hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知症における社会脳機能の新規評価法の開発と臨床応用への挑戦

認知症高齢者において、1枚の漫画から、登場人物の行動意図を読み取る「まんじゅう課題」が認知症の社会脳機能の評価に使えることを示した。社会脳機能の一つである「他者の意図理解」について、記銘力低下などの交絡要因へ配慮した新たな課題を作成し、アルツハイマー型認知症の進行とともにこの課題が難しくなることを示し、論文投稿した。また、社会的認知の視点を医療現場の認知症ケアへ活用する可能性を検討するための調査を実施したが、医療現場では、社会脳に関する知識が広まっていなかった。さらに、社会的な情動機能がBPSD出現と負の相関を示し、社会的な情動が残存しているほどBPSDが出にくい傾向が見られた認知症の評価尺度として、社会脳領域では標準化された評価法がない。そこで社会脳機能の評価法を開発し、認知症の臨床に役立てることが、本研究の目的である。小児の発達過程の評価に用いられている社会脳機能検査(たとえば心の理論課題)の中で、認知症での評価に適するものを見いだす作業から始めた。認知症では複雑な言語指示を使うものは困難と考えられるので、教示がシンプルで、ゲーム感覚で楽しく実施でき、それでいて他者の意図理解や状況判断、場面の空気を読むことなどの社会的認知機能を評価できる指標を検討した。小児領域で既に心理検査として開発されている「子ども版表情認知検査」や「心の理論課題検査」などをベースにし、認知症高齢者でも社会的認知の評価として応用可能な要素を検討した。その結果、2枚の情景画(隣人がテレビを見ているすきに、その人の饅頭を盗もうとしている情景画とそのような意図のない情景画の2枚組)から、登場人物の行動意図や状況の理解の程度を調べるテストを開発した。誘導尋問的に段階的な9個のヒント質問を手がかりとして与えることで正解に導く過程で、どの質問で理解できたかで理解能力を点数化した。このテストは、記銘力の低下している認知症高齢者でも教示の理解ができた。そこで、健常高齢者45名と認知症76名を対象に、このテストの妥当性を検討した。具体的には他者の意図理解などを必要とする行為が描かれた情景画と含まれていない情景画を用意して、その相違点にどの段階で(幾つ目のヒント質問で)気付くことができるかを点数化して評価すると、認知症の進行と共に、得点が低下した。これらについて、データをまとめて論文として投稿できる様に準備を行っている。研究1:複合型老人福祉施設に入居する認知症の疑い-重度認知症高齢者23名を対象に、認知症の重症度(CDR)、認知機能(MMSE)、BPSD (NPI-NH)、生活機能(NMスケール、N-ADL)と認知症情動検査(Mini-Emotional State Examination:MESE)を実施した。MESEと下位項目の総合的情動機能(人情への反応、社会規範への反応、社会現象への反応など)はNPI-NHと有意な負の相関を示した(r=-0.551)。以上より、認知症高齢者の残存機能である情動(社会性)が残っているほど、BPSDが出現しにくい可能性が示された。研究2:認知症高齢者における他者の意図理解について評価するため、記銘力低下などの交絡要因へ配慮した新たな課題を作成し、アルツハイマー型認知症の進行との関連について検討し、論文投稿中である。研究3:認知症ケアに携わる事がある医療従事者を対象として、社会脳機能の認知度や認知症ケアにおける社会脳機能の視点の有用性について予備調査した。これらの結果は未発表だが、具体的なケア場面への応用を検討した。研究4:地域の高齢者96名を対象とした研究で、認知機能が保たれている段階から社会的役割(老研式活動能力指標の下位項目)と歩行機能の低下が始まることを示した。研究5:もの忘れ外来の受信者を対象に認知機能(MMSE)、病識(SED-11Q)、うつ(GDS15)を測定した結果、病識が低いほどうつ傾向が弱いことを見いだし、論文化を予定している。多方面で研究を進め、論文化を進めている。また、成果を書籍に盛り込み、2016年に出版される予定。認知症高齢者における他者の意図理解について評価するため、記銘力低下などの交絡要因へ配慮した新たな課題を作成し、アルツハイマー型認知症の進行とともに社会的認知にかかわる課題が難しくなることを示し、論文投稿した(査読中)。また、社会的認知の視点を医療現場の認知症ケアへ活用する可能性を検討するための調査を実施した。具体的には、二次救急医療機関の急性期病棟に勤務する医療従事者(医師・看護師・薬剤師・リハ職:n=36)の86%が日々の業務で認知症者の対応に「困っている」と回答した。そのため、職員57名に認知症ケアに社会的認知social cognitionの視点を活用するための研修を実施したところ、68%が社会的認知social cognitionの用語を初めて聞いたと回答し、92%がこの視点が臨床業務に役に立つと回答した。社会的認知を認知症ケアに活用する視点は広まっていないため、書籍や雑誌等でそれらの視点についてまとめた。

さらに、高齢運転者における主観的記憶障害と自覚的運転行動との関係を検討する目的で、地域在住高齢運転者172名(平均年齢72.6±5.5歳,運転歴44.6±10.3年)を対象に主観的記憶障害の有無(島田らの5つの質問)、客観的認知機能(タッチパネル式認知機能検査;認知機能バランサー),26項目からなる運転行動に関する自記式アンケートを実施した。その結果、対象者の137名(79.7%)が主観的記憶障害を有していた。主観的記憶障害の有無で認知機能バランサーの得点に有意差を認めなかった。運転行動アンケートは、主観的記憶障害を有するものは5項目以上の該当者が多く,主観的記憶障害が無いものは該当無しが多かった(p<0.001)。以上より、主観的記憶障害者は運転行動が低下しており、その変化を自覚している可能性が示された。認知症高齢者において、1枚の漫画から、登場人物の行動意図を読み取る「まんじゅう課題」が認知症の社会脳機能の評価に使えることを示した。社会脳機能の一つである「他者の意図理解」について、記銘力低下などの交絡要因へ配慮した新たな課題を作成し、アルツハイマー型認知症の進行とともにこの課題が難しくなることを示し、論文投稿した。また、社会的認知の視点を医療現場の認知症ケアへ活用する可能性を検討するための調査を実施したが、医療現場では、社会脳に関する知識が広まっていなかった。さらに、社会的な情動機能がBPSD出現と負の相関を示し、社会的な情動が残存しているほどBPSDが出にくい傾向が見られた社会脳機能の新しい評価指標(行動意図を含む情景画と含まない情景画の違いに誘導質問のどの時点で気づくか)を作成し、データを蓄積し、論文化を進めている。第1弾の評価指標としては、順調に進んでいる。認知症の人の社会脳機能に焦点を当てて、子供の発達との関係、自己モニタリング機能の評価などの研究を進め、認知症診療や認知症ケアで社会脳に着目していくことが重要だと示していく。また、これまでの成果を原著論文や著書として発表する。認知症医療次年度は、社会脳の新しい指標の論文を投稿し、出版にこぎ着けたい。そして、新たな指標開発に取り組みたい。分担研究者が次年度の調査介入研究用に費用を回したため、若干の残金が生じた。本年度は、最終年度である基盤研究Bの課題に力を注いだため、1割弱の残金を生じたが、ほぼ計画通りの支出となった。来年度中に使用予定である。前年度の1割ほどの残金と合わせて、この課題の遂行に専念する。
ディグニティセラピーを用いた看護師のためのスピリチュアルケアモデルの開発

