hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
律令期における地方造瓦組織の復原

本年度は、一昨年・昨年に引き続き、各地の国府・国分寺・国分尼寺およびその周辺地域における出土瓦資料のデータ収集を行い、最終的に畿内の一部をのぞくすべての国の国府・国分寺の瓦についての実測図や計測データ、拓本、写真などの収集を完了することができた。そのうえでとくに本年度は、まずひとつのテーマとして、陸奥や出羽、および日本海沿岸地域の諸国分寺の瓦を中心に資料調査および分析・検討をおこない、中央(平城京)を介しない各国間での瓦工人の交流が多く存在していたことについて論じた(梶原2005「国分寺系瓦の広域展開-日本海沿岸地域を中心に-」『名古屋大学文学部研究論集』152)。また、昨年度の報告において触れた中国地方における平城宮系瓦の分布が意味する事象および当該瓦の年代観などについて新知見を得ることができ、それを論文として発表をおこなった(梶原「山陽道・山陰道における平城宮系瓦の展開-6225・6663系を中心として-」『考古学研究』)。さらに、平安期における国分寺瓦屋が存廃に関して、須恵器や灰釉陶器など陶器生産との協業体制をとるか否かという点が大きいと考え、関東・東北・東海地方におもに分布がみられる、瓦陶兼業体制をとる国々についての調査・分析検討をおこない、論文を執筆した。(梶原2005「国分寺瓦屋と瓦陶兼業窯」『日本考古学』19)本年度で本研究費は最終年度となるが、本研究費をもちいての各国のデータの蓄積はすでに終了しており、それをもとにして、今後各地の国分寺瓦屋についての新知見にもとづき、さらなる論文の刊行をおこなうこと、また本研究費をもちいたこのような諸成果を、ひとつにまとめた形での著作を執筆する予定である。本年度は当初の計画通り、各国国分寺とその周辺遺跡出土瓦の実見・データ収集および、収集データから読みとれる成果の発表を行った。成果発表としては、研究費受領前から継続して調査を行っていた東海地方の国分寺についての研究を「造瓦組織の復原と瓦当文-東海地方の国分寺から-」(『史林』86-3,2003)として発表した。国分寺造営にあたって、中央から地方に対してあらゆる援助が行われ、それは瓦にも表れているという従来の一律的な解釈について、遺物の詳細な検討から再考するべきという、前稿「国分寺造営期の瓦供給体制-西海道諸国の例から-」(『考古学雑誌』86-1,2000)でも述べてきた議論が、地域を変えても成立することを示すと同時に、そこから一歩進んで、軒丸瓦と軒平瓦で文様系譜が異なる国分寺の存在などから、瓦研究で従来重要視されてきた瓦当文の意味についても再検討が必要であるとした。さらに「最古の官営山寺・崇福寺-その造営と維持-」(『佛教藝術』265,2002)では、一つの有力寺院をとりあげ、瓦工房ばかりでなく、鍛冶や銅器生産など、寺院関連の諸生産組織全般のあり方について、それが経済効率に基づき多様であると考察した。データ収集については、全国各地の出土瓦を見て回ったが、特に本年度は、中国地方および北陸地方に重点を置いて資料収集を行い。いくつかの重要な知見を得るに至った。それらを発表していくことが、来年度の主要な研究活動となろう。本年度は、昨年度に続き各地の国府・国分寺・国分尼寺およびその周辺地域における出土瓦資料のデータ収集をおもな作業として行った。とくに昨年度の報告において触れた中国地方の事例については、再三現地を訪れることによって周辺遺跡の出土瓦データを細かく採集し、論としてまとめることができた。資料の一部に未発表資料を含むため本年度は公表を差し控えたが、来年度に論文として発表できる予定である。論文としては、昨年度報告時には掲載予定段階であった「造瓦組織の復原と瓦当文-東海地方の国分寺から-」(『史林』86-3,2003)が、本年度5月に刊行をみた。また、その他の地域においても積極的に資料収集を進め、関東や近畿の一部を除くすべての地方の資料収集が終了した。さらに本年度の成果としては、該当期の地方造瓦組織とは別に、周辺事例についての論考を著したことである。昨年度は造瓦組織と金属生産の相違について論じたが、本年度においては、「京都大学所蔵の西寺採集瓦について」(『古代文化』55-9,2003)において、平安期における九州産瓦の中央への搬入体制を、おもに供給者側から論じ、また「13世紀における「中央官衙系」瓦工の編成と展開-京都大学医学部構内AO18区の資料から-」(『京都大学構内遺跡調査研究年報1999年度』,2003)においては、かつて平安京の瓦生産を担っていた瓦工の、中世以降の展開についての一例を、特定遺跡の事例から分析した。このように、研究課題当該期とは異なる時期の生産組織論を扱うことは、今後当該期の状況を復原していくことへの一助となろう。

そのうえでとくに本年度は、まずひとつのテーマとして、陸奥や出羽、および日本海沿岸地域の諸国分寺の瓦を中心に資料調査および分析・検討をおこない、中央(平城京)を介しない各国間での瓦工人の交流が多く存在していたことについて論じた(梶原2005「国分寺系瓦の広域展開-日本海沿岸地域を中心に-」『名古屋大学文学部研究論集』152)。また、昨年度の報告において触れた中国地方における平城宮系瓦の分布が意味する事象および当該瓦の年代観などについて新知見を得ることができ、それを論文として発表をおこなった(梶原「山陽道・山陰道における平城宮系瓦の展開-6225・6663系を中心として-」『考古学研究』)。さらに、平安期における国分寺瓦屋が存廃に関して、須恵器や灰釉陶器など陶器生産との協業体制をとるか否かという点が大きいと考え、関東・東北・東海地方におもに分布がみられる、瓦陶兼業体制をとる国々についての調査・分析検討をおこない、論文を執筆した。(梶原2005「国分寺瓦屋と瓦陶兼業窯」『日本考古学』19)本年度で本研究費は最終年度となるが、本研究費をもちいての各国のデータの蓄積はすでに終了しており、それをもとにして、今後各地の国分寺瓦屋についての新知見にもとづき、さらなる論文の刊行をおこなうこと、また本研究費をもちいたこのような諸成果を、ひとつにまとめた形での著作を執筆する予定である。
HMGB1致死性画分を標的とした新規敗血症治療戦略の構築

