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Werner症候群における遺伝子発現の異常と動脈硬化促進に関する研究

Werner症候群は遺伝性の早老症であり、動脈硬化症の著しい促進が見られる。この動脈硬化の成因に関しては遺伝子異常に起因した特別な動脈硬化の危険因子のあることが推測される。動脈硬化の成立にはマクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞などの細胞が重要な役割を果たしており、現在これらの細胞の機能異常の面からの動脈硬化の成立と進展の機構が捉え直されてきている。Werner症候群の皮膚線維芽細胞においては細胞外マトリックスの遺伝子とともにsequenceの一部にscavenger receptorとhomologousな配列を含む未知の遺伝子WS9-14やplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)など動脈硬化の促進に働く可能性のある遺伝子が過剰発現していることが明らかになった.われわれはまず本症候群の培養皮膚線維芽細胞における変性LDLの取り込みの促進について検討したが,とくにacetylated LDLのbindingが亢進している事実は認められなかった.つぎに線維芽細胞において過剰発現のみられるPAI-1の血中濃度を検討したところ,測定した全ての症例にて高値が認められた.これは線溶系の低下による動脈硬化の促進の可能性を示唆した.血管内皮細胞の表面ではintercelular adhesion molecule-1(ICAM-1)、vascular cell adhesion molecule-1などの接着因子が発現して単球やマクロファージの内皮下への侵入を仲介する.最近これらの接着因子は血中にてsoluble formとして測定できる.われわれはこと接着因子についても単球やマクロファージの侵入を介した動脈硬化促進機序が存在する可能性を考え、血中濃度を測定した.その結果ICAM-1が本症候群患者の血中にて増加していることを見い出した.Werner症候群は遺伝性の早老症であり、動脈硬化症の著しい促進が見られる。Werner症候群の皮膚線維芽細胞においては細胞外マトリックスの遺伝子とともにsequenceの一部にscavenger receptorとhomologousな配列を含む未知の遺伝子WS9-14やplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)など動脈硬化の促進に働く可能性のある遺伝子が過剰発現していることが明らかになった.われわれはまず本症候群の培養皮膚線維芽細胞における変性LDLの取り込みの促進について検討したが,とくにacetylated LDLのbindingが亢進している事実は認められなかった.つぎに線維芽細胞において過剰発現のみられるPAI-1の血中濃度を検討したところ,測定した全ての症例にて高値が認められた.これは線溶系の低下による動脈硬化の促進の可能性を示唆した.血管内皮細胞の表面ではintercelular adhesion molecule-1(ICAM-1)、vascular cell adhesion molecule-1などの接着因子が発現して単球やマクロファージの内皮下への侵入を仲介する.最近これらの接着因子は血中にてsoluble formとして測定できる.われわれはこと接着因子についても単球やマクロファージの侵入を介した動脈硬化促進機序が存在する可能性を考え、血中濃度を測定した.その結果ICAM-1が本症候群患者の血中にて増加していることを見い出した.Werner症候群の培養皮膚線維芽細胞で発現の過剰を示す遺伝子中に、そのsequenceの一部にscavenger receptorとhomologousな配列を含む未知の遺伝子WS9-14が見い出された。この遺伝子産物がscavenger receptor同様な働きをしているかを検討する目的でこの遺伝子が過剰に発現しているWerner症候群の培養線維芽細胞と、正常対照の培養皮膚線維芽細胞を用いて、両者におけるacetylated LDLのinternalizationの比較を行った。その結果、Werner症候群の培養線維芽細胞では対照とした細胞同様acetylated LDLのinternalizationはきわめて低く、この遺伝子がscavenger receptorとしての働きをもつことに否定的な結果が得られた。またWerner症候群の培養皮膚線維芽細胞において発現の過剰を示す遺伝子の1つにfibronectinがあるが、この発現を変動をballooningにより作製したラット実験的動脈硬化組織で免疫組織染色法を用いて検討した。その結果fibronectinの発現が動脈硬化の組織にて亢進している成績が得られた。実験的糖尿病動物(OLETFラット)での検討では糖尿病の有無によるfibronectinのvariationの違いがあることが明らかとなっておりこの点についての検討も必要と考えられた。またWerner症候群で発現の低下を示す遺伝子としてmitochondriaの遺伝子が見い出されているが、電顕による観察から培養線維芽細胞の継代老化によりmitochondriaが形態学的に変化することが明らかとなり、この変化とmitochondria遺伝子の発現低下との関連を示唆する成績がえられた。Werner症候群は遺伝性の早老症であり、動脈硬化症の著しい促進がみられる。動脈硬化の成立にはマクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞などの細胞が重要な役割を果たしており、現在これらの細胞の機能異常の面から動脈硬化の成立と進展の機構が捉え直されてきている。Werner症候群の皮膚線維

芽細胞においては細胞外マトリックスの遺伝子とともにsequenceの一部にscavenger receptorとhomologousな配列を含む未知の遺伝子WS9-14やplasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)など動脈硬化の促進に働く可能性のある遺伝子が過剰発現していることが明らかになった。われわれはまず本症候群の培養皮膚線維芽細胞における変性LDLの取り込みの促進について検討したが,とくにacetylated LDLのbindingが亢進している事実は認められなかった。つぎに線維芽細胞において過剰発現のみられるPAI-1の血中濃度を検討したところ,測定した全ての症例にて高値が認められた。これは線溶系の低下による動脈硬化の促進の可能性を示唆した。血管内皮細胞の表面ではintercelular adhesion molecule-1(ICAM-1)、vascular cell adhesion molecule-1などの接着因子が発現して単球やマクロファージの内皮下への侵入を仲介する。最近これらの接着因子は血中にてsoluble formとして測定できる。われわれはこの接着因子についても単球やマクロファージの侵入を介した動脈硬化促進機序が存在する可能性を考え、血中濃度を測定した。その結果にICAM-1が本症候群患者の血中にて増加していることを見い出した。
スピンエントロピー逆流機構によるN型酸化物熱電変換材料の設計と合成

