hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高圧下における元素の超伝導化の研究

本研究の目的は、「高温超伝導」の機構解明と「室温超伝導」の実現につながる物質設計の指針を得ることにあり、以下の6項目について今年度の成果を記載する。1.水素の超高密度圧縮実験水素を超高圧下まで封止が可能な電気測定用のガスケットの開発し、約20万気圧の圧力保持に成功した。低温液化水素充填装置による水素封入も安定動作を確認した。2.軽金属元素の超伝導リチウムに次ぐ軽元素金属であるベリリウムの超伝導の圧力効果について30万気圧まで測定した。常圧で約30ミリケルビンの極低温度の超伝導転移温度は加圧によって1ケルビンを超えることを明らかにした。3.磁性金属元素の超伝導探索イッテリビウムについて電気抵抗測定を行い約30万気圧までの範囲においては超伝導転移または磁性転移は起こさないことがわかった。ユーロピウムの高圧下の超伝導性が試料・純度・圧力状態の依存性が大きいことがわかった。4.超高圧下のX線構造解析水素リッチなペロブスカイト型化合物についてその高圧力下結晶構造をSPring-8の超高圧実験ステーションおいて測定した。詳細な構造決定には至っていないが僅かな構造変化を捉えそれが高圧下での電気伝導度変化に起因すると解析した。5.結晶構造と超伝導の理論予測6.圧力発生技術開発ダイヤモンドアンビルの台座側のデザインを変更し到達圧力を向上した。またナノ多結晶ダイヤモンドを用いて大容量試料空間において3050%の高圧力発生に成功した。物性研究において高圧力がもたらす効果は枚挙にいとまがない。物質内の原子間距離を直接的に操作しうる圧力は、結晶構造を変化させるのみならず、これに伴って物質の性質を大きく変える。金属化や超伝導化といった劇的変化がよい例である。常圧力の条件下では超伝導にならない元素も圧力下で超伝導が発現している例がいくつも報告されている。圧力が誘起する量子相転移や、新物質・新機能の創成を目指して高圧下の物性研究が行われてきていた。超高圧力が誘起する超伝導はその極限環境がエキゾチックと思われがちであるが、ありふれた元素を舞台に起こる超伝導現象にこそ「超伝導」理解の本質があると考え、本研究計画を立案した。高温超伝導の機構解明と室温超伝導の実現につながる物質設計の指針を得ることを目的として元素の超伝導化を追求する。未踏の超高圧力下で室温超伝導が理論予測されている水素の金属化と超伝導化を究極の目標として、超高圧力の発生と低温下での物性測定技術を開発して、元素における超伝導現象の普遍性や可能性を追求する。(新超伝導元素の発見)α-ホウ素において初めて超伝導を発見した。160万気圧の超高圧下で転移温度は約6ケルビンであり、これはβ-ホウ素と比較してやや高温である。ホウ素の正20面体クラスター構造の超高圧下の安定性や超伝導の圧力効果の解明に今後結びつく成果である。(超高圧下の電子・結晶構造同時解析)金属水素のモデルの一つとして注目する超高密度のリチウムにおいて、理論予測されている高密度ペアリング構造の探索を行った。SPring-8の放射光X線を用いた結晶構造解析と電気抵抗測定を超高圧・低温下同時計測を可能にし、リチウムの構造変化と超伝導および電気的性質を測定した。約80万気圧以上で半導体へ電気的性質が変化することを発見した。これはペアリング相の出現を示唆するものである。(超高圧下結晶構造と超伝導の理論設計)カルシウムは元素で最も高い超伝導転移温度を示すが、メタダイナミクスと第一原理計算を組み合わせたシミュレーションを開発し、カルシウムの複雑構造であるIV相およびV相の構造探索を行いそれぞれが螺旋変調構造、ジグザグ変調構造となることを明らかにした。(新圧力発生技術開発)近年合成された最も硬いとされる多結晶ナノダイヤモンドをアンビルとして使用して超高圧力発生限界を探った。発生圧力の他アンビルの変形をSPring-8の放射光X線を用いて測定した。およそ200万気圧までの発生に成功し、アンビル先端の変形情報を得た。(測定技術の微細化)超高圧発生のため加工サイズの微細化は必須の開発項目であり、集束イオンビーム(FIB)加工装置およびマニピュレータを導入した。これによって試料の整形と測定電極のダイヤモンドアンビル先端への直接描画、ガスケットの上の試料室の整形をミクロンサイズで行うことを可能にした。(軽金属元素の超伝導)元素の中で2番目に軽いベリリウムにも、超高圧力下での高い超伝導転移温度が期待できる。ベリリウムの超伝導転移温度は1気圧での転移温度がおよそ25ミリケルビンであり、その検出は1気圧下でも強力な冷凍機が必要であった。圧力依存性を約10万気圧まで探索したが、圧力依存性はわずかであるかまたは負であることを示唆するデータを得ることができた。(液化ガス元素実験)寒剤充填装置は冷凍能力を予定より増強することとし4ケルビン(ヘリウムの液化温度)まで冷却可能な仕様とした。寒剤(窒素、酸素)をはじめ水素を超高圧状態まで安定して加圧保持するため、従来使用してきた窒化ホウ素のみのガスケットを変更し、食塩の混合による新しいガスケット材料の開発に成功した。(反強磁性金属元素の超伝導探索)反強磁性体のユーロピウムの圧力誘起超超伝導を発見した。

