hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テネイシン-Cの新規レセプタの探索と病変組織におけるその発現の検討

癌細胞は様々な局面において,細胞・細胞間,細胞・基質間の解離・接着を行い,形態,運動性,接着能変化させ,新たに組織再構築を行う.この際に,細胞外基質は単なる足場ではなく,その発現量,種類の変化,蛋白質分解酵素による破壊などの情報を細胞に伝え,細胞機能を直接変化させると考えられている.細胞外マトリックス蛋白質のひとつであるテネイシン-C (TN-C)は,組織再構築を伴う生体反応では早期から高度にその発現が認められ,特に癌組織に伴うTN-Cの発現量が悪性度の指標となることが報告されている.また,TN-Cにはいくつかのスプライシング・バリアントが存在するが,癌組織におけるバリアント発現の生理的意義は全く不明である.そこで我々は,フィブロネクチン(FN)III反復のスプライシング部位を特異的に認識するモノクローナル抗体などを用いて,癌細胞自身が選択的スプライシング部位含むTN-Cを高度に発現し,かつその発現が癌細胞浸潤面及び癌細胞増殖が活発な部位に一致すること,また培養細胞においてスプライシング部位が細胞の遊走能および細胞増殖を亢進させることを明らかにした.即ち,TN-Cのスプライシング部位が悪性癌細胞の浸潤・増殖など病態形成・進行に直接重要な役割を担うことが考えられた.TN-Cに結合する蛋白質はインテグリンファミリーなどが報告されているが,スプライシング部位に結合する分子やその情報伝達機構は不明な点が多い.そこでスプライシング部位に結合する蛋白質を,アフィニティーカラム法や大腸菌two-hybrid法を用いて検索し,いくつかの分子を得た.その中で,分子量約75kDaの7回膜貫通型のレセプターと推定される分子が最も有力な候補であり,これはin vitroにおいてTN-Cと結合することを明らかにした.現在,この分子に対する抗体を作製中で,今後、in vivo,癌組織におけるTN-C発現との関連性を検討予定である.癌細胞は様々な局面において,細胞・細胞間,細胞・基質間の解離・接着を行い,形態,運動性,接着能変化させ,新たに組織再構築を行う.この際に,細胞外基質は単なる足場ではなく,その発現量,種類の変化,蛋白質分解酵素による破壊などの情報を細胞に伝え,細胞機能を直接変化させると考えられている.細胞外マトリックス蛋白質のひとつであるテネイシン-C (TN-C)は,組織再構築を伴う生体反応では早期から高度にその発現が認められ,特に癌組織に伴うTN-Cの発現量が悪性度の指標となることが報告されている.また,TN-Cにはいくつかのスプライシング・バリアントが存在するが,癌組織におけるバリアント発現の生理的意義は全く不明である.そこで我々は,フィブロネクチン(FN)III反復のスプライシング部位を特異的に認識するモノクローナル抗体などを用いて,癌細胞自身が選択的スプライシング部位含むTN-Cを高度に発現し,かつその発現が癌細胞浸潤面及び癌細胞増殖が活発な部位に一致すること,また培養細胞においてスプライシング部位が細胞の遊走能および細胞増殖を亢進させることを明らかにした.即ち,TN-Cのスプライシング部位が悪性癌細胞の浸潤・増殖など病態形成・進行に直接重要な役割を担うことが考えられた.TN-Cに結合する蛋白質はインテグリンファミリーなどが報告されているが,スプライシング部位に結合する分子やその情報伝達機構は不明な点が多い.そこでスプライシング部位に結合する蛋白質を,アフィニティーカラム法や大腸菌two-hybrid法を用いて検索し,いくつかの分子を得た.その中で,分子量約75kDaの7回膜貫通型のレセプターと推定される分子が最も有力な候補であり,これはin vitroにおいてTN-Cと結合することを明らかにした.現在,この分子に対する抗体を作製中で,今後、in vivo,癌組織におけるTN-C発現との関連性を検討予定である.細胞外マトリックス蛋白質のひとつであるテネイシン-C(TN-C)は,組織再構築を伴う生体反応では早期から高度にその発現が認められる.TN-Cにはいくつかのスプライシング・バリアントが存在し,癌間質に特異的に発現するものも報告されている.しかし,癌組織におけるバリアント発現の生理的意義は全く不明である.そこで我々は,フィブロネクチン(FN)III反復のスプライシング部位(B-D)を特異的に認識するモノクローナル抗体(4C8)を作製した.正常乳腺組織あるいは良性乳腺腫瘍に比べ,乳癌組織ではB-Dを含むTN-Cが過剰に発現することが明らかとなった.すべてのバリアントを認識するTN-Cモノクローナル抗体(4F10)と比較すると,4F10は癌細胞間の間質に染色されたのに対し,4C8は癌細胞の浸潤面に特異的に染色された.癌組織の悪性の指標となるTN-Cは,B-Dを含むスプライシング部位が悪性癌細胞の浸潤をはじめとする病態形成・進行に重要な役割を担うことが考えられた.そこでB-Dに結合する蛋白質を,アフィニティーカラムを用いて検索しいくつかの分子を得た.これらから、量的に多い蛋白種のアミノ酸配列を検討したところ、アクチンとミオシンであり、膜蛋白は現在得られていない。細胞骨格蛋白が同定できることより、結合する膜蛋白には細胞内との結合を有する可能性が示唆される。細胞骨格蛋白の非特異的な吸着を防ぐとともに、生細胞のビオチンによる蛋白ラベルを用い、細胞外成分を標識し、さらに検討を続けている。量的には少ないが新しい蛋白種を見出し、アミノ酸配列を決定できる量を確保しようとしている。

癌細胞は様々な局面において,細胞・細胞間,細胞・基質間の解離・接着を行い,形態,運動性,接着能変化させ,新たに組織再構築を行う.この際に,細胞外基質は単なる足場ではなく,その発現量,種類の変化,蛋白質分解酵素による破壊などの情報を細胞に伝え,細胞機能を直接変化させると考えられている.細胞外マトリックス蛋白質のひとつであるテネイシン-C(TN-C)は,組織再構築を伴う生体反応では早期から高度にその発現が認められ,特に癌組織に伴うTN-Cの発現量が悪性度の指標となることが報告されている.また,TN-Cにはいくつかのスプライシング・バリアントが存在するが,癌組織におけるバリアント発現の生理的意義は全く不明である.そこで我々は,フィブロネクチン(FN)III反復のスプライシング部位を特異的に認識するモノクローナル抗体などを用いて,癌細胞自身が選択的スプライシング部位含むTN-Cを高度に発現し,かつその発現が癌細胞浸潤面及び癌細胞増殖が活発な部位に一致すること,また培養細胞においてスプライシング部位が細胞の遊走能および細胞増殖を亢進させることを明らかにした.即ち,TN-Cのスプライシング部位が悪性癌細胞の浸潤・増殖など病態形成・進行に直接重要な役割を担うことが考えられた.TN-Cに結合する蛋白質はインテグリンファミリーなどが報告されているが,スプライシング部位に結合する分子やその情報伝達機構は不明な点が多い.そこでスプライシング部位に結合する蛋白質を,アフィニティーカラム法や大腸菌two-hybrid法を用いて検索し,いくつかの分子を得た.その中で,分子量約75kDaの7回膜貫通型のレセプターと推定される分子が最も有力な候補であり,これはin vitroにおいてTN-Cと結合することを明らかにした.現在,この分子に対する抗体を作製中で,今後、in vivo,癌組織におけるTN-C発現との関連性を検討予定である.
ＮｉＴｉの表層域ポーラス化とＮｉイオン溶出抑制