本申請研究の平成17年度(最終年度)の研究目的は,(1)昨年度作製したペロブスカイト型コバルト酸化物の高温物性(電気抵抗,熱起電力,ホール係数)を測定し,測定されるコバルト系とマンガン系の高温物性の相違からスピンエントロピー逆流機構が生じるための必要条件を明らかにすること,さらに(2)このコバルト酸化物の室温強磁性における置換効果を調べ,その特異な強磁性状態とその強磁性状態における熱起電力の増大の起源を探ることであった。平成17年度は,(1)の目的を達成するためにSr_<1-x>Y_xCoO_<3-d>の電気抵抗率,熱起電力,ホール係数,磁化率を800Kまで測定し,この物質が550K以上で中間スピンまたは高スピン状態のCo^<3+>が伝導する金属状態を示すことを見出した。この高温における熱起電力は数μV/Kと小さく,スピンエントロピー逆流機構では説明できない。この結果をMn系の測定結果と比較するとスピンエントロピーの逆流が生じるためには,電子が波動状態である金属ではなく粒子と見える状況設定が必要であることがわかった。また(2)の目的を達成するためにSr_<0.75>Y_<0.25>Co_<1-x>Mn_xO_<3-d>,Sr_<0.75-x>Ca_xY_<0.25>CoO_<3-d>の焼結体試料を作製し,電気抵抗率,熱起電力を800Kまで磁化率を400Kまで測定した。測定の結果,わずか1%のMn置換によって50%の磁化が減少し,10%の置換で強磁性が完全に消失することを見出した。この結果は通常の希釈効果では説明できず,この強磁性がハイゼンベルクモデルでは説明できないことが明らかになった。またCa置換を行うと,置換量の増加とともに電気抵抗率は変化しないにも関わらず,熱起電力は100K付近で約4倍に増大することを見出した。この増大はキャリア濃度の変化では説明できず,有効質量の増大が示唆される。この熱起電力の増大はマグノンドラッグ効果によると考えられる。本申請研究の目的は(1)スピンエントロピー逆流機構が成立するMn^<3+>とMn^<4+>からなるMn酸化物を系統的に調べ,より熱電変換性能のよい材料を探索すること,(2)Mn酸化物以外の系でスピンエントロピー逆流機構を用いてN型材料を設計すること,(3)この機構を利用した熱電素子,デバイスの作製を提案することである。得られた熱起電力の値はどの物質においても高温極限で-80μV/Kになることがわかった。これはMn^<3+>イオンのe_g軌道の自由度が高温になって回復したことによる。この結果はより高温まで熱起電力を測定したために初めて明らかになったことである。これらのMn酸化物は高温では軌道の縮退効果により比較的高い熱電特性を持つといえる。また、その他の結果として電気抵抗率と熱起電力は高温極限で,キャリア濃度にも結晶構造にもよらず,それぞれ10mΩcm,-80μV/Kという普遍的な値を持つことが明らかになった。このことは局所的なMn^<3+>イオンとMn^<4+>イオンの交換だけがマクロな電荷輸送特性を支配していることを示唆している。平成16年度は,主に(2)の目的を達成するためにCo酸化物Sr_<1-x>Y_xCoO_y, Ru酸化物CaCu_3Ru_4O_<12>を作製し,800Kまでの電気抵抗率と熱起電力を測定した。残念ながら,どちらの試料においてもスピンエントロピー逆流機構によるN型の熱起電力を観測することはできなかった。しかし,副次的な結果として,Sr_<1-x>Y_xCoO_yはペロブスカイト型Co酸化物で最高の転移温度をもつ強磁性体であることが明らかとなった。これはAサイトのSrとYの整列に関係して,中間スピン状態のCoの軌道が整列することによると考えられる。さらに,CaCu_3Ru_4O_<12>においてはd電子系ではじめてf電子系と等価な重い電子状態を観測した。CuサイトRuサイトの置換効果を調べることによって,Cu^<2+>が局在モーメントを,Ru^<4+>が遍歴電子を担っていることが明らかになった。また昨年まで行っていたMn酸化物,Ca(Mn_<3-x>Cu_x)Mn_4O_<12>の研究を発展させるために800Kまで測定可能なホール係数測定プローブを作製し,測定を行った。

その結果,x=0,75,1の試料において電気抵抗率は大きいにも関わらず,ホール係数は小さいという結果を得た。この結果は昨年報告した高温極限における輸送特性の普遍性との関連性が期待される。本申請研究の平成17年度(最終年度)の研究目的は,(1)昨年度作製したペロブスカイト型コバルト酸化物の高温物性(電気抵抗,熱起電力,ホール係数)を測定し,測定されるコバルト系とマンガン系の高温物性の相違からスピンエントロピー逆流機構が生じるための必要条件を明らかにすること,さらに(2)このコバルト酸化物の室温強磁性における置換効果を調べ,その特異な強磁性状態とその強磁性状態における熱起電力の増大の起源を探ることであった。平成17年度は,(1)の目的を達成するためにSr_<1-x>Y_xCoO_<3-d>の電気抵抗率,熱起電力,ホール係数,磁化率を800Kまで測定し,この物質が550K以上で中間スピンまたは高スピン状態のCo^<3+>が伝導する金属状態を示すことを見出した。この高温における熱起電力は数μV/Kと小さく,スピンエントロピー逆流機構では説明できない。この結果をMn系の測定結果と比較するとスピンエントロピーの逆流が生じるためには,電子が波動状態である金属ではなく粒子と見える状況設定が必要であることがわかった。また(2)の目的を達成するためにSr_<0.75>Y_<0.25>Co_<1-x>Mn_xO_<3-d>,Sr_<0.75-x>Ca_xY_<0.25>CoO_<3-d>の焼結体試料を作製し,電気抵抗率,熱起電力を800Kまで磁化率を400Kまで測定した。測定の結果,わずか1%のMn置換によって50%の磁化が減少し,10%の置換で強磁性が完全に消失することを見出した。この結果は通常の希釈効果では説明できず,この強磁性がハイゼンベルクモデルでは説明できないことが明らかになった。またCa置換を行うと,置換量の増加とともに電気抵抗率は変化しないにも関わらず,熱起電力は100K付近で約4倍に増大することを見出した。この増大はキャリア濃度の変化では説明できず,有効質量の増大が示唆される。この熱起電力の増大はマグノンドラッグ効果によると考えられる。
ＴＬＲアゴニストによる免疫および慢性炎症の制御機構解明ーイメージング手法を用いて

