hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モモ核割れの発生機構の解明と発生回避による収穫期直前落果の防止

わが国では一般に,同じ果物でもより大きな果実が好まれるため,生産者は果実肥大に努める.しかし,果実の肥大を促すと,モモでは核割れを誘発し,生理落果や品質低下を招く.これまでに,1.核割れは果肉組織の発育に伴って生じた引張力が核を引き裂くことによって起こり,2.未熟な種皮は外気に晒されると大量のエチレンを急速に生成することから,3.果柄基部にまで及ぶ激しい核割れを生じた場合は,大気の流入によりエチレン生成が起こり,落果が誘導される恐れがあるが,4.通常の核割れではエチレン生成、はみられないが,成熟は促され,収穫期直前落果がやや多くなること,等を明らかにした.本研究では,果実発育に伴う果肉と核の物理的強度の変化を調査し.肥大促進した果実の特性を明らかにした.核の硬度は果実発育第1期から第3期に掛けて増し続けたが,核割れの起こる第2期には,弾性が小さく脆いため,外圧が加わると核は破壊され易く,果実肥大を促すとその特性が助長されることを明らかにした.果実基部から核内腔へ色素溶液を加圧注入して核割れ症状を人為的に起こしたところ,核の耐圧力は果実発育に伴って一増加し続けたが,肥大促進区の第2期の耐圧力は対照区のそれに比べ低く,また,果実径と耐圧力との間には負の相関が認められた.摘蕾を主体とした管理によって果実肥大の促進を図ったところ,商品として十分な大きさの果実が得られた.若干の核割れは発生したものの従来の摘果主体の管理に比べて,核割れの発生を大幅に減らすことが出来た.以上から,第2期初めに摘果するよりも,摘蕾や摘花によって細胞数の増加に努め,核の硬化が完了した第2期後期に摘果して肥大を促す方が得策であると判断した.なお,摘蕾を行うと奇形化した種子が増え,胚のうの核DNA量に異常が認められた.その原因究明と生理落果との関係を精査する必要がある.わが国では一般に,同じ果物でもより大きな果実が好まれるため,生産者は果実肥大に努める.しかし,果実の肥大を促すと,モモでは核割れを誘発し,生理落果や品質低下を招く.これまでに,1.核割れは果肉組織の発育に伴って生じた引張力が核を引き裂くことによって起こり,2.未熟な種皮は外気に晒されると大量のエチレンを急速に生成することから,3.果柄基部にまで及ぶ激しい核割れを生じた場合は,大気の流入によりエチレン生成が起こり,落果が誘導される恐れがあるが,4.通常の核割れではエチレン生成、はみられないが,成熟は促され,収穫期直前落果がやや多くなること,等を明らかにした.本研究では,果実発育に伴う果肉と核の物理的強度の変化を調査し.肥大促進した果実の特性を明らかにした.核の硬度は果実発育第1期から第3期に掛けて増し続けたが,核割れの起こる第2期には,弾性が小さく脆いため,外圧が加わると核は破壊され易く,果実肥大を促すとその特性が助長されることを明らかにした.果実基部から核内腔へ色素溶液を加圧注入して核割れ症状を人為的に起こしたところ,核の耐圧力は果実発育に伴って一増加し続けたが,肥大促進区の第2期の耐圧力は対照区のそれに比べ低く,また,果実径と耐圧力との間には負の相関が認められた.摘蕾を主体とした管理によって果実肥大の促進を図ったところ,商品として十分な大きさの果実が得られた.若干の核割れは発生したものの従来の摘果主体の管理に比べて,核割れの発生を大幅に減らすことが出来た.以上から,第2期初めに摘果するよりも,摘蕾や摘花によって細胞数の増加に努め,核の硬化が完了した第2期後期に摘果して肥大を促す方が得策であると判断した.なお,摘蕾を行うと奇形化した種子が増え,胚のうの核DNA量に異常が認められた.その原因究明と生理落果との関係を精査する必要がある.早期の着果制限がモモの果実発育と核割れの発生に及ぼす影響を調べた。'紅清水'と'清水白桃'の2品種に摘蕾あるいは摘花の処理を行うと、幼果期には両品種とも無処理の対照区に比べ、両処理区で果実重が大きく、子房壁の細胞数も多かった。果実発育第1期末にいずれの区にも一律に強い摘果を行ったところ、'清水白桃'の収穫時の果実重と核割れ率は、対照区では205gと26.1%であったが、摘蕾区と摘花区では296gと263g、57.8%と41.7%に大きく増加した。対照区と摘蕾区の葉に^<13>CO_2を施与して光合成産物の転流を調査すると、果肉の^<13>C濃度は両区とも増加したが、摘蕾区の方が対照区に比べ高かった。第2期はじめに果梗から水を注入して核の耐圧力を調査すると、大きい果実ほど耐圧力は低かった。第1期末に別樹に設けた対照区と摘果区で果汁の浸透圧の日変化を測定すると、両区とも日中は浸透圧が上昇し、夕方から早朝に掛けては低下するというサーカディアンリズムを描いたが、摘果区の方がその振幅が大きかった。これらの果汁の主要な既知の遊離糖はグルコースとフルクトースであったが、摘果区は総糖濃度、とくにスクロースと転流糖であるソルビトールの濃度が高かった。