反強磁性転移温度の圧力依存性は低圧では小さく、加圧とともに電気抵抗測定での検出は困難になったが、超伝導発現後の転移温度の圧力依存性は正であることがわかった。また、αマンガンにおいて超伝導を観測には至っていないが、反強磁性転移温度の圧力依存性を検出するために微細なひずみゲージを作製しその検出を可能にした。(圧力発生技術開発)新規に合成されたNPD(ナノ多結晶ダイヤモンド)の超高圧実験用アンビルへ応用し、200万気圧を超える圧力の発生に成功した。SPring-8のビームラインに導入した長焦点ラマンプローブによって、同時にアンビル先端部の圧力分布および変形データを取得した天然ダイヤモンドや高純度人工ダイヤモンドなどとの比較を行った。(水素の超高密度圧縮実験)寒剤充填装置に水素充填用加圧装置を装着し、水素を高圧装置(ダイヤモンドアンビルセル)に封入して加圧実験を試行した。SPring-8において高圧下のX線回折実験と下記に示す光学装置によってラマン分光測定を同時に実施した。他グループの先行実験を検証した。上回る圧力発生は達成しなかったが、より精密な電気抵抗や構造研究の準備を完了できた。(軽金属元素の超伝導)リチウムの超伝導-半導体転移を発見しこの結果はNature誌に掲載された。25Kを超える超伝導転移温度を発生するカルシウムの160GPa以上の高圧構造について新構造を複数発見した。下記の理論グループの計算から予測される構造に一致した。(磁性金属元素の超伝導探索)ユーロピウムの反強磁性転移の消失と超伝導転移の発現を詳細に調べるために、圧力分布の少ない微細電極によって電気抵抗測定を行った。イッテリビウムについても30GPa付近まで超伝導探索を行った。(超高圧下のX線構造解析)SPring-8の超高圧実験ステーションにX線屈折レンズと搭載用ゴニオメータを導入した。これによって軽元素のX線とラマン分光などの光学測定との同時測定を可能になった。水素の超高密度構造解析とラマン分光実験を低温下で同時に達成した。(結晶構造と超伝導の理論予測)超高圧下のカルシウムの結晶構造と超伝導転移温度について第一原理電子状態計算によって予測した。上記の通り、実験結果を非常に良く説明かつ予測できた。(圧力発生技術開発)人工ナノ多結晶ダイヤモンドのアンビルとしての応用の可能性を調べるため、超高圧加圧試験を行った。比較的大容量で高圧が達成できることを明らかにした。(中間研究会の開催)中間研究会を開催し、これまでの研究成果の総括と後半の研究計画を策定した。本研究の目的は、「高温超伝導」の機構解明と「室温超伝導」の実現につながる物質設計の指針を得ることにあり、以下の6項目について今年度の成果を記載する。1.水素の超高密度圧縮実験水素を超高圧下まで封止が可能な電気測定用のガスケットの開発し、約20万気圧の圧力保持に成功した。低温液化水素充填装置による水素封入も安定動作を確認した。2.軽金属元素の超伝導リチウムに次ぐ軽元素金属であるベリリウムの超伝導の圧力効果について30万気圧まで測定した。常圧で約30ミリケルビンの極低温度の超伝導転移温度は加圧によって1ケルビンを超えることを明らかにした。
脊椎椎間板の形成・維持を担う分子メカニズムの解析

我々は、腱・靭帯に特異性の高い発現を示し、腱形成に必須の転写因子としてMkxを同定しているが、このMkxは椎間板線維輪においても発現し、Mkxノックアウトマウスでは、加齢と共に椎間板の変性が見られることを明らかにした。ヒト線維輪細胞を用いてMKXをノックダウンさせると、SCXやTNMDなどの靭帯関連遺伝子の発現が低下し、軟骨分化のマスター制御因子であるSOX9の発現が上昇した。さらにC3H10T1/2細胞においてMkxを過剰発現させた細胞では、腱・靭帯関連遺伝子の発現が増大し、軟骨分化、骨分化を抑制することを明らかにした。脊椎椎間板は、椎骨を結合し脊柱を構成する組織であり、その加齢、力学的負荷による変性・損傷は椎間板ヘルニアなどを引き起こし、患者に激痛を与え、日常生活に大きな制限をあたえる。この椎間板の損傷・変性は、栄養血管が少ないこともあり、その治癒力は非常に弱く、再生が困難であり、新しい再生医療技術の発展が望まれている。そのため治療法の開発に向けて基盤となる分子レベルでの研究が急務とされている。しかしながら、椎間板の発生・分化における遺伝子制御機構についてや、これら組織の変性メカニズムは、未だにほとんど不明である。申請者らは、E9.5、10.5、11.5のマウス胚において、遺伝子発現(転写)のスイッチである約1,500個の転写因子・転写コファクターのWhole-mount in situhybridization(WISH)データベース"EMBRYS" (http://embrys.jp/)を構築し、時空間特異的な発現制御により成り立っている個体発生における、複雑な遺伝子ネットワーク解明の足がかりとなるシステムを作り上げた。このデータベースを基に、腱・靭帯に特異的な遺伝子としてホメオボックス遺伝子であるMohawk (Mkx)を同定し、このMkxが腱の形成に重要な転写因子であることをノックアウトマウスの解析により明らかにしている。本年度はノックアウトマウスの椎間板を電子顕微鏡で解析し、野生型と比較して椎間板線維輪外輪のコラーゲン細線維の径が小さくなっていることを見出した。さらに椎間板の経年的な変化をmicro CT及び組織学的に検討し、野生型と比較してノックアウトマウスは腰椎が変形性脊椎症様の変化を示すこと、椎間板組織の変性が進行することを見出した。以上の結果からMkxは脊椎椎間板線維輪の形成、また椎間板変性に重要な働きを持っている可能性が示唆された。このデータベースを基に、腱・靭帯に特異的な遺伝子としてホメオボックス遺伝子であるMohawk (Mkx)を同定し、このMkxが腱の形成に重要な転写因子であることをノックアウトマウスの解析により明らかにした。さらに、本年度はその詳細な解析の中から、我々はMkxが脊椎椎間板の靭帯様組織である、線維輪の細胞に発現していることを見出した。また、Mkxノックアウトマウスでは野生型と比べて椎間板を構成する線維輪の線維束が不明瞭になっていることを見出した。以上の結果から、Mkxが腱の形成のみならず脊椎椎間板の形成、保持を司る働きを持っている可能性が示唆された。脊椎椎間板は、椎骨と結合し脊柱を構成する組織であり、加齢や力学的負荷による椎間板の変性・損傷は、椎間板ヘルニアなどを引き起こし、患者に激痛を与え、日常生活に多大な影響を及ぼす。椎間板の損傷・変性は、栄養血管が少ないことからその治癒力は非常に弱く、再生が困難であり、新たな再生医療技術の開発が望まれており、治療法の開発に向けての基盤となる分子メカニズムの解明が急務とされている。しかしながら、椎間板の発生における遺伝子ネットワークやこれら変性メカニズムは未だ殆ど分かっていない。

我々は、約1500個の転写因子、転写コファクターのWhole-mount in situhybridization (WISH)データベースEMBRYSを構築し、腱・靭帯に特異性の高い発現を示す転写因子としてMohawk homeobox (Mkx)を同定し、このMkxが腱形成に必須の転写因子であることをノックアウトマウスの解析により明らかにしているが、このMkxは椎間板線維輪においても発現し、Mkxノックアウトマウスでは、加齢と共に椎間板の変性が見られることを明らかにした。ヒト線維輪細胞を用いてMKXをノックダウンさせると、SCXやTNMDなどの靭帯関連遺伝子の発現が低下し、軟骨分化のマスター制御因子であるSOX9の発現が上昇した。さらにC3H10T1/2細胞においてMkxを過剰発現させた細胞では、腱・靭帯関連遺伝子の発現が増大し、軟骨分化、骨分化、脂肪分化を抑制することを明らかにした。以上のことからMkxは、他の細胞系への分化を抑制し、線維輪の恒常性維持に重要な遺伝子であることが示された。システム発生・再生医学分野研究において支障はなく、ほぼ計画通りに進めることができた。研究において支障はなく、ほぼ計画どうりに研究をすすめることができたため。Mkxの遺伝子改変マウス由来の線維輪細胞あるいはMkxを過剰発現させた培養細胞系を用いて、Mkxが発現を制御する遺伝子のスクリーニングを行う。取得した候補遺伝子については、ChIPアッセイやルシフェラーゼアッセイによる細胞ベースの実験と、Mkxノックアウトマウス、トランスジェニックマウスを用いた発現解析により、候補遺伝子がMkxの標的遺伝子であるかについて調査する。Mkxの椎間板発生・変性における機能を明らかにするために、Mkxを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製する。Mkx遺伝子座を含むBACクローンを用いて、Red/ETシステムによるrecombinationを行い、Mkx翻訳開始点の5'上流部分にFlagタグをノックインしたBACプラスミドを作製し、これを用いたBACトランスジェニックマウスを作製する。上記で作製したトランスジェニックマウスとMkxノックアウトマウスについて、トレッドミルを用いた運動負荷モデルマウス、加齢マウス、または針の刺入による椎間板変性モデルを作製し、椎間板線維輪の組織切片を作製し、Mkx発現上昇または減少による変性への影響について調査する。
癌特異的遺伝子異常を利用した肺癌患者血清による新しい遺伝子診断

