hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キメラプロテインによる中枢神経再生ニッシェの分子設計

中枢神経の再生のための人工ニッシェを構築するため、細胞外基質(ECM)や人工基材表面に結合できるドメイン、および、細胞の機能制御に働く機能ドメインからなるキメラプロテインを設計した。昨年度に引き続き、オリゴヒスチジンおよび上皮細胞細胞増殖因子(EGF)から構成されるキメラプロテインを調製し、オリゴヒスチジンを介して人工基材上に配向固定した。とくに、基材のベースとなる自己組織化単分子膜にオリゴエチレングリコール誘導体を混在させることでキメラプロテインの非特異的な吸着が抑制され、固定化EGFの効果を更に引き出すことに成功した。一方、ECMに対する結合ドメインを融合したEGFおよび毛様態神経栄養因子(CNTF)を調製した。EGFとコラーゲン結合ドメインとのキメラタンパク質を固定したコラーゲン基材上では神経幹細胞の分化が抑えられ、一方、CNTFとラミニン結合ドメインのキメラタンパク質を固定したラミニン上ではアストロサイトへの分化が有意に亢進した。これらの結果は、キメラタンパク質の固定化によって神経幹細胞の分化をコントロールしながら成育させる良好な環境が構築されたことを意味する。さらに本研究では、神経系細胞の生育状況を簡便かつ定量的に捉えるための分析プラットフォームを構築するため、1次元的なミクロストライプ状に細胞の形態を制御しながら培養するための基材を開発した。中でも、神経組織内の構造を模倣しながらアッセイが行えるよう、神経細胞とアストロサイトの相互作用を維持しながらそれぞれ思い通りの部位に望みの形態で培養するための基材を開発した。基材の作製にはマイクロコンタクトプリンティング法を利用して、それぞれの細胞を特異的に認識できる2種類の抗体分子を用い、それらをミクロパターン化することで目的を達成した。また、この技術はキメラプロテインを足場とする神経細胞の接着培養にも適用できることを示した。以上のように本研究では、キメラプロテインを利用した中枢神経再生ニッシェ構築にとって有用な情報を収集することができ、また、さらに基材の性能をハイスループットに定量分析するためのアッセイ手法を提案することができた。中枢神経の再生のための人工ニッシェを構築するため、その構成成分として、細胞外基質(ECM)や人工基材表面に結合できるドメイン、および、細胞の機能制御に働く機能ドメインからなるキメラプロテインをデザインした。まず、オリゴヒスチジンおよび上皮細胞細胞増殖因子(EGF)から構成されるキメラプロテインを大腸菌発現系を利用して調製し、オリゴヒスチジンを介して人工基材上に固定した。そのさい、オリゴヒスチジンとキレート結合の形成が可能なNiイオンを予め基材上に固定し、その表面にキメラプロテインを固定した。キメラプロテイン固定化表面のキャラクタリゼーションには、高感度赤外分光分析法、X線光電子分光分析法、表面プラズモン共鳴分析法を用いた。このようにして得られた基材表面で神経幹細胞の分化アッセイを行った。アッセイには、ミクロパターン化アルカンチオール自己組織化単分子膜を利用する細胞アレイ法を採用した。その結果、固定されたEGFの効果により、神経幹細胞は未分化性を高く維持しながら盛んに増殖することが示された。さらに、基材のベースとなる自己組織化単分子膜にオリゴエチレングリコールをもつアルカンチオール誘導体を混在させることでキメラプロテインの非特異的な吸着が抑制され、固定化EGFの効果を更に引き出すことに成功した。一方、ECMに対する結合ドメインを融合したEGFおよびciliary neurotrophic factor (CNTF)も調製し、それらをECMのコーティングされた基材に結合させた。このような人工基材表面では細胞の接着性が大幅に亢進するため、人工ニッシェとしてさらに高い性能を有しているとの予備的な知見を得た。

以上のように本研究では、キメラプロテインを利用した中枢神経再生ニッシェ構築にとって有用な情報を収集することができ、また、さらに基材の性能をハイスループットに定量分析するためのアッセイ手法を提案することができた。
糖鎖-フラーレン複合体を用いた高機能医療用材料の開発

カーボンナノチューブは飯島博士の発見以来、その特徴的な電気特性及び形状により各分野の研究者から高い注目を浴びてきた。また、ナノチューブは溶液中で孤立分散することによって人体を透過する近赤外光を励起波長に持つ蛍光を発することから、新規バイオセンサーへの応用が期待できる。本研究ではナノチューブの特異的な蛍光を用いたバイオセンサーの開発を目的として、糖鎖高分子-ナノチューブコンジュゲートを作成し、各スペクトルとAFMによってその評価を行った。α-グルコース糖鎖高分子の水溶液中で未精製カーボンナノチューブ(HiPco)を超音波処理後、黒色の分散溶液を超遠心処理により不純物等を除去し、糖鎖高分子-ナノチューブコンジュゲートを含む上澄み溶液を得た。得られた溶液のラマンスペクトル及び吸収スペクトルによって孤立分散しているコンジュゲートの存在が示唆された。近赤外蛍光スペクトル測定の結果、孤立分散ナノチューブ由来の蛍光スペクトルが得られた。またAFM測定により、高分子のらせん構造に起因すると考えられるラフト構造がナノチューブ上に観測された。これらの結果から、コンジュゲートは糖鎖高分子がナノチューブに巻き付くことによって水中に分散していると予想した。上記の方法によって、α-グルコース糖鎖高分子のみならず他の生理活性糖鎖高分子(志賀毒素を中和するGb_2及びGb_3糖鎖高分子、肝細胞の培養に用いられるPVLAなど多数)によっても同様のコンジュゲートを得ることに成功した。炭素の第三の同位体であるフラーレンは、可視光存在下において一重項酸素を発生することによりDNAやタンパク質といった生体物質を破壊することが可能である。またガドリニウムを内包した水溶性フラーレン(Gd@C_<82>)が市販のGd-DTPAなどのキレート型造影剤に比べ数十倍もの強いMRI造影機能を発揮することが明らかとなるなど興味深い生理活性が続々と発見されている。ゆえに、現在フラーレンは物理分野のみならず化学及び医学分野においても脚光を浴びている。一方、細胞表面上に糖脂質や糖タンパクとして発現している糖鎖に関する研究が活発に行われ、癌の転移・毒素やウィルスの細胞感染など様々な生理現象に深く関与していることが明らかとなってきた。本研究では、高い生理活性を有する糖鎖をフラーレンに結合することで、臓器特異性を示すMRI造影剤そして特定の毒素あるいは生理活性タンパク質を選択的に破壊するような高機能医療材料を開発することを目的としている。本年度は糖鎖-フラーレン複合体合成に向けて、フラーレンに対する付加反応における最適な糖鎖誘導体の設計および生理活性糖鎖の効率的合成法の検討を行った。市販のグリカール(糖鎖1,2-不飽和体)に対して、温和な条件下でのフッ素化を可能にするSelectfluorと様々な求核体を反応させることにより、糖鎖のアノマー位の機能化及び2位にフッ素を導入する二段階の反応を、一段階の反応で、かつ高収率にて達成することを発見した。また、反応溶媒及び温度を制御することにより、生成する4つの立体異性体のうち一つのみを選択的に合成する方法も確立した。以上の結果により、フラーレンに対する付加反応に必要なアジド体をアノマー位に、高い生理活性を示すフッ素を2位にそれぞれ有する糖鎖の効率的合成を達成することができた。本年度の研究は平成15年4月1日より平成16年3月31日までフランス共和国Ecole Normale Superieureにおいて遂行した。
DNA、RNA結合蛋白質Hfqによる大腸菌細胞複製の制御機構