なお、果実や種子組織によって糖組成は大きく異なり、未同定の遊離糖が多数検出された。以上の結果より、摘蕾や摘花は幼果の細胞分裂を促し、大果生産への可能性を示した。一方、第1期末の強摘果は果肉の浸透圧を高め、果実肥大を促したが、核割れも誘発した。したがって、第1期末から第2期末にかけての強摘果は控えるべきである。今後は、早期の着果制限及び硬核期以外の時期の摘果や摘心による肥大促進が、商品性のあるモモ生産にどの程度有効であるかを検証する予定である。'紅清水'を用い3月中旬に約5分の4の蕾を除く摘蕾区を設けた.満開(4月3日)約20日後から40日後まで急速に落果し,最終着果率は無処理の対照区が10%,摘蕾区は25%であった.果径にも区間差を生じ,6月25日には対照区の47.7mmに対し摘蕾区は58.9mmと,約1.23倍であった.7月中下旬に収穫した果実重は対照区が234gに対し287g,糖度は9.0に対し9.8と,摘蕾区が大きかった.しかし,種子重は対照区の0.95gに対し0.78g,胚重は0.65gに対し0.51gと,対照区が大きかった.この差の原因は核割れによる種子の発育不全に基づくと考えられ,縫合線割れ率は対照区の7.1%に対し33.9%と摘蕾区が明らかに高く,種子の壊死率も12.5%対28.6%,褐変率も21.4%対50.0%,"しいな"率も3.6%対10.7%と,摘蕾区が高かった.果梗からの加圧注水によって核の耐圧力を比較した(プレッシャーチャンバー内のシリンジにサフラニン溶液を入れ,チャンバー外の果梗から核内へ針を挿入して1MPa/minの条件で加圧し,既核割れ果は除外).両区とも耐圧力は果実発育と共に増したが,6月24日では対照区が1.66±0.18MPa,摘蕾区は1.02±0.08MPaと,この時期までは対照区が大きかった.両区の果実で縦径と耐圧力との関係をみると,果実が大きいほど耐圧力は小さい傾向を示し,相関係数はr=0.537^*(n=34)であった.これらのことから,何らかの方法で果実肥大を促すと,果肉組織の拡大による核への引張力が増大すると共に,核縫合部における物理的強度の進行も抑制されると考えられた.したがって,大果生産を目的とした果実肥大促進には,その時期と程度に関して十分な注意が必要である.わが国では消費者も流通業者も大果を好むため生産者は果実肥大に努める.しかし,モモでは過度に肥大を促すと核割れを誘発し,落果や品質低下を招く.そこで,摘果よりも早期の処理である摘蕾が果実発育や核割れに及ぼす影響を調査し,核割れの発生要因を検討した.摘蕾区は無摘蕾の対照区(いずれの区にも慣行の肥培管理をした)よりも果実重や糖度が有意に増加したが,核割れ率はわずかに上昇したにすぎなかった.果肉と核の硬度は第1期末にはほぼ同程度の値であったが,果肉硬度はその後低下したのに対し,核硬度は第2期末まで上昇した.しかし,両者とも区間差はみられなかった.摘果処理区を設け,プレッシャーチャンバーを用いで果梗から加圧注水し,核が割れるまでに加えられた圧力を測定すると,第2期中後期の耐圧力は摘果区の方が対照区より有意に小さかった.第2期末の樹上で変位計とひずみ計を用い果径や果皮の変化をみると,晴天日の果実は日中,一時的に収縮し,夕方から急速に肥大するという概日変化を繰り返し,水ポテンシャルが高い夜半に核割れや裂果発生のシグナルが検出された.果汁の浸透圧にも日変化が認められ,摘果すると残した果実の浸透圧が上昇した.なお,核割れの発生時点を把握するための変位計とひずみ計,および核割れの有無を外部評価するための核磁気共鳴装置の利用は有効な手段であると思われた.さらに,摘果処理によって胚発育の異常率が高くなる傾向がプロイディ検査で認められた.これら調査結果に関してはなお一層の精査が必要である.以上のように,第2期の摘果は残した果実の浸透圧を高め,果実肥大を促すが,同時に縫合面の接合強度を弱め,核割れを起こし易くする.したがって,よりマイルドな果実肥大促進技術である摘蕾を重視した栽培が望ましい.
光ピンセット走査力顕微鏡の開発と細胞膜研究ヘの応用

本研究の目的は、光トラップ(光ピンセット)をカシチレバーとし、光トラップに3次元的に捕捉された金コロイド微粒子に結合させた抗体や他のタンパク質を探針とする、走査力顕微鏡(Scanning Force Microscope)を開発することである。この方法の応用範囲は広いが、特に、細胞膜の研究に適しており、細胞膜の領域構造の研究に応用しつつ、開発を進める。ライフサイエンス分野の多くの応用において、通常の原子間力顕微鏡にまさる方法にするのが目標である。本研究においては、原子間力顕微鏡のカンチレバーの部分を光トラップで置き換える。さらに、探針(または膜タンパク質などが探針となるときには、これに力を伝えるトランスデューサ)は特定のタンパク質を結合させた金コロイド微粒子(直径40nm)、または、ラテックスビーズ(直径210nm)である。バネ定数は、前者の場合0.03-10pN/mm、後者の場合0.1-50pN/mmの範囲で変えられる。特にOT-SFMを細胞膜の研究に応用しつつ、装置の改善、実用化をはかった。すなわち、装置の実用試験を細胞膜について行い、多数の改良を加えた。細胞膜研究の主題は、膜タンパク質の局在化・集合の機構、および、それに果たす膜裏打ちタンパク質ネットワーク/細胞骨格の構造変化の役割、膜タンパク質-細胞骨格相互作用の役割の解明であった。さらに、プローブの調製法を工夫した結果、一価性に近い金コロイド微粒子を、うまい場合には調製する事ができた。光ピンセットをカンチレバ-として用いた原子間力顕微鏡(光ピンセット力顕微鏡)の開発をすすめた。既存の原子間力顕微鏡では試料を押す力が強く、水溶液中の柔らかい生体試料の場合はこれを変形させてしまうため、正確な観察ができなかった。光ピンセット力顕微鏡では、光ピンセットで金コロイド(半径20nm)をトラップし、金コロイドをプローブとし、光ピンセットをカンチレバ-とすることによって、試料を押す力を1/300程度にまで減らした。これによって、同時に、分子間相互作用の力の測定感度を300倍向上させた(0.05-10pN)。装置全体は、倒立蛍光ノマルスキー顕微鏡上に組み立て、通常の光学顕微観察をおこないつつ、面白い部位を見つけたら、そこに光ピンセットでプローブを持っていき観察できるようにした。直径200nmのビーズにトランスフェリンを結合させ、それを、培養繊維芽細胞上のトランスフェリン受容体に結合させた。この場合は、受容体が、細胞膜のプローブとなる。このプローブを膜上で走査し、受容体に細胞から働く力を各ピクセル毎に求め、働く力に基づく細胞像を得た。線維状構造体が観察されたが、細胞膜上の受容体を閉じこめる効果を持つ膜骨格が可視化されているものと考えられた。本研究の目的は、光トラップ(光ピンセット)をカンチレバーとし、光トラップに3次元的に捕捉された金コロイド微粒子に結合させた抗体や他のタンパク質を探針とする、走査力顕微鏡(Scanning Force Microscope)を開発することである。本年度は、特にOT-SFMを細胞膜の研究に応用しつつ、装置の改善、実用化をはかった。

主題は、膜タンパク質の局在化・集合の機構、および、それに果たす膜裏打ちタンパク質ネットワーク/細胞骨格の構造変化の役割、膜タンパク質-細胞骨格相互作用の役割の解明であった。具体的には、プローブの調製法を確立した。さまざまな工夫の結果、一価性に近い金コロイド微粒子を、うまい場合には調製する事ができた。これをさらに進め、多くのタンパク質やモノクローナル抗体について、一価性、または、一価のように振る舞う金コロイド-タンパク質複合体の調製法を開発していくことが、今後の課題である。さらに、装置の実用試験を細胞膜について行い、多数の改良を加えた。本研究の目的は、光トラップ(OT)をカンチレバーとし、光トラップに3次元的に捕捉された金コロイド微粒子に結合させた抗体や他のタンパク質を探針とする、走査力顕微鏡(Scanning Force Microscope-SFM)を開発することであった。この方法の応用範囲は広いが、特に、細胞膜の研究に適しており、細胞膜の領域構造の研究に応用しつつ、開発を進めた。ライフサイエンス分野の多くの応用において、通常の原子間力顕微鏡にまさる方法にするのが目標である。本研究においては、原子間力顕微鏡のカンチレバーの部分を光トラップで置き換える。さらに、探針(または膜タンパク質などが探針となるときには、これに力を伝えるトランスデューサ)は特定のタンパク質を結合させた金コロイド微粒子(直径40nm)、または、ラテックスビーズ(直径210nm)である。バネ定数は、前者の場合0.03-10pN/mm、後者の場合0.1-50pN/mmの範囲で変えられる。本年度は、特にOT-SFMを細胞膜の研究に応用しつつ、装置の改善、実用化をはかった。具体的には、プローブの調整法を確立した。さまざまな工夫の結果、多くのタンパク質やモノクローナル抗体について、一価性、または、一価のように振る舞う金コロイド-タンパク質複合体の調整法が開発できた。さらに、装置の実用試験を多数の細胞の細胞膜について行い、多くの細かい改良を加えた。
情報化社会に適合したSNA(国民経済勘定体系)の経済理論的基礎と統計手法の開発

