hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デジタル街路網モデルに基づく詳細な水害対応シミュレーション

研究代表者らが従来研究を進めてきた水害時の住民の避難行動を個人・世帯といったミクロな単位でシミュレーションするシステムの汎用性・応用性を高めるため、一般に入手可能な数値地図情報を用いてコンピュータ上に街路ネットワークを再現するモデルを開発するとともに、避難行動が氾濫水深だけでなく、経路上の障害物や混雑状況に影響を受ける過程をモデル化した。この結果、我が国の任意の地域で比較的簡便に水害避難シミュレーションができるようになり、地域の避難計画の立案等に利用することができるようになった。本年度は、研究計画の初年度として、年度前半は今後3ヵ年で開発するシステムの仕様について検討を進め、後半には、検討した仕様を元にデジタル避難行動場モデルの具体的開発に着手した。具体的には、まず、避難行動場表現のための空間データ・マニピュレーション・ツールを構成する主要要素の開発を行った。シミュレーションシステムの汎用性を高めるため、避難行動場モデルの構築に使用するデータは基本的に市販されているものを使用することにし、道路網や街区等の地物を最も詳細にデータ化している空間データ基盤2500のデータを中心にしてターゲットとなる領域に必要な街路や地物データを切り出すとともに、浸水深など座標系の異なるデータと重ね合わせる機能を持つソフトウエアを開発した。次いで、上記で切り出した対象場のデータをもとに、コンピュータ上に街路ネットワーク、避難場所、氾濫水の状況を一体的に再現するデジタル避難行動場モデルの設計に着手した。ここで重要なことは、次年度に検討する避難行動エージェントモデルが、街路の接続状況や冠水状況を高速に取り出し、自らの経路選択等に反映させることができるようにすることである。そこで、街路の接続状況を高速に把握することを可能にするため、データファイルの段階では番号で区別されていた街路区間や交差点を、コンピュータメモリ上にオブジェクトとして表現するとともに、これらの接続状況を街路番号や交差点番号を用いることなく、コンピュータメモリ上のアドレスを用いて高速に参照できる機能を持つソフトウエアをコーディングした。本研究の目的は、国土数値情報空間データ基盤などの地物データを有効に利用し、水害避難の行動場をコンピュータ上に再現するとともに、申請者が従来開発を進めてきた水害避難ミクロモデルを街路状況やその上の浸水状況に応じて自律的に行動ができるように発展させることで、水害時の住民の心理過程と地形・地物に即した実際の行動をシミュレーションできるシステムを開発することである。平成20年度には、前年の課題について検討を深めるとともに、特に、自律型避難行動エージェントモデルの設計を中心として検討を進めた。モデル開発の原型は、筆者らが従来開発進めてきた水害避難ミクロモデル(高棹ら(1995)、Hori et. al. (2004))である。水害避難ミクロモデルは、住民が浸水の状況や避難情報(準備勧告、勧告、指示)などの情報に反応する過程を、意識パラメータを用いて表現することで、避難開始を決意する、判断を留保するなど、意思決定過程の再現に重きを置いたものであった。そこで、本研究では、避難開始を決意した後、移動中に道路上の浸水状況に応じて引き返したり、経路を変更したりすることを、自律的に行える機能を実現した。具体的には、住民の意識や知識レベルに応じて、避難場所までの最短経路を選択する機能や、交差点で逐次避難場所の方角に最も近い経路を選択する機能など、移動行動にいくつかの現実的なオプションを用意し、これらを実現するソフトウエアシステムをコーディングした。なお、避難する住民間の相互作用の表現については、次年度に検討を引く継ぐことにしている。本研究の目的は、国土数値情報空間データ基盤などの地物データを有効に利用じ、水害避難の行動場をコンピュータ上に再現するとともに、申請者が従来開発を進めてきた水害避難ミクロモデルを街路状況やその上の浸水状況に応じて自律的に行動ができるように発展させることで、水害時の住民の心理過程と地形・地物に即した実際の行動をシミュレーションできるシステムを開発することである。平成21年度には、特に、避難時の街路の混雑状況など人と人あるいは人とモノの相互作用が避難行動に及ぼす影響を中心にモデル化を進めた。具体的には、従来点(ノード)と線分(アーク)で表現してきた街路網について、アークを連続する矩形で表現し、アーク中心線とそれに直交する座標系を設けることで、コンピュータに過度なメモリ負荷を与えることなく、避難住民の位置を道路空間上で2次元的に取り扱うことを可能にした。さらに、避難主体相互や避難主体と障害物の相互作用を表現する方法として、アーク内の群衆密度によって移動速度が変化するとする方法と、避難主体が個別に回避や追越を行う過程を追跡する方法との二種類について検討した。前者は道路区間の面積とその空間上の避難エージェントの数を取り扱うのみで済むため比較的簡便で計算負荷も大きくない一方で、街路網を構成する道路区間に極端に短いものが存在する場合に、不自然なシミュレーション結果をもたらすことがわかった。後者は、計算負荷が大きくなるが様々な相互作用を具体的に再現できるため、今後、人と車の相互作用など、より広範なシミュレーションに適用できる可能性が確認できた。

また、本年度が計画の最終年度であることから、開発を進めてきた避難行動場モデルと自律型避難行動エージェントモデルを組み合わせ、総合的な水害避難シミュレーションを行える一体型ソフトウエアを構築した。
変動する環境下での人工進化実験による進化過程の解析

