hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜法による超臨界混合流体の分離に関する研究

ピロメリット酸二無水物と4,4'ジアミノジフェニルエ-テルからなるポリアミック酸(PMDAー4,4'ーODA)にフェナンスレンを5wt%添加したものをド-プ液として、蒸発温度70°C、蒸発時間4分の条件でポリイミド非対称膜を作成し、超臨界炭酸ガスの膜透過特性と、超臨界炭酸ガスとエタノ-ル、メタノ-ル、イソオクタンとの分離に関する研究を行った。炭酸ガス透過実験では、超臨界状態での透過系数は気体状態と比較して増大し、この傾向は操作温度が臨界温度付近において顕著にみられた。これは超臨界状態になると密度が著しく増加し、膜への溶解度が増大したためであると考えられる。次に超臨界炭酸ガスとエタノ-ル混合比15:1における分離実験では、分離系数は373K,15MPaで最大8.7、423K,15MPaで6.5が得られた。373Kでは膜間圧力の増加と共に分離係数は緩やかに増大し、423kでは膜間圧力にかかわらずほぼ一定であった。膜透過の活性化エネルギ-はエタノ-ルは2.6kJ/mol,超臨界炭酸ガスは7.1kJ/molであった。これはポリイミド対称膜としてエタノ-ルで約1/17,炭酸ガスで約1/10と非常に小さい値となった。実験より得られたデ-タから、1mol%エタノ-ルを含む超臨界炭酸ガス混合流体からエタノ-ルを90%回収するのに必要な膜面積を求めると、373K,10MPaでは0.82m^2、423K,15MPaでは0.28m^2で得られた。メタノ-ルとの分離実験では分離係数は約3.6、イソオクタンとの分離実験では約12.8が得られた。どちらも分離係数は膜間圧力にかかわらず一定の値を示した。本研究室で製膜したポリイミド非対称膜を用いて超臨界炭酸ガス抽出物の分離に関する研究を行った。まず超臨界炭酸ガスの透過特性について、透過流束は操作圧力が大きくなるにつれて高い値となり比例関係が成立することがわかった。従って超臨界状態の炭酸ガスは気体状態同様、溶解ー拡散機構により膜を透過すると考えられる。また本実験で製膜したポリイミド膜は、100気圧付近の高圧域においても透過流束が直線的に増加した。これよりポリイミド膜は構成元素の各原子間の結合が剛直なため、操作圧力に対する膜の緻密化の影響を受けなかったと考えられる。次に超臨界炭酸ガスとエタノ-ルに、透過係数の差があるために分離が可能であると考えられ、超臨界炭酸ガスーエタノ-ル混合化15:1において分離実験を行った。その結果、エタノ-ルの炭酸ガスに対する分離係数αは、操作温度100°Cにおいて79であり操作圧力の増加に伴い増大した。150°Cでは操作圧力の増加に対して分離係数は約6.5で頭打ちの状態になった。これは温度の上昇に伴い膜を構成している高分子の分子運動が活発になることに起因していると考えられる。次に本実験で製膜した膜の中には、ピンホ-ルがあいてしまい実験に使用できない膜が多くできたのでこれらの膜のピンホ-ルをコ-ティングすることにより膜として再成する可能性について検討した。

その結果ピンホ-ルを埋めるためには5wt%から10wt%の濃度のポリアミック酸でコ-ティングし、573Kで1時間熱処理を行なえば、非対称構造を維持しながら膜として再生できることがわかった。耐熱性,耐圧性を有するポリイミド非対称膜を製膜し、超臨界炭酸ガスとエタノ-ルの分離に関する研究を行った。初めに炭酸ガスが超臨界状態になることで膜透過量は増加した。これは超臨界炭酸ガスの密度が気体状態に比べ高く、膜へ溶解し易くなったためと考えられる。また炭酸ガスを冷却、加圧することで液化させ膜を透過させた。液化が始まると透過流束は急激に上昇した。液化により膜への溶解度が増大したものと考えられる。次に高い分離性能を有する膜を得るために、蒸発温度を様々に変化させて製膜し、超臨界炭酸ガスとエタノ-ルの分離実験を行った。その結果、エタノ-ルの炭酸ガスに対する分離係数αは、90°Cで製膜した時最大7.5を得た。これは蒸発温度が低温では分離をつかさどる活性層が十分に形成されないため、また高温では膜の材質であるポリアミック酸が熱的に不安定なため膜の一部に欠損が生じたものと考えられる。また操作圧力に対する分離係数はどの温度で製膜した膜に対してもほぼ一定値が得られた。これは炭酸ガス、エタノ-ルとも操作圧力、透過流束の間に比例関係があるためである。次に溶質にメタノ-ル、イソオクタンを用いて超臨界炭酸ガスとの分離実験を行った。分離係数はメタノ-ル、エタノ-ル、イソオクタンの順で高くなった。これは溶質の沸点と透過係数の間には比例関係があり沸点の高い物質ほど分離係数が大きくなったと考えられる。
心筋梗塞、脳梗塞におけるストレス応答性向血栓遺伝子の発現機構の解明とその制御

