hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
在日中国人女性留学生の性の健康維持・増進をもたらす看護支援に関する研究

その影響を受け、本研究課題の第一段階である平成24年度実施予定の在日中国人女性留学生を対象とした無記名自記式質問紙調査およびインタビュー調査の実施が平成25年度にずれ込んだことによる影響が続いた。つまり研究開始のずれ込みによる遅れが、その後の研究遂行に影響をおよぼした。本研究の目的は、在日中国人女性留学生の性の健康維持・増進をもたらす看護支援方法を開発することであった。平成25年度は、在日中国人女性留学生のセクシュアル/リプロダクティブヘルスニーズを把握することを目的に無記名自記式質問紙調査およびインタビュー調査を実施した。平成26年度は、調査結果を整理・分析し、その成果を学会に発表した。また、これまでに実施した調査の分析結果・収集した情報の分析結果・研究者らの先行研究成果と文献検討の結果等に基づいて、在日中国人女性留学生のための映像教材(中国語、カラー映像11分(DVD))とリーフレット教材(中国語と日本語の2種類、A4両面カラー印刷)を製作した。平成27年度は、製作した教材を活用した在日中国人女性留学生のための婦人科受診行動支援プログラムを作成し、その有用性を検証するために介入研究を実施した。データ収集はフォーカスグループインタビュー法を用いた。その結果、プログラムの「良かった点」「改善点」さらに「リプロダクティブヘルスへのニーズ」が明らかになった。また、製作した教材は、在日中国人女性留学生が在籍する大学等の関連機関、約150カ所に寄贈し紹介した。平成28年度は、介入研究の結果を第36回日本看護科学学会学術集学会にて発表した。本研究で開発した在日中国人女性留学生の性の健康維持・増進をもたらす看護支援方法は有用性がある。また、作製した映像教材やリーフレット教材は、それぞれ単独でも使用可能であり、多く教育機関等で活用していただけるよう今後も広報していきたい。本研究は在日中国人女性留学生の性の健康維持・増進をもたらす看護支援方法を開発することであった。在日中国人女性留学生の性の健康についての実態調査、および文献検討等を行い、看護支援方法を検討した。結果、具体的な目標を設定した「在日中国人女性留学生のための婦人科受診行動支援プログラム」を作成した。目標は1)女性の身体の特徴について正しく知る、2)診療科「婦人科」の特徴を知る、3)婦人科に受診した方がよい症状等について理解する、4)婦人科受診方法について理解する、であった。プログラムで使用する教材も制作した。在日中国人女性留学生を対象にプログラムを検証した結果、目標を達成できる有効性が確認できた。平成24年7月に激化した尖閣諸島問題によって日本と中国の関係性が悪化した。その影響を受け、本研究課題の第一段階である平成24年度実施予定の在日中国人女性留学生を対象とした無記名自記式質問紙調査およびインタビュー調査の実施が平成25年度にずれ込んだことによる影響が続いており、やや遅れている。研究開始年(平成24年度)実施予定の調査研究が、平成25年度にずれ込み、その後の研究遂行に影響をおよぼした。
海洋低次生態系・海底堆積物結合モデルによる伊勢湾の中長期的水質底質特性の研究

伊勢湾の貧酸素水隗は観測が開始された1980年代後半より長期的に発生を続け、水質総量規制が進んだ現在でも終息の気配が見えない。この現象を解明するために、大規模なコンピュータモデルを構築し、高度経済成長期以前の1950年から約90年間の長期間シミュレーションを実施した。コンピュータモデルは伊勢湾の貧酸素水隗の発生と長期化現象を良好に再現し、海底に蓄積した有機物と現在の陸域負荷(特に窒素)の高止まりの両方が長期化に関係することを定量的に明らかにした。本研究成果は、今後の水質総量規制の目標値の設定に役立てることが可能である。平成24年度は低次生態系モデルと海底堆積物モデルを結合した伊勢湾生態系モデルの開発を行い、計算を開始した。計算結果の評価はまだ不十分であるが、水質の季節変化や水質と底質の水平分布などは観測値をうまく再現しているようである。また、3次元流動モデルを用いて1986年から2011年までの水温・塩分・流動場の再現計算を行った。三重県水産研究所が1986年から伊勢湾の定線観測を実施しており、その観測値との比較を行ったが一致度は良好であった。特に興味があるのは、年により貧酸素化の程度が異なる点で、海水交換率にその原因があるとみて研究を進めたが、まだ結果を十分に明らかにできていない。また国土交通省が2010年4月に湾周辺4か所に自動観測局を設置した。そこで2010年と2011年の流動場を計算し、詳しい比較を行ったが、一致度は非常に高く、流動モデルの再現精度を確認できた。湾の流動パターン(表層の循環流や外海水の侵入深度)について過去研究と比較したが、これも良く一致した。貧酸素化現象に関連して、暖候期の湾央底層に低水温プールが発生し、その周りに反時計回りの循環流が生じ、その結果、高密度ドームが形成されるという結果を得た。この高密度ドームは5月頃から10月頃まで存在し、貧酸素水隗の発生時期と重なる。パッシブスカラーを用いた計算で海水交換特性を調べたが、この高密度ドームでは古い海水が取り残され、その影響で暖候期の湾の中底層の海水交換率が低下することを明らかにできた。これらの結果は論文として公表予定である。また、流動モデルの基礎式や離散化法などの詳しい点について公表してこなかったので、論文としてまとめた。本研究の目的は、総量規制や下水道の普及などにも関わらず伊勢湾の水質に下げ止まりが見られ、特に貧酸素水隗の発生が止まらない状況を最新の数理モデルで解析し、原因追及することにある。平成25年度は次の研究を実施した。(1)昨年度までに開発済みの3次元流動モデルの基礎式と数値スキームを解説する論文を発表した。(2)このモデルで2010年から2012年までの再現計算を実施し、国交省の自動観測局3局(湾口、湾央、湾奥)の観測データや過去の流動場調査結果との比較を行った。この中の2010年と2011年の結果を論文発表し、計算精度の評価、流動と水温・塩分場の特徴の抽出、月別海水交換率を明らかにするとともに、貧酸素水隗発生に関与する海水交換機構について考察した。(3)浮遊低次生態系・海底堆積物結合モデルを作成し、基礎式や数値スキームを解説する論文を発表した。本モデルを英虞湾に適用した解析結果を同時に掲載した。(4)20102012年の水質と底質の計算を実施し、国交省の自動観測局の観測データと比較したが、クロロフィル・溶存酸素の一致度は良好で、モデルの再現精度を確認できた(未発表)。(5)2010年の流動データを用いて、1950年から2009年までの60年間の水質と底質の長期計算を開始した。総量規制に基づく陸域負荷の年次変化を与え、1難分解性海底堆積物による遅延効果(海底からの栄養塩の回帰)、2外海負荷の影響等を検討している。(6)(5)の終了後、得られた知見を元に、将来予測を行う。今年度で研究終了の予定であったが、高速なワークステーションの導入が遅れたために1年間研究を延長した。研究の内容については、当初の研究計画に沿って進行中である。伊勢湾の水質・流動・底質観測データ(三重県浅海定線観測調査データ、国交省自動観測局データなど)、河川流量データ、気象データ、検潮データ、JCOPEの太平洋沿岸の水温・塩分・流動データを入手して整理した。また、有明海用の3次元流動モデルを伊勢湾用に修正して、2008年と2010年までの再現計算を実施した。モデルの再現精度はかなり高いことが判明したが、冬場の水温がやや高めに計算された。