歯周病や骨髄炎などにおいては、本来であれば生体を防御するための炎症反応が過剰な骨組織破壊につながり、ひいては修復不可能な病態を引き起こすことになる。骨破壊を起こす破骨細胞はToll-like receptor 4 (TLR4)およびTLR2を有することが知られているので、各々のアゴニストであるLPSおよびPam3CSK4投与により炎症性骨破壊を誘導し、イメージングおよび遺伝子解析手法を用いて実験を行った。その結果、TLR2刺激ではTLR4に比べて、炎症から免疫への移行が遅延するため、より大きな組織障害を惹起すること、すなわち、これらの受容体を介して炎症と免疫が制御されている可能性が示された。重篤な骨破壊を起こすことが知られている関節リウマチ,歯周病,骨転移腫瘍では歩行困難、歯の喪失、骨痛などが生じ,患者のQOLは著しく損なわれる。そのため、超高齢社会である我が国においては、有効な治療薬開発が急務とされている。本研究計画の2年目にあたる今年度は、昨年度の研究から得られた成果に基づいて「本来は感染に対する宿主の防衛反応である炎症によって、過剰な組織破壊がひき起こされるメカニズム解明」を目的として実験を行い、以下の結果が得られた。1.歯周疾患の原因となる細菌成分が宿主と相互作用する際に結合する受容体としてToll-like receptor (TLR) 4またはTLR2が知られている。それぞれのリガンドであるLPSまたはPam3CSK4をマウス頭蓋骨膜下に投与することにより、炎症性骨破壊が誘導された。すなわち、TLR4のみならずTLR2アゴニストも歯槽骨破壊に関与する可能性が示された。2.TLR2を介して作用することが知られているグラム陽性菌成分をマウス頭蓋骨膜下またはラット口蓋骨膜下に投与すると骨破壊が誘導されたことからも、TLR2の作用が確認された。3.In vivo実験でのLPSとPam3CSK4の比較から、TLR4よりもTLR2の方が炎症反応の経過が長引き、組織侵襲度が高いことが示された。4.LPSまたはPam3CSK4を投与したマウスから継時的に採取した血液・頭蓋冠・脾臓・骨髄の蛋白および遺伝子解析の結果、LPS群ではPam3CSK4群よりも早期に樹状細胞のマーカー発現がみられること、血液中のIFNgの発現量が多いこと、さらにRantes産生が増加していることが示され、炎症から免疫反応への移行がPam3CSK4に比して速やかであることが示された。骨粗鬆症や歯周病での病的骨破壊はQOLの著しい低下を招くため、超高齢社会である我が国においては、有効な治療薬開発が急務とされている。本研究では、本来ならば宿主を守るために働く免疫機構が破綻し、過剰な組織破壊を起こすメカニズムについてin vitroとin vivoの両側面から検討すると共に、共同開発中の骨代謝治療薬MPMBPの有効性の検定を行い、本研究計画期間内に以下の結果が得られた。1.TLR2を介して作用するPam3CSK4およびグラム陽性菌成分をマウス頭蓋骨膜下またはラット口蓋骨膜下に投与すると骨破壊が誘導されたことから、TLR4アゴニストであるLPSのみならず、TLR2アゴニストも歯周病における歯槽骨破壊の原因となることが示された。2.TLR2とTLR4アゴニストの作用メカニズムの違いについて調べるために、Pam3CSK4またはLPS投与後のマウスから採取した頭蓋骨・胸腺・脾臓・骨髄試料についてELISA法、real-time RT-PCR法、FACSによる解析を行った。その結果、LPS群ではPam3CSK4群よりも早期に樹状細胞のマーカー発現がみられ、炎症から免疫反応への移行が速やかであった。3.GFP transgenicラット由来の骨髄細胞を用いたin vivoイメージング実験から、TLR4よりもTLR2の方が炎症反応の経過が長引き、組織侵襲度が高いことが示された。4.Pam3CSK4, LPS投与による炎症性骨破壊モデルおよび頭蓋骨欠損モデルでのin vivoイメージング実験で、MPMBP投与により、炎症性骨破壊部位へのGFP, TRAP陽性細胞の移行が抑制された。また、蛍光2重標識法では、MPMBP投与群で、骨吸収抑制に加えて、新規骨形成促進が観察されたことから、MPMBPは骨代謝治療薬として有用であることが示された。

今年度は「感染に対する宿主の防衛反応である炎症により過剰な組織破壊がひき起こされるメカニズム」に着目し、Toll-like receptor (TLR)の関与について調べ、以下の成果が得られた。1.マウス頭蓋骨骨膜下にTLR2アゴニストであるPam3CSK4を投与したところ、全身的な炎症反応が確認された。さらに、このマウスをin vivo X-ray micro-CTにて経時的に観察したところ、1週間後に骨吸収像が認められ、TLR4のみならずTLR2によっても炎症性骨破壊が起こることが示された。2.炎症性骨破壊モデルマウスから採取した、頭蓋骨、炎症皮膚、胸腺、脾臓および骨髄から得られたTotal RNAを用いて定量的RT-PCRを行った結果、炎症性サイトカイン(TNFalpha, IL-1beta, IL-6)、ケモカイン(MCP-1, MIP-1alpha)の発現上昇が確認された。さらに、TLR2またはTLR4遺伝子欠損マウスではPam3CSK4またはLPS投与による骨破壊および遺伝子発現上昇が全く観察されなかったことから、それぞれTLR2またはTLR4依存的におこる現象であることが示された。3.ラット口蓋骨骨膜下にPam3CSK4またはグラム陽性菌であるS mutansを投与後、in vivo X-ray micro-CTにより経時的に観察したところ、9ないし10日後に口蓋骨骨吸収像が観察された。さらに、テトラサイクリンでラベルした口蓋骨の研磨切片でも吸収像が確認され、パラフィン包埋薄切切片にて破骨細胞のマーカーであるTRAP陽性細胞が認められた。本研究計画の初年度に行ったイメージング手法を用いたin vivoの実験から得られた結果に基づく仮説、すなわち、TLR4よりもTLR2を介する反応の方が、炎症の経過が長引き、組織破壊の程度が高いのは、免疫反応への移行が遅れるためではないか、という推測を裏付けるデータを得ることができた。本年度はそれぞれのアゴニストを投与した動物から採取した試料について、主にELISAとreal time RT-PCR法による解析を行ったが、現在までに得られたデータは、今後さらに、組織学的手法により、仮説を証明することを可能にするために有用なものである。また、現在、歯周疾患モデルとして用いられているのが、マウス頭蓋冠の骨破壊モデルであるのに対し、本研究においては、マウスよりも口のサイズ大きいために局所投与が可能なラットを用いて、口蓋骨の骨破壊モデルを作製したことの意義は大きいと考えている。このモデルについても、生きているままで行ったイメージング実験終了後に採取した上顎骨の研磨切片で骨吸収像や、TRAP陽性多核細胞を観察できたことは大きな成果である。本研究計画では、炎症性骨破壊にはTLR4だけでなくTLR2も関与しているという仮説に基づき実験を進めた。今年度、得られた成果により、当初の仮説に矛盾することなく次のステップへと実験を進めることができる。さらに、新たに考案したラット口蓋骨骨膜下投与モデルの有用性が示されたため。本年度までの2年間で、TLR2とTLR4アゴニストの作用メカニズムの違いについて、イメージング手法を用いたin vivo実験、および、ELISAとreal time RT-PCR法により詳細に検討した。その結果、いくつかの分子を候補としてあげることができた。
四元数多様体の複素部分多様体論の展開

