hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タイ類スジゴケ科における葉状体の組織機能分化からみた系統分類

平成14年8月に石川県及び平成14年10月に中華人民共和国雲南省哀牢山において,現地調査を行い,本研究の材料であるタイ類スジゴケ科スジゴケ属Riccardiaおよびミドリゼニゴケ属Aneura各種の生育環境,生態を調べた.また,資料を持ち帰り,光学顕微鏡で葉状体における油体の分布を調べ,その分布パターンと生育環境との関係を調べた.その結果,今まで知られていなかったRiccardia barbuloidesの油体を確認することができた.資料の一部は,透過型電子顕微鏡で観察するための予備実験を行い,また,一部は,樹脂包埋した.また,太平洋諸島のバヌアツのフタマタゴケ目Metzgeriales及びゼニゴケ目Marchantialesを研究した中において,本研究の一部として,スジゴケ科の標本を調べ,3属9種を認めた(Furuki 2002).この9種はいずれも同諸島から新報告となるものであった.この内,Riccardia elataは従来,R. plumosaの異名とされていたが,独立種として認めた.R. womersleyanaとR. heterocladaの油体については,報告がなかったが,観察することができ,現在,考察中である.研究資料を収集するために,箱根山とマレーシアマレー半島,ボルネオ島において野外調査を行い,Aneuraceaeの資料を生品として持ち帰った,今年度は主に,スジゴケ属Riccardiaのsubgenus Hyaloneuraとsubgenus Corioneuraを観察した.その結果,Hyaloneuraの葉状体では,小さい油体が一つの細胞に多数含まれ,ミドリゼニゴケ属Aneuraの葉状体に見られる油体に酷似しているが,Corioneuraではまったく異なり,大きな油体が1細胞に一つしか含まれないことが分かり,改めてこの2亜属の独立性が示された,この過程で,これまで,R.canaliculataとされてきた中に別種と考えられるものが含まれる可能性が示され,検討課題として研究を進めている.また,スジゴケ属の中では,唯一油体が認められないミヤケテングサゴケに近縁と考えられる種をボルネオ島において発見した.日本産と比較したが,一致する形態は多いが,唯一細胞の大きさが異なり,検討中である.その他,これまで,ニューギニアからしか知らわていなかったスジゴケ属の種をボルネオ島において数種採集し,新たに油体を観察することができた.その結果,これまで,Riccardia graeffeiとされてきた種群には,2通りの油体が確認された.底地に生育する種は本種であると思われるが,高地に生育する種は油体が異なり,別種である可能性があり,この種の分類学的種概念を再検討する必要性が示唆された.更に.ミドリゼニゴケ属Aneuraのおいて,葉状体の縁が不規則に切れ込み,あたかも無性芽的な構造をしており,葉状体の背面にも無性芽的な構造を有する種をボルネオ島において発見し,機知の種と比較検討を重ねている最中である.今年度は,当初の申請段階では,欧州の標本庫で基準標本を探索する予定であったが,大まかな基準標本は見ることができたことと,当該博物館におけるコケ植物担当者が死去したことにより,計画を変更した.そして,葉状体の表面にベルカがある種,R.crassa,R.hydra,R.grollei,R.asperaなどの研究と東南アジア産のAneuraceaeの種とオーストラリア産の種を比較するために,タスマニアにおいて補足的に調査を行った.
滑膜肉腫の組織発生

1)滑膜肉腫例の種々の方法による検索:光顕的には従来言われている細胞二相性、腺腔様構造を有する症例の他、単相性症例や種々の細胞密度で紡錘形細胞が増生する例なども対象とした。電顕的には、上皮様細胞、線維芽細胞様細胞を認め、上皮様細胞ではデスモゾ-ム、基底膜も明らかで、腺腔形成もみられる。免疫組織化学的には、主として上皮様細胞にケラチン、EMAが陽性で、さらに基底膜蛋白laminin、type IVコラ-ゲンが周囲に証明された。又、症例によっては、Sー100蛋白、NSE、デスミン陽性細胞までも散見された。レクチン組織化学ではPNA、UEA1が上皮様細胞に陽性である。以上の所見から、本肉腫は腺癌と肉腫部分よりなる癌肉腫と考えるのが妥当と思われる。肉腫部分が様々な分化傾向を示しているというのも癌肉腫という概念とも一致している。2)非腫瘍性滑膜組織の検索:種々の非腫瘍性滑膜組織いずれにても、1)でみられたような上皮様形態所見、マ-カ-局在及び種々の分化傾向は全く認められない。癌肉腫の基盤となり得る所見は特にみられない。3)実験的肉腫作製による検索:ラット膝関節内DMBA注入による滑膜lining cellの初期変化としては異型的増生、腫大をみるが、上皮様分化の所見は認められない。腫瘤形成時の組織像は、未分化肉腫とするのが妥当なもので、腺癌への分化や、種々の分化を示唆するマ-カ-局在も認められない。種々の検索法で、この傾向は一致している。4)総括的考察:滑膜肉腫は癌及び種々の分化を示し得る肉腫像よりなる癌肉腫として定義づけるべきである。一方、滑膜組織には、上皮様分化をはじめ、種々の分化を示す傾向は全く認められず、滑膜由来の実験的肉腫においても同様である。滑膜肉腫の起源を滑膜に求める根拠は認め難く、多分化能を有する未熟間葉系細胞に求めるのが妥当と考えられる。1)滑膜肉腫例の検索:電顕的検索では、明らかな2相性形態が腫瘍細胞に認められた。腺腔構造を伴う上皮様細胞、線維芽細胞様の紡錘形細胞である。両者の移行型と考えられる細胞も観察された。上皮様細胞間にはデスモゾームも明瞭に認められ、microvilliが腺腔側にて認められ、症例によっては単一線毛(single cilia)も観察された。明瞭な基底膜構造が上皮様細胞周囲には認められた。以上、上皮様細胞より成る部は形態学的に腺癌像と考えて何らさしつかえない所見である。又、上皮様細胞、紡錘形細胞ともに胞体内に中間径フィラメントを豊富に認めた。免疫組織化学的検索では、主として上皮様細胞にケラチンを認めるが、低分子量のケラチンに限って局在が観察された。ビメンチンは主として紡錘形細胞に認めるが、上皮様細胞の一部にもケラチンと共に局在が密に認められた。基底膜蛋白laminin type IVコラーゲンは上皮様細胞周囲に明瞭に染色された。