この原因追究を行ったが、乱流パラメータと水面での日射量の低減率の設定に問題があることがわかり、再現精度が上がるようにパラメータの調整を行った。1年分の再現には約2日の計算時間が必要なため、パラメータの調整にかなり時間を費やした。伊勢湾の湾央には、湾を斜めに横断する帯状の底質の悪い部分があるが、水質観測データの分析により、この帯状部分と湾奥からの低塩分水隗の張り出しの縁辺部が良く一致することがわかった。クロロフィルの高濃度域はこの縁辺部に存在する場合があり、これは低塩分水隗とともに運ばれる栄養塩の分布に関係があると推定するのが妥当であろう。貧酸素水隗もこの帯状域付近から発生している場合が多いことがわかった。本研究では海底から海水中への栄養塩の回帰を詳しく調べる予定であるが、上記の観察結果は研究の遂行に重要な視点と考えられる。本研究の目的は、総量規制や下水道の普及などにも関わらず伊勢湾の水質に下げ止まりが見られ、特に貧酸素水隗の発生が止まらない状況を最新の数理モデルで解析し、原因追及することにある。平成26年度は次の研究を実施した。(1)水質と底質の長期計算のために、1986年から2012年までの流動場を求めた。流動場や水温・塩分にについて観測値と比較したが、再現精度は良好であった。(2)統計データを収集して、1950年から2010年までの陸域負荷量を原単位法で推定した。そして、開発した数理モデルにより1986年から2012年までの伊勢湾の水質と底質、及び貧酸素水隗の発生状況を求め、観測値と比較した。この期間に貧酸素水隗が継続的に発生していた状況はうまく再現されたが、年による貧酸素の強度の変動は十分に再現できなかった。これについては、利用可能な外海データが乏しく、月1回の観測値を時間補間して用いたことが、原因のひとつと考えられた。(3)2010年の流動場を用い、1950年から2039年までの伊勢湾の水質と底質、及び貧酸素水隗の発生状況を求めた。その際、1海底堆積物中の難分解性懸濁態有機物(RPOM)の分解速度、2堆積速度等をパラメータとして考慮した。パラメータの与え方で貧酸素水隗の発生状況は変わるものの全体的な傾向は不変で、過去の過剰な陸域負荷で海底に堆積したRPOMが、その後の貧酸素水隗の長期化現象に関与していることを定量的に明らかにした。また、今後の陸域負荷の削減パターンを検討し、それによる貧酸素水隗の発生状況の変化を示した。(4)大学紀要に(2)(3)の検討の一部を発表した。また、査読付きの学会誌への投稿の準備を進めた。沿岸海洋環境学本研究では流動モデルと生態系モデルの整備を行い、それを連結して長期間の再現計算を行い、貧酸素化の原因等を調べることを目的としている。モデルの整備は終了したが、平成24年度は流動モデルを用いた計算に相当の時間を費やし、また結果の論文化にも時間を費やした。そのために生態系モデルの計算がやや遅れた。長期間の再現計算を実施するには出来るだけ高速なワークステーションが必要であり、予定していたマシンの発売が遅れたため、研究もそれに合わせて調整し、研究期間を1年間延長することとした。その遅れた期間に、モデルに関する論文2本と計算結果に関する論文1本の執筆を進めることができたので、効果もあった。伊勢湾の流動の数値モデルを作成し、再現計算を行い、それらと観測結果の比較を行った。ほぼ予定通りであり、面白い研究結果も得られているが、それを論文として公表するところまでは出来なかった。それゆえ、おおむね順調ではあるが、論文の執筆も急がないと3か年の計画の最後の部分で厳しくなることも予想される。
アンタイセンス・アメロゲニン オリゴヌクレオチドを用いたエナメル質形成の抑制

1.研究目的マウス胎生期臼歯歯胚の器官培養を行い、amelogenin mRNAに対するantisense-oligonucleotideを使用してamelogeninの合成を指令とするmRNAの発現をブロックすることによって、amelogeninの合成分泌障害を引き起し、エナメル質のクリスタル形成とエナメル芽細胞の形態に与える影響を形態学的に検索することである。2.研究方法材料と方法(1)マウス胎生期18日の胎児から、実態顕微鏡下で第一臼歯歯胚を注意深く取り出し、一般器官培養したものとα-MEM培地にantisense5′AGGTGGTAGGGGCAT3′およびsense5′ATGCCCCTACCACCT3′の塩基配列を持つ合成oligonucleotidを10μM添加し、37°C、5%CO_2-50%O_2レベルで2,4,7日間培養を行った。(2)器官培養で得られた歯胚を1%glutaraldehyde溶液および4%paraformaldehyde溶液を用いて30分間固定しを行い、脱水後、Epon812およびパラフィンに包埋し、歯胚が頬舌的に従断されるように光顕試料を作製した。(3)in situ Hybridization(ISH)一般器官培養で得られた歯胚の切片をマウスamelogenin全翻訳領域を含むcDNA1, 600bpを用いて、antisenseおよびsense鎖RNA probeを作製した。3.研究結果〈一般器官培養〉器官培養を行った歯胚では、培養後2日から4日で象牙質、7日後では咬頭部にエナメル質が形成された。ISHでは、amelogenin mRNAの遺伝子発現は培養4日および7日後のエナメル芽細胞に見られた。〈antisenseおよびsense-oligonucleotideを使用しての培養〉培養液にantisenseを加えて培養を行い2日後のものでは象牙質形成が見られ、培養7日後では咬頭部に象牙質が数十ミクロン形成された。また培養7日後の歯胚では、咬頭のエナメル芽細胞は高円柱状の外形を示したが、遠心端細胞質にはTomesの突起が見られずその下層にはエナメル質形成は見られなかった。senseを加え培養を行ったものでは培養後7日後ではエナメル芽細胞および象牙芽細胞、歯髄細胞は一般培養を行った歯胚と同様の形態を示した。また極めて薄いエナメルの層が観察された。結論amelogenin mRNAに結合するantisense-oligonucleotideを加えて臼歯歯胚の器官培養を行ったが、7日間培養を行ったものでもエナメル芽細胞は、高円柱状の外形を示したがエナメル質は形成されなかった。この実験結果はantisense-oligonucleotideによってエナメル質形成不全が生じる事を証明するのである。今後、エナメル芽細胞に及ぼす形態学的な変化をさらに検討したい。
新規フォトクロミックＡＴＰアナログによるキネシンモーター機能の可逆的な光制御

