hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子生態学的手法による反すう動物ルーメン細菌群の動態解析

1)16SrDNAの配列中で標的菌種に特異的な領域を利用してデザインした競合PCR用プライマーを使用し、標的菌種の遺伝子のみの増幅が可能であった。開発した競合PCR定量系はきわめて感度が高く、しかも使用菌量に応じて直線的に定量値も変化した。ヒツジルーメン液に既知量の標的菌を加えたものから得られた定量値も、菌添加量に比例して直線的に増加した。このことから混合菌レベルでも定量性は高いと判断された。定量値の再現性にも問題はなかった。2)競合PCRをルーメンサンプル中の標的菌動態分析に応用したところ、3種のうちF.succinogenesが他の2菌種にくらべ圧倒的に多く、かつこの菌種は粗飼料多給時に有意に増加した。さらに後腸でもルーメンと同等の密度で定量された。したがってF.succinogenesが反芻家畜消化管の繊維分解において重要な役割をもつことが示唆された。3)一方顕微鏡下での特異的検出をめざし、蛍光in situ hybridizationの開発を試みた。16SrDNAの特異領域をターゲットとする蛍光プローブに対する反応条件を確立したところ、純菌レベルではいずれも明瞭な蛍光検出が可能であった。またルーメンサンプルに添加した純菌も検出できた。反すう動物ルーメン内でメジャーな繊維分解菌である3菌種(Fibrobacter succinogenes,Ruminococcus albus,Ruminococcus flavefaciens)の動態解析を目的として競合PCR定量系を開発した。PCRプライマーは16SrDNAの塩基配列中で標的菌種に特異的に存在する領域を利用してデザインした。これらを使用することで、標的菌種の遺伝子のみの増幅が可能であった。それぞれの競合PCR系で用いる競合テンプレートを作成し、未知のサンプルのテンプレートにこれを既知量加えてPCRすることで、間接的に標的菌種のDNAを定量することが可能であった。これらの定量系はきわめて感度が高く(定量下限は純菌レベルで1-30細胞相当)、しかも使用菌(DNA)量に応じて直線的に定量値も変化した。ヒツジルーメン液に既知量の標的菌を加え、総DNAを抽出し、これから得られた定量値も、菌添加量に比例して直線的に増加した。定量値の測定間および測定内誤差は8-12%で、再現性にも問題はなかった。これらの定量系を実際のルーメンサンプル中の標的菌動態分析応用したところ、3種のうちF.succinogenesが他の2菌種にくらべ圧倒的に多く、かつこの菌種は粗飼料多給時に有意に増加した。またルーメン液にセルロースパウダーを添加・保温したところ、この菌種のセルロースへの付着を本定量系で十分モニターできた。したがって次年度に予定する消化管内での標的菌の動態解析に、これらの分子的定量法はきわめて有用と判断した。平成11年度に確立した競合PCR定量系を応用し、反すう動物ルーメン内の繊維分解性主要3菌種(Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens)の動態解析を行った。その結果、3種のうちF.succinogenesが他の2菌種にくらべ圧倒的に多く、かつこの菌種は粗飼料多給時に有意に増加した。ルーメン内での分布密度を算定したところ、F.succinogenesが約0.1%、R.albus, R.flavefaciensが各々約0.001および0.01%となった。F.succinogenesは日本、韓国、カナダいずれの反芻家畜(ウシ、ヒツジまたはヤギ)のルーメンで検出定量されたが、Ruminococcusについてはかならずしもすべての動物で認められるわけではなかった。F.succinogenesはヒツジ後腸でもルーメンに匹敵する密度で検出されたが、Ruminococcusは検出されない場合もあった。これらの結果は、F.succinogenesが反芻家畜消化管の繊維分解において重要な役割をもつことを示唆している。一方、F.succinogenesとRuminococcusの顕微鏡下での特異的検出をめざし、蛍光in situ hybridizationの開発を試みた。

16SrDNAの種属特異領域をターゲットとする蛍光プローブに対する反応条件を検討したところ、純菌レベルではいずれも明瞭な蛍光検出が可能であった。またルーメンサンプルに添加した純菌も検出できたが、ルーメンサンプルそのものからは蛍光検出が難しく、これは標的菌の分布量の低さに関連しているものと判断された。
腎尿細管細胞のおけるATPによるc-fosおよびc-mycの発現とその機構解析

本研究課題は、腎尿細管上皮細胞株LLC-PK_1におけるATP処置によるc-fosおよびc-mycmRNAの発現とその調節機構の検討を目的として行った。まず、c-fosおよびc-mycmRNAの発現を調べる方法として、抽出したmRNAを逆転写した後PCRによりcDNAを増幅するRT-PCR法と通常の特異的プローブを用いたノーザンブロット法とを比較した。その結果、c-fosmRNAの発現は通常のノーザンブロット法で感度、再現性ともよい結果が得られることが判明したが、c-mycmRNAに関しては強いシグナルを得られず、RT-PCR法を採用した。ATP(100muM)処置による各mRNAの発現を調べたところ、c-fosmRNAは処置後15-30分にかけて一過性の強い発現が認められた。一方、c-mycmRNAの発現は処置後1-2時間で若干認められたが、c-fosmRNAに比べると明らかに弱かった。次いで、ATP処置によるc-fosmRNAの発現誘導機構について検討を行った。各種プリン受容体アゴニストによる発現誘導を比較したところ、P_<2Z>受容体アゴニストである3′-O-(benzoyl)-benzoyl-ATPに最も強い発現誘導能を認めた。各種蛋白リン酸化酸素阻害薬の影響を調べたところ、Ca^<2+>/カルモデュリン依存性キナーゼII阻害薬KN-62に強い発現誘導阻害作用を認めた。以上の結果から、腎尿細管上皮細胞株LLC-PK_1において細胞外のATPはP_<2Z>受容体活性化-Ca^<2+>/カルモデュリン依存性キナーゼII活性化という系を介して最初期応答遺伝子c-fosmRNAの発現を誘導するものと考えられる。本研究計画により得られた成績は、腎尿細管において細胞外のATPが増殖制御因子として機能していることを示しており、細胞間情報伝達に関与する細胞外ATPの作用機序および生理的役割の一端が明らかになった。
妊娠に起因した睡眠障害に関する基礎的研究