DNA、RNA結合タンパク質Hfq(Hfq遺伝子産物)による細胞複製制御機構の解析を行った。hfq変異株は、鉄イオンの取り込み系タンパク質FepAとFhuEを過剰発現し、過酸化水素のような酸化ストレスに対して高感受性を示した。常磁核磁気共鳴法による細胞内鉄イオン濃度の測定により、変異株では高濃度の鉄イオンが細胞内に蓄積していることが示された。また精製Hfqタンパク質は、試験管内でFenton反応により誘発したDNA損傷を抑制した。これらのことからHfqタンパク質は、鉄イオンの取り込み系タンパク質の発現調節により鉄イオンにより誘起されるラジカルの発生を抑えるとともに、DNAに直接結合してラジカルによるDNA損傷を抑制することにより、静止期における細胞の生存維持に寄与していると考えられた。Hfqによる遺伝子発現制御機構を解析するために、hfqと各種RNA分解酵素との相互作用について調べた。ams1(温度感受性RNase E)変異株に対してhfq::cat変異を導入した結果、asm1変異株の増殖の温度感受性が部分的ながら抑制された。ams1 hfq::cat二重変異株にさらにmg::cat変異を導入したところ温度感受性の抑制が解除された。FtsZ、FepA、FhuEタンパク質以外にHfqタンパク質による発現制御を受けているタンパク質を検索するために、hfq::cat変異株の全タンパク質を細胞質、内膜、外膜に分画して野生株と比較したところ、外膜画分においてhfq::cat変異株で発現量に変化の見られるタンパク質を3種見いだした。現在これらのN末端のアミノ酸配列を決定しているところである。大腸菌の細胞増殖を制御する新たな因子を見い出し、その分子レベルのメカニズムを明らかにすることを目的として、DNA、RNA結合タンパク質Hfq(hfq遺伝子産物)による細胞複製制御機構の解析を行った。これまでに大腸菌hfq変異株は、鉄イオンの取り込み系タンパク質FepAとFhuEを過剰発現し、過酸化水素のような酸化ストレスに対して高感受性を示すことが明らかとなっていた。そこで、生理的に酸化ストレスが誘発されるといわれている静止期におけるhfq変異株の状態を解析した。変異株は静止期において速やかにその生存率が減少することを見いだした。SOSレポーター遺伝子sfiA-lacZの発現から、変異株では静止期において高いレベルのSOS反応が誘導されており、DNA損傷が引き起こされていることが示唆された。HfqがmRNAの安定性にどのように寄与しているかを解析するために、Hfqと各種RNA分解酵素との相互作用について調べた。hfq::cat変異株で過剰発現するftsZのmRNAについては、RNaseEによるプロセッシングを受けて翻訳可能な状態になることが報告されていたので、まずams1(温度感受性RNaseE)変異株に対してhfq::cat変異を導入した。その結果、asm1変異株の増殖の温度感受性が部分的ながら抑制された。またRNaseEとその構造、認識配列において類似性が見られるRNaseGの過剰発現によってもams1の温度感受性が抑制されることも報告されている。そこでams1 hfq::cat二重変異株にさらにmg::cat変異を導入したところ温度感受性の抑制が解除された。RNaseE、RNaseGが触媒することが知られているrRNAのプロセシングはhfq::catの導入によっても変化しなかったため、それ以外の反応、おそらくはmRNAの分解または成熟にHfqが関与していると思われた。

FtsZ、FepA、FhuEタンパク質以外にHfqタンパク質による発現制御を受けているタンパク質を検索するために、hfq::cat変異株の全タンパク質を細胞質、内膜、外膜に分画して野生株と比較したところ、外膜画分においてhfq::cat変異株で発現量に変化の見られるタンパク質を3種見いだした。現在これらのN末端のアミノ酸配列を決定しているところである。
t-J模型,d-p模型のモット転移に関する変分法による研究

今年度は単バンドモデルおよび多バンドモデルに対するモット転移の基礎的データを得る為に、変分モンテカルロ法により様々な基本的変分波動関数の性質を詳細に調べた。以下に主要な研究成果をまとめる。1.1次元t-Jモデルに対して、フェルミ液体(FL)や朝永-ラティンジャー液体(TLL)の波動関数を適用して、その振る舞いを調べた。モット転移の性質を知る為に、転移近傍での電荷圧縮率X_cや帯磁率X_sの振る舞いが重要な指標となる。これらの物理量に対して、上記波動関数は、厳密な結果との比較から、J/t≦2の場合には、非常に良い波動関数となっていることが判った。即ち、ハーフフィルド近傍のX_cやX_sの臨界的振舞いは、定量的に厳密解と一致し、ブリンクマン-ライス転移とは異なる結果が得られた。2.酸化物高温超伝導体の有力なモデルと考えられる2次元t-Jモデルに対して、FLやTLL波動関数、様々な異方性の超伝導や反強磁性の秩序を持った波動関数を適用し、モット転移(ハーフフィルド)近傍での安定性などを調べた。1次元の場合とは異なり、2次元では超対称な場合でも、グッツヴィラ-波動関数(GWF)が安定な領域は低電子密度に限られ、d_x^2_<-y>^2波超伝導状態が安定な領域は広い。ハーフフィルド極限では、FLやTLL等の金属状態は、それ自身が相分離に対して不安定である。この性質は1次元t-Jモデルばかりでなく、ハバ-ドモデルとも異なり、より深い解析が待たれる。一方、この領域でエネルギーの低いd_x^2_<-y>^2波超伝導状態や反強磁性状態は、それ自身では相分離に対して安定である。3.d-pモデルでは、上記の金属状態の関数はそのままでは、ハーフフィルドで絶縁状態にならないことが判明した。これらの研究成果を基にして、2次元単バンド系また多バンド系で、モット転移を記述する変分関数の構築することは、来年度以降に残された重要な研究課題である。
血球から捉える局所的放射線被ばくによる全身組織影響の分子メカニズム