又、紡錘形細胞部では、Sー100蛋白、NSE陽性細胞が散見され、症例によっては、デスミン陽性細胞も見出された。以上の所見の他に、レクチン組織化学による検索にて、PNA UEA1が上皮様細胞のみに陽性であるといった所見も認め、今回の検索では滑膜肉腫は癌への分化を明らかに伴う肉腫(癌肉腫)といえる。2)非腫瘍性滑膜の検索:電顕的にlining cellに上皮様分化を認めることはできず、基底膜やデスモゾームといった構造はみられない。組織化学的検索でも同様である(ケラチン、laminin type IVコラーゲン陰性など)。デスミンやSー100蛋白陽性細胞も認められない。以上、通常の滑膜組織には癌肉腫の基盤となるような所見を見出し得ない。3)実験的肉腫作製による検索:ラット膝関節内DMBA注入による滑膜lining cellの異型的腫大・増生を初期変化として認めるが、上記のような上皮分化は未だ把握できない。次年度の研究で継続観察する。1)実験腫瘍の光顕的検索:ラット膝関節内DMBA注入によって、初期変化としては、滑膜lining cellの腫大・増生を認める。ヒトの炎症性疾患などで認められるlining cellの同様の変化と比較すると、核異型が若干みられる点が異なる。腫瘤形成時の組織像では、類円形、多角形もしくは紡錘形細胞の密な増生を認める。島状の配列を示す部分や、slit状の空隙を形成する部、嚢胞状の部分に立方状細胞が突起様配列を示し隆起する像などを認めるが、あきらかな管腔様構造の形成や細胞二相性という所見は認められない。2)電顕的検索:実験腫瘍では、かなり未分化な間葉系細胞より成り、特徴的所見に乏しい。基底膜、デスモゾ-ムなどの上皮様分化は認められず、腺腔構造や明瞭な細胞二相性も認められない。細胞内小器官もさほど豊富ではなく、中間径フィラメントも少量である。3)組織化学的検索:初期変化及び腫瘤形成時においても免疫組織化学的にケラチン、laminin、typeIVコラ-ゲンの局在は認められず、上皮様分化を示していない。ビメンチンは両群ともに陽性を示している。レクチン組織化学でもUEA-1は陰性である。また、デスミン、S-100蛋白、NSE陽性細胞も認められず、ヒト滑膜肉腫とは異なり、上皮様性格や多彩な細胞分化を示していないと結論づけられる。4)ヒト滑膜肉腫との対比:ヒト滑膜肉腫は明らかな上皮性格を示しており、多彩な分化を併せ持つ癌肉腫として表現し得るものであるが、滑膜内実験腫瘍では、これらの性格を示している像を確実に把握することはできない。滑膜lining cellにこのような分化を示しうる潜在的能力を想定することは疑問であると言わざるを得ない。実験的腫瘍の中で嚢胞状の部を示すものがあり、ヒト滑膜肉腫との類似も考えさせられるが非特異的所見と考えるのが妥当である。
上皮管腔形成におけるWnt5aによる極性制御の分子機構

本研究では、マウス胎児より摘出した臓器の上皮管腔組織をモデルとし、管腔形成におけるWntシグナルによる極性制御の分子機構とその意義を明らかにすることを目的とする。今年度は、上皮管腔形成を解析するための実験系の確立、極性因子群の局在変化、Wntリガンドによる上皮管腔に対する影響を解析した。実験系として、胎生11日目マウス胚より摘出した肺を用いて1)器官培養(細かな穴(直径0.4μm)の開いたフィルターをメディウム上に浮かせ、その上に臓器を静置し培養する)、2)上皮単独培養(間質を取除いた上皮組織をマトリゲル内に埋め込み培養する)、の二つの培養系を確立した。これにより注目している極性因子群の局在変化解析や過剰発現系及び発現抑制系を用いた機能解析を行うことが可能となる。次に頂底極性に関与する極性因子群の局在変化を解析するため、免疫染色を行ったところ、頂端マーカーであるEzrinが管腔の陥入部において消失している。このことから上皮管腔が分岐する際には脱極性が必要であることが考えられた。さらに興味深いことに、Wnt5aリガンドを上皮単独培養系に処理すると分岐が抑制され、頂端マーカーの強い染色が見られたことから、極性化に対して促進的に働くことが考えられた。一方、Wnt-β-カテニン経路の代表的リガンドであるWnt3a処理によって、上皮管腔の分岐が誘導されることも見いだした。Wnt5aはWnt3aによる遺伝子発現調節経路(Wnt-β-カテニン経路)を抑制することが知られており、Wnt5aは生理的に発現している他のWntリガンドに対して抑制的に働いている可能性も考えられる。以上より、Wnt5aによる極性制御だけでなく、Wnt5aと他のWntリガンドとの協調的な働きが管腔形成に重要であると考えられた。
幼少期ストレスによる神経回路変容が引き起こす心身異常の総合的理解

幼少期に虐待やネグレクト(育児放棄)などの大きなストレスを経験すると、脳内に異常が生じ、将来うつ病や心的外傷後ストレス症候群(PTSD)などの不安障害の発症率が高くなることが知られている。また、心臓病や肺がんの発症率も上昇すると言われている。このように、幼少期ストレスは、脳内神経回路の正常な成熟を妨げることで、精神だけでなく身体にも将来的に深刻な異常をもたらす危険性がある。本研究では、幼少期に母仔分離ストレスを経験したマウスを用いて、幼少期ストレスによって精神と身体の両方に異常を引き起こす脳内神経回路の変容機序の解明を目的とした。前年度に、幼少期ストレスが高所ストレス耐性機構に対して雌雄で異なる影響を与えることを見出した。平成30年度は次のような成果を得た。1.異なる性質の匂い物質を用いて匂い認知試験を行った。嫌悪臭である酪酸に対する行動には、幼少期ストレスは雌雄で異なる影響を与えた。すなわち、オスでは嫌悪行動が全く見られなくなったのに対して、メスでは嫌悪行動がわずかに低下しただけであった。2.先天的恐怖を誘起するピラジン化合物に対する行動には、幼少期ストレスの影響は雌雄いずれにおいても見られなかった。3.脳内神経活性の網羅的解析を行った。幼少期ストレスは、情動やストレスに関する脳部位である扁桃体における神経活性に大きな影響を与えた。以上のことから、幼少期ストレスが嗅覚を介するストレスを制御する脳内神経回路にも影響を及ぼし、その影響にも性差があることが明らかになった。嗅覚と高所という異なるストレスに対する耐性に、幼少期ストレスが異なる影響を与えることは興味深い。今後、この新たに派生した研究課題についても取り組んでいく予定である。概ね研究実施計画に記載したスケジュール通り研究が進行しているので。ほぼ予定通り進行しているので研究の大幅な変更はないが、計画していた研究から派生した研究課題について今後取り組んでいく。幼少期に虐待やネグレクト(育児放棄)などの大きなストレスを経験すると、脳内の神経回路に変容が生じ、将来うつ病や心的外傷後ストレス症候群(PTSD)などの不安障害の発症率が高くなることが知られている。このように、幼少期ストレスは精神だけでなく身体にも将来的に深刻な異常をもたらす。本研究では、幼少期に母仔分離ストレスを経験したマウスを用いて、幼少期ストレスによって精神と身体の両方に異常を引き起こす脳内神経回路の変容機序の解明を目的とする。初年度である平成29年度は次のような成果を得た。1.幼少期の母仔分離ストレスは、予想通り、与える期間に応じて異なる影響を与えた。また、この母仔分離ストレスは仔マウスだけでなく親マウスにも大きなストレスを与えた。2.高架式十字迷路試験により仔マウスのストレス耐性を調べた結果、幼少期ストレスが雌雄に対して異なる影響を与えることを見出した。すなわち、オスはストレスに対して過度の耐性を示したのに対して、メスのストレス耐性は低下した。2.仔マウスの血中コルチコステロン濃度についても、幼少期ストレスは雌雄に対して異なる影響を与えた。このことから、幼少期ストレスが仔マウスの脳内神経回路に及ぼす影響には性差があるという興味深い知見が明らかになった。概ね研究実施計画に記載したスケジュール通り研究が進行しており、新たに派生した研究課題についても取り組み始めているので。

