hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NKT細胞の分化、増殖に関わる機能分子の同定

NKT細胞は自然免疫系に属する細胞である。NKT紳胞は、Vα14NKT細胞受容体によってある種の糖脂質を認識して活性化され、IL-4やIFN-γ等のサイトカインを産生するとともに、パーフォリンを分泌して標的腫瘍細胞を傷害し、。腫瘍免疫を担っている。遺伝子操作動物を用いた研究から、生体防御のさまざまな局面で非常に大きな役割を果たしていることがわかってきた。この申請では、NKT細胞の前駆細胞であるNKβ細胞から成熟NKT細胞に分化する機構を分子レベルで解明するとともに、標的腫瘍細胞の認識に関わる分子群を同定することを目的とした。これまでに、サブトラクション・クローニング法の一種であるSuppression subtractive hybridization(SSH法)により、成熟したVα14NKT細胞と、Vα14NKT細胞の前駆細胞であるNKβ細胞において一方のみに発現している遺伝子をいくつか同定した。そのうち、今年度は新規分子NKG2Iを同定・解析した。その機能をin vitro及びin vivoで解析した。NKG2IはCD94のホモログで、抗体で架橋刺激するとサイトカイン産生が上昇しin vivoの解析からはアロの細胞の拒絶反応に関与していることがわかった。NKT細胞は、Vα14NKT細胞受容体によってある種の糖脂質を認識して活性化され、IL-4やIFN-γ等のサイトカインを産生するとともに、パーフォリンを分泌して標的腫瘍細胞を傷害し、腫瘍免疫を担っている。そのうち、Mouse PK3(Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3)の全長のクローニングが終わった。これは、ERKやp38 MAPKの下流の分子であるが、このキナーゼの標的分子は不明である。この遺伝子の転写はGM-CSFでNKβ細胞を刺激すると約18時間で発現が上昇することから、GM-CSF依存性のNKT細胞での分化・遺伝子再構成などのプロセスを誘導している可能性が出てきた。今後、またゲノム上での遺伝子構造の解析を進める。ノックアウトマウス作成のコンストラクトの作成を目指す。
脱凝集活性を持つ分子シャペロンClpBの構造変化と機能

ClpBは凝集したタンパク質を再生(脱凝集)できる。Nドメインの動きをジスルフィド結合で制限すると、ClpBの脱凝集活性が低下するが、その原因は基質を結合した後の糸通し過程にあることを明らかにした。また、ClpB6量体の隣り合うサブユニット2つ、あるいは6つ全てをジスルフィド結合でつないだ変異体をそれぞれ作成した。これらの変異体を用いた実験により、ClpBによる効率的な脱凝集には、6量体の適度な解離会合が必要であることが分かった。分子シャペロンClpBは、他の分子シャペロンDnaKとその補助因子であるDnaJ、GrpEと協力して、凝集タンパク質を再生すること(脱凝集)ができる特異な分子シャペロンである。ClpBはNドメイン、AAA1、ミドルドメイン、AAA2、の4つのドメインからなる。また、ClpBはリング状の6量体を形成して働くが、凝集したタンパク質をそのリングの中央の孔に通すようにしてほぐす活性(糸通し活性)を持つといわれている。ClpBの6量体はそれほど安定ではなく、タンパク質濃度、塩濃度、温度などの条件に応じて解離会合を繰り返すため、生化学的実験の解釈が複雑になってしまうことが多い。そこで今回、ClpB6量体中の隣り合うサブユニットをジスルフィド結合で固定し、6量体構造の崩れないClpBを作成した。このClpBを用いることで、ClpBが働く上で、6量体が解離会合することの意義や、6量体中のサブユニット間の協同性について詳しく検証できるものと期待される。また以前、好熱菌のClpBに変異を導入し、ClpPというプロテアーゼを結合させることによって、ClpBの糸通し活性を、基質タンパク質の分解という形で検出する系を作成している。現在、この実験系を用いて、AAA1、AAA2それぞれへのATPの結合やその加水分解、ClpBリングの中央に保存された芳香族アミノ酸などの、糸通し活性への関与について解析を進めている。ClpBは、AAA+タンパク質ファミリーに属する分子シャペロンで、他の分子シャペロンDnaKとその補助因子であるDnaJ、GrpEと協力することで、一度凝集したタンパク質を再生すること(脱凝集)ができる。ClpBは、Nドメイン、AAA1、ミドルドメイン、AAA2、の4つのドメインからなるサブユニットが、リング状の6量体を形成して働く。その際ClpBは、凝集したタンパク質をそのリングの中央の孔に通す(糸通し)ようにしてほぐすといわれている。ClpBのNドメインは非常に可動性が高いことが知られている。これまでの研究で、ジスルフィド結合により、Nドメインの動きを制限すると、基質との親和性はそのままで、脱凝集活性が低下することを示してきた。今回、この脱凝集活性の低下の原因のひとつが、糸通し活性の低下によるものであることを明らかにした。また、ClpBは、他のAAA+タンパク質と同様に、アルギニンフィンガーと呼ばれる高度に保存されたアルギニン残基を、2つのAAAドメインそれぞれに持つ。これらのアルギニン残基をアラニンに置換した変異体を作製し、影響を見た。その結果、いずれのアルギニン残基も、ATPの結合には関わらないが、それぞれのAAAドメインでのATPの加水分解には必須であることが分かった。さらに、AAA1のアルギニンフィンガーは、AAA1へのATPの結合に依存したClpBの6量体構造の安定化に重要であることを明らかにした。分子シャペロンClpBは、別の分子シャペロンであるDnaKとその補因子と協力し、熱などのストレスにより変性、凝集したタンパク質を再生することができる。ClpBはAAA+タンパク質の1つで、N末端ドメイン、AAA1モジュール、Mドメイン、AAA2モジュールからなるサブユニットがリング状の6量体を形成し、ATPの加水分解のエネルギーを利用して働く。また、凝集したタンパク質をほぐす(脱凝集)際、凝集タンパク質を6量体リングの孔に通す(糸通し)といわれている。ClpBの6量体リングは不安定で、タンパク質濃度、塩濃度、温度、ヌクレオチドの結合状態に応じて、解離会合を繰り返している。この不安定さは、ClpBが効率的に脱凝集を行うために必要ともいわれているが、一方で、ClpBの機能解析を非常に複雑で困難にする。これまでに私たちは、ClpB6量体リング内の隣り合うサブユニットをジスルフィド結合で固定することにより、サブユニット2つをつなげた固定化2量体ClpB、サブユニット6つ全てをつなげた固定化6量体ClpBを作成している。今回これらを用いて、脱凝集反応におけるClpBサブユニットの解離会合の重要性を検証した。固定化2量体ClpBは野生型に比べ6量体構造を安定に維持することができる。生理的な条件において、固定化2量体の脱凝集活性は野生型よりも低かったが、6量体構造がより不安定になる高塩濃度条件下では、野生型よりも高かった。

