hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造血幹細胞支持に関わるストローマ細胞由来分子の同定-造血幹細胞への結合能を指標とした新しいクローニング法を用いて-

本研究では、血球の増殖・分化・死の制御機構に関するストローマ細胞の役割を明らかにすることに加え、造血幹細胞の体外増幅の可能性を探求することを目的として、ストローマ細胞由来の造血制御因子の同定を試みた。BMS2.4細胞株の培養上清は多くの造血細胞株の増殖を抑制するため、BMS2.4からcDNAライブラリーを作製し、WEHI3細胞株を標的としてexoression cloningを行い、増殖抑制作用を持つ新規分子の同定に成功した。この分子は182個のアミノ酸からなる未知の糖蛋白で、インターフェロンα、βとアミノ酸レベルで約20%の相同性を有していた。このcDNAを293Tに遺伝子導入して得た培養上清は、一部のpre-B細胞株にアポトーシスを導入し、他の多くの造血細胞株にG1アレストを誘導した。一方、MS-5はヒト幹細胞を長期にわたり増幅・支持しうるユニークな特徴を有するストローマ細胞株であるため、signal sequence trap methodを改良することによりMS-5由来の分泌蛋白として24種の分子を同定した。これらの中には、コラーゲン、オステオポンチン、ケラチン、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックスやpre-PDGF受容体、トロンビン受容体などの膜蛋白の他に未知の4種類の分子や機能解析がなされていないOsteoblast stimulating factor、Placental proliferin、Hematopoieitic lineage switch-2などが同定された。現在、上記の新規分子および機能不明分子に関して機能解析を行っている。
細胞骨格動態および代謝の加齢変化と神経機能障害

老化した神経系では、神経突起を支える細胞骨格の機能的、構造的破綻を示唆する所見が多数みうけられる。また、アルツハイマー型老年痴呆脳に蓄積する神経原繊維変化が、微小管調節蛋白の一つであるタウ蛋白を主成分とすることから、異常構造物の生成と細胞骨格蛋白の代謝異常との関連が推察される。本研究では神経細胞、特に神経突起における細胞骨格の代謝調節機構を解明し、その加齢変化を明らかにすることを目的とし、固体レベルの軸索内輸送系と、培養神経細胞の系を併用して、以下の成果を得ることができた。1.ニューロフィラメント(NF)に作用する薬物β, β'-イミノジプロピオニトリルを用いて、加齢に伴う細胞骨格蛋白輸送速度の低下や通過障害に似た異常蓄積を実験的に再現することができた。その結果、NFのリン酸化状態が、NFと微小管の相互作用およびNFの輸送を調節する要因の一つであること、輸送阻害により蓄積した蛋白を選択的に分解する機構が存在することが判明した。(J. Neurochem., 63, 291-300, 1994)2.ラット前根より軸索に局在するタウ蛋白を調製したところ、脳微小管由来のタウにみられる多数の分子種のうち、ごく一部の高度にリン酸化されたもののみを含むことがわかった。その60%が不溶性である(Biochem. Biophys. Res. Comm., 210, 338-344, 1995)。坐骨神経運動繊維では、不溶性タウは、不溶性チューブリンとともに最も遅い速度成分SCaで輸送され、可溶性タウは、これらより速い成分SCbで輸送される。3.成熟軸索に特徴的な不溶性チューブリンは、培養下の後根神経節細胞においても、突起形成に伴って出現し増量する(J. Neurochem., 64, 354-363, 1995)。ビデオ増強微分干渉顕微鏡観察により、不溶性チューブリンの実体が、細胞外液中でも数時間以上も脱重合しない安定型微小管であることがわかった。また、アルツハイマー型老年痴呆脳に蓄積する神経腹繊維変化が、細胞骨格調節蛋白の一つであるタウ蛋白を主成分とすることからも、異常構造物の生成と細胞骨格蛋白の代謝異常との関連が推察される。本研究は、このように神経系老化の重要な局面と考えられる細胞骨格の加齢変化を明らかにするとともに、神経細胞における細胞骨格の代謝調節機構を解明することを目的としている。本年度は、個体レベルの軸索内輸送系と、培養神経細胞の系を併用して実験を行い、以下の結果を得た。1.ラット坐骨神経運動繊維の系を用いて、β,β'-イミノジプロピオニトリルによるニューロフィラメントの軸索内輸送阻害と異常蓄積を実験的に作り出した結果、輸送停止が神経の全長にわたって同時に起こり、停止した蛋白を優先的に分解する機構が存在することがわかった。更に、輸送停止に伴い、高分子量ニューロフィラメント蛋白のリン酸化が一過性に減少するとともに,チューブリンの溶解性が高くなることを見出した(J.Neuro-chem.,63,291-300)。リン酸化によるニューロフィラメントの代謝調節および微小管との相互作用の調節について、引き続き検討中である。

2.軸索微小管の安定化に関与すると考えられる微小管結合蛋白タウについて、末梢神経軸索に存在する分子種を同定するとともに、その軸索内輸送を確認した。加齢や神経障害に伴う輸送の変化を、現在、検索中である。3.初代培養ラット後根神経節細胞の突起形成過程における細胞骨格の動態および代謝変化をパルスラベル法によって調べ、培養初期の突起伸展期(5日目まで)と、その後の突起成熟期では、微小管の安定性およびチューブリン代謝に大きな差異があることを見出した(J.Neurochem.,64,354-363)。老化した神経系では、神経突起を支える細胞骨格の機能的、構造的破綻を示唆する所見が多数みうけられる。また、アルツハイマー型老年痴呆脳に蓄積する神経原繊維変化が、微小管調節蛋白の一つであるタウ蛋白を主成分とすることからも、異常構造物の生成と細胞骨格蛋白の代謝異常との関連が推察される。本研究は、細胞骨格の加齢変化を明らかにするとともに、神経細胞における細胞骨格の代謝調節機構を解明することを目的としている。本年度は、個体レベルの軸策内輸送系と、培養神経細胞の系を併用して実験を行い、以下の結果を得た。1.成熟軸索には、様々な脱重合条件でも可溶化されない『不溶性チューブリン』が多量に存在することが明らかになっているが、このような不溶性チューブリンは、培養下の後根神経節細胞においても、突起形成に伴って出現し、増量する(J. Neurochem., 64, 354-363)。ビデオ増強微分干渉顕微鏡観察により、不溶性チューブリンの実体が、細胞外液中でも数時間以上も脱重合しない安定型微小管であることがわかった(印刷中)。2.ラット前根よりタウ蛋白を調整して検索したところ、脳微小管由来のタウにみられる多数の分子種のうち、ごく一部の高度にリン酸化されたもののみが、末梢神経軸索に存在することがわかった。更に、末梢神経軸索ではタウの60%が不溶性であった(Biochem. Biophys. Res. Comm., 210, 338-344)。3.ラット坐骨神経運動繊維の系を用いてタウの軸索内輸送を調べたところ、不溶性タウは、不溶性チューブリンとともに最も遅い速度成分SCaで輸送され、可溶性タウは、これらより速い成分SCbで輸送されることが明らかになった。不溶性タウと不溶性チューブリンが一体となって輸送されることから、上記1.に示した安定型微小管にタウが関与する可能性が示唆される(投稿中)。
免疫チェックポイント分子などに対するエフェクター活性を有するイヌ用抗体医薬の創出