次年度使用額が生じた理由は、新たに派生した研究課題に取り組むために、当初の研究計画を変更したため。本研究を遂行するための設備・装置はほぼ揃っている。そこで、試料調製・解析のために必要な免疫組織化学染色実験、ELISA解析実験、薬物の脳内微量注入実験に関連する試薬や消耗品を購入する。また、研究成果発表のための交通費・宿泊費や論文投稿費として使用することを計画している。研究計画の遂行にあたり、免疫組織化学染色実験および薬物の脳内微量注入実験に必要な試薬や消耗品を購入する。
児童・生徒のスキーマと映像視聴に関する実験研究

映像視聴の個人差を過去の経験によるスキーマと関連づけ,映像を視聴した分類することを課題とした成人対象の実験を行ってきた.成果として映像の分類方法には短期記憶と関連する「共通点分類」,長期記憶と関連する「イメージ分類」の二つがあること,また,個人差が表面化する段階として,映像から共通点分類のための「キュー(手がかり)」をみつけだす段階,映像が「キュー」に合致しているか判断する段階,いくつかの映像からイメージを浮かべる段階の三つがあることを明らかになっている.今回,上記の個人差が児童でもみられるかどうか,スキーマによる分類の違いが児童でもみられるかどうかをねらいとして以下のような実験を行った.〈実験映像〉著作権フリーのCD-ROMから「京都」「大阪」「イタリア」の静止画を4枚ずつ選び,それらをもとにアマチュアの作曲家に依頼して10秒程度の音楽をつけ,静止画+BGMという形にした.実験映像はコンピュータ上で被験者が自由に視聴できるシステムにした.〈被験者〉大阪府下のA小学校5年生10名,富山県下のB小学校5年生11名〈実験手順〉映像視聴→映像分類→インタビュー実験の結果,共通点分類が多いこと,また個人差はキューをみつけだす段階でうまれやすいことがわかった.スキーマとの関連では,富山の児童は「テレビでみたことがあるから」と大阪名物(道頓堀)を「大阪」と分類しているのに対し,大阪の児童は「遠足で行ったから」と大阪以外にもあるような映像(大阪城公園)も「大阪」と分類している.また,富山の小学校は海に面した町であるが,いくつかある川の映像についてはすべての児童が「海」と分類していた.以上より,児童と成人では映像分類の方法に違いがあること,スキーマによる映像分類が児童でも行われることがわかった.今後,ネットワーク上でこの実験を行い,主に地域のスキーマによる映像視聴の個人差をみていきたい.映像視聴の個人差を過去の経験によるスキーマと関連づけ,映像を視聴した分類することを課題とした成人対象の実験を行ってきた.成果として映像の分類方法には短期記憶と関連する「共通点分類」,長期記憶と関連する「イメージ分類」の二つがあること,また,個人差が表面化する段階として,映像から共通点分類のための「キュー(手がかり)」をみつけだす段階,映像が「キュー」に合致しているか判断する段階,いくつかの映像からイメージを浮かべる段階の三つがあることを明らかになっている.今回,上記の個人差が児童でもみられるかどうか,スキーマによる分類の違いが児童でもみられるかどうかをねらいとして以下のような実験を行った.〈実験映像〉著作権フリーのCD-ROMから「京都」「大阪」「イタリア」の静止画を4枚ずつ選び,それらをもとにアマチュアの作曲家に依頼して10秒程度の音楽をつけ,静止画+BGMという形にした.実験映像はコンピュータ上で被験者が自由に視聴できるシステムにした.〈被験者〉大阪府下のA小学校5年生10名,富山県下のB小学校5年生11名〈実験手順〉映像視聴→映像分類→インタビュー実験の結果,共通点分類が多いこと,また個人差はキューをみつけだす段階でうまれやすいことがわかった.スキーマとの関連では,富山の児童は「テレビでみたことがあるから」と大阪名物(道頓堀)を「大阪」と分類しているのに対し,大阪の児童は「遠足で行ったから」と大阪以外にもあるような映像(大阪城公園)も「大阪」と分類している.また,富山の小学校は海に面した町であるが,いくつかある川の映像についてはすべての児童が「海」と分類していた.以上より,児童と成人では映像分類の方法に違いがあること,スキーマによる映像分類が児童でも行われることがわかった.今後,ネットワーク上でこの実験を行い,主に地域のスキーマによる映像視聴の個人差をみていきたい.
官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを活用する実践的合成反応

