hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウストランスポゾンによる生殖系列での遺伝子変異導入と変異マウスの作製

我々はこれまで、Sleeping Beautyという新規のトランスポゾンがマウス生体内で効率良く転位することを示してきた。その応用としていマウスの生殖系列でトランスポゾンの転位により遺伝子変異を誘発し、変異マウスを迅速かつ大量に作製することに成功した。トランスポゾンベクターには、プロモータートラップおよびポリAトラップなどの遺伝子トラップ法に必要なエレメントを導入し、各々のトラップ法のレポーターとしてlacZとGFPを用いた。この結果、GFPの発現を指標にして、容易に変異マウスをスクリーニングでき、lacZ遺伝子活性を指標にして変異遺伝子の生体内での発現部位を容易に特定できるようになった。トランスポゾンの転位の分布についても解析し、転位前の部位の近傍に転位しやすいこと、約2割の転位が他の染色体へ起きることを示した。ホモマウスも作製し、遺伝子発現がほぼ完全にブロックされていることと、実際に表現型が現れることを証明した。また、トランスポゾンとトランスポゼースの両方を有す1匹のマウスから、約1万種類の変異マウスを作製できることを示した。変異マウスの精子または胚を凍結保存し、変異マウスのバンクを構築しつつあり、変異の起きた遺伝子についての情報のデータベース化も進めている。転位効率に影響する因子についても解析し、トランスポゾン領域のDNAのメチル化により転位効率が高まることと、その機能としてトランスポゾン領域のヘテロクロマチン化が関与している可能性を示した。我々は最近、Sleeping Beautyトランスポゾンがマウス個体で効率良く転位することを示した。その応用として、マウスの生殖系列でトランスポゾンの転位により遺伝子変異を誘発し、変異マウスを迅速かつ大量に作製することを試みた。ゲノムの中で遺伝子の存在する領域は1割程度である。そこで、トランスポゾンが転位したマウスの中から、遺伝子内部への転位が起きたものをGFPの発現を指標にして効率良く選択できるように、ポリAトラップ法をマウス個体レベルで試みた。GFP遺伝子の上流にはCAGプロモーターを、下流にはスプライスドナーを配置したトランスポゾンベクターを作製した。遺伝子内部ヘトランスポゾンが挿入した際にはベクターのスプライスドナーと挿入部位の遺伝子のエクソンとの間でスプライシングが起こり、GFPが発現すると期待した。この原理にもとづき、生殖細胞での転位を誘発したマウスの仔マウスを約1600匹スクリーニンしたところ、約7%のマウスにおいてGFPの蛍光を認めた。さらに、3'RACE(rapid amplification of cDNA ends)法により、トランスポゾンが挿入した部位を同定し、実際に遺伝子をヒットした例を得た。また、本年度はマウスの全ゲノム配列が公開されたために、バイオインフォーマティクスを用いて挿入部位の解析をより効率化することができた。さらに多くの変異マウスを得るために、3'RACEによる解析法のhigh-throughput化を進めている。
金属錯体の配位によるフラーレンやカーボンナノチューブなどの電子状態制御

フラーレンやカーボンナノチューブの電子状態は遷移金属錯体への配位により摂動を受け、それまでとは異なる状態になると期待される。本研究ではフラーレンおよびその構成要素と考えられる半球構造のπ共役電子系の遷移金属錯体の構造と結合性を電子状態理論計算から明かにした。(1)Pt(O)錯体に引き続き、Ir(I),Rh(I)などのC60とののバスカ型錯体ついて構造、結合性を明らかにし、その配位安定化エネルギーを求めた。配位安定化エネルギーは密度汎関数理論では過小評価されること、正確な配位安定化エネルギーの評価にはdouble-zeta+polzarization程度以上の基底関数を用い、MP4(SDQ)法以上のpostHartree-Fock計算を行う必要があること、少なくとも、ONIOM法で炭素原子20個以上を含む必要があること、配位は金属からフラーレンへの電荷移動によることなどを明らかにした。(2)フラーレンの一部と見なされるコラニュレン、スマネンのPt(O),CpIr,CpRh錯体の理論的研究を行った。Pt(O)錯体と異なり、CpIr,CpRh錯体は密度汎関数理論が適用できることを明らかにした。また、(3)これまで報告例が無かったCpIr(C60),CpRh(C60)錯体も単離可能であること、IrやRh金属中心がπ共役系の上を移動できることなどを明らかにした。以上より、巨大π共役系と錯形成の可能な金属を予測し、それらの配位位置移動などの動的挙動を解明した。それらの金属錯体の理論的研究はいくつか報告されているいるが、高精度理論計算の報告例は乏しい。本研究ではフラーレンの様々な遷移金属錯体の電子状態計算を行い、配位安定化エネルギーが密度汎関数理論では過小評価されること、正確な配位安定化エネルギーの評価にはdouble-zeta+polzarization程度以上の基底関数を用い、MP4(SDQ)法以上のpostHartree-Fock計算を行う必要があること、少なくとも、ONIOM法で炭素原子20個以上を含む必要があること、配位は金属からフラーレンへの電荷移動によることなどを明らかにした。さらに、フラーレンの一部と見なされるコラニュレン、スマネンの遷移金属錯体の理論的研究を行い、これらの理論計算にも密度汎関数理論は適用できないこと、MP4(SDQ)以上の方法が必要であること、配位結合は金属からこれらの共役炭化水素化合物への電荷移動によることなどを明らかにした。また、配位位置についても検討を行い、安定な配位構造を明らかにした。コラニュレンなどの共役炭化水素の末端炭素の修飾は、新しい機能化につながると期待されるが、これまで、理論的検討例はほとんどない。ここではC-H結合の活性化反応の理論的検討を行い、Pt(0),Rh(I)などによる酸化的付加による活性化は困難であること、むしろ、Pd(II)によるheterolyticな活性化が容易であることを理論的に提言した。
腎糸球体構成細胞での自然免疫を介する炎症病態と新規治療法の開発

