hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小腸の粘膜免疫および全身免疫に対する米タンパク質摂取の有効性

予備的な検討から、米胚乳タンパク質(REP)は小腸の免疫関連遺伝子の発現に影響を与える可能性が示された。そこで本研究では、REPが免疫系に与える影響について明らかにすることを目的にした。細胞性免疫が強いLewisラット、液性免疫が強いBrown NorwayラットにREPを3-4週間摂取させ、小腸の免疫関連遺伝子発現および血漿中I型ヘルパーT (Th1)細胞/II型ヘルパーT (Th2)細胞バランスに与える影響を検討した。その結果、卵白タンパク質群と比較して、REP群では細胞性免疫に関係する遺伝子群の発現が上昇し、血漿中Th1/Th2バランスをTh1細胞側に偏向させることが明らかとなった。本研究では米胚乳タンパク質(RP)摂取が腸管免疫および血中I型ヘルパーT(Th1)細胞/II型ヘルパーT(Th2)細胞バランスに与える影響を検討することを目的とした。本年度は供試動物として,細胞性免疫が強いLewis雄性ラット(3週齢)を用いて検討を行った。試験群はRP群と,対照群として免疫系への有益な効果が報告されていないオボアルブミン(OVA)群の2群とし,試験終了時に回収した空腸をDNAマイクロアレイ解析に供した。マイクロアレイ解析は各個体より抽出したtotal RNAを群ごとにプールし,各群n=1として解析を行った。その結果,OVA群と比較してRP群の空腸において,免疫関連の遺伝子群が数多く変動しており,特にTリンパ球やナチュラルキラー(NK)T細胞,NK細胞の数に関係する遺伝子群などに変動がみられた。具体的な遺伝子として,ノックアウトするとNK細胞数が減少することが報告されているPik3cdやNK細胞の受容体であるCd244が1.5倍以上に発現上昇していた。さらにナイーブT細胞からTh1細胞への分化を誘導するインターロイキン12とそのシグナル伝達に関係するStat4の遺伝子発現が1.2倍以上に発現上昇していた。以上の遺伝子解析の結果より,RP摂取は細胞性免疫を活性化する機能を有している可能性が推察された。この結果を受け,血中のTh1/Th2バランスを算出したところ,OVA群と比較して,RP群で有意な上昇がみられた。以上の結果からRP摂取は細胞性免疫を活性化する機能を有している可能性が示された。一方,腸管において病原菌やアレルゲン侵入阻止に寄与するイムノグロブリンA(IgA)の分泌量を糞中への排泄量から評価したところ,期待に反してOVA群と比較してRP群で有意に低値を示した。平成25年度は細胞性免疫(Th1側)が強いLewis雄性ラットを用いて検討を行ったが、平成26年度は液性免疫(Th2側)が強いBrown Norway(BN)雄性ラット(3週齢)を用いて検討を行った。試験群としてRPをタンパク質源としたRP群、対照群として免疫系への有益な効果が報告されていないオボアルブミン(OVA)をタンパク質源としたOVA群を設定し、血中IgG2a(Th1側)/IgG1(Th2側)バランスおよび空腸の遺伝子発現に与える影響を検討した。空腸の遺伝子発現変動解析はDNAマイクロアレイ法を用いて行い、結果はRP群の値をOVA群の全ての遺伝子発現を1.0としたときの相対値で示し、RP群で1.2倍以上の発現変動がみられた遺伝子群を解析に供した。その結果、Lewisラットを用いた昨年度の検討と同様に、免疫系に関係する遺伝子群の発現変動数が最も多く、RPが腸管免疫系に大きな影響を与えていることが示唆された。個別に発現変動をみていくとNatural killer (NK)細胞の活性化受容体として知られているNcr3、そのシグナル伝達に関与するCd247、Fcer1gなどの遺伝子発現が1.2倍以上にそれぞれ発現上昇しており、さらにNK細胞の細胞障害活性の主役であるGranzymeも1.2倍以上に発現上昇しており、RP摂取によりNK細胞が活性化している可能性が期待された。また腸管免疫において重要なIgA分泌に関与するB細胞の表面抗原や受容体などの遺伝子発現が上昇している可能性が示され、IgA分泌が亢進している可能性が期待された。一方、Th1/Th2バランスは昨年度のLewisラットの結果と同様に、RP摂取により有意にTh1側に偏向することが示された。栄養学食品化学平成25年度の研究実施計画では,細胞性免疫の強いLewisラットを用いた検討を行うこととしており,計画書通りLewisラットを用いた検討を中心に研究を進めてきた。

第一の目的である小腸および脾臓のマイクロアレイ解析は計画書通り進捗し,特に小腸において細胞性免疫に関連する遺伝子群の発現上昇がみられることを明らかにした。現在,マイクロアレイ解析によりスクリーニングされたこれら遺伝子群のreal time PCR解析を行うためにプライマーを設計し,検出条件の検討を行っている。一方,YAC-1細胞を用いた細胞障害活性の測定については,未だ行えておらず平成26年度に速やかに実行する必要がある。また,糞中へのIgA排泄量の測定については,研究実績の概要にも記載した通り,期待通りの結果ではなかったものの既に解析を終了した。この糞中IgA排泄の結果については,今後文献などを検索し,より詳細な考察を進めていく予定である。血中Th1/Th2バランスの測定も予定通り解析が終了しており,期待通りの解析結果を得ることができた。一部研究計画を達成できていない項目もあるが,マイクロアレイ解析や血中Th1/Th2バランスの測定は,当初平成26年度の予定であったBrown Norwayラットを用いた検討を前倒しで既に進めており,データ解析も研究計画書以上に順調に進捗している。また,平成25年度中の検討から,RP摂取によるTh1/Th2バランスの改善効果がより強く期待されたことから,実際のTh1細胞およびTh2細胞の存在比を,フローサイトメーターを用いて検討する予備的な検討を既に行っており,今後は新たにこの解析手法を用いた検討も行う予定にしている。研究計画に従い,平成26年度はBrown Norwayラットを用い,小腸のマイクロアレイ解析および血中Th1/Th2バランスの測定を中心に検討を行い,並行して研究計画を達成できていないreal time PCR解析を行う予定にしている。平成25年度の検討結果より,NK細胞数に関係する遺伝子の発現上昇の可能性が明らかとなったことから,YAC-1による細胞障害活性の評価だけではなく,新たにフローサイトメトリーを取り入れ,細胞障害活性に関与するNK細胞を含む各種免疫担当細胞の存在割合の測定を行い,NK細胞数に与える影響について直接的に評価することも視野に入れ検討を進める。
葉緑体から核への遺伝子移行を説明する翻訳不適合説の実験的検証