ターミナルケアに携わる看護師を対象にディグニティセラピー(以下DTとする)を用いた看護師のためのスピリチュアルケアモデルを開発することを目的とし、予備調査を実施し試案を作成した。1)ターミナルケアにおけるスピリチュアルペインの体験を語る。2)DTの質問について語る。3)一連の体験について語るという3つのステップを取り入れた。6名の看護師に実施した結果、これまでに後悔の念や罪責感、無力感といったスピリチュアルペインを体験し、時折その体験が蘇り苦悩することがあったが、介入後はスピリチュアルペインを語ることの辛さを感じる看護師と癒された看護師がいたが、どちらも看護師としての希望を見出していた。ターミナルケアに携る3名の看護師に、ディグニティ・セラピーを実施した。看護師のスピリチュアルケアを目的にディグニティ・セラピーを実施することから、ディグニティ・セラピーの質問を実施する前に、看護師としてターミナルケアの中で体験したスピリチュアルペインの体験を語る質問項目を作成した。スピリチュアルペインの質問項目としては、「どのようなスピリチュアルペインを体験したか」「その体験をした時、どのような状態になったか」等である。ディグニティ・セラピーの質問項目は、「人生において特に記憶に残っていることや最も大切だと考えていること」「人生における最充実期と体験内容」等である。ディグニティ・セラピーの質問表を研究対象者に渡してから約2ヵ月後に、聞き取り調査を実施した。質問項目は、「ディグニティ・セラピーを受けて気がついたこと」「ディグニティ・セラピーを受ける前に体験したスピリチュアルペインはどのようになったか」「ディグニティ・セラピーを受けて、自分の大切にしているものや人生を支えているものに対する思いはどのようになったか」等である。1事例を分析した結果、ターミナルケアに携る看護師は、後悔、自責の念、無力感、罪悪感といったスピリチュアルペインを体験していた。ディグニティ・セラピーを実施することで、看護師は、個人の拠りどころとつながっている感覚を体験し、スピリチュアルペインが癒され、仕事に対する意欲が向上した。このことから、ディグニティ・セラピーは、看護師のスピリチュアルケアとして活用できることが示唆された。看護師にディグニティセラピーを実施し、その体験の語りの内容を検討し、スピリチュアルケアとしての導入の方法を検討した。研究対象者は、ターミナル期の患者が入院している一般病棟に勤務する臨床経験20年の看護師1名である。データはディグニティセラピー実施前の看護師としてのスピリチュアルペインの語りの内容、ディグニティセラピーの語りの内容、ディグニティセラピー実施後の聞き取り調査の内容の逐語録である。分析は、看護師としてのスピリチュアルペインの体験の内容等を抽出し、ディグニティセラピー実施による語りの内容の変化に注目して分析した。その結果、スピリチュアルペインの語りは、自覚していたスピリチュアルペインとその対処が語られ、ディグニティセラピーにおいては、語ることを避けてきたスピリチュアルペインが語られ、ディグニティセラピー実施後の聞き取り調査では、自分らしさの気づきと自分の存在の意味、看護師としての自分の課題を語った。スピリチュアルペインは、ディグニティセラピーの質問に答えることによって、個人の拠りどころを自覚し、拠りどころと自分が繋がっている感覚に気づくことで変化する。看護師に行なうディグニティセラピーは、1ディグニティセラピーを実施する前にスピリチュアルペインの体験を語る、2ディグニティセラピーを実施する、3一連の体験を語る、という3段階を踏む必要があることが示唆された。この結果は、新潟看護ケア研究学会第6回学術集会で発表した。また、新潟看護ケア研究学会誌に投稿し、短報として掲載された。本研究では、ターミナルケアに携わる看護師を対象にディグニティセラピー(以下DTとする)を用いた看護師のためのスピリチュアルケアモデルを開発することを目的とした。対象者は、常時ターミナル期の患者が入院している一般病棟に勤務している看護師6名である。調査期間は2015年10月から2016年2月であった。まず、予備調査を実施し試案を作成した。実施方法は個別に実施し、1)事前準備として、面接の1週間前に「ターミナルケアにおけるスピリチュアルペインの体験とDTの質問表」と「看護師のためのDTノート」を渡して実施方法を説明した。2)ターミナルケアにおけるスピリチュアルペインの体験を語ってもらった。3)DTの質問について語ってもらった。4)1週間後に3)の語りの内容を文書にして研究対象者に確認し、編集・修正した。5) 4)の1週間後に完成した文書を研究対象者に渡した。6)研究対象者に愛する家族や友人といった大切な人と2週間以内に文書の内容について話し合ってもらった。7)一連の体験について語ってもらった。研究対象者の了解を得て録音し逐語録を作成した。分析は、修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチを用いて行った。看護師は、後悔の念や罪責感、無力感といったスピリチュアルペインを体験していた。対処法としては、同僚や上司と感情を共有したり、励ましてもらったりしてスピリチュアルペインが癒されたり、カンファレンスで話し合ったり、気分転換をしていたが、ふとその体験が蘇って苦悩することがあった。しかし、看護師のためのスピリチュアルケアモデル実施後は、スピリチュアルペインの体験を語ることで癒される場合と過去の出来事を語る辛さを体験する場合があったが、どちらの場合も自己の内面への気づき、看護師としての希望を見出していた。したがって、本モデルは看護師のためのスピリチュアルケアになったと考えられる。