本研究では独自開発した官能基化トリメチルシリルジアゾメタンの有機合成反応への展開を検討した。結果、(o-トリメチルシリル)アリールトリフルオロメタンスルホナートから発生したベンザインとの分子間[3+2]環化付加反応により対応する3-置換インダゾールが効率よく得られることを見出した。さらに官能基化トリメチルシリルジアゾメタンの酸化反応では、高度に官能基化されたアシルシランが合成できること、1-メチルキノリニウム塩との反応続く環拡大反応により1-メチル-1-ベンズアゼピンが得られることを見出した。また、官能基化トリメチルシリルジアゾメタンの調製に用いるトリメチルシリルジアゾメタンのマグネシウムブロミド塩とo-アニシル(オキソ)アセタート類の反応によるベンゾフラン合成法も確立した。最近、研究代表者は反応剤としてジアゾ(トリメチルシリル)メチルマグネシウムブロミドを独自に開発し、この反応剤とカルボニル化合物の反応により、官能基化トリメチルシリルジアゾメタンが簡便に合成できることを見出した。私たちは、得られる官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを活用することで様々な誘導体の効率的合成を達成できると考え、本研究では官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを活用する実用的合成反応の開発を目指した。本年度は、まず官能基化トリメチルシリルジアゾメタン合成の汎用性の検討を行い、より広範囲のカルボニル化合物に適用できることを見出した。また、汎用性検討の過程において、反応温度を上げることでo-アニシルオキソアセタート類からベンゾフラン類が得られるといった新規合成反応も見出した。次に、官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを用いた合成反応として、3-置換ピラゾールおよびその多置換誘導体の合成を検討した。その結果、(o-トリメチルシリル)アリールトリフルオロメタンスルホナートより発生したベンザインと官能基化トリメチルシリルジアゾメタンの分子間[3+2]環化付加反応により対応する3-置換インダゾールを効率的に合成することに成功し、カルボニル化合物からの2工程合成法の確立に成功した。さらに、官能基化トリメチルシリルジアゾメタンの酸化反応により、合成中間体として有用と考えられる官能基化アシルシランが合成可能であることを見出した。最近、研究代表者らは反応剤としてジアゾ(トリメチルシリル)メチルマグネシウムプロミドを独自に開発し、この反応剤とカルボニル化合物の反応により、官能基化トリメチルシリルジアゾメタンが簡便に合成できることを見出した。私たちは、得られる官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを活用することで様々な誘導体の効率的合成を違成できると考え、本研究では官能基化トリメチルシリルジアゾメタンを活用する実用的合成反応の開発を自指した。本年度(最終年度:2年目)は、まず官能基化トリメチルシリルジアゾメタン合成の汎用性の拡張を目指して種々検討した結果、N-メチルキノリニウム塩とジアゾ(トリメチルシリル)メチルマグネシウムプロミドの反応で定量的に1,2-付加体が進行して対応する官能基化トリメチルシリルジアゾメタンが得られることを見出した。本反応においてジアゾ(トリメチルシリル)メチルマグネシウムプロミドの代わりにジアゾ(トリメチルシリル)メチルリチウムを用いた場合、1,2-付加と1,4-付加が共に進行し、その収率も低下することが分かった。また、本生成物である官能基化トリメチルシリルジアゾメタンをCuClと処理することでカルベノイド中間体を介して環拡大反応が進行し、対応する1-メチル-3-トリメチルシリル-1-ベンズアゼピン類が得られることを見出した。また、3位のトリメチルシリル基は容易に脱保護可能であった。
先天色覚異常における赤緑視色素遺伝子変異の機能的解析

1.正常色覚男子230例の解析により日本人におけるL視色素遺伝子のコドン180,296,M遺伝子のコドン283における多形の頻度などがコーカソイドとは異なることを明らかにした。2.プロモーターにおける変異(-71A>C)が転写因子との結合の妨げとなり,結果として遺伝子の発現が抑制され色覚異常の原因となる可能性を示した。3.-71Cの頻度の人種差を調べた結果,日本人:56/230(24.3%),中国人:19/98(19.4%),タイ人:8/104(7.7%),白人:1/50(2%),黒人:0/14(0%)であり,人種により相違があることを明らかにした。4.先頭の遺伝子,後続の遺伝子,最後尾の遺伝子を別々にPCRし,その産物を解析することにより保因者の診断が可能であった。正常色覚女性117例中11例が保因者と判断された。5.3年間で514の色覚異常例を解析した。その中で男子の解析例数463の内訳はP69,PA62,D152,DA167,PCD13例であった。6.P69例の遺伝子型は,P型53,PA型11,正常型3,確定不能2,PA62例は,P型4,PA型50,正常型4,確定不能2,逆正常型(M-L)2,D152例は,D型128,DA型4,正常型7,確定不能13,DA167例は,DA型106,D型14,正常型26,確定不能21,PCDの13例は全例が正常遺伝子型で-71Cを持っていた。臨床型と遺伝子型の不一致例88のうち53例は-71C,あるいはAsn94Lys,Gly338Glu,Cys203Arg,Pro231Leuなどのアミノ酸置換やエキソン5の2塩基欠失で説明がつくものであった。7.なお説明のつかない不一致例が17例残っている。また表現型は異常3色型(2種類の赤錐体あるいは2種類の緑錐体を持つ)であるが遺伝子型が2色型というケースが18例ある。これらの解明が今後の課題となろう。1.新たに解析したもめを加えるとこれまでに正常色覚男子230名,一般女子117名,家系的に保因者である女性6名,保因者診断希望の女性7例,色覚異常341名(第1異常男子94例,第2異常男子247例・色覚異常女子14例)の赤緑視色素遺伝子について解析を行った。2.すでに報告した変異Asn94LyS,Arg330Gln,Gly338Gluに加え,新たにPro231Leu(赤エキソン4)を見出した。これらの変異に他の報告者によるCys203Arg(緑エキソン4)およびPro307LeU(緑エキソン5)の6種の変異を導入したcDNAを用いてオプシンタンパク質を発現させ,次いで11-シスレチナールを結合させて視色素を再構成し,吸収スペクトルを測定した。

