hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ粒子への精密位置制御分子修飾による細胞内サンプルリターン材料の開発

本研究は、細胞内の標的物質を捕捉・回収する(サンプルリターン)ナノ材料の開発を目指すものである。この達成には、細胞内取込の誘起、標的物質の認識および捕捉、細胞外での回収という複数の機能連携が必要となる。本研究では、各機能を担う分子材料の厳密な修飾位置制御というアプローチにより各々の機能の効果的な発現および機能連携を実現し、細胞内サンプルリターンの達成を目指している。2018年度の研究成果は、(1)磁性ナノ粒子の単分散合成条件の確立、(2)標的物質認識用分子材料の合成、(3)標的物質捕捉用分子材料の合成、(4)位置選択的分子修飾法のうちのスポット修飾法の確立である。(1)粒子径の単分散性は位置選択的分子修飾および機能発現における均質かつ高い再現性の確保において重要であり、今回確立した合成条件では粒子径16 nm(±9%)の単分散磁性ナノ粒子が得られた。(2)、(3)において標的物質に薬物代謝酵素のひとつであるCYP3A4を選択した。(2)のCYP3A4認識分子については、CYP3A4と強く相互作用するketoconazole部位、スペーサー部位、磁性ナノ粒子接合部位からなる分子を合成した。(3)のCYP3A4捕捉分子については、接近したCYP3A4のリシン残基との共有結合形成を狙い、カルバメート骨格を有する反応部位、スペーサー部位、ナノ粒子接合部位からなる分子を合成した。(4)のスポット修飾はナノ粒子の一点にのみ特定の分子を修飾する手法であり、後続の1対1修飾、範囲指定修飾の起点ともなるため重要である。シリカ粒子を母材とした修飾補助材を別途合成し、これを用いたスポット修飾反応により粒子表面の一点にのみチオール基を有する磁性ナノ粒子が得られた。現在は、(2)、(3)の分子材料の機能評価を行っている。2018年度の研究実施計画は、主に材料合成と分子修飾法の確立であり、研究実績に記載した通りほぼ当初の予定どおりの進捗状況となった。しかしながら、現在行っているバッチ式スポット修飾法は操作が多段階かつ煩雑であり、効率が悪いことがわかった。この課題の解決のため、フロー式分子修飾システムの構築を検討している。課題としてスポット修飾の効率が低い点があげられる。この点については、現在、フロー式分子修飾システムの作製を企業に依頼中であり、高効率かつ均質なスポット修飾ナノ粒子が得られる環境を整備する予定である。2019年度は、ナノ材料へのさらなる修飾法として1対1修飾法、範囲指定修飾法を確立した後、2018年度に合成した機能性分子、および細胞膜透過性分子、PEG誘導体分子をナノ粒子へ位置選択的に修飾し、標的物質の捕捉・回収の検討を行う。検討する実験系として、2種の精製酵素混合系、ミクロソーム、および生細胞からの標的物質の捕捉・回収といった段階的な検討を想定している。

2019年度は、ナノ材料へのさらなる修飾法として1対1修飾法、範囲指定修飾法を確立した後、2018年度に合成した機能性分子、および細胞膜透過性分子、PEG誘導体分子をナノ粒子へ位置選択的に修飾し、標的物質の捕捉・回収の検討を行う。検討する実験系として、2種の精製酵素混合系、ミクロソーム、および生細胞からの標的物質の捕捉・回収といった段階的な検討を想定している。当初購入を予定していた機器(減圧乾燥装置一式)が共用機器として利用可能となったため、残額が生じた。一方、研究の進展によりナノ粒子へのフロー式分子修飾システム構築の必要性が生じた。現在、企業へ当該装置の開発を依頼しており、上記予算は当該装置の購入に充てる予定である。
ロボティクスやメカトロニクスにおける伸張性と弾力性に富む画期的な多機能材料の開発

プラスチックでないもう一つの高分子溶液としてのゴムに対して,導電性高分子溶液における電解重合法を駆使することで,従来にない,かつ夢を実現する様々な技術を確立することを本研究の目的とし,平成30年度においては,具体的には,1)ピエゾ素子を含むセンサ,2)キャパシタとバッテリーの開発の確立を行った.1)ピエゾ素子を含むセンサピエゾ効果の原理は,MCFゴム中に内在する水分子やポリイソプレンがラジカル化したイオン分子間の距離が圧縮や伸長により変化することで発生するイオン電導であることまでは判明している.現在,水分量や経年的影響とその対策が課題として残っており,これらの解決のために,水分量や経年変化の測定と,圧縮と伸長による電気信号変化の測定を通して,シリコーンオイルゴム等によるセンサ化を行った.すなわち,ゴム自体の開発と,ゴムに接着する金属による導線のセンサに対する固着手法の開発である.これらの技術は,論文や特許にて公表する運びとなった.また,これにより工業化に結びつけられると期待できる.2)キャパシタとバッテリー現在,導電性高分子溶液におけるプラスチックの場合での有機バッテリーで使われているドーパントについて,文献等により調査して数種類選定し,それをドーパントとして用いて作成した.そして圧縮や引張下において,ポテンショメータやインピーダンス測定により充放電特性を計測した.これについても,工業化に結びつけられると期待できる.ピエゾ効果における水分量や経年的影響とその対策について,シリコーンオイルゴム等によるセンサ化を行った.すなわち,ゴム自体の開発と,ゴムに接着する金属による導線のセンサに対する固着手法の開発を行った.これらの技術は,論文や特許にて公表する運びとなり,これらは工業化に結びつけられると大いに期待できることから,当初の計画以上に進展していると判断できる.すなわち,これまでの電解重合によるゴム化に加えて,新しいドーパントを添加する手法であり,これまでになかった新しい手法でもあり,学術的にも工業的にもブレークスルーを起こすものである.要約すると,金属錯体からなる水和物をゴムと電気的に反応させることによってなる新技術は,ゴムの経年変化や,金属とゴムの新しい強固な接着を実現した.研究計画書にあるように,プラスチックでないもう一つの高分子溶液としてのゴムに対して,導電性高分子溶液における電解重合法を駆使することで,従来にない,かつ夢を実現する様々な技術を確立することを本研究の目的とし,ピエゾ素子を含むセンサ,キャパシタとバッテリー以外の機能性として,太陽電池の機能性を有する素材の開発の確立を行う.ここで,前二者の機能性を保持しているものとする.プラスチックでないもう一つの高分子溶液としてのゴムに対して,導電性高分子溶液における電解重合法を駆使することで,従来にない,かつ夢を実現する様々な技術を確立することを本研究の目的とし,平成30年度においては,具体的には,1)ピエゾ素子を含むセンサ,2)キャパシタとバッテリーの開発の確立を行った.1)ピエゾ素子を含むセンサピエゾ効果の原理は,MCFゴム中に内在する水分子やポリイソプレンがラジカル化したイオン分子間の距離が圧縮や伸長により変化することで発生するイオン電導であることまでは判明している.現在,水分量や経年的影響とその対策が課題として残っており,これらの解決のために,水分量や経年変化の測定と,圧縮と伸長による電気信号変化の測定を通して,シリコーンオイルゴム等によるセンサ化を行った.すなわち,ゴム自体の開発と,ゴムに接着する金属による導線のセンサに対する固着手法の開発である.これらの技術は,論文や特許にて公表する運びとなった.また,これにより工業化に結びつけられると期待できる.2)キャパシタとバッテリー現在,導電性高分子溶液におけるプラスチックの場合での有機バッテリーで使われているドーパントについて,文献等により調査して数種類選定し,それをドーパントとして用いて作成した.そして圧縮や引張下において,ポテンショメータやインピーダンス測定により充放電特性を計測した.これについても,工業化に結びつけられると期待できる.ピエゾ効果における水分量や経年的影響とその対策について,シリコーンオイルゴム等によるセンサ化を行った.すなわち,ゴム自体の開発と,ゴムに接着する金属による導線のセンサに対する固着手法の開発を行った.これらの技術は,論文や特許にて公表する運びとなり,これらは工業化に結びつけられると大いに期待できることから,当初の計画以上に進展していると判断できる.すなわち,これまでの電解重合によるゴム化に加えて,新しいドーパントを添加する手法であり,これまでになかった新しい手法でもあり,学術的にも工業的にもブレークスルーを起こすものである.要約すると,金属錯体からなる水和物をゴムと電気的に反応させることによってなる新技術は,ゴムの経年変化や,金属とゴムの新しい強固な接着を実現した.研究計画書にあるように,プラスチックでないもう一つの高分子溶液としてのゴムに対して,導電性高分子溶液における電解重合法を駆使することで,従来にない,かつ夢を実現する様々な技術を確立することを本研究の目的とし,ピエゾ素子を含むセンサ,キャパシタとバッテリー以外の機能性として,太陽電池の機能性を有する素材の開発の確立を行う.ここで,前二者の機能性を保持しているものとする.本年度における研究実施結果が予想以上に進行したため,その成果公表において過不足が生じたため,前倒し申請したが,念のため多めに前倒し申請しておいたため,次年度使用額(B-A)が生じた.それに伴う次年度の研究計画に変更及び支障は来たさない.
インドの小地域住民全数データを参照基準とした途上国地方統計制度の研究