四元数(擬)ケーラー対称空間の複素部分多様体の構成、特徴付けの課題に関して、今年度は、八元数に依拠して定義される8次元四元数ケーラー対称空間である結合的グラスマン多様体の部分多様体に焦点を絞り研究を進め、次のような成果を得た。(1)4次元ベクトル空間内の向きつけられた2次元部分空間のなすグラスマン多様体(4次元)から、結合的グラスマン多様体への埋込を構成し、それが横断的複素埋込になること、さらに特別な4次元ベクトル空間の場合には全複素かつ全測地的埋込になることを示した。これらは、興味深い複素部分多様体の例となっており、幾何学的特質及び特徴付け等を課題として今後の研究の発展も期待できる。これらの結果は、日本数学会2018年度秋季学会で発表した。また、論文としてまとめ、微分幾何学の興味深い研究成果が多く発表されているTsukuba Journal of Mathematicsに掲載予定である。(2)6次元球面には八元数に依拠して、概エルミート構造が自然に定まる。この概エルミート構造に関する6次元球面のラグランジュ部分多様体と結合的グラスマン多様体への写像との興味深い関係を調べた。具体的には、6次元球面のラグランジュ部分多様体から結合的グラスマン多様体へガウス写像と呼ばれる写像が定義され、それが調和写像になることを示した。八元数という代数の幾何学的な応用という意味で興味深いばかりでなく、6次元球面のラグランジュ部分多様体、結合的グラスマン多様体の調和写像の研究に新しい視点を導入し2つの対象の相互作用による研究の発展に寄与するものである。この成果は論文としてまとめ、学術雑誌に投稿中である。研究目的、研究実施計画に沿って研究を進め、目標とした研究課題について一定の成果が得られたので、「おおむね順調に進展している。」と判断した。具体的には「四元数(擬)ケーラー対称空間の複素部分多様体の構成、特徴付け」の課題では、8次元四元数ケーラー対称空間である結合的グラスマン多様体について、興味深い複素部分多様体の例の構成を行い、その幾何学的特徴を明らかにするという成果を得た。この成果がまとめられた論文は数学専門誌に受理され掲載予定であり、また数学会でも発表するなど、成果の発信にも努めた。「四元数射影空間の複素部分多様体に関する変換や変形の理論構築」については、異なる設定ではあるが類似の課題を研究した関連する文献を学び準備的な研究を進めた。次年度以降の研究につながるものと考える。1.四元数射影空間の複素部分多様体に関するBaecklund変換に相当する変換や変形の理論構築に関しては、異なる設定での類似の課題についての先行研究(例えば、Lotayらによるラグランジュ部分多様体、全実部分多様体に関する研究、Hitchinによる複素シンプレクティック多様体の複素ラグランジュ部分多様体の研究など)を深く検討し、変形理論の構築に向けた研究を進める。全複素部分多様体や横断的複素部分多様体をツイスター空間へリフトして議論する方法は有効と思われる。ツイスター空間の理論に深い蓄積がある研究分担者江尻と共同で取り組む。2.四元数(擬)ケーラー対称空間の複素部分多様体の構成、特徴付けの課題に関しては、実グラスマン多様体の部分多様体に焦点を絞り研究を進めたい。そのツイスター空間をより幾何学的に実現し,その描像に依拠して全複素部分多様体を構成することを試みる。JoyceやCortesらの等質四元数多様体の構成法についてよく吟味し,等質複素部分多様体の構成方法を見出す研究を進める。3.これまでに得られた成果の発信と四元数複素微分幾何学の研究のさらなる進展のため、本研究課題やより広く四元数複素微分幾何学に関係する国内外の研究者との研究交流を進める。特に国際研究集会等での研究成果発表を行う。

研究目的、研究実施計画に沿って研究を進め、目標とした研究課題について一定の成果が得られたので、「おおむね順調に進展している。」と判断した。具体的には「四元数(擬)ケーラー対称空間の複素部分多様体の構成、特徴付け」の課題では、8次元四元数ケーラー対称空間である結合的グラスマン多様体について、興味深い複素部分多様体の例の構成を行い、その幾何学的特徴を明らかにするという成果を得た。この成果がまとめられた論文は数学専門誌に受理され掲載予定であり、また数学会でも発表するなど、成果の発信にも努めた。「四元数射影空間の複素部分多様体に関する変換や変形の理論構築」については、異なる設定ではあるが類似の課題を研究した関連する文献を学び準備的な研究を進めた。次年度以降の研究につながるものと考える。1.四元数射影空間の複素部分多様体に関するBaecklund変換に相当する変換や変形の理論構築に関しては、異なる設定での類似の課題についての先行研究(例えば、Lotayらによるラグランジュ部分多様体、全実部分多様体に関する研究、Hitchinによる複素シンプレクティック多様体の複素ラグランジュ部分多様体の研究など)を深く検討し、変形理論の構築に向けた研究を進める。全複素部分多様体や横断的複素部分多様体をツイスター空間へリフトして議論する方法は有効と思われる。ツイスター空間の理論に深い蓄積がある研究分担者江尻と共同で取り組む。2.四元数(擬)ケーラー対称空間の複素部分多様体の構成、特徴付けの課題に関しては、実グラスマン多様体の部分多様体に焦点を絞り研究を進めたい。そのツイスター空間をより幾何学的に実現し,その描像に依拠して全複素部分多様体を構成することを試みる。JoyceやCortesらの等質四元数多様体の構成法についてよく吟味し,等質複素部分多様体の構成方法を見出す研究を進める。3.これまでに得られた成果の発信と四元数複素微分幾何学の研究のさらなる進展のため、本研究課題やより広く四元数複素微分幾何学に関係する国内外の研究者との研究交流を進める。特に国際研究集会等での研究成果発表を行う。次年度使用額が生じた理由:研究代表者塚田は、所属研究機関に設置されたグローバルリーダーシップ研究所において、29年度までその所長を務めた。30年度は所長の職は退いたものの、同研究所の業務に引き続き注力する必要があった。そのため国内外への出張がしにくく、直接訪問しての研究交流や研究発表がしにくかったこと。以上のような理由で次年度使用額が生じた。今後の使用計画について:これまでに得られた成果の発信と四元数複素微分幾何学の研究のさらなる進展のため、本研究課題やより広く四元数複素微分幾何学に関係する国内外の研究者との研究交流を進める。国際研究集会等での研究成果発表を行う。以上のように研究交流、研究成果発表を行うための旅費に多くの予算を充てる計画である。上記研究交流のほか、関係する専門分野の研究者から専門的知識の提供を受け、研究を進展させたい。その謝金等にも経費を充てたい。四元数幾何学,複素微分幾何学や擬リーマン幾何学などの最新の成果を盛り込んだ幾何学
マイクロPIXEによる骨髄腫細胞における微量元素の動態解明と新規治療薬の開発