ターミナルケアに携わる看護師を対象にディグニティセラピー(以下DTとする)を用いた看護師のためのスピリチュアルケアモデルを開発することを目的とし、予備調査を実施し試案を作成した。1)ターミナルケアにおけるスピリチュアルペインの体験を語る。2)DTの質問について語る。3)一連の体験について語るという3つのステップを取り入れた。6名の看護師に実施した結果、これまでに後悔の念や罪責感、無力感といったスピリチュアルペインを体験し、時折その体験が蘇り苦悩することがあったが、介入後はスピリチュアルペインを語ることの辛さを感じる看護師と癒された看護師がいたが、どちらも看護師としての希望を見出していた。パイロットスタディの分析に時間を要したことと、今後の介入方法と分析方法について再検討したため、予定より遅れている。看護管理学これから10名程度のデータを収集して、平成28年3月までに分析結果をまとめる。ディグニティ・セラピーを1人目の研究対象者に実施したところ、スピリチュアルペインの理解が難しいことや、チョチノフが開発したディグニティ・セラオイーの質問項目だけの面接では、ターミナルケアに携る看護師のスピリチュアルペインの表出がされにくいことがわかり、研究対象者への説明の仕方や面接の実施方法を再検討したため、時間を要した。10名程度のデータ収集をまだ実施しておらず、データ収集のための交通費、謝礼(図書カード)、テープ起こしなどの費用がかからなかった。平成26年7月から集中してデータ収集をして、データを分析していく。また、事例としてまとめたものを論文投稿する予定である。これから、データ収集を開始し、平成28年3月までに結果をまとめる予定である。データ収集が遅れた為、必要経費(謝礼用の図書カード、文書作成費用等)が未使用であった。平成26年7月から平成27年3月までに10人程度、データ収集を実施する。
問題解決において用いられる無意識的情報の表象形式と機能についての研究

洞察問題解決においては閾下ヒント呈示が促進効果を持つという知見が積み重ねられてきている。本研究は事前に提示された閾下情報の所在、および問題解決におけるその機能をより明確にすることを目的としている。連続フラッシュ抑制と二重課題を組み合わせて行われた実験の結果は、二重課題の実施は被験者のパフォーマンスを低下させないというものであった。このことは閾下情報が通常のワーキングメモリとは異なる貯蔵庫に保持されている可能性を示唆している。また閾下ヒント情報の順次呈示を行った実験では、促進効果が全く見られなかった。このことは保持された閾下情報は操作可能性を持たない、静的な表象であることを示唆している。本年は3つの実験を行った.そのうちの2つは,閾下情報が単に問題解決を促進するだけでなく、問題解決のプランやストラテジーに影響を与えるかを検討するものであった.このため解決のステップに対応して、閾下情報を順次呈示し、その順序に応じたパフォーマンスが見られるかを検討した.閾下刺激の提示方法としては連続フラッシュ抑制を用い、課題は従来用いてきたTパズル(空間パズル)と9点問題を用いた.2つの結果ともに仮説を支持するものではなかった.閾下順次呈示をした場合にはそもそも問題解決への促進効果が見られなかった.これは否定的結果であるので、以下は推測に過ぎないが、この結果は潜在情報の貯蔵庫がワーキングメモリとは異なること、またそれはワーキングメモリのような情報の操作機能を有していないことを示している可能性がある.もう1つの実験は、閾下ヒント情報の呈示の際に、ワーキングメモリ特に視覚情報の貯蔵庫に干渉を与える副次的課題を実施し、それによってヒントの効果に変化があるかを検討した.これについては予測とは異なるが、副次課題によって負荷をかけられたグループの成績が有意に向上するという興味深い結果が得られた.この原因については現在検討中である.研究発表は閾下情報順次呈示の実験については日本心理学会で行い、ワーキングメモリへの負荷についての実験はCognitive Science Societyの年次総会論文として投稿し、ポスター発表として採用された.これらの研究の社会的意義(無意識的情報に寄るオフィスワーカの動機づけ)を強調した発表を人工知能学会全国大会において行った.また昨年までの成果をまとめ、日本認知科学会の学術誌に投稿し、受理、掲載された.洞察問題解決においては閾下ヒント呈示が促進効果を持つという知見が積み重ねられてきている。本研究は洞察問題解決過程が潜在的学習プロセスであること,またそこでの情報の貯蔵と表現形式を閾下刺激を用いて検討する独自性の高いものである.閾下刺激の呈示は,連続フラッシュ抑制という,長時間の閾下呈示ができる方法を用いて実験を行っている.本年は解決状態を閾下で順次呈示していくことで問題解決が促進されるかを検討した.つまり解をすべて一挙に呈示するのではなく,解決のステップに応じて呈示していくというものである.しかしながら,こうした条件下では閾下情報呈示の効果は見られなかった.これに加えて,本年は,昨年までに明らかにされた閾下呈示刺激効果について,別条件下での検討を行った.これまでの結果は閾下刺激が強く働き,通常は15分程度関わる問題解決が数秒で終わることを明らかにした.しかしこれは問題解決というよりも直接プライミングによる想起に基づく解決である可能性がある.そこで,問題解決状況をさらに困難にした状況下での閾下刺激の呈示の効果を検討した.その結果,閾下刺激の効果を直接プライミングとする可能性はきわめて低いことが明らかになった.次に,より厳密で統制された環境での実験を行うために,新たな刺激呈示環境を構築した.これまでは2台のモニターを用いて実験を行ってきたが,ステレオスコープ実験装置を購入し,一台のモニターで実験が可能になるようにした.またワーキングメモリーの負荷をコントロールする装置を開発した.現在予備実験が終了している段階である.これらの成果を日本心理学会,日本認知科学会,Cognitive Science Societyで発表するとともに,関連の研究を行っている研究者とのワークショップを開催した.また上記の成果をまとめ,学会誌に投稿し,現在査読中である.これまでの研究において閾下呈示された情報が洞察問題解決に影響を与えることが示されてきた.本研究は,閾下呈示された情報の所在とその機能を特定することを目的として行われた.閾下呈示された情報がワーキングメモリに置かれているとすると,問題解決のヒント

