hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
維管束植物の頂端分裂組織の進化を原形質連絡ネットワークから探る

頂端分裂組織の進化を解明するため、維管束植物14科19種の根端の透過電子顕微鏡観察を用いて、根端分裂組織の原形質連絡(PD)ネットワークを比較した。種子植物とシダ植物小葉類の複数始原細胞群型根端のPD密度は全体的に低い値であったが、シダ植物大葉類と小葉類の頂端細胞型根端のPDは頂端細胞を頂点として、約3倍の高い密度を示した。このPDネットワーク2タイプは、分類群ではなく根端構造の違いと強く相関する点、茎頂と同様であった。初年度として、シダ植物大葉類と小葉類の根端分裂組織のPDネットワーク解析を行った。大葉類では、初期の分岐群であるゼンマイとリュウビンタイ、そして派生的な分岐群であるイワヒメワラビを材料に用いた。これらはともに頂端細胞を1個もつ頂端分裂組織であり、ともに頂端細胞とこれらに隣接する細胞群を頂点として高い原形質連絡密度を示した。この値はそれぞれの茎頂分裂組織に匹敵し、数十個/1μm^2にも及んだ事から、茎頂と同様lineage specific PDネットワーク(LPD、大葉類型)の名称を用いることとした。小葉類では頂端細胞型を示すクラマゴケ類と、複数始原細胞群型を示すヒカゲノカズラ類(トウゲシバ、ミズニラモドキ、とヒカゲノカズラ)を解析した。頂端細胞型のクラマゴケ類は、大葉類と同様、頂端細胞とまわりの細胞群を頂点とする高い密度(数十個/1μm^2)をもつLPDネットワークを示した。これに対して、複数始原細胞群型のヒカゲノカズラ類の根端の原形質連絡密度は、数個/1μm^2と、極端に低い値をもつことが示された。これらの値は、茎頂での値と良く似ており、interface specific PDネットワーク(IPD、種子植物型)と考えられる。以上から、(1)根端分裂組織も茎頂分裂組織とほぼ同様の値のPD密度をもつこと、(2)頂端細胞型の根端をもつ大葉類は大葉類型PDネットワークを示すこと、そして(3)小葉類は根端分裂組織が頂端細胞をもつか否かで、大きく異なり、シダ植物であるにも係わらず、大葉類型PDネットワークと種子植物型PDネットワークの両方をもつこと、が示された。昨年度までの本研究にてデータが不足していた裸子植物について、針葉樹綱(アカマツ)、イチョウ綱(イチョウ)、ソテツ綱(ソテツ)、グネツム綱(グネモングネツムGnetum gnemon)とシニカエフェドラEphedra sinica)を材料に、根端分裂組織を構成する細胞群の細胞壁の原形質連絡密度を求めた。イチョウとグネツムは新鮮な根を得ることが困難であったため、取木によって発根させたものを材料に用いた。結果として、裸子植物の根端分裂組織は、被子植物のそれと同様,最高10.0/μm^2の原形質連絡密度を示した。したがって裸子植物の根端分裂組織の構造多様性、すなわち、根冠に発達したカリプトラをもつ(例アカマツ)か否(グネーツム)か、という特徴の違いには関係なく、すべて低い値の原形質連絡密度をもつことがわかった。シダ小葉類については、根端分裂組織が、シダ植物大葉類と同様の1個の頂端細胞をもつか、複数の始原細胞群をもつかによって大きく異なる原形質連絡ネットワークを持つ事がわかった。頂端細胞型のマルテンシクラマゴケの原形質連絡密度は最高60-70/μm^2であるのに対して、複数始原細胞群をもつカゲノカズラは最高10.0/μm^2であった。前者はシダ植物大葉類のイワヒメワラビで得た数値と同じであり、後者は裸子植物、被子植物で得たのと同様の数値であった。以上から、根端分裂組織が1個の頂端細胞をもつか、複数の始原細胞群をもつかによって、原形質連絡ネットワークが異なることが示された。系統群による違いはみられなかった。この結果は、茎頂分裂組織におけるImaichi and Hiratsuka(2008)の結果と同様であり、シュートと根の間に違いがないことが明らかになった。この事実は、4億年前の軸状構造テロムが茎と根を進化させる以前に頂端分裂組織の構造と原形質連絡ネットワークとの間に密接な関係が確立していたことを示すものであり、茎と根の起源を解明する上で重要な情報となると考えられる。本研究の最終年度として、これまでに不足していたデータの補完を行い、結果の総括を行った。被子植物2綱4科4種、裸子植物4綱4科4種、シダ植物大葉類4科5種、シダ植物小葉類3科6種の根端分裂組織構成細胞の細胞壁の原形質連絡(PD)密度を透過電子顕微鏡観察から明らかにした。

その結果、根端分裂組織の構造と原形質連絡(PD)ネットワークとの間には高い相関があることが示された。すなわち1個の頂端細胞をもつシダ植物大葉類とシダ植物小葉類の一部では、根端分裂組織における最高値は>48.0±5.6/μm2であった。これに対して複数始原細胞群をもつ種子植物とシダ植物小葉類の残りでは最高値はく19.8±0.0/μm2であり、両者の間に2倍以上の開きがみられた。被子植物と裸子植物との間には違いはみられなかった。一方シダ植物においては、始原細胞が1個か複数かによって大きくPDネットワークが異なり、特筆すべきは小葉類において始原細胞が1個であれば大葉類型、複数であれば種子植物型を示したことである。根端分裂組織のPDネットワークは、植物分類群による違いではなく、分裂組織の構造、特に始原細胞の数の違いによって2つのタイプに分けられる事が示され、これは茎頂分裂組織と全く同様であった。本結果は頂端分裂組織をもつ1個の軸(テロム)から茎と根が作られたとする仮説を支持するものである。さらに頂端分裂組織の起源を解明するため、茎・葉・根を進化させていないコケ植物ヒメツリガネゴケ胞子体のPDネットワークを観察した。結果、コケ植物のPD密度はシダ植物大葉類と種子植物の中間の値ではあるが、発生初期には頂端部で高いことから、PDネットワークはシダ植物大葉類と小葉類の一部がもつ頂端細胞型に近いことが示唆され、コケ植物の胞子体はテロムと比較できる可能性が高いと考えられる。
EAF2による自己反応性胚中心B細胞の除去機構の解明

