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食道癌の浸潤におけるNOTCH1シグナルの解析

本研究の目的はβ-cateninが核に蓄積しない食道癌においてNOTCH1シグナル活性化が浸潤へ誘導する因子を同定することである。この目的を達成するための実験の概要を以下に示す。1臨床検体と細胞株を用いたNOTCH1シグナル亢進と食道癌浸潤能の相関2食道癌におけるNOTCH1が関与する遺伝子の検討3β-cateninが蓄積しない食道癌、およびβ-cateninをノックアウトした大腸癌におけるNOTCH1経路に関与する候補因子の同定4同定した候補因子の浸潤/増殖能における機能解析(in vitro, in vivo)5NOTCH1経路の抑制による抗癌作用の有効性の評価本研究の目的はβ-cateninが核に蓄積しない食道癌においてNOTCH1シグナル活性化が浸潤へ誘導する因子を同定することである。1臨床検体と細胞株を用いたNOTCH1シグナル亢進と食道癌浸潤能の相関2食道癌におけるNOTCH1が関与する遺伝子の検討3β-cateninが蓄積しない食道癌、およびβ-cateninをノックアウトした大腸癌におけるNOTCH1経路に関与する候補因子の同定4同定した候補因子の浸潤/増殖能における機能解析(in vitro, in vivo)5NOTCH1経路の抑制による抗癌作用の有効性の評価
逆解法による工作機械壁面熱伝達率分布の同定とその熱変形解析への応用

精密工作機械の熱変形解析には壁面の熱伝達率を把握することが重要であるが,これを精度よく求めることは実験的にも解析的にも容易ではない.そこで,我々は実験と数値解析を併用する方法として,逆解法の適用の可能性を研究している.その一つとして,比較的短時間の壁面温度測定結果を用いて特異値分解法により熱伝達率分布を推定する方法を開発してきた.本研究では,他の方法としてニューラルネットワークを用いる熱伝達率分布の推定を試み,特異値分解法と比較検討した.本方法においても,壁面温度測定結果を入力データとして熱伝達率分布を推定するので,逆解法の一つとみることができる.得られた結果を以下に要約する.(1)ニューラルネットワークを用いて工作機械各面の壁面温度から滅伝達分布を推定することができた.ただし,本方法では,学習した運転条件の範囲内では,特異値分解法と大差ない精度で推定できたが,学習範囲外の条件に対しては推定精度は低かった.(2)有効なモデルを構築するには広範囲な運転条件の下での実験データが必要であり,実験にかかる負担が大きい.いっぽう,特異値分解法を用いる方法は,一度対象とする工作機械の有限要素モデルを作成すれば広範囲な運転条件に対して有効である.(3)したがって,特異値分解法による方法がニューラルネットワーク法より,汎用性,実用性の点で優れているといえる.精密工作機械の熱変形解析には壁面の熱伝達率を把握することが重要であるが,これを精度よく求めることは実験的にも解析的にも容易ではない.そこで,我々は実験と数値解析を併用する方法として,逆解法の適用の可能性を研究している.その一つとして,比較的短時間の壁面温度測定結果を用いて特異値分解法により熱伝達率分布を推定する方法を開発してきた.本研究では,他の方法としてニューラルネットワークを用いる熱伝達率分布の推定を試み,特異値分解法と比較検討した.本方法においても,壁面温度測定結果を入力データとして熱伝達率分布を推定するので,逆解法の一つとみることができる.得られた結果を以下に要約する.(1)ニューラルネットワークを用いて工作機械各面の壁面温度から滅伝達分布を推定することができた.ただし,本方法では,学習した運転条件の範囲内では,特異値分解法と大差ない精度で推定できたが,学習範囲外の条件に対しては推定精度は低かった.(2)有効なモデルを構築するには広範囲な運転条件の下での実験データが必要であり,実験にかかる負担が大きい.いっぽう,特異値分解法を用いる方法は,一度対象とする工作機械の有限要素モデルを作成すれば広範囲な運転条件に対して有効である.(3)したがって,特異値分解法による方法がニューラルネットワーク法より,汎用性,実用性の点で優れているといえる.
バイオマイクロマシニングによる隔膜型細胞デバイスの構築

本年度は,細胞機能の評価が簡便に再現性良く行えるアッセイシステムの開発を目的とし,微細構造体を利用した培養システムの開発,ならびに電気化学計測に基づく細胞計測との融合をおこなった.以下に,本研究で得られた成果を述べる.細胞集団に対して簡便に再現性良く局所薬剤投与をおこなうことが可能な隔膜型の培養基板を開発し,電気化学計測(SECM測定)や細胞パターニング技術と組みあわせることで,局所薬剤投与に基づくバイオアッセイシステムを構築した.直径約50μmの貫通孔を有する培養基板を作製し,細胞数個の領域に40分間以上継続して局所薬剤投与がおこなえるシステムを実現した.次に,開発した局所薬剤投与技術を,SECM測定や細胞パターニング技術と組みあわせて,相対比較に基づく電気化学バイオアッセイと,心筋細胞マイクロパターンの薬理特性の評価がおこなえることを確認した.これらは,バイオアッセイにおける感度と信頼性の向上,および,細胞間作用の詳細な解析を可能とする有用な成果である.これらの成果はSensors and Actuators誌にて発表した.また,貫通孔を有する培養基板の上下に平板電極を設置すると,電場印加によるエレクトロポレーション現象を利用して,細胞集団の局所に分子導入がおこなえることを明らかにした.これは,培養基板の貫通孔近傍に高電場が局所形成されることを利用したものであり,サイズが異なる貫通孔の配置によって,蛍光分子やDNAの導入に最適な電場強度をスクリーニングすることに成功している.この成果は,医学,生物学的に重要な初代培養細胞やES細胞などへも簡便に遺伝子を導入するシステムの実現に有効な知見である.以上のように,微細な構造を有する細胞培養システムを開発,ならびに細胞アッセイへの応用をおこない,隔膜型細胞デバイスの構築に有効な成果を得たと考えている.本年度は,細胞機能の評価が簡便に再現性良く行えるアッセイシステムの開発を目的とし,微細構造体を利用した培養システムの開発,ならびに電気化学計測に基づく細胞計測との融合をおこなった.以下に,本研究で得られた成果を述べる.細胞集団に対して簡便に再現性良く局所薬剤投与をおこなうことが可能な隔膜型の培養基板を開発し,電気化学計測(SECM測定)や細胞パターニング技術と組みあわせることで,局所薬剤投与に基づくバイオアッセイシステムを構築した.直径約50μmの貫通孔を有する培養基板を作製し,細胞数個の領域に40分間以上継続して局所薬剤投与がおこなえるシステムを実現した.次に,開発した局所薬剤投与技術を,SECM測定や細胞パターニング技術と組みあわせて,相対比較に基づく電気化学バイオアッセイと,心筋細胞マイクロパターンの薬理特性の評価がおこなえることを確認した.これらは,バイオアッセイにおける感度と信頼性の向上,および,細胞間作用の詳細な解析を可能とする有用な成果である.これらの成果はSensors and Actuators誌にて発表した.また,貫通孔を有する培養基板の上下に平板電極を設置すると,電場印加によるエレクトロポレーション現象を利用して,細胞集団の局所に分子導入がおこなえることを明らかにした.これは,培養基板の貫通孔近傍に高電場が局所形成されることを利用したものであり,サイズが異なる貫通孔の配置によって,蛍光分子やDNAの導入に最適な電場強度をスクリーニングすることに成功している.この成果は,医学,生物学的に重要な初代培養細胞やES細胞などへも簡便に遺伝子を導入するシステムの実現に有効な知見である.以上のように,微細な構造を有する細胞培養システムを開発,ならびに細胞アッセイへの応用をおこない,隔膜型細胞デバイスの構築に有効な成果を得たと考えている.
LED光源利用による食用茸類の生体電位を指標とした至適栽培制御装置の開発

