hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子データベースを利用した唾液腺再生治療の試み

本研究は、口腔乾燥症(ドライマウス)の新しい治療法を開発するために、唾液腺再生をめざして、臓器形態形成機構を解明することを目的としている。具体的には、胎生期マウスの唾液腺の分枝部位(cleft)と非分枝部位(bud)から、上皮組織を摘出し、遺伝子発現のデータベースを作製し、分枝形態形成に寄与する新規遺伝子群を探索した。唾液腺、肺、腎臓、前立腺などの臓器は、胎生期において、上皮の塊を形成し、立体的な分枝(枝分かれ)を繰り返して発達する。分枝はこれらの臓器形成にとり、必須の現象であり、臓器再生の鍵を握っていると考えられる。本研究では、胎生期マウス唾液腺を分枝のモデルとして用い、いくつかの遺伝子の機能解析を行い、形態形成に寄与する新規遺伝子群を明らかにする予定である。1)唾液腺の分枝部位に発現する遺伝子のスクリーニング平成1920年度:基盤研究Bで得られた遺伝子データをもとに研究を開始した。唾液腺分枝形態形成機構を解明するために、マウス胚の唾液腺上皮分枝部(cleft)と非分枝部(bud)に特異的に発現する遺伝子を連続的遺伝子発現解析法: SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)法を改良したT7-SAGE法で網羅的に同定した。このデータベースを用いて、分枝部(cleft)と非分枝部(bud)を対比してcleftに強く発現する遺伝子をリストアップした。将来的に臨床応用をめざすためには詳細な機能を明らかにする必要があり、データベース中のから分枝形態形成に重要な遺伝子を見いだすために、コンピューター解析にて機能を推測している。フリーのウェブサイトであるPROSITEを用いてタンパク質構造を推測し、特徴的な機能ドメインを有する遺伝子を選択しているところである。2) cleft上皮に特異的に発現する遺伝子の発現量確認リストアップしたcleft上皮に特異的に発現する遺伝子が、実際にcleftに発現しているかどうかを一部RT-PCR法で確認した。引き続いて、定量的real-time PCR法で、SAGEのdataを確証し、cleftとbudに発現する遺伝子の発現量を比較検討する予定である。マウス胚の唾液腺上皮分枝部(cleft)と非分枝部(bud)に特異的に発現する遺伝子を連続的遺伝子発現解析法:SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を改良したT7-SAGE法で網羅的に同定した。このデータベースの中から、分枝部(cleft)と非分枝部(bud)を対比してcleftに強く発現する遺伝子をリストアップした。将来的に臨床応用をめざすためには、分枝形態形成に関与する詳細な機能を明らかにする必要があり、コンピューター解析にて機能を推測している。フリーのウェブサイトであるPROSITEを用いてタンパク質構造を推測し、特徴的な機能ドメインを有する遺伝子の選択を行った。2)cleft上皮に特異的に発現する遺伝子の発現量確認リストアップしたcleft上皮に特異的に発現する遺伝子が、実際にcleftに発現しているかどうかを一部RT-PCR法で確認した。引き続いて、定量的real-time PCR法で、SAGEのdataを確証し、cleftとbudに発現する遺伝子の発現量を比較検討している。構造的に特徴のある遺伝子に関しては、すぐにsiRNAを用いた機能評価を開始し、in situ hybridizationにて発現分布の確認を進めている。胎生期において、唾液腺、肺、腎臓、前立腺などの臓器は、上皮の塊を形成し、立体的な分枝(枝分かれ)を繰り返して発達する。分枝はこれらの臓器形成にとり、必須の現象であり、臓器再生の鍵を握っている。本研究は、胎生期マウス唾液腺を分枝のモデルとして用いて、いくつかの遺伝子の機能解析を行い、形態形成に寄与する新規遺伝子群を明らかにすることを目的とする。1)唾液腺の分枝部位に発現する遺伝子群のスクリーニング胎生期マウスの唾液腺上皮分枝部(cleft)と非分枝部(bud)に特異的に発現する遺伝子をT7-SAGE法で同定した。このデータベースの中から、cleftとbudを比較してcleftに強く発現する遺伝子をリストアップした。分枝形態形成に関与する機能を予測するために、PROSITEを用いてタンパク質構造を推測し、特徴的な機能ドメインを有する遺伝子の選択を行った。2)cleft上皮に特異的に発現する遺伝子の発現量・発現分布確認リストアップした遺伝子が、実際にcleftに発現しているかどうかをRT-PCR法と定量的real-time PCR法で確認した。構造的に特徴のある遺伝子に関しては、in situ hybridizationにて発現分布を解析したところ、Btbd7という遺伝子を発見した。

唾液腺組織にsiRNAを導入すると、分枝形成が阻害され、機能的な関与が示唆された。4)器官培養を用いた遺伝子導入実験アデノウィルス等を用いて、唾液腺にBtbd7を強制発現させたところ、分枝形成が誘導された。現在、電子顕微鏡を用いた上皮の構造解析をしながら、他の遺伝子を含あ、機能解析中である。
ヒトの血液脳関門における薬物の輸送に寄与できる高活性トランスポーターの探索