本研究課題にて得られた主な成果は次の2点である。(1)光照射によって可逆的に大きく構造変化する分子・アゾベンゼンを組み込んだ新規なアデノシン3リン酸(ATP)の疑似物質、ATP-Azoを合成した。また、このATP-Azoの水溶液中での光応答性を確認した。(2)ATPをエネルギー源として駆動する生体分子モーター・キネシンに対して、ATP-Azo存在下、かつ、光照射時において、その運動特性について調べた。その結果、異なる波長の光照射を用いた、キネシンの運動の可逆的な光変調を実現した。最終年度である平成25年度においては、平成24年度の実施報告においてに主な課題として挙げた(1)ATPのリボース3'位に特異的にアゾベンゼン誘導体を導入する合成スキームの検討と、(2)平成24年度に論文報告したATP-AzotBuをキネシン以外のモータータンパク質活性の光制御に適用することに取り組んだ。(1)については、アゾベンゼン誘導体を導入する中間体の合成に成功したが、収率がかなり悪いという問題が生じている。また、合成試薬が高価であるため、本研究予算ではテーマの続行が現実的でないため、新しい研究テーマとして取り組む必要性があると考えている。また、別の合成ルートの検討も必要となる可能性もある。(2)については、東京工業大学資源研資源循環研究施設との共同研究によって、回転モーターであるF1ATPaseの回転運動の光制御に取り組んだ。申請者が合成したフォトクロミックATPアナログを提供し、回転活性(加水分解活性と一分子回転運動アッセイ)実験の結果、ATPに比べて活性はかなり低下するが、加水分解活性と回転運動を確かに観察できることを確認した。また、アゾベンゼン部位がシス体のとき回転活性が高く、トランス体のときに低くなることを明らかにし、F1ATPaseの回転を一分子レベルで光制御に成功した。研究期間全体としては、本研究の目的であったモータータンパク質・キネシンの運動活性の可逆的な光制御を実現することを達成でき、おおむね順調に研究を遂行できたものと考えている。研究当初の目的である、フォトクロミック分子・アゾベンゼン誘導体を組み込んだ新規なフォトクロミックATP(adenosine 5'-triphosphate)アナログ(ATP-Azos)を合成し、モータータンパク質・キネシンに対する運動特性への可逆的な光制御を試みた。新規なフォトクロミックATPアナログとして、ベンジル型のアゾベンゼンとそのパラ位にターシャルブチル基を導入したアゾベンゼン誘導体をリボースの2'位に結合させた、それぞれ、ATP-Azo, ATP-AzotBuの2種類の化合物を合成した。これらの化合物が水溶液中において、紫外光照射時にアゾベンゼン部位がシス体に異性化し、可視光照射時にトランス体に戻ることを分光器を用いて明らかにし、期待される光化学特性があることを確認してキネシンの運動特性の光制御を試みる実験を行った。具体的には、上述したATP-AzoとATP-AzotBu2種類をインビトロモーティリティーアッセイに供し、紫外光照射したところ、キネシン上を滑走する微小管の速度が上昇し、また、可視光照射によって、おおよそ元の速度に戻ることを、ATP-AzotBuにおいて見出した。また、興味深い現象として、このATP-AzotBuの高濃度(1mM)条件下では、紫外光照射時には微小管がキネシンと結合する、また、可視光照射時には解離するという現象も見出した。本成果は、幾つかの学会や研究集会、また、学術雑誌1報に報告した。研究当初の目的である、フォトクロミック分子・アゾベンゼン誘導体をATPのリボースにおける2'位と3'位に組み込んだ新規なフォトクロミックATP(adenosine 5'-triphosphate)アナログのうち、2'位に組み込んだものについては合成に成功した。アゾベンゼン部位にターシャルブチル基をもつATPアナログについては、その存在下でインビトロモーティリティーアッセイにおいてキネシンー微小管系の運動特性を光変調させることに成功した。まだ、光変調効果が小さいことや3'位にアゾベンゼン誘導体を組み込んだATPアナログの合成には成功していないものの、当初の目的の一部は成功しているので進行状況はおおむね順調だと言える。前年度に引き続き、ATP-Azosを用いてキネシンー微小管系の運動の光制御について研究を続行する。現在、ATP-Azoを用いたキネシンの運動の光制御効果は完全にスイッチオンーオフするようなクリアーなものではないので、それができるような条件をつめていく。具体的には、アデノシンのリボースにアゾベンゼンを導入するベンジルブロマイドの位置や置換基を変化させることを考えている。また、ATPのリボースの3'位に特異的にアゾベンゼン誘導体を導入する合成スキームを確立することと、キネシンー微小管系の運動特性をATPase活性の測定等、生化学実験も行うことを予定している。

時間的な余裕があれば、他のモータータンパク質への適用などについても検討する。平成24年度未使用額165,043円については、平成25年度に実施する研究計画において使用する試薬や少額備品の購入に費用に充てる予定である。
生物の性戦略に関する総合的研究

本研究は平成9、10年度の2年間にわたり実施され、下記の如き成果を上げた。HNI系統の野生型雄又は雌メダカをγ線照射し、非照射T5系統テスターメダカの雌又は雄と交配し、F1での突然変異率を調べた結果、雄の生殖細胞は雌に比べて約2倍高い総突然変異誘発率を示した。ニワトリの雌雄差の決定には生殖腺に対する黄体形成ホルモンの作用が重要であり、それはエストロゲンの分泌を促進するためであることを明らかにした。一般的アクチンの遺伝子を欠失したクラミドモナス変異株を用いて,配偶子における接合管の形成機構を検討し、その変異株では接合時に接合管は形成されないが、新規アクチン様蛋白質が多量に発現することが見いだされた。群体性ボルボックス目の多くの塩基配列情報に基づく系統解析を実施するためにatpBとpsaB遺伝子を増幅するPCR用のプライマーを開発し、これら両遺伝子とrbcL遺伝子の塩基配列情報を加えた系統解析を実施し、本生物群における有性生殖の初期進化過程を推測した。性にリンクした昆虫の形態形成を特に翅形成に着目して解析し、雌だけが本来翅を欠くガの翅欠損の原因がステロイドホルモンによることを明らかにした。雄の選好性による一夫一妻の性淘汰モデルを開発し、ヒトの皮膚色の進化の研究に応用した。HLA型に関する異類交配の可能性を日本人で検証したが、任意交配の帰無仮説は棄却されなかった。出芽酵母のインテイン・ホーミング遺伝子が持つ数々の新機能を発見し、「利己的に振る舞う遺伝子」として誕生した理由とこの遺伝子の真の狙いを解きあかした。花粉精形成過程におけるオルガネラ核の挙動、特に花粉第一分裂直後の雄原細胞内におけるオルガネラDNAの増減が、高等植物における細胞質遺伝の様式を決定する重要な要因であることを示す結果を得た。生物の性戦略に関する研究の一般的な動向と現状について、班員間で意見を交換し、各班員が従来の研究経緯を踏まえて、今年度の研究の概要を説明し、今後のおおよその研究方向の把握を行った。守班員は哺乳類とくにラットでの内分泌器官の分化について、平井班員は原始的霊長類であるメガネザルの性染色体の特徴、とくに原始的霊長類のY染色体には繰り返し配列がないこと、一方人類的には日本人のY染色体は他の人類に比べて長く、これは繰り返し配列が長いことによること、長田班員はイチョウの精子形成の特徴およびたばこ由来培養細胞の細胞周期に関して、山本班員は分裂酵母の減数分裂制御遺伝子群とくにstell、mei2、sme2、pat1についての研究現状、青木班員は配偶者選択に関する遺伝的支配に関する理論生物学的側面ならびに近親交配の法律による禁止の問題点について、神谷班員はクラミドモナスの受精管の蛋白質について、配偶子の状態では顕在化していないが鞭毛の接触により受精管が出てくること、藤原班員は昆虫における性的2型の遺伝子制御について調べるに当たり、昆虫では性的2型が顕著である一方、性ホルモンが存在しないと言う特徴があること、野崎班員はクラミドモナスの群体構成に伴う有性生殖移行について調べ、細胞数が増えると有性生殖を始め、接合管様のものが形成されること、大矢班員は酵母の利己的遺伝子について、酒井班員はオルガネラのゲノムについて、嶋班員はメダカの生殖細胞突然変異の特徴と雄生殖細胞と雌生殖細胞とで、放射線や化学変異原による生殖細胞突然変異誘発感受性に大きな差があることについて、研究した。(683字)今年度各班員により得られた実績は、下記の通りである。

