hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィトクロムによる植物成長相転換制御の基本メカニズム

陸上植物は、光情報(日長、光質)を感知して栄養成長から生殖成長への総転換を制御する。本研究は、植物の赤色光・遠赤色光受容体フィトクロムによる成長相転換調節の基本プログラムとその進化を理解することを目的とし、現存する種の中で、陸上植物進化の基部に位置する"苔類ゼニゴケ"をモデルとし研究を行った。ゼニゴケのフィトクロムが核で機能し、遺伝子発現を制御することを示す結果を得た。ゼニゴケのフィトクロムが転写因子PHYTOCHROME INTERACTINGFACTOR(PIF)の相同遺伝子を介して光応答を制御すること、また細胞周期の調節因子サイクリンDの発現調節御に関わることを示唆する結果を得ている。フィトクロムによる核内遺伝子発現を介した細胞分裂制御が、ゼニゴケの成長相転換制御に関与する可能性を示唆した。本研究は、陸上植物における、光情報による成長相調節の基本プログラムの解明を目的とし、現存する種の中で、陸上植物の祖先に極めて近いと考えられる"苔類ゼニゴケ"をモデルとし研究を行った。近年、我々の研究室において、赤色光/遠赤色光の受容体であるフィトクロムが、ゼニゴケの生殖成長相移行に関与する鍵因子であることが示唆されていた。フィトクロム遺伝子と成長相転換制御変異株bonoboの解析を中心に、フィトクロムを介した成長相転換制御経路の分子メカニズムを解明する。平成22年度では、まずゼニゴケのフィトクロム遺伝子の機能メカニズムに焦点を当てた。これまでの研究から、ゼニゴケのフィトクロムが主として核で機能し、細胞分裂の間接的/直接的制御を行うことで、ゼニゴケの生長相転換を制御することが示唆されていた。Mpphy-citrine発現株を用いた解析により、Mpphyが光質非依存的に核に局在することが観察され、基部陸上植物におけるフィトクロムのユニークな性質が見出された。一方で、赤色光照射条件下では、Mpphyが核において顆粒状構造体を形成することを見出した。今後、核内における顆粒状構造体とフィトクロム機能メカニズムの関係については、さらに解析が必要である。さらに成長相転換制御変異体bonoboについては、連鎖解析を進めている。また国立遺伝学研究所の協力により、連鎖解析に用いるKit2株のゲノム配列解析も進めている。米国エネルギー省JGIにおいて、ゼニゴケ野生株Tak1と連鎖解析参照株Kit2のF1世代50株のゲノム解析を行い、高密度マーカーの作出と連鎖解析を同時に進める道筋をつけた、bonobo株の戻し交配も進めることにより、次世代シークエンサーによるbonobo変異原因遺伝子の単離にむけた準備を進めている。本研究は、植物の光情報による成長相調節の基本プログラムと進化の理解することを目的とし、現存する種の中で、陸上植物の祖先に極めて近いと考えられる"苔類ゼニゴケ"をモデルとし研究を行った。これまでに、赤色光/遠赤色光の受容体であるフィトクロムが、ゼニゴケの生殖成長相移行に関与する鍵因子であることが示唆されていた。平成23年度では、特にゼニゴケのフィトクロム遺伝子の機能メカニズムに焦点を当てた。ゼニゴケフィトクロムを特異的に認識する抗体を作成し、ゼニゴケのフィトクロムが光に安定なII型の性質を持つことを示した。さらにMpphy-citrine発現株を用いた解析により、赤色光照射により核に移行することを確認した。被子植物ではフィトクロムが核で機能し、転写制御を介して様々な光応答を制御することが知られているが、シダおよびコケ植物ではこれまでフィトクロムが主として細胞質で機能すると考えられてきた。核における転写制御を介したフィトクロム機能メカニズムが基部陸上植物でも確認されたことで、フィトクロムを介した光応答の基本的なメカニズムが、植物の陸上化時点まで遡れる可能性を示した。さらにフィトクロムの核における転写制御において中心的な役割を持つと考えられるPHYTOCHROME INTERCTING FACTOR (PIF)のゼニゴケ相同遺伝子を単離し、フィトクロム下流で働くことを示唆する結果を得た。今後、フィトクロムによるPIFの制御について、更なる解析を進めたい。成長相転換制御変異体bonoboについては、連鎖解析を進めている。米国エネルギー省JGIにおいて、ゼニゴケ野生株Tak1と連鎖解析参照

株Kit2のF1世代150株のゲノム解析を行い、高密度マーカーの作出と連鎖解析を同時に進める道筋をつけた。bonobo株の戻し交配も進め、次世代シークエンサーによるbonobo変異原因遺伝子の単離にむけた準備を進めている。
映像社会学の基礎的・応用的研究(ビデオ・コミュニケ-ションを中心に)

1.ビデオ・システムを利用した社会学的フィ-ルド調査。昨年度行ったいくつかの試行的なフィ-ルド調査を分析していく中で、広島市高陽地区で行った「塾を中心とした子どもの生活空間調査」が、研究過程における映像利用の点で、興味深いデ-タとなっているので、今年度はさらにそのデ-タを検討し、補足的な聞き取り調査を行った。2.イベントのビデオ効果。今年度新たに展開した課題である。各種イベントに企画の段階から参加し、イベントでビデオを使い、ビデオ・コミュニケ-ションの観点から、その効果を検討した。また、その準備のため、補足的なビデオ・コミュニケ-ション実験も行った。3.「出来事の社会学」の映像社会学的展開。フランスの社会学者E.モランの言う「出来事の社会学」について、新たにビデオによる参与を試み、出来事の促進効果を検討した。具体的には、56件の出来事において、ビデオによる関わりを試み、そのうち少なくとも2件については、出来事の促進効果があり、映像が出来事の展開の一つの焦点ともなった。1件については、「確認・糾弾会と差別キャンペ-ン-〈いま、ここ〉の噴出と隠蔽-」という論文にまとめた。4.映像化社会における映像の位置、ビデオを中心とする映像メディアは社会一般にも広がっている。そこで、昨年度に引き続き、「映像化社会」における映像の位置を検討するため、各種の映像資料を収集し、聞き取り調査等を行った映像化社会の枠組を検討することを通して、研究過程における映像利用の意味や分析方法の検討を行った。このテ-マの一般化として、「映像化社会への視角」「身体とメディア」などの著書・論文を準備している。1.社会学および関連諸領域における映像資料の収集。撮る主体(研究主体)の問題を考えさせてくれるドキュメンタリー作品や、住民運動の中で情報交換のために用いられているビデオ資料などを収集した。しかし、研究目的で作成された映像資料の収集は困難で、文献を通して映像の位置づけを判断するほかないようだ。2.映像環境の実態把握のために若干の聞き取り調査を行った(東京、広島)。3.ビデオ・システムを利用した社会学的フィールド調査。(1)広島市安佐北区高陽町での塾教育を通した子どもの実態調査。被調査者の協力もあって、授業の定点観測、子どもの生活空間などについての興味深い映像資料を得ることができた。(2)確認・糾弾会のビデオ分析。従来から継続して行っている研究であるが、今回の研究計画の一環に組み入れることで、大幅な研究の進展をみることができた。(3)山口県新南陽市でのフィールド調査。被差別部落地域、学習会の様子などをビデオで撮影。4.他の研究者が行っている参与観察等の研究状況をビデオ撮影(神奈川県、千葉県、沖縄県等)。研究方法についての関心からではあったが、短期間での撮影のため、映像研究資料としては不十分。5.「在日韓国・朝鮮人問題をめぐる社会学的研究」(総合研究(A)、研究分担者)と結合した映像社会学的研究。民団サマーキャンプ、集会などのビデオ撮影を行った。6.「身ぶりコミュニケーション」をテーマにした簡単なビデオ・コミュニケーション実験を行った。
インドネシア産植物性食素材の機能性と嗜好性を活かした食品の開発