2年目までの研究において、トランスポーターを網羅的に探索するための網羅的プロテオミクス手法「SWATH法」の解析系を用いてブタの血液脳関門に発現するトランスポーターの探索を行った。その結果、複数のトランスポーター候補が同定された。候補分子について、順次、輸送機能解析を進めているが、効率よく高活性のトランスポーターを同定することができなかった。そこで、SWATH法の改良検討を行った結果、網羅的に、タンパク質絶対発現量を決定することのできる「quantitative Global Absolute Proteomics (qGAP)法」を開発することに成功した。また、美原記念病院ブレインバンクとの共同研究を本格的に開始することができたため、ヒトの脳組織から高純度に脳毛細血管を単離でき、その膜画分を調製できた。そこで、qGAP法を、この血液脳関門の膜画分に適用した結果、ブタでは探索されなかった複数のタンパク質の発現が新たに検出され、絶対発現量を決定することができ、機能解析を行う上での優先順位をつけることができた。ヒト脳毛細血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)あるいは強制発現細胞を用いた輸送解析を行った結果、有機カチオン性薬物の取り込み輸送を担うタンパク質を絞り込めた可能性があり、現在、各種検証実験を行っている。また、プロテオミクスに基づく網羅的探索・定量手法の開発によって、Claudin-11やCD46がヒト血液脳関門における密着結合や輸送に重要であることやP糖タンパク質の機能制御メカニズムを包括的に解明でき、論文発表することができた。複数のトランスポーター候補分子からの絞り込みが課題であったが、新規手法の開発によって合理的に優先順位を決定することができ、トランスポーター探索の突破口を拓いたため。ヒト血液脳関門における新規分子の同定に成功し、その機能やメカニズムを解明でき、ヒト血液脳関門における新たな分子機構を発見できたため。トランスポーター候補分子について更なる機能的な検証実験を進め、血液脳関門における薬物輸送への寄与を証明する。ヒトの血液脳関門の薬物透過機構を解明することは、中枢疾患治療における長年の重要課題である。脳への薬物の送達を考える上で、血液から脳への取り込み方向および脳から血液への排出方向の輸送機構を解明することが重要である。そこで、本研究では、最新の超網羅的プロテオミクス技術を用いて、血液脳関門のそれぞれの方向の物質輸送に寄与するトランスポーター群を新規に同定することを目的とした。これを達成するため、先ず平成28年度(初年度)では、膜蛋白質を中心に複数のタンパク質の発現量を一斉かつ高感度に測定できるSWATH定量系を構築することを目的とした。ブタの脳血管、肝臓、腎臓および小腸の細胞膜画分を調製し、それらをトリプシン消化し、等電点電気泳動装置を用いて12分画した。PBI社製の超高圧抽出システムバロサイクラーを購入し、pressure cycling技術を用いて、タンパク質を効果的に可溶化・変性およびトリプシン消化する処理方法を導入した。各組織試料について、12分画されたペプチド試料をLC-MS/MS(TripleTOF5600)のdata dependent acquisition(ショットガン)モードで測定した結果、約1万2千種類のタンパク質のペプチドのLC保持時間、MS/MSスペクトルおよびアミノ酸配列・タンパク質名の情報を収載したSWATH assay libraryを構築できた。ブタ組織のSWATH測定を行い、このlibraryを用いて解析した結果、約8千タンパク質も定量でき、予定していたSWATH定量系を構築することに成功した。この結果は、ショットガン測定などによる従来のプロテオミクス技術(定量タンパク数:12千タンパク質)に比べて、網羅性の点で飛躍的な進歩である。また、脳機能に重要なドコサヘキサエン酸(DHA)の脳への供給輸送機構として、SLC27A1を同定した。当初予定していた通りに、トランスポーター探索のための網羅的なSWATH定量系を構築することができたため。中枢関門の薬物透過機構を解明することは、中枢疾患治療における長年の重要課題である。本研究では、最新の超網羅的プロテオミクス技術を用いて、中枢関門を介した物質輸送に寄与するトランスポーター群を新規に同定することを目的とした。平成28年度に、トランスポーターを網羅的に探索するための網羅的プロテオミクス手法「SWATH法」の解析系を構築することに成功したため、平成29年度は、それを用いて血液脳関門に発現するトランスポーターの探索を行った。その結果、複数のSLCトランスポーターが候補として同定された。また、膜貫通部位数などの構造的情報を組み合わせることによって、機能未知の膜タンパク質をトランスポーター候補として絞り込んだ。候補トランスポーターについて、ヒト脳毛細血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)におけるタンパク質絶対発現量を決定した。高発現量分子について、強制発現細胞の構築が完了し、輸送解析を行っているところである。血液脳関門に加えて、中枢組織の広範囲の外表面を覆う血液クモ膜関門についても網羅的にトランスポーターの探索・定量を行ったところ、OAT1、OAT3、MATE1、OCT2などの多くの薬物輸送トランスポーターがタンパク質レベルで発現することを初めて明らかにし、さらに、それらが高発現するという興味深い結果を得た。OAT1およびOAT3については、有機アニオン性物質の脳脊髄液からの排泄に関与することがin vivo(大槽内投与)実験によって示された。血液クモ膜関門は脳脊髄液全体の約8割と接しており、脈絡叢が支配する脳室内の脳脊髄液の体積(約2割)よりも顕著に大きい。

従って、上記の結果は、血液脳関門に加えて血液クモ膜関門も中枢組織の薬物濃度の制御に重要な役割を担っている可能性を示唆している。結論として、本年度は、血液脳関門及び血液クモ膜関門において有望なトランスポーター(候補)分子を複数同定することに成功した。当初予定していた通りに、トランスポーター探索に必要な網羅的なSWATH解析系を構築し、それを用いて複数のトランスポーター候補分子を絞り込むことができたため。2年目までの研究において、トランスポーターを網羅的に探索するための網羅的プロテオミクス手法「SWATH法」の解析系を用いてブタの血液脳関門に発現するトランスポーターの探索を行った。その結果、複数のトランスポーター候補が同定された。候補分子について、順次、輸送機能解析を進めているが、効率よく高活性のトランスポーターを同定することができなかった。そこで、SWATH法の改良検討を行った結果、網羅的に、タンパク質絶対発現量を決定することのできる「quantitative Global Absolute Proteomics (qGAP)法」を開発することに成功した。また、美原記念病院ブレインバンクとの共同研究を本格的に開始することができたため、ヒトの脳組織から高純度に脳毛細血管を単離でき、その膜画分を調製できた。そこで、qGAP法を、この血液脳関門の膜画分に適用した結果、ブタでは探索されなかった複数のタンパク質の発現が新たに検出され、絶対発現量を決定することができ、機能解析を行う上での優先順位をつけることができた。ヒト脳毛細血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)あるいは強制発現細胞を用いた輸送解析を行った結果、有機カチオン性薬物の取り込み輸送を担うタンパク質を絞り込めた可能性があり、現在、各種検証実験を行っている。また、プロテオミクスに基づく網羅的探索・定量手法の開発によって、Claudin-11やCD46がヒト血液脳関門における密着結合や輸送に重要であることやP糖タンパク質の機能制御メカニズムを包括的に解明でき、論文発表することができた。複数のトランスポーター候補分子からの絞り込みが課題であったが、新規手法の開発によって合理的に優先順位を決定することができ、トランスポーター探索の突破口を拓いたため。ヒト血液脳関門における新規分子の同定に成功し、その機能やメカニズムを解明でき、ヒト血液脳関門における新たな分子機構を発見できたため。平成28年度にトランスポーターを網羅的に探索するための網羅的プロテオミクス手法「SWATH法」の解析系を構築することに成功したため、翌年度は、この技術と脳血管試料を用いて、血液脳関門の物質輸送に関与するであろうトランスポーターの候補を実際に探索する予定である。トランスポーター候補分子の強制発現細胞あるいはknockdown細胞を用いて、in vitro輸送解析によって候補分子が薬物・化合物輸送を担うトランスポーターであるか否かを検証する。トランスポーター候補分子について更なる機能的な検証実験を進め、血液脳関門における薬物輸送への寄与を証明する。
大型類人猿における情動喚起とその社会的影響－赤外線サーモグラフィによる研究

