hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カタツムリニューロンを用いた単一細胞RT-PCRによるGABA_B受容体の機能解析

抑制性伝達物質として神経機能の調節に重要な役割を果たしているγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid:GABA)は,大別して二つのサブタイプからなる.一つは古くからその存在が知られているGABA-A受容体であり,もう一つはGABA-B受容体(B受容体)である.B受容体の分子構造や機能に関しては,未だあまり研究が進んでいない.私は研究の目標を,1,B受容体を,哺乳類の神経細胞に発現させ,電気生理学的にその機能を調べることが可能な発現系を樹立すること,2,B受容体の生理機能の解析,の2点に置いて検討を進めた.1,に関しては,いろいろな種類の細胞及び遺伝子導入の方法を検討して,以下のような結論を得た.受容体機能を発現させるための細胞系としては,本来は維持管理が比較的容易で細胞の性質のばらつきが少ない腫瘍細胞系が望ましいが,発現レベルが低いものが大部分で標本として適していない.齧歯類の上頚交感神経節ニューロンは,細胞/核の容積比が小さく,遺伝子の核内インジェクションに適していることやB受容体の発現が無いことなどより,最適である.遺伝子トランスフェクションは,通常行われている電気パルス法やリン酸カルシウム法は,初代培養神経細胞の場合は細胞障害が大きいため,適しておらず,微小ガラス管ピペットを用いて発現ベクター遺伝子を細胞の核内に注入する方法が,良好な結果が得られる.2,のB受容体の生理機能の解析に関しては,B受容体によるカルシウムチャネルの制御機能を検討し,以下の結果を得た.B受容体の活性化は,中枢および末梢の神経細胞において,高閾値活性化型カルシウム電流(HVA-IC)の減衰を引き起こすことはよく知られているが,私はこの抑制作用に加えて,B受容体の活性化が一過性のHVA-ICの増大をも,引き起こすことを見いだした.この作用はG蛋白活性化による細胞内情報伝達系を介した二次的作用であると推論された.抑制性伝達物質として神経機能の調節に重要な役割を果たしているγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid:GABA)は,大別して二つのサブタイプからなる.一つは古くからその存在が知られているGABA-A受容体であり,もう一つはGABA-B受容体(B受容体)である.B受容体の分子構造や機能に関しては,未だあまり研究が進んでいない.私は研究の目標を,1,B受容体を,哺乳類の神経細胞に発現させ,電気生理学的にその機能を調べることが可能な発現系を樹立すること,2,B受容体の生理機能の解析,の2点に置いて検討を進めた.1,に関しては,いろいろな種類の細胞及び遺伝子導入の方法を検討して,以下のような結論を得た.受容体機能を発現させるための細胞系としては,本来は維持管理が比較的容易で細胞の性質のばらつきが少ない腫瘍細胞系が望ましいが,発現レベルが低いものが大部分で標本として適していない.齧歯類の上頚交感神経節ニューロンは,細胞/核の容積比が小さく,遺伝子の核内インジェクションに適していることやB受容体の発現が無いことなどより,最適である.遺伝子トランスフェクションは,通常行われている電気パルス法やリン酸カルシウム法は,初代培養神経細胞の場合は細胞障害が大きいため,適しておらず,微小ガラス管ピペットを用いて発現ベクター遺伝子を細胞の核内に注入する方法が,良好な結果が得られる.2,のB受容体の生理機能の解析に関しては,B受容体によるカルシウムチャネルの制御機能を検討し,以下の結果を得た.B受容体の活性化は,中枢および末梢の神経細胞において,高閾値活性化型カルシウム電流(HVA-IC)の減衰を引き起こすことはよく知られているが,私はこの抑制作用に加えて,B受容体の活性化が一過性のHVA-ICの増大をも,引き起こすことを見いだした.この作用はG蛋白活性化による細胞内情報伝達系を介した二次的作用であると推論された.GABA受容体のなかのGABA-B受容体は現在でも多くの未解明な部分が残されており、特にその分子構造に関しては私が、本申請をおこなった時点では、未だ解明されていなかったが、昨年(1997年)、スイスの研究グループによって、その構造が、特殊な発現クローニングの手法を用いて、ついに解明されるという事態にいたり、私自身の研究もやや軌道修正をせざるを得なくなった。すなわち、そのアミノ酸一次構造が、解明されたため、カタツムリの巨大神経細胞を用いて、遺伝子構造を解析する必要がなくなり、私の研究も、その次の段階、すなわちGABA-B受容体遺伝子を用いての機能解析、へと進むことが可能となった。そこで、私は初年度の研究目標を、GABA-B受容体を、哺乳類の神経細胞に発現させ、電気生理学的にその機能を調べることが可能な発現系を樹立することとし、これまでに、いろいろな種類の細胞及び遺伝子導入の方法を検討して、以下のような結果を得た。受容体機能を発現させるための細胞系としては、本来は維持管理が比較的容易で細胞の性質のばらつきが少ない腫瘍細胞系が望ましいが、COS cell、HECK cell、あるいはneuroblastoma cellなど、いろいろと検討を加えたが、すべて発現レベルが低く、齧歯類の初代培養神経細胞、特にその中でも、上頚交感神経節ニューロンが、細胞/核の容積比が小さく、遺伝子の核内インジェクションに適していること、シプナス後GABA-B受容体の発現が無いことなどより、最適であると結論された。

