hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内因性アジュバントを用いた新規口腔癌治療ワクチンの開発

膜型ムチンMUC1は、腫瘍細胞表面に存在し、癌の標的として注目されている。また、C3dは、補体第3成分の分解産物で、アジュバント様に作用する。本研究では、MUC1にC3dを繋げたMUC1-C3dワクチンを開発し、その効果を解析した。マウスモデルにおいては、MUC1-C3d投与により、MUC1に対する抗体及び、IFN-γ産生細胞を誘導できた。ヒトにおいても、末梢血リンパ球に添加することで腫瘍に対するCD8陽性細胞を誘導できた。これらより、MUC1-C3dは、効率の良いアジュバントとして働き、癌に寛容になっている癌患者において抗体応答のみならず細胞性免疫を誘導できる可能性を示した。口腔癌患者において、腫瘍組織に口腔癌特異的な腫瘍抗原が発現しているにもかかわらず、腫瘍に対する抗体価は低く、口腔癌特異的細胞障害性T細胞(CTL)の頻度は低い。そこで、内因性アジュバントC3dを用いた口腔癌特異的MUC1抗原の新規ワクチンを作成し、その効果を検証することを目的とした。MUC1は、粘液の主成分の高分子糖蛋白質ムチンで、以下の理由により新たな癌の標的分子となりえると考えられる。(1)主に腫瘍細胞の細胞表面に存在し、正常組織では発現量が少ないこと。(2)正常組織と腫瘍細胞表面では糖鎖付加様式が異なること。(3)MHC class I非拘束性CTL応答を誘導できること。一方、C3dは、補体成分3Cの断片で、アジュバント様に作用する。MUC1単独では免疫原性が低いが、C3dを融合させる事により、効率よく補体レセプターを持つ細胞に認識され、MUC1に対する抗体産生を誘導するのみならず、MUC1に対するCTL誘導も可能な新規ワクチンになると予想される。そこで本研究では、まず、マウス型及びヒト型MUC1-C3dワクチンの発現ベクターを構築した。MUC1-C3d発現ベクターをCOS細胞に遺伝子導入し、目的のタンパク質分子が発現するかどうか、ウエスタンブロッティングにより確認したが、phCMV1ベクターを発現ベクターとして用いた場合、目的のタンパク質の発現が確認されなかった。そこで、pTR600ベクターに組み換えて、再度、COS7細胞に遺伝子導入を行ったところ、目的のタンパク質が検出された。MUC1-C3dの精製が完了すれば、その効果をin vivo及びin vitroで解析する予定である。平成25年度は、腫瘍抗原MUC1と補体成分のC3の断片であるC3dの融合タンパクを精製し、MUC1に対するCTLの誘導を試みた。MUC1-C3dを添加して培養した末梢血リンパ球(PBMC)は、フローサイトメトリー法により解析したところ、約39.6%のCD8+細胞が認められたのに対し、MUC1のみを添加した培地では、26.2%と、何も添加しない培地で培養した場合(27.4%)と同等であった。また、全体の細胞数は、MUC1-C3dを添加して培養したPBMCでは、MUC1のみ添加して培養したPBMCに対して、1.78倍と増加していた。次に、MUC1-C3dを添加して培養したPBMCよりCD8+細胞を分取した。検体とHLAが適合した口腔癌細胞がなかったため、ヒト乳癌細胞株であるMCF7と共培養し、IFN-γの産生をELISPOT法により解析した。MUC1-C3dで刺激したPBMC由来のCD8+細胞は、MUC1で刺激したPBMC由来のCD8+細胞より、1.7倍のIFN-γの産生細胞が認められた。これらIFN-γの産生細胞が、MUC1に対して特異的な細胞かどうかを確認するために、MUC1を発現したLCL (Epstein-Barr virus transformed B lymphoblastoid cell line)を作成した。作成したMUC1発現LCL(LCL-MUC1)を標的細胞に、分取したCD8+細胞をエフェクター細胞にして、IFN-γの産生をELISPOT法により解析したところ、MUC1の発現していないLCLに対して、LCL-MUC1を標的細胞にした場合は、1.7倍のIFN-γの産生細胞が認められた。これらの事から、C3dと癌抗原MUC1と融合させることにより、効率の良いアジュバントとして働き、癌に寛容になっている癌患者において抗体応答のみならず細胞性免疫を誘導できる可能性を示した。口腔癌患者において、腫瘍組織に口腔癌特異的な腫瘍抗原が発現しているにもかかわらず、腫瘍に対する抗体価及び細胞障害性T細胞(CTL)の頻度は低い。

着目した腫瘍抗原MUC1は、粘液の主成分の高分子糖蛋白質ムチンで、主に腫瘍細胞の細胞表面に存在し、正常組織では発現量が少ない。一方、C3dは、補体成分C3の断片で、アジュバント様に作用する。MUC1単独では免疫原性が低いが、C3dを融合させる事により、効率よく補体レセプターを持つ免疫細胞に認識され、MUC1に対する抗体産生を誘導し、さらに、MUC1に対するCTL誘導も可能な新規ワクチンになると予想される。24年度は、MUC1-C3dワクチンの発現ベクターを、pTR600ベクターを用いて構築した。COS7細胞に遺伝子導入を行ったところ目的のタンパク質が確認されたので、大量培養を行った。また、安定的にタンパク質を発現するCHO細胞を用いて、遺伝子導入後、クローニングを行い、数種類のMUC1-C3d産生細胞株を樹立した。培養上清中のMUC1-C3dを、イオン交換カラムを用いて精製した。精製したMUC1-C3dを用いて、ヒトPBMCと2週間培養することにより、MUC1に対するCTLの誘導を試みた。CTLがうまく誘導されたことを確認するため、現在、MUC1が発現している標的細胞として、MUC1が発現しているEB-virus transformed B lymphoblastoid cell line (LCL)と、MUC1が発現していないLCLを作成中である。今後、誘導したCTLの特異性を検討するため、作成したLCL及び、口腔癌細胞株にCTLと同じハプロタイプのHLAを遺伝子導入した標的細胞を作成して用いる予定である。H22の途中より産休育休のため中断していたが、復帰後、MUC1-C3d発現ベクターも順調に作成し、精製段階に入っているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。MUC1特異的細胞障害性T細胞(CTL)の特異性を検討するための標的細胞の作成に、少々時間がかかっているが、MUC1-C3d及び、MUC1の発現ベクターの検索、遺伝子導入する細胞の検討、タンパク質の精製方法の検討も順調に進み、MUC1-C3d及び、MUC1タンパク質が、解析に用いるのに十分量精製できたため。MUC1-C3dを大量に精製するため、発現ベクターの検索や、遺伝子導入する細胞を検討する必要がある。MUC1-C3dの精製が完了すれば、その効果をin vivo及びin vitroで解析する予定である。
ライフサイエンスの推進力としてのウイルス研究の方法に関する基礎的研究