情報の閾下呈示時にワーキングメモリに負荷をかけるような課題を同時に実施することで(二重課題),その効果が弱まることが予想される.一方,ワーキングメモリとは独立の貯蔵庫に閾下呈示ヒント情報が存在するとすれば,同時に行う課題による干渉は受けないと考えられる.連続フラッシュ抑制を用いた実験を行った結果,二重課題を行っても成績は低下しないことが明らかになった.このことは独立の貯蔵庫であることを示唆する.しかしヒント情報を与えない条件で二重課題を行った場合,問題解決の成績が向上することが認められた.このことはワーキングメモリと洞察との間の新しい関係を示すものと言える.閾下情報の機能については,問題解決中に無意識的に参照される画像のようなものとして存在するのか,問題解決のプランや制御などにも関わるのか2つの可能性が存在する.そこで部分的なヒントの継時的な呈示を行い,その効果が見られるかを検討した.もし後者の仮説が正しければ,部分的ヒント情報の継時的な呈示は問題解決を促進するだけでなく,問題解決の方略にも影響を与えることが予測される.実験の結果,継時的な情報の呈示は全く問題解決を促進しないことが明らかになった.この結果は順次呈示される閾下情報が前の情報を上書きしてしまうことを示す可能性がある.そこでヒントの後に無関連情報を閾下提示する条件を加えた実験を行った.その結果,こうした条件でもヒントの効果は現れた.よって閾下情報が後続の情報によって上書きされる可能性は否定された.認知科学実験の実施についてはおおむね順調に進展している.ただし閾下刺激の継時呈示についての結果は、予測とは異なるものである.これがWM以外の貯蔵装置の特性なのか、または実験方法の不備によるものなのかは判然としない部分もある.これの検討をさらに進めることが必要となる.また上に記したように、副次課題が促進効果を持つなどの予想外の結果も存在し、これらを統合的に説明する枠組みを現在模索中である.当初の計画に基づく研究は再検討が必要なものもあるが,ほぼ終了している.また2013年度に実施する実験の下準備も完了している.こうした観点から,研究はおおむね順調に進展している.本年度は、副次課題の与える影響をより包括的に検討する.特に、音韻ループや実行機能に負荷をかける課題、また視空間スケッチパッドに負荷をかける課題を与えたときの、閾下刺激の効果を検討する.具体的には、構音抑制課題、スイッチング課題を実施する。これらを通して、問題解決に影響を与える閾下情報の貯蔵の形式、機能について統合的な県警を提出する予定である.今年度は二重課題を用いて,ワーキングメモリへの負荷,特に視空間スケッチパッドへの干渉を与えた実験を行う予定である.閾下呈示情報は何らかの貯蔵システムに保存され,問題解決をコントロールしていることは,これまでの研究から明らかである.一般にこれらはワーキングメモリ内に存在すると考えられ,特に今回のような図形パズル課題の場合には視空間スケッチパッド内に存在すると考えられる.もしこれが正しいとすれば,視空間スケッチパッド内の情報保持に干渉する課題を与えれば,閾下ヒント呈示の効果はなくなる,あるいは減少するはずである.もしこのような結果が出たとすれば,ワーキングメモリ内に意識からのアクセスができない情報が存在することになる.これは従来のワーキングメモリについての考え方を根底から見なおす契機となる可能性がある.
iPS細胞を活用した間葉系細胞分化におけるエストロゲン関連受容体の役割の解明

エストロゲン関連受容体(ERR)の間葉系由来細胞分化における役割を解明することを目的とし、定法と初期化特異的EGFP発現系を組み合わせて遺伝子改変マウス由来iPS細胞を樹立した。さらに、分化マスター遺伝子強制導入による効率的分化誘導法を用いて脂肪・骨芽細胞分化誘導を行った結果、一定の分化誘導効率の改善は見られ、同時に対象となるiPS細胞クローン間のばらつきが大きいことも判明した。幹細胞分化における機能評価とiPS細胞の実用化には、均質なiPS細胞クローンの樹立・選別法の確立が必要であると考えられた。本研究は、エネルギー代謝や発癌における機能的役割に加え、細胞分化においても重要な役割を担うことが明らかにされつつあるエストロゲン関連受容体(ERR)の、細胞初期化ならびに間葉系由来細胞分化における役割を解明することを目的としている。本年度は、まずN末端にFlagタグを付加したERRのcDNAをCAGプロモーター下流に連結したプラスミドを構築し、直鎖状にしたDNAフラグメントをマウス受精卵にマイクロインジェクションすることでERRトランスジェニックマウス作出を行った。一方で、野生型マウス由来胚性繊維芽細胞(MEF)を対象としたiPS細胞誘導系の確立を行った。iPS化の効率上昇を目的とし、Sox2あるいはOct3/4のエンハンサー領域をEGFP遺伝子に連結したコンストラクトを有するレンチウイルスベクター(Hotta, et al., 2009)を予め感染させて安定発現株の樹立を行い、その後初期化因子をレトロウイルスベクターにより強制発現させiPS化を誘導した。樹立したiPS細胞について、EGFP発現、細胞塊形態変化、増殖能、初期胚特異的マーカー遺伝子発現アルカリフォスファターゼ染色などの検討により性質・機能評価を行った。さらに、樹立したマウスiPS細胞の間葉系由来細胞、特に脂肪細胞分化ならびに骨芽細胞分化誘導系の樹立を行った。iPS細胞をhanging drop法により胚様体(embryoid body)を形成させたのち、PPAR_γ遺伝子(脂肪細胞分化)あるいはRunx2遺伝子(骨芽細胞分化誘導)をそれぞれ発現するアデノウイルスベクターを感染させ、さらにそれぞれの細胞系譜へのin vitro分化誘導試薬を添加し分化誘導を行った。形態変化や分化能、遺伝子発現変化等の評価を行うことで、分化誘導効率を検討した。これらの検討から、ERRの細胞初期化ならびに間葉系由来細胞分化に対する機能評価のための研究基盤を確立した。細胞初期化ならびに間葉系細胞分化における生理的役割の評価として、遺伝子改変マウスから胚性繊維芽細胞(MEF)を単離し、iPS細胞への誘導を行った。その方法として、Sox2あるいはOct3/4のエンハンサー領域をEGFP遺伝子に連結したコンストラクトを有するレンチウイルスベクターを予め感染させる方法を用いて、安定発現株の樹立を行った。その後、初期化因子をレトロウイルスベクターにより強制発現させiPS化を誘導した。得られたiPS細胞はEGFP発現により選別、細胞塊形態変化、増殖能、初期胚特異的マーカー遺伝子発現などの検討を行った結果、遺伝子型間の顕著な差は見られなかった。遺伝子改変マウス由来iPS細胞の間葉系細胞分化誘導として、PPARγ遺伝子あるいはRunx2遺伝子をそれぞれ発現するアデノウイルスベクターを感染させる方法を用いて脂肪細胞分化ならびに骨芽細胞分化誘導を行った。その結果、本方法により一定の分化誘導効率の改善は見られ、同時に対象となるiPS細胞クローン間のばらつきが大きいことも判明した。幹細胞分化における機能評価、あるいは生理機能や病態に関連する生理活性物質ならびに薬剤のスクリーニングに向けたiPS細胞の実用化には、遺伝的かつ性質的により均質なiPS細胞クローンの樹立もしくは選別法の確立が必要であると考えられた。
肺腺癌の悪性化に関わるECT2の検討

