hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞の選択的除去法を用いた嗅球新生神経細胞による神経回路再構成の解析

成体嗅球では新しい神経細胞が神経回路に組み込まれているが、これが既存の神経細胞にどの様に影響されるかは不明である。遺伝子操作マウスを用いて嗅球の既存の神経細胞のサブタイプ(mGluR2陽性細胞)を選択的に除去したところ、新生mGluR2陽性顆粒細胞が優先的に組み込まれ、2ヶ月後にはmGluR2陽性顆粒細胞がほぼ元通りに回復した。新生神経細胞は、不足した既存の神経細胞サブタイプを補って、神経回路を修復する能力を持つことが明らかとなった。嗅球では、成体においても新しく生まれた神経細胞が神経回路に組み込まれている。成体脳ではすでに機能的な神経回路が形成されており、そこに新しい神経細胞が組み込まれるので、新生神経細胞による神経回路の再構成のメカニズムは、既存の神経細胞、神経回路との関連の中で考えていく必要がある。本研究の目的は、マウス嗅球の既存の神経細胞を選択的に除去する手法を用いて、新生神経細胞の組み込みが既存の神経細胞、神経回路の状態によってどのように調節を受けるかを知ることである。緑膿菌の毒素と抗体分子(human IL-2 receptor αchain(hIL2Rα)に対するモノクローナル抗体)との融合蛋白(イムノトキシン)の局所注入によって、mGluR2プロモーター下にイムノトキシン受容体を発現するトランスジェニックマウス嗅球の抑制性介在神経細胞(granule cell)を除去し、細胞除去とその後の修復過程を観察した。granule cellの中でイムノトキシン受容体を発現するmGluR2陽性細胞が選択的に除去されることが確認され、除去後にはBrdUアナログで標識された新生細胞が除去部位に数多く集積していた。特に、新生細胞の中でmGluR2陽性細胞が優先的に神経回路に組み込まれ、細胞除去2ヶ月後には除去された神経細胞はほぼ元通りに回復していた。これらのことから、新生細胞の組み込みが局所神経回路の状態によって影響を受け、神経回路の欠損を補償するように機能していることが示唆された。今後、移植実験やウイルス感染実験によって新生細胞による神経回路の構造的・機能的修復機構を検討する予定である。嗅球では,成体においても新しく生まれた神経細胞(顆粒細胞)が神経回路に組み込まれている。成体脳では,すでに機能的な神経回路が形成されており,更に新しい神経細胞が組み込まれるので,新生神経細胞による神経回路の再構成のメカニズムは,既存の神経回路,神経細胞との関連の中で考えていく必要がある。本研究では,マウス嗅球の既存の神経細胞を選択的に除去する手法を用いて,新生神経細胞による神経回路の再構成が既存の神経細胞によって如何なる調節を受けているかを検討する。前年度に,緑膿菌の毒素と抗体分子(human IL-2 receptorに対するモノクローナル抗体)との融合蛋白(イムノトキシン)の局所注入によって,mGluR2プロモーター下にイムノトキシン受容体を発現するトランスジェニックマウス嗅球のmGluR2陽性顆粒細胞を選択的に除去できること,その2ヶ月後には,除去されたmGluR2陽性顆粒細胞がほぼ元通りに回復することを観察した。本年度に,新生細胞を標識し,mGluR2陽性新生顆粒細胞とmGluR2陰性新生顆粒細胞の組み込みを比較したところ,除去部位ではmGluR2陽性顆粒細胞が優先的に組み込まれることが分かった。さらに未分化神経細胞の移植実験を行い,除去部位では移植細胞が多くの樹状突起を伸ばし,多くのシナプス構造を形成していることを見出した。以上のことから,新生細胞の組み込みは嗅球局所の既存の神経細胞の影響を受け,局所神経回路の欠損を補償するように働いていると考えられた。嗅球では、成体においても新しい神経細胞(顆粒細胞)が神経回路に組み込まれている。成体脳ではすでに神経回路が形成されているので、新生神経細胞による神経回路の再構成機構は、既存の神経回路、神経細胞と関連付けて考えていく必要がある。本研究では、マウス嗅球の既存の神経細胞を選択的に除去し、新生神経細胞による神経回路の再構成が既存の神経細胞によって如何なる調節を受けているかを検討した。前年度までに、緑膿菌毒素と抗体分子との融合蛋白(イムノトキシン)の局所注入によって、mGluR2プロモーター下にイムノトキシン受容体を発現するトランスジェニックマウス嗅球のmGluR2陽性顆粒細胞を選択的に除去できること、その2ヶ月後には除去されたmGluR2陽性穎粒細胞がほぼ元通りに回復すること、既存のmGluR2陽性顆粒細胞を除去した部位では新生mGluR2陽性顆粒細胞が優先的に組み込まれること、未分化神経細胞の移植実験によって除去部位では移植細胞が多くの樹状突起を伸ばし多くのシナプス構造を形成していること、を見出した。本年度は、新生細胞の組み込みをさらに詳しく解析し、・既存の細胞を除去しない部位ではmGluR2陽性

顆粒細胞の組み込みは促進されず、組み込みの増加は細胞を除去した領域に限局しておこる・既存のmGluR2陽性顆粒細胞は嗅球の浅層に分布しており、これらを除去すると新生顆粒細胞も浅層まで移動して組み込まれる・Calretinin陽性細胞はその多くがmGluR2陽性であり、Calretinin陽性細胞の除去によってより多くの新生Calretinin陽性細胞が組み込まれる以上の点を明らかにした。これらのことから、新生顆粒細胞は、既存の神経細胞の除去による局所神経回路の変化を正確に検知し、神経回路を元通りに修復する能力があると考えられた。
力を加えると作用する固体酸触媒構造体の創製