大気micro-PIXE法を用いた骨髄腫(MM)細胞内微量元素測定法の確立と抗腫瘍薬添加後の微量元素の変化を検討した。MM細胞株を用いて、プロテアソーム阻害薬のボルテゾミブとアルキル化薬のメルファランを添加した。細胞を集細胞遠心装置にてポリカーボネート膜に接着させ、真空蒸着後、大気micro-PIXE法にて細胞内微量元素を解析した。高濃度ボルテゾミブ処理では、1細胞あたりのCaが増加し、PおよびCaの分布が変化した。アルキル化薬では変化はなかった。集細胞遠心装置を用いたMM細胞の大気Micro-PIXE法による微量元素測定法を確立できた。プロテアソーム阻害薬によるPとCaの変動が確認された。【平成26年度目的】多発性骨髄腫(MM)の治療抵抗性機序の解明と新規治療薬の開発を研究目的としている。本年度は、骨髄腫細胞培養株、臨床検体、正常リンパ球を用いて、細胞内微量元素の含量および分布をin-air micro-Particle Induced X-ray Emission(大気マイクロPIXE)法を用いて解析し、さらにサイトカイン等の増殖刺激前後、および各種治療薬添加前後の微量元素の動態を大気マイクロPIXE法を用いて解析する予定であった。【成果】MM細胞株と臨床検体において、マイクロPIXEにて細胞内微量元素の含量と分布の解析を開始したが、フリーな細胞であるため試料作成の条件設定が困難であった。マイラー膜に細胞を固着する技術、および約1mmの範囲に細胞を均一に固着させる技術の確立が必要であた。そのため核の無い赤血球において初めに検討した。正常人5例および各種貧血患者15例に用いて、赤血球中の微量元素含量と分布の測定系は確立した。その結果、骨髄異形成症候群等の疾患ではS(硫黄)の赤血球内分布と含量が正常と異なることを見出した。次いで、MM細胞株において検討した。細胞内微量元素測定に最も影響が少ない希釈液はTris-HNO3(pH 7.4)であった。細胞数は5×1061×107/mlが最適であった。以上のように条件設定はほぼ終了し、5種類のMM細胞株における細胞内微量元素の含量と分布測定は終了した。しかし、サイトカイン等の増殖刺激前後および各種治療薬添加前後の微量元素の動態解析には至らなかった。1.はじめに:大気micro-PIXE法を用いた多発性骨髄(MM)細胞株内の微量元素測定法の確立と検討を行った。2.対象と方法1)使用細胞:骨髄腫細胞株:KMS-112)方法:KMS-11をプロテアソーム阻害剤であるBortezomib終濃度0nM、20nM、50nMにて24時間処理を行った。細胞を洗浄後、48×103個/μLの濃度に再懸濁する。集細胞遠心装置にて、浮遊液50μLを500rpm、15分遠心し、0.5μm厚のポリカーボネート膜細胞を接着させ、液体窒素にてー150°Cに冷却したイソペンタンに沈め真空蒸着させた。分析試料を大気micro-PIXE分析チャンバーに装着し、KMS-11MM細胞内微量元素を解析した。3.結果:細胞濃度は細胞の大きさにもよるが、48×103個/μL程度で良好な細胞密度が得られた。KMS-11MM細胞株では、S・Kが細胞全体に比較的均一に分布していたのに対し、Pは核に高濃度で分布していた。Fe・Cu・Znなどの微量金属元素は明らかな分布が同定されなかった。Bortezomibによる処理では、0nMを100%とした場合それぞれ20nMは97.3%、50nMは38.6%の生存率であった。それぞれの濃度で各元素を比較したところ、P・S・Kおよび微量金属元素ではBortezomibの濃度による差は認められなかった。Caは50nMでは他の濃度では認められなかったCaの核内への分布集積が認められた。4.結語:浮遊細胞であるMM細胞株KMS-11のmicro-PIXE用試料作成法を開発した。集細胞遠心装置を用いることによって、in vitroにおいて様々な薬剤が添加されたMM細胞株の微量元素を、micro-PIXE法にて測定することが可能となった。Bortezomibの添加では、50nMの濃度でCaの核内への分布が観察された。多発性骨髄腫細胞株は浮遊細胞であり、接着性が乏しく、マイラー膜へ上への細胞固着が非常に困難であったが、集細胞遠心装置(サイトスピン)を使用することで克服できた。さらに、治療薬による骨髄腫細胞株内の微量元素の動態観察を行うことにも成功した。1.はじめに:MMの病態解明・治療法の開発へと結びつけることを目的とし、大気micro-PIXE法を用いたMM細胞内の微量元素の測定法の確立と、抗腫瘍薬添加後の微量元素の変化の検討を行った。2.実験:MM細胞株(KMS11)を用いて、プロテアソーム阻害薬のボルテゾミブを0 nM、20 nM、50 nMの濃度で添加し、24時間培養を行った。またアルキル化薬のメルファランを0μM, 50μMの濃度で添加し、10時間培養を行った。

細胞をTRIS-HNO3(pH 7.4)にて洗浄後、3×105個/mLに再懸濁後、集細胞遠心装置にて、500 rpm、15分遠心し、0.5 μm厚のポリカーボネート膜に細胞を接着させ、真空蒸着させる。量子機構・高崎研のシングルエンド加速器からSBコースのビームを受け取り、マイクロビーム形成を行う。ビームサイズおよびビーム電流を確認後、分析試料を大気micro-PIXE分析チャンバーに装着、順次測定し、MM細胞内微量元素を解析する。3.結果と考察:1細胞あたりの元素ヒストグラムの比較では、0 nMと20 nMでは各元素のピークに差は認められなかった。しかしながら、50 nMでは0 nMに比べ、Caのピークが高かった。さらに、P、S、Cl、Caの元素分布を比較したところ、0 nMと20 nMでは各元素の分布に差は認められなかった。50 nMでは他の濃度と比較し、P分布が断片化しており、細胞死による核の断片化を反映していると示唆された。また、50 nMではCa分布の核への集積が認められた。4.結論:集細胞遠心装置を応用したMM細胞の大気Micro-PIXE法による微量元素の測定法を確立できた。また、プロテアソーム阻害薬によるMM細胞内のPとCaの変動が確認されたが、アルキル化薬ではこのような変化は見られなかった。大気micro-PIXE法を用いた骨髄腫(MM)細胞内微量元素測定法の確立と抗腫瘍薬添加後の微量元素の変化を検討した。MM細胞株を用いて、プロテアソーム阻害薬のボルテゾミブとアルキル化薬のメルファランを添加した。細胞を集細胞遠心装置にてポリカーボネート膜に接着させ、真空蒸着後、大気micro-PIXE法にて細胞内微量元素を解析した。高濃度ボルテゾミブ処理では、1細胞あたりのCaが増加し、PおよびCaの分布が変化した。アルキル化薬では変化はなかった。集細胞遠心装置を用いたMM細胞の大気Micro-PIXE法による微量元素測定法を確立できた。プロテアソーム阻害薬によるPとCaの変動が確認された。マイクロPIXE法の試料作成に時間を要した。これまでの報告にある接着細胞においては、マイラー膜上への細胞固着が比較的容易であったが、フリーな細胞をマイラー膜上に固着されることは非常に困難であった。特に、観察に適した細胞数の設定、細胞浮遊液の条件設定に時間を要した。しかし、核の無い赤血球を用いた実験で条件を確立することが出来た。副産物として、各種貧血における細胞内微量元素の含量および分布が正常と異なることを見出した。現在まで、プロテアソーム阻害薬であるボルテゾミブ添加による微量元素の動態を観察してきたが、今後は、他の化学療法薬剤の添加による測定を行い、薬剤作用機序や耐性獲得の解明に結び付けたい。血液検査学細胞株における測定系が確立したため、MM細胞株11種、白血病細胞株4種、骨髄異形成症候群細胞株1種の細胞内微量元素の含量および分布解析を行う。ついで、MM細胞株にサイトカイン(IL-6, TNF-α)を添加した前後に微量元素の変化を解析する。同時に、MM患者の骨髄穿刺液よりCD138抗体を用いてMM細胞を純化し、細胞内微量元素の含量および分布解析を行う。浮遊細胞である骨髄腫細胞株のPIXE測定法の開発に時間がかかったため、抗腫瘍薬はbortezomibのみの検討に留まったため、細胞株培養液、各種サイトカインの購入を行わなかった。また、患者骨髄細胞の検討数が少なかったためCD138抗体等の購入額が少なかった。以上より、使用額が減じた。
トリプルスパイク法を用いた鉄隕石の精密Pb同位体分析