葉緑体はラン藻様の原核生物が宿生細胞に共生して生じた。この祖先原核ゲノムは、一部を葉緑体に残し大部分は核に移行した。我々は、翻訳系の変化に対応できなくなった遺伝子が核に移行したという「翻訳不適合説」を立て、この説の検証を我々のタバコ葉緑体融in vitro翻訳系を用いて試みた。1.タバコ核由来のrbcS mRNAの翻訳速度の測定(中邨)約1.8kbのタバコ葉緑体rbcL mRNAの翻訳速度を蛍光リジンtRNAの取込みで測定したが、長すぎて翻訳されにくかった。3'末端側を順次欠失させて翻訳効率を上げ、約3分の2を欠失して158コドンにしたものが良い結果を得たので、この短縮rbcL mRNAを使うことにした。一方、核コードのrbcS mRNAはトランジット配列と成熟SSをコードするので、SSコード領域のみを葉緑体rbcL mRNAのLSコード領域と置き換えたキメラmRNAを作製した。この両mRNAのin vitro翻訳を試みたが、再現性ある結果がまだ出ていない。2,対照実験としての他種のmRNAの調査と調製(杉浦)対照実験として、葉緑体コードのリボソームタンパク質S2と核コードのリボソームタンパク質L23の遺伝子をまず候補とした。本調査中に、葉緑体のリボソームタンパク質Sl6遺伝子がシロイヌナズナの核にもあり、その産物がミトコンドリアと葉緑体へも移行するとの報告が出たので(Ueda et al.2008)タバコ葉緑体Sl6 mRNAを用いてin vitro翻訳を行っている。タバコのESTも蓄積中なので核ゲノムのS8遺伝子を探索中である。本計画は完了までに至らなかったが、引き続き研究費を申請して研究を続行する予定である。葉緑体はラン藻様の光合成原核生物が宿生細胞に共生して生じた。我々は、翻訳系の変化に対応できなくなった遺伝子が核に移行したという「翻訳不適合」という考えに至り、この説の検証を我々の改良タバコ葉緑体in vitro翻訳系を用いて試みた。1.タバコ核由来のrbcS mRNAの翻訳速度の測定(中邨)核と葉緑体の翻訳開始の機構は全く異なるので、核のmRNAを葉緑体で翻訳させるためには5'UTRと3'UTRを葉緑体のものと置換する必要がある。rbcS mRNAはトランジット配列と成熟SSをコードするので、SSコード領域のみを葉緑体のrbcL mRNAのLSコード領域と置き換えたキメラmRNAを作製するための素材作りを行った。次いで、rbcL mRNAの翻訳速度をin vitro系で蛍光リジンtRNAの取込みで測定した。このmRNAは1.8kbにもなる大きなものでin vitro系では翻訳されにくいことがわかったので、3'末端側を決失させて翻訳効率を上げることとした。2.対照実験としての他種のmRNAの調査と調製(長谷川、杉浦)上記の実験結果の評価には、対照実験が必要であるとの考えに至った。そこで、対照実験用mRNA種としてどれが適当か調査し、葉緑体コードのリボソームタンパク質S2と対応する核コードのリボソームタンパクの遺伝子を調べたが配列決定されているのが少なく、我々がクローニングしたリボソームタンパクL23を一応の候補とした。また、翻訳開始因子IF-1はタバコ葉緑体では5'末端が壊れており偽遺伝子化していて、核ゲノムに機能する遺伝子が移っているので、葉緑体の方をAUGを加えて翻訳できるかどうか、核コードのIF-1コード領域が葉緑体の5'と3'UTRに入れ替えて翻訳可能かどうかを調べるのが良いと思われる。
早期観測によって迫るIa型超新星の起源

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
EBウイルス感染症の多様性と病態発現機序に関する研究;標的細胞特異的病態発現におけるウイルス遺伝子発現調節とクローン成立機構

EBVコード化小RNA1(EBV encoded small RNA1,EBER1)は、あらゆるEBV感染細胞に全ての感染様式において大量に発現しているRNAであるが、その発現調節機構は明らかではない。しかし現在、EBER1を標的とした生体内局所ハイブリダイゼーション(in situ hybridization,ISH)が、EBV関連疾患の診断に広く利用されている。今回の検討では、EBER1を標的としたISHにフローサイトメトリー(flow cytometry,FCM)による解析を組み合わせた解析法(ISH/FCM)によりEBV感染細胞の定量的評価を試みた。その結果、フルオレッセン標識EBER1プローブを用いたISH/FCMによって、従来のアルカリフォスファターゼ標識EBER1プローブによるISHに比べ、より定量的な評価が可能であった。しかし、EBER1陽性細胞1%以下の、感染細胞比率の低い検体での定量的評価は現時点では困難であった。また今回の検討ではEBER1発現の程度は種々の細胞株によって異なり、また同一細胞株においても蛍光輝度の分布が幅広く、個々の細胞におけるEBER1発現量が異なることが明かとなった。このことより、EBER1発現は、宿主細胞種の違いや、個々の細胞により異なる因子によって調節されていることが示唆された。本法を用いた臨床検体の解析では、対照及び伝染性単核症では末梢血中にEBER1陽性細胞は検出されず、HLHやCAEBVでは容易に検出できた。したがってEBER1 ISH/FCMによりHLHやCAEBVにおける感染細胞や感染様式のモニターが比較的容易にできると考えられた。また本法は、他のEBV関連遺伝子や感染細胞の表面抗原との多因子解析により、さらに簡便に多くの情報をもたらすと考えられた。浮遊細胞状態にてin situ hybridizationを行ないフローサイトメトリー法を駆使して,個々の細胞レベルでのEBER-1 mRNA発現を定量的に解析した.既存のEBV感染培養細胞株とEBV非感染培養細胞株を様々な比率で混合し,その検体を直接蛍光標識されているプローブを用いてin situ hybridizationを行ないフローサイトメトリー法にて解析し,その検出率に関し検討した.EBV感染細胞比率1.6%まで検出可能であったが,蛍光強度の弱い細胞株を用いて検討した場合検出が困難で一定の結果が得られなかった.臨床検体を用いた検討では,健康成人や急性EBV感染症である伝染性単核症では感染細胞に比率が低く評価困難であったが,重症EBV感染症である血球貪食症候群(HLH),慢性活動性EBV感染症(CAEBV)では,感染細胞の比率を本法にて評価可能であり経過観察にも適していた.また,このような感染細胞をセルソーターにて表面マーカー上有意に増加している亜群を単離し本法にて解析した結果,EBV感染の有無が速やかに解析できた.現在は,検出感度を向上させるため,蛍光標識プローブではなく,他の標識プローブにて感度を上げるよう検討中である.また,セルソーターを使用せずに表面マーカーの解析と本法を2カラー法にてさらに簡便に施行し,感染細胞のcharacterizationを簡便に解析できるよう検討中である.なおPCR法によるEBV terminal repeatを指標としたクローナリティーに関してはまだ検索中である.EBVコード化小RNA1(EBV encoded small RNA1,EBER1)は、あらゆるEBV感染細菌に全ての感染様式において大量に発現しているRNAであるが、その発現調節機構は明らかではない。今回の検討では、EBER1を標的としたISHフローサイトメトリー(flow cytometry,FCM)による解析を組み合わせた解析法(ISH/FCM)によりEBV感染細胞の定量的評価を試みた。その結果、フルオレッセン標識EBER

