hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
陸上地磁気三成分データを用いた津波ダイナモ効果の検出

現行の津波早期警戒システムの津波検知能力を向上させる目的で,海岸線に近い観測点と内陸の基準観測点との地磁気ベクトル差を用い,津波の最大波高に先行すると予想される津波起源磁場を陸上観測により検出する為の基礎研究を行った。その結果,高知県の室戸観測点と馬路基準点間の地磁気ベクトル差リアルタイムモニタリングを実施する観測体制が整い,来るべき南海/東南海巨大地震の際に発生が想定される津波の早期警戒への新たな基礎データの提供が可能になった。平成23年度は、高知県安芸郡馬路村馬路土川に、地磁気ベクトル観測基準点を設けた。本研究では、良導的な海水の津波による粒子運動と地球主磁場とのカップリングで生じる津波電磁場を陸上で検知する為、海岸線に近い地磁気三成分観測点と海岸線から離れた基準点との間で地磁気ベクトル差を逐次観測する事を目的としている。平成23年度は、このうち地磁気基準点の設置に成功した。高知県安芸郡馬路村は、過去の地球電磁気学的移動観測により、人工電磁ノイズが極めて小さい地磁気観測適地として知られていた。そこで本研究では、馬路村役場の協力を得、村内の長期観測候補地を探した所、馬路土川の集落跡が電磁気的に静穏で、かつ、観測点設置に利用可能な電気・電話設備を備えた家屋も存在する事が分かった。その為、当該家屋の地権者と交渉し、本研究費の最終年度まで敷地内に地磁気ベクトル観測の基準点を設ける許可を得た。その後、年明けの一月中旬過ぎに敷地内裏庭に磁力計の埋設と家屋内に地磁気三成分2Hzデータの記録・転送を行う機器設置を行い、一月下旬からは連続して地磁気ベクトルデータを京都大学へリアルタイム転送できている。この地磁気基準点設置の経緯に関しては,平成24年度4月末から5月初めにかけてパシフィコ横浜で開催される「日本地球惑星科学連合2014年大会」で成果発表する予定である。平成26年度は,前年度に高知県の馬路基準点で開始した地磁気ベクトル観測(2Hz値)に加え,気象庁地磁気観測所の協力を得て,地磁気全磁力絶対値の連続観測(毎分値)を同点で開始した。この連続観測用のプロトンスカラー絶対磁力計の設置時には馬路基準点において地磁気三成分の絶対観測も実施し,既設のフラックスゲート型ベクトル磁力計の基線値も確定した。この絶対観測と全磁力値の連続観測により,馬路基準点における地磁気ベクトル観測の基線変化の上限が推定でき,室戸観測点と馬路基準点との地磁気ベクトル差データにも必然的に現れる基線変化の不確定さを軽減する事ができるようになった。一方,室戸観測点では,国土地理院地磁気係の協力を得て,八月以降には毎秒値をインターネット経由で取得できる様になった。これにより,馬路基準点からの地磁気三成分リアルタイムデータを差し引いて,室戸ー馬路の地磁気ベクトル差リアルタイムモニタリングが可能になり,本研究で目標とした津波電磁場の観測システムは一応の完成をみた。しかし,八月上旬に四国に上陸した台風11号に伴う大雨と落雷の為,馬路基準点のベクトル磁力計の故障および同点における長期停電が発生し,その復旧に12月下旬までを要した。その結果,馬路基準点においては約四ヶ月の欠測期間が生じてしまったが,幸い室戸観測点には,この台風による影響は無かった。これら平成26年度の成果により,来るべき南海/東南海地震の際の津波災害軽減に向け,津波電磁場の事例研究を実施する態勢が整った。本研究の目的を達成する為には,(1)海岸線に近い観測点における地磁気の連続ベクトル観測,(2)海岸線から離れた基準点における地磁気の連続ベクトル観測,の二種のデータが必要である。(1)については,研究協力者となっている国土地理院地磁気係が従前より高知県室戸岬で行っている地磁気三成分観測が充当でき,かつ,平成25年度中にサンプリングの高速化も図られている。本研究では,平成25年度は(2)を実現する事に力を注ぎ,「研究実績の概要」欄で述べた通り,高知県安芸郡馬路村馬路土川で地磁気ベクトルのリアルタイム連続観測を開始する事に成功した。以上が,本研究を現時点で「おおむね順調に進展している」と評価する理由である。平成26年度は,研究協力者である気象庁地磁気観測所の協力の下,全磁力絶対計の付加や馬路観測点での地磁気絶対観測等を行い,引き続き馬路観測点の整備・高精度化を図る。また,高速化した室戸観測点のデータをインターネットを介してリアルタイム接続し,馬路観測点との差を取る事によって,二地点間のリアルタイム地磁気ベクトル差を算出する。算出した地磁気ベクトル差から海洋ダイナモ起源の磁場を抽出し,地磁気時間変化異常の検出を津波早期警戒情報発信とどうつなげるか,についての検討材料とする。以上の研究活動は適宜国内外の学会で発表すると共に,平成26年度は最終年度でもあるので,研究代表者/連携研究者/研究協力者による研究

打合せ会を,京都・茨城・高知のいずれかの場所で秋から冬にかけての時期に開き,成果をとりまとめる。磁力計は現有設備が利用できる事になった為,物品費は消耗品だけで済み使用予定額から約60万円の黒字となった。旅費は,観測点選定・地権者との交渉・磁力計設置等でそれぞれ複数回ずつ現地出張が必要になった事等から,逆に約30万円の赤字となった。馬路観測点の土地・家屋は地権者のご好意により無償で借り受ける事ができたが,観測点の維持に必要な電気・電話及びインターネット接続料等の費用が発生した為,謝金とその他の費目で差し引き15万円強の赤字となった。これらを合計すると,12万5760円が次年度使用額として生じた。平成25年度に生じた次年度使用額は,平成26年度に実施予定の馬路および室戸観測点の整備に充当する。
始原生殖細胞(PGC)を用いた家禽遺伝子資源の保存に関する基礎的研究