本研究ではDNAのCpG配列のメチル化を特異的に検出できるmethylation-specific PCR(MS-PCR)法を用いてその特異性と感度を高めるととによって微小転移の検出が可能であるかについて検討した。(1)初めにMS-PCR法の検出感度・特異性に関して検討した。メチル化DNAの希釈系列を作成した後、DNAをSodium bisulfite処理し、DNAのチミンをウラシルに変換した。CpG配列でのチミンはメチル化されているとウラシルには変換されないことを利用し、p16遺伝子のプロモーター領域のメチル化を特異的に検出できるプライマーを設計してPCRをおこない検出感度と特異性を調べた。特異性と感度を高めるためにnested PCRとし、2nd PCRではアニーリング温度を高く(72°C)設定した。更に各サイクル時間を短くし(15秒)且つサイクル数を多くした(35サイクル)。その結果メチル化DNAを10^<-6>まで希釈したサンプルでもp16遺伝子のプロモーター領域のメチル化を検出することが可能となった。(2)次に完全切除された50例の原発性非小細胞肺癌の原発巣でのメチル化の有無を検索した。凍結保存された肺癌と正常肺組織からDNAを抽出し、Sodium bisulfite処理をおこなった後にMS-PCR法を用いてp16遺伝子プロモーター領域のメチル化の有無を検索した。正常肺でもメチル化が検出される症例を対象から除外すると原発性肺癌43例中18例(41.9%)でメチル化が検出された。(3)現在手術前後の血清からDNAを抽出し上記の方法で血清中に含まれるメチル化遺伝子の検出を試みている。またp16遺伝子のみではメチル化の頻度が高くないことから今後は他の遺伝子(MGMT、DAP kinase、RASSF1A遺伝子など)も利用して検索を進める予定である。肺癌切除後再発死亡の原因の1つとして従来の診断法では検出できない微小転移の存在が考えられている。本研究は術前或いは術後の血液から効果的に微小転移を検出し、再発ハイリスク症例を選別する方法を確立することが目的である。癌に特異的な遺伝子変異検索の方法としてmutant-allele specific amplification法(MASA法)が開発されている。以前に我々は肺癌切除症例においてP53遺伝子変異を検索し、変異を有する症例のうちpathological N0症例を対象としてMASA法を用いてリンパ節微小転移の有無と予後との関係をretrospectiveに検討した。その結果MASA法で転移陰性の症例は全例生存しているのに対して、陽性の症例は高率に再発死亡しており、MASA法での微小転移検出は予後を推定するうえで非常に有用であることが明らかになった。肺癌組織および患者血清からのDNAの採取・保存および実験での使用にあたっては当院において遺伝子倫理申請を行い、それに基づきインフォームドコンセントを得ている。同意の得られた症例を対象にするために現在も腫瘍組織および手術前後の血清の採取と保存、そしてDNAの抽出をおこなっている。また、DNAのメチル化を特異的に検出するmethylation-specific PCR(MS-PCR)法も最近開発された。現在、p16遺伝子を用いたMS-PCR法で微小転移の検出が可能であるかを検討する目的でp16遺伝子のプロモーター領域でのprimerの設計とPCR条件の決定、検出感度に関する検討、および原発巣でのmethylationの有無を検索中である。
Ca2+を標的とする骨肉腫の新規な治療法の基礎研究

骨肉腫細胞のカルシウム流入に対するミトコンドリアカルシウム(MCA)変調剤の作用:プラズマ照射液(PSM)は細胞質内カルシウム(CCA)及びMCAを上昇させたが、CCAが濃度依存的に上昇するのに対してMCAの増加効果はPSM濃度の増加とともに減少した。TRAILもCCAならびにMCAを増加させたが、その効果はPSMに比べて弱かった。一方、膜脱分極作用を持つKCl、グリベンクラミド、U37883AはCCAを減少させ、両者の併用はより著しく減少させた。これらの結果からMCAの増加は、ミトコンドリアのカルシウムリザーバー機能によるものだけではないと考えられた。またPSMはストア依存性カルシウム流入(SOCE)を強く抑制した。TRAIL及び膜脱分極剤も単独でSOCEを抑制し、両者の併用ではより強い抑制効果が見られた。PSMが持続的な膜電位の脱分極を強く誘発することから、MCA変調には、(1)SOCEとは別の膜電位依存性輸送経路からのカルシウム流入が起きること、(2)この経路の活性化はSOCEを抑制することが示唆された。MCA変調による骨肉腫細胞死のメカニズム解析: MCA変調によってアポトーシスが誘発されるかどうかを検討するため、Annexin V及び7-actinomycin D (7-AAD)染色後にフローサイトメトリーで解析した結果、Annexin V陽性細胞は全く増加しなかった。カスパーゼ-3/7活性化は検出されたが、カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKは全く細胞死を抑制しなかった。ネクロトーシス特異的阻害剤necrostatin-1は一部の細胞株でのみ細胞死を有意に抑制した。これらの細胞では、ネクロトーシス誘発に必要なRIP1/3のリン酸化が刺激後10分から検出されたことから、ネクロトーシスが活性化されることが明らかとなった。おおむね順調に進捗している。理由:本年度はMCA変調による骨肉腫細胞死の機序の解明が大きな目標であったが、細胞死の機序と同様に重要な課題としてなぜMCA変調が生じるかを明らかにする必要があった。二つの異なるMCA変調剤(PSMとTRAIL/膜脱分極剤)をモデルに用いて解析を行った結果、SOCE抑制がMCA変調に共通に寄与することが明らかにできた。さらに、このSOCE抑制には膜電位依存性カルシウム輸送経路からのカルシウム流入によるCCA及びMCAの増加が付随することが示唆されたことから電位差依存性カルシウムチャネルの関与が考えられ、次年度の課題と考えられる。細胞死のモードに関しては、アポトーシスではなくネクロトーシスが関与することを明らかにできた。しかし、ネクロトーシスの特異的阻害剤の効果は限定的であるため、このモードが決定的な因子かどうかはまだ不明である。一方、オートファジーは細胞保護的に働き、PSM及びTRAIL/膜脱分極剤による細胞死のメディエーターではないことが示された。MCA変調による骨肉腫細胞死におけるパラトーシス、フェロトーシスの関与の検討:ネクロトーシス様細胞死の一つであるパラトーシスはカルシウム依存性であることが報告されており、MCA変調による細胞死ではパラトーシスの形態学的特徴であるミトコンドリア及び小胞体の膨潤ならびに細胞質の空包化が観察されることから有力な候補である。また、MCA変調による細胞死は活性酸素依存性であることをすでに報告したが、鉄依存性細胞死であるフェロトーシスも活性酸素が重要なメディエーターであることから、この関与も考えられるので鉄キレート剤や特異的阻害剤フェロスタチン1が細胞死に影響するかどうかを検討する。MCA変調による骨肉腫細胞死におけるミトファジーの関与:骨肉腫細胞では細胞死刺激がなく、飢餓が起きない条件下においても多数のオートファゴソーム斑点とLC3-IIの発現が観察され、オートファジー阻害剤はこのオートファジーフラックスを抑制する一方で、細胞死を誘発した。さらに、オートファジーの抑制はMCA変調剤(PSMとTRAIL/膜脱分極剤)による細胞死及びミトファジーを著しく増強した。これらの結果は、マクロオートファジーが細胞保護的に働くのに対してミトファジーは細胞死の誘発に関与することを示唆する。ミトファジーはミトコンドリアの膜電位消失によって誘発され、その分裂によって起こるが、MCA変調はこれらの細胞内イベントを誘導することから、ミトファジーの過剰活性化が細胞死の重要なメディエーターである可能性が想定されるのでこの仮説を検証する。MCA変調による骨肉腫細胞死のメカニズム

