hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会インフラを支援する開放型ユビキタスネットワーク

既にグループに加わったセンサノードは、新たな親となり、センサデータ配送グループを形成していく。ns-2を用いたシミュレーションにより、予めグループに登録したノードだけがデータ配送グループに参加できることが確認された。次にルーティング機構として、実世界通信を指向して、地理上の位置と一対一対応のある階層化ルーティング手法SAMONを開発した。具体的には、階層化可変長のアドレスを割当てることとし、アドレス情報を辿るだけで暗示的なソースルーティングを実現した。さらに、階層化をするだけではノード故障に弱い点を解消するために、ノード故障に対応したバックアップ経路を構築する機構を導入した。このプロトコルを10台のMICAMOTEに実装し、耐故障性のあるルーティング機構を確認することができた。今後は、実際のセンシングを目指して、HARおよびSAMONを他プラットフォームへの適用を進めていく。平成17年度は、前年度までに開発した開放型センサネットワークにおけるセキュア階層化通信の方式を大学内部で大規模な実験システムを用いて実証実験を行うと共に、大学外部の千代田区街中に実際にセンサノードを配置して実世界での実験を行った。まず、スケーラビリティを見るための実験として、Mica Mote上に、SAMONプロトコルを搭載した。SAMONでは、地理上の位置と一対一対応のある階層化ルーティングを行うだけではなく、バックアップパスを持たせて、ノード故障に対するロバスト性を向上させた。実験の中において、ノードを意図的に故障させても、動的バックアップパス形成により、瞬時に通信が再開することが確認でき、SAMONの有効性を確認することができた。次に、「千代田区街中実験」においては、大学周辺にあるビル屋上に実際にセンサノードを設置して、無線メッシュコアネットワークを構築した。このセンサノードは気象観測センサとLinuxコンピュータとで構成され、相互にSAMONプロトコルで通信することとした。このコアネットワークと信頼関係にある歩行者の持つウェアラブルコンピュータとで通信をし、歩行者にデータを提供可能であることも確認された。また、歩行者自身をセンサとみなし、歩行者の傘の開閉をにわか雨信号として、コアネットワークを通して情報配信が可能であることも確認された。以上、学内、学外の2つの実験を通して、3年間の本研究で開発した方式を実証することができた。
微生物の段階的連続培養による農水産有機廃棄物の脱重金属と資源化

農水産業及びその加工業において排出される非可食部(組織)には,タンパク質や核酸類,あるいは脂質等の有用生理活性物質が含有されるものの,同時にカドミウムをはじめとする多種多量の有害重金属も存在するため,飼肥料などへの転換が困難であった.これを踏まえて,微生物を利用するこれら組織からの脱重金属について検討した.すなわち廃棄組織抽出液を栄養源として高タンパク質分解活性を有する土壌微生物を培養し,次いでこれに硫酸還元菌を接種して培養したところ,抽出液中に溶存する有害重金属,特にカドミウムが硫化物として沈殿した.組織中では重金属タンパク質と結合して存在するカドミウム等の重金属が,タンパク質分解活性をもつ土壌微生物群によって遊離イオンとなり,これと硫酸還元菌が生成する硫化水素とによって硫化重金属沈殿が形成され,結果的に反応系から重金属が除去される機構が推定された.農水産業及びその加工業において排出される非可食部(組織)には,タンパク質や核酸類,あるいは脂質等の有用生理活性物質が含有されるものの,同時にカドミウムをはじめとする多種多量の有害重金属も存在するため,飼肥料などへの転換が困難であった.これを踏まえて,微生物を利用するこれら組織からの脱重金属について検討した.すなわち廃棄組織抽出液を栄養源として高タンパク質分解活性を有する土壌微生物を培養し,次いでこれに硫酸還元菌を接種して培養したところ,抽出液中に溶存する有害重金属,特にカドミウムが硫化物として沈殿した.組織中では重金属タンパク質と結合して存在するカドミウム等の重金属が,タンパク質分解活性をもつ土壌微生物群によって遊離イオンとなり,これと硫酸還元菌が生成する硫化水素とによって硫化重金属沈殿が形成され,結果的に反応系から重金属が除去される機構が推定された.1.水産業において非可食部として廃棄されるホタテガイ中腸腺やイカ内臓部などは、多量のカドミウムを含有するため飼・肥料への転換が困難である状況を踏まえ、これらの組織からの微生物的カドミウム除去について検討した。廃棄組織抽出液を栄養源として土壌微生物群を培養し、次いでこれに硫酸還元菌を接種して培養したところ、抽出液中に溶存するカドミウムは硫化物として沈殿した。組織中ではタンパク質因子と結合して存在するカドミウムが土壌微生物群の分泌する酵素によって遊離状態となり、これと硫酸還元菌が生成する硫化水素とによって硫化カドミウム沈殿が形成され、結果的にこの重金属が除去される機構が推定された。2.一部地域で収穫される水稲には5ppm以上のカドミウムが含有されるため食用には不適であり、焼却処分されている現状を踏まえ、上記1.と同様に微生物を利用してカドミウムを除去することを試みた。すなわちカドミウム汚染米を主要な炭素源として土壌微生物を培養し、次いでこれに硫酸還元菌を接種して培養したところ、抽出液中に溶存するカドミウムは硫化物として沈殿した。汚染米が土壌微生物群の分泌する酵素によって糖化され、次いでタンパク質因子と結合して存在するカドミウムが土壌微生物群の分泌する酵素によって遊離状態となった後、硫酸還元菌が生成する硫化水素とによって硫化カドミウム沈殿が形成され、結果的にこの重金属が除去される機構が推定された。ジャガイモ澱粉搾粕やビート搾粕等の農産廃棄物、あるいは養殖ホタテガイなどの非可食部等の水産廃棄物を、アミラーゼやプロテアーゼを分泌する微生物で処理して可溶化した後、硫酸還元菌と共に培養した。その結果、農水産廃棄物組織内でメタロチオネインなどの高分子物質と強固に結合して存在するカドミウム等の有害重金属は遊離状態となり、さらにこれらの遊離重金属は硫酸還元菌が生産する硫化水素によって硫化金属沈殿に変換されて、これら廃棄物の脱重金属と資源化が可能であった。例えば、アミラーゼやプロテアーゼ活性を有する微生物群、及び硫酸還元菌で連続培養処理したジャガイモ澱粉搾粕を主要な栄養源として光合成細菌の1株を培養すると、各種のビタミン類が生産されて培養液中に蓄積されたが、培養液は重金属を含有しないので、これを農作物に直接投与して農作物の栄養成分を増強することが可能であった。またホタテガイやイカの内臓部などの高濃度カドミウム汚染組織を、プロテアーゼ活性を有する微生物群、及び硫酸還元菌で連続培養処理して有害重金属を除去した標品には市販飼・肥料と同程度の栄養成分が含まれ、これらを資源化することが可能であった。農水産業及びその加工業において排出される非可食部(組織)には,タンパク質や核酸類,あるいは脂質等の有用生理活性物質が含有されるものの,同時にカドミウムをはじめといる多種多量の有害重金属も存在するため,飼肥料などへの転換が困難であった.これを踏まえて,微生物を利用するこれら組織からの脱重金属について検討した.すなわち廃棄組織抽出液を栄養源として高タンパク質分解活性を有する土壌微生物を培養し,次いでこれに硫酸還元菌を接種して培養したところ,抽出液中に溶存する有害重金属,特にカドミウムが硫化物として沈殿した.組織中では重金属タンパク質と結合して存在するカドミウム等の重金属が,タンパク質分解活性をもつ土壌微生物群によって遊離イオンとなり,これと硫酸還元菌が生成する硫化水素とによって硫化重金属沈殿が形成され,結果的に反応系から重金属が除去される機構が推定された.
ミセル電解法による有機顔料薄膜の作製

