hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
寒冷刺激時の皮膚血管収縮反応における皮膚冷受容体機能の解析

本研究の目的は局所冷却時の皮膚血流調節における冷受容体機能の役割と冷え症者の皮膚血流調節の特徴を明らかにすることであった。局所冷却時の皮膚血流量の減少反応は冷受容体刺激剤メントールの局所投与によって影響されなかった。このことは冷受容体機能が局所性皮膚血管収縮に主要な役割を果たしていないことを示唆する。冷え症者の血流量調節システムの特徴として、全身および局所冷却中に下肢末梢部において皮膚血管収縮が顕著に起こること、それには高いアドレナリン感受性が関与していることが示唆された。近年、職場、公共施設、一般家庭において冷房設備が普及し、夏季であっても日中の冷えが問題になってきている。日常生活における「冷え」の愁訴は男性より女性に多く、「冷え」は体幹部よりも下肢末端部で強く感じるとされている。しかし冷え性者の寒冷暴露中の足部の温冷感や皮膚血管運動機能について検討した研究は少なく不明な点が少なくない。そこで今年度は、冷え性の女性10名(冷え性群)と冷え性ではない女性9名(非冷え性群)を対象として全身冷却時の下肢皮膚血管収縮機能と温度感覚機能について検討した。全身冷却は人工気候室において室温を29.5°Cから23.5°Cまで-0.1°C/分の速度で低下させることにより行った。実験中は、皮膚温(前額、胸、前腕、手背、大腿、下腿、足背、指先)、代謝量、深部体温、身体3か所の皮膚血流量(前腕、下腿、足背)、血圧および心電図を測定した。全身と足先の温冷感をビジュアルアナログスケールを用いて10分毎に測定した。全身冷却による皮膚温低下(入力)と皮膚血管収縮反応(出力)および皮膚温低下(入力)と温度感覚(出力)のそれぞれの入出力関係を群間で比較することにより、冷え性女性における寒冷暴露時の皮膚血管収縮および冷感覚受容の機能的特性を検討した。いずれのグループにおいても深部体温は寒冷暴露によって有意に変化しなかった。寒冷暴露中に平均皮膚温は2グループで類似して低下した。いずれのグループにおいても代謝量は寒冷環境下で増加する傾向がみられ、その増加は冷え性群の方が小さかった。皮膚温の低下に対する全身と足先の冷感覚の感受性は、冷え性群の方が非冷え性群よりも高かった。皮膚血管収縮反応の感受性は、前腕部および下腿部では両者で差がなかったが、足背部では冷え性群の方が非冷え性群よりも有意に高かった。皮膚を局所的に冷却すると、冷却部の皮膚血管は速やかに収縮する。皮膚表面麻酔薬を用いて感覚神経機能を遮断すると、薬剤投与部の皮膚血管は冷却刺激に対して一旦拡張してから緩やかに収縮することが報告されている。これは局所冷却時の皮膚血管収縮機能に感覚神経が関与ことを示唆しているが、感覚神経末端の冷受容体機能の役割は明らかでない。本年度は、皮膚寒冷刺激時の皮膚血管収縮機構におけるtransient receptor potentialチャネル(TRPM8)受容体機能の関与について明らかにすることを目的として研究を行った。健康な成人10名を対象として、下腿部の皮膚表面に冷受容体TRPM8チャネル活性刺激剤であるメントール(0.2、0.5、および1.0%)を塗布した。コントロール部にはメントールを塗布しなかった。被験者は中性温度環境下(29°C)で仰臥位安静を保ち、メントール塗布部および非塗布部の局所皮膚温を、温度コントロール用プローブを用いて35°Cから25°Cまで5分毎に2.5°Cずつ低下させた。局所温度コントロール用プローブの中心部での皮膚血流量をレーザードップラー法によって測定した。いずれの冷却部位においても、皮膚温の低下に伴って冷感覚は増大した。同一皮膚温で比較するとメントール塗布部の方がコントロール部よりも冷感覚が強かった。冷却前のベースライン血流量は、いずれの濃度のメントール塗布によっても変化しなかった。いずれの濃度のメントール塗布部においても、皮膚温の低下に伴って皮膚血流量は有意に減少し、メントール塗布部の血流減少反応はコントロール部のそれと異ならなかった。これらの結果から、直接的な皮膚冷却による皮膚血管収縮に冷受容体活動の増強は関与しないことが示唆された。これまでの研究により、冷え性の人では全身寒冷暴露中に全身性冷覚や反射性皮膚血管収縮が顕著に生じることが明らかとなった。本年度は冷え性者における局所冷却時の冷覚受容と皮膚血管収縮の機能的特性を明らかにすることを目的として以下の実験を行った。被検者は1822歳の女子学生で、冷えに関するアンケートをもとに冷え性者8名(冷え性群)、非冷え性者8名(非冷え性群)を選出した。被験者は室温を29.5°Cに設定した実験室内でTシャツと短パンのみの服装で仰臥位安静を維持した。

下腿部と足背部の局所(それぞれ約6cm2)の皮膚温を35°Cから25°Cまで2.5°Cずつ5分毎に段階的に低下させ、冷却部の皮膚血流量(レーザードップラー法)と温冷感(ビジュアルアナログスケール)を測定した。皮膚血管コンダクタンス(CVC)は皮膚血流量を血圧で割って算出し、冷却前ベースライン値からの相対値で評価した。その結果、皮膚温の低下に対する冷覚感受性は、いずれの部位においても冷え性群の方が非冷え性群よりも有意に高かった。冷却中のCVCの減少反応は、足背部では冷え性群の方が非冷え性群よりも大きかったが(p<0.05)、下腿部ではグループ間で有意な差が見られなかった。冷え性者では非冷え性者に比べて、足部局所冷却時の冷覚受容の感受性が高いことおよび局所冷却時の皮膚血管収縮反応は脚の遠位部でより顕著に生じることが明らかとなった。さらに局所冷却時の皮膚血管収縮反応の発現に皮膚冷受容体活動は主要な役割を果たしていないことが示唆された。健康・スポーツ科学所属研究機関の変更のための準備などにより年度の後半に予定していた実験ができなかったため、当初の予定よりも進度がやや遅れている。研究の遂行に必要な実験機材を購入し、当初の計画通りに研究を進めることができている。これまでの研究により、若齢女性における全身寒冷暴露時の足部の反射姓皮膚血管収縮反応は、冷え性者の方が非冷え性者より大きく現れることを明らかにした。しかしながら、1)冷え性者における足部皮膚血管収縮反応の亢進が局所冷却に対する反応においても生じるのか、2)冷え性者の下肢の冷覚感受性の亢進は冷受容体機能の違いによるのか、については明らかではない。これらの不明点について検討するために、中性温度環境(29.5°C)下で、下肢(下腿、足背)のメントール塗布部と非塗布部を局所的に冷却している時の皮膚血流量や温度感覚を冷え性者と非冷え性者との間で比較する予定である。近年、職場、公共施設、一般家庭において冷房設備が普及し、夏季であっても日中の冷えが問題になってきている。日常生活における「冷え」の愁訴は男性より女性に多く、「冷え」は体幹部よりも下肢末端部で強く感じるとされている。しかし冷え性者の寒冷暴露中の足部の温冷感や皮膚血管運動機能について検討した研究は少なく不明な点が少なくない。そこで今年度は、冷え性の女性10名(冷え性群)と冷え性ではない女性10名(非冷え性群)を対象として全身冷却および下肢の局所冷却時の下肢皮膚血管収縮機能と温度感覚機能について検討する。全身冷却は人工気候室において室温を29.5°Cから23.5°Cまで-0.1°C/分の速度で低下させることにより行う。局所冷却は下腿部および足背部のそれぞれ皮膚温を局所温度刺激装置を用いて35°Cから25°Cまで段階的に低下させることにより行う。実験中は、皮膚温(前額、胸、前腕、手背、大腿、下腿、足背、指先)、代謝量、深部体温、身体3か所の皮膚血流量(下腿、足背、足指)、血圧および心電図を測定する。全身と足先の温冷感をビジュアルアナログスケールを用いて5-10分毎に測定する。全身あるいは局所の皮膚冷却による皮膚温低下(入力)と皮膚血管収縮反応(出力)および皮膚温低下(入力)と温度感覚(出力)のそれぞれの入出力関係を群間で比較することにより、冷え性女性における皮膚冷却時の皮膚血管収縮および冷感覚受容の機能的特性を明らかにする。
歯周ポケット内生息細菌の病原性を直接モニタリング可能な診断法の開発