1.研究目的本研究では、ECT2の細胞質への発現と悪性化との関連性について検討した。2.研究方法(1)2000年から2010年までに筑波大学附属病院で外科的に手術された66例について、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを用いて免疫染色を行った。(2)上記期間の症例のうち、新鮮凍結検体がある4例に対して、RNAシークエンスを行い、ECT2遺伝子の遺伝子変異の有無を調べた。(3)肺腺癌細胞株を用いて、核と細胞質を分離し、それぞれから蛋白を抽出した。ECT2高発現細胞株を同定しECT2との結合タンパクや下流の経路の活性化の状態についてCo-immunoprecipitation(Co-IP)を用いて検討した。3.研究成果(1)ECT2の細胞質への発現は、N因子、pStage、v因子、1y因子、組織亜型、喫煙歴と関連を認め、5年生存率とも相関した。(2)肺腺癌症例4例に対して、ECT2の全exon領域に対してシークエンス解析を行ったが、遺伝子変異は検出されなかった。(3)(2)において、遺伝子変異が検出されなかったため、肺腺癌細胞株を用いて核と細胞質におけるECT2の発現を確認した。Calu-3、A549、RERF-LC-KJにおいて細胞質におけるECT2の高発現を確認した。さらに、Co-IPを用いて、細胞質におけるECT2とPKCiとの結合を確認した。また、ECT2の下流シグナルであるErk1, 2やMek1, 2を活性化していることがわかった。
ストレス応答型人工酵素リポソームの設計・開発

本申請課題では,リポソーム界面を反応場として,環境条件の変動(ストレス)に応答して触媒活性を制御する新規な人工酵素の創成を目的とする.平成17年度は,環境の酸化ストレス状態を認識して活性を制御するための活性中心として,アミロイドβタンパク質やスーパーオキシドジスムダーゼ(SOD)を膜上に提示し,酵素様活性が発現することを示した.そこで,平成18年度は,ROS応答・制御型人工酵素リポソームの設計・開発を目的として,以下の2班にわけて検討を進めた.(a)人工SOD機能解析班:天然SODの活性中心を模倣した人工SODリポソームを設計・開発する.前年度に開発したPorphyrinやアミノ酸残基をベースとしたリガンドをリポソームに修飾する事により,リガンドの離合集散(クラスター形成)挙動とSOD活性とが相関することを見出した.したがって,リポソーム膜のストレス応答特性による活性制御の可能性が示唆された.(馬越,吉本,久保井)(b)リポソーム/センサ班:上記の機能性リガンドにより修飾した,あるいはその他の膜成分を変化させたリボソームを調製し,誘電分散解析法,あるいはリボソーム固定化QCM(水晶振動子)を用いて,そのドメイン形成挙動やタンパク質・ペプチドとの相互作用を解析した.その結果,温度変化などのストレス条件に応じてリガンドのクラスター形成挙動を制御することが可能であり,SOD活性を制御可能であることが示された.(島内,森田,久保井)上記の知見を総括して,当該研究期間において,リボソームのストレス応答特性に基づいて,活性中心としてのリガンドのクラスター形成挙動を制御することによりSOD活性を発現することが可能であることを示せた.さらに,人工酵素リボソームを設計・開発するための新規なアプローチ(Build-up型ならびにBreak-down型)を提案し,体系化の方針を明確にした.本申請課題では,リポソーム界面を反応場として,環境の酸化ストレスに応答して触媒活性を制御する新規な人工酵素の創成を目的とする.平成17年度は,環境の酸化ストレス状態を認識して活性を制御する,ROS応答・制御型人工酵素リポソームの設計・開発を目的として,以下の2班にわけて検討を進めた.(a)活性中心検討班:天然SODの活性中心を模倣した人工SODリポソームを設計・開発する.(i)Porphyrinなどをベースとした錯形成リガンド,あるいは,(ii)酵素活性中心をmimicした機能性ペプチドを系統的に合成・分離し,構造・物性等の基礎的な知見を蓄積した.また後述の(b)班と連携をとりながら,リポソーム上における基礎物性(クラスタ形成挙動,特性・構造変化など)を解析した.(馬越,吉本,久保井)(b)リポソーム/センサ班:上記の機能性リガンドにより修飾した,あるいはその他の膜成分を変化させたリポソームを調製し,誘電分散解析法,あるいはリポソーム固定化QCM(水晶振動子)を用いて,その酸化ストレス応答挙動を解析した.特に,ストレス条件下における膜の物理化学的な特性と膜上におけるクラスタ構造形成挙動との関連性に注視して検討し,ストレスによるクラスタ形成制御手法を確立した.(島内,森田,久保井)上記の知見を総括して,人工酵素リポソームを設計・開発するためのアプローチ(Build-up型ならびにBreak-down型)を提案し,体系化の方針を明確にした.本申請課題では,リポソーム界面を反応場として,環境条件の変動(ストレス)に応答して触媒活性を制御する新規な人工酵素の創成を目的とする.平成17年度は,環境の酸化ストレス状態を認識して活性を制御するための活性中心として,アミロイドβタンパク質やスーパーオキシドジスムダーゼ(SOD)を膜上に提示し,酵素様活性が発現することを示した.そこで,平成18年度は,ROS応答・制御型人工酵素リポソームの設計・開発を目的として,以下の2班にわけて検討を進めた.(a)人工SOD機能解析班:天然SODの活性中心を模倣した人工SODリポソームを設計・開発する.前年度に開発したPorphyrinやアミノ酸残基をベースとしたリガンドをリポソームに修飾する事により,リガンドの離合集散(クラスター形成)挙動とSOD活性とが相関することを見出した.したがって,リポソーム膜のストレス応答特性による活性制御の可能性が示唆された.(馬越,吉本,久保井)(b)リポソーム/センサ班:上記の機能性リガンドにより修飾した,あるいはその他の膜成分を変化させたリボソームを調製し,誘電分散解析法,あるいはリボソーム固定化QCM(水晶振動子)を用いて,そのドメイン形成挙動やタンパク質・ペプチドとの相互作用を解析した.その結果,温度変化などのストレス条件に応じてリガンドのクラスター形成挙動を制御することが可能であり,SOD活性を制御可能であることが示された.(島内,森田,久保井)上記の知見を総括して,当該研究期間において,リボソームのストレス応答特性に基づいて,活性中心としてのリガンドのクラスター形成挙動を制御することによりSOD活性を発現することが可能であることを示せた.さらに,人工酵素リボソームを設計・開発するための新規なアプローチ(Build-up型ならびにBreak-down型)を提案し,体系化の方針を明確にした.
非線型退化楕円型偏微分方程式とその応用

1.第1番目の目的は非線形期化楕円型偏微分方程式に対するDin'chlet問題の解法を確立することであった。この問題に関しては完全に満足のゆく成果を得られた。具体的には、退化している偏微分方程式にも通用するような陰関数定理を創ることに成功した。2.第2番目の目的は前述の成果をもとにして、2次元Riemann多様体の3次元Euclid空間への大域的等長埋込問題を解決することであった。この目的は部分的に達成された。その成果はJournal of Differential Geometryに掲載されることになった。3.第3の目的は数値実験であった。この目的も部分的に達成された。具体的には、退化楕円型偏微分方程式の新しい一般的な数値解法を確立することができた。
ベータタングステンにおける巨大スピン流と超伝導