糸球体構成細胞群の炎症経路群のToll様受容体3 (TLR3)を起点とする制御機構の詳細を検討し,将来的な慢性腎臓病(CKD)の新規治療法開発につなげる目的で以下の検討を行った。培養ヒト糸球体内皮細胞(GECs)における好中球の遊走・接着に関わるTLR3/IFN-β/CXCL1とTLR3/IFN-β/E-selectinの発現が示された。腎生検組織では好中球活性化の関与が大きい半月体形成性腎炎で内皮細胞領域に有意なCXCL1の発現が確認された。Plasminogen acitivator inhibitor-1 (PAI-1)は糸球体硬化に関与する。GECsにおけるTLR3を起点とするPAI-1の発現と欧米でのSLEの標準治療薬である抗マラリア薬chloroquineのPAI-1発現に及ぼす影響を検討した結果,GECsではTLR3を起点とするPAI-1の発現増強が認められること,抗マラリア薬の前処置でPAI-1発現は有意に抑制されることが明らかとなった。GECsでのTLR3を起点とする炎症経路群の制御はCKDの新規治療法として有用となる可能性があり,chloroquineは候補となり得る。Clarithromycin (CAM)はlipopolysaccharide処置後のMCsにおいて,TLR4を起点として発現するmonocytechemoattractant protein-1とinterleukin-8の発現をp38 MAPKを抑制することで低下させた。CAMのMCs上でのTLR4経路を起点とする炎症性ケモカイン抑制効果が示されたことから,CAMのCKD治療での有用性が示唆された。抗マラリア薬クロロキン(CQ)はMCsにおいて, STAT1のリン酸化を抑制しNF-κB p65の核内移行を阻害することでTLR3/IFN-βを起点とする炎症経路の初期段階を抑制することが示された。このことから,CKD治療でのCQの有用性も示唆された。以上のように,CKDの炎症病態に関わるTLR3/TLR4を起点とする炎症経路群の制御に有用ないくつかの成果を挙げられた。これまでの成果に準じて培養ヒトメサンギウム細胞(MCs)でのToll-like receptor 3 (TLR3)を起点とする炎症経路群を抑制しうるinterferon-stimulated gene (ISG)や候補薬剤の検索は概ね進んでいる。また,自然免疫のシグナリングであるTLR4経路でのClarithromycin (CAM)の抑制効果とTLR3/IFN-β経路に関わるクロロキンの抑制効果を明らかとしたことから, CKDの新規治療としてISGsの制御やCAM,およびクロロキンの使用が有望となる可能性も示唆された。一方,MCs以外の腎糸球体構成細胞である糸球体内皮細胞(ECs)を用いた検討はまだ進んでいないことから,培養ヒトECsを用いた自然免疫を介する炎症経路群とその制御の検討を順次行って行く必要がある。糸球体構成細胞群の炎症経路群の制御機構を解析し,将来的なCKDの新規治療法開発につなげる目的で以下の検討を行った。1.培養ヒトメサンギウム細胞(MCs)におけるCylindromatosis (CYLD:様々な細胞においてNF-κBを抑制的に制御するとされる)の意義を検討した。CYLDをRNA干渉法でknockdownしたMCsを人工合成ウイルスdsRNAのpolyinosinic-polycytidylic acid (poly IC)で刺激し,これまでのわれわれの報告で示されたToll-like receptor 3 (TLR3)/interferon (IFN)-βを介して発現する代表的な炎症経路群(TLR3/IFN-β/RIG-I/CCL5とTLR3/IFN-β/MDA5/CXCL10)への影響を検討した。CYLDのknockdownはRIG-I/CCL5, MDA5/CXCL10の発現をタンパクレベルで増加させた。一方, IFN-βとSTAT1のリン酸化には影響しなかった。腎生検組織では増殖性ループス腎炎でCYLDの染色性が明らかであった。CYLDはTLR3/IFN-βを介する炎症経路群を抑制的に制御している可能性がある。2.培養ヒト糸球体内皮細胞(GECs)におけるTLR3/IFN-βを介する炎症経路群の詳細は不明である。GECsは直接血流と接するため,好中球の遊走・接着に関わるTLR3/IFN-β/CXCL1とTLR3/IFN-β/E-selectinの発現を検討した。結果, GECsにおけるpoly IC刺激で上記炎症経路群が活性化することが示された。GECsでのTLR3/IFN-βを介する炎症経路群の制御はCKDの病態を改善する可能性がある。腎糸球体構成細胞における自然免疫を介した炎症経路群の詳細の解析は,当初の予定通りほぼ順調に進んでいる。1.腎メサンギウム細胞を用いた実験ではこれまで報告に乏しいCylindromatosis (CYLD:様々な細胞においてNF-κBを抑制的に制御するとされる)の意義を検討し,新たな知見を見出した。

ヒトの腎組織においても病態により異なるCYLDの染色性が確認されたことから,CYLDはTLR3/IFN-βを介する炎症経路群を抑制的に制御しており,慢性腎臓病の新たな治療のターゲットとなり得る。2.腎糸球体内皮細胞では,腎メサンギウム細胞と同様にTLR3/IFN-βを介する炎症経路群が腎局所に浸潤する好中球の活性化に関わる可能性を見出した。このことは慢性腎臓病がウイルス感染などを契機に悪化する機序のいったんを示唆しており,今後の治療戦略の構築の基礎となり得る。一方,腎糸球体内皮細胞の培養は腎メサンギウム細胞の増殖と異なる点があり,当初の実験計画が順調に進まない点もあったが,年度末にはおおむね良好な成果が得られた。糸球体構成細胞群の炎症経路群のToll様受容体3 (TLR3)を起点とする制御機構の詳細を検討し,将来的な慢性腎臓病(CKD)の新規治療法開発につなげる目的で以下の検討を行った。培養ヒト糸球体内皮細胞(GECs)における好中球の遊走・接着に関わるTLR3/IFN-β/CXCL1とTLR3/IFN-β/E-selectinの発現が示された。腎生検組織では好中球活性化の関与が大きい半月体形成性腎炎で内皮細胞領域に有意なCXCL1の発現が確認された。Plasminogen acitivator inhibitor-1 (PAI-1)は糸球体硬化に関与する。GECsにおけるTLR3を起点とするPAI-1の発現と欧米でのSLEの標準治療薬である抗マラリア薬chloroquineのPAI-1発現に及ぼす影響を検討した結果,GECsではTLR3を起点とするPAI-1の発現増強が認められること,抗マラリア薬の前処置でPAI-1発現は有意に抑制されることが明らかとなった。GECsでのTLR3を起点とする炎症経路群の制御はCKDの新規治療法として有用となる可能性があり,chloroquineは候補となり得る。今年度は腎糸球体内皮細胞でのTLR3やTLR4を介する炎症経路群の解析を加速させ,研究課題である慢性腎臓病の新規治療法への足掛かりをより強固なものとする予定である。具体的にはこれまで腎メサンギウム細胞で確認されたマクロファージ遊走・活性化に関わるTLR3, TLR4を介する炎症経路群に関して,腎糸球体内皮細胞での検討を行うことで両細胞間の相違の詳細を検討する。また,可能であれば両細胞間をクロストークのいったんを明らかとする予定である。これまでの成果を再検討し,CKDの新規治療法の候補薬剤,候補分子群の検討を優先させたため,新規の細胞購入のための費用などが当初の予定より少額となった。腎糸球体内皮細胞の培養において,これまで行ってきた腎メサンギウム細胞の培養と状況が異なる点が判明し,実験計画の遂行に多少の遅れが生じたためである。今年度は腎糸球体内皮細胞培養の状況を十分に把握しており,予算の使用に基づいた予定の実験計画は順調に進むものと考えている。次年度は,培養ヒト糸球体内皮細胞を用いた実験系を順次進める予定である。培養ヒト糸球体内皮細胞は培養ヒトメサンギウム細胞よりも高額であり,また培養を順調に進めるためには多くの細胞株が必要となることから,前年度からの繰り越し分は有用し使用出来る予定である。
音声による誘導を目的とする大面積斜方放射型音響設備に関する研究

