hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IoT時代の遠隔操作型・自律型移動システムにおける安全かつ高信頼な通信の実現

(1)システムに適応した暗号化手法の開発、(2)セキュア通信プロトコルの開発、(3)高信頼なデータ通信の開発と実装、(4)遠隔操作型・自律型移動ロボットによる実証実験、それぞれ以下のような研究開発を進めた。まず(1)については、ECUなどによる接続や機器の偽装を防止するため、公開鍵暗号による認証を検討した。具体的には、楕円曲線暗号(ECC)とペアリング暗号を用いることで、秘密鍵漏洩時の対策としての鍵交換方式の検討を行った。リアルタイム性を大きく損なうことが見込まれたが、RaspberryPiを使用して1秒を切る程度の処理時間であった。(2)については、車載ネットワークにおける改ざん検知手法として、準同型性をもつMACが適していると考え、準同型共通鍵暗号SymPCを利用した手法を提案し、擬似乱数列を共有することにより短いMAC値で送信できる手法を考えた。(3)については、暗号回路のサイドチャネル攻撃対策として、S-BoxをLUT実装したAES回路に対して乱数によるマスキング対策を実装し、サイドチャネル攻撃耐性を評価し、最高レベルの安全性であるLevel 4をクリアすることを示した。電流注入プローブを用いた妨害波パルスに対するCAN送受信器の挙動試験系を構築し、一部の条件においてプロトコルと異なる挙動も確認された。(4)については、独立二輪駆動タイプの遠隔操作型の移動ロボットに前年度の実験系を組み込んで、セキュリティ対策の有用性を実証するための一連のデモンストレーションを実施し、SHA-1あるいはChaskeyによる認証を実装したCAN通信により、バスオフ攻撃が成立したとしても、その後に攻撃ノードから発行されるコマンドでロボットが乗っ取られることを防ぐことができることを確認した。遠隔操作性に影響を与える遅延時間について400msecに収まるべきという指針を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度研究の概要として、まず乱数生成については、これまで研究グループで提案してきている二値の擬似乱数系列に対して、その複雑度(次のビットの予測困難性)について多くの理論的な研究成果を得た。具体的には、擬似乱数の生成について、有限体理論を活用した乱数生成手法と、整数上・有限体上でのロジスティック写像を活用した乱数生成手法について検討を行った。とりわけ今回のような活用については、その効率的な生成と、自己・相互相関、複雑度などが重要な指標となる。それらの事柄について得られた成果は、国際会議および論文として報告することができている。また、通信の信頼性については、実験なども踏まえながら定量的に評価することができ、そのような実際的な様子も踏まえながら、今後のプロトコル設計へと展開できるようになっている。具体的には、CANパケットのペイロード部の活用について、安全性と信頼性のどちらにウェイトを置くべきか厳密な検討が進められる状況にある。また駆動系の実験については、初年度にしてCANネットワークを乗っ取る実験を進めることができた。その際に、どのような偽パケットをどのようなタイミングで送信すれば、本来の正しいECUをダウンさせ、CAN通信を乗っ取ることができるか、などの実験を具体的に行うことができた。これに合わせ、実験用の電気自動車コムスの納入および基本的な動作の確認も済み、来年度に向けた具体的な実験の準備を整えることができている。おおむね、予定している研究開発項目について進んでいる。その上で、以下幾つかの点で再検討も行っている。まずCAN通信の信頼性については、もとより良好な状況にあり、誤り訂正符号の導入については掘り下げた状況検討が必要となっている。具体的には、実際的な状況から少し離れ、極めて劣悪な通信環境(電磁環境が劣悪な場面)などを想定する必要がある。それから、先行して検討を進めている暗号状態制御(暗号化したまたせでの制御を可能とする)については、CANなどで活躍するマイコンなどの性能レベルに合わせて、この機能を実現することは困難な状況にある。もとより本研究項目は、理論的な検討を先行させ、実際的な適用を考える場合には、適切なパラメータ設定・アルゴリズム開発で対応することを考えていた。どのような形で実現するか・実現できるかについて再検討を進めている。自動車やロボットの内部に複数実装されている電子制御ユニットにおいて、CAN通信が広く用いられているが、CANのプロトコルには脆弱性があることが指摘されており、今後IoTによりインターネットにこれらの機器が接続される時代にあっては、セキュリティ対策が必要となる。一方で、セキュリティ対策を実装することにより,機器の性能が損なわれないようにする必要ある。本研究では、自動車を主たるターゲットとしてセキュア制御通信・自律駆動に関する研究を進めている。本年度は、CAN通信に対するメッセージ認証を実現するためのHashに用いるセキュアな乱数系列の生成について、論文成果を得た。また、CAN通信におけるメッセージ認証実現のために、秘密鍵共有プロトコルの実装を行ない、仮想的なCAN環境で動作実験を行なった。また、IoT環境における属性ベースの相互認証プロトコルの実装も行なった。そして、CANにおけるMAC検証技術について検討した。データフィールド長(64ビット)を制約としたMAC検証技術として、SHA-1により生成できるMACの一部を添付する手法、さらには一部のみの添付という特徴から、本来生成するMAC値自身を短いものにでき、計算能力の低いCPUでも計算可能な縮退版SHA-1を定義した。AES暗号のサイドチャネル攻撃対策を目的として、主要な情報漏洩回路部および漏洩メカニズムを特定した。そして具体的に、遠隔操作型の移動ロボットにおいては、操作遅延が重要なファクターとなるため、これを考慮したセキュリティ対策を検討している。また、その有効性を示すための実験を実施する準備を進めている。

