hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属酸化物微粉体の不定比酸素と吸着酸素の分離定量

本研究は,遷移金属酸化物の酸素不定比量の変化と表面吸着酸素量の変化とに基づく酸素の吸放出を分離定量し,酸化物の不定比性と酸素吸着平衡を各々熱力学的立場から解明することを目的とした.表面積の大きく異なる試料を作製し,両者の温度、雰囲気酸素分圧によって決まる平衡重量がどの様に異なるかを熱天秤で精密測定することにより,通常分離し難い酸素不定比量と吸着酸素量の分離定量を試みている.導電性酸化物,電極材料,センサ-材料などとして注目される酸化スズ,安定化ジルコニア,およびペロブスカイト型酸化物La_<1-x>Sr_xMnO_3を対象とした.当初計画期間の2年を経過し,以下の成果を得ているが,初期目的を充分に達成していないため、更に一年ほど研究を継続する予定である.(1)酸化スズ:本研究期間に先駆けて測定した酸化スズ微粉体試料の酸素分圧,温度による重量変化の測定結果に,同試料の表面積測定結果を加え,それらの測定結果をラングミュア吸着等温式の温度微分式と固体内の欠陥平衡式を組み合わせる新らたに考案した解析法を適用して詳細に解析した.その結果,酸素スズ表面の吸着酸素量,微分吸着熱,格子内の不定比酸素量,欠陥平衡定数などを定めることに成功した.(2)安定化ジルコニア:1000°C以上で焼成し、最大20m^2/gの任意の比表面積を有する試料の作製に成功し,併せて合成条件,微粉体粒径と相関係の関連を解明した。800°C程度以下の温度における酸素吸着量を熱天秤で測定し始めているが,粉体の飛散,室温変動による熱天秤の零点シフトなどの誤差要因のため,まだ確実なデ-タを得るに至ってない.(3)La_<1-×>Sr_×MnO_3:(LaSr)/Mn比が1から僅かにずれただけで高酸素雰囲気中での不定比量に大きな変化が出ることなど新たに見いだされ,吸着酸素量を求める前段階としての,表面積の小さい試料による酸素不定比量の正確な測定を進めている.吸着測定は今後の課題である.多くの遷移金属酸化物は酸素不定比組成を示す.その変化にともない,電子物性,反応性などが大きく変わる.一方,酸化物上に吸着した酸素は酸化物の触媒能を左右するほか,表面近傍の電子状態にも影響を与え,酸化スズガスセンサ-などの形で応用されている.然るに,酸化物格子内から出入りする不定比酸素と表面に吸着した酸素を分離定量することが困難であるため,従来酸化物上に酸素がどの様に吸着するかを吸着平衡の立場から定量的に明らかにした研究は無い.本研究では,導電性酸化物,電極材料,センサ-材料などとして注目されている酸化スズ,安定化ジルコニア,およびペロブスカイト型酸化物La_<1-x>Sr_xMO_3(M=Co,Mn,Fe)に着目し,表面積の大きく異なる試料について平衡重量が温度,雰囲気酸素分圧によってどの様に変わるかを熱天秤で精密測定することにより,酸素不定比量と吸着酸素を分離定量し,酸化物上への酸素吸着がどのような形で起こるかを明らかにすることを目的とする.計画初年度に当たる本年度は,理論面の整備と測定装置の整備,試料作成を中心に研究を進めた.理論面については,ラングミュア吸着等温式の温度微分式と固体内の欠陥平衡式を組み合わせることによって,本研究代表者が他の共同研究者と過去に測定した酸化スズ微粉体についての酸素分圧,温度による重量変化測定の結果を詳細に解析した結果,酸素スズ表面の吸着酸素量,微分吸着熱,格子内の不定比酸素量,欠陥平衡定数などを定めることに初めて成功した.この研究を更に継続するための装置整備は,熱天秤系の精度を上げるための調整を残してほぼ完了した.また,安定化ジルコニアについては,1000°C以上で焼成し,なおかつ20m^2/gの表面積を有するものが作製され,800°C程度以下の温度における酸素吸着の状態を精密測定することが可能な段階に到達した.現在,熱天秤系の調整を進め,本格測定にはいる準備中である.本研究は,遷移金属酸化物の酸素不定比量の変化と表面吸着酸素量の変化とに基づく酸素の吸放出を分離定量し,酸化物の不定比性と酸素吸着平衡を各々熱力学的立場から解明することを目的とした.表面積の大きく異なる試料を作製し,両者の温度、雰囲気酸素分圧によって決まる平衡重量がどの様に異なるかを熱天秤で精密測定することにより,通常分離し難い酸素不定比量と吸着酸素量の分離定量を試みている.導電性酸化物,電極材料,センサ-材料などとして注目される酸化スズ,安定化ジルコニア,およびペロブスカイト型酸化物La_<1-x>Sr_xMnO_3を対象とした.当初計画期間の2年を経過し,以下の成果を得ているが,初期目的を充分に達成していないため、更に一年ほど研究を継続する予定である.(1)酸化スズ:本研究期間に先駆けて測定した酸化スズ微粉体試料の酸素分圧,温度による重量変化の測定結果に,同試料の表面積測定結果を加え,それらの測定結果をラングミュア吸着等温式の温度微分式と固体内の欠陥平衡式を組み合わせる新らたに考案した解析法を適用して詳細に解析した.その結果,酸素スズ表面の吸着酸素量,微分吸着熱,格子内の不定比酸素量,欠陥平衡定数などを定めることに成功した.

(2)安定化ジルコニア:1000°C以上で焼成し、最大20m^2/gの任意の比表面積を有する試料の作製に成功し,併せて合成条件,微粉体粒径と相関係の関連を解明した。800°C程度以下の温度における酸素吸着量を熱天秤で測定し始めているが,粉体の飛散,室温変動による熱天秤の零点シフトなどの誤差要因のため,まだ確実なデ-タを得るに至ってない.(3)La_<1-×>Sr_×MnO_3:(LaSr)/Mn比が1から僅かにずれただけで高酸素雰囲気中での不定比量に大きな変化が出ることなど新たに見いだされ,吸着酸素量を求める前段階としての,表面積の小さい試料による酸素不定比量の正確な測定を進めている.吸着測定は今後の課題である.
一般人における臺式簡易客観的精神指標(UBOM-4)の活用可能性の検討

精神機能評価にUBOMを用いることで、精神機能の数値化が図れるため、メンタルヘルスの定期的なチェックや、基準を示すことにより適正な受療行動につながることが期待でき、ひいてはセルフマネジメント行動の向上に寄与することが考えられる。
アモルファス合金の構造緩和・結晶化に及ぼす通電効果