本研究ではラットを用いた実験系において、1)妊娠開始に特異的な生殖器官由来のめサイトカインの睡眠活性を分析し、2)そのサイトカインのホルモン分泌に対する作用を睡眠活性と相関させて分析した。また、3)その妊娠特異的なサイトカインの中枢作用を阻害し、妊娠によって変動した睡眠パターンがどのように影響を受けるかを調べた。さらには、4)新規に発見されたプロラクチン分泌放出ペプチド(PrRP)のラット睡眠に対する効果についても検討した。1)顆粒球/マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)は妊娠初期の生殖器官内で著しく産生されるサイトカインである。これを雄ラット脳室に投与すると(10pmol)、夜間のノンレム睡眠は27%、レム睡眠は203%増加した。2)睡眠-覚醒リズムと内分泌環境の変化は頻繁に連動することが知られている。したがって、GM-CSFの睡眠誘発作用はホルモン分泌の変化がもたらした結果に起因するとも考えられるため、脳内における神経内分泌的パラメータに対する影響を調べた。結果、視床下部においてGM-CSFは一酸化窒素(NO)の放出を刺激しソマトスタチンの分泌を促進させることが明らかとなった。3)妊娠ラットにGM-CSF中和抗体、または対照IgG抗体をそれぞれ妊娠開始日から4日間、連続して脳室内投与した。GM-CSF抗体を投与された群の妊娠初期4日間の暗期睡眠量は対照群と比較して、ノンレム睡眠が76.9%に、レム睡眠が54.0%に抑制された。4)PrRPを雄ラットの脳室に投与すると、ノンレム睡眠は1,10pmolで、レム睡眠は0.1,1pmolの用量で有意に増加した。連続採血の実験結果から、レム睡眠の増加は血清プロラクチン量の上昇および血清成長ホルモン量の低下と相関した。今年度はラットを用いた実験系において、1)妊娠開始に特異的な生殖器官由来のサイトカインの睡眠活性を分析し、2)そのサイトカインのホルモン分泌に対する作用を睡眠活性と相関させて分析した。また、3)新規に発見されたプロラクチン分泌誘発ペプチド(PrRP)のラット睡眠に対する効果を中枢投与によって検討した。1)顆粒球/マクロファージ・コロニー刺激因子(GM-CSF)およびマクロファージ・コロニー刺激因子(M-CSF)は妊娠初期の生殖器官内で著しく産生されるサイトカインである。これを雄ラット脳室に投与すると(それぞれ10pmol)、GM-CSFは夜間のノンレム睡眠(27%増)・レム睡眠(203%増)、M-CSFはレム睡眠(54%増)のみを有意に増加させた。また、M-CSFには脳温上昇効果もみられた。したがって、GM-CSFならびにM-CSFの睡眠誘発作用はホルモン分泌の変化がもたらされた結果に起因するとも考えられるため、これらCSFsが脳内で神経内分泌的パラメーターに影響をおよぼすかどうかを調べた。結果、視床下部において一酸化窒素(NO)の放出量が両CSFs投与後有意に増加し、この変化によってGM-CSFはソマトスタチンを、M-CSFは成長ホルモンの分泌を促進させることが示唆された。3)PrRPを雄ラットの脳室に投与すると、ノンレム睡眠は1,10pmolで、レム睡眠は0.1,1pmolの用量で有意に増加した。連続採血の実験結果から、レム睡眠の増加だけが血清プロラクチン値の上昇と相関した。今年度は、1)妊娠経過に特異的な生殖器由来のサイトカインの作用を中枢的に阻害することを試み、2)妊娠によって変化した睡眠パターンがどのように影響を受けるかを調べた。

また、昨年度から継続しているプロラクチン分泌誘発ペプチド(PrRP)の睡眠修飾作用について、様々な内分泌的パラメータ変動との相関を分析した。1)特に妊娠の開始時に必要とされる顆粒球・マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)に着目し、その抗マウスGM-CSF抗体の自然睡眠に対する作用を解析した。暗期連続脳室内投与を雄ラットに行うと、GM-CSF(10μg/100μl/10h)は投与日には何の作用も示さないが、翌日の暗期にノンレム睡眠(17%)・およびレム睡眠(36.1%)の有意な減少をもたらした。2)妊娠ラットを2群に分け、実験群には抗マウスGM-CSF抗体を、対照群にはIgG抗体をそれぞれ妊娠開始日から4日間、連続して脳室内投与を行った。対照群と比較し、実験群の睡眠量は処理2日めより有意に減少し、妊娠初期4日間の暗期睡眠量は全体でノンレム睡眠が76.9%に、レム睡眠が54.0%に抑制された。この結果により、GM-CSFは妊娠初期の過剰睡眠に関与することが示唆される。3)低用量のPrRPによるレム睡眠誘発作用は、プロラクチン分泌の上昇をともなうことが昨年までの実験で明らかとされた。しかし、今年度の実験では、in vitroの実験系でPrRPのプロラクチン分泌能は確認されず、in vivoでみられた作用はおそらくその他の経路(例えばオキシトシン)を介したものと考えられる。また新たに、PrRPの成長ホルモン分泌抑制作用がin vivoの実験系で確認され、これはPrRPがソマトスタチン分泌を刺激した結果と考えられる。今年度は昨年度に引き続き、1)妊娠に起因した過剰睡眠の誘発物質であるホルモンあるいはサイトカインの抗体・拮抗剤を妊娠ラットに中枢投与、2)または機械的な断眠処理を加えることにより、妊娠初期に特有な睡眠増加を抑制した結果生じる影響について調べた。また今年度から、3)免疫活性と女性ホルモンの相互作用がどのように睡眠-覚醒パターンへ影響を与えるかについて解析するため、新たに高齢雌ラットを用いた実験モデルの開発に着手した。1)妊娠ラットを2群に分け、実験群にはGM-CSFの中和抗体を、対照群には非活性のIgG抗体をそれぞれ妊娠開始日から4日間、連続して脳室内投与を行った。対照群と比較し、実験群の睡眠量は処理2日目より有意に減少し、妊娠初期4日間の暗期睡眠量は全体でノンレム睡眠が76.9%に、レム睡眠が54.0%に抑制された。この結果により、GM-CSFは妊娠初期の過剰睡眠に関与することが示唆され、妊婦の睡眠変動に免疫物質の介在があることが明らかとなった。2)小型動物用回転ケージに強制歩行モータを取り付け、断眠装置を開発した。この独自の装置の使用により、ラットを24時間歩かせたまま睡眠ポリグラフの連続記録が可能となり、ストレス負荷をかけずにレム断眠が行なえることが検証された。この装置を利用して、妊娠ラットの過剰(レム)睡眠を抑制した結果、数例のラットで妊娠中断が確認された。3)これまでの通念に反し、妊娠初期に過剰睡眠が起こるのはエストロゲンによるものではないことが判明した。しかしながら、エストロゲンの睡眠-覚醒におよぼす影響について、あまりはっきりとした見解が得られていないため、卵巣からのエストロゲン分泌が枯渇する更年期モデルで、その睡眠に対する作用を調べた。
ITS-PCR法及びPOT法によるMRSAの菌株識別に関する研究