遺伝子トランスフェクションの方法は、通常行われる電気パルスによる方法が、初代培養神経細胞の場合は細胞障害が大きいため、採用できず、微小ガラス管ピペットを用いて、発現ベクターに組み込んだ遺伝子を直接、細胞の核内に注入する方法をとったが、良好な結果が得られた。抑制性伝達物質として神経機能の調節に重要な役割を果たしているγ-アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid:GABA)は,大別して二つのサブタイプからなる.一つは古くからその存在が知られているGABA-A受容体であり,もう一つはGABA-B受容体(B受容体)である.B受容体の分子構造や機能に関しては,未だあまり研究が進んでいない.私は研究の目標を,1,B受容体を,哺乳類の神経細胞に発現させ,電気生理学的にその機能を調べることが可能な発現系を樹立すること,2,B受容体の生理機能の解析,の2点に置いて検討を進めた.1,に関しては,いろいろな種類の細胞及び遺伝子導入の方法を検討して,以下のような結論を得た.受容体機能を発現させるための細胞系としては,本来は維持管理が比較的容易で細胞の性質のばらつきが少ない腫瘍細胞系が望ましいが,発現レベルが低いものが大部分で標本として適していない.齧歯類の上頚交感神経節ニューロンは,細胞/核の容積比が小さく,遺伝子の核内インジェクションに適していることやB受容体の発現が無いことなどより,最適である.遺伝子トランスフェクションは,通常行われている電気パルス法やリン酸カルシウム法は,初代培養神経細胞の場合は細胞障害が大きいため,適しておらず,微小ガラス管ピペットを用いて発現ベクター遺伝子を細胞の核内に注入する方法が,良好な結果が得られる.2,のB受容体の生理機能の解析に関しては,B受容体によるカルシウムチャネルの制御機能を検討し,以下の結果を得た.B受容体の活性化は,中枢および末梢の神経細胞において,高閾値活性化型カルシウム電流(HVA-IC)の減衰を引き起こすことはよく知られているが,私はこの抑制作用に加えて,B受容体の活性化が一過性のHVA-ICの増大をも,引き起こすことを見いだした.この作用はG蛋白活性化による細胞内情報伝達系を介した二次的作用であると推論された.
近赤外線吸光法による食用油脂の過酸化物価の非破壊測定

これまで液体油脂の酸化速度を検討し,さらに過酸化物価の非破壊測定について検討してきた.液体の食用油の酸化の速度過程については,1つの式にまとめられ(飯渕:農化, 70, 29-36, 1996),油脂の保存条件と反応速度定数(開始期,連鎖反応期,重合期,分解期)の関係が示されている.本年度は固形食品に含まれる油脂の酸化にも酸化速度式が適用できるか,また近赤外分光法による非破壊測定が可能かどうかを検討した.試料はポテトチップス,インスタントラーメン,クラッカー,揚げ米菓を用いた.紫外線を照射し強制的に酸化させ,経時的にサンプリングし, Carl Zeissの分光装置(9501700nm)を用いて近赤外スペクトルを測定し,スペクトルRの逆数の対数Iog(1/R)の2次微分値を求めた.酸化の程度はWheelerの変法により過酸化物価を測定した.その結果,近赤外スペクトルより得られた2次微分値と過酸化物価の測定値の相関が高かった1465nmの値を用いて,過酸化物価の値を単回帰式で示すことができた.試料とした固形食品は主としてパーム油が用いられていたため,パーム油の過酸化物価についても測定したところ,同じ波長で非破壊測定が可能であった.さらに,速度定数を求めた結果,開始期,重合期および分解期の速度定数の値は液体油脂と比べて大きな違いはなかった.しかし,連鎖反応期は液体油脂に比べて極めて小さい値であることがわかった.その理由として,固形食品中の油脂は他の食品成分と結合しているため互いに接触する機会が少ないので,連鎖反応が起こりにくいものと考えた.本研究により,液体油脂および固形食品の油脂の酸化の程度を非破壊測定することが可能であることが示され,さらに固形食品中の油脂の酸化のメカニズムは液体油脂と油脂の存在状態が違うため,連鎖反応の進み方が異なることが明らかとなった.カロテノイドは油脂の酸化を抑制する効果があるといわれている.もし効果があるとすれば,食用油脂や油脂含有食品の酸化防止やカロテノイド吸収帯における油脂の過酸化物価油脂の測定に応用できると考えられる.平成17年度は光を遮断した40°Cの条件化で油脂を酸化させ,カロテノイドの酸化抑制効果およびカロテノイド吸収帯を利用した過酸化物価の測定について確認を行なった.