hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
吻合部内膜過形成における接着分子の役割と同分子のブロッキングによる内膜過形成の抑制

人工血管移植モデルとしてラットの腹部大動脈に人工血管を端々で移植した。人工血管には我々が以前に開発した超極細繊維で作成した直径3mmのものを用いた。9-0nylonによる2点支持連続縫合で吻合した。術後3(n=8)、7(n=7)、28日目(n=8)にラットを犠牲死させ標本を採取した。人工血管周囲の癒着が強く採取に難渋した。1:移植後の開存率は3日目、7日目、28日目でそれぞれ87%、85%、62%であった。2:一般染色(EVG染色)。開存していた標本を4%パラホルムアルデヒドにて5時間固定した後にOCTコンパウンドに包埋した。同一切片上で人工血管と宿主動脈が観察できるように長軸方向にクリオスタッドで薄切り市凍結切片を作成した。この作業は技術的に困難で5例を標本作成の段階で失った。それぞれの群における末梢側吻合部の最大肥厚部を画像解析装置で測定した結果、3日目、7日目、28日目で、それぞれ4±3、20±10、98±40μmと経時的に肥厚が増した。閉塞していたものはいずれも血栓形成が原因であった。3:免疫染色(1)ABC法による抗PCNA抗体免疫染色で細胞の増殖活性を検討した結果7、28日群において吻合部周囲に多数の陽性細胞を認めた。陽性細胞は縫合糸周辺に特に集中しており、多くはリンパ球や好中球で異物反応の結果と考えられた。また血管平滑筋細胞においても縫合部に高率に陽性細胞を認め、吻合部内膜肥厚がcompliance mismatchのみならず異物反応にも起因していることが示唆された。(2)接着分子の検討。ICAM-1、VCAM-1、LFA-1の各抗体による染色は抗体濃度50、100倍希釈では特異的な染色が見られず、今後、抗体希釈濃度、反応時間、標本固定条件を変えながら至適条件をもとめる予定である。
日本の下水・都市河川水における初期スクリーニングにて選定された医薬品物質の検出

国内河川および下水における医薬品物質の動態把握のため、これまで都内を対象に調査を進めてきた。その結果、下水処理場からの放流水が主要な負荷源であると推測されたため、本年度は多摩川流域の下水処理場を対象としてその汚染要因を究明すべく下水幹線試料も含めた詳細調査を実施した。試料は、東京都青梅市および瑞穂町からの下水幹線試料(13地点)と下水採水地域を管轄する下水処理場の流入水ならびに放流水(各12試料)を用いた。測定対象はカルバマゼピン(CBZ)、エリスロマイシン(EM)、クラリスロマイシン(CAM)、インドメタシン(IMD)、メフェナム酸(MEF)、イフェンプロジル(IFP)、ベンザルコニウム(BAC)、オフロキサシン(OFLX)の8物質である。調査の結果、これら8物質は下水処理場の流入水および放流水の全試料から検出された。下水処理場の流入水では、OFLX(幾何平均値580ng/L)、CAM(530ng/L)、BAC(350ng/L)、EM(280ng/L)が主要成分であり、放流水ではCAM(390ng/L)、OFLX(250ng/L)、EM(200ng/L)が顕著であった。BACの放流水中濃度は17ng/Lと流入水に比べて1桁低く、OFLX、MEFに関しても下水処理前後で有意差(1%)が確認された。下水幹線試料においては測定対象物質の各濃度に変動があったが、いずれの地点においてもBACは高濃度(24016000ng/L)で検出された。BACは殺菌消毒剤(逆性石鹸の成分)であり家庭からの寄与は想定し難く医療機関での使用が中心と考えられる。調査区域は都内でも様々な医療施設が集中していることから、これらの施設からの環境負荷も予測された。最初に,優先的に測定すべき物質を選定するための初期スクリーニングを行った。まず,ヒト用医薬品の日本における消費量を算出した。計算には,2003年度までの統計・売上高および薬価に関する資料などを用いた。その結果,88の医薬品について,年間国内消費量が10t以上であると算出された。続いて,これら88物質について,PEC/PNEC(予測環境中濃度÷予測無影響濃度)・環境残留性・生物蓄積性の評価を行った。河川水中のPECの算出には,消費量の他に未変化体排泄率を用いた。また,諸外国における年間消費量,および河川水中・下水放流水中の濃度に関する2004年までの報告も用いた。一方,水環境中の生物に対するPNECの算出には,緑藻類・甲殻類・魚類などを対象とした毒性試験に関する2004年までの報告,および定量的構造活性相関モデルによる推定値を用いた。さらに,水中半減期および生物濃縮係数の算出にも同モデルを用いた。環境残留性・生物蓄積性に関しては,薬局方および医薬品集などの記述も考慮した。以上より,PEC/PNECが1をこえる物質として,エリスロマイシン(抗生物質)・オフロキサシン(抗菌剤)が,また0.1をこえる物質として,カルバマゼピン(てんかん・躁状態治療剤)・クラリスロマイシン(抗生物質)・メフェナム酸(解熱消炎鎮痛剤)・インドメタシン(解熱消炎鎮痛剤)が選定された。うち抗生物質・抗菌剤3物質に関しては,環境残留性が問題となる可能性も示された。なお88物質中,生物蓄積性が問題となりえると評価された物質は無かった。さらに,上の6物質について分析条件の検討を行った。環境水試料の濃縮には,親水性・疎水性重合ポリマーを用いた固相抽出を利用することができた。定量分析には,LC/MSおよびLC/MS/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析計および同/タンデム質量分析計)を利用することができた。多摩川水系の中流域の7地点・多摩川流域の下水処理場2ケ所・東京都内の都市河川5水系17地点において、医薬品物質の濃度調査を行った。その結果、東京都の水道水源でもある羽村堰においては、カルバマゼピン・エリスロマイシン・クラリスロマイシン・インドメタシン・メフェナム酸のいずれも検出されなかった。下水処理場の処理放流水が流入した後の多摩川において、それぞれ物質の最高検出濃度は、カルバマゼピンは43ng/L、エリスロマイシンは895ng/Lクラリスロマイシンは197ng/L、インドメタシンは44ng/L、メフェナム酸は49ng/L(いずれも多摩川原橋)であった。下水処理場において、流入水中の濃度は、カルバマゼピンは45ng/L80ng/L、エリスロマイシンは353ng/L2142ng/L、クラリスロマイシンは125ng/L262ng/L、インドメタシンは50ng/L以下(定量限界以下)116ng/L、メフェナム酸は20ng/L以下(定量限界以下)104ng/Lであった。処理水中の濃度は、カルバマゼピンは27ng/L73ng/Lエリスロマイシンは135ng/L727ng/L、クラリスロマイシンは67ng/L111ng/L、インドメタシンは10ng/L以下(検出限界以下)92ng/L、メフェナム酸は20ng/L60ng/Lであった。