茸の至適成育条件(培地・温度・湿度・光など)に関して、科学的側面の検討は大変遅れている。申請者らは、茸の成長の活性化と密接な関係があると推定される生体電位信号を指標とし、光刺激条件(波長,輝度,照射方法など)や形態形成との対応関係を調べ、至適成育条件を工学的側面から究明し茸栽培制御用の新しいタイプの光源装置の開発を試みる。また、培地内部の菌糸の発達をMRI装置により非破壊的に撮影する。更に、光質変化が形態形成に及ぼす影響に関し、さらに踏み込んだ分子的機構である遺伝子解析による発現遺伝子の解明も試みる。本研究の実施概要を以下に記す。(1)光刺激因子の系統的な変化実験の趣旨に対応した自作のインキュベータを用いた、光刺激による生体電位の更なる精密自動計測システムの改良を実施した。(2)自発性生体極微弱計測の試み非破壊・非侵襲の計測方法であるSQUID装置を用いた、茸から発生する極微弱磁場信号計測を試みることで、培地内部の菌糸の熟度診断や菌傘の成長診断への有効性を検討した。(3)茸工場の現場での光源装置開発簡易自作型Growth Chamberを更に改良し、種々の光刺激を与えた場合の成長の比較実験(形態形成実験)をChamber内で実施した。併せて生体電位のセンシングも同時に行い、茸の健康診断も同時に行った。茸自身が環境モニタとしてのバイオセンサ的機能の有効性を検証した。なお、現時点でも民間の茸工場と共同で「連続光・ゆらぎ光・パルス光」などを茸に照射して、予備的に現場での形態形成の比較実験を進めているが、未だ充分な検証までは至っていない。(4)MRI装置を用いた培地断層撮影培地内部の菌糸の発達に関して、植菌から原基形成に至るまでをMRI装置により、非破壊的に約2週間毎に系統的に撮影し、その方法を確立し塾度診断に目処をつけた。(5)遺伝子解析光質変化が形態形成に及ぼす影響に関し、分子的機構である遺伝子解析による発現遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)の検出をDD法で比較し、解析を試みた。茸の至適成育条件(培地・温度・湿度・光など)に関して、従前より生産現場の経験的側面からの検討は十分行われているが、科学的側面の検討は大変遅れている。申請者らは、茸の成長の活性化と密接な関係があると推定される生体電位信号を指標とし、光刺激条件(波長,輝度,照射方法など)や形態形成との対応関係を調べ、至適成育条件を工学的側面から究明し茸栽培制御用の新しいタイプの光源装置の開発を試みている。また、培地内部の菌糸の発達をMRI装置により非破壊的に撮影した。更に、光質変化が形態形成に及ぼす影響に関し、さらに踏み込んだ分子的機構である遺伝子解析による発現遺伝子の解明にも着手した。得られた成果の概要を以下に記す。1.光刺激因子の系統的な変化実験の趣旨に対応した自作のインキュベータを用いた、光刺激による生体電位の更なる精密自動計測システムの改良を実施した。(1)強さ・明暗刺激間隔:光刺激の強度や規則的な明暗刺激間隔などによる生体電位に及ぼす影響力に関する知見はすでに得ているが、成長制御(形態形成)に最適な条件の確立までには至っていない。

系統的な外的刺激実験を実施した結果、連続照射光よりも間欠照射光の方が形態形成に与える影響力が強いことを突き止めた。(2)波長(光刺激の色):刺激光源の波長が、菌枝の徒長や菌傘・枝などへの変色効果へ与える影響について、これまでに得られた結果をほぼ検証できた。2.MRI装置を用いた菌糸の撮影地下系である培地内部の菌糸の発達に関して、植菌直後から子実体が胞子を落とすまでの茸の一生の期間において、MRI装置を用いて非破壊的に系統立てた断層画像に成功した。3.遺伝子解析光形態形成と細胞の分子機構との関係について、発現遺伝子であるメッセンジャーRNA(mRNA)の検出をDD法で比較検討中である。茸の至適成育条件(培地・温度・湿度・光など)に関して、生産現場の経験的側面からの検討は十分行われているが、科学的側面の検討は大変遅れている。申請者らは、茸の成長の活性化と密接な関係があると推定される生体電位信号を指標とし、光刺激条件(波長,輝度,照射方法など)や形態形成との対応関係を調べ、至適成育条件を工学的側面から究明し茸栽培制御用の新しいタイプの光源装置の開発を試みている。本年度の実施概要を以下に記す。(1)茸工場の現場での光源装置開発簡易Growth Chamberを更に改良し、前年度で得られた結果を踏まえ、種々の光刺激を与えた場合の成長の比較実験(形態形成実験)をGrowth Chamber内で実施した。併せて生体電位のセンシングも同時に行い、茸の健康診断も同時に行った。茸自身が環境モニタとしてのバイオセンサ的機能の有効性を検証した。なお、現時点でも民間の茸工場と共同で「連続光・ゆらぎ光・パルス光」などを茸に照射して、予備的に現場での形態形成の比較実験を進めているが、未だ充分な検証までは至っていない。(2)自発性生体極微弱計測の試み非破壊・非侵襲の計測方法であるSQUID装置を用いた、茸から発生する極微弱磁場信号計測を試みることで、培地内部の菌糸の熟度診断や菌傘の成長診断への有効性を検討した。(3)遺伝子解析光質変化が形態形成に及ぼす影響に関し、前年度の研究成果を踏まえ更に分子的機構である遺伝子解析による発現遺伝子の解析を継続した。(4)MRI装置での培地断層撮影培地内部の菌糸の発達に関して、植菌から原基形成に至るまでをMRI装置により非破壊的に約2週間毎に系統的に撮影し、その方法を確立した。(5)その他光刺激に対する生体電位の発生機序については、茸の細胞内に存在するカロチノイドの補助色素成分が一般的に関与することは文献等から推定されるが、本研究で対象としている茸類に適用するかは不明である。そこで、各種光刺激を与える前後の茸のサンプルに対する生体の成分分析を外部の調査機関と共同で実施し、色素成分の変化と生体電位との関係を検討した。
エピジェネティクス動態―ライブイメージングからの挑戦―

