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正則モース不等式とコホモロジーの漸近挙動の研究

本研究の目的は,複素射影多様体上の正則直線束のコホモロジーとその直線束の曲率との関係を明らかにすることであった.昨年度は,直線束の幕に関するコホモロジーの漸近的な消滅定理(Serre,Andreotti-Grauert型の消滅定理)について詳しく研究した.本年度は,より精密な随伴東に対するコホモロジー消滅定理(小平,川又-Viehweg,Nadel型の消滅定理)を研究した.具体的には,最小特異計量に付随する乗数イデアル層付きのNadel型の消滅定理が成立するかを研究した.この問題は,乗数イデアル層の上半連続化の挙動についてのDemailly-Kollarの予想と関係が深く,重要である.また,最小特異計量の乗数イデアル層の代数的な対応物である漸近的な乗数イデアル層に対しては,消滅定理が確立されていることを考えると,その複素解析版を問うこの問題は代数幾何と複素幾何の差を調べる点でも大変意義のあるものである.研究成果として,特異計量の滑らかさの仮定の下でNadel型の消滅定理を証明した.その証明の過程で,Kollar,榎の単射性定理を乗数イデアル付きの定理へと一般化した.その後に,コホモロジーの漸近的な消滅定理を応用した.この証明法は従来の消滅定理の証明と比べて,優位な点がある.例えば,単射性定理の証明は調和積分論に基づいており,多様体の射影性の仮定は必要ない.コホモロジーの漸近的な消滅定理を射影性の仮定を外して証明できれば,ケーラー多様体上で,随伴東に対するコホモロジー消滅定理が証明できる.ケーラー多様体上でのコホモロジー消滅定理は最近までほとんど知られておらず,この方針でケーラー多様体上での消滅定理を調べることは価値がある.本研究の目的は,コンパクトな複素多様体上の正則直線束の冪に関するコホモロジーの漸近挙動とその直線束のチャーン曲率との関係を調べることであった。本年度は「Andreotti-Grauertの定理の逆が成立するか」という問に対して,価値のある結果を得た.Andreotti-Grauertの定理は,直線束の曲率の部分的な正値性から,その直線束の冪に関する高次のコホモロジーの消滅が発生することを主張する.この逆が成立するかは長年未解決であった.私は,半豊富な直線束に対して任意の複素多様体でこの間を肯定的に解決した.また,直線束に何の仮定をつけずとも,2次元の射影多様体に対してはこの間が肯定的であることを示した.直線束に何の仮定もつけないで,この間を解決した結果はなかった.この意味で,私の研究成果は重要であり,意義深い.このAndreotti-Grauertの定理は,正則モース不等式とも密接に関係する.この正則モース不等式についても,逆の不等式が成立することが予想されている.近年,高次元の多様体では,Andreotti-Grauertの定理の逆に反例があることが示された.この反例を用いて,正則モース不等式にも反例が構成できないかと考察した.その考察ので過程で,私はこれらの逆問題はベクトル束のGriffiths予想と多くの類似点を持つことを発見した.この観点からベクトル束のGriffiths予想を解決できないかと研究を推し進め,豊富なベクトル束の正則切断の零点に対するLefschetzの定理についての結果を得た.(Lefschetzの定理は切断の零点と元々の多様体のホモトピーを比較する定理である.)具体的には,ベクトル束に豊富性よりも強い解析的な仮定を付けることで,Lefschetzの定理が成立することを示した.また,解析的な仮定を付けずとも,基本群の全射性に関してはLefschetzの定理が成立することを示した.本研究の目的は,複素射影多様体上の正則直線束のコホモロジーとその直線束の曲率との関係を明らかにすることであった.昨年度は,直線束の幕に関するコホモロジーの漸近的な消滅定理(Serre,Andreotti-Grauert型の消滅定理)について詳しく研究した.本年度は,より精密な随伴東に対するコホモロジー消滅定理(小平,川又-Viehweg,Nadel型の消滅定理)を研究した.具体的には,最小特異計量に付随する乗数イデアル層付きのNadel型の消滅定理が成立するかを研究した.この問題は,乗数イデアル層の上半連続化の挙動についてのDemailly-Kollarの予想と関係が深く,重要である.また,最小特異計量の乗数イデアル層の代数的な対応物である漸近的な乗数イデアル層に対しては,消滅定理が確立されていることを考えると,その複素解析版を問うこの問題は代数幾何と複素幾何の差を調べる点でも大変意義のあるものである.研究成果として,特異計量の滑らかさの仮定の下でNadel型の消滅定理を証明した.その証明の過程で,Kollar,榎の単射性定理を乗数イデアル付きの定理へと一般化した.その後に,コホモロジーの漸近的な消滅定理を応用した.

この証明法は従来の消滅定理の証明と比べて,優位な点がある.例えば,単射性定理の証明は調和積分論に基づいており,多様体の射影性の仮定は必要ない.コホモロジーの漸近的な消滅定理を射影性の仮定を外して証明できれば,ケーラー多様体上で,随伴東に対するコホモロジー消滅定理が証明できる.ケーラー多様体上でのコホモロジー消滅定理は最近までほとんど知られておらず,この方針でケーラー多様体上での消滅定理を調べることは価値がある.Andreotti-Grauertの定理や正則モース不等式などのコホモロジーの漸近挙動を研究する過程で,コホモロジーの漸近挙動とベクトル束や余次元の高い部分多様体の正値性との関係が明らかになってきた.今後は,コホモロジーの漸近挙動の問題を研究した際に得た知識技術を用いて,これらの問題についても研究していく予定である.
発がん抵抗の性差に関する実験的疫学的研究