敗血症病態において、細胞外に放出された核内タンパク質high mobility group box 1 (HMGB1)は、遠隔臓器障害を引き起こす「致死性因子」として作用する。その一方で、HMGB1には組織修復を促す「生体防御因子」としての側面もあるため、HMGB1をひとくくりに捉えても、鋭敏な予後予測因子、理想的な治療標的分子とはなりえなかった。その後の研究で、HMGB1にはサブタイプがあり、組織修復を促すものと、全身性炎症を惹起して遠隔臓器障害を引き起こすものとでは、異なる構造を取っていることが明らかになった。本研究の目的は、HMGB1を認識する抗体の中からサブタイプ特異的抗体を選別することで、より生命予後を反映しうる新規検査法の開発につなげるとともに、より救命効果が期待できる新規治療戦略の構築につなげることである。初年度には、1000を超える抗HMGB1抗体候補の中から特定のHMGB1サブタイプを選択的に認識する抗体をスクリーニングし、その抗体の配列情報を読み取ることができた。また、その配列情報をもとに人工遺伝子配列を組み込んだ発現ベクターを作製し、Chinese hamster ovary (CHO)細胞に発現させ、来年度以降の機能解析に必要な量の抗体を確保することに成功した。来年度以降は、この抗体の機能評価に焦点をあて、HMGB1サブタイプに対する特異性を検証するとともに、敗血症モデル動物に対しての救命効果を検討する。また、新規検査法としての応用可能性についても検討していく。初年度は、抗HMGB1抗体候補の中から特定のHMGB1サブタイプを選択的に認識する抗体をスクリーニングし、二年目以降の機能解析に必要な量の抗体を確保することを目的としていたが、それを達成することができた。来年度以降は、初年度に作製した抗体の機能評価に焦点をあて、HMGB1サブタイプに対する特異性や、救命効果、新規検査法としての応用可能性を検討していく。想定していたような特異性や救命効果を得られないことも考えられるため、別のスクリーニング方法で候補抗体を再度選択し、再度作製することも同時に進めていく。
医療者と協働して同病者を支援する患者ボランティア育成プログラムの開発

本年度は,昨年度に引き続き,実施計画に沿った調査研究活動を行い,それに伴う以下のような知見・成果を得た。今までに医療者と協力しながら同病者を支援してきた経験のあるオストメイト5名に対し,「同病者を支援するにあたり学んできたこと」,「最低限備えておいたほうが良い資質」,「同病者支援の体験談」,「困難・問題と感じたこと」半構成的面接調査を行い,内容分析を行った結果,患者ボランティア(ピア・サポーター)育成のためのプログラムに組み込むべき内容として,「基本的な医学知識・最近の治療などの医学面」,「患者の疾患受容などの患者の心理プロセス」,「傾聴を中心とするカウンセリング技術」,「接遇の技術」,「ピア・サポートの意義や効果」,「社会保障制度などの福祉面」,「医療者とピア・サポーターの役割の明確化」,「ピア・サポーターの心得・責任」が挙げられた。また,同病者を支援する患者と協働している医療者への面接からは,上記に加え,「ピア・サポーターからの患者支援内容のフィードバック」,「情報交換」が,協働の鍵となることが示された。また,昨年来,月に一度,院内で開催される自主グループ活動へ参加し,対応の難しかったケース,あるいは連携のできたケース(医療者が行うサービスへ繋がったケース,または医療者から自主グループ活動へ繋がったケース)などについて,患者ボランティア,実践家と共に事例検討を行う中で,疾患を受け入れられず治療に専念できない患者を医療者から自主グループへ紹介,同病者の支援により,治療に前向きなれたケースがみられ,医療者と患者ボランティア(ピア・サポーター)が,うまく協働できた具体的な事例も経験でき,その重要性が再認識されると同時に,具体的活動方法についても示唆を得ることができた。今後の課題は,統計結果から明らかになった医療者と協働しながら同病者を支援しているオストメイトの特徴を考慮した患者ボランティア(ピア・サポーター)の選定や,さらに,上記結果を盛り込んだ育成プログラムを試み,その評価を行っていくことである。本年度は,以下の調査研究活動を行い,それに伴う以下のような知見を得た。1.既存データの二次的分析:オストメイトの同病者支援の実態に関するアンケート調査の二次的分析を行った。医療者と協働して(医療者から依頼を受けて),先輩患者の立場から同病者への支援を行っているオストメイト群38名(以下,同病者支援群)と499名のアンケートの中から「性別」,「年齢」,「術後年数」の項目においてマッチングした一般のオストメイト群38名(以下,対照群),計72名を対象に,「基本的属性」,「身体的状況」,「サポート状況」,「同病者との関わり状況」,「精神的健康」の項目について2群間の比較を行い,同病者支援を行っている患者の特性を検討した結果,同病者支援群が対照群より有意に高かった項目は,「経済的なゆとり」,「医師との関係性」,「ストーマの管理状況」,「患者会活動頻度」,「ピア・サポート機能」,「存在価値」,「意欲」であった。一方,「抑うつ」の項目に関しては、同病者支援群が対照群に対して有意に低いことが明らかとなった。2.同病者支援経験者への面接調査:同病者支援経験者5名に対し,「同病者を支援するにあたり学んできたこと」,「最低限備えておいたほうが良い資質」,「同病者支援の体験談」,「困難・問題と感じたこと」,「必要と思う技術」,「学びたいこと」,「医療者との協働する上で守るべきこと」などについて,一人1時間程度の面接を行い,医療者と協働して同病者支援を行っている患者側のデータを収集した。これらのデータに関しては,現在分析中である。また,次年度は,同病者を支援する患者と協働している医療者に対して面接調査を行う予定である。3.同病者支援の場でのフィールドワークによるピア・サポート状況の把握4.患者ボランティア,関連領域の研究者,実践家との勉強会上記の3,4に関しては,月に一度開催される自主グループ活動への参加の中で,対応の難しかったケースや連携のできたケース(医療者が行うサービスへ繋げたケース,あるいは医療者から自主グループ活動へ繋げたケース)などについて,患者ボランティア,実践家と共に事例検討する機会を持ち,現場での対応に役立てている。この中で出された課題についても,本研究の知見として,分析・考察に組み込んでいく予定である。

また,昨年来,月に一度,院内で開催される自主グループ活動へ参加し,対応の難しかったケース,あるいは連携のできたケース(医療者が行うサービスへ繋がったケース,または医療者から自主グループ活動へ繋がったケース)などについて,患者ボランティア,実践家と共に事例検討を行う中で,疾患を受け入れられず治療に専念できない患者を医療者から自主グループへ紹介,同病者の支援により,治療に前向きなれたケースがみられ,医療者と患者ボランティア(ピア・サポーター)が,うまく協働できた具体的な事例も経験でき,その重要性が再認識されると同時に,具体的活動方法についても示唆を得ることができた。今後の課題は,統計結果から明らかになった医療者と協働しながら同病者を支援しているオストメイトの特徴を考慮した患者ボランティア(ピア・サポーター)の選定や,さらに,上記結果を盛り込んだ育成プログラムを試み,その評価を行っていくことである。
スルホン酸基を有する海産異常スフィンゴシン類の合成研究

近年、分子内にスルホン酸基を有する“異常なスフィンゴシン類"が海産天然物として単離された。海産細菌Flavobacteriumsp.より単離されたDNAポリメラーゼα阻害活性を有するFlavocristamide A、Bと、同族の細菌より単離されたSulfobacin A、Bである。(Flavocristamide BとSulfobacin Aは同一化合物である。)これらの合成研究を行っている。1)従来のスフィンゴシン合成法に基づき合成したスフィンゴシン類縁体を、キラルなアジリジン化合物へと変換した。NaSHを用いてアジリジン環を求核的に開環し、鍵中間体となるジスルフィドを合成した。ジスルフィドをスルホン酸へと酸化できれば基本骨格の構築が完了であるが、この酸化反応は進行せず、現在も検討を続行中である。2)硫黄原子の酸化状態を事前に高めておく別経路を検討した。天然型システインを原料とし、天然物と同じ炭素骨格を有するキラルなチアゾリジン化合物を合成した。チアゾリジン環上の硫黄原子をスルホンへと酸化し、スルフィン酸等価体へと導き、保護基の除去によってアミノスルフィン酸エステルを調製した。これのアミン部分を、別途調製した酸クロリドを用いてアミド化した後、加水分解及びスルフィン酸のスルホン酸への酸化を行い、Sulfobacin Bの合成を達成した。
免疫監視機構におけるSOCSファミリー分子の役割