生殖細胞突然変異に関しては、γ線照射した野生型雌メダカをテスター雄メダカと交配し得られたF1の突然変異率は、照射雄生殖細胞に比べて約半分であることがわかった。分裂酵母の減数分裂開始制御因子は、特異的なRNAと結合することによりその局在を細胞質から核へと変化させることを証明した。114種の植物について観察を行い、2つの精細胞間あるいは1つの雄原細胞内でオルガネラDNAが不均等に分布する植物を合計8種発見した。インテイン・ホーミングを引き起こす出芽酵母のエンドヌクレアーゼVDEで、ホストキラー効果というホーミング以外の機能を持つことを初めて示した。雄の選好性による一夫一妻の性淘汰モデルを開発した。ヒトの白い肌は、性淘汰の上で有利であるが、自然淘汰の上では不利であることを指摘し、実際に進化するか否かは、両者の力関係によることをこのモデルに基づいて理論的に示した。雄は正常だが、雌の翅だけが欠損するアカモンドクガの翅の発生過程を解析し、その原因がエクダイソンによっておこる細胞死であることを発見した。群体性ポルボックス目の30種以上を用いた分子系統解析をrbcL、atpB及びps,aB遺伝子、合計3120塩基対を用いて実施し、本生物群における有性生殖の初期進化過程を推測した。クラミドモナスのプラス接合型配偶子は接合に際してアクチンを含む突起(接合管)を形成する。今回,接合時には配偶子内のcAMP濃度上昇に伴って,アクチン遺伝子の転写量が増加することが見いだされた。エストロゲン合成阻害実験により、ニワトリ胚生殖腺における黄体形成ホルモン受容体の発現開始時期がエストロゲンの影響下にあることを明らかにした。
植物ウイルスに対する防御ネットワークに関わる宿主遺伝子の解析

本研究でRNAサイレンシングと連携したタバコのカルモジュリン様タンパクrgs-CaMによる未知のウイルス防御機構の存在を明らかにした。rgs-CaMは多様なウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパクに普遍的に結合し、結合したRSSをオートファジーによる分解に導くことで宿主のRNAサイレンシングによるウイルス防御能を高めていることが示唆された。植物は自然免疫を多層的に発達させ、互いに連携したネットワークとして病原微生物に対抗していることが明らかになりつつある。ウイルスに対してもこのような防御ネットワークが発達していることが想定されているが現在の知見ではうまく説明できない。本研究でタバコのカルモジュリン様タンパクrgs-CaMを介した未知の防御機構がRNAサイレンシングや他の防御機構と連携してウイルスに対する防御ネットワークを形成していることを明らかにする。タバコのカルモジュリン様タンパク質rgs-CaMがウイルスセンサーとして多くのウイルスがコードするRNAサイレンシング抑制タンパク質RSSと相互作用すること、そして宿主植物の抵抗性機構を活性化してウイルス病耐病性を高めることを検証してメカニズムを解明するのが本研究の目的である。当初、rgs-CaMはポティウイルスのRSS、HC-Proタンパク質に結合する宿主植物のRSSと報告された。そこで、そのRSS活性について検証したところ、アグロバクテリウムなどを用いた一過発現系で誘導されるサイレンシングを抑制しなかった。一方、HC-Proと直接に結合することは大腸菌で発現精製したタンパク質を生体分子間相互作用解析装置(BIACORE)で解析して確かめた。この時、キュウリモザイクウイルス(CMV)のRSS、2bタンパク質とも結合することを見出した。さらに、in vivoでもこの結合が見られるかFlag標識したrgs-CaMタンパク質を発現するジャガイモXウイルスベクター(flag-rgs-CaM-PVX)とCMVを重複感染させたタバコで調べてみた。その結果、Flagに対する抗体を用いた免疫沈降法により、rgs-CaMと2bタンパクは植物細胞中でも結合していることが示唆された。この時、rgs-CaMの過剰発現によりCMVの接種葉での蓄積、上葉への移行が抑制されることが分かった。さらに解析を進めるためにrgs-CaMの強発現および発現抑制した形質転換タバコを作製したところ、強発現個体の一部でえそ斑様の細胞死が観察された。このえそ斑はflag-rgs-CaM-PVXを接種した葉でも観察されたことから、rgs-CaMの過剰発現で細胞死を伴うウイルス抵抗性機構が活性化される可能性が考えられ、今後はこの点を中心に形質転換体などを用いた解析を行っていく予定である。タバコのrgs-CaMタンパクが植物ウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク(RSS)と相互作用してウイルスの侵入を感知し、防御機構を活性化する宿主のウイルスセンサー(PAMPs受容体)であるという仮説について、下記の点について検証した。(A)rgs-CaMはHC-Proおよびキュウリモザイクウイルス(CMV)の2b以外のRSSと結合するのか。(B)rgsCaMの高発現がどのように宿主植物のウイルス病抵抗性を高めたり、えそ斑様の細胞死を誘導するのか。その結果、(A)Tomato bushystuntvirusのRSS、P19とは結合しなかったがトマトアスパーミウイルスとヒト免疫不全ウイルスのRSS、2bおよびTatとの結合が生体分子間相互作用解析装置(BIACORE)で検出され、普遍的にRSSと結合する可能性が考えられた。またタバコBY2のプロトプラストを用いた免疫組織染法(Proximity Ligation Assay)で細胞内のrgs-CaMとCMV 2bの結合を検出することができた。(B)昨年、ウイルスベクターを用いてrgs-CaMを高発現したタバコはCMVの接種葉での増殖、全身への移行を抑制して抵抗性が高まっていることが示唆された。今年は作製したrgs-CaM過剰発現した形質転換タバコにCMVを接種してウイルスに対する抵抗性について検証したところ、やはりウイルスに対する抵抗性が高まっていた。これらrgs-CaM過剰発現タバコに、えそ斑様の細胞死の見られる株があり、マイクロアレーで網羅的に病原性関連PR遺伝子の発現を調べてみたところ、野生タバコと有意な差は見られず、このえそは過敏感反応(HR)様の反応による細胞死ではないことが分かった。そこで、来年度はrgs-CaMは直接、結合するRSSの活性を阻害してウイルス病抵抗性が高まっている可能性について検証を進める。rgs-CaMが結合したRSSタンパクのRNAサイレンシング抑制能に影響を及ぼしているのか検討した。一過的にrgs-CaMを過剰発現もしくはRNAサイレンシングにより発現抑制したNicotiana benthamianaプロトプラストで、ルシフェラーゼを指標にRSSのRNAサイレンシング活性を定量的に測定したところ、rgs-CaMを過剰発現した場合には影響が見られなかったが、内生のrgs-CaMの発現を抑制した場合に、RSSタンパク(HC-Proと2b)のRNAサイレンシング抑制活性が上昇した。従って、rgs-CaMは結合したRSSタンパクのRNAサイレンシング抑制能をある程度、抑制していることが明らかになった。