工業的有用性が高いFAU, BEA, MFI, MOR, MWWゼオライト構造について,異なる結晶学的位置を持つイオン交換サイトと対カチオン等の組成(純SiO2型,アニオン型, H, Na, NH4,C3H9型)の組み合わせ全て708モデルについて,周期境界条件でHCTH関数を用い振動エネルギーを含む全エネルギーと最適化構造を求めた.先行して行った精度の低い計算に続いて,AlO距離が短いほどアンモニア脱離エネルギーが大きい相関が得られ,精度の向上によってより高い相関が得られたことから,SiOHAlユニットを両端から押す力によって酸強度が強められることが明確となった.AlOが短いときにはNH4やC3H9などのカチオンがより安定化されることが理由で,他方,脱プロトンエネルギーはSiOAl角度,すなわちねじれによって制御されていた.このように,酸性OHの化学的特性が単純では無いことをまず明らかにし,続いてカチオンの安定化,プロトンの反応性という2つの異なる特性と構造の相関を明らかにした.他方,マクロ細孔中へのゼオライト微粒子の充填については,研究当初の予想とは異なり,細孔中でゼオライトを合成するためには物質輸送の制御がさらに必要であること,その手前の段階としてゼオライト前駆体微粒子をマクロポーラスアルミナのほぼ全ての細孔内に均一に充填する方法・条件は明らかとなった.当初計画より予算が減額されているので無機合成に用いる機材が当初計画より少なく、以下の実験には予想より時間を費やした。アルミニウム基板をシュウ酸溶液中で二段階アノード酸化し、クロム酸リン酸水溶液中でポアワイドニングをすることでマクロポーラスアルミナ皮膜を合成した。この方法で高い規則性を持つマクロ細孔が得られることがわかった。一般的なゼオライト合成条件(pH11程度)ではアルミナ皮膜が溶解してしまう。そこで報告例のあるフッ化水素酸や濃塩酸を用いて種結晶溶液のpH調整を行った。フッ化水素酸ではポーラスアルミナ皮膜が溶解したのに対し、濃塩酸では溶解せずポーラス構造が維持された。また、結晶性の高いゼオライトが合成できる条件は種結晶溶液のpHが8以上だということもわかった。ゼオライト合成をしたポーラスアルミナ皮膜の表面SEM像から、同一アルミナ皮膜でも細孔内に生成物が入っていない部分と入っている部分が存在した。円形の細孔内では、10 nm程度の微粒子生成物が見られ、皮膜上にZSM-5ゼオライト特有のコフィン型粒子も見られた。一方皮膜のごく一部にはポアワイドニングがより進行した六角形の細孔が見られ、この細孔内では細孔壁に沿うようにリング状の生成物が見られた。シュウ酸中でのアノード酸化では、ポア壁の内側部分に不純物としてシュウ酸イオンが取り込まれることが知られている4)。六角形細孔ではこの不純物含有層が完全に溶解しており、シュウ酸種の有無などによる形態の変化が示唆される。以上のように、マクロ細孔にゼオライト前駆体が入り合成が進行するには,アルミナの洗浄が重要であることまではわかった。一方理論計算によって圧縮力がゼオライト骨格が負電荷を帯びた状態(アニオンフォーム)の安定化をもたらし,これが酸強度を強めること,圧縮とは別にねじれが異なる化学的特徴を制御することなど大きな進展が得られた.円筒状・貫通孔を持つポーラスアルミナの調製の検討に手をつけられなかった.ただしこれらは平板状のポーラスアルミナで代替できるかもしれず,必須ではない.平板状のポーラスアルミナの合成は計画通り進捗した.アルミナ被膜の形態維持とゼオライトの合成を両立させる条件は予想より狭く,明らかにするのに時間を要した.しかし明らかにすることができた.マクロ細孔内でゼオライトが合成できる条件は明らかとなったが,まだ全ての細孔内にゼオライトを有する試料は得られていない.以上,当初の計画に比べると遅れている部分はあるが,予想通りではない発見のためであり,予想通りではない点に対しては適切に対処しており,ポーラスアルミナのマクロ細孔内でゼオライトを合成する指針は確立できた.一方予定しなかった理論計算による成果で力による制御が二次元的に可能であることが予測され,新しい計画に繋がる可能性が出てきた.昨年度,マクロポーラスアルミナの調製法を本研究のためにチューニングすること,そのようにして調製した平板状マクロポーラスアルミナのマクロ細孔にゼオライト前駆体を導入することを検討し,ある程度の成果を得た.しかしマクロ細孔の全てではなく一部に導入されたのみであったので,本年度はマクロポーラスアルミナの調製および後処理,またゼオライト前駆体の導入方法を改良し,マクロ細孔の全てにゼオライト前駆体を導入することを試みた.(1)マクロポーラスアルミナは従来は残渣の残るシュウ酸法で調製していたが,残渣の残らない方法を探索し,リン酸法によって残渣ない試料を合成した.ただし同時に他の条件を検討し,ゼオライト前駆体が入りやすいと考えられる,より大きく均一な細孔径を持つマクロ細孔を作ることも並行して行った.これらはpreliminaryな研究なので系統的に行ったわけではないが,最終的に200 nm程度で均一な細孔径を持ち,不純物を持たないマクロポーラスアルミナ薄膜が得られた.また厚さ(マクロ細孔の深さ)制御に必要な探索を行い,任意の深さの最高を作ることもできるようになった.

(2)ゼオライト前駆体,ないしは種結晶を様々な条件で導入しようと試みた.アルミナのマクロ細孔を洗浄,乾燥する,洗浄・乾燥条件を変える,超音波を照射する,容器内での上面,下面の配置による影響を調べるなどしたが,これらの影響は決定的ではなかった.(3)ゼオライト前駆体は単純に濃度勾配に従ってマクロ細孔に入っているようで,浅い細孔を有するマクロポーラスアルミナの全てのマクロ細孔に前駆体を導入することができた.一方で構造と酸強度の関係に関する高精度な計算を行っており,本年度に全試行が終了した.解析は今後行う.細孔内にゼオライト作り,その機能を測定する計画であるが,細孔内にゼオライトを作る直前の段階までしか到達していない.ただしゼオライト前駆体を導入することに意外な困難があり,それを克服し,かつ制御因子を明らかにしているので,意義深い成果が得られていると考えている.理論計算については計画通り進行している.工業的有用性が高いFAU, BEA, MFI, MOR, MWWゼオライト構造について,異なる結晶学的位置を持つイオン交換サイトと対カチオン等の組成(純SiO2型,アニオン型, H, Na, NH4,C3H9型)の組み合わせ全て708モデルについて,周期境界条件でHCTH関数を用い振動エネルギーを含む全エネルギーと最適化構造を求めた.先行して行った精度の低い計算に続いて,AlO距離が短いほどアンモニア脱離エネルギーが大きい相関が得られ,精度の向上によってより高い相関が得られたことから,SiOHAlユニットを両端から押す力によって酸強度が強められることが明確となった.AlOが短いときにはNH4やC3H9などのカチオンがより安定化されることが理由で,他方,脱プロトンエネルギーはSiOAl角度,すなわちねじれによって制御されていた.このように,酸性OHの化学的特性が単純では無いことをまず明らかにし,続いてカチオンの安定化,プロトンの反応性という2つの異なる特性と構造の相関を明らかにした.他方,マクロ細孔中へのゼオライト微粒子の充填については,研究当初の予想とは異なり,細孔中でゼオライトを合成するためには物質輸送の制御がさらに必要であること,その手前の段階としてゼオライト前駆体微粒子をマクロポーラスアルミナのほぼ全ての細孔内に均一に充填する方法・条件は明らかとなった.円筒状・貫通孔を持つポーラスアルミナの調製は検討するが,研究計画を少し修正し,より重要な,マクロ細孔内でのゼオライト合成に注力し,洗浄方法を検討することなどによって平板状のポーラスアルミナの全面にゼオライトを修飾した試料を得る.これだけでも新規性が高い.つぎには予定にしたがい,ゼオライトを圧縮したときの性質の変化を調べる.方法としては酸性OH基のIR測定と指示薬の変色が第一に有望であるので検討する.マクロ細孔内にゼオライト前駆体が導入されている状態で,ゼオライト原料を追加して導入し,前駆体をゼオライト結晶に転換する方法を見出す.既に,前駆体が導入されている状態で水熱合成を行うと,原料が移動しうる細孔外ではゼオライト結晶が発生すること,その際にアルミナの構造が保たれることを見出しており,つぎには原料を導入することで細孔内でも結晶への転換が促進されると予測している.現在の条件で困難な場合には,細孔外でゼオライトができる条件を参考にして,細孔内の環境を細孔外に近づけるアプローチで結晶化を試みる.量子化学計算では,本研究の初期に発見した,イオン交換サイトを押す力とねじる力の異なる化学的効果を定量的に明らし,発現メカニズムを立証する.
冷水病原因菌の血清型を決定する遺伝子構造の解析と感染疫学マーカーの開発

