hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
女性の精神性ストレス緩和のための機能性食品の研究

精神性ストレスおよび閉経は心血管疾患の危険因子である。我々の先行研究では雌性ラットにおいてエストロゲンが精神性ストレスによる循環反応を緩和した。本研究ではエストロゲンのストレス緩和作用のメカニズムの解明とその代替としての抗酸化ビタミンやイソフラボンの作用を検討した。その結果、エストロゲンはレニンーアンギオテンシン系の制御によりストレス性昇圧反応を抑制した。しかし、閉経モデルラットへの葛蔓抽出物投与はストレス性昇圧反応を抑制しなかった。一方、閉経後女性は同年代の閉経前女性と比べ、安静時の血管内皮機能が低下し、ストレス時の血管抵抗が増大したが、ビタミンC経口投与により改善されることが判明した。1.雌性ラットにおける精神性ストレス時のエストロゲンによる循環反応緩和のメカニズム(1)急性ストレス時の昇圧反応におけるAngiotensinII/NADPHoxidase系の関与とエストロゲンの抑制効果成熟雌ラットを卵巣摘出+プラセボ群とエストロゲン補充群の2群(各群8匹)に分けた。17週齢でケージ交換ストレスを負荷し、血圧・心拍数上昇反応のエストロゲンによる抑制効果について、NADPHオキシダーゼ阻害薬(Apocynin)、Angiotensinタイプ1受容体拮抗薬(Losartan)の前投与の影響を比較検討した。また、ストレスによる血漿レニン活性の変化やアンジオテンシンIIの静脈内投与による昇圧反応についても検討した。その結果、エストロゲンは、精神性ストレス時にNADPHオキシダーゼ系を介してストレスによる心拍数上昇反応を抑制し、Angiotensinタイプ1受容体に作用するAngiotensinIIを減少させることによって、昇圧反応を抑制することが示唆された。(2)慢性ストレスによる循環調節機構への影響とエストロゲンの関与上記と同様に作成した2群のラットで間欠的低酸素による昇圧反応をエストロゲン補充が抑制したが、この機序として、エストロゲンが抵抗血管の拡張性を調節すると考えられた。2.卵巣摘出ラットへの葛蔓イソフラボン慢性経口投与による精神性ストレスへの影響卵巣摘出ラットを用いて、葛蔓のエタノール抽出物の慢性投与を行い、精神性ストレスによる循環反応への影響を検討した。葛蔓抽出物投与群では、非投与群と比べて体重が減少したが、ケージ交換ストレスによる心拍数・血圧反応には差が見られなかった。3.女性を対象とした精神性ストレス負荷時の血圧・血管反応における抗酸化ビタミンの効果閉経前・後の中年女性16名(各8名)を対象に、酸化ストレス抑制効果のあるVitaminCの経口投与・非投与下でカラーワードテスト(CWT)による精神性ストレス負荷を行なった。閉経後女性でのみVitaminCの投与後にCWTによる上腕動脈血管床の血管抵抗や血漿ノルエピネフリンの増加反応が抑制された。また、閉経後女性は閉経前に比べて、安静レベルでの血管内皮機能の低下が見られ、この低下はVitaminC投与で改善できたが、精神性ストレス後にはこの効果が見られなくなった。1.雌性ラットにおける精神性ストレス時のエストロゲンによる循環反応緩和のメカニズム1ケージ交換(CS)ストレス時の昇圧反応におけるレニン-アンギオテンシン系の関与とエストロゲンの作用:成熟ラットを卵巣摘出+プラセボ群とエストロゲン補充群の2群に分けた。精神性ストレスとしてCSストレスを負荷した。エストロゲンはCSストレス時にレニン-アンギオテンシン系を抑制し、昇圧反応を減弱させたが、この反応にはNADPHオキシダーゼの関与はないことが示唆された。2間欠的低酸素(IH)誘発性昇圧反応とエストロゲンの作用:上記と別の2群を用い、2週間のIHストレスを負荷した。プラセボ群ではIH暴露により血圧が上昇したが、エストロゲン群ではこの反応が抑制された。しかし、2週間目にはエストロゲン群でも血圧の上昇が見られた。また、エストロゲンはIHによる血漿ノルエピネフリン・エピネフリン増加反応及び血漿レニン活性の増加を抑制することが分かった。2.雌性メタボリックシンドローム(MetS)モデルラットへの葛蔓イソフラボン投与の影響:葛蔓エタノール抽出物により、雌性MetSモデルラットにおいて血圧上昇抑制、体重増加抑制が示唆され、機能性食品としての効果が認められた。3.若年女性及び中年女性を対象とした精神性ストレスによる血管内皮機能の変化に与える運動習慣・抗酸化ビタミンの影響:若年女性を運動習慣なしのSED群16名、運動習慣ありのEXE群12名に分けカラーワードテスト(CWT)を行なった。EXE群はSED群に比べて、CWT時に心拍数が減少した。しかし、安静時の血管内皮機能は両群間に差がなく、両群ともCWTによる内皮機能の変化は見られなかった。中年女性では、CWT終了後に若年女性に比べ上腕動脈血流量が低下したが、ビタミンC投与後には改善した。

