hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｈｓｐ９０阻害剤と放射線照射による新しい肺癌治療戦略

Hsp90阻害剤であるNVP-AUY922の肺癌細胞株に対する放射線増感作用および抗腫瘍効果を検討した。特に、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに対し耐性化した肺癌細胞株に対して検討した結果、MET増幅またはT790M変異を耐性化の機構として持つ細胞株ではNVP-AUY922の放射線増感作用および抗腫瘍効果を認めた。一方、癌幹細胞様の特質により耐性化した細胞株ではNVP-AUY922の放射線増感作用および抗腫瘍効果は認めなかった。Heat shock protein 90 (以下Hsp90)は、AKTなど癌で鍵となる多くのシグナル伝達蛋白の安定化に関与しており、Hsp90阻害剤は癌治療薬として開発が進んでいる。さらに、Hsp90阻害剤は放射線の増感作用が報告され、放射線治療への応用が期待できる。本研究は肺癌におけるHsp90阻害剤と放射線の併用時の抗腫瘍効果の機序について検討し、肺癌における新しい治療法を確立することを目的とする。平成24年度では、EGFR変異肺癌細胞株PC9, H1975, H3255、KRAS変異肺癌細胞株H358, A549、PIK3CA変異肺癌細胞株H460、AKT活性化を示さない肺癌細胞株H1299, H838の8株を使用して、2種類のHsp90阻害剤(17-DMAG、NVP-AUY922)に対してHsp90阻害剤単独・放射線単独・両者の併用による抗腫瘍効果をMTSアッセイ・コロニーフォーメーションアッセイで評価し、放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群の同定を行った。平成25年度は、EGFR変異肺癌細胞株HCC827, PC-9と、それぞれより作成したEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(Gefitinib)に対する耐性株(HCC827-GRmet, HCC827-GRstem, PC-9-GRt790m)を用いてHsp90阻害剤NVP-AUY922の抗腫瘍効果を、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性株とその親株との差に注目して評価し、さらに放射線療法との併用による抗腫瘍効果も検討した。Hsp90阻害剤は耐性株(HCC827-GRmet, PC-9-GRt790m)においても抗腫瘍効果を示し放射線増感作用も認めたが、癌幹細胞様の性質を持った耐性株( HCC827-GRstem)においては抗腫瘍効果・放射線増感作用ともに乏しかった。本研究では3年間の研究期間内で以下の項目を検討する。# 1.肺癌細胞株におけるHsp90阻害剤の放射線増感作用の検討。# 2. Hsp90阻害剤の放射線増感作用機序の解明と併用療法至適条件の検討(in vitro)。(1) Hsp90阻害剤と放射線併用療法によるHIF-1α、DNA修復蛋白への影響(2) Hsp90阻害剤と放射線併用療法の治療スケジュールの検討。# 3.マウスモデルでの併用療法の抗腫瘍効果および至適治療スケジュールの検討。平成24年度では、EGFR変異肺癌細胞株PC9, H1975, H3255、KRAS変異肺癌細胞株H358, A549、PIK3CA変異肺癌細胞株H460、AKT活性化を示さない肺癌細胞株H1299, H838の8株を使用して、2種類のHsp90阻害剤(17-DMAG、NVP-AUY022)に対してHsp90阻害剤単独・放射線単独・両者の併用による抗腫瘍効果をMTSアッセイ・コロニーフォーメーションアッセイで評価し、放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群の同定を行った。平成24年度は、EGFR変異肺癌細胞株PC9, H1975, H3255, KRAS変異肺癌細胞株H358, A549, PIK3CA変異肺癌細胞株H460, AKT活性化を示さない肺癌細胞株H1299, H838の8株を使用して、2種類のHsp90阻害剤(17-DMAG, NVP-AUY922)に対してHsp90阻害剤単独・放射線単独・両者の併用による抗腫瘍効果をMTSアッセイ・コロニーフォーメーションアッセイで評価し、放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群の同定を行った。

平成25年度は、EGFR変異肺癌細胞株HCC827, PC-9と、それぞれより作成したEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(gefitinib)に対する耐性株(HCC827-GRmet, HCC827-GRstem, PC-9-GRt790m)を用いてHsp90阻害剤NVP-AUY922の抗腫瘍効果を、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性株とその親株との差に注目して評価し、さらに放射線療法との併用による抗腫瘍効果も検討した。Hsp90阻害剤は耐性株(HCC827-GRmet, PC-9-GRt790m)においても抗腫瘍効果を示し放射線増感作用も認めたが、癌幹細胞様の性質を持った耐性株(HCC827-GRstem)においては抗腫瘍効果・放射線増感作用ともに乏しかった。最終年度では、Hsp90阻害剤単独治療群・放射線単独治療群・併用療法群について、腫瘍細胞におけるDNA修復能を評価した。具体的には、ヒストン蛋白gamma-H2AXのリン酸化を免疫染色により評価した。HCC827およびHCC827-GRmetでは併用療法群で腫瘍細胞におけるDNA修復能の低下を認めたが、HCC-827-GRstemではDNA修復能の低下を認めなかった。また、Hsp90阻害剤の抗腫瘍効果を、細胞周期にも注目して検討した。HCC827およびHCC827-GRmetでは併用療法群でG2/Marrestを認めたが、HCC-827-GRstemでは認めなかった。呼吸器外科学初年度として、EGFR変異肺癌細胞株PC9, H1975, H3255、KRAS変異肺癌細胞株H358, A549、PIK3CA変異肺癌細胞株H460、AKT活性化を示さない肺癌細胞株H1299, H838の8株を使用して、2種類のHsp90阻害剤(17-DMAG、NVP-AUY922)に対して放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群を同定している。初年度として、EGFR変異肺癌細胞株PC9, H1975, H3255、KRAS変異肺癌細胞株H358, A549、PIK3CA変異肺癌細胞株H460、AKT活性化を示さない肺癌細胞株H1299, H838の8株を使用して、2種類のHsp90阻害剤(17-DMAG、NVP-AUY022)に対して放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群を同定している。最終年度では、AKT-HIF-1α経路やDNA修復関連蛋白質の活性(リン酸化)状態を、Hsp90阻害剤単独療群・放射線単独療群・併用療法群についてウエスタンブロット法により確認する。特に、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤(Gefitinib)に対する耐性株(HCC827-GRmet, HCC827-GRstem)における、耐性株の異なる特徴による抗腫瘍効果の差について、蛋白発現を詳細に検討する。また、Hsp90阻害剤の抗腫瘍効果を、細胞周期にも注目して検討する予定である。今後は上記の放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群の同定結果を踏まえて、AKT-HIF-1α経路やDNA修復関連蛋白質の活性(リン酸化)状態を、Hsp90阻害剤単独療群・放射線単独療群・併用療法群についてウエスタンブロット法にて確認する予定である。また、併用療法感受性株を用いて、有効な抗腫瘍効果を示す至適薬剤量・放射線照射量・薬剤/放射線投与のタイミングをin vitroに検討する予定である。物品を予定より安く購入できたため未使用額が生じた。平成26年度は、次年度使用額と当該年度分の助成金を消耗品の購入及び論文投稿料として使用する予定である。次年度としては、放射線増感作用および非増感作用を示す細胞株群における蛋白発現状態をウエスタンブロット法で解析する。
STAT3によるグリオブラストーマ幹細胞化の解析とその応用