冷水病の血清型による簡便な疫学マーカーを開発するため,原因菌の血清型の決定に関与するDNA配列点変異や遺伝子構造変異を解析した。複数の変異を確認したが,各血清型に特徴的なものは見られなかった。この結果,血清型別の技術的改良と宿主特異性の確認においては期待された成果を上げることができなかった。冷水病発生河川における疫学調査では,357株の冷水病原因菌株の分離に成功し,これらを既報の遺伝子タイピング法で型別した。その結果,調査河川における冷水病が複数の感染源から構成されていることと出現頻度の高い遺伝子型の存在が判明した。このことにより,疫学調査としては一定の成果を上げることができた。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,冷水病原因菌Flavobacterium psychrophilumのLPSコアの生合成に関わる酵素タンパクであるLpsA,およびLPS糖鎖の生合成に関わると推察される酵素タンパクであるWzxEをコードする遺伝子領域にPCRプライマーを設計し,それらの一部と思われる領域の特異的PCR増幅に成功した。また,血清型が異なる複数の菌株において,LpsAおよびWzxEと思われる遺伝子領域の塩基配列を決定し,菌株間に塩基配列の変異があることを確認した。さらに,この塩基配列の変異と血清型を比較し解析を行ったが,各血清型と相関する特徴的な塩基配列の変異等は見られなかった。小課題「冷水病発生河川における感染環を解明する疫学調査」においては,予定した調査河川である群馬県神流川の各管轄漁協の放流実績と放流後の魚類生息状況や河川環境について,聞き取り調査や現地における河川調査を行った。さらに,同河川において試験採捕した16魚種から冷水病原因菌の分離を試みたところ,合計69株の冷水病原因菌株の分離培養に成功し,これらを-80°Cのグリセロールストックに保存しコレクション化した。また,これらの冷水病原因菌の菌株コレクションを既報のPCR-RFLPによる冷水病原因菌遺伝子型タイピング法で型別したところ,複数の遺伝子型が見出され,同河川における冷水病流行が複数の感染源から構成される可能性が示唆された。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,冷水病原因菌の血清型の決定に関与していると推察される複数のLPS合成関連遺伝子のPCR増幅と塩基配列解析に成功したが,現在のところこれらの塩基配列の変異と血清型との間に有意な関連を見出すには至っていない。小課題「冷水病発生河川における感染環を解明する疫学調査」においては,調査河川である群馬県神流川で冷水病が発生したことから,当初の予想を上回るペースで冷水病原因菌株の収集ができており,また,当該河川管轄漁協からの聞き取り調査も順調に進捗している。これらは小課題担当機関である群馬県水産試験場が長年培ってきた魚病研究および河川調査におけるノウハウが活用された結果であると考える。収集した冷水病原因菌株の由来魚種は多魚種にわたっており,また収集菌株分離時期や分離水域も十分に広いことから,収集菌株のコレクション化が今後の研究の進展に寄与するものと考えられる。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,前年度(平成27年度)に標的領域とし,その一部配列を解析した酵素タンパクであるWzxEをコードする遺伝子領域を全長に渡って再解析した。さらに冷水病原因菌のLPS糖鎖の生合成に関わると推察される膜タンパクであるABCトランスポーターをコードする遺伝子領域に新規のPCRプライマーを設計し,このABCトランスポーター遺伝子の全領域の特異的PCR増幅にも成功した。さらに,血清型が異なる冷水病原因菌30株において,ABCトランスポーターの全遺伝子領域の塩基配列を決定し,各菌株の塩基配列と血清型を比較し解析を行った。しかし,WzxE,ABCトランスポーターの両領域において複数の塩基配列変異が存在することが確認できたものの,各血清型に特徴的なものは見られなかった。小課題「血清型別の技術的改良と宿主特異性の確認」は,この小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」の結果が充分とは言えないことで期待された成果をまだ上げることができていない。小課題「冷水病発生河川における感染環を解明する疫学調査」においては,調査河川である群馬県神流川の各管轄漁協の放流実績と放流後の魚類生息状況や河川環境について聞き取り調査と現地の河川調査を行った。河川で試験採捕した16魚種から冷水病原因菌の分離を試みたところ,173株の冷水病原因菌株の分離培養に成功し,これらをー80°Cのグリセロールストックに保存しコレクション化した。また,これらの冷水病原因菌の菌株コレクションを既報のPCR-RFLPによる冷水病原因菌遺伝子型タイピング法で型別したところ、複数の遺伝子型が検出され、同河川における冷水病の流行が複数の感染源から構成される可能性が前年度に続き示唆された。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,冷水病原因菌の血清型の決定に関与していると推察される複数のLPS合成関連遺伝子の塩基配列解析に成功したが,現在のところこれらの塩基配列の変異と血清型との有意な関連を見出すには至っていないことから,同小課題とこの小課題の成果が影響する小課題「血清型別の技術的改良と宿主特異性の確認」の進捗がやや遅れている。小課題