1.研究目的:黙近、我々は、酸化還元能を有するフェロセンを導入した界面活性剤(1)の水溶液にフタロシアニン等の顔料を分散させ、この界面活性剤を電気化学的に酸化することにより、電極上に顔料の有機薄膜を作製できることを発見した(ミセル電解法)。その後の研究でフタロシアニン以外の顔料も薄膜化に成功し、本法が非常に有用な有機薄膜の作製法であることが明らかとなりつつある。そこで、本研究では、ミセル電解法により薄膜化できる顔料の範囲、得られる薄膜の形態、薄膜の生成条件等を検討することを計画した。2.研究実績:(i)ミセル電解法の適用範囲の検討。電解液には2mM 1,0.1M LiBrの水溶液に10-20mMの顔量を加え、10分間超音波処理後、3日間攪拌し、その上澄み用いた。薄膜は、ITOを電極として+0.5V vs.SCEで定電位電解して作製した。検討した17種の顔料のうち14種の顔料の成膜に成功した。(ii)薄膜の形態の検討。得られた薄膜のSEM写真より、これらの薄膜は粒子より構成されており、また、使用した顔料の加えた顔料のサイズおよび形状のそれらと一致していた。また、その断面写真より、これらの薄膜は均一な膜厚(約0.5-数μm)を有していることがわかった。つぎに、電解時間を変えたところ、膜厚は電解時間により制御可能であった。また、α,β,ε-CuPcの薄膜の吸収スペクトルは、相応する結晶型特有の吸収ピ-クと一致していた。以上のような実験結果より、ミセル電解法の長所として(1)水に難溶または不溶で界面活性剤溶液に分散する粒子サイズが0.5μm以下の広範囲の顔料の微粒子を容易に薄膜化できる、(2)膜形成物質を電解しないで界面活性剤のみを電解するので、膜形物質の結晶型および化学構造が変化せずにそのまま膜を形成する、(3)膜厚の制御が容易である等があることが明らかとなった。
Ｘ線ポンプ（共鳴磁気散乱）とプローブ（弾性散乱）による磁性電子雲の観測

X線共鳴磁気散乱では、干渉で磁気散乱強度を強調でき、元素や席選択的に電子遷移に関係づけた磁気情報を取り出せる。本研究では、入射と散乱X線の偏光の基底状態を円偏光オペレータで扱うことで、共鳴と非共鳴の磁性電子を同時に観測できる円偏光磁気散乱法(CP-RXMS)を開発した。両磁性電子を同時に観測できるため、内殻電子の共鳴散乱で電子をポンピングし、それと同時に弾性散乱で超交換相互作用で拡がった電子軌道を観測する手段を得た。フェリ磁性体であるガドリニウム鉄ガーネットやマグネタイトに対し、左右円偏光でのX線散乱強度の差を係数とするフーリエ合成を行い、超交換相互作用に関与する磁性電子の電子密度を求めた。当該研究の最初の年度として、原子内での共鳴効果を利用する放射光X線共鳴磁気散乱(RXMS)と非共鳴X線の弾性磁気散乱の両者に着目して、両者の磁気情報を同時に取り出す磁気構造解析法の確立を目指した。そのため、結晶内原子に属する電子がもつ磁気モーメント(磁性電子密度)を円偏光X線との係わりで考察した。実験では円偏光X線を結晶に入射し、X線の基底状態を入射側も散乱側も円偏光にとって完備性を持たせ、出射側では偏光状態で積分した散乱強度を用いる測定システムを構築した。特徴的なフェリ磁性酸化物であるガドリニウム鉄ガーネット、Gd3Fe5O12 (GdIG)を用い、(1)共鳴するFeイオンに注目したRXMSエネルギー依存測定、および(2)非共鳴のGdイオンと共鳴するFeイオンが共存する磁性電子密度分布解析を行い、有意義な研究結果を得た。また、同様のフェリ磁性酸化物であるMnフェライトについて、基礎データを収集するとともに、RXMS測定を行った。特に、RXMS実験では、X線磁気円二色性よりも高エネルギー分解能で電子遷移スペクトルが求まったことを特筆する。X線実験には、エネルギー選択的に円偏光が得られる高エネルギー加速器研究機構・放射光実験施設Photon FactoryのビームラインBL-6Cに設置された4軸型X線回折装置AFC-5を利用した。(001)カット・ダイヤモンド結晶移相子を用い、Laue配置111反射で円偏光X線を生成した。円偏光反転で非対称度のエネルギー依存を求めるとともに、磁性電子密度分布解析のために3次元反射強度を可能な限り広い逆格子空間で測定した。測定強度差から円偏光反転での結晶構造因子の差を求め、結晶構造解析により、不対電子の電子密度が求めた。以上の結果から測定法についての基本的な問題をクリアし、次のステップであるポンプ・プローブ実験に移れる状態に達したと考えている。円偏光X線を利用した実験・解析により、放射光X線共鳴磁気散乱の効果と非共鳴X線の弾性磁気散乱の効果が、同時に観測された。これにより、ポンプ・プローブを利用した磁性電子雲のピンポイント観測への道が開けつつある。磁性電子を電子遷移に関連づけて共鳴させるX線共鳴磁気散乱は、干渉で磁気散乱強度を強調するとともに、元素・電子遷移選択的に磁気情報を取り出せる特徴をもつ。本研究では、円偏光X線のもつ偏光特性を利用して、共鳴と非共鳴の磁性電子を同時に観測する円偏光共鳴磁気散乱法(CP-RXMS)を開発した。入射X線と散乱X線の偏光基底状態を円偏光オペレータで完備性を持たせることで、左右円偏光の差(非対称度ΔI/2I)を与えるX線散乱強度式に、共鳴電子および非共鳴電子からの磁気的寄与を分離して取り込むことに成功した。すなわち、共鳴散乱が起こる条件下で、共鳴および非共鳴部分に寄与するブラッグ反射を同時に観測することにより、結晶学的3次元情報を求める磁気構造解析に適用することができた。この手法を用いると、X線ポンプに対応する共鳴磁気散乱とプローブに対応する(非共鳴)弾性散乱とを同時に観測することが可能になり、超交換相互作用による磁性電子分布をも観測にかけられる。放射光X線実験にはPhoton FactoryのビームラインBL-6Cを用いた。フェリ磁性体であるガドリニウム鉄ガーネット(GdIG; Gd3Fe5O12)やマグネタイト(Fe3O4)を対象に、最初に、Fe K前吸収端で非対称度のエネルギー依存を測定した。得られたGdIGおよびFe3O4の非対称度は、サイト選択的に電子状態密度(DOS)と関係づけられた。特にGdIGの磁気応答ピークは、磁気モーメントの向きの違いから、磁気円二色性(XMCD)より見かけ上高分解能で得られた。その後、磁気的な電子遷移が起こる波長で、数十数百個のブラッグ反射に対し、左右それぞれの円偏光で3次元積分反射強度を収集した。非対称度を電子遷移と関係づけ、散乱強度の左右円偏光での差を係数とするフーリエ合成を行い、磁性電子密度を求めた。