金属浴浸漬法をNiTi合金に適用することにより、表面からNiを除去したポーラス層を作製することができた。反応層のNi濃度は基板側から段階的に減少し、内側はTi2Ni相、表層はα-Ti相となった。これらの試料からの1mass%乳酸中への金属イオン溶出量は、Mg浴浸漬試料においては、ポーラス化による表面積の増大にも関わらずNiイオン溶出量は未処理試料と同程度であった。二段階熱酸化法によるアナターゼ皮膜形成によっても、Niイオン溶出量を抑制することができた。生体用金属材料であるNiTi合金からのNiイオン溶出抑制を目的として、溶融金属浸漬法による脱Niポーラス化処理およびガス酸化によるアナターゼ層形成処理を行った。脱Niポーラス化処理は金属原子同士の親和性(混合熱ΔHMix)の差を利用したものであり、浸漬浴としてはNiとの親和性が高く、Tiとの親和性が低い元素の選択が必要である。H25年度はH24年度に確立したCe浴浸漬により作製した脱Niポーラス化表面に対して、二段階熱酸化法を適用することでアナターゼ層形成を検討した。二段階熱酸化法は、Ti表面に対してAr-COガス雰囲気中における熱処理によりTiC皮膜を作製し(一段階目処理)、それを大気中にて熱処理(二段階目処理)することでアナターゼ皮膜を得ることができる。脱Niポーラス化処理により、試料最表面からはNiが除去され、Tiのみとなっていたため、アナターゼ層を作製することができた。特に、本プロセスはガスを用いた高温酸化であるため、ポーラス表面全体をアナターゼ層にて被覆することができた。脱Niポーラス化処理のみにおける水接触角は高い値を示し、疎水性であったが、アナターゼ皮膜を施すことにより水接触角は低下し、ポーラス中に水が浸透していった。1%乳酸中へのNiイオン溶出量は二段階目処理温度により異なり、573 Kの方が873 Kで処理した試料よりも低い値を示した。本プロセスにより作製したポーラス化表面へのアナターゼ皮膜は、大きな表面積を生かした光触媒用デバイスにも応用できると考えられる。NiTi合金からのNiイオン溶出抑制を目的として、NiTi合金の溶融金属浴浸漬法により脱Niポーラス化処理を行った。本法は金属原子同士の親和性(混合熱ΔHmix)の差を利用したものであるが、浸漬浴としては、具体的にはNiとの親和性が高く、Tiとの親和性が低い元素の選択が必要である。これらの条件を満たす金属浴として、CeおよびMgに着目し、Ce、MgおよびCe-Mg浴を用い、浴組成、処理温度および処理時間が形成される脱Niポーラス化層のモロフォロジー(ポーラススケール、ポア率等)および厚さに及ぼす影響を調査した。Ce含有浴を用いた場合は、2層構造を有する脱Niポーラス層が形成され、基板側からTi2Ni相およびTi2Ni+α-Ti相から構成されていた。一方Mg浴においても脱Niポーラス層が形成されたが、浴中Mg割合の増加に伴い反応層厚さは減少した。Mg浴を用いて1123 Kの浸漬を行った場合においても脱Niポーラス表面を作製することができた。また、β-Ti形成温度以下である973 Kの処理においても、脱Niポーラス層を作製できた。この反応層はα-TiおよびTi2Ni相で構成されており、表面のNi濃度は2.0 at%程度であった。JIS T0304に準拠し、作製した試料から1mass%乳酸中への金属イオン溶出量をICP-MSにより測定した。Ce含有浴を用いて処理した試料からは、未処理基板と比べ10倍以上高いNiおよびTi溶出が確認された。ただし、ポーラス化による表面積の増大を考慮すると、単位面積あたりのNiイオン溶出量は低減することができた。一方、Mg浴中にて973 K, 600 s処理した試料からのNiイオン溶出量は、未処理基板のそれとほぼ同量であった。Mg浴を用いることで、ポーラス構造を有し、未処理基板と同程度のNiイオン溶出量を示す脱Ni表面を作製することができた。NiTi合金の溶融金属浴浸漬法に及ぼす浴成分、処理温度、時間の影響を明らかにすることができ、脱Niポーラス化層を作製すること、およびその形態を制御することも可能であった。また、ポーラス化による表面積の増大にも関わらず、1mass%乳酸中への金属イオン溶出量も未処理基板と同程度に抑制する条件を見出した。表層域ポーラス化NiTi合金の更なるNiイオン溶出抑制を目的として、ガス処理による表面酸化を行う。ガス処理は簡便、低コスト、複雑形状に対応した表面処理法であり、密着力の高い皮膜が得られるといった利点を有する。

これまでの当グループでの研究により、COガスを用いることで工業用純チタン上にTiO1-xCx相を作製し、さらに大気中における酸化により、アナターゼ相が得られることを見出した。この方法を表層域ポーラス化NiTiへ適用し、1mass%乳酸溶液中へのNiイオン溶出低減を目指す。アナターゼ相は光触媒能を有することから、ポーラス体という大表面積へのコーティングは、触媒としての応用にも繋がる。消耗品として、NiTi基板、金属浴原料、坩堝等を購入する。また、酸化実験に用いるガス類、耐火物、発熱体も購入する。24年度に得られた成果は、ハワイで開催されるPRICM8にて発表予定であり、そのための旅費を計上する。また、25年度の成果と併せて、学術論文を投稿予定であり、外国語論文の校閲、研究成果投稿料をそれぞれ計上した。
膝内障各種疾患の関節軟骨病変の発生