生物システムの進化ダイナミクスは、システムの安定性に起因する拘束条件や、時間的に変動する環境条件に依存して、適応度地形上の表現型変化は複雑な軌跡を持ち、その軌跡が持つ性質を解析することは、その進化過程の理解において重要な意味を持つ。そこで本研究では、コントロールできる環境下での大腸菌の人工進化実験を用いて、その進化ダイナミクスにおける表現型変化をマイクロアレイ実験による発現解析によって定量する。24年度は、複数の抗生物質を添加した環境での進化実験を行った。大腸菌MDS42株を親株としたこれまでの進化実験の結果として、単独の薬剤を添加した植え継ぎ培養による耐性能の向上とそれをもたらす遺伝子発現量変化・ゲノム変異の解析を行ってきた。さらに、ある薬剤Aの耐性株が、別の薬剤Bへの耐性能をどのように変化させるかを様々な組み合わせで解析したところ、薬剤Aの耐性株が薬剤Bについては感受性になるといったトレードオフの関係を持つ薬剤が複数確認された。そこで、こうしたトレードオフの関係などにある2つの薬剤について、それを同時に添加する、あるいは時間的に変動させて添加する環境下での進化実験を行った。その結果、薬剤の組み合わせによっては(例えば、クロラムフェにコールとアミカシン)、同時添加によって耐性能の獲得速度の有意な低下が見られた。こうしたトレードオフの関係にある薬剤の同時添加での進化実験は、複合適応形質の獲得過程を実験的に構成したことに対応し、複合適応形質の遺伝子基盤解明のための基盤となると期待できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。23年度は、抗生物質を添加した環境下での進化実験を行った。大腸菌MDS42株を親株として、大腸菌に作用があるとされる33種類の抗生物質を添加した環境での進化実験をそれぞれの薬剤について独立4系列で行い、31種類の薬剤について親株より有意に耐性能が向上した耐性株の取得に成功した。これらの株のうち11種類の薬剤について耐性となった44株について、次世代シーケンサFLXを用いたゲノム変異解析を行い、それぞれ520カ所程度の変異の同定に成功した。今後、これらの変異解析のデータとマイクロアレイを用いた発現解析のデータの対応を解析することにより、薬剤添加環境での進化ダイナミクスの理解を目指す。加えて、上述した薬剤耐性大腸菌株について、耐性能のトレードオフの存在を解析した。ここでは、ある薬剤Aの耐性株が、別の薬剤Bへの耐性能をどのように変化させるかを様々な組み合わせで解析したところ、薬剤Aの耐性株が薬剤Bについては感受性になるといったトレードオフの関係を持つ薬剤が複数確認された。今後このようなトレードオフの関係がどのようなメカニズムによって出現するかを解析するとともに、こうした組み合わせの薬剤を同時に添加、あるいは時間的に変動させて添加したときにどのような進化ダイナミクスが出現するかを解析する。多くの抗生物質について耐性能を持つ大腸菌株の取得に成功し、その一部についてはゲノムに固定された変異を高い精度で同定している。こうした結果は、今後の進化ダイナミクスの解析において基礎データとなる。また、トレードオフの関係にある薬剤の組み合わせを見いだしており、本研究提案の主テーマである変動する環境での進化実験に用いる環境条件の候補となっている。24年度は、トレードオフの関係にある2つの抗生物質について、それを同時に添加する、あるいは時間的に切り替えて添加するといった環境下での進化実験を行う。

その変化の軌跡を増殖プロファイルやマイクロアレイの発現解析の結果など表現型レベルで記述し、一方で次世代シーケンサを用いた変異解析の結果から遺伝子型レベルでの記述を行う。これらのデータ間の対応を解析することにより、例えば一時的に適応度が減少するといった複合適応形質的な性質が見いだされるかなど、「矛盾した入力」の下で微生物がどのような適応進化ダイナミクスを示すかの理解を目指す。
量子化条件で規定される新規な絶縁体状態の理論的研究

擬一次元物質を特徴付けるラダー模型の鎖の数をNxとした時、Nx=2,3,4の場合に対して、電子異方性プラトーが生じるパラメタ領域を、化学ポテンシャル(またはサイトあたりの電子数)と外的な異方性の大きさの平面で明らかにした。温度は絶対零度である。電子間相互作用がない極限でもプラトーが生じることを相図上で確かめると共に、相互作用が存在すると電子異方性プラトー状態には不連続的に入り込むことが分かった。この不連続性は、プラトー状態に入る相境界で電子ネマチック転移が生じることによる。プラトー状態へ不連続的に入り込む例は、類似現象である磁化プラトーやホール伝導度プラトーでは知られていないことから、電子異方性プラトーの特異な性質であることが分かった。ただし、常に不連続的になる訳ではなく、連続的にプラトー状態に入るパラメタ領域も存在することを明らかにした。プラトー状態は、サイトあたりの電子数とNxのみで記述される量子化条件で決定される絶縁体状態であるが、それ以外にも、ある「マジック」化学ポテンシャルに対して、量子化条件で規定されないプラトー状態も現れることが分かった。このプラトー状態は金属状態である。これらの相図の理解を式の上ですべて確認すると共に、プラトー現象の背後にある物理的な概念を掴むことにも成功した。以上の成果は、本研究課題の一年目の研究計画に則ったものであり、ほぼ順調に研究を実施できたと言える。1年目の研究計画そのものを終えることが出来たが、その結果を論文としてまとめることが2年目にずれ込んでしまった。この意味で、おおむね順調に進展している現状である。2年目に論文執筆がずれ込んだ原因は、関連する研究の原著論文を2019年1月に2報出版し、そのために多くの時間がかかり、相対的に本研究課題への時間配分が少なくなったことにある。1年目の成果を論文としてまとめることが最優先課題であり、現在進行中である。その中で、類似模型に対するくりこみ群による研究結果があることに気づいた。その結果を本研究課題に適応すると、擬一次元物質特有の強い揺らぎがあっても、期待されるプラトー状態は、安定的に存在できることが示唆される。つまり、量子化条件で規定された電子異方性プラトーの絶縁体状態は、サイトあたりの電子数と鎖の数Nxのみで決まっている、という可能性が強く示唆され、相互作用の強さに依存しない全く新しい絶縁体状態と言える、という結論が見え隠れしている。この結論を確かめるべく、過去のくりこみ群の結果を再考すると共に、必要であれば、より現代的な理論手法である汎関数のくりこみ群を用いて電子相関効果を吟味する。ただし、1年目に発見した「マジック」化学ポテンシャルにおけるプラトー状態は金属状態であり、これが電子相関効果によってどうなるかは全く不明である。この点に関しては、汎関数くりこみ群による計算を行う。以上の研究を通して、電子異方性プラトーの絶縁体状態の学術的位置付けを明確にする。

この結論を確かめるべく、過去のくりこみ群の結果を再考すると共に、必要であれば、より現代的な理論手法である汎関数のくりこみ群を用いて電子相関効果を吟味する。ただし、1年目に発見した「マジック」化学ポテンシャルにおけるプラトー状態は金属状態であり、これが電子相関効果によってどうなるかは全く不明である。この点に関しては、汎関数くりこみ群による計算を行う。以上の研究を通して、電子異方性プラトーの絶縁体状態の学術的位置付けを明確にする。数値的物質解析装置の増強において、入札価格が見通し通りピッタリでなかったために繰り越しを行なった。その繰り越し金は、次年度の旅費として主に使用する予定である。
慢性閉塞性動脈硬化症に対するバイパス手術の長期開存性に関する研究-分子生物学的, 臨床生化学的および医用電子工学的検討