始原生殖細胞(PGC)を用いて家禽遺伝子資源を保存する事に関する一連の研究を行った。現在、ニワトリ精子の凍結保存は可能であるが、精子の凍結保存のみでは鳥類の遺伝資源を完全な型で保存する事はできない。一方、鳥類の受精卵は大型で、卵黄に富み、また放卵時の細胞数が50,000から60,000に達しているため、凍結保存を行うことが困難であり、孵化能力を損なわずにニワトリ受精卵を保存できる期間は2-3週間にすぎない。従って、鳥類の遺伝資源を保存するためには哺乳類における受精卵の保存・移植とは異なった戦略が必要である。そこで、我々は将来精祖細胞または卵祖細胞に分化する細胞である始原生殖細胞(PGCs)を回収、保存並びに移植し、生殖系列キメラを作製する事により鳥類における遺伝資源の保存ができると考え研究を行った。本研究によって明らかになった点は以下の通りである。様々な条件下におけるニワトリ初期胚血液1μl中のPGCsの変動パターンを調べた結果、ステージ14において最高であり、ステージが進むにつれて減少することが明らかになった。2)ニワトリ初期胚血液中に含まれている総PGCs数を推定した結果、ステージ14において807個、ステージ15において857個であることが明らかになった、3)実験毎に回収することができるPGCs数が大きく変動する理由を探った結果、血液中PGC数の多い個体と少ない個体があることが明らかになった。次に、ニワトリ5日胚から回収した生殖腺に存在する生殖細胞(gPGCS)を凍結・融解後2日胚血液中に移植する事により、生殖系列キメラが作製された。さらに、フィルター法による新しい血液中PGCsの回収方法を開発した。ニワトリにおいては精子の凍結保存は可能であるが、精子の凍結保存のみでは鳥類の遺伝資源を完全な型で保存する事はできない。そこで、将来精祖細胞または卵祖細胞に分化する細胞である始原生殖細胞(PGCs)を回収、保存並びに移植し、生殖系列キメラを作製する事により家禽における遺伝資源の保存ができると考え研究を行ってきた。そこで、ニワトリ5日胚の生殖腺原基から回収されたgPGCsを用いて生殖系列キメラ作製を試みた。5日胚生殖腺原基から回収されたgPGCsを凍結・融解後に2日胚の血管内に移植し後代検定を行った結果、凍結・融解されたgPGCsに由来するヒナの生産が確認された。その結果、ニワトリ5日胚の生殖腺原基から回収されたgPGCsを用いてニワトリ遺伝資源の保存が可能である事が示された。ニワトリ始原生殖細胞(PGCs)の動態を知るための一連の研究を行い、以下のことが明らかになった。1)ニワトリ初期胚血液中の平均PGCs濃度はステージ1315までの間で最も高く、約60個/μlであったが、ステージ16以降急激に低下し、ステージ17では正常なPGCsほとんど認められなかった。2)しかしながら、ステージ13から15にかけてのニワトリ初期胚血液中の平均PGCs濃度は卵間での差異が極めて大きかった。3) 2)で述べたニワトリ初期胚血液中の平均PGCs濃度の卵間の違いは何に起因するかを調べる事を目的にまず一個の卵から3時問おきに採血を行い、初期胚血液中の平均PGCs濃度の個体内変動を調べた。その結果、PGCs濃度が高い卵と低い卵が存在することが明らかになった。4)そこで、特定の雌個体がPGCs濃度の高い、または低い卵を生産すると仮定し検討を行った。

その結果、実験に用いた7羽の雌個体の内、1羽の生産した卵においては平均90個/μlと極めて高い濃度のPGCsが循環している一方、他の一羽が生産した卵においては平均PGCs濃度が約20個/μlと極めて低い濃度のPGcsしか循環していなかった。5)以上の結果より、2)で認められた極めて大きなニワトリ初期胚血液中の平均PGCs濃度の卵間での差異は、卵を生産した雌鶏の違いに起因することが明らかになった。本研究においては様々な条件下におけるニワトリ初期胚血液1μl中のPGCsの変動パターンを調べた上で2)ニワトリ初期胚血液中に含まれている総PGCs数を推定する事により、実験毎に回収することができるPGCs数が大きく変動する理由を探り、さらに最も効率よくPGCsを回収することができる実験条件を探ることを目的に一連の実験を行った。その結果、1)ニワトリ初期胚血液1μlに含まれるPGC数はステージ13から15にかけて最も多く、ステージ16から減少し、ステージ17ではほとんど血液中にPGCsは認められなかったこと2)貯卵期間が2週間の達すると血液1μlに含まれるPGC数が有意に減少すること3)ニワトリ初期胚血液1μl中に存在するPGC数には受精卵を生産した雌間に差違が存在すること4)同一胚から4時間間隔で3回採血を行い血液1μl中に存在するPGC数の変化を求めた結果、ニワトリ初期胚血液1μl中に存在するPGC数は経時的に減少すること5)ニワトリ初期胚血液中に存在する総PGCs数はステージ14においては平均807.4±137個、ステージ15においては平均857.0±239であること6)5個または6個の受精卵から採取された血液を混合した後フィルターする事により平均54.4±6.3%の率でPGCsが回収されること7)数個の受精卵から採取された血液を凍結・融解後フィルターする事により平均31.4±15.7%の率で正常なPGCsが回収されることが明らかになった。現在、フィルター法により回収されたPGCsを用いて生殖系列キメラを作製する準備を進めている。始原生殖細胞(PGC)を用いて家禽遺伝子資源を保存する事に関する一連の研究を行った。現在、ニワトリ精子の凍結保存は可能であるが、精子の凍結保存のみでは鳥類の遺伝資源を完全な型で保存する事はできない。一方、鳥類の受精卵は大型で、卵黄に富み、また放卵時の細胞数が50,000から60,000に達しているため、凍結保存を行うことが困難であり、孵化能力を損なわずにニワトリ受精卵を保存できる期間は2-3週間にすぎない。従って、鳥類の遺伝資源を保存するためには哺乳類における受精卵の保存・移植とは異なった戦略が必要である。そこで、我々は将来精祖細胞または卵祖細胞に分化する細胞である始原生殖細胞(PGCs)を回収、保存並びに移植し、生殖系列キメラを作製する事により鳥類における遺伝資源の保存ができると考え研究を行った。本研究によって明らかになった点は以下の通りである。様々な条件下におけるニワトリ初期胚血液1μl中のPGCsの変動パターンを調べた結果、ステージ14において最高であり、ステージが進むにつれて減少することが明らかになった。2)ニワトリ初期胚血液中に含まれている総PGCs数を推定した結果、ステージ14において807個、ステージ15において857個であることが明らかになった、3)実験毎に回収することができるPGCs数が大きく変動する理由を探った結果、血液中PGC数の多い個体と少ない個体があることが明らかになった。
考古地磁気学データの集約と高アクセシビリティデータベースの構築