我々はN6-T7プライマーを用いて、経済的で効果的なリニア増幅を導く原核生物用のRNA増幅法を開発した。Affymetrix社のGeneChipマイクロアレイプロトコールに従って、全RNAから得られたcDNAを用いたRNA増幅しない試料、および、500ngまたは50ngの全RNAを1回IVT(In vitro transcription)法または2回IVT法で増幅した試料とで、得られたマイクロアレイ結果の再現性を検討した。我々のN6-T7プライマーを用いたプロトコールでは、コンスタントにマイクロアレイ実験に必要なマイクログラムオーダーのRNA増幅が可能であった。またN6-T7プライマーを用いて得られた増幅試料で得られた結果は、増幅しないで得られた結果と高い相関が得られた。IVT法によるリニアRNA増幅は真核生物に用いられるスタンダードな技術である。加えて、ランダムプライマーは原核生物の遺伝子発現解析によく用いられる。従って、本プライマーを使用する事の優位性・利便性は以下の通りである。1)プライマーの製造が容易かつ安価である。2)必要な試薬類の大部分は真核生物用IVTキット中に含まれる。3)マイクロアレイのプローブ作製法(オリゴプローブやPCRプローブ他)や標識法-一色法(ビオチン標識やCy5標識他)や二色法(Cy3とCy5)にとらわれない。4)目的に応じてsense鎖の増幅、antisense鎖の増幅、またはsense, antisense鎖の両方とも増幅可能である。5)Gene Chip標準マニュアル法の3'末端標識に比較してIVTではバックグランド蛍光強度は変化しないが、目的遺伝子の蛍光強度が強まるため、S/N比が高まることから、10wcopy数の遺伝子に対してより精度の高い解析が行なえる。近年、マイクロアレイ等における遺伝子発現レベルでの診断が盛んに行われ始めており、今までのような組織検査一辺倒による確定診断に変わりうるだけでなく、より詳細な病態を遺伝子発現レベルで推可能なものになってきた。原核生物においてはpolyA構造が存在しないことから臨床の場で得られるような微量な微生物のRNAを増幅するにoligo d[T]20プライマーは用いる事ができない。そこで5'末端側にT7,T3またはSP6等のプロモーター配列を付加したランダムプライマーを使用することで極微量のmRNAを増幅することが可能になるかを探った。まず、T7配列を付加したプライマーにより原核生物のmRNAがIn vitro transcription(IVT)法により増幅可能であるかを検証した。P.gingivalisのhtp35遺伝子のDNA塩基配列を基にRT反応の基盤となる配列を任意に選択し、その5'末端側にT7配列を付加したプライマー(Gene-specific primer with T7 promoter)を合成し,IVT増幅を行った。これを増幅していないもとの試料とリアルタイムPCR法を行ないmRNAの絶対数を推定することで検証を行なった。結果、IVT後の全RNA量には量的変化は認められなかった。また、増幅有り/無しの試料中のhtp35に対するmRNAコピー数を計算したところ、"増幅無し"が2,000,000コピーに対して"増幅有り"が91,000,000コピーとなり、増幅率は約45倍と計算された。以上の結果からT7 promoter配列をつけたプライマーは細菌においてIVT反応により十分にmRNA増幅が可能であることが判明した。原核生物のプロテオーム解析をマイクロアレイで行なう場合には通常、約10μgの全RNAが必要とされるが、臨床サンプルから得られるRNAは極微量であるためその量を確保する事は困難である。本研究は微量RNAを増幅する目的で、T7配列付加のランダムプライマー(T7-N6)を使用し、ngオーダーの微量RNAをin vitrotranscription(IVT)法にて増幅することでアレイ解析が遂行可能かを検証した。

基本的には真核生物用GeneChipマニュアルに従って、0.05および0.5μgのE.coli全RNA試料からIVT法にて1回増幅または2回増幅を行ない、E.coli Genome2.0 Array(Affymetrix社)にて解析した。またRNA増幅を施さない方法は原核生物用GeneChipマニュアルに準じて行なった。T7-N6を使用してRNAを1回IVT増幅した結果と2回IVT増幅を行なった結果との相関係数は0.87(Parametric, two-tail, p<0.01)であり、増幅をしない試料から得られる結果と1回IVT増幅した結果との相関係数は0.75、2回IVT増幅した結果との相関係数は0.69(共にParametric, two-tail, p<0.01)となり統計学的に有意に高い相関が認められた。またcDNAをbiotin末端標識するGeneChipマニュアル法に比較してIVT法によってUTP-およびCTP-biotinを取り込ませる方法で得られた試料の方が、各遺伝子のraw signal値の平均はおよそ4倍高い値が得られた。これらの結果から原核生物のプロテオーム解析にT7-N6を使用する事は非常に有用であることが確認された。N6-T7プライマーを使用したRNAの増幅方法が有効であるかを更に検証するために、大腸菌に刺激を加えた群と加えない群との比較で、各遺伝子の発現変化の程度を検討した。大腸菌をmid-log phaseまで培養した後に、一部の大腸菌にcold shock(16°C,1時間)を施し、刺激しない大腸菌群を対象とした。Total RNA回収後、IVT法にて1回増幅及び2回増幅を行う事で得られたaRNA試料または、Affymetrix社の原核生物用GeneChipマニュアルに従って得られたcDNA試料を用いて、アレイ解析を行った。1回IVT増幅と2回IVT増幅の結果から、少なくともどちらか一方の群で発現が認められる遺伝子(1893遺伝子)を対象とし、各遺伝子のcold shock(+)/cold shock(-)比を求め、その相関を調べたところ、相関係数は0.83(p<0.01)と有意に相関が認められた。また、増幅を施さないcDNA試料から得られる結果を、増幅して得られたaRNA試料で得られる結果と比較したところ、1回IVT増幅との相関係数は0.62(n=2090,p<0.01)、2回IVT増幅との相関係数は0.47(n=1.498,p<0.01)であった。これらの相関は統計学的に有意に高いものではあるが、1回、2回IVT試料での相関に比較し低い理由は、元々のシグナル強度の低い遺伝子、言い換えればmRNAコピー数の少ない遺伝子群でのばらつきが、各々のアレイ用試料調製法で生ずるバイアスの違いとして鮮明に現れたことによるものと思われた。
選択的ポリアデニレーション制御を介した新規大腸癌悪性形質獲得のメカニズムの解明

