hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食肉の品質安全管理のための電位計測式食肉鮮度センサの開発

1.食肉を構成する蛋白質から食肉の鮮度劣化に伴って、水素イオン、酸化還元物質、硫化成分などの濃度変化が予想される。これらの物質には既に化学センサが用意されているので、食品の鮮度管理用のマルチチャンネル化学センサによる食肉鮮度センサの構築は可能となるものと考えられる。そこで、本研究では、このような考えに基づき、化学センサによる食肉の鮮度劣化を判定する方法の開発のための基礎的検討を行うことを目的としている。2.食肉10gを超純水200mlに1分間浸し、食肉を取り除いた溶液を水抽出試料溶液とした。この溶液に校正済みのpHセンサ及びNH_<4^+>センサ、S^<2->センサ、及び酸化還元(ORP)電極を浸し、これらのセンサを浸せきしてから12分後の4本のセンサの指示値を同時測定した。これらセンサは、電気化学計器株式会社製の液体膜型アンモニウム電極、6154型ORP電極、固体膜型硫化物イオン電極、ノンリーク塩化銀内極6157-W型pH電極をそれぞれ用いた。20°C、10°C及び5°Cで保存した豚肉を食肉の試料として用いた。また、この水抽出試料溶液を希釈し、その10μlをフードスタンプ標準寒天培地に塗り広げ、10°Cの場合は5日間、5°Cの場合は13日間培養後の細菌数をコロニーカウント法により求めた。3.10°Cで保存した豚肉を用いた場合の、水抽出試料中に浸せきしたORP電極とS^<2->イオンセンサの電位変化に及ぼす豚肉の保存機関の影響を検討した。保存期間が長くなるにつれて、ORP電極の電位は著しく低下した。これは、豚肉中の蛋白質が微生物によって分解されたため、酸化還元物質の濃度が増加したためだと推測される。しかしながら、S^<2->センサを用いて同様の実験を行った場合には、豚肉の保存期間が510日の間には、保存期間とS^<2->センサの電位との間には明瞭な相関が認められなかった。このことから、S^<2->イオンは豚肉の鮮度劣化を追跡するための化学種として適当でないことがわかった。10°Cで保存した豚肉を用いた水抽出試料中のpHとNH_<4^+>濃度変化に及ぼす豚肉の保存期間の影響を検討した。豚肉の保存期間が長くなるにしたがって、pH値及びNH_<4^+>濃度は増加する傾向を示した。ついで、10°Cで保存した豚肉を用いた水抽出試料のpH値及び細菌数に及ぼす豚肉の保存期間の影響を検討した。保存期間が長くなるにつれてpH及び細菌数のいずれも増加し、pH値と細菌数との間には明瞭な相関性が認められた。一方、5°Cで保存した豚肉を用いた場合も、10°Cで保存した豚肉を用いた場合と同様の実験を行ったが、ORP電極及びS^<2->センサの電位、pHおよびNH_<4^+>の濃度変化と保存期間には明瞭な相関性は認められず、ORPセンサ及びS^<2->センサの電位とPhおよびNH_<4^+>の濃度変化は、5°Cで保存した豚肉の鮮度劣化の示標とはなりえないことがわかった。これらの結果より、pH値、NH_<4^+>濃度及びORP電極の電位を同時にモニターすることによって、本センサシステムは、10°Cで保存した豚肉の鮮度劣化を判定できる可能性を持っていることがわかった。このことから、S^<2->

イオンは豚肉の鮮度劣化を追跡するための化学種として適当でないことがわかった。10°Cで保存した豚肉を用いた水抽出試料中のpHとNH_<4^+>濃度変化に及ぼす豚肉の保存期間の影響を検討した。豚肉の保存期間が長くなるにしたがって、pH値及びNH_<4^+>濃度は増加する傾向を示した。ついで、10°Cで保存した豚肉を用いた水抽出試料のpH値及び細菌数に及ぼす豚肉の保存期間の影響を検討した。保存期間が長くなるにつれてpH及び細菌数のいずれも増加し、pH値と細菌数との間には明瞭な相関性が認められた。一方、5°Cで保存した豚肉を用いた場合も、10°Cで保存した豚肉を用いた場合と同様の実験を行ったが、ORP電極及びS^<2->センサの電位、pHおよびNH_<4^+>の濃度変化と保存期間には明瞭な相関性は認められず、ORPセンサ及びS^<2->センサの電位とPhおよびNH_<4^+>の濃度変化は、5°Cで保存した豚肉の鮮度劣化の示標とはなりえないことがわかった。これらの結果より、pH値、NH_<4^+>濃度及びORP電極の電位を同時にモニターすることによって、本センサシステムは、10°Cで保存した豚肉の鮮度劣化を判定できる可能性を持っていることがわかった。1.現在、食肉の鮮度を評価するには、コロニーカウント法が用いられている。しかしながら、この方法は鮮度の判定に5日間程度要するという欠点を持っている。食品の鮮度劣化は蛋白質が食品に付着している嫌気的並びに好気的微生物による酸化還元反応によって分解されるという考えに基づくと、食肉を構成する蛋白質から食肉の鮮度劣化に伴って、水素イオン、酸化還元物質、硫黄成分などの濃度変化が予想される。従って、これらを検出する化学センサを用いることにより、簡便に食肉の鮮度を判定できるものと期待される。本研究では、このような考えに基づき、化学センサによる食肉の鮮度劣化を判定する方法を開発することを目的としている。2.10°Cで保存した豚肉10gを超純水200mlに1分間浸し、食肉を取り除いた溶液を水抽出試料溶液とした。この溶液に校正済みのpHセンサ及びNH_4^+センサ、さらにS^<2->センサ、酸化還元(ORP)電極を浸し、これらのセンサを浸せきしてから12分後の4本のセンサの指示値を同時測定した。10°Cで保存した豚肉を食肉の試料として用いた。また、この水抽出溶液試料を希釈し、その10μlをフードスタンプ標準寒天培地に塗り広げ、5日間培養後の細菌数をコロニーカウント法により求めた。3.10°Cで保存した豚肉を用いる水抽出試料中に浸せきしたpHとNH_4^+濃度変化に及ぼす豚肉の保存期間の影響を検討した。保存期間が長くなるにつれて、pH値及びNH_4^+濃度は増加する傾向を示した。これは、豚肉の鮮度劣化による豚肉中の蛋白質がそれに付着している微生物により分解されたため、pH並びにNH_4^+の増加が起こったものと推測される。ORP電極を用いて同様の実験を行った場合も、保存期間が長くなるにつれてORP電極の電位が著しく低下する傾向を示した。これも、豚肉の鮮度劣化による豚肉中の蛋白質がそれに付着している微生物により分解されたためたと推測される。しかしながら、S^<2->センサを用いて同様の実験を行った場合には、保存期間とS^<2->センサの電位の間には明瞭な相関が認められなかった。
土木鋼構造物の安定に対する設計基準の再検討