次にrgs-CaMの下流で働く宿主因子に関しては、植物の防御反応の指標となる病原関連(PR)タンパクの発現をノーザンブロット解析により調べたところ、rgs-CaMを過剰発現する形質転換タバコでPR1aやPR2などがウイルス感染やRSSの有無に関係なく発現誘導されていることが分かった。さらにマイクロアレイでの解析をやり直したところ、多くのPRタンパク、抗菌性タンパク、防御関連遺伝子などがrgs-CaM過剰発現タバコで誘導されていた。これらの結果からrgs-CaMは侵入したウイルスRSSに結合して、その活性を阻害してウイルスに対する基礎防御であるRNAサイレンシングの活性を高めると共にそれ以外の防御機構も活性化してウイルスに対抗している可能性が考えられた。さらにFlagタグを付したrgs-CaMをPVXウィルスベクターにより感染タバコで発現し、Flag抗体を用いて免疫沈降したところ、意外にもPVXベクターの外皮タンパクが共沈澱してきた。これは、rgs-CaMがウイルスのRSSタンパクばかりでなく外皮タンパクにも結合する可能性を示唆しており、今後、この部分にも注目して解析を進めていくつもりである。今年度は本研究で見出したタバコのカルモジュリン様タンパク(rgs-CaM)を介した防御ネットワークを裏付ける分子メカニズムについて解析・検証を進めた。まず、(1)タンパク分解系ユビキチン-26Sプロテアソームとオートファジーの阻害剤を用いた解析を行い、rgs-CaMとRSSタンパクは結合するとすぐにオートファジーにより分解されていることが示唆された。さらに、(2)タバコからプロトプラストを調整して、rgs-CaMを過剰発現すると活性酸素の産生や細胞死が観察された。これらは、サリチル酸シグナルなどの防御反応を誘導することが知られており、rgs-CaMがそれらを介してRNAサイレンシング以外の防御機構を活性化することが示唆された。(3)また、rgs-CaMがRSSだけでなくウイルスの外皮タンパク(CP)とも結合する可能性について検証した。その結果、アグロインフィルトレーションにより一過発現したウイルスCPとrgs-CaMの結合が確認されたことから、rgs-CaMとウイルスCPは他のウイルスタンパクを介さずに結合できることが分かった。rgs-CaMとウイルスCPの結合がどのように宿主やウイルスに作用しているのか、今後の興味深い研究課題の一つである。(1)(2)の結果とこれまでの本研究課題の成果からウイルスに対する自然免疫機構について次に示す新たなモデルが考えられた。rgs-CaMはウイルスRSSの2本鎖RNA/siRNA結合領域に親和性を持つことで普遍的にRSSに結合し、ウイルスの侵入を感知して自身の発現を誘導する。
関節軟骨の維持・変性における酸素濃度変化の解析とその応答シグナルの探索

本研究は関節軟骨が低酸素環境に存在することに着目し、変性に伴う関節軟骨の酸素濃度変化と変形性関節症への関与を調べることを目的に行われた。加齢や外科的変形性関節症モデルでは変性の進行に伴い関節軟骨の酸素濃度は上昇し、その結果HIF-1αの発現が低下していることがわかった。またHIF-1αが低下することでMMP13やMMP9などの変性マーカーが上昇することをin vivoとin vitroで示し、HIF-1αがanti-catabolicな作用を有することを明らかにした。よって関節軟骨の酸素濃度が上昇し、HIF-1αが低下することで変性マーカーが上昇し、変形性関節症が進行することがわかった。関節軟骨の酸素濃度を調べるためプローブの選定と条件検討から開始した。低酸素プローブを数種類マウスに腹腔内投与し関節軟骨がIVISでうまく描出されるか試みたところ体表から撮影することは困難であった。血流が乏しいことが要因と考え、関節内注射を行うと投与後4時間以上で関節軟骨の低酸素域が蛍光発色することが分かった。IVISを用いたin vivo imagingを試したが、発色は確認できるものの解像度が悪く関節面の詳細な検討は困難であった。そこで関節内の凍結切片を作製し、関節軟骨の低酸素領域を検討した。矢状面で切片を作製すると荷重部に酸素濃度が低い部分が確認された。続いて酸素濃度を定量するためにスタンダードの作製を行った。関節軟骨を野生型マウスから採取しガラス底プレートに平面培養した。メディウムに低酸素プローブを添加し、4時間後よりカバーガラスをガラス底プレートに被せると低酸素環境が作製された。カバーガラスでおおわれた中心部は低酸素領域となり、蛍光発色が確認された。そこでさまざまな酸素濃度での発光強度を調べるため低酸素インキュベーターを用いて低酸素プローブ入りの培地で平面培養を行った。細胞数などの条件により差が生じることがわかったため、現在条件検討を重ねスタンダード作製をおこなっている。同時にex vivoでも同様の検討を行っており、膝関節の器官培養も同時に行っている。また軟骨細胞における低酸素の影響をみるために関節軟骨を低酸素環境下で培養し、mRNAを回収し軟骨マーカーをリアルタイムPCRで調べたところ、anabolicなCol2a1, Sox9などの遺伝子が増加していることがわかった。初年度に得た結果をもとにin vivoで関節軟骨の酸素濃度変化に注目し実験を行った。我々が発案した実験的マウス変形性関節症モデルを用いて、変形性関節症の進行に伴う酸素濃度変化を低酸素プローブを用いて調べた。すると変性の進行に伴い、酸素濃度が上昇することが分かった。そこで低酸素のマスター転写因子であるHIF-1αの発現を免疫組織染色で調べると発現の低下が見られた。そこで低酸素環境で起こる遺伝子発現の変化を見るためにマウスの関節軟骨細胞を低酸素環境で培養し、一部はIL1β刺激を加え、それぞれをマイクロアレーで比較した。すると低酸素環境ではMmp13やMmp9などのcatabolic factorとともにアポトーシス関連遺伝子が抑制されることがわかった。これらの結果に対するHIF-1αの関与を調べるため、siRNAを用いて実験を行った。するとHIF-1αが抑制されることでcatabolic factorの発現が著明に上昇し、HIF-1αがこれをを抑制していることが示唆された。さらにリアルタイムRT-PCRでHIF-2αの発現を見ると、HIF-1αを抑制することでHIF-2αは上昇し、catabolic factorsの誘導に重要な役割を担っていることが示された。またLMDを行い、関節軟骨の様々な部位での発現プロファイルを調査しようとしたが、結果にばらつきが大きく網羅的解析までは至らなかった。整形外科計画書の通りに実験を行い、一定の成果が得られている。低酸素領域の描出が再現性高く行えるように条件検討を重ねている。スタンダード作製も一部難渋しているが、酸素濃度による変化を捉えらることが可能となってきた。マウス変形性関節症モデルを用いた実験も行っているが、プローブを投与するタイミングを含め条件検討がまだ必要である。in vitroでは低酸素で変動するシグナルを同定するため低酸素誘導因子(HIF)を中心にみているが、Col2a1やSox9などのanabolic factorの変動がみられている。これらのサンプルをマイクロアレーに提出し、網羅的解析を行う予定である。in vivoではマウス変形性関節症モデルにおける関節軟骨の低酸素領域を同定し、変性に伴う関節軟骨の酸素濃度変化を引き続き検討する。変性に伴い酸素濃度変化が見られた場合、部位別にLaser micro dissectionで検体を採取し遺伝子発現解析を行う予定である。そのために、微小サンプルからの遺伝子増幅法を確立する必要がある。