1.雌性ラットにおける精神性ストレス時のエストロゲンによる循環反応緩和のメカニズム1急性ストレス時の昇圧反応におけるRenin-Angiotensin系の関与とエストロゲンの抑制効果:成熟ラットを卵巣摘出+プラセボ群とエストロゲン補充群の2群に分けた。17週齢でケージ交換ストレスを負荷し、エストロゲンがストレスによる血漿レニン活性、AngiotensinII・Aldosterone濃度の変化に及ぼす影響について検討した。その結果、エストロゲンは、精神性ストレス時に血漿レニン活性を抑制し、AngiotensinIIを減少させることによって、昇圧反応を抑制することが示唆された。なお、エストロゲンは腸間膜血管におけるAngiotensin変換酵素遺伝子発現には影響を与えなかった。2慢性ストレスによる循環調節機構への影響とエストロゲンの関与:上記と同様に作成した2群のラットで間欠的低酸素ストレスによる昇圧反応をエストロゲン補充が抑制した。これは、エストロゲンが腸間膜動脈の一酸化窒素合成酵素を増やし、一酸化窒素による血管拡張性を増強したことが一因と考えられた。2.卵巣摘出ラットへの葛蔓イソフラボン慢性経口投与による精神性ストレス反応への影響:葛蔓エタノール抽出物の慢性投与群と非投与群では、ケージ交換ストレスによる心拍数・血圧の上昇反応に差は見られなかった。3.閉経後女性を対象とした精神性ストレス負荷時の血圧・血管反応における抗酸化ビタミンの効果:閉経後女性に、酸化ストレス抑制効果のあるVitamin Cの経口投与・非投与下でカラーワードテスト(CWT)による精神性ストレス負荷を行なった。Vitamin Cの投与前では、CWT負荷5分後に上腕動脈の内皮機能が低下する傾向が見られたが、Vitamin C投与後には低下は見られず、精神性ストレスによる血管機能低下を改善できた。科研費を使用して、ラット用血圧送信器を増やすことができ、テレメトリーシステムを用いたin vivo実験が効率よく実施できるようになった。また、HPLC用オートサンプラーや微量サンプル用ナノドロップを購入できたため、血漿カテコラミンやRNAの測定効率がアップした。さらに、各種測定キットが購入できたため、エストロゲンの作用を見逃すことなく検討できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究はおおむね順調に進展しており、特にラットを用いた実験で、急性精神性ストレスによる循環反応におけるエストロゲンの抑制作用のメカニズムを明らかにできたため、論文作成中である。一方、慢性精神性ストレスにおける心血管系への影響とエストロゲンの作用を検討する実験では、当初予定した「他者同居ストレス」負荷を行ったが、ラットが適応しやすく、持続的な血圧上昇が見られなかった。しかし、慢性身体(+精神性)ストレスとして間欠的低酸素を負荷したところ血圧上昇を誘発することができたので、慢性ストレスモデルとして今後も継続して実験を行う予定である。また、卵巣摘出ラットへの葛蔓イソフラボン慢性経口投与はケージ交換ストレスによる心拍数・血圧の上昇反応を抑制しなかった。
PD-L1/PD-1シグナルによる口腔扁平上皮癌の浸潤・転移機構への関与

本研究では、口腔扁平上皮癌(OSCC)における抗免疫チェックポイント分子PD-L1/PD-1の発現と臨床病理学的所見との関連を検索するとともに、PD-1からPD-L1へのシグナルを介したOSCC細胞の増殖、遊走および浸潤に関わる分子機構の解明を目的としている。われわれはこれまでOSCC浸潤先端部腫瘍細胞でのPD-L1発現亢進、および周囲炎症性細胞におけるPD-1高発現を認める患者群では低発現群と比較して、頸部リンパ節転移や遠隔転移が有意に多く、予後が不良であることも明らかにし、頸部リンパ節転移の有無に関してはOSCC生検標本におけるPD-L1/PD-1の高発現が独立した危険因子として抽出された。in vitroでは6種類のOSCC細胞にrecombinant human PD-1 (rhPD-1)を作用させたところ、PD-L1高発現株においてrhPD-1濃度依存的に細胞増殖率の上昇が認められ、PD-1からPD-L1へのシグナル伝達によりOSCCの増殖が促進されることを明らかにした。また、PD-L1高発現株にrhPD-1を作用させたところ、rhPD-1濃度依存的に細胞遊走能・浸潤能の亢進が認められ、PD-1からPD-L1へのシグナル伝達によりOSCCの遊走・浸潤が促進されることを明らかにした。PD-1からPD-L1へのシグナル伝達によるOSCCの細胞遊走能・浸潤能の亢進の詳細な分子メカニズムに関して詳細はわかっておらず、さらなる詳細な解析が必要であると推察される。そのため、本研究期間内にはOSCC細胞株培養上清中のPD-1をELIZAによって測定、PDーL1高発現株において、PD-1をオートクラインに発現している可能性を明らかにした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
薬剤関連顎骨壊死に対するテリパラチドの効果についての研究

8週齢Wistar系雄性ラットを用いて,BP製剤であるゾレドロン酸(以下ZOL)を週に1度,4週間皮下投与した.その後、両側の下顎骨および大腿骨に対して骨穿孔を行い、骨穿孔部に歯周病原菌であるAggregatibacter(アグリゲイトバクター) actinomycetemcomitans(以下A.a)を凍結乾燥させたもの填入した.その後4週間経過観察行い、BRONモデルを作製した.作製したBRONモデルラットを、2群に群分けし、TPTD投与群と生理食塩水群を作製、TPTDまたは同量の生理食塩水を週に3回、4週間投与した、1週間の経過観察ののち、検体の採取を行った.なお、骨採取の10日前および3日前に骨の蛍光標識のためにカルセインを腹腔内投与した.採取した骨検体から標本を作製し、両群の検体を比較した。新生骨量と、壊死骨量の測定とカルセイン2重染色によるリモデリングの測定まで施行することができた。非脱灰標本を作製し、破骨細胞の測定。血清中の含まれる、破骨細胞分化因子のRANKL、骨形成マーカーのオステオカルシン、骨吸収マーカーのCTXの測定を行う。次年度は本年度でできなかった標本の免疫染色や、血液検査データの解析を行うために使用する予定である。
DNA損傷シグナルとテロメア維持との関係に関する研究

染色体DNAが損傷を受けると、DNA損傷チェックポイントが働き、すみやかに損傷を受けたDNAは修復される。一方、真核生物の染色体末端に存在する構造体であるテロメアは、二重鎖DNA切断部位として認識されることなく、安定に維持される。これにはKuタンパク質などの関与が示されているが、DNA損傷シグナルとテロメア維持との関係については不明な点が多く残されている。出芽酵母Tel2はテロメアDNA長制御に重要であり、増殖にも必須である。線虫Tel2ホモログはDNA損傷チェックポイントに関与しており、発生のタイミングや寿命にも関与することが明らかになっている。そこで、我々は分裂酵母ゲノムデータペースより、新規にtel2ホモログ遺伝子を同定した。さらに、ヒトやマウスにおいてもtel2ホモログ遺伝子が存在することを発見した。以上のことから、Tel2は真核生物において広く保存されている重要なタンパク質であると考えられた。分裂酵母細胞においてtel2遺伝子を破壊したところ致死であったので、分裂酵母Tel2は増殖に必須の役割を果たすことが明らかになった。また、人工的にtel2遺伝子の発現を低下させると、HUやUVに対して感受性を示すようになり、DNA複製チェックポイントタンパク質であるCds1の活性化に異常が生じていた。以上のことから、分裂酵母Tel2は他の生物と同様にDNA損傷チェックポイントと生育の両方において機能を果たすと考えられた。ChIP assayによりTel2タンパク質の局在を調べたところ、染色体全体に弱く結合し、テロメア領域においては特に多く局在している可能性が示唆された。また、tel2遺伝子の発現を低下させると、細胞分裂に異常をきたすことから、Tel2は染色体の維持と細胞分裂をリンクする重要な役割を果たしている可能性が示唆された。テロメアDNA末端は二重鎖DNA切断部位として認識されることなく、安定に維持される。そこで、我々は出芽酵母においてDNA損傷シグナルとテロメア維持の両方において機能していることが示されていたSet1の分裂酵母ホモログについて解析した。分裂酵母Set1はクロマチン制御因子に頻繁に見られるSET domainを有し、in vitroでヒストンH3のLys4をメチル化する活性を持っていた。さらに、set1破壊株においてヒストンH3のLys4のメチル化が検出されなくなったことから、分裂酵母Set1はヒストンH3のLys4メチル化酵素であると考えられた。set1破壊株では、テロメアおよびセントロメアにおけるサイレンシング効果に弱い欠陥が見られた。また、set1破壊株では野生株に比べて若干長いテロメアDNAが観察され、その表現型はチェックポイントタンパク質Rad3-Rad26に依存していたことから、Set1はRad3-Rad26依存的にテロメア維持において何らかの機能を果たしていると考えられた。さらに、set1遺伝子を破壊すると、チェックポイントタンパク質Hus1、Rad1、Rad17などを欠損した株のDNA damage sensitivityが弱くなった。このような効果は、Rad3やRad26を欠損した株においては観察されなかった。set1遺伝子破壊によるDNA damage sensitivityの緩和は、チェックポイントによる細胞周期調節やDNA修復遺伝子の発現調節の変化によるものではなかった。以上のことから、分裂酵母Set1はRad3-Rad26依存的にテロメア機能およびDNA damageに対する感受性を調節する因子であると考えられた。
知的障害のある思春期女子の月経教育プログラムの開発と効果の検証