サイトカインシグナル制御分子SOCS1は、非常に強力にサイトカインシグナルを抑制する。SOCS1をT細胞に恒常的に発現させたトランスジェニック(Tg)マウスでは、末梢のT細胞全てがメモリー表現型(CD44^<hi>CD62L^<lo>)になってしまう。これらの変化は胸腺では認められない事から、ナイーブCD4T細胞が胸腺から末梢へと移行する際に、サイトカインシグナルがナイーブあるいはメモリーT細胞の分化・維持機能に関与している可能性が考えられる。ナイーブT細胞が胸腺から末梢へと移行する際のサイトカインの関与を解析する目的で、SOCS1 Tgマウス由来の胸腺細胞を野生型マウスに移入したところ、移入したCD4T細胞は細胞分裂とは無関係にCD44^<hi>のメモリー表現型を示した。この時、移入した細胞数を末梢において経時的に追ったところ、CD44 ^<lo>CD4T細胞は経時的に激減したが、CD44 ^<hi>CD4T細胞の数は1週間後も移入したときと同じ数で維持されていた。この事から、CD44 ^<lo>CD4ナイーブT細胞が末梢において生存維持されるためには、サイトカインシグナルが必要不可欠である事が明らかとなった。そこで、ナイーブT細胞の維持に働くサイトカインを検索する目的で、STAT5が恒常的に活性化されているactive STAT5をSOCS1 TgのT細胞に発現させたが、末梢にナイーブCD4T細胞を維持させる事は出来なかった。これに対し、IL-4レセプター欠損マウスの末梢のT細胞ではCD44^<hi>のメモリー表現型の増加傾向が見られる事から、IL-4シグナルはIL-7のシグナルよりも有為に末梢にナイーブT細胞を維持させるのに必要不可欠な因子である可能性が示唆された。
植物の環境ストレスによる酸化的シグナリングの分子機構

葉緑体由来の活性酸素種(ROS)に応答する遺伝子群を約800個同定し、それらの機能解析を行った。その結果、PSI1およびPSS8と名付けた新規遺伝子が葉緑体由来のROSを介したストレス応答に重要であることを明らかにした。また、植物の環境ストレス応答に重要である熱ショック転写因子(HsfA2)の誘導機構について解析し、HsfA2の発現はHsfA1dおよびHsfA1eに制御されることを明らかにした。活性酸素種(AOS)を介したレドックス制御機構は現在最も注目されている研究分野の一つであり、多く研究グループが全容の解明に凌ぎを削っているのが現状である。しかし依然として、環境ストレス下でのAOSの生成やそれによるレドックス変化を認知する分子機構については不明のままである。本研究では酸化的シグナリングによるレドックス制御の初期イベントを明らかにすることを目標とし、(1)葉緑体由来の酸化的シグナリング機構の解析、(2)レドックス制御因子の一つであるHsfA2の発現誘導に関わる上流因子の同定を行う。1.葉緑体型APX一過的抑制による酸化的シグナリングの初期イベントの解明ストロマ型APX(sAPX)およびチラコイド型APX(tAPX)のT-DNA挿入ノックアウト変異株(KO-sAPXおよびKO-tAPX)の光酸化的ストレスに対する感受性を野生株(WT)と比較したところ、KO-sAPXはWTと比べ有意な違いは認められなかったが、KO-tAPXではWTに比べ感受性の上昇が認められた。そこで、tAPXの一過的抑制植物(tAPX XR)のtAPX抑制に必要十分なエストロゲン量および処理時間などについて検討した。その結果、300μMエストロゲン処理により、24時間後にはtAPXの転写レベルでの発現をほぼ完全に抑制できる事が明らかになった。このとき膜画分のAPX活性の顕著な低下を確認した。tAPXの発現抑制に伴う、抗酸化系の応答をRT-PCRにより解析を行ったところ、顕著な変動は認められ無かった。2.HsfA2誘導に関わる上流因子の同定HsfA2プロモーター5'側から徐々に欠失させた一連の5'欠失系列とルシフェラーゼ(Luc)遺伝子とを融合させたコンストラクトを形質転換したシロイヌナズナを作製し、強光に対するLuc活性の変動を解析したところ、33479bp上流のプロモーター領域にHsfA2発現の誘導に関与するシスエレメントが存在することが明らかとなった。また、高温ストレス、過酸化水素、プロテアソーム阻害剤およびHSP90阻害剤に対するHsfA2の応答をシロイヌナズナ培養細胞を用い、解析を行ったところ、いずれの処理によってもHsfA2の迅速な誘導(15分以内)が認められた。1.葉縁体型APX一過的抑制による酸化的シグナリングの初期イベントの解明100μMエストロゲンを処理し、48時間後のtAPXの一過的抑制植物(tAPX XR)を用い、マイクロアレイ解析を行った。その結果、コントロール植物(GUS XR)と比較し、tAPX XRでは365個の遺伝子の発現が2倍以上に上昇し、409個の発現が1/2以下に抑制されていた。発現が誘導/抑制された遺伝子にはシグナリングに関与する遺伝子(転写因子、タンパク質キナーゼ、タンパク質分解系)が多く含まれていた。この中から、64遺伝子の発現をリアルタイムPCRにより詳細な解析を行ったところ、いくつかの遺伝子はマイクロアレイ解析の結果と一致していた。2.HsfA2誘導に関わる上流因子の同定前年度までにHsfA2のストレス応答に関わるシスエレメントが33479 bp上流のプロモーター領域に存在する事を明らかにした。本年度はトランジェントアッセイにより、この領域の詳細な解析を行った。その結果、HsfA2の応答に関わるシスエレメントは熱ショックエレメント(HSE)が関与していることが強く示唆された。HSEを介する遺伝子発現の制御にはクラスA HSFが関与しており、シロイヌナズナには15種類のクラスA HSFが存在する。そこで、これらのHSFをエフェクター、HsfA2プロモーターをレポーターとしてトランジェントアッセイを行ったところ、いくつかのHSFがHsfA2プロモーターを活性化することが明らかとなった。現在これらクラスAHSFのT-DNA挿入遺伝子破壊シロイヌナズナを用いて、強光ストレス下におけるHsfA2の発現をリアルタイムPCRにより解析を行っている。1.葉緑体型APX一過的抑制による酸化的シグナリングの初期イベントの解明エストロゲン処理(100μM、48時間)によりtAPX発現を一過的に抑制し、マイクロアレイ解析を行った。

