hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜蛋白質Semaphorin 6CのX線結晶構造解析

Semaphorin 6C(Sema6C)は1回膜貫通型の膜蛋白質で、神経節の成長制御において重要な役割を果たしており、近年、創薬ターゲットとして大きな注目を浴びている。この膜蛋白質の構造解析は創薬という応用面のみならす、1回膜貫通型の膜蛋白質による情報伝達の仕組みを解き明かす基礎研究としても重要である。本研究ではSema6Cの細胞外ドメイン及び分子全体を高等動物細胞で大量発現、精製、結晶化及びX線結晶構造解析を目指す。平成17年度にSema6Cの細胞外ドメインについて、いろいろな発現系を試して、哺乳動物の培養細胞293Tを用いた系において恒常的な発現系の構築に成功しており、結晶化するために十分な量の蛋白質を得ることができた。さらに精製・結晶化条件の検討を行った。検討の結果、この蛋白質の微結晶を得ることができたが、X線結晶構造解析に必要な大きさの結晶を得ることはできなかった。またSema6Cの全長蛋白質の大量発現系を哺乳動物の培養細胞293Tで接着培養の一過性発現系と恒常発現系を構築し、発現をウエスタンブロッティングで確認した。平成18年度にSema6Cの細胞外ドメイン結晶化の条件に続く検討を行ったが、良質の結晶を得られなかった。Sema6Cの細胞外ドメインは分子量の約10%が糖鎖である。糖鎖は良質の結晶を得ることを困難にすると考え、糖鎖を切断した蛋白質が安定する条件を探し、糖鎖を切断した蛋白質を用いて結晶化条件の検討を行った。十分な量の全長Sema6C蛋白質を得るためには、全長Sema6C蛋白質の293T発現系の代わりに、バキュロウイルス発現系を構築し、Sf9昆虫細胞を使って、大量発現を行った。発現をウエスタンブロッティングで確認し、精製条件の検索を行った。Semap6Cは1回膜貫通型の膜蛋白質であるため、界面活性剤による可溶化条件の最適化等検討を行った。構造解析を行うために、精製の検討、結晶化条件の検討に取り組んだ。Semaphrin 6C (Sema6C)は1回膜貫通型の膜蛋白質で神経節の成長制御において重要な役割を果たしており、近年、創薬ターゲットとして大きな注目を浴びている。この膜蛋白質の構造解析は創薬という応用面のみならず、1回膜貫通型の膜蛋白質による情報伝達の仕組みを解き明かす基礎研究としても重要である。本研究ではSema6Cの細胞外ドメイン及び分子全体を高等動物細胞で大量発現し、精製、結晶化及びX線結晶構造解析を行うことを目的としている。平成17年度、Sema6Cの細胞外ドメインについては哺乳動物の培養細胞293Tを用いた系で恒常的な発現系の構築に成功し、1L当たり5mgのSema6Cを得ることができた。結晶化に十分な量の蛋白質を得ることができたため、目的蛋白質をさらに高純度に精製する方法及び結晶化条件の検討を行い、数種の条件で微結晶を得た。しかし、これらの条件をさらに幅広く条件検索したが、X線結晶構造解析を行うには十分な大きさではなかった。Sema6Cの細胞外ドメインは分子量の約10%の糖鎖を含むため、これが結晶化の妨げになっていると考えられた。したがって、酵素処理により糖鎖を切断した蛋白質を用いて結晶化条件の検索を行っているところである。Sema6Cの全長蛋白質については、293Tの浮遊細胞で恒常発現系を構築に成功した。発現もウエスタンブロッティングにより確認済みで、現在は精製条件の検索を行っている。Sema6Cは1回膜貫通型の膜蛋白質であるため、界面活性剤による可溶化条件の最適化が最も重要である。よって、数十種類以上の界面活性剤を用いてSema6Cの可溶化に最適な界面活性剤条件の検索を重点的に行っている。十分な量の全長Sema6C蛋白質を得るためには、全長Sema6C蛋白質の293T

発現系の代わりに、バキュロウイルス発現系を構築し、Sf9昆虫細胞を使って、大量発現を行った。発現をウエスタンブロッティングで確認し、精製条件の検索を行った。Semap6Cは1回膜貫通型の膜蛋白質であるため、界面活性剤による可溶化条件の最適化等検討を行った。構造解析を行うために、精製の検討、結晶化条件の検討に取り組んだ。
Barrel領野内局在型パルブアルブミン陽性ニューロンと視床－皮質間入力の関係

視床の後内側腹側核(Ventral posteromedial thalamic nucleus:以下VPM核)に順行性のトレーサーである、Biotinylated dextran amines (以下BDA)を微量注入したマウスを高濃度のグルタルアルデヒドを含む固定液を用いて灌流固定し、1次体性感覚野を含むCoronal sectionを作成し、Parvalbumin陽性GABA作動性インターニューロン(以下PVニューロン)を蛍光免疫染色で、BDAを蛍光ラベルで染色し、共焦点レーザー顕微鏡下で、PVニューロンの細胞体/樹状突起上に分布するBDA標識神経終末を観察した後で同一切片についてPVニューロンをDABで、BDAをDAB-Niで標識して可視化した後、電子顕微鏡観察用に脱水・包埋した。超薄切片を作成した後で、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した箇所を電子顕微鏡で観察した。共焦点レーザー顕微鏡観察でPVニューロン上に付着が認められたBDA標識ブトンSoma: 5個/ 6個、Dendrite: 6個/ 8個標的上でのシナプス形成を電子顕微鏡で確認した。さらに、同様の微量注入を行ったマウスについて、低濃度のグルタルアルデヒドを含む固定液で灌流固定し、上記と同様の切片を作成して、PVとBDAと併せて視床ー皮質間入力のマーカー蛋白である、Vesicular glutamatetransporter type2を蛍光免疫染色した。VGluT2の染色像が鮮明でBDAの標識が少数のBarrelを選択し、共焦点レーザー顕微鏡下で連続断層画像を取得して、NeurolucidaでPVニューロンとBDA標識終末を3次元的に再構築した。現時点では、視床のBarreloidからの入力はGap junctionで相互に結合しないType1 PV neuronを複数標的とする、ということが分かった。現在、他の研究課題を学術論文にまとめる作業や他の研究機関との共同研究に時間を取られているものの、本研究課題についての研究成果はおおむね順調に出てきているものと判断している。今後は、共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡を組み合わせたシナプス観察の例数を増やすことと、BDA標識神経終末のPVニューロンへの分布パターンとPVニューロン間で作られるGap junctionとの関係についての所見を得ることを予定している。平成30年度に購入予定であった、Neurolucida-Desktopワークステーションについて、他の購入物品や、旅費などの予算の都合がついた場合、次年度の交付金と併せて購入を検討したい。
磁場焦点法のNMRの局所スペクトロスコピ-への応用とエネルギ-代謝動態の無侵襲計測

