hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神科領域における科学的な医療安全に関する研究

精神医療における医療安全のトピックとして、見直しを迫られている身体拘束、有効性と新型機器の導入から再び脚光を浴びている電気けいれん療法、精神科救急患者のホメオスターシスの崩れが挙げられる。本研究は、それらについて症例対照研究デザイン等を用いて科学的な検証を行い、身体拘束ストレスと薬剤性肝障害、電気けいれん療法と自律神経系変化、急性精神病状態の異常な生理学的変化について明らかにし、入院医療の安全性向上を追求した。目的:拘束ストレスによる生体異物惹起の肝障害の増悪が動物モデルで示唆されているため、身体拘束と薬剤性肝障害との関連性を検討する症例対照研究を実施した。方法:2003年1月2006年12,月までの4年間に順天堂大学医学部附属順天堂医院メンタルクリニック病棟に入院した全患者について、身体拘束を受けた患者(拘束群)106名と受けなかった(非拘束群)528名との問の薬剤性肝障害の発生頻度や臨床的な特徴を後ろ向きに比較した。なお、研究実施について所属機関倫理委員会の承認を得た。結果:拘束群と非拘束群との問に入院時の医学的状態の差異は認められなかったが、薬剤性肝障害の発生頻度は、拘束群が非拘束群より有意に高かった(8.5%vs.1.9%,オッズ比4.81,p=0.0016)。投与薬剤数について2群問に差は認められなかった。抗精神病薬投与を受けた割合は拘束群の方が大きかったが、抗うつ薬投与を受けた割合は非拘束群の方が大きかった。考察:後ろ向きデザインという方法論的限界はあるが、本研究結果は、身体拘束が薬剤性肝障害の危険因子となる可能性を示唆している。本結果の意義は、自傷・他害の防止などに身体拘束を実施する場合も最小限にとどめる必要があることを、科学的に裏付けた点である。ただし、前向き研究による検証が必要である。目的:救急・急性期医療における安全性向上のために、電気痙攣療法(ECT)の効果と安全性に関する前向き症例対照研究、および急性精神病状態の患者の生理学的異常に関する検討を行った。方法:ECT研究については、順天堂医院にてECTを受ける患者のうち研究へのICを得られた患者を対象とし、ECT効果、せん妄および呼吸循環系副作用の発生の有無、尿中カテコールアミン(ECT 1,4,7,10回目に測定)などを検討した。生理学的異常の検討についてはsympathetic, creatine-phosphokinase, hypokalemia, QT-interval, leukocytosis, dehydrationなどのキーワードを基に文献レビューした。結果:全体(n=30)では一定の傾向を見出すことはできなかったが、気分障害(n=12)では、ECT終了1週間後のドーパミンがECT前に比べて上昇する患者の方がHAM-Dを指標にした改善率は高く(p=0.040)、ECTを2回終了した後の尿中ノルアドレナリン(NA)の変化率(ECT中の値/ECT前の値)が0.9以上の患者の方が最終的なうつ病の改善率は高かった(p=0.0044)。一方、研究期間中、重篤な副作用は発生しなかった。生理学的異常の検討では、上記キーワードで検索された1,309の文献を検討した。考察:ECT研究の結果は、抗うつ作用におけるNA関与に関連する可能性があり、尿中NAの測定により、ECTの効果を予測できる可能性を示唆する。ただし、多数例での検証を要する。急性精神病状態の患者の生理学的異常は、脱水や交感神経系の過剰な活動亢進を背景にした高CK血症、低K血症とそれに伴うQT延長などの所見を主に比較的高頻度であり、薬物療法における副作用出現を助長させる危険性があるため、十分な配慮を要する.
バイオエレクトロ法を組み込んだ単一槽型硝化・脱窒同時処理装置の開発

1.生物膜電極法による硝化と脱窒の各過程に対する電流密度及び液本体DO濃度条件の影響について実験的検討を行った.単位電極面積当りの硝化速度及び脱窒速度はともに,電流密度の増大とともに大きくなった.通電の硝化速度向上効果は,低液本体DO濃度条件下で大きく,液本体DO濃度が1mg/L以下でも,通電のない高液本体DO濃度条件に匹敵する硝化速度に維持することが可能であった.一方,脱窒は,液本体DO濃度が3mg/L以上でも電解生成水素を利用して進行し,液本体が無酸素環境にある場合の約50%程度の速度を保つことが可能であった.2.一対の生物膜電極を陽極及び陰極として用い,連続硝化・脱窒処理実験を行ったところ,液本体DO濃度によらず,無通電系に比べて通電系では,亜硝酸性窒素の蓄積がない安定した硝化と脱窒が単一槽内で同時的に進行し,処理水のTN濃度は減少した.低液本体DO濃度条件下でも陽極での電解生成酸素が生物膜内で利用されることにより,硝化が安定して進行した.液本体DO濃度の増大に伴い,硝化速度は増大するが,陰極での脱窒に対する水素利用率は低下した.3.充填層型生物膜電極を嫌気-好気生物ろ床法の好気槽に浸漬し,実下水を用いて連続処理実験を行った結果,無通電の対照系に比べTN除去率が向上し,本法の適用性が示された.また,2mg/L程度の液本体DO濃度がTN除去に対して効果的であった.4.硝化と脱窒に対する生物膜反応モデルを構築して反応速度解析を行い,陽極の硝化細菌生物膜内が全域に渡って好気環境となるように液本体DOと電流密度条件を操作すると,効果的に硝化速度を増大でき,陰極の脱窒細菌生物膜では,液本体DO濃度が3mg/L程度までであれば膜内での生物学的酸素消費により深部が無酸素環境に保たれて,高水素利用率で脱窒処理が行えることが理論的に示された.1.生物膜電極法による硝化と脱窒の各過程に対する電流密度及び液本体DO濃度条件の影響について実験的検討を行った.単位電極面積当りの硝化速度及び脱窒速度はともに,電流密度の増大とともに大きくなった.通電の硝化速度向上効果は,低液本体DO濃度条件下で大きく,液本体DO濃度が1mg/L以下でも,通電のない高液本体DO濃度条件に匹敵する硝化速度に維持することが可能であった.一方,脱窒は,液本体DO濃度が3mg/L以上でも電解生成水素を利用して進行し,液本体が無酸素環境にある場合の約50%程度の速度を保つことが可能であった.2.一対の生物膜電極を陽極及び陰極として用い,連続硝化・脱窒処理実験を行ったところ,液本体DO濃度によらず,無通電系に比べて通電系では,亜硝酸性窒素の蓄積がない安定した硝化と脱窒が単一槽内で同時的に進行し,処理水のTN濃度は減少した.低液本体DO濃度条件下でも陽極での電解生成酸素が生物膜内で利用されることにより,硝化が安定して進行した.液本体DO濃度の増大に伴い,硝化速度は増大するが,陰極での脱窒に対する水素利用率は低下した.3.充填層型生物膜電極を嫌気-好気生物ろ床法の好気槽に浸漬し,実下水を用いて連続処理実験を行った結果,無通電の対照系に比べTN除去率が向上し,本法の適用性が示された.また,2mg/L程度の液本体DO濃度がTN除去に対して効果的であった.4.硝化と脱窒に対する生物膜反応モデルを構築して反応速度解析を行い,陽極の硝化細菌生物膜内が全域に渡って好気環境となるように液本体DOと電流密度条件を操作すると,効果的に硝化速度を増大でき,陰極の脱窒細菌生物膜では,液本体DO濃度が3mg/L程度までであれば膜内での生物学的酸素消費により深部が無酸素環境に保たれて,高水素利用率で脱窒処理が行えることが理論的に示された.下水処理場の活性汚泥を種汚泥として脱窒細菌及び硝化細菌群の混合培養をそれぞれ行い,生物濃度が300400mg-VSS/L程度に維持されるように培養槽を維持操作した.電極として陽極材に酸素発生過電圧の小さなメッシュ状不溶性金属,陰極として,グラファイトを選定し,被処理水を模擬したアンモニア性窒素含有人工廃水を用いて本系での水素および酸素生成効率の検討をしたところ,電流密度0.050.3mA/cm^2の範囲で水素生成電流効率は約80%,酸素生成電流効率も80%程度であることがわかった.電極材への生物付着性を考慮し,これらの電極材表面を任意の厚さのウレタンフォームで覆い,上記培養槽に浸漬して作製した脱窒細菌固定化電極および硝化細菌固定化電極のそれぞれを生物固定のない対極とともに反応槽に設置して,通電による硝化及び脱窒の各過程の進行に及ぼす電流条件及び液本体溶存酸素濃度の影響について回分実験を行った.硝化過程に対し,液本体溶存酸素濃度の大きな条件では,通電に伴う酸素生成による硝化反応への寄与は小さく,液本体溶存酸素濃度の低下とともに電解生成酸素による硝化反応への寄与が顕著となった.通電条件下で硝化を進行させた場合,アンモニア性窒素濃度が大きく減少していないにも関わらず,時間の経過とともに反応速度が低下する傾向が見られた.この原因については,今後検討が必要であるが,陽極近傍での水素イオン濃度等の変化による硝化活性への影響が一因として推察された.