細胞集団的解析"populational analysis"が主流であるエピジェネティクス研究領域に、細胞個別的解析"single cell imaging analysis"を導入することを目標に、プローブ開発およびイメージングシステムのセットアップを行った。メチル化DNAへの親和性を変化させたプローブ作製を計画し、より細胞毒性の少ないプローブ候補を検討した。候補プローブの多色化を行い、性能評価を行った。Fucci技術との併用を検討した。4次元イメージングを高解像度に行うための顕微鏡システムのセットアップを行った。今後は本研究を平成25年度・基盤研究(C)に引継ぎ、さまざまな状態の細胞集団の細胞個々をイメージングしながら、細胞周期スイッチ・分化スイッチ・エピジェネティクススイッチの関連の可視化・解釈を行っていく。以上より、候補MBDドメイン断片“A"は、メチル化DNAへの親和性が高いため、長期間の観察を行うと、細胞にダメージが現れる可能性を示唆するデータを得た。そのため、親和性を変化させたプローブ作製を開始した。さらに、DNAのメチル化・非メチル化状態を、プローブの局在変化に置き換える事をふまえ、プローブの改良を検討中である。3.Fucci技術との併用を検討した。4.4次元イメージングを高解像度に行うための顕微鏡システムのセットアップを行った。1年計画申請の本研究の大半は、プローブ性能評価および、改良・開発に費やした。また並行して、4次元イメージングを高解像度に行うための顕微鏡システムのセットアップを行った。宮脇研にあるFV1000confocal imagingsystemに、マルチウェル・ステージトップCO2インキュベータおよび、生体観察に最適なシリコーン浸対物レンズを導入した。生命現象の一端を多角的に可視化する準備が整ったことになる。しかし、生命現象はエピジェネティクス変化のみならず、種々の現象が複雑にからみあって進行している。今後は、本研究を引き継ぐ形で、基盤(C)へと移行する。細胞の様々な反応を可視化するプローブを作製し、細胞周期(Fucci)やメチル化状態と絡めながら、生命現象を可視化・理解していくことを目的として鋭意研究をすすめていく。
黄土高原からの土壌流出を抑えるスイッチグラスの機能解析と系統選拔

荒廃した中国黄土高原において、過去15年間に導入した約2万種の雑草の中から、スイッチグラスだけが現地の斜面に良く生育し、低温乾燥の冬期に耐え、土壌の流出を抑えることを見出した。本研究では、現地適応性の機能と低温乾燥耐性種の選抜について検討した。1、黄土高原に適応し、土壌流出を抑えるスイッチグラスの生態的機能は次の通りである。(1)低温耐性機能はラィゾームにある。スィッチグラスのラィゾームは典型的な寒地型雑草であるシバムギと同程度の低温耐性を持ち、-20°Cに24時間置かれても生存する特性を示した。(2)乾燥耐性機能はライヅームにある。スイッチグラスのライゾームはシバムギよりも乾燥耐性が強く、-20°Cで水分が50%以下に低下しても生存できる特性を示した。(3)土壌緊縛力は根系にある。スイヅチグラスの根系は黄土高原に優占するイネ科のホクシハネガヤやキク科のヨモギ類に比べて、10倍以上の土壌緊縛力を持ち、その原因は太く、長く、数多い根系を持っことに起因した、(4)競合力機能は比較的小さい。現地に優占するホクシハネガヤなどは種子の先端に2本の長いのぎを持ち、空中湿度の変化を利用して種子が土中2cm以下にもぐり込むことで冬期の低温と乾燥に耐える機能を具えている。スイッチグラスはそのような機能を持っていないので、人が土中2cm以下に播種した個体だけが越冬し、ライゾームを伸ばして個体を拡大させることが出来ても、自然条件で個体数を増加させることは出来ない。従って、スイッチグラスは競合力が比較的弱く、黄土高原の在来種を駆逐することはないと結論される。2、スイッチグラスの低温と乾燥耐性を具えた系統選抜は次の通りである。中国の試験地において、低温と乾燥の耐性を具えた系統を選抜した。中国の黄土高原は数千年にわたる森林伐採、傾斜畑の造成、羊の過放牧に加えて、崩れ易い黄土の特性が相まって砂漠化が進行している。私たちは、この高原の緑化のため現地に導入した約2万種の雑草の中から、アメリカ合衆国原産で中国東北地方の雑草となっているswitchgrassだけが良く生育し、土壌の流失を抑えることを見出した。本研究では、現地の冬期気温が-20°C以下、降雨が全く無いという厳しい環境条件に、この雑草がどのような機能を発揮して適応し、黄土の流失を抑えるのかについて検討した。その結果、(1)switchgrassのライゾームはこれまで現地で緑化植物として評価されていたBromus inermisに比べて生存限界温度が低く、水分蒸発に伴う生存限界水分含有率の低いことが、低温と乾燥条件の厳しい現地に適応したと考えられる。(2)switchgrassによる黄土の流出防止効果がBromus inermisよりも大きい原因は、土壌緊縛力が約10倍大きく、一株根系分布域が約6倍大きいことと密接に関係していると考えられる。(3)Stipa bungeana(被度40.3%)とArtemisia spp.(42.8%)が優占し、埴被率101.9%の現地にswitchgrassを播種すると、4年後にはswitchgrass(被度53.4%),Stipa bungiana(27,8%)およびArtimisia spp.(25.9%)が優占し、植被率111.4%に変化した。

