hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
起壊死性抗がん剤の皮膚傷害メカニズムの解明と臨床ケアの確立

起壊死性抗がん剤である微小管機能阻害薬の血管外漏出によりしばしば認められる重篤な皮膚傷害のメカニズムを明らかにし,皮膚傷害の適切な予防とケアについて検討した。ヒト由来の培養細胞を用いた研究により,曝露初期から認められる急性期の細胞傷害には,酸化的ストレスと微小管の断片化による細胞骨格の崩壊が関与すると考えられた。冷罨法(23°C)に相当する培養条件下では細胞傷害性は有意に抑制された。副腎皮質ホルモン剤を添加することによりIL-6の発現が抑えられ炎症反応の抑制が期待されるが,ステロイド剤そのものにも細胞傷害性が出現するため,適正な用量のコントロールが必要であることが明らかとなった。起壊死性抗がん剤は,血管外漏出により皮膚傷害をきたしやすい薬剤の中でも特に重篤な傷害を生じることがあり,医療従事者の間では,有害事象を回避する方策やケア,治療のエビデンスが不足し,情報が錯綜している。そこで,起壊死性抗がん剤に分類される微小管機能阻害薬であるタキサン系化合物及びビンカアルカロイドを用いて,その皮膚傷害メカニズムを解明し,がん化学療法に伴う皮膚傷害を回避する方策の確立とがん患者のQOLの向上を試みている。現在まで我々は,曝露初期に起こる急性の細胞傷害と,その後に起こる遅延型細胞毒性の2つの細胞障害パターンが認められること,遅延型細胞毒性は,アポトーシスによる細胞毒性が関与している可能性が考えられルことを明らかにした。また,脂質過酸化により生じるマロンジアルデヒドの細胞内濃度が顕著に増加したことより,起壊死性抗がん剤が血管外漏出した際の急性の細胞傷害には,脂質過酸化による酸化的ストレスの関与することを示した。さらに,タキサン系抗がん剤で用いられている添加剤(ヒマシ油,界面活性剤等)そのものにも曝露初期に細胞傷害性が認められ,製剤の毒性に寄与していることが示唆された。ヒト皮膚線維芽細胞を用いた研究により,タキサン系ならびにビンカアルカロイドによる細胞傷害性は,長時間曝露及び高濃度における短時間曝露では, 41°Cでの曝露により細胞生存率の減少が増強され, 23°Cでの曝露により,細胞生存率の低下が抑制された。一方,低濃度による短時間暴露では,23°C及び41°Cでの曝露のいずれにおいても細胞傷害性が抑制された。これらの結果より,組織傷害が激しい場合には冷罨法を,傷害が軽度の場合には冷罨法に加えて温罨法も有効な可能性が示唆された。1.起壊死性抗がん剤による細胞傷害性ならびに細胞保護作用のメカニズムの検証:1曝露初期に起こる急性の細胞傷害とその後に起こる遅延型細胞毒性の2つの細胞障害パターンが認められ,遅延型細胞毒性は,アポトーシスによる細胞毒性が関与している可能性が考えられた。2微小管機能阻害薬を培養細胞に曝露した場合,脂質過酸化により生じるマロンジアルデヒドの細胞内濃度が顕著に増加したことより,起壊死性抗がん剤が血管外漏出した際の急性の細胞傷害には,脂質過酸化による酸化的ストレスの関与が示唆された。3ミトコンドリア毒性は認められず,タキサン系抗がん剤に含まれる添加剤(ヒマシ油,界面活性剤,等)が抗がん剤曝露初期(曝露後8時間まで)の細胞毒性に大きく関与している。さらに,主薬の細胞毒性発現には酸化ストレス以外の毒性メカニズムが存在する可能性が示唆された。2.起壊死性抗がん剤による細胞傷害性に対する罨法およびステロイド療法の妥当性の影響:1タキサン系ならびにビンカアルカロイド(VNR)による細胞傷害性は,組織傷害が激しい場合には冷罨法を,傷害が軽度の場合には冷罨法に加えて温罨法も有効なことが示唆された。2VNRの血管外漏出による皮膚傷害に対する温罨法処置においては,熱感受性タンパク質(HSP),HSP70及びHSP90αが誘導され細胞保護作用に大きく関与することが示唆された。3微小管機能阻害薬の血管外漏出がIL-6の放出を促し,ヒトの皮膚組織における初期の炎症反応の進行に関与する可能性が示唆された。4ステロイド剤そのものにも臨床用量の濃度では細胞傷害性があり,薬剤の投与量に注意が必要である。細胞傷害性を示さず,IL-6を抑制するステロイド剤の濃度は,局所投与薬液濃度の100105倍希釈であり,臨床における薬液調整の目安となることが示唆された。起壊死性抗がん剤であるタキサン系およびビンカアルカロイド系の細胞傷害メカニズムを明らかにし,その分子メカニズムの一部を明らかにすることができた。また,臨床での予防・治療効果につながる皮膚細胞傷害保護作用を有する分子(熱感受性タンパク質:ヒートショックプロテイン)の可能性を見出すとともに,現在,経験則をもとに臨床で行われている治療方法の科学的な検証を進行させることができた。特に,罨法における細胞保護タンパク質の誘導状況の確認や,副腎皮質ホルモンによる炎症初期サイトカインの動態とその至適濃度の解明は,現行のステロイドによる抗炎症療法の適切な方法の確立につながる結果が得られた。これまでの研究内容については,日本薬学会第136年会,国際医療福祉大学学術大会で発表するとともに,学術論文を作成中である。1.微小管機能阻害性抗がん剤によるヒト由来培養細胞(HepG2,SF-TY,HUV-EC-C)を用いた細胞傷害性のメカニズムの検証