インドネシアの植物性食素材としてメリンジョおよびクルワックを選び、その機能性と嗜好性を活かした食品の開発を試みた。まず、メリンジョに含まれる有効成分であるグネチンC、グネモノシドA、グネモノシドDを分画し、その呈味性を明らかにしたところ、これらは強い苦味を有し、有効性と苦味とは分離できないことが明らかとなった。次に、メリンジョ粉末を利用した菓子類と食パンを調製したところ、菓子類は5%添加でも苦味が感じられた。食パンは30%添加で食することが可能であったが、嗜好性は低下した。最後に、クルワックの抗酸化性を解析したところ、水系ではフェノール化合物、油系ではγートコトリエノールが主体であった。植物資源の宝庫であるインドネシアにおいて、現地で利用されているが国外では広く流通していない植物性食素材として、グネツム科グネモン(Gnetum gnemon L.)の果実melinjoを選び、その機能性を活かし、日本人の食生活に受け入れられる新規食品および調味料を開発するとともに、その調理法を提言することを目的として研究を遂行中である。平成24年度は、魚の生臭さを抑制する調味料の開発を目的として、melinjo抽出物の添加によるにおい成分および嗜好性の変化を検討した。マサバを試料とし、種々の濃度のmelinjo抽出物を加えた調味液に浸漬後、加熱調理を行い、SPME法により抽出した揮発成分をGCおよびGC-MSで解析した。また、官能検査により嗜好性の差異を解析した。その結果、魚の調理加工において、melinjo抽出物が脂質酸化およびオフフレーバーの生成を抑制できることが明らかとなった。特にグネチンCよりもmelinjo抽出液の方が抑制効果が高いことから、配糖体の寄与が示唆された。さらに、melinjo粉末を用いた菓子の作成を試みるとともに、その機能性、嗜好性について検討した。HPLCを用いて菓子中のグネチンC量を定量するとともに、ORAC法により抗酸化活性を測定し、それらの機能性を評価するとともに、官能検査にて嗜好性を評価した。その結果、加熱により、グネチンC量および抗酸化性が減少すること、油を用いた揚げ調理では,苦味がマスキングされることが明らかとなった。植物資源の宝庫であるインドネシアにおいて、現地で利用されているが、国外ではあまり流通していない植物性食素材として、グネツム科グネモン(Gnetum gnemon L.)およびイイギリ科パンギノキ(Pangium edule Reinw.)を選び、その機能性を活かし、日本人の食生活に受け入れられる新規食品および調味料を開発するとともに、その調理法を提言することを目的として、研究を遂行した。平成25年度は、前年度の「揚げ調理では苦味がマスキングされる」という結果を踏まえ、グネモンの種子(メリンジョ)を油脂を用いた調理に応用することを目的として研究を遂行した。油脂の酸化を抑える天ぷら粉の調製を行うため、メリンジョ粉末を天ぷらの衣に加え、衣のみ、もしくはサバ・大葉(シソ)を揚げ種として、揚げ調理を行った。その結果、衣に吸着した油脂の酸化はメリンジョ量が多いほど抑制されていた。また、サバを揚げた場合、官能評価ではメリンジョ量が多いほど生臭みが減少する傾向にあった。しかし、メリンジョ量が20%を超えた場合、苦味が増すため、好ましくないと考えられる。以上の結果から、メリンジョ粉末を加えた天ぷら粉は、油脂の酸化や素材の生臭みを抑える機能を持つことが示唆された。今後は、協力企業と連携して、天ぷら粉の商品化を検討することとしている。そのほか、パンギノキについては、発酵させた種子(クルワック)を抗酸化性を活かした加工食品に応用することを試みた。その結果、加熱調理により抗酸化性が増加したが、流通が不安定であり、加工食品として利用することは困難であると考えられる。平成23年度は、melinjoを試料として、抗酸化性を世界的に広く用いられているORAC法で測定するとともに、melinjo特有のポリフェノールであり、各種の機能性が報告されているグネチンCおよびその配糖体グネモノシドA・Dについて測定を行った。また、melinjoからカラムクロマトグラフィー法により、グネチンC、グネモノシドA・Dを分画することを試みた。また、melinjoは単独ではやや苦味を呈するが、この苦味がどの成分に由来するのかを官能検査を用いて評価した。

その結果、melinjoは高い抗酸化性を有すること、この高い抗酸化性はグネチンCおよびその配糖体グネモノシドA・Dに由来することが明らかとなった。また、固定相に芳香族系合成樹脂SP70、移動相にエタノール水溶液を用いたカラムクロマトグラフィーにより、グネチンC、グネモノシドA・Dを分画することが可能であった。また、官能検査を行った結果、グネチンCおよびグネモノシドA・Dはいずれも苦味を呈すること、グネチンCの苦味閾値はナリンギンと同程度の0.16mM、グネモノシドA・Dの苦味閾値はカフェインと同程度の0.47mMであった。これらの機能性成分は苦味を併せて有することから、その利用法に工夫が必要であると考えられる。植物資源の宝庫であるインドネシアにおいて、現地で利用されているが、国外ではあまり流通していない食素材として、グネツム科グネモン(Gnetum gnemon L.)およびイイギリ科パンギノキ(Pangium edule Reinw.)を選び、その機能性を活かし、日本人の食生活に受け入れられる新規食品の開発を目的として、研究を遂行した。平成26年度は、グネモンの種子「メリンジョ」を世界的に広く食されているパンに応用し、その活用を試みた。メリンジョは炭水化物約70%、タンパク質約12%を含有し、グネチンCなどのポリフェノールを含んでいるが、口内に残る特徴的な苦味を有する。このメリンジョの粉末を種々の割合で食パンの材料に加え、焼成した食パンの膨化性の測定および官能評価を行った。また、機能性として、総ポリフェノールをFolin-Ciocalteu法にて定量するとともに、抗酸化活性をラジカル吸収能(ORAC)にて評価した。その結果、メリンジョを添加することにより、総ポリフェノール量および抗酸化活性が高まった。また、パンに加工することによるこれら機能性成分の有意な損失は見られなかったが、メリンジョを添加することで膨化性が著しく減少した。しかし、小麦タンパク質粉末を添加し、グルテン量を強力粉よりも高レベルとすることで膨化性が改善された。メリンジョを30%添加した食パンは小麦粉パンにやや劣る程度の嗜好性を示し、また、高い機能性を示した。食品化学・調理科学当初より遅れている点として、現地調査を行うことができなかった点があげられる。これは現地調査に同行する予定であった大学院学生が育児のため休学したため、スムーズな現地調査が望めなくなったためである。これについては、平成25年度の復学をもって実施が可能となっている。それ以外はおおむね順調と言える。期間内に事業を終了させるべく研究を遂行してきたが、平成2324年度の研究協力者(大学院学生サントソマルタ)の育児休学のため、研究が遅れ気味となっていた。平成25年度は急ピッチで研究を遂行したが、やむなく実験の一部およびこれに関係する論文投稿・掲載が次年度にかかる見込みとなった。当初より遅れている点として、現地調査を行うことができなかった点があげられる。これについては、平成24年度後期の復学をもって実施が可能となる見込である。
大面積・折畳み可能なフレクシブル光蓄電素子創製に関する研究