本年度実施の班会議の詳細は別冊子にまとめてある。将来のライフサイエンス研究の方向に関しては、脳機能、免疫、発生・分化・増殖調節等々若い研究者を魅了する数々の研究のフロンティアが論議された。そしてそれらの基礎研究が人間の病気の本態解明と不可分の関係にある事も認識された。一方新しい研究を行うための研究体制に関しては杉村班員による「日本の科学(研究体制)の現状は窒息的である」という発言に象徴される様に現状の不備が次々に指摘された。そして現在アメリカの体制内で研究しているか、あるいは過去にその体験を持つ研究者(利根川等)、更には日本に於いて新しい組織を作った体験を持つ班員(江橋、杉村、井川、高浪、関口等)より日米の比較、日本の制度で早急の改善の望まれる具体例が数多く指摘された。特に注目すべき点はアメリカから独創的研究が多く出る理由の一つとして、アメリカでは若い研究者が独立して自由に研究できる体制ができており、それら若い研究者の活力がアメリカ全体の科学の力の源となっているという指摘である。現在いくつかの日本の大学等でライフサイエンス系研究グループの再編、ライフサイエンスセンターあるいは独立研究科の創設等の構想が検討されている。本研究で明らかになった日本の科学研究体制の欠点とその改善策は、これらの新しい組織づくりを模索している大学等にきわめて有意義な、しかもタイムリ-な示唆を与えるものと考えられる。殆どすべての本研究班の班員が、日本のどこかでブレークスルーを作り、それが全国に広がるのが望ましいという期待を表明した。ライフサイエンスの推進力としてのウイルス研究の新しい研究方向を探るため、平成5年3月3日、京都市左京区、芝蘭会館において研究会を開催した。議論の集中した主要な点を下に記す。(1)研究処点としてのライフサイエンスセンターの設置。京都大学ウイルス研究所に分館を設置し、ライフサイエンスセンターとし、研究の飛躍的な高度化と研究領域の拡大を計る構想がある。一方マサチュセッツ工科大学教授、ウイルス研究所客員教授の利根川進博士も日本に同様の研究センターを設立したい意欲を持っており、この2つを融合して、ウイルス研究所分館/ライフサイエンスセンター構想が形成されている。この構想につき討論を行ったが、21世紀に向けての研究推進方策として望ましい動きであるというのが大勢の意見であった。(2)国立の研究機関と民間資金について。上記センター構想の骨子の1つは、国立の研究機関として基幹部分を構成し、民間資金による財団を設財してその支援のもとに研究体制を強化するというものである。これは従来あまり例のない構想であるので質疑が集中した。この点に関しては詳細につき更なる具体策の検討をすることとなった。(3)京都大学、あるいは他大学、研究機関における同様の構想との整合性について。上記構想は京都大学一部局の問題ではなく、全学的あるいは全国的な視野で考えるべきものである。従って京都大学内あるいは他研究機関における同様の構想との整合性を検討した。京都大学では多学部にまたがった大型の医学・生物学教育研究体制の再編計画があるが、現時点どはその計画は長期的展望として扱われており、近末来に目立った動きは予定されていない。従って上記構想がこの大型再編計画の一部として、先行するものとしてとらえられるべきものであると考えられた。今後これらの議論をふまえ更に検討を加えることとなった。本研究で明らかになった日本の科学研究体制の欠点とその改善策は、これらの新しい組織づくりを模索している大学等にきわめて有意義な、しかもタイムリーな示唆を与えるものと考えられる。

そして現在アメリカの体制内で研究しているか、あるいは過去にその体験を持つ研究者(利根川等)、更には日本に於いて新しい組織を作った体験を持つ班員(江橋、杉村、井川、高浪、関口等)より日米の比較、日本の制度で早急の改善の望まれる具体例が数多く指摘された。特に注目すべき点はアメリカから独創的研究が多く出る理由の一つとして、アメリカでは若い研究者が独立して自由に研究できる体制ができており、それら若い研究者の活力がアメリカ全体の科学の力の源となっているという指摘である。現在いくつかの日本の大学等でライフサイエンス系研究グループの再編、ライフサイエンスセンターあるいは独立研究科の創設等の構想が検討されている。本研究で明らかになった日本の科学研究体制の欠点とその改善策は、これらの新しい組織づくりを模索している大学等にきわめて有意義な、しかもタイムリ-な示唆を与えるものと考えられる。殆どすべての本研究班の班員が、日本のどこかでブレークスルーを作り、それが全国に広がるのが望ましいという期待を表明した。
対流に伴う非線形偏微分方程式の研究

時間依存領域におけるBoussinesq近似熱対流方程式の研究において以下の結果を得た.1.流速Uに対する非斉次境界条件の下で,弱解が時間大域的に存在すること. (昭和62年度春季数学会で発表)2.領域と境界データが時間周期的に変化する時,弱周期解が存在すること. (昭和62年度秋季数学会で発表)3.境界が適当になめらかならば,一意的な時間局所強解が存在すること.(学士院紀要に発表予定)上記1および2の弱解の証明方法はFujita-Sauer(1970東大紀要)のpenalty法を用いた. 3の局所強解の存在の証明には, Otani-Yamada(1978,東大紀要), Yamada(1976,東大紀要)による劣微分作用素を用いた.今後の研究の方向としては,強解の時間大域的存在とその正則性, 2次元における弱解の一意性,自由境界問題, Rabinowitzとは異なる領域での分岐問題,漸近挙動などを順次調べて行く計画であり,部分的には既に着手している.なお,流体の数学的研究の動向を幅広く知るために,昭和63年1月には,東京大学教養学部の岡本久氏に「進行波の理論について」という標題で講演をして頂いた.更に各自が研究集会,シンポジウム等に参加し,常時討論の場を持った.時間依存領域におけるBoussinesq近似熱対流方程式の研究において以下の結果を得た.1.流速Uに対する非斉次境界条件の下で,弱解が時間大域的に存在すること. (昭和62年度春季数学会で発表)2.領域と境界データが時間周期的に変化する時,弱周期解が存在すること. (昭和62年度秋季数学会で発表)3.境界が適当になめらかならば,一意的な時間局所強解が存在すること.(学士院紀要に発表予定)上記1および2の弱解の証明方法はFujita-Sauer(1970東大紀要)のpenalty法を用いた. 3の局所強解の存在の証明には, Otani-Yamada(1978,東大紀要), Yamada(1976,東大紀要)による劣微分作用素を用いた.今後の研究の方向としては,強解の時間大域的存在とその正則性, 2次元における弱解の一意性,自由境界問題, Rabinowitzとは異なる領域での分岐問題,漸近挙動などを順次調べて行く計画であり,部分的には既に着手している.なお,流体の数学的研究の動向を幅広く知るために,昭和63年1月には,東京大学教養学部の岡本久氏に「進行波の理論について」という標題で講演をして頂いた.更に各自が研究集会,シンポジウム等に参加し,常時討論の場を持った.
マウスの空間認識に及ぼす揮発性麻酔薬の影響

