hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
M1アミノペプチダーゼ機能異常と自己免疫疾患病態の分子機構

小胞体アミノペプチダーゼ(ERAP1)の分泌機構を解析した。その結果、感染により複数のサイトカインがマクロファージに発現誘導され、それらが相乗的に作用することによることが明らかになった。また分泌されたERAP1は一酸化窒素の産生を個体レベルで誘導することが、ノックアウトマウスを用いた検討の結果明らかとなった。したがってERAP1が生体防御において重要であるとともに、エンドトキシンショックのメディエーターとも成りうる可能性が示唆された。またERAP1の阻害剤を検索した結果、良好なIC50値を有する候補化合物の同定に成功した。今後本化合物をシードとして検討していく予定である。ERAP1は高血圧症、強直性脊椎炎、骨粗鬆症などの病態に関与することが示唆されている多機能で興味深い酵素(アミノペプチダーゼ)である。本酵素は私たちが初めてクローン化したものであり、これまでにその特徴である小胞体への貯留性、および抗原ペプチドのプロセシング機能を報告してきた。本研究では私たちが独自に見出した炎症性刺激による本酵素の分泌現象の意義(特に病態との関わり)について検討することを提案している。私たちはこれまでに、炎症性の刺激でERAP1がマクロファージより分泌され、その貪食能の亢進に寄与することを見出していた。さらに最近分泌されたERAP1がマクロファージのNO産生を亢進することを見出した。このことは従来のSNP解析により示唆されてきた本酵素による血圧調節の可能性を高めるものである。そこで研究ではまず本酵素の分泌機構の解明をおこなうこととした。ERAP1の分泌は種々のToll-様受容体(TLR)のアゴニストにより誘導された。さらにTLRの情報伝達に関わるMyD88の阻害およびMyD88により誘導されるサイトカインの阻害によりその分泌は抑制された。またカルモジュリンの阻害によってもその分泌は阻害された。これらに結果からLPSによるERAP1の分泌はTLR4の活性化による、IFN-beta等のサイトカインの産生、さらにはサイトカインによる細胞内カルシウムレベルの上昇を介して誘導されることが考えられた。このようにERAP1は刺激依存性に小胞体から細胞外へその局在性を変化させ、異なる機能を発揮するユニークな酵素であることが明らかになった。さらに私たちは基質ポケットのモデリングにより、阻害剤の候補物質の絞り込みを継続して行っており、有望な物質を見出しつつある。今後組み換え型酵素を用いてシーズとなる化合物を確定していく予定である。小胞体アミノペプチダーゼ(ERAP)1は、MHCクラスI分子が細胞表面に提示する抗原ペプチドを小胞体内腔で生成する。最近私たちは、マクロファージにおいてトール様受容体リガンド(LPSなど)の刺激に伴い本酵素が細胞外へと分泌されること、そして、細胞外ERAP1がマクロファージの貪食やNO産生を亢進することを明らかにした。今回、ERAP1分泌現象を個体レベルで確認すべく、LPS投与前後のマウス血中におけるERAP1動態を解析した。LPS(1 mg/kg)を腹腔内投与したマウス(C57B6)から経時的に採血し、血清を調製した。次に、血清中のERAP1量をウエスタンブロットにより解析したところ、LPS投与前から投与後12時間まではERAP1がほとんど検出できなかったが、投与24および48時間後にはERAP1が確認できた。すなわち、ERAP1は個体レベルにおいてもLPS依存的に分泌されることが明らかになった。また、ERAP1の分泌が確認された時間には、血中一酸化窒素濃度は上昇から低下に転じていたことから、ERAP1は急性期後期もしくは急性期終了直後に分泌されることが分かった。さらに、LPS投与による血中のロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)活性を経時測定したところ、LAP活性はLPS投与後6時間以内に一端10%程度低下し、その後12-24時間の間に投与前レベルまで回復した。この回復期はERAP1の分泌時期と完全に一致した。そこで、分泌されたERAP1の血中LAP活性への寄与について確認するためにERAP1遺伝子欠損(ERAP1-/-)マウス由来血清のLAP活性を測定したところ、LPS刺激前には野生型およびERAP1-/-マウス由来試料のLAP活性には差が認められなかったが、LPS刺激24時間後にはERAP1-/-マウス由来血中LAP活性は野生型マウスの90%程度を示した。また、血中アミノ酸(LeuやArgなど)濃度もLAP活性同様にLPS刺激前では両者に変化がなく、LPS投与24時間後では遺伝子欠損による低下が認められた。これまでの私たちの検討から、ERAP1はLPS刺激によりマクロファージより分泌され、NO産生の増加に寄与することがわかっている。今年度はERAP1遺伝子ノックアウトマウスを用いてin vivoにおいてもNO産生の増加が起こるか検討した。その結果LPS刺激時のERAP1-/-マウスのNO産生能力は+/+マウスに比べ30%程度低下していることが明らかとなった。この時血中のロイシンアミノペプチダーゼ活性は同程度の低下を示した。したがって細菌感染時におけるNO産生の増加には活性を保持した分泌型ERAP1の寄与があるものと考えられた。NO産生には遊離のアルギニンが必要である。そこでERAP1-/-

