hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インダクティブ結合を用いた超広帯域低電力チップ間無線通信の研究

LSI製造プロセスの微細化によるトランジスタの速度と集積度向上により演算速度は指数関数的な向上を続けている.一方、従来のプリント基板実装によるLSIシステムでは,長い通信距離と入出力チャネル数の制限により,チップ間の通信速度が制限され,チップ間通信とチップ内演算との速度格差が拡大している.いまやチップ間の通信はシステム全体の性能を律則する主要因になっており,高性能システム実現の障害となっている.この問題を解決する技術として三次元積層LSIシステムに注目が集まってきた.本研究で提案する積層チップ間インダクティブ結合通信は,チップに搭載したインダクタ間の誘導結合を入出力チャネルとする積層LSIチップ間の無線通信技術であり、本技術を確立することは高性能LSIシステム実現の鍵となる。本研究では,インダクティブ結合チャネルの面積を最小化する設計理論を確立し,またチャネルを配列する際に問題となるチャネル間クロストークの削減技術を提案し,これらを用いて誘導結合チャネルを高密度に配列したテストチップを設計,試作,評価して高速チップ間通信を達成することを目的とした.提案回路技術を搭載した配列チャネルを設計しテストチップを試作して,その性能を実測した.位相補間回路により4位相のクロックを発生して4相時分割多重を行った.時分割多重の相数を2相から4相に増加させてクロストークを削減し,チャネルの配列間隔を30ミクロンに短縮した.以上の結果,1mm^2の面積に配列可能となった10^<24>個の誘導結合チャネルにより,ビット誤り率10^<-13>以下でチップ間通信速度を1Tb/sまで高速化できることを実証した.また通信方式にバイフェーズ変調を用いて受信器のノイズ耐性を高めることで,必要な送信電力を2mWに削減した.LSI製造プロセスの微細化によるトランジスタの速度と集積度向上により演算速度は指数関数的な向上を続けている.一方、従来のプリント基板実装によるLSIシステムでは,長い通信距離と入出力チャネル数の制限により,チップ間の通信速度が制限され,チップ間通信とチップ内演算との速度格差が拡大している.いまやチップ間の通信はシステム全体の性能を律則する主要因になっており,高性能システム実現の障害となっている.この問題を解決する技術として三次元積層LSIシステムに注目が集まってきた.本研究で提案する積層チップ間インダクティブ結合通信は,チップに搭載したインダクタ間の誘導結合を入出力チャネルとする積層LSIチップ間の無線通信技術であり、本技術を確立することは高性能LSIシステム実現の鍵となる。本研究では,インダクティブ結合チャネルの面積を最小化する設計理論を確立し,またチャネルを配列する際に問題となるチャネル間クロストークの削減技術を提案し,これらを用いて誘導結合チャネルを高密度に配列したテストチップを設計,試作,評価して高速チップ間通信を達成することを目的とした.提案回路技術を搭載した配列チャネルを設計しテストチップを試作して,その性能を実測した.位相補間回路により4位相のクロックを発生して4相時分割多重を行った.時分割多重の相数を2相から4相に増加させてクロストークを削減し,チャネルの配列間隔を30ミクロンに短縮した.以上の結果,1mm^2の面積に配列可能となった10^<24>個の誘導結合チャネルにより,ビット誤り率10^<-13>以下でチップ間通信速度を1Tb/sまで高速化できることを実証した.また通信方式にバイフェーズ変調を用いて受信器のノイズ耐性を高めることで,必要な送信電力を2mWに削減した.世界で初めて電磁気的結合によるチップ間無線通信CMOS LSIを開発して、世界最高性能のチップ間無線通信を達成した。具体的には、(1)電磁界と電子回路を総合デザインする設計理論を構築した。(2)その理論よりスケーリング則を導き性能改善のための指導原理を見出した。(3)以上の成果をIEEE国際会議Symposium onVLSI Circuitsで発表した。(4)送受信機を配列配置した際のチャネル間クロストークを評価する理論モデルを構築した。(5)信号やノイズを評価するためのモニター回路を内蔵したテストチップを試作してクロストークを評価し、理論モデルを検証した。(6)クロストークを低減するためのコイル形状や送受信回路および送受信方式を考案した。(7)以上の成果をIEEE国際会議Custom Integrated CircuitConferenceで発表した。(8)送信電力を半減する新しい送信器回路を考案した。(9)チップ間距離に応じて送信電力を最適調整することによりチャネル間クロストークを最小にする技術を考案した。(10)195個の送受信回路を世界最小の50μmピッチで配列したチップを開発した。(11)以上の技術を用いたテストチップを設計試作し、4枚のチップを3次元積層実装して、195Gb/sで1.2Wのチップ間通信に成功した。(12)以上の成果をIEEE国際固体素子回路会議(ISSCC)の将来技術のセッションで発表した。世界最高速度、最小電力、最小エネルギー、最小面積のチップ間無線接続技術を開発した。データ転送速度は1Tビット/秒、消費電力は3W、消費エネルギーは3pJ/ビット、チップ面積は1mm2である。0.18um CMOS技術で実現した。これは、「Cellプロセッサ」に採用されたRambus社のチップ間インタフェース技術「FlexIO」と比べて、3.3倍高速で、1/2の電力で、1/7のエネルギーで、およそ1/4の面積である。データ転送のビット誤り率(BER)は10の-14乗以下であり、信頼性は有線並みに高い。データ転送の同期に必要な1GHzのクロックも無線伝送するので、クロックを各チップに供給する必要がない。

データはバイフェーズ変調し4相時分割多重(TDMA)して伝送される。バイフェーズ変調でSN比を劣化せずに送信電力を1/5程度に低減できることを見出した。また、4相TDMAでクロストークを低減し、チャネルピッチを削減できた。1辺が29umの正方形コイルで1Gビット/秒の通信チャネルを形成し、これを30umピッチで1024個配列した。チップの厚さが10umになるまでチップの裏面を削り、2枚のチップを表向きに積層実装して性能を評価した。以上の成果をIEEE国際固体素子回路会議(ISSCC)の将来技術のセッションで発表した。今後の研究目標は、1Pビット/秒で10Wを実現することである。そのためには、ビット当たりの消費エネルギーを現在の3pJから10fJにしなければならない。また、100万個のチャネルを10mm2程度のレイアウト面積に収めるためには、チャネルピッチを現在の30umから3umにしなければいけない。さらに回路技術と磁性体材料の活用を研究する。データ転送の消費エネルギーを3pJ/ビットから0.14pJ/ビットに低減することに成功した。パルス通信の送信エネルギーは、パルス幅の2乗に比例することを見出し、パルス幅を従来の1/5の50psに正確に制御する回路技術を研究開発したことで、送信エネルギーを1/25に低減できた。また、受信エネルギーは、CMOS回路と同様に電源電圧の2乗に比例して、デバイスを90nmに微細化することで低減できた。以上の結果、高精細テレビ解像度の動画像をH.264/AVCで圧縮伸張処理するためのプロセッサとメモリ間の通信に必要な電力を2mWに低減でき、携帯用途にも応用できるようになった。また、通信距離を従来の数100umから1.2mmに伸ばすことに成功した。受信回路の初段に30dBの増幅回路を導入した結果である。チップから放射される電磁波ノイズが比較的小さい後半のクロックサイクルで通信を行った。データ転送のビット誤り率は十の-10乗以下であり、信頼性は十分に高い。この技術を市販のマイクロコントローラチップに埋め込み、パッケージ内部に封印されたマイコンのバスのデータをパッケージ外部からモニターすることに成功した。ユーザシステムに実装されたマイコンをテスト用ピンを用いずにデバッグできるようになった。以上の成果をIEEE国際固体素子回路会議(ISSCC)の将来技術のセッションで2件の論文にまとめて発表した。また、インダクティブ結合を用いた無線通信チャネルの磁界一定スケーリング則を提唱した。チップの水平方向の微細化と共に垂直方向、すなわちチップの厚さも微細化することで、磁界結合を用いた通信チャネルの磁界を一定にできることを示した。これは、電界効果トランジスタの電界一定のスケーリング則に匹敵する。3次元集積された将来の集積回路の微細化に関する指導原理を提案できた。この知見をヨーロッパ固体素子回路会議(ESSCIRC)の基調講演で発表した。
脳微小循環解析による脳室周囲白質軟化症発症機序解明に関する研究