また、固定化6量体では、いずれの条件においても脱凝集活性は著しく低下しており、効率的な脱凝集反応にはClpB6量体の適度な解離会合が重要であることが示唆された。
ライフコースを通じた女性の就業キャリアの経路・変動の向きと家事労働

本研究は、パネルデータ(働き方とライフスタイルの変化に関する全国調査)と国際比較調査データ(ISSP2012)を用いて、1ライフコースを通じた配偶者間の家事労働分担の実態と変動を明らかにすること、2女性の就業キャリアの経路や変動の向きに着目して、世帯内労働・関係性との関連を分析すること、3女性の就業キャリアの経路と世帯内のジェンダー不平等との関連を国際比較分析することを目的とする。
近世地方知行制の比較史的研究

そもそも近世における封建的土地所有体系の頂点に立つのは徳川将軍で、大名の領地は将軍より宛行われるものであり、大名家臣の知行地はその領地の一部を大名よりさらに宛行われたものであった。つまり、領地・知行地は宛行われる者にとって主従関係を結ぶ上位権力者からの拝領地であった。しかも、所替・改易の可能性があったし、実際に行われもした。もっとも大名の場合、「鉢植え」という認識がすでに当時からあったものの、基本的には刑罰(裁判)権・行政権・徴税権などの独自の領地支配権を将軍=幕府は認めていた。これに対して、大名家臣の場合、大名権力の確立=集権政策のなかで、知行地に対する諸権限は漸次削減・形骸化され、知行地との関係が実質的に保たれた場合でも、その権限は徴税権に限定されたというのが通説となっている。知行地を拝領した大名家臣、いわゆる給人の多くはそのような性格を有していたと考えられ、地方知行制に近世的意義を認める論者のなかで、近世の領主権の基本が徴税権であり、刑罰権や行政権等をあわせたいわば完全な支配権の所有が封建領主としての本質ではないとの主張も、その実態に照らし合わせて考えれば、有力な考え方であろう。しかし、本研究で明らかにしたように、拝領地である知行地を自らの「家」相続の観念から「私領」=家産視し、行政権や刑罰権を保持・行使していた給人もいる。彼らの独自の支配権はいわゆる官僚として郡奉行・代官の地方支配とは異質のものであろう。いわば近世における領主制の多層構造(将軍-大名-給人)の具体的ありようは、武士の官僚制的性格(国家支配のいわば代執行)と領主的性格の連関構造の解明という観点から、改めて検討する必要があろう。このような視角から地方知行制をめぐってはさらに多角的に検討すべきであろう。1.主として東北諸藩の知行制について、西南諸藩の一つ佐賀藩との比較を念頭におきながら検討してきたが、従来例外的・特殊的と目されてきた上層給人の知行地支配の分析が近世社会の特質を考える上で重要との結論を得た。つまり、上層給人は知行地と強固な関係を有し、領主としての有り様は大名に近いとさえいえる。そもそも、武士には土地支配への指向性があったと思われ、それは封建的土地所有が将軍を中心とする上位権力者に集中されていたとしても、武士としての基本的属性である土地支配に対する欲求を、将軍が大名に、大名が給人に満たしてやらねばならなかったのであろう。その知行地については拝領地であるものの、給人のレベルでは特に「家」の連続意識とあいまって特別の意味を有していた。すなわち、厄除け・葬礼・婚姻等の通過儀礼が「家」の儀礼として「在所」=知行地でなされ、武士=給人の立場からすれば「家」の儀礼は知行地でなすものとの共通認識があった。大名家の存続が前提となる給人は、自らの「家」存続のために幕府巡見使にも知行地において主体的に対応する。1、主として西南諸藩(萩藩・広島藩・高知藩等)の知行制について、昨年度の仙台藩を中心とする東北諸藩および報告者が従来から行ってきた佐賀藩等との比較を念頭におきながら検討してきたが、やはり例外的・特殊的と目されてきた上層給人の知行地支配の分析が近世社会の特質を考える上で重要との結論を得た(萩藩の福原家〔宇部市立図書館〕、広島藩の上田家〔三原市立図書館〕、東城浅野家〔広島市立中央図書館〕、土佐藩の後藤家〔

安芸市立歴史民俗資料館〕等の調査)。すなわち、自らの「家」相続と領主的支配の連関構造である。特に、実質的な知行地支配業務を行っていた陪臣の役目規定等に、主人=給人の「家」連続と知行地の支配が関連して述べられる場合があることは重要であろう。また、成果の一部を報告した給人の家の葬礼をめぐる問題は、陪臣のみならず領民をも包摂した形式で実施され、「家」と領主制の問題を考察する上で今後に検討を重なる必要があろう。しかし、他方でいわゆる近世領主概念の再構成の必要も感じられた。具体的には、萩藩の広範な在郷家臣、高知藩の郷土層と土地・民衆との関係である。彼らは地主的側面をも有していたと考えられ、彼らが村落共同体の実質的支配者としてたちあらわれる場合さえある。これは例えば仙台藩の所給人制や佐賀藩の被官制等との比較検討が必要であり、大名や上層給人と村落共同体との間で、さらに大庄屋・庄屋等との関係の中で、いかなる地域社会構造を構成していたのか。領主と民衆のそれぞれのレベルで多層な構造があり、私は上層給人(給人領主とよんでいる)の領主的性格を明らかにすることを通じて領主層の多層構造を解明しようとしたが、それだけでは勿論不十分で、在村し地主的性格を併有した中・下層の家臣と農民上層の村役人である大庄屋・庄屋クラスの関係の分析も、いわば「領国」地域では必要であろう。今後の課題としたい。
硬組織再生に及ぼすアディポサイトカインの効果

