hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜結合型増殖因子と受容体型チロシンキナーゼを介したがん細胞の浸潤制御機構

SiRNAによるPACSIN3とEve-1のノックダウンは共にTPAとAngIIによるHB-EGFのプロセシング誘導を効果的に抑制した。一方、HB-EGFのプロセシングによるカルボキシ末端断片(HB-EGF CTF)の産生は細胞周期のG1後期に起こり、PLZFの核外移行はS期後期に起こることをLasar scanning cytometry (LCS)を用いた解析により明らかにし、HB-EGF-Cシグナルが細胞周期の進行と深く関わることを示唆した。今後、これらの分子の解析からより詳細なADAM12を含むADAMの活性化機構が明らかにできるものと期待できる。またHB-EGF CTFシグナルによる細胞周期制御機構の解析は、今後新たな細胞増殖制御の分子機構の側面を明らかにできると考えている。研究分担者の佐々木らは、がん細胞の浸潤・転移機構について、膜蛋白質である細胞間接着分子の細胞内小胞輸送に注目した解析を行った。これまでに、上皮細胞のタイトジャンクション(TJ)を構成する接着分子claudinがゴルジ体から細胞膜に運ばれる過程や今一つのTJ接着分子occludinが細胞膜から細胞内に取り込まれ、再び細胞膜へリサイクリングされる過程をRab13低分子量G蛋白質(Rab13)が制御することを明らかにしてきた。本研究では、TJ接着分子の輸送を制御するRab13の標的蛋白質としてJRABを同定した。
核タンパク質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

1.HMG1,HMG2の一次構造上のDNA結合部位の同定:HMG1タンパク質を化学および酵素分解後、ペプチドを分離し、DNA結合能を測定した。この結果と一次構造、および最近見いだされたHMGタンパク質類似のDNA結合ドメインをもつタンパク質との比較により、結合に必要な2つの領域をほぼ特定できた。2.HMG1とHMG2のDNAへの親和性の差異の検索:前年度の研究によりゲルシフト・アッセイでHMG1,2の間にDNA結合能の大きな差異が認められた。この差異がリン酸化に由来するか否かを検索する為、脱リン酸化処理を行い、DNA結合能を比較したところ変化は認められなかった。他の結果と併せて考えると、DNA結合能の差異は両タンパク質の修飾によるのではなく、一次構造に起因するものと推定される。3.DNAとHMG2複合体の立体構造:HMG2タンパク質の上記2つの結合領域のうち、ドメインAをコ-ドするcDNAの塩基配列をPーガラクトシダ-ゼのcDNAの下流への連結し、P_Rプロモ-タ-をもつプラスミドへ挿入、大腸菌ヘトランスフォ-ムした。誘導によって高発現した融合タンパク質を分離精製後、ドメインAを酵素分解により切出し、分離精製する系を確立できた。今後、NMRおよびX線結晶回析を行い、DNA結合領域の立体構造解析を進める。4.HMG2遺伝子構造と発現制御領域の検索:ヒトHMG2遺伝子の単離にはじめて成功し、全塩基配列を決定した。この遺伝子の発現に必要な上流配列を特定し、その領域に結合する核内因子の存在を認め、結合配列を決定した。その発現促進の機構を検索中である。
コミュニティワークの社会教育的アプローチの構築に関する理論的・実践的研究

本研究では、コミュニティワークの社会教育的アプローチを構築するための理論的、実践的な研究である。以下の諸点を明らかにした。第1に、コミュニティワークをすすめる際に、参加する人びとのエンパワーメントをはかる必要があり、そのためには教育的アプローチが必要である。第2に、教育的アプローチとは、講座を開催するという手法ではなく、参加を深めるような教育的支援が求められる。第3に、教育者の役割は、この参加を支援するために学ぶ環境をつくることが大切である。研究成果を有効なものにするために、「市民参加でつくる計画・評価のためのツール」を開発し、NPOなどで活用されている。「コミュニティワークの社会教育的アプローチの構築に関する理論的・実践的研究」の今年度の研究では、主に、理論的研究を中心にすすめるとともに、実践的調査の準備のために予備調査等を実施した。理論的な検討については、とくに、地域福祉論のコミュニティワーク研究を批判的に研究した。その結果、以下の課題を明らかにできた。1.コミュニティワークは、イギリスの歴史では、社会福祉の専門職としてではなく、教育職など広い広がりがあること。2.地域福祉の領域では、コミュニティ・ソーシャルワークという概念が主流になりつつあり、その結果、個別化志向が強まりつつあること。つまり、リスク・アプローチに志向したことによって、コミュニティワークのもつ意義が十分理解されていないこと。3.他方、教育的実践固有の方法論も未確立であること。本研究が目的とするコミュニティワークの教育的実践の方法論の構築が求められていることを確認した。今年度は、2つの研究成果をまとめている。その一つが、『市民参加でつくる計画・評価ツールーロジック・モデルのガイドブック』の公刊であり、『コミュニティワークの教育的実践_教育と福祉とを結ぶ』(東信堂、発行予定)である。前者は、コミュニティワークの教育的アプローチをすすめる際の実践ツールを開発したものであり、後者は、今年度研究の総合的なまとめである。そこでは、(1)教育的実践を支える学習論の検討、(2)実践の目標である「福祉コミュニティ」をめぐる福祉研究の批判的な検討をする。(3)これらをうけて、実践の具体的なすすめ方、考え方等を論じている。以上、今後の研究の出発点をつくることができた。本研究では1.コミュニティワークの社会教育的アプローチの可能性を理論的に基礎づけるとともに、2.健康づくり、震災からの復興をめぐる対象地域をとりあげ、アクションリサーチによりながら実践の手法を開発することを試みる。この教育的アプローチの意義は、住民の地域活動への参加とエンパワーメントを図ることを通して、地域力を高める点にある。本年度の研究課題は、以下のようであった。1.コミュニティワークの理論研究である。計画にあったイギリスの調査については2013年8月に実施し、とくにスコットランドのCommunity learning and developmentに関する資料を収集するとともに、エディンバラ大学の研究者との研究交流をすすめた。韓国の調査については、ソウル大学との共同研究を進めるべく協議し、2013年10月には共同研究発表をすることができた。2.健康のまちづくりについては、行政及び住民組織との共同事業を行い、試験的な事業展開を実施した。3.被災地の調査については、研究分担者である上田幸夫が被災地の公民館調査を実施して研究報告をまとめた。また、韓国ソウル大学との共同研究の一環として、宮城県登米市の地域づくり計画の策定を、住民主体で実施する支援をしつつ必要な情報を収集することができた。行政、公民館を中心とする住民組織、NPO支援組織との協力関係を築くことができた。これらをもとに、次年度、引きつづき実践的調査を進める基盤を形成することができた。今年度は、1.健康づくりで活動している住民・住民組織の調査を実施すること、2.被災3地区の住民組織のヒヤリングを実施するとともに、各地区の復興をめぐる住民の活動を支援しながら、参加者のヒヤリング調査を実施すること、3.これまでの研究成果(日本社会教育学会、日本都市学会、東北社会学会)を学会で発表すること、などを研究課題として研究を進めてきた。研究の成果としては、2つの学会で発表し、「震災ボランティアの現状と課題」東北社会学会『社会学年報』第43号、31ー34頁、2014年.「だれがボランティアに参加しているのかー学ぶことの意義」日本社会教育学会『社会教育学研究』74ー76頁、2014年.「生涯学習のガバナンスとNPOの役割」『教育ネットワークセンター年報』、1-9頁、2014年と3つの論文をまとめることができた。調査としては、健康づくりの活動を展開している仙台市鶴ヶ谷地区の市民活動団体の活動を支援しながらアクションリサーチを展開し、健康祭りの成功に寄与することもできた。また、登米市の3つの地域の住民活動のヒヤリングも地域の協力をえて実施することげできた。最終年度に向けて詳細に分析すべき諸資料、インタビューデータなどをそろえることができた。企業、サードセクター、地域組織など多様な主体と行政とのネットワーク、連携、協働関係の構築が求められている。これによって指定管理者制度が導入され、生涯学習関連施設のガバナンスの再編がすすんでいる。しかし、その「協働」がいかなる関係であるのか、ということについてはそれほど詰められた検討はなされていない。また、地域のガバナンスを考える場合、生涯学習施設だけではなく、関連する諸施設のガバナンスの再編と、その再編原理を検討することが不可欠であるが、これらが総合的に検討された研究も見られない。

