hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラボノイド配糖体による脱髄回復効果の分子メカニズムの解明

生薬・陳皮は脳の脱髄を回復させる効果をもっていることから、脱髄回復効果の分子メカニズムを明らかにするため、陳皮の有効成分の1つであるヘスペリジン(Hes)を用いて髄鞘形成担当細胞の前駆細胞(OPC)への効果を培養系で検討した。その結果、Hesの投与で髄鞘形成に必須であるRNAヘリカーゼDdx54分子を発現するOPCが増加することが明らかになった。再髄鞘化に関与するOPCは老化に伴って減少するがHesによってOPCを増やすことができることから、脱髄が関与する難治性脳疾患が陳皮によって改善される可能性が期待された。(ヘスペリジンよってOPCが増殖することを確認)マウス胎児脳よりOPCを採取し、ヘスペリジンを添加してvitroの系で増殖をBrdUの取り込みなどから調べたところ、OPCの増殖が確認できた。さらに細胞周期を動かすタンパク質の発現や、Rbタンパクのリン酸化をウェスタンブロッテイングで調べたところ、一部のタンパク質に変化がみられた。(細胞内に取り込まれたヘスペリジンを確認→受容体を探索)ヘスペリジンのポリクローナル抗体を作製し、添加後のOPCを染色した結果細胞質が主に陽性であることがわかった。さらにその抗体を用いてウェスタンブロッティング等の生化学解析を行って、ヘスペリジン添加で増加するタンパクを切り出し、MALDI-TOFによるPMF法によって受容体(標的分子)候補を明らかにした。(増殖したOPCがDdx54陽性かどうかを確認)私たちはOPC/OLの細胞系譜で特異的に発現するDdx54がミエリン形成に重要なMBPの発現の制御を行っており、Ddx54を発現している細胞のみが実際にミエリンを形成できると考えている。そのため、Ddx54陽性の細胞がヘスペリジン添加によって増えるかどうかをvitroの系で細胞免疫染色により確認したところ、増加した細胞はDdx54陽性であることがわかった。意義・重要性:1)生薬チンピの主な有効成分であるフラボノイド配糖体ヘスペリジンには、脳を守る機能をもつ髄鞘(ミエリン)を作る細胞の前駆細胞であるOPCを増やす効果があることを明らかにした。2)また増殖したOPCはミエリン形成において必須のタンパク質であるDdx54を発現していること(機能的なOPCであること)を明らかにした。3)ヘスペリジンによるOPCの増殖の分子メカニズムに関与するOPCの受容体の候補を明らかにした。これらの点が重要で意義があると思われる。髄鞘(ミエリン)は脳の高次機能を支えており、脱髄(ミエリンが壊れること)はアルツハイマー病など脳の難治性疾患に関与しているがわかってきた。本研究の目的は、チンピの有効成分であるフラボノイド配糖体(ヘスペリジン/ナリルチン)がどのように脱髄を回復させるのか、その分子メカニズムを明らかすることである。マウス胎児脳由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC;ミエリンを作る細胞の前駆細胞)を採取し、チンピを加えて細胞の増殖をin vitroの系で調べた結果、チンピがOPCを増やすことがわかった。同様にチンピの有効成分の一つであるヘスペリジンを添加したところ、ヘスペリジン単独でもOPCの増殖を促すことがわかった。さらにチンピおよびヘスペリジンによって増えたOPCはRNAヘリカーゼのDdx54を発現していることがわかった。そしてvitroの系でヘスペリジンによるOPCの増殖効果は、ファルネシル化の阻害薬によって抑制されること、ファルネシル化を促進すると、増殖効果も上がることが明らかになった。さらにヘスペリジンを添加することにより、OPC細胞内におけるファルネシル基転移酵素の発現が増加することがわかった。これらの結果により、チンピの有効成分の一つであるヘスペリジンにはOPCを増殖させる効果があり、その分子メカニズムにはファルネシル化が関与していることが示唆された。また増殖したOPCがDdx54陽性であったことから、分化しミエリン膜を形成できる機能を持っている可能性が示唆された。ヘスペリジンが機能的OPCを増やすことがチンピのもつ脱髄回復効果のメカニズムに含まれることが明らかになった。神経生物学ヘスペリジンによる脱髄回復効果の分子メカニズムの解明において、まずミエリン形成担当細胞の前駆細胞であるOPCを増やすことが重要である。ヘスペリジンのOPC増殖効果の分子メカニズムの解明が平成25年度の目標であったが、今年度の研究計画・方法と照らし合わせておおむね順調に進展していると思われる。具体的には、1)私たちが確立したOPCの採取方法(J. Neurosci. Res., 2002)を用いてOPCを採取し、vitroの系でヘスペリジンを添加してその増殖効果をBrdU法などで確認することができた。

2)また、ヘスペリジンによって増殖したOPCがミエリン形成に極めて重要なタンパク質であるRNAヘリカーゼ、Ddx54陽性であること(機能的なOPCであること)を明らかにした。3)タンパク質ではないヘスペリジンに対する抗体をBSA結合方法によって作製し、この抗体を用いてウェスタンブロットなどの方法を行い、ヘスペリジン添加で増加するタンパク質を抽出し、質量分析法によってOPCのヘスペリジン受容体の候補となるタンパク質を明らかにした。1)2)3)の点で大きな進展がみられた。まずはヘスペリジンによるOPCの増殖の分子メカニズムにタンパク質のプレニル化が重要であることと、ヘスペリジンのOPCの受容体を明らかにする。そして増殖したOPCがミエリンを巻く機能を備えているかどうか(ミエリン形成細胞に分化して本当にミエリンを形成するかどうか)を明らかにする。さらにその分化・ミエリン形成の過程においてMBP, Ddx54および昨年度の研究で示唆されたヘスペリジン受容体と推定されるシャペロンタンパクが重要な役割を果たすことを明らかにし、さらにそれぞれに関与する分子を特定しシグナル伝達の機構の解明を目指して研究を進める。(研究計画の変更点)1.ヘスペリジンとナリルチンを添加して効果を調べる前にまずヘスペリジン単独効果の分子メカニズムを解明する。2.Fynチロシンキナーゼ欠損マウスの系統維持ができなくなったためと、ヘスペリジンの受容体タンパクの候補がしぼられたため、Fynよりもヘスペリジンの受容体であると推定されるシャペロンタンパク質がMBP、Ddx54およびそれらに関係する分子とどのように相互作用するのかについて解析する。(研究を遂行する上での課題に対する対応策)昨年度の研究成果によりヘスペリジンによるOPCの増殖にプレニル化が重要であることがわかった。そのためOPC内に取り込まれたヘスペリジンがプレニル化されるかどうか調べる必要が生じたので、その解析を京都大学生存圏研究所と共同研究の中で行う予定である。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、次年度の研究費と合わせて消耗品購入に充てる予定である。実験のための試薬・器具および実験動物などの消耗品購入や、論文作成のための参考図書購入、英文校閲費用などの経費として、また成果発表のための旅費などに使用する予定である。
気管支平滑筋の収縮および細胞内カルシウム濃度に及ぼす各種麻酔薬の影響

