hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブナ科樹木を加害するキクイムシ類と共生菌に関する群集生態学的研究

キクイムシ類(ナガキクイムシ科及びキクイムシ科)はコウチュウ目の大きな分類群に属し、多様な生活史を持つ昆虫として知られている。本研究では、ブナ及びコナラの樹幹を利用するキクイムシ類の時間空間的な群集特性を、種数・個体数・繁殖成功度を用いて明らかにした。ブナ・コナラとも樹幹全体をキクイムシ類が利用しており、キクイムシ類は森林の高さと樹幹の腐朽段階に応じて、時間空間的にニッチを分割していると考えられた。両樹種において、雌のみで評価した繁殖成功度に種間差は見られず、利用可能な資源が十分存在すれば、密度や繁殖システムにかかわらず、何れのキクイムシ類も高密度になる可能性が示唆された。研究に先立ち、国内の関連研究者と、研究実施計画の妥当性や解析手法に着いて、意見交換を行った。ブナ科樹木の萎凋枯死を起こしていないブナと萎凋枯死を起こしているコナラを対象に、キクイムシ類の時間的空間的群集動態と共生・随伴菌の詳細な実態解明を通じてのブナ科樹木の萎凋枯死のメカニズムの解明を目的に、以下の調査を実施した。野外調査カシノナガキクイムシが多数発生しているコナラにおいて、幹に存在する全てのキクイムシ類の穿孔穴に、個別トラップを設置し地上高を記録した上で、全てのトラップをチェックした。キクイムシ類が捕獲された場合は、日時の記録とともに全てのキクイムシ類を捕獲し標本を作成した。樹木地上部が枯れた時期を正確に確認するために、枯れていない2本の樹木に樹液流速計を設置し、樹液流速を計測中である。キクイムシ類標本は、種レベルの正確な同定後、得られたデータを用いたデータベースを作成中である。室内実験における共生菌の同定;培養及び野外接種実験の実験デザインを検討中である。カシノナガキクイムシが多数発生しているコナラにおいて、幹に存在する全てのキクイムシ類の穿孔穴に、個別トラップを設置し地上高を記録した上で、全てのトラップをチェックした。室内実験における共生菌の同定培養及び野外接種実験の実験デザインを検討中で、近くサンプルを採集する見込みである。野外実験はあるほぼ計画通り実行され、サンプルや野外データが蓄積され、成果が得られつつある。研究に先立ち、国内の関連研究者と、研究実施計画、解析方法、とりまとめ指針の妥当性について、意見交換を行った。キクイムシ類標本は、種レベルの正確な同定後、得られたデータを用いたデータベースを作成中し、最終的なとりまとめを目指し、キクイムシ類の生態的特性について解析を行った。室内実験における共生菌の同定、培養及び野外接種実験の実験デザインを再検討中で、サンプル方法を検討中である。野外実験はあるほぼ計画通り実行され、サンプルや野外データが蓄積され、データ解析がほぼ終了しつつある。ブナの調査から、ヤチダモノナガキクイムシは、カギナガキクイムシとシナノナガキクイムシよりも高い樹幹部位を利用していた。さらにヤチダモノナガキクイムシは、生存木と枯死木を利用した一方、カギナガキクイムシとシナノナガキクイムシは、枯死木のみを利用したことから、ヤチダモノナガキクイムシがキクイムシ類群集の遷移初期種として、樹幹上部を利用していると考えられた。ブナでは、コナラよりもキクイムシ類の個体数密度が低く、時間空間的なニッチの重複度が小さいことが示された。コナラの調査から、カシノナガキクイムシとヨシブエナガキクイムシを含む11種が、同時期に繁殖を開始しており、キクイムシ類群集の遷移初期種として、樹幹全体を同時に利用すると考えられた。それら11種のうち、ヨシブエナガキクイムシを含む

6種は、遷移後期にも出現していたため、それら6種は、広範囲の腐朽段階の資源を利用可能であると考えられた。さらに、コナラではブナよりもキクイムシ類の時間空間的なニッチの重複度が大きいものと考えられた。ブナ林にて2年間、コナラ林にて3年間に渡り、エタノールトラップ法による調査を行った。両調査地において、ザイノキクイムシ族が、総捕獲個体数の70%以上を占めた。このことから、ザイノキクイムシ族キクイムシ類は、エタノールに誘引される傾向が強いと考えられた。また両調査地において、いずれの年でも、5月に捕獲される種数が最も多く、エタノールトラップ法は、春に用いると有効であることが示唆された。キクイムシ類(ナガキクイムシ科及びキクイムシ科)はコウチュウ目の大きな分類群に属し、多様な生活史を持つ昆虫として知られている。本研究では、ブナ及びコナラの樹幹を利用するキクイムシ類の時間空間的な群集特性を、種数・個体数・繁殖成功度を用いて明らかにした。ブナ・コナラとも樹幹全体をキクイムシ類が利用しており、キクイムシ類は森林の高さと樹幹の腐朽段階に応じて、時間空間的にニッチを分割していると考えられた。両樹種において、雌のみで評価した繁殖成功度に種間差は見られず、利用可能な資源が十分存在すれば、密度や繁殖システムにかかわらず、何れのキクイムシ類も高密度になる可能性が示唆された。野外実験はあるほぼ計画通り実行され、サンプルや野外データが蓄積され、成果が得られつつある。(1)国内外野外調査を実施し、継続的なキクイムシ群集の実態調査及びデータ解析(2)共生菌の同定、培養及び野外接種実験の計画及び実施(3)これら研究遂行のため、国内外の関連研究者と、研究実施計画の妥当性や解析手法に着いての意見交換今後の研究の推進方策(1)国内外野外調査を実施し、継続的なキクイムシ群集の追加実態調査及びデータ解析と結果のとりまとめ(2)共生菌の同定、培養及び野外接種実験の計画及び実施(3)これら研究遂行のため、国内外の関連研究者と、研究実施計画の妥当性や解析手法に着いての意見交換29年度が最終年度であるため、記入しない。森林生態学,昆虫生態学、個体群生態学、応用昆虫学(1)国内外野外調査を実施し、継続的なキクイムシ群集の実態調査(2)共生菌の同定•培養及び野外接種実験の計画及び実施(3)これら研究遂行のため、国内外の関連研究者と、研究実施計画の妥当性や解析手法に着いての意見交換、及び研究成果の中間発表適当な研究補助要員が集まらなかったため、人件費の支払いが予定より少なかった。調査に関する消耗品が予定より少なく済んだこと、及び標本同定確認や調査に関わる旅費が予定より少なかったことによる。29年度が最終年度であるため、記入しない。旅費として使用予定消耗品の購入と、旅費として使用予定。
東日本におけるモータリゼーションに伴う地域変容に関する地理学的研究