まず、マウス由来骨芽細胞株やヒト歯髄由来線維芽細胞におけるアディポサイトカインレセプターの発現について検索し、これらの細胞がアディポサイトカインの作用を受けることを明らかにした。骨芽細胞にアディポネクチン(AN)を作用させたところ、骨芽細胞の分化誘導関連タンパク質の発現にANが深く関与することを示唆する結果が得られた。次に、骨芽細胞-破骨細胞のコミュニケーションについて遺伝子レベルで検索し、リン脂質リン酸化酵素PI3-kinaseがsRANKL刺激時の破骨細胞分化誘導に関与することを明らかにした。さらに、高脂血症治療薬を添加したときの骨芽細胞の石灰化能を検索したところ、脂質代謝の改善は硬組織形成を促進した。また、口腔領域におけるアディポサイトカインの役割を明らかにするために、ヒト歯髄由来線維芽細胞を用いてANとレプチン(LP)の作用を検討した。培養細胞にANおよびLPを添加したところ、ANは細胞増殖を促進するとともにBMP-2を増加させたが、LPは細胞増殖には影響せず象牙質シアロタンパクを増加させた。これらの結果から、ANはヒト歯髄由来線維芽細胞の増殖・分化に、LPは象牙質形成に影響を及ぼすことが示唆された。単純性肥満マウスの脂肪組織細胞におけるアディポサイトカイン遺伝子発現の変化と漢方薬投与の効果について検索した。その結果、高脂肪食による単純肥満は、脂肪組織において、高血圧に関与するLPやインスリン抵抗性を惹起するTNFαの遺伝子発現を増加させ、逆にインスリン感受性亢進性で動脈硬化の修復に作用するANやアディプシンの発現は抑制した。本実験で処方された漢方薬はこれらの単純肥満によるアディポサイトカインの発現異常を正常な状態に改善した。【in vitro実験系】培養骨芽細胞機能に及ぼすアディポサイトカインの影響についてマウス由来骨芽細胞株(MC3T3-E1)を用い、まず、アディポネクチンレセプター(AdipoR1およびAdipoR2)の遺伝子発現をRT-PCR法にて確認した。次に、同細胞にアディポネクチンを添加して培養した。培養細胞よりmRNAを抽出し、石灰化能を左右する細胞外マトリックスタンパク質のI型コラーゲンおよび骨芽細胞-破骨細胞間のコミュニケーションに関与するM-CSFの遺伝子発現をreal time RT-PCR法にて検索した結果、I型コラーゲンの遺伝子発現が減少し、M-CSFの遺伝子発現が増加していた。【in vivo実験系】単純性肥満マウスの血中アディポサイトカイン濃度の変化と漢方薬投与の効果について生後3週齢のJcl:ICRマウスに特殊配合高脂肪飼料を投与したところ、13週齢で著明な体重差が生じた。そこで13週齢より6週間漢方薬(単純性肥満改善薬)を投与し、19週齢の通常飼料投与群(N群)、高脂肪飼料投与群(C群)、高脂肪飼料・漢方薬投与群(CH群)の体重、臓器重量を測定、また、血液生化学検査を行った。体重はC群で増加したが、CH群ではN群と同じレベルまで改善した。また、肝重量はC群で有意に増加していた。血清総コレステロール量はC群、CH群ともに有意に上昇していたが、血清酵素活性(GOT、GPT、ALP、LDH)、タンパク質含量、無機質含量には変化がなかった。ELISA法にて測定した血清インスリンおよびアディポネクチン濃度はC群、CH群ともに、N群に比べ有意に上昇していた。一方、血清レプチン濃度は、C群、CH群ともにN群に比べ有意に増加していたが、C群に比べCH群で有意に減少していた。【in vitro実験系】まず、マウス由来骨芽細胞株(MC3T3-E1)を用いて骨芽細胞機能に及ぼすアディポネクチン(AN)の作用を検索した。

アディポネクチンレセプターの遺伝子発現をsiRNAで抑制したところ、アスコルビン酸によって誘導されるBMP-2、オステオカルシン、オステオポンチンなどの骨芽細胞の分化、石灰化能に重要な分子の遺伝子発現が抑制された。また、口腔領域におけるアディポサイトカインの役割を明らかにするために、ヒト歯髄由来線維芽細胞を用いてANとレプチン(LP)の作用を検討した。まず、Western BlottingでANとLPのレセプターの発現を確認し、アディポサイトカインが歯髄由来線維芽細胞にも作用することを明らかにした。次に、培養細胞にANおよびLPを添加したところ、ANは細胞増殖を促進するとともにBMP-2を増加させたが、LPは細胞増殖には影響せず象牙質シアロタンパクを増加させた。これらの結果から、ANはヒト歯髄由来線維芽細胞の増殖・分化に、LPは象牙質形成に影響を及ぼすことが示唆された。【in vivo実験系】単純性肥満マウスの脂肪組織細胞におけるアディポサイトカイン遺伝子発現の変化と漢方薬投与の効果について検索した。特殊配合高脂肪飼料を3週齢のマウスに10週間投与し、単純性肥満マウスを作製した。さらにこのマウスに漢方薬(単純性肥満改善薬)を6週間投与し、その効果を脂肪組織細胞の形態的・機能的変化から検討した。その結果、高脂肪食による単純肥満は、脂肪組織において、高血圧に関与するLPやインスリン抵抗性を惹起するTNFαの遺伝子発現を増加させ、逆にインスリン感受性亢進性で動脈硬化の修復に作用するANやアディプシンの発現は抑制した。本実験で処方された漢方薬はこれらの単純肥満によるアディポサイトカインの発現異常を正常な状態に改善した。
沿岸漁民の口頭伝承にもとづく、ローカルな経済史・環境史の構築

これまで調査を継続してきたマダガスカルが政情不安のため、2002年度は渡航を自粛し、昨年度までの調査成果をとりまとめた。1970年代以降の経済変化と漁場環境変化、とりわけナマコやフカヒレの採取活動の変遷に関しては雑誌論文を現在作成中であるが、このほかに、国立民族学博物館で開催された文部科学省国際シンポジウム「先住民による回遊性海洋資源の利用と管理」(代表者:岸上伸啓)において研究発表をおこなった。この時の発表は、英語論文集所収の論文としてすでに原稿を準備しており、現在校正が進められている。国内における漁村調査の成果も、とりまとめ中である。これまでの漁民研究では、明治期における南西諸島での漁民拡散が詳しく研究されてきたが、今年度おこなった調査で明らかになったのは、奄美諸島や八重山諸島で昭和初期頃に沖縄漁民が移住したことにより、都市の魚市場や漁村の形成が促されたという事実である。また、村の地先における干潟利用について詳しく聞き込みをおこなったところ、太平洋戦争や本土復帰、バブル好況期など、日本の政治経済の画期に干潟利用の状況や干潟環境が大きく変わってきたことも明らかになった。その反面、職業的漁業者以外の人々が多様なかたちで今なお干潟に出かけ、さまざまな小動物をなかば娯楽として採取している実態も明らかになった。これらに関しては今後補足調査をおこない、文献による裏づけをとってから成果を公表する予定である。マダガスカル南西海岸部の一漁村について聞き込みをおこない、以下のような環境=経済的変化が明らかとなった。村の生活が大きく変化する画期は、漁獲物の商品化が進展する1970年代である。この時期、州都と地方都市を結ぶ陸路が整備されるのにともない、ナマコやイセエビなどが高価格で取引されるようになったほか、村民の一部が他の村民から鮮魚の買いつけをおこなうようになった。また、ナイロン製魚網や水中メガネなども普及した。こうした変化が起こって30年にも満たない現在、いずれの魚種についても漁場が村から遠ざかり、全体的に漁獲量が減ってしまったと漁師たちは証言する。つまり、流通経路の整備と漁獲技術の向上が漁場環境の劣化を招いたのである。このように、経済的変化が漁場環境を変化させたいっぽうで、環境劣化への対処として漁民たちは新たな漁場を開拓し、季節的出漁という新しい経済活動を定着させていった。すなわち、環境の変化と経済の変化は相互影響するかたちで展開してきており、漁民自身もそのように認識しているのである。以上から、漁獲対象や漁法の変化についての聞き込みにより、自然環境と経済環境の両方が変化していくさまを追跡できることが明らかになった。この変化の過程は、単なる環境史ないし経済史というより、生活史をめぐる自然環境的側面と経済的側面といった方がよいかもしれない。これを改めて環境史・経済史と呼ぶためには、さまざまな生活史的背景を持つ語り手から資料を集めて整合性を見出すとともに、文字資料との照合をもおこなう必要があろう。
新規フッ素系グラファイト層間化合物の設計、作製、物生と機能発現