マウスの血中アルギニン濃度を+/+マウスと比較したところやはり30%程度の低下が認められた。一方ERAP1では遊離されないプロリンに関しては両マウスで差は認められなかった。以上の結果は細菌感染時等におけるNO産生の増加には、LPS刺激により血中に分泌されたERAP1が酵素活性を発揮し、特定の基質ペプチドのN-末端アルギニンを遊離させることが少なくとも一部寄与していることを示唆している。したがって私たちが見出した分泌型ERAP1はマクロファージの活性化及びNO産生の亢進を介して生体防御に重要な役割をはたしていることが本研究課題の遂行の伴ない明らかになったと考えられる。一方ケミカルバンクのリソースから比較的活性の高い新規骨格を有するERAP1の同定に成功した。今後最適化を行い特に自己免疫疾患の治療薬としての可能性を検討していく予定である。小胞体アミノペプチダーゼ(ERAP1)の分泌機構を解析した。その結果、感染により複数のサイトカインがマクロファージに発現誘導され、それらが相乗的に作用することによることが明らかになった。また分泌されたERAP1は一酸化窒素の産生を個体レベルで誘導することが、ノックアウトマウスを用いた検討の結果明らかとなった。したがってERAP1が生体防御において重要であるとともに、エンドトキシンショックのメディエーターとも成りうる可能性が示唆された。またERAP1の阻害剤を検索した結果、良好なIC50値を有する候補化合物の同定に成功した。今後本化合物をシードとして検討していく予定である。ERAP1は自己免疫疾患、血管新生、炎症反応など多様な病態と関連することが示唆されている。本研究において私たちは本酵素がマクロファージの活性化に関与する可能性を示した。また他のグループは私たちの結果を追試するとともに本酵素がナチュラルキラー細胞を活性化すると報告している。これらの結果は本酵素が自然免疫系の活性化に重要な役割を果たすという、これまでには想定されてこなかったまったく新しい機能の発見を示している。したがって本報告を基盤とした研究を進展させることは、本酵素の生体防御における役割の解明に資する重要な知見を提供するものと考えられる。本研究の提案はERAP1と特定の病態との関連を明らかにしようとするものであり、必ずしも提案した内容すべてについて検討がすすんでいるわけではないが、ここで見出した機能を追求することで本酵素と癌などの疾患との関連が議論できるようになることが期待される。したがって本研究はおおむね順調に進展しているものと判断する。27年度が最終年度であるため、記入しない。生化学本研究において新たに見出した、ERAP1によるマクロファージの活性化および一酸化窒素の産生亢進作用を個体レベルで追求していく。すなわちERAP1遺伝子のノックアウトマウスを用いて、1)細菌およびウイルス感染時におけるマクロファージの活性化を野生型と比較する。2)細菌およびウイルス感染時における一酸化窒素の産生量の比較およびその際の血圧の動態等を検討し、in vivoにおけるERAP1の機能について検討する。またこれまでの検討でERAP1の阻害剤候補化合物を数種絞り込んでいる。
超微粒子金属が均一に分散した新炭素材の研究

有機金属ポリマーおよび高分子錯体の焼成による超微粒子金属均一分散型炭素材の研究に関して次の事を明らかにした。1)ジエニル鉄(カルボニル)アクリレートとアクリロニトリルの共重合体は800°C付近ではセメンタイト(Fe_3C)粒子のみが発生し、さらに1000°Cまで加熱するとαーFe超微粒子となることをメスバウァーおよびX線解析によって明らかにした。一方、石灰ピッチにポリビニルフェロセンを溶解したものでは600°Cの加熱でもαーFe(粒径20nm)が生成し、1000°C加熱により凝集し粒径100nm程度のαーFe粒子となる。Ni,Co錯体を結合したポリマーの焼成でもほぼ同じ傾向が見られた。これらはいずれも1000°C焼成後、高い電気伝導性を示し磁性体にもなる。また過酸化水素の接触分解触媒としても優れた効果を示した。2)有機金属ポリマーの合成法を開発するためにCpMo(Co)_2やCpw(Co)_2を側鎖に有するポリマー、cp^*Tacl_4やCpNbCl_4との反応による新ポリマー合成を行なった。これらを焼成した時に生成する超微粒子の組成を検討した。3)一連の有機金属ポリマーをエキシマーレーザー(パルス)やYAGレーザーで焼結する試みを行なった。アブレーションが優先し超微粒子が発生しにくいのでCO_2レーザーの使用を検討している。4)Fe,Co,Ni,Rh,Ptのような後周期遷移金属と異なり、Tz,Zr,Ta,Nb等の前周期遷移金属を含有するポリマーの焼成では金属でなく、酸化物や窒化物などの超微粒子になることが判明した。ポリマー中に含まれる配粒子(ヘテロアトムを含むもの)の成分により酸化物(例えばポリビニルアルコールに結合した錯体を用いた時)、窒化物(例えばポリビニルピリジン錯体を用いた時)に変換される。X線解析、TEM測定等により焼成温度を生成物の粒径、組成との関係を明らかにした。
敗血症におけるカルニチンによるミトコンドリア機能保護に関する研究

敗血症におけるミトコンドリア障害がX-XOによる酸化ストレスと同様にL-carnitine投与にて抑制できるか否かについて、ラットを12時間絶食の後に、ラット腹腔内にLPS5,10mgと生理食塩水1mlを投与し、検討群にはLPSと同時にL-carnitine 500mg/1mlを投与した。その12時間、24時間後にラットを屠殺し、脂質代謝の面より検討した。脂質代謝に重要な役割をなすCPT1はX-XOによる酸化ストレスにてVmaxが有意に低下し、palmitoyl CoAに対するMichaelis係数(Km)も同様な動態を示した。これらの低下はcarnitine添加により有意に抑制された。LPS投与にても同様にCPT 1活性の低下が認められ、carnitineによる抑制を認めた。longchain acy CoA及びcarnitineの動態を測定したところ、酸化ストレス及びLPS投与によるfree radicalによりlongchain acy CoA,longchain acycarnitineの増加とfreecarnitineの低下を認めた。すなわち酸化ストレスおよびLPSはCPT1活性を抑制するとともに、free carnitineの低下によるミトコンドリア内でのlongchain acy1 CoAが蓄積、それに伴う脂質代謝の抑制を介するエネルギー不足による間接的、あるいは脂肪酸自体による直接的な影響によりミトコンドリア障害がもたらされると解された.以上の結果より、X-XO及びLPSによる酸化ストレスはミトコンドリア酸素消費量の減少、ミトコンドリア膜膨化、mitochondrial permeability transition,matrixよりのNAD^+,NADH及びCa^<2+>の流出を惹起して、ミトコンドリア障害を発生せしめ、carnitineは脂質代謝の改善を介してmitochondrial permeability transition,ミトコンドリア膜の膨化を抑制することにより酸化ストレスによるミトコンドリア障害を防止すると考えられた。Carnitineがミトコンドリアのmembrane poreの開閉(MMP)に関与しているか否かについて検討した。結果1)200g前後のWistar系雄性ラットを用い、既存の方法にて肝遊離ミトコンドリアを作成した。遊離ミトコンドリア1mg/mlは200μM xanthineおよび3、6unite/ml xanthine oxidase(XO)とincubateし、ミトコンドリアにoxidative stressを与えた。このoxidative stressに対して1、3、5mM carnitine付加してMMPおよびミトコンドリア機能について検討した。2)XO添加によりcarnitine非付加ではミトコンドリア膜は急激に膨化した。それともに細胞内Ca^<2+>急激に細胞外へと逸脱した。この逸脱はcanitine添加により阻害された。クラーク電極を用いてミトコンドリア機能ついて検討した。Pyruvate,β-hydroxybutyrate,succinate,ascorbateを基質としてその酸素消費量について検討したところ、carnitine非添加においては急激な酸素消費量の減少を認めたが、carnitine添加により、その消費量の減少抑制を認め、ミトコンドリア機能は維持されていた。4)細胞内Ca^<2+>濃度はcarnitine添加群の方が、有意に高値を維持していた。結論以上より、carnitineには酸化的ストレスの際のミトンドリア障害とりわけMMPを抑制することが判明した。敗血症において発生するmitochondorial membrane pore permeability transition (MMP)がcarnitineにより防止できるか否かについてin vivoにて検討した。200g前後の雄性ラットにLPS5および10mg投与にて敗血症を作成後、12時間、24時間後にラットを屠殺し実験に供した。L-carnitine投与群はL-carnitine500mgをLPSと同時に腹腔内投与し、同時間に屠殺し、肝を摘出した。