わが国における最近10年間の自動車保有台数の増加は極めて著しく、約10倍の伸びを示している。施設面では都市間交通に関しては高速自動車道路網の建設、既存の主要国道の改良、自動車輸送を核とした流通施設の拡充がみられる。それに伴って、国民生活は時間距離の短縮によるばかりでなく、自動車交通の利便性を享受することによって大きく変化し、これが地域の経済・社会・文化の諸側面の変化に直接かかわることはいうまでもない。本研究は、このようなモータリゼーションが地域のどの構成要素にどのような変化を与えるかについて、東日本における実地調査により明らかにすることを目的とした。この目的を達成させるための一方法として、マクロ、メソ、ミクロの3水準の地域を設定し、モータリゼーションの地域構成要素に対する影響の実態を明確化するとともに、その影響の強度の順位化を試みることとした。そして、最終的には、モータリゼーションと地域構成要素の間の関係を記述する、地域的に再現性のあるモデルの構築を目指した。表記2年次にわたる本研究の成果は、このモデル構築の段階にまでは至らなかったが、マクロ水準としての東北地方についての自動車流動に基づく地域システムの分析によれば、自動車台数の増加はトリップ長の相対的短縮化をもたらすとともに都市的中心地の機能の向上を促し、これによってその中心地を独立性を高めていること、メソ水準としての松本盆地の地域性の規定要因の解明結果によれば、このような中心地を核とする流動圏内では伝統的な地域性が、モータリゼーションを初めとする都市化と工業化によって特徴づけられるに至っていること、ミクロ水準としての山形県尾花沢と茨城県波崎においては、物流の関係地域や生活行動圏の拡大がモータリゼーションによって主としてもたらされ、これらが居住形態の変化にまで影響を及ぼしていることが判明した。
日本人英語学習者による属格の'sおよびofの習得

日本語話者による英語の属格の習得並びに使用について、理論研究を行うと同時に、コーパスデータに基づく調査並びに実験によるデータ収集を行った。理論研究では、西山(2003)による日本語の「の」の研究ならびに、Rappaport(2004)およびRozwadowska(2006)による英語の-'s属格およびof属格の研究に基づいて、3つの形態素の共通点と相違点を明らかにした。コーパスデータについては和泉・内元・伊佐原(2004)によるThe NICT JLE Corpusを使用し日本人英語学習者の産出に見られる-'s属格とof属格の特徴を調べた。その結果、日本人英語学習者はofを-'sよりも多用し、その使用は母語話者と同様の傾向がみられるものの、母語の転移に基づくと考えられる誤用も散見されることがわかった。また、ofの使用は一般的英語力の伸びとともに増加するが、-'sの使用は一定程度以上増加しないことがわかった。実験によるデータ収集は、日本人英語学習者74人と英語母語話者21人を対象に、動詞由来派生名詞を主要部とする名詞句内の項構造に関する-'s属格とof属格の使用上の制限についての理解を見るために実施した。しかし、英語母語話者のふるまいが理論に基づく予測と異なった。本実験では、理論的には不可とされる構造でも、母語話者が可とする場合があり、予想通りの結果を得られなかったためである。これは、属格に関する形態統語の知識には、意味・語用の影響が深くかかわっており、その統制が十分に取れなかったためと考えられる。今後、文脈を統制した実験が必要であり、期間終了後も、引き続き研究を行う予定である。本年度は主に文献研究を行い、また、小規模のパイロットテストを行った。文献研究の結果、日本人英語学習者の属格の'sの習得については研究差がるが、'sとofについて形態統語的・意味的な分析を行い、第二言語学習者による使い分けを調べている先行研究は、少なくとも主要な学術誌には掲載がないことがわかった。Shirahata(1988)は、日本人英語学習者の口頭産出における形態素使用における正用率を見るという形の、いわゆる形態素習得研究であるが、この結果では、日本語を母語とする高校生は属格の'sをかなりの割合で正しく使用しており、他の形態素より習得が早い。その理由について、Shirahata(1988)は、母語である日本語に、この形態素とよく似た振る舞いをする格助詞「の」が存在することを挙げている(その他の研究については寺内、1994を参照)。一方、本年度に行ったパイロット研究では「の」の影響は、'sではなく、ofの使用に強く現れていることが示唆された。日本語の格助詞「の」は「N1のN2」の形でつかわれるが、N1とN2の関係は、英語の属格の'sおよびofが、それぞれ、N1'sN2、N2 of N1という形で使われる場合とは異なり、大まかに言って、格助詞「の」の用法が英語のもおよびofの用法を部分集合として含む関係にある。パイロット研究のデータからは、日本人英語学習者は、N1とN2の意味的な関係に関わらず、特にof以外の前置詞が使われるということをチャンクとして記憶している場合(例'sinterest in history)以外は、ofを「の」に相当するものとして、過剰拡張して使用していることが伺われる。一方もは、N1とN2の意味的関係から、制約を設けて使用しているようである。来年度はさらに様々な角度から仮説を立てデータを収集していく予定である。本年度は文献研究と同時に、学会での資料収集、および、学習者コーパスデータに基づく研究を行った。1言語理論の文献研究の結果、日本語の格助詞は英語の前置詞に相当するという考え方があることがわかった。

これが正しければ、統語的な観点から見れば、日本語の「の」は、名詞句の統語的主要部(D)に位置する」-'sとは範疇が異なり、前置詞ofと同じということになる。一方、格助詞がDであるという考え方もある。この考えによれば、'sと「の」が同じで、ofは異なることになる。2言語習得の文献研究については、Shirahata(2001)が、日本人英語学習者が日本語の「の」の仕組みを英語の'sに当てはめて使用する誤りが見られることを報告していた。一方、日本語話者のofの使用について詳しい研究は見つからなかった。3実証的研究として、本年度前半は、本研究に関連する分野のうち、日本人英語学習者の屈折の仕組み、文産出の仕組み、ならびに名詞句の解釈に関する研究を行った。後半は和泉絵美他(2004)の発話コーパスについて、'sに関する分析を行った。そこから、学習者のレベルがかなり低い場合(SSTレベル1)では、'sの生産的な使用は見られないこと、レベルがある程度上がると(レベル3)'sの使用は爆発的に増えるが、さらにレベルが上がると(レベル5)その使用頻度は下がること、ならびに、'sが頻繁に使用されるレベルでは、誤りも多く、母語の影響のほか、母語には起因しない誤りも見られることが明らかになった。4来年度は、コーパスで見られた誤りと言語理論に基づく予測を組み合わせて課題を作り、実験を行ってデータを収集し、それを下に第二言語習得研究モデルの検証を行い、本研究のまとめを行う。本年度は、昨年度に引き続き、文献研究を行うと同時に、コーパスデータに基づく調査並びに実験によるデータ収集を行った。文献研究では、西山(2003)による日本語の「の」の研究ならびに、Rappaport(2004)およびRozwadowska(2006)による英語の-'s属格およびof属格の研究に基づいて、3つの形態素の共通点と相違点を明らかにした。コーパスデータについては和泉・内元・伊佐原(2004)によるThe NICT JLE Corpusを使用し日本人英語学習者の産出に見られる-'s属格とof属格の特徴を調べた。その結果、日本人英語学習者はofを-'sよりも多用し、その使用は母語話者と同様の傾向がみられるものの、母語の転移に基づくと考えられる誤用も散見されることがわかった。また、ofの使用は一般的英語力の伸びとともに増加するが、-'sの使用は一定程度以上増加しないことがわかった。実験によるデータ収集は、日本入英語学習者74人と英語母語話者21人を対象に、動詞由来派生名詞を主要部とする名詞句内の項構造に関する-'s属格とof属格の使用上の制限についての理解を見るために実施した。しかし、英語母語話者のふるまいが理論に基づく予測と異なった。本実験では、理論的には不可とされる構造でも、母語話者が可とする場合があり、予想通りの結果を得られなかったためである。これは、属格に関する形態統語の知識には、意味・語用の影響が深くかかわっており、その統制が十分に取れなかったためと考えられる。今後、文脈を統制した実験が必要であり、期間終了後も、引き続き研究を行う予定である。
蛋白分子内構造制御によるアミロイド線維形成機構の解明

