hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高性能不斉補助剤の開発と応用

1.ビシクロ環系2-オキサゾリジノン体の効率合成と利用2-オキサゾロンとアントラセン類、シクロペンタジエン類との[4+2]環化付加体を(1S,2R)-2-methoxy-1-apocamphancarboxylic acid(MAC acid)を用いて光学分割することにより、両対掌体を大量合成することに成功し、不斉補助剤としての有用性を検討した。既に実証済みであるアルキル化やDiels-Alder反応における有効性と同様に、ジアステレオ選択的アルドール反応やマイケル反応においてもほぼ完璧な立体制御が可能であることが明らかとなり、特に4,5-(9,10-dihydro-9,10-dimethylanthraceno)oxazolidin-2-one(DMAOx),4,5-[1,4-(1,2,3,4,5,5-hexamethyl)-cyclopenteno]oxazolidin-2-one(HMCOx)においては、従来のエバンス型不斉補助剤をはるかに凌駕する性能を持つことを示すことができた。2.ビシクロ環系2-アミノアルコール類の利用(a)不斉配位子として:上記2-オキサゾリジノン類の開環体である2-アミノアルコール類を配位子とする有機金属反応剤の反応を検討したところ、ジエチル亜鉛によるアルデヒドのエチル化反応の触媒として有効であることが明らかとなった。さらに、窒素原子上の置換基の種類を変えることによりエナンチオ選択性を完全に逆転するという興味深い現象も見いだすことができた。(b)不斉反応剤として:ビシクロ環系2-アミノアルコールとn-BuLiとの混合物は、キラルアルコキシドとしてmeso-酸無水物と反応し、ハーフエステル体を高いエナンチオ選択性で与えることを明らかにした。
サブセット制御による組織修復型マクロファージの大量増幅と組織再生療法への応用

本研究ではマクロファージと呼ばれる細胞を用いた創傷治療法の原理を確立することを目的に検討を行った。マクロファージの状態を蛍光で検出できるマウスを作製し、背部の皮膚を一部欠損させて、創傷が治癒する過程を顕微鏡を用いて観察した。また、マウスの血液から創傷治癒を促進する働きを持つマクロファージを増殖させる方法や、その効果について検討した。さらに、マウス体内で軟骨が再生する過程におけるマクロファージの働きについても、非常に小さな構造が観察可能な電子顕微鏡などを用いて検討した結果、軟骨再生の早期においてマクロファージが軟骨細胞に直接作用していることが強く示唆された。マクロファージおよびM1/M2サブセットを特異的に標識する遺伝子改変マウスを作製した。当初は、マクロファージを特異的に検出し、かつ過去にM1サブセットに分化したことを刻印するため、LysMプロモーターの下流に、2つのLoxP配列に挟まれた緑色蛍光タンパク質GFPとpolyA配列(ストップ配列)、さらに下流に青色蛍光タンパク質CFPを持つDNAコンストラクト(1)、M1サブセットを検出するため、iNOSプロモーターの下流にCFPを持つコンストラクト(2)、M2サブセットを検出するため、Arginase Iプロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質tdTomatoを持つコンストラクト(3)、M1サブセット特異的にCreリコンビナーゼを発現させるためにiNOSプロモーターの下流にCreを有するコンストラクト(4)を作製する予定であったが、掛け合わせの困難さ等を考慮し、再度設計を行った。結果として(1)と(3)を併せてcfmsプロモーターの下流に2つのLoxP配列に挟まれたストップ配列、さらに下流にGFP、アルギナーゼプロモーター、tdTomatoの配列を持ったコンストラクト(pcfms-lp-STOP-lp-EGFP-pArg-Tmt)および(4)を作製し、それぞれを導入した遺伝子改変マウスを計2系統作製した。また、創傷治癒部の2光子観察の有用性を確認するために、組織修復後の皮膚切片を作製し、正立型2光子励起顕微鏡による観察を行った。コラーゲンの存在を示す第2次高調波発生シグナル強度は、創傷部の成熟度によって異なることが確認できた。さらに、2光子励起顕微鏡によるマウス組織修復観察系の確立のため、C57BL6マウスの背部を剃毛し、ペントバルビタールナトリウム麻酔下に生検用パンチを用いて直径5 mmの皮膚欠損を作製した。また皮膚欠損の長期観察を可能とするために背側皮膚チャンバーを導入した。本研究において最も重要な実験材料である、マクロファージおよびM1/M2サブセットを特異的に標識する遺伝子改変マウスを作製する事が出来た。当初は、4系統を作出し、うち3系統を掛け合わせることでM1/M2サブセットを検出可能なマウスを作成する予定であったが、掛け合わせの困難さを解消し、目的の遺伝子を持ったマウスを得られる可能性を高めるため、当初別々のマウスに導入予定のコンストラクトを単一のベクターに挿入することで、最終的には2系統のマウスの掛け合わせで目的のマウスを得ることが可能となった。これにより、今後の解析の効率が非常に改善することが見込まれる。本研究では創傷治癒に重要な役割を果たすマクロファージに着眼し、マクロファージのサブセット、特に形成期のサブセット動態を標識する遺伝子改変マウスを作成し、in vivoイメージングを用いた長期的な定点観察、および創傷治癒の各過程における遺伝子プロファイルの作成により、創傷治癒の末期に出現する組織形成性マクロファージのサブセットを同定する。さらに、末梢血を由来とする組織形成性サブセットの増幅法を開発し、このサブセットとの共培養による上皮系・間葉系細胞の増殖・分化促進、皮膚欠損モデル動物における組織形成性サブセット投与による治癒促進を明らかにする。これらの治験を基に、大量増幅した組織形成性サブセットを創傷部に投与することにより、一般の採血のみで実現する新規な組織修復・再生医療法を原理的に確立する。平成28年度は、これまでに得られた知見を基に、マウス末梢血から得られた単球分画に由来する組織形成性サブセットの増幅法の確立を行った。C57BL6/Jの下大静脈から採血を行い、Ficoll-Paqueを用いて単核球を分離した後、培養皿に播種し、M-CSFやインスリンを添加した培地で培養したのち、高濃度ヒアルロン酸存在下で培養することで、組織形成性サブセットマクロファージの大量増幅を試みた。フローサイトメトリーで計測したところ、dectin-1 (-)/VEGF(+)を示す細胞の割合が増加していた。これは創傷治癒性M2マクロファージの中でも、M2dとされる組織形成性サブセットの特徴と合致した。また、マクロファージと脂肪組織由来間葉系幹細胞との共培養を行い、炎症性サイトカインTNF-αの減少と抗炎症性サイトカインIL-10の増加を観察した。本研究の鍵となる、組織形成性サブセットの増幅法が確立でき、翌年度の動物実験へとつなげることができたため。本研究では創傷治癒に重要な役割を果たすマクロファージに着眼し、マクロファージのサブセット動態を標識する遺伝子改変マウスを作成し、in vivoイメージングなどを用いて組織形成性マクロファージのサブセットを同定、組織形成性サブセットの大量増幅法を開発し、皮膚欠損モデル動物における治癒促進を明らかにすることにより、新規組織修復・再生医療法を原理的に確立することを目指す。