本課題では,公共空間における音声案内や音によるう誘導を目的として,単純な構成で広い範囲にわたり同じ方向から音が到来するように知覚させるために,板を伝搬する屈曲波から音が斜めに放射される現象を利用する方式を考案し,その実用化におけるいくつかの問題を解決すべく研究を実施している。平成29年度には,音声誘導が目的であることを考慮して,アクチュエータによって音響放射パネルを実際に駆動したときに,その放射音において十分な音量が得られること,および,パネルから斜めに音が放射される条件が満たされるかどうか実験により検証した。平成30年度は,前年度の成果を踏まえて国際会議にて成果発表(1)を行うとともに,音の到来方向の実測と放射音の周波数特性および過渡特性に関する評価を行い,国内会議で成果発表(2)を行った。(2)大東祥太朗,若槻尚斗,水谷孝一,「大面積パネルの屈曲波を用いるスピーカの放射特性測定に関する研究」,電子情報通信学会情報・システムソサイエティ特別企画学生ポスターセッション予稿集,ISS-ISP-004, 1 page, (20 Mar, 2019).当初の予定では,平成30年度は次の2項目を重点に研究を実施することを予定していた。(1)低損失音響放射パネルの設計,(2)位相同期波動中継ネットワークの設計。まず,項目(1)に関連して放射音の特性評価を行った。音の伝搬方向などについては概ね想定通りの結果が得られたものの,現在試料として用いているアルミハニカムパネルを用いた実験において,放射音の周波数特性が当初想定していたよりも良好でなく,音声を明瞭に伝えるための要件を十分に満たさない可能性が見出された。その原因と解決方法の究明に研究リソースを割く必要が生じ,項目(2)については未実施となっている。アルミハニカムパネルを音響放射板として用いた時の放射音における周波数特性を改善することが,当初計画では重視していなかった新たな課題として見出された。この問題は,当初計画における平成31年度の実施予定項目「音声明瞭度に関する評価」にも関係する事項であることから,平成31年度における研究項目は次のとおりとする。(1)放射音における周波数特性の改善(=音声明瞭度の改善),(2)長距離伝搬のための波動中継方法の検討,(3)放射音の方向知覚を含む総合評価。なお,これまでの研究成果を社会に還元するとともに今後製品化などの可能性を模索するため,イノベーション・ジャパン2019に出展申込中である。本課題は,公共空間における音声案内や音によるう誘導を目的として,広範囲にわたり音の到来方向を知覚できる音響空間を実現することを目的としている。音声で誘導を行う場合,通常は言語情報により誘導方向を提示することになるが,例えば海外からの旅行者のように言語情報を理解するのに時間がかかる場合など,言語情報のみで方向を指示するよりも誘導したい方向から音が到来したように知覚されるような音の提示方法が望ましいと考えられる。これを実現するため,音の方向知覚に関する「先行音効果」(先に音が聞こえた方向から音が到来するように知覚される)を用いる手法が提案されており,多数のスピーカをわずかな時間差で駆動するシステムなどが提案されている。しかしながら,多数のスピーカをわずかな時間差で駆動するため,どうしても信号処理やハードウェアが複雑化することは避け難い問題である。この問題に対して本課題では,厚み数cmの軽い板を伝搬する機械的な振動が,空気中に斜めに音を放射する性質を持つことに着目して,大面積の音響放射パネルを利用して特定の音の到来方向を広い範囲にわたって知覚させる音響設備を実現させることを検討する。これが実現すれば,パネルを駆動するアクチュエータと大面積の音響放射板により,非常にシンプルな構成で所望の特性を実現できることが期待できる。初年度にあたる本年度は,公共空間で音声による誘導を行うという目的を考慮して,音響放射パネルを効率よく駆動することによって,十分な音量を得ることと,想定した通りにパネルに対して斜めに音が放射されることを確認するための検証実験を行った。本年度は,当初計画では音響放射パネルを効率よく駆動するための手法を検討することを目的としていた。パネルを駆動するアクチュエータには,電磁式アクチュエータ,ピエゾ素子,超磁歪振動子などを順に検討することを計画していた。実際の検討過程において,市販されている電磁式のアクチュエータを購入して使用したところ,予想以上にアルミハニカムパネルとのマッチングが良く,周波数特性,駆動効率などの観点から良好な性能が得られることが早期に判明した。そこで,翌年度以降に計画している低損失音響放射パネルの設計に向け,現状でのパネルの振動特性と音響放射方向を含む放射音場などの測定を行った。

(2)大東祥太朗,若槻尚斗,水谷孝一,「大面積パネルの屈曲波を用いるスピーカの放射特性測定に関する研究」,電子情報通信学会情報・システムソサイエティ特別企画学生ポスターセッション予稿集,ISS-ISP-004, 1 page, (20 Mar, 2019).当初の予定では,平成30年度は次の2項目を重点に研究を実施することを予定していた。(1)低損失音響放射パネルの設計,(2)位相同期波動中継ネットワークの設計。まず,項目(1)に関連して放射音の特性評価を行った。音の伝搬方向などについては概ね想定通りの結果が得られたものの,現在試料として用いているアルミハニカムパネルを用いた実験において,放射音の周波数特性が当初想定していたよりも良好でなく,音声を明瞭に伝えるための要件を十分に満たさない可能性が見出された。その原因と解決方法の究明に研究リソースを割く必要が生じ,項目(2)については未実施となっている。3ヶ年計画の2年目にあたるH30年度は,広範囲にわたる音声誘導を実現させるため,音響放射パネルに振動のエネルギーを長距離伝搬させることを目的とする。そのために二つの事項について検討することを計画している。一つは,低損失な音響放射パネルを実現することである。本課題で用いる方式は,軽い音響放射パネルを伝搬する機械振動からの音響放射を用いているため,本質的に距離が長くなるほどパネルの振動エネルギーが徐々に失われるが,音響放射以外にも振動のエネルギーの損失となるファクターがあれば,それを可能な限り取り除くことで,パネル自体のエネルギー損失を低く抑えることを検討する。より具体的には,実際に音響設備を施工することを考える場合,部材としての音響パネルの大きさには限度があるため,ある程度は現場で複数のパネルを接合する必要性が想定される。これは構造的に繋がっているというだけではなく,音響的に滑らかに接続されなければ一枚板のように斜めに音響放射される特性を維持できない可能性があるため,その接合方法についても検討を行う。二つ目は,より広範囲に誘導音声を放射できるようにするため,複数のパネルにわたり振動を中継する手法について検討を行う。前述の通り音響放射により機械的な振動エネルギーが失われることは本質的に避けられない。複数のパネルを中継して駆動する場合でも,中継箇所においても一定の放射方向を維持するためには,音響的な連続性を維持しながら中継を行う必要があると想定されるため,その手法について検討を行う。前者については実験を中心に,後者については複数パネルの配置やアクチュエータの配置と駆動方法など,まず理論の構築とシミュレーションによる検証を行い,最終的に,数十メートルオーダで連続的に斜めに音を放射できるようにすることを目標とする。アルミハニカムパネルを音響放射板として用いた時の放射音における周波数特性を改善することが,当初計画では重視していなかった新たな課題として見出された。この問題は,当初計画における平成31年度の実施予定項目「音声明瞭度に関する評価」にも関係する事項であることから,平成31年度における研究項目は次のとおりとする。(1)放射音における周波数特性の改善(=音声明瞭度の改善),
Kinetic Energyの小児歯科領域への応用

