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バルザックにおける共作の生成論的研究

1.十九世紀フランス文学や生成批評全般に関連する版本、参考書籍、各種資料を幅広く収集・参照し、同時代におけるフランスの文学生産の状況(特に出版、ジャーナリズムの発展の様態)を検討した。他方、小説・演劇・論説等の各文学ジャンルにおける作家間あるいは作家と諸芸術のアーティストの協同的な作品制作のあり方について歴史的状況を整理した。2.バルザック『人間喜劇』およびその他の作品に関して、本研究の観点から資料収集を進め、必要な書籍や論文を入手するとともに、フランス学士院図書館ロヴァンジュール文庫のバルザック関係の原資料(プラン、草稿、校正刷り、版本、契約書、書簡)を調査し、『人間喜劇』ほかの作品に関して保存されている共作に関連する資料群を閲覧し、保存状況を精査した上で研究ノートを作成した。3.最新のバルザック研究、とりわけ生成論的アプローチによる研究の進展状況を参照し、国内およびフランスの研究会やセミナーなどの場で第一線の研究者たちと意見交換を行った。特にリヨン高等師範学校のエリック・ボルダス教授、ランス大学のナタリー・プライス教授から数度にわたって本研究課題について意見をうかがうことができ、研究方針や関連資料についてアドヴァイスを得た。4.上記の準備作業に基づき、バルザックの文学制作における共作の通時的進展を1)共同執筆、2)オムニバス作品への寄稿、3)序文等のパラテクストの寄稿、4)反=協力的介入の問題を考慮しながら分析し、論文「バルザックにおける共作についてー問題の素描の試みー」にまとめた(投稿済、2019年度中に刊行予定)。また、バルザックの作品制作メカニズムと当時のメディアの関係を広く考察した一冊の共著と一編の論文の刊行を行い、同じ問題系をめぐって三本の研究発表を行った。全般的な資料収集、ロヴァンジュール文庫関連の原資料の閲覧が計画通り順調に進み、バルザックにおける共作について、時代背景を考察し、個別のケースの具体的な進展について論点整理を行って論考を進めることができた。十九世紀における共作の問題の全般的状況とバルザックにおけるその展開について基礎的資料の収集と情報の整理を終えたので、今後は研究計画の完遂に向け、原資料調査によるバルザックの共作の実態とその創造性の分析を行っていく。2019年度は関連するバルザックの版本(連載小説、初版、再版)を広く参照するとともに、草稿・校正刷りなどの自筆資料の分析を進め、その中から特に重要な資料をピックアップし、ケーススタディーの分析を行う予定である。2020年度はこの作業を継続し、バルザックにおける共作の様態と個別の事象について総合的にまとめた報告の作成を進めて行く。
タバコ培養細胞の植物ホルモン応答を利用した根冠細胞の分化モデル系の開発

タバコ培養細胞BY-2は、オーキシン(2,4-D,0.2mg l^<-1>)を添加した通常培地では活発に分裂・増殖し、小型の細胞が多数直列に連なった細胞塊を形成する。その際、色素体は未分化な状態(原色素体)のままである。一方、オーキシン欠如・サイトカイニン(BA,1 mg l^<-1>)添加培地で培養した場合には、細胞増殖は抑制され、細胞は大型化し、色素体は大量のデンプンを合成・蓄積してアミロプラストへと分化する。こうした変化は、基本的にはオーキシンの除去により引き起こされるが、サイトカイニンの添加によってさらに強化される。オーキシン欠如・サイトカイニン添加培地では、(1)不活発な細胞増殖、(2)細胞体積の増大、(3)アミロプラスト分化、などの特徴に加えて(4)細胞相互の剥離、(5)細胞の寿命の短縮、(6)分泌活性の増大といった、根冠における細胞の挙動との類似性が多く認められた(以下、根冠型細胞分化誘導系と記載)。それらのうち、(6)について詳しく検討した結果、BY-2の根冠型細胞分化誘導に伴って特異的に分泌されるタンパク質4種類の存在が明らかになった。そのうち一つは分泌型のペルオキシダーゼであることが判明し、SPCT44と名付けたが、残りについてはN末端がブロックされておりアミノ酸配列を決定することができなかったため、内部アミノ酸配列の決定を進めている。また、根冠型細胞への分化に伴う遺伝子発現の変化を明かにするために、ddRT-PCRおよびBY-2のマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析(理化学研究所との共同研究)を行い、根冠型細胞分化誘導過程で特異的に発現する遺伝子をいくつか同定した。マイクロアレイの成果は理化学研究所のBY-2 ESTデータベース(http://mrg..psc.riken.go.jp/strc/)にて公開されている。今後は本研究で得られた分子マーカーを利用し、植物体の根冠でも同様に分泌タンパク質や遺伝子発現の変化が起きているかさらに検討していく予定である。本研究の目的は、タバコ培養細胞BY-2のホルモン応答を利用して、根冠における細胞分化のモデル系を開発することである。タバコ培養細胞BY-2はオーキシン(0.2mg/l2,4-D)を含む通常の培地中では活発に分裂・増殖し、細胞体積は比較的小さく、色素体は未分化な状態を保つ。一方、オーキシンを除去しサイトカイニン(1mg/l BA)を添加したアミロプラスト分化誘導培地中では、細胞はほとんど増殖せずに体積を増大し、色素体は大量のデンプンを蓄積したアミロプラストに分化する。改変培地における細胞の挙動は、根冠における細胞の挙動と類似していることから、改変培地における細胞の挙動をさらに詳細に調べた。その結果、改変培地では培養が進むにつれてクラスターあたりの細胞数が減少することから、細胞相互の接着が弱く、剥離しやすくなっていることが示唆された。また、細胞から培地中に分泌されるタンパク質量も通常の培養条件に比べ増大していること、培養開始後4日目以降になると死細胞が急激に増加することも明らかになった。こうした細胞の剥離、分泌活性の増大、細胞の短命化などの特徴も、根冠における細胞の挙動と一致する。

