hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工細胞法を用いた新規膜融合型プロテオリポソームの創製とDDS応用

本研究では、プロテオリポソームを基盤とした新規薬物内封方法、薬物送達技術の開発を目的として、膜融合活性を示す種々の膜融合性膜タンパク質をデザインした。リポソーム存在下、無細胞膜タンパク質合成を行うことで、膜融合性膜タンパク質を組み込んだ膜融合型プロテオリポソームを調製し、その膜融合活性を評価した。しかしながら、目的とする膜融合活性を有する膜融合型プロテオリポソームを得ることはできず、膜融合活性を得るには、さらなる分子シャペロンの添加、あるいは、糖鎖修飾などの翻訳後により膜融合性膜タンパク質の高次構造の保持が必要であることが示唆された。H27年度は膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームの構築を目的に、pH応答型、酵素応答型の2種類の膜融合性膜タンパク質発現プラスミドDNAを構築し、リポソーム存在下、無細胞タンパク質合成を行うことでリポソームヘの組込みを評価した。pH応答型膜融合性膜タンパク質では、リポソーム膜への良好な組込みが認められた。この膜タンパク質は正確な立体構造を形成することではじめて、プロテアーゼによる特異的な切断を受けることが知られている。そこで、調製したプロテオリポソームをプロテアーゼと反応させ、その切断断片を分子量を解析したところ、期待される分子量に切断断片が認められ、また、細胞膜表面に存在するリガンドとの結合も確認されたことから、組込まれた膜タンパク質は正確な立体構造を形成していることが明らかとなった。一方で、酵素応答型膜融合性膜タンパク質では、タンパク質合成は認められたものの、リポソーム膜への組込みは殆ど認められず、また、タンパク質合成が途中であることを示すポリペプチドも多く認められた。酵素応答型膜融合性膜タンパク質の膜貫通ドメインは、タンパク質のカルボキシ末端側に存在することからも、組込み効率が低い原因として、膜貫通ドメインまでタンパク質が翻訳されなかったため、翻訳途中のポリペプチドはリポソーム膜と相互作用できず、リポソーム膜へ組込まれなかったと考えられる。研究計画に従い膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームを調製できた。酵素応答型膜融合性膜タンパク質に関しては、予備検討からリポソームの脂質膜組成を変更することで組込み効率の改善が認められたことからも、本研究はおおむね順調に進展している。本研究は、種々の膜融合性膜タンパク質をデザインし、無細胞タンパク質合成システムを利用することで、膜融合型プロテオリポソームの調製を行い、得られた膜融合型プロテオリポソームを基盤とした新規薬物内封方法、薬物送達技術の開発を検証することを目的としている。平成28年度は、まず前年度に構築したpH応答型膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームを用いて膜融合能の評価を行った。具体的には、各濃度の酵素で処理した後、反応溶液のpHが4、5、6、7の条件で経時的に蛍光脂質を混合したリポソーム膜のFluorescence resonance enegy transfer (FRET)解消を評価することで膜融合能を評価した。しかしながら、いずれの条件においてもFRET解消が認められなかったことから膜融合は生じていないと考えられる。これはpH応答型膜融合性膜タンパク質の分子内ジスルフィド結合が正確に形成されていないためと推察した。そこで、反応溶液中にジスルフィド結合イソメラーゼを添加することで、タンパク質合成と同時に分子内ジスルフィド結合を形成する条件でpH応答型膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームを調製し、検討を進めている。また、酵素応答型膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームの調製を行った。反応溶液に添加する脂質濃度を増大することで組込み効率が約30%と改善され、現在、膜融合活性を示す条件に関して検討を進めている。二種類の膜融合性膜タンパク質をリポソームに組込むことに成功したが、膜融合活性を示す反応条件を確立できてなく、計画した膜融合を介した薬物内封方法、薬物送達技術の開発へ向けた展開に至っていないことから、予定よりやや遅れている状況である。平成29年度は、まず反応溶液中にジスルフィド結合イソメラーゼを添加することで調製したpH応答型膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームの膜融合能の評価を行った。種々のpH条件下、Fluorescence resonanceenegy transfer (FRET)解消を指標に脂質膜の融合を評価したところ、いずれの条件においても膜融合は認められなかった。また、前年度検討を進めていた酵素応答型膜融合性膜タンパク質の組込み量を改善した膜融合型プロテオリポソームを用い場合においても、pH応答型膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームと同様膜融合活性が認められなかった。前年度の実績状況も踏まえ、無細胞タンパク質合成システムを用いてpH応答型膜融合性膜タンパク質全長そのものを組込んだ膜融合型プロテオリポソームを用いても膜融合活性を得難いと考えられる。そこで、膜融合性膜タンパク質の完全長をリポソームに組み込むのではなく、膜融合に不必要とされるドメインを削除したタンパク質を新たに設計し、プロテオリポソームを調製した。

その結果、膜貫通ドメインが翻訳されていない不完全なタンパク質においても組込みが認められたことから、比較的疎水性が高い膜融合活性ドメインが無秩序にリポソーム膜に挿入されていると考えられる。すなわち、これまでの検討において膜融合活性が認められなかった一因に、生体内と同様の組込みが起こるとういう仮説に反して、膜貫通ドメインによる無秩序なリポソーム膜への組込みが生じたからと考えられる。本研究では、プロテオリポソームを基盤とした新規薬物内封方法、薬物送達技術の開発を目的として、膜融合活性を示す種々の膜融合性膜タンパク質をデザインした。リポソーム存在下、無細胞膜タンパク質合成を行うことで、膜融合性膜タンパク質を組み込んだ膜融合型プロテオリポソームを調製し、その膜融合活性を評価した。しかしながら、目的とする膜融合活性を有する膜融合型プロテオリポソームを得ることはできず、膜融合活性を得るには、さらなる分子シャペロンの添加、あるいは、糖鎖修飾などの翻訳後により膜融合性膜タンパク質の高次構造の保持が必要であることが示唆された。調製した膜融合性膜タンパク質組込みプロテオリポソームを用いて、水溶液のpH、あるいは、各プロテアーゼで処理を施し、膜融合型プロテオリポソームを活性状態にすることで膜融合能の評価を行う。融合による粒子サイズの増大を動的光散乱法で評価する。また、予めリポソーム膜を異なる蛍光色素で標識した膜融合型プロテオリポソームをそれぞれ準備し、膜融合による蛍光共鳴エネルギー移動を測定することで、膜融合の進行具合を継時的に評価する。併せて、膜融合反応前、反応中、および、反応後のプロテオリポソームの形態を透過型電子顕微鏡観察することで評価する予定である。最終年度は、各膜融合プロテオリポソームの膜融合条件の探索を可及的速やかに行う。確立した膜融合条件を基に、脂質膜キャリアの高機能化、細胞質へのダイレクトデリバリー能を評価する。生物薬剤学当初計画に予定していた国内学会への参加を取り止めたことから、旅費として計上していた予算が未使用となったため、平成27年度は一部予算が未執行となったが、執行金額に計画からの大きな変更はない。進捗が遅れたことから、予定していた高額試薬(RNA、抗体)の購入を必要とする実験が次年度に持ち越されたため。平成27年度から繰り越した予算は、細胞培養試薬、および、実験動物の購入に使用する。また平成28年度の予算は、予定通り、消耗品の購入と、情報収集の為の学会参加に当てる予定である。平成27年度から繰り越した予算と併せ、平成28年度もほぼ計画通りの予算執行となる。研究を加速することで、計画通りの予算執行を行う。
自己固定型反応器における生物膜・グラニュール形成機構に及ぼす細胞外ポリマーの役割