カルバマゼピン・インドメタシン・メフェナム酸は、下水処理過程を通した除去率が比較的低かった。都内の都市河川の中では、隅田川水系(新河岸川も含む)において、多摩川水系と同程度あるいはそれ以上に高い濃度でこれらの物質が検出された。一方、江戸川水系ではエリスロマイシンおよびクラリスロマイシン濃度は比較的低く、インドメタシン・メフェナム酸は検出されないことが多かった。羽村堰より下流の多摩川や隅田川などでは、下水処理場の処理放流水が主な負荷源であると推察された。国内河川および下水における医薬品物質の動態把握のため、これまで都内を対象に調査を進めてきた。その結果、下水処理場からの放流水が主要な負荷源であると推測されたため、本年度は多摩川流域の下水処理場を対象としてその汚染要因を究明すべく下水幹線試料も含めた詳細調査を実施した。試料は、東京都青梅市および瑞穂町からの下水幹線試料(13地点)と下水採水地域を管轄する下水処理場の流入水ならびに放流水(各12試料)を用いた。測定対象はカルバマゼピン(CBZ)、エリスロマイシン(EM)、クラリスロマイシン(CAM)、インドメタシン(IMD)、メフェナム酸(MEF)、イフェンプロジル(IFP)、ベンザルコニウム(BAC)、オフロキサシン(OFLX)の8物質である。調査の結果、これら8物質は下水処理場の流入水および放流水の全試料から検出された。下水処理場の流入水では、OFLX(幾何平均値580ng/L)、CAM(530ng/L)、BAC(350ng/L)、EM(280ng/L)が主要成分であり、放流水ではCAM(390ng/L)、OFLX(250ng/L)、EM(200ng/L)が顕著であった。BACの放流水中濃度は17ng/Lと流入水に比べて1桁低く、OFLX、MEFに関しても下水処理前後で有意差(1%)が確認された。下水幹線試料においては測定対象物質の各濃度に変動があったが、いずれの地点においてもBACは高濃度(24016000ng/L)で検出された。BACは殺菌消毒剤(逆性石鹸の成分)であり家庭からの寄与は想定し難く医療機関での使用が中心と考えられる。調査区域は都内でも様々な医療施設が集中していることから、これらの施設からの環境負荷も予測された。
血管内皮細胞における小胞体ストレス応答のシグナル機構

【目的】前年度研究において、血管内皮細胞におけるアポトーシスの出現には、細胞内Ca濃度の上昇よりも、小胞体内のCa枯渇が重要であること。また、Caspase-12(C-12)非依存的なアポトーシスシグナル経路が存在することが示唆された。平成16年度研究では、caspase inhibitorとcalpain inhibitorを用い、thapsigargin刺激時およびBAPTA/AM(20μM)で前処置しBK刺激を行った際に生じるアポトーシスについて検討した。【方法】細胞内Ca濃度はfra-2/AM負荷法を測定した。アポトーシスはDNA Ladder法を、C-12の活性化はWestern blotting法を用いて判定した。【結論】1)C-12によるアポトーシスシグナル経路の上流にはcalpainが位置し、2)thapsigarginによるアポトーシスの出現には、C-12依存的な経路と、caspase依存的ではあるがC-12非依存的な経路が存在すること、3)小胞体Ca枯渇によって生じるアポトーシスは、caspase依存的ではあるがC-12非依存的なシグナル経路を介することが示唆された。【研究目的】ERストレスの誘導因子であるthapsigargin(TG)は、細胞内Ca^<2+>濃度の上昇をもたらし、アポトーシスを惹起する事が知られている。一方、PI3キナーゼの下流に存在するセリン/スレオニンキナーゼであるAktが、アポトーシスエフェクターであるBadやIKKαなどをリン酸化することによりアポトーシスを抑制することが注目されている。本研究では、Aktのアポトーシス抑制作用がCa^<2+>応答の変化を介したものであるかを検討した。【方法】対象としてブタ下行大動脈培養血管内皮細胞を用いた。TG投与時の細胞内Ca^<2+>濃度変化に対する、PI3キナーゼ/Akt阻害薬LY294002をwortmanninの効果をfura-2法で画像解析した。さらにAktの役割をdominant negative Akt(dn Akt)とβ-gal導入細胞において比較した。Aktとその下流に存在するeNOSのリン酸化はWestern Blottingで検討した。【結果】(1)コントロール条件下で、AktおよびeNOSのリン酸化が認められた。両者のリン酸化はPI3キナーゼ/Akt阻害薬LY294002とwortmannin、およびdn Aktにおいてほぼ完全に抑制された。(2)LY294002(1-50μM)はPI3キナーゼ/Akt阻害作用非依存的に容量性Ca^<2+>流入を阻害してTG(1μM)投与時の細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を抑制したが、wortmannin(100nM)投与およびdn Akt導入細胞では細胞内Ca^<2+>応答に対する影響を認めなかった。【総括】Aktは、ERストレス誘導因子であるTGによる血管内皮細胞Ca^<2+>濃度の上昇には、影響を与えず、そのアポトーシス抑制はCa^<2+>応答の変化を介したものではない事が示唆された。【目的】血管内皮細胞のapoptosisは動脈硬化の発生因子として注目されている。近年、小胞体内Ca枯渇によりapoptosisを生じること、Caspase-12 (C-12)が小胞体に関連するapoptosisの重要なシグナルとなることが報告されている。しかし血管内皮細胞において、小胞体のCa枯渇とC-12の関係は明らかでない。本研究では、ブタ大動脈培養血管内皮細胞を用い、apoptosis惹起時のCaシグナルとC-12の活性化との関連を検討した。ApoptosisはDNA Ladder法を、C-12の活性化はWestern blotting法を用いて判定した。【成績】小胞体に存在するCa-ATPaseの選択的阻害薬であるthapsigargin(2μM)は持続性に小胞体内のCa枯渇を生じ、容量性Ca流入を刺激して細胞内Ca濃度を上昇させた。その際、C-12の活性化とapoptosisの出現が認められた。一方、bradykinin(BK,10nM)は細胞内Ca濃度を上昇させたが、C-12の活性化もapoptosisも生じなかった。