今年度では、EAF2により誘導されるB細胞のアポトーシスがBCL-2により抑制されるかどうかについて解析を行った。胚中心B細胞由来の細胞株Daudiにて、レトロウイルスベクターを用いてEAF2を一過性に過剰発現させると、30%の細胞がアポトーシスに陥った。この際、同時にBCL-2を発現させると、アポトーシス細胞の割合が半分程度に減少した。即ち、EAF2により誘導されるDaudi細胞のアポトーシスがBCL-2発現により部分的に抑制されることが判明した。今後さらに細胞株の種類を増やして、EAF2とBCL-2の機能的相互作用を明らかいにしていきたい。また、EAF2のターゲット遺伝子についても解析を進めた。その結果、EAF2がB細胞機能に密接にかかわる複数の遺伝子の発現を制御していることが分かった。今年度はさらに加齢EAF2欠損マウスにおいて、新たに以下のことが判明した。12か月齢のEAF2欠損マウスにおいて、腹腔および腋窩リンパ節が著しく肥大し、同月齢のWTマウスのリンパ節に比べ、細胞数が約4倍に増えていた。さらにFACSで調べたところ、EAF2欠損マウスのリンパ節に含まれている細胞の約80-90%がB細胞であった。即ち、加齢に伴い、EAF2欠損B細胞が異常増殖していることが明らかになった。今後、EAF2欠損マウスのリンパ節の組織染色やクローン増殖の有無について解析し、これらの異常増殖しているB細胞の性質を明らかにしていく。一部の実験は若干遅れているものの、新たに加齢マウスにおいてB細胞の異常増殖が見られた。全体としては順調に進展している。今後は、1)EAF2とBCL-2ファミリーの機能的相互作用の解析;2)EAF2ターゲット遺伝子の絞り込みと機能解析;3)加齢EAF2欠損マウスのリンパ節で異常増殖しているB細胞の性質の解明。これらの項目に重点を置いて研究を進めていく。今年度では、種々の刺激により活性化されたB細胞のアポトーシスに果たすEAF2の役割を解明するために、in vitroの培養系を用いて以下の実験を行った。1)WT及びEAF2欠損マウスより胚中心B細胞を多く含むリンパ節細胞を無菌的に回収し、無刺激並びにF(ab')2-anti-IgM抗体、CD40リガンド、LPS、BAFF、anti-FAS抗体などの存在下で48時間培養した後、Annexin-Vと7ーAADで染色し、生細胞の割合を解析した。その結果、EAF2欠損マウス由来のB細胞は、WTマウス由来のB細胞に比べ、いずれの培養条件下においても生存率が有意に高かった。この結果から、EAF2は、胚中心B細胞のみならず、in vitroで活性化されたB細胞の細胞死も促進することが示唆された。さらに、EAF2がFASによるアポトーシスをも促進することが判明した。2)レトロウイルスベクター(pMX-IRES-GFP並びにpMX-IRES-CD8a)を用いて、LPSで刺激した脾臓B細胞及びB細胞株WEHI231でEAF2を一過性に発現させると、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。即ち、EAF2欠損と過剰発現の両方の実験から、EAF2が胚中心B及び活性化B細胞のアポトーシスを促進することを明らかにした。3)BCL-2を発現するレトロウイルスベクターを構築した。脾臓B細胞でBCL-2を一過性に発現させると、B細胞のアポトーシスが抑制されることを確認した。これらの実験で樹立したEAF2によるアポトーシス誘導とBCL-2によるアポトーシス抑制のin vitro培養系を用いて、次年度ではEAF2によるB細胞アポトーシス誘導に果たす役割をさらに詳しく調べたい。平成29年度中に実施予定の実験のうち、In vitroでの実験は予定通り行うことができた。一方、In vivoの実験については、マウスの飼育場所不足により、充分な匹数のWTとEAF2欠損マウスを確保できず、実施することができなかった。その代わり、平成30-31年度に予定していたEAF2による遺伝子発現制御およびEAF2とBCL-2ファミリーの機能的相互作用の実験のために、pMX-IRES-BCL-2をはじめ、いくつかの発現ベクターを構築することができた。全体としては、ほぼ計画通り進展している。

さらにFACSで調べたところ、EAF2欠損マウスのリンパ節に含まれている細胞の約80-90%がB細胞であった。即ち、加齢に伴い、EAF2欠損B細胞が異常増殖していることが明らかになった。今後、EAF2欠損マウスのリンパ節の組織染色やクローン増殖の有無について解析し、これらの異常増殖しているB細胞の性質を明らかにしていく。一部の実験は若干遅れているものの、新たに加齢マウスにおいてB細胞の異常増殖が見られた。全体としては順調に進展している。次年度では、1)WT及びEAF2欠損マウスのリンパ節細胞の培養実験について、F(ab')2-anti-IgM抗体、CD40L、LPS、BAFF、anti-FAS抗体の濃度及び刺激時間を変えて実験を行う。さらに胚中心B細胞をセルソーターで分離し、同様な実験を行う。2)レトロウイルスベクターを用いて、B細胞でEAF2単独またはBCL-2とともに発現させ、EAF2によるB細胞アポトーシスがBCL-2によってレスキューされるかどうかを明らかにする。これらの実験により、EAF2とBCL-2の機能的相互作用の有無を解明する。さらにin vivoにおけるB細胞アポトーシスに果たすEAF2の役割や、EAF2が制御する遺伝子群の解析も進める予定である。今後は、1)EAF2とBCL-2ファミリーの機能的相互作用の解析;2)EAF2ターゲット遺伝子の絞り込みと機能解析;3)加齢EAF2欠損マウスのリンパ節で異常増殖しているB細胞の性質の解明。これらの項目に重点を置いて研究を進めていく。今年度は主にin vitroの培養実験を中心に実験を進めたので、比較的少ない費用で研究できた。来年度では、多くのin vivoの実験を行うので、マウスの飼育及び購入費用、さらにマウスに投与する抗原や刺激用の抗体の購入費用など多額な経費を計上する必要がある。そのために、今年度の余剰金を来年度に繰り越して使用する必要がある。理由:次年度では、マウスを用いた実験が予定されており、多額なマウス飼育費及び解析費用が必要なため、今年度の実験費用を最小限に抑えた。使用計画:マウス飼育費、肥大リンパ節の解析、病理切片の作製など。
Aβ・タウ蛋白を標的とした1分子蛍光法によるアルツハイマー病予防・改善物質の探索

Nigella sativaの種はblack seedあるいはblack cuminとして知られ、アジア、中東、アフリカでアユルベーダ医学として治療目的に使われている。Thymoquinone(TQ)は、Nigella sativaの種の最も生理活性のある主要な精油成分である。これまでの研究により、TQはアルツハイマー病に特異的なアミロイドβ(Aβ)により誘発される神経毒性や細胞毒性に対して海馬や大脳皮質の神経や人工多能性幹細胞由来神経を保護することが知られ、我々は、TQがオリゴマーAβによるSH-SY5Y細胞死を阻害しグルタミン酸誘発毒性に対してSH-SY5Y細胞を保護することを示した。Aβ_<1-42>線維形成に対するTQの阻害機構は未解明であり、そのメカニズムを明らかにすることを目的に研究を行った。1.蛍光色素チオフラビンT (ThT)を用いてTQのAβ_<1-42>凝集抑制作用を検討した。ThTは凝集したAβと結合すると蛍光を発する。TQ存在下・非存在下でAβ_<1-42>溶液の蛍光強度を比較した。0.053μMTQは蛍光強度を減少させAβ_<1-42>線維化に対して有意な阻害効果を示した。2. Aβ_<1-42>ペプチドの10番目のチロシン(Tyr10)の蛍光強度を測定しAβ_<1-42>の局所環境について検討した。TQ存在下蛍光強度は顕著に減少しTQがAβ_<1-42>の局所環境を保護し線維形成しにくい状態にすることを示唆した。3.一分子蛍光分析システム(FCS)を用いてTQによるAβ_<1-42>凝集抑制作用を検討した。FCSは並進拡散時間を測定することにより蛍光物質の大きさを測定することが可能であり、Aβ_<1-42>の凝集が進むと分子が大きくなるため並進拡散時間は増加する。3μMTQはAβ_<1-42>の並進拡散時間を顕著に減少させAβ_<1-42>線維形成の初期段階を阻害することを示唆した。
小学校児童のバリスティックな動作におけるパワー発揮の発達に関する研究