本年度においては、前述の通りハッシュのための乱数生成、また既存のMAC認証などとも比較しながら、CAN通信を安全に行うための認証通信プロトコルの実現、そしてこれを用いながらの安全な動作駆動・リアルタイム動作駆動についての検証と、最終年度に向けた準備が進められており、とくだん大きな問題は発生していない。そして、CAN通信を用いて、自動運転の制御を行う実験車両を用いて自動駐車を行うシステムを開発し、最終年度の実機実験に向けた準備を進めている。具体的には、8ビットCPUで高速に処理できることを期待した縮退版SHA-1ではなく、標準的な暗号であるAESによる実装を検討した。ArduinoUNOによるソフトウェア実装でも暗号化処理に12msecで処理可能であることを確認した。また、前年度実施した、十数ビットのMAC値を利用する方法では、その十数ビットのランダムなビット列によるMAC値の偽造が1/2^{十数(ビット)}の確率で成功する問題に対して、複数のメッセージをまとめて検証することで、フルのビット長を持つMAC値をトラフィックを大幅に増加させることなく、検証可能な手法を提案した。AESへのサイドチャネル攻撃については、以下のことが分かった。ルックアップテーブル版と論理回路構成版のAESの2種類のFPGA実装に対して検討し、前者はラウンド出力値を保持するフリップフロップ(FF)が主要漏洩源であり、FF出力のハミング距離と相関のある漏洩が発生している。後者はFFに加えてSBox回路でも情報漏洩が発生しており、SBox内の複数箇所においてハミング重みと相関のある漏洩が発生している。(1)システムに適応した暗号化手法の開発、(2)セキュア通信プロトコルの開発、(3)高信頼なデータ通信の開発と実装、(4)遠隔操作型・自律型移動ロボットによる実証実験、それぞれ以下のような研究開発を進めた。まず(1)については、ECUなどによる接続や機器の偽装を防止するため、公開鍵暗号による認証を検討した。具体的には、楕円曲線暗号(ECC)とペアリング暗号を用いることで、秘密鍵漏洩時の対策としての鍵交換方式の検討を行った。リアルタイム性を大きく損なうことが見込まれたが、RaspberryPiを使用して1秒を切る程度の処理時間であった。(2)については、車載ネットワークにおける改ざん検知手法として、準同型性をもつMACが適していると考え、準同型共通鍵暗号SymPCを利用した手法を提案し、擬似乱数列を共有することにより短いMAC値で送信できる手法を考えた。(3)については、暗号回路のサイドチャネル攻撃対策として、S-BoxをLUT実装したAES回路に対して乱数によるマスキング対策を実装し、サイドチャネル攻撃耐性を評価し、最高レベルの安全性であるLevel 4をクリアすることを示した。
行動経済学における公平性およびコミュニケーションの理論

まず、申請者はMurooka(2009)において人々の効用に「公平性(fairness)」という情動を組み入れたpsychological gameのモデルの研究を行い、またTrust Gameの文脈において第三者がTrusteeに送るメッセージがTrusteeの行動にどのような影響を及ぼすかについて中央大学においてパイロット実験を行った。この研究については、米国Arizona State University助教授の田中知美氏と打ち合せの上、米国にて本実験を行い、その実験結果をもとにモデルを構築する予定である。この研究を通じて、情動とコミュニケーションの関係がどのように人々の経済行動に結びつくかを究明したい。また、近年注目されているニューロエコノミクスの分野において、申請者は2007年8月より東京大学大学院工学系研究科准教授の渡邊正峰氏、同研究科博士課程の上野有実子氏、東京工業大学大学院総合理工学研究科博士課程の野澤真一氏、東京大学大学院経済学研究科修士課程の今井泰佑氏、および米国Uni-ver-sity of Illi-nois at Urbana-Champaign助教授のHsu Ming氏と共同研究を行っている。研究内容はMurooka(2009)と同じく、人々の情動を対象とするものである。申請者はMurooka(2009)において「公平性」の情動を分析しているが、現実の意思決定において重要な影響を及ぼす情動は他にも存在すると考えられる。この共同研究では人々が持つ「恥(shame)」という情動について、(1)理論モデル、(2)行動実験、(3)MRI(磁気共鳴映像撮影装置)内での実験による脳活動の計測、の三つのパートから分析を試みている。申請者は(1)および(2)において主体となって研究しており、(1)についてAndreoni and Bernheim(2008, forthcoming in Econometrica)モデルをもとに新たな理論モデルを構築し、いくつかの仮定の下でそのモデルの均衡が存在することを示した。今後な実験計画の細部を調整ののち、米国Uni-ver-sity of Illi-nois at Urbana-Champaignにおいて行動実験を行う予定である。まず、申請者はMurooka(2009)において人々の効用に「公平性(fairness)」という情動を組み入れたpsychologicalgameのモデルの研究を行い、またTrust Gameの文脈において第三者がTrusteeに送るメッセージがTrusteeの行動にどのような影響を及ぼすかについて中央大学においてパイロット実験を行った。
工業高専における総合力を養う設計製作教育に関する研究

本研究では,工業高専における新たな設計製作教育を提案することを最終目的とし,阪府高専システム制御工学科の第四学年「基礎研究」を中核に置いた設計製作教育を考察する.授業実践を通じて吟味していくことに重点をおき,主に1)コンカレント・エンジニアリング(Concurrent Engineering)を技術教育に導入する場合の3次元モデルに関する研究2)直列設計製作と並列設計製作の比較に関する研究を行う.また,以上のことを踏まえて,より質の高い「基礎研究」を確立していく.平成14年度は,直列設計製作と並列設計製作の比較に関する研究を以下のように進めた.平成6年度より始まった「基礎研究」において,学生はロボット製作をはじめて行う場合が多く,役割分担を決めたグループ作業により1台のロボット製作を行うために,ロボット製作の順序や作業のスケジューリングなどの面において支障をきたすことが多かった.そこで,平成10年度より,第1学年の工作実習において「ライントレーサ(トレースロボット)」の製作を開始した.1人で1台のロボットを半年間で製作させ,直列設計製作の考え方を体験させている.この2つの作業を体験した学生の比較検討を行い,直列設計製作及び並列設計製作の有機的な結合方法を検討した.学生は第1学年の時に1人で1台のロボットを半年で製作しているために,ロボット製作の順序やスケジューリングなどの面において,効率よく作業を進める方法を学習している.これにより第4学年の「基礎研究」でグループによる並列設計製作をする場合において,その効果が現われていることがわかった.また「基礎研究」において工数分析を行わせることにより,並列設計製作の効果について学習させることができた.また2年間の研究の成果を盛り込んだ内容を信州大学学位論文としてまとめた.本研究では,工業高専における新たな設計製作教育を提案することを最終目的とし,阪府高専システム制御工学科の第四学年「基礎研究」を中核に置いた設計製作教育を考察する.授業実践を通じて吟味していくことに重点をおき,平成13年度は主にコンカレント・エンジニアリングー(Concurrent Engineering)を技術教育に導入する揚合の3次元モデルに関する研究を以下のように進めた.コンカレント・エンジニアリングは計画,研究,設計,生産,販売といった工程を最初の計画段階から同じ基盤に立つて並列に協力して進み,開発の途中では情報交換をしながら目標に向かい,最終製品を仕上げる製品開発手法である.これを「基礎研究」に導入するにあたり,技術教育としての観点から,教員側はTeam-Teaching,学生側はグループ学習とそれぞれ体制をつくり,検討を行った結果を論文として投稿した.コンカレント・エンジニアリングにおいて軍要なポイントは3次元データの取り扱いである.並列設計を行っていく上で,共通データとしての3次元モデルは情報交換を行う上で大変重要である.これまで,3D-CADによるデータ,ペーパークラフトを利用してきた.近年,コンピュータ内蔵のブロック(LEGO-MindStorms)が発売され,ロボット工学の教育・研究において盛んに利用されでいる.これを利用して3次元モデルを作成し,導入できる可能性を検討した.また,3D-CADによるデータやペーパークラフトと比較検討を行い,それぞれの長所・短所をまとめ,過去の教育実践から組合せ方や利用方法などを検討した.その結果,3D-CADによるデータを利用する前段階において,ブロックを利用した3次元モデルを作成する方が,具体的にわかりやすくかつ機構が実現しやすいという知見が得られた.これらの詳細については,平成14年度に研究発表を行う予定である.本研究では,工業高専における新たな設計製作教育を提案することを最終目的とし,阪府高専システム制御工学科の第四学年「基礎研究」を中核に置いた設計製作教育を考察する.授業実践を通じて吟味していくことに重点をおき,主に1)コンカレント・エンジニアリング(Concurrent Engineering)を技術教育に導入する場合の3次元モデルに関する研究2)直列設計製作と並列設計製作の比較に関する研究を行う.また,以上のことを踏まえて,より質の高い「基礎研究」を確立していく.平成14年度は,直列設計製作と並列設計製作の比較に関する研究を以下のように進めた.平成6年度より始まった「基礎研究」において,学生はロボット製作をはじめて行う場合が多く,役割分担を決めたグループ作業により1台のロボット製作を行うために,ロボット製作の順序や作業のスケジューリングなどの面において支障をきたすことが多かった.そこで,平成10年度より,第1学年の工作実習において「ライントレーサ(トレースロボット)」の製作を開始した.1人で1台のロボットを半年間で製作させ,直列設計製作の考え方を体験させている.この2つの作業を体験した学生の比較検討を行い,直列設計製作及び並列設計製作の有機的な結合方法を検討した.学生は第1学年の時に1人で1台のロボットを半年で製作しているために,ロボット製作の順序やスケジューリングなどの面において,効率よく作業を進める方法を学習している.これにより第4学年の「基礎研究」でグループによる並列設計製作をする場合において,その効果が現われていることがわかった.また「基礎研究」において工数分析を行わせることにより,並列設計製作の効果について学習させることができた.また2年間の研究の成果を盛り込んだ内容を信州大学学位論文としてまとめた.
IL-22Rを強発現した三次元培養皮膚を免疫不全マウスに移植した乾癬モデルの開発