大型類人猿であるチンパンジーを対象に、情動とその社会的影響を客観的に評価するため、赤外線サーモグラフィで顔表面温度を測定した。様々なビデオ映像をモニターに提示し、これをチンパンジーが見ている際の顔表面温度を測定した。その結果、攻撃的な行動のビデオ映像を見た場合に、特に鼻部において温度低下する傾向が確認された。情動的変化を赤外線サーモグラフィによって客観的に定量化できることが示された。ただし、個体差も大きく存在することも明らかとなった。大型類人猿における情動とその社会的影響を客観的に評価するため、赤外線サーモグラフィで顔表面温度を測定した。情動喚起に伴う自律神経系の働きにより体表面の血流が変化し、それによって体表面温度が変わるという原理に基づくものであり、これを赤外線サーモグラフィでとらえようという試みである。「心」の進化的基盤を探ることを目指した多様な動物種比較研究が展開されているが、ヒトに近縁な大型類人猿の研究ではこれまでもっぱら「知」の側面を扱い、「情」の側面に焦点が当たるのは稀であった。赤外線サーモグラフィを使った同様の研究は、大型類人猿では過去に皆無であり、本研究が初の試みである。本研究において、まずは測定方法の確立をおこなった。機械の特性や実験環境に応じてキャリブレーションをおこない、可能な限り正確にチンパンジーの体表面温度を測定する条件を探った。これによって、最適と考えられる測定方法を見出すことができた。次に、チンパンジーを対象に実際の測定をおこなった。様々なビデオ映像をモニターに提示し、これをチンパンジーが見ている際の顔表面温度を赤外線サーモグラフィで測定した。提示するビデオ映像として、被験体にとって既知の個体や未知の個体が、攻撃的な行動をおこなう場面や中立的な場面などを用いた。前年度までにこの本テストに着手し、最終年度である本年度もデータ収集を継続した。その結果、攻撃的な行動のビデオ映像を見た場合に、特に鼻部において表面温度が低下する傾向があることが確認された。ただし、個体差にも大きく影響され、同様の傾向が認められない個体もいた。ヒトにおいても情動については各人の性格など個体差が大きいことが示されているが、チンパンジーでも同様であると考えられる。情動を顔表面温度の非侵襲的な測定によって評価するという本挑戦萌芽研究の目的は果たされたと言えるだろう。赤外線サーモグラフィを使った同様の研究が、ヒトやヒト以外の動物を対象としておこなわれた報告はあるが、大型類人猿を対象とした研究はこれまで全くなかった。本研究が初の試みである。次に、研究実施計画にある通りの条件で、チンパンジーを対象に実際の測定をおこなった。つまり、様々なビデオ映像をモニターに提示し、これをチンパンジーが見ている際の顔表面温度を赤外線サーモグラフィで測定した。その結果、攻撃的な行動のビデオ映像を見た場合に、顔表面温度が有意に上昇することが確認された。これによって、類人猿の情動を顔表面温度測定によって評価するという本挑戦萌芽研究の妥当性が確かめられたといえる。赤外線サーモグラフィを用いた体表面温度の測定は、ヒト以外の霊長類を対象としては過去にほとんどおこなわれておらず、こと類人猿に限っては前例が皆無であったが、この研究によって初めてチンパンジーを対象とした測定に成功した。また、情動を喚起すると想定される条件で測定した結果、実際に顔表面温度が上昇しているのを捉えることができた。よって、本研究計画の妥当性を示すことができたと言える。平成24年度はチンパンジーを対象にして最適な実験手法を確立することを主要な目標に掲げており、この目標は十分に達成することができた。すでに実験手法は確立することができたので、それに基づいて継続的にデータ収集をおこなう。

ビデオ映像を提示して被験体の顔表面温度を測定すること自体は、一度このように方法が確立されれば比較的容易に繰り返し実施することができる。今後のポイントは、多様なビデオ映像を準備することである。被験体にとって既知の個体、未知の個体、既知の個体の中でも親しい個体とそうでない個体といった具合に、被験体との関係を考慮して多様なバリエーションのビデオ映像を用意する必要がある。ビデオ映像を収集することに時間を費やし、多様な条件設定が可能になるように工夫したい。また、チンパンジーとの比較のため、ボノボとオランウータンでもデータ収集をおこなう。この際の実験方法はチンパンジーのものに倣う。得られた成果を学会や学術誌等で発表する。該当なし
前立腺癌に対する温熱療法の基礎的研究