癌幹細胞仮説は癌の治療抵抗性の本質と考えられるが、癌幹細胞の出自は未だ明らかでない。本研究では、癌幹細胞療法への応用を念頭に、化学療法や免疫反応といった癌細胞へのストレスに応答して通常のGBMから癌幹細胞への転換が生じるかを検証した。ヒトGBM検体において、リン酸化型STAT3(p-STAT3)が過剰発現しており、幹細胞マーカーと相関する事が確認された。幹細胞マーカーは癌細胞に対する各種細胞ストレスによって誘導され、内在性のmicro RNA-302/367 clusterによるSTAT3リン酸化抑制を介して制御されていた。今後、GBM幹細胞標的療法開発への応用が期待される。癌幹細胞仮説は癌の治療抵抗性の本質として注目されている。しかし、癌幹細胞の出自はいまだ明らかでなく、その維持機構を解明することは医学的に重要な意義を持っている。グリオブラストーマ(GBM)は癌幹細胞仮説に従うと考えられる悪性度の高い腫瘍である。また、GBMではSTAT3と呼ばれる幹細胞性維持やリプログラミングによるiPS細胞作成を促進するタンパクの活性が高いことが知られている。本研究では、GBM幹細胞からGBMが作られるという一方向性のモデルではなく、「化学療法や免疫反応といった癌細胞へのストレスに応答して通常のGBMから癌幹細胞への転換が生じる」との仮説を立て、特に重要と考えられる幹細胞化促進タンパクSTAT3の制御機構を中心として、仮説の検証・メカニズムの解明を目的とする。平成25年度はGBM幹細胞化系の確立、GBM幹細胞化メカニズムの解析およびGBM患者標本におけるSTAT3依存性幹細胞化の検討を実施した。3種のGBM培養細胞株(U87MG, U373, T98G)を用いて、細胞分散、低酸素、抗癌剤という3種のストレス下に培養したところ、リプログラミング遺伝子群(OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc, NANOG, LIN28)が、それぞれ一定の組み合わせで誘導されることを確認した。また、GBM幹細胞に発現するとの報告がある遺伝子(CD133, SSEA-1, BMX, ALOX5, etc.)の発現も誘導されることが確認された。また、上記ストレスと同時にSTAT3阻害剤の処理を加えると、GBM幹細胞化が抑制されたことから、STAT3活性化が癌幹細胞化にも重要な役割を担っていることが想定された。さらにGBM患者標本における免疫組織学的解析を実施したところ、活性化型(リン酸化型)STAT3がGBM細胞に強く発現していることを確認した。現在までに、パラフィン標本上でGBM幹細胞を染色することに完全には成功しておらず、条件検討を進めている。癌幹細胞仮説は癌の治療抵抗性の本質として注目されているが、癌幹細胞の出自はいまだ明らかでない。本研究では、GBM幹細胞からGBMが作られるという一方向性のモデルではなく、「化学療法や免疫反応といった癌細胞へのストレスに応答して通常のGBMから癌幹細胞への転換が生じる」との仮説を立て、特に重要と考えられる幹細胞化促進タンパクSTAT3の制御機構を中心として、仮説を検証した。ヒトGBM検体において、リン酸化型STAT3 (p-STAT3)の発現が亢進しており、特にストレスの強い壊死巣の周辺で高いことを確認した。また、培養細胞株を用いた実験でも、低酸素刺激もしくは抗癌剤処理によって一過性にSTAT3リン酸化が誘導されることが確認された。GBM幹細胞化のメカニズムに関して、さらに、体細胞のリプログラミングを誘導することが報告されているmicro RNA(miR)-302/367クラスターの影響を検討した。この結果、mesenchymal phenotypeを呈するGBM培養細胞U87MG細胞において、miR-302/367によりPI3 kinaseおよびSTAT3が不活性化し、各種の幹細胞関連遺伝子発現が低下、proneural typeに近い遺伝子発現形質に転換され、増殖・浸潤能が抑制された。XenograftモデルにおいてもmiR-302/367クラスターを導入したGBMの増殖・転移が抑制された(業績)。以上の結果から、GBMにおいてストレスに関連してSTAT3が活性化、幹細胞化を促進するが、内在性のmiR-302/367発現を増加することによって、この経路を不活性化できることが明らかとなった。本知見はGBM治療への応用が期待される。腫瘍学平成25年度は、所属機関の変更により、設備や資材、日程の面で、当初の研究計画通りの順番で研究を進めることが出来ず、順序を変更しながら研究計画全体を進めた。

具体的には、新所属機関では主に病理組織学的な解析に関する設備が充実しているものの、一部の分子生物学的検討やイメージングに関する機器が完全には備わっていなかったため、平成25年度に実施する予定であったイメージング細胞の作製を遅らせ、平成26年度に実施する予定であったGBM患者標本における検討を先行させた。現在は機器類等の環境がほぼ整ったため、当初の計画に沿った実験の遂行が可能となっている。全体として、研究計画は順調に進捗している。今後の研究計画としては、平成25年度に作成予定であったGBM幹細胞化イメージング細胞の作製を急ぐ。また、予定通りにGBM xenograftモデルを作製し、幹細胞化のin vivo imagingおよびSTAT3経路阻害に基づく幹細胞化標的療法の実施を順次進める予定である。GBM患者標本の検討に関してはパラフィン標本における幹細胞の染色条件の検討に時間がかかっているが、CD133, SSEA-1以外の幹細胞マーカーの使用も視野に入れ、最適化する予定である。研究計画の進行状況にも記載した通り、所属機関の変更に伴い、実験計画を微調整しながら進めている。大きな差額は生じていないが、当初の予定から少しの差額が生じてしまった。全体の計画に変更はないため、初年度使用しなかった研究費に関しては次年度に使用する予定である。
パーキンソン病患者におけるオーラルディスキネジアと補綴処置の効果に関する研究