本研究は、局所的な放射線照射に対する造血組織及び赤血球の放射線応答の解明を目的とし、メダカにおけるγ線に加えて炭素イオンビームを利用した評価法の開発およびその解析を行った。血球数は、2 Gyから15 Gyの範囲では線量効果は認められず、造血組織である腎臓が放射線により照射されることで、面積依存的に1週間後には血球数が減少すること、また減少した血球数は28日後に回復しなかった。さらに貧血処理後において、放射線照射により貧血からの血球数の回復は1日程度遅れるが、放射線照射による血球数の低下が抑制されたことから、貧血処理後の造血細胞において放射線に対して抵抗性が上がったことが示唆された。放射線治療等において、局所の急性症状が発生することはよく知られている。全身性の症状については存在が議論されているものの、それらが誘起される分子メカニズムについては詳しく研究されていない。我々は、メダカへの放射線の部分照射において、照射部位以外に生じる症状を見出しており、その原因として有核赤血球に着目した。本研究では、平成27、28年度の2年間で、放射線照射後のメダカの血球を分子レベルで解析し、全身性の応答を引き起こすメカニズムを明らかにすることを目的とする。本研究は、メダカを用いた局所放射線照射系を利用して、血液に着目し、血球の示す放射線影響の評価を、細胞膜表面分子や転写から直接的に分析することで、高感度かつ特異的な応答を検出する。本研究により、被ばくによる体内影響への対処法の発展に寄与することが期待される。平成27年度は、まず、血球・血液成分からの免疫応答物質の同定解析のためにメダカSK2成魚から2ulの血液を取得する方法を確立した。放射線照射後の初期応答と1週間程度との間で得られた血液を希釈後、塗抹標本を作製し、赤血球および白血球の病理学的解析および形態的数量的評価を行った。赤血球の核および細胞形態の変化が観察された。一方、放射線照射により好中球の増加傾向が観察されたが、有意な差を見出すには至らなかった。次に、全身応答を促す最低線量と最小照射面積の検討として、麻酔処理後のメダカSK2に対し、背あるいは腹側から1mmの領域に炭素イオンビームを15Gy照射1週間後まで採血を行い、血液の形態学的および数量的評価を行った。その結果、照射1日後には末梢の有核赤血球の減少が観察され、7日後にはメダカの造血組織である腎臓が照射された背側照射のみで顕著な血球数の減少が観察された。本研究は、独立行政法人日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所との共同利用により実施した。平成27年度は、計画に示されているように血液成分の取得方法を確立し、血球数の形態的・数量的評価を実施した。特に、高崎量子応用研究所の重粒子イオンビームを利用して限局された領域への照射を実施し、造血組織である腎臓への照射による二次的な変化と末梢血への直接的な変化を解析することを可能とした。赤血球については核および細胞の形態変化を観察することができた一方で、白血球の数が少なく数的有意差を持って評価することが困難であった。そこで、赤血球系列の放射線応答により絞って、赤芽球の放射線応答についても解析することとした。現在、フェニルヒドラジンによる溶血性貧血後に、メダカにおいても末梢に赤芽球が排出されることを確認している。また、平成27年度には、国際と国内学会併せて4回の成果発表を行った。従って、当初の予定におおよそ沿った形で順調に進行していると考えている。平成28年度は、平成27年度に確立・実施した系を用いて、まず放射線照射の面積および線量による血球数への影響の検討を、国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研究所との共同利用により重粒子イオンビーム照射装置利用して実施した。アクリル板による遮蔽を用いて限局した炭素イオンビーム照射系を確立し、照射野の面積増加に伴い血球数の減少が認められることが明らかとなった。2, 5, 15 Gy照射による線量依存性は認められなかった。次に、フェニルヒドラジンによる貧血誘導後のメダカから血液を採取し、赤血球の放射線応答を解析した。末梢赤血球における細胞死や形態異常などの放射線影響は、貧血誘導の有無により変化しない一方で、貧血環境下では造血組織が放射線に対して抵抗性を示すことが明らかとなった。造血器官である腎臓は、貧血処理1週間後でコントロールと同程度まで組織像が回復しており、放射線影響のみが観察された。一方、メダカから血液を採取し、GC-MSを用い血清中に存在する脂溶性低分子化合物を測定したが、検出できる変化を認められなかった。

これまでに得られた結果をもとに、これまでの成果を国際学会において発表し、学会誌への投稿をした。本研究は、局所的な放射線照射に対する造血組織及び赤血球の放射線応答の解明を目的とし、メダカにおけるγ線に加えて炭素イオンビームを利用した評価法の開発およびその解析を行った。血球数は、2 Gyから15 Gyの範囲では線量効果は認められず、造血組織である腎臓が放射線により照射されることで、面積依存的に1週間後には血球数が減少すること、また減少した血球数は28日後に回復しなかった。さらに貧血処理後において、放射線照射により貧血からの血球数の回復は1日程度遅れるが、放射線照射による血球数の低下が抑制されたことから、貧血処理後の造血細胞において放射線に対して抵抗性が上がったことが示唆された。平成27年度に確立・実施した系を用いて、赤血球の放射線応答の解析を引き続き実施する。特に新生赤血球とそれ以外での放射線感受性に注目して実験を実施する。また、質量分析用のサンプルを調製し、マススペクトロスコピーにより解析する。血清中に存在する低分子化合物の測定にはGC-MSを用い、血球表面の高分子は、LC-MS/MSを用いて分析・同定する。得られた成果を国際学会で発表し、また学術雑誌への投稿を行うことで本研究をまとめる。環境生理学平成27年度は、計画に示されているもののうち、ヘマトクリット遠心機および水圧式マニピュレータを購入する予定であったが、幸運にも、東京大学の2014年および2015年予算で双方の購入が可能となったので、この予算を平成28年度のGC-MS解析用試薬および消耗品の購入に充てられることになった。平成28年度は、当初予定されていた質量解析用の試薬および物品購入、メダカ飼育費用に加えて、GC-MS用の新しいキャピラリーカラムを購入する。また、成果を海外および国内学会で発表し、海外雑誌への論文の投稿を行う。以上の項目を実施するための費用が必要である。
表現型責任細胞の包括的な同定を目指す次世代型マウス遺伝学の開発