本研究では、イヌの難治性腫瘍に対する新規治療法の樹立を最終目標に、免疫チェックポイント分子や腫瘍抗原に対する抗体医薬を作出し、実用化に向けてその効果を検討する。作出する治療用抗体は遺伝子工学技術により、イヌに対する免疫原性の軽減を図ると同時に抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性や補体依存性細胞傷害(CDC)活性などのエフェクター機能を付与する。作出した抗体は目的の活性を示すかをイヌ由来の細胞を用いたin vitro試験により確認する。安全性を検討したのち、北海道大学動物医療センターに来院した腫瘍罹患犬に対し投与試験(臨床研究)を行って、治療効果を評価する。
原子間力顕微鏡を用いた生きた微生物細胞に働く相互作用力の直接測定法の開発

本研究では、原子間力顕微鏡AFMを用いて生きた微生物細胞に働く相互作用力を直接測定するために、AFMのカンチレバー先端への微生物1細胞やナノ粒子1個の固定について検討を行った。その結果、細胞もしくはナノ粒子がカンチレバーに付着したときの自由エネルギー変化が負の場合、細胞1個が生きたまま固定されたシングルセルプローブ、ナノ粒子1個が固定されたシングルナノプローブを作製できることを明らかにした。微生物に働く相互作用力を正確に理解することは、細胞が関係する種々の分野において非常に重要な課題である。しかし、生物に由来した相互作用は極めて複雑なため、その理論は未だ確立されていない。本研究では、物質間に働く相互作用を直接測定できる原子間力顕微鏡AFMを用いて、生きた細胞に働く相互作用力を直接測定する手法の開発を目的とする。平成28年度の研究では、1)シングルセルプローブにおける細胞の固定要因の定量的評価、2)作製したシングルセルプローブを用いた細菌ー基板間と細菌ー細菌間に働く付着力の直接測定、について主に検討を行い、以下の結論を得た。1)AFMプローブ、分散媒、基板について種々の組み合わせでセルプローブの作製を試みた。その結果、AFMプローブはポリドーパミン修飾したコロイドプローブ、分散媒は低イオン強度の電解質水溶液、基板は負帯電ガラスの組み合わせにおいて、乳酸菌1個が生きたまま固定されたセルプローブの作製に成功した。次に、コロイドプローブへの細菌の固定要因を熱力学とDLVO理論から検証した結果、(細菌ーコロイドプローブ間の付着力)>(細菌ー基板間の付着力)の関係を満たせば、セルプローブを作製できることを定量的に明らかにした。2)作製したセルプローブを用いて細菌1個に働く付着力を測定した結果、細菌ー細菌間の付着力は細菌ー負帯電ガラス間と比べて非常に小さく、接触圧が増加してもほとんど変化しないことが分かった。これは、ガラスと比べて細菌が柔らかいため、表面間距離が縮まりにくいことと、細菌周りの高分子鎖による立体斥力が原因であると推察される。これらの結果は、細菌のガラスへの付着率および細菌の自己凝集率の傾向とよく一致しており、その妥当性が実証された。細胞1個を生きたまま固定したセルプローブの作製に改めて成功し、その固定要因について定量的に明らかにした。また、作製したセルプローブを用いて直接測定した相互作用力は、細胞の付着特性とよく一致することを実証した。以上より、本研究は、おおむね順調に進んでいると判断した。本研究では、物質間に働く相互作用を直接測定できる原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、生きた細胞に働く相互作用力を直接測定する手法の開発を試みた。平成29年度の研究では、AFMカンチレバーのチップ先端にナノ粒子を固定したシングルナノプローブの作製と、それを用いた細胞ーナノ粒子間に働く相互作用力の直接測定を行った。チップ先端に固定するモデルナノ粒子として、公称径100 nmのカルボキシル修飾したポリスチレン(PSL)粒子とアミノ基修飾したPSL粒子を用い、純水もしくはエタノールに分散させてから用いた。カンチレバーは、そのままのものと、プラズマ処理で親水化したものを用いて、ナノプローブの作製を試みた。接触角の実測値より表面張力を推算し、ナノ粒子がチップ先端に付着したときの自由エネルギー変化の計算値が負になる組み合わせであれば、チップ先端にナノ粒子が固定されることが分かった。また、ナノ粒子分散液を蒸発させるときの速度による影響は見られなかったが、チップ先端は固定前に粒子径に応じて平坦化すると効果的であった。作製したナノプローブを用いて、酵母1細胞とアミノ基修飾したPSLナノ粒子の間に働く相互作用力を直接測定した。その結果、付着力の中位値は、イオン強度の低い5 mM NaCl水溶液と5%グルコース水溶液中ではそれぞれ400 pNと310 pNであったのに対して、イオン強度の高い生理食塩水中では54 pNと約一桁小さくなることが分かった。また、相互作用力の測定結果は、ナノ粒子の動的挙動(分散、付着、取込)とよく相関しており、作製したナノプローブの妥当性が実証された。今後の研究の推進方策は以下の通りである。1)シングルナノプローブの作製:カンチレバー先端に極性の異なる溶媒に分散したナノ粒子懸濁液を滴下し、真空脱気することで溶媒を蒸発させる。このとき、溶媒の蒸発速度と懸濁液濃度を主に検討する。2)シングルナノプローブを用いた細胞ーナノ粒子間の相互作用力の直接測定:作製したシングルナノプローブを用いて、種々の細胞ーナノ粒子間の相互作用力を直接測定する。また、得られた付着力分布と熱力学的物性の相関関係を検討する。

3)シングルセルプローブを用いて、細胞ー細胞間に働く相互作用を直接測定することで、バイオフィルムの形成メカニズムの解明を試みる。粒子ー細胞間に働く相互作用力の評価と応用
生活再建時のセルフエンパワーメント向上に資する防災教育プログラムの開発