本研究では、パーキンソン病患者に見られるオーラルディスキネジアの発現形態と補綴処置の効果について検討するために、以下のような検討を行った。1:オーラルディスキネジアを有する患者の下顎運動測定、解析システムの開発まず、下顎運動測定装置(ナソヘキサグラフ)から得た下顎運動の3次元データを、パーソナルコンピューターにて自動解析するプログラムを製作した。このプログラムは、3次元の座標軸原点を任意に設定できるもので、咬頭嵌合位を原点として設定可能な咀嚼運動と異なり持続的で不定型なオーラルディスキネジアを定量的に評価することが可能となった。つづいて、軟組織の運動を測定する際の測定点となる口角点、眼角点、鼻翼点などの安静時左右対称性を評価する目的で、写真測量の原理を応用した、軟組織3次元形態測定システムを開発し、十分な精度を有することを確認した。2:パーキンソン患者におけるオーラルディスキネジアの発現形態と補綴物の効果前述したシステムにより観察したオーラルディスキネジアを、発現部位により口唇型、舌型、下顎型、混合型に分類し、(1)無歯顎患者について、適切に製作された全部床義歯の効果を開発したシステムを用いて評価したところ、多くの患者で補綴物の効果が認められた。また、(2)咬合支持のある患者に対しては、咬合拳上を行う各種スプリントを装着し、ディスオーラルディスキネジアの改善程度を評価したところ、咬合をロックするタイプより、自由な側方滑走運動を行えるタイプのスプリントにおいて、症状緩和効果が認められた。本年度は、パーキンソン病患者に見られるオーラルディスキネジアについて、下顎運動、軟組織運動といった複数の観点からその特徴を観察する目的で、以下の検討を行った。1:オーラルディスキネジアを有する患者の下顎運動測定、解析システムの開発オーラルディスキネジアの1病態である下顎不随意運動は、咀嚼運動と比べて運動範囲が小さく、不定形な運動を呈するので、咀嚼運動の解析に用いるパラメータは有効でない。そこで、下顎運動測定装置(ナソヘキサグラフ)から得た下顎運動の3次元データを、パーソナルコンピューターにて自動解析するプログラムを製作した。このプログラムは、3次元の座標軸原点を任意に設定できるもので、咬頭嵌合位を原点として設定可能な咀嚼運動と異なり、持続的で不定型なオーラルディスキネジアを定量的に評価することが可能となった。2:写真測量の原理を応用した軟組織三次元形態測定システムの開発軟組織の運動を測定する際の測定点となる口角点、眼角点、鼻翼点などは、左右側に存在する。そのため、これら測定点の運動を左右対称性の観点から評価するには、運動のスタートラインとなる安静時の測定点の左右対称性を評価する必要がある。システムの開発に当たり、外部標点要素及び内部標点要素を解析的に求めるために、座標値が既知で、被写体周囲に立体配置された基準点が15個ある基準点を製作した。本基準点を写真の標点に使用することによって測定点の3次元座標は、この基準点群によって校正される座標系によって表すことができる。これを用いて、本システムの精度を、単写真標点時の中等誤差、基準点誤差、相対精度について、検討したところ、本研究における測定点の測定に十分は精度を有することが判明した。
中性子ラジオグラフィ-による噴流層内の流体・粒子運動の測定法の開発

1.噴流層内の粒子運動の可視化および解析H2年度に引続き、流体にフロリナ-トFCー77、粒子にガラスビ-ズを用いた噴流層内にホウ素のトレ-サ-粒子を投入し、層内の粒子運動を中性子TVセットで撮影、解析した。得られたデ-タから、粒子の高さ方向ならびに半径方向の速度を算出し、その充填高さ依存性、液流量依存性などについて検討を加えた。得られた結果については、光ファイバ-やRIをトレ-サ-に用いた他の研究者の実験結果と一致し、その測定方法の妥当性が確認できた。2.噴流層内の粒子の充填密度分布の測定中性子ラジオグラフィ(フィルム法)により、噴流層を撮影し、得られたフィルムの濃淡から粒子の充填密度ならび噴流部の形状を求めた。この際、フォトデンシトメ-タ-で数値化されたフィルムの黒化度から、層内の局所充填密度を算出するための画像処理用のプログラムを新たに製作した。得られた結果は、その再現性にまだ課題が残るものの、十分に層内の様子を説明できるものであった。3.流体の可視化液流体の可視化を行うために以下の2つの方法を実験に基づき検討した。1)流体にフロリナ-トFCー77を、流れの可視化のための造影剤に三塩化ほう素(BCl_3)を使用する。2)流体に重水を、流れの可視化のための造影剤に塩化ガドリニウム(GdCl_3)水溶液を使用する。1.実験装置の製作噴流層容器は高さ200mm,内径46mmのアルミ製容器の底部に直径5mmのノズルを設けた構造とし、充てん粒子にφ1mmのガラス粒子を、流体にフッ素系液体フロリナ-トを使用することにした。これらは、いずれも中性子がよく透過するため(実験によって確認済)、適当な造影剤を層内に入れることで、粒子・流体の動きを可視化する事が出来る。尚,実験装置は上記の噴流層本体の他、フロリナ-トを循環させるためのポンプ,ポンプのコントロ-ラ-,タンク,流量計から構成されている。2.固体粒子運動の測定ホウ素粒子を層内部に入れ、この動きを実時間中性子ラジオグラフィを用いて可視化する事で、(1)固体粒子の軌跡、(2)固体粒子のh方向およびZ方向の速度分布を測定した。(1)からは固体粒子がθ方向の速度成分を有しないことを確認し、(2)については、その充てん高さ依存性,液流量依存性についても調べ、結果が他の研究者の報告と一致する事を確認した。3.流体速度の測定流体の動きを可視化するための適当な流体ー造影剤の組合せを実験デ-タを基に検討した。現時点として有望な組合せはフロリナ-トを流体に用いるのであれば、造影剤はBCl_3、もしくは、フロン112である。但し、前者については沸点が12°Cと低いことが取り扱う上で不便な点であり、後者については造影効果が前者ほどでないこと、実験終了後に分離回収する事が困難であること等の欠点を有する。平成3年度は上記の組合せの他に、重水を流体に使用する事も含め噴流層内の流体の可視化を実現する予定である。1.噴流層内の粒子運動の可視化および解析H2年度に引続き、流体にフロリナ-トFC-77、粒子にガラスビ-ズを用いた噴流層内にホウ素のトレ-サ-粒子を投入し、層内の粒子運動を中性子TVセットで撮影、解析した。得られた結果については、光ファイバ-やRIをトレ-サ-に用いた他の研究者の実験結果と一致し、その側定方法の妥当性が確認できた。

2.噴流層内の粒子の充填密度分布の測定中性子ラジオグラフィ(フィルム法)により、噴流層を撮影し、得られたフィルムの濃淡から粒子の充填密度ならび噴流部の形状を求めた。この際、フォトデンシトメ-タ-で数値化されたフィルムの黒化度から、層内の局所充填密度を算出するための画像処理用のプログラムを新たに製作した。得られた結果は、その再現性にまだ課題が残るものの、十分に層内の様子を説明できるものであった。3.流体の可視化液流体の可視化を行うために以下の2つの方法を実験に基づき検討した。1)流体にフロリナ-トFC-77を、流れの可視化のための造影剤に三塩化ほう素(BCl_3)を使用する。2)流体に重水を、流れの可視化のための造影剤に塩化ガドリニウム(GdCl_3)水溶液を使用する。
好熱性藍色細菌のDNAマイクロアレイの開発と生物時計研究への応用