噴射切削によるエナメル質窩洞の窩縁部形態は、比較的滑らかな丸みを帯びた形態が乳歯および永久歯標本ともに観察された。しかし、乳歯エナメル質の展開角は平均60.5°(1S.D.±7.2)これに対して永久歯エナメル質の展開角は36.3°(1S.D.±11.8)と小さい値を示し、エナメル質の強度と厚さの違いによるものと考えられた。また、乳歯形成窩洞の象牙質の開放角は平均30.7°(1S.D.±10.7)で、永久歯形成窩洞の象牙質開放角は平均18.9°(1S.D.±6.3)より大きい値を示した。窩洞辺縁の窩縁斜面の展開角は、乳歯・永久歯ともほぼ等しい値を示した。噴射切削によって形成された象牙質の窩洞壁面の表面は、比較的滑らかな形状を呈した。窩洞形態は、ほとんどが、窩洞底部に点角および線角の存在しないV字型のものとU字型であった。今回の実験では、試料の中には、噴射切削部の一部に象牙質の存在しない遊離エナメルの構造を有するものも認められた。これはエナメル質と象牙質の硬度の違いが、噴射されたアルミナ粒子の窩洞内における噴射渦の流体と、アルミナ粒子の窩洞外への流出方向などに、起因しているものと考えられた。切削開口部の径は27μm50μmとも試料に対する噴射角度が90°の試料に比較して、60°の方が有意に大きい値を示した。脱灰象牙質のSEM像では、脱灰時間の進行とともに切削効率の低下が確認され、形成窩洞はクレーター状を呈し、窩洞辺縁形態も同心円上のものから不均一な形態のものに、変化することが認められた。また24時間脱灰された脱灰象牙質においては、窩洞周囲に散在するアルミナ粉末も確認できた。脱灰時間の進行とともに窩洞壁面に粗造な形態が認められ噴射切削粒子による脱灰象牙質の除去が困難な傾向にあることが確認できた。また、噴射切削の象牙質にみることのできる微細な波状隆起は脱灰象牙質試料にもみられた。小児歯科臨床で、一般に使用されている回転切削器具は騒音、振動および発熱などの問題があり、過大な恐怖心を与えることなど精神発達途上の小児への対応には考慮する必要がある.また、実際に回転切削が歯の硬組織や歯髄におよぼす傷害なども多くの報告がなされており、様々な問題点を解決するために、回転切削以外の切削法として、以前より噴射切削装置の研究がなされてきた.噴射切削装置による窩洞形成時、噴射時間、噴射距離、および噴射角度等それぞれの任意の条件下で、エナメル質、象牙質に、噴射粒子の粒径の選択、噴射圧の変化がどのように影響し、切削形成された窩洞の辺縁部および窩底部における形態学的特徴はどのように変化するか、基礎的な検討を行った.結果:1.同じ粒子径の噴射粒子で同じ噴射圧を使用した場合は1条件(160psi,50μm,5秒間切削)を除いては、噴射時間が長いものほど深く切削されていた.

2.各の条件下で形成された窩洞は、U宇型とV字型の2種類に分類される.3.噴射切削によって窩洞辺縁には、特徴的なアルミナベベルの形成が認められた.4.成形窩洞の深度と窩洞の開放角には相乗的な関係が示唆された.噴射切削によるエナメル質窩洞の窩縁部形態は、比較的滑らかな丸みを帯びた形態が乳歯および永久歯標本ともに観察された。しかし、乳歯エナメル質の展開角は平均60.5°(1S.D.±7.2)これに対して永久歯エナメル質の展開角は36.3°(1S.D.±11.8)と小さい値を示し、エナメル質の強度と厚さの違いによるものと考えられた。また、乳歯形成窩洞の象牙質の開放角は平均30.7°(1S.D.±10.7)で、永久歯形成窩洞の象牙質開放角は平均18.9°(1S.D.±6.3)より大きい値を示した。窩洞辺縁の窩縁斜面の展開角は、乳歯・永久歯ともほぼ等しい値を示した。噴射切削によって形成された象牙質の窩洞壁面の表面は、比較的滑らかな形状を呈した。窩洞形態は、ほとんどが、窩洞底部に点角および線角の存在しないV字型のものとU字型であった。今回の実験では、試料の中には、噴射切削部の一部に象牙質の存在しない遊離エナメルの構造を有するものも認められた。これはエナメル質と象牙質の硬度の違いが、噴射されたアルミナ粒子の窩洞内における噴射渦の流体と、アルミナ粒子の窩洞外への流出方向などに、起因しているものと考えられた。切削開口部の径は27μm50μmとも試料に対する噴射角度が90°の試料に比較して、60°の方が有意に大きい値を示した。脱灰象牙質のSEM像では、脱灰時間の進行とともに切削効率の低下が確認され、形成窩洞はクレーター状を呈し、窩洞辺縁形態も同心円上のものから不均一な形態のものに、変化することが認められた。また24時間脱灰された脱灰象牙質においては、窩洞周囲に散在するアルミナ粉末も確認できた。脱灰時間の進行とともに窩洞壁面に粗造な形態が認められ噴射切削粒子による脱灰象牙質の除去が困難な傾向にあることが確認できた。また、噴射切削の象牙質にみることのできる微細な波状隆起は脱灰象牙質試料にもみられた。
器官培養した蝸牛有毛細胞の浸透圧刺激に対する細胞内カルシウム濃度の変化