解析: MCA変調によってアポトーシスが誘発されるかどうかを検討するため、Annexin V及び7-actinomycin D (7-AAD)染色後にフローサイトメトリーで解析した結果、Annexin V陽性細胞は全く増加しなかった。カスパーゼ-3/7活性化は検出されたが、カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKは全く細胞死を抑制しなかった。ネクロトーシス特異的阻害剤necrostatin-1は一部の細胞株でのみ細胞死を有意に抑制した。これらの細胞では、ネクロトーシス誘発に必要なRIP1/3のリン酸化が刺激後10分から検出されたことから、ネクロトーシスが活性化されることが明らかとなった。おおむね順調に進捗している。理由:本年度はMCA変調による骨肉腫細胞死の機序の解明が大きな目標であったが、細胞死の機序と同様に重要な課題としてなぜMCA変調が生じるかを明らかにする必要があった。二つの異なるMCA変調剤(PSMとTRAIL/膜脱分極剤)をモデルに用いて解析を行った結果、SOCE抑制がMCA変調に共通に寄与することが明らかにできた。さらに、このSOCE抑制には膜電位依存性カルシウム輸送経路からのカルシウム流入によるCCA及びMCAの増加が付随することが示唆されたことから電位差依存性カルシウムチャネルの関与が考えられ、次年度の課題と考えられる。細胞死のモードに関しては、アポトーシスではなくネクロトーシスが関与することを明らかにできた。しかし、ネクロトーシスの特異的阻害剤の効果は限定的であるため、このモードが決定的な因子かどうかはまだ不明である。一方、オートファジーは細胞保護的に働き、PSM及びTRAIL/膜脱分極剤による細胞死のメディエーターではないことが示された。MCA変調による骨肉腫細胞死におけるパラトーシス、フェロトーシスの関与の検討:ネクロトーシス様細胞死の一つであるパラトーシスはカルシウム依存性であることが報告されており、MCA変調による細胞死ではパラトーシスの形態学的特徴であるミトコンドリア及び小胞体の膨潤ならびに細胞質の空包化が観察されることから有力な候補である。また、MCA変調による細胞死は活性酸素依存性であることをすでに報告したが、鉄依存性細胞死であるフェロトーシスも活性酸素が重要なメディエーターであることから、この関与も考えられるので鉄キレート剤や特異的阻害剤フェロスタチン1が細胞死に影響するかどうかを検討する。MCA変調による骨肉腫細胞死におけるミトファジーの関与:骨肉腫細胞では細胞死刺激がなく、飢餓が起きない条件下においても多数のオートファゴソーム斑点とLC3-IIの発現が観察され、オートファジー阻害剤はこのオートファジーフラックスを抑制する一方で、細胞死を誘発した。さらに、オートファジーの抑制はMCA変調剤(PSMとTRAIL/膜脱分極剤)による細胞死及びミトファジーを著しく増強した。これらの結果は、マクロオートファジーが細胞保護的に働くのに対してミトファジーは細胞死の誘発に関与することを示唆する。
ヨーロッパ学校衛生論史研究