一方,脱窒過程では,硝化過程に比べて液本体溶存酸素濃度の影響は顕著ではなかった.これは,陰極生成水素の一部が酸素消費に利用されていることや液本体側から拡散してくる酸素が,生物膜表面近傍の脱窒細菌により消費されることにより,生物膜内の電極近傍では,無酸素的環境が形成・維持されているためと推察された.1.生物支持体を設置した不溶性金属電極を用いた硝化細菌生物膜電極を陽極とし,所定の液本体DO濃度及び電流密度に制御した条件下で回分硝化実験を行った。同一電流密度条件では,単位陽極面積当たりの硝化速度は,液本体DO濃度の増大につれてほぼ直線的に増大し,通電による硝化促進効果は,DO濃度が小さい条件程大きくなる傾向が得られた.一方,同一液本体DO濃度では,電流密度の増大に伴い,硝化速度は増大したが,0.2mA/cm^2以上ではその効果は低減した.また,液本体DO濃度1mg/Lでも通電により,液本体DO濃度3mg/L条件程度の速度を得ることが可能であった.2.上記と同様に作製した脱膣細菌生物膜電極を用い,硝化実験と同様な操作条件下で脱窒を行った場合,同一電流密度条件では,単位陰極面積当たりの脱窒速度は,液本体DO濃度の増大につれて低下したが,DO濃度3mg/Lでも無酸素条件の70%であった.これは,生物膜内が表面近傍の細菌による酸素消費で低酸素条件が維持されており,電解生成水素による脱窒が液本体DOの影響を受けにくくなるためであると考えられた.一方,電流密度の増大につれて,脱窒速度は,比例的に増大し,生成水素の脱窒に対する利用率は,条件によらず安定して5060%であった.3.上述の検討から,液本体DO濃度13mg/Lで操作した場合,面積基準硝化速度は,脱窒速度の約1/3程度であるため,これを補完する陽・陰極面積比を有する同時処理反応槽を試作した.現在,硝化及び脱窒細菌生物膜電極の培養・馴致段階であり,次年度では種々の操作条件下で硝化・脱窒同時処理特性を明らかにする予定である.4.人工排水による電解実験から,酸素・水素生成電流効率は,00.3mA/cm^2の範囲内でそれぞれ2885%及び3550%程度であるとともに,通電に伴うアンモニア性窒素の電気化学的酸化等は起こっていないことが確認された.1.単位電極面積当りの処理特性を検討するために,一対の生物膜電極を槽内に浸漬して連続硝化・脱窒処理実験を行ったところ,液本体DO濃度が1mg/Lの条件下において,無通電系に比べて通電系は,亜硝酸性窒素の蓄積がない安定した硝化と脱窒が単一槽内で同時的に進行した.また,液本体DO濃度を0.2mg/L以下にしても,電解で生成する酸素を利用することにより硝化が進行した.液本体溶存酸素濃度が1mg/L程度以下の場合,硝化で生成した硝酸性窒素は,電流密度の増大に対応した処理速度で脱窒され,処理水のTN濃度は減少した.しかしながら,液本体溶存酸素濃度が5mg/L程度になると陰極から生成する水素の脱窒への利用率は,脱窒細菌生物膜に浸透する溶存酸素による脱窒活性の低下が顕著になること等により,大きく低下した.2.充填層型生物膜電極を嫌気-好気生物ろ床法の好気槽に浸漬し,実下水を用いて連続処理実験を行った結果,対照系に比べTN除去率が向上し,本法の適用性が示された.また,2mg/L程度の液本体DO濃度がTN除去に対して効果的であった.
プログラム可能なDNAナノデバイスの構築

