hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ショウジョウバエ消化管の左右非対称形成に必須な上皮密着結合の新規機能の研究

実験開始から近年になり、我々はUAS-GAL4システムにおけるドライバーの組織特異性について再考を迫られることになった。というのも、我々がこれまで左右非対称性の力学的因子の探索のために用いてきた内臓筋のドライバーの幾つかがショウジョウバエ胚のyolk-cellにも発現することが解ったからだ。その中には、我々の研究室がこれまで左右非対称性形成に関する研究に多用したドライバーである24Bも含まれていた。内臓筋組織で強制発現させた蛍光タンパク質はyolk-cellで発現するだけでなく、発生が進むと内臓上皮組織に移行することが明らかになった。これまで研究してきた上皮密着結合(Sertate Junction、以降SJ)が臓器の形態形成にどのように影響するのかについて、いくつかの進展があった。上皮細胞においてはSJは細胞側面下部に集中しているが、多核で細胞間接着が上皮のように整列せず、重なるように配置されている内臓筋細胞では多方面で細胞接着がみられる。そのためSJを構成する因子も内臓筋肉細胞では多方面にみられることがわかった。ショウジョウバエ胚内臓筋には縦走筋と環状筋という2種の異なる組織がクロスするように形成されるが、SJ構成因子はそのどちらにもみられた。SJ構成因子をコードする遺伝子のホモ突然変異体胚をリアルタイムで観察した結果、縦走筋の伸張に異常はみられなかったが、左右から延びる環状筋の伸張とそれらが接着することで形成される臓器のチューブ形成に不安定性がみとめられた。接着が不安定な場合は、内臓は左右からの接着面で破断され、形態形成に著しい影響を及ぼした。一方、接着が安定的に行われたものの半数は、中腸前半部の構造が反転することがわかった。これはSJ構成因子の欠落した変異体は、接着面で破断せず構造的な破壊をまぬがれても、左右の正常な形成が正常に行われないことを示唆した。またSJ構成因子をコードする遺伝子のホモ突然変異体では、Fas3,Nrx4,ATPαなどのような細胞間接着因子の細胞膜への集積が野生型と比べて弱いことが明らかになった。これまで我々の研究で、上皮組織を構成する細胞の接着因子であるcadherinなどの集積が左右非対称性形成に重要な役割を果たすことを示してきた。本研究によって、上皮細胞だけでなく内臓筋細胞にも同様の機構が存在することが推測される。これまで研究は順調であったが、冒頭に述べた研究に関する基本的な技術において疑問点が生じてしまった。このため論文発表のような公的な成果を出す前に、これらの問題を解決するほうを優先させねばならなかった。UAS-GAL4システムのドライバーとyolk-cellからの物質とりこみを詳細に観察し、既存の中で最適なドライバーを選定する。みつからなければ遺伝子を組み替えて作成する。また、yolk-cellが発生にどのように関与するかを左右非対称性形成を中心に調査する。これまでSJ構成因子の機能は上皮細胞でよく研究されているが、内臓筋におけるSJ構成因子の存在及び、それらの機能は全く未知であった。SJ構成因子をコードする遺伝子の突然変異体の内臓筋の発生過程を詳細に観察した結果、通常では胚の左右から環状筋が伸張し、胚の中央部分で癒着するのに対し、これらの系統では環状筋の伸張は行われるものの、中央部分での接着が正常に行われず、腹側、および背側に間隙が生じているのがみられた。ショウジョウバエ胚消化管の筋肉は大きく2つに分類される。一つは左右から伸張し、消化管を環状に覆う環状筋。もう一つは消化管を前後に結ぶ縦走筋である。正常な左右非対称性形成に、どちらの筋肉組織がより重要な役割をしているかを確かめるために、SJ構成因子をコードする遺伝子の突然変異体のホモ接合体胚において、UAS-GAL4システムを用いてそれぞれの組織特異的に正常なSJ構成因子を発現させたところ、環状筋で発現させた場合に、表現型の救済が確認された。また、これまで上皮細胞のみに存在すると考えられていたSJ構成複合体の主要な因子であるcoracleが、内臓筋でも発現していることを抗体染色により確かめた。このことから、SJ構成因子は左右から伸張してきた環状筋の中央部分での接着に、重要な働きをしていることが示唆された。これまでの研究から、ショウジョウバエ胚中腸前半部の消化管の正常な左右非対称性形成には、環状筋の正常な発生が必要であることがわかっている。環状筋においてSJ構成因子が正常に形成されない場合、環状筋の正常な接着が阻害され、結果的に左右非対称性形成に異常が生じるものと考えられる。多くの動物の内臓器官の配置は左右非対称であり、その非対称性は遺伝的に決定されると考えられている。マウス・ゼブラフィッシュなどの脊椎動物では、発生初期のノード流によりよって形成された左右極性がnodal, leftyなどのTGFβタンパク質の発現を誘発し、その後の発生における左右非対称性形成に関与していることが知られている。

しかし、線虫やモノアラガイなどの無脊椎動物では、卵割初期から左右非対称性が観察されることから、ノード流モデルとは異なる仕組みで左右非対称性が形成されていると考えられている。そこで私は、モデル生物であるショウジョウバエを用いて、無脊椎動物の左右非対称性形成の機構を明らかにしようと試みた。ショウジョウバエの内臓器官は前腸、中腸、後腸の3つに大きく分類できる。この中で私は中腸の左右非対称性形成に着目して研究を行ってきた。その結果、中腸の前半部分と後半部分ではその決定にかかわる組織が異なることを発見した。前半部分は筋肉組織依存的であり後半部分は上皮組織依存的であった。ショウジョウバエの上皮密着結合の役割は上皮において広く研究されてきた。しかし私は、ショウジョウバエ中腸前半部分の左右非対称性形成の異常がみられる系統として、この上皮密着結合の構成因子を複数同定し、筋肉組織における上皮密着結合構成因子の新規の役割を探索してきた。これまでの研究で、ショウジョウバエの内臓の筋肉組織における上皮密着結合構成因子の役割が、筋肉細胞同士の正常な結合に重要であることを明らかにした。筋肉細胞内で上皮密着結合構成因子の正常な発現及び局在が起こらない場合、中腸の内臓筋細胞同士が正常に接着せず、また一旦接着しても形態形成の最中にこれが乖離してしまうことが解った。実験開始から近年になり、我々はUAS-GAL4システムにおけるドライバーの組織特異性について再考を迫られることになった。というのも、我々がこれまで左右非対称性の力学的因子の探索のために用いてきた内臓筋のドライバーの幾つかがショウジョウバエ胚のyolk-cellにも発現することが解ったからだ。その中には、我々の研究室がこれまで左右非対称性形成に関する研究に多用したドライバーである24Bも含まれていた。内臓筋組織で強制発現させた蛍光タンパク質はyolk-cellで発現するだけでなく、発生が進むと内臓上皮組織に移行することが明らかになった。これまで研究してきた上皮密着結合(Sertate Junction、以降SJ)が臓器の形態形成にどのように影響するのかについて、いくつかの進展があった。上皮細胞においてはSJは細胞側面下部に集中しているが、多核で細胞間接着が上皮のように整列せず、重なるように配置されている内臓筋細胞では多方面で細胞接着がみられる。そのためSJを構成する因子も内臓筋肉細胞では多方面にみられることがわかった。ショウジョウバエ胚内臓筋には縦走筋と環状筋という2種の異なる組織がクロスするように形成されるが、SJ構成因子はそのどちらにもみられた。SJ構成因子をコードする遺伝子のホモ突然変異体胚をリアルタイムで観察した結果、縦走筋の伸張に異常はみられなかったが、左右から延びる環状筋の伸張とそれらが接着することで形成される臓器のチューブ形成に不安定性がみとめられた。接着が不安定な場合は、内臓は左右からの接着面で破断され、形態形成に著しい影響を及ぼした。一方、接着が安定的に行われたものの半数は、中腸前半部の構造が反転することがわかった。これはSJ構成因子の欠落した変異体は、接着面で破断せず構造的な破壊をまぬがれても、左右の正常な形成が正常に行われないことを示唆した。
分岐型DNA合成を基盤とするDNAカプセルおよびDNAシートの創製