近年の超音波断層法の急速な進歩によって脳室周囲白質軟化症(periventricular leukomalacia)が発見され,今日,脳性麻痺の重要な原因として注目されている.しかし,その病態、発症機序について十分に明らかにできていない.本症の病態を解明し,受傷前にその予知を行うことができれば,心身障害の発生の予防に極めて重要である.最近,前期破水によって脳室周囲白質軟化症が発症するリスクが高まることが報告され,その発症機構に炎症性サイトカインの関与が示唆される.そこで今回,炎症性サイトカインであるTNF-αが脳微小循環に与える影響について検討した.さらに脳細動脈収縮反応の変化に関するRhoキナーゼの関与について検討した.まず,アンジオテンシンII(ATII)(1μg/kg/min)投与6時間前にTNF-α(25μg/kg)を腹腔内投与して生理食塩水を投与した対照群と脳細動脈の収縮反応を比較検討した.さらに,ATII投与時にRhoキナーゼ阻害剤Y-27632(10^<-9>10^<-5>Mol)を投与し,ATIIに対する脳細動脈収縮反応に対する影響について検討した.TNF-αの前投与によってATII投与による脳細動脈の収縮率は23±14%と、コントロール群の7±5%に比較して強い収縮反応を認めた(p<0.05).この増強した収縮反応はY-27632投与によって用量依存性に抑制された(p<0.05).TNF-αの前投与によってATII投与による収縮反応の増強を認め,炎症性サイトカインによる脳微小循環への影響が明らかとなった.また,この反応はY-27632投与によって抑制されたことから,炎症性サイトカインによる脳細動脈収縮反応の増強にはRhoキナーゼの活性化が関与していることが示唆された.近年の超音波断層法の急速な進歩によって脳室周囲白質軟化症(periventricular leukomalacia)が発見され,今日,脳性麻痺の重要な原因として注目されている.しかし,その病態、発症機序について十分に明らかにできていない.本症の病態を解明し,受傷前にその予知を行うことができれば,心身障害の発生の予防に極めて重要である.最近,前期破水によって脳室周囲白質軟化症が発症するリスクが高まることが報告され,その発症機構に炎症性サイトカインの関与が示唆される.そこで今回,炎症性サイトカインであるTNF-αが脳微小循環に与える影響について検討した.さらに脳細動脈収縮反応の変化に関するRhoキナーゼの関与について検討した.まず,アンジオテンシンII(ATII)(1μg/kg/min)投与6時間前にTNF-α(25μg/kg)を腹腔内投与して生理食塩水を投与した対照群と脳細動脈の収縮反応を比較検討した.さらに,ATII投与時にRhoキナーゼ阻害剤Y-27632(10^<-9>10^<-5>Mol)を投与し,ATIIに対する脳細動脈収縮反応に対する影響について検討した.TNF-αの前投与によってATII投与による脳細動脈の収縮率は23±14%と、コントロール群の7±5%に比較して強い収縮反応を認めた(p<0.05).この増強した収縮反応はY-27632投与によって用量依存性に抑制された(p<0.05).TNF-αの前投与によってATII投与による収縮反応の増強を認め,炎症性サイトカインによる脳微小循環への影響が明らかとなった.また,この反応はY-27632投与によって抑制されたことから,炎症性サイトカインによる脳細動脈収縮反応の増強にはRhoキナーゼの活性化が関与していることが示唆された.近年の超音波断層法の急速な進歩によって脳室周囲白質軟化症(periventricular leukomalacia)が発見され、今日、脳性麻痺の重要な原因として注目されている。しかし、その病態、発症機序について十分に明らかにできていない。本症の病態を解明し、受傷前にその予知を行うことができれば、心身障害の発生の予防に極めて重要である。Heme oxygenase (HO)は肝臓、脾臓などにおいて強く発現し、一酸化炭素(CO)を生成するが、肝微小循環においてはNOではなく、COが循環抵抗制御の主役を担っていることが明らかになってきた。また、HOによって同時に生成されるhemineとともに血小板凝集抑制作用を有し、局所循環に対して保護作用をもつ。そこで、我は、ラットを用いて胎児、新生児期を通したHOの脳における発現状態について検討した。その結果、HOがこれらの時期を通して脳において広く発現していることが明らかになった。現在、胎児期から新生児期にかけて一過性脳虚血を負荷し、脳内の局所におけるHOの発現量とアポトーシス感受性との関連について検討中である。また、脳室周囲白質軟化症好発部位を灌流するレンズ核線状体動脈の循環動態についてパワードプラ法を用いて検討した。その結果、正常新生児および胎児では、レンズ核線状体動脈は前大脳動脈や中大脳動脈に比較して極めて低い血管抵抗を示すこと、血流速度が緩やかであること明らかとなり、この領域に特殊な循環調節機構が存在することを示唆した。近年の超音波断層法の急速な進歩によって脳室周囲白質軟化症(periventricular leukomalacia)が発見され、今日、脳性麻痺の重要な原因として注目されている。