平成9年度の実験において、前立腺癌細胞株に対する温熱刺激では、細胞により増殖抑制効果が異なり、これにHSP70の発現や細胞周期が深く関与していることが示唆された。特に、HSP70は、温熱刺激により誘導され、熱に対する細胞保護としての機能が働いており、これにより温熱刺激の増殖抑制効果を不十分にしていると考えられる。したがって、HSP70の発現を抑制、減弱させることにより温熱刺激の増殖抑制効果の増強が期待される。よって、平成10年度、11年度は、HSP70の発現を減弱させると最近報告されているケルセチンの温熱刺激増強効果について検討した。3種類の前立腺癌細胞株(LNcap,JCA-1,PC-3)を用いて、ケルセチンは50μMの濃度を24時間曝露し、以下の4群で実験を行った。1)非温熱刺激群2)温熱刺激群3)ケルセチン単独処理群4)ケルセチン前処置後温熱刺激群1)細胞増殖への影響:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でも増殖抑制効果が見られ、さらに温熱刺激増強効果が見られた。2)細胞周期の変化:LNcap,JCA-1ではS期細胞の割合の減少が見られ、LNcapでは、温熱刺激増強効果が見られた。PC-3細胞では明らかな変化はなかった。3)HSP70の発現:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でもHSP70の発現を減少させ、さらに温熱刺激により増強されるHSP70の発現を抑制した。PC-3細胞では若干の増強効果のみ認められた。4)アポトーシスの発現:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独で明らかなアポトーシスの発現が見られた。さらに温熱刺激によって誘導されるアポトーシスの発現を増強した。以上よりケルセチンは、HSP70の発現を抑制、減弱させ、アポトーシスの発現を増強することにより、温熱刺激の増殖抑制効果を増強するものと考えられた。平成9年度に得られた実験結果を研究計画書に記載した実験方法の順に報告する。1.温熱刺激による細胞周期の変化:前立腺癌細胞LNcap細胞およびJCA-1細胞を43°Cで培養し、BrdUでラベル後FITCとPIの二重染色を行い、フローサイトメトリーで各細胞周期の細胞数の割合を解析した。両細胞とも4時間でS期細胞の割合が減少し、8時間でG2期停止を認めた。2.温熱刺激による熱ショック蛋白-70(Hsp-70)の発現:ウエスタンブロット法にてHsp-70の発現を解析した。温熱刺激前の状態では、LNcaP細胞およびJCA-1細胞でHsp-70の発現を認め、LNcap細胞は特にその発現が弱かった。43°Cの温熱刺激では、JCA-1細胞は温熱刺激時間依存性にHsp-70の発現が増強された。LNcap細胞では、温熱刺激早期より明らかな発現の増強を認めた。3.温熱刺激によるアポトーシスの検索:LNcap細胞は,43°Cの温熱刺激6時間より、JCA-1細胞では、12時間より細胞数が減少した。しかし、細胞数の減少を示した温熱刺激時間に、Tdtアッセイを行ったが,アポトーシス細胞の明らかな存在は認められなかった。フローサイトメトリーの測定においても、アポトーシス細胞の増加は認められなかった。

以上の結果より、LNcap細胞、JCA-1細胞ともに、43°Cの温熱刺激によって細胞周期においてG2期停止を起こし、その後細胞数が減少することがわかった。細胞数減少の機序として、温熱刺激による細胞増殖抑制が関与していると推測され、明らかなアポトーシスの関与は認められなかった。また、両細胞の温熱感受性に差異が認められたが、これにHsp-70の発現が関与していることが示唆された。前立腺癌細胞株に対する温熱刺激では、細胞により増殖抑制効果が異なり、これにHSP70の発現や細胞周期が深く関与していることを我々は報告してきた。特に、HSP70は、温熱刺激により誘導され、熱に対する細胞保護としての機能が働いており、これにより温熱刺激の増殖抑制効果を不十分にしていると考えられる。したがって、HSP70の発現を抑制、減弱させることにより温熱刺激の増殖抑制効果の増強が期待される。よって、平成10年度は、HSP70の発現を滅弱させると最近報告されているケルセチンの温熱刺激増強効果について検討した。3種類の前立腺癌細胞株(LNcap,JCA-1,PC-3)を用いて、ケルセチンは50μMの濃度を24時間曝露し、以下の4群で実験を行った。1)非温熱刺激群2)温熱刺激群3)ケルセチン単独処理群4)ケルセチン前処置後温熱刺激群1)細胞増殖への影響:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でも増殖抑制効果が見られ、さらに温熱刺激増強効果が見られた。2)細胞周期の変化:LNcap,JCA-1ではS期細胞の割合の減少が見られ、LNcapでは、温熱刺激増強効果が見られた。PC-3細胞では明らかな変化はなかった。3) HSP70の発現:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でもHSP70の発現を減少させ、さらに温熱刺激により増強されるHSP70の発現を抑制した。PC-3細胞では若干の増強効果のみ認められた。4)アポトーシスの発現:LNcap,JCA-1ではケルセチン単独で明らかなアポトーシスの発現が見られた。さらに温熱刺激によって誘導されるアポトーシスの発現を増強した。以上よりケルセチンは、HSP70の発現を抑制、減弱させ、アポトーシスの発現を増強することにより、温熱刺激の増殖抑制効果を増強するものと考えられた。前立腺癌細胞株に対する温熱刺激では、細胞により増殖抑制効果が異なり、これにHSP70の発現が深く関与している。HSP70は、温熱刺激により誘導され、熱に対する細胞保護として働き、これにより温熱刺激の増殖抑制効果を不十分にしていると考えられる。よってHSP70の発現を抑制することにより温熱刺激の増殖抑制効果の増強が期待される。平成10、11年度は、HSP70の発現を抑制すると報告されているケルセチンの温熱刺激の細胞増殖抑制効果の増強について検討した。1)非温熱刺激群2)温熱刺激群(8時間)3)ケルセチン単独処理群4)ケルセチン前処置後温熱刺激群LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でも増殖抑制効果が見られ、さらに温熱刺激増強効果が見られた。LNcap,JCA-1ではケルセチン単独でもHSP70の発現を減少させ、さらに温熱刺激により増強されるHSP70の発現を抑制した。さらに、HSP70低発現のsubG1細胞の明らかな増加を認め、これがアポトーシス細胞であると思われた。
非興奮性細胞の電位作動性カルシウムチャネルのサブユニット間相互作用の領域と役割