平成29年度は、マウス皮膚欠損モデルを用いた皮膚創傷治癒の検討を、創傷部の収縮を防止するための工夫を加えつつ行った。これまでの脾細胞を用いた検討では、ヒアルロン酸存在下の培養により組織修復性M2dマクロファージと考えられる細胞の割合が増加することで、ヒアルロン酸のみマクロファージ投与に比べ、創傷面積の減少が速い傾向にあり、また組織学的にも皮膚再生が良好な印象であったが、一方で血液中の単球より誘導できるM2dマクロファージの割合は脾細胞に比べ少なく、有効な創傷治癒のためにはさらなるプロトコールの改良が必要と考えられた。この皮膚創傷治癒の検討に加え、軟骨再生に対しての組織修復性マクロファージの応用についても検討するため、まず軟骨細胞移植時のホスト側マクロファージの動態について併せて検討した。マクロファージはカバースリップに播種した軟骨細胞を移植後早期に増加し、また電子顕微鏡を用いた検討では、軟骨細胞との細胞間接着と考えられる像が見られた。これらの所見からは、移植早期においてマクロファージが軟骨細胞に直接作用し、軟骨組織再生においても何らかの形で関与していることが強く示唆された。本研究ではマクロファージと呼ばれる細胞を用いた創傷治療法の原理を確立することを目的に検討を行った。マクロファージの状態を蛍光で検出できるマウスを作製し、背部の皮膚を一部欠損させて、創傷が治癒する過程を顕微鏡を用いて観察した。また、マウスの血液から創傷治癒を促進する働きを持つマクロファージを増殖させる方法や、その効果について検討した。さらに、マウス体内で軟骨が再生する過程におけるマクロファージの働きについても、非常に小さな構造が観察可能な電子顕微鏡などを用いて検討した結果、軟骨再生の早期においてマクロファージが軟骨細胞に直接作用していることが強く示唆された。2光子顕微鏡を用いたマウス組織修復のin vivoイメージングおよび各時点において採取したマクロファージの遺伝子プロファイル解析により得られた知見を基に、マウス末梢血から得られた単球分画に由来する組織形成性サブセットの大量増幅法について検討する。マウス血液中の単核球を分離した後、培養皿に播種し、M-CSFやIL-4ならびに組織形成性サブセットにおいて高発現している増殖因子を添加した培地で10日間程度培養し、組織形成性サブセットの大量増幅を試みる。得られた細胞は遺伝子プロファイルを解析し、また、F4/80、CD68といったマクロファージマーカーあるいはiNOS、Arginase IなどといったM1/M2マーカーを用いてフローサイトメトリーで計測し、組織形成性サブセットの純度や均一性を評価する。また、組織形成性サブセットマクロファージと、マウスより単離した皮膚角質細胞、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞や間葉系幹細胞のトランスウェル上での共培養による上皮系・間葉系細胞の増殖・分化促進について検討する。1、2、5、7日で各細胞を回収して、細胞数を計測し増殖促進能を評価するとともに、各細胞の分化マーカーを解析し分化促進能を検討する。マウス皮膚欠損モデルにおける組織形成性サブセット投与による治癒促進の検討マウス末梢血から大量増幅された組織形成性サブセットを、マウス配布皮膚欠損モデルに投与し、組織修復効果を評価する。
β構造を有するポリペプチド-ポルフィリン複合体の自己組織化と光・触媒機能

ポルフィリンの集合構造は生体中で優れた機能を示す。これの構造と機能の相関を求め、人工的に利用することは意味深い。本研究ではポリペプチドのβシ-ト構造を利用し、ポルフィリンを含む両親媒性集合構造の構築を試みた。ポリペプチドAcCysLysValLysValNH_2、AcCysLysValSerValLysValNH_2を固相合成した。これにp-、o-ブロモアセトアミドフェニルトリトリルポルフィリンを反応させ、βシートペプチドを結合させたポルフィリンを得た。pH9緩衝液20%TFE中、両親媒性ポリペプチドはランダム構造をとっていたが、ペプチドを結合させたポルフィリンのペプチドはβ構造であり、これらの化合物が溶液中で集合していることが示された。これらの化合物のUV吸収は複数あり、溶液中で徐々に集合していくと考えられる。CDスペクトルでも大きな複数のCotton効果が現れ、二つ以上のポルフィリンが励起子相互作用をしている。ポリペプチドがβシート構造を形成した場合、多数のペプチド鎖が配列すると解釈される。分子モデルによると、ペンタペプチドを結合したポルフィリンでは隣り合ったポルフィリン同士が最も近接する。これに対しヘプタペプチドを結合した場合、一つのペプチド鎖を挟んだポルフィリン同士が近接する。D_2O-CD_3OD(7:3)中ペプチドを結合したポルフィリンのポルフィリン部分の1H NMRシグナルはまったく観測されない。D_2O含量を下げるとシグナルは観測されるが、広幅化しており強度も小さい。検討の結果、ポルフィリンの水素の広幅化、強度低下(消失)は分子集合にともない、水素の緩和時間(T2)が短くなっており、このことが異常なNMR挙動の原因であると判明した。ポルフィリンとポリペプチドを複合した分子は、水系溶媒中ではポルフィリン同士の相互作用、ペプチド同士の相互作用それぞれが独立に観測される可能性があり興味深く、また天然のクロロフィル集合体と関連性も高い。今回は、両親媒性β構造を形成しうる7ペプチドAc-Cys-Lys-Val-Ser-Val-Lys-Val-NH_2のCys側鎖に(4-ブロモアセトアミドフェニル)トリトリルポルフィリンを結合させたp7PPについて、溶液中での集合様式を検討した。pH9緩衝液-20%TFE中、p7PPは216nmにCotton効果を示し、ペプチド部分はβ-シート構造をとり集合していることが示された。ポルフィリンをつけていない7ペプチドはp7PPとは異なり、201、222nmにCotton効果を示した。7ペプチドはβ構造をとっておらず、ポルフィリンが結合したp7PPがβ構造であることと対照的である。p7PPはポルフィリンの吸収領域に分裂型CDを示す。UVスペクトルにおいても、p7PPはTFE100%中で413nmに吸収を示すが、pH9緩衝液-20%TFE中ではこの413nmの吸収が減少し、405、422nmに吸収が現れた。これらのことから、水系溶媒中p7PPのポルフィリン部分は集合していると考えられる。p7PPがアンチパラレルβ-シート集合体構造をとっていると、集合したペプチド鎖の1本目と3本目に結合したポルフィリンが最も近接する。天然型βシートでは主鎖間のねじれを反映して、側鎖ポルフィリン同士の配向は右ねじれとなり、本系でのp7PPのCotton効果の符合(+-)と合致する。疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸の交互配列からなる両親媒性ポリペプチドを合成し、これにポルフィリンを結合させた。ペプチド鎖とポルフィリンが1:1、2:1、1:2となる3種類のポリペプチド-ポルフィリン複合体を合成した。