本研究では、少子高齢社会と関連する教育、健康・福祉領域における課題解決をめぐる協働関係の形成過程を追究しながら、これらのサービス・事業の提供をめぐる創発的協働の形成条件を明らかにすることをとおして、新しいガバナンスの構成要件を明らかにすることに目的があった。本研究では、1コミュニティワークに関する社会福祉領域の研究を批判的に総括しつつ、2スコットランドの三職種(コミュニティワーカー、コミュニティ・エデュケーター、ユースワーカー)の共同に関する政策をふまえ、3さらに、いくつかの地域における地域づくりにかかわる専門職者間の協働に関する実証的調査を実施した。その結果、社会教育的アプローチとは、社会的活動への能動的参加のなかで、参加した人たちの意欲や関心を高めるとともに、地域づくりに必要な知識、コミュニケーション力などを高める専門職による専門的な介入が必要なことを確認した。具体的な手法等については、高橋満著『コミュニティワークの教育的実践』(東信堂)としてまとめることができた。本研究では、コミュニティワークの社会教育的アプローチを構築するための理論的、実践的な研究である。以下の諸点を明らかにした。第1に、コミュニティワークをすすめる際に、参加する人びとのエンパワーメントをはかる必要があり、そのためには教育的アプローチが必要である。第2に、教育的アプローチとは、講座を開催するという手法ではなく、参加を深めるような教育的支援が求められる。第3に、教育者の役割は、この参加を支援するために学ぶ環境をつくることが大切である。研究成果を有効なものにするために、「市民参加でつくる計画・評価のためのツール」を開発し、NPOなどで活用されている。「おおむね順調に達成している」としたのは、昨年度学会報告をして3つの論文としてまとめることができたこと、必要な調査について、対象者や地域住民の協力を得えて実施することが予定通りできたことによる。27年度が最終年度であるため、記入しない。教育学今年度は最終年度である。最終報告に向けて必要な研究協力者を補充したので、追加の地域調査、より詳細な分析をすすめていきたい。研究成果は、社会教育学会・平成教育学会主催の日韓学術研究交流大会で報告を予定している。研究計画にもとづき、先行研究として地域福祉領域の研究成果を批判的に検討して、2つの成果をだしたこと。一つは、理論的な成果として、『コミュニティ・ワークの教育的実践』の出版。実践ツールとして、『市民参加でつくる計画・評価ツール』を出版である。研究2年目に向け、順調にすすんでいる。この科研費での研究成果をもとに、国際学会で研究成果を発表することができた。また、韓国ソウル大学との共同研究、イギリス(スコットランド)の研究者との情報交換をすることができて、今後の2年間の研究の基盤をつくることができた。研究成果としても、国際学会ほか、国内の学会雑誌の招待論文を執筆することができた。
マトリックス効果を考慮した二次イオン質量分析イメージングの開発

飛行時間型二次イオン質量分析(TOF-SIMS)は100nm程度の高い面分解能と数nmの深さ分解能で2次元及び3次元化学イメージングが得られる手法で、生体試料から高機能デバイスまで多様な分野への応用が期待されているが、共存物質による影響(マトリックス効果)のため、正確な定量が難しい場合もある。そこで、特に生体試料で問題となるタンパク質やペプチド由来の二次イオン強度への脂質の影響を調べ、さらにその補正方法を検討することにより、より正確なTOF-SIMSイメージングを可能とすることを目指して、研究を進めた。3成分系も含めて、複数のタンパク質およびペプチドの混合試料を調整し、TOF-SIMSおよび比較対象として、ほとんどフラグメント化を起こさない分子クラスターによるイオン化手法desorption/ionization induced by neutral cluster: DINeCによる測定を進めた。2017年度のデータも含め、測定が終了した混合試料データについて、マトリックス効果がどのように現れるか検討した。マトリックス効果は、注目する二次イオンによって効果の大きさが異なる。また、同じ脂質との混合試料でもペプチドによってマトリックス効果が異なり、増大される場合と抑制される場合のいずれも起こりうることが示された。さらに昨年度に引き続き、ペプチド脂質の混合系である生物試料の測定を高い質量分解能でピーク分離できるオービトラップおよびMSMSを搭載したOrbiSIMSで実施した。OrbiSIMSは、英国物理学研究所が所有する装置を用い、生物試料は、2017年度のデータの解析結果から、注目する因子をより効果的に取り出せるように、細胞をなるべく破壊しない手法で調整した。これらの成果は論文投稿と、学会発表を準備中である。研究計画に従って、3成分系以上の混合試料も含めて、複数のペプチド、脂質の混合試料を作製し、TOF-SIMSおよびDINeCでの測定を実施している。また、生体試料の測定もすでにある程度終わっており、解析に取りかかっている段階である。3成分系も含めた混合モデル試料におけるマトリックス効果を評価できる指標を見つけ出し、2成分系に応用されていた補正方法を3成分系にも応用する。また、TOF-SIMS以外の測定方法によるマトリックス効果の大きさや有無を検討し、複数の測定データを相補的に解析することによって、マトリックス効果を補正できるか検討する。比率を変えた脂質とペプチドをvortexミキサーを用いて混合した溶液をSi基板に滴下して、試料を作製した。この作製方法によって、再現性の高い比較的均一な試料の調整が可能となった。各試料を飛行時間型二次イオン質量分析(TOF-SIMS)および分子イオンクラスター(DINeC)で測定し、発生するイオンの相対強度を比較した。TOF-SIMSスペクトルに関しては、ペプチドおよび脂質の[M+H]+(Mは各分子)などの分子構造を保った二次イオンとフラグメントイオンそれぞれに関してマトリックス効果の違いを検討した。また[M+H]+とフラグメントイオンの差異がペプチドの分子量と関係があるかなども検討する。TOF-SIMSに関しては、異なる一次イオン源(GaとBiクラスター)を用い、一次イオンビームによるマトリックス効果の大きさの違いも検討したが、よく混合した試料では大きな違いは見られなかった。DINeCに関しては、マトリックス効果の有無をまず検討したところ、マトリックス効果があることが確認された。ただしDINeCとTOF-SIMSでは、同じ試料でもマトリックス効果の現れ方が異なることが示された。これらの成果は、国際学会でも発表し、学術誌に論文として投稿し、採択された。ペプチド脂質の混合系である生物試料の測定を高い質量分解能でピーク分離できるオービトラップおよびMSMSを搭載した3D nanoSIMSによる測定を英国物理学研究所で行った。解析は次年度に続く。脂質とペプチドの混合方法が改良され、TOF-SIMS, DINeC, OrbiSIMSによる試料測定が実施できた。また、これまでに得られた成果をまとめた論文を学術雑誌に投稿し、採択された。