私たちは、非興奮性細胞である酵母の電位作動性Ca2+チャネル(voltage-gated Ca2+ channel = VGCC)ホモログの構造と機能を研究した。このVGCCホモログはCch1とMid1という主要サブユニットから構成されているので、まず両者の相互作用に必須なアミノ酸残基をそれぞれのサブユニットで明らかにした。また、Mid1の全長548アミノ酸残基のうちN末端から209アミノ酸残基を切り詰めても、Cch1のCa2+流入機能を仲介できること、N末端には20個のアミノ酸残基からなるシグナル配列が存在することを明らかにした。出芽酵母のCch1は、ほ乳類の電位作動性カルシウムチャネルのα1サブユニットのホモログである。Cch1がカルシウムチャネルとしてはたらくためには、サブユニットであるMid1の存在が不可欠である。本研究では、Mid1に依存しない変異型Cch1の取得と解析を目的とした。その取得に当って、細胞外に出ているCch1のシステイン残基(Cys)に着目した。Cch1には細胞外に出ていると予想されるCys残基が10個ある。本研究によりそのうちの2残基がMid1との相互作用に必要であることが示唆された。一方、Mid1に着目すると、細胞外に出ていると予想されるCys-rich領域には10個のCys残基が存在する。今年度の研究の結果、そのうちの2残基がCch1との相互作用に関与する可能性が示唆された。電位作動性Ca2+チャネル(voltage-gated Ca2+ channel = VGCC)の研究は、主にヒトやマウスなどの興奮性細胞(神経細胞、筋細胞など)に存在するVGCCを対象として行われ、その構造と機能、一部の補助サブユニットの役割などが明らかにされてきた。しかし、VGCCは動物だけに存在するのではなく、酵母やカビなど、非興奮性の細胞にも存在するが、その構造と機能などはほとんど分かっていない。本研究では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のVGCCのポア形成α1サブユニットのホモログ(Cch1)およびα2/δサブユニットのホモログ(Mid1)に焦点を当て、両者間の相互作用とMid1によるCch1の活性化機構を解明することを目的とする。平成27年度は、前年度までにMid1との相互作用に重要であると特定されたCch1タンパク質のドメインIIIに注目して研究を行った。方法としては、ドメインIIIだけに突然変異が生じるように、この部分だけをMn-PCR法で増幅した後、完全長のCCH1遺伝子を作製した。次にそのCCH1遺伝子でcch1欠損株を形質転換した。この形質転換体群のうち、CCH1の機能を持てない株を選択し、機能できないCCH1遺伝子のドメインIII領域の塩基配列決定により、変異部位を特定した。この方法により、10数箇所の変異部位を見出している。今後、これらの変異型Cch1タンパク質がMid1タンパク質と相互作用をするか否かを共免疫沈降法で調べる予定である。上記「研究実績の概要」でも述べたが、前年度までにMid1との相互作用に重要であると特定されたCch1タンパク質のドメインIIIに注目して研究を行った。その結果、ドメインIII領域内のloss-of-functionの変異部位を複数特定することができた。電位作動性Ca2+チャネル(voltage-gated Ca2+ channel = VGCC)の研究は、主に動物の興奮性細胞(つまり神経細胞、筋細胞など)を用いて多くの研究がなされてきた。その結果、その立体構造と電気生理学的性質がかなり明らかにされ、Ca2+チャネル病の理解にも貢献している。一方、VGCCは動物界だけでなく菌界にも広く存在している。しかし、菌類のCa2+チャネルの構造と機能はほとんど分かっていない。本研究では、非興奮性細胞であり、菌類のモデル生物である出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のVGCCに着目して、そのポア形成サブユニットであるCch1と制御サブユニットであるMId1の研究を行った。Cch1とMid1が共存してはじめてCa2+透過活性が発生する。そのため、両サブユニット間の相互作用がチャネル活性に重要である。また、Cch1またはMid1の遺伝子を欠損した株は、性フェロモンであるα-factor受容後にCa2+を取込めずに死にいたる。昨年度までの本研究から、Cch1の4つのドメインのうちドメインIIIがMid1との相互作用に重要であることが明らかにされている。これを踏まえて、本年度はこのドメインIIIの領域にMn-PCR法で突然変異を導入し、変異タンパク質のcch1欠損株の致死性を相補できるか否かでドメインIII内のどのアミノ酸残基がCch1の機能に重要かを調べた。その結果、C1284R, S1322G, M1333K, P1353L, D1371V, C1379S, I1392T, M1393TおよびS1394Fの合計9個の単一変異を見出した。そのうち、Mid1との共免疫沈降実験で、D1371V、I1392TおよびS1394FがMid1との相互作用に関与することが示唆された。

Cch1タンパク質のドメインIII内のアミノ酸残基群のうち、3つのアミノ酸残基がMid1との相互作用に重要であることを示唆できたから。電位作動性Ca2+チャネル(voltage-gated Ca2+ channel = VGCC)はほ乳類の神経、脳、筋肉などの興奮性細胞ではたらいていることが良く知られ、研究が盛んになされてきた。その結果、ほ乳類のVGCCの電気生理学的特性、立体構造、サブユニット間相互作用などが明らかにされている。一方で、VGCCは非興奮性細胞である酵母やカビなどの真菌類にも存在することが、本研究代表者らによって明らかにされたが、その構造と機能について十分に明らかにされていない。本課題研究では、これまでに酵母(Saccharomyces cerevisiae)のVGCCの2つの主要なサブユニットであるCch1とMid1との相互作用における、それぞれのサブユニット上の必須のアミノ酸残基を明らかにしてきた。Cch1はCa2+を直接透過させる活性をもち、Mid1はCch1を正に制御する活性をもつ。本年度は、Mid1上のCch1との相互作用に必要な領域を絞る目的で、Mid1のN末端から複数のアミノ酸残基を順次切り詰めていくtruncation analysis(切り詰め解析)を行った。その結果、Mid1の全長548アミノ酸残基のうちN末端から209アミノ酸残基を切り詰めても、Cch1のCa2+流入活性を仲介できることが分かった。言い換えれば、この実験結果は、Mid1のN末端から209個のアミノ酸残基からなる領域はCch1との相互作用に不要であり、203番目のアミノ酸残基以降の領域がCch1との相互作用に重要であることを示している。本研究から更に分かったこととして、Mid1のN末端には20個のアミノ酸残基からなるシグナル配列が存在するが、それがなくてもMid1は小胞体に入り、Nグルコシレーションを受け、細胞膜まで運ばれることが明らかになった。Mid1はN末端以外にもシグナル配列をもつことが示唆される。私たちは、非興奮性細胞である酵母の電位作動性Ca2+チャネル(voltage-gated Ca2+ channel = VGCC)ホモログの構造と機能を研究した。このVGCCホモログはCch1とMid1という主要サブユニットから構成されているので、まず両者の相互作用に必須なアミノ酸残基をそれぞれのサブユニットで明らかにした。また、Mid1の全長548アミノ酸残基のうちN末端から209アミノ酸残基を切り詰めても、Cch1のCa2+流入機能を仲介できること、N末端には20個のアミノ酸残基からなるシグナル配列が存在することを明らかにした。Cch1分子とMid1分子上の互いに相互作用する可能性の高い部位を特定できたため。これにより、今後両分子間の相互作用の実像を明らかにできれば、Mid1がなくても活性をもつCch1分子をデザインできると予想される。Cch1タンパク質のドメインIII領域内に見つかったloss-of-functionの変異部位が、Mid1タンパク質との相互作用に重要であるか否かを変異型Cch1タンパク質と野生型Mid1タンパク質の共免疫沈降で調べる。また、当初より行っているMid1タンパク質に非依存的な変異型Cch1タンパク質のスクリーニングは依然としてうまく行っていない。
パターン形成と形態転移に関する研究