マウスに拘束ストレス法を負荷し、向血栓性遺伝子PAI-1の発現を解析した。拘束ストレス負荷2時間後に早くも血中PAI-1抗原量および腎臓、副腎、脂肪組織などでのPAI-1 mRNA発現量が有意に増加した。ストレス負荷20時間後には血中PAI-1抗原量のさらなる顕著な上昇を認め、組織でのPAI-1 mRNA発現量も肝臓、大動脈、副腎、脂肪組織にて著明に増加した。in situ hybridization法による解析では、拘束ストレス負荷により肝細胞、腎尿細管上皮細胞、傍大動脈交感神経節細胞、脂肪細胞、副腎髄質内の腺細胞などにおいてPAI-1 mRNAシグナルの増強を認めたが、脂肪組織(細胞)におけるPAI-1 mRNAシグナルの増強がもっとも顕著であった。以上より、心因性ストレスによって種々の臓器で向血栓遺伝子PAI-1の発現が増強することが明らかとなった。一方、心筋梗塞後慢性期のマウス心臓における間質線維化病変の進展とPAI-1発現との関連について検討した。マウスの左冠状動脈を結紮することによって部分的な心筋梗塞を起こさせ、24週後の慢性期に、不全心の生理機能とPAI-1の発現、病理組織学的変化について解析を行った。Shamマウスと比較して心筋梗塞後マウスでは、血中PAI-1値の有意な上昇と心臓由来のPAI-1 mRNAの顕著な発現亢進を認めた。in situ hybridization法により、このPAI-1 mRNAの発現増強は不全心での梗塞巣周囲の心筋細胞、血管平滑筋細胞、肥満細胞等に由来することが明らかとなった。また心筋梗塞後マウスでは、梗塞巣周囲、非梗塞域の血管周囲および心内膜側に明らかな線維性変化の進展を認めた。以上よりPAI-1は、心臓において創傷治癒、リモデリングの過程で線維化病変の制御を介して重要な役割を果たしていると考えられた。マウスに心因性ストレスを負荷する方法として拘束ストレス法を用い、ストレス負荷後の向血栓(血栓溶解阻害)遺伝子PAI-1の発現動態を解析した。具体的にはマウスを50ml tube内に一定時間(最長20時間)閉じ込めた(飲水のみ可)後、血漿と組織を採取し、血漿中のPAI-1抗原量を測定するとともに、組織からRNAを抽出してcompetitive RT-PCR法によりPAI-1 mRNAを定量した。ストレス負荷20時間後には、血中PAI-1抗原量は負荷前の約7倍と著明に上昇し、組織でのPAI-1 mRNA発現量も肝臓(4倍)、大動脈(3倍)、副腎(12倍)、脂肪組織(20倍)において顕薯に増加した。また同時に、サイトカインのひとつでPAI-1の発現刺激因子でもあるTNF-αの血中レベルも測定したが、拘束ストレス後には有意な増加を認めた。in situ hybridization法にてマウス組織におけるPAI-1 mRNAの局在について検討してみると、拘束ストレス負荷により肝細胞、腎尿細管上皮細胞、傍大動脈交感神経節の細胞、脂肪細胞、副腎髄質内の腺細胞(クロム親和性細胞)などに一致してPAI-1 mRNAシグナルの増強を認めたが、脂肪組織(細胞)におけるシグナルの増強がもっとも顕著に認められた。一方、20時間拘束ストレス負荷後のマウス組織において、フィブリン免疫組織化学により微小血栓沈着の有無を検索したが、明らかな血栓形成は認められなかった。

以上の検討により、心因性ストレスによって種々の臓器で向血栓遺伝子PAI-1の発現が増強することが明らかとなったが、これが直接に血栓症発症につながるかどうかについては、さらなる検討が必要であると考えられた。向血栓性因子PAI-1は血栓形成を促進するのみならず、組織の線維化の進展にも寄与する。これは、プラスミン生成の抑制による組織線溶の阻害を介するもので、結果として細胞外マトリックスの沈着が促進され、組織の線維化が進むことになる。心筋梗塞病変部におけるPAI-1の病理学的役割を明らかにするため、心筋梗塞後慢性期のマウス心臓における間質線維化病変の進展とPAI-1発現との関連について検討した。マウスの左冠状動脈を結紮することによって部分的な心筋梗塞を起こさせ、24週後の慢性期に、不全心の生理機能と、PAI-1の発現、病理組織学的変化について解析を行った。その結果、Shamマウス(開胸のみで冠状動脈の結紮をしない)と比較して心筋梗塞後マウスでは\血中PAI-1値の有意な上昇と、心臓由来のPAI-1 mRNAの顕著な発現亢進を認めた。in situ hybridization法による検討により、このPAI-1 mRNAの発現増強は不全心での梗塞巣周囲の心筋細胞、血管平滑筋細胞、肥満細胞等に由来することが明らかとなった。また心筋梗塞後マウスでは、梗塞巣周囲、非梗塞域の血管周囲および心内膜側に明らかな線維性変化の進展を認めた。一方、非梗塞域心筋では、通常は見られない炎症性サイトカイン(TGF-β、TNF-α)のmRNA発現の亢進を認め、心筋において炎症性サイトカインがオートクライン的にPAI-1の遺伝子発現をup regulateしたと考えられた。PAI-1ノックアウトマウスでは慢性期の間質線維化病変は有意に減少する一方で、急性期の心破裂が有意に多かった。以上より、PAI-1は心臓においても創傷治癒、リモデリングの過程で、線維化病変の制御を介して重要な役割を果たしていると考えられた。
脊椎動物の発生拘束を担う遺伝子群の同定とその役割

本研究では、発生と進化の関係性を説明した発生砂時計モデルの検証を目標としている。発生砂時計モデルでは、脊椎動物の発生中期には拘束の強い、進化的に最も保存されたファイロティピック段階と呼ばれる胚段階が存在するとされている。これまで我々は、これまでにマウス胎仔の発生段階別ESTデータを用いて、vertebrate ancestor indexを算出し、その値がもっとも高くなるステージをE8.5前後とした。本年度は、マウス胎性7.5, 8.5, 9.5, 10.5においてより高い精度での遺伝子発現情報を得るため、マイクロアレイを用いて網羅的な解析を行った。また、公共の各種(ゲノム、GeneOntologyなどの)データベースから最新の情報を取得し、大型計算機により様々な生物種の配列情報を解析することで、マウス胚発生において進化的に保存された胚段階の解析を行った。これによりマウス胎性8.5日から9.5日にファイロティピック段階が存在しうるという、これまでのESTによる解析結果と矛盾しない結果を得た。また、原始脊椎動物が起こしたと考えられるボディプランの大きな変革が、胎性8.5-9.5日に痕跡として残っている可能性も示唆された。これらの結果は、発生砂時計モデルをゲノムレベルで支持するだけでなく、当該分野において分子レベルでの新たなアプローチの有用性を示すものである。
水素結合性主鎖を有する超分子繊維の創製とその機能開発