乾癬では、IL-22レセプター(IL-22R)の発現が増強しており、IL-22に対する反応性が亢進していることが推測される。本研究において、乾癬病変の早期に皮膚で検出されるIFN-αが表皮角化細胞のIL-22Rの発現を増強させ、IL-22の感受性を増強させること、IL-22レセプターを強発現させた表皮角化細胞では、IL-22刺激で核内のBcl-3発現が増強し、乾癬特有の遺伝子発現を増強させることを解明した。以上の結果は、IL-22Rを強発現させた表皮角化細胞を用いた三次元皮膚培養皮膚が乾癬モデルになりうることを示唆する。近年、われわれはIL-22レセプター(IL22R)の発現が乾癬の表皮各細胞で増強していることを報告した。IL22RのリガンドであるIL-22は、乾癬の病態形成に必須のサイトカインであるが、IL22Rの発現の増強は、培養表皮角化細胞においてIL-22の働きを増強することを確認しており、IL22Rのさらなる検討の重要性を示している。ここで問題となるのは、培養表皮角化細胞がIL22Rをほとんど発現しないことである。そのため、アデノウイルスベクターを用いてIL22Rを発現させて検討してきたが、三次元培養皮膚の表皮角化細胞においては、IL22Rの発現があることを確認できた。そこで、より生体の構造に近い三次元培養皮膚での検討を開始した。しかし、三次元培養皮膚においても、IL-22の添加で誘導されるSTAT3のリン酸化はわずかであり、IL-22で誘導される遺伝子の発現レベルも低く、通常、生体ではIL-22に対する反応は制御されていると推測された。そこで、乾癬においてIL22Rの発現を増強させる要因について検討したところ、IFN-α刺激がIL22Rの発現が増強することを見いだした。IFN-αが乾癬の発症に関与するということが最近注目されているが、その作用機序については明らかでなかった。三次元培養皮膚においてIFN-αの添加は、IL22Rの発現をmRNAレベル、蛋白レベルで増強し、IL-22の添加によるSTAT3のリン酸化、IL-22誘導遺伝子発現も顕著に増強した。以上の結果はIFN-αが乾癬モデルの作成に重要な要因の一つであることを明らかとしたが、IFN-αにより処理した三次元培養皮膚はその後の長期の培養に耐えることができず、従って、今後の検討においては、レンチウイルスを用いてIL22Rの発現を増強させた三次元培養皮膚を用いることが最適であると考えた。IL22RのリガンドであるIL-22は、乾癬の病態形成に必須のサイトカインであり、表皮角化細胞の増殖、分化、感染防御、炎症に関わる遺伝子の発現を制御している。乾癬モデルの作成には、IL-22がどのようなシグナル経路で遺伝子発現を制御しているかについての理解が重要である。これまで、IL-22のシグナルにおいて、STAT3のリン酸化とその活性化が重要と報告されているが、実際にSTAT3が遺伝子の発現にどのように関与しているのかほとんど検討されていなかった。そこで、IL-22により種々発現する遺伝子発現とそのメカニズムについて検討した。IL-22の刺激によりSTAT3のリン酸化は1時間以内の早期に認められる。IL-22により発現が誘導される遺伝子のうち、MCP-1やSOCS3は刺激後1時間で遺伝子の発現が誘導され、またSTAT3シグナルの抑制により発現が抑制されることよう、STAT3依存性に直接誘導される遺伝子と考えられた。一方、HB-EGF、IL-8、S100A7、HBD2のmRNAは、IL-22刺激により遅発性に発現が誘導され、STAT3のシグナル抑制により発現が抑制されることより、STAT3により誘導される2番目の因子の関与が示唆された。そこで、Bcl-3に注目して検討を行ったところ、IL-22の刺激によりSTAT3を介したBcl-3の核内発現の増強がみられることを確認した。siRNAによりBcl-3の発現を抑制した表皮角化細胞では、IL-22によるHB-EGF、IL-8、S100A7、HBD2の遺伝子発現が抑制された。さらに、Bcl-3を表皮角化細胞に強発現させると、HB-EGF、IL-8、S100A7、HBD2の遺伝子発現が誘導された。以上の結果は、乾癬の病態におけるBcl-3の重要性を初めて明らかにした。IL-22RのリガンドであるIL-22は、乾癬の病態形成に必須のサイトカインであり、IL-22のシグナルにおいては特にSTAT3のリン酸化とその活性化が重要であることが知られているが、実際にSTAT3がIL-22により誘導される遺伝子の発現にどのように関与しているのかほとんど検討されていない。