東日本大震災後に早期生活再建を果たした被災世帯18ケースの生活再建過程を分析した結果,避難所生活やプレハブ仮設住宅生活を経験していないことが明らかとなった。また救援物資に頼らず自腹で買い物をし,長時間並んでガソリンを確保し自力で移動するなど一切公助をあてにしないで震災後の生活を送ってきたことが明らかとなった。次いで早期に生業を含む生活再建を体現したケースで合理的な判断・意思決定を可能とした能力として1「自助努力」,2「社会性」,3「共通目標を有する仲間の存在」, 4「現役時代に仲間をつくる努力」,5「投資家精神を持つ」の5つの能力が明らかとなった。1.エスノグラフィー調査に基づく早期生活再建者の生活再建過程の解明東日本大震災の被災地である宮城県名取市を中心に,沿岸9市町を対象として早期生活再建を果たした被災世帯を対象としたエスノグラフィー調査(非構造化面接法調査)を実施した。避難所生活を経験していない,あるいは仮設住宅への入居は考えもせず自分で仮の住まいさがしに奔走しているケースが多く,震災直後から救援物資に頼らず自腹で買い物をし,長時間並んでガソリンを確保し自力で移動するなど,一切公助をあてにしないで震災後の生活を送っていたことが共通点である。さらに,自分たちの生活再建あるいは住宅再建に対する公助への不満が語られたことは一度もなく,親類・知人・職場の同僚等の伝手を使い,不動産会社や住宅メーカーと早期に直接交渉し,震災からわずか2年以内に住宅再建を成し遂げた方も多い。2.早期生活再建に関わる重要パラメーターの導出次いで,早期再建を果たした被災世帯のエスノグラフィー調査のデータから典型ケースを抽出し、テキスト分析をおこなった。頻出語上位20位を自動抽出し、生活再建にかかわると考えられる単語を選定した。この結果、借り上げ仮設住宅経験者の語りから、こども有・夫婦のみの世帯両方に共通する生活再建に関連する特徴語:「自分」「分かる」が抽出された。「自分たちで何とかしなければいけない」「自分たちでやっていく」というように、積極的・能動的に生活再建に向けて自分自身を鼓舞し、行動していた様子が明らかになった。この傾向は、震災直後の避難時から自宅再建に至るまで見られた。「まちの復興の方向性が分からない」「さまざまな手続きや相談先等が分からない」「プレファブ仮設住宅がいつできるかが分からない」「どこに住めばよいかが分からない」という、何も分からない状況の中でも、生活再建に向けて自ら行動していたといえる。東日本大震災の被災地沿岸9市町を対象として早期生活再建を果たした世帯を対象にエスノグラフィー調査を実施した。避難所生活や仮設住宅への入居は考えず自ら仮の住まい探しに奔走しているケースが多く、救援物資に頼らず一切公助をあてにしないで生活を送っていたことが共通点であった。次いで、エスノグラフィー調査のデータから典型ケースを抽出し、テキスト分析により頻出語上位20位を自動抽出し、生活再建にかかわると考えられる単語を選定した。この結果、こども有・夫婦のみの世帯両方に共通する特徴語:「自分」「分かる」が抽出された。「自分たちで何とかしなければ」「自分たちでやっていく」というように、積極的・能動的に生活再建に向けて自分自身を鼓舞し、行動していた様子が明らかになった。この傾向は、震災直後から自宅再建に至るまで見られた。次いで早期に生活再建(生業を含む)を体現した被災世帯に研究対象を拡大し、生活再建過程で合理的な判断・意思決定を可能とした要員を解明した。その結果、1「社会性」(これまでお世話になった消費者への恩返しに1日も早く新鮮な野菜を提供しなければという思い)、2「共通目標を有する仲間の存在」(夫はガレキ拾いに毎日行き休んだ時はなかった。あの時みんな一生懸命止まらないで前に進んでいた)、3「現役時代に仲間をつくる努力」(昔の婦人学級や趣味の会等、自分が元気なときに仲間をつくっておくということ。そこに行くと、すぐ10年も20年も前のあの時代にぽんと戻れるのです。こんなに人は会話に助けられる。それさえあれば、物は後からでいいです)、4「投資家精神」(お金を運用しないで持っていた方がいいという人と、投資し運用する人との違いでは。なくても動く人は動いて、それなりに生活ができるのだもの)、という4つの要因が早期再建を可能とした判断・意思決定に大きく作用していることが明らかとなった。本研究の研究目的は早期に生活再建を実現した被災者の生活再建過程を詳細に解明し、判断・意思決定が求められた局面とその時に下した決断、その決断がもたらされた背景、役立った知識・情報、活用した資源を分析することである。

そのための研究項目として, 1)エスノグラフィー調査により早期生活再建者の生活再建過程を解明,2)生活再建過程において早期再建を可能とした要因分析,3)早期生活再建者に求められる能力(知識・技能・態度・資金等)の解明,4)生活再建過程で被災者の自助を促進するための教育プログラムの開発を掲げている。初年度はこのうち,1),2)の研究項目について概ね当初予定していた成果が得られたことより,おおむね順調に進展していると評価した。防災教育住宅再建とともに,早期に生活再建(生業を含む)を体現した被災世帯に研究対象を拡大し,生活再建過程を解明する。その後,生活再建時のセルフエンパワーメント向上に資する防災教育プログラムの開発を目指す。教育プログラムで対象とすべき諸要素に関して、生活再建過程で合理的な判断・意思決定を可能とするために必要な能力、すなわち育成すべき能力を解明する。自律して早期生活再建に取り組める能力育成のための教育プログラムのコンテンツは、初年度研究で明らかとなった1自律的早期生活再建モデルの提示、2生活再建7要素である「すまい」「つながり」「まちづくり」「こころとからだ」「そなえ」「景気・生業・くらしむき」「行政の対応」で事前に修得しておくべき知識・情報、3早期生活再建の必要性と効用の理解を促す項目、で構成する。研究開始以前に実施していたエスノグラフィー調査のデータ分析が多くなったために,当初予定していた旅費の使用額が少額となった。平成27年度は、引き続き名取市・仙台市等を対象としたエスノグラフィー調査、ワークショップ開催を予定している。また、エスノグラフィー調査、ワークショップ等で得られた音声データを文字データ化するための経費、調査結果から得られた資料の整理と情報の電子化のため、資料整理およびデータ入力補助としての謝金、さらに論文投稿料などを予定している。
教授-学習過程における教師-生徒関係の再構造化に関する実証的研究