膝内障の骨,軟骨障害について基礎的実験および臨床的研究を行い,新たな発見および知見を得,今後の課題も明らかとなった.本研究の基礎的知見は関節端の骨軟骨複合体の生体工学研究である.本研究では軟骨,軟骨下骨,海綿骨のそれぞれ物性の異った複合体の剪断力破壊が力学的条件により異った損傷形態をとりうることを実験的に証明することが出来た.又,その損傷形態も4型8種類に分類することが出来,これは,各種膝内障にみられる骨軟骨損傷型と類似し,あるいは臨床的には証明しえないが,望論上,可能な損傷型を実験的に証明しえたことの意義は大きいと言える.要約すれば骨軟骨複合体の剪断力による損傷メカニズムは,衝撃スピードと衝撃エネルギーの両者によって支配され,スピードの遅い剪断力では,在する関節軟骨には損傷が生じないにもかかわらず,内部の軟骨下骨・海綿骨に損傷が生ずることが明らかになり,臨床的には見逃す,捕えがたい損傷型といえる.実験的にこのような変化を証明することで,膝内障における軟骨病変のメカニズムも同時に明らかになり,膝蓋大腿関節適合不良にみられる軟骨下骨の異常陰影の意味ずけも可能となった.また,離断性骨軟骨炎の発生メカニズムも体験値によるclosed subchondral fractureによるものと理解されるものといえる.治療面からは,発生メカニズムから考えられる予防的治療と,発生した軟骨欠損に対する治療に大別される.本研究では特に軟骨欠損に対する骨軟骨の移植の面について家兎をもちいた動物実験を行い,同種移植の成功をうるための条件を知ることが出来た.なお現在継続して行っている研究に半月板の機能と欠損による軟骨障害について生体工学的に研究を行っており,近く,成果がえられるものと思う.膝内障の骨,軟骨障害について基礎的実験および臨床的研究を行い,新たな発見および知見を得,今後の課題も明らかとなった.本研究の基礎的知見は関節端の骨軟骨複合体の生体工学研究である.本研究では軟骨,軟骨下骨,海綿骨のそれぞれ物性の異った複合体の剪断力破壊が力学的条件により異った損傷形態をとりうることを実験的に証明することが出来た.又,その損傷形態も4型8種類に分類することが出来,これは,各種膝内障にみられる骨軟骨損傷型と類似し,あるいは臨床的には証明しえないが,望論上,可能な損傷型を実験的に証明しえたことの意義は大きいと言える.要約すれば骨軟骨複合体の剪断力による損傷メカニズムは,衝撃スピードと衝撃エネルギーの両者によって支配され,スピードの遅い剪断力では,在する関節軟骨には損傷が生じないにもかかわらず,内部の軟骨下骨・海綿骨に損傷が生ずることが明らかになり,臨床的には見逃す,捕えがたい損傷型といえる.実験的にこのような変化を証明することで,膝内障における軟骨病変のメカニズムも同時に明らかになり,膝蓋大腿関節適合不良にみられる軟骨下骨の異常陰影の意味ずけも可能となった.また,離断性骨軟骨炎の発生メカニズムも体験値によるclosed subchondral fractureによるものと理解されるものといえる.治療面からは,発生メカニズムから考えられる予防的治療と,発生した軟骨欠損に対する治療に大別される.本研究では特に軟骨欠損に対する骨軟骨の移植の面について家兎をもちいた動物実験を行い,同種移植の成功をうるための条件を知ることが出来た.なお現在継続して行っている研究に半月板の機能と欠損による軟骨障害について生体工学的に研究を行っており,近く,成果がえられるものと思う.本年度研究においては、骨軟骨病変の発生機序に関する力学的研究(基礎編)と膝蓋大腿関節適合不良障害に関する臨床的ならびにX線学的研究(臨床編)について発表を行い一応の結論をえた。基礎編においては、豚膝関節の大腿軟関節面に衝撃的剪断力を加えて骨軟骨病変を発生させ、この病変が種々の膝内障における軟骨病変の発生との関りについて多くの興味ある結果を得た。即ち骨軟骨病変は衝撃スピード,衝撃エネルギー,衝撃時の軟骨,軟骨下骨骨梁の方向と衝撃力の方向など、力学的条件によって骨軟骨の損傷部位,拡がり,形態がきまってくることが証明された。一般的に関節軟骨に加わる衝撃スピードが早い場合には、主に関節軟骨表面より損傷が生じ、衝撃スピードがむしろ低い場合には、関節軟骨損傷が生じないにもかかわらず軟骨下骨,軟骨内部の損傷が生ずる。又、一定以上の衝撃エネルギーが与えられれば、関節軟骨のみならず、軟骨下骨組織の損傷も生じ、混合した損傷形態となる。この事実は骨軟骨病変を主とする骨軟骨々折,離断性骨軟骨炎,軟骨軟化症の発生のモデルとして興味あるものと言える。臨床的研究では膝蓋大腿関節適合不良について行った。本疾患は膝蓋骨関節軟骨に種々の病変を発生することで知られているが何故この種にバラエティーに豊んだ病変を生ずるかに関しては必ずしも一致した意見はない。病態解明のため621例1242関節について膝蓋大腿関節の適合性を膝蓋大腿関節動的軸射造影法によって観察を行い適合性の程度を第一度より第四度にまで分類した。この結果適合性の悪い第三度,四度に臨床的に適合不良障害の症状が多くみられ同時に膝蓋軟骨軟化症,骨軟骨骨折,離断性骨軟骨炎などの軟骨病変が多くみられた。この事実は前述の基礎編の研究とも多くの点で符合し病態の発生機序の点で興味ある結果といえる。
くも膜下出血後脳血管攣縮における脳微小循環における組織学的・機能学的研究