DNAは一本鎖であるが,核酸塩基の持つ相補的な水素結合形成により,二重螺旋構造となる。もし,三本に枝分かれしたDNAを化学的に調整できれば,これを構成単位とする,二重螺旋以外の多様な構造の分子会合体が形成可能になると考えられる。本研究では,三方向に核酸を配置した分岐型DNAを合成し,これを会合させることで,シート状やカプセル状の新規なDNA会合体を合成すること目指して研究を展開した。その結果,相補的な塩基を持つ分岐型DNA二種と,塩基性のゲスト分子1分子を水中で混合することで,ゲスト分子を取り込んだカプセル型構造を取っている可能性がある,新規な三成分系錯体が形成する現象を見出した。核酸塩基の持つ相補的な水素結合形成能は,低分子化合物をユニットとする分子会合体の形成に利用可能であると考えられる。私たちは今回、三方向に核酸を配置した分岐型の人工DNAを合成し,その分子会合体形成能の解析を目的に研究を行った。1,3,5-benzenetrimethanolに,4種の核酸(A, T, G, C)をそれぞれホスホロアミダイト法で結合し,保護基を順次除去して目的の4種の分岐型人工DNA三量体を得た。さらに,これらを用いた会合体形成について検討した。インターカレーターの一種である臭化エチジウムを4種の分岐型人工DNA三量体にそれぞれ添加すると,赤色の蛍光が観測された。臭化エチジウムは疎水的環境で蛍光を発することから,何らかの会合体を形成し,臭化エチジウムが水から隔てられた環境に置かれていると考えられた。そこで,その会合体の構造を明らかにすべく,MOEを用いたドッキングシミュレーションを行った。その結果,分岐型の人工DNA三量体は,臭化エチジウムを掴むように包接する事が示唆された。一方,アクリジンオレンジは一本鎖と二本鎖DNAの区別に用いられ,一本鎖の場合は赤色の,二本鎖の場合は緑色の会合体を生成することが知られている。そこで臭化エチジウムに換えて,アクリジンオレンジと分岐型人工DNA三量体との混合を試みた。その結果,GとCを塩基として持つ分岐型人工DNA三量体を1対1で混合し,アクリジンオレンジを加えた場合は赤色に,一方,AとTとアクリジンオレンジを混合した場合は黄色を呈することが分かった。これらの結果から,核酸塩基の違いにより,会合体の構造が異なることが示唆される。前年度に見出した,三量体DNAの包接現象をさらに詳細に検討するために,ゲスト分子としてアクリジンオレンジを用いた検討を進めた。アクリジンオレンジは赤色蛍光を有するが,二本鎖DNAにインターカレートすると緑色の蛍光を発する事が知られており,細胞の生死判定等に用いられる。このアクリジンオレンジをゲスト分子として,三量体DNAと混合したところ,三量体dAと三量体dT,アクリジンオレンジを1対1対1に混合した場合に,溶液は赤色蛍光を示したが,24間放置後は,赤色の沈殿を生じると共に,溶液は緑色の蛍光を示すことが明らかとなった。この上澄み液をESI質量分析装置で測定したところ,混合した三成分の1対1対1に対応した分子イオンが観測された。また1H NMR測定では,三種を混合した際のケミカルシフトが,三量体dAとアクリジンオレンジのみ,及び,三量体dTとアクリジンオレンジのみをそれぞれ混合した際の,二系分の混合物のケミカルシフトと大きく異なることから,三成分複合体の生成が示唆された。さらに,MOEを用いたドッキングシミュレーションの結果でも,三成分複合体が安定に存在することが示された。またその最安定構造では,二つの核酸塩基に,アクリジンアレンジが挟まれたような形を取っており,この構造が,アクリジンオレンジが二本鎖DNAにインターカレートした際と類似の効果を示して,緑色蛍光を発する原因の一つとなっていると考えられた。さらに生じた赤色の沈殿は,薄い塩基の水溶液で洗うと,赤色は容易に洗い流されて,薄い黄色に変色することから,三量体DNAが会合して沈殿し,その表面にアクリジンオレンジが吸着して,赤色蛍光を発しているものと考えられた。この沈殿中では,三量体DNAが分子間で規則正しく会合した多量体構造を取っている可能性があり,その構造様式を解明することは,分岐型DNAの機能を解析する上で,極めて重要であると考えられる。目的の分岐型人工DNA三量体の合成を完了し,その会合体形成能を確認出来た。また臭化エチジウムをゲスト分子とした場合,分岐型人工DNAがゲスト分子を掴むように包接する特有の機能があることも明らかとなり,その会合定数の決定にも成功した。

さらに,アクリジンオレンジをゲスト分子に用いた実験では,核酸塩基の違いにより構造の異なる会合体が形成する新規な現象を発見し,分岐型人工DNAの機能を明らかにする糸口が得られた。有機合成化学今後,アクリジンオレンジをゲスト分子に用いた会合体の構造を解析すると共に,分岐型人工DNAの持つ会合体形成能を薬物との会合体形成に発展させて,ドラックデリバリーに応用可能か,会合体の安定性などの基本的な性質をさらに詳細に検討する。また分岐型人工DNA6量体の合成を完了し,その会合体形成能についても検討を進める。
近代日本における「性犯罪」抑止政策と法の批判的検討