トリフルオロエタノールを20%含むpH9緩衝液中、これら複合体は自己集合体を形成した。ペプチド鎖はβシート構造をとることをCDスペクトルにより確かめた。ペプチド鎖の疎水性アミノ酸側鎖とポルフィリンが近接し、これら複合体分子自体が両親媒性構造をとっている。この自己組織体はおもにポルフィリン同士の疎水性相互作用により形成されており、有機溶媒含量を増やすと崩壊した。ポルフィリン同士が近接している様子は、CD、UV、NMRスペクトルより詳細に解析した。ポルフィリンを亜鉛、鉄、コバルト錯体として、これとβシートペプチドの複合体について自己組織化を試みた。亜鉛、鉄(III)錯体では、ポルフィリン錯体の会合力が弱まり、充分な会合数の超分子を形成しなかった。コバルト錯体とポリペプチドの複合体は、金属を含まない対照化合物と同程度の自己集合能を示した。ここれらのことは、上記各種スペクトルの他、サイズ排除クロマトグラフィーにより明らかにした。4,4'-ジピリジルを加えたところ、亜鉛、コバルト錯体では金属錯体間を架橋した安定な錯体が生じた。これらについて可視光励起し、ビオローゲン類をアクセプターとする光有機電子移動反応を試みたところ、単量体ポルフィリン錯体に比べ活性が数倍向上していた。ポルフィリンの会合のため吸収が長波長シフトしており、有用性が高いと考えられる。
顔面非対称の解析と診断法の確立

本研究では、顎変形症患者の下顎骨形態を三次元的に評価することで、顔面非対称の要因を分析することを目的とした。対象は本学顎変形症外来所蔵のX線CTデータとした。まず顔面の骨格データを抽出し、顎顔面骨格モデルを三次元構築し、さらにこのモデルから下顎骨のみを抽出し再分化してそれぞれのセグメントの体積を計測し、左右差を分析した。その結果、非対称群では、下顎骨、下顎枝、関節突起・筋突起を除いた下顎骨で有意差がみられ、非対称の要因となっていることが示唆された。顎顔面形態の特徴を三次元的に分析して構造的な評価を行う方法を確立し、それらに基づいて非対称の要因となる項目ごとに客観的に顔面非対称を分類する方法を考案することを目的として、平成25年度では昨年度に引き続き、顔面非対称患者の形態的分析を行うためにその構成要素の一つである下顎骨の形態の分析を継続した。本学顎変形症所蔵の顎変形症患者の術前X線CT画像のdicomデータからV-WorksTMを用いて顔面骨格を抽出し、RapidFormTMで顔面骨格モデルを三次元構築した。この顔面骨格モデルから顔面の正中矢状平面を作成し、この正中矢状平面へ骨格モデル上に設定したMeからの垂直距離が3mm未満を対称群、それ以上を非対称群として対象とした。この三次元顔面骨格モデルからさらに下顎骨だけを抽出し、下顎骨正中矢状平面を作成し、この平面を基準として下顎骨を左右に分割した。各半側下顎骨についてそれぞれ歯槽部を分割・削除したうえで、下顎枝・下顎骨体部に分割し、さらに筋突起と関節突起領域を下顎切痕で分割して半側下顎骨、下顎枝部、下顎骨体部、筋突起と関節突起領域を除いた下顎枝部・半側下顎骨の10セグメントに細分化した。それぞれについて体積を計測して左右差の比を算出し、両群間について比較検討をした。その結果、非対称群では下顎骨,下顎枝および,関節突起・筋突起を除いた下顎骨の体積に有意な左右差が存在することが判明した。顎顔面形態の特徴を三次元的に分析して構造的な評価を行う方法を確立し、それらに基づいて非対称の要因となる項目ごとに客観的に顔面非対称を分類する方法を考案することを目的として、平成24年度ではまず、顔面非対称患者の形態的分析を行うためにその構成要素の一つである下顎骨の形態の分析から行った。下顎骨の形態的特徴を分析する方法の一つとして左右差の比較・検討することを考え、特に体積の差を検討することに着目した。そのため、これまでの研究で下顎骨の正中矢状平面を作成する方法を確立した。この作成した正中矢状平面を利用して下顎骨を左右に分割する事を考えた。今回は本学顎変形症所蔵の顎変形症患者の術前X線CT画像のdicomデータからV-Worksを用いて顔面骨格を抽出し、RapidFormで顔面骨格モデルを三次元構築した。この顔面骨格モデルから顔面の正中矢状平面を作成し、この正中矢状平面へ骨格モデル上に設定したMeからの垂直距離が3mm以下のものを対象とした。それぞれについて体積を計測して左右差・性差について比較検討した。その結果、筋突起と関節突起領域を除いた下顎枝と半側下顎骨において体積の左右差に男女差を認めず下顎骨の対称性を評価する基準として応用可能である事が示唆された。顎顔面形態の特徴を三次元的に分析して構造的な評価を行う方法を確立し、それらに基づいて非対称の要因となる項目ごとに客観的に顔面非対称を分類する方法を考案することを目的として、平成26年度では顔面非対称患者の形態的分析を行うために三次元構築した顎顔面骨格モデル(以下3Dとする)と従来の正面頭部X線規格写真(以下PAとする)による顔面の対称性の評価について分析しその妥当性について比較・検討をした。この顔面骨格モデルから顔面の正中矢状平面を作成し、この正中矢状平面へ骨格モデル上に設定したMeからの垂直距離を計測した。

PAでは、sassouni分析法に従い、左右の眼窩縁と斜眼窩線との交点(Lo)を結んだ平面を作成し、鶏冠頚部の最も狭窄している部位(NC)から作成した平面への垂線を作成してそれを顔面正中線とし、Meからの垂直距離を計測した。それぞれの計測値が3mm未満のものを対称、3mm以上を非対称とした。この2群間の計測結果について3DをGolden standardとして比較・検討した。両群間について比較検討をした。その結果、3Dと従来のPAによる顔面の対称性について評価した結果、その感度は77.3%であった。PAによる対称性の診断の信頼性は乏しく、X線CTデータから三次元顔面骨格モデルを構築して分析・診断することの必要性を示唆するものと考えた。口腔外科本研究の遂行に際し、データの収集と分析に時間が必要となり思うように研究が進まなかった。データ数を増やすのに当初の予想よりももう少し時間が必要となる事が考えられる。本研究の遂行に際し、データの収集と分析に時間が必要となり思うように研究が進まなかった。本年度以降も引き続きデータの収集と分析を継続する。顔面非対称の要因となりうる上・下顎骨・脳頭蓋底の形態学的な特徴や位置関係について分析・評価することで顔面非対称の分類をするための基準を確立できると考える。本年度以降も引き続きデータの収集と分析を継続し、まず下顎骨について顔面非対称を伴うものとそうでないものとの形態的な特徴を分析・評価していき、非対称の要因を明らかにしていく。研究の遅延に伴い予定していた成果報告が出来ず、次年度へ繰り越す結果となった。今年度の研究費とあわせて、データ保存用媒体や参考書籍、分析システムの追加購入、情報収集および研究成果報告のための経費に使用する予定である。次年度への研究費は翌年度の研究費とあわせて、蓄積されたデータ保存用の媒体の購入や書籍の購入、分析システムの追加購入、情報収集および研究成果発表の為の出張費などに主に使用する予定である。
熱特性を利用した新規汎用液/液二相有機溶媒系による合成反応-分離システムの構築