1.ドプラー超音波診断装置(7.5MHz)による末梢動脈血流の評価:68肢において、足背動脈、後脛骨動脈の流速波形を測定し、収縮期平均流速(MSV)、収縮期最大流速(PSV)、収縮期平均血流量(MFV)を計測した。上腕動脈でも同様に計測し、下肢/上肢の比をm-AVI、p-AVI、m-AFIとした。各指標ともFontaine分類別に有意差が認められた。ankle pressureindex(API)とpeak-AVIでは相関(r=0.68)が認められたが、APIが0.7以上でpeak-AVIが0.5以下を呈した4肢では血管造影やエコー上、動脈硬化が強く、壁の石灰化が認められた。逆にAPIが0.7以下でpeak-AVIが0.8以上の3肢はFontaineI度で、血管造影上発達した側副血行路が認められた。この結果より、新たな指標であるm-AVI,p-AVIはAPIより臨床所見により相関した。血行再建術後は、mean-AVIで術前0.35が術後0.8に、peak-AVIで術前0.26が術後に0.70と有意に改善し、AFIでも同様の改善が認められた。2.虚血肢末梢での術前後の内皮由来血管収縮因子(ET-1)、拡張因子(NO2、NO3)の経時的変化:末梢血で測定されたET-1値をFontaine分類別にみると、I度(2.66±0.19pg/ml)とII度(n=23、2.65±0.16pg/ml)では有意差は認めなかったが、III度以上(n=8、3.45±0.23pg/ml)で有意に高値を示した。また、III度以上では血行再建術により、術後1週間目に平均2.64に有意に低下し、またfollow-up中さらに低下した。また、NO値については、術前高値を示した5肢において血行再建術により早期に正常域に低下したが、follow-up中グラフト狭窄の認められた2肢ではAVI,AFIの低下とともにNOの再上昇が認められた。以上より、術前NOが高値を示した症例では、NOがfollow-upの指標となりうる可能性が示唆された。1.ドプラー超音波診断装置(7.5MHz)による末梢動脈血流およびグラフト流量の経時的変化:血行再建術を施行した22肢に行い、浅大腿動脈の再建例では、末梢動脈の収縮期最大流速(PSV)は術前0.32*0.11m/sが術後0.66*0.23m/s、収縮期平均流速(MSV)は術前0.21*0.07m/sが術後0.35*0.12m/sと有意に改善し、流速波形でも全例で改善を認めた。また深大腿動脈においては、PSVが術前0.71*0.26m/sが術後1.38*0.47m/s、MSVは術前0.38*0.12m/sが術後0.65*0.17

m/sと有意に改善し、浅大腿動脈の再建は側副血行路である深大腿動脈の血流も増加させることが示唆された。グラフトのPSVおよびMSVは、それぞれ1.41*0.30m/s、0.44*0.09m/sであり、流速波形は全例II型であった。今後、経時的変化を以下の分析と共に追跡する予定である。2.虚血末梢動脈血での術前、術後の内皮由来血管収縮因子(ET-1)、拡張因子(NO2、NO3)の経時的変化:上記対象肢において、軽症虚血肢(FontaineII度)では、各因子に術前後の有意の変化を認めなかったのに対し、重症虚血肢(Fontaine III,IV度)では拡張因子において、術前高値であったものが、術後には有意な低下を認める傾向が判明した。これは上記因子が臨床症状とも有意に関連している可能性を示唆するものと考えられた。今後、末梢血行改善剤の投与およびグラフト流量との関連について検討を進める。3.末梢側吻合部で組織での内皮由来血管収縮因子、拡張因子のm-RNAの発現とその分布、および従来の組織学的重症度及び分子生物学的重症度とグラフトの長期開存性との関係については、現在検討中であり、次回報告予定である。1.ドプラー超音波診断装置(7.5MHz)による未梢動脈血流経時的変化:新しい血流評価法として、下肢/上肢血流速度・血流量比を測定した。血行再建術を施行した34肢において、足背動脈、後脛骨動脈の流速波形を測定し、これより収縮期平均流速(MSV)、収縮期最大流速(PSV)、収縮期平均血流量(MFV)を計測した。続いて上腕動脈でも同様に計測し、それぞれの下肢/上肢の比をm-AVI、p-AVI、m-AFIとして計測した。血行再建術前後でankle pressure index(API)が平均0.55から0.77へと上昇したのに対し、m-AVIは平均0.35から0.93へ、p-AVIは平均0.25から0.80へ、m-AFIは平均0.06から0.13へと上昇した。しかし、APIが高値(0.90以上)であるにも関わらず、Fontaine分類II度以上であった症例では、m-AVI,p-AVIが0.75以下を示し、末梢flowの不良な症例であることが考えられた。逆にAPIが低値であるにも関わらず、Fontaine分類I度であった症例では、m-AVI,p-AVIが高値を示した。この結果より、新たな指標であるm-AVI,p-AVIは従来のAPIより臨床所見に相関することが示唆された。2.虚血末梢動脈血での術前後の内皮由来血管収縮因子(ET-1)、拡張因子(NO2、NO3)の経時的変化:上記対象肢において、重症虚血肢(FontaineIII,IV度)では術前ET-1が有意に高値を示し、血行再建術後早期に低下する傾向を示した。一方、NO2、NO3値が術前高値を示した症例では、血行再建術後1週間目に正常に復した。しかし、NO2、NO3値の再上昇と共に、AVI,AFIが低下し、グラフト流量も低下した事実から、血行再建術後のfollow-up指標としてのNO2、NO3値の意義が示唆された。今後、さらに検討予定である。1.ドプラー超音波診断装置(7.5MHz)による末梢動脈血流の評価:下肢/上肢血流速度・血流量比(m-AVI、p-AVI、m-AFI)を前年度に引き続き測定した。68肢において、ankle pressure indcx(API)とpeak-AVIでは、相関(r=0.68)が認められたが、APIが0.7以上でpeak-AVIが0.5以下を呈した4肢は、FontaineIII度が1肢、II度が3肢であり、動脈硬化が強く、壁の石灰化が認められた。逆にAPIが0.7以下でpeak-AVIが0.8以上であった3肢は、いずれもFontaineI度で、足背動脈、後脛骨動脈への非常に発達した側副血行路が認められた。mean-AVIとFontaine分類では、I度0.83、II度0.56、III度以上0.27で、それぞれの群間に有意差が認められた。
自己免疫疾患におけるHLA領域遺伝子および遺伝子産物の研究