1.アミロイド様会合体形成の基本過程全ジスルフィド結合欠損リゾチーム変異体(OSS)のアミロイド様線維形成反応速度は塩濃度やpHに依存し、蛋白の正電荷遮蔽が会合を速める。会合は核形成-伸長反応スキームに合致し、臨界モノマー濃度が存在し、核サイズは塩濃度やpHに依存する。線維中のトリプトファン残基は疎水環境にあり、量子収率が上昇する。圧力解離解析から得られる線維の比容積はかなり大きい。線維の長さ分布を考慮した理論式を導き、1分子解離の速度定数を得た。一方、種々の部分構造を保持する1SS変異体間では線維形成速度に3桁に及ぶ差異が見られ、プロトフィブリル様線維の効率的な形成にはN末端とC末端領域の隔絶が必要である。それらの核サイズと原子間力顕微鏡下の形態には大差がないが、X線小角散乱から得られる線維径には有意な差がある。さらに、4SS体の作る線維は形態、線維径ともに大きく異なる。以上、蛋白内構造の種類と大小が線維形成反応の速度ならびに反応様式を左右していることがわかった。2.アミロイド様会合体における構造化ペプチド領域の同定NMR検出H-D交換法を用い、水素結合形成などの構造化により線維中で交換から保護されるペプチド領域を同定した。0SS体線維では夫々7-9残基長の4箇所のペプチド領域であり、高い疎水性とベータ形成能の両者を示す領域と一致した。赤外吸収測定によれば、それらの領域は反平行ベータ構造をとる。一方、1SS変異体線維では構造化領域に差が見られ、2種の1SS体では0SS体で見られた部位に近似し、他の1SS体では異なった部位が保護された。それらの部位は、WTリゾチーム線維でのプロテアーゼ耐性コア領域とも異なる。これらの結果は、蛋白内構造の種類と大小により、線維化の核形成部位ならびに伸長部位が多様であることを示す。1.アミロイド線維形成の基本過程(1)ジスルフィド結合をすべて欠損させたリゾチーム変異体(OSS)はアミロイドprotofibril様線維をつくる。その形成反応速度は塩濃度の上昇、pHの上昇に伴い増加し、蛋白の持つ正電荷による反発が会合を遅くしていることがわかった。一方、NMR検出H-D交換法により、線維中で分子間ベータシート構造をとっているポリペプチド領域が4箇所同定された。それらは高い疎水性ならびにベータ構造形成傾向の両者を示す領域であり、うち3箇所はWTリゾチーム単量体ではアルファ構造をとっている領域であった。蛋白のイントリンジックな蛍光測定から、線維中でトリプトファン残基は疎水環境にあり、量子収率が大きく上昇していることがわかった。(2)Sizeexclusion HPLC法で見た会合反応速度の蛋白濃度依存性より、会合反応は核形成-伸長反応スキームに合致すること、臨界モノマー濃度が存在すること、核のサイズは塩濃度やpHに依存することがわかった。2.蛋白質内部分構造のアミロイド線維形成への影響さまざまな分子内構造を持つ4分子種のリゾチーム1SS変異体の会合体形成反応の解析より、N末端とC末端部位の接近は線維形成を2桁遅くすること、一方、それと対照的に、残基30部位と115部位の接近ならびに残基64部位と80部位の接近は線維形成を1桁近く速くすることがわかった。すなわち、protofibril様線維の形成にはN末端領域とC末端領域が離れることが重要である。1.アミロイド様会合体形成の基本過程

ジスルフィド結合をすべて欠損させたリゾチーム変異体(OSS)の圧力解離会合関連の熱力学量を求め、この線維の比容積がかなり大きいことを示した。また、線維の長さ分布を考慮した理論式を導き、解離実験結果を解釈して、1分子の解離の速度定数を求めた。一方、種々の部分構造保持変異体の線維形成速度、溶液条件依存性、臨界モノマー濃度、線維形態情報を求めた。1SS体間では線維形成速度に3桁に及ぶ差異が見られるにもかかわらず、蛋白濃度依存性より推定される核のサイズおよび原子間力顕微鏡観察によって得られた形態には大差が見られない。しかしエックス線小角散乱から得られた線維径には有意な差がみられ、さらに、4SS体の作る線維は形態、線維径ともに大きく異なる。これらの結果は、蛋白内構造の種類と大小がアミロイド線維形成反応の速度論的側面のみならず、反応様式そのものを左右していることを示す。2.アミロイド様会合体における分子間ベータシート構造領域の同定種々の部分構造保持変異体のアミロイド線維中で水素結合を形成しているポリペプチド領域をNMR検出H-D交換法によって同定した。OSS体の場合はさらに赤外吸収測定により、それらの領域が分子間反平行ベータシート構造をとっていることが示された。1SS体のレベルで、構造化により交換から保護された領域に差が見られた。すなわち、2種の1SS体ではOSS体で見られた部位に近似している一方、他の1SS体では異なった部位が保護された。またそれらの部位は、WT lysozyme線維で報告されているプロテアーゼ耐性コア領域とも異なるものであった。これらの結果は、蛋白内構造の種類と大小により、線維化の核形成反応部位ならびに伸長反応部位が多様であることを示す。
卵巣癌におけるＨＩＦによる癌幹細胞誘導機構の解明と治療戦略への応用