これまでに我々は、ゲルろ過精製した45merの非修飾オリゴDNAが性能、コストの両面から適当であることを明らかにした。そのようなオリゴDNAを用いて、クラミドモナスの核、葉緑体、ミトコンドリアの計231遺伝子を搭載したマイクロアレイを作製し、その性能を詳細に検討した。同一のRNAからCy3とCy5で標識されたcDNAを合成し3回のハイブリダイゼーション実験を行い、合計6点分のCy3/Cy5値の平均値を求めた。この値はすべてのスポットにおいて0.5以上2以下の範囲に収まった。これよりアレイ間での再現性は高いことが明らかになった。次に、アレイで有意な発現変化が検出された20遺伝子についてノザンブロットを行い、定量性の高さを検証した。アレイとノザン間での発現変化の定量値の相関係数は0.345であり、約4割の遺伝子でアレイの結果が定性的にノザンのものと一致した。さらに、Cy5で標識されたランダムな配列を持つオリゴDNAの混合液を用いてハイブリダイゼーションを行い、全スポットの検出感度を推定した。その結果オリゴDNAのT含量と検出感度には負の相関があることを見出した。この結果を踏まえて、アレイ用オリゴDNAの選別条件を以下のように設定した。(1)ゲノムの他の遺伝子に対して70%以上の相向性を示さない、(2)GC含量が3555%、(3)Tを22%以上含まない、(4)分子内で安定な2次構造をとらない(自由エネルギーが-10.5kcal/mol以上)、(5)繰り返し配列を含まない。好熱性藍色細菌Thermosynechococcuselongatusの全遺伝子についてオリゴDNAの検索を行ったところ、約9割について上記5つ全ての条件を満たすものが見つかった。残りの1割の遺伝子については、できるだけ基準に近い値を示すオリゴを採用した。これらのオリゴDNAをもちいて、T.elongatusのほぼ全遺伝子を含むオリゴアレイを作製した。RNAサンプルから蛍光標識cDNAを合成してハイブリダイゼーションを行った結果、十分な強度のシグナルが得られた。また、ハイブリダイゼーションの、特異性も確認することができた。
木材中の水分を利用した高圧水蒸気処理による圧縮木材製造装置の開発

スギ材や南方産早生樹材の軟質で強度が低く、材質の変動が大きいなどの欠点を、これらの材を横圧縮後、材中に含まれる水分を利用した高圧水蒸気処理によって、変形を永久固定することによって改良することが可能である。本研究では、この加工法の実用化を目指した加工装置の開発を行った。装置の設計に先立ち、スギ材やアルビジア材を用いて、種々の含水率や飽和水蒸気圧力(温度)において、放射方向の応力-ひずみ図を求め、圧縮の度合いに応じて必要とする応力を求め、最高100kgf/cm^2が必要であることを明らかにした。木材を熱板で圧縮する際、その周囲を治具によって密閉し、木材に含まれる水分を系内に閉じ込め、高圧になった水蒸気によって処理するのが、この加工の原理である。装置の主要部分は、冷却管と水蒸気による予備加熱管を備えたオイルヒート方式の熱板プレスであるが、加工材の厚さが大きくなった場合に、加熱効率を高めるのに高周波加熱装置を組込むため、熱板を電気絶縁材料とした。また、治具内が高圧となるため、防御フェンスや熱板外周に枠を設けるなど、安全装置に十分な注意を払った。厚さが小さい場合の加工では、熱板加熱のみで、180°Cでは約8分、200°Cでは約1分の処理により、変形は完全に固定できた。一方、例えば、厚さ60mmの木材を30mmに圧縮加工する場合、熱板のみの加熱では、材温度を200°Cに上げるのに約80分を要したが、高周波加熱の併用により、約4分に短縮された。本装置を用い、木材含水率、圧縮量、熱板温度、高周波照射時間などが変形の回復抑制に与える影響について調べるとともに、加工材について、硬さ、強度、材色変化などを測定した。その結果、本装置を用いた処理により、同密度で比較した時、硬質の広葉樹材と同等以上の物性を備えた圧縮木材が調製できることが明らかとなった。スギ材や南方産早生樹材の軟質で強度が低く、材質の変動が大きいなどの欠点を、これらの材を横圧縮後高圧水蒸気処理して変形を永久固定することによって改良する研究を行ってきた。その過程で、木材中に含まれる水分を利用した高圧水蒸気処理によって、圧縮変形が極めて短時間で永久固定されることを発見した。本研究は、この加工法の実用化を目指した加工装置の開発を目的とする。本年度に得られた結果を要約すると、次の通りである。装置の設計に先立ち、必要な基礎データを集積した。スギ材を用いて、種々の含水率および温度において、放射方向の応力-ひずみ図を求め、圧密度に応じて必要とする荷重量を求めた。その結果、種々の加工の可能性を考えて、100kgf/cm^2の応力を必要とすることを明らかにした。また、高周波加熱組み込みのために必要な熱板上下に配置する絶縁材料の強度と価格を検討し、熱板寸法を550mm×750mm×100mm(熱板有効寸法400mm×600mm)、総加圧力を184ton(圧力調節範囲9184ton)、絶縁材料の材質をガラスファイバーを基材とした無機材料に決定した。熱板加熱方式は、補助加熱装置としてスチーム加熱を併設したオイルヒート式(有効寸法内最大温度差6°C以内)、温度はサイリスター制御、熱板は水冷却可能とした。熱板の加圧速度は0.052.9mm/secで可変で、上昇速度は3mm/min、高周波発振器は、出力15kW、周波数13.56MHzとした。