本年度は、スピン軌道相互作用が大きいベータータングステン(W)の超伝導特性を調べた。ベータータングステン(W)をスパッタ法で成膜すると、5nm程度の膜厚以上で結晶化し、ベータ(A15)構造からアルファ(BCC)構造に構造相転移が起きる。アルファータングステンの超伝導転移温度は非常に小さいことが報告されており(10mK程度)、超伝導を観測するにはベータータングステンが必要となる。しかしながら、薄膜の超伝導は膜厚の低下とともに超伝導転移温度が減少することが知られており、膜厚が薄い試料の測定は困難である。そこで本年度は、極低温の測定系を用いてスパッタ法で成膜した厚さ3 nm程度のベータータングステン薄膜の超伝導特性を評価した。その結果、約2 Kで試料が超伝導転移したことを観測した。また、超伝導状態が維持できなくなる臨界磁場(Hc)を測定した結果、磁場を膜面水平方向に印加した時の値が非常に大きいことがわかった。これは過去の報告と概ね一致する結果である。面内臨界磁場と測定温度の関係を調べたところ、2次元系の超伝導特性と一致する結果が得られ、膜厚が3 nm程度の超伝導体の性質を捉えた結果と考える。また、面直方向の臨界磁場の値から超伝導のコヒーレンス長が7-14 nm程度であることがわかった。今後はベータータングステンや昨年度調査したW/MoN多層膜を用いて、スピン軌道相互作用が大きい超伝導物質へのスピン流注入やスピン流生成に関する実験を行う。本研究は大きなスピンホール角と比較的高い超伝導転移温度を持つA15構造(ベータ相)タングステンを用いて、超伝導体におけるスピン流制御の可能性を明らかにすることを目的とする。スピン軌道相互作用が大きく、大きなスピンホール効果を発現する物質が超伝導状態に転移した際、超伝導体内のスピン流に関する調査を行う。本年度は、タングステン薄膜の超伝導転移温度の成膜条件依存性を調べた。RFスパッタ法を用いて、タングステン膜をシリコン基板上に成膜した。成膜中のガス圧やスパッタ電力、タングステン膜の成長に影響を与える下地層などを変えて成膜を行なった。しかしながら、ほぼ全てのタングステン膜で超伝導転移温度が2 K程度かそれ以下であった(膜厚は10-20 nm)。一方で、収束イオンビームを用いて作成したタングステン膜の超伝導転移温度が5 K程度であることがわかり、組成分析から炭素やガリウムが入っていることがわかった。そこで、スパッタで用いるターゲットに、炭素を50%程度含有する炭化タングステンを用い成膜を行った。その結果、超伝導転移温度が3 K程度にまで上昇した。また、超伝導転移温度の高い物質からのクーパー対の染み出しによる近接効果を利用して、スピン軌道相互作用が大きい物質に超伝導を誘起する実験を行った。超伝導転移温度の高い物質として、モリブデンに窒素を添加したMoNに着目した。MoN膜を成膜し、超伝導転移温度を調べたところ、最大で7 K程度の膜を得ることに成功した。今後はMoN/W膜における超伝導近接効果などを利用して、スピン軌道相互作用が大きい物質におけるスピン流を調査する。当初の予定どおり、スピン軌道相互作用の大きい物質の超伝導転移温度の評価を行い、スピン流の影響を調査できる物質群に目処が立った。今後はスピン流注入の実験を行うことができるため、概ね順調に進捗していると考える。今後は収束イオンビームを用いて作成したW膜や、超伝導転移温度が高い物質(MoNなど)からのクーパー対染み出しによる近接効果などを利用して、スピン軌道相互作用が大きい物質におけるスピン流を調査する。今年度、超伝導転移温度が大きくなる条件探索に注力したため、来年度以降に物品購入を延期した。
孝子伝をめぐる幕府と地方　――『官刻孝義録』と藩政資料を比較して

本研究の4年間で得た成果は下記4点である。1:著書『孝子を訪ねる旅』2:論文「近世孝子伝解題(一)」、3:論文「近世孝子伝解題(二)ー熊本藩」、4:著書『親孝行の江戸文化』。この通り、本課題で十分な成果を挙げた。また資料的にも、今後科研費の援助を得ずとも研究を遂行できる見通しが立った。また、各藩の孝子伝の調査を通じて、江戸における写本文化という、より大きな問題が浮かび上がった。そこへ、UCバークレーから調査を依頼されるという稀有なチャンスを得て、科研B(海外学術)の支援も得ることができた。これを逃さず、「写本文化の近世」の研究テーマを世に問うて人文科学に貢献したい。今年度は、当初の研究計画で言えば1年半分の成果を挙げることができた。今年度は計画段階では「研究準備期」と位置付け、1718世紀孝子伝の基礎的なデータ集めを行う予定であった。しかしこの作業がたいへん順調に進み、年度途中で完了した。日本国内で1718世紀に書かれた孝子伝を現時点でできる限りリストアップし、その地域や所蔵機関についての整理が完了したのである。よって平成26年度の予算を前倒し請求し、来年度行う予定の調査にも踏み込んだ。具体的には、各地の具体的な調査を始めたのである。そのさい、一つ進行上の大きな進歩があった。それは地域別の調査から、年代順の調査への転換である。計画当初は、関東、東北、などと地域別に調査を行おうと考えていたのだが、地理的条件を問わず、孝子表彰を早い時期に行った地域から先に調査することにしたのである。そのため、高知県、山形県鶴岡市、新潟県、愛知県、三重県といった、一見バラバラな地域へ調査出張を行った。しかしこの調査によって、幕初から寛延期ごろまでにかけての全国的な動向の時代感覚を把握することができた。こうした調査を踏まえて、初年度より研究成果の公表に踏み切った。勤務校の紀要に「近世孝子伝解題(一)」という論文を発表したのである。手始めに今回は、高知県(土佐藩)における孝子表彰について整理した。これはこの地の孝子伝の本格的な整理としては初めてのものとなる。のみならず、当地で最も著名な『土佐国鏡草』について、従来知られている本文に大きな欠陥があることも明らかにした。『孝子を訪ねる旅ー江戸期社会を支えた人々』(三弥井書店、3月)を出版した。これは近世中期の勤皇思想家・高山彦九郎の旅日記に出てくる孝子良民伝との接触の記事を追跡調査したものである。彦九郎は丁度、安永寛政期に全国を旅したので、彼の事蹟を追うことは、そのまま本科研の対象範囲と重なる。結果的に、この時期の重要な地域における孝子表彰、孝子伝執筆の実態について明らかにすることができた。若狭の小浜藩では、彦九郎が訪れていた時期にちょうど集中的に孝子表彰が数多く行われていたことを指摘。『懿民小伝』(小浜市立図書館蔵)など、未紹介の資料を紹介した。また山梨のあるお寺に残る災害文学の一資料だったものが、三輪執斎の手によって伝記として編まれ、その自筆伝記が高山彦九郎の手から執斎の子孫の手に渡る様子を明らかにした。この経緯を通じて、創成期の懐徳堂、播州龍野藩などの文事のありかたについて、新たな問題を提示した。また抽象的な問題では、江戸時代中期文化に闇斎学が果たした役割を明らかにした。娯楽・創作を中心とした従来の文学研究において闇斎学は重んじられて来なかったが、教訓・事実を中心とした文学史を考えようとする際には、闇斎学が大きな役割を果たしていることを論じた。彦九郎の調査を通じて、元禄寛政、という本科研で対象とする時期における、孝子表彰の全体的な色合いも明らかになった。この時期は、各藩が独自に孝子顕彰を行い、藩同士の連携はほとんど無いという、個別の時代なのであった。だからこそ全国を旅した彦九郎の記録は貴重なのであり、そして『官刻孝義録』という幕府の試みも必然であったのである。今年度は、熊本藩に関する孝子表彰と孝子伝に関する調査をまとめた。熊本藩は、江戸時代で早くから孝子表彰を行い、孝子伝の執筆もさかんであった割には調査が備わっていない藩である。その一因は、孝子伝が早くから出版された訳ではなく、写本で伝わっていたからという点にある。今回、幕初から寛政改革期(16,17世紀)における熊本藩の孝子表彰の様子と、孝子伝執筆について、熊本への調査出張を行って総合的に整理した。とくに、いままで原本の所在が明らかでなかった資料水足屏山『肥後州民イ伝』および村井見朴『肥後孝子記事』の確認できたのは大きな進展であった。両書は、国文学研究資料館の「古典籍総合目録データベース」には掲載されていなかったが、それぞれ、熊本県立図書館と熊本大学永青文庫で所蔵が確認できた。これの所在を明らかにし、概要を知ることができた。その結果、熊本藩が、五代将軍徳川綱吉の孝行奨励政策へ過敏に反応し、藩内で実践していった藩の一つであることが明らかになった。その成果は口頭発表「水足屏山と『肥後州民イ伝』」(雅俗研究会12月26日於九州大学)および論文「近世孝子伝解題