本研究ではラットの老化の研究で従来行われてきた放射状迷路学習をマウスに準用し、マウスの老化による空間認識の低下が迷路学習により定量的に測定できることを確認し、さらにこれに対する低濃度揮発性麻酔薬の吸入がどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的とした。以上のようにこの研究では、まずラット用の実験系をマウスに応用できることの確認を行う。つぎにこれに対して低濃度揮発性麻酔薬の吸入を行い、その影響を調べる二段階の計画となっている。現在のところddN系マウスを用いて放射状迷路学習が実際に可能かどうかを確認し、さらにこれが週令の変化によって変化するのかを確認している段階である。今までのところ、個体により迷路学習の目標達成時間にばらつきがあり、群内で安定したデータが集積されるに至っていない。そのため実験条件(食餌量、環境等)を変更して安定したデータが得られるようにしているところである。このように今だ実験は前半の予備段階に留まっているために、発表可能な成果をあげうる状態にいたっていない。今後も実験条件を確定し、次の段階に進めていく予定である。
ゴ・ジン・ジェム政権崩壊に見るアメリカ=南ベトナム関係としてのベトナム戦争

(1)南ベトナム仏教徒危機(1963年511月)について、ゴ・ジン・ジェム政権に対する国民の不満の蓄積、仏教徒の政治運動に対するジェム政権の強圧的な対応、事態解決に向けたケネディ政権の圧力戦術の失敗などを実証的に分析した。その際、アメリカ側の対応に見られる問題点として、南ベトナム政府とまったく異なった事実認識や目標設定の上に立っていたこと、事態収拾や政治の民主化を求める圧力がジェム政権を一層硬化させたこと、ジェム政権の置かれた立場を理解しようとする努力もあったがそれがかえってアメリカの圧力に制約を加えたこと、改革要求挫折の原因について最後までジェム政権に責めを帰すのみで十分な反省を行わなかったことなどを指摘した。(2)ケネディ政権が民族解放戦争の脅威に対抗すべく南ベトナムで展開した反乱鎮圧戦略について、とくにその担い手たる南ベトナムの政府と軍が抱える問題点、アメリカと彼らの間で表面化した軋礫、アメリカが彼らに押しつけた戦術や武器・装備面などの機能不全とその原因などを分析し、1964年以降の大規模介入以前に、いわばアメリカ式戦争の破綻が明白となっていたことを示した。(3)ケネディ政権のベトナム政策をめぐる研究上避けて通れない、ケネディが暗殺されなかったら年末以降ベトナムから撤退したかどうかという問題に取り組み、ケネディ政権が想定した1965年以降の完全撤退路線や段階的な米軍事援助顧問団の縮小計画がきわめて非現実的な楽観にもとついていたこと、ケネディには介入政策逆転に必要とされる国民教育の努力や、一時的な外交上の挫折を甘受するだけの政治的勇気が欠如していたことを明らかにした。1.本研究全体のうえで基礎段階にあたる平成15年度は、ベトナム戦争関係およびケネディ政権を中心としたアメリカ外交関係図書の購入を進めながら、全体の構想についていっそうの明確化を図った。とくに今後の研究上中核的な資料となるForeign Relations of the United States 1961-1963や各種マイクロ資料を利用して詳細な外交文書を検討した。1963年5月の仏教徒危機発生以前から対ゲリラ戦争の遂行をめぐってアメリカ=南ベトナム関係が険悪化していたこと、両国の見解の相違が短期的にはゴ・ジン・ジェム政権を転覆させ、長期的にはベトナム戦争の勝利を阻害する大きな要因となったことがより明らかになった。2.国際政治学会(平成15年11月)の欧州国際政治分科会に討論者として参加し、ベトナムを含む東南アジアを中立化するというフランスの構想と、それに対するアメリカ側の対応をめぐる発表について、米仏関係および米=南ベトナム関係の視点からコメントを行った。その際、フランスが中立化構想を公にした1963年の段階で、すでにアメリカ側に中立化を受け入れる素地がなかったと思われること、その背景には冷戦思考と並んで急速に悪化する南ベトナムの政治情勢があったことなどを指摘した。3.ベトナム戦史研究と現代アメリカ外交分析を並行して進めるよう心がけ、とくに「ベトナム症候群」と呼ばれるこの戦争の後遺症について検証を加えた。ベトナムでの敗北がアメリカ社会に甚大な影響を与えたのはそれが「正義」不在の戦争だったためであり、1963年、仏教徒の弾圧に始まる政治危機がいわば「正義なき戦争」の始まりであったことを再確認した。前年度に引き続き、ベトナム戦争関係図書、およびケネディ政権を中心にアメリカ外交関係図書の購入を進めながら、その体系的な利用を図った。具体的には、ベトナム戦争史の重大な分岐点のひとつである1963年を中心に、ケネディ政権とゴ・ジン・ジェム政権との軋轢を軍事・政治・外交の3つの局面から分析することとし、今年度はとくに軍事的側面を考究の対象とした。その結果、ケネディ政権が発展途上世界対策の一環として推進した「反乱鎮圧戦略」に内包されたいくつかの矛盾が明らかになった。