本研究はダブル・トリプルスパイク法を用いて鉄隕石のPb同位体比を精密に測定することにより、様々な鉄隕石の母天体が形成されたタイムスケールを明らかにする事を最終的な目的としている。本研究ではまずダブル・トリプルスパイクの実験に必要な実験器具や試薬・エミッターを作成し、10ナノグラム程度の鉛を0.01%以下の内部精度で測定できるようにした。次にダブル・トリプルスパイクの中でもオーバースパイクに対する誤差拡大率の小さい204-207Pbダブルスパイクを作成し、その同位体比をNBS982標準試薬を使って求めた。さらに求められたスパイクの同位体組成が正確であるかを確認するために標準試薬NBS981の同位体比をダブルスパイク法を用いて求めた。このようにして求められたNBS981の値は以下の通りである。206Pb/204Pb=16.9419(23;2σ_p),207Pb/204Pb=15.4987(32),208Pb/204Pb=36.7295(95).この値はGaler(1997)によって求められた16.9405,15.4963,36.7219と誤差範囲内で一致しており、ダブルスパイクを使った測定とデータ解析が正確に行われていることを示している。本研究では上記のスパイクを用いていくつかの鉄隕石やトロイライトインクルージョンの分析を行った(一部は進行中)。その中でも特に鉛含有量が高いNantan隕石中のトロイライトについては段階的な分解を行い、それぞれの同位体比を測定した。その結果、同位体比が最も低いフラクションでもCanyon Diablo中のトロイライトよりも高い同位体比を示すことが明らかになった。今後、さらに年代学的な理解を深めるためにはCanyon Diabloトロイライトの同位体比をダブルスパイク法を用いて求める必要がある。本研究は鉄隕石のPb同位体比をトリプルスパイク(又はダブルスパイク)法を用いて精密に測定することにより、(1)太陽系初期のPb同位体比を求め(2)異なるグループの鉄隕石が形成されたタイムスケールを明らかにする事を目的としている。鉛の同位体分析(特にダブル・トリプルスパイク法)では実験中のブランクを無視できる程度に抑える必要がある。従って本研究ではまず実験に必要な試薬のPbブランクを最小限に抑える工夫を行った。その結果以下のブランクを達成した。6N HCl 0.35ppt,8.9N HBr 1.0ppt,13N HN03<3ppt, H2O 0.4ppt, loading blank (Silica gel+H3P04) 0.1pg。このブランクは、世界の他の研究室と比べても極めて低く、トリプルスパイク法を使ったPb同位体分析を行うための環境が本研究室に整ったと言える。次に^<204>Pb,^<206>Pb,^<207>Pbのスパイクを作成し、それらを混合することによりダブルスパイクを作成した(トリプルスパイクは現在準備中)。またこれと並行してNBS981,NBS982の2種類の標準試料を作成した。NBS982は作成したダブル・トリプルスパイクのキャリブレーションに用いるものであり、NBS981はキャリブレーション後のスパイクを用いた同位体分析が正確に行われているかを確認するために用いる。一方、隕石の化学処理では、鉄隕石専用のカラムを新たに作成し、HBr-HN03を用いた鉛抽出法のキャリブレーションを行った。現在Buenaventura (IIIB),Guadalupe Y Calvo (IIAB),Carbo (IID)の処理を同時に進めており、平成14年度6月くらいまでにはこれらのデータが得られる予定である。なお、本研究では全ての試料について段階的な酸分解(リーチング)を行い地球上での鉛の汚染を除去する。その中でも特に鉛含有量が高いNantan

隕石中のトロイライトについては段階的な分解を行い、それぞれの同位体比を測定した。その結果、同位体比が最も低いフラクションでもCanyon Diablo中のトロイライトよりも高い同位体比を示すことが明らかになった。今後、さらに年代学的な理解を深めるためにはCanyon Diabloトロイライトの同位体比をダブルスパイク法を用いて求める必要がある。
地方都市における社会変動と社会移動に関する社会学的研究