フェリ磁性体であるガドリニウム鉄ガーネットやマグネタイトに対し、左右円偏光でのX線散乱強度の差を係数とするフーリエ合成を行い、超交換相互作用に関与する磁性電子の電子密度を求めた。電子を内殻から調べたい電子軌道へと跳ね飛ばすポンプ役を共鳴磁気散乱に担わせ、X線弾性散乱(トムソン散乱)をプローブとして、跳ね飛ばされた電子が係る磁性電子雲をピンポイントで観測することを目指す。固体物理・X線結晶学平成27年度の実験・解析には、放射光実験施設に設置した既存の移相子ゴニオメータや4軸型X線回折装置を利用することで当初予想より節約することができた。また、研究結果がまとまったのが年度末であり、主要な学会発表等を平成28年度に予定している。その上で、次年度の実験には新規開発の要素が多く、研究全体の実現度を考えると次年度へ使用額をシフトした方が良いと判断した。エネルギー分解能に問題がないことはわかったが、速い反応を追うことになるため、弱い散乱強度を測定する点で工夫する必要があり、精密測定を見越したX線計測システムの開発に尽力する。
選択的抗癌システムを目指した細胞内動態の分子シンクロナイゼーション

平成14年度は,オクタアルギニンとステアリルオクタアルギニンの細胞内導入機構および,遺伝子との複合体の細胞内導入機構について解析した.オクタアルギニンはエンドサイトーシスを介さずに細胞内へ移行することが明らかとなった.ステアリルオクタアルギニンはエンドサイトーシスで細胞内に移行した.これらを遺伝子との複合体にすると,いずれもエンドサイトーシスにより細胞内へ移行した.遺伝子とオクタアルギニンとステアリルオクタアルギニンの複合体の粒子径とゼータ電位を測定すると,粒子径はそれぞれ100nm,120nmでゼータ電位はそれぞれ,10mV,20mVであり,大きな違いは見られなかったが,オクタアルギニンの方が強固なパッケージングであると予想した.ところが,原子間顕微鏡により粒子の形状を観察したところ,ステアリルオクタアルギニンの方がより精密なパッケージを形成していることが明らかとなった.このことは,ステアリルオクタアルギニンの高い遺伝子発現効率の主要因と考えられた.本研究は,リポソームに,臓器レベル,細胞レベル,オルガネラレベルで正常細胞と耐性癌細胞とを識別する能力を有する分子を設計し,各プロセスが分子レベルでシンクロナイズすることにより相乗的に抗腫瘍効果を発揮する殺細胞キャリアーシステムの開発する.その基本戦略として,1)臓器レベルでの識別:血中滞留性リポソーム(LCL)を用いることにより癌組織への選択的送達2)細胞レベルでの識別:LCLをリガンドで修飾⇒細胞内で内在化⇒汲み出しポンプからの回避3)オルガネラレベルでの識別という,3段階の各ステップで正常細胞と(耐性)癌細胞を識別し,強力な選択毒性を発揮せしめる.平成13年度は,癌細胞標的化リガンドの分子シンクロナイゼーションの最適化を中心に検討した.(1)リガンド修飾リポソームによる癌細胞標的化の最適化:耐性癌細胞に選択的に発現している細胞表面レセプターを標的とし,トランスフェリンレセプターにより標的化と最適化を行った.(2)細胞内動態における分子シンクロナイゼーションの最適化:二木博士(京大・化研)との共同研究により,エンドソーム膜融合能を有するGALA誘導体をリポソームに付与し,細胞質への放出効率を促進することに成功した.(3)フリーの抗癌剤とリポソーム封入型抗癌剤で抗腫瘍のメカニズムが変化するか否かを検討する.抗癌剤として,北大大学院薬学研究科の松田らが設計したECydについても検討を行い,細胞系では濃度依存性であること,in vivo系では時間依存性を示すことを明らかにした.平成14年度は,オクタアルギニンとステアリルオクタアルギニンの細胞内導入機構および,遺伝子との複合体の細胞内導入機構について解析した.オクタアルギニンはエンドサイトーシスを介さずに細胞内へ移行することが明らかとなった.ステアリルオクタアルギニンはエンドサイトーシスで細胞内に移行した.これらを遺伝子との複合体にすると,いずれもエンドサイトーシスにより細胞内へ移行した.遺伝子とオクタアルギニンとステアリルオクタアルギニンの複合体の粒子径とゼータ電位を測定すると,粒子径はそれぞれ100nm,120nmでゼータ電位はそれぞれ,10mV,20mVであり,大きな違いは見られなかったが,オクタアルギニンの方が強固なパッケージングであると予想した.ところが,原子間顕微鏡により粒子の形状を観察したところ,ステアリルオクタアルギニンの方がより精密なパッケージを形成していることが明らかとなった.このことは,ステアリルオクタアルギニンの高い遺伝子発現効率の主要因と考えられた.
野生植物由来のアルミニウム高耐性遺伝子群の単離と重金属ストレス耐性等への応用