さらに、根冠において特異的に分泌されるタンパク質の存在が報告されていることから、アミロプラスト分化を誘導した培養細胞でも同様に特異的な分泌タンパク質があるか検討した結果、88kDaおよび44kDaの、アミロプラスト分化誘導条件に特異的な分泌タンパク質を同定した。44kDaのタンパク質(SPCT44と命名)についてN末端アミノ酸配列を決定したところ、いくつかのペルオキシダーゼと非常に高い相同性を示すことが明らかになった。現在、SPCT44を初めいくつかの分泌タンパク質について内部アミノ酸配列の決定を行うための準備を進めている。本研究の目的は、タバコ培養細胞BY-2のホルモン応答を利用して、根冠における細胞分化のモデル系を開発することである。タバコ培養細胞BY-2はオーキシン(0.2mg/1 2,4-D)を含む通常の培地中では活発に分裂・増殖し、細胞体積は比較的小さく、色素体は未分化な状態を保つ。一方、オーキシンを除去しサイトカイニン(1mg/1BA)を添加したアミロプラスト分化誘導培地中では、細胞はほとんど増殖せずに体積を増大し、色素体は大量のデンプンを蓄積したアミロプラストに分化する。前年度は改変培地における細胞の挙動が根冠における細胞の挙動と類似していることに注目し、根冠において特異的に分泌されるタンパク質の存在が報告されていることから、アミロプラスと分化を誘導した培養細胞でも同様に特異的な分泌タンパク質があるか検討した結果、88kDaおよび44kDaの、アミロプラスト分化誘導条件に特異的な分泌タンパク質を同定した。今回、さらに詳細な比較を行ったところ、新たに46kDaのアミロプラスト分化誘導条件に特異的な分泌タンパク質を見い出した。また、44kDaのタンパク質(SPCT44と命名)については、アスパラガス培養細胞の細胞壁結合型ペルオキシダーゼと高い相同性を示すことから、細胞壁構成タンパク質についても検討を行った。その結果、SPCT44自体は細胞壁結合タンパク質ではないが、新たにアミロプラスト分化誘導条件(47kDa)および非誘導条件(62kDa,49kDa)に特異的な細胞壁タンパク質を見い出した。現在、これらアミロプラスト分化誘導条件に特異的なタンパク質について内部アミノ酸配列の決定を行うための準備を進めている。タバコ培養細胞BY-2は、オーキシンを含む通常の培地中では活発に分裂/増殖し、小型で、色素体は未分化な状態を保つが、オーキシンを除去しサイトカイニンを添加したアミロプラスト分化誘導培地中では細胞は殆ど増殖せずに体積を増大し、大量のデンプンを蓄積したアミロプラストが形成される。本研究では、アミロプラスト分化誘導系における細胞の挙動が根冠における細胞分化過程に類似していることに注目し、この系が根冠細胞分化のモデル系となり得るか検討するための基礎的な情報を収集した。根冠と同様、特異的分泌タンパク質が存在するか検討した結果、アミロプラスト分化誘導条件で分子量88,46,および44kDaの分泌タンパク質が特異的に分泌されることが明らかになった。このうち、44kDaの分泌タンパク質に関してはN末端アミノ酸配列の分析結果からペルオキシダーゼであることが判明したが、それ以外のタンパク質のN末端はブロックされており、配列を決定できなかった。限定分解による内部アミノ酸配列の決定を試みているが、決定には至っていない。また、44kDaの分泌タンパク質がペルオキシダーゼであることから、根冠における細胞外ペルオキシダーゼ活性増大の可能性を検討したが、肯定的な結果は得られなかった。
色素性乾皮症の迅速診断法の確立

色素性乾皮症が疑われる光線過敏症状を来たしている患者7名について、皮膚生検ののち、繊維芽細胞を培養した。これを96穴プレートにまき、UVCを照射してDNA損傷を誘発した。このDNA損傷が修復される際に、チミジンアナログとしてエチニルデオキシウリジン(EdU)を取り込ませた。これにアジ化蛍光色素を加えた後、蛍光画像自動取得顕微鏡装置を用いて蛍光画像を自動収集した。この蛍光強度(=修復活性)を解析し、不定期DNA合成能(UDS)およびRNA合成能(RRS)を測定した。UDSとRRSの組み合わせにより、色素性乾皮症の亜型分類、責任遺伝子候補が推定可能である。次に、患者由来繊維芽細胞に、既知のXP各群遺伝子cDNAを含むレンチウイルスを患者細胞に感染させ、その細胞にUVCを照射後、上述のごとくUDS、RRSを測定し、相補されている群を決定する。(遺伝子相補性試験)しかし、現時点で、上記診断システムを用いて色素性乾皮症と診断が確定したものはおらず、よって、責任遺伝子のDNAシークエンスも行うことができていない。但し、臨床的に光線過敏症状をきたしているため、色素性乾皮症ではない、新たな光線過敏症をきたす疾患を同定できる可能性があり、今後、遺伝子解析も視野に入れている。色素性乾皮症(xeroderma pigmentosum、以下XP)は本邦での頻度は稀ではあるが、光線過敏症の患者が来院した際には鑑別疾患の一つとして見逃してはならない重篤な疾患である。しかし、従来の方法による相補性試験は迅速性、簡便性、さらに感度に問題があり、確定診断に至らない例が存在しているのが現状である。今回、我々はDNA修復を研究している基礎研究教室と連携し、エチニルウラシル化合物の取り込みと直接蛍光標識法を取り入れた高感度アッセイを用いてUDS(不定期DNA合成能、unsheduled DNA synthesis:UDS)およびRNA合成能(RNA合成回復能、recovery of RNA synthesis:RRS)を測定し、XP遺伝子発現ベクターをプラスミドからレンチウイルスに変えトランスフェクション効率を飛躍的にあげることにより、XPの亜型診断を迅速に行った。光線過敏をきたし、XPを疑った症例17例について、下記解析を行った。1.患者の皮膚生検を試行し、線維芽細胞を培養する。2.UDSを測定し、XPの診断を行う。UDS以外にRRSも測定する。3.XPAXPGまでのコーティンク領域を組み込んだレンチウイルスを感染させ、相補を調べ、群を決定する。4.候補遺伝子のDNAシークエンスを行い、XPの遺伝子診断を確定する。上記解析の結果、色素性乾皮症F群3例、色素性乾皮症A群1例、色素性乾皮症バリアント4例の診断および亜型診断をつけることができた。残り9例はXPとは診断できなかった。XPにおいては、バリアントも含め、迅速に診断確定を行う事ができ他たと考える。診断未確定例にはUDS、RRSが正常であっても、DNA損傷修復に関与する分子の軽微な機能低下が関与している可能性があるのではないかと考えられるため、今後は、これらについても検討していきたい。皮膚科学色素性乾皮症が稀な疾患であることから該当患者数が少ないため、目標症例数に達していない昨年度と同様、引き続き残っている症例並びに新規症例を収集し、色素性乾皮症の遺伝子変異の同定を行っていく予定である。色素性乾皮症が稀少な疾患で該当患者数が少ないため、新規症例を集めて今後の検討を行う。培養費用:700,000円、UDS、RRS測定用試薬:900,000円、DNAシークエンス:1,200,000円、その他分子生物学的実験費用:150,000円を予定している。
糸状菌CCAAT配列結合複合体による鉄のホメオスタシス制御機構