換気・血流比を適正に保つための機構を検索するため、ブタ気管支平滑筋と肺動脈平滑筋リングを作成し、これに蛍光カルシウム指示薬Fura-2/AMを負荷し等尺性張力と細胞内カルシウム濃度変化を同時に測定した。1.気管支平滑筋に対するハロセンの影響についてハロセンは臨床的に気管支収縮を抑制する。標本の潅流溶液を14%のハロセンにて飽和し,K C1刺激を行って,収縮張力および細胞内カルシウム濃度増加を測定した。その結果、収縮張力および細胞内カルシウムを濃度依存性に抑制した。従って、ハロセンの気管支平滑筋収縮を抑制する機構として細胞内カルシウム濃度増加の抑制が示唆された。2.気管支平滑筋に対するヒスタミンの効果について気管支痙攣を発生するヒスタミンとその特効薬であるカフェインの気管支平滑筋に及ぼす影響を検索した。その結果ヒスタミンによる収縮の際、細胞内カルシウム濃度は、一過性の大きな増加と、その後の持続的な増加を示した。カルシウムを除いた溶液中では、ヒスタミンにより張力は減少した。また、細胞内カルシウム濃度上昇は一過性であった。従ってヒスタミンによる気管支平滑筋収縮においては細胞内外からのカルシウムがともに関与していた。3.肺動脈平滑筋に対する酸素および二酸化炭素の影響について高濃度酸素は高濃度カリウム刺激により発生する張力および細胞内カルシウム濃度増加を同時に増強した。また、高濃度二酸化炭素は高濃度カリウム刺激により発生する張力および細胞内カルシウム濃度増加を同時に抑制した。従って、高濃度酸素および二酸化炭素の張力に対する効果は細胞内カルシウム濃度変化を介していることが示唆された。雑種成犬ならびにブタの気管を摘出し、平滑筋標本を作製した。作製した組織標本にカルシウムイオン感受性蛍光色素Furaー2/AMを負荷した。日本分光社製CAFー100を用いて蛍光を測定することにより、平滑筋細胞内のカルシウムイオンを測定した。細胞外液を高カリウム状態にすることにより平滑筋を刺激したところ、細胞内カルシウム濃度は上昇した。また細胞外液にカルバコ-ルを加える刺激によっても、細胞内カルシウム濃度は上昇した。これらの結果を踏まえ、今後はカルシウム拮抗薬であるベラパミルとテオフィリン誘導体で細胞内サイクリックAMPを増加させるアミノフィリンの前処置を行い、その後にカリウムやカルバコ-ルによる刺激を加えることにより、ベラパミルやアミノフィリンの細胞内カルシウム濃度変化に及ぼす影響を測定する。また収縮時の張力を、張力トランスヂュ-サ-を用いて測定する。このことにより、細胞内カルシウム濃度の上昇と筋の収縮は常に同時発生するのか、また気管平滑筋内のカルシウムイオン上昇にはどのようなタイプのカルシウムチャネルが関与しているかを推測することができる。また気管支平滑筋弛緩作用を有するため喘息に有効とされる吸収麻酔薬のハロセンを負荷しながら、高カリウム刺激とカルバコ-ル刺激時の細胞内カルシウム濃度および収縮張力に対する影響を計測する。ハロセンの平滑筋弛緩作用は、細胞内カルシウムイオンの増減と相関するのか、あるいはしないのかを調べることは、平滑筋収縮メカニズム解明の一助となり得る。また、麻酔中の効果的な薬剤作用の参考となるであろう。肺には換気・血流比を適正に保つための機構が存在し、気管支平滑筋と血管平滑筋が直接関与している。我々はブタ気管支平滑筋と肺動脈平滑筋リングを作成し、これに蛍光カルシウム指示薬Fura-2/AMを負荷し等尺性張力と細胞内カルシウム濃度変化を同時に測定した。なお実験の初めに70mM/LのKClにて平滑筋を刺激し、そのときの発生張力と蛍光強度比を収縮時の基準値とした。1.気管支平滑筋に対するヒスタミンの効果について気管支痙攣発生に深く関わっているヒスタミンとその特効薬であるザンチン誘導体カフェインの気管支平滑筋収縮機構に及ぼす影響を検索した。

その結果、ヒスタミンによる収縮の際、細胞内カルシウム濃度は、一過性の大きな増加と、その後の持続的な増加を示した。カフェイン投与の後ヒスタミン刺激を行うと、張力および細胞内カルシウム濃度増加を抑制した。カルシウムを除いた溶液中では、ヒスタミンにより張力は減少した。また、細胞内カルシウム濃度上昇は一過性であった。従ってヒスタミンによる気管支平滑筋収縮においては細胞内外からのカルシウムがともに関与していた。2.肺動脈平滑筋に対する酸素および二酸化炭素の影響について全身麻酔中の患者の外呼吸を適正に保つ機構検索のため、肺血流、ひいては血管平滑筋の酸素および二酸化炭素に対する動態を検索した。高濃度酸素は高濃度カリウム刺激により発生する張力および細胞内カルシウム濃度増加を同時に増強した。また、高濃度二酸化炭素は高濃度カリウム刺激により発生する張力および細胞内カルシウム濃度増加を同時に抑制した。従って、高濃度酸素および二酸化炭素の張力に対する効果は細胞内カルシウム濃度変化を介していることが示唆された。
マウス神経系初期発生におけるPOU転写調節因子の役割の解析

生体の発生・分化を制御している各種転写制御因子の中で、POUドメインと呼ばれるDNA結合領域を有する転写因子はPOU転写因子と総称されるが、本研究で我々はジーンターゲティング法を用いてクラスIIIPOU転写因子に属する4種の転写因子(Brnl,Brn2,Brn4,Oct6)の機能解析を行っている。本年度の研究実績は以下の通りである。1) Bm2遺伝子の多角的な機能の解明:我々は昨年度までにBm2遺伝子マウスを樹立し、その解析からこの変異マウスでは視床下部の大細胞性ニューロンの発生が見られないことを報告している。本年度はさらに、抗Spot35抗体を用いることによりBm2変異マウスでは大細胞性ニューロンの発生が、胎生12.5日の段階で停止することを同定した。さらにRNAaseプロテクション法により、Bm2変異マウスのヘテロ接合体では、大細胞性ニューロンの産生する神経ペプチドであるバゾプレッシンとオキシトシンの転写産物量が野生型の約半分になっていることを発見した。これらの結果は、Bm2遺伝子が大細胞性ニューロンの発生から成体における機能発現までを制御していることを示すものである。2) Bm1遺伝子欠損マウスにおける海馬の構造異常の発見:我々は昨年度までにBm1遺伝子変異マウスを樹立し、この変異マウスのホモ接合体は全て生後48時間以内に死亡することを報告した。本年度はこの変異マウスの中枢神経系の詳細な解析を行い、このマウスでは海馬のCA1及びCA2領域の層構造の形成不全が見られることを発見した。3) Bm4遺伝子欠損マウスの樹立:本年度我々はBm4遺伝子欠損マウスの樹立に成功した。このマウスは正常に発生し、交配も行う。しかし、詳細な解析の結果、この変異マウスは全く聴力が欠失していることが判明した。現在その機構を解析中である。
二酸化チタンバイオセラミックスの傾斜機能調節機構の確立

