hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視覚の適応が引き起こす種分化の分子機構

視覚の適応が引き起こす種分化が多くのシクリッドの種で起こってきた共通の現象であることを分子レベルで明らかにすることを目的として研究を行った。ヴィクトリア湖内の様々な深さに生息する様々な種を用いて、それぞれの種が生息光環境に光受容体を適応させていることを、視物質の配列と機能、それぞれの種の生息光環境を用いて解析を行った。その結果、ヴィクトリア湖の種は透明度や深さによって変化する光環境にLWS,RH1のアリルを適応させ進化してきたことが示唆された。またそれぞれの種の婚姻色はその種の視覚に吸収される環境光と最も重なりが大きく、同種に最も目立つことが明らかになった。これらの結果から、視覚の適応が引き起こす種分化がヴィクトリア湖のシクリッドで共通に起こってきた種分化の機構であることが明らかになった。本年度までに水深や透明度などビクトリア湖の様々な環境に生息する種の長波長領域に吸収帯をもつ光受容体遺伝子(LWS)が、生息環境の光に適応するように分化していることを予測した。また、実際に光受容体を構築し吸収波長の測定を行い、適応的であることもA1レチナールを発色団に用いて示してきた。しかし、淡水魚はA1だけでなくA2レチナールも発色団に用いることが知られており、これを用いてLWSの吸収波長を調べる必要があった。そこで本年度は、LWSのすべてのアリルについてA2レチナールを用いた光受容体の構築と吸収波長の測定を行った。その結果、LWSの光受容体の最大吸収波長は568-611nmの範囲で異なった最大吸収波長を持つことが明らかになり、それぞれの種が生息する環境の光に適応してきたことが明らかになった。また、薄明視で働く光受容体、RH1についても同様にA2レチナールを用いた光受容体の構築と吸収波長の測定を行った。その結果、深い生息水深の種から浅い生息水深の種になるにつれて、RH1のアリルが遷移し最大吸収波長は長波長側から短波長側にシフトする(539-522nm)ことが明らかになった。これらのことからビクトリア湖の種は透明度や深さによって変化する光環境にLWS,RH1のアリルを適応させ進化してきたことが明らかになった。本年度は主にデータの解析を中心に研究を行った。始めにこれまでヴィクトリア湖の様々な透明度、深さで測定を行った水中の環境光スペクトルの解析を行った。その結果、透明度により光の減衰率が透明度ごとに、またそれぞれの波長ごとに異なることが明らかになった。この波長ごとに異なった光の減衰率が異なった透明度異なった深さで、そこにだけ存在する環境光を作り出し、水中の多様な光環境を生み出している明らかになった。次にそれぞれの深さと透明度の環境光に生息する種が、視覚をその環境光に適応させているか解析を行った。解析は本研究で明らかになったすべてのLWS視物質の吸収波長を用い、それぞれの環境光をどの種の視物質が一番効率よく吸収できるかを算出して行った。その結果、それぞれの種がもつLWS視物質はその種が生息する光環境で最も効率よく光を吸収することができることが明らかになった。つまり、それぞれの種が限られた光の成分が存在する環境で効率よく光を吸収できるように視覚を適応させてきたことが明らかになった。最後にそれぞれの種のオスが呈する婚姻色が生息する環境光で目立つか、つまり環境光を効率よく反射し、かつ適応した視覚に効率よく吸収される光を反射しているかを解析した。解析は婚姻色を16の部位に分け、その色を主波長に変換して波長の分布を求め、その分布と視覚により吸収される環境光の分布の重なりを算出することにより行った。その結果、それぞれの種の婚姻色はその種の視覚に吸収される環境光と最も重なりが大きく、同種に最も目立つことが明らかになった。
シロイヌナズナAGL6遺伝子の胚株の形態形成における役割の遺伝解剖学的研究

シロイヌナズナのMADS-box遺伝子の一つAGL6遺伝子が、胚株の成熟、胚嚢の分化、種子形成において果たしている役割を明らかにすることを主たる目的として、本年度には以下の成果を得た。(1)AGL6遺伝子の機能喪失変異体を得る目的で、シロイヌナズナNossen野性型株から作出した突然変異原処理第2(M2)世代、200家系のうち、これまでに157家系を家系ごとにスクリーニングし、た8るAGL6遺伝子のアンチセンス・コンストラクトを持つ形質転換植物と類似の表現型を持つものを探した。その結果、8系統(3つの相補群)の独立の突然変異体候補を得た。表現型異常の程度が著しい5系統のうち3系統についてAGL6遺伝子の塩基配列の決定をおこなったところ、1系統(Nom2-55-#1)で、第7エクソンにG→Aの塩基置換(188番目のアミノ酸がAlaからThrに置換している)が見いだされた。現在、これをAGL6遺伝子の機能喪失変異の有力な候補と考え、この系統におけるAGL6遺伝子の突然変異と花の形態異常表現型の共分離を解析中である。NoM2-55-#1と同程度の表現型異常を示す残る2系統について、AGL6遺伝子の塩基配列の決定を進めている。残る43家系についても、現在スクリーニングを進行中である。(2)AGL6遺伝子の異所的発現が胚株の形態形成におよぼす影響を検討するために、AP3プロモーター(外株皮で発現する)の制御下にAGL6cDNAを発現させるプラスミドを構築し、植物の形質転換をすませ、現在、形質転換植物体の選抜をおこなっている。(3)AGL6遺伝子を発現する内株皮内皮の選択的細胞死が胚株の形態形成におよぼす影響を検討するために、AGL6プロモーターの制御下にBarnase遺伝子を発現させるプラスミドを構築し、植物の形質転換をすませ、現在、形質転換植物体の選抜をおこなっている。
大強度ビームで生成するイオンを利用したポンプ機能を持つ超高真空ダクトの開発