研究計画に従って、3成分系以上の混合試料も含めて、複数のペプチド、脂質の混合試料を作製し、TOF-SIMSおよびDINeCでの測定を実施している。また、生体試料の測定もすでにある程度終わっており、解析に取りかかっている段階である。3成分系以上のモデル試料を作製し、予定にしたがって、TOF-SIMS, DINeCでの検討を実施する。3成分系も含めた混合モデル試料におけるマトリックス効果を評価できる指標を見つけ出し、2成分系に応用されていた補正方法を3成分系にも応用する。また、TOF-SIMS以外の測定方法によるマトリックス効果の大きさや有無を検討し、複数の測定データを相補的に解析することによって、マトリックス効果を補正できるか検討する。データの解析をおもに進めたため、試薬類の新たな購入や測定にかかる費用の一部が次年度に必要となったため。
軟骨石灰化不全ラットの形態異常を規定する分子の解明：頭蓋底軟骨と下顎頭軟骨

SD系列ラット由来の軟骨石灰化不全ラット(Cartilage Calcification Insufficient rat, CCIラット)は全身性軟骨石灰化遅延を示し軟骨の肥大化が特徴で、一方骨には影響しない軟骨内石灰化制御不全である。本研究では、形成された軟骨と、軟骨の吸収不全による骨化の遅れの二面性があり、軟骨から採取したcDNAマイクロアレイでインディアンヘッジホッグシグナル関連するGli1遺伝子の亢進がreal time PCRとin situ hybridization法のいずれでも明らかとなった。すなわち、BrdU取込み軟骨細胞数からみても軟骨増生の亢進が明らかとなった。交付申請における研究目的、研究計画では、自然発症型の軟骨石灰化不全を示すCCIラットは、責任遺伝子のホモ相同染色体で形質発現することから、ダブルヘテロの親CCIラットによる常染色体劣性遺伝によるフェノタイプが生じていることが考えられる。本研究では、先ずこの自然発症型CCIラットの繁殖と交配実験から、責任遺伝子の同定と遺伝子の機能解明を行うため、(1)CCIラットの形質発現に関する責任遺伝子解明(2)CCIラットの病態に関する形態学的および分子生物学的検索(3)CCIラットとヒトにおける発育異常との関連検索としている。平成27年度は(1)の責任遺伝子解明に向けた研究を行った。その結果、CCIラットのWild type近交系SDラットからの発症頻度がほぼ1/3に近似することが判明し、劣性遺伝で発症することが明らかだった。そこで、親の責任遺伝子ヘテロ接合である場合、常染色体に責任遺伝子が存在すると仮定し、Wild typeの近交系オス、メスの各SDラットと対応するペアのCCIラットとのF1世代を作成して、表現型とその割合を確認しようとしたが、CCIラットとの自然性交が成功しなかった。一方、CCIラットの形態発現の異常の検索も行い、軟骨内骨化への分子シグナルの異常で、Ihh-PTHrPシグナルに関するmRNAの異常高値を検出している。現在はPTHrPの発現についても下顎頭軟骨と頭蓋底軟骨結合において観察しており、2週齢のCCIラットでは、Wild typeのSDラットに比べて下顎頭軟骨の表層には大量の線維層が存在し、この部におけるIhhとGli1のmRNA発現がin situ hybridizationで高いことが判明した。しかし、この結果は同時期の同個体の頭蓋底軟骨結合ではあてはまらず、これらの分子の発現時期が時・空間的に変化しながら軟骨内骨化をしていくことが予想できた。Wild typeの近交系オス、メスの各SDラットと対応するペアのCCIラットとのF1世代を作成して、表現型とその割合を確認しようとしたが、CCIラットとの自然性交が成功しなかった。これはCCIラットの形態異常なのか、生殖能力としての機能不全なのかが不明なため、この検索を追従して行う必要があると考え、現在、人工的受精などに切り替えるなどの検討をしている。軟骨石灰化不全を生後自然発症するラット(CCIラット)の頭蓋底軟骨結合や下頭頭軟骨における軟骨内骨化と成長の異常について形態学的な異常がみられた。さらに軟骨細胞におけるインディアンヘッジホッグシグナル(Ihh-PTHrP)、特に転写因子のGli1mRNAの過剰発現とこれに伴う軟骨細胞の増殖と分化抑制が明らかとなり、これらと関連する遺伝子群との関係から、CCIラットはダブルヘテロのCCIラットによる常染色体劣性遺伝による形質発現が考えられる。1)CCIラット親がヘテロの場合、常染色体に責任遺伝子が存在すると仮定し、Wild typeの近交系SDラットとCCIラットとのF1世代を作成して、表現型を確認した。その結果、平均3:1の遺伝型と表現型の発症率と一致しているため、責任遺伝子は常染色体劣性遺伝形式をとる可能性が高いことが明らかとなった。2)CCIラットの原因遺伝子座における原因遺伝子の種類を限定するために連鎖解析を行い、軟骨石灰化異常が単一遺伝子の異常で生じるかを調べたが、候補遺伝子までの検索にまでは至らなかった。マイクロアレイ結果の解析(KEGG)による結果に多種多様の可能性が上がったために、各異常の解析に時間を要するため。全身の低成長や軟骨内骨化不全を示すSDラット由来の自然発症型軟骨石灰化不全(CCI)ラットが確立され、生後2週齢における頭蓋底軟骨結合と下顎頭軟骨について形態的・分子生物学的にSDラットと比較したところ、CCIラットでは、1頭蓋底軟骨結合と下顎頭軟骨の軟骨内骨化の時期が異なる。2両軟骨の成長板における石灰化軟骨の破骨細胞性吸収には差を認めない。3両軟骨のIhh、Gli1、Smo mRNAの過剰発現と軟骨細胞の過剰増殖を示した。また、このラットの形質発現異常は、原因遺伝子のホモアリルによる発症率(25%)になるので、常染色体潜性(劣性)遺伝形式をとることが示唆され、ヒトの場合に相当する疾患を探るために、これらの分子間におけるマイクロアレイ解析を行った。CCIラットのピアソン相関係数によるクラスター解析では、SDラットとCCIラット間で遺伝子クラスター発現に差があり、プロテオグリカンが2番目、ヘッジホッグシグナルが14番目に異常候補として挙がり、KEGG pathwayによるヘッジホッグシグナルでは、SmoとGliの異常が有意に検出された。プロテオグリカンについても異常分子については検索中である。以上の結果から、CCIラットの軟骨では共通したシグナルの異常による軟骨細胞の増殖とその基質調節の異常が生じた結果、関節軟骨における形態異常が生じることが示唆された。