本研究は1968年に国連が制定し、公表したSNA(国民経済計算の体系)を現在の社会・経済的要請と課題に照らして再検討し、その改善の方向を明らかにする目的で着手された。研究の進行過程において、国連統計局から上記SNAを改訂するための草案が公表(United Nations,Revised System of National Accounts:Draft Chapters and Anーnexes,ST/ESA/STAT/SER.F/2・Rev.4,1990)されるに至り、本研究は上記草案に対する徹底的な検討を行い、以下のような結論を得ている。1)勘定構造と部門分類についてーイ)「二重部門分類」の考え方が後退し、制度部門分類中心の勘定体系となっている。これは経済における「物質生活」の過程を記述する現行SNAの特徴を失わせる結果を招いている。ロ)非市場サ-ビスの供給主体の重要な柱でいる「対家計民間営利機関」が独立部門から家計を構成する亜部門に格下げされており、非市場サ-ビスの生産と消費の過程に関する情報が失われるおそれがある。2)概念上の問題についてーイ)現行SNAでは有形財のみに限定されていた資本形成が、無形の〈ソフト〉な資本形成概念をもとり入れることが提案されている。情報化社会の発展に伴う適切な対応と言うべきである。ロ)しかし銀行の帰属サ-ビスについては伝統的思考の枠を殆ど出ていない。むしろ金融仲介機関が持つ不完全情報市場における情報提供サ-ビスを産出として評価する方法を確立すべきである。3)価格・数量測度の計測について一実質可処分所得の概念を確立し、これに伴う「交易条件の変動効果」項の導入は大きな前進である。「交易条件の変動効果」の算式としては倉林・クルビ-ス法の採用が妥当であると考える。4)サテライト勘定の導入とマイクロ・デ-タ・セットへのデ-タ・セットとのリンクが提案されていることは今後の展開の方向が示唆されているものとして評価される。とくにマイクロ・デ-タ・セットへのデ-タ・ベ-スの拡張は本研究が当初から指向した研究の重要領域であったからである。本年度における研究の成果は、(1)各研究分担者と、関連分野の専門研究者を外部から招待して、1989年7月より〓回にわたって開催したSIWW(Studies in Income,Wealth and Welfare)ウワ-クショツプの開催と(2)1990年1月26日に如水会館において開催した本年度の研究の成果を綜合するSIWWミニコンフアレンスの実施とに要約することができる。(1)SIWウワ-クショツプの活動とその概略ーそれぞれ以下の議題がカツコ内に示す研究分担者と外部より招いた専門家によって報告され、これをめぐって討議を行った。i)SNA改訂をめぐる諸問題(倉林)、ii)地域経済活動の計測と評価(刈屋)、iii)福祉概念の評価と方法ーA、センの所説をめぐって(専修大学大庭健、川本隆史;コメント鈴村)、iv)SNAのシステム論的基礎(国際大学出口弘)。(2)SIWWミニコンフアレンスの概略ー本研究の代表者と分担者のほかに外部からの専門学者8人を招き、本年度の研究成果を総括し、来年度への研究の展開をはかる目的で1日の集中的な討議のためのミニコンフアレンスを持った。

報告者と題目は次の通りである。報告1.作間逸雄(専修大学)、相対価格構造の国際比較、報告2.鈴木英夫(名城大学)、貨幣経済における均衡の安定性について、報告3.鈴木興太郎、福祉と自由:厚生経済学の基礎、報告4.倉林義正、SNAの公理論的基礎。これらの研究活動のほかに、倉林は1989年8月西ドイツのLahnsteinで行われたInternational Association for Research in Income and Wealthにおいて、鈴木は1989年8月のギリシャのアテネで開催されたthe World Congress of the International Economic Associationにおいて、またさらに松田は1989年9月フランスのパリで開催されたInternational Statistical Instituteの総会において、それぞれ研究成果についての論文発表を行った。前年度の研究の実績と成果とを承けて、本年度は、(1)福祉概念の表章としてのSNA集計量の社会選択理論的基礎づけを検討する公共経済学研究グル-プと、(2)SNAの改訂とその応用分野に関する研究を追跡するSNA研究グル-プとを編成し、前者に関しては鈴村が、後者に関しては江口がそれぞれグル-プリ-ダ-として、各グル-プ毎に数回の研究会を持ち、研究分担者が隨時参加する研究体制を組織した。(1)公共経済学研究グル-プの活動とその概略ーこの研究グル-プが主として取り上げた問題は以下の諸点である。i)パレ-ト最適概念の再検討、ii)アロ-の不可能性定理の適用範囲、iii)社会保障における世代間分配の公正。(2)SNA研究グル-プの活動とその概略ーこの研究グル-プが取り上げた主要な研究テ-マは以下の諸点である。i)改訂SNA草案(1990年11月国連統計局より公表)の検討、ii)SNAにおけるマイクロデ-タ統合の問題、iii)国連国際比較プログラム(UNICP)の発展と意義。本研究は1968年に国連が制定し、公表したSNA(国民経済計算の体系)を現在の社会・経済的要請と課題に照らして再検討し、その改善の方向を明らかにする目的で着手された。研究の進行過程において、国連統計局から上記SNAを改訂するための草案が公表(United Nations,Revised System of National Accounts:Draft Chspters and Annexes,ST/ESA/STAT/SER.F/2/Rev.4,1990)されるに至り、本研究は上記草案に対する徹底的な検討を行い、以下のような結論を得ている。1)勘定構造と部門分類についてーイ)「二重部門分類」の考え方が後退し、制度部門分類中心の勘定体系となっている。これは経済における「物質生活」の過程を記述する現行SNAの特徴を失わせる結果を招いている。ロ)非市場サ-ビスの供給主体の重要な柱である「対家計民間営利機関」が独立部時から家計を構成する亜部門に格下げされており、非市場サ-ビスの生産と消費の過程に関する情報が失われるおそれがある。2)概念上の問題についてーイ)現行SNAでは有形財のみ限定されていた資本形成が、無形の〈ソフト〉な資本形成概念をもとり入れることが提案されている。
大脳皮質視覚野における神経結合の生後発達に視覚入力が及ぼす影響に関する研究