2.地方統計制度のなかで重要な位置を占める農業統計についてFASと共同研究を展開することができた。その成果を2013年10月に地域農林経済学会でFASと共同発表した。1.平成2009-2011年度基盤研究(C)「インドの小地域住民全数データを参照基準にした途上国センサス・行政データの研究」(研究代表者:岡部純一)の研究成果を発展させる目的で、地方分権化の下での地方統計制度の統計需要を総合的に研究した。具体的には、インド側学術団体「農村研究財団(Foundation of Agrarian Studies-FAS)」との共同研究によって、地方自治体(panchayat)統計制度に関する統計需要の全体像を把握し、その実態について全面的に著作をまとめる段階に入った(草稿が完成)。このような研究はインド国内では不足しているため、その研究水準を上回る内容にまとまりつつある。2.インドを中心に、途上国と先進国の地方分権化政策と地方統計制度に関係する文献・資料リストを作成し、その研究成果の一部を公表することができた。4.地方統計制度のなかで重要な位置を占める農業統計についてFASと共同研究を展開することができた。その成果を2013年10月に地域農林経済学会でFASと共同発表することが決まった。<最終年度に実施した研究の成果><研究期間全体を通じて実施した研究の成果>平成2009-2011年度基盤研究(C)「インドの小地域住民全数データを参照基準にした途上国センサス・行政データの研究」(研究代表者:岡部純一)の研究成果、ーすなわち、FASと協力してインド諸村落の世帯全数データベースを比較基準に当該村落の政府基礎データ(センサスデータや行政記録)の精度をミクロレベルで検証した成果ーを発展させる為に、インド地方自治体の統計需要(住民自治・自治体財政・地域計画のための基礎統計の整備要求)について体系的に研究した。その体系的研究を基礎に、FASとの共同研究として、インド国民向け英文著書: A New Statistical Domain in India: An Enquiry into Gram Panchayat-level Databases (Tulika出版社から近刊)の原稿について、インドの広範な分野の統計家と議論し、国際学会で発表し、最終的に脱稿まで漕ぎ着けた。経済統計学そのことは、平成21-23年度基盤研究の成果についてインドの広範な地方統計家・統計利用者と議論し、内容を向上させようとする本研究の目的を十二分に達成させたことになるからである。後半からはじまり、かなり進展を見せている。また、FASの研究者V. Rawal氏が2012年度中に来日したためFASとの研究交流が予定していたより進展した。地方自治体(panchayat)統計制度の全体像をハンドブックの形で公表することを2013年度以降に予定していたが、この作業が2012年度後半からはじまり、かなり進展を見せている。まずなにより重要なことは、当ハンドブックの草稿: A New Statistical Domain in India: An Enquiry into Gram Panchayat-Level Databasesを完成させて出版に漕ぎ着けることである。現在、研究のフォローアップを続けながら完成に近づいている。それを学会等で公表する予定である。地方自治体(panchayat)統計制度の全体像に関するハンドブックを完成させインドで公表することを急ぐ予定である。インド研究者の反響を見て更なる研究の進展が期待できるからである。そのためのフォローアップ調査をFASと共同で行う必要がある。横浜国立大学が2013年7月から10月までFASの理事長V.K. Ramachandran(兼インド統計研究所教授)を招聘するのでその機会にこの研究の進展を図る。農業統計についてのFASとの共同研究を進展させ、その成果を2013年10月に地域農林経済学会でFASと共同発表する。インド農村部におけるBPLセンサス(Socio Economic and Caste Census, 2011)と国民人口登録が現在進行途上なのでその進行について状況観察し、可能な範囲で本研究の対象に含め、研究を改訂する。第1に、V.K. Ramachandran氏が2013年8月から10月に横浜国立大学に招聘されたため、日本からインドへの渡航がのべ2回分延期されたこと。ハンドブックの出版が次年度に繰り越されたため次年度の出版打ち合わせ費用が必要になったため。2014年6月-9月:インドでのハンドブック出版のためのフォローアップ調査と打ち合わせのため、研究代表者、研究分担者、研究連携者が海外渡航。2014年9月:ハンドブックを出版。次年度使用額(B -A)」が生じたのは、上述の地方自治体(panchayat)統計制度ハンドブックの作成が早まったため、インド渡航が延期され、ハンドブックの完成を待って、そのフォローアップ調査を兼ねた長期渡航のために次年度使用することになったためである。
波動干渉法による実建物の耐震安全性診断技術の開発に関する研究