現行の鋼骨組構造物の設計体系は必ずしも合理的でない。特に、安定性の照査に使われる座屈長に関しては、様々な問題点が指摘されている。この点に鑑み、本研究では、耐荷力算定手法として、以下の3つを提案した。1)接線剛性行列の固有値解析を行って、各断面での有効座屈長を決める方法を提案した。固有値解析を用いて有効座屈長を決めるとき、小さな圧縮力の働く断面が存在すると、その断面に対する有効座屈長が長くなり、耐荷力が過小評価されることが起こる。この問題は、断面の圧縮応力に拡大係数の概念を導入することにより、解決できることを明らかにした。2)非線形構造解析を前提とした設計法を提案した。しかし、設計業務で、全ての非線形要因を取り入れた解析を行うのは現実的でない。このため、ここでは解析自体には幾何学的非線形性のみを取り入れ、材料非線形性、製作誤差、残留応力等は全て幾何的な初期不整(これを“等価初期不整"と称する)で考慮することとした。この解析では、部材応力が降伏点に達したときの荷重を持って構造物の耐荷力とした。3)構造物によっては、等価初期不整の与え方が問題になる。そこで、初期不整に代えて、製作誤差、残留応力等の影響を弾性係数の中に取り込む手法を提案した。この弾性係数と等価低減弾性係数と呼び、内力の関数として定めた。この解析でも、部材応力が降伏点に達したときの荷重をもって構造物の耐荷力とした。これらの解析法の有効性は、数値計算により検証した。いずれも明快な解析法であるため、これらをもとにすれば、より合理的な設計体系の確立が可能と考えられる。本年度は面内問題を対象に、2つの設計方針を検討した。1)接線剛性行列の固有値解折を行って、骨組を構成する部材の各断面で面内崩壊に対する有効座屈長を決める方法を提案した。固有値解析を用いて有効座屈長を決めるとき、小さな値の圧縮応力の働く断面が存在すると、その断面に対する有効座屈長が長くなり、骨組の耐荷力が過小評価される場合が起こる。必要に応じて断面の圧縮応力に拡大系数の概念を導入すれば、この過小評価される問題を解決できることを明らかにした。しかし、設計業務で、すベての非線形要因を取り入れた解析を行うのは現実的でない。このため、ここでは解析自体には幾何学的非線形性のみを取り入れ、材料非線形性、製作誤差、残留応力等はすべて初期不整(これを"等価初期不整"と称する)で考慮することとした。また、部材応力が降伏点に達したときの荷重をもって構造物の耐荷力とした。本手法では、等価初期不整がその精度を大きく左右することになる。そこで、境界条件の異なる6本の柱部材を用いてこの点を子細に検討した。その結果、接線剛性行列の固有ベクトルを初期不整のモ-ドとし、最大たわみを部材長の0.33%とすれば、実用上十分な精度で耐荷力が得られることを明らかにした。さらに、本手法の妥当性、有効性を検証するため、現状では必ずしも取り扱いが明確でない変断面柱部材、さらには、梁一柱部材やラ-メンの解析を行った。結果は、いずれの場合にも高々10%程度の誤差が見られるのみであった。計算量および精度の点から見て、本手法は十分実用的であり、またこれにより合理的な設計法の構築が可能であると考えられる。昨年度提案した等価初期不整を用いた弾性有限変位解析による耐荷力算定法についてさらに検討を加えたが、複雑な骨組構造物への適用性において若干問題の生じることが明らかとなった。

そこで新たに、幾何形状に関する初期不整や残留応力等の影響を弾性係数により考慮することを提案し、柱の耐荷力曲線からそのための弾性係数を定めた。この手法では、幾何学的非線形性のみならず、材料の非線形挙動をも考慮に入れた解析が必要となるが、この場合の材料非線形性はそれほど強くなく、厳密な解析に比較すれば、はるかに計算コストの低い算定法となっている。また、解析に際して必要な幾何形状の初期不整はシステマチックな方法で決定することが可能であり、先に提案した手法の問題点を克服している。梁一柱部材や簡単なラーメン等の解析によりその精度は検討したが、十分に満足ゆく結果を得ており、今後は、より実際的な骨組講造物を対象に検討を加える予定である。こうした耐荷力算定法を立体骨組に拡張するには3次元梁一柱部材の有限変位解析用プログラムが必要となる。この場合ねじれの取扱いが重要となるが、本研究では連続体力学理論に基づき、3次元梁一柱有限要素を開発した。この要素の妥当性は、有限変位解析および固有値解析により検証した。今後はこの要素を用いて、2次元挙動を対象に提案した耐荷力算定法の拡張を行う。またこの研究に関連し、釣合径路追跡において非常に有効な孤長法の研究を、計算効率の面から行った。孤長制御式の導入に伴う接線剛性行列の非対称化の問題は、スカイライン法に適用により簡単に処理できることを指摘し、さらに初期値の与え方についても検討を加えた。等価初期不整を用いた弾性有限変位解析による耐荷力算定法の複雑な面内骨組構造物への適用性を検討し、ゲーブルフレームや6層2スパンラーメンの解析を行い、実用上十分な精度を得ることができた。これにより、面内骨組構造物に関しての課題はほぼすべてクリアーできたものと考えている。次にこの耐荷力算定法の立体骨組構造物への拡張を試みた。まずその精度を検討するための3次元梁-柱部材の有限変位解析用プログラムを開発した。3次元の場合、荷重形式や初期不整の与え方に多くのパターンがあり、2次元の場合に比べ、本耐荷力算定法の精度にはばらつきが見られる。現在この点を改善するべく、検討中である。製作誤差や残留応力等を考慮に入れて平面骨組構造物の耐荷力を算定する方法として、先に、1)等価初期不整を導入して弾性有限変位解析を行う。2)等価低減弾性係数を用いて有限変位解析を行う。という2つの手法を提案し、数値計算例によりその有効性を検証している。本年度は、これらの手法を拡張し、3次元にも適用可能な解析法を提案した。3次元の解析では、横倒れ座靴が重要な問題になる。等価初期不整の決定に際しては、部材端モーメントを受ける単純支持の梁を基準問題として取り上げ、必要な初期不整パラメータの値を算出した。等価低減弾性係数は、軸力と曲げモーメントの関数となる。まず軸力のみが作用する問題において、等価低減弾性係数を求め、次に曲げモーメントのみが作用する場合の等価低減弾性係数を求めた。さらにこれらの結果をもとに、軸力と曲げモーメントの両方が作用する場合の等価低減弾性係数を定めた。これらの手法の有効性を検討するために、自由端に鉛直荷重が作用する片持ち梁、中央点に鉛直荷重が作用する単純支持梁、端部に圧縮力と曲げモーメントが作用する梁-柱等の問題を解析した。得られた計算結果を厳密解と比較したが誤差は高々18%であり、実用上十分なものと考えられる。これらの手法は、耐荷力を算定するための明快な解析法となっている。
雇用形態差別に対する法的アプローチ