野生植物メリケンカルカヤやススキのアルミニウム(Al)耐性機構について解析した。さらに前者より、Alストレス誘導性遺伝子群の単離を試みた。その内の1つは、ABC transporter遺伝子で、酸化ストレスや重金属処理でも誘導された。一方Alストレスを含む多種のストレスに耐性となる遺伝子の単離も試み、S-adenosyl methionine sysnthetase遺伝子が得られた。これを導入した酵母形質転換体はAl、Zn、diamideに耐性を示した。現在、これら2つの完全長cDNAが単離された。今回は特にAl、重金属などの金属ストレスや酸化ストレスに対する植物の耐性機構について分子遺伝学的手法を用いて以下の点について研究した。Finger printing法により、上記の2つの植物からA1誘導生遺伝子の候補群を単離した。これまでに各々から最終的に16個と9個の候補クローンを得た。これらの内、メリケンカルカヤの分についてA1ストレス下での発現量をRT-PCR法で解析した。その結果、7クローンに関しては確かな発現誘導性を確認できた。ススキについても検討を試みたが、得られたRNAサンプルの精製度が悪く確認にまで至っていない。2)メリケンカルカヤからのA1ストレス耐性遺伝子群の直接単離上記の誘導性遺伝子群からの間接的選抜のみならず、直接的な耐性遺伝子の単離も試みた。今回は、A1処理を施したメリケンカルカヤ由来のmRNAを用いてcDNAライブラリーを構築し、この中から酵母のスクリーニングシステムを使って耐性遺伝子の選抜を試みた。5つの候補遺伝子が得られたが、再現よく耐性をしめしたのは2候補(#3A-4,#5B-2)であった。DNA配列を決定した結果、前者はS-adenosyl methione sysnthetase(SAMS)をコードしていたが、後者は機能未知の蛋白質と思われた。今後SAMSの耐性機構との関わりについて検討していく予定である。3)両植物を用いたA1処理によるプロリンの合成量の検討重金属ストレスや酸化ストレスでは、生育阻害の現われのためプロリンの合成量が上昇することが知られている。A1ストレスにおける合成量を検討した結果、両植物では少ないことが判明した。A1耐性であることとよく一致している。今後、感受性植物シロイヌナズナでの合成量も検討する予定である。4)両植物を用いたA1処理による蛋白質合成量の検討2次元電気泳動法によるストレス誘導型蛋白質群や抑制型蛋白質群の生成状況を検討し始めた。今後、特に誘導性蛋白質群については、耐性遺伝子単離に向けて活用する計画である。1)重金属集積植物の解析重金属を高集積するような耐性植物を選抜、検索するために、メリケンカルカヤ、ススキ、イヌビエなどの6種の野生植物に対してCd,Cu,Znなどの重金属ストレスを付加し、植物体内への集積の状況や同時に発生する酸化ストレス(脂質酸化物の蓄積)の状況を経時的に測定している。現在も継続して解析中である。2)ケリケンカルカヤの示す多種のストレス耐性機構の解明メリケンカルカヤは、Al,Znなどの金属ストレスやH_2O_2、diamideなどの酸化ストレスに対して耐性を示す。そこでこの多種耐性機構に関連すると考えられる遺伝子群の単離と解析を試みた。まずAlストレスを付与したメリケンカルカヤから全RNAを抽出し、逆転写によりcDNAを調製しcDNA libraryを構築した。さらにlibraryからAl,Cd,Zn.diamide,H_2O_2等に耐性を示すクローンの単離を行った。その結果、其々のストレスに対していくつかのクルーンが得られたので、さらにその耐性について再現性を確認した。さらに挿入されていたcDNA断片に関して塩基配列を決定し、その機能の推定を行ったところ、AL3A-4クローンについては、SAMS(S-adenosyl methionine synthetase)遺伝子であることが明らかとなった。しかし、残りのクローンついてunknown proteinであった。SAHS遺伝子の完全長cDNAを得て、これを導入した酵母形質転換体についても感受性試験を行った。その結果、この形質転換体も金属ストレス、酸化ストレスに広範囲に耐性を示した。3)メリケンカルカヤやススキ由来のAl誘導性遺伝子群からの多種ストレス耐性遺伝子の単離これら2つの植物より既にAl誘導性遺伝子を8クローン単離していたが、これらがAlを始めとする上記の多種ストレスに対して耐性を示すかを検討した。2つのクローンを持った酵母形質転換体が酸化ストレスに耐性を示したが、他のクローンはどのストレスにも影響を与えることは無かった。これら2つは、ストレス誘導性であり、且つ酸化ストレス耐性であると考えられる。塩基配列情報からは、それらの機能の推定はできなかったが、来年度も継続して解析する。野生植物のメリケンカルカヤは、Al、重金属、酸化等のストレスに広く耐性を示す。その耐性機構を解明し、他の植物に応用できれば問題土壌への植物作付けが可能となり農業上大変有益である。

このような観点から以下の基礎研究を進めた。1) Al耐性機構に関する生理学的解析まずAl処理した根と地上部の中のAl含有量を測定した。その結果、土壌から吸収した毒性Alを根に過剰蓄積しないように地上部へ輸送することが耐性となる要因の1つであることが示された。また、地上部に輸送されたAlは、葉の表面のトライコームに集積しやすいことも明らかにし、葉の表面から外界へ排出される可能性を示唆した。また、メリケンカルカヤなど5種類の野生植物を用いてAl、Zn、Cr金属ストレスにおける根から地上部への毒性金属の輸送についても比較した。その結果、Alでのみメリケンカルカヤで地上部への高い輸送活性が見られた。2)ストレス特異的なNO(nitric oxide)の生成についてAlを含めた金属ストレスや温度ストレス下にあると応答の1つとしてNOを生成する植物がある。そこでNO特異的なDAF-FMを用い、メリケンカルカヤの根でもNOが発生することを確認した。またNOの発生阻害剤で予め処理した後にAl処理してみると、Al処理にも関わらずNOの発生や酸化ストレスの生成が抑制された。これは、3者間の強い関連性を示しており、NOの生成は毒性機構の現われであると同時に、抗酸化作用を引き起こすことへ繋がる重要な現象と考えた。3) Alや多種のストレスに応答する遺伝子群の分子遺伝学的解析メリケンカルカヤより、Alストレス誘導性遺伝子群や耐性遺伝子群の単離も試みた。前者の1つとしてABC transporter遺伝子を得たが、Al、diamideによって根で誘導されるものの、Cd、Zn、過酸化水素にはむしろ根で逆に発現抑制が見られ、異なる応答を示した。また、後者の1つとして、S-adenosyl methionine sythetase(SAMS)遺伝子を得た。現在両者の完全長ORFが単離された。
高齢者の施設における生活水準と長期ケアへの適応に関する研究

本研究は平成11年度-12年度の2年間の研究であるが、平成11年度においては、佐賀県下における特別養護老人ホーム(特養)と老人保健施設(老健)の要介護高齢者に対し、施設での生活水準と長期ケアへの適応を捉えるために、身体機能(FIM)、QOL(SF-36),生活満足度調査(LSQ)を実施し、施設生活の再評価を行った。特養では、FIMとSF-36の相関は見られず、身体機能は低いがSF-36の値は高く、それはさらに老健よりも高く、生活面を重視したケアが中心の特養の要介護高齢者が身体機能の回復を重視し、家庭復帰を目指す老健よりも適応度が高いという傾向が見られた。平成12年度における研究の重点は、平成12年4月1日から施行された介護保険法に注目し、介護保険施行後再認定の時期(10月)にversion upした調査を特養、老健で実施し、施設における生活水準とと適応について分析することであった。生活水準のLSQの生活部分は「特別養護老人ホーム・老人保健施設のサービス評価基準」に準拠しているため、介護保険前後の両施設における高齢者の調査結果を比較分析することによって生活水準の評価を行うことができた。平成12年の調査では、FIMによる身体機能は特養と老健の格差が縮まり、SF-36によるQOL評価では老健で高得点化傾向が見られた。施設への適応度は、介護保険以前においては特養が高く老健が低いと評価されたが本調査によって、介護保険施行後はそれぞれの特異な差が一段と縮小していくのではないかと推測することができる。それは、老健が長期ケア型にシフトし、長期ケアについては特養との差異が見られなくなりつつあることが大きな要素である。特養のみならず両施設共に、Helsonの「適応レベル説(adoption level theory)」がより顕著に現れてくるのではないかと考えられる。本調査においても適応レベル説が適用できる初期的段階が窺われ、要介護高齢者の施設における長期ケアへの適応は、SF-36、FIMで測定した身体機能以外の要因が強く働いているといるということが分かった。すなわち、HRQOLを規定する要因としてSF-36、FIMの結果はあまり影響を与えず、期間と生活環境がHRQOLを変化させ、従って適応レベルが健康期、要介護期さらに年齢生活環境によって変化してきているものであることが本研究により明らかにされた。生活水準の主要な規定要因は、意思の表明とその受容の程度であり、それは、施設ケアを受ける期間の長短との密接な関連があることも本研究により得られた成果である。1999年度は、虚弱高齢者がケアを受ける特別養護老人ホーム、老人保健施設の高齢者の生活水準・クオリテイ・オブ・ライフ(QOL )が果たして保たれているかどうかということを捉えるために、高齢者の身体機能、衣食住、医療など生活環境、施設生活の生活満足度等について調査し、施設ケアの再評価を行った。