その後、直ちに遊離ミトコンドリアを作成し、MMPおよびミトコンドリア機能についての検討を行った。1)0.6μCi[^<14>C]sucroseと200μlsampleを30秒間incubateした後のミトコンドリア内放射活性を測定する[^<14>C]soucrose entrapment法にて検討したMMPではLPS投与12時間後、24時間後にmitochondria内放射活性の低下、すなわち、mitochondria swellingによるsucroseの膜通過障害を認めたが、carnitine投与12時間後のmitochondrial swellingは軽減されており、その放射活性の有意の回復をみた。しかし、24時間後の放射活性には有意差を認めなかった。Garnitineの尿中排泄による効力低下なのか、他の機序によるものかは現在不明である。2)細胞内Ca2+はLPSによるmitochondrial swellingにより大量に遊離したが、carnitineはその遊離を阻止した。したがって、carnitineはLPS投与にて発生するMMP,mitochondrial swellingを抑制することにより、その機能を保持するのに有効と思われた。敗血症におけるミトコンドリア障害がX-XOによる酸化ストレスと同様にL-carnitine投与にて抑制できるか否かについて、ラットを12時間絶食の後に、ラット腹腔内にLPS5.10mgと生理食塩水1mlを投与し、検討群にはLPSと同時にL-carnitine500mg/1mlを投与した。その12時間、24時間後にラットを屠殺し、脂質代謝の面より検討した。脂質代謝に重要な役割をなすCPT1はX-XOによる酸化ストレスにてV_<max>が有意に低下し、paimitoyl CoAに対するMichaelis係数(K_m)も同様な動態を示した。これらの低下はcarnitine添加により有意に抑制された。LPS投与にても同様にCPT1活性の低下が認められ、carnitineによる抑制を認めた。longchain acy CoA及びcarnitineの動態を測定したところ、酸化ストレス及びLPS投与によるfree radicalによりlongchain acy CoA,longchain acycarnitineの増加とfreecarnitineの低下を認めた。
金星極域の雲画像解析による物質循環の研究

1今年度の研究では金星における雲追跡アルゴリズムの改良を行った。金星などの地球以外のほかの惑星では直接風速等を測定することが困難なため主に人工衛星などによって取得された画像を用いた雲追跡によって風速場が求められてきた。しかしこれまで主に使用されてきた相互相関法では特徴的パターンの平行移動しか検出できずパターンの回転や拡大、縮小などは検出できなかった。実際の金星の大気運動においてはパターンの回転や雲層下部からの上昇流、下降流などによる未知の吸収物質が作る特徴的パターンの拡大、縮小などが存在しており、これらの動きを追跡することは重要であると考えられる。今年度の研究では今まで使われていた雲追跡アルゴリズムを改良し新たに回転不変位相相関限定法を用いて金星の雲追跡を行うアルゴリズムを作成した。回転不変位相相関限定法とは追跡領域を対数極座標変換した画像を用いて追跡領域の回転角度を求め、その求まった角度だけ元の追跡領域を回転させたのちに位相相関限定法を用いて平行移動量を求める手法である。また、位相相関限定法は画像の複素振幅スペクトルを用いて位置ずれ量を検出する手法である。この回転不変位相相関限定法により、特徴的パターンの平行移動のみでなく回転運動も同時に検出できるようになった。実際に検出された回転角度を見ても求まった角度が大きいところは大きく回転しており、このアルゴリズムが正しく動いていることが見て取れた。また、この手法を用いることにより追跡の精度を向上させることに成功した。これらの結果をJpGU-AGU Joint Meeting 2018、第144回地球電磁気・地球惑星圏学会、The 20th Symposium on Planetary Sciencesなどの国内学会で発表し、意見交換を行った。時間的に連続して取得された惑星大気画像から大気の運動を読み取る新たな手法を考案し、日本の金星探査機による画像データに適用した。従来の雲追跡手法が平行移動のみを検出していたのに対し今回の手法では回転運動を同時に検出できるようになった。これにより追跡の精度を向上させるとともに回転運動という新たな情報が得られるようになった。今後はこの手法の信頼性を検証すべく、疑似データを解析して考察を進めてゆく。また、現在は特徴的パターンの回転運動と平行移動を検出しているがこれをパターンの拡大、縮小も検出できるようにアルゴリズムを改良し、金星探査機の画像データに適用して行くことを目標にする。
ストーム時に発生するマイクロメカニクスによる大気海洋間輸送フラックス