従って、switchgrassは在来種との競合力の強いことが判明した。(4)switchgrassは形態的変異ならびに遺伝的変異の大きいことが判明した。今後、低温耐性と乾燥耐性の特性を具えた系統を選抜できる可能性が示唆された。荒廃した中国黄土高原において、過去15年間に導入した約1万7千種の雑草の中から、スイッチグラスだけが現地の斜面によく生育し、低温乾燥の冬期に耐え、土壌の流出を抑えることを見出した。本研究では以下のことを明らかにした。1、黄土高原に適応し、土壌流出を抑えるスイッチグラスの生態的機能は次の通りである。(1)低温耐性機能はライゾームにある。スイッチグラスのライゾームは典型的な寒地雑草であるシバムギと同程度の低温耐性を持ち、-20度に24時間置かれても生存できる特性を示した。(2)乾燥耐性機能はライゾームにある。スイッチグラスのライゾームはシバムギよりも強く、-20度条件下において水分が50パーセント以下に低下しても生存できる特性を示した。(3)土壌緊縛力機能は根系にある。スイッチグラスの根系は黄土高原に優占するイネ科のホクシハネガヤやキク科のヨモギ類に比べて、10倍以上の土壌緊縛力を持ち、その原因は太く、長く、数多い根系を持つことに起因した。(4)競争力機能は比較的小さい。現地に優占するホクシハネガヤなどは、スイッチグラスと同じイネ科でスイッチグラスよりも草高が低いにもかかわらず、スイッチグラスに消滅させられることはない。なぜならば、スイッチグラスは多数の種子を生産し、翌年、土壌表面に落ちた種子から幼苗を生育させるが、冬期の低温と乾燥に耐えるだけのライゾームを形成出来ずに枯死し個体を増やすことが出来ない。これに対してホクシハネガヤなどの現地優占種は種子の先端に2本の長いのぎを持ち、空中湿度の変化を利用して土中2cm以下にもぐり込み、越冬できるという特性を具えている。そのため、スイッチグラスについては、人が土中2cm以下に播種した個体だけしか生存出来ず、自然条件下で在来種を駆逐することは出来ないと結論される。2、スイッチグラスの低温および乾燥耐性を具えた系統選抜は次の通りである。原産地のアメリカ合衆国と試験地である中国陝西省において形態的な特性および倍数性について調査、分類した。低温および乾燥耐性の系統については中国の試験地で数系統を得た。
チタンのドライ・セミドライプレス加工における凝着抑制技術の開発

本研究は、容易に金型への凝着が生じるチタンの絞り加工における凝着抑制を目的としている。チタンの凝着は表面の酸化膜が加工中に剥離し、金属の清浄面が露出した個所で金型と接触することに起因して、凝着が発生することに着目し、絞り加工中の酸化膜の剥離を抑制することで、チタンの凝着を抑制する方法を提案した。具体的な凝着抑制技術(酸化膜剥離抑制技術)として、「絞り加工が行われる金型内へ圧縮空気を積極的に援用すること」と「圧縮空気が金型内に円滑に入り込むために高周波振動を金型へ印加すること」に着目した内容であり、交付申請書で3カ年計画の2年目となる平成29年度では、平成28年度において設計・開発した小型サーボプレス機は、高比強度のチタン合金の成形を行うに十分な性能を発揮しており、純チタンおよびチタン合金を対象として、本凝着抑制技術の骨子である圧縮空気の援用+高周波振動印加しわ抑え力を適用した絞り加工を行った。チタンの酸化膜は、陽極酸化、大気酸化といった生成方法により、結晶構造が異なることから、それぞれの生成方法で酸化膜を有する純チタンおよびチタン合金を供試材として絞り加工を行った。また、各生成方法と膜厚によって、絞り加工における酸化膜が剥離する特性が異なるため、加工条件として、金型形状、金型の材質、加工速度、しわ抑え力といった一般的な絞り試験における基礎特性を取得した。その後、異なる条件における圧縮空気の援用+高周波振動印加しわ抑え力の効果を解明するために、圧縮空気の温度、圧力、また高周波振動印加の有無といった凝着抑制技術の適用によってチタンの加工中の酸化膜の剥離を抑制し、加工中の酸化膜の剥離抑制により金型へのチタンの凝着を抑制する結果を得た。申請時の予定として、平成29年度の研究計画では、純チタン・チタン合金を対象として、加工前のブランクを大気酸化することで、膜厚の異なる酸化膜を有するブランクを作成し、各酸化膜の条件に対して、圧力、湿度および温度等の異なる湿り空気の条件を用いて、加工中に酸化膜が剥離しない要素技術の開発を行う予定であったが、研究の進展に伴い、膜厚のみだけではなく、酸化膜の生成方法によっても、酸化膜の剥離特性が異なることが示唆されたため、剥離モデルおよび凝着抑制モデルの構築のため、陽極酸化・大気酸化した純チタン・チタン合金を対象として、絞り加工を行った。陽極酸化・大気酸化のいずれの手法で生成された酸化膜を有する純チタン・チタン合金においても、圧縮空気および高周波振動印加しわ抑え力の適用は、絞り加工中の酸化膜の剥離を抑制し、チタンの金型への凝着を抑制する効果を得たため、現在はいずれの条件も考慮した酸化膜の剥離モデルおよび凝着抑制モデルの構築中である。平成30年度では、平成28年度に開発した小型サーボプレスを引き続き用いて、平成29年度から現在構築中の酸化膜の剥離モデルおよび凝着抑制モデルを発展させ、陽極酸化および大気酸化により生成した酸化膜を有する純チタン・チタン合金を対象として様々な加工条件(絞り比、金型の寸法など)に対して、凝着を抑制可能な圧縮空気および高周波振動印加しわ抑え力の条件を探索することで、純チタンおよびチタン合金のドライ・セミドライプレス加工を実現する。チタンの凝着は表面の酸化膜が加工中に剥離し、金属の清浄面が露出した箇所にで金型と接触するために凝着が発生するということに着目し、絞り加工中の酸化膜の剥離を抑制することで、チタンの凝着を抑制する方法を提案した。具体的な凝着抑制技術(酸化膜剥離抑制技術)として、「絞り加工が行われる金型内へ湿り空気を積極的に援用すること」と「湿り空気が金型内に円滑に入り込むために高周波振動を金型へ印加」に着目した内容である。そのため、従来のプレス機(絞り加工装置)にはない機能として、湿り空気の圧力、温度等を制御した状態で金型内へ送り込む機構と金型(しわ抑え)に高周波振動を印加できる機構を有する装置の開発が必要である。また、絞り加工の対象となる材料として、純チタンのみではなく、高強度のチタン合金としているため、装置自体の剛性が高く、高強度材料の変形抵抗を超える推力を有する加工装置である必要がある。そのため、交付申請書は3カ年の計画となっており、初年度にあたる平成28年度は上記内容を達成するための機構を備えた絞り加工装置の設計・開発を予定しており、計画に従い装置の設計・開発を行った。具体的には、申請者が先行研究(所属機関内の資金による研究)において、開発した小型サーボプレス装置(純チタン用の低加工力)をベースに、装置の高剛性化と高推力を備えた機構とし、さらには、本研究の最大の骨子となる「湿り空気を金型内へ援用可能な構造」と「金型(しわ抑え)に高周波振動を印加できる機構」を備えた絞り加工装置とした。申請時の予定として平成28年度研究計画として、湿り空気および高周波振動の援用が可能なプレス装置の開発を設定し、予定通りに本年度は、円筒深絞り加工中に金型(しわ抑え)への高周波振動が印加可能であり、高比強度のチタン合金に対応可能な加工力を有するプレス加工機および湿り空気の圧力、湿度および温度を制御した湿り空気を送り込むための装置を開発した。