1.フッ素系グラファイト層間化合物の設計と作製2.フッ素-グラファイト層間化合物CxFのイオン伝導性と電子伝導性グラファイトへ金属フッ化物イオンがインターカレーションすることによりab-面内電子伝導性は8倍程度に増加するがイオン伝導性はない。HF中のF_2によるグラファイトの酸化や単体フッ素との直接的な反応によって生成するCxFはフッ化物イオン伝導性固体電解質であることが交流インピーダンス測定によって明らかにされた。3.イオン性CxF,半イオン性CxF生成のインターカレーション反応を設計することによって得られた一連の物質群について、反応条件と組成、C-F結合の性質との相互関係を明らかにした。4.イオン性CxF,半イオン性CxFを正極としたリチウム電池を構築し、CxFの電気化学的性質と放電反応機構を詳細に調べ、インターカレーション反応C-F結合の性質エネルギーバンドの変化電池起電力と放電特性の関係を明らかにした。イオン性CxFの放電反応は電気化学的均一反応であり、半イオン性CxFのそれは電気化学的不均一反応である。従って、OCVが放電率に依存せず、放電電位が平坦で利用率も高い半イオン性CxFの方がリチウム電池正極として優れている。試験セルLi/1M LiClO_4-PC/C_xMF_yを構築し、一次電池、二次電池正極活物質としての機能を評価した。特にC_xPbF_6正極のサイクリックボルタンメトリーから可逆的な電気化学的酸化・還元反応が明らかにされ、リチウム二次電池活物質とすることが可能となった。Li/C_xPbF_6セルの0.1mA/cm2におけるクーロン効率は75100%であった。3.フッ素-グラファイト層間化合物C_xFのイオン伝導性と電子伝導性グラファイトへ金属フッ化物イオンがインターカレーションすることによりab-面内電子伝導性は8倍程度に増加するがイオン伝導性はない。HF中のF_2によるグラファイトの酸化や単体フッ素との直接的な反応によって生成するC_xFはフッ素化物イオン伝導性固体電解質であることが交流インピーダンス測定によって明らかにされた。このことはC_xFの電気化学的酸化(インターカレーション)や還元(脱インターカレーション)が可逆であることからも支持された。フッ化物イオンの輸率を実験的に決定する方法を検討中である。共有結合性層状化合物(CF)_nを正極とするリチウム電池の放電過電圧と比較して、C_xFのそれが著しく低いこともフッ化物イオン伝導性と関連していることは明らかであり、この観点からリチウム電池正極として最適なC_xFの構造、物性を設計しつつある。1.金属フッ化物-グラファイト層間化合物の設計と作製金属フッ化物の液体HF溶液中におけるインターカレーション反応を制御することにより、C_x^+MF_y^-(MF_y=SnF_6^<2->,PbF_6^<2->)を合成し、反応条件と生成物についての詳細なキャラクタリゼーションから、インターカレーション反応のメカニズムを明らかにした。PbF_4-HF系ではPbF_4自身の酸化能によって反応が進行し、SnF_4-HF系では反応系に単体フッ素の共存が必要である。2.C_xSnF_6の構造相転移、光反射スペクトルと物性第2ステージC_xSnF_6は120200Kで二次元相転移をすること、フェルミ準位の低下(ΔE_F=1.04V)と電荷移動量(f_c=0.024)はC_xAsF_5と同程度であるが、インターカレーションに伴う格子欠陥の発生や結晶性の低下によって、σ=0.94×10^5Scm^<-1>程度となることが明らかにされた。3.イオン性および半イオン性C_xFの電気化学的性質Li/C_xFセルを構築し、C_xF正極のサイクリックボルタンメトリーと定電流分極曲線の解析から、イオン性C_xFの放電反応は電気化学的均一反応であり、半イオン性C_xFのそれは電気化学的不均一反応であることを明らかにした。OCVが放電率に依存せず、放電電位が平坦で高く、利用率も高い半イオン性C_xFの方がリチウム電池正極として優れている。
誤嚥性肺炎の初期病態の解明と、治療法に関する研究

平成5年度の目的:ウサギの右肺へ塩酸を注入したときの、(1)塩酸投与肺と反対側肺の肺胞上皮細胞、肺血管内皮細胞、胸膜のタンパク、水分透過性の経時的変化を知る。(2)ペントキシフィリン(PTX)がこれらのパラメータに及ぼす効果について検討する。結果:塩酸注入により塩酸投与肺の肺胞上皮細胞、肺血管内皮細胞、胸膜のタンパク、水分透過性は亢進した。対側肺の肺血管内皮細胞のタンパク、水分透過性も亢進した。PTXの前投与は対側肺の肺血管内皮細胞のタンパク、水分透過性亢進を抑制した。6年度の目的:(1)サイトカイン、好中球数とその活性化の経時的な変化を調べる。(2)PTXがこれらのパラメータや、心、腎、肝、小腸に及ぼす効果について検討する。結果:(1)血中のTNF-αは塩酸投与1、2時間にのみ出現した。8時間後の肺胞洗浄液(BALF)中でも塩酸投与側で6例中4例でプラスであった(p<0.05)。PTXの前投与はTNF-αの出現を抑制した。(2)好中球の活性化の指標としてH_2O_2を調べた。これは塩酸投与30分後より増加した。PTXはこの増加を抑制した。(3)塩酸注入は、両側肺と小腸のミエロペルオキシダーゼ(MPO)、湿乾重量比(W/D)を増加させた。PTXは対側肺、小腸のこれらの増加を抑制した。(4)以上のPTXの効果は主にTNF-α出現の抑制作用によるのではと考え、TNF-αの抗血清を前投与してその効果を調べた結果、PTX前投与と同じ結果が得られた。結論:塩酸の肺内注入は遠隔の対側肺、小腸の浮腫をきたす。これは血中に増加したTNF-αにより活性化された好中球がこれらの臓器に集積し血管透過性を増したためと考えられた。マクロファージのTNF-α産生、好中球の活性化を抑制するペントキシフィリンの前投与はこれらの反応を抑制した。1.ウサギの右肺に塩酸を注入し、静注した^<131>I-albuminと、右肺に注入した^<125>I-albuminにより右肺の肺胞上皮細胞、血管内皮細胞のタンパク透過性を8時間にわたり調べた。またこれらにたいするペントキシフィリン前投与の効果を調べた。2.右肺の肺胞上皮細胞のタンパク透過性は速やかに上昇し、肺水分量の増加が見られた。これらに対するペントキシフィリンの抑制効果は認められなかった。塩酸投与により、左肺の肺水分量は増加し、血管透過性も亢進したが、これらはペントキシフィリンにより抑制された。3.右肺に塩酸を注入し、静注した^<131>I-albuminと、左肺に注入した^<125>I-albuminにより左肺の肺胞上皮細胞のタンパク透過性も8時間にわたり調べたが、タンパク透過性の亢進は見られなかった。4.右肺臓側胸膜の透過性も亢進したが、これもペントキシフィリンにより抑制された。