均一溶液中に溶解した二種類以上の物質を、各々同容器内で簡便な操作で分離することができれば、化学物質の合成反応・分離・精製に極めて有用な方法論となる。本研究は、一般に広く用いられている有機溶媒を組合せることにより、均一溶液反応/反応容器内分離精製システムの構築を実現する革新的な方法論を確立し、広範な有機合成反応-生成物分離精製の一連のプロセスを簡便に行うことを可能にすることを目的とした。研究代表者は最近、メディア効果に関する一連の研究過程で、シクロヘキサンとそれ以外の単一または混合有機溶媒を特定の比率で混合することにより、僅かな温度変化で、二相分離と均一化を繰り返す有機溶媒系が構築できることを初めて発見し、液相ペプチド連続合成に成功した。本法は、応用探索研究を推進することによって、実験レベルから工業レベルに至る多段階逐次合成、触媒、有用試薬回収システム、ハイスループット合成、および液相コンビナトリアルケミストリーにおける有機合成法の新たな突破口となると考え、下記の項目について研究を行った。環状オリゴペプチド液相自動合成システムの構築近年環状オリゴベプチドを母核とする多くの生理活性物質が報告され、立体構造、立体配座と活性との関連で注目を集めている。本液相ペプチド合成システムでは、担体からペプチドを切断する手法として、従来の固相法にない多くの方法が採用でき、環状ペプチドの簡易合成法を確立した。新規相溶性2相溶媒システムの探索相溶性2相溶媒システムが低揮発性、難燃性有機溶媒や含水溶媒をもちいても構築することができれば、産業上、生化学反応系を含め、その用途はさらに広範に広がる。僅かな温度変化で相状態が顕著に変化するあらたな溶液系の探索を行った結果、カーボネート系を含む実用的なあらたな混合溶媒系を見出し、連続合成反応系の応用開発を行った。アミノ酸配列の異なるオリゴペプチドは、その配列に基づく立体構造により多様な活性を発現する。特に生理活性ペプチド、あるいは蛋白質の活性部位は5から10のアミノ酸からなるオリゴペプチドが重要な役割を果たすことが多く、これら活性本体の分子構造、立体配座の解明において、多様なペプチドを合成することが重要となっている。そこで、下記のスキームに基づき、オリゴペプチドの多段階-並行合成システムを確立し、ペプチドの低コスト多段階多種類同時合成を行った。A)直線型液相ペプチド連続合成1.溶液(35°Cに加温)を均一にした状態で、ペプチド鎖を一段階伸長した。2.反応完結を確認後、5°Cに冷却すると可溶性担体に結合したペプチドは上層に、その他の試薬(縮合剤、未反応のアミノ酸、塩基、脱離した保護基等)は下層に分配した。3.下層を廃棄し、上層のペプチドについて、さらに伸長反応を繰り返した。B)セグメント結合型液相ペプチド連続合成本反応システムでは、均一溶液中で反応を行うため、過剰なアミノ酸伸長試薬を用いる必要がなく、また短時間で反応が完結する。従ってその特徴を活かし、たとえばオリゴペプチド同士(一方は可溶性担体に結合し、N末端が保護されていないもの。もう一方は可溶性担体から切り離され、C末端がCOOH, N末端はFmoc基で保護されているもの)を同一溶液内で反応、結合させる新規ペプチドセグメント合成-分離精製システムの構築が可能と考えられ、この新たな反応系を完成さえ、高速自動ペプチド合成法実現への新たな方法を開発した。本法では、固相合成法と異なり、合成中間体の構造、純度、最終精製物の構造確認等が担体に結合した状態で実施できる。また、各段階ごとに反応を完結させて次のステップに進むことができるようになった。

均一溶液中に溶解した二種類以上の物質を、各々同容器内で簡便な操作で分離することができれば、化学物質の合成反応・分離・精製に極めて有用な方法論となる。本研究は、一般に広く用いられている有機溶媒を組合せることにより、均一溶液反応/反応容器内分離精製システムの構築を実現する革新的な方法論を確立し、広範な有機合成反応-生成物分離精製の一連のプロセスを簡便に行うことを可能にすることを目的とした。研究代表者は最近、メディア効果に関する一連の研究過程で、シクロヘキサンとそれ以外の単一または混合有機溶媒を特定の比率で混合することにより、僅かな温度変化で、二相分離と均一化を繰り返す有機溶媒系が構築できることを初めて発見し、液相ペプチド連続合成に成功した。本法は、応用探索研究を推進することによって、実験レベルから工業レベルに至る多段階逐次合成、触媒、有用試薬回収システム、ハイスループット合成、および液相コンビナトリアルケミストリーにおける有機合成法の新たな突破口となると考え、下記の項目について研究を行った。環状オリゴペプチド液相自動合成システムの構築近年環状オリゴペプチドを母核とする多くの生理活性物質が報告され、立体構造、立体配座と活性との関連で注目を集めている。本液相ペプチド合成システムでは、担体からペプチドを切断する手法として、従来の固相法にない多くの方法が採用でき、環状ペプチドの簡易合成法を確立した。新規相溶性2相溶媒システムの探索相溶性2相溶媒システムが低揮発性、難燃性有機溶媒や含水溶媒をもちいても構築することができれば、産業上、生化学反応系を含め、その用途はさらに広範に広がる。僅かな温度変化で相状態が顕著に変化するあらたな溶液系の探索を行った結果、カーボネート系を含む実用的なあらたな混合溶媒系を見出し、連続合成反応系の応用開発を行った。
がん薬物療法における抗がん薬曝露に対する科学的エビデンスの創出

新規抗がん薬の開発により、外来化学療法で取り扱う抗がん薬レジメンは増加する一方である。外来化学療法室の利用患者は年々増加し、多様なニーズに応えるがん薬物療法に習熟した医療者の関わりが重要となっている。がん薬物療法を専門とする医療者の育成、拡充にあたっては、専門的な教育・訓練とともに抗がん薬を扱う現場における医療者の安全、職場環境の整備も提唱されている。曝露防止のための機器開発が進む中で過去の報告は現状と乖離しており、医療者がコストと時間をかけてどこまで曝露対策を行うかの科学的実証は未確立である。本研究では、抗がん薬曝露の実態を経年的・経時的に調査し現状に即したエビデンスを創出する。
哺乳動物精巣特異的ポリ(A)ポリメラーゼTPAPによる精子形態形成制御の分子機構