しかし、血管内皮細胞をBAPTA/AM(20μM)で前処置し、BKを投与すると、小胞体内の持続したCa枯渇を生じ、apoptosisの出現が認められたが、C-12の活性化は認められなかった。【結論】apoptosisの出現には、細胞内Ca濃度の上昇よりも、小胞体内のCa枯渇が重要であること、また、C-12非依存的なアポトーシスシグナル経路が存在することが示唆された。【目的】前年度研究において、血管内皮細胞におけるアポトーシスの出現には、細胞内Ca濃度の上昇よりも、小胞体内のCa枯渇が重要であること。また、Caspase-12(C-12)非依存的なアポトーシスシグナル経路が存在することが示唆された。平成16年度研究では、caspase inhibitorとcalpaln inhibitorを用い、thapsigargin刺激時およびBAPTA/AM(20μM)で前処置しBK刺激を行った際に生じるアポトーシスについて検討した。【結論】1)C-12によるアポトーシスシグナル経路の上流にはcalpainが位置し、2)thapsigarginによるアポトーシスの出現には、C-12依存的な経路と、caspase依存的ではあるがC-12非依存的な経路が存在すること、3)小胞体Ca枯渇によって生じるアポトーシスは、caspase依存的ではあるがC-12非依存的なシグナル経路を介することが示唆された。
硬組織におけるアミノ酸のラセミ化率に関する研究

アミノ酸のラセミ化反応に関する報告は少ない。アミノ酸の中のアスパラギン酸(Asp)は、ラセミ化反応速度が速く、L型から変換されたD型が加齢に伴いほぼ規則的に増加している(ラセミ化率)。我々は世界に先駆けて法医学で重要な歯(象牙質)からの年齢鑑定にこれを活用し良好な成果を上げている(r=0.99)。そこで、この研究をさらに進展させるために、加熱された歯、外国人の歯、DNA分析とラセミ化率との関連などについて検索を試みた。アスパラギン酸のラセミ化率を用いた歯からの年齢推定は、最も正確に年齢を求めることが可能と思われる。しかし、ラセミ化反応は化学反応のため、とくに、熱に影響される。このため、強く熱せられた歯から正確に推定年齢を特定することは、重要な意義がある。そこで、備品として購入した測色計を用いて、焼死体の歯から年齢推定可能か否か検索した。その結果、褐色になった焼死体の歯のアスパラギン酸のラセミ化率と測色値との間に高い相関がみられ、年齢推定に役立つことが確認できた。一方、欧米諸国ではアミノ酸のラセミ化率(D/L比)がDNAの保存状態と深い関わりを持っていることが知られている。しかし、この種の報告例は、わが国ではほとんどみられない。とくに、日本のような保存性の低いとされる酸性土壌では、DNA保存性に関する情報を検索することも意義あることと考える。そこで、日本の酸性土壌における白骨化した死体の歯を供して、アミノ酸のラセミ化率とDNA情報の保存性について検索した。歯の歯根部におけるラセミ化率は、0.020.04を示し、同一資料よりDNAをPCRしたところ、すべて250bpにおいて増幅が確認された。また、歯根部以外でもラセミ化率とPCRの増幅性との相関がみられた。ラセミ化率の低い資料に熱処理を加えたところ、0.083を超えると90bpにおいてもPCRによる増幅が確認できなかった。これらのことから、日本のような多湿の環境下においても、アミノ酸のラセミ化率は、DNA保存性に関する情報を提供するとともに、DNA分析可能な貴重な資料を効率良く選別でき、大変有効な手段となる可能性が示唆された。歯からの年齢推定において、アスパラギン酸(Asp)のラセミ化率は、加齢に伴い直線的に増加する。しかし、熱が加わると象牙質が褐色を呈すると共にラセミ化率が直線性を示さなくなり、正確な推定年齢が困難になる。そこで、加熱実験(160°C)を行い直線性を示さなくなる限界のAspのラセミ化率を求め、その時の測色値を測定し、焼死体の歯からの年齢推定に役立つか否か検索した。その結果、Aspのラセミ化率の直線性の限界は、50分付近の0.0973で、60分過ぎると直線の傾きが小さくなる傾向で、ラセミ化率が0.1以上であった。ラセミ化率と測色値との相関は、L*a*b*表色系のうちb*がもっとも高く、その時のb*値が17.09で、60分以上では17.99以上を示した。このことから、本法はb*値が17前後以上になった場合、ラセミ化率の直線性がなくなり、正確な年齢を示さなくなる可能性があり、十分注意が必要であることが示唆された。また、カロリンスカ研究所より送られたスウェーデン人の歯と日本人の歯のラセミ化反応速度を比較したところ、加熱実験の結果、ほぼ同様な速度であることが示唆された。そこで、日本人の歯を対照歯として年齢算出式を求めスウェーデン人の歯(18歯)からの年齢鑑定を実施した。後日、実年齢が判明したが、推定年齢は日本人のデータほど良い成績は得られなかった。その理由は、民族による口腔内温度の影響も考えられたが、スウェーデン人の鑑定した歯が上顎臼歯が多く複根(14歯)であったため、その象牙質の年齢に応じた正確なラセミ化率が得られなかったことに起因していることが示唆された。D-アスパラギン酸とL-アスパラギン酸を明瞭に分離することは、この研究でもっとも重要な点である。我々は、再現性があり明瞭に分離できるキャピラリーカラムを作製し、実際の歯からの年齢鑑定に活用している。また、ラセミ化反応速度が国あるいは民族により異なるか否か検討したところ、ほぼ同様であることが判明した。これにより、日本人の歯を対照歯として年齢鑑定に用いることができ、外国人の歯からの年齢鑑定にも対処可能であることが示唆された。また、この研究で、単根歯を用いることが重要であることが再確認された。さらに、ラセミ化法は、歯全体(歯そのものの)のラセミ化率を検出することが重要で、これを解決するために、歯を丸ごとからでも年齢推定できるか否か、他大学と検討したところ、象牙質同様、相関が高い傾向を示した。

これは、複根である上顎臼歯に用いることも可能で、同時に簡便に検査ができることになると思われる。アミノ酸のラセミ化率は、DNA分析可能な貴重な資料を効率よく選別でき、大変有効な手段で、わが国の古生物学領域の新たな指標となる可能性が示唆された。カロリンスカ研究所と共同研究を行ない、放射性炭素法(成年推定法)とラセミ化法(年齢推定法)と比較したところ、両者の短所を利用すれば、さらに、より良い年齢鑑定が可能と思われた。AspとGluおよびAlaのラセミ化率と実年齢との相関は、可溶性成分を用いるとGluおよびAlaでもラセミ化率が高くなり、歯からの年齢推定に活用できることが示唆された。
分子コヒーレンス制御を指向したテラヘルツパルス波形整形技術の開発