ラット脳微小循環について脳血流制御因子の細胞外イオン濃度における薬理学的研究を中心に行った。細胞外イオン濃度(カリウムとマグネシウム)のレンズ核線条体動脈に対する血管反応を解明した。レンズ核線条体動脈周囲の組織学的検討を試みたが、間隙の評価が難しく評価方法の再考が必要であった。くも膜下出血後の脳微小循環評価をMRIで行ったが、観察症例では大きな変化は認められなかった。くも膜下出血後脳血管攣縮における脳微小循環の組織学的・機能学的研究を行い有効な治療方法を開発することを目的に、今年度は生理的状態におけるレンズ核線条体動脈(Lenticulostriate artery:以下LSA)の研究を行った。(1)組織学的研究:今年度はコントロール群に対する実験を行った。SDラット(雄、12週齢)の脳を顕微鏡下に摘出固定し中大脳動脈より分枝するLSA(血管内径50100マイクロメートル)を含む脳切片を作成しIntraparenchymalportionとExtraparenchymalportionにつき検討を行った。(2)血管薬理学的研究:今年度は、生理的状態での細胞外カリウムとマグネシウム濃度変化による血管反応を検討した。以前我々は生理的条件下では軽度カリウム濃度の上昇(Stroke 2002;33:2692-2699)による著明な血管弛緩反応を報告してきたが、カリウム濃度の低下反応については不明であった。細胞外カリウム濃度を3.0mmol/Lから1.0mmol/Lに低下させると、2相性の血管反応(一過性の収縮反応後に弛緩反応)を認めた。この一過性収縮反応はNa-K-ATPase阻害剤とL-type Ca channel阻害剤にて有意に抑制された。一方、K channlの阻害剤存在下では、変化は認められなかった。よって細胞外カリウム濃度低下による一過性収縮反応はK channelは関与しておらず、Na-K-ATPaseの抑制によるものと思われた。細胞外マグネシウム濃度変化についても検討を行った。コントロールの細胞外マグネシウム濃度は1.5mmol/Lとして、上昇と低下により血管反応を解析した。濃度を0.5mmol/Lに低下させると有意に収縮反応を認め、3.0mmol/Lに上昇させると拡張反応を認めた。細胞外マグネシウムはカルシウムの拮抗作用があることが知られており、細胞内カルシウムの流入を阻害することによる血管反応と思われた。くも膜下出血後脳血管攣縮における脳微小循環の組織学的・機能学的研究を行い有効な治療方法を開発することを目的に、今年度はくも膜下出血モデルにおけるレンズ核線条体動脈(Lenticulostriate artery:以下LSA)の研究を行った。また、実際のくも膜下出血患者にける、穿通枝領域の血流評価についてMRI perfusionで研究を行った。(1)組織学的研究:今年度はくも膜下出血モデルについて検討を行った。腹腔内投与による麻酔後SDラット(雄、12週齢)の自己血を大槽内に注入し、血液のひろがりについて検討した。(2)血管薬理学的研究:昨年度の生理学的状態での研究結果を追試し論文発表を行った。また、くも膜下出血モデルへの実験に向けて予備実験を行った。(3)最近臨床応用が可能となった非造影のMRI perfusion imageを用いて実際のくも膜下出血における穿通枝領域の血流変化について評価した。くも膜下出血後、2週間程度低下しているものと予想されたが、実際には軽度増加している事が多い事が判明した。くも膜下出血後は、一時的にauto-regulationが障害されていることが示唆された。臨床的な脳血管攣縮を示した患者がなかったのも関係していると思われ、来年度も検討が必要である。くも膜下出血後脳血管攣縮における脳微小循環の組織学的・機能学的研究を行い有効な治療方法を開発することを目的に、本年度は主に今までの研究結果を解析した。1組織学的研究:前年度に施行したくも膜下出血モデルについての血液分布について組織学的に検討を行った。穿通枝周囲の脳脊髄液は間隙がわずかで評価が困難であった。また個体差が大きい印象があり、今後の検討には方法の変更も考慮にいれる必要があると思われた。2血管薬理学的研究:くも膜下出血モデルでの生理活性物質での反応性を実験した。拡張作用には、有意な差が認められないような結果であった。現在統計学的に検討中である。3MRIを用いた脳血流研究:昨年度と同様にくも膜下出血後に検査を施行した。本年度の結果も昨年と同様の傾向であった。くも膜下出血以外の脳卒中でも血流検査を施行し有用な疾患があることを論文として発表した。組織学的にLSA周囲の評価が予想より困難であり、くも膜下出血モデルでの研究がやや遅れている。具体的には、Virchow-Robin腔の評価が脳を固定してしまうと評価が難しい。24年度が最終年度であるため、記入しない。

組織学的研究では、評価が難しいので凍結標本への変更なども視野にいれて研究をすすめる。脳微小循環での脳血流評価が比較的簡易的にMRIを用いて可能となってきているので臨床例での研究も合わせて行っていく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
消化器癌の染色体不安定性と紡錘体形成チェックポイント蛋白発現の関連

【研究の目的】紡錘体形成チェックポイント関連分子の一つであるBubR1の高発現が染色体不安定性、胃癌の悪性度に関連する結果が示唆されたことから、BubR1高発現が実際に染色体不安定性を引き起こすのか、またそれにより癌細胞の悪性度が変化するかを明らかにすると共に、MAD2やcdc20などの他の紡錘体形成チェックポイント関連分子についても同様の検討を行うことで、これらの分子の発現と染色体不安定性や胃癌の悪性度との関連を明らかにする。さらに、各分子の相互関係について細胞株や臨床検体を用いて検索し、機序を明らかにすることで、胃癌の悪性度診断に有用なマーカーの抽出と新たな治療標的の同定を試みる。【結果】Aneuploidyである胃癌細胞株でCdc20とともに紡錘体形成チェックポイント関連分子であるBubR1が高発現していたが,今回の検討ではCdc20の発現に明らかな差は認めなかった。【結果】胃癌臨床検体6例においてDiploidyとAneuploidyでCdc20の発現に明らかな差は認めなかった。またDiploidyでは2症例とも癌部のCdc20発現量が多いが,Aneuploidyにおいては癌部と非癌部でCdc20発現量に一定の傾向は認められなかった。
速度データの相関解析に基づく非二状態蛋白質のフォールディング機構研究