第一にもっぱら軍事的手段に依拠しながら政治戦争を遂行したこと、第二にアメリカが代理戦争の主役として期待した南ベトナム政府軍との間に、アメリカの介入拡大に起因する軋轢が強まったこと、第三に政治的側面の軽視、空軍力をはじめ火力・機動力・科学技術への過度の依存など、アメリカがベトナムに移植した戦争遂行のやり方に限界があったことである。本研究の推進にあたっては、基盤研究(A)(1)「アメリカの戦争と世界秩序形成に関する総合的研究」研究分担者としての活動が大きく貢献した。なお、本研究の遂行にあたっては、当初の予定と大幅に異なる支出を行い、補助金をほぼ全額、研究資料の購入、すなわち物品費にあてた。それは、かねて予想した数をはるかに超える文献、それもきわめて重要なアメリカの外交文書集やベトナム戦争関連の研究書などが今年度入手可能となったこと、そうした資料を購入できなかった場合、来年度以降利用できる保証がないこと、したがって旅費(他大学でのマイクロ資料などの利用のため)や謝金(膨大な資料の整理など研究補助のため)などの支出を断念しても、今年度中に上記資料の確実な入手をめざすほうが研究上有益と判断されたことによる。平成15・16年度に引き続き、ベトナム戦争関係図書およびケネディ研究関係図書の入手およびそれらの分析を中心的課題としながら、研究全体をめぐる構想の明確化を図り、来年度の研究完成に向けていっそうの前進を示した。前年度、反乱鎮圧戦略の立案・展開・挫折という軍事的失敗の側面に焦点を当てて成果を上げたことを受けて、本年度は、外交・政治的側面の検証にとくに力を入れた。具体的には、ケネディ政権が「ドミノ(将棋倒し)理論」に象徴される冷戦論理にもとづき、南ベトナム防衛を至上命令として軍事的コミットメントの大幅拡大に踏み切ったこと、しかし同時に朝鮮戦争のようなアジアでの大規模地上戦争を強く嫌悪する世論の制約との狭間で最後まで揺れ動いていたことを一次史料から明らかにした。しかしその躊躇が必ずしも、従来しばしば見受けられる、ケネディ大統領が1965年までにベトナムから完全に撤退する決意を固めていたとする主張に根拠を与えてはいないことを指摘した。本研究はこうした二律背反的な様相について、アメリカのベトナム介入が抱える本質的な問題の顕在化であり、同時に、同盟国であるはずのアメリカ=ベトナム関係の齟齬、つまり改革による国民の支持獲得・戦争遂行の強化をともに求めるアメリカと、それに抵抗するベトナム側の対立の前提をなすものとして促えた。なお本研究においては、同時に文科省科研費・基盤研究(A)(1)「アメリカの戦争と世界秩序形成に関する総合的研究」に研究分担者として参加した活動、とりわけ国外の研究者の知見に接したことが大きな刺激となった。(1)4年間の研究の最終年度にあたり、最も中心的な課題であるアメリカと南ベトナムの政治的な軋轢について、その背景や展開、影響などの解明に取り組んだ。(2)1963年5月に南ベトナムで勃発した仏教徒危機が11月のゴ・ジン・ジェム政権打倒につながるまでの過程について、危機の底流となった南ベトナム国民のジェム政権への不満の蓄積、仏教徒の政治運動に対するジェム政権の強圧的な対応、事態解決に向けたケネディ政権の圧力戦術の失敗などを実証的に分析した。
言論市場における政府の役割・意義・限界についての憲法学的研究

本研究は、言論市場にさまざまな仕方で関与・介入している公権力の現状を踏まえたうえで、そうした政府の活動を憲法論として的確に位置づけるとともに、その意義と憲法上の限界について明らかにすることを目的とした研究である。具体的には、(1)政府が、特定内容の表現を強制するという仕方によって言論市場に参入する場合、及び(2)言論市場に「規制」ではなく「助成」という仕方で介入する場合、そして、(3)言論市場に直接発言者として参入する場合について、それぞれ憲法的観点からその統制の可能性と方途についての考察を行い、その展望を明らかにした。本研究は、言論市場にさまざまな仕方で関与・介入している公権力の現状を踏まえたうえで、そうした政府の活動を憲法論として的確に位置づけるとともに、その意義と憲法上の限界について明らかにすることを目的としている。平成20年度は、次の通り、3つの課題の検討を試みた。(1)私人や団体に対し、特定内容の表現を強制するという仕方によって言論市場に参入する場合について、とくに表現の自由のコロラリーとして導き出される「表現しない自由」の観点からいかなる統制が可能なのかにつき、アメリカ合衆国の判例・学説を参考に検討した。検討の結果、「表現しない自由」を侵害されるのは、「意に反して」特定の表現があたかも自分自身の見解のように帰属させられる場合であることを明らかにした。(2)言論市場に「規制」ではなく「助成」という仕方で介入する場合について、アメリカ連邦最高裁および学説による対応の変遷と代表的アプローチを概観し、それぞれの意義と課題を整理した。(3)公的言論助成を行う政府の権限統制の可能性について、特に表現の自由の観点から、アメリカの学説を整理・検討した。検討により、近年の学説は自己統治の価値や公共討論の価値に着目した議論を展開していることを明らかにし、その課題も提示した。以上の検討により、言論市場に対して「助成」、「表現の強制」という仕方で介入する場合において表現の自由の観点からの統制の方途について、一定の道筋を提示できた。平成21年度は研究実施計画に基づき、次の通り、3つの課題の検討を試みた。第1に、文化助成に代表される国家による表現活動への助成を、憲法的観点から考察するにあたっての前提的な論点、すなわち、そもそもいかなる根拠に基づいて、そうした助成を行うことができるのかという論点について検討した。検討により、日本国憲法上、文化助成を行う憲法上の「義務」は存在していないが、「権限」はあることを明らかにした。第2に、表現活動への助成を表現の自由条項のもとで考察する理由と範囲について検討した。検討により、文化助成の問題すべてを表現の自由の問題として構成する必要はなく、表現の自由の観点から考察が必要な局面は、助成条件として特定の表現活動を行わないことを義務付けたり、表現内容を理由に助成を撤回したり、特定の表現のみに助成する場合であると論じた。第3に、近年アメリカ憲法学で用いられている「政府言論の法理」について検討した。一般に二本において「政府言論」といわれる場合、言論市場に参加する政府活動一般を指すが、アメリカの連邦最高裁における「政府言論の法理」は、観点中立原則の例外を認める法理であることを指摘した。加えて、「政府言論の法理」に関する最新の判例である2009年に下されたPleasant Grove City v.Summum,129 S.Ct 1125(2009)の検討を行い、「政府言論の法理」の問題を考えるにあたって重要なことは、いかなる政府行為が政府言論に該当することになるのかを明らかにすることであると指摘した。
表面フォノンによる表面反応制御機構の解明

1.表面音響フォノン励起とその観測LiNbO3単結晶の表面にinterdigital transducer電極を設け、2つの電極の間には真空蒸着により銀などの金属薄膜試料を準備した。この電極に周波数20MHzのラジオ波(RF)の電場をかけることにより表面音響フォノンの定在波を立て、レーザードップラー振動計を用いてこの表面音響フォノンの定在波による表面の変位を測定することができた。2.偏光変調反射赤外吸収分光超高真空下ではなく試料ガスが比較的高圧で存在する雰囲気下での反応に着目したため,気相中に反応ガスが存在する条件下で金属表面に吸着した分子の振動スペクトルを観測する必要がある。このため,通常の反射赤外吸収分光法ではなく、入射光の偏光面を変調させた偏光変調法を採用した。これを用いて銅薄膜上でメタノールを反応させたところホルムアルデヒドに特徴的な吸収ピークを観測することができた。3.仕事関数の変化音響フォノンの定在波を1で用意した銅,金,パラジウム薄膜上に導入し、光電子顕微鏡(PEEM)を用いて、仕事関数変化を測定した。その結果、音響フォノン定在波による表面金属原子の変位が金属の仕事関数の変化と関連があることが分かった。
一次相転移の誘導期間における秩序形成の解明