遷移金属酸化物の一種であるアモルファス酸化タングステン(α-WO_3)は、電圧印加で色の変化が起きるエレクトロクロミズムを示す。この現象を機能という側面から捉えた場合の特徴は、着色後に回路を開いても長時間その状態を保つメモリー効果を持つ事であり、ディスプレイ・不揮発性メモリーへの応用が考えられる。また、逆起電力も観測され、蓄電池としての機能をも持っている。本申請課題の目的は、数種の(遷移金属酸化物ゲル+有機物添加物)によって光・化学・電気エネルギー相互の変換機能を動作させ得る素子の開発を行う事であり、エネルギー蓄積可能な光電エネルギー変換系を構成し、反応機構の解明を行なうと伴に、ゾル-ゲル法の特徴を活かし高分子ゲルマトリックス中へ導入を行い、柔軟で折畳み・大面積化が可能な光電変換・蓄積機能を持つ新規素子の可能性を探る事である。初年度は製膜技術確立のための基礎物性の研究を重点的に行なった。フォトクロミズム・エレクトロクロミズム複合系セルの試作にはまず有機分子配合試料で薄膜を作成する手法を確立する必要があり、その力学特性について調べた。タングステン酸に添加する高分子の量によって薄膜の力学物性を調整する必要性があり、高分子のタングステン酸への添加はフォトクロミズムやエレクトロクロミズムの増感をもたらすが、力学物性の調節との兼ね合いで実際の製膜のための最適値は膜のサイズに依存する。特に、ゲル化による構造の変化がその後の特性に大きな影響を与えるので、構造評価が必要である。2年度は複合系セルのための高分子ゲルマトリックス構造の評価、およびフォトクロミズム・エレクトロクロミズム複合系についての知見を得るため、構造的に同様なものとなると考えられる色素増感型太陽電池との比較検討を行った。高分子ゲルマトリックス構造については基礎データの蓄積により多くの知見を得た。また、色素増感型太陽電池、すなわちグレッツェル・セルの微結晶構造とタングステン酸ゲルの構造は類似のものであり、フォトクロミズム・エレクトロクロミズム複合系セルとの類似点が多いことが分かった。遷移金属酸化物の一種であるアモルファス酸化タングステンでは、電圧印加で色の変化が起きるエレクトロクロミズムを示す事が知られている。この現象を機能という側面から捉えた場合の特徴は、着色後に回路を開いても長時間その状態を保つメモリー効果を持つ事であり、ディスプレイ・不揮発性メモリーへ応用が考えられている。また、逆起電力も観測されており、蓄電池としての機能をも持っている。本課題の目的は、数種の(遷移金属酸化物ゲル+有機物添加物)による光エネルギーから化学エネルギー、そしてまた電気エネルギーへという両方の変換機能を動作させ得る素子の開発を行う事により、エネルギー蓄積可能な光電エネルギー変換系を構成し、ゾル-ゲル法の特徴を活かし高分子ゲルマトリックス中へ導入を行い、柔軟で折畳み・大面積化が可能な光電変換・蓄積機能を持つ新規素子の可能性を探ることである。本年度は、大面積化に不可欠となえるゲル化を利用した製膜技術確立のための基礎物性の研究を重点的に行なった。

タングステン酸に添加する高分子の量によって薄膜の力学物性を調整する必要性があり、高分子のタングステン酸への添加はフォトクロミズムやエレクトロクロミズムの増感をもたらすが、力学物性の調節との兼ね合いで実際の製膜のための最適値は膜のサイズに依存する。特に、ゲル化による構造の変化がその後の特性に大きな影響を与えるので、構造評価が必要である。それら知見を基に、複合系セルの試作を行なうためのセル構造の検討を行った。基本的には透明電極の下に有機分子配合試料を、さらにその下には、プロトン等陽イオンを出入りさせるために電解質を置き、一番下に電子を取り出すための電極を取り付けるという構造を取る。しかし、実用化のためには高効率化が不可欠であり、そのために燃料電池で用いられているイオン交換膜を応用するためには構造の最適化が必要である。遷移金属酸化物の一種であるアモルファス酸化タングステン(a-WO_3)は、電圧印加で色の変化が起きるエレクトロクロミズムを示す。この現象を機能という側面から捉えた場合の特徴は、着色後に回路を開いても長時間その状態を保つメモリー効果を持つ事であり、ディスプレイ・不揮発性メモリーへの応用が考えられる。また、逆起電力も観測され、蓄電池としての機能をも持っている。本申請課題の目的は、数種の(遷移金属酸化物ゲル+有機物添加物)によって光・化学・電気エネルギー相互の変換機能を動作させ得る素子の開発を行う事であり、エネルギー蓄積可能な光電エネルギー変換系を構成し、反応機構の解明を行なうと伴に、ゾル-ゲル法の特徴を活かし高分子ゲルマトリックス中へ導入を行い、柔軟で折畳み・大面積化が可能な光電変換・蓄積機能を持つ新規素子の可能性を探る事である。今年度は複合系セルのための高分子ゲルマトリックス構造の評価、およびフォトクロミズム・エレクトロクロミズム複合系についての知見を得るため、構造的に同様なものとなると考えられる色素増感型太陽電池との比較検討を行った。高分子ゲルマトリックス構造については基礎データの蓄積により多くの知見を得た。また、色素増感型太陽電池、すなわちグレッツェル・セルの微結晶構造とタングステン酸ゲルの構造は類似のものであり、フォトクロミズム・エレクトロクロミズム複合系セルとの類似点が多いことが分かった。
DANTEパルスを利用した高速CEST-MRI撮像法の開発