強風下に発生するマイクロイベントを通じて形成される幅広いサイズレンジの飛沫及び気泡の運動を微視的確率乱流モデルをベースとする大気海洋せん断乱流シミュレータによって再現し,気液相互作用を経由した移流拡散を通じて輸送される熱,気体を見積もる数値モデルを開発した.風洞造波水槽における強風下の砕波過程を通した飛沫,気泡サイズ分布の同時計測,並びに高速サーモグラフィによる熱輸送計測を行い,エアレーションを受ける海面表層の運動量及び熱輸送が風波レイノルズ数をパラメータして整理可能であることを明らかにした.現地海洋観測により台風イベント中の飛沫,気泡計測を行い,数値的,実験的成果との検証を行った.強風下に発生するマイクロイベントを通じて形成される幅広いサイズレンジの飛沫及び気泡の運動を微視的確率乱流モデルをベースとする大気海洋せん断乱流シミュレータによって再現し,気液相互作用を経由した移流拡散を通じて輸送される熱,気体を見積もる数値モデルを開発した.風洞造波水槽における強風下の砕波過程を通した飛沫,気泡サイズ分布の同時計測,並びに高速サーモグラフィによる熱輸送計測を行い,エアレーションを受ける海面表層の運動量及び熱輸送が風波レイノルズ数をパラメータして整理可能であることを明らかにした.現地海洋観測により台風イベント中の飛沫,気泡計測を行い,数値的,実験的成果との検証を行った.タスク1暴風下の大気海洋界面の気液乱流シミュレータの開発研究代表者渡部,研究協力者Ingramと共同で気液乱流ソルバーの最適化,並列化,そして熱流体モデルとサブグリッド粒子確率モデルを統合し,飛沫気泡を含む気液せん断乱流境界層内の熱輸送を再現するため大気海洋気液乱流シミュレータの開発を進めた.また,砕波の乱流量を支配する基本パラメータである流体の伸張と渦度によって局所水面形及び飛沫サイズ並びに個数を決定するメカニズムを明らかにするため,線型安定性解析を新たに進め,パラメータスタディに対する理論的サポートを構築した.タスク2ストームイベントにおける海面過程による熱,気体輸送フラックスの可視化計測砕波過程に対するバックライト気泡飛沫画像計測,海面飛沫の高速熱赤外線計測及びLIFによる酸素並びに二酸化炭素濃度計測を行い,乱流強度,混入気泡サイズ及び飛沫サイズ分布をパラメータとした気体及び海中への輸送フラックスを定量化するめの統計量を取得した.高速赤外線カメラの特性を把握し,液滴の着水に伴う熱遷移評価に対するテストケースを実施し,可視画像情報から水温情報のみを取得するための効率的な解析法を確立した.タスク3海面上マイクロメカニクスによる熱気体輸送パラメタリゼーション本年度実施する現地観測ため,降雨,エアロゾル,そして飛沫水を分離しサンプリングすることで,相互に指標化を行うための新たな方法を考案した.砕波,降雨イベントにおけるマイクロメカニクスとタスク2で得られた同パラメータに対する輸送フラックスを結合しモデル化を行うための準備を進めた.研究代表者渡部,研究協力者Ingramと共同で,気液乱流ソルバーとサブグリッド粒子確率モデルを統合し,気液二相化を含むせん断乱流境界層内の運動量輸送を再現するため大気海洋気液乱流シミュレータの開発を進めた.昨年度までに明らかになった質量保存性に関わるモデルの問題をFarvre平均を応用することによって解決し,多量の気泡混入を伴う混相流下の流れの再現に成功した.砕波の乱流量を支配する基本パラメータである流体の伸張と渦度によって局所水面形及び飛沫サイズ並びに個数を決定するメカニズムを解析的に明らかにし,また波ー構造物相互作用に伴う飛沫数確率密度分布のモデル化に成功した.強風時の砕波過程に対する気液二相化に伴うフラックス輸送をパラメータ化するため,風洞波浪水槽において,バックライト気泡飛沫画像計測,海面飛沫の高速熱赤外線計測及びLIFによる酸素並びに二酸化炭素濃度計測を行い,乱流強度,混入気泡サイズ及び飛沫サイズ分布の統計量を取得した.波浪及び風速の基本物理量に応じた海面温度の変調が風波レイノルズ数によってパラメータ化され,気泡,飛沫生成量との相関が観測された.和歌山県白浜町において現地観測を行い,波浪,風速,水温,塩分濃度,雨滴径,エアロゾルの台風下での応答の相関を計測し,砕波,降雨イベントにおけるマイクロメカニクスとタスク2で得られた同パラメータに対する輸送フラックスを結合しモデル化を行うための統計解析を進めた.タスク1大気海洋せん断乱流熱流体シミュレータの開発:ジェットの水面への着水に伴って生じる楔形キャビティーからのマイクロバブルの生成並びにその後発生するエアチューブからの大気泡への分裂の両者を記述するLES-Stochasticハイブリッドモデルを構築し,精度検証並びに実践的アプリケーションを土木学会論文集(海岸工学)にて公開した.混入気泡分布に応じて発生する乱流場の変調を特徴化し,現在その成果を国際雑誌に投稿する準備を行っている.タスク2ストームイベントにおける海面過程による熱,気体輸送フラックスの可視化

計測:風洞波浪水槽において風速,流速,水位変動,混入気泡分布,放出飛沫そして熱赤外線の同時計測を前年度から継続して行い,相当する10m海上風にして10m/sから30m/sの暴風条件に対する気液二相化への影響および熱輸送過程の変化の特徴を明らかにした.飛沫放出に伴う海面抵抗の変化は従来のソースモデルでは記述できず,それを修正するモデル係数を提案した.高風速下で矛盾が生じる海面熱輸送モデルの問題点を明らかにし,経験的修正パラメータを提案した.砕波下の流体側の応答については,国際専門誌であるCoastal Engineering Journalで出版され,また海面の二相化と熱輸送に関わる新たな知見は,土木学会論文集(海岸工学)にて公開すると同時に,国際専門誌への投稿を準備している.タスク3海面上マイクロメカニクスによる熱気体輸送パラメタリゼーション:連携研究である京都大学防災研究所共同研究で行っている和歌山県白浜海象観測サイトにおける観測結果と気象,海象モデルによる数値結果を比較し,台風下における気象,海象の相互作用を調査した.海面の二相化のモデル化を進めるために必要な砕波率及び分布を決定する新たなパラメータが必要であることが判明し,本研究をさらに発展させる準備を整えた.26年度が最終年度であるため、記入しない。海岸工学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り,タスク1及び2は順調に研究が進展した.本年度においてもこれらを継続して行い,各タスクの成果を相互確認しながら研究を進める.また,当初昨年度予定していなかったタスク3で行う現地観測の測定項目及びサンプリング手法を検討し,準備を進める事ができた.当初の計画通り,タスク1,2及び3はおおむね順調に研究が進展した.本年度においてもこれらを継続して行い,各タスクの成果を相互確認しながら研究を進める.また,タスク3で行った現地観測において明らかになった観測機器の海中でのメンテナンスに関わる問題を解決し,継続して観測を行う.26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年に引き続き研究分担者,連携研究者と連携し,各タスクを進める.また連携プロジェクトで行う台風下での波浪観測と本研究で行う飛沫観測を同時に行い,データの共有化を経たパラメタリゼーションを進めていく.昨年に引き続き研究分担者,連携研究者と連携し,各タスクを進める.また連携プロジェクトで行う台風下での波浪観測と本研究で行う飛沫観測を昨年同様,同時集中観測を実施し,データの共有化を経たパラメタリゼーションを進めていく.26年度が最終年度であるため、記入しない。予定していた海象予備観測が観測環境の不順のため次年度に行うことになった.購入予定であった観測用計器,ケーブル,電源を次年度に購入し,観測を実施する予定である.
理論計算から始まる有機合成-SP^2炭素上でのS_N2反応を用いる合成法の開発