糸状菌における鉄の恒常性に関わる転写因子HapXに関して以下の新しい知見が得られた。1)チトクロームcなどのように鉄を含んだタンパク質をコードする遺伝子プロモータへのHapXの結合様式(HapB/C/Eとの協調的結合と鉄関連遺伝子への特異的結合)を解明した。2)invivo解析によりHapXの鉄ホメオスタシスへの関与を示した。3)HapXの機能ドメインを調べるための部分欠失変異の作成と部分欠失リコンビナントタンパク質を取得した。HapB/C/E依存のHapXのDNA結合性をin vitroで、HapXの認識配列に関して以下の結果を得た.1) EMSAによる結合領域の絞込み:チトクロームc遺伝子プロモータ由来のDNA断片を各種調製し、プローブを作製した。HapB/C/E複合体については既にリコンビナントサブユニットから複合体を再構成をする条件を見出していたので、そこにHapXを加えることによりHapB/C/E-HapX複合体とチトクロームcプロモータとの結合を調べ、HapB/C/E-HapX複合体の認識配列を絞りんだ。ii)DNaseIフットプリント法による結合領域の決定:DNaseIフットプリント法は複合体がプロモータのどの領域と相互作用しているかの情報を詳しく得るための有力な手法である。チトクロームcプロモータに対してのHapB/C/Eの結合パターンとHapB/C/E-HapXのパターンを比較し、HapXが実際にDNAにコンタクトしていることを示すことが明らかとなった。保護部位の比較によりHapXはCCAAT配列の約10塩基対上流に結合することが判明した.iii)変異プローブを用いたHapX認識配列の推定:i)のEMSAによる絞込みの結果、HapB/C/E-HapX複合体が結合する最小領域が明らかとなったため、この配列に対応する合成DNA(領域内に点変異を導入したプローブのセットも併せて調製した)を用いたEMSAにより同定をおこなったところ、CCAAT配列から約10塩基対離れたGAT配列がHapXの認識配列であることが明らかとなった。2)その他の鉄関連遺伝子の解析:チトクロームcの解析と同様に、その他の鉄関連遺伝子(アコニターゼ遺伝子acoA、シスアコニターゼ遺伝子lysF、鉄取り込み系抑制因子遺伝子sreA)についても解析を行い、チトクロームcの解析で得られた結論を支持する結果を得た。平成22年度に明らかになった鉄関連遺伝子プロモータにおけるHapXの結合配列に関する知見をもとに以下の成果を得た。1.HapX認識配列に変異を導入し、in vivoでのHapX結合の影響を調べた。平成22年度の解析で明らかになったHapXが結合できなくなるような変異プロモータを用い、HapX結合の抑制機構への影響をin vivoで調べた。具体的には野生型のチトクロームcプロモータと変異プロモータをレポーター遺伝子(lacZを用いる)に連結し、A. nidulansに導入後、β-ガラクトシダーゼ活性を調べることにより解析をした。その結果、鉄欠乏時にチトクロームcの発現が抑制されるのにはHapXおよびチトクロームcプロモータ上の推定HapX結合配列が必要であることが明らかとなった。2.HapXの部分欠失変異リコンビナントタンパク質を作製した。平成24年度の実験に用いるHapXの部分欠失変異リコンビナントタンパク質を調製した。HapXはN末端部分にHapB/C/E複合体と相互作用すると推定されているドメイン、それに続く塩基性のドメイン、鉄と相互作用することが推定されているシステインに富むC末端ドメインを有する。これらのドメインに着目して、各ドメインを分割するように部分欠失変異リコンビナントタンパク質を生産するような大腸菌の発現系を構築し、各欠失リコンビナントタンパク質を調製した。具体的には全長のHapXおよびDNA結合に重要と思われるN末端部分のHapB/C/E複合体との相互作用ドメインとそれに続く塩基性のドメインを含むような複数のリコンビナントタンパク質の発現系を構築し、リコンビナントタンパク質を取得することに成功した。これらを用いて平成24年度の実験を遂行する。1)前年度に引き続き、HapX認識配列に変異を導入し、in vivoでのHapX結合の影響を調べた。平成24年度には、野生型のチトクロームcプロモータと変異プロモータをレポーター遺伝子(lacZを用いる)に連結し、A. nidulansに導入後、β-ガラクトシダーゼ活性を調べ、in vivoにおけるHapX結合部位の解析をおこなった。その他の鉄関連遺伝子(sreA, acoA, catB)については、in vitroによるHapXの結合様式を調べた。2)HapXの部分欠失変異リコンビナントタンパク質を作製した。

これらのドメインのうち、C末端のドメインを欠くような部分欠失変異タンパク質を生産するような大腸菌の発現系を構築し、各欠失リコンビナントタンパク質を調製した。3)HapB/C/EおよびHapXの部分欠失変異体を利用し、それぞれの機能ドメインを同定する実験に関しては、時間の都合上行われなかったため、計画期間終了後も引き続き行う。4)これまでの結果を総合し、真菌類における鉄関連遺伝子の転写抑制機構について考察するゲノム配列が明らかになっている近縁の真菌類についても、今回得られた知見が一般化できるかを調べた。その結果、子嚢菌類のみでなく、担子菌類の一部にもHapX様の因子が存在することが明らかとなった。当初の計画通り、平成22年度にはin vitroによる解析でHapXの結合配列を決定することに成功し、それらの知見をもとに平成23年度にはその配列に変異を導入し、in vivoの解析により、結合配列の重要性を示すことができた。以上のように順調に研究は遂行されているため、(2)であると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。重大な問題点なく研究が遂行されているため、計画に基づいて今後も研究を遂行する。平成23年度は研究の遂行に重点を置いたため、成果発表が後回しとなった。平成24年度はまとめの年度であるので、成果発表を積極的に行いたい。
神戸サイ化石と極東アジアの環境変遷