本研究は被測定体内局所での精密測定法である磁場焦点法を高磁場・高分解能NMRに適用し、測定領域の限局精度、分解能、S/Nなどの技術的検討、及び各種臓器、疾患を対象にリンエネルギ-代謝動態の観察を通じて、本法の応用面を基礎的に明かにする目的で立案し、下記の成果を得た。1.既存FT-NMR装置(磁場強度6.3T、ボア径89mm)を用い、25mmφプロ-ブ外套に装着可能な巻数及び幅の異なる3組の円形軸対称コイル対による焦点磁場発生器(焦点領域直径6mm、磁場偏差15ppm)を設計・試作した。また、NMR装置からの制御パルスに同期する焦点磁場駆動・制御システムを構成した。2.前記焦点磁場発生器を用い、局所スペクトル測定のための基礎的検針を行った。微小試料による信号強度分布の測定より、焦点磁場を重畳することにより焦点領域のみからの信号が観測できること、駆動電流の増加により焦点領域を縮少可能なことを明かにした。また焦点領域中心にHMPA、その周囲にリン酸を置いたファントムを用い、焦点磁場の重畳によりS/Nは1/12に低下するが、焦点領域中心のHMPAの信号だけを観測できること、またピ-クの半値幅は約6倍に拡がるが、生体内リン化合物による信号の識別は可能なことを明かにした。3.本法の応用面を開拓するために、リンエネルギ-代謝面から各種臓器の機能を解析した。まずLangendorff法で正常及び甲状腺機能低下症ラットの摘出潅流心を用い、心周期内各種高エネルギ-リン酸化合物の変動を観察した。次でGAL急性肝障害ラットを作成し、摘出潅流法で進行過程におけるリンエネルギ-代謝動態を解析するとともに、フルクト-ス負荷による肝機能評価の可能性を明かにした。更にラットガラクト-ス白内障形成過程における眼内リン酸化合物の動態についても検討し、本法の有用性を基礎的に明かにした。
全固体アルカリ金属電池を実現するための固体界面デザイン

金属Li、もしくは金属Na電極ー固体電解質間の固体界面の構築に取り組んだ。Li / Li3PS4電解質界面近傍においてのみ、電解質の一部が還元分解されることがわかった。界面へAu薄膜を挿入し、100oCで作動させることによって、Liの溶解・析出挙動が著しく改善することがわかった。一方、Na-Sb / Na3PS4界面を有する全固体セルが可逆に充放電することを明らかにし、PLD法を用いたNa3PS4電解質薄膜の成膜条件を確立した。本研究では、全固体アルカリ金属電池の実現にむけて、金属Li電極ー固体電解質間の固体界面を構築し、微細組織観察や構造解析を行った。Li/Li3PS4電解質界面付近の構造をSEMとXPSを用いて調べた。界面付近の断面SEM像から、界面において組成変化のコントラストや形態変化が見られないことがわかった。一方、S2pおよびP2p XPSスペクトルの結果から、界面近傍においてのみ、Li2SやLi3Pの存在が確認され、金属LiによってLi3PS4の一部が還元されていることがわかった。Li/Li3PS4間にバッファ層として60nm厚のAu薄膜を挿入した場合においても同様に、界面において還元分解生成物の存在が確認された。どちらの場合も界面における還元分解生成物層は薄く、長期間にわたって安定に存在することが示唆された。また全固体Li対称セル(Li/Li3PS4/Li)を100°Cにおいて定電流サイクル試験を行ったところ、室温作動時と比較して、Liの析出・溶解挙動が著しく改善することがわかった。界面におけるLiの析出形態をSEMにより観察したところ、室温で作動させた際には突起したLiの析出が観察されたのに対して、100°C作動時には表面の凹凸が抑制されていることがわかった。界面へAu薄膜を挿入した対称セル(Li/Au/Li3PS4/Au/Li)は、Auを挿入していない場合と比較して約4倍大きな1.4 mA cm-2の電流密度においても、リチウムの析出・溶解を繰り返し行えることがわかった。以上の結果から、作動温度や界面バッファ層の挿入によって、リチウムの利用率を向上させることができた。本年度の研究において、界面におけるLi析出・溶解時の形態変化が、リチウムの利用率に大きく影響することがわかった。界面の形態は、作動条件や界面バッファ層の有無によって変化することが明らかになった。また界面評価手法として、深さ方向XPS測定の条件を確立した。今後、様々なバッファ層を挿入した際の界面の形態や構造を調べていくことによって、Liの利用率向上に適した界面を見出すことができると考えられる。よって、本研究は順調に進行していると判断する。全固体ナトリウム電池へのNa金属電極の適用に向けて、Na3PS4固体電解質との界面安定性について調べた。全固体対称セル(Na/Na3PS4/Na)を作製したところ、保持時間の経過に伴ったセル抵抗が増加し、Na3PS4の一部が還元分解していることがわかった。昨年までのLi金属界面修飾の検討結果を基にして、Na金属/Na3PS4界面に対してAu薄膜の挿入を行ったが、セル抵抗の増加が同様にみられ、Au薄膜の挿入では還元分解が抑制できないことがわかった。Na3PS4との安定な界面形成にむけて、Na-Sb合金負極(作動電位は約0.6 V vs. Na)に着目した。NaとSbとKetjen Blackを出発原料に用い、Na-Sb合金のメカノケミカル合成を行ったところ、仕込み組成に対応したNaSbおよびNa3Sb合金相が得られた。全固体対称セル(Na-Sb/Na3PS4/Na-Sb)を作製したところ、セルは室温で繰り返し充放電が可能で、330 mAh g-1の容量を10サイクルの間、安定に保持した。よって、Na-Sb合金が全固体ナトリウム電池用の金属負極として有望であることを明らかにした。ナトリウム金属電極との理想的な接合界面の形成を目的として、パルスレーザー堆積法を用いたNa3PS4電解質薄膜の成膜条件について調べた。KrFエキシマレーザを用いて、数ミクロン厚の緻密なアモルファス薄膜を作製することができた。ICPおよびラマン分光法の結果から、得られた薄膜の組成はNa3PS4と考えられる。薄膜は200°Cで熱処理することによって結晶化し、導電率が増大した。熱処理後の薄膜は3.5×10-5 S cm-1の室温導電率と45 kJ mol-1の伝導の活性化エネルギーを示し、ナトリウムイオン伝導性を示す電解質薄膜を得ることに成功した。Liの利用率向上に適した固体界面形成を目的として、界面に挿入するバッファ層の種類や厚みを検討するだけでなく、固体電解質の組成や形態がLiの析出・溶解挙動に与える影響についても調べる。