筆者らは、視覚の中継核である外側膝状体(LGN)を大脳皮質視覚野(VC)の白質下に移植した標本を用いて、LGNからVCへ、またVCからLGNへの結合が形成される過程を解析してきた。これまでに電気生理学的、及び形態学的手法を用いて、1)移植後、まずLGNの軸索は宿主VCの第2-6層に広く単シナプス性の結合を作り、その後この結合はVC第4、6層に限局し皮質内結合が2/3、5層に形成されること、2)宿主VCから移植LGNへの投射は最初は2-6層から広く起こり、その後に5、6層(主に6層)に限局されること、の2点が移植後1週目から3週目にかけて起こっていることを明らかにした。これまで、刺激に対するシナプス応答の記録は、細胞内記録により行っていたが、この記録法では膜電位を固定できないため、シナプス伝達に寄与するnon-NMDA,NMDA等の電流成分の正確な分離同定が困難であった。そこで今年度は、スライス標本にパッチクランプ法を適用し、シナプス電流を記録して、各々の電流成分の生後発達を定量的に解析することを試みた。生後様々な時点で、ラットVCのスライス標本を切り出し、皮質細胞にblind typeのwhole-recordingを適用して膜電位を静止電位程度に固定し、白質刺激に対するシナプス電流を記録した。生後1週目程度の若い動物からは、比較的時間経過の長いシナプス電流が記録されたのに対し、生後3週目以降の動物からは、時間経過の短い電流応答が記録された。またNMDAレセプターのアンタゴニスト(DL-APV,0.1mM)を投与すると、シナプス電流のlate componentが著しく減少した。これらの知見はこれまでの研究結果に良く一致し、さらに今後この標本を用いたLGN-VC間の結合の発達に対する視覚入力の影響を研究する上で基礎的なデータになると思われる。
拡散テンソルMRIを用いた脳内ネットワークイメージング法の開発とその臨床応用

大脳皮質およびそれを連絡する白質路からなる脳内神経ネットワークと、その疾患による障害を、拡散テンソル画像を用いて定量的に画像化する方法を開発し、その妥当性を検証した。またこの方法を用いて、正常の脳における部位による構造の違い、思春期以降の脳の発達や加齢による変化を研究した。さらにアルツハイマー病における病的変化を検討し、開発された方法がアルツハイマー病の診断に有用であることを突き止めた。本研究の目的は、(1) MRI拡散テンソルイメージングを用いて、脳の皮質および白質からなる神経ネットワークの障害を定量的に画像化する新たな手法を開発すること、(2)本研究で開発された手法を用いて、脳疾患の病態解明や早期診断への応用を検討すること、である。脳では皮質内の異なる部位に種々の機能が局在すると同時に、各々の皮質が白質の神経線維束により連結されたネットワークを形成している。従って、脳機能とその障害の全体像を評価するとき、皮質と白質の障害を同時に観察する必要がある。拡散ンソルイメージングは、MRIを用いて脳組織内の微小構造の病的変化を敏感に検出することができる画像技術である。この技術をさらに発展させ、皮質とそれらを結ぶ白質線維束からなる神経ネットワークの障害を定量的に評価する手法を独自に開発する。拡散テンソル画像に基づく独自の手法を用いて、アルツハイマー病患者の大脳皮質の障害の分布を推定し、3次元的に表示した。21名のアルツハイマー病患者と7人の健常者についてこの解析を行い、作成された3Dマップを視覚的に評価した。その結果、皮質障害は側頭葉と頭頂葉を中心に分布し、中心溝付近は障害されにくいことが分かった。この結果は、病理学的に知られている皮質障害の空間分布とよく一致し、この解析手法の妥当性を支持するものであった。拡散テンソルトラクトグラフィーの新しいアルゴリズムを考案した。従来の方法では、線維束の分岐や交差に対応することができず、白質路の全体像を描出することができなかった。我々が開発したアルゴリズムでは、各イメージボクセルでの拡散の3次元確立密度分布に基づいて、directional diffusion function(DDF)を定義し、DDFの隣接ボクセル間の重なりからボクセル間のconnectivityを計算する。白質路の推定では、指定された2つの領域を結ぶ最もconnectivityの高いpathを最終的な経路として採用した。この手法を用いて、健常者と脳腫瘍患者で錐体路の推定を行った。その結果、健常者と脳腫瘍患者の両方で、分岐して中心前回に広い範囲に連続する錐体路が描出できた。従来法と比較して、錐体路の全体像の描出に近づいた。脳腫瘍患者では、腫瘍と錐体路の3次元的な位置関係の評価を行うことができた。前年度開発し論文で報告した、拡散強調画像に基づいて大脳皮質の障害を推定しマッピングする方法を改良し、大脳半球外側面に加え、内側面の皮質障害の推定が行えるようにした。この改良した方法を用いて、アルツハイマー病患者の皮質障害を改めて評価した。その結果、後部帯状回や楔前部を含む頭頂葉内側部、側頭葉内側部などの皮質障害を視覚的に評価することができた。この解析法では、皮質障害の分布をマッピングして視覚的に評価することはできるが、定量的な解析を行うことができなかった。そこでさらに、同手法を改良し、皮質障害の推定の指標となる皮質下白質のdiffusivityを定量的に解析する方法を考案した。この新しい方法を用いることで、各皮質領域の障害の程度を定量的に解析することができるようになった。前年度開発し論文で報告したdirectional diffusion function(DDF)に基づく拡散テンソルトラクトグラフィー法の妥当性を検証するため、内包後脚内の錐体路におけるsomatotopic organizationを正しく反映するか否かを検討した。その結果、大脳皮質運動野内でより頭頂よりの躯幹や臀部を支配する領域に連続する線維束に比べ、運動野内でより脳底部よりの顔面を支配する領域に連続する線維束が、内包内のより前部に推定された。これは、解剖学的知識によく一致していることから、DDFトラクトグラフィーの妥当性を支持する結果であった。これまでに拡散テンソル画像に基づいて、皮質下白質の微小構造の変化を調べ、これにより皮質の異常をマッピングする方法を提案している。昨年度までは、これを視覚的に評価していたが、今年度は、この評価を皮質領域ごとに、かつ定量的に行う方法を考案した。IBASPM(Individual Brain Atlases using Statistical Parametric Mapping Software)と呼ばれるソフトウエアを導入することで、個々の被験者の脳MRI画像上で、標準脳上に定義された区分に従って、78の皮質領域に分割することができた。これにより、各皮質領域における見かけ上の拡散係数の平均値を自動的に測定することができ、測定者によるバイアスがない評価が可能となった。この新たな方法を用いて、正常者の皮質白質の微小構造の年齢による変化を調べた。