現在、ヒトにおける同疾患の同定までが達成されていないが、CCIラットは軟骨内骨化の遅延で頭蓋底軟骨結合と下顎頭軟骨の成熟に遅れを示すが、これにはIndian hedgehog-PthrPシグナル異常による軟骨細胞の分化抑制と、プロテオグリカンの産生異常が関係していると考えられる。SD系列ラット由来の軟骨石灰化不全ラット(Cartilage Calcification Insufficient rat, CCIラット)は全身性軟骨石灰化遅延を示し軟骨の肥大化が特徴で、一方骨には影響しない軟骨内石灰化制御不全である。本研究では、形成された軟骨と、軟骨の吸収不全による骨化の遅れの二面性があり、軟骨から採取したcDNAマイクロアレイでインディアンヘッジホッグシグナル関連するGli1遺伝子の亢進がreal time PCRとin situ hybridization法のいずれでも明らかとなった。すなわち、BrdU取込み軟骨細胞数からみても軟骨増生の亢進が明らかとなった。現在は(1)の原因遺伝子解明について遅れているが、対策としての人工的受精や生殖能力の確認が取れれば、問題は解決できると考え、引き続き研究計画の(2)CCIラットの病態に関する形態学的および分子生物学的検索(3)CCIラットとヒトにおける発育異常との関連検索を行う予定である。なおすでに(2)の計画は進行中で下顎頭軟骨と頭蓋底軟骨結合での形態発現に関連する分子の時空間的な発現動態が明らかになりつつあり、学会発表、論文発表等を通じてその成果を発表していく予定である。マイクロアレイに加えて、リアルタイムPCRによる特定遺伝子のアップレギュレーションとダウンレギュレーションについて、定量的な検索を加える。さらに、CCIラットの他の症状として、不妊が挙げられる。これは子宮粘膜のグリコサミノグリカンの異常による受精卵の生着が妨げられることが示唆されており、アグリカンを始めとする軟骨に存在する基質成分の異常に繋がっていることが関連していることが想定される。このような全身性の検索との照らし合わせにより、さらに異常分子の特定に絞り込んでいけると考える。主要なヘパラン硫酸であるアグリカンの発現異常も検索の対象として進めている。これまでの検索から、この骨軟骨形態に基づく発育異常は軟骨基質形成のGAGの主成分であるアグリカン合成過程に異常があるのではないかと予測し、ISHとマイクロアレイによって部位特異的に軟骨細胞にGli1の異常高値がみられ、明らかな軟骨細胞の増殖亢進に繋がることが判明した。今後は、さらに他の遺伝子との関連を検索するとともに、単一遺伝子原因を中心としたヒトの骨系統疾患にみられる発育異常に対応できるかを検討する。口腔病理学当該年度に予定していた額の中で、RNA量の簡便な計測が必要となり、当初の予定にはなかった分光光度計の購入をした。そのために、遺伝子解析ソフトとコンピュータの購入を控え、実験の一部が予算的にも時間的にも実行困難となったため、次年度計画に回す予定とした。マイクロアレイ解析と組織学的検索にかかる物品費が遅滞に伴い、実施できなかった分が次年度使用額として残した。
プレキャスト構造システムの復旧性・冗長性評価のための劣化・崩壊解析手法の開発

本研究では、継手・定着機構を含むPCa部材およびPCaシステム全体の、安全性、耐久性、復旧性ならびに冗長性の評価が可能な、1)コンクリートのひび割れ進展挙動および圧縮軟化・局所化挙動、2)鉄筋、継手・定着鋼材の弾塑性挙動および座屈を含む大変形挙動、3)収縮、クリープ、鉄筋腐食、ASRによる時間依存変形・劣化現象、4)大変位・大回転を伴う構造システム全体の崩壊挙動を、5)鉄筋の節、継手・定着機構の細部形状から高解像度で再現可能な数値解析手法を開発する。
含ケイ素ポリマーの合成と機能材料へのアプローチ