球状蛋白質のフォールディング速度過程に関する文献調査を行い,蛋白質フォールディングのデータベースを構築した。データベースの総エントリー数は141(非二状態蛋白質59,二状態蛋白質82)である。このデータベースから,非二状態蛋白質と二状態蛋白質を,それぞれ別々に取りだし,フォールディング速度定数の対数(ln kf)と,蛋白質の立体構造特性との間の相関を解析した。立体構造特性として,研究代表者等が提案している非局所的接触クラスターの数の対数(ln Nc)を用いることにより,非二状態蛋白質と二状態蛋白質のフォールディング分子機構の違いを明確に示すことが出来た。二状態蛋白質のフォールディング機構が主鎖構造のトポロジカルな要因によって決まることが定説となっているが、非二状態蛋白質のフォールディング分子機構に関しては不明である。申請者等のこれまでの研究によって、非二状態蛋白質のフォールディングは単純に主鎖構造のトポロジーのみで決まるのではなく、二次構造要素の空間配置が重要な要因になっていることが期待される。本研究では、Φ値解析などによってフォールディング開始部位が明らかにされている非二状態蛋白質を対象として、フォールディング速度データと立体構造との間の相関解析を行い、非二状態蛋白質のフォールディング分子機構の解明に寄与することを目的とする。25年度の研究実績を以下に示す。(1)速度パラメータとΦ値解析データの収集現在までの、蛋白質フォールディング速度過程に関する学術論文を調査し、SS結合を含まない一本鎖の二状態蛋白質と非二状態タンパク質について、フォールディング速度パラメータとΦ値解析データの収集を行った。49種の二状態蛋白質と35種の非二状態蛋白質の速度パラメータを得ると共に、これらの内、41種の二状態タンパク質と14種の非二状態蛋白質については、Φ値解析データも得ることが出来た。(2)解析プログラムの作成とln kfvs ln Ncの解析上記(1)で収集されたデータを用いて、ln kfNとln Ncとの相関解析を行った(ここで、kfはフォールディング速度定数、Ncは一次配列上離れた残基間で形成される相互作用の集まり(Nonlocal contact cluster, NLCC)の数を示す)。その結果、非二状態タンパク質については、相関係数-0.8程度の強い相関が観測されたが、二状態タンパク質では十分な相関が観測されなかった。本研究では、Φ値解析などによってフォールディング開始部位が明らかにされている二状態蛋白質と非二状態蛋白質を対象として、フォールディング速度データと立体構造との間の相関解析を行い、非二状態蛋白質のフォールディング分子機構の解明に寄与することを目的とする。26年度の研究実績を以下に示す。(1)log kf vs log Ncの相関解析:74種の二状態蛋白質と47種の非二状態蛋白質のフォールディング速度定数(kf)を学術論文より収集し、log kfとlog Ncとの間の相関解析を行った(Ncは蛋白質立体構造のコンタクトマップ上で観測される、一次構造上離れた残基間で形成されるコンタクトクラスター(Nonlocal contact cluster)の数)。残基間のコンタクト強度γを、ロジスティック関数(γ=Σ(1/(1+exp(α(dn-d))))で表し、二状態蛋白質と非二状態蛋白質、それぞれについて、関数を最適化する、パラメータ(配列セパレーション(L)、カットオフ距離(dn)、傾斜度(α))の値を交差検証解析により求めた。求められた値を用いて、log kfとlog Ncとの間の相関解析を行った。二状態蛋白質と非二状態蛋白質のいずれに対しても、統計的に有意な相関が観測された(相関係数-0.7-0.8)。(2)Φ値と残基間コンタクト強度γの相関解析:Φ値解析が行われている、41種の二状態蛋白質と14種の非二状態蛋白質について、上のロジスティック関数とパラメータ値を用い、Φ値とγ値との間の相関解析を行った。その結果、意外なことに、二状態、非二状態のいずれの蛋白質においても、統計的に有意な相関は観測されないことが分かった(相関係数-0.10.1)。本研究では、フォールディング速度定数が実験的に明らかにされている二状態蛋白質と非二状態蛋白質を対象として,速度データと立体構造との間の相関解析を行い,非二状態蛋白質のフォールデイング分子機構の解明に寄与することを目的としている。27年度の研究実績を以下に示す。(2)立体構造コンタクトマップの作成とフォールディング分子機構の解析:非二状態蛋白質と二状態蛋白質のそれぞれについて,昨年度導入された,ロジスティック関数に基づく非局所的コンタクトクラスターの解析を行い,各蛋白質のコンタクトマップ上にコンタクトクラスターを描いた。その結果,非二状態蛋白質と二状態蛋白質との間で,コンタクトクラスターの数(Nc)と分布に明確な違いを見出すことが出来た。本研究の手法を用いて,蛋白質の立体構造コンタクトマップ上に,非二状態蛋白質と二状態蛋白質の違いを描き,そのフォールディング速度を予測することが可能となった。昨年度導入した,ロジスティック関数に基づく非局所的コンタクトクラスターの解析を行い,コンタクトマップ上に非二状態蛋白質と二状態蛋白質を明確に識別し,それらのフォールディング速度を立体構造のみから予測することが可能となった。また,非二状態蛋白質と二状態蛋白質のフォールディング分子機構の違いを,本研究の手法を用いて明らかにすることができた。

すなわち,非二状態蛋白質においては,そのコンタクトマップ上に通常5個以上の非局所的コンタクトクラスターが描かれるのに対し,二状態蛋白質においては,コンタクトマップ上の60%以上の領域が,一つの大きな非局所的コンタクトクラスターで覆われてしまうことが明らかとなった。非局所的コンタクトクラスターは,αヘリックスやβヘアピンなどの二次構造要素間の接触領域に対応していることが多いので,上記の結果は,非二状態蛋白質においては,二次構造要素間の再配置がフォールディング反応の律速段階となっているのに対し,二状態蛋白質においては,分子全体の協同的な構造形成が律速段階となっていることを示している。本研究では、Φ値解析などによってフォールディング開始部位が明らかにされている二状態蛋白質と非二状態蛋白質を対象として、フォールディング速度データと立体構造との間の相関解析を行い、非二状態蛋白質のフォールデイング分子機構の解明に寄与することを目的とする。28年度の研究実績を以下に示す。(1)蛋白質フォールディングの速度論データの収集:昨年度に引き続き,PubMedなどを利用した学術論文調査を行い,単一ドメイン球状蛋白質のフォールディング速度定数(kf)とフォールディングタイプ(二状態または非二状態)に関するデータを収集した。現在,データのエントリー数は,二状態蛋白質78個,非二状態蛋白質55個の計133個であるが,現在登録途上のものが6件ほどあるので,最終的にはエントリー数が140程度になる予定である。これは,現在まで知られている,蛋白質フォールディングのデータベースの中で,最大で最新のものとなる。このデータベース公開の準備のため,共同研究者である,韓国高等科学院Jooyounh Lee教授の研究室ホームページにデータベースをアップロード中である(URL: http://lee.kias.re.kr/protein/wiki/doku.php?id=pkhd:view)。(2)蛋白質フォールディング速度データベースの温度補正に関する準備研究:平成28年度より,基盤研究(C)「速度データと天然構造の相関解析による蛋白質フォールディングの遷移状態の研究」を実施しており,その準備研究として,本研究で作成したデータベース中の,各蛋白質のフォールディング実験における測定温度の調査を行った。球状蛋白質のフォールディング速度過程に関する文献調査を行い,蛋白質フォールディングのデータベースを構築した。データベースの総エントリー数は141(非二状態蛋白質59,二状態蛋白質82)である。このデータベースから,非二状態蛋白質と二状態蛋白質を,それぞれ別々に取りだし,フォールディング速度定数の対数(ln kf)と,蛋白質の立体構造特性との間の相関を解析した。立体構造特性として,研究代表者等が提案している非局所的接触クラスターの数の対数(ln Nc)を用いることにより,非二状態蛋白質と二状態蛋白質のフォールディング分子機構の違いを明確に示すことが出来た。ロジスティック関数を用いた解析プログラムを作成し、新たにlog kf vs log Ncの解析を行った。Φ値と残基間コンタクト強度との間の相関解析を終えることが出来た。
アニマルウェルフェア養魚に関する研究