そこで、葉緑体由来の酸化的シグナリングの分子機構を明らかにすることを目的として、葉緑体AOSに応答する遺伝子群の破壊株から、パラコートによる光酸化的ストレスに対して感受性あるいは非感受性を示す変異株(それぞれpssおよびpsi)の選抜を試みた。その結果、独立した3つのpsi(psi13)株および1つのpss(pss1)株が得られた。2.HsfA2誘導に関わる上流因子の同定前年度までにHsfA2のストレス応答に関わるシスエレメントは熱ショックエレメント(HSE)が関与していることを明らかにしている。HSEを介した遺伝子発現制御にはクラスA HSFが関与しており、シロイヌナズナには15種類のクラスA HSFが存在する。本年度はクラスAHSFのT-DNA挿入遺伝子破壊シロイヌナズナを用いて、強光ストレス下におけるHsfA2の発現をリアルタイムPCRにより解析を行っている。また、HsfA2のストレス応答に関与する分子機構を明らかにする目的で、プロテアソームおよびHSP90阻害剤に対するHsfA2の応答を解析したところ、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積がHsfA2の誘導を引き起こしていることが明らかになった。
腹部を網羅するレシピエント血管の作成と形態学的変化に関する研究

悪性腫瘍や外傷などによって広範囲に皮膚や軟部組織が欠損した場合には遊離皮弁での再建が考慮されるが、こと上腹部や側腹部ではしばしば適切なレシピエント血管が存在せず再建方法に難渋することがある。そこで本申請者は、遠隔の静脈を動脈に吻合することで動脈血を有する静脈ループ(シャント血管)を作成し腹部全域をカバーするレシピエント血管を作成することを考案した。臨床応用がなされる際は大伏在静脈と大腿動脈によるループ血管作成を考えているが、今回ラットを用いた動物実験を計画するため、腹壁静脈および腹壁動脈とで作成したシャント血管に対側の腹壁皮弁を吻合し、48時間後および可能な限りの経時的な皮弁生着率を調査する。
形状可変型密閉容器内燃焼による熱損失と有害排気成分の制御

本研究では,密閉容器内の火炎伝播過程において容器形状を変化させることにより,様々な熱発生率パターンを得ることを通して,熱効率の向上および有害排気ガスの低減の可能性を調べるための基礎データの取得を行うことを目的とした.その第一段階として,火炎伝播過程の一定の段階に冷却素子による熱損失を負荷したときの燃焼特性および有害排気ガス排出特性を調べた.その結果,火炎伝播過程の初期段階に熱損失を与えると,燃焼特性にほとんど変化はないものの,窒素酸化物排出濃度が大きく低下することを明らかにした.一方,火炎伝播末期に熱損失を与えると,燃焼期間がやや短縮し,窒素酸化物濃度も若干低下することがわかった.また,燃焼室形状が火炎伝播過程に及ぼす影響を基礎的に明らかにするため,様々な形状の燃焼室における火炎伝播過程の観察を行い,燃焼時間が燃焼室形状により大きく変化する傾向を示すことが認められた.さらに,密封容器中に燃料を噴射させ,噴射形態が燃焼特性および窒素酸化物排出特性に及ぼす影響を調べた.その結果,燃焼を対向して噴射させ,燃焼室中央部で燃料噴流を衝突させると,燃焼期間が短縮し,窒素酸化物濃度が低減することがわかった.また,燃焼室形状,噴射条件および噴射間距離が燃焼特性に及ぼす影響を調べた.これらの実験結果から,燃焼室形状が燃焼特性および排気特性に及ぼす影響に関する様々な知見が得られ,これらは燃焼室形状をいかなる時間にいかに変形させるか等の考察を行う上で有用な基礎データとなるものと思われる.本研究では,密閉容器内の火炎伝播過程において容器形状を変化させることにより,様々な熱発生率パターンを得ることを通して,熱効率の向上および有害排気ガスの低減の可能性を調べるための基礎データの取得を行うことを目的とした.その第一段階として,火炎伝播過程の一定の段階に冷却素子による熱損失を負荷したときの燃焼特性および有害排気ガス排出特性を調べた.その結果,火炎伝播過程の初期段階に熱損失を与えると,燃焼特性にほとんど変化はないものの,窒素酸化物排出濃度が大きく低下することを明らかにした.一方,火炎伝播末期に熱損失を与えると,燃焼期間がやや短縮し,窒素酸化物濃度も若干低下することがわかった.また,燃焼室形状が火炎伝播過程に及ぼす影響を基礎的に明らかにするため,様々な形状の燃焼室における火炎伝播過程の観察を行い,燃焼時間が燃焼室形状により大きく変化する傾向を示すことが認められた.さらに,密封容器中に燃料を噴射させ,噴射形態が燃焼特性および窒素酸化物排出特性に及ぼす影響を調べた.その結果,燃焼を対向して噴射させ,燃焼室中央部で燃料噴流を衝突させると,燃焼期間が短縮し,窒素酸化物濃度が低減することがわかった.また,燃焼室形状,噴射条件および噴射間距離が燃焼特性に及ぼす影響を調べた.これらの実験結果から,燃焼室形状が燃焼特性および排気特性に及ぼす影響に関する様々な知見が得られ,これらは燃焼室形状をいかなる時間にいかに変形させるか等の考察を行う上で有用な基礎データとなるものと思われる.研究実績の概要(当該年度のまとめ)1).本研究課題の目的を達成するための予備的実験として,まず密閉容器内の層流及び乱流火炎伝播過程の一定の段階に冷却素子による熱損失を付加したときの燃焼特性上への影響を調べる必要がある.このために平成7年度の実験は主に固定形状燃焼容器(円筒型)内の火炎伝播過程の初期および末期における燃焼ガスに熱損失を与えることの効果に関して実験を行った.2).層流火炎伝播においては,初期火炎伝播過程に熱損失を付加した場合の燃焼時間上の影響はなかった.火炎伝播末期においては,4%程度燃焼時間は短縮された.燃焼ガス成分のNox濃度を測定したところ,火炎伝播過程初期に熱損失を与えると,No濃度が約40%低下した.同様に火炎伝播過程末期における熱損失付加では,生成濃度が約30%低下した.このことは,ホプキンソン効果による燃焼ガスの温度上昇を,熱損失を加えることによって低下させ,結果的にNO濃度の低減を計られたことを示唆する.なお,熱効率に関係する最高圧力値は両者はも約7%程度の低下を示した.3).一方,乱流火炎伝播(乱流強度15m/s程度)において同様の実験を行うと,冷却素子の配置によって,NOx濃度は約30%40%,最高圧力は約1%4%程度低減した.燃焼時間については,火炎伝播初期に冷却素子を用いると約16%,末期では2.4%程度増大した.さらに,冷却素子を容器周壁付近に設置し,スワールの影響について調べたところ,NOx濃度は約50%程度,最高圧力値は3%程度低下し,燃焼時間は8%程度増大した.4).これら結果の詳細な解析は未だ行っていないが火炎伝播の如何なる段階で,どの程度の熱損失を与えれば,熱効率を低下させずに有害排気成分を低下させることができるかの本研究課題達成上の有益な知見を得ることができた.本研究では,密閉容器内の火炎伝播過程において容器形状を変化させることにより,様々な熱発生率パターンを得ることを通して,熱効率の向上および有害排気ガスの低減の可能性を調べるための基礎データの取得を行うことを目的とした.その第一段階として,火炎伝播過程の一定の段階に冷却素子による熱損失を負荷したときの燃焼特性および有害排気ガス排出特性を調べた.その結果,火炎伝播過程の初期段階に熱損失を与えると,燃焼特性にほとんど変化はないものの,窒素酸化物排出濃度が大きく低下することを明らかにした.

