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塩化バリウム系固体電解質を用いた塩素ガスセンサの実用化

塩素ガスはハロゲン元素中最も大量かつ広範囲に用いられているが、毒性の強い腐食性ガスであるため、排出ガス中や工場内の塩素ガス濃度をモニターできるセンサの設置が切望されている。我々は、塩化物イオン伝導体である塩化バリウム系固体電解質(0.97BaCl_2-0.03KCl)を開発し、新たな方法である溶融法を用いてセンサプロープを作成した。本研究の目的は塩化バリウム系固体電解質を用いて濃淡電池方式の塩素ガスセンサを開発し、特に10ppm以下の低塩素ガス濃度域での応答を向上させ、現場への応用を可能にすることにあった。結論として、固体電解質中に含まれる不純物としての酸化バリウムが、応答速度や低塩素ガス濃度域における起電力応答を影響を与えることが明らかにされ、溶融法によるプロープの作製を真空中で行うと、塩化バリウムが空気中の酸素と反応して酸化バリウムとなることがなく、最も優れた応答が得られる。10ppm1000ppmまでの範囲ではほぼ測定値が理論起電力と一致しているが、それ以下の塩素ガス範囲では、理論起電力よりも約20mV小さい測定起電力となった。この10ppm以下の理論起電力と測定起電力の差についての原因はまだ明らかではない。また応答速度についても、真空中作製することによりかなり改善されることが明らかになっている。現在の段階では、10ppm以上の高濃度塩素ガスの検知する目的での応用が可能であるが、1ppm程度の低濃度域では理論起電力と測定値が一致していないため、現場への応用を見合わせている。本研究により、塩化物系固体電解質を用いた塩素ガスセンサについての電極における副反応の影響が明らかになり、これらの研究結果を基に将来の研究では現場への応用を試みる段階まで到達できると確信している。申請者らはこれまでに、塩化物イオン伝導体である塩化バリウム系固体電解質(0.97BaCl_2-0.03KCl)を用いた塩素ガスセンサを開発している。本研究の目的は特に10ppm以下の低塩素ガス濃度域での応答を向上させ現場への応用を可能にすることにある。平成6年度は、特に低濃度域での応答を改善するために以下のことを行った。1.ガス分割器とガスラインの改良これまでは所定のガス濃度を得るために電磁弁を用いたステンレス製の分割器を用いていたが、ステンレスの内壁の面積が大きいため室温の高い日は塩素ガスと反応し、特に低濃度域の濃度が変化してしまうことがわかった。そこで、ガスと金属面がほとんど接触しない流量計を購入し、ガスラインをできるだけ短くして塩素ガスとの反応や吸着を防いだ。2.電極の粒径による影響測定極として用いるRuO_2について、様々な粒径のものを用いて応答を比較した。3.センサ作動温度の影響これまで350°Cのみしか測定を行っていないが、200400°Cの範囲で変化させて応答を比較した。ガス分割器とガスラインの改良により、気温の高い日にガス濃度が変化するということはなくなり、0.5ppmまで信用できる塩素ガス濃度を作ることができるようになった。センサ応答を比較すると粒径のきわめて小さいペーストを用いるよりも粒径のやや大きい粉末を用いるほうが応答速度が速くなり、またセンサの作動温度は300°Cが最も適していることが明らかになった。その結果、1ppmまでの低濃度まで理論起電力と測定値が一致した。しかし、現場への応用は0.1ppmまでの低濃度域での応答が必要であり、この濃度をどのようにして作り出すかが今後の課題である。

塩素ガスはハロゲン元素中最も大量かつ広範囲に用いられているが、毒性の強い腐食性ガスであるため、排出ガス中や工場内の塩素ガス濃度をモニターできるセンサの設置が切望されている。我々は、塩化物イオン伝導体である塩化バリウム系固体電解質(0.97BaCl_2-0.03KCl)を開発し、新たな方法である溶融法を用いてセンサプローブを作成した。本研究の目的は塩化バリウム系固体電解質を用いて濃淡電池方式の塩素ガスセンサを開発し、特に10ppm以下の低塩素ガス濃度域での応答を向上させ、現場への応用を可能にすることにあった。結論として、固体電解質中に含まれる不純物としての酸化バリウムが、応答速度や低塩素ガス濃度域における起電力応答を影響を与えることが明らかにされ、溶融法によるプローブの作製を真空中で行うと、塩化バリウムが空気中の酸素と反応して酸化バリウムとなることがなく、最も優れた応答が得られる。10ppm1000ppmまでの範囲ではほぼ測定値が理論起電力と一致しているが、それ以下の塩素ガス範囲では、理論起電力よりも約20mV小さい測定起電力となった。この10ppm以下の理論起電力と測定起電力の差についての原因はまだ明らかではない。また応答速度についても、真空中作製することによりかなり改善されることが明らかになっている。現在の段階では、10ppm以上の高濃度塩素ガスの検知する目的での応用が可能であるが、1ppm程度の低濃度域では理論起電力と測定値が一致していないため、現場への応用を見合わせている。本研究により、塩化物系固体電解質を用いた塩素ガスセンサについての電極における副反応の影響が明らかになり、これらの研究結果を基に将来の研究では現場への応用を試みる段階まで到達できると確信している。
情報漏洩を防ぐ安心・安全プロセッサアーキテクチャの研究

情報漏洩は情報化社会が本質的に抱える問題であり、技術的な解決が必要である。マイクロプロセッサの制御方式を含めて情報漏洩を検討している研究は少ない。データがどのように扱われるべきかは、本来プログラムが任意に酌量することではなく、データそのものに付加されるべき属性である。その上でプログラムがデータをどのように扱うかを監視することができれば、プログラムの出所に関わらず、情報漏洩防止を実現することができる。このような情報フロー追跡は計算コストが膨大なことから、これまであまり検討がされてこなかった。我々はマイクロプロセッサの処理スループットを向上させる研究を数多く行ってきており、情報フロー追跡を利用して情報漏洩を防ぐことは少ない性能オーバヘッドで可能であると考えている。本研究では柔軟かつ堅牢な情報漏洩防止アーキテクチャの実現を目指す。すべてのデータにはどのような使用を許可するかというライセンス条件が付加される。ライセンス条件は、プログラム中のデータ処理において、ソースからディスティネーションへと伝播し、情報漏洩を検出し、プログラムを停止させることができる。本年度は、分岐によって生じる暗黙的情報フローによる情報漏洩をも防止できるプラットフォーム技術を提案した。この方式に則れば、たとえアプリケーションに脆弱性があったとしても、情報漏洩を完全に防止することができる。ライセンス条件は、プログラム中のデータ処理において、ソースからディスティネーションへと伝播し、情報漏洩を検出し、プログラムな停止させることができる。
統計力学と量子論に動機を持つ数理物理学の確率解析的研究