1次相転移には、誘導期間と呼ばれる前駆現象が観察される場合がある。この誘導期間は、古典的には、核形成・成長において、新しい相の核が安定に存在し得るまで、成長するのに必要な確率的な時間であると説明されてきた。本研究では、高分子・界面活性剤・液晶分子に代表されるような複雑液体においては、その大きな内部自由度に基づく複数の秩序変数間のカップリングにより様々な相転移前駆現象が観察されることを明らかにした。1)高分子の結晶化誘導期間における秩序形成高分子(ポリエチレンテレフタレート)の結晶化誘導期間における秩序形成を小角X線散乱・中性子散乱・偏光解消光散乱により追跡し、高分子結晶化に際しては、最初に高分子鎖が平行に配向し(ネマティク転移)、その後、分子鎖間のアジャストメントによりパッキングが開始し、誘導期間は分子鎖のパッキングが始まる前の平行配向化の段階であることを明らかにした。また、そのメゾスケールの秩序形成がスビノーダル分解のキネティクスに従い、この実験結果が土井らの平行配向理論と記述できることを見い出した。2)高分子/液晶系の液晶・結晶化転移のキネティクス高分子/液晶系では、高分子濃度がある値以上になると液晶分子が結晶化することが知られている。この液晶分子の結晶化は、その秩序パラメーターが密度と配向の2パラメーター系であることから上の高分子の結晶化と類似の結晶化キネティクスが期待される。我々は、高分子/液晶系の結晶化挙動を小角散乱散乱手法とモンテカルロシミュレーション手法により追跡した。その結果、液晶分子の結晶化の前段階で液晶分子の配向秩序化が進んでいることがシミュレーションから予想されることが明らかとなった。3)非イオン性界面活性剤/水系でのモルフォロジー転移の前駆現象非イオン性界面活性剤/水系でのラメラ/Gyroid転移を高分解能小角X線散乱法により追跡した。ラメラ/Gyroid転移点より高温側のラメラ相においてすでに、Gyroid相に繋がる特定の波数ベクトルをもつ膜の揺らぎが発生し、温度が転移点に近づくにつれてその揺らぎが次第に成長し、最終的には、ラメラ面に穴のあいた穴あきラメラ構造が形成される事が明らかになった。この相転移の前駆現象として膜に特定の揺らぎのモードが安定化する現象は実験的に初めて確認されたものであり、モルフォロジー転移にも前駆構造が存在することを明らかに出来た。一次相転移には、誘導期間と呼ばれる相転移が起こる前の前駆現象が観察される場合がある。この誘導期間は、古典的な核形成・成長理論では、新しい相の核が安定に存在し得るまで成長するのに必要な時間と説明されてきたが、最近新しいタイプの誘導期間の存在が指摘され始め、誘導期間における秩序形成の研究が注目されている。本研究では、両親媒性分子/水系におけるモルフォロジー転移をそのような一次相転移のモデル系として選び、その相転移のダイナミクスを中世子小角散乱およびX線小角散乱により追跡した。

まず、両親媒性分子(C16E7)/水系でのラメラ相からキュービック相への相転移を放射光を用いたX線CCDカメラシステムを用い30msの時間分解能で観察することに成功し、相転移が始まる時にサブ秒スケールでエンブリオの生成・消滅が行われ、それが次第に安定な核へと収束していく様子が明らかとなった。さらに、この系のカメラ相からキュービック相への相転移を流動場下で行う事により、相転移における誘導期間が著しく増大することを流動場下での中世子小角散乱により見い出した。これは、モルフォロジー転移を引き起こす両親媒性分子膜の曲率の変化を流動場により抑制したためであり、誘導期間とオーダーパラメーターの関係を直接関係づけることが出来た。1次相転移の誘導期間における秩序形成を明らかにする目的で、我々は本研究を行い、次の点を明らかにしてきた。1)高分子の結晶化誘導期間において、メゾスコピックな空間スケールで分子鎖の配向秩序化がまず進行し、その後結晶化が進む。2)両親媒性分子のモルフォロジー転移においてその転移の極初期段階で、サブ秒の時間スケールで、微結晶の生成・消滅が繰り返され、これが次第に大きな結晶へと成長していくこと。平成10年度は、この結果を踏まえ、以下の相転移の前駆現象について研究を行った。1.非イオン性界面活性剤/水系でのモルフォロジー転移(ラメラ/Gyroid転移)のpretransition現象高エネルギー加速器研究機構のシンクロトロン放射光のX線小角散乱装置(PF15A)を用いて非イオン性界面活性剤/水系でのラメラ/Gyroid転移を追跡した。ラメラ/Gyroid転移点より高温側のラメラ相においてすでに、Gyroid相に繋がる特定の波数ベクトルをもつ膜の揺らぎが発生し、温度が転移点に近づくにつれてその揺らぎが次第に成長することが明らかになった。現在、得られた散乱曲線をCailleの相関関数を用いて解析することにより、膜の弾性率の温度依存性を求めており、これと特定モード揺らぎとの関係を調べることにより、モルフォロジー転移の前段階における膜の不安定性を定量的に解析し、前駆現象と相転移の関係を明らかにする。また、これに関連するトピックスとしてモルフォロジー転移後期過程のスローダイナミクスおよびモルフォロジー転移に及ぼす流動場の影響を明らかにした。2.高分子/液晶系の液晶・結晶化転移のキネティクス高分子/液晶系では、高分子濃度がある値以上になると液晶分子が結晶化することが知られている。この液晶分子の結晶化は、その秩序パラメーターが密度と配向の2パラメーター系であることから上の高分子の結晶化と類似の結晶化キネティクスが期待される。10年度は、この・高分子/液晶系の結晶化挙動を小角散乱散乱手法とモンテカルロシミュレーション手法により追跡した。その結果、液晶分子の結晶化の前段階で液晶分子の配向秩序化が進んでいることがシミュレーションから予想されることが明らかとなった。平成11年度はこれらの研究をさらに推進することにより、1次相転移の誘導期間における秩序形成の役割を明らかにする。1次相転移には、誘導期間と呼ばれる前駆現象が観察される場合がある。この誘導期間は、古典的には、核形成・成長において、新しい相の核が安定に存在し得るまでの確率的な時間であると説明されてきた。本研究では、高分子・界面活性剤・液晶分子に代表されるような複雑液体においては、その大きな内部自由度に基づく複数の秩序変数間のカップリングにより様々な相転移前駆現象が観察されることを明らかにした。
圧電駆動型磁気光学効果を用いた超高速空間光多値変調マイクロデバイス