癌組織内の低酸素環境には治療抵抗性の癌幹細胞が維持されている可能性がある。我々は卵巣癌細胞で低酸素環境下にHIF蛋白発現に伴って幹細胞因子・癌幹細胞マーカーが発現亢進していることを見出した。また卵巣癌の場合はHIF2αを介していることが示唆された。更にHIF阻害薬TX-402によってHIF2αの発現と癌幹細胞が抑制されることを見出した。次いで卵巣癌細胞株によるスフェロイド(三次元低酸素モデル)を用いて、低酸素領域に幹細胞因子高発現細胞の出現を確認した。TX-402処理によりこの癌幹細胞が死滅した。よってHIF阻害薬は腫瘍組織内部の癌幹細胞を死滅させ、治療感受性を向上させる可能性が示された。我々は難治性卵巣癌の治療法の開発を目的として、HIFをターゲットとした阻害剤の分子標的薬としての可能性を検討してきた。H23年度に行う予定であった、卵巣癌手術の94検体からのTissue Micro Arrayの作成が完了し、現在HIF-1α, HIF-2α、CA9抗体による免疫染色結果を解析中である。それらの発現と悪性度、予後、抗癌剤抵抗性などの関連を検討していく予定である。また、既に見出している低酸素下での幹細胞因子の発現誘導がHIFを介しているかどうか検討するため、卵巣癌細胞株においてsiRNAを用いた実験を行った。その結果、oct4, sox2については主にHIF-2αを介して、低酸素下で発現誘導されていることがわかった。免疫不全マウスを用いた実験では、コントロール群、べバシツマブ単独投与群、シスプラチン単独投与群、べバシツマブ、シスプラチン併用群の4群に分け、約4週間投与し、その後、腫瘍を採取した。その間、腫瘍の大きさを計測した。現在は、低酸素マーカーであるpimonidazoleと癌幹細胞マーカーといわれているALDHの免疫染色を行っているところである。癌組織の内部は急激な癌細胞の増殖のため機能的な血管新生が不十分となり、低酸素となっている。そのような低酸素微小環境には治療抵抗性の癌幹細胞が発生し、維持されている可能性がある。我々は卵巣癌細胞株において低酸素環境下でHIF1α、HIF2αの発現が亢進していることを観察した。またHIFの発現に伴って幹細胞因子(oct3/4, nanog, lin28, sox2)や癌幹細胞マーカー(CD133、CD44)の発現が亢進していた。またsiRNAによってHIF1α、HIF2αそれぞれの発現をノックダウンすると、HIF2αの発現抑制に伴って、特異的に癌幹細胞因子・マーカーの発現が抑制されていた。つまり卵巣癌における低酸素微小環境での癌幹細胞発現誘導はHIF2αを介したものであることが示唆された。さらに低酸素細胞毒TX-402(岐阜薬科大学永澤秀子氏より供与)によってHIF2αの発現が抑制され、癌幹細胞の発現が抑制されることを見出した。次いで卵巣癌のin vivo実験に先立って、卵巣癌細胞株を用いたスフェロイド(三次元低酸素モデル)をin vitroで作製した。このモデルではスフェロイドの中央部が低酸素領域(ピモニダゾールで確認)となって癌幹細胞様の細胞(oct3/4発現)が出現する。TX-402で処理すると、このスフェロイドの増大が抑制され中央部の低酸素領域の細胞が死滅していた。同時にoct3/4発現細胞が消失していた。このようには腫瘍組織内部の癌幹細胞を含む低酸素領域の癌細胞を死滅させることが示された。癌幹細胞は抗がん剤などに対する治療抵抗性に関与していることがわかっており、低酸素細胞毒TX-402は治療感受性を向上させることができる可能性が示された。平成23年度の計画であった卵巣癌手術検体からのTissue Micro Arrayの作成に関しては、約100症例の検体からのスポット抽出が終了し、まもなく準備できるところである。また卵巣癌細胞株を用いた実験としては、まず初めに低酸素環境下でのHIF-1の発現亢進をウエスタンブロッティング法により検討し、酸素濃度1%環境下2時間以降でHIFの発現誘導を検出した。その時、下流遺伝子であるVEGFの発現も上昇していることをELISA法により確認した。次にHIF阻害剤であるTX-402を用いて、VEGFの発現に対する効果を検討したところ、いずれも低酸素下において濃度依存的に顕著にその発現を抑制していた。

以上の結果から、HIFをターゲットとした阻害剤は、卵巣癌において低酸素下で増大したVEGF産生を阻害することにより、血管新生を抑制し、癌の増殖・転移を抑制する可能性が示された。また、低酸素による癌幹細胞化にも注目し、幹細胞因子が誘導されるかReal time PCRを用いて検討したところ、Oct3/4, Sox2, Lin28, Nanogの低酸素による発現誘導がみられた。またその時、卵巣癌を始め多くの癌種で癌幹細胞のマーカーとして知られているCD133の発現も低酸素により誘導されていた。そこで、低酸素によりHIFが増加し、幹細胞因子の発現が誘導され、癌幹細胞化が引き起こされるという仮説を立て、HIF阻害剤の効果を検討した。その結果、幹細胞ならびに癌幹細胞マーカーの低酸素による発現誘導はHIF阻害剤によって抑制された。TMAはHIF-1α, HIF-2α抗体による免疫染色が終了し、現在解析中である。またHIF-1の下流因子であり、低酸素マーカーとしても知られているCA9についても免疫染色し、解析している。また、ヌードマウスを用いたin vivoでの実験はおおむね順調に進んでおり、現在は腫瘍の薄切を用いて、低酸素プローブ(pimonidazole)や癌幹細胞マーカーのALDHで免疫染色を行っているところである。TMAは準備できるところであるが、当初の計画にあったその後の抗体を用いての解析はこれからである。また細胞株を用いた実験はおおむね順調に進行しているが、ヌードマウスを用いたin vivoでの実験は始めたところである。TMAの解析を進め、HIF-1α,HIF-2α,CA9の発現と抗がん剤感受性・予後との関連を調べる。また、低酸素による癌幹細胞化について、主に卵巣癌細胞株とマウスを用いて検討を進めていきたい。TMAを用いて、HIF-1,2αについてその発現と抗がん剤感受性・予後との関連を調べる。HIF阻害剤を用いて、主にin vivoでの効果の検証を進めていきたい。その際、他の抗癌剤との併用効果も検討する予定である。具体的には、既に見出している低酸素下での幹細胞因子の発現誘導がHIFのみを介しているかどうか検討するため、siRNAを用いた実験を行う予定である。また低酸素環境下での培養後の癌幹細胞化を、フローサイトメトリー、スフィアアッセイやマウスにおけるin vivoでの評価も検討していきたいと考えている。免疫不全マウスの購入費、ならびに主にキットなどを含む消耗品に研究費を充てる予定である。今年度は免疫不全マウスを用いたマウスの実験に着手できなかったため、次年度はその購入費に研究費を充てる予定である。また、他には主にキットなどを含む消耗品に使用する予定である。
彗星衝突による木星大気変動の観測的研究