対象は10歳代から60歳代の60名の健康な右利き男性であった。その結果、大脳半球の多くの皮質領域で皮質下白質における見かけ上の拡散係数は年齢とともに低下し、その変化は少なくとも中年までは持続することが示された。そのような変化を示す皮質領域は、大きく4つのシステムに分類できた:1)主に左大脳半球の言語関連皮質、2)後頭葉や側頭葉の視覚またはマルチモダリティの処理に関する連合野、3)辺縁系の一部、4)運動感覚野。これらの一部では年齢に対して二次関数で近似できる変化を、その他の部位では直線的な変化を示した。この新たな手法を用いることで、より定量的で自動的な解析が可能となった。今後、アルツハイマー病患者のデータに応用していく予定である。昨年度に開発した、拡散テンソル画像に基づいて皮質下白質の微小構造の変化を皮質領域ごとに定量的に解析する方法を使って、正常な脳の皮質下白質の微小構造に、部位によるvariationが見られるか否かにつき、検討した。対象は、44名の健常成人。78の異なる皮質領域において、皮質下白質のmean diffusivity(MD)の平均値を測定し、左右大脳半球内、および左右大脳半球の対応する皮質領域間での比較を行った。その結果、両側において、中心前回はその他の領域に比べ低いのを、頭頂葉ではその他の領域に比べ高いMDを示すことが分かった。また、左右半球間での比較では、頭頂葉、中後頭回、前頭葉の眼窩面や内側面で、左側が右側に対し有意に低いMDを示し、反対に、前頭弁蓋部、補足運動野、側頭葉、辺縁系、楔部および楔前部では、右側が左側に対し有意に低いMDを示すことが分かった。この生理的なvariationは、神経軸索や髄鞘の密度と関連している可能性が考えられた。同じ解析法をAlzheimer病(AD)患者と健常者に適用し、(1)ADにおいて特異的な空間分布を持つ、皮質下白質の微小構造の異常がみられるか否か、および(2)この皮質下白質の微小構造の異常がADの診断に利用できるか否か、について検討した。対象は33名のAD患者と28名の高齢健常者。解析の結果、ADでは、29皮質領域で皮質下白質のMDの有意な増加をみとめた。この皮質下白質のMDにもとづき、健常者とAlzheimer病の判別を行ったところ、単一の領域(左中後頭回)のMD値に基づいた場合、88.5%の正確度で両群を判別できた。複数の領域のMD値を組み合わせた場合、正確度は96.7%と改善した。以上から、ADにおいて特異的な空間分布を持つ皮質下白質の微小構造の異常がみられ、それは診断に利用できることが示唆された。
唾液分泌量および性状が嚥下反射誘発におよぼす影響について

急速な高齢社会を迎え,歯科からの支援内容が時代のニードに併せて大きく変化をしている.介護保険制度においては新予防給付(口腔の機能向上)が導入されているが,口腔の機能向上に関係する,加齢変化と嚥下機能減退に関するデータはまだ少ないのが実際である.我々は,加齢変化による唾液の分泌量および性状が,どのように嚥下機能に影響を及ぼすか検討を行った.本研究について説明をし,同意が得られたボランティアを対象とした.若年群として学生ボランティア118名(男性59名,女性59名:平均20.4歳),高齢者群として特別養護老人ホーム入居者の33名(男性15名,女性18名:平均69.7歳,要介護度24)を用いた.評価項目は唾液に関しては唾液分泌量(刺激唾液),口腔乾燥度(MUCUS^<【○!R】>(株)ヨシダ社製使用),唾液粘稠度(NEVA METER^<【○!R】>(株)石川鉄工所社製使用)を用い,嚥下の評価には反復唾液嚥下テスト(RSST),超音波エコー装置(SonoSite^<【○!R】>180II 0LYMPUS社製)を用いた.また得られた結果から統計処理を行った.ガム咀嚼を行った際の唾液分泌量は4.0±2.5ml/min(若年者)に対して,2.7±1.7ml(高齢者)であった.安静時の口腔乾燥度は28.0±1.3(若年者)に対して,24.6±3.8(高齢者)であった.また刺激唾液の唾液粘稠度は2.27±0.56mm(若年者)に対して,2.53±0.98ml(高齢者)でp<0.05で有意差があった.反復唾液嚥下テストは5.0±2.4回/30sec.(若年者)に対して,3.4±1.2回/30sec.(高齢者)であった.超音波エコー装置では高齢者群で舌の平坦化(舌背面の陥凹深度の低下)が観察された.唾液には多くの作用があることは知られているが,嚥下運動との関連性を求めたものは少ない.今回,唾液に関して,分泌量は高齢者群の方が少なかった,刺激時唾液に関して,高齢者は健常成人とほぼ同程度との報告があるが,対象者はすべて常時服薬があるため服薬の影響も少なくはないと思われる.粘稠度に関しては,若年者より高齢者群の方が有意に高かったが,これは前述の刺激唾液の分泌量が少ないため粘稠性が高くなった結果と推測される,粘稠性が上昇する事により,嚥下運動のように口腔の前方から後方へと移動させる際に,物理的な運動量が増加すると想像される.実際にRSSTのように嚥下運動の評価を行う際には高齢者群の方が減少していた.したがって高齢者の嚥下障害を考える上で,唾液の量ならびに性状が重要である事が示唆された.急速な高齢社会を迎え,歯科からの支援内容が時代のニードに併せて大きく変化をしている.介護保険制度においては新予防給付(口腔の機能向上)が導入されているが,口腔の機能向上に関係する,加齢変化と嚥下機能減退に関するデータはまだ少ないのが実際である.我々は,加齢変化による唾液の分泌量および性状が,どのように嚥下機能に影響を及ぼすか検討を行った.本研究について説明をし,同意が得られたボランティアを対象とした.若年群として学生ボランティア118名(男性59名,女性59名:平均20.4歳),高齢者群として特別養護老人ホーム入居者の33名(男性15名,女性18名:平均69.7歳,要介護度24)を用いた.評価項目は唾液に関しては唾液分泌量(刺激唾液),口腔乾燥度(MUCUS^<【○!R】>(株)ヨシダ社製使用),唾液粘稠度(NEVA METER^<【○!R】>(株)石川鉄工所社製使用)を用い,嚥下の評価には反復唾液嚥下テスト(RSST),超音波エコー装置(SonoSite^<【○!R】>180II 0LYMPUS社製)を用いた.また得られた結果から統計処理を行った.ガム咀嚼を行った際の唾液分泌量は4.0±2.5ml/min(若年者)に対して,2.7±1.7ml(高齢者)であった.安静時の口腔乾燥度は28.0±1.3(若年者)に対して,24.6±3.8(高齢者)であった.また刺激唾液の唾液粘稠度は2.27±0.56mm(若年者)に対して,2.53±0.98ml(高齢者)でp<0.05で有意差があった.反復唾液嚥下テストは5.0±2.4回/30sec.(若年者)に対して,3.4±1.2回/30sec.(高齢者)であった.超音波エコー装置では高齢者群で舌の平坦化(舌背面の陥凹深度の低下)が観察された.唾液には多くの作用があることは知られているが,嚥下運動との関連性を求めたものは少ない.