1.DNAの分子反応(ハイブリダイゼーション)を利用して、分子やナノサイズの粒子をナノスケールの精度で特異的に配置するためのDNAナノ構造体を設計・作成した。このDNAナノ構造体は、各部に固有のアドレスを持つプログラム可能な構造体(DNAの非周期構造)であり、異なる塩基配列からなるDNAユニットを階層的に組み立てる(階層的アセンブリ)ことで、複雑な構造形成を可能にした。各階層における生成物は、ゲル電気泳動により分子量を測定し、階層が上がるにつれ構造体の分子量が大きくなることを確認した。また、第4階層後の構造体に金微粒子を特異的に配置して、原子間力顕微鏡(AFM)により画像化した。2.DNAタイル(5本のDNAから成るDNAの複合体ユニット)の自己組織化により、二次元構造体を形成した。タイル同士の結合部分を光ライゲーション反応により結合し、耐熱性のDNA構造体を作成した。従来の酵素によるライゲーションでは、構造体のニックの部分に酵素がアクセスできずライゲーション効率が非常に低いという問題があった。光ライゲーションによるDNA構造体のライゲーションはこの問題を克服した画期的な研究成果である。3.DNAタイルの並び方を決める情報を書き込んだDNAのルーラー分子を利用して、プログラマブルなDNA構造体形成を行った。一次元方向に非周期のアドレスを書き込むことに成功し、6×n個のアドレスを持つバーコード型構造体形成に成功した。今後は、二次元方向のアドレス化も行い、二次元構造体上にナノサイズの文字や絵を描く予定である。1-3の技術を利用し、今後は、耐熱性のプログラム可能なDNA構造体を実現する予定である。再加熱しても壊れないため、より複雑な構造体形成(例えば3次元積層化)が可能となる。また、この構造体をテンプレートとして様々な分子やナノ粒子を階層的に結合し、ナノサイズの集積回路の形成をすることも可能となるであろう。DNAの分子反応(ハイブリダイゼーション)を利用して、分子やナノサイズの粒子をナノスケールの精度で特異的に配置するためのDNAナノ構造体を設計・作成した。構造体を形成するDNAの配列は、23merの正規直交配列を連結して設計した。正規直交配列は、分子内二次構造を形成したり、ミスハイブリダイゼーションを起こしたりしないよう特別に設計された配列である。第1階層のA1-D1ユニットの形成に始まり、ハイブリダイゼーションとライゲーション反応を繰り返して構造体は階層的に組み上げられる。例えば、第3階層のA3ユニットは、第2階層のA2及びB2ユニットから形成される。第3階層以降では、新たに導入されるDNA一本鎖が高次構造を形成することを防ぐため、新たに導入されるDNAを23merの正規直交配列を用いて部分的に二本鎖化してから構造体の組み上げを行った。階層的に組み上げることで、各階層におけるDNAの分子反応がシンプルになり、少ないエラーで複雑な構造を組み立てることができる。また、ライゲーション反応で構造体の融解温度(Tm)を上げてから次の階層に持ち込むことで、前階層の構造体を壊すことなく次階層で再び温度を上げ、ハイブリダイゼーション反応を行うことができる。また、第4階層後のA4ユニットに金微粒子を特異的に配置して、原子間力顕微鏡(AFM)により画像化した。
ビタミンKによる肝癌細胞増殖抑制効果の分子機構の解明と臨床応用

我々はこれまでに、DCP陽性肝癌例に対するビタミンK投与により1)血清DCPが低下し2)PVTTの発生率が有意に減少し3)予後についても改善傾向をもたらすことを明らかにしてきた。本研究はこのような臨床的に観察されたVitamin K2の肝細胞癌門脈浸潤抑制・予後改善効果についての基礎的機構を検討することで、より効果的な肝癌治療法の開発と個々の患者に最適化した治療システムを構築することを目的とした。まずVitamin K2の生物学的特性を解析するために、in vitroで肝癌細胞にVitamin K2を添加したところ癌細胞の細胞周期がG1/G2期で停止した。その作用機序解明のために、Vitamin K2添加後の遺伝子発現プロファイルと50種をこえる転写因子の活性を検討することにより、Vitamin K2添加後の比較的早期にPKA活性があがることを同定した。逆にPKA活性の阻害剤を用いることでVitamin K2の細胞増殖抑制作用が打ち消されることから、Vitamin K2はPKAの活性をあげることにより癌細胞に対するその生物学的特性が発揮されている可能性が示唆された。さらにVitamin K2の直接の細胞内標的の探索として、pull-down法とmass-spectrometryを用いてVitamin K2に結合する細胞内蛋白の同定を試みたところ、VitmainK2は17hydroxysteroid dehydrogenaseと結合しその活性を修飾しestrogenの作用に影響を与えることが明らかとなった。今後これらの標的分子の活性状態を検討することでVitamin K2の薬効の予測、あるいは新たな発癌の化学予防法の開発につなげられる可能性が示された。我々はこれまで、肝癌227例のprospectiveな検討により、DCPは肝癌の門脈腫瘍塞栓(PVTT)の最も強力な予測因子である事をみいだした。そのうえで、DCP陽性肝癌例に対するビタミンK投与が1)血清DCPが低下し2)PVTTの発生率が有意に減少し3)予後についても改善傾向をもたらすことを明らかにしてきた。本研究は、このように臨床的に観察されたVitamin Kの門脈浸潤抑制・予後改善効果についての基礎的機構を検討することで、より効果的な肝癌治療法の開発と個々の患者に最適化した治療システムを構築することを目的としている。今年度はVitamin K2の生物学的特性を解析するために、まずin vitroで肝癌細胞に添加したところ癌細胞の細胞周期がG1/G2期で停止すること共に、浸潤能が抑制されることが確認された。その作用機序解明のために、Vitamin K2添加後の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイと、50種をこえる転写因子の活性を検討することにより、少なくともある一定の濃度ではVitamin K2はいくつかの転写因子の活性をあげると共に、様々な遺伝子の転写に影響を与えていることが判明した。これらの遺伝子活性化の根本的な原因として、Vitamin K2によって転写活性があがることが示されたCREB/USF/AP2の共通の活性化因子としてPKAがあることが知られていたため、Vitamin K2添加によるPKAの活性変化を検討したところ、Vitamin K2添加後2時間ほどの比較的早期にPKAの活性があがることが示され、Vitamin K2はPKAの活性をあげることにより生物学的特性が発揮されている可能性が示唆された。現在これらの機構のさらに詳しい解析をつづけており、解明された点から新たな発癌の化学予防法の開発につなげることを試みている。我々は、DCP陽性肝癌例に対するビタミンK投与により1)血清DCPが低下し2)門脈腫瘍塞栓の発生率が有意に減少し3)予後についても改善傾向をもたらすことを明らかにしてきた。

まずVitamin K2の生物学的特性を解析するために、in vitroで肝癌細胞にVitamin K2を添加したところ癌際網の細胞周期がG1/G2期で停止した。その作用機序解明のために、Vitamin K2添加後の遺伝子発現プロファイルと50種をこえる転写因子の活性を検討することにより、Vitamin K2添加後の比較的早期にPKA活性があがることを同定した。逆にPKA活性の阻害剤を用いることでVitamin K2の細胞増殖抑制作用が打ち消されることから、Vitamin K2はPKAの活性をあげることにより癌細胞に対するその生物学的特性が発揮されている可能性が示唆された。さらにVitamin K2の直接の細胞内標的の探索として、pull-down法とmass-spectrometryを用いてVitamin K2に結合する細胞内蛋白の同定を試みたところ、Vitamin K2は17hydroxysteroid dehydrogenaseと結合しその活性を修飾しestrogenの作用に影響を与えることが明らかとなった。今後これらの標的分子の活性状態を検討することでVitamin K2の薬効の予測、あるいは新たな発癌の化学予防法の開発につなげられる可能性が示された。
微分方程式の数値解法

区分的多項式(スプライン関数)を用いて特異点を持つ微分方程式の数値解法の比較検討をみた。カナダのマニトバ大学応用数学科ウスマニ教授・ドイツのドレスデン工科大学数学科シュミット教授との共同研究の結果いくつかの面白い結果を得た。本研究の結果、スプライン関数を用いた数値解法は“計算の手間と計算の複雑さ"の面から非常に優れていることが分かった。各分担者が、いろいろな研究機関に専門家を訪ね情報交換するとともに、開発した方法のプログラミング化を進めた。そしていくつかの例題をとうして使用上の問題点を詳しく分析した。その結果2、3の検討すべき点があきらかになった。(1)特異点の近くすなわち境界層の中では、解析的手法を併用すべきであるという結論になり、プログラムを変更した。(2)プログラムに組み込まれている特異点をもつ積分公式の改良が必要であることがわかった。これに関んしては、ウスマニ教授との共同研究の結果、極めて高精度の公式を開発した。その結果は、今年度の研究実績報告書にあげた3つの論文にまとめて投稿中である。(3)近似解を図示するための平面曲線の近似法をスプライン関数によるものに改めた。なおこの方法の誤差についてはBITに出版予定(印刷中)の酒井・ウスマニによる論文で解析ずみである。今後のの予定としては、プログラム化を完成の上、全国共同利用計算センタ-等に登録の上、いろいろの研究者に使用してもらい問題点の指摘をうけて一層の改良を進める予定である。
匂い環境適応における細胞接着分子OCAMの役割