非晶質合金(Cu_<30>Zr_<70>)92.5Al7.5について構造緩和及び結晶化に及ぼす通電効果を電気抵抗測定法により調べ以下の結果を得た。電流密度idがしきい値約2×10^3A/cm^2を越すとidの増分に比例して構造緩和温度T_<SR>および結晶化温度Txが低下し、低下量はid=5×10^3A/cm^2でそれぞれ15Kおよび10Kである。構造緩和の場合、通電下で熱活性化過程の活性化エネルギーは1%程度増大するが前指数頂(振動数因子)が10倍程度増大するのがT_<SR>低下の原因である。結晶化の場合、活性化エネルギーは2%程度低下するのがTxの低下の原因であり、主として核形成過程が促進されている。構造緩和過程に及ぼす通電効果の結果は、同過程における原子の移動が、原子の集団的運動を介して進行することを示唆する。結晶化過程については、前記と類似した機構により結晶核における界面エネルギーが低下するためであると推定した。T_<SR>およびTxに及ぼす通電効果をさらにCu_<50>Ti_<50>およびCu_<50>Zr_<50>について調べ、前記と酷似した結果を得た。以上のことは、前述した通電効果は非晶質合金の共通的性質を反映していることを示唆する。原子の集団的運動の概念は、非晶質合金の原子構造には、比較的大きな自由体積を持つ局所的構造が連結した領域が存在していることを推測させる。この点をさらに追究する目的でCu_<50>Ti_<50>およびCu_<50>Zr_<50>中の水素の短距離拡散およびCu_<50>Ti_<50>中の水素の長距離拡散について調べた。前者の研究結果は、金属原子の化学的構成は同じであるが水素拡散の活性化エネルギーは離散的に異なる複数種の局所構造が存在することを示唆し、長距離拡散の研究結果はこれらの局所構造が同種の間である規模で連結していることを示唆した。これらの結果は、通電効果からの推測を支持しているが具体的な対応については今後の研究が必要である。
筋萎縮性側索硬化症患者とその家族の診断時からの支援プログラムの作成

本研究では,診断から呼吸器装着前までのALS患者とその家族の支援プログラム作成を目的とした.研究の結果,ALS患者とその家族は,【告知後の精神的ショックに対するサポート】【病気の知識の提供】【病気の進行の見通しの情報提供】【経済的問題に関する相談】【制度の知識の提供】【日常生活介助が必要となった時期の在宅療養支援体制の整備】【介護時間獲得のための支援】【PEG造設の意思決定支援】,【TPPVの意思決定支援】,【療養の場の意思決定支援】の10の支援ニーズを持っていることが明らかとなった.今後,これらの支援ニーズを反映させた支援プログラム作成の必要性が示唆された.本研究では,診断から呼吸器装着前までのALS患者とその家族の支援プログラム作成を目的とした.研究の結果,ALS患者とその家族は,【告知後の精神的ショックに対するサポート】【病気の知識の提供】【病気の進行の見通しの情報提供】【経済的問題に関する相談】【制度の知識の提供】【日常生活介助が必要となった時期の在宅療養支援体制の整備】【介護時間獲得のための支援】【PEG造設の意思決定支援】,【TPPVの意思決定支援】,【療養の場の意思決定支援】の10の支援ニーズを持っていることが明らかとなった.今後,これらの支援ニーズを反映させた支援プログラム作成の必要性が示唆された.本研究は,筋萎縮性側索硬化症(以下, ALS)患者とその家族の,診断時から呼吸器装着前までのニーズを明らかにし, ALS患者,家族への支援プログラムを作成してその効果を評価することを目的としている.本年度は,主治医からALSと診断を受けた後にALS患者と面接し,現在の思いを聴き取っていった.その中から患者のニーズをアセスメントしニーズに沿った支援内容を検討し実践した.診断後の面接により抽出された患者のニーズは,以下の4つであった.「どうやって病気と付き合っていったら良いのか泣いてばかりいる.といった【精神的支援】また,「どうしてこの病気になるのか」「治ることはないのか」といった【病気の知識の提供】を希望していた.また,「いつ頃寝たきりになるのか」といった進行への不安が強く,病気の進度を心配し,仕事・家事の継続ができるのかということを考えていた.日常生活に支障がある場合は,進行に伴う生活調整をするため,介護用品や在宅サービスの利用をどうするかといった【制度・サービスの情報提供】を求めていた.そして,仕事の継続と合わせて,【経済的問題に関する相談】も多く,診断時から,身体的・心理的・社会的問題に関してトータルなサポートの必要性が示唆された.以上の患者のニーズに合わせて支援を行い,その他,進行性の疾患であることに着目し,看護師は,療養の場の選沢,患者を取り巻くネットワーク構築を視野に入れて,面接,介入を行っていた.侵襲的人工呼吸器(以下, TPPV)装着前のALS患者は「診断直後の時期が一番辛かった」と語り,診断直後からのサポートを求めていた.そのため,本研究は,診断時から患者のニーズに合わせた介入をしながら,その介入の効果を明らかし,診断からTPPV装着前の時期の支援の基準化に役立てることができるという点で意義がある.次年度以降,支援内容の効果を評価していく.本研究は,筋萎縮性側索硬化症(以下,ALS)患者とその家族の診断時から呼吸器装着前までのニーズを明らかにし,ALS患者・家族への支援プログラムを作成してその効果を評価することを目的としている.昨年度は,診断直後の患者のニーズを明らかにした.本年度の調査では病気が進行し,胃ろう,非侵襲的人工呼吸療法,侵襲的人工呼吸療法(以下,TPPV)のいずれかの医療処置が必要となった方で日常生活全般に介助が必要となっている方を対象に現在の思いを聴き取っていった.その中で,【介護体制の整備】といった課題と共にTPPVを含めた【今後の生き方を考える】という内容が語られた.対象は,いずれも介護保険,自立支援法によるサービスを受けていたが,市町村の担当者に自ら掛け合う等して介護時間の延長を希望していた.介護保険や医療保険で利用できる範疇の支援ネットワークの構築は,医療機関で対応できていたが,自立支援に関わる支援については不足している状況があった.また,医療・福祉にまたがる領域で制度も複雑であることから「最大限利用できる制度を教えて欲しい」といった【制度の知識の提供】や「一人ではできないので専門職の力を借りたい」といった【介護時間獲得のための支援】を求めていた.診断直後は,特に精神的サポートや病気を理解することの支援を必要としていたが,病気の進行に伴い介護体制の確保という問題についての支援の比重が大きくなっていた.