(2)熊本藩」として「明星大学研究紀要【人文学部・日本文化学科】」第24号(3月)で発表した。とくに論文においては、複数の孝子伝に重複して掲載されている人物の引き当て作業を行った。これによって江戸時代前半の熊本藩で表彰された人物の全容がはじめて明らかになった。1年目に論文「近世孝子伝解題(1)」を発表、2年目(昨年度)著書『孝子をたずねる旅』(三弥井書店)を出版、さらに3年目の今年も、論文「近世孝子伝解題(2)」を発表した。5年計画の3年目としては、おおむね順調に進展していると言って良いであろう。今年度は本来、平成25年度から29年度までの5年計画である。本年はそのうち4年目であった。しかし幸いにも、平成28年度研究公開促進費(採択課題番号:16HP5041)が採択されたので、進行中の基盤Cと今までの研究とを合わせて整理し、研究書として一書と成すことに力を注いだ。とくに本科研と関わる部分に関して述べておく。第二章「表彰と孝子伝の発生」第一節「綱吉による孝行奨励政策の背景」では、『官刻孝義録』の記事を中心に、会津、岡山、福知山、各地で行われた孝子表彰について再確認を行った。同章第二節「偽キリシタン兄弟の流転ー保科正之の孝子認定と会津藩における顕彰」では、会津藩と江戸幕府を中心とした孝子顕彰の諸現象について論じた。第三節「表彰と説話集とのあいだー岡山藩」、第四節「宝物としての孝子伝ー福知山藩・島原藩」においては、地方における孝子表彰と孝子伝執筆について、江戸の林家の役割を絡めて論じた。上記の各章節は主に旧稿を再構成したものであるが、引用の再確認や資料の再検討、新しく出た論文の確認などにおいて、本科研費は大きく役立った。その結果として、研究書『親孝行の江戸文化』(2017年3月、笠間書院、412ページ)を刊行した上記の著書刊行によって、孝子伝研究については一定の成果を得たと判断し、2017年度の科学研究費(B海外学術)に新たなテーマで申請したところ、採用された。よって本研究は一年前倒しで、本年度をもって終了することにした。本研究の4年間で得た成果は下記4点である。1:著書『孝子を訪ねる旅』2:論文「近世孝子伝解題(一)」、3:論文「近世孝子伝解題(二)ー熊本藩」、4:著書『親孝行の江戸文化』。この通り、本課題で十分な成果を挙げた。また資料的にも、今後科研費の援助を得ずとも研究を遂行できる見通しが立った。また、各藩の孝子伝の調査を通じて、江戸における写本文化という、より大きな問題が浮かび上がった。そこへ、UCバークレーから調査を依頼されるという稀有なチャンスを得て、科研B(海外学術)の支援も得ることができた。これを逃さず、「写本文化の近世」の研究テーマを世に問うて人文科学に貢献したい。5年間の計画の2年目で著書を刊行できたことは、研究が計画以上に進展していると評して良いであろう。拙著は書き下ろしであるが、本研究課題に該当する学術論文として、67本分の内容を盛り込んだつもりである。該書で明らかにした地域は次の通りである。第二章「小浜城下周遊」(小浜藩)、第三章「若狭路から北陸へ」(小浜藩、越後高田藩)、東海道の旅(小田原藩、駿府)、第六章「甲斐国の節婦」(甲斐国、龍野藩、懐徳堂)、第七章「京都で会った伊豆新島の孝子」(大和国)、第八章「常陸の孝子をたずねて」(水戸藩)、第九章「語り部としての彦九郎」(仙台藩)。
小胞体の細胞内流動を介したウイルス移行メカニズムの解明