本研究は、教授-学習過程において教師-生徒関係がいかにして再構造化されているのかについて、授業コミュニケーションの参与観察及びその調査データの社会学的分析によって実証的に解明しようとしたものである。この課題への取り組みとして次の3つの作業を行った。第一は教師-生徒関係、授業コミュニケーションの文献研究であり、a)関連性理論、b)エスノメソドロジーの先行研究の整理を通じて、コミュニケーションの中で起こる社会関係の秩序化の機制について学んだ。第二は質問紙調査データの分析を通じて、教師という社会的役割がいかなる構造をもち、どのような社会的関係の中でその役割が構成されているのかについて検討した。ここでは、教師役割が《教授実践》をめぐって構成されていることが明らかになり、その分析結果の一部は日本教育社会学会第48回大会において報告を行った。第三は授業実践の参与観察データを用いての教授-学習過程の秩序構造の分析である。この課題については現在も分析を継続しており、まだ報告書の公刊に至っていないが、次のような知見が導かれつつある。授業秩序は、教授-学習過程において生徒が教師の評価構造を先取りすることによって成立し、その過程を通じて、生徒は生徒役割と同時に教師役割をも身体化する。教師の評価構造の先取りとは、教師の個々の評価に対応するだけでなく、階層構造化された教師の評価に対応できることによって成立しており、その意味で、教授-学習過程とは、生徒が教師役割の内面化を通じて生徒となり、教師-生徒関係を再構造化する過程なのである。今後は、以上の知見の更なる実証とともに、家庭・生徒・教師の三者の評価構造の関連性についても検討を進めてみたいと考えている。これは学校の文化的再生産機能に関する実証研究への道を開くものとして期待している。なお上記の知見については、近日中に論文をまとめる予定である。
20世紀前半のインドにおける地域アイデンティティとナショナリズム

今年度は、20世紀前半のインドにおける地域アイデンティティやナショナリズムを考察する上で、新たに二つの側面に注目した。その一つは、南アジア研究で近年活発なジェンダー研究の観点を取り入れながら、インド人エリート層が地域アイデンティティやナショナリズムを強調する中で、この動きとの関連から「男性性」「女性性」をどのような形で構築しようとしたのかをさぐるものである。その際には、エリート層内部でのジェンダー観の多様性に注目すると同時に、こうしたエリート層が提示したジェンダー観が、社会の異なる立場の人々の間でどのように受け止められたのかについても、限られた資料から考察を試みた。特に興味深かった点は、いわゆるエリート層出身者ではない女性たちや、社会的な地位の低い寡婦たちが、植民地期の学校教育制度を利用しながら、次第に地方レベルの教育・社会・文化活動に独自の形で携わるに至るまでの過程である。そこには、エリート層が主張するようなジェンダー観と折り合いをつけながら、実態としてはそのジェンダー観にとらわない独自の活動領域を築いていった女性たちの姿が見いだせる。今年度の研究で注目したもう一つの側面は、地域アィデンティティやナショナリズムが形成過程での英語の位置づけである。すでに昨年度にM・K・ガンディーの言語観をまとめた際にも言及したが、エリート層が「インド」や「グジャラート」というアイデンティティを強調する際には、植民地統治の中でエリート層に深く浸透した英語をどのように位置づけるのかが大きな問題点となった。この議論は、独立後のインドでも続けられており、現代の状況も視野に入れながら、今後さらに検討をすすめる予定である。今年度は、20世紀前半のインドにおける地域アイデンティティとナショナリズムという観点から、インド西部、グジャラートにおいて刊行された定期刊行物や、この地域で独立運動に関わった人々の回顧録・資料集などを中心に資料収集・分析を行った。その過程でまず注目したのは、19世紀後半に確立されたグジャラート人意識やグジャラートの誇りといった概念が、20世紀前半にこの地域がインド独立運動に関わる中で繰り返し強調されている点である。特にグジャラートの場合は、インド独立運動で活躍したM・K・ガンディーがこの地域の出身者であったため、独立運動の参加者が「インド」と「グジャラート」を重複してとらえる傾向が強かった。グジャラートに対する誇りの意識や帰属意識と、この地域がガンディーの独立運動において果たした役割との関連については、これまで十分に指摘されてこなかったが、今後さらに検討を進める必要がある。この点と合わせて分析したのが、ここで主張されたグジャラート人意識が、グジャラート地域内部の多様性を抑制する方向を促したことである。その顕著な例は言語問題に表れている。ガンディーや彼の支持者たちは、全インド・レベルの言語としてのヒンディー語の優位を強調した上で、各地域で一定のヘゲモニーを確立しているグジャラーティー語などの言語については、「州」レベルの共通語として地位を保証した。しかし、その州内部に存在する少数派の言語や「方言」については、これらを州の共通語に置き換える方針を採る。この結果、独立運動以降、グジャラーティー語が地方言語として地位を保持する一方、グジャラート南部のトライブ地域の諸言語は、グジャラーティー語に押される形でその地位を劇的に低下させた。特定の地域アイデンティティの確立が、その内部の多様なアイデンティティに及ぼす影響についても、来年度以降引き続き検討する予定である。
アミノアシル-tRNA合成酵素によるtRNAの分子認識

tRNAのアミノアシル-tRNA合成酵素による分子認識を研究するための対象として、プロリンtRNAを選び、まず初めに大腸菌では唯一RNAレベルで一次構造が明らかにされていない3種のプロリンtRNAのうち、メジャーなプロリンtRNA_1(アンチコドン、CGG)をビチオン化DNAプローブを用いて単離し、修飾を含めてその一次構造の決定を行った。またT7RNAポリメラーゼの系で、in vitroでの構造変異体を数多く作製し、アミノアシル化反応により各変異体の反応速度論的定数を測定した結果、大腸菌のプロリンtRNAのプロリル-tRNA合成酵素による認識部位として、アンチコドン2文字目と3文字目のG35G36、アンチコドンに隣接するG37、識別位塩基A73、TΨステム中のG49、アクセプターステムのC1-G72(特にG72)、それにジヒドロアーム中のU17Aを同定した。また、SELEXによるロイシンtRNAの構造と活性と特異性の相関については、Dループ及びエキストラループにランダムな塩基を導入したDNAを合成し、M-MLV逆転写酵素で二本鎖DNAとし、T7RNAポリメラーゼにより未修飾tRNAプールを作製し、アミノアシル化後、活性なRNAを選別し、逆転写酵素でcDNAを調製して、これをPCRで増幅過程を繰り返すことによって、アミノ酸特異的でより活性の高いtRNAを選別することができた。現在、これらの高い活性を持ったtRNA遺伝子の構造を決定しつつある。
気泡/滴/粒子の素過程流動構造