【研究目的】MRSAは院内感染症の原因菌として最も分離頻度が高く、感染対策の観点から本菌の迅速な菌種同定と型別が求められている。当院では入院患者から分離されたMRSA株について、迅速にスペーサー領域のPCR泳動パターン(ITS-PCR)による型別と毒素産生性により菌株の識別を実施し、アウトブレイクの監視を行っている。しかし、同一病棟で同一パターンの株が分離された場合、さらに詳細な菌株識別が必要となる。そこで、今回Multiplex PCRを用いて短時間で容易に解析可能なPhage open reading flame typing(POT)方法による菌株識別について検討する。【研究方法】2011年4月から2012年3月に当院で分離されたMRSA105株について、ITS-PCR法と毒素産生試験(SET-A,B,C,D、TSST-1、EXT-A,B)、POT法(シカジーニアス分子疫学解析キット:関東化学)により菌株解析を実施した。【研究成果】(1)ITS-PCR法と毒素産生性:ITS-PCR法で13パターン、さらに毒素産生性を組み合わせると27パターンに分類された。ITS-Type22でSET-CとTSST-1産生(22-CT)株が21株(20.0%)と最も多く、次にType8でSET-A産生(8-A)株が18株(17.1%)、Type19でSET-CとTSST-1産生(19-CT)株が10株(9.5%)と3パターンで全体の46.7%を占めた。(2)POT法:47パターンのPOT型に分類され、POT1:93の値から62株(59.0%)が院内感染型(NY/Japanクローン)のSCCmecII型であった。ITS-PCR法で分離頻度が高かった22-CT株は7パターン(93-137-16,93-137-25,93-145-57,93-151-13,93-153-56,93-155-56,93-191-117)、8-A株は類似型の3パターン(106-183-32,106-183-37,106-183-45)、19-CT株は2パターン(93-19-39,93-222-47)のPOT型を示し、ITS-PCR法より詳細に分類することが可能であった。しかし、同一POT型を示した株の中にもITS-Typeや毒素産生性が異なった株や院内伝播の関連性が認められなかった株も存在し、今後の検討課題となった。【まとめ】MRSAの菌株識別は、ITS-PCRと毒素産生性による方法で迅速にスクリーニングを行い、アウトブレイクの可能性がある場合はさらにPOT法で詳細に識別することで、検査部から今まで以上に精度の高い菌株識別情報が発信でき、病院の感染対策および制御に貢献できると考えられる。【まとめ】

MRSAの菌株識別は、ITS-PCRと毒素産生性による方法で迅速にスクリーニングを行い、アウトブレイクの可能性がある場合はさらにPOT法で詳細に識別することで、検査部から今まで以上に精度の高い菌株識別情報が発信でき、病院の感染対策および制御に貢献できると考えられる。
４次元多様体の微分構造と結び目

多様体と呼ばれる空間の微分構造の分類は,位相幾何学における最も基本的な問題の1つである.しかし,4次元固有の様々な現象のため,他の次元と違い4次元の場合は分類には程遠いのが現状である.本研究の主な目的は,4次元多様体の性質を様々な観点から解明することで4次元多様体の分類問題に寄与し,さらに結び目理論への新しい応用を与えることである.具体的には,幾何学的単連結4次元多様体,4次元多様体の微分構造の(非)安定化,枠付き結び目で表示される4次元多様体,の3つのテーマを中心に研究を進める.多様体と呼ばれる空間の微分構造の分類は,位相幾何学における最も基本的な問題の1つである.しかし,4次元固有の様々な現象のため,他の次元と違い4次元の場合は分類には程遠いのが現状である.本研究の主な目的は,4次元多様体の性質を様々な観点から解明することで4次元多様体の分類問題に寄与し,さらに結び目理論への新しい応用を与えることである.具体的には,幾何学的単連結4次元多様体,4次元多様体の微分構造の(非)安定化,枠付き結び目で表示される4次元多様体,の3つのテーマを中心に研究を進める.
グラム陽性細菌の自己誘導ペプチドを捕捉するクオラムセンシング阻害技術の開発