また上記に示したマイクロアレーの結果と照合し、酸素濃度による遺伝子発現を網羅的に解析する。これらの結果より酸素濃度の変化に伴い変動する遺伝子を同定し、in vivo, in vitroで機能解析する予定である。特に低酸素誘導因子HIFを中心としたシグナルの下流にある遺伝子を探索することで軟骨における酸素濃度の影響を詳細に検討できる可能性がある。具体的には関節軟骨における発現を免疫組織学的に検討し、変形性関節症での発現変化をタンパクレベルでとらえること、またsiRNAなどを用いてノックダウンすることで変性マーカーの変動を検討し変形性関節症への関与、また治療ターゲットとなりうるかを検討する。in vivoの実験を中心に行っていたため、試薬の使用量が予想よりも少なかったことにより繰越金が生じた。また予定していたマイクロアレー解析用のサンプル採取が行えなかったため、来年度にこの予算を計上する。本年度はマイクロアレーの提出、またリアルタイムPCRを多用するため、サイバーグリーンなどの高額試薬を多量に使用する。
植物表層における病原糸状菌の分子パターン認識機構とシグナルネットワークの解明

本研究では、病原糸状菌の感染に対する植物の基本的抵抗性の実体解明を目的として、植物の病害応答性の強度に関連する炭疸病菌、およびいもち病菌の分子パターン変異株(ssd1株)を用い、病原菌の表層構造の変化と植物細胞表層における防御応答に関する認識とシグナル伝達に関する研究を進めた。とくに、イネ-いもち病菌系、シロイヌナズナ-炭疸病菌系における、ゲノム科学的アプローチにより分子パターン認識の下流で進行するシグナルネットワークに関する研究を進め、耐病性に重要な転写因子の同定とイネいもち病菌に対する耐病性を示すトランスジェニック植物を作出した。本研究は、病原糸状菌の感染に対する植物の基本的抵抗性の実体解明を目的として、植物の病害応答性が変化する炭疸病菌、およびいもち病菌の分子パターン変異株を用い、植物細胞表層における分子パターン認識の分子機序と防御応答に関する研究を飛躍的に進めることを目的とする。特に、イネ-いもち病菌系、シロイヌナズナ-炭疸病菌系の展開により、ゲノム科学的アプローチにより分子パターン認識の下流で進行するシグナルネットワークを解明し、耐病性植物作成の基盤的研究成果の獲得をめざす。<植物表層における分子パターンの認識機構>(1)細胞壁エリシターの構造解析可溶性細胞壁画分に野生型株とcossd1変異株のHPLC分析により、エリシター活性をもつ細胞壁成分純化作業を進めた。(2)いもち病菌のDNAアレイ解析によるMoSSD1遺伝子制御下の遺伝子の機能解析イネいもち病菌の野生株とmossd1変異株間の菌糸生育時に発現する遺伝子のDNAアレイ解析とプロテオーム解析条件の検討を進めた。<植物の基本的抵抗性のシグナルネットワーク解析>(1) mossd1変異株特異的に発現応答を示すイネ遺伝子の包括的解析mossd1変異株の接種のアレイ解析を行うと同時に、既に解析済みのいもち病菌に対する真性抵抗性のアレイデータと比較解析を行い、mossd1株によって誘導される抵抗性についてプロファイリング解析を行った。(2) chssd1変異株とシロイヌナズナ変異株を用いた防御応答経路の遺伝子解析シロイヌナズナ多糖質受容体変異株を含む受容体変異候補株に対してアブラナ科植物炭疸病菌のchssd1変異株を接種し、感染性の評価を行い、防御応答に関連すると推定される遺伝子の解析を進めた。本研究は、病原糸状菌の感染に対する植物の基本的抵抗性の実体解明を目的として、植物の病害応答性が変化する炭疽病菌、およびいもち病菌の分子パターン変異株を用い、植物細胞表層における分子パターン認識の分子機序と防御応答に関する研究を飛躍的に進めることを目的とする。〈植物表層における分子パターンの認識機構〉(1)細胞壁エリシターの構造解析可溶性細胞壁画分に野生型株とcossd1変異株のHPLC分析によりエリシター活性をもつ細胞壁成分純化作業を進めた。(2)炭疽病菌のプロテオミック解析によるCoSSD1遺伝子制御下の遺伝子の機能解析ウリ類炭疽病菌の野生株とcossd1変異株間の菌糸生育時に発現するタンパク質のプロテオーム解析を進め、特異的なタンパク質の同定に成功した。〈植物の基本的抵抗性のシグナルネットワーク解析〉(1)mossd1変異株特異的に発現応答を示すイネ遺伝子の包括的解析mossd1変異株の接種のアレイ解析を行うと同時に、既に解析済みのいもち病菌に対する真性抵抗性のアレイデータと比較解析を行い、mossd1株によって誘導される抵抗性についてプロファイリング解析を行った。(2)chssd1変異株とシロイヌナズナ変異株を用いた防御応答経路の遺伝子解析シロイヌナズナ多糖質受容体変異株を含む受容体変異候補株に対してアブラナ科植物炭疽病菌のchssd1変異株き接種し、感染性の評価を行い、防御応答に関連すると推定される遺伝子としてVOZ遺伝子を同定した。<植物表層における分子パターンの認識機構>