本研究ではMRIを用いた分子イメージング法の一つとして注目されているCEST法における撮像を高速化する新しい高速CEST-MRI撮像法の開発を目的とする。従来のCEST-MRI法では多数の画像から周波数スペクトルを求めるため計測に長時間を要するが、本研究ではCEST法における飽和パルスとして周波数領域で周期性を持つDANTE法と傾斜磁場を導入することにより一回の画像収集で周波数スペクトルを求めCEST-MRI法の高速化を実現する。研究開発は1) DANTEパルスの最適化、2)アミノ酸水溶液を対象とした提案手法の実現可能性の検討、3) in vivo計測のための課題探索とその対処法の検討、という3つの研究項目に分けて実施しているが、研究の初年度にあたる平成30年度には提案手法の原理検証を目指して研究項目1), 2)を進め、標準的なDANTEパルスと傾斜磁場を組み合わせた撮像パルスシーケンスを研究用MRI装置に実装し、グルタミン酸水溶液を対象に実証実験を行った。傾斜磁場の導入によりDANTEパルスの周波数領域における周期性を空間的な周期性に変換し、5mm毎の位置にある水分子が飽和されるよう傾斜磁場を設定したところ、グルタミン酸のアミノ基の化学シフトである3ppmにあたる1.5mmだけ水の飽和位置から離れた位置にCEST効果による信号の低下が繰り返して現れることが確認できた。これにより提案手法の原理は実験的に検証できたが、正確なCEST効果の計測にはDANTEパルスの線幅をより狭帯域化することが望ましいため、DANTEパルスを構成するパルス数やパルス形状について、実験結果を参照しながら改良を進めている。本研究では、具体的な研究内容として、1) DANTEパルスの最適化、2)アミノ酸水溶液を対象とした提案手法の実現可能性の検討、3) in vivo計測のための課題探索とその対処法の検討、という3つの研究項目に分けて研究を進める計画を立案している。3年間の研究初年度にあたる平成30年度は、当初の計画の通り、実証実験にあたる研究項目2)の実験結果を撮像法のデザインにあたる研究項目1)へフィードバックし、撮像法のデザインを担当する研究代表者とMRI装置への実装を行う研究分担者が協力して、得られた画像の評価を行いながら開発を進めた。DANTEパルスと傾斜磁場を組み合わせた撮像パルスシーケンスを研究用MRI装置に実装し、グルタミン酸水溶液を対象に行った実証実験では、グルタミン酸のアミノ基の化学シフトである3ppmだけ水の共鳴周波数から離れた位置にCEST効果による信号の低下が確認できた。提案手法の原理検証を予定通り終えることができており、順調に進展していると判断した。2019年度は研究の2年目にあたるが、当初の計画通り引き続きファントムを対象に撮像方法の改良を進める。前年度の実験結果から、水の共鳴周波数に近接するアミノ基のCEST効果を明確に捉えるためにDANTEパルスの線幅をより狭帯域化する重要であることが確認できた。また、より大きなCEST効果を得るためには、計測対象となるプロトンの交換速度や濃度に応じてDANTEパルスを構成する個々のパルスの持続時間や照射間隔、照射強度を適切に選択する必要があることが示唆された。このように本研究で提案しているDANTEパルスのCEST法への適用には十分に解明されていない点が多く、プロトンの交換速度や濃度とCEST効果の関係に関する理論的解析のみならず、実験結果に関する検討を加えてCEST効果による信号変化の検出効率を改善するためのDANTEパルスの調整を行う予定である。3年間の研究初年度にあたる平成30年度は、当初の計画の通り、実証実験にあたる研究項目2)の実験結果を撮像法のデザインにあたる研究項目

1)へフィードバックし、撮像法のデザインを担当する研究代表者とMRI装置への実装を行う研究分担者が協力して、得られた画像の評価を行いながら開発を進めた。DANTEパルスと傾斜磁場を組み合わせた撮像パルスシーケンスを研究用MRI装置に実装し、グルタミン酸水溶液を対象に行った実証実験では、グルタミン酸のアミノ基の化学シフトである3ppmだけ水の共鳴周波数から離れた位置にCEST効果による信号の低下が確認できた。提案手法の原理検証を予定通り終えることができており、順調に進展していると判断した。2019年度は研究の2年目にあたるが、当初の計画通り引き続きファントムを対象に撮像方法の改良を進める。前年度の実験結果から、水の共鳴周波数に近接するアミノ基のCEST効果を明確に捉えるためにDANTEパルスの線幅をより狭帯域化する重要であることが確認できた。また、より大きなCEST効果を得るためには、計測対象となるプロトンの交換速度や濃度に応じてDANTEパルスを構成する個々のパルスの持続時間や照射間隔、照射強度を適切に選択する必要があることが示唆された。このように本研究で提案しているDANTEパルスのCEST法への適用には十分に解明されていない点が多く、プロトンの交換速度や濃度とCEST効果の関係に関する理論的解析のみならず、実験結果に関する検討を加えてCEST効果による信号変化の検出効率を改善するためのDANTEパルスの調整を行う予定である。学内行事のため3月に参加を予定していた学会出席が不可能となり、当該年度の予定額の全額を使用することができなかった。次年度には、学会出張、MRI装置の使用料金などを予定しており、旅費およびその他の費用として使用する予定である。
地方中規模都市における公営住宅団地の建て替えを核にした地域の住環境再編

北海道内の公営住宅再生マスタープランを策定している地方中小都市において、公営住宅の建て替えを市街地再編の戦略として位置づける視点としておおきく以下の2点を得た。1.地方中小都市における公営住宅団地の敷地の有効性北海道内において公営住宅再生マスタープランを策定している自治体にアンケートを行ったところ、地方中小都市では公共的な施設に用いるための敷地が不足している場合が多く、公営住宅団地の立地する用地が有用であることがわかった。例えば、地方レベルのためのコミュニティセンターや高齢者福祉施設の建設のために既成市街地内に新規に用地を取得することは困難であり、公営住宅団地の土地に複合的に配置することが有用であることが明らかになった。2.市街地構造を再編する場合の公営住宅団地の移転・集約の有効性人口が減少しつつある市町村にとって、都市中心部の活性化のために公営住宅団地の移転・集約は有効である可能性を示すことができた。公営住宅団地は都市中心部よりも郊外部に立地するケースが多く、都市中心部では購買人口が減少するなどして中心商店街の衰退が著しい状態である。そこで、自治体内に分散する公営住宅団地を移転・集約して、都市中心部に再配置しなおすことで、中心商店街の活性化を図ることができると考えられる。このことは幕別町などいくつかの自治体担当職員に対するヒアリングより、可能性が明らかになった。ただその場合に問題となる点は、中心部での公営住宅団地用地の確保にある。これには2つの解決策があげられ、一つは散発的に抜けていく中心商店街の店舗の敷地を、残存する店舗の集約と併せて早急に集約する手法が必要であり、いま一つは小規模の敷地を逐次買収して公営住宅団地として整備する手法の整備が望まれる。本研究では、公営住宅の再生プログラムを考え合わせると、後者の考えにもとづく手法を早急に整備する必要があることを明らかにした。なお、本研究の成果は、千歳市や幕別町における策定プランにおいて反映されている。
海洋の有機物の動態における動物性ナノプランクトンの役割に関する研究