分散二相流の複雑な流動特性を明らかにするための基礎として、単一粒子の運動すなわち粒子(固体粒子、液滴、気泡を指す)の素過程特性について実験を主体にして総合的に調べた。垂直管の試験装置を用いて、一定流量の水上昇流中に種々の単一粒子を放ち、その運動や変形について、高速ビデオシステムを用いて解析した。水流速は、He-Neレーザードップラー流速計を用いて測定した。粒子の大きさ、密度差、形状、変形の効果を分離して議論できるように工夫して、次の5種類の粒子を用意した。(1)球形固体粒子(直径変化)(2)球形液滴(直径変化)(3)気泡(等価直径変化)(4)軽球形固体粒子(直径一定)(5)偏平回転楕円体固体粒子(体積一定、等価直径一定、アスペクト比変化)測定と解析の結果、次の知見を得た。(1)サイズ効果:サイズ(直径)が大きくなるにつれて、浮力の増加、相対速度の増加を来たし、正の横方向揚力が働いて、球形粒子は壁の方向に移動する。しかし、(非球形の)気泡の場合は、管中央部へ移動する。2mm程度以下の小粒子は、流路断面上で一様に上昇する。(2)密度差/浮力効果:密度差の増加に伴い、浮力の増加、相対速度の増加を来たし、粒子は正の横方向揚力を受けているにもかかわらず、管中央部に移動する。(3)形状/変形効果:アスペクト比を減少させる(球形から偏平回転楕円体へ形状を変える)と、負の相対速度の減少を来たし、(非球形の)偏平回転楕円体粒子は、負の横方向揚力を受けて管壁の方向へ移動するが、管壁までには達せず、中間領域を上昇する。非球形の気泡は、正の横方向揚力を受けて管中央部へ移動する。特に(2)および(3)の結果は、大変興味深い。なお、固体粒子の流動位置に対する粒子自身の回転による顕著な効果は認められなかった。
生理活性ペプチド及びアミンの選択的電気化学計測システムの開発と応用

(岡)GnRHニューロンの分泌活動を調べるために,微小炭素繊維電極(CFE)による電気化学的な測定法を開発した。アンペロメトリーによる記録を行った結果、自発的なスパイク状の電流が記録された。スパイク状電流の大きさがGnRH溶液のアンペロメトリーと同様の電極電位依存性を示したことから、この電流は終神経GnRH細胞の細胞体から自発的に開口分泌により放出されたGnRHの酸化電流であろうと結論した。CFE測定法の結果を実際のGnRH放出と関連づけるために脳スライスを用いてメディウム中へのGnRHの放出を飯郷の協力の下に現在測定している。(篠原)電極表面における分子集積膜の設計により、生体有用物質を分離プロセスなしてできるだけ簡便かつ迅速に計測できる電極システムを設計、作製することを目指し、以下の2つの成果をあげた。(1)ヒトの必須アミノ酸であり神経伝達物質やホルモンの前駆体として重要なトリプトファン(Trp)の疎水性に着目し、疎水性分子で表面修飾した電極におけるその選択的酸化計測を実現した。さらにGnRHなどTrp含有ペプチドホルモンの酸化計測能と修飾分子層の構造との関係を考察した。(2)メルカプトウンデカン酸(MUA)の自己集積化草分子膜を形成させた金電極において、アスコルビン酸などの親水性電極反応物質の酸化は大きく抑制される一方、疎水性メディエーターの酸化計測は全く影響を受けないことを明らかにした。さらに自己集積化膜上に酸化還元酵素を固定化したハイブリッド電極を作製し、妨害物質の影響を受けにくいメディエーター型アンペロメトリックバイオセンサーを作製できた。(飯郷)アユ松果体の灌流培養を行い,メラトニン分泌リズムを指標に生物時計の性質について検討した。明暗条件下で観察される暗期に高く明期に低い日周リズムは明暗条件を逆転させると新しい光周期に同調したリズムを示した。恒暗条件下で6時間の光パルスを様々な時刻に与えると,光パルスの開始時刻によりメラトニン分泌リズムは異なった位相変位を示した。すなわち,主観的暗期の前半の光パルスは位相の後退を,主観的暗期の後半の光パルスは位相の前進を引き起こしたが,主観的明期の光パルスは位相変位を起こさなかった。以上の結果から,アユ松果体に存在する生物時計の性質の一端が明らかになった。(岡)GnRHニューロンの分泌活動を調べるために微小炭素繊維電極(CFE)による電気化学的な測定法を開発した。まず既知濃度のGnRH溶液を用い、電極電位が約800mV以上の時にGnRHの酸化電流を記録できることを確認した。次に、魚類の全脳in vitro標本を用いて、終神経GnRH細胞の分泌活動のアンペロメトリーによる記録を行った結果自発的なスパイク状の電流が記録された。(篠原)

疎水性分子を電極表面に修飾することにより電極反応に選択性を持たせ、電気化学反応性の疎水性生体物質の簡便な選択計測を行い、生物リズム指標ホルモン・メラトニンと疎水性アミノ酸トリプトファンの選択的電気化学計測の可能性を検討した。1、5-ペンタンジオール修飾電極においてはオクタノール修飾電極に比べてメラトニンとトリプトファンの酸化ピークの電位差を拡大することができ、設定電位によってメラトニンの選択計測ができることが示唆された。一方、血清の様にトリプトファン濃度が著しく高い試料においてはトリプトファンを選択計測できることが示唆された。(飯郷)アユ松果体の灌流培養を行い、メラトニン分泌リズムをラジオイムノアッセイにより測定した。培養液としてMEMを用いたところ、アユ松果体からのメラトニン分泌は明瞭なサーカディアンリズムを示した。電気化学的検出の妨害物質となりうるアミノ酸類を除いたRinger液を用いてもこの日周性は維持された。また、メラトニンの前駆物質をRinger液に添加してもメラトニン分泌量は変化しなかった。以上の結果から、Ringer液を用いたアユ松果体培養系がメラトニン分泌リズムのリアルタイム測定に適したシステムとなりうることが明らかになった。(岡)GnRHニューロンの分泌活動を調べるために,微小炭素繊維電極(CFE)による電気化学的な測定法を開発した。アンペロメトリーによる記録を行った結果、自発的なスパイク状の電流が記録された。スパイク状電流の大きさがGnRH溶液のアンペロメトリーと同様の電極電位依存性を示したことから、この電流は終神経GnRH細胞の細胞体から自発的に開口分泌により放出されたGnRHの酸化電流であろうと結論した。DFE測定法の結果を実際のGnRH放出と関連づけるために脳スライスを用いてメディウム中へのGnRHの放出を飯郷の協力の下に現在測定している。(篠原)電極表面における分子集積膜の設計により、生体有用物質を分離プロセスなしでできるだけ簡便かつ迅速に計測できる電極システムを設計、作製することを目指し、以下の2つの成果をあげた。(1)ヒトの必須アミノ酸であり神経伝達物質やホルモンの前駆体として重要なトリプトファン(Trp)の疎水性に着目し、疎水性分子で表面修飾した電極におけるその選択的酸化計測を実現した。さらにGnRHなどTrp含有ペプチドホルモンの酸化計測機能と修飾分子層の構造との関係を考察した。(2)メルカプトウンデカン酸(MUA)の自己集積化単分子膜を形成させた金電極において、アスコルビン酸などの親水性電極反応物質の酸化は大きく抑制される一方、疎水性メディエーターの酸化計測は全く影響を受けないことを明らかにした。さらに自己集積化膜状に酸化還元酵素を固定化したハイブリッド電極を作製し、妨害物質の影響を受けにくいメディエーター型アンペロメトリックバイオセンサーを作製できた。(飯郷)アユ松果体の灌流培養を行い,メラトニン分泌リズムを指標に生物時計の性質について検討した。明暗条件下で観察される暗期に高く明期に低い日周リズムは明暗条件を逆転させると新しい光周期に同調したリズムを示した。恒暗条件下で6時間の光パルスを様々な時刻に与えると,光パルスの開始時刻によりメラトニン分泌リズムは異なった位相変位を示した。
質量分析イメージング解析による口腔粘膜前癌病変の糖鎖構造プロファイル

