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北海道日高帯の第三紀火成岩類の岩石学的・地球化学的・造構論的研究

中央北海道を南北約300kmにわたって分布する日高火成活動帯の垂直断面は中央北海道南部の日高山脈地域(日高変成帯主帯)において良好に観察される。また日高火成活動帯内部にはアイスランダイト質深成岩が分布する。ソレアイト質層状分化岩体であるパンケヌシかんらん石斑れい岩体,それに貫入する千呂露ドレライト岩脈,不均質でカルクアルカリ質の組成変化を示す芽室岳岩体について詳細な岩石学的・地球化学的検討を行なった。パンケヌシ岩体のトロクトライト,芽室岳岩体の斑れい岩,千呂露岩脈は全てNーMORBと同様の地球化学的性質をもっている。ここで特に重要なことは,カルクアルカリ質の芽室岳岩体もNーMORBに由来していることである。カルクアルカリ質岩は一般に火成弧を特微付ける火成岩と考えられており,これまでの日高火成活動帯の造構論においても,カルクアルカリ質岩類の産出は火成弧と考える大きな根拠であった。しかし,芽室岳岩体の地球化学的性質は,火成弧と考える根拠がないことを示した。日高火成活動は中央海嶺の火成活動が陸源性砕屑物(日高累層群)の中に侵入したと考えれば最も容易に説明可能である。例えば,中央海嶺の収束的プレ-ト境界への沈み込み,あるいは陸域に大変近い位置に中央海嶺が存在したなどのモデルを想定しうる。しかし,弧火成活動として現在認識されている特微は成熟した火成弧の情報に基づいている。海洋プレ-ト内に発生した弧火成活動の開始期の実態は十分に理解されていないかもしれない。日高火成活動を開始直後に停止した火成弧火成活動とみなすことの検討も必要であろう。日高火成活動帯内のアイスランダイト質岩は,海嶺において産出例が報告されている鉄に富む安山岩類とは明瞭に異なり,むしろ海嶺近傍のホットスポット上に産出する鉄に富む安山岩類と良く類似している。1.下部地殻から上部地殻にわたって活動する日高火成活動の全体像を代表する岩体として、日高山脈北部の深成岩体群を選定し、岩石学的・地球化学的検討を行った。その結果、ソレアイト質分化岩体であるパンケヌシ斑れい岩体の最も苦鉄質の岩相、パンケヌシ岩体に貫入する未分化苦鉄質岩脈、カルクアルカリ質の芽室岳岩体の最も苦鉄質の岩相はともに大変低いSr同位体比(約0.7025)を持ち、またそれらの内の前2者は大変高いNb同位体比(約0.5132)を持っていることが判明した。このような同位体比は中央海嶺玄武岩のみが特徴的に示す値に一致している。中央海嶺玄武岩との類似は主要元素組成のTi/K比や、希土類元素組成においても認められる。従って日高火成活動帯の苦鉄質マグマの起源マントルは、中央海嶺玄武岩の起源マントルと同様のものであったと考えられる。2.日高火成活動帯にはFeやTiに富むソレアイト質の分化岩、つまりアイスランダイト様岩石が存在することが明らかとなった。3.研究代表者は既に、南北に延長する沈み込み帯から太平洋プレートがユーラシアの下に沈み込むことによって日高火成活動が発生したとする"日高火成弧モデル"を提案している。

しかし、中央海嶺玄武岩様火成活動やアイスランダイト様火成活動が火成弧に産出するという例は知られていない。さこで、ユーラシアに付荷していたクラプレートの下にクラ・太平洋海嶺が沈み込むことによって、クラプレート内の古海嶺が復活して日高火成活動帯を形成したとする作業モデルを提案し、今後の検討に供することとした。1.パンケヌシ斑れい岩体は日高火成活動帯を代表するソレアイト質層状分化岩体であるが、この岩体のSr同位体比の垂直変化を検討した。その結果,Sr同位体は層序的下位から上位に向かってほぼ連続的に増加していることが判明た。つまり、最下位のトロクトライトでは0.70256であり、最上位の鉄斑れい岩では0.70405であった。この変化は単純な分別結晶作用では説明できない。Sr同位体(およびNd同位体)的にMORBに類似する玄武岩質マグマが分別結晶作用を行なうと同時に、高いSr同位体比を持つ物質を取り込むというようなプロセスを想定することが必要である。パンケヌシ岩体の東に露出するカルクアルカリ質の芽室岳岩体は、0.7025程度の低いSr同位体比を持つ塩基性岩類と0.7048程度の高いSr同位体比を持つ酸性岩類が不均質な産状を示すことから、マグマの混合が想定されていたが、パンケヌシ岩体のようなソレイアイト質の層状分化岩体においても同様なプロセスが起こっていたものと考えられる。今後は記載岩石学や岩石化学的情報を再検討し、このようなプロセスの実態を明らかにすることが必要である。2.日高火成活動帯北部の奥士別岩体から中性から酸性に及ぶアイスランダイド組成の分化岩脈が発見された。この岩脈の存在は日高火成活動にFeやTiに富むような分化系列を示す火成活動があったことを確実にした。しかもこのような火成活動が日高火成活動の中でも比較的後期に発生していることが産状から推定されたことは造構論を議論する際に重要である。今後は同位体年代を測定し、アイスランダイト質火成活動の時期を確定することが急務であるとともに、詳細な岩石学的・地球化学的検討を行ない、日高火成活動帯におけるアイスランダイド質火成活動の詳細な検討が必要である。過年度の研究によって、日高火成活動帯にマントルからもたらされたマグマは中央海嶺玄武岩(NーMORB)と同様の地球化学的性質をもっていたということが明かとなったが,本年度はデ-タ追加によってそれがさらに補強された.今年度の研究で特に重要なことは,カルクアルカリ質の芽室岳深成岩体のうちの比較的末分化なものもNーMORBと全く区別できないSt・Nd同位体比を持っていることが明かとなったことである.カルクアルカリ質岩は一般に火成弧を特徴付ける火成岩と考えられている.これまでの日高火成活動帯の造構論においても,カルクアルカリ質岩類の産出は火成弧と考える大きな根拠であった.しかし,芽室岳深成岩体の性質は単純に火成弧と考えることの困難性を示している.また、このことはNーMORBを出発物質として,なんらかの地殻構成物質と混合させることによって,カルクアルカリ質マグマを形成しうることを示している.今年度はまたソレアイト質の層状分化斑れい岩体であるパンケヌシ岩体の活動年代を確定することを目的にRbーSr全岩アイソクロン法の適用を試みた.しかし,測定点はかなりのばらつきを示し,有意の年代を求めることができなかった.このこともNーMORBと地殻構成物質との混合作用の存在を強く示唆している.以上の検討結果はNーMORBと地殻構成物質との混合作用の解明が必要であることを示している.今年度はまた,アイスランダイト質岩の岩石化学的検討を行なった.その結果,日高火成活動帯のアイスランダイト質岩は海嶺において産出例が報告されている鉄に富む安山岩類とは明瞭に異なり,むしろ海嶺近傍のホットスポット上に産出する鉄に富む安山岩類と良く類似していることが判明した.
異常アミノ酸を含むペプチドの微量構造解析