昨年度までに、高速な「交配なし」遺伝学の構築と検証実験を終了し、原著論文および英文総説としてまとめ、報告を完了している。本年度は特に全臓器スケールのサンプルから細胞を同定する技術(個体レベルのシステム要素同定技術)についてさらに検討を進めた。具体的には、アデノ随伴ウイルスや狂犬病ウイルスを用いた細胞ラベリング後、アップデートした組織透明化プロトコルを適応して、蛍光タンパク質等の発現を全臓器スケールで3次元的に観察することに成功した。さらに、イメージングの高速化に向けた画像取得シーケンスや、取得画像から必要な前処理やセグメンテーションを行うための解析手法について検討し、取得画像からの情報抽出に必要な解析パイプラインの構築を進めた。その結果、画像取得に使用しているライトシート顕微鏡のスペックに十分対応した画像処理シーケンスの構築に成功したほか、全脳のイメージングデータからラベルされた特定の細胞を1細胞解像度で検出するアルゴリズムの構築に成功した。また、透明化と組織学的染色法の組み合わせによるmulti-modalな情報取得についても検討し、一定の成果を得た。以上のシステム要素同定技術についての結果をまとめ、近く論文投稿を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画では、高速な「交配なし遺伝学(ESマウス遺伝学)」と「全脳イメージング(CUBIC)」技術を組み合わせ、表現型の表出に関わる責任細胞を同定する技術(個体レベルのシステム要素同定技術)の開発を目指している。本年度は、理化学研究所の研究協力者らが稼働させているESマウスの作製系の導入のため、ES細胞の培養系の導入と改良、ES細胞インジェクションのためのインジェクターとレーザー穿孔装置の導入を行った。ま他、遺伝学的ツールの空間的な発現系を立ち上げるため、特徴的な細胞にCreリコンビナーゼを発現するマウス系統(Creトランスジェニックマウス、ノックインマウス)を導入した。今年度は特に、新規のESマウスの作製に先行して、全脳3次元イメージング系CUBICの汎用化を中心に計画の遂行と成果発表を行った:1)透明化・イメージング・画像解析のプロトコル化とリソース化を進めた(Susaki et al. Nature Protocols 2015)。2)上記の関連手法を取りまとめた英文総説を発表した(Susaki and Ueda, Cell Chemical Biology 2016)。3)CUBICを応用した脳神経活動の全脳モニタリングに成功し、in situ hybridizationを用いたvalidationstudyも行った(Tatsuki et al. Neuron 2016)。予定していたES細胞培養系と機材の導入が順調に進んだこと、またCUBICを用いた全脳イメージング系の整備と応用例の蓄積が進み、原著論文としての発表を複数行ったことから、概ね順調な推移とした。本研究計画では、高速な「交配なし遺伝学(次世代型マウス遺伝学)」と、高速な「全脳イメージング(CUBIC)」技術を組み合わせ、表現型の表出に関わる責任細胞を同定する技術(個体レベルのシステム要素同定技術)の開発を目的としている。本年度は、所属先及び理化学研究所の共同研究者らとともに稼働させたESマウス作製系を利用し、次世代型マウス遺伝学の実証実験を完了させ報告した(Ode, Ukai, Susaki et al. Mol Cell 65: 176-190, 2017, co-first)。本論文では、概日時計遺伝子Cry1及びCry2のダブルノットマウス(24時間の行動リズムが消失する表現型を示す)にCry1のレスキューカセットをノックインし、表現型の回復を個体の行動レベルで観察する系を開発した。最終的に、転写制御領域やCry1タンパク質中の変異体を含む合計20種類のレスキューカセットを準備して、Cry1/Cry2ダブルノックアウトバックグラウンドにノックインし、交配なしに解析個体を作製して行動解析を行うことに成功した。その他、ESマウス作製系の代替・補完的技術と位置付けているアデノ随伴ウイルスを用いた細胞ラベリング系について、ウイルスインジェクションシステムを所属先に初めて導入し稼働させた。また、組織透明化と組織学的染色法を組み合わせ、細胞種を3次元データから同定する技術の開発のため、30種類以上の抗体や染色剤をテストし、CUBICとのコンパチビリティを確認した。本研究計画では「個体レベルのシステム生物学」の実現のため、2つの基盤技術の確立を目標としている。このうち、高速な「交配なし遺伝学(次世代型マウス遺伝学)」の確立および実証実験について、計画2年目までに完了させ論文報告した(Ode, Ukai, Susaki et al. Mol Cell 65: 176-190, 2017, co-first)。「全脳イメージング(CUBIC)」技術については、初年度にプロトコル論文(Susaki et al. Nature Protocols 10: 1709-1727, 2015)および関連技術を網羅的にまとめた英文総説(Susaki and Ueda. Cell Chemical Biology 23: 137-157, 2016)を発表した。特に後者については、網羅的な細胞・細胞回路解析技術が「個体レベルのシステム生物学」に資することを初めて提唱した。加えて、アデノ随伴ウイルスや3次元組織学技術の導入・開発を進めており、さらに応用例を蓄積するために研究を展開させる準備を進めている。以上の内容から、現在までに概ね順調に進展していると判断した。

本研究計画の集大成の一つとして、「次世代マウス遺伝学」を実現するスキームをまとめた英文総説を発表した(Susaki et al. npj Syst. Biol. App 2017)。昨年度に引き続き、アデノ随伴ウイルス等の遺伝学的ラベリングツールを用いた細胞ラベリング系の検討のため、ウイルスの作製・投与系の導入を進めるとともに、外部研究者らの協力を得て検証用のラベル済みサンプルを確保した。これらのサンプルを用いて、アップデートされた組織透明化プロトコルにおける蛍光タンパク質等へのコンパチビリティやイメージングのデータクオリティの評価を進めた。イメージングには新規に導入した高速マクロズームライトシート顕微鏡を使用し、イメージング手法の高速化に向けた画像取得シーケンスや、取得画像の前処理、細胞体の検出法(セグメンテーション)等を行うための解析手法について検討した。マウス全脳を例とした場合、1データセットあたり100GB近いサイズとなり、PCのスペックが極めて重要であることが判明したため、ハイスペックなワークステーションを導入し、画像の前処理から基本的な解析までを回す体制を整えた。また、透明化と組織学的染色法の組み合わせによるmulti-modalな情報取得について検討し、ウイルスラベル脳に対する免疫染色によって、1細胞解像度でラベル細胞の細胞種を同定するスキームの検証を行なった(投稿準備中)。また、CUBIC技術のヒト病理学への応用を目指した研究を進め、発表した(大阪大学大学院医学系研究科病態病理学講座との共同研究)(Nojima etal.Sci Rep 2017)。昨年度までに、高速な「交配なし」遺伝学の構築と検証実験を終了し、原著論文および英文総説としてまとめ、報告を完了している。本年度は特に全臓器スケールのサンプルから細胞を同定する技術(個体レベルのシステム要素同定技術)についてさらに検討を進めた。具体的には、アデノ随伴ウイルスや狂犬病ウイルスを用いた細胞ラベリング後、アップデートした組織透明化プロトコルを適応して、蛍光タンパク質等の発現を全臓器スケールで3次元的に観察することに成功した。さらに、イメージングの高速化に向けた画像取得シーケンスや、取得画像から必要な前処理やセグメンテーションを行うための解析手法について検討し、取得画像からの情報抽出に必要な解析パイプラインの構築を進めた。その結果、画像取得に使用しているライトシート顕微鏡のスペックに十分対応した画像処理シーケンスの構築に成功したほか、全脳のイメージングデータからラベルされた特定の細胞を1細胞解像度で検出するアルゴリズムの構築に成功した。また、透明化と組織学的染色法の組み合わせによるmulti-modalな情報取得についても検討し、一定の成果を得た。以上のシステム要素同定技術についての結果をまとめ、近く論文投稿を行う予定である。本年度中に導入したESマウス作製系の稼働を目指す。また代替手法として、アデノ随伴ウイルスを用いた細胞ラベリング系に着目しており、遺伝学的改変をスキップした形で細胞ラベリングが実現できないかを検討する。
発達期脳に対して吸入麻酔薬が及ぼす毒性の原因と対策