2016、2017年度の調査で、「痴漢」という性犯罪の被害状況や社会認識、適応法令等について、これまで、学術研究において重要な研究対象と見なされてはこなかったことがわかった。「痴漢」は日常的に起こり得る身近な被害であり、性暴力の抑止を考える上で重要な研究テーマであることから、2018年度は、「痴漢」についての社会認識の変容や公的機関の対策の状況を明らかにすることをめざした。現在、痴漢事件の多くは、各都道府県警察が立案した迷惑防止条例によって取締りが行われている。この条例の制定や改正の経緯、運用状況に着目すれば、「痴漢」がどのように概念化され犯罪化されていったのかを明らかにすることができる。そこで、迷惑防止条例の制定やそれによる取り締まりの状況が分かる資料の調査を、国会図書館や公立図書館において行った。上記の調査の他、性暴力問題を語るに外せない「地下鉄御堂筋線事件」「福岡セクハラ訴訟」等に関わった方を招いた連続公開研究会「性暴力・セクシュアルハラスメントを考えるためにー性暴力の顕在化・概念化・犯罪化」を実施し、当時の性暴力認識や対策、現在の性暴力抑止政策の問題について、参加者と議論を行った。また、性犯罪被害を抑止するための警察の防犯指導に使用される資料から、取締機関には、今なお強姦神話が根強く残っていることや、性的ステレオタイプを助長するジェンダー表象の問題があることを指摘する論考をまとめた。加えて、第63回国連女性の地位委員会(CSW63)期間中に、国連本部や周辺で行われたサイドイベント、パラレルイベントに参加し、諸外国のジェンダー研究者や性暴力被害者支援に関わる人たちと議論を行い、性教育や性暴力抑止政策について新たな知見を得た。調査、分析・考察、公表のそれぞれに、当初の予定通りには進行していない部分はあるが、全体として概ね順調に進展していると考えている。2019年度中に、これまで「痴漢」問題について行った研究成果を、論文、単行本として発表予定である。2019年度は、引き続き痴漢問題について調査・考察を行う。2000年前後から大きな社会問題として扱われてきた痴漢冤罪問題について、捜査機関の問題やその語られ方、痴漢冤罪が他の冤罪とは異なる扱われ方をしていることについて、ジェンダーの視点から考察を深める。2019年度も、前年度に引き続き、性暴力問題について議論する研究会を実施する予定である。女性被害者の保護のために、捜査過程への女性の関与の必要性が指摘されて久しいが、女性警察官の参入によって、性犯罪捜査がどのように変わり、また、警察組織のジェンダー観がどのように変わったのかについても研究を進める。本研究の目的は、「性犯罪」抑止を目的とした法と政策の歴史を、意に反する性的行為という「性暴力」概念により批判的に検討し、性暴力を容認してきた公的機関の認識、及び、それを支えてきた社会的背景を明らかにすることである。研究所年度である2016年度は、まず、「性暴力」定義について、公的機関が対処する「性犯罪」と比較して概念整理を行い、その成果を日本女性学会で報告した。次に、法や政策の効果を判断するための指標として、捜査機関の「性犯罪」定義による従来の犯罪統計を見直し、「性暴力」概念によって統計を再構成すべく、従来の「性犯罪」統計には該当しない性暴力被害数値の抽出を行った。これまでの犯罪統計では、いわゆる「痴漢」事案は、捜査機関に届出・相談されても、犯罪統計として扱われないという問題があった。性犯罪の中でも、強姦罪や強制わいせつ罪は、刑法犯としてその被害件数(認知件数)が「犯罪統計書」等に掲載されているが、「痴漢」の多くは各都道府県の迷惑防止条例で対応されているため、犯罪統計システム上、刑法犯ではなく特別法犯として扱われており、犯罪統計として計上・公表されるのは検挙数のみなのである。「痴漢」事案を強姦罪や強制わいせつ罪等と同様に扱うためには、公的機関に対する届出数を把握する必要がある。そこで、2016年度は、公的統計が取りこぼしている「痴漢」を中心に、新聞や議事録等を対象に調査を行い、新聞記事に取り上げられた被害届出数や、条例制定・改正議論で言及される相談数等を抽出した。現在もこの調査は継続中であるが、終了次第、都道府県・年ごとに整理して統計資料に組み込み、成果を報告したいと考えている。当初の計画通り、所属する京都大学付属図書館をはじめ、国会図書館や近隣施設で閲覧が可能なものを対象にして集中的に調査を行った。収集した資料は、各都道府県の迷惑防止条例で取り締まられる痴漢事件に関するものを対象に、新聞、雑誌、議事録、公的統計、取締り機関の部内資料等である。当初の予定では、得られたデータは随時公表することとしていたが、公表については全体のデータ整理ができてから行いたいと考えている。2年目となる2017年度は、いわゆる「痴漢」事案を中心に調査・分析を行った。まず、「痴漢」についての社会認識の変容を明らかにするため、国会図書館他において調査を行い、明治以降の「痴漢」に言及した新聞、雑誌記事を抽出し、それらの言説分析を行った。公的機関の「痴漢」認識を知るため、公立図書館等に所蔵されている防犯指導パンフレットや統計分析資料等の調査も行った。また、官公庁に対する情報開示請求により、一般に公表されている統計数値よりも詳細なデータも得られた。

かつて「痴漢」は、公的な用法としても、重大な被害をもたらす事案も含めた「性犯罪」一般、あるいは、その加害者を示す語であったが、被害者の声に押され、「痴漢」行為が取締りの対象になると、重大事件の前兆事案として扱われて、軽微な性的侵襲行為として定着していき、「痴漢」被害の重大性はむしろ後退していった。「痴漢」事件の多くは、各都道府県の迷惑防止条例によって取締りが行われていることから、全国の条例について、その制定や改正の経緯を議事録や警察教養誌等を中心に調査し、データベースを用いて、迷惑防止条例にかかる判例の分析も行った。迷惑防止条例は、1962年、オリンピックを控えた首都東京の街頭から暴力行為を排除するため東京で最初に制定され、それに倣って、大阪、愛知をはじめ、東京以外でも条例が制定された。1990年代半ばから、「痴漢」取締りに重点が置かれると、条例違反での検挙数も増加するが、条例が整備されていない県もあったことから、「痴漢」に対する取締りには地域差があったといえる。2002年に栃木県で迷惑防止条例が制定されたことにより、全ての都道府県に本条例が整備された。本条例の制定当初は、いわゆる「痴漢」事案に対応するものとしては想定されていなかったが、痴漢事案での運用が定着すると、それに合わせた立法手当が行われるようになった。2017年度は所属機関が変更となり、その手続きに時間を要したこともあり、当初の計画よりも調査期間が短縮された。そのため、予定していた遠方の資料調査が完了できず、次年度以降に持ち越されたものがある。「痴漢」については、当初の予定より早く、資料調査、分析がほぼ終了し、2018年中に成果発表を行うべく、作業を進めている。HPによる公開は、インターネット上で公開された論文の内容がドキュメンタリー番組に剽窃されたという事例を受けて、公開方法について再考することにした。インターネット上で公開するとしても、論文・著書による成果公表後に行うことが適切であると考え、最終年度に行う予定である。調査、分析・考察、公表のそれぞれに、当初の予定通りには進行していない部分はあるが、全体として概ね順調に進展していると考えている。2016、2017年度の調査で、「痴漢」という性犯罪の被害状況や社会認識、適応法令等について、これまで、学術研究において重要な研究対象と見なされてはこなかったことがわかった。「痴漢」は日常的に起こり得る身近な被害であり、性暴力の抑止を考える上で重要な研究テーマであることから、2018年度は、「痴漢」についての社会認識の変容や公的機関の対策の状況を明らかにすることをめざした。現在、痴漢事件の多くは、各都道府県警察が立案した迷惑防止条例によって取締りが行われている。この条例の制定や改正の経緯、運用状況に着目すれば、「痴漢」がどのように概念化され犯罪化されていったのかを明らかにすることができる。そこで、迷惑防止条例の制定やそれによる取り締まりの状況が分かる資料の調査を、国会図書館や公立図書館において行った。上記の調査の他、性暴力問題を語るに外せない「地下鉄御堂筋線事件」「福岡セクハラ訴訟」等に関わった方を招いた連続公開研究会「性暴力・セクシュアルハラスメントを考えるためにー性暴力の顕在化・概念化・犯罪化」を実施し、当時の性暴力認識や対策、現在の性暴力抑止政策の問題について、参加者と議論を行った。
二酸化炭素の回収・濃縮および還元の両機能を併せ持つ金属錯体光触媒系の開発