本研究では細菌細胞間の情報伝達機構であるクオラムセンシングの阻害技術を検討している。グラム陽性細菌のクオラムセンシングでは、固有の一次構造を有するペプチドが情報伝達シグナルとして利用される。細胞外部へ放出される情報伝達ペプチドの濃度は増殖に伴い増大し、標的遺伝子の発現が活性化する。本研究では、情報伝達ペプチドと高い親和性を有する高分子をスクリーニングし、細胞の外部で情報伝達ペプチドを高分子ミクロスフェアへ捕捉するクオラムセンシング阻害技術を検討した。疎水性部位としてコレステリル基を導入したポリビニルアルコールを有機合成し、水溶液中での粒子径分布を解析した。これを黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの培養時に共存させ、クオラムセンシングにより誘導されるヘモリジン毒素の溶血活性を試験した。高分子担体へのヘモリジンの捕捉、情報伝達ペプチドの捕捉効果を評価し、合成した高分子担体がヘモリジン活性を抑制する効果を明らかにした。高分子ミクロスフェアを培養初期に添加した培養液中のヘモリジン量と、培養終了後に高分子ミクロスフェアを添加した場合の培養液に残存するヘモリジン量を比較すると、培養初期の添加により明らかにヘモリジン生産量は減少している。そこで、ビオチン修飾したS. aureusのAIP-I情報伝達ペプチドを合成し、水晶振動子マイクロバランス法を用いて高分子ミクロスフェアに捕捉されるAIP-I量を評価した。水晶振動子上の電極表面に自己組織化膜を形成させ、そこにアビジンを固定化した。ビオチンーアビジン結合により試料溶液中のビオチン化AIP-Iを水晶振動子上の修飾電極に捕捉し、共振周波数の減少量をアドミッタンス解析し評価した。この分子特異的な微量センサーを用いて、高分子ミクロスフェアにAIP-Iが捕捉されることが示唆された。グラム陽性細菌が生産する情報伝達ペプチドの捕捉担体として疎水基を導入した親水性高分子が自己形成するミクロスフェアを検討した。コレステリル基を導入したポリビニルアルコールを各種合成し、水溶液中での粒子径は動的光散乱法およびレーザー回折/散乱法で、コレステリル基含有量は酵素法で評価した。クオラムセンシングのシグナルとしてAIP-I情報伝達ペプチドを生産する黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusをモデル細菌として、クオラムセンシング依存性の溶血毒素であるヘモリジンの溶血活性を指標に共存させた高分子ミクロスフェアによるヘモリジン活性抑制効果を評価した。溶血試験には精製したヒツジ赤血球を用い、溶出したヘモグロビン量を吸光度測定により定量した。更に、培養液に存在するヘモリジン量は電気泳動法により評価した。その結果、培養液に高分子ミクロスフェアを添加することで、培養上清中のヘモリジン活性が顕著に減少すること、培養液中のヘモリジン量が減少することを明らかにした。AIP-I情報伝達ペプチドの定量には水晶振動子マイクロバランス法の修飾電極を作成し試験した。水晶振動子上の金電極にカルボキシ基末端を有する自己組織化膜を作成し、水溶性カルボジイミドを用いて活性化エステルとし、アビジンを固定化した。一方、N末端をビオチン修飾したAIP-I情報伝達ペプチドを合成し、このAIP-I水溶液へ高分子ミクロスフェアを添加するAIP-I捕捉試験を行った。アビジン-ビオチン結合によりAIP-Iが電極上に捕捉されると水晶振動子の共振周波数は減少する。ネットワークアナライザーを用いたアドミッタンス解析により、高分子ミクロスフェアにAIP-Iペプチドが捕捉されることが示された。今後は、クオラムセンシング機構を有するグラム陽性モデル細菌としてAIP-I情報伝達ペプチドを生産する黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusを対象に、異なる高分子ミクロスフェアによるAIP-Iペプチドの捕捉効果を培養液上清のヘモリジン活性試験および水晶振動子マイクロバランス法により評価し、効果の高い高分子ミクロスフェアをスクリーニングする。水晶振動子マイクロバランス法の金電極上にAIP-I情報伝達ペプチドを直接固定化し、外部添加した高分子ミクロスフェアの捕捉をアドミッタンス解析により追跡することで、AIP-Iペプチドとアフィニティの高い高分子ミクロスフェアを探索する。これらの試験に加え、ペプチドをクオラムセンシング機構のシグナルとするモデル細菌としてう蝕原因菌であるStreptococcus mutansを対象に加え試験する。S. mutansのcom系クオラムセンシングのシグナルである18CSP(SGSLSTFFRLFNRSFTQA)を用いて水晶振動子マイクロバランス法によりコレステリル化ポリビニルアルコール等の高分子ミクロスフェアとの相互作用を定量的に追跡する。S. mutansのクオラムセンシング機構の活性化により可溶性グルカンおよび不溶性グルカンが生産されバイオフィルムが形成される。バイオフィルム形成量を指標に高分子ミクロスフェアによるクオラムセンシング抑制効果を評価する。更に、培養液およびバイオフィルム試料から可溶性、不溶性グルカンの各フラクションを取得しフェノール硫酸法を適用することで単糖の濃度分析を実施し、誘導されたグルカン量を指標とするクオラムセンシング抑制効果の評価を試みることとする。

疎水性部位としてコレステリル基を導入したポリビニルアルコールを有機合成し、水溶液中での粒子径分布を解析した。これを黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの培養時に共存させ、クオラムセンシングにより誘導されるヘモリジン毒素の溶血活性を試験した。高分子担体へのヘモリジンの捕捉、情報伝達ペプチドの捕捉効果を評価し、合成した高分子担体がヘモリジン活性を抑制する効果を明らかにした。高分子ミクロスフェアを培養初期に添加した培養液中のヘモリジン量と、培養終了後に高分子ミクロスフェアを添加した場合の培養液に残存するヘモリジン量を比較すると、培養初期の添加により明らかにヘモリジン生産量は減少している。そこで、ビオチン修飾したS. aureusのAIP-I情報伝達ペプチドを合成し、水晶振動子マイクロバランス法を用いて高分子ミクロスフェアに捕捉されるAIP-I量を評価した。水晶振動子上の電極表面に自己組織化膜を形成させ、そこにアビジンを固定化した。ビオチンーアビジン結合により試料溶液中のビオチン化AIP-Iを水晶振動子上の修飾電極に捕捉し、共振周波数の減少量をアドミッタンス解析し評価した。この分子特異的な微量センサーを用いて、高分子ミクロスフェアにAIP-Iが捕捉されることが示唆された。グラム陽性細菌が生産する情報伝達ペプチドの捕捉担体として疎水基を導入した親水性高分子が自己形成するミクロスフェアを検討した。コレステリル基を導入したポリビニルアルコールを各種合成し、水溶液中での粒子径は動的光散乱法およびレーザー回折/散乱法で、コレステリル基含有量は酵素法で評価した。クオラムセンシングのシグナルとしてAIP-I情報伝達ペプチドを生産する黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusをモデル細菌として、クオラムセンシング依存性の溶血毒素であるヘモリジンの溶血活性を指標に共存させた高分子ミクロスフェアによるヘモリジン活性抑制効果を評価した。溶血試験には精製したヒツジ赤血球を用い、溶出したヘモグロビン量を吸光度測定により定量した。更に、培養液に存在するヘモリジン量は電気泳動法により評価した。その結果、培養液に高分子ミクロスフェアを添加することで、培養上清中のヘモリジン活性が顕著に減少すること、培養液中のヘモリジン量が減少することを明らかにした。AIP-I情報伝達ペプチドの定量には水晶振動子マイクロバランス法の修飾電極を作成し試験した。水晶振動子上の金電極にカルボキシ基末端を有する自己組織化膜を作成し、水溶性カルボジイミドを用いて活性化エステルとし、アビジンを固定化した。一方、N末端をビオチン修飾したAIP-I情報伝達ペプチドを合成し、このAIP-I水溶液へ高分子ミクロスフェアを添加するAIP-I捕捉試験を行った。アビジン-ビオチン結合によりAIP-Iが電極上に捕捉されると水晶振動子の共振周波数は減少する。
4D世界地図システムによる地域文化の意味的・時空間的分析・検索・可視化環境の実現