本研究は、現有の地震計を有効活用してIT計測技術を用いた収録システムを新たに構築し、観測された波形から建物のモデルパラメータ(質量、剛性、減衰)を逆同定することにより、建物の正確な耐震安全性診断システムを開発することを主眼とした。実大鉄骨骨組み架構で長期間・多地点において同時に連続データを収録した結果、振動特性は季節,気温,降雨の影響が少ないが風邪の影響が強いこと、付加質量を設置した実験により実際の建物の図面から得られた値と比べ階によっては剛性が約50%、質量が約65%であることがわかった。本研究では、実建物の耐震安全性診断のために建物内の2点間(建物全体だけではなく柱端部など)の波動伝播(常時微動および微小地震)の観測波形に波動干渉法(Seismic Interferometry)を適用し自己相関関数・相互相関関数からグリーン関数(点加振による応答の伝達関数)を抽出し、それを説明できるモデルパラメータ(剛性、質量、減衰)を精度よく同定する方法を開発することを目的とする。その目的達成のため、現有の地震計を活用したIT計測技術を用いた収録システムを新たに構築し、観測された波形から建物のモデルパラメータ(質量、剛性、減衰)を逆同定することにより建物の正確な耐震安全性診断が出来るシステムを開発する。本年度は実建物の耐震安全性診断技術の開発に向けた研究準備および研究を進めることを主眼として、以下の研究を推進した。(1)現有の地震計と組み合わせて使える収録装置およびIT計測技術を駆使したデータ収録システムを開発した。開発した収録システムにより試験的にデータ収集を行い、安定的にデータ収集を行う方法を検討した。(2) (1)と並行して、単純な鉄骨骨組み架構について、既存の地震計を用いることにより各所での波動の長時間・広周期帯域観測を試験的に行い、プログラム開発に用いるテストデータを収集した。(3) (2)で得られたデータについて、波動干渉法を適用して2点間の自己相関関数・相互相関関数に含まれているグリーン関数を抽出する手法について検討した。本研究では、実建物の耐震安全性診断のために建物内の2点間の波動伝播の観測波形に波動干渉法を適用し自己相関関数・相互相関関数からグリーン関数を抽出し、それを説明できるモデルパラメータを精度よく同定する方法を開発することを目的とする。主な研究課題は、以下の通りである。その目的達成のため、現有の地震計を活用したIT計測技術を用いた収録システムを新たに構築し、観測された波形から建物のモデルパラメータを逆同定することにより建物の正確な耐震安全性診断が出来るシステムを開発する。本年度は実建物の耐震安全性診断技術の開発に向けた研究を進めることを主眼として、昨年に引き続き以下の研究を推進した。(1)平成22年度に整備した、現有の地震計と組み合わせて使える収録装置およびIT計測技術を駆使した新収録システムを、実構造物に設置することを考慮して工夫をした上で鉄骨骨組み架構の各階に収録装置を設置した。(2)(1)のシステムにおいて、長時間連続して安定して観測できることを確認し、継続して長時間・広周期帯域観測を行った。(3)波動干渉法を適用して実構造物の2点間の自己相関関数・相互相関関数に含まれているグリーン関数を抽出する手法について引き続き検討した。(4)さらに、一昨年度末に平成23年(2011年)東北地方太平洋沖地震により東日本大震災が発生したため、本震時に大加速度が記録された地域や震動被害のあった地域を調査し、実建物の耐震安全性の診断を行うための情報を収集した。本研究は、実建物の耐震安全性診断のために建物のモデルパラメータを精度よく同定する方法を開発することを目的とした。その目的を達成するため、現有の地震計を有効活用してIT計測技術を用いた収録システムを新たに構築し、観測された波形から建物のモデルパラメータ(質量、剛性、減衰)を逆同定することにより、建物の正確な耐震安全性診断が出来るシステムの開発に向けた研究を主眼として行う計画とした。最終年度の平成24年度は実建物の耐震安全性診断技術の開発に向け、これまでに実大構造物に設置した計測システムを利用して得られた計測データを用い、以下の研究成果が得られた。単純な実大鉄骨骨組み架構に設置した新収録システムにより長期間・多地点において同時に安定的にデータを収録した。この観測を行うことにより、収録データの時間変化について把握することができた。その結果、上階の各階と1階のフーリエスペクトル比は季節や日夜の気温および降雨による影響少ない一方、風による影響が大きいことがわかった。フーリエスペクトル比から読み取れる固有振動数からは質量と剛性の比しか得られるないため、実際の質量と剛性を得るために各階ごとに付加質量を設置する計測を一定期間継続して行い、付加質量を設置した際の一次と二次の固有振動数の変化を説明できる質量と剛性を同定した。

その結果、実際の建物の計測から得られた値と比べ階によっては剛性が約50%、質量が約65%であることがわかった。一方、東北地方太平洋沖地震の際に大阪湾岸の超高層建物で観測された地震動について建物応答シミュレーションにより、実建物の減衰定数についての検討をした結果、減衰定数が設計値よりもかなり小さかったことを確認した。今後は、これまでに蓄積されてきた計測データを用いて、波動干渉法により抽出される2地点間のグリーン関数の精度の確認をした上で、モデルパラメータの同定手法を確立する。実大構造物において長時間・広周期帯域観測が安定して行えるようになり、研究に必要なデータが順調に収集出来ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。収集した波動の長時間・広周期帯域観測データを用い、波動干渉法を適用して2点間の自己相関関数・相互相関関数に含まれているグリーン関数を抽出し、建物のモデルパラメータの逆同定プログラム開発する。また、実際の鉄筋コンクリート造建物等に新収録システムによる波動の長時間・広周期帯域観測を行い、実際の建物への適用性について検討する。得られたモデルパラメータに基づき地震応答解析モデルを構築し、地震時の建物応答から耐震安全性診断を行う手法について研究・開発を行う。設計図面から推定したモデルパラメータによる地震応答解析モデルも構築し、モデルパラメータの差が耐震診断結果にどのような影響を与えるかについて検討する。
増殖抑制因子Tobを含んだ転写制御複合体因子群の探索と解析