精巣特異的ポリAポリメラーゼTPAPは,特定mRNAの球状精細胞特異的なポリA鎖伸長に関与している。その欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,精子形成が球状精細胞の段階で停止する。TPAP欠損による精子形成不全の分子基盤と特定mRNAのポリA鎖伸長機構について検討し,次のような研究成果を得た。1.TPAPを過剰発現するマウス精巣でもmRNAポリA鎖が通常の長さしか伸長されないので,ポリA鎖を一定の長さで停止させる機構が存在することを明確にした。2.TPAPは,減数分裂後の精子形態形成に関与するタンパク質(プロタミンやTP1,Fsc1など)と転写因子群.(TFIIAγ,CREMτ,およびTAF10など)をコードするmRNAと相互作用しており,TPAPのmRNA認識に選択性があることを見いだした。3.CPEB2は精巣で高発現しておりTFIIAγやTRF2のmRNA 3'非翻訳領域へ結合したので,TPAPと共同でmRNAポリA鎖伸長に関与していることが示唆された。4.ポリA鎖結合タンパク質PABPC1は,TFIIAγのmRNA3'非翻訳領域にポリA鎖が存在するときに結合した。TPAPはポリA鎖の有無にかかわらずその非翻訳領域には結合していなかったので,TPAPはTFIIAγのmRNAへ直接的に結合せず,何らかの複合体として相互作用していることが示唆された。5.TPAPと相互作用する分子の同定を試み,ヘリカーゼの一種であるRecQLが同定された。TPAPとRecQLの直接的な結合も明らかにした。哺乳動物精巣特異的ポリ(A)ポリメラーゼTPAPは,特定mRNAの球状精細胞特異的なポリ(A)鎖伸長に関与している。その欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,結果として精子形成が球状精細胞の段階で停止していた。今年度は,TPAP欠損による精子形成不全の分子基盤と特定mRNAのポリ(A)鎖伸長機構について検討した。(1)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析...TPAP欠損マウス精巣では,基本転写因子TAF10の核移行が減少していたことから,TAF10は転写活性化因子CREMの支配下にある半数体特異的遺伝子の転写に関与していることが示唆された。そこで,抗TAF10抗体を用いた免疫沈降を行なった結果,モータータンパク質KIF2AのモータードメインのC末端38アミノ酸残基を欠損する分子種(KIF2Asと命名)などいくつかのタンパク質が免疫共沈降された。TPAP欠損マウス精巣ではKIF2As mRNAレベルは野生型と同じであるがポリ(A)鎖が短くなっていること,またタンパク質量が減少していることが明らかとなった。現在,KIF2As mRNAの球状精細胞でのポリ(A)鎖伸長不全と翻訳効率の関連について検討している。(2)TPAPによるmRNAポリ(A)鎖伸長機構の解析...TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。そのmRNA特異性や時期特異性を決定する機構について検討した。抗TPAP抗体により,精巣特異的熱ショックタンパク質Hsp70-2が免疫共沈降した。現在,TPAPに対するその機能について検討中である。一方で,標的mRNAの1つであるTFIIAγの3'-UTRを用いたEMSA法とUVクロスリンク法により,精巣特異的な70kDaの結合タンパク質の存在を確認した。

現在,結合領域の限定を行っており,その配列を用いて結合タンパク質の同定を行う予定である。また,TPAP過剰発現マウス精巣でもmRNAポリ(A)鎖は野生型と同じ長さまでしか伸長されないことから,mRNA特異性およびポリ(A)鎖をそれぞれのmRNA固有の長さで停止させる機構が存在することがより明確になった。さらに,核や卵成熟過程の細胞質でのポリ(A)鎖付加に関与するCPSF160が,他の組織と比べて精巣の細胞質に著量に存在し,TPAPと相互作用することを明らかにした。哺乳動物精巣に特異的なポリ(A)ポリメラーゼTPAPの欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,結果として精子形成が球状精細胞の段階で停止する。今年度は,昨年度に引き続きTPAP欠損による精子形成不全の分子基盤について検討した。(1)TPAPによるmRNAポリ(A)鎖伸長機構の解析・・・TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。そのmRNA特異性や時期特異性を決定する機構について検討した。標的mRNAであるTRF2とTFIIAγの3'-非翻訳領域(UTR)を用いたEMSA法による競争阻害実験により,同一の因子が結合していると考えられた。TFHAγとTRF2の3'-UTR中にはそれぞれ3つと1つのcytoplasmic polyadenylation element(CPE,UUUUU/AAU)が存在し,その結合タンパク質CPEB1には3つのパラログが存在する。CPEB2が精巣において高発現していることから,CPEB2がポリ(A)鎖伸長に関与していることが推測された。(2)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析・・・抗TAF10抗体を用いた精巣抽出液の免疫沈降により,神経細胞形成に関わるモータータンパク質KIF2AのスプライシングバリアントであるKIF2βとKIF2γが共免疫沈降されたが,GST-pull downアッセイの結果,両者は直接相互作用しているのではないことが判明した。また,RT-PCRと免疫沈降によりスプライシングバリアントのうち,KIF2γのみが精巣においてTAF10の細胞内輸送に関わっていることが判明した。今後,両者を仲介するタンパク質を探索する予定である。(3)TPAP欠損マウスのプロテオーム解析・・・TPAP欠損マウスの球状精細胞では,TAF10以外にも影響を受けているタンパク質が存在する可能性がある。そこで,野生型とTPAP欠損マウスの精巣タンパク質を二次元電気泳動により比較したところ,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではSorbitol dehydrogenaseとAdenylate kinaseが減少していた。事実,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではこれらmRNAのポリ(A)鎖伸長が不完全であった。これらのことから,いくつかのmRNAの球状精細胞における正常な翻訳にはポリ(A)鎖の伸長が不可欠であることが示唆された。哺乳動物精子形成過程での精細胞特異的ポリAポリメラーゼTPAPの機能と役割を解明するために研究を行い,次のような研究成果が得られた。(1)TPAPがどのようなmRNAと相互作用しているのかを明らかにするために,マウス精巣抽出液を抗TPAP抗体で免疫沈降させ,RIP法によって同定を試みた。
抗老化遺伝子SIRT1に着目した男性不妊の病態解明と新規治療法の探索

少子化の点からも男性不妊の新たな治療法が求められている。我々は、DNA修復欠損マウス(Xpaマウス)精巣が、老化の促進で造精障害(精子形成ができず不妊)となることを示した。最近、A群色素性乾皮症の患者細胞(Xpa欠損)でNAD+が枯渇し、抗老化遺伝子サーチュイン1(Sirt1)の発現が低下し、変性が進む新病態がわかった。本研究は、NAD+の代謝産物を補うことで、Sirt1発現を維持するNAD+を増やし、Xpaマウス精巣の変性が抑制されるか否かを調べる。男性不妊患者でも同様の病態と考えられる。本研究は、造精機能障害の新病態に基づく治療を行うことで、造精障害の治療法の開発に貢献するものと考える。
有機電気化学の新展開