相分離の外的要因の変化に対する応答を調べるために時間空間的に非一様な外部条件のもとでの相分離の機構を調べた。特に相分離の初期における外的要因の違いは、その後のパターン形成に決定的な影響を及ぼすことが分かった。本研究で行った理論研究によく似た例として、解けた溶媒に接触した単結晶をゆっくり引き上げて巨大な単結晶をつくる場合をあげることが出来る。又、提案する実験として、溶媒に溶かした高分子及び高分子ブレンドを用いた同様な実験をあげることが出来る。いずれも実用的側面からは、効率のよい単結晶生成を予測するものであり、また学術的側面からは非平衡状態における形態転移として未開拓な分野の提供として、大きい意義をもつ。本研究では固体のみならず液体をも研究対象である。そのため液体のスピノーダル分解についてその特徴的長さの成長則を調べた。相分離のスケール則によって長さのさのスケールL(t)が時間tの関数としてt^aに比例して大きくなる。ここでaは成長(則)指数と呼ばれ物質の詳細にはよらず固体でa=1/3、液体でa=1とされている。一方、液体におけるa=1はt→∞で、流体の時間発展の法則に矛盾することが知られており、最終的にa=2/3になると考えられる。シミュレーションによって成長指数a=2/3を確認した。また重要な点はa=1→2/3のクロスオーバーが成長のslowing-downを示すことである。例えば、水と蒸気の系でa=1に対して予想される流速(7000cm/sec)は指数a=2/3で予想されるもの(10cm/sec)に比べて約3桁も大きい(L(t)=1cmのスケールで)。このように成長の著しいslowing-downは無重力状態における材料合成等においても重要な事義をもつと考える。秩序化の理論的研究は、通常、無秩序な系の一様な急冷等によって見られる秩序化が対象とされてきた。又、実験等でも同様な条件で行われてきた。しかし自然界では熱及び物質の流れが秩序化に大きな影響をもつ。そのため通常の秩序化では多くの場合場所によって時間的おくれが生じる。本研究では秩序化の空間伝播の速さと秩序状態の関連をモデルを用いて調べた。用いたモデルは二種類である。一つは二元合金の相分離に用いられるカ-ン・ヒリヤ-ドモデルであり、他の一つは非保存系の気体モデルの一つであるポッツモデルである。次の結果を得た。二元合金では三つの特徴的な形態が観測された。すなわち秩序相の急速な拡大ではパタ-ンは乱雑であり、パタ-ンの粗大化がゆっくりと進行する。中速の拡大では規則的なラメラ状のパタ-ンが出現した。ゆっくりとした拡大では拡大方向に伸びる棒状のパタ-ンが出現した。このうち乱雑及び棒状のパタ-ンは自然界で観測されている。非保存系のポッツモデルでも三つの特徴的なパタ-ンが観測された。このモデルはいわゆる結晶成長のモデルに担当する。秩序化の急速な拡大では小さな結晶粒が多く出現し、それが時間と共に粗大化した。秩序相のゆっくりした拡大では,境界条件の違いにより、パタ-ンは成長方向に長い結晶の集合体となるか、又は単結晶となるかのいずれかである。このいずれも自然界で観測されるが、理論的な裏付ははじめてであろう。

本研究で行った理論研究によく似た例として、解けた溶媒に接触した単結晶をゆっくり引き上げて巨大な単結晶をつくる場合をあげることが出来る。又、提案する実験として、溶媒に溶かした高分子及び高分子ブレンドを用いた同様な実験をあげることが出来る。いずれも実用的側面からは、効率のよい単結晶生成を予測するものであり、また学術的側面からは非平衡状態における形態転移として未開拓な分野の提供として、大きい意義をもつ。本研究では固体のみならず液体をも研究対象である。そのため液体のスピノーダル分解についてその特徴的長さの成長則を調べた。相分離のスケール則によって長さのさのスケールL(t)が時間tの関数としてt^aに比例して大きくなる。ここでaは成長(則)指数と呼ばれ物質の詳細にはよらず固体でa=1/3、液体でa=1とされている。一方、液体におけるa=1はt→∞で、流体の時間発展の法則に矛盾することが知られており、最終的にa=2/3になると考えられる。シミュレーションによって成長指数a=2/3を確認した。また重要な点はa=1→2/3のクロスオーバーが成長のslowing-downを示すことである。例えば、水と蒸気の系でa=1に対して予想される流速(7000cm/sec)は指数a=2/3で予想されるもの(10cm/sec)に比べて約3桁も大きい(L(t)=1cmのスケールで)。このように成長の著しいslowing-downは無重力状態における材料合成等においても重要な意義をもつと考える。これらの研究はワークステーションを用いたシミュレーションを主体にしてなされた。
ベーチェット病の自己抗体の解析：好中球遊走能にかかわるコフィリンに対する抗体