私は細胞増殖抑制因子Tobの機能を解析するために、MALDI-TOF/TOFによるTob複合体因子群を同定した。はじめにFlagタグを融合したTobを安定に発現するHeLa.S3細胞株を樹立した。次に、この細胞から精製したTob複合体をSDS-PAGEにより展開しクマシー染色した結果、複数のバンドが検出され、それらをMALDI-TOF/TOFによって同定した。これらのうち250kDa付近のタンパク質は、転写制御やmRNA代謝に関わるCCR4-Not複合体の主要因子Cnot1であることがわかった。他にもCnot7を含むCCR4-Not複合体構成因子が多数同定された。またグリセロールグラジエント法によってCnot1、Tob、Cnot7が同じ複合体を形成していることもわかった。これらTob複合体因子群のなかでも、酵母や植物でも保存されており、複合体内でも足場としての機能が考えられているCnot1の機能について、RNAi法や過剰発現系用いた解析を進めた。RNAi法によって発現を抑制されたHaLa細胞の増殖は遅くなり、このことからもCnot1は細胞増殖の制御に何らかの影響をもっていることが示唆された。またcyclinD1プロモーターの活性を上昇することも見出した。上記のタンパク質精製においてmRNAのスプライシング制御に関わるSam68などのRNA結合タンパク質も複数同定され、これらのことからTobを含む複合体とmRNA代謝との関わりが推測された。Sam68の標的であるCD44 mRNAのスプライシングパターンをCnot1の過剰発現系で調べたところ、一部のバリアントフォームの発現が抑制された。以上、本研究によってCnot1が細胞周期の制御に関わっていることが示され、またCnot1のmRNAスプライシングとの関与を示唆するデータが得られた。私はTobタンパク質複合体と細胞周期調節機構との関わりを理解するために、MALDI-TOF/TOFによるTob複合体因子群の同定を試みた。この細胞の増殖はオリジナル細胞株に比べ遅く、これはTob複合体が細胞周期に何らかの機能を有していることが示唆された。次に、この細胞から精製したTob複合体をSDS-PAGEにより展開しクマシー染色した結果、複数のバンドが検出された。これらのうち250kDa付近のタンパク質は、転写制御やmRNA代謝に関わるCCR4-Not複合体の主要因子Not1 (Negative regulator of transcription 1)であることがわかった。他にCaf1 (CCR4-associated factor 1)を合むCCR4-Not複合体構成因子が多数同定された。また、mRNAのスプライシング制御に関わるSam68などのRNA結合タンパク質も複数同定され、これらのことからTobを含む複合体とmRNA代謝との関わりが推測された。これらTob複合体因子群のなかでも、下等生物や植物でも保存されており、複合体内でも足場としての機能が考えられているNot1の生物学的機能について、RNAi法や過剰発現系用いた解析を進めた。RNAiによって発現を抑制されたHaLa細胞の増殖は遅くなり、このことからもNot1は細胞増殖の制御に何らかの影響をもっていることが示唆された。また、Sam68の標的であるCD44 mRNAのスプライシングパターンをNot1の過剰発現系で調べたところ、一部のバリアントフォームの発現が抑制された。以上の結果から、Not1が細胞制御やmRNAの代謝に機能を有していることが考えられ、今後さらに解析を進め、これらの現象の確証が得られることを期待している。
希少放線菌が形成する遊走子の運動停止メカニズムの解明

本研究計画は希少放線菌Actinoplanes missouriensisが形成する遊走子を材料として、べん毛運動により水中を高速で遊走する細菌が外界の環境変化に応答して運動を停止する分子メカニズムの全容解明を目的としている。具体的には、遊走子の運動停止に必須のタンパク質として既に見いだしたFtgAの標的タンパク質の同定とFtgAの結合による運動停止機構の解明、およびFtgAの機能発現制御機構の解明を進めている。今年度はFtgAの組換えタンパク質、およびBacterial two-hybrid assayによってFtgAと相互作用することが示唆されていたべん毛タンパク質FliG, FliN, FliIの組換えタンパク質の発現と精製を行った。FtgAとこれら3種のべん毛タンパク質との相互作用をpull-down assayによって解析したところ、FtgA-FliN間およびFtgA-FliI間で相互作用を示す結果が得られた。この結果はFtgAがべん毛タンパク質に直接結合することで遊走子の運動停止時にべん毛の回転運動を停止させることを示唆する重要な成果である。ただし、pull-down assayで検出された相互作用は非常に微弱なものであったため、今後Surface plasmon resonance解析により結合の強度の定量を行い、FtgAによる相互作用のより詳細な解析を進める予定である。FtgAとべん毛タンパク質FliN, FliIとの相互作用については研究の進展が見られたが、in vivoでの相互作用解析やタンパク質の結晶構造解析、およびftgAの発現制御機構についての解析は実施できておらず、研究計画にやや遅れが見られる。FtgAの組換えタンパク質を発現、精製することには成功しているため、今後はこの組換えタンパク質を用いて抗FtgA抗体を作製し、pull-down assayやウエスタンブロット解析を進め、研究計画の完了を目指す。FtgAとFliG, FliN, FliIとの相互作用解析については、pull-down assayで検出された相互作用が微弱なものであったため、抗FtgA抗体を作製してウエスタンブロット解析を併用することで検出感度の向上を行う。並行してSurface plasmon resonance解析による相互作用強度の定量を進めるとともに、部位特異的変異導入によりFtgAとべん毛タンパク質との相互作用に重要な残基の同定を行う。また、FtgAの発現制御機構についても転写解析、ウエスタンブロット解析を行って、ftgAの発現時期を特定する。本研究課題は希少放線菌Actinoplanes missouriensisが形成する遊走子を材料として、べん毛による運動性を示す細菌が外界からのシグナルを感知して運動を停止する分子メカニズムの全容解明を最終的な目的としている。特に、これまでの研究成果により遊走子のべん毛運動の停止に必須であることが判明しているタンパク質FtgAと相互作用するタンパク質の同定、およびそれによりべん毛運動が停止する分子メカニズムの解明と、FtgAが運動停止時にのみ機能を発揮するよう制御している分子メカニズムの解明に焦点を絞り実験を進めている。本年度は大腸菌を用いたBacterial two-hybrid assayによりFtgAがべん毛基部を構成するタンパク質であるFliGとFliN、およびべん毛タンパク質を分泌するIII型分泌装置を構成するATPaseであるFliIと相互作用することを確認した。また、in vitroでFtgAとFliG、FliN、FliIとの相互作用を解析するため、大腸菌を宿主としてこれらの組換えタンパク質を発現し、精製した。一方、A. missouriensisの遊走子がFtgAの作用により運動を停止する際に必要となるタンパク質として、走化性の制御タンパク質CheYが機能していると予想し、cheY遺伝子破壊株においてFtgA依存的な遊走子の運動停止が見られるか観察を行った。その結果、A. missouriensisが持つ全てのcheY遺伝子を欠失させた変異株においてもFtgA依存的な遊走子の運動停止が観察されたことから、FtgAによるべん毛運動の停止機構にCheYタンパク質は関与していないことが判明した。FtgAとFliG、FliN、FliIとの相互作用をBacterial two-hybrid assayにより示し、これらの組換えタンパク質を大腸菌を宿主として発現、精製することに成功したことから、これらのタンパク質間の相互作用をin vitroで解析するための準備ができた。