近年、非共有結合性の主鎖を有する超分子ポリマーに関する研究が盛んに行われている。本研究では、多重水素結合で形成される剛直な一次元超分子ポリマー鎖を、緩衝材として働く柔軟でかさ高い置換基で保護して階層性を付与するという分子設計を用い、紡糸により超分子ポリマー鎖が高度に配向した超分子繊維を作製することを目的としている。ヌクレオシドを用いた予備的な実験では、側鎖として柔軟なアルキルシリル鎖を用いたところ、十分な安定性としなやかさを有するマクロスケールの超分子繊維を得ることが出来た。このような階層的な分子設計の汎用性を調べるために、主鎖として三重の水素結合を形成するシクロヘキサントリアミドを用いたところ、アルキルシリル側鎖を導入することでシクロヘキサンがカラム状に集積した柔軟な超分子繊維を得ることができた。またこの系では、主鎖が可逆的に形成されるという超分子ポリマー鎖の特性を利用して、側鎖の嵩高さに基づく交互共重合体の形成という一次配列制御が容易に実現できた。さらに、超分子繊維への機能付与を目指してベンゼントリアミド誘導体およびビフェニルテトラアミド誘導体を合成して溶融紡糸を行い、水素結合に加えて芳香環のπスタック構造を有する一次元超分子ポリマー鎖が、繊維軸方向に高度に配向した超分子繊維を得た。これらの検討を通して、柔軟なアルキルシリル鎖を用いるという本研究の階層的な分子設計指針が、溶融紡糸による超分子ポリマー鎖の高度な軸配向の実現に向けた汎用性のある有効な手法であることを実証し、非共有結合主鎖を持つ超分子繊維の特性・機能をはじめて明らかにした。さらにこの分子設計の応用を検討し、これが結晶やフィルムのようなマクロスケールの超分子構造を階層的に作製する際にも有効に機能することを明らかにし、非共有結合で形成された超分子フィルムなどの作製に成功した。我々は、多重の水素結合により形成される擬似高分子鎖を柔軟な置換基で覆うという分子設計に基づいてグアノシン誘導体を設計し、溶融紡糸により柔軟な超分子繊維を得ることに成功している。分子設計の汎用性を確かめ、さらに、水素結合の多重化による強度の向上を目指して、トリアミドシクロヘキサンが形成する三重の水素結合主鎖の周りを柔軟なアルキルシリル基で囲んだ擬似高分子鎖を設計した。3本のアルキルシリル基を導入した誘導体(1)では、赤外吸収スペクトルにより水素結合主鎖の形成が確認されたが、アルキルシリル基を6本導入した誘導体(2)は液体となり、アルキルシリル基の立体障害により水素結合主鎖が形成されていない事がわかった。1は融点を持たないものの、加熱紡糸により柔軟な超分子繊維を得ることができた。X線回折より計算された配向関数はfc=0.6であり、繊維中での擬似高分子鎖の比較的良い配向性が示されたが、ドメイン形成により水素結合の多重化による強度の向上は成されず破断強度は1MPa程度であった。しかし、水素結合主鎖を変えても同様に柔軟な超分子繊維が得られたことから、この分子設計の有用性が確認された。さらに、単独では全く水素結合を形成しない2においても、1との混合により水素結合主鎖を形成することができ、2の割合が50mol%以下の場合はほとんどの分子が水素結合主鎖形成に関与している。かさ高い2の隣に1が来ることで立体反発が軽減され、1-2-1のセグメントを有する共重合型擬似高分子鎖が形成されたと考えられ、特に等モル混合物においては、さらに交互性の高い交互共重合型擬似高分子鎖の形成が示唆された。

これまでの研究で、共有結合で形成された主鎖を持つ高分子ではなく,一次元多重水素結合により形成された疑似高分子鎖を持つ超分子繊維を溶融紡糸により作製することに成功している。基本となる分子設計の指針は、多重水素結合で形成される擬似高分子鎖が比較的剛直なため、柔軟な置換基でその周囲を覆い、側鎖部位の選択的加熱溶融により、水素結合性疑似高分子鎖を配列させた超分子繊維を作製するというものである。この指針に基づき、塩基間多重水素結合に基づくグアノシン超分子繊維だけでなく、トリアミドシクロヘキサン誘導体間の三重水素結合を利用した超分子繊維を作製しており、この分子設計指針の有効性を実証した。このような超分子繊維は、共有結合性主鎖を持つ高分子材料とは異なる機能・特性の発現が可能であると期待される。そこでその一環として、非共有結合形成の可逆性に着目し、トリアミドシクロヘキサン系超分子繊維を用いた検討から、側鎖の嵩高さを利用した疑似高分子鎖の一次配列制御が容易に実現できることを示した。また新たな機能性付与を目指し、シクロヘキサンを芳香環に変えたベンゼントリアミド誘導体を設計・合成し、分子構造最適化を行ったところ、赤外吸収スペクトルおよびUVの淡色効果から三重水素結合で形成された疑似高分子鎖内でベンゼン環がπスタッキングしていることが確認され、さらに溶融紡糸で超分子繊維とすることができた。X線回折から、溶融紡糸した繊維の軸方向に、ベンゼン環が3.57Å間隔でπスタッキングしていることが示唆され、芳香環がπスタックした疑似高分子鎖を持つ超分子繊維の作製に成功した。これまでの研究で、共有結合で形成された主鎖を持つ高分子ではなく、一次元多重水素結合により形成された擬似高分子鎖を持つ超分子繊維を溶融紡糸により作製することに成功している。基本となる分子設計の指針は、多重水素結合で形成される擬似高分子鎖が比較的剛直なため、柔軟な置換基でその周囲を覆い、側鎖部位の選択的加熱溶融により、水素結合性擬似高分子鎖を配列させた超分子繊維を作製するというものである。また、トリアミドベンゼン誘導体を用い、擬似高分子鎖に、水素結合に加えてπスタック部位を持つ超分子繊維を得た。繊維軸方向への光電子移動といった機能の発現を目指して、πスタック部位を拡張したビフェニルテトラアミド誘導体を設計・合成した。赤外吸収スペクトルおよびUVの淡色効果から、四重の水素結合で形成された擬似高分子鎖内でビフェニル環がπスタッキングしていることが確認された。また、得られた固体は熱可塑性を示し、加熱時にも四重の水素結合は保持されていた。そこで加熱紡糸を行ったところ、柔軟な超分子繊維を得ることが出来た。X線回折から、溶融紡糸した繊維の軸方向にビフェニル環が3.3Å間隔でπスタッキングしていることが示された。分子の対称性を落としたビフェニルにおいてもベンゼンと同様の擬似高分子鎖が得られたことで、今後芳香環をさらに拡張し、光・電子機能材料系へと発展させる可能性を示すことが出来た。
硫黄共存下における炭化鉄の安定的生成と生成速度の調査