幼若脳に麻酔薬を暴露すると、神経細胞に影響を与え、成長後の行動異常や学習機能の低下に関連することが知られている。麻酔薬暴露の1日前のプレコンディショニング(PC)がその毒性に関連するのかを検討した。10%酸素PCが3%セボフルランPCよりも強く、その後の神経変性に影響を与え、8方向性迷路での改善とNueN染色での正常細胞数の増加に関連した。デクスメデトミジンのPCでは、セボフルラン暴露による認知機能低下を改善、成長後の正常細胞数の割合を増加させることが示唆された。新生児のセボフルラン暴露による神経毒性は、PCにより減弱させることが示唆された。幼若脳に対する麻酔薬暴露により、成長後の脳の変性や学習機能障害が起きることが示唆されているが、詳細な原因や防止策は不明である。麻酔薬暴露前に与えられた種々の薬物や状況(プレコンディショニング)が、その後の麻酔薬暴露による神経変性に影響を与えるのかも詳細は未だ不明である。このため、本研究では、生後7日目のラットへセボフルラン暴露影響が各種のプレコンディショニングにより短期的・長期的な組織学的変化と学習機能へ及ぼす効果を短期的な組織学的評価を行う。生後6日のラットを、クリアアクリルボックス内で1時間暴露、30分空気に戻して、再度1時間暴露後に母親のケージに再度戻す。グループ:低濃度酸素(酸素10%)、水素15%+空気、高濃度酸素(酸素90%)、セボフルレン2%+酸素30%、デクスメデトミジン10μg/kg、デクスメデトミジン10μg/kg投与+低濃度酸素、プレコンなし翌日生後7日目に吸入麻酔薬セボフルラン3%の暴露を、酸素50%下で4時間、6時間吸入させる。暴露直後にラットの脳を採取してカスパーゼ3染色を行った。海馬CA1と歯状回のカスパーゼ3陽性細胞数は低酸素暴露群とデクスメデトミジン暴露群で、陽性細胞数が少ない傾向が見られた。プレコンディショニングによりその後の麻酔薬暴露による影響を変化させることが示唆された。吸入麻酔薬併用酸素濃度により、セボフルラン暴露時の生存率に影響がでることがわかっていたが、今回の実験で酸素濃度を減少させると死亡率が増加して、計画通り実験を遂行できず、若干の遅れが生じた。麻酔薬暴露前に与えられた種々の薬物や状況(プレコンディショニング、PC)が、その後の麻酔薬暴露による神経変性に影響を与えるのかも詳細は未だ不明である。このため、本研究では、生後7日目のラットへセボフルラン暴露によるその後の影響がPCにより長期的な組織学的変化と学習機能へ及ぼす効果を検討する。グループを下記の4群に分けた:PC(10%O2:酸素10%)、PC(Sevo:セボフルラン2%+酸素30%)、PC(none)、コントロール。コントロール群以外には生後7日目にセボフルラン3%と酸素30%で4時間吸入させた。コントロール群はPCと7日目の暴露を酸素30%のみで行った。暴露5週目にフィアコンディショニングテスト、6週目に8方向性迷路を4日間行い、評価後、脳を採取してNeuN染色を行い海馬CA1の正常細胞数を計測した。フィアコンディショニングテストでは、いずれの群でも差が見られなかったが、8方向性迷路の遂行時間と正選択率はPC(10%O2)群でコントロール群と同程度になった。海馬CA1の正常細胞数は、コントール群が多く、次いでPC(10%O2)群、その後にPC(Sevo)とPC(none)になった。この実験結果により、低酸素によるプレコンディショニングはその後のセボフルラン暴露による認知機能への影響を変化させることが示唆された。このことは、幼若脳への麻酔薬暴露による神経変性を、プレコンディショニングは改善する可能性を示し、麻酔薬の毒性を減弱させる方法の1つとし利用できる可能性を示唆する。実験施設の感染による利用の長期的な中断のため、当初の計画の用量反応を検討するところは実験を遂行できなかった。このため、本研究では、生後7日目のラットへセボフルラン暴露によるその後の影響がPCにより長期的な組織学的変化と学習機能へ及ぼす効果を検討した。生後6日のラット腹腔内にcontrol(生食)、sham(生食)、DEX2 (デクスメデトミジン2μg/kg)、DEX20 (デクスメデトミジン20μg/kg)及びDEX200 (デクスメデトミジン200μg/kg)を投与した。翌生後7日目にセボフルラン3%と酸素30%で4時間吸入させた。sham群は7日目の暴露を酸素30%のみで行った。

4時間後ケージに戻し、暴露3週目に水迷路を連続4日間学習させ、暴露5週目にフィアコンディショニングテスト、再度6週目にフィアコンディショニングテストと3日間の水迷路を行った。評価後、脳を採取してNeuN染色を行い海馬CA1と大脳皮質の単位面積あたりの正常細胞数を計測した。3週後の水迷路では、到達までの時間、距離ともに学習効果がみられたが各群での差はなかった。6週後の水迷路でも、群間差は見られなかった。プローベトライアルでは、DEX20で1/4占有率が増加した。フィアコンディショニングテストでは、DEX2とDEX20群でcuedとcontextualともにコントロールに比べ増加した。大脳皮質と海馬CA1の正常細胞数は、sham群が多く、DEX群ではコントロール群に比べ増加していた。この実験結果により、デクスメデトミジン投与によるプレコンディショニングはその後のセボフルラン暴露による認知機能への影響を改善させることが示唆された。幼若脳に麻酔薬を暴露すると、神経細胞に影響を与え、成長後の行動異常や学習機能の低下に関連することが知られている。麻酔薬暴露の1日前のプレコンディショニング(PC)がその毒性に関連するのかを検討した。10%酸素PCが3%セボフルランPCよりも強く、その後の神経変性に影響を与え、8方向性迷路での改善とNueN染色での正常細胞数の増加に関連した。デクスメデトミジンのPCでは、セボフルラン暴露による認知機能低下を改善、成長後の正常細胞数の割合を増加させることが示唆された。新生児のセボフルラン暴露による神経毒性は、PCにより減弱させることが示唆された。酸素濃度を変更して、プレコンディショニングの影響を検討する必要があるが、生存率が少ない状況を改善する試みが必要である。今後は、酸素濃度を変更してプレコンディショニングの影響を検討し、この状況でよい結果を示す容量を判明していく。また、暴露後長期的な変化を検討するため、学習機能と組織学的変化を検討していく。プレコンディショニングの種類によるプレコンディショニングの影響を検討する必要がある。今後は、数種類のプレコンディショニングの影響を検討し、併せて、容量やタイミングの検討を検討していく。また、暴露後のさらに長期的な変化を検討するため、学習機能と組織学的変化を検討していく。麻酔科学、神経科学実験の遂行上で予想外の死亡率のために追加実験が必要になり、物品費の補充のため前倒し請求を行った。その結果、請求した額より少ない金額の補充で済んだため差額が生じた。実験施設利用不可の時期が生じたため、実験中断が生じ、実験費用が減少したため。差額を次年度に繰越、物品費に充填する予定である。次年度に昨年分の実験が追加されるため、実験費用を上乗せして当初の計画通りに使用する。
中学校社会科授業における,新聞を活用した戦後史の教材開発