Asn94Lys,Gly338Glu,Cys203Arg,Pro231Leuを導入した系では全く吸収スペクトルが認められず,これらの変異を持つオプシンは視色素として機能しないと考えられた。Arg330GlnやPro307Leuでは530nmに極大吸収を持つスペクトルが得られたが,正常の系と比べると吸収率が低く,視色素として機能する可能性は低いと推定された。3.プロモーターに見出した変異-71A>Cは色覚正常者にも見られるが,正常者では視色素遺伝子アレーの3番目(以降)に、第2異常者では2番目に存在することをすでに示している。これをさらにLong-rangePCRにて確認した。また変異のあるプロモーターと転写因子との結合活性を測定する系を準備中である。4.-71Cの頻度の人種差に関し、日本人:56/230(243%),中国人:19/98(19.4%),タイ人:8/104(7.7%),白人:1/50(2%),黒人:0/14(0%)であり,人種による相違が明確になった。1.平成15年度に新たに98例の色覚異常例を経験した。男子92例,女子6例である。また家系的保因者である母親9名から試料を得た。これらのうち主に色覚異常例男子の遺伝子解析を行った。昨年度までの解析例と合わせると,男子の解析例数は436となった。内訳はP65(15%),PA60(14%),D138(32%),DA161(37%),PCD12例(3%)である。他に,女性の25例,本人のDNAがない9例,兄弟の1例のみを解析した9例の計43例がある。2.P65例の遺伝子型は,P型(1あるいは複数の同構造のM遺伝子のみ)48,PA型(異なる構造の複数のM遺伝子)12,正常型(L,M両遺伝子)3,確定不能(遺伝子数が多い)2,PA60例は,P型4,PA型48,正常型4,確定不能4,D138例は,D型(L遺伝子のみ)117,DA型(異なる構造の複数のL遺伝子)4,正常型8,確定不能9,DA161例は,DA型102,D型13,正常型24,確定不能22,PCD12例は全て正常遺伝子型であった。臨床型と遺伝子型の不一致例が84あったことになる。このうち43例は-71CあるいはAsn94Lys,Gly338Glu,Cys203Arg,Prom231Leuなどのアミノ酸置換で説明がつくものであった。PCDの12例は全て遺伝子型は正常で,かつ全例に-71Cが見られたことは特筆すべきである。遺伝子型が2色型で臨床型が異常3色型である17は現在の解析方法では解決できない矛盾点を持った例である。3.新たな変異として正常遺伝子型Dの1例において,M遺伝子エキソン5に2塩基の欠失を見出した。4.プロモーター領域の変異(A-71C)が色覚異常の原因となっていることをまとめて論文にした。5.第1異常は比較的頻度が低いため多数例を解析した報告がない。第1異常125例の解析結果をまとめて論文にし,投稿した。6.Long-range-PCRを女性例に応用し,より確実に保因者の診断ができるようになった。1.本年度の症例を加え男子の全解析例数は454例,P68,PA62,D145,DA166,PCD13例となった。2.P68例の遺伝子型は,P型52,PA型11,正常型3,確定不能2,PA62例は,P型4,PA型50,正常型4,確定不能2,逆正常型(M-L)2,D145例は,D型123,DA型4,正常型8,確定不能10,DA166例は,DA型106,D型14,正常型25,確定不能21,PCDの13例は全例が正常遺伝子型で-71Cを持っていた。臨床型と遺伝子型の不一致例88のうち44例は-71CあるいはAsn94Lys, Gly338Glu, Cys203Arg, Pro231Leuなどのアミノ酸置換やエキソン5の2塩基欠失で説明がつくものであった。3.PA62例中確定不能であった4例のうち2例が正常とは逆(M-L)の遺伝子型を持つことを明らかにした。L遺伝子は-71Cを持っていた。
定量的なPET脳神経受容体機能画像化のための画像処理システム

本研究は、陽電子断層撮影(PET)を用いた脳神経受容体機能定量画像の高精度化を目指し、ガウシアンノイズ除去及び部分容積効果補正に関してシステムを構築しその有用性を数値シミュレーションで実証した。また、これらの技術が必要とされている臨床例(脳内ドーパミンD2受容体結合能や脳萎縮が進行したアルツハイマー病患者の糖代謝画像など)への適応を行い、その有用性を確認した。本研究は、PET脳神経受容体機能の定量画像化を可能とするために、ガウシアンノイズ除去及び部分容積効果補正に関してシステムを構築し、臨床データに対して適応を行い実際の効果を評価することを目指している。初年度は、PET脳神経受容体機能の定量画像化を可能とする画像処理システムを構築するために、脳内の放射性薬剤の濃度分布を模擬した数値シミュレーション、及びファントムを用いた基礎実験を行い、最適な閾値処理アルゴリズム(ガウシアンノイズ除去)の開発を行い、Eur J Nucl Med and Mol Imgにその成果を発表した。また、解剖情報の導入の方法(部分容積補正)に関してもシミュレーションデータを用い検討を行った。陽電子断層撮影(PET)において脳内神経受容体機能を画像化するためには、体内投与した放射性薬剤の濃度を表す画素値の時系列変化をモデル式にあてはめ、各画素でモデルパラメータ(神経受容体機能)を推定しなければならない。このパラメータ推定を高精度に行うためにはPET画像に含まれるガウシアンノイズが問題となるため、画像のガウシアンノイズ除去が必要となる。また、PETの画像では空間分解能が約6mmであるため、脳内の構造がぼやけ画素値の定量性が失われる部分容積効果が観察される。前年度までに、ウェーブレッド変換を用い神経受容体機能画像の計算に用いる時系列情報を含んだPET画像にガウシアンノイズ除去処理を行い、算出される機能画像の雑音信号比の改善及び精度が向上することを示してきた。また、ウェーブレッド変換にMRIなどの形態情報を組み込んで部分容積効果を補正する方法の提案も行った。最終年度は、前年度に構築したPET脳神経受容体機能の定量画像化を可能とする部分容積効果補正に関する画像処理システムの有用性を脳を模擬した数値シミュレーションによって実証を行い、特に、部分容積効果補正が必要とされている臨床例(脳内ドーパミンD2受容体結合能や脳萎縮が進行した痴呆患者の糖代謝画像)への適応を行いその効果・有用性を評価した。この成果は、雑誌Neuroimageにて誌上発表された。
進行性尿路上皮癌に対する癌幹細胞を標的としたMUC１阻害剤の抗腫瘍効果の検討