CO2還元能を有するレニウム錯体について、ジイミン配位子の種類、用いる溶媒や塩基など種々の条件を検討することで、CO2分子捕捉能に必須の条件、そして、そのCO2捕捉能が変調可能であることを明らかにした。この条件をふまえて特別な添加剤を必要とせず、自身が積極的にCO2を捕捉できる錯体を新規に設計し合成に成功した。これらの錯体は、CO2捕捉を補助する置換基の数や導入位置によって、CO2還元光触媒能が大きく異なることがわかった。これらの結果から、CO2の回収・濃縮とその還元の両機能を併せ持つ金属錯体光触媒系を実現し、また、他の金属錯体光触媒系にも転用可能な新しい光触媒の設計指針を獲得できた。二酸化炭素(CO2)の還元光触媒能に加えて、その捕捉能も有することを見出したレニウム錯体について、その電子構造を変調し、また用いる反応条件を変化させることで、錯体構造および反応条件とCO2捕捉能の間の相関関係を検討した。まず、ジイミン配位子の4位に種々の置換基を導入したレニウム錯体を調製した。これらの錯体を用い、ジメチルホルムアミド(DMF)-トリエタノールアミン(TEOA)混合溶媒中CO2雰囲気下において、錯体に配位しているジイミン配位子による置換基効果を検討した。その結果、ジイミン配位子の4位に電子求引性基を導入することで、CO2とTEOAを一分子ずつ取り込んだレニウム錯体の生成が優勢に、電子供与性基を導入することで抑制されることを明らかにした。次に、TEOAとともに用いる溶媒の種類を変化させ、CO2-TEOA付加錯体の生成の違いを確認した。ジメチルスルホキシドやテトラヒドロフラン中では、DMF中と同様にCO2-TEOA付加錯体の生成が見られた。一方で、アセトニトリル(CH3CN)中では、レニウム錯体に単座配位したCH3CNにTEOAが求核攻撃することで、対応するイミノエステル錯体が生成し、CO2雰囲気下でもCO2-TEOA付加錯体を生成しないことがわかった。さらに、TEOAの代わりに、塩基としてトリエチルアミン(TEA)、アルコールとしてエタノールを用いたところ、その両方が共存する場合のみ、CO2とエタノールが1分子ずつ取り込まれたレニウム錯体が得られることが明らかになった。これらのことから、ジイミン配位子の電子効果によりCO2捕捉能が変調可能であり、また、CO2捕捉には塩基とアルコールの両方の共存が不可欠であることがわかった。レニウム錯体によるCO2捕捉に関して、錯体に用いる配位子の種類と溶媒の満たすべき条件を明らかにし、当初の予定通りにその制御因子を明確にできたため。昨年度までに得られていた、レニウム錯体による二酸化炭素(CO2)の捕捉機構を考慮して、従来の系で用いられてきたトリエタノールアミンのような、CO2捕捉を補助する添加剤を必要とせず、錯体自身が積極的にCO2を捕捉できる錯体を新たに設計・合成した。具体的には、レニウム中心近傍にヒドロキシ基が位置するように、レニウムに配位する芳香族ジイミン配位子を修飾した新規錯体を数種合成・同定し、そのCO2捕捉能とCO2還元光触媒能を検討した。単結晶X線構造解析や核磁気共鳴分光等から、溶液中・固体中において分子内にCO2分子を捕捉できる距離にヒドロキシ基が位置していることが確認できた。実際に、塩基性溶液中においてCO2を通気すると、室温条件で錯体中にCO2分子が取り込まれることが赤外吸収スペクトルから明らかになった。これらの錯体を光触媒としてCO2還元反応を行ったところ、CO2の還元生成物であるCOの生成量は、レニウム中心周辺に配置したヒドロキシ基の数や位置に大きく依存することがわかった。これは、錯体の1電子還元種の蓄積の程度や中間体として生成する錯体の種類が、レニウム中心周辺のヒドロキシ基の数、位置、種類で変化することに起因することを見出した。さらに、ヒドロキシ基の導入によってCO2捕捉能が錯体に付与される一方で、それによる電子的効果が有意に働くことで、錯体の電気化学的性質が大きく変化し、光触媒能が左右されていることがわかった。今回得られた知見から、CO2捕捉能を維持しながら、CO2還元能を高める光触媒の設計指針が得られた。当初予定していた通りに、二酸化炭素捕捉のための添加剤を特に必要としない新規金属錯体を合成・同定することに成功し、さらに、それらの錯体に二酸化炭素捕捉能と二酸化炭素還元能の両方が備わっていることが確認できたため。これまでに合成してきた、二酸化炭素(CO2)分子の捕捉に特別な添加剤が不要な、金属中心近傍にヒドロキシ基が位置するレニウム錯体を、光触媒、また、光増感剤共存下で触媒として、CO2還元反応を行い、系中で生成する錯体種を調査した。その結果、触媒反応に用いる塩基性条件において、金属中心近傍に位置するヒドロキシ基の水素が脱プロトン化して生じたヒドロキシドによって、2個の錯体が互いに配位して自己二量化することを、紫外可視吸収スペクトル、単結晶X線構造解析等から明らかにした。この二量体は単量体より長波長側に吸収帯を持つことから、ヒドロキシ基を持たないレニウム錯体と比較して、照射光の吸収光量が異なり、光触媒能の差異の原因の一つになったと考えられる。