本研究は、日本の正規・非正規雇用労働者間における不合理な労働条件格差を公平な形で改善していくための有効な法規制のあり方を考察することを目的とし、雇用形態差別に対してとりうる法的アプローチとして、比較法の手法を用いてイギリスにおける実体法規制、アメリカにおける市場調整、アメリカにおける手続法規制の概要、特徴および課題を明らかにするとともに、日本の雇用システムに適合的な法規制のあり方を検討した。日本の正社員・非典型雇用労働者間における不合理な労働条件格差を「身分格差(差別)」と捉えて、これを公平な形で改善していくための有効な法規制のあり方を考察することを目的とし、雇用形態差別に対してとり得る法的アプローチの検討を行ってきた。日本では、戦後、長期雇用システムの中心的な担い手である正社員を保護していくための措置として、非典型雇用労働者は同システムの保護の枠外に置かれてきた。近年、職業紹介事業や労働者供給事業に対する法規制や労基法14条における雇用期間の上限規制が緩和され、非典型雇用労働者の低処遇問題が解消されないまま、労働者の非正規化が進行し、「格差問題」が深刻化している。今年度は、日本の非典型雇用に関する諸問題について判例を中心に検討を行ったほか、比較法の手法を用い、(非典型雇用労働者の中心に位置する)パートタイム労働に焦点をあて、多様な実体法的アプローチからパートタイム労働問題に取り組んでいるイギリスを参考に、パートタイム労働者の平等法理に関する研究を進めた。イギリスにおいて、雇用形態の多様化により、労働者や労働内容に関する比較の難しさから、これらの原則が十分には機能しない場面が出てきていることについてより詳細な検討を行った。日本の正規・非正規雇用労働者間における不合理な労働条件格差を「身分格差(差別)」と捉えて、これを公平な形で改善していくための有効な法規制のあり方を考察することを目的とし、雇用形態差別に対してとり得る法的アプローチの検討を行ってきた。日本では、戦後、日本的雇用システムの中心的な担い手である正規労働者を保護していくための措置として、非正規労働者は同システムの保護の枠外に置かれてきた。近年、労働法の規制が緩和されるなか、正規労働者の過剰労働と表裏一体の関係で、非正規労働者の低処遇問題が深刻化している。今年度は、昨年度に引き続き、日本の非正規労働者(特に派遣労働者)に関する判例の検討を行ったほか、比較法の手法を用い、アメリカにおける非正規労働者に関する法規制の状況、アメリカにおける正規労働者と非正規労働者間の格差についてさらに検討を進めた。また実体法規制でも市場による調整でもない第3のアプローチとして注目される手続法的規制について、日本の非正規労働問題への適用可能性を含めて検討を行った。それぞれの規制手法の特徴(メリットとデメリット)を明らかにした上で、均等待遇原則をベースにしたこれまでの実体法的アプローチと、手続法的アプローチの併存可能性について考察した。
調和組織材料の革新的力学特性発現メカニズムの解明

調和組織制御をFe-0.3mass%C炭素鋼に適用した実験を実施した。供試粉末として、ガスアトマイズにより作製されたFe-0.3C材(C:0.317、Si:0.99、Mn:1.00、P:0.006、S:0.005、Ni:0.09、Cr:0.13、Fe: bal. (mass%))を用いた。粉末をAr雰囲気中にて200rpm、180ksのメカニカルミリング(Mechanical Milling: MM)処理を施し、得られたMM粉末をプラズマ放電焼結により固化成形し、調和組織(Harmonic Structure: HS)を有する焼結体を作製した。比較材としてミリングを施さずに焼結した均一組織材を作製した。SPS条件は、1063K-3.6ks保持、焼結圧力100MPa、真空中(<5Pa)である。その後、得られた焼結体をγ域の1063K-600s保持してから水焼入れを行い、さらに、その後、573Kから873Kの種々の温度で1.8ksの焼戻し(空冷)を行った。MM粉末および焼結体の組織観察はSEM、EBSDを用い、機械的特性は引張試験(初期ひずみ速度5.6×10-4s-1)により評価した。その結果、Fe-0.3C調和組織材は、α+パーライト(P)組織となる。その後,焼入れによりα+α'組織に変化するが、特に、Core部よりもShell部にα'相が多く観察され、DP鋼と類似した組織を呈した。これは、焼結時に粉末表層部の超微細粒領域での炭素の拡散の促進とγ相の核生成場所の増加のために、γ相割合が多いShellが形成されたと推測される。機械的性質を評価した結果、均一組織材と比較して、調和組織材では引張強さ、靭性ともに上昇しており、高強度と高靱性が両立した。Shellでのγ化促進によって連なったγ相がShellに形成されたためと考えられる。30年度が最終年度であるため、記入しない。
タンパク質活性中心近傍における特異的基質認識部位・機能制御部位の人工構築

研究目的研究は、補因子再構成方に基づく、タンパク質活性中心近傍における特異的基質認識部位・機能制御部位の人工構築を目的とした。具体的には、任意の基質結合機能を有するポリペプチド分子とタンパク質補因子とを共有結合で連結したペプチド-補因子複合体の設計合成ならびにアポタンパク質への再構成を行った。これにより、人工ペプチド配列から成る新規の基質認識および化学反応サイトのタンパク質立体構造上における人工構築を図った。また、得られたペプチド-タンパク質複合体の高次立体構造、安定性および機能を詳細かつ系統的に調べ、高触媒機能に最低限必要となるファクターを分子レベルで見いだすことを目的とした。研究成果上記の目的をふまえ、DNA結合能を有するペプチド配列と補因子ヘムとを複合化したペプチド・ヘム複合体の調製に成功した。さらに、アポミオグロビンとの再構成によって、DNA認識能を有する人工ミオグロビンを構築し、DNAとの結合に依存したタンパク質機能・酵素様活性の制御に成功した[Bull.Chem.Soc.Jpn.,71,1749-1756(2005)]。この成果の一部に対し、日本化学会からBCSJ Awardを授与されている。さらに、フラビン結合機能を有する機能性ペプチドをファージディスプレイ法とコンビナトリアル化学法を用いて獲得し、補因子再構成法を用いてミオグロビンと複合化した。次いで、得られたペプチド複合化ミオグロビンを用いて、タンパク質表面上でのフラビン認識と効率的電子移動活性の発現に成功した[Peptide Science 2005,423-426(2006)]。本研究は、補因子再構成法に基づく、タンパク質活性中心近傍における特異的基質認識部位・機能制御部位の人工構築を目的とする。すなわち、任意の基質結合機能を有するポリペプチド分子とタンパク質補因子とを共有結合で連結した-ペプチド補因子複合体の設計・合成ならびにアポタンパク質への再構成を行うことで、人工ペプチド配列から成る新規の基質認識および化学反応サイトをタンパク質立体構造上に人工構築する。最終的には、得られたペプチド-タンパク質複合体の高次立体構造、安定性および機能を詳細かつ系統的に調べ、高触媒機能に最低限必要となるファクターを分子レベルで見いだすことを目的とする。上記の目的の第一段階として、任意の基質結合機能や特異的外部シグナル応答能を有する機能性ポリペプチド分子のコンビナトリアル化学法による設計・合成を試みた。すなわち、デノボ設計したポリペプチドを基体として、数残基を標準アミノ酸および人工アミノ酸で位置特異的にランダム化したペプチドライブラリを調製した。さらに、核酸、糖やフラビン等の基質結合能を指標としたスクリーニングを行うことで、数種の機能性ペプチド分子の獲得に成功した。また、ペプチド-補因子複合体の化学合成ならびにアポタンパク質への複合化についても詳細な条件検討を行った。具体的には、DNA結合能を有するポリペプチドを補因子であるヘムに導入したヘム-ペプチド複合体を設計かつ合成し、アポミオグロビンに再構成することで機能性ペプチド複合化ミオグロビンを構築した。さらに得られた半合成ミオグロビンの高次構造や機能に関する評価を行った。
下層大気の大規模擾乱に起因する宇宙空間電磁気現象の研究