本研究は、ビームで生成したイオンを用いて真空ダクト表面の酸化膜を除去し、表面に露出したチタン自体が持つ気体吸着能を利用して、ビームライン全体を一様に超高真空にするような真空ダクトを開発することを目的としたものである。研究計画の基盤となる開発は、チタン製真空ダクト表面のチタン酸化膜を、イオンによりスパッタリングできる条件の確立および酸化膜除去後の気体排気性能の検証である。1年目である今年度はチタン製真空ダクト内表面のチタン酸化膜をスパッタリングで除去し、ピュアなチタンのポンプ作用を検証するための装置開発に取り組んだ。円筒状のチタンダクトの内表面を一様にスパッタリングできる電極を設計・製作した。スパッタリングにおける磁場の効果を検証できるよう、電磁石を円筒の中心部と外側に配置できる構造とした。またスパッタリング電源として、十分に放電が持続でき継続したスパッタリングが可能な電源を選定した。実際に、真空ダクト中心軸に電磁石を配置した場合、ダクト外側に配置した場合、両者とも配置した場合、両者とも配置しない場合の各条件でスパッタリング試験を行い、中心軸上の電磁石がスパッタリングに優位な効果があることを見出した。並行してJ-PARC 3GeVシンクロトロンにおいて、ビームラインにおける残留ガス分析を可能な系を構築した。これはどのような成分のガスが真空ダクト中に残留しているか、および大強度ビーム運転中に発生するかを測定し、上記チタン製真空ダクトの真空排気の有効性を検証するために必要である。残留ガス分析計をシンクロトロンの複数の箇所に設置し、常時データを収集できる系を構築した。計測の結果、通常の場所では水素の分圧が大きいこと、キッカー電磁石近傍では水の分圧が大きいことが分かった。このことはキッカー電磁石の構成材料であるフェライトからの水蒸気成分の放出ガスが多いという過去の研究成果と一致した。本年度はその検証を行うための試験装置の設計・製作を完了した。さらに、チタン酸化膜をスパッタリングにより除去するために効果的な電磁石の配置を実測により検証することまで遂行することができた。今後、チタン酸化膜をスパッタリングにより除去し、ピュアなチタンを表面に出しチタンゲッターとしての排気特性を測定していく予定である。J-PARC 3GeVシンクロトロンのビームラインの残留ガス分析を測定した。この測定は前述のチタンゲッターの各気体分子に対する吸着性能が検証できた際に、現状のシンクロトロンビームラインの残留ガスに対してどれほどの効果を発揮するかを見積もる際に必要である。本項目は研究計画段階にはなかったが、加速器運転維持のためにも残留ガス分析を行う必要が生じたため、併せて実施することができた。以上より、現在までの進捗状況についてはおおむね順調に進展していると評価する。今後の研究は、チタン製真空ダクト表面のチタン酸化膜をイオンによりスパッタリングできる条件の確立および酸化膜除去後の気体排気性能の検証を優先的に推進する。今年度はチタン製真空ダクトスパッタリング装置の製作を完了させ、スパッタリングが効率よく行える磁石の配置の検証も遂行した。今後はスパッタリング時の投入パワーの条件を確定する。さらにスパッタリング前後での放出ガス測定、残留ガス分析を行うことで、ピュアなチタン表面の排気特性を測定する。研究計画段階ではビームラインにガス導入を行い、ビームによりガスをイオン化することで、スパッタリングのためのイオンを作り出すことを検討していた。しかしながら、原理実験において導入ガスの圧力は0.1 Pa程度と事前の想定よりも高い圧力のほうがスパッタリング効率が良いという観点で、望ましいことが分かった。ビームのガス気体分子による散乱が大きく、ビームロス並びに放射化のリスクもある。そのためスパッタリングをオフラインで電極を用いて行ったうえで、ビームラインにインストールする方法を検討することとする。この方法は一度露出したピュアなチタン面が再度酸化膜に覆われる。そのため、再形成された酸化膜の除去方法についても検証を行う。具体的にはまた、サンプルを用いて再形成される酸化膜の厚み等を測定する。そのうえで、チタン製真空ダクトスパッタリング装置を用いて、酸化膜除去後に意図的に大気暴露により酸化膜を形成させ、加熱により再形成された酸化膜除去を試みる予定である。

並行してJ-PARC 3GeVシンクロトロンにおいて、ビームラインにおける残留ガス分析を可能な系を構築した。これはどのような成分のガスが真空ダクト中に残留しているか、および大強度ビーム運転中に発生するかを測定し、上記チタン製真空ダクトの真空排気の有効性を検証するために必要である。残留ガス分析計をシンクロトロンの複数の箇所に設置し、常時データを収集できる系を構築した。計測の結果、通常の場所では水素の分圧が大きいこと、キッカー電磁石近傍では水の分圧が大きいことが分かった。このことはキッカー電磁石の構成材料であるフェライトからの水蒸気成分の放出ガスが多いという過去の研究成果と一致した。研究計画の基盤となる開発は、チタン製真空ダクト表面のチタン酸化膜を、イオンによりスパッタリングできる条件の確立および酸化膜除去後の気体排気性能の検証である。本年度はその検証を行うための試験装置の設計・製作を完了した。さらに、チタン酸化膜をスパッタリングにより除去するために効果的な電磁石の配置を実測により検証することまで遂行することができた。今後、チタン酸化膜をスパッタリングにより除去し、ピュアなチタンを表面に出しチタンゲッターとしての排気特性を測定していく予定である。J-PARC 3GeVシンクロトロンのビームラインの残留ガス分析を測定した。この測定は前述のチタンゲッターの各気体分子に対する吸着性能が検証できた際に、現状のシンクロトロンビームラインの残留ガスに対してどれほどの効果を発揮するかを見積もる際に必要である。本項目は研究計画段階にはなかったが、加速器運転維持のためにも残留ガス分析を行う必要が生じたため、併せて実施することができた。以上より、現在までの進捗状況についてはおおむね順調に進展していると評価する。今後の研究は、チタン製真空ダクト表面のチタン酸化膜をイオンによりスパッタリングできる条件の確立および酸化膜除去後の気体排気性能の検証を優先的に推進する。今年度はチタン製真空ダクトスパッタリング装置の製作を完了させ、スパッタリングが効率よく行える磁石の配置の検証も遂行した。今後はスパッタリング時の投入パワーの条件を確定する。さらにスパッタリング前後での放出ガス測定、残留ガス分析を行うことで、ピュアなチタン表面の排気特性を測定する。研究計画段階ではビームラインにガス導入を行い、ビームによりガスをイオン化することで、スパッタリングのためのイオンを作り出すことを検討していた。しかしながら、原理実験において導入ガスの圧力は0.1 Pa程度と事前の想定よりも高い圧力のほうがスパッタリング効率が良いという観点で、望ましいことが分かった。ビームのガス気体分子による散乱が大きく、ビームロス並びに放射化のリスクもある。そのためスパッタリングをオフラインで電極を用いて行ったうえで、ビームラインにインストールする方法を検討することとする。この方法は一度露出したピュアなチタン面が再度酸化膜に覆われる。そのため、再形成された酸化膜の除去方法についても検証を行う。
３次元可視化による成形プロセスの粒子充填構造と焼結の熱力学的駆動力の解明と制御