平成5年3月にパロマ-山天文台で発見されたシューメーカー・レビ-第9彗星(1993e)という天体が、平成6年7月に木星へ衝突した。彗星自身は当初から20個ほどの核に分裂しており、大きさは1km以上の天体で、衝突速度は毎秒60km、ひとつの核の衝突エネルギーは10^<29>エルグ、広島型原爆の約1億倍に相当すると思われ、惑星大気に大きな変動を与えると予想された。われわれは本研究によって、CCD素子を用いた撮像観測を行い、彗星核の大きさと衝突規模を推定し、また実際に起こった木星大気の変動の観測を行った。彗星核は少なくとも直径800m以上あると推定した。彗星核、あるいは木星大気から巻き上げられたダストが上昇流にのって成層圏に達し、黒い痕跡をつくった。この痕跡の衝突直後の分光観測でも、すでにガスがなく、塵だけになっていることが判明した。また、この痕跡の移動スピードは成層圏にも関わらず、木星のアンモニアの雲の速度(対流圏)とあまり差が無いこともわかった。これらの観測のために国立天文台岡山天体物理観測所188cm望遠鏡および91cm望遠鏡を使用している。これらは本研究の一環として共同利用観測を国立天文台へ申請し、承認を受けたものである。。。
還元性高速焼結法を駆使した透明な欠陥導入セラミックスの創製

多結晶セラミックスの透明焼結体の合成手法として高速焼結法を提案し、蛍石型関連構造を有するLu系複酸化物において、透明焼結体の合成プロセスを確立することを目的とした。高速焼結法を用いて、Lu3NbO7透明セラミックスを合成した。得られたLu3NbO7透明セラミックスのXRD図形は、立方晶の欠陥蛍石型構造に指数付けることができたが、電子回折像にはサテライトスポットが観察され、欠陥蛍石構造中の規則構造生成を示唆した。得られた成果は、透光性、結晶構造、イオン伝導性の3つの因子を制御した透明性とイオン伝導性を併せ持つ複合機能セラミックスの創製につながることが期待される。ルテチウム(Lu)複酸化物は、高輝度レーザー媒質や量子ビーム用シンチレータとして期待されるが、その単結晶成長には2000°C以上の超高温液相プロセスの開発が必要である。そのため、基礎研究は限定的であり、実用化への障害にもなっている。近年、単結晶光学材料に替わる多結晶セラミックスの透明焼結体が注目されている。セラミックスは、粒界・空隙・介在物などのマクロ欠陥を含むため、焼結体は一般的には不透明だが、原料や合成プロセスの工夫によって、光の散乱源となる欠陥を取り除くことで、透明なセラミックス焼結体を合成できる。平成25年度は、Nd2O3-Lu2O3系において、透明焼結体の合成プロセスを確立した。放電プラズマ焼結装置を用いて、Lu2O3とNd2O3粉末を焼結した。合成した試料の結晶相はX線回折装置を用いて評価し、光学特性は紫外可視近赤外分光光度計を用いて評価した。また、光学特性を向上させるため、LiF添加の効果についても調べた。0.05-0.2 wt%LiFを添加した場合、可視光において特に優れた光学特性を示すNd2O3-Lu2O3透明焼結体が得られた。一方、Lu2Ti2O7およびLu3NbO7透明焼結体については、光学特性やイオン電導性をより詳細に評価していくことで、透光性、結晶構造、イオン伝導性の3つの因子を制御した透明性とイオン伝導性を併せ持つ複合機能セラミックスの創製につながる展開が期待される。平成24年度は、Lu2Ti2O7およびLu3NbO7について、透明焼結体の合成プロセスを確立した。放電プラズマ焼結装置を用いて、Lu2O3粉末とTiO2およびNb2O5粉末を焼結した。印加圧力、焼結温度、昇温速度、保持時間といった焼結条件の最適化を行った。また、合成した試料の微細構造を走査型電子顕微鏡(SEM)や透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてより詳細に評価することで、微細構造が光学的特性に与える影響について明らかにした。Lu3NbO7の結晶構造は、立方晶の欠陥蛍石型構造(Fm-3m, a = 0.518 nm)で指数付けることが出来た。Lu2O3とNb2O5粉末を予め固相反応させることにより、Lu3NbO3粉末を得た。得られたLu3NbO7粉末を、放電プラズマ焼結装置を用いて焼結温度1723 K、印加圧力100 MPaで焼結し、Lu3NbO7焼結体を得た。焼結密度をアルキメデス法により測定したところ、相対密度はほぼ100%であった。得られた焼結体の平均粒径は0.77 μmであった。Lu3NbO7焼結体の透過率は、波長550 nmで68%に達し、透明な焼結体が得られた。Lu3NbO7焼結体のTEM観察を行ったところ、電子回折像像には、サテライトスポットが観察され、欠陥蛍石構造中の酸素欠損の規則構造を示している。Lu2Ti2O7、Lu3NbO7などのLu系複酸化物について、放電プラズマ焼結法を用いて焼結体を作製し、透明セラミックスの合成に成功した。Lu3NbO7透明セラミックスの結晶構造は、立方晶の欠陥蛍石型構造で指数付けることが出来たが、一方、Lu3NbO7透明セラミックスのTEM観察を行ったところ、欠陥蛍石構造中における酸素欠損の規則構造を持つことを明らかにした。初年度で確立した本手法を用いて透明焼結体を合成し、そこに酸素欠陥を導入制御することで、酸素欠損が規則ー不規則構造転移やイオン・混合伝導特性に与える影響を検証する。

還元性雰囲気での焼結中に導入される酸素欠損量は、焼結条件や背圧、対象材料によっても異なることが予想されるため、実験してから初めてわかることも多いが、現時点では二通りの方法を検討している。一つは、焼結条件を制御することで、還元性焼結雰囲気中を利用してin-situで適量の酸素欠損を入れる方法であり、もう一つは、焼結中に十分量の酸素欠損量を導入した後に、後熱処理を低酸素分圧・低温で行い導入する方法である。結晶相はX線回折図形により同定し、伝導特性は複素インピーダンスアナライザを用いて評価する。透光性、結晶構造、イオン伝導の三つの物性を制御することで、透明性とイオン伝導体性を併せ持つ複合機能セラミックスを創製する。該当なし
門脈内急速投与によるオリゴヌクレオチド肝導入方法の確立