本研究は知的障害のある思春期女子の月経教育プログラムの開発とその効果の検討である。これまで知的障害のある思春期女子に対する月経教育の実態は、障害の程度や社会的文化的背景などの要因が関連し、ほとんど明らかになっていない。研究者自身が実施してきた研究では、月経発来から思春期女子本人がセルフケアを行うに至る過程での保護者の不安が大きいことが明らかになっていた。そのためこれら月経時の教育やセルフケア獲得に至る実態を把握するため、本研究1年目は特別支援学校担任と養護教諭に対してインタビューを実施し、これまでに対応した個別事例、全体で実施している月経教育等について調査した。その結果を基に、研究2年目は、1年目のインタビュー結果の分析内容の学会発表、インタビュー内容から得られたデータをまとめた保護者向けの小冊子の作成、知的障害のある思春期女子の月経教育プログラム介入研究である。学会発表、小冊子の作成は2年目中旬までに実施し、小冊子は関係機関、保護者へと配布している。介入研究については9名の思春期女子に実施し、分析を実施している。人形を使用したナプキン交換では、療育手帳Bの思春期女子は月経準備教育段階であっても、手技を獲得し1か月後の効果測定まで手技が定着していた。しかし重度な自閉がある場合には、教育プログラム導入段階から困難な姿勢が見られ、手技の確認まで至らないケースも見られた。今後は、月経教育により適した人形や動画等視覚的支援の得られる指導教材の開発と、障害の程度による指導の工夫について検討していくことが必要である。2年目の予定として、1年目のインタビュー内容について分析し、保護者・支援者向けの小冊子を作成することと、知的障害のある思春期女子に対する月経教育プログラムの介入研究を行う事としていた。予定通り、小冊子の作成をし、各関係機関や保護者への配布を実施している。また、介入研究は順調に実施でき、当初の目標である対象数にほぼ達している。効果測定の結果についても現在分析を開始している。さらに、それぞれの実施内容については学会で発表を実施している。保護者向けの月経教育に関する講義などを開催し、論文投稿も行っている(2019年7月掲載予定)。2年目の研究で実施した小冊子の有用性についての検証、教育プログラムの検証を行い、論文を作成するとともに、国際学会での発表を予定している。今後の課題として、当初3年目の予定としてはe-learningの作成を考えているため、その内容を具体的に検討していきたい。月経教育プログラムに適した人形がないことや、視覚的支援としての動画などもないことから、ITを使用した教育プログラムを検討していくことが3年目の研究終了年後も継続課題となることが予測され、その内容についても検討していきたい。その結果、協力の得られた教員・養護教諭から以下のような回答を得た。1月経時セルフケアに関して:数年前と異なりここ近年ではセルフケアに至るまでに困難であった事例はほとんど上がっていない。その背景には保護者・教員との連携が密にあったことが考えられた。2継続的な対応に関して:小学校では声かけや教師の観察、保護者の支援によってナプキン交換で失敗をしてしまう例は少ないものの、個々のケースによっては継続的なフォローが必要な場合もある。そのため中学校・高等学校時に再度セルフケアの確認を定期的にすべきである。3月経時の手当ての月経教育について:全体で行うというより、個別のケースに合わせて実施する。手当というより、人権教育に絡めた性教育の必要性がある。4教員や保護者の意識について:教員の意識の差、保護者の意識の差などの問題が関連してくるため、教員に向けた研修の必要性を感じる。このような結果から2年目の月経教育プログラムの開発に関して、誰を対象にどのような内容で行っていくか再度検討していく必要性が示唆された。知的障害の思春期女子の月経教育の実態について、インタビュー協力に同意を得るまでに時間を要した。しかし、1年目の年度末に人数に達したため細かな分析を現在行っている状況である。

その結果を基に、研究2年目は、1年目のインタビュー結果の分析内容の学会発表、インタビュー内容から得られたデータをまとめた保護者向けの小冊子の作成、知的障害のある思春期女子の月経教育プログラム介入研究である。学会発表、小冊子の作成は2年目中旬までに実施し、小冊子は関係機関、保護者へと配布している。介入研究については9名の思春期女子に実施し、分析を実施している。人形を使用したナプキン交換では、療育手帳Bの思春期女子は月経準備教育段階であっても、手技を獲得し1か月後の効果測定まで手技が定着していた。しかし重度な自閉がある場合には、教育プログラム導入段階から困難な姿勢が見られ、手技の確認まで至らないケースも見られた。今後は、月経教育により適した人形や動画等視覚的支援の得られる指導教材の開発と、障害の程度による指導の工夫について検討していくことが必要である。2年目の予定として、1年目のインタビュー内容について分析し、保護者・支援者向けの小冊子を作成することと、知的障害のある思春期女子に対する月経教育プログラムの介入研究を行う事としていた。予定通り、小冊子の作成をし、各関係機関や保護者への配布を実施している。また、介入研究は順調に実施でき、当初の目標である対象数にほぼ達している。効果測定の結果についても現在分析を開始している。さらに、それぞれの実施内容については学会で発表を実施している。保護者向けの月経教育に関する講義などを開催し、論文投稿も行っている(2019年7月掲載予定)。分析結果から、当初の研究計画として挙げていた月経時の手当てに関する女子本人への教育プログラムを作成していくか、教員に対する意識改革のプログラムを作成していくか再度検討し、2年目は教育プログラムを開発していく予定である。また1年目の結果については学会で発表していく。2年目の研究で実施した小冊子の有用性についての検証、教育プログラムの検証を行い、論文を作成するとともに、国際学会での発表を予定している。今後の課題として、当初3年目の予定としてはe-learningの作成を考えているため、その内容を具体的に検討していきたい。月経教育プログラムに適した人形がないことや、視覚的支援としての動画などもないことから、ITを使用した教育プログラムを検討していくことが3年目の研究終了年後も継続課題となることが予測され、その内容についても検討していきたい。インタビューを行った場所が近畿圏内に限られたため、旅費や人件費が予定より下回った。その分、次年度は、研究施設へ出向する回数が増えるためその使用に当てる予定である。月経教育に必要な女性器モデルを購入予定としていたが、勤務校に同様の模型があり借用できたため、購入不要となった。次年度のe-learningの開発費用に充てることとする。
消化管ステロール輸送担体の多層的発現調節