ヒト大腸癌細胞HCT116を用いて、選択的ポリアデニレーションによるがん細胞の悪性形質獲得メカニズムの解明のために上皮間葉移行モデルの構築を行った。独自に構築した上皮間葉移行モデル細胞において、Exon arrayにより3'UTRの短縮する遺伝子を同定することに成功した。また、選択的ポリアデニレーション制御関わるプロセッシング因子の発現解析では、遊走能獲得細胞において、CPSFファミリーの発現が上昇していることを見出した。遺伝子の転写後調節機構の一つである、3'非翻訳領域(以下UTR)の長さを変える選択的ポリアデニレーション機構の重要性が注目されている。幹細胞や未分化癌細胞では、3'UTR長の短いmRNAを選択的に発現し、非コードRNAやRNA結合蛋白質による発現制御を回避する性質を獲得している。選択的ポリアデニレーションを介した細胞の形質転換・発癌の研究はこれからの重要な課題である。本研究では、大腸癌悪性形質獲得のひとつである上皮間葉移行能の高い細胞集団を、transwell culture dishを用いて作製することに成功した。これらの細胞集団は、上皮間葉マーカー(VIM, ZEB1 etc)が上昇していた。また、5種のmicroRNAが、これらの細胞集団で変動することを明らかにした。今後は、これらの細胞集団を用いて、ポリアデニレーション調節因子の発現パターンの変動を評価する予定である。選択的ポリアデニレーションによる大腸癌悪性形質獲得のメカニズムを明らかにするために、上皮間葉移行モデルの構築を行った。このモデルにより得られた細胞集団は、間葉系マーカーの上昇ならびに、遊走が獲得していることを確認した。この細胞集団を用いて、上皮間葉移行に伴い変化する3'end processing factorsの発現変化を解析したところ、CPSFファミリーの発現が上昇することを確認した。CPSFファミリーは、ポリアデニレーションシグナルの認識な重要な役割を果たしており、3'UTR長の調節に必須な因子である。Exon arrayを用いた解析により、3'UTR長の変化する遺伝子を同定することに成功した。CPSFファミリーの発現パターンの変化が、癌の悪性形質獲得を促進する可能性が示された。また、3' end processingに関わるSRタンパク質ファミリーのひとつであるSRSF7に関しても解析を進めた。SRSF7は、選択的ポリアデニレーション制御に関わる因子であり、SRSF7のノックダウンにより、細胞周期の停止が生じることを明らかにした。この細胞周期の停止のひとつのメカニズムに、HuRタンパク質の発現制御を介したp21タンパク質の誘導を明らかにした。SRSF7のノックダウンによりHuR 3'UTR長は長くなっており、HuRの発現調節のひとつのメカニズムとなっている可能性が示唆された。上皮間葉移行モデルの作製に成功し、さらに、大腸癌悪性形質獲得を促進する5種のmicroRNAの同定に成功した。現在は、これらの細胞集団を用いて、当初の目的である選択的ポリアデニレーションの影響を評価するために、次世代シーケンサーを用いてた網羅的解析により、ターゲット遺伝子同定を行っており、研究は、ほぼ順調に進展している。RNAバイオロジー本研究で作製した、上皮間葉移行能の高い細胞集団から、当初の予定していた遺伝子に加え、新たなターゲット遺伝子の網羅的解析を次世代シーケンサーを用いて行う準備を行っている。次世代シーケンサーを用いた解析から得られた複数のターゲット遺伝子と、既に上皮間葉移行と関係のあるmicroRNAと相互作用を中心にして、選択的ポリアデニレーションを介した上皮間葉移行能獲得メカニズムを明らかにする予定である。
ヒト唾液腺由来腺癌細胞におけるオートクリン増殖シグナル機構

HSG細胞は46KのEGF様分子(ELM)を合成、分泌しオートクリン増殖を行うが、このオートクリン増殖のシグナル伝達系とオートクリン増殖の制御機構について検索した。初年度は、ELMを培養上清より精製しELMのレセプターを調べたところ、(1)ELMはHSG細胞膜上に存在するEGFレセプターに結合し、EGFレセプターのチロシンリン酸化を引き起こすこと、(2)HSG細胞にはEGFレセプターファミリーであるc-erbB2産物も同時発現しているが、ELMはc-erbB2産物には結合しないこと、(3)c-erbB2抗体添加はHSG細胞の増殖を著しく阻害する、すなわち、ELMの直接のレセプターはEGFレセプターであること、また同時発現するc-erbB2産物もまたオートクリン増殖シグナルに関与することが明らかになった。次年度ではEGFレセプター以降のリン酸化シグナルを検索した。その結果、EGFによる増殖シグナルは、下流に存在するMAPキナーゼを介し核内転写因子のひとつFosへと伝達されることが明らかになった。EGFなどの増殖因子はある種の核内転写因子の発現をすみやかにかつ一過性に誘導する。そこでつぎに、これらimmediate early geneのひとつであるc-fos,c-myc発現に対する効果を調べた。その結果、RGF投与後30分でc-fos mRNAが、3時間でc-myc mRNAが一過性に誘導され、ひき続いてこれらタンパクの誘導が起こった。以上の結果から、EGF様分子によるシグナルはMAPKを介したカスケードを経て核内転写因子へと伝達されること、また、Fos,Mycなどの転写因子の誘導がEGFによる増殖促進効果と共役していることなどが判明した。グルココルチコイドやレチノイン酸はHSG細胞のオートクリン増殖を制御したが、これら作用には内在性の核内レセプターを介した転写調節があることがレポータージーンのトランスフェクション実験より示唆された。また分化誘導剤であるdibutyryl cAMPもまたHSG細胞の増殖を抑制したが、これには、Aキナーゼによるシグナル伝達系を経た核内転写因子によるEGFレセプターの発現抑制が関与するものと考えられた。HSG細胞のオートクリン増殖シグナル伝達系の詳細を明らかにすべく研究を行ってきた。本年度はまず、EGF様分子による増殖シグナル伝達系の下流にc-erbB2タンパクの関与があるか否かを検討した。このためにまず、抗EGF抗体結合アフィニティーカラムを用いてEGF様分子を精製し、続いてこのEGF様分子をHSG細胞培養系へ加え、以下の実験を行った。1.細胞数ならびに[^3H]チミジンの取り込みを測定したところ、両者共に加えたEGF様分子の用量依存的に増加しHSG細胞の増殖促進効果が認められた。2.EGF様分子による増殖促進効果発現過程へのc-erbB2タンパクの関与を、抗体による増殖阻害実験により検討した。抗EGF,抗EGFレセプター,抗c-erbB2抗体を培養系に加えると、それぞれ単独で増殖阻害を誘導するとともに、EGF様分子により誘導される増殖促進効果に対しても強い阻害効果を示した。なかでも抗c-erbB2抗体による阻害効果がもっとも強く、c-erbB2タンパクのオートクリン増殖への関与が明らかとなった。