今回,唾液に関して,分泌量は高齢者群の方が少なかった,刺激時唾液に関して,高齢者は健常成人とほぼ同程度との報告があるが,対象者はすべて常時服薬があるため服薬の影響も少なくはないと思われる.粘稠度に関しては,若年者より高齢者群の方が有意に高かったが,これは前述の刺激唾液の分泌量が少ないため粘稠性が高くなった結果と推測される,粘稠性が上昇する事により,嚥下運動のように口腔の前方から後方へと移動させる際に,物理的な運動量が増加すると想像される.実際にRSSTのように嚥下運動の評価を行う際には高齢者群の方が減少していた.したがって高齢者の嚥下障害を考える上で,唾液の量ならびに性状が重要である事が示唆された.健康な20歳代の若年者を対象に,超音波診断装置で得られる嚥下動態と唾液分泌量との関連性を対照群データとして採得した。安静時唾液分泌量はロールワッテ法により,また,刺激時唾液分泌量はガムベースを咀嚼させて5分間の分泌量を吐唾法により測定して求めた。嚥下動態は唾液空嚥下時および3cc水分嚥下時の動態を記録した。動態の解析としては,顎下部にエコーウィンドを設定し下顎第一大臼歯近心面相当部の舌背歯の前額断画像を描出したデータを基に行った。計測項目としては,(1)嚥下指示から嚥下時舌背陥凹形成のスタートするまでの時間(嚥下誘発時間)(2)初回嚥下誘発時から2回目の嚥下誘発時までの間隔(3)舌背陥凹形成時間(4)舌背陥凹深度とした。安静時唾液ないしは咀嚼刺激時唾液分泌量と嚥下誘発時間および嚥下時の舌動作時間などには関連性を認めなかった。すなわち,上記(1)(4)の計測結果は個人葦が大きいが,唾液の分泌量との,相関性は認められなかった。健康は若年者であれば,嚥下時の舌の筋力が強く,嚥下動態に予備力が大きいため,口腔の湿潤(乾燥)状態によらず安定した嚥下動態を示すものと考えられた。これに対し,高齢者および嚥下機能に障害を有する者では嚥下に予備力が少ないであろうと考えられ,唾液分泌量の影響が嚥下動態に反映されるものと思われる。そこで,高齢者群を嚥下障害のない群とある群とに分け,データ採得を開始した。今後,対照群データと比較しながら唾液分泌量と動態の関連性についての加齢の影響について検討していく予定である。H16年度は唾液分泌量および性状が嚥下誘発に及ぼす影響を知るため,健康成人を対象(22±2歳)に測定を行った(20名)。測定項目は唾液分泌量,口腔乾燥度(口腔乾燥時計MUCUS【○!R】使用),反復唾液嚥下テスト(RSST),超音波エコー診断装置を用いた。超音波エコー装置は簡便に舌の運動を観察評価できるが,今回の機器はモニター画面が小さいため,超音波エコー装置にモニターを23台接続して,複数の評価者(研究協力者を含む)で評価し,舌の陥凹や深度を決定した。結果,唾液分泌量は4±2.5ml/minと20歳の年齢での平均値が求められた。またMUCUS【○!R】を用いた口腔乾燥度の測定では28±1.3と「やや乾燥」との数値が多かった。これは,唾液分泌測定の後に行っていることと,気湿に影響を受けやすいことから,研究に際しては適切な条件にて計測しなければならなく,早急に改善して再度行いたい。RSSTに関しては5±2.4回/30sec.であり,しきい値の3からは外れている。また,舌運動(陥凹度・一口量)は年齢を合わせると身長に比例することがわかった。これに関しては,新しい知見であるため,今後,身長計測項目を追加しなければならない。また,モニター23台を用いた評価方法は,経験年数に左右されず客観的な評価が可能であった。最終年度は,年齢の層を20歳から40歳・50歳・60歳・70歳・80歳と上げていきデータを集計する事によって加齢変化の検討としていきたい。また,当初の計画より身長,湿度等の新たな測定項目を追加する事によって精度を上げて行きたい。最終的には年齢分布による嚥下反射の誘発と口腔内環境との関連性を考察していく予定である。H17年度は,H16年度に引き続き健康成人を対象に20名ずつの測定を行った。対象は20歳から30歳,40歳,50歳,60歳,70歳,80歳までとした。
ヒトiPS細胞からの選択的外有毛細胞分化誘導法樹立と疾患iPS細胞による難聴研究

1外有毛細胞への選択的な分化誘導の樹立:内耳前駆細胞から各感覚上皮に分化誘導するにあたり、有毛細胞と支持細胞は同一の前駆細胞から分化することが知られている。本研究では試薬の種類や濃度などの条件検討を行うことで、外有毛細胞への選択的な分化誘導方法を確立する。国内外でヒトES/iPS細胞からの分化誘導に難渋していることを踏まえ、霊長類であるコモンマーモセットのコルチ器における遺伝子発現パターンを念頭に試薬の種類、濃度、暴露する時間などの条件検討を前年度に引き続き進めた。2コモンマーモセットの蝸牛上皮における遺伝子発現パターンの検討:これまでの経験で、マウスとコモンマーモセットでは、内耳における遺伝子発現パターンが大きく異なることに複数遭遇しているため、本研究では霊長類であるコモンマーモセットを用いて難聴遺伝子の発現パターンを詳細に検討した。若年成体のコモンマーモセットから側頭骨を剖出したのち、脱灰固定し、内耳蝸牛の凍結切片を作成した。作成した切片を用いて免疫染色を行い、遺伝子の蝸牛上皮への発現を検討した。コモンマーモセット側頭骨は本来入手困難であるが、当研究室ではすでに実験動物中央研究所と検体提供について供与契約を締結しており、定期的に検体を入手している。本研究では、難聴を呈する遺伝性疾患の一つであるWolfram症候群の原因遺伝子であるWFS1のコモンマーモセットの蝸牛上皮における発現パターンの検討を行った。さらに、外有毛細胞への発現が確認されている遺伝性難聴の原因遺伝子であるMYOSIN15A、SLC26A5、DFNA5、KCNQ4も追加検討対象とした。本研究では様々な条件検討を行うことで選択的な外有毛細胞への分化誘導法を確立する。国内外でヒトES/iPS細胞からの分化誘導に難渋していることを踏まえ、霊長類であるマーモセットのコルチ器における遺伝子発現パターンを念頭に試薬の種類、濃度、暴露する時間などの条件検討を進めた。霊長類である若年成体のコモンマーモセットから側頭骨を剖出したのち、脱灰固定し、内耳蝸牛の凍結切片を作成した。本研究では、難聴や糖尿病を呈する遺伝性疾患であるWolfram症候群の原因遺伝子であるWFS1のコモンマーモセットの蝸牛上皮における発現パターンの検討行い、さらに外有毛細胞への発現が確認されている遺伝性難聴の原因遺伝子であるMYOSIN15A、SLC26A5、DFNA5、KCNQ4を検討対象とした。平成28年度は、疾患特異的iPS細胞の樹立を進行する予定であった。外有毛細胞での機能が重要と思われる難聴遺伝子を絞り込み、遺伝性難聴症例からiPS細胞を樹立し、疾患外有毛細胞を作成して病態解析を行い、これにより新規治療標的候補の同定につなげることを計画している。コモンマーモセットの外有毛細胞に発現が確認された遺伝子を原因とする難聴疾患の患者より採血を行い、初期化遺伝子(OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC, p53shRNA)をエピソーマル・プラスミドで導入する。得られた細胞から未分化な細胞を選択し、コロニー化する。iPS細胞はライン間の差異があることが知られている。細胞樹立後は、1継代可能で2未分化性が十分維持され、かつ3内耳耳胞様細胞への効率よく誘導しうるラインを選別する。継代の効率のよいラインの選別や、内耳耳胞様細胞への効率的な分化誘導にやや難渋した。本研究では様々な条件検討を行うことで、外有毛細胞への選択的な分化誘導方法を確立する。国内外でヒトES/iPS細胞からの分化誘導に難渋していることを踏まえ、霊長類であるコモンマーモセットのコルチ器における遺伝子発現パターンを念頭に試薬の種類、濃度、暴露する時間などの条件検討を昨年に度に引き続き進めた。