本研究は、バリスティックな動作中におけるパワーに着目し、小学校児童における瞬発的なパワー発揮の発達を検討することを目的とした。また、バリスティックなパワー発揮能力を評価するためのドロップジャンプの至適な台高についても検討した。本研究では、北海道教育大学附属函館小学校の1年生から6年生までの健康な男子および女子児童、各学年10名ずつ(計120名)を被検者とした。ドロップジャンプにおける踏切時間、跳躍時間を計測し、P-INDEXの算出を行った。また、バリスティックな動作の条件(踏切動作に要する時間が0.2秒以内)を満たすドロップジャンプの至適な台高設定のため、各学年の児童について30cm、20cmの台高におけるドロップジャンプを行わせた。得られた成果は次の通りである。1.バリスティックな能力を評価するための至適なドロップジャンプ高については、4年生以上の男女児童では、成人同様、30cmの台高からの能力の評価は妥当であった。それに対し、3年生以下の男女児童では、30cmの台高からのドロップジャンプは0.2秒以上の動作時間を要し、バリスティックな動作の遂行が難しいものと思われる。台高を20cmに下げた場合、女子ではバリスティックな動作がほぼ可能となるものの、男子では30cm同様バリスティックな動作の遂行は困難であると思われる。2.バリスティックな能力(P-INDEX)については、男子では1年生から3年生にかけては能力に差が認められないが、4年生以降、能力の増加傾向が認められ、6年生での増加が最も顕著に認められた。女子では、1年生から5年生までは顕著な能力の差は認められず、6年生でバリスティックな能力の増大が認められた。
生体における膝関節動態解析。健常、靭帯損傷、変形性関節症を含む。

本研究は、側面透視画像にCTより作成した3次元骨モデルをPC上で画像マッチングさせ、膝関節の運動解析を行う研究である。生体膝で行う研究として極めて正確に膝関節の動態解析を行うことが可能とされる。臨床成績は多く報告されているが、生体膝を用いた解析で術前術後に動的キネマティクスがどのように変化するかは未だ不明な点が多い。よって、本研究の目的は以下の3点とする。1)ACL不全膝に対する手術加療の効果を検証する2)OA進行過程における不安定性や異常動態メカニズムを解明する3)変形性膝関節症に対する膝関節周囲骨切り術の治療効果を検証する本研究により、膝関節治療の成績向上につながることを期待する。
誘電体における光誘起構造相転移の動的機構解明

本年度は光誘起相転移物質として優れた物性を示す無機・有機結晶の物質探索をおこない光誘起相転移機構の解明をおこなうことを目的とし引き続き研究を遂行した。本研究では強誘電強弾性相転移を示すロッシェル塩(RS)と前年度顕著な光誘起効果を報告した常誘電強弾性相転移を示す水素結合系結晶KD_3(SeO_3)_2(DKTS)の二つの物質に注目し、UVフェムト秒パルスレーザーを励起光として照射することにより転移点近傍で現れる光誘起効果の物理的機構を解明した。両物質は対称中心の有無という点で大きく異なり、(DKTSには対称中心があるがRSにはない。)この対称性に起因した電気光学効果の相違からそれぞれの相転移において異なる光誘起効果の観測が期待される。レーザー屈折光強度測定によりそれぞれの特徴的な光誘起効果が測定された。まずDKTSの屈折光強度の温度依存性はUV光励起をおこなうことによりTc以上の温度領域で屈折光強度の減衰が温度上昇に対し著しく小さくなるのに反してRSではTc以下で大きな屈折光強度の減少が測定される。DKTSに関する結果は光照射によりTc以上の温度領域に於いても強弾性ドメインが誘起されていることを示す。一方、RSでは光照射によりTc以下でドメイン壁が減少することを示す。さらにDKTSの屈折光強度の温度依存性には光照射による顕著なメモリー効果が測定された。以上の結果を考慮しバンド輸送モデルの立場から測定された光誘起効果を考察すると、強弾性ドメインもしくは強誘電性ドメインが形成された結晶中へUV光照射をおこなうことで励起電荷に起因した空間電場が形成され電歪効果を介してドメインが光誘起されると考察される。以上のことから本研究により強弾性ドメインや強誘電性ドメインを光制御できる可能性を示唆する点で極めて重要であり基礎物理学と応用物理学の両面で重要な知見を与えるものである。本研究ではこれまで光誘起相転移に対し報告例がない無機結晶系の誘電体、強誘電体に注目し光誘起相転移物質として優れた物質を探索し、測定された光誘起相転移現象に対して超短パルスレーザーを駆使した時間分解分光法を用いて光誘起相転移の動的機構を解明することを目的とする。11年度では水素結合系結晶KD_3(SeO_3)_2(DKTS)とLiH_3(SeO_3)_2(LTS)、酸化物であるチタン酸バリウム、また強誘電体で古くから知られているロッシェル塩の4物質に注目した。この四物質の中で特にDKTS結晶が示す強弾性相転移において顕著な光誘起効果が測定された。本実験では再生増幅フェムト秒パルスTi:Sレーザーを用いてTHG光を発生させ、波長266nm、パルス幅130fs、4μJのパルス光を励起光として用い、屈折光強度をプローブとして相転移の光誘起効果を調べた。光を照射しない場合とcw光励起を行った場合では転移点が約0.1Kシフトする他は顕著な違いは見られない。それに対しパルス光励起の結果は著しい光誘起相転移現象を示し、特に転移点直上の温度領域で光誘起効果が顕著になる。本実験結果によりパルス光照射によって強弾性相転移のドメイン初期形成過程において強い光誘起効果が現れることが明らかとなった。この様な光誘起相転移現象の実験例は世界的にも初めてであり、本結果はこれまで不明確であった相転移点近傍で現れるドメイン初期形成過程の機構解明に重要な知見を与える。(本研究結果は日本物理学会1999年秋の分科会(27aYJ-10)、また詳細な実験結果を日本物理学会2000年春の分科会(22aX-9)にて発表。)またLTS結晶については光誘起相転移現象を調べるために融点近傍において熱誘起で現れる前駆融解現象に注目し基礎データを実験的に収集した。(本結果については原著論文J.Phys.Soc.Jpn:69巻2000年頁643-646にて出版公表。)本年度は光誘起相転移物質として優れた物性を示す無機・有機結晶の物質探索をおこない光誘起相転移機構の解明をおこなうことを目的とし引き続き研究を遂行した。