2018年度は、MALDI-IMSを用いた病理組織切片上での糖鎖発現および局在の解析について、朝日大学医科歯科医療センターにて生検および切除され上皮異形成、上皮内癌および扁平上皮癌と診断した症例(以下病変)について試料を作製し、MALDI-IMSにより解析を行った。MALDI-IMS解析機器については、「原子・分子の顕微イメージングプラットフォーム」に参画している浜松医科大学のMALDI-TOF/TOF型質量分析イメージング装置を利用した。利用するにあたり、浜松医科大学の倫理委員会およびプラットフォーム利用の承認を得て解析を行った。イメージング装置には、Solarix XRを用い、正常部と前癌病変部および浸潤癌部について解析を行なった。当初は凍結標本を含めて解析する予定であったが、解析装置の利用スケジュールに合わせて凍結標本を準備できる症例に乏しかったため、本年度は通常の病理診断で用いているパラフィン包埋標本に限定して解析を行なった。また、病変の範囲については、典型的な部位に絞って計測し、質量についても、以前の研究によりN型糖鎖構造が改変することが示唆されているため、範囲を限定して計測した。その結果、正常部と病変部で10種類の質量において差が確認された。またMALDIイメージング解析に先立ち、通常の口腔粘膜前癌病変の病理診断において、現在一般的に用いられているKi-67、p53、CK13およびCK17の免疫染色を行い、MALDIイメージング解析の結果との関連について検討する準備を行なった。当初、パラフィン標本での解析は困難であることが予測されていたが、パラフィン標本でのMALDIイメージングによる解析が可能であることが確認できたため、今後も同様の方法で進める予定である。また、凍結標本においても、解析可能な症例については計測を行うことにより、糖脂質に関しても解析し、また糖タンパク質に関してはより精度の高い解析結果を導くことができる。次年度以降はさらに解析症例を増やし、データの蓄積を行うとともに、凍結標本を用いることにより、糖タンパク質のみならず、糖脂質についても解析を行い、より精度の高い計測および解析が可能となる。MALDIイメージングによる計測結果はグライコインフォマティクス解析により、正常と病変部で改変される糖鎖構造を見出すとともに、病理組織標本において免疫染色により再現性の検証を行う。本研究について倫理審査承認済みであったが、研究メンバーの退職により朝日大学および浜松医科大学での倫理審査を再度受ける必要が生じた。また浜松医科大学の施設工事により、本年度における利用可能期間が短縮された。以上の事由により、利用料が変更となり次年度使用額が生じた。
脳微小血管障害における動脈波反射の役割

一般成人において、動脈波反射に関連する圧脈波指標は無症候性ラクナ梗塞や白質病変を含む脳微小血管障害と有意に関連する。脳の微小血管障害と腎の微小血管障害(アルブミン尿)は相互連関し、その結びつきには大動脈硬化が介在する。高血圧患者において、全身の大・小動脈の構造的・機能的変化に起因する動脈波反射の増加は、脳への血圧と血流の拍動を増加させ、これらが脳微小血管障害を進展させると推測される。本年度(Hl9年度)は以下のことを明らかにした。1.高血圧患者において動脈波反射の増加に伴って起こる中心大動脈血圧の上昇が、左室で過剰に浪費される仕事量(wasted effort)を増加させ、左室肥大を引き起こす。2.動脈波反射の指標であるaugmentationindexやpulse amplicationは、従来の随時カフ血圧指標や家庭血圧指標と比べて、高血圧患者における降圧治療に伴う左室心筋重量の退縮をより良く予測する。3.血管拡張性降圧薬による治療は、中心大動脈よりもむしろ末梢の筋性小動脈や細動脈に作用して波反射の大きさ(amplitude)を減少させ、ventricular-vascular ineractionの改善を介して左室肥大の退縮を促す。4.地域一般住民において、動脈波反射に影響を及ぼす脈波伝播速度は、脳の微小血管障害(ラクナ梗塞や白質病変)と関連し、この関連は上腕血圧を含む従来の血管リスクの影響とは独立に認められる。5.地域一般住民において、動脈波反射に影響を及ぼす脈波伝播速度は、腎のアルブミン尿と関連し、この関連は上腕血圧を含む従来の血管リスクの影響とは独立に認められる。6.一般集団において認められる無症候性脳ラクナ梗塞は腎のアルブミン尿と相互に関連し、微小血管障害としての両者の結びつきに大血管の壁硬化が介在している。本年度(H20年度)は以下のことを明らかにした。地域の一般住民を対象とした疫学的研究から、脳MRI検査で検出される無症候性ラクナ梗塞や白質病変が、動脈波反射に影響を与える脈波伝搬速度(PWV)と密接に関連し、この関連は年齢や上腕血圧など様々な脳血管障害リスクと独立に認められることが明らかとなった。また、これらの脳微小血管障害が、腎の微小血管障害の表れであるアルブミン尿と相互に関連することを実証した。このような脳腎連関における大血管硬化の影響を検討した結果、動脈スティフネスの増加が、脳と腎の微小血管障害の結びつきにおいて仲介的な役割を有していることがわかり、末梢からの動脈波反射の増大がこれら生命維持に必須な臓器の潜在的な障害を進展させ、最終的に血管イベントを誘発させる可能性が推測された。また、病態生理学的研究から、頸部超音波検査を用いて頸動脈血流波形を記録し、血圧波の反射の影響を血流波上で評価することが可能であることが明らかとなった。このことは、血圧の波反射が、血流の拍動に伴う脳血管のshear stressを増加させ、血圧の拍動性ストレスの増加とともに血管障害を引き起こす要因となることを示唆した。さらに、血圧波形を投射波と反射波に分離する方法を確立し、末梢の微小血管から発生する波反射の増大が高血圧患者,における臓器障害の発症や進展と関連する可能性について明らかにし、また血管拡張性降圧薬による治療は波反射の減少を介して臓器障害の退縮をもたらすことを示した。
ロイコトリエンの活性化を規定する因子(合成・分解酵素,受容体)の分子生物学的解析