平成11年度に続き,始新世のサイ類(アミノドン類)の化石を神戸市北区で発掘し,合計3頭に由来する歯と骨の化石が神戸市北区の神戸層群より得られた。これらは,中央アジアの後期始新世に繁栄したZaisanamynodonであることが明らかとなった。これにより,神戸層群はアジアの哺乳類年代区分であるエルギリン期(後期始新世)に相当することが明らかとなった。植物化石が示す年代も,神戸層群の時代は後期始新世であることを示した。一方,今回得られた年代測定結果は4千万年前という年代値を示した。これは哺乳類・植物化石が示す年代も古い。この矛盾を解決するためには,より精度の高い年代測定を行うと同時に,古地磁気層序を確立する必要がある。今回,従来古地磁気資料として使われて来なかった泥岩からも古地磁気方位を得られることが明らかとなった。これにより,精度の高い古地磁気層序を神戸層群において確立する道が開けた。アミノドン類化石産出地点の堆積相の分析から,扇状地外縁部から下流域の低地帯の沼沢性の堆積物および古土壌中に,アミノドン類化石は埋没したものと推定された。これは,植物化石,貝化石,アミノドン類化石の保存状態から推定される古環境と整合性があった。限られた地点に関する分析ではあるが,この結果は東アジアの古第三紀哺乳動物化石産地でははじめての詳細な古環境復元であり,他の東アジアの古第三紀哺乳動物化石産地において古環境復元を今後進める上で,モデルケースとなるものである。今回は,普及教育の一環として,市民が参加する発掘を試みた。その際,2タイプの参加方式を実施した。第一のタイプは,少数の市民が,長期にわたって発掘に本格的に参加するものであり,第二のタイプは,多数の市民が短期の体験型の参加をするものである。このような市民参加型の発掘を行うには,博物館の普及活動を支援するNPOの存在が重要であった。神戸市北区において、始新世のサイ化石の発掘調査を約1ヵ月間行った.サイの化石は,神戸層群吉川層長尾砂岩泥岩層中の植物遺体をほとんど含まない青灰色の砂岩シルト岩層およびその上位に重なる植物遺体を大量に含む砂岩層の2層から産出した.上位の層は下位の層を削り込んでおり,チャネルを形成している.産出した化石は上下層ともに大部分が骨片であったが,これらは上位の化石産出層準では,複数個体に,これに対して下位の層では一個体に由来していた.同定に耐えられる標本は,上位層からの寛骨(腰の骨),臼歯,犬歯,椎骨,下位層からの寛骨,肋骨,椎骨,下顎犬歯,臼歯,小臼歯などである.これらの剖出,保存処理,同定は12年度に行う予定であるが,発掘現場で観察した限りでは,今回の化石はザイサンアミノドンである可能性が高い.また化石骨の採取と同時に,大型植物化石の採集,地層の堆積学的な観察,花粉・珪藻化石試料の採取,古地磁気試料の採取をおこなった.古地磁気試料(シルト岩)からは残留磁化が確認されたので,さらに資料を周辺地域でも採取すれば古地磁気層序を確立することが可能である.残りの試料の分析は12年度に行う予定である.今回の発掘では,近隣大学・高校の学生,社会人などからなる多くのボランティアが参加して進められた.したがって今回の発掘は学術調査であると同時に普及教育の場ともなった.現場の安全上の問題等から今回はボランティアを限られた範囲から募集したが,12年度に行う第二地点での化石発掘では,発掘ボランティアをより広く募集する予定である.平成11年度に続き,始新世のサイ類(アミノドン類)の化石を神戸市北区で発掘し,合計3頭に由来する歯と骨の化石が神戸市北区の神戸層群より得られた。

第一のタイプは,少数の市民が,長期にわたって発掘に本格的に参加するものであり,第二のタイプは,多数の市民が短期の体験型の参加をするものである。このような市民参加型の発掘を行うには,博物館の普及活動を支援するNPOの存在が重要であった。
ヒト環境発癌分子を標的とした新規発癌抑制物質スクリーニング系の構築

従来、多くの発癌予防試験はPKC活性化剤であるTPAを用いた発癌誘導に対する予防効果の検討によってなされてきたが、TPAによる発癌誘導機構は不明であった。我々はサイクリン依存性キナーゼの阻害因子として細胞増殖抑制に働くp18遺伝子の発現低下が、TPAによる発癌誘導に深く関与していることを見出した。本研究ではこのp18遺伝子発現低下を回復させる新規発癌抑制物質のスクリーニング系構築を目指し、まず既に発癌予防効果が指摘されている食品成分について試行したところ、TPAによるp18発現低下を、ゲニステインとクルクミンが回復させうることを見出した。特にゲニステインはチロシンキナーゼ阻害活性を有することが知られており、チロシンキナーゼの関与が考えられた。ハービマイシンA等のチロシンキナーゼ特異的阻害剤を用いても、TPAによるp18発現低下が回復されたことから、この経路に実際にチロシンキナーゼが関与している可能性が考えられ、現在その同定を行っている。一方で、ケルセチンがTPAによるp18発現低下を促進してしまうこともわかった。ケルセチンは発癌予防効果だけでなく、場合によっては発癌促進に働くとする報告も散見され、今回の結果でその分子機構が説明出来るかも知れない。本研究でゲニステインやクルクミンのような発癌抑制物質と、またケルセチンのような発癌促進に働く可能性のある物質を見出せたことで、TPAによるp18発現低下に着目したスクリーニング系の有用性が示された。同時に、発癌プロモーターを用いた動物発癌実験系が、ヒト発癌において中心的な役割を果たすRB遺伝子の失活に至る経路と密接に関連していることと、癌予防におけるRB経路の深い理解が極めて重要であることがあらためて示された。従来、多くの発癌予防試験には、PKC活性化剤であるTPAを用いた発癌誘導が施され、それに対する予防効果をもって発癌予防効果の有無が検討されてきたが、TPAによる発癌誘導の分子機構は不明であった。我々はTPAによる発癌誘導の分子機構は、サイクリン依存性キナーゼの阻害因子として細胞増殖抑制に働くp18遺伝子の発現低下によるものであること見いだしていた。本年度は、このTPAにより発現低下がもたらされたp18遺伝子の発現が、従来発癌予防効果があると判定された食品成分によってどのような影響を受けるかを検討した。細胞はヒト胚性腎細胞であるHEK293を用い、TPAと食品成分を同時処理した際のp18発現量をタンパク質レベルで評価した。用いた食品成分は、アピゲニン、ゲニステイン、クルクミン、エピガロカテキン-3-ガレート、ケルセチンの5種である。検討の結果、ゲニステインとクルクミンには、TPAによるp18の発現低下を阻害する作用を認め、逆にケルセチンにはp18の発現低下を促進する作用を認めた。これらの結果は、ゲニステイン及びクルクミンの発癌予防効果を分子レベルで明らかにしたものであり、またケルセチンによるp18発現の低下促進も、ケルセチンが場合によっては発癌促進に働く作用を示す過去の報告を分子レベル説明しうる結果となった。したがって、このTPAによるp18発現低下に対する食品成分による影響を検討する事は、発癌抑制物質だけでなく発癌促進物質のスクリーニングにも有用である事が明らかとなった。
下水処理施設におけるダイオキシン類の挙動と化学的凝集沈殿処理の効果に関する研究