そこで、HB-EGF、IL-8、S100A7、HBD2など乾癬でいずれも発現が増強している蛋白が、IL-22刺激により遅発性に発現が誘導されることに注目して検討し、STAT3の活性化を介して産生されるbcl-3がこれらの遺伝子発現に重要な役割を果たしていること、bcl-3によるこれら遺伝子発現にはp50の存在が必要であることを明らかにした。そこで、乾癬の病変部に実際にbcl-3の発現が増強しているのかを検討した。正常皮膚、乾癬皮膚において、免疫組織染色においてbcl-3は乾癬病変の表皮の核に強く発現しており、この発現はやはり発現が増強しているp50の発現パターンと一致していた。これらの所見は、乾癬の病態におけるIL-22の重要性を明らかとし、IL-22Rを強発現させた表皮角化細胞を用いた三次元皮膚培養皮膚が乾癬モデルになりうることを示唆する。三次元皮膚にレンチウイルスを導入し目的のレセプターを強発現した系の作成を試みているが、レンチウイルスの導入の影響により表皮の重層化に異常を生じやすく、実験の進展が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。真皮成分を用いない三次元表皮の作成を試みている。この手技が確立されれば、レンチウイルスベクターを導入し、再度強発現系の三次元皮膚を作成する予定である。また、三次元皮膚および通常の培養表皮角化細胞を用いて、乾癬におけるIL-22Rの役割を、細胞内シグナルに重点をおいてさらなる検討を行う。三次元皮膚は正常皮膚と同程度にIL-22Rが発現しており、検討可能である。また、通常の培養表皮角化細胞においては、アデノウイルスベクターを用いてIL-22Rを発現させた実験系を確立している。
麻酔薬による担癌動物の免疫抑制環境の改変と癌悪性化の分子機構

本研究では、麻酔薬が癌組織微小環境に与える影響を1口腔扁平上皮癌(OSCC)、間質細胞およびマウス脾細胞の生存率、2脾細胞の抗CD3抗体刺激に対するサイトカイン産生能、3間質細胞(10T1/2)の免疫抑制能に対する効果から検討した。脾細胞はその他の細胞株に比較して最も低濃度の麻酔薬で生存率が低下し、特に静脈麻酔薬に高い感受性を示した。その免疫応答能は、細胞毒性が現れる濃度よりさらに低濃度域でも抑制された。またミダゾラムは、10T1/2の免疫抑制作用も阻害する点で他の麻酔薬とは異なっていた。一方担癌マウスを用いた動物実験では、静脈麻酔薬が腫瘍の進展に対して抑制的に作用する可能性が示唆された。平成27年度は、おもに口腔扁平上皮癌(OSCC)、間葉系間質細胞および同系統マウスから単離した脾細胞を用いた試験管内共培養系の構築と局所麻酔薬添加の影響を検討した。OSCCとしてC3Hマウス由来OSCCであるSq-1979細胞株、およびそのサブクローンL系OSCC細胞株を、癌関連間質細胞のモデルとしてはC3Hマウス胎児由来繊維芽細胞株10T1/2細胞を用い、OSCCと10T1/2との共培養が脾細胞の免疫応答に与える影響を観察した。その結果、本共培養系において、10T1/2は刺激脾細胞のサイトカイン産生を抑制する効果を有しており,Sq1979が液性因子を介して本効果を増強する可能性を指摘できた。次に、本共培養系における麻酔薬の影響を検討した。麻酔薬として、リドカイン、ロピバカインなどの局所麻酔薬を選択し、それらの細胞毒性をalamarBlue生細胞試薬を用いて測定したところ,リドカインのCC50はL系細胞(0.8mg/ml)>Sq-1979-1(0.6 mg/ml)>10T1/2(0.5 mg/ml)>単離脾細胞(0.3 mg/ml)であり,ロピバカインも同様の傾向であった。両麻酔薬とも1.25mg/ml以上の濃度では、10T1/2と脾細胞の生存率は05%まで激減したが、OSCC細胞株はなお2060%の生存率を示した。一方脾細胞の免疫応答能はさらに低濃度の局所麻酔薬で影響をうけ、CD3抗体刺激を受けた脾細胞からのインターフェロンγ産生は、0.10.3mg/mlの局所麻酔薬で完全に阻害された。これらの結果から、OSCC細胞株は、10T1/2や脾細胞に比較して局所麻酔薬に高い抵抗性を示すこと、脾細胞の免疫応答能はさらに本薬物の影響を強く受けることが明らかとなった。次年度はこれらの結果を考慮し、OSCC-CAF-脾細胞の相互作用における麻酔薬の影響を解析する予定である。本年度の実験計画に従い,OSCC担癌モデルマウスの諸条件の設定と試験管内共培養系の構築を進めた。試験管内共培養系を構築するには,各細胞株単独培養における麻酔薬の影響を精査することが必須であったため,まず集中的に各細胞株の麻酔薬感受性に関する研究を遂行した。その結果,局所麻酔薬に関しては実験計画通り麻酔薬感受性を考慮した至適条件がほぼ決定し,その結果の一部は平成27年度歯科基礎医学会で報告した。一方,OSCC担癌モデルマウスを用いた動物実験は経過観察の時間が長いためもあり,やや遅れ気味である。今後は,試験管内共培養系で得られた知見も取り入れ,動物実験系の構築を遂行する予定である。我々は,マウス口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞と同系統マウスの胎仔線維芽細胞(10T1/2)を単独あるいは組合せて刺激脾細胞と共培養することで,間質細胞を含む腫瘍組織内微小環境モデルの構築を試み,平成27年度までに試験管内共培養系をほぼ確立している。そこで今年度は,平成27年度に引き続き,本試験管内共培養系(癌微小環境モデル)をもちいて,局所麻酔薬・静脈麻酔薬等に対するOSCC, 10T1/2および刺激脾細胞の感受性を検討し,麻酔薬投与による免疫病態改変の解析を行った。その結果,用いた全ての麻酔薬に対して,脾細胞が最も感受性が高く,逆に転移巣由来L系OSCCが最も強い抵抗性を示す事が明らかとなった。加えて,これら麻酔薬は刺激脾細胞のインターフェロンγ産生能をさらに低濃度で阻害し,なかでもロピバカインとプロポフォールのIC50が最も低い値を示した。以上の結果から,脾細胞は10T1/2やOSCC細胞株に比較して麻酔薬に対する感受性が高く,免疫応答能は細胞毒性を示さないより低濃度でも有意に抑制されることが示された。一方,本年度は担癌マウスの全身免疫系の変動について,脾細胞のサイトカイン産生能に加えMDSCの存在比率を指標にした解析も行った。その結果,転移巣由来のOSCCを移植したマウスは強い免疫抑制環境下にあることが明らかとなった。さらに,麻酔薬処置による影響の観察も開始しており,プロポフォール連続処置群において,担癌マウスの生存日数がコントロール(未処置群)およびミタゾラム処置群に比較して短くなる傾向を認めている。現在その原因を追及中である。