:1タキサン系抗がん剤(タキソール:PTX,タキソテール:DOC)においては,主薬を含まない添加剤のみでも曝露8時間までに主薬を含む製剤と同様の傷害が認められることから,急性期における細胞傷害に界面活性剤等の添加剤による細胞膜傷害が関与していることが示唆された。2タキサン系抗がん剤およびビンカアルカロイド(ビノレルビン:VNR)といった微小管阻害剤の曝露により,曝露10min以降という早い段階から細胞骨格の断片化が始まることがβ-チューブリンの免疫染色により明らかとなった。3VNRは曝露後短時間で薬理作用によるG2/M期での細胞周期の停止を引き起こすとともにアポトーシスも誘導することが確認された。以上より,起壊死性抗がん剤の細胞傷害発現機構として,曝露初期には酸化ストレスとともに細胞骨格の破綻が関与していることが示唆された。2.微小管阻害剤による罨法の効果:1冷罨法を想定した23°Cの培養条件では,PTX,DOC,VNRによる細胞傷害性は37°C培養条件に比べて有意に低下し,起壊死性抗がん剤の漏出時の臨床における対処法として冷罨法が有効である可能性を既に報告している。また,漏出溶液の拡散を想定したVNR臨床用投与薬液のx0.01以下の低濃度での暴露において,温罨法に相当する41°Cにおいても細胞傷害性の抑制効果が認められるとともに,heat shock protein (HSP)70および90αの発現量が顕著に増加していた。1HepG2を用いた曝露実験において,HSP70およびHSP90αそれぞれの阻害剤の共存により細胞傷害抑制効果が消失することから,低濃度抗がん剤曝露時の温罨法による細胞傷害抑制には,これらHSPsの関与が示唆された。起壊死性抗がん剤である微小管機能阻害薬の血管外漏出によりしばしば認められる重篤な皮膚傷害のメカニズムを明らかにし,皮膚傷害の適切な予防とケアについて検討した。ヒト由来の培養細胞を用いた研究により,曝露初期から認められる急性期の細胞傷害には,酸化的ストレスと微小管の断片化による細胞骨格の崩壊が関与すると考えられた。冷罨法(23°C)に相当する培養条件下では細胞傷害性は有意に抑制された。副腎皮質ホルモン剤を添加することによりIL-6の発現が抑えられ炎症反応の抑制が期待されるが,ステロイド剤そのものにも細胞傷害性が出現するため,適正な用量のコントロールが必要であることが明らかとなった。起壊死性抗がん剤であるタキサン系及びビンカアルカロイド系の細胞障害性の特徴を明らかにし,その分子メカニズムの1つを解明することができた。また,研究内容を日本薬学会第135年会,国際医療福祉大学学術大会,2014年環境トキシコロジーフォーラムで発表することができた。微小管機能阻害薬であるビノレルビン,パクリタキセル及びドセタキセルの医薬品製剤が血管外漏出した際に引き起こす皮膚傷害に対する処置法として現在用いられている罨法(温罨法及び冷罨法)ならびにステロイド剤の皮下投与による傷害抑制効果について,正常ヒト皮膚線維芽細胞(SF-TY細胞)を用いて解明する。1微小管機能阻害薬による細胞周期の変動:微小管機能阻害薬の薬理効果(主作用)である微小管重合阻害または促進に伴う細胞周期の変動(G2/M期への細胞集積)の,血管外漏出による皮膚傷害への関与についてフローサイトメーターを用いて検討する。2微小管機能阻害薬の薬理効果である微小管重合阻害または促進に伴って引き起こされるアポトーシスが血管外漏出による皮膚傷害への関与するかについて,DNA断片化とDNAヒストグラムの結果により確認する。
海水中で使用できる新規分解性両親媒性化合物の創製と機能に関する研究

海洋事故などに使用する際、環境負荷の低減が期待できるように、親水基に糖を有する分解性非イオン両親媒性化合物の創製とその機能に関する研究を行った。まず、酒石酸と長鎖ケトンから、1,3-ジオキソラン環を有するタイプ1と、酒石酸とヨードオクタンからエステル型のタイプ2を合成した。それらの人工海水の界面物性は、一般的な界面活性剤と同等以上であることをあった。重油に対する乳化・分散力は市販の油処理剤と同程度であった。これらの分解性界面活性剤の4週間後の生分解度は60%以上であり、通常型の界面活性剤よりも優れていた。また、重油の生分解性を検討した結果、これらを添加することで生分解性の向上が見られた。これまで研究を行ってきた化学分解機能を付与した新しい両親媒性化合物は、分解性連結部(アセタール基、1,3-ジオキソラン環、エステル基など)を分子内に導入していることからそのままでも微生物による生分解性がいいことも判明している。そのなかでも海水(ミネラル、塩を含む水)中で、良好な界面物性が保持できる分解性両親媒性化合物を創製することができれば、海洋事故などに使用する際、環境負荷の低減が期待できる。そこで、親水基には糖などの天然物を有する海水中で使用できる分解性非イオン両親媒性化合物の創製とその機能に関する研究を行った。今年度は、1,3-ジオキソラン環を有しない新規両親媒性化合物を合成し、その界面物性を測定した。まず、果実などの各種植物中に遊離酸または塩として存在する酒石酸ジエチルとヨードオクタンをDMF中で水素化ナトリウムを加えて、アルキル化することによりエステル型中間体を合成した。その中間体とショ糖を炭酸カリウム存在下、DMF中でエステル交換することにより、糖由来の化学分解性界面活性剤を合成した。反応終了後、中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行った。これらの曇点は90°C以上となり、市販ショ糖脂肪酸エステルと同様の結果となった。表面張力低下能は30 mN m-1以下となり、非常に低い値となった。起泡力、泡安定性は、市販ショ糖脂肪酸エステルよりも良い結果となった。大豆油を用いた乳化力は、市販ショ糖脂肪酸エステルに比べ若干優れていた。人工海水中では、cmc、表面張力低下能ともに市販ショ糖脂肪酸エステルよりも優れていた。海水中で、良好な界面物性が保持できる分解性両親媒性化合物を創製することができれば、海洋事故に使用する際、環境負荷の低減が期待できる。まず、タイプ1として、果実などの各種植物中に遊離酸または塩として存在する酒石酸と長鎖ケトンをトルエン中、酸触媒存在下、脱水縮合反応させ、1,3-ジオキソラン環を有する中間体を合成した。続いて中間体と糖(ショ糖、ラクトビオン酸)を炭酸カリウム存在下、DMF中でエステル交換反応を行い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を得た。次に、タイプ2として、酒石酸ジエチルとヨードオクタンをDMF中で水素化ナトリウムを加えて、アルキル化することによりエステル型中間体を合成した。その中間体とショ糖を炭酸カリウム存在下、DMF中でエステル交換し、中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を得た。そして、それらの基本的界面物性(曇点、表面張力、起泡力)を測定して対照界面活性剤(通常のエトキシレート界面活性剤や食添用シュガーエステル)と同等以上であることを明らかにした。また、人工海水で測定した結果も同様であった。植物油に対する乳化力は、対照界面活性剤とほぼ同程度であったのに対し、人工海水中では、上回る結果となった。重油に対する乳化・分散力においては、市販の油処理剤と同程度であることがわかった。化審法に規定された方法に準じて生分解度試験を行った結果、これらの分解性界面活性剤の4週間後の生分解度は60%以上であり、通常型の界面活性剤よりも優れていた。これまで研究を行ってきた化学分解機能を付与した新しい両親媒性化合物は、分解性連結部(アセタール基、1,3-ジオキソラン環、エステル基など)を分子内に導入していることからそのままでも微生物による生分解性がいいことが判明している。そのなかでも海水(ミネラル、塩を含む水)