調査はFIM、SF-36および独自に考案したLSQにより、佐賀県内の特別養護老人ホームと老人保健施設居住高齢者200名中、1ヵ月以上の居住者で自立したコミュニケーション力がある高齢者83名を対象とした。老人保健施設ではFIMとSF-36の身体機能(PF)は強い相関を示し、特別養護老人ホームではFIMとSF-36の身体機能(PF)とはほとんど相関がみられず、FIMとSF-36の体の痛み(BP)とに相関を認めた。特別養護老人ホーム居住者はFIMによる身体機能の評価は低いものの、QOLの尺度であるSF-36のスコアは高く、SF-36のサブスケールにおいて、特別養護老人ホームのスコアが老人保健施設より高かった。特にハイスコアであったおしゃれスコアでは、特別養護老人ホーム居住者は、SF-36との相関を認めた。老人保健施設入所者のSF-36は身体機能(PF)、体の痛み(BP)についてのスコアが高かった。老人保健施設においては、身体機能の回復、緩和を重視したサービスの提供、身体機能の低下に伴う精神的ストレスや社会的役割喪失へのケアがQOLに影響し、特別養護老人ホームにおいては、身体的側面より生活面における自由意志の尊重が自己実現の一部分を形成すること、両施設の機能の差異と居住期間の違いにより生活満足度には差異がみられること、医療サービスの充実度などがQOL向上に関わるということが今回の研究によって明らかにされたことである。次年度は多数の施設および在宅虚弱高齢者に対するFIM、SF-36、SLQバージョンアップ版による調査の実施によって虚弱高齢者のQOL測定方法・基準を検討する。本研究は平成11年度-12年度の2年間の研究であるが、平成11年度においては、佐賀県下における特別養護老人ホーム(特養)と老人保健施設(老健)の要介護高齢者に対し、施設での生活水準と長期ケアへの適応を捉えるために、身体機能(FIM)、QOL(SF-36),生活満足度調査(LSQ)を実施し、施設生活の再評価を行った。特養では、FIMとSF-36の相関は見られず、身体機能は低いがSF-36の値は高く、それはさらに老健よりも高く、生活面を重視したケアが中心の特養の要介護高齢者が身体機能の回復を重視し、家庭復帰を目指す老健よりも適応度が高いという傾向が見られた。平成12年度における研究の重点は、平成12年4月1日から施行された介護保険法に注目し、介護保険施行後再認定の時期(10月)にversion upした調査を特養、老健で実施し、施設における生活水準とと適応について分析することであった。生活水準のLSQの生活部分は「特別養護老人ホーム・老人保健施設のサービス評価基準」に準拠しているため、介護保険前後の両施設における高齢者の調査結果を比較分析することによって生活水準の評価を行うことができた。平成12年の調査では、FIMによる身体機能は特養と老健の格差が縮まり、SF-36によるQOL評価では老健で高得点化傾向が見られた。施設への適応度は、介護保険以前においては特養が高く老健が低いと評価されたが本調査によって、介護保険施行後はそれぞれの特異な差が一段と縮小していくのではないかと推測することができる。それは、老健が長期ケア型にシフトし、長期ケアについては特養との差異が見られなくなりつつあることが大きな要素である。特養のみならず両施設共に、Helsonの「適応レベル説(adoption level theory)」がより顕著に現れてくるのではないかと考えられる。
トウモロコシ葉PEPカルボキシラ-ゼ遺伝子発現の窒素による制御機構

窒素ストレス下で生育したトウモロコシ幼植物に窒素源を補填し、その完全に展開した最も若い葉の基部、すなわち、成熟中の光合成細胞について、ストレス回復過程における代謝中間体、酵素活性、タンパク質およびmRNAの解析を基に以下の研究成果を得た。(A)PEPカルボキシラ-ゼ(PEPC)の優先的な蓄積は窒素の栄養状態に応答し、一義的には転写段階で制御される。この遺伝子発現を誘導する窒素栄養状態を解析し、グルタミン(またはその下流代謝産物)がこの遺伝子発現を制御するシグナルとなることを明らかにした。さらに、グルタミンの蓄積を制御する代謝的な要因を探索し、その蓄積は窒素ストレスからの回復過程で生ずるグルタミン合成酵素とグルタミン酸合成酵素の活性比の変動に起因することを強く示唆する結果を得た。(B)窒素ストレス植物の切取り葉における窒素に依存したPEPC遺伝子の発現には、窒素源に加えてゼアチンが必須であることを明らかにした。この植物ホルモンの効果の特異性を検討し、サイトカイニンが特異的なであることを立証した。(C)PEPCと同様にこの植物の葉肉細胞サイトソルに局在し核遺伝子の支配を受け、PEPCに基質HCO_3ーを供給するカルボニックアンヒドラ-ゼ(CA)の遺伝子発現の挙動を解析した。その結果、これら両酵素は同一または類似のしくみによって窒素に依存した発現制御を受け、それらの遺伝子は整合的に発現することを明らかにした。(D)この植物の光合成細胞のサイトソルに局在するグルタミン合成酵素(GSI)の窒素による遺伝子発現制御を解析した。この酵素のmRNA蓄積は窒素の栄養状態とは無関係に一定であることが明らかになった。このことは窒素依存の遺伝子発現が少なくともPEPCとCAに特異的であることを示すものである。1.トウモロコシ幼植物の窒素欠乏からの回復過程にある展開葉の基部、すなわち成熟中の細胞領域を用い実験を行い、以下の研究実績を得た。1)窒素源として硝酸塩の他にアンモニウム塩もPEPカルボキシラ-ゼ(PEPC)遺伝子の転写を誘起することが明らかになった。2)植物生育の昼または夜に硝酸塩を補填し、その12時間後に単離核を得て、PEPC遺伝子の転写活性を測定したところ、いずれの場合にも転写活性は増加したが、昼に補填したものにおいてより大きな促進がみられた。この転写反応の日周リズムは主として硝酸塩吸収の昼夜におけるものと判断された。3)切除葉による転写反応解析のバイオアッセイ系を確立し、窒素源または代謝中間体などを吸収させ、転写反応ならびにmRNA蓄積の変動を調べた。その結果、窒素源、グルタミンまたはグルタミン酸を加えることにより、PEPC遺伝子の転写が促進されるとともに、そのmRNA蓄積が認められるが、それにはzeatinをはじめとするサイトカイニンの共存が不可欠であることが判明した。4)窒素回復過程においてグルタミンとグルタミン酸の蓄積と並行しPEPC遺伝子の転写活性が増大するとともにmRNAの蓄積も増加することが明らかになった。5)窒素回復過程ではPEPC遺伝子発現の促進と並行してフェレドキシン依存型グルタミン酸合成酵素(FdーGOGAT)の活性が増大することが明らかにされたため、両者の遺伝子発現の相関を解析にむけてトウモロコシFdーGOGATのcDNAを単離し、その塩基配列を決定した。6)以外のC_4酵素であるカルボニックアンヒドラ-ゼ活性がPEPCと同様に窒素により選択的に制御されることを明らかにした。2.NADーリンゴ酸酵素型のC_4酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼについて遺伝子発現の窒素による制御様式を調べるため、この酵素をシコクビエから精製し、その特異抗体の作製に成功した。