がん死亡率を比較するとき,まず目に付くことの一つは男女間における死亡率の差である。この差は国内外いづれの地域でも,また,性徴器管を除いたいづれの部位でも,いづれの時代でも普遍的に見られる現象である。そして,いづれの場合でも男子が女子に比べて高率である。本研究では,これら性差の実態とその原因についての実験的および疫学的研究を行った。性差の疫学的研究では現在追跡中の「食生活とがん発生に関する疫学調査」のデータを中心に分析を行った。この調査は1982年に全国18市町村の国民健康保険加入者のうち30才から69才の全員およびがん死亡率の低い1宗教団体(モルモン教)の同年齢階層にある信者を対象として60種類の食品および嗜好品摂取量の調査を行い,その対象者のがんの発生の追跡を行った。これから10才代毎の平均的な食事中変異原性の陽性化食品と陰性化食品の摂取バランスから算出した地域別・性別食生活指数の生涯平均値とそのがん死亡率の相関および回帰直線を求め,がん死亡率の性差の検討を行った。この相関は全がんおよび胃がんとも0.1%レベルで有意であり,がん死亡率の多くは男性で回帰直線がより高率であり,女性ではそれより低率で,同程度の変異原性陽性化食品を摂取した場合でも男性に比べて女性はがん抵抗性の高い事が明らかになった。一方,いづれの地域でも男性は女性より変異原性陽性化食品の嗜好性が高く,また,がんの家族集積性を示す家族では陽性化食品嗜好性が高いが,この集積性と嗜好性は女性の手によって継承され,集積性のある家族の女性と結婚した男性ではさらにその嗜好性が助長された。実験的にはがん家族集積性の異なる男女から採血し,そのリンパ球からmRNAを抽出して,チトクロムP_1-450,グルクロン酸転移酵素およびアクチンを定量したが有意の性差は得られなかった。昭和57年1月から開始した食生活と癌発生に関する追跡調査成績から対象者を選択する目的で、癌感受性の個体差に関する種々の検討を行った。上記調査では全国19市町村の国保加入者のうち3069才の全員を対象として食品・嗜好品60種目の摂取量を調査し、癌発生者を追跡している。この調査成績から、対象地区別の癌発生率と食事中変異原性陽性者の出現率は強い相関が見られた。また、この変異原性陽性者の出現率には大きな性差がみられ、女性は癌高率地区で50%低率であった。このように全対象者では女性が男性より陰性化食品の摂取傾向が強いのに反し、癌発生者では女性が全癌、胃癌、腸癌、その他の癌のいづれでも陽性化食品の摂取が大きい傾向にあった。また、ln(癌発生率)をY軸に、食事中変異原性陽性者出現率をX軸に取ると、回帰直線が男が女より上部に位置し、女性が男性より発癌因子(特に変異原性因子)による癌発生には強い家族集積性がみられ、癌家族集積性の見られる対象者での訂正癌発生率を比較するとそれの見られない対象者の1015倍に当たる。このことから、感受性試験の対象者の選択には癌家族集積性を加味した。癌発生に関する疫学的検討は上述したように、癌抵抗性の性差が変異原性物質にたいする感受性の差に起因する事が示唆され、この事は、その代謝過程に由来する事が考えられた。

この事から、発癌抵抗性に関連する代謝機構を究明するために、米国NIHより薬物代謝酵素系P-450、グルクロンサン転位酵素、グルタチオン転位酵素とともに癌抑制遺伝子として知られるRb遺伝子のcDNAを送ってもらった。各種P-450の酵素タンパク質部はお互いに多くの部位で一致し、個々のP-450を識別するためcDNAのノンコ-ドン部のハイブリダイズしない切片の検索を行っている。疫学的には、胃がん,腸がん及びその他のがんに分類して、これらがん発生者の食事中変異原性関連食品の摂取バランスを男女で比較した。このバランスは、がん発生者の全員が、食事中変異原性の疑陽性あるいは陽性域に分布していた。男女間の比較では、3種類のがん発生者とも女性でより陽性化食品の摂取傾向が強く、特に肺がん発生者に関して見ると、食事バランスが発がん群の中で最も広範囲に分布していた。これらの事は、がんの発生には食事バランスが変異原性疑陽性以上であり、男は女より陰性化食品の摂取が高くてもがんに成り得る。一方、肺がんの発生には、食事以外の要因(おそらく吸気)がある事が示された。実験的には、食事要因として食事摂取バランスが陽性域にあり、かつ家族要因として種々のがん家族集積性のある20家族の男女全員を対象として選び研究協力を要請した。協力を承諾した家族は16家族で、小学生以下の小児を除く68名から採血を行った。一方、がん家族集積性を発がん部位別にみると、同家族では同部位での集積が強く、薬物代謝酵素誘導のAh locsの遺伝様式を示唆するものであった。この事から、発がん物質暴露を経口,経気道および経皮として薬物代謝酵素高誘導群,低誘導群および両者の混合型(両親が高誘導型と低誘導型)に分類して比較した。これらのがん発生者は当然低誘導者の食事バランスが陽性化食品摂取傾向が強く、高誘導者のがん発生と同レベルの食事ではがん発生が起きにくい事を示している。これらの採血対象者は高誘導型男14名,女12名、低誘導者男10名,女14名,混合型男8名,女10名であり、男女の割合が高誘導者の男44%に対し、女33%であり、低誘導者は男31%に対し、女39%であった。これら血液は血清とリンパ球を分離し、血清については種々の臨床検査項目を測定し、リンパ球からはmRNAを分離し、実験を継続しているが、未だ著名な性差は得られていない。疫学的には,胃がん,腸がん,肺がんおよびその他のがんに分類してこれらがん発生者の食事中変異原性に関連する食品の摂取バランスを男女間で比較した。このバランスでは全てのがん発生者が変異原性陽性域あるいは疑腸性域に分布した。男女間比較では,いずれのがんでも男性のがん発生者に比べ女性のがん発生者で陽性化食品の摂取傾向が強かった。特に肺がん発生者ではこの分布が広領域に広がり,食事以外の発がん要因(吸気)の関与を示唆するものと考えられた。これらの成績はがんの発生には、食事中変異原性関連食品(陽性化食品および陰性化食品)の摂取バランスが少なくとも疑陽性以上の陽性化摂取傾向にあり,男は女より陰性化傾向でも,がんの発生があるものと考えられた。実験的には,食事要因としての食品摂取バランスが陽性域にあり,かつ家族要因として種々のがん家族集積性の異なる16家族の男女全員を対象として,未学童を除く68名から採血した。また,がん家族集積性を発がん部位別にみると,同家族では発がん部位の集積性も強く,薬物代謝酵素誘導のAh locusの遺伝様式の関与を示唆するものと考えられた。この事から,発がん物質暴露を経口,経気道および経皮膚として薬物代謝酵素高誘導群,低誘導群および両混合群(両親が高誘導型と低誘導型)に分類して比較した。これらのがん対象者は高誘導群男14名,女12名,低誘導群男10名,女14名,混合群男8名,女10名で,高誘導家族と低誘導家族とでは男女出生率が異なる事が示唆された。
出土木製遺物の水中保管時における劣化を効果的に抑制する手法の開発