熱板内に組み込む絶縁材料を用いた圧縮部の治具寸法は、30mm×400mm×600mmとした。熱板と治具の密閉には、耐熱性、耐薬品性を考慮し、バイトン製のオーリングを用いた。また、加工時の治具内の圧力は最高30気圧(実際の加工では20気圧以下)と見込んで設計した。安全装置には特に注意を払い、防御フェンスや熱板外周に枠を設けるなどして治具破損に備えている。現在、装置の製造が完了し、予備運転と実験を行っているが、計画通りの良好な結果が得られつつある。スギ材や早生樹材が横圧縮性能に優れていることに着目し、軟質で強度が低く、材質の変動が大きいなどの欠点を改良することを目的に、横圧縮加工について研究を行ってきたが、この場合、変形の固定化が重要要の課題となる。圧縮変形の永久固定が、木材中に含まれる水分を利用した熱処理によって、極めて短時間で可能なことを発見したので、この原理を応用した加工装置を行った。装置の主要部分は、オイルヒート方式の熱板プレスであるが、加熱効率を高めるのに高周波加熱装置の組込みを行った。設計に際して、治具内が高圧となるため、防御フェンスや熱板外周に枠を設けるなど、安全装置に十分な注意を払った。厚さが小さい場合の加工では、熱板加熱のみで、180°Cでは約8分、200°Cでは約1分の処理により、変形は完全に固定できた。一方、厚さ60nmの木材を30nmに圧縮加工する場合、熱板のみの加熱では、材温度を200°Cに上げるのに約80分を要したが、高周波加熱の併用により、約4分に短縮された。本装置を用い、木材含水率、圧縮量、熱板温度、高周波照射時間などが変形の回復抑制に与える影響について調べるとともに、加工材について、硬さ、強度、材色変化などを測定した。その結果、本装置を用いた圧縮加工により、圧縮前の素材に比べ、強度的性質、硬さ、耐摩耗性などが飛躍的に向上し、個体間の材質の変動が減少し、また、化粧性が増して、高級感が付与された。加工材は、高級な広葉樹材にも劣らない質感をもち、高級家具材、床や壁などの内装仕上げとして、また、工芸品の材料として利用可能っと判断された。
中国・日本で発生した大地震に対する国内外の宗教団体の役割に関する比較研究

26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度に実施した研究の成果としては、交付申請時に予定していた通り、初年度は主に今後の研究のための準備期間とした。具体的な準備内容としては以下の通りである。1."Tohoku Research Site"の設置。5つの地域の代表者たちと研究の協力を要請した。5つの地域とは、石巻、仙台、陸前高田、福島、南三陸の5ヶ所である。復興が進んでいる地域・遅れている地域、原発問題に直接的に携わっている地域など、様々な特徴がある地域と連携を図れるよう研究範囲となる地域を設置した。2.上記の地域に住む被災者に対するインタビューを企画。質問事項を決定するための調査をし、実際にインタビューに協力してくれる地域・被災者への協力要請を実施した。幸い全ての地域で多くの協力していただける被災者の方に会うことができた。3.被災者に対するインタビューの実施。これは我々研究者たち、及び学生たちが実際に現地を訪問することを要した。最終的には、この1年間のみで100本を上回るほどのインタビューを収集することに成功した。4.現在はこれらのインタビューを録画したビデオ内容の文字起こし、更には英訳の段階にある。新しい機器の購入したことにより、順調に文字起こしや英訳を進めることができていると考える。平成25年度に実施した研究の成果としては、交付申請時に予定していた通り、2年目にあたる本年度は主に、前年度行なった研究継続とインタビューの実施に力を入れた。具体的な内容としては以下の通りである。1.前年度設置した"Trohoku Research Site"である、石巻、仙台、陸前高田、福島、南三陸に加えて、名取市閖上や、福島において原発問題に携わる方々など、多面的な角度から研究ができるよう、研究範囲を広げた。2.前年度同様、上記の地域にてインタビューを企画した。前年度の成果を含めてプロジェクトについて説明したためか、協力していただける機会が増えた。3.更なるインタビューの実施とデータの採集。前年度からプロジェクトに携わっている学生の数名に協力を継続してもらえたため、新しい学生の指導も当初よりスムーズに行えた。今年度もまた100本近くのインタビューを採集することに成功した。4.現在は、3で述べたように、データが増えたため、それらのテープ起こしと英訳を進めている。同時に前年度のデータとの比較研究も進めている。申請書に記載した通り、研究を進めるための準備を整え、多くのインタビューを実施できていて、更にはそのインタビューを学術的な研究資料にするためのシステムを構築しつつあるため。申請書に記載した通り、研究材料の収拾とそれらの研究材料を学術的な研究資料にするためのシステムの構築を進められているため。本研究課題の今後の推進方策については、前期で行った研究を続けると共に、研究範囲としている地域を拡大し、更にはインタビューの内容となる質問事項をより詳しく、具体的なものにする。そして、今後の研究に活かせるデータにするべく、データの管理・保管のシステム化を行う。
異種金属間結合の伸長反応による鎮状貴金属クラスター分子の創製

Cp^*Ru(CO)_2Cl(1,Cp^*=η^5-C_5Me_5)とNaCo(CO)_4(2)とをTHF中60°Cで一晩反応させるとRu-Co結合形成反応が進行し、ヘテロ2核錯体(3)が良好な収率で得られた。これに対し、(1)と[PPN][Rh(CO)_4](4,PPN^+=(Ph_3P)_2N)とを同様の条件下で反応させると、(3)に対応する2核錯体は全く生成せず、代わってRu-Rh結合形成反応が一挙に2段階進行し、鎖状骨格を有するRu_2Rh3核クラスター(5)が選択的に得られた。このように、(1)との反応において、同属金属の求核種である(2)と(4)とはきわめて対照的な結果を与えた。さらに、(5)は同一分子内にルテニウムとロジウムとを有する一連の分子性金属化合物の良好な前駆体となることも判明した。(5)を種々の条件下で処理することにより、異種金属同士が交互に配列したナノサイズのRu_3Rh_2金属ワイヤー(6)やRu_4Rh_4金属ホイール(7)をはじめとするRu_2Rh, Ru_2Rh_2,Ru_4Rh_2の組成を有する一連の化合物がいずれも選択的に高効率で得られた。一方、求核種として[PPN][Ir(CO)_4](12)を用いると、(4)を用いた場合と同様の条件下では反応が全く進行しなかった。そこでRu源を[Cp*RuCl]_4(11)に代えたところ、三角形型の骨格を有する(13)が選択的に生成した。(13)はさらにCOで処理することによりRu-Ru結合が開裂して(5)に対応する(14)が生成することも明らかにした。新規に得られた化合物についてはすべてについてX線解析を行い、構造の詳細を明らかにした。単咳錯体CP^*M(C_6H_4S_2-1,2)(la, M=Rh;1b, M=Ir ; Cp^*=η^5-C_5Me_5)をビルィシグブロックとして活用し、これを系中で発生させた配位不飽和金属錯体種に付加させることにより、ベンゼンジチオラートユニットが異なる配位形式で異種金属原子間を架橋した一連の新規三核および二核混合金属クラスターが、選択的に高収率で得られることを見いだした。すなわち、1を先に報告した手法により二核錯体Cp^*M(μ_2-C_6H_4S_2-1 2)MCp^*(2a, M=Rh;2b, M=Ir)に変換した後に、配位不飽和種前駆体である[Cp^*Ru(MeCN)_3]PE_6(3)と反応させると、2の芳香環にCp^*Ru^+ユニットが結合した混合金属三核クラスター(4a, M=Rh;4b, M=Ir))がほぼ定量的に得られた。さらに、4をヨウ素で処理するとM_2Ru骨格のMRu骨格への変換が定量的に進行し、混合金属二核錯体[Cp^*M(η^2:η^6-μ_2-C_6H_4S_2-1,2)RuCp^*]PF_6(5a, M=Rh,5b, M=Ir)が生成した。