以上の結果を考慮しバンド輸送モデルの立場から測定された光誘起効果を考察すると、強弾性ドメインもしくは強誘電性ドメインが形成された結晶中へUV光照射をおこなうことで励起電荷に起因した空間電場が形成され電歪効果を介してドメインが光誘起されると考察される。以上のことから本研究により強弾性ドメインや強誘電性ドメインを光制御できる可能性を示唆する点で極めて重要であり基礎物理学と応用物理学の両面で重要な知見を与えるものである。
長管骨／骨盤骨折に合併する脳脂肪塞栓症の発生頻度の解明と治療法の開発

大腿骨や骨盤骨折に合併する脂肪塞栓症のうち中枢神経症状を呈する脳脂肪塞栓症は、重篤な場合には意識障害や高次脳機能障害を来すが、その発生頻度や機序は不明で予防法及び治療法も確立されていない。大腿骨や骨盤骨折患者は脳挫傷等の頭部外傷を合併することが多く、意識障害や高次脳機能障害をきたす。しかし、その多くはMRIなどの画像診断なしに脳挫傷やびまん性脳損傷によるものと診断されているものも多く、潜在的に脳脂肪塞栓症による患者が含まれている可能性がある。本研究の目的は、大腿骨や骨盤骨折患者に合併する脳脂肪塞栓症の発生頻度を明らかにするとともに、動物実験等を行って予防法・治療法を開発することである。
放射線治療における難治性再発腫瘍の生理的因子に関する研究

癌治療において腫瘍組織の局所制御、及び転移の抑制はもっとも重要な課題である。特に限局して存在する癌組織に対しては、局所制御の面からも、QOLの面からも放射線治療の役割がますます重要になりつつある。一方癌の放射線治療は、限局した特定の悪性腫瘍の局所制御や転移の制御に効果をあげてはいるものの、放射線抵抗性の再発腫瘍に対しての生物学的アプローチはまだ緒に就いたばかりであり、その生物学的背景については未知の要員が多い。ここでは腫瘍の栄養状態や環境因子を規定する生理因子に着目し、マウス腫瘍モデルを用いて増殖する腫瘍系および照射された組織における腫瘍の血管新生・エネルギー状態・ATP合成能・血流・細胞内pHなどの因子を計測することにより、Tumor Bed Effect(TBE)の生理的な状態およびそれらの相互関係について調べた。Angiogenesis・NMRの結果を合わせると、腫瘍のエネルギー状態・ATP合成計測・酸素分圧等の計測より、照射された組織中の腫瘍では血流やエネルギー状態、pHiの低下、ATP合成の低下を認めた。特にTBE中では腫瘍の縮退よりも早期に生理的因子(新生血管・血流・エネルギー状態・pHi)の変化を認めた。これらより生理因子が腫瘍の局所制御に重要であることが示唆された。生理因子が最終的な予後にどう影響を及ぼすかについては今後の検討課題である。一方最近分子生理学の発展と共に細胞増殖因子等の発見による血管の分子生物学が盛んとなり、腫瘍血管新生のメカニズムへの解明研究が緒に就きつつある。今後はさらに腫瘍の放射線応答および血管新生抑制物質による応答を、血管内皮細胞増殖因子やサイトカイン等との相互作用を含めて明らかにする方向の研究を進めていきたい。また放射線抵抗性を形づくる他の生物学的因子すなわち腫瘍細胞固有の放射線抵抗性、照射後の再増殖能、免疫因子などについてもあわせて平行して研究を進めることにより放射線による再発腫瘍の制御機構解明への一助としたい。平成5年度においては、1)マウス腫瘍モデルを用い、増殖する腫瘍系および照射された組織における腫瘍の生理因子について、2)Oxygenationを探る前段階としての腫瘍の代謝状態そのものにつき、ヒト由来の結腸癌細胞を用い、in vitro perfusion下での腫瘍のエネルギー状態およびその時間的変化、グルコースの利用状況、およびこれらのfactorsのin vivoとの関係につき研究をすすめた。1)では、照射された組織中の腫瘍では相対的に血流量の低下、細胞内pHの低下、エネルギー状態の低下がみられること、またATP合成においても合成速度の低下を認めることなどが明らかになった。2)では、in vitroにて、増殖するHCT-116腫瘍系では増殖とともに、NTP利用率の低下を認めた。また高いレベルのcell growthに関係したPE(cell membrane functionに特徴的なphosphorylated glycanのピーク)も認められた。C-13にては1mg/mlの1-13C glucoseを負荷したところ、高いglucoseの利用、高いlactateの産生を認め、高いaerobic glycolysisの状態にあると考えられた。これらより、放射線に効きにくい腫瘍組織の生理因子の基礎データが集積され、次年度への十分な基盤が達成された。Angiogenesisとの対比については、やや遅れ気味であるが、基礎的なsettingが完成しデータを積み重ねつつある。

一方癌の放射線治療は、限局した特定の悪性腫瘍の局所制御や転移の制御に効果をあげてはいるものの、放射線抵抗性の再発腫瘍に対しての生物学的アプローチはまだ緒に就いたばかりであり、その生物学的背景については未知の要因が多い。ここでは腫瘍の栄養状態や環境因子を規定する生理因子に着目し、マウス腫瘍モデルを用いて増殖する腫瘍系および照射された組織における腫瘍の血管新生・エネルギー状態・ATP合成能・血流・細胞内pHなどの因子を計測することにより、Tumor Bed Effect(TBE)の生理的な状態およびそれらの相互関係について調べた。Angiogenesis・NMRの結果を合わせると、腫瘍のエネルギー状態・ATP合成計測・酸素分圧等の計測より、照射された組織中の腫瘍では血流やエネルギー状態、pHiの低下、ATP合成の低下を認めた。特にTBE中では腫瘍の縮退よりも早期に生理的因子(新生血管・血流・エネルギー状態・pHi)の変化を認めた。これらより生理因子が腫瘍の局所制御に重要であることが示唆された。生理因子が最終的な予後にどう影響を及ぼすかについては今後の検討課題である。一方最近分子生物学の発展と共に細胞増殖因子等の発見による血管の分子生物学が盛んとなり、腫瘍血管新生のメカニズムへの解明研究が緒に就きつつある。今後はさらに腫瘍の放射線応答および血管新生抑制物質による応答を、血管内皮細胞増殖因子やサイトカイン等との相互作用を含めて明らかにする方法の研究を進めていきたい。また放射線抵抗性を形づくる他の生理学的因子すなわち腫瘍細胞固有の放射線抵抗性、照射後の再増殖能、免疫因子などについてもあわせて平行して研究を進めることにより放射線による再発腫瘍の制御機構解明への一助としたい。
口腔癌微小環境と浸潤転移：免疫表現型と空間位置情報に基づく悪性度診断