急変によりTPPV導入することになった患者は,「呼吸器を着けて良かったか悪かったかはこれからで決まる」と語り,生活の質を確保するために介護体制をいかにして整えるかという課題を抱えていた.次年度は,モデルケースの分析を行い,患者の支援プログラムを作成していく.本研究は,筋萎縮性側索硬化症(以下,ALS)患者とその家族への診断時から呼吸器装着前までのニーズを明らかにしALS患者・家族への支援プログラムを作成することを目的としている.本年度は、ALS患者とその家族を対象に継続的に面接しニーズに合わせて支援を行った.対象の概要:ALS患者6名(男性2名,女性4名)及びALS患者を介護している家族5名(男性2名,女性3名)の計11名.研究期間中,患者の6名中4名が胃瘻造設(以下,PEG)し,2名が侵襲的人工呼吸療法(以下,TPPV)を開始した.その内1名は,呼吸器装着の意思を固めた上で装着となったが,もう1名は,呼吸器装着を希望されていなかったものの,他の疾患の発症による救急搬送後にTPPV装着となった.家族5名中1名が病気の発症により介護が困難となり長期入院していた.また,6名中3名が独居であり,そのうち2名が病気の進行に伴い施設入所となった.呼吸器装着前のALS患者と家族の支援ニーズとして,特に,【告知後の精神的ショックに対するサポート】,【日常生活介助が必要となった時期の療養環境支援体制の整備】,【PEG造設の意思決定支援】,【TPPVの意思決定支援】,【療養の場の意思決定支援】の5つが明らかとなった.これらの支援については,諸外国においても多職種専門チームが,患者と家族をトータルに支援することが望ましいとしているが,実際は,神経難病専門病院以外に通院するALS患者も多くおり,専門的な支援を受けるには限界があった.ALSの支援には,院内外の多職種といかに"うまくつながる"かが鍵となる.その対処の一つの方法として,患者の生活全体をコーディネートする役割である退院調整看護師の活用が期待され,今後は,退院調整看護師向けにALSの患者と家族に対し,病気の進行に合わせた面談のポイントや情報提供の仕方等,活用しやすい支援プログラムを作成することが期待される.
シーターバースト連続磁気刺激の作用機序に関する非侵襲的脳機能分析による基礎的研究

本研究は、臨床的に治療として用いる事が出来そうな磁気刺激法を開発することと、その機序を解明する事を目的としている。今年度は、単層性連続磁気刺激の組み合わせの方が従来行われている二相性刺激による連続磁気刺激より強力な効果が得られる事を示し、2発、4発と単相性刺激を与える事により、より強力で持続時間の長い効果が誘発される事をしめし、その機序に関しても若干の考察を行った。2相性連続磁気刺激と単相性連続磁気刺激の効果の比較に関する研究従来の2相性磁気刺激を高頻度で与えてその後に現れる持続的効果を全く同じ条件の単相性刺激を連続的に与えて現れる効果と比較すると、単相性連続刺激の方が持続時間の長い・強度も大きい効果を誘発することを証明した。すなわち、治療効果を期待するには単相性刺激を組み合わせるのが合理的だと判断された。単相性2連発磁気刺激の作用機序に関する研究単相性2連発刺激の促通効果が大脳皮質に由来するものか、またシナプスの可塑性に基づくものかを検討した。この結果、大脳皮質の促通効果を誘発していること、またシナプスの可塑性を変化させていることを証明した。単相性4連発磁気刺激の長期効果に関する研究単相性磁気刺激を4連発組み合わせることにより、2連発より効果の大きい・持続の長い・シナプスの可塑性に立脚した長期効果を誘導できることを証明した。この方法により、治療効果を持つ刺激法が開発されると期待される。今年度は、従来から知られているシーターバースト連続磁気刺激(TBS)に関する研究、新しい強力な刺激法としての単層性連続磁気刺激の作用機序に関する研究、連続磁気刺激(rTMS)を用いたpre-cued choice reaction timeの機序に関する研究を行った。近赤外線脳血流測定(NIRS)によるTBSに関する研究最近開発したNIRS記録用磁気刺激コイルと脳全体に変化を記録できるNIRS記録プローブを使用して、運動野や感覚野刺激前後・刺激最中に脳全体のヘモグロビン濃度変化を記録した。運動野刺激で、対側運動野の血流低下・感覚野の血流上昇が起きることが証明された。両側の大脳皮質の抑制関係と、運動野と感覚野が互いに抑制関係に在ることが示された。電気生理学的解析rTMSと反応時間視覚情報による位置情報を処理して手の運動を起こす反応において、左右の大脳半球がどのようなタイミングでどのように関与するかを解明した。特に左右の半球が時間とともに、関与する仕方が時々刻々と変化する事を証明した。単層性連続磁気刺激の機序と効果従来のrTMSと比べて、効果が強力で持続時間が長いafter effectを誘発出来る単層性連続磁気刺激法を開発した。この方法での持続効果が大脳皮質起源であることを証明した。単層性連続磁気刺激を用いると、持続性の促通効果・抑制効果を誘発出来る可能性があり、この刺激法は臨床で治療法として用いる事が大いに期待出来る方法と考えられた。

単相性2連発磁気刺激の作用機序に関する研究単相性2連発刺激の促通効果が大脳皮質に由来するものか、またシナプスの可塑性に基づくものかを検討した。この結果、大脳皮質の促通効果を誘発していること、またシナプスの可塑性を変化させていることを証明した。単相性4連発磁気刺激の長期効果に関する研究単相性磁気刺激を4連発組み合わせることにより、2連発より効果の大きい・持続の長い・シナプスの可塑性に立脚した長期効果を誘導できることを証明した。この方法により、治療効果を持つ刺激法が開発されると期待される。
ヘテロクロマチン形成・維持に果たすヒストンシャペロンの役割に関する研究