E-β-chloro-δ-hydroxystyreneから得られるアニオンのDMF中での環化反応の遷移状態計算を行った(B3LYP/6-31+G^*,SCRF(Dipole, DMF))ところ、活性化エネルギーは14.4kcal/molと小さく充分に合成反応として使えるという結論を得た。さらに驚いたことに、遷移状態においては酸素と脱離していく塩素はオレフィン平面状にある完璧なsp^2炭素上でのS_N2型の反応であった。比較のためZ-Cl体及びdi-Cl体の計算も行った所、これらでは活性化エネルギーが高くπ結合への付加-脱離の遷移状態を通っていることが分かった。対応するフッ素化合物、臭素化合物についても同様の計算を行い、E体のみがsp^2炭素でのS_N2型の反応を示し、Z体およびジハロ体はπ結合への付加-脱離の経路で反応し高い活性化エネルギーを持つことが分かった。ハロゲン間での反応性を比較したところ、F>Cl>BrでS_N2型反応の機構と一致している。なお、E-フッ素体の分子内環化反応はDMF中80度43時間で17%の収率であったという報告がある。今回、我々はE-塩素体の環化反応を行い、室温12時間で82%の収率、E-臭素体の環化は室温3時間で73%という結果を得た。一方、対応するZ-塩素体からは110度に加熱しても環化体を与えなかった。このようなタイプの反応が分子間反応でも可能かを調べるために、Z-ClHC=CHCH_3とCH_3O-の反応の遷移状態計算を行った所、π結合への付加の方がS_N2型の反応より2.5kcal/mol安定であった。また、β位にメチル基をもう一つ付けるとエネルギー差は3.3kcal/molにひろがり、α位に置換基がつく場合は、S_N2型反応が極めて起こりにくくなる。S_N2型の反応は立体障害を受けやすいことと一致している。我々が見つけた分子内反応の場合π結合への付加の時大きなひずみがかかり、それがS_N2型遷移状態を取る要因となっていると考えられる。E-β-chloro-o-hydroxystyreneから得られるアニオンのDMF中での環化反応の遷移状態計算を行った(B3LYP/6-31+G^*,SCRF(Dipole, DMF))ところ、活性化エネルギーは15.8 kcal/molと小さく充分に合成反応として使える反応であるという結論を得た。さらに驚いたことに、遷移状態においては酸素と脱離していくCl-はオレフィン平面状にある完璧なsp^2炭素上でのS_N2型の反応であると言う点であった。対応するフッ素化合物、臭素化合物についても同様の計算を行い同様の結果を得た。つまり、E体のみがsp^2炭素でのS_N2型の反応を示し、Z体およびジハロ体はπ結合への付加-脱離の経路で反応し高い活性化エネルギーを持っていた。

ハロゲンにおける活性化エネルギーの大きさを比較したところ、E-フッ素体では活性化エネルギーが25.8kcal/molと塩素体に比べ大きいこともS_N2型反応の機構と一致している。なお、過去に報告された実験結果としてはE-フッ素体の分子内環化反応がDMF中80度43時間で17%の収率であったとある。今回、我々はE-塩素体の環化反応を行い、室温12時間で82%の収率を得た。一方、対応するZ-塩素体からは110度に加熱しても環化体を与えなかった。このようなタイプの反応が分子間反応でも可能かを調べるために、Z-ClHC=CHCH_3とMeO-の反応の遷移状態計算を行った所、π結合への付加の方が安定の反応がおこる因子となっている。以上、単純なハロゲン化アルキルのsp^2炭素上でのSN2型であった。分子内反応の場合π結合への付加の時大きなひずみがかかり、それがS_N2型反応を理論計算で見出し、初めて実験的にも証明することに成功した。E-β-chloro-o-hydroxystyreneから得られるアニオンのDMF中での環化反応の遷移状態計算を行った(B3LYP/6-31+G^*,SCRF(Dipole,DMF))ところ、活性化エネルギーは14.4kcal/molと小さく充分に合成反応として使えるという結論を得た。さらに驚いたことに、遷移状態においては酸素と脱離していく塩素はオレフィン平面状にある完璧なsp^2炭素上でのS_N2型の反応であった。比較のためZ-Cl体及びdi-Cl体の計算も行った所、これらでは活性化エネルギーが高くπ結合への付加-脱離の遷移状態を通っていることが分かった。対応するフッ素化合物、臭素化合物についても同様の計算を行い、E体のみがsp^2炭素でのS_N2型の反応を示し、Z体およびジハロ体はπ結合への付加-脱離の経路で反応し高い活性化エネルギーを持つことが分かった。ハロゲン間での反応性を比較したところ、F>Cl>BrでS_N2型反応の機構と一致している。なお、E-フッ素体の分子内環化反応はDMF中80度43時間で17%の収率であったという報告がある。今回、我々はE-塩素体の環化反応を行い、室温12時間で82%の収率、E-臭素体の環化は室温3時間で73%という結果を得た。このようなタイプの反応が分子間反応でも可能かを調べるために、Z-ClHC=CHCH_3とCH_3O-の反応の遷移状態計算を行った所、π結合への付加の方がS_N2型の反応より2.5kcal/mol安定であった。また、β位にメチル基をもう一つ付けるとエネルギー差は3.3kcal/molにひろがり、α位に置換基がつく場合はS_N2型反応が極めて起こりにくくなる。S_N2型の反応は立体障害を受けやすいことと一致している。我々が見つけた分子内反応の場合π結合への付加の時大きなひずみがかかり、それがS_N2型遷移状態を取る要因となっていると考えられる。
生体部分肝移植術のためのMRIによる肝静脈正常変異の研究