(1)細胞壁エリシターの構造解析炭疽病菌のプロテオミック解析によるCoSSD1遺伝子制御下の遺伝子の機能解析ウリ類炭疽病菌の野生株とcossd1変異株間の菌糸生育時に発現するタンパク質のプロテオーム、グリコプロテオーム解析を進め、特異的なタンパク質の存在の確認と解析を進めた。また、炭疽病菌の細胞表層糖質を認識する抗体によりcossd1変異株特異的タンパク質を確認した。<植物の基本的抵抗性のシグナルネットワーク解析>(1)chssd1変異株とシロイヌナズナ変異株を用いた防御応答経路の遺伝子解析シロイヌナズナ多糖質受容体変異株を含む受容体変異候補株に対してアブラナ科植物炭疸病菌のchssd1変異株を接種し、感染性の評価を行い、防御応答に関連すると推定される遺伝子としてVOZ遺伝子を同定した。(2)イネのVOZ遺伝子を同定し、過剰発現体、ノックダウン形質転換イネを作出し、これらがイネいもち病菌に対してそれぞれ抵抗性の増強と減退を示す結果を得、病害抵抗性イネの作出の基盤的成果を得た。
コラーゲン生化学的性状に起因する歯槽骨の表現型とその加齢変化パターンの同定

骨粗鬆症では骨量が減少し,骨質も低下する.骨粗鬆症では骨質を決定するコラーゲンが量的・質的に低下するが,下顎骨もその例外ではなかった.骨粗鬆症所見を呈さない下顎骨においてもミネラル量とともにコラーゲンの量的・質的個人差が認められたが,それらは骨量と年齢との間に有意な相関性を示さなかった.下顎骨の骨量にも個人差があるが,骨量は女性の皮質骨以外で加齢によって変化しない傾向であった.下顎骨のコラーゲン生化学的性状は骨量との関連が少なく,むしろ骨質と密接な関連があるものと推測された.歯槽骨の表現型(骨量や形態)とその加齢変化(特に,抜歯後あるいはインプラント治療後)は患者間で多様性が認められる.コラーゲンは骨基質の構築と機械的強度の付与に最も重要な基質蛋白であり,その翻訳後修飾の程度(例えば,コラーゲンリジン残基の水酸化の程度)はコラーゲン線維の形成とミネラルの沈着に大きく影響する.そこで,「歯槽骨(顎骨)の表現型とその加齢変化にはヒト固有のコラーゲンの(生化学的)性状が少なからず関与する」という仮説を立て,コラーゲンの性状と顎骨の表現型およびその加齢変化との関連を調べるために,以下の研究計画を設定した.(1)老化促進モデルマウス(老年性骨粗鬆症モデルマウス)とそのコントロールマウス(通常老化マウス)の下顎骨を用いて,典型的に老化した2種類のマウスの顎骨の表現型とコラーゲン性状との関連を調べる.(2)インプラント術前のCTによるレントゲン検査の結果から,ヒト下顎骨の表現型の多様性を具現化し,骨量と年齢,性差,歯の有無との関係を調べる.(3)ヒト献体の下顎骨を用いて,下顎骨の骨量,ミネラル量,コラーゲン量,コラーゲンリジン残基の水酸化の程度を調べ,下顎骨の表現型とミネラル,コラーゲン生化学的性状との関連およびそれらと年齢,性差,歯の有無との関連を調べる.以上を統括して,仮説の信憑性を検討し,コラーゲン生化学的性状による歯槽骨(顎骨)の表現型およびその加齢変化パターンの同定の可能性を探る.骨粗鬆症では骨量が減少し,骨質も低下する.骨粗鬆症では骨質を決定するコラーゲンが量的・質的に低下するが,下顎骨もその例外ではなかった.骨粗鬆症所見を呈さない下顎骨においてもミネラル量とともにコラーゲンの量的・質的個人差が認められたが,それらは骨量と年齢との間に有意な相関性を示さなかった.下顎骨の骨量にも個人差があるが,骨量は女性の皮質骨以外で加齢によって変化しない傾向であった.下顎骨のコラーゲン生化学的性状は骨量との関連が少なく,むしろ骨質と密接な関連があるものと推測された.下顎骨の皮質骨と海綿骨の骨量が減少している骨粗鬆症モデルマウスSAMP6とそのコントロールマウスSAMR1の下顎骨のコラーゲン性状に関与するコラーゲン分子間架橋を比較分析した.SAMP6ではSAMR1に比べ,未熟架橋数と総架橋数が少なく,架橋の成熟度が増大していた.これらの結果から,骨粗鬆症モデルマウスの皮質骨と海綿骨の骨量が減少する下顎骨では,架橋形成に必要なリジルオキシダーゼの遺伝子発現あるいは酵素活性が低く,骨代謝回転が遅く,骨がもろい可能性が示唆された.続いて,ヒトでの下顎骨の表現型(皮質骨量と海綿骨量の関係)の多様性を明らかにするために,2003年7月から2007年4月までに福岡歯科大学医科歯科総合病院でCTによるインプラント術前検査を受けた女性患者の中で,下顎第一大臼歯を有した全患者35名の下顎第一大臼歯部の顎骨の皮質骨と海綿骨の骨量をCT画像から計測した.皮質骨骨量は,50歳未満の患者群と50歳代の患者に比べ,60歳以上の患者群で有意に少なかったが,海綿骨骨量では3群間での相違が認められなかった.また,皮質骨と海綿骨の骨量は,3群あるいは全患者群で相関関係が認められず,患者の皮質骨と海綿骨の骨量関係には患者固有の個体差が存在する可能性が示唆された.この患者のデータから,顎骨の表現型を分析していく上で皮質骨と海綿骨を個別に分析する必要性が推察され,モデルマウスのデータからこれらの分析のためのコラーゲン生化学分析の有用性が示唆された.本年度は,下顎第一大臼歯部の顎骨のCTデータから皮質骨と海綿骨の骨量を定量的に分析することにより,下顎骨における皮質骨と海綿骨の骨量関係を明らかにしてヒト下顎骨の表現型の様相を探った.2007年5月から2009年1月までにインプラント術前CT検査を受け,福岡歯科大学倫理委員会の承認と同意を得た,少なくとも片顎に第一大臼歯を有する女性患者44名を被験者とした.下顎第一大臼歯の近心根部のCT横断画面像(SimPlant Pro 12.03)上で,歯根膜腔下縁3mmから下顎骨下縁までの顎骨領域から皮質骨骨量(皮質骨面積/顎骨総面積,%)と海綿骨骨量(hounsfield units,HU)を測定した.