ヒストンシャペロン関連遺伝子を網羅的に破壊してFACT構成因子であるpob3破壊株のヘテロクロマチン崩壊様表現型が顕著である事を発見した。またSwi6依存的FACTリクルートメカニズムを発見した。マイクロアレイ解析からFACT変異株とswi6破壊株のグローバルなRNA発現パターンに高い類似性を見いだした。さらにFACT変異株でヒストンH2A/H2Bのヌクレオソーム組込不全が起きていた。加えて新規H3K9メチル化の領域を発見した。ヘテロクロマチンとユークロマチンの境界決定因子のノックアウト株でこのピークが増加する事からH3K9メチル化の生物学的意義の一端が明らかになった。前年度に引き続き、ヒストンシャペロン活性を有するクロマチン因子FACTがヘテロクロマチン形成に及ぼす影響に付いて分裂酵母を用いて解析を行った。まずSpt16とPob3の相互作用を切る為に、Spt16内に存在するPob3結合領域を同定し、欠損変異体Spt16ΔPID(Pob3 Interaction Domain)を作製し、この変異体がヘテロクロマチンに及ぼす影響をレポーターアッセイによって観察した。その結果pob3遺伝子欠損変異株はヘテロクロマチン崩壊様の表現型を示すものの、Pob3との結合能を失ったSpt16ΔPID株はヘテロクロマチン崩壊様の表現型を示さなかった。上記の実験結果に加えてFACT複合体の生化学的精製をゲル濾過クロマトグラフィー法で行った所、Spt16/Pob3複合体の存在に加えてフリーのPob3タンパク質が多量に存在する事が明らかとなった。加えてヘテロクロマチンタンパク質のSwi6とSpt16の結合も確認された結果、ヘテロクロマチン形成・維持においてFACT複合体はSwi6に依存してヘテロクロマチン上にリクルートされる分子メカニズムに加えて単体のPob3をヘテロクロマチン上にリクルートする未知の分子メカニズムの存在が示唆された。またpob3遺伝子破壊株中でヘテロクロマチンが崩壊する理由を調べた結果、ヒストンH2A/H2Bが抜け落ちたようなヘキサマー/テトラマータイプのヌクレオソームの蓄積がヘテロクロマチン領域内に観察された。このヌクレオソームの異常によって引き起こされるヘテロクロマチンの崩壊はヒストンH2AもしくはヒストンH2Bの過剰発現によって抑制させることから、FACT複合体はヌクレオソームの動的制御機構を通じてヘテロクロマチンサイレンシングを維持する事が強く示唆された。本研究課題では以下に掲げた3つのテーマに関して研究を行った:「1.へテロクロマチン形成・維持に必要なヒストンシャペロンの同定」、「2.FACTによるへテロクロマチン形成・維持機構の解明」、「3.染色体上における新規H3K9メチル化領域およびHP1結合領域の探索」。1に関して、分裂酵母のデータベース上に登録されている非必須ヒストンシャペロン遺伝子のノックアウトしてヘテロクロマチン崩壊様表現型が出るかをチェックした所、FACT構成因子以外にもヘテロクロマチン崩壊が起きる事が明らかとなった。2に関してFACTがヘテロクロマチン上で作動する為の分子機構の解析を行い、その一端を明らかにした。研究結果は国内外の学会・シンポジウムで発表を行い、現在は論文投稿中である。3に関してはヒストンH3K9me抗体によるChIP-sequencingを行い染色体上の分布を調べて、新規のヒストンH3K9me化領域を発見した。現在は解析が進行中であり非常にインパクトの大きな発表になる事が期待できる。ヒストンシャペロン活性を有するクロマチン因子FACTがヘテロクロマチン形成に及ぼす影響に付いて分裂酵母を用いて解析を行った。酵母のFACTは3つのタンパク質Spt16, Pob3, Nhp6から構成される複合体であり、申請者が現在までに行った研究からNhp6がその正電荷豊富なタンパク質の特性を利用してDNAに非特異的に結合し、ヒストンシャペロン活性を持つ他の二つの構成因子Spt16とPob3を呼び込む事が予想された。しかしながら分裂酵母を用いた遺伝学的・分子生物学的解析からFACTはヘテロクロマチン形成領域に強力に結合するものの、その結合はNhp6に依存しない事が明らかとなった。Nhp6の性質ゆえにFACTは染色体上に普遍的に存在すると考えられているが、その普遍性ゆえに解析が困難な一面をもつ。本研究では新たにヘテロクロマチン形成に中核的役割を果たす分裂酵母ヘテロクロマチンタンパク質Swi6がFACT複合体中のPob3と相互作用する事が明らかとなり、Nhp6に非依存的なSpt16-Pob3のヘテロクロマチン形成領域へのリクルートメント機構を明らかにした。真核生物中で分裂酵母は唯一pob3遺伝子破壊が可能なモデル生物でありpob3破壊株を作製して分子遺伝学的解析を行った。

非常に興味深い事にpob3遺伝子を破壊するとヘテロクロマチンに依存するサイレンシングは大きく脱抑制されるのだがヘテロクロマチンの指標となるヒストンH3K9のメチル化量やそれに結合するヘテロクロマチンタンパク質Swi6の量に変化はなくヘテロクロマチン構造そのものに影響は無いように見受けられた。この表現型は当研究室のスクリーニングから単離された他の変異株でも見受けられ更なる解析が必要になると思われる。本研究計画および研究目的において平成24年度には以下の2点に焦点を当てて研究を進めた:1.FACTによるへテロクロマチン形成・維持機構の解明、2.新規H3K9メチル化領域およびHP1結合領域の探索。1.FACTによるへテロクロマチン形成・維持機構の解明:Spt16に変異を導入する事でSpt16とPob3の結合を切る事に世界に先駆けて成功した。この変異株を用いた解析を進める事でpob3遺伝子破壊株内におけるヘテロクロマチン崩壊の分子メカニズムの一端が明らかとなった。このテーマについては極めて新規性の高い重要なデータが蓄積しつつあり、今後の進展が大いに期待できるように思われる。2.新規H3K9メチル化領域およびHP1結合領域の探索:新学術領域「ゲノム支援」によるサポートを受けて、分裂酵母野生株でのH3K9me2 ChIP-sequencingを実施したがセントロメア近傍、MAT領域近傍、テロメア近傍以外に際立ったH3K9me2ピークは観察されなかった。今後はヘテロクロマチン/ユークロマチンの境界を決定する因子epe1遺伝子破壊株を用いてH3K9me2 ChIP-sequencingを行い、境界の変動状態を高解像に解析する予定である。このテーマに関しては先行論文が複数報出されてしまっているが境界線の変動を追いかけた論文はまだなので研究を加速させていく必要がある。本研究計画および研究目的において平成23年度には以下の3点に焦点を当てて研究を進めた:1.へテロクロマチン形成・維持に必要なヒストンシャペロンの同定、2.FACTによるへテロクロマチン形成・維持機構の解明、3.新規H3K9メチル化領域およびHP1結合領域の探索。1.「へテロクロマチン形成・維持に必要なヒストンシャペロンの同定」に関してはヒストンシャペロンをコードする遺伝子を破壊してその表現型を確認し、明瞭な表現型を示すものを選択的に解析中である。その中でも特に顕著にヘテロクロマチン形成異常を示したものがpob3遺伝子であった為、現在はpob3に関する解析を中心に行っている。2.「FACTによるへテロクロマチン形成・維持機構の解明」に関してはNhp6に依存しない新たな機構の発見とFACTリクルート因子Swi6の発見、pob3破壊によって生じるヘテロクロマチン構造の変性の発見と順調に研究が進行中であり、今後の複数報の論文発表が予測され更なる研究の進展が大いに期待できる。3.「新規H3K9メチル化領域およびHP1結合領域の探索」に関しては研究を進めて行く間に海外の研究者からゲノムワイドに解析を行った先行論文が出されてしまった。しかしながら詳細な分子機構は不明瞭な点が多く、先行論文を参考にしながら本研究を掘り下げて行く価値があると思われる。
自然発症高血圧ラットの血管反応性の分子生理学的機構

内皮細胞は、内膜依存性血管弛緩因子(EDRF)やプロスタグランディンI_2(PGI_2)を産生し、血管の弛緩作用や抗動脈硬化作用を示す、自然発症高血圧ラットでは、EDRFの産生が低下し、血管の弛緩が抑制され、血管の収縮性の亢進がみられている。私共は、SHRの大動則により内皮細胞を遊離し、直接内皮細胞の情報伝達機構を検討し、その著しい異常をみとめた。正常血圧ラットWKYとSHR8週齢から大動脈を取り出し酵素法により内皮細胞を遊離・培養した。いづれも蛍光アセチルLDLの取りこみをみとめ、またconfluentでは、cobble stone状配列を示し内皮細胞であることを確認した。内皮細胞の形態は、WKYとSHRにおいていづれも等しかった。また細胞内Ca^<2+>を動員するbradykimin(BK)を用いて情報伝達を検討した。BKの受容体数とKdはいづれもWKYとSHRで差はなかった。しかし、BK10^<ー7>Mに対し、細胞内Ca^<2+>の増加は、SHRで約21%の高値を示した(P<0.05)。またイノシト-ル1.4.5三リン酸(IP_3)も、SHRで8.6±2.8pmol/10^6cellsと60%の増加を示した(P<0.05)。一方、PGI_2の産生は、SHRで約54%低下していた.(P<0.05)。以上より、SHRでは.ホスホリパ-ゼCの亢進とともにPGI_2産生系のホスホリパ-ゼAzの低下がみられ、両酵素系の解離がみられた。これのことはSHRのEDRFの産生低下やエンドセリンの産生異常の機構に関与している可能性を示す.また培養細胞において情報伝達系の異常をみとめたことは、これらの異常が遺伝的に継体されることを意味し、SHRにおける高血圧の発症や血管障害の引き金となる可能性を示す。
薬物代謝関連酵素の遺伝子多型解析とその個別がん化学療法への応用