窒素ストレス下で生育したトウモロコシ幼植物に窒素源を補填し、その完全に展開した最も若い葉の基部、すなわち、成熟中の光合成細胞について、ストレス回復過程における代謝中間体、酵素活性、タンパク質およびmRNAの解析を基に以下の研究成果を得た。(A)PEPカルボキシラ-ゼ(PEPC)の優先的な蓄積は窒素の栄養状態に応答し、一義的には転写段階で制御される。この遺伝子発現を誘導する窒素栄養状態を解析し、グルタミン(またはその下流代謝産物)がこの遺伝子発現を制御するシグナルとなることを明らかにした。さらに、グルタミンの蓄積を制御する代謝的な要因を探索し、その蓄積は窒素ストレスからの回復過程で生ずるグルタミン合成酵素とグルタミン酸合成酵素の活性比の変動に起因することを強く示唆する結果を得た。(B)窒素ストレス植物の切取り葉における窒素に依存したPEPC遺伝子の発現には、窒素源に加えてゼアチンが必須であることを明らかにした。この植物ホルモンの効果の特異性を検討し、サイトカイニンが特異的なであることを立証した。(C)PEPCと同様にこの植物の葉肉細胞サイトソルに局在し核遺伝子の支配を受け、PEPCに基質HCO_3ーを供給するカルボニックアンヒドラ-ゼ(CA)の遺伝子発現の挙動を解析した。その結果、これら両酵素は同一または類似のしくみによって窒素に依存した発現制御を受け、それらの遺伝子は整合的に発現することを明らかにした。(D)この植物の光合成細胞のサイトソルに局在するグルタミン合成酵素(GSI)の窒素による遺伝子発現制御を解析した。この酵素のmRNA蓄積は窒素の栄養状態とは無関係に一定であることが明らかになった。このことは窒素依存の遺伝子発現が少なくともPEPCとCAに特異的であることを示すものである。
GRPはなぜ重篤な果物アレルギーを引き起こすのか

果物アレルギーは、子どもに多い卵や牛乳のアレルギーと異なり、成長してから発症し、さらには対象となる果物が増えていくという特徴を持っている。申請者は代表的な植物アレルゲンであるLipid Transfer Protein(LTP)の研究過程で、新規アレルゲンGibberellin Regulated Protein(GRP)を発見した。本研究では、両者を明確に分離し、アレルゲンタンパク質としての特徴を明らかにする。「GRPがなぜ重篤なアレルギーを引き起こすのか」、という謎を解くことが、難解な果物アレルギーの作用機序を正しく理解する近道であり、診断・治療・予防への道筋を開くと考えている。
廻船ルートで栄えた日本海沿岸（北陸～東北地域）町家の建築構法・建築文化の継承

初年度は北陸地域の中でも内部空間調査を行っていなかった滑川や岩瀬浜などの再確認を行った。北陸エリアについてはほぼ調査を終了し、今後は追調査程度かと思われる。実施計画では,その後、福井県エリアの調査を行う計画であったが、先に山形県エリアの事前調査を行った。酒田市内の大火を免れた地域を中心に目視調査・写真撮影を行った。酒田市内で、せがい造りの町家は少なく、平入りの屋根形状より入母屋などが多く見られた。また、飛島という酒田から1時間ほどの小さな島にある港町の町家では、多層梁(多段梁り)や二階の妻面が出し桁で構成される珍しい構法が見られた。妻面出し桁は、56件現存している。今後この調査も継続したいとか考える。この構法は酒田市内でも数件見られたことから、通常は軒側に張り出す構法が、妻側から桁が出て屋根を支えている珍しい構法感じるに。これも片持ち梁のひとつの手法としてとらえることが出来ると考えられる。理由北陸エリアで一定の調査が終わり、酒田エリアを先に調査を開始した。せがい造りの構法が東北地方に直接伝承されていないようにも思われ、秋田まで目視調査をし確認したい。それにより、せがい造りの北限が新潟地域の村上地域と推測されそうである。このあたりを本年度探りたい。福井地域と研究年度は異なるが全体ではおおむね順調に研究が進展していると考える。今後、福井エリアについても先に目視調査・事前調査を行いか廻船ルートのつながり、伝承を再確認したい。それにより、福井石川富山新潟山形の全体像を探りたい。ダイナミックな研究であるが、今後全容の解明が進められそうである。研究はおおむね順調に進んでいるが、福井エリアの事前調査などの旅費や酒田エリアの実測調査を中断し、近隣の目視調査を優先したため、謝金なども予定より低額で推移した。それらから、文献調査を行い活動費が抑えられたため、差異が生じた理由である。
間葉系幹細胞とαリン酸三カルシウムを用いたイヌ顎裂骨再生部への矯正学的歯の移動

β-TCPに比較して吸収性に優れていることから今回α-TCPを移植材料として選択したが、骨再生が起こるまで移植部に移植細胞を留めておく事が困難であり、α-TCPの易感染性のために今後さらなる検証が必要であるが口腔内に使用する移植材料としては適さないことが示唆された。近年急速に発展している再生医療に注目し、我々の研究室では顎顔面領域で最も発生頻度の高い口唇裂口蓋裂の骨欠損部の骨再生を試みてきた。Scaffold(足場)にβ-リン酸3カルシウム(β-tricalcium phosphate : β-TCP)を使用し腸骨由来間葉系幹細胞(MSCs)を播種したものを移植したところ、術後10週から13週にかけて骨再生が起こって骨の連続性が回復し、骨密度を上昇させることに成功した。しかしβ-TCPは骨欠損部の再建に使用する材料としては非常に優れているものの生体吸収性にやや難があるため、より生体吸収性の高いα-リン酸3カルシウム(α-tricalcium phosphate : α-TCP)を用いて骨再生を試み、再生された骨内へ歯科矯正学的に歯の移動を行うことで、再生骨が咬合圧に耐え歯槽骨として機能しうるかを解析するとともに、移動を行った歯の歯根の状態・歯根吸収の有無・scaffoldの残存との関係を確認することで再生骨が臨床応用可能かを検討することを目的とする。本年度は人工的顎裂部にすでに成功しているβ-TCPと同様にα-TCPを用いても骨再生が行えるように、α-TCP内での幹細胞の最適な培養期間と細胞数を検討することを目的とした。使用予定のα-TCP内に1.0x10^7cell/mm^3細胞を播種し5,10,15,20日と培養期間を設定し最適な培養期間を検討した。培養期間が10日を越えると、徐々に細胞の活性が低下しα-TCP内で細胞の減少が生じてしまった。長期の培養は本研究には向かず、さらに短期間での培養が必要であると考えられた。また並行して、同じα-TCPに細胞数の異なる0.5x10^7cell/mm^3、1.0x10^7cell/mm^3、2.0x10^7cell/mm^3の幹細胞を播種し培養することにより骨再生に最適な細胞数を検討した。2.0x10^7cell/mm^3の幹細胞では培養液がα-TCP内に行き渡らず活性が低下し、0.5x10^7cell/mm^3の幹細胞ではα-TCP内全体に幹細胞が播種できなかった。これらの結果により臨床応用を考慮した際、必要充分な量の幹細胞を可及的に組織障害が少なく採取することが可能になり、患児の負担の軽減につながると考えられる。本年度は前年度に決定した細胞数および細胞培養期間にて培養したα-TCPとMSCsを移植し、顎裂部に骨再生が生じる事を確認した後、歯の移動の開始時期を決定することから検討した。最適な歯の移動時期がわかることにより、より早期に安全に歯の移動を行うことができ、長期的に安定した歯列咬合を獲得できる点で非常に有用である。まずイヌ2頭に対してこれまでβ-TCPで行っていたのと同様の方法で、間葉系幹細胞とスキャホールドであるα-TCPを用いて上顎骨の骨欠損部位に骨再生を試みた。移植用の間葉系幹細胞は実験動物の腸骨より採取し、培養後にα-TCPに播種して用いた。間葉系幹細胞は継代培養後、スキャホールド内に1.0×10^7cell/cm^3の細胞密度で播種し分化誘導培地で14日間培養することで骨芽細胞方向への分化を誘導し、実験動物の顎裂部に移植した。移植後2週間目で2頭ともに術部感染が認められた。経時的にエックス線写真撮影を行ったところ、1頭に関しては術後2週目で、もう1頭に関しては術後4週目で移植材料の消失が観察された。術後感染が移植失敗の原因であると考え、術前術後の消毒方法と食事を見直し、再度イヌ2頭について移植を行ったが、術部粘膜は感染症状を認められなかったにもかかわらずエックス線写真では移植材料の消失が生じた。移植を行った4頭とも移植後15週経過時まで観察を行ったが、骨再生は認められなかった。
柿タンニンの胆汁酸吸着物質としての性質および生体内エネルギー代謝への影響