門脈内急速投与がベクター非依存性の生体肝組織遺伝子導入方法として有効であるかの前段階研究としてOligodeoxynucleotides (ODN)を用いて検討した。naked NF-kBODNをラット門脈に急速投与し、naked ODNが肝臓に導入されるか、生体内で機能するのかを検討した。門脈内急速投与でnaked ODNは肝内のクッパー細胞、類洞内皮細胞に取り込まれることが明らかとなった。肝虚血再灌流障害をモデルとし、生体内での機能を確認すると、NF-kBの活性化は抑制されていたが、肝障害の軽減までには至らなかった。門脈内急速投与で遺伝子導入が可能であるかどうかは今後の課題である。前年度の研究において、NF-κB decoy ODNの門脈内急速投与により、NF-κB decoy ODNはクッパー細胞、類洞内皮細胞に導入されることを明らかにした。本年度は、導入されたNF-κB decoy ODNが細胞内でNF-κB活性化を実際に抑制するのかを検討するため以下の実験を行った。1細胞分画方法の確認:予備実験として正常SDラット肝を摘出し、肝細胞を分離後に、エルトリエーターにより、クッパー細胞、類洞内皮細胞をそれぞれ分画可能であった。2electrophoretic mobility shift assay (EMSA)方法の確認:予備実験として、SDラットを用い、45分間の肝流入血遮断(Pringle法)を行い、1時間再灌流させた後に肝を摘出し,傷害肝を作製した。正常SDラットからも肝を摘出し、それぞれより核タンパク質を抽出した。アイソトープを用いたNF-κBのEMSAを行い、傷害肝ではNF-κBが活性化していることを確認し、EMSAの手技を確かなものとした。3虚血再灌流後の各細胞分画でのNF-κB decoyODNによるNF-κB活性化抑制の検討:SDラットにNF-κB decoy ODNを門脈内急速投与し、24時間後に45分間の肝流入血遮断(Pringle法)を行い、1時間再灌流させた。肝を摘出し、肝細胞を分離、また、エルトリエーターにより、クッパー細胞、類洞内皮細胞をそれぞれ分画した。各分画より核タンパクを抽出後、アイソトープを使用し、EMSAでNF-κB活性がNF-κB decoyODN投与により抑制されているか検討した。NF-κB decoy ODNが導入されたクッパー細胞、類洞内皮細胞において、NF-κB活性はNF-κB decoyODN投与により抑制されていることを確認した。1、門脈内急速投与による肝へのFITCNF-kB decoyODN導入の確認:ラット門脈内に、1mlに希釈した50nmolのFITC NF-kB decoyODNを3秒内に急速投与した。コントロール群として、溶媒として用いたリンガー液のみを投与した。投与24時間後に肝を摘出し以下の検討を行った。1蛍光顕微鏡による肝内FITCNF-kB decoyODNの確認:凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡で肝内にFITC NF-kB decoyODNが導入されているかをコントロールと比較し検討したところ、実験群では肝内にび慢性にFITCが分布していたが、コントロール群では認められなかった。2肝組織の蛍光量測定によるFITC NF-kB decoy ODNの確認:肝組織をホモジネートし、上清を採取した。蛍光測定器で上清中の蛍光強度を測定した。上清のタンパク濃度を測定し、単位タンパク重量あたりの蛍光強度を算出したところ、実験群(n=5) 83.7 ±10.6、コントロール群34.4 ±4.2/mg protein (p < 0.05)であり、門脈内急速投与により、肝へFITC NF-kB decoyODNが導入されていることを確認した。2、門脈内急速投与による導入細胞の検討:凍結切片を作製し、抗アルブミン抗体(肝細胞)、抗CD68抗体(クッパー細胞)、抗hepatic sinusoidal endothelial cell抗体(類洞内皮細胞)を用いて蛍光免疫染色し、FITC NF-kB decoyODNが導入された細胞の同定を行った。FITC NF-kB decoyODNはクッパー細胞、類洞内皮細胞内に分布していたものの、肝細胞内には認められず、門脈内急速投与によってFITC NF-kB decoyODNはクッパー細胞、類洞内皮細胞に導入されたものと考えられた。昨年度までの研究実績としては、20塩基のFITC標識oligodeoxynucleotides (ODN)を門脈内急速投与することで、肝組織中の蛍光強度は有意に増加し、肝組織中にODNが導入されているとの結果を得た。また、肝組織を蛍光顕微鏡で観察すると、肝細胞にFITC-ODNが取り込まれないが、類洞内皮細胞、クッパー細胞にはFITC-ODNが取り込まれることを確認した。さらに、NF-κBの遺伝子結合部位と同様の配列をもつNF-κB decoy ODNを門脈内急速投与すると類洞内皮細胞、クッパー細胞においては、肝虚血再灌流1時間後のNF-κB活性がNF-κB decoyODN投与により抑制されることをEMSAにより細胞レベルで明らかにした。

以上から、門脈内急速投与することで20塩基程度のODNは類洞内皮細胞、クッパー細胞にとりこまれ、NF-κB decoy ODNはNF-κBの活性化を抑制することが明らかとなった。当該年度は、NF-κB decoyODN投与によって肝虚血再灌流障害が軽減するか否かをラット個体レベルにおいて検討した。SDラットにNF-κB decoy ODNを門脈内急速投与し、24時間後に45分間の肝流入血遮断(Pringle法)し、その後再灌流させた。再灌流1,3,6時間後に血液、肝組織を採取し、肝酵素値(AST, ALT, LDH)、血中サイトカイン値(TNF-α, IL-1β, IL-6, GRO/CINC-1)、HE染色による肝壊死、炎症所見の程度、肝類洞内好中球数を検討した。NF-κB decoyODN群のほかにscrambled decoy ODN群、コントロール群(溶媒のみ投与)の三群を設け比較検討した。現在、順次得られたサンプルから測定など行っている状態であるが、最終的な結論は得られておらず、来年度以降も研究を継続する予定である。20塩基のFITC標識oligodeoxynucleotides (ODN)を門脈内急速投与することで、肝組織中の蛍光強度は有意に増加し、肝組織中にODNが導入されるとの結果を得た。また、肝組織を蛍光顕微鏡で観察すると、肝細胞にFITC-ODNが取り込まれないが、類洞内皮細胞、クッパー細胞にはFITC-ODNが取り込まれることを確認した。さらに、NF-κBの遺伝子結合部位と同様の配列をもつNF-κB decoy ODNを門脈内急速投与すると類洞内皮細胞、クッパー細胞においては、肝虚血再灌流1時間後のNF-κB活性がNF-κB decoyODN投与により抑制されることをEMSAにより細胞レベルで明らかにした。最終年度は、NF-κB decoy ODN投与によって肝虚血再灌流障害が軽減するか否かをラット個体レベルにおいて検討した。再灌流1,3,6時間後に血液、肝組織を採取し、肝酵素値、血中サイトカイン値、HE染色による肝壊死、炎症所見の程度、肝類洞内好中球数を検討した。NF-κB decoy ODNを投与することで、虚血再灌流1時間後には、炎症性サイトカイン産生抑制をかいした肝酵素値の低下が認められたが、虚血再灌流3時間以降ではその効果は明らかでなく、NF-κB decoy ODNの容量増加、頻回投与が虚血再灌流障害抑制のためには必要であると結論した。門脈内急速投与がベクター非依存性の生体肝組織遺伝子導入方法として有効であるかの前段階研究としてOligodeoxynucleotides (ODN)を用いて検討した。naked NF-kBODNをラット門脈に急速投与し、naked ODNが肝臓に導入されるか、生体内で機能するのかを検討した。門脈内急速投与でnaked ODNは肝内のクッパー細胞、類洞内皮細胞に取り込まれることが明らかとなった。肝虚血再灌流障害をモデルとし、生体内での機能を確認すると、NF-kBの活性化は抑制されていたが、肝障害の軽減までには至らなかった。
固体高分子形燃料電池の無加湿運転のための高性能ガス拡散層に関する研究