当研究で取り組んだ具体的な課題は次の2つである。1つには安定型白色雑音を伴う放物型確率偏微分方程式の解の正則性の問題、もう1つは確率線型輸送方程式の観測地から係数を推定する逆問題である。第一の問題については、(可積分性の低い)バナッハ空間の補間空間論を援用して正則性を議論する方針をとり、基準となる各空間での(非対称)独立確率変数の収束条件を得た。逆問題については2次変分過程を元としてランダムな観測地から決定論的係数を推定する公式を得ることにも成功した。今年度は7月までケンブリッジ大学アイザック・ニュートン数理科学研究所において確率偏微分方程式に関する集中研究プログラムに参加し、量子力学ハミルトニアンが導く複素ヒルベルト空間上の線形力学系の再帰性に関する確率解析的研究・飛躍を持つ安定型白色雑音を伴う線形放物型方程式の解の正則性・ガウス型白色雑音を伴う線形輸送方程式に関する係数推定の逆問題について集中して研究を行った。量子系については、Brzezniak, Dawidovichらと有益な意見交換を行い、複素ヒルベルト空間上にハミルトニアンが自然に導くガウス測度がシュレーディンガー流に対する不変確率測度になっていることを示したほか、この測度を積分分解することによってハミルトニアンの固有空間における位相変数が無限次元トーラス上の自然なルベーグ測度を不変にすることを示すことに成功したほか、ワイル変換の無限次元拡張として自然なエルゴード性の条件を示すことができた。この結果についてはニュートン研究所の隔離偏微分方程式セミナーおよびEast Midland Stochastic Analysis Seminarにて研究成果の講演を行った。放物型方程式の解の正則性に関してはBrzezniak, Xieらと共同して研究を行い、特に楕円形作用素の時間方向および空間方向への解の正則化効果について明快な関係式を得ることができた。また逆問題については、Crisan, Peszatと共同して研究を行い、大きな進展が得られたほか、年度末にリオーベン大学を訪問した際にその研究は完成をした。本年度はヒルベルト空間上の正値で対称なハミルトニアンが定める量子系の時間発展に対して無限次元空間上の線形作用素が定める力学系としての観点から研究を行った。特に興味があったのは、ハミルトニアンが離散スペクトルのみを持つ場合の測度論的考察と、特異連続なスペクトルを持つ場合の関数解析的考察である。前者においてはハミルトニアンのスペクトル構造から、そのシュレーディンガー群の定義されるヒルベルト空間上に自然にガウス測度が決定され、その積分分解によって自然にワイル変換の無限直積が導かれる。それによって量子系の時間発展に対する精緻な解析が可能となることが昨年までに示されていたが、今年度はエルゴード性の観点からそれをさらに精密なものとした。従来線形空間上の線形変換は力学系の理論の中ではさして重要とは考えられていなかったが、この成果によって無限次元空間では非自明で深い解析が可能であることが明らかとなり、また偏微分方程式が定める無限次元力学系としての様相も明らかなものとなった。さらに特異連続なスペクトルを持つ場合にはそのような測度論的な考察は現時点では不可能であるが、関数解析的な分析によって、相当程度一般といえる関数空間において、再帰性が決して成り立たないことを示すことができた。これは再帰性の観点から言えば、特異連続スペクトルは絶対連続スペクトルに近い挙動を示すことを意味しており、従来理解されてきた散乱理論の観点ではむしろ離散スペクトルに近いと考えられていたことをあわせると、きわめて重大で繊細な現象であるといえる。ただし、現時点では特異連続スペクトルに属す完全に一般の初期関数に対してこの性質が成り立つかどうかは不明なままである。本年度は、安定型白色雑音をもつ確率偏微分方程式の解の構成のために必要となるバナッハ空間値の独立確率変数の和についての収束の条件についての研究を行った。安定型雑音自身は対称な確率変数であるが、熱核が作用する結果対称性は失われるので、これは伊藤ー西尾の一般論では議論できない。前年度までの研究において、低い可積分性の下での末尾確率の制御が残されていたが、これをかなり一般の状況下で解決でき、解が連続になることと安定指数が独立であることなどの研究成果が得られた。これによって対象の確率偏微分方程式の解の時間方向及び空間方向の正則性の問題についてかなり見通しよく議論できるようになり、それをもとにして現在まで得られていた成果を精密化する作業を開始することができるようになった。一方でもう一つの課題であった確率輸送方程式の逆問題については、加法型・乗法型の両方の方程式と、時間白色・空間白色のガウス型雑音の組み合わせによって4通りの方程式を考えていたが、特に時間方向への乗法型雑音を持つ場合、長い間の懸案であった2次変分過程を用いた係数推定が可能となった。