これまでに3回の会議を開催し、づきの成果を得た。I.研究内容の検討と課題の探索1)炭化鉄の熱力学:準安定相である炭化鉄の熱力学的研究は少ない。熱力学データ・計算ソフト、数値計算ソフトを購入し、炭化鉄の生成条件を検討した。セメンタイト□相、過炭化鉄□相ともにより正確なデータの測定が必要であるとの結論に達した。2)硫黄の炭化鉄安定化作用とその機構:硫黄の活量、反応ガス種と組成、温度、反応時間について発現機構と効果のさらなる研究が必要である。3)硫黄以外の炭化鉄安定化作用の研究:硫黄と同族の酸素、鋳鉄においてセメンタイトを安定化させる窒素、マンガンについて、炭化鉄安定化作用を研究する。特に、酸素は鉄に対する有害作用がないため研究が期待される。4)炭化鉄生成速度の定式化:既往の浸炭速度、炭素折出速度を調査・討論し、炭化鉄生成反応速度の定式化のために必要な研究項目を探索した。5)炭化鉄の核生成と政調機構解明:炭化鉄の構造は、拡散等について文献調査して、機構解明が必要との結論に達した。6)流動層、移動層による炭化鉄生成プロセス:粉鉄鉱石の流動層、移動層還元プロセスにおける、固着、粉化等が問題となる。これについての研究が必要である。II.平成10年度文部省特定領域研究(B)の申請「地球環境共生型新素材としての炭化鉄の科学と工学」の題目で平成9年12月2日文部省に提出した。III.平成11年度文部省特定領域研究(B)の申請準備特定領域研究(B)の採釈が全体で少数であるので、平成10年度申請書を基にさらに検討を深め、平成11年度申請書を作成した。IV.国際会議での研究成果の発表平成10年3月2225日にカナダ国トロント市で開催される第2回世界性鉄会議で他国の研究発表内容を調査し、同時に我々の成果を発表の予定である。V.特許情報調査炭化鉄関連の特許情報を国内外に渡り調査した。
ゼノフリー治療用ヒトiPS細胞による霊長類歯周組織再生療法への展開

本研究ではフィーダーフリー・ゼノフリーiPS培養法から、歯周組織の起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。マウスの歯根膜組織には神経堤細胞が存在し、その一部は間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRαやCD44が発現していることを確認した。そのため神経堤由来間葉系幹細胞は歯周組織再生療法の有力な細胞供給源になる可能性が示唆された。これらの細胞を実際の歯周病モデルマウスに移植するべく、その疾患モデルマウスの作製とその評価を行った。マウスの大臼歯に絹糸を結紮することで骨破壊を誘導するというきわめて臨床の歯周病に近い歯周病誘発モデルの再現実験を行い、その技術的再現性を確認し移植実験の準備をしている。本研究課題はiPS細胞から歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞を誘導することを研究計画とした。これまでの研究成果は1実際の治療を目的として誘導されたiPS細胞、すなわち治療用iPS細胞を京都大学と提携することによって用いることができるようになった。2治療用iPS細胞を使用することから、培養に用いるフィーダー細胞の使用も課題となっていることから本研究課題の重要なステップとして、フィーダーフリー培養法を確立した。3臨床実用化の重要なステップになる無血清培養法、すなわちゼノフリー培養法でのiPS細胞の維持と神経堤細胞への誘導を実現させた。この123の結果本研究課題の(研究期間に限定されない)最終的ゴールであるヒト歯周組織再生に向けた非常に重要かつ必須のステップとその成功だったと考えている。現在はフィーダーフリー/ゼノフリーの条件で培養した治療用iPS細胞から神経堤細胞に誘導し、その増殖能や分化能に加え、神経堤細胞の重要な性質の一つである遊走能に関してもin vivo実験で評価を行っている。歯周組織は歯肉・歯根膜・歯槽骨・セメント質からなることから、iPS細胞から各々を誘導するのか、あるいは歯のユニットとして誘導するべきなのかについては文献や他の研究協力者と相談し、試行錯誤していく。また、現在歯周組織再生の候補として基礎・臨床研究が進んでいる間葉系幹細胞系統への誘導と分化能については確認できた。さらに誘導幹細胞による歯周組織再生に向けた画像評価法の確立、すなわちサクリファイスすることなく生体外のから移植細胞の生存を確認する方法を検討している。治療用iPS細胞の使用と、無血清培地の使用およびフィーダーなしでの培養法の確立など、概ね順調に推移している。本研究ではヒトiPS細胞を用いた組織再生メカニズムを免疫組織学的手法と画像解析によって明らかにし、安全・確実な歯周組織iPS細胞再生療法を確立する事を目的としている。初年度の研究成果からフィーダーフリー・ゼノフリーiPS培養法から、歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞への誘導も実現していた。2016年度は初年度の研究成果を踏まえ、1組織再生メカニズムを検証する前提として、申請者らがiPS細胞から誘導した神経堤細胞が、組織再生を目的とする歯周組織に存在しているのかを確認・検証を行った。発生学的な観点から歯周組織構築の起源を確認した。神経堤の細胞系譜を追跡できる遺伝子改変マウス(P0Cre/floxed-EGFP)を用いた実験により間葉系幹細胞マーカーであるCD44,CD140a(PDGFRα)などが歯根膜に存在し、それらの細胞の一部はGFPとの共在により神経堤に由来することが示唆された。これは間葉系幹細胞の一部が神経堤に由来するというMorikawa et al., BBRC, 2009にもつながる結果となった。そのため、神経堤由来間葉系幹細胞は歯周組織再構築への有用な細胞源である可能性が示唆された。2そこでヒトiPS細胞から神経堤様細胞を介することで、LNGFR(+)THY-1(+)細胞を誘導作製した(Ouchi et al., Differentiation, 2016)。LNGFR(+)THY-1(+)細胞は過去の報告から有効なヒト間葉系幹細胞マーカーとして報告されている(Mabuchi et al., Stem Cell Reports, 2013)。ヒトiPS細胞由来LNGFR(+)THY-1(+)細胞は組織由来のそれに比較し、より効率良く分離できた。治療用iPS細胞をフィーダーフリー、ゼノフリー状態で培養できている。その状態から歯周組織の発生学的起源であり神経堤細胞を誘導することに成功し、さらにそれらの誘導細胞は間葉系幹細胞の性質を有していることも確認できている。本研究ではヒトiPS細胞を用いた組織再生メカニズムを免疫組織学的手法と画像解析によって明らかにし、安全・確実な歯周組織iPS細胞再生療法を確立することを目的としている。初年度の研究成果からフィーダーフリー・ゼノフリーiPS培養法から、歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞への誘導を実現していた。2016年度はマウスの歯根膜組織には神経堤細胞が存在し、その一部は間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRαやCD44が発現していることを確認した。これは間葉系幹細胞の一部が神経堤にその由来の一部を持つとする我々の過去の報告とも一致している。