水中保管時における木製遺物の劣化には、好気性微生物の活動が大きく影響していると考えられる。これまで申請者らは、実際の遺物の水中保管環境において溶存酸素を低減する方策を検討、考案してきた。一方、木製遺物を水中で長期間安定して保管するためには、溶存酸素のほか、光および温度条件の違いによる遺物の劣化への影響を定量的に評価する必要がある。本研究では、出土木材を試料とした腐朽実験を中心に、水中における木製遺物の劣化を十分抑制するための、人的・経済的な負担や環境負荷が小さく、簡便かつ継続的に運用可能な手法の開発を目指すこととしている。平成29年度より、出土木材を試料とした腐朽実験に着手した。本実験では、溶存酸素の有無、および微生物の栄養源の有無の条件がそれぞれ異なる、4つの水槽に出土木材試料を保管し、あらかじめ設定した期間が経過するごとに取り出して、劣化状態の分析をおこなうこととしている。すでに回収した試料については、飽水重量などから推定される最大含水率値を中心に、劣化程度の評価を試みている。平成30年度においても、前年度に引き続いて、回収済みの試料の分析を実施した。実験初期においては、条件の違いによる差異は明瞭でなかったものの、実験の継続により、一定の傾向が現れたものとみられる。なお当初計画では、上記のほか種々の条件を設定した実験の実施を検討していたが、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、研究期間内に一定の成果を得られるよう計画を見直す。すなわち、当初より継続して実施している上記の実験について、試料の設置期間を延長し、条件の違いが試料の劣化に及ぼす影響を中長期的な観点で検討できるようにする。これにより、遺物の劣化を効果的に抑制するための環境条件に関する基礎的な要件について、信頼性の高い検討結果を提示できるようになることが期待される。環境条件の違いが木材試料の劣化程度に及ぼす影響について、中長期的な観点から検討できるよう、研究開始当初より実施している実験の期間を延長する。この変更により、研究期間内に一定の成果が得られる見込みであることから、本研究の進捗状況はおおむね順調であると判断される。当初計画では、種々の条件を設定した複数の実験の実施を検討していたが、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、研究期間内に一定の成果を得られるよう計画を見直す。平成29年度には、出土木材を試料とした腐朽実験に着手した。すでに回収した試料については、飽水重量などから推定される最大含水率値を中心に、劣化程度の評価を試みているが、実験条件の違いによる差異は明瞭でない。一方、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、本実験は現在も継続して実施している。なお、以上のほかに光や温度をはじめとした種々の条件を設定した実験をおこなうことで、遺物の劣化をより効果的に抑制するための環境条件を、より詳細かつ具体的に提示できるようになることが期待される。試料の分析精度の向上と合わせて、新たな腐朽実験の手法についても、検討を進める予定である。当初の予想と異なり、現時点において、実験条件の違いによる木材試料の劣化程度の差異が明瞭となっていないため、やや遅れていると評価される。ただし、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、今後も観察を継続する必要がある。

平成30年度においても、前年度に引き続いて、回収済みの試料の分析を実施した。実験初期においては、条件の違いによる差異は明瞭でなかったものの、実験の継続により、一定の傾向が現れたものとみられる。なお当初計画では、上記のほか種々の条件を設定した実験の実施を検討していたが、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、研究期間内に一定の成果を得られるよう計画を見直す。すなわち、当初より継続して実施している上記の実験について、試料の設置期間を延長し、条件の違いが試料の劣化に及ぼす影響を中長期的な観点で検討できるようにする。これにより、遺物の劣化を効果的に抑制するための環境条件に関する基礎的な要件について、信頼性の高い検討結果を提示できるようになることが期待される。環境条件の違いが木材試料の劣化程度に及ぼす影響について、中長期的な観点から検討できるよう、研究開始当初より実施している実験の期間を延長する。この変更により、研究期間内に一定の成果が得られる見込みであることから、本研究の進捗状況はおおむね順調であると判断される。過年度に着手した腐朽実験を継続して実施するとともに、試料の劣化程度の分析手法について再検討をおこなう。具体的には、FT-IRをもちいた分析手法の導入を検討する。また、試料の形状および実験系を見直し、あらたな腐朽実験を並行して実施することを検討する。当初計画では、種々の条件を設定した複数の実験の実施を検討していたが、木材試料の腐朽には比較的長い実験期間を要することから、研究期間内に一定の成果を得られるよう計画を見直す。腐朽実験における木材試料の劣化状態に明確な差異がみられず、当年度は湿式の化学分析の実施を見送ったため、次年度への繰越金が生じた。これについては、次年度以降に実施する化学分析等で必要となる器具等の購入に充てる予定であり、全体の使用計画に大幅な変更は生じない見込みである。実験試料の回収予定日(実験供試期間)、および分析対象項目に変更が生じたことから、未使用額が生じた。翌年度においては、これらを含むすべての試料について、あらためて劣化程度等の分析を実施するとともに、必要に応じて補助的な実験を実施する予定である。これらの遂行のために、前年度からの繰越金を含めた助成金を使用する計画である。
光駆動分子結晶アクチュエータを用いた新方式カテーテルの作製

現代医療において、内視鏡・カテーテルは、重要な検査・治療医療機器となっている。私達はこれまで光を当てると屈曲する種々のフォトメカニカル結晶を開発してきた。そこで、フォトメカニカル結晶をアクチュエータに用いた、新方式の光駆動カテーテルを作製する研究を行った。フォトメカニカル結晶のヤング率、応力などの機械的特性、繰り返し光屈曲の耐久性を実際に測定した結果、光駆動アクチュエータに使用可能であることが確認された。今回、5 Hzの速い屈曲を示す新たなフォトメカニカル結晶も開発した。最終的に、フォトメカニカル結晶と光ファイバーとの接続を行い、プロトタイプの光駆動部を作ることができた。現代医療において内視鏡・カテーテルは重要な検査・治療医療機器となっている。外科手術を要しないカテーテル治療が増えるに連れて、ワイヤーガイド式に替わるアクチュエータを用いた能動カテーテルの需要が高まっている。現在、アクチュエータとして形状記憶合金コイルが用いられているが、時間応答性、血管内での熱発生などの問題がある。フォクロミック結晶に光を当てると屈曲するアゾベンゼン、サリチリデンアニリンなどのフォトメカニカル結晶を数年前から開発してきた。本研究においては、フォトメカニカル結晶を光駆動アクチュエータに用いた、光で動く、新方式の内視鏡・能動カテーテルを作製する。実現すれば、操作が簡単迅速で、安価な使い捨てタイプの内視鏡、カテーテルが可能となる。本初年度は、フォトメカニカル結晶材料を光駆動アクチュエータとして用いたカテーテルを作製するための前準備として、(1)結晶の機械的強度の測定、(2)結晶の光屈曲における耐久性のテストを行った。その結果、フォトメカニカル結晶の機械的強度、耐久性が確認され、光駆動アクチュエータとしての適用可能であることが明らかとなった。フォトメカニカル結晶材料を光駆動アクチュエータとして用いたカテーテルを作製するための前準備として次の検討を行った。(1)結晶の機械的強度フォトメカニカル結晶材料を内視鏡・カテーテルに利用するには、結晶の機械的強度が要求される。これまで有機結晶のヤング率、応力などの機械的特性はあまり測定されておらず、データがほとんど見当たらないため、実際に測定した結果、まずまずの機械的強度があることが確認された。(2)結晶の光屈曲における耐久性実用化に当たっては、フォトメカニカル結晶材料の耐久性は最も重要なファクターとなるため、繰り返し光屈曲を測定した結果、耐久性が確認された。外科手術を要しないカテーテル治療が増えるに連れて、熟練を要するガイドワイヤ式ではなく、先端部が可動してガイドワイヤが不要となる能動カテーテルの需要が高まっている。現在、能動カテーテルのアクチュエータとして形状記憶合金コイルが用いられているが、温度管理フィードバック機構を備えた高精度のMEMS駆動ユニットを必要とし、高度な製造設備が要求されるので高コストになっている。さらに、生体内で通電加熱によって余剰な熱が発生してしまうことや、コイル状に成型するためカテーテルの直径が大きくなる欠点があり、生体にとって好ましくないなどの問題がある。数年前から、フォクロミック結晶に光を当てると屈曲するアゾベンゼン、サリチリデンアニリンなどのフォトメカニカル結晶を開発してきた。本研究においては、フォトメカニカル結晶の実用化の一つとして、これらの結晶をアクチュエータに用いた、新方式の光駆動内視鏡・能動カテーテルの作製を行う。前年度は、フォトメカニカル有機結晶のヤング率、応力などの機械的特性、および繰り返し光屈曲の耐久性を実際に調べた結果、光駆動アクチュエータに使用可能であることが確認された。本最終年度は、フォトメカニカル結晶を能動カテーテルのアクチュエータとして用いるには、光屈曲の動きの高速化が必要と考えられたため実際に検討を行った。その結果、o-アミノサリチリデンアニリン結晶は、紫外光で屈曲させて可視光で元に戻すことにより、5 Hzの比較的に速いフォトメカニカル特性を示すことが明らかとなった。また、メカニカル結晶のポリマーとのハイブリッド化についても検討し、結晶と同様の光屈曲を示すハブリッド膜を作製することができた。最終的に、光ファイバーを接続した結晶の光屈曲が確認された。29年度からは前年度の研究を継続しつつ、(3)結晶のコーティングの検討、(4)カテーテル駆動部の作製と性能の評価を行う。(3)結晶のコーティング有機化合物からできたフォトメカニカル結晶は、有機溶媒には溶け易いが、水には溶解し難いと考えられる。