当研究は、地震や火山噴火、台風など地球表面付近の現象が、それより上層の海洋、大気の運動を通して、電離圏や磁気圏に電磁気学的現象を発生させるメカニズムの理論的考察と、観測および数値シミュレーションによる検証を全体構想とする。本年度は、下記の成果が得られた。1.平成18年夏から観測を開始した微気圧観測データと、近接地点の地磁気観測データを統計的に解析することにより、理論的に予想されてきた3つの周波数帯に、気圧、磁場ともスペクトル密度ピークが存在することを、データを増やすことにより、統計的により確実にすることができた。また、微気圧振動のピークは秋に明瞭に見られるという前年度示唆された結果をより確実なものにした。2.平成20年度は微気圧観測システムをペルーのアンコン観測所に設置した。このデータは、磁場観測データと共に昨年末から京都大学に転送されており、解析を進めつつある。3. 2004年12月のスマトラ地震時に、中国南部で観測された約20秒余りの周期の地磁気脈動が、その場所での磁力線共鳴周期とほぼ一致すること、また、それ以外の場所では見られないことを、それぞれ、理論的計算およびデータ解析から確認した。このことは、この約20秒余りの周期の地磁気脈動が、スマトラ地震によって引き起こされた磁力線共鳴現象であることを強く示唆し、下層大気の大規模擾乱に起因する宇宙空間電磁気現象の一つであることを示す。4.研究協力者と共に、数値シミュレーションで確認するための計算コードの3次元化に着手した。1.平成18年夏から観測を開始した信楽での微気圧観測データと、阿蘇における地磁気観測データを統計的に解析することにより、理論的に予想されてきた3つの周波数帯に、気圧、磁場ともスペクトル密度ピークの存在を確認することができた。また、微気圧振動のピークは秋に明瞭に見られることがわかった。これまで理論的には重視されていなかった150秒前後の短い周期帯にスペクトルピークが比較的明瞭に現れることが新たに見いだされた。このピークは地磁気観測データにも見られる。2.平成19年度は微気圧観測システムを4セット作成し、1セットはタイ・ピマーイ大気科学観測所に設置し、1セットはトルコ・イズニック観測所に設置した。これらのデータは、磁場観測データと共に準リアルタイムで京都大学に転送されている。他の2セットは、平成20年度にペルーおよびグルジアの地磁気観測所に設置して観測を開始する予定である。3.2004年12月のスマトラ地震および2007年4月の三重県における地震発生時に観測された音波共鳴モードと考えられる震動は、地震発生後、数時間継続したので、その周波数およびパワー密度の時間変化を調べた。その結果、3つの主要な共鳴モードの周波数およびパワー密度共、複雑に変化することがわかった。
脳細胞の興奮・活性化状態を制御するＴＲＰＶチャネルの新たな病態生理学的役割の解析

脳の免疫担当細胞であるミクログリアは病的な刺激により異常活性化することで中枢神経変性疾患の病態形成に関与することが明らかになりつつある。そこでミクログリアの興奮・活性化状態を制御する目的で、浸透圧変化や機械伸展刺激等で活性化するTRPV4チャネルに着目した。In vitroおよびin vivo実験、電気生理学的検討による結果を多角的に評価した結果、TRPV4開口刺激は細胞膜の脱分極を介してミクログリアの活性化に対して抑制的に働くことが明らかになった。カルシウム過剰蓄積による神経細胞およびグリア細胞の変性やグリア細胞へのカルシウム流入による増殖・悪性因子放出等の病態形成過程におけるTRPVサブファミリー分子の中心的な役割を明らかにし、難治性中枢神経変性疾患に対する有効性の高い根本的治療薬の薬物標的としての評価を行うことを目的とし様々な検討を行った結果、以下の知見を得た。1、脳内においても末梢と同様に発現が認められるTRPV1のノックアウトマウスを用いて脳虚血傷害における病態生理学的役割について検討した。一過性中大脳動脈閉塞を施したところ、野生型と比較してノックアウトマウスでは虚血負荷48時間後における神経学的症状の増悪および梗塞巣の形成が有意に抑制された。TRPV1選択的阻害薬であるカプサゼピンを投与したところ、虚血負荷48時間後における神経学的症状の増悪および梗塞巣の形成が野生型マウスでは有意に抑制されたが、TRPV1ノックアウトマウスでは有意な影響は与えなかった。以前のin vitroにおける予備的な結果も含めるとTRPV1は脳内炎症やpH低下などの脳虚血傷害の病態に関連した事象により特異的に活性化され、神経細胞へのカルシウムの過剰な流入が脳虚血傷害の引き金になっていると想定される。2、TRPV1はミクログリアに発現していることが報告されているため、活性化ミクログリアにおける一酸化窒素(NO)やTNFαの遊離に対する選択的刺激薬カプサイシンの作用について検討したが、有意な影響は観察されなかった。3、TRPV4アゴニストである4αPDDを適用することによりLPS誘発ミクログリア活性化が抑制されることが明らかになった。その機序にはTRPV4開口によるミクログリアに脱分極が関与することが示唆された。詳細な機序については引き続き検討中である。脳の免疫担当細胞であるミクログリアは脳内環境の恒常性維持を担うが、その一方で病的な刺激により活性化することで中枢神経変性疾患の病態形成に関与することが明らかになりつつある。近年、ミクログリアの活性化過程におけるイオンチャネル動態の重要性が提唱されてきたが、カチオン流入経路の一つと考えられるTRPチャネルの関与についてはほとんど明らかになっていない。そこで本年は、脳細胞のうちミクログリアに着目し、TRPVチャネルを介したイオン流入がミクログリアの異常活性化にどのような影響を及ぼすかについて、特に浸透圧変化や温和な熱、機械伸展刺激等で活性化するTRPV4チャネルに着目して詳細に解析した。実験には生後1-2日齢のWistar/ST系ラット新生仔大脳皮質より調製したミクログリアを用いた。RT-PCR法、免疫染色化学および電気生理学的測定によりラット初代培養ミクログリアにおいてTRPV4が機能的に発現していることを明らかにした。In vitroおよびin vivoの両検討により、lipopolysacch興ride(LPS)により惹起される各種ミクログリア活性化指標(TNF-α遊離、galectin-3発現、iba-1免疫陽性増大、外向き整流性K^+チャネル電流)の増大は、LPSと同時にTRPV4アゴニストである4αPDDを処置することにより抑制されることが明らかになった。また、培養ミクログリアに4αPDDを適用することにより膜電位の軽度な脱分極が観察され、持続的な4αPDD処置はCa^<2+>利用能の減弱をもたらした。高濃度KCI溶液を用いた脱分極刺激もまた、各種LPS誘発ミクログリア活性化指標を減弱したことから、4αPDDの抑制作用を模倣したと想定された。以上の結果より、TRPV4開口刺激は細胞膜の脱分極を介してミクログリアの活性化に対して抑制的に働くことが明らかになった。
脳虚血病態に及ぼすアストロサイトギャップ結合機能のヒト剖検脳を用いた検討