海洋生態系において植物プランクトンの光合成によって生産された有機物は、バクテリアにより分解され消失する。その過程でバクテリアの現存量は増大する。系が安定であるためには、そこにバクテリア捕食者が存在し、腐食連鎖系が成立している筈と考えられる。本研究では、これまで殆ど不明のまゝに残されてきた腐植連鎖系におけるバクテリア捕食者としての動物性ナノプランクトンの実態と生態的役割を明らかにすることを目的とした。研究方法としては、光学顕微鏡に加えて透過・走査電子顕微鏡を多用してきたが、さらに螢光染色法による微小動物・植物プランクトンの識別、それらの微小プランクトンとバクテリアを同一視野内で高い感度と精度で、かつ簡便に識別し、定量する方法を開発した。ほかに有機化学的手法をも用いた。以上の手法を用いて、材料として、大阪湾,南極海,北部太平洋,ベーリング海からの天然試料を解析し、次のような知見を得た。南極海において、動物性ナノプランクトンの現存量は、全プランクトン量の025%(平均7%)を占めた。主要構成生物の襟鞭毛虫は、不飽和脂肪酸および必須アミノ酸含量が高く、他の捕食生物、ナンキョクオキアミにとっては有効な餌であると判断された。この事実は、南極海生態系における食物連鎖には、従来の無機栄養塩-植物プランクトン-動物プランクトン-鯨系の他に、溶存有機物-バクテリア-動物性ナノプランクトン-ナンキョクオキアミー鯨系が存在することを実証するものである。北部太平洋、ベーリング海にも、大阪湾にも、これら動物性ナノプランクトンが普遍的にかつ多量に分布していることも明らかになった。海洋生態系では、これらバクテリア捕食者が広く分布し、主要な群集構成生物であり、重要な生態的役割をはたしている実態を解明することができた。
ストレスに伴う脳活動は、噛み締めによって制御されるか?機能的MRIを用いた研究

情動に伴う脳活動が噛み締めによって制御されるか否かを明らかにすることが本研究の目的である。ヒトを被験者としてfMRIを用いた脳画像記録中に、異なる圧で噛み締めてもらい、脳活動の変化を解析した。噛み締め圧はクリアリテーナに装着した平板圧センサにてモニタし、画像記録中に被験者に視覚的にフィードバックした。噛み締め圧と相関する脳の活動は、後頭葉-側頭葉視覚皮質、頭頂葉視覚連合野、1次および2次感覚皮質、1次運動皮質で認められた。さらに、噛み締めによって扁桃体の脳活動が抑制されることが明らかになった。【研究成果の具外的内容】ヒトにおけるストレスや情動と関連する「噛み締め」の神経科学的基盤を、機能的磁気共鳴断層撮影(fMRI)を用いて解明することが目的である。当該年度は噛み締め圧センサを開発し、fMRI装置内でセンサが機能すること、さらに、fMRI画像に影響が出ない磁気シールドの開発を行った。(1)噛み締め圧センサ作成:まず、岐阜大学において被験者の歯列模型に合わせて加工したリテナーを作製した。次に、リテナーの接触点に平板型圧センサー(Tekscan社製)をレジンを用いて固定した。アンプの出力をUSBケーブルでノートPCにてモニタした。軽い「噛み締め」と、食い縛りに近い強い「噛み締め」を、明瞭に区別して記録できた。(2)fMRI装置内での圧センサ機能:生理学研究所に圧センサとPCを持ち込み、3.0Tスキャナー(Siemens,MAGNETOM Allegra)撮像部位にて圧センサが機能し、前室のPCにて明瞭に圧をモニタできることを確認した。(3)fMRI撮像予備実験:ファントム上に圧センサを装着し、前室にて圧モニタ中に、fMRI撮像した。USBケーブル接続部位からのノイズが、画像に乗ることが判明した。(4)磁気シールド開発:圧モニタアンプのUSBケーブル接続部位に、銅箔を巻きつけて、ノイズをシールドした。【意義】「噛み締め」圧を、fMRI計測中に、モニターすることが可能になった。ヒトの顔の表情に対する扁桃体活動の、「噛み締め」による制御機構を、科学的に検証できる。【重要性】「噛み締め」によって、ストレスに対応することは、日常的に経験している。この現象の神経科学的基盤を明らかにする。【研究成果の具体的内容】ヒトにおけるストレスや情動によって引き起こされる神経活動と「噛み締め」との関連の神経科学的基盤を、機能的磁気共鳴断層撮影(fMRI)を用いて検討した。(1)当該年度は、昨年開発した噛み締め圧センサを被験者に装着してもらい、fMRIを用いて噛み締め時の脳活動を記録した。その結果、運動野や1次および2次体性感覚野において、噛み締めに相関する神経活動が記録された。問題点として、噛み締め時に頭蓋の動きが出現すること、座位とfMRI内部における仰臥位とで、噛み締め圧センサの接触点が異なっており、噛み締め圧の調節が難しいことが明らかになった。(2)さらに、当該年度は、嫌悪感や怒りの表情と中性的な表情の顔のデータベースから、情動ストレス視覚刺激画像を作製した。この視覚刺激を刺激提示用ソフトウェアPresentation(Neurobehavioral systems, Inc.)を用いて、ブロックデザインで感情顔あるいは中性顔の画像を15枚ずつ連続で提示し、各ブロック直前に噛み締め圧を教示するスクリプトを作製した。この刺激システムを用いて、異なる噛み締め圧を加えた状態で、感情顔あるいは中性顔の視覚刺激を表示し、fMRIを用いて被験者の脳活動を記録した。同時に心拍数と呼吸をモニタし、情動反応の指標とした。【意義】噛み締め圧を変化させることによって、噛み締めに関連する脳活動を、fMRIを用いて記録した。さらに、心拍数や呼吸モニタによって、情動反応の記録を同時に行えた。顔表情画像によるfMRI記録を行い、噛み締めと脳活動との関連を記録した。【重要性】情動による神経活動と噛み締めとの関連の神経科学的基盤を、fMRIを用いて明らかにする準備が整った。ストレス制御に関して直接脳活動との関連を研究できることが重要である。噛み締めによって脳の情動活動が制御されるか否かを明らかにする目的で、機能的磁気共鳴断層撮影(fMRI)を用いてヒトを被験者として研究した。健常成人28名(18ー37歳、男性22名、女性6名)を被験者とし、各人の歯列の印象を取り、歯型を作製した。それぞれの歯型に合わせてクリアリテーナ(厚さ0.5mm)を作製して、平板圧センサを歯科用レジンを用いて接着した。画像および音声提示ソフトウェアpresentationを用いて噛み締め圧を提示し、圧センサのモニタ画面をバックプロジェクションスクリーンで被験者にフィードバックし、一定の噛み締め圧を維持した。

