hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機-無機コンポジットマテリアル用新規金属ナノ構造体の創製

ナノサイズの大きさを持つ金属ナノ粒子は、触媒をはじめ、光学材料や電子材料、センサーや磁気材料、抗菌材料など非常に幅広い応用が期待されている。また、界面活性剤などの有機分子集合体で保護された金属ナノ粒子を用いて形成された13次元超格子は、金属ナノ粒子単独では発現しない新たな特性を示すことから、非線形光学特性を利用した光スイッチ、表面増強ラマン散乱基板などの光デバイスなどへの応用が盛んに研究されている。しかし、超格子の作製には自己組織化法や外部力場を用いる方法が用いられているが、その制御は容易ではない。一方、メソ多孔体は高い比表面積を有し、極めて規則性の高いメソ細孔を持つ。また、合成時間、界面活性剤の量、種類などの合成条件を変化させることにより、容易に六方、立方、層状と細孔構造および細孔径を制御することが出来る。このような特性を活かし、触媒、吸着・分離剤以外に金属ナノ粒子、機能性有機分子などのホスト物質への応用されている。特にメソ多孔体をホスト物質として利用した量子ドットや量子細線の作製は試みられているが、メソ多孔体の細孔構造内での金属ナノ粒子超格子を作製した例は報告されていない。そこで本研究では、メソ多孔体が界面活性剤などの有機分子集合体を鋳型として合成されていることに注目し、その有機分子集合体の代わりに界面活性剤で保護された金属ナノ粒子を用いてメソポーラス多孔体に規則的に配列した新規金属ナノ構造体の創製を目指した。その結果、光還元法によって調製した界面活性剤保護白金ナノ粒子を用いて合成した場合、白金ナノ粒子フリーの界面活性剤が多く共存していることより界面活性剤保護白金ナノ粒子がMCM-41細孔内に優先的に取り込まれなかった。そこで、ゲル濾過法により分取した界面活性剤保護白金ナノ粒子を用いた結果、高分散に構造内に存在していたことより、本手法による金属ナノ構造体の合成が出来ることが示された。一方、メソ多孔体は高い比表面積および極めて規則性の高いメソ細孔を有し、合成条件を変化させることにより容易に六方、立方、層状と細孔構造および細孔径を制御することが出来る。このような特性を活かし、触媒、吸着・分離剤以外に金属ナノ粒子、機能性有機分子などのホスト物質への応用されているが、メソ多孔体の細孔構造内での金属ナノ粒子超格子を作製した例は報告されていない。本研究では、メソ多孔体が界面活性剤などの有機分子集合体を鋳型として合成されていることに注目し、その有機分子集合体の代わりに界面活性剤で保護された金属ナノ粒子を用いてメソポーラス多孔体に規則的に配列した新規金属ナノ構造体の創製し、金属ナノ粒子単独得られない触媒特性の発現を目指す。本年度は、界面活性剤保護白金ナノ粒子を調整し、それを用いメソポーラス多孔体の合成を行った。その結果、一度ナノ粒子をゲル濾過により分収した界面活性剤保護白金ナノ粒子を用いることにより、多くの白金ナノ粒子を多孔体中に導入することが出来た。しかし、多孔体の合成中に白金ナノ粒子から保護している界面活性剤が外れる問題が生じた。そこで、白金ナノ粒子と相互作用が強いチオール基を有する界面活性剤を合成し、それを用いて白金ナノ粒子を合成する必要があることがわかった。

その結果、光還元法によって調製した界面活性剤保護白金ナノ粒子を用いて合成した場合、白金ナノ粒子フリーの界面活性剤が多く共存していることより界面活性剤保護白金ナノ粒子がMCM-41細孔内に優先的に取り込まれなかった。そこで、ゲル濾過法により分取した界面活性剤保護白金ナノ粒子を用いた結果、高分散に構造内に存在していたことより、本手法による金属ナノ構造体の合成が出来ることが示された。
三元素を使用した燃焼材料合成法における燃焼波伝播に及ぼす非溶融の二元素の影響

ここでは,複数元素を直径反応させ,高融点無機化合物や金属間化合物を迅速かつ経済的に合成する燃焼材料合成法を研究対象とし研究が行われた.本研究においては,チタニウム・炭素・ホウ素の三成分からなる系を取り上げ,これらの粉末を用いて元素混合粉末圧粉体(直接10mm,長さ約30mm)を作成し,これを着火させるとともに,圧粉体中を自己伝播する燃焼波(火炎)に着目し,燃焼波伝播に及ぼす成分組成,非溶融二元素の粉末粒径,初期温度などの影響を実験的に調べるとともに,これらの実験結果をもとに,燃焼速度の増大や可燃範囲の拡張に関連した因子・要因の検討を行った.なお,試料として用いた元素混合粉末圧粉体は小型プレスを用いての加圧成形により作成しているし,粉末粒径に関しては可能な限り粒径分布範囲が狭いものを使用している.燃焼速度の測定実験においては,粒径が10μm以上の粒子を用いて,チタニウム,炭素,ホウ素の各粒径が燃焼速度に及ぼす影響の調査が行われた.これら三成分のうちで最も融点の低いチタニウム(融点約1950K)については,高温の燃焼波内で融解するため,チタニウム粒径が燃焼速度に影響を及ぼすことがないこと,次に融点が低いホウ素(融点約2550K)については,燃焼波内で融解するものの,チタニウムとの反応が液滴粒子表面で進行するため,粒径が20μm以上のホウ素粒子については粒径の増加が燃焼速度の低下を引起こすこと,溶融することがない炭素粒子については,チタニウムとの反応が粒子表面で進行するため,炭素粒径の増加が燃焼速度の低下を引起こすことなどが明確になった.粒径の増加にともなう燃焼速度の減少については,三成分の割合が同一であれば,ホウ素または炭素の粒径増加はチタニウムとの反応に関与する粒子表面積の減少を意味しており,このため燃焼速度の減少が引起こされるとの結論に達している.ここでは,複数元素を直径反応させ,高融点無機化合物や金属間化合物を迅速かつ経済的に合成する燃焼材料合成法を研究対象とし研究が行われた.本研究においては,チタニウム・炭素・ホウ素の三成分からなる系を取り上げ,これらの粉末を用いて元素混合粉末圧粉体(直接10mm,長さ約30mm)を作成し,これを着火させるとともに,圧粉体中を自己伝播する燃焼波(火炎)に着目し,燃焼波伝播に及ぼす成分組成,非溶融二元素の粉末粒径,初期温度などの影響を実験的に調べるとともに,これらの実験結果をもとに,燃焼速度の増大や可燃範囲の拡張に関連した因子・要因の検討を行った.なお,試料として用いた元素混合粉末圧粉体は小型プレスを用いての加圧成形により作成しているし,粉末粒径に関しては可能な限り粒径分布範囲が狭いものを使用している.燃焼速度の測定実験においては,粒径が10μm以上の粒子を用いて,チタニウム,炭素,ホウ素の各粒径が燃焼速度に及ぼす影響の調査が行われた.これら三成分のうちで最も融点の低いチタニウム(融点約1950K)については,高温の燃焼波内で融解するため,チタニウム粒径が燃焼速度に影響を及ぼすことがないこと,次に融点が低いホウ素(融点約2550K)については,燃焼波内で融解するものの,チタニウムとの反応が液滴粒子表面で進行するため,粒径が20μm以上のホウ素粒子については粒径の増加が燃焼速度の低下を引起こすこと,溶融することがない炭素粒子については,チタニウムとの反応が粒子表面で進行するため,炭素粒径の増加が燃焼速度の低下を引起こすことなどが明確になった.粒径の増加にともなう燃焼速度の減少については,三成分の割合が同一であれば,ホウ素または炭素の粒径増加はチタニウムとの反応に関与する粒子表面積の減少を意味しており,このため燃焼速度の減少が引起こされるとの結論に達している.
肺癌およびびまん性肺疾患におけるテロメラーゼ活性化の解析