FtgAとべん毛タンパク質FliN, FliIとの相互作用については研究の進展が見られたが、in vivoでの相互作用解析やタンパク質の結晶構造解析、およびftgAの発現制御機構についての解析は実施できておらず、研究計画にやや遅れが見られる。FtgAの組換えタンパク質を発現、精製することには成功しているため、今後はこの組換えタンパク質を用いて抗FtgA抗体を作製し、pull-down assayやウエスタンブロット解析を進め、研究計画の完了を目指す。精製したFtgA、FliG、FliN、FliIの組換えタンパク質を用いてpull-down assayや表面プラズモン解析を行い、FtgAがFliG、FliN、FliIと相互作用するかin vitroで解析を行う。相互作用が検出された場合、部位特異的変異導入により変異型タンパク質を作製し、検出された相互作用に必須の残基を探索する。また、FtgAタンパク質を抗原として抗FtgA抗体を作製し、FtgAタンパク質の局在解析とウエスタンブロット解析を行う。FtgAとFliG, FliN, FliIとの相互作用解析については、pull-down assayで検出された相互作用が微弱なものであったため、抗FtgA抗体を作製してウエスタンブロット解析を併用することで検出感度の向上を行う。並行してSurface plasmon resonance解析による相互作用強度の定量を進めるとともに、部位特異的変異導入によりFtgAとべん毛タンパク質との相互作用に重要な残基の同定を行う。また、FtgAの発現制御機構についても転写解析、ウエスタンブロット解析を行って、ftgAの発現時期を特定する。
赤痢菌VirG蛋白のアクチン結合性および重合化分子構造の解析

赤痢菌VirG蛋白のNおよびC末端のアミノ酸配列に対し、合成ペプチドを用いて抗体を作製した.菌体をトリプシン処理した前後の変化を上記抗体を用いたイムノブロットで解析すると、外膜蛋白であるVirGはN末端が菌体外に、C末端が外膜内に存在する一極構造を示すことが判明した.VirG蛋白をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化し、セファクリルS-300によるゲル漉過、ヒドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフィーにより精製した.SDSを除去した後、この精製蛋白とF-アクチンとの結合を超遠心によるcosedimentation assayにより調べた.VirGは濃度に依存してF-アクチンと結合することが認められた.さらにF-アクチンと反応させた後、negative染色による電子顕微鏡で観察すると蛋白がアクチン束に結合する像がみられた.pyrenを結合させたアクチンは重合すると蛍光強度が増加するが、これを用いてVirGとの関係を調べた.VirGはアクチンの重合および脱重合に関与していなかった.しかし、F-アクチンと結合した場合、その安定化に寄与していた.赤痢菌は上皮細胞に侵入し、細胞内拡散する.この時、菌体の一極にアクチン束の凝集がみられる.これにVirG蛋白が関与しているが、VirGはアクチンを重合するのではなく、F-アクチンを菌体に結合させ、アクチン束の形成を促す場を提供するのではないかと考えられる.以上の内容は現在投稿中である.赤痢菌VirG蛋白のNおよびC末端のアミノ酸配列に対し、合成ペプチドを用いて抗体を作製した.菌体をトリプシン処理した前後の変化を上記抗体を用いたイムノブロットで解析すると、外膜蛋白であるVirGはN末端が菌体外に、C末端が外膜内に存在する一極構造を示すことが判明した.VirG蛋白をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化し、セファクリルS-300によるゲル漉過、ヒドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフィーにより精製した.SDSを除去した後、この精製蛋白とF-アクチンとの結合を超遠心によるcosedimentation assayにより調べた.VirGは濃度に依存してF-アクチンと結合することが認められた.さらにF-アクチンと反応させた後、negative染色による電子顕微鏡で観察すると蛋白がアクチン束に結合する像がみられた.pyrenを結合させたアクチンは重合すると蛍光強度が増加するが、これを用いてVirGとの関係を調べた.VirGはアクチンの重合および脱重合に関与していなかった.しかし、F-アクチンと結合した場合、その安定化に寄与していた.赤痢菌は上皮細胞に侵入し、細胞内拡散する.この時、菌体の一極にアクチン束の凝集がみられる.これにVirG蛋白が関与しているが、VirGはアクチンを重合するのではなく、F-アクチンを菌体に結合させ、アクチン束の形成を促す場を提供するのではないかと考えられる.以上の内容は現在投稿中である.
超高倍率X線顕微鏡が拓く3D/4Dメゾスケール材料科学