平成17年度に引き続き、平成18年度も対象サンプルに対して、抗ニューロフィラメント(NF70)抗体、抗GFAP抗体、抗ミクログリア(CD68)抗体、抗コネキシン43抗体を用いた免疫組織染色を行った。さらに、各蛋白質発現量の発光強度測定による半定量的解析も行った。関心領域は、対象とした心原性脳塞栓および多発性脳梗塞の脳組織において、正常部位と梗塞巣周辺部位とに無作為に設定した。その結果、コネキシン43蛋白の発現量は、心原性脳塞栓では正常部位と梗塞巣周辺部位とで変化を認めず、多発性脳梗塞の虚血巣周辺部において正常部位と比較して有意な発現量の増加を認めた。また、正常部位においても心原性脳塞栓より多発性脳梗塞でコネキシン43蛋白の発現量が有意に増加していた。さらに、心原性脳塞栓の梗塞巣周辺部位では多発性脳梗塞に比べてミクログリア上でのコネキシン43蛋白発現量が増加していた。結論として、虚血ストレスに対してはアストロサイトとミクログリアともにコネキシン43蛋白の発現量を増加させ、神経保護的に作用していると考えられた。特に慢性期脳虚血巣においては正常部位でのアストロサイトもその発現量を増加させていたことから、アストロサイトのギャップ結合は虚血耐性に対しても重要な役割を果たしていると考えられた。以上の結果は国際学術誌"GLIA"にて報告した。また、ヨーロッパ神経学会年次総会(FENS、ウィーン)にてポスター発表を行った。平成17年度はまず、対象剖検脳の抽出を行った。過去10年間の脳梗塞症例(全236例)の中から、診療記録にて患者背景や病態が把握できたもの(53例)を抽出した。さらに、急性発症の脳梗塞として心房細動のみを有する脳塞栓症と過去に数回の脳梗塞既往を有する多発性脳梗塞症例とに分類し、免疫組織染色が可能であったもののみを対象とした。その結果、心原性脳塞栓症は5例あった。多発性脳梗塞は合併症による結果の修飾を避けるため、死亡までの期間が1週間以内のもののみを対象としたため4例であった。次に、ヘマトキシリン-エオジン染色を行って脳梗塞巣を検出し、新たに免疫組織染色用に切片を作成した。神経細胞の観察用に抗ニューロフィラメント抗体、アストロサイト観察用に抗GFAP抗体、ギャップ結合観察用に抗コネキシン43抗体、虚血障害部位の検出用に抗ヒートショック蛋白抗体などを用いて免疫染色を行った。2次抗体に蛍光標識を用いることで蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡での二重染色の観察を可能にした。各種蛋白の発現量を免疫染色陽性領域として計算したところ、心原性脳塞栓に比べて多発性脳梗塞の病巣周辺部にてコネキシン43発現量の有意な上昇を認めた。また同部位における神経細胞も多発性脳梗塞の方で有意に多く保持されていた。アストロサイトギャップ結合は繰り返す虚血障害により発現量が増加し、神経細胞保護的に作用している可能性が示された。以上の結果は国際神経学会で報告した。
血液-組織関門を形成する細胞群のヒト細胞株の樹立と低用量抗がん薬の作用機序解明