嫌気性固着型反応器での生物膜,グラニュール増殖体形成(自己固定化)における細胞外ポリマーの役割を以下の手法で検討した.(1)上昇流嫌気性スラッジブランケット(UASB)反応器で形成されたグラニュール汚泥から細胞外ポリマーを回収するため,種々の抽出方法(EDTA抽出,水ーフェノール抽出,水蒸気抽出,アルカリ抽出等)による最適抽出条件を検討した.(2)カオリン懸濁液,EDTA振蘯によるグラニュールからの遊離菌体等を凝集基質賭して,上記抽出ポリマー添加による凝集能試験を行った(凝集能試験の最適条件探索).(3)グラニュール汚泥の細胞外ポリマーの存在形態を走査電顕,透過電顕により観察した.(4)EDTA抽出細胞外ポリマーを種々のゲルろ過法を組み合わせて分子分画,精製を行い,各画分の凝集能試験を行い,細胞外ポリマーの凝集誘因物質の単離同定を行った.その結果以下のような知見が得られた.(1)EDTA抽出ポリマー,アルカリ抽出ポリマーは良好な凝集能を示した.いずれもポリマー添加濃度が高くなると凝集能は弱くなり,凝集能発現には最適濃度が在存する.凝集能発現には,多価カチオンの共存が必要であり,Ca^<2+>,Al^<3+>,Ba^<2+>,Mg^<2+>などの2mM以上の存在が有効であった.(2)TEM観察の結果,細胞付着に関与する細胞外ポリマーは,2040nmの緻密なglycocalyx様のものと,より粗な繊維状構造のものの,二形態が存在した.細胞外ポリマーはガラクトロン酸を含む酸性糖を含み,その主要中性糖構成はグルコース,ラムノース,ガラクトースであった.(3)細胞外ポリマーはSepharose CL-2Bで分画される糖とタンパクから成る第二画分に凝集能を有し,この画分はさらにSephacryl S-200HRによって分離された糖画分に凝集能が存在した.この多糖成分は分子量2000040000の範囲であった.嫌気性固着型反応器での生物膜,グラニュール増殖体形成(自己固定化)における細胞外ポリマーの役割を以下の手法で検討した.(1)上昇流嫌気性スラッジブランケット(UASB)反応器で形成されたグラニュール汚泥から細胞外ポリマーを回収するため,種々の抽出方法(EDTA抽出,水ーフェノール抽出,水蒸気抽出,アルカリ抽出等)による最適抽出条件を検討した.(2)カオリン懸濁液,EDTA振蘯によるグラニュールからの遊離菌体等を凝集基質賭して,上記抽出ポリマー添加による凝集能試験を行った(凝集能試験の最適条件探索).(3)グラニュール汚泥の細胞外ポリマーの存在形態を走査電顕,透過電顕により観察した.(4)EDTA抽出細胞外ポリマーを種々のゲルろ過法を組み合わせて分子分画,精製を行い,各画分の凝集能試験を行い,細胞外ポリマーの凝集誘因物質の単離同定を行った.その結果以下のような知見が得られた.(1)EDTA抽出ポリマー,アルカリ抽出ポリマーは良好な凝集能を示した.いずれもポリマー添加濃度が高くなると凝集能は弱くなり,凝集能発現には最適濃度が在存する.凝集能発現には,多価カチオンの共存が必要であり,Ca^<2+>,Al^<3+>,Ba^<2+>,Mg^<2+>などの2mM以上の存在が有効であった.(2)TEM観察の結果,細胞付着に関与する細胞外ポリマーは,2040nmの緻密なglycocalyx様のものと,より粗な繊維状構造のものの,二形態が存在した.細胞外ポリマーはガラクトロン酸を含む酸性糖を含み,その主要中性糖構成はグルコース,ラムノース,ガラクトースであった.(3)細胞外ポリマーはSepharose CL-2Bで分画される糖とタンパクから成る第二画分に凝集能を有し,この画分はさらにSephacryl S-200HRによって分離された糖画分に凝集能が存在した.この多糖成分は分子量2000040000の範囲であった.
血管内視鏡および血管内超音波同時使用によるレーザー僧帽弁形成術の基礎的検討

今回われわれはL-PTMC専用カテーテルを従来型の血管内視鏡にリングを装着し血管内超音波と2連銃のように成型するType 1から臨床応用に即したデザイン,Type 2に設計を改良した。即ち(1)Type2は内視鏡にレーザーファイバー用(1.2mm)と、血管内超音波用(1.2mm)のチャンネルを設けた。外径は3.5mmで断面は円形とした。内視鏡部の全長は600mmであった。(2)同部位に挿入する血管内超音波カテーテル探触子は周波数は30MHz、外径は0.9mm、長さは120cmであった。(3)レーザーの発振装置として、高出力半導体レーザーを使用した。レーザーファイバーは外径0.9mmの石英ファイバーを使用し,先端出力は8Wとした。(1)雑種成犬を用いた、in vivo評価ではEUカテーテルType2はType1と比較して挿入部の血管損傷も最少限度で、断面が円形であるためType1と比較して心血管内での操作性も向上した。(2)Type2でも立体的な画像情報下で心血管系に対する心拍動下レーザー手術を行うことが可能であった。レーザーの照射条件を2Wから8Wに上昇させたことで,短時間で確実に交連部の照射が可能であった。8W5secの照射条件による反復照射でレーザー照射中の気泡の発生は認めなかった。(3)病理学的検討の結果,肉眼的には同定した僧帽弁交連部は確実にレーザー照射されていた。組織学的検討では,レーザー照射による周辺組織(冠状動静脈,心筋)への熱影響はほとんど認めなかった。以上よりL-PTMC(EV)Type 2は構造,機能共にType 1と比較してより臨床応用に即した型であると考えられた。今後の検討課題として,(1)今後の本手術装置の設計改良点として,Type 2に最低1方向の先端屈曲能を付与する,(2)臨床で行われているPTMCと同様の手技で手術を行い装置の機能の評価を行う,(3)僧帽弁交連部に対するレーザー照射だけでなく他の心血管領域での本手術装置の適用の可能性の検討を行う事などが考えられた。
Ｘ線及び中性子溶液散乱法による高次ヌクレオソーム複合体の動態構造解析