化学凝集沈殿処理を行っている実験プラントから着水井流入水、初沈流出水、曝気槽内活性汚泥、処理水、初沈汚泥、返送汚泥を各2L採取し、試料とした。0.45mumのメンブランフィルターでろ過後、ろ液はジクロロメタンで液々抽出、残渣は風乾後ベンゼンでソックスレ-抽出を行った。クリーンナップとして40%H_2SO_4/SiO_2カラムで有機物を除去し、続い多層カラム(2%KOH/SiO_2、44%H_2SO_4/22%H_2SO_4/SiO_2、10%AgNO_3/SiO_2)処理を行った。内標準物質添加後、液量を50muLとし、GC/MSの試料とした。なお、アルミナカラム(A1_2O_3)は回収率が確認できなかったため省略し、また濃縮後の初沈汚泥試料はゲル状を呈し、前処理が不十分であると判断して、GC/MS分析は保留した。GC/MS分析でははじめに着水井流入水試料をHRGC/HRMS/SIMによって分析したが、夾雑成分が非常に多くベースラインが高くなったため、四塩化六塩化ダイオキシン類は検出できなかった。ピークが確認できたのは八塩化ダイオキシンであり、内標準との比較からおよそ30ng/Lであった。その他の試料についても、ダイオキシン類と同時に溶出する夾雑成分のためイオン源でのイオン化が安定しないようであり、安定したデータは得られなかった。そこでHRGC/LRMS/SIMにより八塩化ダイオキシンの分析を行った。定性的に存在が認められた試料は着水井流入水、曝気槽内活性汚泥、返送汚泥であった。次にHRGC/LRMS/SCAN(50500amu)により、夾雑成分の溶出状況をクロマトによって検討した。標準物質や清掃工場飛灰抽出液のクロマトとの比較から、下水処理関連の試料中には四塩化六塩化ダイオキシン類が溶出する時間帯に非常に多量の夾雑成分が溶出することがわかり、これらをクリーンナップにおいて効果的に除去しておかなければHRGC/HRMS/SIM分析でも対応が難しいものと思われた。
概日リズムと細胞周期および細胞増殖、細胞がん化との関連

哺乳類において概日リズム中枢であるSCNは何らかの神経経路や分泌因子を介して全身の末梢時計を同調させていると考えられているが、その実体は長年の間不明であった。最近の研究によって概日リズムをリセットできる内因性因子がいくつか報告され、生体内における末梢時計の同調因子候補として注目を集めている。本研究で私は新たにPGE_2が概日リズムをリセットできることを見出した。PGE_2は生体内に存在し、体温上昇や炎症促進など様々な作用を持つことが知られている生理活性物質の一つである。私はまず、NIH3T3細胞をPGE_2で処理することでmPer1の一過性の発現誘導が起こり、時計遺伝子発現の概日リズムが誘起されることを見出した。さらにマウスの腹腔内にPGE_2を投与することで肝臓、腎臓、心臓などの末梢組織において時計遺伝子発現の概日リズムが位相変化を起こすことを見出した。この位相変化はPGE_2受容体のサブタイプのうちEP1およびEP3のアゴニストであるSulprostoneによっても引き起こされたが、EP2のアゴニストであるButaprostでは効果が無かった。またEP1のアンタゴニストであるSC-51322の存在下ではPGE_2による位相変化は観察されなかった。これらのことから、PGE_2は生体内においてEP1受容体を介して末梢組織の概日リズムをリセットしていることが示唆された。末梢組織の概日リズムはPGE_2の投与時刻依存的に位相変化したが、マウスの行動リズムには顕著な位相変化が観察されなかったことから、PGE_2は概日リズム中枢に作用すると言うよりは、むしろ中枢から末梢への同調シグナルとして働いている可能性が高いと考えられる。
低自己評価者の対人ネットワークの拡大を支える重要他者の制御資源保存機能

親密な関係の醸成は、排他的に対人ネットワークを縮小させる可能性がこれまで指摘されているが、親密な関係に付随する関係的自己の効果に着目するならば、特に自己評価の低い者では逆に親密な関係の醸成がネットワークの拡大に寄与する可能性があるといえ、本研究ではこの点を実証的に明らかにすることが目的である。平成30年度は、「低自己評価者の自己呈示では制御資源がより消費されること、その傾向は、ポジティブな自己呈示に強く動機付けられる場合、また、ありのまま信念が強い場合に特に顕著になる」との仮説を検証する当初予定の研究1を大学新入生を対象として実施した。30名程度を対象とした予備実験を実施後、手続きを一部修正して68名を対象に本実験を行った。その結果、女性のみに仮説を支持する結果が得られ、自己評価が低く、ありのまま信念が強い場合に、ペアとなった相手への自己呈示を強要された自己呈示群の方が、自由に会話をした統制群よりも、その後の計算問題に対する回答数が少なくなり、パフォーマンスが低下していることが示された。ただし、ありのまま信念が強いものの、自己評価が高い場合は、自己呈示群の方が統制群よりも回答数が多くなっており、自己評価が高い場合の自己呈示のポジティブな効果もみられた。女性のみで仮説が支持されたことも含めて、結果の解釈には慎重になる必要があり、研究2の計画について見直しを行っている。また、昨年度実施した大学新入生の初期適応を検討した研究2のフォローアップ調査である研究4を実施した。さらに、研究3の検定力を高めるために新たな大学新入生からもデータを得て、サンプル数を増やした。これらについては現在、分析中である。全体的に当初の予定より遅れている。平成30年度は、関係的自己の概念整理のために順番を変更して研究を実施する必要があったため、平成28年度、29年度と実施を見送っていた研究1を実施した。平成30年度は研究1に引き続き、「未知の他者との接触時になされる低自己評価者の統制的自己呈示には制御資源が必要であること」を検証する研究2を実施予定だった。ただし、研究1で研究3と同様に仮説が女性のみでしか支持されなかったこと、また未知の他者と会話する際に自己呈示を行うことがポジティブな効果を有することが示されたことに対して、研究2の実施計画を見直す必要が生じたため、研究2の実施は令和元年度に延期することとなった。現在は研究2の実施計画も修正がほぼ完了し、令和元年度の早い段階で実施できる予定である。令和元年度については、研究2を実施し、「未知の他者との接触時になされる低自己評価者の統制的自己呈示には制御資源が必要であること」を確認した上で、本研究課題のメインともいうべき研究5を実施する。研究5では「重要他者の表象を活性化することで低自己評価者の自己呈示において制御資源の消費が抑制される」ことを示すことを目的とする。研究計画が当初よりも遅れていることから、研究期間を1年延長することとして、研究6と研究7は令和2年度に実施する予定であるが、スムーズに実施できるよう令和元年度中に準備を入念に行う。また、令和元年度には研究3について当初の予定通り、社会人を対象に実施し、結果の頑健性を確認する。自己評価の低い者は自己高揚目標と自己確証目標が同時に生起した場合、呈示すべき自己概念に大きなズレが生じやすい。このため、制御資源を枯渇させやすく、結果として効果的な自己呈示に失敗し、他者との新たな関係形成が難しくなる。このようなズレは社会的文脈や信念の影響を受けて生じる。だが、彼らでも既存の親密な関係の中で培われた関係的自己が活性化すると、上記のズレが生じにくくなり新たな対人関係の形成が可能になり得る。平成28年度は予備的研究として、後続の実験で使用する「ありのまま信念尺度」の開発を行った。具体的には本来感尺度(伊藤・小玉, 2005)や過剰適応尺度(石津, 2006)の項目を参考にして、16項目の仮項目を作成した。大学生254名を対象として質問紙調査を実施し、項目分析を行い、14項目を「ありのまま信念尺度」として確定した。本尺度は充分な信頼性を有しており(α=.76)、予測通り、本来感尺度(r=.45)、個人志向性(r=.32)、セルフ・コンパッション(r=.21)と有意な正の関連を示しており妥当性を有していることも確認された。また、イラーショナル・ビリーフとは有意な関連が示されず、作成された尺度が偏った信念を測定しているものでないことも確認された。また、本尺度を用いた実験を行うための準備を進めた。具体的には当該研究課題と関連する研究として、前年度までに実施していた関係的自己に関わる研究について2つの学会で発表し、他の研究者との議論を通じて概念整理を行った。