血液.組織関門の形成には組織特異的な関門細胞と血管内皮細胞(EPC)の相互作用がある。その解析のために、組織特異的関門形成細胞株を用いた評価系が望まれる。骨髄由来血管内皮前駆細胞株、TR-BME、を用いた研究で、タキサン系抗癌剤は殺細胞効果を示す濃度よりも低濃度で、EPCの遊走能阻害を主因とした血管発生を阻害し、腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。化学療法に用いられている抗がん剤には殺細胞効果に加えて血管新生(angiogenesis)阻害効果も報告されているが、新血管新生(neovascularization)阻害は解明されていない。抗がん剤の血管新生抑制による腫瘍増殖抑制効果は殺細胞効果による抗がん作用より毒性の低い治療法として有益である。本年度は殺細胞効果を示す濃度より低濃度において得られる腫瘍増殖抑制効果の解明を目的とした。そのため、新血管新生に重要である骨髄由来血管内皮前駆細胞のモデルとしてラット骨髄由来血管内皮前駆細胞TR-BMEを用い、新血管新生に対するin vitro評価系及びin vivoモデルを構築し、ドセタキセルもしくはパクリタキセルの細胞毒性および管腔形成能、遊走能を解析した。タキサン系抗癌剤のin vitro評価系における細胞毒性のIC50値は、対照である脳血管内皮細胞TR-BBBやラット腫瘍細胞であるWalker256よりも高い値を示した。一方で、TR-BMEにおいて細胞毒性を示す濃度よりも低濃度で管腔形成および遊走を阻害することが示された。さらに、in vivoにおいてTR-BMEの腫瘍部位への集積をFACSにより解析したところ、低投与量のタキサン系抗がん剤はTR-BMEの腫瘍への集積を抑制した。またCD31染色により腫瘍内の微小血管密度低下が示された。以上より、これらタキサン系抗がん剤の新血管新生阻害により、細胞毒性の少ない腫瘍増殖抑制効果が示された。我々が樹立した血管内皮前駆細胞TR-BMEは血管内皮細胞用培地EGM-2で培養することにより壁細胞へ分化する。壁細胞へ分化する因子を同定するため、EGM-2培地に含まれるbFGF,VEGF,EGF,IGFの分化への影響を検討した。分化因子を含まない培地にこれらの因子を添加しTR-BME細胞を培養したところ、bFGF添加のみ壁細胞マーカーであるSMA(smooth muscle α-actin)が増加しなかった。さらにbFGF非添加においては血管内皮前駆細胞マーカーであるCD133発現が消失した。またTR-BME細胞はbFGFレセプターであるFGFR-1を発現していた。したがって、bFGFは血管内皮前駆細胞の未分化維持に関与することが示唆された。さらに20ng/mLのbFGF添加によりTR-BME細胞は非添加時と比較して増殖速度が約150%に増加した。またbFGF添加によりTR-BME細胞は管腔形成能を維持するが、bFGF非添加により管腔形成能は減少した。したがってbFGFは血管内皮前駆細胞の増殖因子および管腔形成能維持因子として機能することが示された。以上により、血管内皮前駆細胞はbFGF刺激を受け、増殖を継続しながら新生血管腔を形成し、ここでbFGF刺激が消失することで壁細胞へと分化する過程が示唆された。本知見は血管新生阻害によるがん治療法開発を目指した抗がん薬の作用点として重要である。血液-組織関門を形成する細胞群には組織特異的な関門細胞と血管内皮細胞の相互作用がある。これまでの申請者らの研究で、骨髄由来血管内皮前駆細胞、TR-BME、が内皮のみならず血管を構成する壁細胞にも分化することが明らかとなった。さらに血管内皮前駆細胞はbFGF刺激を受け、増殖を継続しながら新生血管腔を形成し、bFGF刺激が消失することでSMAを発現する壁細胞へと分化する過程が示唆された。興味深いことに低用量の抗がん剤は血管内皮前駆細胞のケモタキシスを強く抑制した。これらの知見は血管新生阻害によるがん治療法開発を目指した抗がん薬の作用点として重要である。また、血管新生は血液-組織関門である胎盤においても重要であり、胎児由来の胎盤に対して新生母体血管が侵入することで効率的な物質交換の場としての胎盤関門能を形成する。血液-胎盤関門の本体は合胞体栄養芽細胞である。我々が樹立した合胞体栄養芽細胞株、TR-TBT、を抗がん剤ミトキサントロンで処理したところ、排出輸送担体ABCG2が誘導されることを発見した。これを糸口として、血液-胎盤関門の構築と変動要因を検討したところ、転写因子ERが特異的に誘導されていることが分かった。また、ヒト白血病細胞ではER発現が誘導されなかった。本知見は胎盤において、毒性薬物を胎児から母体へ排出するABCG2が組織特異的に発現誘導されることを示すものである。

血液-組織関門における輸送担体を介した機能性関門の制御は、抗がん剤治療に重要な意味を持つ。以上により、新たな血管新生および組織-関門研究の基盤をつくることができた。
最適化手法の分子系統樹推定への応用

分子系統樹の推定において、現在の最尤法の欠点は他の方法に比べて計算時間がかかることである。これは、トポロジーを仮定した系統樹の尤度を計算する際に、最尤なパラメータ(各枝の長さ)をNewton法で最適化する必要があるため計算量が多いことによる。本研究では、最適化手法を用いて、最尤法のこの欠点をある程度まで克服した。まず、各2種間の距離を最尤法で推定しておいて、トポロジーを固定した際に、各枝の長さを、その距離行列に関する最小2乗法を行なって近似的に求めると、その残差平方和の値は最尤法を行なった時の尤度の値と相関が高いことが分かった。従って、このような簡便法で有望であるようなトポロジーを予めスクリーニングしておいて、残差平方和の小さいトポロジーについてのみ、きちんした最尤法で解析を行なうことが有効である。この場合、より正確には枝の長さが正であることを考慮する必要がある。ところが、このような制約をつけた場合の最小2乗法は、正確に解けるものの、制約がない場合に比してかなり計算時間がかかる。そこで、この困難を解決するために、残差平方和を最小化する代わりに残差の絶対偏差和(L1ノルム)を最小化することを考えた。この問題は、線形計画問題に帰着でき、枝の長さが正であるという条件をつけくわえても簡単に解ける。そこで、絶対偏差をスクリーニングに使う評価関数とし、これを正確に最小化するようなトポロジーを見つけ、その後で絶対偏差が小さいいくつかのトポロジーに関して尤度を最大化し、そのなかで最大のものをもっともらしい系統樹であると推定することを考えた。この問題に対し、組合せ最適化についてよく使われる定石の一つである分岐限定法を適用し、効率的なトポロジー探索法を開発した。
アシル尿素誘導体からなる集積反応場による特異的な分子識別に関する研究

アシル尿素誘導体からなる集積反応場を利用する研究の結果から導かれた3つの仮説ー(1)「分子識別における置換基の形の類似性の役割」、(2)「非極性基の識別における容媒中の水の役割」および(3)「分子識別における容媒分子の形の役割」に関する仮説ーを証明するために、右図のような対になった会合性チオール【I】と【II】(【R^1】と【R^2】は分子識別に関与する識別部位)を用い、その酸素酸化反応の選択性(非対称ジスルフィドと対称ジスルフィドとの生成比の1/2の自然対数、分子識別の尺度)を検討した。その結果、次のような知見が得られた。1.仮説1に関連して、【R^1】がn-ブチル基で、【R^2】が炭素数3から6の直鎖状アルキル基の場合について、選択性と【R^2】の炭素数との関係を調べた。水-エタノール混合容媒[水のモル分率(χω)=0.75]および水-アセトニトリル混合容媒(χω=0.42)中35.0°Cでの選択性は、【R^1】と【R^2】が共にn-ブチル基の時に極大になることを見出した。2.仮説2に関連して、【R^1】がフェニル基で【R^2】がn-およびi-ペンチル基の場合について、含水容媒の組成および温度を変えて選択性を調べた。ペンチル基の識別は、非水容媒中よりも含水容媒中で起り易くなることがわかった。3.仮説3に関連して、【R^1】がフェニル基で【R^2】がn-およびi-ペンチル基の場合について、水ーn-プロピルアルコール中および水ーi-プロピルアルコール中での選択性を調べた。35.0°Cでの選択性は、【R^2】がi-ペンチル基の時には水ーi-プロピルアルコール中で高くなるのに対して、n-ペンチル基の時には逆に水-n-プロピルアルコール中で高くなることが明らかになった。
視聴覚拡張現技術を用いた個人適応型空間認知システムの構築