本症の病態を解明し、受傷前にその予知を行うことができれば、心身障害の発生の予防に極めて重要である。Heme oxygenase(HO)は肝臓、脾臓などにおいて強く発現し、一酸化炭素(CO)を生成するが、肝微小循環においてはNOではなく、COが循環抵抗制御の主役を担っていることが明らかになってきた。また、HOによって同時に生成されるhemineとともに血小板凝集抑制作用を有し、局所循環に対して保護作用をもつ。ラットを用いて胎児、新生児期の脳におけるHOの発現状態について検討した結果、これらの時期を通して広く発現していることが明らかになった。このことはH0が脳循環を保持し、局所循環を保護する働きをしている可能性を示唆した。前期破水によって脳室周囲白質軟化症が発症するリスクが高まることが報告され、その発症機構に炎症性サイトカインの関与が示唆される。今回、炎症性サイトカインの脳微小循環に及ぼす影響について検討した。Closed cranial window法を用いて脳微小血管を観察した結果、脳微小循環においてノルエピネフリン(NE)投与によって紳動脈が収縮し、アンジオテンシンII(ATII)投与では収縮しなかったことから血管反応の臓器特殊性を示唆した。TNF-α前投与によってATII投与による細動脈収縮を認めるようになったことからTNF-αが脳循環調節に影響を及ぼすことが示唆された。前期破水によって脳室周囲白質軟化症が発症するリスクが高まることが報告され,その発症機構に炎症性サイトカインの関与が示唆される.そこで今回,炎症性サイトカインであるTNF-αが脳微小循環に与える影響について検討した.ペントバルビタール麻酔下にcranial window法を用いてラット脳微小循環を観察した.ノルエピネフリン(NE) (n=5)またはアンジオテンシンII (ATII) (n=5)をそれぞれ0.0110μg/kg/min投与し,細動脈の反応を検討した.次にATII(1μg/kg/min)投与6時間前にTNF-α(25μg/kg)を腹腔内投与して対照群と比較した(n=5).さらにTNF-αの前投与時に抗ICAM-1抗体(1mg/kg)を投与して反応性の変化を検討した(n=5).NE0.01,0.1,1,10μg/kg/min投与時の血管収縮率(mean±SD(%))は4±3,15±10,24±12,28±15,ATII投与では4±5,7±4,6±5,7±5であった.NE投与では用量依存性の収縮を認めた(p<0.01)が,ATII投与では有意な変化を認めなかった.TNF-αの前投与によってATII投与による収縮率は22±16と対照群の8±6に比較して有意な収縮を認めた(p<005).この収縮反応は抗ICAM-1抗体によって抑制された.NE投与によって細動脈が収縮したがATII投与では収縮せず,脳における血管反応の特異性を示した.TNF-αの前投与によってATII投与による収縮を認めるようになったが,抗ICAM-1抗体がこの収縮反応を中和したことからTNF-αが接着反応を介して脳微小循環に作用することが示唆された.前期破水によって脳室周囲白質軟化症が発症するリスクが高まることが報告され,その発症機構に炎症性サイトカインの関与が示唆される.そこで今回,炎症性サイトカインであるTNF-αが脳微小循環に与える影響について検討した.さらに脳細動脈収縮反応の変化に関するRhoキナーゼの関与について検討した.Cranialw window法を用いてラット脳微小循環を観察した.
パラレル機構を用いた工作機械の位置・姿勢精度測定装置の開発

1.試作測定装置の改造関節に使用する磁気座用の新しい強力な永久磁石が開発されたため、それを利用して新しいジョイントの設計を行った。設計を行ったジョイントは実際の測定器に適用するまでにはいたらなかったが、十分な保持力があることがわかった。今後とも磁石材料の改良が進むであろうと思われるので、本測定装置は将来展望として明るいと思われる。2.スチュワートプラットフォーム型測定装置との比較一般的に6自由度パラレル機構としてよく知られているスチュワートプラットフォーム型について調査を行い、測定装置の構成の変更について検討した。動作範囲は現状の構造に比べて均一になるであろうが、座標計算が複雑になることがわかった。また、測定装置として最も重要な測定精度については未知であるため今後解明していく必要がある。3.測定装置のサンプリング速度向上今までの測定装置の構成だと、OSのタイマーを使用していたためサンプリング間隔が10ms以上にできなかった。そこで、測定インタフェースのメモリ機能を使用すればサンプリング間隔が100μs以下にもできることがわかり、基本的な確認を行った。これにより例えば小さな半径で高速の送り速度での計測を行った場合も測定点数が多くとれ、機械の情報がより多く得られるようになる。4.研究成果の口頭発表日本国内で7月中旬に一件、ブラジルで9月中旬に一件、計2件の国際会議で成果発表を行った。会議では本研究に対する意見を得ることができた。1.6自由度を持つ測定装置の試作(1)ベースプレートとエンドプレートを6本の脚を使って連結した測定装置を試作した。6本の脚には測定長さ10mmのデジタル測長器を使い、両端には回転運動が自由に高精度で行えるように高精度な鋼球を3点支持で磁石に吸いつける構造(磁気座)を採用した。(2)各デジタル測長器の測定長さは2チャンネル入力可能な専用のインタフェースボードを経由してPCに取り込んだ。また、本測定装置は持ち運びの便を考慮してノートPCで作業を行うため、ノートPCから計3枚のインタフェースボードを拡張できるボックスを使用した。(3)試作した測定装置の測定精度・測定範囲・分解能・動特性について研究した。2.6本の脚の長さより位置および姿勢を計算するソフトウェアの開発1.で作製した測定装置は今回考案した特別な構造をとっているため、6つのデジタル測長器の出力から6自由度を計算で求める方法については一般のパラレル機構の順運動学計算に必要な収束計算が不要なため非常に高速に行えるはずであるが、動的な精度測定を可能にするために計算速度を向上させる必要があった。そこで、MATLABなどの数値計算ソフトウェアを使用してソフトウェアを開発した。3.測定装置のキャリブレーション法の開発一般的なパラレル機構に共通することであるが、1.で作成した測定装置の関節(=球中心)の位置は微妙に誤差を含んでいるため,設計通りのパラメータを使ってエンドプレートの座標を計算しても高い測定精度は得られない。そこで、リニアスケールを用いた別置きのキャリブレーション装置を作製し、測定精度の向上を図った。近年工作機械においては、加工のフレキシビリティを得るために主軸の位置だけでなく姿勢の制御も行える、いわゆる多軸制御が広まりつつある。主軸の位置決め精度の測定方法や装置は以前からさまざまなものが考案されてきたが、姿勢の精度を含めた精度測定装置は測定精度、取り扱いの容易さ、価格を考えると適当なものが存在しないのが現状である。本研究では、位置3自由度、姿勢3自由度の6自由度を持つパラレル機構が成り立つにはアクチュエータが自由度と同じ6つあればよいことに注目し、6本のストラット(脚)の長さを変位センサで測定することにより多軸制御マシニングセンタなど加工機械の主軸の位置と姿勢の6自由度を測定する測定器を試作し、測定精度や分解能などを検討した。その主な実績は次のとおりである。1.試作測定装置の改造関節に使用する磁気座用の新しい強力な永久磁石が開発されたため、それを利用して新しい字きざの設計を行った。2.スチュワートプラットフォーム型測定装置との比較