本研究課題では、CO2還元能の他に、CO2分子捕捉能も有することを見出したレニウム錯体について、ジイミン配位子の種類、用いる溶媒や塩基など種々の条件を検討することで、そのCO2捕捉の必須条件、そして、CO2捕捉能が変調可能であることを明らかにした。このCO2捕捉の条件をふまえて、CO2捕捉を補助する添加剤を必要とせず、錯体自身で積極的にCO2を捕捉できる錯体を新規に設計し合成に成功した。これらの錯体は、その金属中心近傍にヒドロキシ基が配置されることで、溶液中で分子内にCO2分子を捕捉でき、そのヒドロキシ基の数や位置によって、CO2還元光触媒能が大きく異なることがわかった。また、その光触媒反応中に生成する中間体も同定することで、その光触媒能を左右する因子を明らかにできた。これらの結果から、CO2の回収・濃縮とその還元の両機能を併せ持つ金属錯体光触媒系を実現し、また、他の金属錯体光触媒系にも転用可能な新しい光触媒の設計指針を獲得できた。CO2還元能を有するレニウム錯体について、ジイミン配位子の種類、用いる溶媒や塩基など種々の条件を検討することで、CO2分子捕捉能に必須の条件、そして、そのCO2捕捉能が変調可能であることを明らかにした。この条件をふまえて特別な添加剤を必要とせず、自身が積極的にCO2を捕捉できる錯体を新規に設計し合成に成功した。これらの錯体は、CO2捕捉を補助する置換基の数や導入位置によって、CO2還元光触媒能が大きく異なることがわかった。これまでの結果をもとに、CO2捕捉能を強化した錯体を合成し、高いCO2還元能とCO2捕捉能を有する光触媒系の開発を進める。これまでの成果をもとに、特別な添加剤を用いずに二酸化炭素を捕捉しながら、低濃度の二酸化炭素も高効率に還元できる光触媒系を実現する。無機化学今年度に購入を予定していた機器を用いて実施予定の実験が、安価な器具・消耗品を用いた代替法で実施することができたため。当初から計画していた消耗品等に加えて、次年度に開発する光触媒系の性能評価の迅速化に資する装置(励起状態追跡装置)と物品を追加で購入する予定である。
免疫関連遺伝子発現プロファイルを用いた魚類ウイルス性疾病の診断・予防法の開発

魚類ウイルス病診断のための基礎的データを得るために、リンパ球の表面抗原や分化・成熟に関わる遺伝子を単離し、ウイルス感染細胞や抗原で刺激した個体における免疫関連遺伝子の発現を明らかにした。また、リンパ球の動態解析のためのヘルパーT細胞やキラーT細胞に対する抗体作製に魚類で初めて成功した。さらに、ウイルスに対する感染防御に中心的な役割を果たすキラーT細胞による細胞傷害機構を明らかにした。平成18年度においては、クローンギンブナよりTリンパ球表面抗原及びT細胞の分化・成熟や機能発現に関わる遺伝子の単離ならび発現解析を行い以下のような成果が得られた。1)T細胞サブセットの同定及び分離のためのリンパ球表面抗原遺伝子の単離CD4及びTCRγ鎖遺伝子全長を単離した。TCRγ鎖については、定常領域の異なる3種類のcDNAが得られ、それぞれ特異的な発現を示したが、いずれも胸腺や粘膜で発現が認められ粘膜免疫への関与が示唆された。2)T細胞の分化・成熟及び機能発現に関わる遺伝子の単離Th1、Th2細胞の分化・成熟に関わる転写因子であるT-bet、GATA-3遺伝子をギンブナより単離した。GATA-3には異なる転写活性を有する幾つかの変異体が存在し、いずれも表面免疫グロブリン(sIgM)陰性のリンパ球で発現していることからT細胞の機能に関与することが示唆された。3)T細胞サブセットの分離のための抗体の作製CD8αに対するモノクローナル抗体(MAb)をラットのフットパッド法により作製した。本抗体はsIgM陽性のBリンパ球とは反応せず、鱗移植によるアロ抗原感作により頭腎において陽性細胞が増加したことから、CD8陽性の細胞障害性T細胞を認識していると考えられた。また、セルソーター及び抗CD8αMAbを用いて、ギンブナ頭腎よりCD8陽性T細胞の分離に成功し、これらの細胞群においてTCR及びCD8遺伝子が発現していることをRT-PCR法により確認した。4)サイトカイン遺伝子の単離及び組み換え体の作製一部の魚類には、2種類のIFN-γ伝子(IFN-γ1,IFN-γ2)が存在することが知られているが、ギンブナにおいてはIFN-γ1にさらに2種類のアイソタイプが存在することを明らかにした。また、発現解析よりIFN-γ1,IFN-γ2両分子が細胞性免疫に関与していることが示された。クローンギンブナ及び同じコイ科魚類でゲノム解析が進んでいるゼブラフィッシュを用いて下記の課題について検討した。1)細胞障害性Tリンパ球(CTL)の機能発現に関わる遺伝子の単離本年度はウイルス感染において主要な役割を果たすCTLの機能発現に関わるパーフォリンPerfolinおよびグランザイムGranzyme遺伝子を単離し発現解析を行った。ギンブナのperforinには3つのアイソタイプ(Pfn-1、Pfn-2及びPfn-3)が存在し、アロ抗原刺激後の鱗移植部位では、Pfn-1のみ強く発現することが明らかとなった。21種類存在するゼブラフィッシュのGranzyme様遺伝子のうち5種類の遺伝子についてRT-PCR法により発現解析を行ったところ、4種類のGranzymeに細胞性免疫への関与が認められた。2) T細胞サブセットの分離のためのギンブナCD4に対するモノクローナル抗体(MAb)の作製CD8αに対するMAb作製と同様の方法を用いCD4に対するMAbを作製した。CD4に対するMAbは、ギンブナCD4を細胞表面に発現するラット腎臓細胞(NRK)のみを認識し、slgM陽性のBリンパ球およびCD8α陽性のTリンパ球とは反応しなかった。形態的にリンパ球を認識しており、50%以上の胸腺細胞と反応した。セルソーター及び免疫磁気抗体法によりギンブナ頭腎よりCD4陽性T細胞を分離し、遺伝子の発現をRT-PCR法により解析したところ、CD4及びTCR遺伝子のみが発現していることが判った。以上のことから、本MAbはCD4陽性のヘルパーT細胞を認識していると考えられた。3) IL-12遺伝子の単離及び組み換え体の作製ギンブナよりIL-12p35およびp40遺伝子を単離し幾つかのアイソタイプが存在することを明らかにした。IL-12p35は1種類しか存在しないが、IL-12p40にはa,b,cの3種類のアイソタイプが存在し、さらにa及びcには2種類のバリアントが存在することが明らかとなった。IL-12p35およびIL-12p40aを昆虫細胞に組み込み、共発現させてIL-12の組み換え体を作製した。組換えIL-12をギンブナの頭腎細胞に加えところ、IFN-γの発現誘導が観察された。今回の研究において、クローンギンブナCD8αおよびCD4分子に対するモノクローナル抗体(mAb)の作製に成功した。そこで、これらのmAbを用いてT細胞サブセットを分取し機能解明を試みた。1.魚類CD8陽性(CD8^+)T細胞の特性及び傷害機構の解析:CD4陽性細胞は細胞傷害活性を全く示さず、CD8α^+細胞のみがアロ抗原特異的に強い細胞傷害活性を示した。