1.これまでに94例の生体部分肝移植術が施行されており、それらすべての症例でドナー肝に対する術前のMRI検査および術中の超音波検査が施行された。内訳は男性40名、女性54名、平均年令32才である。2.移植肝としては1例で右葉を使用した以外は左葉もしくは外側区を使用しており、すなわち左肝静脈と中肝静脈の解剖が大きな意味を持つ。外側区域を移植肝として使う場合は左肝静脈の本数や、左肝静脈へ流入してくる内側区域枝(V4)の有無、その大きさが問題となる。左葉を移植肝として使う場合は、左肝静脈と中肝静脈との共通幹の有無、中肝静脈へ流入する前上区域枝V8の有無とその大きさが問題となる。3.(1)左肝静脈はその分枝形態に変異が多く、左肝静脈が2本ある症例が16%、3本ある症例が3%あり、また左肝静脈が1本の症例のうちで根部1cm以内で3本以上に分枝するのが20%、2本に分枝するのが13%存在した。鎌状間膜周囲の静脈の多くは左肝静脈へ流入するものの、内側区前上部からの静脈(V4)が下大静脈あるいは中肝静脈根部へ流入するのが35%において認められた。(2)中肝静脈と左肝静脈とが共通幹を有する例が71%に、それぞれが独立して下大静脈へ流入する例が29%に認められた。径3mm以上の前上区域枝(V8)が35%に認められ、そのほとんどが中肝静脈へ、一部は下大静脈へ流入した。4.これらの変異を術前に知りおくことにより円滑な肝移植術に貢献でき、今後の移植術式の決定において大きな意味を持つ。
黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン合成のポストゲノム解析と新規抗菌薬への応用研究

本研究では免疫力が低下した人への感染症の原因菌である黄色ブドウ球菌について、増殖に必須なペプチドグリカン合成酵素の解析を目的とする。次に、新しい抗菌剤の開発を試みることを目的とする。まず黄色ブドウ球菌のペプチドグリカン合成酵素の活性に必要な部位(アミノ酸残基)を構造情報から推測し、遺伝学的・生化学的実験により検証する。更に、ペプチドグリカン合成酵素の構造情報と遺伝学・生化学的解析結果を基にシミュレーションを行い、抗菌作用を有する物質の基礎となる情報を得る。黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンの合成では、MurAとMurBによりNアセチルムラミン酸骨格が合成されMurC, MurD, MurE, MurF, DdlAによりアミノ酸が順次付加されて構造単位が生成し、細胞表層で連結される。MurCの解析では、既にインフルエンザ菌MurCと基質の複合体の結晶構造が解析されているので、そのデータを基にホモロジーモデリングを行った。基質との相互作用が強く示唆されたアミノ酸残基について変異遺伝子及び変異タンパク質の発現ベクターを構築した。変異遺伝子による遺伝学的解析を行うとともに、変異タンパク質の精製とその生化学的解析を行った。今後DdlA, MurDについても活性に必須なアミノ酸残基を順次明らかにしていく必要が有る。また、標的酵素の構造情報と低分子化合物の構造情報をもとにドッキングシミュレーションを行う必要が有る。阻害活性の予測が上位の化合物については実験系において酵素活性の阻害を評価する。既に酵素活性に必須なアミノ酸残基を7つ同定できているMurBについては、MurBの結晶構造解析が既に行われてPDBデータベースに登録されているので、その立体構造情報を基にドッキングシュミレーションによる化合物のin silicoスクリーニングを行っている。
欧米史上における国家的集権代とRegionalsmの分析

本研究班は平成3年、4年度と2年度にわたって国家形成の問題を歴史的に考察した。ヨーロッパ統合やボスニア・ヘルツゴビナの事態をあげるまでもなく、今日、国家の問題がcuttingedgeな問題となっていることは誰の目にも明らかであろう。今日の世界史の現象は、パリー・コミューン以来の人類の理想である「国家の死滅」の方向を暗示しているのか、それとも国家の機能の拡大を象徴しているのか。本研究は、このような問題意識のもと古代から現代までにわたる様々な研究領域の歴史家が、自己の専門領域において国家の問題にアプローチした。そのさい国家の問題は、一時的時事評論的分析で解明できるほど単純な問題ではないと言う共通認識にたって短絡的で単純な国家論的結論をだす誘惑を極力避け、専門領域にしっかりと足をおいた地道な基礎研究に徹した。そのため統合的国家論の構築には到らなかったが、個別には学会でも注目される研究成果が得られた。その一つとして従来国家論的分析が最も弱かったアメリカ合衆国史の領域における本格的国家論的分析としての『南北戦争と国家』(東大出版会1982年)長田豊臣が挙げられる。本年度は各自の専門とする領域で、それぞれの国家形態とその特質についての基礎研究を行った。その際研究対象領域を時代別に(1)古代ー中世、(2)絶対主義ーブルジョア革命、(3)産業革命、工業化課程、(4)現代国家の四班に分けて、それぞれの時代領域での国家研究の問題点の整理を行った。古代中世班では、従来のロ-マ皇帝や中央政府を中心とした研究から一歩踏み出して、帝国と諸属州との支配、もしくは権力構造に焦点があてられた。また中世における国家の問題は、中世都市の権力構造と周辺部農村地域との人的交流及び支配関係が主要な研究テ-マとなった。またブルジョア革命の研究では、フランスやドイツにおける国家形成については、すでにかなりの研究が行われているため、これまでStatelessnessが特色とされるイギリス・アメリカ合衆国におけるStateーmaking processが研究対象に選ばれた。研究はフランス・ドイツのいわば古典的ともいえる国家形成の過程と国家統治機構の弱体さがいわれるアメリカ合衆国において、国家の機能にどのような相違がみられるのか。もし相違があるとしたら、それはなぜか。どう説明できるのかといった問題が比較史的観点から追求された。現代国家論は、おりしも東欧・ソビエトにおいて国家解体が進行していったこともあって、これらの地区の国家と所謂先進国家の国家とはどう違うのかという点が問題とされた。先進資本主義国家においてもヨ-ロッパ統合に動きにみられるようにボ-ダ-レス減少が進行しつつある。国家の解体は体制の問題か、それとも体制を越えた現象として理解すべきなのか。ともかく国家の問題は、まさしくCulting edgeな問題となりつつあることに全員が同意した。平成3年度の研究成果をひきついで、本年度も(1)古代ー中世、(2)絶対主義ーブルジョア革命(3)産業革命、工業化過程の四班でそれぞれの専門領域にしたがって研究領域を分担担当した。古代ー中世班では平成3年度のローマ帝国と属州との支配関係に加えて本年度は古代のいま一つの巨大な帝国、セレウコス王調の分析を加えオリエントにおける古代国家の問題を考察した。さらに中世の国家の問題としては叙権闘争期における帝国教会体制の分析、さらにはドイツ帝国における所謂帝国改造運動(Reic hsrefrom)の考察を加えた。ブルジョア革命期の問題は、1848年から1871年にかけてのビスマルクによるドイツ統一過程の分析、工業化移行期の問題としては19世紀初期のドイツ邦国形成過程のバイエルンにおける分析等によって考察した。なおフランスにおける国家形成の問題は第二帝政期におけるレジオナリズムを「ナンシー綱領」において分析した。現代国家の問題はドイツ第二帝政下のプロイセン・ヘゲモニーを軍制において考察した。以上の様に、今年度は統一的国家論も構築もしくはその合意を前提にして平成3年度に続いて、研究分担者の専門領域での実証研究に集中した。
二次特性類の幾何