界面評価は、XRDやRaman、SEM、XPSなどの構造解析手法に加えて、交流インピーダンス法による抵抗分離に取り組む。また全固体金属ナトリウム電池の構築に向けて、Na/Na3PS4界面の構造とNaの析出・溶解挙動の相関について調べ、作動条件やバッファ層の挿入による特性改善について検討する。最終的には、LiとNaが析出・溶解する際の界面挙動を比較することによって、それぞれのアルカリ金属界面における支配因子を見出し、界面の設計指針を提案したい。無機材料化学
感染歯髄保存のための新抗菌性生体親和性材料の開発並びにその修復技法の確立

基礎的研究としては、第一に、う蝕象牙質中の細菌についてこれまで分類されてきた菌種からDNAレベルで一層詳細に属まで検討を行い、新しい分類を明らかにした。すなわち「16S-γDNT RCR-RFLP分析によるPseudoramibacter alactolyticusの遺伝学的多様性」の研究を行い、今後はそれらのう蝕患部における作用についての研究の一層の発展が期待される。第二には、化学療法剤が細菌におよぼす効果に対するバイオフィルムの影響についての研究を行った。すなわち、「共焦点レーザー顕微鏡を用いたPseudomonas aeruginosa biofilmの観察と解析」の研究により、これまである種の細菌に特異的に有効であると考えられてきた抗生物質が細菌の作り出すバイオフィルムの在存下では、その効果が著しくさまたげられることが明らかになった。第三には、修復象牙質形成過程における細胞分化のメカニズムを検討するための基礎的研究として、歯の発生過程を調べ、マウス歯胚におけるラミニン-5とインテグリンの発現と局在の研究を行い充分な成果が得られた。第四には、感染歯髄保存のための抗菌的歯髄保護修復後の窩洞の再感染を防止し、長期にわたってその機能を維持するために、修復材料の研究としてフッ素含有諸修復材による歯質強化のための各種研究などを行った。すなわち、フッ素含有コンポジットレジンボンディング剤や同コンポジットレジンセメントあるいはグラスアイオノマーセメントからのフッ素の溶出、歯質への取り込みおよび歯質の耐酸性の強化などを調べ、それらが歯質の強化による再感染防止に効果的であることが判明した。また、臨床研究では、前年からの試作新抗菌性生体親和性薬剤による感染象牙質、感染歯髄保存のための治療法をボランティアにより継続し、好成績を得ている。本年度は、交付申請書に記した研究実施計画に従って研究を進めてきた。まず、基礎実験については、本年度備品として購入したDNA sequencerシステム及びパルスフィールド泳動が可能なCHEF Mapperシステムを用いて感染歯髄他、う触患部の細菌の検索を行い、すでに、従来発見されていなかった新たな数種の細菌を明らかにし、その同定を行うと共に、それらの菌の臨床的対処法の検討を続けている。また、同じく本研究費にて購入した蛍光顕微鏡を用いて、歯髄内の各種条件下での被蓋硬組織形成のための細胞の動向についての免疫組織学的検討を行い、極めて興味のある知見を得ている。一方、本研究班員らがすでにこれまで明らかにしてきたう触患部の細菌の圧倒的多数をしめる偏性嫌気性菌に対して特異的に有効な抗菌剤・メトロニダゾールについては、これまですでに報告してきた生体親和性材料であるαTCP以外の各種歯科用材料に加えた場合の抗菌効果、その持続性、材料の物性の変化などについて研究を進め、臨床使用上充分な効果が得られる可能性を明らかにしている。また、この他にも各種関連研究を続けている。臨床実験については、本研究班員らがすでに試みてきた抗菌性材料についてのボランディアによる臨床観察を続けており、良好な結果が得られている。その他、臨床上各種症例へ応用するために、各種修復材料に加えてその効果について臨床成績を継続的に調べており、いづれもその有効性が確認されている。本年度は、交付申請書に記した研究実施計画に従って研究を進め、以下のような成果が得られた。まず、基礎的研究としては、第一に、う蝕による歯髄反応を検索する目的で、特にその免疫応答について観察した結果、う蝕病巣直下の歯髄組織に抗原提示細胞(HLA-DR陽性細胞)と神経線維とが集積し、互いに密接に関連して観察され、歯髄組織修復との関連性が示唆された。

第二に、歯の発生過程と修復象牙質形成過程における細胞分化のメカニズムと基底膜の機能を比較する目的で、歯の発生過程における基底膜構成成分ラミニン-5の発現と局在した結果、ラミニン-5は発生時期に特異的な発現パターンを示すこと、また細胞分化の過程で基底膜構成成分の変化が起こることが明らかにされた。第三に、生体親和性直接覆髄材・αTCPに、感染歯髄等に存在する細菌の圧倒的多数を示す偏性嫌気性菌に特異的に有効な抗菌剤を加えて、ボランティアの抜去適応歯に直接覆髄を行い、被蓋硬組織形成時に現れる糖タンパクであるフィブロネクチンなどを特殊染色法により検討し、その形成メカニズムの解明を試みている。第四には、特殊技法により、慢性感染病巣作製のモデルを確立し、その病理組織免疫学的検討を行った。第五には、病巣無菌化後の再感染を防止するための接着性、抗菌性修復材料の検討のために、新しく開発された接着性コンポジットレジンレジン用フッ素含有ボンディング剤からのフッ素の溶出、歯の組織への取り込み、酸抵抗性の強化などの研究を行い、その有効性を明らかにした。また、臨床研究としては、前年からの試作新抗菌性生体親和性材料による感染象牙質、感染歯髄保存のための治療法をボランティアにより継続し、好成績を得ている。本年度は、交付申請書に記した研究実施計画に従って研究を進め、以下のような成果が得られた。まず、基礎的研究としては、第一に、う蝕象牙質中のある種の細菌についてこれまで分類されてきた菌種からDNAレベルの検討により属まで分類を可能にした。すなわち「16S-γDNT RCR-RFLP分析によるPseudoramibacter alactolyticusの遺伝学的多様性」の研究を行い、今後それらのう蝕患部における作用についての研究の発展が期待される。第二には、化学療法剤が細菌におよぼす効果に対するバイオフィルムの影響についての研究を行った。すなわち、「共焦点レーザー顕微鏡を用いたPseudomonas aeruginosa biofilmの観察と解析」の研究により、これまである種の細菌に特異的に有効であると考えられてきた抗生物質が細菌の作り出すバイオフィルムの在存下では、その効果が著しくさまたげられることが明らかになった。その他、修復象牙質形成過程における細胞分化のメカニズムを検討するための基礎的研究として、歯の発生過程を調べ、マウス歯胚におけるラミニン-5とイシテグリンの発現と局在の研究、歯髄保護修復後の再感染を防止するためのフッ素含有諸修復材による歯質強化のための各種研究などを行い、多くの成果を上げた。また、臨床研究では、前年からの試作新抗菌性生体親和性薬剤による感染象牙質、感染歯髄保存のための治療法をボランティアにより継続し、好成績を得ている。
チャネリングイオンを用いた非晶質表面上への二次元人工結晶格子の作製