主鎖にπ-電子系とケイ素-ケイ素結合とを交互に含む新しい含ケイ素ポリマーとしてポリ[ジシラニレンナフタレン](1)、ポリ[ジシラニレンエチニレン](2)およびポリ[ジシラニレンブトエトイン](3)を合成しそれらの光機能および導電性を検討した。1、2は相当するビスクロロシリル誘導体のナトリウムによる縮合によって、3は遷移金属触媒によるジエチニル化合物の重合によって得られた。分子量(M^^ーw)はそれぞれ1万4万の値を示した。これらのポリマーはケイ素上の置換基によってさまざまな形状となるが、多くは常温で固体である。又、一般の有機溶媒に可溶で成膜性が非常によく、スピンコーティングにより数千〓の均一な膜厚の薄膜にすることができた。ポリマー13はそれぞれπ電子系置換ジシランに特有の吸収を紫外線領域に有するが、薄膜状にしたポリマーに紫外光(254nm)を照射すると速やかにこれらの吸収の消失が見られた。又、溶液中での光照射では分子量の急激な減少が確認され、これらのことはポリマー13がケイ素-ケイ素結合の開裂により低分子量化したことを示し、ポジ型フォトレジストとして利用できることがわかった。これらの光分解過程を明らかにする目的でポリマー1のモデル化合物である1、4-および1、5-ビス(ペンタメチルジシラニル)ナフタレンを合成しその光反応を行ったところケソ素-ケイ素結合のラジカル的切断に基づく生成物が得られ、ポリマー1の光分解の初期過程はケイ素-ケイ素結合のラジカル的切断であることがわかった。ポリマー2、3の薄膜をSbF_5蒸気により処理すると0.20.5S・cm^<-1>という金額領域に近い導電性を示すことがわかり、新しい導電性高分子材料としての利用が期待される。今後、さらに新しいタイプのポリマーの合成を行う予定である。
中国語話者の複合語アクセント習得に関する研究

本研究では、日本語の音声教育(特に複合語のアクセント習得)について、日本語学習者の発話データや教育実践をもとに音声指導を行う際の示唆を得ることを目指したものである。その結果として、幾つかのアクセント習得において困難な点を抽出した。またPCを活用して音声指導が行えるような教材の開発を行った。今年度は研究の初年度であり、関連学会・研究会への出席や文献資料・情報の収集を行い研究体制の整備を行うことに努めた。また、次年度以降に本格的な調査を実施するための予備調査として、様々な日本語学習者の複合語アクセントデータを収集し、その特徴と課題を探った。調査に関しては、具体的には以下のような活動を行った。1.日本在住の留学生22名(母語は韓国語、中国語(中国、台湾)、スウェーデン語、ロシア語)の複合名詞発話を録音し(3回)アクセント型別に分析した。1回目は何も教えずに発話してもらい、2回目は規則を教えた後2か月後、3回目は4か月後。その結果、母語によらず練習をした学生は習得ができていることがわかり、教えることが有効であることが分かった。しかし、ある程度の訓練を行わないと自分の発話の高低を意識化できないことも分かった。2.中国語と同じ声調言語であるベトナム語を母語とするベトナム在住(ホーチミン、ハノイ)日本語学習者の単純名詞・複合名詞発話を録音し(3回)アクセント型別に分析した。その結果、単純語複合語共に、全て同じ高さで発音したり、最後の拍が下降するものが多かった。複合語では、中国語話者にも多いと言われる1語の中で2度高い箇所が見られる「二度上がり」(形態素境界に下降がある形が多い)が多く見られ、拍数の多い語、正解率の低い語に出現しやすいことが分かった。また、前部要素が頭高型、特殊拍が含まれている語の正解率が低かった。昨年度から引き続き、関連学会・研究会、研修会への出席等により、研究動向や研究方法などを調べたり文献資料等の情報収集を行った。また、研究課題に関する以下のような調査を実施した。1.中国語(北京語)話者の日本語複合名詞アクセントの発話の特徴を調べるため、中国語(北京語)と同じぐ声調を持つ言語であるベトチム語話者の複合語発話のアグセントデータを収集した。特に、前年度実施した予備調査によっても明らかになった、1語の中で2度高い箇所が見られる「二度上がり」の現象がどのような場合に現れやすいかを明らかにするために調査を実施した。2.韓国、中国、ヨーロッパ(ドイツ、ロシア、ノルウェー)の留学生延べ50人を対象に、複合語の習得の難しい組み合わせを抽出した。その結果、以下の3点が母語に関係なく習得の難しい例であることが明らかになった。(1)「韓国語」のように、前の語が「頭高型」の場合(2)「あの人」後部の語のアクセント型が変化する場合(3)「おとうとのかばん」のように、助詞を用いて複合化する場合。前部の語が「尾高型」か「平板型」かが習得されていない。1の調査に関しては、分析作業中である。2に関しては、近日中に結果をまとめて公表する予定である。これまでと同様に、研究動向や研究方法等を調べたり文献資料等の情報収集を行った。また、本年度の研究計画に基き次の活動を実施した。1. PCを利用した音声指導が行える教材開発は、やむを得ない事情により企業との共同開発が不可能となったため、急遽、慶応大学のITC上に日本語発音教材を独自に立ち上げた。(名詞のアクセント学習教材については以下参照)。その中の「音声(クラス1)」を選択。学生はアカウントを作成。試用としては、ユーザ名:sampleパスワード:testuserクラス登録時に必要なパスワードは、nihongo(今後変更予定)。ここからボイスレコーダーを設置。第二回日本語の名詞のアクセント第三回日本語の複合名詞のアクセント以上のウェブ教材を利用し、日本語の名詞のアクセントが学習できる教材を作成した。2.中国語話者(北京語)とベトナム語話者を中心とした日本語学習者の複合名詞の発話データの分析を引き続き行った。2人の日本語教師による聴覚判断及び音声ソフトによるアクセント判定作業を進めているが、判断が難しく全体の結果をまとめるまでには至っていない。ただ、これまでの分析から、日本語学習者にとって等時性及び各音素のピッチの保持自体が容易ではないこと、また特殊音素の存在がアクセント発話を困難にしていることが分かった。今後、早急に結果をまとめて発表したいと考えている。
Thymidine phosphorylaseとapoptosisの肝転移関連