本研究では、大別して14Dイメージング周辺技術の整備、2先端実験技術開発、3定量解析技術、画像応用解析技術の整備の3点からアプローチしている。これにより、SPring-8の優れたシンクロトロン放射光技術が材料工学、機械工学の分野で応用成果に結び付くよう先導する。本年度は、まず昨年度までに達成されたイメージング技術の応用として、通常のX線イメージングに加えて超高分解能ゼルニケ位相コントラストX線イメージングを用いて、水素が誘起すると考えられる応力腐食割れの発生プロセスを解析した。亀裂前方の粒界上に存在するβ相であるAl3Mg2が腐食環境中にさらされることで溶出し空隙を生成した。その空隙を亀裂が通過するように進展するため、水素脆化に代表される擬へき開亀裂及び粒界亀裂ではなく、粒内亀裂が発生したと考えられた。Al3Mg2を減少させた試料を用いて、応力腐食割れの発生プロセスのより深い解析を行うことでAl3Mg2を減少させた試料で応力腐食割れは発現せず、Al3Mg2の存在が応力腐食割れには不可欠であることが明らかとなった。次に、鋼に位相コントラストイメージングを適用することにより、二相組織の可視化に取り組んだ。超高分解能ゼルニケ位相コントラストX線イメージングを用いて、二相組織の変態挙動のその場観察に成功した。さらに1ミクロン径まで細く絞ったX線を用いたXRD実験により、ミクロンオーダー変態挙動の結晶学的解析を行った。これまでに、20keVのX線顕微鏡と4D(3D+時間)観察のセットアップに加え、30keVのイメージングにも成功している。そして、それらイメージングの条件の調整、改良等も当初計画よりかなり前倒しで進行している。おおむね、現在の進行状況は初期のタイムスケジュールより1年先行している。SPring-8のBL20XUにおいて30keVの超高分解能X線顕微鏡の実験を行うためにセットアップをさらに改善する予定である。TRIP鋼では、試料全体にわたる相変態および損傷・破壊挙動へ及ぼす変態の影響を理解するために、超高分解能X線顕微鏡法によるその場引張試験を行うと同時に、1μmまで絞ったビームを用いたXRD実験を行う。これを解析することで実用的なレベルの結晶組織を持つTRIP鋼の引張負荷下の相変態挙動を明らかにする。また、Al-Zn-Mg-Cu系アルミニウム合金の変形時の各種トラップサイト間の水素の再分配挙動を高精度化する。そのため、η2析出物、および金属間化合物粒子のトラップサイトを特定し、それらの情報を取り入れた高精度な水素分配計算を実施する。最高水準の分解能の超高分解能X線顕微鏡観察を、SPring-8のBL20XUにおいて20keVの条件で実施した。このシステムは、高精度ステージ、コンデンサゾーンプレート(CZP)、CZPのオーダーソートアパーチャとしてのピンホール、フレネルゾーンプレート(FZP)、位相板およびX線画像検出器で構成されている。現行の投影型X線トモグラフィーと比較して、超高分解能X線顕微鏡の空間分解能は1μmから100nmまで向上し、ナノサイズの微細構造を3Dで特徴を明らかにすることができる。超高分解能X線顕微鏡は、Al-Zn-Mg-Cuアルミニウム合金の変形中の水素誘起ナノボイドおよびTRIP鋼の変形中の局所的なγ相変態の3次元観察に適用された。水素誘起ナノボイドは、変形中にAl-Zn-Mg-Cuアルミニウム合金のアルミニウムマトリックスにおいて均一に核生成し、その高いトラップ密度に起因して水素の再分配挙動に重要な役割を果たすことが明らかにされている。一方、γ相の変態速度、大きさ、形状との関係が証明された。不規則形状γ相の変態速度は、不規則形状γ相の鋭い角部における歪集中と高い応力3軸性に起因し、球形状の変態速度と比べて高くなっている。初年度の計画と比較して、20keVのX線顕微鏡と4D(3D +時間)観察のセットアップが完了した。X線顕微鏡法では、画像スライスは従来のフィルタ逆投影アルゴリズムに基づいて再構成され、ボクセルサイズは62nm3である。Al-Zn-Mg-Cu合金では、変形中に水素誘起ナノボイドが試料全体にわたって観察された。対照的に、透過率が低いため、TRIP鋼では非常に薄い試験片および局所的な観察を行った。TRIP鋼の損傷および破壊挙動の評価には、30keVのX線顕微鏡が必要である。おおむね現在の進捗状況は初期のタイムスケジュールより1年先となっている。

Al3Mg2を減少させた試料を用いて、応力腐食割れの発生プロセスのより深い解析を行うことでAl3Mg2を減少させた試料で応力腐食割れは発現せず、Al3Mg2の存在が応力腐食割れには不可欠であることが明らかとなった。次に、鋼に位相コントラストイメージングを適用することにより、二相組織の可視化に取り組んだ。超高分解能ゼルニケ位相コントラストX線イメージングを用いて、二相組織の変態挙動のその場観察に成功した。さらに1ミクロン径まで細く絞ったX線を用いたXRD実験により、ミクロンオーダー変態挙動の結晶学的解析を行った。これまでに、20keVのX線顕微鏡と4D(3D+時間)観察のセットアップに加え、30keVのイメージングにも成功している。そして、それらイメージングの条件の調整、改良等も当初計画よりかなり前倒しで進行している。おおむね、現在の進行状況は初期のタイムスケジュールより1年先行している。翌年中に、SPring-8のBL20XUにおいて30keVの超高分解能X線顕微鏡の実験を行うためにセットアップを改善する予定である。TRIP鋼では、試料全体にわたる相変態および損傷・破壊挙動へ及ぼす変態の影響を理解するために、超高分解能X線顕微鏡法によるその場引張試験を行う。また、Al-Zn-Mg-Cu系アルミニウム合金の変形時の各種トラップサイト間の水素の再分配挙動とナノボイドの発展挙動に及ぼす粒子の影響について検討する。一方、今年度に得られた実験結果と革新的な成果を論文として投稿予定である。SPring-8のBL20XUにおいて30keVの超高分解能X線顕微鏡の実験を行うためにセットアップをさらに改善する予定である。TRIP鋼では、試料全体にわたる相変態および損傷・破壊挙動へ及ぼす変態の影響を理解するために、超高分解能X線顕微鏡法によるその場引張試験を行うと同時に、1μmまで絞ったビームを用いたXRD実験を行う。これを解析することで実用的なレベルの結晶組織を持つTRIP鋼の引張負荷下の相変態挙動を明らかにする。また、Al-Zn-Mg-Cu系アルミニウム合金の変形時の各種トラップサイト間の水素の再分配挙動を高精度化する。そのため、η2析出物、および金属間化合物粒子のトラップサイトを特定し、それらの情報を取り入れた高精度な水素分配計算を実施する。
肺腺癌の上皮間葉転換におけるエピジェネティックス異常とリプログラミング機構の解析