膀胱癌細胞株T24、UMUC3を持ちいてCDDPを濃度依存性に12か月間暴露し、CDDP耐性株T24CRとUMUC3CRを樹立した。CDDP耐性株はPI3K/AKT経路活性化に伴い薬剤排出性トランスポーター(MDR1)の発現が亢進していた事に加え、細胞内シスチントランスポータ-であるxCTとCD44v9の有意な亢進が確認された。これらの結果からCDDP耐性株は薬剤排出機構の促進とシスチンの細胞内取り込み促進による抗酸化作用の増強が耐性メカニズムの中心であることが示唆された。この一連の耐性機序が癌細胞膜上に存在するムチン1型C末端ペプチド(MUC1C)に起因すると考えた。野生株と耐性株におけるMUC1C発現を確認したところ、T24CR/UMUC3CR両耐性株においてMUC1CはmRNAレベル、および蛋白レベルで有意に亢進していることを確認した。ヒト臨床検体におけるMUC1C発現の検証には2000-2014年において腎尿管全摘除術を行った238例の上部尿路上皮癌の内、術後補助化学療法を行った81例を対象とし、MUC1Cの発現を確認した。結果、MUC1C陽性群は独立した再発規定因子であった。次に耐性株にsmall interfering RNA法を用いてMUC1Cをknock downしたところ、CD44v9、xCT、MDR1の有意な発現抑制を認めたことを確認した。MUC1C阻害剤であるGO-203(Harvard Universityより寄贈)を使用し、MUC1C阻害剤とCDDPの併用効果を検証した所、CDDP耐性株において一部抗癌剤感受性が回復する事を確認した。これらの結果から、MUC1Cは難治性尿路上皮癌に対する治療標的になりうると考えられ、膀胱癌に対する新規治療戦略としてのMUC1C阻害剤の有用性が示唆された。1)尿路上皮癌耐性株の樹立とMUC1C発現上昇の確認。現在までに当教室で保有している膀胱癌細胞株であるT24、UMUC3を使用して、それぞれの細胞株を6か月間の間、CDDPおよびGEMに晒し、培養を継続することでCDDP、GEM耐性の膀胱癌細胞株を樹立した。抗癌剤耐性の確認には、WSTassay法を用いて抗癌剤感受性株と比較し、CDDP耐性株およびGEM耐性株において抗癌剤による殺細胞効果が減弱していることを確認した。次に、抗癌剤耐性膀胱癌細胞株4種において野生株と比較してMUC1Cの発現が蛋白レベルで亢進していることを確認した。2)癌剤耐性株であるT24CR/GRとUMUC3-CR/GRにsiRNAを使用しMUC1Cをknock downしたのちに、GEM/CDDPそれぞれの薬剤を添加すると抗癌剤耐性細胞株において、薬剤の殺細胞効果が増強されることを確認した。3)MUC1Cの発現上昇を認めているCDDP/GEM耐性株において、CD44v9および、xCTの発現上昇が相関して上昇していることを確認した。さらに、双方の耐性株にGEM/CDDPを添加後野生株と比較すると、濃度依存性に細胞内グルタチオン濃度の上昇、およびROS産生の低下を認めることを確認した。さらに、MUC1Cのknock downによりROS産生量の上昇も確認ができており、MUC1CがCD44v9-xCTと架橋構造を作成する事で癌細胞が酸化ストレスから回避できる機構を備えていることが示唆された。当初計画していた内容では、膀胱癌細胞が幹細胞化を認める機序としてCD44v9-xCT-MUC1Cの架橋構造が形成されると考えていた。しかし、野生株においては、MUC1Cの発現そのものをとらえるのが困難であったため、抗癌剤による暴露で酸化ストレスに強い細胞が必要であった。当初、当研究室で樹立したT24PRと5637PRという2つの抗癌剤耐性細胞株を使用する予定であったが、MUC1Cの発現が野生株と比較し、有意でなかったため、再度T2とUMUC3の細胞を購入の下、新に耐性株の樹立を行った。そのため、約半年間にわたり抗癌剤耐性細胞株の作成に時間を要した。結果、耐性株作成以降はおおむね計画していた仮説通りに進んでいると考えている。

結果、MUC1C陽性群は独立した再発規定因子であった。次に耐性株にsmall interfering RNA法を用いてMUC1Cをknock downしたところ、CD44v9、xCT、MDR1の有意な発現抑制を認めたことを確認した。MUC1C阻害剤であるGO-203(Harvard Universityより寄贈)を使用し、MUC1C阻害剤とCDDPの併用効果を検証した所、CDDP耐性株において一部抗癌剤感受性が回復する事を確認した。これらの結果から、MUC1Cは難治性尿路上皮癌に対する治療標的になりうると考えられ、膀胱癌に対する新規治療戦略としてのMUC1C阻害剤の有用性が示唆された。1)薬剤耐性のメカニズムの1つとして、薬剤排出性トランスポーターの発現上昇がMUC1C発現と相関していると報告されている。そのため、すでに各耐性株において、P-glycoproteinの一種でATP-bindingcassette transporter(MDR1)蛋白の発現上昇を確認した。さらに、MUC1C knock downにより両細胞株においてMDR1のmRNAであるABCB1が著明に減少していることも確認した。これらのことから、MUC1CとMDR1の間には強い関連性があることが示唆され、今後MUC1C発現上昇株において、細胞内の抗癌剤濃度を測定する予定である。2)過去の報告からMUC1CはHif1αを細胞内で安定化させ、嫌気下での糖代謝迂回路を亢進させ、薬剤耐性を獲得すると報告されている。当院のCDDP/GEM抵抗株においてもHif1α蛋白の増強を確認した。よって、今後野生株と耐性株での糖代謝経路の変化の解明をメタボローム解析を行うことでさらに進めていく予定である。3) MUC1阻害剤であるGO-203を今後各耐性株に投与し、標的蛋白がどのように変化するかを確認するよていである。4)今後、各耐性株と各野生株でのMUC1C発現量の確認とその抗腫瘍効果を比較、検討する予定である。
筋ジストロフィーに対する遺伝子治療法の開発(AAVベクターを用いた遺伝子修復)

トランス・スプライシングとアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを利用したDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)に対する新たな遺伝子治療法の開発を試みた。本研究の目的は、スプライシング過程においてAAVベクターからの外来性pre-trans-splicing RNAと内因性ジストロフィンpre-mRNAの間でトランス・スプライシングを強制誘導し、変異を持つエクソンを正常エクソンに置換することにより、ジストロフィン蛋白質の発現を正常な状態に回復させることである。そこで、DMDモデルであるmdxマウスの遺伝子異常(exon 23にナンセンス変異を持つ)を修正するために、ジストロフィンpre-mRNAのintron 22-23を特異的にターゲティングするpre-trans-splicing RNA分子を構築し、これを転写する組換えAAVベクター(rAAV)を作製した。本rAAVベクターをマウス骨格筋へ導入し、内因性のジストロフィンpre-mRNAに対するトランス・スプライシングについてRT-PCR及びnested PCRにより解析した結果、効率は低いが目的のエクソン23の前後でトランス・スプライシングを誘導可能であることが分かった。これは本ストラテジーがDMD治療へ適用できる可能性を示唆するものである。一方で、pre-trans-splicing RNAや発現ユニットの構造(プロモーター、スプライシング・ユニット、ポリAシグナル、ターゲット配列など)がトランス・スプライシングの効率に大きく影響を与えることも明らかになった。そのため今後の課題として、トランス・スプライシング効率を改善するためにコンストラクトの改良を進める必要がある。トランス・スプライシングとアデノ随伴ウイルス(AAV>ベクターを利用したDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)に対する新たな遺伝子治療法の開発を試みた。本研究では、スプライシング過程においてrAAVからの外来性pre-trans-splicing RNAと内因性ジストロフィンpre-mRNAの間でトランス・スプライシングを強制誘導し、変異を持つエクソンを正常エクソンに置換することで、正常なジストロフィン蛋白質の発現回復を目的とする。そこで、DMDの治療モデルにエクソン23(ex23)にナンセンス変異を持つmdxマウスを使用し、トランス・スプライシングによるジストロフィンmRNAの変異ex23の置換修正を試みた。先ず、正常マウス骨格筋からint22-ex23-int23を含む2.0kbのゲノムDNAをクローニングし、これを基にトランス・スプライシングを誘導するためのpre-trans-splicing moleculeを構築した。次に、トランス・スプライシングが誘導可能かどうかを調べるために、myc-tag配列を持つpre-trans-splicing RNAを発現する1型AAVベクターを作成し、正常マウスの骨格筋へ導入した。導入2,4週後にRT-PCRとnested PCRによりジストロフィンmRNAの解析を行ったところ、効率は低いがトランス・スプライスされたmRNAが存在することを確認した。しかし、myc抗体を用いた免疫組織染色では、myc陽性線維は検出されなかった。そのため、今後はターゲティング配列などpre-trans-splicing分子を改良し、トランス・スプライシング効率をあげるための工夫が必要と考えている。
金属ガラスのガラス・結晶・溶融状態における熱物性