基板の張り合わせとエッチングにより、100nm(100)Si/25nmSiO_2/(110)Si構造の試料を作製し、これにイオン注入装置で、加速エネルギー180KeV、ド-ズ量5x10^<15>cm^<-2>の条件にて、Ne^+イオンを(100)Si層にチャネリングさせてSiO_2層に照射した。その結果、以下の結論を得た。1.イオン注入装置の試料ホルダーと試料との間に低熱伝導材料であるマイカを挟んでイオン注入を行い、その試料のRBSスペクトルを測定したとこ、SiO_2の酸素のアラインスペクトルとランダムスペクトルの後方散乱収率の比チャネリング収率χが68%という値を得た。これは、SiO_2中にコリメータ層である10nmSi層の<100>軸方向に沿って酸素原子の密度の少ない領域が形成されていることを示唆している。また、マイカを挟まないものは、χが約83%程度であった。このことは、マイカを挟むことによりイオンビームによる試料の加熱が促進されて、イオンビームによる(110)Si基板表面結晶の破壊が抑えられ、その結果、その領域でのNe^+の後方散乱粒子の数が減少し、構造変化したSiO_2層の破裂が抑制されたもとの推測される。2.この結果に基づき、X線回折法によりSiO_2層内の周期構造の存在を検証したところ、コリメータ層の面間隔に相当する2θの角度にSiO_2層からピークが観測された。但し、このピークは、コリメータ層の結晶軸に対して35°傾斜しており、その原因については、まだよく分っていない。これらのことから、チャネリングオンを用いることにより非晶質であるSiO_2層中に2次元人工格子が形成されたものと考えている。
水素利用固体高分子型燃料電池におけるミクロ輸送機構の解明

次世代自動車用動力源として期待の高まる固体高分子型燃料電池であるが,その大量導入を達成するためには高性能化・低コスト化の実現が必須となる.本研究では燃料電池内での根本的な現象である原子スケールでの物質輸送現象を解明し,それらの知見に立脚した設計指針を提案することを目的として研究を遂行した.昨年度では,電池性能に多大な影響を与えるカソード側Pt触媒のCu, Ni, Co, Feによる合金化により,触媒の高活性化が実現できることを発見した.しかし合金化による高活性化のメカニズムに関しては不明であった.本年度では,触媒能の本質となる電子構造まで定量的に解析することが可能な第一原理分子動力学法を適用し,カソード触媒反応機構と合金効果の解明を行った.有限温度での第一原理分子動力学法を用い,原子スケ-ルでの界面反応経路は,O_2→O_2(ad)→HO_2(ad)→H_2O_2(ad)→H_2O(ad)+OH(ad)→2H_2O(ad)→2H_2Oとなることが明かとなった.さらにこれらの反応経路に対してポテンシャルエネルギーを算出したところ,Pt上においては最終過程のH_2O(ad)の脱離過程が0.73eV(実験値0.65eV)という最大のポテンシャル障壁を有することが判明し,OH(ad)等に代表される酸化種による被覆率の増大が反応速度を低減させる可能性が指摘された.また,Pt-X(X=Cu, Ni, Co, Fe)合金上においてはH_2O(ad)の脱離過程のポテンシャル障壁が0.15eV程度も低下する現象が発見され,これらの合金上においてカソード反応速度が増大する要因が,H_2O(ad)の脱離促進による被覆率の低下によるものであることが判明した.以上から,合金化による反応活性の増大のメカニズムが明らかになると共に,高活性カソード触媒の開発にとってH_2O(ad)・触媒間相互作用の低下が重要であると言う設計指針を得た.次世代自動車用動力源として期待の高まる固体高分子型燃料電池であるが,その大量導入を達成するためには高性能化・低コスト化の実現が必須となる.本研究では燃料電池内での根本的な現象である原子スケールでの物質輸送現象を解明し,それらの知見に立脚した設計指針を提案することを目的として研究を遂行した.昨年度では,電池性能に多大な影響を与えるカソード側Pt触媒のCu, Ni, Co, Feによる合金化により,触媒の高活性化が実現できることを発見した.しかし合金化による高活性化のメカニズムに関しては不明であった.本年度では,触媒能の本質となる電子構造まで定量的に解析することが可能な第一原理分子動力学法を適用し,カソード触媒反応機構と合金効果の解明を行った.有限温度での第一原理分子動力学法を用い,原子スケ-ルでの界面反応経路は,O_2→O_2(ad)→HO_2(ad)→H_2O_2(ad)→H_2O(ad)+OH(ad)→2H_2O(ad)→2H_2Oとなることが明かとなった.さらにこれらの反応経路に対してポテンシャルエネルギーを算出したところ,Pt上においては最終過程のH_2O(ad)の脱離過程が0.73eV(実験値0.65eV)という最大のポテンシャル障壁を有することが判明し,OH(ad)等に代表される酸化種による被覆率の増大が反応速度を低減させる可能性が指摘された.また,Pt-X(X=Cu, Ni, Co, Fe)合金上においてはH_2O(ad)の脱離過程のポテンシャル障壁が0.15eV程度も低下する現象が発見され,これらの合金上においてカソード反応速度が増大する要因が,H_2O(ad)の脱離促進による被覆率の低下によるものであることが判明した.以上から,合金化による反応活性の増大のメカニズムが明らかになると共に,高活性カソード触媒の開発にとってH_2O(ad)・触媒間相互作用の低下が重要であると言う設計指針を得た.
リンパ球ホーミングを阻害する抗糖鎖抗体を用いたアレルギー疾患治療法の確立