X線・中性子溶液散乱解析から、H2A.Bモノ・ヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることを実証し、この性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンが形成できることを示した。また、H3およびH3のバリアント(CENP-A)を含むヌクレオソームが3つ連結した高次ヌクレオソーム複合体(H3-CA-H3トリ・ヌクレオソーム)のX線溶液散乱解析からH3-CA-H3トリ・ヌクレオソームが通常のものに比べて開いた構造をしていることを示した。さらに、粗視化モデルを構築してMD-SAXS法による動的解析を行い、H3-CA-H3トリ・ヌクレオソームのセントロメア領域おける機能を明らかにした。真核生物のDNAはヌクレオソームが数珠状に連なったクロマチン構造をとり高度に折れ畳まれて核内に収納されている。転写やDNAの複製・修復の際には、クロマチン構造はダイナミックに変化する。本研究では、細胞分裂期に重要な働きをする染色体のセントロメア領域の高次ヌクレオソーム複合体や、転写・複製・修復に関与するヒストンバリアントを含む高次ヌクレオソーム複合体の構造をX線及び中性子溶液散乱法で解析し、ヒストンバリアントの使い分けによる高次ヌクレオソーム複合体の動態を解析する。平成25年度はH2AのバリアントであるH2A.B (別名H2A.Bbd)を含むモノ・ヌクレオソームのX線溶液散乱解析を行った。また、セントロメア特異的なヒストンバリアント(CENP-A)を含む高次ヌクレオソーム複合体のX線溶液散乱解析も行った。その結果、H2A.Bモノ・ヌクレオソームの解析では、通常であればヒストン8量体に硬く巻きついている約146塩基対のDNAの両端が、H2A.Bヌクレオソームではヒストン8量体から剥がれ、大きく揺らいでいることを明らかにした。この結果は、他の生化学および細胞生物学的な解析と合わせて論文にまとめ(Arimura et al. 2013, Scientific reports)、H2A.Bのもつこのような性質から転写・複製・修復の際に緩んだクロマチン領域にこのようなヌクレオソームが形成されることを示した。また、セントロメア領域の高次ヌクレオソーム複合体の解析では、通常の高次ヌクレオソーム複合体と比べ、大きく動態が異なることを示すデータが得られた。H2AのバリアントであるH2A.Bを含むモノヌクレオソーム(H2A.Bモノヌクレオソーム)の中性子溶液散乱(SANS)解析を行った。H2A.Bモノヌクレオソームは通常のH2Aを含むモノヌクレオソーム(H2Aモノヌクレオソーム)と生化学的な性質が異なるため、立体構造に大きな違いがあるものと推測されているが、結晶構造は明らかにされていない。昨年度のX線溶液散乱(SAXS)解析から、H2Aモノヌクレオソームでは146bpのDNAがヒストン8量体にしっかりと巻きついているのに対し、H2A.BモノヌクレオソームではDNAの両端の2030bpがヒストン8量体からはがれて大きく揺らいだ状態にあることが推測されていた。そこで、本年度のSANS実験では溶媒の重水と軽水の比を変化させることで溶媒とヒストンとDNAの散乱のコントラストを変化させて測定を行った。その結果、H2A.BヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることが明確に確認でき、このような性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンを形成できることが明らかになった。さらに、ヌクレオソーム内部のヒストン8量体にも構造の違いが観測された。この違いはヒストンテールの構造状態の違いによるものと推測された。また、セントロメア特異的なCENP-A(H3のヒストンバリアント)を含むヌクレオソーム(CENP-Aモノヌクレオソーム)についてもSAXS解析を行った。これまでの研究からCENP-Aモノヌクレオソームもヒストンに巻きついたDNAの両端がはがれていることが示されている(Tachiwana et al, 2011 Nature)。そこで、H3またはCENP-Aを含む3つのヌクレオソームをつないだトリヌクレオソーム(H3-CENP-A-H3)のSAXSを測定したところ、H3-H3-H3のトリヌクレオソームとは異なる散乱パターンが観測され、動的な構造に違いがあることが示され、セントロメア領域のクロマチン構造の違いを反映していることが示唆された。クロマチンはDNAがヒストン蛋白質に巻き付いたヌクレオソームを構成要素とし、それが数珠状につながって多量体を形成し、高次構造を形成する。本年度は当該研究の最終年度で、当該研究の目的である高次ヌクレオソームの動態解析に的を絞って研究を行った。高次ヌクレオソームとしては、クロマチンの動態を理解するためには、連続したヌクレオソーム同士のなす角度分布が特に重要であるので、3つのヌクレオソームを含めトリ・ヌクレオソームをターゲットにするとともに、細胞分裂時の動原体形成がどのように制御されるのかを明らかにするために、セントロメア特異的なヒストンバリアントであるCENP-Aをその中に包含したトリ・ヌクレオソームを調製し、その動態を解析した。

解析は、様々なイオン強度で測定されたSAXSプロファイルを実験データとして使用し、分子動力学計算で得られるモデルから計算されるとSAXSデータと比較して、セントロメア領域特異的なクロマチンの動態を世界で初めて実験と理論の両面から原子レベルで明らかにした。なお、分子動力学(MD)計算は、トリ・ヌクレオソームの動態が通常のタンパク質に比べて大きく揺らいでいることを考慮し、広い時空間での揺らぎに対応できる粗視化分子シミュレーションによって、トリ・ヌクレオソームの動態を調べた。こうして、ヒストンはアミノ酸を1個の球で、DNAはヌクレオチドを3個の球で近似して、Langevin動力学によるMDシミュレーシを行った。さらに、こうした粗視化されたモデルからSAXSプロファイルを理論的に計算する方法を開発するとともに、少ない情報量のSAXSプロファイルに三次元構造をフィットさせるときに生じるOver-fittingの問題を避ける目的で、MD計算ではSAXSデータを考慮しないようにして、SAXSデータと整合する構造群を求めるアルゴリズムを開発した。X線・中性子溶液散乱解析から、H2A.Bモノ・ヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることを実証し、この性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンが形成できることを示した。また、H3およびH3のバリアント(CENP-A)を含むヌクレオソームが3つ連結した高次ヌクレオソーム複合体(H3-CA-H3トリ・ヌクレオソーム)のX線溶液散乱解析からH3-CA-H3トリ・ヌクレオソームが通常のものに比べて開いた構造をしていることを示した。さらに、粗視化モデルを構築してMD-SAXS法による動的解析を行い、H3-CA-H3トリ・ヌクレオソームのセントロメア領域おける機能を明らかにした。昨年度行ったX線溶液散乱(SAXS)解析で推測されたH2AとH2AのバリアントであるH2A.Bを含むモノヌクレオソームの違いをコントラスト変調法を利用した中性子溶液散乱(SANS)で解析し、H2A.BヌクレオソームのDNAは両端がヒストン8量体からはがれていることを実験的に証明し、このような性質によりH2A.Bは緩んだ状態のクロマチンを形成できることを明らかにしたこと、および、H3またはCENP-Aを含む3つのヌクレオソームをつなげたトリヌクレオソームのSAXSを測定し、H3-CENP-A-H3トリヌクレオソームとH3-H3-H3トリヌクレオソームが異なる散乱パターンを示して両者の動的構造に違いがあることを明らかにし、本研究の目的である高次ヌクレオソーム複合体の動態解析に目途を立てることができたことなどから、おおむね順調に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学H2A.BモノヌクレオソームおよびH3-CENP-A-H3トリヌクレオソームについて、分子動力学シミュレーションを行う。これにより通常のH2AモノヌクレオソームおよびH3-H3-H3トリヌクレオソームとの動的な挙動の違いを解析し、これらのヒストンバリアントが高次のクロマチン構造に与える影響を明らかにする。このような巨大複合体では実際の溶液中の分子挙動を正しく再現するためには計算と実験の両面で様々な工夫が必要である。そこで、分子動力学計算では全原子シミュレーションの代わりに疎視化シミュレーションを行う。疎視化シミュレーションではアミノ酸残基1つを1粒子、塩基1つを3粒子とすることで巨大複合体を簡素化し、全原子シミュレーションでは追えないような長時間にわたる大規模な構造変化を追うことができる。
Ｃｅジグザグ鎖構造を持つ新しい重い電子系化合物における電流誘起磁化現象の探索