焼結は成形した粉体を加熱して複雑形状部品を製造する技術である。成形プロセスならびに焼結過程での微構造形成過程をX線マイクロトモグラフィーにより可視化し、粒子充填構造と焼結の熱力学的駆動力の解明と制御を目指した研究を実施した。具体的に、1)X線マイクロトモグラフィーによるガラス粒子の粘性焼結における3次元気孔構造観察から焼結応力、体積粘性係数を推定する手法を提案した。2)アルミナ粉体成形体の焼結時の粗大気孔発生機構を解明し、微構造形成に及ぼす原料顆粒の影響を調べるとともに、異方性焼結に及ぼす結晶配向の影響を明らかにした。3)シミュレーションにより2球粒子焼結と気孔収縮の力学原理を解明した。a)X線マイクロトモグラフィーによる粉体成形プロセスと粒子充填構造の解析粒径8μmのガラス球粒子を基板上にテープ成形した場合の粒子充填構造をX線マイクロトモグラフィーにより解析し、面内方向の異方性に比べて、面外方向の異方性が大きいことを表面エネルギーテンソルの解析により明らかにした。微視的に不均一な組織をもつ材料を巨視的な連続体理論で取り扱う場合、代表体積要素(RVE)という中間スケールの概念が有用である。代表体積要素は粒子径より十分大きく多数の粒子を含んでおり、微構造を代表するが、巨視的な部材よりはずっと小さい要素である。トモグラフィーによる可視化をもとに微構造の不均一性のスケールを解析し、代表体積要素の大きさを決定した。b)粉体の成形過程及び焼結過程における微構造変化と収縮挙動の実験的研究アルミナの不均一構造について、成形体中の疎な構造の分布、およびその焼結時の構造変化の過程をマイクロx線コンピュータトモグラフィを用いて観察した。また、粉体成形において、スラリー中の粒子の構造とスラリー中の粒子が沈降する挙動について共焦点走査型レーザー蛍光顕微鏡で観察した。c)粒子スケールの焼結シミュレーション粘性流動によるガラス流の形状変化は流体力学の原理に基づいて有限要素法によりシミュレーション可能である。最も単純なモデルとして単一粒の粘性流動による形状変化を考えを、粒子内部で焼結力を定義できることを示し、粘性焼結の運動方程式を提案した。細長い楕円体粒子は粘性流動によって時間とともに短軸が増加し、最終的に球へと形状変化する。粒子の対称面に作用する焼結力と短軸径の増加速度との間に比例関係が成立することを示した。この知見に基づき、短軸径の増加速度の実験的測定から焼結力を決定する方法を提案した。3次元可視化による成形プロセスの粒子充填構造と焼結の熱力学的駆動力の解明と制御を目指し、以下の成果を得た。1)粒径150μmのガラス粒子のスラリーをテープ成形、乾燥した試料を焼結、X線マイクロトモグラフィーによる内部構造観察を繰り返し、焼結の進行とともに内部の微構造が変化する挙動を3次元で可視化した。微構造観察に基づき、相対密度より微視的な緻密化曲線を決定するとともに、比表面積、気孔表面の平均曲率を相対密度の関数として測定した。粘性焼結の力学解析より、緻密化の熱力学的駆動力である焼結応力を曲率法、エネルギー法、混合法の3つの方法で推定した。さらに、緻密化曲線より得られる緻密化速度と焼結応力より巨視的粘性係数を決定した。2)アルミナの焼結時の不均一構造の形成について、x線マイクロトモグラフィを用いて、同一のサンプルの同一箇所を逐次観察して3次元可視化を行った。性質の異なるアルミナ原料顆粒を用いて成形体を作製し、脱脂後から焼結に至る過程、特に中期段階において、顆粒間および顆粒境界の三重点が、顆粒内の焼結と顆粒間の焼結に伴って数μmから約30μmの大きさまで拡大することを明らかにした。特に、成形用のバインダを含む顆粒は、成形性には優れるが、表面の偏析層が脱脂後に粗大欠陥形成の核となり、欠陥も粗大化する様子が明らかとなった。これにより粗大欠陥の抑止のための指針がえられる。3)2つのガラス球粒子の粘性焼結の流体力学的な解析を行い、焼結の駆動力である焼結力を接触面の平均圧力と表面張力より定義でき、それがネック成長と関係することを数学的に証明する理論を確立した。2球粒子の3次元有限要素法シミュレーションを行い、焼結力とネック成長に関する理論的な予測が厳密に成立することを実証した。さらに、焼結力は2球粒子間距離の収縮をも決定していることを見出した。2球粒子の粘性焼結モデルは1945年にFrenkel欠陥で有名なFrenkelによって提唱され、過去70年間、ネック成長と収縮に関する議論がなされてきた。今回、ネック成長と収縮の背後に焼結力が存在し、それが焼結挙動を支配していることを理論的に解明し、シミュレーションによって実証した。これは焼結理論における70年ぶりの大きな進歩であると考えている。さらに、膨大な粒子の関与する焼結現象は巨視的な緻密化曲線を用いて記述されてきたが、X線マイクロトモグラフィーによってミクロスケールの内部構造観察から直接緻密化曲線を決定するとともに、焼結現象を支配する焼結応力と巨視的粘性係数を相対密度の関数として決定できたことは、ミクロスケールとマクロスケールをつなぐものである。焼結過程に於いて、粗大欠陥の形成の原因を明らかにしたことは、セラミックス部品の強度の信頼性を向上するためのプロセス開発において重要な知見と成る。

3次元可視化による成形プロセスの粒子充填構造と焼結の熱力学的駆動力の解明と制御を目指し、平成28年度は以下の成果を得た。1)ガラス粒子の粘性焼結のX線マイクロトモグラフィーによる3次元内部構造の可視化を行った。緻密化の熱力学的駆動力である焼結応力を推定する方法には曲率法、エネルギー法、混合法の3つの方法があるが、初期焼結では互いに推定値が異なった。初期焼結における焼結応力を、粒子の平均配位数と平均ネック半径をもとに粒子間に作用する焼結力から推定する方法を提案した。この結果、初期焼結、中期焼結では混合法が、また、終期焼結ではエネルギー法が正確な値を与えることを示した。2)焼結における複雑な3次元気孔構造の変化は、気孔率、表面積、表面曲率で通常解析されるが、気孔形態の界面トポロジーの視点からの解析に取り組み、Euler標数が初期焼結、中期焼結、終期焼結を区別する指標になることを提唱した。3)ミクロなレベルでの不均一収縮について,等軸状粒子を用いて磁場中配向によりC軸配向アルミナ成形体を作製し,配向の影響について検討を行った。焼結時間にともなう収縮異方性を測定し,構造との関係を調べた結果,焼結初期段階からc軸方向の収縮が大きいことが明らかとなり,構造観察からc軸方向に配位する粒子の増加と,c軸から30-45°方向の配位粒子も多くなることがわかった。4)湿式成形での構造観察の前に,成形の前段階でのスラリー内部構造の三次元可視化についても検討を行った。粒子と分散溶液との屈折率マッチングを行い透明な高濃度スラリーを調製し,観察には,共焦点顕微鏡を用いた。せん断運動や沈降挙動での粒子を観察できるように独自の観察セルを開発した。高濃度での分散スラリーでの粒子運動や沈降挙動を明らかにすることができた。また,分散性によって,スラリーの構造が大きく異なることがわかった。セラミックス製品の力学的信頼性を向上するには、焼結中の不均一な気孔構造変化を理解し、粗大気孔の形成を抑制する原理を見いださないといけない。本年度の新しいアプローチとしては、複雑な気孔構造の形態変化を記述するための「言語」として、界面トポロジーの概念を提案したことにある。一見、複雑で当惑する3次元気孔構造変化の意味を解明するための一歩であると考えている。界面トポロジーを使って焼結の各段階を区別することができる。さらに、成形プロセスにおけるスラリー構造の直接観察、ならびに、磁場配向したアルミナ成形体の異方向的収縮についての実験的研究において大きな進展があった。平成29年度は以下の成果を得た。1)巨視的な焼結における収縮挙動を支配する焼結応力と体積粘性率を焼結鍛造試験により相対密度の関数として実験的に測定した。CASガラスの測定値を、ガラス球粒子粘性焼結のX線マイクロトモグラフィーから推定した値を比較した。粒径ならびに化学組成の違いにもかかわらず、焼結鍛造の測定値はトモグラフィーからの推定値と良い一致を示した。手間と日時がかかる焼結鍛造試験に対し、計測時間の大幅な短縮が見込めるトモグラフィー法の正確さを実証した。2)焼結中には気孔チャネルの形成と閉鎖による複雑な微構造変化がおこる。
老化など脳病変修復機序の研究:残存ニューロンの機能保持を求める