一方、sIgM^+細胞も細胞傷害活性を示したがアロ抗原特異的ではなくNK細胞によるものと思われた。細胞の傷害にはターゲット細胞との接触が必要であり、アポトーシスを誘導し、パーフォリン依存的傷害経路の阻害剤であるEGTAあるいはコンカナマイシンAの添加により細胞傷害活性が抑制された。また、ギンブナにおける3種類のパーフォリンのうちパーフォリン-1の発現増強が感作後のCD8α^+細胞において認められた。以上より、CD8α^+細胞による傷害にはCA^<2+>依存性のパーフォリンを介した傷害経路が重要な役割を果たすことが示された。2.移植片対宿主病(GVHD)におけるCD8+T細胞の役割解明:感作ドナー細胞移植7日目のレシピエントにおいてドナー肉来CD4^+T細胞の著しい増加が認められ、続いてCD8^+T細胞の増加が認められた。CD8^+T細胞を除いた白血球移植群ではGVHDの発症及び死亡個体は認められなかった。以上のことから、魚類においてもCD8^+T細胞が急性GVHDの誘導において主要な役割を果たしていることが示された。3.ウイルス感染細胞における免疫関連遺伝子の発現解析:クローンギンブナ由来鰭細胞より4種類のMHCクラスI遺伝子を単離し、フナ造血器壊死症ウイルス(CHNV)感染後の発現について解析した。その結果、4種類のMHCクラスI遺伝子のうち2種類の遺伝子が、ウイルスが顕著に増殖する以前の感染後36時間後に高い発現を示した。遺伝子の構造及び発現よりこれらの遺伝子が古典的MHCクラスI遺伝子として抗原の提示に関与していることが示唆された。
心理学・計算科学・神経科学を統合させた計算モデルによる感情と認知の相互作用の解明

本研究では、興奮覚醒によって知覚機能がどのような影響を受けるか、また、その影響は加齢によってどのような影響を受けるのかを、心理学的アプローチ・神経科学的アプローチ・そしてコンピューターシミュレーションによって明らかにした。GANEモデル(Mather et al., 2008)によると、優先的に処理されている情報は、興奮覚醒時には更に促進される。一方で、興奮覚醒時に優先的に処理されていない情報は、興奮覚醒時に処理が抑制される。つまり、Signal-to-ratio比が更に増すという予測が成り立つ。これを心理学実験で解明するために、(a)興奮覚醒の要因(不快な情動と条件づけられた音の呈示の有無)と、上記の(b)情報の優先性という要因(2つの刺激のうち、明瞭に呈示された刺激を処理する条件と不明瞭な刺激を処理する条件)という2つの要因を直交に操作した。課題は、2つの画像が画面左右に提示され、建物の画像が出てきた方をクリックするというものであった。結果、反応時間において予測を支持する結果が得られた。また、GANEモデルによると、高齢者はGABAなどの抑制機能が低下しているため、処理の優先度に関わらず、興奮覚醒によって処理が促進されるという仮説が成り立つ。これを検討するために、高齢者の成績と比べたところ、仮説を支持する結果が得られた。上記の結果は、神経イメージング研究によっても支持され、「建物」を処理すると期待される脳部位の活性値は、上記の反応時間と同じパタンが得られた。最後に、GANEモデルが仮定する神経伝達物質のメカニズムを導入したニューラルネットワークモデルを構築し、上記の結果を再現した。これらの結果は、心理学的知見・神経科学的知見・計算論的知見をまとめて単一モデルで説明するものである。本研究結果は、既に論文として発表された(Lee et al., 2018)。行動実験・神経科学実験・加齢研究・ニューラルネットワークシミュレーションの全てを実施出来たのみならず、それを論文として発表することが出来たため(Lee et al., 2018)。今後は、上記の研究アプローチを、その他の認知機能へと拡張する。上記の研究は、二つの画像のうち、「建物」の写真を示す方を選択するという「知覚判断課題」であった。ここで、GANEモデルは、認知機能・課題を問わず、「情報処理の優先度」と「興奮覚醒の有無」の要因の交互作用を予測するところに価値がある。そこで、今年度は、この予測を記憶課題に拡張し、検討することを目的とする。行動実験のみならず、加齢研究や神経科学研究、そしてコンピューターシミュレーションを用いた、領域横断的な手法を用いる予定である。2018年度は研究が非常によく進み、論文執筆まで終了することが出来た。海外学会への参加・発表よりも、この執筆活動を優先したために、旅費項目支出に大きな変化が生じたため。

また、神経科学的研究を、申請者の所属校ではなく、共同研究者の機関によって実施出来たことも、経費が抑えられた理由の一つである。翌年度分として請求した助成金と合わせ、2019年度は海外学会での発表を多く行っていきたい。
偏光放射観測に基づく地球大気エアロゾル特性の解析

本研究では,大気エアロゾルの光学特性(化学組成,密度,大きさ等)の時空間変化からその起源や分布を調べた.エアロゾル光学特性の導出にあたり,放射強度と合わせて,偏光度を利用した.偏光度データの取得には,下記のスケジュールで多波長偏光放射計(PSR1000)を用いて検証実験を実施した.●平成8年5月平成9年2月近畿大学(東大阪市)●平成8年5月平成9年1月気象庁気象研究所(つくば市)にて気象研,金沢工大と共同観測●平成8年7月,平成9年3月神戸商船大学深江丸にて四国・九州沖にて洋上観測これらの取得データを基に,光散乱シミュレーション値と比較照合から最適なエアロゾルモデルの導出を行った.得られた結果を次に記す.1)つくば市上空,東大阪市上空の陸域のエアロゾルに関しては,有機物溶存型エアロゾル(Water Solubleタイプ)と,都市型エアロゾルとしての煤(Sootタイプ)などが混合している.また,エアロゾル粒径半径と分布は,変化が激しい.2)大阪湾など,瀬戸内海上空では海塩粒子(Oceanicタイプ)と共に,陸域起源の有機物溶存型が混合している.3)太平洋上では,ほぼ海塩粒子に限られ,エアロゾル粒径分布変化はほとんど無かった.本研究と通じて,人的な影響だけでなく大陸と海洋の影響を受けた日本近海の大気エアロゾルの地域的な分布状況や,粒径変化が分かった.本研究では,大気エアロゾルの光学特性(化学組成,密度,大きさ等)の時空間変化からその起源や分布を調べた.エアロゾル光学特性の導出にあたり,放射強度と合わせて,偏光度を利用した.偏光度データの取得には,下記のスケジュールで多波長偏光放射計(PSR1000)を用いて検証実験を実施した.●平成8年5月平成9年2月近畿大学(東大阪市)●平成8年5月平成9年1月気象庁気象研究所(つくば市)にて気象研,金沢工大と共同観測●平成8年7月,平成9年3月神戸商船大学深江丸にて四国・九州沖にて洋上観測これらの取得データを基に,光散乱シミュレーション値と比較照合から最適なエアロゾルモデルの導出を行った.得られた結果を次に記す.1)つくば市上空,東大阪市上空の陸域のエアロゾルに関しては,有機物溶存型エアロゾル(Water Solubleタイプ)と,都市型エアロゾルとしての煤(Sootタイプ)などが混合している.また,エアロゾル粒径半径と分布は,変化が激しい.2)大阪湾など,瀬戸内海上空では海塩粒子(Oceanicタイプ)と共に,陸域起源の有機物溶存型が混合している.3)太平洋上では,ほぼ海塩粒子に限られ,エアロゾル粒径分布変化はほとんど無かった.本研究と通じて,人的な影響だけでなく大陸と海洋の影響を受けた日本近海の大気エアロゾルの地域的な分布状況や,粒径変化が分かった.
IgG4関連心疾患における冠動脈硬化性病変の進展メカニズムの解明