日本では数多くの考古地磁気測定が行われてきたが、研究者・発掘報告書ごとにデータが散逸した状態であった。本研究ではこれらの結果を集約し網羅的なデータベースを作成するために、文献調査を中心としたデータそのものの発掘作業を行った。また、データベースを組織的かつ広範囲に公開するために、オンライン化し検索サービスや日本各地での永年変化モデルを提供し、考古地磁気に関する解説文を記したサイトを構築した。日本における考古地磁気学は、1980年代初頭までに地磁気永年変化曲線の作成と年代推定法への応用と言う形で一応の完成を見た。その後も数多くの測定がされてきたが、各発掘報告書に所蔵される以上のまとまりはなく、データの集約をすることが困難であった。本研究では、この散逸した報告データを集約し、可読性が高く考古学・文化財科学研究者へも説明が可能なデータベースと言う形にする端緒をつけることを目的として行い、以下の成果を得た。考古地磁気データベースの拡充:本学考古学研究室に所蔵される発掘報告書を丹念に調査し、そこに記載された過去の考古地磁気学研究のドキュメントを掘り起こした。これまでに約50の報告書より約150サイト分のデータを発見し、手元のデータベースへ加えた。また、各地で考古地磁気を研究してきた研究者と個別に会ったり、文化財科学方面の研究者に働きかけて、関連文献やそのリストを得ることができた。さらに、データを統一的に扱って今後の維持管理をするためにリレーショナルデータベースを使用したオンラインデータベースを構築した。考古地磁気データベースサイトの構築と更新:地磁気研究者、考古学研究者、および教育・一般等を対象として、データベースと解説等を提供するサイトを開設・更新した。最終年度はとくにデータ検索インターフェイスの調整と、日本周辺の任意の位置における地磁気方位と地磁気永年変化曲線を提供するシステムを追加した。上記の成果によって、日本の考古地磁気データを総覧するデータベースの素地ができ、今後の考古地磁気研究と年代推定にかかる基盤が整備されたと考えられる。平成24年度の研究実施計画について具体的に以下のことを行った。(A)データベースの設計:現在手持ちの考古地磁気方位・強度データとその遺跡、場所、時代分布等を基にデータベース設計書を作成した。後から拡張することも考慮し多少の余裕を持たせている。(B)リレーショナルデータベースへの実装:データベースとフロントエンド部を実装委託する業者を選定、打ち合わせの後に実装作業に入った。データベースは概ね出来上がって、手元のデータのうち一部を掲載しているが、次年度にも変更や拡張を加える予定である。(C)過去の考古地磁気学研究に関する文献調査:本学の考古学教室にある各種文献(発掘報告書等)より考古地磁気学に関する文献を探し出す作業手順を確立し、実際に作業を開始した。これまでに約千の文献より十数の考古地磁気学報告(約50サイトのデータ)を見つけており、現在精査中のこれらデータは今後データベースへと追加する予定である。(D)考古地磁気学・完新世の地磁気学に関する研究集会の開催と議論:2013年3月2,3日に本学で小研究集会を開催した。これには十数名が集り各自現状の報告と濃密な議論ができた。日本における考古地磁気コミュニティは人数こそ少ないものの、近年世代交代が進んでいる。このような研究集会を継続的に開催することが発展のために大きく寄与すると考えている。(A)(D)の結果に加え、(B)の作業について打ち合わせ等をするうちに、フロントエンド部(Webアプリケーション部)の作成も同時に進める方が作業効率が良いとわかり、こちらの作業も開始した。現在Webサービス(の一部)を公開するところまでこぎつけている(http://mag.center.ous.ac.jp/)。また、日本における地磁気永年変化の特徴から、考古地磁気年代推定法について一定の制約(得意な年代・不得意な年代)を割り出した。研究の目的に挙げた(1)使い勝手の良い考古地磁気データベースの作成と公開,(2)発掘報告書等に埋もれている考古地磁気学データ・文献の発掘とデータベースへの追加,(3)考古学年代値が明確に付与されていない考古地磁気データについての年代値の調査,(4)アップデートしたデータベースをもとにした地磁気永年変化モデルの改訂,についてそれぞれ以下のような進捗状況である。(1)については上記概要に記したように作業手順の組換えを行った結果、予定よりも進んでいる。当初平成25年度の計画に予定していたフロントエンド部のうち、データの入力インターフェイスについてはほぼ実装が終わり、一般に公開するWebアプリケーション(サービス)部についても基本的な部分について実装が行われている。現在は、暫定公開フェーズに入ってコミュニティへのアナウンスと公表をする段階まで来ている。(2)については、考古学文献資料から考古地磁気学報告を探し出す作業が始まり、一定の成果が出ている。これについては今後も進めたい。また、他の研究者や図書館等からの文献を取り寄せる作業も並行して行っている。(3)については、まだまだこれからである。すでに手元にある文献を調べる限り、考古地磁気学推定年代のみが載っているものが多く、新規に年代値が付くものはなかなかなさそうである。

ここについては数少なくても見つかればよいと考えているので、この作業を続けていくとともに、インターネット等の手段を使い、新規に付与された年代があるかの検索を続けたい。(4)については、データベースのアップデート作業をしている最中であるので、今後手を付けるべき作業である。以上のことから、達成度としては「おおむね順調」と自己評価した。交付申請書「平成25年度の研究実施計画」に基づいて、以下の方向で研究を進める予定である。目的(1)について、引き続きデータベースの構築作業を進める。特に、現在できているリレーショナルデータベースの細目についての修正・増補作業を行う。また、Webアプリケーションについては引き続き改良とサービスの充実をはかっていく作業を続けると同時に、考古学研究者や教育関係者、学生、一般向けにもわかりやすい考古地磁気と地磁気永年変化、考古地磁気年代推定について説明を増やしていく予定である。目的(2)については、平成24年度に開始した調査を引き続き行う。新たに見つかった考古地磁気データについては、吟味してデータベースへ加える作業を行う。さらに(1)で作っているデータベースをアナウンスする段階で、国内の他の考古学・考古地磁気学研究者へデータ提供を行う。協力してくれそうな方には直接出向いて、データベース化の意義についてご説明したい。目的(3)については、(2)同様文献をあたって考古学年代値の調査を行う。また、インターネット上にある他のデータベースや情報から、遺跡年代等についての調査を行う。目的(4)については、データベースの更新が進んだのち、地磁気永年変化モデルのアップデートを行う。また、(1)のサービス等で可視化して表示させたい。また、昨年度同様日本の考古地磁気コミュニティとの連携をはかるため、小研究集会を開催する。今年度の研究集会では特に(2)で挙げた今後協力してくれそうな人や、今後データを増やすべき考古地磁気強度測定をしている研究者を招待したいと考えている。研究費の使用計画について、金額の大きいものから列挙する。一番大きな用途は、目的(1)についてのデータベースの実装作業の委託である(「その他」に約60万円を予定)。次に旅費であるが、目的は2つあり、研究成果やデータベースの発表のためと、研究協力者を訪ねデータや年代について話し合うためである。後者は受け入れてもらえるか多少の流動性がある(約50万円を予定)。次は人件費・謝金である。目的は2つあり、文献調査を考古学関係・地球科学関係の学生に委託するためと、研究集会にかかる費用である(約30万円を予定)。最後は物品であるが、これは昨年度導入したサーバー周辺の機器購入や文献を整理用物品、その他研究遂行上の物品購入に使用する予定である(約8万円を予定)。
女性労働者における勤務中の身体活動と必要体力について