作成した切片を用いて免疫染色を行い、遺伝子の蝸牛上皮への発現を検討した。コモンマーモセット側頭骨は本来入手困難であるが、当研究室ではすでに実験動物中央研究所と検体提供について供与契約を締結しており、定期的に検体を入手している。本研究では、難聴を呈する遺伝性疾患の一つであるWolfram症候群の原因遺伝子であるWFS1のコモンマーモセットの蝸牛上皮における発現パターンの検討を行った。さらに、外有毛細胞への発現が確認されている遺伝性難聴の原因遺伝子であるMYOSIN15A、SLC26A5、DFNA5、KCNQ4も追加検討対象とした。平成29年度は、疾患特異的iPS細胞の樹立を進行する予定であった。外有毛細胞での機能が重要と思われる難聴遺伝子を絞り込み、遺伝性難聴症例からiPS細胞を樹立し、疾患外有毛細胞を作成して病態解析を行い、これにより新規治療標的候補の選別を行うことを計画している。コモンマーモセットの外有毛細胞に発現が確認された遺伝子を原因とする難聴疾患の患者より採血を行い、初期化遺伝子(OCT3/4、sox2、KLF4、LIN28、L-MYC、p53shRNA)をエピソーマル・プラスミドで導入する。得られた細胞から未分化な細胞を選択しコロニー化する。iPS細胞はライン間の差異があることが知られており、細胞樹立後は、1継代可能で2未分化性が十分に維持され、かつ3内耳耳胞様細胞へ効率よく誘導しうるラインを選別する。継代の効率の良いライン選別や、内耳耳胞様細胞への効率的な分化誘導に難渋した。1外有毛細胞への選択的な分化誘導の樹立:内耳前駆細胞から各感覚上皮に分化誘導するにあたり、有毛細胞と支持細胞は同一の前駆細胞から分化することが知られている。本研究では試薬の種類や濃度などの条件検討を行うことで、外有毛細胞への選択的な分化誘導方法を確立する。国内外でヒトES/iPS細胞からの分化誘導に難渋していることを踏まえ、霊長類であるコモンマーモセットのコルチ器における遺伝子発現パターンを念頭に試薬の種類、濃度、暴露する時間などの条件検討を前年度に引き続き進めた。2コモンマーモセットの蝸牛上皮における遺伝子発現パターンの検討:これまでの経験で、マウスとコモンマーモセットでは、内耳における遺伝子発現パターンが大きく異なることに複数遭遇しているため、本研究では霊長類であるコモンマーモセットを用いて難聴遺伝子の発現パターンを詳細に検討した。若年成体のコモンマーモセットから側頭骨を剖出したのち、脱灰固定し、内耳蝸牛の凍結切片を作成した。疾患特異的iPS細胞の樹立をすすめ、昨年度に得られた分化誘導法を樹立したiPS細胞に用い、外有毛細胞を可及的大量に調整してin vitroで解析を加える。解析内容は疾患の原因遺伝子ごとに注意深く選択するが、特に細胞死抑制と、機能解析におけるレスキュー実験を重要視する。疾患特異的iPS細胞の樹立をすすめ、得られた分化誘導法を用い、外有毛細胞を可及的大量に調整して、in vitroで解析を行う。
明治〜昭和初期の日本の心理学における「自我」概念の展開

本年度研究計画として,(1)平成16年の調査旅行中発見された川本清一の手による「心理学」という2つの翻訳稿本(アレキサンダー・ベイン原著日本学士院蔵,一橋大学図書館蔵)それぞれを,ベインの原著"Mental Science"と照合させ,「自我」にかかわる諸名称および諸概念(「自覚」「意識」等)と原語との対応関係,そして後年に刊行されたベインの日本語版(井上哲次郎,松島剛ら,矢嶋錦蔵による3点)との対応関係を明らかにしつつ,訳語の定着過程と意味内容を分析検討すること(2)日本初の心理学の教授である元良勇次郎が用いた「自我」概念の意味内容の変遷を追い,さらに元良の弟子でジェームズの著作を訳出している福来友吉の「自我」概念について分析考察を行なうこと。加えて,後続の研究者たち(松本亦太郎,千葉胤成,増田惟茂など)がこの概念をどう捉えていたかについても考察すること,という2つのテーマを挙げていた。このうち(1)については作業過程にあり,結果を平成18年度中に雑誌『心理学史・心理学論』に投稿予定である。一方,(2)のうち,元良の「自我」の内容は裏面項目11の1番目の英語論文及び3番目の共著論文においてその一部を明らかにした。後者の論文は日本心理学会第69回大会にて行なわれたワークショップでの報告をもとにしている。このなかで鈴木は,精神分析の中心的概念である「自我」と「無意識」それぞれが,精神分析輸入前後の時期に心理学的な文脈のなかでいかに受けとめられていたかを,元良のほか上野陽一,増田惟茂らの著作から分析したが,特に「自我」概念の展開については明治20年代半ばからの「自我実現説」(T.H.グリーンの説が中島力造によって翻訳された)の流行から受けた影響を指摘している。以上と並行して,元良の「自我」概念を解く上で貴重な資料である博士学位論文"Exchange"の翻訳及び分析作業も継続している(裏面項目11の2番目・4番目)。今年度の研究計画として(1)ジェームズの心理学が日本語に翻訳されるにあたり特に強調されている部分の分析検討(2)日本におけるジェームズ心理学の受容過程の解明(3)ジェームズとラッドそれぞれのself概念の意味内容の比較検討(4)上記2名と同時代の海外心理学者の著作、学説が日本国内でどのように訳されたのか分析検討する、という4点を挙げ、これらを並行して進めた。特に(3)の成果の一部は論文としてまとめ、近日中に発表予定である(裏面項目11)。また、(4)について、特にアレキサンダー・ベインに関する文献収集を重点的に行なった。ベインに焦点を当てたのは下記の理由による。研究代表者(鈴木)は元良勇次郎に関する文献収集の一環で8月に三田市立図書館(兵庫県)を訪問した折、偶然に、ベイン原著の未公刊の日本語訳文献の存在をしった。翻訳者は元良の三田時代の師である川本清一(化学者として著名な川本幸民の子)であり、ベインの"Mental Science"を「心理学」として訳したものであった。所蔵する日本学士院と一橋大学図書館にて原本を確認したところ、学士院蔵のものは草稿、そして一橋大学のものは文部省に提出された清書であり、それぞれの複製を入手、分析を行なっている。文部省の官吏であった川本が明治5年から8年のあいだに手がけた仕事と推測される。明治8年に文部省から刊行された西周訳の『心理学』がタイトルに「心理学」が付いた最初の書とされていることからも重要な発見と考えられる。内容については、例えば川本が「自覚」という語を充てているところに、校閲者(西村茂樹か?)が「意識」に朱字で修正するなど、「自我」概念そして「自我」に関連する諸名称、概念の定着過程を考察するうえで極めて有益な資料であり、この分析も引き続き進めて行きたいと考える。