空間光変調デバイス(SLM)は、光コンピュータや光通信用スイッチなど様々な情報通信システムの要となる重要な光マイクロデバイスである。中でも磁気光学空間光変調デバイス(MOSLM)は高速駆動、堅固等の従来のSLMでは得られなかった特長を持つデバイスである。従来のMOSLMの駆動には電流を用いてきたが発熱による問題のため実現が困難となっている。この問題を解決する方法として我々は圧電効果と磁歪効果を利用し磁化方位を制御する方法を提案した。この方法は電圧駆動のため発熱を抑えることが可能となる。この電圧駆動型MOSLMを作製する前に、構造解析シミュレーションによって効率的に応力が印加される構造を求めた。応力計算は有限要素法シミュレーション(ANSYS Ver.6.0)を用いた。これら結果より電圧駆動型MOSLMの構造を決定した。またこのときの応力によって生じる磁界は、ピクセルをスイッチングさせるのに十分であることを確認した。電圧駆動型MOSLMの圧電薄膜には強誘電体であるPZTを使用しており、従来のゾルゲル法等の成膜方法では熱処理温度が高く磁気光学層のダメージ、電極の剥離を生じている。ここで我々は新規の技術であるエアロゾルデポジション法(AD法)を用いて従来の方法よりも低い温度でPZT膜の作製を試みた。AD法では、N_2ガスとペロブスカイト構造に結晶化しているPZT微粉を試料瓶内に混入し振動させることによりエアロゾル状態としたものを、成膜室内を排気させ試料瓶内と成膜室内との圧力差によって、加速させながら搬送し基板に吹き付け、堆積させる。この時の堆積速度はおよそ0.21.0μm/minと従来の方法と比較し高速で成膜出来る。膜厚は670nmで堆積後は特性向上のため500°C5分の熱処理を行った。ゾルゲル法は膜厚375nmで熱処理450°C30minと650°C5minで作製した。この結果よりAD法は堆積速度が速く、熱処理温度が150°C低減したにも関わらずゾルゲル法と同程度以上の分極が得られでいることが確認された。このAD法によって熱処理によるデバイスの問題点を解決することが可能となった。電圧駆動型MOSLMは、計算結果より得られた構造とAD法によるPZT膜によって作製し駆動の確認を行った。初めに-260 Oeの外部磁場によって全ピクセルの磁化方向を一定方向にした。次に電圧を上下電極間に8V印加し、+170 Oeの外部磁界によりピクセルのスイッチングの確認が可能であった。この時の駆動電流はおよそ数百μAである。これにより電流駆動型での問題点を克服した電圧駆動型MOSLMが可能となった。圧電駆動型MOSLMの原理の証明として、ゾルゲル法によるPZT薄膜の作製を試みた。Pt下地層を用いることで高配向した(111)PZT膜を作製し、実際に5×5ピクセルをもつMOSLMでの駆動を行った。Pt薄膜はPZT駆動用の電極としても動作する。PZT薄膜の厚さは約700nmであった。PZT駆動用の上部電極にはAlを用いた。この素子の特定ピクセル電極に、ピーク値8V、周波数10MHzのパルス状電圧を印加することでピクセルの磁化の反転を確認した。この結果を元に、様々な膜厚、構造等についてのコンピュータ・シミュレーションによる解析を行う事によって、電流損失が少なく、製作しやすい構造を明らかにすることを目的として以下を有限要素シミュレーションによって行った。(1)電極幅は、減少にともない応力の集中が行われることがわかり電極幅5μmで応力の極大値が得られることを導き出した。(2)電圧大きさは、圧電現象は理論的には電圧と圧電体の変位量は比例関係のため電圧とストレスが比例関係であることが確認できた。(3)圧電膜厚は、理論的には変位量と電界は比例関係となり、電界は距離の2乗に反比例するため膜厚の増加に伴ないストレスの減少を伴なう。(4)電極膜厚は、電極幅の増加とともにストレスの減少が生じている。これは、電極幅が大きくなるほど電極の硬化が生じるため、圧電膜の固定およびGarnetまでの応力が減少するためであると考察される。(5)最小電力は、電極の減少にともない電力の減少を生じている。今後は、この解析結果を元にMOSLMを試作し、更にピクセル数の多いMOSLMを試作し構造解析、駆動速度を検討していく予定である。

電圧駆動型MOSLMの圧電薄膜には強誘電体であるPZTを使用しており、従来のゾルゲル法等の成膜方法では熱処理温度が高く磁気光学層のダメージ、電極の剥離を生じている。ここで我々は新規の技術であるエアロゾルデポジション法(AD法)を用いて従来の方法よりも低い温度でPZT膜の作製を試みた。AD法では、N_2ガスとペロブスカイト構造に結晶化しているPZT微粉を試料瓶内に混入し振動させることによりエアロゾル状態としたものを、成膜室内を排気させ試料瓶内と成膜室内との圧力差によって、加速させながら搬送し基板に吹き付け、堆積させる。この時の堆積速度はおよそ0.21.0μm/minと従来の方法と比較し高速で成膜出来る。膜厚は670nmで堆積後は特性向上のため500°C5分の熱処理を行った。ゾルゲル法は膜厚375nmで熱処理450°C30minと650°C5minで作製した。この結果よりAD法は堆積速度が速く、熱処理温度が150°C低減したにも関わらずゾルゲル法と同程度以上の分極が得られでいることが確認された。このAD法によって熱処理によるデバイスの問題点を解決することが可能となった。電圧駆動型MOSLMは、計算結果より得られた構造とAD法によるPZT膜によって作製し駆動の確認を行った。初めに-260 Oeの外部磁場によって全ピクセルの磁化方向を一定方向にした。次に電圧を上下電極間に8V印加し、+170 Oeの外部磁界によりピクセルのスイッチングの確認が可能であった。この時の駆動電流はおよそ数百μAである。これにより電流駆動型での問題点を克服した電圧駆動型MOSLMが可能となった。
葉細胞の分化に伴うプラスチド転写・翻訳系の発現統御プログラム

T7ファージ型RNAポリメラーゼをコードすると思われる2種のcDNAをイネからクローニングした。他の植物種からすでにクローニングされている同種の遺伝子との比較から、これらのうち一つが葉緑体局在型(rpoTp)、他の一つがミトコンドリア局在型(rpoTm)であると推定した。RT-PCRによりそれぞれの発現パターンを解析したところ、野生株では成長点近傍に位置する発生段階初期の葉で、どちらの遺伝子も強く発現していることが分かった。一方、制限温度下のvirescent突然変異株(v1,v2,v3)では、ミトコンドリア局在型は発現パターンが野生株と同じであったが、葉緑体局在型は成長点近傍に位置する発生段階初期の葉での発現は抑えられ、そのかわりに成熟葉での発現が見られた。この葉緑体局在型の発現パターンは、葉緑体ゲノムにコードされている大腸菌型RNAポリメラーゼ遺伝子(rpo)の発現パターンと一致した。また、制限温度下のvirescent突然変異株における葉緑体局在大腸菌型RNAポリメラーゼタンパクの蓄積パターンを抗体を用いて調べたところ、その遺伝子の転写産物の蓄積パターンと類似する結果が得られた。これらの知見から、葉緑体局在T7ファージ型RNAポリメラーゼの発現を通じて葉緑体の遺伝情報発現系が活性化され、virescent遺伝子はその制御におけるキー遺伝子の一つであることが示唆された。
腸内細菌が産生する新規機能性脂質の標的細胞同定と腸疾患における役割解明