試験管内共培養系に関してはほぼ順調で,27年度に引き続き細胞株,麻酔薬の種類を増やして麻酔薬感受性に関する研究を遂行し,麻酔薬感受性を考慮した共培養系の至適条件の決定を済ませている。一方,着手が遅れていた担癌マウスを用いた動物実験について,従来行ってきた1末梢血サイトカイン濃度, 2脾リンパ球のサイトカイン産生能および、3脾細胞リンパ球亜集団の存在比率などを指標とした免役応答解析に加え,4MDSCの存在比率を指標とした解析を試みた。このためMDSC解析の条件設定に時間を費やし,計画がさらに遅れ気味となってしまったが,現在までに解析条件の設定も終了した。これらの結果の一部は,平成28年歯科基礎医学会学術大会で発表したほか,2017年中に学術雑誌に論文掲載予定である。平成28年度までに、マウス口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞と同系統マウスの胎仔線維芽細胞(10T1/2)を単独あるいは組合せて刺激脾細胞と共培養することで、間質細胞を含む腫瘍組織内微小環境モデルを再構築し、本実験系を用いてOSCC、10T1/2および刺激脾細胞に対する局所麻酔薬(ロピバカイン、メピバカイン、リドカイン)の細胞毒性や、免疫応答に対する効果を評価してきた。その結果、脾細胞は10T1/2やOSCC細胞株に比較して局所麻酔薬に対する感受性が高く、免疫応答能はより低濃度でも有意に抑制されることを明らかにしている。平成29年度はさらに静脈麻酔薬であるプロポフォールとミダゾラムの効果についても同様の解析を進め以下の結果を得た。1プロポフォールのOSCC、10T1/2、刺激脾細胞に対する50%細胞毒性(CC50)はそれぞれ、0.27、0.46、0.14mg/ml、であり、オーダー的にも、脾細胞が最も感受性が高い点でも局所麻酔薬と類似していた。2ミダゾラムのOSCC、10T1/2、刺激脾細胞に対するCC50は、0.014、0.058、0.039 mg/mlであり、他麻酔薬に比較して10倍以上も細胞毒性が強く、OSCCも本薬剤に対して強い感受性を示す点が特異であった。3静脈麻酔薬は、細胞毒性を示さない程度の低濃度領域でも有意に刺激脾細胞のサイトカイン産生能を阻害した。特にミダゾラムの阻害効果は強力で、インターフェロン-γとインターロイキン-10産生に対する50%阻害濃度(IC50)は脾細胞に対するCC50の440倍以上低値を示した。以上の結果から、静脈麻酔薬は局所麻酔薬に比べて脾細胞の免疫応答を抑制する作用が強く、特にミダゾラムでは臨床的に使用する際の血中濃度に近い濃度でも免疫応答に影響を与える危険性が示唆された。本研究では、麻酔薬が癌組織微小環境に与える影響を1口腔扁平上皮癌(OSCC)、間質細胞およびマウス脾細胞の生存率、2脾細胞の抗CD3抗体刺激に対するサイトカイン産生能、3間質細胞(10T1/2)の免疫抑制能に対する効果から検討した。脾細胞はその他の細胞株に比較して最も低濃度の麻酔薬で生存率が低下し、特に静脈麻酔薬に高い感受性を示した。その免疫応答能は、細胞毒性が現れる濃度よりさらに低濃度域でも抑制された。またミダゾラムは、10T1/2の免疫抑制作用も阻害する点で他の麻酔薬とは異なっていた。一方担癌マウスを用いた動物実験では、静脈麻酔薬が腫瘍の進展に対して抑制的に作用する可能性が示唆された。平成27年度に引き続き,静脈麻酔薬等に対するOSCC,MSCおよび免疫担当細胞の感受性を検討する。そして,これらの結果をもとに構築した試験管内共培養系(癌微小環境モデル)をもちいて,麻酔薬投与による免疫病態改変の解析を行う。さらに,これと平行してOSCC担癌モデルマウスにおける麻酔管理等の条件を確立し,麻酔薬の投与に伴う宿主免疫動態の変化を血清サイトカイン濃度測定,刺激脾細胞のサイトカイン産生量測定,脾リンパ球亜集団解析をもとに明らかにする予定である。
DLK遺伝子は肺癌における神経内分泌形質発現のトリガーか

肺癌細胞の神経内分泌形質発現にDLK1が与える影響を解析するに当たり、まず種々の組織型に由来する肺癌細胞株における、DLK1を含めたDelta-Notchファミリー分子の発現をRT-PCR法で確認した。Deltaリガンドのうち、神経内分泌形質を有する小細胞肺癌株はDLL1およびDLL2、DLL3、DLK1を高発現する傾向がみられ、中でもDLK1は小細胞肺癌以外の株では発現がほとんどみられず、高い発現特異性を示した。Notchレセプターの発現に関しては、小細胞肺癌株でやや低い傾向がみられたが、細胞株間の発現差はDeltaリガンドほど顕著でなかった。PCR結果の裏づけをとるため、肺癌細胞株のDLK1タンパク発現をウエスタンブロット法により解析すると、小細胞肺癌株ではDLK1発現を示すシグナルが検出された一方、非小細胞肺癌株では検出されなかった。以上の発現解析から、小細胞肺癌細胞におけるDLK1の発現特異性が明らかにされた。DLK1を高度に発現する小細胞肺癌株としてTKB15およびTKB16、Lu135を、DLK1発現の低い非小細胞肺癌株としてA549およびTKB5、H1299細胞などを選別し、遺伝子導入/発現抑制実験に用いることとした。DLK1遺伝子をCRISPR-Cas9システムにてノックアウトするため、検索ツール等を用いてガイドRNA配列を設計し、ガイドRNAとCas9タンパクを発現するプラスミドを構築した。プラスミドをTKB15に導入してクローニングし、DLK1をノックアウトしたTKB15細胞を得た。また、DLK1遺伝子をクローニングして発現ベクターを構築し、非小細胞肺癌に導入して安定発現株を得た。遺伝子発現の変化はウエスタンブロット法で確認した。現在、作製した細胞株を用いての遺伝子発現解析を進めている。種々の組織型に由来する肺癌細胞株におけるDelta-Notch関連遺伝子の網羅的発現解析から、DLK1の小細胞癌細胞における発現特異性が明らかにされ、研究対象分子として有意義であろうことが再確認された。またDLK1遺伝子のノックアウト株および強制発現株が樹立され、研究を進める上での重要なツールが揃いつつある。研究実施計画に従い、DLK1遺伝子発現を変化させた細胞における神経内分泌関連遺伝子の発現解析を行う。小細胞肺癌の細胞株は、in vivoでの様態と異なり一般に増殖速度が遅く、遺伝子ノックアウト等の作業には時間を要し容易ではないが、根気よく取り組む。理由:本年度に作製した培養細胞を用いた遺伝子発現解析、並びに培養細胞実験を継続するため、次年度使用額が生じた。使用計画:1.遺伝子発現解析用試薬の購入、2.細胞培養用培地・血清・消耗器具の購入、3. DLK1陽性細胞を選別するためのプラスミドベクター作製にかかる試薬・消耗品の購入、4.細胞を特殊な状況(ゲル包埋など)で培養するための消耗品の購入
バイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの力学的特性評価