イリノテカンはプロドラッグであり、エステラーゼによって母化合物の数百倍高い抗腫瘍活性を示す活性代謝物SN-38に変換され、主に肝臓でグルクロン酸抱合を受けて胆汁から排泄される。イリノテカンによる副作用の個人差は、SN-38の薬物動態に関連があると報告されている。SN-38の代謝的解毒過程であるグルクロン酸抱合は、グルクロン酸転移酵素(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)の分子種であるUGT1A1によって行われる。UGT1A1には遺伝子多型が存在しそれぞれの多型により酵素活性が異なることから、多型の解析は本酵素によって代謝される薬物の副作用発現の個人差を説明しうる可能性がある。しかし未だそれらの関連を検討した報告はない。過去にイリノテカンの投与を受けた118名の患者より同意を得た上で採取した末梢血液からゲノムDNAを調製し、UGT1A1の遺伝子多型を検索した。検討した多型はプロモーター領域の(TA)_7TAA(UGT1A1^*28)、エクソン1の211G→A(UGT1A/^*6)、686C→A(UGT1A1^*27)、エクソン4の1099C→G(UGT1A1^*29)、エクソン5の1456T→G(UGT1A1^*7)である。Grade4の白血球減少またはgrade3以上の下痢が認められた者は26名、認められなっかたものは92名であった。UGT1A1以外に重篤な副作用に寄与する因子として、性、化学療法の内容(イリノテカン単独、イリノテカンと白金製剤、イリノテカンと白金以外の製剤)、イリノテカンの投与スケジュールが候補となった。これらの因子を加味して多要因解析を行ったところ、UGT1A1^*28の寄与度は(odds ratio,7.23;95%CI,2.52-22.3;p<0.001)と補正された。イリノテカンの使用に際してUGT1A1の多型を検討することは副作用防止に有用である。本研究は名古屋大学医学部倫理委員会の承認を受けて実施されたものである。
マイコプラズマの菌体由来物質等を用いた肺炎の構築と動物のワクチン用抗原の検索

Mycoplasma pulmonisによるマウスとラットのマイコプラズマ肺炎は肺病変の形成過程が異なっている。しかし、これら2種類の動物の肺炎を解析することにより、いわゆるマイコプラズマに感染したヒトや家畜が肺炎に至るメカニズムの全貌が、ほぼ明らかにできる可能性のあることを、我々は主張してきた。そこで、本研究では、(1)マイコプラズマの菌体由来物質等を用い、マイコプラズマ肺炎の種々の炎症反応を再構築して、この肺炎の特性をさらによく明らかにし、その成果を基に、(2)この肺炎の治療法を検討し、(3)菌体構成分の中に肺炎阻止坑原(ワクチン用坑原)の検索を行った。(1)物質投与による肺炎の構築:感染初期の肺胞領域にみられる炎症や肺動脈周囲とその間質にみられる炎症は、肺と共通な坑原をもつ腎臓の基底膜坑原(合成品;ネフリトジェノシド)、菌体の培養濾液由来の精製坑原(NCBA:not cell-bound antigen)や、mitogen活性のあるConAを鼻腔から投与することでほぼ再現されたが、気管支とその周囲の炎症の再現には、死菌体の投与が必要であった。一方、これらの炎症が慢性の炎症へ進むには、感染による宿主側の全身性の変化の関与が必要であると思われた。(2)この肺炎は、抗生物質のみを投与したのでは十分な治療効果が認められないが、種々の免疫抑制・調製剤(prednisolone,Cyclosporin A,IL-2)とminocyclineをそれぞれ組み合わせることによってはじめて有効な治療効果がみられたので、これられ薬物の肺の炎症におよぼす作用の仕方について検討している。(3)今までに知られていない強力な感染防御能をもつ坑原の存在を、マウスを用いた受身免疫と能動免疫実験により証明した。そこで、その感染防御坑原の検索を継続中である。肺炎の構築法として確立されつつあるのは、マウス・ラットの気道を介し、(1)3GluーαNH_2(合成抗原)の投与を行う方法(M.pul感染初期の肺胞基底膜の所見の再現)、(2)CoAを投与する方法(気管支肺動脈周囲、肺胞領域のリンパ球を主とする間質性肺炎を構築)、(3)M.pul死菌投与法(生菌感染による初期の間質性肺炎像)などと、M.pul抗原記憶T細胞をラットに移植する方法(自己免疫疾患としての肺炎の構築)である。また、それらの肺炎の免疫病理学的検索を実施している。その他、現在検討中の方法としては、種々の肺炎構築物質を認識したモノクロ-ナル抗体の、抗イディオタイプ抗体による肺炎の構築法である。M.pul菌体の内にある肺炎起炎物質(抗原)の検索により、私達が初めて分離したSigmodon hispidus由来のM.pulと、共通な抗原のひとつが肺炎を重症化することを明かにした。2.マウスのM.pulによる肺炎の初期感染像の免疫調整剤による反応と、その免疫病理学的解析感染初期における肺炎の病理学的推移を観察しながら、抗生剤と免疫抑制剤や免疫調整剤(サイクロスポリンA、インタ-ロイキン2)を投与し、免疫反応の関与したM.pul肺炎の増悪化と治癒過程を種々のパラメ-タ-を用いて検討することで、感染マウスにおけるTーcell systemとB-cell systemの変動について解析すると同時に、M.pul肺炎動物の免疫調整剤などによる治療法が有効であることを示した(札幌医学雑誌、58巻、1989)。3.感染防御阻止抗体とワクチン用抗原に関する検討M.pul感染の後、遅れて産生されるIgGとIgA抗体のごく微量(ELISA法で、IgGとIgA抗体価がひと桁)を含む血清が投与されたマウスは、感染による肺炎が阻止されることを発見した。