IgG4の冠動脈病変への関与を解明するため、心血管イベント、脂質代謝パラメータ、投薬状況と血清IgG4値の関連を検討した。経皮的冠動脈形成術前の血清IgG4値が高値の症例では、その後の経過で、再血行再建を含めた心血管イベントを高率に認めた。弁膜症や心筋症と血清IgG4値の間には明らかな関連を認めず、投薬状況と血清IgG4値の間にも関連は見られなかった。さらに、血清IgG4値は脂質代謝パラメータと関連を認めたが、冠動脈ハイリスクプラークと血清IgG4値の関連は、脂質代謝パラメータと独立していた。冠動脈硬化へのIgG4の関与の可能性が示された。これまでの研究で、申請者は、血清IgG4値の高値が冠動脈有意狭窄や冠動脈低輝度プラークと有意な関連があることを報告した(Sakamoto A. Clin Chim Acta, 2012; Sakamoto A. J Cardiol, 2016)。今回の検討では、IgG4と心血管病変の関連をより詳細に検討することを目指し、血清IgG4値が、冠動脈形成術後の心血管イベント発生や、弁膜症、脂質代謝パラメータと、どのような関連があるかについて解析を行った。はじめに、冠動脈造影検査で有意狭窄を認め経皮的冠動脈形成術を行った症例を対象に、治療前の血清IgG4値と心血管イベント発生の関連を検討したところ、治療前の血清IgG4値が高値の症例では、ステント内再狭窄を含めた心血管イベント発生を高率に認め、さらにこの関連は、古典的冠危険因子と独立していることが示された。同様の検討を冠動脈CT施行症例についても行ったところ、冠動脈造影施行症例と比べて追跡期間が短いこともあり、今回の追跡期間では統計学的有意差は見られなかったが、今後、より長期間での検討を進めていきたいと考える。続いて、血清IgG4値と、近年、症例数の増加が著しい大動脈弁狭窄の関連について検討した。その結果、血清IgG4値と大動脈弁石灰化との間には、明らかな関連を認めなかった。さらに、血清IgG4値と脂質代謝パラメータとの関連を解析したところ、血清IgG4値は、血清HDLコレステロール値、中性脂肪値、中性脂肪/HDLコレステロール比との間に有意な相関を認めた。血清IgG4値やこれらの脂質代謝パラメータの値と、冠動脈のハイリスクプラークとの間にはいずれも有意な関連が見られ、多変量解析の結果、血清IgG4値および中性脂肪/HDLコレステロール比は、いずれもハイリスクプラークに対する独立した危険因子であった。これらの結果をとおして、冠動脈硬化やその進展に、IgG4関連免疫炎症学的機序が関与する可能性が示された。IgG4関連免疫炎症学的機序と、冠動脈形成術後の心血管イベント、大動脈弁狭窄、脂質代謝パラメータとの関連について検討を行い、結果を国際学会や国内学会で発表することができた。さらに、臨床で実際に経験した、自己免疫性膵炎の既往のある、冠動脈内腔の狭窄を合併したIgG4関連冠動脈周囲炎症例の、ステロイドによる治療効果について、症例報告としてまとめることができた。現在、さらなる論文発表を目指して、論文を作成中である。これまでの研究で、申請者は、血清IgG4値が冠動脈有意狭窄や冠動脈低輝度プラークを認める症例で高値をとることを報告した(Sakamoto A. Clin Chim Acta, 2012; Sakamoto A. J Cardiol, 2016)。今回の検討では、血清IgG4値が、冠動脈形成術後の心血管イベント発生や、弁膜症、脂質代謝パラメータ、脂質代謝異常症や糖尿病に対する投薬状況とどのような関連があるか解析を行った。冠動脈造影の結果、経皮的冠動脈形成術を施行した症例を対象に、治療前の血清IgG4値と心血管イベント発生の関連を検討したところ、治療前の血清IgG4値が高値の症例では、ステント内再狭窄を含めた心血管イベント発生を高率に認め、この関連は古典的冠危険因子と独立していた。一方で、血清IgG4値と大動脈弁石灰化や先天性心疾患の間に統計学的に有意な関連は見られなかった。続いて、前年度よりも症例数を増やして血清IgG4値と脂質代謝パラメータとの関連を解析した。血清IgG4値は、血清HDLコレステロール値、中性脂肪値、LDLコレステロール/HDLコレステロール比、中性脂肪/HDLコレステロール比との間に有意な相関を認めた。血清IgG4値と血清LDLコレステロール値との間にも統計学的に有意な弱い相関が見られた。さらに、古典的冠危険因子に加え、LDLコレステロール/HDLコレステロール比、中性脂肪/HDLコレステロール比を共変量とした多変量解析では、血清IgG4値はハイリスクプラークに対する独立した危険因子であった。次に、スタチンやピオグリタゾンを内服している症例と内服していない症例では、いずれの場合も血清IgG4値に統計学的有意差を認めなかった。以上の結果から、冠動脈プラーク脆弱性および冠動脈硬化性病変の進展に、IgG4関連免疫炎症学的機序が関与する可能性が示された。

弁膜症や心筋症と血清IgG4値の間には明らかな関連を認めず、投薬状況と血清IgG4値の間にも関連は見られなかった。さらに、血清IgG4値は脂質代謝パラメータと関連を認めたが、冠動脈ハイリスクプラークと血清IgG4値の関連は、脂質代謝パラメータと独立していた。冠動脈硬化へのIgG4の関与の可能性が示された。これまでの研究結果をとおして、冠動脈造影施行症例では、血清IgG4値の高値は、経皮的冠動脈形成術後の心血管イベント発生に対する独立した予測因子である可能性が示された。さらに、血清IgG4値と、血清HDLコレステロール値、中性脂肪値、中性脂肪/HDLコレステロール比の間にも有意な相関を認め、血清IgG4値および中性脂肪/HDLコレステロール比は、冠動脈のハイリスクプラークに対する、それぞれ独立した危険因子であった。一方で、血清IgG4値と大動脈弁の石灰化との間には、今回の検討では明らかな関連を認めなかった。今後も引き続き、対象症例をさらに増やしつつ、心血管イベント発生の追跡調査を行うとともに、次年度は、脂質代謝異常症や糖尿病に対する投薬の有無と血清IgG4値との間にどのような関連があるか、検討を行うとともに、より一層、積極的な学会発表、論文発表を目指していく。医歯薬学
グレリン受容体遺伝子の転写調節機構を利用した代謝改善栄養素ないし薬剤の探索