「冷水病発生河川における感染環を解明する疫学調査」においては,前年度を上回るペースで冷水病原因菌株の収集ができている。また,これらの菌株を用いた既存の遺伝子型タイピングによって,対象河川における冷水病の感染疫学的な知見を得ることができており,順調な進捗となっている。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,血清型の決定に関与している遺伝子領域の候補をFlippase遺伝子とその上流の13遺伝子座とし,全ゲノム配列が既報の冷水病原因菌CSF259-93株の当該領域約14000 bpのデータを基にして20個のプライマーを設計した。これらのプライマーによる網羅的PCRによって候補領域のシンテニー,欠損や挿入等の変異を確認し,必要に応じて変異部位の塩基配列を決定した。その結果,血清型不明のテンチ由来株において,ピロリン酸キナーゼ遺伝子領域を含むPCRで他株より約1200 bp長いPCR産物が確認され,この領域の塩基配列を決定したところ,ピロリン酸キナーゼ遺伝子下流にトランスポザーゼ遺伝子を含む塩基の挿入変異が見られた。しかし,この変異は各血清型に特徴的なものとはいえないことから,小課題「血清型別の技術的改良と宿主特異性の確認」においては目立った進捗を得られなかった。小課題「冷水病発生河川における感染環を解明する疫学調査」においては,調査河川である群馬県神流川の各管轄漁協の放流実績と放流後の魚類生息状況や河川環境について聞き取り調査と現地の河川調査を行った。河川で試験採捕した16魚種から冷水病原因菌の分離を試みたところ,3か年で357株の冷水病原因菌株の分離培養に成功し,これらをー80°Cのグリセロールストックに保存しコレクション化した。また,これらの冷水病原因菌の菌株コレクションを既報のPCR-RFLPによる冷水病原因菌遺伝子型タイピング法で型別したところ,複数の遺伝子型が検出され,同河川における冷水病の流行が複数の感染源から構成される可能性が示唆された。さらに、3か年連続で出現頻度の高い遺伝子型を確認し,神流川における冷水病の流行型が判明した。冷水病の血清型による簡便な疫学マーカーを開発するため,原因菌の血清型の決定に関与するDNA配列点変異や遺伝子構造変異を解析した。複数の変異を確認したが,各血清型に特徴的なものは見られなかった。この結果,血清型別の技術的改良と宿主特異性の確認においては期待された成果を上げることができなかった。冷水病発生河川における疫学調査では,357株の冷水病原因菌株の分離に成功し,これらを既報の遺伝子タイピング法で型別した。その結果,調査河川における冷水病が複数の感染源から構成されていることと出現頻度の高い遺伝子型の存在が判明した。このことにより,疫学調査としては一定の成果を上げることができた。小課題「血清型決定遺伝子群の遺伝子構造解析」においては,LpsAおよびWzxE以外のLPS関連タンパクの遺伝子領域を探索すると同時に,これらのLPS関連遺伝子群を含めた血清型関連遺伝子群の構造解析も実施し,冷水病原因菌の血清型を決定している遺伝子配列や塩基配列の変異等を明らかにしていく。さらに,その結果を受けて,今年度(平成28年度)よりはじまる小課題
シロイヌナズナAtMEKK1情報伝達上流因子の同定

AtMEKK1は病原菌の感染や傷害、低温、乾燥、塩などさまざまな環境ストレスに応答して活性化し、その下流因子をリン酸化により情報伝達すると考えられており、外界環境情報伝達のキーエンザイムである。しかしその情報伝達(特に上流)については不明な点が多い。本研究では本酵素と直接結合するタンパク質を同定し、また各種阻害剤を用いた実験により上流情報伝達経路に関する知見を得た。これらの成果は植物のストレスシグナル伝達の解明につながるものと期待される。本研究のターゲットであるシロイヌナズナのAtMEKK1は病原菌の感染や傷害、低温、乾燥、塩などさまざまな環境ストレスに応答して活性化し、その下流因子をリン酸化により活性化し情報伝達すると考えられており、外界環境情報伝達のキーエンザイムである。しかしながらこれら様々な刺激がどのようにAtMEKK1に伝達されるかについては、これまでのところその受容体や情報伝達因子の同定などの知見は限られており、特に直接の上流因子についてはこれまでのところ全く報告がない。そこでAtMEKK1と直接相互作用するタンパク質を同定することでこれらの情報伝達経路の解明を行うことを目的とした。まず以下に示す方法により相互作用タンパク質の同定を試みた。1.Yeast two-hybrid法を利用したシロイヌナズナcDNAライブラリーからのスクリーニング。2.抗AtMEKK1抗体を用いたシロイヌナズナタンパク抽出液からの共沈実験。上記1,2の実験において現在相互作用の候補タンパク質を得て、現在さらに解析中である。また様々なストレス処理により活性化した内在性のAtMEKK1を免疫沈降により精製し、その活性を測定した結果、低温や塩処理により一過的に活性化することが明らかになった。さらにAtMEKK1の下流MAPKKに対する基質特異性を検証した結果、各種ストレス処理によりその特異性を変化させ、下流MAPKKを選択していることを示唆するデータを得た(論文投稿準備中)。また本研究を遂行するために論文検索により得たシロイヌナズナにおけるMAPKカスケードの役割に関する知見をまとめ、総説として論文発表した。(Matsuoka, et. al.2007.Plant Stress 1(1)113-117)本研究のターゲットであるシロイヌナズナのAtMEKK1は病原菌の感染や傷害、低温、乾燥、塩などさまさまな環境ストレスに応答して活性化し、その下流因子をリン酸化により活性化し情報伝達すると考えられており、外界環境情報伝達のキーエンザイムである。そこでまず様々なストレス処理したシロイヌナズナ芽生えから内在性のAtMEKK1を免疫沈降により精製し、その活性を測定した結果、低温や塩処理により一過的に活性化することが明らかになった。さらにAtMEKK1の下流MABKKに対する基質特異性を検証した結果、各種ストレス処理によりその特異性を変化させ、下流MABKKを選択していることを示唆するデータを得た(学会発表、論文投稿準備中)。AtMEKK1の活性化が観察された低温や塩処理などについてAtMEKK1の活性化を引き起こす上流因子を同定するため、カルシウムイオンの流入を阻害する薬剤やG-タンパク質の阻害剤などの効果を検証した。その結果AtMEKK1の上流にカルシウムイオンに依存した経路が存在することを示唆する結果が得られ、現在詳細に解析中である。これらの結果により本研究の目的であったAtMEKK1情報伝達上流因子の同定につながることが期待される。
白血病における分子標的療法の至適臨床応用と併用による効果増強に関する研究