1プローブを用いたISH/FCMによって、従来のアルカリフォスターゼ標識EBER1プローブによるISHに比べ、より定量的な評価が可能であった。しかし、EBER1陽性細胞1%以下の、感染細胞比率の低い検体での定量的評価は現時点では困難であった。また今回の検討ではEBER1発現の程度は種々の細胞株によって異なり、また同一細胞株においても蛍光輝度の分布が幅広く、個々の細胞におけるEBER1発現量が異なることが明らかとなった。このことより、EBER1発現は、宿主細胞腫の違いや、個々の細胞により異なる因子によって調節されていることが示唆された。本法を用いた臨床検体の解析では、対照及び伝染性単核症では末梢血中にEBER1陽性細胞は検出されず、HLHやCAEBVでは容易に検出できた。したがってEBER1 ISH/FCMによりHLHやCAEBVにおける感染細胞や感染様式のモニターが比較的容易にできると考えられた。また本法は、他のEBV関連遺伝子や感染細胞の表面抗原との多因子解析により、さらに簡便に多くの情報をもたらすと考えられた。
カオリン水頭症モデルで見られる異所性アクアポリン1の水頭症発症における役割の解明

カオリン誘発性水頭症モデルラットを用いて、水頭症発症時に異所性に増加している水チャンネル・Aquaporin 1(AQP1)を、RNA interference (RNAi)を用いてノックダウンすることにより、AQP1が水頭症形成にどのような影響を及ぼすか検討した。その準備として、ウェスタンブロットに適したウサギ抗AQP1血清の調製と、ノックダウンに適したsiRNAの配列を見出すことが出来た。しかし、in vivo RNAiを実現するための投与法については、本期間内に適切な方法を見出すことが出来ず、その確立が今後の課題となった。くも膜下出血後の合併症などとして知られる正常圧水頭症の発症機序解明のため、カオリン誘発性水頭症モデルラットを用いて、水頭症発症時に異所性に増加している水チャンネル・Aquaporin-1(AQP1)を、RNA interference (RNAi)を用いてノックダウンすることにより、AQP1が水頭症形成にどのような影響を及ぼすか検討することとし、以下の研究を実施した。はじめに、RNAiを用いて水頭症モデルラットでのAQP1の発現を特異的に抑制させることを目指すにあたり、その基礎となるAQP1の発現量を定量するシステムが必要であった。AQP1の発現量については、mRNAを定量する方法と蛋白質を定量する方法が想定されるが、1AQP1蛋白質の定量法がまだ充分には確立していなかったこと。2当研究室において、ウサギにAQP1部分ペプチドを免疫し、抗AQP1血清をすでに調製していたこと。など、以上の2点の理由から、AQP1蛋白質をウェスタンブロット(WB)法で定量する方法の確立を目指すこととした。AQP1を発現している培養細胞株(C6ラットグリオーマ細胞)とラット脳組織を用いて、得られていた抗血清2ロットの反応性を検討したところ、一方がWB法に適していることを確認できた。次に、最適なsiRNA配列を決定するために、in silicoにて検索した3つの配列を元に合成したsiRNAをC6細胞に導入し、WB法でAQP1の発現量を調べることにより、RNAiの効率について検討した。その結果、1つの配列が効率よくAQP1蛋白質の発現を低下させることが明らかとなった。一方、この配列をラットへ投与するにあたり、投与法を検討した。これについては、髄腔内という特殊な環境下に、分解しやすいsiRNAを投与し続ける必要があり、本期間内に適切な方法を見出すことが出来ず、その投与法の確立が今後の課題である。1.培養細胞株を用いたアクアポリン1(AQP1)のノックダウン効果についての評価法の確立RNA interference (RNAi)法を用いてラットの疾病モデル(水頭症)でのAQP1の発現を特異的に抑制させることを目指すにあたり、まず最適なsiRNA配列を決定する必要がある。このため、AQP1を発現している培養細胞株(C6グリオーマ細胞)を用いて、AQP1の発現量を定量するシステムが必要であった。AQP1の発現量については、mRNAを定量する方法とタンパク質を定量する方法が想定される。(1)AQP1がin vivoの実験系である水頭症形成に何らかの役割を演じていると仮定した場合、その機能分子としてのAQP1タンパク質を定量評価することが望ましく、タンパク質の定量法についても、in vitroの系である細胞培養系を用いて確立させておくことが望ましい。(2)当研究室において、ウサギにAQP1タンパク質を免疫し、抗AQP1血清をすでに調製している。以上の2点の理由から、AQP1タンパク質をウェスタンブロット法で定量する方法の確立を目指すこととした。現在までに、得られた抗血清2ロットのうち、適切な1ロットがウェスタンブロットに適していることを確認できており、さらにノックダウン実験に向けた予備実験を行っている。2.ラット髄腔内への持続的siRNA投与法の検討in vivoでのRNAiによるAQP1ノックダウンの効果を評価するにあたり、数ヶ月間と比較的長期間に渡り、髄腔内という特殊な環境下にsiRNAを投与し続ける必要がある。このため、溶媒のグレード、手術手技などを検討し、現在その検証準備を行っている。現在、培養細胞よりタンパク質を精製しウェスタンブロット法でAQP1タンパク質を定量する実験系について検討している。AQP1を含むタンパク質の精製法について、今後in vivoからの精製を行うことも鑑み、in vitro, in vivo共通で適用できる方法について検討を行っている。概ね、培養細胞からのタンパク質精製を行うための、培養細胞数・培養条件などの確認作業はほぼ終了したが、RNAiを行うことから、今まで行っていた細胞スケールより小さいスケールでの実験となるために条件設定が厳しくなり、新たなプロトコールを作成する必要があったため、この確認に時間を費やした。