分子の振動回転量子状態のコヒーレンス制御の実現を目指し、その基盤技術としてテラヘルツレーザーパルスの高精度な波形整形及び計測技術の開発を行うことを目的とした。まず、光整流法及びプラズマ法を用いたテラヘルツパルス光発生の試験を行い、そのパルス波形測定装置の製作を行った。平成21年度は、テラヘルツ任意波形整形へ向けた最も簡単な系として、テラヘルツダブルパルス発生について精査した。干渉計を用いて励起光を等強度パルス対とし、そのパルス対を用いて光整流法によりテラヘルツ光を発生させた。励起光の波形がテラヘルツ光に正確に転写されると仮定すると、テラヘルツ波形として等強度パルス対が観測されるはずである。しかし、テラヘルツ光の発生の場である結晶のダイナミクスやプラズマ内での光の挙動が、ダブルパルス発生に対して大きく影響し、励起光のダブルパルス波形のテラヘルツパルスへの精密な転写を行うことはできなかった。これは精密なテラヘルツ波形整形の実現における本質的な問題点であり、結晶やプラズマのダイナミクスを正確に考慮に入れた実験装置の設計及び非線形光学結晶の選択が必須であることがわかった。本研究で用いた半導体結晶は、バンドギャップが励起光二光子のエネルギーより小さい。そのため、励起光照射により容易に伝導帯に励起されてしまい、精密なテラヘルツ波形整形を阻害したと考えられる。現在は、バンドギャップの大きい透明材料であるLiNbO_3結晶を用いたテラヘルツパルス光発生とその整形実験の予備的数値計算を行い、装置設計を行っている。
血小板膜蛋白異常の分子論的解析

得られたモノクローナル抗体を用いて、抗原分子上の抗体結合部位と種々血小板機能との関連について検討した。ゲルろ過カラム(TSK4000SW)を用いて、得られた蛋白複合体をGP【II】bとGP【III】aに分離回収し、同一カラムにて再クロマトグラフィーを行なった。SDSが除去されたGP【II】bおよびGP【III】aの各検体をリシルエンドペプチダーゼにて処理し、オリゴペプチドに分解されたGP【II】bとGP【III】aの各検体を逆相カラム(C18)を用いた高速液体クロマトグラフィーにて解析した。214nmの吸光度でモニターし、それぞれの分子のペプチド・マッピングを得た。GP【II】bおよびGP【III】aの一部のオリゴペプチドのアミノ酸配列を決定した。GP【II】bにおいて26残基(2ペプチド),GP【III】aにおいて34残基(3ペプチド)を同定した。
乳幼児突然死症候群(SIDS)の発症因子と覚醒反応発現に関する研究

乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome:SIDS)はそれまで健康と思われていた乳幼児が睡眠中に突然死亡する原因不明の疾患であり、その病態として睡眠中の覚醒反応の異常が示唆されている。リスク因子としては妊娠中あるいは出生後周囲での喫煙、うつぶせ寝、非母乳哺育、低出生体重などがあげられている。ブリュッセル自由大学附属小児病院において睡眠時ポリグラフ検査をうけた乳幼児のうち性別、月齢、体重、寝かせ方、哺乳の種類などを一致させた母親の喫煙のある群と喫煙のない群で覚醒反応の頻度について検討を行い、喫煙の影響について検討した。それぞれの群は男児7例、女児10例で、喫煙のある群では母親の1日の喫煙数は平均17.5本であった。単位時間あたりの覚醒反応の発現頻度は喫煙グループでは16.6±6,6、喫煙しないグループでは16.5±3.8で、両群間で有意差は認めなかった。さらにこのうちの各群10例において覚醒反応をcorticlarousalとsubcortical activationに分類しその頻度について検討した。REM睡眠期において、喫煙グループではcortical arousalの頻度が低く、subcortical activationの頻度が高い傾向を示したが、有意差は認めなかった(cortical arousalの頻度:喫煙グループ10.4/h、非喫煙グループ14.2/h、subcortical activationの頻度:喫煙グループ2.2/h、非喫煙グループ1.6/h)。NREM期においてはcortical arousalとsubcortical activationの頻度に有意差は認めなかった。有意差は認めなかったものの喫煙の環境下にある乳児でSIDS症例と同様の傾向を認めたことはSIDSの病態を考慮する上で重要な所見と思われた。乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome : SIDS)はそれまで健康と思われていた乳幼児が睡眠中に突然死亡する原因不明の疾患であり、その病態として睡眠中の覚醒反応の異常が示唆されている。ブリュッセル自由大学附属小児病院との共同で、母親の喫煙というSIDSリスク因子を持つ乳児における睡眠中の覚醒反応の頻度とその特徴について、リスク因子のない乳児との比較検討を行った。覚醒反応の頻度は、母親が喫煙する群においては一晩に1症例あたり113.9±33.4回、喫煙しない群では112.8±27.6回で、両群間に有意差は認めなかった。今後さらに各群における単位睡眠時間あたりの覚醒反応の頻度、皮質下および皮質での覚醒反応の頻度、持続時間などについて検討を行い、喫煙が児の覚醒反応に及ぼす影響について検討していく予定である。乳幼児突然死症候群(Sudden Infant Death Syndrome: SIDS)はそれまで健康と思われていた乳幼児が睡眼中に突然死亡する原因不明の疾患であり、その病態として睡眠中の覚醒反応の異常が示唆されている。単位時間あたりの覚醒反応の発現頻度は喫煙グループでは16.6±6.6、喫煙しないグループでは16.5±3.8で、両群間で有意差は認めなかった。

さらにこのうちの各群10例において覚醒反応をcortical arousalとsubcortical activationに分類しその頻度について検討した。REM睡眠期において、喫煙グループではcortical arousalの頻度が低く、subcortical activationの頻度が高い傾向を示したが、有意差は認めなかった(cortical arousalの頻度:喫煙グループ10.4/h、非喫煙グループ14.2/h、subcortical activationの頻度:喫煙グループ2.2/h、非喫煙グループ1.6/h)。NREM期においてはcortical arousalとsubcortical activationの頻度に有意差は認めなかった。有意差は認めなかったものの喫煙の環境下にある乳児でSIDS症例と同様の傾向を認めたことはSIDSの病態を考慮する上で重要な所見と思われた。
ナノクラスター化によって創出される金の触媒反応の起源解明