しかし、体内は水環境のため、結晶表面が劣化するのに加えて、溶解した化合物が健康に害を及ぼす恐れもあるため、結晶表面のコーティングを検討する。(4)カテーテル駆動部の作製と性能試験これまでの検討結果を評価し、優れた性能を持つフォトメカニカル結晶を選定して、内視鏡・カテーテルの先端に取り付ける光駆動結晶アクチュエータを試作する。光ファイバーにより結晶に光照射する。今回の光屈曲性結晶を光駆動アクチュエータに用いたカテーテルは全く初めての試みで、プロトタイプというべきものである。有機固体光化学光駆動結晶アクチュエータの試作は29年度行う予定のため、実際に試作した時点で、これを作動させるための小型光照射装置の機種を選定する方が良いと判断し、28年度は購入しなかったためである。29年度に光駆動結晶アクチュエータを試作し、これを作動させるのに適した小型光照射装置の機種を選定して購入する予定である。
美しい構造を有する組織・臓器を作るための新しい戦略

(1)トランスグルタミナーゼゲル化法を用いた細胞外マトリクス配置と基本骨格ペプチド設計RGDペプチドなど細胞接着因子のコンセンサス配列を持つペプチドやトランスグルタミナーゼ結合部位を複数有するマトリクスの基本骨格となるペプチドを設計、数種調製した。これら数種のペプチドとトランスグルタミナーゼを任意の濃度で混合し、シャーレ上に配置した細胞に塗布、細胞間に複合マトリクスを配置した。RGDコンセンサス配列の量によりマトリクスの性状が変化し、細胞に対する応答が変化する材料を開発することができた。(2)トランスグルタミナーゼゲル化法を用いた真三次元構造の形成シャーレ上にBAMを一定のパターンで塗布し、細胞懸濁液を添加したところ、細胞の固定が確認された。また、ポリジメチルシロキサンで作製したマイクロ流路の側面に細胞を固定化することができた。作製した擬三次元構造を核として、その上部にトランスグルタミナーゼゲル化法を用いた三次元構造を形成する検討を行った。肝実質細胞をパターン状に配置し、肝実質細胞のアルブミン分泌能を確認した。(3)ヘテロ構造を有した真三次元構造の形成(2)に加え、血管や胆管のような管腔構造を有する構造の形成を行った。ポリジメチルシロキサンで流路の型を作製し、これにゼラチンを流し込み、ゲル化することでゼラチンゲルのマイクロ流路を作製した。これに繊維芽細胞を組み込んだ。同構造の流路にチューブをつなぎ培地を供給する事で構造体中の細胞の生存を維持する事ができた。一方、ゼラチンゲル表面にHeLa細胞や血管内皮細胞を配置し、これを折り畳むことで複雑な三次元構造を構築した。(1)細胞固定化剤(BAM)を使った細胞の擬三次元(Pseudo 3D)配置シャーレ上にBAMを一定のパターンで塗布し、細胞懸濁液を添加したところ、細胞の固定が確認された。細胞固定の後、コラーゲンゲルを細胞の上に載せ、培養したところ、コラーゲンの種類によって細胞の挙動が変化することがわかった。また、ポリジメチルシロキサンで作製したマイクロ流路上にBAMを塗布し、流路側面に細胞を固定化することができた。これらの結果より、組織・臓器の断面をシミュレートした擬三次元的な培養法を構築できることが示唆された。(2)トランスグルタミナーゼゲル化法を用いた細胞外マトリクス配置と基本骨格ペプチド設計本年度はRGDペプチドなど細胞接着因子のコンセンサス配列を持つペプチドやトランスグルタミナーゼ結合部位を複数有するマトリクスの基本骨格となるペプチドを設計し、これらが人工的な細胞外マトリクスとなることを確認した。また、ポリジメチルシロキサンで流路の型を作製し、これにゼラチンを流し込み、ゲル化することでゼラチンゲルのマイクロ流路を作製することができた。マイクロ流路には浮遊性細胞を流通することができ、細胞と細胞外マトリクスとのミクロ構造を構築することができた。(3)細胞内可視化、細胞間可視化技術を使ったシグナル伝達の解析蛍光共鳴エネルギー移動原理に基づく免疫学的測定法を利用し、細胞-細胞間・細胞-細胞外マトリクス分子接着による効果を分子間結合のダイナミクスを調べることを目的に、今年度はそのモデル系としてヒトアルブミンに対する単鎖抗体とGFP/YFP/CFP等の蛍光蛋白質との複合体を用い観察を行ったところ、細胞内での検出が可能であった。(1)トランスグルタミナーゼゲル化法を用いた細胞外マトリクス配置と基本骨格ペプチド設計昨年度に引き続き、RGDペプチドなど細胞接着因子のコンセンサス

配列を持つペプチドやトランスグルタミナーゼ結合部位を複数有するマトリクスの基本骨格となるペプチドを設計、数種調製した。これら数種のペプチドとトランスグルタミナーゼを任意の濃度で混合し、シャーレ上に配置した細胞に塗布、細胞間に複合マトリクスを配置した。RGDコンセンサス配列の量によりマトリクスの性状が変化し、細胞に対する応答が変化する材料を開発することができた。(2)トランスグルタミナーゼゲル化法を用いた真三次元構造の形成昨年度の検討により作成した擬三次元構造を核として、その上部にトランスグルタミナーゼゲル化法を用いた三次元構造を形成する検討を行った。肝実質細胞あるいは腎上皮細胞をパターン状に配置し、肝実質細胞のアルブミン分泌能および腎上皮細胞の上皮様構造化を確認した。また、肝実質細胞パターン上への血管内皮細胞の配置にも成功した。(3)ヘテロ構造を有した真三次元構造の形成(2)に加え、血管や胆管のような管腔構造を有する構造の形成を行った。ポリジメチルシロキサンで流路の型を作製し、これにゼラチンを流し込み、ゲル化することでゼラチンゲルのマイクロ流路を作製した。これに繊維芽細胞を組み込んだ。一方、同様に作製した流路の表面に血管内皮細胞を配置して先のマイクロ流路と組み合わせて三次元構造を構築した。同構造の流路にチューブをつなぎ培地を供給する事で構造体中の細胞の生存を維持する事ができた。
生体吸収性材料と細胞増殖因子を応用した骨髄幹細胞三次元培養骨の骨形成能