一方、1を3と直接反応させると、1の2つの硫黄原子と芳香環の一部とがCp^*Ru^+ユニットに結合した二核クラスター(6a, M=Rh;6b, M=Ii)がやはり高収率で得られた。4a,5a,6aについてX線解析を行い、構造の詳細を明らかにした。昨年度までの研究により、2種類の単核錯体Cp^*Ru(CO)_2Cl(1;Cp^*=η^5-C_5Me_5)と[PPN][Rh(CO)_4](2;PPN^+=(Ph_3P)_2N^+)とをTHF中室温で反応させると、異種金属間結合が一挙に2つ形成され、鎖状骨格を有する混合金属3核クラスター(Cp^*Ru)_2Rh(CO)_6(3)が選択的に生成することを明らかにした。本年度は、異種金属間結合の伸長によるより高次の多核混合貴金属骨格の構築をめざして、(3)の化学反応性について詳細に検討した。その結果、(3)の金属骨格の選択的変換・伸長反応が穏和な条件下で進行し、様々な金属組成と骨格を有する一連の新規混合金属クラスター[Li(H_2O)_2(thf)][(Cp^*Ru)_2Rh(CO)_4Br_2] (4), (Cp^*Ru)_2Rh_2(CO)_6Cl_2 (5), (Cp^*Ru)_4Rh_4(CO)_<12>(6)が得られることを見いだした。さらに(4)(6)のすべてに関してX線解析を行って構造の詳細を明らかにすることができた。さらに、(3)と[M(cod)Cl]_2(M=Rh, Ir;cod=1,5-シクロオクタジエン)との反応により、(4)の類縁体である(Cp^*Ru)_2RhM(CO)_4(cod)C(7:7a;M=Rh,7b;M=Ir)が講習率で得られることも明らかにした。これら一連の研究により、単核錯体(1),(2)とを出発物質として、3核クラスター(3),(4)、4核クラスター(5)、(7)、5核クラスタ-(Cp^*Ru)_3Rh_2(CO)_9Cl(8)、8核クラスター(6)が効率的に構築できることが判明した。本年度に得られた知見により、次年度にこれら混合貴金属クラスター上での有機基質の結合状態や化学反応性に関して詳細に検討する確固たる基盤を築くことができた。
地球型惑星の起源・進化・構造

本研究の主要なテーマは原始太陽系における微惑星同志の衝突が、惑星形成・進化に大きな影響を与えている事を考えて、衝突過程の物理・化学を室内実験、隕石やクレーター近傍の岩石の組成・組織に関する鉱物学的研究などを通して理解し、これから惑星形成過程を解明しようとするものである。本年度は室内実験に関する部分で名大、京大の衝突装置の改良、新装置の開発が行われ、従来不可能であった衝突条件で実験が行えるようになった。特に名古屋大学では弾丸、標的の温度制御が出来るようになり、従来実験の難しかった氷同志の衝突実験が可能となった。また京都大学ではミクロンサイズの微粒子を10km/sまで加速できるようになったために、これまでより高速度の衝突現象を調べる事ができるようになった。これらを使った実験の数はまだ限られているが、来年度以降の成果が大いに期待されるものである。また現在世界的に研究者の興味を引いているユレーライト(エイコンドライトの一種)の起源について、この隕石の鉱物学的研究とこの隕石の隕石の鉱物組織がどの様な過程で出来たかを調べるための衝突実験が行われた。鉱物学的研究と酸素同位体のデータからユレーライトが全体としては弱く、局所的に大きな衝撃によって出来たという武田(分担者)の説を裏づけるような衝突実験データが得られた。神戸大学には隕石や衝突実験にサンプルの組織を詳しく観察するための透過型電子顕微鏡が設置され、分析のための整備が行われた。この新装置は来年度以降に実際の成果を生むであろう。惑星形成過程に関する数値シミュレーションの研究について、これまでの衝突実験の成果にもとづき、微惑星の破壊を取り入れた計算が世界ではじめて実行された。これによれば地球の形成時間は約1億年となるが、惑星形成最終段階でも100個程度のかなり大型の微惑星が存在する。これらは原始太陽系の進化について我々の描像を変える可能性がある。
被爆直後（１９４５－１９４８）の広島・長崎「復興」に関する研究

本研究は、1945年後半から1948年に対象時期を限定し、被爆者の実体験から広島・長崎両市の「復興」を歴史的に考察することを目的とした。1945年1948年は、被爆問題を考察する上で重要な時期であるにも関わらず、先行研究ではこの時期の研究が十分になされてきたとはいえない。先行研究史における本研究の意義は、2点あげられる。1広島・長崎両市の「復興」に関して、既成の研究蓄積が乏しい時期の史料・証言を収集することができた点である。そして、2その収集した史料に基づいて、両市の「復興」に対する被爆者の違和感を、被爆地の地方行政府、日本政府、占領軍および国際関係において分析し検討した点である。本研究課題「被爆直後(1945ー1948)の広島・長崎『復興』に関する研究ー被爆者関係史料の発掘と復興史上の意義の考察ー」は、1945年後半から1948年に対象時期を限定し、被爆者の実体験から広島・長崎両市の「復興」を歴史的に考察することを目的としている。平成25年度の研究実施の報告として評価できる点は、広島・長崎両市の「復興」に関して、特に、既成の研究蓄積が乏しい時期の史料・証言を多々収集することができた点である。研究の対象時期に定めた、1945年1948年の3年間は、被爆直後ゆえに被爆者が最も肉体的、精神的及び経済的に行政当局をはじめとして被爆していない人々に支援を求めた時期であったにもかかわらず、アメリカ占領軍によるプレスコードにより、被爆者は原爆被害を訴えることができず、更に、日本政府が戦後の急速な「復興」政策のもとで被爆者への医療面や生活面での援護は行わなかったという時期である。被爆問題を考察する上で、重要な時期であるにも関わらず、先行研究ではこの時期の研究が十分になされてきたとはいえない。そのような先行研究史史における本研究の意義は、被爆後3年間の史料(聞き取り調査も含めて)を収集することであり、平成25年度はその調査目的を計画以上に進展させることができた。具体的には、広島平和記念資料館、防衛省防衛研究所、国会図書館、長崎原爆資料館、長崎県立図書館において史料の収集を実施した。また、聞き取り調査においては、地区別の復興状況に関する証言収集を行った。更に、復興事業に携わった人物のご遺族にご協力いただき、個人史料を調査することができた。以上、研究課題を進展させることができた。平成24年度の研究実施の報告として最も評価できる点は、既成の研究蓄積が乏しい長崎の被爆問題について、貴重な史料や証言を収集することができ、研究調査を更に発展させることができた点である。具体的には、聞き取り調査においては、長崎の証言の会の協力のもと、被爆者の方々への面接調査、及び史料調査を行うことができた。浦上地区や旧市街地の被爆者など、様々な立場の被爆者にそれぞれの戦後史について面接調査を行うことができた。予想以上に、市民生活から見た「復興」に関する貴重な証言を得ることができ、大変有意義な聞き取り調査となった。また、長崎原爆資料館において長崎平和推進協会の写真資料調査部会の協力を得て、聞き取り調査、及び、「復興」に関する史料調査を行うことができた。被爆直後の長崎市の様子や戦後復興を写真史料から調査した。長崎県立図書館にておいては、長崎の戦後「復興」に関する史料・文献調査を行った。1947年、1948年の『長崎日日新聞』を読み込み、長崎における占領政策を分析する史料を幾つか収集することができた。また、福田須磨子の文献と、個人史料を閲覧した。以上、戦後長崎の「復興」の調査を進展させることができた。最終年度にあたる26年度は、1.長崎での研究調査に集中し、2.それまでに収集した広島・長崎での史料(聞き取り調査を含む)の整理と分析を行い、3.論文執筆作業に重きを置くことを目標に研究に取り組んできた。1.長崎での研究調査について:既成の研究蓄積及び史料が乏しい長崎について、更に問題として発展させる余地があるため、26年度は、爆心地である浦上地区での聞き取り調査と共に、爆心地より離れた長崎市の他地区の被爆者への聞き取り調査、史料調査を行うことに集中して取り組んだ。