ランダムな観測から決定論的な係数を回復するためには、典型的には大数の法則型の議論と2次変分型の議論とがあり、従来は大数の法則型の議論しかできていなかった。なお加法型雑音の場合には、観測値の2次変分過程はもとの方程式の係数の情報を含んでいないことは以前から示していたところであったので、これによって確率解析学的観点から満足いく議論ができるようになった。本年度の一つの目標は線型輸送方程式に雑音項が加わった場合にその係数推定の逆問題を考える基礎となる、雑音効果の除去法であった。もし系が常微分方程式で与えられているならば、加法的雑音が加わった場合の解の分布は単なるブラウン運動に絶対連続であり、一つの見本路からそれらを区別することは一見困難に見える。係数推定の逆問題では偏微分方程式においてこの問題を実行することが本質的な問題となるが、観測されたデータを適切にスケール変換して極限操作をとることによって解の分布を特異なものとして推定することが可能になることが見いだされた。この手法を輸送方程式に適用し、その成果は研究集会においてすでに口頭発表を行っている。もう一つの目標は安定雑音を伴う放物型確率偏微分方程式の解の正則性問題であった。ガウス型雑音と異なり、一般の安定雑音のもとでは、ラプラス作用素による正則性効果が時間方向と空間方向とで全く異なる現れ方をするという予測のもとでその詳細な定式化に取り組んだ。2月には共同研究者であるZdzislaw Brzezniak氏とも徹底的な議論を行い、この現象に対する理解が深められた。これは確率論としては独立同分布な確率変数の和の収束に関わる問題であり、古くから伊藤-西尾型の理論として知られる由緒正しい問題であるが、安定雑音の場合には容易に一般論には落ちず、残念ながらまだ証明は完成していない。しかし確率の末尾分布の漸近挙動と積率の和の収束に関しては完全な結果が得られており、それは予測と完全に一致している。この両者から概収束を導くことが残された課題であるが、現在も電子メール等を利用して議論を継続しており、近々証明が完了するものと期待している。当初計画であった量子系に対する力学系的解析を加えるという点では、不変測度の構成が可能であり、非自明なワイル変換を導いたということで順調である。ただし量子場の挙動についてはまだ解明されていない点が残る。特異スペクトルの場合にはかなり広い空間で深い現象を観察できている。25年度が最終年度であるため、記入しない。確率的な輸送方程式の逆問題についてはおおむね予定通り研究が進捗した。順問題の解の存在、一意性についてはほぼ完全な解が得られたと言って過言ではないが、技術的には若干途中用いた半群の解析性についてやや一般化したい点が残されており、数学研究として完全に決着したとはいえない。安定雑音のばあいの確率偏微分方程式の正則性の問題については、当初期待していた証明の完成とはいかず、未だ技術的問題点が若干残っている。しかしながら、それによって明らかとなった解析的あるいは確率論的な構造も多くあり、証明完成に向けて順調に進展しているという感覚が得られていると同時に、新たに得られた知見も多くあり、全体として研究の進捗は順調であると判断できる。今後も計画通り無限次元解析あるいは確率解析的な手法を用いて、量子場の場合を込めて、力学系的な考察を行う予定である。
Sprouty/Spredの癌における役割の解明

Sprouty/Spredファミリー分子は、増殖因子やサイトカインによるERK経路活性化を抑制する調節因子である。Sprouty/Spredファミリーの生理的な役割を明らかにするためにノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。これまでにSpred1/2DKOマウスがVEGF-C/VEGFR-3シグナルに異常を来し、リンパ管の異常を呈することを報告した。本年度はSprouty2/Sprouty4 DKOマウスの解析を継続し、DKOマウスは心血管系の異常が見られることを確認した。これらの結果よりSproutyは血管新生、VEGF-A/VEGFR-2シグナルの調節因子として生理的に重要であることを明らかにした。またSpredに関しては、Legius syndromeがSprouty/Spredファミリーの1つであるSPRED1に変異を持ち、神経線維腫症1型に類似した症状を示す症候群であることを見いだしている。本年度はベルギーとの共同研究において、患者で発見された様々な種類のSPRED1の機能欠損変異を作製し、機能を検討した。増殖因子によるERKの活性を指標とするレポーターアッセイやPC12分化のアッセイなどの実験を行い、その結果14種類の新たな機能欠失変異を同定した。さらにSpred/Sproutyファミリーの発がんに対する寄与を検討するためにアメリカ合衆国・カリフォルニア大学サンディエゴ校のMichael Karin教授の研究室において共同研究をスタートしている。大腸癌、肝臓癌におけるSprouty/Spredファミリーの働きをin vivoで明らかにするために、大腸と肝臓にそれぞれ特異的なプロモーターを使用し、SproutyやSpredを活性化させたトランスジェニックマウスを作製した。哺乳類ではSproutyは4種類、Spredは3種類報告されている。我々はSprouty/Spredファミリーの生理的な役割を明らかにするためにSprouty/Spredファミリーのノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。Sprouty4欠損マウスにおいては血管新生に重要なVEGF-A/VEGFR-2シグナルが過剰に入り、血管密度の増加、血管新生の亢進を認めた。また腫瘍血管の数や虚血モデルにおける新生血管の数もSrouty4欠損マウスで多く、Sprouty4が生理的にも血管形成を負に制御していることを明らかにした。Sprouty4はVEGF-A(血管内皮増殖因子)によるERK活性化を抑制するが、VEGF-CによるERK活性化は抑制しない。今回の研究ではSprouty4がMARCKS及びPKDの活性化やPKC依存性のNF_κBの活性化といった、PKCの下流と考えられるシグナル群を抑制することがわかった。更にSprouty4はカルシウム流動やフォスラアチジルイノシトール2リン酸(PIP_2)、イノシトール3リン酸(IP_3)といった、PKCより上流のシグナル群も抑制することがわかった。こうした抑制効果はSprouty4のカルボキシル末端にあるシステインリッチなドメインに依存しており、FGFによるERK活性化抑制に必須なアミノ末端の領域を必要としないことがわかった。Sprouty4の過剰発現や遺伝子欠損によってPIP_2の分解酵素であるフォスフォリパーゼC(PLC)_γ-1の活性化は影響を受けなかった。またSprouty4はVEGF-AだけでなくGタンパク共有受容体に活性化されるPLCβ/εを介したリゾフォスファチジン酸(LPA)によるPIP_2の加水分解をも抑制した。これらのことから、SproutyはさまざまなタイプのPLC依存性のシグナルを抑制することがわかった。これまでにSpred1/2 DKOマウスがVEGF-C/VEGFR-3シグナルに異常を来し、リンパ管の異常を呈することを報告した。一方Sprouty2/Sprouty4 DKOマウスは100%胎生致死であり、著明な浮腫や出血を認め、心血管系の異常が疑われた。そこで、Sprouty4単独KOマウスの血管を詳細に検討したところ、リンパ管の異常は認めないが、末梢の血管が増加していることが明らかとなった。そこで、マウスの下肢虚血、背部虚血モデルを行ったところ、Sprouty4 KOマウスでは野生型マウスに比べて、血管新生の亢進を認め、虚血に抵抗性であった。さらにSprouty2およびSprouty4のshRNAを下肢虚血モデルで投与したところ、コントロール群に比べて、虚血に抵抗性であった。以上より、Sproutyは下肢虚血の新しい治療標的となることが明らかとなった。またSprouty4 KOマウスは腫瘍の皮下移植モデルにおいても、野生型に比べ腫瘍内外の血管新生の亢進を認め、腫瘍の増殖も著明に速かった。Sprouty4はVEGF-AやFGFのみならず、sphingosine-1-phosphate(SIP)シグナルも抑制することができた。以上より、Sproutyは血管新生、VEGF-A/VEGFR-2シグナルの調節因子として生理的に重要であることが明らかとなった。これらの結果をCancer Science誌とPLoS One誌に発表した。