中で、良好な界面物性が保持できる分解性両親媒性化合物を創製することができれば、海洋事故に使用する際、環境負荷の低減が期待できる。そこで親水基には糖などの天然物を有する海水中で使用できる分解性非イオン両親媒性化合物の創製とその機能に関する研究を行った。今年度は、1,3-ジオキソラン環を有する新規両親媒性化合物を合成し、その界面物性を測定した。まず、果実などの各種植物中に遊離酸または塩として存在する酒石酸と長鎖ケトンをトルエン中、酸触媒存在下、脱水縮合反応させ、1,3-ジオキソラン環を有する中間体を合成した。精製は、クーゲルロール蒸留法により行った。収率は、約80%であった。続いて中間体と糖(ショ糖、ラクトビオン酸)を炭酸カリウム存在下、DMF中でエステル交換反応を行い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、目的物を得た。ショ糖は食添用界面活性剤に用いられ、ラクトビオン酸はヨーグルトなどに含まれ最近注目されている。そして、それらの基本的界面物性(曇点、表面張力、起泡力)を測定して対照界面活性剤(通常のエトキシレート界面活性剤や食添用のシュガーエステル)と同等以上であることを明らかにした。また、人工海水で測定した結果も同様であった。乳化力は、対照界面活性剤とほぼ同程度であったのに対し、人工海水中では、上回る結果となった。今年度は、1,3-ジオキソラン環を有しない新規両親媒性化合物を合成するにあたり、中間体と目的物の最適反応条件を確立し、目的物の化学分解性両親媒性化合物が得られることを見出した。その後、純水中、人工海水中での種々の界面物性を対照両親媒性化合物と比較し、同等以上であることを明らかにした。特に、人工海水中でのcmc、表面張力低下能は対照両親媒性化合物よりも良好であった。よって本年度の研究計画はおおむね達成することができた。今年度は、2種類の両親媒性化合物を得るために反応温度、時間、溶媒などを検討し、最適反応条件の確立を目指し、次年度以降、それらの物性を測定することになっていたが、今年度は1種類の両親媒性化合物を合成し、引き続きその界面物性を測定した。まず、中間体と目的物の最適反応条件を確立し、目的物の化学分解性両親媒性化合物が得られることを見出した。その後、純水中、人工海水中での種々の界面物性を対照界面活性剤と比較し、同等以上であることを明らかにした。特に、人工海水中での乳化力は対照界面活性剤よりも良好であった。これまでに合成した1,3-ジオキソラン環を有する分解性非イオン両親媒性化合物と1,3-ジオキソラン環を有しない分解性非イオン両親媒性化合物の応用実験を行う。まず、微生物による活性汚泥を用い生分解性試験を両親媒性化合物単体や油分散系などいろいろな系で行う。さらに、実際の使用に関して重油などの分散・乳化力も検討する(MDPC法、船査第52号法)。その際、ショ糖脂肪酸エステルや市販の分散剤と比較する。今後は、もう1種類の両親媒性化合物の合成と評価を行う。親水基には、今年度同様ショ糖およびラクトビオン酸を用いる。酒石酸骨格の二鎖型化合物中間体は、酒石酸水酸基とアルキルハロゲン化物のエーテル化を、一般的なWilliamson法に従って合成する。まずアルカリ触媒として、水酸化ナトリウム、溶媒としては、ヘキサンまたはジオキサンを使って反応を試みる。中間体と糖との反応は、アルカリ触媒としては炭酸カリウムを用い、溶媒としてDMFを考えている。
嗅覚記憶中枢キノコ体の複数出力域の網羅的同時観測による匂い地図作成と可塑性の解明

ショウジョウバエのキノコ体(MB)は、忌避/報酬刺激と嗅覚刺激の連合学習・記憶形成の場であるとされる。MB神経には機能が異なるサブタイプが存在し、各タイプの軸索束は接続先別に複数の出力領域に区画化され機能していると考えられている。2光子カルシウムイメージングにより、サブタイプを区別したMB神経軸索束の複数の出力域で、学習前の匂い応答を同時計測し、可塑性解析の基盤となる神経科学的な回路図を構築する。匂いの応答強度や速度,分離度,回路内での遷移様式をサブタイプごとに網羅し、学習後の応答変化の指標とする。MB回路網をin vivoライブイメージングの手法により解剖していくことで、情報の連合を担う記憶神経回路のプレシナプス側での可塑性を動的に明らかにすることを最終目標とする。当該年度までに、本研究を遂行するために必要な多重遺伝子組換え系統の作成が完了した。本研究と関連し、所属研究室の山崎助教がMBγ神経において行動遺伝学的に相反する機能を持つサブタイプγCRE-p、γCRE-n神経を新たに見出した。これらのサブタイプをラベルするGal4系統とGCaMP発現系統等を掛け合わせ、新たな多重組み換え系統を作成した。申請者はこれらの組み換え系統と光遺伝学的手法を組み合わせ、γCRE-p神経とγCRE-n神経が拮抗的に働くことをライブイメージングの系で明らかにした。さらにγCRE-p、γCRE-n系統でラベルされるγMB神経はValenceを有することが示唆されたた。このためこれまで計画していたようあ記憶学習で汎用される匂い物質であるMCHやOctに加え、ショウジョウバエにおいて生得的に忌避性の匂いとして見なされているCO2やCitronella,誘引性の物質としてはリンゴ酢、酵母等を匂い刺激として追加し、研究計画の修正を行い、解析を継続している。本研究を遂行するために必要な多重遺伝子組み換え系統の作成が完了していたが、系統の維持に用いていたインキュベーターが故障、発熱し、各種系統が死滅した。また計画当初は軸索束の出力領域を区画化するためのマーカーとしてmCherryの使用を想定していたが、発現量が過剰なためか形態発生に異常が見られる個体が観察されたため、発生への影響が少なく高輝度であるtdTomatoを用いることに変更した。このため、バックアップしていた組換え前の系統等を用い多重組換え体の再構成をおこなった。その後、発現パターンのチェックを行い、発生に異常ないことを確認した。忌避性あるいは誘引性の行動を起こす際、MB神経レベルでもValenceがコードされていることが本研究室の先行研究から明らかになってきたことから、提示する匂い物質の種類を追加することとした。記憶学習の系で汎用されるMCH,Oct,に加え、生得的に中立的性質の匂いとしてHexanol、忌避性の匂いとしてCO2, Citronella,誘引性の匂いとしてリンゴ酢、酵母を選定し、匂い刺激実験をおこなっている。特定の匂い物質に関し、匂い呈示終了後もチューブ内に匂い物質が残存していることが示唆されたため、所属研究室の廣井助教の協力により、チューブやジョイントの素材の変更を計画し、これまでシリコンチューブであった領域も全て匂いの付着が少ないテフロン素材への変更を完了し、改善が観察された。上記の問題への対策に時間を要し予定より数ヶ月計画が遅延したが、現在はこれらの複数種の匂いを安定的に提示する系が構築された。また、負の価値情報の条件付けに用いる電気ショック刺激も同様に安定的に提示可能なシステムが構築されたため、学習前後の応答変化を顕微鏡下で観察するための実験環境はほぼ整ったと考えている。キノコ体神経は、古典的には3つのタイプ:γ神経,α'/β'神経、α/β神経に分けられ、それぞれ、記憶の獲得、固定、想起などの段階において異なる機能を持つことが明らかにされてきたが、Asoらにより公開されたsplit-gal4系統の利用により、γ(main、d型)、α'/β'(m、ap型)、α/β(p、s、c型)のように、さらなるサブタイプへの細分化が可能となっている。本研究と並行し、所属研究室で見出されたγCRE-p、γCRE-n神経は解剖学的にはそれぞれγ-main、γ-d型に対応し、記憶形成における重要な機能が明らかにされつつあるため、これらのサブタイプを優先し、可塑性検証の土台となる応答地図の構築を目指す。ピクセルレベルの画像解析も計画しているため、多変量データの解析に精通している廣井助教の協力のもと、応答データの解析を行っていく。これと並行し、γ神経以外のサブタイプに関しても、組み換え系統はすでに完成しているため、匂いや電気ショック刺激への応答などを出力域を区画化して網羅的に取得し、キノコ体神経全サブタイプにおける匂い応答回路図の構築を目指す。学習前の匂い応答を、サブタイプを区別した軸索束の複数の出力域で、2光子カルシウムイメージングにより同時計測し、可塑性解析の基盤となる神経科学的な回路図を作成する。匂いの応答強度や速度,分離度,回路内での遷移をサブタイプごとに網羅し、学習後の応答変化の指標とする。