アニマルウェルフェアの基本的な考え方を養魚に導入するために、自発摂餌で鮭鱒類を飼育し、アニマルウェルフェア五原則(空腹や不快の回避、痛み・損傷・病気や恐怖・苦痛の回避、異常行動の抑制など)に関する実験を行った。その結果、混養、シェルターの設置などを組入れることによりアニマルウェルフェアを考慮した養魚は可能であることが示唆された。本研究は、魚類の動物福祉を視点とした養魚のための基礎研究である。自発摂餌を用いた魚類飼育では、魚は自らスイッチを起動して摂餌し、魚自身の食欲に合わせた給餌ができる。しかし、スイッチ起動が少ない魚種では食欲が満たせず空腹が継続するため動物福祉の観点から自発摂餌導入の課題となっていた。そこで、スイッチ起動回数の多いニジマスとスイッチ起動回数が少ないと考えられているアマゴを混養し、アマゴの「空腹の回避」を試みた。ニジマス単独の飼育群(ニジマス群)、アマゴ単独の飼育群(アマゴ群)、両種混養群(混養群)の3実験群を用いた。自発摂餌を学習するまでの期間は、実験終了直近の20日間の平均スイッチ起動回数を求め、その値の75%到達日を学習期間と定義した。その結果、ニジマス群・混養群では、自発摂餌の学習期間は1-9日であった。しかし、アマゴ群・混養群では2-25日であり、学習期間の変動巾が大きい特徴がみられた。摂餌量に関しては、実験初期にアマゴ群の摂餌量が他の2群に比して有意に低かったが、実験後半には回復した。しかし、ニジマス群と混養群の摂餌量には有意差が認められなかった。したがって、自発摂餌の導入初期にアマゴで避けられなかった空腹を、ニジマスとの混養によって回避できることが分かった。また、アマゴ群と混養群のアマゴのみの成長を比較したところ、混養群のアマゴの方が有意に大きかった。以上の結果から、自発摂餌に適した魚種と混養することによって、スイッチ起動が少ない魚種でも、特に自発摂餌導入初期に避けられなかった空腹期間を低減できることが示唆された。本研究は、アニマルウェルフェアの考え方を養魚産業に導入するための基礎研究である。飼育環境下における養魚が発する生理学的・行動学的な要求をアニマルウェルフェア五原則に基づいて評価し、総合的な飼育技術の質的向上を目指すことが目的である。本年度はアニマルウェルフェア五原則の中の損傷の回避に関するニジマスとイワナを用いた実験を行った。飼育水槽中の養魚の鰭や体表の損傷は、しばしば優占魚からの攻撃や摂餌、遊泳時の魚同士の擦傷などに起因することが多い。これらは感染・病気に直結しやすいためアニマルウェルフェア養魚からみれば低福祉の指標となる。そこで、飼育期間中の攻撃や損傷について調べた。また、本実験では自発摂餌に適さないと考えられている魚種への自発摂餌の適応をも目的としているため、自発摂餌飼育が容易なニジマスと、比較的難しいとされているイワナの2魚種の混養を組入れた実験群(ニジマス群3水槽、イワナ群3水槽、ニジマスとイワナの混養群3水槽)を用いた。その結果、自発摂餌のスイッチ起動回数、摂餌量、体重増加は、ニジマス群>混養群>イワナ群の順であった。特に混養群のイワナは、イワナ単独群に比して顕著な体重増加が認められ、ニジマスとの混養は明らかにメリットとなることが分かった。その一方で、混養群のイワナはニジマスに対する攻撃の多いことが明らかになった。混養群ではイワナの攻撃性が主因と考えられる鰭の損傷が多くなる傾向が認められた。以上の結果から、単独で自発摂餌が不得手な魚種も自発摂餌に適した魚種と混養することによって成長は期待できるが、攻撃に起因する損傷といったリスクも考慮する必要があるため、アニマルウェルフェア養魚の観点からは、今後、魚種の混養比率に関する研究が必要である。平成24年度は最終年であるため、「恐怖・苦痛の回避」に関する実験を行った。具体的には、1非優占魚や被攻撃魚が退避できるシェルターに関する実験、および2非優占魚や被攻撃魚のストレスを体色変化で測定し、指標としての妥当性について調べた。1に関しては、申請書の計画に記載されていないが、近年、北欧の研究者らにより重要性が指摘されてきたこともあり急遽追加した。シェルターに関する実験では、各水槽にニジマスとヤマメを混養し、水槽底部にシェルター(塩ビ製円板)を設置したシェルター群5水槽と、シェルターが無いコントロール群5水槽を用いて自発摂餌で飼育した。

その結果、摂餌活動(自発摂餌のスイッチ起動回数)と1日当たりの平均摂餌量はシェルター群がコントロール群に比して有意に高い結果が得られた。また、両魚種ともシェルター群はコントロール群に比して有意に体重の増加が認められた。一方、攻撃行動や鰭の損傷に関しては、両群間に有意差が認められなかった。以上のことから、シェルターの設置は非優占魚や被攻撃魚に対する攻撃を回避する効果よりも、摂餌活動を増加させる効果のあることが示唆された。ニジマスとヤマメを用いた非優占魚および被攻撃個体のストレスを体色変化で測定する実験では、飼育時の静止画像や映像を撮影し、頭部・背部・腹部・尾部の部分的な拡大写真を比較測定した結果、体色変化を指標とすることは汎用性の点で困難であることが分かった。指標として使用するためには、遊泳個体の特定法と容易な追尾撮影、水槽底部での光量改善等が必須条件となることが判明した。本研究は平成22年度から24年度までの3年間の計画の2年目である。実験は当初計画に沿ってほぼ順調に進展しその成果も得られている。研究の目的、達成度などの点から(2)と評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の研究は3年間の実施計画の最終年度になることから、アニマルウェルフェア五原則の恐怖・苦痛の回避に関する実験を実施する。具体的には、恐怖・苦痛を評価するために、群れの中の個体および群れ全体について、正常時とストレス下での体表の明度を数値化し比較検討する。さらに、恐怖・苦痛からの回避に関する実験として、逃避場所を設置し逃避行動に関する実験を行う。いずれも自発摂餌下で、混養も組入れた実験を行う。現在のところ、研究計画の変更あるいは研究を遂行する上での問題点はない。
日本人学校におけるグローバル人材育成にむけた新たな教育モデルの創出に関する研究