このなかで鈴木は,精神分析の中心的概念である「自我」と「無意識」それぞれが,精神分析輸入前後の時期に心理学的な文脈のなかでいかに受けとめられていたかを,元良のほか上野陽一,増田惟茂らの著作から分析したが,特に「自我」概念の展開については明治20年代半ばからの「自我実現説」(T.H.グリーンの説が中島力造によって翻訳された)の流行から受けた影響を指摘している。以上と並行して,元良の「自我」概念を解く上で貴重な資料である博士学位論文"Exchange"の翻訳及び分析作業も継続している(裏面項目11の2番目・4番目)。
ラット新規小眼球関連遺伝子の同定と、それをターゲットにした新規マウスモデルの樹立

NAK/Nokhラットは完全な眼球欠損を認める無眼球ラット系統であり、その主要な発症原因となる遺伝子変異は、第16番および2番染色体に存在することを明らかとした。そこで、これら染色体領域を対象とした次世代シークエンス解析により、第16番染色体ではTti2およびCyp4v3、第2番染色体ではGja8およびAbca2がNAKの無眼球症に関与する有力な遺伝子であることが示唆された。さらに、Tti2についてはアミノ酸残基の置換を引き起こすミスセンス変異がNAK特異的に同定された。以上の結果から、本研究はTti2がNAKの小眼球症の原因の一つとなることを強く示唆した。我々はヒト小眼球症モデルとなり得るNAK/Nokh(NAK)ラットを樹立し、本系統が他の系統との交配によってヒト集団にみられるような表現型のバリエーションを示すこと、およびその発症原因遺伝子が第16番染色体に存在することを報告してきた。本研究では、NAKの発症責任遺伝子を同定するために、RNA-seqによるNAKの遺伝子変異スクリーニング、および遺伝子発現解析を試みた。NAK、SDおよびBNにおけるRNA-seq解析を行った結果、平均してそれぞれ3.1 Gb、4.6 Gbおよび3.7 Gbのシークエンスデータが得られた。次にBNとNAKにおけるシークエンスデータを比較した結果、4,214個のindelおよび7,600個のSNP、合計11,814箇所の変異が検出された。また、NAKの責任遺伝子座が存在する第16番染色体上の5070 Mbの領域には12個のSNPおよび16個のindelが存在し、それらは5種類の遺伝子において認められた。一方、SDおよびNAKにおける遺伝子発現解析の結果、100種類の遺伝子において有意な発現変動が確認され(FDR < 0.01)、そのうち14種類の遺伝子では発現量の増加、86種類の遺伝子では発現量の減少が認められた。また、発現量が減少した遺伝子のうち25種類は眼球発生に関与するGO termに分類された。このことから、NAKの無眼球症は眼球発生に関与する遺伝子群の発現量の減少により引き起こされることと推測された。さらに、NAKの責任遺伝子座が存在する第16番染色体の候補領域では、2種類の遺伝子について発現量の有意な減少が認められた。現在は第16番染色体において変異が検出された遺伝子、および発現変動が確認された遺伝子について解析を進めている。我々は、ヒト小眼球症のモデルとなりうる無眼球ラット系統を樹立し、さらに、本系統は他系統との交配によって、ヒト集団にみられるような表現型バリエーションを示すこと、およびその発症原因遺伝子および修飾遺伝子が、ともに第16番染色体に存在することを明らかにした。そこで本研究は、無眼球ラットの発症原因遺伝子および修飾遺伝子群の同定、ならびにそれら遺伝子群の遺伝子改変動物を用いた眼球発生における遺伝子機能の解明を目的とした。本年度では昨年度のRNA-seqにより得られた発現変動遺伝子群について、免疫組織染色またはin situハイブリダイゼーション解析による発現解析を実施した。その結果、RNA-seqの発現量の減少と同様に、NAKラットにおいて組織レベルにおいてもVSX2およびRaxの著しい発現量の減少が認められた。さらに、NAKの水晶体および網膜においてPAX6の発現が認められた一方で、SOX2については水晶体のシグナルが検出されたのに対し、網膜においてのみシグナルの欠失が認められた。以上のことから、NAKラットの胎児期における眼球消失は、網膜発生の異常に起因することが強く示唆された。加えて、本年度ではホールゲノムリシークエンシングによって、これまでの連鎖解析によって候補となった染色体領域の網羅的変異スクリーニングを実施した。その結果とin silico解析の結果から、第16番染色体に存在する2つの遺伝子がNAKの表現型に関与する有力な候補遺伝子であることが示され、それら遺伝子のうち1つにはサンガーシークエンスによりNAK特異的な非同義置換、もう1つにはRT-PCRにより3'側の転写産物の欠失が認められた。以上の結果から、これら遺伝子がNAKラットの表現型に関与することと強く示唆された。本年度ではRNA-Seqより得られた遺伝子発現プロフィールおよびcSNPなどの変異解析を実施した。その結果、NAKにおいて発現量が減少する遺伝子群の同定、ならびに第16番染色体の遺伝子群の変異を検出し、これをNAK小眼球症の原因となる候補として選定した。従って、研究計画は概ね順調と考える。実験動物学今後は前年度のRNA-Seqに加え、全ゲノムシークエンシングにより、シスエレメントやスプライスサイトなどの変異スクリーニングを実施する。さらにそれらの情報に基づいた遺伝子およびタンパク質発現解析、CRISPR/Cas9を利用したゲノム編集マウスおよびラットの作製を試みる。研究費の執行可能期間に試薬の納品が間に合わなかったため、次年度の執行とした。繰り越した研究費はPCRによるラットのジェノタイピングに関する試薬を購入する。