3.EGF様分子をHSG細胞培養系に加えると、約170Kならびに340Kタンパクがチロシン特異的にリン酸化を受けた。このうち170Kの分子はEGFレセプターであることが明らかとなつた。しかし、340Kの分子に関しては不明であり、EGFレセプターやc-erbB2タンパクを含む二量体である可能性も考えられた。そこで、EGF様分子を添加後、細胞可溶化物を抗EGFレセプターあるいは抗c-erbB2抗体で免疫沈降させ、チロシンリン酸化抗体を用いてウェスタンブロットにより検出したところ340K分子は認められなかった。この結果から、340KタンパクにはEGFレセプターおよびc-erbB2タンパクが含まれないことが明らかとなった。340K分子の同定に関しては今後の課題と考える。以上、本年度の実験結果からEGFレセプターは、EGF様分子、すなわち、高分子量EGFの直接のレセプターとして機能しており、その伝達系の下流にc-erbB2タンパクが存在することが明らかとなった。これらの結果は高分子量EGFの作用機構解明へむけてのひとつの手がかりとなるものと考えられる。なお、シグナル伝達系におけるc-erbB2の作用点を含めたリン酸化カスケードに関しては以後検討する予定である。本年度は昨年度にひき続き、EGF様分子によるシグナル伝達について詮索した。これまでにEGF様分子はEGFレセプターに結合しリン酸化カスケードを駆動させることが明かとなったので、まずはじめに、EGFレセプター以降のリン酸化シグナル伝達について検討した。一般に、EGFシグナル伝達系の下流にはMitogenactivated proteinkinase (MAPK)カスケードが存在することが明かとなってきている。そこで、外来性のEGFに対し増殖応答性の高いHSGサブクローンのひとつHSGAZA3細胞を用いてEGF刺激がMAPKへ及ぼす影響を調べた。EGF処理後経時的にMAPKをイムノブロット法により調べたところ、処理後5-15分でMAPKのリン酸化が顕著に誘導され、その後3時間まで維持された。つぎに、増殖シグナルが核内転写制御因子であるFosやMycのリン酸化やこれらタンパクの発現誘導に及ぼす影響について検索した。抗Fos抗体を用いたイムノブロット法により、EGF処理後1-3時間でFosタンパクのバンドの強度が顕著に増加するとともに、リン酸化されたFosのバンドが新たに出現した。RT-PCR法を用いmRNAレベルでc-fosならびにc-mycmRNAの発現を調べたところ、EGF処理後c-fos mRNAでは30分、c-myc mRNAでは2時間で有意にかつ一過的に上昇した。これらの結果から、EGFのリン酸化シグナルはMAPKを介し核内Fosへと伝達されること、またFosやMycの発現誘導がEGFによる増殖促進に先だって起こることが明らかとなった。つぎに、オートクリン増殖を制御するレチノイン酸が、HSG核内に存在するレセプターを介し転写レベルで作用しているかを調べるために、HSG細胞にレチノイン酸応答配列を有するルシフェラーゼレポータージーンを導入し、転写活性化能を検討した。
構造生物学によるミトコンドリア翻訳装置の構築原理の解明

本研究の目標は、現存する生物のうちでもっとも単純と思われる、動物ミトコンドリアの特異な翻訳システムにおける個々の装置の機能特性と構造的な異常性に焦点を当て、それらの機能構造の詳細な解析と実行可能なものからその立体構造を解明し、機能発現に必要な構造を探ることをにより、ミトコンドリア翻訳システムの構築原理を解明することである。主たる研究成果は以下の通りである。(1)ウシ・ミトコンドリアのin vitro翻訳システムを構築し、系の最適化を計った結果、ポリ(U)依存ポリ(Phe)合成で大腸菌のものと比肩し得る活性を示す系を確立した。(2)tRNAと翻訳因子をセットにする限り、またL7/L12蛋白質のみ大腸菌由来のものを使う限り、大腸菌とミトコンドリア・リボソームに互換性があるので、本質的にリボソーム機能は両者で等価である。(3)異常な2次構造をもつ2種類のセリンtRNAが低いながらも翻訳機能をもつことを実証した。特に片腕を欠くtRNAの効率の低さはA部位への結合に欠陥のあるためであった。(4)これら2種類のセリンtRNAは単一のセリルtRNAシンテターゼ(SeRRS)でアミノアシル化されることを明らかにし、その認識部位を特定した。(5)線虫ミトコンドリアに存在する大部分のTアーム欠損tRNAを認識する特殊なEF-Tuを発見した。それはC末端に57アミノ酸の延長部をもち、それが欠けたTアーム部分を補完していた。また2種類のDアーム欠損セリンtRNAに対応する別のEF-Tuはアミノ酸部分をも認識していた。(6)これらの翻訳因子の結晶化を行い、SerRSでは針状結晶を得た。tRNA-EF-Tu複合体の結晶化とともに、これらのX線解析を行う。本研究では動物ミトコンドリアの特異な翻訳システムの個々の装置の機能特性と構造上の異常性に焦点を当て、それらの機能構造の詳細な解析と実行可能なものからその立体構造を解明し、機能発現に必要な構造を探ることにより、現存する生物のなかでRNAから見て最も単純と思われるミトコンドリア翻訳システムの構築原理を解明することを目的とする。本年度の成果は以下の通りである。1.異常構造を持つtRNA^<Ser>GCUとEF-Tu複合体のX線結晶解析--現在高度好熱菌Thermus thermophilusEF-Tuの大腸菌内の大量発現系により、数十mgオーダーでEF-Tuを取得し、ゲルretardation法を用いて種々のミトコンドリアtRNAとの複合体形成の条件検討を行っており、有望なものから結晶作製に入っている。2.ミトコンドリアのトランスホルミラーゼ(MTF)のX線結晶解析--フランスEcole PolytechniqueのBlanquet博士との共同研究により、当研究室の元大学院生がポスドクとして滞在し、大量調整した酵素の結晶化とそのX線結晶解析を試行中である。3.ウシミトコンドリア・リボソームの機能構造解析--牛ミトコンドリアの55Sリボソームから2次元ゲル電気泳動により約40個の蛋白質を分離し、液体クロマトグラフ/質量分析法(LC/MS)によって解析し、大腸菌のタンパク質とホモロジーを比較して多くのタンパク質の同定に成功した。その結果タンパク質結合部位が保存されているRNAに対応するリボソームタンパク質(L2など)の大きさは大腸菌とミトコンドリアでほぼ変わらないのに対し、タンパク質との結合部位が短縮、あるいは欠落しているRNAに対応するタンパク質(L1,L3,L9,L27など)は大きくなっているという傾向を確認した。4.SerRS---ウシ・ミトコンドリウ・セリルtRNA