1.生吸収性scaffoldの作成.Collagen溶液にPGA繊維を加え、凍結乾燥と熱脱水架橋により、collagen spongeよりも強度と細胞侵入性に優れたPGA/collagen spongeを開発した.さらに、これにUV処理を加えることにより強度の高いPGA/collagen(UV)sponge)を得た.ラットBMSCの単層培養で検討したころ、DexとbFGFはそれぞれALPase活性と細胞増殖を促進し、同時併用はALPase活性に相乗効果とbone noduleの活発な形成を示した.3.生体吸収性scaffoldsにおけるBMSCの増殖、分化能.ラットBMSCをPGA/collagen sponge, PGA/collagen(UV)spongeで三次元培養したところ、(1)両spongeとも培養後の収縮が軽度で、pore構造が良好に保たれ、sponge内部への細胞の侵入が認められた。(2)PGA/Collagen(UV)Spongeではcollagenがより多く残り、ポア内での細胞の接着,細胞外マトリックスの形成が良好であった。(3)細胞増殖とALPase活性はPGA/collagen(UV)sponge群で最も高生く、scaffoldとしての有用性が示唆された.4.BMSCの三次元培養骨の骨形成能.1)各種培地で培養したラットBMSCとβ-TCPの複合体を、同系ラットの背部皮下に移植したところ、Dex+βグリセロリン酸+bFGF添加培養液群で良好な骨形成がみられた。2)上記BMSC/β-TCPの複合体を成犬下顎骨区域切除部に自家移植したが、欠損部の骨連続性を回復できなかった。BMSCの培養期間及び骨形成を促進する生理活性因子の適切な局所導入法の確立が検討課題とされた。(1)継代1(P1)におけるラット骨髄骨源性幹細胞(SBMC)の増殖能とALPase活性について。Fischer系ラットオスの大腿骨から、Ishaugらの方法により骨髄細胞を採取し、初代培養により間葉系幹細胞(MSC)を得た。P1培養における活性型ビタミンD(VD3),β-glycerophosphate(GP),bFGF,Dexamethasone(Dex)の単独あるいは併用添加における増殖活性(DNA量)とALPase活性を3から14日に経時的に調べたところ、D3、Dex、GPの単独またはそれらの併用群と無添加対照群との間には培養期間を通じて、有意差は認められなかった。一方、bFGF単独あるいはbFGFと他の生理活性物質との併用群の増殖活性はいずれも14日後に対照群に比べ有意に上昇した。またALPase活性ではbFGFとDexの併用群のみが対照群に比べ有意に増加した。(2)(1)の結果を受け、三次元培養までの単層培養におけるMSCの増殖、分化にとって適切なbFGFとDexの添加時期のタイミングについて,(1)と同様に検討した。その結果、P1からbFGFとDexを併用する群およびP0、P1でbFGFとDexを併用する群がSBMCの増殖と分化を著明に促進した。また、前者は7日14日に急速なDNAとALPaseの上昇を示し、単層培養条件としてより好ましいと考えられた。2.三次元培養のscaffoldの検討コラーゲンスポンジへのSBMCのseedingを行っているが、気孔内への細胞の増殖や線維の形成にともない収縮を起こし易く、また気孔の縮小化により内部まで細胞が侵入しないことがある。コラーゲンとPGAの複合スポンジを作成し、上記の培養条件を基に検討している。

Fisher系ラット大腿骨のMSCの単層培養において、Dex, bFGFの添加濃度(10pM100nM,0.055.0ng/ml)の骨芽細胞への分化、増殖能の影響についてALPase活性とDNA量を指標として検討した。その結果、(1)Dex, bFGFの単独ではそれぞれALPase活性と細胞増殖を促進する。(2)両者の併用はALPaseに相乗効果を示し、Dex10nMとbFGF2.5ng/mlの併用で最も高かった。(3)DexとbFGFはP1から添加するのが効果的だが、P4以降は分化能が低下することが示唆された。2.生体吸収性scaffoldsの調整と骨髄M間葉系幹細胞の三次元培養1.吸収性材料を足場としたBMSCの三次元培養の骨形成能2)RBMSCをβ-TCP多孔体に播種し、Dex、Dex+βG(βグリセロリン酸)、Dex+bFGF、Dex+βG+bFGF添加培養液で、2週間培養した。培養終了後、PLLAメッシュのシリンダーにRBMSC/β-TCP複合体を充填し、同系ラットの背部皮下に移植を行い、4週後、組織学的検索を行った。その結果、無添加およびbFGF添加群では骨形成はみられなかったが、Dex添加群ではβ-TCPに接して新生骨を認め、その形成量はDex+bFGF+βGが最も高く、以下Dex+βG、Dex+bFGF、Dexであった。以上の結果、DexとbFGF、βGの併用はPGA/collagen spongeおよびβ-TCP多孔体内におけるBMSCの増殖、骨芽細胞への分化に促進的に働くことが推察された。現在、ビーグル犬の下顎骨の実験的骨欠損において再生実験を行っている。2.骨髄間葉系幹細胞の吸収性scaffoldについてコラーゲン溶液にPGA繊維を加え、凍結乾燥後、熱脱水架橋(140°C、12時間)を行い、PGA/collagen spongeを作成した。これによりほぼ満足すべき、scaffoldを得ている。
WNKキナーゼによる細胞内クロライドセットポイント変化が細胞周期の進行を制御する