生理学研究所のSiemens社製Allegra(静磁気強度3テスラ)を用いて、TR2.5秒で、ブロックデザインにて頭頸部を撮像した。被験者に所定の噛み締め圧(10%、30%、60%、ランダムに6回繰り返し)をそれぞれ20秒間提示して噛み締めてもらい、20秒間の噛み締め無しを間に挟んだ。1セッションは18(3x6)ブロックで、休憩を挟んで、2セッションのMRI画像を記録した。9名の撮像が終了した時点で、MATLAB上のspm8を用いて個人およびグループ解析を行った。噛み締め時に活動を示した領域は、両側の1次運動野と1次感覚野、外側溝上弁蓋、島皮質、右下頭頂小葉、両側の後頭葉ー下側頭葉(右優位)であった。これらの領域の活動は、噛み締め圧と正の相関を示した。扁桃体の活動は、弱い噛み締め(10%圧)よりも中程度並びに強い噛み締め(30%圧、60%圧)の際に抑制される傾向が見られた。その後さらに19名の被験者で撮像を行い、現在28名全員のデータを用いて解析を進めている。(1)噛み締め圧計測装置の開発に時間がかかった。(2)ヒトの表情画像を多数準備することが、当初考えていたよりはるかに困難であった。特に、当該年度から、大垣ソフトピアから発売されていた画像データベースの使用許可が得られなくなったため、視覚刺激作成の困難さを増大させた。当該研究パラダイムには、200人分以上の顔画像が必要で、この確保が困難を極めた。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在撮像してあるfMRI画像を解析し、噛み締めと表情との相関を明らかにする。呼吸や脈拍などの生理学的指標と脳活動との相関を解析する。これらのデータをもとに、さらに被験者を増やす。最大の問題点は、20人程度の被験者からfMRI画像を収集する必要があることである。時間と実験機器、被験者の確保が、今後重要である。顔画像は、印象が強いため、同一人物の顔が2回以上視覚刺激として出現すると、扁桃体活動は極端に減衰してしまう。この現象を避けるためには、表情顔と中性顔それぞれ100人以上の異なった人物の顔が必要である。したがって、今後も顔画像データベース検索を継続して行う。
近世・近代沖縄の集落移動における立地選定とその空間形成の情報化

本研究は、八重山地域を中心とした集落移動の事例を各種の歴史資料を中心としながら整理し、近世近代にいたる時期の集落移動の全体像をとらえたうえで、それを基礎としながら近世・近代に移動の行なわれた西表島祖納・石垣島安良集落の調査を行い、移動の実態と旧集落の復元、移動前・移動後において、空間の特性、ひいては空間観・環境観がいかに引き継がれたかを明らかにすることを試みた。その結果祖納村では、古地図等の分析と現地調査から、すでに1863年頃には現在の村の位置に番所を中心とする村が存在し、旧集落からの移動が比較的ゆっくりと行われ、移動前には御嶽(後)→本家→分家(前)という空間認識が存在したが、移動した地域の地形や空間認識の変化から本家(後)→分家(前)という原則のみが引き継がれたことが明らかになり、一方、石垣島において唯一、集落移動に関する具体的痕跡が残された廃村・安良村では、『北木山風水記』の記述と現地調査から、この村は風水判断後に「可移居之地」として指定された場所に建立された村であることが確認され、移動前の村についても、各種資料の分析から、津波前の村が津波後70m近く山側に移動し、高山の近くの風水上良くない場所に村建てをした様子、さらには1864年以降に再度、移動した事実を確認することができた。
ウシ歯髄細胞培養中に発現されるコラゲナ-ゼインヒビタ-の遺伝子の研究

1.実験方法(2)TPA含有培地で培養した細胞のmRNAを抽出し、cDNAライブラリ-(λgtll)を作る。(3)C.I.ポリクロナ-ル抗血清でライブラリ-をスクリ-ニングし、クロ-ンを取り出し、挿入されたDNAのサイズの測定ならびにDNAの精製。またタンパク質を発現させ、ライセ-トの性質を同定した。(4)ダイデオキシチェ-ン法により塩基配列を決定し、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較をする。2.結果(1)TPA処理により高発現条件下でcDNAライブラリ-を作成できた。(2)ポリクロナ-ル抗血清によるスクリニングで、10^3個に数個の陽性プラ-クを得た。(3)10種のクロ-ンを取り出した。挿入DNAサイズは4001100塩基であった。タンパク発現ライセ-トはどのクロ-ンもC.I.活性を示さずモノクロナ-ル抗体とも反応はしなかった。(4)塩基配列の決定によりクロ-ン間に相同性が無かったが、ヒトC.I.cDNAの塩基配列との比較により、1つのクロ-ンがC末端側アミノ酸90をコ-ドする塩基配列を含むと予想された。3.考察ならびに今後の計画cDNAの1部を含むクロ-ンDANをプロ-ブとして、ライブラリ-をスクリニングし、全cDANを含むクロ-ンを取り出す。
肝幹細胞のクローニングと肝内局在部位の同定に基づく肝組織再生機序の解明

本研究は肝上皮性幹様細胞をクローン化し、そのモノクローナル抗体を作成し、肝再生過程におけるこの細胞の役割を明らかにすることを目的にしている。また、本紳胞に対し増殖因子やサイトカインを投与して補助肝臓として利用可能な機能肝細胞塊を作成することを目指している。クローン化では96穴wellに播種した1個の細胞からクローン細胞の増殖に成功した。次いで、この細胞を兎耳静脈に3回に分けて投与しその3週間後に血清を採取し凝集価により抗体産生をみたがこの細胞特有の抗体は認められなかった。未分化細胞のマーカーの検索ではCD45R.(Anti-Lineage marker)(+++),CD117(Anti-c-kit)(Receptor of stem cell factor)(-),CD34(low/-),CD90(Anti-Thy1)(+/low)で、本細胞が全くの未分化な細胞ではなくある程度分化した細胞であることを示していた。しかし、c-Met(+++)とCD117(Anti-c-kit)(-)の組み合わせは胎児肝における幹細胞のマーカーとされており(谷口英樹実験医学25(5):812-817,2008)、本細胞がその特徴を備えていることは本細胞が肝幹細胞の一つの候補といえるものと考えられる。また、Flk-1(Anti-VEGF R)(+++),c-Met(Anti-HGF R)(+++),Bek(Anti FGF R)(+++),Anti-EGF R(++)で増殖因子に影響されやすいことを推測させた。これらに共通していることは培養初期に強発現し、細胞がconfluentになり増殖が停止すると発現が消失することであった。しかし、TGFβ1,TGFβ2はM期の細胞に特化して強発現し、GI,G2,S期には発現が消失し上記の諸因子とは別な機序で発現することが推測された。VEGF添加による細い糸状構造の形成、HGF添加による大きな網状構造の形成が認められたが、肝実質細胞への分化は認められなかった。EGFやFGFの添加では形態の変化は認められなかったが増殖能、生存能が増強された。本研究では本細胞が増殖能、多分化能、長期生存能を持つ体性幹細胞であることを明らかにし、肝障害時に肝再生に重要な役割を発揮する可能性を示すことが出来た。本研究は肝幹細胞の肝内局在部位を同定し肝再生のメカニズムの解明を目的にしている。本年度の目標は1.肝幹細胞のクローニング、2.肝幹細胞のモノクローナル抗体の作成、3.肝幹細胞の局在の同定、4.肝幹細胞の機能細胞への分化転換、5.肝幹細胞によるオルガノイドの作成であった。1では1wellに1個の細胞に単離すると、細胞は数回分裂するが細胞巣を形成するまでに至らなかった。