また、この系で用いる抗AQP1抗体について、既にウサギ抗血清は精製済みで、2つのロットが得られ、ロットチェックは概ね終了していたが、ウサギ抗血清の性能やウェスタンブロットの反応条件について、引き続き検討が必要で慎重に評価を行っており、ここでもさらなる時間が必要となっている。また、ラット髄腔内への持続的siRNA投与法についても、中枢神経系内という特殊な空間に、外部から持続的に薬剤(siRNA調製液)を注入する必要から、検討に時間を要している。siRNA調製液の中枢神経系への安全性、siRNAの導入効率について、既製品を使用できるか検証作業中である。またラットの手術についても、感染やRNase混入のリスクを極力減じた手技を確立する必要があり、現在カテーテルの長さ、刺入長や留置部位あるいは、オスモティックミニポンプの留置部位や手順など諸々の条件について、既にある程度は確立しており既製品の存在するが、一部カスタマイズする必要が生じており、その検討や確認に時間を要している。AQP1タンパク質のノックダウンの評価のためには、ウェスタンブロット法によるAQP1タンパク質の定量が不可欠であったが、その実験条件の設定に時間を要してしまったために、全般的に進行が遅れてしまっている。このため、早急に、AQP1タンパク質を定量するためのウェスタンブロット法について実験条件を確立し、in vitro実験系でのRNAiを実施する。RNAiで使用するsiRNAの配列については、既にいくつかの候補をピックアップし、既に合成済みである。このため、AQP1タンパク質の定量法が確立したところで、直ちにRNAi実験を行うことが出来る見込みであり、そしてAQP1タンパク質の発現抑制度について評価した上で、この実験系にふさわしい適切なsiRNA配列を決定できる見込みである。そして、この実験結果をもって、in vivo実験系にsiRNA配列を適用する予定となっている。また、動物の手術手技やオスモティックミニポンプによる髄腔内へのsiRNA長期投与についての検討を行う。とりわけ、髄腔内へ挿入するカテーテルの選択が重要と思われる。刺入部位やどれくらいの深さまで刺入し先端をどこに留置するかなど、諸々の条件について検討する必要があるが、類似の実験が既にいくつかなされていることから、若干の修正を行うことで適応できる見込みである。そしてin vivo実験系におけるRNAiの効果について、脳よりAQP1タンパク質を抽出し、発現抑制が実際にみられるか評価を実施できる見込みである。その結果を踏まえ、ラット水頭症モデルに適応し、AQP1のノックダウンが水頭症形成にどのような影響を与えるか評価し、AQP1の役割について検討する予定となっている。1. AQP1タンパク質の定量およびRNAiの評価AQP1タンパク質の精製およびウェスタンブロット法で使用する試薬、また、siRNAの合成や細胞・組織内に導入する試薬など、当初は平成23年度中に終了する予定であったものもあるが、引き続き24年度でも実施する必要があり、適宜購入予定である。また、一部は使用期限の短いものがあり、引き続き実施予定があるものもあるため、使用の都度購入する予定である。2.ラット髄腔内への持続的siRNA
移行運動量をパラメータとする電子・分子衝突立体ダイナミクスの研究

電子と分子が衝突するとき、分子の向きが入射電子ビーム軸と垂直か平行か、あるいは遠方衝突か近接衝突かに依存して衝突が起こる確率や衝突の物理的内容が異なるのではないだろうか。本研究の目的は、そうした電子・分子衝突の立体ダイナミクスという新しい研究分野の開拓である。この目的を達成するため、分子の空間的配向と移行運動量の二つをパラメータとする電子散乱同時計測法を開発し、予期していた以上に顕著な立体ダイナミクスの効果を見出すことに初めて成功した。電子が分子に衝突する時、分子軸の向きが入射電子ビーム軸と垂直か平行か、あるいは遠方衝突か近接衝突に依存して衝突の起こる確率や衝突の物理的内容が異なるのではないだろうか。本研究の目的は、そうした極めて基礎的な問いに初めて応える、電子・分子衝突の立体ダイナミクスという新しい研究分野の開拓である。具体的には、研究代表者らが世界に先駆けて開発した(e,2e+M)分光を展開し、分子配向と衝突径数の二つをパラメータとして電子衝撃イオン化断面積を測定する「電子・分子衝突の反応顕微分光法」として確立する。上記の目的に向けて、本研究計画初年度である平成25年度は、まず荷電粒子トラジェクトリー・シミュレーションにより(e,2e+M)反応の検出効率の精査を行った。その結果、当初予定していた(電子・電子・解離イオン)三重同時計測に比べて、解離イオンの運動量精密測定を前提とする(電子・解離イオン)二重同時計測の方が桁違いに大きな信号強度が期待できることを見出した。この知見を踏まえ、真空チェンバーと電子エネルギー分析器の設計と製作を行うと共に、イオン分析器の新規設計を進めた。また真空チェンバーの排気ポンプとして市販のターボ分子ポンプを購入した。以上の成果を踏まえて、試作ないしは開発を要するイオン分析器、超音速分子線源、およびパルス電子銃を次年度に整備し、「電子・分子衝突の反応顕微分光装置」をシステムとして完成させる予定である。電子が分子に衝突する時、分子軸の向きが入射電子ビーム軸と垂直か平行か、あるいは遠方衝突か近接衝突かに依存して衝突の起こる確率や衝突の物理的内容が異なるのではないだろうか。上記の目的に向けて、本研究計画初年度の平成25年度には真空チェンバーと電子エネルギー分析器の設計・製作、及び市販ターボ分子ポンプの購入を行った。この成果を踏まえ、本年平成26年度には、高分解能マルチヒット位置検出システム、高圧電源、およびそれらを収容・操作するためのラックを購入すると共に、パルス電子銃や分子線源の設計・製作を行い、これらを組み合わせることにより装置を完成させた。上記の目的に向けて、真空チェンバー、電子エネルギー分析器、高分解能二次元検出器、パルス電子銃、分子線源など試作や開発を要する設備を組み合わせて装置をシステムとして本研究計画2年目の平成26年度までに完成させた実績を踏まえ、本年度平成27年度には、予備実験を開始した。具体的には、MHz周期でナノ秒幅、エネルギー2 keVのパルス電子線をN2分子やO2分子に衝突させ、生成する非弾性散乱電子と解離イオンとの二重同時計測を行い、それら二つの荷電粒子のエネルギー相関と角度相関を調べた。その結果、電子エネルギー損失分光断面積の角度分布が、予期した通り、標的分子の空間的な向きや衝突衝突径数に依存して大きく変化する様を初めて捉えることができた。現在は、電子エネルギー損失分光断面積の角度分布が何故そのようなふるまいをするのかについて、検討を進めている。本研究計画は、新規分光法の開発に大きなウエイトを置くため、応募申請書では研究計画期間の4年を装置開発のための前半2年と装置立ち上げおよび実験研究のための後半2年に分けた。事実、研究計画3年目の平成27年度には、予備的結果ではあるものの、電子散乱断面積が標的分子の空間的な向きや衝突衝突径数に依存して大きく変化する様を捉えることができた。従って、本研究計画全体に対するこれまでの達成度は、本研究計画の応募申請書とほぼ相違なく、おおむね順調に進展していると判断できる。電子が分子に衝突するとき、分子軸の向きが入射電子ビーム軸と垂直か平行か、あるいは遠方衝突か近接衝突かに依存して衝突の起こる確率や衝突の物理的内容が異なるのではないだろうか。具体的には、研究代表者らが世界に先駆けて開発した(e,2e+M)