反体側の同歯を欠損する患者36名の同歯欠損顎骨領域においても同様の測定を行った.皮質骨と海綿骨の骨量関係は,必ずしもLekholm&ZarbやMischの分類のような単純な比例関係にあるわけではなく,皮質骨が厚いにも関わらず海綿骨が少ない患者や逆に皮質骨が薄いにも関わらず海綿骨が多い患者が存在し,皮質骨と海綿骨の骨量の間には相関性が認められなかった.皮質骨と海綿骨の骨量関係には大きな個人差が認められたが,同一患者内での歯がある側とない側の両骨の骨量関係には高い相関性が認められ,下顎第一大臼歯部の顎骨領域の皮質骨と海綿骨の骨量関係は歯の有無に影響されない可能性が示唆された.皮質骨と海綿骨の骨量を指標とした下顎骨の表現型には多様性があり,それが歯の有無に影響されないことを考え合わせると,他の部位の骨のように下顎骨の表現型は遺伝子支配を強く受けている可能性が推察される.2007年4月2009年10月に福岡歯科大学医科歯科総合病院でインプラント術前CT検査を受け,偏側に下顎第一大臼歯を有する男性患者36名(平均年齢55.9歳)と女性患者55名(平均年齢55.8歳)を被験者とし,有歯下顎骨臼歯部基底骨のCT画像から皮質骨量と海綿骨量を定量し,両骨の関係,骨量と年齢の関係およびそれらの性差を調べた.男女ともに皮質骨と海綿骨の骨量に相関がなく,両骨の骨量関係の多様性が認められた.皮質骨量は男性が女性に比べ有意に多かった.男性では骨量と年齢の相関はなかったが,女性では年齢とともに皮質骨量が減少する負の相関が認められた.歯を有していても女性は男性と異なり,下顎骨基底骨の皮質骨がもともと薄く,加齢とともにさらに薄くなる傾向が推察された.次に,男性献体27体(平均年齢76.7歳)と女性献体21体(平均年齢83.9歳)の下顎骨オトガイ部の皮質骨を用いて,骨基質分析(ミネラル量,コラーゲン量,コラーゲンリジン残基の水酸化の程度)を行い,骨基質の性差の有無を調べた.ミネラル量(男性:平均62.9%,女性:62.8%),コラーゲン量(男性:平均163.7μg/mg,女性:平均156.8μg/mg),リジン残基の水酸化の程度(男性:平均11.9%,女性:平均11.9%)ともに男女間に有意な相違を認めなかった.上記の2つの実験結果を単純に比較できないが,下顎骨の骨量には多様性があり男女差が認められるものの,コラーゲンやミネラルの骨基質は骨量と単純に関連しない可能性が推察された.偏側にのみ下顎第一大臼歯を有する男性患者36名(平均年齢55.9歳)と女性患者55名(平均年齢55.8歳)のインプラント術前CT画像から,下顎第一大臼歯部(有歯側と無歯側)の基底骨の皮質骨量と海綿骨量を定量し,両骨量の年齢との関係の性差を調べた.男女ともに有歯側と無歯側の間に皮質骨量の有意な相違は認められなかったが,海綿骨量は有歯側に比べて無歯側で有意に高い値を示した.男性においては有歯側,無歯側ともに,年齢と皮質骨量との間に有意な相関は認められず,年齢と海綿骨量との間も同様であった.女性では有歯側,無歯側ともに,年齢と海綿骨量との間に有意な相関が認められなかったが,年齢と皮質骨量との間に有意な負の相関が有歯側,無歯側ともに認められた.以上より,男性とは異なり,女性では歯の有無に関わらず下顎大臼歯部の基底骨の皮質骨の厚みが加齢とともに減少する可能性が見出された.次に,加齢に伴う骨基質の変化の分析のために献体(男性27名(平均年齢76.7歳),女性21名(平均年齢83.9歳))を用いて下顎骨のミネラルとコラーゲンの分析を行った.ミネラル量,コラーゲン量,コラーゲン分子中のリジン残基の水酸化の程度に有意な性差は認められなかった.
免疫抑制剤の投与を必要としない究極の移植医療を確立するための基盤構築

移植医療は良い面ばかり注目されるが、あまり認識されていない深刻な課題こそが生涯に渡る免疫抑制剤の服用である。それにより副作用の発現や高額な医療費がもたらされ、特に近年悪性腫瘍の発生率増加が大きな社会問題と化している。この解決法として最も期待されているのが免疫隔離能を有する細胞デバイスの活用である。しかし患者が最も恩恵を受ける理想的移植部位である皮下への細胞封入デバイスの移植は、実用化とは程遠いのが現状である。本研究では、申請者等が独自に開発を進めてきた免疫隔離細胞デバイスと皮下における新生血管誘導手法を組み合わせ、糖尿病や肝不全治療を雛形として、夢の治療と考えられてきた“皮下における免疫抑制剤を必要としない移植医療"を実現するための基盤構築を目指す。本年度は、まず皮下における免疫隔離細胞デバイスの物性の至適化に取り組んだ。光センサータイプの高感度酸素分圧系を用いることにより、細胞デバイス留置部となる皮下の組織酸素分圧は10mmHg以下と極めて低値である事が明らかとなったため、後述する新生血管誘導法に加え、細胞デバイス内への持続的酸素供給を可能とする皮下埋め込み型の徐放性酸素ポートの構築に取り組み、プロトタイプを作製する事ができた。プロトタイプポートを用いることにより、細胞デバイス内の酸素分圧を48時間以上にわたって約200mmHgまで上昇させる事に成功した。この環境下での細胞デバイス内の移植細胞のバイオマーカーについて現在検証中である。さらに本年度は、リコンビナントペプチド(RCP)と脂肪組織由来間葉系幹細胞(ADSC)の組み合わせが皮下の細胞移植成績へ及ぼす影響に関しても検証を行い、移植細胞周囲の新生血管構築やフィブロネクチン等の細胞外マトリックスの補填により、皮下移植の成績が現行の世界標準法である門脈内移植の結果を凌駕し得ることを見出し、現在論文投稿中である。本年度は、皮下における免疫隔離細胞デバイスの物性の至適化と、リコンビナントペプチド(RCP)と脂肪組織由来間葉系幹細胞(ADSC)の組み合わせが皮下の細胞移植成績へ及ぼす影響に関する検証という二つのテーマを設定し研究を推進してきたが、いずれの検証も当初の計画通り順調に進み、前者においては酸素徐放ポートの構築という新たな展開を切り拓く事に繋がった。また後者においては世界初となる知見を見出し、論文にまとめる事ができたため、本年度の研究計画は当初以上に極めて進展していると判断した。本年度の研究を推進する事により、目的とする免疫抑制剤を使用しない皮下細胞移植を実現するためには酸素徐放ポートの構築が有用である事が判明したため、2019年度は2018年度の成果を基に国内企業と連携し、より洗練された試作機を作製し、細胞デバイスの更なる至適化を推し進めていく予定である。

本年度の研究を推進する事により、目的とする免疫抑制剤を使用しない皮下細胞移植を実現するためには酸素徐放ポートの構築が有用である事が判明したため、2019年度は2018年度の成果を基に国内企業と連携し、より洗練された試作機を作製し、細胞デバイスの更なる至適化を推し進めていく予定である。