MB回路網をin vivoライブイメージングの手法により解剖していくことで、情報の連合を担う記憶神経回路のプレシナプス側での可塑性を動的に明らかにすることを最終目標としている。当該年度までに、本研究を遂行するために必要な多重遺伝子組換え系統の作成が完了した。本研究と関連し、共同研究者がMBγ神経において行動学的に相反する機能を持つサブタイプγCRE-p、γCRE-n神経を新たに見出した。これらサブタイプをラベルするGal4系統とGCaMP発現系統等を掛け合わせ新たな多重組み換え系統を作成した。申請者はこれら系統と光遺伝学的手法を組み合わせ、γCRE-p神経とγCRE-n神経が拮抗的に働くことをライブイメージングの系で明らかにした。さらにγCRE-p、γCRE-n系統でラベルされるMB神経はValenceを持つことが示された。このため、これまで計画していた匂い物質に加え、ショウジョウバエが生得的に誘引性/忌避性を持つことが知られている匂い物質の提示も加えることとし、応答様式の解析の研究計画を修正した。これに伴い、匂い提示のシステムの改良も行なっている。当該年度中頃までに、本研究を遂行するために必要な多重遺伝子組み換え系統の作成が完了していたが、系統の維持に用いていたインキュベーターが故障、発熱し、各種系統が死滅した。また計画当初は軸索束の出力領域を区画化するためのマーカーとしてmCherryの使用を想定していたが、発現量が過剰なためか形態発生に異常が見られる個体が観察されたため、発生への影響が少なく高輝度であるtdTomatoを用いることに変更した。このため、バックアップしていた組換え前の系統等を用い多重組換え体の再構成を行っている。忌避性あるいは誘引性の行動を起こす際、MB神経レベルでもValenceがコードされていることが本研究室の先行研究から明らかになってきたことから、提示する匂い物質の種類(忌避性、誘引性、中立の匂い物質)を追加した。特定の匂い物質に関し、匂い呈示終了後もチューブ内に匂い物質が残存していることが示唆されたため、チューブやジョイントの素材の変更を計画しておる。今後は、チューブ間の接続部も含め全てテフロンコーティングされたものを用い、匂い流路内への匂い物質の付着を防ぎ改善させる予定である。上記の問題への対策を続けており、予定より数ヶ月計画は遅延している。ショウジョウバエのキノコ体(MB)は、忌避/報酬刺激と嗅覚刺激の連合学習・記憶形成の場であるとされる。MB神経には機能が異なるサブタイプが存在し、各タイプの軸索束は接続先別に複数の出力領域に区画化され機能していると考えられている。2光子カルシウムイメージングにより、サブタイプを区別したMB神経軸索束の複数の出力域で、学習前の匂い応答を同時計測し、可塑性解析の基盤となる神経科学的な回路図を構築する。匂いの応答強度や速度,分離度,回路内での遷移様式をサブタイプごとに網羅し、学習後の応答変化の指標とする。MB回路網をin vivoライブイメージングの手法により解剖していくことで、情報の連合を担う記憶神経回路のプレシナプス側での可塑性を動的に明らかにすることを最終目標とする。本研究と関連し、所属研究室の山崎助教がMBγ神経において行動遺伝学的に相反する機能を持つサブタイプγCRE-p、γCRE-n神経を新たに見出した。
混相流における支配方程式の適用領域と評価

固液混相流の支配方程式の構造とその適用性について研究を推進し、つぎのような成果を得た。(1)一流体モデルは適用に際して粒子径や粒子濃度などの制約は厳しいものの、支配方程式の数学的表現は明確である。そのため、適用例も多く、浮遊砂流、土石流、掃流砂流などの解析に適用されている。しかし、構成則の一般性という面からこのモデルを見ると、システムのエネルギー散逸構造を直感的にこれを定めて議論している段階にある。(2)二流体モデルは、固相と液相それぞれ独立な支配方程式から出発し、二つの相の境界を含むごく薄い領域に汎関数を導入してある領域にわたる平均操作から得られたものである。このモデルにおいては、相互作用が支配方程式および構成則にどんな形で取り込まれるかが重要であるが、通常body forceの形式で支配方程式に表現されている。これは、相互作用がエネルギー散逸機構には影響を与えないという結果であって、その物理的な解釈はかなり難しい。これはシステムの作り方、あるいは平均操作の仕方に起因するものと思われるので、今後、問題を見直す必要がある。(3)粒子流体モデルは、粒子は質点、弾性体、あるいは非弾性体からなる粒の支配方程式に従うとするものである。粒子濃度が小さく、相互作用がone wayの条件を満たすような領域の研究では多くの成果があげられている。また、相互作用がtwo wayの場合においても、上述(2)のような問題は残されるものの、掃流砂流などの解析に適用されるようになってきている。本研究を進めるに当たり、三つの課題を設定し、これらを以下のように推進した。1.支配方程式による従来の研究の分類研究手法の違いによって混相流研究をみると、実験を主体としたもの、理論解析的色彩の強いもの、および数値解析を主体としたものがある。これらの研究を解析モデルの種類、および解析モデルの中で用いられている支配方程式の違いに着目して分類した。2.支配方程式の適用領域混相流の解析には、A.一流体モデル、B.質点(剛体を含む)流体モデル、C.流体流体モデルなどが用いられている。それぞれの研究対象において、固相の粒子径、密度、濃度、および各相の運動を記述する支配方程式の構造、さらに実験的研究に着目しながら、各研究対象ごとにこれらの解析モデルの適用限界について検討を進めている。さらに、解析モデルの適用領域は、モデルの中で用いられている支配方程式の構造に依存する部分が大きいが、支配方程式の理論的な合理性について考察を行っている。3.支配方程式の応力項に関する統一見解上述の課題2と並行して次のように推進している。各解析モデルにおいて、異相間の相互作用が支配方程式の中でどのように表現されているか、これまでの研究を研究対象ごとに分類した。同時に、研究対象による応力項の表現の違いを明らかにした。ここで、研究対象として、土石流、泥流、掃流砂流、浮遊砂流、砂粒子プリューム、氷雪流、樹木・杭群の中の流れなどを選んでいる。固液混相流の支配方程式の構造とその適用性について研究を推進し、次のような成果を得た。このため、適用例も多く、浮遊砂流、土石流、掃流砂流などの解析に適用されている。これは、相互作用がエネルギー散逸機構には影響を与えないという結果であって、その物理的な解釈なかなり難しい。