高齢者の健全な社会適応に関する諸問題解決の重要性は今日の国民的合意である。神経細胞は「正常な老年者」でも確実に変性脱落している。にも拘らず、知的に優れた老人も決して少なくない。個々の神経細胞脱落のあとが如何に修復され、最小の機能喪失をもって治癒してゆくものか、その修復過程と機能の保持、再生の機序を解明する研究班を設立することを我々は志向してきた。本研究の分担者はすべて「健やかで活発な脳機能を保持させる」ための医学的裏付けを求めることを目的とした。かくしてこの研究班は、一カ年の間に世界的なレベルで叡知を結集し、あらゆる生物学的手技を動員し、神経細胞脱落後の修復機序を解明することを目標とした研究班の結成させることを志向した。また、本研究の代表者および分担者は、それぞれ臨床面,形態学,分子生化学,膜脂質学,生理学等々の各学会分野を代表しているが、この一年間に班員相互間で真剣に将来の研究体制が如何にあるべきかを討論し、特にこの研究班が文部省の「重点領域研究」としての研究班を提案することを志向し、会合を重ねてきた。それらの中には米国のテーリー,ウィーン大学のザイテルバーガー所長等とも打ち合わせて、国内外の動静に配慮しつつその可能性を追求した。しかし、類似するいくつかの研究班の動きもあり、また、他のプロジェクトとの競合等も考えられ、結局、重点領域研究として提案することはひとまづ見合わせ、各自が、それぞれの専門とする方向の研究を、より一層追求してゆくこととした。従って本研究班は特に具体的な研究内容を研究するための班ではないために、各班員の学問上の研究業績はあまりに多数となるため、むしろここでは割愛させて頂くことにした。
粘膜免疫により誘導される特異的免疫制御T細胞の詳細な分画の特定と誘導機序の解析

マウスの心臓移植モデルを用いて実験を行った。ドナーはC57BL/10,レシピエントはCBAでフルミスマッチの組み合わせである。無処置ではCBAマウスはC57BL/10の移植心を8日で拒絶する。移植7日前にドナーの脾細胞を気管内に投与すると、移植心の生着は中央値が70日に延長する。免疫制御細胞の存在を確かめるために移入実験をおこなった。ドナー脾細胞投与7日後、心臓移植を行うべき日に、心移植を行わず、脾臓を取り出し、脾細胞を別の無処置マウスに投与した。そして、そのマウスにC57BL/10の心臓を移植した。この脾細胞移入により中央値は70日と延長した。このことは、移入した脾細胞の中に免疫制御細胞が存在することを示す。そこで、免疫制御細胞の分画をどうていするために、移入する細胞を、B細胞、CD4陽性細胞、CD8陽性細胞、樹状細胞に分けたところ、CD4陽性細胞と樹状細胞の移入で、移植心の生着は延長した。樹状細胞が免疫寛容を誘導することは興味深いが、今回はその解析は行わなかった。CD4分画をさらにこまかくするために、CD25陽性細胞または陰性細胞、CTLA4陽性細胞または陰性細胞に分けて、細胞移入実験を行った。この結果CD25陽性、CTLA4陽性細胞で著明な心臓移植片の生着延長が見られた。よってわれわれの実験系でのひとつの免疫制御細胞の分画はCD4陽性CD25陽性CTLA4陽性であった。従来型の免疫抑制剤(アザチオプリン、サイクロスポリン、FK506,MMF,ラパマイシン)が免疫制御細胞の誘導にどのように働くかを気管内投与モデルを用いて調べた。脾細胞を気管内投与後から別のマウスに細胞移入を行う間の7日間に連日上記の薬剤を投与した。その結果、サイクロスポリン、アザチオプリン、高濃度のFK506では免疫制御細胞の誘導を阻害した。一方で、MMFとラパマイシンでは免疫制御細胞の誘導の相乗的に働いた。骨髄から常時新しい細胞が供給される通常の状態では、免疫寛容をうるためにアナジーやディレーションによれば、終生薬剤の投与が必要になる。ところが、免疫制御細胞を誘導するレギュレーションを樹立すれば、その時点で薬剤の投与は不要になる。臨床では免疫制御細胞の誘導を導けば、少なくとも従来型の免疫抑制剤の量を軽減でき、副作用を回避できる。急性期は今まで通りのプロトコールで移植心の拒絶反応を防止し、慢性期には免疫制御細胞が誘導できる薬剤に適宜変更することで、上記が達成できる。その薬剤の組み合わせは、低用量のFK506とMMF,ラパマイシンの組み合わせである。一方で、閉塞性動脈硬化症患者に使用しているサルポグレラートも免疫制御細胞の誘導に相乗的に働くことが判明した。よって、サルポグレラートを移植の慢性期に投与することは非常に有益なことである。以上が、この2年間にこの研究費の使用によって判明したことです。