開発した装置を用いて、プレス機としての性能(加工速度、最大加工板厚、しわ抑え力の下限上限値等)の確認と、凝着抑制技術の条件の範囲(湿り空気の圧力、温度等、また、高周波振動の周波数等)の動作確認、およびそれらを複合的に組み合わせた際のいわゆる装置全体としての動作確認を行っている状態である。本研究は、容易に金型への凝着が生じるチタンの絞り加工における凝着抑制を目的としている。チタンの凝着は表面の酸化膜が加工中に剥離し、金属の清浄面が露出した個所で金型と接触することに起因して、凝着が発生することに着目し、絞り加工中の酸化膜の剥離を抑制することで、チタンの凝着を抑制する方法を提案した。具体的な凝着抑制技術(酸化膜剥離抑制技術)として、「絞り加工が行われる金型内へ圧縮空気を積極的に援用すること」と「圧縮空気が金型内に円滑に入り込むために高周波振動を金型へ印加すること」に着目した内容であり、交付申請書で3カ年計画の2年目となる平成29年度では、平成28年度において設計・開発した小型サーボプレス機は、高比強度のチタン合金の成形を行うに十分な性能を発揮しており、純チタンおよびチタン合金を対象として、本凝着抑制技術の骨子である圧縮空気の援用+高周波振動印加しわ抑え力を適用した絞り加工を行った。チタンの酸化膜は、陽極酸化、大気酸化といった生成方法により、結晶構造が異なることから、それぞれの生成方法で酸化膜を有する純チタンおよびチタン合金を供試材として絞り加工を行った。また、各生成方法と膜厚によって、絞り加工における酸化膜が剥離する特性が異なるため、加工条件として、金型形状、金型の材質、加工速度、しわ抑え力といった一般的な絞り試験における基礎特性を取得した。その後、異なる条件における圧縮空気の援用+高周波振動印加しわ抑え力の効果を解明するために、圧縮空気の温度、圧力、また高周波振動印加の有無といった凝着抑制技術の適用によってチタンの加工中の酸化膜の剥離を抑制し、加工中の酸化膜の剥離抑制により金型へのチタンの凝着を抑制する結果を得た。申請時の予定として、平成29年度の研究計画では、純チタン・チタン合金を対象として、加工前のブランクを大気酸化することで、膜厚の異なる酸化膜を有するブランクを作成し、各酸化膜の条件に対して、圧力、湿度および温度等の異なる湿り空気の条件を用いて、加工中に酸化膜が剥離しない要素技術の開発を行う予定であったが、研究の進展に伴い、膜厚のみだけではなく、酸化膜の生成方法によっても、酸化膜の剥離特性が異なることが示唆されたため、剥離モデルおよび凝着抑制モデルの構築のため、陽極酸化・大気酸化した純チタン・チタン合金を対象として、絞り加工を行った。陽極酸化・大気酸化のいずれの手法で生成された酸化膜を有する純チタン・チタン合金においても、圧縮空気および高周波振動印加しわ抑え力の適用は、絞り加工中の酸化膜の剥離を抑制し、チタンの金型への凝着を抑制する効果を得たため、現在はいずれの条件も考慮した酸化膜の剥離モデルおよび凝着抑制モデルの構築中である。平成29年度は、平成28年度において開発した装置を用いて、純チタンおよびチタン合金を供試材とし、本凝着技術の骨子である湿り空気および高周波振動を援用した円筒絞り加工を行う。凝着の要因である酸化膜の剥離においては、湿り空気の条件(圧力、温度等)および高周波振動(周波数等)の条件だけではなく、供試材となるチタン表面の酸化膜の膜厚、絞り加工速度等にも影響を受けるため、これら加工条件において異なる条件で試験を行いデータベース化を行う。
植物病原菌フィールド分離株のDNAに病原菌の起源と進化の道筋を探る

本研究の目的は、フィールド調査等で収集する植物病原菌に対して分子系統学的アプローチで病原性進化の道筋を想定し、「いつ・どこで宿主植物に対する病原性を獲得」し、「それ以降現在までどのようにして病原性を進化させてきたか」を考察することである。そのため、主にトマト萎凋病菌-トマト系を対象に研究を遂行し、以下の成果を得た。トマト原産地であるチリ北部で2度(2002年12月および2004年3月)のフィールド調査を実施、自生野生種トマト属植物を採集、輸入、それより650余株の糸状菌(植物体上に生息していたものと考えられる)を分離、同定、解析を進めた。2002年の調査で得た約250菌株の、形態学的、分子生物学的手法を併用した同定は終了した。そのうち、F.oxysporum16菌株について、トマトに対する病原性検定を行ったところ、病原性を有する株は認められなかった。2004年の調査で得た約400菌株については現在同定中である。国内、米国、中国、欧州等で採集あるいは研究者等の協力を得て収集したトマト萎菌凋病菌F.oxysporum f.sp.lycopersici菌株について系統解析を行った。その結果、世界的に3つの系統が存在すること、各系統内で病原性分化が起きていること、宿主植物(種子等と推測される)の移動によりダイナミックに病原菌も移動していること、最近わが国へ新系統であるレース3が侵入していること、などを明らかにした。2002年度の調査で分離したトマトに病原性を持たないF.oxysporum菌株について、分子系統解析を行った。大変興味深いことに、野生種トマト属植物から分離した菌株は、トマト萎菌凋病菌に近縁であることが判明した。これは、トマト萎菌凋病菌の祖先型である病原性を持たない菌が、野生トマトに定着していることを示唆するものであり、トマト-萎凋病菌の共進化を強く示唆した。本研究の目的は、フィールド調査などで収集する海外各地および日本産の植物病原菌に対して分子生物学的アプローチにより病原菌の病原性進化の道筋を想定し、これと宿主植物の進化・育種の歴史を併せ、植物病原菌が「いつ・どこで宿主植物に対する病原性を獲得」し、また、「それ以降現在までどのようにして病原性を進化させてきたか」を考察することである。本年の実施状況は以下のとおりである。1、トマト原産地であるチリ北部より野生トマト属植物を採集・携行輸入、それより数百の糸状菌菌株を分離、現在同定・解析を進めている。同時に、チリの栽培トマトからの病原菌等の分離も行った。2、中国、ベトナム、ガーナで栽培イネを採集し、それより数百のいもち病菌を分離した。同定、病原性検定、多様性解析を進めている。3、国内のトマト、イネより分離したF.oxysporum、A.alternata、M.griseaおよび国内、米国、中国、欧州、アフリカ等の菌株保存機関、研究者の協力を得て収集したこれら糸状菌の菌株について系統解析を行った。トマト萎菌凋病菌F.oxysporum f.sp.lycopersiciでは、世界的に3つの系統が存在すること、各系統内でレースなどの病原性分化が起きていること、宿主植物(種子等と推測される)の移動によりダイナミックに病原菌も移動していること、最近わが国への新系統の新レースであるレース3が侵入していること、などが見出された。