これはシステムの作り方、あるいは平均操作の仕方に起因するものと思われるので、今後、問題を見直す必要がある。(3)粒子流体モデルは、粒子は質点、弾性体、あるいは非弾性体からなる粒の支配方程式に従うとするものである。粒子濃度が小さく、相互作用がone way条件を満たすような領域の研究では多くの成果が上げられている。また、相互作用がtwo wayの場合においても、上述(2)のような問題は残されるものの、掃流砂流などの解析に適用されるようになってきている。
南西日本におけるアオリイカ地方個体群の識別に関する生理・生態学的研究

南西日本におけるアオリイカ地方個体群の解析、識別のために、沖縄県阿嘉島および石垣島におけるアオリイカの産卵生態調査、標本採集、発生の観察などを行い、下記の結果が得られた。1.沖縄県のアオリイカには漁業的にいくつかの集団が知られているが、外部形態からははその区別が極めて難しい。2.産卵生態の調査の結果、阿嘉島および石垣島のアオリイカについて、従来より報告されている産卵生態を示す個体群と、これまでに報告されていない新たな産卵基盤、産卵習性、卵嚢の形態を示す個体群の2種類の異なった産卵集団が観察された。また、石垣島ではこれらの2つの産卵集団の産卵期は重複が見られなかった。この結果、生態的に隔離された異なる2つの個体群の存在の可能性が示唆された。3.上記の2つの異なる産卵生態を示すそれぞれの卵の発生を観察したところ、新たに観察された卵では、色素胞の出現時期が従来型の卵と比較して1ステ-ジ早いことを除くと両者は極めて類似しており、卵から孵化した稚イカの形態、色素等にもマクロな差は認められなかった。4.アイソザイムによるアオリイカの集団遺伝学的研究のための基礎的知見を得るため、千葉県沿岸で得られたアオリイカについてデンプンゲル電気泳動法により、多型酵素の検索を行なった結果、アオリイカでは口球の筋肉および消化盲嚢の組織が有効であることがわかり、これらの組織を用いて酵素の検索を行なったが、沖縄で得られた材料について検索と応用の研究を継続している。南西日本海域のアオリイカは、その外観から白イカ、赤イカおよびグワイカに分けられている。これらの3種類の差異を明らかにするため、沖縄から得られた標本を基に外部形態の比較、潜水調査による産卵生態の比較、卵発生の観察を行なった。また、アイソザイムの手法による地方集団の解析のための基礎的知見を得るため、千葉県産のアオリイカを用いて、アイソザイムの検索を行なった。結果は下記の通りである。1.固定標本を用いて外部形態を調べた結果、アオリイカの3種類間の明らかな差異は認められなかった。このため、今後電子顕微鏡等を用いた。より細部の構造を観察し比較することが必要で、現在検討中である。2.アオリイカの卵塊には、従来から報告されていた1卵嚢中の卵数が5-9粒の卵塊の他に、新たに卵嚢中の卵数が例外なく2粒のものが観察された。これらの2種類は、産卵場所も異なり、産卵状態が異なることが示唆され、少なくとも産卵生態により沖縄のアオリイカは2群に分けられることがわかった。また発生を観察したところ、発生過程にも色素胞の出現時期などに差がある可能性がみられた。これらの異なると考えられる2群の親イカに関する知見が未だ得られていないため、これらの親が3種類のいずれに属するのか早急に明らかにする必要がある。3.千葉県産のアオリイカについて、デンプンゲル電気泳動法によりアイソザイムの検索を行なったところ、組織としては、アオリイカの口器の筋肉および消化盲嚢を用いることが有効であることがわかった。多型酵素については現在検索中で、今後この研究を継続することにより明らかになると考えられる。南西日本のアオリイカの地方集団の解析を行なうことを目的として、平成元年9月に沖縄県阿嘉島周辺のアオリイカの産卵生態の調査を行ない、従来考えられていたアオリイカの産卵生態とは異なった習性を示す地方集団を認めた。この知見に基づき、平成2年度は4月10月に沖縄県石垣島のアオリイカの地方集団について、産卵生態に重きを置いて調査研究を行なった。この結果、石垣島周辺のアオリイカ地方集団にも阿嘉島と同様に従来の報告と異なる産卵生態を示す季節産卵集団が観察された。

すなわち従来報告されているアオリイカの卵は、1卵嚢中に平均47粒の卵が収められた卵嚢塊が房状に産卵基盤上露出してに産み付けられるが、今回新たに観察された卵嚢塊は死んだテ-ブル状サンゴの下面に一面に1卵嚢中の卵数が2粒の卵嚢が平面的に産み付けられている。石垣島での従来型の卵嚢は、4下旬5月下旬にモク類やエダミドリイシ類に産み付けられ、新しく観察された産卵群の卵嚢塊は6月下旬10月上旬にテ-ブル状サンゴの死骸を選択的に利用して産卵されていた。これらの2群の産卵期には重複が無く、それぞれの産卵期の間にも綿密な探索を行なったにも関わらず、卵嚢塊は発見されなかった。これらの点から、両者の個体群間には、生態的隔離の存在の可能性が高く、石垣島周辺のアオリイカの地方個体群には少なくとも産卵期、産卵基盤、産卵習性、1卵嚢中卵数が明らかに異なる2群の季節産卵群の存在が識別された。
２色ＬＩＦ法を用いた気体の高精度３次元温度・速度分布計測システムの開発