近年、実用化が進んでいる頭部伝達関数合成法を基礎としたVADシステムにおいて、良好な音像定位を提供する最適なHRTFを受聴者毎に選択する個人適応型の空間認知システムを構築することを目標として基礎研究を進めた。具体的には、受聴者個人の耳介形状の特徴量情報から個々の定位能力を推定し、それをもとにデータベースから個人毎に最適なHRTFを選択する手法を確立することを目的とした。耳介形状の特徴量として鏡面反射特徴量を導入し、音源方向別の値と受聴者個人の定位能力の関係分析を行った結果、いくつか特定の鏡面反射角度と音像定位能力に、高い相関関係があることを見出した。H24年度は、被験者の耳介形状の特徴量抽出のパラメータとして、光源から耳介表面へ光を入射した際の鏡面反射量を導入し、このパラメータが本研究課題における被験者の音像定位能力と耳介の形状の関係分析に有効であることを見出したが、この場合、耳道入り口から耳甲介腔付近の形状が特に重要であり、この付近のメッシュの解像度をより細かくする必要性を確認した。そこで、H25年度は、その点を考慮して、3次元メッシュデータの再構築と解析を進めた。その結果、音源の入射角度が正中面内で変化する場合、耳道入り口を反射点として、水平面からの反射光の角度情報で鏡面反射の綿密度を分割して分析した場合に、音像定位の定位誤差量のRMS値(音源の到来方向と音像を知覚した方向の偏差量)と相関がみられることを確認した。また、特に音像定位の誤差が大きい場合、反射の多い面が、耳介外部に多く観られ、それが音源の入射角度に依存して移動する現象を可視化して確認した。一方で、3Dスキャナーは見えない部分のデータ欠損が避けられず、耳介の窪みや裏側の形状の影響が考慮できない。そこでMRIを用いてシリコン製の耳介レプリカの3D形状をデータ化する手法を検討し、32個の詳細な耳介データを新たに採取した。これらのデータをこれまでの手法で再度、解析し、分析を実施している。H24年度は、まずは耳介形状の特徴量の数値化に注力した.採取してある耳介のシリコンレプリカを3Dスキャナを用いて3Dメッシュデータ化を試みた.また特徴量の表現方法として、音波の伝搬現象を光に置き換え、光源から物体へ光りが入射した場合の鏡面反射量の綿密度分布の解析手法を導入し、耳介形状と光源の入射方向によってそれらの特徴量がどのように変化するか検討した.さらにそのデータと音像定位能力との相関分析を実施した.その結果、外耳道入り口からある特定の角度への反射光の量が音像定位能力と関係が深い可能性が見いだされた.一方で、耳介の特に耳甲介腔付近の形状の影響が特に重要であることから、今回、用いたメッシュ化手法では、その部分のメッシュ化解像度が不十分であると考えられることから、今後、別の3Dメッシュ化手法を導入することが不可欠であることも明確になった.またkinectを用いて身体運動の位置を計測しながら同時に頭部回転をジャイロセンサで検出し、それらのデータから、実験者の手元に仮想音源が生成されながら、手の動きに追従して、音像の位置が移動するインタラクティブ3次元音像提示システムも構築した.H25年度までの研究結果より、耳介の三次元メッシュデータ元に算出した鏡面反射特徴量と、仰角方向の音像定位精度の相関分析により、全体として定位誤差が大きい耳介サンプルは反射成分が多い場所が耳介外部に分布する傾向にあり、一方で定位精度の高い耳介には特徴的な反射成分の分布が見られないことが分かった。これより「耳介における鏡面反射特徴量は定位精度が低い場合の耳介形状、ならびに耳介部位の説明変数である」という仮説を立て、その検証実験として、定位精度の低い耳介に「反射音の特徴的な分布を変化させる」、すなわち反射音が他の耳介部位に分散するようなアダプターを装着することで、音像定位精度が向上するのか、音像定位実験を実施した。16名の被験者を定位能力のレベルでグループ分けし、それぞれのグループについて、アダプター装着の有無と音像定位の精度について相関分析を実施した。その結果、定位能力の高い被験者についてはアダプター装着の影響は見られなかったが、定位能力が低い被験者グループについては、アダプターを装着することによって、定位の精度が向上する傾向が観測された。一方で、実験参加者耳介の三次元メッシュデータから算出した鏡面反射特徴量と定位精度についての明確な関係性を抽出することはできなかった。

これより、個人適応型の視聴覚提示技術の再現手法として、再現システムの要素である頭部伝達関数を個人に適応させる手法として、定位精度の劣化に影響する特徴的な反射音を分散させるような耳介アダプターを導入する手法の可能性が示唆された。音響工学、ディジタル信号処理、空間音響MRIを用いてシリコン製の耳介レプリカの形状をデータ化する手法を考案し、そのデータをメッシュ化する手続きを確立できたことから、基礎的な分析に必要な3次元形状データを採取できたので、それを元に音像定位の定位精度と耳介形状の関係性分析を進め、いくつかの知見を得ることができた。H24年度に3Dスキャナを用いて耳介レプリカのメッシュデータ化と、そのデータを元に音像定位能力との関係分析を実施した結果、音像定位能力で重要となる形状部分(コンチャ部分)のメッシュ精度の向上が必要であることが示唆された.従って、MRIなどによる高精度なメッシュ化を再実施した上で研究を進めることが必要であり、当初の予定よりデータ採取と分析がやや遅れる結果となった.H26年度は本課題の最終年度であるので、これまで採取した耳介データの特徴量と音像定位精度、更には音響的な特徴量(HRTF)との関係分析を進め、良好な定位に必要とされる耳介形状の特徴を明確にする。同時に個人に最適化した3次元音場生成の構築を目指し、各個人に良好な音像定位を提供するために、個々人毎に一番マッチする適当な形状を有する耳介をデータベースから抽出し、その耳介の有するHRTF情報を算出、システムにローディングするようなアルゴリズムの構築を目指す。今後は、まずはMRIを用いて高精度の耳介メッシュデータの作成を最優先して進め、耳介形状と音像定位能力との関係分析を進める.同時に耳介形状とHRTFsとの関係解析を進めるために、110個の耳介レプリカのHRTF測定を実施する.360度方向のHRTF計測を迅速に進めるために、全方向HRTFの自動計測システムを構築する.またARtoolkitやkinectを用いて、実験者の身体運動を検出し、その3次元座標値や角度に連動して動的に音像を制御する3次元音場再生システムを構築する.3次元データをMRIを用いて再度採取する際に、学内設備の使用のため費用がかからなかった。同時にデータ採取が遅れたことにより、本課題にて構築を目指しているシステム開発に着手できなかったため、その費用が支出されなかった。MRIによる3次元データ採取方法になったことにより、3次元メッシュデータ作成は外部に発注する必要が出たので、その費用とする。また、今期実施予定としている耳介の方向別の音響特徴量解析のために、方向特性を1度精度で採取する目的で自動制御のモーター回転台を購入する予定である。H25年度は、MRI装置を使用して再度、耳介形状の数値化を試みるので、耳介サンプルの3Dメッシュデータ化に伴う費用(装置使用費と解析ソフト代)を支出する。110個の耳介サンプルの頭部音響伝達関数のデータベース化のために360度方向のHRTF計測を実施するにあたり、計測を迅速に進めるために全方向HRTFの自動計測システムを作成するにあたり、その費用を支出する。また、成果発表のための出張費として使用する。
アルコール脱水素酵素の臓器障害発症への関与