本研究者が樹立した抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体(S2)を野生型マウスに投与すると、鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングが阻害され、アレルギー性鼻炎の症状が抑制することが明らかとなっている。本年度は引き続き、S2がアレルギー性鼻炎を抑制するメカニズムについて解析を行った。S2は末梢リンパ節および鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングを著しく抑制し各リンパ組織を構成するリンパ球数を減少させ、免疫応答を低下させる。さらに(卵白アルブミン)OVAを抗原とし野生型マウス(C57BL/6)に投与し、作製したアレルギー性鼻炎モデルマウスにS2を投与すると、抗体のクラススイッチに重要なサイトカインであるインターロイキン-13の発現を低下させ、また免疫抑制のサイトカインであるインターロイキン-10の発現を増加させることが明らかとなった。以上より、S2を投与することでIgEへのクラススイッチが抑制されるとともに、鼻咽頭関連リンパ組織内が免疫抑制性の環境となることで、アレルギー性鼻炎が抑制されたと考察された。インターロイキン-10は免疫抑制性のT細胞である制御性T細胞が産生するサイトカインとして知られる。そのためS2投与後の制御性T細胞の割合を再解析したところ、S2を投与した群では制御性T細胞以外のリンパ球ホーミングは抑制されるが、制御性T細胞のホーミングは抑制されないことがFACS解析及び逆転写q-PCRにより明らかになった。リンパ球ホーミングはリンパ組織内の高内皮細静脈上に発現する硫酸化糖鎖にリンパ球上のLーセレクチンが結合することで開始される生体内防御機構である。これまでに本研究者は、鼻腔由来の抗原に応答するリンパ組織である鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)へのリンパ球ホーミングには、上述の硫酸化糖鎖が必須の役割を果たすことを硫酸基転移酵素欠損マウスを用いた解析により報告してきた。硫酸基転移酵素欠損マウスではNALTへのリンパ球ホーミングが抑制されるとともに、アレルギー性鼻炎などのアレルギー反応が抑制されることが明らかとなっている。本研究では新規に樹立した抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体(S2)を用いて、リンパ球ホーミング阻害に基づくアレルギー症状の抑制・緩和が可能であるかについて検証を行った。S2抗体はマウスIgM抗体であるため、マウスを用いた網羅的な解析には抗体の標識が必要不可欠である。そのため、解析に必要なモノクローナル抗体の腹水化、精製、Biotin/AlexaFluor等の標識を行い、フローサイトメトリー及び免疫組織染色により抗体活性の確認を行った。またS2抗体は6-sulfo-sialyl Lewis Xと呼ばれる硫酸化糖鎖構造を特異的に認識するIgM抗体であり、IgGとは異なる血中動態を示すことが予測される。そこで具体的な抗体の投与量、投与期間、投与経路、半減期、組織への集積などビオチン化S2抗体を用いたELISAにより解析を行った。解析の結果、S2抗体の単回投与後に投与経路違いによる半減期の違いが尾静脈/腹腔投与で確認された。以上より、ビオチンS2抗体を検出するELISA法は確立されてはいるが、組織へのS2抗体の蓄積などさらなる解析が必要であると思われる。年度末に本申請者の所属移動があり、若干の遅れが生じている。当初予定していたS2抗体の動態に関する研究を速やかに進める必要があるが、解析系は既に樹立出来ていることから遅れを取り戻すことができると思われる。本年度は、新規に樹立した抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体(S2)を用いて、リンパ球ホーミング阻害に基づくアレルギー症状の抑制・緩和が可能であるかについて検証を行った。まず始めに、ビオチン標識したS2を野生型マウスに投与し血中濃度を解析すると、急速な血中濃度の減少が見られた。静脈・腹腔投与等の投与経路に関わらず抗体濃度の減少は見られたことから、マウスIgMであるS2特異的な現象であるのかについてさらなる解析が必要である。腹水より精製したS2を野生型マウスに投与し、OVA(卵白アルブミン)投与モデルマウスにおけるアレルギー性鼻炎の抑制効果を検討したところ、OVA特異的IgEの産生低下が認められた。またOVAに対するマウスのくしゃみや鼻かき行動の回数も優位に抑制されたことから、S2はアレルギー性鼻炎を抑制できることが示唆された。さらにアレルギー性鼻炎を抑制するメカニズムについて解析を行ったところ、Th2サイトカインの産生が抑制されること、S2を投与した野生型マウスのNALTでは制御性T細胞の割合に変化ないことが分かった。これら結果から、S2投与後の野生型マウスで見られたアレルギー抑制効果は、S2投与によるリンパ球ホーミング阻害により、NALTを構成する免疫細胞数が減少し免疫抑制が起こったためと推測された。さらに免疫系を抑制する制御性T細胞の割合に変化が見られなかったことから、制御性T細胞が産生するサイトカインが免疫抑制をしている可能性が示唆された。所属研究機関変更後のセットアップ等に時間がかかり、実験系の確立に若干の遅れが生じているため。これまでの解析により、抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体(S2)を野生型マウスに投与すると、鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングを阻害することでアレルギー性鼻炎が抑制することが明らかとなっている。そこで本年度は、S2がアレルギー性鼻炎を抑制するメカニズムについて解析を行った。

S2は末梢リンパ節および鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングを著しく抑制することにより各リンパ組織を構成するリンパ球数を減少させ、免疫応答を低下させる。さらにOVAを抗原とし野生型マウスに投与し作製したアレルギー性鼻炎モデルマウスにS2を投与すると、抗体のクラススイッチに重要なサイトカインであるインターロイキン-13の発現を低下させ、また免疫抑制のサイトカインであるインターロイキン-10の発現を増加させることが明らかとなった。以上より、S2を投与することでIgEへのクラススイッチが抑制されるとともに、鼻咽頭関連リンパ組織内が免疫抑制性の環境となることで、アレルギー性鼻炎が抑制されたと考察された。インターロイキン-10は免疫抑制性のT細胞である制御性T細胞が産生するサイトカインとして知られる。そのためS2投与後の制御性T細胞の割合を再解析したところ、S2を投与した群では制御性T細胞以外のリンパ球ホーミングは抑制されるが、制御性T細胞のホーミングは抑制されないことがFACS解析及び逆転写q-PCRにより明らかになった。所属研究機関の変更により実験系の確立に若干の遅れが生じているため。本研究者が樹立した抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体(S2)を野生型マウスに投与すると、鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングが阻害され、アレルギー性鼻炎の症状が抑制することが明らかとなっている。本年度は引き続き、S2がアレルギー性鼻炎を抑制するメカニズムについて解析を行った。S2は末梢リンパ節および鼻咽頭関連リンパ組織へのリンパ球ホーミングを著しく抑制し各リンパ組織を構成するリンパ球数を減少させ、免疫応答を低下させる。さらに(卵白アルブミン)OVAを抗原とし野生型マウス(C57BL/6)に投与し、作製したアレルギー性鼻炎モデルマウスにS2を投与すると、抗体のクラススイッチに重要なサイトカインであるインターロイキン-13の発現を低下させ、また免疫抑制のサイトカインであるインターロイキン-10の発現を増加させることが明らかとなった。次年度以降は、S2抗体投与マウスで見られたアレルギー症状の抑制はどのようなメカニズムに基づくものなのか、NALTリンパ球サブセットの動態変化やサイトカインの発現解析に着目した解析を進める。硫酸基転移欠損(DKO)マウスで見られたアレルギー症状抑制の要因として、NALTへのリンパ球ホーミング抑制の他、Foxp3+制御性T細胞(Treg)のホーミングには硫酸化糖鎖以外にCD44/ヒアルロン酸(HA)、PSGL-1/P-セレクチンの接着が関与するため、DKOマウスではFoxp3+Tregの数が野生型マウスと同数であることが明らかとなっている(Ohmichi and Hirakawa, J. Exp. Med., 208:1015, 2011)。
ホタテ貝殻焼成粉末の口腔内細菌に対する抗菌作用