本研究では細胞培養系におけるTiO2の影響を調べることにした.ルチル型TiO2を用いて,1300°CTiO2焼結体を用いて細胞培養実験を行った.MC3T3-E1細胞を試料上で培養し,7,14,21,28日間後の生細胞数ならびに細胞形態像を観察し,以下の結果を得た.1300°CTiO2焼結体では,焼成前と比較し,結晶粒子の増大,気孔の減少が観察された.培養時間の増加は,細胞増殖の増大を示し,生細胞数はおよびALP活性は対照群と比較し,1300°CTiO2焼結体の方が高い値を呈した.以上のことより,1300°CTiO2焼結体はMC3T3-E1細胞に対し良好な親和性およびALP活性の上昇を示した.本研究の目的は、傾斜機能付与させた二酸化チタンの基礎的データを追究し、生体親和性と抗菌性の割合を随時容易にコントロールする手法の確立し、患者さん各自に適合したテーラーメイドの二酸化チタン焼結体を作製することである。二酸化チタンを800900°C付近まで加熱することによりアナターゼ型はルチル型に結晶構造が転移することに着目し、傾斜機能を付与し、用途に合わせその機能をコントロールでき得る材料の開発を検討するため焼成条件を決定した。900°C、950°Cの試料ではルチル型優位となり、生体親和性を期待する環境下すなわち細胞増殖を促す。600°C、650ではアナターゼ型優位となり防汚・殺菌を有するすなわち光触媒能が強いであることは一部証明できた。焼結状態を詳細に検討することが必須であるり、光触媒作用、ぬれ性、表面性状など生体材料として対応しうるかどうかを作製した資料の物理的性質の評価を行った。生体材料として傾斜機能が制御可能となれば、歯科インプラント体の長期予後に期待できる。本年度では、生体親和性および抗菌性を自在にコントロールするための焼成条件の確立および焼結体作製を行った。そのために多くの焼成条件を変えて試料を作成した。各焼成条件によって作製された試料の物性を計測。生体材料として適応範囲であるかどうか検討をおこなった。傾斜機能を付与した焼結体の光触媒作用を評価を行った。傾斜機能を付与した焼結体の抗菌性試験の実験環境の準備、予備実験をおこなった。本研究の目的は、傾斜機能付与させた二酸化チタンの基礎的データを追究し、生体親和性と抗菌性の割合を随時容易にコントロールする手法を確立し、患者さん各自に適合したテーラーメイドの二酸化チタン焼結体を作製することである。二酸化チタンを600°Cから1200°Cそれぞれに加熱した試料を作製した。用途に合わせその機能をコントロールでき得る材料の開発を検討するため焼成条件を決定した。各試料の細胞初期接着について検討するため、ぬれ性の計測を行った。細胞培養試験では、マウス線維芽細胞を試料上で培養し、細胞毒性試験を行った。低温で焼成したアナターゼ優位の試料では、細胞は増殖しなかった。マウス骨芽細胞を培養しその増殖、細胞形状、アルカリフォスファターゼ(ALP)の発現について観察した。線維芽細胞と同様に低温で焼成した試料では増殖できなかった。900°C、1000°Cの試料ではルチル型優位ではあるがアナターゼも存在するため生体親和性を期待する環境下すなわち細胞増殖を促した。ALPについては、培養7日後と14日後に計測した。1100°Cおよび1200°Cの試料でALPの量が最大となり、石灰化が促されていることが示唆された。低温の700°Cの試料は細胞数およびALPは最低の値を示した。27年度では、・生体親和性および抗菌性を自在にコントロールするための焼成条件の確立および焼結体作製を引き続き行った。・焼成条件によって作製された試料の細胞初期接着について検討するためぬれ性を計測した。・傾斜機能を付与した焼結体のルチル型およびアナターゼ型の比率を検討するため、結晶相の同定を行った。また光触媒作用の評価をメチレンブルーおよびインクにて行った。・傾斜機能を付与した焼結体の抗菌性試験の実験を開始した。平成27年は細胞培養実験および試料の作製に重点を置き、研究を遂行した。平成26年から引き続き、傾斜機能を有する二酸化チタンの試料片を作製するにあたり、アナターゼ型二酸化チタンが、900度前後の焼成温度にてルチル型二酸化チタンに転移することを利用した。焼成条件・温度・の範囲を様々に変化させ試料を作製するとともに、細胞培養実験に使用する条件を統一した試料作製も行った。安定した傾斜機能付与試料を得るため、試料ごとの基礎的データを得るため再度繰り返し計測を行う必要がある。細胞培養では、マウス線維芽細胞による細胞毒性試験、マウス骨芽細胞による細胞増殖試験を行った。・実験試料として700°C1300°Cの温度設定を検討した二酸化チタン試料を作製した。・焼成条件を変化させたときの、物理的性質(硬さ、表面性状の観察)を計測した。・各焼成温度で焼結した試料片の焼結状態の変化を観察した。(表面粗さ、ぬれ性の測定)・細胞培養試験を行い、生体材料としての適性となる焼成温度について検討をおこなった。・抗菌試験の予備実験を行った。

以上、おおむね順調に進展していると判断した。本研究では、歯科用生体材料への応用を念頭に置き、ルチル型TiO2を選択し焼結した成形体の細胞増殖に与える影響を、焼成温度と表面性状の面から検討した。MC3T3-E1細胞を用いた細胞培養試験は歯科生体材料の評価において一般的に用いられており、その細胞増殖は再現性が高くかつ迅速に行える評価法である。ALP活性は骨芽細胞様細胞の分化の指標であり、骨芽細胞用細胞の活性化の有無を評価できる。本実験では、ルチル型TiO2は対照群より良好な細胞増殖およびALP活性を示した。これより本実験に使用したルチル型TiO2は生体材料として化学的性質および物理的性質が安定していることが示唆された。今回細胞の増殖が良好であった理由の1つとしては、おそらく対照群と表面の粗さの違いではないかと考えられる。金属チタンに表面処理を施した材料あるいはハイドロキシアパタイトなどのセラミックスの表面粗さはシャーレなどのポリスチレンよりも大きく、これらの試料上での細胞増殖は対照群よりも良好であったと報告されており、本実験と同様の結果を示している。ALP活性はいずれの日数でも1300°CTiO2が対象群より大きな値を示し、骨芽細胞様細胞の分化に影響を与える可能性が示唆された。出発材料としてルチル型TiO2を用いて、1300°CTiO2焼結体を用いて細胞培養実験を行った。MC3T3-E1細胞を試料上で培養し、7、14、21、28日間後の生細胞数ならびに細胞形態像を観察し、以下の結果を得た。1300°CTiO2焼結体では、焼成前と比較し、結晶粒子の増大、気孔の減少が観察された。培養時間の増加は、細胞増殖の増大を示し、生細胞数はおよびALP活性は対照群と比較し、1300°CTiO2焼結体の方が高い値を呈した。以上のことより、1300°CTiO2焼結体はMC3T3-E1細胞に対し良好な親和性およびALP活性の上昇を示した。本研究では細胞培養系におけるTiO2の影響を調べることにした.ルチル型TiO2を用いて,1300°CTiO2焼結体を用いて細胞培養実験を行った.MC3T3-E1細胞を試料上で培養し,7,14,21,28日間後の生細胞数ならびに細胞形態像を観察し,以下の結果を得た.1300°CTiO2焼結体では,焼成前と比較し,結晶粒子の増大,気孔の減少が観察された.培養時間の増加は,細胞増殖の増大を示し,生細胞数はおよびALP活性は対照群と比較し,1300°CTiO2焼結体の方が高い値を呈した.以上のことより,1300°CTiO2焼結体はMC3T3-E1細胞に対し良好な親和性およびALP活性の上昇を示した.本年は主に実験試料の作製に重点を置き、研究を遂行した。これまでルチル型二酸化チタン単独、アナターゼ型二酸化チタン単独の試料片を作製し評価していた。傾斜機能を有する二酸化チタンの試料片を作製するにあたり、アナターゼ型二酸化チタンが、900度前後の焼成温度にてルチル型二酸化チタンに転移することを利用する。このため焼成条件・温度・の範囲を吟味し設定することは不可欠である。焼成条件を検討し安定した傾斜機能付与試料を得るため、平成26年度では下記の基礎的データ実験を再度繰り返し行う必要があると考えられる。実験試料として900°C付近の細かな温度設定を検討した二酸化チタン試料の試作した。
日常生活における暑熱環境適応能の実態把握研究