そこで、ウエスタン・ブロッティング法を用い、この感染防御を示す抗体を産生した抗原(有望なワクチン用抗原)の単離・同定を進めている。今年度はとくに,マイコプラズマ肺炎を重症化し遷延化する因子の存在について,受身免疫実験系の成果を中心に,以下にまとめてみた.<1.肺炎形成(重症化)因子の存在と,その作用の仕方>___ー:<M.pulmonis>___ー感染10週目の肺炎マウスから採取した血清(肺炎血清)をマウスに受身免疫すると,その感染防御率は,投与血清の希釈倍率が進むに従い低下をみるのは10^<-2>までで,それ以上の希釈(10^<-3>10^<-5>)血清の投与例では,感染対照より重症の肺炎がみられた.このことは,感染防御抗体が10^<-3>倍希釈で殆ど失われ,希釈されても残っている肺胞上皮基底膜抗原などと反応する抗体,免疫複合体,種々の免疫抑制性蛋白因子などの作用により,炎症が修飾されていることを示唆している(第17回日本マイコプラズマ学会で報告,1990.5.26).<2.マイコプラズマ肺炎の特性である肺炎の遷延化にかかわる抗原>___ー:上記の所見から,マイコプラズマ肺炎の典型的例は,一度肺炎を起こしたマウスは,殆ど一生肺炎と持続感染が続くが,それは,肺炎血清がもつ感染防御と肺炎成形阻止抗体は,肺炎重症化連因子より量的に少ないことが,主原因の一つであるとみることを可能にしていると思われた.一方,生菌免疫マウスは,造血系やリンパ系臓器内で保菌しながら,免疫の程度に比例して感染を防御し,感染6ケ月を経ても,肺炎を悪化するような因子の産生はほとんど認めることができなかった.以上の所見と,過去の成績を合わせて検討すると,マイコプラズマ肺炎は,菌が肺で増殖して起きる宿主の種々の反応と、その産生物による複雑な感作の結果ではあるものの,やはり,そこに特定の抗原や物質がそれぞれの役割分担に従って肺炎を構築し,規定していると思われる.従って,現在,とくに肺炎構築上の最重要課題である肺炎の遷延化抗原と,感染防御抗原の同定と確認のための種々の実験を行っている.本研究の最終目的は,マイコプラズマの呼吸器感染によって起きる肺炎発症のメカニズムを明らかにするため,菌体由来物質等を用いて動物に肺炎を構築し,肺炎を物質レベルにおける種々の反応として捕らえ明らかにする具体的方法を確立することと,その過程で明らかになるのであろう,感染防御物質(抗原)を用いたワクチン開発への手がかりを提供することにある.以下に,研究成果の概要を記す.肺炎の構築:生菌を用いないでマウスやラットにマイコプラズマ肺炎と区別できない間質性肺炎を構築した.その肺炎の概要は,Phase I(第3病日以内の所見の再現)
変性状態の構造情報を基にしたアミロイド線維化抑制法の開発

アミロイドはタンパク質から構成される線維状凝集体であり、様々な疾患発症への関与が指摘されている。しかし、未だにタンパク質のアミロイド線維化抑制法は確立されていない。本研究では、変性状態の構造情報に着目し、タンパク質の線維化を抑制する新規方法論の確立を目的とした。これまでに、変性状態におけるタンパク質の残存構造が線維化に重要であることが分かっていた。本年度の研究では、抗体λ6鎖Jto、Wilを用いてさらに詳細な解析を行った。その結果、WilがJtoよりも3つ多く有するHis残基を変異させると、WilのN末端側のR_2値(NMR緩和解析により得られる、残存構造の指標となる値)のみが大きく上昇し、さらに線維化がより早い時期に開始することが分かった。即ち、Wilの3つのHis残基がJtoとの違いに大きく寄与していることが示された。特に、変異によってN末端側のR_2値のみが大きく上昇すると線維化しやすくなることが分かった。さらに、Wil変異体のNMRスペクトルの経時的変化を解析した。その結果、N末端、C末端を除く広範囲のアミノ酸残基で変化が観察され、速い化学交換が生じる領域と遅い化学交換が生じる領域が存在することが示唆された。特に、速い化学交換が観察された領域は残存構造が保たれた領域とよく一致していることから、残存構造が何らかの形で分子内あるいは分子間相互作用に関わっている可能性が考えられる。以上の研究成果は、タンパク質の構造と線維化のつながりの理解、ひいては線維化抑制剤の開発に有用であると考えられる。
フラボノイドを用いた日本産キク属植物の環境ストレスに対する適応機構の解明

キク属植物は日本に18種が自生し、いずれも海岸や岩場、斜面のような日当りの良い環境に生育することから紫外線や乾燥、塩などの環境に適応していると考えられる。また、厳しい環境ストレスに対し、植物は二次代謝産物のひとつであるフラボノイドを合成し、防御物質のように利用しているといわれている。本研究では多様な環境に適応した日本産キク属植物を用い、これのフラボノイドと環壕適応の関係を明らかにすることを目的としている。平成25年度は、日本では知床半島にのみ自生の知られるアキノコハマギク、および皇居にのみ生育するカモメギクなど稀少な種についてフラボノイド分析をおこなった。この結果、アキノコハマギクは品種関係のあるチシマコハマギクと同様の組成を示したことから近縁であることが明らかとなった。またカモメギクについても品種関係にあるキクタニギクと同様の組成を示した。さらに、共同研究者らによる研究から、カモメギクはキクタニギクから生じた園芸品種であることが示唆された。本研究を通じ日本産キク属植物のフラボノイド組成は種によって異なるものの、いずれの種も細胞内と表皮の上(細胞外)にフラボノイドを蓄積すること、また細胞内ではグルクロン酸のような糖を結合した物質、表皮の上では多様にメチル化した物質を合成することが共通した特徴として見られた。これらの物質はストレスによって細胞内ではカテコール型およびUV-A領域に吸収をもつ物質が増加することから抗酸化活性や紫外線の遮蔽に機能していると考えられた。また細胞外では乾燥や塩による水ストレスに対してフラボノイドが増える傾向が見られ、蒸散の抑止に機能していることが考えられた。蒸散抑止という細胞外のフラボノイドの機能については防御機構が解明されておらず、今後の課題である。(抄録なし)本研究は多様な環境に適応した日本産キク属植物を用い、フラボノイドと環境適応の関係を明らかにすることを目的としている。研究は(1)フラボノイドを指標とした化学分類および局在箇所の観察による日本産キク属植物のフラボノイドの特徴の特定、(2)フラボノイド特性の異なる植物を用いた栽培実験を行い、物質と生長量の変異を調査することでフラボノイドによるストレス応答機構を解明、そして(3)実際にストレス環境下に適応している自生地の植物に含まれる物質の変異を比較する、という3つの過程に大別しておこなうことを計画している。本年度はこのうち、主に(1)と(2)について研究をおこなった。(1)については、これまでフラボノイドの組成が明らかにされていないチシマコハマギクの成分を定性し、細胞内と表皮の上(細胞外)に蓄積するフラボノイドを8成分明らかにした。この種はコハマギクと同種内の亜種とする見解が存在しているが、細胞内フラボノイドの特性が明らかに異なるため、両種は別種である事が本研究から示唆された。(2)については海岸と山地のような異なる場所に生育する日本産キク属植物4種を供試し、それぞれの生育地で考えられるストレス(塩、乾燥、紫外線)を施し、形態およびフラボノイドの変動を対照区と比較した。この結果、フラボノイドについては、いずれの種も各処理による質的な変化は認められなかった。しかしながら、量的な変動については、葉の細胞内と細胞外に存在するフラボノイドで応答が異なり、細胞内ではカテコール型のフラボノイドが増加、細胞外ではメトキシル化された物質が一様に増加することが明らかとなった。多くの植物は細胞内にのみフラボノイドを蓄積させるが、中にはキク属植物のように細胞外に蓄積する植物もあることが知られている。しかし、これら蓄積箇所の異なるフラボノイドが各種環境ストレスに対してどのように応答するのかは明らかにされておらず、本研究で初めて明らかにされた。
Fas Lのエピトープの同定と異種移植用トランスジェニック動物への応用