好中球数は塩酸投与後30分に低下したが、ペントキシフィリンにより抑制された。5.ペントキシフィリンには、TNF産生の抑制、好中球活性化、接着抑制作用がある。塩酸非投与肺の間質性肺水腫、塩酸投与肺の胸膜の透過性亢進はペントキシフィリンにより抑制されたことから、活性化された好中球によるものと考えられた。塩酸投与肺の肺胞上皮細胞のタンパク透過性亢進は、ペントキシフィリンにより抑制されなかったことにより、塩酸の直接作用と考えられた。
生物反応修飾物質(BRM)で誘導される腫瘍壊死因子(TNF)産生細胞の遺伝子工学的研究

腫瘍壊死因子(TNF)は主として貧食細胞、単核球により産生され、ヒト悪性腫瘍の退縮に重要な役割を果たしている。本研究は、NTFのmRNAをタ-ゲットとして、各種BRMを作用させたときのTNF産生細胞の誘導状況並びにその局在を遺伝子工学的手法で直接的に証明しようとするもので、そのためにまず476bpからなる合成TNFcDNAプロ-ブを作製した。このプロ-ブをスルホン化し、私たちが開発したmRNA-DNA in situ hybridization法を用いて各種のBRMで活性化させたヒト末梢血単核球のTNFmRNAを検出することに成功した。また、培養上清中のTNFをEIA法で測定したところ、TNF活性はBRM作用後1.5時間から検出されはじめ、12時間でピ-クに達することも分かった。さらに各種の固定法を検討した結果、microwave照射による迅速固定法が抗TNF抗体による免疫染色に有用で、単核球の細胞質でTNFが合成されてゆく過程を鮮明に捉えることが可能となった。こうした研究結果をふまえて、他のcytokineであるIL-1α、IL-1β、IL-5などの検出も可能となってきている。こうしたアッセイ系でもっとも効率よくcytokineの産生を誘導するBRMを担癌生体の腫瘍局所に投与しその抗腫瘍効果を検討中したが、単独投与ではいかに局所投与といえども著明な抗腫瘍効果をうることは出来なかった。そこで、BRMの投与効果を増強させるためにfibrinogenと混合投与する方法を考察し、動物実験で検討した結果、きわめて効率のよい局所反応が誘発され著明な抗腫瘍効果と生存期間の延長が認められることが分かった。現在、この手法で癌患者に術前局所投与を行ない、手術摘出材料の病理学的な解析を行っているが、投与局所での癌細胞の変性・壊死ばかりでなく、転移リンパ節においても著名な抗腫瘍効果が得られることが明らかになってきている。末梢血より単核球を採取し、2ー3時間培養して付着細胞を選択した。これらの細胞をOKー432 0 1KE/mlで24時間培養刺激したのち、培養上清中のTNF活性をPTー050 EIA kitで測定するとともに、cytospinでスライドグラスに付着させた細胞をmicrowave照射にて迅速固定してTNFのin situ hybridizationと免疫染色を行なった。EIA法ではOKー432で24時間刺激培養した上清に10U/mlから200U/mlの活性が見られ、また100U/ml以上の活性をみとめた刺激細胞のin situ hybridizationならびに免疫染色では、その細胞質にTNFのmRNAならびにその産物(TNF)の蓄積が確認された。EIA法でTNF産生の経時的変化をみると、上清中の活性値は刺激後24時間でピークに達するが、OKー432に対する感受性には著しい個体差があることが分かった。一方、HLー60細胞ならびにARHー77細胞を用いた刺激実験では当初の予想に反して効果的なTNFの誘導を行うことが出来なかった。これは細胞の培養条件によるcell differentiationやviabilityの違い等が微妙に影響しているものと考えられ、現在その条件設定を検討中である。

また、OKー432のin vivoでのTNF誘導能をみるために、大腸癌患者を対象に術前経内視鏡的にOKー432を10KEから30KE局所投与し、その新鮮手術材料を用いてTNFのin situ hybridizationならびに免疫染色を施行しているが、現在までに10例の局所投与例のうち1例でTNF免疫染色陽性の単核球が検出された。今後、OKー432の局所投与から切除までの時間をいろいろと変えて検討を行ない、in vivoでTNFの誘導がピークに達する時間をみきわめたうえでさらに症例を重ねる予定である。大腸癌担癌局所における癌と宿主の免疫応答を解析するため、cytokine mRNAをタ-ゲットとするin situ hybridization法を試みた。まずTumor necrosis factor(TNF)mRNAを検出するためにTNFのcDNA probe(476bp、全塩基配列)を人工的に合成した。pennicaらの報告したTNF cDNAの塩基配列をもとに、全体を6個のブロックに分割した人工遺伝子を作製。各ブロックを独立にpUc18にサブクロ-ニングしたのち、おのおのをDNA ligaseで順次連結して目的とする476bpのTNF cDNAをえた。このprobeをスルホン化し、BRMの1種であるOKー432で活性化させたヒト末梢血単核球のマイクロウエ-ブ固定標本を対象にTNF mRNAの検出を行ったところ、刺激後12ー24時間の単核球の細胞質にTNF mRNAが検出された。この細胞の培養上清中のTNF活性をEIA法で経時的に測定したところ、in situ hybridizationでTNF mRNAが検出された時間に一致して、TNF活性のピ-クが認められた。また、その細胞標本をTNFに対する抗体で免疫染色したところ、刺激後1.5時間で核陥凹部に一致した細胞質にTNFの免疫反応が出現し、3、6、12、24時間と培養するにつれて細胞質の反応が増強し、EIA法による培養上清中のTNF値変動と非常によく一致した。また、同時に行なったILー1αおよびILー1βの免疫染色では、EIA法でピ-クの値をとる刺激後6時間目の単核球の細胞膜にILー1α、細胞質内にILー1βの強い免疫反応が得られた。以上の結果から、TNF、ILー1αおよびILー1βの検出には、マイクロウエ-ブ照射による迅速固定法がもっとも適していると考えられた。次に、ヒト大腸癌組織のマイクロウエ-ブ固定パラフィン切片を対象に、癌巣に浸潤する単核球中のTNF mRNAの検出を試みたが、まだ明らかな陽性所見が得られるには至っていない。そこで、OKー432を術前に腫瘍内投与し、cytokineの産生を誘導することを試みたところ、投与法を工夫することによって効率的なcytokine産生がおこる可能性が示唆された。
α(2→8)結合N-グリコリルノイラミン酸ポリマーの免疫抗原性と抗体産出-Neisseria menigitidis B群細菌感染予防のためのワクチン開発の基礎