ところが、免疫制御細胞を誘導するレギュレーションを樹立すれば、その時点で薬剤の投与は不要になる。臨床では免疫制御細胞の誘導を導けば、少なくとも従来型の免疫抑制剤の量を軽減でき、副作用を回避できる。急性期は今まで通りのプロトコールで移植心の拒絶反応を防止し、慢性期には免疫制御細胞が誘導できる薬剤に適宜変更することで、上記が達成できる。その薬剤の組み合わせは、低用量のFK506とMMF,ラパマイシンの組み合わせである。一方で、閉塞性動脈硬化症患者に使用しているサルポグレラートも免疫制御細胞の誘導に相乗的に働くことが判明した。よって、サルポグレラートを移植の慢性期に投与することは非常に有益なことである。以上が、この2年間にこの研究費の使用によって判明したことです。CBAマウスの腹部にC57/BL10マウスの心臓を移植した。無処置では8日から10日で心臓は拒絶される。移植7日前にこのマウスの気管内にC57/BL10マウスの脾細胞を投与すると、移植心は70日以上生着する。また、CBAマウスの気管内にC57/BL10マウスの脾細胞を投与し、7日後に心臓移植をせずに、そのCBAマウスの脾細胞を、無処置のCBAマウスに移入し、その当日にC57BL/10マウスの心臓を移植するとその心臓も70日以上生着する。このことは、ドナー細胞の気管内投与により免疫制御細胞が誘導されたことを意味する。そこで、この脾細胞を分画に分けて、移入し心臓移植をおこなった。その結果、B細胞やCD8T細胞では、C57BL/10移植心の生着延長は認められなかったが、CD4T細胞では生着延長が認められた。さらに、CTLA4陽性細胞と陰性細胞をわけて移入すると、CTLA4陽性細胞の移入群で移植心の生着延長が得られた。以上のことは、この実験系での免疫制御細胞は、CDTA4陽性CD4陽性T細胞と考えられた。今年度は、さらなる分画の解析を行う予定である。一方、誘導機序の解析であるが、気管内投与時にインターロイキンー10とTGFベータの中和抗体を投与すると、インターロイキンー10の中和抗体投与時には、免疫制御細胞が得られなかった。また、移入時に、インターロイキンー10とTGFベータの中和抗体を投与すると、インターロイキンー10の中和抗体投与時には、免疫制御細胞が得られなかった。以上のことは、インダクッションフェーズとエフェクターフェーズにともにインターロイキンー10の関与が必要と結論付けられる。現在、細胞間シグナルの必要・不必要を解析中である。PDL1,CD40,CD80,CD86,などの遮断抗体を使用して、解析している。マウスの心臓移植モデルを用いて実験を行った。ドナーはC57BL/10,レシピエントはCBAでフルミスマッチの組み合わせである。無処置ではCBAマウスはC57BL/10の移植心を8日で拒絶する。移植7日前にドナーの脾細胞を気管内に投与すると、移植心の生着は中央値が70日に延長する。免疫制御細胞の存在を確かめるために移入実験をおこなった。ドナー脾細胞投与7日後、心臓移植を行うべき日に、心移植を行わず、脾臓を取り出し、脾細胞を別の無処置マウスに投与した。そして、そのマウスにC57BL/10の心臓を移植した。この脾細胞移入により中央値は70日と延長した。このことは、移入した脾細胞の中に免疫制御細胞が存在することを示す。
乳歯歯質が持つ生理的歯根吸収の調節機構に関する研究

象牙質から抽出した有機基質成分中には破骨細胞の活性を抑制する因子が存在していることが判った。このような抑制効果について乳歯の有機基質成分と永久歯の有機基質成分で統計学的に有意な差は認められなかったが、永久歯の方が抑制効果は高い傾向が認められた。上顎永久犬歯の萌出時に、近接する永久側切歯や第一小臼歯の歯根は吸収されないが、先行乳犬歯にのみ歯根吸収が生じていることは臨床のエックス線写真検査でよく観察される。このことは乳歯と永久歯の歯根の被吸収性に差がある事を示唆している。そこで我々は象牙質中に破骨細胞の吸収活性に影響を与えるシグナル物質が存在し、歯根吸収を調節しているとの作業仮説をたて、これを確認する目的で本年度は以下の実験を行った。マウス骨髄細胞を骨芽細胞と共存培養して分化させた破骨細胞を象牙(ivory)スライス上に播種した後、培地にウシ乳歯象牙質と永久歯象牙質の脱灰抽出物を添加して破骨細胞活性に及ぼす影響を観察した。その結果、破骨細胞の数には変化がなかったが、象牙(ivory)表面の吸収窩の形成が抑制され、破骨細胞の活性に関係するc-Srcリン酸化活性が抑制された。さらに、破骨細胞マーカー遺伝子(TRAP、CTR、MMP-9、v-ATPase、Cathepsin K)のmRNAレベルも抑制されていることが明らかになった。これらの結果は象牙質の有機基質中に破骨細胞の吸収活性に影響を及ぼす因子が含まれていることを示しており、この結果は乳歯の生理的歯根吸収の発生機序解明のみならず、永久歯の病的歯根吸収発生のメカニズム解明の一助になり、今後、小児歯科および歯科矯正科の臨床における多くの課題の解決に寄与する可能性を示唆している。そこで我々は象牙質中に破骨細胞の吸収活性に影響を与えるシグナル物質が存在し、歯根吸収を調節しているとの作業仮説をたて、これを確認する実験を行った。その結果、象牙質の有機基質中に破骨細胞の吸収活性を抑制する因子が含まれていることが示されたが、乳歯と永久歯で比較した所、両者の間で有意な差は確認できなかった。そこで本年度は象牙質の有機基質中に破骨細胞の分化を抑制する因子が含まれていて、これが乳歯と永久歯の歯根象牙質の吸収性に影響しているとの仮説をたて、次のような実験を行った。マウス骨髄マクロファージを培養している培地に象牙質の脱灰抽出物を添加した後、5日間培養して破骨細胞のマーカーの変化を調べた。その結果、象牙質の脱灰抽出物とTGF-βはTRAPの活性を上げたが、BMP-2は上げなかった。一方、TGF-βreceptor阻害剤による破骨細胞のTRAP活性の抑制は象牙質の脱灰抽出物の方がTGF-βより低かった。これらの結果は、象牙質の有機基質中に含まれるTGF-βとBMP-2が破骨細胞の分化に影響している事を示している。この結果は乳歯の生理的歯根吸収の発生機序解明のみならず、永久歯の病的歯根吸収発生のメカニズム解明の一助になり、今後、小児歯科および歯科矯正科の臨床における多くの課題の解決に寄与する可能性を示唆している。本研究開始以前の研究結果と本研究のこれまでの結果から、象牙質の有機基質中には破骨細胞の吸収活性のみならず破骨細胞の形成を調整する因子が含まれていることが解った。一方、歯の形成時にTGF-βやBMPs、FGFsなどのサイトカインが象牙質有機基質中に補足され、残留している事もすでに解っている。そこで本年度研究では象牙質の有機基質中に含まれるこれらの因子が乳歯と永久歯の歯根象牙質の被吸収性に影響しているとの仮説をたて、前年度に引き続き、以下の実験を行った。マウス骨髄マクロファージをM-CSFとRANKLを含む培地で培養し、象牙質の脱灰抽出物やTGF-β、BMP-2を添加した後、破骨細胞のマーカーの変化を調べた。その結果、象牙質の脱灰抽出物とTGF-βはTRAPの活性を上げたが、BMP-2はTRAPの活性を上げないことが確認出来た。また、象牙質の脱灰抽出物やTGF-βと共にTGF-β受容体阻害剤を培地に添加するとTRAP活性は抑制されるが、象牙質の脱灰抽出物の場合はTGF-βの場合より抑制度が低いことが確認出来た。以上の結果は象牙質の有機基質中に含まれるTGF-βとBMP-2が破骨細胞の分化に影響している事を示している。このことは、乳歯の生理的歯根吸収の発生機序解明のみならず、永久歯の病的歯根吸収発生のメカニズム解明の一助になり、今後、小児歯科および歯科矯正科の臨床における多くの課題の解決に寄与する可能性を示唆している。
歯科臨床に必要な英語力の分析