本研究では、我が国においても臨床応用が開始された以下の分子標的療法薬の至適使用法と臨床効果増強のために、主として化学療法耐性白血病細胞株と臨床検体を用い、耐性白血病に十分な臨床効果をもたらすにはどうすべきかにつき基礎的研究を行った。カリキアマイシン結合ヒト化抗CD33抗体(CMA676)については、CD33陽性急性骨髄性白血病(AML)細胞株およびその臨床検体を用いて有効性を検討した。まず細胞株においてCD33陽性非耐性株では、CMA-676 10100 ng/mlにて殺細胞効果が認められたが、それは細胞増殖能やCD33発現量等により影響された。多剤耐性株ではCMA-676の殺細胞効果は減弱したが、耐性克服剤の併用によりCMA-676の多剤耐性株への有効性がよく回復した。ついで臨床検体でもCD33陽性AMLにおいてCD34発現細胞では非発現細胞より多剤耐性遺伝子産物が高発現しCMA-676効果の減弱を認めたが、CMA-676と耐性克服剤の併用によりCMA-676薬剤効果の部分的回復を認めた。all-trans retinoic acid(ATRA)の新規誘導体であるタミバロテンのATRA耐性急性前骨髄球性白血病(APL)に対する有効性と薬剤血中濃度に関する検討では、24例中58%に完全寛解が得られ、血中濃度は投与量に相関して上昇し、投与終了時でも血中濃度の低下は見られず、ATRAの場合と異りレチノイン酸代謝の亢進による血中濃度の低下は見られなかった。亜砒酸によるATRA耐性APLに対する検討では、12例中75%が完全寛解に到達したが、11例にQTc時間の延長を認め、心室性頻拍など心電図異常の出現により4例で抗不整脈剤の併用を必要とした。以上のように再発・難治性急性骨髄性白血病に対し各種薬剤の有効性が明らかになったが、多剤耐性遺伝子発現、副作用等に対する詳細な検討も必要であることが明らかにされた。
Claudin-4 binderを利用したパイエル板指向性経口ワクチンの開発

粘膜ワクチンは粘膜面、体液性・細胞性免疫誘導活性を有しており長年に渡り理想的な感染予防法であると謳われている.パイエル板を始めとする粘膜組織にはClaudin-4が高発現しており,Claudin-4を利用した粘膜ワクチン開発の可能性が示唆されているものの,claudin-4指向性分子に関する研究は立ち遅れておりclaudin-4を利用した粘膜ワクチン開発は進んでいない.Claudin-4結合分子としてはウエルシュ菌エンテロトキシン断片(C-CPE)が知られている.現在までに申請者は,世界に先駆けてC-CPEを利用した薬物送達研究を推進し,C-CPEを付加することにより蛋白質およびリポソームにclaudin-4指向性を付与できることを見出してきた.当該申請課題は,これら独自のclaudin-4 binderの研究成果を基に,『粘膜ワクチン』の開発を目指すものである.本年度はモデル抗原OVAとC-CPEとの融合蛋白質を作製し,融合蛋白質による免疫賦活化作用を検証した.その結果,週1回,計3回経鼻投与することで,OVA特異的な抗体価の上昇が血清および鼻腔粘膜,膣粘膜,腸管粘膜において観察された.さらに,IgGサブクラスであるIgG1,IgG2a抗体価の上昇,Th1系サイトカインIFN-γ,Th2系サイトカインIL-2の産生が認められた.また,OVA-C-CPEの経口投与による免疫賦活化作用を解析したところ,抗原特異的な免疫賦活化作用は観察されなかった.このことは,腸管粘膜における免疫寛容が原因であると考え,免疫寛容を解除することのできるリポソームを用いた解析を進めているところである.以上の知見は,claudin-4を標的としたワクチン開発が可能であることを示唆するものであり,粘膜ワクチン開発においてこれまで問題となっていた,粘膜免疫組織への抗原送達に対する解決の糸口を示すものである.粘膜ワクチンは粘膜面、体液性・細胞性免疫誘導活性を有しており長年に渡り理想的な感染予防法であると謳われている.パイエル板を始めとする粘膜組織にはClaudin-4が高発現しており,Claudin-4を利用した粘膜ワクチン開発の可能性が示唆されているものの,claudin-4指向性分子に関する研究は立ち遅れておりclaudin-4を利用した粘膜ワクチン開発は進んでいない.Claudin-4結合分子としてはウエルシュ菌エンテロトキシン断片(C-CPE)が知られている.現在までに申請者は,世界に先駆けてC-CPEを利用した薬物送達研究を推進し,C-CPEを付加することにより蛋白質およびリポソームにclaudin-4指向性を付与できることを見出してきた.当該申請課題は,これら独自のclaudin-4 binderの研究成果を基に,『粘膜ワクチン』の開発を目指すものである.本年度はモデル抗原OVAとC-CPEとの融合蛋白質を作製し,融合蛋白質による免疫賦活化作用を検証した.その結果,週1回,計3回経鼻投与することで,OVA特異的な抗体価の上昇が血清および鼻腔粘膜,膣粘膜,腸管粘膜において観察された.さらに,IgGサブクラスであるIgG1,IgG2a抗体価の上昇,Th1系サイトカインIFN-γ,Th2系サイトカインIL-2の産生が認められた.また,OVA-C-CPEの経口投与による免疫賦活化作用を解析したところ,抗原特異的な免疫賦活化作用は観察されなかった.このことは,腸管粘膜における免疫寛容が原因であると考え,免疫寛容を解除することのできるリポソームを用いた解析を進めているところである.以上の知見は,claudin-4を標的としたワクチン開発が可能であることを示唆するものであり,粘膜ワクチン開発においてこれまで問題となっていた,粘膜免疫組織への抗原送達に対する解決の糸口を示すものである.
集団同期現象を用いた周波数シンセサイザシステムに関する研究