一方,火炎伝播末期に熱損失を与えると,燃焼期間がやや短縮し,窒素酸化物濃度も若干低下することがわかった.また,燃焼室形状が火炎伝播過程に及ぼす影響を基礎的に明らかにするため,様々な形状の燃焼室における火炎伝播過程の観察を行い、燃焼時間が燃焼室形状により大きく変化する傾向を示すことが認められた.さらに,密閉容器中に燃料を噴射させ,噴射形態が燃焼特性および窒素酸化物排出特性に及ぼす影響を調べた.その結果,燃料を対向して噴射させ,燃焼室中央部で燃料噴流を衝突させると,燃焼期間が短縮し,窒素酸化物濃度が低減することがわかった.また,燃焼室形状,噴射条件および噴射間距離が燃焼特性に及ぼす影響を調べた.これらの実験結果から,燃焼室形状が燃焼特性および排気特性に及ぼす影響に関する様々な知見が得られ,これらは燃焼室形状をいかなる時間にいかに変形させるか等の考察を行う上で有用な基礎的データとなるものと思われる.
レイノー症状におけるムスカリン性アセチルコリン受容体に対する自己抗体関与の検討

膠原病におけるレイノー症状発現の機序の一つとして、ムスカリン性アセチルコリン受容体(m-AC hR)に対する自己抗体の存在により、血管レベルでのm-AC hRの機能低下をきたし、血管攣縮の抑制が障害され、その結果、寒冷刺激によりレイノー症状が発現する可能性があり、それを検討した。その結果、ヒト脳から抽出したm-AC hRを抗原として測定してみると、確かにレイノー症状陽性の膠原病患者血清IgG中にm-A Ch Rの活性を阻害する因子がみられ、既に報告した。そこで、昭和62、63年度では、血管内皮細胞より血管弛緩因子(EDRF)が分泌されるとの報告に注目し、内皮細胞に対する患者血清の障害活性によるEDRFの低下の可能性を検討した。その結果、患者全血清の同細胞に対する障害活性を示す死細胞率(dye exelusion法)は、レイノー症状陽性群、および血管炎合併群、それぞれ61.9±22.7% (M±SD膠原病におけるレイノー症状発現の機序の一つとして、ムスカリン性アセチルコリン受容体(m-AC hR)に対する自己抗体の存在により、血管レベルでのm-AC hRの機能低下をきたし、血管攣縮の抑制が障害され、その結果、寒冷刺激によりレイノー症状が発現する可能性があり、それを検討した。その結果、患者全血清の同細胞に対する障害活性を示す死細胞率(dye exelusion法)は、レイノー症状陽性群、および血管炎合併群、それぞれ61.9±22.7% (M±SDレイノー現象陽性の膠原病患者の血清中には,脳を材料としたアセチルコリン受容体(m-AChR)を用いると,それに対する抗体が存在することが前年度の研究で明らかになった.そこで,直接,血管を材料としたm-AChRを用いた場合にも抗体活性がみられるかを検討した.そのために,まず,血管内皮細胞由来の培養細胞株(PAE20)を用いて,そこにm-AChRやアドレナリン受容体の有無を検討した. Yamamuraら,およびGreengrassらの方法を用いて測定したところ, m-AChRは検出することができなかった.他の血管材料を用いて,さらに検討を継続することとした.一方,近年,血管内皮細胞から血管弛緩因子(EDRF)が分泌されるとの報告があるので,上記患者血清中に血管内皮細胞を免疫学的に障害して,ひいてはEDRFの分泌低下をきたして血管の過剰攣縮に至る可能性を検討した.PAE20細胞を標的細胞として,患者IgGとを反応させ,補体源として正常ヒト新鮮血清を添加, dye exclusion法にて死細胞率をみた.その結果,健常人血清群では32.5±6.8%,レイノー現象陰性膠原病血清群では40.8±20.9%であったが,レイノー現象陽性膠原病血清群では61.9±22.7%(p<0.01),血管炎血清群では76.6±16.6%(p<0.001)と,有意に高値であった.この内皮細胞障害因子は,膠原病患者にみられる抗n-RNP抗体などの他の既知の自己抗体とも別個のものであった.この所見から,レイノー現象の機序の可能性の一つとして,血管内皮細胞の障害の関与を示唆された.この現象は単一の機序によっておこるとは限らず,抗m-AChR抗体などの複数の機序の総合によっておこるのかもしれない.レイノー症状発現の機序の解明のために、従来より、種々検討を加えてきた。その機序の一つとして、ムスカリン性アセチルコリン受容体(m-AChR)に対する自己抗体の存在により、血管レベルでのm-AChRの機能低下をきたし、寒冷刺激に対する血管攣縮の閾値の減少によりレイノー症状が発症する可能性を検討した。その結果、ヒト脳から抽出したm-AChRを抗原として測定してみると、確かにレイノー病状陽性の膠原病患者血清1gG中にm-AChRの活性を阻害する因子がみられ、既に報告した。前年度、m-AChRの材料を脳ではなく、血管内皮細胞を用いて、レイノー症状発現のより直接的な機序の解明を試みた。血管内皮細胞由来培養細胞株(PAE20、都老人研の山本清隆博士により分与)を用いて、その細胞内のm-AChRに対する自己抗体の検出を試みたが、同細胞中には、充分なm-AChR活性が検出できなかったので、同抗体の測定はできなかった。そこで、同細胞に対する患者血清の傷害活性を検討した。その結果、患者全血清を同細胞と反応させると、対照に比し有意に傷害活性が高いことが分かった。この傷害活性が抗体であるのか、あるいは他の血清内の因子によるのかを確認するために、患者血清033%硫安分画でγ-グロブリンを、DEAE-セファデックスA-50にて1gG分画を精製し検討した。

症例数が少なく、推計学的には有意ではなかったものの、レイノー症状陽性膠原病患者では正常人に比し、血管内皮細胞傷害性を示す死細胞率(dye exclusion法)が高い傾向が示された。この傷害活性は患者血清中の1gG濃度や他の自己抗体(RNP抗体などの)とは相関は示さなかった。これらの成績から、レイノー症状の発現には、m-AChRに対する阻害因子のみならず、血管内皮細胞よる分泌されるといわれている血管弛緩因子に対する傷害も関与している可能性が示唆された。
加工誘起による新粒組織の生成機構-再結晶の再定義