アレルギー性炎症の発現にロイコトリエン(LT)はきわめて重要な役割をはたしそいる.これらのLTの作用発現において,合成酵素,受容体(cysLTR1,cysLTR2,BLT)およびLT分解酵素の役割の解明は重要な課題である.合成酵素,分解酵素,受容体は気道上皮を含む多くの細胞に発現していることが明らかになりつつあるが,これはLTの重要で多彩な生理活性を示唆するものである.その結果,CysLTsはアレルギー性炎症の発現にきわめて重要な役割をはたしていることが示され,Th2サイトカイン(IL-4,IL-13)優位のアレルギー疾患患児でcysLTsの活性化の機序に受容体のmRNAレベルでのサイトカインを介した制御機構が関係していることが明らかとなった.また,Th2サイトカイン(IL-4,IL-13)刺激により気道上皮から産生される好酸球遊走因子Eotaxin3の産生が強く誘導されることも発見し報告した.分子機構の解明の経過中にウイルス感染で産生されるINF-γが,Th2サイトカインによって転写レベルで誘導されるeotaxin3の発現を制御する機構があることを見出し,喘息の発症および増悪との関与が強く示唆される知見を得た.今後更に解明すべき課題と考えられる.アレルギー性炎症の発現にロイコトリエン(LT)はきわめて重要な役割をはたしそいる.これらのLTの作用発現において,合成酵素,受容体(cysLTR1,cysLTR2,BLT)およびLT分解酵素の役割の解明は重要な課題である.合成酵素,分解酵素,受容体は気道上皮を含む多くの細胞に発現していることが明らかになりつつあるが,これはLTの重要で多彩な生理活性を示唆するものである.その結果,CysLTsはアレルギー性炎症の発現にきわめて重要な役割をはたしていることが示され,Th2サイトカイン(IL-4,IL-13)優位のアレルギー疾患患児でcysLTsの活性化の機序に受容体のmRNAレベルでのサイトカインを介した制御機構が関係していることが明らかとなった.また,Th2サイトカイン(IL-4,IL-13)刺激により気道上皮から産生される好酸球遊走因子Eotaxin3の産生が強く誘導されることも発見し報告した.分子機構の解明の経過中にウイルス感染で産生されるINF-γが,Th2サイトカインによって転写レベルで誘導されるeotaxin3の発現を制御する機構があることを見出し,喘息の発症および増悪との関与が強く示唆される知見を得た.今後更に解明すべき課題と考えられる.cysLT, LTB4の作用発現において,受容体(cysLTR1,cysLTR2,BLT)およびLT分解酵素の役割が注目をあびている.これらの受容体は気道上皮を含む多くの細胞に発現していることが明らかになりつつあるが,これはcysLT, LTB4の多彩な生理活性を示唆するものである.我々も,ヒト培養気道上皮細胞上にcysLTs, LTB4のレセプターであるcysLT1R, cysLT2RおよびBLTが発現していることを確認した.また,気道上皮はcysLTsの分解酵素活性(gamma-glutamyl leukotrienase ; GGLT)を有し,cysLTsの不活化にも関与している.このGGLTはステロイドにより誘導され,mRNAレベルでのup-regulationの機構が存在することも明らかになった.cysLT受容体,BLTを介して気道上皮のケモカイン産生が制御され,それにより気道過敏性が影響を受けている可能性について検討した.細胞に種々のサイトカインを作用させて,cysLT1,LT2受容体,LTB4受容体のmRNA発現を検討したところ,Th2サイトカインであるIL-13でcysLT1およびLT2受容体の発現の上昇を認めた.そこで,IL-13の存在下に,LTC4,LTD4,LTE4の混合物(CysLTs)を細胞に24時間作用させたうえで,気道上皮産生ケモカインのmRNA発現を検討した.CysLTsの添加によりケモカインの発現には影響を認めなかった.一方,ケモカインレセプターCCR-3はIL-13の存在下においてはcysLTsにより濃度依存性に発現がup-regulationされた.この生理的な意義付けは現時点では不明である.何らかのautocrineの制御機序の存在が推測される.今後検討を加えていく必要がある.同じ系にTh2サイトカインおよびcysLTs,もしくはLTB4を加えて培養し,ケモカイン(eotaxin 1,eotain2,eotaxin 3,RANTES),エモカインレセプター(CCR-3)の発現およびを検討したところ,eotaxin 1,eotaxin 2,eotaxin 3,RANTESの発現は影響を受けなかったが,CCR-3のmRNAは用量および時間依存性に誘導されることが判明した.これらの結果よりTh2サイトカインを含む活性物質により,気道上皮のCysLTR1の発現が上昇し,cysLTsが作用することによりCCR-3の発現が更に制御されている可能性が示された.その臨床的な意義については更に検討を加える必要があり,来年度の研究課題とする.

本研究で我々は培養したヒトの気道上皮細胞を用いてロイコトリエン(leukotriene ; LT)の生理作用発現およびその活性化を規定する因子を,合成酵素,受容体,分解酵素の遺伝子レベルで検討し,その制御機構の存在を明らかにした.前年度までの研究で,CysLT1RおよびBLTはTNFαおよびTh2サイトカインであるIL-13の刺激により時間および用量依存性にそのmRNAおよび蛋白の発現が誘導されることが明らかとなった.CysLTsはアレルギー性炎症の発現にきわめて重要な役割をはたしていることが示されており,Th2サイトカイン(IL-4,IL-13)優位のアレルギー疾患患児でcysLTsの活性化の機序に受容体のmRNAレベルでのサイトカインを介した制御機構が関係していることが明らかとなった.また,昨年度,我々はTh2サイトカイン(IL-4,IL-13)刺激により気道上皮から産生される好酸球遊走因子Eotaxin3の産生が強く誘導されることを発見し報告したが,その,分子機構の解明の経過中にウイルス感染で産生されるINF-γがTh2サイトカインによって転写レベルで誘導されるeotaxin3の発現を制御する機構があることを見出し,喘息の発症および増悪との関与が強く示唆される知見を得た.これは次年度に是非検討を続けていかねばならない課題と考える.
骨系統疾患の原因遺伝子の同定、及び遺伝子診断システムの構築