日本の歯学教育における歯学のための英語教育(以下「歯科英語教育」)に関する研究はとても少なく、カリキュラム内における目標や方略、時間数、教材等について検討する必要がある。グローバル時代においては、臨床等においても英語の運用能力は必須であり、本研究では歯科医師の臨床における英語運用力向上のためのeラーニング教材等を開発し、それらを用いて学習のアウトカム等を評価し、歯科臨床に必要な英語力に関する検討を行い、学部段階で学ぶべき歯科英語教育について研究する。2018年度は開発したESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」)について学習者からの教材評価を得て、その結果を日本以外の(英語を母語としない)国からも参加者のいる学会にて発表し、その成果や取り組みと教材について広く発信した。急患対応教材では臨床判断・診断能力の取得だけでなく、診療室での会話をリスニング問題とするなど臨床における英語でのコミュニケーション技法学習のための工夫も盛り込み、日本語母語話者がおかしやすい間違いを指摘しつつ、できるかぎり効率的に学習ができるように工夫している。今後医療の世界においても更なる英語の実践的運用能力が必要となるため、歯科英語学習への学習者のニーズも確認できた一方で、さらなる日本の歯科英語教育の充実が必要なことが考えられた。本教材が歯科英語学習機会の一助となることが考えられたが、eラーニング(自己学習)のみならず段階的な学習機会(教材提供等)の必要性についても考察された。今後は引き続き学習機会の提供とともにアウトカム評価を用いながら学部段階で学ぶべき歯科英語(教育)について検討することとし、その準備も整えた。計画通りESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」)の開発を行い、その教材評価を学習者から得て考察することができた。急患対応教材を用いた学習コースをeラーニング上に立ち上げ、次年度以降も同様に学習機会提供を可能とする基盤を整え、また活用する計画や準備を行うことができた。インターネット環境があれば、全国の歯科大学で使用可能な教材である。学習者からの評価より、やはり歯科英語を学ぶ教材や機会が少ないこと、特にリスニングや実際に使われる会話例等、実践的歯科英語学習の機会が少ないことが推測された。教材では視覚・聴覚素材(会話などのリスニング)を提示しながら説明文・問題文等を提示しており、eラーニング教材の有用性やニーズは高く、歯科英語学習機会の一助となることが考えられた。一方で、もうすこし(歯科英単語等含め)基礎的なところからも復習・学習したいという意見があり、eラーニング(自己学習)のみならず、段階的な学習機会・教材提供等の必要性も考察された。臨床における英語運用能力の向上に貢献できるインタラクティブなシミュレーション教材を引き続き開発していく等、歯科英語教育教材の充実化をすすめる準備を行うことができた。歯科臨床において必要な英語力に関する考察を引き続き行い、学部段階で学ぶべき歯科英語や未だ確立されていない歯科英語教育について検討する。1.教育によるアウトカムの評価:急患対応教材学習等による、歯科臨床において必要な英語力や臨床(対応)能力等の向上をWeb上やペーパーベースでのテストや、可能であれば模擬患者(SP)等により客観的に評価する。これにより学習方法と必要な英語力について考察する。2.歯科英語教育についての検討:これまでの結果より、今後より一層の学部教育における歯科英語教育の必要性・さらなる歯科英語教育の充実が望まれることが考察された。研究協力者(学習者)の教材学習、これまでの歯科英語に関する学習機会、臨床(実習)経験や客観的英語能力試験等の結果も含め考察を深め、臨床における様々な場面に対応できる歯科英語(運用)力について、到達目標、方略、どの時期におこなうことが効果的か等を検討し、カリキュラムについての提言や考察をおこなう。3.教材開発:引き続き歯科英語教育で活用できる教材を開発していく。作成しているeラーニング教材はインターネット環境があれば国内(外)で使用可能な教材であるため、汎用性が高いと考えられる。日本の歯学教育における歯学のための英語教育(以下「歯科英語教育」)に関する研究はほとんど行われておらず、教材についても検討があまりなされていない現状がある一方で、グローバル時代においては臨床等においても英語の運用能力は必要であり、その課題は軽視できない。そこで、初年度は歯科英語教育に活用できる教材を開発した。歯科診療外来に急患かつ英語しか話せない方が来院した想定のコンピュータシミュレーション教材(ESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」))を開発し、委員会等2段階の検討を経て完成とし、その質を担保した。開発教材をLearning Management System(LMS)上で配信し、研究協力者に学習して頂いたのち、教材の難易度、学習による知識獲得の有無(将来役に立つか)、継続的学習希望の有無、教材の操作性等をWeb上で質問票を用いて調査した。全ての協力者が教材は将来役に立つと回答し、高評価を得た。これより、本教材学習が歯科英語学習機会提供の一助となることが考えられたが、一方で歯科英語学習の機会が限られていることや個人の差が大きいことが伺えた。得られた評価とその分析等を元に教材を検討し、急患対応教材7本をシリーズとして完成させた。これにより、インターネット環境があれば、全国の歯科大学で使用可能な教材が一つ増えることとなる。平成30年度以降は教材を用いながら歯科臨床において必要な英語力に関する検討を行い、歯科英語教育について検討を行う予定である。ESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」)の開発を行った。

これまでのノウハウを生かし、外来に急患かつ英語しか話せない患者が来院した想定の、インタラクティブな臨床に即したコンピュータシミュレーション教材を、東京医科歯科大学で開発した教材作成支援ツールを用い作成した。視覚・聴覚素材(会話などのリスニング)を提示しながら説明・問題文等を提示でき、臨床で英語が必要な場面では英語、解説は日本語とし、日本語母語話者が学習しやすい構成とし、臨床における英語でのコミュニケーション技法を学習できるように工夫するのみならず、臨床ステップごとの問題が、臨床推論・判断能力の学習に効果的であるように作成した。開発教材は使用する前に学内の委員会等において二段階評価にてその質を保証した。本研究に参加を承諾した研究協力者に教材をLearning Management System(LMS)上で配信し実施させて、教材の難易度、学習による知識獲得の有無(将来役に立つか)、継続的学習希望の有無、教材の操作性等をWeb上で質問票を用いて調査した。全ての協力者が教材は将来役に立つと回答し、教材の有用性は高く、歯科英語学習機会提供の一助となることが考えられた。日本の歯学教育における歯学のための英語教育(以下「歯科英語教育」)に関する研究はとても少なく、カリキュラム内における目標や方略、時間数、教材等について検討する必要がある。グローバル時代においては、臨床等においても英語の運用能力は必須であり、本研究では歯科医師の臨床における英語運用力向上のためのeラーニング教材等を開発し、それらを用いて学習のアウトカム等を評価し、歯科臨床に必要な英語力に関する検討を行い、学部段階で学ぶべき歯科英語教育について研究する。2018年度は開発したESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」)について学習者からの教材評価を得て、その結果を日本以外の(英語を母語としない)国からも参加者のいる学会にて発表し、その成果や取り組みと教材について広く発信した。急患対応教材では臨床判断・診断能力の取得だけでなく、診療室での会話をリスニング問題とするなど臨床における英語でのコミュニケーション技法学習のための工夫も盛り込み、日本語母語話者がおかしやすい間違いを指摘しつつ、できるかぎり効率的に学習ができるように工夫している。今後医療の世界においても更なる英語の実践的運用能力が必要となるため、歯科英語学習への学習者のニーズも確認できた一方で、さらなる日本の歯科英語教育の充実が必要なことが考えられた。本教材が歯科英語学習機会の一助となることが考えられたが、eラーニング(自己学習)のみならず段階的な学習機会(教材提供等)の必要性についても考察された。今後は引き続き学習機会の提供とともにアウトカム評価を用いながら学部段階で学ぶべき歯科英語(教育)について検討することとし、その準備も整えた。計画通りESL歯科医師のための急患対応教材(以下「急患対応教材」)の開発を行い、その教材評価を学習者から得て考察することができた。急患対応教材を用いた学習コースをeラーニング上に立ち上げ、次年度以降も同様に学習機会提供を可能とする基盤を整え、また活用する計画や準備を行うことができた。
1900種の組換えマラリア原虫タンパク質を用いたワクチン候補抗原スクリーニング