固体高分子形燃料電池の総合効率向上,並びにコスト低減の方策として無加湿運転を実現することが重要な研究課題になっている.本研究では撥水マイクロポーラス層(MPL)の表面に薄い親水層を塗布した親水・撥水複合MPL付き拡散層を考案した.複合MPLを適用すると親水層により電極触媒層における保湿性が高まると同時に,撥水層により基材部を流れる乾燥ガスが親水層部の水分を取り去ることを抑制できるため耐ドライアップ性の向上策として有効であることを明らかにした固体高分子形燃料電池の総合効率向上,並びにコスト低減の方策として無加湿運転を実現することが重要な研究課題になっている.本研究では撥水マイクロポーラス層(MPL)の表面に薄い親水層を塗布した親水・撥水複合MPL付き拡散層を考案した.複合MPLを適用すると親水層により電極触媒層における保湿性が高まると同時に,撥水層により基材部を流れる乾燥ガスが親水層部の水分を取り去ることを抑制できるため耐ドライアップ性の向上策として有効であることを明らかにした固体高分子形燃料電池(PEFC)の性能を向上させるためには,電解質膜を適正な湿潤状態に保ちプロトン伝導性を高めるとともに,電極触媒部の過剰な水分を速やかに排出してフラッディング発生を防止することが重要である.通常のPEFCでは加湿器を設けアノード・カソード両極に加湿した反応ガスを供給している.しかし近年はPEFCの総合効率向上,並びにコスト低減の目的から加湿器を設けない簡便なPEFCシステムの実用化が求められており,無加湿運転の実現が重要な課題になっている.PEFCの耐ドライアップ性を向上させる方策としてガス拡散層の表面に撥水マイクロポーラス層(MPL)を塗布する手法が一般に適用されているが,MPLに関する適正な設計指針については不明な点が多い.本研究ではMPLの細孔径を減少させガス透過性を低下させると同時に撥水性を弱めることが耐ドライアップ性の向上に有効であることを明らかにした.また撥水MPL表面に親水層を塗布した親水・撥水複合MPL付きガス拡散層を適用すると,親水層により電極触媒部における保湿性が高まると同時に,親水層と基材の間に設けた撥水層により基材部を流れる乾燥ガスが親水層部の水分を取り去ることを抑制できるため耐ドライアップ性の大幅な向上が期待できることを明らかにした.親水層の厚さは5μm程度まで薄く設定することが発電性能の向上に重要である.親水層厚さを過大にすると電極触媒部への酸素供給が阻害され発電性能が低下することがわかった.また親水層の細孔径が発電性能に及ぼす影響は比較的小さいこと,親水性バインダー(PVA:ポリビニルアルコール)量の違いによる親水性の変化は発電性能に大きな影響を及ぼし,PVA量を5%に設定して親水性を適度に高めると発電性能が大幅に向上することなどを明らかにした固体高分子形燃料電池(PEFC)の性能を向上させるためには,電解質膜を適正な湿潤状態に保ちプロトン伝導性を高めるとともに,電極触媒部の過剰な水分を速やかに排出してフラッディングの発生を防止することが重要である.通常のPEFCでは加湿器を設けアノード・カソード両極に加湿した反応ガスを供給している.しかし近年はPEFCの総合効率向上,並びにコスト低減の方策として加湿器を設けない簡便なPEFCシステムの実用化が求められており,無加湿運転時の発電性能向上が重要な研究課題になっている.PEFCの耐ドライアップ性を向上させる方策としてガス拡散層の表面に撥水マイクロポーラス層(MPL)を塗布する手法が一般に適用されているが,MPL付き拡散層に関する設計指針については不明な点が多い.そこで本研究ではPEFCの耐ドライアップ性を向上させる方策として,撥水MPL表面に親水層を塗布した親水・撥水複合MPL付きガス拡散層を考案した.親水・撥水複合MPLを適用すると親水層により電極触媒部における保湿性が高まると同時に,親水層と基材の間に設けた撥水MPLにより基材部を流れる乾燥ガスが親水層部の水分を取り去ることを抑制できるため耐ドライアップ性の大幅な向上が期待できることを明らかにした.親水層の厚さは5μm程度まで薄く設定することが発電性能の向上に重要であることがわかった.また複合MPLにおける撥水MPLの最大細孔径は20μm程度に設定することが耐ドライアップ性の向上に重要であることがわかった.さらにPEFCカソード出口に親水MPL付き拡散層を用いた湿度交換システムを考案した.この湿度交換システムを適用するとカソード出口ガスに含まれる水分を回収し,アノード入口の乾燥ガスに水分を供給できるため,PEFC低湿度(無加湿)運転時の発電性能を向上させる方策として有効であることが明らかになった.固体高分子形燃料電池(PEFC)の性能を向上させるためには,電解質膜を適正な湿潤状態に保ちプロトン伝導性を高めるとともに,電極触媒層の過剰な水分を速やかに排出することが重要である.通常のPEFCでは加湿器を設けアノード・カソード両極に加湿した反応ガスを供給している.しかし近年はPEFCの総合効率向上,並びにコスト低減の方策として加湿器を設けない簡便なPEFCの実用化が求められており,無加湿運転時の発電性能向上が課題になっている.PEFCの耐ドライアップ性を向上させる方策として,拡散層の表面に撥水マイクロポーラス層(MPL)を塗布する手法が一般に適用されているが,MPL付き拡散層に関する設計指針については不明な点が多い.