そこでヒトiPS細胞から神経堤細胞を介することでLNGFR(+)/THY-1(+)細胞の誘導に成功した(Morikawa, Nakagawa et al., Differentiation, 2016)。LNGFR(+)/THY-1(+)細胞は骨髄における間葉系幹細胞のマーカーとして報告しているものである(Mabuchi, Morikawaa et al., Stem Cell Reports, 2013)。2017年度はこれらの細胞を実際の歯周病モデルマウスに移植するべく、その疾患モデルマウスの作製とその評価を行った。これまでの歯周病モデルは骨を削ることで骨欠損を作製し、そこに移植材料を入れて評価するというものが多かった。細菌感染症による骨破壊が歯周病の実態であるため、我々は2013年に報告されたマウスの大臼歯に絹糸を結紮することでバイオフィルムを蓄積させ、骨破壊を誘導するというきわめて臨床の歯周病に近い歯周病誘発モデルの再現実験を行い、成功した。また、炎症性骨破壊もH-E染色で確認できていることから、神経堤誘導間葉系幹細胞の移植実験を行っている。本研究ではフィーダーフリー・ゼノフリーiPS培養法から、歯周組織の起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。マウスの歯根膜組織には神経堤細胞が存在し、その一部は間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRαやCD44が発現していることを確認した。そのため神経堤由来間葉系幹細胞は歯周組織再生療法の有力な細胞供給源になる可能性が示唆された。これらの細胞を実際の歯周病モデルマウスに移植するべく、その疾患モデルマウスの作製とその評価を行った。マウスの大臼歯に絹糸を結紮することで骨破壊を誘導するというきわめて臨床の歯周病に近い歯周病誘発モデルの再現実験を行い、その技術的再現性を確認し移植実験の準備をしている。今後の予定として、1将来の移植治療を見据えたフィーダーフリー・ゼノフリーの培養方法で間葉系幹細胞、歯および歯周組織の起源細胞である歯原性上皮細胞/間葉細胞への誘導と、そこから歯周組織構成細胞への分化方法を構築する。2マウスとコモンマーモセットの歯周組織および骨欠損モデルを作製する。32のモデルマウスに移植治療を行い、マイクロCT・MRI・発光イメージングを駆使して組織再生様式を解析し、有効性と安全性を評価する予定である。申請者らは実験動物中央研究所理化学研究所(和光)での霊長類コモンマーモセットの歯周組織解析を計画しており正常歯周組織、炎症歯周組織でのマーカー発現を探索する予定である。歯周病学消耗品として抗体などの購入を予定していたが、予定より使用抗体量が若干少なかったためである。抗体等を含めた実験消耗品の購入が少なかったために、次年度使用額が生じました。ほぼ、抗体一本分の費用であり、繰り越された金額はH28年度の使用予定通り進めるつもりである。今年度は組織再生メカニズムを免疫組織学的手法と画像解析によって明らかにしていく予定なので、その解析を行うために適切に使用していく予定です。
機能的電気刺激による対麻痺者の平行棒内歩行再建

脊髄損傷による体麻痺患者を中心とする下肢機能障害者の、機能的電気刺激による歩行機能再建の第1段階として、平行棒内での歩行機能の再建および評価・検討を試みた。研究では、まず、力情報と位置情報を同時にかつ同期して得るために、床反力計とビデオ記録装置の、同期装置を作成した。さらに、刺激装置、制御スイッチおよび制御プログラムから成る、歩行制御システムを構築した。このようにして、構築したシステムで健常者の歩行を解析する一方、下肢の各筋の制御方策(電気刺激パターン)のプロトタイプを、解剖学的知見および健常者歩行の文献資料に基づいて作成した。上記システムを用いて対麻痺患者2名に対して、平行棒内で歩行の再建をおこなった。このとき、床反力と動作軌跡をオンライン計測し、解析した。その結果、現在の機能的電気刺激による歩行では、これまで問題とされていなかった支持脚相に重要な問題が存在することが明らかになった。すなわち、両脚の支持期において、一方の足からもう一方へ荷重移動する際に、荷重移動が不十分であり、これを補うために上肢への依存が大となっていることが、床反力を運動を同時に解析することによって判明した。機能解剖学的に見て、これを改善するためには、体幹への制御も必要であることが示唆された。以上の結果はエム・イ-学会などで口頭発表した。さらに、得られた結果に基づいて、臨床的実用を目指して、杖歩行など次の段階に発展させてゆく計画である。
感染症患者の人権を守るための看護師の倫理的行動に関する研究

これまでの研究成果の一部を論文で公表した。また、HBV(B型肝炎ウイルス)キャリア10名を対象にしたインタビュー調査から得られた質的帰納的分析結果を基に、感染症患者が医療従事者から受けている倫理的配慮に関する質問紙を作成した。質問項目の内容は「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」24項目で、<全くそうではなかった:1いつもそうだった:5>の5段階で回答を得た。また、長谷川ら1)から使用許諾を得て「入院患者の尊厳に関する質問」21項目を含めて質問紙を完成させた。「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」では、医療機関でB型肝炎と診断された当時の状況と、B型肝炎に関する診療で最も現在に近い受診年での状況について回答を得た。調査は2019年2月3月に、HBVキャリアの方々1,152名を対象に実施した。回収数(回収率)205件(17.8%)であった。「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」では、欠損値がなく対応可能なデータは151件で、B型肝炎の診断を初めて受けた年の中央値は1990年、最も現在に近い受診年の中央値は2018年であった。倫理的配慮の違いについて、診断当時と最近との差をウイルコクソンの符号付き順位和検定で分析した結果、差が無かったのは“感染予防に関する日常生活上の指導があった"の1項目のみで、中央値(平均値±標準偏差)は、診断当時が3(2.7±1.3)、最近が3(2.9±1.4)であった。診断当時に比べて中央値が高かったのは、“対応の違いが周りの人にわからないように配慮してくれた" (p=0.003)、“感染させる病気であることをわかりやすく説明してくれた"(p=0.003)等複数みられた。データ分析はまだ途中であり、今後も進めていく。引用文献1)長谷川奈々子太田勝正:患者尊厳測定尺度日本版の開発と信頼性・妥当性の検討,日本看護倫理学会誌,9(1),2017.平成2829年度に実施したインタビュー調査を基に、感染症患者への倫理的配慮に関する質問紙を作成した。平成30年度は、HBVキャリアの方々に対して質問紙調査を実施し、受診時に医療者から受けている倫理的配慮の実態について把握することができた。1.インタビュー調査の結果から得られた、HBVキャリアの医療機関での経験と病気体験が及ぼした影響について論文にまとめ公開する。2.平成30年度に実施した質問紙調査の結果を分析し、標準予防策が日本に導入・普及した年次の前後で、医療機関での経験と病気体験が及ぼした影響にどのような変化があったのかを比較する。結果は日本看護科学学会にて発表し、論文にまとめる。また、HBVキャリアの方々が受けた医療・ケアの性質をデータ分析で明らかにし、論文にまとめる。B型肝炎で療養経験のある成人7名(居住地が東北地方2名、中部地方1名、関東地方2名、四国地方1名、九州地方1名)を対象にインタビュー調査を実施した。対象者の年齢は4060歳代(平均56.7歳,標準偏差8.7歳)で、インタビュー時間は平均83.4分(標準偏差25.1分)であった。インタビュー項目は、「B型肝炎を知った時期ときっかけ・治療処置の内容、感染症治療以外での医療機関利用状況、B型肝炎を知ってから生じた生活の変化・価値観の変化、感染症が原因で医療機関の対応に嫌な思いをした経験、医療従事者の対応で救われた思い、医療機関に求める配慮とその理由について」で、許可を得て録音し、音声データから逐語録を作成した。逐語録にある文章の前後や全体を捉えて対象者が語った意味がわかるようにコード化した結果、計342コードが抽出された。更に、類似した意味内容を持つコードを集めてまとまりを作り、共通の性質に名前を付けカテゴリー分類した。その結果、「B型肝炎を知ってから生じた生活の変化・価値観の変化」では“自分が加害者にならないよう生活行動に気を遣う"など16カテゴリーが抽出され、「感染症が原因で医療機関の対応に嫌な思いをした経験」では“使用物品や扱いが他患者と違うことに対する明快な説明がなかった"など20カテゴリーが抽出された。「医療従事者の対応で、救われた思い」では、“スタンダードプリコーション実施により人にうつす危険性がないので安心した"など11カテゴリーが、「医療機関に求める配慮とその理由」については“他患者と違う物品使用や行動に対して説明が欲しい"など12カテゴリーが抽出された本研究は、差別や偏見を受けやすい感染症患者の人権を守るために必要な看護師の倫理的行動を明らかにするための質問紙調査を予定している。今年度は、人権を守るための看護のあり方を検討するためにB型肝炎で療養経験のある成人にインタビューを実施したが、結果は予想以上の内容の広がりがみられた。平成28年度に実施したインタビュー調査に引き続き、3名のB型肝炎で療養経験のある成人にインタビューを実施した。対象者の居住地は、2名が関西地方、1名は北海道で、年齢はいずれも50歳代であった。計10件の逐語録を意味のある一つの情報ごとに区分した結果、コードは877個に及び、全てのコードをマッピングしてカテゴリー化した。