本研究では、口腔癌の浸潤転移機構の解明と悪性度組織診断指標の確立を目指して、腫瘍微小環境の構成要素(腫瘍細胞、血管・リンパ管内皮細胞、筋線維芽細胞、マクロファージ)を免疫表現型と空間位置情報に基づき分画した上で、それらの細胞間相互作用を網羅的に解析する。リンパ節転移や遠隔転移を示した口腔扁平上皮癌(舌癌)の原発病巣を解析対象として、癌胞巣形状(サイトケラチン;CK)や癌病変全域における脈管走行(血管内皮CD31,CD34、リンパ管内皮D2-40)、マクロファージ(CD68、CD163)・線維芽細胞(S100A4)の局在を捉えるため、連続薄切切片(4μm厚;100枚)に対する多重免疫標識と立体構築法を用いて細胞間相互作用を複合的に解析した。舌癌浸潤先端部の3次元観察では、CK陽性癌細胞の母集団近傍に110個程度の癌細胞で構成された微小浸潤胞巣が分散しており、癌細胞の単細胞浸潤や集団浸潤の共存がみられた。間質要素では、癌胞巣内外を走行する血管内皮の表現型が変化に富むこと、血管を介して癌浸潤先端部に集積するM1/M2マクロファージの分布が異なることも確かめた。さらに、舌扁平上皮癌でのリンパ節転移機序を探る目的で、原発病巣における癌胞巣と脈管との接触箇所とリンパ管内侵襲部位を網羅的に検出するとともに、リンパ管侵襲に間質細胞が関与するか検討した。その結果、侵襲部位ではD2-40陽性のリンパ管内皮に囲まれて、CK陽性の癌細胞集団が塞栓を起こし、癌細胞周囲にS100A4陽性線維芽細胞が集積しているのが確認できた。これらの3次元解析により、癌微小浸潤様式として単細胞遊走と集団遊走の発生頻度と免疫表現型の特徴、癌微小浸潤胞巣を先導する筋線維芽細胞(CAF)、癌細胞と脈管内皮細胞を橋渡しするマクロファージ(TAM)の局在を明示できた。さらに、線維芽細胞にエスコートされた癌細胞集団は上皮形質を維持した状態で移住しリンパ管腔内に侵襲することを明らかにした。癌微小環境の構成要素として、腫瘍実質に加えて脈管、間質細胞(線維芽細胞、炎症性細胞等)、細胞外基質、分解酵素などを含んでおり、多要素間の相互作用が癌の生物学的性質を規定している。本研究では、口腔癌の浸潤転移機構の解明と悪性度組織診断指標の確立を目指して、腫瘍微小環境の構成要素(腫瘍細胞、血管・リンパ管内皮細胞、筋線維芽細胞、マクロファージ、骨髄由来前駆細胞)を免疫表現型と空間位置情報に基づき分画した上で、それらの細胞間相互作用を網羅的に解析する。初年度の今回、所属リンパ節転移や遠隔転移を示した口腔扁平上皮癌(舌癌)の原発病巣を解析対象として、癌胞巣形状(サイトケラチン;CK)や癌病変全域における脈管新生(血管内皮マーカCD31、CD34、CD105、リンパ管内皮マーカD2-40)を捉えるため、連続薄切標本(4μm厚;100枚)に対する多重免疫標識と立体構築法を用いて細胞間相互作用を複合的に解析した。舌癌浸潤先端部の3次元観察では、CK陽性癌細胞母集団の近隣において110個程度の癌細胞で構成された微小浸潤胞巣が間質中に分散しており、癌細胞の単細胞浸潤や集団浸潤の共存がみられた。間質要素に関しては、癌胞巣内外を走行する血管内皮の表現型が変化に富むこと、また、抗腫瘍作用を示すM1マクロファージと腫瘍増生の促進に働くM2マクロファージを各々CD68、CD163発現で判別することにより、血管を介して癌浸潤先端部に集積するマクロファージの分布が異なっていることも確かめられた。今回の3次元形態計測により、腫瘍実質・間質境界における癌微小浸潤様式として単細胞遊走と集団遊走の発生頻度と免疫表現型の特徴、これらの癌微小浸潤胞巣を先導する筋線維芽細胞(CAF)、癌細胞と脈管内皮細胞を橋渡しするマクロファージ(TAM)の局在を明らかにできた。

さらに、舌扁平上皮癌でのリンパ節転移機序を探る目的で、原発病巣における癌胞巣と脈管との接触箇所とリンパ管内侵襲部位を網羅的に検出するとともに、リンパ管侵襲に間質細胞が関与するか検討した。その結果、侵襲部位ではD2-40陽性のリンパ管内皮に囲まれて、CK陽性の癌細胞集団が塞栓を起こし、癌細胞周囲にS100A4陽性線維芽細胞が集積しているのが確認できた。これらの3次元解析により、癌微小浸潤様式として単細胞遊走と集団遊走の発生頻度と免疫表現型の特徴、癌微小浸潤胞巣を先導する筋線維芽細胞(CAF)、癌細胞と脈管内皮細胞を橋渡しするマクロファージ(TAM)の局在を明示できた。さらに、線維芽細胞にエスコートされた癌細胞集団は上皮形質を維持した状態で移住しリンパ管腔内に侵襲することを明らかにした。3次元腫瘍微小環境における癌実質・新生脈管・間質間での細胞間相互作用を解析するうえでは、これらの細胞群・標的分子の空間位置情報について同時観察できることが望まれる。この実現に向けて、研究代表者らがこれまでに確立してきた癌細胞表現形質マーカの多段階・多重免疫標識に基づく分画法を腫瘍微小環境の構成要素に拡張した条件を設定した。最初に全構成細胞の核質をヘマトキシンで染色し、個々の核質の空間座標情報をラベリングした後に、それぞれの細胞核と連結する免疫表現型マーカを指標として、癌細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞を同定した。複数の表現型マーカ発現を組み合わせた応用例として、FSP1陽性/αSMA陰性を線維芽細胞、FSP1陽性/αSMA陽性を筋線維芽細胞と細分画・定義することも実現できた。さらに、3次元空間での位置情報に基づいた設定として、脈管内皮では、間質空間で互いに連結して脈管壁を構築している内皮細胞と間質中に分散・孤立している内皮前駆細胞との区別、またαSMA陽性細胞集団の例では、間質に独立して局在する場合を筋線維芽細胞、脈管内皮に隣接して脈管壁を構築する場合を周皮細胞として区別することも可能となった。同様の工夫により、細胞間の空間位置情報に基づいて、遊走する癌微小胞巣に隣接する筋線維芽細胞をCAF、癌細胞・内皮細胞と隣接するCD163陽性マクロファージをTAMとして分画できると考えている。本研究の目標として、3次元癌微小環境において癌胞巣形状と癌細胞の免疫表現型の変化、間質構成要素との相互作用、脈管内侵襲を包括的に捉えることにより、新たな悪性度診断指標を定めることを掲げている。この達成に向けても、血管腔・リンパ管腔に位置する細胞集団について、上皮形質(CK、Eカドヘリンなど)を維持した癌細胞と上皮形質を示さない細胞(ビメンチン陽性)の可視化・定量化が可能であると考えている。本年度に確立した腫瘍実質・間質の組織立体構築法により、ヒト口腔癌全摘症例の組織試料を対象とした病理形態学的な細胞間相互作用の解析が進められる。今回の3次元組織解析結果では、癌細胞が脈管を含む間質組織環境を構築しながら、単一細胞あるいは集団で浸潤していくことが想定された。次年度においては、この腫瘍微小環境における癌細胞動態を制御する細胞間相互作用に着目して、隣接する細胞間の直接接触とchemokine-axisによるシグナル伝達に注目する。これらの構成細胞間に働くchemokine-axisについては、CCL22-CCR4と舌扁平上皮癌のリンパ管侵襲との関わりに注目して、腫瘍実質・間質でのリガンド(CCL22)・受容体(CCR4)を発現する細胞を同定する。癌微小環境におけるリガンド・受容体の局在に基づき、癌細胞におけるオートクライン回路、近接するTAMー癌細胞ーリンパ管内皮細胞間でのパラクライン回路についても検証する。
ゴマ種子におけるリグナン生合成経路の解明