我々は、匂い・フェロモン環境に応じてどのようにセルセンサー機能を変化(モーダルシフト)させ、引いては個体適応へと導くのかという問題の解明を目指している。本年度は特に、匂い環境適応におけるOCAMの役割、アデノウイルスベクターを用いた鋤鼻受容体のin vitro発現・フェロモン応答評価系の確立に関する解析を行い、以下の成果を得た。昨年度、OCAM遺伝子欠損マウスの脳切片を用いて種々の電気生理学的解析を行い、OCAM欠損マウスでは、嗅神経の興奮・伝播から神経伝達物質放出までのいずれかの段階で障害があることを明らかにした。そこで、嗅細胞自体の異常を詳細に解析するために、今年度はin vitroにおける嗅細胞の単独培養系、嗅細胞とその投射先である嗅球細胞との共培養系の確立を試み、詳細な解析に適した嗅細胞-嗅球細胞共培養系を得ることができた。この系を用いて電気生理、イメージングによる解析を行っている。鋤鼻受容体とフェロモンの対応関係を明らかにするために、ラット鋤鼻培養細胞に対し特定の鋤鼻受容体VIRb2遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを感染させ、Cre-loxP系を介してVIRb2を強制発現させた。強制発現の後、カルシウムイメージングで発現・応答の評価を行ったところ、投射先の副嗅球と共培養を行った場合にのみ、VIRb2のリガンドとして知られている2-heptanoneに対する選択的な応答が得られた。このin vitro発現・フェロモン応答評価系は、鋤鼻受容体とフェロモンとの対応関係を明らかにするためのツールとして有効である。本年度は特に、匂い環境適応におけるOCAMの役割、鋤鼻感覚細胞の機能発現制御機構について解析を行い、以下の成果を得た。嗅上皮ゾーン2-4の嗅細胞に発現している細胞接着分子OCAMの機能を明らかにするために、OCAM遺伝子欠損マウスの脳切片を用いて電気生理学的解析を行った。嗅神経の電気刺激によって誘発されるフィールド電位を嗅球の糸球体層から記録した。野生型の全域と変異型のOCAM陰性領域に比べ、変異型のOCAM陽性領域におけるシナプス応答が有意に低下していた。また、数発の低頻度刺激を5分間隔で与えたところ、野生型では5分間隔で十分な応答の回復が見られたのに対し、変異型では著しい応答の減衰が認められた。一方、ヘアパルス抑圧には差が認められなかった。従って、OCAMは嗅神経の興奮・伝播から神経伝達物質放出までのいずれかの段階で機能しているものと考えられる。培養鋤鼻器における鋤鼻受容体VR1,VR4の発現量は,副嗅球との共培養によって共培養714日目にかけて有意に上昇し,その後プラトーに達した。共培養鋤鼻器では,発現した受容体は本来あるべき部位に局在していた。また,受容体発現量の経時的な変化と一致して鋤鼻ニューロンが尿に対する応答性を獲得することが判明した。以上より,鋤鼻ニューロンの鋤鼻受容体発現と機能性獲得がその投射の標的である副嗅球ニューロンによって制御されることが明らかになった。
アスパラガスにおけるルチン生合成系の光環境応答機構の解明

アスパラガス冬季伏せ込み栽培における栽培中の光環境制御がルチンの生合成に及ぼす影響を検討するため、光環境を変えて栽培した若茎からRNAを抽出して得たcDNAについて、ルチン生合成系の遺伝子のクローンニングおよび発現解析を行った。その結果、配糖化酵素以外のすべての遺伝子についてリアルタイムPCR条件が確定できた。また、遺伝子発現解析を行った結果、グリーン(ルチン含有)とホワイト(ルチンなし)とで、FLS遺伝子の発現量にきわめて大きな差異があることを見いだした。またフラボノイド配糖化酵素についてはGTおよびRT遺伝子の部分配列を得ることができた。弘前大学のビニールハウスにて平成26年1月2月にかけてアスパラガスの伏せ込み栽培(グリーン、ホワイト)を光環境制御条件下(自然光区(対照区)、補光区(白色蛍光灯1,3本、24時間)、遮光条件(ホワイトアスパラ)で行いって若茎を収穫し、収穫直後の若茎の頂部表皮組織からゲノムDNAを抽出した。さらに同組織から全RNAを抽出後に逆転写を行い、cDNAを得た。ルチン生合成経路の酵素のうち、CHS, CHI, FLS, F3H, F3'H、さらに発現量の対照として用いるActinについて、北海道大学で遺伝子発現解析に用いるプライマーを設計し、上記のサンプルのゲノムDNAおよびcDNAを用いてPCRを行い、プライマーが発現解析に有効であるかを検討した。その結果、設計したプライマーでゲノムDNAおよびcDNAで明瞭なPCR反応物のバンドが検出されたことから、ほぼ問題なく発現解析が行えることが明らかとなった。さらに、ルチンを多く合成することが知られている紫アスパラ(Purple Passion)も用いて、フラボノイド合成系の遺伝子およびアクチンの全長クローニングを試みた。現在までにactinのシークエンス解析を完了した。部分配列のみが分かっていたCHS、F3'H、FLS、ANSについては3'RACEによりC末端側の配列の決定を行い、現在5'RACEを用いて全長シークエンスの解析を進行中である。またDFRについては部分配列を決定し、紫アスパラではUC157よりDFR発現量が高いという予備試験結果(半定量PCR)を得た。これまでに得られている配列において品種間の違いをみると、CHS、CHI、F3H、FLS、ANSでは2種に違いはほとんど無かったが、F3'HではUC157とパープルパッションで違いがあった。詳細な発現解析については、これまでの知見をもとに平成26年度に本格的に行う予定である。アスパラガス冬季伏せ込み栽培における栽培中の光環境制御がルチンの生合成に及ぼす影響を検討するため、光環境を変えて栽培したアスパラガスからRNAを抽出し、逆転写を行って得たcDNAをテンプレートに、ルチン生合成に関わるCHS, CHI, F3H, F3'H, FLS,さらにリファレンスに用いる予定のActin遺伝子についてプライマーの設計、PCR条件やリアルタイムPCRの条件の検討を行った。また、生合成系の最下流である配糖化酵素についてはこれまで同定例が少ないため、他作物で同定された配列を元にプライマーを設計し、クローンニングを試みた。また、Actinについては、発現量はグリーンの無補光区、補光区、さらにルチンが含まれないホワイトの各サンプルによる差はほぼ見られず、一定であることが確認された。これにより、Actinはルチン生合成系の遺伝子発現解析時にリファレンスとして用いることが可能であることが確認できた。H27年1月に収穫したアスパラガスのサンプル(無補光区、強光補光区、遮光(ホワイト))から調製したcDNAを用いて、本格的に光環境がルチン生合成系の遺伝子発現に及ぼす影響についての解析を開始した。また配糖化酵素についてはこれまで他植物においても報告がほとんどなく苦労しているが、GT、RTのうちGTについては部分配列を得ることができた。アスパラガス冬季伏せ込み栽培における栽培中の光環境制御がルチンの生合成に及ぼす影響を検討するため、光環境(光の有無及び強度)を変えて栽培したアスパラガス可食部の若茎からRNAを抽出し、ルチン生合成系の酵素遺伝子のクローンニングおよび発現解析を行った。逆転写を行って得たcDNAをテンプレートに、ルチン生合成に関わるCHS, CHI, F3H, F3'H, FLS、さらにリファレンスに用いるActin遺伝子についてプライマーを設計し、PCR条件やリアルタイムPCRの条件の検討を行った。また、ルチン生合成系の最下流である配糖化酵素(グルコシルトランスフェラーゼ:GT及びラムノシルトランスフェラーゼ:RT)についてはこれまで遺伝子が同定された例が少ないが、他作物で同定された配列を元にプライマーを設計し、クローンニングを試みた。その結果、配糖化酵素以外のすべての遺伝子についてリアルタイムPCR条件が確定でき、各酵素遺伝子の発現解析を行うことが可能となった。また、伏せ込み栽培にて収穫したアスパラガスのサンプル(グリーン無補光区、強光補光区及びホワイト(遮光条件))から調製したcDNAを用いて、本格的に光環境がルチン生合成系の遺伝子発現に及ぼす影響についての解析を行った結果、グリーン(ルチン含有)とホワイト(ルチンなし)とで、FLS遺伝子の発現量に大きな違いがあることを見いだした。またフラボノイド配糖化