トポロジー,数理物理,数論をつなげる研究を推進し,その成果としてクイバーのミューテーションの列に付随する分配関数を導入し,その基本的な性質,特に量子ダイログ関数との関係を確立した加藤・水野氏との研究成果をまとめた論文がA. Kato, Y. Mizuno, Y. Terashima, "Quiver mutation sequences and q-binomial identities", IMRN, Issue 23 (2018), 7335-7358として学術論文誌に掲載された.クイバーのミューテーションの列に付随する分配関数はq二項係数を用いて定義される多項式であり,それが無限積である量子ダイログ関数のある種の比として表される点は,様々な文脈で現れるクイバーのミューテーションの列に応じて異なる興味深い解釈があると思われ,これからの発展が期待できる.また,クラスター代数と結び目の位相的不変量であるアレクサンダー多項式の新しい関係の発見としてクラスター変数の特殊化と二橋結び目のアレクサンダー多項式が一致することを示した永井氏との研究成果をまとめた論文をW. Nagai, Y. Terashima, "Cluster variables, ancestral triangles and Alexander polynomials", arXiv:1812.02434として公表した.これはトポロジーと数理物理の橋渡しになる結果であり,さらに深めていきたい.トポロジー,数理物理,数論をつなげる本研究課題のテーマについて,研究が順調に進展し,その成果を学術論文として公表できたので.トポロジー,数理物理,数論をつなげる今までの方向の研究を今後も積極的に継続し深めていき,その成果を着実に学術論文として公表する.トポロジー,数理物理,数論をつなげる本研究課題のテーマについて,研究が順調に進展し,その成果を学術論文として公表できたので.トポロジー,数理物理,数論をつなげる研究を推進し,その成果としてクイバーのミューテーションの列に付随する分配関数を導入し,その基本的な性質,特に量子ダイログ関数との関係を確立した加藤・水野氏との研究成果をまとめた論文がA. Kato, Y. Mizuno, Y. Terashima, "Quiver mutation sequences and q-binomial identities", IMRN, Issue 23 (2018), 7335-7358として学術論文誌に掲載された.クイバーのミューテーションの列に付随する分配関数はq二項係数を用いて定義される多項式であり,それが無限積である量子ダイログ関数のある種の比として表される点は,様々な文脈で現れるクイバーのミューテーションの列に応じて異なる興味深い解釈があると思われ,これからの発展が期待できる.また,クラスター代数と結び目の位相的不変量であるアレクサンダー多項式の新しい関係の発見としてクラスター変数の特殊化と二橋結び目のアレクサンダー多項式が一致することを示した永井氏との研究成果をまとめた論文をW. Nagai, Y. Terashima, "Cluster variables, ancestral triangles and Alexander polynomials", arXiv:1812.02434として公表した.これはトポロジーと数理物理の橋渡しになる結果であり,さらに深めていきたい.トポロジー,数理物理,数論をつなげる本研究課題のテーマについて,研究が順調に進展し,その成果を学術論文として公表できたので.トポロジー,数理物理,数論をつなげる今までの方向の研究を今後も積極的に継続し,その成果を着実に学術論文として公表する.トポロジー,数理物理,数論をつなげる今までの方向の研究を今後も積極的に継続し深めていき,その成果を着実に学術論文として公表する.位相不変量についての研究打ち合わせを行うための旅費に使用する予定だったが,当初予定していた位相不変量の計算が完成しなかったので,次年度研究打ち合わせを行うために使用する予定である.
中国の水環境におけるフィブラート系薬物の残留性調査と水棲生物への影響に関する研究

水循環が乏しい中国大都市の水系環境を対象に、蓄積性が疑われているフィブラート系薬物の存在実態を明らかにした。LC/MS/MSを用いたフィブラート系薬物同時分析法を新たに確立し、上海や浙江周辺の上水場の原水・水道水中の濃度を測定した。全ての検水からほとんどの対象化合物が検出されたが予想に反して低濃度であった(ng/L)。また生物活性ベースでの汚染度を評価するためにPPARαレポーターアッセイ系を構築し、これら対象化合物のアゴニスト活性を測定した。各活性濃度はすべての化合物でmg/Lレベルであり、今回検出された濃度よりはるかに高かった。よって、現在の中国の上水にはさほど問題はないことが示唆された。さらに河川および浄水場から水検体のサンプリングも行った。今後はこれらの検出系を用いて、採集した検体の分析を行う予定である。本研究では、水資源が乏しい中国の大都市近郊の河川水、下水および下水処理水等を対象に、最近世界的に汚染が懸念されている医薬品やパーソナルケアー製品起源の化学物質(PPCPs)の中でも特に環境蓄積性が疑われているフィブラート系薬物の河川や下水中の存在実態を明らかにし、中水からの汚染物質除去策を見出すことを最終目標としている。今年度は、前年度に確立したフィブラート系薬物等のLC-MS/MSにおける分析条件を基に、中国大都市(上海および浙江周辺等)の河川水や上水場の原水について、対象化学物質の濃度の測定や水質に関する予備検討を行った。その結果、フィブラート系薬物やその代謝物が検出されるものの、その濃度は予想よりも少なくfenofibrateが0.040.07ng/L程度、fenofibric acidは検出限界以下であった。またこれらの化合物については、浄水後の水ではほぼ100%除去されていた。一方で、生物活性ベースでの汚染度を測定するための評価系として、酵母または大腸菌two-hybrid系を用い、フィブラート系薬物の受容体として働くperoxisome proliferator-activated receptor (PPAR)alphaのリガンド活性を評価できるアッセイ系の構築も試みてきた。しかし大腸菌を用いた評価系では、既に酵母を用いた評価系で良好に機能している核内受容体を発現させて、アゴニストを作用させても酵母ような良好な応答が得られなかったことから、大腸菌two-hybrid系は核内受容体リガンドスクリーニング系には不向きである可能性が示唆された。本研究では、水資源が乏しい中国大都市の水系環境を対象に蓄積性が疑われているフィブラート系薬物の存在実態を明らかにし、汚染物質除去策を見出すことを最終目標としている。昨年度からサンプリングの場所を上海や浙江周辺の上水施設に変更して研究を行ってきた。最終年度である今年度は、初年度に確立したフィブラート系薬物等のLC/MS/MS分析法を用いて、上水場の原水および水道水中の対象化合物濃度を測定した。全10カ所の上水場で、benzafibrate(BF)、fenofibrate(FF)、gemfibrozil(GF)およびその代謝物であるclofibric acid(CF)とfenofibric acid(FA)の全てが原水より検出された。また上水処理後の水道水にはFFを除くすべての化合物が検出されたが、その濃度は0.06 ng/L(GF)から0.80 ng/L(CA)と予想に反してかなり低かった。さらに生物活性ベースでの汚染度を評価するために、初年度に構築したレポーターアッセイ系を用いてこれら対象化合物のPPARαアゴニスト活性を測定し、これを元に各検水中のFF等量(対象化合物のアゴニスト活性をFFのアゴニスト活性に換算した値:ng-FF/L)を算出した。各水道水における総FF等量(すべての対象化合物のFF等量の和)の平均値(0.94 ng-FF/L)は、欧州数か国の水道水中フィブラート系薬物濃度(既報告)から算出した総FF等量(0.95-61 ng-FF/L)と比較して低い値であった。また各対象化合物のアゴニスト活性濃度(mg/Lレベル)に対して、今回検出された濃度(ng/Lレベル)ははるかに低かったことより、生物活性ベースを考慮しても、現在の中国の上水場における原水および水道水はさほど問題はないことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。毒性学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の最初のハードルはフィブラート系薬物を良好な感度で分析できる手法(条件)の探索であったが、物質ベースの分析に関しては初年度にその条件を確定することができた。