我々が発見したCe3TiBi5は局所的な空間反転対称性を持たないCeジグザグ鎖構造を有し、Ceの比較的局在性の強いf電子が反強磁性秩序を示す。拡張多極子による分類では、Ce3TiBi5の秩序状態は強トロイダル秩序状態に分類され、電気磁気効果による電流誘起磁化が期待できる。Ce3TiBi5において電流誘起磁化の探索を行った。我々はカンタムデザイン社の磁束計MPMSを利用して予想された電流誘起磁化の観測に成功した。試料依存性や再現性、測定システムにエラーがないことを確認した。Ce3TiBi5における電流誘起磁化現象の特徴として、1「電流の変化に対して線形的に増加する。」、2「電流誘起磁化成分は磁場に依存せず、ゼロ磁場においてもその成分は存在する。」が観測され、理論研究による指摘と一致した。しかしながら、現実の系としては反強磁性状態にドメイン構造が存在すると考えられる。ドメイン構造がランダムに発生していると考えると、トータルの強トロイダル成分は相殺し、電流誘起磁化も発生しないと考えられる。また、イントラチェーン内では強トロイダル秩序状態を形成するが、インターチェーン間では120度構造を形成するとも考えられ、いくつかの問題点が残っている。ホール素子による電気磁気効果測定システムの開発に関して、直流測定では困難であることが判明してきており、交流測定に切り替えて開発を進めている。理論研究との整合性と言う点において問題点はあるものの、実験的にはすでに電流誘起磁化の観測に成功し、順調に進展している。カンタムデザイン社の磁束計MPMSを利用する実験手法に関しての課題はすでに無くなり、新たに発見したCe3TiBi5と同型の化合物における電流誘起磁化現象の観測にも期待が持たれる。理論研究との整合性については、Ce3TiBi5の詳細な磁気構造の決定や、転移温度より十分低温での電流誘起磁化現象の異方性が重要となってくる。前者を解決するためには中性子散乱実験やNMR測定、後者の解決のためには、SQUID素子やホール素子を利用した超低温下における測定が必要となる。これらの測定に関しても、準備を進めており、その成果を期待している。ホール素子を利用した測定手法は圧力下測定にも対応可能なため、Ce3TiBi5の結晶構造の対称性を破る方向への一軸圧への応用への拡張へも期待している。電流誘起磁化が観測されているCe3TiBi5において、マクロに電流誘起磁化が発生していることを究明するため、中性子散乱実験、NMR測定およびSQUID素子を利用した超低温測定を共同研究によって計画している。また、電流の印加方向や測定方向の配置の違いによる異方性の測定が重要になるため、同様の測定方法によってこれを確かめる。同型の構造を持ち、ジグザグ鎖の原子間距離やジグザグ鎖の角度の異なる化合物Ce3ZrBi5における電流誘起磁化現象の観測を進め、この比較によってもこの系における電流誘起磁化についての考察を進める。さらに一軸圧下における電流誘起磁化の実験も残された時間で挑戦していく。六方晶の対称性を破るa軸方向と破らないc軸方向への一軸圧を印加し、実験を行う。Ce3ZrBi5とCe3TiBi5の違いは前者には磁場中に複数の磁気相が存在する点である。SQUID素子は磁場中や圧力環境下に弱いため、ホール素子による測定を現在試みている。希土類元素を置換したSm3TiBi5において、0.1K程度のヒステレシスや磁化の大きな変化を伴う一次転移を約17Kに発見している。Sm系では価数転移が期待されるため、この転移が価数の変化を伴っているのかを確認しつつ、圧力下において一次転移のエンドポイントがないかの探索を行う。これを実行するため8GPa程度までMPMSで磁化測定が可能なマイクロセラミックアンビルセルを準備している。Ce3TiBi5の希土類置換は、反強磁性転移温度の上昇を期待し、電気磁気効果が出現する温度の上昇を狙って行ったものであるが、現状では有効な系は見いだせておらず、今後も希土類置換による探索を継続する。

ホール素子による電気磁気効果測定システムの開発に関して、直流測定では困難であることが判明してきており、交流測定に切り替えて開発を進めている。理論研究との整合性と言う点において問題点はあるものの、実験的にはすでに電流誘起磁化の観測に成功し、順調に進展している。カンタムデザイン社の磁束計MPMSを利用する実験手法に関しての課題はすでに無くなり、新たに発見したCe3TiBi5と同型の化合物における電流誘起磁化現象の観測にも期待が持たれる。理論研究との整合性については、Ce3TiBi5の詳細な磁気構造の決定や、転移温度より十分低温での電流誘起磁化現象の異方性が重要となってくる。前者を解決するためには中性子散乱実験やNMR測定、後者の解決のためには、SQUID素子やホール素子を利用した超低温下における測定が必要となる。これらの測定に関しても、準備を進めており、その成果を期待している。ホール素子を利用した測定手法は圧力下測定にも対応可能なため、Ce3TiBi5の結晶構造の対称性を破る方向への一軸圧への応用への拡張へも期待している。電流誘起磁化が観測されているCe3TiBi5において、マクロに電流誘起磁化が発生していることを究明するため、中性子散乱実験、NMR測定およびSQUID素子を利用した超低温測定を共同研究によって計画している。また、電流の印加方向や測定方向の配置の違いによる異方性の測定が重要になるため、同様の測定方法によってこれを確かめる。同型の構造を持ち、ジグザグ鎖の原子間距離やジグザグ鎖の角度の異なる化合物Ce3ZrBi5における電流誘起磁化現象の観測を進め、この比較によってもこの系における電流誘起磁化についての考察を進める。さらに一軸圧下における電流誘起磁化の実験も残された時間で挑戦していく。六方晶の対称性を破るa軸方向と破らないc軸方向への一軸圧を印加し、実験を行う。Ce3ZrBi5とCe3TiBi5の違いは前者には磁場中に複数の磁気相が存在する点である。SQUID素子は磁場中や圧力環境下に弱いため、ホール素子による測定を現在試みている。希土類元素を置換したSm3TiBi5において、0.1K程度のヒステレシスや磁化の大きな変化を伴う一次転移を約17Kに発見している。Sm系では価数転移が期待されるため、この転移が価数の変化を伴っているのかを確認しつつ、圧力下において一次転移のエンドポイントがないかの探索を行う。これを実行するため8GPa程度までMPMSで磁化測定が可能なマイクロセラミックアンビルセルを準備している。Ce3TiBi5の希土類置換は、反強磁性転移温度の上昇を期待し、電気磁気効果が出現する温度の上昇を狙って行ったものであるが、現状では有効な系は見いだせておらず、今後も希土類置換による探索を継続する。
鋼繊維強化コンクリートの被壊挙動に及ぼす鋼繊維の強度及び配向の影響