蝸牛の器官培養はこれまで困難とされており、有毛細胞の形態を保ったまま長期に培養することは容易ではないとされてきた。前年度からの研究で蝸牛の形態をほぼ保ったまま数週間にわたり、培養するテクニックを開発した。具体的には蝸牛を各回転ごとに鋭的に切断し血管条をほぼ残したまま培養するものでこれにより比較的長期にわたる培養でも立体的に構造が変化しにくい。またその後の観察も容易である。さらに細胞栄養因子、特にGDNFの投与によりより安定した培養が可能となることが確認された。有毛細胞は正常の浸透圧の外液から低浸透圧液に置換されると数十秒から数分のオーダーで細胞内カルシウム濃度が上昇する。このときカルシウム濃度の上昇が認められるのは正常の80%以下に浸透圧を低下させた場合であった。浸透圧を低下されるほどカルシウム濃度の上昇は顕著であるが、40%以下に低下させると数分以内に細胞死がおこることが確かめられた。また細胞外カルシウム濃度を下げるとカルシウム濃度の上昇が抑制されることからこの反応は細胞外カルシウムの流入により引き起こされていることが明らかとなった。細胞内カルシウムを枯渇させた状態ではカルシウム濃度上昇が抑制されることから細胞内カルシウムストアからの放出によりさらにカルシウム濃度が上昇している可能性が示唆された。これらの知見は内リンパ水腫が原因と考えられるメニエール病の病態を明らかにする知見と考えられる。現在までに得られた成果を中心としてさらに若干の追加実験を行い投稿予定である。本年度の研究で蝸牛の形態をほぼ保ったまま数週間にわたり、培養するテクニックを開発した。細胞栄養因子の効果についてはさらに検討していく予定である。メニエール病などにおいては長期間低浸透圧刺激が持続することが病態の基本的な変化であると考えられているが、このようなカルシウム濃度の変化を観察できた細胞はその後短時間(数時間から数日)で細胞死に至り、現時点では長期の培養は実現できていない。今後の課題として、浸透圧の低下と細胞死の率の関係を明らかにする必要がある。またカルシウム濃度の測定自体が細胞にダメージを与えている可能性もあり、カルシウム測光と細胞死の関連も検討する予定である。
ランゲルハンス細胞の細胞学的・免疫学的研究

ランゲルハンス細胞(以下細胞と略す)の特性については最近かなり明確にされてきている。我々も従来より種々の検索を重ね、特にTリンパ球との関連性について報告してきた。この2年間では主に次2点について検討した。1.ラ細胞と扁平上皮との関連性:ラ細胞は通常皮膚表皮内に存在するものであるが、食道、子宮頚部等の粘膜扁平上皮内にも存在する。そこで病的組織の扁平上皮内におけるラ細胞について検討を加えた。卵巣のdermoid cyst、皮膚真皮・皮下組織のepidermalcyst扁平上皮内に存在し、形態学的、免疫学的特性は全く皮膚ラ細胞と同様であった。肺・食道・子宮頚部扁平上皮癌及び膀胱・胆嚢の扁平上皮癌についても検索した所、角化傾向を示す高分化型扁平上皮癌ほどラ細胞の出現頻度が高かった。しかし分布状態は正常表皮内に比べ癌胞巣内ではばらつきが強かった。肺腺癌,膀胱移行上皮癌,胆嚢腺癌の癌胞巣内には認められなかった。ラ細胞が扁平上皮と密接な関連性を有することを示唆する所見であるが、今後扁平上皮細胞とのco-culture等により検索を進めて行く予定である。2.ヌードマウスにおけるラ細胞:Tリンパ球と緊密な関連性を有していることから、Tリンパ球の存在しないヌードマウスにおけるラ細胞を検討した。表皮内においては分布、形態等に全く差異はみられなかった。しかし真皮にはかなり頻繁に認められ、リンパ節においてはT領域に相当する部位はリンパ球が少なく、大部分がラ細胞ないしBirbeck顆粒は有していないが同様の形態像,免疫学的特性を有しているinterdigitating reticulum cellで占められていた。これらの部位は通常はTリンパ球の存在部位であり、ラ細胞がTリンパ球の役割の一端を担っている可能性と、真皮内リンパ管内,リンパ節辺縁洞にも存在していることから、Tリンパ球を探し求めて生格各所を巡回している可能性を考えた。又ラ細胞の起源についての論証を得るべく検索中である。
新規分子配向技術を用いた液晶性有機半導体太陽電池の高性能化に関する研究

薄膜中における液晶性有機半導体の配向制御を行い、デバイス中におけるキャリア輸送特性向上を目的とした。液晶性有機半導体として高いキャリア輸送特性が報告されているフタロシアニン誘導体を用いた。(i)プラナー配向薄膜および(ii)ホメオトロピック配向薄膜の二種類を作製し、それぞれの配向薄膜を用いてトランジスタおよび太陽電池応用を行った。(i)プラナー配向薄膜バーコート法の低速で一軸の製膜が可能な性質を用いて、1 mm四方の幅広い範囲において一様なプラナー配向薄膜を作製した。配向薄膜中における分子配向方向および結晶構造に関して、単結晶X線構造解析および微小角入射広角X線散乱法により明らかにした。また、配向薄膜を用いてトランジスタ素子を作製した。配向処理によりキャリア移動度が向上すること、フタロシアニン誘導体のカラム軸方向への高いキャリア移動度を明らかにした。(ii)ホメオトロピック配向薄膜気液界面のない状態で液晶相にすることにより、ホメオトロピック配向が誘起されるというフタロシアニン誘導体の性質を利用し、ホメオトロピック配向薄膜を作製した。薄膜中における分子配向方向に関して、温度を制御した状態における微小角入射広角X線散乱法により明らかにし、液晶相においてホメオトロピック配向が誘起されていることを明らかにした。また、配向薄膜を用いて太陽電池素子を作製した。配向処理により移動度が約40倍向上し、太陽電池特性が改善することを明らかにし、本配向処理手法の有用性を明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。液晶性有機半導体は自己組織的に分子が配向し、異方性のある電気的特性を示す。そのため、液晶性有機半導体の分子配向方向の制御はデバイス応用を考えた上で必要不可欠な技術である。本研究課題は新規分子配向制御技術を確立し、有機エレクトロデバイスの高性能化・実用化の基盤となる研究を行うことを目的としている。液晶性有機半導体として一軸性の高いキャリア移動度を示すことが報告されている、フタロシアニン誘導体を用いた。新規分子配向制御技術の確立のためには、薄膜内における分子配向方向を評価する必要がある。そのためには、薄膜内におけるフタロシアニン誘導体の分子パッキング構造および分子配向方向を明らかにする手法を確立することが重要な課題となる。1年目は研究実施計画通り、薄膜内における分子パッキング構造の解明についX線散乱法および単結晶試料を用いた単結晶X線構造て検討した。薄膜内における分子パッキング構造に関して、薄膜試料を用いた微小角入射広角解析により解析した。薄膜試料および単結晶試料の両方を用いることにより、詳細な薄膜内の分子パッキング構造を明らかにする手法を確立した。上記の結果は2年目以降の分子配向制御技術の確立において重要な知見になると考えられる。また、単結晶構造を用いた詳細な薄膜内の分子パッキング構造の決定により、密度汎関数理論等を用いた電気的特性のシミュレーションを行うことが可能となり、実験と理論の比較も可能となると考えられる。本研究課題は、液晶性有機半導体太陽電池応用へ向けた新規配向技術の開発を目的としている。1年目は液晶性有機半導体であるフタロシアニン誘導体の構造および配向方向の解析を行い、薄膜の結晶構造の解析手法を確立することを計画した。その課題を解決するため(a)薄膜中におけるフタロシアニン誘導体の分子パッキング構造の解明、(b)フタロシアニン誘導体の単結晶の作製および薄膜中における分子パッキング構造との比較、(c)フタロシアニン誘導体の結晶多形発生のメカニズム解明の三点に関して検討した。(a)に関しては、SPring-8内のBL46XUにおいて微小角入射広角X線散乱法によるX線回折測定を行うことにより、薄膜中におけるフタロシアニン誘導体の詳細な分子パッキング構造を明らかにした(M. Ohmori et al., J. Nanosci. Nanotechnol., 16, 3312-3317, (2016))。(b)および(c)に関しては、フタロシアニン誘導体の単結晶を作製し、単結晶X線構造解析を行った。得られた結果と(a)の結果を比較することにより、薄膜中の分子パッキング構造の詳細な構造を明らかにした(M. Ohmori et al.,accepted to J. Cryst. Growth (2016))。また、フタロシアニン誘導体は結晶多形が存在することを明らかにし、その発生メカニズムについても解明した。以上の(a)(c)の手法により、薄膜内におけるフタロシアニン誘導体の詳細な分子パッキング構造を明らかにした。2年目以降は1年目で確立した薄膜内の分子パッキング構造の解析手法を用いて、フタロシアニン誘導体の配向制御を行う。本研究では、薄膜中における液晶性有機半導体の配向制御することにより、有機薄膜太陽電池および有機薄膜トランジスタの特性向上を目的とした。平成28年度は(1)フタロシアニン誘導体の結晶多形発生のメカニズム解明、(2)バーコート法を用いて作製した薄膜中におけるフタロシアニン誘導体の配向方向及び結晶構造解析、(3)フタロシアニン誘導体配向薄膜を用いた電界効果トランジスタの作製の三点について検討を行った。また、液晶性有機半導体としてフタロシアニン誘導体を用いた。