本研究の目的は、欧米における「学校衛生」の歴史的展開を、とくにその「精神衛生」化の過程に焦点を合わせて明らかにすることである。学校衛生の「精神衛生」の過程を凝縮したかたちを示す事例を、われわれは、1904年から1913年にかけて4回にわたり開催された「学校衛生国際会議」の展開と転回に見出した。そこで、「学校衛生国際会議」記録の分析を綿密に実施し、その成果を軸に、学校教育の「衛生」化・「精神衛生」化のプロセスを詳細に跡づけることができた。成果として、「学校衛生」の歴史的特異性に関する分析を含む、最終報告書(102頁)を刊行した。2.連携研究者1名をフランス・パリに派遣し、人口衛生史研究者との情報交換、および史料調査・蒐集のため、現地調査研究を実施した。3.「学校衛生国際会議」の学校衛生論の裾野を成す英・仏・独における学校衛生論の歴史的展開について、英・仏・独それぞれを専門とする連携研究者との共同研究会を開催した。研究会においては、第一にフランスでの情報交換・資料調査の成果が報告され共有されるとともに、第二に、学校衛生(思想)史に直接関連する二つの先行研究についての報告と討論が行なわれた。一つは、S・パレール『フランス学校衛生史:18-19世紀』(2011)。もう一つは、Stephen Petrina“The Medicalization of Education: A Historiographic Synthesis"(2006)。1. 1904年に第1回が開催された「学校衛生国際会議」(International Congress on School Hygiene)について、1907年ロンドンで開催された第2回、1910年にパリで開催された第3回、そしてアメリカ合衆国バッファローで1913年に開催された第4回まで、それら会議録(Transactions)の目次をほぼ網羅的に整理することができた。特に、第2回・第4回に関しては、会議録全ての蒐集を完了した。その内容の精査により、第4回学校衛生国際会議において、「精神衛生(Mental Hygiene)」が前面化・全面化してきたこと、およびその中心にWilliam Henry Burnham(クラーク大学)の存在があったことが浮かび上がっている。2.連携研究者2名をロンドンおよびベルリンにそれぞれ派遣することができ、これにより、1.で述べた会議録の調査・整理、および「学校衛生国際雑誌」(International Magazine of School Hygiene)の第9巻までの蒐集・整理が可能となった。3.学校衛生論の歴史的展開について、英・仏・独を専門とする連携研究者との共同研究会を開催した。研究会においては、ロンドンおよびベルリンでの史料調査の成果が報告され共有された。ウェルカム医学史図書館での史料調査にもとづき、Arthur Newsholmeを中心にイギリス学校衛生論の動向が報告され、教育史研究図書館での史料調査にもとづき、「学校衛生国際雑誌」第6巻第9巻の概要と、ドイツ学校衛生史に直接関連する先行研究(Bennack, J., Gesundheit und Schule: Zur Geschichte der Hygiene im preussischen Volksschulwesen, 1990)についての報告と討論が行われた。1. 1904年に第1回が開催された「学校衛生国際会議」の会議録(International Magazine of School Hygiene)および1907年に開催された第2回学校衛生国際会議の会議録(Second International Congress on School Hygiene: Transactions"(1908)の目次整理を行い、史料分析の前提作業を終えた。また、1891年にロンドンで第7回会議が開催された「世界衛生会議」中の学校衛生が主題とされたものを、その会議録(Transactions of the seventh international congress of hygiene and demography (Vol. iv: infancy, childhood and school life), 1892)から抽出した。2.「学校衛生国際会議」の学校衛生論の裾野を成す英・仏・独における学校衛生論の歴史的展開について、英・仏・独それぞれを専門とする連携研究者との共同研究会を計2回開催した。第1回研究会においては、今回科研課題の趣旨および「学校衛生国際会議」史料の分析作業成果が共有された。第2回研究会においては、19世紀以降に誕生する「学校衛生(school hygiene)」概念を身心思想史のなかに位置づけることの重要性に鑑みて、英・仏・独それぞれの身心思想史(身心医学史・社会衛生史を含む)に関する先行研究について情報の交換と共有が行われた。その中で、19世紀イギリス公衆衛生改革におけるエドウィン・チャドウィックに関する報告、19世紀イギリス骨相学(Phrenology)の衛生観に関する報告、1900年前後のフランスにおける人口衛生政策に関する報告が行われ、学校衛生(思想)史に直接関連する先行研究に関する情報交換が行われた。

蒐集した史資料の整理と分析を行い、最終報告書『ヨーロッパ学校衛生論史研究』(平成27年3月刊行、全102頁)としてまとめ刊行した。その主な内容は、以下のようである。1904年にドイツのニュールンベルクで第1回会議が開催された学校衛生国際会議(International Congress on School Hygiene)は、その後、第2回が1907年にイギリスのロンドン、第3回が1910年にフランスのパリ、そして第4回が1913年にアメリカ合衆国ニューヨーク州のバッファローで開催された。第1章では、この一連の会議記録における言説展開を分析し、「学校衛生(school hygiene)」概念の展開を跡づけ、第2回会議を変曲点として第4回会議において教育の「精神衛生(mental hygiene)」化の湧溢・前面化が見られ、それによって「学校衛生」の転回と全面化が成立した次第を明らかにした。そのさい、「忘れられた心理学者・教育パイオニア」ウィリアム・H・バーナム(1855-1941)の役割を浮かび上がらせた。第2章では、この「学校衛生」概念が身体と精神を包括するプロセスの歴史的特質に照明をあてるため、対比的に、18世紀以前の養生論の構造を基層・古層として提示することを試みた。第3章では、第2回ロンドン会議で参加・報告を行ったアーサー・ニューズホーム(1857-1943)の学校衛生論に関して、彼の著作『学校衛生(School Hygiene)』(1887年)を中心として詳細に分析した。第4章では、第1回学校衛生国際会議開催に際して初代会長に就任した、ヘルマン・アドルフ・グリースバッハ(1854 - 1941)の1907年第2回ロンドン会議での講演「医学と教育学の関係」の全訳を試み掲載した。また、研究成果として、蒐集・分析した史料の主なものについて、以下の3つの内容から成る「資料篇:学校衛生国際会議関連資料」をデータベースとして作成した。(1)学校衛生国際会議(14)会議録目次、(2)学校衛生国際雑誌1-9〈1905-1914〉目次、(3)学校衛生論著作目次一覧。教育史2年目としては、研究対象の中心にある「学校衛生国際会議」(International Congress on School Hygiene)の第3回・第4回の開催が確認でき全容が見えてきた点で、見通しが開けてきた。また、学校衛生(思想)史に直接関連する先行研究についても、十分に依拠することのできるものについて検討し得、特に2011年刊行のフランス学校衛生史通史が見出せたことは大きい。これは、フランスでの現地調査の成果の一つでもある。次年度において、蒐集資料の分析および先行研究の検討・整理が進み、かつさらなる史料の蒐集が現地調査も含め進展することが期待される。
薬剤耐性遺伝子に関するmicroRNAを用いた悪性脳腫瘍に対する分子治療の研究