女性労働者において,保母、調理員、学童指導員のうち勤務制限をしていない正規職員321名を対象に労働における体調の良、不良と体力との関係を調べた。調理員と学童指導員においては、体力と体調の違いによる有意差はみられなかったが、保母において20才代では、体調の良い群は、不良体調群に比較して最大酸素摂取量が有意に高かった。30才以上では、体調の良い群は、不良体調群に比較して背筋力、伏臥上体そらしが有意に高かった。3つの職種の中で保母において仕事を苦痛無く遂行していくためには、相対的に高水準の体力を保持し、相対的な身体負担度を低くさせることが必要であると思われる。さらに保母26名を対象に労働中の身体活動量と最大酸素摂取量との関係について調べた。労働中の活動量は、最大酸素摂取量との間に有意な正の相関関係を示した。このことは、最大酸素摂取量の高いものほど労働中の活動量が高い傾向を示し、それは労働強度が最大酸素摂取量の大小によらないことを意味する。すなわち保母においては、体力が高いからといって必ずしも労働強度が低くなるとは限らず最大酸素摂取量の高いものは、それなりに仕事量が増大しやすい職場状況であることが示唆された。一方事務職においては、このような関係はみられなかった。筋骨格系障害により勤務制限を受けている保母15名(制限群)と健康な保母7名(健康群)との筋力を比較した。制限群は、健康群に比べて背筋力、右肩関節外転筋力および同持久力筋力で有意に低かった。しかし握力、体幹部伸展力については、有意な差は認められなかった。肩、腰の筋の負担を筋電図に記録し保母3名について最適仕事姿勢を調べた。特に授乳での肘かけイスの利用、赤ちゃん体操での台の利用は腰の負担を少なくさせたので職場での労働軽減対策に今後さらに検討する必要があると思われた。
生体触媒を用いた手法による分子認識機能を持つ有機化合物のキラルシントンの合成

本研究年度ではキラル化合物の絶対配置を決める新しい手法としての可能性を持つ光学活性色素化クラウンエ-テルの合成と、ホスト化合物の合成に利用できるキラルシントンを経済的に有利な酵素による光学分割でつくることを目的として研究を展開した。色素基を組み込んだキラルクラウンエ-テルではゲスト分子のキラリティ-の違いが錯体の安定性の差になってあらわれ、それを紫外ー可視吸収スペクトルの吸収極大波長のシフトとして容易に検出できる。従って、この型のホスト化合物はゲスト分子の絶対配置を色の違いで知ることができる新しい型の指示薬としての機能を持つ。本研究では、安価に入手可能な加水分解酵素;リパ-ゼを用いて相当するアセタ-トのラセミ体を鏡像体区別加水分解して色素化クラウンエ-テルのキラルシントンである1ーフェニルー1,2ーシクロヘキサンジオ-ルの光学活性体を光学純度85%(再結晶で容易に99%以上に精製できた)で光学分割した。この酵素的光学分割法はキラルシントンを経済的に安価で、かつ容易に多量合成するのに適した方法である。このキラルシントンを使って光学活性色素化クラウンエ-テルを合成しゲストのアミン分子に対してキラリティ-認識機能を持つことを確かめた。引き続き、リパ-ゼを使った有機溶媒中でのエステル交換反応でホスト化合物や有機金属触媒のキラルシントンとして利用できる化合物であるビシクロ【2.2.1】ヘプタンジオ-ルおよびビシクロ【2.2.2】オクタンジオ-ルの光学分割を行った。この方法は水になじみ難い有機化合物を合成する方法としては水溶液中での加水分解反応よりも利用価値の高いものである。以上、本年度の研究計画に沿って一応の成果をあげることができ、これらの成果は「色素化クラウンエ-テルの合成」と「有機溶媒中でのリパ-ゼによるアシル化反応」の二つの論文として平成4年の日本化学会春季年会で口頭発表し、学会誌に投稿すべく準備中である。
アンジオテンシンによるTリンパ球系幹細胞の分化・増殖・活性化と不安定プラーク破綻

本研究は、骨髄におけるレニン・アンジオテンシン系の動脈硬化における働きに注目した先端的研究である。動脈硬化進展過程において骨髄単球系細胞の分化・増殖が亢進するが、骨髄細胞AT1受容体は、骨髄造血系幹細胞(HSCs)および単球系前駆細胞におけるM-CSF受容体の発現調節を介してHSCsから単球系前駆細胞への分化・増殖を促進し、動脈硬化形成の進展に関与していることが明らかとなった。骨髄レニン・アンジオテンシン系を動脈硬化性疾患の治療標的とした新たな治療方法の開発に発展することが期待される。[研究の概要]骨髄細胞はアンジオテンシンII(Ang II)タイプ1(AT1)受容体を発現しているが、動脈硬化病変形成や不安定プラーク破綻の関与については十分解明されていない。本研究の目的は、アポE欠損(apoE^<-/->マウスの骨髄をAT1受容体欠損(Agtr1^<-/->)マウスの骨髄で置換した骨髄移植モデルを用いて、骨髄由来細胞AT1受容体の動脈硬化形成における機序を明らかにすることである。[研究発表および今後の方針]上記の研究成果は、American Heart Association Scientific Sessions 2007において発表された。今後は、骨髄単球系細胞の分化・増殖メカニズムにおける骨髄AT1受容体の働きを明らかにするとともに、リンパ球系前駆細胞の分化・増殖における働きと動脈硬化形成におけるその意義についても解析を進める予定である。【目的】不安定プラークの破綻機序における骨髄AT受容体の働きを明らかにすること。【方法】1)骨髄移植モデルを用いた動物実験:8週齢アポE欠損マウスに全身X線照射後、AT1欠損マウスまたは野生型マウスの骨髄細胞をそれぞれ静脈内投与し、骨髄移植モデルを作製した。移植後4ヶ月後より高脂肪食を2ヶ月間投与した後、組織学的検討および骨髄細胞および末梢血をフローサイトメトリー法を用いて解析した。2)骨髄造血系幹細胞(HSC)の分離培養実験:HSCから単球系前駆細胞への分化・増殖過程における骨髄AT1受容体の作用機序を検討するため、AT1欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞よりFACSAriaを用いてHSCsを分離し、M-CSF刺激培養下における単球系前駆細胞数の変化を経時的に検討した。また、分離したHSCおよび単球系前駆細胞におけるM-CSF受容体(c-Fms)の発現およびそのシグナル伝達経路について解析した。【成績】1)骨髄AT1欠損マウスでは対照マウスに比べて動脈硬化形成が有意に抑制されていた(31%、P<0.05)。ドナーマウスおよび移植4ヶ月後のマウスにおける単球系前駆細胞数および末梢血単球数は両群間で差を認めなかった。一方、高脂肪食開始2ヵ月後のマウスでは、HSC数は両群間で有意差を認めなかったものの、単球系前駆細胞数は骨髄AT1欠損マウスにおいて有意に減少しており(4.7±0,7vs10.2±1.4x10^3cells/tibia、P<0.05)、高脂肪食開始後における単球系前駆細胞への分化・増殖がAT1受容体欠損マウスでは抑制されていることが示唆された。2)M-CSF非投与下におけるHSC培養実験では、単球系前駆細胞数の増加は両群間で同等であった。一方、M-CSF投与下では単球系前駆細胞数の増加がAT1欠損HSC群で有意に抑制されていた(40%、P<0.01)。M-CSFの受容体であるc-Fmsの発現はAT1欠損HSCおよび単球系前駆細胞において著明に低下し(39%、60%、P<0.05)、c-Fmsのシグナル伝達経路であるPKC-δおよびJAK2のリン酸化も著明に抑制されていた(80%、75%、P<0.05)。【結論】骨髄細胞AT1受容体は、HSCおよび単球系前駆細胞におけるM-CSF受容体の発現調節を介してHSCsから単球系前駆細胞への分化・増殖を促進し、動脈硬化形成の進展に関与する。
上皮系細胞で低酸素非応答的に産生されるエリスロポエチンの機能解析