2色LIF法による温水の温度分布計測技術を応用し、蛍光染料を雰囲気中に噴霧し、これを可視化計測することで、気体の温度分布の非接触多点計測を行う方法を提案した。また、レーザー光とスキャニングミラーを用いたW型スキャニング法を確立し、気流の3次元温度、速度同時計測システムを開発した。この計測手法を実際の気流(垂直浮力噴流)に対して適用したところ、周囲流との混合による噴流の温度低下、周囲流体の巻き込みといった現象がみられ、こうした浮力噴流の傾向は過去の研究の結果とも一致したことから、本計測手法の有効性が示された。平成25年度は、1、温度場、速度場の3次元同時計測を実現する2、電子基盤用加熱炉を想定した温度計測範囲(0°C-250°C)で計測できる、の2点を目標に研究を行った。1、温度場、速度場の3次元同時計測について2、温度計測範囲の拡張について平成24年度の研究成果により、ローダミンB、ローダミン110の2種蛍光染料を用いた気流温度場計測を行うことができたが、ローダミン110の蛍光強度が、高温雰囲中で経時劣化することが、温度計測範囲の拡張に対して解決すべき課題として残っていた。そこで、経時劣化しにくいローダミンBのみで温度場計測を行う手法を開発した。ローダミンBの蛍光強度特性の温度変化を波長域毎に詳細に計測した結果、光源を紫色レーザー(波長405nm)に変えることで、ローダミンBの蛍光のみで温度場計測ができることが分かった。その結果、目標温度250°Cでの温度場計測が可能である見込みを得た。この成果は平成26年6月のISFV2014国際会議において報告し、英文誌に投稿する予定である。平成24年度は、1、家庭用空調機器の熱交換器周りを想定した温度範囲(0°C80°C)で計測できる。2、従来の手法(NO-LIF)と比較して十分小さい温度計測誤差(1.0K以下)で計測できる、の2点を研究目標とし、研究を実施した。1、気体の温度計測手法の構築本年度の可視化計測実験では、ローダミンB、ローダミン110を溶解した液体(グリコール系溶剤)を微粒化し、それを計測対象となる雰囲気中に噴霧し、この噴霧液滴に対して側方からレーザーシート光を照射し、正面から高感度カラーカメラを用いて可視化画像を取得し、得られた可視化画像を処理することとした。その結果、2種類の蛍光染料の輝度比の空間分布を算出することができた。2、温度計測の誤差要因の解明と計測精度の向上本研究で用いたグリコール系溶液は、計測領域内で僅かずつ沈降し、計測領域内に存在する液滴数の減少とともに、レーザー光を照射した際の蛍光強度も減少する。こうした蛍光強度の減少の影響は、2色LIF法を用いることで打ち消すことができ、温度変化の影響のみ可視化することが可能であると予想されるが、完全には打ち消すことができず、温度計測誤差の要因の一つとなることが考えられる。そこで、液滴沈降による温度計測誤差について詳細に評価した。また、速度計測との同時計測を行うにあたり、速度計測精度の向上を図るため、気体温度計測に用いた高感度カラーカメラを用い、高精度カラーPIV計測システムを開発し、その計測精度を評価した。平成26年度は、電子基板用加熱炉の熱交換器周りの温度・速度分布計測を行うことの出来る計測システムの構築を目標として、それに必要な取り組みを行った。1.温度計測手法の改良:前年度まで取り組んできた、温度分布の可視化計測では、ミスト化した蛍光染料を噴霧する必要があるため、実験中にミストの沈降が生ずることによる温度計測誤差が無視出来なかった。また、蛍光染料の噴霧は雰囲気を汚染するため、計測環境に制約があった。そこで、これらの問題を解決するため、極細ワイヤーに蛍光染料を塗布し、これを可視化計測することで、雰囲気温度分布を計測するシステムを構築した。その結果、ミストの噴霧が不要なLIF温度分布計測システムを開発することが出来た。2.2色LIF計測手法の改良:これまで、2種類の蛍光染料(ローダミンB、ローダミン110)を用いて温度分布の可視化計測を行ってきたが、ローダミン110の蛍光特性は、周囲光に長時間晒されることで蛍光強度劣化することが知られており、実験時間に制約があった。そこで、ローダミンBのみを用い、この蛍光の緑色成分、赤色成分を分離することで2色LIF温度計測を行う手法を開発した。その結果、実験時間の制約無く、長時間計測(24時間以上)を実現させることに成功した。これらの改良により、計測対象、計測条件を大幅に広げることが出来たため、今後は、ヒートポンプシステムの長時間熱量計測(24時間)、自動車用排気マフラー内の排ガス流動評価といった、様々な計測対象に対して、可視化計測を行っていく予定である。

可視化計測(1)温度場、速度場の3次元同時計測について気流の3次元速度場計測法の開発を行った。その結果、2種類のビームをW型に3次元スキャンし、得られた可視化画像を3次元再構成することによる3次元PIV法を開発することができた。その結果、当初予定していたライトシートスキャンによる3次元速度計測で懸念された、速度計測精度の低下を防ぐことができた。計測精度を評価した結果、従来のPIV法と同等の計測精度(5%FS)を実現できることが分かった。(2)温度計測範囲の拡張について研究目的に設定した本年度の目標(温度計測範囲)に対し、特に、温度計測範囲の拡張において問題となる、ローダミン110蛍光染料の蛍光強度劣化の対策について検討した。その結果、このローダミン110を用いず、蛍光強度劣化の小さいローダミンBのみでの、単染料2色LIF温度計測法の開発を行うことができた。ただし、高温用の温度計測精度評価装置の完成が間に合わず、目標温度250°Cでの温度計測精度実験が未実施である。また、蛍光染料1種類での温度分布計測が可能になった結果、従来法(2種染料での2色LIF法)での計測誤差要因であった、長時間計測における計測精度低下の問題が解決された。従来法では、蛍光強度の劣化度合いが染料毎に違うことが誤差要因であったが、蛍光染料が1種類(ローダミンB)のみになったことで、この誤差要因が無くなり、計測精度が向上した。計測精度の詳細については平成26年度中に評価し、英文誌に投稿する予定である。研究目的に設定した、本年度の数値目標(温度計測範囲:0°C80°C、温度計測誤差1.0K以下)に対し、研究実績概要に記載の装置開発、評価実験を行った結果、温度計測範囲:0°C60°C、温度計測誤差0.99Kを実現することができ、概ね良好な達成度であると言える。温度計測範囲については、高温側の評価実験に適した評価装置の完成が間に合わず、評価実験が未実施であるが、予備実験の結果から、100°C程度まで伸ばすことが可能であることが予想される。温度計測誤差については、数値目標を達成することができた。来年度以降、蛍光液滴の噴霧手法等の改良により液滴の沈降量を減らすことで、温度計測誤差については更に改良の見込みがある。また、速度計測との同時計測を行うにあたり、気体温度計測に用いた高感度カラーカメラを用い、高精度カラーPIV計測システムを開発し、その計測精度を評価した結果、従来のPIV法と同等の計測精度(5%FS)を実現できることが分かり、3次元温度・速度同時計測システムの実現に有望な見通しが得られた。最終年度(平成26年度)の目標は、電子基盤用加熱炉の熱交換器周りの温度・速度分布計測を行うことができる計測システムを提供することとしている。そこで、可視化実験用のガラス窓付き加熱炉を製作し、炉内の温度・速度分布計測を行う。当初の研究実施計画では、計測領域内に蛍光液滴を一様に噴霧するため、可視化実験専用の煙発生器(ミスト粒径1ミクロン以下)を導入することとしていた。これに対し、平成25年度の研究成果により、ライトシートスキャンによる速度計測精度低下を防ぐことができたため、ミスト粒径3ミクロン以下の家庭用超音波噴霧器で代用できる見通しが立てられた。こうした計測システムの低コスト化により、本研究成果の産業界への導入が更に促進する効果が期待できる。また、狭隘な炉内で可視化実験を行うにあたり、ガラス窓への噴霧液滴の付着の影響が懸念される。
肥満関連腎症における尿沈査中ポドサイトmRNA排泄量の有用性の検討と進展機序解明

肥満症や糖尿病に関連した腎症の診療で使用されている微量アルブミン尿は必ずしも有用ではなく、新たなバイオマーカーが求められている。糸球体疾患では尿中に糸球体上皮細胞(ポドサイト)が多く検出され、申請者らは、尿沈渣中ポドサイト特異的mRNA(ポドシンmRNA)が糸球体疾患のバイオマーカーとして有用であることを示した。また、糖尿病においても、同マーカーが早期診断及び疾患活動性を反映することを明らかとした。本研究の目的は、尿沈査中ポドシンmRNA排泄量などの尿中ポドサイトマーカーが、微量アルブミン尿より精度の高い肥満関連腎症のバイオマーカーとして有用であることを明らかにすることである。
消滅に瀕しているインド諸語の調査研究