【方法】大腸癌株LS174Tを6週齢のBALB/c nu(+)の皮下移植後14日の腫瘍を摘出し細切後メッシュを用い腫瘍細胞浮遊液を作成する。マウスをネンブタール麻酔下に肋骨弓下開腹し30G注射針を用い上腸間膜静脈より腫瘍細胞106個を注入する。腫瘍細胞注入後1週目より血管新生阻害剤6-amino-5-chlorouracilを腹腔内投与しコントロール群と比較し肝転移抑制効果の有無を検討した。【結果】6-amino-5-chlorouracilを注入した群の平均体重は16.8±0.7g、コントロール群18.3±1.0と両者間に有意傾向(p=0.009)が認められたが、平均肝重量には注入群1-4±0.2g,コントロール群1.4±0.1gと両者間に差はなかった。一方、6-amino-5-chlorouracilを注入した群の平均転移個数は3.0±1.0個に対し、コントロール群5.3±1.5と両者間に有意傾向が認められた(P=0.09)。【まとめ】大腸癌株LS174Tを用いThymidine phosphorylaseの阻害剤である6-amino-5-chlorouracilを腹腔内投与し、有意傾向ながら肝転移抑制効化の可能性が示唆された。腫瘍細胞の増殖に血管新生が関与しているかどうかの検討のため以下の実験を行った。6週齢の雌のBALB/c nu(+)の背部皮下にcolon26細胞1x10^6個を5ヵ所注入し、経過中自由摂水、摂食とし術後2w目に背部腫瘤を摘出した。今後の実験を考えヌードマウスは単なる開腹操作を加えたいわゆる単開腹群群と生食を投与した生食群の2群を設定した。腫瘍内新生血管測定は摘出腫瘍を10%ホルマリン固定後、ヤギ抗第VIII因子関連抗原抗体を1次抗体し、autoprobeIIIを用い発色し新生血管内皮を染色した。新生血管面積測定はAVI0社のcolor image processor(SPICCA)を用い、200倍の顕鏡下で染色された血管内皮細胞をトレースし面積測定を行った。実験期間中の体重増加率は単開腹群で6.8%、生食投与群で7.9%と両者間に差はなかった。摘出腫瘍重量の平均は単開腹群59.4mg、生食投与群で71.2mgで各群間に差はなかった。背部腫瘤皮下移植後2週目での新生血管面積総和の平均は単開腹群で869.1μm^2,生食投与群で782.2μm^2の測定結果でいづれの群でも血管新生は起きていることが判明した。現在低肝転移株LS174Tと高転移株colon26による肝転移モデルを作成中でモデル完成後犠牲死の時期を決定し、腫瘍増殖とThymidine phosphorylaseやapoptosisの関連を検討する予定である。BALB/c nu(+),雌、6週齢の皮下にcolon 26をlx10^7個/0.1ml移植し2w後腫瘤を摘出しコラゲナーゼ溶解液(腫瘍1gに対しコラゲナーゼ20mgの割合でRPMI+lO%FBSに溶解しミリポアフィルターを通す。)5ml中で腫瘍片を細切する.細切した腫瘍片をコラゲナーゼ溶解液に入れ37°C恒温槽内でI晩インキュベートしメッシュを通してから遠心する(1500rpm,5min).その後上清を吸引し培養液を20ml加え遠心し、この操作を3回繰り返した後、細胞数を数え1x10^7個/0.1mlの細胞浮遊液を作成する.6週齢のBALB/c nu(+),雌、にネンプタール麻酔下に季肋下横切開を加え門脈を露出し30Gのリンパ管造影針を用い先の細胞浮遊液を0.1ml門脈内注入する。門脈注入後1w後より血管新生阻害剤6- amino

-5-chlorouracil 250mg/kgを1w間腹腔内に連日投与する(IP群).連日投与終了後1w後に肝転移の有無につき検討した.またコントロールとして同数の腫瘍細胞を門柱後生食を腹腔内注入する群を設定した(C群)。C群の平均重量は18.4g.IP群16.7gと両群間に差はなかった.摘出肝重量の平均もC群で1.4g.IP群で1.3gと両群間に差はなかった。転移個数はC群で5.3個、IP群で2.3個とIP群で転移個数が少ない結果であった。今回各群間のnが3と非常に少ない数での検討であるため今後さらにサンプル数を増やし検討したい。
胎児成長遅延改善のための食品中成分による胎盤アミノ酸輸送体ＳＮＡＴ２賦活化

小型中性アミノ酸輸送体SNAT2は、ヒト胎盤刷子縁膜に発現して胎児成長に重要なアミノ酸供給を担う。胎盤におけるSNAT2発現低下は、子宮内胎児成長遅延との関連が示されており、その病態の理解および診断法や治療法、予防法の提案をする上でSNAT2発現制御機構の理解は重要である。ラットにおいても、in vivoで胎盤SNAT2の発現変動が示された。そこで、ラット胎盤とそのin vitroモデル細胞を用いて、SNAT2発現制御機構を解明し、その分子機構に基づいた胎盤SNAT2発現可視化マーカーの同定を目指した。SNAT2発現変動は、そのmRNAの分解速度が変化することで生じる。そこでmRNA分解を促進するmiRNAに着目し、SNAT2発現制御miRNAを同定することとした。主としてmiRNAは、分解するmRNAの下流に位置する3'非翻訳領域に結合し作用する。SNAT2が持つ全長約2.7 kbaseの3'非翻訳領域の内、SNAT2 mRNAの安定性に寄与する領域を検討した結果、約200 baseまで限定することができた。塩基配列を基に、その領域に結合しうるmiRNAを選定し、SNAT2発現制御miRNAの候補を5つに絞り込めた。現在は、各候補miRNAの阻害剤を用いた、直接的なSNAT2発現制御の評価を行っている。また、LC-MS/MSを用いた定量的標的絶対プロテオミクスによる胎盤アミノ酸輸送体定量メソッドが確立でき、ラット胎盤刷子縁膜におけるSNAT2を含む5種類の中性アミノ酸輸送体の発現量が定量できた。この結果によると、SNAT2よりも胎盤刷子縁膜に豊富に存在する中性アミノ酸輸送体として、大型中性アミノ酸輸送体LAT1が見出された。LAT1は、必須アミノ酸の大部分を基質とすることからも、SNAT2と同様に胎児成長を促す重要な分子である可能性が高い。SNAT2発現制御miRNAの候補を5つまで絞り込むことができ、それぞれの阻害剤を用いた実験の条件検討も済んでいることから、その同定も目前である。計画通り、SNAT2発現制御機構の解明を進める。また、食品成分による胎盤SNAT2およびLAT1の発現および機能に対する影響も観察し、胎児成長に寄与する食品成分の探索を行う。
磁気島、エルゴディック層等の磁気面の乱れに対するプラズマ修復能力