種々の繊維強化コンクリートが開発されてきた。一般に繊維といえば太さがミクロンオーダーの細さである。しかし、いわゆる鋼繊維強化コンクリート(SFRC)の鋼繊維の太さは0.11mmの太さの線であり,引張強さと共に剛性をもっているので,鉄筋コンクリート(RC)との類似性があると考えられる。このような特異性に着目して,今回は特にSFの強度・太さおよび配向の弾性率と破壊強度に及ぼす影響を中心に研究を行った。用いたSFは神戸製鋼所製のシンコーファイバーであるが,冷間加工のまま,これを焼鈍したものの他に,日本冶金製のステンレス鋼ファイバー,ピアノ線,あるいは直径10μmのたわし用の鋼ファイバーを使用し,またセメント原料を変えても実験した。試験片の大きさは40×40×160mm^3で,弾性率測定には3点曲げ,破壊試験には4点曲げ試験を行った。得られた結果は次のとおりである。(1)SF1%添加(wt%で示す)でも亀裂進展阻止の効果はあるが,強度の向上のためには5%以上の配合が必要である。(2)曲げ弾性率はSFの添加によって減少する。膨張セメントを普通ポルトランドセメントに適量配合すると,弾性率の低下を防止できる。(3)グリースを塗布したSFを配合しても強度の向上にはあまり役立たない。(4)太は10μmの細織細は切断しやすく,また長さ10mmのSFは引き抜かれやすく,強度向上にはあまり役立たない。(5)長手方向にSFを配向させることにより有効に強度の向上に役立つ,(6)オートクレーブ処理をすると,SFRCの弾性率は低下する。このようにSF添加によるSFRCの弾性率低下の原因は,繊維の囲りに微小クラックが発生しやすいためと思われる。コンクリ-トは極めて優れた構造用材料であるが、引張り、曲げ強度や靭性に乏しいなど、構造用としては宿命的な欠点を持っている。近年、この欠点を克服する手段として、各種の繊維を配合した繊維強化コンクリ-ト(FRC)が開発された。今回は、FRCの強度に及ぼす繊維の量、形状の影響を明らかにする目的で、長さ、直径、形状の異なる8種類のステンレス鋼繊維を配合したコンクリ-トの曲げ破壊挙動を実験した。モルタル原料としてはジェットセメントと5号珪砂を用い、S/C=1.,W/C=0.5とし、これら減水剤と遅延剤を加えた。鋼繊維としては、SUS430鋼をメルトエクストラクション法により製造したもので、直径0.30.6mm,長さ1035mmであり、その中4種は両端に滑り止めをつけたドッグボ-ン型である。試験片の大きさは40×40×160mmであり、下部支達距離100mm,上部支点距離30mmの4点曲げ試験を行った。材齢は約28日である。曲げ試験の結果を要約すれば次の通りである。(1)繊維長が15mm以上の場合、繊維配合比が多い程、アスペクト比が大きい程曲げ破断強度も靭性も顕著に増加する。(2)ストレ-ト型の繊維よりドッグボ-ン型の方が曲げ破断強度も靭性も大きい。(3)しかし繊維配合率が13%と少ないとき、靭性は増加するが、曲げ破壊強度の向上効果はない。直径0.3mm,長さ10mmの繊維の場合は、9%添加しても強度の向上は認められない。今回の実験範囲では、直径0.6mm,長さ35mmの繊維を9%添加したもので最高120kg/cm^2の曲げ強度と高い最も高い靭性が得られた。

コンクリートやモルタルは圧縮力には強いが、引張力には弱い。このために繊維強化コンクリート(FRC)は引張り、曲げ、捩りのかかる部材に用いられる。このため、本研究では曲げ試験を中心に鋼繊維強化モルタルの研究を行った。試験片製作のための素材は次のとおりである。普通ポルトランドセメント、珪砂、減水剤(ダーレックス)、神戸製鋼所製鋼繊維(シンコーファイバー)、日本板ガラス製耐アルカリガラス繊維(セムフィル)ローピング。水/セメント比は0.35とし、全重量に対する鋼繊維配合率は9%とした。ガラス繊維を1%、および0.5%添加したときは、鋼繊添加量を6%および7.5%とした。鋼繊維は強く冷間加工されたままのもの、これを700°Cで1hr真空焼鈍したもの、およびこれら2種の鋼繊維の表面にグリスを塗付したものの4種を用意した。型枠は40×40×160mm^3であり、鋼繊維をランダムに混入したものと長手方向に配向させたものの2種を用意した。これらとは別にガラス繊維のみを配合したGFRCも参考のために作製した。結果の主なものは次のとおりである。(1)曲げ弾性率は鋼繊維を添加する程低くなり、同時に弾性限界も低下する。鋼繊維の弾性率はモルタルの約7倍である。従って、所謂複合則によれば鋼繊維配合率とともに増加するはずであるが、上述の結果が得られたのは鋼繊維とモルタルの界面の応力集中部でモルタルの微小割れが発生するためと思われる。フレキシブルなガラス繊維強化モルタルの弾性率は向上した。グリスを塗布することによって弾性率は一層低下したが、真空焼鈍鋼繊を用いたときは弾性率がグリス塗布によって向上した。(2)曲げ強度及び靭性は鋼繊維添加によって向上し、グリス塗付によって低下した。鋼繊維の硬さの影響は殆んどなかった。コンクリートの宿命ともいえるひびわれに対する抵抗を高める目的で、各種の繊維が配合された繊維強化コンクリート(FRC)の開発が行われている。この際、炭素繊維、ガラス繊維、あるいはカオウール繊維などはいずれも10ミクロン程度のフィラメント状の細繊維であるが、鋼繊維の場合は1ミリ程度の直径の針金状のものが使用されている。このため、「繊維」と総称されても、FRCの挙動は一様でないと考えられるので、今回は主としてこの観点から研究を行った。今回使用した鋼繊維は公称直径0.6mm,公称長さ30mmのシンコーファイバーと、厨房用たわしとして使用されている直径30mmの鉄ファイバーを使用した。普通ポルトランドセメント:4号硅砂:水を1:1.5:0.38として、これに上記の繊維を長手方向に配列させたり、ランダムに混合し、4×4×16cm^3の型枠にキャストし、1ケ月以上の水中養生を行い、一部の試料は185°Cのオートクレーブ養生を行った。これらの試料を用いて曲げ弾性率を3点曲げにより、また、曲げ破壊試験を4点曲げ方式により行った。得られた結果を要約すれば次のとおりである。(1)弾性率(E)について:細繊維配合によりEは上昇するが、太繊維配合の場合、これを整列させたときはEが増加したが、ランダムに混合したときは減少した。また、オートクレーブ処理によっても増加しなかった。(2)曲げ破壊試験について:細繊維配合による曲げ強度の増加量は僅かであるが、太繊維配合により、著しく強化される。前者の場合、オートクレーブ処理により、強度は上昇した。細繊維配合試料は引張り型破断したが、太繊維配合試料では剪断型破断となった。
長鎖脂肪酸受容体ＧＰＲ４０の皮膚炎症抑制作用のメカニズム