本研究は重点領域研究「有機電気化学の新展開」の総括班としての機能を有し、実施グループ5名と評価グループ6名から構成され、評価グループの助言を得ながら、4つの班相互の連絡を緊密にして研究計画全体の効果的推進を計った。1.研究項目と成果電子移動反応場の設計と制御(A01)、超活性反応種の創成(A02)、メディエーター反応の展開(A03)と錯体電子移動系の展開(A04)の4研究項目を設け、計画班員29名(3年間同数)、公募班員平成7年度91名(平成5年度55名、6年度87名)により研究の推進を計った。平成8年10月の総括班による評価では、各研究項目は何れも顕著な成果を挙げ、有機電気化学の格段の発展に繋がるとともに、他の方法では実現できない有機反応系を発展させ、さらに錯体化学、生物電気化学と有機電気化学との境界領域を築く成果も得られ、当初の目的を充分達成した。2.全体会議、公開シンポジウム等の開催6回の全体会議、5回の公開シンポジウム(第2回全体会議から全体会議に続けて実施)、11回の総括班会議、17回の実施グループ会議、10回以上の班会議、4回の班組織を越えた横断的研究会議を開き、班員相互の情報交換、班員同士の協力研究や横断的研究の実施、研究計画全体の効果的推進、報告書の作成打ち合わせ等を進めた。3.印刷物の発行各年度未に研究成果報告書(各班員和文2ページ、英文2ページ)および3年間の研究成果報告書(各班員英文4ページ)を刊行した。また、全体会議、公開シンポジウムの際には要旨集を、さらに12回のニュースレターを班員等に配布し、研究の目的、研究の進行状態等の周知徹底を計った。平成10年2月には英文図書“New Challenges in Organic Electrochemistry"を出版するべく一般学術図書の補助金申請を行い準備を進めている。本研究は重点領域研究「有機電気化学の新展開」の総括班として機能し、評価グループ(6名)は高い学識から本領域研究に対する評価を行うとともに運営についての適切な助言を与えた。実施グループ(研究代表者、4班の各班長、生物電気化学の有機電気化学への展開を計るための担当者の計6名から構成)は評価グループの助言に対処するとともに研究班相互の連携を緊密化し、研究計画全体の効果的実現を計った。1.会議の開催平成5年7月23日熊本市において(第15回エレクトロオーガニックケミストリー討論会終了後)まず全体会議を持ち、代表者、各班長による本重点領域研究の目的、計画等の説明、評価班員による挨拶があり、引き続き班会議において計画・公募班員の研究説明、研究目標等について議論がなされた。第2回全体会議(松永是、小久見善八、仁木克己、土田英俊の研究発表)と第1回公開シンポジウム(藤島昭、大森秀信、佐々木和夫、大辻吉男の他、部外の本多健一、西山明徳の講演)が12月67日仙台市で開催され、同時に総括班会議、班会議が行われた。2.印刷物の発行ニュースレター3回および班員名簿を班員を主な対象として配布した。また全体会議および公開シンポジウムの要旨集を配布した。3.研究成果の早期公開など全班員の本年度成果の和文および英文報告書を年度末までに配布し、自他の研究計画等の評価、他班の班員との研究協力などへの利用、第三者への早期公開への利用に供した。

本研究は6名の評価グループと5名の実施グループから構成され、本重点領域研究「有機電気化学の新展開」の実施2年目の総括班として機能した。本年度新たに40名の公募班員が加わり、全組織は118名に拡大したため、反応場としての電極界面の新しい概念の確立と超反応活性種の創世による有機電気化学の格段の飛躍をめざして各研究班内はもちろん研究班相互の連携を緊密化し、研究計画全体の効果的実現を計った。1.会議の開催平成6年6月30日学士会館において第3回全体会議(各班より2名発表)、7月1日同館において第2回公開シンポジウム(各班より1名と外部から軽部征夫氏の講演)と平成5年度の未発表班員によるポスター発表、班会議、総括班会議を開催した。また、12月910日せとうち児島ホテルにおいて第4回全体会議(各班より2名発表)、第3回公開シンポジウム(各班より1名講演)と平成6年度の新規公募班員全員によるポスター発表、班会議、総括班会議を実施した。一方、各研究班は別時期に班会議を持ち、相互の連携と、目的に沿った研究の推進に努めた。2.印刷物の発行ニュースレター4回、全体会議および公開シンポジウムの要旨集2回、全班員名簿1回を印刷し、班員等に配布した。ヒアリング資料の作成を班員のデータをもとに行った。また平成6年度の研究成果(和文2ページ、英文2ページ)を平成7年2月に全班員から提出してもらい、前年度と同様に報告書を作成すべく進めている。3.研究班相互の研究協力この目的を推進するために、班長会議を3回開き、各班員の研究に共通する研究対象物、研究手法を整理し、横断的研究の推進に努めた。特に不斉合成の成果が各班より得られ、当初の予想以上の研究の進展が見られた。本重点領域研究の最終年度の総括班の役割を果たし、評価グループ6名と実施グループ5名から構成された。計画班員29名、公募班員91名の組織からなり、反応場としての電極界面の新しい概念の確立と超反応活性種の創成による有機電気化学の格段の飛躍をめざして各研究班内はもちろん研究班相互の連携を緊密化し、研究計画全体の効率的進展を計った。1.会議の開催京大会館において平成7年6月29日第5回全体会議(各班より2名発表)、6月30日第4回公開シンポジウム(各班より1名と外部から生越久靖氏の講演)と39名のポスター発表、班会議、総括班会議を開催した。また、12月24日セミナープラザすずかけ台において第6回全体会議(各班より4名発表)、第5回公開シンポジウム(各班より1名と外部から徳田耕一氏の講演)と48名のポスター発表、班会議、総括班会議を実施した。2.印刷物の発行ニュースレター4回、全体会議および公開シンポジウムの要旨集2回、全班員の研究概要、全班員名簿を印刷し、班員等に配付した。また平成7年度の研究成果報告書(全班員和文、英文各2ページ)を作成した。3.研究班相互の研究協力と関連した討論会への共催班長会議を2回開き、班組織を越えた横断的研究の推進に努めた。たとえば、第18回エレクトロオ-ガニックケミストリー討論会、第2回日韓電気化学セミナーを共催し、電極界面、メディエーター反応、錯体電子移動反応の主題を設け、またその機会に参加者のロビ-討論を行い横断的研究の実を計った。研究目標は順調に達成でき、総括班は円滑に機能した。平成57年度実施された重点領域研究「有機電気化学の新展開」の総括研究を行った。研究組織はいままでと同じく実施グループ5名、評価グループ6名の計11名で構成された。1.全期間にわたる研究成果報告冊子の作成
慢性腸炎時における消化管運動機能傷害の分子機序