この成果については現在論文投稿中である。本研究の目的は、フィールド調査などで収集する海外各地および日本産の植物病原菌に対して分子生物学的アプローチにより病原菌の病原性進化の道筋を想定し、これと宿主植物の進化・育種の歴史を併せ、植物病原菌が「いつ・どこで宿主植物に対する病原性を獲得」し、また、「それ以降現在までどのようにして病原性を進化させてきたか」を考察することである。昨年中に、主に、1,トマト原産地であるチリ北部で野生トマト属植物を採集し、数百の糸状菌菌株を分離した、2,分子系統学的手法により、トマト萎菌凋病菌F.oxysporum f.sp.lycopersiciでは、世界的に3つの系統が存在することを示した。本年の主要な実績は以下の通りである。1、H15年度にトマト原産地であるチリ北部で採集した野生トマト属植物から分離した糸状菌の同定を行った(成果は、2003年9月の日本植物病理学会関東部会で報告)。同定は、形態学的観察、分子同定法を併用した。2、1で同定した糸状菌のうち、F.oxysporumについて、トマトに対する病原性検定を行ったところ、病原性を持つ株は認められなかった。3、1で同定した糸状菌のうち、F.oxysporumについて、分子系統解析を行った。大変興味深いことに、野生トマト属植物から分離したF.oxysporumは、トマト萎菌凋病菌F.oxysporum f.sp.lycopersiciに近縁であることが判明した(成果は、2003年11月の糸状菌分子生物学コンファレンスで報告)。4、3で示した結果は、野生トマトに、病原性を獲得する以前の、トマト萎菌凋病菌の祖先に近縁の菌が定着していることを示すものであり、トマト-萎凋病菌の共進化を強く示唆した。5、これらをふまえて、確認のため、平成16年3月に再度チリ北部における野生トマトの採集を行った。
ガドリニウム錯体による新規光増感剤の開発

前年度までに開発したガドリニウム錯体の光増感を指向した物性探索を行った。その結果、フェニル基を発光部位とするガドリニウム錯体が、通常観測困難な「空気下・室温」で燐光を示すことを見出した。X線結晶構造解析を行った結果、励起三重項状態の失活の原因となるπ-π相互作用を巧みに回避しうるパッキングになっていることがわかった。また、アルゴン雰囲気下と空気下において、結晶の発光量子収率はほとんど変化しない。つまり、結晶化することで励起三重項状態の酸素による消光が制御できていることがわかった。さらに興味深いことに、1-ナフトールをドープすることで発光色を青色から薄緑色へ制御可能であり、発光量子収率は約3倍になることを見出した。発光寿命等の測定により、フェニル基を発光部位とするガドリニウム錯体の結晶をプラットフォームとして、1-ナフトールの燐光が光増感されていることを明らかにした。これらの成果は、平成28年5月に学術論文として発表した(Dalton Trans. 2016, 45, 11620.)。さらに、ガドリニウム錯体の配位子内遷移のみに強く依存した励起三重項状態を詳細かつ系統的に検討し、酸素に応答する発光性テルビウム錯体やジスプロシウム錯体の酸素応答メカニズムに関する重要な知見を得た(Dalton Trans. 2016, 45, 9492.; Inorg. Chem. 2016, 55, 6609.)。平成28年11月から平成29年3月までの間、カリフォルニア大学アーバイン校にて研究活動を行い、蛍光顕微鏡を用いて極微量の中間体を観測し、従来ではブラックボックスになっていた反応メカニズムを解明する革新的な実験技術を習得し第一著者として学術論文を発表した(ACS Catl. 2017, 7, 3786.)。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、ガドリニウム錯体を用いて、光電気化学セルや二酸化炭素の光還元における変換効率を向上させる、高性能な光増感剤を開発することである。具体的には、ガドリニウム錯体が、光増感剤として重要な次の2つの性質を示すことを期待して研究を進めている。(1)長い励起寿命を有する。(2)化学修飾によって容易に酸化還元電位を制御することができる。平成27年度は、当初の研究計画に沿って研究を遂行した。先行実験(Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 8722)の結果をもとに、新たに2種類のガドリニウム錯体を設計・合成し、その構造を調べた。単結晶X線構造解析の結果より、期待していた通り、溶媒分子であるTHF(テトラヒドロフラン)が1分子配位した7配位構造を有するガドリニウム錯体が合成できていることがわかった。また、合成した新規ガドリニウム錯体の「光増感剤」としての基本物性(酸化還元電位、励起エネルギー、励起寿命および量子収率)を明らかにした。これらの研究を進めている過程で、フェニル基を発光部位とするガドリニウム錯体が、通常観測困難な「空気下・室温・結晶状態」でリン光(励起三重項状態からの発光)を示すことを発見した。この現象は、高輝度な発光デバイスの開発という観点から近年注目集めている。この錯体の結晶状態での光物性を明らかにし、得られた結果を学術論文にまとめた(投稿中)。平成27年度の研究計画に沿って、予定通り「光増感剤」への応用を目的とした新規ガドリニウム錯体を設計・合成し、その物性を明らかにした。また、得られた成果の一部は学術論文としてまとめ(投稿中)、研究は着実に進展している。

平成28年11月から平成29年3月までの間、カリフォルニア大学アーバイン校にて研究活動を行い、蛍光顕微鏡を用いて極微量の中間体を観測し、従来ではブラックボックスになっていた反応メカニズムを解明する革新的な実験技術を習得し第一著者として学術論文を発表した(ACS Catl. 2017, 7, 3786.)。予定通り、平成27年度(1年目)に開発したガドリニウム錯体を、二酸化炭素の光還元系や光電気化学セルの光増感剤として応用する研究を進める。具体的には、酸化還元電位やエネルギー準位を考慮して、様々な触媒やアノード電極との組み合わせを検討する(光増感反応用試薬、光照射関連器具、実験用ガラス器具を新たに購入予定)。早期にプロトタイプとなる系を見出し、変換効率や反応の量子収率等を評価する(現有設備有り)。28年度が最終年度であるため、記入しない。
フラーレン結晶の光照射硬化