当初は平成28年度中に「低自己評価者の自己呈示では制御資源がより消費されること、その傾向は、ポジティブな自己呈示に強く動機づけられる場合、また、ありのまま信念が強い場合に特に顕著になること」を示す研究1の実験を実施する計画であったが、実験に先立ち、関係的自己の概念について整理する必要が生じたからである。そのため、平成28年度中は実験の実施をあえて急がず、仮説モデルの見直しを行った。ただ、実験の道具となる「ありのまま信念尺度」も完成し、全体としては当初の研究計画を履行できる予定である。親密な関係の醸成は、排他的に対人ネットワークを縮小させる可能性がこれまで指摘されているが、親密な関係に付随する関係的自己の効果に着目するならば、特に自己評価の低い者では逆に親密な関係の醸成がネットワークの拡大に寄与する可能性があるといえ、本研究ではこの点を実証的に明らかにすることが目的である。平成29年度は「新たな対人関係の形成場面において、関係的自己がポジティブであれば、自己評価が低くても、初期適応が果たされること」を示す研究3を大学新入生を対象として実施した。具体的には、「大学入学前の友人関係に付随する関係的自己がネガティブであれば、シャイネスが新たな対人関係の形成を阻害するものの、関係的自己がポジティブであれば、シャイネスと新たな対人関係の形成に関連が見られない」との仮説について検証した。大学新入生112名を対象として質問紙調査を実施し、女性においてのみ仮説を支持する結果が得られた。つまり、大学入学前の友人と一緒にいる時に自分のことを「思いやりがある」などと思うことができていれば、大学という新たな環境での対人関係面での適応をシャイであることが阻害することが少ないことが示された。ただし、男性では逆に関係的自己がネガティブな場合に、シャイであることと対人関係面での適応の阻害とが関連していなかった。また、大学入学前の友人関係に付随する関係的自己が高いと、大学入学後に知り合った友人に対してポジティブな自己呈示を行い、さらに本来の自分を呈示していると認識し、結果として新たな環境への適応感が高まるという影響過程が確認された。全体的に当初の予定より遅れている。平成29年度も平成28年度に引き続き、「低自己評価者の自己呈示では制御資源がより消費されること、その傾向は、ポジティブな自己呈示に強く動機づけられる場合、また、ありのまま信念が強い場合に特に顕著になること」を示す研究1の実験の実施を見送った。これは、関係的自己の概念についての整理にあたって、先に研究3を実施しておくことが望ましいと判断したからである。研究3については予定通り実施することができ、予想していた仮説モデルを概ね検証できたため、平成30年度は速やかに研究1、研究2の実施を行えると考えている。平成30年度は、「低自己評価者の自己呈示では制御資源がより消費されること、その傾向は、ポジティブな自己呈示に強く動機付けられる場合、また、ありのまま信念が強い場合に特に顕著になる」との仮説を検証する当初予定の研究1を大学新入生を対象として実施した。30名程度を対象とした予備実験を実施後、手続きを一部修正して68名を対象に本実験を行った。
HSV感染防御におけるマスト細胞の役割の解明

従来よりマスト細胞はI型アレルギーを惹起する細胞として知られているが、近年自然免疫の誘導や調整におけるマスト細胞の重要性が明らかにされてきている。我々は最近、人体にとって重要な病原体のひとつである単純ヘルぺスウイルス(HSV)を用いて、HSV感染防御におけるマスト細胞の重要性を初めて明らかにし、特にマスト細胞の活性化因子となるIL-33が生体防御に有益であることをマウスのHSV皮膚感染モデルを用いて示した。また、in vitroの実験系でIL-33が表皮細胞由来である可能性が示唆されたため、HSV感染皮膚におけるIL-33の産生につき検討した。B6マウスにHSVを皮内接種し、24時間後の感染皮膚の免疫染色にて表皮細胞にIL-33の発現を認めた。また、接種皮膚の溶解液を用いてIL-33をELISAで測定したところ、IL-33の産生が認められた。HSV感染とIL-33産生との関連を調べるため、同時に感染皮膚のウイルス量も継時的に測定したところ、IL-33はHSV感染価と同様の動態を示し、ウイルスの増殖に伴い、IL-33が放出されている可能性が示唆された。次に、感染皮膚から産生されたIL-33がマスト細胞の活性化刺激となるかどうかをin vivoの実験系を用いて検討した。HSVを皮内接種したB6, IL-33欠損マウス各々から感染皮膚を採取し、表皮シートを培養液に浮かべた後、上清を骨髄由来マスト細胞(BMMC)に添加し、マスト細胞のサイトカイン産生につき調べたところ、B6のHSV感染表皮から採取した上清をBMMCに添加した際にはTNF-α, IL-6産生の増加を認めたが、IL-33-/-マウスの感染表皮から採取した上清の刺激では、マスト細胞から炎症性サイトカインの産生を認めず、HSV感染表皮由来のIL-33がマスト細胞のサイトカイン産生を誘導していると考えられた。従来よりマスト細胞はI型アレルギーを惹起する細胞として知られているが、近年、自然免疫の誘導や調節におけるマスト細胞の重要性が明らかにされてきている。我々は最近、人体にとって重要な病原体である単純ヘルペスウイルス(HSV)を用いて、HSV感染防御におけるマスト細胞の重要性を初めて明らかにした。特にマスト細胞の活性化刺激となる表皮細胞由来因子としてIL-33の関与が示唆されたため、HSV感染防御におけるIL-33の関与について検討を行った。まず、HSV感染防御におけるIL-33の関与について調べるため、IL-33の受容体であるST2欠損(ST2-/-)マウス、コントロール(B6)マウスの背部にHSV2 7.5×105PFU/50μlを皮内接種し、皮疹、麻痺を観察し、生存率の差について検討した。ST2-/-マウスではB6マウスと比較して皮疹、麻痺が重症化し、生存率が有意に低く、IL-33/ST2経路がHSV経皮感染における生体防御に重要であることが示された。次に、マスト細胞のIL-33/ST2経路の重要性をin vivoの実験系で明らかにするために、マスト細胞欠損(W/Wv)マウスの皮膚へ骨髄由来マスト細胞(BMMC)を再構成する手法を用いて検討した。W/WvマウスにB6マウス由来のBMMC1×106を皮内接種すると、68週間後に接種部位の皮膚にマスト細胞が再構成されることがすでに示されている。この手法により、W/Wvマウスの背部皮膚に、B6, ST2-/-マウス由来BMMCをそれぞれ再構成した後、同部位にHSV2を皮内接種し、観察した。W/Wvマウスで低下した生存率は、皮膚へのB6由来BMMCの再構成で完全に回復するのに対し、ST2-/-マウス由来BMMCの再構成では回復せず、マスト細胞のIL-33/ST2経路がHSV感染防御に重要であることが明らかとなった。