1.メーヤワイン試薬を用いる方法イミノエーテルは穏和な条件でエステルに変換可能で、後者は弱アルカリで切断することができるため、アミドをイミノエーテルに変換することを第一の目的とした。文献(Syn.Commun.1997,27,923)にある条件にしたがい、formyl-Met-Leu-PheとEt3OBF4の反応を試みたが、薄層クロマトで原点成分を与えたのみで、期待したイミノエーテルを得ることはできなかった。2.Boc化によるペプチド結合の活性化アミド結合をBoc化すると、弱アルカリでアミドが選択的に加水分解されることが知られている(J.Org.Chem.1997,62,7054)。まず、Boc化の反応条件を検討した。反応溶媒としてTHFが推奨されているが、文献記載どおりMeCN中での反応は非常に遅かった。しかし、通常のペプチドはTHFに溶けにくい。そこで、Boc化の前にTHFに可溶な誘導体とする必要がある。そこで、カルボキシル基はメチル化、アミノ基と水酸基はアセチル化することとした。メチルエステル化はHCl/MeOH中、室温で進行した。溶媒を留去したのち、無水酢酸_ピリジンでアセチル化を行った。反応物を減圧下長時間乾燥しても塩が残存し、Boc化を妨げることが判明した。そこで、アセチル化の後にODSの小カラムを通し脱塩を行うと、Boc化がスムーズに進行した。得られたペプチドのアミド結合は含水メタノール中2当量の水酸化リチウムで速やかに加水分解され、Boc化アミノ酸を与えた。
無染色生細胞の"その場"内部観察を可能とする新規顕微鏡の開発

本研究では、無染色の生細胞の内部観察を可能とするような顕微装置の開発を目的としており、その有力候補として光熱変換現象の一つである熱レンズ分光法を利用した画像化装置の開発を行った。本年度は、開発した顕微鏡を用いての三次元イメージングについての研究と、応用検討としてのマルチカラー型熱レンズ顕微鏡の開発を行った。三次元イメージングに関しては、試料として微粒子・酵母菌を利用した測定に成功し、さらに、通常の吸収を用いた顕微鏡が持たない三次元分解能を持つと結論付けた。また、三次元測定を詳細に行う際には、測定試料と周辺環境との屈折率差をなくす、インデックスマッチングが必要となることが判明した。今回の成果から、測定試料を励起する際にも三次元分解能を持つ手法と組み合わせることで、さらに深さ分解能の向上した熱レンズ顕微鏡開発の可能性が示唆された。応用検討のためのマルチカラー型熱レンズ顕微鏡として、励起光としてTi:sapphireレーザー光の第二高調波と、He-Neレーザー光を用いた装置系を構築した。測定試料としては、凝集した金ナノ粒子を用いた。金ナノ粒子を用いた理由としては、粒径や凝集状態により光の吸収スペクトルが変化することが良く知られているためである。測定を行った結果、照射する励起光により異なった画像が得られた。画像中の信号について、どちらの波長の励起光がより大きな影響を与えるかの指標となる値を定め、画像中の各点においてその値を計算する事で、熱レンズ信号画像における励起光の影響を可視化した。その結果、本手法により、マルチカラー型熱レンズ顕微鏡を用いる事で、散乱の影響を排除した上で、測定試料の、局所的な、特定波長における光吸収測定の可能性が示唆された。これは、開発した熱レンズ顕微鏡が、従来の光学顕微鏡にない利点を備えている事を示すものであると言える。本研究では、無染色の生細胞の内部観察を可能とするような顕微装置の開発を目的としており、その有力候補として光熱変換現象の一つである熱レンズ分光法を利用した画像化装置の開発を行っている。これまでに、生細胞として酵母菌を利用し、無染色の生細胞を画像化することが可能であることを実証済みである。本年度は特に熱レンズ現象の最適観測技術の確立を第一の目的として計画を立て、研究を行った。本装置の大きな特徴の一つとして反射対物レンズの使用が挙げられるが、この利用が原因の一つとなり、測定結果にゴースト像が生じる・同一対象を測定した場合でも結果が異なる場合がある、といった問題が生じていた。同じ対象を測定して同じ結果が得られないという問題は顕微装置として致命的である。この問題を解決するため、イオン交換樹脂を測定試料として用い、光学系を見直しつつ異なる測定条件での測定を行い、問題が生じる条件を特定した。また、この問題の解決が可能な光学系を提案、実際に解決可能であることを示した。さらに、本装置においては今後測定時間の改良が大きな課題の一つとなると考えられる。本装置は試料をコンピュータ制御のステージで走査させる形式であり、その制御には自作のソフトウェアを用いている。測定時間のみならず、装置・測定ソフトウェアそのものの安定性も問題となり安定した測定が行えないでいたため、測定時間短縮のための第一歩として、本年度にこの制御部分の刷新をハードウェア・ソフトウェアの両面にて行った。その結果、それまでと比較して3分の1の時間で測定を行うことが可能となった。本年度は、目標値として挙げた空間分解能:0.1μm(平面)×0.3μm(深さ)の達成へ向け、熱レンズ現象の最適観測技術の確立を目指し取り組んできた。まず、平面方向の分解能改善のため、装置光学系の改良と、本研究における装置系での熱レンズ信号画像取得最適手順確立を行なった。昨年問題として生じていた、画像に"歪み"が生じる事について、その歪みを減少させることが可能な装置系を用い、実際に細胞として酵母菌を試料としての測定を行い、熱レンズ画像の取得に成功した。深さ方向の分解能についてはこれまでデータが取得できていなかったため、新たに測定プログラムを作成することで、深さ方向の位置をずらしながら二次元平面画像を連続的に取得可能にした。粒径7μmのポリスチレン微粒子を用い、その粒径よりも大きな範囲の深さ方向依存の画像取得に成功した。その結果、現在の装置系をそのまま用いた場合、測定手順改良や光学系の改良、高倍率対物レンズの使用だけでは、深さ方向の分解能の目標値達成が難しい事が判明した。現在の装置系と組み合わせ可能であり、特に深さ方向の分解能改善が期待できる手法の調査を行なった。その結果、二色二光子吸収の利用により、深さ方向の分解能改善が期待できると判断した。新たな手法を組み合わせた装置系の開発は、当初目標として掲げた分解能を達成するために非常に重要である。二色二光子吸収を組み合わせた装置構成を決定した。現在、その新しい装置系の構築を進めている。