多くの自己免疫疾患の発症には複数の遺伝子が関与しており、その遺伝子のうち少なくとも1つはHLA領域に存在する。欧米では自己免疫疾患を発症した者はほぼ共通してHLA-DR3.DQ2ハプロタイプを有している。一方、日本人ではDR3やDQ2は極く稀で、自己免疫疾患の全身性エリテマトーデス(SLE)や、シェーグレン症候群(SS)、重症筋無力症(MG)、強皮症(SSc)などの発症を規定している遺伝子は明かでない。このことはDR3、DQ2自体が疾患発症を規定していない可能性、および欧米人患者のみの研究では判らなかったこれら疾患の不均一性を示している。本研究では、SLE:86例,SS:69例,MG:74例,MCTD/PM:36例,SSc:33例を対象として、臨床的細分類を行ない、HLAや補体蛋白型を決定するとともに、染色体DNAをrestriction fragment length polymorphism(RFLP)およびpolymorascchain reaction-RFLP法を用い患者と正常人のDNAを比較検討し、次のような結果を得た。SLE患者のうちDR4を有する例は腎障害を併発しやすいが中枢神経ループスに抵抗性であった。補体のC4Aのnull allclc(C4AQ0)を有する例は対象(1.6%)にくらべて高率(13.5%)に認められたが、RFLP法では白人SLEの報告と同様なC4A領域遺伝子の大きな欠損は認めなかった。したがって、C4A領域の遺伝子欠損がSLE発症を決定している可能性は低いと考えられた。MGでは30歳以下に発症した女性患者にDR53,DPB1【.thenmod.】0201,DQA1【.thenmod.】0301が強い相関を示すことが判明した。これらのことは30歳以下の女性のMGの発症機序は他のMGと異なること、およびHLAクラスIIの2つ以上の遺伝子が関与していることを示唆している。SScは肺線維症合併例が非合併例に比して高率にDR2,C4AQ0,Sc1-70を有しており、予後不良因子と考えられた。MCTD/PM患者にはDR2,DQ1陽性例が多く、Jo-1陽性例はすべて肺線維症を合併しDR1,DQ1が高頻度であった。全身性エリテマト-デス(SLE)患者60例、混合性結合組織病(MCTD)患者1例、強皮症(PSS)患者34例の末梢血よりリンパ球を分離し、主要組織適合抗原(HLAーA.B.C.DR.DQ)型を細胞障害試験で決定した。平行して、EDTA加血漿をもちいたアガロ-ス電気泳動による補体第4成分のアロタイプ型の決定を開始した。患者の残った白血球はDNA抽出のため凍結保存した。現在までに、SLE患者のDNAを分離精製し、数種の制限酵素で消化した後にアガロ-ス電気泳動を行ない、サザンプロット法でDNA切断片をナイロン膜に移動させ、DRβとDQβのcDNAをプロ-ブとしてhybridizationを行ない、restriction fragment length polymorphism(RFLP)のパタ-ンを検討した。

また、それぞれの患者の発症年齢、臨床症状、検査所見の異常、治療の効果について調査した。今年度に得た結果は以下の通りである。1.PSS患者では欧米の報告と異なりセントロメア抗体を有する例は殆どなく、約2/3の患者にSc170もしくはRNP抗体が陽性であった。患者の殆どがHLAーDQ1抗原を有しており、DQ1を有することがPSS発症の必要条件である可能性が強い。Sc170抗体陽性の患者は肺線維症を合併する頻度が高く、高率にHLAーDR2を有していた。従ってDR2を有している患者には早期より肺の検索が必要と考えられた。2.日本人SLE患者全体ではHLAーDR2を有する患者が多いがその相関は著明なものではない。中枢神経障害や腎障を有する例にDR2陽性例が多い傾向があるが、現在のところ統計的有意差は認めせていない。RFLPの検討では、白人SLEで報告されているような補体第4成分のC4Aのnull alleleおよびC4A領域の遺伝子の広範な欠損は日本人SLEでは認められない。3.MCTDに関しては症例数を増やし検討中である。本年は昨年度に引き続き患者数を増やし自己免疫疾患患者のHLA,補体アロタイプ、染色体DNAのRFLPによる解析、PCRを用いてのHLA遺伝子型の決定を行なった。本年度は新しく、抗アセチルコリンレセプター抗体が発症に関与している重症筋無力症患者74例を加えた。対象とした患者数は、全身性エリテマトーデス(SLE)は計86例、シェーグレン症候群(SS):69例、強皮症(SSc):33例、混合性結合組織病と多発性筋炎(MCTD/PM):36例である。その結果を以下に示す。1)SLE患者のうちDR4を有する例は腎障害を併発しやすいが中枢神経ループスに抵抗性であった。補体のC4Aのnull allele(C4AQO)を有する例は対象(1.6%)にくらべて高率(13.5%)に認められたが、RFLP法では白人SLEの報告と同様なC4A領域遺伝子の大きな欠損は認めなかった。したがって、C4A領域の遺伝子欠損がSLE発症を決定している可能性は低いと考えられた。2) MGでは30歳以下に発症した女性患者にDR53,DPB1*0201,DQA1*0301が強い相関を示すことが判明した。これらのことは30歳以下の女性のMGの発症機序は他のMGと異なること、およびHLAクラス2の2つ以上の遺伝子が関与していることを示唆している。3)SScは肺線維症合併例が非合併例に比して高率にDR2,C4AQO,Sc1-70を有しており、予後不良因子と考えられた。4)MCTD/PM患者にはDR2.DQ1陽性例が多く、Jo-1陽性例はすべて肺線維症を合併しDR1.DQ1が高頻度であった。現在、PCR-RFLP法を用いて遺伝子型を決定しているところである。
細胞壁再生イメージング解析法による細胞壁ネットワーク構築メカニズムの解明

前年度、プロトプラストの細胞壁再生が遅くなる突然変異体の探索の結果、xyloglucanxylosyltransferase 1/2 (xxt1 xxt2)を同定した。この突然変異体は、細胞壁主成分の1つであるキシログルカンを欠損していることで知られる。本年度はこの突然変異体について詳細な解析を進めた。24時間培養したxxt1 xxt2プロトプラストの細胞壁をカルコフロールというβ-グルカン染色試薬で染色したところ、xxt1 xxt2は確かに野生型よりも細胞壁再生が遅いものの、一見したところ野生型と類似した正常なネットワーク構造を形成することができることがわかった。この突然変異体を、キシログルカンを含む培地で培養した結果、カルコフロールで可視化されたネットワーク構造は太く明確な構造へと変化した。しかし、セルロース特異的な抗体を用いた免疫染色ではこのような構造変化は観察されなかった。また、電界放出型走査型電子顕微鏡によるセルロース微繊維の観察の結果、通常の培地で培養したxxt1 xxt2プロトプラストとキシログルカンを含む培地で培養したxxt1 xxt2プロトプラストの間には、見た目やネットワークの太さに違いが認められなかった。このことから、カルコフロール染色時に見られた見た目の変化は外因性キシログルカンの過剰沈着によるものと判断した。これらの結果はキシログルカンが正常なネットワーク構造を持つ細胞壁の構築に必須ではないことを示唆している。xxt1 xxt2は根や胚軸においてセルロースネットワークパターンに異常が観察されているが、本研究によってこのような異常がネットワーク構築後に生じるものであることが提案された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で確立した、プロトプラストからの細胞壁再生過程を共焦点イメージングと画像解析によって定量的に解析する手法についての研究成果を論文にまとめた。次に、この手法を用いて細胞壁の新規構築に関わる因子の逆遺伝学的スクリーニングと、細胞壁関連遺伝子の一過的過剰発現による標的遺伝子の機能解析を試みた。そのの結果、細胞壁の主骨格であるセルロースネットワークの構築が遅延する2種類の突然変異体としてxyloglucanxylosyltransferase 1/2 (xxt1xxt2)とchitinase-like1 (ctl1)を同定した。これらの突然変異体のうちxxt1xxt2では、キシログルカンが含まれないことが免疫蛍光抗体染色によって確かめられ、さらに形成されたネットワークのパターンも異なることがわかった。現在、原子間力顕微鏡や電子顕微鏡などを用いたナノメートルスケールのイメージングにより、野生型とxxt1xxt2プロトプラストから再生した細胞壁再生パターンの違いをより詳細に解析しようと試みている。これらの研究により、セルロースネットワーク構築におけるキシログルカンの機能を明らかにできるものと期待している。標的遺伝子の一過的過剰発現については、まず核局在性のYellow-fluorescent protein (YFP-NLS)をポリエチレングリコール法でプロトプラストに導入し蛍光を確認した。その結果、約60%のプロトプラストに遺伝子を導入することができた。続いてセルロース合成酵素であるCESA1、セルロース合成関連遺伝子であるKORRIGAN 1、セルロース分解酵素であるCELLULASE 3を過剰発現させたが、これらの遺伝子の過剰発現は細胞壁再生に有意な影響を与えなかった。現在、影響が出ることが期待される他の遺伝子の解析を検討中である。本研究の当面の目的は、自ら確立したプロトプラストからの細胞壁再生過程を定量的に解析する手法を用いて、細胞壁の新規構築に関わる因子を同定することであった。細胞壁の新規構築に関わる因子の逆遺伝学的スクリーニングによって、セルロースネットワークの構築が遅延する2種類の突然変異体としてxxt1xxt2とctl1を同定することができたことで、目的は達成できたと言える。現在進めているxxt1xxt2の詳しい解析では、キシログルカンを添加した培地でxxt1xxt2プロトプラストを培養したときにセルロースネットワークパターンの変化が認められている。この結果は、キシログルカンが細胞壁の機械的性質に重要な役割を果たすセルロースネットワークを形成するうえで重要であることを示す根拠となる可能性がある。この点において、本研究の進捗状況は順調である。一方で、プロトプラストに標的遺伝子を過剰発現させる実験系については、検証を重ねているものの、安定した実験条件の確立や標的遺伝子の選定がまだ不完全である。総合的に見て、本研究は概ね順調に進んでいると考えられる。