化学的に不活性な金が、ナノサイズ化(3nm程度)され、二酸化チタンなどの金属酸化物に担持された時に示す特異的な触媒活性の起源を明らかにするために、二酸化チタン担持金クラスターモデル触媒を用いて局所的電子状態と触媒活性との関連を調査した。二酸化チタン表面の性質を担う欠陥由来の電子状態について調べたところ、これまで信じられてきた酸素欠損サイトでの局在は見られず、その周りへ広く分布している事を初めて直接観察した。また、金クラスターは二酸化チタンの表面欠陥サイトに吸着し、そこでTi 3d電子を受け取っていること、さらに、そのTi 3d電子の移動が、金の触媒活性発現に関わっていることを明らかにした。金は化学的に不活性な金属であり、永遠や不変の象徴であるが、2-3nm程度の金クラスターを二酸化チタンなどに担持すると、突如として化学的な活性を示すようになり、一酸化炭素の低温での酸化反応などに対し極めて高い触媒活性を示す。この金の触媒性発現機構については、様々な仮説が立てられているが、いずれも決定的な結論には至っていない。本研究では、この金クラスターの触媒活性発現機構を表面科学的な手法を用いて明らかにすることを目的としている。本年度は、(1)担体となる二酸化チタンの局所的な電子状態(2)二酸化チタン表面と金ナノクラスターとの電子的な相互作用を走査トンネル顕微鏡、光電子分光法、密度汎関数計算などで調べた。その結果、(1)これまで酸素欠損に局在すると信じられてきた欠陥由来の過剰電子が、5配位チタンに広く分布していること(2)二酸化チタンに担持した金ナノクラスターが欠陥サイト(ステップや酸素欠損など)に吸着し、二酸化チタン表面の過剰電子を受け取って負に帯電していることの2点が明らかとなった。これらは、金ナノクラスターが触媒活性を示す機構に関連していると考えられ、次年度はこれらの電子状態が触媒活性に与える効果について、実際に触媒活性試験を行って調べる予定である。既に実験は進行しており、負に帯電した金ナノクラスターが高い触媒活性を示す傾向が得られつつある。さらに詳細を調べ、金の触媒活性発現機構を明らかにする。昨年度までは、金のナノクラスターを担持する担体となる二酸化チタンの電子状態を原子レベルで明らかにし、さらに金クラスターとの電子的な相互作用を光電子分光を用いることで明らかとした。これらの成果を基に、今年度は金の電子状態と触媒活性の関係のより直接的な解明を進めた。まず、走査トンネル顕微鏡で二酸化チタン上の金クラスターの構造を確認した後、光電子分光法で電子状態を調べ、そのまま一酸化炭素の酸化反応の触媒活性試験を行うことで、構造-電子状態-触媒活性の関連の直接観察を行った。その結果、金クラスターのサイズが3.0nm以下の場合は、二酸化チタンからの電子移動による負の帯電が強く、酸素の吸着が安定となるが、一酸化炭素が吸着できず、得られる酸化反応の触媒活性は低くなることが明らかとなった。また、金クラスターサイズが3.0nm以上の場合は、電子移動の効果が徐々に薄れ、一酸化炭素の吸着は安定となるが、酸素の吸着は不安定となり、同様に得られる酸化反応の触媒活性は低くなることが分かった。最大の触媒活性は、二酸化チタンからの電子移動の効果が最大となるサイズである3.0nmにおいて得られることが明らかとなった。この事実は、二酸化チタンと金ナノクラスターの電子的な相互作用が金の触媒活性発現に強く関与していることを示しており、本研究成果は、化学的に不安定な金が活性となる機構を明らかにする重要な手がかりとなるだろう。
大学研究力強化のための分析指標および研究戦略プロセスモデルの提案

本研究の目的は、1.研究力向上を導く戦略策定のための研究力分析指標提案、2.研究戦略策定・実施プロセスモデル提示を試み、大学における研究戦略策定・実施方法を体系化することにある。研究力分析に関わる組織、研究力分析を研究戦略に活かすプロセス、研究戦略実施に関する調査を行った。参考としてイギリスの研究評価制度の調査を行ったが、イギリスでは指標を用いた評価はピアレビューを行う際の参考としてのみ用いられていることが明らかになった。指標による評価は、被評価側の偏った行動を誘起しやすいため、自機関の分析のための指標利用と、研究機関への資金配分のための指標利用は、厳密に区別する必要がある。本研究は、1.研究力向上を導く戦略策定のための研究力分析指標提案、2.研究戦略策定・実施のプロセスモデル提示を試み、大学における研究戦略策定・実施方法の体系化を目指すものである。平成26年度は、国内の研究機関において研究力分析および評価を担う部署の同定および分析指標についての国内外における調査を行った。本年度は、研究機関を対象としたメゾ視点での研究力分析手法に主に着目して調査を進めたが、今後は、国の科学技術政策立案のための研究力分析というマクロ視点、研究者個人レベルを対象としたミクロ視点の分析手法についての調査も並行して行う。また、研究とイノベーションに関する都市単位での分析を行った興味深い海外の事例があることから、新たな視点による分析として、研究戦略立案に活用する可能性を検討したい。本研究の目的は,1.研究力向上を導く戦略策定のための研究力分析指標提案、2.研究戦略策定・実施のプロセスモデル提示を試み、大学における研究戦略策定・実施方法を体系化することにある。本年度は,現在用い要られている国内外の研究力分析指標に焦点をあて,調査を行った。国内では,平成25年度に研究大学強化促進事業の採択校決定に際して,研究に関連する10の指標に基づく研究機関の数値評価が行われた。海外では,特に英国において,研究評価が重視されている。英国では,1986年からResearch Assessment Exercise(RAE)という研究評価に基づく運営費交付金の配分がなされており,2014年からはResearch Excellence Framework(REF)という新たな評価システムが始まっている。今回はREFによる調査が大学の研究力および研究戦略策定にどのような影響を及ぼしたかを調査した。調査対象として,REF2014評価ポイントランキングにおいて,2008年度の調査から大幅にランキングを上げた大学を抽出した。評価指標に関する英国国内での議論については,HEFCEによる報告書やその他文献を調査した。英国国内の議論では,数値による評価そのものが手法として未成熟であるため研究評価に直接用いることはできないという結論に至っており,そのため各分野におけるピアレビューで評価を行うことが重視されている。論文引用数などの数値による評価は,あくまでピアレビューのための参考である。また,各大学の大学評価・研究戦略担当者へのインタビューでは,評価による研究戦略の影響として,評価でポイントを取れる研究者のヘッドハンティング,学部の統廃合,共同研究促進のための研究者の長期派遣,それを支える仕組みとしての研究または教育系教員の2トラック制度と教員評価の確立などが挙げられた。さらい国および大学両者において,評価が英国全体の研究力強化に繋がっているという認識を持っていることがわかった。当初の研究目的は,どのような定量的な研究力分析方法および評価指標が研究力強化に結びつくのか,またそのプロセスの課題を明らかにすることにあったが,調査を進めるにあたり,定量的な評価そのものが手法として未熟であり,研究評価に用いることが適切でないということに行き当たった。そのため,対象とする研究評価手法自体から見直すこととなり,国内で行う予定であったアンケートの構成を行うまえに,長年定性的な研究評価を進めてきた海外事例の調査を先に進めることとした。本年度は、各機関で研究分析をどのような組織で行っているか、研究評価と研究戦略という機能それぞれについて調査した。ピックアップした大学の関係者にインタビュー調査を行ったところ、研究力分析を行う専門の人材を配置している機関、配置していない機関がともにあったが、いずれも分析結果を何らかの執行部や部局長らに提供するということは行っていた。しかしながら、提出された分析結果をもとに会議内で研究戦略を立案することは難しいということ、分析結果は学長または研究担当理事の参考として扱われ、研究戦略の判断材料の一つとして有益なものとなっていることがわかった。また、その調査結果をもとに、研究評価および研究戦略の組織・人材、それらのプロセス、結果をどのように扱っているか、それらに関する課題についての調査票を作成した。他の研究教育プロジェクトのマネジメントが肥大し、充分に本研究課題の遂行に時間が取れなかった。