いま、多くの地方都市が衰退しその影響を受けて市民生活は深刻な危機に面している。地方都市を再生させ市民生活を危機的状況から救い出す即効薬は存在しない。地方都市の再生産過程-盛衰の歴史-を解明し、未来を見据えた対応策を講ずるという科学的作業だけが、迂遠にして、しかしもっとも有効な方法である。われわれはそうした認識に立って調査を行い、成果として以下の諸点を発見・確認した。(1)小樽市の盛衰は明治国家の北海道・北方領土政策と極めて密であった。国家の地域政策は都市の再生産-盛衰-に大きな影響を有している。都市の盛衰に関する研究に「国家」の視点は不可欠である。(2)都市の盛衰と社会階層-構成と移動-の関係も密接である。小樽市の場合、発展・成長期(明治-大正)に各種事業者を中心に資本家・名望家と労働者群が創出され、衰退期(昭和-現在)には多くの資本家・名望家が姿を消している。都市の社会階層は都市の盛衰に歩調をあわせてその構成を変えている。社会階層の動態把握は都市の盛衰と市民生活の分析に不可欠の視点である。(3)都市盛衰の歴史は、同時に、地域文化盛衰の歴史であった。特にわれわれが調査の対象とした小樽市高島地区の事例は地域文化の盛衰が都市の盛衰と密接であることを教えている。(4)小樽市は、現在、発展期に蓄積した歴史的資源によって観光都市となっている。しかし財政事情は非常に厳しい。そうした中で市民は「安定層」と「不安定層」に分化しつつある。階層の移動に関しては「上昇志向型」と「現状維持型」が存在することも確認された。なお、調査は、小樽市民の行政(小樽市政)に対する評価が高くないという事実も発見した。特に若年層における評価には厳しいものがある。平成13年度は小樽市・富士吉田市・備前市において資料の収集と聞き取り調査を行い、小樽市については統計調査を実施した。少しく具体的に述べれば以下の通りである。(1)3都市(小樽市・富士吉田市・備前市)の階層構成を明らかにするために、国勢調査・事業所統計の操作・検討を行った。(2)小樽市:小樽市の都市形成にかかわる資料を収集するとともに、小樽市民(2、000サンプル)と小樽市市議会議員(40名)を対象に「社会階層と社会移動」を内容とする統計調査を実施した。また、小樽市高島地区において地区住民の階層構成と社会移動に関する聞き取り調査を実施した。(2)富士吉田市:富士吉田市の都市形成にかかわる資料を収集するとともに、富士吉田市の階層構造を解明するために富士吉田市における「御師」と「機業」の実態について資料の収集と聞き取り調査を実施した。(3)備前市:備前市の都市形成にかかわる資料を収集するとともに、備前市の階層構造と社会移動の解明に必要な基幹産業(耐火煉瓦)に関する資料の収集を行った。平成13年度に引き続き資料の収集をはかりながら、市民各層を対象に聞き取り調査を行い、合わせて、小樽市における上層階層を対象にした標準化調査を実施した。その内容と成果を少しく具体的に示せば以下の通りである。(1)小樽商科大学・市立図書館・市立博物館・北海道立資料館などを中心に資料収集を実施した。「山田家」資料、「渡辺家」資料をはじめ、小樽市の形成を解明する上で不可欠な資料を入手した。また、小樽において発行された新聞(マイクロフイルム)から地方都市=小樽に生きた諸階層の生活を追求した。

(2)小樽市における諸階層の生活動態を出来るだけ具体的に把握するという認識に基づいて、多様な人生を歩んできた「女性」の生活史を追求した。生業と家計を夫と共に支えた女性たちの、あるいは人生を一人生き抜いてきた女性たちの生活史から、近・現代における地方都市=小樽市の構造を解明する手がかりを獲得した。(3)以上の作業と平行して、小樽市における地域リーダー調査を行った。小樽市の階層構成において「上」に位置すると判断されたロータリークラブ、ライオンズクラブの会員が対象である。詳細は、現在、分析中であるが、この調査によって小樽市において上層階層が形成された背景が解明された。同時に、上層階層の生活構造・意識構造の解明に手がかりを得た。平成14年度に引き続き小樽市の都市構造と小樽市民の生活構造を解明するために複数の調査を計画・実施し、以下の成果を得た。(1)小樽新聞(明治26年以降)、北海道新聞(昭和17年以降)のマイクロフィルムを通読し必要箇所の複写を行った。小樽新聞は戦前の小樽市と北海道を理解する上で欠くことのできない資料であり小樽の都市構造と市民生活に関する情報の宝庫である。これを通読し得たことでわれわれは小樽の都市形成・発展期の研究を深めることができた。特に統計資料では解明に限界があった複数の点を解明することができた。一例を挙げれば、新聞には名望家層が創出される契機や過程が生き生きと記述されている。そうした記述を含む新聞記事の獲得は小樽市(戦前期)における名望家層の社会的位置と役割をできるだけリアルにとらえることを課題とするわれわれにとって貴重な成果であった。(2)小樽市民及び地域リーダーを対象に、生活構造と小樽市の政策課題にかかわる聞き取り調査を実施した。あわせて小樽市内高島地区の地域構造と地域の文化的特質を解明する目的から「越後踊り」を中心に、地域文化の担い手層に対する聞き取り調査を実施した。そして以上の調査から現在小樽市の直面する政策課題が歴史的・構造的なものであること、地域文化は小樽市の再生にとって戦略的位置を占めるとの確信を得た。(3)3年間の集大成として『資料集』を作成した。この『資料集』はわれわれが研究を体系的な形に仕上げる上で必要・不可欠であるだけでなく、今後、小樽市(小樽市民と行政)が都市政策を展開する上で基礎となる貴重な成果である。
眼球運動前後における視覚情報獲得の精神生理学的研究

眼球運動終了直後の視覚情報処理の特性を調べるために、眼球運動終了直後に呈示される図形に対する反応時間(検出時間)と脳波(視覚誘発脳電位)を計測した。眼球運動終了直後に呈示された図形に対する検出時間は、眼球静止中に呈示された図形に対する検出時間よりも長かった。これに対して、脳電位の反応は、眼球運動終了直後に図形を呈示した方が眼球静止時に呈示した場合よりも速くなる場合があることが示された。この結果は、多くの場合では眼球運動によって視覚情報処理が抑制されるが、一部の視覚情報処理はサッカードによって促進される可能性があることを示唆する。本研究課題の目的は、眼球静止時の視覚情報処理と比較して、眼球運動によって視覚情報処理がどのように変化するのかを、精神生理学的に検討することである。精神生理学的手法として視覚誘発脳電位を計測指標として用いることが、本研究の特色の一つとして挙げられる。この特色を十分に活かすためには、明瞭な視覚誘発脳電位を惹起する視覚刺激(パタン刺激)の選定が重要なポイントになる。平成19年度の研究においては、明瞭な視覚誘発電位を惹起する視覚刺激(パタン刺激)の選定に取り組んだ。いくつかの先行研究によって、顔パタン刺激によって惹起される視覚誘発電位(N170成分)が比較的安定して記録できることが知られている。これらの先行研究を踏まえて、顔パタン刺激の中でも最も安定して顕著なN170成分を惹起するパタンを調べるために、顔パタン刺激のパーツ(目・口)の配置を変化させて、それに応じたN170成分を記録した。実験の結果として、(1)比較的単純な顔パタン刺激に対しても、後側頭部において明瞭なN170成分が記録できること、(2)顔の上下方向が逆転したパタン刺激(倒立パタン)の方が、より明瞭なN170成分を惹起すること、(3)正立状態(上向き)の顔パタン刺激においてはパーツの配置がN170成分の大きさに影響するのに対して、倒立状態(下向き)の顔パタン刺激においてはパーツの配置はN170成分の大きさに影響しないこと、などが明らかになった。我々が外界の視覚情報を獲得する際には、ある視点から次の視点へと急速に移動する眼球運動(サッカード)が重要な役割を果たしている。本研究課題の目的は、サッカード終了直後の視覚情報獲得の特性を、精神生理学的に検討することである。本研究の特色の一つとして、脳電位(脳波)を指標とすることによって、行動指標(反応時間など)よりも早い段階での視覚情報処理の変化を計測することが挙げられる。今回の研究で用いる視覚刺激(パタン図形)としては、段階的に刺激特性を変化させることができる、その刺激によって惹起される脳電位が刺激特性に応じて変化する、という2つの要件を満たす必要がある。このような背景の上で、脳電位を惹起する視覚刺激の選定の一環として、線画顔パタン刺激によって惹起される脳電位が顔要素(目・口)の配置によってどのように変化するかを検討した。その結果、顔として認識し易い要素配置が存在することが示唆されたが、要素配置の変化によって脳電位が劇的に変化することはなかった。次いで、視覚刺激パタンとしてチェッカーボードパタンを用いて、パタンのコントラスト、チェックサイズ、パタン呈示のタイミングを変化させて脳電位とパタン検出反応時間を計測した。実験結果のひとつとして、パタン検出反応時間は眼球静止時(サッカード終了250ミリ秒後)に刺激呈示した方がサッカード終了直後に刺激呈示した場合よりも反応時間が短いのに対して、脳電位のピーク潜時はサッカード終了直後に刺激呈示した方が眼球静止時に刺激呈示した場合よりも潜時が短くなる場合があることが示された。この結果は、行動指標で計測できる段階よりも早期の段階では、サッカードによって促進される視覚情報処理が存在することを示唆する。
内分泌撹乱物質は注意欠陥多動性障害の原因となるか?