細胞分裂毎に短縮する染色体末端を伸長し,細胞の分裂寿命を延長させる酵素テロメラーゼは,不死化した癌細胞のみならず末梢血リンパ球にも活性があり,in vitroの増殖刺激で増強することを報告してきたが,本研究で,呼吸器疾患におけるテロメラーゼ活性は,癌の診断および生物学的悪性度の指標となり得ること,びまん性肺疾患では疾患活動性の指標となり得ることを示した.すなわち肺癌のテロメラーゼ活性は,小細胞癌,p53およびRb癌抑制遺伝子の両方にヘテロ接合性の消失(LOH)を認めた症例に高活性例が多く,病期や腫瘍径とは明らかな関連性が認められなかった。テロメラーゼ活性レベルは、個々の遺伝子変異や臨床背景よりもより総括的に腫瘍の生物学的悪性度を反映した指標となることが期待された。肺癌症例の細胞診検体を用いて,テロメラーゼ活性と細胞診の判定との比較検討を行うと,小細胞癌の胸水例では,細胞診陰性でもテロメラーゼ活性が検出され,その数カ月後の細胞診で悪性細胞が検出された症例もあり,従来の細胞診とテロメラーゼ活性を組み合わせることで,より診断率の向上が期待できるものではないかと考えられた。びまん性肺疾患の検討では,各種呼吸器疾患のBAL細胞についてテロメラーゼアッセイを行った。76例中4例(5.3%)に活性を検出したが,そのうち3例が膠原病症例で,いづれもリンパ球比率が増加しており,うち2例はステロイド療法にも反応せず,予後不良であった。しかし,リンパ球が著増しているサルコイドーシス症例では有意な活性は認めず,これらの疾患におけるリンパ球の活性化機序が異なる可能性が示された。BAL細胞のテロメラーゼ活性は,びまん性肺疾患の活動性の新たな指標となる可能性とともに,新たな治療戦略のターゲットとなる可能性が期待された。細胞分裂毎に短縮する染色体末端を伸長し,細胞の分裂寿命を延長させる酵素テロメラーゼは,不死化した癌細胞のみならず抹消血リンパ球にも活性があり,in vitroの増殖刺激で増強することを報告してきたが,本研究で,呼吸器疾患におけるテロメラーゼ活性は,癌の診断および生物学的悪性度の指標となり得ること,びまん性肺疾患では疾患活動性の指標となり得ることを示した.すなわち肺癌のテロメラーゼ活性は,小細胞癌,p53およびRb癌抑制遺伝子の両方にヘテロ接合性の消失(LOH)を認めた症例に高活性例が多く,病期や腫瘍径とは明らかな関連性が認められなかった.テロメラーゼ活性レベルは,個々の遺伝子変異や臨床背景よりもより総括的に腫瘍の生物学的悪性度を反映した指標となることが期待された。肺癌症例の細胞診検体を用いて,テロメラーゼ活性と細胞診の判定との比較検討を行うと,小細胞癌の胸水例では,細胞診陰性でもテロメラーゼ活性が検出され,その数カ月後の細胞診で悪性細胞が検出された症例もあり,従来の細胞診とテロメラーゼ活性を組み合わせることで,より診断率の向上が期待できるのではないかと考えられた。76例中4例(5.3%)に活性を検出したが,そのうち3例が膠原病症例で,いづれもリンパ球比率が増化しており,うち2例はステロイド療法にも反応せず,予後不良であった。

BAL細胞のテロメラーゼ活性は,びまん性肺疾患の活動性の新たな指標となる可能性とともに,新たな治療戦略のターゲットとなる可能性が期待された。
ヒマ〓果上に形成される突起状組織の解明に関する研究

油料作物のヒマを実験園場で裁培し,開花後20日目の〓果を採取して組織の形態を電子顕微鏡で調査した。また開花受精後の〓果の表面に発生する刺を切除して成熟させ,標準区と対比させて種子の形成と種子内容物の品質を調査した結果,次の結論を得た。(1).発育中の〓果の組織について〓果の表面は葉緑素を含み気孔を有する組織ら,茎葉に類似した形態を有し,珪素カルシウムおよびカリウムに富むことが明らかになった。一方,中果皮は組織が全く異り,葉緑素は殆んど含まれず,堅い組織で構成されていた。この組織はカリウム,カルシウム,珪素および塩素などを含んでいることが判明した。またこの堅い組織は2種類の異なる組織を形成して中の種子を保護していることが認められた。(2)〓果上の突起状組織(刺)の切除と種子内要物生成との関係発育中の〓果上に発生する突起状組織(刺)は,400mmの波長を吸収していることを以前筆者が見出したが,この波長は光合成上にはさほど重要でない波長であるため,種子内要物の生成との関係を調査した。開花及び受精後この刺を切除し成熟させた結果次のことを明らかにした。【○!a】種子の含油率:種子中の油脂生成量を刺切除区と標準区とで比較すると,乾物ではそれぞれ62.77%および64.39%で,刺を切除した区は油脂の生成量が低かったが,統計的には有意差が認められなかった。【○!b】油脂の酸価:種子から抽出した油脂の品質を比較するため,酸価を調査したところ,刺切除区は0.83に対し標準区は0.53で刺切除区の品質が若干劣化していた。しかしこの場合も統計的に有意差が認められなかったが,油脂の生成には刺を通じて受容する光が必要であると思われる。【○!c】種子百粒重:刺切除区は27.2g,標準区は28.6gで刺切除区が劣ったが,この場合も統計的に有意な差は認められなかった。
セラミックスにおける微小クラックの発生と破壊エネルギー