本研究は,脳膸膜炎菌Neisseria meningitidis B群細菌感染予防を終局の目的とし,低抗原性のN-アセチルノイラミン酸(NeuAc)のα-(2→8)結合ポリマーに対する抗体産生の試みを, N-グリコリルノイラミン酸(NeuGc)のα-(2→8)結合ポリマーを分子内にもつニジマス卵ポリシアロ糖タンパク質(PSGP)を利用して実行することであった.本研究によって得られた成果を要約すると以下の通りである.(1)α-(2→8)結合NeuGcポリマーはα-(2→8)結合NeuAcポリマーと同様抗原性は極めて低い.ウサギ,マウス系では十数ヶ月にわたって静脈投与を続けても抗体産生は認められなかった.(2)米国N.I.H.のJ.B.Robbins博士がN.meningitidis生菌をホルマリン処理したものをウマに数年間に亘って静脈投与後ようやく抗血清を得ることに成功し,世界中でポリシアリル鎖の鋭敏なプローブとして使用されているH.46抗-(ポリシアリル基)抗体(IgM)の抗原特異生を調べた結果, H.46は鎖長>12のα-(2→8)NeuAcポリマーとのみ特異的に反応し, α-(2→8)NeuGcポリマーとは交差反応しないことが明らかとなった.(3)α-(2→8)NeuGcポリマーを含むポリシアロ糖タンパク質を抗原として用いニワトリに免疫することによって,抗血清を得ることに成功した.この抗血清中に抗NeuGcポリマー抗体が含まれているものとみられ,現在,その精製と抗原特異性の決定を行っている.この抗血清とNeuGcポリマーをもつポリシアロ糖タンパク質との反応はα-(2→8)NeuAcポリマーであるコロミン酸によって阻害されないことから, H-46抗血清とは対照的なNeuGcポリマーに特異的な抗体を含んでいるものとみられる.この事実は,今後の動物細胞系の初期発生および腫瘍細胞表面に特異的に発現されることが次第に明らかとされてきつつある細胞生物学の分野に極めて有効なプローブを提供し得るものとみなされる.また,上記結果から推してNeuGcポリマーはヒトに対して抗原性を呈することが予期されワクチン開発への道を開き得た.本研究は,脳膸膜炎菌Neisseria meningitidis B群細菌感染予防を終局の目的とし,低抗原性のN-アセチルノイラミン酸(NeuAc)のα-(2→8)結合ポリマーに対する抗体産生の試みを, N-グリコリルノイラミン酸(NeuGc)のα-(2→8)結合ポリマーを分子内にもつニジマス卵ポリシアロ糖タンパク質(PSGP)を利用して実行することであった.本研究によって得られた成果を要約すると以下の通りである.(1)α-(2→8)結合NeuGcポリマーはα-(2→8)結合NeuAcポリマーと同様抗原性は極めて低い.ウサギ,マウス系では十数ヶ月にわたって静脈投与を続けても抗体産生は認められなかった.(2)米国N.I.H.のJ.B.Robbins博士がN.meningitidis生菌をホルマリン処理したものをウマに数年間に亘って静脈投与後ようやく抗血清を得ることに成功し,世界中でポリシアリル鎖の鋭敏なプローブとして使用されているH.46抗-(ポリシアリル基)抗体(IgM)の抗原特異生を調べた結果, H.46は鎖長>12のα-(2→8)NeuAcポリマーとのみ特異的に反応し, α-(2→8)NeuGcポリマーとは交差反応しないことが明らかとなった.(3)α-(2→8)NeuGcポリマーを含むポリシアロ糖タンパク質を抗原として用いニワトリに免疫することによって,抗血清を得ることに成功した.この抗血清中に抗NeuGcポリマー抗体が含まれているものとみられ,現在,その精製と抗原特異性の決定を行っている.この抗血清とNeuGcポリマーをもつポリシアロ糖タンパク質との反応はα-(2→8)NeuAcポリマーであるコロミン酸によって阻害されないことから, H-46抗血清とは対照的なNeuGcポリマーに特異的な抗体を含んでいるものとみられる.この事実は,今後の動物細胞系の初期発生および腫瘍細胞表面に特異的に発現されることが次第に明らかとされてきつつある細胞生物学の分野に極めて有効なプローブを提供し得るものとみなされる.また,上記結果から推してNeuGcポリマーはヒトに対して抗原性を呈することが予期されワクチン開発への道を開き得た.1.米国NIHのJ.B.Robbins博士から提供されたウマ抗N-アセチルノイラミン酸α-(2→8)結合ポリマー抗血清(IgM)の抗原特異性を明確にした。即ち、この抗血清はN-グリコリルノイラミン酸α-(2→8)結合ポリマー(ニジマス未受精卵ポリシアロ糖タンパク質から単離)とは免疫交差反応はしない。ポリシアル酸のN-アシル基を抗原決定基として厳密に識別している。また、ハプテン活性にとって(8NeuAcα2→)nにおける重合度は少なくともn≧6である。2.ウマ抗(8NeuAcα2→)n抗血清を用い、組織免疫化学的手法により、レイクトラウト未受精卵ポリシアロ糖タンパク質(NeuAc/NeuGc=3/7)の卵細胞内局在部位を卵内顆粒である表層胞と明確に同定した。

3.ウサギに対しては(8NeuGcα2→)nポリマーの抗原活性は著しく低いことを実証した[同一の結論はその後弘前大(医)の佐藤公彦博士によっても確認された]。そこで抗体産生能の高いBALB/cマウスを用い免疫化を行い、ELISA法でNeuGcポリシアロ糖タンパク質に対する抗体産生の判定を行なった。ニトロセルロース膜に抗原糖タンパク質を固定し免疫組織化学染色法で最も高感度のABC(avidin-biotin peraxidase complex)法のキットで染色を行なった。しかしいずれのマウスの血清も反応性を示さなかった。4.ニワトリ(NeuGcはニワトリにとっては全くnon-self)に対しては、群馬大(医)の工藤重治博士の協力を得、シアル酸としてNeuGcのみから成るニジマス卵ポリシアロ糖タンパク質を用い抗体産生を試み、成功した。このことは、画期的なことであり、抗体の抗原特異性等について現在研究を進めている。5.シアル酸アナログであるデアミノノイラミン酸を発見し、それがポリシアリル基の非還元末端にcappingし、シアリダーゼ作用から保護されていることを明確にした。この残基(KDN)はかかる意味で非常にユニークであり、その抗原性について今後研究を計画している。
放射光単色X線を用いた心血管系の立体的診断システムの開発