ベーチェット病は好中球の活性化に伴い、口内炎や陰部潰瘍、ぶどう膜炎をおこす難病である。コフィリン1は可溶性のタンパク質で、好中球の殺菌能と関連が報告されている。本研究はベーチェット病患者における抗コフィリン1抗体の好中球機能に対する影響を明らかにし、病態の解明をすることが目的である。本研究ではコフィリン1を3つの部分に分けて作成し、患者血清と反応性を確認した。60検体中11検体(18.3%)でコフィリン1に対する抗体を持っていた。そのうち45.5%は複数の部分に反応しており主要抗原であることが示唆された。抗コフィリン1抗体は赤血球沈降速度の軽度亢進とINFα産生と関連している可能性があった。難病であるベーチェット病の主な病態は好中球の活性化に伴って、組織の破壊が起こることである。本研究は抗コフィリン1抗体の好中球機能に対する影響を明らかにし、ベーチェット病の治療応用へと展開するための研究基盤を確立することが目的である。計画研究項目1抗コフィリン1抗体の抗原性の確認、2抗コフィリン1抗体の好中球運動能殺菌能亢進機構の解明、3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連解明、4抗コフィリン1抗体機能の抑制試験のうち、1はコフィリンを3分割して大腸菌にてMPBのフュージョン蛋白として作成し、18検体のベーチェット病患者血清を用いてELISAを施行した。それぞれのFragmentに対して反応が見られ、epitopeが多数あることが示唆された。全体の抗コフィリン抗体と疾患活動性には関連する傾向が認められたが、各臨床症状(結節性紅斑、ぶどう膜炎、口内炎、陰部潰瘍、消化器症状、関節痛、血管病変)と、それぞれのFragmentに対する抗体とには関連する傾向はなかった。さらに抗コフィリン抗体を精製し、健常人好中球遊走能に対する影響を測定しているベーチェット病は好中球の活性化に伴い、口内炎や陰部潰瘍、ぶどう膜炎をおこす難病である。計画している具体的な研究項目は1抗コフィリン1抗体の抗原性の確認、2抗コフィリン1抗体の好中球運動能殺菌能亢進機構の解明、3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連解明、4抗コフィリン1抗体機能の抑制試験の4つである。このうち1、3について初年度に施行することを予定していた。1抗コフィリン1抗体の抗原性の確認について、コフィリン1を3分割して設計し、コンピテントセルとして大腸菌DH5α、また、pMalベクターを改良し、終末にHisTagを挿入したベクターを用いて各フラグメントをMBPのフュージョン蛋白として作成した。しかし、1フラグメントのみ発現せず、現在、方法を変えて作成している最中である。2抗コフィリン1抗体の好中球運動能殺菌能亢進機構の解明については当初より本年度施行する予定。3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連解明については各臨床症状(結節性紅斑、ぶどう膜炎、口内炎、陰部潰瘍、消化器症状、関節痛、血管病変)本抗体とに現時点(8人)では相関はなかったが、CRP、血沈などの炎症反応とは関連がある傾向が認められた。現在、症例数を増やして、確認している。4抗コフィリン1抗体機能の抑制試験については当初より本年度施行する予定。好中球の活性化する難病であるベーチェット病において、本研究は抗コフィリン1抗体の好中球機能に対する影響を明らかにし、治療応用へと展開するための研究基盤を確立することが目的である。平成25年度についてはコフィリン1に対するベーチェット病患者における抗原性の確認をさらに検体数を増やして確認した。また、精製した抗コフィリン1抗体を用いて抗コフィリン抗体の好中球に対する影響について検討した。本研究全体として研究項目1コフィリン1の抗原性の確認については、コフィリン1を3つのFragmentに分割し、大腸菌を用いてリコンビナント蛋白を作成した。ベーチェット病患者60人の血清でELISAを行った。コフィリン1に対しては11人(18.3%)の患者血清で少なくとも一つ以上のFragmentと反応した。

2つ以上のFragmentと反応した患者血清は5検体(45.5%)であった。研究項目3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連の解明については臨床症状とは有意差がつくものがなかったが、臨床データにおいては赤血球沈降速度と関連がある傾向があった。研究項目2抗コフィリン1抗体の好中球の機能への影響の解明については、患者血清から精製した抗コフィリン1抗体と、好中球に反応させることにより検討した。遊走能については3μm孔のポリカーボネート膜を用いて測定したが抗コフィリン1抗体添加の有無によって有意差はなかった。サイトカイン分泌能に関しては抗コフィリン1抗体添加群の方がINFαの産生と関連する傾向があった。以上のことから一部のベーチェット病患者においてコフィリン1は複数のエピトープを持つことから主要抗原の一つであり、抗コフィリン1抗体の存在が好中球に影響を与えている可能性が示唆された。確立するためにはさらなる症例数の蓄積が必要である。自己免疫疾患当初の計画では4つの研究項目のうち抗原性の確認に用いるFragmentの一つが発現しない問題があったが、その後改善し、現在は概ね順調に進んでいる。研究を阻害する大きな問題も発生していない。当初の計画では4つの研究項目のうち、1抗コフィリン1抗体の抗原性の確認、3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連解明について初年度に終了する予定であった。このうち1について、リコンビナント蛋白の作成において1フラグメントの発現がうまくいかず現在方法を変えて発現を試みている最中である。その他については概ね計画通り、進んでおり、研究を阻害する大きな問題も発生していない。現在行っている好中球に対する抗コフィリン抗体の影響について結果をまとめて、報告する予定。計画している具体的な研究項目のうち1抗コフィリン1抗体の抗原性の確認については残りのフラグメントの発現を最優先で実行する。その後、2抗コフィリン1抗体の好中球運動能殺菌能亢進機構の解明について施行する予定。3ベーチェット病の活動性、臨床症状と抗コフィリン1抗体との関連解明については症例数を増やして行う予定。最後に4抗コフィリン1抗体機能の抑制試験を行う予定計画している使用が消耗品であることから、研究の進捗状況により使用額が左右される。前年度、コフィリンのFragmentの一部の作成に時間がかかったため、その分、本年度分の使用額がずれ込んでいる。現在、健常人好中球に対するコフィリン抗体の影響を測定しており、随時使用していく予定。本研究に必要な物品は既に研究実施施設に存在し、自由に使用できるため物品購入の必要性がない。また、今後の研究に関しても研究代表者のみで施行が可能なため謝金などの必要性がない。よって使用計画としては消耗品にのみ使用を予定している
プラズモニック金属ナノ構造体の化学的環境制御と新規な磁気円二色性応答の発現