試料には大豆油(和光純薬製)を用いた.カロテノイド(和光純薬製)濃度を変えた油(080ppm添加)をビーカーに入れ,マグネティックスターラーで撹拌しながら,光を遮断した40°Cの恒温装置において保存し,経時的にサンプリングを行った.スペクトルの測定には本補助金で購入した吸光スペクトル測定装置を用いた.サンプリングした試料をガラスシャーレに入れて,白色セラミック板の上に載せて,外光を遮断した暗箱内に設置し,反射強度のスペクトルを測定した.得られたスペクトルデータの対数の逆数をとってスムージング処理後,2次微分し解析を行なった.過酸化物価の測定はWheelerの変法によって行なった.その結果,過酸化物価を従属変数,いくつかの波長(382,400,483nm)における2次微分値を独立変数として,過酸化物価を予測する回帰式を得た.この式によれば標準誤差20%程度で,過酸化物価0100程度を推定することができた.しかし,カロテノイドの初期濃度の影響が大きく,大豆油以外の油に応用することはできなかった.また速度解析を行なった結果,カロテノイドの酸化抑制効果はないことが分かった.これは従来の定説とは異なる結果であって,さらに研究を深める必要がある.今回の測定によって得られた波長はカロテノイドの吸収波長でもあるので,データの信頼性を得るため,カロテノイドの色の影響を受けない波長領域でも検討を行なう予定である.液体の食用油の酸化の速度過程については,1つの式にまとめられ(飯渕:農化,70,29-36,1996),油脂の保存条件と反応速度定数(開始期,連鎖反応期,重合期,分解期)の関係が示されている.平成18年度は液体の食用油を構成するオレイン酸リノール酸およびリノレン酸を光を遮断した40°Cの条件下で酸化させ,経時的にサンプリングしたものを試料とし,本申請で購入した装置を用い,近赤外光(9501700nm)を照射し反射光のスペクトルを解析した.同時に従来法により,過酸化物価を化学的に定量して,スペクトルと化学分析値との関係を解析し,3種の脂肪酸の2次微分スペクトルに共通に現れるピークの波長域を選んだ.それらの波長域における反射強度(生データの反射率をRとした時log(1/R)の2次微分値)を独立変数とし,過酸化物価の化学分析値を従属変数として重回帰分析を行ったところ,係数が有意となる4波長域が選ばれた.それらの4波長域の値から過酸化物価を推定する回帰式を得た.過酸化物価=-9.66+1.07×10^6(λ1140)+7.31×10^5(λ1180)+1.86×10^6(λ1395)+8.06×10^5(λ1420)

(ただし,λnmはその波長における反射強度(例えばλ1140は11301150nmにおける反射強度の和)である.この回帰式を用いれば油脂の過酸化物価をリアルタイムで非破壊測定し,酸化速度を予測することが可能となる.また,脂肪酸の自動酸化の各段階における反応速度定数を求めた結果,自動酸化の開始期,連鎖反応期の酸化速度定数は脂肪酸の種類によらず同じであったが,重合と分解の速度定数は2重結合が多い脂肪酸ほど大きいことがわかった.今後は,23種の脂肪酸で構成されている食用油脂および油脂含有固形食品の酸化速度の分析にも応用できるようにさらに検討を続ける予定である.これまで液体油脂の酸化速度を検討し,さらに過酸化物価の非破壊測定について検討してきた.液体の食用油の酸化の速度過程については,1つの式にまとめられ(飯渕:農化, 70, 29-36, 1996),油脂の保存条件と反応速度定数(開始期,連鎖反応期,重合期,分解期)の関係が示されている.本年度は固形食品に含まれる油脂の酸化にも酸化速度式が適用できるか,また近赤外分光法による非破壊測定が可能かどうかを検討した.試料はポテトチップス,インスタントラーメン,クラッカー,揚げ米菓を用いた.紫外線を照射し強制的に酸化させ,経時的にサンプリングし, Carl Zeissの分光装置(9501700nm)を用いて近赤外スペクトルを測定し,スペクトルRの逆数の対数Iog(1/R)の2次微分値を求めた.酸化の程度はWheelerの変法により過酸化物価を測定した.その結果,近赤外スペクトルより得られた2次微分値と過酸化物価の測定値の相関が高かった1465nmの値を用いて,過酸化物価の値を単回帰式で示すことができた.試料とした固形食品は主としてパーム油が用いられていたため,パーム油の過酸化物価についても測定したところ,同じ波長で非破壊測定が可能であった.さらに,速度定数を求めた結果,開始期,重合期および分解期の速度定数の値は液体油脂と比べて大きな違いはなかった.しかし,連鎖反応期は液体油脂に比べて極めて小さい値であることがわかった.その理由として,固形食品中の油脂は他の食品成分と結合しているため互いに接触する機会が少ないので,連鎖反応が起こりにくいものと考えた.本研究により,液体油脂および固形食品の油脂の酸化の程度を非破壊測定することが可能であることが示され,さらに固形食品中の油脂の酸化のメカニズムは液体油脂と油脂の存在状態が違うため,連鎖反応の進み方が異なることが明らかとなった.