本年度は、開発した顕微鏡を用いての三次元イメージングについての研究と、応用検討としてのマルチカラー型熱レンズ顕微鏡の開発を行った。三次元イメージングに関しては、試料として微粒子・酵母菌を利用した測定に成功し、さらに、通常の吸収を用いた顕微鏡が持たない三次元分解能を持つと結論付けた。また、三次元測定を詳細に行う際には、測定試料と周辺環境との屈折率差をなくす、インデックスマッチングが必要となることが判明した。今回の成果から、測定試料を励起する際にも三次元分解能を持つ手法と組み合わせることで、さらに深さ分解能の向上した熱レンズ顕微鏡開発の可能性が示唆された。応用検討のためのマルチカラー型熱レンズ顕微鏡として、励起光としてTi:sapphireレーザー光の第二高調波と、He-Neレーザー光を用いた装置系を構築した。測定試料としては、凝集した金ナノ粒子を用いた。金ナノ粒子を用いた理由としては、粒径や凝集状態により光の吸収スペクトルが変化することが良く知られているためである。測定を行った結果、照射する励起光により異なった画像が得られた。画像中の信号について、どちらの波長の励起光がより大きな影響を与えるかの指標となる値を定め、画像中の各点においてその値を計算する事で、熱レンズ信号画像における励起光の影響を可視化した。その結果、本手法により、マルチカラー型熱レンズ顕微鏡を用いる事で、散乱の影響を排除した上で、測定試料の、局所的な、特定波長における光吸収測定の可能性が示唆された。これは、開発した熱レンズ顕微鏡が、従来の光学顕微鏡にない利点を備えている事を示すものであると言える。当初目標としていた装置性能について、この達成のためにはレーザー光集光条件の最適化や高倍率対物レンズの使用だけでは難しいことが判明し、既存の装置系に対し新たな原理を組み合わせた装置の開発が必要となったためである。既にその新装置系構築に向け動いてはいるが、申請書作成時には予定していなかった方向であるため、(3)やや遅れている、とした。今後の推進方策として、現行装置系に二色二光子吸収を組み合わせた装置開発を行なっていく。現在のシステムの問題点として、分解能、特に深さ方向の分解能が不足している点、紫外レーザー光を使用する事による細胞へのダメージの可能性がある点、が挙げられる。二色二光子吸収を組み合わせることのメリットは、(1)非線形光学現象であることによる、高分解能化、特に深さ方向の高分解能化、(2)励起用レーザー光波長を長波長にすることが可能、の二点である。現在は励起光源として波長260nmのレーザー光を利用しているが、これを波長780nmと390nmのレーザー光に変更できるため、細胞へ与えるダメージの減少を期待できる。
パネル遺伝子解析による新規プロテアソーム機能不全症の同定と病態解明

臨床的に中條ー西村症候群と診断されるがPSMB8変異を認めない症例を全国から集積し、プロテアソーム、さらには既知のインターフェロン異常症、インフラマソーム、オートファジー関連遺伝子を合わせたパネル解析と全エキソーム解析を行った。その結果、複数のTREX1変異を持つエカルディーグティエール症候群の患者に加え、PSMB9変異を持つ新規プロテアソーム関連自己炎症性症候群と、疾患関連変異の報告のない遺伝子に変異を持つ新規インターフェロン異常症の患者を見出した。これらの症例におけるプロテアソーム酵素活性、複合体形成、ユビキチン蓄積の検討を行い、中條ー西村症候群とは異なる病態の存在が示唆されている。NNSが疑われ臨床診断基準5項目を満たす横浜の小児例、福島の成人例と、脂肪萎縮がなく診断基準を満たさないが臨床的に酷似する沖縄の幼児例について、PSMB8遺伝子解析にて変異を認めないため、プロテアソーム関連パネル遺伝子解析と、両親(福島の症例は父親のみ)とトリオでのエキソーム解析を行った。その結果、横浜の小児例では有意な変異を見いだせなかったが、福島の成人例ではプロテアソーム合成シャペロンの一つであるADRM1遺伝子に新規ヘテロ変異を見出した。末梢血単核球のプロテアソーム活性測定にてキモトリプシン活性の軽度低下を認めたが、エキソーム解析により円板状エリテマトーデスと診断されていた父親とともに既知のTREX1遺伝子ヘテロ変異を認め、優性遺伝型のエカルディ・グティエール症候群(家族性凍瘡様ループス)と診断した。ADRM1変異は患者特異的であり、父子の表現型の違いを反映する可能性が考えられた。また沖縄の幼児例では、プロテアソーム誘導型β1iサブユニットコードするPSMB9遺伝子の新規ヘテロ変異と合成シャペロンの一つであるPSMD9遺伝子のまれな一塩基多型(SNP)を認めた。末梢血単核球のプロテアソーム活性測定では明らかな異常を認めなかったが、エキソーム解析にてその他に有意な変異を見いだせず、またPSMB9変異は患児特異的、PSMD9変異は患児と父親に認めることから、PSMB9変異が主たる原因と考えられた。プロテアソーム活性測定の精度を上げるため、細胞蛋白質をシュクロース濃度勾配にて分画したものを用いた測定も行ったが、すべての分画に共通した明らかな機能低下・亢進は認められなかった。その他にも、臨床診断基準5項目を満たしNNSが疑われる症例が複数見出されており、うち1例においてはPSMB8変異を認めておらず、さらなる検討を予定している。交付申請時の、<NNS臨床診断例におけるパネルあるいはエキソーム解析によるプロテアソーム関連遺伝子変異の同定>を開始し、同時に<NNS臨床診断例におけるプロテアソーム酵素活性の測定>するという本年度の研究計画をほぼ遂行した。具体的には、当科に遺伝性自己炎症疾患疑いとして相談のあった症例のうち、臨床的にNNSと診断されるがPSMB8変異を認めない3症例に対し、インフォームドコンセントを得て検体を長崎大学に送付し、次世代シーケンサーを用いたプロテアソーム関連遺伝子のパネル解析と全エキソーム解析を行った。当科においては、サンガー法のダイレクトシーケンスによりPSMB8など候補遺伝子の解析による既存遺伝性自己炎症疾患の除外を行った。さらに、プロテアソーム関連遺伝子に変異を認めた2症例について、市販のキットを用いて患者末梢血単核球、不死化B細胞などのプロテアソーム酵素活性を測定し、NNS患者や健常者由来細胞と比較した。その結果、1症例では有意な変異を認めず、1症例はADRM1の新生新規ヘテロ変異を見出したもののTREX1の疾患関連変異を認めエカルディ・グティエール症候群と診断したが、残る1症例にPSMB9の新生新規ヘテロ変異とPSMD9の稀なSNPを見出した。市販のキットを用いたプロテアソーム酵素活性測定では異常を認めていないが、PSMB8以外の遺伝子変異によるプロテアソーム関連自己炎症疾患の可能性があり、今後もさらなる検討を予定している。まず、新規PSMB9遺伝子変異が見出された沖縄の幼児例について、患者由来不死化B細胞から細胞蛋白質を抽出し抗ユビキチン抗体でウェスタンブロットを行い、遺伝子型が野生型の患者の母親由来細胞や、中條ー西村症候群(NNS)患者由来細胞と比較したが、PSMB9変異患者細胞ではNNS患者細胞ほど明らかなユビキチンの蓄積は見られなかった。また、皮疹の病理標本の薄切切片を抗ユビキチン抗体にて免疫染色してNNS患者皮疹と比較したところ、PSMB9変異患者組織でも浸潤細胞の細胞質や核にユビキチンの蓄積を認めるものの、NNS患者組織ほど広く強い蓄積は見られなかった。一方、患者由来不死化B細胞内蛋白質をシュクロース濃度勾配にて分画したものを用い、プロテアソーム各酵素活性を測定するとともに各サブユニットの抗体にてウェスタンブロットを行ったところ、すべての分画に共通した明らかな機能低下は見られなかったが、NNS患者由来細胞と同様に未成熟な複合体の残存を認め、プロテアソーム複合体形成不全の存在が示唆された。また、臨床的にNNSと診断されながらPSMB8変異のない症例の発掘と遺伝子解析を進めた。