脂質受容体のマウス接触性皮膚炎モデル及び乾癬様皮膚炎への作用を検討した。長鎖脂肪酸受容体であるGPR40は接触性皮膚炎を抑制することをすでに報告しているが、乾癬様皮膚炎には有意な影響を示さなかった。次に、脂質誘導体であるプロスタグランジンD2の受容体DP1の乾癬様皮膚炎の作用を検討した。DP1欠損マウスでは、野生型マウスより耳介腫脹が有意に抑制され、炎症性サイトカインの遺伝子発現も有意に抑制された。以上より、DP1受容体は乾癬様皮膚炎の発症に寄与することが示された。本研究により、脂質受容体作動薬は各種皮膚炎への新規治療薬開発において有望なターゲットとなりうることが示唆された。本年度は脂質受容体の乾癬様皮膚炎モデルへの影響を調べた。乾癬様皮膚炎はTLR7/8アゴニストであるImiquimodクリームをマウス耳介に反復塗布することにより誘発される。まず、プロスタグランジンD2受容体DP1の欠損マウスでは、野生型マウスと比して耳介厚、HE染色での表皮厚及び真皮への細胞浸潤が低下することを見出した。免疫染色ではDP1受容体は真皮樹状細胞、γδT細胞、並びに表皮に発現していた。定量的PCRにて、DP1欠損マウスではIL-23p19, IL-17A, IL-17Fの耳介でのmRNA発現が有意に低下していた。FACS解析では、真皮のγδT細胞の数が野生型と比して優位に減少していた。以上の結果より、樹状細胞によるIL-23の低下がγδ細胞の浸潤並びにIL-17A, IL-17F mRNA発現の低下を誘発し、結果的に皮膚炎が減弱すると考えた。そこでin vitro実験としてマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)を作成し、DP1アゴニストまたは溶媒の存在下でTLR7/8アゴニストであるgardiquimodで刺激し、IL-23p19 mRNA発現を定量的PCRで調べたところ、DP1アゴニスト投与にてIL-23p19 mRNA発現が有意に増加し、PGD2-DP1シグナル伝達系が樹状細胞によるIL-23産生に対し促進的に作用することが分かった。最後に、ヒトの皮膚凍結切片(健常者及び乾癬患者由来)からの免疫染色では表皮ケラチノサイト及び真皮樹状細胞にDP1が発現しており、ヒトでも同じ機構が作用していることが示唆された。GPR40アゴニストであるGW9508をAldaraクリーム塗布前に毎回塗布しその効果を調べたが、わずかな抑制効果を認めたものの有意な効果は得られなかった。最後にresolvin E1が皮膚樹状細胞の機能を抑制し、接触性皮膚炎を抑制することを見出した。まず、GW5908の接触性皮膚炎モデルへの抑制作用の再現性を確認した。さらに、DNA microarrayに供するサンプルを現在準備しているところである。耳介に浸潤する細胞の解析では、好中球およびT細胞が減少していたが、こちらも再現性の確認が必要である。GPR40はGi及びGqに共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)である。長鎖脂肪酸受容体を生理的リガンドとする。申請者らはGPR40が表皮ケラチノサイト(KC)に発現し、GPR40アゴニストがサイトカイン刺激によるKCのケモカイン産生を抑制することを見出した。マウス接触性皮膚炎モデルとアトピー性皮膚炎モデルでもGPR40アゴニストは皮膚炎を抑制し、KCのケモカイン産生を抑制した。本研究は、GPR40による皮膚炎症制御のメカニズムを解析し、さらに分子メカニズムにまで迫ることを目的として実験を開始した。接触性皮膚炎の惹起相でのGPR40アゴニストGW9508の塗布により、惹起24時間後でT細胞及び好中球数の軽度低下の傾向が見られたが、有意差は見られなかった。接触性皮膚炎惹起後の耳介からの好中球、T細胞、樹状細胞の単離とそれらを用いたin vitroでの実験を試みたが、細胞数及び純度ともに実験に使用しうる程度には及ばなかったため、実験は中断した。次に、他の皮膚炎モデルでのGW9508の効果を調べることとした。TLR7/8アゴニストであるImiquimod外用によるマウス乾癬様皮膚炎モデルを用いてGW9508の効果を検討したが、有意な効果を認めなかった。他の脂質誘導体であるプロスタグランジンD2 (PGD2)の受容体DP1の乾癬様皮膚炎の作用を検討した。DP1欠損マウスでは、野生型マウスより耳介腫脹が有意に抑制され、IL-17A, IL-17F, IL-23等の炎症性サイトカインの遺伝子発現も有意に抑制された。