骨系統疾患の原因遺伝子の同定とその変異の解析、及びそれに基づく分子病態の解析、遺伝子レベルでの診断法の開発、遺伝子診断システムの構築を目的として研究を行ない、以下の成果を得た。1.多発性骨端異形成症の6つの既知遺伝子の包括的解析をおこない、遺伝子変異のスペクトラム、遺伝子型-表現型連関を明らかにした。3.臨床的、レントゲン学的検討により、脊椎肋骨異形成症の表現型のスペクトラムを解明し、再分類した。4.Marfan症候群、及びその関連疾患で、既知の2つの原因遺伝子、fibri111in1、TGF-b type II受容体遺伝子を調べ、新規の遺伝子変異を同定した。5.毛髪軟骨低形成症の新規のRMRP遺伝子変異を同定し、日本人患者には2つの頻度の高いハプロタイプがあることを発見した。7.致死性の骨系統疾患であるSchneckenbecken dysplasia(SBD)の原因遺伝子SLC35D1を世界に先駆けて発見した。2症例でSLC35D1の機能を完全に欠損させる変異遺伝子を同定した。これにより、SBD及びその関連疾患の遺伝子診断が可能となった。同時に、骨格の形成には糖鎖の代謝が重要な役割を果たしており、糖ヌクレオチド輸送体を中心とした糖鎖科学からの原因究明のアプローチが、骨・関節疾患の病態解明に不可欠であることが明らかとなった。骨系統疾患の原因遺伝子の同定とその変異の解析、及びそれに基づく骨系統疾患の分子病態の解析、遺伝子レベルでの診断法の開発、遺伝子診断システムの構築を目的として研究を行ない、本年度は以下のような成果を得た。1.多発性骨端異形成症(multiple epiphyseal dysplasia)の6つの既知遺伝子の包括的解析をおこない、遺伝子変異のスペクトラム、遺伝子型-表現型連関を明らかにした。4.Marfan症候群、及びその関連疾患で、既知の2つの原因遺伝子、fibrillin1、TGF-b type II受容体遺伝子を調べ、新規の遺伝子変異を同定した。1)致死性の骨系統疾患である蝸牛様骨盤異形成症(Schneckenbecken dysplasia;SBD)の原因遺伝子SLC35D1(solute carrier 35D1)を世界に先駆けて発見した(Hiraoka, et. al.Nature Med2007)。
視細胞杆体外節円板膜上の光刺激受容伝達マイクロマシーナリーの解析

脊椎動物の視細胞杆体外節(ROS)は多数の膜性円板が規則正しく堆積して構成され、それらの円板膜が外節先端での廃棄と基部での生成を生涯繰り返している。この特殊で動的な構造を持つ外節円板膜上にはロドプシンをはじめとする光刺激受容伝達関連タンパク質群が無数に存在し、光を受容すると効率的な光刺激伝達カスケードが働く。このカスケード反応はきわめて短時間で進むので、それらのタンパク質群を互いに至近距離に集積する足場となる構造関連タンパク賛が存在し、光刺激受容伝達マイクロマシーナリーを形成していることが予想される。このような課題のもとに本研究に着手した。免疫細胞化学、免疫沈降、ウエスタンブロット及びマススペクトロメトリーを用いて、tubulinα・β・γとtauが円板膜上に共局在すること、'tubulinαとグアニル酸シクラーゼが結合していること、tubulinβ・γとannexinが結合していることを明らかにし、tubulinが光刺激受容伝達マイクロマシーナリーの足場を形成していることを初めて明らかにした。次に、新鮮なウシの網膜がBSEによって入手不可能になったことから、材料を脊椎動物の中でも視細胞外節が大きなウシガエルに替え、外節タンパク質の網羅的同定作業を開始した。二次元電気泳動で検出されたタンパク質スポット136個の内、マススペクトロメトリーによって35個のタンパク質スポットを同定できた。それらは、視細胞外節由来のrhodopsin、phosphodiesteraseα・β、transducinα・β・arrestin、s-modulinを含む14個と、内節由来のHSC70、enolase、GTP-rho binding protein、neuronal intermediate filgment、ATP synthase等を含む18個、及び両者に共通なtubulinα・β、actinであった。脊椎動物の視細胞杆体外節(ROS)は多数の膜性円板の規則正しい堆積から構成され、それらの円板膜が外節先端での廃棄と基部での生成を生涯繰り返している。このカスケード反応はきわめて短時間で起こるので、それらのタンパク質群を互いに至近距離に集積する足場となる構造関連タンパク質が存在し、光刺激受容伝達マイクロマシーナリーを形成しているはずである。具体的には以下の3つの方法によりタンパク質群の同定と局在を明らかにした。(1)免疫細胞化学によりラット・ウシ・カエルの各視細胞外節円板膜上に存在するtubulinα、β、γ、とtauの局在を解析した。それぞれのタンパク質は円板膜上に共局在し、光刺激受容伝達マイクロマシーナリーの足場となっている可能性を示した。(2)ウシ及びカエルの視細胞杆体外節(ROS)画分を界面活性剤で可溶化し、各構造関連タンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降を行った。得られたタンパク質沈降物を光刺激受容伝達に関わるタンパク質をに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行い解析した。その結果、tubulinαとグアニル酸シクラーゼ(GC)が結合していることが明らかにならた。すなわちtubulinαは円板膜上で光刺激受容伝達に関わるタンパク質であるGCと結合しマイクロマシーナリーの足場を形成していることが示された。(3)ウエスタンブロットで明らかにできなかった免疫沈降物をマススペクトロメトリーを用いて同定した。その結果、tubulin βとγの両方で共沈する40kDのタンパク質がannexinであることが明らかになった。

AnnexinはF-actinと結合することが知られているが、ROSにおける役割は現在解析中である。以上の結果から、tubulinが光刺激受容伝達マイクロマシーナリーの足場を形成していることが初めて明らかになった。これは極めて新しい発見である。平成14年度に引き続き、光刺激受容伝達マイクロマシーナリーの解析に着手した。免疫細胞化学・免疫沈降・ウエスタンブロット及びマススペクトロメトリーにを用いた解析に必要な材料である新鮮なウシの網膜が、BSE検査の実施によって入手不可能になったことから、材料を脊椎動物の中でも視細胞外節が大きなウシガエル(bullfrog)に替えた。カエルの光刺激受容伝達関連タンパク質に対する抗体の入手及び作成する目的で、マススペクトロメトリーを用いて視細胞外節(ROS)タンパク質の網羅的同定作業を開始した。BullfrogのROS画分を単離・精製し、等電点電気泳動とSDS-PAGEによる二次元電気泳動によって展開し、クマシーブルー(CBB)染色を行った。1.5枚の網膜から単離・精製したROS画分に由来するタンパク質スポットが136個検出できた。これらのタンパク質スポットを切り出し、in-gel digestionを行って、生じたペプチド混合物の質量をHPLC直結型マススペクトロメトリー装置を用いて測定した。得られたペプチドマスデータをWEBベースの検索プログラムMascotを用いて解析したところ、二次元電気泳動で検出されたタンパク質スポット136個の内、35個のタンパク質スポットを同定できた。それらは、視細胞外節由来のrhodopsin、phosphodiesteraseα・β、transducinα・β、arrestin、s-modulinを含む14個と、内節由来のHSC70、enolase、GTP-rho binding protein、neuronal intermediate filament、ATP synthase等を含む18個、及び両者に共通なtubulinα・β、actinであった。Bullfrogタンパク質のデータベースは哺乳類当に比べて充実度が低いにも関わらず、多くのタンパク質を同定できた。その多くはアフリカツメガエル(xenopus laevis)やゼブラフィッシュ(zebrafish)との相同性を有していた。