2)EMT形質を示す肺腺癌では、クロマチンレモデリング因子BRG1, BRMの発現消失、遺伝子変異がみられる。BRMのノックダウンにより、細胞形態の紡錘形化、E-cadherinの低下などEMTの形質が誘導されることを明らかにした。3)non-TRU typeの形態を示す肺腺癌を次世代シーケンサーにより解析し、この症例群ではTTF-1の失活変異が高頻度にみられることを発見した。TTF-1陰性の症例では、TTF-1遺伝子領域がメチル化されており、TTF-1陰性の肺癌細胞に脱メチル化剤を添加するとTTF-1遺伝子の発現が一部回復した。以上、non-TRU typeの肺腺癌ではヒストン修飾の異常、クロマチンレモデリング因子BRG1, BRMやTTF-1遺伝子の失活により分化異常が起きている可能性が考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により、肺腺癌ではクロマチンレモデリング因子であるBRMとBRG-1の発現低下が、高中分化症例に比し低分化症例で多くみられること、上皮間葉転換の形質(E-cadherinの低発現、Vimentinの高発現)と相関することを示している。今年度は、まずこのような関係が広く非小細胞肺癌でもみられるかについて検討を行った。検討に用いた症例は、肺腺癌70例,扁平上皮癌25例、大細胞癌16例,多形癌22例である。免疫染色により、BRG1,BRMの発現を解析した。その結果、BRG1,BRMの発現低下は、腺癌と扁平上皮癌をあわせた群ではそれぞれ7%と15%であるのに対し、大細胞癌と多形癌をあわせた群ではそれぞれ34%と45%と有意に高頻度にみられることが判明した。BRMとBRG-1の低下による癌細胞の形質の変化を検討するため、レンチウルスベクターを用いてノックダウン実験を行った。その結果、肺腺癌細胞H1975とHCC4006では、BRMのノックダウンにより細胞の紡錘形化の誘導が比較的短期間で起きることを見出した。細胞形態の変化は上皮間葉転換(EMT)を示唆しているが、形態変化の前後でE-cadherinの発現の変動はみられず、これまで一般的に考えられてきたEMTとは異なる分子機構を介している可能性が示唆されている。現在、その分子機構をさらに検討している。これまでの研究により、上皮形質の低下した低分化な非小細胞肺癌においてクロマチンリモデリング因子BRM, BRG-1の発現低下が高頻度にみられることを明らかにしている。BRM, BRG-1の発現低下と細胞分化、上皮形質の喪失(上皮間葉転化; EMT)の間の因果関係を明らかにするためレンチウイルスベクターを用いたノックダウン実験を行った。肺腺癌細胞H1975は多角形の上皮形態のシート状増殖を示すやや低分化な細胞であるが、BRMのノックダウンにより細胞の形態が紡錘形へと変化することが観察された。BRM-KD細胞はNOD/SCIDマウスの皮下に移植したところ、ヒトの肉腫様癌に似た紡錘形細胞からなる癌が形成されることを確認した。BRMのノックダウンによりEMT形質が誘導されたことは、タンパク、mRNAレベルにおいてE-cadherinの低下、Vimentinの発現上昇を認めることによりさらに確認された。BRMのノックダウンによるEMT誘導に相関してglobalなヒストン修飾の変化が起きているかをwhole cell lysateを用いたWestren blotで検討してみたが、有意な変化はみられなかった。EMTの制御転写因子として、zeb1, snail, slugが知られている。これらの発現を検討した結果、EMT形質の誘導と最も相関するのはZeb1であることが判明した。BRMのノックダウンが何らかの機構よるzeb1誘導を介して起きていることが示唆された。研究分担者の佐久間は、EGFR阻害剤の耐性化とEMTについての研究を行っている。これまでの研究により、T790M, MET増幅のような二次変異のほかに、オートファジーが関与することを示してきたが、さらに今回はPIN1 (prolyl isomerase)がEGFR耐性に関わっていることを明らかにした。BRMのノックダウン実験によりEMT形質を誘導できたことは研究計画全体の中で重要なmilestoneと考えている。さらにEMTの誘導と相関してzeb1の誘導を起きていることを見出しており、BRMによるEMTの制御機構を解明するうえで重要な手がかりとなっている。これまでの研究により、上皮形質の低下した低分化な非小細胞肺癌においてクロマチンリモデリング因子BRM, BRG1の発現低下が高頻度にみられることを明らかにした。さらにレンチウィルスベクターを用いてBRM, BRG1のノックダウンを行ったところ、肺腺癌細胞H1975では、BRMのノックダウンにより1)多角形の上皮様の形態から紡錘形の肉腫様細胞へと形態変化が誘導されること、2)E-cadherinの低下、Vimentinの誘導など上皮間葉転換(EMT)の形質が誘導されていることも確認してきた。本年度の実績は、以下のとおりである。A)様々な培養条件下での増殖能を検討した。

その結果、BRMをノックダウンしたH1975細胞では、1)血清依存性が低下すること、2)接着阻害の喪失がみられること、3)足場非依存性の増殖能が増すことが判明した。B)近年、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、リジンメチル基転移酵素阻害剤、リジン脱メチル化酵素阻害剤など、さまざまなヒストン修飾酵素の阻害剤が開発されている。そこでこれらエピジェネティク阻害剤ならびにシスプラチン,ゲムシタビン,タキソール,塩酸イリノテカンなどの化学療法剤への感受性を検討した。その結果、BRMをノックダウンしたH1975細胞では、1)ヒストン脱アセチル化阻害剤への感受性が増すこと、2)ゲムシタビンへの感受性が低下することが明らかとなった。BRMのノックダウンによりEMT形質が誘導されることに加え、増殖能や薬剤感受性の違いが誘導される点をさらに明らかにすることができた。これまでの研究により、上皮形質の低下した低分化な肺腺癌(肺腺癌全体の10%程度)においてクロマチンリモデリング因子BRM, BRG1の発現低下が高頻度にみられることを明らかにしてきた。肺本来の上皮形質をよく保持した腺癌は、肺胞置換性ないし乳頭状の組織形態を示すことが多いが、これに対し肺本来の分化形質の発現が低下した腺癌では粘液産生性の腺癌や充実増殖を示す低分化腺癌の形態を示すことが多く、また既知のドライバー変異が見つかる頻度が低い。そこで粘液産生性あるいは充実増殖を示す腺癌43症例を形態学的に選出し、次世代シーケンサによる全エキソーム解析を行った。その結果、以下の知見を見出した。(2)Bisulfate sequencingによりTTF-1遺伝子領域のメチル化を解析したところ、TTF-1の発現低下した症例では、TTF-1遺伝子のintron 1からその3'領域が広範囲にメチル化されていた。TTF-1陰性の肺癌細胞に脱メチル化剤を添加するとTTF-1遺伝子の発現が一部回復した。TTF-1陰性の肺腺癌は肺腺癌全体の20-30%を占め、これまで見出されたEFGR, ALKなどの主要なドライバー変異が見つかる頻度は低い。TTF-1の失活変異あるいはDNAのメチル化による発現低下は、肺本来の分化形質の発現が低下した腺癌の発癌過程において重要な意義をもつものと考えられる。研究過程で、偶然ではあるが、TTF-1遺伝子の失活変異という興味ある発見をしたため、その変異解析、メチル化解析を優先的に行う必要が生じ、当初予定していた、E-cadherin, ZEB1のプロモーター解析、ヒストン修飾の解析が遅れることとなった。現在、TTF-1についての研究は論文にまとめてすでに発表しており、現在、当初予定した解析に戻って研究を行っている。2)EMT形質を示す肺腺癌では、クロマチンレモデリング因子BRG1, BRMの発現消失、遺伝子変異がみられる。BRMのノックダウンにより、細胞形態の紡錘形化、E-cadherinの低下などEMTの形質が誘導されることを明らかにした。3)non-TRU typeの形態を示す肺腺癌を次世代シーケンサーにより解析し、この症例群ではTTF-1の失活変異が高頻度にみられることを発見した。TTF-1陰性の症例では、TTF-1遺伝子領域がメチル化されており、TTF-1陰性の肺癌細胞に脱メチル化剤を添加するとTTF-1遺伝子の発現が一部回復した。
コスタリカの「文化鑑定」に関する人類学的研究