微小クラックの発生と破壊エネルギーの関係を明らかにするための試料セラミックスとして黒鉛材料を用いた。本研究では非線形破壊現象を定量的に解析するため「無次元荷重変位汎曲線法が開発された。これにより非線形破壊エネルギーを弾性破壊エネルギーと非可逆破壊エネルギーに分離評価することが可能となった。等方性黒鉛材料を用い、その亀裂進展抵抗曲線(R-Curve)を求め、亀裂の進展に伴う破壊抵抗性の増加を、応力誘起微視亀裂に基づくウェイクでの残留歪効果と破面間に働く粒子架橋効果の両面から考察した。その結果、亀裂進展の初期に見られる上昇型R-曲線挙動は主に粒子架橋効果により支配されていることを明らかにすることが出来た。またこの粒子架橋は亀裂進展に必要となる破壊エネルギーを著るしく増大させる効果のあることが明らかとなり、この効果は非可逆的な破壊機構に基づくエネルギー散逸効果と共に黒鉛材の破壊抵抗性を著るしく高めている事を明らかにした。アクゥスティクエミッション(AE)を用い微視亀裂の発生とその臨界応力を明らかにすることを試みた。しかしながら黒鉛材料の場合、主亀裂の進展に伴うAEを明確に捕えることは出来たが、その前駆現象としての微視割れ発生に伴うAEを検出するには致らなかった。このため微視亀裂の発生に対する臨界応力は試験片に外部荷重を掛けながら走査型電子顕微鏡観察を行い決定した。この臨界応力を用いて、亀裂進展に伴う応力誘起微視亀裂プロセスゾーンの寸法を見積り、亀裂進展抵抗性へのプロセスゾーンの影響を考察した。
治水施設間の最適機能分担に関する研究の総合化-等危険度線マップの作成-

貯留により水を治めるのか排水により水を治めるのか、両者を併用するとすればどのような考え方で治水機能を分担させるのか-個々の河川計画策定の都度、幾多の議論が続けられてきたが、この簡明かつ治水計画上の基本的な問題に対して、いまだ明確な結論・指針は示されていない。本研究ではこの問題について水理水文学的、治水経済学的検討を行い、もって貯留をともなう治水システムの安全度、貯留施設(ダム,遊水池等)と排水施設(河川,トンネル,ポンプ等)の間の機能分担のあり方について、具体的な評価の手法,指針を与えることを目的とする。極端な例を考えよう。排水施設がなく貯留施設のみにより治水を行うとすれば、全流量を一滴も流すことなく貯留しなければならないから、総流量(総雨量)を確率評価し、ある生起確率に対応する総流量を貯えることができるだけの容量を持つ貯留施設を備える必要がある。逆に排水施設のみによる場合はピーク流量(ピーク雨量)の確率評価により排水施設容量を決定すればよい(現行の方式)。両者を併用する場合は当然、総流量・ピーク流量の結合分布に基づいて安全度評価を行うべきである。江藤・室田・中西はこの様な考え方に基づいて等危険度線の式を導いた。等危険度線とは「治水安全度をある水準に保つに必要な貯留施設容量と排水施設容量の関係を表す曲線」である。極めて簡便な解が得られ、大阪平野の治水計画への適用によりその高い実用性が実証された。さらに、等危険度線の理論をわが国のいくつかの地点の水文資料に適用し、実用時に必要な各パラメータ値の地域による差を調べた。同時に浸透施設を含む場合等に対する理論の拡張経済性をも考慮した最適治水機能分担線の理論の実用化を行った。極端な例を考えよう。
蛍光眼底造影による周辺部網膜血管の反応様式の検索

周辺部網膜と毛様体の血管反応を検索するために、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、眼サルコイドーシス、加齢黄斑変性など約50眼を対象として、内視鏡による術中フルオレセイン螢光眼底造影を行った。内視鏡螢光眼底造影は、硝子体手術中にその治療方針を決定する上でも有用であった。1.糖尿病網膜症23眼を対象に、硝子体手術中に内視鏡造影を行った。新生血管を手術中に同定することでその安全な切除が可能であり、術前眼底が不明な例でも、網膜血管床閉塞を術中に同定することで、眼内光凝固を有効に行うことができた。5眼で網膜最周辺部ないし毛様体に過螢光が観察され、ルベオーシスや前部硝子体線維血管性増殖の前駆所見と思われた。房水産生を示唆する毛様体突起部での蛍光漏出が3眼で観察された。2.網膜静脈閉塞症でも術中に新生血管、血管床閉塞の程度を客観的に判定できた。網膜静脈分枝閉塞症では、閉塞領域の無血管野は通常鋸状縁まで及んでいることが明らかとなり、時に鋸状縁部に網状の過蛍光が観察された。これらの所見は、光凝固の方法を決定する上で有用であった。嚢胞様黄斑浮腫のある例では、黄斑部の薄膜を除去することで、黄斑部の血管透過性が弱まることが検出された。3.眼サルコイドーシス12眼では、嚢胞様黄斑浮腫が高率にみられること、周辺部で高率に脈絡膜由来の漏出が見られることが判明した。化学因子のリザーバーないし黄斑牽引の原因となっている硝子体を十分に除去することで、術後徐々に漏出や黄斑浮腫が改善することが判明した。4.加齢黄斑変性では、内視鏡造影を使い脈絡膜新生血管を術中に同定することで、完全な摘出術が可能であった。また、手術中眼圧が不安定となるが、その際の網膜循環のモニターとしても内視鏡造影は有効であった。増殖糖尿病網膜症(牽引性網膜剥離例、硝子体出血例)12例12眼を対象に、硝子体手術の際に内視鏡によるフルオレセイン螢光造影を行い、網膜血管の反応様式を検索した。1,牽制性網膜剥離例での螢光造影では、顕微鏡だけの観察に比べはるかに多くの情報が得られた。(1)新生血管切除の際、大きなものは顕微鏡でも同定可能であったが、網膜に強く癒着し一体化しているもの、成熟し太い口径を有しているものでは螢光造影による新生血管の同定が有用であった。さらに、周辺部や最周辺部に発生した小さな新生血管は、内視鏡による螢光造影が特に有用であった。これら新生血管は必ず硝子体と癒着しており、これの処理を確実に行うことは、硝子体手術の成績に大きく関係した。(2)網膜血管床閉塞は、術前の螢光造影でもある判定できたが、術中の螢光造影を行うことで、術前その確認ができなかった部位、すなわち、出血部や最周辺部での網膜血管床閉塞の程度を判定でき、適切な眼内光凝固治療を行うことができた。