本研究ではゴマの種子中に含まれるゴマリグナン(セサミン、セサモリン、セサミノールなど)の生合成経路の解明を目的に、I.セサミノール含有形質、II.総リグナン含有形質を制御する遺伝子の同定を試みている。I.セサミノール含有形質の解析セサミノール含有形質のQTL解析により見出した1つのQTLついて、対応するゲノム領域に存在する、セサミノール生合成に関与する可能性のある遺伝子を探索したところ、シトクロムP450 (CYP)遺伝子が7個見出された。これらの遺伝子についてQTL解析に用いた遺伝集団の親系統(セサミノール高含有および低含有系統)のアレルの塩基配列を決定、比較したところ、1つのCYP遺伝子のみプロモーター領域にSNP(一塩基多型)が確認された。続いて遺伝集団からセサミノール高含有と低含有の個体を選び、登熟種子におけるCYPの発現を調査した。その結果このCYP遺伝子が登熟種子で高発現していることが確認されたものの、セサミノール含量と発現量の間に関連性は認められなかった。II.総リグナン含有形質の解析多くのゴマ系統を用いたゲノムワイド関連解析により、セサミン、セサモリンの含量の決定に関連しているとされるSNPがいくつか報告されている(Wei et al., 2015)。これらの中からセサミンとセサモリン両方の含量に関わると報告されたSNPについてリグナン総含量との関連を調べた。まず226の富山大学保存ゴマ系統のリグナン総含量を決定した。総含量が高い系統と低い系統を6系統ずつ選抜し、各SNP領域の塩基配列の比較を行ったところ、1つのSNPについて、リグナン総含量とSNP型の間に関連が認められた。そこでリグナン総含量に関して段階的な表現型を示す54系統を選び解析を行ったところ、リグナン総含量が極端に少ない系統のSNP型は全てマイナーアレル型であることが確認され、SNPが存在する遺伝子がリグナン総含量の制御に関わることが強く示唆された。総リグナン含有形質の解析において、当初の計画では、ゴマリグナンの総含量の著しく低い系統と高い系統の交雑より得られた遺伝材料を用いて遺伝学的な解析を行う予定であった。しかし、概要に記載したとおり、1つの塩基置換によりリグナン総含量を著しく低下させる遺伝子が存在することが示され、すでに作成していた遺伝集団のリグナン含量の差は、この効果の大きな遺伝子に起因する可能性が高いことが明らかとなった。そのため、当初の計画を変更し、今後はまず、この遺伝子の影響を調査することした。また、当初作成した遺伝集団はこの遺伝子以外の原因遺伝子同定のための遺伝的解析を行うには不適と考えられたため、この遺伝子の影響を排除した新しい遺伝集団を作成し解析することにした。以上の理由から、解析材料の育成が遅れたが、今後、新たな材料を用いて解析を行うことで、原因遺伝子の同定が可能と考えている。I.セサミノール含有形質の解析今回の解析では候補遺伝子を絞り込むことができなかった。その原因として、遺伝学的解析によりセサミノール含量を制御する遺伝子は複数存在することが示されており、今回ターゲットとした遺伝子以外の遺伝子がセサミノール含量に影響を与えている可能性を排除できていないことが考えられた。そのため、今後は現在候補としているQTL領域と他のQTL領域の遺伝子型の組み合わせが異なる様々な材料を用いて、候補遺伝子の発現解析を行う予定である。II.総リグナン含有形質の解析上述のリグナン総含量に大きな影響を与える遺伝子は転写因子をコードしている。今後は、この遺伝子の遺伝子型が異なる系統を用いて、登熟種子における網羅的な発現解析を行い、上記転写因子のターゲットとなるリグナン総含量の決定に関与する酵素遺伝子の同定を試みる。また、上記転写因子以外にリグナン総含量の決定に関与する原因遺伝子を探索するため、転写因子遺伝子が同じ型であるがリグナン含量が異なる系統を用いて登熟種子における網羅的な発現解析を行うとともに、それら系統間の交雑に由来する遺伝材料を育成し遺伝学的解析行う。