分子生物学的手法を用いた細菌の定量とバイオガス発生メカニズムの解明

医療用に開発された半導体ガスセンサー(mBA-3000)を用いて牛舎や堆肥場から発生するメタンおよび水素ガス濃度を測定した。その結果、メタンと水素や亜酸化窒素とは相関が見られなかったが、メタンとアンモニア濃度の間には弱い相関関係が見られた。次に、半導体ガスセンサーを用いて、反鯛動物から発生するメタン、水素ガス濃度を経時的に測定できる装置を新たに開発した(mBA-5000)。本装置はメタン及び水素ガスを10秒おきに、メタンを11000ppm、水素を1100ppmの感度で測定することが可能であり、約20時間分のデータを蓄積してシリアルポートを介してコンピューターに取り込むことができる。本装置を、ホルスタイン種雌ウシを収容した代謝チャンバー内に設置し、飼料給与前から給与後約6時間までメタンおよび水素ガス濃度を測定した。その結果、飼料給与開始後515分後から水素ガスの発生が見られ、飼料給与後約30分で最高値に達した。最高値は2090ppmと個体によって異なるが最高値に達するまでの時間はほぼ同じである。また、どの個体も飼料給与後約150分で水素濃度は0ppmとなり、次回の飼料給与まで水素ガスを検出しなかった。一方、メタンは飼料給与後約1時間で1000ppm近くまで増加し、その後濃度は減少するが、常に500700ppmの濃度を保っていた。メタン菌のPCR法による定量については、メチルコエンザイムMレダクダーゼαサブユニット(MGR)及び16SrDNAの塩基配列を用いたプライマーを用いて、定量的PCR法による定量法を確立した。本手法によって、プロトゾアの存在するウシおよび存在しないウシからのルーメン内容液中のメタン菌の種類と密度を解析した結果、有意な差があることを明らかにした。半導体センサー生体ガス測定システム(mBA-3000 (株)タイヨウ)及び30ml真空バイアル瓶を用いて、牛舎や堆肥場から発生するメタン、水素、及び一酸化炭素濃度を測定する手法を開発した。バイアル瓶に標準ガスを保存した実験では2週間までガス濃度の低下は見られなかった。本手法によって、これらのガスを0.1ppmまで測定することが可能であることを明らかにした。北海道の畜舎等から採取した試料にたついて、環境中のメタン、水素濃度を測定し、同時にナンモニア検知管によってアンモニア濃度を、ガスクロマトグラフによって亜酸化窒素濃度を測定した。これらのガス濃度それぞれの相関について検討したところ、メタンと水素や亜酸化窒素とは相関が見られなかったが、メタンとアンモニアガスとは弱い正の相関が見られた。また、メタン菌の定量については、従来は培養法を用いて行っていたが、メタン菌の培養には場合によっては2週間程度必要なことから、迅速な定量法の確立が求められていた。そこで分子生物学的な手法を用いることによって、環境中に存在するDNAからPCR法によって目的とする細菌に特異的な配列を検出する方法を応用することとした。実際には、メチルコエンザィムMレダクターαサブユニット(MCR)及び16SrDNAの塩基配列を用いたプライマーを用いて、定量的PCR法によるメタン菌の定量法を確立した。メタン菌の培養液を用いた試験ではメタン菌が100個程度まで定量することが可能であることを明らかにした。半導体センサー生体ガス測定システム(mBA-3000、(株)タイヨウ)を用いて、ウシの呼気中に含まれるメタン、水素および一酸化炭素ガス濃度を測定する手法を開発した。メタン濃度に関しては、同時にガスクロマトグラフィーを用いて測定し、半導体センサーを用いた値と比較した結果、0 100ppmの濃度範囲において非常によく相関していた。

また、水素ガスとメタンガス濃度の間にはほとんど相関が見られなかったことから、水素ガスを完全に採取するのは難しいことが示唆された。畜舎内のメタンおよび炭酸ガス濃度を経時的に測定した結果、時間や場所によって炭酸ガス濃度が高くメタンガス濃度がそれほど高くない場合や、逆にメタンガス濃度が高く炭酸ガス濃度がそれほど高くない場合があり、畜舎内では、この両者のガス濃度は必ずしも常に一定の割合で推移しないことが明らかとなった。ルーメンにおけるメタンガス発生を抑制する物質をスクリーニングするための予備実験として、ルーメン内容液を30mlのバイアル瓶中で嫌気的に培養し、気相中に含まれるガス成分を半導体センサーを用いたガス測定システムで測定した。また、同時にバクテリオシンを生産する乳酸菌10株について、その培養液を加えて培養した。その結果、ルーメン内容液を24時間培養した後、気相中の水素ガス及びメタンガスを測定したところ、水素ガスは105 305ppmの範囲に、メタンガスは4700 5100ppmの範囲であった。また、乳酸菌培養液を加えてもその値にほとんど変化は見られなかった。半導体センサーを用いて、反芻動物から発生するメタン、水素ガス濃度を経時的に測定できる装置を新たに開発した(mBA-5000)。本装置はバッテリーでも駆動することができる装置で、メタン及び水素ガスを10秒おきに、メタンを1 1000ppm、水素を1 100ppmの感度で測定することが可能であり、約20時間分のデータを蓄積してシリアルポートを介してコンピューターに取り込むことができる。代謝チャンバーに収容した生後33 35ヶ月齢のホルスタイン種雌ウシ(体重600 700kg)に低水分イタリアンライグラスサイレージ及び配合飼料を主体とした飼料を給与し、本装置をウシの顔面上部約1mに設置し、飼料給与前から給与後約6時間までメタン及び水素ガス濃度を測定した。その結果、飼料給与開始後5 15分後から水素ガスの発生が見られ、飼料給与後約30分で最高値に達した。最高値は20 90ppmと個体によって異なるが最高値に達するまでの時間はほぼ同じである。また、どの個体も飼料給与後約150分で水素濃度は0ppmとなり、次回の飼料給与まで水素ガスを検出しなかった。一方、メタンは飼料給与後約1時間で1000ppm近くまで増加し、その後濃度は減少するが、常に500 700ppmの濃度を保っていた。ルーメン内容液中のメタン菌は、16SrDNAあるいはメチルコエンザイムMレダクターゼαサブユニット(MCR)の塩基配列を用いたプライマーによるPCR法によって検出できるが、実際のルーメン液よりメタン菌を定量するためにはプライマーの設計等についてさらに検討を加える必要があることが明らかとなった。