2,硝子体出血例では、術前に螢光造影を行うことは不可能であり、術中螢光造影を行うことで、網膜症の病期やその程度を判定でき、安全な硝子体手術が可能であった。3,周辺部網膜血管の観察を行うことで、重症な糖尿病網膜症ほど周辺部に血管閉塞や網膜血管異常が発生していることが解明された。また、周辺部網膜の血流動態を初期から観察することで、血管床閉塞の修復された所見や閉塞部に発生した動静脈短絡路を検出できた。前年度の増殖糖尿病網膜症を対象とした研究により内視鏡造影の基礎的データを集積した。今年度は、そのデータを踏まえ、糖尿病以外の疾患に対し内視鏡によるフルオレセイン螢光造影を行った。1.網膜静脈閉塞症(1)子体出血のある網膜静脈閉塞症5眼に対し内視鏡造影を行った。術中に新生血管の有無、血管床閉塞の程度を客観的に把握でき、安全な手術および適切な光凝固を行うことができた。ほとんどの例で広範な血管床閉塞が最周辺部網膜まで及んでいることが明らかとなり、ルベオーシスの前段階である鋸状縁部の過蛍光が時に観察された。(2)嚢胞様黄斑浮腫のある4眼では、術中に血管透過性亢進の程度、黄斑浮腫の範囲を正確に同定でき、黄斑部の薄膜を除去することで、血管透過性が弱まることが検出された。2.葡萄膜炎では、ステロイドに抵抗する眼サルコイドーシス12眼を対象として内視鏡造影を行った。術中、嚢胞様黄斑浮腫が高率にみられること、周辺部で脈絡膜由来の漏出が見られることが判明した。硝子体手術でサイトカインや網膜牽引を十分に除去することで、術後徐々に漏出や黄斑浮腫が改善することが判明した。3.加齢黄斑変性10眼で、脈絡膜新生血管抜去の際に内視鏡造影を行った。術中に、新生血管を正確に同定でき、新生血管膜の残存を防ぐことが出来た。また、術中止血を目的として一過性に高眼圧環境を作るが、その際の網膜循環のモニターとしても内視鏡造影は有効であった。多くの例では網膜循環はほぼ正常に保たれるが、2眼で網膜への色素の流入が大きく遅延し、この2眼では、術中に脈絡毛細管板の小葉構造が観察された。4.糖尿病網膜症の再手術例2眼に対して、以前のポート部を狙い内視鏡造影を行った。今回の検索では、前部線維血管増生を示すような明らかな新生血管の発育は観察されなかった。
SPECTと蛍光を同時に行うデュアルイメージング標識薬剤の開発

体外診断と手術時の可視化の両方を可能とする薬剤の開発を目的に、ガンマ線によるSPECT画像と特定の生体分子のみを特異的に可視化する蛍光画像を同時に可能とするデュアルイメージング薬剤を作製を行った。種々の配位子およびRe錯体を作製し、ジピリジル(Dp)およびベンジルイソニトリル(CN-Bz)を用いたRe(CO)3(Dp)CN-Bz錯体が蛍光を発することを認めた。現在、センチネルリンパ節(SLN)検出薬剤への応用について検討している。アミノ酸の一つであるリジン(Lys)を母体とし,側鎖のアミノ基よりピリジンを2個結合した配位子Lys(Py)2を合成した.また,スイッチ機能として,既報を参考にし,アミノ酸の一種であるトリプトファン(Trp)をLysのアミノ末端(Trp-Lys(Py)2)あるいはカルボキシ末端(Lys(Py)2-Trp)に結合した薬剤を設計合成した.これらの配位子と一価のトリカルボニルレニウム(Re(CO)3)によりRe錯体を作製し,蛍光収率及び蛍光強度を測定した.水におけるRe(CO)3-Lys(Py)2の蛍光収率は0.1%未満と極めて低かった.そのため,蛍光強度も低く,測定するためには,0.1 mMという高い濃度を必要とした.一方,Trpを結合したものは予想に反し,0.4%程度と蛍光収率の増加が認められた.これはTrp骨格の発光が影響していると考えられた.また,蛍光強度はこの化合物を用いた場合においても低く,改善の必要性が考えられた.そこで,ピリジンではなく,キノリンを用いた薬剤についても新たに設計,合成し,その蛍光収率および蛍光強度を検討した.しかしながら,本錯体においもても蛍光収率は0.7%と低く,蛍光強度もピリジンを用いた場合と同程度であった.現在,蛍光収率及び発光強度を高めるために,錯体がリジッドになるように,ピリジンを2個繋げたジピリジンを用いた新たな配位子を設計,合成し,目的とする蛍光収率を与える錯体を与えるかどうか検討していくことを考えている.99mTcとReは同族であり、同様の配位子により同様の錯体を形成することから、99mTcにより放射性薬剤に、非放射性Reにより蛍光薬剤になる配位子の開発およびそれらの配位子を用いた薬剤への開発を検討した。これまでに2個のピリジンとアミンを含む配位子とトリカルボニルレニウムコアを用いた錯体が蛍光を発すると報告されていることから、この配位子の蛍光強度を測定した。しかしながら、水溶液中では発光収率が低く,新規の配位子の必要性が認められた。そこで、より配位部がリジッドなジピリジル骨格およびフェナントロリン骨格を用いた錯体の開発を行った。また、配位子の脂溶性が高くなることから、ジピリジル骨格にはカルボン酸を導入したもの、およびフェナントロリン骨格にはスルホン酸を導入した配位子についても検討した.その結果、ジピリジル骨格の場合がもっともより蛍光収率を示し、ついで,フェナントロリン骨格にスルホン酸を導入したものとなった。ジピリジル骨格にカルボン酸を導入したものおよびフェナントロリン骨格は低い値であった。そこで、ジピリジル骨格を配位子に選択し、リンパ節転移の有無を確認するために使用されるセンチネルリンパ節検出薬剤への応用を目指し、現在、オリゴマンノースを結合した薬剤の合成を行っている。本年度は,当初予定していた配位子の合成およびレニウム錯体の作製を完了し,蛍光強度および蛍光収率を測定することができた.しかし,当初予定していたよりも,蛍光強度および蛍光収率が低く,改善する必要があった.このようなことは計画当初の予想範囲内であることから,達成度は十分であると考えている.放射性薬品化学昨年度作製したピリジンを用いたレニウム錯体では,蛍光強度および蛍光収率が低く,改善が必要と考えられた.そこで,より錯構造がリジッッドであると考えられるジピリジンを母体とした化合物について合成を行っている.鉄の蛍光検出薬剤であるフェナントロリンを用いたレニウム錯体も計画している.
鉄筋とコンクリートの付着応力-すべり関係における時間依存性