本研究により、小腸上皮細胞・肝細胞の頂端膜においてステロール類の吸収に働き、エゼチミブの薬効標的であるヒトNiemann-Pick C1-like 1(NPC1L1)がSREBP2/HNF4αによりコレステロール依存的な制御を受けること、脂肪酸を生理的リガンドとする核内受容体PPARα/NR1C1により正の転写調節を受けること、および、糖尿病時に機能上昇が見られるPGC1αがSREBP2/HNF4αおよびPPARαによるNPC1L1転写活性を亢進することが明らかとなった。これらの知見は、相互に増悪因子となる高脂血症と糖尿病の病態生理の解明に向けた重要な一歩となることが期待される。消化管からのコレステロール吸収は生体内の脂質恒常性維持に重要な役割を果たし、脂質トランスポーター分子の相次ぐ発見・新規高脂血症治療薬エゼチミブの誕生により、ここ数年で急速に研究が進んでいる。本研究においては、小腸上皮細胞の管腔側膜においてコレステロール・植物性ステロールの胆汁ミセルからの吸収に働き、エゼチミブの薬効標的でもあるNiemann-Pick C1-like 1(NPC1L1)が多層的な発現調節を受けているという仮説のもと、特に転写調節・翻訳後調節に着目して研究を進めている。本年度は、転写調節研究に関してはコレステロール依存的制御の解析を重点的に行い、翻訳後調節に関してはInsigのクローニングおよび各種タグ付き発現ベクターへの組み込みを行った。in vivo・in vitro実験においてコレステロール量とNPC1L1 mRNA発現量に負の相関が観察されたため、転写調節領域を用いたレポータージーンアッセイ・ゲルシフトアッセイにより詳細に検討した結果、ヒトNPC1L1のコレステロール依存的発現調節にはSREBP2・HNF4αが関与し、この制御にはHNF4αの5'-上流域への結合が必要であることが明らかとなった。NPC1L1-Insig相互作用に関しては、Insigの二つのアイソフォームであるInsig-1およびInsig-2のクローニングに成功し、すでに蛍光蛋白およびエピトープタグとの融合蛋白発現用ベクターへの組み込みを完了している。今後は免疫沈降・ウェスタンブロット・免疫染色等を行い検討を進めていく。消化管からのコレステロール吸収は生体内の脂質恒常性維持に重要な役割を果たし、脂質トランスポーター分子の相次ぐ発見・新規脂質異常症治療薬エゼチミブの誕生により、ここ数年で急速に研究が進んでいる。本研究においては、小腸上皮細胞・肝細胞の頂端膜においてコレステロール・植物性ステロールの胆汁ミセルからの吸収に働き、エゼチミブの薬効標的でもあるNiemann-PickC1-like1(NPC1L1)が多層的な発現調節を受けているという仮説のもと、特に転写調節・翻訳後調節に着目して研究を進めた。翻訳後調節として想定したNPC1L1-Insig相互作用に関しては、両遺伝子の発現ベクターを同時導入した共発現細胞を用い免疫沈降実験を行った結果、両蛋白質間の分子間共役は示唆されたものの、これはNPC1L1がERを通過する際に生じる一過性の弱い相互作用である可能性が考えられた。ヒトNPC1L1の転写調節については、昨年度明らかにしたSREBP2/HNF4αによるコレステロール依存的制御に加え、脂肪酸を生理的リガンドとする核内受容体PPARα/NR1C1による正の制御が見出された。5'-上流域へのPPARαの直接結合を介したこの制御は、エゼチミブと同時使用されうる他の脂質異常症治療薬群であるフィブラート系薬剤により活性化することから、脂質異常症の薬物治療における薬剤選択にも示唆を与える知見である。さらに、糖尿病時に機能上昇がみられるPGC1αがSREBP2/HNF4αおよびPPARαによるヒトNPC1L1転写活性を亢進することが明らかとなり、相互に増悪因子となることが知られる高脂血症と糖尿病の病態生理の解明に向けた重要な一歩となることが期待される。
オンチップ集積された光ナノ共振器系における動的制御に基づく光操作