酵素についてはGTおよびRTの部分配列を得ることができた。アスパラガス冬季伏せ込み栽培における栽培中の光環境制御がルチンの生合成に及ぼす影響を検討するため、光環境を変えて栽培した若茎からRNAを抽出して得たcDNAについて、ルチン生合成系の遺伝子のクローンニングおよび発現解析を行った。その結果、配糖化酵素以外のすべての遺伝子についてリアルタイムPCR条件が確定できた。また、遺伝子発現解析を行った結果、グリーン(ルチン含有)とホワイト(ルチンなし)とで、FLS遺伝子の発現量にきわめて大きな差異があることを見いだした。またフラボノイド配糖化酵素についてはGTおよびRT遺伝子の部分配列を得ることができた。平成26年度の研究により、ルチン生合成系遺伝子の関連するほぼすべての酵素の遺伝子について、遺伝子発現解析の準備が整い、本格的な発現解析に着手することができた。アスパラガスの栽培試験も予定通り行えており、研究はほぼ計画通りに進行していると考えている。蔬菜園芸学今年度は、昨年度末に調製したcDNAを用いて発現解析を行うとともに、RACE法により各遺伝子の全配列を順次決定していく予定である。アスパラガスについてはこれまでフラボノイド生合成系の遺伝子については同定の報告がないため、貴重な知見になると考えている。各試験区および茎色の異なる品種についてcDNAが採取できており、今後発現解析とRACE法による全配列の解明を進めることで計画している成果を達成できると考えられる。平成26年度は、平成25年度に得られた各試験区試料のcDNAを用いて発現解析および遺伝子の全配列の解明を進めるとともに、RACE法による全長シークエンスの解析を行う。
エレクトロスプレー法を用いたマイクロLPP燃焼技術の開発

超小型高密度エネルギー発生装置,高効率小型ヒータとして微小空間で燃焼を行うマイクロコンバスタの研究が多くなされてきている.マイクロコンバスタにエネルギー密度の高い液体燃料を用いるには,小さい燃焼器内において短時間で液体燃料の蒸発と空気との混合・燃焼を行う必要がある.本研究ではエレクトロスプレー法と金属メッシュを組み合わせたマイクロコンバスタを製作し,小径管内での液体燃料の安定燃焼を実現させた.超小型高密度エネルギー発生装置,高効率小型ヒータとして微小空間で燃焼を行うマイクロコンバスタの研究が多くなされてきている.マイクロコンバスタにエネルギー密度の高い液体燃料を用いるには,小さい燃焼器内において短時間で液体燃料の蒸発と空気との混合・燃焼を行う必要がある.本研究ではエレクトロスプレー法と金属メッシュを組み合わせたマイクロコンバスタを製作し,小径管内での液体燃料の安定燃焼を実現させた.エレクトロスプレー用のノズルおよび電極配置を設計,製作し,エレクトロスプレーのモードおよび噴霧特性について,レーザーシート法による噴霧外形観察,短時間バックライトと高速度ビデオカメラを用いた過渡特性調査,位相ドップラー粒子分析計(PDPA)による液滴径および液滴速度測定などにより調査を行った.マイクロコンバスターへの適用を考慮し,噴霧角が小さく,かつ,安定した微細噴霧の形成可能なコーンジェットモードの形成条件の把握を主として行った.形成された噴霧の空間分布は流路内に設置した複数の電極により制御した.電極位置および電位差を変化させ,電極への噴霧付着条件の検討も行った.また,電気伝導率の低い燃料のエレクトロスプレー形成についても検討を行い,混合燃料を用いることで,微粒化特性を改善可能であることを明らかにした.以上の試験と並行して,小径ガラス管内での燃焼特性について液体燃料を用いる前にプロパンを用いて確認を行った.再生予熱を模擬した外部加熱時の燃焼特性をまず調べ,流量と混合気の当量比に依存した可燃範囲および特殊な火炎形状を確認した.また,低流量時において発生する振動火炎の特性についても把握を行った.さらに,排熱による再生予熱を行った際の火炎挙動について調査を行った.空気および燃料の流量を変化させ,また,予熱方法を変化させ,詳細に調査を行った.これより,流量と混合気の当量比に依存した火炎伝播特性が得られ,定在化条件も存在することが示唆された.以上から,次年度に向けて,エレクトロスプレーを用いたマイクロコンバスターの設計のための基礎データを得ることができた.小径ガラス管内での燃焼特性について気体燃料のプロパンを用いて確認を行った.昨年度に引き続き,再生予熱を模擬した外部加熱時の燃焼特性をまず調べ,流量と混合気の当量比に依存した可燃範囲および特殊な火炎形状を確認した.また,低流量時において発生する振動火炎の特性についても把握を行った.さらに,排熱による再生予熱を行った際の火炎挙動について調査を行った.空気および燃料の流量を変化させ,また,加熱方法を変化させ,詳細に調査を行った.さらに,小径ガラス管内にメッシュを挿入した燃焼器について,同様に管内・外における燃焼条件を調べた.当量比および流速範囲によっては,外部加熱無しでも管内で火炎が定在化する条件が存在することが明らかになった.気体燃料を用いた実験と並行して,液体燃料を用いた場合の小径ガラス管内での噴霧形成条件および燃焼特性について実験を行った.噴霧の形成には静電微粒化を用い,異なる電極配置に対して,また,異なる燃料流量,当量比に対して,エレクトロスプレーの形成およびガラス管内壁への燃料付着,管内火炎定在条件について詳細に調査を行った.実験の結果,リングエクストラクター無しには小径ガラス管内でのエレクトロスプレーの形成が困難であること,ある燃料流量以上ではガラス管内壁へ燃料付着が生じ,長時間の燃焼器運転が困難となること,外部加熱無しにガラス管内に火炎が長時間定在可能な条件が存在することが明らかになった.小径ガラス管内にステンレスメッシュを挿入した燃焼器について,燃料としてプロパンを用い,空気および燃料の流量を変化させ,管内・外における燃焼条件を調べた.ガラス管の内径として,消炎直径より大きい場合,消炎直径に近い場合,消炎直径より小さい場合の3種類を対象とした.その結果,外部加熱無しでも管内のメッシュ近傍で火炎が定在化する当量比および流速条件が存在することが明らかになった.特に,消炎直径より小さい内径のガラス管内においても火炎の定在可能な条件が明らかになった.逆火不可能条件および,逆火可能でもメッシュで消炎する条件においても,初期条件を徐々に変化させることで,メッシュ付近での火炎が定在可能であり,燃焼ガスからガラス管壁を通して未燃混合気に熱が移動する再生予熱効果が示唆された.気体燃料を用いた実験と並行して,液体燃料を用いた場合の小径ガラス管内での噴霧形成条件および燃焼特性について実験を行った.噴霧の形成には静電微粒化を用い,異なる電極配置に対して,また,異なる燃料流量,当量比に対して,エレクトロスプレーの形成およびガラス管内壁への燃料付着,管内火炎定在条件について詳細に調査を行った.実験の結果,気体燃料の場合と同様にメッシュを挿入することで,外部加熱無しにガラス管内に噴霧が壁面付着することなく火炎が長時間定在可能な条件が存在することが明らかになった.この場合,メッシュには静電気力による噴霧の捕獲と再生予熱の促進の役割があると考えられる.なお,燃料希薄条件においても振動燃焼は発生しなかった.
DLC 成膜による矯正装置の表面改質に関する研究