被爆者や復興事業に携わった関係者への聞き取り調査は、高齢のために一刻も争えない状況にある。聴き取り調査を通して得られる新たな知見は貴重であり、関係者が存命の間に取組まなければならない現時点での重要な課題である。そのために、史料調査も重要であるが、更に、聴き取り調査を優先的に行った。具体的には、長崎の証言の会と歴史文化協会の協力により、様々な立場の被爆者(例えば、浦上住民被爆者、旧市街地の被爆者、被動員被爆者、更には、胎内被爆者や「原爆孤児」の被爆者、等)に聞き取り調査を行った。2.広島・長崎での史料調査の整理と分析について:広島・長崎の被爆者や被爆関係者への聴き取り調査を行った際に、自宅で保存している貴重な史料を提供してくださり、復興の状況についての貴重な証言を得ることができた。また、被爆者への聞き取りの中で「被爆二世」の意識の問題も明らかになったため、「被爆二世」たちにも聞き取り調査を実施し、研究が発展した。3.最終年度の後半は、執筆作業に取り組んだ。研究成果は、研究書として27年度に刊行する予定である。国際関係学・国際関係史本研究の目的は、被爆直後(1945ー1948)の広島・長崎「復興」に関する史料の発掘と復興史上の意義の考察である。本年度は、被爆後数年間の広島・長崎の「復興」に関する史料・証言を収集することに集中したが、当初の計画以上に研究を進展することができた。特に、個人が保管している史料を確認することができ、また、ご遺族のご協力をいただき、実際に調査することができたことは研究において大きな進展となった。また、復興状況に詳しい被爆者に聞き取り調査を行うことができ、被爆者の実体験から広島・長崎両市の「復興」を歴史的に考察するという研究目的を当初の計画以上に発展させることができた。長崎の戦後「復興」に関する調査では、長崎市民、特に被爆者の実体験から復興を検討するために、長崎県立図書館、長崎原爆資料館において史料調査、及び、地区ごとに被爆者の方々への聴き取り調査を行うことができ、当初の計画以上に研究を発展させることができた。しかし一方で、長崎の調査に重点を置いたために、広島の調査は、研究計画の通りには進めることができなかった。また、国立国会図書館の東京本館に収蔵されているアメリカ国立公文書館・記録管理(NARA)の広島・長崎の占領期の史料調査を行う予定であったが平成24年度は行うことができなかった。史料に関しては、引き続き、広島市立中央図書館、広島市公文書館、広島平和記念資料館、防衛省防衛研究所、国立国会図書館、長崎原爆資料館、長崎県立図書館において調査する予定である。研究調査の進捗状況を鑑みて、広島の調査により一層力を入れる必要がある。まずは長崎の調査同様に、広島の調査においても研究史の省察をしっかり行う。その上で、史料調査や聞き取り調査を実施していく。史料調査において、具体的には、広島市公文書館には被爆関係者の個人史料が膨大に寄贈され保管されているので、復興に関する史料を読み込み、広島市という地域の復興プロセスから、復興の問題を検証していく。更に、戦後国際関係や日本史という歴史文脈の中で分類、整理していく必要がある。広島市立中央図書館には、峠三吉をはじめ、「原爆文学」の作家たちの様々な史料が保管されているので、文芸評論や作品、活動から、被爆者の復興運動が目指したものとは何かも検討していく。これらの作業に携わりながら、被爆体験と被爆者の戦後史を多様な視点から実証分析する予定である。
骨軟部肉腫の新規起源細胞、ペリサイトの悪性化機構の解明と肉腫治療薬開発への応用