本研究では,マルチメディアの分析・検索・可視化によって地域文化の差異や類似性の比較分析を可能とするクロス・カルチュラルな4Dマルチメディア世界地図システムを,海外の大学・研究機関の研究グループとの協働により構築・実現した.本システムは,歴史・文化に関する多様な人文社会科学系マルチメディアデータ間の意味的・時空間的関連性計量に適用し,分析結果を時間軸を伴った地図上に可視化することにより,各国・地域・都市の文化的差異・類似性の比較分析を可能とする多元的情報分析システムである.本環境の実現により,利用者の興味・関心・視点・問題領域と時空間情報の組み合わせに応じた,利用者毎の多種多様な歴史的・文化的ストーリー(解釈)生成と新たな学術的メディア・コンテンツの生成が可能となった。本研究では,マルチメディアの分析・検索・可視化によって地域文化の差異や類似性の比較分析を可能とするクロス・カルチュラルな4Dマルチメディア世界地図システムを,海外の大学・研究機関の研究グループとの協働により構築・実現した.本4Dマルチメディア世界地図システムは,歴史・文化に関する多様なマルチメディアデータ(文書・画像・音楽・動画)間の意味的・時空間的関連性計量に適用し,各時代や文化の多様性を反映した動的計量・分析結果を時間軸を伴った三次元地図上に可視化することにより,国際社会における各国・地域・都市の文化的差異・類似性の比較分析を可能とする多元的情報分析システムである.本環境の実現により,利用者の視点・問題領域と時空間情報の組み合わせに応じた,利用者毎の多種多様な歴史的・文化的解釈の生成と新たな学術的メディア・コンテンツの生成が可能となる.平成24年度は,基本機能間の連結,分析結果の可視化機能,ユーザに対して直観的理解を提供する入出力インタフェースの設計,実現を行った.さらに,各国文化財および国際貿易データを対象とした実証実験システムの構築を行い,文化財データベース,ICTベース自然環境情報分析の先端的研究を行う海外の研究者グループ(フィンランド,インドネシア,タイ)との協働により,インタフェースの設計,および,各国・地域・都市の文化財・地域情報関連マルチメディアを対象とした実証実験・システム評価を行った.これらの分析・検索・可視化・共有機能を用いることにより,利用者はインタフェースにおける検索条件ならびに問題領域に関するキーワードの入力・選択,または,マルチメディアデータの投稿を行うのみで,検索・分析意図に応じて自動的に生成された意味的クエリおよびメディアデータ・クエリによって,歴史・文化に関するマルチメディア群を多角的・動的に検索・分析することが可能となった.本研究では,マルチメディアの分析・検索・可視化によって地域文化の差異や類似性の比較分析を可能とするクロス・カルチュラルな4Dマルチメディア世界地図システムを,海外の大学・研究機関の研究グループとの協働により構築・実現した.本システムは,歴史・文化に関する多様な人文社会科学系マルチメディアデータ間の意味的・時空間的関連性計量に適用し,分析結果を時間軸を伴った地図上に可視化することにより,各国・地域・都市の文化的差異・類似性の比較分析を可能とする多元的情報分析システムである.本環境の実現により,利用者の興味・関心・視点・問題領域と時空間情報の組み合わせに応じた,利用者毎の多種多様な歴史的・文化的ストーリー(解釈)生成と新たな学術的メディア・コンテンツの生成が可能となった。本研究では,マルチメディアの分析・検索・可視化によって地域文化の差異や類似性の比較分析を可能とするクロス・カルチュラルな4Dマルチメディア世界地図システムを,海外の大学・研究機関の研究グループとの協働により構築・実現する.本4Dマルチメディア世界地図システムは,歴史・文化に関する多様なマルチメディアデータ(文書・画像・音楽・動画)間の意味的・時空間的関連性計量に適用し,各時代や文化の多様性を反映した動的計量・分析結果を時間軸を伴った三次元地図上に可視化することにより,国際社会における各国・地域・都市の文化的差異・類似性の比較分析を可能とする多元的情報分析システムである.本環境の実現により,利用者の興味・関心・視点・問題領域と時空間情報の組み合わせに応じた,利用者毎の多種多様な歴史的・文化的ストーリー(解釈)生成と新たな学術的メディア・コンテンツの生成が可能となる.平成23年度は,基本システム機能の設計(マルチメディアデータからの意味的メタデータ抽出機能,文化別メディア要素分析機能,メディア別計量空間,クエリ処理・解釈機能,時空間情報分析機能,文化的先・類似性計量機能等),対象とするメディア・分野の選定,および,プロトタイプシステムの構築を,文化財のデジタル・アーカイヴ化,検索・分析システム構築を推進する海外の研究者グループ(インドネシア,タイ)との共同により行った.これらの分析・検索・可視化・共有機能を用いることにより,利用者はインタフェースにおける検索条件ならびに問題領域に関するキーワードの入力・選択,または,マルチメディアデータの投稿を行うのみで,検索・分析意図に応じて自動的に生成された意味的クエリおよびメディアデータ・クエリによって,歴史・文化に関するマルチメディア群を多角的・動的に検索・分析することが可能となった.本システム実現に関する学術的成果として,1件の国際ジャーナル論文の発表,1件の国際会議における招待講演発表,6件の国際学会発表(査読有り),2件の国内学会発表(査読有り),1件の国内学会発表(査読無し)を行った他、本研究の推進過程において国際的な学術的・人的交流ネットワーク,および,国際協働体制(フィンランド,ドイツ,タイ,インドネシア,ベトナム等)を構築し,The 1st Indonesian-Japanese Conference on Knowledge Creation and Intelligent Computing (KCIC 2012)をインドネシアEEPISの研究者と共に主催するなど,国際的な展開に関して成功を収めたため.(1)これまでに構築したメディア別意味的検索システム,文化的差異・類似性計量システムと時間的・空間的情報データベースとの連結・統合を行う.

(2)連結・統合された意味的情報検索システムおよび時間・空間的情報データベースから得られた分析結果を可視化する機能を設計,実現する.(3)実現された分析システムの結果を,時系列および問題領域・情報源・イシュー別・地域別に表示可能とする3Dメディア・インタフェースを設計し,実現する.必要に応じて,研究補助に依頼し,3Dオブジェクト作成ソフトウェアの開発を行う.(4)総合的な実証実験システムを設計,実現し,内外の研究協力者の協力のもとに実証実験を行う.海外の研究協力者には,マルチメディアデータベース,メディアデザイン,ユーザインタフェースの研究者(Aalto Univ.,フィンランド),セマンティック・ウェブの研究者(Christian-Albrechts University,ドイツ),画像検索(CBIR)手法・データマイニング研究者(EEPIS,インドネシア),および,画像メディアのアノテーションおよび検索手法の研究者(NECTEC,タイ)を予定している.(5)実証実験の結果を受けて,文化的差異・類似性計量機能,および,情報可視化機能の改良を行う.平成24年度においては,前年度に引き続き歴史・文化に関する時空間情報データベースの作成作業および実証実験システムの構築を行うため,また,可視化する機能,3Dメディア・インタフェースの実装のために,研究・プログラミング補助を約30日間設ける.また,総合的システムの実用性について海外の研究協力者の協力を得て検証実験を行うため,国内出張・国外出張を5回程度予定している.具体的には,国内・海外研究打ち合わせを1回程度,国内における成果発表や研究打ち合わせのための会議を2回程度,海外における成果発表2回程度を予定している.この国際会議における成果発表のための海外出張旅費の一部には,平成23年度の研究費残額(スケジュールの都合により実施できなかった海外研究者招聘のための費用)を使用する.
Ras遺伝子産物のモノクローナル抗体を利用したがん診断法の開発