Sprouty/Spredファミリー分子は、増殖因子やサイトカインによるERK経路活性化を抑制する調節因子である。Sprouty/Spredファミリーの生理的な役割を明らかにするためにノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。これまでにSpred1/2DKOマウスがVEGF-C/VEGFR-3シグナルに異常を来し、リンパ管の異常を呈することを報告した。本年度はSprouty2/Sprouty4 DKOマウスの解析を継続し、DKOマウスは心血管系の異常が見られることを確認した。これらの結果よりSproutyは血管新生、VEGF-A/VEGFR-2シグナルの調節因子として生理的に重要であることを明らかにした。またSpredに関しては、Legius syndromeがSprouty/Spredファミリーの1つであるSPRED1に変異を持ち、神経線維腫症1型に類似した症状を示す症候群であることを見いだしている。本年度はベルギーとの共同研究において、患者で発見された様々な種類のSPRED1の機能欠損変異を作製し、機能を検討した。増殖因子によるERKの活性を指標とするレポーターアッセイやPC12分化のアッセイなどの実験を行い、その結果14種類の新たな機能欠失変異を同定した。さらにSpred/Sproutyファミリーの発がんに対する寄与を検討するためにアメリカ合衆国・カリフォルニア大学サンディエゴ校のMichael Karin教授の研究室において共同研究をスタートしている。大腸癌、肝臓癌におけるSprouty/Spredファミリーの働きをin vivoで明らかにするために、大腸と肝臓にそれぞれ特異的なプロモーターを使用し、SproutyやSpredを活性化させたトランスジェニックマウスを作製した。
グリーンケミストリーを指向した生理活性天然物の合成及び構造活性相関に関する研究

申請者はグリーンケミストリーを指向した有機合成を展開すべく、1)創薬シーズとなる機能性天然分子の探索、2)それらを用いたアナログ合成とそれらの構造活性相関の検討、3)酵素を利用した有機合成反応の開発及びその応用、4)金属触媒を用いる有機合成反応開発や、5)アミノ酸を用いた生理活性天然物の合成などを検討した。その結果、1)比較的栽培が容易な植物に着目、それらの素材の分離の際は、逆相カラムを用い水系溶媒を利用することを念頭に新規機能性有機天然分子の探索を行った。その結果、新規セスキ・ジテルペン数種を見いだすことが出来た。2)細胞毒活性などの生理活性を指標とし、比較的多量に得られた天然物のアナログ合成を行った。ent-カウレン型、イセテキサン型、及びアビエタン型ジテルペンについて細胞毒活性に関して構造相関を論じた。アナログ合成には、グリーンケミストリーを意識してマイクロウェーブの利用を検討し、天然物brussonolの生合成模倣型合成を実現した。更に、demethylsalvicanolを原料として酸化、固相条件下加熱することにより天然物grandioneを合成し、その報告された構造の訂正を行った。3)リパーゼTLを用いる光学分割反応をグリセロール誘導体に適用し、光学活性グリセロールの合成に成功した。一方、炭素5個の2級アルコールの光学分割反応のセミラージスケールへの適用が可能であることを示すことが出来、ピペラジン酸の多量合成への道を開いた。現在はヘキサデプシペプチドGE3の合成を検討している。4)パラジウム触媒を用いる創薬機能性分子骨格であるインドール、ピロールの簡易合成に成功した。5)安価で多量に購入できる天然資源であるアミノ酸をキラルプールとした異常アミノ酸の合成を行った。今後、グリーンケミストリーをより意識した有機合成を展開していく予定である。本年度は、以下の5つの項目に従い研究を遂行した。1)抗腫瘍活性環状ヘキサデプシペプチドGE3の合成:GE3の環状ヘキサデプチペプチド部分の合成で鍵となるピペラジン酸の両鏡像異性体のリパーゼTLのリサイクル化による実用的な合成方法を確立した。更に、ピペラジン酸を中心とするトリペプチドの合成を検討した結果、一方のトリペプチドの合成に成功した。現在残りのトリペプチドの合成を検討中である。2)Perovskia abrotanoidesより水系溶媒を用いるHPLC分取により得られたジテルペン類の誘導化及び細胞毒活性評価:イセテキサン型ジテルペンであるdemethylsalvicanolを原料として、天然物grandioneの生合成指向型合成を行なった。その結果、grandioneの構造訂正を行なうことが出来、更に、grandione及びそれらのアナログに細胞毒活性を見出した。一方、アビエタン型ジテルペンであるcarnosic acidを原料としてそれらのアナログを合成、及び細胞毒活性試験を行なったところ、C環部キノン構造もしくはその等価体構造が活性発現にとって重要であることを見出した。3)水系溶媒を用いるHPLC分取により得られたent-カウレン型ジテルペン及のアナログ合成及びそれらの細胞毒活性評価:天然から多量に得られるジテルペンexcisanin Aを原料として、1、12-モノ及びジアシル化合物を合成、細胞毒活性評価の結果、これらの類縁体の細胞毒活性に関する構造活性相関を明らかにすることが出来た。4)アミノ酸の有効利用の一環として、L-serineから容易に誘導されるGarnerアルデヒドをキラルテンプレートして、生理活性プロリン誘導体を合成した。5)毒ウツギから新規セスキテルペンの単離・構造決定を行い報告した。来年度は、マイクロウェーブを積極的に利用した天然物の構造変換を検討していく予定である。

本年度は以下の4項目について検討を行った。1)シソ科植物Perovskia abrotanoideより得られたicetexane型ジテルペンを出発原料として、マイクロウェーブを用いるアナログの合成を行い、それらの細胞毒活性を評価した。更に、それらの構造と活性との相関を明らかにした。一方、昨年度見いだしたdemethylsalvicanol σ-quinoneからgrandioneへの生合成模倣型立体選択的二量化反応の理論的な考察を行った。2)シソ科Salvia leucantha、マキ科Podocarpus macrophyllusからの水系溶媒を用いた新規ジテルペン類の探索を行い、数種の新規ジテルペン類を見いだした。更に、得られたent-kaurene型ジテルペンであるexcisanin Aを原料にして、1,14-位水酸基に関するアナログ合成を進め、それらの細胞毒活性を評価した。一方、Rabdokunmin Cを原料として、NF-κB活性化阻害作用を指標にしたアナログ合成も行い、それらの構造活性相関を明らかにした。2)昨年度、リパーゼTL^<TM>を用いる光学分割反応により多量に合成したピペラジン酸の両鏡像異性体を用いて他のアミノ酸残基との縮合を検討し、環状ヘキサデプシペプチドGE3の環状コア部分の合成に必要な2つのトリペプチドフラグメントの合成を行った。3)グリセロール誘導体のリパーゼTL^<TM>を用いる光学分割反応を鍵反応として、癌細胞浸潤阻害活性リン脂質PHYLPAアナログのコア部分の不斉合成に成功した。4)パラジウム触媒を用いるヒドロキシエナミン類の酸化を経るインドール及びピロール類の簡易合成法の開発に成功した。
哺乳動物初期胚における全能性の分子制御機構の解明