本研究においては,新聞を活用することで,中学生が戦後の日本の社会やそこに暮らす人々の価値観の大きな変化に気づけることをねらった。そのため,時代ごとの空気や人々の価値観が読み取れる新聞資料を探すことが必要であったが,科学研究費により資料収集や整理にスタッフを得て1500点以上の記事を収集し,授業に最適な記事を選択することができた。当初平和都市建設法を教材にすることを考えていたが,中学生の既成概念をくつがえして価値観の変遷に気づけるより適切な教材として原爆ドームを選択し,10本の新聞記事を再構成して授業指導案を作成した。授業実践では,まず生徒の問題意識を高めるために原爆ドーム周辺の現在の様子を示したが,科学研究費によって購入した,大画面テレビと高精細なデジタルカメラの画像によって関心を高めると同時に具体的なイメージをもたせることができ,生徒は,その後の新聞を読む活動にも熱心に取り組むことができた。その結果,新聞記事から生徒は「復興」から「伝えること」へと,広島市民の重視しているものが変化していることを読み取り,整理することができた。様々な社会の問題について討論する社会科の学習では,自分の意見の根拠となる事実(根拠)とその事実が意見に結びつくための価値観(論拠)を整理することが求められるが,本研究では,複数の年代にわたる新聞を使用として活用し時間の経過に伴う価値観の変化をとらえさせることで,意見の背景にある個人の価値観の存在や,同じ個人内でも価値観が変化することに気づかせることができ,自分自身の価値観を相対化してとらえ,多様な価値観を認め合いながら問題解決をめざす態度の育成をめざす教材開発を行うことができたと考える。
卵巣明細胞腺癌の新規癌抑制遺伝子ＡＲＩＤ１Ａの変異と抗癌剤耐性機構との関連

卵巣明細胞腺癌における新規癌抑制遺伝子ARID1Aの、遺伝子増幅の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後、抗癌剤感受性について検討した。ARID1Aの遺伝子変異は高頻度(57%)に認められ、ARID1A発現消失は臨床進行期III、IV期、腫瘍マーカーCA125値の高値と有意に正の相関を認めた。ARID1A発現消失は無増悪生存率の低下と有意に相関したが、全生存率との有意な相関はみられなかった。またARID1Aの発現消失は有意に化学療法抵抗性と相関した(P=0.04)。以上のことからARID1Aの発現消失は卵巣癌明細胞腺癌の早期再発、抗癌剤耐性に関連し、有力なバイオマーカーとなり得ると考えられた。本邦での卵巣癌における明細胞腺癌の発生頻度は24.8%であり、30年間で約5倍に増加している。卵巣明細胞腺癌は白金製剤を主体とする現在の化学療法に抵抗性で、極めて予後不良であるが、その分子生物学的特徴はほとんど解明されていない。今後、治療成績向上のためには、卵巣明細胞腺癌の分子生物学的特徴を解明し、その特徴にターゲットを絞った創薬が必要と考えられる。卵巣明細胞腺癌における新規癌抑制遺伝子ARID1Aに焦点を絞り、遺伝子増幅の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後、抗癌剤感受性について検討してきた。1. ARID1A遺伝子導入における抗癌剤感受性の検討:ARID1Aが遺伝子変異している卵巣明細胞腺癌株にWild typeのARID1Aを遺伝子導入し安定遺伝子導入細胞を樹立し、その後、コントロールベクター導入細胞と比較し、抗がん剤に対する感受性が上昇するか検討した。2. ARID1A遺伝子ノックアウトにおける抗癌剤感受性の検討:逆にARID1AがWild typeの卵巣明細胞腺癌株においてAdeno-associated virus vector(AAV)を用いてホモロガスリコンビネーションを生じさせ、ARID1Aの遺伝子ノックアウト細胞を樹立する。コントロールのAAV導入細胞と比較し、抗癌剤感受性(抗癌剤耐性誘導)が変化するか検討した。3. ARID1Aの制御する遺伝子群、パスウェイの解析:上述したARID1Aが遺伝子変異している卵巣明細胞腺癌株におけるWild typeのARID1Aの遺伝子導入細胞あるいは、Wild typeの卵巣明細胞腺癌細胞株におけるARID1Aの遺伝子ノックアウト細胞を用いてARID1Aの制御する下流遺伝子群を、マイクロアレイ法を用いて網羅的に検討する。マイクロアレイの結果を用いてパスウェイ解析を行い、標的遺伝子が制御するシグナル経路の同定を試みた。当初,卵巣明細胞腺癌における新規癌抑制遺伝子ARID1Aの,遺伝子変異の詳細,臨床病理学的因子との関連,予後,抗癌剤感受性について検討を進めたが,その後の機能解析はクローニングの段階で非常に時間を要し困難であった。そこでARID1Aと並び卵巣明細胞腺癌で遺伝子変異がみられるPIK3CA(phosphoinositide-3-kinase)に着目し研究を進めた。PI3K/AKT系路はチロシンキナーゼ受容体を介した主要なシグナル伝達系の1つで,増殖,生存,浸潤といった細胞機能を調節する。癌においてこの系路はPIK3CA,AKT,PTENなどの癌遺伝子の変異で活性化する。PIK3CA変異は他癌種でも頻繁にみられ,この変異が卵巣明細胞腺癌の予後不良に関与するか調べるため臨床病理学的因子との相関について検討し,その後細胞株を用い機能解析を行った。卵巣明細胞腺癌でPIK3CA変異は28.6%(16/56)にみられたが,卵巣漿液性腺癌では15例中1例もみられなかった。PIK3CA変異と臨床病理学的因子の検討では,54歳以下で有意に変異を認めたが,それ以外の因子(進行期、残存腫瘍の有無,子宮内膜症の有無など)で有意差は認めなかった。またPIK3CA変異群では,全生存期間が有意に延長した(p=0.0342)。次に細胞株を用いた検討では,明細胞腺癌細胞株9株中3株,漿液性腺癌細胞株4株中1株にPIK3CA変異を認め,PI3Kの下流標的であるp-AKTとp-mTORの発現がみられた。PIK3CA変異とPI3K/AKT/mTOR系路の阻害剤の感受性に相関はなく、この系路は他のシグナルによっても活性化される可能性が示された。以上の事からPIK3CA変異は,卵巣明細胞腺癌において予後良好の指標となるが,PI3K/AKT/mTOR阻害剤の有効性を判断するバイオマーカーにはなり得ない事が示唆された。