本研究の目的は発がん遺伝子の一種であるC-Ha-ras遺伝子の遺伝子産物に対する抗体を作成し、その抗体をがんの診断に応用することである。C-Ha-w・s遺伝子産物は、その遺伝子を化学合成し、大腸菌で発現させて大量に得ることにし、膀胱がん,肺がん,腎盂がん,正常細胞が有する4種類の遺伝子を合成した。これらは、コドン12番目あるいは61番目に点突然変異を有する。合成遺伝子を含むプラスミドで大腸菌をトランスホームしたところ、それぞれのrasたんぱく質が効率よく発現されていることが判明したので、大腸菌を大量に培養し、細胞抽出液を得て、DEAE-Sephacilカラムクロマトおよびゲル濾過法により目的のたんぱく質を+数mgから数+mg得た。これらのたんぱく質はすでに報告されているGDP結合活性,GTPase活性を有することも明らかにした。得られたrasたんぱく質の抗体を得るために、マウスを免疫し、脾臓細胞を取り出し、マウスのミエローマとのハイブリドーマを作製した。スクリーニング、クローニングを行なってc-rasたんぱく質に特異的なモノクローナル抗体産生細胞を10種得た。このうちrasたんぱく質のN末端から12番目がバリンに変異したrasたんぱく質に特異的なモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養上清から得、その性質を調べた。抗【ras^(val12)】は【ras^(val12)】に強く結合し、また他の変異rasたんぱく質、正常細胞のrasたんぱく質とも抗原抗体反応を示した。従って、膀胱がん【ras^(val12)】に特異的なモノクローナル抗体を選択することはできなかったが、rasたんぱく質に対するモノクローナル抗体は作製できたので、ras遺伝子が活発に発現しているがんを診断する方法は確立できる見込みである。膀胱がん、肺がん、ミエローマなどには、がん遺伝子の1種であるras遺伝子が活性化されて存在することが明らかにされており、膀胱がんなどのras遺伝子産物にはN-末端から12番目あるいは61番目に変異を有する。従って、それぞれのがんに特異的なras遺伝子産物のモノクローナル抗体を調製すれば、膀胱がん、肺がんなどのがんの診断が可能である。この目的のために、それぞれのがん特異的なC-Ha-ras遺伝子を化学合成し、大腸菌で発現させて、rasたんぱく質を大量に調製し、モノクローナル抗体を作成することを計画し、現在までに以下の成果を得た。1) C-Ha-ras遺伝子構築のために必要な約40種のオリゴデオキシリボヌクレオチドを固相リン酸トリエステル法および固相亜リン酸トリエステル法により合成した。2) 1)で合成したオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼを用いた2段階の結合法により、膀胱がんおよびミエローマ由来のC-Ha-ras遺伝子を合成し、大腸菌のトリプトファンプロモーターを有するプラスミドベクターに插入してras遺伝子を含むプラスミドを構築した。3)上記で得た膀胱がんのras遺伝子を含むプラスミドを制限酵素ClaIおよびBssHIで切断し、DNAフラグメントの置換により正常細胞由来のC-Ha-ras遺伝子を含むプラスミドを構築した。4) 3種類のプラスミドでそれぞれ大腸菌をトランスホームし、ras遺伝子を効率よく発現させた。5)トランスホームした大腸菌を大量培養し、溶菌の後にイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーにより3種類のras遺伝子産物を十数mg単離精製した。単離精製したrasたんぱく質はGDP結合汚性およびGTPase活性を示した。
Moduli空間の解析的研究

以下は1996年4月2日、日本数学会年会で発表予定の研究成果である。リーマン面の理論においては、面上の点を表示するパラメータとして普遍被覆面上の座標を用いると都合の好いことが多い。リーマン面の解析族においても、アールフォース、ベアスの理論や、最近の木塚の仕事において普遍被覆面上のパラメータが有効に用いられている。このように、解析族に関する話を一旦被覆空間に上げた時に遭遇する一つの一般的問題は、それが擬凸多様体かどうかということである。ロバン定数など、重要な等角不変量の半連続性が、そもそも擬凸性によって始めて保証されるからである。昨年春の学会では、単位円板上のコンパクトリーマン面の解析族の被覆空間の正則凸性が普遍被覆空間についてだけでなく、任意の被覆空間に対して言える性質であることを報告した。ここではそれをさらに進めてリーマン面の退化族について分かった被覆空間の一性質について報告する。Τを可縮な複素解析空間、π:X→Τを上への固有正則射とし、t∈Τ,U⊂Τに対し、X_t=π^<-1>(t),X_U=π^<-1>(U)とおく、またω:X→Xを被覆写像、X_t=ω^<-1>(X_t),X_U=ω^<-1>(X_U)とおく。定理点to∈Τに対し、dimX_<to>=1かつX_<to>が正則凸であるとせよ.このときある近傍U∋toが存在してX_Uは正則凸になる。証明には12年前の論文で用いた方法が役に立った。
高速イオン輸送研究のための2.45及び14MeV中性子の同時計測システムの開発