目的主成分が炭酸カルシウム(CaCO_3)であるホタテの貝殻は、焼成することにより抗菌活性を有する酸化カルシウム(CaO)になることが知られている。さらに、CaOは食品添加物として人体に影響を及ぼさないことが厚生労働省によって報告されている。これらのことから、われわれは、焼成したホタテ貝殻粉末を含有した義歯を作製することで、義歯自体に抗菌機能を付与することが可能ではないかと考えた。本研究では、義歯への抗菌機能付与を目的に、まず、焼成ホタテ貝殻粉末の物性評価と口腔内抗菌性評価をもとに、臨床応用の可能性を検討する。材料と方法1用いる焼成ホタテ貝殻粉末の特性評価焼成ホタテ貝殻粉末(酸化カルシウム)の結晶相を調べるためにXRD測定を行い、走査型電子顕微鏡(SEM)によって粒子サイズや形状を観察した。また、精製水に焼成ホタテ貝殻粉末を0・0.1・1.0・2.5・5.0質量%添加したpHの測定を行った。2抗菌試験唾液検査キット、デントカルトSM(ミュータンス連鎖球菌)、デントカルトLB(ラクトバチラス菌)、カンジダ菌検出用簡易試験薬(ストマスタット)を用いて、細菌培養を行いコロニー数の確認を行った。すべての抗菌試験後、細菌数測定装置(細菌カウンタ)を用いて細菌測定を行った。考察・結論今回使用した市販の焼成ホタテ貝殻粉末のXRD測定の結果、CaOのピークが認められた。このことは、今回使用した焼成ホタテ貝殻粉末は抗菌効果を示すCaOを含んでいることを示している。口腔内細菌抗菌試験では、焼成ホタテ貝殻粉末の質量%が高いほど強い抗菌効果が認められた。このことから、焼成ホタテ貝殻粉末のCaOが口腔内細菌に対しても抗菌作用を示すことが分かった。よって、われわれの目標とする焼成したホタテ貝殻粉末を含有した義歯を作製することによって、義歯自体に抗菌機能を付与することが可能であると考えられる。
現代日本語の話しことばに現れる「言い直し表現」の体系化に関する研究

本研究では、現代日本語の話しことばに現れる言い直し表現を大量に収集し、その体系化と実態調査を行うことを目的とする。本年度は、『日本語話し言葉コーパス(CSJ)』に対して言い直し表現のアノテーション作業を実施した。CSJに含まれる自発音声199講演(約50万語分)を観察し、6,722個の言い直し表現を人手で抽出した。これらの言い直し表現について、形態的・機能的な観点から分析を行ったところ、以下の5つの機能的な類型に分類できることが分かった。自発的な話し言葉に現れる言い直し表現は、これらの類型によって体系付けることができる。1.発音エラーに伴う言い直し2.単純な繰り返し3.語彙的な誤りに伴う言い直し4.情報不足に伴う言い直し5.別表現への言い換えさらに、CSJに付与されている種々の言語外要因に関するデータと言い直し表現の出現傾向の関係について、分析を行った。例えば、講演に対する話者の意識(得手・不得手)と言い直し表現の出現傾向を分析したところ、一般的なスピーチ(「模擬講演」)では、自分は講演が不得手だと答えた話者ほど言い直し表現が頻出していることが分かった。一方、各種学術学会での発表(「学会講演」)では、得手と答えた話者でも言い直し表現が頻出している場合が多く、話者の意識と行動とにずれが生じていることが確認された。本研究では,現代日本語の話しことばに現れる言い直し表現を大量に収集し,その体系化と実態調査を行うことを目的とする。本年度は,言い直し表現の認定基準に関する検討,およびアノテーション方法の設計を行った。まず,言い直し表現に関する国内外での先行研究を網羅的に調査し,情報収集およびサーベイを行った。次に,『日本語話し言葉コーパス(CSJ)』から30講演を無作為に選び,分析を行った。講演音声を聴取しながら転記テキストを読み進め,言い直し表現およびそれに付随する現象を発見したら,その範囲をマークすることとした。この時点では厳密なアノテーションは考えず,言い直しに関連する現象を網羅的に収集することに主眼を置いた。この分析が終了した時点で,マークされた言い直し表現を収集・整理し,言い直し表現が果たしている機能という点から,考察を行った。その結果,言い直し表現は次の2種類に大別できることを確認した。1.言い誤りに伴う言い直し2.言い換えのための言い直し1.は発音エラーや言い間違いなどを訂正するための言い直しで,2.はある語や表現を意図的に別の語や表現に意図的に言い換えるための言い直しである。これらの違いを言い直し表現の大区分とした上で,アノテーション方法の設計を行った。具体的には,言い直し表現を「(被言い直し部|編集表現|言い直し部)」という形で記述することにした。また先行研究では行われていない試みとして,その言い直し表現の種類に応じて個別のタグを付与することにした。次の例の「E」は,言い誤りに伴う言い直し表現であることを意味する。私も実際には(E七歳の時|(Fあ)|八歳の時)からスキーに連れてってもらったんですけれども来年度は,設計されたアノテーション手法に基づいて,CSJに現れる言い直し表現の収集と記述を行う。また,形態的・機能的な類型に着目し,言い直し表現の分析と実態調査を行う。
適応的セマンテックWebの構築技術の研究