一般的に6自由度パラレル機構としてよく知られているスチュワートプラットフォーム型について調査を行い、測定装置の構成の変更について検討した。3.シリアルメカニズムとの比較6つの変位センサを使用すれば、スチュワートプラットフォームのようなパラレル機構でなくとも6自由度で位置・姿勢が測定できるはずである。その際に使用するマスタとしてのオプティカルフラットが実用に耐えるかを試験した。4.研究成果の口頭発表日本国内と海外で一件ずつ、計2件の国際会議で成果発表を行った。
ヒト化マウスを用いたＡＴＬ腫瘍幹細胞の同定と機能解析

NOD/SCID/JAK3 KOマウスの新生仔肝臓にヒト臍帯血造血幹細胞を移植したところ、ヒトCD4陽性T細胞の増加が認められた。HTLV-1感染細胞株MT2をヒト化マウスの腹腔内に移植したところ、肝臓、脾臓および骨髄においてHTLV-1感染細胞が存在すること、非感染マウスの脾臓では見られない細胞が多数存在することから、ATL幹細胞のニッチは脾臓に存在することを示唆された。また、本モデルマウスを用いて、HTLV-1感染細胞を標的とした新規HTLV-1候補薬剤の効果検証を行ったところ、末梢血におけるヒトリンパ球数の抑制、ウイルス量の抑制などの効果が検証でき、モデルマウスの有用性も示せた。今年度は、より効率的なヒト化マウスを作製するため、免疫不全マウスであるNOD/SCID/JAK3 KOマウス(NOJマウス)の新生仔肝臓にヒト臍帯血より分離したCD34陽性造血幹細胞を移植した。その結果、移植後10週目には、移植マウスの末梢血リンパ球のおよそ3070%がヒトCD45陽性細胞に置き換わり、移植後16週目にはHTLV-1感染実験に用いるために十分なヒトCD4陽性T細胞の増加が認められた。この方法は成体マウスに移植する方法と比べて、HTLV-1感染実験開始時に若いヒト化マウスを用意できるため、より長期の感染実験が可能になると考えられる。さらに今回、ヒト化NOJマウスを用いてHTLV-1感染実験を行った。まず、HTLV-1の感染源であるMT-2細胞がマウスの体内で一定期間に死滅するように、マイトマイシンC(MMC)処理の方法を精査した。MT-2細胞をMMC 50μg/mlの濃度で37°C1時間処理すると、MT-2細胞はシャーレ内では処理後3日で死滅し、マウス体内では、少なくとも移植後2週間には検出されないことを確認した。この条件でMMC処理したMT-2細胞をヒト化NOJマウスに移植した後、マウス末梢血を用いて細胞数カウント、FACSおよびReal-time PCRを行って解析したところ、MMC処理MT-2細胞移植後3週目にはHTLV-1感染細胞が確認された。さらに、MMC処理MT-2細胞移植後4週目になると、HTLV-1感染細胞の増殖が確認され、マウスの個体によっては末梢血中に数万個/μlを超える感染細胞が存在することがわかった。このとき、末梢血中のウイルス量を調べると、3098 copies/100 cellsであった。HTLV-1感染モデルマウス作製はほぼ確立されており、今後はこのモデルを用いたATL研究やHTLV-1に対する薬剤等の評価に活用していく。ヒト化マウスを用いたヒトHTLV-1感染症モデルを構築するため、東京臍帯血バンクより譲渡された研究用臍帯血中の単核細胞(MNCs)から磁気ビーズを使ってヒトCD34陽性細胞を単離し、NOG (NOD/SCID/IL2RγKO)マウスへの移植を行った。マウス1匹あたり34 ×105個のヒトCD34陽性細胞を尾静脈より移植した場合、移植後1ヶ月目には既に末梢血リンパ球細胞のおよそ1555%にヒトCD45陽性細胞が認められたが、50%以上がB細胞(CD19陽性)であり、T細胞(CD3陽性)は見られなかった。しかし移植後3ヶ月目から4ヶ月目にかけてCD3陽性CD4陽性またはCD3陽性CD8a陽性の分化したヒトT細胞の増加が認められ(およそ1030%)、相対的にB細胞の割合は減少した(およそ1530%)。次に我々はヒトCD45陽性CD3陽性細胞が末梢血リンパ球細胞の10%以上となり、かつ50%以上のCD4細胞の分化が認められたマウスを選別して、HTLV-1感染モデルの作製を試みた。マイトマイシンCを添加した培養培地で37°C、1時間処理したHTLV-1感染細胞株MT2をヒト化マウスの腹腔内に2.5 ×106個移植した。現在、移植したマウスの末梢血をFACSとReal-time PCRにより解析し、in vivoでHTLV-1感染T細胞が増殖することを確認している。

同様の感染モデルでは移植後4ヶ月以降ATL様のリンパ腫及び白血病を発症することが報告されているため、この腫瘍細胞を免疫不全マウスに連続移植することにより、高い腫瘍原性を維持する細胞集団を同定し、その機能特性を明らかにして行く予定である。このようにヒト化マウスの作製は順調に進んでおり、HTLV-1を含めた多くのヒト感染症のモデルとして活用する準備が整った。平成26年度は、ヒト化NOJマウスのHTLV-1感染方法の改善を行った。MT-2細胞を10GyのX線で処理することで、in vitroでは少なくともX線処理後5日間は細胞増殖することなく生存し続け、その後死滅することがわかった。一方、マウス体内では、X線処理MT-2細胞は少なくとも移植後2週間には検出されないことがわかった。この方法による感染マウスではMT-2細胞移植後24週間で末梢血中にHTLV-1感染ヒトリンパ球の存在が確認された。この結果から、改良したHTLV-1感染ヒト化NOJマウスは高頻度にATL症状を発症している可能性が考えられる。また、各臓器を解析したところ、肝臓、脾臓および骨髄においてHTLV-1感染CD4+CD25+ T細胞が存在した。特に、脾臓は有為に体積が増加しており、HTLV-1感染CD4+CD25+ T細胞の集積が見られた。さらに、非感染ヒト化マウスの脾臓では観察されない細胞が多数存在することを示唆する結果が得られた。マウスでは成体においても脾臓は造血組織であり、造血幹細胞を支持するニッチが存在することが知られている。このことから、HTLV-1感染ヒト化NOJマウス脾臓から得られた結果は、ATL幹細胞のニッチは脾臓に存在することを示唆する。さらに平成26年度構築した高頻度にATL様病態を示すモデルマウスを用いて、HTLV-1感染細胞を標的とした新規HTLV-1薬剤候補の効果検証を行った。その結果、この薬剤候補は1)感染マウス末梢血におけるウイルス量の抑制、2)感染マウスにおけるヒトリンパ球数増加の抑制、3)感染マウス末梢血で増加したヒトリンパ球数の減少、4)感染マウスの脾臓の肥大抑制、などの効果があることが検証できた。このように、本研究で構築したHTLV-1感染ヒト化マウスは新規薬剤の効果検証においても有用なツールとなることが期待される。血液内科現在までにヒト化マウスの作製からHTLV-1感染モデルマウスの作製まで、ほぼ確立することができている。また、このHTLVー1感染モデルマウスによって新規HTLV-1薬剤候補の効果を検証することができるよう予備的な結果も得られている。今後さらに、このモデルマウスを用いて薬剤等の検証を行う予定である。一方、ATL幹細胞の解析については、今年度に腫瘍化したと考えられる細胞がモデルマウスに出現することが確認できた段階である。詳細な解析については、平成26年度に行う予定である。申請書では平成24年度の計画として、ヒト化マウスへのHTLV-1感染によるATLモデルマウスの作製とATL-LSC同定及び病態進展機序の解明を行うこととした。現在までに定期的に臍帯血由来造血幹細胞移植を実施することにより、安定したヒト化マウスの作製を行うことができている。また、HTLV-1感染細胞を用いたin vivo感染モデルの構築も計画通り行えている。ただし、過去に同様の系を用いた実験においては、ATL様の病態を発症するまでに4ヶ月程度の期間を必要としたため、現在はHTLV-1感染ヒト細胞の解析を行いつつ、腫瘍化した細胞の出現を待っている段階である。
キラルナノ空孔をらせん状に配列した高分子分離膜の創製