平成10年度-11年度に行われた本研究の成果を報告する。C60結晶とC70結晶の光照射硬化について以下のことがわかった。1.C60結晶に光を照射し、微小硬度計で硬さの測定を行うと硬さは光照射時間、光照射強度、照射光の波長、測定温度、に依存した。特に照射光の波長に強く依存し赤色による照射が最も効果があった。また、硬さの測定温度にも強く依存し、400K以上では照射効果は認められなかった。2.C60結晶の光照射硬化の原因となる光生成物をラマン分光により固定した。光照射硬化の原因となるC60結晶の光生物についていろいろ議論があり未解決の部分があった。そこでC60結晶の光照射時間に関してラマン振動数の変化を測定した結果、intrinsicな1469cm^<-1>のピークは光照射時間とともに1465,1464,1460cm^<-1>へと変化した。このことはC120,C120O_2、などを経て光誘起ポリマーに変化することがわかった。結果として光照射硬度化はこれらの光生成物と転移との相互作用によるもと結論された。3.C70結晶の光照射効果を研究するためにC60結晶と同じような実験を行った。その結果、C60結晶の10倍近い照射時間によって光照射硬化が観察された。このことからC70結晶でも光生成物が形成されることがわかった。C60結晶に比べ光生成物の反応速度が遅いため余分の時間がひつようであるが、光生成物としてC70ダイマーが形成されているものと考えられる。平成10年度に得た研究成果を以下に示す。C_<60>結晶で光照射すると微小硬さが硬化する現象がある.その硬化の原因としてふたつの可能性が考えられる。ひとつは酸素の影響、もうひとつは光誘起ポリマーの影響である。そこで、本研究はフラーレン結晶のC_<60>結晶とC_<70>結晶をもちいて微小硬さの酸素と光の影響について調べた。(1) C_<60>結晶では10^<-6>Torr.の真空中で光照射した結果、光照射硬化が観測された。(2) C_<60>結晶で光照射硬化の励起波長依存性を測定した結果、光誘起ポリマーが生成される波長とその依存性が一致した。(3) C_<60>結晶ではC_<60>薄膜で観察されているような酸素による光誘起ポリマーの生成の凍結が見られなかった。以上の結果より光照射硬化は酸素よりむしろ光誘起ポリマーに起因するものと考えられる。また、C_<70>結晶においても微小硬さ試験が行われた。その温度依存性は温度の増加にともない硬さも増加し、一般的な挙動を示した。光照射に関してはC_<70>結晶も長時間照射によって硬くなることがわかった。このことからもC_<70>結晶でも光照射硬化が現れることがわかった。本年度はC60結晶の光照射硬化の原因となる光生成物のラマン分光による同定とC70結晶の光照射硬化について研究しその成果を得たので報告する。光照射硬化の原因となるC60結晶とC60薄膜の光生成物についていろいろ議論があり未解決の部分があった。そこでC60結晶の光照射時間に関してラマン振動数の変化を測定した結果、intrinsicな1469cm^<-1>のピークは光照射時間とともに1465、1464,1460cm^<-1>へと変化した。このことはC120、C120O_2、などを経て光誘起ポリマーに変化することがわかった。結果として光照射硬化はこれらの光生成物と転位との相互作用によるものと結論された。

C60薄膜について光照射時間の関数としてラマンピークのシフトを観察した結果、1460cm^<-1>から1469cm^<-1>への変化が観察され結晶とは逆なシフトをした。そこでAFM観察を行った結果、薄膜表面起状の変化が観察された。このように結晶と薄膜では光照射生成物に違いがあるものと考えられる。また、C70結晶の光照射硬化を研究するためにC60結晶と同じような実験を行った。その結果、C60結晶の10倍近い照射時間によって光照射硬化が観察された。このことからC70結晶でも光生成物が形成されることがわかった。
圧迫性病変による脊髄内神経伝導障害発生機構についての動的画像解析

外傷、腫瘍、ヘルニアなどに伴う脊髄圧迫性病変例における脊髄内神経伝導障害の病態を検討するため、ラット脊髄圧迫病変モデル標本に膜電位感受性色素を用いた光計測の手技を適用し、実験を行った。平成11年度には若齢ラットよりのin vitro脊髄標本において、脊髄内神経伝導の時間的空間的動態を動画像として解析する方法を確立したので、平成12年度にはその計測システムを用い、脊髄への様々な圧迫強度、圧迫様式に伴う脊髄内神経伝導障害を解析した。1.脊髄横断スライス標本を用いた解析厚さ数百マイクロメートルの脊髄横断スライス標本において、後根あるいは前根の電気刺激により、後角内に数百ミリ秒間、あるいは前角内に数ミリ秒間持続する脱分極領域が、それぞれ出現した。これら領域の脱分極は、それぞれ脊髄後方、あるいは前方からの機械的圧迫により、減弱傾向を示し、その減弱度は圧迫強度と相関する傾向を示した。圧迫時間が数分と短時間の場合には、圧迫解除後まだ脊髄の強い変形が残っていても神経伝導障害は速やかに回復することを見出した。2.摘出脊髄標本における長軸方向興奮伝播に対する圧迫の影響平成12年度には、脊髄横断スライス標本の他に、摘出脊髄をスライスにしない所謂en bloc標本についても、圧迫実験を行った。まずen bloc標本において、脊髄上行路あるいは下降路の電気刺激により、我々が知る範囲で初めて、脊髄内long tractを通る神経インパルスの画像化に成功した。次いで、このような電気刺激中に、脊髄標本へ外部より圧迫を加えたところ、long tractを通る経インパルス信号について、圧迫部位における伝導速度低下、圧迫部位を過ぎた後の信号の減弱を画像化することに成功した。en bloc標本においても、圧迫解除後速やかに神経伝導の障害は回復する傾向を示した。平成12年度におけるこれらの研究成果は、脊髄圧迫病変に伴う神経伝導障害の病態理解を飛躍的に高めるものと考えられる。1.概要:脊髄内神経興奮伝播過程ならびに圧迫によるその障害を光計測法により画像化し、脊髄圧迫性病変の病態生理機構を解明することを目的とした。本年度は方法論を確立しえた、即ち圧迫により髄内興奮伝播障害が惹起される過程を初めて画像として検出することに成功した。2.方法:幼若ラットより作製した脊髄スライス標本を蛍光膜電位感受性色素で染色した後、酸素化人工脳脊髄液で灌流し維持した。蛍光顕微鏡下で脊髄横断面を緑色光により励起した際の蛍光を特殊高速高感度カメラで計測し、コンピュータ処理により計測領域内膜電位変化を動的画像として表示できるようにした。前あるいは後根の電気刺激に伴う髄内興奮伝播様式を解析した。急性圧迫モデルとしてプラスチック棒で脊髄の前あるいは後面を段階的に圧迫し、神経興奮伝播様式への影響を観察した。さらに圧迫解除後の回復過程も観察した。3.結果:非圧迫標本において、後根刺激により興奮波は後角後外側部から前方及び内側へ円形に拡がるとともに、後角の一部は0.5sec以上と長い脱分極を示した。前根刺激による興奮は前角部に出現し、持続時間は4msec以下と短かった。前後それぞれからの圧迫により、圧迫部の神経興奮は減弱し、高度の圧迫では興奮性が消失した。圧迫解除直後には形態上の変形は残存するにもかかわらず、興奮様式は既にかなりの回復を示した。4.考察:圧迫に伴う髄内興奮伝播障害の発生機序として血流障害と組識への機械的圧迫とが考えられるが、本法により血流障害の影響を除外し、純粋に機械的圧迫による影響を評価できた。圧迫解除直後、脊髄に変形が残存している時点でも髄内神経興奮伝播能の回復が認められたことより、脊髄の変形よりも圧迫による圧が障害を惹起する主たる因子と考えられた。今後圧迫の強度、部位、時間について詳細な検討を行う予定である。
ミトコンドリア膜電位低下に伴う膜内切断制御機構の解明