一昨年度に開始したコンクリートブロックの中心に埋め込んだ鉄筋に引抜き荷重を持続して作用させる片引き付着クリープ試験を継続して行ってきた。試験方法は,センターホール油圧ジャッキを用いて鉄筋に所定の引抜き荷重を作用させたものである。そのときの荷重の大きさはセンターホール型荷重計によって制御した。時間の経過とともに生じる鉄筋の伸び出しによる荷重の低下を小さくするために,反力装置として鋼製バネを用いた。付着応力-すべり関係を求めるためには,鉄筋軸方向のひずみ分布および自由端での鉄筋のすべりを測定する必要がある。鉄筋のひずみおよび自由端すべりを長期間継続して測定するために,デジタルひずみ測定器およびスイッチボックスを用いた。長期間継続して測定されたひずみ分布から,時間とともに変化する付着応力-すべり関係を求めた。時間の経過とともに付着応力は低下するが,低下の割合に対する鉄筋のフシ形状,コンクリート強度,持続荷重の大きさの影響を明らかにした。モデル化の手法については,すべり量を時間依存性すべり成分と瞬間すべり成分とに分離して,時間依存性成分を時間の関数で表すのが適当であると考えられ,すべり量を粘性成分,瞬間弾性成分および瞬間塑性成分とが組合わさったものとして考えた。コンクリートブロックの中心に埋め込んだ鉄筋に引抜き荷重を持続して作用させる片引き付着クリープ試験を行っている。付着割裂ひびわれが生じないようにするために,コンクリートブロックの大きさを鉄筋径の20倍程度とした。定着長すなわち供試体の長さは,載荷する反対側の自由端で鉄筋のすべりが生じない長いものを用いている。センターホール油圧ジャッキを用いて鉄筋に所定の引抜き荷重を作用させている。そのときの荷重の大きさはセンターホール型荷重計によって制御している。時間の経過とともに生じる鉄筋の伸び出しによる荷重の低下を小さくするために,反力装置として鋼製バネを用いている。実験条件は,コンクリート強度,鉄筋のふし形状,持続荷重の大きさである。鉄筋のひずみおよび自由端すべりを長期間継続して測定するために,デジタルひずみ測定器およびスイッチボックスを用いている。モデル化については,載荷を開始してから時間が短いために,十分な考察は行えないが,載荷初期におけるひずみ分布の変化すなわち付着クリープの測定結果から,長期にも適用できる基本的な考え方をまとめているところである。手法については,すべり量を時間依存性すべり成分と瞬間すべり成分とに分離して,時間依存性成分を時間の関数で表すのが適当であると考えられ,すべり量を粘性成分,瞬間弾性成分および瞬間塑性成分とが組合わさったものとして考えようとしている。昨年度に開始したコンクリートブロックの中心に埋め込んだ鉄筋に引抜き荷重を持続して作用させる片引き付着クリープ試験を継続して行っている。方法は,センターホール油圧ジャッキを用いて鉄筋に所定の引抜き荷重を作用させている。モデル化については,載荷を開始してから時間が十分ではないが,初期におけるひずみ分布の変化すなわち付着クリープの測定結果から,長期にも適用できる基本的な考え方をまとめているところである。最終年度である来年度に付着クリープの定量的モデルを提案する予定である。
化学療法による膵癌組織遺伝子発現変化の網羅的解析

学内の研究分担者と,症例の選定基準やインフォームドコンセントの取得,術前生検標本及び手術検体からの凍結標本採取に関するフロー,マニュアルを作成し,症例の選定,登録が確実かつ速やかに行われる体制を整えた.2018年度に研究施設(東京医科大学病院)で術前化学療法後に手術が施行された膵癌症例は,19例であった.男女比は9:10で,年齢分布は44歳77歳(平均66.1歳),腫瘍の局在は頭部が13例,体尾部が6例であった.19例中,14例(73.7%)では術前に超音波内視鏡ガイド下の生検(Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)が行われており,13例において膵癌の確定診断がついていた.Gemcitabine + nab-Paclitaxelの術前化学療法施行後に膵切除が行われ,切除材料における治療効果判定(膵癌取扱い規約第7版に基づく)は,Grade 1a (癌の推定残存率が90%以上)が9例,Grade 1b (同50%以上かつ90%未満)が7例,Grade 2 (同10%以上かつ50%未満)が1例,Grade 3 (同10%未満)が0例,Grade 4 (生存し得ると判断される癌細胞を認めない)が2例であった.多くは"治療効果が軽度の効果あるいは無効(Grade 1)"であったが,"完全奏功(Grade 4)"例もみられる結果となった.以上の所見からは,術前治療施行例の多くにおいて術前生検標本からも癌のサンプルの採取が可能,すなわち同一症例において化学療法の施行前後の癌組織で遺伝子発現の比較検討が可能であることが分かった.また,治療効果には症例ごとにばらつきがあり,各Grade間においても遺伝子発現の変化に関しての比較が出来る可能性があることが示唆された.学内での倫理審査の手続き,承認に時間がかかってしまった.研究実績概要の部に示したように,当院での術前化学療法施行例は非常に豊富であり,その多くで術前の生検包本による癌との確定診断が付いている.また手術検体における治療効果判定も適切に施行出来ている.今後は症例の登録,集積は順調に進み,研究期間中に予定症例数10例の解析を終了することが見込まれる.学内の研究分担者と,症例の選定基準やインフォームドコンセントの取得,術前生検標本及び手術検体からの凍結標本採取に関するフロー,マニュアルを作成し,症例の選定,登録が確実かつ速やかに行われる体制を整えた.2018年度に研究施設(東京医科大学病院)で術前化学療法後に手術が施行された膵癌症例は,19例であった.男女比は9:10で,年齢分布は44歳77歳(平均66.1歳),腫瘍の局在は頭部が13例,体尾部が6例であった.19例中,14例(73.7%)では術前に超音波内視鏡ガイド下の生検(Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration, EUS-FNA)が行われており,13例において膵癌の確定診断がついていた.Gemcitabine + nab-Paclitaxelの術前化学療法施行後に膵切除が行われ,切除材料における治療効果判定(膵癌取扱い規約第7版に基づく)は,Grade 1a (癌の推定残存率が90%以上)が9例,Grade 1b (同50%以上かつ90%未満)が7例,Grade 2 (同10%以上かつ50%未満)が1例,Grade 3 (同10%未満)が0例,Grade 4 (生存し得ると判断される癌細胞を認めない)が2例であった.多くは"治療効果が軽度の効果あるいは無効(Grade 1)"であったが,"完全奏功(Grade 4)"例もみられる結果となった.以上の所見からは,術前治療施行例の多くにおいて術前生検標本からも癌のサンプルの採取が可能,すなわち同一症例において化学療法の施行前後の癌組織で遺伝子発現の比較検討が可能であることが分かった.また,治療効果には症例ごとにばらつきがあり,各Grade間においても遺伝子発現の変化に関しての比較が出来る可能性があることが示唆された.学内での倫理審査の手続き,承認に時間がかかってしまった.研究実績概要の部に示したように,当院での術前化学療法施行例は非常に豊富であり,その多くで術前の生検包本による癌との確定診断が付いている.また手術検体における治療効果判定も適切に施行出来ている.今後は症例の登録,集積は順調に進み,研究期間中に予定症例数10例の解析を終了することが見込まれる.本年度に予定していた術前生検サンプルを用いたmRNAの網羅的解析まで研究が進まなかったため次年度使用顎が生じた.次年度は,本年度に予定していた症例に加え今後加わる新規症例を併せて上記解析を行うために使用する計画である.
単球増殖誘導技術を用いた樹状細胞の大量生産