以前から知られていた横浜の成人例について、患者と両親の末梢血を用いたプロテアソーム酵素活性の測定を行ったが、明らかな酵素活性の低下は認めず、さらに、プロテアソーム関連遺伝子パネルおよびエキソーム解析を行ったが、有意な疾患関連変異を見出すことはできなかった。次いで、厚労科研難治性疾患政策研究事業で行った全国疫学調査にて見出した大分の小児例について、現在遺伝子解析を進めている。さらに、PSMB8ホモ変異をもつNNS患者4例についてプロテアソーム関連遺伝子をパネルで網羅的に検討することにより、一部の症例に報告のない変異を見出し、重症度など臨床病型の違いとの関連が示唆された。交付申請時の計画に沿って、<NNS臨床診断例におけるパネルあるいはエキソーム解析による新たなプロテアソーム関連遺伝子変異の同定>と<NNS臨床診断例におけるプロテアソーム酵素活性の測定>を継続し、新たに<NNS臨床診断例におけるユビキチン蓄積の検討>、さらに<NNS患者におけるパネル解析によるプロテアソーム関連遺伝子変異の検索>を行い、<NNS臨床診断例における血中サイトカインの網羅的解析>を除き、本年度の研究計画を概ね遂行した。具体的には、NNS疑いとして当科を紹介受診したがPSMB8変異を認めない1症例について、末梢血を用いたプロテアソーム酵素活性の測定と次世代シーケンサーを用いたプロテアソーム関連遺伝子パネル解析と全エキソーム解析を行ったが、有意な活性異常や遺伝子変異を見出すことはできなかった。引き続き現在は、全国疫学調査で見いだされた新たな症例について遺伝子検索中である。一方、PSMB9の新生新規ヘテロ変異とPSMD9の稀な一塩基多型を見出した1症例について、さらにプロテアソームの機能や構造を検討した結果、明らかなユビキチン蓄積を伴わず、プロテアソーム酵素活性の低下も軽度だが、NNS患者と同様の複合体形成異常を認めた。プロテアソーム酵素活性低下とユビキチン蓄積を特徴とするNNSとは異なるメカニズムによるプロテアソーム関連自己炎症疾患である可能性が高く、今後もその発症メカニズムを追究する必要がある。さらに、PSMB8ホモ変異が明らかなNNS患者4例についてプロテアソーム関連遺伝子パネル解析を行い、一部の症例に新しい変異の併存を見出したことから、重症度など症例ごとの臨床病型の違いとの関連が示唆されている。本年度も、臨床的にNNSが疑われながらPSMB8変異のない症例の発掘と遺伝子解析を進めた。まず凍瘡様ループスとの臨床診断であった北海道の小児例にTREX1遺伝子の既知のヘテロ変異を見出し、エカルディ・グティエール症候群と確定診断した。全国調査で見出された大分のNNS類似症例については、両親とトリオでエキソーム解析を行い、患児に特異的なヘテロ変異を見出したが、積極的に機能的意義が示唆されるものではなかった。プロテアソーム関連遺伝子についてパネル解析を行っていたが、さらにインターフェロン異常症関連、インフラマソーム関連、オートファジー関連など約90遺伝子まで対象を広げ新たなパネル解析を始めたが、有意な変異は見出せなかった。次いでやはり凍瘡様症状が目立つ神奈川の小児例について両親とトリオでエキソーム解析を行った結果、患児にこれまで疾患と関連変異の報告のないSTAT1の転写制御遺伝子の複合ヘテロ変異を見出した。血清中IP-10濃度がNNS患者と同程度に高く、またIFNγで刺激した末梢血単核球におけるSTAT1リン酸化が両親よりも亢進していたことから、新たなインターフェロン異常症であることが示唆されている。
小分子RNAが制御するクロマチンポテンシャルと遺伝子発現

正常な細胞活動や疾患の原因として、タンパク質に翻訳されない小さなRNA(小分子RNA)が大きな役割を果たす。そうした小さなRNAの1グループであるpiRNAは、個体発生や生命の次世代継承にとって重大な脅威となるトランスポゾンの転写抑制を行う。我々はこれまでの研究を通して、このpiRNAによるトランスポゾンの転写抑制が、クロマチン凝集を介するものであることを解明してきた。本研究では、piRNAが形成するクロマチン状態の包括的な解析と関連因子のスクリーニングをオミクス解析技術により行い、さらに、個々の因子の詳細な機能解析を生化学実験により行うことで、piRNAによるクロマチンポテンシャルと遺伝子発現の制御機構を明らかにする。
PET賦活検査法による高次脳機能障害の病態生理学的研究

【はじめに】本研究ではこれまで失語症の症例を対象に、安静時検査では明らかでない変化を、言語課題施行時の脳血流量変化をみることによりとらえることができることを示してきた。本年度は聴覚失認の症例を対象に、PET賦活検査法を用いて皮質性聴覚認知障害の成立機序について検討した。【方法】臨床的に聴覚失認と診断された2症例(両側側頭葉損傷例)と正常人4例に対し、安静時とクリック音聴取時にそれぞれ、酸素-15標識水(H_2^<15>O)ボーラス静注とポジトロンCTによる局所脳血流量測定を施行し、6.5mm間隔14スライスの体軸断層画像を作成した。全脳血量を標準化した後、課題時の画像から安静時の画像を差し引いたサブトラクション画像を作成し、これを同一人のMRIと3次元的に重ね合わせ、課題によって生じた聴皮質の血流変化について検討した。【結果】正常人ではクリニック音刺激により横側頭回に限局して血流増加を認めた。一部の正常人では、内側膝状体の血流増加も認められた。聴覚失認の症例でも両側の横側頭回で血流増加を認めた。その程度は正常人に比べると小さい反面、血流の増加した範囲は横側頭回に限局せず聴覚連合野に及び、正常人よりも広範であった。【考察】聴覚失認は要素的聴力は保たれて音の存在認知はできるが、音の性状認知が困難な病態である。音の存在認知に聴皮質が必要かどうかはこれまでのところよくわかっていないが、今回調べた症例では、いずれも両側の一次聴覚領への入力が不十分ながらもあることがPET賦活検査で確認された。聴覚失認の病態生理学的背景として、聴覚領への入力が不十分であるために音の存在認知はできるが、性状認知のための入力情報の処理が十分行えないという機序が推定された。PET賦活検査法はこのような高次脳機能障害の病態解析に有用と考えられる。
近位尿細管エンドサイトーシスの分子機構と慢性腎臓病の発症機序における病的役割