暑熱順化の様相は、一般に繰り返し型暑熱順化と、連続曝露型暑熱順化の二様が知られている。前者は1日に46時間の、暑熱の繰り返し曝露を行った場合で、発汗が早くに起こって体温の上昇が抑えられるという順化で、日本などの温帯地方の夏に現れる、とされている。一方、後者は連続的な暑熱曝露で、発汗量は少なくなるとともに蒸発効率が増加し、核心温が上昇して顕熱放散が増大するという順化で、熱帯地方で現れる、とされている。そこで問題は、日本の夏で暑熱順化がどのように現れるか、を知ることである。研究は、人工気候室を用いた実験によって行われた。暑くも寒くもない、温度25度、相対湿度50%の準備室で被験者は指定着に着替え、センサー類を装着して約1時間滞在して後、温度30度、相対湿度50%の試験室に移動して30分を過ごすという、温度にして+5度の熱負荷を課する実験である。生理反応としては発汗量、耳内温(核心温)、平均皮膚温を測った。心理反応としては暑熱感、不快感、発汗感を調べた。被験者は健康な男子大学生5名であった。実験は2004年の6月から10月にかけて、約50回行った。その結果、5人の被験者に表れた期間の長さに個人差はあっても、5人共通する暑熱順化特性が現れた。それは、6月ごろのまだ暑熱順化が生じていない平常期から、7月ごろの繰り返し型暑熱上昇順化期を経て、8月ごろの真夏の連続曝露型暑熱順化期に達し、やがて9月ごろの繰り返し型暑熱下降順化期を経て、10月ごろの平常期へもどって暑熱順化が消滅する、という一連の変化である。また、繰り返し型暑熱上昇順化期の温度(日最高気温)に比して、繰り返し型暑熱下降順化期の温度(日最高気温)は約2度低いのが特徴であった。近年のエアコンの普及に伴い、特に夏季において室内の過剰冷房が一般化し、建築物のエネルギーの過剰消費をもたらして地球温暖化を加速させるだけでなく、人体の健康保持にとっても悪影響が懸念されるところから、日常生活における暑熱環境に対する人体の適応能を調べることを研究目的とした。目的を達成するための方法としては、人工気候室を用いて、人体に一定の暑熱負荷をかけたときの発汗量の増加を中心とする生理的反応を調べることとした。すなわち、被験者を3人として、それぞれ毎月1回、人工気候室内で被験者に測定器類を装着してのち、気温25°C、湿度50%の準備室で30分間経過してから、気温30°C、湿度50%の試験室へ移動して30分間滞在したときの、発汗量、耳内温(核心温度)、平均皮膚温、等の変化を調べた。耳内温は準備室ではほぼ一定であったが、試験室では入室とともに急激に上昇し、後半はなだらかに変化した。平均皮膚温は準備室では変化が少ないが、試験室に移動すると一時的に下がるが、3分程経過して上昇に転じた。発汗量は前腕と背中の2箇所で測ったが、発汗量は一般に背中が前腕より多かった。

発汗があるときは、背中と前腕で発汗量が同期する場合が多かったが、発汗が生じない場合、すなわち不感蒸散の場合は、前腕では試験室へ移動後はいったん上昇するが、数分して下降に変わるのに対して、背中では時間経過とともに下降することはなかった。いずれにしろ、個人差が多かったので、実験例から一般的な結論が導くことはできないため、実験を続行している。暑熱順化の様相については、一般に繰り返し型暑熱順化(短期暑熱順化ともいう)と、連続暴露方暑熱順化(長期暑熱順化ともいう)の二様が知られている。前者は1日に46時間の暑熱の繰り返し曝露を行った場合の順化で、発汗が早くに起こって体温の上昇が抑えられ、日本などの温帯地方の夏に現れる、とされている。一方、後者は連続的な暑熱曝露で、発汗量は少なくなるとともに蒸発効率が増加し、深部体温が上昇して顕熱放散が増加するもので、熱帯地方で現れる、とされている。そこで問題は、日本の夏で暑熱順化がどのように現れるか、を知ることである。研究は人工気候室を用いて行った。暑くも寒くもない、温度25度、湿度50%の準備室に30分以上滞在して後、温度30度、湿度50%の試験室に移動して30分を過ごすという、温度にして+5度の熱負荷を課する実験である。生理反応として発汗量、耳内温(深部体温)、平均皮膚温、を測った。心理反応としては温冷感、快適感、発汗感、を調べた。結果の解析は、準備室の状態から試験室の状態へ、生理反応および心理反応の変化量を中心に調べた。被験者は健康男子学生5名であった。その結果、6月から10月に及ぶ実験を通じて、5人の被験者は共通して、暑熱順化のない平常期から、繰り返し型暑熱上昇順化期を経て、真夏の連続曝露型暑熱順化期に達し、やがて、繰り返し型暑熱下降順化期を経て、平常期へ戻って暑熱順化が消える、という道筋をたどることがわかった。
現代日本の社会階層に関する全国調査研究