樹状細胞を用いたがん治療は、国内外において幅広く実施されている。樹状細胞療法をさらに普及させ、評価を進めるには、樹状細胞の安定大量供給が必須である。樹状細胞は、末梢血単球から作製されているが、従来、単球を増殖させることことは不可能であり、必要数の単球を得るためにアフェレーシス操作による白血球分離が必要である。本研究では、こヒトの単球を増殖させる手法を開発し、これを臨床的に実用化するための基礎的検討を行った。その成果として、侵襲性を伴うアフェレーシスを行うことなく樹状細胞療法を行うことが可能になった。これにより、末梢血単球数の少ない患者でも実施可能になることが期待される。悪性腫瘍に対する能動免疫療法として、患者末梢血の単球に由来する樹状細胞を用いたワクチン療法が、国内外の多くの施設で行われている。樹状細胞ワクチン療法には大量の樹状細胞を作成することが必要であるため、アフェレーシス操作による患者末梢血からの白血球分離が行なわれている。この手法には、患者の負担が大きく、また、化学療法を受けたがん患者等では、白血球が減少しており、実施できないという問題がある。本年度の研究では、ヒトの単球を生体外で増殖させることにより、少量の末梢血から大量のDCを作成する方法を開発している。末梢血より分離した単球に細胞増殖因子であるcMYCとBMI1を導入し、M-CSFとGM-CSFの存在下で培養すると3-5週後に細胞増殖を認め、最終的に20-1000倍に増殖させることが可能であった。この現象は健常人ドナーの約7割に由来する単球で認められた。そして、この増殖細胞をCD14 cell-derived myeloidcell line(CD14-ML)と命名した。増殖したCD14-MLにIL-4とTNFαまたはOK432を添加すると強力なT細胞刺激活性を有する樹状細胞(CD14-ML-DC)へと分化した。ウイルス抗原由来のエピトープペプチド、あるいは、腫瘍抗原由来のペプチドをこのCD14-ML-DCに負荷し、同じ血液細胞ドナー由来のT細胞をこのCD14-ML-DCを用いて刺激培養を行なうことにより抗原特異的なT細胞ラインを誘導することができた。癌免疫療法においては、HLA抗原により提示された癌抗原ペプチドに特異的なT細胞を誘導することが最も重要である。樹状細胞(DC)は非常に高いT細胞刺激能力を有する細胞であり、DCを用いた抗腫瘍ワクチン療法は広く行われている。これまでにDCワクチン療法が、腫瘍の縮小、生存率の改善に有用であるという報告もなされている。しかしながら、血液中に存在するDCはわずかであり、血液中のDCを採取して免疫療法に使用することは難しい。そこで、一般には、DCワクチン療法を行うために、患者自身の単球(約1×108個)より、DCを作製することが行なわれている。そして、大量の単球を得るためにアフェレーシス操作による癌患者末梢血からの白血球分離が行なわれており、患者の負担が大きいという問題がある。この問題の解決法の一つとしてヒトiPS細胞からDCに分化させる方法があるが、個々のヒトiPS細胞樹立には時間がかかる上、ヒトiPS細胞からDCに分化させる段階でも約1ヶ月程度かかるという問題がある。研究代表者らは、以前の研究において、ヒトの末梢血単球をin vitroにおいて増殖させる手法を開発していた。この手法により増殖させたミエロイド系血液細胞をCD14MLと命名した。CD14MLは、通常の末梢血単球と同様に、GM-CSFとIL-4の刺激により樹状細胞(CD14ML-DC)へ分化する。そこで、末梢血単球からCD14MLを作成し、増殖させた後、CD14ML-DCへ分化させる事により、大量の樹状細胞を作成できる。平成26年度の研究においては、CD14ML-DCを用いて各種腫瘍抗原に反応性を有するT細胞の誘導を行なった。癌に対する抗原特異的免疫療法には、適切な癌抗原を標的とすることにより、副作用が少なく、かつ効果の高い治療法になる可能性がある。近年、癌抗原ペプチドを用いたワクチン療法の臨床試験が進められており、腫瘍ワクチンとして有用な抗原の同定が進んでいる。樹状細胞療法は、腫瘍抗原を用いたワクチンの効果を増強する手法として期待されるが、“患者の末梢血単球を単純に樹状細胞に分化させて治療に用いる“という既存の方法では、樹状細胞調整の不安定性および作成可能な樹状細胞の数が少ないことから医療技術としての確立およびさらなる普及は困難であると考えられる。特に、治療の対象となる悪性腫瘍患者では、化学療法等の影響もあり、末梢血単球が減少していて、十分な数の樹状細胞を調整できない場合が少なくない。本研究では、ヒトの末梢血単球に、cMYCとBMI1、さらに、BCL2あるいはLYL1の遺伝子を導入することにより、腫瘍化させることなく、増殖させる技術を開発した。そして、ヒト単球由来の増殖能力を有するミエロイド細胞をCD14-MLと命名した。CD14-MLは、樹状細胞への分化能力を保持したまま100倍から数千倍に増殖する。本研究の成果を実用化できれば、比較的少量の末梢血から樹状細胞を安定して大量生産することが可能になり、樹状細胞療法の普及に大きな貢献をなすものと期待される。

樹状細胞療法をさらに普及させ、評価を進めるには、樹状細胞の安定大量供給が必須である。樹状細胞は、末梢血単球から作製されているが、従来、単球を増殖させることことは不可能であり、必要数の単球を得るためにアフェレーシス操作による白血球分離が必要である。本研究では、こヒトの単球を増殖させる手法を開発し、これを臨床的に実用化するための基礎的検討を行った。その成果として、侵襲性を伴うアフェレーシスを行うことなく樹状細胞療法を行うことが可能になった。これにより、末梢血単球数の少ない患者でも実施可能になることが期待される。CD14ML-DCを用いた腫瘍抗原に特異的なT細胞のin vitro誘導に関しては、従来のDCを用いた培養法の場合とは条件を修正する必要があることが判明した。これは、CD14ML-DCが、通常のDCよりも強いT細胞刺激活性を有しており、また、IL-12などのサイトカインの産生量も非常に多い事によるものと考えられた。そこで、培養系へ加えるCD14ML-DCの数を調整する等の条件を検討し、最適化を試みた。その結果、複数の癌抗原に特異的なT細胞ラインを複数のドナーから樹立する事に成功した。免疫学現状では、凍結保存した単球からのCD14ML作成はやや困難である。また、以前に比べると大幅に改善されてはいるものの、細胞ドナーによって作成効率に大きな違いがある。この技術を癌免疫療法において使用するべく実用化するためには、このよう問題を解決するべく、CD14MLの作成方法を改善する必要がある。今年度は、この問題に取組みたい。CD14-ML作成の問題点として、細胞ドナーにより、作成できない場合があることが挙げられる。細胞増殖因子としてcMYCとBMI1に加えてこれら以外の因子を導入することにより、この問題を解決するべく試行錯誤している。これまでに、10種類以上の細胞増殖因子、あるいは、細胞死抑制因子を試みている。しかしながら、現時点では、ドナーによらずだれからでもCD14-MLを作成できるという状況には至っていない。こんごともこの点に関しては努力を続けていきたい。次年度も継続して研究を実施する必要がある。ドナーによらずだれからでもCD14-MLを作成できるように手法を改善することが、まず、必要であると考えている。このために、付加的な因子の探索を平成26年度にも行なうことを計画している。さらに、T細胞の認識エピトープを合成ペプチドとして作製しCD14-ML-DCに負荷するのではなく、抗原タンパク質をコードする遺伝子を導入して、エピトープを提示させることを試みたい。また、CD14-ML-DCの樹状細胞としての詳細な特性解析も行なう。
麻酔前投薬が体温(中枢温・末梢温)に及ぼす影響と低体温防止に関する研究