セマンテックWeb上の高度な処理を正確かつ高速に行うプログラムを、適応的に自動生成する技術を研究した。セマンテックWebにおける質問応答問題を一般的にかつ厳密に定式化し、それを等価変換で解く手続きを開発した。適応的なセマンテックWebを実現するために、正当で高速なプログラムを自動的に構築する方法を研究し、ルール生成に基づくプログラム生成システムの強化を行った。これらにより、適応的なセマンテックWebを実現するための基礎技術を得た。セマンテックWebサービスについて研究し、本研究で達成すべきシステムの構造を探求した。それに基づいて次のように研究を進めた。(A)Webサービスの基礎には、XMLやSOAPなどによるコミュニケーションの部分があるが、それらを適切に隠蔽することが、本研究のような高次の情報処理を扱うために必要である。そこで、XMLやSOAPなどに関するいくつかの組み込み述語を開発した。たとえば、[1]S式で示された質問内容をSOAPメッセージにしてWebサービスへ送信し、Webサービスの実行によって得られる答えをSOAPメッセージとして受信し、答えをS式の形で得るビルトイン、[2]リクエスタが送信してきたSOAPメッセージを受信し、S式に変換するビルトイン、[3]S式をSOAPメッセージに変換し、リクエスタに返信するビルトイン、などである。これにより、セマンテックWebサービスの実現は、文字列などの低次のデータ構造(XML,SOAP)から解放された。すなわち、1つのコンピュータの中での1つのETプログラムの高速化とルール生成などに基づく適応技術が実現できれば、それを直ちにインターネットを介して行われるWebサービスに(変換して)適用できる。(B)Webサービスの記述と認識のために、記述論理について研究し、論理構造を扱う一般理論の構築が進められた。これは、等価変換による計算理論との統合を目指して、論理による表現理論を一般的に構築するものであり、「Webサービスをいかに表現し、いかに発見し、いかに計算するか(高速に、適応的に)」の全体系を支える理論になる可能性がある。セマンティックWebの基礎理論について研究し、本研究で達成すべきシステムの構造を探求した。セマンティックWebのオントロジーを基礎付ける有力な理論はDL(記述論理)である。現在、DLにルールを導入する課題が大きな焦点になっている。すなわち、「DLを拡張して、ルール型の質問応答を行い、与えられた論理式を満たす解をすべて高速に求めるにはどのような理論体系にすればよいか」という問題である。この解決方法は、今後のセマンティックWebの技術の方向を大きく左右する可能性がある。本年度は、これに関連して次のような項目を研究した。(A)DLを明確に捉えるために、論理構造に関する一般理論を構築した。DLは1つの論理体系であるが、一階述語論理とは異なる体系になっているために、わかりにくい面がある。そもそも一階述語論理やDLなどの論理構造を統合的に捉える枠組みが確立していないのは大きな問題である。そこで、「特殊化システム上の一般論理構造の理論」を構築した。これは、いろいろなデータ構造を対象とする論理構造を、特殊化システムというパラメータによって共通に捉え、汎用の論理学を建設しようという試みである。(B)この結果DLは、ある特定の特殊化システム上の論理構造とみなせることが証明された。また、DLのタブロー法による証明が、より一般的な視点から、等価変換に基づく計算としてとらえられた。これらにより、DLとruleの問題をも新たな枠組みで考察することができるようになった。そこで、DLにおける質問応答問題の定式化とその解法について、研究を進めている。これによって、「セマンティツクWebにおいて、知識をいかに表現し、いかに質問に答えるか(高速に、適応的に)」に対するより深い理論を得る可能性がある。セマンティックWebのオントロジーを基礎付ける有力な理論DL(記述論理)とルールを結びつける課題は、この分野の懸案となっている。(A)DLを明確に捉えるために、論理構造に関する一般理論をすでに構築したが、今年度はこれを発展させて、与えられた論理構造を拡張する方法の研究を行った。1つの論理構造を用いて与えられた論理的な問題を解く場合に、その論理構造を含む拡大された論理構造の中で計算することによって、より効率的な計算を得ることが期待できる。そのため、論理構造を安全に拡大する技術が重要である。本年度はこれを解決する理論を構築した。(B)論理構造の上に表現された論理的問題を解決する方法を研究した。従来のPrologのような問題は閉世界問題と呼ばれ、開世界の問題である一般の論理的問題とは区別される。本研究では、開世界問題を高速に解くためのアルゴリズムを目指して、等価変換べースの解法の可能性を模索した。はじめに、仮定

アトムを用いる方法を考案し、実験システムを実装し、実験を行った。これにより多くの問題が解けることが確認された。しかし、大きな問題に対しては探索量の増加が起こるなどの難点が発見された。現在は、仮説アトムを使わない等価変換べースの解法を考案し、実験と証明を進めている。これらにより、「DL+ルール」の問題は、等価変換の方法で解ける見通しとなっている。これにより、「セマンティックWebにおいて、知識をいかに表現し、いかに質問に答えるか(高速に、適応的に)」に対するより深い理論と実用的な技術を得る可能性がある。セマンテックWeb上の高度な処理を正確かつ高速に行うプログラムを、適応的に自動生成する技術を研究し、真に適応的なセマンテックWebを実現する基礎を作るのが研究の目的である。セマンテックWebにおける質問応答問題を一般的にかつ厳密に定式化した。さらにそれを等価変換で解く手続きを開発した。記述論理で書かれた質問応答問題を述語論理で書かれた形に変換し、さらにスコーレム化して節形式で書かれた問題に直す。それからトップダウンあるいはボトムアップの計算を行うルールを生成し、そのルールで変換することによって問題を解決する方式を提案し実験でその有効性を示した。従来の研究との大きな違いの1つは、スコーレム化の部分である。従来のスコーレム化は論理式の意味を保存しないので、質問応答問題を正しく解くための基礎として不十分である。本研究では「意味保存スコーレム化」という新たなスコーレム化アルゴリズムを提案し、その問題を解決している。さらに、適応的なセマンテックWebを実現するために、正当で高速なプログラムを自動的に構築する方法を研究した。(1)ルール生成の基礎理論の改善、(2)ルール生成システムの再構築と高遠化、(3)例に導かれたルール生成方法の確立、などによりルール生成に基づくプログラム生成システムの強化を行った。特筆すべきは、「論理等価式」を経由してルールを自動生成する方法と、その基盤となる理論を新たに創始したことである。これを使うことにより、これまで生成できなかった難易度の高いプログラムの自動構築ができることを例で示した。
アブシジン酸アナログを用いたアブシジン酸8'位水酸化酵素の機能解明