分光を展開し、分子配向と衝突径数の二つをパラメータとする電子衝撃イオン化断面積を測定する「電子・分子衝突の反応顕微鏡」として確立する。上記の目的に向けて、真空チェンバー、電子エネルギー分析器、イオン二次元検出器、パルス電子銃、分子線源など試作を要する設備を組み合わせて前年度までにシステムとして立ち上げた装置を用いて、N2分子やO2分子等の単純二原子分子を標的とした実験を行った。例えば、MHz周期でナノ秒幅、エネルギー1.4-2 keVのパルス電子線を標的分子に衝突させ、F2Σg+イオン励起状態への遷移で生じる非弾性散乱電子と解離イオンとの同時計測を行い、それら二つの荷電粒子のエネルギー相関と角度相関を測定した。その結果、分子座標系での電子エネルギー損失分光断面積の角度分布が、予期した以上に鋭敏に、標的分子の空間的な向きや衝突径数に依存して変化することを見出した。また、電子衝突の利点を活かして、N2分子の光学禁制遷移(2Σg⇒1πg)にも取り組んだ。この場合は、分子座標系での散乱断面積が標的分子の空間的な向きや衝突径数によって大きく変化することのみでなく、遷移に関係する分子軌道の空間的形状にも強く依存することを見出した。以上のように、本研究は所期の目標を達成し、一定の成果を得ることができた。電子と分子が衝突するとき、分子の向きが入射電子ビーム軸と垂直か平行か、あるいは遠方衝突か近接衝突かに依存して衝突が起こる確率や衝突の物理的内容が異なるのではないだろうか。本研究の目的は、そうした電子・分子衝突の立体ダイナミクスという新しい研究分野の開拓である。この目的を達成するため、分子の空間的配向と移行運動量の二つをパラメータとする電子散乱同時計測法を開発し、予期していた以上に顕著な立体ダイナミクスの効果を見出すことに初めて成功した。本研究計画は、新規分光法の開発に大きなウエイトを置くため、応募申請書では研究計画期間の4年を装置開発のための前半2年と装置立ち上げおよび実験研究のための後半2年に分けた。応募申請書の内容からの変更点は、本研究計画初年度に行った荷電粒子トラジェクトリー・シミュレーションによる検出効率の精査の結果を踏まえて、当初予定していた(電子・電子・解離イオン)三重同時計測に比べて桁違いに大きな信号強度が期待できる新規プロトコルに則した電子エネルギー分析器の仕様のみである。従って、本研究計画全体に対するこれまでの達成度は、本研究計画の応募申請書とほぼ相違なく、おおむね順調に進展していると判断できる。平成27年度までの成果を踏まえて、本研究計画最終年度となる平成28年度では、開発した装置のエネルギー分解能、運動量分解能、時間分解能など各種実験パラメータの最適化を図り、種々の単純分子を対象として分子配向と衝突径数の二つをパラメータとする電子衝撃イオン化断面積の測定を行う。これにより、分子配向と衝突径数の二つをパラメータとして電子衝撃イオン化断面積を測定する「電子・分子衝突の反応顕微分光法」として確立し、所期の目的を達成する。28年度が最終年度であるため、記入しない。物理化学平成25年度、26年度までの成果を踏まえて、本研究計画3年目の平成27年度では、オシロスコープを購入し、予備実験を重ねることにより装置をシステムとして立ち上げる。具体的には、まずcw型電子線を用いてエネルギー分析器の立ち上げと調整を図る。
奄美における文化の〈メディア媒介的な伝承・創生〉とアイデンティティ再生の研究

2018年度は、3年間の研究期間の最終年度であるので、奄美島唄と余興文化の調査に集中し、取材と執筆を進めた。【調査実績】島唄の大会については、春に開催された日本民謡協会奄美連合委員会主催の「奄美連合シマ唄大会」(4/29)への取材、南海日日新聞社主催の「奄美民謡大賞」大会(5/19)を取材し、さらに奄美島唄研究の第1人者である小川学夫鹿児島純心大学名誉教授と研究交流を行った。6月(6/29から7/1)と9月(9/4から9/10)には社会調査実習の「島唄研究班」の学生を同伴して、5つの島唄教室への集中的な取材を実施した。永井しずつ・昇和美・松山美枝子・森山ユリ子・大笠利わらべぇ島唄教室である。9月の調査では、共同研究者の川田と合流して一部共同取材を実施した。また、沖縄のうた文化比較のために、沖縄市コザで、沖縄市音楽資料館を中心に資料収集とスタッフ取材を実施した(6/8から6/11)。また共同研究者である久万田と研究討議を重ねた。ポピュラー音楽については、秋に行われた「唄島プロジェクト」イベント(10/26から29)への取材を行った。また、大学の研究費も活用して、沖縄・奄美の文化に関わる文献の収集を集中的に行った。【研究成果】2018年度にまとめた「文化生産論」という文化研究の方法論に関する論考を基に、各論(「奄美島唄の教室化」)にあたる論考を2本まとめた。「奄美島唄という文化生産(1)」と「奄美島唄という文化生産(2)」である。各論の続編(組織化・大会化など)も、続いて公表予定である。また『月刊奄美』(南海日日新聞社)2016から2018年の3カ年間の奄美の音楽イベントを、時系列的に作表した。奄美の音楽活動の全域を表として作成し、社会調査実習報告書のIII部として掲載・発刊した(2019年3月)。また、明治から現代までの「奄美うた文化」のおおまかな文化史も作表した。1うた文化、余興文化、芸能について、メンバーそれぞれが必要に応じて、奄美・東京・大阪などの奄美関係のイベントや文化の担い手への取材を行ってきた。とりわけ昨今では観光や奄美アイデンティティをめぐって奄美からの情報発信が盛んであるので、そうした奄美を発信する文化イベントは極力取材するようにしてきた。2奄美のうた関係者への取材は、奄美大島だけでなく、徳之島、沖永良部島、与論島まで広げて実施してきた。沖永良部島・与論島は、ほぼ全ての唄関係者への第一次の取材を終えることができた。奄美大島・徳之島はまだ多くの対象者が残っている。新民謡については、取材により、グループの存在や歴史的変遷についてかなり解明することができた。ただ、いずれも詳細な整理が残されている。3奄美のうた文化の継承と発展については、その一部の成果を『奄美文化の近現代史生成・発展の地域メディア学』にまとめることができた。とりわけ、唄・音楽イベントと深い関係のある〈文化媒介者〉であるあまみエフエムについては詳細な研究をまとめた。また、島唄・新民謡・奄美ポップスをめぐる奄美関係の音楽産業についても、詳細な論考にまとめた。また、島唄文化については、龍郷町で開設された「奄美・龍郷島ミュージアム」の島唄パネルの執筆を担当し、研究成果を地元に還元した。4社会調査実習の学生を指導して、録音メディア化された奄美の歌文化を対象に、歌詞分析も進めてきた。そうした中で、最近の奄美の歌謡が、アイデンティティ・ソングの側面を強くもっていることも明らかにした。5研究者の交流のため、研究代表者の加藤晴明が、沖縄の分担者の久万田と東京の分担者である川田を訪ねて研究実施や研究内容に関するミィーティングを重ねている。川田は、奄美の余興文化イベントを取材したり、島の余興イベントの担い手への取材を続けている。1全体の進捗状況は、順調である。うた文化研究や芸能研究は、これまでの比較的長い研究の継承しているので、その継承を基盤により網羅的かつ詳細な研究が進んでいる。余興文化については、各種の余興文化イベントや担い手への取材を開始し、現状と研究対象がより明確になりつつある。2うた文化については、奄美群島全域(奄美大島・徳之島・沖永良部島・与論島)まで調査を広げることができた。これは次年度に予定して調査事項であるので、研究の進捗が予定より早く進んでいる。それにより、群島の文化は各島の間での差異をかなり明確に認識することができた。また、群島内で、島唄・新民謡文化の担い手については、対象者の全体を把握することができた。対象者への取材も逐次進めている。奄美ポップスについては、まだ調査がスタートした段階で、全容の把握には至っていない。3本研究では文化の〈メディア媒介的展開〉について、唄文化などのイベントのリスト化は、記事素材(南海日日新聞)は集めることができた。そこからピックアップしてのリスト化はこれからの課題である。島の既存マスメディアのうち、ケーブルテレビとラジオについては、イベントや番組プログラムのリスト化はほぼ完成している。具体的な内容分析をどこまで進めるかの検討作業は未着である。