本研究は、日本人学校でどのようなグローバル人材が育成できるかをこれまでの実践報告の分析と調査等を通して明らかにすることを目的にした。日本人学校で育成可能な人材とは、グローバル型能力と英語力を兼ね備えた人材、バイカルチュラル・バイリンガルで二つの国の架け橋になる人材、現地コミュニティにおけるリーダーとなる人材、そして親日的な人材の4タイプである。香港日本人学校などを通してこうした人材育成の具体の取り組みを検討し、日本人学校の新たな教育モデルを構築するための課題を明らかにした。平成26年度は、香港日本人学校と蘇州日本人学校の訪問調査を行った。香港日本人学校では、学校の現状と課題について関係者と協議するとともに、香港校小学部、同中学部、大甫校小学部、同中学部、そして同国際学級を訪問し、授業参観と主幹クラスの教員にインタビュー調査を行った。その調査で香港校が児童生徒の減少が続いており、なんらかの改革が必要なことが関係者の共通認識になっていることが明らかになった。そこで、香港校小学部において、グローバル人材の育成をめざして改革を行うことになり、その改革に参画することになった。蘇州日本人学校では、学校運営委員、校長、教頭との協議を行うとともに、教員に面接調査を実施した。また、蘇州日本人学校の児童生徒を対象にして、学習習慣、学習意欲、生活実態、交友関係、自己概念等を把握するためのアンケート調査を共同で実施することになった。平成26年12月に小学部300名、中学部75名について調査を終えた。成果としては、香港日本人学校では、香港校小学部でグローバル人材の育成を目指した「国際学級」を開設することになり、そのための教育の基本設計とカリキュラムの基本構造を共同で検討することになった。今回の研究の目的が、グローバル人材育成のための日本人学校の教育モデルを検討することにあり、その一歩になる。蘇州日本人学校では児童生徒調査により学校の教育課題を明らかにできる点が成果である。平成27年度は、その結果をもとに教員の研修会を実施する予定である。平成27年度は、香港日本人学校と蘇州日本人学校の訪問調査を行った。香港日本人学校では、香港小学校を訪問し、新しく設置する「グローバル・クラス」について、学校関係者と協議した。特に新しく開設する科目「グローバル・スタディズ」について基本的なコンセプト、カリキュラムの枠組み、授業の進め方、評価の仕方などについて検討し明確化した。特に、トピックの選択の仕方、活動の組みたて方(長期にわたるプロジェクト型学習)、教師の指導などの具体的な課題について話し合いを行った。その後も、グローバル・クラスの平成28年度開設に向けた支援を継続的に行った。蘇州日本人学校では、全児童生徒を対象にして、学習習慣、学習意欲、生活実態、交友関係、自己概念等を把握するための質問紙調査を学校と共同で実施し、その結果を全教職員に向けて報告し、具体の指導の課題について協議した。特に、学力調査結果と質問紙調査結果とを各学年ごとにつきあわせをし、指導の指針について協議を行った。成果としては、香港日本人学校では、香港校小学部でグローバル人材の育成を目指した「グローバル・クラス」の開設が決定し、新たな日本人学校の教育モデルの1つを示すことができた点である。特に、その特徴として高い日本語能力と英語力をつけるためのカリキュラム、独自科目の「グローバル・スタディズ」の内容が明確になった点は大きな成果の1つである。また、蘇州日本人学校では児童生徒の実態調査により学校・学級の具体の課題を明らかにできた点が成果である。平成27年度は、蘇州日本人学校、香港日本人学校の2校に絞り調査を継続することだったが、予定通り訪問調査が遂行できた。特に、香港日本人学校の新しい試みが実現したことは大きな成果である。しかし、まだ、立ち上がったばかりであり、継続的な支援が必要である。平成28年度にも訪問調査を行い、成果の検証と課題を明らかにするとともに、必要な支援をついて検討する。蘇州日本人学校では全児童生徒を対象にした質問紙調査を行い、それをもとに指導計画の作成までこぎつけたことは成果である。ただ、その指導計画がどの程度まで実行に移され効果が出ているかという評価はこれからの課題である。また、両校とも派遣教員の任期が23年であり、担当してきた教員が入れ替わることになり、こうした試みをどのように継続するかが大きな課題であり、この対応について具体的に検討する必要がある。平成28年度は、香港日本人学校とクアラルンプール日本人学校の調査を行った。香港日本人学校の調査では、平成28年度に開設した「グローバルクラス(国際学級)」の成果の検証を行うとともに、中学部の「グローバルクラス」の開設について、学校関係者と協議を行った。「グローバルクラス」については、英語力と独自科目であるグローバルスタディズの実践について、レポートなどをもとに成果の検証を行ったが、成果の検証はまだ不十分である。クアラルンプール日本人学校は、国際結婚家庭の児童生徒の増加により、日本語教育が大きな課題になっており、現状では課外で週1回程度日本語指導を行っている。この日本語教育の現状と課題について学校関係者と協議し、今後の支援のあり方を検討した。しかし、具体の支援についてはまだ具体化できていない。平成28年度の成果としては、これまでの調査結果から、日本人学校の改革の視点として「ダイバーシティ」がキーになることが明確になっている。日本人学校においては、多様な子供が共に学び、その多様性を活かす教育が可能であり、そのことがグローバル人材の育成にもつながる。

日本人学校は、多様な人種、民族、文化、宗教などから成る海外に設置されており、その特質を教育に活かし子供たちの多様な見方や考え方を育成するための教育を構築していく必要がある。新たな教育モデルの構築には補充調査等を行うなどもう1年期間が必要である。平成29年度は補充調査を行うとともに、これまでの成果をまとめ、教育モデルの構築を目指す。また、平成28年度までに調査が実現できなかった日本人学校についても訪問調査を行い、各学校での成果とともにグローバル人材育成に向けた日本人学校の教育モデルを提案する。香港日本人学校については予定通り訪問調査を行い、グローバル人材育成のための教育モデルについての共同検討が実現した。また、グローバル化に伴い日本人学校の児童生徒の多様化が急激に進行している。特に国際結婚家庭の児童生徒が増加しているクアラルンプール日本人学校の訪問調査が実現し、日本語指導の実態について学校関係者と協議を行うことができた。国際結婚家庭の児童生徒を中心に、学年相当の日本語の力が十分に備わっていない児童生徒への日本語教育の取り組みの実態が把握できた。平成27年度から、放課後に日本語支援教室を開設し、希望する家庭の子供を対象に指導を行っている。平成28年度は、学年相当の日本語の力で身についていないことを重点的に補習しているが、体系性が十分でなく、学校全体での取り組みもまだ不十分なことが明らかになった。学校全体で日本語指導にどう取り組むかが課題であることを共通確認できた。ただ、平成28年度に予定していた日本人学校(蘇州日本人学校、台北日本人学校)の訪問調査について日程調整が困難となり、実施できなかった。以上のことから、おおむね順調に進展していると評価する。本研究では、日本人学校でどのようなグローバル人材が育成できるかをこれまでの実践報告の分析と調査等を通して明らかにした。その結果、第1に広い視野、論理的思考力、適応力、自己表現力などのグローバル型能力と英語力を兼ね備えた人材(香港日本人学校、シンガポール日本人学校等)、第2に日本語能力・外国語能力を持ち、二つの文化と社会を理解し二つの国の架け橋になる人材(台北日本人学校等)、第3に世界各国の日系人及び現地コミュニティにおけるリーダーとなるグローカルな人材(タイ日本人学校、アスンシオン日本人学校等)、そして第4に日本社会・文化、日本語を理解し、日本を支援する親日的な人材(西大和学園カリフォルニア校等)、の4タイプである。第2の成果は、香港日本人学校の実践からグローバル人材育成のための実践モデルを提案したことである。香港日本人学校は、国際バカロレア(IB)に準拠した教育を軸に改革を進めており、その立ち上げと具体のプログラム開発の支援を行ってきた。特設の「グローバルクラス」を立ち上げ、理科と算数の英語「イマージョン」教育、独自教科である「グローバル・スタディズ」といったプロジェクト学習を導入した。平成29年度については、「グローバル・スタディズ」の小学5年生用の単元の開発支援と「協働学習プロジェクト」のプログラム(「学校にいけない子どもたち」)の単元の開発支援を行った。
検体に尿を用いた結核迅速診断キットの実用化の検討