【目的】内分泌撹乱物質と考えられているビスフェノールA(BPA)に胎児期に曝露されたラットは成長後に多動を示すとの報告がある。注意欠陥多動性障害(Attention-deficit hyperactivity disorder ; ADHD)は「多動」と「不注意」を二大兆候とする疾患で、近年その発症率が増加している。本研究では、内分泌撹乱物質がADHD発症要因の一つとなる可能性を想定し、BPAを長期間慢性飲水投与したラットにおいて、注意力に変化が現れるかどうかを検討した。【方法】雄性ラットに3週齢時より、BPA 5mg/Lを含有する飲料水を投与した(n=9)。これらのラットの飲水量は対照群(n=8)と違いはなかった。飲水投与開始後3週間よりトレーニングを始め、Fixed-Ratio Scheduleにて基準条件をクリアしたラットについて、Light Tracking Testにより注意力を測定した。【結果・考察】平均反応潜時[コントロール群(ctl):1.91±0.16(sec)、BPA群:1.68±0.16(sec)]、反応率[ctl群:0.55±0.05(resp/sec)、BPA群:0.63±0.06(resp/sec)]、正答数[ctl群:33.1±6.64(回)、BPA群:35.1±5.30(回)]、エラー数[ctl群:5.50±1.09(回)、BPA群:8.22±2.34(回)]、interval response[ctl群:105±21.0(回)、BPA群:169±46.0(回)]、無反応数[ctl群:21.4±7.45(回)、BPA群:16.7±6.40(回)]"となり、いずれの指標においても、コントロール群、BPA投与群間において、有意差は認められなかった。以上より、BPAを3週齢より慢性投与してもラットの注意力に影響しないものと考えられた。
肝臓および脾臓のSP(サイドポピュレーション)細胞による細胞移植肝再生療法の試み

1)培養での肝細胞分化誘導法の確立コラーゲンゲルサンドイッチ法を用いた初代培養肝細胞培養において、重層時期を変えて培養細胞の肝細胞分化機能を検討したところ、この方法が単に分化維持だけではなく、脱分化した肝細胞を再分化できる培養法であることを見出した。肝細胞が再分化する環境が、幹細胞の肝細胞分化誘導に適している可能性が示唆されたので、造血幹細胞の含有が知られている骨髄から採取した単核球で試みたところ、2週間の培養で、アルブミン産生能獲得が確認された。2)脾臓SP細胞採取法の確立と細胞特性解析ラット脾臓では、骨髄以上の存在率でSP細胞を認めた。表面抗原マーカーの陽性率の違いから、脾臓SP細胞は骨髄SP細胞とは異なる細胞集団であることが判明した。致死量放射線照射マウスにラット脾臓のSP細胞と非SP細胞をそれぞれ移植したところ、非SP細胞移植群は全例死亡したが、SP細胞移植群は約3割が生存し、その血液・骨髄・脾臓にラットの血球細胞を認めた。脾臓SP細胞が血球細胞に分化することが示唆された。3)脾臓SP細胞の肝細胞分化脾臓SP細胞と初代培養肝細胞をコラーゲンゲルサンドイッチ法で2週間共培養したところ、培養前に発現していなかった肝細胞特異的マーカーが、培養後には高率に発現していることが確認された。SP細胞と初代培養肝細胞の間にコラーゲンゲルを挟み直接的接触なしで培養しても同様の結果が得られた。このことから、脾臓SP細胞は肝細胞に分化しうることが示唆された。4)凍結細胞からのSP細胞採取脾臓から単核球を分離して凍結保存し、2週間後に解凍してSP細胞解析を行ったところ、生細胞に占めるSP細胞の割合が増加していた。SP細胞は凍結ストレスに強いことが示唆され、移植細胞候補として考えたとき、凍結保存が可能であるという有利な特徴を持つことが示された。GFPトランスジェニックラットの脾細胞からHoechst33342染色法と2波長解析FACSによりSP細胞を分離し、ラット初代培養肝細胞とコラーゲンゲルサンドイッチ法で共培養した。GFP陽性細胞を経時的に蛍光および位相差顕微鏡で観察し、免疫染色で解析した。細胞融合はFISH法で評価した。脾臓SP細胞の割合は0.3%で、肝非実質細胞(NPC)よりも多かった。脾臓SP細胞のCD34とc-kitの陽性率は、40.7%と73.0%で、NPC-SP細胞の表現型と大きく異なった。脾臓SP細胞はNPC-SP細胞と形態的な違いを認めず、NPS-SP細胞と同様に初代培養肝細胞との共培養で肝細胞様になり、免疫染色でアルブミン陽性、CK18陽性、CK19陰性を示した。同様に培養した脾臓MP細胞ではこれらを認めなかった。【結論】脾臓SP細胞が可塑性を持ち、肝細胞機能を獲得し得る可能性を示した。細胞移植に組織幹細胞、とくにSP細胞が有用であり肝硬変において脾臓SP細胞が重要な検討対象であることが示された。B6系マウスを用い、肝非実質細胞を2段階灌流法により、胎児肝、脾臓細胞はコラゲナーゼ消化法により、骨髄細胞は大腿骨より得た。CCl4腹腔内投与肝傷害モデルを作成した。