また、電界放出型走査型電子顕微鏡によるセルロース微繊維の観察の結果、通常の培地で培養したxxt1 xxt2プロトプラストとキシログルカンを含む培地で培養したxxt1 xxt2プロトプラストの間には、見た目やネットワークの太さに違いが認められなかった。このことから、カルコフロール染色時に見られた見た目の変化は外因性キシログルカンの過剰沈着によるものと判断した。これらの結果はキシログルカンが正常なネットワーク構造を持つ細胞壁の構築に必須ではないことを示唆している。xxt1 xxt2は根や胚軸においてセルロースネットワークパターンに異常が観察されているが、本研究によってこのような異常がネットワーク構築後に生じるものであることが提案された。細胞壁構築に影響を与える因子の逆遺伝学的スクリーニングによってxxt1xxt2が同定されたことで、セルロースネットワーク構築時におけるキシログルカンの役割を解明する糸口が見出された。また、xxt1xxt2プロトプラストをキシログルカン添加培地で培養すると、再生したネットワークパターンが、少なくとも蛍光イメージングレベルにおいて変化することもわかった。しかし、太さ約3.5nmであるセルロース微繊維やそれが束化したセルロースフィブリル構造のネットワークパターンを詳細に解析するためには、これまで用いてきた蛍光イメージングよりも分解能の高い手法が必要である。そこで今後の研究で、細胞壁ネットワークをナノメートルスケールで可視化できる電子顕微鏡や原子間力顕微鏡によるイメージングを導入しようと考えている。これらの手法を用い、野生型とキシログルカンを持たないxxt1xxt2との間で見られるセルロースネットワークのパターンの違いや、人為的にキシログルカンを添加した際のネットワークパターンの変化を解析し、それに加えて形成されたネットワーク構造の物理的性質を原子間力顕微鏡で計測することで、細胞壁が機械的強度を制御するうえでキシログルカンが果たす役割を明らかにできると期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
頭頚部癌における骨髄由来抑制細胞とアデノシン代謝

頭頸部癌において、細胞外アデノシンは抗腫瘍免疫を抑制する因子として注目されている。頭頸部癌患者の腫瘍内の骨髄由来免疫抑制細胞では、血液中に比較して、アデノシン産生酵素であるCD73の発現が亢進しているという結果をこれまでに得ている。さらに今回、細胞外アデノシンを産生する腫瘍とアデノシンの関与が少ないと想定される腫瘍に分け、腫瘍内の免疫細胞、特に骨髄系細胞(骨髄由来免疫抑制細胞)のアデノシン産生酵素であるCD39とCD73の発現について、解析することを目的とした。まず腫瘍細胞によるアデノシン産生を調べるため、ヒト、マウスのそれぞれの培養細胞株について、アデノシン代謝に関与するCD39、CD73、アデノシン受容体A2A、A2Bの発現を調べた。具体的にはマウス肺扁平上皮癌(KLN205)、ヒト頭頸部癌(SCC22B)、マウスメラノーマ(B16F10)、マウスルイス肺癌(3LL)を使用した。これまでに免疫染色ではCD39およびCD73の発現が頭頸部癌において亢進している結果が得られているが、現在はヒト組織における陽性、陰性コントロールとの対比、解析を行っている状況である。マウスの細胞株においては、マウスメラノーマ細胞株であるB16F10はCD73の発現が殆どなく、ネガティブコントロールとして使用できることが判明した。一方、マウス肺扁平上皮癌の細胞株では比較的CD73の発現が上昇しており、アデノシン代謝経路が腫瘍内の免疫抑制に関与している可能性が示唆された。また腫瘍のPD-L1の発現についても同時に調べており、CD39やCD73の発現との間に相関関係があるか、解析中である。研究室で保管しているヒト、マウスの細胞株について、マイコプラズマの感染状況を調査した。多くは現在の実験に使用していない細胞株についてではあるが、複数の細胞株において、マイコプラズマの感染が発覚した。そのため、追加実験、検証実験が必要になった。またインキュベーターの滅菌消毒、マイコプラズマの除去を行うため、実験の実施がやや遅延している状況である。また共同研究施設のフローサイトメトリーの予約取得が困難であり、検体が採取できた時に使えないことが多く、今後は手法の見直しも必要になっている。頭頸部癌のアデノシン代謝の解析にフローサイトメトリーを用いる予定であったが、過去の病理標本を利用して、臨床情報を照らし合わせて解析を予定している。そのため、多重蛍光免疫染色の手法を学習し、新たに解析する手法として規導入することを検討している。研究室において、細胞株のマイコプラズマ汚染が発覚したため、研究の遅延が生じた。計画の遅延に伴い、次年度に予算を繰り越した。抗体試薬の購入に使用する予定である。
ICTを活用した教員・保育者養成機関におけるピアノ実技教育の質保証