本研究では、矯正用ワイヤーと矯正用ブラケットの表面にプラズマビームイオン注入法を用いてDLC(Diamond-Like-Carbon)を成膜し、DLC膜がブラケット/アーチワイヤー間の摩擦特性に及ぼす影響を調べた。矯正用ワイヤー2種類(Ni-Tiワイヤー、ステンレス鋼ワイヤー)とステンレス鋼製ブラケットの表面にDLCをプラズマイオン注入法により成膜した。摩擦試験において、DLCを製膜したワイヤーとブラケットは、ともに非成膜試料と比較して有意に低い摩擦特性を示した。以上の結果から、矯正用装置の表面は、プラズマビームイオン注入法を用いたDLC成膜により表面改質が可能で、DLC成膜は矯正治療中の歯の移動に有益であることが考えられた。矯正治療において、ブラケットとアーチワイヤー間の摩擦抵抗やバインディングは、治療期間の長さに影響するため重要な因子である。本研究の目的は、複雑な三次元形状を有する矯正用ブラケットと矯正用ワイヤーの表面にプラズマビームイオン注入法によりDLC(Diamond-Like-Carbon)を成膜し、DLC膜の矯正装置への応用を検討することである。平成22年度においては、2種類の矯正用ワイヤー(Ni-Tiワイヤー、ステンレス鋼ワイヤー)にDLCの成膜を試み、DLC膜表面の原子間力顕微鏡観察、ナノインデンテーション試験およびDLCを成膜した矯正用ワイヤーの摩擦試験を行った。その結果、成膜したDLCの表面はコントロール試料と同様の表面形状を示し、DLC表面の荒さ値はコントロール試料と同レベルの値を示した。ナノインデンテーション試験では、DLC膜がコントロール試料と比較して、有意に高い硬さを示した。ステンレス鋼ワイヤーに成膜したDLC層は、コントロール試料と比較して有意に低い弾性係数を示した。市販ブラケットとの摩擦試験においては、DLCを成膜したワイヤーがコントロール試料と比較して有意に低い摩擦特性を示した。以上の結果から、プラズマビームイオン注入法によるDLC成膜は、矯正用ワイヤーの摩擦特性を改善することに有効な手法であることが考えられた。同手法の矯正用ブラケットへの応用も摩擦特性の改善に有効であるものと示唆された。マルチブラケットを用いた矯正治療において、ブラケットとアーチワイヤー間のバインディング等の摩擦特性は、治療期間の長さを左右することから非常に重要なものと考えられる。本研究の目的は、複雑な立体構造を有する矯正用ブラケットと矯正用ワイヤーの表面にプラズマビームイオン注入法によりDLC(Diamond-Like-Carbon)を成膜し、DLC膜の矯正装置への応用を検討することである。平成23年度までに、2種類の矯正用ワイヤー(Ni-Tiワイヤー、ステンレス鋼ワイヤー)にDLCの成膜を試み、DLC膜表面の原子間力顕微鏡観察、ナノインデンテーション試験およびDLCを成膜した矯正用ワイヤーの摩擦試験を行った。その結果、成膜したDLCの表面粗さは、コントロール試料同様の表面形状を示し、DLC表面の荒さ値はコントロール試料と同レベルの値を示した。ナノインデンテーション試験では、DLC膜がコントロール試料と比較して、有意に高い硬さ値を示した。ブラケットに対するDLC成膜条件についても検討した結果、スロット内面へのDLC層の形成を考慮してワイヤーの場合と比較して厚いDLC成膜が望ましいことが示唆された。マルチブラケットを用いた矯正治療において、ブラケットとアーチワイヤー間のバインディング等の摩擦特性は、治療期間の長さを左右することから非常に重要な因子である。本研究の目的は、ブラケット/アーチワイヤー間の摩擦特性を改善するために矯正用ブラケットと矯正用ワイヤーの表面にプラズマビームイオン注入法を用いてDLC(Diamond-Like-Carbon)を成膜し、DLC膜の矯正装置への応用を検討することである。矯正用ワイヤー2種類(Ni-Tiワイヤー、ステンレス鋼ワイヤー)とステンレス製ブラケットの表面にDLCを成膜した実験用試料を作製した。DLC膜の表面解析(3D走査型電子顕微鏡観察、原子間力顕微鏡観察)、DLC膜の機械的特性の評価(ナノインデンテーション試験)、およびブラケット/アーチワイヤー間の静摩擦・動摩擦特性評価を行った。その結果、成膜したDLCの表面は、コントロール試料に類似した表面形状を示し、DLC表面の荒さ値はコントロール試料と同レベルの値を示した。また、各試料に成膜したDLC層はコントロール試料と比較して有意に低い弾性係数を示した。DLCを製膜したワイヤー・ブラケットともに市販ワイヤー・ブラケットと比較して有意に低い摩擦特性を示した。

以上の結果から、プラズマビームイオン注入法によるDLC成膜は、矯正用ブラケットワイヤー間の摩擦特性を改善することに有効な手法であることが考えられた。矯正装置(ワイヤーとブラケット)へのDLC成膜を検討するにあたり、ワイヤーに対する成膜については、実験が終了し、投稿論文も国際誌に掲載された。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、矯正用ブラケットに対するDLC成膜の応用について検討する予定である。成膜条件の検討は終了しているため、ワイヤーの成膜で確立済みの同様の実験を行う予定である。
ヘパリナーゼ過剰発現を起こした転移性肺腫瘍における腫瘍微小循環新生機構の解明