イオン性結晶薄膜中の励起子と励起子分子の閉じ込め効果

共有性からイオン性結合に至る一連の物質群について,エピタキシャル成長による薄膜制作,界面形成に関する要求と,その空間閉じ込め効果による,電子状態の変化に対する興味は,ますます大きく成っている。本研究では,先ず超高真空下での分子線エピタキシ-法により,NaCl型構造のMgO(001)基板上に,閃亜鉛鉱型構造のCuCl,CuBrを成長させる事を試みた。薄膜の構造は,反射高速電子線回折(RHEED)のその場観察,及びX線回折,原子間力顕微鏡を用いて調べた。そして,良好な2次元成長が生じ,CuCl,CuBrがそれぞれ異なる界面原子配置を与える事を見いだした。このようなCuCl薄膜の吸収スペクトルの膜厚依存性を液体He温度で測定した。その結果,300Aより薄い各種膜厚の試料で,量子閉じ込め効果を受けた励起子に特徴的な新たな吸収構造を見いだした。この構造の解析により,閉じ込めを受けた励起子の新たな光遷移選択則を得る事ができた。試料がさらに厚くなると,励起子ポラリトンの干渉効果が強まり,この選択則は乱される。また励起子の振動子強度は,膜厚に比例して増大し,閉じ込め量子数の二条に反比例して小さくなる事が示された。これらの実験結果は,励起子の空間量子閉じ込めに特有の効果である事が,大阪大学張教授の解析を用い示された。
グリオーマ患者における免疫動態ー併用薬剤とBRMの選択・使用方法

悪性グリオーマは、主として局所に限局した浸潤性腫瘍である。しかも、臨床的に診断されたグリオーマは、他の癌では手術対象にならない全摘出不可能な症例が大半である。それ故、外科的に切除可能病変か否かにより、脳腫瘍の治療方針を選択する必要がある。視床部や脳幹部の腫瘍の様に手術切除不可能な病変では、放射線療法の他には、血液脳関門を通過しやすいニトロソウレア系制癌剤を投与するにすぎない。ニトロソウレア系制癌剤は、骨髄抑制が強く、6ー8週毎にしか全身投与できない。またこの制癌剤は、体内での半減期も短く、その代謝産物に抗腫瘍効果がないことから、必ずしも適切な制癌剤ではない。本研究では、主として手術可能病変に生じた脳腫瘍の治療方法の確立を目的として行われた。脳表面に広く分布した脳神経機能の局在のために、腫瘍の部位診断が正確に行われても、神経欠落症状を残さずに腫瘍全摘出術を行うことは不可能であった。それ故、腫瘍摘出術後、放射線療法を行うこと共に種々の制癌剤の投与が試みられてきた。しかし、制癌剤の大半は神経毒性を有している事から、血液脳関門を通過するニトロソウレア系制癌剤の他には、腫瘍切除腔内への制癌剤の投与にも自ずと制限がある。脳実質内には、リンパ組織が存在しない事から、BRMを用いたいわゆる能動性免疫療法では、効率良くEffector細胞を脳実質内に誘導する事は不可能であった。一般に脳腫瘍患者は、全身痙攣を生じる危険性が高く、その予防のために抗痙攣剤の投与を受けている事が一般的である。以上の様な諸条件下にある脳腫瘍患者の治療を行うには、腫瘍切除後、放射線療法中に制癌剤の感受性テストを行い、制癌剤の全身あるいは局所療法を選択する必要がある。また、病状早期より免疫機能低下が認められるので、免疫療法を行うには、BRMによる能動性免疫療法は効果乏しく、LAK細胞等による養子免疫療法の有用性が示唆された。免疫学的に特殊な部位であると考えられていた脳実質内にも,マウス1a抗原やヒトHEA-DB抗原が存在することから,免疫応答が生じる可能性が示唆されるようになった.そこで,グリオーマ患者における免疫応答の機能低下の有無を調べる目的で,患者の抹消リンパ球からのインターフェロン産生能を調べたところ, Karnotsky scaleが80%ある比較的状態の良い患者でも,リンパ球からのインターフェロン産生能は極端に低下していることがわかった.また,臨床でよく用いられているニトロソウレア系制癌剤であるACNUは,骨髄抑制が強く生じることでよく知られており,患者の痙攣予防の目的で用いられているフェニトインも,免疫系を抑制するといわれている.そこで本年度は1)脳腫瘍患者における病態(Karnofdky scale)と,末梢リンパ球からのインターフェロンの産生能を調べたところ,グリオーマと診断のついた比較的早期の時期より産生能の低下がみられ,脳実質内にある腫瘍から直接あるいは間接的にも免疫抑制が働いている可能性が示唆された.2)現在マウスグリオマトーシスモデルを作製し,その機転回復の有無について検討中である.3)フェニトインのみならず,フェノバルビタールやバルプロ酸ナトリウムの免疫機能への影響について正常マウスを用いて調べた.その結果は,フェニトインが最も強く免疫機能を低下させており,バルプロ酸ナトリウムが最も副作用がすくなかった.しかしいずれの場合も, LAK細胞の抗腫瘍効果には影響を与えなかった.4)現在,この正常マウスに生じた各種抗ケインレン剤による免疫抑制について,画BRMがその病態を改善しうるかどうか調べているところである.5)本年度よりさらに,制癌剤等により生じた骨髄機能低下について,各種BRMがその免疫機能を改善しうるかどかについて,マウスを用いて比較検討中である.悪性グリオーマは、主として局所に限局した浸潤性腫瘍である。