本研究は,リアルタイムの対面式授業に,eラーニング教材の閲覧や学習者自身による演奏映像の録画・提出等をブレンドすることによって,教員・保育者養成機関におけるピアノ実技教育の授業方法の改善を図るものである。本研究により,2つのeラーニング教材(バイエルeラーニングコースおよび歌唱eラーニングコース)が制作された。また,教材閲覧前後の学習者の演奏を詳細に分析した結果,eラーニング教材は学習者に自己内省を生じさせ,演奏技術の自己トレーニングを可能にすること等を示した。本研究は、eラーニングピアノ弾き歌い教材(http://oberon.nagaokaut.ac.jp/kwu/piano/)をリアルタイムの対面授業とブレンドすることによって、教員・保育者養成機関におけるピアノ実技教育の質保証および授業方法の改善の実現を目的とする3ヵ年にわたる研究である。初年の本年度は、上記教材(代表的な子どものうた(7曲)の模範演奏映像、注釈付楽譜、解説映像及びテキスト)を約100名に視聴させ、視聴前後の演奏を比較分析した。その結果、eラーニング教材の視聴は、初心者には基礎技能の獲得のために、上級者にはより一層高次のレベルの表現技能獲得のために有益であり、一般的には、歌唱面での進歩をもたらすことがわかった。また、演奏録画と併せて実施したアンケート分析を通じて、模範演奏と自身の演奏との比較などを通じて、学習者に自己内省が生じ、演奏技術の自己トレーニングが可能となることを示唆できた。教材開発については、上記のピアノ弾き歌い模範演奏の後継として、ピアノ教則本「バイエル」の模範演奏の撮影を完成させた(注釈付楽譜は現在作成中である)。さらに、上記eラーニング教材での注釈付楽譜作成のノウハウを生かし、約50曲の子どものうたの注釈付楽譜を新たに作成した(平成22年中に出版予定)。本研究は、eラーニングピアノ弾き歌い教材(http://oberon.nagaokaut.ac.jp/kwu/beyer/)をリアルタイムの対面授業とブレンドすることによって、教員・保育者養成機関におけるピアノ実技教育の質保証および授業方法の改善の実現を目的とする3ヵ年にわたる研究である。2年目の本年度は、昨年度に引き続き、上記教材(代表的な子どものうた(7曲)の模範演奏映像、注釈付楽譜、解説映像及びテキスト)を視聴させ、視聴前後の演奏を比較分析した。また関西学院大学においても同様の実践に取り組んだ。その結果、学習者の自己学習に対する適切な指示によって学生の演奏能力は大きく向上することが確認された。加えて今年度より、注釈付楽譜に焦点を絞り、学生の注釈付楽譜に対する分析の共通点・相違点および演奏の様子の変化を捉え、ピアノ実技能力の経年変化を考察し始めた。教材開発については、上記のピアノ弾き歌い教材の後継として、ピアノ教則本「バイエル」教材を完成し、模範演奏映像と注釈付楽譜の配信を始めた(http://oberon.nagaokaut.ac.jp/kwu/piano/)。さらに、注釈付楽譜作成のノウハウを生かし、約50曲の子どものうたの注釈付楽譜を新たに作成し、『子どものう弾き歌いベスト50注釈付き』(音楽之友社)として発刊した。本研究は、eラーニングピアノ弾き歌いコースやeラーニングピアノ(バイエル)コースをリアルタイムの対面授業とブレンドすることによって、教員・保育者養成機関におけるピアノ実技教育の質保証および授業方法の改善の実現を目的とする3ヵ年にわたる研究である。また、上記ピアノ教材(http://oberon.nagaokaut.ac.jp/kwu/beyer/)を使った実践として、保育士・幼稚園教諭採用試験の主要課題である「バイエル」60番以降の楽曲の視範演奏映像、注釈付楽譜を視聴する前後の演奏を比較し、この教材がどの程度実力の向上に寄与するかを分析した。(現在、分析の最終段階に入っており、平成24年度に開催される学会などで成果を発表する予定である。)教材材開発については、上記ピアノ弾き歌い教材に加え、著作権が消滅している楽曲8曲の歌唱模範演奏(ピアノ伴奏)を撮影・編集・加工した。現在、アップロードの準備中である。
多様な癌抗原への対応を目指した新しい樹状細胞療法の開発

進行がん患者を対象に患者末梢血由来樹状細胞を体外にて培養し、腫瘍内に投与する第1相臨床試験を施行し、その安全性を確認し得た。しかし、副次目的である抗腫瘍免疫反応は得ることはできなかった。そこで、投与した樹状細胞の解析により、進行がん患者由来樹状細胞の機能不全が明らかになった。一方、生体内にある樹状細胞の前駆細胞をそのまま生体内で直接分化増殖へと誘導させることができればより実用性の高い手法となる。Flt3Lは生体内の樹状細胞の分化、増殖を誘導するサイトトカインである。そこで、我々は、すでに確立したIn vivoエレクトロポレーション法を用いてにFlt3Lを生体内に遺伝子発現させた。その結果、生体内で樹状細胞を動員、かつ成熟化し、免疫反応を制御できる可能性が示唆され、論文報告した。樹状細胞療法との併用療法として、自然免疫が備えるNatural Killer細胞やNatural Killer T細胞を活性化させるIL-18に注目し、効率よくIL-18を発現するアデノウイルスベクターを開発した。我々の研究結果により、生体内に存在する樹状細胞の動員と成熟化のみでは十分な抗腫瘍免疫反応は惹起できないことが判明したことから、Flt3L遺伝子導入による生体内樹状細胞の動員と腫瘍局所へのIL-18遺伝子治療を組み合わせた併用治療を考案し、マウス腫瘍モデルで検討した。その結果、併用療法により、それぞれ単独治療で得られなかった全身の抗腫瘍免疫反応を誘導できることが明らかになった。以上の結果から、樹状細胞がもつ獲得免疫能の増幅とIL-18がもつ自然免疫能の増強が相互に補完しあうことにより、癌抗原の多様性に対応できる可能性が示唆された。以上、この2年間の助成期間中内に基礎的および前臨床的研究を進め、多くの知見を集積し得た。本研究結果から、生体内の樹状細胞を動員した獲得免疫と自然免疫が備えるエフェクター機能をサイトカインによって増強する新しい免疫遺伝子療法の有用性が示唆された。今後、臨床応用へ向けてさらなる検討を重ねていく予定である。研究計画調書に記載した平成15年度の研究計画に沿って研究を進めた。1.Flt3L遺伝子をウイルスを用いない方法であるin vivoelectroporation(IVE)法で遺伝子発現させ、生体内で樹状細胞を効果的に動員できることはすで報告済みである(第60回日本癌学会総会)。動員された樹状細胞が腫瘍に集積する際の形質を解析するために免疫組織学的手法を用いてに検討した。その結果、無治療の腫瘍にはほとんど樹状細胞が存在しないのに対し、Flt3L-IVEを行ったマウスでは腫瘍の周辺のみならず、腫瘍内部にまで浸潤していることが明らかになり、Flt3L-IVEによる効果的な樹状細胞の腫瘍への動員が示唆された。(投稿準備中)2.樹状細胞療法との併用療法として抗腫瘍エフェクター機構の増強を目指して抗原の多様性やMHCクラスI経路に依存しないNatural Killer細胞やNatural Killer T細胞活性を増強させるサイトカインを検索した。その結果、IL-18に注目し、IL-18のcDNAをコードし、効率よい遺伝子導入できるアデノウイルスベクターを開発した。今後、Flt3Lとの併用療法による抗腫瘍効果の判定とその機序を解明する方針である。