本年度の海外調査事例をもとに,国内でのアンケート調査を再構築する予定である。具体的には,国内の定量的な指標を用いた研究力評価で研究戦略に何らかの影響があったか,大学の研究戦略の策定にどのような要因が関与しているか。定性的・定量的な何らかの指標をもとに研究戦略が策定されることがあるか,研究戦略策定のプロセスはどのようなものか,その課題は何か,といったことを明らかにするアンケート調査を行う予定である。研究マネジメント・約40機関を対象に、研究戦略策定と研究力分析、研究評価に関するアンケートを実施する。・アンケートから絞り込んだ対象機関に対し、研究戦略策定のための研究分析や研究評価のための研究分析方法の調査をインタビュー等により行う。・国の科学技術政策立案に活かされる研究力等の分析と、大学の研究戦略立案との関係を整理し、海外事例を参考に、新たな分析指標や分析の観点について調査・検討を行う。見積もりと支払額に誤差が生じたため本年度は調査分析のためのPCを購入したが、当初予定額より若干安価であったため、残額がでた。次年度の物品費に加えて使用する計画である来年度は調査分析に必要な基本的なソフトウェアの購入を予定している。
ヘム酵素とその変異体ハイブリッドを用いた不安定反応中間体のキャラクタリゼーション

ペルオキシダーゼやP450など酸化反応を触媒するヘム酵素は、活性発現のために高い酸化能力を有する高原子価オキソ-鉄錯体を生成.していると考えられている。しかしながら多くの中間体は、未だ酵素系では観測されておらず、高原子価状態を生成する機構の詳細、特に活性部位周辺アミノ酸の役割解明が急務となっている。本研究では、モデル研究で示された反応機構に基づく活性部位周辺のアミノ酸の役割を実証する目的で、ミオグロビンの遠位ヒスチジンの空間的な位置を置さ換えるミユ-テーションを行い、ミオグロビンに酸素酵素活性を賦与する事に成功した。特に、ミオグロビンの64番目のヒスチジンをフェニルアラニン43の位置へ移動することで、酸素添加能が極めて高くなることを見いだし、本ミユ-タントを用いることで、反応活性種であるO=Fe(IV)ポルフィリンπラジカルの直接観測に初めて成功した。本活性種は60ミリ秒程度で生成し、数秒以内に一電子還元を受けてO=Fe(IV)ポルフイリンヘと変化する。ダブルミキシング方によって種々の基質と反応活性種との反応を直接観測することにより、詳細な反応性の検討を併せて行った。一方、不安定化学種を低温下、有機溶媒中で直接観測する目的で西洋ワサビペルオキシデ-ゼの蛋白表面の化学修飾を行い、有機溶媒中で高原子価状態にある中間体の初めての観測に成功した。ペルオキシダーゼやP450など酸化反応を触媒するヘム酵素は、活性発現のために高い酸化能力を有する高原子価オキソ-鉄錯体を生成していると考えられている。本研究では、モデル研究で示された反応機構に基づく活性部位周辺のアミノ酸の役割を実証する目的で、ミオグロビンの遠位ヒスチジンの空間的な位置を置き換えるミューテーションを行い、ミオグロビンに酵素活性を賦与する研究を行っている。現在、ミオグロビンの64番目のヒスチジンをロイシン29の位置へ移動することで、高い酵素活性発現に成功している。さらに、ミオグロビンとペルオキシダーゼの遠位ヒスチジンでは水素結合の有無が、その化学的な性質に大きく影響していると考えられるため、ペルオキシダーゼの遠位ヒスチジンと水素結合を作っているアスパラギンを取り除いた蛋白を合成し、その酵素活性を検討した。その結果、水素結合が遠位ヒスチジンの塩基性をコントロールしており、それを通じて反応性に大きな影響を与えていることが初めて明らかとなった。一方、不安定化学種を低温下、有機溶媒中で直接観測する目的でヘム蛋白質の蛋白表面の化学修飾を行っている。P450の場合、部分的化学修飾が進行せず、一端化学修飾が始まると、多くのアミノ基が化学修飾され、蛋白の三次構造が大きく変わってしまうことが明らかとなった。現在、修飾試薬等の選定を行っているところである。本研究では、モデル研究で示された反応機構に基づく活性部位周辺のアミノ酸の役割を実証する目的で、ミオグロビンの遠位ヒスチジンの空間的な位置を置き換えるミューテーションを行い、ミオグロビンに酸素酵素活性を賦与する研究を行っている。本年度は、ミオグロビンの64番目のヒスチジンをフェニルアラニン43の位置へ移動することで、酸素添加能が極めて高くなることを見いだし、本ミュータントを用いることで、反応活性種であるO=Fe(IV)ポルフィリンπラジカルの直接観測に初めて成功した。本活性種は60ミリ秒程度で生成し、数秒以内に一電子還元を受けてO=Fe(IV)ポルフィリンへと変化する。

ダブルミキシング方によって種々の基質と反応活性種との反応を直接観測することにより、詳細な反応性の検討を現在行っている。一方、不安定化学種を低温下、有機溶媒中で直接観測する目的で西洋ワサビペルオキシダーゼの蛋白表面の化学修飾を行い、有機溶媒中で高原子価状態にある中間体の初めての観測に成功した。
環境負荷・耐震性を考慮した薄肉パイプラインの限界状態設計法の確立と検証