Zr基金属ガラスのZr-TM-AlのTMをCu,Co,Niにした幅広い組成領域において、室温における熱拡散率の測定をレーザーフラッシュ法により行った。Zr_<(90-X)>Cu_XAl_<10>では、Cu濃度が上がるに従い、わずかに熱拡散率が減少する傾向が認められた。また、この金属ガラスの熱拡散率の値は23×10^<-6>m^2/sであり、合金を構成する各元素の値(Zr:12.7×10^<-6>m^2/s、Cu:117×10^<-6>m^2/s、Al:100×10^<-6>m^2/s)に較べ非常に小さくなっている。Zr-Co-AlおよびZr-Ni-Alについても同様の測定を実施し、ほぼ同じ測定値が得られた。比熱の測定を示差走査熱量計を用いてエンタルピー法により行った。密度の測定も室温において、アルキメデス法により行った。これらの測定値から熱伝導率を算出した。また、電気抵抗率の測定も四端子法方によりそれぞれの合金について実施した。温度依存性については、まだ完全に測定はできていないが金属ガラスの鋳造シミュレーションに必要な基本的なデータの収集を行うことができた。金属ガラスの形成可能な大きさを推算するために、収集した熱物性値データに基づき伝熱解析を行った。銅鋳型を用いて円柱状の金属ガラスを作製する場合の金属ガラスの内部の温度変化を数値計算により求めた。円柱の金属ガラスの表面と試料中心部の冷却速度には鋳造直後に差があること、試料の直径を大きくすると冷却速度が小さくなることを定量的に評価することができた。このように金属ガラスの内部の伝熱解析が可能になったことから、金属ガラスが作製可能な臨界直径あるいは臨界冷却速度の推算が可能になると考えられる。研究代表者等は、Pd系金属ガラスの融体状態における熱拡散率の値と臨界冷却速度の問に相関があることを見出した。具体的には液相線における熱拡散率の値を金属ガラスが得られる臨界冷却速度で整理すると、臨界冷却速度が小さいほど熱拡散率が小さいという結果が得られた。Pd系の金属ガラスの場合には非金属であるPを含んだ合金であるので、金属のみの系で同様の傾向があるかは明らかではなかった。そこで、ZrAlNi系について3種類の合金(Zr65Al7.5Cu27.5,Zr60Al15Ni25,Zr55Al10Ni5Cu30)について、液相線における熱拡散率の値をもとめ、Pd系と同様の整理をおこんった。その結果、Pd系の場合と同様に臨界冷却速度が小さいほど熱拡散率が小さいという結果が得られた。さらに、ZrCuAl系の金属ガラスについて、Alの濃度を一定にし、Cu、Zrの濃度を変化させた3種類の金属ガラスについて室温において熱拡散率を測定し、比較を行った。Cuの濃度は30,35,40at%で変化させた。その結果、熱拡散率の値はCu濃度が35at%のところで極小を示した。また、その値は合金を構成する元素の熱拡散率の値よりはるかに小さい値を示した。このように小さな熱拡散率を示す原因について構造の観点から考察を行った。Pd系の場合には非金属であるPの周りに共有結合的クラスが形成されるとガラス形成能が向上すると考えられている。このことから共有結合的クラスタの形成により、共有結合の電子数が増加し、それに伴い自由電子数が減少し、熱拡散率が減少するということが考えられる。一方、Zr系の場合には、Zrのまわりに共有結合と金属結合が共存した局所構造があると考えられており、共有結合が増大し、共有結合の電子数の増加により、自由電子数が減少し、熱拡散率が低下するということが考えられる。

円柱の金属ガラスの表面と試料中心部の冷却速度には鋳造直後に差があること、試料の直径を大きくすると冷却速度が小さくなることを定量的に評価することができた。このように金属ガラスの内部の伝熱解析が可能になったことから、金属ガラスが作製可能な臨界直径あるいは臨界冷却速度の推算が可能になると考えられる。
ペプチド・タンパクへの選択性に焦点を当てたフルオラス・分析化学の新機軸