1. Flt3L遺伝子をin vivo electroporation (IVE)法でマウス生体内に発現させ、血中でのFlt3L遺伝子の発現を確認した。また、生体内で樹状細胞を効果的に動員していることをすでに報告している。腫瘍に動員された樹状細胞のうち、成熟樹状細胞は腫瘍の辺縁に局在するのに対し、未熟樹状細胞が腫瘍内に局在することを明らかにした。しかし、抗腫瘍効果を検討したところ、有意な腫瘍増殖抑制効果がみられなかった。以上の結果を報告した。(Int.J Oncol. in press)2. IL-18はIFN-γを誘導するサイトカインであり、NK,細胞やT細胞等を活性化することにより抗腫瘍効果を発揮することが知られている。一方、IL-18単独では特異的な腫瘍免疫の誘導は難しい。この問題点を解決するため、強力な抗原提示細胞として知られる生体内の樹状細胞を動員するFlt3Lを用い、IL-18との併用により腫瘍特異的免疫の誘導を試みた。マウス皮下腫瘍接種モデルを用いて、Flt3L遺伝子をin vivo electroporation (IVE)法を用いて後肢下腿筋内に遺伝子導入し、アデノウイルスベクターを用いて腫瘍内にIL-18を遺伝子導入し、抗腫瘍効果を検討した。Flt3LとIL-18の併用治療群では、IL-18の単独治療群と比較し有意な治療側の腫瘍の完全退縮を認めた、非治療側の腫瘍においてもコントロール治療群と比較し有意な腫瘍の縮小を認めた。さらに腫瘍特異的CTL活性、NK活性においても他群と比較し有意な増強が得られた。以上、Flt3Lの併用が、IL-18によるNK細胞等の自然免疫の増強のみならず、樹状細胞を介した獲得(特異的)免疫の成立に寄与する可能性が示唆され、報告した。(第63回日本癌学会総会)
中国大興安嶺森林－湿原生態系における水・熱および炭素・物質動態と山火事撹乱の影響

中国大興安嶺地区の山火事撹乱の影響を受けたカラマツ林ー湿原生態系において、炭素および物質循環の観測をおこない、北海道のカラマツ林の結果と比較した。北海道の伐採跡地に植林したカラマツ林では伐採後10年で二酸化炭素の放出から吸収に転じたのに対し、大興安嶺では山火事後20年を経過してもカラマツ林の炭素・土壌養分蓄積量は山火事以前の状態には回復しなかった。本研究より、中国東北部の永久凍土南限域では炭素を中心とする物質フローは森林の温暖化に対する緩衝機能を欠如したまま温暖化により変化し、湿原はより不安定化して分解が進み、二酸化炭素のみならずメタンを含めた温室効果ガスの放出を加速させると推定された。永久凍土南限域では、カラマツ林の存在が湿原・永久凍土の安定性と関連し、その維持管理がCO2の放出を含む地球温暖化と密接に関連している可能性がある。本研究は、中国大興安嶺地区における森林(カラマツ林)-湿原複合生態系を対象とし、1)炭素を中心とする水・物質動態の把握、2)湿原の安定性と温暖化への影響、3)北海道のカラマツ林との比較、4)湿原におけるカラマツ林の物質循環への影響評価等をおこなう。調査地は、(1)東北林業大学老山演習林、(2)大興安嶺中心部・加格達寄付近、(3)大興安嶺東部の瓮河自然保護区周辺、(4)大興安嶺西部の根河周辺を候補地とした。調査は南開大学・東北林業大学・黒竜江省林業研究所の共同研究者と合同でおこない、(1)、(2)の調査地では中国側共同研究者が水・物質循環に関する観測を開始している。本研究では、湿原維持におけるカラマツ林の機能評価を大きなテーマにしているため、(3)の瓮河自然保護区の大規模湿原(特別保護区)を観測の主要調査地とし、湿原保護管理局と観測候補地や受け入れ体制について協議するとともに、湿原内部に点在しているカラマツ林と、湿原に隣接する流域に観測地を設定し、器材の設置および土壌水観測等の一部の項目について観測を開始した。(4)の根河周辺のカラマツ林流域では、調査対象地域が山火事の影響が大きく、候補地選定のための予備調査(周辺カラマツ林の地形・地質・植生状況等)をおこなった。また、北海道に設定したカラマツ林流域(北海道大学天塩・苫小牧研究林)において、日中共同研究者による炭素循環に関する共同調査をおこない、観測器材やモニタリングの方法について意見交換した。永久凍土南限域では、カラマツ林の存在が湿原・永久凍土の安定性と関連し、その維持管理管理がCO2等の人間活動に由来するガス放出を含む地球温暖化と密接に関連している可能性がある。本研究は、中国大興安嶺および小興安嶺地区における森林(カラマツ林)ー湿原複合生態系を対象とし、1)炭素を中心とする水・物質動態の把握、2)湿原の安定性と温暖化への影響、3)北海道のカラマツ林との比較、4)湿原におけるカラマツ林の物質循環への影響評価について調査・研究をおこなう。本年度は、小興安嶺地区伊春市に位置する豊林自然保護地区内に設定されている、黒龍江林業科学研究所の流域試験地にある観測用タワーを整備するとともに、流域出口の量水堰にデータロガー(水位計)、林内および土壌に気温・地温計を設置して林業科学研究所に所属する研究者および技術者の協力のもとに気象・水文モニタリングを立ち上げた。また、CO2観測用のクローズドパス渦相関用モニタリングシステムを現地へ送付して観測流域における運転を開始した。また、比較試験地として設定している北海道のカラマツ林(北海道大学天塩研究林・国有林苫小牧東部森林管理署)における炭素循環に関する観測を継続するとともに、北海道札幌研究林実験苗圃において、人間活動に由来して大気中に放出されるCO2も含めた地球温暖化ガスやオゾンなどの大気汚染物質の樹木生理影響に関する試験も課題とりまとめや今後の課題展開を視野に入れて開始した。本研究は、中国大興安嶺地区における森林(カラマツ林)ー湿原複合生態系を対象とし、1)炭素を中心とする水・物質動態の把握、2)湿原の安定性と温暖化への影響、3)北海道のカラマツ林との比較、4)湿原におけるカラマツ林の物質循環への影響評価等をおこなう。調査地は、1東北林業大学老山演習林、2大興安嶺中心部・加格達寄付近、3大興安嶺東部の瓮河自然保護区周辺、4大興安嶺西部の根河周辺を候補地とし、南開大学・黒竜江省林業研究所の共同研究者と共同で昨年度に引き続き調査を進めている。