本年度は、in vivoの腸炎においてもCPI-17の発現低下が運動機能障害に関与するのかを明らかにするため、TNBS誘発回腸炎モデルマウスを用いて解析を実施した。さらに、IL-1βならびにTNF-αとCPI-17の関係について詳細に検討するために、IL-1αβKOマウスとTNF-αKOマウスを用いて回腸組織培養標本による解析を行った。結果、以下の様な成績を得た。1)急性腸炎モデルであるTNBS誘発1賜炎において収縮力とCPI-17発現量の低下が認められた。2)IL-1αβKOマウスの回腸平滑筋組織にTNF-αを処置すると、収縮力およびCPI-17発現量が低下したのに対して、TNF-αKOマウスの回腸平滑筋組織にIL-1βを処置しても影響が無かった。3)TNBS誘発腸炎により、TNF-αKOマウスではCPI-17発現が変化しなかったのに対して、IL-1αβKOマウスと野生型マウスでは顕著なCPI-17発現量の低下が観察された。以上の成績から、in vivoの急性腸炎においてもCPI-17が運動機能障害に関与し、さらにTNF-αがCPI-17発現抑制に必須であり、IL-1βはTNF-αを介してこの経路に関与することが示唆された。さらに慢性腸炎でのCPI-17発現低下の有無について検討するために、IL-10KO大腸炎モデル用いて解析を行った。結果、慢性腸炎モデルにおいても顕著なCPI-17の発現低下と受容体刺激による収縮抑制が認められた。本研究により腸炎疾患における消化管運動機能障害の分子機序のひとつとしてCPI-17発現低下によるミオシンのリン酸化低下があげられることを実証することが出来た。これまで私は「消化管運動機能不全の分子機構」を解明する糸口として、まず炎症性サイトカインであるIL-1βの長期作用が消化管平滑筋細胞自身に機能異常をきたすとの仮説を立て、消化管平滑筋組織培養法を用いた検討を行い、IL-1βの消化管への長期暴露は、平滑筋収縮機構の中で特にミオシン軽鎖フォスファターゼ(MLCP)を阻害する内在性タンパク質CPI-17の発現量を顕著に減少させるとともに、MLCP調節サブユニットMYPT-1とCPI-17のリン酸化を減弱させることでミオシンフォスファターゼ活性を増強させることで平滑筋収縮能を低下させることを報告した(Journal of Biological Chemistry,278:48794-48804,2003)。そこで、今回私はさらにin vivoの腸炎モデルにおける運動機能障害とCPI-17の関係の検討を行った。また、サイトカインネットワークによるCPI-17発現抑制機構を解明するために、各種サイトカインノックアウトマウスと組織培養法を用いて、以下の知見を得た。1.急性腸炎モデルであるTNBS誘発腸炎、慢性炎症モデルであるIL-10KOマウスにおいて収縮力とCPI-17発現量の低下が認められた。2.IL-1α/βKOマウスの回腸平滑筋組織にTNF-αを処置すると、収縮力およびCPI-17発現量が低下したのに対し、TNF-αKOマウスの回腸平滑筋組織にIL-1βを処置しても影響がなかった。3.TNBS誘発腸炎により、TNF-αKOマウスではCPI-17発現が変化しなかったのに対して、IL-1α/βKOマウスではwild typeのマウスよりも顕著なCPI-17発現量の低下が観察された。以上の結果から、IL-1βはTNF-αを介してCPI-17発現抑制による収縮力の低下を引き起こすことが示唆された(Gut,投稿中)。
非アルコール性脂肪性肝炎進展を抑制するガレクチン9を制御するマイクロRNAの同定

1.WTマウスを用い、STAMマウスを作製、4週目より高脂肪食を与えたマウスに週3回90μg/日のガレクチン9を腹腔内投与、9週目(肝線維化出現)と16週目(肝細胞癌出現)に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無、サイズを計測した。投与群、非投与群の肝臓を用いそれぞれマイクロRNAを抽出、ガレクチン9投与群にて著明に増減しているマイクロRNAを同定した。2.ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成し、上記1と同様に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無を解析した。また、マイクロRNAを抽出、ガレクチン9の欠損によって特異的に増減しているマイクロRNAを同定した。3. WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、脂肪性肝炎時に脂肪細胞から分泌されるレプチン存在下でLPSを培養液に濃度別に投与し、免疫応答の代表的な分子であるCD14とTNFαを測定したところ、ガレクチン9欠損マウス由来のマクロファージではそれらの著明な亢進を認めている。よって、NASH改善効果に大切な役割を果たすM2様マクロファージ(肝ではクッパー細胞)において、ガレクチン9の分泌を制御ことが重要であることを見出し、それに関与するマイクロRNAを同定した。4.同定したマイクロRNAのターゲット遺伝子をData baseから推定し、その遺伝子の発現調節を解析し、ガレクチン9のM2様マクロファージ内の下流シグナルを同定している。ガレクチン9欠損マウスからのSTAMマウスを作製する際に、生後48時間以内にストレプトゾトシンを注射しなければならず、breedingに少し手間取り、少し作成時間が長めになっている。ただし、STAMマウス自体は順調にNASHの進展、発癌モデルとして十分な役割を果たしており、ガレクチン9ノックアウトマウスの骨髄細胞も比較的安定しているため、マイクロRNAやそのターゲット遺伝子の解析も順調に進んでいる。NASH進展およびNASH発癌において特異的に発現減弱するターゲットマイクロRNAのアデノウイルスベクターを用いた肝特異的レスキューモデルによるin vivoでの機能解析を行う。平成29年度の実験により得られたマイクロRNAプロファイルより、共通する真のターゲットマイクロRNAを解析、同定してゆく。そのマイクロRNAをCMVプロモーターのあるアデノウイルスベクターにサブクローニングし、高力価にしたあとに、STAMマウスの5週目のNASH形成直前に尾静脈より静注し、肝細胞に強発現させる。その後肝組織での脂肪化、炎症、線維化等おNASH進展の度合い、また肝発癌の状態を経時的に解析しているが、現時点ではその尾静脈注射の注入量の安定化がやや難しく、今後手技を安定化させることを改良している。1.WTマウスを用いて、STAMマウスを作製、ガレクチン9投与群、非投与群のそれぞれ肝組織を用いたマイクロRNAの網羅的解析;WTマウスを用い、STAMマウスを作製、4週目より高脂肪食を与えたマウスに週3回90μg/日のガレクチン9を腹腔内投与、9週目(肝線維化出現)と16週目(肝細胞癌出現)に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無、サイズを計測した。2.ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成、NASH進展およびNASH発癌において特異的に増減するマイクロRNAのターゲット遺伝子の実験的確証;ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成し、上記1と同様に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無を解析した。3. WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、脂肪性肝炎下でのガレクチン9欠損による過剰免疫反応に関与するマイクロRNAの解析;WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、、脂肪性肝炎時に脂肪細胞から分泌されるレプチン存在下でLPSを培養液に濃度別に投与し、免疫応答の代表的な分子であるCD14とTNFαを測定したところ、ガレクチン9欠損マウス由来のマクロファージではそれらの著明な亢進を認めている。よって、NASH改善効果に大切な役割を果たすM2様マクロファージ(肝ではクッパー細胞)において、ガレクチン9の分泌を制御ことが重要であることを見出し、それに関与するマイクロRNAを同定しつつある。。ただし、STAMマウス自体は順調にNASHの進展、発癌モデルとして十分な役割を果たしているため、それなりに順調であるといえる。