キラルなモノマーのアキラル触媒による重合、アキラルなモノマーのキラル触媒によるらせん選択重合あるいはキラルな溶媒によるアキラルポリマーへのらせん構造誘起などの方法により規則的ならせん構造を持つ高分子を合成しそれらの自立膜を調製した。それらの膜を膜状態で反応により置換基を除去することでらせん状に配列したキラルナノ孔を有する高分子膜を合成した。それらの膜が分離膜として光学異性体選択透過性を示すことを明らかにした。本研究の目的は、有機高分子膜の膜状態での反応により、「不斉情報を転写したキラルナノ空孔をらせん状に配置した高分子膜」を合成し、その機能の1つとして光学異性体の高速かつ完全分離について検討することである。本年度は、初期段階として、光学活性基を階層的に配列した高分子膜を合成するための片巻きらせん構造を持つ高分子を新たに合成した。まず、本研究課題では高分子主鎖の階層構造を利用して、光学活性基を階層的に配列制御することが重要であるため立体規則性重合を利用して、らせん選択重合による片巻きらせん構造を持つポリフェニルアセチレン誘導体の合成を行った。また、キラル溶媒による相互作用を利用した誘起片巻きらせん構造を有するポリジフェニルアセチレン誘導体の合成を行った。モデルとしてアキラルなシリル基であるトリメチルシリル基を有するポリ(4-トリメチルシリルジフェニルアセチレン)を五塩化タンタル触媒およびテトラブチルスズ共触媒を用いて重合した。生成したポリマーのテトラヒドロフラン溶液の円偏光二色性(CD)スペクトル測定において、主鎖を含むポリマーの吸収領域にコットン効果が見られないことから不斉ならせんねじれ構造を持たないことが確認できた。このポリマーを光学活性なD-あるいはL-リモネン中80°Cで8時間以上加熱すると、CDスペクトルにコットン効果が現れ、主鎖に片巻きらせん構造が誘起されたことが確認できた。また、このポリマーのトルエン溶液をキャストすることで透過測定可能な丈夫な膜が得られることが確認できた。4-(p-ホルミルベンジルオキシ)-3,5-ビス(ヒドロキシルメチル)フェニルアセチレンに対してイミン結合形成を利用して種々の置換基を導入し、それらモノマーのキラルなロジウム触媒系によるらせん選択重合により片巻きらせんポリマーを合成することに成功した。本年度は、光学活性基を階層的に配列した高分子膜を合成するための片巻きらせん構造を持つ高分子の合成を新たに検討した。まず、立体的な高分子構造が制御された高分子が得られる重合法として、らせん選択重合を利用し、片巻きらせん構造を持つポリフェニルアセチレン誘導体の合成を行った。また、除去可能な光学活性基を有するフェニルアセチレンをロジウム触媒により重合し片巻きらせん構造に制御されたポリフェニルアセチレンの合成を行った。また、光学活性な溶媒中で光学活性溶媒との相互作用を利用して合成した誘起片巻きらせん構造を有するポリジフェニルアセチレン誘導体の膜を用いた光学異性体識別能についても検討した。イミン結合を介して置換基を有する芳香族置換基を有するアキラルフェニルアセチレンのらせん選択重合により片巻きらせんポリマーを合成することに成功した。イミン結合は反応性が高く高分子膜状態でも容易に加水分解または交換反応により置換基の除去および交換が可能であり、除去によりナノ孔の生成について検討を予定している。イミダゾリル塩部位を介して光学活性なジメチルピナニルシリル基を有するフェニルアセチレンを合成し、ロジウム触媒により重合した。生成したポリマーのテトラヒドロフラン、クロロホルム、N,N-ジメチルホルムアミド溶液の円偏光二色性(CD)スペクトルでコットン効果が見られたことから高分子主鎖が片巻きらせん構造をもつことが確認できた。アキラルなポリ(4-トリメチルシリルジフェニルアセチレン)を光学活性なD-(+)-あるいはL-(ー)-リモネン中で加熱し、片巻きらせん構造をポリマーに誘起した。このポリマーの膜を用いて、濃度勾配を駆動力とするラセミ体のアミノ酸水溶液の光学異性体選択透過性について調べたところ、選択透過性が見られることがわかった。本課題は高分子主鎖の階層構造を利用して、光学活性基を階層的に配列制御することが重要であるため、光学活性基を階層的に配列した高分子膜を合成するための片巻きらせん構造を持つ高分子を新たに合成し、また、除去可能な置換基を導入し、膜状態で除去することによりナノ空孔を生成し、ナノ空孔を有する膜の光学分割能を検討した。具体的な内容については下記の通りである。1)アキラルなトリメチルシリル基を有するポリ(4-トリメチルシリルジフェニルアセチレン)のテトラヒドロフラン溶液の円偏光二色性(CD)スペクトル測定において、コットン効果が見られないことから不斉ならせんねじれ構造を持たないことを確認し、そのポリマーを光学活性なD-あるいはL-リモネン中で加熱することで、主鎖に片巻きらせん構造を誘起することに成功した。このポリマーの膜を用いたラセミ体のアミノ酸水溶液の光学異性体選択透過性からこの膜が光学分割能を示すことがわかった。2)イミダゾリル塩部位を介して光学活性なジメチルピナニルシリル基を有する片巻きらせんポリフェニルアセチレンを合成した。生成ポリマーのテトラヒドロフラン、クロロホルム溶液の円偏光二色性(CD)スペクトルでコットン効果が見られたことから高分子主鎖が片巻きらせん構造をもつことが確認できた。(最終年度に実施した研究の成果):