新規マラリアワクチン候補抗原探索のため、1900種のタンパク質からなる熱帯熱マラリア原虫タンパク質ライブラリーとマリ成人IgGの抗原抗体反応を網羅的に解析した。抗原抗体反応値とマリ成人IgGの培養熱帯熱マラリア原虫に対する増殖阻害活性の相関を解析した結果、3種の抗原に対する抗体の反応値が増殖阻害活性と有意に正に相関した。さらに、最も高い正の相関を示したLSA3に対する特異的ヒト抗体は培養熱帯熱マラリア原虫に対して24%の増殖阻害活性を示すことを実験的に証明できた。以上より、本スクリーニングにより、LSA3を有望な新規赤血球期マラリアワクチン候補抗原として同定できた。これまでに実用化されたマラリアワクチンは一つもなく、有望視されてきたマラリアワクチン候補も臨床試験で効果が無いことが明らかになり、ワクチン候補から除外されている。このような状況を打開するために、新規ワクチン候補抗原同定の必要性が叫ばれている。マラリア流行地域居住者はマラリア原虫に繰返して感染することにより熱帯熱マラリアに対する防御抗体を獲得する。また、彼らから得られた抗体は培養熱帯熱マラリア原虫に対する増殖阻害活性(Growth Inhibitory Activity: GIA)を有することが分かっている。そのため、マラリア流行地域居住者の抗体が標的とし、その抗体価がGIAと相関する抗原を探索することによって、新規マラリアワクチン候補抗原を同定できると考えられる。本研究は、愛媛大学が開発したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成法によってゲノム網羅的に合成した1900種の組換え熱帯熱マラリア原虫タンパク質を用いて、新規マラリアワクチン候補抗原を同定することを目的として実施されている。平成26年度は、ハイスループットに抗原抗体反応を検出できるアルファスクリーンを応用し、マリ共和国の成人から得たIgGサンプル(n=52)の1900種タンパク質に対する抗原抗体反応値を測定した。測定した抗原抗体反応値に対してカットオフ値を設定することで陽性反応を示した抗原905種を選抜した。陽性反応抗原905種の中から、抗原抗体反応値とマリ成人IgGが有するGIAが正に相関する抗原を39種選抜した。これら39種の抗原はGIAに関連しているため、マラリアワクチン候補抗原であることが示唆される。マラリア流行地域居住者は熱帯熱マラリア原虫に繰返し感染することにより熱帯熱マラリアに対する防御免疫を獲得する。彼らから得られた抗体は培養熱帯熱マラリア原虫に対する増殖阻害活性(Growth Inhibitory Activity: GIA)を有することが分かっている。本研究は、マラリア流行地域居住者の抗体が標的としGIAに寄与している抗原、つまり新規マラリアワクチン候補抗原を同定することを目的としている。そのために、ゲノム網羅的に合成した1900種の組換え熱帯熱マラリア原虫タンパク質とマリ成人IgGの抗原抗体反応をハイスループットに測定した。抗原抗体反応値とマリ成人IgGが有するGIAの相関を解析し、正の相関を示したマラリア原虫タンパク質を選抜した。次に、抗原抗体反応値とGIAが正に相関する抗原のうち、最も高い正の相関を示したLiver stage antigen 3 (LSA3)に対する特異的抗体がGIAを有するのかを検証した。まず、組換えタンパク質をコムギ胚芽無細胞タンパク質法によって合成し、カラムに固定した。作製したカラムにマリ成人IgGを流し、組換えLSA3タンパク質と結合するヒト抗LSA3抗体を単離した。単離したヒト抗LSA3抗体を用いてGIAを測定した結果、ヒト抗LSA3抗体は培養熱帯熱マラリア原虫の増殖を阻害した。このことから、LSA3は新規マラリアワクチン候補抗原であることが明らかとなった。さらに、本研究で応用したスクリーニングシステムはマラリアワクチン候補抗原の探索において有用であることも示された。平成26年度内にマリ成人IgG (n=52)と1900種のタンパク質の抗原抗体反応の検出を全て終了し、抗原抗体反応値とGIAの相関解析を行い、GIAと関連する抗原を選抜できた。寄生虫学選抜された抗原をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成法によって合成し、ウサギに免疫する。得られたウサギ抗体を用いてGIAを測定し、本研究のスクリーニングの有用性を実証する。3月の東京への出張内容を急遽変更したために生じた。次年度の物品費または旅費に充てる。
マウス瞬目反射学習に小脳は不要か?