酒類はアルコール(エタノール)を主成分とする嗜好品であるとともに、依存症や臓器障害を引き起こす薬物でもあります。われわれはさまざまなアルコール関連疾患発症の要因を諸臓器に分布するClass IIIアルコール脱水素酵素(ADH3)が担うと考えています。本研究は、ADH3が疾患発症にどのように関わっているかを形態学的・生化学的・免疫学的に明らかにし、新規治療の足掛かりとすることを目的とする基礎研究です。
ES細胞を用いた包括的動静脈リンパ管分化多様化機構の解析

研究代表者等は、ES細胞を用いて血管および心臓の分化研究を行い、心血管分化過程を細胞レベルで経時的系統的に解析できる新しい分化システムを構築した(Nature,2000)。本研究は、我々の系統的ES細胞分化誘導システムを用いて、包括的に内皮細胞多様化機構を明らかにし、腫瘍血管リンパ管に対する新しい抗がん治療戦略を開発することを目的とする。1)動静脈リンパ管内皮特異的分化誘導法の確立、2)同分化系を用いた動静脈リンパ管分化機構の解析、3)内皮分化多様化過程における遺伝子プロファイリング、4)分化過程における遺伝子機能解析系の構築と同定候補遺伝子機能解析。5)同定遺伝子の腫瘍血管等における意義の解析、の5項目の研究を行う。昨年度までに、1)動静脈内皮細胞分化と動脈内皮分化の定量的評価及び誘導動脈内皮細胞の純化に成功した(Yurugi-Kobayashi,Arterioscler Thromb Vase Biol,2006)。2)リンパ管内皮分化誘導法の開発と純化に成功した(Kono,Arterioscler Thromb Vase Biol,2006)。本年度は、3)内皮分化多様化過程における遺伝子プロファイル:1)2)で純化した種々の細胞群からRNAを抽出し、遺伝子プロファイルを作製した。5)内皮細胞多様化機構の解明:昨年度4)にて構築したRNA干渉を用いたES細胞における遺伝子機能阻害のシステム(Hiraoka-Kanie,Biochem Biophys Res Commun,2006)を用いて、3)で同定した遺伝子群の機能解析を進めている。5)ヒトES細胞を用いた血管多様化機構の解析:ヒトES細胞を用いた実験を開始し、動静脈リンパ管内皮分化誘導系の構築を進めている。本研究は、我々の系統的血管内皮細胞分化誘導システムを用いて、動静脈リンパ管内皮細胞分化機構を明らかにし、腫瘍血管リンパ管に対する新しい治療戦略開発することを目的とする。本年度は、年度研究計画に従い以下の研究を行った。1)動静脈内皮細胞分化と純化:アドレノメデュリン及びサイクリックAMPが、内皮細胞においてNotchシグナルを活性化するとともに動脈内皮分化を促進することを明らかにした。またCXCR4が新たな動脈内皮マーカーであることを見出し、抗CXCR4抗体を用いたFACSにより誘導動脈内皮細胞の純化に成功した(Yurugi-Kobayashi, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006)。2)リンパ管内皮分化誘導法の開発と純化:Flk1陽性細胞をOP9ストローマ細胞上で培養することにより、prox-1陽性リンパ管内皮細胞を分化誘導することに成功した(Kono, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006)。これらの成果により、血管多様化機構を探索する新たな実験手法の樹立に成功した。3)内皮分化多様化過程における遺伝子プロファイル:1)2)で純化した種々の細胞群からRNAを抽出し、遺伝子プロファイルを作製した。4)siRNAを用いた機能阻害実験系の構築:内皮分化に必須であるFlk1遺伝子発現を抑制することにより、内皮細胞分化を阻害することに成功した(Hiraoka-Kanie, Biochem Biophys Res Commun, 2006)。ES細胞の分化途上の任意の段階で分化遺伝子の機能を解析することが可能となった。5)内皮細胞多様化メカニズムの解明:4)のシステムを用いて、3)で同定した遺伝子群について機能解析を進めている。5)ヒトES細胞を用いた血管多様化機構の解析:ヒトES細胞を用いた動静脈リンパ管内皮分化誘導系の構築を進めている。
既存薬による転写を標的とした萎縮性側索硬化症の新規治療法開発

本研究で我々の確立したスクリーニング・システムは、SOD1の転写を抑制するFDAで承認されている既存薬Xを同定した。既存薬XのSOD1転写抑制効果は、in vitroで、定量的リアル・タイムRT-PCR及びウェスタン・ブロッティングでmRNA、蛋白レベルともに効果を判定した。さらに、他のrhoキナーゼ(ROCK)阻害薬であるY-27632でも同様にSOD1の発現を抑制することを見出した。ROCKはROCK1とROCK2の2種類あり、RNA干渉によりその発現をひとつずつ抑制しても、SOD1の発現を抑制する作用はなかった。しかし、ROCK1とROCK2を同時にノックダウンすることにより初めてSOD1転写抑制作用を有することを見出した。以上の結果から、ROCK1及び2の活性を抑制することがSOD1の転写を制御することにつながり、かつ既存薬XがROCKの抑制効果を介してSOD1の転写を抑制していることを示唆するものである。既存薬Xは国内で既に臨床で使用されており、その安全性は広く受け入れられている。我々の研究は既存薬Xの新たな薬理学的性質を提示するとともに、ALS治療薬として新たに再配置できる可能性を示すものである。NFκBレポーターアッセイを用いてさらに解析すると、既存薬XがROCK抑制効果を介してNFκBの活性を低下させていることが示された。NFκBは神経炎症に関わる主要な転写因子で、ALS患者の脊髄前角においてその発現が亢進することが報告されている。さらにNFκBの転写調節領域が、SOD1の5'非翻訳領域にあるプロモータ領域に存在しており、NFκBが実際にSOD1の転写調節因子の一つであるという報告もある。既存薬XのSOD1発現調節作用メカニズムの少なくとも一部は、NFκBを介している可能性が示唆された。
骨格筋における機械的刺激によるエネルギー代謝調節機構の解明

骨格筋の不活動は筋の萎縮を生じさせるとともに、エネルギー代謝にも影響することが明らかにされている。しかし、その詳細なメカニズムは不明な部分も多い。本研究では骨格筋への機械的刺激や荷重負荷によるエネルギー代謝調節機構に神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)が関与していると考え、ラットの尾部を懸垂し、後肢筋への荷重負荷を減少させた筋におけるnNOSおよびnNOSと相互作用する種々のタンパク質発現の変化を明らかにするとともに、それらとnNOSとの相互作用の変化を明らかにすることを目的とする。また一酸化窒素が関与するタンパク質の翻訳後修飾であるニトロ化についても検討する。