本邦での卵巣癌における明細胞腺癌の発生頻度は24.8%であり、30年間で約5倍に増加している。卵巣明細胞腺癌は白金製剤を主体とする現在の化学療法に抵抗性で、極めて予後不良である。しかしその分子生物学的特徴はほとんど解明されておらず、今後、治療成績を向上させるためには、卵巣明細胞腺癌の分子生物学的特徴を解明し、その特徴にターゲットを絞った創薬が必要と考えられる。卵巣明細胞腺癌における新規癌抑制遺伝子ARID1Aに焦点を絞り、遺伝子増幅の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後、抗癌剤感受性について検討中である。(1)ARID1Aの遺伝子変異とタンパク発現の検討:ARID1Aの遺伝子変異は卵巣明細胞腺癌において高頻度(57%)に認められる。今回の検討でARID1Aのタンパク質発現の消失は15%(9/60)に認められた。漿液性腺癌では100%(17/17)で発現陽性であり、明細胞腺癌において有意に発現消失率は高かった(P<0.01)。(2)ARID1Aの発現と臨床病理学的因子との関連:ARID1Aの発現消失は臨床進行期III期IV期卵巣癌症例、高CA125値と有意に正の相関を認めた。(3)ARID1Aの発現と予後:ARID1Aの発現消失は無増悪生存率の低下と有意に相関していたが、全生存率との有意な相関はみられなかった。多変量解析の結果、無増悪生存率に関してはARID1Aの発現消失は独立予後因子であった。(4)ARID1Aの発現と抗癌剤感受性:60例中14例に術後の評価可能病変が存在し、ARID1Aの発現消失率はResponderで0%(0/6)、Non Responderは50%(4/8)で有意に化学療法抵抗性と相関した(P=0.04)。昨年度は遺伝子クローニングに時間を要し、現在も引き続きクローニングの条件を検討中である。その間、昨年度は子宮頸癌、子宮体癌といった他癌腫に対するARID1Aの位置づけについて検討した。子宮頚部腺癌/子宮頚部腺扁平上皮癌でARID1Aの消失は31.1 % (14/45)に認められ、子宮頚部扁平上皮癌の6.5 % (3/46)と比較し有意に高かった(p=0.0017)。また子宮頚部腺癌/子宮頚部腺扁平上皮癌におけるARID1Aの消失はFIGO進行期、脈管侵襲、リンパ節転移、年齢、Ki67陽性などの臨床病理学的因子と相関せず、全生存期間、無増悪生存期間とも相関しなかった。また子宮体癌についてもARID1Aの消失がよくみられることが報告されている。われわれの検討では、子宮体癌の24 % (27/111)にARID1Aの消失を認めたが、FIGO進行期、グレード、筋層浸潤、リンパ節転移、脈管侵襲、BMI、閉経の有無、年齢、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター陽性などの臨床病理学的因子との相関は認めなかった。またPTEN、p53、Her2,MLH1の発現との相関は認めなかった。全生存期間、無増悪生存期間とも相関しなかった。卵巣明細胞腺癌症例におけるARID1Aの遺伝子変異の頻度、臨床病理学的因子との関連、予後、抗癌剤感受性について検討したところ、ARID1Aの発現消失は無増悪生存率の低下と有意に相関し、多変量解析の結果、無増悪生存率に関しては独立予後因子であった。
地域一体型ＮＳＴおよび在宅に向けた栄養管理システムの構築に関する研究

本研究の目的は輸液療法,経腸栄養療法,食事療法を施行する患者の投与栄養量,糖質量,アミノ酸量,脂肪量,ビタミン量などの栄養に関する情報を携帯端末にて瞬時に応用できるシステムの構築であり,本年度に行った研究によりほぼ実現可能となった。つまり, 1:適切な栄養評価(主観的包括的アセスメント(SGA)に加えて,高齢者の栄養評価に適した簡易栄養評価法(MNA)の何れにも対応), 2: 1の結果に基づいた三大栄養素(糖質,アミノ酸・蛋白質,脂肪)や必要栄養量の算出, 3:輸液療法から食事療法に至る過程での栄養量の一括算出, 4静脈栄養および経腸栄養の処方設計を支援する機能, 5水分量のイン/アウトの算出, 6脂肪乳剤の投与時間の算出, 7糖質の投与時間の算出等の機能が携帯端末上で瞬時に実現可能となった。そして,実際に急性期の日々病状が変わる患者について主治医とベットサイドで栄養に関する検討が可能となり,適切な栄養療法に寄与できると考える。さらに,薬学生の実務実習教育においても本栄養システムを利用した栄養管理の実際を体験させることが可能となった。つまり,チーム医療の中で薬剤師が行わなければならない薬剤(輸液製剤,経腸栄養剤)の適正使用(用法・用量,投薬日数)に貢献できる能力の育成に利用できると考える。本研究で構築したシステムは日本病院薬剤師会学術第5小委員会で配布する方向となっている。そして,この研究で構築した栄養管理に特化したシステムを多くの中小の医療施設で導入することにより急性期病院から地域の療養型病院やディサービス・介護福祉施設において栄養管理に関する情報の共有が容易に図られ,時間や導入費用の節約が期待できると考える。
Direct reprogrammingを用いた短腸症候群の新規治療法の開発