現行の農業用パイプライン設計基準は,パイプの剛性EI/D^3によって計算されており,管厚tは考慮されていない.しかしながら近年のコスト縮減策などより,さらに管厚が薄くなり,パイプが座屈する可能性がある.当研究では,パイプの管厚がその埋設挙動に与える影響を解明し,設計に際して考慮すべき重要点を明らかにするものである.そのために, 1G場におけるφ400供試管を用いた中型実験土槽ならびに30G場(φ130)での遠心力載荷埋設実験,さらにせん断土槽ならびに800gal大規模振動台実験(φ300)の一連の実験を遂行し,薄肉パイプの動的挙動を明らかにした.近年老朽化が進む45,000kmに及ぶ農業用幹線水路の改修に際して,コスト縮減や環境配慮などの経緯より,パイプラインの薄肉化が進展してきている.しかしながら,現行のパイプライン設計基準ではm構造力学を基本とした設計手法であるため,パイプ剛性が同一であれば,管材料すなわち管厚の差異は考慮できないことになるため,極端な管厚の薄肉化が,座屈などのパイプの破壊を引き起こす可能性が高くなってきている.また,さらに,超大口径薄肉管を採用した現場における実証実験結果から判断して,極度の薄肉化は極めて危険性を有していることが明らかになっている本研究は,これらの社会的ニーズ,パイプラインの更新時期などの時代的背景を受け,薄肉パイプラインの挙動を明らかにし,さらにパイプの肉厚を考慮した,耐震性の高い環境に優しいパイプラインの新たな設計手法の提案・確立を行うものである現行の農業用パイプライン設計基準は,パイプの剛性EI/D^3によって計算されており,管厚tは考慮されていない.しかしながら近年のコスト縮減策などより,さらに管厚が薄くなり,パイプが座屈する可能性がある.当研究では,パイプの管厚がその埋設挙動に与える影響を解明し,設計に際して考慮すべき重要点を明らかにするものである.そのために, 1G場におけるφ400供試管を用いた中型実験土槽ならびに30G場(φ130)での遠心力載荷埋設実験,さらにせん断土槽ならびに800gal大規模振動台実験(φ300)の一連の実験を遂行し,薄肉パイプの動的挙動を明らかにした.近年,老朽開水路のパイプライン化が急増している中で,コスト縮減や環境負荷低減に起因して管厚の薄肉化が進展してきている.しかしながら,現行の構造設計は,"構造解"を基に設計されているために,極度の薄肉化によるパイプの座屈挙動などを予測することができず,破壊の危険性を含んだ設計手法であると言わざるを得ない.よって,当研究では,これらの現行設計の適用限界を明らかにし,耐震性向上や限界状態を考慮した,新たな大口径パイプラインの設計法の提案ならびに検証を行うものである.今年度は,薄肉パイプの静的埋設実験に先がけて,同一曲げ剛性を有する管厚の異なる供試パイプの製作・検証を行った.製作した供試パイプはパイプ内面からの観察等を考慮して口径400mmとした.材質は鋼管,塩ビ管,ポリエチレン管の3種類とした.また,摺動型の100mm精密変位計と回転角度計を連動させ,動的ローガーを組み合わせた微小変形挙動観測システムを構築した.上記システム開発後,2点載荷実験ならびに中型土槽内埋設実験を遂行した。埋設条件は,密詰めならびに緩詰地盤の2種類で実施した.なお,実験に使用した鋼板製土槽は,幅2m,奥行き1m.,深さ1.4mの中型土槽である.また,供試パイプの変形挙動を正確に捉えるため,パイプ内外面に計240枚のひずみゲージを貼付し,発生ひずみを計測した.その結果以下のことが明らかになった.(1)パイプの変形に対して管厚の違いが与える影響は少ない.(2)管厚が薄く,弾性係数の高いパイプにおいて,より大きく不均一な軸応力が生じ,座屈が発生する可能性が高い.(3)パイプの剛性が高いほど,地盤内応力集中が生じて,より大きな軸応力が発生する.上記の挙動は,現行の設計では考慮されていない点であり,きわめてパイプラインの安全性に影響のある挙動である.大口径パイプラインの過度な管厚の薄肉化は,座屈等の危険性を含んでおり,十分な検討が望まれるところである.今年度は,さらに低剛性で同一外圧剛性を有する管厚の異なるたわみ性管を対象として,異なる埋設条件下においてφ400mmの模型管を用いた埋設実験を行い,その変形挙動に関して検討した.実験には内寸幅1,830×高さ1,230×奥行1,000mmの鋼板製土槽を使用した.また供試管,環剛性EI/D^3が同程度で管厚の異なる2種類(鋼管,低密度PE管)を使用した.各供試パイプには内外両面に管周方向3°間隔でそれぞれ120枚ずつ計240枚のひずみゲージを貼付し,パイプの詳細な変形挙動を計測した.模型地盤には,6-7混合珪砂を用い,密詰め地盤のケースについてはDr=95%,ゆる詰め地盤のケースについてはDr=25%となるように作製した.さらに,管底部から管側部までの埋戻し材としてコンクリートブロックを用いたゆる詰め地盤のケースについても実験を行った.また,土被り400mmの状態まで埋戻した後,エアバッグにより地盤表面に増分10kPaで120kPaまで段階的に載荷を行った.コンクリートブロックを用いたケースでは,エアバッグによる載荷後,油圧ジャッキにより,パイプ幅で地盤に140kPaの集中載荷を行った.

その結果,以下のことが明らかになった.(1)本実験の条件下では,パイプの曲げ変形に対して管厚の違いが与える影響は見られなかった.(2)管厚が薄く,弾性係数の高いパイプにおいて,より大きく不均一な軸応力が生じ,座屈が発生する可能性が高いことがわかった.(3)パイプの剛性が周辺地盤に比べて相対的に大きいほど,応力集中が生じてより大きな軸応力が発生することがわかった.本年度は,管剛性が等しく管厚が異なる大口径パイプの埋設挙動を明らかにするため,当初より計画されていたとおり,米国コロンビア大学所有の遠心力載荷装置を用いて,埋設実験を遂行した.供試管はφ130のアルミ管,ナイロン管ならびに低密度ポリエチレン管である.これらの供試管を3種類の異なる地盤条件で埋戻した計9ケースの遠心力載荷模型実験を行い,管のたわみ量,管頂部周辺土圧,曲げひずみ分布および軸応力分布から,大口径管の埋設挙動について検討した。その結果,アルミ管,ナイロン管では,埋戻し過程において側圧の影響を受けて管は縦長に変形し,土被りが増加するにつれて縦長変形が緩和されるという変形挙動を示した.しかしながら,重力加速度が増加した場合,アルミ管とナイロン管を比較すると,管厚の薄いアルミ管のほうが縦長変形が顕著である.このことから,大口径管においては管厚の薄い管ほど,埋戻しによる側圧の影響を受けやすいと考えられる.また,軸応力分布においては,管厚の薄い管において大きく不均一な軸応力が発生することが確認され,大口径管においてその傾向が顕著であるということが明らかになった.支床上に管を設置したケースでは,支床により管の変形が抑制されることから,管厚の薄い管における軸応力の不均一性が緩和されることが明らかになった.しかしながら,支床と地盤との境界部に大きな圧縮応力が発生していることから,管厚の薄い管においては,周辺地盤剛性の急変する位置に応力集中が生じる傾向にあると考えられる.管底部にアングルを設置したケースにおいては,アルミ管の管底部に大きな軸応力が発生し,大口径になるほど発生する軸応力が卓越することが明らかとなった.一方で,ナイロン管にはアングルによる軸応力への変化は見られなかった.このことから,管厚の薄い管においては地盤内の異物の影響を受けやすく,応力集中を起こしやすいという傾向があることが明らかとなった.現行の農業用パイプラインの設計においては,環剛性が等しい管であれば管厚が異なる管であっても,理論上,同一の埋設挙動を示すものとされている.しかしながら,設計基準を満たす管であっても,管厚が薄い場合に座屈破壊などが発生する事例が報告されている.本年度は,同一環剛性を有する種々の埋設管に対して,アルミ棒を用いた単純せん断試験ならびに大型振動台実験を実施し、震時変形挙動特性の解明を行った.単純せん断試験機を用いた実験には,φ130のアルミ管ならびにナイロン管を用いた.また、振動台実験には,農村工学研究所所有の3次元振動台を使用した.実験土槽は幅1990mm×奥行1500mm×高さ970mmのせん断土槽を使用した.供試管は,鋼管,塩化ビニル管、高密度ポリエチレン管を使用した.入力波は2Hz正弦波とし,最大800galまで加震した.主な研究成果を以下に示す.(1)地盤のせん断変形によって管の斜め方向に卓越したひずみが発生することが明らかになった.また,繰返しのせん断によって管は徐々に縦長に変形していくが,その程度には管厚によって違いがある可能性が明らかになった.(2)斜め方向は,初期のせん断から大きなたわみが発生することから,強地震によって地盤に大きなせん断変形が作用した場合,斜め方向の部分が鉛直水平方向の部分よりも先に破壊する危険性が高いことが明らかになった.
分泌現象に関与する細胞骨格蛋白質に関する研究