本年度は3の瓮河自然保護区の大規模湿原(特別保護区)において、黒龍江省林業研究所の研究者と協力し、気象や土壌水等の湿原内部の観測を開始した。さらに、同研究所と協議して大興安嶺地区に隣接する小興安嶺地区においても同様の観測を開始することとした。小興安嶺地区の調査地は伊春市豊林自然保護区内に位置し、カラマツ林帯から北海道を含む針広混交林帯への移行帯にあたり、永久凍土分布域としてはより環境変化に敏感なエリアである。また、当調査地には量水堰と観測用鉄塔がすでに設置されており、器材を用意すればすぐに観測できるという利点もある。また、中国で観測を担当する研究者を招へいし、北海道に設定したカラマツ林流域(北海道大学天塩・苫小牧研究林)において、日中共同研究者による炭素循環に関する観測器材やモニタリングの方法について意見交換会を開催した。永久凍土南限域ではカラマツ林の存在が湿原・永久凍土の安定性と関連し、その維持管理がCO2の放出を含む地球温暖化と密接に関連している可能性がある。本研究では中国の南開大学・東北林業大学・黒龍江省林業研究所の研究者と共同で大興安嶺および小興安嶺の森林(カラマツ)ー湿原複合生態系に調査地を設定し、水・炭素を中心とする物質循環の観測、北海道のカラマツ林との比較、山火事等の人為影響によるカラマツ林の撹乱が湿原生態系に与える影響、森林回復の技術的課題について検討した。大興安嶺地区では山火事が頻発し、湿原あるいは周辺のカラマツ林が焼失することによって湿原が不安定化し、地下部の泥炭層や永久凍土が融解して二酸化炭素(CO2)やメタン(CH4)などの地球温暖化ガスが大気へ放出される。メタンは二酸化炭素の約25倍の温室効果を持つが、林床にあるリター層の好気的環境では森林はメタンの吸収源となる。北大FACE実験からは、2040年頃のレベルと想定される高CO2(500 ppm)に設定された林床におけるメタンの吸収量は、対照区(380390 ppm)の半分程度になることが解った。高CO2下では樹木は葉面の気孔を閉じ気味にするため、樹木からの蒸散が減る。また、上層木の葉が繁茂し林床へ届く光量も減るため地面からの蒸発も減少し、リターは湿気を帯びた状態になる。これらの変化によって林床が嫌気条件になることが原因の一つとして考えられた。さらに同じ土壌含水率でもFACEの方がメタン吸収は低下していた。これらのことから、今後CO2濃度が上昇し続けると強力な温室効果ガスであるメタンの森林からの放出量が増加すると考えられた。また、本プロジェクトに関連した研究者による日中共同セミナーを北海道大学で開催し、人為影響による大興安嶺地区の炭素循環変化の現状や森林回復技術について意見交換し、課題のとりまとめをおこなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。森林機能学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の主要観測地として考えていた、中国大興安嶺地区の湿原で新規に炭素・水循環に関する観測できる態勢が構築されたため。前年度調査地に加えた、小興安嶺地区豊林自然保護区試験流域での森林ー湿原生態系における炭素・水循環に関する流域観測を、中国側研究者(黒龍江省林業科学研究所)と協力しながら立ち上げることで、より温暖化に鋭敏な地域の温暖化影響について評価可能になったこと。
アンチフロリゲンによる植物改良

本研究の目的は、花芽分化の決定因子・フロリゲンとその抑制因子・アンチフロリゲンの分子機能を解析し、両者を人工的に改変してイネの種子数を増加させる技術を開発することである。アンチフロリゲンを恒常的に発現させたイネは種子数が増加するが、同時に花成が遅延するため実用的でない。本研究では「花成の前は発現がなく、花成直後から発現を開始するプロモーター」の制御下でアンチフロリゲンを発現させることで、花成を遅延させることなく種子数のみ増加させることを試みた。作成した形質転換イネの表現型を解析した結果、花成の遅延なく一次枝こうを増加させることには成功したが、一穂粒数の増加した系統を得ることはできなかった。本研究の目的は、花芽形成の決定因子・フロリゲンFTとその抑制因子・アンチフロリゲンTFL1の分子機能を解析し、さらに両者を人工的に改変してイネの種子数を増加させる技術を開発することである。アンチフロリゲンを恒常的に増強したイネは種子数が増加することが知られているが、同時に花成も著しく遅延するため実用的ではない。本研究では、「花成の前は発現がなく、花成直後から活性化するプロモーター」の制御下でアンチフロリゲンを発現させることによって、花成のタイミングに影響を与えることなく、種子数のみ増加させることを試みる。本年度は花成直後に活性化するプロモーターとしてPAP2遺伝子及びFTL1遺伝子のプロモーターを用いた形質転換イネを作成した。作成したイネを栽培してその到穂日数を測定した。本実験を二度反復し、穂の形質を詳細に解析している。また、PAP2プロモーターの活性化のタイミングを正確に把握するために、PAP2プロモーターで蛍光タンパク質のCloverもしくはmRuby2を発現する形質転換イネを作成した。これらの茎頂メリステムを観察し、PAP2プロモーターが花芽分化の開始後に活性化することを確認した。今後はPAP2プロモーターの制御下でアンチフロリゲン人工遺伝子を発現する形質転換イネを短日条件、長日条件、温室内の自然日長条件で栽培し、穂の形質と種子数を計測することによって、アンチフロリゲンによる収量増加が可能かどうかを検討する。これまでに作成した形質転換イネを様々な条件で栽培し、穂の形質及び種子数を計測する。アンチフロリゲンRCNをPAP2プロモーターで発現するイネを作成し、これの穂の形質を調査する。アンチフロリゲンとしては、イネのフロリゲンHd3aのアニオン結合ポケットに面するヒスチジンをチロシンに置換したもの、及びこれらにさらに転写抑制機能を与えるSRDX配列を付加した人工遺伝子を用いた。計測する穂の形質は、一次枝こう数、一次枝こうに着生した側生器官数、二次枝こう数、二次枝こうへの着生えい花数及び種子数である。花成抑制機能を与えるとされる点変異を導入した改変型イネFT遺伝子にキメラリプレッサーを融合する「人工アンチフロリゲン遺伝子」を作成し、茎頂メリステムにおいて花成直後から穂の形成を通して発現するプロモーターと融合した発現コンストラクトをイネに導入した。人工アンチフロリゲン遺伝子としては点変異を導入したものと導入しないもの、さらにキメラリプレッサーとの間にリンカーを導入したものと導入しないものの4種類を作成した。