1)ペリサイトの単離・培養方法の確立と不死化ペリサイト株の樹立:マウス胎児からフローサイトメトリーを用いてペリサイトを単離し、培養する方法を確立した。また、初代培養ペリサイトにSV40 large T antigenを導入し、不死化ペリサイト株の樹立にも成功した。2)In vitroにおけるペリサイトの多分化能の検証:樹立した不死化ペリサイト株を骨分化誘導培地にて培養したところ、ALP活性は著しく上昇し、石灰化能も亢進した。また、この細胞株は、脂肪分化能および軟骨分化能を有していることも明らかとなった。3)生体におけるペリサイトの多分化能の検証:ペリサイト由来細胞をtdTomatoで標識できるマウスを作出した。このマウスの各組織の凍結切片を作成し、各組織におけるtdTomato陽性細胞の分布を解析した結果、一部の骨芽細胞、骨細胞、筋細胞はtdTomatoを発現しており、これらのtdTomato陽性細胞はペリサイト由来であることが示唆された。4)In vitroでのペリサイトへの発癌誘導:1)と同様の方法にてp53欠損マウスからp53欠損ペリサイトを単離し、p53欠損不死化ペリサイト株を樹立した。また、この細胞株の分化能、増殖能、腫瘍形成能を検討した。5)ペリサイト特異的発癌変異誘導マウスの作成と解析:当該年度はペリサイト特異的pRb欠損マウスに形成された腫瘍の解析を行った。しかしながら、この遺伝子改変マウスにおいて、骨軟部肉腫の形成は認められなかった。6)ペリサイトの悪性化を誘導するシグナル伝達経路の同定:これまでに同定した肉腫発症に関与する複数のシグナリング経路の中から特に重要な経路を明らかにし、その経路の活性化もしくは不活化が肉腫の発症や増殖に与える影響を、in vitroおよびxenograftモデルを用いて検討した。1)生体におけるペリサイトの可視化:NG2発現細胞でCreリコンビナーゼ遺伝子を発現するNG2-CreマウスとtdTomatoレポーターマウスを交配させ、ペリサイトもしくはペリサイト由来細胞特異的にtdTomatoを発現させたマウス(NG2-Cre; Rosa-tdTomatoマウス)を作成した。このペリサイト可視化マウスから各組織を採取して凍結切片を作成し、各組織におけるtdTomato陽性細胞の分布を検討し、目的とする細胞が標識されていることを確認した。2)マウス肉腫形成におけるペリサイトから発生した肉腫細胞の意義の解明:p53欠損マウスは様々な肉腫を形成することから、1)で作成したペリサイト可視化マウスとp53欠損マウスを交配させることで、ペリサイト可視化マウスに肉腫形成を誘導した。形成された肉腫における蛍光タンパク質の発現を組織学的に検討したところ、腫瘍を構成する細胞の大半が蛍光タンパク質を発現しており、ペリサイトが肉腫の起源である可能性が示唆された。3)種々のペリサイト特異的発癌変異誘導マウスの作成と肉腫形成の検証:ペリサイト特異的に癌抑制遺伝子(p53、Rb1)を欠損させたマウス(NG2-Cre; p53flox/floxマウスもしくはNG2-Cre; pRbflox/floxマウス)を作成した。すでに一部のマウスで腫瘍の発症が認められ、現在、腫瘍の種類や局在、遺伝子発現などを検討中である。当初の計画通りおおむね順調に研究は進行している。1)生体におけるペリサイトの多分化能の検証:生体におけるペリサイトの細胞系譜を検討するために、タモキシフェンの投与によりペリサイト由来細胞をtdTomatoで標識できるNG2-CreER; Rosa26-tdTomatoマウスを作出した。そして、このマウスの各組織の凍結切片を作成し、各組織におけるtdTomato陽性細胞の分布を解析した。2)ペリサイト特異的発癌変異誘導マウスの作成:ペリサイト特異的にp53を欠損させたマウス(NG2-Cre; p53 flox/floxマウス)を作出したところ、生後14か月までに90%以上のマウスが骨肉腫もしくは軟部肉腫を発症した。形成された骨肉腫のほぼ全てが骨芽細胞型骨肉腫であり、軟部肉腫は平滑筋肉腫様の腫瘍であった。また、骨肉腫を発症したマウスの約30%は肺転移も認められた。一方、タモキシフェンの投与によりペリサイト特異的にK-rasの発現亢進とp53の発現低下を誘導できるNG2-CreER; K-ras flox/+; p53 flox/floxマウスも作出した。このマウスの筋肉内にタモキシフェンを投与したところ、投与部に未分化多型肉腫様の軟部肉腫の形成が誘導された。3)ペリサイトの悪性化に伴う遺伝子発現プロファイルの変化の検討:p53欠損に伴う悪性転化の前後でペリサイトに起こる遺伝子プロファイルの変化をRNA-seq解析にて検討し、肉腫発症に関与する複数のシグナリング経路を同定した。当初の計画通り概ね順調に研究は進行している。

また、この細胞株は、脂肪分化能および軟骨分化能を有していることも明らかとなった。3)生体におけるペリサイトの多分化能の検証:ペリサイト由来細胞をtdTomatoで標識できるマウスを作出した。このマウスの各組織の凍結切片を作成し、各組織におけるtdTomato陽性細胞の分布を解析した結果、一部の骨芽細胞、骨細胞、筋細胞はtdTomatoを発現しており、これらのtdTomato陽性細胞はペリサイト由来であることが示唆された。4)In vitroでのペリサイトへの発癌誘導:1)と同様の方法にてp53欠損マウスからp53欠損ペリサイトを単離し、p53欠損不死化ペリサイト株を樹立した。また、この細胞株の分化能、増殖能、腫瘍形成能を検討した。5)ペリサイト特異的発癌変異誘導マウスの作成と解析:当該年度はペリサイト特異的pRb欠損マウスに形成された腫瘍の解析を行った。しかしながら、この遺伝子改変マウスにおいて、骨軟部肉腫の形成は認められなかった。6)ペリサイトの悪性化を誘導するシグナル伝達経路の同定:これまでに同定した肉腫発症に関与する複数のシグナリング経路の中から特に重要な経路を明らかにし、その経路の活性化もしくは不活化が肉腫の発症や増殖に与える影響を、in vitroおよびxenograftモデルを用いて検討した。1) p53欠損マウスもしくはペリサイト特異的発癌変異誘導マウスに形成された腫瘍の解析については、平成29年度以降も継続して実施する。2) In vitroでのペリサイト悪性化の検証:不死化したペリサイト細胞株への癌原遺伝子の導入、もしくはCRISPR/Cas9ゲノム編集システムによる癌抑制遺伝子の不活化により、ペリサイトの悪性化をin vitroでも検証する。発癌変異を誘導したペリサイトの形態、分化能、増殖能を検討するとともに、この細胞を免疫不全マウスの皮下に移植し、肉腫形成能も検討する。3)ペリサイトの悪性化に伴う遺伝子発現プロファイルの変化の検討:悪性化前後のペリサイトの遺伝子発現プロファイルを、網羅的トランスクリプトーム解析にて比較検討する。この解析から得られたデータに基づいて、付加的な遺伝子変異を予測するとともに、悪性化に伴い活性化されるシグナル伝達経路を同定する。1)ペリサイト特異的発癌変異誘導マウスの作成と解析:ペリサイト特異的pRb欠損マウス(NG2-Cre; pR bflox/floxマウス)に形成された腫瘍の解析については、平成30年度も継続して実施する。2) In vitroでのペリサイトへの発癌誘導:現在、p53欠損ペリサイト細胞株を樹立中である。平成30年度は、このペリサイト株の形態、分化能、増殖能を検討するとともに、免疫不全マウスの皮下に移植し、肉腫形成能も検討する。3)ペリサイトの悪性化を誘導するシグナル伝達経路の同定:これまでの研究において、肉腫発症に関与する複数のシグナリング経路を同定した。平成30年度は、その中から肉腫発症に特に重要な経路を明らかにするとともに、その経路の活性化もしくは不活化が肉腫の発症や増殖に与える影響を、in vitroおよび肉腫発症モデルマウスを用いた実験を通して検討する。