1.バイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの作製チタン(Ti)基材にハイドロキシアパタイト(HAp)を大気中プラズマ溶射法でコーティングして作製した。ハイドロキシアパタイト80μm単層とチタンとハイドロキシアパタイトの混合体積比を傾斜させて各層20μmを4層コーティングした試料を製作した。2.バイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの残留応力分布評価セラミックコーティング層内に等二軸応力分布を仮定し、有ひずみ、無ひずみ試料の特性X線による測定回折角から応力を算出する式を構築した。本法を用いてハイドロキシアパタイトコーティング試料の残留応力を測定した。測定には特性X線Mo-Kαを用い、管電圧と管電流は40kV-40mAとした。測定回折面は、ハイドロキシアパタイトがHAp(002)面、チタンがTi(103)面である。測定の結果、HAp単層材のコーティング層には約295MPa(標準偏差48MPa)の圧縮残留応力、HAp傾斜材には約224MPa(標準偏差72MPa)の圧縮残留応力が生じた。このことから、コーティング層を傾斜機能化することにより圧縮応力が低減することが明らかになった。3.コーティングインプラントコーティング層のはく離強度コーティング層はく離強度実験は3点曲げ試験で行った。試験片寸法は、幅10mm、厚さ2mm、長さ60mmである。支点間距離は42mmとした。コーティング層が引張負荷側となるように試料を設置した。各試料ともたわみが3mmになった時点で負荷を止めた。はく離の大きさを比較するために,はく離領域を三角形に近似してその面積を測定した。その結果、はく離領域の面積は単層コーティング試料が10.9mm^2、傾斜機能コーティング試料が4.6mm^2であった。このことから、コーティング層を傾斜機能化させることによってはく離強度が増すことが明らかになった。1.傾斜機能材料に対応した白色X線法の開発(1)材料成分の傾斜組成を考慮した白色X線法の理論式を構築した。傾斜組成によってX線の回折強度が変化するので、その割合を深さzの関数とし、先に開発した白色X線法の理論式に組み込んだ。(2)数値シミュレーションにより、同一負荷の下で傾斜組成が変化した場合および同一傾斜組成の下で負荷が変化した場合の回折線プロファイルの変化を調べ、ひずみ測定の可能性を検討した。2.バイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの作製と評価(1)基材に生体材料として利用されているチタンTiを用い、その上にハイドロキシアパタイトHApとチタンが傾斜組成となるように大気中プラズマ溶射法でコーティングした。コーティング層は4層とし、基材側から(Ti75%、HAp25%)、(Ti50%、HAp50%)、(Ti25%、HAp75%)、(HAp100%)の層をそれぞれ20μmずつ溶射した。溶射はプラズマ出力42kW、溶射距離120mmで行った。(2)上記試料の3点曲げによる密着強度試験を準備中。試験機は現有の材料試験機(インストロン)を使う。3.バイオセラミック傾斜機能コーティングインプラント応力測定予備実験(1)試料の各回折面のX線的弾性定数を理論的に算出した。(2)白色X線装置を用いての予備測定を準備中。

回折X線の強度、SSDの検出効率、ピークの重なりやエスケープピークを測定によって検討し、測定に適した格子面と最適Bragg角を決定する。1.X線法によるバイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの残留応力測定(1)X線法を用いてハイドロキシアパタイトコーティング試料の残留応力を測定した。測定には特性X線Mo-Kαを用い、管電圧と管電流は40kV-40mAとした。測定回折面は、ハイドロキシアパタイトがHAp(002)面、チタンがTi(103)面である。測定の結果、HAp単層材のコーティング層には約295MPa(標準偏差48MPa)の圧縮残留応力、HAp傾斜材には約224MPa(標準偏差72MPa)の圧縮残留応力が生じた。このことから、コーティング層を傾斜機能化することにより圧縮応力が低減することが明らかになった。(2)コーティングインプラントのコーティング層はく離強度を3点曲げ試験で評価した。試験片寸法は、幅10mm、厚さ2mm、長さ60mmである。支点間距離は42mmとした。コーティング層が引張負荷側となるように試料を設置した。各試料ともたわみが3mmになった時点で負荷を止めた。はく離の大きさを比較するために,はく離領域を三角形に近似してその面積を測定した。その結果、はく離領域の面積は単層コーティング試料が10.9mm^2、傾斜機能コーティング試料が4.6mm^2であった。このことから、コーティング層を傾斜機能化させることによってはく離強度が増すことが明らかになった。2.研究のまとめバイオセラミック傾斜機能コーティングインプラントの力学的特性を、残留応力とはく離強度の観点から評価した。その結果、単層コーティングインプラントに比べ、コーティング層の残留応力の減少とはく離強度の増加が確認され、力学的特性の向上が認められた。
精神疾患のおそれのある住民に対する近隣苦情相談への保健師の支援方法の開発

本研究は精神疾患に罹患している恐れのある住民に関する近隣苦情相談への保健師の対応方法を探求することを目的とし、前期中堅期以上の市区町村保健師11人に半構造化面接を行った。その結果、保健師は苦情主の主訴を契機として本人の支援を開始し、本人や家族を脅かさないように信頼関係を構築していた。また、本人が地域で生活を継続できるように支援していた。保健師は、苦情主も住民の一人として支援し、精神疾患に対する偏見や誤解を改善するための情報提供をしていた。本結果から保健師は苦情の的である本人を支援する糸口をつかみ、精神障害者に対する苦情主の理解を深めることに寄与する可能性が示唆された。平成25年度は、先行研究のsystematic reviewと行政機関に寄せられた近隣苦情相談のうち、近隣苦情の的となっている精神疾患に罹患しているおそれのある住民の特徴と保健師による支援方法を量的研究により解明した。先行研究のsystematic reviewの結果、総務省の統計などから近隣苦情相談のうち、特に「近隣騒音」が問題になっていることが明らかとなったため、医中誌、Cinii Articles、国立国会図書館OPACの3つのデータベースを用いて検索し、最終的に23本の論文を検討した。その結果、半数以上の論文が1980年代以後に書かれており、経済発展と都市化の進展が近隣騒音問題に影響している可能性が示唆された。また、従来は法律で規制することが可能な工事現場や商業施設の騒音が問題となっていたが、次第に近隣住民の生活音が問題となっていた。生活音活については、法律での規制が困難であり、近隣住民とのコミュニケーション不足が騒音の受け止め方にネガティブな影響を及ぼしていた。反対に、近隣住民との関係が良好な場合には、日常生活音に対するネガティブな感情は有意に減少していた。都市化の影響を考慮すると、近隣騒音の問題は住民や行政にとって避けて通れない問題であり、特に都市部では、地縁が脆弱化しているため、行政による介入が必要となっていることが明らかとなった。近隣騒音問題の改善には、近隣住民の関係性を改善するような支援の必要性が示唆された。量的研究の結果、保健師は精神疾患に罹患しているおそれのある住民に対して精神科の外来受診支援をしていた。また、受診支援の有無で2群比較した結果、受診支援あり群は受診支援なし群に比べて、生活保護受給者、過去の精神科治療中断歴がある者、自立生活が不可能な者、現状を放置した場合本人の生命・身体への影響がある者の割合が有意に高かった。保健師は、治療中断を予防し、精神障害者の生活をまもる支援を行う必要性が示唆された。平成26年度は、精神疾患に罹患している恐れのある住民に関する近隣苦情相談にどのように対応していたのかを探求することを目的として事例研究を実施した。研究参加者は、精神疾患に罹患している恐れのある住民に関する近隣苦情相談に対応した経験のある前期中堅期以上の市区町村保健師11人である。1人つき1回の半構造化面接を行った。11人の保健師に共通する対応方法として10個のカテゴリーを作成した。各カテゴリーを時間軸に基づき検討した結果、共通の段階が抽出された。Phase1『苦情主の主訴から本人の問題行動と精神疾患の関連を検討し対応の可否を説明する』、Phase2『本人やキーパーソンになれる家族に関する情報収集をし、信頼関係を構築する』、Phase3『本人のプライバシーを保護しながら、本人と苦情主を行政として支援する』であった。保健師は、苦情主の主訴を契機として苦情の的となっている本人の支援につなげていた。その際本人や家族を脅かさないようなアプローチで信頼関係を構築し、本人が地域で生活を継続できるように支援していた。また保健師は、苦情主も住民の一人として支援し、精神疾患に対する偏見や誤解を改善するための情報提供をしていた。本結果から、保健師は近隣苦情相談への対応を通して、苦情の的となっている本人を支援するきっかけをつかむと共に、精神障害者に対する苦情主の理解を深めることに寄与する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。地域看護学26年度が最終年度であるため、記入しない。H25年度に行った量的研究は、研究代表者が研究協力の得られた職場から円滑にデータを得たこともあり、順調に研究が進んだ。このため、H26年の1月から、当初H26年度に計画していたヒアリング調査を一部前倒しして開始している。H26年度は、精神疾患に罹患しているおそれのある住民に関する近隣苦情相談への保健師の支援方法の解明(質的研究)を行う予定である。既に3人の保健師から協力を得て、ヒアリング調査を行っている。
高速原子ビームによる表面反応ダイナミックスの解明