DP1アゴニストは樹状細胞のIl-23産生を増強したことより、DP1は樹状細胞のIL-23産生に寄与し、IL-17産生T細胞の皮膚への遊走を促進している可能性が示唆された。以上より、脂質受容体作動薬は各種皮膚炎への新規治療薬開発において有望なターゲットとなりうることが示唆された。今後は皮膚炎のみならず他の免疫疾患でのDP1受容体や他の脂質受容体の役割につき研究を展開させる予定である。Gタンパク質共役型受容体の免疫系への制御機能脂質受容体の乾癬様皮膚炎への作用が、DP1受容体を中心に明らかにされてきている。さらに、DP1受容体の役割についてはその詳細なメカニズムまで解明されてきており、順調に進んでいると判断する。AKプロジェクトの研究課題が予想以上に遂行困難であったため、当初の予想よりも多くの時間を費やしてしまった。また、本研究課題については耳介から採取される細胞数が予想より少なく、実験条件の検討に時間がかかった。乾癬様皮膚炎へのPGD2-DP1シグナリングの作用に関する研究が順調に進んでいることから、こちらを取りまとめる方向で進めていく。今後は、ヒト単球由来樹状細胞を用いて、gardiquimodに誘発されるIL-23p19発現を調べる予定である。GW9508の効果については、乾癬様皮膚炎での作用をもう一度確認する。抑制効果の再現性が得られれば、組織学的所見及びFACS解析を中心に作用メカニズムの解析を進め、取りまとめることを目標とする。今後の予定としては、DNAマイクロアレー用サンプルの準備を続ける。また、細胞採取のプロトコールを確立し、浸潤細胞の各分画間の割合と数の差異を明らかにする。次に、磁気ビーズを用いた細胞分離により、各免疫細胞のGPR40発現を確認する。発現細胞の同定後、in vitroでの各種免疫細胞へのGW9508の作用を明らかにする。脂質との関連については、近年、resolvin E1やprotectin D1等のomega3脂肪酸の免疫制御作用が多数報告されている(生化学第80巻第11号1042-6)。これらは喘息、腹膜炎、アルツハイマー病モデルで抗炎症作用を示し、in vitroでは好中球の遊走抑制、樹状細胞やT細胞のサイトカイン産生抑制効果が報告されている。本研究においても、脂質全般に標的を広げ、皮膚炎への作用を探索することも考えている。前年度からの繰り越し分と合わせて計画的に研究費を使用し、必要物品はすべて購入したが、当初の計画と比して価格の誤差が生じ、結果として次年度使用額が発生した。フローサイトメトリーに必要な抗体の購入にあてる予定である。平成24年度は上記に理由並びに、所属研究室の物品が使用可能であったため、平成25年度に使用予定の金額が生じた。今年度の使用計画は以下のとおりである。磁気ビーズ: 200,000円、PCRプライマー: 30,000円、免疫染色用抗体: 200,000円、その他消耗品:46,622円。
区分的アフィンシステムの局所安定化に関する研究

区分的アフィンシステムは,近年活発に研究されているハイブリッドシステムの代表的なモデルのひとつである.入力飽和,リレー要素やバックラッシュなどを有する制御システムは区分的アフィンシステムとして表現できるので,実システムにおいても区分的アフィンシステムはよく見られる.本研究では,区分的アフィンシステムに対する局所安定条件および局所安定化手法を新たに提案することを目標とする.1前年度に得られた区分的アフィンシステムのリミットサイクルの計算方法および安定性解析に基づいて,区分的アフィンシステムのリミットサイクルの安定化に関して考察した.特に,切替え型コントローラの実装などを想定して,モード切替えに遅れが存在する場合の安定化可能性を検討した.現時点では,最終的な研究結果を得るには至っていないが,継続して検討を続ける予定である.2本研究課題に関連する研究として,区分的アフィンシステムの同定問題に関して検討を行い,統計的クラスタリングに基づく方法を提案した(研究発表の欄参照).区分的アフィンシステムは,近年活発に研究されているハイブリッドシステムの代表的なモデルのひとつである.入力飽和,リレー要素やバックラッシュなどを有する制御システムは区分的アフィンシステムとして表現できるので,実システムにおいても区分的アフィンシステムはよく見られる.本研究では,区分的アフィンシステムに対する局所安定条件および局所安定化手法を新たに提案することを目標とする.(1)区分的アフィンシステムの特別な場合である入力飽和システムの新しい局所安定条件を導出し,古典的な手法である円板条件よりも,大きな安定領域を与えることを証明した(研究業績の欄参照).(2)さらに,入力の振幅と変化率に飽和のあるシステムに対して,(1)の安定条件に基づく安定化コントローラの設計法を提案し,提案法が制御系設計においても有用であることを示した(研究業績の欄参照).(3)一般の区分的アフィンシステムの局所安定性について,線形行列不等式(LMI)と区分的2次形式Lyapunov関数を用いた局所安定条件を導出した(研究業績の欄参照).この条件に基づいた安定化コントローラの設計法については,現在検討中である.(4)(3)のアプローチを,不確かさを有する区分的アフィンシステムの可到達集合解析にも援用することにより,状態可到達集合を計算する新しい手法を提案し,T-Sファジィシステムの解析に応用した.この結果は,計測自動制御学会第3回制御部門大会(2003年5月)で口頭発表し,現在論文投稿中である.区分的アフィンシステムは,近年活発に研究されているハイブリッドシステムの代表的なモデルのひとつである.入力飽和,リレー要素やバックラッシュなどを有する制御システムは区分的アフィンシステムとして表現できるので,実システムにおいても区分的アフィンシステムはよく見られる.本研究では,区分的アフィンシステムに対する局所安定条件および局所安定化手法を新たに提案することを目標とする.1前年度に得られた局所安定条件の考え方に基づいて,不確かさを有する区分的アフィンシステムの状態可到達集合を計算する新しい手法を提案し,Takagi-Sugenoファジィシステムの解析に応用した(研究発表の欄参照).2区分的アフィンシステムのリミットサイクルの計算方法および安定性解析について考察した.特に,切替え型コントローラの実装などを想定して,モード問の切替えに遅れが存在するような区分的アフィンシステムのリミットサイクルの安定条件をポアンカレ写像を用いて導出した.3モード切替がサンプル時刻でのみ許されるようなサンプル値区分的アフィンシステムに対して,このシステムを2次安定化するサンプル値状態フィードバックコントローラの設計法を提案した.この結果は,現在論文投稿中である.4また,本研究課題に関連する研究として,統計的データクラスタリング手法とサポートベクタマシンを援用した区分的アフィンシステムの同定手法に関して検討を行い,予備的な結果を得た(研究発表の欄参照).区分的アフィンシステムは,近年活発に研究されているハイブリッドシステムの代表的なモデルのひとつである.入力飽和,リレー要素やバックラッシュなどを有する制御システムは区分的アフィンシステムとして表現できるので,実システムにおいても区分的アフィンシステムはよく見られる.本研究では,区分的アフィンシステムに対する局所安定条件および局所安定化手法を新たに提案することを目標とする.1前年度に得られた区分的アフィンシステムのリミットサイクルの計算方法および安定性解析に基づいて,区分的アフィンシステムのリミットサイクルの安定化に関して考察した.特に,切替え型コントローラの実装などを想定して,モード切替えに遅れが存在する場合の安定化可能性を検討した.現時点では,最終的な研究結果を得るには至っていないが,継続して検討を続ける予定である.2本研究課題に関連する研究として,区分的アフィンシステムの同定問題に関して検討を行い,統計的クラスタリングに基づく方法を提案した(研究発表の欄参照).
流動場リプロン光散乱法による非平衡界面現象の動的測定