フォトニック結晶共振器は非常に微小な領域に長時間光を閉じ込められるため,光のままでの情報処理を可能にする技術として期待されている.本研究では,共振器中に閉じ込めた光の性質を動的に制御することで可能となる光操作の発展を目指して,電気的な制御による多彩な光操作について研究を行なっている.これまでに電気的な制御機構の導入によって可能となる共振波長の周期的な変調を利用した光制御について理論的な検討を行い,これを用いて共振器間の結合の強度と位相を動的に制御できるということを定式化してきた.特に結合位相の制御を用いれば,時間反転対称性を破ることができるため,磁場を用いない非相反的な光操作などの高度な光操作が可能になる.一方このような光操作を行うには,十分な時間共振器に光を保持しておく必要があるが,共振器単体の性能は年々向上しており,光閉じ込めの性能指数であるQ値として1100万という非常に高い値が達成されている.しかしながら電気的制御機構を導入した共振器のQ値は数10万程度に留まっており,上述のような高度な光制御を可能にするためにはQ値の向上が必須といえる.そこで従来の超高Q値単一共振器作製プロセスを継承しつつ,電気的な制御において必要となるpn領域や金属配線の導入を,光学性能を劣化させることなく行うための新たなプロセスを開発に取り組んだ.その結果,共振器Q値は数十万から数百万にまで向上した.また,このような共振器Q値の共振器結合系で実際に光操作が可能となることを数値計算によって明らかにした上で構造設計を行ない,基礎特性の評価を行なった.高い光学性能と電気的制御機構を両立するフォトニック結晶デバイスの作製プロセスに着手した結果,光閉じ込め性能であるQ値が従来の数十万から数百万にまで向上した.この閉じ込め性能は他の研究グループのデバイスに比べて100倍程度高く,従来では実現が困難であった新たな光操作を実証できると期待される.実際に,共振器に閉じ込めた光を別の共振器に転送する操作について,現実の実験における種々の損失などを考慮した数値計算を行ない,実験を可能とするようなパラメーターを発見できている.現在設計した構造を作製し評価を進めている.作製プロセスの改善にあたって電極材料の変更を強いられたなど,当初想定しなかった多数の課題を解決する必要があった.また,Q値の向上にともなって測定系の改善も必要になったのでそのため当初の研究計画に完全に沿っているわけではないが,これを機会に更なる特性向上に役立つようなプロセス,及びより安定的に測定できる系の構築についての知見も得られたので,今後の実験の基礎的な部分を習得したといえ,概ね順調な研究進捗であると考えている.現在,高速制御に必要なp-i-n接合を導入した共振器及び共振器結合系も作製しており,基礎特性の評価を進めている.一方で動的光操作実証に向けた測定系構築も進めており,これらを経て,まずは断熱的な光転送の実証を行っていく.それに付随して,正弦波状の変調について,有限要素法による電極パターンの最適化や回路設計などを行いつつ,ネットワークアナライザーを用いた基礎特性評価を行っていく.また,電気的制御機構の導入によって可能となる大規模集積化に向けて,多数の共振器からなる共振器結合系における光操作について現時点で得られた着想を更に深化させていく.フォトニック結晶共振器は非常に微小な領域に長時間光を閉じ込められるため,光のままでの情報処理を可能にする技術として期待されている.本研究では,共振器中に閉じ込めた光の性質を動的に制御することで可能となる光操作の発展を目指して,電気的な制御による多彩な光操作について研究を行なっている.これまでに電気的な制御機構の導入によって可能となる共振波長の周期的な変調を利用した光制御について理論的な検討を行い,これを用いて共振器間の結合の強度と位相を動的に制御できるということを定式化してきた.特に結合位相の制御を用いれば,時間反転対称性を破ることができるため,磁場を用いない非相反的な光操作などの高度な光操作が可能になる.一方このような光操作を行うには,十分な時間共振器に光を保持しておく必要があるが,共振器単体の性能は年々向上しており,光閉じ込めの性能指数であるQ値として1100万という非常に高い値が達成されている.しかしながら電気的制御機構を導入した共振器のQ値は数10万程度に留まっており,上述のような高度な光制御を可能にするためにはQ値の向上が必須といえる.そこで従来の超高Q値単一共振器作製プロセスを継承しつつ,電気的な制御において必要となるpn領域や金属配線の導入を,光学性能を劣化させることなく行うための新たなプロセスを開発に取り組んだ.その結果,共振器Q値は数十万から数百万にまで向上した.また,このような共振器Q値の共振器結合系で実際に光操作が可能となることを数値計算によって明らかにした上で構造設計を行ない,基礎特性の評価を行なった.高い光学性能と電気的制御機構を両立するフォトニック結晶デバイスの作製プロセスに着手した結果,光閉じ込め性能であるQ値が従来の数十万から数百万にまで向上した.この閉じ込め性能は他の研究グループのデバイスに比べて100倍程度高く,従来では実現が困難であった新たな光操作を実証できると期待される.

実際に,共振器に閉じ込めた光を別の共振器に転送する操作について,現実の実験における種々の損失などを考慮した数値計算を行ない,実験を可能とするようなパラメーターを発見できている.現在設計した構造を作製し評価を進めている.作製プロセスの改善にあたって電極材料の変更を強いられたなど,当初想定しなかった多数の課題を解決する必要があった.また,Q値の向上にともなって測定系の改善も必要になったのでそのため当初の研究計画に完全に沿っているわけではないが,これを機会に更なる特性向上に役立つようなプロセス,及びより安定的に測定できる系の構築についての知見も得られたので,今後の実験の基礎的な部分を習得したといえ,概ね順調な研究進捗であると考えている.現在,高速制御に必要なp-i-n接合を導入した共振器及び共振器結合系も作製しており,基礎特性の評価を進めている.一方で動的光操作実証に向けた測定系構築も進めており,これらを経て,まずは断熱的な光転送の実証を行っていく.それに付随して,正弦波状の変調について,有限要素法による電極パターンの最適化や回路設計などを行いつつ,ネットワークアナライザーを用いた基礎特性評価を行っていく.また,電気的制御機構の導入によって可能となる大規模集積化に向けて,多数の共振器からなる共振器結合系における光操作について現時点で得られた着想を更に深化させていく.
サスティナブルハウジングに向けてのセルフ・リノベーションの計画技術と社会性