近年我々は、正常な細胞周期の進行には、細胞周期進行に伴った細胞内Cl^-濃度の周期的な変動が不可欠であること明らかにした。特に、G_1期からS期への進行には、Na^+-K^+-2Cl^--cotransporter (NKCC)の活性上昇による細胞内Cl^-濃度の上昇を認めた。近年、NKCCやK^+-Cl^--cotransporter(KCC)は、WNK (with no lysine【K】)キナーゼによるリン酸化により活性が制御されることが明らかになっており、WNKキナーゼ自体も細胞内Cl^-濃度により活性がコントロールされている(低Cl^-濃度により活性化される)ことから、WNKキナーゼは細胞内のCl^-センサーとして機能しているものと考えられる。そこで本研究では、WNKキナーゼが細胞内Cl'濃度センサーとして機能し、その結果、細胞内Cl^-が細胞周期進行の制御分子として機能するという仮説の検討を行う。まず、細胞周期のG_1期からS期にかけての細胞内Cl^-濃度変化の詳細を明らかにするため、前立腺細胞株LNCaP細胞をチミジン処理により細胞周期を同調させ、細胞周期のG_1期からS期にかけての滞在時間を明らかにした。その結果、LNCaP細胞ではG_1期の滞在時間が約10時間、S期の滞在時間が約9時間、G_2/M期の滞在時間が約3時間であることが明らかになった。次いでG_1期からS期にかけての細胞内Cl^-濃度の変化を明らかにするため、Cl^-感受性蛍光色素MQAEを細胞周期同調細胞に導入して継時的に測定を行った。細胞内Cl^-濃度は、G_1期からS期にかけて上昇し、S期で最高値を示した。その後、細胞内Cl^-濃度は急激に減少し、G_2/M期に最低値を示した。G_1期からS期にかけては細胞容積も増加していたことから、細胞外からのイオン輸送活性、つまりNKCCの活性化が予想された。
効率的な遺伝子発現抑制技術を利用した担子菌類の遺伝子解析手法の確立

食用担子菌類(きのこ)において、効率的な遺伝子破壊技術を確立する目的で、遺伝子破壊ベクターの構築、及び耐性マーカー遺伝子回収技術開発を試みた。シイタケにおいて、DelsGate法により、効率的に遺伝子破壊ベクターを構築する手法を開発した。更にそのベクターにloxP配列を挿入することに成功した。現在のところ、シイタケにおいて、得られたベクターによる破壊株はまだ得られていないことから、条件検討が必要である。また、シイタケにおいて、一核菌糸体において子実体形成を負に制御していると考えられるpcc1遺伝子、及び非相同組み換えに関わるKu80遺伝子のクローニングに成功した。今後これらの破壊株を作出することで、一核菌糸体で子実体を発生し、かつ遺伝子組換え効率の高い菌株が得られると期待できる。また、シイタケにおいては、遺伝子組換えに時間がかかることから、条件検討を効率化するために、ウシグソヒトヨタケの系を利用することとした。そこで、ウシグソヒトヨタケの遺伝子破壊用カセットに、loxP配列を挿入した。今後はまず、ウシグソヒトヨタケにおいて、マーカー回収技術を確立し、その後シイタケにおける破壊系を確立することを予定している。食用、薬用きのこ(担子菌類)であるシイタケにおいて、遺伝子機能解析技術を確立し、育種上有用な遺伝子を特定する技術の開発を行っている。本研究では、子実体形成などに関わる遺伝子の発現抑制方法の確立を目指し、シイタケにおいて遺伝子破壊法の開発を目指している。22年度において、シイタケ用遺伝子破壊用ベクターを効率よく構築し、さらにそのベクターのマーカー遺伝子を脱落させるための配列(lox-P)を導入したベクター(Dels-Gate-loxpベクター)の構築を完了した。現在、シイタケに形質転換を行い。有効性を確認しているところである。さらに、遺伝子破壊効率が高く、一核菌糸体(半数体)で子実体を形成するシイタケ菌株を開発することで、子実体形成に関連する遺伝子の機能解析を効率化することを目的としている。22年度において、シイタケにおけるゲノム配列の解読を行い、子実体形成遺伝子の発現を負に制御している遺伝子(pcc1)、非相同組換えに関わる遺伝子(Ku80)の遺伝子配列の決定を終了している。現在これらのDels-Gate-loxpベクターを利用して、遺伝子破壊用ベクターの構築を進めている。pcc1遺伝子破壊により、一核菌糸体(半数体)で子実体を形成するシイタケが得られることが期待され、Ku80破壊により、効率的な遺伝子組換え用の菌株が得られることが期待できる。また、最終目的として、シイタケ栽培に関わる重要形質に関連する遺伝子の特定を目指していることから、pcc1遺伝子破壊株及びKu80遺伝子破壊株を利用して、子実体形成に関わる遺伝子の発現抑制を行うことを想定している。担子菌類において、効率的な遺伝子組換え技術を確立することを目的として、研究を進めている。特に、DelsGate法による遺伝子破壊技術と、Cre-loxP法によるマーカー遺伝子回収技術を目指している。昨年度までに、シイタケにおいてDelsGate法により、遺伝子破壊ベクターを効率的に作出する技術は完成した。今年度は、昨年度作出したlcc1遺伝子破壊ベクターを用いて、遺伝子破壊の条件検討を行ったが、残念ながら、これまで遺伝子破壊株が得られていない。そこで、今年度は新たな遺伝子破壊用遺伝子のクローニングを行った。その結果、子実体発生を負に制御しているpcc1遺伝子と、非相同組換えに関わるku80遺伝子のクローニングに成功した。pcc1遺伝子に関しては、子実体形成能力を持つ、二核菌糸体で発現が低いことが確認された。現在は、これらの遺伝子に関して、Dels Gate法を用いて、遺伝子破壊ベクターを作出しているところである。シイタケにおいて、遺伝子破壊の条件検討を進めるには、非常に時間がかかることから、ウシグソヒトヨタケを用いて、Cre-loxP法が可能かどうかを検証することとした。ウシグソヒトヨタケにおいては、既にKu70破壊株と、ハイグロマイシン耐性マーカーによる遺伝子破壊技術が確立されている。そこで、ウシグソヒトヨタケ遺伝子破壊ベクターに、loxP配列を組み込んだ。得られたベクターは、ハイグロマイシン耐性マーカー両端にloxP配列が組み込まれ、容易に任意の遺伝子の破壊ベクターが構築できるデザインとした。
集落土地利用計画における合意形成支援システムの実用化