肥満は、慢性炎症の原因や発癌のリスクファクターであり、脂質の過剰摂取が肥満の原因の一つである。多価不飽和脂肪酸のリノール酸は、ヒトが持つ酵素によりプロスタグランジンなどの脂質メディエーターに変換され、炎症反応を誘導する可能性がある。一方、腸内細菌もリノール酸を代謝し、代謝過程で生じる中間代謝産物の中には炎症性疾患を抑える作用を持つものがあることが示唆されている。しかし、その詳細な作用機序、特に炎症反応を引き起こす免疫細胞に対する腸内細菌代謝脂質の作用は十分には解明されていない。そこで本研究では、免疫系に対するリノール酸代謝物の効果と、代謝物が生成される場である腸に着目した。まず、リノール酸を過剰摂取した場合にどのリノール酸代謝物が多く生成されるのか明らかにするため、低リノール酸ー高脂肪食摂取マウスと高リノール酸ー高脂肪食摂取マウスの大腸におけるリノール酸代謝脂質量を測定した。その結果、高リノール酸ー高脂肪食摂取マウスの大腸には、予備試験で免疫細胞のサイトカイン産生を抑制したリノール酸代謝脂質(HYA、KetoA、KetoC等)が多く存在することがわかった。そこで、単独で強い抑制作用を持ち、高リノール酸食摂取後に組織中で増加したKetoAとKetoCに着目し、免疫細胞のサイトカイン産生に対する効果を改めて検討した。その結果、各代謝物は単独でも免疫細胞によるサイトカイン産生を抑制したが、併用することでより強い抑制効果を示すことがわかった。したがって、生体内で複数のリノール酸代謝物が生成された場合、協調して働き、より強い作用を発揮すると考えられる。今後、炎症性腸疾患や大腸癌の病態形成に対するリノール酸腸内細菌代謝物の効果が明らかにされ、生体内における詳細な役割が解明されることを期待したい。
外国人介護人材養成のための日本語能力判定基準の開発に基づく効果検証

外国人の介護人材が就業している現場では、徐々に、日本語教育の重要性が認知されてきたが、候補者や実習生の、介護現場での的確な日本語能力を判定するスケールが開発されておらず、まずは、介護人材の適切な日本語能力診断が求められる。今回の申請では、これまでの研究によって開発されたWKBSを、さまざまな介護現場で、外国人介護就労人材の研修に当たる関係者が、簡便にアクセスし使用できる、インターネット上でのアプリケーションを開発することを大きな目的としている。それによって、より多くの利用者からのフィードバックを得られ、その効果を検証することで、完成度の高いバンドスケールに仕上げていくことができると考えられる。
トリチウムによるマウス個体での遺伝子突然変異の誘発

トリチウムの遺伝的影響の個体レベルの研究、特に、哺乳動物を用いた突然変異の定量的研究は、膨大な数の動物を必要とし、経済的にも、施設設備の面からも、極めて困難である。しかし、私共のinvivo体細胞突然変異検出法PT-HTFI法を用いると、これまで、想像もできなかった低線量の放射線(10R)でも突然変異を検出することがわかった。本研究では、PT-HTFI法を用い、トリチウム水によるマウス個体レベルでの遺伝子突然変異誘発を試みた。1.突然変異の検出;大阪大学医学部無菌動物室においてPT♀とHT♂を交配し、妊娠10.5日目に、広島大学原医研にてトリチウム水を腹腔内に注射した。生後4週齢でF1マウスを屠殺し、体細胞突然変異と細胞死および奇形を検出した。F1マウス(a/a,b/t,pcch/tt,d/t,ln/t,pa/t,pe/t)の毛色は正常では黒色であるが、野性型遺伝子に変異がおこると、その胎児色素芽細胞由来の毛の部分が、茶-灰白色のスポットとなる。これまでの研究成果により、倍加線量(33R),1R,1遺伝子座当り変異率(2.2×【10^(-7)】)は、精原細胞での突然変異とよく一致している。2.トリチウム水による突然変異の誘発;トリチウム水120μCi/g体重投与により、PT-HTF1マウス85匹中22匹(25.9%)に、トリチウム水60μCi/g体重投与により、F1マウス92匹中12匹(13.0%)に体細胞突然変異による毛色スポットが検出された。単純な計算では、今回、用いたトリチウム水120μCi/g体重は、110radに相当する。X線110R緩照射では、F1 161匹中25匹(15.5%)に変異が誘発されており、トリチウム水によるin vivoでの体細突然変異のRBEは1.8以上となり、精原細胞での突然変異(2.2)とよく一致している。これまでの結果はトリチウム水によるマウス体細胞突然変異の量効果曲線を求めることにより、ヒトへの遺伝的影響を推定することが可能となることを強く示唆している。
コモンオーナーシップが株価形成、企業ガバナンスに与える影響

本研究では、下記の2点の分析を行う。(1)外国人投資家のコモンオーナーシップが株価の形成に与える影響の分析を通じて、その影響の程度、ファンダメンタル価値からの乖離が解消するプロセスを明らかにし、流動性ショックのバッファーや規制の創設の必要性などといった政策的提言を行う。(2)外国人投資家のコモンオーナーシップが企業の投資・資本政策に与える影響を分析し、外国人投資家の増加による企業パフォーマンスの改善の背後にある経路を明らかにし、企業が株主構造などの資本政策をどのように調整していくべきであるかという指針を提示する。
T細胞活性化の一分子イメージング解析

T細胞の抗原特異的な活性化において、活性化シグナルを伝達する重要な分子が集合して存在し、シグナル伝達の場であるlipid raftを可視化する目的で、lipid raft局在分子LATの細胞内ドメインをEGFPに置換したLAT-GFPを、アクチンプロモーターを用いて全身性に発現するトランスジェニックマウスを作製した。このLAT-GFPマウスではどの細胞もGFPを発現し、リンパ球もほとんどがGFP陽性であった。T細胞やマスト細胞では細胞表面とともに内部にもGFPが検出された。これら細胞由来のライセートを超遠心分画法で解析し、LAT-GFPはTriton不溶性のlipid raft分画に存在していることが判明した。この正常細胞に発現しているlipid raftを代表するLAT-GFPを2つの方法で解析した。(1)刺激をしない状態で、lipid raftに存在するGFPがどのような状態であるかを、リアルタイム蛍光一分子イメージング解析を行った。一分子レベルの解析では、LAT-GFPは非常に早い速度で細胞内外を入れ替わっていった。より解像度を下げると複数のGFP分子が同一の挙動をする基点を形成しており、raftの単位と考えられた。(2)人工的に作った脂質二重膜を用いたPlanar membraneのシステムを用いて、T細胞を活性化したときのLAT-GFPの動態を解析した。MHCクラスIIとICAM-1のGPI結合型分子を精製し、脂質二重膜に埋め込んだ膜上に、LAT-GFP発現T細胞を反応させて免疫シナプスを形成させると、一部のLAT-GFPがシナプス中心に集まったが、多くのLAT-GFPは凝集しないままであった。T細胞活性化にraftのシナプスへの凝集が必要でないことを示しているか、または、GM1で検出してきたlipid raftとの多様性を示している可能性も考えられた。
光遺伝学を活用した新しい蝸牛神経刺激法：光学人工内耳の開発に向けて