1997年度は、昨年度末の「基礎集計表」の発行を受けて、研究班に分かれて分析・研究を続行し、8月のカナダ・ケベック市での国際会議、および1998年1月の台湾・台北市での国際会議における研究発表のほか、国内の各種の学会で研究発表を行った。さらに、研究の集大成として、総計180本以上の研究論文からなる全21巻の報告書を作成した。そのリストは次の通り。1.『社会階層・移動の基礎分析と国際比較』,2.『近代日本の移動と階層:1896-1995』,3『社会移動とキャリア分析』,4.『社会階層の地域的構造』,5.『職業評価の構造と職業威信スコア』,6.『現代日本の階層意識』,7.『政治意識の現在』,8.『公平感と社会階層』,9.『教育機会の構造』,10.『教育と世代間移動』,11.『教育と職業-構造と意識の分析』,12.『女性のキャリア構造とその変化』,13.『ジェンダーとライフコース』,14.『ジェンダーと階層意識』,15.『階層と結婚・家族』,16.『豊かさと格差』,17.『社会階層とライフスタイル』,18.『文化と社会階層』,19.『東アジアの階層比較』,20.『社会階層の新次元を求めて』,21.『産業化と階層変動』多くの新しい知見がえられたが、そのごく一部を記す。(1)55年データの職歴を用いて戦前における世代間移動を計算してみると、途中、戦争による一次的な変動はあるものの1915年から95年の長期にわたって、世代間移動のパターンは驚くほど安定している。(2)職業威信の構造も、55、75、95の3時点で安定性が極めて高い。(3)階層と政治的態度との関連は弱いながら継続しており、達成目標のスケールという近代社会の特性は維持されている。補助金の交付は終了するが、今後もさらに研究を継続し、成果を広く公表していく予定。本年度は、以下のように本研究プロジェクトの基本体制の確立と実査のための準備を遂行した。(1)研究代表者および分担者を中心として研究協力者を含めて23個(職業コード、威信、移動・教育、移動の歴史分析、産業化と就業、職歴、職業選択ネットワーク、豊かさ・資産格差、政治意識、意識と階層、公平感、社会的公正、階層意識、文化と階層、ライフスタイル、女性のキャリア、家族と女性、性役割、女性のライフコース、地域、国際比較、階層の新次元、数理モデル)の特定的な研究班を組織し、総勢約11O名からなる研究組織を立ち上げた。(2)各研究班において分析課題と調査票案の準備を精力的に進め、これは3月上旬に集められる予定になっている。(3)職業コードの再検討に着手。(4)職業威信課査を本調査とは切り離すことを決定。(5)それに伴い、本調査の地点数は336、一地点当たり男性12名、女性12名とすることを決定。(6)職業威信に関して、2月にプリテストを実施(中央調査社に委託)、3月上旬にデータが納入されるので、分析・検討する予定。(7)55年および65年のコードプックの増刷り。なお、3月中には、具体的な地点サンプリングを終え、4月からは実査体制の準備にはいるとともに、調査票の具体的なとりまとめに着手する予定になっている。本年度、正確には平成7年3月以降の研究経過は以下の通り。3月6月にかけて、調査票作成の準備のために、各研究班からの質問項目、質問文案を検討し、7月には調査票案の第一稿を作成した。7月下旬に研究委員会を開催してさらに検討し、調査票について基本的な決定を行った。9月にプリテストを実施し、それに基づいて当初本調査について男女それぞれ2種類づつ計4種を考えていた調査票を、男女の別をなくして、2種に統合した。他方、4月からは地点の抽出の準備を進め、統計数理研究所の協力のもとに、7月までに、本調査336地点の抽出を終えた。うち、79地点の実査を研究分担者および研究協力者による直接管理、残り257地点を社団法人中央調査社に委託して実施することにした。9月下旬からは、各地点の選挙管理委員会等への対象者抽出許可の申請、抽出作業を行い、10月下旬から、全国において総対象者数を9,744とする個別面接調査の実査に入った。そして、11月末までに実査を終了し、その時点で有効回収数6,600(67.7%)をえた。(これは、今後の精査により変わる可能性がある。)また12月には、95年SSM調査用の「SSM産業分類・職業分類(95年版)」を作成し、3月にはこれを用いたコーディング作業を予定している。平成8年は、前年度に一応終了したデータ・コーディングを経て、6月に集中的にデータ・クリーニングを実施し、7月には研究組織を再編して分析を開始した。その後も分析過程で発見されるデータのエラーを修正して、12月にほぼ完全データを確立した。それに伴い、12月にコード・ブックを作成、3月に基礎集計表を作成予定になっている。これまでの主な分析結果は次の通り。(1)ブルーカラー層の縮小が、とりわけ女性において著しい。

(2)世代間社会移動に関しては、若年層でやや固定化の様子が見られるものの、全体としてはやや開放化の傾向もみられ、今後用いる指標を吟味しながら正確な確定が必要である。(3)階層帰属意識と政党支持は、75年以降の基調が継続している。(4)性別役割意識は、この10年間に著しい平等化の方向へ変化した。(5)職業的な世襲ではなく、教育が地位達成の主要ルートとしてますます重要になってきている。(6)しかし、教育達成は男女とも出身階層間格差が85年以降やや強まる傾向を示している。(7)女性では、若年層がそれ以前に比して、高学歴者のキャリア志向と中等学歴者の主婦志向という分化を示しているように見えるが、まだより慎重な分析が必要。(8)公平感については、「努力にみあった処遇=公平」とする考えが日本人にはもっとも強いが、現実は「実績に見合って処遇されている」とみており、この「努力主義」はアンビバレントな学歴意識と関連している可能性がある。以上の内容は、昨年11月の日本社会学会大会で報告された。また、日本行動計量学会の機関誌に研究論文として掲載されることが決まっている。1997年度は、昨年度末の「基礎集計表」の発行を受けて、研究班に分かれて分析・研究を続行し、8月のカナダ・ケベック市での国際会議、および1998年1月の台湾・台北市での国際会議における研究発表のほか、国内の各種の学会で研究発表を行った。さらに、研究の集大成として、総計180本以上の研究論文からなる全21巻の報告書を作成した。そのリストは次の通り。1.『社会階層・移動の基礎分析と国際比較』,2.『近代日本の移動と階層:1896-1995』,3『社会移動とキャリア分析』,4.『社会階層の地域的構造』,5.『職業評価の構造と職業威信スコア』,6.『現代日本の階層意識』,7.『政治意識の現在』,8.『公平感と社会階層』,9.『教育機会の構造』,10.『教育と世代間移動』,11.『教育と職業-構造と意識の分析』,12.『女性のキャリア構造とその変化』,13.『ジェンダーとライフコース』,14.『ジェンダーと階層意識』,15.『階層と結婚・家族』,16.『豊かさと格差』,17.『社会階層とライフスタイル』,18.『文化と社会階層』,19.『東アジアの階層比較』,20.『社会階層の新次元を求めて』,21.『産業化と階層変動』多くの新しい知見がえられたが、そのごく一部を記す。(1)55年データの職歴を用いて戦前における世代間移動を計算してみると、途中、戦争による一次的な変動はあるものの1915年から95年の長期にわたって、世代間移動のパターンは驚くほど安定している。(2)職業威信の構造も、55、75、95の3時点で安定性が極めて高い。(3)階層と政治的態度との関連は弱いながら継続しており、達成目標のスケールという近代社会の特性は維持されている。補助金の交付は終了するが、今後もさらに研究を継続し、成果を広く公表していく予定。
筋緊張性ジストロフィーの病態発症機構に関する研究