本研究テーマを通して、端末単体の性能を向上させることでシステム全体の性能向上を実現するという従来の工学思想を、複数端末の群としての挙動を制御することでシステムの性能を向上させること意味する「量が質を生む」新たな工学領域への拡張を目指す.具体的には,現在のワイヤレスセンサネットワーク(WSN)の無線端末開発が抱えている,「消費電力を削減するために周波数チャンネルの管理を手放す→端末が多数あるため容易に混信を起こし,端末の数という優位性が生かせない」という矛盾を解決し,WSNが持つ「多数の端末で構成される」という強みをより発揮させることを目指している.本年度は,回路的アプローチから提案システムの表現式を導出し,その定量的関係を明らかにした.はじめに,[1]で報告されている電流ドメインの注入同期モデルを提案システムにおける多数結合のモデルへと拡張した.結果,前年度のモデルにおいて結合係数をロックレンジで置き換えた式を導出した.続いて,導出した式と発振器のパラメータとの対応を示した.結果,提案システムの挙動は発振器のQ値と発振器間の距離にのみ依存し,発振器の電流や発振電力には依存しないことを示した.提案システムの性質として以下のものを導出した.まず,ロック後の周波数は,システム内に存在する発振器の自走発振周波数の平均値であらわされる.続いて,N個の発振器間のロックレンジをωLで同一と仮定すると(1)オフセット周波数ωL以下では,位相雑音は1/N.(2)そこから位相雑音のカーブの減衰は緩やかになり,オフセット周波数NωL付近ではほぼフラットになる.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究テーマを通して、端末単体の性能を向上させることでシステム全体の性能向上を実現するという従来の工学思想を、複数端末の群としての挙動を制御することでシステムの性能を向上させること意味する「量が質を生む」という新たな工学領域へと拡張することを目指している.より具体的には,現在のワイヤレスセンサネットワークの無線端末開発が抱えている,「消費電力を削減するために周波数チャンネルの管理を手放す→端末が多数あるため容易に混信を起こし,端末の数という優位性が生かせない」という矛盾を解決し,ワイヤレスセンサネットワークが持つ「多数の端末で構成される」という強みをより発揮させることを目指している.最初に,相互に結合した周期性を持つ群の挙動を,数値計算により示した.最初は抽象度の高い状態で検討するため,動作モデルとして蔵元モデルを採用した.これを用いてmatlab上で数値解析を行い,端末個数が増加するほど結合強度が強まること,初期周波数にばらつきがある場合は固定位相差を保ちつつ同期すること,ジッタを含む場合は位相差がランダムに変わりつつも一定範囲内に収まって同期することなどを示した.次に,伝達関数による解析を行った.簡略化のため端末数は二つとし,結合は相互ではなく片方からもう片方への一方通行のみとした.このときのダウンコンバート後の位相雑音は,帯域内ではフラット,帯域外は+3dBされることを示した.最後に,以上の効果を実機で確認するための前段階として,ディスクリートトランジスタを用いて作成した発振回路やミキサを用いて,ランダムデータの貫通実験を行った.その結果,BPSK変調されたPRBSデータの復調を,PLL制御されていないフリーラン状態の結合発振回路で行えることを示した.これらの成果は,国内の研究会で計3回発表した.また,国際会議にも1件採択され,2016年6月に発表予定である.交付申請書に記載の研究計画での達成予定項目は,(i)同周波数同期による発振器モデルを用いて,数値演算上でシステムモデルを構築する.(ii)ディスクリート部品で構成したハードウェアモックアップによる,動作・通信実験.(iii)180nm CMOSプロセスを用いて,消費電力100uWの発振回路を実現する.の3つである.研究実績の概要でも述べたとおり,これら3項目のうち(i)と(ii)についてはおおむね順調に進展していると言える.しかし,(iii)の発振回路の低消費電力化については検討は進んでいない.本検討項目はその他のシステム的な検討項目とは独立に存在しているため,平成27年度の検討項目には直接影響は与えない.よって,研究全体の進捗として,「やや遅れている」とした.本研究テーマを通して、端末単体の性能を向上させることでシステム全体の性能向上を実現するという従来の工学思想を、複数端末の群としての挙動を制御することでシステムの性能を向上させること意味する「量が質を生む」新たな工学領域への拡張を目指す.具体的には,現在のワイヤレスセンサネットワーク(WSN)の無線端末開発が抱えている,「消費電力を削減するために周波数チャンネルの管理を手放す→端末が多数あるため容易に混信を起こし,端末の数という優位性が生かせない」という矛盾を解決し,WSNが持つ「多数の端末で構成される」という強みをより発揮させることを目指している.本年度は,回路的アプローチから提案システムの表現式を導出し,その定量的関係を明らかにした.はじめに,[1]で報告されている電流ドメインの注入同期モデルを提案システムにおける多数結合のモデルへと拡張した.結果,前年度のモデルにおいて結合係数をロックレンジで置き換えた式を導出した.続いて,導出した式と発振器のパラメータとの対応を示した.結果,提案システムの挙動は発振器のQ値と発振器間の距離にのみ依存し,発振器の電流や発振電力には依存しないことを示した.提案システムの性質として以下のものを導出した.

まず,ロック後の周波数は,システム内に存在する発振器の自走発振周波数の平均値であらわされる.続いて,N個の発振器間のロックレンジをωLで同一と仮定すると(1)オフセット周波数ωL以下では,位相雑音は1/N.(2)そこから位相雑音のカーブの減衰は緩やかになり,オフセット周波数NωL付近ではほぼフラットになる.今後の推進方策は大きく分けて三つあり,以下に示す.(i)異周波数同期による発振器モデルを構築し,数値演算上でシステムモデルを構築する.(ii)提案するシステムにおいて,実際に無線通信の貫通実験を実機で行う.(iii)発振回路の消費電力目標として,10uW以下を達成する.(i)に関しては平成26年度に達成した,同周波数同期におけるモデル構築の知見をもとに,それを発展させる.(ii)は本研究の最終目標とも言える部分である.実機で実際に無線通信を実現することで,提案システムのメリット・デメリットを明確化する.(iii)は上記二つとは独立に存在する項目なため,平行して進める.平成26年度では本項目はその他の項目に比べて進捗が思わしくなかったため,少し大目に時間を割くこととする.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
シクロペンタジエニル配位子の修飾による錯体触媒反応の制御

本研究はシクロペンタジエニル金属錯体のシクロペンタジエニル(Cpと略す)基を修飾し、そこに生じる錯体反応場の電子的、立体的環境の変化と錯体の示す触媒活性の相関を明らかにし、より優れた触媒の設計を行うことを目的としている。(1)既にアルキル置換Cp環をシリレン架橋した配位子よりなるジルコノセンあるいはハフノセンジクロリドのうちC_2対称のものはプロピレンのアイソタクチック重合の優れた触媒となることを明らかにした。これらのメタロセンの合成において副生するアイソ重合不活性なメソ体の生成を抑制する方法を見い出すための実験を行った。架橋部分の構造やCp環上の置換基の種類、位置、数を変化させて錯体を合成し、ラセミ体とメソ体の生成比をNMR法により調べた。架橋基がMe_2Si,Et_2Si,n-Pr_2Siのいずれも生成比に変化を与えなかった。また、Cp環上の3位に嵩高い置換基を導入しても変化は少ないが、2,5-位への導入はラセミ体の増加に効果があることがわかった。(2)Cs対称の架橋メタロセン錯体はプロピレンのシンジオタクチック重合触媒になることが明らかにされている。本研究ではMe_2SiおよびMe_2Cを架橋基とし、Cp環をメチル基で修飾したCs対称メタロセンジクロリドを合成し、そのシンジオ重合活性を調べた。メチル基を導入したCp基を用いた錯体はフルオレニル基のものに比べて極めてシンジオ特異性の発現が困難であることがわかり、活性中心へのプロピレンの配位段階で置換基のわずかな嵩高さがエナンチオ面選択に致命的な影響を与えることを推論した。(3)種々の電子吸引性基で修飾したCp金属錯体を合成した。今後、これらの触媒活性を調べる本研究はシクロペンタジエニル金属錯体のシクロペンタジエニル(Cpと略す)基を修飾し、そこに生じる錯体反応場の電子的、立体的環境の変化と錯体の示す触媒活性の相関を明らかにし、より優れた触媒の設計を行うことを目的としている。今後、これらの触媒活性を調べる
糖尿病網膜症の神経病変における小胞体ストレスの役割の解析