これらの中からセサミンとセサモリン両方の含量に関わると報告されたSNPについてリグナン総含量との関連を調べた。まず226の富山大学保存ゴマ系統のリグナン総含量を決定した。総含量が高い系統と低い系統を6系統ずつ選抜し、各SNP領域の塩基配列の比較を行ったところ、1つのSNPについて、リグナン総含量とSNP型の間に関連が認められた。そこでリグナン総含量に関して段階的な表現型を示す54系統を選び解析を行ったところ、リグナン総含量が極端に少ない系統のSNP型は全てマイナーアレル型であることが確認され、SNPが存在する遺伝子がリグナン総含量の制御に関わることが強く示唆された。総リグナン含有形質の解析において、当初の計画では、ゴマリグナンの総含量の著しく低い系統と高い系統の交雑より得られた遺伝材料を用いて遺伝学的な解析を行う予定であった。しかし、概要に記載したとおり、1つの塩基置換によりリグナン総含量を著しく低下させる遺伝子が存在することが示され、すでに作成していた遺伝集団のリグナン含量の差は、この効果の大きな遺伝子に起因する可能性が高いことが明らかとなった。そのため、当初の計画を変更し、今後はまず、この遺伝子の影響を調査することした。また、当初作成した遺伝集団はこの遺伝子以外の原因遺伝子同定のための遺伝的解析を行うには不適と考えられたため、この遺伝子の影響を排除した新しい遺伝集団を作成し解析することにした。以上の理由から、解析材料の育成が遅れたが、今後、新たな材料を用いて解析を行うことで、原因遺伝子の同定が可能と考えている。I.セサミノール含有形質の解析今回の解析では候補遺伝子を絞り込むことができなかった。その原因として、遺伝学的解析によりセサミノール含量を制御する遺伝子は複数存在することが示されており、今回ターゲットとした遺伝子以外の遺伝子がセサミノール含量に影響を与えている可能性を排除できていないことが考えられた。そのため、今後は現在候補としているQTL領域と他のQTL領域の遺伝子型の組み合わせが異なる様々な材料を用いて、候補遺伝子の発現解析を行う予定である。II.総リグナン含有形質の解析上述のリグナン総含量に大きな影響を与える遺伝子は転写因子をコードしている。今後は、この遺伝子の遺伝子型が異なる系統を用いて、登熟種子における網羅的な発現解析を行い、上記転写因子のターゲットとなるリグナン総含量の決定に関与する酵素遺伝子の同定を試みる。また、上記転写因子以外にリグナン総含量の決定に関与する原因遺伝子を探索するため、転写因子遺伝子が同じ型であるがリグナン含量が異なる系統を用いて登熟種子における網羅的な発現解析を行うとともに、それら系統間の交雑に由来する遺伝材料を育成し遺伝学的解析行う。当初の計画では、2018年度に次世代シークエンサーを用いたQTL-seq解析を行う予定であった。しかし、計画を変更し、2019年度以降に新たな材料を用いて解析を行うことにしたため、この解析に用いる予定であった金額を次年度以降に繰り越した。
難原因遺伝子を強制発現させた培養線維細胞の蝸牛内移入による難聴のレスキュー

まずマウス蝸牛管外側壁線維細胞の培養に取り組み、モノレイヤープライマリーカルチャーに成功した。しかしPOU3F4、GJB2、GJB3などの難聴原因遺伝子をこの培養線維細胞に発現させそれをマウス生体に遺伝子導入させる段階にて困難を極めた。次にアポトーシス化を阻害するアンチアポトーシスの働きをするBCL2 geneをマウス蝸牛内に手術的に遺伝子導入を行い、遺伝子発現させることに取り組んだ。このBCL2 geneが蝸牛管外側壁や外有毛細胞のアポトーシス化を阻害させるかどうかを調べるため、シスプラチン(CDDP)による薬剤性難聴の出現の程度でもってみることとした。まずBCL2 geneを蝸牛内に導入するアデノウイルスベクターを完成することに成功し、これを介して手術により遺伝子導入を行った。このマウスが数週間生存するよう手技を安定させた後、ABRおよびDPOAEにて聴力を測定したマウスをBCL2 gene投与モルモット群とコントロール群の二群に分けた。そのうちのBCL2 gene投与群に対しては、round window経由と蝸牛管側壁に孔をあけて投与するcochleostomyの二通りの方法にて遺伝子導入を行う。その後両群にCDDP腹腔内注射を施行し、2週間後にABRおよびDPOAEによる再聴力検査を行った。その結果、CDDPによる聴力低下が両群の間にて有為差が存在した。現在このマウス蝸牛の免疫組織化学的手法にて形態学的観察を行い、蝸牛機能の解析を施行中にてこの後論文発表予定である。平成12年度初めよりマウス蝸牛管外側壁線維細胞の培養に取り組み成功した。しかしPOU3F4、GJB2、GJB3などの難聴原因遺伝子をこの培養線維細胞に発現させて、マウス生体に遺伝子導入させる段階にて成功せず、現在も取り組み中であるが、難聴原因遺伝子を用いない下記実験を試みている。BCL2 geneをマウス蝸牛内に遺伝子導入を行い、発現させる。BCL2 geneは蝸牛管外側壁や外有毛細胞のアポトーシス化を阻害するアンチアポトーシスの働きをする。この遺伝子が発現された蝸牛が、シスプラチン(CDDP)による薬剤性難聴に対して、ニューロプロテクションの働きをするかどうかを研究する。遺伝子導入はアデノウイルスベクターを介して行う。現在アデノウイルスベクターを完成しつつある段階である。今後の方針はABRおよびDPOAEにて聴力を測定したマウスをBCL2 gene投与モルモット群とコントロール群のニ群に分け、BCL2 gene投与群に対しては、round window経由と蝸牛管側壁に孔をあけて投与するcochleostomyの二通りの方法にて遺伝子導入を行う。その後両群にCDDP腹腔内注射を施行し、2週間後再聴力検査を行い、CDDPによる聴力低下が両群の間にて有為差があるかどうかを検討する。また聴力測定後マウス蝸牛を取りだし、免疫組織化学的手法にてこのマウス蝸牛の形態学的観察を行い、蝸牛機能の解析を行う予定である。
管内流れ中で変形する物体周りにおける微小粒子のダイナミクス