生体試料中の生理活性ペプチド及びタンパク質の高感度分析のための高選択的かつ高効率な抽出法として、「フルオラスケミストリー」に基づいた次の2種方法論を開発した。(1)ペプチド中の特定官能基をパーフルオロアルキル基で修飾し、その誘導体をフルオラス溶媒抽出することにより、LC/MS分析に最適な前処理が可能となった。(2)配位結合能を持ったフルオラス性試薬を用いてリン酸化ペプチド補足してフルオラス溶媒抽出することにより、非リン酸化ペプチドと完全分離が可能となった本研究では、パーフルオロアルキル鎖同士による特異的親和性(フルオラス相互作用)を利用し、ある特定のペプチド・タンパクのみを極めて選択的な分析する方法の開発を行っている。本年度は、先ず、先行研究にて開発した「フルオラス誘導体化法」を、分子内ジスルフィド結合を有するペプチド(バソプレシン及びオキシトシン)を対象とした分析に応用した。具体的には、これらペプチド類のジスルフィド結合を還元剤にて切断し、パーフルオロアルキルヨードアセトアミド試薬によって多重にラベル化した。本誘導体の構造をMSスキャン測定にて確認したところ、目的のパーフルオロアルキル化体が生成されており、また、それらは期待通りフルオラスLCカラムにて選択的に保持・分離された。また本法では誘導体の定量分析に、MS/MSによるMRM測定ではなく、より選択的かつ高感度な検出が可能なMS/MS/MSによる測定を行った。さらに、リン酸化ペプチド類の選択的抽出法として汎用的に利用される金属キレートアフィニティー法に、フルオラスの相互作用を組み合わせた方法の開発を試みた。本研究では先ず、金属キレート能を持つフルオラス試薬として、パーフルオロアルキルイミノ二酢酸(PFIDA)の合成を行った。さらに、合成したPFIDAに種々の金属類を配位させ、それによるモデルペプチドの金属キレートアフィニティー/フルオラス抽出を行った。本法において、フルオラス溶媒を用いた液液抽出を行ったところ、モデルとしたペプチドのリン酸化体はフルオラス溶媒中に抽出することができたが、非リン酸化体は抽出されなかった。また、フルオラス溶媒中に抽出されたリン酸化ペプチドは、脱キレート用のアンモニア溶液の添加によって容易に逆抽出することが可能であり、その後のHPLC分析を容易に行うことができた。本研究では,ペプチドに焦点を当て,その選択的分析を行うべく,パーフルオロアルキル鎖同士が示す特異的な親和性(フルオラス)を利用した方法論の開発を行っている。前年度において,リン酸化ペプチドを選択的に抽出すべく,パーフルオロアルキル基を有するイミノ二酢酸試薬(PFIDA)を合成し,フルオラスと金属キレートアフィニティー法とを組合せた新たな抽出法の開発に成功した。本年度は,このPFIDA試薬を用いて,プロテインキナーゼ(PK)活性測定法の構築を試みた。その原理は,プレ蛍光標識化した基質ペプチドに,キナーゼ処理を施してリン酸化し,そのリン酸化体のみをフルオラス相互作用にて抽出するといったことに基づく。非リン酸化基質ペプチドは抽出されない(非フルオラス層に残存)ため,その蛍光強度の減少率からキナーゼの活性測定を行うことが可能となる。今回,PKAの基質として知られているKemptide(TAMRA標識化体)を用い,本法の原理確認と,実際にキナーゼの活性測定に供したところ,良好な結果を得ることができた。今後,本原理を用い,更なる検討を重ねていく予定である。研究実績の概要に記載のとおり,フルオラス相互作用を利用した新たな抽出技術の開発とその応用までを特段の問題もなく進めており,良好な結果を得ることができている。従って,本研究はおおむね順調に進展しているものと考えている。本研究では、ペプチドやタンパク質の特定官能基をフルオラスラベル化し、そのフルオラス性を利用して、より簡便により選択的に分析する方法論を確立する。数種の市販ペプチドをモデル化合物として用いて、ラベル化する官能基の種類(アミノ基、チオール基、グアニジノ基、フェノール性水酸基)、ラベル化の種類(アミノ基に対する各種活性エステル化試薬を用いる方法、アルデヒド試薬による還元アルキル化法;チオール基に対するマレイミド試薬法他)と反応条件の検討、LC分離条件、MS検出条件の最適化他を検討した。結果として、フルオラス試薬としてN-Succinimidyl-4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoateを用い、ペプチド内のアミノ基にパーフルオロアルキル基を導入し、フルオラスLCカラム分離し、MS検出行うことで、選択的で簡便な分離分析が可能であった。本方法では、ペプチド中のアミノ基(第1級)の数だけパーフルオロアルキル基が導入され、クロマトグラム上では、その数だけ保持時間が大きくなる。結果的に、アミノ基の数によってペプチドが大別されルことになる。また、第1級アミンを持たない夾雑物質は保持されないため、MS検出において問題となるマトリックス効果による妨害も極めて少ない。設定した上記条件も基に、脳内に存在する生理活性ペプチド数種を分析する条件を確立した。更に、病態モデルマウスの脳組織の分析に適用し、簡便な前処理で高感度に分析出来ることを確認し、その有用性と実用性を確認した。

本来であれば、平成27年度に基本的な条件検討を終えて、研究3年度目の平成28年度に種々の生理活性ペプチドやタンパク質への適用を検討し、研究を完成させる予定であった。しかし、ペプチドの種類によって、最適な条件が若干相違している項目もあり、個々に再度最適化し、微調整する必要があることがわかり、その条件設定に想定外の時間を費やすこととなった。また、アミノ基に対するラベル化法に関しても、最終的にはN-Succinimidyl 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoateを用いる方法としたが、その他の活性エステル試薬や還元的アミノ化法についても詳細に検討し、時間を要した。さらにはチオール基のフルオラスラベルについても基礎的検討を行った。上記の状況で結果的に、平成28度では、モデルペプチドを用いた方法論の確立と有用性の実証は出来たが、予定していたペプチド、タンパク質類を対象とした研究の実施には至らなかった。本研究では、新規かつ有用なペプチド・タンパク分析・抽出法として「フルオラスケミストリー」の概念を採り入れた2つの方法論として,(1)脳神経ペプチドをフォーカシングするマルチフルオラス誘導体化&#8722;LC-MS/MS分析法,及び(2)配位結合能とフルオラスの選択性を融合したペプチド・タンパクの選択的抽出法,の開発を試みた。(1)フルオラス誘導体化法を脳内ペプチド類の測定へと適用し,選択的かつ高感度な測定法を開発した。本法は,測定対象物質にパーフルオロアルキル(PFA)基を導入(誘導体化)することで,誘導体をPFA基修飾LCカラムに選択的に保持させ,分離する方法である。ペプチド内の複数のアミノ基に対し,N-succinimidyl-4,4,5,5,6,6,7,7, 8,8, 9,9,9-tridecafluorononanoate(SITF)にてPFA基を導入し,妨害成分からの分離及び高感度分析が可能であった。この本法をマウス脳組織中サブスタンスP(SP)分析へと適用したところ,極微量のSPを検出することができた。本法は、複数のアミノ基以外に、複数のSH基、複数のカルボキシル基、アミノ基+SH基など選択性を残したままに対象物質を拡大できる可能性があると考えられる。(2)前年度までに、配位結合能とフルオラスの選択性を融合したフルオラス金属キレートアフィニティー法によるリン酸化ペプチドの選択的抽出法を開発し、これプロテインキナーゼ活性の測定へ適用した。この方法は、従来前処理が極めて困難であったリン脂質の抽出にも適用できることが確認された。今後、更に広範なリン酸化合物に適用できる可能性を示すことができた。生体試料中の生理活性ペプチド及びタンパク質の高感度分析のための高選択的かつ高効率な抽出法として、「フルオラスケミストリー」に基づいた次の2種方法論を開発した。(1)ペプチド中の特定官能基をパーフルオロアルキル基で修飾し、その誘導体をフルオラス溶媒抽出することにより、LC/MS分析に最適な前処理が可能となった。(2)配位結合能を持ったフルオラス性試薬を用いてリン酸化ペプチド補足してフルオラス溶媒抽出することにより、非リン酸化ペプチドと完全分離が可能となった研究実績に記載のとおり、本年度は、フルオラス相互作用を利用し、特定のペプチドのみを選択的に分析あるいは抽出するための基礎的な検討を行った。