今回我々は、microRNAと薬剤耐性遺伝子との関係に着目し、脳腫瘍の治療薬であるTMZに対する薬剤耐性遺伝子であるMGMTの発現量に関わるmicroRNAを同定し、その治療効果への影響および内因性のMGMT発現調節機能として薬剤耐性に関わる重要性を調べた。・薬剤耐性遺伝子MGMTを抑制しうるmicroRNAの絞り込み:種々のデータベース(microRNA.org、miRbase、Target Scan)を用いて、MGMTのメッセンジャーRNA(mRNA)の3'-UTRに対して相補性を持つmicroRNAを割り出し、予想される結合力、動物種間の保存性の高いものからMGMTの発現を抑制しうる可能性をもつmicroRNAを6候補に絞り込んだ。これらのmicroRNAをリポフェクション法で脳腫瘍細胞株に強制発現させたところ、MGMTのmRNAおよび蛋白レベルにおける発現をそれぞれ40%および60%抑制していた。・MicroRNAのMGMT mRNA 3'-UTRへの直接結合の確認:MicroRNAとMGMTのmRNAが直接結合していることを確認するため、プラスミドベクター上のMGMT mRNA 3'-UTRのmicroRNA結合部位を変異させたMGMT発現ベクター(mutMGMT)を用い、内在性MGMT発現のない脳腫瘍細胞株にmicroRNAとmutMGMTの両者を発現させ、mutMGMTがmicroRNAにより発現抑制されないことをRNAレベルおよびタンパクレベルにおいて示した。この結果より、microRNAが予想されていたmRNAに直接結合して翻訳抑制されていることが証明された。なお、本年度の実施計画にあるmicroRNAによる細胞への影響(増殖能、遊走能、アポトーシスなど)の評価は目下進行中である。今回我々は薬剤耐性遺伝子を標的とするmicroRNAを同定し、microRNAの関与する脳腫瘍の薬剤耐性取得機構を明らかにし、化学療法や放射線療法に対する治療効果の向上をめざしている。MicroRNAとMGMTのmRNAが直接結合していることを確認するため、プラスミドベクター上のMGMT mRNA 3'-UTRのmicroRNA結合部位を変異させたMGMT発現ベクター(mutMGMT)を用い発現させ、mutMGMTがmicroRNAにより発現抑制されないことを示した。この結果より、microRNAがmRNAに直接結合して翻訳抑制されていることが証明された。現在、microRNAによる細胞への影響(増殖能、遊走能、アポトーシスなど)の評価を行っている。本研究計画の目的の一つに、microRNAがmRNAと結合することによって翻訳抑制する性質を利用して、薬剤耐性遺伝子であるMGMTの発現量を抑制することにより、脳腫瘍のテモゾロマイドに対する感受性を増加させ、より効果的な化学療法の治療効果の向上がある。その候補となるmicroRNAを絞り込み、実際に薬剤耐性遺伝子MGMTの発現抑制をきたすmicroRNAを同定できた。次に、実際にどれぐらい感受性向上に効果があるかを調べるために、microRNAがMGMTのmRNAに結合して、直接作用していることを示すのは非常に重要であり、本年度の研究成果からMGMTの3'-UTRに結合していることを確認できた。これにより、他の物質を介さず、microRNAが直接MGMTの発現量を調節していることが示され、臨床応用において重要なデータが得られた。また、細胞の癌化や増殖に関係している新たな物質として(pro) renin receptor ((P)RR)についてもグリオーマで検討を行っており、新しい分子標的治療として期待ができると考えている。microRNA(miR-655)がMGMTのmRNAを6割程度に発現抑制していた。さらにmiR-655を過剰発現させると、蛋白レベルでもMGMTの発現抑制が認められた。MGMTのmRNAとmir-655は直接結合していことを確認し、細胞株T98GにmiR-655を過剰発現させると、TMZに対する感受性が濃度依存性に亢進した。In vivo脳腫瘍モデルを用いても、miR-655がTMZ感受性を向上させ、マウスの生存期間延長を来たした。本年度においては、まずその候補となるmicroRNAを絞り込み、実際に薬剤耐性遺伝子MGMTの発現抑制をきたすmicroRNAを同定できた。このmicroRNAはRNAレベルで40%、蛋白レベルで70%の発現を抑制できることがわかっており、この抑制率をもって実際にどれぐらい感受性向上に貢献できるかが今後の研究課題である。また、microRNAがMGMTのmRNAに結合して、直接作用していることを示すのは非常に重要であり、データベースより予想された通り、本年度の研究成果からMGMTの3'-UTRに結合していることを確認できた。現在、増殖、遊走、アポトーシスを中心に、このmicroRNAが細胞に与える影響を評価中である。現在進行中のmicroRNAが細胞に与える影響(増殖、遊走、アポトーシス)を継続して評価していく。

さらに、このmicroRNAによる脳腫瘍細胞株のテモゾロマイド感受性向上の確認をin vitroにおいて行う。具体的にはリポフェクション法を用いて一過性にmicroRNAを脳腫瘍細胞株に過剰発現させ、MGMTが発現抑制された状態で、テモゾロマイドに対する感受性が向上しているかを評価する。このリポフェクション法がうまくいかない場合には、CMVレンチウィルスを用いてmicroRNAを安定発現させた細胞株を樹立し、同様のテモゾロマイドに対する感受性試験を行う。In vitroにおけるmicroRNAのMGMT発現抑制効果を確認できた時点で、レンチウィルスを用いてmicroRNAを安定発現させた脳腫瘍患者細胞株を免疫不全マウス(Athmic nude)の脳内に定位装置を用いて移植する。この脳腫瘍モデルにPBSを腹腔内投与したコントロール群において、microRNAがホストマウスの生存期間に悪影響を及ぼさないことを確認しつつ、テモゾロマイド腹腔内投与群においてはin vivoにおいてもmicroRNAが脳腫瘍細胞のテモゾロマイド感受性を向上させ、ホストマウスの生存期間延長を来たすことを確認する。感受性の確認方法としては、Caplan-Meier法を用いた生存期間の比較や、一定期間ごとの脳組織切片を用いた体積比較を予定している。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経外科現在進行中のmicroRNAが細胞に与える影響(増殖、遊走、アポトーシス)を継続して評価していく。今後このmicroRNAを臨床応用するにあたり、考慮すべき基礎となるデータであり、慎重に評価を行う。その結果を踏まえた上で、このmicroRNAによる脳腫瘍細胞株のテモゾロマイド感受性向上の確認をin vitroにおいて行う。
歯周炎浸潤T細胞の網羅的解析による結合組織・骨組織破壊機構の解明

歯周炎は臨床的には結合組織破壊と歯槽骨の吸収で、免疫組織学的には多数のB細胞・形質細胞の浸潤で特徴づけられるが、多数のT細胞も認められる。我々はそれらの一部は自己抗原を認識し、自己反応性の応答が歯周炎の病態形成に重要な役割を演じていることを明らかにした。近年、形態的・機能的に異なる様々なT細胞サブセットが免疫応答の調節に複雑に関与していることが明らかになってきた。そこで、歯周疾患感受性の決定に深く関わっていると考えられる歯周炎局所のT細胞に関して免疫学的・分子生物学的手法を用いて網羅的に解析した。その結果、免疫組織学的検索から歯周炎局所に浸潤しているCD4陽性のT細胞の一部はCTLA-4とCD25を発現していることが明らかになった。このCD4^+CD25^+CTLA-4^+T細胞はregulatoryT細胞のphenotypeであり、B細胞の浸潤が強くなるのに伴って比率の上昇が見られた。また、遺伝子レベルではnaturalregulatory T細胞マーカーとされるFOXP3、1L-10,TGF-βの発現が歯周炎組織で上昇していた。さらに、別の制御性T細胞集団であるNKT細胞も歯周炎における免疫制御に関与し、その機能はB細胞上に発現するCDld分子によって制御されていることが示唆された。さらに、局所に浸潤している細胞の機能を詳細に検討するため、歯周炎組織から多数のT細胞クローンを樹立し、それらの遺伝子発現とCD4^+CD25^-T細胞の増殖に及ぼす影響についても検索した。ほとんどのT細胞クローンはTh1,Th2いずれのサイトカインおよびマウスにおけるnatural regulatoryT細胞のマーカー分子であるFOXP3遺伝子を発現していたが、骨吸収に関わるIL-17,RANKLについては患者間で発現しているT細胞クローンの頻度に差が見られた。これまでの歯周炎局所のT細胞が発現する受容体遺伝子の解析からは歯周ポケット内細菌叢の複雑さを考慮すると比較的限られた種類の抗原を認識することがわかっていたが、同じ受容体レパートリーを持つT細胞が胸部・腹部動脈瘤の組織からも検出され、歯周炎と動脈硬化症の関連についても示唆された。本年度は歯周炎局所よりT細胞クローンを樹立し、遺伝子発現を検討した。歯周炎患者より歯周外科処置時に歯肉組織を採取し、酵素処理と比重遠心法で単核細胞を分離した。末梢血からも同様に単核細胞を分離し、Alloフィーダー細胞存在下で抗CD3抗体とIL-2を加えて限界希釈法によりT細胞クローンを樹立した。3名の歯周炎患者から歯肉T細胞クローン57個、末梢血T細胞クローン101個についてRT-PCR法によりCD25,CTLA-4,FOXP3,IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β1,IL-17,RANKLのmRNA発現を検討した。また、T細胞クローンのmRNA発現が歯肉局所におけるmRNA発現を反映しているかどうかを調べるために歯周外科処置時に得られた組織から直接RNAを抽出してRT-PCR法を行った。歯肉組織、末梢血それぞれから樹立されたT細胞クローンのほとんどがCD4陽性であった。歯肉由来T細胞クローンではそれらのすべてでCD25、CTLA-4、TGF-β1のmRNAが検出された。