合成酵素(SerRS)の大量発現系の構築に成功し、現在その単結晶の作製、及び異常構造を持つ2種類のミトコンドリアtRNA^<Ser>との複合体形成の条件検討を行っている。本研究では、動物ミトコンドリアの特異な翻訳システムの個々の装置の機能特性と構造上の異常性に焦点を当て、それらの機能構造の詳細な解析と実行可能なものからその立体構造を解明し、機能発現に必要な構造を探ることにより、現存する生物の中でRNAから見てもっとも単純と思われるミトコンドリア翻訳システムの構築原理を解明することを目的とする。本年度の成果は以下の通りである。1.異常構造をもつtRNA^<Ser>GCUとEF-Tu複合体のX線結晶解析-本年度の研究により初めてDアームを欠くtRNA^<Ser>GCUの翻訳活性を実験的に検証し得た。ゲルretardation法により、Thermus aquaticus EF-Tuとアミノ酸受容ステムを強化したウシ・ミトコンドリアtRNA^<Ser>GCUが非水解GTPアナログ存在下に安定な複合体を形成することが判明し、ゲルろ過により複合体のみを単離する条件を見出した。現在その針状結晶が得られており、X線解析に耐え得る結晶への成長条件を探索中である。2.ウシ・ミトコンドリア・SerRS-大腸菌内で大量発現させたウシ・ミトコンドリアのセリル-tRNAシンテターゼ(SerRS)と異常構造をもつ2種類のセリンtRNA (tRNA^<Ser>GCUとtRNA^<Ser>UGA)との複合体形成の条件検討を行なっている。3.ウシ・ミトコンドリア・トランスフォルミラーゼ(MTF)-前年度に引き続き、MTF単独と、tRNA^<Met>との複合体の結晶化を試みている。MTFの結晶は生成しているが、X線解析可能な結晶はまだ得られていない。4.ウシ・ミトコンドリア・リボソームの機能構造解析-ウシ・ミトコンドリアの55Sリボソームから、2次元ゲル電気泳動と液体クロマトグラフ/質量分析法(LC/MS)を組み合わせることにより、現在50種類以上のリボソーム蛋白質を分離・同定した。大腸菌の蛋白質のホモログ以外にウシ・ミトコンドリア・リボソームに特異的な数種類の蛋白質が見出された。今後これらのRNAとの再構成を行ない、大腸菌リボソームとの比較してその機能の等価性を検討する。本基盤研究(A)の目標は、現存する生物のうちで最も単純と思われる、動物ミトコンドリアの特異な翻訳システムにおける個々の装置の機能特性と構造的な異常性に焦点を当て、それらの機能構造の詳細な解析と実行可能なものからその立体構造を解明し、機能発現に必要な構造を探ることにより、ミトコンドリア翻訳システムの構築原理を解明することである。本研究実施期間の3年間における主たる成果は以下の通りである。(1)ミトコンドリアのin vitro翻訳システムの確立:ウシ.ミトコンドリアでin vitro翻訳システムを構築し、系の最適化を計った結果、ポリ(U)依存ポリ(Phe)合成で大腸菌のものと比肩し得る活性を示す系を構築することができた。
口腔類上皮癌KB細胞の産生する新しいTIMPの構造解析

ヒト口腔類上皮癌KB細胞培養液中に産生されるコラゲナーゼ阻害活性のうちTIMP-1を抗TIMP-1免疫吸着カラムで除去後、さらに残存するコラゲナーゼ阻害活性をSDS-PAGEで単一蛋白バンドとなるまで精製した。精製標品はコラゲナーゼの他ゼラチナーゼ、ストロムライシンをも阻害することからTIMPファミリーに属する蛋白と考えられた。(以下KB-TIMPと略す)。SDS-PAGE後PVDF膜へのウエスタンブロットを行ない、蛋白バンドを切り出しアミノ酸配列解析を行なったところ、TIMP-2のそれと一致した。しかし、その分子量はTIMP-2より約数kDa小さく、またTIMP-2は糖鎖を持たない事実からKB-TIMPはTIMP-2の低分子化したものと考えられた。TIMP-2はその性質としてプロゼラチナーゼAと複合体を形成し、その結合にはC末端から9個のペプチドが必須である。KB-TIMPをプロゼラチナーゼAと混ぜ、複合体形成をゼラチン-セファロースカラムで分析したところ、TIMP-2と異なり複合体を形成しなかった。またKB-TIMPおよびTIMP-2をトリプシン、V8プロテアーゼで分解し、その断片を比較検討したが、明かな違いを認めなかった。またTIMP-2のC末端から19個のペプチドに対し作成したポリクロナール抗体と反応した。これらの結果は、KB-TIMPはTIMP-2のC末端から多くとも9つのアミノ酸ペプチドがタンパク分解あるいは遺伝子欠損により消失したものである可能性を示唆している。
アポトーシス関連遺伝子の相乗的発現亢進に関与する蛋白質の研究