1平成12年度においてトダ語の口語語彙集(約2,600語について、それぞれの発音と意味を記述し、さらにそれが1957年にM.B.エメノー博士が発表した記述と一致するか否かを註記してある)を公刊したので、平成13年度はそれ以外の語彙(主に歌謡や宗教儀礼で用いられるやや古風で特殊なもの)を調査収録し、民話10篇の収録記述も行った。この民話10篇の分析記述と発音は、モノグラフにCD-ROMを添付した形で公刊する。なお、口語語彙集には逆引き索引や英語訳索引も併記されている。2ナハリ語に関しては、平成12年度に約400語の基本語彙と民話3篇が収録記述されたが複数の母語話者の面接調査の結果、被調査者によって発音や形式が多少異なることがわかったため、それが方言差によるものなのか、それとも個人差によるものなのかをはっきりさせるための調査を行った。その結果、方言差よりも個人差によるものであることがわかったが、調査する際に用いる媒介言語としてのヒンディー語に対する理解度の差によるものと思われる。3今年度収録したトダ語の特殊語彙とナハリ語の基本語彙は、それぞれの動詞活用形と文法説明とを加え、平成14年中に公刊する。4収録記述した語彙に関しては、トダ語の場合はドラビダ諸語と、ナハリ語の場合はアーリア諸語(特にヒンディー語とマハラーティー語)とオーストロ・アジア諸語(特にコルク語)と比較することによって、歴史的変化過程や系統的・類型的特徴を明らかにする。5すべての収録語彙をデータベース化し、発音をCD-ROMの形で保存し、インターネットを通じて一般研究者に公開する。
iPS細胞を用いた肝細胞癌に対する血管新生抑制遺伝子治療のベクタ-細胞作製の試み

本研究はiPS細胞から肝細胞癌組織へ高率に遊走するベクター細胞を作成し、この細胞に血管新生抑制因子を遺伝子導入し担癌マウスに投与することで抗腫瘍効果を得ることを目的としたものである。当初、マウスiPS細胞から平滑筋細胞を作製しベクター細胞にする予定であったが細胞の増殖能と腫瘍への遊走能が予想に反して低かったためヒトiPS細胞から間葉系幹細胞を作成し、さらに遊走能を高めるためCXCR4cDNAを遺伝子導入しかつ、担癌マウスに投与した細胞が腫瘍部で様々な増殖因子を産生して腫瘍の増大を促進しないようにHIF1-?のsiRNAを遺伝子導入しベクター細胞を完成させた。この細胞に血管新生抑制因子である可溶性VEGFレセプター1,2をアデノウイルスを用いてexvivoで遺伝子導入後担癌マウスの尾静脈から1×106個を週1回4週間にわたり投与した。その結果、対照群に比べて腫瘍の増大が抑制された。投与したベクター細胞は主に腫瘍内の間質に存在し、その一部は血管内皮細胞や平滑筋細胞にも分化していたが非主要部へのベクター細胞の浸潤は乏しかった。さらに腫瘍内血管密度は減?していた。ベクター細胞を投与する事での骨髄系および肝機能への影響はみられなかった。マウスiPS細胞から平滑筋細胞への分化誘導を行った。その結果、免疫組織化学による検討では、平滑筋細胞への分化を示すαSMA陽性の細胞と内皮細胞への分化を示すCD31陽性細胞が観察され、FACSによる解析でαSMA陽性の細胞とCD31陽性細胞は各々約30%を占めていた。次に、これらの細胞をsingle cell cultureし、αSMA陽性の細胞を単離した。Western blottingとTR-PCRによる解析では、単離された細胞は腫瘍や炎症部位への遊走に不可欠なCXCR4やVEGF receptor-1,2を発現していた。マウス骨髄細胞から分化誘導したαSMA陽性細胞と遊走能をBoyden chamber法にて比較した結果、両細胞とも同等の遊走能を示した。この結果、iPS細胞から誘導したαSMA陽性の細胞は大量に作成可能であり骨髄細胞由来のαSMA陽性細胞と同等の遊走能を持ち合わせていることが明らかとなった。さらに遊走能の強力な細胞を作成するためCXCR4を遺伝子導入した細胞の作製を行っている。iPS細胞から誘導したαSMA陽性細胞を大量培養し、ヌードマウスの皮下にヒト肝癌細胞株であるKYN-2を接種して作成した肝癌モデルの尾静脈から蛍光色素でラベルした後に投与し(10^6個)、腫瘍組織への遊走を検討した結果、iPS細胞から誘導したαSMA陽性細胞は腫瘍組織に選択的に遊走していた。この結果、in vivoにおいてもiPS細胞から誘導したαSMA陽性細胞は腫瘍組織への遊走能を有しており、本研究の目的である腫瘍での血管新生抑制療法のためのベクター細胞になりうる細胞であることが証明された。現在、その遊走の程度を骨髄細胞由来のαSMA陽性細胞と比較検討中である。マウスiPS細胞から(らの方法にしたがい)αSMA陽性細胞へ分化誘導させ、さらに単離した細胞株を作成した。この細胞株を用いてより細胞の遊走能を高めるためにCXCR4遺伝子をレトロウイルスを用いて導入した。この遺伝子導入した細胞からG418を用いて細胞株を作成した。この細胞株を用いて、Boyden chamberによるSDF-1に対する細胞遊走能をCXCR4遺伝子を導入していないαSMA陽性細胞と比較したがわずかに遊走能が亢進しているのみであった。現在、再度αSMA陽性細胞にCXCR4遺伝子を導入し新たなベクター細胞を作成している。作成したαSMA陽性細胞の産生する腫蕩の増殖に関与する増殖因子を検討するため、プロテインアレイで検討したところVEGF、PDGFが腫瘍の増殖に関係する重要な増殖因子と考えられた。VEGFのsiRNAを用いてその発現を抑制を試みたが恒常的に発現を抑制する細胞株は作成できなかった。さらに、αSMA陽性細胞に対し可溶性VEGFレセプター1,2cDNAをアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入し可溶性