1.Pt(111)表面上に吸着したメタンの光励起メカニズムメタンの吸着状態をTPD、XPS,仕事関数変化などの測定から明らかにした。メタンを第一層飽和吸着させたPt(111)表面に193nmの紫外光を照射するとメタンは解離し、表面上に水素原子とメチルの吸着種を生成する。直線偏光した紫外光を用い、反応の断面積の入射角依存性の測定から、光励起のメカニズムとしては、励起が吸着種に局在化した吸着種の電子状態の直接励起であることが判明した。2.Pt(111)表面上での高速水素原子と吸着メチルとの反応ダイナミクスメタンの光解離と共に表面からはメタンとメチルが高い並進エネルギーを持って脱離してくること、また、メタンの光解離によって生成されたホットな水素原子が余剰エネルギーを散逸する前に、さらに吸着メチルと反応し、メタンとして脱離することを明らかにした。水素原子とCH_3の再結合反応のダイナミクスメチルと水素原子が共吸着したPt(111)表面をパルスレーザー照射によってパルス加熱することにより、メチルラジカルと水素原子間の再結合反応を誘起した。この再結合反応によって生成したメタンの脱離に関して、その空間分布と並進エネルギー分布を測定した。脱離では空間分布は表面法線方向に鋭い分布を持ち、その平均並進エネルギーは0.43eV(2500K)で表面温度120Kに比べて極めて高いことが判明した。Pt(111)表面でのメチルと水素原子の再結合反応に関するRRKM理論を用いた最近のモデルとの比較を試み、その取り扱いの不十分な点を明らかにした。本年度は主に金属表面上での吸着種の光解離によって生成される高いエネルギーを有する原子と他の吸着種との反応について実験を行った。Pt(111)表面上のNOとO_2の共吸着系では低温で酸素原子の交換反応が起きることを明らかにした。この反応には分子状の酵素が関与していると思われるが、酸素分子として反応に関与しているのか、あるいは、吸着酸素分子が解離した際に生じる表面と平衡状態になる前の酸素原子がかかわっているのかという点は明らかでない。そこで、この共吸着系に紫外光を照射すると吸着酸素分子が解離しエネルギー的に高い酸素原子が生成することを利用し、酸素交換反応のメカニズムを明らかにしようとした。高エネルギー原子と共吸着種との反応のもう一つの例として、P(111)表面上のメタンの光解離とそれに続いて起きる水素原子とメタン、あるいは、メチルラジカルとメタンとの反応についての検討を行った。193nm照射によりメタンは光解離を起こし、水素原子とメチルラジカルを生成する。そこで、水素原子をあらかじめ吸着させておいた表面にメタンを吸着させ193nmの光を照射したところ収率としては少ないがメタンの光解離によって生成したメチルラジカルと水素原子との間の再結合反応が起きることを光照射後の昇温脱離によって見出した。この反応は約10kcal/mol程度の反応障壁があると考えられ、メタンの光解離で生成された水素原子やメチルラジカルはこの障壁を乗り越えるのに十分なエネルギーを有していることがわかる。更に、このダイナミックスを明らかにするために、この反応によって生成し脱離してくるメタンのエネルギー分布を測定している。2.Pt(111)表面上での高速水素原子と吸着メチルとの反応ダイナミクス

メタンの光解離と共に表面からはメタンとメチルが高い並進エネルギーを持って脱離してくること、また、メタンの光解離によって生成されたホットな水素原子が余剰エネルギーを散逸する前に、さらに吸着メチルと反応し、メタンとして脱離することを明らかにした。3.水素原子とCH_3の再結合反応のダイナミクスメチルと水素原子が共吸着したPt(111)表面をパルスレーザー照射によってパルス加熱することにより、メチルラジカルと水素原子間の再結合反応を誘起した。この再結合反応によって生成したメタンの脱離に関して、その空間分布と並進エネルギー分布を測定した。脱離では空間分布は表面法線方向に鋭い分布を持ち、その平均並進エネルギーは0.43eV(2500K)で表面温度120Kに比べて極めて高いことが判明した。Pt(111)表面でのメチルと水素原子の再結合反応に関するRRKM理論を用いた最近のモデルとの比較を試み、その取り扱いの不十分な点を明らかにした。
腸管出血性大腸菌の病原性評価に有用な絶対嫌気バイオロジーの確立