近位尿細管上皮細胞エンドサイトーシス受容体メガリンの分子機構の解析を行い、さらにメガリンを用いた慢性腎臓病の新規診断法の開発を行うと共に、慢性腎臓病の病態(レニン-アンジオテンシン系)におけるメガリンの役割について検討を行った。1)メガリンの細胞内ドメインがアダプター蛋白Dab2を介してnonmuscle myosin heavy chainIIAと結合し、それがエンドサイトーシスの駆動力となるとなることを明らかにした(Kidney Int 2009)。2) 2型糖尿病やタボリックシンドロームにおいては血液中のエンドトキシン(LPS)が増加するが、LPSが培養PTCにおいて、TNF.の発現誘導を介してメガリンの発現を抑制すること、さらにその下流はERK1/2経路が関係することを見出した(BBRC 2011)。3)ヒト尿中メガリンELISA測定系を確立し、糖尿病性腎症の早期発見・重症度判定および心腎連関リスクに関する新しいバイオマーカーになりうることを示した(Diabetes Care 2012)。4)肝臓で産生されたアンジオテンシノゲンが腎臓におけるレニン-アンジオテンシン系の活性化(アンジオテンシンIIの産生)に関わることを明らかにした。さらに糸球体を濾過したアンジアンジオテンシノゲンは近位尿細管においてメガリンを介して取り込まれることを示した(JASN 2012)。1)近位尿細管上皮細胞(PTC)由来の培養細胞系を用いて、蛋白の取り込みに関係するエンドサイトーシス受容体メガリン、キュビリン-アムニオンレス複合体などの遺伝子導入細胞を作製した。それらの相互作用機序について、免疫沈降反応、Blue-Native PAGEなどを用いて解析した。(斉藤、竹田)2)2型糖尿病・メタボリックシンドローム(MetS)モデルであるOLETFラット(およびその対照LETOラット)において、腎臓(特にPTC)におけるレニン-アンジオテンシン系活性化とインスリン抵抗性の発現機序を解析するとともに、摂取カロリー制限を行うことによる腎病変(慢性腎臓病)の予防効果を検討した。さらにDNAマイクロアレイを用いてそれらの群でのPTCの遺伝子発現の違いを検討し、OLETFラットの腎障害の発症に寄与する遺伝子の候補群を見出した。(斉藤、佐藤、飯野)3)腎特異的メガリンKOマウスおよび対照マウスに高脂肪食を与え、2型糖尿病・MetSモデルを作製したところ、メガリンKOマウスでは腎障害が軽減すること、すなわちそれらの腎障害にはメガリンの存在が寄与することを明らかにし、その発症機序の詳細を検討した。(斉藤、佐藤、飯野)4)2型糖尿病やMetSにおいては血液中のエンドトキシン(LPS)が増加するが、LPSが培養PTCにおいて、TNFαの発現誘導を介してメガリンの発現を抑制することを見出した。(斉藤、佐藤)5)培養PTCにAngiotensin converting enzyme(ACE)を発現させた細胞を樹立し、アンジオテンシノゲンがプロレニン存在下で培養PTCに取り込まれ、アンジオテンシンIIにまで変換される過程をアッセイする系を作成した。(斉藤、佐藤)1)近位尿細管上皮細胞(PTC)由来の培養細胞系を用いて、アルブミンのトランスサイトーシスに関係する受容体FcRnの遺伝子導入細胞を作製した。その細胞を用いてアルブミンの処理についてin vitroでの解析を行った。(斉藤、竹田)2)2型糖尿病・メタボリックシンドローム(MetS)モデルであるOLETFラットに対して、摂取カロリー制限を行うことによる腎病変(慢性腎臓病)の予防効果を検討した。DNAマイクロアレイを用いてそれらの群の腎臓内の遺伝子発現の違いを検討し、OLETFラットの腎障害の発症に寄与する遺伝子の候補群についてウエスタンブロット、免疫組織化学法を用いた解析を行った。(斉藤、佐藤、飯野)3)腎特異的メガリンKOマウスおよび対照マウスに高脂肪食を与え、2型糖尿病・MetSモデルを作製したところ、メガリンKOマウスでは腎障害が軽減すること、すなわちそれらの腎障害にはメガリンの存在が寄与することを明らかにした。

さらに、その発症機序においてエンドサイトーシス系とオートファジー系の異常が関連すること、すなわちautolysosomeの異常が起こることを見出した。(斉藤、佐藤、飯野)4)2型糖尿病やMetSにおいては血液中のエンドトキシン(LPS)が増加するが、LPSが培養PTCにおいて、TNFαの発現誘導を介してメガリンの発現を抑制すること、さらにその下流はERK1/2経路が関係することを見出した。(斉藤、佐藤)5)培養PTCにangiotensin converting enzyme (ACE)を発現させた細胞を樹立し、アンジオテンシノゲンがプロレニン存在下で培養PTCに取り込まれ、アンジオテンシンIIにまで変換される過程をアッセイする系を作成し、取り込み実験を開始した。(斉藤、佐藤)メガリンは近位尿細管に発現し、糸球体濾過タンパク質を再吸収するエンドサイトーシス受容体である。1)ヒト尿中メガリン測定系を確立し、糖尿病性腎症の早期発見・重症度判定および心腎連関リスクに関する新しいバイオマーカーになりうることを示した(Diabetes Care2012)。さらに急性腎障害患者にも新たな測定意義を見出し、特許を出願した(斉藤、佐藤、飯野、竹田)2)肝臓で産生されたアンジオテンシノゲンが腎臓におけるレニン-アンジオテンシン系の活性化(アンジオテンシンIIの産生)に関わることを明らかにした。さらに糸球体を濾過したアンジオテンシノゲンは近位尿細管においてメガリンを介して取り込まれることを示した(JASN2012)。さらにメガリンがどのようにしてアンジオテンシンIIの産生に関わるかについて研究を進めた。(斉藤)3)2型糖尿病やMetSにおいては血液中のエンドトキシン(LPS)が増加するが、LPSが培養PTCにおいて、TNFαの発現誘導を介してメガリンの発現を抑制すること、さらにその下流はERK1/2経路が関係することを見出した(BBRC2011)。(斉藤、佐藤)4)メタボリックシンドロームモデルであるOLETFラットにおいて、ケモカインのMCP-1の発現とその受容体であるCCR2が近位尿細管で増強することを明らかにした。(斉藤、佐藤、飯野)5)腎特異的メガリンKOマウスおよび対照マウスに高脂肪食を与え、2型糖尿病モデルを作製したところ、メガリンKOマウスでは腎障害(近位尿細管および糸球体障害)が軽減すること、すなわちそれらの腎障害にはメガリンの存在が寄与することを明らかにした。(斉藤、佐藤、飯野)6)高効率の新しい腎特異的メガリンKOマウスの作製に成功した。(斉藤、佐藤)
バイオミメティック環境浄化触媒の開発とクリーン物質変換反応