住み手自らのアイデアや労力による住戸改修をセルフ・リノベーション(SR)と定義し、特質・意義と促進条件を解明した。1)SRは住まいの今日化、新たな生活スタイル、住戸の個性化を実現し、住み手の住まいに対する満足感や愛着を高める。2)大規模なSRは入居後2週間以内で、小規模なSRは随時行なわれる。3)SRは、計画と使用が直接的に連動した、即人的・即空間的・即時的な行為であり、自律性・多様性・個別性を備えている。4)SRを通して、住み手は、より良き住環境づくりに向けての恊働者へと、位置づけを転換する。5)簡便な改修申請、入居前の相談と恊働改修、情報・技術・コスト面のサポートは活発なSRに繋がる。住み手自らが住戸の改修を行なうセルフ・リノベーション(以下SR)を対象に、今年度はSRを可能とするハード・ソフトの賃貸システムの特性を解明し、効果的なSRを誘導し、一般化するための賃貸システムのあり様を考察した。SR賃貸を運営している関東・関西・九州の18の事業者を対象に、SRを可能とする賃貸契約と住み継ぎの仕組み、住戸空間の初期設定、SRのサポート体制、事業性に関するヒアリング調査、並びに資料収集を行なった。SRの促進要件は、改修申請手段の簡便化、自由なSRを促進するハードの条件(SRを動機付ける余地性のある空間、幅広いSR可能範囲の設定、未承認でも改修可能な部位の設定)やSRのサポート体制である。改修承認では、承認主体が居住者の申請内容に可能な限り対応しながらも、未承認を含めて住戸の価値を高めるSRは残し、建物性能・法的適合性・安全性を損なう内容は取り除き、あるいは、厳密に原状回復や補修費を請求することが必要である。そのためには、契約面では「造作買取請求権の放棄」が効果的で、居住者の円滑な退去、次の居住者へのSRの継承が可能となる。また、承認記録の正確性も、SRの質的向上と退去時のトラブル抑制に作用する。SR賃貸住宅では、空室率の低減、家賃の増額、事業者と入居者の良好な関係づくりなどが生まれ、事業性を高める手法である。SR賃貸システムの要件は、事業者・居住者・次の居住者の希求する多様なSRの質(次への貸しやすさ、建物性能、法的適合性、安全性の維持向上、事業性、自由なSR、容易な施工、入退居のスムーズさ)を同時に高めていくような契約・空間・住戸継承の仕組みの整備である。以上より、SRの促進と質的向上、次の居住者への容易な継承、事業者の負担低減と事業性向上に寄与する賃貸システムの必要性と要件を解明し、SR賃貸住宅普及に向けての基盤を提起した。住み手自らが住戸の改修を行なうセルフ・リノベーション(SR)を対象に、住み手によるSRの取組み実態を把握し、トップダウン型改修との差異や住み手にとってのSRの有意性を考察した。SR賃貸共同住宅17団地に居住する40世帯を対象に、戸別訪問により、SRの目的や内容、施工方法、SRに対する評価、住まい方などのヒアリング調査、並びに実測調査を行ない、以下の結論を得た。1.入居動機やSRに関する経験・技術等に関わらず、住み手は、自らの住要求に応じたSRに取り組んでおり、SRへのニーズの高さが顕著である。2.その内容は、床・壁・天井等の仕上げの変更が最も多く(9割)、次いで棚やフックや造作家具の設置などの軽微なSR(8.5割)、電気配線や器具の新設などの設備改修(5割)となる。壁の撤去・新設といった、大掛かりなSRも4割弱を占め、改修部位では[空間改変型・仕上げ変更型・造作付加型]、改修目的では[機能面/用途改変型・不便解消型、意匠面/理想実現型・状況対応型]など、部位、方法、程度に関するSRの多様なタイプが見られる。3.事業者が設定した可能範囲や方法などのSRに関するルールを住み手は遵守し、また、工事騒音などにも配慮するなど、自律的なSRが実施されている。4.経時的な変化では、入居初期段階で、壁の改変や仕上げの大幅な変更、設備更新など活発に行なわれ、入居後に、棚や造作の設置などの軽微なSRが随時、アドホックに、継続的に取り組まれている。SRの特性は、計画・施工・使用を統合しながらも、即人的・即地的・即時的な対応による住まいの個性化や現代化の実現、機能と意匠の両面の充足、入居前後の活発な取り組みとその後の継続性等にある。また、SRが共同住宅における住まいづくりのパラダイムを「自律・個別・一体・動的」に転換するうえで、有用な方法であることを、住み手の立場から実証した。今年度の目的である住み手によるSRの取り組みの実態・特性の解明に関して、当初の住戸の空間状態や改修手続き、事前相談や改修サポートなど、ハード・ソフトの賃貸システムの異なる共同住宅を選定し、当初の計画を超える40世帯を対象とした戸別訪問調査によって、SRの実態(内容・方法・目的・入居前から入居後の経時的な取り組み)、SRに対する住み手の評価(改修内容・住まい方・手続きやルールなどのソフト面)など、詳細なヒアリングデータを収集するとともに、SR箇所を逐一確認しながら、動機・意図、時期、施工方法、材料、評価などの実態と実測による図面採集・写真撮影を行なうことが出来た。その結果を取り纏めて、居住者属性、入居動機、SRに関する経験

・技術・意欲、箇所毎のSRの経緯・目的・使用材料・施工方法・時期・成果・評価などのSRの取り組みのプロセス、SRや住まいに対する評価、意識、住まい方の変化、SRに伴う近隣関係の生成などを、各世帯別に詳細に記録・整理したデータシートを作成することができた。それを活用して定量・定性分析を行い、SRの程度と入居者属性やSRの習熟との関係、SRの経緯・目的(向き合い方)についての分類[機能重視型(用途改変/不便解消)・意匠重視型(理想実現/状況対応)]や内容・程度についての分類[空間改変型・仕上げ変更型・造作付加型]、さらには、入居前・入居当初・それ以降の三段階における時系列的な取り組み状況を視点とした分類[収束型・間欠型・拡大型]などを行ない、各分類やその相関性によって、SRの特性を多面的に解明するとともに、その生成要因の検討を行なうことが出来、当初に予定していた研究計画を達成することが出来た。セルフリノベーション(以下、SR)の貸し手による位置づけ方に応じて、入居前の相談・改修(セレクト型・オーダーメイド型・DIY型)、SR可能範囲の設定、改修承認方法、時間・技術・費用・情報面でのSRサポートなどと、[原状型・裸貸し型・改修済型・改修+裸型]といった住戸の初期状況とが合理的に組み合わされたSR賃貸システムが構築されている。ソフト面は、入居前には[直接誘導(D)・間接誘導(I)・未誘導(U)]に、入居後は[誘導継続(F)・放任(N)・限定(R)]に分類され、共通してSRを促す仕組みが内在している。その方法には1老朽化・陳腐化の進む原状型や裸貸し型の場合には、[D-F型][I-F型]等の積極的なSRを促す仕組みが用意され、活発で大掛かりなSRが入居前後に展開する。それらは、住み手の多様な住要求が直接的に投影され得る賃貸システムである。2改修済型、改修+裸型や良好な原状型の場合には、[D-R型][U-N型][U-R型]など、SRを制約する仕組みが用意され、指定された範囲内でのSRに留まる。事前改修によって現代化された住戸に惹かれた住み手が、軽微なSRで住まいを個性化する等、簡便性の高いシステムである。事業者や不動産関係者とともに、賃貸住宅における効果的なSRを実現するための制度的・技術的な方法を検証し、以下の結論を得た。老朽化・陳腐化の進む賃貸住戸の現代化・個性化を進めるうえで、特に、貸し手と住み手との協働SRは効果的である。協働SRの普及に向けて、SRに対して積極的な住み手から簡便性を志向する住み手まで、多様な考え方に対応する賃貸システムの構築が求められる。そのためには、相談による入居前改修を用意し、簡便型には改修+裸型の住戸とセレクト型改修の組み合わせとし、積極型には、オーダーメイド型や貸し手と費用・設計・施工を分担するDIY型などの事前SRを用意する。住み手自らのアイデアや労力による住戸改修をセルフ・リノベーション(SR)と定義し、特質・意義と促進条件を解明した。1)SRは住まいの今日化、新たな生活スタイル、住戸の個性化を実現し、住み手の住まいに対する満足感や愛着を高める。2)大規模なSRは入居後2週間以内で、小規模なSRは随時行なわれる。3)SRは、計画と使用が直接的に連動した、即人的・即空間的・即時的な行為であり、自律性・多様性・個別性を備えている。4)SRを通して、住み手は、より良き住環境づくりに向けての恊働者へと、位置づけを転換する。5)簡便な改修申請、入居前の相談と恊働改修、情報・技術・コスト面のサポートは活発なSRに繋がる。
テネイシン欠損マウスを用いた造血微小環境解析モデル確立と造血支持能の検索