室温から温間域までの大ひずみ加工下で生じる微細粒組織の生成過程と生成機構を明らかにするため,銅,アルミニウム合金,マグネシウム合金に通常の単軸圧縮と我々が開発した多軸多段階圧縮加工(MDF)を施し,その際に現れる変形特性と微視組織の生成過程との関係を系統的に調査した.また,変形誘起微細粒組織の焼きなまし特性を調査し、その熱的安定性を検討した.得られた主な成果は,次のようにまとめられる.1.結晶粒内にマイクロシアバンド,キンクバンドなどの変形帯がある臨界ひずみ以上で生じ,その密度とバンド境界間の方位差が変形と共に増加し,結晶粒内を細かく分割することが微細粒組織生成の原因と考えられる.これより,微細粒生成は加工誘起によるその場または動的な連続再結晶が働いて生じる,と結論される.2.多軸鍛造では変形帯が三次元空間中に種々の方向に生じ,それらが交差する結果,初期の粗大初期結晶粒が細かく均一に分割される結果,それを元に高ひずみ域で微細粒組織が生成する,いわゆる連続動的再結晶が働くと結論される.これより,多軸鍛造加工法は微細粒組織の生成を促進させる最も有効な大ひずみ加工法であると結論される.3.変形誘起微細粒組織の生成プロセスは3段階に分けられる.(1)平均粒界間方位差が変形に伴い急増して5°付近で停滞するステージ1,(2)ある臨界ひずみ以降で粒界間方位差が急増するステージ2,(3)高ひずみ域で新粒組織形成が顕著に起こり,粒界間方位差がある飽和値に接近するステージ3,である.4.加工誘起微細粒組織の焼きなまし過程では,核生成と新粒成長による通常の不連続再結晶ではなく,回復を伴った粒成長のみの過程,いわゆる静的なその場または連続再結晶,が起こると結論される.室温から温間域までの大ひずみ加工下で生じる微細粒組織の生成過程と生成機構を明らかにするため,銅,アルミニウム合金,マグネシウム合金に通常の単軸圧縮と我々が開発した多軸多段階圧縮加工(MDF)を施し,その際に現れる変形特性と微視組織の生成過程との関係を系統的に調査した.また,変形誘起微細粒組織の焼きなまし特性を調査し、その熱的安定性を検討した.得られた主な成果は,次のようにまとめられる.1.結晶粒内にマイクロシアバンド,キンクバンドなどの変形帯がある臨界ひずみ以上で生じ,その密度とバンド境界間の方位差が変形と共に増加し,結晶粒内を細かく分割することが微細粒組織生成の原因と考えられる.これより,微細粒生成は加工誘起によるその場または動的な連続再結晶が働いて生じる,と結論される.2.多軸鍛造では変形帯が三次元空間中に種々の方向に生じ,それらが交差する結果,初期の粗大初期結晶粒が細かく均一に分割される結果,それを元に高ひずみ域で微細粒組織が生成する,いわゆる連続動的再結晶が働くと結論される.これより,多軸鍛造加工法は微細粒組織の生成を促進させる最も有効な大ひずみ加工法であると結論される.3.変形誘起微細粒組織の生成プロセスは3段階に分けられる.(1)平均粒界間方位差が変形に伴い急増して5°付近で停滞するステージ1,(2)ある臨界ひずみ以降で粒界間方位差が急増するステージ2,(3)高ひずみ域で新粒組織形成が顕著に起こり,粒界間方位差がある飽和値に接近するステージ3,である.4.加工誘起微細粒組織の焼きなまし過程では,核生成と新粒成長による通常の不連続再結晶ではなく,回復を伴った粒成長のみの過程,いわゆる静的なその場または連続再結晶,が起こると結論される.温間,冷間での大ひずみ加工で生じる微細粒組織の生成過程を,銅,ニッケル合金,マグネシウム合金に単軸圧縮と多軸多段階圧縮加工を施して調査し,また大ひずみ加工後に施す焼きなまし過程を通常加工材のそれと比較調査し,次の諸結果を得た.1.マイクロシアバンド,キンクバンドなどの変形帯による結晶粒内の微細分割が大ひずみ域での微細粒組織生成の原因であり,これは加工誘起による「その場再結晶」または「連続再結晶」である.2.多軸鍛造では変形帯が三次元空間中に種々の方向に生じ,それらが交差する結果,初期の初期結晶粒が細かく均一に分割され,その結果高ひずみ域で微細粒組織が生成する.報告者が開発した多軸鍛造加工法は微細粒組織の生成を促進させる最も有効な大ひずみ加工法である.3.加工誘起微細粒組織の焼きなまし過程では,核生成と新粒成長による通常の不連続再結晶ではなく,回復を伴った粒成長のみが全領域で均質に起こり,いわゆる「静的な連続再結晶」が起こると結論される.温間,冷間での大ひずみ加工で生じる微細粒組織の生成過程を,鉄鋼,銅,アルミニウム合金,マグネシウム合金に単軸圧縮と多軸多段階圧縮加工を施して調査し,また大ひずみ加工後に施す焼きなまし過程を通常加工材のそれと比較調査し,次の諸結果を得た.

1.多軸鍛造では変形帯が三次元空間中に種々の方向に生じ,それらが交差する結果,初期の初期結晶粒が細かく均一に分割され,その結果高ひずみ域で微細粒組織が生成すること,いわゆる連続動的再結晶が働くと結論される.報告者が開発した多軸鍛造加工法は微細粒組織の生成を促進させる最も有効な大ひずみ加工法である.2.変形誘起微細粒組織の生成プロセスは3段階に分けられる.(1)平均粒界間方位差θ_<AB>が変形に伴い急増して5°付近で停滞するステージ1,(2)ある臨界ひずみ以降でθ_<AB>が急増するステージ2,(3)高ひずみ域で新粒組織形成が顕著に起こり,θ_<AB>がある飽和値に接近するステージ3,である.3.連続動的再結晶によって生じる微細粒組織の焼きなまし過程では,核生成と新粒成長による通常の不連続再結晶ではなく,回復を伴った粒成長のみが全領域で均質に起こり,いわゆる「静的な連続再結晶」が起こると結論される.
巨大芳香族環拡張ポルフィリンの開拓

ポルフィリンはピロール環を4つのメチン炭素でつないだ大環状化合物であり、可視光領域に吸収をもつことや発光があること、磁性、非線形光学効果、触媒機能など、様々な観点から研究されている。4つ以上のピロール環で環状になった環拡張ポルフィリンは、ポルフィリンとは異なり、柔軟な骨格をもつことや複数の金属を配位できること、近赤外領域にまで吸収をもつことなどからポルフィリンでは実現できないような性質をもっている。サブポルフィリンとは3つのピロール環を環状につないだ14π系の芳香族化合物で、強い発光があり、メゾ位の置換基の電子的な摂動が母核のサブポルフィリンの性質に大きく影響するなど、ポルフィリン、環拡張ポルフィリンとはまた違った性質を示す。サブポルフィリンの合成法は色々あるが、大変興味深いルートは環拡張ポルフィリンの分裂反応である。これにより、従来法である、トリピロリルボランとアリールアルデヒドとの縮合反応では得られない様々なメゾ位置換基をもつサブポルフィリンを得ることができる。以上の点を踏まえて、今年度はサブポルフィリンのメゾ位の置換基効果を詳細に検討するために、これまで合成例のないメゾ-ナフタレニルサブポルフィリン、メゾ-フェロセニルサブポルフィリンの合成などに着手した。特に後者はこれまでのサブポルフィリンとは違い、分子内電荷分離の影響で蛍光が微弱なために単離精製が困難であることを確かめた。ナフタレニルサブポルフィリンについてはX線結晶構造解析によってその構造を確かめた。当初は、新しい環拡張ポルフィリンをターゲットとして合成を行う予定であったが、単純な置換基修飾で光化学物性を制御できる理由で、環縮小ポルフィリンであるサブポルフィリンを研究対象として、研究を行った。サブポルフィリンでは、メゾ位の芳香環置換基が自由回転を行うため、置換基効果がポルフィリンに比較して非常におおきいことが分かっている。当面は、芳香環置換基を選択することにより非線形光学応答である2光子吸収断面積の大きな色素開発と蛍光量子収量の大きな色素開発を行うこととした。メゾにナフタレンやアントラセンを置換したサブポルフィリンの合成を検討中である。予備的な結果として、蛍光量子収量の値は大きいそうである。まだ、確定はしていない。
希土類錯体を用いた太陽光のマニピュレーション