(1)示差走査熱量測定および高温X線回折測定によりフタロシアニン誘導体の結晶相転移を観測し、その結果からフタロシアニン誘導体の結晶多形発生のメカニズムについて検討した。結晶多形発生のメカニズムは周辺側鎖の乱雑度の違いによるものであることを明らかにした。(2)バーコート法を用いてフタロシアニン誘導体の一軸配向薄膜を作製した。作製した配向薄膜に対してSPring-8内のBL46XUにおいて微小角入射広角X線散乱法によるX線回折測定を行うことにより、その配向方向及び結晶構造に関して明らかにした。また、単結晶構造からX線回折像をシミュレーションすることに成功した。(3)配向薄膜を用いて、電界効果トランジスタを作製したものである。素子構造を最適化することにより、ボトムゲートートップコンタクト型のトランジスタを作製した。また、電気的異方性を評価することにより、分子スタック方向へのキャリア移動度がカラム間方向に対して高いことを示した。平成27年度の研究計画に記載した内容についてほぼ予定通りに遂行した。大面積の製膜が可能であるバーコート法を用いて、液晶性フタロシアニンのプラナー配向薄膜の作製に成功した。作製した薄膜をSPring-8における放射光を用いて測定し、三次元的に結晶構造を解明した。上記のSPring-8における測定は大学院生提案型課題により行ない、研究成果はApplied PhysicsLetters誌に掲載されている。また、基板の表面修飾剤・電極構造の検討を行うことにより、プラナー配向薄膜を用いた、ボトムゲートートップコンタクト型のトランジスタの作製に成功している。また、密度汎関数理論を用いた電荷輸送特性の計算と同様に分子スタック方向に高いキャリア移動度を示すことを明らかとした。薄膜中における液晶性有機半導体の配向制御を行い、デバイス中におけるキャリア輸送特性向上を目的とした。液晶性有機半導体として高いキャリア輸送特性が報告されているフタロシアニン誘導体を用いた。(i)プラナー配向薄膜および(ii)ホメオトロピック配向薄膜の二種類を作製し、それぞれの配向薄膜を用いてトランジスタおよび太陽電池応用を行った。(i)プラナー配向薄膜バーコート法の低速で一軸の製膜が可能な性質を用いて、1 mm四方の幅広い範囲において一様なプラナー配向薄膜を作製した。配向薄膜中における分子配向方向および結晶構造に関して、単結晶X線構造解析および微小角入射広角X線散乱法により明らかにした。また、配向薄膜を用いてトランジスタ素子を作製した。配向処理によりキャリア移動度が向上すること、フタロシアニン誘導体のカラム軸方向への高いキャリア移動度を明らかにした。(ii)ホメオトロピック配向薄膜気液界面のない状態で液晶相にすることにより、ホメオトロピック配向が誘起されるというフタロシアニン誘導体の性質を利用し、ホメオトロピック配向薄膜を作製した。薄膜中における分子配向方向に関して、温度を制御した状態における微小角入射広角X線散乱法により明らかにし、液晶相においてホメオトロピック配向が誘起されていることを明らかにした。また、配向薄膜を用いて太陽電池素子を作製した。配向処理により移動度が約40倍向上し、太陽電池特性が改善することを明らかにし、本配向処理手法の有用性を明らかにした。
近世期紀伊半島海民の多様かつ広域的生業形態とその近代的変容