糖尿病や肥満症においては厳密なカロリー制限や運動療法などが必要となるが、継続困難な場合が少なくない。GH secretagogue受容体(GHS-R)リガンドのグレリンが胃より同定され、GH分泌や食欲の促進効果に加え、私共は肝でインスリンの代謝シグナルに拮抗することを報告した。これらの背景から、今回GHS-R遺伝子転写活性をルシフェラーゼアッセィで測定し、種々の栄養素、薬剤、ペプチドなどの効果を探索した。なお活性と関連の深いGHS-R遺伝子上流は-608-534bpに限定され、AP2やbHLHの結合が予想される配列を認めた。この領域のDNAを蛍光ラベルしたDNAとHepG2からの抽出核タンパクとゲルシフトアッセイを行ったところ特異的結合が確認された。EPAやトログリタゾンがGHS-R遺伝子転写活性を軽度抑制し、インスリン感受性改善機序の一部にグレリン作用の減弱が考えられた。一方食欲抑制脂質のオレイルエタノールアミドは軽度にGHS-R遺伝子転写活性を促進した。またある種の減肥茶がインスリン分泌や感受性に影響して糖尿病を誘発した例を経験し、培養RIN-5F細胞に添加したところグルコースによるインスリン分泌を抑制した。この減肥茶についてもGHS-R遺伝子転写活性を検討したが明らかな影響は認めなかった。またビタミンC, E、インスリン、グレリン、レプチンなどで転写活性は有意に変化しなかった。さらにEPAがGHS-R遺伝子転写活性を抑制したので、若年ボランティアで不飽和脂肪酸の摂取量を増加させた。その結果血中アデイポネクチン値が上昇し、引き続いてHOMA-IR値の低下が認められた。代謝に関わる遺伝子の転写活性の検討は肥満、糖尿病などを予防する栄養素や薬剤の探索に有用である。GH secretagogue受容体(GHS-R)リガンドのグレリンが胃より同定され、GH分泌や食欲の促進効果に加え、我々は肝でインスリンの代謝シグナルに拮抗することを報告した。そこで今回、肝におけるGHS-R遺伝子発現調節と、栄養素の影響を検討した。既報の種々サイズのGHS-R遺伝子5'上流をpGL3-Basicに組み込み、培養細胞に一過性発現し、ルシフェラーゼ(Luc)活性をデュアル法で測定した。ラットインスリン産生細胞RIN-5Fでは活性を認めなかったが、ヒト肝細胞HepG2では-1243,-743, -669, -531, -445GHS-R/Lucは、各々pGL3-Basicの活性に対する比で4.2±0.26, 103±0.1, 89±6.9, 37.6±1.8, 16.2±0.61であった。さらに-608GHS-R/Lucを検討したところ、-669GHS-R/Lucとほぼ同様であり、GHS-R遺伝子上流-608-531bpに細胞特異的転写調節領域があると考えられた。この結果は下垂体細胞におけるGHS-R遺伝子発現調節領域よりやや近位であった。今後転写調節蛋白の検討が必要である。一方、n3系不飽和脂肪酸エイコサペンタエン酸EPAがインスリンの代謝シグナルに協調的であることを報告したが、これを培養HepG2細胞に100μM, 24時間添加した結果、-445, -608GHS-R/Lucにおいて各々非添加群の73±1.6, 76±4.8%と軽度の抑制傾向を示した。

また摂取量が内臓脂肪面積と逆相関したビタミンC, E(未発表)については、100nMビタミンC、24時間の添加は-608, -669GHS-R/Lucを各々141±19.3, 143±35.5%に増加させる傾向が見られた。以上より有意な調節因子はまだ認めていないが、この系により糖尿病、肥満症の発症予防や治療に有用な栄養素や薬剤の候補物質の探索が可能と考えられる。各種栄養素、薬剤のグレリン受容体遺伝子転写活性への影響今回は以前に転写活性を確認したグレリン受容体(GHSR)遺伝子上流(-743)をルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結させ(GHSR/Luc)、培養ヒト肝細胞HepG2に一過性に発現、ルシフェラーゼ活性に対する種々の栄養素、ホルモン、薬剤の影響を検討した。OEA(Oleylethanolamide)はカナビノイドアナログで、末梢から視床下部を介して摂食抑制効果が報告された脂質で、1-100μMのOEAは軽度ながら有意かつ用量依存的にGHSR/Luc活性を増加させた。我々は以前グレリンが肝臓で糖新生酵素遺伝子発現を高めることを報告しており(JBC277,5667-5674,2002),OEAによるGHSR遺伝子発現のUp-regulationは摂食抑制時に肝糖を供給する意義が示唆される。11種の植物成分からなる市販の減肥茶が服用者に糖尿病の誘発をみたため、GHSR/Luc活性を検討したが1100倍希釈の減肥茶の添加では明らかな影響を認めなかった。この減肥茶を培養RIN-5F細胞に添加したところグルコースによるインスリン分泌を抑制した。また肥満、糖尿病と関連の深いインスリンやレプチンはいずれもGHSR/Lucに影響を認めなかったが、PPARγリガンドのトログリタゾン0.110μMはGHSR/Luc活性の抑制傾向を認め、インスリン感受性改善機序の一部に肝臓のグレリン感受性抑制が考えられた。また下垂体細胞ではGHSRがないため、フォルボールエステルとBayK8644でグレリンシグナルを活性化することでGHSR遺伝子抑制を報告したが(BBRC55,175-181,2001)、HepG2細胞ではグレリン添加ではGHS-R/Luc活性は変化しなかったものの、1100nM GHRP-6では軽度ながら抑制された。なお前年度に示した活性と関連の深いGHSR遺伝子上流(-608-534bp)を蛍光ラベルしたDNAとHepG2からの抽出核タンパクとの特異的結合をゲルシフトアッセイで確認した。不飽和脂肪酸のインスリン感受性、血中アディポネクチン値への影響前年度に報告したようにエイコサペンタエン酸は培養HepG2細胞におけるGHSR/Luc活性を抑制した。そこで若年女性に不飽和脂肪酸(PUFA)の豊富な食品摂取を1ヶ月間にわたって増やしたところHOMA-IRは有意に低下し、血中アディポネクチン値はそれに先行して有意に上昇した。PUFAのインスリン感受性改善作用の一部に、肝でのグレリン感受性抑制に加えて脂肪細胞からのアディポネクチン分泌促進の関与が示唆され、PUFAは代謝改善栄養素の1有力候補と考えられた。