糖尿病網膜症における神経細胞死にはミトコンドリア・カスペース依存性経路が関与することを網膜器官培養を用いて解析した。また、同時に小胞体ストレス関連細胞死経路も糖尿病誘導神経細胞死に関与していることを網膜培養及び人糖尿病網膜組織切片を用いて解析した。このことからミトコンドリア・カスペース依存性経路と小胞体ストレスの間には分子レベルでのクロストークがあることが示唆された。さらにBDNF,NT-4,citicolineは糖尿病誘導神経細胞死を救済し再生を促進することを確認した。特にNT-4は糖尿病環境における神経保護・再生に最も適した神経栄養因子であることが示唆された。高濃度グルコースが網膜神経病変に与える影響を解析するためラットを3次元培養し、GCLにおけるTUNEL陽性率、再生突起数を比較検討した。また、種々の栄養因子を付加し、細胞救済効果・再生促進作用を検討した。さらに細胞死メカニズム解明のためcaspase-9,-3の免疫染色を施行し比較検討した。結果高濃度グルコースはGCLにおけるTUNEL陽性率を増加させ再生突起数を減少させた。また、高濃度グルコースでは正常グルコースに比べcaspase-9,-3の免疫活性が有意に増加した。Caspase-9は培養中細胞質から核に移行していた。BDNF,NT-4,citicoline,VEGF120,VEGF164は高濃度グルコース誘導神経細胞死を有意に救済した。また、BDNF,NT-4,citicolineは再生突起数も有意に増加させcaspase-9.-3の免疫活性も有意に減少させた。NT-4が最も救済効果、再生促進作用が強かった。次に糖尿病環境誘導神経細胞死にER stressが関与するかをPERK,CHOPの免疫染色を施行し比較検討した。次いでNT-4付加がER stress関連因子の発現に影響を与えるかも検討した。高濃度グルコース、糖尿病ラット網膜ではGCLのTUNEL陽性率は有意に増加しPERK,CHOP免疫活性も有意に増加した。NT-4付加でTUNEL陽性率は有意に減少し、PERK,CHOP免疫活性も有意に減少した。以上より糖尿病環境誘導神経細胞死にER stressが関与することが示唆され、NT-4はER stress関連細胞死経路を阻害することで細胞死を救済することが示唆された。前述の結果とふまえて糖尿病環境ではER stressとミトコンドリア依存性経路にはクロストークがあることが示唆された。前年度、糖尿病誘導神経細胞死にミトコンドリア依存性経路と小胞体ストレスER stress依存性経路両方が関与することを網膜3次元培養を用いて解析した。すなわち、ミトコンドリアとERの間には分子レベルのcrosstalkがあることが示唆された。そこで今年度、両者の分子レベルcrosstalkと候補の1つとしてc-Jun/JNK経路に注目した。JNKはER stressで活性化されることが知られており、その標的のc-JunはAP-1を形成し、細胞死のシグナルをミトコンドリアに伝えている。そこでまず、同じ網膜3次元培養で糖尿病ストレスを与え、誘導される神経細胞死にp-c-Jun, p-JNKが関与するかを免疫染色で確認した。糖尿病網膜および高濃度グルコース培養群ではTUNEL陽性率とともにp-c-Jun/p-JNK免疫陽性率が上昇していることが確認された。さらに糖尿病ラット網膜ではp-c-Jun/p-JNKのタンパク量が増加していることがWestern blotで確認された。次に年齢をマッチさせた正常者5眼、糖尿病患者5眼の網膜を単離・固定し、凍結切片を作成、p-c-Jun/p-JNKの免疫染色と変性ニューロンのマーカーであるFluoro-Jade B染色を同時に施行し、FJB陽性+p-c-Jun陽性、FJB+p-JNK陽性細胞数を両者で比較した。人糖尿病網膜の変性ニューロンではp-c-Jun/p-JNK陽性細胞数が正常網膜に比べて有意に増加していることが確認された。このとから、人およびラット糖尿病網膜神経細胞死にc-Jun/JNK経路が関与していることが示唆された。また、前述のした通り、c-Jun/JNK経路はミトコンドリア・ER stress細胞死経路のcrosstalkの候補の1つであり、神経保護的治療戦略における標的部位の1つになりうることが推察された。低濃度(10 ug/ml)AGEが網膜神経病変に与える影響を解析するためラット網膜を3次元培養し、GCLにおけるTUNEL陽性率、再生突起数を比較検討した。使用したAGEはglucose-AGE-BSA、glycolaldehyde-AGE-BSA、glyceraldehyde-AGE-BSAの3種類である。また、細胞死メカニズムの解明のためapoptosis inducing factor (AIF)及び活性型caspase-9の免疫染色も追加検討した。培養7日において低濃度AGEは3種類ともGCLにおけるTUNEL陽性率を有意に増加させ、再生突起数を有意に減少させた。