1.EGCGとレチノイド併用に関する研究緑茶を飲用する日本人にもレチノイドは投与されているから、EGCGとの併用は相乗効果を誘導するか検討した。GADD153遺伝子発現の亢進EGCGはレチノイドとの併用により相乗効果を誘導した。2.EGCGと肺がん治療薬gefitinib(イレッサ)との併用に関する研究イレッサの治療効果を日本人と西欧人について比較すると、日本人の治療効果は西欧人の3倍良好であるとアメリカNCIの研究者が発表した。緑茶カテキンは、イレッサと同様EGFRのチロシンリン酸化を阻害するので、良好な治療効果は日本人が飲用する緑茶カテキンの相乗効果であると考え、検討した。(1)肺がん細胞増殖抑制:ヒト肺がん細胞株PC-9、A431とA549細胞のいずれでも、EGCG+イレッサの併用は細胞の増殖を強く抑制した。(2)EGFRとチロシンリン酸化阻害:EGCG+イレッサ併用は両単独群より強く阻害した。(3)アポトーシスの誘導: EGCG+イレッサ併用は両単独群より強くアポトーシスの誘導を促進した。以上の結果から、緑茶の飲料がイレッサによる日本人のがん治療効果を増強している可能性が示唆された。しかも、緑茶飲料によりイレッサ投与量の減量が示唆された。3.アルキルガレートの発見EGCGとsulindac、celecoxib、ATRA、9-cis-RA、の併用は著しくGADD153遺伝子発現を誘導した。GADD153はアポトーシス関連遺伝子であるから、特異的なアポトーシスの誘導は"新たながん治療機構"になると考えられる。ここで、GADD153遺伝子発現を特異的に誘導する化合物を検索した。既に記したように、EGCG+sulindacはGADD153の遺伝子発現を11.61倍誘導したが、アルキルガレートは単独で13倍強く発現を亢進し、WAF1の発現も24倍強く誘導した。この結果からアルキルガレートは新しいがん治療薬の可能性が示された。今後、アルキルガレートを新しい抗がん剤とする研究が始まる。ヒト肺がん細胞PC-9を、緑茶の主成分である(-)-epigallocatechingallate(EGCG)とがん予防薬sulindacとを同時に処理すると、アポトーシス関連遺伝子の発現が相乗的に亢進することを見出した。この際、がん細胞の増殖抑制とアポトーシスに関連したGADD153遺伝子の発現亢進が認められた。本年度は先ず、EGCGとsulindac、EGCGと非活性型のsulindac sulfoneで相乗効果を確認し、更に、EGCGと抗がん剤5-FUの併用について検討した。1.PC-9細胞増殖の相乗的抑制(1)EGCGとsulindac同時処理による増殖抑制EGCGは51.5%、sulindacは5.5%の抑制を示した時、EGCGとsulindacの同時処理は、81.1%と減少した。肺細胞A549について同様の実験を行うと、同時処理による減少は小さく、がん細胞によって少々異なることが見出された。

(2)EGCGと非活性型sulindac sulfone同時処理による増殖抑制EGCGは61.8%、sulindac sulfoneは9.9%の抑制を示した時、同時処理は99.4%と減少し、非活性型でも著明な抑制が認められた。(3)EGCGと5-FU同時処理による増殖抑制PC-9、A549、H226Bのヒト肺がん細胞3株について検討したが、相乗効果ではなく、相加的増殖抑制が得られた。2.GADD153遺伝子の相乗的発現亢進(1)EGCGとsulindacの同時処理18時間後に最大の発現亢進が認められた。EGCGと5-FUの同時処理12時間後に最大発現亢進が認められた。以上、本年度は相乗効果の確認を行い、更にEGCGと抗がん剤との併用に研究を進めた。EGCGとNSAIDであるsulindacの同時処理は、2つの遺伝子発現の亢進と4つの遺伝子発現の減少をヒト肺がん細胞PC-9で誘導した。この結果を基に、EGCGやsulindacの同時処理をPC-9とA549細胞に処理し、その共通性を見出した。1.EGCGとsulindacによる相乗的細胞増殖抑制75μM EGCG単独、25μM sulindac単独、EGCG+sulindac併用で処理し、48時間後細胞生存率を測定した。A549細胞83.6% 76.8% 45.20%2.相乗的アポトーシスの誘導200μMEGCG単独、10μM Sulindac単独、EGCG+sulindacの併用で、併用群にのみ多くの核の凝縮が観察された。3.相乗的GADD153の発現200μM EGCG、10μM Sulindac、EGCG+sulindac併用で、PC-9細胞にGADD153蛋白質をウエスタンブロットで証明した。蛋白質の発現のタイムコースは処理18時間後から認められ、48時間後に強く認められた。4.EGCGと不活性型Sulindac salfoneによる相乗効果EGCG+sulindac salfoneはPC-9細胞に於いて細胞生存率とGADD153遺伝子発現を相乗的に誘導し、NSAIDと別の活性によることが示唆された。以上、本年度は相乗効果をタンパクのレベルで証明し、新しい誘導機構が推測できた。1.EGCGとレチノイド併用に関する研究緑茶を飲用する日本人にもレチノイドは投与されているから、EGCGとの併用は相乗効果を誘導するか検討した。GADD153遺伝子発現の亢進EGCGはレチノイドとの併用により相乗効果を誘導した。2.EGCGと肺がん治療薬gefitinib(イレッサ)との併用に関する研究イレッサの治療効果を日本人と西欧人について比較すると、日本人の治療効果は西欧人の3倍良好であるとアメリカNCIの研究者が発表した。緑茶カテキンは、イレッサと同様EGFRのチロシンリン酸化を阻害するので、良好な治療効果は日本人が飲用する緑茶カテキンの相乗効果であると考え、検討した。(1)肺がん細胞増殖抑制:ヒト肺がん細胞株PC-9、A431とA549細胞のいずれでも、EGCG+イレッサの併用は細胞の増殖を強く抑制した。(2)EGFRとチロシンリン酸化阻害:EGCG+イレッサ併用は両単独群より強く阻害した。(3)アポトーシスの誘導:EGCG+イレッサ併用は両単独群より強くアポトーシスの誘導を促進した。
陽電子プラズマの特性と制御に関する実験