シリカと有機シランとの複合体であるORMOSIL(Organically Modified Silicate)にユウロピウムフェナントロリン錯体またはテルビウムビピリジル錯体を導入し、可視域に高い透光性を有する赤色および緑色蛍光体ガラス成形体あるいは薄膜をゾル-ゲル法を用いて作製した。得られた透明蛍光体の蛍光強度はテトラエトキシシランから誘導されるシリカ成分とジエトキシジフェニルシランなどから誘導される有機シラン成分の割合に大きく依存し、ユウロピウム錯体では有機シラン成分の多い領域で、またテルビウム錯体ではシリカ成分の多い領域で、それぞれ蛍光強度は最大となることがわかった。さらに、ORMOSILマトリックスに導入する錯体濃度ならびに試料に残存している水あるいは有機溶媒を取り除くために熱処理条件を最適化することにより、得られた透明蛍光体の相対蛍光強度は市販の無機蛍光体に対して高いもので60%にも達することが明らかとなった。次に、得られた高輝度透明蛍光体薄膜を石英板にディップコートし、ユウロピウム錯体の紫外光を赤色光へ効率的に波長変換する作用を利用した太陽光集光板としての機能を検討した。得られた薄膜の厚さは、一回のコーティングでおよそ0.1-0.2mmとなり、重ね塗りをすることにより0.5mm程度の膜厚の薄膜が得られた。その結果、紫外域に分光感度を持たない単結晶シリコン太陽電池の短絡電流が蛍光体薄膜の波長変換作用のために、被覆しない場合に比べおよそ10%増大することが明らかとなった。
細胞内応答駆動型超分子によるバイオ分子間反応解析

本研究では、分子科学に基づいたナノメディシンの実現を目指し、細胞内の生命反応を応答駆動力として細胞内反応を調節する超分子を設計した。基本分子骨格として、線状高分子であるポリエチレングリコール(PEG)に環状分子であるシクロデキストリン(CD)が貫通した骨格のポリロタキサン(PRX)を使用した。PRXは末端の切断による分解応答特性を示すため、分解応答型PRXを基盤材料として、ポリロタキサン分子骨格と生体分子との相互作用、核酸やタンパク質等の細胞内導入と生理活性の発現におけるPRX分子構造の影響、ならびに細胞内分解特性の効果について検討した。本年度は、細胞内での分子間反応を解析する動的超分子の基盤として、環状分子としてα-シクロデキストリン(α-CD)、線状高分子としてポリエチレングリコール(PEG)を用いて種々の細胞内分解性基をPEG末端に有するポリロタキサンを合成し、その細胞内分子反応の基礎となる解析を行った。具体的には、細胞内還元環境下で分解するジスルフィド結合、細胞小胞内など低pH下で分解するアセタール基をそれぞれPEG両末端に導入したポリロタキサンを合成した。その上で、タンパク質や核酸など有用物質の細胞内送達、細胞膜タンパク質との相互作用、および細胞内取り込みを制御するために、CD側鎖に疎水性基(メトキシ基)あるいはカチオン性基(ジメチルアミノエチル基)を導入した。これらポリロタキサンを用いて、核酸(pDNAおよびsiRNA)との複合体形成および核酸放出特性を解析した。また、細胞毒性を培養HeLa細胞を用いたMTTアッセイにより評価した。更に、来年度以降にポリロタキサンの細胞内挙動を共焦点レーザー顕微鏡およびFACSにより定量的に解析する目的で、CD側鎖に蛍光物質を導入した。カチオン性基を導入した細胞内分解性ポリロタキサンと核酸との複合体形成については、pDNAではカチオン/アニオン比に依存した傾向が、siRNAではモル比依存性がそれぞれ認められた。またこれら核酸の放出特性解析から、siRNAとの複合体がpDNAよりも粗であることが示された。こうした結果から、pDNAとsiRNAとではポリロタキサンとの複合体形成の機構が異なっていることが明らかとなった。また、種々のカチオン性基を有する細胞内分解性ポリロタキサンの細胞毒性をMTTアッセイにより評価した。対照として用いたポリエチレンイミンではカチオン濃度依存的な強い細胞毒性が認められたが、ポリロタキサンの毒性ははるかに軽微であり、カチオン濃度依存性の低いことがわかった。これより、カチオン性基を導入した細胞内分解性ポリロタキサンでは、カチオン性基が導入されているCDの運動性やポリロタキサン骨格による分子剛直性などによって細胞膜構造を破壊するような強い相互作用を回避しているものと推測された。本研究では、シクロデキストリンの空洞部に線状高分子が貫通した超分子ポリロタキサン(PRX)を用いた細胞内分子反応解析、および治療技術の確立を目的としている。前年度まで細胞内分解性結合を有するPRXを設計し、核酸やタンパク質の細胞内導入に関して検討を行ってきた。今年度は、細胞内分解性PRXが細胞内で分解し多数のCDを放出する点に着目し、ライソゾーム病の一つであるNiemann-Pick病C型治療への応用を検討した。本疾患はNPC1の変異により、リソソーム内にコレステロールや脂質の異常蓄積が起こる疾患であり、進行性の神経後退を引き起こす致死的疾患であるが、現在有効な治療法が確立されていない。分解性PRX、非分解性PRX、および現在臨床応用が進められているHP-β-CDをβ-CD濃度0.1 mMでNPC病患者由来繊維芽細胞(NPC細胞)と24時間接触させ、コレステロールの局在をFilipin染色により観察した。分解性PRXで処理したNPC細胞はFilipinに由来する蛍光強度が未処理NPC1細胞と比較して低下し、正常細胞と同程度までコレステロール蓄積が改善さていることが明らかとなった。一方、HP-β-CDで処理したNPC細胞は,本実験濃度では大きな変化は認められなかった。分解性PRXのコレステロール蓄積改善作用をより明らかとするため、細胞内コレステロール蓄積量の定量を行なった。コレステロール蓄積量に対する用量反応曲線より求めたHP-β-CDの半数効果濃度(EC50)は2.6 mMであったのに対し、分解性PRXの半数効果濃度はHP-β-CDの約1/100である0.024 mMであった。一方、非分解性PRXでは10 mMでも有意なコレステロール量の変化が認められなかったことより、細胞内環境におけるPRXの分解とβ-CDの放出がコレステロール蓄積改善に非常に有効であることが示唆された。本研究課題では、環状分子の空洞部に線状高分子が貫通したインターロック構造の超分子ポリロタキサン(PRX)を基盤材料として、細胞内反応の解析、および治療技術への応用を目的としている。前年度までの研究で、細胞内環境で超分子骨格が分解する細胞内分解性PRXを設計し、核酸タンパク質の細胞内導入キャリアとしての機能評価を進め、PRX骨格の有用性を明らかとしてきた。一方、細胞内分解性PRXが細胞内で分解し、多数の環状分子(シクロデキストリン)を放出する現象に着目し、これを利用したライソゾーム病治療について検討を進めてきた。先天的な遺伝子変異によりリソソームにコレステロールが慢性的に蓄積するニーマンピック病C型に対し、PRXはリソソーム内のコレステロール異常蓄積を改善することを明らかとした。