「HBVキャリア患者が医療機関で受けたポジティブな経験」では、23サブカテゴリー、7カテゴリー、3コアカテゴリーが抽出され、半数である5名以上から抽出されたサブカテゴリーは、<丁寧に説明をしてくれる>、<励ましてくれる>、<不必要な区別はない>、<標準予防策で加害者にならなくて済む>で、カテゴリーは『納得できる説明』、『親身なサポート』、『差別されない』、『病院の感染対策で不安がない』、コアカテゴリーは【適切な医療が受けられた】、【医療の場で人として尊重される】、【自分が加害者にならずに済む】であった。「HBVキャリア患者が医療機関で受けたネガティブな経験」では、42サブカテゴリー、7カテゴリー、2コアカテゴリーが抽出され、5名以上から抽出されたのは、<診療が間違っていた>、<食器を区別されて不快だった>、<理不尽な対応をされた>、<医師の病状説明で不安になった>、<病気の詳しい説明がなかった>、<説明はあったが理解できなかった>、<日常生活の詳しい説明はなかった>、<院内で感染させる不安があった>で、『診療に対して不満があった』、『管理システム上の区別が不快だった』、『医療従事者から配慮のない言動があった』、『説明でショックを受けた』、『病気について理解できなかった』、『感染させる不安があった』、【医療に対して不満があった】、【病気に対して不安があった】であった。他にも「HBVキャリアによる影響」「医療機関に期待すること」についてカテゴリー分類した。本研究は、差別や偏見を受けやすい感染症患者の人権を守るために必要な看護師の倫理的行動を明らかにする質問紙調査を予定している。今年度、新たに得られたデータを交えた10例について、カテゴリーが対象者の発言の意図を表しているかについて、研究者間で一致するまで何度も作業を繰り返し分析したことで、より客観的に信頼性の高い内容となり、カテゴリーにも広がりがみられた。また、質問紙調査の質問項目を作成するうえで基礎的データとなる「HBVキャリア患者が医療機関で受けたポジティブ(ネガティブ)な経験」では、今年度のインタビュー調査対象者3名から得られたコードが新規にカテゴリー化されなかったことから、飽和状態に達したと判断し、インタビュー調査を終了することができた。これまでの研究成果の一部を論文で公表した。また、HBV(B型肝炎ウイルス)キャリア10名を対象にしたインタビュー調査から得られた質的帰納的分析結果を基に、感染症患者が医療従事者から受けている倫理的配慮に関する質問紙を作成した。質問項目の内容は「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」24項目で、<全くそうではなかった:1いつもそうだった:5>の5段階で回答を得た。また、長谷川ら1)から使用許諾を得て「入院患者の尊厳に関する質問」21項目を含めて質問紙を完成させた。「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」では、医療機関でB型肝炎と診断された当時の状況と、B型肝炎に関する診療で最も現在に近い受診年での状況について回答を得た。調査は2019年2月3月に、HBVキャリアの方々1,152名を対象に実施した。回収数(回収率)205件(17.8%)であった。「感染症患者への倫理的配慮に関する質問」では、欠損値がなく対応可能なデータは151件で、B型肝炎の診断を初めて受けた年の中央値は1990年、最も現在に近い受診年の中央値は2018年であった。
植物病原糸状菌の抗ウイルス免疫機構研究のフロンティア