しかし、ポリエチレンイミンでコーティングした大型プレートで培養を続けると目的細胞を残して他の細胞が浮上することが判明したので現在、この方法でクローニングを行っている。2は未施行。3は本細胞の抗体作成に換えてGFP遺伝子を組み込んだウイルスベクターを作成し、GFPをこの細胞に導入することを試みたところGFPを発現する細胞を増殖させることが出来た。GFP発現細胞をクローニングして、これをラット門脈に注入し定着する部位を検索している。4では肝上皮性幹様細胞にVEGF(vascular endothelial growth factor)のリセプターであるFlk-1が強発現していることを免疫染色により確認したので、5000/plateの細胞数で以下の6種類のメディウムで培養VEGF効果を検討した。1.DMEMのみ、2.DMEM+VEGF、3.DMEM+FBS、4.DMEM+FBS+VEGF、5.DMEM+FBS+EGF、6.DMEM+FBS+EGF+VEGF。その結果、DMEM+VEGFで培養した細胞から樹枝状の血管様構造が形成され管腔構造も認められた。しかし、他のメディウムでは全て扁平な細胞巣が形成された。VEGFにより血管様構造が誘導されたことはこの細胞に対し適当な他の増殖因子を共作用させることにより血管構築を伴った人工肝臓作成の可能性が示唆された。5では本細胞を浮遊状態で増殖させ、細胞集団を形成させることができた。本研究はラットの肝上皮性幹様細胞の肝内局在部位を同定し肝再生のメカニズムの解明を目的にしている。本年度の目標は1.本細胞のクローニング、2.本細胞の性格づけ、3.本細胞の増殖因子受容体の検討、4.本細胞の機能細胞への分化転換の試み、5.本細胞によるオルガノイドの作成であった。1では1wellに1個の細胞を分裂増殖させクローナルな細胞を継代培養することが出来た。2では一般に幹細胞因子とされているマーカーの発現はCD117(Anti-c-kit)(-),CD45R(Anti-Lineage marker)(+++),CD90(Anti-Thy 1)(+/low),Anti-CD34(low/-)であった。一般的には幹細胞にはCD117(+),CD45R(-)とされているので乖離が認められた。3ではFlk-1(Anti-VEGF R)(+++),c-Met(Anti-HGF R)(+++),Bek(c-17)(Anti FGF R)(+++),Anti-EGF R(++),Anti-c-kit(Receptor of stem cell factor)(-)であった。また、Actin(+++)、マクロファージマーカーED2(+++)、PECOM-1(+++)、F-VIII因子、CK7/17は(+/-)、AFP, Albumin, PASは(+)であった。4ではVEGF添加による細い糸状の構造の形成、HGF添加による大きな網状構造の形成が認められた。EGFやFGFの添加では形態の変化は認められなかったが増殖能、生存能が増強された。5では本細胞と内皮細胞の混合細胞液を70%肝切除ラットの腹壁皮下に注入するとこの細胞は皮下脂肪細胞内に浸潤し定着して細胞塊(PAS+,AFP+/low)を形成した。上記から本細胞は分化した血球系細胞と内皮細胞の性格を持ち増殖因子により形態変化を来す細胞であることが認められた。本研究は肝上皮性幹様細胞をクローン化し,そのモノクローナル抗体を作成し,肝再生過程におけるこの細胞の役割を明らかにすることを目的にしている。
酵母における小胞体カルネキシンノックアウトが新生糖蛋白の品質管理機能に及ぼす影響

酵母S.cerevisiaeの小胞体シャペロンカルネキシンの品質管理機構を明らかにするために、カルネキシンをノックアウトした酵母とノックアウトしていない野生型酵母を用いて、糖蛋白質の発現、分泌を比較した。モデル糖蛋白質として、構造安定性の異なる種々の変異リゾチームをグリコシル化するように分子設計したものを用いた。リゾチームでアミロイドシスを引き起こすことが知られている変異体Asp66His,Ile55Thrは正常な酵母ではほとんど分泌しないが、カルネキシン欠損株では多量に分泌すること、また、ジスルフィド欠損変異体C76A、へリックス不安定変異体K13Dも同様に、カルネキシン欠損株で多量に発現分泌することを明らかにした。この観察はカルネキシンの品質管理機能の存在を直接証明したものである。本研究では、さらに、カルネキシンの品質管理機構をより詳細に解明するために、不安定変異リゾチームを分泌させる系において、カルネキシン欠損による他の分子シャペロン、UPR(unfolded protein response)の挙動を調べた。この結果、カルネキシン欠損株で不安定変異体を発現、分泌させると、BipやPDIのような小胞体分子シャペロンが著しく増加した。このことはカルネキシンで行っていた品質管理が機能しなくなり、UPRが生じたことに起因し、カルネキシンの品質管理がさらに証明された。今後、このカルネキシンの品質管理がプロテアソーム分解系で起こるのかを明らかにすることが残された課題である。
PKN3阻害によるがん転移抑制のメカニズムを解明する。