(1)テネイシンホモ欠損マウスの骨髄・脾臓および胸腺を病理組織学的に検索したが,正常マウスに比して加齢変化も含め,形態学的相違・変化を認めなかった。骨髄標本においても各段階の造血細胞の組成に相違を認めなかった。さらに末梢血のへマトクリット・血液細胞組成にも相違は認められなかった。(2)テネイシンホモ欠損マウスを用いた初代骨髄長期培養系を樹立し,BDF1マウス由来コントロールとの造血動態の相違につき比較検討を行った。骨髄球系細胞分化を主に支持するDexter培養系およびリンパ球系分化を主に支持するWhitlock-Witte両培養系において,コントロールに比して早期(2-10週)で優位の造血支持能低下が認められ,テネイシンホモ欠損マウスのin vitroでの造血支持能の質的相違が示された。さらにこの造血支持能低下はWhitlock-Witte培養系でより顕著に見られたことから,造血現象のリンパ球分化におけるテネイシン分子の関与が示唆された。(3)テネイシンホモ欠損マウスの骨髄及び脾臓由来初代間質細胞の細胞外マトリックス糖蛋白(fibronectin,Iaminin)産生を,BDF1由来間質細胞と比較検討したが過剰産生等の代償機能発現を認めなかった。またこれより株化細胞を樹立し,現在その造血支持能についての解析を進めている。さらにWhitlock-Witte培養系でのIL-2・IL-7mRNA発現,造血細胞増殖の負の因子であるTGF-βの局在の相違についての比較検討を開始している。
高等植物細胞の微小管構築制御機構の解明

高等植物細胞は中心体のような明確な構造物としてのMTOC(microtubule organizing center;微小管形成中心)を持たない。そのMTOCは細胞内の様々な場所に分散しており、細胞周期の進行に応じて様々な微小管構築群を見せる。細胞核の表面も高等植物細胞のもつMTOCのひとつである。間期のある時期には細胞核表面から細胞膜に向かって放射状に微小管が形成される。核表面にどのようなMTOCが存在するのだろうか?これまで数年の試みにより、高等植物細胞の核表面に局在するピストンH1が、チューブリンと結合し複合体を形成することで微小管を構築することが示唆された。この微小管形成機構は旧来のγ-チューブリン型のMTOCとは全く異なり、微小管へのチューブリンの取り込みが基部側末端で起こることが明らかとなった。ヒストンH1とチューブリンからなる複合体はこのようなユニークな微小管構築をどのようなメカニズムで実現しているのだろうか。高等植物は通常、ピストンH1 variantを複数種持つ。タバコの場合少なくとも5つのピストンH1 variantを持つので、これらのどれが微小管形成に関わるのか明らかにすることとした。遺伝子配列情報が入手可能であったRIB, HIC, HIDについてGSTタグを融合したリコンビナントタンパクを大腸菌内で発現、これを精製しin vitroでの微小管形成活性を比較した結果、全てのピストンH1がMTOC活性を有していた。しかし一方で、これらのMTOC活性はGSTタグを切り離した上で一旦リフォールディング過程を経ることで初めて現れることがわかった。このことは、ピストンH1のMTOC活性が、自身の正しい立体構造に深く依存することを示唆するものであった。また、これまでの研究でピストンH1の核表面での局在を示したピストンH1抗体が、ピストンH1Bとのみ交差することも明らかとなった。このことから、少なくともヒストンH1Bが核表面に局在し、チューブリンと結合することで微小管を構築すると考えられる。これまでの研究により、高等植物細胞において核表層からの微小管の構築がヒストンH1によって行われていることが示唆されている。核表層におけるヒストンH1の局在は、核膜を除去する界面活性剤処理によって影響を受けず、このことからヒストンH1は核膜上にあるわけではなく、むしろ核骨格と結合しているのではないかと想像された。本年度、単離核を界面活性剤、塩およびヌクレアーゼ処理することで得られた核マトリクスを間接蛍光抗体法により染色した結果、核マトリクス上にヒストンH1が局在することが示された。このことは以前の結果と矛盾せず、これまで知られていなかったDNAと局在を共にはしないタイプのピストンH1が存在し、これが核骨格上に位置し細胞質に対し微小管骨格を作るとの考えを支持するものであった。次年度以降、この局在様式をより詳細に明らかにしたいと考えている。一方、その局在の解析のみならず、活性、すなわち微小管の構築機構の解析についても進展が見られた。これまでにヒストンH1によって構築される微小管へのチューブリンの取り込み部位を調べた結果、チューブリンの重合反応は核表面側の微小管末端で行われていることが示唆されていた。本年度、蛍光標識したチューブリンを用いた実験系の改良および顕微鏡の光学系の改善を行い、これまでのものとは比較にならないくらい明確なデータを得ることができた。微小管の重合はやはり核表面側の末端で行われており、形成される多数の微小管は比較的同調的に伸長を行うことも新たに明らかとなった。以上の結果について、できるだけ早期にデータをまとめ、論文として発表したいと考えている。高等植物細胞は中心体のような明確な構造物としてのMTOC(microtubule organizing center ;微小管形成中心)を持たない。それはあたかも、動物細胞において核近傍に配置される中心体が細胞膜へ向かって放射状に微小管を形成するさまを見ているかのようである。では高等植物細胞の核表面は中心体の代わりをしているのであろうか?それとも中心体とは全く異なる仕組みが核表面にあるのだろうか?私は、核から放射状に伸びる微小管(以下放射状微小管)の特徴をとらえるため、まずその重合末端を明らかにすることを試みた。動物細胞において中心体から伸びる微小管は、基部側をマイナス端、遠末端側をプラス端としチューブリンの重合・脱重合はプラス端側で起こる。タバコ培養細胞BY-2より単離した核をGTPとブタ脳由来のチューブリンと混合しインキュベートするとin vitroで放射状微小管の構築を再現できる。この系を用いて、放射状微小管の伸長時にチューブリンの付加が核表面から見て基部側(proximal)、遠末端側(distal)のいずれで起こるかを蛍光ラベルの濃淡を利用した方法、フォトブリーチ法、フォトアクチベート法という3つの方法を用いて調べた。その結果、チューブリンの重合反応は中心体の場合と異なり微小管の基部側で起こることが明らかとなった。このことは、高等植物細胞の核表面に存在するMTOCが中心体の機能的ホモログであるという考え方を否定するものであり、基部側重合型の全く異なるMTOCの存在を示唆するものであった。