江戸時代から明治・大正期に掛けての、紀伊半島を拠点とする海民、特に女性の潜水漁業者=海女たちが、居住する村を離れて盛んに出稼ぎに赴く活動の実態と出稼ぎ先への影響、その歴史的な変容過程を分析した。また、関連史料を集め、データベース化した。江戸時代には、漁業資源が枯渇した時や初心者の修業目的で、熊野灘や房総半島へ赴く出稼ぎが一般的であったが、明治期以降には海藻需要の増大と中国への海産物輸出の活発化により、出稼ぎ形態は一気に広域化し、規模も拡大する。だがそれは、居村の生産構造を単純化させることにもつながったのである。4.研究成果海の博物館(鳥羽市浦村町)、鳥羽市立図書館、志摩市越賀町郷蔵が収蔵する志摩漁村の古文書類を調査・分析し、江戸時代の海女の技能をテーマに論文にまとめた。絵画資料を合わせ読み解くことにより、船上の男と海女との分業関係や、体温を維持するための装置について、知見を得た。またノミなど魚貝を獲るための道具や装束という観点に止まらず、志摩漁村において海女漁を成り立たせている知恵や工夫という点から、年間暦や出稼ぎのあり方、獲物の販売についても注目した。季節に応じて獲物を変え、時には農業や林業に従事し、磯が荒れた際には近隣に出稼ぎに行く形態が、江戸時代における志摩海女の生業の特質である。加えて、海女自身によるアワビの熨斗鮑への加工や、テングサなど海草類を晒し草に仕立てて販売している様相を見出した点が、従来明らかになっていなかった成果である。生の獲物を加工して保管することにより、京都・大坂など外部の商人に対して有利な立場で販売することが可能になったのであり、いわばローカルな経済において「六次産業化」が行われていたことが判明した。これらの成果の一部は、日本水産学会秋期大会および海女文化シンポジウムにおいて報告した。水産学会誌に報告の概要を発表したほか、三重県教育委員会が刊行した『海女習俗詳細調査報告書』に、「古文書史料にみる海女漁の「技能」」と題して寄稿した。また、熊本市や愛媛県、和歌山県などの図書館、博物館において近代の行政史料や新聞類を調査した。特に、明治以降に志摩海女が全国的に出稼ぎに行くあり方、またそれらと関連しつつ、各地から海女が朝鮮半島へ出漁する動きに関する資料を見出し、次年度以降の分析に備えた。鳥羽・志摩地方における海女漁村文書調査として、鳥羽市の海の博物館が収蔵する浦村文書、小浜村文書、志摩市越賀区の区有文書の調査を行い、漁場争論や宗門人別改帳等の人別記録を中心に大量の撮影データを得た。鳥羽・志摩以外に海女漁業が盛んだった三陸海岸、愛媛県、福井県の図書館、博物館等で関連資料を調査した。東京海洋大学附属図書館において、近代以降の水産事業に関する基礎的な文献である『大日本水産会報告』から関連記事を検索する作業を継続的に行い、明治期については400件ほどをデータ化した。これらの作業によって、近代の朝鮮海出漁に関する史料はかなり集積し、次年度の分析作業に備えることができた。鳥羽・志摩地方の漁村文書調査の成果を用いて、江戸時代中の志摩海女が主に熊野灘へ出稼ぎに赴いた要因や体制などの実態を解明した論考「近世志摩海女の出稼ぎについて」(『三重大史学』15号、2015年3月)を発表した。これまで活動の広域性のみに目が奪われていた研究状況に対して、江戸時代から磯売り形態での出稼ぎがなされていたこと、明治期以降との違い、領主との関係などを整理した点に意義があったと考える。呼び掛け人の一人として開催している海女研究会において、4月21日に「古文書に見る海女漁の『技能』」を報告し、磯眼鏡や滑車が普及する以前の海女漁の技法を史料に基づいて論証し、また12月15日には「海女の後継者」について論点を整理する報告を行った。外国人研究者として韓国から招いた海女文化の研究者2名と学術交流をした。研究成果の社会発信として、市民向けの講演を4回担当(大阪市、志摩市、鳥羽市2回)したほか、10月25日に志摩市で開催された海女サミットでは、主催者側の一員としてシンポジウムのコーディネーターを務めた。また、志摩市の歴史民俗資料館が行った海女文化に関する展示に協力した。昨年度に引き続き、明治期の朝鮮出漁に関する史料調査を、兵庫県立図書館、神戸市中央図書館、社団法人淡路水交会、大分県立図書館、同文書館、同公文書館などで行った。淡路水交会においては、志摩海女を雇用したことが三重県側の史料で確認できる淡盛商会及びその中心人物である森野正気に関する史料を見出したが、直接の関わりを示すものではなかった。東京海洋大学附属図書館にて大日本水産会報などの雑誌類を検索し、明治期の水産界の全体像を把握することに努めた。また志摩市域で最大規模の史料である越賀区有文書を検討し、海女の朝鮮出漁が地元の村社会に与えた影響について分析した。これらの調査に基づく研究成果を2015年12月14日の海女研究会で報告し、そこでの議論を受けて「近代志摩海女の朝鮮出漁とその影響」(『三重大史学』16、2016年3月)として公表した。

朝鮮出漁の時期変化と濫獲を招いた漁撈と雇用の形態、済州島海女との関係、そして志摩の村落の経済構造が農業や林業など種々の兼業を伴ったあり方から「漁業専業者」が増加し田畑が衰退していく起点になったことを論じた。7月10日に日韓若者の海女文化交流事業にて「日本の海女の歴史」、8月5日に立命館高等学校SSHで「海女の歴史と文化を科学する」の講義を担当し、11月6日の第6回海女サミットでパネルディスカッション「日韓海女の交流を進めるために」のコーディネーターを務めるなど、海女文化の発信に努めた。また、海の博物館が刊行した写真集『志摩半島の海女』に「志摩半島の海女の歴史」を寄稿した。直接関係する内容ではないが、志摩地域の調査等の成果と課題や、部落史のなかでの志摩漁村の課題も論じる機会を得た。志摩地方の古文書類の検討を進め、尾鷲市中央公民館郷土室に残る尾鷲組大庄屋文書の漁業史料と合わせて、来年度に予定している近世海女関係の史料集の準備を行った。近代海女出漁については、この3年間の調査と研究の成果を集約した論考を公表することができた。それに並行して、研究成果の社会還元や、海女文化を通した日韓文化交流事業などは、当初の計画以上に遂行できている。一方で、江戸時代中の海女漁に関する史料の検索については、該当史料の多さもあって、やや難航している。これまでの3か年で調査対象にできていなかった石川県(能登)、千葉県(房総半島)、それに沖縄県について、県立図書館・県立博物館や文書館、現地漁村の関係機関を対象に調査を行い、全国的な紀伊半島海民の動向や、海女など潜水漁業の分布についての分析・検討を行った。同時に、三重県内の志摩地方を中心に漁村文書の詳細調査を重ね、三重県史編さん班、三重県総合博物館、海の博物館、志摩市歴史民俗資料館などの協力を得て情報を蓄積した。これらの調査に基づく研究成果として、江戸時代に広域的・多様な活動を展開した鳥羽志摩の海女に関する史料を「近世志摩海女に関する基礎史料集」として集約・編さんし、『三重大史学』17(2017年3月)に発表した。正確な翻刻文と共に解説文、関連論文なども紹介したもので、現段階の志摩海女に関する重要な史料を網羅できたと自負している。また、昨年度に発表した「近代志摩海女の朝鮮出漁とその影響」(『三重大史学』16)の内容を深めて、2017年3月に志摩市磯部生涯学習センターで開催されたシンポジウム(「先志摩の魅力を一緒にしゃべろうや人と自然、今と昔」)において「先志摩海女が迎えた近代朝鮮出漁と漁業専業化」と題して報告し、質疑応答及び関係者と議論を行った。朝鮮出漁を契機として、海女を中心とする漁民らの「漁業専業化」と表現されたような生業形態の変化が生じ、一時的に収入が増加したものの、漁業以外の生業が衰退し、また商業資本家に雇用され漁獲のみを行う関係に陥ったことを明らかにした。近世段階では出稼ぎ海女漁を含め小規模の多様な生業の組み合わせによって成り立っていた志摩の海女漁が、近代以降に生産規模は拡大させつつも、単純な生産構造に変化したことを論じた。このほか、女性史の観点からの課題や、文学作品等に登場する海女の問題などを含め、論文集及び一般書をまとめる準備を進めている。江戸時代から明治・大正期に掛けての、紀伊半島を拠点とする海民、特に女性の潜水漁業者=海女たちが、居住する村を離れて盛んに出稼ぎに赴く活動の実態と出稼ぎ先への影響、その歴史的な変容過程を分析した。また、関連史料を集め、データベース化した。江戸時代には、漁業資源が枯渇した時や初心者の修業目的で、熊野灘や房総半島へ赴く出稼ぎが一般的であったが、明治期以降には海藻需要の増大と中国への海産物輸出の活発化により、出稼ぎ形態は一気に広域化し、規模も拡大する。だがそれは、居村の生産構造を単純化させることにもつながったのである。
脂肪組織由来幹細胞の抗炎症作用による創傷治癒促進に関する基礎的研究