一般に脳腫瘍患者は、全身痙攣を生じる危険性が高く、その予防のために抗痙攣剤の投与を受けている事が一般的である。以上の様な諸条件下にある脳腫瘍患者の治療を行うには、腫瘍切除後、放射線療法中に制癌剤の感受性テストを行い、制癌剤の全身あるいは局所療法を選択する必要がある。また、病状早期より免疫機能低下が認められるので、免疫療法を行うには、BRMによる能動性免疫療法は効果乏しく、LAK細胞等による養子免疫療法の有用性が示唆された。免疫学的に特殊な部位であると考えられていた脳実質内にも、マウスIa抗原やヒトHLADR抗原が存在することから、免疫応答が生じる可能性が示唆されるようになった。そこで、グリオーマ患者における免疫応答機能の低下の有無を調べる目的で、患者の未梢リンパ球からのインターフェロン産生能を調べた。Kaphofsky scaleが80%ある比較的状態の良い患者でも、リンパ球からのインターフェロン産生能は極端に低下していることがわかった。また、臨床でよく用いられているニトロソウレア系制癌剤であるACNUは、骨髄抑制が強く、またグリオーマ患者の痙攣予防の目的で用いられているフェニトインも、免疫系を抑制するといわれている。そこで前年度は、グリオーマ患者における病態(Karnofsky scale)と、未梢リンパ球からのインターフェロンの産生能を調べたところ、比較的早期よりインターフェロンの産生能が低下しており、脳実質内にある腫瘍から直接あるいは間接的にも免疫抑制が働いている可能性が示唆された。そこで本年は、1)マウスグリオーマトーシスを作製し、そのインターフェロン産生能を調べると、臨床データと同様に、病態早期より分泌能が低下しており、各種BRM薬剤の全身投与でも効果はなかった。2)各抗痙攣剤の免疫機能への影響について正常マウスを用いて調べたところ、フェニトインが最も強く免疫能を低下させており、バルプロ酸ナトリウムが最も副作用が少なかった。しかしいずれの抗痙攣剤も、LAK細胞の抗腫瘍効果に影響を与えなかった。3)悪性脳腫瘍患者29症例に対し、LAK細胞を用いた養子免疫療法を施行したところ、15症例に有効な結果が得られた。治療後44ヵ月という長期生存例もあり、また他人から採取したリンパ球より誘導したLAK細胞の抗腫瘍効果も確認された。以上のデータを基に、グリオーマ患者を治療する場合には、併用薬剤の選択と、局所免疫療法としての養子免疫療法の有用性を十分に検討する必要がある。
帯域内全二重における送受信機の非理想性を考慮した干渉除去フィルタの研究

電波資源を有効に利用する技術として,帯域内全二重の技術課題に取り組む.帯域内全二重を阻害する大きな問題に自己干渉がある.自己干渉は,受信したい信号に対して数十デシベルから百デシベルほど大きく,また送受信機の非理想性により歪んでいる.非理想性による歪を考慮した自己干渉除去フィルタは一般に,計算コストが高く,収束特性が悪い.本課題では,非理想性を解析的に分解・再構成し,高精度,低計算量,高速収束を同時に達成するフィルタを開発する.電波資源を有効に利用する技術として,帯域内全二重の技術課題に取り組む.帯域内全二重を阻害する大きな問題に自己干渉がある.自己干渉は,受信したい信号に対して数十デシベルから百デシベルほど大きく,また送受信機の非理想性により歪んでいる.非理想性による歪を考慮した自己干渉除去フィルタは一般に,計算コストが高く,収束特性が悪い.本課題では,非理想性を解析的に分解・再構成し,高精度,低計算量,高速収束を同時に達成するフィルタを開発する.
高解像度 MRI を用いた視神経疾患における神経内代謝物質の組成解析

高解像度MRI装置を用いて、視神経に対するプロトンMRスペクトロスコピー(1H-MRS)を試み、ヒトのin vivoにおける視神経内代謝物質の組成解析を行った。結果として、ヒトの大脳視覚領域において1H-MRSを用いた生体内代謝物質の濃度測定が可能であった。重度の視神経萎縮患者では、N-アセチルアスパラギン酸(NAA)が低値を示し、緑内障においては視野障害が重症なものほどNAAの減少が著明であった。また緑内障モデルラットを用いた実験からNAAの減少は緑内障発症後期にみられることがわかった。高解像度3-Tesla MRI装置を用いて、視神経に対するプロトンMRスペクトロスコピーを試み、ヒトのin vivoにおける視神経内に存在するN-アセチルアスパラギン酸をはじめとする生体内代謝物質を捉える実施計画を遂行した。1:正常者における視神経MRスペクトロスコピーの施行3-Tesla臨床用MRI装置(GE社製Signa HDx, 3,0T)を用いて頭部MRIを施行した。得られた画像から球後視神経、視交叉、視放線、視中枢領域に各々関心領域を設定し、各関心領域において最適な撮影条件(エコー時間、繰り返し時間、コイルの選択など)になるように工夫しプロトンMRスペクトロスコピーを施行した。結果として、眼窩内球後視神経では3×3×15mmの関心領域を設定して基礎実験を行ったが、開眼、閉眼どちらにおいても眼球微動による眼窩内脂肪のプロトンの混入が2.OppmのN-アセチルアスパラギン酸の解析の妨害となった。