高等植物細胞は中心体のような明確な構造物としてのMTOC(microtubule organizing center;微小管形成中心)を持たない。そのMTOCは細胞内の様々な場所に分散しており、細胞周期の進行に応じて様々な微小管構築群を見せる。細胞核の表面も高等植物細胞のもつMTOCのひとつである。間期のある時期には細胞核表面から細胞膜に向かって放射状に微小管が形成される。核表面にどのようなMTOCが存在するのだろうか?これまで数年の試みにより、高等植物細胞の核表面に局在するピストンH1が、チューブリンと結合し複合体を形成することで微小管を構築することが示唆された。この微小管形成機構は旧来のγ-チューブリン型のMTOCとは全く異なり、微小管へのチューブリンの取り込みが基部側末端で起こることが明らかとなった。ヒストンH1とチューブリンからなる複合体はこのようなユニークな微小管構築をどのようなメカニズムで実現しているのだろうか。高等植物は通常、ピストンH1 variantを複数種持つ。タバコの場合少なくとも5つのピストンH1 variantを持つので、これらのどれが微小管形成に関わるのか明らかにすることとした。遺伝子配列情報が入手可能であったRIB, HIC, HIDについてGSTタグを融合したリコンビナントタンパクを大腸菌内で発現、これを精製しin vitroでの微小管形成活性を比較した結果、全てのピストンH1がMTOC活性を有していた。しかし一方で、これらのMTOC活性はGSTタグを切り離した上で一旦リフォールディング過程を経ることで初めて現れることがわかった。このことは、ピストンH1のMTOC活性が、自身の正しい立体構造に深く依存することを示唆するものであった。また、これまでの研究でピストンH1の核表面での局在を示したピストンH1抗体が、ピストンH1Bとのみ交差することも明らかとなった。このことから、少なくともヒストンH1Bが核表面に局在し、チューブリンと結合することで微小管を構築すると考えられる。
低アルカリホスファターゼ血症の着床前遺伝子診断を実施するための基礎研究

TNSALP遺伝子のゲノムDNAをPCR法にて増幅した。ゲノム遺伝子は12エクソンに分かれているため、PCR法に用いるプライマーはそれぞれのエクソンについて合成する必要がある。しかも細胞1個にはTNSALP遺伝子は1対(2個)しか含まれていないため、これを遺伝子増幅するためには増幅対象領域についてPCR反応を繰り返して2度行ういわゆるnested PCR法が必要となる。この方法に必要なTNSALP遺伝子のプライマーの塩基配列はすでに報告されているので、これらの情報を用いて、細胞1個より増幅可能な条件を検討した。増幅された遺伝子がTNSALPであるかどうかについてはそれぞれの増幅された遺伝子内に存在する制限酵素部位が、既知のTNSAPLの遺伝子配列と一致するかどうかで判断した。同じ増幅法であっても細胞融解の方式によって増幅の程度の差が出ることが判明した。すなわち蛋白融解酵素を用いたものよりもアルカリ溶解法を用いた方が正確な増幅が期待できることがわかった。しかし、allele drop out(ADO)と呼ばれる、2本の染色体のうちの1本がうまく増幅されない減少についての検討を次に行った。低アルカリホスファターゼ症は常染色体劣性遺伝形式をとる疾患であるので、ADOがあっても正常のalleleの増幅がみられれば、少なくとも保因者であり、罹患はしていないと診断できる。しかし、あまりにADOの頻度が高いと、正確な診断という意味では問題が生じる。文献上はいずれの方法が良いかについては相反する報告があり、増幅する遺伝子によって違いがあるものと考えられた。そこでADOの頻度を検討して、さらに増幅率を加味して検討した結果、TNSALP遺伝子の増幅についてはアルカリ溶解法を用いた方が、増幅効率とallele drop outの率から考えて、良いと考えられた。組織非特異的アルカリホスファターゼTNSALP遺伝子の変異がすでに同定されている保因者の白血球細胞1個を試料として用い、この細胞から抽出したゲノムDNAを用いて、PCR法にて遺伝子の増幅・検出・変異の同定が可能であるかどうかを検討した。試料は静脈血でこれをリンホライトリンパ球分離液を使用して、リンパ球を回収した。PBS洗浄後にマイクロマニピュレーターを用いて、白血球1個を回収し、溶解液4μlを入れたPCR用チューブに移し、この状態で65°Cで10分間加温して細胞を融解してゲノムDNAを溶出させた。ついで94°Cにて10分間加温して溶解液中のproteinase Kを不活性化させ、その後4°Cに低下させて、そのまま次のステップに進むか、-20°Cで凍結保存した。次にTNSALP遺伝子のゲノムDNAをPCR法にて増幅した。

PBS洗浄後にマイクロマニピュレーターを用いて、白血球1個を回収し、溶解液4μlを入れたPCR用チューブに移し、この状態で65°Cで10分間加温して細胞を融解してゲノムDNAを溶出させた。ついで94°Cにて10分間加温して溶解液中のproteinase Kを不活性化させ、その後4°Cに低下させて、そのまま次のステツプに進むか、-20°Cで凍結保存した。次にTNSALP遺伝子のゲノムDNAをPCR法にて増幅した。ゲノム遺伝子は12エクソンに分かれているため、PCR法に用いるプライマーはそれぞれのエクソンについて合成する必要がある。しかも細胞1個にはTNSALP遺伝子は1対(2個)しか含まれていないため、これを遺伝子増幅するためには増幅対象領域についてPCR反応を繰り返して2度行ういわゆるnested PCR法が必要となる。この方法に必要なTNSALP遺伝子のプライマーの塩基配列はすでに報告されているので、これらの情報を用いて、細胞1個より増幅可能な条件を検討した。増幅された遺伝子がTNSALPであるかどうかについてはそれぞれの増幅された遺伝子内に存在する制限酵素部位が、既知のTNSAPLの遺伝子配列と一致するかどうかで判断した。これによると同じ増幅法であっても細胞融解の方式によって増幅の程度の差が出ることが判明した。すなわち蛋白融解酵素を用いたものよりもアルカリ溶解法を用いた方が正確な増幅が期待できることがわかった。TNSALP遺伝子のゲノムDNAをPCR法にて増幅した。同じ増幅法であっても細胞融解の方式によって増幅の程度の差が出ることが判明した。しかし、allele drop out(ADO)と呼ばれる、2本の染色体のうちの1本がうまく増幅されない減少についての検討を次に行った。低アルカリホスファターゼ症は常染色体劣性遺伝形式をとる疾患であるので、ADOがあっても正常のalleleの増幅がみられれば、少なくとも保因者であり、罹患はしていないと診断できる。しかし、あまりにADOの頻度が高いと、正確な診断という意味では問題が生じる。文献上はいずれの方法が良いかについては相反する報告があり、増幅する遺伝子によって違いがあるものと考えられた。