4本研究では、メディア概念の拡張して多様な文化活動の実践をメディアとして捉える視点を提起してきたが、その一翼である、公民館講座ついては、群島全部の公民館の講座・4年分の受講者の一覧表を作成することができた。文化の裾野にあたる人々の文化活動、とりわけ奄美ポップスなどの現代的な文化については、一部の代表的に担い手への取材が始まったばかりである。5研究は、それぞれのテーマにも基づいて3名の研究者が個々に現地入りしているが、代表者がそれぞれの分担者と研究交流してそれぞれの研究調整や進展を図っている。3年間の研究の2年目であり、現地での取材調査と資料収集・文献収集を続けてきた。取材については、奄美の歌文化のなかでも、「奄美新民謡・奄美歌謡」の社会的世界を長く担ってきた3つのファミリー(山田サカエファミリー、久永美智子と夕月会、米倉ファミリー)への取材を繰り返してきた。また、地元の新民謡研究者(楠田哲久氏・鹿児島大学大学院出身)との交流を続けて新民謡についての理解を深めてきた。奄美と沖縄の歌文化の比較のために、沖縄市の音楽村の資料コーナー取材や沖縄の地元レーベル(キャンパスレコード)関係者、音楽批評雑誌(「沖縄音楽旅行」)関係者への取材を行い、比較研究を進めてきた。また沖縄の民謡・新民謡の代表的な音源の収集も行ってきた。奄美シマ唄では、著名な唄者(松山美枝子氏・川畑さおり氏・菅沼節枝氏等)などへのライフストーリー取材を続けてきた。また集落の中でのシマ唄の昔の姿を知るために笠利の「用」集落、名瀬の「小宿」集落の方々との交流・取材を実施した。とりわけ「用」集落では、学生の社会調査実習者にも参加してもらい、集落の方々と交流することで豊年祭・八月踊りを再現していただいた。研究成果のまとめとして、『奄美うた文化の近現代史』の出版に向けての執筆作業を進めた。具体的には、1章の方法論(文化研究の方法論)にあたる部分を執筆した。また成果の地元貢献の一つの形として、地元あまみエフエム10周年祝賀会や地元写真家浜田太氏の国際賞受賞記念会での講演講師を務めて地元への成果の還元に努めてきた。共同研究者との討議作業を進めた。代表研究者の加藤は、沖縄の久万田研究室、東京の川田研究室を訪問し、研究についての意見交換を進めてきた。2017年度末までに、奄美シマ唄、奄美新民謡関係者の取材はほぼ終えることができた。取材が必要な残りの主要な唄者は、3名程度である。とりわけ、新民関係者の取材がほぼ終わり、戦後奄美の歌謡史と人々の奄美アイデンティティ形成との関わりの資料などは揃ったといってよい。8割から9割の達成度といってよい。ポピュラー音楽については、まだ十分とは言えないが、レーベル主宰者の取材は終わっているので、6割から7割の達成度といってよい。奄美の文化メディア史の年表作成は、2016年度末に作成し『奄美文化の近現代史』の一部として公刊しているが、その後の詳細化が進んでいない。達成度は、7から8割程度である。公民館講座の一覧など、うた文化の伝承教室の資料化はほぼ終えることができた。年度ごとの補完は残されているが、ほぼ9割の達成度である。現代の余興文化など他の民俗文化のメディア媒介的展開の本格的な取材調査は、2018年度の課題となっている。第1弾の成果物(『奄美文化の近現代史』2017.3)に続く『奄美うた文化の近現代史』は、1章の方法論の部分が完成し、「地域・文化・メディアをめぐる研究方法:文化生産論との対話」として学内紀要に発表された。
発作性失調症2型モデルマウスの作製と遺伝子治療の試み

本研究はP/Q型Caチャネルをコードするaipha1A遺伝子の変異に起因する発作性失調症2型(以下EA2)のモデルマウスの作製を目的とし、それを用いたEA2発症機序の解明およびその遺伝子治療法の開発を目指すものである。まず、すでに我々がクローン化した正常ヒト由来alpha1A cDNAにPCRを利用してEA2変異(C4110T, R1279がStopコドンになる)を導入した(EA2-alpha1A)。このEA2-alpha1A cDNAをマウスalpha1A遺伝子の内在性プロモーターで発現させることを目指し、Cre-lox系を利用してマウス胚幹細胞(ES細胞)のalpha1A遺伝子エクソン1に挿入することを試みた。これは、変異導入lox配列(lox71およびlox66)間のCreによる組換え反応は、本来の認識配列であるloxP-loxP間の組換え反応にくらべて逆反応が起こりにくいということに基づく方法で、染色体上の特定の位置に外来遺伝子を効率的に挿入できると考えられる。lox66,EMCV由来IRES, EA2-alpha1A cDNA, polyAシグナル、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセット、を含むノックインベクターを作製し、これをマウスalpha1Aエクソン1にlox71配列が挿入されたES細胞(BI-176)にCre発現ベクターとともに導入した。その結果、ハイグロマイシン耐性株の約30%という高い効率で目的のEA2ノックインES細胞が得られた。そして常法に従いEA2ノックインマウスを作製した。また、親株であるBI-176細胞に導入した変異はalpha1A遺伝子のヌル変異であると期待されるので、EA2変異との比較を可能にするためBI-176由来マウスも作製した。現在はこれらのマウスの交配によりホモ接合体が得られることが判明した段階であり、今後それらの行動学的、病理学的な解析をすすめる予定である。
戦間期国際法理論の研究