一方、末梢血由来のT細胞クローンではIFN-γとTGF-β1 mRNAの発現率が100%であった。IL-4 mRNA発現は歯肉由来のT細胞クローンにおいて末梢血由来T細胞クローンより陽性率が低かったが、CD4+CD25+制御性T細胞のマスター遺伝子と考えられているFOXP3と抑制性サイトカインであるIL-10の発現率は歯肉由来のT細胞クローンで高かった。歯肉サンプルのIL-4 mRNA陽性率は歯肉T細胞クローンの陽性率と比較して低かった他はmRNA発現の割合に大きな違いはなかった。以上より、抗CD3とIL-2による非特異的方法により樹立されたT細胞クローンは炎症歯肉組織の病態を反映した集団であることが示唆された。昨年度に確立した方法に準じて歯肉組織由来CD4^+T細胞クローンを樹立し、FOXP3およびCD25の遺伝子発現が陽性であるものを選択して実験に供した。また、末梢血から比重遠心法と磁気細胞分離システムを用いてCD4^+CD25^+T細胞とCD4^+CD25^-T細胞を分離し、以下の実験を行った。機能的解析としては、抗原提示細胞存在下で、CD4^+CD25^-T細胞とCD4^+CD25^+T細胞またはFOXP3陽性T細胞クローンと共培養し、P.gingivalis外膜蛋白または抗CD3抗体、抗CD28抗体を抗原として刺激した。CD4^+CD25^-T細胞の増殖活性をトリチウム-チミジン法にて測定した。同時に培養上清中のIL-2,IL-10,TGF-βの産生量をELISA法で測定した。その結果、FOXP3陽性T細胞クローンのフローサイトメトリーによる解析では、CD25の発現は陽性、CTLA-4、GITR、CD103の発現は陰性であった。CD4^+CD25^+T細胞とCD4^+CD25^-T細胞の集団のFOXP3遺伝子発現の定量解析では、CD4^+CD25^+T細胞で有意にFOXP3遺伝子発現量が高かった。末梢血由来CD4^+CD25^+T細胞はCD4^+CD25^-T細胞の増殖活性を有意に減少させた。対照的に、歯周炎組織由来FOXP3陽性T細胞クローンはCD4^+CD25^-T細胞の増殖活性を有意に増加させた。サイトカイン産生量については歯肉T細胞クローンにおいてIL-2の産生がCD4^+CD25^+T細胞と比較して有意に高かったが、IL-10,TGF-βについて差は見られなかった。歯周炎組織から分離したFOXP3陽性T細胞クローンは制御性の性質を示さず、ヒトにおいてはFOXP3が必ずしもCD4^+CD25^+制御性T細胞のマスター遺伝子にはなり得ない可能性が示唆された。
社会的包摂を志向する公衆衛生看護の原理に基づくロジック・モデルの開発

地域社会の人間関係の希薄化・縮小化により育児や介護、災害や転居、独居や死別など、いつでもどこでも誰にでも社会的排除のリスクが存在する。社会的包摂の推進は国策の喫緊の課題である。住民のよりよく生きる権利を守るために社会の包容力を志向することは保健師の責務である。現代社会における弱者を包容する地域づくりに取り組む保健師の実践知から社会的包摂を志向する公衆衛生看護の概念構造(原理)を解明し、原理に基づくロジック・モデルを開発する。先ず社会的包摂を志向した保健師の活動の好事例を発掘し、それらの概念構造(原理)を検討し、領域別にロジック・モデルを考案する。最終的にはモデルの実践への適応可能性を担保する。
インフラストラクチャーからみるラオスにおける都市空間の生成に関する人類学的研究

本研究の目的は交通インフラ整備にかかわる事業主体と、利用主体である人々、そして交通インフラそれ自体とが結ぶ諸関係に注目することで、ラオス首都ヴィエンチャンの都市化の過程を明らかにし、民族誌的に記述することである。平成28年度は、日本文化人類学会第五十回研究大会で口頭発表を行ったほか、愛知大学で行われたワークショップ「マテリアリティの政治と「インフラ論的展開」:社会の近代性を支えるヒトーモノへの問い」にコメンテーターとして参加したことで、社会学や歴史学などの隣接分野におけるインフラ研究の近年の動向と人類学的なアプローチを比較検討することができた。これらの研究者との交流を通じて、道路や水道、橋といった物質的基盤それ自体を研究の対象とすることと、ヒトや知識などをインフラとしてみるということによって、従来の西洋近代的なインフラの捉え方を問い直すという異なる視点から「インフラ研究」の有効性について検討する機会を得ることができた。平成28年度の達成目標は、交通インフラとその整備事業に、シンボリックにもマテリアルにも織り込まれている「ラオスにおける(創造的)発展」の様態について、言説分析とフィールドワークを通して明らかにすることであった。そのため7月から9月にかけてラオス首都ヴィエンチャンに滞在し、ラオス国公共事業運輸省などの関連省庁及び公文書館、ラオス国立社会科学院で資料収集を行い、インフラ整備事業に関わる省庁職員や国際援助機関の職員、コンサルタントへの聞き取り調査を行った。フランス植民地期に近代的な公共事業の概念がラオスへ紹介されて以来、1975年以降の社会主義体制を経て、外国からの援助の時代とも呼べる現在に到るまで、ラオスにおける「発展」や「近代化」の意味づけやそれらを象徴するモノのあり方は、変化しながら歴史的に重層的になっており、各層を構成する要素間の複雑な関係を考察した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではラオス首都ヴィエンチャンにおける交通インフラに注目することで、都市化の過程を明らかにし、それを民族誌的に記述することを目的としている。平成27年度は、日本文化人類学会第四十九回研究大会(大阪)、第845回東京都立大学・首都大学東京社会人類学研究会(東京)、International Union of Anthropological and Ethnological Sciences (IUAES) Inter-Congress(タイ・バンコク)での口頭発表、また関連する研究会や国際ワークショップに参加し、国内外の研究者たちとの意見交換を通して、本課題が飽くまで具体的な実体を持つ対象としてきたインフラストラクチャーについて、その概念的な含みについての理論的な検討を行った。その結果、道路や橋といった個別の施設を、モノ、あるいは一つの科学技術として注目することと、システム、あるいはネットワークとしてみることとの差異が明らかとなった。とりわけインフラを通して都市の生成過程を明らかにしようとする本研究課題にとってこの差異は重要な気づきである。平成27年度の研究の達成目標は、個別のインフラ施設が持つ象徴性について理解することであった。そこで平成27年12月から平成28年3月までは、インフラへの注目を通して、都市(生活)と人、国家と人との関係、そしてヴィエンチャンの都市計画史についての調査をラオス首都ヴィエンチャンで行った。ラオス国公共事業運輸省の職員、新たに道路整備を行っている地域の住民にインタビューを行ったほか、ラオス国内の新聞社二社、公文書館、フランス国立極東学院ヴィエンチャン支部で資料収集を行った。個別のインフラ施設に注目したこれらの調査結果を近年の人類学、科学社会論の諸研究に照らし合わせながら、上述の理論的な問題についてさらなる検討を行う必要性が確認された。平成27年度の調査では、当初の計画での現地調査中の訪問予定地にはなかった公文書館へのコネクションを作ることができ、また今後の調査にとって重要となるラオス国立社会科学院からの受け入れ許可を得ることができたため、平成27年度の研究は計画以上に進展していると言える。