1.本研究の目的である、マウスにおける瞬目反射条件づけにおいて小脳が必須ではないという仮説を検討するために厳密な条件のもと、小脳切除による条件反射の形成および保持に対する効果を調べた。小脳半球切除の後、i)2週間、ii)4週間、iii)8週間の三通りの回復期間を置いたのち条件づけを行った。その結果、いずれの回復期間においても、小脳切除野生型マウスはコントロール群に比し著明な学習障害を呈し、10日間の学習試行において有意な学習率の上昇を見なかった。これまでの研究で、ウサギやラットでは小脳(小脳核あるいは小脳皮質)を切除すると本学習の獲得が大きく損なわれ、また一度蓄積された記憶も著明に失われることが知られていた。今回の結果は、マウスにおいても他の種同様、小脳が本学習の記憶の形成・保持の場として働いていることを示すものである。適切な条件の実験系を用いた場合、小脳が広く種を超えて、このタイプの運動記憶成立に必須であることを明らかにすることができた。なお、遺伝子操作により、小脳皮質の機能を可逆的に活性化/不活性化することのできる数種のミュータントマウスでも本実験の結果を支持するデータを得ている。2.麻酔下にC57BL/6マウスおよびDBA/2マウスの右側小脳半球を吸引除去し、2週間以上の回復期間の後に、右眼(対側)を用いた典型的な遅延課題による瞬目反射条件づけを行った。以前の結果と同様に、C57BL/6マウスにおいては対側小脳破壊群の学習障害は認められなかった。加えて、前年度に顕著な同側小脳依存性が明らかとなったDBA/2マウスにおいても、対側小脳依存性は認められなかった。以上の結果は、DBA/2マウスにおける小脳破壊の効果は、これまで報告されているNew Zealand白ウサギにおける小脳依存性と一致していることを示唆している。麻酔下にC57BL/6マウスおよびDBA/2マウスの左側小脳半球を吸引除去し,2週間以上の回復期間の後に,左眼(同側)を用いた典型的な遅延課題による瞬目反射条件付けを行った。以前の結果の通りC57BL/6マウスにおいては同側小脳破壊群の学習障害は認められなかったが,DBA/2マウスにおいては顕著な同側小脳依存性が認められた。[川原]瞬目反射条件付けにおける基本的なマウス(C56/BL6)の小脳皮質の役割を調べるために,薬物注入による小脳皮質破壊を行い,その学習獲得に対する影響を検討した。その結果,同側性の小脳皮質の破壊は,条件反射の獲得を著明に抑制した。この結果は,これまでのウサギなどの実験動物と同様に,少なくとも急性には,マウスにおいても小脳皮質が本学習の発現に必須であることを確認するものとなった。他方,小脳深部核の破壊も検討したところ,小脳中位核は,条件反射の発現のみならず,潜在的な獲得にも必要であることが明らかとなった。[岸本他]1.本研究の目的である、マウスにおける瞬目反射条件づけにおいて小脳が必須ではないという仮説を検討するために厳密な条件のもと、小脳切除による条件反射の形成および保持に対する効果を調べた。
哺乳類カリウムチャネルの環境依存的イオン透過制御メカニズムの解明

2018年度は、哺乳類カリウムチャネルTWIK-1に対する解析から確立した、環境依存的なチャネルの構造変化を全反射赤外分光法を用いて解析する方法論を、他のカリウムチャネルやチャネル以外の膜タンパク質(受容体)に適用した。具体的には、ナトリウムイオン濃度依存的にチャネル特性が変化することが知られているKir3.2に対して、溶液中のイオンをカリウムからナトリウムに置換した際の赤外吸収スペクトル変化を測定した。その結果、Kir3.2とTWIK-1の間で類似しているスペクトル変化と、異なる変化を観察した。今後、変異体など用いて吸収バンドの同定を進めることで、Kir3.2に特異的な構造変化を明らかにできると期待できる。イオンチャネルの他にも、細胞外のシグナル分子を認識して、細胞内シグナル経路を駆動するGタンパク質共役受容体が、シグナル分子の結合に伴いどのような赤外スペクトル変化を示すのかについても解析を行った。具体的には、立体構造上の豊富なA2aアデノシン受容体について、アゴニストであるアデノシンの結合前後での赤外吸収変化を精度よく測定した。さらに、同位体標識したアデノシン分子を結合した際のスペクトル変化も測定・比較することで、リガンド結合に伴うスペクトル変化を、受容体由来の成分と受容体に結合したリガンド由来の成分に分離することに成功した。TWIK-1については、細胞外環境の変化を細胞外ドメインを用いて感知していると考えられているが、具体的にどのような機構なのかは不明なため、部位特異的蛍光標識を細胞外ドメインに導入することを計画している。用いる蛍光標識bimaneはシステイン残基に結合するため、TWIK-1に元々存在するシステイン残基のうちいくつかを他のアミノ酸に置換し、チャネル全体の構造を変えずに、結合しうる蛍光標識の数を1/10程度まで減らすことができた。2017年度には、TWIK-1について赤外分光による環境依存的構造変化の解析を行い、2018年に原著論文として発表することができた。これを踏まえて、2018年度は同じ研究手法を、異なるタイプの哺乳類カリウムチャネルKir3.2や細胞外シグナル分子(アデノシン)を受容するGPCRに適用することにも成功した。このように、赤外分光を用いた解析が、イオンチャネルや他の膜タンパク質の環境依存的な構造変化を理解するために有効であることを示す結果を得られ、予定通りに研究を進めることができた。一方で、TWIK-1の細胞外ドメインに蛍光標識を導入する計画については、当初予定していた研究計画の一部が遂行できなかったため、本研究費の事業期間を一年延長し、2019年度に、現在までに遂行できなかった研究計画を進めることを予定している。上述したように、赤外分光解析については予定通り進捗し、蛍光標識を用いた解析については一部遅延があるため、合わせるとおおむね順調に進捗していると考えている。「研究実績の概要」「現在までの進捗状況」に記したように、2019年度には、TWIK-1において細胞外環境を感知する役割を果たすとされている細胞外ドメインに蛍光標識を導入し、イオン環境やpH環境を変えたときに、そのドメインがどのように構造変化するかを蛍光特性をもとに解析することに取り組む。得られた構造変化情報をもとに、環境に応じてチャネル特性を変えるTWIK-1が、どのように細胞外の環境を認識しているのかを考察する。平成29年度は、哺乳類の心房や心室の細胞などにおいて、ナトリウムイオンの「漏れ」電流を生じさせることで静止膜電位を調節するカリウムチャネルTWIK-1について赤外分光解析と生化学的解析をメインに行い、機能制御メカニズムを明らかにした。ほとんどのカリウムチャネルはイオン選択性が極めて高く、ナトリウムイオンは透過しない。しかしTWIK-1は前述のようにナトリウムイオンも透過し、そのイオン透過性は環境に応じて変化することも知られていた。まず、哺乳培養細胞で大量発現させたTWIK-1を精製し、脂質小胞リポソームに再構成し、蛍光インジケータACMAを用いてイオン透過性を評価した。その結果、TWIK-1の野生型はそのチャネル自体が低いイオン選択性を持つことを明らかにし、T118I, L228F変異体は野生型よりも高いイオン選択性を示すことも確認できた。そして、TWIK-1の野生型およびT118I, L228F変異体について、外部のイオン環境を変化させた時の赤外吸収スペクトル変化をATR-FTIR(全反射赤外分光法)を用いて解析した。その結果、カリウム条件において1680cm-1のバンドを細菌由来のカリウムチャネルKcsAと同様に見出した。このバンドは、カリウムチャネルに特異的なイオン選択フィルタとカリウムイオンとの相互作用を反映していると考えられた。さらに、カリウム濃度とナトリウム濃度の量比を様々に変化させた際の1680cm-1のバンド変化量から、TWIK-1では、選択フィルタ部位とカリウムイオンとの結合親和性が大きく低下していることを示す結果を得た。また外部のイオン種を様々に置換した実験などから、TWIK-1では選択フィルタの形状がイオン種を変化させても変化しにくいことも見出した。これらの機構によって、TWIK-1のイオン選択性が低く制御されていると考えられた。平成29年度は、TWIK-1について詳細な赤外分光解析を行うことで、タンパク質外の環境を変化させた時のこのチャネルの構造変化を明らかにすることができた。