柿の品種間での胆汁酸活性の違いを検討し、胆汁酸吸着活性と縮合タンニン含量に正の相関があることを明らかにした。最も高い胆汁酸吸着活性を有する品種である蜂屋柿から柿タンニンを調製し、2型糖尿病モデルマウスに高脂肪食を摂取させる実験系においてその機能性を検討したところ、柿タンニンは脂質異常症および糖尿病に対し予防効果を示し、褐色脂肪組織において脱共役タンパク質の発現上昇を誘導することが明らかになった。4種類の柿(富有柿(完全甘)、平核無柿(不完全渋)、四溝柿(完全渋)、蜂屋柿(完全渋))の未成熟果実から柿タンニンを抽出し、胆汁酸吸着能について調べた。乾燥果実からの各柿タンニン抽出量は蜂屋柿>四溝柿=平核無柿>富有柿であり、胆汁酸吸着能は蜂屋柿=四溝柿>平核無柿>富有柿であった。各未成熟果実乾燥粉末の胆汁酸吸着活性が蜂屋柿>四溝柿>平核無柿>富有柿であることから、柿未成熟果実の胆汁酸吸着能の強さは柿タンニンの量と種類に影響されていると考えられた。続いて活性の最も高かった蜂屋柿由来の柿タンニンを用いて動物実験を行った。2型糖尿病モデルマウスNSY/Hos系統とKK/Ta系統に柿タンニンを1%混ぜた高脂肪飼料を8週間摂取させたところ、KK/Ta系統はヘモグロビンAlcの著しい増加など、特徴的な糖尿病病変を示したが、柿タンニンだけでなくポジティブコントロールである医薬品のコレスチラミンも糞中への胆汁酸排泄促進効果を示さず、血中コレステロール等への影響も全く見られなかった。このことから、胆汁酸吸着剤の機能性評価にはKK/Ta系統は不適であると考えられる。一方、NSY/Hos系統では柿タンニンの摂取により糞中への胆汁酸排泄が促進され、血漿脂質濃度および血漿インスリン濃度が非摂取群に比べ有意に低く、さらに脂肪肝の予防効果を示した。また、柿タンニン摂取により、肝臓ではコレステロール代謝系の遺伝子が増加し、褐色脂肪組織では脂肪酸燃焼に関係する遺伝子およびタンパク質の発現が増加していた。このことから、褐色脂肪組織における脂肪酸の燃焼促進が柿タンニンの脂質代謝改善効果に寄与していることが示唆された。本年度は柿タンニンの胆汁酸吸着剤としての性質を明らかにするために、医薬品である胆汁酸吸着剤「コレスチラミン」と柿タンニンの性質を比較した。In vitro胆汁酸吸着活性および10日間摂取による胆汁酸排泄促進効果の検討結果から、柿タンニンはコレスチラミンの7割程度の胆汁酸吸着活性を有することが明らかになった。続いて、高脂肪食にコレスチラミン1%、柿タンニン1.5%を添加した飼料を2型糖尿病モデルマウスに摂取させることにより、脂質代謝および糖代謝への影響を検討した。試験開始後10週目の糞中胆汁酸排泄効果はコレスチラミンの方が有意に強かったため、長期間の投与では柿タンニンは消化管内で胃酸や腸内細菌のタンナーゼによる分解を受け、その結果胆汁酸吸着活性がコレスチラミンより有意に低くなったものと考えられる。一方、コレスチラミンより胆汁酸排泄促進効果が弱かったにもかかわらず、血中コレステロール上昇抑制効果および血中遊離脂肪酸上昇抑制効果についてはコレスチラミンより柿タンニンの方が強いという結果が得られた。これは、柿タンニンが分解を受けた際に生じるカテキンが影響しているのではないかと思われる。また、血糖値、尿糖値、HbA1cを検討した結果、2型糖尿病予防効果に関してはコレスチラミンの方が柿タンニンよりも強いという結果が得られた。胆汁酸排泄の促進はGLP-1を介した経路で2型糖尿病を予防することが明らかになっており、胆汁酸排泄促進効果の差が2型糖尿病予防効果の差として現れたと考えられる。以上の結果から、柿タンニンは消化管内で分解を受けるものの、胆汁酸吸着剤としての機能を発揮し、特に脂質代謝を改善する性質を有することが明らかになった。
電極集積化マイクロ流体デバイスとDNA増幅による細菌の迅速・高感度・現場分析