燃焼プラズマの物理の理解に必要な高速イオン輸送研究のために、2.45及び14MeV中性子の同時計測可能なシステムの研究開発を行った。開発では、これまでの実績による課題を念頭に、ゲイン変動と呼ばれる波高変動の特性の把握、シンチレータ検出器の特性の把握、パルス波形最適化のための高速パルス波形処理用機器や解析ソフトの開発、処理用機器の試験を行い、改良に向けた指針を得た。指針にもとづき、多段式の検出システムを考案した。試験の結果、多段式検出システムが有望であることが確認できた。平成22年度は、核融合中性子源施設(FNS)にて、高いDT中性子フラックスを用いた実験ができ、DT中性:子によるゲイン変動の特性の取得ができた。実験では、光電子倍増管のデバイダーについて既存のデバイダー回路に加え、市販のアクティブデバイダーを用いた実験も行うことができた。得られた結果はどちらの方式でもほぼ同じでDT中性子フラックスの増加と線形の傾向をもって最大波高が減少した。さらに光電子倍増管の印可電圧を変化させて、印可電圧依存性のデータを取得したところ、印可電圧を下げると最大波高の減少は小さくなる。この波高の変動は波高の高いパルスに顕著にみられることから、デバイダー電流による電圧降下よりも、光電子倍増管の後段における空間電荷効果の可能性が高いと考えられる。また、1インチの有機シンチレータについて、絶対較正を行った結果、ガンマ線の混入が数%未満の設定ではDD中性子について0.1-0.15 count/neutronであった。これは、有機シンチレータの上限に近い。このため、一つの検出器での検出効率の現状からの大幅な向上は難しい。このような、結果を考慮すると核融合装置の実験でゲイン変動を押さえつつ、DD中性子とDT中性子の検出効率をあげるには、二つの検出器を直列に並べたタンデム式の検出器を開発するのがよいと考える。さらに、200MHz程度のサンプリング周波数で、弁別精度を向上させるパルス波形を得ることができるように、波形を50-150ns程度にする高速な波形整形回路の設計検討を行ったところ、既存の機器の改造で調達できた。この波形整形回路を通した信号は、弁別に必要な波形情報が維持されていた。時定数の増加とともに、弁別精度を向上させることができた。高い計数率との両立を考え、50ns程度の時定数を用いることとした。加えて、高速対数アンプの製作、及び、弁別プログラムの改良を行った。高速対数アンプの調整実験は平成23年度に実施する。DD中性子とDT中性子は、核融合実験装置における高速イオン閉じ込め特性研究で重要な測定鼻であり、時間と空間分解能にすぐれたシンチレータ検出器を用いた計測システムの構築を進めてきた。本システムによる計測では、原子力機構のトカマクプラズマ発生装置(JT-60U)の実験で高計数率時に時間スケール数百ミリ秒でパルス信号がなまる現象(ゲイン変動)が発生することがわかり、処理の自動化が困難であった。本研究は、このゲイン変動を抑えつつ、DD中性子とDT中性子の検出効率をあげる測定法を開発することを目的としている。JT-60Uで得られた実験結果、及び、平成22年度の原子力機構の核融合中性子源施設(FNS)で得られた実験結果より、ゲイン変動を押さえつつ、検出効率をあげるには、二つの検出器を直列に並べたタンデム方式の検出器を開発することがよいという考えに至った。そこで、平成23年はタンデム方式の設計検討を行い、検出器を制作した。一方、デジタル処理法では、中性子-γ線弁別処理をソフトウェアで実施しているが、ゲイン変動により、中性子-γ線弁別処理の自動化には困難な部分があった。平成22年度までの実験結果からゲイン変動の素性の理解がすすんだため、その特性を考慮した改良を行うことができた。これにより、これまで手動で行なっていた部分の多くの自動化が進んだ。また、上記タンデム式の検出器の調整実験を行う予定であった。加えて、平成22年度に製作したが、調整実験ができていなかった高速対数アンプの調整実験も行う予定であった。しかしながら、平成23年3月の震災時に被災したFNSの復旧が予定より遅れ、平成23年度は、これら実験に関する部分を実施できなかった。平成24年度に実施予定である。DD中性子とDT中性子は、核融合実験装置における高速イオン閉じ込め特性研究で重要な測定量であり、原子力機構のトカマクプラズマ発生装置(JT-60U)の中性子分布計測において、高い計数率と高い中性子-γ線の弁別精度を特徴とするデジタル処理法を開発したが、高計数率時に発生する信号がなまる現象(ゲイン変動)が弁別の自動処理を困難とした。

JT-60Uで得られた実験結果、及び、平成22年度の原子力機構の核融合中性子源施設(FNS)で得られた実験結果より、ゲイン変動を押さえつつ、検出効率をあげるには、光電子増倍管(PMT)の高電圧の設定電圧を下げ、ゲイン変動に耐性をあげ、検出効率は検出器の個数で稼ぐ、二つの検出器を直列に並べたタンデム方式の検出器を開発することがよいという考えに至った。そこで、平成23年度にタンデム方式が実用可能なような小型の検出システムの設計検討を行い、検出システムを制作した。この新しい検出システムについて、平成24年度にFNSにおいて、DT中性子に対し、シンチレータ検出器・光電PMTの設置体系を変え、比較し、性能評価を行った。後段が前段より受ける影響については、波高スペクトル形状を変えるような影響は見られず、前段のシンチレータ・PMTの配置の組み合わせに依存して、計数率が20-40%減少した。PMTを後段の視線から外すのが最善であり、同じ検出器2台を並べたシステムで検出効率は1.8倍となる。また、検出効率も評価し、25mmシンチレータ時、3%程度であった。本方式が有望であることが確認できた。今後、DD中性子について同様に特性を調査する予定である。平成23年3月の震災時に被災したFNSの復旧が予定より遅れ、平成23年度、実験を実施できなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記のように被災した実験施設FNSの復旧の遅れにより、実験を実施できていないが、夏ごろまでにはFNSでの実験が可能になる見通しを得ている。マシンタイムの制限は予想されるが、FNS関係者の協力のもと、可能な限り必要なデータを取得する。
オンライン手書き楽譜認識システムの構築

手書きの楽譜を認識する場合においても、五線部分は印刷されている場合が多く、その五線位置を基準として他の記号が描かれているため、前処理として、正確に五線位置を検出する技術が必要不可欠である。そこで、次の手法を使って印刷された五線を検出する手法を考案した。1.画像領域を複数の垂直線で等分割し、その分割線上で五線の候補となり得る点を検出する。2.動的計画法を用いて、五線候補点を結合する。この際、隣合う分割線上の候補点間を結ぶ直線の傾きや線上の黒画素の存在状態に基づいて、動的計画法における距離計算を行った。3.五線の各線の線間隔を考慮に入れ、ラベリング操作によって、一つの五線の固まりを検出する。この際、動的計画法で検出できなかった線分の補間も行った。4.黒画素の探索により、五線の端点部分の検出と位置補正を行う。上記手法を、途切れ、傾き、湾曲した五線を含む71枚の印刷楽譜に適用したところ、99.4%の高検出率を得ることができた。一方、手書き楽譜認識システムについては、昨年度、フリーマンコードとテンプレートマッチングを相互に使う手法を用い、楽譜の基本記号については97.45%の認識率を得ている。現在、さらに高い認識率を上げるために、記号の筆記順序を学習する隠れマルコフモデルを用いた認識アルゴリズムを考案中である。オンライン楽譜認識を行うために次の2つの手法を開発した。1.タブレット上にライトペンで書かれた筆記情報を等時間間隔でサンプリングし、その座標間の直線を07の数値でコード化する(フリーマンコード化)。1ストロークのコード列を追跡し、コード相互間の形状特徴に基づき、端点、屈曲点、直線、曲線、閉区間のパーツに分類する。分類した各パーツの相対位置関係から、音楽記号の識別を行う。2.上記の筆記情報を2次元の白黒画像として扱う。ストロークから得られた線図形に対して太線化、大きさの正規化を行い、あらかじめ用意しておいた標準テンプレート画像とテンプレートマッチングを行う。この結果、類似度の高い音楽記号を認識結果とする。最終的には、上記2つの手法を組み合わせて1つの認識結果を出力する必要がある。手法1は、単純で閉区間を含むような記号に適し、手法2は線画的に複雑な記号に適していることが実験を通してわかっている。そこで、手法1の結果で音符記号が得られた場合には、その結果を採用し、それ以外は手法2の結果を採用することにした。実験では、対象記号として、8分音符、4分音符、2分音符、全音符、8分休符、2分休符、全休符、シャープ、ナチュラル、フラット、タイ(スラー)の11種類の記号を用いた。各記号50パターンについて認識実験を行ったところ、全体で97.45%の認識率を得ることができた。今後は、更なる認識率の向上と対象記号の拡大を行うとともに、筆記者の癖の情報を有効に利用できる手法に改良していくつもりである。
果実の糖蓄積および糖酸バランス調節における糖新生・PEPCKの機能解明