「RNA干渉機構(RNAi)」による菌類ウイルスに対する自然免疫機構(複製阻害)を植物病原糸状菌で総合的に解析し、ウイルス防御機構の研究における植物・動物界に次ぐ第三極の形成を目指す。特に、動植物ウイルス・宿主系では知られていない「新奇RNAウイルス認識機構」、「RNAi誘導機構」、「AGO不要な抗ウイルスRNAi」の分子機構の解明を進め、抗ウイルス機構としての菌類RNAiをより深く理解する。A.宿主菌によるウイルス(分子パターン)認識、防御機構および宿主ウイルス防御への反撃機構の解明1菌類RNAi関連遺伝子のウイルス応答性とその機構解明各種RNAウイルスの感染に対し、クリ胴枯病菌のRNAi鍵因子dcl2, agl2遺伝子の転写レベルで数十倍上昇することを示した。この現象が、白紋羽病菌では起こらないことを、明らかにした。クリ胴枯病菌では、RNAi誘導による干渉作用が生じる2種のウイルスの組み合わせを用いたが、白紋羽病菌では干渉作用は起こらず、共感染を許容した。2子のう菌によるウイルス認識・RNAi誘導機構クリ胴枯病菌dcl2, agl2の各種ウイルス感染による誘導は、本菌の核酸(分子パターン)認識機構の存在を強く示唆する(植物ではこのような大幅な発現上昇は認められない)。この認識・誘導機構の解明は3つのアプローチで進める。申請者らは、ウイルス感染応答性プロモーター領域の同定、関連宿主因子のスクリーニング系の開発・同定に成功した(Andika et al., PNAS, 2017)。B RNAウイルス/宿主菌の新奇せめぎ合いの解明ウイルス由来RNAi抑制蛋白質の作用点の解明を目指し、CHV1 p29と相互作用する因子の同定を進めるため、組み替えp29抗体を作成した。GHP標識p29、wt p29相互作用性因子免疫沈降により同定していく。p29相互作用性宿主因子の同定には、困難も予想されるが、2種類の交代を用いて推進していく。A.宿主菌によるウイルス認識、防御機構および宿主ウイルス防御への反撃機構の解明H29年実施予定の課題のうち2、3は継続して行う。認識・誘導機構の解明は3つのアプローチとして、機能性Flag-DCL2、Flag-AGL2を用いて、相互作用する宿主あるいはウイルス蛋白質の網羅的探索を進める。同定される相互作用性因子は、標的破壊、相補試験に回す。ウイルス感染によるRNAi誘導あるいはDCL2、AGL2によるポジティブフィードバックに関与するに関与する因子の同定が期待される。4自然免疫としてのRNAiのマイコウイルスの宿主域限定要因になっているか?これまで、クリ胴枯病菌標準菌株(EP155)で安定的に維持不能なウイルス2種、単分節型dsRNAウイルス(RnVV1)と11分節型dsRNAウイルス(MyRV2)を同定している。これらのウイルスが分離された野外菌株と標準菌株の間でウイルス感染によるRNAi誘導レベルが異なるという予備試験結果を得て、RNAi機構が宿主域を限定している仮説を立てている。これを、実証すべく申請書図6に示したレポーターアッセイ、課題1で同定される因子の菌株間の配列比較、さらには比較ゲノム解析を行う。B RNAウイルス/宿主菌の新奇せめぎ合いの解明申請書課題3を引き続き進め、抑制蛋白質と相互作用する宿主因子の標的破壊、相補試験を実施し、機能解析を行う。

認識・誘導機構の解明は3つのアプローチとして、機能性Flag-DCL2、Flag-AGL2を用いて、相互作用する宿主あるいはウイルス蛋白質の網羅的探索を進める。同定される相互作用性因子は、標的破壊、相補試験に回す。ウイルス感染によるRNAi誘導あるいはDCL2、AGL2によるポジティブフィードバックに関与するに関与する因子の同定が期待される。4自然免疫としてのRNAiのマイコウイルスの宿主域限定要因になっているか?これまで、クリ胴枯病菌標準菌株(EP155)で安定的に維持不能なウイルス2種、単分節型dsRNAウイルス(RnVV1)と11分節型dsRNAウイルス(MyRV2)を同定している。これらのウイルスが分離された野外菌株と標準菌株の間でウイルス感染によるRNAi誘導レベルが異なるという予備試験結果を得て、RNAi機構が宿主域を限定している仮説を立てている。これを、実証すべく申請書図6に示したレポーターアッセイ、課題1で同定される因子の菌株間の配列比較、さらには比較ゲノム解析を行う。B RNAウイルス/宿主菌の新奇せめぎ合いの解明申請書課題3を引き続き進め、抑制蛋白質と相互作用する宿主因子の標的破壊、相補試験を実施し、機能解析を行う。
人為起源物質の制御にはたすリスク評価と管理手法の役割

本年度は6つの個別研究課題について研究をすすめるとともに,研究課題に関連する研究動向の把握のために,格子をまねいて研究交流をおこなった.まず第1課題である「リスク概念の発生経緯と環境政策との係わりの解明」について,文献およびヒヤリング調査により確率論史からみたリスク概念の発生経緯としてベルヌーイ論文をとりあげ,現代的意義について検討した.第2課題「リスクの発生・伝搬構造の解明」については,都市における物質循環をシステム論および経済学の観点から考察することによって,リスク要因を生起せしめる社会経済構造の特質を明らかにするための方法論的検討および予備的なデータ収集・解析を行なった.第3課題「リスクの被害構造の解明」については,日常生活において人々が人為起源物質とどのようにつきあっているかの実態把握として,美容員の顧客を対象にして大規模アンケート調査を実施した.第4課題「先端技術リスク評価の理念と枠組み:リスク評価支援システムにむけて」では,バイオテクノロジに代表される先端技術のリスク分析の特徴と枠組みを明らかにするとともに,評価支援システムの開発にむけて基本的機器の購入をおこなった.第5課題「リスク管理手法と経済合理性」については,自然現象由来のリスクと比較して,人為的要素が強く被害発生の不確かな場合のリスク管理手法の特質についてゲーム論的考察を加えるとともに,関連事例の収集を行なった.最後に第6課題「リスク管理法制の方向づけ」については,関連分野の専門家のヒヤリング調査によって,人為的要素の強い場合のリスク管理法制を構想する場合の留意点について検討した.本年度は6つの個別研究課題について研究をすすめるとともに,研究課題に関連する研究動向の把握のために,格子をまねいて研究交流をおこなった.まず第1課題である「リスク概念の発生経緯と環境政策との係わりの解明」について,文献およびヒヤリング調査により確率論史からみたリスク概念の発生経緯としてベルヌーイ論文をとりあげ,現代的意義について検討した.第2課題「リスクの発生・伝搬構造の解明」については,都市における物質循環をシステム論および経済学の観点から考察することによって,リスク要因を生起せしめる社会経済構造の特質を明らかにするための方法論的検討および予備的なデータ収集・解析を行なった.第3課題「リスクの被害構造の解明」については,日常生活において人々が人為起源物質とどのようにつきあっているかの実態把握として,美容員の顧客を対象にして大規模アンケート調査を実施した.第4課題「先端技術リスク評価の理念と枠組み:リスク評価支援システムにむけて」では,バイオテクノロジに代表される先端技術のリスク分析の特徴と枠組みを明らかにするとともに,評価支援システムの開発にむけて基本的機器の購入をおこなった.第5課題「リスク管理手法と経済合理性」については,自然現象由来のリスクと比較して,人為的要素が強く被害発生の不確かな場合のリスク管理手法の特質についてゲーム論的考察を加えるとともに,関連事例の収集を行なった.最後に第6課題「リスク管理法制の方向づけ」については,関連分野の専門家のヒヤリング調査によって,人為的要素の強い場合のリスク管理法制を構想する場合の留意点について検討した.
化学物質の新規甲状腺ホルモン様作用評価系開発のための基礎的研究