3)エステル基およびカルバメート基を介して光学活性基を導入したフェニルアセチレンモノマーから誘起片巻きらせん構造を有するポリフェニルアセチレンを合成した。生成ポリマー膜の膜状態での脱置換反応により、階層的に空孔を有し、かつアミノ基およびカルボキシル基を空孔内に有するポリマー膜の合成に成功した。4)ポリジフェニルアセチレン誘導体から調製した膜を用いて、脱置換反応によるナノ空孔の生成およびクリック反応を利用したナノ空孔内へ官能基の導入に成功した。キラルなモノマーのアキラル触媒による重合、アキラルなモノマーのキラル触媒によるらせん選択重合あるいはキラルな溶媒によるアキラルポリマーへのらせん構造誘起などの方法により規則的ならせん構造を持つ高分子を合成しそれらの自立膜を調製した。それらの膜を膜状態で反応により置換基を除去することでらせん状に配列したキラルナノ孔を有する高分子膜を合成した。それらの膜が分離膜として光学異性体選択透過性を示すことを明らかにした。種々のアキラルおよびキラルな置換基を有するらせんポリアセチレン類の合成には成功しているものの、それらのポリマー膜を用いた透過実験およびナノ孔の生成についてはまだ一部のポリマーについて行った段階である。丈夫な膜を得るためにはより高重合体であることが望ましいと思われる。今後の重合条件の検討も行うことおよび膜厚を大きくすることによっても改善できると考えられる。主鎖のみに不斉片巻きらせん構造を有するポリジフェニルアセチレンについて光学異性体選択透過性について検討を行ったが、選択性は見られたもののより改善が望まれる。透過基質の検討あるいは透過方法などの検討を今後行う必要がある。機能性高分子合成ポリジフェニルアセチレン系、ポリフェニルアセチレン系について種々のアキラルおよびキラルな置換基を有するらせん階層構造をもつポリマー合成を行う。合成方法としてはアキラルモノマーからのらせん選択重合、キラルモノマーからの片巻きらせん誘起重合、およびキラル溶媒による片巻きらせん構造の誘起など外部刺激による方法を引き続き検討する。合成したポリマーを製膜後、膜状態での脱置換反応により膜中へのナノ細孔の生成を行う。ナノ空孔を階層的に持つ高分子多孔膜の機能として不斉分子認識能の検討を予定している。光学異性体分離膜として、濃度勾配を駆動力とした透過およびパーベーパレーション法を検討する。また、キラルナノ孔を活用する不斉分子吸着能または触媒能についても検討したいと考えている。ブランク実験を行うことにより不斉ナノ空孔および不斉ナノ孔の階層的(片巻きらせん状)配列構造の高分子機能への効果について検証したい。種々のアキラルおよびキラルな置換基を有するポリジフェニルアセチレンの合成を行い、その片巻きらせん構造の解明、成膜性の確認を行うことを予定していたが、十分な量のモノマーおよびポリマーの合成が進んでいない。これは、最初に合成したポリジフェニルアセチレンが予想以上に分子量が高くなったことにより、溶解性の低下などから、十分に高い濃度で製膜用のキャスト液を調製することが困難であったことによる。しかし、現状は重合条件の検討により分子量を抑えることに成功しているため、順次ポリマー合成を進める予定である。
潰瘍性大腸炎大腸粘膜の免疫反応と微小循環障害機序の解明

潰瘍性大腸炎は慢性持続化や再燃緩解を繰り返す難治性疾患であり,終末像は潰瘍や仮性ポリポ-シスを呈するが,それまでに至る過程の大腸粘膜は,発赤,易出血性,びらんがみられ,このことは粘膜内や粘膜下の炎症による血管反応が惹起されていると考えられ,以下の研究を行った。1.DR抗原陽性活性化T細胞とILー2レセプタ-陽性T細胞の動態:活性化T細胞は膜表面にDR抗原を発現することから,その染色は抗Leu 2a(CD8)およびLeu 3a(CD4)抗体にFITCを標識し,さらにPE標識の抗HLAーDR抗体を用いた蛍光抗体二重染色法を行い検討したところ,本症では粘膜固有層単位面積当たりのCD4およびCD8陽性細胞数は増加し,かつDR陽性の活性化CD4陽性細胞が有意に増加していた。さらに大腸粘膜上皮のDR抗原陽性群と陰性群に分けてT細胞の活性化率を検討すると,粘膜上皮DR抗原陰性群では陽性群に比し,CD4陽性細胞の活性化率が有意に増加していた。また腸粘膜中のILー2レセプタ-陽性細胞も著明に増加していた。血清中可溶性ILー2レセプタ-値は活性化T細胞の指標ともいわれているが,本症では有意に増加していた。大腸粘膜内活性化T細胞とサイトカインの関係では,CD4陽性細胞の活性化率と血清ILー6や可溶性ILー2レセプタ-濃度との間には正の相関がみられた。2.大腸粘膜内顆粒球およびマクロファ-ジが発生するケミルミネッセンスの検討:顆粒球とマクロファ-ジが発生するfreeradicalsを発光剤ルミノ-ルを用いてケミルミネッセンス測定装置(ル-マット)で測定した。末梢血中では活動期に有意に亢進し,非活動期に低下を示した。また,大腸粘膜の生検材料を細切して測定したところ,対照に比して明らかにケミルミネッセンス値が高値を示し,本症の活動期にはfree radicalが炎症の悪化に関与していることが示唆された。
性ホルモンと自然免疫を介したシェーグレン症候群の新たな病因論の構築

免疫システム異常は自己免疫疾患を含む様々な免疫難病の誘引となる。自然免疫は、従来、獲得免疫系始動のための一時的機構とされていた。近年、この自然免疫機構の異常や、獲得免疫機構との相互作用の異常が自己免疫疾患の病態に関わるとされている。本研究ではシェーグレン症候群(SS)のモデルマウス標的臓器に存在するマクロファージに着目し、疾患の発症・進行における機能的役割を検討する。また、SSを含む多くの自己免疫疾患は女性優位に発症することから、マクロファージ制御因子としての性ホルモンの役割について解明することで幅広い自己免疫疾患への応用と女性のライフステージに合わせた新たな治療戦略の介入が期待できる。
スフィンゴ脂質によるインスリン分泌制御機構の解明