生物個体を構成する200種類以上の細胞に自律的に分化できる能力(全能性)を持つ細胞は受精卵と一部の初期胚に限定されている。しかしながら、全能性の分子制御機構は、未だ解明されていない。本研究では、未受精卵・受精卵・初期胚の経時的な差次的プロテオーム解析により、全能性の獲得・維持・喪失と関連すると考えられる時期に発現量が変化するタンパク質を同定し、タンパク質の分子ネットワークの基礎的知見を獲得した。分化全能性とは生物個体を形成する200種類以上の細胞に自律的に分化できる能力であり、この能力を持つ細胞は受精卵と一部の初期胚に限られている。しかしながら、受精卵が分化全能性を獲得するメカニズムは、未だ解明されていない。そこで、本研究では分化全能性の制御機構の分子基盤を解明すること目的に、未受精卵・受精卵・初期胚における経時的な差次的プロテオーム解析によって、分化全能性の獲得・維持・喪失と関連すると考えられる時期に発現量が変化するタンパク質を同定し、タンパク質の分子ネットワークに関する基礎的知見の獲得を行った。平成23年度は、未受精卵・受精卵・初期胚の経時的な差次的プロテオーム解析により発生過程の特徴を示すタンパク質が同定した。さらに、タンパク質発現変化を俯瞰するため、各発生段階で有意な発現変動を示すタンパク質群について、多変量解析(階層クラスタリングおよび主成分分析)やWestern blot解析による各タンパク質の発現と定量性を検証した。平成24年度は、獲得したタンパク質情報から、公共データベース及び酵母two-hybrid systemを用いた相互作用タンパク質を同定し、分化全能性の獲得・維持に関する分子ネットワークに関する基礎的知見を獲得した。具体的には、脱アデニレーション機能を持つnocturninの母性mRNA分解への関与、母性タンパク質分解における初期胚特異的プロテアソーム形成シャペロンZPACの同定、さらに能動的DNA脱メチル化に関与するZGAの同定が挙げられる。以上から、分化全能性を持つ受精卵が形成されるエピジェネティック・リプログラムに対する母性mRNA分解・母性タンパク質分解の関与機構の存在が認められた。今後、本研究成果として同定された因子が受精卵や初期胚で果たす機能を解明し、受精卵が分化全能性を獲得する分子メカニズムの理解に貢献することが期待できる。排卵後のマウス未受精卵(MII期、供試数:約3万個)で発現しているタンパク質を二次元電気泳動によって分離し、得られた各スポットのタンパク質を質量分析によって同定した。同定したタンパク質は、公開データベース(GO、Pantherなど)に基づいてアノテーションを行い、タンパク質の機能別に分類した。次に、MII期で同定したタンパク質の経時的な発現変動を解析するために、MII期および受精後の発生各段階(1細胞期、初期2細胞期、後期2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑実胚期、胚盤胞期)の細胞(供試数:約600個)よりタンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行った。二次元電気泳動像(各区3枚以上)の画像解析により、各タンパク質スポットの発現量の定量解析を行い、発生段階間の発現量を比較し、初期胚発生過程におけるタンパク質発現プロファイルを得た。その結果、MII期卵に存在するタンパク質のうち、50種類以上を同定した。また、同定したタンパク質をタンパク質の機能別に分類した結果、MII期卵にはタンパク質代謝および修飾に関連するタンパク質が最も多く存在した。タンパク質の種類ならびにその発現量において、既に報告されている多分化能を持つES細胞のそれらと比較して明らかに違いが認められた。今後、同定精度を上げるとともに、初期胚発生過程におけるタンパク質発現変化を俯瞰的に把握するため、各発生段階において有意な発現変動が認められたタンパク質群に対して、多変量解析(階層クラスタリングおよび主成分分析)を実施する。また、同定されたタンパク質で、一部特異抗体を用いたWestern blot解析により、各タンパク質の発現と定量性が検証することができた。本研究計画に従って、平成23年度には「実験1:初期胚における差次的プロテオーム解析」及び「実験2:タンパク質の機能予測と発現の検証」を実施した。上記に示すように、差次的プロテオーム解析により発生過程の特徴を示すタンパク質が同定されおり、その機能予測と発現の検証も、順次進めていることができている。また、当該研究に関連した論文発表、学会発表及び特許出願が順調実施することができている。実験1及び実験2は順調に進捗しているため、平成24年度も継続して実施する。また、実験計画にしたがって、「実験3:分化全能性の獲得・維持に関する分子ネットワークの基盤構築」のおいては、既に実験1及び2の結果から獲得したタンパク質情報から、公共データベースならびに酵母two-hybrid systemを用いた相互作用タンパク質の同定を進め、分化全能性の獲得・維持に関する分子ネットワークに関する基礎的知見を獲得する。本研究計画の実験13のステップの最低限度経費として消耗品費(物品費)として主に使用する。また、積極的に実施する研究成果発表(学会参加費など)にも使用を予定している。
ダウン症候群関連急性リンパ性白血病の発症機構の解明と新規分子標的の探索