本研究ではASCの抗炎症作用機序および創傷治癒過程における治癒機転促進の機序を明らかにすることを目的とし、ASCのハイドロゲルを用いたデリバリーシステムを検討した。さらに、皮膚欠損モデルを用いて、従来の創傷被覆材や薬剤とASC含有皮膚創傷モデルマウスにおけるASCのデリバリーの違いによる創傷治癒効果の比較検証、次に皮膚創傷モデルマウスにおけるASCのデリバリーの違いによる創傷治癒効果の比較検証した。ASCの創傷治癒過程における作用機序を基に、ASCの至適投与数、投与のタイミングを確立した。実際の臨床の場において、特に口腔内に広範に症状を呈す難治性口とが困難であるため、ASCを創部に一定時間保持でき、創傷治癒に促進的に働く因子を徐放させることで効率的に口内炎に対して、ASCを創部に一定時間保持でき、創傷治癒に促進的に働く因子を徐放させることで効率的に治癒させる必要がある。そこで、これまでいくつかの報告がなされ、実績のあるヒアルロン酸1.0x1068mL、アテロコラーゲン、PuraMatrixといったデリバリー剤に注目し、これらにASCを混和させることによって、創部への作用・効果を比較検証するとともに、最適なデリバリー剤を決定した。1.0x1068同定した因子を各デリバリー剤と混和したのち、創部に塗布する。その後、創部の形態、創幅の計測、上皮化をおこない、ASCの局在、炎症性細胞および線維芽細胞の浸潤を組織学的、免疫組織学的に評価した。また、組織よりmRNAおよび蛋白質を採取し、炎症反応の指標であるIL1b, IL6, TNF a, MMP2また肉芽形成・収縮の指標であるCOL1a1, TGFb, SMA(ACTA2)をリアルタイムRT-PCR、western blottingによって生化学的に評価を行った。皮膚創傷モデルマウスにおけるASCの抗炎症作用の検証と創傷治癒メカニズムの探求GFP標識C57BL/6JマウスからASCを採取し、ASC懸濁液(1.0x1068 cells/mL)をマウス皮膚欠損に対して塗布し、フィルムドレッシングを貼付する。ASC塗布後4, 7, 10, 14日後、創閉鎖時、創閉鎖後1週間、1か月でのASCの生着状態および創傷治癒過程におけるASCの作用を二光子顕微鏡によって、ASCをGFPで、コラーゲン線維を第2次高調波発生(Second harmonic generation: SHG。コラーゲンなどの非線形光学結晶により入射波長の半分の光を発生する現象。染色不要)で観察し、ASCの分布とSHGシグナルの分布の関連を検討する。その後、マウスを犠牲死させたのち、創部の形態、創幅の計測(収縮)、新生上皮長の計測(上皮化)をおこない、ASCの局在、炎症性細胞および線維芽細胞の浸潤を組織学的、免疫組織学的に評価する。また、組織よりmRNAおよび蛋白質を採取し、炎症反応の指標であるIL1b, IL2, IL6, IL8, TNFa, MMP2, MMP8, MMP9、また肉芽形成・収縮の指標であるCOL1a1, TGFb, SMA(ACTA2)、さらに上皮化の指標であるLAMA5, FN1, COL4a2をリアルタイムRT-PCR、western blottingによって生化学的に評価をおこなう。抗炎症因子を抑制するshRNAにより発現抑制されたASCを用いて比較検討することで、ASCが創傷治癒に関与することを実証するとともに、創傷治癒の各過程におけるASCが分泌する治癒促進に効果的な因子の同定し、ASCによる治癒作用機序を明らかにする。粘膜炎、潰瘍は、要因除去、洗浄、軟膏塗布などによる治療で多くは治癒するが、一部では慢性炎症、難治性潰瘍として長期化する。創傷を早期に治癒に導く低侵襲の治療法を開発することは喫緊の課題である。近年、脂肪由来幹細胞(ASC)が抗炎症作用、治癒促進作用を有することが報告され、が注目されている。ASCが創傷治癒過程において、成長因子やサイトカインを分泌することが報告され、それらの相互作用により、組織修復や抗炎症作用などの重要な役割を果たしていることが示唆されているが、その作用機序などは依然明確になっていない。そこで、これまで報告されてきたASCの機能を基に、治癒不全糖尿病マウスを用いて創傷モデルを作製し、ASCの抗炎症効果ならびに創傷治癒過程における治癒機転促進の機序を検証している。また、ASCを用いた細胞療法による創傷治癒効果が期待できるとすれば、具体的には、いかにASCを患部に有効に滞留させ、サイトカインを有効に徐放させるかという事が大きな課題となる。適切な組織分化を期待する治療にも関わらず、細胞が本来目的とする組織に留まらないばかりでなく、多部位を標的とするようになってしまう事は回避しなければならない。申請者らは過去の研究でハイドロゲルと成長因子の組み合わせによる徐放効果を利用した体細胞増殖法を確立している。これを応用しハイドロゲルを用いたサイトカインのデリバリーシステムを構築することが本研究の目的である。具体的には以下の研究をに行う。1in vitroにおけるASCの純化・培養法の確立および特性評価2モデルマウスを用いた皮膚創傷モデルの作製3皮膚創傷モデルマウスにおけるASCの抗炎症作用の検証と創傷治癒メカニズムの探求4皮膚創傷モデルマウスにおけるASCのデリバリーの違いによる創傷治癒効果の比較検証している。