本研究の成果として(1)筋緊張性ジストロフィー(DM)患者線維芽細胞初代培養の経時的長期培養によって,CTG repeatの延長が体細胞分裂によっておこり、更にDMの遺伝子産物であるDM protein kinase(DMPK)の蛋白量が,CTG repeatの延長に比例して減少することを初めて明らかにした。(2)DMPKのポリクローナル抗体を作製し,この抗体が,full lengthのDMPKを認識すること、成熟した骨格筋では,従来の報告にある神経筋接合部、筋紡錘のみでなく、骨格筋のtype I筋線維に強く局在することを明らかにし、更に免疫組織化学的、免疫電顕的に筋小胞体(SR)のterminal cisternaeに局在することを初めて明らかにした。また、心筋では、corbular及びjunctional SRに局在することを免疫組織化学的,免疫電顕的に初めて明らかにした。(3)DM骨格筋において、Western blotによる検討でDMPKの発現は低下し、形態学的にはDMPKはDM筋おいてもSRに局在するが、DMPK陽性の筋小胞体は筋病変の初期から変化すること、更に古典的なDM筋病理上、DM筋の特徴的変化と考えられているcentral nuclei、nuclear chains、sarcoplasmic mass、type I atrophyはいずれもDMPK陽性筋線維に多く存在することを明らかにし、DM筋変性の基本はDMPKの機能異常によるものであることを初めて明らかにした。(4)更に、ヒト骨格筋-ラット脊髄併置培養系を使用して、ヒト骨格筋の発達段階におけるDMPK mRNAの変化及びDMPKの局在の変化に関して、RT-PCR法、Western blot法及び免疫組織化学的、電顕的検討を行い,神経支配後一過性にDMPKmRNAが減少すること、DMPKは神経支配によって細胞内の局在を変えSRに限局していくことを初めて明らかにした。1。MtPKの局在の検討。MtPKのC末端領域の合成ペプチドを作成し、これをウサギに免疫して、ポリクローナル抗体を作成した。この抗体は、Western blotでは、70kDaの膜分画および55kDaの可溶性分画を認識した。MtPKの骨格筋における局在を検討するために、MtPKとアクチンあるいはミオシンとの2重染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で局在を検討し、MtPKは主としてI帯に存在すること、更に免疫電顕による検討から、SRのternminal cisternaeに強く存在することをあきらかにした。更に、培養ヒト筋細胞に胎児ラット脊髄片を併置した培養系を使用し、筋細胞の発達段階におけるMtPKの局在の変化を検討した。筋芽細胞では、MtPKははっきりと染色されず、筋管細胞では、核の周辺、細胞膜下にpatchyに存在し、神経支配を受け、横紋形成した筋線維ではMtPKとアクチンあるいはミオシンによる2重染色の共焦点レーザー顕微鏡による観察から、I帯に存在するようになり、MtPKが神経支配によるregulationを受けていることを初めてあきらかにした。2。3塩基対反復配列の増大機構に関する研究MtPK遺伝子の3塩基対反復配列の増大の機構が細胞分裂と関連しているか否かを明らかにするために、DM患者5例及びcontrol3例の生検筋の線維芽細胞の長期培養を行い、MtPKの3塩基対反復配列数に変化が見られるか否かサザンブロット法を用いて解析した。この結果、DM患者1例で培養の経過に伴いCTG repeatの明かな延長を認めた。本年度の研究成果として,(1)筋緊張性ジストロフィー(DM)患者線維芽細胞の初代培養の経時的長期培養法によって,CTG repeatの延長が体細胞でおこり,更にDMの遺伝子産物であるmyotonin protein kinase(MtPK)の蛋白量が,CTG repeatの延長に比例して減少することを明らかにした.

(2)MtPKのポリクローナル抗体を作製し,この抗体が,full lengthのMtPKを認識すること,成熟した骨格筋では,神経筋接合部のみではなく,筋小胞体(SR)のterminal cisternaeに局在することを免疫組織化学的,免疫電顕的に明らかにした.(3)ヒト骨格筋-ラット脊髄併置培養系を使用して,骨格筋の発達段階におけるMtPKmRNAの変化及びMtPKの局在の変化に関して,RT-PCR法,Western blot法及び免疫組織化学的方法で検討をおこない,神経支配後,一過性にMtPKmRNAが減少すること,MtPKは,神経支配によって,細胞内の局在を変え,SRに限局していくことを初めて明らかにした.(4)8例のDM骨格筋においては,MtPKの局在の異常の有無に関して検討を行い,DM筋のおいてもMtPKはSRに存在するが,筋内膜系は乱れており,MtPKの発現量は減少していていること,特に先天性DMでは,発現が著明に減少していることを明らかにした.(5)DMでは,心筋障害は重要な合併症であるが,正常ヒト心筋におけるMtPKの細胞内局在に関して,免疫組織化学的に検討をおこない,corbaral and junctional SRに存在していることを初めて明らかにした.本研究の成果として(1)筋緊張性ジストロフィー(DM)患者線維芽細胞初代培養の経時的長期培養によってCTG repeatの延長が体細胞分裂によっておこり、更にDMの遺伝子産物であるDM protein kinase (DMPK)の蛋白量が,CTG repeatの延長に比例して減少ることを初めて明らかにした。(2)DMPKのポリクローナル抗体を作製し,この抗体が,full lengthのDMPKを認識すること、成熟した骨格筋では,従来の報告にある神経筋接合部、筋紡錘のみでなく、骨格筋のtype I筋線維に強く局在することを明らかにし、更に免疫組織化学的免疫電顕的に筋小胞体(SR)のterminal cisternaeに局在することを初めて明らかにした。また、心筋では、corbular及びjunctional SRに局在することを免疫組織化学的,免疫電顕的に初めて明らかにした。(3)DM骨格筋において、Western blotによる検討でDMPKの発現は低下し、形態学的にはDMPKはDM筋においてもSRの局在するが、DMPK陽性の筋小胞体は筋病変の初期から変化すること、更に古典的なDM筋病理上、DM筋の特徴的変化と考えられているcentral nuclei、nuclear chains、sarcoplasmic mass、type I atrophyはいずれもDMPK陽性筋線維に多く存在することを明らかにし、DM筋変性の基本はDMPKの機能異常によるものであることを初めて明らかにした。
精神分裂病におけるNMDA型受容体サブユニットNMDAR1遺伝子の解析