国際連盟の時代の国際法学は、一般に、法律の万能を信じ、法の適用によって平和を維持することを目指していたと理解されてきました。それに対する批判として、国際政治学が生まれたというのです。しかし、実際には、当時の国際法学の中では、法の適用によって紛争を解決することの限界を指摘し、法を変更する仕組みを作るべきだという意見が強く主張されていました。そのような批判的な国際法理論の中から、国際政治学的な考え方が形成されてきた、ということを明らかにしたのが、この研究の成果です。2014年5月、研究代表者・分担者が集まり、問題意識の共有を図ったほか、戦間期日本の国際法学に関する川副令氏の研究についての検討を行った。2015年2月23日には、今年度の研究進捗状況を確認するため、研究会を開催した(ただし、代表者は、ドイツ滞在のため不参加)。研究代表者は、2014年9月より2015年3月まで、ベルリン・フンボルト大学のクリストフ・メラース教授の下で、ケルゼンの国際法理論を理解するための前提として、19世紀後半から20世紀前半にかけての国際法構想についての研究を行った。とりわけ、19世紀の実証主義国際法学の代表的理論家とされるイェリネックの自己拘束理論やトリーペルの共同意思定立理論についての研究、および、観念論的立場から、国際法について批判的な理論を提示したエーリッヒ・カウフマンの事情変更論についての研究を行うに当たり、ベルリン国立図書館の資料を利用できたことは非常に、有益であった。この調査のための予備的考察の一部は、『法律時報』2014年9月号に公表した。その後の研究成果については、2015年度に順次公表を予定している。そのうち、戦間期の国際法秩序構想としても重要な意味を持つモーゲンソーやカーの理論の意義を分析した二つの論文については、目下、校正中である(『関西大学法学論集』65巻2号掲載予定)。2015年3月上旬には、研究分担者である川副令氏がベルリンを訪れ、フンボルト大学図書館で資料調査を行ったほか、ドイツの研究者との間で国際法思想史研究のあり方について、意見を交わした。戦間期国際法理論について、従来においては十分に理解されてこなかった点について、研究を深めることができた。欧州国際法学については、ケルゼンをはじめとする重要な戦間期国際法学説の位置づけを根本的に見直す視軸を確立し、そこから得られた成果を複数の論文において公表しつつある。とりわけ、戦間期ドイツの国際法学諸理論については、連盟の下で試みられた平和構想の関連付けのなかで新たな位置づけを行い、学問を進歩させたと評価しうるだけの、意義のある知見をうることができた。とりわけ、国連憲章に至る戦争違法化過程として一面的に把握されてきた歴史理解を修正し、連盟期の平和構想の独自の意義を見出したことの意義は大きい。欧州との対比において研究する戦間期日本の国際法学説については、立作太郎を中心として、その歴史的・政治的文脈の下での学説の意義の見直しを行っている。論文としての成果公表までには至っていないが、平成28年3月には、日本政治外交史を専門とする酒井哲哉東京大学教授との意見交換を行い、歴史学からの評価にも耐えうるだけの研究を遂行しているという感触を得た。思想史研究としては多くの論文を公表しており、その点は順調である。研究会も、この間、4回行っており、研究関心・成果の共有も十分にできている。ただ、公開シンポジウムなど、研究成果の社会的還元については、必ずしも十分ではない。研究分担者の転勤等もあり、日程の調整が予定通りにいかなかったことが原因である。戦間期の国際法理論において最重要の意義を持っていた「紛争の性質」論を中心に、これまで正当に理解されてこなかった当時の学説を意味を再評価した。戦間期の国際法学においては、法の限界が強く意識され、それが、法の適用によってすべての紛争を解決する可能性をめぐる理論的な争いとして表現されていた。法の適用による紛争解決の限界を指摘する主張は、国際法学の内部において有力に主張されており、その代表的理論家の一人がモーゲンソーであった。本研究では、モーゲンソーの動態的紛争論・政治的紛争論を、一方で、アドルフ・ラッソンやエーリッヒ・カウフマンらの観念論者の系譜のうえに把握し、他方で、イェリネックやトリーペル、ハンス・ケルゼンらの実証主義者たちの理論と対照することにより、その歴史的・理論的文脈のなかで明らかにした。そのことを通じて、国際法学に関して言えば、「戦争違法化」や「実証主義対自然法論」という視角にとらわれた従来の学説史研究によっては理解されてこなかった戦間期国際法理論の一側面を明らかにしたといえる。また国際政治学に関して言えば、従来は、戦間期の国際秩序思想・国際法思想をリーガリズム(法万能主義)とみなし、それを否定することによって国際政治学が生まれたと理解されているのに対し、本研究によって、むしろ、戦間期国際法学の内部において発展せられた法の限界論のなかから、国際政治学的思考が形成されたということが明らかにされた。最終年度には、本研究の意義を外部の研究者に問うためのワークショップを開催し、高い評価と生産的な助言を得た。

しかし、実際には、当時の国際法学の中では、法の適用によって紛争を解決することの限界を指摘し、法を変更する仕組みを作るべきだという意見が強く主張されていました。そのような批判的な国際法理論の中から、国際政治学的な考え方が形成されてきた、ということを明らかにしたのが、この研究の成果です。戦間期の国際法理論について、代表者・分担者ともに、ほぼ予定通り、文献の検討と意見の交換を進めている。ただ、分担者の勤務先の変更などもあり、スケジュールの調整に手間取り、研究会が予定通りには開催できなかった。すでに公表しつつある論文を28年度中に完成させることを目標とする。また、ドイツ学説を中心に行ってきた研究を、イギリス学説にも広げる予定である。研究成果の社会的還元についても、研究成果公表の区切りがついたところで、行いたい。国際法予定通り、戦間期の国際法秩序構想について、その理論的側面に着目しながら研究を進めてゆき、従来の国際法史理解に重要な変更を迫る意味を持つような、新たな視点を提示したい。方法としては、予定通り、文献の検討と、研究会による意見の交換を中心とする。複数の講演者を招聘して研究会を開催する予定であったが、日程の調整が難しく、1名のみの招聘となったことによる。研究分担者の所属に異動があり、日程の調整が難しくなったため、予定していた研究会の一部が開催できなかった。とくに、ベルリンにおいてドイツの研究者との意見の交換を行った際には、日程の調整がうまくゆかず、結局、齋藤氏と伊藤氏は参加を見送った。そのため、支出予定額と実支出額との差が生じた。研究成果の最終的な取りまとめのために開催する研究会の開催費用、研究成果を評価するために外部研究者を招聘して行う講演会の開催費用、論文として成果を公表する際に必要となる諸費用に充てる。分担者である伊藤氏の新しい勤務地が遠隔にあり、研究会開催の費用が増加したけれども、今年度は、研究の成果を共有し、さらにはそれを公表してゆくために積極的に研究会を開催する。また、公法および法哲学の研究者を招いて、戦間期国際法理論の意義を広い視点から話し合う機会を設ける予定である。
岩盤急傾斜地の地震時安定性評価に関する地質工学的研究