出生後のエリスルポエチン(EPO)産生は、主に、低酸素誘導的にEPOを産生することができる腎EPO産生細胞に依存している。したがって、腎EPO産生細胞が障害されている慢性腎障害患者は、重篤な貧血(低酸素)があっても十分なEPOを産生することができず、EPOの補充療法が必須である。本研究では、私たちが見いだしてきた、「低酸素非応答的にEPOを産生するポテンシャルを有する上皮系細胞」に着目して、慢性腎障害患者(腎EPO産生細胞は障害されているが上皮系細胞は健常である)における「異所性EPO誘導」が腎性貧血の治療法として確立可能かどうかを検討することを目的とする。EPOは、転写翻訳されたあとにジスルフィド結合や糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けて安定で機能的、また、ホルモンとして生体内移動が可能となるため、異所性に産生されるEPOと腎臓で産生されるEPOの機能的異同を検討することは、臨床応用可能な治療薬創出のための大規模スクリーニングを開始する上で、必要不可欠である。本年度は、EPO遺伝子転写開始点付近に強力な人工的プロモーターを導入したmIMCD細胞を樹立した。また、マウス骨髄を用いて赤芽球コロニーアッセイを行ない、同細胞の培養上清中に赤芽球コロニーを支持する因子が存在することを確認した。さらに、ELISA法で上清中のEPO蛋白質の存在を確認した。このことから、通常、EPOを産生しない上皮性細胞から、赤血球分化誘導機能をもつEPOが分泌されることが分かった。上皮系細胞では、EPO遺伝子の発現が上昇することは分かっていたが、その転写産物が機能的なEPOに翻訳することは分かっていなかった。本年度の解析により、上皮系細胞から赤血球分化誘導機能をもつEPOが細胞外に分泌されることを明らかにする事ができた。細胞外に分泌されるEPOが血流にのって造血組織まで到達しうるか、造血組織での赤血球造血を誘導できるかを検討する。そのために、恒常的にEPO遺伝子発現を抑制している転写因子の結合領域に変異を持つマウスを作成する。本マウスでは、恒常的なEPO遺伝子発現抑制が解除されると予想されるので、本マウスの上皮系細胞でのEPO遺伝子発現について、血中EPO濃度、造血組織の解析を行う。2018年度に、CRISPR-Cas9法を用いて遺伝子改変マウスの樹立を試みたが、候補と考えられるファウンダーマウスを1匹歯科樹立することができなかった。再度樹立を試みる必要がでてきたため、樹立に係る費用を次年度に繰り越しした。
口腔扁平苔癬の病態発現における上皮細胞間接着機構の解析

口腔扁平苔癬の上皮細胞間接着機構の変化を明らかにするために、15症例の口腔扁平苔癬を対象とし、対照症例として3例の正常頬粘膜と3例の正常歯肉および角化病変として3例の歯肉白板症について、デスモソームカドヘリンであるDsg1,Dsg2,Dsc1,Dsc3の局在を検討し、以下の結果を得た。1. Dsg1の局在は、正常口腔粘膜および歯肉白板症では基底層から有棘層に陽性反応を認めた。この陽性反応は上皮組織の角化の程度と相関があった。一方、口腔扁平苔癬では基底細胞の融解変性と固有層の細胞浸潤の程度が大きい程、有棘層におけるDsg1の局在の低下が認められ、病変によりDsg1の局在に変化が起きていることが示唆された。2. Dsg2の局在は、正常頬粘膜と歯肉白板症では陰性であり、正常歯肉と口腔扁平苔癬の過角化した組織の基底細胞に陽性反応を認めた。即ち、軽度に角化した上皮の基底細胞にのみDsg2の局在が認められた。3. Dsc1の局在は、非角化上皮では陰性であり、角化亢進した口腔粘膜の有棘層上層で局在が認められた。口腔扁平苔癬でも角化亢進した有棘層上層で、Dsc1の不規則な陽性反応が認められ、角化亢進と相関する局在を示した。4. Dsc3の局在は、正常口腔粘膜、歯肉白板症および口腔扁平苔癬で基底層から有棘層に陽性反応を認め、この陽性反応は上皮組織の角化の程度と相関があった。以上、口腔扁平苔癬の頬粘膜上皮では、基底細胞の融解変性と固有層の細胞浸潤により有棘層のDsg1の局在は低下するが、一方、過角化によりDsg2,Dsc1,Dsc3は増加していることが明らかとなった。口腔扁平苔癬における上皮細胞間接着機構の変化は、デスモソームを構成する接着分子の構造変化と局在する量的変化が起きていることが考えられた。口腔扁平苔癬は、難治性の慢性炎症性疾患であり、長い経過中には悪性化することもあり臨床上きわめて重要な意味をもつにもかかわらず、その病因および発生機序は不明である。そこで我々は、口腔扁平苔癬の病態を明らかにすることを目的として、細胞表層の糖鎖構造について、その糖鎖と特異的に結合するレクチンを用いて組織化学的に検討した。その結果、コムギ胚芽レクチン(WGA)が、光顕所見では細胞間橋に特徴的な染色像を示した。細胞レベルでは、共焦点レーザー顕微鏡所見では細胞間橋のWGA結合性が低下し、電子顕微鏡(TEM)所見ではデスモソームのWGA結合性が低下していることを報告した。そこで今回は、デスモソームの構成糖蛋白であり、かつ細胞接着分子であるデスモソームカドヘリン(デスモグレインとデスモコリン)に着目し、口腔扁平苔癬の病態発現機序を解明することを目的とした。方法は、臨床的に口腔扁平苔癬と診断された患者の頬粘膜生検材料を用い、10%中性ホルマリンにて固定後、パラフィン包埋後、薄切切片を作成し、HE染色およびデスモグレイン(DG2、DG1+2)とデスモコリン(DC1, DC3)を用いた免疫染色を行い光顕観察した。結果は、正常粘膜と比較し口腔扁平苔癬の有棘層下層のデスモソームおいてデスモグレイン(DG1)の結合に変化が認められ、過角化と棘細胞症および細胞浸潤などの組織変化と相関しており、口腔扁平苔癬の病態によりデスモソームにおける構成糖蛋白の質的変化が起きていることが示唆された。今後、免疫電顕の手法を用いてTEMにてデスモソームの構成糖蛋を細胞レベルで検索する予定である。