腫瘍の肺転移は血行性で起こると考えられている。腫瘍細胞が転移先(肺)で増殖する際に既存の構造を破壊していることが病理学的検討から明らかで、この際にはMMPが関与していることが示唆されている。われわれはMMPだけではなく、Heparanaseも発現することが腫瘍の転巣移形成に必要ではないかとの仮説のを立て研究を行った。使用したLY80は浮遊細胞系の腹水肝癌である。転移の研究をする場合、免疫不全マウスやSCIDラットを使用すると腫瘍の間質および腫瘍循環はAllogenicな間質および血管から構成されるため、転移巣形成の正確な評価ができないことが考えられたためこのSyngenicな腫瘍系列を選択した。LY80は肝には親和性があり、吹く水中で増殖する場合、腫瘍細胞が単独で浮遊している状況である。この状態で静脈内投与を行っても肺転移を起こしにくいことが明らかとなった。腫瘍細胞を皮下に注入し固形腫瘍を作った後に静脈注入したところ肺転移を比較的効率よくつくることができるようになった。この系では腫瘍の肺転移には肺循環の末梢部位にSequestrateするだけでなく、間質を伴う腫瘍細胞塊が必要であることを示したものと考えられた。腫瘍細胞が肺に親和性を持つ場合、遊離細胞とした腫瘍細胞分散液で肺転移を構成できるか否かを調べる必要があると考えられた。間質への進展と腫瘍の増生の点で、肺転移時にLY80を用いた肺転移巣の形成過程にHeparanase活性が変化しているかについて検討した。腫瘍細胞投与14-16日後に肺を摘出、転移巣を切除し、凍結保存、Haparan Degrading Eazyme Assay Kitを用いて転移組織内Heparanase活性を測定した。その結果、直径3mm以下の転移巣ではHeparanase活性は正常肺よりも高い値を取り、転移形成初期の最階でHeparanaseが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また、蛍光遺伝子の導入を試みたが、恒常的に蛍光を発する腫瘍細胞を作成することが困難であった。恒常的に導入した腫瘍細胞を得て肺転移におけるHeparinase活性の変化を明らかにすること、Heparan sulphate proteo-glycan(HSPG)の分解の程度を検討することが次なる課題であると考えられた。○肺転移モデルと腫瘍循環の評価技術の確立【方法】肺転移モデルに使用する悪性腫瘍として、Donryu Ratに発生したラット腹水肝癌LY80を用いた。腫瘍の皮下移植、皮下移植した腫瘍を細切して尾静注するモデルで検討した。皿管径はFITCアルブミンにて血漿部分を標識して計測、血流速度はFITC標識赤血球を用いて計測した。【結果】皮下腫瘍を生食中で細切し,1x10^6/mlに調整したものを0.2ml尾静注することにより、16日目に腫瘍径2mmの腫瘍結節を約半数のラットに認めることができることが明らかとなった。14日目の検討では、顕微鏡下では、肺胞毛細血管の拡張した1から2mm径の転移巣が認められた。

ウィンドウチャンバーを装着して観察すると、腫瘍結節には血管の新生はなく、結節周囲の肺胞毛細血管の拡張のみが認められた。このモデルでは、胸水の貯留が著しいことが特徴であった。腫瘍循環の成立に関する観察では1mmから3mmの腫瘍では腫瘍周囲の肺胞毛細血管の拡張のみが目立ち、新生血管や肺動静脈の拡張は認められなかった。【考察】腫瘍内に明らかに血管と認識できる構造が3mm程度の腫瘍では明らかとならず、腫瘍循環としては計測できていない。この系では、腫瘍径が5mmを超えると胸水の貯留が著しくなり、転移巣観察には適さなかったので、現在腫瘍株を変えるべく検討に入った。○ヘパリナーゼ遺伝子過剰発現腫瘍細胞株の樹立【方法】腹水肝癌細胞LY80を培養し、リポフェクション法を用いてLacZ遺伝子、GFP遺伝子を導入し、安定して発現する細胞株を樹立する。【結果】遺伝子導入後、限外希釈して、遺伝子導入細胞を選択し、継代培養したところ、継代するに従ってLacZ遺伝子、およびGFP遺伝子の発現が薄れてゆく株が多く、いまだに観察に適する安定して遺伝子を発言する細胞株が得られていない。これは、LY80固有の性質であるか、導入遺伝子の性質によるものかが不明であるが、上記のごとく肺転移巣の成長を観察するのに適さない可能性があるので、現在、腫瘍株をDonryu ratに自然発生したSato Lung TumorとSD ratに発生した横紋筋肉腫であるMCA-2に変更して検討している。○ヘパラン硫酸プロテオグリカンの局在と血管新生との関係:間質の恒常性が失われた癌組織において、血管新生と、間質の構成要素であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの局在の関係について検討することとした。そのための腫瘍モデルとして昨年度に確立したDonryuラットの皮下移植モデルおよび尾静脈注入による肺転移モデルを用いた。また、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの局在を明らかとし、腫瘍の増大とともに、腫瘍周囲間質および腫瘍内観質のHSPGが経時的、空間的にどのような変化をきたしているかをプロテオグリカンに対する抗体(SantaCruz社製NG2(H-300))を用いてWestern blottおよび免疫染色にて検討し、血管新生については抗第VIII因子抗体を用いて内皮細胞を、抗VEGF抗体によって腫瘍組織および辺縁部を染色し、血管密度を計測することにより判定した。現在までに、HSPGの染色は弱く、腫瘍周囲で分解の過程を空間的に把握することは困難であった。VEGFの染色と新生血管の関係は皮下腫瘍の腫瘍辺縁部ではVEGFの染色が強く、同時に血管密度も正常部分に比し増加するようであるが、転移性肺腫瘍でははっきりとした相関は明らかではなかった。○ヘパラナーゼ遺伝子過剰発現腫瘍株の樹立:本研究ではヘパラナーゼの遺伝子をクローン化し、強発現をする腫瘍細胞を樹立する予定であった。クローン化を行う前段階として外来遺伝子として蛍光遺伝子(pEGFP C1,BD社製)を用いて安定した腫瘍株の樹立を行うプロトコールを検討した。リポフェクション法では導入される遺伝子が少なく、発現強度も弱かった。また、慶大による発現の低下も著しかった。そこで、遺伝子導入試薬を他の界面活性剤であるFugene6を用いて行った。
neuromodulation：神経可塑への作用は過活動膀胱の新治療となり得るか