平成元年度から2か年計画で実施してきた科研費一般研究(C)「集落地域整備計画のための地域合意形成支援システムの研究」で開発した地権者討議の合意形成支援システムのアルゴリズムを,一般研究(C)で使用したパーソナルコンピュータの約100倍の演算速度を持つワークステーション上に下記の手順で再構築した.これにより,地権者の討議の場で議論の進行に応じて,地権者の希望とプランナーの計画判断を統合した計画図を,リアムタイムな形で議論に参加する者全てに提示することが可能となった.(1)既に概念構築が試されている「4地目型土地分級システム」のうち,数量化理論第I類を用いた適性土地利用判別論理をワークステーション上でインプリメントした.(2)平成4年度に整備された,平石西部地区(栃木県)の2,046筆の全筆地についての評価データを,上記のインプリメントしたソフトウェアに適用した.その結果を,土地利用の最適化の観点からの土地利用図の形で地権者に示し,討議を通じて,地権者の土地利用意向・希望の自主修正を促すと共に,データベースの構造とアルゴリズムに修正を加えた.(3)構造を修正したデータベースからのデータを,アルゴリズムを修正したソフトウェアに適用し,その結果得られた土地利用図を地権者に示した.この土地利用図への同意が,ステップ(2)で最初に示された土地利用図よりも多くの地権者から得られることを確認した.(4)以上の過程で,より汎用性のある一般化されたシステムに向けて整備するために必要な条件を明らかにし,それをデータベースの構造とアルゴリズムに反映した.以上によって完成したデータベースおよびソフトウェアを,市町村の現場での使用に適するようにユーザー・インターフェースを改良し,実用的なシステムとして構築した.平成元年度から2か年計画で実施してきた科研費一般研究(C)「集落地域整備計画のための地域合意形成支援システムの研究」で開発した地権者討議の合意形成支援システムのアルゴリズムを,一般研究(C)で使用したパーソナルコンピュータの約100倍の演算速度を持つワークステーション上に下記の手順で再構築した.これにより,地権者の討議の場で議論の進行に応じて,地権者の希望とプランナーの計画判断を統合した計画図を,リアムタイムな形で議論に参加する者全てに提示することが可能となった.(1)既に概念構築が試されている「4地目型土地分級システム」のうち,数量化理論第I類を用いた適性土地利用判別論理をワークステーション上でインプリメントした.(2)平成4年度に整備された,平石西部地区(栃木県)の2,046筆の全筆地についての評価データを,上記のインプリメントしたソフトウェアに適用した.その結果を,土地利用の最適化の観点からの土地利用図の形で地権者に示し,討議を通じて,地権者の土地利用意向・希望の自主修正を促すと共に,データベースの構造とアルゴリズムに修正を加えた.(3)構造を修正したデータベースからのデータを,アルゴリズムを修正したソフトウェアに適用し,その結果得られた土地利用図を地権者に示した.この土地利用図への同意が,ステップ(2)で最初に示された土地利用図よりも多くの地権者から得られることを確認した.(4)以上の過程で,より汎用性のある一般化されたシステムに向けて整備するために必要な条件を明らかにし,それをデータベースの構造とアルゴリズムに反映した.以上によって完成したデータベースおよびソフトウェアを,市町村の現場での使用に適するようにユーザー・インターフェースを改良し,実用的なシステムとして構築した.圃場整備が予定されている平石西部地区(栃木県)を対象地区として,栃木県農村整備課と地元住民の協力のもとに,その2,046筆の全筆地について,アンケートの結果から数値化された評価データを,新たに導入したワークステーション上でデータベース化する作業を修了した。全筆地について,各筆地の地図上での位置,形状および大きさを地理情報システム形式でデータベース化するために,新たに導入したディジタイザによってポリゴン(多角形)としてワークステーションに入力した。又,その結果の出力をプロッターおよびカラープリンターより得る為のソフトウェアを整備した。各筆地の植生および土地利用の判定については,磁気テープによるMOS/MESSRによるリモートセンシング・データを本学の情報処理センターからイーサネット経由でワークステーションにダウンロードするためのソフトウェアを整備し,これをクラスター分析した結果を援用した。この結果,植生および土地利用の指標としては,MOS/MESSRのバンド2(赤色域)及びバンド4(近赤外域)から算出される正規化植生指標[(Band4-Band2)/(Band2+Band4)]を,各バンドの輝度値と共にクラスター分析に適用することが妥当であるとの結論を得た。既に概念構築が為されている「4地目型土地分級システム」のうち,数量化理論第I類を用いた定性的データの定量化および適性土地利用判別論理を,ワークステーション上でインプリメントするためのアルゴリズムの開発に着手した。又,パーソナルコンピュータ上で,既にBASICによって記述されている合意形成支援アルゴリズムを,ワークステーション上にCおよびFORTRANによってインプリメントする作業を進めている。平成元年度から2か年計画で実施してきた科研費一般研究(C)「集落地域整備計画のための地域合意形成支援システムの研究」で開発した地権者討議の合意形成支援システムのアルゴリズムを,一般研究(C)で使用したパーソナルコンピュータの約100倍の演算速度を持つワークステーション上に下記の手順で再構築した.これにより,地権者の討議の場で議論の進行に応じて,地権者の希望とプランナーの計画判断を統合した計画図を,リアルタイムな形で議論に参加する者全てに提示することが可能となった.

(1)既に概念構築が試されている「4地目型土地分級システム」のうち,数量化理論第I類を用いた適性土地利用判別論理をワークステーション上でインプリメントした.(2)平成4年度に整備された,平石西部地区(栃木県)の2,046筆の全筆地についての評価データを,上記のインプリメントしたソフトウェアに適用した.その結果を,土地利用の最適化の観点からの土地利用図の形で地権者に示し,討議を通じて,地権者の土地利用意向・希望の自主修正を促すと共に,データベースの構造とアルゴリズムに修正を加えた.(3)構造を修正したデータベースからのデータを,アルゴリズムを修正したソフトウェアに適用し,その結果得られた土地利用図を地権者に示した.この土地利用図への同意が,ステップ(2)で最初に示された土地利用図よりも多くの地権者から得られることを確認した.(4)以上の過程で,より汎用性のある一般化されたシステムに向けて整備するために必要な条件を明らかにし,それをデータベースの構造とアルゴリズムに反映した.以上によって完成したデータベースおよびソフトウェアを,市町村の現場での使用に適するようにユーザー・インターフェースを改良し,実用的なシステムとして構築した.
フリーラジカルを生成する金属フラビン酵素の構造と機能

1.キサンチン脱水素酵素・タンパク分解酵素による酸化酵素のそれぞれの2.1、2.5Å分解能のX線結晶構造の違いを解析し、コンフォメション変化の生ずる理由を解明した。X-線結晶解析で得た構造としては最長のアミノ酸配列である。蛋白は2量体でそれぞれ3つの大きなドメインからなり、モリブドプテリン、2つの非ヘム鉄、フラビンは一列をなし、電子伝達経路が確定した。脱水素酵素型、酸化酵素型ではフラビン周囲のコンフォメーションが異なった。この差は、タンパク質分解酵素作用によりフラビンドメインとモリブデンドメインを結ぶ長鎖リンカーの切断により、F549とR335、R429との水素結合ネットワークが断たれ、それに伴いW336とR427-D429の相互作用が切断され結果としてD429のフラビン環6位近傍からの遠ざかりとR427の接近が生ずる結果である。これらの電荷をもつ残基の置換とともにNADの接近のブロックが生ずる。またF337Lの変異体を作成し、この酵素が殆どスーパーオキシドのみを産生することを見い出した。その理由はセミキノンをより安定化させることによることを確認し、以前の我々の予想と一致した。2.NO合成酵素の2量体形成およびヘム周囲のXAFS解析を行った。またNO合成酵素の阻害剤のアイソザイム特異性を検討した。3.箱嶋らと共同でおこなったHBP23の立体構造の解析結果をもとに、活性中心のCys52,Cys173およびその周辺のアミノ酸残基の変異体を作成し、それぞれの役割を解析した。ヘム結合の様式を可視部吸収スペクトル、ラマン分光により解析しリガンドを予想した。ヘム結合により過酸化水素分解活性が阻害されることを見い出した。NO合成酵素およびキサンチン酸化酵素はフリーラジカルを生成する複合金属フラビン酵素である。本年度の経過と成果は以下のとおりである。1)NO合成酵素につき、大腸菌による発現系を開発し、現在全酵素(野性型および数種の変異型)およびヘムドメインの発現酵素を各種分光学的解析に供せられる量がとれるようになった。同時に安定化因子の主要物質がPhosphatidyletanolamine(PE)であることをphospholipase,PE特異的結合蛋白処理でその作用が消失することおよびTLC分析、TOF-massから調べた。種々の酵素につき物理化学的性質の解析を開始した。また天然に存在が知られる変異酵素(スプライシング異常により生じた変異酵素)を大腸菌による発現系により発現させ、その酵素がヘムを持っているが配位が異常であるために活性がないことなどを解明した。3)キサンチン酸化酵素のX-線結晶解析のデータ収集を終え、現在進行中である。またcDNA発現系を用いて、ニワトリ/ラットのキメラ酵素を作成、非ヘム鉄を欠落した変異酵素の作成を行い、その解析をおこなった。キメラ酵素を用いてこの酵素が脱水素酵素型から酸化酵素型への変換に関与する構造ドメインを同定した。2つの非ヘム鉄についてEPR、酸化還元電位および一次構造モチーフ上2つのタイプが知られているが、その同定を部位特異的変異法により作成した酵素を用いてその解析を行い同定に成功した。またモリブデン配位子であるイオウの転移に関与が推測されるイオウ転移酵素のcDNAクローニングとその反応機構および類似酵素ロダネ-ゼとの基質特異性の違いの理由を大腸菌の発現系を用いての解析をおこなった。また酵素の局在につき調べた。