野生型マウス蝸牛神経から記録される応答(興奮性シナプス後電流の振幅)に多様性があることが知られてきたが、これが内有毛細胞における単一シナプス小胞の融合および融合細孔のダイナミクスによって達成され得るという新規知見を見出し、国際誌に原著論文を発表した。また、難聴遺伝子otoferlinのコードする遺伝子産物が蝸牛神経応答の多様性の形成に寄与することを明らかにした。現行の人工内耳は蝸牛神経を一様に電気刺激するため、蝸牛神経の持つ入出力特性の多様性を再現できていない。本研究では光遺伝学(オプトジェネティクス)を活用して蝸牛神経に光感受性タンパク質を遺伝子導入し、個々の細胞レベルでのタンパク質発現量の違いを利用することにより蝸牛神経応答の多様性の獲得を目指す。そして、生理的な蝸牛神経応答を再現し得る光学人工内耳の開発の可能性を検証する。具体的には、光感受性タンパク質であるチャネルロドプシン2をげっ歯類蝸牛神経に遺伝子導入し、青色光により光誘発性応答を引き起こす。そしてパッチクランプ法にて光誘発性応答の多様性を検証する。以下に平成25年度の研究成果を記す。1.野生型のげっ歯類を使って蝸牛神経初代培養系の確立と最適化を行った。細胞の単離にパパイン、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いたが、生後1週齢の標本にはパパイン単独、2週以降にはコラーゲナーゼとトリプシンを混合し、安定した結果を得た。2.野生型のげっ歯類を使って蝸牛組織培養系の確立と最適化を進めている。以下に平成26年度の研究成果を記す。1.チャネルロドプシン2遺伝子改変ラットの蝸牛において、チャネルロドプシン2の発現を示唆するVenus蛍光を確認した。2.先行研究により、野生型マウス蝸牛神経から記録される蝸牛神経応答(興奮性シナプス後電流の振幅)に多様性があることが知られてきたが、これが内有毛細胞における単一シナプス小胞の融合および融合細孔のダイナミクスによって達成され得るという新規知見を見出し、国際誌に原著論文を発表した(ドイツ・ゲッティンゲン大学耳鼻科との国際共同研究)。3.共同研究先(ドイツ・ゲッティンゲン大学耳鼻科)より難聴を呈する遺伝子改変マウスを輸入し、難聴マウスの蝸牛神経にチャネルロドプシン2を遺伝子導入する準備を開始した。平成27年度の研究成果を以下に記す。1.チャネルロドプシン2遺伝子改変動物よりコルチ器を摘出して蝸牛神経を対象に青色光刺激を行ったが、有意な応答を得られなかった。2.平成26年度に野生型マウス蝸牛神経から記録される応答(興奮性シナプス後電流の振幅)の多様性に関する原著論文を発表したが(Chapochnikov, Takago et al. Neuron 83:1389-1403, 2014)、共同研究先であるドイツ・ゲッティンゲン大学耳鼻科より輸入した難聴マウス(otoferlin遺伝子改変マウス)を対象に実験を行ったところ、難聴遺伝子otoferlinのコードする遺伝子産物が蝸牛神経応答の多様性の形成に関与することが明らかになった。野生型マウス蝸牛神経における蝸牛神経応答(興奮性シナプス後電流振幅)の多様性のメカニズムを解明し、国際誌に原著論文を発表した。また、チャネルロドプシン2遺伝子改変ラットの蝸牛においてチャネルロドプシン2の発現を示唆するVenus蛍光を確認し、光誘発性応答確認実験の準備を調えた。

聴覚医学平成27年度はチャネルロドプシン2遺伝子改変ラットの蝸牛を使って光誘発性応答の確認実験を実施する。また、平成26年度末に共同研究先(ドイツ・ゲッティンゲン大学耳鼻科)より難聴マウスを輸入したが、今後は正常聴力を有する野生型マウスでなく難聴マウスの蝸牛神経にチャネルロドプシン2を遺伝子導入するべく研究計画を修正し、より臨床応用に近い形を調えていく。野生型げっ歯類の蝸牛神経初代培養系/蝸牛組織培養系の確立、最適化は順調に進んでいる。一方で、チャネルロドプシン2遺伝子改変動物の導入が遅れている。遺伝子改変動物の導入が平成26年度末にずれこみ、動物の維持繁殖用の費用が少なく済んだため。チャネルロドプシン2遺伝子改変動物を入手次第、蝸牛神経における光誘発性応答の確認実験を行う。また、平成27年度に計画していた野生型げっ歯類蝸牛神経への遺伝子導入実験についても前倒しにして平成26年度より着手していくことにする。遺伝子改変動物の維持繁殖、技術補助員への謝金、学会発表の旅費、論文の出版費など(1)平成25年度に購入を予定していた備品を、所属施設内の経費にて平成24年度内に調達することができた。(2)野生型のげっ歯類を所属施設内の経費で調達することができた。主に、遺伝子改変動物の維持に使用する予定である。
核膜形成と分解の分子機構

核膜とゴルジ体は有糸分裂時に分解・小胞化し、分裂終期に小胞が融合して再形成される。ゴルジ体の形成にはVCP/p97とNSFという2つのATPascが関与していることが示されているが、核膜の形成機構はまだよくわかっていない。VCP/p97の酵母のホモログはCDC48pであり、このタンパク質はカリオガミー(核膜融合)に関与する。我々はNSFがゴルジ体以外に核膜にも存在していることを見い出した。本研究の目的はVCP/p97とNSFが核膜融合に関与しているかどうかを調べることであり、本年度は以下の研究成果を得た。1) NSFは膜表在性のSNAPおよび膜内在性のSNARE(syntaxinやSNAP-25などのサブユニットから構成される)と複合体を形成して膜融合反応に関与する。抗SNAP抗体および抗SNAP-25抗体を作成し、それらの抗体がアフリカツメガエルの卵母細胞抽出液を用いたin vitroの核膜融合反応を阻害することを示した。抗体で認識されるアフリカツメガエルのタンパク質は既知のSNAP-25より約7kDa大きく、新規な分子種の可能性が考えられたので、現在このタンパク質のクローニングを進めている。2) NSFに対するモノクローン抗体2E5はHeLa細胞の核膜およびゴルジ膜のNSFを認識したが、モノクローン抗体2C8は核膜のNSFを認識しなかった。このことは核膜とゴルジ膜のNSFが異なる分子種である可能性を示唆している。3) VCP/p97は膜表在性のp47を介して膜内在性サブユニットのsyntaxin5に結合する。一方、CDC48pの膜内在性サブユニットはUfelp(このタンパク質もsyntaxinの一種)である。酵母のtwo-hybrid systemを用いてヒトのUfelpを同定した。現在、ヒトUfelpがVCPと結合するかどうかを調べている。