磁場閉じ込め装置においてプラズマの性能を左右すると考えられる磁気島の成長・修復過程が、プラズマの効果によってどのように影響を受けるかを系統的な実験データ収集を行って調べた。プラズマの圧力が高く、かつ衝突周波数が低い場合に磁気島の修復が効果的に起こることが明らかになった。また、数値シミュレーションによるプラズマ電磁流体の平衡解析を行い、プラズマ圧力の増加に伴う磁場構造の変化について解析を行った。磁気島のプラズマ修復について包括的なパラメータ依存性をみるために、磁気軸(R_<ax>)の位置とベータ値を変化させた場合のプラズマ応答を調べる実験をおこなった。それによると、磁気軸がトーラス外寄りの場合には同じプラズマベータ値に対して、内寄せに比べてプラズマ修復能力が大きく、磁気島が強く抑制されることがわかった。このことについては以前から予測はされていたが、今回系統的なデータ収集を行うことで新たに実験的に証明された。R_<ax>=3.75mの配位では、周辺部にm/n=1/1の磁気島を形成してさらに周辺部を強力に排気することにより、極めて明瞭な粒子輸送障壁がρ=0.50.6に観測された(ρは規格化小半径)。この輸送障壁は磁気シアーが小さくなる付近に形成されており、その内側では高密度領域が現れる(5×10^<20>m^<-3>)。ベータ値を上げるほど輸送障壁はより小半径外側に現れ、中心の高密度領域が顕著になることがわかっているが、これは回転変換の分布の変化によるものであると考えられる。一方で、これまでの実験から磁気島はベータ値を上げるほど強く抑制されることがわかっており、MHD安定性を介して磁気島修復と輸送障壁形成がお互いに影響し合っている可能性もある。今後の解析ではこの点についても考察をおこなっていく予定である。周辺部の磁気島・エルゴディック層の磁場構造を3次元的に取り入れたプラズマ輸送シミュレーションコードの準備も始めており、コードのベンチマークと初期的な結果が得られている。プラズマ応答のポロイダルモード数測定用のサドルループコイルを現在製作中であり、校正試験の準備を進めている。平成17年度では磁気島のプラズマ修復について、磁気軸位置(Rax)およびベータ値(β)を変化させた実験を行い、それぞれのパラメータ依存性について整理を行った。これをうけて平成18年度ではさらに、磁気島が拡大・縮小するときのプラズマ応答による摂動磁場をサドルループコイルを用いて測定を行った。特に磁気軸を固定した場合のプラズマ修復について詳しい実験・解析を行い、その結果、磁気島縮小は高β値かつ低衝突周波数(collisionality, v_h^*)で、磁気島拡大は低β値かっ高V_h^*でより顕著にみられることがわかった。また新たに購入したコイルの取り付けと校正試験を行い、これによって摂動磁場のポロイダルモード数についての測定を開始した。現在のところ、プラズマ修復による摂動磁場は奇数のポロイダルモード数を持っていることがわかった。LID(Local Island Divertor)のような磁気島を用いたダイバータ配位(アイランドダイバータ配位)における、プラズマ修復についても研究を進めた。LID配位の場合は、最外殻磁気面がダイバータ部の磁気島と同じモード数で変形を受けているために、磁気面に沿って一様に電流が流れたとしても、磁気島の形成に影響を与える。解析の結果、β値が高いほど磁気島が縮小する傾向にあることがわかった。縮小・拡大はトロイダル磁場の向きと中性粒子ビームの入射方向にも依存していることから、ビーム駆動の電流の影響についても考慮する必要がある。以上の結果について、プラズマ中に流れる電流の影響を考慮したモデル構築のために、Bootstrap電流、Pfirsch-Schluetr電流、ビーム駆動電流(Ohkawa電流)の向きと量について考察を始めている。平成19年度はこれまでに得られた実験データにつての考察をすすめるために、数値シミュレーションを用いた解析を行い、以下の成果を得た。β値が上昇するにつれて周辺部の磁気島が互いに重なり合い、エルゴディック層が形成される様子がMHD平衡コードHINTによって得られた。磁力線構造の乱れ具合(ergodization level)を定量的に評価するために、β値の変化に対して磁力線の拡散係数(D_<FL>)とコロムゴロフ長(L_K)を計算した。その結果、β値の上昇とともにD_<FL>は増加、L_Kは減少し、磁場の乱れ具合が強くなっていることがわかった。また、得られた磁場構造について周辺輸送コードEMC3によって輸送解析をおこなった結果、高いβ値のプラズマでは、磁力線に垂直方向の輸送が増大しているという結果が得られた。また、昨年度に購入・設置したサドルループコイルの測定系の整備を行い、これを用いてm/n=2/1の摂動磁場を印加した場合のプラズマの応答について実験を行った。磁気シアの小さい配位においてm/n=2/1と思われる偶数モードの誤差磁場を観測した。またこのとき、プラズマ中心部での電子温度分布の減少が観測され、輸送特性が変化していると考えられる。

さらに、m/n=1/1の磁気島について、磁気島の拡大・縮小はβとνで明確に場合分けされることがわかっていたが(低β高νで磁気島が拡大し、高β低νで磁気島が消失する)、さらに拡大・消失に対する依存性は、νに対しては弱く、βに対しては強いことが示された。βがある閾値を超えるとその後はβの増加にかかわらず誤差磁場強度は一定値を保ち、プラズマ修復によって完全に磁気島が修復されていることがわかった。プラズマのβ値(プラズマ圧力と磁気圧力の比)が上昇した場合の周辺部の圧力分布の形成についてMHD平衡コードHINT2により数値シミュレーションをおこなった。その結果、βの上昇とともにプラズマの圧力中心がトーラス外側に移動することにより(シャフラノフシフト)磁気面が乱れはじめ、磁力線に平行方向の輸送の寄与によりそこでの圧力勾配が減少することが明らかになった。体積平均β値はプラズマ中心のβ値とともに増えるが、磁気面の乱れに伴いその増加率が小さくなり、結果として平衡限界となっていると考えられる。磁気島近傍の電流分布が磁気島修復に与える影響について、磁気島のX点におけるフィラメント電流のモデルによる初期的な結果を得た。それによると磁気島の修復は起こらず、逆にフィラメント電流による摂動磁場の側帯波、高調波の影響で磁気面がさらに乱れる結果となった。これについては今後、電流の分布についてさらに議論をする必要があると思われる。種磁気島の大きさを変化させたときのプラズマ応答について、β値依存性を実験的に調べた。種磁気島が大きいほどプラズマの応答は大きくなり、且つβ値の上昇とともにその応答は強くなる傾向がみられた。この結果は理論モデルと定性的に一致している。一方、種磁気島が全く無いような実験条件では有意なプラズマの応答は見られなかったが、この点については上の理論モデルと違っていることがわかった。ポロイダルモード数の同定に資することを目的に磁束ループを増設して計測の整備を進めてきた。同一トロイダル角上に設置してある磁束ループの信号との極性の関係から、ポロイダルモードの偶奇を判別できる。実験では、m/n=2/1の磁気島が成長したと考えられる放電において、偶数ポロイダルモードを持つ誤差磁場強度が成長する有意な信号を観測することができた。今後、磁気島の動的応答と関連してこれらのデータ解析を進めていく。
フォーカスド・プロテオーム解析による再生組織成熟シグナルの解明と再生医療への応用