ダウン症候群の急性リンパ性白血病(DS-ALL)の発症機構を解明し新規分子標的を同定するために本研究を行い、以下の成果を得た。1.本邦のDS-ALLの約40%にレセプターチロシンキナーゼ(RTK)-RAS経路、約20%にCRLF2-JAK経路の遺伝子異常が認められ、両者は相互排他的であった。RTK-RAS経路とCRLF2-JAK経路は分子標的治療の有力な候補と考えられた。2.エピゲノム制御因子の遺伝子変異は、RTK-RAS経路の変異もCRLF2-JAK経路の変異も持たない症例の約半数に認められた。これらの症例にはエピジェネティック治療薬が有用である可能性が示唆された。ダウン症候群関連急性リンパ性白血病(DS-ALL)は、高2倍体やt(12;21)などの予後良好な染色体異常の頻度が低く、予後不良であることが知られている。また、ダウン症候群の患者は抗癌剤に対する認容性が低く治療関連死の割合が高いため、分子標的治療のような毒性の低い治療が求められている。DS-ALLにおける遺伝子異常は長らく不明であったが、最近欧米のグループからDS-ALLの約20%でJAK2遺伝子の活性化変異、約60%でCRLF2遺伝子の高発現がみられることが報告された。しかし、本邦のDS-ALLでは上記の異常の頻度はそれぞれ16%、33%であり、欧米よりも頻度が低いことが明らかとなった。CRLF2-JAK経路以外の遺伝子異常を明らかにするために、この経路に異常を認めない5例についてRNAシークエンスを行ったところ、4例で受容体型チロシンキナーゼ(RTK)-RAS経路の遺伝子変異(FLT3 1例、NRAS 1例、PTPN11 2例)が認められた。また、1例でエピゲノム制御因子(MLL2)の変異が認められた。RTK-RAS経路とエピゲノム制御因子は分子標的治療の有力な標的であることから、これらに絞って遺伝子解析を行う方針とした。また、ダウン症候群関連急性骨髄性白血病(DS-AML)で高頻度に変異が認められるコヒーシン複合体の遺伝子変異についても併せて解析することとした。本年度は、これらの遺伝子群から32遺伝子を選択し、イルミナ社のHaloPlexターゲットエンリッチメントシステムとMiSeqを用いたターゲットシークエンスの方法を構築した。JAK2変異のある3例とRTK-RAS経路の遺伝子変異のある3例について解析したところ、正確に変異アリルの頻度を同定することが可能であった。また、マイナークローンに由来すると思われる低頻度の変異も検出可能であった。しかし、我々の先行研究により、本邦のDS-ALLでは上記の異常の頻度はそれぞれ16%、33%であり、欧米よりも頻度が低いことが明らかになった。そこで、CRLF2-JAK経路以外の遺伝子異常を明らかにするために、本邦のDS-ALL37例の診断時骨髄を用いてRTK-RAS経路の遺伝子変異の解析を行った。RTK-RAS経路の変異は37例中16例(43%)と高頻度で認められ、その頻度は最近欧州のグループから報告された頻度(36%)とほぼ同様であった。RTK-RAS経路の変異の中で最も多かったのはFLT3の変異であり、37例中7例で認められた(19%)。欧米のDS-ALLではFLT3の変異は比較まれ(7%)であり、FLT3の変異が多いのは本邦のDS-ALLの特徴かもしれない。CRLF2-JAK経路の遺伝子変異は37例中7例(19%)で認められ、RTK-RAS経路の変異とは相互排他的であった。RTK-RAS経路の変異の有無と臨床像との関連について解析したが、変異陽性群と陰性群との間で、年齢、性別、診断時白血球数、NCIリスク分類、染色体・遺伝子異常、無イベント生存率、全生存率に違いはみられなかった。当初の計画通り、本邦のDS-ALL37例の診断時骨髄を用いてRTK-RAS経路の遺伝子変異の解析を行った。

ダウン症候群関連急性リンパ性白血病(DS-ALL)は、高2倍体やt(12;21)などの予後良好な染色体異常の頻度が低く、予後不良であることが知られている。また、ダウン症候群の患者は抗癌剤に対する認容性が低く治療関連死の割合が高いため、分子標的治療のような毒性の軽い治療が求められている。DS-ALLにおける遺伝子異常は長らく不明であったが、最近欧米のグループからDS-ALLの約20%でJAK2遺伝子の活性化変異、約60%でCRLF2遺伝子の高発現がみられることが報告された。しかし、我々の先行研究により、本邦のDS-ALLでは上記の異常の頻度はそれぞれ16%、33%であり、欧米よりも頻度が低いことが明らかになった。そこで、CRLF2-JAK経路以外の遺伝子異常を明らかにするために、本邦のDS-ALL37例の診断時骨髄を用いてreceptor tyrosine kinase (RTK)-RAS経路の遺伝子変異の解析を行った。RTK-RAS経路の変異は37例中16例(43%)と高頻度で認められ、その頻度は最近欧州のグループから報告された頻度(36%)とほぼ同様であった。FLT3変異が37例中7例(19%)で認められ、最も有力な治療標的の候補と考えられた。CRLF2-JAK経路の変異は37例中7例(19%)で認められ、RTK-RAS経路の変異とは相互排他的であった。RTK-RAS経路の変異の有無と予後を含む臨床像との間に関連はみられなかった。21例についてRNAシーケンスを行ったところ、1例で新規融合遺伝子が同定された。遺伝子発現のデータを用いてクラスター解析を行ったところ、CRLF2-JAK2異常を持つ症例とETV6-RUNX1融合遺伝子を持つ症例は別々のクラスターに分類され、ETV6-RUNX1陽性例ではRUNX1とIGF2BP1の発現が高いことが明らかになった。ダウン症候群の急性リンパ性白血病(DS-ALL)の発症機構を解明し新規分子標的を同定するために本研究を行い、以下の成果を得た。1.本邦のDS-ALLの約40%にレセプターチロシンキナーゼ(RTK)-RAS経路、約20%にCRLF2-JAK経路の遺伝子異常が認められ、両者は相互排他的であった。RTK-RAS経路とCRLF2-JAK経路は分子標的治療の有力な候補と考えられた。2.エピゲノム制御因子の遺伝子変異は、RTK-RAS経路の変異もCRLF2-JAK経路の変異も持たない症例の約半数に認められた。これらの症例にはエピジェネティック治療薬が有用である可能性が示唆された。当初の計画通り、本邦のDS-ALLの診断時骨髄を用いてRTK-RAS経路の遺伝子変異の解析を開始した。ダイレクトシークエンス法による解析を予定していたが、数十種類の遺伝子を一度に解析でき、正確に変異アリルの頻度を決定でき、さらに低頻度の変異も検出できるイルミナ社のHaloPlexターゲットエンリッチメントシステムとMiSeqを用いたターゲットシークエンス法を採用した。RTK-RAS経路以外の解析対象遺伝子としては、分子標的治療の標的となりうるエピゲノム制御因子と、DS-AMLで高頻度に変異が認められるコヒーシン複合体をコードする遺伝子群を選択し、合計32遺伝子について一度に解析する方法を構築した。JAK2変異のある3例とRTK-RAS経路の遺伝子変異のある3例について解析したところ、正確に変異アリルの頻度を同定することが可能であった。
ピアサポート機能に注目した認知症家族会の運営マニュアルの開発と評価に関する研究