これまでに、下記脂肪運命が追跡可能なマウスを確立した。Adipoq-CreERT2/tdTomatoマウスは、脂肪細胞特異的遺伝子であるAdipoq遺伝子の下流にCre/ERT2を発現し、タモキシフェン投与時に脂肪細胞特異的にCreリコンビナーゼが核内へ移行する。また、内在性のROSA26プロモーター上にLox/Lox-tdTomatoを発現しており、Creリコンビナーゼによる配列組換えにより赤色蛍光色素tdTomatoが恒常的に発現する。そのため、Adipoq-CreERT2/tdTomatoマウスは、タモキシフェン投与時に脂肪細胞特異的に赤色蛍光色素tdTomatoを発現する。この赤色蛍光色素tdTomatoの発現は、タモキシフェン投与以降のAdipoq遺伝子の発現の有無に関わらないため脂肪細胞の運命追跡が可能となる。この脂肪運命が追跡可能なマウスを用いて腸管炎症モデルマウスを作製し、腸管障害に対し周囲脂肪組織(腸間膜脂肪組織)の脂肪細胞が、障害腸管粘膜の再生へ寄与するかを否かを確認する目的に、以下の実験を行った。脂肪運命の追跡が可能なマウスに対し5%デキストラン硫酸ナトリウムを1週間、自由飲水にて投与し、腸管障害部位に対する脂肪細胞の関与を組織学的に検討したところ、上記条件では腸管再生に対する脂肪細胞の関与は見られなかった。5%デキストラン硫酸ナトリウム飲水の投与期間や、組織学的評価を行う時期を検討することで、腸管障害部位に対する周囲脂肪細胞の関与が強く表れる時期を検討したが、いずれも腸管再生に対する脂肪細胞の関与は確認できなかった。腸管障害時、周囲脂肪組織(腸間膜)から再生への寄与を検討するために、当科にて飼育しているAdipoq/CreマウスとROSA26-tdTomatoマウスの繁殖とともに、交配して生まれたAdipoq-Cre / tdTomatoマウスの樹立を行った。次に、4-6週齢のオスAdipoq-Cre / tdTomatoマウスに対して、既報に従い5日間Tamoxifenの腹腔内投与を1mg/bodyで行い、Tamoxifen投与から一週間後に、皮下脂肪と内臓脂肪並びに脂肪組織が存在しない肝臓、脾臓などの実質臓器を摘出した。脂肪組織は、コラゲナーゼ処理を行い、フィルトレーション後、低速遠心にて成熟脂肪細胞を単離した。成熟脂肪細胞に対して、脂肪組織マーカーであるperilipinとHoechst33258にて核染色を行い、成熟脂肪細胞中のtdTomato陽性率(赤色)を検討したところ、97-99%が陽性であった。また、実質臓器に対しては、Frozen切片を作製し、脂肪組織のない組織では赤色に染まる細胞がないことを確認した。以上より、脂肪細胞の運命を追跡できるモデルマウスの確立とした。また、腸管組織に遺伝子をデリバリーするmaterialとして、当研究室において使用している脱分化脂肪細胞(DFAT: dedifferentiated fat cell)を用いる予定であったが、近年、細胞内に存在するexosomeが、細胞間伝達に重要な役割を果たし、かつ、腹腔内投与により、腸管組織への取り込みがみられることが報告された。そこで、本実験に用いる遺伝子デリバリーを、DFATのexosomeにて行うことを考えた。DFATからのexosomeは、電子顕微鏡にて100-200nmの小胞体として確認することができ、exosomeのマーカーである、CD69をウエスタンブロッティングにて確認したAdipoq/CreマウスとROSA26-tdTomatoマウスの系統維持に時間がかかり、かつ交配の結果得られてくるAdipoq-Cre / tdTomatoマウスの中でもCre陽性マウスの数が少なく、腸管炎症時の上皮再生に脂肪組織が関与していることを証明するための検討まで行えなかった。また、遺伝子のデリバリーに細胞(DFAT)を用いる予定であったが、レンチウイルスシステムを用いても、DFATに対する遺伝子導入が困難であった。そこで、遺伝子デリバリーにDFATから分泌されるexosomeに変更したことにより、exosomeに対する検討が必要になったため。前年度においてAdipoq-CreマウスとROSA26-tdTomatoマウスの繁殖とともに、交配して生まれたAdipoq-Cre / tdTomatoマウスを樹立することで、脂肪運命が追跡可能なマウスを確立した。本年度は、この脂肪運命が追跡可能なマウスを用いて腸管炎症モデルマウスを作製し、腸管障害に対し周囲脂肪組織(腸間膜脂肪組織)の脂肪細胞が、再生への寄与の有無を確認した。腸管障害を惹起する方法としては、化学物質による炎症を誘発する方法である、デキストラン硫酸ナトリウム(以下DSS)の経口投与法、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(以下TNBS)の注腸投与法のほか、SCIDマウスに対してC3Hマウスの脾臓から抽出したeffecter Tcellを腹腔内投与することによる免疫学的炎症惹起法、IL10欠損マウスを作製する遺伝子改変法などが存在するが、本実験では、化学物質による炎症を惹起するDSS飲水法を用いた。脂肪運命の追跡が可能なマウスに対し5%DSSを1週間、自由飲水にて投与し、腸管障害部位に対する脂肪細胞の関与を組織学的に検討したところ、上記条件では腸管再生に対する脂肪細胞の関与は見られなかった。今後はDSS飲水の投与期間や、組織学的評価を行う時期を検討することで、腸管障害部位に対する周囲脂肪細胞の関与が強く表れる時期を図る。また、TNBS注腸法も並行して行い同様に評価する。

5%DSSを1週間、経口投与では、腸管障害部位の腸管再生に対する脂肪細胞の関与は期待通りに見られなかった。現在投与期間、観察の時期を検討している。我々はすでにAdipoq-CreマウスとROSA26-tdTomatoマウスの繁殖とともに、交配して生まれたAdipoq-Cre / tdTomatoマウスを樹立することで、脂肪運命が追跡可能なマウスを確立ているが、それぞれのマウスの繁殖及び交配には一定の時間がかかるため、上記の条件検討に時間を要している状況である。これまでに、下記脂肪運命が追跡可能なマウスを確立した。Adipoq-CreERT2/tdTomatoマウスは、脂肪細胞特異的遺伝子であるAdipoq遺伝子の下流にCre/ERT2を発現し、タモキシフェン投与時に脂肪細胞特異的にCreリコンビナーゼが核内へ移行する。また、内在性のROSA26プロモーター上にLox/Lox-tdTomatoを発現しており、Creリコンビナーゼによる配列組換えにより赤色蛍光色素tdTomatoが恒常的に発現する。そのため、Adipoq-CreERT2/tdTomatoマウスは、タモキシフェン投与時に脂肪細胞特異的に赤色蛍光色素tdTomatoを発現する。この赤色蛍光色素tdTomatoの発現は、タモキシフェン投与以降のAdipoq遺伝子の発現の有無に関わらないため脂肪細胞の運命追跡が可能となる。この脂肪運命が追跡可能なマウスを用いて腸管炎症モデルマウスを作製し、腸管障害に対し周囲脂肪組織(腸間膜脂肪組織)の脂肪細胞が、障害腸管粘膜の再生へ寄与するかを否かを確認する目的に、以下の実験を行った。脂肪運命の追跡が可能なマウスに対し5%デキストラン硫酸ナトリウムを1週間、自由飲水にて投与し、腸管障害部位に対する脂肪細胞の関与を組織学的に検討したところ、上記条件では腸管再生に対する脂肪細胞の関与は見られなかった。5%デキストラン硫酸ナトリウム飲水の投与期間や、組織学的評価を行う時期を検討することで、腸管障害部位に対する周囲脂肪細胞の関与が強く表れる時期を検討したが、いずれも腸管再生に対する脂肪細胞の関与は確認できなかった。脂肪細胞の運命追跡が可能なadipoq-cre/tdTomatoマウスに対して、腸管炎症を誘導し、腸管上皮の再生に脂肪細胞が関与していることを証明する。腸管炎症には、TNBSやDSSによる薬剤誘導性の腸管炎症と、他系統マウスの脾臓からTリンパ球を単離し、腹腔内にリンパ球を投与することで免疫学的に腸管炎症を起こす方法が存在するが、本実験では、腸管再生に関わる脂肪細胞の関与を検討するために、薬剤性に腸管炎症を誘導する。また、脱分化脂肪細胞から分泌されるexosomeの解析を行い腸管再生に関するmiRNAやサイトカインの発現解析をマイクロアレイやReal time PCRを用いて行う。今後はDSS飲水の投与期間や、組織学的評価を行う時期を検討することで、腸管障害部位に対する周囲脂肪細胞の関与が強く表れる時期を図る。また、TNBS注腸法も並行して行い同様に評価する。周囲脂肪組織から腸管障害組織への関与が証明されたら、その後は腸管周囲脂肪組織(腸間膜脂肪)への遺伝子導入を検討する。