本研究では雌性Sprague-Dawleyラットで一側中大脳動脈塞栓術による脳梗塞モデルと胸髄離断による脊髄損傷モデルを作製し、左側脛骨神経に設置したカフ電極から5ヘルツ、200μ秒幅のパルス波による電気刺激を1日1回30分間、連続して行った。それぞれのモデルで刺激開始時期をかえて比較を行った。覚醒下での膀胱内圧測定を実施したが、脳梗塞モデル、脊髄損傷モデルとも有意な蓄尿機能の改善を認めなかった。このため、中枢神経での神経可塑性に関わる遺伝子の発現、神経伝達物質の評価は行われなかった。中大脳動脈塞栓ラットにおいて、一側脛骨神経の電気刺激(5ヘルツ、200μ秒幅、motor thresholdの24倍の刺激強度)の作用を覚醒下で評価した。塞栓後3時間経過で膀胱容量は約50%に減少したが残尿量の増加を認めなかった。最大排尿収縮圧は個体差が大きかったが、統計学的な有意な変化を認めなかった。脛骨神経刺激を行うとラットの体動が大きく、安定した膀胱内圧測定が困難であった。過半数のラットで膀胱容量が増大する傾向にあったが、体動のノイズ等によりnon-voiding contraction (NVC)の評価はできなかった。膀胱内圧測定後にラットの脳を摘出して梗塞範囲の評価を行ったが、梗塞巣の個体差が大きく研究者の手技が不安定であることが推測された。平成27年度の研究計画では、ラット中大脳動脈塞栓(脳梗塞)モデルに対する脛骨神経電気刺激の作用ならびに排尿中枢での神経可塑性に関わる遺伝子(c-fos、zif 268、c-jun等)の発現に加え、中枢神経系でのエンケファリンやGABA等の神経伝達物質を評価する予定であった。しかしながら、現状では中大脳動脈塞栓ラットにおける膀胱内圧測定のデータのばらつきが大きく、脳梗塞を生じたラットにおいて脛骨神経刺激が排尿反射を抑制しているかどうかの評価が困難であり、中枢神経系での神経可塑性についての評価ができていない。このため研究の達成度は遅れているとせざるを得ない。本研究では雌性Sprague-Dawleyラットを使用した。第7、8胸椎で胸髄を離断し脊髄損傷を作成したラットの左側脛骨神経にカフ電極を設置し、1回30分、5ヘルツ、200μ秒幅の刺激条件で電気刺激を行った。脊髄損傷作成後に排尿反射が回復するまでの間、1日2回のクレーデ排尿を連日実施した。脊髄損傷作成の4週後に膀胱内圧測定を実施し、電気刺激を継続後の作用を覚醒状態で評価した。膀胱内圧測定は膀胱頂部より挿入したポリエチレンカテーテル(PE-50)より持続的に生理食塩水を0.04 ml/分で注入し、ラットはボールマンケージ内に拘束し、測定を行った。脊髄損傷後のラットの平均膀胱容量は1.02 ±0.05 ml(0.81.24 ml)、平均non-voiding contraction (NVC)数は5.6 ±0.7回(29回)、平均の最大排尿収縮圧は54.9 ±1.8 cmH2O (46.163.9 cmH2O)であった。脊髄損傷作成前1週間、脊髄損傷作成直後、脊髄損傷作成後1週間に脛骨神経電気刺激を開始した群で比較を行ったが、膀胱容量、NVC数、最大排尿収縮圧に有意差を認めなかった。研究計画では、ラット胸髄離断(脊髄損傷)モデルに対する脛骨神経電気刺激の作用ならびに排尿中枢での神経可塑性に関わる遺伝子(c-fos、zif 268、c-jun等)の発現に加え、中枢神経系でのエンケファリンやGABA等の神経伝達物質を評価する予定であった。しかしながら、脊髄損傷ラットにおける膀胱内圧測定上の脛骨神経電気刺激の作用を示すことができず、脛骨神経刺激が不随意収縮や排尿反射の回復に影響するという仮説も裏付けることができなかった。このため中枢神経系での神経可塑性についての評価を実施しなかった。平成26年度の研究計画では、ラット中大脳動脈塞栓(脳梗塞)モデルに対する脛骨神経電気刺激の作用

ならびに排尿中枢での神経可塑性に関わる遺伝子(c-fos、zif 268、c-jun等)の発現を評価する予定であった。しかしながら、現状では中大脳動脈塞栓ラットにおける膀胱内圧測定のデータのばらつきが大きく、脳梗塞を生じたラットにおいて脛骨神経刺激が排尿反射抑制作用を有するのかどうか評価が困難であり、中枢神経系での神経可塑性についての検討には着手できていない。このため研究の達成度は遅れているとせざるを得ない。中大脳動脈塞栓ラットにおける神経因性排尿筋過活動の発現、脛骨神経電気刺激の作用にばらつきが多き理由の一つとして、研究者の手技未熟による脳梗塞範囲が不安定であることが一因として考えられる。このため、引き続き症例数を増やして研究者の手技を向上させ、理想的な梗塞発症ラットの歩留まりを増す必要がある。麻酔下での実験では神経伝達物質の受容体の遮断が生じている場合があり、本研究では覚醒下での実験を予定したが、電気刺激の疼痛が大きくラットで安定した排尿反射を確立できない場合には、ウレタン麻酔の併用を検討する。研究の遅延を解消すべく、平成28年度は本研究の進捗状況に留意し励みます。医歯薬学中大脳動脈塞栓ラットにおける神経因性排尿筋過活動の発現、脛骨神経電気刺激の作用にばらつきが多い理由の一つとして、研究者の手技未熟による脳梗塞範囲が不安定であることが一因として考えられる。このため、症例数を増やして研究者の手技を向上させ、理想的な梗塞発症の歩留まりを増す必要があると考える。覚醒下での電気刺激の疼痛が大きくラットが安定した排尿反射を確立できない場合には、ウレタン麻酔の併用により電気刺激の苦痛を和らげる。この場合、ウレタンによる排尿反射回路におけるグルタミン酸NMDA受容体の遮断が指摘されており、研究結果の解釈時に注意を要する。昨年度の遅延を解消すべく、平成27年度は本研究の進捗状況に留意し励みます。
脊髄におけるシナプス可塑性モデル、アロディニアの作用機構の解明

我々はマウス髄腔内に投与したプロスタグランジン(PG)が熱などの侵害性刺激に対して痛覚過敏反応を引き起こすだけでなく、非侵害性の触覚刺激に対して痛みや不快感を示すアロディニアを長期間にわたって引き起こすことを生理活性物質として初めて見いだし、そのアロディニアにグルタミン酸受容体が関与していることを明らかにした。今年度、1)アロディニアだけでなくPGにより誘発される痛覚過敏反応にNMDAグルタミン酸受容体が関与していること、2)活性化されたNMDA受容体は一酸化窒素合成酵素(NOS)を活性化してアロディニアや痛覚過敏反応を引き起こすこと、3)PG誘導体NT-012がPGE2により引き起こされたアロディニアを特異的かつ非常に低濃度で抑制すること、4)アロディニアが一旦完成された後、NT-012やNMDA受容体アンタゴニストを投与してもアロディニアを軽減させることはできないが、NOS阻害剤L-NAMEではアロディニアが軽減されることから、アロディニアの維持にNO系が重要な役割をしていることが明らかにした。さらに5)脊髄スライス標本を用いたin vitroの系においてPGE2がグルタミン酸を遊離させること、6)興奮性アミノ酸であるグルタミン酸だけでなく、抑制性アミノ酸であるグリシンやGABAもアロディニアの誘発に関与していることをグリシン受容体アンタゴニストであるstrychnineとGABA受容体アンタゴニストであるbicucullineを用いて明らかにした。