以上、口腔扁平苔癬の頬粘膜上皮では、基底細胞の融解変性と固有層の細胞浸潤により有棘層のDsg1の局在は低下するが、一方、過角化によりDsg2,Dsc1,Dsc3は増加していることが明らかとなった。口腔扁平苔癬における上皮細胞間接着機構の変化は、デスモソームを構成する接着分子の構造変化と局在する量的変化が起きていることが考えられた。
生育環境に応答したバラ香気成分生合成経路シフトの分子機構の解析と可視化

本研究の目的は季節によって変化するバラ主要香気成分2-フェニルエタノール(以下2PEと略記)の生合成経路の解明である。重水素標識L-フェニルアラニン([2H8] LPhe)をバラ花弁、プロトプラストに投与し、生成する重水素標識2PEの量、標識パターンをGCMSにより詳細に解析することにより、DC経路(LPhe→フェニルアセトアルデヒド:PAld→2PE)に加え、特に高温期(夏期)にはAT経路(LPhe→フェニルピルビン酸PPA→2PE)が活性化すること、その環境要因が温度であることをはじめて解明した。本研究においては、高温ストレスに対するバラの生理的適応機構をバラ花弁における季節・栽培環境変化に応答した主要香気成分2-フェニルエタノール(2PE)の生合成経路シフト、新生合成経路に焦点を絞り以下の各課題について検討した。1)安定同位体標識前駆体・代謝物消長解析に基づく生合成経路シフトと新生合成経路の解明。2)生合成酵素反応・遺伝子発現の解析に基づく、生合成経路のシフトと新生合成経路の詳細の解明。3)質量顕微鏡による生合成中間体の花弁表層細胞における移動・推移の可視化の達成。1)重水素標識L-フェニルアラニン(L-Phe)から生成する2PEにおけるアイソトポローグの比率を基に生合成経路を推定したところ、夏期、冬期それぞれにおいて季節により2PEの主要な生合成経路が異なることを確認できた(論文投稿中)。2)2PEの新たな生合成経路に関わる酵素としてL-フェニルアラニンの芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素:AAATおよび、ピルビン酸脱炭酸酵素:PDCを解明し、それらの遺伝子のクローニングにも成功した。また、RNAi実験により、2PE生合成における季節間で酵素の役割の相違も解明した。各酵素、遺伝子の機能も解明した(J.Plant Physiol.2012掲載;論文投稿中)。3)バラ花弁の凍結切片を作製し、質量顕微鏡分析に供した。その結果、2PE配糖体の検出に成功したものの、細胞サイズに比較してイオン化に必要なマトリックスの粒子径が十分小さくできなかったため、花弁内での局在を解明には至らなかった。上記以外に、阻害剤を用いた新規生合成系の解析に必要な標識体、阻害剤の合成に成功した。季節に伴う2PE生合成経路の変化と気温、大気圧、日照時間、湿度の変化を照合した結果、気温および大気圧が[2H7]-2PEの生成量を変化させる環境要因の一つであることを推定した。そこで本研究では、AT routeの活性が温度上昇によって亢進することで[2H7]-2PEが増加するとの仮説の基、(1) AT routeを亢進させる環境要因および(2)季節変化の分子機構について検証した。(1) AT routeを亢進させる環境要因の検討:バラ花弁に対し4°Cおよび30°Cの温度処理を行い、生成する[2Hn(n=7,8)]-2PEを定量した。その結果、処理時間に伴い[2H7]-2PEの生成量が4°C処理で減少し、30°C処理で増加した。これらの結果から、気温が2PE生合成経路の季節変化をもたらす環境要因の一つであることが強く示唆された。(2)季節変化の分子機構の解析:夏季および高温下ではAT route上の酵素(AAAT、PDC)の発現量が上昇し、冬季および低温下では発現量が低下するとの仮説を立てた。この仮説を検証するため、夏季・冬季に採取したバラおよび4°C・30°Cで温度処理したバラを用いて、AAATおよびPDCのRNA-seq解析を行った。その結果、AAATの発現量は温度変化に関わらず一定であった。また、PDCは夏季および30°C処理では予測に反して発現量が減少していた。以上のデータより、温度の違いによるAT routeの活性の変化は、生合成酵素遺伝子の転写レベルの相違によるものではなく、翻訳後修飾、酵素活性等に起因することが示唆された。1)バラRosa `Yves Piaget'の切り花に温度変化処理後、重水素標識L-フェニルアラニン(L-Phe)から生成する2PEにおけるアイソトポローグの比率を基に生合成経路を推定した。

高温(30°C)処理によりL-Phenylalanineからアミノ基転位反応、脱炭酸反応によって2PEが生成する経路が優位となり、低温(4°C)処理により、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素反応優位となることを実証した(Plant J.審査中、学会発表済、論文投稿準備)。2)プロトプラストでの実験結果に基づいた解析に加え、切り花で、各酵素遺伝子の転写レベルを検討している。高温期には2PE生合成に関わる酵素遺伝子の転写レベルは著しく低下した。酵素遺伝子以外の遺伝子解析が必要である。3)質量顕微鏡解析のネックとなっていたマトリックスの粒子径が大きすぎる点を、マトリックス蒸気の塗布法により克服できる目処が立った(質量顕微鏡操作指導者、浜松医大・瀬藤教授)。マトリックス塗布条件の検討を進めている。課題1)での結果を踏まえ、課題2)の検討の結果、当初の目標である酵素の解明については計画通りに進捗した.課題3)の検討については機器の本質に関わる問題に起因しており、問題点を初年度に明らかにできた。上記課題以外にも阻害剤を用いた新規生合成系の解析に必要な標識体、阻害剤の合成に成功するなど、当初の計画以上に研究が進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。課題1)において、生合成変化をもたらす環境要因が気温であることをほぼ解明した。しかし温度の上昇が制御する分子メカニズムは不明のままである。課題2)では切り花での遺伝子発現、転写を検討したが温度変化との整合性は認められず、標的遺伝子が異なるとの感触を得た。課題3)では分析機器、操作上の課題を克服できる目処が立った。以上の通り、当初の予定通り順調に推移している。課題2)における環境要因の解明については現在利用しているプロトプラストに加え、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の一過的抑制実験をインタクトな植物もしくは切り花での実験系を立ち上げる。課題3)の質量顕微鏡による実験は機器の精度が要因であるため、本検討はしばらく見合わせる。課題1)、課題2)において、温度変化と生合成経路の変化との関係は、生合成酵素遺伝子の発現転写レベルの相違からだけで説明できないとの示唆を得た。今後は、芳香族香気成分生合成経路上流の転写調節因子について検討を進める。
非線形拡散方程式系と関連する楕円型微分方程式系の研究