本研究代表者はこれまで、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)を発現する金属ナノ粒子、特にAgナノ粒子が微分型の大きな磁気円二色性(MCD)応答を示し、それがマグネトプラズモン由来である事を明らかにした。本研究では、その様なマグネトプラズモンに対し、金属ナノ粒子・ナノ構造体と光、あるいは磁場とのより広範な相互作用を誘起するために「ナノ構造体近傍の化学的環境を精密に制御」し、新規なMCD応答やその増強・変調を目指す事、またその応答発現のメカニズムを明らかにする事」を目的と定めた。これを達成するために、Agナノ粒子をベースとして、Agナノ粒子にマグネタイトFe3O4ナノ粒子を近接させるヘテロダイマーの作製、更には、プラズモンの変調を期待してAgナノ10面体の作製に取り組み、かつ、その磁気円二色性を評価した。まず、Ag-Fe3O4ナノへテロダイマーの作製に於いては、高温下でのポリオール反応を適用して作製に取り組んだ結果、収率は低いながらもヘテロダイマーの形成が見られ、それを元にMCD応答の評価を行った。その結果、Agが示すMCD応答にFe3O4が与える影響は小さく、逆に、Fe3O4のMCD応答にAgが多大な影響を与えている事を示唆する結果が得られた。特にそのMCD応答は、Agの光学定数(消衰係数及び屈折率)に関わる変調であった。一方、Agナノ10面体作製ではシードを用いての光照射成長法を適用してその作製を検討した。その結果、首尾良く作製に成功し、MCD応答を評価すると、通常の吸収スペクトルでは見ることのできない10面体の生成確率や形の規則性などがMCD応答には明確に観測され、この手法が10面体のクオリティ評価に適用可能であることを見出した。本課題による研究が開始した平成30年度は、研究代表者が本学に異動して2年目という事もあって研究室に大学院生はいなかった。その後配属された4年生6人が研究に関わることとなり、全く新たな状態で本研究が開始された。その様な状況の下、まずは学生達の基本的指導に始まり、実効的な研究が行われ出したのは、その学生達の一部が大学院入試に合格した秋以降であった。その後、幸いにも学生達は熱心に研究に取り組んで切れたお蔭で、興味深い研究成果が得られつつあり、概ね順調に進展していると考えている。例えば、金属ナノ粒子の形状、及びそれに起因するLSPR出現を著しく変調させるためにAgナノ10面体の作製に様々な論文などの参考にしながら取り組んだが、そのクオリティが相当に良くなって作製できるようになるには時間を要した。しかしながら、その研究過程に於いて通常の吸収分光測定では決して分からないクオリティをMCD測定では明らかに検出可能であることが分かった点は興味深い。一方、金属ナノ構造体と他のナノ構造体との広範な相互作用を利用しての変調は、やはりそのナノ構造体の作製が難しい点から生成収率は低い問題点はあるが予想とは異なる興味深い結果が得られつつあり、研究すべき内容は尽きない。平成30年度の研究成果を踏まえ、以下のような研究を展開したいと考えている。まず、金属ナノ粒子・ナノ構造体の形状変調に関わる研究としては、やはり多面体が興味深く、双ピラミッド型ナノ構造体の作製とMCD応答評価を行う予定である。この構造体が発現するLSPR特性もやはり形の正確さなどに敏感であり、クオリティがどの様にMCD応答に反映されるか興味のある所である。更に、そのナノ構造体に異方性が大きい場合はマグネトプラズモン由来の応答がどの様に変化するのかも調べる所存である。尚、金属としてAgのみならずAuについても検討を行う予定である。一方、ヘテロダイマー型ナノ構造体については、Agを中心とする系はやはり安定性に問題があり、こちらもAuをベースとしたヘテロダイマーを積極的に作製を試みる。金属ナノ粒子に近接・相互作用させるナノ構造体は磁性体以外も検討したい。また、金属以外の物質(特に欠陥型半導体)にも最近はLSPR発現が観測されているが、未だその現象は統一的に理解されているとは言い難い。従って、その様な半導体が発現するLSPRについてMCD応答の特徴を調べる研究にも着手したい。この様に、様々な物質の作製とそのMCD応答の研究から、種々物質が有するLSPRの特徴を理解し、その上で、複合型ナノ構造体が有するプラズモンハイブリダイゼーションへの研究へと推進していく予定である。尚、平成31年度は幸いにも数名の4年生が大学院修士課程に進学することが決まり、研究の分断が生じる心配は回避された点も、研究の滞りない進展に大いに期待する所である。更に、新たに配属された4年生がより広範囲な視点から材料合成及びその磁気円二色性応答評価に取り組んでいくことをも大いに期待している。

これを達成するために、Agナノ粒子をベースとして、Agナノ粒子にマグネタイトFe3O4ナノ粒子を近接させるヘテロダイマーの作製、更には、プラズモンの変調を期待してAgナノ10面体の作製に取り組み、かつ、その磁気円二色性を評価した。まず、Ag-Fe3O4ナノへテロダイマーの作製に於いては、高温下でのポリオール反応を適用して作製に取り組んだ結果、収率は低いながらもヘテロダイマーの形成が見られ、それを元にMCD応答の評価を行った。その結果、Agが示すMCD応答にFe3O4が与える影響は小さく、逆に、Fe3O4のMCD応答にAgが多大な影響を与えている事を示唆する結果が得られた。特にそのMCD応答は、Agの光学定数(消衰係数及び屈折率)に関わる変調であった。一方、Agナノ10面体作製ではシードを用いての光照射成長法を適用してその作製を検討した。その結果、首尾良く作製に成功し、MCD応答を評価すると、通常の吸収スペクトルでは見ることのできない10面体の生成確率や形の規則性などがMCD応答には明確に観測され、この手法が10面体のクオリティ評価に適用可能であることを見出した。本課題による研究が開始した平成30年度は、研究代表者が本学に異動して2年目という事もあって研究室に大学院生はいなかった。その後配属された4年生6人が研究に関わることとなり、全く新たな状態で本研究が開始された。その様な状況の下、まずは学生達の基本的指導に始まり、実効的な研究が行われ出したのは、その学生達の一部が大学院入試に合格した秋以降であった。その後、幸いにも学生達は熱心に研究に取り組んで切れたお蔭で、興味深い研究成果が得られつつあり、概ね順調に進展していると考えている。例えば、金属ナノ粒子の形状、及びそれに起因するLSPR出現を著しく変調させるためにAgナノ10面体の作製に様々な論文などの参考にしながら取り組んだが、そのクオリティが相当に良くなって作製できるようになるには時間を要した。しかしながら、その研究過程に於いて通常の吸収分光測定では決して分からないクオリティをMCD測定では明らかに検出可能であることが分かった点は興味深い。一方、金属ナノ構造体と他のナノ構造体との広範な相互作用を利用しての変調は、やはりそのナノ構造体の作製が難しい点から生成収率は低い問題点はあるが予想とは異なる興味深い結果が得られつつあり、研究すべき内容は尽きない。平成30年度の研究成果を踏まえ、以下のような研究を展開したいと考えている。まず、金属ナノ粒子・ナノ構造体の形状変調に関わる研究としては、やはり多面体が興味深く、双ピラミッド型ナノ構造体の作製とMCD応答評価を行う予定である。この構造体が発現するLSPR特性もやはり形の正確さなどに敏感であり、クオリティがどの様にMCD応答に反映されるか興味のある所である。更に、そのナノ構造体に異方性が大きい場合はマグネトプラズモン由来の応答がどの様に変化するのかも調べる所存である。尚、金属としてAgのみならずAuについても検討を行う予定である。一方、ヘテロダイマー型ナノ構造体については、Agを中心とする系はやはり安定性に問題があり、こちらもAuをベースとしたヘテロダイマーを積極的に作製を試みる。金属ナノ粒子に近接・相互作用させるナノ構造体は磁性体以外も検討したい。また、金属以外の物質(特に欠陥型半導体)にも最近はLSPR発現が観測されているが、未だその現象は統一的に理解されているとは言い難い。