本研究ではヒト培養細胞を用い、受容体と緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質の分解に伴う蛍光強度の低下を指標として、甲状腺ホルモンが甲状腺ホルモン受容体タンパク質を特異的に分解することを明らかにした。蛍光強度の低下は甲状腺ホルモン濃度に依存し、さらに血液中の甲状腺ホルモン濃度程度でも検出可能であったことから、このバイオアッセイ系は、既存の甲状腺ホルモン受容体および甲状腺ホルモン応答因子を介した転写活性化を用いた系よりも鋭敏な指標となる可能性が示唆された。本研究は、(1)甲状腺ホルモン受容体とGFPの融合タンパク質を用いて、分解に伴うGFPの蛍光強度の変化を指標とした新規バイオアッセイ系を構築し、このバイオアッセイ系を用いて、農薬や食品添加物、食品含有物質等による甲状腺ホルモン系への影響を明らかにすること、(2)甲状腺ホルモン受容体について、リガンド結合後の受容体の分解過程及び甲状腺ホルモン受容体による転写活性化との関連を明らかにすることを目的としている。平成21年度は上記目的のために、まず、ヒト甲状腺ホルモン受容体α1(TRα1)の全長cDNAとGFP(green fluorescent protein)cDNAを接続した真核細胞発現プラスミドを作成した。さらにG418耐性遺伝子を挿入し、HeLa細胞、HEK293細胞およびNIH3T3細胞へ導入した。constitutiveにTRα1とGFP融合タンパク質を発現する細胞株、またコントロールとしてGFPのみをconstitutiveに発現する細胞株をG418耐性により選択後、蛍光測定装置を用いて蛍光強度の最も高い細胞株を以後の実験に使用した。またHEK293細胞に導入した場合、蛍光強度が最も高かったことから、バイオアッセイにはHEK293細胞、及びHEK293由来の細胞株を使用することにした。これまで申請者はTRα1を高発現したHeLa細胞を用い、甲状腺ホルモン受容体を介した転写活性化を指標として種々の化学物質の甲状腺ホルモン様作用について検討してきた。そこで、次にHEK293細胞における至適T3濃度を検討した。HEK293細胞においてtransientにTRα1とGFPの融合タンパク質を発現させ、種々のT3濃度の影響を検討した結果、ルシフェラーゼ活性を指標とした転写活性化は以前の結果とほぼ同様であったが、融合タンパク質の分解は以前の研究結果より低濃度で濃度依存的に引き起こされることが明らかになった。現在、受容体タンパク質の分解を指標に、これまで受容体の転写活性化を指標としたバイオアッセイ系では甲状腺ホルモン様作用が明確でなかった化合物について検討しているところである。本研究は(1)甲状腺ホルモン等リガンドが甲状腺ホルモン受容体に結合することにより受容体タンパク質が分解する過程を利用した新規バイオアッセイ系の構築、(2)リガンド結合による甲状腺ホルモン受容体の転写活性化と受容体タンパク質分解との関連、(3)(1)のバイオアッセイ系を利用し農薬や食品添加物、食品含有物質等の有する(抗)甲状腺ホルモン(様)作用を明らかにすることを目的としている。平成22年度はヒト甲状腺ホルモン受容体α1(TRα1)とGFP(green fluorescent protein)の融合タンパク質(TR-GFP)をtransientにHEK293細胞で発現させ蛍光測定装置を用いて蛍光強度を測定した結果、甲状腺ホルモン濃度依存的にGFPの蛍光強度が減少することを明らかにした。特に蛍光強度の減少は血清遊離甲状腺ホルモン濃度と同程度の低濃度においても観察され、TR-GFPの蛍光強度の減少を指標としたバイオアッセイ系は申請者がこれまで行ったルシフェラーゼ活性を指標とした甲状腺ホルモンによる転写活性化よりも感度が優れている可能性が示唆された。さらに蛍光顕微鏡を用いTR-GFPの細胞内での挙動を検討した結果、甲状腺ホルモン添加により蛍光が消失することを確認した。また、これまで甲状腺ホルモン受容体の転写活性化を指標としたバイオアッセイ系では甲状腺ホルモン様作用が明確でなかったフタル酸ジエチルヘキシルについてTR-GFPの分解を検討した結果、フタル酸ジエチルヘキシル添加により蛍光強度が有意に減少すること、血中濃度と同程度の甲状腺ホルモンを同時に作用させることによりTR-GFPの蛍光強度はさらに減少することから、フタル酸ジエチルヘキシルによる甲状腺ホルモン様作用が示唆された。そこで現在、他の内分泌攪乱化学物質や農薬、食品添加物などについてTR-GFPの分解を指標として(抗)甲状腺ホルモン様作用を検討するとともに、蛍光顕微鏡を用いてリガンド添加に伴うTR-GFPの細胞内挙動を詳しく検討しているところである。本研究は(1)甲状腺ホルモンや甲状腺ホルモン受容体に結合することができるリガンド様作用を有する化学物質が受容体に結合後、受容体タンパク質が分解する過程の解明、(2)(1)における受容体タンパク質の分解を利用した新規バイオアッセイ系の開発、(3)(2)のバイオアッセイ系を利用し農薬や食品添加物、食品含有物質の有する(抗)甲状腺ホルモン(様)作用を明らかにすることを目的としている。平成23年度はtransientにHEK293細胞で発現させたヒト甲状腺ホルモン受容体α1(TRα1)とGFP(green fluorescent protein)の融合タンパク質(TR-GFP)の蛍光を指標として、甲状腺ホルモン添加による蛍光強度の低下がTR-GFPタンパク質のプロテアソームを介した分解によるものか否かについて、プロテアソーム阻害剤であるMG132を使用して検討した。

数nM数μM程度のMG132は培養細胞内でプロテアソームを阻害するとされているが、本バイオアッセイ系においては、25nM MG132を甲状腺ホルモンと同時に添加することにより、甲状腺ホルモンによるTR-GFPの蛍光強度の低下を抑制した。高濃度の場合はMG132による細胞障害が認められたが、本研究により甲状腺ホルモンによるTR-GFPの分解にはプロテアソーム系が関与することが示唆された。さらに、MG132による蛍光強度の低下抑制効果が甲状腺ホルモン添加時期により異なることから、現在、甲状腺ホルモンと受容体タンパク質の結合と分解の時間経過等に関してより詳しく検討している。また、輸入食品等から違法農薬として検出されている化学物質の中で内分泌系への影響が懸念されるatrazineについて、甲状腺ホルモン系への影響を従来の甲状腺ホルモン受容体の転写活性化を指標としたバイオアッセイ系において検討した結果、甲状腺ホルモンによる転写活性化をさらに増強することを明らかにした。現在この化合物に関してもTR-GFPの分解に及ぼす影響を検討している。