術中・麻酔中の体温低下は我々麻酔科医が常日頃遭遇することである。その中でも麻酔導入時の中枢温の低下は特に著しい。その原因として中枢から末梢への熱の再分布が大きく影響している。さらに、手術中も熱産生、熱喪失のバランスが崩れることにより、中枢温は低下することが多い。その結果、手術後のシバリング(ふるえ)、虚血性心電図変化などの合併症が生じ得る。本研究では、麻酔前投薬として頻用されるミダゾラム、硫酸アトロピンが体温(中枢温、末梢温)に及ぼす影響およびミダゾラムによる体温変化(特に中枢温低下)をどの様に防止するか、について臨床的・体温生理学的な観点から検討した。<プロトコール>対象:全身麻酔(予定手術症例):60歳以上ミダゾラム、硫酸アトロピン投与(筋注)によるグループ分けGroup1:前投薬なし(コントロール)(n=10)、Group2:ミダゾラム(0.05mg/kg)(n=10)Group3:硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)、Group4:ミダゾラム(0.05mg/kg)+硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)測定項目(前投薬直前および30分後)体温:体温測定装置(Mon-a-therm6510,マリンクロット社製:現有設備)体温測定プローブ:消耗品購入中枢温:鼓膜温(右、左)、食道温、膀胱温、直腸温末梢温:末梢温:皮膚温(7ヶ所):胸部、上腕、前腕、示指、大腿、下腿、栂指以上のようなプロトコールに基づいて研究を行い、ミダゾラムのもたらす中枢温低下がアトロピン投与により防止され得ることを示した。これらを英文論文化した。本研究では、麻酔前投薬として頻用されるミダゾラム、硫酸アトロピンが体温(中枢温、末梢温)に及ぼす影響およびミダゾラムによる体温変化(特に中枢温低下)をどの様に防止するか、について臨床的・体温生理学的な観点から検討する。ミダゾラム、硫酸アトロピンが実際の患者の体温中枢温・末梢温)に及ぼす影響を検討することに加えて、ボランティアにおいて麻酔前投薬前に保温することによりミダゾラムによる再分布性体温低下(Redistribution hypothermia)の予防法を検討することを目的とする。<プロトコール>対象:全身麻酔(予定手術症例):平成12年度ミダゾラム、硫酸アトロピン投与(筋注)によるグループ分けGroup 1:前投薬なし(コントロール)(n=10)、Group 2:ミダゾラム(0.05mg/kg)(n=10)Group 3:硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)、Group 4:ミダゾラム(0.05mg/kg)+硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)測定項目(前投薬直前および30分後)体温:体温測定装置(Mon-a-therm 6510,マリンクロット社製:現有設備)

体温測定プローブ:消耗品購入中枢温:鼓膜温(右、左)、食道温、膀胱温、直腸温末梢温:末梢温:皮膚温(7ヶ所):胸部、上腕、前腕、示指、大腿、下腿、拇指以上のようなプロトコールに基づいて研究を行っている。術中・麻酔中の体温低下は我々麻酔科医が常日頃遭遇することである。その中でも麻酔導入時の中枢温の低下は特に著しい。その原因として中枢から末梢への熱の再分布が大きく影響している。さらに、手術中も熱産生、熱喪失のバランスが崩れることにより、中枢温は低下することが多い。その結果、手術後のシバリング(ふるえ)、虚血性心電図変化などの合併症が生じ得る。本研究では、麻酔前投薬として頻用されるミダゾラム、硫酸アトロピンが体温(中枢温、末梢温)に及ぼす影響およびミダゾラムによる体温変化(特に中枢温低下)をどの様に防止するか、について臨床的・体温生理学的な観点から検討した。<プロトコール>対象:全身麻酔(予定手術症例):60歳以上ミダゾラム、硫酸アトロピン投与(筋注)によるグループ分けGroup1:前投薬なし(コントロール)(n=10)、Group2:ミダゾラム(0.05mg/kg)(n=10)Group3:硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)、Group4:ミダゾラム(0.05mg/kg)+硫酸アトロピン(0.01mg/kg)(n=10)測定項目(前投薬直前および30分後)体温:体温測定装置(Mon-a-therm6510,マリンクロット社製:現有設備)体温測定プローブ:消耗品購入中枢温:鼓膜温(右、左)、食道温、膀胱温、直腸温末梢温:末梢温:皮膚温(7ケ所):胸部、上腕、前腕、示指、大腿、下腿、拇指以上のようなプロトコールに基づいて研究を行い、ミダゾラムのもたらす中枢温低下がアトロピン投与により防止され得ることを示した。これらを英文論文化した。
魚類細胞の培養技術が直面した問題点特異点解消に関する研究