現行の軟骨再生医療は、培養中に脱分化する軟骨細胞が、生体内に移植されると自然に成熟する過程を活用して行われているが、その分子メカニズムの詳細は不明である。本申請では、フォーカスド・プロテオーム解析を導入した網羅的かつ精緻な解析により、生体内における軟骨細胞の成熟促進因子を同定し、組織成熟シグナルを明らかにすることを目的としている。さらに得られた知見を基に、in vitroで成熟した再生軟骨を誘導する方法の確立を目指す。「生体内に移植された軟骨細胞」と「基質誘導培地で培養された軟骨細胞」を比較対象とした網羅的プロテオーム解析を行い、新たな切り口で組織成熟過程に関わる因子を同定していく。また、微量酵素やシグナル分子、転写因子など、細胞内で極微量にしか存在しないタンパクの変動については、2次元電気泳動を用いた通常の網羅的プロテオーム解析での検出は困難になることが想定される。そこで、リン酸化タンパク質の抽出など試料の前処理により、微量因子の検出を可能にするフォーカスド・プロテオーム解析を用いた精緻な解析も併せて行い、生体内における組織成熟メカニズムのシグナル伝達経路の解明を目指す。さらに得られた知見を基にinvitroで成熟した再生軟骨を作製する技術を確立する。予定通り、in vivoとin vitroの軟骨細胞の評価を行い、網羅的な解析を行うためのサンプル採取を行っている。カバースリップ以外にも共培養で使用するインサートの内面に細胞を播種し、インサート上面同士を接着させることにより内腔面に細胞が播種されたデバイスが完成する。これをマウス皮下に移植することにより、ホスト側の細胞間接着なしで移植側細胞が侵入することができない空間形成が可能となった。この系を確立し、in vivoで軟骨再生が形成されない群と形成される群を作製することにより、in vitroとin vivo比較、in vivoとin vivoの比較が可能となり、より詳細な検討が行えるようになった。軟骨細胞の成熟過程に関わる因子の網羅的検索として、インサートを用いたデバイス作製により、インサート外面に細胞を播種し軟骨形成が見られる群とインサートの内面に細胞を播種した群、上面同士を接着させたほうのインサートのメンブレン側にさらにポリカーボネートを接着させ完全にホスト側の細胞侵入を防止する群、細胞播種なしインサートのみ群で移植を行い、結果により比較対象となりえる群のインサート内の貯留液におけるプロテオーム解析を行い、詳細に内容物を評価する。カバースリップを用いたin vitro群、in vivo群においては細胞を回収し、網羅的なマイクロアレイを行い、遺伝子レベルでも併行して比較を行う。これらの解析により、組織成熟シグナル伝達機構の解明と促進因子の選定を行う。本研究では、フォーカスド・プロテオーム解析を導入した網羅的かつ精緻な解析により、生体内における軟骨細胞の成熟促進因子を同定し、組織成熟シグナルを明らかにすることを目的としている。1.In vivoおよびin vitroにおける軟骨細胞成熟過程の継時的評価「生体へ移植された軟骨細胞(in vivo群)」および「基質誘導培地で培養された軟骨細胞(in vitro群)」の成熟過程について、継時的な比較検討を行った。軟骨細胞を増殖培地にて培養させた後(P0)、24 wellプレートにポリプロピレンプレートのカバースリップを静置し継代した(P1)。In vivo群については、培養7日後に軟骨細胞をカバースリップごとプレートから取り出し、ヌードマウスの腹腔内へ細胞面を腸に向けて移植した。In vitro群では、カバースリップ(P1)での培養7日後に増殖培地を吸引し、基質誘導培地で培養した。In vivo群、in vitro群ともに、トルイジンブルー染色、ヘマトキシリンエオジン染色で組織学的に軟骨細胞の成熟過程を評価した。real-time RT-PCRにより遺伝子発現を検討した。2.軟骨細胞の成熟過程に関わる因子の網羅的検索第1項に準じてカバースリップへ播種した軟骨細胞を準備し、ヌードマウスの腹腔内へ移植、あるいは基質誘導培地で培養した。移植後1週および2週でカバースリップを回収し、M-PERによりタンパクを抽出した。今後、それぞれの細胞抽出液全体を二次元電気泳動にかけ、スポットの差を比較検討する予定である。予定通り、in vivoとin vitroの軟骨細胞の評価を行い、網羅的な解析を行うためのサンプル採取を行っているため。

さらに得られた知見を基にinvitroで成熟した再生軟骨を作製する技術を確立する。予定通り、in vivoとin vitroの軟骨細胞の評価を行い、網羅的な解析を行うためのサンプル採取を行っている。カバースリップ以外にも共培養で使用するインサートの内面に細胞を播種し、インサート上面同士を接着させることにより内腔面に細胞が播種されたデバイスが完成する。これをマウス皮下に移植することにより、ホスト側の細胞間接着なしで移植側細胞が侵入することができない空間形成が可能となった。この系を確立し、in vivoで軟骨再生が形成されない群と形成される群を作製することにより、in vitroとin vivo比較、in vivoとin vivoの比較が可能となり、より詳細な検討が行えるようになった。2.軟骨細胞の成熟過程に関わる因子の網羅的検索細胞抽出液全体を二次元電気泳動にかけ、スポットの差を比較検討する。質量分析によるタンパク同定を行い、両群の比較からin vivo群特異的に発現し、組織構築に関与していると推察される候補分子を模索する。3.組織成熟シグナル伝達機構の解明と促進因子の選定第1項に準じて、マウス腹腔へ移植した軟骨細胞からタンパクを抽出する。上記で選定した候補分子の継時的な発現変化を検証する。カバースリップ上の軟骨細胞について、候補分子の免疫組織化学染色を行い、軟骨成熟過程に伴う候補因子の局在変化を観察する。生体内における軟骨細胞の組織成熟誘導との関連が示唆される因子を選定する。4.選定因子の軟骨成熟促進効果の検証選定した因子について、培養軟骨細胞での軟骨成熟促進効果を検証する。選定因子の恒常活性型あるいは抑制型遺伝子をクローニングし、レンチウイルスにそれぞれの遺伝子を組み、ヒト耳介軟骨細胞に導入する。カバースリップに播種し、DMEM/F12および組織成熟誘導培地にて培養する。組織学的観察、免疫組織化学的観察、遺伝子発現、生化学的定量を行う。5.軟骨成熟促進因子を活用した培養法の確立検証された軟骨成熟促進因子が液性因子である場合は、軟骨細胞を培養する際に、培地中へ種々の濃度で添加し、in vitroで培養軟骨細胞の組織成熟を誘導する。関与するシグナル経路の全容が明らかになっている場合には、そのリガンドやシグナル伝達関連化合物により刺激し、その効果を検証する。In vitroで軟骨組織形成を促進する培養法を検討する。6.軟骨再生医療への応用前項で確立した培養法により、軟骨としての組織形状と十分な強度を有する再生軟骨をin vitroで作製し、それを移植することにより軟骨再生医療への応用を検討する。