1.副腎随質の細胞骨格蛋白質の解析この組織の細胞膜画分より新しいアクチン結合蛋白質(39k蛋白質)を発見した。この蛋白質は細胞膜画分を非水解性GTPアナログであるGTPγSで処理することで特異的に可溶化される為G蛋白質である可能性が高かったので既知のG蛋白質(Gi,Go,Gs)の抗体に対する反応性をみたがこれらとは反応せずまた39k蛋白質に対する特異抗体もこれらG蛋白質とは反応しなかった。現在この蛋白質の構造解析を進めつつある。2.中枢神経系に存在する膜蛋白質の解析脳組織の細胞膜に多く存在しカルモジュリンとの結合能を持つ蛋白質を新たに精製しcDNAクローニングによりその分子構造を明らかにした。この蛋白質は特異的なアミノ酸組成を持つ酸性蛋白質であり熱処理、酸処理等に抵抗性を示し疎水性アミノ酸残基に乏しい等神経分泌への関与が考えられているMARCKSやGAP-43と似た物理学的性質を示すことが分かった。またN端にはミリスチル化される部位を持ちこれによって細胞膜へ移行すると考えられる。ただ大腸菌で発現させた蛋白質はカルモジュリン結合能を示さず翻訳後の修飾による活性化の機構が存在することを示唆している。今後真核生物の発現系でこの点を解析する予定である。特異抗体による解析はこの蛋白質が神経系に特異的に発現していること、発生に伴う発現量の変化が見られること、神経細胞の膜系に局在すること等を明らかにした。平成3年度までに行ってアドセベリンの物理化学的・生化学的解析よりこの蛋白質が分泌現象の制御に適した機能を示すことが明らかになった。さらに副賢髄質の膜画分を非水解性アナログであるGTPγSで処理すると特異的に遊離してくる蛋白質を発見しこれを精製する事を得た。この蛋白質(39K蛋白質)はアクチン繊維と強く結合することが分かった。一方神経成長円錐部の不溶性画分にチュ-ブリンと新しい酸性蛋白質(A50)が存在するという知見を得、この新しい蛋白質の精製法を確立しその性質を調べつつある。これまでのところA50がカルシウム依存的にカルモジュリンと結合すること、その物理化学的性質が神経成長に関連した蛋白質であるGAPー43(neuromodulin)やCーキナ-ゼの細胞内基質と考えられている見かけの分子量8万の蛋白質(MARCKS)とよく似ていること等を見いだした。そこで今年度においては、以下の課題を重点的に解析することを考えている。1、副賢クロム親和細胞における新しいアクチン結合蛋白質の解析。新たに発見した39K蛋白質は分泌調節におけるGTPの標的蛋白質あるいはその近傍に存在する因子である可能性が高い。そこでこの蛋白質の機能をさらに解析することが重要である。蛋白質の部分配列の決定、遺伝子クロ-ニング、抗体作製等によりこの蛋白質の性質を解明する手がかりを得る。2、神経成長部に存在する新しい酸性蛋白質(A50)の解析。現在クロ-ニング中のA50の構造決定後、そのカルモジュリン結合部位を遺伝子工学的手法で決定する。また大量発現した蛋白質を基質にしてこれを特異的に修飾する酵素(リン酸化酵素等)、あるいは細胞骨格系蛋白質に対する作用を検索する。特異抗体を作製し神経細胞を染色し神経突起の伸長に伴う局在の変化を調べる。また中枢神経系での発現と発生に伴う変化等を解析しその生理的意義を解明する。1.副腎髄質の蛋白質の解析平成3年度までに行った実験によりこの細胞膜画分より新しいアクチン結合蛋白質(39k蛋白質)を発見した。

この蛋白質は細胞膜画分を非水解性GTPアナログであるGTPγSで処理することで特異的に可溶化される為G蛋白質である可能性が高かったので既知のG蛋白質(Gi,Go,Gs)の抗体に対する反応性をみたがこれらとは反応せずまた39k蛋白質に対する特異抗体もこれらG蛋白質とは反応しなかった。現在この蛋白質の構造解析を進めつつある。2.中枢神経系に存在する膜蛋白質(A50)の解析この蛋白質のクローニングは修了しその分子構造が明らかになった。この蛋白質は特異的なアミノ酸組成を持つ酸性蛋白質であり熱処理、酸処理等に抵抗性を示し疎水性アミノ酸残基に乏しい等神経分泌への関与が考えられているMARCKSやGAP-43と似た物理化学的性質を示すことが分かった。またN端にはミリスチル化される部位を持ちこれによって細胞膜へ移行すると考えられる。ただ大腸菌で発現させた蛋白質はカルモジュリン結合能を示さず翻訳後の修飾による活性化の機構が存在することを示唆している。今後真核生物の発現系でこの点を解析する予定である。特異抗体による解析はこの蛋白質が神経系に特異的に発現していること、発生に伴う発現量の変化が見られること、神経細胞の膜系に局在すること等を明かにした。