液体表面や液-液界面に両親媒性分子が単層で吸着して形成する単分子膜は、ナノメートルの厚さをもつ2次元分子集合体として物性物理の興味深い研究対象である。これらの膜はまた、機能性有機薄膜として応用が進められるLB膜の前駆体として工業的にも重要な素材である。しかし表面に分子が吸着する過程、あるいは表面内の分子移動や配列などのダイナミクスについては、その測定はきわめて困難である。本研究の目的は、流動する表面上に形成される分子膜の状態をリプロン光散乱を用いて観察することにより、表面層形成のダイナミクスを調べる全く新しい手法「流動場リプロン光散乱法」を開発することにあった。研究ではまず、フローセル上を流速1.030cm/sで流動する液体表面について、実際に熱揺動により生じたリプロンの光散乱分光を行い、その周波数シフトが流速に平行な成分と流速に反平行な成分とで流動に伴なうドップラーシフトを示すことを実験的に明らかにした。このシステムをデカン酸水溶液表面における分子吸着膜の形成過程を測定に応用し、溶液中の拡散が律速となる吸着現象を見出した。さらにリプロンの精密測定により、吸着段階で表面弾性が時間と共に増加することを確認し、流動場計測が表面の非平衡過程の測定法として有用であることを示した。また液体表面の超高速現象を捉えるために、光散乱信号の処理をディジタル化し、その相関測定をすることにより10m秒の時間分解能でリプロンスペクトルを測定することに成功した。このシステムを用いてオクタン酸ナトリウムなどの標準的な両親媒性分子の吸着測定を行った結果,10msという高い時間分解能で溶液表面に分子膜を形成する動的過程を観察することができた。このシステムの時間分解能はこれまでのあらゆる表面計測測定手法を凌駕するものであり,今後液体界面物性の有効な手段となることが期待できる。本研究の目的は、流動する表面上に形成される分子膜の状態をリブロン光散乱を用いて観察することにより、表面層形成のダイナミクスを調べる全く新しい手法「流動場リプロン光散乱法」を開発することである。本年度は、フローセル上を流速1.030cm/sで流動する液体表面について、実際に熱揺動により生じたリプロンの光散乱分光を行い、その周波数シフトが流速に平行なストークス成分と、流速に反平行なアンチストクス成分とで流動に伴なうドップラーシフトを示すことを実験的に明らかにし、これを用いて表面の流動速度を非接触かつ非破壊的に測定できることを示した。このシステムを用いてデカン酸水溶液表面における分子吸着膜の形成過程を測定し、溶液中の拡散が律速となる吸着現象を見出した。これにより汎用の界面活性剤の吸着現象を、極めて精度よく観察することが可能になった。

液体表面や液-液界面に両親媒性分子が単層で吸着して形成する単分子膜は、ナノメートルの厚さをもつ2次元分子集合体として物性物理の興味深い研究対象である。これらの膜はまた、機能性有機薄膜として応用が進められるLB膜の前駆体として工業的にも重要な素材である。しかし表面に分子が吸着する過程、あるいは表面内の分子移動や配列などのダイナミクスについては、その測定はきわめて困難である。本研究の目的は、流動する表面上に形成される分子膜の状態をリプロン光散乱を用いて観察することにより、表面層形成のダイナミクスを調べる全く新しい手法「流動場リプロン光散乱法」を開発することである。本年度は液体表面の超高速現象を捉えるために、光散乱信号の処理をディジタル化し、その相関測定をすることにより10m秒の時間分解能でリプロンスペクトルを測定することを試みた。これまでの測定では、熱ゆらぎにより生じるリプロンからの微弱な散乱光を検出するために、その周波数スペクトルの解析にはアナログのスペクトラムアナライザーを使用していた。本研究のこれまでの成果により、このリプロン検出感度は大幅に向上した。このためゆらぎのスペクトルを直接観察してこれを大容量メモリに取り込み、これを数値的にフーリエ変換処理することにより、極めて短時間の観測でリブロンスペクトルを得ることが可能になった。このシステムを用いてオクタン酸ナトリウムなどの標準的な両親媒性分子の吸着測定を行った結果、10msという高い時間分解能で溶液表面に分子膜を形成する動的過程を観察することに成功した。このシステムの時間分解能ならびに表面エネルギーの測定精度は、これまでのあらゆる表面計測測定手法を凌駕するものであり、今後液体界面物性の有効な手段となることが期待できる。
新しい治療薬開発の基盤としての有痛性糖尿病性神経障害の発症機序解明

Na^+ channelのサブタイプのひとつであるtetrodotoxin(TTX)抵抗性(TTX-R)Na^+ channelは、侵害刺激反応の伝達に重要な役割を果たしていることが知られている。II型pyrethroid系殺虫剤であるfenvalerateはTTX-R Na^+ channelおよびTTX感受性(TTX-S)Na+ channelの両者に親和性を有するものの、TTX-R Na^+ channelにおいてより強いNa^+の流入を引き起こすことが知られている。本研究では、fenvalerateを髄腔内および足蹠皮下投与した際に誘発される侵害刺激反応に対する糖尿病の影響について検討した。Fenvalerateを髄腔内へ投与することにより、侵害刺激反応類似の行動が誘発された。対照群マウスにおいて、fenvalerateの0.1?3.0μgの用量範囲で、糖尿病マウスにおいては0.01? 0.1μgの用量範囲において用量依存的な反応時間の延長が認められた。PKC阻害薬であるcalphostin C)により、対照群および糖尿病マウスにおいてともにfenvalerate誘発侵害刺激反応時間の有意な短縮が認められた。PKC活性化薬であるPDBuは、対照群マウスにおいて、fenvalerate誘発侵害刺激反応時間を有意に延長させた。PKCの活性化により、TTX-R Na^+ channelを介したNa^+の流入は増加するもののTTX-S Na^+ channelを介したNa^+の流入は減少することが報告されている。今回、PKCの活性化によりfenvalerate誘発侵害刺激反応が増強されたことから、fenvalerate誘発侵害刺激反応には、TTX-R Na^+ channelの活性化が関与している可能性が示唆された。さらに、糖尿病時にはPKCの活性が上昇していることが報告されている。これらのことから、糖尿病マウスにおいてみられるfenvalerate誘発侵害刺激反応の増加に、PKCの活性化が一部関与していることが示唆された。また、糖尿病マウスにおいては、脊髄におけるNMDA受容体の機能亢進が上位中枢でのμ受容体を介した抗侵害効果の減弱に一部関与していることも明らかとなり、糖尿病マウスにおける有痛性神経障害にも、脊髄でのNMDA受容体の機能変化が一部関与している可能性が示唆された。Na^+chanelのサブタイプの一つであるtetrodotoxin(TTX)抵抗性(TTX-R)Na^+channelは、侵害刺激反応の伝達に重要な役割を果たしていることが知られている。また、II型pyrethoid系殺虫剤であるfenvalerateはTTX-R Na^+chamelおよびTTX感受性(TTX-S)Na^+chamelの両者に親和性を有するものの、TTX-R Na^+channelにおいてより強いNa^+の流入を引き起こすことが知られている。以上のことから、本研究では、fenvalcrateを髄腔内投与した際に誘発される侵害刺激反応について検討した。Fenvalerateを髄腔内へ投与することにより侵害刺激反応類似の行動が誘発された。この反応はmorphineにより用量依存的に抑倒されたことから侵害刺激反応に基づく反応であることが確認された。またPKC阻害薬であるcalphostin Cによりfenvalerate誘発侵害刺激反応時間の有意な短縮が認められた。一方、PKC活性化薬であるPDBuはfenvalerate誘発侵害刺激反応時間を有意に延長させた。