本研究では、ウイルスの細胞内移行が植物の原形質流動を利用したものであると考え、その移行メカニズムを解明する。初期感染細胞においてウイルスは、複製複合体を小胞体(ER)膜上に形成し隣接細胞に至るまで細胞内を移行すると考えられているが、どのように移行を行っているかについては不明であった。申請者は、ウイルスの複製複合体は、ER膜上に存在したままミオシンを介してアクチン上を流動することによって細胞骨格を利用して移行するものと考えた。本年度においては「ウイルスの移行速度解析」および「ウイルス様病原体を用いた解析」の二点について、以下の研究を実施した。1.ウイルスの移行速度解析前年度作出した緑色蛍光タンパク質(GFP)により標識したplantago asiatica mosaic virus (PlAMV-GFP)を用いて、植物個体におけるウイルスの移行速度解析を行った。ウイルス接種後7日目から31日目まで経過時間毎のウイルスの拡がりをGFPを用いて追尾し、可視化した。この成果は平成26年度日本植物病理学会本大会において発表された。2.ウイルス様病原体を用いた解析植物ウイルスPlAMVを用いた研究と並行して、ウイルスと同様に植物細胞内に寄生する細菌についても解析を進めた。このウイルス様病原体は、自らは細胞内に留まりながら宿主植物の代謝を撹乱し、形態異常などの病徴を誘導する。先行研究により、このウイルスによく似た生活環を持つ細菌は媒介昆虫の体内でアクチンフィラメントと結合して存在していることが示されており、その宿主の細胞骨格を利用した感染・増殖機構の知見は植物ウイルス研究にも大いに活用することが可能であると考えられる。今年度申請者はこの細菌が分泌するタンパク質が植物の器官成熟に与える影響とその機構を明らかにした。この成果は平成26年12月にScientific reportsに掲載され、また平成27年3月の日本植物病理学会本大会において発表された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、これまで全く未知であったウイルスの細胞内移行が植物の原形質流動を利用したものであると考え、原形質流動に着目してウイルスの移行メカニズムを解明する。植物ウイルスの感染は、ウイルスの「複製」、「細胞間移行」、「長距離移行」という3段階を経て進行する。初期感染細胞においてウイルスは、まず宿主細胞内の膜構造を変形させた「複製複合体」という構造体を形成し、その中で複製を行う。多くの植物ウイルスの複製複合体は小胞体(ER)膜上に形成され、その中には複製に必須なウイルスの複製酵素(RdRp)が含まれる。さらに、植物ウイルスは複製後、隣接細胞との間をつなぐ原形質連絡(plasmodesmata ; PD)を経由して、隣の細胞へと移行していく。ウイルスがER膜上で複製したのちPDに至るまでには、ウイルスは細胞内を移行すると考えられている。しかし、ウイルスが複製を行った後、どのように複製の場であるERからPDへと移動し、PDから隣接細胞へと移行を行っているかについては知見が乏しいままだった。一昨年植物細胞の原形質流動に関して、ERが他のオルガネラを巻き込みながら、ミオシンを介してアクチン上を流動することによって原形質流動が起こるとする新規なモデルが提唱された。そこで申請者は、この原形質流動に関するモデルに着目し、ウイルスの複製複合体は、植物細胞内においてER膜上に存在したまま原形質流動を利用して移動し、さらにその形状を保って細胞間移行するものと考えた。前述した目的を達成するために、本年度においては「原形質流動とウイルスの細胞内移行をトレースする」ことを目標とし、以下の研究を実施した。(1)RdRp抗体の作出(2)形質転換体の作出原形質流動を可視化するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)により小胞体(ER)、および赤色蛍光マーカーtdTomato-ABD2によりアクチンを標識した形質転換シロイヌナズナを作出中である。初期感染細胞においてウイルスは、「複製複合体」という構造体を形成し、その中で複製を行う。多くの植物ウイルスの複製複合体は小胞体(ER)膜上に形成される。さらに植物ウイルスは複製後、隣接細胞との間をつなぐ形質連絡(PD)を経由して、隣の細胞へと移行していく。しかし、ウイルスがどのように複製の場であるERからPDへと移動し、PDから隣接細胞へと移行を行っているかについては長らく不明であった。植物細胞の原形質流動に関して、ERがミオシンを介してアクチン上を流動することによって原形質流動が起こるとするモデルが提唱されたことから、申請者はこのモデルに着目し、ウイルスの複製複合体は、植物細胞内においてER膜上に存在したまま原形質流動を利用して移動し、細胞間移行するものと考えた。本年度においては「解析に最適なウイルスの再設定」および「生きたままの植物培細胞を用いて細胞内移行をトレースする系の確立」を目標とし、以下の研究を実施した。1.解析に適したウイルスの改変前年度まで使用していたradish mosaic virus (RaMV)は感染に二本の分節ゲノムを必要とし、原形質連絡にチューブル様の構造を作るために、細胞内移行の観察には適していたが細胞間移行の観察にはやや不適であった。

そこで申請者は近年受け入れ研究室で盛んに解析が行われているplantago asiatica mosaicr virus (PIAMV)に注目した。PIAMVは細胞間移行の際にも特殊な構造は形成せず、細胞内のみならず細胞間の移行を解析するのに適していると考えられた。申請者は生きた植物細胞におけるPIAMVの動態を可視化するため、ウイルスをベクター化し緑色蛍光タンパク質(GFP)により標識したPIAMVを作出した。この成果は2013年10月25日にArchives of Virologyの電子版に掲載された。2.培養細胞を用いた細胞内移行を可視化する系の確立シロイヌナズナ植物体を用いる研究と並行して、細胞内の移行だけをより厳密に観察するために培養細胞による実験系の確立を試みた。実験には、理化学研究所バイオリソースセンターより分譲して頂いたタバコ培養細胞BY2のゴルジ体をGFP標識した「TBY2-RERIB」を用いた。本研究では、ウイルスの細胞内移行が植物の原形質流動を利用したものであると考え、その移行メカニズムを解明する。初期感染細胞においてウイルスは、複製複合体を小胞体(ER)膜上に形成し隣接細胞に至るまで細胞内を移行すると考えられているが、どのように移行を行っているかについては不明であった。申請者は、ウイルスの複製複合体は、ER膜上に存在したままミオシンを介してアクチン上を流動することによって細胞骨格を利用して移行するものと考えた。本年度においては「ウイルスの移行速度解析」および「ウイルス様病原体を用いた解析」の二点について、以下の研究を実施した。1.ウイルスの移行速度解析前年度作出した緑色蛍光タンパク質(GFP)により標識したplantago asiatica mosaic virus (PlAMV-GFP)を用いて、植物個体におけるウイルスの移行速度解析を行った。ウイルス接種後7日目から31日目まで経過時間毎のウイルスの拡がりをGFPを用いて追尾し、可視化した。この成果は平成26年度日本植物病理学会本大会において発表された。2.ウイルス様病原体を用いた解析植物ウイルスPlAMVを用いた研究と並行して、ウイルスと同様に植物細胞内に寄生する細菌についても解析を進めた。このウイルス様病原体は、自らは細胞内に留まりながら宿主植物の代謝を撹乱し、形態異常などの病徴を誘導する。先行研究により、このウイルスによく似た生活環を持つ細菌は媒介昆虫の体内でアクチンフィラメントと結合して存在していることが示されており、その宿主の細胞骨格を利用した感染・増殖機構の知見は植物ウイルス研究にも大いに活用することが可能であると考えられる。今年度申請者はこの細菌が分泌するタンパク質が植物の器官成熟に与える影響とその機構を明らかにした。この成果は平成26年12月にScientific reportsに掲載され、また平成27年3月の日本植物病理学会本大会において発表された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画の通り、今年度は特別研究奨励費を用いてウイルスの複製複合体の根幹をなす