一方、視交叉部、視放射領域のMRスペクトロスコピーでは生体内代謝物質を捉えることが可能であった。また、大脳皮質に局在する視覚中枢は鳥距溝を中心とする7x12x30mmの関心領域が皮質代謝解析に最適であることがわかった。また、再現性も確認したうえで、健常者30名に対してこの研究におけるインフォームドコンセントを得、正常者の視神経MRスペクトロスコピーを施行するに至った。2:正常者における視神経内生体内代謝物質の濃度解析1で得られたデータをMRスペクトロスコピー解析コンピューターで解析し、MRスペクトロスコピーで得られたN-アセチルアスパラギン酸の濃度解析を行った。同様な方法でコリン、クレアチン、グルタミン酸についても濃度定量を行った。7-Tesla実験用MRI装置を用いてラットの大脳視覚領域における生体内代謝物質をMRスペクトロスコピーで捉える実験を試みた。また、高解像度3-TeslaMRI臨床装置を用いて視神経疾患患者における大脳視覚領域の生体内代謝物質の変化を捉えた。1:実験用視神経障害モデルの作成とラットにおける大脳視覚領域の代謝物質の同定実験モデルとしてメスのウィスターラット(生後4週)を用いペントバルビタールで腹腔麻酔し全身麻酔下で行った。大脳視覚中枢は全例左の第一次視覚領域に関心領域を設定し7-Tesla実験用MRI装置を用いてプロトンMRスペクトロスコピーを施行しN-アセチルアスパラギン酸、コリン、クレアチニンの代謝物質が捉えられた。また、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)20mmolをラットの右眼角膜輪部から1mm後極側の強膜より硝子体内投与し、視神経障害モデルのウィスターラットを作成した。今後、術後6,12,32週のMRスペクトロスコピーを正常ラットと共に施行し代謝物質の変化を解析していく予定である。2:視神経疾患患者に対するMRスペクトロスコピーの施行3-Tesla臨床用MRI装置(GE社製Signa HDx, 3.0T)を用いて、視神経疾患患者の大脳視覚領域におけるMRスペクトロスコピーを測定した。対象は、多発性硬化症による脱髄性視神経炎、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎、レーベル遺伝性視神経症、アルコール中毒性視神経症で、視力が0,1以下の重篤な症例は、MRスペクトロスコピーで得られたN-アセチルアスパラギン酸、コリン、クレアチン、ミオイノシトールといった視神経組織内代謝物質が、昨年度の研究で得られた正常群の値と比べて低い結果であった。しかし症例数がまだ少ないため、今後の研究で症例数を増やし検討していく予定である。高解像度3-TeslaMRI臨床装置を用いて緑内障性視神経障害患者の大脳視覚中枢領域(V1)におけるプロトンMRスペクトロスコピー(1H-MRS)を施行し、視神経内代謝物質濃度と視覚障害の重症度について比較検討した。また、緑内障モデルラットを作成し、V1における代謝物質の経時的変化について実験用7-Tesla MR装置を用い1H-MRSを施行し解析した。1:緑内障性視神経障害のV1における神経内代謝解析及び視覚重症度との関連性について正常群にage matchingした緑内障患者13名に対し、V1の1H-MRSを施行し代謝物質の解析を行った。

結果として代謝物質の中でN-アセチルアスパラギン酸(NAA)が緑内障群で有意に低下しており、それ以外の代謝物質では有意差はみられなかった。更に緑内障群の数を増やし(n=21)、V1のNAA濃度と視野障害の重症度(両側のHumprey静的視野検査におけるMD値の平均値)を比較したところ、R=0.679で相関を認めた。従って、緑内障では正常人に比べてV1内のNAAが減少しており、視野障害の重症なものほどV1内のNAA濃度は減少していることが推定された。2:緑内障モデルラットにおけるV1代謝物質の経時的変化の解析昨年度報告した緑内障性視神経障害モデルラット(生後4週)と正常ラットに対し、術後6,12,32週のV1領域における1H-MRS測定を7-Tesla実験用MRI装置を用いて行った。結果として、緑内障発症6週、12週後では、緑内障ラットと正常ラットのNAAに差はみられなかったが、発症33週では緑内障ラットにおいてNAA/Cr(クレアチン)比の減少が見られた。従って、緑内障モデルラットを用いた動物実験より、緑内障におけるV1のNAA減少は緑内障発症後期にみられることが示唆された。当初SDラットを用いて7-Tesla実験用MRI装置で大脳視覚領域の代謝解析を試みたが、コイルの大きさとSDラットの大きさがうまく適合せず渦電流によるアーチファクトが混入してしまいMRスペクトロスコピーが解析困難であったため、急遽サイズの小さいウィスターラットに切り替えてin vitroの実験を遂行中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。In vitroのラットを用いた実験においては、経時的にラットの大脳視覚領域をMRIにて測定していく予定であるが撮像時間が長いので全身麻酔の管理を慎重にしていく必要がある。In vivoの臨床研究においては、視神経疾患患者特に緑内障患者のデータが少ないので今後さらに対象数を増やしていく予定である。
4探針走査トンネル顕微鏡の開発とナノメータ・スケール表面電気伝導の研究