また生物活性ベースの検出に関しては、フィブラート系薬物がPPARαアゴニスト活性を示すものの、その強度は他の核内受容体アゴニストと比較すると弱いため、感度良く検出できる系の構築が難題であった。酵母の転写因子であるGAL4のDNA結合領域とPPARαリガンド結合領域を融合したキメラ受容体を用いたレポーターアッセイ系等を作製するなど試行錯誤したが、Hepa1-6細胞に、PPARαとRXR発現ベクター、PPAR応答配列をもつレポーター遺伝子を導入することで、μMレベルで検出できる評価系を確立することができた。当初、研究計画ではフィブラート系薬物を生物活性ベースの検出するために、大腸菌two-hybrid系を用いたPPARalphaリガンド評価系を構築する予定であったが、残念ながら構築することは現状では難しいことが判明した。しかしながら、これらは想定の範囲内であり、構築できなかった場合の代替法として培養細胞系を用いたレポーターアッセイ系が既に構築できている上、本研究の主たる研究目的であるフィブラート系薬物を実際の環境検体から物質ベースで検出できていることから、概ね研究は順調に進んでいると考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は日中間の政治的問題等により思うように中国国内で検体を回収することができなかったが、今年度は確立した分析手法を元に、予試験的にいくつかの環境サンプルを測定し、どのような地域や施設の検体を採取するのかを再検討する予定である。この結果次第では、北京以外の場所でも検体の採取を行うことを想定している。また中国の共同研究者と密接に連絡を取るために、日本でも会合を行い、お互いの分析技術について意見交換等を行う予定である。さらに培養細胞よりもより簡便に生物活性が測定できる技術の開発も積極的に進め、中国でも活性をハイスループットに測定できるようにする予定である。今年度も北京の下水処理場等の施設における検体回収の許可が下りずに、致し方なく上海や浙江周辺の上水場の施設にサンプリングの場所を変更して研究を継続してきた。最終年度は、回収したこれらの検体について、未測定のフィブラート系薬物やその代謝物についても詳細な検討を行う。また生物活性ベースでの測定も行い、物質ベースでの検出結果と併せて、中国の水系環境におけるフィブラート系薬物の汚染状況に関する結論を導き出したいと考えている。今年度は日中の領土問題等により、思うように中国で検体を回収することができなかったため、結果的に旅費がかなり節約されてしまった。今年度は確立した分析手法を元に、精力的に環境サンプルの測定を行うために、フィールド活動に予算を充てると共に、本研究をさらに推進させるため'に、中国の共同研究者を国内にも招き、意見交換等も積極的に行う予定にしている。残高はわずか28円なので、ほぼ計画通りに執行できたと考えている。次年度も当初の計画通りに使用していく予定である。
酵母における遺伝暗号変化の分子機構

一群のCandida酵母は通常ロイシンのコドンであるCUGをセリンに翻訳する。私はこの暗号変化がCUGコドンをセリンに翻訳する特殊なセリンtRNA(tRNA^<Ser>CAG)の出現によるものであることを9種類のCandida酵母においてすでに明らかにしている。C.zeylanoidesをはじめとするこれらのtRNAは、in vitroにおいてセリンを効率よく受容するが、アンチコドンループにロイシンtRNAの特徴を有しているために、若干のロイシン受容能を持つこと、またその認識機構を昨年度報告した。今年度は、in vitroにおいて観測されたセリンtRNAのロイシル化が、in vivoで実際に生じているかについて焦点をあてた。まず細胞内において、tRNA^<Ser>CAGがロイシンを受容しているかを確認するために、細胞内アミノアシルtRNAの分析法を確立した。この手法により、C.zeylanoidesのtRNA^<Ser>CAGが細胞内でセリンに対し約3%のロイシンを実際に受容していることが明らかになった。次に、このロイシル化したセリンtRNAが、タンパク質合成に参加して、CTGコドンにセリンと若干のロイシンを取り込むかを示すため、C.maltosaのura3変異株を用い、活性に必須な45番目のロイシン残基がCTGコドンでコードされているS.cerevisiae由来のURA3遺伝子を導入して相補を試みた。コントロールとして対応する位置をTCTコドンに改変した遺伝子では全くの相補が観測されなかったのに対し、CTGコドンでは、若干の相補が観測された。この結果は、CTGコドンの若干のロイシル化に由来するURA3遺伝子の低レベルの活性発現によるものであると考えられる。したがって、CTGコドンはセリンとロイシンに翻訳されると結論できる。この知見は1つのコドンが1つのアミノ酸に対応するというこれまでの常識を覆すものであり、遺伝暗号の二重指定状態(dual assignment)であると考えている。二重指定状態が実際細胞において不可欠であるかどうかは、今後の課題であるが、暗号変化の中間状態を支える重要な役割を果たしたと考えている。