分裂病と健常人でNMDAR1遺伝子内の多型について関連研究を行うための前段階として、データベースにある既知のNMDAR1遺伝子内の多型が、日本人の健常人でもみられるか、PCR-RFLP法を用いて検討した。対象は、32名の健常人で男性18名、女性14名である。データベースに報告されているNMDAR1遺伝子内の多型のうち、PCR-RFLP法で検出可能な2つの部位でPCRを行った。さらに、それぞれを制限酵素処理してバンドのパターンを比較した。PCRの結果、1つの領域では予期したものより長いバンドが、全例でみられた。また、もう1つの領域では予期したものより短いバンドが、全例でみられた。いずれの領域も、制限酵素処理後のパターンに差はみられなかった。PCR産物の長さの違いは、既知のNMDAR1遺伝子の塩基配列の人種差によると考えられた。多型については、日本人では、欧米人でみられる多型がないか、あってもその頻度が低いと考えられ、精神分裂病との関連研究を行う上で適さないと考えられた。本研究の目的は、精神分裂病の新たな病因仮説として興奮性アミノ酸受容体の一つであるNMDA受容体を中心とする興奮性アミノ酸伝達の低下説が最近提唱されてきていることから、分子遺伝学的手法により精神分裂病患者でこのNMDA受容体遺伝子とくにNMDAR1遺伝子の異常があるかどうかを検証することである。NMDAR1遺伝子はこれまでの分子遺伝学的研究により、ヒトの9番染色体長腕34.3領域(9q34.3)にマッピングされ、938のアミノ酸をコードする相補的DNA(cDNA)の塩基配列(2814塩基対)から成ることが既に知られている。平成7年度では、まず対照研究として正常人を対象とし、このNMDAR1遺伝子のDNA多型性部位の検出を行い、その遺伝子多型の発現頻度を調べることを目的とした。教室内のドクターを対象に、彼等の内諾の下に血液を採取し、そのリンパ球からRNAを抽出し、次にRT-PCR法により遺伝子増幅装置を用いてRNAからNMDAR1遺伝子cDNAを合成、さらにRFLP法により制限酵素を用いてNMDAR1遺伝子の多発性部位の有無を検討した。結果として、操作ミスや汚染による失敗が多く5人でしか検討できなかったが、これらの中では多型性部位は検出できなかった。現在なおこの正常者を対象とする多型性部位の有無を検討中である。近年、精神分裂病の新たな病因仮説として、興奮性アミノ酸受容体の一つであるNMDA受容体を中心とする興奮性アミノ酸伝達の低下説が最近提唱されてきている。本研究の目的は分子遺伝学的手法により精神分裂病患者でこのNMDA受容体遺伝子とくにNMDARI遺伝子の異常があるかどうかを検証することである。NMDARI遺伝子はこれまでの分子遺伝学的研究により、ヒトの9番染色体長腕34.3領域(9q34.3)にマッピングされ、938のアミノ酸をコードする13440塩基対のDNAから成ることが既に知られている。平成7年度から平成8年度では、まず対照研究として正常人を対象とし、このNMDAR1遺伝子のDNA多型性部位の検出を行い、その遺伝子多型の発現頻度を調べることを目的とした。13例の正常人ボランティアを対象に、彼等の内諾の下に末梢血液を7cc採取し、そのリンパ球からDNAを抽出した。次にRT-PCR法によりプライマーと遺伝子増幅装置を用い、NMDAR1遺伝子領域の受容体としての機能に重要なglutamate結合部位であるexon12-19の2840の塩基対のDNAを増幅した。さらにRFLP法により制限酵素(Stu1)を用いてNMDAR1遺伝子のexon12-19の間でのDNA多型性部位の有無を検討した。結果として、13例のすべてで予測された三つの制限酵素認識部位で切断され、多型性部位は検出できなかった。本研究の目的は分子遺伝学的手法により精神分裂病患者でNMDA受容体とくにNMDAR1遺伝子の異常があるかどうかを検討することである。

平成7年度から平成8年度は対照研究として13人の正常人を対象とし、NMDAR1遺伝子領域の受容体としての機能に重要なglutamate結合部位であるexon12-19の2840の塩基対のDNAに焦点をあて、この部分の多型性(mutation)の有無を調べたが、結果として多型部位は検出できなかった。平成9年度はやはり対照研究として以下の研究を行った。最近の外国の研究でNMDAR1遺伝子のexon21に相当する部分に多型部位があることが報告されている[(HSAMDARIC)12694に相当する部位のg→Aへの変異]。そこで新たに正常人20名(男性12名、女性8名)を対象とし、その白血球のゲノムDNAを抽出して、その部位を制限酵素BsmA1で認識し、さらにその部位を含む領域にプライマーを設定してPCRを行った。結果として全例で約2000塩基のPCR産物が確認されたが、そのPCR産物の制限酵素処理ではバンドのパターンは全例で同じであり、多型部位は検出されなかった。これらの結果に関して、上記の約2000塩基は既知の外国の報告よりも約800塩基多く、おそらく人種差によるものと考えられた。また多型部位については既知の報告ではその出現頻度は11%であることから症例を増やす必要があると思われた。
材料機能のメカニズム解析と可能性予測

現在,多方面の関心を集めている機能性材料は,超伝導,あるいは導電物質に示されるように,有機,無機,金属,さらに生体物質など多岐にわたっている.さらにこれらの材料は,既存の物質に加えて,新しい物理的,科学的作製方法にもとづくものが多く,構成因子の空間配置,構成因子間の特異な相互作用,直接的,あるいは間接的電子間相互作用が,材料の機能発現に関与しているものと考えられる.本研究,ならびにCo1研究班では,特定の材料を対象とする縦断的,タテ系性格の研究と並行して,材料の枠組みを超え,原子,分子レベルにたって材料研究の横断的,ヨコ系的性格を担う研究を行ない,材料に関する基礎的研究に新しい突破口を見出すことを目標としている.これらの研究成果は1.ヨコ系的材料研究の方向づけ超伝導物質,導電材料,有機磁性体,高分子機能材料,金属クラスターなど多岐にわたる材料についての横断的研究を行なうにあたって,機能,作製法などによる分類に比して,構成因子とその集合体との関連を考塾するに最も簡単な出発物質を,元素と分子から組立てられる二つの材料に分類することにより,金属性超伝導物質-分子性超伝導物質,金属導体-導電性ポリマー,有機磁性体-金属磁性体などの対比を通じて,構成因子の空間配置,分子レベルと集合体レベルの性質の関連性を追及して行くこととした.2.有機超伝導体と酸化物高温超伝導体の有機発現機構の解明(BEDT_2Cu(SCN)_2など有機(分子)超伝導体のTcが10Kをこえる物質が見出されたが,このNMR測定結果の解析などより,これらの非BCS状態と初めて確認した.また酸化物高温超伝導体の機能発現についても,これらの高いTcは,従来からのバンド理論にもとづいた考え方が必かすじも正しくないことを示し,有機物の高いTcの可能性を追求した.現在,多方面の関心を集めている機能性材料は,超伝導,あるいは導電物質に示されるように,有機,無機,金属,さらに生体物質など多岐にわたっている.さらにこれらの材料は,既存の物質に加えて,新しい物理的,科学的作製方法にもとづくものが多く,構成因子の空間配置,構成因子間の特異な相互作用,直接的,あるいは間接的電子間相互作用が,材料の機能発現に関与しているものと考えられる.本研究,ならびにCo1研究班では,特定の材料を対象とする縦断的,タテ系性格の研究と並行して,材料の枠組みを超え,原子,分子レベルにたって材料研究の横断的,ヨコ系的性格を担う研究を行ない,材料に関する基礎的研究に新しい突破口を見出すことを目標としている.これらの研究成果は1.ヨコ系的材料研究の方向づけ超伝導物質,導電材料,有機磁性体,高分子機能材料,金属クラスターなど多岐にわたる材料についての横断的研究を行なうにあたって,機能,作製法などによる分類に比して,構成因子とその集合体との関連を考塾するに最も簡単な出発物質を,元素と分子から組立てられる二つの材料に分類することにより,金属性超伝導物質-分子性超伝導物質,金属導体-導電性ポリマー,有機磁性体-金属磁性体などの対比を通じて,構成因子の空間配置,分子レベルと集合体レベルの性質の関連性を追及して行くこととした.2.有機超伝導体と酸化物高温超伝導体の有機発現機構の解明(BEDT_2Cu(SCN)_2など有機(分子)超伝導体のTcが10Kをこえる物質が見出されたが,このNMR測定結果の解析などより,これらの非BCS状態と初めて確認した.また酸化物高温超伝導体の機能発現についても,これらの高いTcは,従来からのバンド理論にもとづいた考え方が必かすじも正しくないことを示し,有機物の高いTcの可能性を追求した.
小児ステロイド性顎骨骨粗鬆症に対する臨床応用を目指した骨吸収抑制剤の開発