本研究は、コスタリカの事例をとおして、当該社会のマイノリティとなっている人びとの視点から「正義へアクセスする」ということの意味を問い直す試みであり、最終年度となる本年は前年度に引き続き現地調査を行うとともに研究成果を国内外で報告した。現地調査は12月に実施し、コスタリカ南部の先住民居住区内およびその周辺地域での聞き取り調査や参与観察が主であった。具体的な成果としては、以前は接触が難しかった年長者の見解を聞くことができた点や、ここ数年間に居住区内で発生した事件のうち慣習法裁判所へ届けられそこで解決された紛争事例の補足的情報を得られた点などがある。また、先住民居住区内で発生した事件が居住区外の従来どおりの裁判所で国家法によって裁かれる様子も傍聴した。このことで、一般の裁判所へ届けられた先住民を当事者とする紛争事例のうち、文化鑑定が実施されなかった場合であっても、実際の公判では先住民の文化が重視されている様子を傍聴席から観察し記録することができた。国内における日本語での研究発表では、ラテンアメリカ地域研究や法人類学の国内外の研究動向を踏まえ、コスタリカの先住民居住区内の新たな司法機関として期待される慣習法裁判所の成り立ち・現状や、この慣習法裁判所での具体的な紛争事例、それらの紛争が解決されるまでの詳細について報告した。国外における英語およびスペイン語での発表では、日本社会のマイノリティ(外国人や先住民)に対する司法サービスの現状と課題を紹介した上で、コスタリカでの文化鑑定の実施状況や慣習法裁判所の取り組み、またそこでの研究者の関わり方について報告した。日本、コスタリカ、アメリカ合衆国、メキシコなど世界各国の人類学者や関連領域の研究者らからフィードバックを得るとともに、研究成果の一部をコスタリカの研究者らと共に英語とスペイン語の出版物として二言語で発表することも決定した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、「文化鑑定(peritaje cultural)」が実施された裁判事例を検証することによって、コスタリカ社会におけるマイノリティとなっている「先住民」の現状や、これらの人びとの「文化」とマジョリティの人びとの「文化」との関わり方について、主に質的方法を用いてその実態を明らかにすることである。コスタリカの「文化鑑定」とその関係者の実情を民族誌的に記述し考察することをとおして、より普遍的なテーマである「マイノリティにとっても公平な裁判のあり方」について考える。本年度は、コスタリカの首都周辺(主要司法機関の所在地)と先住民居留地にて、夏と冬の2回にわたって現地調査を実施し、裁判資料の収集、コスタリカ検察庁の職員、研究者、先住民居留地住民からの聞き取り調査、先住民居留地内での参与観察を行った。とりわけ大きな成果としては、「慣習法裁判所」を有するカバグラ先住民居留地内での参与観察と聞き取り調査より得られた「文化鑑定」に対する居留地住民の見解、「慣習法裁判所」の誕生背景、「慣習法裁判所」に持ち込まれる事件の概要、当事者の属性等を挙げることができる。これらのデータより、法律実務家や「文化鑑定士」の視点だけではなく、当事者である先住民居留地住民の視点を踏まえた上で「文化鑑定」について研究を進めて行くための土台をつくることができた。また、関連分野の学術大会や勉強会に参加することによって、他国の類似事例や法律実務の現状についての情報も収集した。国際学会での研究発表では、ここまでの調査内容についてスペイン語で口頭発表を行い、国内外の研究者から広くフィードバックを受けた。本研究の目的は、コスタリカ先住民が当事者となった具体的な裁判事例や、文化鑑定(peritaje cultural)と呼ばれる司法鑑定の実施に直接ないしは間接的に関わるさまざまな人びと(先住民の当事者、当事者の親族あるいは先住民居住区に暮らす住民、文化鑑定人を務める文化人類学者、文化鑑定のユーザーである検察官・弁護士・裁判官など法律実務家)の視点や見解を民族誌的に描写することによって、コスタリカ社会のマイノリティとなっている先住民が正義(法的サービスを含む)へアクセスするということの意味や国家法と先住民の慣習法との関係を明らかにすること、そしてこれらを人類学的な視点から考察することである。本年度は6月から12月にかけてコスタリカでの約半年間の現地調査を実施した。今回の現地調査では、前年度に行った短期滞在型の調査をとおして部分的には明らかになっていたカバグラ慣習法裁判所(Tribunal de Derecho Consuetudinario de Cabagra, TDCC)(TDCCはカバグラ先住民居住区に暮らす先住民ブリブリが主体となって居住区内で発生した係争・紛争をブリブリの慣習法にもとづいて対処する住民組織の名称である。)の成り立ちや現在のあり様、TDCCがカバグラ先住民居住区内外に及ぼす社会的文化的な影響、あるいはTDCCの拠り所ともなっている先住民ブリブリの慣習法と国家法とのダイナミックな関係性について、より全体的な理解を深めることができた。今回の調査により、より多くの貴重な民族誌的データや、裁判事例に関する豊富な資料を得られた。このことより、来年度も引き続き行う分析と考察の内容をさらに深めていくことが可能となった。本年度は、当初の計画どおり、約半年間の現地調査を行った。現地調査中は、カバグラ慣習法裁判所(TDCC)のあるカバグラ先住民居住区にて、住み込みのボランティアスタッフとしてTDCCの運営・活動に実際に参加することができた。このため、同地で発生している係争・紛争の内容や、それに対するTDCCの対応プロセス、TDCCの成り立ちと現状、さらには先住民ブリブリの慣習法と呼ばれるようなものがTDCC内そして日常生活の中でどのように実践されているのかについて、フィールドノート、録音データ、TDCC作成の裁判記録や資料等さまざまな形式の貴重なデータを豊富に収集することに成功した。