スフィンゴミエリン合成酵素1(SMS1)は、セラミドをスフィンゴミエリンに変換する酵素であり、細胞内のスフィンゴ脂質の恒常性を維持する重要な役割を担っている。本研究では、SMS1欠損マウスの示すインスリン分泌不全の原因を調べた。その結果、SMS1欠損マウスの膵β細胞では、スフィンゴ脂質組成の異常により、ミトコンドリア機能が低下し、酸化ストレスが亢進することにより、インスリン分泌機能が低下していると考えられた。また、抗酸化剤で酸化ストレスを抑制することにより、インスリン分泌を部分的に回復できることがわかった。スフィンゴミエリン合成酵素1(SMS1)は、ゴルジ体においてセラミドをスフィンゴミエリンに変換する酵素であり、細胞内のスフインゴ脂質の局在バランスを調節する重要な役割を担っている。これまでに、我々は、SMS1ノックアウト(SMS1-KO)マウスを用いた解析により、SMS1-KOマウスではグルコース刺激により分泌されるインスリン量が極端に低下していることを見出していた。そこで、本研究では、細胞内のスフィンゴ脂質が膵β細胞からのインスリン分泌を制御するメカニズムの解析を行った。まず、SMSl-KOマウスの膵島のイオンチャンネル機能を測定したが有意な変化は認められなかった。次に、SMS1がゴルジ体に局在することから、SMS1-KOマウスにおいて細胞内オルガネラにおけるセラミド量に変化が生じている可能性を検討したところ、膵臓のミトコンドリアにおいてセラミドが増加していることがわかった。また、SMS1-KOマウスの膵島では、グルコース刺激によるATP合成が著しく低下していたことから、ミトコンドリア機能が低下していることが示唆された。一方で、SMS1-KOマウス膵島のミトコンドリア膜電位は上昇しており、活性酸素種の産生が活発であることがわかった。また、それに伴い膵島のタンパク質は活性酸素種による修飾によりダメージを受けていることがわかった。実際、SMS1-KOマウスの膵島では、ミトコンドリア電子伝達系のタンパク質の発現が上昇していた。以上の結果から、SMS1-KOマウスの膵β細胞では、ミトコンドリアにおけるセラミド量が増加したことにより、ミトコンドリアの電子伝達系に機能不全が生じ、その結果として増加した活性酸素種がミトコンドリア電子伝達系の機能不全を促進しており、その機能不全を補うために電子伝達系タンパク質の発現が上昇していると推定された。スフィンゴミエリン合成酵素1(SMS1)は、ゴルジ体においてセラミドをスフィンゴミエリンに変換する酵素であり、細胞内のスフィンゴ脂質の局在を調節する重要な役割を担っている。昨年度の本研究においてSMS1欠損マウスの解析を行ったところ、1)高い生後死亡率を示すこと、2)膵島のミトコンドリア機能不全によりグルコース応答性のインスリン分泌が著明に低下すること、3)膵島において活性酸素種(ROS)が増加していること、4)脂肪が萎縮する『痩せ』の表現型を示すこと、5)酸化ストレスマーカーである8-OH-dGが尿中に高濃度で検出されること、などを見出した。そこで本年度の本研究においては、これらのSMS1欠損マウスの示す病態とROS産生増加との関連性について更に解析を進めた。SMS1欠損マウスの示すインスリン分泌不全の原因を調べたところ、膵島におけるROSの産生増加に加え、ATP合成不全、ミトコンドリア膜電位の異常、ミトコンドリア電子伝達系構成因子の発現上昇、酸化ストレス応答経路の活性化などが観察された。また、膵臓のミトコンドリアにおいては、セラミド類の蓄積が観察された。これらの結果から、SMSI欠損マウスの膵β細胞では、ミトコンドリアにおけるスフィンゴ脂質組成の異常により、ミトコンドリアの電子伝達系の機能不全が生じ、ROSの異常産生による酸化ストレスにより、細胞機能の低下が起きていると推定された。さらに、NACの投与により、インスリン分泌不全が改善されるとともに、糖の取り込みが改善された。これらの結果から、スフィンゴ脂質代謝異常による酸化ストレスの亢進が、SMS1欠損マウスの示すインスリン分泌不全の一因であることが示された。
プラズマ照射高分子を利用する新規なドラッグ工学への応用研究

1.申請者らはかねてより非反応性プラズマ照射によって種々の合成高分子粉末試料に生成する表面ラジカルをそのESRスペクトル測定とシミュレーションによって明らかにしてきた。本研究においては、同様の方法によって未検討であった合成高分子に加えて、医薬品助剤として有用と考えられる糖類(単糖類、多糖類)に種々の条件下でアルゴンプラズマ照射し、生成する表面ラジカル構造と生成特性を明らかにした。2.プラズマ照射高分子に生成する固体表面ラジカルの完全無酸素状態でのメカノケミカル再結合反応は、ポリエチレン等の主鎖型ラジカルのみならず、ポリメチルメタクリレートなどの主鎖切断型ラジカルにおいても進行したが、さらに、種々の糖類の固体表面ラジカルにおいても首尾よく進行することが示された。この様に、メカノケミカル的な固相ラジカルの再結合反応は、ポリアクリルアミドやポリアクリル酸などのように高分子間相互作用がとくに大きい高分子を除き、一般性ある反応であることを明らかにした。3.このような固体表面ラジカルのメカノケミカル再結合反応に基づいた、テオフイリン(モデル薬物)とプラズマ照射高分子粉末とを混合粉砕することによる薬物溶出制御は、ポリメチルメタクリレートなどの主鎖切断型ラジカルをもつ高分子においては、有意な効果を示さなかったが、ポリエチレンなどの主鎖型ラジカルをもつ高分子においては、いずれもその効果を示し、プラズマ照射条件やメカノケミカル反応条件の設定によって、合目的の様々なモノリティック型DDS製造の可能性が強く示唆された。
日本語アイヌ語二重言語話者の音声の収集と研究

(1)収録調査現存するアイヌ出身の方々21名を対象に、平成1、2、3年度にわたり収録調査を行い、予定した調査は流量した。残念なことにこの間お二人の方々が亡くなられた。平成4年度には、資料整理分析の段階でさらに補充調査が必要な項目について調査を行うが、その際にアイヌ語音声も可能な限り収録する予定である。(2)新しい資料の入手平成3年度から新しく研究分担者として参加した田村すず子氏(早稲田大学教授)によってアイヌ語北海道方言話者の音声資料が入手できた。本研究で既に収集された資料と合わせて、音声デ-タベ-ス「アイヌ語」CD(60分)を出版した。(3)最終年度の資料のまとめ方これまでの調査によって、アイヌ話者の日本語音声の特徴が明らかになった。これらの特徴に従って、各方言話者の音声サンプルをまとめる。また、先にだしたCDについても、そのテキストと詳しい解説をまとめて印刷する。
ボツリヌスE型毒素の神経細胞への結合、侵入機構