結果としては、1-57AA以上の全FasL-TMともブタの血管内皮上に高発現し、NK細胞抑制効果がみられた。しかし、1-8AA1-18AAについては不明に終わった。I型FasL分子の機能ドメインはN末端に限局し、NK細胞の制御に有効であることが示唆された。FAS-LはII型蛋白である。一方、異種移植の研究で多く見られる、膜状に発現している分子は、I型の蛋白(例として、補体制御因子、CD46,CD55やCD59)であるため、これらとのhybrid化が将来の研究で必要と考えられたため、1型のFac-Lを作製した。その際、発現量を上げるため、哺乳類で頻度が高いcodonを選択しI型に遺伝子合成した。次に、この合成I型FasLを鋳型として、細胞外(N末端)より1-8 amino acid(AA),1-12AA,1-18AA,1-57AA,98AA,1-117AA,1-134AAおよび1-152AAに、HLA-Gの膜貫通部位(TM)に結合した形の分子(FasL-TM)をそれぞれ作製した。また、1-134AAおよび1-152AAに関しては、DAF(CD55)のPI-anchorを付けた形の分子も合成した。これらの合成FasLは血清中の酵素による切断部位をはずし、また全例マーカーとして、FLAG-tagをN末端につけ加えた。発現vectorであるpCAGGSに組み込み、ブタ血管内皮細胞(PEC)にlipofection法を用い、遺伝子導入し、各lineの発現をFACSで確認した。現在までに、これらのFasL-TM発現細胞を使い、NK依存性PEC傷害に対する抑制効果を検討し、有効な結果がでている。その際、NK細胞としては、YT細胞(NK-like cellline)を使用した。
吹抜空間の配置法による煙突効果の特性の解明

1.吹抜空間を利用した自然換気法の効果解析近年自然換気を併用するハイブリッド空調が注目されている。この場合、自然換気を促進する吹抜空間の役割が重要である。ソーラチムニー化した階段室を煙突効果主経路としたオフィスビルの自然換気効果を解明した。(1)実測による効果解析:7階建てのオフィスビルにおいて、各階床内にある換気口と階段室上部の換気口を開放して行う自然換気の効果を定量化した。自然換気量を、換気口の風速及び差圧測定結果から求める方法、トレーサガス実験により求める方法、室内CO2濃度と在室人員調査結果から求める方法により得たところ、どの結果でも12回/hであることが判明した。(2)数値計算による自然換気効果に影響する要因の感度解析:実測を行った建物をモデル化し、建物全体の風量収支を計算した。自然換気量の計算値と実測値が一致することを確認した上で、温度・開口条件が自然換気量に及ぼす影響を感度解析した。その結果、各階開口面積を2m^2に増やすと、換気量は7回/h程度まで増加することがわかった。2.高層アトリウム建築の冬期エントランス外気侵入量の定量化高層建築では、通行時のエントランス開口から冬期に大量の外気が侵入し、熱環境・エネルギー消費に悪影響を与えることが問題である。これは、アトリウムなどの吹抜空間をもつとさらに重大な問題である。まず、通行人数からエントランス自動扉の有効開口面積を推定する方法を考案した。次に、吹抜空間の配置が異なる5つの建物タイプを想定し、エントランス開口面積のほかに、建物階数、温度条件、外皮漏気性、建物内の扉の開口状態が、エントランス外気侵入量にどの程度影響するかを数値解析により明らかにした。基準条件の外気侵入量に対して、補正係数などを乗じて異なる条件の値を推定できるかどうかを、要因ごとに検討した。1アトリウム建築の吹抜け空間配置に関する実例調査最近のアトリウム建築について文献調査を行い、吹抜空間配置に関するタイプ分類の検討を行った。2アトリウム建築の煙突効果に関する数値解析のための計算条件の検討文献調査結果に基づき5タイプのアトリウム建築と1タイプのアトリウムのない建築について、標準的と思われる外皮内皮漏気性に関する条件設定を行い、数値解析のためのケースを作成した。3入退館に伴うエントランス外気侵入量の特性に関する数値解析6タイプの建築について、入退館に伴う冬期のエントランス外気侵入量の数値計算を行った。吹抜空間の配置、エントランス開口面積、建物階数、エレベータ・階段室・居室の扉の隙間、外壁漏気性、建物内外温度差などの要因が、煙突効果によるエントランス外気侵入量にどのように影響するかを解析した。さらに、今後開発しようとする暖房設計用エントランス外気侵入量の簡易推定法において、考慮するべき重要な要因とその影響の推定の仕方について検討を行った。4煙突効果による自然換気を活用する建築の環境実測のための準備本年度3月より予定している、階段室の煙突効果を利用する自然換気併用ハイブリッド空調を実施する建築での自然換気効果の実測のための測定計画検討、測定装置の特性チェックを行った。(1)高層アトリウム建築の冬期エントランス外気侵入量の定量化吹抜空間の配置が異なる5つの建物タイプを想定し、エントランス開口面積のほかに、建物階数、温度条件、外皮漏気性、建物内の扉の開口状態が、エントランス外気侵入量にどの程度影響するかを数値解析により明らかにした。(2)吹抜空間を利用した自然換気法の効果解析

a)階段室を煙突効果経路として利用するオフィスビルの自然換気法の効果解析7階建てのオフィスビルにおいて、各階床内にある換気口と階段室上部の換気口を開放して行う自然換気の効果を定量化した。自然換気量を、換気口の風速及び差圧測定結果から求める方法、トレーサガス実験により求める方法、室内CO2濃度と在室人員調査結果から求める方法により得たところ、どの結果でも12回/hであることが判明した。b)自然換気効果に影響する要因の感度解析実測を行った建物をモデル化し、建物全体の風量収支を計算した。自然換気量の計算値と実測値が一致することを確認した上で、温度・開口条件が自然換気量に及ぼす影響を感度解析した。その結果、各階開口面積を2m^2に増やすと、換気量は7回/h程度まで増加することがわかった。
消化管神経内分泌腫瘍におけるｌｕｍｉｃａｎの機能解明と新規治療薬の開発