本研究では粘性が支配的な系において,1)流れ中での物体の変形,2)物体の間隙を流れる微小粒子の移動に着目した.1)では特に赤血球について,流れ中における変形および浸透圧差に起因する変形の挙動を実験により調べ,定量的に評価した.2)では,障害物の間隙を流れる微粒子懸濁液の移動特性を実験と数値解析により調べた.実験では球形ガラスビーズを充填した準二次元流路中に微小粒子懸濁液を流し,流路内の微粒子分布とその時間変化を詳細に調べた.数値解析ではストークス動力学法を用いて粒子間隙を移動する微粒子群挙動を求め,粒子の空隙率と個々の微粒子の速度および微粒子群全体の拡がり方との関係について明らかにした.本研究では血管内で変形する赤血球の存在によって生じる血小板のマージネーションの詳細解明を背景とし,管内流れ中で変形する物体周りでの微小粒子の挙動について調べることを目的としている.上記の現象は,1)管内流れ中での物体の変形プロセス,2)その間隙を流れる微小粒子の懸濁液の移動プロセスの2段階に分けて説明されている.平成26年度の研究計画はプロセス1)を重点的に行うものであったが,当初の予定を変更し,プロセス2)に対して実験および数値解析によるアプローチを行ってきた.実験では準二次元流路に球形のガラスビーズを充填し,その間隙を流れる微小粒子の懸濁液の挙動を顕微鏡により観察するシステムを構築した.大きさの異なる微小粒子を用意し,それぞれの条件に対して流路中での微小粒子の空間分布を測定することで,ガラスビーズの間隙のスケールと微小粒子の大きさの相対値が移動特性に与える影響を調べている.球形ビーズの充填流路と共に予定している非球形の障害物が存在する流路については,マイクロ加工技術を利用した流路の自作を検討中であり,準備を進めている.また,次年度以降で必要となる赤血球の蛍光染色方法について検討し,DiIC12(3)を用いた染色に成功した.数値解析ではStokes近似が成り立つ系を仮定し,Stokesian dynamics(SD)法を用いた間隙を流れる流体中の微粒子挙動の解析方法を検討した.検討の結果,SD法は有効であるものの現有のコードに大幅な改良が必要であると判断したため,修正を行い,最も大きな問題点の一つを解決した.本研究以前からSD法を用いて微小粒子を含まない流体のみの場合における間隙中の透過特性について調べる研究を進めていたため,その研究と併せて平成26年度には,間隙の連結性がその中の流体の移動特性を決定するための重要なファクターであることを定量的に確かめ,さらに間隙の空間分布特性を数値で定量的に表す方法を検討した.本研究は管内流れ中で変形する物体周りでの微小粒子の挙動について調べることを目的とし,1)管内流れ中での物体の変形プロセス,2)その間隙を流れる微小粒子の懸濁液の移動プロセスの2段階に着目して進められている.平成26年度には当初の研究計画を変更してプロセス2)に対する実験および数値解析を行った.平成27年度にはプロセス2)の解析をさらに継続して解析を行うとともに,プロセス1)に関しても研究を進めてきた.実験では準二次元流路(幅5.0mm,厚さ0.8mm,長さ50.0mm)に球形のガラスビーズ(直径0.600.71mm)を充填し,その中を流れる微小粒子(直径15μm,69μmの二種類の蛍光微粒子)の懸濁液の挙動を顕微鏡により観察した.密度を調整した水とグリセリンの混合溶液に微小粒子を中立浮遊させて流量Q = 0.153 mL/minでガラスビーズ充填流路中に流した.粒径の異なる微小粒子を用いた実験結果から,サイズの小さな粒子は充填流路中の空隙部分を一様に流れるのに対し,大きな粒子は比較的大きな空隙部分に偏って流れる様子が観察された.こうした微粒子の流路内の分布を蛍光微粒子の輝度値を用いて定量的に表し,その時間変化について解析した.球形粒子充填層に加え,非球形の障害物が存在する流路のデザインがほぼ決定し,現在は細部について検討中である.数値解析ではStokes近似が成り立つ系を仮定し,Stokesian dynamics法を用いた間隙を流れる流体中の微粒子挙動の解析を行った.前年度から継続して詳細な確認と修正を繰り返し,解析手法の妥当性を示すことができた.構築したコードを用いて,粒子層の間隙を移動する微粒子懸濁液の挙動をシミュレートし,粒子層の空隙率とその中を移動する個々の微粒子の速度および微粒子懸濁液全体の拡がり方との関連性について定量的に明らかにした.前年度には実験システムの構築および数値解析コードの修正のために当初の予定よりも時間がかかってしまったため,それらを用いた解析については十分な結果を得るまでに至らなかった.しかしながら平成27年度には,前年度に構築した実験システムを用いて,微小粒子の空間分布とその時間変化,および粒子充填層の空隙スケールに対する微小粒子サイズの関係を明らかにするための基礎的な実験を行うことができた.さらなる考察および議論が必要ではあるものの,粒子充填層の間隙を流れる微小粒子の分布について定量的な解析を行うことができた.さらに今後の展開として非球形の障害物が存在する場合の微小粒子懸濁液の移動現象に着目するため,新たな流路の準備を進めた.当該年度中の完成は達成できなかったものの,大枠のデザインを決定し,あとは細部についてのいくつかの検討を残すのみとなった.

また数値解析については,前年に引き続き慎重に解析手法の確認と修正を繰り返し,コードの妥当性が得られた.得られた解析コードを用いて,粒子層中を微粒子懸濁液が移動する現象をシミュレートし,粒子層の空隙率とその中を移動する個々の微粒子の速度および微粒子懸濁液全体の拡がり方との関連性を示すことができた.本研究は管内流れ中で変形する物体周りでの微小粒子の挙動について調べることを目的とし,特にレイノルズ数の小さい粘性が支配的な系において,1)管内流れ中での物体の変形プロセス,2)その間隙を流れる微小粒子の懸濁液の移動プロセスの2段階に着目して進められてきた.平成26年度には当初の研究計画を変更してプロセス2)に対する実験および数値解析を行った.平成27および28年度には,プロセス2)の解析をさらに継続して解析を行うとともに,プロセス1)に関しても研究を進めてきた.プロセス1)では赤血球の変形挙動に着目し,管内流れ中における流体力による変形,および浸透圧差に起因する変形の挙動を実験により調べた.実験結果から,赤血球の形状変化を定量的に評価した.プロセス2)では,障害物の間隙を流れる微粒子懸濁液の移動特性を実験と数値解析により調べた.実験では,球形ガラスビーズを充填したmmオーダーの準二次元流路中を流れる微小粒子懸濁液の挙動を観察した.充填するガラスビーズのサイズ,流体に懸濁させる微粒子のサイズ,および流量を変化させ,障害物の存在下での微粒子懸濁液挙動について,特に流路内における微粒子の偏りやその時間変化に着目して整理した.数値解析ではStokes近似が成り立つ系を仮定し,Stokesian dynamics法を用いた間隙を流れる流体中の微粒子挙動の解析を行った.前年度から引き続き計算コードを構築して妥当性を確認した後,粒子層の間隙を移動する微粒子懸濁液の挙動をシミュレートし,粒子層の空隙率とその中を移動する個々の微粒子の速度および微粒子懸濁液全体の拡がり方との関連性について定量的に明らかにした.本研究では粘性が支配的な系において,1)流れ中での物体の変形,2)物体の間隙を流れる微小粒子の移動に着目した.1)では特に赤血球について,流れ中における変形および浸透圧差に起因する変形の挙動を実験により調べ,定量的に評価した.2)では,障害物の間隙を流れる微粒子懸濁液の移動特性を実験と数値解析により調べた.実験では球形ガラスビーズを充填した準二次元流路中に微小粒子懸濁液を流し,流路内の微粒子分布とその時間変化を詳細に調べた.数値解析ではストークス動力学法を用いて粒子間隙を移動する微粒子群挙動を求め,粒子の空隙率と個々の微粒子の速度および微粒子群全体の拡がり方との関係について明らかにした.本年度は,物体の間隙を流れる流体中の微小粒子の挙動に関する実験および数値解析手法の展開に焦点を当てて研究を進めてきたが,実験システムの構築および数値解析コードの修正のために当初の予定よりも時間がかかってしまったため,それらを用いた解析については十分な結果を得るまでに至らなかった.そのため,計画に多少の遅れが生じた.しかしながら,例えば間隙の空間分布特性の定量的評価や赤血球の蛍光染色など計画の中のいくつかの部分はおおむね順調に準備できた.平成28年度にも引き続き粒子充填層を用いた実験を行い,微小粒子の空間分布とその時間変化,および粒子充填層の空隙スケールに対する微小粒子サイズの関係を定量的に明らかにする.実験を繰り返し行うことで結果のサンプル数を増やし,より一般的な知見を得られるように結果を整理していく.平成27年度に達成できなかった非球形の障害物が存在する流路に関しては,細部の検討を行い,流路を完成させる.