また、NT-4を付加するとTUNEL陽性率は有意に減少し、再生突起数は有意に増加した。ついでAIFの免疫活性はAGE負荷群で有意に増加し、免疫活性は主に核に観察された。AIFはミトコンドリアから放出された後、核に移行しcaspase非依存性にアポトーシスを誘導することからAIFはAGE誘導神経細胞死に関与していることが示唆された。同様に活性型caspase-9の免疫活性もAGE投与群で増加した。すなわちcaspase依存性経路も同時に活性化していることが示唆された。NT-4付加するとAIF、及びcaspase-9の免疫陽性率は有意に減少することから、NT-4はAIF、caspase-9の免疫活性を抑制することで神経保護、再生促進作用を発揮していることが示唆された。なお、3種類のAGE-BSAの間には特に有意差が見られず、従来から報告されているglyceraldehydeの毒性が他の2種類より強いという結果にはならなかった。AGEはRAGE依存性に神経毒性を発揮することが知られているが、今回の結果からむしろRAGE非依存性経路による細胞死誘導が主な網膜神経毒性メカニズムとして考えられた。糖尿病網膜の神経病変、特に網膜神経節細胞RGCの変化は血管病変に先行して起きることが知られている。我々は特に糖尿病網膜における初期RGCの変化を細胞死・軸索変性も含めてRGC neuropathyと称している。我々の最終目標は糖尿病網膜におけるRGC neuropathyがどうして起きるかということと、それをどうやって救済するかという2点である。今年度の研究では特にRGC neuropathy発症のメカニズムに焦点を当てているが、ラットのみならず、人糖尿病網膜においても共通の細胞死メカニズムが同定できていることから、動物実験の結果と臨床でみられる神経病変との間に分子レベルでの共通点を見いだせている。細胞死のメカニズムが共通していることから網膜3次元培養で有効な神経保護・再生促進因子は人糖尿病網膜においても有効に作用しうることが期待できる。今後はどのような神経栄養因子が網膜3次元培養において有効に作用するかという点に焦点を当てて研究を進めていけばよい。その中で特に有用と思われる因子・あるいは戦略をin vivoのモデル動物へ応用していけば時間や労力・費用(使用動物数)などを節約しながら効率よく糖尿病誘導神経細胞死に対する神経保護・再生治療戦略を確立してくことができると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。網膜3次元培養で糖尿病ストレスを負荷するやり方は大きく分けると3種類ある。1つは糖尿病モデル動物を作成し、その網膜を直接培養、正常網膜培養と比較するやり方である。もう1つは正常動物の網膜を培養し、高濃度グルコースと正常濃度グルコースで培養・比較するやり方である。これらの方法で我々はすでにある程度の結果を出している。それ以外に重要な方法としてAGEを培養液に負荷する方法がある。
電子辞書に依存する英語学習者のネガティブワードアタックとその矯正プログラムの開発

本研究では、電子辞書に依存する英語学習者の読解ストラテジーに焦点を当て、未知語推測における手掛かり処理(ワードアタック)が旧来の印刷体辞書利用時における辞書引きプロセスに比すと、著しく短絡的方途によるものであろうことを仮説設定し、その証明を行うとともに、電子辞書に付随する種々の問題点の所在をあらためて明確にし、その結果に基づいての辞書引き矯正のためのプログラム開発を行った。電子辞書がマルチツール化し始めたことにより、操作昨日の面において電子辞書出現当初よりも複雑化の様相を呈している。学習者にとっての使いやすさ、すなわちユーザビリディとしての観点から、人気モデル機種、最新モデル機種などの売れ筋機種に対して、そのディスプレイサイズに始まり、キー配列、表示設計、コンテンツのプライオリティを調査した。また、電子辞書を用いる学習者の利活用の態様および意識傾向をも抽出するために同時に「電子辞書の利活用に関する実態調査」を全国規模でアンケート実施した。なお、本年度の研究においてとりわけ注目した要素として、未知語検索時に電子辞書ユーザが陥る「ネガティブワードアタック」現象の解明が挙げられる。繰り返し行った印刷体辞書と電子辞書を個別に使用させた比較実験結果らは、特に多義語処理において電子辞書ユーザが安直な辞書引きプロセスを採用する傾向があることが顕在的に窺えた。この傾向は、「読み」の停滞に繋がるものであるとの危惧から、研究代表者・分担者間で一層の議論を深め、最終的に「ネガティブワードアタック矯正プログラム」の在り方を検討することとした。具体的には、コンテクストを絶えず視野に入れた帰納的未知語検索プロセスの在り方の検討となる。これに関しては2009年度研究の中核に据えていく考えである。さらに、本年度の研究計画の一環として、2008年9月、研究代表者はフィンランドのアムリ総合学校およびアイスランドのブレクスコリ総合学校の初等部における英語授業を視察した。いずれも英語教育に定評のある小学校であり、英語読解リテラシー育成への大いなる示唆を得ることとなった。本年度前半は、各メーカーから市販されている電子辞書の現物およびカタロクをとりそろえ、その実際を解明する調査を広域的に実施した。その結果、従来より電子辞書と呼ばれているものが、昨今著しく多機能化し始め、コンテンツの多彩さ・豊富さからマルチツール化し始めている特徴が浮き彫りとなった。そこで次に、英語学習機能において調査してみると、受験モデル、語学学習モデル、趣味モデル、一般モデルなどと謳ってリスニング機能を増強したり、ビジュアルインプットの側面を強調したり、さらにまた英語模擬テスト搭載の実践力アップを念頭においたりと、各種電子辞書メーカーによる他社との差異性を意識したアピール度が散りばめられていることが明らかとなった。しかし、前述したマルチツール化、すなわちワンセグ機能、ゲーム機能、通信機能などとの関連コンテンツの配列から、電子辞書本来のユーザビリティに複雑性が加味されたものも少なくないことが判明し、あらためて未知語入力→検索→英文用例一覧→選択→語義提示→確認の流れのもとに未知語検索が行われるべき配列を検討することとした。そして、年度後半は、英語学習者の未知語処理に対するワードアタックが電子辞書を活用した場合にはネガティブに作用している現実をより確固たる事実として突き止めるために、全国の知人の英語関係者に依頼し、高校および大学において広く実験を執り行った。その結果、印刷体辞書を用いた場合の未知語処理よりも、電子辞書を用いた未知語処理の方が、用例参照度が極めて低いことが判明し、と同時に多義語表出時のワードアタックに困難を抱える学生が多いことを突き止めた。いわゆる、文脈逸脱の現象が電子辞書ユーザに多いことが明らかとなり、本研究の最終年度となる22年度においては、具体的にそれらの問題を解決するための自律矯正プログラムづくりが研究の集大成として必要となることを確認した。最終年度となる本年度は、辞書引き(電子辞書)におけるネガティブワードアタックの主要因が、電子辞書ユーザの初出画面の初出語義依存に起因する点を複数回の実験を通じてあらためて再検証した。その結果、電子辞書ユーザにとっては、電子辞書活用の簡便性が手伝って、学習習熟度の中位層以下の学習者にあっては、明らかな文脈無視傾向が習性として身についてしまっていることを浮き彫りにするに至った。そこで、その矯正のためのプログラムのファーストステップとして、長文に位置づけられた未知語を、比較的平易な英語によってパラフレーズ定義し、その練習が行える素材をweb上に用意して実験を試みた。次にセカンドステップとして、解の誤り選択をした場合には、そのつど解へ至るプロセスをcue方式で提示できる練習問題をCGI媒体により作成し、点的思考から脱却した線的思考の訓練が行える学習の場を用意した。具体的には、結果に至るプロセスの発見を旨としたonline学習と実地調査との併用による学習教材の提示である。この教材づくりの背景には、フィンランドの、あらゆる教科教育において重用されている連続的思考を培う「MIKSI」の思想を大いに拠り所とした。そして、最終ステップとしては具体的に教材の編集作成を行った。これに関しては、読解問題が豊富に散りばめられているTOEICを意識し、本研究において得た知見を網羅した要素を多々散りばめることに腐心した。