腸管が感染部位である腸管出血性大腸菌では絶対嫌気環境での病原性、および抵抗性の評価が重要であることは容易に理解される。そこで絶対嫌気環境での腸管出血性大腸菌の増殖性、毒素産生性、抵抗性、遺伝子発現性、薬剤感受性などを嫌気チャンバーを用いて明らかにした。このことによって腸管出血性大腸菌の病原性評価に新たに絶対嫌気環境における評価項目が必要である可能性を示唆した。腸管が感染部位である病原細菌では絶対嫌気環境での病原性、および抵抗性の評価が重要であることは容易に理解される。しかしながら、そのことを確認するための方法論の限界や実験の困難さによって、ほとんど行われていない。そこで我々はマウスでの病原性を評価した複数の腸管出血性大腸菌(EHEC)株を用いて、絶対嫌気環境での増殖性、薬剤感受性、毒素産生性、抵抗性、遺伝子発現性などを嫌気チャンバーを用いて明らかにし、各々の項目の変動とマウスでの病原性との関連を菌株ごとに比較した。まず、10株の腸管出血性大腸菌を用いて好気条件と嫌気条件での増殖性、志賀毒素の産生性、活性酸素種に対する抵抗性、抗生物質に対する感受性、抗生物質による志賀毒素産生促進効果などを明らかにし、それぞれを比較した。その結果、ある特定のEHEC株は好気性でも嫌気性でも他のEHEC株よりも増殖が遅かった。志賀毒素の産生性に関しては好気性でも嫌気性でも産生量が多いものはどちらの条件でも多く、少ないものはどちらの条件でも少なかった。嫌気条件で大幅に毒素の産生量が増加した菌株は無かった。活性酸素種のうちの一つである一酸化窒素に対する抵抗性は嫌気条件では完全型一酸化窒素還元酵素に依存していた。抗生物質に対する感受性は10株すべてで嫌気状態の方が多少効果があった。また、1/8MICにおける志賀毒素産生増強を見たところ、嫌気状態ではカルベニシリンとホスホマイシンによって志賀毒素2の産生が大幅に増強している菌株が存在した。このようにとりあえず当初確認することを考えていた検査項目は一通り好気条件と嫌気条件で行った。今後はこれら10株の腸管出血性大腸菌(EHEC)の病原性を特定するために、マウスを用いた感染実験を行う。これによって、病原性と相関がある嫌気条件での検査項目が明らかになる。昨年度解析したEHEC O157株の病原性を明らかにするために、マウスを用いた致死活性で評価した。EHEC O157はヒトに対して、非常に少ない菌数で病気を起こすことが知られている。しかしながら、マウスに対しては大量のEHEC O157を経口的に投与しても発症することが無い。そこで、何かしらの処置をしてマウスを少し弱らせて実験する必要がある。今回、我々はPCMの系を用いて行った。このPCMの系とはマウスにストレプトマイシンの入った水を飲ませておき、マウス腸管内の菌を排除しておく、そこにストレプトマイシン耐性のEHEC O157を経口的に投与して、マウスの様子を観察する。この方法では本来EHEC O157では発症しない個体であったも、腸内フローラが万全でないマウスでは発症し、その程度によって死亡する。その致死に至った過程を観察することによって、それぞれのEHEC O157の病原性の強さを評価した。その結果、10株のEHEC O157に1010個の菌を投与したところ、C1, C13, C18のEHEC O157株で死亡が観察されました。それ以外のEHEC O157では死亡例は観察されませんでした。これらのことから、C1, C13, C18のEHEC O157株は他のEHEC O157よりも病原性が強いことが考えられました。しかしながら、これらの結果と嫌気状態での増殖性、志賀毒素の産生性、活性酸素種に対する抵抗性、抗生物質に対する感受性、抗生物質による志賀毒素産生促進効果に相関はありませんでした。残念ながら、今回調べた検査項目ではEHEC O157のマウスに対する病原性と対応するものはなかったと思われます。今後はさらに検査項目を増やすことによって、病原性と相関する検査項目を明らかにし、病原性発現機構を明らかにして行きたいと考えている。最初の想定は腸管出血性大腸菌の感染部位は腸管内なので、腸管出血性大腸菌の嫌気条件での検査項目の結果とマウスに対する病原性との間の相関を求めるものであった。このことはこの2年間の実験によって、明らかに出来た。このことは当初の目的を概ね達成できたと考えている。しかしながら、これらの結果を詳細に検討したが相関のある検査項目は見つからなかった。マウスでの病原性を評価した複数の腸管出血性大腸菌(EHEC)株を用いて、絶対嫌気環境での増殖性、薬剤感受性、毒素産生性、抵抗性、遺伝子発現性などを嫌気チャンバーを用いて明らかにし、各々の項目の変動とマウスでの病原性との関連を菌株ごとに比較した。

志賀毒素の産生性に関しては好気性でも嫌気性でも産生量が多いものはどちらの条件でも多く、少ないものはどちらの条件でも少なかった。嫌気条件で大幅に毒素の産生量が増加した菌株は無かった。活性酸素種のうちの一つである一酸化窒素に対する抵抗性は嫌気条件では完全型一酸化窒素還元酵素に依存していた。抗生物質に対する感受性は10株すべてで嫌気状態の方が多少効果があった。次に、解析したEHEC O157株の病原性を明らかにするために、マウスを用いた致死活性で評価した。その結果、C1, C13, C18のEHEC O157株で死亡が観察された。それ以外のEHEC O157では死亡例は観察されなかった。しかしながら、これらの結果と嫌気状態での増殖性、志賀毒素の産生性、活性酸素種に対する抵抗性、抗生物質に対する感受性、抗生物質による志賀毒素産生促進効果に相関は見出せなかった。そこでさらに最終年度はEHEC O157株の検査項目として宿主防御機構に対する抵抗性を菌株ごとに詳細に検討したが、明確に病原性と相関がある検査項目を見いだすことはできなかった。腸管が感染部位である腸管出血性大腸菌では絶対嫌気環境での病原性、および抵抗性の評価が重要であることは容易に理解される。そこで絶対嫌気環境での腸管出血性大腸菌の増殖性、毒素産生性、抵抗性、遺伝子発現性、薬剤感受性などを嫌気チャンバーを用いて明らかにした。このことによって腸管出血性大腸菌の病原性評価に新たに絶対嫌気環境における評価項目が必要である可能性を示唆した。10株の腸管出血性大腸菌の嫌気性と好気性でのそれぞれの性状に関して、ほぼ解析が終わっている。さらに、嫌気状態での各々のEHEC O157の性状を明らかにして、病原性と相関のある項目を探す。病原細菌学10株の腸管出血性大腸菌のマウスでの病原性を決定し、その病原性の強さと相関のある嫌気条件下での項目を探すことをおこなう。そして、相関のある項目が本当に病原性に関与しているか変異株を作成して確認する。本研究は研究代表者が行う嫌気条件での各々の腸管出血性大腸菌(EHEC)の性状解析と研究分担者が担当しているマウスを用いたそれらのEHECの病原性解析が含まれるが、予想以上にEHECを用いた動物実験に時間が掛かっており、来年度まで行うことになったため。論文投稿費として考えていたものだが、昨年度では論文投稿ができていないため。EHECの病原性を評価するためにマウスを用いた動物実験を行う。今年度に論文投稿を行う予定なので、その時の論文投稿費として使用する。