C型,E型毒素による培養細胞でのSNAP-25あるいはsyntaxinの分解我々はC型毒素が培養神経細胞NG108に高親和性の結合ををすることを明かにした。この結合による毒素の細胞内取り込みを検討するために,培養液に加えた毒素がNG108細胞内の標的syntaxinを分解するかどうかを調べた。0.5から50nMのC型毒素で48から96時間処理した場合に分解が認められた。96時間後のED50は1.5nMであった。50nM毒素によるsyntaxinの切断はクロロキンによって促進され,サイクロヘキシミドやNH4C1によって阻害された。50nMの濃度ではクラスリン被覆小胞によるエンドサイトーシスとは異なる経路で細胞内に取り込まれる可能性が示唆された。また,毒素の細胞への結合を阻害するモノクローナル抗体はsyntaxinの分解を阻害した。C型毒素は低温でNG108細胞に結合し,低温で結合した毒素は抗毒素抗体によって中和されsyntaxinを分解できなかった。E型毒素については,毒素の結合性を示す細胞実験系が存在しなかっことからC型毒素のような試みは行われていなかった。しかし,我々はSK-N-F1細胞がE型毒素を結合することを見いだし,毒素の結合とSNAP-25の切断実験を試みた。トリプシン処理をしたE型毒素はintactSK-N-F1細胞のSNAP-25を切断したが,未処理の毒素には切断活性が認められなかった。1.神経毒素の結合領域-ボツリヌスC型,E型毒素の標的神経細胞への結合ドメインを決定するために,毒素重鎖に対する中和活性を示すモノクローナル抗体を用いてエピトープ解析を行なった。C型毒素は重鎖C端RHNYLV(1260-1265),E型毒素はYLTHMRD(1223-1229)がエピトープであることが判明した。2.神経細胞への結合-NT2細胞をレチノイン酸で分化誘導することによって中枢神経系細胞へ分化する。分化によってSNAP25の発現が認められることが確認できた。現在結合性を検討中である。3.侵入機構-NG108細胞をC型毒素で処理した場合,0.550nM(48-96時間)においてシンタキシンの分解が認めらられた。C型,E型毒素による培養細胞でのSNAP-25あるいはsyntaxinの分解我々はC型毒素が培養神経細胞NG108に高親和性の結合ををすることを明らかにした。50nM毒素によるsyntaxinの切断はクロロキンによって促進され,サイクロヘキシミドやNH4Clによって阻害された。C型毒素は低温でNG108細胞に結合し,低温で結合した毒素は抗毒素抗体によって中和されるsyntaxinを分解できなかった。E型毒素については,毒素の結合性を示す細胞実験系が存在しなかったことからC型毒素のような試みは行われていなかった。
初期胚予定外胚葉において表皮と神経の運命分岐を制御する新規分子の機能解析

脊椎動物の未分化外胚葉は、最初に表皮あるいは神経組織へと運命分岐する。我々はアフリカツメガエル初期胚の外胚葉において、新規の1回膜貫通型タンパク質をコードするEIG121Lが、表皮への分化を促進し神経への分化を抑制することを見出した。そしてEIG121LがBMP受容体と結合することによりBMP刺激に対する感受性を増大させていることを示した。脊椎動物の初期胚発生過程においては、最初に外胚葉、中胚葉、内胚葉と呼ばれる三種類の細胞集団が形成され、その後、外胚葉からは神経や表皮などが、中胚葉からは心臓、筋肉、骨格、血液などが、内胚葉からは消化管や呼吸器などが、それぞれ発生していく。本研究では、未分化外胚葉において表皮と神経の運命分岐を担う新規の分子機構を解明することを目指した。具体的には、外胚葉の表皮への分化を促進する新規分子として我々が同定した、一回膜貫通型タンパク質EIG121Lについて、その具体的な作用機構を解析した。まず我々は、未分化外胚葉においてEIG121Lをノックダウンすると、BMP経路を伝達する細胞内シグナル分子Smad1のリン酸化が顕著に抑制されることを見出した。さらに免疫沈降実験により、EIG121Lが複数のBMP受容体と結合することを明らかとした。また、免疫染色実験により、初期胚外胚葉細胞の細胞膜、小胞体、ゴルジ体にEIG121Lが局在していること、そして少なくても細胞膜においてはEIG121LとBMP受容体が共局在しうることが分かった。以上の結果より、EIG121LがBMP経路制御因子として膜近辺で働くことが示唆された。この研究成果は、2011年2月にJournal of Biological Chemistry誌に論文として掲載された(Araki, T., Kusakabe M., and Nishida, E.J.Biol.Chem.286, 6760-6768 (2011).)。脊椎動物の初期胚発生過程においては、最初に外胚葉、中胚葉、内胚葉と呼ばれる三種類の細胞集団が形成され、その後、外胚葉からは神経、表皮、神経堤細胞などが発生していく。主要なシグナル伝達経路の一つであるRas/ERK経路は、未分化外胚葉の表皮への分化を抑制し、神経への分化を促進することが知られている。本研究では、アフリカツメガエル胚の未分化外胚葉においてRas/ERK経路により転写抑制をうける機能未知遺伝子を探索し、初期胚外胚葉の運命決定を担う新規分子の同定を目指した。平成23年度は、複数の候補遺伝子のうち、KCTDファミリーに属する遺伝子であるKCTD15に注目した。KCTD15蛋白質は255アミノ酸から成り、カリウムチャネル四量体ドメインをN末端側に持つ。アフリカツメガエル初期発生過程におけるKCTD15の発現を調べたところ、原腸胚期では外胚葉全体で発現が観察された。ところが神経胚初期になると、外胚葉のうち背側に位置する予定神経領域では発現が消え、腹側に位置する予定表皮領域では発現が持続していた。神経胚中期になると、神経堤、プラコード、蓋板といった限られた領域にのみKCTD15の発現が観察された。またFGF受容体の阻害剤存在下で胚を培養すると、KCTD15の発現部位が顕著に拡大したことから、KCTD15の組織特異的な発現には、FGFシグナルによる負の制御が必要であることがわかった。さらにKCTD15のノックダウンにより神経および神経堤特異的な遺伝子の発現が上昇して頭部形成等が阻害されることを見い出した。すなわちKCTD15が外胚葉の神経・神経堤への分化を負に制御することが示唆された。この研究成果をまとめた論文は、2012年3月5日にInternational Journal of Developmental Biologyに受理され、現在印刷中である。
シナプス前カイニン酸受容体による海馬苔状線維シナプス可塑性の制御機構

カイニン酸型グルタミン酸受容体が高密度に発現する海馬CA3野苔状線経シナプスでは、入力線維の繰り返し刺激に伴いNMDA受容体非依存性のシナプス前性長期増強(long-tem potentiation : LTP)および長期抑圧(long-term depression : LTD)を示す。これらの長期可塑性の誘発には、繰り返し刺激に伴うシナプス前部でのカルシウム濃度上昇が重要な役割を果たすと考えられている。本研究では、苔状繊維シナプスに特異的に発現するシナプス前カイニン酸受容体が長期可塑性誘発時のシナプス前終末内カルシウム動態を制御する可能性について、シナプス前終末カルシウムイメージング法および電気生理学的手法により検討した。軸索標識法によりマウス海馬スライス標本の苔状線維シナプス前部に選択的に蛍光カルシウム指示薬を負荷し、苔状線維に単発あるいは高頻度の繰り返し電気刺激を与えた際のシナプス前部でのカルシウム動態を測定した。AMPA型およびカイニン酸型受容体の非特異的阻害剤であるCNQXは、単発刺激によるシナプス前部でのカルシウム上昇に影響を与えなかったが、LTPを誘発する100Hzl秒の高頻度刺激によるシナプス前カルシウム上昇を部分的に抑制した。AMPA型受容体の選択的阻害剤であるGYKIは単発および高頻度刺激に対する応答にほとんど影響を与えなかった。海馬苔状線維の繰り返し刺激に伴い放出されたグルタミン酸によりシナプス前カイニン酸受容体が活性化され、シナプス前部でのカルシウム動態を活動依存的に増幅し、苔状線維シナプスにおけるシナプス前性LTPの誘発に促進的に作用するという機序が考えられた。