消化管神経内分泌癌(NEC)におけるlumicanの発現と役割について検討.免疫染色ではLumicanはNECの細胞質と腫瘍間質に発現.上行結腸神経内分泌癌由来の培養細胞株NENMS-1を用いた検討では,NENMS-1のスフェアでSrc,CD133,lumican mRNA発現が高値で,lumican過剰発現NENMS-1で細胞増殖の抑制,スフェア形成能の抑制,細胞遊走の抑制が見られた.Aldefluorassayで陽性分画と陰性分画の比較では,陽性分画でCD133とlumican mRNAの発現が高値を示した.以上より,lumicanは消化管NECのCSCマーカーとなる可能性が示唆された.消化管神経内分泌癌は高悪性度で予後不良の疾患である.近年,がん幹細胞(CSC)はニッチ依存的に幹細胞性を維持し,腫瘍の増殖・転移のみならず,薬剤・放射線耐性能にも関与すると報告された.一方で,細胞外基質の構成因子であるlumicanはsmall leucine rich proteoglycanfamily(SLRP)に属し,腫瘍の増殖・遊走・接着に抑制的に働き分化に関与する.本研究では神経内分泌癌におけるlumicanの発現と役割について検討した.平成24年度は,大腸の神経内分泌癌,神経内分泌分化を伴う腺癌,カルチノイドの病理組織切片を用い,腫瘍細胞におけるCSCマーカーの発現を検討し,神経内分泌癌においてCD24の発現が高い傾向を確認した.LumicanはNECの細胞質,および腫瘍間質に発現を認めた.平成25年度は,上行結腸神経内分泌癌由来の培養細胞株NENMS-1を用いた検討を開始した.CSCの性質を検討する方法の一つであるスフェア形成法を行ったところ,NENMS-1のスフェアではSrc,CD133といった幹細胞マーカーとともに,lumicanの発現が高値を示した.また,NENMS-1にlumican発現ベクターを遺伝子導入し,lumican過剰発現細胞を作成したところ,lumican過剰発現NENMS-1では細胞増殖の抑制,スフェア形成能の抑制,細胞遊走の抑制が見られた.以上より,lumicanは,消化管NECのCSCマーカーとなる可能性が示唆された.消化管神経内分泌癌(NEC)におけるlumicanの発現と役割について検討.免疫染色ではLumicanはNECの細胞質と腫瘍間質に発現.上行結腸神経内分泌癌由来の培養細胞株NENMS-1を用いた検討では,NENMS-1のスフェアでSrc,CD133,lumican mRNA発現が高値で,lumican過剰発現NENMS-1で細胞増殖の抑制,スフェア形成能の抑制,細胞遊走の抑制が見られた.Aldefluorassayで陽性分画と陰性分画の比較では,陽性分画でCD133とlumican mRNAの発現が高値を示した.以上より,lumicanは消化管NECのCSCマーカーとなる可能性が示唆された.大腸神経内分泌癌は、高頻度に遠隔転移をきたす極めて予後不良の疾患であり、新規治療法の開発が待ち望まれている。これまでに申請者らは、lumicanが大腸癌、膵癌、肺癌、子宮頸癌、皮膚腫瘍等の様々な腫瘍細胞やその間質に発現し、癌の進展に関与する重要なタンパク質であることを明らかにした。さらに、大腸神経内分泌腫瘍においてもlumicanが発現し、その発現が分化度や増殖に関与することを報告した。近年の研究で癌細胞の中には、癌幹細胞と呼ばれる特殊な細胞が存在することが明らかになってきた。癌幹細胞は、癌の遠隔転移や治療後再発に中心的な役割を担うと考えられており、癌幹細胞の特性を解明し、それを根絶する治療法の開発に注目が集まっている。Lumicanは間葉系幹細胞と、血管内皮細胞の前駆細胞の遊走や浸潤の制御に重要な細胞外基質であることが報告されている(Malinowski M et al., PLoS One. 2012)。癌組織においても、癌幹細胞のニッチを形成する細胞外基質であることが知られているが、大腸神経内分泌腫瘍における癌幹細胞とlumicanの関連については明らかとなっていない。そこで申請者は大腸神経内分泌腫瘍における癌幹細胞について検討を開始した。平成24年度は、大腸の神経内分泌癌、神経内分泌分化を伴う腺癌、カルチノイドの各病理組織切片を用い、腫瘍細胞における癌幹細胞マーカーのCD24, CD44, CD133, ESA, Src, CXCR4の発現を酵素抗体法にて検討した。その結果、腫瘍細胞は様々な程度に癌幹細胞マーカーを発現していた。腺癌、カルチノイドと比べ、神経内分泌癌においてはCD24の発現が高い傾向が見られた。今後、症例の追加を行い、結果の確認を行うとともに、培養細胞を用いた神経内分泌腫瘍における癌幹細胞の役割やlumicanとの関連について解明する。消化管神経内分泌癌は高悪性度で予後不良の疾患である.近年,がん幹細胞(CSC)はニッチ依存的に幹細胞性を維持し,腫瘍の増殖・転移のみならず,薬剤・放射線耐性能にも関与すると報告された.一方で,細胞外基質の構成因子であるlumicanはsmall leucine rich proteoglycanfamily(SLRP)に属し,腫瘍の増殖・遊走・接着に働き分化に関与する.本研究では神経内分泌癌におけるlumicanの発現と役割について検討した.平成24年度は,大腸の神経内分泌癌,神経内分泌分化を伴う腺癌,カルチノイドの病理組織切片を用い,腫瘍細胞におけるCSCマーカーの発現を検討し,神経内分泌癌においてCD24の発現が高い傾向を確認した.

LumicanはNECの細胞質,および腫瘍間質に発現を認めた.平成25年度は,上行結腸神経内分泌癌由来の培養細胞株NENMS-1を用いた検討を開始した.CSCの性質を確認する方法の一つであるスフェア形成法を行ったところ,NENMS-1のスフェアではSrc,CD133といった幹細胞マーカーとともに,lumicanの発現が高値を示した.また,NENMS-1にlumican発現ベクターを遺伝し導入し,lumican過剰発現細胞を作成したところ,lumican過剰発現NENMS-1では細胞増殖の抑制,スフェア形成能の抑制,細胞遊走の抑制が見られた.以上より,lumicanは,消化管NECのCSCマーカーとなる可能性が示唆された.消化器外科神経内分泌癌由来の培養細胞株での検討を行い,lumicanの役割について検討できた.大腸の神経内分泌腫瘍のうち、神経内分泌癌の症例数が少なく、統計学的に十分な数の病理組織切片での検討を行なえていない。NENMS-1以外の細胞株での同様の検討,およびlumican発現抑制細胞での同様の検討を行う.さらに,動物実験による生体内での腫瘍細胞のlumicanの発現の変化やlumicanの制御機構について検討する.平成24年度に行った、各種の癌幹細胞マーカーを用いた酵素抗体法の症例数を増やす予定である。また、大腸神経内分泌癌組織から樹立された培養細胞株を用い、酵素抗体法の結果の確認と、lumicanと癌幹細胞の関連について検討を行う。さらに、大腸神経内分泌癌の培養細胞をマウスに移植し、in vivoでのlumicanと癌幹細胞との関連について検討する。概ね順調に研究は進んでいるが,次年度以降に継続して培養細胞実験を行うため繰り越しが生じた.実験のために消耗品のために使用します.病理組織切片作成、抗体、培養細胞関連試薬、実験動物の購入、飼育など、消耗品として使用する。また、研究成果の発表、および情報収集のため、国内学会への参加費として使用する。