本年度はカムワン県内の病院においてインフォームドコンセントのもと結核患者(疑いを含めて)の検体を収集した。今回、HIV感染との混合感染の患者2名を含む約40名の結核患者の検体(尿及び血清)をサンプリングすることができた。特に発展途上国において結核とHIVとの混合感染者は年々増加しており、これらの患者の診断を行う事も重要視されている。昨年度から新規診断用抗原としてクローニングしたDNAを用いて、発現ベクターへのクローニング、大腸菌による発現させたタンパクの精製を行った。このタンパクをドットブロット法により収集した検体を用いてその診断の有用性を件とした結果、活動性結核患者の検体を用いた場合は確実に陽性を示すことが分かった。しかしながら非結核患者において頻度は少ないものの陽性及び擬陽性を示すものがあった。これはラオスでも実施されているBCGワクチン接種の影響が関与していることも示唆され課題が残された。そこで今後は簡便で確実に診断可能な診断法を開発することが必要であると考え、活動性結核において尿中に特異的に検出される新規バイオマーカーの探索を行うことにした。その上で、その診断法としての有用性を確認するために収集した複数の患者検体を用いて、その個体差による比較及び治療経過におけるバイオマーカーと症状との関連も同時に検討する。これにより、結核患者における活動期と非活動期とのバイオマーカーの検出量の差及び種類の違いを捉えることで、活動期か非活動期かの見極めや治療効果の目安にもなる指標としての有用性を検討する予定である。診断用キットを開発する上で必要な抗原MPB64タンパクを取得するため大腸菌によるリコンビナント抗原の作成を行った。今までに取得したリコンビナント抗原は、1)発現量の低さ、2)不溶性タンパクとして発現するなどの理由から再検討が必要であった。そこで、当該年は発現安定性の向上のため、mpb64遺伝子を発現ベクターに組む際に発現安定化を図るコドンを挿入し、発現ベクターへの再クローニングを行った。更に発現タンパクの可溶化することを目的に実績のある数種類の大腸菌株(ホスト)にトランスフォームし、検討を行った。その結果、発現量の改善は見られたものの、可溶化に関しては劇的な改善は認められなかった。現在、リコンビナント抗原の大量取得を目指し、培養のスケールアップとその際の目的タンパクの発現量の相違を検討することで、最適な培養条件を検討している。また、研究計画によると当該年は検体を収集するラオス国において倫理申請書の承認まで非常に時間がかかっており未だ検体を収集するに至っていない。本調査にともなう前段階とした、ラオスカムワン保健局との協議ならびに結核病院との協力の構築とタイマイドン大学における熱帯地域の結核診断状況の情報収集をおこなった。倫理申請書の承認が下り次第、ラオスカムワン県において病院にて結核、特に活動性結核と診断された患者に対してインフォームドコンセントを行い、検体を採取していく予定である。本年は共同研究先であるラオス国と検体の採取に関して、共同研究の申し出と倫理申請書の承認手続きを行った。従来は比較的短期間での申請書の承認が得られていたが、昨年より政府の組織とシステムが大きく変わり非常に煩雑になった。申請書は英語とラオス語の併記が必要となり、内容に関しても査読者の増加など審査も非常に厳しくなり承認を得るまでに時間を要するようになった。予想以上に承認まで時間がかかっているために検体採取が未だできておらず、予定より少し遅れている状況である。1.ラオス国での検体の収集共同研究先であるラオス保健省に依頼をし、カムワン県内の病院においてインフォームドコンセントのもと結核患者(疑いを含めて)の検体を収集した。昨年ラオス保健省に対して申請を行っていた倫理申請書がようやく承認されたため、カムワン県内の病院にて結核患者(疑いを含め)92人から検体(血清と尿)を採取することが出来た。しかしながら、活動性結核の患者の数が予想以上に少なく、さらなる患者数の取得が必要である。また、治療前、治療中、治療後の数回分のサンプルをそれぞれ取得してもらい、それぞれの段階において反応性がどのように変化するか検討する予定である。2.リコンビナントタンパクの精製と患者血清との反応性の検討診断用キットを開発する上で必要な抗原MPB64タンパクを取得するため大腸菌によるリコンビナント抗原の作成を行った。昨年までに可溶化をうまくいかず、不溶性タンパクのまま尿素に溶解し、His-tagを用いて精製を行った。その後、ラオスより取得した検体を用いて患者と健常者の比較検討を行った。喀痰塗抹検査陽性の結核患者より取得した血清を用いてDotBlot法にて評価を行った結果、健常者と比較してその反応性は明らかに強かった。しかしながら、健常者にも弱いながら反応性が認められ、非特異的反応が検出された。そこで、現在1次抗体である血清及び2次抗体の希釈倍率の再検討を行う事で最適化を図っている。また、新たな抗原の候補として結核菌cDNA libraryから患者血清を用いてスクリーニングを行い、診断キットに最適な抗原を探索する。現在、候補遺伝子のクローニングを行い、発現タンパクの確認とその反応性を患者血清を用いて検討しているところである。ラオス国において遅れていた倫理申請書の承諾がようやく取れ、2017年9月にラオス国カムワン県の保健局に出向き結核患者殻のサンプル採取を正式に依頼し、受け入れられた。