HSVを皮内接種したB6, IL-33欠損マウス各々から感染皮膚を採取し、表皮シートを培養液に浮かべた後、上清を骨髄由来マスト細胞(BMMC)に添加し、マスト細胞のサイトカイン産生につき調べたところ、B6のHSV感染表皮から採取した上清をBMMCに添加した際にはTNF-α, IL-6産生の増加を認めたが、IL-33-/-マウスの感染表皮から採取した上清の刺激では、マスト細胞から炎症性サイトカインの産生を認めず、HSV感染表皮由来のIL-33がマスト細胞のサイトカイン産生を誘導していると考えられた。HSV感染防御におけるIL-33の重要性について、特にマスト細胞のIL-33/ST2経路の重要性について、HSV皮膚感染モデルを用いてin vivoの実験系で証明することができた。HSV感染皮膚において実際にIL-33が産生されるかどうか、in vivoで検討する。B6マウスの背部にHSV2 7.5×105PFU/50μlを皮内接種し、感染皮膚の免疫染色を行いIL-33の発現をみる。また、skin lysatesを作成し、IL-33をELISAで測定する。HSV感染とIL-33産生との関連を調べるため、同時に感染皮膚のウイルス量も測定する。さらに、ヒトのヘルペス感染皮膚組織を用いてIL-33染色を行い、ヒトでもIL-33の発現がみられるかどうかを検討する。HSV感染皮膚におけるIL-33の産生が認められた場合は、次に、産生されたIL-33がマスト細胞の活性化刺激となるかどうかをin vivoの実験系を用いて検討する。HSVを皮内接種したB6, IL-33欠損マウス各々から感染皮膚を採取し、表皮シートを作成して培養液に浮かべ、上清を骨髄由来マスト細胞(BMMC)に添加し、マスト細胞のサイトカイン産生につき調べる。さらに、マスト細胞が生体防御に働くメカニズムについて検討する。マスト細胞由来の各種サイトカインがウイルス排除に関与しているかどうかを調べるため、各種サイトカイン欠損マウス由来のBMMCをマスト細胞欠損(W/Wv)マウス皮膚に再構成し、HSVを皮内接種した後、感染皮膚のウイルス量を測定する。また、各々の再構成マウスの所属リンパ節のHSV特異的CD8+T細胞、樹状細胞につき解析を行う。マスト細胞の再構成実験を順調に行うことができたため、再構成に必要となる骨髄由来マスト細胞の培養に必要なサイトカイン量が予定していたより少なく済み、未使用金が生じた。HSV感染皮膚におけるIL-33の発現をみるための実験に必要となるIL-33抗体やELISAキット、骨髄由来マスト細胞の培養に必要なサイトカイン、マスト細胞が生体防御に働くメカニズムについての検討実験を行うにあたり、HSV特異的CD8+T細胞、樹状細胞等の解析に必要となる各種抗体の購入にあてる。
中枢排尿機構における青斑核由来ノルアドレナリンと黒質由来ド-パミンの相互作用

青斑核由来ノルアドレナリンは仙髄副交感神経中枢ニュ-ロンのα_1受容体を介して興奮させ、膀胱を収縮させる。本研究ではさらに、青斑核ノルアドレナリン細胞が実際に排尿反射に関与しているか否か、この排尿反射を黒質由来のド-パミンがどのように調節しているのかを明らかにする目的で麻酔ネコを用いて研究を行った。得られた成績は次の通りである。1)膀胱内へ一定速度で生理的食塩水を注入すると、内圧上昇に伴い、膀胱に自発性収縮がえられた。この動物の両側青斑核に6-ハイドロキシド-パミンを注入し、ノルアドレナリン細胞を破壊した場合には、この自発性収縮は起らず、アドレナリンα、アゴニストのフェニレフリンを脊髄腔内へ投与した場合にこの自発性収縮は再発された。2)正常動物において、膀胱内への注水によっておこる膀胱の自発性収縮は、黒質の電気刺激によって抑制された。しかし、青斑核刺激によっておこる膀胱収縮は黒質刺激によって抑制されなかった。黒質刺激による膀胱の自発性収縮の抑制は脳室内に投与しさハロペリド-ルおよびド-パミンD-2受容体アンタゴニストのドンペリドンにより拮抗され、D-1アゴニストのSCH23390の投与によっては拮抗されなかった。さらに、膀胱の自発性収縮は脳室内へ投与したド-パミンおよびキンピロ-ル(D-2アゴニスト)により抑制され、SKF38393(D-1アゴニスト)によっては影響を受けなかった。これらの成績から、排尿反射には青斑核由来ノルアドレナリンが中枢的役割を演じており、黒質由来のド-パミンは青斑核ノルアドレナリン細胞をド-パミンD-2受容体を介して抑制的に働き、排尿反射をコントロ-ルしていると考えられた。
表面カルシウム修飾による歯科用インプラント材料の骨伝導性制御法の 開発