陽電子プラズマを形成してその特性を研究することが本研究の目的である.このためには,大量の陽電子を安定に非中性プラズマとして蓄積・閉じ込める方法関する研究がまづ必要であった.本3カ年計画で最終的に陽電子プラズマを形成するに至った.以下,主な成果を纏める.1.電子線形加速器(LINAC)を用いて大量の低速陽電子を発生する実験を行い,対創生でできた非熱化陽電子と熱化陽電子をともに取り出す方法を開発して,時間平均発生率6x10^<10>[e+/s]を実現した.この発生率は世界的にみても最高値に位置する.2.LINACで発生した陽電子を固体Ar薄膜の再減速器で数eVに低エネルギー化して,それを電磁場トラップに蓄積して陽電子プラズマを形成することが出来た.得られた粒子総数は10^6を上回り,十分プラズマ状態である.このプラズマのトラップ内での位置制御・排出制御等も可能になった.3.得られる陽電子プラズマの物性を調べる上で,安定な閉じ込めが必須である.非中性プラズマの自己電荷効果を考慮した閉領域に,安定な剛体回転平衡状態でプラズマを閉じ込める原理的考察とその実証をした.この多リング電極配列を利用する方法を用いて,多様な低温プラズマの固有振動モードの実験研究を行った.非線形効果によるモード間変換過程等を観測している.4.超伝導マグネット(<8T)を用いた低温陽電子プラズマの形成にも成功した.(1)閉じ込め時間は最長4000秒を記録した.(2)サイクロトロン放射冷却過程を電子プラズマについて観測した.(3)(1),(2)の結果を用いて,微量線源(^<22>Na, 3.7MBq)からのエネルギーの高い陽電子を,低温電子を陽電子の減速体として低エネルギーにして,長時間(>1000s)の蓄積を行った.その結果,室温の陽電子プラズマを形成することに成功した.陽電子プラズマを形成してその特性を研究することが本研究の目的である.このためには,大量の陽電子を安定に非中性プラズマとして蓄積・閉じ込める方法関する研究がまづ必要であった.本3カ年計画で最終的に陽電子プラズマを形成するに至った.以下,主な成果を纏める.1.電子線形加速器(LINAC)を用いて大量の低速陽電子を発生する実験を行い,対創生でできた非熱化陽電子と熱化陽電子をともに取り出す方法を開発して,時間平均発生率6x10^<10>[e+/s]を実現した.この発生率は世界的にみても最高値に位置する.2.LINACで発生した陽電子を固体Ar薄膜の再減速器で数eVに低エネルギー化して,それを電磁場トラップに蓄積して陽電子プラズマを形成することが出来た.得られた粒子総数は10^6を上回り,十分プラズマ状態である.このプラズマのトラップ内での位置制御・排出制御等も可能になった.3.得られる陽電子プラズマの物性を調べる上で,安定な閉じ込めが必須である.非中性プラズマの自己電荷効果を考慮した閉領域に,安定な剛体回転平衡状態でプラズマを閉じ込める原理的考察とその実証をした.この多リング電極配列を利用する方法を用いて,多様な低温プラズマの固有振動モードの実験研究を行った.非線形効果によるモード間変換過程等を観測している.4.超伝導マグネット(<8T)を用いた低温陽電子プラズマの形成にも成功した.(1)閉じ込め時間は最長4000秒を記録した.(2)サイクロトロン放射冷却過程を電子プラズマについて観測した.(3)(1),(2)の結果を用いて,微量線源(^<22>Na, 3.7MBq)からのエネルギーの高い陽電子を,低温電子を陽電子の減速体として低エネルギーにして,長時間(>1000s)の蓄積を行った.その結果,室温の陽電子プラズマを形成することに成功した.非中性陽電子プラズマの特性研究は、電子・陽電子混合の中性プラズマを調べるために必要な基本的な過程の一つである。また、陽電子プラズマは純粋の反物質プラズマでもある。実験的に、陽電子プラズマを調べるためには、まず、長時間閉じ込めることが必要である。陽電子の消滅を防ぐには、十分に温度の低いプラズマでなければならない。且つ、拡散による散逸を防ぐために、中性ガス分子が少ない高真空が要求される。また、閉じ込めた陽電子プラズマの不安定性が生じにくい外部電磁場配位が必要である。本年度では、上記の要請を満たす方法について、以下のような成果を得た。(i)低温の陽電子を得るために、LINACを用いて発生した1-3KeV帯の陽電子ビームを減速する方法を実験的に試行した。約10kに冷やした金表面にXe,N2薄膜氷をつくり、後方散乱で減速する方法で、7eV以下のエネルギーに冷やすことが出来た。この方法は、大表面積の減速器として作動させることができる。減速効率は5%程度である。(ii)LINACで発生する陽電子ビームはパルス的であるので、多パルスを蓄積するには特別の工夫がいる。閉じ込めとして軸対称の磁場と軸方向の静電ポテンシャル井戸を用いているが、進行波ポテンシャルによる押し込み・蓄積の方法を試みた。電子での予備テストでは、閉じ込め時間で決まるパルス数まで閉じ込め粒子数が増加する。陽電子では、消滅によって、高々1.7倍であった。この改善が必要である。

(iii)陽電子プラズマの安定な閉じ込めは、剛体回転状態の平衡が成立していなければならない。外部静電場配位に剛体回転を実現する双曲面ポテンシャルを用いたとき、実際の粒子閉じ込め時間が長くなることを、電子プラズマを用いて確認した。また、この配位のときには、従来より言われていた配位軸長増大による閉じ込め時間の短縮が生じないことも観測している。この配位を、来年度陽電子プラズマに適用する予定である。非中性陽電子プラズマの特性研究は、電子・陽電子混合の中性プラズマを調べるために必要な基本的な過程の一つである。また、陽電子プラズマは純粋の反物質プラズマでもある。実験的に、陽電子プラズマを調べるためには、まず、大量の低エネルギー陽電子を発生し、かつ長時間閉じ込めて、十分に温度の低いプラズマをつくる必要がある。また、閉じ込めた陽電子プラズマの不安定性が生じにくい外部電磁場配位が必要である。本年度では、上記の要請を満たす方法について、以下のような成果を得た。(i)陽電子を得るために、LINACを用いて1-4KeV帯の熱化・非熱化陽電子ビーム発生する方法の最適条件化を探り、発生率3X10^<13>/Sを達成した。(ii)約8Kに冷やした金表面にAr薄膜氷をつくり、後方散乱で減速する方法で、7eV以下のエネルギーに減速し、その発生率は3X10^<11>/Sを得た。(iii)LINACで発生する陽電子ビームはパルス的であるので、多パルスを蓄積するには特別の工夫がいる。軸方向一様磁場と軸方向に傾斜する静電ポテンシャル井戸を用いて、井戸の底領域に蓄積していく方式をとって、低速陽電子を閉じ込めた。得られた陽電子の総数は1.8×10^6、閉じ込め時間は0.18sである。デバイ長はプラズマ軸長とほぼ同じである。完全にプラズマ条件を満たすためには、さらに閉じ込め時間を延長する必要がある。(iv)陽電子プラズマの安定な閉じ込めは、剛体回転状態の平衡が成立していなければならない。閉境界内に剛体回転平衡を実現するポテンシャル配位を実現する多電極静電場発生方法を考案し、その有効性を電子プラズマの振動励起の方法を用いて確認した。この方法を、来年度陽電子プラズマに適用する予定である。非中性陽電子プラズマの特性の研究は反物質の集団挙動を調べることできる数少ない手段である。実験的に陽電子プラズマを作るためには,大量の低エネルギー陽電子を限られた空間内に閉じ込めるが必要とする.本研究では,低速陽電子の線形加速器を使った大量発生,その再減速,長時間閉じ込め,集団挙動の励起・観測が実験の主課題となる.これらに関して以下の成果を得た.1.低速陽電子を,LINACと開発した「光子・陽電子変換器」を組み合わせ,時間平均発生率を1.5X10^<10>[e^+/s]に上げることができた.2.再減速器に後方散乱型Ar固体薄膜を用いて7eV以下に冷却したあとと磁場と静電場で捕捉する方法で,数eVの陽電子を6X10^7[e^+/s]の時間平均率で発生して閉じ込めることを可能にした.3.この方法で蓄積した低温陽電子群はプラズマの要件を満たし,陽電子プラズマを形成することができたと言える.4.高密度陽電子を安定な剛体回転平衡状態に閉じ込めるために,多電極型静電場トラップを開発して,その特性を検証した.
酸化ニッケル表面のプロトン伝導性の発現とそのエレクトロクロミック素子への応用