ミトコンドリアはATP産生によるエネルギー供給の場としてのみならず、細胞死やウイルス感染応答など様々なストレス応答シグナルの制御の場としても重要な働きを担うことが知られている。当研究室では、ストレス応答性MAPキナーゼ経路の最上流に位置するMAPKKKの一つ、ASK1の活性化因子として同定されたPGAM5がミトコンドリア膜電位低下依存的に切断されることを明らかにしてきた。本研究は、「PARLによるPGAM5の膜内切断」を「新たなミトコンドリア内膜電位低下感知システム」としてとらえ、PGAM5切断上流因子のゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行い、ロンボイドプロテアーゼPARLの活性制御機構の解明、及びミトコンドリア膜電位応答因子の同定によるミトコンドリア膜電位低下ストレス感知システムの解明を目的とする。スクリーニングを行うために蛍光顕微鏡で取得した画像の自動解析よるハイコンテントスクリーニング系を完成させた。この系と約1,8000遺伝子のsiRNAライブラリーを用いて各々の遺伝子を網羅的に発現抑制し、PGAM5の膜内切断に影響を与える因子のスクリーニングを行った。最終的に得られた候補遺伝子とPGAM5の切断に対する応答性の検討を行い、PGAM5、PARL、及び他の制御因子との空間的な位置関係を検討した。その結果、PARLの活性がミトコンドリアの脂質環境の変化で調節されていることを新たに見出した。これらはPARLがミトコンドリア脂質によって制御されていることを示した初めての結果である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、「PARLによるPGAM5の膜内切断」を「新たなミトコンドリア内膜電位低下感知システム」としてとらえ、PGAM5切断上流因子のゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行い、ロンボイドプロテアーゼPARLの活性制御機構の解明、及びミトコンドリア膜電位センサーの同定によるミトコンドリア膜電位低下ストレス感知システムの解明を目的とする。今までの研究結果から、PGAM5は、ミトコンドリア膜電位低下というストレスに応答し、ミトコンドリア局在型ロンボイドプロテアーゼPARLにより、膜内切断を受けることが明らかとなっている。近年、PGAM5と同様に、様々なミトコンドリア局在分子の切断が、ミトコンドリア膜電位低下に伴って正もしくは負に制御されることが明らかとなってきている。これらの例はいずれもミトコンドリアのストレス応答に関与することが示唆されていることから、ミトコンドリア膜電位低下を感知し適切な応答を導くことは、生体にとって重要なストレス応答のひとつであると考えられる。しかしながら、これまでミトコンドリアの膜電位を感知してシグナルを伝えるメカニズムは不明な点が多い。また、PARLをはじめとするロンボイドプロテアーゼの活性制御機構の詳細はほとんど明らかにされていない。このような知見より、私はミトコンドリア膜電位低下依存的なPGAM5の切断を指標としたゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行おうと考えた。本年度の研究成果として、スクリーニングを行うために蛍光顕微鏡で取得した画像の自動解析よるハイコンテントスクリーニング系を完成させた。この系と約1,8000遺伝子のsiRNAライブラリーを用いて各々の遺伝子を網羅的に発現抑制し、PGAM5の膜内切断に影響を与えた因子についてsiRNA一次スクリーニングを行った。これらの結果から、統計的解析をもとに上位数百遺伝子に絞り込んだ。しかしながら、これまでミトコンドリアの膜電位を感知してシグナルを伝えるメカニズムは不明な点が多く残されていた。このような知見より、私はミトコンドリア膜電位低下依存的なPGAM5の切断を指標としたゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行うことで、ミトコンドリアの膜電位を感知し、応答するメカニズムを明らかにしようと考えた。そして、実際に構築したシステムと約1,8000遺伝子のsiRNAライブラリーを用いて各々の遺伝子を網羅的に発現抑制し、PGAM5の膜内切断に影響を与える因子のスクリーニングを行った。この結果と統計的解析をもとにPGAM5の膜内切断に影響を与える因子を数十遺伝子同定することに成功した。

当研究室では、ストレス応答性MAPキナーゼ経路の最上流に位置するMAPKKKの一つ、ASK1の活性化因子として同定されたPGAM5がミトコンドリア膜電位低下依存的に切断されることを明らかにしてきた。本研究は、「PARLによるPGAM5の膜内切断」を「新たなミトコンドリア内膜電位低下感知システム」としてとらえ、PGAM5切断上流因子のゲノムワイドsiRNAスクリーニングを行い、ロンボイドプロテアーゼPARLの活性制御機構の解明、及びミトコンドリア膜電位応答因子の同定によるミトコンドリア膜電位低下ストレス感知システムの解明を目的とする。スクリーニングを行うために蛍光顕微鏡で取得した画像の自動解析よるハイコンテントスクリーニング系を完成させた。この系と約1,8000遺伝子のsiRNAライブラリーを用いて各々の遺伝子を網羅的に発現抑制し、PGAM5の膜内切断に影響を与える因子のスクリーニングを行った。最終的に得られた候補遺伝子とPGAM5の切断に対する応答性の検討を行い、PGAM5、PARL、及び他の制御因子との空間的な位置関係を検討した。その結果、PARLの活性がミトコンドリアの脂質環境の変化で調節されていることを新たに見出した。これらはPARLがミトコンドリア脂質によって制御されていることを示した初めての結果である。候補遺伝子の絞り込み、及び候補遺伝子の解析、共に当初の計画通り進行しており、最終的な目的達成に向け、おおむね順調に進展していると考えられるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。【スクリーニングにより決定した最終候補遺伝子の解析】候補遺伝子の膜電位低下やPGAM5の切断に対する応答性の検討を行い、PGAM5、PARL、及び他の制御因子との空間的な位置関係を明らかにする。これらの解析によって、ロンボイドプロテアーゼの活性制御モデル、およびミトコンドリア膜電位低下ストレスの認知機構の分子メカニズムの提唱を目的とする。siRNA一次スクリーニング、及び候補遺伝子の絞り込み、共に当初の計画通り進行しており、最終的な目的達成に向け、おおむね順調に進展していると考えられるため。一次スクリーニングにおけるsiRNAのオフターゲットの影響による偽陽性を除くため、複数のsiRNAを用いた二次スクリーニングを行う。ここではRSA rankingと言ったsiRNAのオフターゲットの影響を考慮した統計的手法によって偽陽性の遺伝子を除き、候補をさらに絞り込む。さらにここで、膜電位センサーの候補の絞り込みとして、候補から外すべきである膜電位低下を直接誘導する分子を除くため、ミトコンドリア膜電位をモニターできる試薬を用いて候補をさらに絞り込む。この時点でまだ候補遺伝子が多ければさらにウエスタンブロットなど異なる評価系で三次スクリーニングを行い、最終候補遺伝子を決定する。