骨伝導性を示さないアルミナを塩化カルシウム水溶液中で水熱処理すると、アルミナ表面にカルシウムが結合した。ヒトの体液とほぼ等しい無機イオン濃度をもつ水溶液(擬似体液)を用いた骨伝導性のin vitro評価、細胞培養実験、実験動物を用いた骨伝導性in vivo評価の結果より、カルシウム修飾アルミナは生体内で骨伝導性を示す可能性が高いことが示唆された。骨伝導性(材料が生体骨と直接結合できる性質)を示さないアルミナセラミックスに骨伝導性を付与することを目的として、アルミナを塩化カルシウム水溶液中で水熱処理を行った。水熱処理前後のアルミナ表面をX線光電子分光分析、および、走査型電子顕微鏡観察により分析した結果、塩化カルシウム水溶液中での水熱処理により表面形態は変化しないが、カルシウムイオンが結合していることが分かった。これを、人の体液環境を模倣した水溶液中に浸漬した結果、未処理のアルミナ表面に変化は観察されなかったが、Ca結合アルミナ表面には14日後に骨様アパタイトの形成が観察された。また、未処理のアルミナ、および、Ca結合アルミナ上で、骨芽細胞様細胞を培養した結果、Ca結合アルミナは、未処理のアルミナよりも、細胞接着性、増殖性にも優れ、Bone nodule形成も早期に観察された。これらの結果から、Ca結合アルミナは、生体内で骨伝導性を示す可能性が極めて高いことが示された。未処理のアルミナ、および、Ca結合アルミナ試料について、ラット大腿骨への埋入実験を行い、4週間、8週間埋入後の大腿骨をマイクロX線CTで観察した。この結果では、現在のところ、未処理アルミナ、Ca結合アルミナともに、試料周囲への骨形成が観察されている。今後はこれらの骨試料を病理組織学的に評価するとともに、埋入初期段階における骨形成過程を調べるために、さらなる動物実験の実施が必要であると考えられる。歯科インプラント治療においては、チタンやチタン合金を用いたインプラント体が多用されている。しかし、金属アレルギーや審美性の問題からセラミックスインプラント材料に注目が集まっている。しかし、アルミナは、生体不活性な材料であるために、インプラント体としては、不適である。そのため、アルミナをインプラント体として用いるためには、生体不活性材料であるアルミナを、骨伝導性材料にする必要がある。申請者らは、アルミナ基板を塩化カルシウム水溶液中で水熱処理して得たカルシウム修飾アルミナは、生体内で骨伝導性を示す可能性が高いことを、in vitro評価により、既に確認している。そこで、本研究では、このカルシウム修飾アルミナの骨伝導性のin vivo評価を行うことを主な目的とする。直径2mm長さ4mmのアルミナ柱を塩化カルシウム水溶液中で水熱処理し、水熱処理後、これらのアルミナを水熱処理容器から取り出して、蒸留水中で超音波洗浄し、余分なカルシウム塩を除去した。得られた試料を、X線光電子分光分析装置(XPS)を用いて分析した結果、試料表面へのカルシウムの結合が検出された。さらに、XPS分析によりカルシウムの結合が検出された試料に関しては、ヒトの細胞外液とほぼ等しい無機イオン濃度をもち、細胞やタンパク質を含まない水溶液(擬似体液)を用いて、骨伝導性のスクリーニングテストを行った。スクリーニングテストにより、生体内で骨伝導性を示す可能性が高いことが確認された試料については、同じ条件で再度試料を作製し、10週齢のラット脛骨に形成した骨欠損部に埋入した。対照試料としては、カルシウム修飾していないアルミナ柱、及び、水酸アパタイト柱を用いた。試料埋入2週、4週後については、ラットを安楽死させ、試料を周囲の骨組織とともに摘出し、病理組織学的評価を進めている。本研究では、このカルシウム修飾アルミナの骨伝導性のin vivo評価を行うことを主な目的としている。平成23年度は、研究遂行上の問題もなく、ラット脛骨への試料の埋入手技を確立し、カルシウム修飾アルミナの動物実験は順調に進行している。現在進行中の動物実験を引き続き行う。所定期間、ラット脛骨に試料を埋入後、試料を周辺の骨組織とともに摘出し、試料を病理組織学的に解析する。すなわち、周囲組織と一塊の組織試料を、脱水後、硬組織研磨標本作製用硬質レジンに包埋する。その後、試料を2分割し、一方は非脱灰研磨標本を作製、トルイジンブルー染色後、試料周辺の骨形成状態を、光学顕微鏡を用いて観察する。病理組織学的評価において、良好な骨伝導性の発現が確認された場合は、同様の動物実験を行い、試料と骨の結合強度の定量的な評価も行う予定である。以上の結果を総括して、カルシウム修飾アルミナの骨伝導性を評価し、インプラント材料としての可能性を検討する。今年度に実施中の動物実験、および、骨伝導性評価を継続するために必要な物品・消耗品の購入に加えて、得られた成果を公表するための学会への参加費、および、旅費として研究費を使用する。
時計遺伝子に着目したガンの時間薬物治療法に関する基礎研究

本研究では、明暗周期(明期7:00-19:00)条件下で9:00-17:00の間のみエサを与え、マウスの体温や種々のホルモン分泌などの日周リズムに関し周期性を保ったまま、位相(日周リズムのpeak及びtrough時刻)を変容させる時間制限摂食(TRF)下で飼育したマウスを対象とした。自由摂食(ALF)下では、塩酸イリノテカン(CPT-11)の毒性が5:00に重篤、17:00に軽度となったため、投薬時刻を5:00及び17:00とした。TRF群では、17:00投薬群と比較し5:00投薬群で有意に体重減少及び白血球減少を軽減できることが明らかとなった。ALF群と比較しTRF群では、約12時間毒性発現の位相のシフトが確認され、両群とも副作用がマウスの活動期において重篤となることで一致していた。本研究より、生活環境の変化に伴いCPT-11の時間毒性は変容し、これらの変容に伴い日周リズムがシフトする因子がCPT-11の毒性発現規定因子となる可能性が考えられる。これら毒性発現の機序を薬物動態学的および薬力学的側面より検討した結果、ALF群では副作用の日内変動と薬物動態およびTopoisomerase-I活性の日周リズムの関与が認められたが、TRF群ではこれらの関与は認められなかった。しかし、両群共に骨髄細胞の細胞周期の日周リズムと骨髄抑制の日周リズムには対応が認められた。従って、CPT-11の時間治療における投薬タイミング規定因子の一候補として骨髄細胞の細胞周期を選定した。また、白血球と骨髄細胞の細胞周期の日周リズムには対応が認められ、白血球は頻回採取が不可能な骨髄細胞に代わる代替生体リズムマーカーとして利用できる可能性が示唆された。また、CPT-11以外にも種々の薬剤で投薬タイミングの違いによる効果および副作用への影響を評価した。投薬タイミングを規定する候補因子は各薬剤において個々に異なった。以上より、一元的な生体リズムマーカーによって投与設計を行うのではなく、個々の薬剤の治療目的に対し柔軟に生体リズムマーカーを選択し投与設計を行う必要性があることが明らかとなった。本研究では、明暗周期(明期7:00-19:00)条件下で9:00-17:00の間のみエサを与え、マウスの体温や種々のホルモン分泌などの日周リズムに関し周期性を保ったまま、位相(日周リズムのpeak及びtrough時刻)を変容させる時間制限摂食マウスモデルを利用した。また、自由摂食マウスモデルにおいて、塩酸イリノテカン(CPT-11)の毒性が5:00に重篤、17:00に軽度となったため、投薬時刻を5:00及び17:00とした。・時間制限摂食マウスモデルを対象としたCPT-11の副作用に及ぼす投薬タイミングの影響及び副作用発現規定因子の探索体重減少及び白血球減少は、17:00投薬群と比較し5:00投薬群で有意に軽減できることが明らかとなった。自由摂食マウスモデルと比較し時間制限摂食マウスモデルでは、約12時間毒性発現の位相のシフトが確認され、両モデルとも副作用がマウスの活動期において重篤となることで一致していた。