欠陥構造を積極的に導入してイオン伝導性を発現させた酸化物薄膜のデバイスへの新しい応用を検討した。当初目指していたナノ構造を持つNiO薄膜では残念ながら期待したイオン伝導は認められなかったのだが,水素導入スパッタリング法で形成した水素含有Ta2O5薄膜は,ドライプロセスのみで積層するエレクトロクロミックセル中でプロトン伝導に基づく電解質として機能する可能性が示された。また,TiO2-δ中で電界によって酸素空孔が輸送される性質を利用して,TiO2-δ/CoFeB強磁性体薄膜の積層構造の磁気異方性が電圧印加によって不揮発的な変化を示すことを発見し,イオン伝導駆動型の新しい磁性デバイスの可能性を実証した。今年度は当初の計画に従い,まず同時スパッタリング成膜が可能な装置の準備(次年度より使用開始予定)と並行して,NiOおよびWO_3の2つの酸化物薄膜の成膜条件による膜質制御の検討を行った。反応性スパッタリング時のAr/O_2比およびチャンバー圧力,基板加熱温度を変えつつ,NiOとWO_3の結晶性,光吸収特性および抵抗率の評価を行った。NiOは,高O_2分圧下では結晶化が生じにくくなると同時にNi空孔濃度の増大に起因すると思われる導電性が急増した。一方,低O_2分圧下で基板加熱をして成長させた結晶性薄膜では,初期抵抗は大きくなるものの,いわゆる抵抗スイッチングを示す領域となった。本研究では動作中の抵抗変化は好ましくないため,低O_2分圧下のまま,基板加熱温度を低下させた成長を行ったところ,低結晶性の高抵抗膜が安定して得られる領域を見出した。これらによりNiOの物性の理解に基づきながら抵抗率を制御して作り分ける指針が得られたと考えている。また,WO_3については,まだ定量的な検討が十分に行えていないものの,O_2分圧と共に抵抗率は単調に増大することを確認している。一方,光吸収については分光エリプソメトリーを用いた評価により,膜厚30nmのNiO薄膜のバンドギャップは成膜条件や成膜後の熱処理によってもほとんど変化しないこと,またバンドギャップ以下のエネルギー領域に強い光吸収が現れることからギャップ内準位の存在が示唆されるとともに,この領域の光吸収が成膜後の熱処理によって変化することが観察された。まだこれらの変化と欠陥準位との相関は解明に至っていないが,NiOの光透過性に関する重要な情報が得られつつあり,次年度にさらに詳細な検討を行ってデバイス作製へ結び付ける予定である。Ta_2O_5は,水を取り込んで水酸化すると低温でも局所的にプロトン伝導性を示すことが知られている酸化物である。母体が電子絶縁性に優れた酸化物であるため,欠陥構造の制御によって全酸化物型のECセルの電解質として期待できる。しかしエレクトロクロミック(EC)セルの各層を気相法で成膜するには,ドライプロセスのみで効率よくプロトンをTa_2O_5中へ導入する方法が不可欠である。そこでTa_2O_5のRFスパッタリングをアルゴン/水素混合ガスを用いて行うことによる,Ta_2O_5内部への高濃度水素の導入可能性,及びそのプロトン伝導性について検討した。水素/アルゴン比を0%5%で変えてTa_2O_5の成膜を行ったところ,FT-IRからは2500Cm^<-1>3500Cm^<-1>の範囲でブロードな吸収ピークがみられ,-OH基が導入されていることがわかった。また,このピークは水素/アルゴン比と強い相関を示し,RFプラズマ中で活性化した水素が膜へ取り込まれたことが示唆された。成膜後に熱処理を加えたところ,400°C以上ではFT-IRのピークはほぼ消滅したが,200°Cでは-OHを膜中に残すことが可能であった。加熱雰囲気中に酸素または水素を加えてその影響をみたところ,特に水素ではFT-IRのピークがむしろ増大したことから膜中の欠陥構造中にさらに水素が取り込まれたことが示唆された。このように成膜と熱処理によって水素を導入した膜を,WO_3と積層してハーフセルとし,ITO電極で挟んでから電圧を印加したところ,数%の透過率の変化が観察された。即ち,作成したTa_2O_5膜はプロトン伝導性を僅かながら示していると考えられる。一方,インピーダンス解析の結果,熱処理を行わない場合よりも電子伝導は抑制できたが,まだプロトン伝導よりも電子伝導が優勢であることが示され,さらに電子伝導を抑制することが次年度の課題として残された。前年度までに,水素添加したイオン伝導性Ta2O5薄膜の電解質応用について検討してきたが,今年度はアプローチを変え,このようなイオン伝導性酸化物を強磁性体薄膜スタックの中に組み込み,新しい機能を持つ磁性デバイスを開発することを試みた。

ここで注目したのは,強磁性体金属は,酸化物との界面で強磁性金属元素と酸素の結合に由来して,界面に垂直な磁化が誘起されるという界面磁気異方性である。本研究では,酸化物中の酸素イオン伝導を利用し,電界によって酸素空孔を界面近傍に蓄積,または界面から空乏させる操作を可逆的に行って,強磁性体-酸素間で生じる磁気異方性エネルギーを増減させるという新しい動作の実証を目指した。つまり外部電界のみで強磁性体の磁気異方性を変調できるという新しいスピントロニクスデバイスの可能性である。既往の強磁性体CoFeB薄膜を用いた垂直磁化形成には殆どの場合,トンネル磁気抵抗効果の期待できるMgOが用いられてきたのだが,本研究ではまずAl2O3,Y2O3やZrO2等の種々の酸化物の適用可能性を検証した。その結果,界面磁気異方性の観点ではMgOと同等の効果が観測されることを見出し,且つ,外部電界による異方性の僅かな変化の観察に成功したが,これは揮発的な動作のみであった。そこで次に,Tiを低酸素分圧雰囲気化で酸化してつくるTiOx層とCoFeBを連続成膜した素子に数MV/cmの電界を加えたところ,電界による磁気異方性の変化は,電界を開放した後も不揮発的にその状態を保持していることを見出した。これは,酸素イオン伝導性の酸化物とCoFeBの界面近傍における酸素空孔濃度が電界によって変調され,しかもその効果がメモリー動作をしているものと解釈でき,これは磁気イオニクスデバイスという,新しいイオン伝導性酸化物の応用の可能性が期待できる結果である。・当初に計画したナノ構造が狙い通りに機能するには至らず,手法を再検討したこと・今年度から実施予定であったECセル作成については,まだ着手したばかりであること24年度が最終年度であるため、記入しない。申請時に計画していた研究項目のうち,イオン伝導性を発揮しながら電子伝導を抑制した構造の作成での困難が多くある。当初想定していたナノ構造ではイオン伝導性を与えることはできても,電子伝導の抑制は本質的に困難であると判断した。これは導入される欠陥構造が電子伝導を直接的に増大させてしまうためである。一方,昨年度に見出されたように,可動イオンを高密度に挿入して形成された酸化物アモルファス構造の材料設計が有望な手法となる可能性がある。今後,この形成法を主軸として,実際のECセル作成を行って当初課題の目的達成を目指す。24年度が最終年度であるため、記入しない。