ニーマンピック病C型を含むライソゾーム病ではリソソーム機能の異常により、細胞のタンパク質分解機能であるオートファジーが正常に機能していないことが明らかとされている。特にニーマンピック病C型では定常状態でオートファゴソームの蓄積が認められる。このようなニーマンピック病C型におけるオートファジー機能異常に対し、細胞内分解性PRXを作用させることでオートリソソームの形成を促進し、オートファジー機能を正常細胞と同程度まで改善することを明らかとした。平成23-26年度の期間、様々なCD貫通率、ジメチルアミノエチル(DMAE)基修飾数のポリロタキサンを合成し、分子構造と細胞、生体分子との相互作用解析、および細胞内デリバリーに関する検討を行なった。これまでの研究を踏まえ本年度は、マイナス電荷の硫酸基を有するポリロタキサンを新たに設計し、カチオン性の成長因子であるBMP-2との複合体形成、ならびに成長因子活性(骨分化能)に関して評価を行った。硫酸基修飾数の異なるポリロタキサン(PEG分子量4500, α-CD貫通数29)を調製し、BMP-2と混合することで複合体を作成した。MC3T3-E1細胞を使用し、BMP-2複合体添加後に骨分化を調べるために、初期分化マーカーであるalkaline phosphatase(ALP)産生量、石灰化の評価としてAlizarin Red染色を行った。比較対象として、BMP-2と複合体を形成し成長因子活性を亢進することが知られているヘパリンを使用した。培養3日後の調べた結果、BMP-2単体、ヘパリン/BMP-2複合体では既報と同様にALP産生量の向上が認められた。興味深いことに硫酸化ポリロタキサン/BMP-2複合体はヘパリンの約2倍、BMP-2単体の約3倍という非常に高いALP産生量を示した。また、培養14日後にAlizarin Red染色を行い、石灰化を評価した結果、硫酸化ポリロタキサン/BMP-2複合体では他群と比較して約10倍以上の顕著な石灰化を認めた。また、ヘパリンは血液抗凝固作用を示すことが知られているが、硫酸化ポリロタキサンはヘパリンが抗凝固作用を示す濃度の1000倍でも全く抗凝固作用を示さなかった。以上より、硫酸化ポリロタキサンは安全性、骨形成の亢進に優れることから骨形成因子を体内で有効に利用するための添加剤やスキャフォールドとしての利用が期待される。本研究では、分子科学に基づいたナノメディシンの実現を目指し、細胞内の生命反応を応答駆動力として細胞内反応を調節する超分子を設計した。基本分子骨格として、線状高分子であるポリエチレングリコール(PEG)に環状分子であるシクロデキストリン(CD)が貫通した骨格のポリロタキサン(PRX)を使用した。PRXは末端の切断による分解応答特性を示すため、分解応答型PRXを基盤材料として、ポリロタキサン分子骨格と生体分子との相互作用、核酸やタンパク質等の細胞内導入と生理活性の発現におけるPRX分子構造の影響、ならびに細胞内分解特性の効果について検討した。本研究では分析、診断、治療における超分子ポリロタキサン(PRX)の応用を推進しており、本年度は特に生体分子の細胞内デリバリーを推進し、PRX超分子骨格の効果を明らかとすることを目的に研究を実施した。
種間雑種・突然変異による性転換を用いたメダカ性決定/性分化制御機構の解明

野生集団中の性転換個体、XX雄、XY雌出現に関する遺伝子の同定とその機能解析、およびメダカとハイナンメダカの種間雑種における性転換の解析を通じて、メダカの性決定、性分化の分子機構の解明を目指した研究を進めている。本年度の主要な成果は以下の通りである。1.日本の野生メダカ集団中には遺伝的原因によるXX雄、XY雌が約1%程度生息していた。2.XY雄は性決定遺伝子DMYの機能欠損型あるいは機能低下型の突然変異であった。3.性決定遺伝子が同じであるメダカとハイナンメダカの種間雑種個体の性転換の原因は、野生メダカの機能低下型突然変異と同様のしくみによることが示唆された。4.突然変異および近縁種の機能低下型DMYによる性転換に関わる遺伝因子がメダカLG2, LG4, LG17に存在していることが明らかになった。5.新潟市白根由来のXX雄出現の原因はSox9bの発現低下によることが判明した。Sox9b白根型対立遺伝子を持つ個体の性については遺伝的背景に影響がある、つまり、他に関与する遺伝子が複数存在することが示唆された。また、変異型遺伝子をHd-rR系統に導入した系統では、ヘテロに持つものからは機能的な雌雄が出現するが、ホモ個体では生殖細胞欠損になり、表現形は雄になった。つまり、Sox9b遺伝子は雌雄にかかわらず生殖細胞の維持に関わっており、その機能次第で性転換が誘導されうることが判明した。以上から、メダカの性決定に関与する遺伝子がY染色体以外の常染色体上に複数存在することが明らかになった。また、機能低下型突然変異の解析から、メダカ近縁種の性決定遺伝子の多様性の出現機構が、種内の性決定関連遺伝子の多型性により説明可能であることが示された。野生集団中の性転換個体、XX雄、XY雌出現に関する遺伝子の同定とその機能解析を通じて、メダカの性決定、性分化機構の解明を目指して研究を進めている。1)新潟市白根地区から得られたXX雄の原因遺伝子のさらなる探索を進めた。昨年までに、メダカ連鎖群8の190KBの領域に原因遺伝子が存在することが明らかになっていたが、本年、その領域の塩基配列をメダカゲノムデータベースから得て、その領域に存在する遺伝子を予測した。RT-PCR解析から、予測遺伝子のうち、性分化時に発現していたのは3遺伝子であること、さらにin situ Hybridizationにより、性分化しつつある生殖巣で発現しているのは1つであることが判明し、原因遺伝子の有力な候補がSox9bであることが明らかになった。変異個体のSox9bのアミノ酸コード領域の塩基配列には異常は認められなかったが、正常個体とXX雄個体の発現比較から、XX雄個体においてはSox9bの発現低下が認められた。以上から、Sox9bの発現量の低下により、精巣分化が誘導される可能性が示唆された。2)新潟市白根地区から得られたDMYの発現低下による雌出現に関わる遺伝子について、メダカのLG1-24の全ての連鎖群のマーカーを使って連鎖解析を行ったところ、従来から存在が示唆されていたLG2上の遺伝子に加えて、LG4上にも"性変更遺伝子"が存在することが明らかになった。以上を含め、これまでの研究から、メダカ野生集団およびメダカとハイナンメダカの種間雑種の性転換個体の解析から、LG2,4,8,17上の遺伝子が性決定/性分化に関与していることが示されたことになる。