新たな遺伝子改変マウス個体の作製実験については、昨年度報告の「現在までの進捗状況」欄に記載したとおり、当初の予定からの変更を行った。血管内皮細胞特異的ノックアウトマウスを作製するために、当初はTie2-Creマウスを利用する予定であったが、Tie2-Creマウスよりもより血管内皮特異性が高いとされるCdh5-Creマウスを医薬基盤研究所から導入し、Cre-loxPシステムによって、コンディショナルにPKN2をノックアウト可能なPKN2 flox/floxマウスと交配し、今回血管内皮特異的にPKN2をホモノックアウトしたマウス生体を得ることができた。血管内皮細胞特異的PKN2ホモノックアウトマウスは、生殖・発育ともに、現在までのところ明らかな異常を認めていない。臓器のマクロ解剖レベルでの異常も認められなかった。現在、解剖学的には、顕微鏡レベルでの異常の有無について解析中である。またコントロールマウスを用いて、Luciferaseを発現しているLewis肺がん細胞の血行性転移実験の系を確立した。現在遺伝子改変マウスをもちいた腫瘍の血行性肺転移実験のために、充分数のマウスを準備すべく交配中である。培養細胞レベルの実験については、やはりマウスの初代血管内皮細胞を、十分量、コンタミなく準備することは難しく、コストも増大してきたため、HUVECを用いたPKN3およびPKN2をターゲットとしたsiRNAノックダウン実験にシフトした。PKN2を有意にノックダウンしたHUVEC細胞を得たが、PKN1やPKN3の発現量には有意な変化はなかった。PKN2 flox/floxでかつCdh5-Cre陽性のマウスについて、PKN2 floxについてホモの個体がなかなか得られなかったため、Cdh5-Creを用いた部位特異的PKN2ホモノックアウトマウスは胎生致死ではないかと疑われたが、昨年度後半にやっとPKN2ホモノックアウト個体が得られた。HUVEC細胞において、PKN2, PKN3をそれぞれノックダウンした細胞を調整し、これらの細胞における種々の細胞間接着因子の発現量の変化および、関連リン酸化酵素のリン酸化レベルを、増殖因子存在下で検討したが、明かな有意差をみとめる分子はいまだ同定できていない。PKN3をノックダウンしたHUVEC細胞シートをBoyden chamberのupper chamber内に作製し、その細胞シートを透過するがん細胞数を検討する実験を繰り返し着手したが、再現性のある結果がいまだ得られていない。PKN3、およびPKN2をノックダウンした血管内皮細胞で、野生型マウスと比べて、発現量が有意に変化している細胞間接着分子は未だ見いだせていないので、この探索は今後も継続していく予定である。血管内皮特異的PKN2ノックアウトマウスの表現型については、さらに解剖学的解析をすすめていく。現在繁殖させている血管内皮特異的PKN2ホモノックアウトマウスおよびPKN3ホモノックアウトマウスは、ともに充分数が確保でき次第、コントロールマウスとともに、Luciferase発現Lewis肺がん細胞およびB16メラノーマを静脈注入し、転移腫瘍の数、増殖能を検討していく。またPKN3ノックアウトマウスにおいて、PKN3 siRNA製剤が、付加的な転移抑制効果を持つかどうかについても、やはり尾静脈-肺転移モデルを用いて、検討していく予定である。PKN3ノックアウトマウスを用いて、aorta ring assayやcorneal pocket assayを行うと、どちらにおいても増殖因子依存性の血管新生が抑制されていることをすでに確認しているが、血管内皮特異的PKN2ホモノックアウトマウスについてもこれらのアッセイを行って、血管内皮PKN2の血管新生に対する影響も検討する予定である。PKN3ノックアウトマウスにおいては、メラノーマの血行性転移が抑制されている。その分子メカニズムを明かにするため、今年度、PKN3ノックアウトマウスから、大動脈や、肺・肝臓などの血管もしくは血管が豊富な組織を採取して、膜分画をとり、E-selectin, P-selectin, VCAM1, ICAM-1等の種々の細胞間接着因子の発現量を測定した。しかしいまだ野生型と比べて有意な発現量の差を認める分子を見いだすことはできていない。また、初代血管内皮細胞を、PKN3ノックアウトマウス肺から、磁気ビーズを用いて採取したが、特定の膜タンパク質の発現量について、野生型との有意な差は見いだせていない。HUVEC細胞をsiRNA処理することにより、PKN3ノックダウン血管内皮細胞シートをBoyden chamberのupper chamber内に作製し、その細胞シートを透過するがん細胞数を検討する実験にも着手しているが、いまだ安定した結果を得られていない。新たな遺伝子改変マウス個体の作製実験については、下記の「現在までの進捗状況」欄に記載したとおり、当初の予定からの変更を行った。血管内皮細胞特異的ノックアウトマウスを作製するために、当初はTie2-Creマウスを利用する予定であったが、Tie2-Creマウスよりも、より血管内皮特異性が高いとされるCdh5-Creマウスが利用可能であることがわかり、今年度そのトランスジェニックマウスを、医薬基盤研究所から導入し、Cre-loxPシステムによって、コンディショナルにPKN2をノックアウト可能なPKN2 flox/floxマウスと交配し、血管内皮特異的にPKN2をヘテロノックアウトしたマウスを得、現在、ヘテロ個体同士の交配により、ホモノックアウト個体を得ようとしている段階である。(i)本申請研究で使用を予定していた、IMPCによって樹立されたES細胞が、その後のquality checkにより、コンディショナルノックアウトの構築に失敗していることが示唆されたこと。(ii)血管内皮特異的PKN3ノックアウト

マウスの作製にすでに着手している研究室がある旨の情報を入手したこと。(iii)我々が準備をすすめていた、PKN3のアイソフォームであるPKN2のコンディッショナルノックアウト可能なマウスがすでに樹立できたこと。上記(i), (ii), (iii)の事情により、研究予定期間内に、オリジナリティのある研究成果を得るため、当初の実験計画を変更し、新たな遺伝子改変マウスの作製に関しては、血管内皮特異的PKN3ノックウアウトマウスではなく、血管内皮特異的PKN2ノックアウトマウスをめざすこととし、PKN3に関しては、既存のPKN3ノックアウトマウスを用いての実験に集中することとした。PKN2は、その構造類似性および発現様式から、PKN3との間で冗長性を有し、腫瘍転移へ関与することも予想されていたが、全身でのPKN2ノックアウトが胎生致死に至るため、この分野において解析が行われてこなかった分子である。今回のアプローチ変更により、PKN2の血管内皮細胞・腫瘍転移における機能を解析できるとともに、PKN3ノックアウトによる表現型をより明瞭にとらえることも期待される。新たな遺伝子改変マウス個体の作製実験については、昨年度報告の「現在までの進捗状況」欄に記載したとおり、当初の予定からの変更を行った。血管内皮細胞特異的ノックアウトマウスを作製するために、当初はTie2-Creマウスを利用する予定であったが、Tie2-Creマウスよりもより血管内皮特異性が高いとされるCdh5-Creマウスを医薬基盤研究所から導入し、Cre-loxPシステムによって、コンディショナルにPKN2をノックアウト可能なPKN2 flox/floxマウスと交配し、今回血管内皮特異的にPKN2をホモノックアウトしたマウス生体を得ることができた。血管内皮細胞特異的PKN2ホモノックアウトマウスは、生殖・発育ともに、現在までのところ明らかな異常を認めていない。臓器のマクロ解剖レベルでの異常も認められなかった。現在、解剖学的には、顕微鏡レベルでの異常の有無について解析中である。またコントロールマウスを用いて、Luciferaseを発現しているLewis肺がん細胞の血行性転移実験の系を確立した。現在遺伝子改変マウスをもちいた腫瘍の血行性肺転移実験のために、充分数のマウスを準備すべく交配中である。培養細胞レベルの実験については、やはりマウスの初代血管内皮細胞を、十分量、コンタミなく準備することは難しく、コストも増大してきたため、HUVECを用いたPKN3およびPKN2をターゲットとしたsiRNAノックダウン実験にシフトした。PKN2を有意にノックダウンしたHUVEC細胞を得たが、PKN1やPKN3の発現量には有意な変化はなかった。