VEGFレセプター1,2の培養液中への分泌をウエスタンブロットにて確認した。invivoの検討ヒト肝癌細胞株をヌードマウスに皮下接種し作成した肝癌細胞株に対して試験的に可溶性VEGFレセプター1,2cDNAをアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入したaSMA陽性細胞を投与した結果、対照群に比べて抗腫瘍効果を認め、腫瘍組織を観察すると、CD31陽性腫瘍血管数は対照群に比べて治療群では減少していたが、蛍光色素多添加しt_aSMAfib性細胞の局在は予想に反して乏しかった。昨年度にマウスiPS細胞から作成した平滑筋細胞はマウスCXCR4cDNAをレトロウイルスを用いて遺伝子導入するとわずかにSDF-1に対して遊走能は増加するものの細胞増殖能が減少し、in vivoでの抗腫瘍効果を評価するための十分な量の細胞数を確保することが困難であった。このため、ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞を作成し、この細胞にマウスCXCR4cDNAを遺伝子導入した。この細胞は良好に増加し、さらにSDF-1に対する遊走能も良好であった。つぎに昨年の検討で産生が増加していたVEGFやPDGFの産生を抑制するためにレンチウイルスを用いてHIF1-alphaに対するsiRNAを遺伝子導入しベクター細胞を完成させた。このベクター細胞は5%の酸素濃度で培養してもHIF1-alphaのsiRNAを遺伝子導入していない細胞に比べHIF1-alpha,VEGF, PDGF, TGF-alphaなどの産生も抑制されていた。可溶性VEGFレセプター1, 2 cDNAを組み込んだアデノウイルスをベクター細胞の培養液に投与しアデノウイルスに感染した細胞のみを採取し皮下に肝癌細胞株(Hepa1-6, KYN-2)を接種して腫瘍を作製したマウスの尾静脈から1x106個を週1回4週にわたり投与し継時的に腫瘍径を計測した。その結果、腫瘍径はコントロールに比較し腫瘍の増大が抑制された。また、腫瘍内のCD31陽性血管密度も有意に低下していた。腫瘍組織は低酸素状態にありSDF-1を多く産生しており可溶性VEGFレセプター1, 2 cDNAを遺伝子導入したベクター細胞は他の臓器に比べ有意に多く腫瘍組織へ浸潤しておりその多くは腫瘍内の間質に存在していたが一部は内皮細胞や平滑筋細胞へ分化していた。さらに、治療に対する骨髄系および肝機能の副作用はみられなかった。当初昨年度に予定していた、CXCR4を遺伝子導入した細胞の作製がうまくいかず、今年度に持ち越したことから、in vivoで可溶性VEGFレセプター1,2を遺伝子導入して治療に用いる予定の細胞が完成していないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年予定していたαSMA陽性細胞にCXCR4を遺伝子導入した細胞の作製を行い、この細胞を用いて予定している、in vivoの実験を行い腫瘍局所で血管新生抑制療法を行うことの有用性を証明する。
脳出血後のリハビリによる上肢機能の回復過程における皮質赤核路の関与に関する研究

脳血管障害後の有効なリハビリ法に、麻痺側上肢を集中的に使用させるCIMT療法がある。CIMTによる早期からの上肢機能の回復が、皮質赤核路の促通性亢進による直接的作用によるのか?他の神経回路を介する間接的作用によるのか?について、解析を進めた。具体的には、脳出血前に予め二重ウイルスベクター感染法により赤核へレンチウイルスを運動野へアデノ随伴ウイルスを感染させ、CIMT後に皮質赤核路をドキシサイクリン(DOX)投与で選択神経遮断する時期を可変化させ、上肢機能を評価した。一方、赤核における促通性亢進関連因子の探索も行った。これまでに、脳出血作成前にレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを感染させ、1. CIMT開始期(出血1日後)からのDOX投与による持続的な神経遮断、2. CIMT終了5日後(出血13日後)からの皮質赤核路の神経遮断、を実施し、上肢運動機能の評価を行った。その結果、CIMT開始期から皮質赤核路を選択遮断した場合には、出血18日後の1週間のCIMTにより上肢機能の改善が観察された。このとき、皮質赤核路の神経投射の増加は認められないのに対し皮質網様体路の網様体部への神経投射が多く認められることが明らかになってきた。一方、CIMT終了5日後の出血13日後からの7日間を神経遮断した場合には、遮断直前(出血12日後)に確認されたCIMTによる上肢機能改善がDOX投与により完全に消失した。すなわち、出血後早期のCIMTにより皮質赤核路が早期からの機能回復に重要であることが明確になった。また同時に、早期CIMT中の皮質赤核路の神経遮断は、皮質網様体路を含む他の神経回路による機能回復メカニズムを誘引することも示唆される。一方、赤核の促通性亢進関連因子の探索は、脳出血後のCIMTで発現増加する成長関連因子などを網羅的に調べ、いくつかの候補遺伝子を明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳血管障害後の有効なリハビリテーション法に、麻痺側上肢を集中的に使用させるCIMT療法がある。CIMT法による早期からの上肢運動機能の改善が、皮質赤核路の促通性亢進による直接的な作用なのか、それとも他の神経回路を介する間接的な作用によるのかを明らかにすること目指した。H27年度は、1)脳出血後早期のCIMT実施中に皮質赤核路を選択的に遮断させることを可能とすること(伊佐研からウイルス二重感染法の技術移転)、2)出血後早期の皮質赤核路選択的遮断によるCIMT効果の検証、3)オプトゲネティクス法を用いた実験のための準備、を具体的目的とした。その結果、1)伊佐研からのウイルス二重感染法の技術移転が順調に進み、出血後早期からの皮質赤核路の選択遮断が可能になった。2)脳出血後のCIMT実施中にドキシサイクリン(DOX)を経口投与し皮質赤核路を選択遮断した場合にも、CIMTによる上肢運動機能の改善を確認した。3)光量の強いオプトゲネティクス法を用いた実験設備を整え、チャネルロドプシンを有するウイルスベクターも確保した。レンチウイルス(NeuRet-TRE-EGFP.eTeNT)およびアデノ随伴ウイルス(AAv1-CAMKII-rtTAV16)を用いた実験に必要な学内書類申請を行い、名古屋市立大での実施が可能になった。また、必要な実験器具およびテクニックも修得した。すなわち、伊佐研からの技術移転が順調に進んだ。脳出血モデル作成の50日前からウイルス二重感染を行い、大きな細胞毒性がないことを確認した。その後、出血前および直後からDOXを経口投与しCIMT実施中の皮質赤核路を選択遮断し、CIMT実施(脳内出血1日後から7日後まで)後の上肢運動機能の評価も順調に進んでいる。オプトジェネティクス法の実験設備を用いた予備実験を進める必要がある。

一方、CIMT終了5日後の出血13日後からの7日間を神経遮断した場合には、遮断直前(出血12日後)に確認されたCIMTによる上肢機能改善がDOX投与により完全に消失した。すなわち、出血後早期のCIMTにより皮質赤核路が早期からの機能回復に重要であることが明確になった。また同時に、早期CIMT中の皮質赤核路の神経遮断は、皮質網様体路を含む他の神経回路による機能回復メカニズムを誘引することも示唆される。一方、赤核の促通性亢進関連因子の探索は、脳出血後のCIMTで発現増加する成長関連因子などを網羅的に調べ、いくつかの候補遺伝子を明らかにした。脳出血後のCIMT実施中に皮質赤核路を選択遮断した場合にも、CIMTによる上肢運動機能の改善が確認されている。出血13週後の皮質赤核路の選択遮断がCIMT効果を抑制するという結果と異なるため、以下の実験を進める必要がある。1)出血後の選択遮断時期を可変させ、CIMTによる皮質赤核路の可塑的変化の臨界期をけんとうしていく。2)CIMT実施後早期の上肢機能回復のメカニズムについて、他神経路の可能性を検する。3)臨界期が明らかになった後、皮質赤核路での可塑的変化のに関与する因子を網羅的に検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。本支援による研究結果(J. Neurosci)は、平成28年1月14日発行の朝日新聞朝刊の第一面をはじめ、読売新聞朝刊、中日新聞朝刊、毎日新聞夕刊など全国の各新聞紙上で大きく取り上げられた。その他、yahooニュース、科学新聞(1月29日発行)、女性なごや、中部経済新聞などにも報道された。