従来のX線撮影法に比較して、画像上での空間分解能、濃度分解能の大幅な向上が期待され、放射光単色X線を用いた心血管系・がん・脳内代謝、骨微細構造などの診断を目的とする撮影システムが、世界各国の放射光施設において開発されている。この場合、加速器から発生する放射光の特性により、多くの撮影システムで被写体への単色X線の照射方向が制限されることになる。そのため、たとえば血管造影検査については、1.静脈から造影剤を注入する冠動脈造影検査では動脈系と静脈系、血管系と心房・心室などの軟部組織、2.動脈から造影剤を注入する微小血管造影検査では血管系自身、のX線投影画像上での重なり合いが、画像診断上問題となる場合がある。画像上での血管系の重なり合いを少しでも軽減し、3次元的な血管系の情報を得ることは臨床診断上、大変有用であると考えられる。そこで、本研究では、血管系のX線投影像上での重なり合いの低減と血管系の3次元的情報を得る方法に関して基礎的検討を行うことを目的とした。そのために、単色X線の被写体への照射方向を変え被写体の3次元的な情報を得るためのラウエ結晶を用いるX線光学系および被写体を低速度で回転させながらX線撮影を行なう回転撮影方法の開発と評価を行ない、これらの方法が有用であることを確認できた。今回の成果により、日本独自に行ってきた血管系の2次元動画像診断システムの開発に関して、より実用的なシステムの実現が可能になると期待される。また今回の成果は、2種類の単色X線で撮影した画像間の差分を行うエネルギー差分システムや、近年注目されているX線の屈折を利用した撮影法による肺がん、乳がんや骨などの診断システムにも応用できると期待される。放射光単色X線を用いた多くの画像診断システムにおいては、放射光の特性により被写体への単色X線の照射方向が制限されるので、被写体内構造のX線画像上での重なりが画像診断上、問題になる場合がある。本研究では、被写体の立体的情報を得るために被写体を低速度で回転させながら撮影し、画像再表示時に高速に表示させる方法とラウエ結晶を用いて被写体への入射X線の角度を変える方法について検討を行なってきた。1.回転撮影法については、照射面積が縦70mm、横70mmのX線エネルギー34keVから38keVの放射光単色X線によりイメージ・インテンシフアイアーテレビ系を用いて`心血管系のファントームを用いた撮影を行ない、立体的な情報を得るための被写体の回転速度、回転角度、1枚の画像を得るために必要なフォトン数などを定量的に評価した。また、計算機に取り込んだデジタル画像の再表示について、立体的情報を得るために最適な表示速度について評価を行なった.これらの結果、この方法が心血管系の立体的情報を得るために有用であることを確認できた。心血管系診断の臨床応用においても有用な方法であると期待される。2.ラウエ結晶を用いる方法については、照射面積が縦20mm、横20mmを得るためのSi(220)面のテスト結晶を作成して血管ファントームの撮影を行ない、X線エネルギーが34keVのときにステレオペアの画像が得られることを確認するとともに、照射面積内のX線強度の変化や画像のゆがみなどを定量的に評価した。この結果を踏まえて、より大きな照射面積を得ることができるラウエ結晶の製作を行なった。また、撮像系として蛍光板とCCDカメラを用いる方法について検出効率などを定量的に評価した。

放射光白色X線から単色X線を得るにはシリコン等の分光素子を用いる場合が多いが、加速器から発生する放射光の特性により、多くの医用画像診断システムにおいて被写体への単色X線の照射方向が制限され、画像診断上問題となる場合がある。昨年度に引き続いて本年度は、放射光単色X線を用いた冠動脈系や微小血管系の血管造影検査において、X線投影画像上での血管系の重なりや血管系と軟部組織、骨などとの重なりを軽減し、立体的な血管系の情報を得るために、被写体を微小角速度で回転させ画像の再生時に高速再生を行なう方法とラウエ結晶を用いて単色X線の被写体への照射角度を変える方法(ステレオ撮影)の提案してきた2種類の撮影方法に関して、血管ファントームや空間分解能評価用ファントーム、濃度分解能評価用ファントームなどを用いて、得られる画像の空間分解能、濃度分解能、必要な被写体回転角度などの物理的特性の評価を行なった。実験は、分光結晶の非対称反射を利用して得られた2次元照射野を持つ単色X線(33.4-37keV)を用いた。撮像系としては、イメージングプレート、X線フィルム、イメージ・インテンシファイアーテレビ系、X線CCDカメラを用いた。その結果、両撮影方法に関して、血管系の立体的情報を得るための物理的パラメータを定量的に評価することができた。画像上での血管同士の重なり合いを少しでも軽減し3次元的な血管系の情報を得ることは疾患の臨床診断を行う上で大変有用であると考えられる。
口腔癌におけるangiogenin遺伝子の発現と機能解析

【目的】Angiogenin(Ang)は血管新生蛋白であり、血管内皮細胞において核へ移行し核小体に集積する。そして、リボソームRNAの転写を刺激し、リボソームの産生、蛋白質への翻訳、細胞増殖を誘導する。最近、AngはリボソームRNAの転写を介して、癌細胞の増殖にも関与していることが明らかとなった。本研究では、口腔癌におけるAngの発現とその機能について検討した。【方法】1.口腔扁平上皮癌患者からの生検標本におけるAngの発現を免疫組織学的に調べた。2.各種口腔癌細胞におけるAngおよびVEGFの産生量をELISAにて測定した。そして、AngおよびVEGFの発現が高いHSC-2細胞を選択して、Angに対するRNAi constructを遺伝子導入し、puromycinで選択後安定導入株を作製した。3.Vector controlおよびAng-RNAiの安定導入株細胞1×10^6個をそれぞれヌードマウスの皮下に植え付け、RNAi in vivoモデルを作製した。4.マウスを15日目に屠殺し、腫瘍組織をホルマリン固定後、パラフィン切片標本を作製し、免疫組織学的に調べた。【結果】1.正常口腔粘膜上皮にはAngの発現は認められなかったが、癌組織ではAngの発現が核と細胞質に認められた。2.各種口腔癌細胞株のAngとVEGFの分泌レベルは、それぞれ異なっており、HSC-2細胞がAngとVEGFを多量に分泌していた。3.ヌードマウスに植え付けられたAng-RNAi導入株は、control vector導入株に比べ劇的な増殖抑制を示した。4.Ang-RNAi導入株の腫瘍組織では、血管新生が阻害され、PCNAの発現の低下も認められた。【結論】口腔癌においてAngは血管新生のみならず癌の増殖においても重要であることが示唆された。1.DNA vector-based RNAi methodによるangiogenin-RNAi plasmidの作製:U6 RNA polymerase III promoterにより転写されるangiogenin-RNAi plasmidとしてpAng34ならびにTA0061-2、TA0061-3、TA0061-5と、これらに対応するcontrol vectorとしてpBS/U6ならびにpcPURU6biSTOP(SV401)をそれぞれ作製した。2.口腔癌細胞へのangiogenin-RNAi plasmidの遺伝子導入およびangiogenin-RNAistabletransfectantの作製:まず、HeLa細胞にtransfectionを試み、4つのangiogenin-RNAi stable transfectantと2つのcontrol vector stable transfectantを選択した。次にUM1およびUM2細胞へtransfectionを試みたがstable transfectantを選択することはできなかった。このため、angiogeninの分泌レベルがUM1およびUM2細胞よりも高くリンパ節への高転移株であるHSC-2にtransfectionを試みた。そして、3つのHSC-2 angiogenin-RNAi stable transfectantと2つのcontrol vector stable transfectantを選択した。3.Angiogenin-RNAi stabletransfectantにおけるangiogeninレベルの測定:HeLa angiogenin-RNAistabletransfectantはcontrol vector transfectantに比べ、いずれも3倍以上angiogeninのレベルは下がっており、これらのデザインのRNAiが機能していることを確認した。口腔癌患者におけるangiogeninの発現性を解析し、angiogeninが口腔癌の転移および予後を規定する因子となりうるかを検討した。対象は、正常口腔粘膜上皮5例、上皮異形成14例、当科で根治的治療を施行した口腔扁平上皮癌症例60例である。