そこで本研究ではPEFCの耐ドライアップ性を向上させる方策として,撥水MPL表面に親水層を塗布した親水・撥水複合MPL付き拡散層を考案した.複合MPLを適用すると親水層により電極触媒層の保湿性が高まると同時に,親水層と基材の間に設けた撥水MPLにより基材部を流れる乾燥ガスが親水層部の水分を取り去ることを抑制できるため耐ドライアップ性が大幅に向上することを明らかにした.一方,PEFCの無加湿運転時においても高電流密度条件下では生成水によるフラッディング発生を防止することが不可欠であり耐フラッディング性に関する検討も重要である.複合MPLの親水性を過大にすると耐フラッディングが大幅に低下する.しかし適度な親水性を付与した複合MPLを用いると,撥水MPLのみの場合と比較して排水性が高まり,耐フラッディング性が大幅に向上することを見出した.複合MPLにおける撥水MPLの平均流量細孔径を3μmに設定すること,並びに撥水MPL中のPTFE量を20mass%に設定し撥水性を適度に高めることが耐フラッディング性を向上させるうえで重要であることを明らかにした.PEFCの低湿度(無加湿)運転時の発電性能を向上させる方策として,親水・撥水複合MPL付きガス拡散層を考案し,耐ドライアップ性を向上させるための複合MPLの細孔径,厚さ,並びに親水・撥水性に関する設計指針を明らかにすることができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はPEFCの低湿度運転時の発電性能を向上させるための親水・撥水複合MPL付きガス拡散層の設計指針について明らかにした.一般にPEFCは低湿度から高湿度までの幅広い湿度条件で運転されるために,耐ドライアップ性のみならず耐フラッディング性を向上させることも極めて重要な課題である.そこで今後は高湿度条件下における親水・撥水複合MPL付きガス拡散層の発電特性を明らかにし,無加湿から高湿度までの幅広い条件で発電性能を向上させるための適正な設計指針について検討していく予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
昆虫ウイルスにおける生物間相互作用に資する遺伝子の生態的機能の解明

宿主の発育を操作する遺伝子について、当該遺伝子をGFPで破壊したノックアウトウイルス、ノックアウトウイルスに当該遺伝子を入れなおしたレスキューウイルス、GFPを遺伝子非コード領域に挿入したノックインウイルスと野生型ウイルスの表現型を比較した。野生型ウイルス、レスキューウイルス、ノックインウイルスに感染した幼虫は、終齢期間が延長して幼虫で死亡した。ノックアウトウイルスに感染した場合、蛹や蛹ー幼虫中間体で死亡する傾向があった。また、当該遺伝子は、宿主が蛹化のために地下部に潜る行動を阻害し、ウイルスの伝播が実際に起こる地表や植物体上にとどまらせることが明らかとなった。昆虫ウイルスが如何に周囲の環境に適応しているのか、すなわち、昆虫ウイルスの物理的・生物的環境への適応戦略を明らかにすることを研究の全体構想としている。昆虫ポックスウイルスの2つの遺伝子(1.宿主の発育を操作する遺伝子と2.宿主に寄生した寄生バチの幼虫を殺すタンパクをコードする遺伝子)を題材に、これら遺伝子がウイルスの生態へ果たす機能を解明する。具体的には、当該遺伝子をノックダウンしたウイルスと野生型ウイルスの表現型や適応度形質を細胞、個体レベルで比較し、さらに個体間レベルで伝播力を比較することで、これら遺伝子がどのように生態的な機能を果たしているのかを明らかにする。本年度の計画は、1については、細胞レベルでの性状解析を行うことおよび宿主昆虫個体における解析を開始することである。また、2については、ノックアウトウイルスの作出と細胞レベルでの解析を行うことである。1については、遺伝子をノックアウトしたウイルスと野生型ウイルスの細胞における増殖を解析し、双方の間に差がないことを明らかにした。また、宿主昆虫を用いて病原力や子ウイルスの産生能力などを比較したが差はなかった。しかし、野生型ウイルスでは、蛹化が阻止されるため宿主が蛹になるときにとる一連の行動がなく、死亡する時に腸を脱落させるため、子ウイルスを環境中にばらまくことが観察されたが、ノックアウトウイルスではそのようなことがなく子ウイルスが効率よく環境中にばらまかれないことが示唆された。2については、遺伝子ノックアウトウイルスを作成し、細胞での増殖を野生型ウイルスと比較したが差は認められなかった。また、宿主昆虫に対して生物検定を行い野生型との間に病原力の差がないことが明らかとなった。昆虫ポックスウイルスの2つの遺伝子(1.宿主の発育を操作する遺伝子と2.宿主に寄生した寄生バチの幼虫を殺すタンパクをコードする遺伝子)がウイルスの生態へ果たす機能を解明する。具体的には、当該遺伝子をノックアウトしたウイルスと野生型ウイルスの適応度形質を比較し、これら遺伝子がどのように生態的な機能を果たしているのかを明らかにする。1について、遺伝子ノックアウトウイルスのほかに、マーカーを遺伝子非コード領域に入れたノックインウイルスおよび、ノックアウトウイルスに当該遺伝子を入れなおすレスキューウイルスを新たに作成した。これらウイルスの病原力や、昆虫体重当たりの増殖数に差はなかった。しかし、野生型やノックインウイルス、レスキューウイルスに感染した宿主幼虫が蛹にならず死ぬまで幼虫のまま成長するのに対し、当該遺伝子をノックアウトしたウイルスでは、ほとんどの感染昆虫が、蛹ー幼虫中間体や不完全な蛹で死亡した。これらのノックアウトウイルス感染個体は幼虫で感染致死した個体よりも小さく、ウイルス産生量も少なかった。当該遺伝子の存在によりウイルスの適応度は高くなると考えられた。また、健全虫は、植物下のリター中等に蛹室をつくりそこで蛹化するが、ノックアウトウイルス感染虫も同様の行動をとり蛹室を作り、死亡した。野生型やノックインウイルス、レスキューウイルス感染虫はそのような行動はとらず、脱腸することにより、産生した娘ウイルスで周囲が汚染され、最終的に植物上から落下すると考えられた。当該遺伝子は、ウイルスの空間分布に影響し、伝播に影響するものと推察された。2について、作成したすべてのノックアウトウイルスが宿主に寄生した寄生バチを殺すことが判明した。ウイルスゲノムに機能的ホモログが存在することが強く示唆されたため、それもノックアウトするための、組換えベクターを構築し、組換えウイルスの作成に着手した。発育を延長させる遺伝子について、遺伝子をGFP遺伝子でノックアウトしたウイルス、GFPを非コード領域に挿入したノックインウイルス、当該遺伝子を入れもどしたレスキューウイルス、そして親株ウイルスを用いてアワヨトウ幼虫の行動に及ぼす影響を調査した。それぞれのウイルスに感染させ、人工飼料を用いてカップで飼育し、観察した。非感染幼虫では、蛹化前に、スピニングをして蛹化するための蛹室を作り蛹化した。ノックアウトウイルス感染幼虫は、非感染幼虫と同様に成長し、同様にスピニングの後、蛹室を作り蛹化の準備をしたが、多くの個体は、蛹ー幼虫中間体で死亡した。ノックインウイルス、レスキューウイルス、野生型ウイルスは、終齢期間が延長し幼虫のまま死亡した。これらの個体は、蛹化にかかわる行動は示さなかった。