ビタミンB12依存性酵素のCo(I)種は超求核性を有し、様々な有機塩素化合物と反応しコバルト-炭素結合を有する有機金属錯体を与える。その結合は可視光により容易に開裂するため、コバルト錯体を利用した高効率な脱ハロゲン化触媒プロセスを構築することが期待できる。本研究では、脱ハロゲン化反応を行うビタミンB12酵素に着目し、その機能モデル錯体と酸化チタンを複合したハイブリッド触媒を作成し、有機ハロゲン化合物のクリーンで高効率な分解プロセスを開発した。具体的には、酸化チタンの表面にビタミンB12錯体を固定化したハイブリッド触媒を作製し、光駆動型脱塩素化反応を開発した。さらに本性質を利用し、有機ハロゲン化物を基質としたユニークなラジカル型有機合成反応(Ph基転位反応)の開発にも成功した。本反応の選択性は溶媒の水素ラジカル供与性に依存し、水素ラジカル供与能に低いベンゾニトリル中では選択的に目的とするPh基転位体が得られた。これらの反応は、酸化チタン伝導帯の励起電子の還元力を利用しビタミンB12のCo(I)種を生成させ、基質となる有機塩素化合物との求核反応によりアルキル錯体が中間体として生じ、続いてアルキル錯体のコバルト-炭素結合の光開裂により触媒であるCo(II)錯体が再生すると推定される。そこで酸化チタン上での本ハイブリッド触媒の反応機構を明らかにするために、ESRにより詳細に解析したところ、酸化チタン上に固定化したビタミンB12のCo(II)種に由来する信号が観測された(g=2.31,2.00,A=109G)。そこに光照射すると、Co(II)種に由来する信号が減少し、また光照射を止め空気にさらすと、再び元のCo(II)種の信号が観測された。以上の変化はESRサイレントなCo(I)種の生成を示しており、酸化チタンへの光照射により触媒活性なCo(I)種が生成していることを示唆している。トリハロメタン、テトラクロロエチレン等に代表される有機塩素化合物は、分解され難く自然界に長く滞在・蓄積されるため、深刻な環境汚染物質として問題視され、効率の良い除去・分解法の開発が望まれている。本研究では、自然界で脱塩素化反応を行うビタミンB12酵素に着目し、その機能モデル錯体を用いて有機塩素化合物の超高効率分解プロセスの開発を目指した。触媒としては、天然の脱塩素化触媒であるビタミンB12酵素をモデル化した疎水性ビタミンB12錯体を合成した。疎水性ビタミンB12錯体は天然のビタミンB12酵素の構造、物理化学的性質を忠実に再現しており、天然酵素と同様の高い触媒活性が発現する事が期待できる。また従来は錯体の活性化法として電気化学的手法を用いていたが、本研究ではよりクリーンで簡便な活性化法として、光増感剤(ルテニウム錯体)を利用した。使用した光増感剤は、可視光に応答して高い還元作用を示すため、光増感剤による光還元反応では、高価な電気化学装置や高濃度の支持電解質が不要であり、環境低負荷で省エネルギー型のクリーンなシステムの構築が期待出来る。実際に、環境汚染物質であるDDTの脱塩素化反応を行ったところ、3時間の反応で効率よく脱塩素化が進行することが明らかとなった。本反応は、暗所(光照射なし)や光増感剤なしでは進行せず、ねらい通り光駆動型の電子移動反応により疎水性ビタミンB12錯体が触媒活性化され、進行することが明らかとなった。
βカテニン遺伝子変異ラット大腸粘膜細胞巣の腫瘍顕在化に関する分子病理学的研究

β-カテニン蓄積変異巣(BCAC)は、ラット大腸発癌モデルを用いた化学予防物質の検索において有用なバイオマーカーであるが、BCACの検出は組織標本作製を要するため、煩雑である。今回、これらの問題点を解消すべく、腫瘍性病変でのムチン、ムコ蛋白質の変化に注目して、High-iron diamine alcian blue (HID+AB) pH2.5染色およびAB pH1.0単独染色を用いて検討した。HID+AB pH2.5染色による陰性病変巣は、従来の方法にて検出したBCACと同一病変巣を従来利用されている大腸変異陰窩病巣(aberrant crypt foci)よりも有意に含まれており、特に4個以上のcryptからなるHID+AB pH2.5染色陰性病変巣とBCACとの一致率は高かった。従って、4個以上のcryptからなる陰性病変巣がBCACの代用となりうると思われた。しかしながら、HID+AB pH2.5染色は大腸近位側におけるBCACの検出が解剖学的特徴及びHID+AB pH2.5染色の染色性の面から困難であり、HID+A pH2.B染色同様にスルホムチン及びシアロムチンを同時に短時間に染出すことが可能なAB pH1.0単独染色を試み、HID+AB染色に比較し、より容易に陰性巣を検出しえ、また近位側における陰性巣も、検出が可能であることが分かった。HID+AB pH2.5染色及びAB pH 1.0染色は、BCACを含む前癌病変を容易に検出できる簡便な染色法であることが示唆された。今後、これらムチンの変化する病変とBCAC及び従来の前癌病変として利用されているaberrant crypt foci (ACF)との相互関係の検索が必要である。研究は雄F344ラットにazoxymethaneの皮下注射により、大腸に比較的特異的に大腸腫瘍を形成できる大腸発癌モデルを使用して、大腸腫瘍を作成している途中である。経時的な屠殺により、それら腫瘍の前癌病変と考えられている従来からの大腸陰窩変異巣(aberrant cryptfoci ; ACF)と新規提唱されたβカテニン遺伝子変異巣(β-cantenin-accumulated crypt ; BCAC)を比較検討を行っている。がん予防物質候補であるシクロオキシゲナーゼー2(COX-2)の特異的抑制剤であるCelecoxib投与により、ACFは検索した大腸粘膜面積あたり陽性対照群で9.33土4.82に対してCelecoxib500ppm投与群で7.37±3.36(21%抑制)および1500ppm投与群で6.20士3.98(34%抑制)であった。一方BCACはそれぞれ4.77±1.55に対し、2.51±1.88(47%抑制)、1.45±1.25(70%抑制)であり、ACFの抑制率よりも有意に減少を認める結果を得、従来の前癌病変であるACFの抑制効果以上にBCACの抑制効果を示しており、このBCACがより前癌病変としてのパイオマーカーとなりうる可能性を示した。現在、前癌病変であるBCACを未処理の大腸粘膜から特定し得ないため、ホルマリン固定したパラフィン材料からのマイクロディセクション法での高率な抽出を試みている。また、未処理の大腸粘膜から特定方法の検討も始めている。研究は雄F344ラットにazoxymethaneの皮下注射により誘導されるβカテニン蓄積変異巣(beta-catenin-accumulated crypt ; BCAC)の前癌病変としての意義について、大腸がんのプロモーション作用を有する胆汁酸のひとつであるコール酸を利用して検討した。従来からの云われている前癌病変である変異陰窩巣(aberrant crypt foci ; ACF)との比較検討を行った。