本研究では電極集積化マイクロ流体デバイスをプラットフォームとする細菌の迅速・高感度・現場分析法の開発を目指して研究を進めた。ミクロ交流電場を用い、マイクロ流路内で試料を濃縮するための基礎検討を行った。ローリングサークル増幅法を用い、細菌を培養せずそのDNAを増幅・検出する原理を実証した。反応系にポリエチレングリコールを加えることで産物数が増大し高感度検出が実現できることを示した。本研究は微細加工技術により作製したマイクロ流体デバイスをプラットフォームとし、電気化学的手法とDNA増幅法を組み合わせ、細菌を迅速・高感度・現場分析する手法の開発を目的としている。本年度はまず、流路内に電極を集積化したマイクロ流体デバイスの作製について検討した。ガラス基板にマイクロ電極を、ポリジメチルシロキサン基板にマイクロ流路パターンを作製し、これらを直接貼り合わせてデバイスとした。流路に溶液を導入したところ、漏れなどは見られず、デバイスを設計通りに作製できた。電気化学的手法については、ミクロ交流電場を利用する流体駆動・試料濃縮に関する基礎検討を行った。DNA増幅については、Rolling Circle Amplification(RCA)法によるDNA増幅・検出の基礎検討に取り組んだ。まず、N-ヒドロキシスクシンイミド修飾アガロースマイクロビーズにアミノ基修飾プライマーDNAを固定した。修飾後のビーズに、padlock probeと呼ばれるオリゴDNA、及びT4リガーゼを加えて反応させ、padlock probeを環化させたのち、phi29ポリメラーゼを用いてRCA産物(プライマーDNAが伸長されてできた長鎖一本鎖DNA)を得た。その後、RCA産物に相補的な配列を有する蛍光標識オリゴDNAを加えてハイブリダイズさせたのち、蛍光顕微鏡でビーズを観察した。結果、RCA産物に由来する直径1マイクロメートル程度の蛍光輝点をビーズ上に多数観察でき、RCA法によるDNA増幅及び検出に成功した。DNA染色試薬であるSYBRGreenを用いたRCA産物の検出にも取り組んだが、ビーズへの非特異吸着が多く、検出は困難であった。本研究では、微細加工技術により作製したマイクロ流体デバイスをプラットフォームとし、電気化学的手法とDNA増幅法を組み合わせ、細菌を迅速・高感度・現場分析する手法の開発を目的としている。本年度はまず、マイクロビーズ上でのRolling Circle Amplification (RCA)法によるDNA増幅・検出の高感度化に取り組んだ。前年度に基礎検討を行い、RCA法の原理を実証した。しかし従来法では検出効率が1%程度であるため、これを向上させることで従来よりも低濃度のDNAを検出できると考えた。そこで反応系にポリエチレングリコール(PEG)を加え、分子クラウディング効果によってDNAや酵素が反応しやすい環境とし、RCA法の反応効率を向上させることとした。結果、PEGの添加に伴いRCA反応の産物数が増加した。PEGの分子量及び濃度と産物数の関係を調べ、産物数が最大となる最適濃度が存在すること、および分子量が大きいほど最適濃度が低下することを見出した。過去の研究において、分子クラウディング環境でDNAの連結・伸長反応が促進され、かつ最適濃度が存在すると報告されていることから、おそらくは本研究においても分子クラウディング効果によって産物数が増加したものと考えている。次にDNAに結合する発蛍光色素を用いたRCA産物の検出に取り組んだ。従来法ではDNAを伸長したのち、蛍光標識DNAを加えてRCA産物を検出していた。本研究ではこれを発蛍光色素に変更することで、産物により多くの色素を結合させ高感度検出が実現できると考えた。前年度はマイクロビーズへの色素の非特異吸着のために検出が困難であったため、本年度はビーズへのプライマーDNAの固定化量を変化させて実験を行ったところ、固定化量を減らすことでRCA産物に由来する蛍光輝点が観察できた。マイクロ分析化学本研究における各検討項目において、いずれもおおむね当初予定の通りに進捗している。研究計画に従い、着実に研究を遂行していく。本研究は2年間で行う計画であり、次年度が最終年度となる。概ね計画通りに経費を執行したが、試薬等の支出が予定よりも少なかったため、次年度使用額が生じた。実験に必要な試薬、機器等の購入に主に使用する。
喉頭挙上筋障害時における残存筋機能制御様式の変化に関する研究

嚥下障害には様々な障害パターンが存在するが、そのうち喉頭挙上障害に主に起因する嚥下障害患者に対しては喉頭挙上術の適応となる。しかし、その適応については個々の術者の経験による判断が主であり十分なエビデンスは得られていない。そこで喉頭挙上運動に関与する筋群の神経支配様式の解明と、喉頭挙上筋の部分障害時に残存筋機能を制御する神経回路における変化についての研究を行い、喉頭挙上術の有効性についての理論的背景を明らかにすることを試みた。嚥下障害の原因としての喉頭挙上障害について,嚥下造影検査を用い挙上のタイミング,挙上の距離を定量的に評価した.今後の喉頭挙上筋障害時の嚥下の際における喉頭運動を定量的に評価するために,DIPP-MotionPROを使用し,喉頭並びに舌骨の運動を確実に定量化することが可能となった.喉頭挙上におけるオトガイ舌骨筋,顎舌骨筋,顎二腹筋前腹は,嚥下咽頭期に強調して収縮することにより有効な挙上を来たすが,それぞれ舌下神経,三叉神経の支配を受ける.これらの障害による挙上障害は嚥下障害の上で大きな問題となる.今後の喉頭挙上筋群の神経支配とその運動を検討していく上で,嚥下運動の定量的比較が可能となることはきわめて重要である.今後,舌下神経核,三叉神経運動核からさらに上位の神経入力を確認していく上での基礎的な情報を得ることができた.嚥下障害には様々な障害パターンが存在するが、そのうち喉頭挙上障害に主に起因する嚥下障害患者に対しては、保存的治療だけで改善が見られない場合、喉頭挙上術の適応となる。本研究代表者の実際の診療においても喉頭挙上術を積極的に行なっているが、その適応については個々の術者の経験による判断が主であり十分なエビデンスは得られていない。本課題においては、喉頭挙上運動に関与する筋群の神経支配様式の解明と、喉頭挙上筋の部分障害時に残存筋機能を制御する神経回路における変化についての研究を行い、喉頭挙上術の有効性についての理論的背景を明らかにすることを目的とする。研究1.喉頭挙上関連筋群の神経支配様式に関する検討マウスオトガイ舌骨筋および甲状舌骨筋を支配する運動神経細胞の局在の確認と、上位中枢からの投射経路を神経トレーサーを注入し確認した。運動神経細胞の確認には至るも上位中枢からの投射を確認できるのに十分な生存期間を維持できたマウスの数が感染死などが原因で予定のモデル数に達しなかった。研究2.喉頭挙上障害の嚥下機能に与える影響とその代償に関する研究研究1の結果を元にオトガイ舌骨筋に代表される舌骨上筋群障害時の、喉頭挙上に重要な役割を担っている舌骨下筋群の一つである甲状舌骨筋による代償機構の解明を試みた。舌骨上筋群を切断したモデルマウスを作製し、対照群との体重増加率を比較したが、体重増加率が正常に回復したモデルがわずかであったため対照群との比較が出来なかった。嚥下障害には様々な障害パターンが存在するが、そのうち喉頭挙上障害に主に起因する嚥下障害患者に対しては、保存的治療だけで改善が見られない場合、喉頭挙上術の適応となる。上位中枢からの投射の追跡を行ったが、運動神経細胞との連絡を確認するに至らなかった。舌骨上筋群を切断したモデルマウスを作製し、対照群との体重増加率を比較した。一部のモデルマウスは体重増加を示したが、対照群に対し有意な増加率を示し、代償機構を証明するには至らなかった。研究1についてはトレーサーを注入したマウスが感染死等で予定数に達しなかったことと、研究2については舌骨上筋群を切断したマウスの体重増加率が正常化する率が少なかったことが原因である。