NO合成酵素につき、大腸菌による発現系を用い、現在全酵素(野性型および数種の変異型)およびヘムドメインの発現酵素を発現させ、各種分光学的解析を用い解析を進めた。H4B非存在下で精製した酵素の超遠心分析によれば、大腸菌で発現したものは不活性の1量体型であり、H4Bによって始めて2量体を形成することが明かになった。しかし、2量体の形成は精製後は部分的であり、1量体型が何らかの変成型に容易に変化し、2量体を形成しないことを想像させた。種々の変異酵素につき物理化学的性質の解析を開始し、ヘム結合周囲の構造機能相関につき理解を進めた。また天然に存在が知られる変異酵素を大腸菌による発現系により発現させ、その性質の検討を行った。また、脂質による阻害を見い出しその作用部位と作用様式を蛋白化学的、反応速度論的に検討した。キサンチン酸化酵素に引き続き、脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。その分解能は2.3Åを示し、良好なnativeデータ収集が得られた。解析は現在進行中である。またcDNA発現系を用いて、脱水素酵素型から酸化酵素型への変換に関与するSH基の解析同定を行った。また2つの非ヘム鉄について前年度に部位特異的変異法により作成した酵素を用いてそれぞれの同定に成功した。本年度はさらにFeSIに配位しているシステイン毎に変異を与え、鉄に対する影響をEPRおよび酸化還元電位測定により調べた結果、FeSIの2つの鉄が同一の性質を示さないことが知られた。また複合金属フラビン酵素であるセロビオース脱水素酵素につきHumicola insolensから精製した酵素のフラビンドメイン、ヘムドメインを分離しそれぞれを解析した。NO合成酵素およびキサンチン酸化酵素はともに分子量30万前後の2量体蛋白質であり、複数の反応中心をもつ複合金属フラビン酵素である。本研究ではこれらの複合金属酵素に加えセロビオース脱水素酵素(ヘムフラビン酵素)、およびラット由来ヘム結合蛋白質(HBP23)につきその構造と機能の解析を課題とした。研究経過とその成果は以下のとおりである。NO合成酵素:NO合成酵素ヘム結合ドメインはシトクロムP450と分光学的に類似していることが示唆されていたが、NO生産の場であるヘム中心の微細環境については十分解明されていなかった。可視、電子スピン共鳴、X線吸収スペクトル法により、基質非結合型、アルギニン結合型、ヒドロキシアルギニン結合型、銅イオン阻害型マウスnNOSホロ酵素の酸化型ヘム微細環境の構造変化を解析した。NO合成酵素活性に影響を与える諸因子について検討を加えた。特に脂質の結合部位とその阻害機構を検討した。キサンチン酸化酵素:すでに作成してあるキサンチン酸化酵素に引き続き、脱水素酵素型の精製法を改良し結晶化に成功した。立体構造が2.1Åまでのデータセットを基に構造が解かれた。詳細は現在論文執筆中である。脱水素酵素型の立体構造をもとにキサンチン酸化酵素の立体構造もMR法により2.5Å分解能でとかれた。フラビン周囲の構造はNADが近付き難い構造が酸化酵素ではみられいままでの推測を裏付けた。さらに二つの酵素型でセミキノンの安定性を説明できる周囲環境の差異が見られた。
浅海域に残留する低レベルのトリブチルスズは甲殻類の性比に影響を及ぼすのか?

海洋生態系における内分泌撹乱物質の一種、トリブチルスズ(TBT)は1990年に防汚塗料を漁網や小型船舶等に使用することが禁止されたが、近年でも沿岸域に残留していることが報告されており、低濃度でも内分泌攪乱物質としての生物影響が懸念される。また、有機スズ化合物は海水から植物プランクトンないしワレカラ類(甲殻綱:端脚目)の間で高い生物濃縮を示すが、それより上位の魚類から哺乳類間の生物濃縮は低く、低次の生物ほど影響が大きいと推察された。よって、禁止後10年たった汚染の現況と、その濃度におけるワレカラ類等の浅海域生態系の低次生物に対する影響評価を検討する必要がある。禁止後、10年経過した2001年におけるブチルスズ化合物の濃度の実態を明らかにするため、瀬戸内海西部、宇和海、及び高知沿岸の約60地点から海水及びワレカラ類を採水(採取)し、TBTとその分解物であるジブチルスズ(DBT)とモノブチルスズ(MBT)の濃度を分析した。その結果、TBTは瀬戸内海側ではN.D.39ng/L、宇和海側ではN.D.16ng/Lであり、低レベルではあるが有機スズ化合物の汚染が継続していることが確認された。ワレカラ類からも248ng/g(湿重量)の総ブチルスズ化合物が検出された。また、TBT濃度が増加するに従い、ワレカラ類を採集することができた地点の比率は低下した。次に、以上の濃度の生物影響を明らかにするために、野外から採集したホソワレカラの抱卵雌を清海水で飼育し、孵化後の幼体を010,000ngTBTCl/Lの5段階のTBT濃度で飼育した。水温は20°Cに設定した。0ng/L以外の全ての実験区で卵の発生期間中に加え、清海水に移行後も死亡が続いた。当初の産卵数と比較すると10ng/L区でも、孵化時の生残率は70%、成熟時における生残率は50%以下に低下した。また、0ng/L区における孵化個体のメスの比率は36%であったが、TBTClの濃度の上昇に伴い、メスの比率が増加し、100、1000ng/L区ではメスが80%以上を占めた。よって、現在、検出されている低濃度のTBTでも日本沿岸ではワレカラ類の分布域の減少や個体群密度の低下が起こっている可能性が極めて高い。