0.5%コール酸混餌投与により、ACFの頻度は大腸全体で65.1±23.1と対照群(194.9±23.2)に対し、有意に減少し、大きさも減少した。しかし、BCACは逆に対照群が2.21±0.99(単位面積あたり)に対し、2.60±1.05と増加傾向を認め、大きさも増大した。特に異常陰窩を6個以上集合する大きなBCACは有意に増加を示した。この結果はコール酸が大腸腫瘍発生の増加作用が示されていることから、ACFよりもBCACが大腸腫瘍形成に対するバイオマーカーとして意義か有ることを示唆している。現在、このBCACの病変から大腸腫瘍顕在化に関わる遺伝子の同定をmRNAレベルでの発現の違いを見ることで、検討しているが、mRNAレベルでの有意な差を示す遺伝子群は残念ながら、見つかっていない。その大きな原因の一つはACF及びBCACが顕微鏡サイズの大きさであるために、充分な量のmRNAの収集が困難であるためと考えている。今後の収集の効率化と方法論の改善をする予定である。β-カテニン蓄積変異巣(BCAC)は、ラット大腸発癌モデルを用いた化学予防物質の検索において有用なバイオマーカーであるが、BCACの検出は組織標本作製を要するため、煩雑である。今回、これらの問題点を解消すべく、腫瘍性病変でのムチン、ムコ蛋白質の変化に注目して、High-iron diamine alcian blue(HID+AB) pH2.5染色およびAB pH1.0単独染色を用いて検討した。HID+AB pH2.5染色による陰性病変巣は、従来の方法にて検出したBCACと同一病変巣を従来利用されている大腸変異陰窩病巣(aberrant crypt foci)よりも有意に含まれており、特に4個以上のcryptからなるHID+AB pH2.5染色陰性病変巣とBCACとの一致率は高かった。従って、4個以上のcryptからなる陰性病変巣がBCACの代用となりうると思われた。しかしながら、HID+AB pH2.5染色は大腸近位側におけるBCACの検出が解剖学的特徴及びHID+AB pH2.5染色の染色性の面から困難であり、HID+A pH2.B染色同様にスルホムチン及びシアロムチンを同時に短時間に染出すことが可能なAB pH1.0単独染色を試み、HID+AB染色に比較し、より容易に陰性巣を検出しえ、また近位側における陰性巣も検出が可能であることが分かった。HID+AB pH2.5染色及びAB pH 1.0染色は、BCACを含む前癌病変を容易に検出できる簡便な染色法であることが示唆された。今後、これらムチンの変化する病変とBCAC及び従来の前癌病変として利用されているaberrant crypt foci (ACF)との相互関係の検索が必要である。
多核子移行反応による陽子過剰核の研究

この研究は陽子過剰核の構造を調べることを目的としている。陽子過剰核の構造の情報は天体内における陽子吸収過程(rp-process)による元素合成の説明に必要である。陽子過剰核を生成するには標的である安定核に陽子を付加するか、中性子を引き抜く核反応を行い、その終状態を調べるという手法をとる。この陽子、中性子の移行数もできるだけ多いことが望ましい。そのような反応は断面積が小さいために反応粒子識別能力を高めた検出器の開発が必要である。この研究はそのような反応実験に必要な検出器開発をおこなった。この検出器は表題の目的以外にガンマ線検出にも有用であるので、新しいガンマ線検出器に利用できるかどうかもあわせて検討した。昨年度の科研費では、大きさが約30mm×30mm×200mmのBSO結晶(ビスマス、シリコン、酸素を含む結晶)を作った。この大きさのBSO結晶は世界最大である。これを多数組合わせれば全方向を覆うガンマ線検出器になることを意識し、その場合の一部にもなるようにしていた。これに本年度の科研費で購入した光電子増倍管を結合して検出器として組み立てた。これに電子シンクロトロン加速器からの電子ビームを照射する実験を行い、エネルギー分解能を調べた。その結果、6%の分解能を得たが、これは1本のシンチレータで予想されたとおりの分解能である。このBSO結晶に比べて、ヨウ化セシウム結晶のシンチレータはより低エネルギー領域に、タングステン鉛酸結晶(PWO結晶と略称)はより高いエネルギー領域に向いている。これら2種類の結晶の特性についても加速器からの電子ビームを用いて性能確認の実験を行った。今年度は新しいガンマ線検出器の基礎研究に重点を置いている。将来的に全方向(4π)を覆う新しいガンマ線検出器に利用できるかどうかを検討する。ビスマス、シリコン、酸素を含むBSOクリスタルは、ガンマ線のシンチレーターとしてすでに活用されているビスマス、ゲルマニウム、酸素を含むBGOクリスタル等に比べて、崩壊定数が100ナノ秒以下の短さであるという利点がある。これは時間分解能のよい信号が得られることを意味し、高速計数に有利である。この様な利点を持ちながら、光量はBGOクリスタルと比べてそれほど少なくない。さらに将来的には、ゲルマニウム半導体よりシリコン半導体が普及したように、BSOクリスタルがBGOクリスタルよりもずっと安価となる可能性があり、大量のクリスタルを使う全方向を覆うガンマ線検出器として有望である。この研究では、実際に使用する大きさ(約30mmx30mmx200mm)のBSOクリスタルを1個だけ作った。これを多数組合わせれば全方向を覆うガンマ線検出器になりうる。この大きさのBSOクリスタルは世界で初めてである。これに光電子増倍管を結合し、放射線源を使っての信号テストを行うための準備が進行中である。この結果をみて加速器のマシンタイムを申請し、ビームを使ったテストを行い、エネルギー分解能や位置分解能を調べる予定である。更に、薄いプラスチックシンチレータを前面に張ることによって、一本の検出器で、粒子識別が可能かどうかを調べる。