認知症患者を介護する家族を支援する社会資源として,「認知症家族会」が注目されている.だが近年では,ピアサポート(仲間同士、当事者同士の支え合い)機能が十分に発揮できず,活動が停滞するグループが増加している.認知症家族会のピアサポート機能を十分に発揮するためには,特別なノウハウが必要である.しかし現状では,各グループは“手探り"で運営を行わなければならず,活動の停滞,グループの解散などの問題をかかえている.こうした背景を踏まえ,本研究では認知症家族会の効果的な運営に寄与するため,ピアサポート機能に注目したマニュアルの開発と評価を行なった.認知症介護家族を支援する社会資源として、「認知症家族会」が注目されている。だが近年では、ピアサポート(当事者同士の支え合い)機能が十分に発揮できず、活動が停滞するグループが増加している。認知症家族会のピアサポート機能を十分に発揮するためには、特別なノウハウが必要である。しかし現状では、各グループは“手探り"で運営を行わなければならず、活動の停滞、グループの解散などの問題をかかえている。こうした背景を踏まえ、本研究では認知症家族会の効果的な運営に寄与するため、ピアサポート機能に注目したマニュアルの開発と評価を目的とする。平成25年度の主な研究実績は、(1)ナラティヴ理論の精緻化、(2)運営ノウハウの蓄積、(3)研究成果の発表、の3点である。(1)ナラティヴ理論の精緻化としては、交流会における語り易さ/語り悪さを説明する概念として「共同体の物語」を導入し分析を進めた。(2)運営ノウハウの蓄積としては、月1回程度開催されている認知症家族会に参加し、許可を得た上で発言内容をまとめ、発言録を作成した。(3)研究成果の発表としては、ナラティヴ研究の成果として単著『ナラティヴ・ソーシャルワークー“〈支援〉しない支援"の方法』(新泉社)を出版した。またセルフヘルプ・グループ研究の成果として、共著『ピア・サポートの社会学ーALS、認知症介護、依存症、自死遺児、犯罪被害者の物語を聴く』(伊藤智樹編、晃洋書房)を出版した。認知症介護家族を支援する社会資源として、「認知症家族会」が注目されている。平成24年度の主な研究実績は、(1)研究動向の把握、(2)運営上の課題・ニーズの把握、(3)研究成果の発表、の3点である。(1)研究動向の把握としては、認知症家族会の運営支援や調査研究法に関する国内外の文献を収集した。収集した文献のキーワードは、ピア・サポート、ナラティヴ・アプローチ、共同体の物語、パーソンセンタードケア、当事者と専門職のパートナーシップ、質的研究、テキストマイニングである。(2)運営上の課題・ニーズの把握としては、認知症家族会への参与観察、代表者へのインタビューを複数回実施した。課題・ニーズとしてミーティングの司会進行方法、ミーティングの際の世話人の役割、他の家族会との連携が課題・ニーズとして抽出された。(3)研究成果の発表としては、第13回日本認知症ケア学会大会(アクトシティ浜松)において「認知症家族会におけるファシリテーション技法の可視化ーテキストマイニングによるナラティヴ・データの分析」と題した研究発表を行った。また、第54回日本老年社会科学会大会(佐久大学)において、「ソーシャルワークにおける困難事例への支援に関する質的研究ーナラティヴ・アプローチ,ICT,テキストマイニング」と題した奨励賞受賞記念講演を行った。平成26年度の主な研究実績は、(1)ナラティヴ理論の精緻化、(2)運営ノウハウの蓄積、(3)運営マニュアルの開発、(4)研究成果の発表、の4点である。(1)ナラティヴ理論の精緻化としては、オープンダイアログ・アプローチを中心に文献研究を行った。(2)運営ノウハウの蓄積としては、交流会のファシリテーションにおいてオープンダイアログ・アプローチを採用することの有効性と課題を検証した。(3)運営マニュアルの開発としては、司会者の立ち位置や言語的応答に注目した。(4)研究成果の発表としては、日本社会福祉学会第62回秋季大会において、「ソーシャルワークにおける『専門性』に関する実践的・理論的検討ーナラティヴ・アプローチ、コラボレイティヴ・アプローチ、オープンダイアログ」、「ナラティヴ・データを対象とした質的研究ーテキストマイニングとナラティヴ分析」と題する研究発表を行った。

だが近年では、ピアサポート(当事者同士の支え合い)機能が十分に発揮できず、活動が停滞するグループが増加している。認知症家族会のピアサポート機能を十分に発揮するためには、特別なノウハウが必要である。しかし現状では、各グループは“手探り"で運営を行わなければならず、活動の停滞、グループの解散などの問題をかかえている。こうした背景を踏まえ、本研究では認知症家族会の効果的な運営に寄与するため、ピアサポート機能に注目したマニュアルの開発と評価を目的とする。平成27年度の主な研究実績は、(1)ナラティヴ理論の精緻化、(2)運営ノウハウの蓄積、(3)運営マニュアルの開発、(4)研究成果の発表、の4点である。(1)ナラティヴ理論の精緻化としては、ナラティヴ・アプローチ、コラボレイティヴ・アプローチ、オープンダイアローグ・アプローチをを手がかりに理論的な整理を行った。(2)運営ノウハウの蓄積としては、月1回程度開催されている認知症家族会に参加し、許可を得た上で発言内容をまとめ、発言録を作成した。(3)運営マニュアルの開発としては、オープンダイアローグ・アプローチにおける不確実性への耐性、平場のリフレクティング、ポリフォニックな対話などのアイデアを参考とした。(4)研究成果の発表としては、著書(共著)として木下大生・後藤広史・本多勇・木村淳也・長沼葉月・荒井浩道著『ソーシャルワーカーのジリツー自立・自律・而立したワーカーを目指すソーシャルワーク実践』(生活書院)を出版した。また学会発表として日本社会福祉学会第63回秋季大会において「オープンダイアローグ・アプローチによるピアサポートファシリテーションの可能性と課題ー認知症家族会を対象としたナラティヴ分析」と題する発表を行った。本研究では、運営ノウハウの蓄積として、月1回程度開催されている認知症家族会に参加し、許可を得た上で発言内容をまとめ、発言録を作成している。当初は平成27年度中に理論的飽和化に至る十分なデータを収集できる予定であったが、必ずしも十分なデータを収集できなかった。認知症患者を介護する家族を支援する社会資源として,「認知症家族会」が注目されている。だが近年では,ピアサポート(仲間同士、当事者同士の支え合い)機能が十分に発揮できず,活動が停滞するグループが増加している.認知症家族会のピアサポート機能を十分に発揮するためには,特別なノウハウが必要である.しかし現状では,各グループは“手探り"で運営を行わなければならず,活動の停滞,グループの解散などの問題をかかえている.こうした背景を踏まえ,本研究では認知症家族会の効果的な運営に寄与するため,ピアサポート機能に注目したマニュアルの開発と評価を目的とする.平成28年度の主な研究実績は,(1)ナラティヴ理論の精緻化,(2)運営ノウハウの蓄積,(3)運営マニュアルの開発,(4)研究成果の発表,の4点である.(1)ナラティヴ理論の精緻化としては,オープンダイアローグ・アプローチを手がかりに理論的な整理を行った.
リボザイムの細胞内アンチセンス活性の研究