PEPCKは糖新生の初発段階の律速酵素であるが、液果型果実の代謝における機能は明らかになっていない。本研究はトマトを用いて同酵素遺伝子を過剰発現/発現抑制した形質転換体を作出し、果実糖度・糖酸バランス調節、植物体生長への影響を調査した。その結果、果実の糖、リンゴ酸含量はPEPCKの発現に応じて増減が見られ、これらの成分調節にPEPCKおよび糖新生が関与していることが明らかとなった。またPEPCK発現レベルは実生生長にも影響し、特に過剰発現形質転換体では糖の添加に伴い顕著な生長促進効果が見られた。このことからPEPCKは実生発達における糖エネルギー利用にも関与していることが明らかとなった。(1) PEPCKRNAi形質転換系統における果実成分の動態および表現形質の解析:PEPCK発現抑制形質転換体について、35Sプロモーターおよび果実特異的E8プロモーター駆動型双方において1コピー、ホモ接合体のT2世代系統を各々2系統づつ獲得した。これらの系統において形質調査を行った結果、種子発芽後の実生生育に明らかな遅延が見られ、成熟植物体の草丈も減少することを明らかにした。また、果実成分についても形質転換体系統において、糖含量の低下と有機酸含量の増加を確認した。(2) PEPCK過剰発現形質転換体の作出と果実成分の動態および表現形質の解析:PEPCK cDNA全長を35Sプロモーターに連結した形質転換体ベクターを作成し、アグロバクテリウム法により品種`Micro-Tom'へ形質転換を行った。25年度末までに2倍体のT0世代を十数系統獲得し、現在、サザンブロット解析によってコピー数を調査中である。また、E8プロモーター駆動型の過剰発現形質転換体作出についてもベクターを作成し形質転換を開始した。(3)新規PEPCK遺伝子の特性解析:先行研究においてゲノムデータベースより同定した新規遺伝子(PEPCK2)について、遺伝子特異的プライマーを用いてRT-PCRにより発現解析を行った。その結果、果実において発現レベルがPEPCK1の1/5000以下であることが明らかとなり、偽遺伝子である可能性が高いことが示された。(1) PEPCK発現抑制形質転換体における代謝動態解析および初期生長への影響評価:PEPCK酵素活性の測定を行い、供試系統においてPEPCK酵素活性が有意に下がっていることを確認した。また、果実におけるアミノ酸含量を解析した結果、PEPCKの発現抑制による顕著な影響は見られなかった。このことから、同遺伝子の発現抑制による一次代謝への影響は、主として糖、有機酸に限定されることが明らかになった。(2) PEPCK発現抑制形質転換体における発芽種子生長への影響評価:前年度、PEPCKの発現抑制により発芽実生の生長が抑制されることを報告した。今年度、これらの影響をより詳細に解析した結果、生長抑制は地上部よりも根により顕著に見られることが明らかとなった。(3) PEPCK過剰発現形質転換体の作出:35Sプロモーターおよび果実成熟期特異的E8プロモーターを用い、両プロモーター駆動型において1コピー、ホモ接合型のT2系統を各々複数形等獲得した。35Sプロモーター駆動型形質転換系統の果実糖含量を測定した結果、赤熟期果実において、可溶性糖含量が増加することが明らかとなった。これは、RNAi法により発現を抑制した場合と逆の結果であり、PEPCKが赤熟期果実において糖含量の調節に関与しているという、我々の仮説を裏付けるものである。他方、有機酸を測定した結果、過剰発現形質転換体と野生型の間で顕著な差は見られなかった。今後、E8プロモーター駆動型過剰発現形質転換体と併せて、糖、有機酸以外の一次代謝産物の測定を行うと共に、植物体生長、果実収量への影響を評価する予定である。(1) PEPCK発現抑制形質転換体における代謝動態解析および初期生長への影響評価:平成26年度までに解析を終了し、27年度はPEPCK過剰発現形質転換体の解析に注力した。[(3)を参照](2) PEPCK発現抑制形質転換体における発芽種子生長への影響評価:平成26年度までに解析を終了し、27年度はPEPCK過剰発現形質転換体の解析に注力した。[(3)を参照。](3) PEPCK過剰発現形質転換体における代謝動態解析および初期生長への影響評価:平成26年度までに形質転換体の作出およびエリートラインの選抜を行い、35Sプロモーター駆動型で4系統、果実成熟期特異的E8プロモーター駆動型において5系統獲得した。これらの系統について、赤熟果実における果実成分(糖、有機酸)および表現形質解析(実生生長、栄養生長、果実収量等)を解析し、赤熟果実において糖含量が増加し、リンゴ酸含量が減少すること、CaMV 35Sプロモーター駆動型形質転換体において、発芽実生生長が促進されることを明らかにした。これらはPEPCK発現抑制形質転換体で得られている結果と相反する効果であることから、果実の糖・有機酸蓄積や実生生長の制御にPEPCK /糖新生が遺伝子発現レベルで直接関与することが証明された。興味深いことに、過剰発現形質転換体の実生において外生的な糖処理によって、より強力な生長促進作用が認められた。これらの結果は、PEPCKの作用機作が器官によって異なり、実生では糖の利用効率に影響を及ぼしていることを示唆している。