本研究では,準線形拡散項を伴う数理生態学モデルの正値定常解集合の構造の解析,および相転移現象を記述する半線形拡散方程式の解集合の構造の解析を主として行なった.数理生態学モデルでは拡散項が個体数密度に依存するprey-predatorモデルについて同次Dirichlet境界条件の下で正値定常解集合の構造を解析した.この問題においてu, vはそれぞれprey, predatorの個体数密度であり,正値定常解集合が存在するための十分条件は知られており,問題になるのは正値解の形状や個数である.本研究では例えばφ(u, v)=1, φ(u, v)=1-βuとすると, βが大きいならば,適当な条件の下では3組の正値定常解が存在することを示したのみならず,それぞれの解の安定性に関する結果も得ることができた.相転移現象モデルとして研究した方程式ほ同次Neumann境界条件下でのである。拡散係数εが非常に小さいときには多種多様な定常解の存在が知られている。とりわけ、関数の値が急激に変化する内部遷移層やスパイクを持つ解が最大の関心の的である。我々の研究グループとAi-Chen-Hastingsのグループが独立に研究しており,内部遷移層が現れる位置はa(x)=1/2となる点xの近傍,スパイクが現れる位置はa(x)が極値を取る点xの近傍に限られることを示した.さらに、多重内部遷移層や多重スパイクが現れる条件や解の安定性(Morse指数)と解の形状についでも詳しい結果を得ることができた.本研究では,準線形拡散項を伴う数理生態学モデルの正値定常解集合の構造の解析,および相転移現象を記述する半線形拡散方程式の解集合の構造の解析を主として行なった.数理生態学モデルでは拡散項が個体数密度に依存するprey-predatorモデルについて同次Dirichlet境界条件の下で正値定常解集合の構造を解析した.この問題においてu, vはそれぞれprey, predatorの個体数密度であり,正値定常解集合が存在するための十分条件は知られており,問題になるのは正値解の形状や個数である.本研究では例えばφ(u, v)=1, φ(u, v)=1-βuとすると, βが大きいならば,適当な条件の下では3組の正値定常解が存在することを示したのみならず,それぞれの解の安定性に関する結果も得ることができた.相転移現象モデルとして研究した方程式ほ同次Neumann境界条件下でのである。我々の研究グループとAi-Chen-Hastingsのグループが独立に研究しており,内部遷移層が現れる位置はa(x)=1/2となる点xの近傍,スパイクが現れる位置はa(x)が極値を取る点xの近傍に限られることを示した.さらに、多重内部遷移層や多重スパイクが現れる条件や解の安定性(Morse指数)と解の形状についでも詳しい結果を得ることができた.本年度に扱った研究課題は相転移現象を記述する半線形拡散方程式の解集合の構造、および準線形拡散項を伴う数理生態学モデルの正値定常解の2つに大別される。相転移現象モデルで解析した方程式はゼロNeumann境界条件下でのである。このタイプの反応拡散方程式については拡散係数εが非常に小さいときには多種多様な定常解の存在が知られている。とりわけ、関数の値が急激に変化する内部遷移層や棘のような形状を示すスパイクといったものを持つ解が最大の関心の的である。当研究では方程式に空間非一様性をもたらす関数a(x)に着目し、内部遷移層が現れる位置はa(x)=1をみたすxの近傍であること、スパイクが現れる位置はa(x)が極値を取る点xの近傍であることを示した。さらに、いかなる条件下で多重内部遷移層や多重スパイクが現れるかについても詳しい結果を得ている。数理生態学モデルでは拡散が個体数密度にも依存するprey-predatorモデルを解析した。これはu, vをそれぞれprey, predatorの個体数密度とするモデルであり、いかなる条件下で正値定常解(共存解)が存在するか、その条件を導くことが重要である。われわれは、分岐理論を用いて共存解が存在するための十分条件、および共存解の非存在を保証する十分条件を導くことに成功した。定常解の形状やその個数に関する研究は今後の課題である。本年度集中的に扱った方程式は相転移現象を記述する半線形拡散方程式である。空間1次元に限定し,u_{t}=ε^{2}u_{xx}+u(1-u)(u-a(x)),0<x<1,をゼロNeumann境界条件下で考える。ただし0<a(x)<1である。拡散係数εが非常に小さいとき、関数値が0と1の間で急激に変化する内部遷移層や棘のような形状を示すスパイクを持つ解が興味の的である。このタイプの解について内部遷移層が現れる位置はa(x^*)=1/2をみたすx^*の近傍に限られ、スパイクが現れる位置はa(x_)が極値を取る点x_の近傍に限られることが知られている。当研究では、いかなる条件下で多重内部遷移層や多重スパイクが現れるか、またその形状はいかなるものか、についても詳しい結果を得ている。

同一結果はAi-Chen-Hastingsらによっても最近得られているが、彼らの研究とは異なるアプローチを開発した。また定常解に関しては安定性も非常に重要な問題である。定常解uの安定性は、対応する線形化問題-ε^{2}v"+(3u^{2}-2(a(x)+1)u+a(x))v=μv,0<x<1,に関する負の固有値の個数(=Morse指数)によって調べられる。内部遷移層を伴う解の場合、遷移層が単一でしかもu'(x^*)a'(x^*)<0をみたすときのみが安定であり、その他のケースは不安定、かつMorse指数も解の形状から正確に導くことができる。スパイクを伴う解の不安定性についても満足できる結果を得ている。これらの結果は5th International Conference on Dynamical Systems and Differential Equations, Pomona, CA, June, 2004などの国際会議で発表した。本年度の研究テーマは反応拡散方程式に現れるパターンの研究である.εを微小な拡散係数するとき非線形微分方程式u_{t}=_εu^{2}_{xx}+u(1-u)(u-a(x)),(x,t)∈(0,1)×(0,∞),に対する定常問題を斉次Neumann条件の下で考える.ただし,0<a(x)<1,である.εが十分小さいときには,空間変数に依存して変化する空間的非均質性の状況に応じて,色々なパターンを伴う解が現れる.これまでの研究でa(x)=1/2となるxの近傍に内部遷移層を持つ定常解や,a(x)が極値を取るxの近傍に突起(スパイク)の形状を持つ定常解の存在することが我々の研究やAi-Chen-Hastingsらの研究によって知られている.我々はさらに定常解の形状と安定性(Morse指数)の関係について詳しい解析を続行した.例えばx=x^*の近傍に内部遷移層を持つ解u(x)について,安定な解はu'(x^*)a'(x^*)<0をみたす単一遷移層を伴うものに限られているのに対し,不安定な解はu'(x^*)a'(x^*)>0をみたす内部遷移層を伴っており,このような内部遷移層の個数がMorse指数を与えることの厳密な証明を与えるた.同一の結果はAi-Chen-Hastingsらのグループによっても得られているが,我々とは異なる証明方法である.これらの結果は2005年7月11-16日に曲阜師範大学(中国山東省)で開催された"international Conference on Nonlinear Partial Differential Equations"をはじめとする内外の会議で講演発表した.
積層型微小立体化学システムを用いた環境微量分析法の研究