遺伝子の発現を抑制する段階としてDNAの複製または転写のレベルで行なう場合とRNAのプロセシングやRNAの翻訳の段階でRNAを対象とする方法がある。アンチセンス活性という概念はメッセンジャーRNA(mRNA)を不活性化するという意味から始まったRNAレベルの遺伝子の発現調節である。本研究では、酵素活性のあるRNA(リボザイム)を用いて特異的にmRNAを加水分解して有害な遺伝子の発現を阻止する方法を確立することを目的として研究を行なった。ヒトがん遺伝子の一つであるHa-ras遺伝子は突然変異によって活性化されることが知られているので、これから生ずるmRNAのみを細胞内で分解するRNAの遺伝子を細胞内に導入して活性化されたHa-ras遺伝子の発現抑制を調べた。方法は、c-Ha-ras遺伝子の正常型Gly-12と活性型Val-12のそれぞれを哺乳動物細胞のプロモーターであるRS-LTRを含むベクターに結合し、N1H3T3細胞におけるフォーカス形成の有無を定量的に観察した。活性型Va-12mRNAを切断するリボザイムを合成し、ネオマイシン耐性遺伝子を持つベクターに結合しN1H3T3細胞にトランスフェクトした。リボザイム遺伝子が導入された細胞を選択し、これに活性型Val-12Ha-ras遺伝子を持つベクターをトランスフェクトし、細胞の癌化の阻止を観察した。その結果、リボザイム遺伝子ベクターで処理した細胞は、12番目のフォーカス形成を50%以上減少させたことがわかった。しかし、61番目が活性化されているras遺伝子による細胞のフォーカス形成には効果がなかった。このことは、相補的塩基対によるアンチセンス効果による抑制ではなく、リボザイムによる切断効果によるものであることが明らかになった。切断による遺伝子の不活性化は不可逆的であることから、リボザイムによる効果は塩基対形成による効果よりも有利である。広い意味でのリボザイムの細胞内アンチセンス活性を明らかにすることができた。1.リボザイムの設計と合成細胞内でのリボザイムの活性を調べるために、活性型cーHaーras遺伝子からのmRNAを標的とするリボザイムを設計した。活性型cーHaーras mRNAは活性型ras蛋白p21を生成しNIH3T3細胞にフォ-カスを形成させる。このmRNAは12番目のコドンがバリンのGUUを持つので、切断に必要なCGとAU塩基対を形成させるように相補的RNAをコ-ドする鎖長39の遺伝子断片を合成した。次に細胞内でリボザイムを生成させるために、Rouse sarcoma virusのLTRをプロモ-タ-として持ち、ネオマイシン耐性遺伝子をも含む発現ベクタ-にリボザイム遺伝子を組み入れた。2.リボザイムのNIH3T3細胞への導入と活性測定リボザイム遺伝子を含むベクタ-をNIH3T3細胞にリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフォ-ムした細胞は、ネオマイシンアナログである抗生物質を用いて選択した。これらの細胞に標的mRNAの遺伝子を含む発現ベクタ-をトランスフェクトし、フォ-カス形成を測定した。リボザイム遺伝子を導入した細胞ではコントロ-ルの細胞に比べて約50%のフォ-カス形成阻害が観察された。3.リボザイムの細胞内での分析リボザイム遺伝子と標的mRNA遺伝子の両方を含むベクタ-をNIH3T3細胞にトランスフェクトし、活性cーHaーras遺伝子を含み、表現型はがん化していない細胞を選択した。この復帰型細胞のDNAを抽出し、ポリメラ-ゼチェンイン反応を用いて369塩基対のリボザイム遺伝子の存在を確認した。

遺伝子の発現を抑制する段階としてDNAの複製または転写のレベルで行なう場合とRNAのプロセシングやRNAの翻訳の段階でRNAを対象とする方法がある。アンチセンス活性という概念はメッセンジャーRNA(mRNA)を不活性化するという意味から始まったRNAレベルの遺伝子の発現調節である。本研究では、酵素活性のあるRNA(リボザイム)を用いて特異的にmRNAを加水分解して有害な遺伝子の発現を阻止する方法を確立することを目的とした研究を行なった。ヒトがん遺伝子の一つであるHa-ras遺伝子は突然変異によって活性化されることが知られているので、これから生ずるmRNAのみを細胞内で分解するRNAの遺伝子を細胞内に導入して活性化されたHa-ras遺伝子の発現抑制を調べた。方法は、c-Ha-ras遺伝子の正常型Gly-12と活性型Val-12のそれぞれを哺乳動物細胞のプロモーターであるRS-LTRを含むベクターに結合し、N1H3T3細胞におけるフォーカス形成の有無を定量的に観察した。活性型Va-12mRNAを切断するリボザイムを合成し、ネオマイシン耐性遺伝子を持つベクターに結合しN1H3T3細胞にトランスフェクトした。リボザイム遺伝子が導入された細胞を選択し、これに活性型Val-12Ha-ras遺伝子を持つベクターをトランスフェクトし、細胞の癌化の阻止を観察した。その結果、リボザイム遺伝子ベクターで処理した細胞は、12番目のフォーカス形成を50%以上減少させたことがわかった。しかし、61番目が活性化されているras遺伝子による細胞のフォーカス形成には効果がなかった。このことは、相補的塩基対によるアンチセンス効果による抑制ではなく、リボザイムによる切断効果によるものであることが明らかになった。切断による遺伝子に不活性化は不可逆的であることから、リボザイムによる効果は塩基対形成による効果によりも有利である。広い意味でのリボザイムの細胞内アンチセンス活性を明らかにすることができた。