これらの症例の生検および手術材料からパラフィン包埋切片を作製し、1次抗体には抗angiogenin抗体を用い、Elite ABC system (Vector Laboratories)によりangiogenin蛋白の免疫組織染色を行った。angigenin蛋白発現の判定は、細胞2000個につき染色性の判定を行い25%以上に中等度以上の染色性が認められた場合を陽性とし、それ以外を陰性とした。Angiogeninの発現は、正常口腔粘膜上皮ではその発現が認められなかった。一方、上皮異形成では79%に核に発現が認められ、口腔扁平上皮癌では主に核に発現しているものが5%、主に細胞質に発現しているものが10%で、核および細胞質に発現しているものが55%であった。Angiogeninの臨床病理学的意義について、核でのangiogeninの発現で比較したところ、年齢、性別、腫瘍径、リンパ節転移、分化度、浸潤様式、血管侵襲と有意な相関は認められなかった。しかし、陽性群では腫瘍血管密度が高い傾向にあった。また、陽性群では有意に低い生存率であった。さらに、多変量解析を行った結果、angiogeninは独立した予後規定因子であった。以上から、angiogeninが口腔癌の予後を規定する因子の1つであると考えられた。
乳児内斜視の両眼視機能の発達における超早期手術の影響

1.ビデオ画像計測によるヒルシュベルグ法の臨床検査としての信頼性、有用性を明らかにするため、この方法論を用いて、87例の斜視症例について眼位ずれを測定した。繰り返し計測における測定値のrepeatabilityは、95%信頼区間として、水平変位については±0.18mm(±2.2゚)、上下変位については±0.28mm(±3.4゚)であった。この測定法と交代プリズム遮蔽試験との95%一致区間は、±7.8゚であった。ヒルシュベルグ換算値は12.3±1.2゚/mmであった。ビデオ画像計測で測定制度を増強したヒルシュベルグ法は、優れた測定再現性と、乳幼児を検査対象とする検査法としての簡便性を示した。しかし、定量的な解析には、換算値の個体差に基づく系統誤差に注意すべきである。2.入射瞳の楕円率を基準とする眼位ずれのビデオ画像計測について、有効性を検証するため、8名の正常被検者についてシミュレーションした斜視角(<84prism diopters)を測定し、測定誤差について検討した。斜視角(θ)と測定値(φ)の間には高い相関(r=0.86,p<0.001)がみられた。回帰式はφ=0.71θ+4.39で、RMS誤差は5.6゚であった。測定値は、画像上で瞳孔を抽出するためのしきい値の影響を大きく受けた。検査法は、従来の検査法と異なり、スケールファクターを要しない利点があるものの、瞳孔画像の光学的歪に由来する系統誤差、不適切なしきい値による偶然誤差への配慮が必要である。ビデオ画像処理により強化されたHirschbergtestの臨床的な信頼性評価1.目的:ビデオ画像処理により強化したHirschbergtestの、臨床の場における信頼性と、有用性について明ら6かにする。2.方法:生後4か月から75歳にいたる87例の斜視患者について、赤外線ビデオレフラクション装置PR1100をもちいて、角膜反射像のずれを最低2回、自動計測した。そして、得られた眼位ずれの測定値について、再現性(repeatability)、プリズム交代遮蔽試験(PACT)との比較、Hirschbergの換算比の度数分布の3点について検討することで、検査法としての信頼性を評価した。3.結果:ビデオ画像処理により強化されたHirschbergtestの測定値における再現性(95%信頼区間)は、水平方向の眼位ずれについては±0.18mm(±2.2°または±3.8prism diopters)、垂直方向の眼位ずれについては、±0.28mm(±3.4°または±5.9prism diopters)であった。この方法によるHirschbergtestとPACTの測定値が一致する95%信頼区間は、±7.8°または±13.7prism dioptersであった。Hirschberg換算値の平均(±標準偏差)は12.3±1.2°/mmまたは21.8±2.1prism diopters/mmであった。4.結論:ビデオ画像処理によって強化されたHirschbergtestは良好な測定値の再現性と、乳幼児の検査においても簡便性を発揮した。しかし、定量的な目的には、Hirschberg換算値の固体差による系統誤差の影響を配慮すべきであることが明らかとなった。1.赤外線ビデオレフラクション装置を応用して、角膜反射像のずれの画像計測により斜視角度を自動的に測定する方法を開発した。2.この方法を用いて、臨床症例、斜視患者86名について斜視角度を測定し、測定値の再現性、交代プリズム遮蔽試験による測定値との比較、角膜反射像にずれから斜視角を得る際に必要な換算値(Hirschberg比)の分布について検討を行なった。

その結果、測定値の再現性、臨床試験としての取り扱いの容易さの2点では、優れた検査法であることが判明されたが、一方で換算値の大きな個体差が系統誤差の原因となることがわかった。さらに、角膜曲率半径、前房深度を全身麻酔下で乳幼児132名について生体測定を行い、換算値の個体差との関連について検討した。3.動的ランダムドットステレオグラムを作成するプログラムを作成し、これを動画として被検者に見せることによって、電気眼振図(ENG)記録により視運動性眼振が誘発されることを確認した。これにより、従来の自覚的な応答に基づく方法に比べ、殊に乳幼児において立体視機能の評価がより確実になることが期待された。4.角膜反射像に基づく斜視角測定法の短所であった、換算値の個体差に基づく系統誤差の問題を解決するため、入射瞳の楕円率の基づく斜視角測定法を考案した。同じ赤外線ビデオレフラクション装置で正常者8名について実験的にシミュレートした斜視角を測定を施行し、得られた測定値について誤差の検討をおこなった。その結果、大角度での測定値の再現性は向上するものの、角膜屈折作用による系統誤差、ビデオ画像上で入射瞳を抽出する上で必要な閾値の問題も明らかになった。5.14で挙げた検査法を併用し、乳児内斜視の手術治療を既に12例に行い、現在さらに症例を追加しつつ術後症例に関して両眼視機能を追跡中である。