本研究の目的は、積層型のバイオマイクロリアクターを新たに提案し、酵素免疫測定法を用いた多検体の環境微量分析に適用するためのプロトタイプを実現することにある。本バイオマイクロリアクターは、微細貫通孔を集積した構造を有する流体フィルターを用いて、垂直方向への送液を制御するものである。最終的に放射光を用いた3次元LIGAプロセスにより、垂直流路上の各層を区切る流体フィルタを作製し、これを用いて単一および複数(3個体)の積層型マイクロバイオリアクターのプロトタイプの作製に成功した。さらに流体挙動特性と、内分泌撹乱物質の測定への適用が可能かどうか検証を行った。具体的には、抗体感作粒子を用いた酵素免疫測定法による抗原測定の検討を行った。抗ノニルフェノール抗体感作粒子(70μm径)を調製し、内分泌撹乱物質・ノニルフェノールの測定を試みた。ここで、放射光にて40μm径の円形或いはハニカム型の貫通口を有するフィルタを作成し、このフィルタを各層の間に挿入して、反応固相を上層に堰き止め、ノニルフェノールを酵素免疫法により検出した。従来の競合酵素免疫法による分析下限値は5μg/lであったが、積層型マイクロバイオリアクターでは、0.1μg/lのノニルフェノール(ハプテン)を用いた場合にも、酵素修飾ハプテンと、未修飾ハプテンとの間で、有意な競合が確認でき、測定下限値が、環境省が定めるGC/MS分析レベルの0.1μg/lに匹敵することを明らかにした。作製した流体フィルタ(直径3mm)内には、高アスペクト比の貫通孔が2000個以上集積された微細空間構築されるため、同内壁を反応場として用いることで、特に、拡散律速の反応速度を飛躍的に高めることが期待できる。そこで、流体フィルタの内壁に抗体を結合させ、マウス・免疫グロプリンの検出を行った。その結果、酵素免疫実験系において、免疫グロブリンの検出が可能であることを明らかにした。また、多項目多検体同時測定系を将来的に構築することを考慮し、3サンプル同時測定できる集積化デバイス作成し評価した結果、マウス免疫グロブリンの同時3サンプル測定を行うことが可能であることを明らかにした。最終的に内分泌撹乱物質としてノニルフェノールに注目し、流体フィルター内に抗体を固定化し、サンドイッチELISA法にて0.1μg/lの感度にて測定する事に成功した。また、多項目多検体同時測定系を将来的に構築することを考慮し、3サンプル同時測定できる集積化デバイス作製し評価した結果、マウス免疫グロブリンの同時3サンプル測定を行うことが可能であることを明らかにした。ここにおいても抗体結合型流体フィルターを用いた測定系として、ノニルフェノールの測定を行い、0.1μg/lの感度を得た。

本研究の目的は、積層型のバイオマイクロリアクターを新たに提案し、酵素免疫測定法を用いた多検体の環境微量分析に適用するためのプロトタイプを作製することにある。本年度は、単一の積層型マイクロバイオリアクターの設計と作製を行うことを目的としている。積層型マイクロバイオリアクターでは、垂直方向への送液を制御することが必要となるが、そのための微細貫通孔を集積した流体フィルターを新規に提案し、数値流体力学解析を用いて流体挙動をシミュレーションしながら設計パラメータの最適化を行った。シミュレーション結果から、微細貫通孔のサイズ、及び流体フィルター表面の水との親和性を制御することによって、送液をフィルターの上下両表面で制御出来ること、及びフィルターを流体が通過する際の顕著なミキシング効果のあることが見いだされた。積層型リアクターの具体的な作製には、放射光による1000ミクロンレベルの高アスペクト比の加工が必須となる。このために、高エネルギー(<10KeV)放射光が制御可能な新規ビームラインと露光装置を作製し、積層型リアクターを構成する各パーツ作製のための高アスペクト比の微細加工の確立を図った。さらに、本技術を用いてフィルターを作製した。リアクターの他のパーツは精密機械加工にて作製した。実際の垂直送液実験を行った結果、フィルターを挟む上下リアクター槽に圧力空気を導入することによって上下送液に成功した。さらに流量及び圧力が微小であること、流量を制御することで輸送する流体を精度良く制御できることを見い出した。次いで環境微量分析として内分泌攪乱物質であるノニルフェノールの免疫的分析を取り上げ、その手法について検討を行った。アルキルフェノールに対するモノクローナル抗体をポリスチレンラテックスビーズ樹脂に固定化しておき、次いで、環境試料を固定化樹脂を含む反応容器に注入して抗原-抗体反応を行う酵素免疫測定法が有望であるとの見通しを得た。本研究の目的は、積層型のバイオマイクロリアクターを新たに提案し、酵素免疫測定法を用いた多検体の環境微量分析に適用するためのプロトタイプを実現することにある。本年度は、昨年度に作製した単一の積層型マイクロバイオリアクタープロトタイプの流体挙動特性の評価を行うことを目的としている。本バイオマイクロリアクターは、微細貫通孔を集積した構造を有する流体フィルターを用いて、垂直方向への送液を制御するものである。今年度は、新たに設計を最適化したフィルターを、放射光による高アスペクト比X線リスグラフィーによって作製した。流体の送液は上槽・下槽内の空気を加圧して液体を押し出すことによって移送するが、その際の流速は加圧空気の圧力によって制御する。加圧力に対して送液流量は緩やかな勾配を描き、印加圧力にてサンプル流量を精密に制御可能であることが分かった。また、フィルター材質、微細貫通孔のサイズ、開口率等の構造パラメータを制御することによって、フィルター内部への液体蓄積が可能なこと、及び微細貫通孔のアスペクト比を数十以上に高くすることにより、一回の送液で顕著なミキシング効果のあることが見いだされた。また、本リアクター内での生化学反応速度を測定することにより、液体の混合効果の評価を行った。酵素(カテコール-2,3-ジオキシゲナーゼ)によりカテコールの開環反応を触媒し、2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドを生成する。