グルココルチコイド(GC)は、重篤な喘息、若年性の関節リューマチ、慢性的な腎疾患などの様々疾患の治療に使用されている。しかしながらGCの使用を6ヶ月以上使用することにより、GC誘発性の骨粗鬆症を約50%の患者が惹起すると報告されている。GCを小児期に投与すると骨粗鬆症のみならず,骨の成長発育抑制が惹起されることが報告されている。しかしながら小児期におけるGCが顎骨の骨代謝や骨微細構造に及ぼす影響については知られていない。ビスフォスフォネートは、骨粗鬆症の治療薬として広く使用されており、その化学構造と作用メカニズムの違いにより2つに大別される。リセドロネートのような窒素含有ビスフォスフォネートは、エチドロネートやクロドロネートのような窒素非含有ビスフォスフォネートに比較し、はるかに高い破骨細胞抑制作用がある。しかしながら,成長発育期の窒素含有ビスフォスフォネートがGC誘発性骨粗鬆症を惹起している顎骨の骨形成や骨構造への効果に関する報告は少なく解明されていない。リセドロネートがステロイド性骨粗鬆症を惹起した成長期ラット脛骨および顎骨に対して比較検討することである。5週齢のWistar系雄ラットに対して,グルココルチコイド(GC)30mg/kgを6週間経口投与し,骨骨粗鬆症検索は、pQCTによるの解析、非脱灰標本による組織形態計測を行い比較検討の発症を確認した後、リセドロネート0(生理食塩水)、0.5,1.0mg/kgを4週間経口投与した。実験終了10日前と3日前カルセイン8mg/kgを皮下投与した。実験終了後、両部位を摘出した。その結果,リセドロネートは、皮質骨の骨形成を促進することによって下顎骨の成長遅延を回復させた。骨量、骨強度低下は回復したところから,リセドロネートは,成長期ステロイド性骨骨粗鬆症に対して有効であることが示唆された。成人における続発性ステロイド性骨粗鬆症の治療および管理には、破骨細胞をターゲットとしたビスホスホネート(BP)が第一選択薬として用いられている。小児にBPを長期投与すると成長抑制が報告されており、BP投与の適応症は重篤な骨形成不全症などに限られている。成長期の小児においては、骨成長を抑制せず、かつリバーシブルな骨吸収抑制剤の開発が望まれている。即ち本研究は、破骨細胞による骨吸収の分子機構を明らかにし、将来有望な小児続発性ステロイド性骨粗鬆症顎骨及び他の骨組織の治療へ展開できる可能性を探索することを目指す。平成20年度は、成長期ステロイド性骨粗鬆症モデルラットに対してBP(リセドロネート)を投与し,脛骨と下顎骨のpQCTによる骨構造の解析、非脱灰標本による組織形態計測を行い,リセドロネートが脛骨、下顎骨に及ぼす影響について比較検討を行った.その結果,リセドロネートは、皮質骨の骨形成を促進することによって下顎骨の成長遅延を回復させたが,脛骨の骨幹部では.骨形成を抑制したため,成長遅延を回復できなかった.両部位ともに骨量、骨強度低下は回復したことから,リセドロネートは成長期ステロイド性骨粗鬆症に対して有効であることが明らかになった。【目的】p130 Casによる骨吸収調節機構の解明

Src欠損マウスの破骨細胞ではp130Casがリン酸化されないことから、Srcの下流分子としてp130Casが働いていることが予想されるが、p130Cas欠損マウスは胎生致死であるため骨の解析が出来ない。そこで分子生物学的手法を用いて、破骨細胞でp130Casの発現を抑制したり、機能を発現できない遺伝子変異体を過剰発現させることで破骨細胞による骨吸収能をアクチンリングを指標に検討する。さらに、破骨細胞特異的にOC-p130CasKOマウスを作製し、破骨細胞におけるp130Casの機能を個体レベルで検討する。【結果】RAW264.7細胞にp130CasshRNAを導入し、破骨細胞を誘導すると、アクチンリングを持っ破骨細胞の数が減少し、p130Casの発現も減少した。2.ドミナントネガティブ型p130Casを過剰発現とアクチンリング形成との相関RAW264.7細胞にSH3ドメインを欠失したドミナントネガティブ型p130Casを過剰発現させたところ、アクチンリングを持っ破骨細胞の数が減少した。これらの結果から、破骨細胞の骨吸収にp130Casが重要な役割を担う可能性が示唆された。【今後の見通し】広島大学原爆研究所本田教授との共同研究で破骨細胞特異的にOC-p130CasKOマウスを作製、破骨細胞におけるp130Casの機能を個体レベルで検証する。p130CasFloxマウスの骨髄細胞にCreリコンビナーゼ遺伝子を発現させることで、p130Casを欠失した破骨細胞がp130CasshRNAやドミナントネガティブ型p130Casを発現させた時と同じようにアクチンリングをもっ破骨細胞が減少するか検討する。これまで我々は、成長期ラットにステロイド製剤を投与すると顎骨や大腿骨、脛骨の成長を抑制また骨量、骨強度および骨質が低下することを画像解析装置および末梢骨塩定量専用CT装置(pQCT)、3DマイクロCTを用いて明らかにしてきた。成人における続発性ステロイド性骨粗鬆症の治療および管理には、破骨細胞をターゲットとしたビスボスホネート(BP)が第一選択薬として用いられている。しかし、BPの長期投与による骨質の低下や、特に近年報告されている顎骨壊死などの副作用が問題視されている。しかしながら,小児へのBP投与の骨への影響については,報告が少ない。特に成長期顎骨への報告は,数例のみである。本研究では、新世代BPであるリセドロネートの顎骨および脛骨への影響を成長期ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを使用し,検索した。検索は、pQCTによる両部位の骨構造の解析、非脱灰標本による組織形態計測を行い比較検討を行った。その結果,リセドロネートは、皮質骨の骨形成を促進することによって下後骨の成長遅延を回復させたが,脛骨の骨幹部では骨形成を抑制したため、成長遅延を回復できなかった。両部位ともに骨量、骨強度低下は回復したところから,リセドロネートは,成長期ステロイド性骨粗鬆鵜匠に対して有効であることが死させれた。