地震時の急傾斜地の崩壊は、現在の岩盤工学や土質力学の範ちゅうでは解明し得ない種々雑多な支配要因によって引き起こされる。その形態については岩盤への水の浸透状況,き裂の存在,斜面内の応力状態など現場での調査・計測から明確にする必要があり、地質状況を取り込んだ地質工学の使命は重い。加えて、岩質材料の真に近い強度・変形挙動を組み入れた解析手法の確立を目指す総合的な研究の必要性が大きい。本研究では、急傾斜山腹斜面の地震による崩壊現象を、岩盤不連続面の特性,地形の状態などを考慮に入れながら、従来行ってきた岩盤工学の研究成果を基に、新しく開発した数値シミュレーション(改良型個別要素法)を実施し、岩盤斜面の崩壊パターン(トップリング,すべり破壊など)の分類,破壊に対する対策などを検討、斜面の形状を踏まえた地震時の安定性評価について討議することを目的としており、二つの課題を研究した。岩盤急傾斜地の地震時挙動に関する数値解析的研究については、個別要素法の改良に取組み、高速化、大容量化のための作業とともに、パソコンでの解析のためのプログラムも作成した。岩盤斜面のモデル化として、き裂パターンの把握や地質性状の認識をフラクタルや画像処理手法を用いて検討し、パソコンによる解析を行った。また、現場で採録された岩盤の情報を個別要素法での解析パターンにモデル化する方法としてボロノイ分割法を採用し、地震時の岩盤斜面の安定解析を実施した。弱面を持つ岩盤の動態時の力学特性に関する研究として、弱面を持つ岩石を三軸装置内で繰り返しせん断し、数値解析への入力定数の収集に努め、応力依存性、間隙水の影響についての検討も行った。これらの成果を基に、簡単な地形形状の山腹での岩盤挙動をモデル実験で検討し、解析モデルの適合性,精度についての考察ならびに岩盤斜面安定における設計の考え方について従来手法との相違を調査した。
培養歯根膜細胞移植による人工歯根の歯根膜再生に関する研究

直径3mm、長さ8mmのポリエチレン(PE)製の人工歯根を作成し、その表面にプラグマ重合法により、I、IIIおよびIV型アテロコラーゲンの固定化を試みた。その結果、IおよびIII型を用いた群では、人工歯根表面1cm^2当たり1230μgのコラーゲンを固定化することができた。一方、IV型を用いた群では十分な量の固定化は得られなかった。これまでの2次元培養法を用いた移植実験では満足すべき結果を得ることができなかった。そこで、歯根膜細胞の3次元ゲル内培養法を試みた。その結果、コラーゲン・ゲル内での細胞の増殖は培養7日でプラトーに達し、細胞数は、対照群では初期細胞数(1×10^5個/ml)の約8倍、TGF-b_110ng/ml+PDGF100ng/ml添加群では約11倍に増加した。また培養3日目には、各群とも強いALPase活性陽性を示した。上記の結果に基づき、ビ-グル成犬5頭の両側下顎臼歯を抜去、2か月後、抜歯窩の治癒を待って、片側に3か所づつ両側に計6か所のインプラント窩を形成し、I型コラーゲン固定化人工歯根、III型コラーゲン固定化人工歯根、対照の無処理人工歯根のそれぞれに歯根膜細胞封入ゲル(細胞数5×10^5/0.2ml)を被覆させ、各々2本づつ(各群10本づつ)を埋入した。その結果、埋入2週までにI型群で2本、III型群で3本、対照分で5本が脱落した。残存した人工歯根はI、III型コラーゲン群とも類似の組織反応を示し、埋入1か月では、材料-骨間隙は肉芽様組織で満たされ、埋入2か月では、材料表面に平行な線維性被膜が形成されるなど、歯根膜類似の組織構造は得られなかった。直径3mm、長さ8mmのポリエチレン製人工歯根、および同径のヒドロキシアパタイト製人工歯根(HAP群)を作製した。ポリエチレン製人工歯根の表面には、プラズマ重合法により、I型、III型およびIV型アテロコラーゲンの固定化を試みた(コラーゲン群)。その結果I、III型コラーゲン群では、人工歯根表面に12.1μm/cm^2のアテロコラーゲンを固定化することができた。しかし、IV型コラーゲン群では、固定化効率が悪く、現在、固定化条件の改変を検討中である。上記の結果に基づき、予備実験としてビ-グル成犬5頭の両側下顎臼を抜歯、2か月後、抜歯窩が治癒するのを待って、両側に計8か所のインプラント窩を形成し、実験群としてHAP、I型コラーゲン、III型コラーゲンの各群をそれぞれ2本づつ(各群計10本づつ)、対照群として歯根膜細胞を付着させていないHAP、I型コラーゲンを各1本づつ埋入した。その結果、埋入2週間までに、実験群では、HAPで10本中2本が、また、I型、III型コラーゲンではそれぞれ10本中3本が脱落し、HAP群8本、I型コラーゲン群7本、III型コラーゲン群7本が観察対象となった。HAP群では、埋入2週には材料表面に一層のセメント質ないし骨様組織の添加がみられ、一部には歯根膜類似の線維構造もみられた。しかし、埋入1か月では材料-骨間隙はほぼ完全に新生骨で満たされ、対照群に比べて骨の形成速度は明らかに早かった。

一方コラーゲン群ではI型、III型コラーゲンとも、埋入2週では材料-骨間隙は肉芽様組織で満たされ、明らかな線維配列はみられないが、埋入1か月になると材料に向かって垂直的に走る歯根膜類似の線維構造がみられた。埋入2か月群は、現在、標本を作製中である。直径3mm、長さ8mmのポリエチレン(PE)製の人工歯根を作成し、その表面にプラズマ重合法により、I、IIIおよびIV型アテロコラーゲンの固定化を試みた。その結果、IおよびIII型を用いた群では、人工歯根表面1cm^2当たり1230μgのコラーゲンを固定化することができた。一方、IV型を用いた群では十分な量の固定化は得られなかった。これまでの2次元培養法を用いた移植実験では満足すべき結果を得ることができなかった。そこで、歯根膜細胞の3次元ゲル内培養法を試みた。その結果、コラーゲン・ゲル内での細胞の増殖は培養7日でプラトーに達し、細胞数は、対照群では初期細胞数(1×10^5個/ml)の約8倍、TGF-b_110ng/ml+PDGF100ng/ml添加群では約11倍に増加した。また培養3日目には、各群とも強いALPase活性陽性を示した。上記の結果に基づき、ビ-グル成犬5頭の両側下顎臼歯を抜去、2か月後、抜歯窩の治癒を待って、片側に3か所づつ両側に計6か所のインプラント窩を形成し、I型コラーゲン固定化人工歯根、III型コラーゲン固定化人工歯根、対照の無処理人工歯根のそれぞれに歯根膜細胞封入ゲル(細胞数5×10^5/0.2ml)を被覆させ、各々2本づつ(各群10本づつ)を埋入した。その結果、埋入2週までにI型群で2本、III型群で3本、対照群で5本が脱落した。残存した人工歯根は、I、III型コラーゲン群とも類似の組織反応を示し、埋入1か月では、材料-骨間隙は肉芽様組織で満たされ、埋入2か月では、材料表面に平行な線維性被膜が形成されるなど、歯根膜類似の組織構造は得られなかった。