2.ガレクチン9欠損マウスを用いSTAMマウスモデルを作成し、上記1と同様に犠死させ、それぞれ肝組織内の脂肪化、炎症、線維化、肝細胞癌の有無を解析した。また、マイクロRNAを抽出、ガレクチン9の欠損によって特異的に増減しているマイクロRNAを同定した。3. WTとガレクチン9欠損マウスの骨髄由来マクロファージを用いて、脂肪性肝炎時に脂肪細胞から分泌されるレプチン存在下でLPSを培養液に濃度別に投与し、免疫応答の代表的な分子であるCD14とTNFαを測定したところ、ガレクチン9欠損マウス由来のマクロファージではそれらの著明な亢進を認めている。よって、NASH改善効果に大切な役割を果たすM2様マクロファージ(肝ではクッパー細胞)において、ガレクチン9の分泌を制御ことが重要であることを見出し、それに関与するマイクロRNAを同定した。4.同定したマイクロRNAのターゲット遺伝子をData baseから推定し、その遺伝子の発現調節を解析し、ガレクチン9のM2様マクロファージ内の下流シグナルを同定している。ガレクチン9欠損マウスからのSTAMマウスを作製する際に、生後48時間以内にストレプトゾトシンを注射しなければならず、breedingに少し手間取り、少し作成時間が長めになっている。ただし、STAMマウス自体は順調にNASHの進展、発癌モデルとして十分な役割を果たしており、ガレクチン9ノックアウトマウスの骨髄細胞も比較的安定しているため、マイクロRNAやそのターゲット遺伝子の解析も順調に進んでいる。NASH進展およびNASH発癌において特異的に発現減弱するターゲットマイクロRNAのアデノウイルスベクターを用いた肝特異的レスキューモデルによるin vivoでの機能解析を行う。平成29年度の実験により得られたマイクロRNAプロファイルより、共通する真のターゲットマイクロRNAを解析、同定してゆく。そのマイクロRNAをCMVプロモーターのあるアデノウイルスベクターにサブクローニングし、高力価にしたあとに、STAMマウスの5週目のNASH形成直前に尾静脈より静注し、肝細胞に強発現させる。その後肝組織での脂肪化、炎症、線維化等おNASH進展の度合い、また肝発癌の状態を経時的に解析していく予定である。その後肝組織での脂肪化、炎症、線維化等おNASH進展の度合い、また肝発癌の状態を経時的に解析しているが、現時点ではその尾静脈注射の注入量の安定化がやや難しく、今後手技を安定化させることを改良している。分担研究者の他の科研費より、平成29年度の共通の実験に必要な物品の購入があり、重なっていたため、平成30年度以降の予算に移行致しました。
中間活性層による特異なNb3Sn超伝導層拡散生成の誘発と機能創成

本研究は、今やNMR等の超強磁場磁石に欠かせないNb3Sn超伝導線材の臨界電流特性のブレークスルーを実現するために、中間Cu-X活性層を利用した“特異"なNb3Sn拡散反応現象を発掘し、新たな機能創成につなげることを目指している。2018年度は、Zn添加に加え、GeまたはMgの同時添加を行い、元素の拡散挙動、結晶組織を電子顕微鏡観察やEDX分析を通じて詳細に調べ、極めて有益な知見を得た。まずZnおよび微量Ge添加では、結晶粒粗大化抑制効果が明らかとなり、やや高温の熱処理を施すことで、臨界磁場を改善しつつ、磁束線ピン止め力を維持できることが明らかとなった。GeはNb3Snフィラメントの周囲に化合物相を形成することが報告されているが、微量Geの同時添加では化合物相の形成は見られない。Zn量は14wt%程度とし、Geは1wt%としたが、加工硬化は顕著ではなく、工業化への適用性に問題ないことも示された。さらに興味深い結果として、Znおよび微量Mgの同時添加により、結晶粒組織の微細化の効果がより一層増大し、高磁界特性のみならず、低磁界側においても臨界電流特性の大幅な改善が明らかとなり、線材設計上極めて有望であることがわかった。おそらくMgはNb3Sn結晶粒界に原子レベルで偏析し、結晶成長を抑制するピンとして機能しているものと考えられる。先のGeも同様の効果と考えられるが、Mgの方がより一層顕著に思われる。臨界電流密度は、従来比で6%以上の向上が実現された。さらに進展した結果として、Ti添加場所によるNb3Sn結晶組織形成への影響を、最先端分析技術であるアトムプローブ分析により調査し、TiをSn芯(母材)側にドープするか、Nb芯側にドープするかでNb3Sn結晶粒界の均一性に違いが現れることが明らかとなった。Tiドープモードが、結晶組織形成と深く関係する可能性が示唆される。元素添加効果を調べる中で、現象解明に関わる新しい知見を得、そこから注意深く、系統的にその効果を調べたことで、微量Mg同時添加で当初想定以上の効果が見出され、研究が大きく進展したため。現代の高性能Nb3Snの拡散生成においては、大きく2つのステップに分かれている。第1ステップでは、Snと中間Cu層との相互拡散が行われ、第2ステップでは、Cu-Sn層とNbと拡散反応が行われる。第1ステップのSn/Cu相互拡散は、両者の拡散速度の差によるカーケンダルボイドの形成を伴う反応となり、Snの均一拡散や、第2ステップにおけるCu-Sn/Nb拡散反応に大きな影響を与える。特に、実際の極細多芯構造では、Nbフィラメント間の間隔がサブミクロンオーダーと極めて小さく、小さなボイドがSnの拡散に極めて大きく作用する。従って、Nb3Snの高性能化を実現する上で、カーケンダルボイドの生成メカニズムの解明と、その抑制方法の開発は、極めて重要な課題となる。これまでZn添加によるSn拡散の促進の効果を明らかにしてきたが、Zn量の最適化はまだ行われておらず、加えてZn添加とカーケンダルボイド形成との相関も明らかにされていない。Zn添加効果を最大限に引き出すためには、Sn拡散挙動、カーケンダルボイド形成等の複合的な観点から、Zn添加効果を調査することが不可欠である。こうした背景から、2019年度では単純構造試料を準備し、Sn/Cu-Zn拡散反応における生成層の同定や、生成層の成長速度などの調査を行い、基礎材料学問的基盤の確立に尽力する。そうした土台の上に、Zn量の最適化等、Nb3Sn高性能化に繋がる芽を見出し、次世代線材のための設計指針を検討するとともに、新たな課題発掘に取り組む。