この検出器は表題の目的以外にガンマ線検出にも有用であるので、新しいガンマ線検出器に利用できるかどうかもあわせて検討した。昨年度の科研費では、大きさが約30mmx30mmx200mmのBSO結晶(ビスマス、シリコン、酸素を含む結晶)を作った。この大きさのBSO結晶は世界最大である。これを多数組合わせれば全方向を覆うガンマ線検出器になることを意識し、その場合の一部にもなるようにしていた。これに本年度の科研費で購入した光電子増倍管を結合して検出器として組み立てた。これに電子シンクロトロン加速器からの電子ビームを照射する実験を行い、エネルギー分解能を調べた。その結果、6%の分解能を得たが、これは1本のシンチレータで予想されたとおりの分解能である。このBSO結晶に比べて、ヨウ化セシウム結晶のシンチレータはより低エネルギー領域に、タングステン鉛酸結晶(PWO結晶と略称)はより高いエネルギー領域に向いている。これら2種類の結晶の特性についても加速器からの電子ビームを用いて性能認識の実験を行った。
スタチンの血管内皮増殖因子(VEGF)合成の促進による顎骨欠損部の再生

1.スタチンによる骨形成促進機能をin vivoで解析する前段階として以下の3つの実験を行こった。(1)マウス骨髄由来の細胞株であるST2細胞を用いて、in vitroにて解析した。ST2細胞は、培養条件において骨芽細胞・脂肪細胞、あるいは筋芽細胞に分化する性質を持っている。この性質を利用してスタチンが、骨芽細胞分化を促進することを確認し、さらには、脂肪分化への抑制を行う事を確認した。この結果では、特に骨芽細胞分化への促進機構において、VEGFの発現が明らかに関与していることが分かった。(2)マウス線維芽細胞株である3T3-L1細胞は、脂肪細胞へと分化するが、この脂肪分化機構を、詳細に解析を行った。結果、スタチンの脂肪分化抑制機構は、Leptinの遺伝子発現抑制を伴い、起こっていることが判明した。しかし、この過程においてはVEGFの関与を示唆する確証が得られなかった。(3)さらに、マウス胚由来の前駆軟骨細胞であるATDC5細胞株を用いて、スタチンによる軟骨分化への影響を調べた。しかし、スタチンは軟骨分化には影響をほとんど与えなかった。また、この過程においてもVEGFが関与しているという有力な確証が得られなかった。これらの結果から、スタチンには明らかに、脂肪分化を抑制し、骨分化を促進するという能力を備えていることがわかり、骨分化促進能にのみVEGFが関与していることが明らかとなった。2.OVXラットを用いてin vivoでスタチンによる骨形成促進作用の解析を行った。スタチンをラットの顎骨に局所応用すると、BMP-2,オステオカルシン、およびVEGFの遺伝子発現の促進が確認できた。しかし、有意な骨密度上昇までは確認できなかった。現在、この原因を検索し、成果を発表する準備を行っている。スタチンは骨芽細胞に対して、有意な分化促進と石灰化促進作用を有する事がわかっている。また、in vitroにおいて骨芽細胞の分化促進の一つには、VEGF遺伝子発現促進が関係していることが示唆される。一方、スタチンを単独で、ラットの腹腔内に投与しても、骨密度には変化のないことがわかった。これらの事から、スタチンの骨形成作用をin vivoで十分に発揮させるためには、(1)何らかの骨形成(骨吸収抑制)作用を持つ薬剤との併用、あるいは、(2)局所への直接投与のいずれかが必要であると考えられる。(1)の検索を行うために、エストロゲンとSERMの一つであるラロキシフェンが骨やその他の臓器に対して起こす、VEGF遺伝子発現と蛋白質の発現の変化について詳しく解析を行った。その結果ラロキシフェンは血中のVEGF濃度を上昇させることは無かったが、骨に対しては、エストロゲンと同様に、有意なVEGF遺伝子発現効果を示した。よって、ラロキシフェンとの併用で、全身応用でも、スタチンが骨形成作用を表す可能性があることがわかった。(2)スタチンの局所応用を行うために、in vitroで骨芽細胞以外の細胞に対するスタチンの作用について検索を行った。ST2細胞は脂肪細胞や骨などに分化するが、スタチンは、脂肪細胞への分化を抑制し、骨芽細胞への分化を促進した。同様に脂肪に分化する3T3-L1細胞でも、スタチンは分化の抑制を行う事がわかった。また、軟骨に分化するATDC5細胞においては、スタチンは分化の抑制をする一方で、石灰化の促進作用(分化促進)がある可能性が判明した。上記の事象について、現在、学術論文等への報告準備を行っている。
層別ネスティッド・ケース・コントロール研究における解析方法の開発

ネスティッド・ケース・コントロール研究は、既に対象集団が定義されているコホート研究において、ケース(興味があるイベントを発症した対象者)を同定し、その発症時期に一致させて、その時期のリスク集合からコントロールを選ぶデザインである.その中でも、発症時期のリスク集合の中で指定されたマッチング変数の水準がケースと同じ集団からランダム抽出するデザインである層別ネスティッド・ケース・コントロール研究が提案され、近年がん疫学研究などへの応用例がみられている.層別ネスティッド・ケース・コントロール研究では、コホート研究全体を用いた場合に比ベハザード比の推定精度が低くなることは避けられない.そこで、コホート研究全体を解析した場合の精度により近い推定量を得ることが期待される.本研究では、層別ネスティッド・ケース・コントロール研究における解析方法の開発を目的として、既存の方法よりも推定精度が高くなるハザード比と絶対リスクの推定方法に関する調査を進めている.平成20年度は、層別ネスティッド・ケース・コントロール研究における絶対リスクを推定する方法を検討し、これをまずコホート研究全体のデータに当てはめ、その結果を学術雑誌に報告した.今後は,実際の層別ネスティッド・ケース・コントロール研究への応用とハザード比の推定方法に関する調査を継続する予定である.ネスティッド・ケース・コントロール研究は、既に対象集団が定義されているコホート研究において、ケース(興味があるイベントを発症した対象者)を同定し、その発症時期に一致させて、その時期のリスク集合からコントロールを選ぶデザインである.その中でも、発症時期のリスク集合の中で指定されたマッチング変数の水準がケースと同じ集団からランダム抽出するデザインである層別ネスティッド・ケース・コントロール研究が提案され、近年がん疫学研究などへの応用例がみられている.層別ネスティッド・ケース・コントロール研究では、コホート研究全体を用いた場合に比ベハザード比の推定精度が低くなることは避けられない.そこで、コホート研究全体を解析した場合の精度により近い推定量を得ることが期待される.本研究では、層別ネスティッド・ケース・コントロール研究における解析方法の開発を目的として、既存の方法よりも推定精度が高くなるハザード比と絶対リスクの推定方法に関する調査を進めた.まず、層別ネスティッド・ケース・コントロール研究における絶対リスクを推定する方法を検討し、これをまずコホート研究全体のデータに当てはめ、その結果を学術雑誌に報告した.次に,実際の層別ネスティッド・ケース・コントロール研究への応用とハザード比の推定方法に関する調査し,学術雑誌への投稿まで行った.