本研究の目的は、水産研究の基礎となる実用的な改良型細胞培養法、1:細胞の浮遊培養、2:無血清培養、3:細胞外マトリックスについて現在抱えている課題・問題点を克服することにあり同時に魚類細胞の培養技術の確立と改善発展を目的とした。その結果、(1)魚類細胞の浮遊培養:魚類細胞において唯一の完全浮遊培養適合マスノスケ細胞CHSE-spの利用と魚類細胞の特性・低温耐性の兼用により、低温状態で単離細胞の開発に成功した。本細胞は汎用冷蔵庫等で保存でき、用時プレート等に注ぐだけで培養細胞は即接着伸展を開始しアッセイに使用可能な状態を提供し、煩雑な継代保存等の操作をいっさい必要としない。細胞性状は類縁細胞と異なるもののウイルス感受性等有用性状に変化がない。(2)無血清培養:魚類細胞で初めて連続継代可能な完全無血清培養系細胞CHSE-nsの樹立に成功した。本細胞は培養上清に増殖促進、接着促進物質を分泌する。(3)細胞外マトリックス:陸上動物I型コラーゲン上におけるCHSE-sp細胞の接着拒否の問題は熱変性により解消できること、またその接着機構には-RGD-配列が関与している事を明らかにした。真皮I型コラーゲンは、由来動物に依存しCHSE-spの細胞接着親和性の違い、として現れる事が明らかになった。以上のことから、CHSE-ss細胞は各種バイオアッセイ(環境汚染物質、病原ウイルス等の検出)に、CHSE-ns細胞は魚類特異的増殖因子の検索等において同時に自己分泌するサイトカインにおいて、コラーゲン問題では困難を究めているある種の魚類初代細胞の培養法に有用であると考えられる。魚類由来の培養細胞は,魚類生理や魚病ウイルス研究の材料としてだけでなくバイオテクノロジー,細胞工学などの分野で,今後更にその重要性そして将来的有用性を発揮すると予想されるが,既に哺乳動物の細胞培養技術を安易に転用,または依存して事足りる段階は終了し,魚類細胞の特性,特異性を充分理解した上で,新たな培養法を開発していく事が急務となっている。そこで本研究では,今後,水産応用研究の基礎となる実用的な改良型細胞培養法,(1)細胞の浮遊培養(2)無血清培養(3)細胞外マトリックスを用いた培養法,が現在抱えている問題点を克服すること,同時に具体的成果として,魚類細胞の培養技術の確立と改善することを目的とした。上記(1)-(3)について平成6年度は以下のような結果及び実績を得た。1)従来申請者が開発して来た連続浮遊培養法に加え,6年度は,CHSE-sp細胞を用い間欠攪拌浮遊培養法,更に静置浮遊培養法の可能な細胞系統を選抜した。この株化細胞は,これまで報告されている魚類由来株化細胞には例のない新しいタイプの細胞系統であり,つまり,その培養において専用の培養容器を必要とせず,汎用撥水性容器,例えばプラスチック試験管等,でも静置浮遊状態で培養可能であり,用時ミキシング・ピッペティング等で容易に単離分散細胞をあたえる培養系である。今後,各種バイオアッセイ等の素材として,また生理活性物質生産における高密度培養に適する細胞として期待される細胞である。2)細胞の増殖効率を迅速に評価できる方法としてMTT法をCHSE-sp細胞について検討評価した結果,有効であることが明らかになった。3)コラーゲン基質を評価する上で必要な,完全に細胞接着を拒否するシャーレの調整は,合成高分子試薬で皮膜することにより可能であることを明らかにした。

そこで本研究では,今後,水産応用研究の基礎となる実用的な改良型細胞培養法,(1)細胞の浮遊培養(2)無血清培養(3)細胞外マトリックスを用いた培養法,が現在抱えている問題点を克服すること,同時に具体的成果として,魚類細胞の培養技術の確立と改善することを目的とした。上記(1)-(3)について平成7年度は以下のような結果及び実績を得た。1)従来申請者が開発して来た連続浮遊培養法に加え,7年度は,これまでほとんど知見のない有用培養法である高密度培養にチャレンジした。その結果,コイ科魚類細胞(FHM-sp)において魚類細胞としては初めて1000万細胞/mlの密度を越え,最高細胞密度2500万細胞/mlまで到達する培養に成功した。同時に物質生産の観点からウイルス生産(IHNV)を試み,この高密度状態においても充分高い物質生産活性を維持することを確認した。(2)完全無血清条件で長期連続培養可能な細胞系(CHSE-ns)の開発に魚類細胞として初めて成功した。かつこの培養系のトリプシン継代法にも成功した。(3)哺乳類I型コラーゲンを用いて,マスノスケCHSE-sp細胞の静置浮遊培養に初めて成功した。以上の成果はいずれも魚類細胞の培養法として,初めて実現可能となった培養系であり,今後関連する基礎応用研究の貴重なモデルとして多くの知見を与えるものと確信する。現在,雑誌投稿論文として発表準備中である。本研究の目的は、水産研究の基礎となる実用的な改良型細胞培養法、1:細胞の浮遊培養、2:無血清培養、3:細胞外マトリックスについて現在抱えている課題・問題点を克服することにあり同時に魚類細胞の培養技術の確立と改善発展を目的とした。その結果(1)魚類細胞の浮遊培養:魚類細胞において唯一の完全浮遊培養適合マスノスケ細胞CHSE-spの利用と魚類細胞の特性・低温耐性の兼用により、低温状態で単離分散状態のまま長期保存可能なCHSE-ss細胞の樹立に成功した。つまり缶詰瓶詰型の培養細胞の開発に成功した。本細胞は汎用冷蔵庫等で保存でき、用時プレート等に注ぐだけで細胞は即接着伸展を開始しアッセイに使用可能な状態を提供し、煩雑な継代保存等の操作をいっさい必要としない。細胞性状は類縁細胞と異なるもののウイルス感受性等有用性状に変化がない。(2)無血清培養:魚類細胞で初めての連続継代可能な完全無血清培養系細胞CHSE-nsの樹立に成功した。本細胞は培養上清に増殖促進、接着促進物質を分泌する。(3)細胞外マトリックス:陸上動物I型コラーゲン上におけるCHSE-sp細胞の接着拒否の問題は熱変性により解消できること、またその接着機構には-RGD-配列が関与している事を明らかにした。真皮I型コラーゲンは、由来動物に依存しCHSE-spの細胞接着親和性の違い、として現れる事が明らかになった。以上のことから、CHSE-ss細胞は各種バイオアッセイ(環境汚染物質、病原ウイルス等の検出)に、CHSE-ns細胞は魚類特異的増殖因子の検索等において同時に自己分泌するサイトカインにおいて、コラーゲン問題では困難を究めているある種の魚類初代細胞の培養法に有用であると考えられる。
実時間コンフォーカル位相差顕微鏡の開発と組織細胞観察

組織細胞の屈折率構造を3次元実時間観察可能な位相差顕微鏡の開発を目指し,レーザーによる輪帯照明と能動型画像処理とを融合したコンフォーカル位相差顕微鏡の構築と性能評価,組織細胞の実時間観察を実現する.この顕微鏡はこれまで実現できなかった厚い生体組織内部の位相構造を選択的に3次元観察可能であり,学術的には結像理論に基づく新しい共焦点位相差顕微鏡の開発,産業的にはiPS細胞や細胞シートなどの細胞評価法の開発に貢献できる.特に本研究では,実時間コンフォーカル位相差顕微鏡の試作,弱位相微粒子を用いた性能評価,位相マッピングを融合した強位相物体の定量抽出,厚い生体組織内部の3次元位相構造観察を検討する.組織細胞の屈折率構造を3次元実時間観察可能な位相差顕微鏡の開発を目指し,レーザーによる輪帯照明と能動型画像処理とを融合したコンフォーカル位相差顕微鏡の構築と性能評価,組織細胞の実時間観察を実現する.この顕微鏡はこれまで実現できなかった厚い生体組織内部の位相構造を選択的に3次元観察可能であり,学術的には結像理論に基づく新しい共焦点位相差顕微鏡の開発,産業的にはiPS細胞や細胞シートなどの細胞評価法の開発に貢献できる.特に本研究では,実時間コンフォーカル位相差顕微鏡の試作,弱位相微粒子を用いた性能評価,位相マッピングを融合した強位相物体の定量抽出,厚い生体組織内部の3次元位相構造観察を検討する.