フランス植民地期に近代的な公共事業の概念がラオスへ紹介されて以来、1975年以降の社会主義体制を経て、外国からの援助の時代とも呼べる現在に到るまで、ラオスにおける「発展」や「近代化」の意味づけやそれらを象徴するモノのあり方は、変化しながら歴史的に重層的になっており、各層を構成する要素間の複雑な関係を考察した。平成28年度は引き続き現地調査と分析、理論的課題の検討を行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。
システイン合成系破綻動物を用いた腎尿細管機能に及ぼす含硫アミノ酸代謝の役割の解明

硫黄を含むメチオニンをシステインに代謝する経路の2酵素Cystathionine β-synthase (CBS)とcystathionine γ-lyase (CSE)の欠損は,前者は重篤な病態だが,後者は顕著な症状はない。マウスでは両酵素は肝臓や腎近位尿細管に強く発現するが,本件は不明点の多い腎での生理的役割を探索した。CBS欠損マウスでは毒性の高いメチオニンの尿中排泄の効率が低いのに対し,CSE欠損マウスではCBSによる代謝物の排泄効率が高く,両者の病態差に関わると考えられた。また一見正常なCSE欠損マウスでも妊娠高血圧腎症様の病態があった。両酵素は血管弛緩因子の硫化水素を産生するが,腎内の硫化水素は両酵素の発現部位に高濃度に存在しており,病態への関与が考えられた。システイン生合成経路の2酵素Cystathionine β-synthase(CBS)とCystathionine γ-lyase(CTH)の欠損は,前者(ホモシスチン尿症)が重篤な症状であるのに対し,後者(シスタチオニン尿症)は顕著な臨床症状はない。本課題では欠損マウスを用い,両酵素が発現する腎近位尿細管での役割を探る。NBD-F(同人化学)アミノ酸ラベル法によるHPLCで血中および尿中アミノ酸濃度の比較し,再吸収率を算出したところCBS欠損ではほとんどの中性アミノ酸の再吸収率が低下し,過剰排泄されるが,血中で特に過剰なメチオニンの再吸収率は野生型並であること,CTH欠損では血中に蓄積するシスタチオニンは効率よく排泄されることから,含硫成分排泄の差が両欠損の表現型の違いに結びつくと考えられた。硫黄排泄の90%以上は尿への硫酸排泄によるが,その尿中量は,CBS欠損では野生型並だが,CTH欠損では検出されず,余剰を硫酸に依らずに排泄することが裏付けられた。メチオニンによる再吸収障害を実証するため腎尿細管の中性アミノ酸トランスボーターB_0AT1とその補助因子であるCollectrinとACE2をクローニングし,その発現ベクターを作成し,培養細胞への導入を開始した。また,CE-TOF-MS,クーロアレイ,GCを用いて腎ホモジネート中の低分子代謝物のメタボローム解析を行ったが,組織中でもCBS欠損では高メチオニン,CTH欠損は高シスタチオニンであることが確認されたが,肝臓では減少するGSHと硫化水素レベルは腎臓では野生型と同等であり,虚血再灌流による尿細管壊死の観察でも顕著な差はなかった。一方新たにCTH欠損妊娠メスに蛋白尿と高血圧を同時に発症する妊娠高血圧腎症様の病態を見だしたが,一連の結果は細胞障害に依らない脆弱性を考えていく上で重要である。システイン生合成経路の酵素で、硫化水素産生酵素でもあるCystathionineβ-synthase (CBS)とCystathionine γ-lyase (CTH)の欠損は、前者(ホモシスチン尿症)が重篤な症状であるのに対し、後者(シスタチオニン尿症)は顕著な臨床症状はない。本課題では両酵素の遺伝子欠損マウスを用い、両酵素が発現する腎近位尿細管での役割を探る。前年度までの計画により、各酵素の欠損マウスにおけるアミノ酸排泄異常が示され、CTH欠損マウスでは余剰硫黄成分がシスタチオニンとして効率良く排泄されるのに対し、CBS欠損マウスではメチオニンが体内蓄積に蓄積するが、硫黄排泄の90%を占める尿中への硫酸排泄は正常であることが示されている。CE-TOF-MS、クーロアレイ、GCを用いた低分子硫黄代謝物のメタボローム解析の結果、高メチオニン食投与マウスではトランスアミレーション経路が活性化し、トランススルフレーション経路による硫黄代謝が代償されることを示した(発表論文2)。トランスアミレーション経路では毒性のあるメチルメルカプタンが産生され、CBS欠損のメチオニン蓄積による病態に関与すると考えられる。各欠損マウスのGSH、硫化水素レベルは肝臓では著減するが、腎臓では野生型と同等に維持されており、腎臓虚血再灌流による尿細管壊死の観察でも顕著な差を見出すことできなかったが、新たにCTH欠損妊娠メスに蛋白尿と高血圧を同時に発症する妊娠高血圧腎症様の病態が見出され、さらにGCによる硫化水素計測では、腎臓は主要臓器で最も硫化水素レベルが高いことから、未だ未知の腎臓における硫化水素産生の生理的役割に注目した。

血管拡張因子である硫化水素の腎内分布を解明するため、腎臓組織切片をスタンプした銀蒸着板をTime of flight secondary ion mass spectrometry(TOF-SIMS)により表面解析することで、銀との反応性が高い硫化水素やハロゲン分子をイメージングする手法を新たに構成し、腎臓皮質-髄質外帯外層の硫化水素レベルが高いことを示した(発表論文1)。