植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼであるABA8'-水酸化酵素(CYP707A)によって代謝不活性化される。様々な植物に存在するCYP707Aは内生ABA量を調節する重要な酵素であり、この酵素の阻害剤によって内生ABA量が高められた植物体は乾燥耐性が高くなる。そこでより効果的なCYP707A阻害剤を開発するために、さまざまな分子プローブを用いて酵素のリガンド認識を明らかにした。またin vitroの阻害剤試験に用いるリコンビナントCYP707A3の大量調製及び変異酵素を作製するために、大腸菌による酵素の発現系を確立した。前年度に合成した特異的酵素阻害剤AHI1及びその構造異性体の酵素阻害能から、ABAの6員環に相当する領域に酸素官能基が存在しないABAアナログは、側鎖の配向や不斉中心の立体に関係なく酵素に結合できると予想された。6員環領域に相当する部分をほとんど有しないABAアナログや6員環のメチル基が全て欠如したAHI1アナログは酵素阻害活性を示さなかったが、6員環を半分ほど有する化合物やメチル基を1つ以上保持しているAHI1アナログは酵素を阻害したことから、炭素数5の側鎖と分岐鎖を含む少なくとも炭素数7の炭化水素鎖からなる化合物であれば、CYP707Aを阻害することが示唆された。一方で大腸菌によるリコンビナントCYP707Aの発現を試みた(京都大学化学研究所にて。水谷正治博士の指導の下、計4ケ月ほど)。CYP707A2以外、植物由来のcDNAでは酵素発現が見られなかったが、アミノ末端を削除することで数種のCYP707Aisoformの発現に成功した。またP450還元酵素との共発現によって、in vitro阻害剤試験に用いる酵素液の調製が容易になった。更に、大腸菌発現系を用いて部位特異的変異酵素を作製し、リガンドと相互作用していると思われる酵素のアミノ酸残基を数個明らかにすることができた。植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)主要代謝経路の初発酵素は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼであるABA 8'-水酸化酵素である。植物体内における本酵素の機能を有機化学的に解明するために、ABA 8'-水酸化酵素に特異的な阻害剤を開発することにした。そこで本年度は本酵素における基質の構造要求性を明らかにし、酵素阻害剤を開発するためのリード化合物を設計・合成した。昆虫細胞で発現させたABA 8'-水酸化酵素(CYP707A3)と、各部位を改変した45のABAアナログを用い、酵素との結合や酵素反応に関与している基質の官能基を調べた。その結果、ABA 8'-水酸化酵素は水酸化するABAの8'位とその近傍(9'位)の立体を厳密に認識している一方で、側鎖のメチル基(6位)と1'位水酸基は酵素との結合に関与していないことが明らかになった。ここで得られた基質の構造要求性とABA活性の構造要求性を比較し、ABA活性を有しないが酵素特異的に作用するようABA骨格を有した阻害剤のリード化合物・6-ノル-2',3'-ジヒドロ-4'-デオキソ-ABA(1)をデザインした。この化合物は容易に合成できるという特徴をもつ。実際に、6ステップ・29%の収率で化合物1を合成した。化合物1はABA 8'-水酸化酵素の拮抗阻害剤として作用し、その阻害定数はABAのKm値より下回っていた。このことから、化合物1はABAに匹敵する酵素親和性を持った酵素阻害剤であることが明らかになった。一方植物を用いた生物試験で、化合物1はほとんどABA活性を示さなかった。この結果より、化合物1は当初の目的に適った阻害剤であることが確認された。チトクロムP450モノオキシゲナーゼであるCYP707A3は、植物ホルモンアブシジン酸(ABA)の8'位水酸化酵素である。本酵素はABA生合成酵素と共に、植物体内のABA濃度を一定に保つという重要な役割を担っている。本研究は植物体内におけるABA8'位水酸化酵素の機能を有機化学的に解明することを目的とし、本酵素に特異的な阻害剤を開発することにした。本年度はABAアナログを用いて、本酵素の基質認識メカニズムについて詳細に調べた。ABA8'位水酸化酵素は(S)-ABAを水酸化する一方で、植物体内には存在しない(R)-ABAとは結合できない。しかし昨年度合成した本酵素特異的阻害剤のリード化合物・6-ノル-2',3'-ジヒドロ-4'-デオキソ-ABA(AHI1)のエナンチオマーは共に酵素阻害活性を示した。1'位の立体がABAでは酵素に認識されるのに対しAHI1では認識されなかった原因を探るため、ABAとAHI1の構造で異なっている箇所を1つずつ改変したABAアナログを合成し、酵素阻害定数を測定した。その結果、ABAの4'位ケトンがCYP707A3によるABAの不斉認識に関わっていることが明らかになった。また6員環のコンフォメーションも酵素との親和性に影響を与えることが分かった。一方、これまで4'位ケトンを持つABAアナログは側鎖がアキシアルでないと結合できないとされていたが、側鎖がエクアトリアルで、かつ4'位ケトンを持たないエピ-AHI1は1'位の立体に関係なく酵素に結合した。

以上の結果より、酸素官能基を含まない6員環と末端にカルボン酸を持つ炭素5個の側鎖から構成される化合物であれば、1'位の立体や環のコンフォメーションに関係なく、CYP707A3の活性部位に結合することができると示唆された。植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)は、チトクロムP450モノオキシゲナーゼであるABA8'-水酸化酵素(CYP707A)によって代謝不活性化される。様々な植物に存在するCYP707Aは内生ABA量を調節する重要な酵素であり、この酵素の阻害剤によって内生ABA量が高められた植物体は乾燥耐性が高くなる。そこでより効果的なCYP707A阻害剤を開発するために、さまざまな分子プローブを用いて酵素のリガンド認識を明らかにした。またin vitroの阻害剤試験に用いるリコンビナントCYP707A3の大量調製及び変異酵素を作製するために、大腸菌による酵素の発現系を確立した。前年度に合成した特異的酵素阻害剤AHI1及びその構造異性体の酵素阻害能から、ABAの6員環に相当する領域に酸素官能基が存在しないABAアナログは、側鎖の配向や不斉中心の立体に関係なく酵素に結合できると予想された。6員環領域に相当する部分をほとんど有しないABAアナログや6員環のメチル基が全て欠如したAHI1アナログは酵素阻害活性を示さなかったが、6員環を半分ほど有する化合物やメチル基を1つ以上保持しているAHI1アナログは酵素を阻害したことから、炭素数5の側鎖と分岐鎖を含む少なくとも炭素数7の炭化水素鎖からなる化合物であれば、CYP707Aを阻害することが示唆された。一方で大腸菌によるリコンビナントCYP707Aの発現を試みた(京都大学化学研究所にて。水谷正治博士の指導の下、計4ケ月ほど)。CYP707A2以外、植物由来のcDNAでは酵素発現が見られなかったが、アミノ末端を削除することで数種のCYP707Aisoformの発現に成功した。またP450還元酵素との共発現によって、in vitro阻害剤試験に用いる酵素液の調製が容易になった。更に、大腸菌発現系を用いて部位特異的変異酵素を作製し、リガンドと相互作用していると思われる酵素のアミノ酸残基を数個明らかにすることができた。