(1)超高真空槽内で、走査電子顕微鏡で観察しながら4探針を独立駆動できる4探針走査トンネル顕微鏡を製作・完成させた。トンネル電流をモニターしながら4探針を同時に自動接近させてトンネル接触状態にすることが可能となった。これにより、表面原子配列を破壊することなく探針を試料表面に接触させて電気伝導を測定することができる。また、単原子高さのステップを明瞭に走査トンネル顕微鏡像中で観察できるようになった。それを用いて、4端子プローブ法による表面電気伝導の測定を行った。(2)ローブ間隔依存性:4探針プローブの間隔を1mmから1μmまで変化させながら、Si(111)-7×7清浄表面とSi(111)-√3×√3-Ag表面について室温で電気抵抗を測定した。その結果、(a)プローブ間隔を短くすると、表面に対する感度が飛躍的に向上する。(b)7×7表面の場合、電気伝導は結晶内部までが関与する3次元的な性格を持つのに対し、√3×√3-Ag表面では、表面近傍だけの2次元的な性格を持つ。これは表面状態を通る伝導であることが定量的な解析から判明した。(3)正方4端子プローブ法:4探針を正方形状に配置して試料表面上に接触させて伝導度を測定する「正方4端子法」を考案し、実際にSi(111)-4x1-In表面に適応した。この方法は、従来の「線形4端子法」と異なり、伝導度の異方性を測定することができる。実験の結果、4x1-In表面は、インジウム原子鎖に平行方向の伝導度(σ_<//>)がそれに直角方向の伝導度(σ_⊥)より70倍高いことが明らかとなった。バンド構造から計算される伝導によると、σ_<//>は1次元的な表面電子バンドにより、σ_⊥は下地基板の表面空間電荷層による伝導でほぼ説明できることがわかった。つまり、この表面状態は電気伝導の観点からも極めて1次元性が強い擬1次元電子系といえる。(4)多層カーボンナノチューブ(MWCNT)1本を2探針で拾い上げて固定することにより、その伝導度を2探針法によって測定可能となった。4探針走査トンネル顕微鏡(4T-STM)装置を製作・完成させ、それを用いた測定を開始した。(1)4探針スキャナー機構をすべて製作・完成させ、それぞれの探針を独立に駆動してスキャンできることを確認した。(2)走査電子顕微鏡(SEM)用鏡筒を購入し、4探針スキャナーが設置されている超高真空チャンバーに結合させ、所期の動作を確認した。これによって、試料表面とともに、4探針をSEM観察しながら、試料表面上の所望の場所で、所望のプローブ間隔で電気伝導測定が可能となった。(3)Si(111)-7×7清浄表面とSi(111)-√3×√3-Ag表面について、この装置を用いて、プローブ間隔を1mmから1μmまで変化させながら室温で電気抵抗を測定した。その結果、次の2点を発見した。(a)プローブ間隔を短くすると、表面に対する感度が飛躍的に向上する。

(b)7×7表面の場合、電気伝導は、結晶内部までが関与する3次元的な性格を持つのに対し、√3×√3-Ag表面では、表面近傍だけの2次元的な性格をもつ。昨年度製作した4探針走査トンネル顕微鏡(4T-STM)装置の改良を行いながら、それ用いた測定を行った。(1)真空槽内での配線を改良し、耐震性を向上させた。その結果、シリコン試料表面上の単原子高さのステップをSTM画像として捕らえることに成功した。(2)昨年度設置した走査電子顕微鏡(SEM)用鏡筒の最適動作条件を見出し、その結果、極めて明るい反射高速電子回折(RHEED)パターンを得ることが可能となった。また、金属原子の部分蒸着によって、単原子高さのステツプを明瞭にSEM画像中で観察できるようになった。これによって、試料表面の構造とともに、4探針をSEM観察しながら、試料表面上の所望の場所で、所望のプローブ間隔で電気伝導測定が可能となった。(3)従来は4本の探針を手動で試料に接近させて直接接触させていたが、新しい制御系を製作し、トンネル電流をモニターしながら自動接近させてトンネル接触状態にすることが可能となった。これにより、表面原子配列を破壊することなく探針を試料表面に接触させて電気伝導を測定することが可能となる。(4)(3)で述べた自動接近を4本の探針同時に行うことが可能となった。これにより、4端子プローブ測定の信頼性が向上するとともに、測定の迅速化が実現した。一昨年度に製作し、昨年度に改良を加えた4探針走査トンネル顕微鏡(4T-STM)装置を用いて実験を行い、下記の成果を得た。1.4つの探針を正方形状に配置して試料表面上に接触させて伝導度を測定する「正方4端子法」を考案し、実際にSi(111)-4x1-In表面に適応した。この方法は、従来の「線形4端子法」と異なり、伝導度の異方性を測定することができる。実験の結果、4x1-In表面は、インジウム原子鎖に平行方向の伝導度(σ_<//>)がそれに直角方向の伝導度(σ_⊥)より80倍高いことが明らかとなった。バンド構造から計算される伝導によると、σ_<//>は1次元的な表面電子バンドにより、σ_⊥は下地基板の表面空間電荷層による伝導でほぼ説明できることがわかった。つまり、この表面状態は電気伝導の観点からも極めて1次元性が強い擬1次元電子系といえる。2.多層カーボンナノチューブ(MWCNT)を酸化膜に覆われたシリコン基板上に分散させ、そのうちの1本を2探針で拾い上げて固定することにより、1本のMWCNTの伝導度を2探針法によって測定した。その結果、抵抗値はCNTの長さに依存しなかった。これは、W探針とCNTとの接触抵抗が大きく、CNT固有の抵抗値を測定できていないと考えられる。3.大阪大学工学部より、金属電極間に架橋したCNTの試料の提供を受け、それを2探針法で測定した。
カスケード型増幅機能を有する生物機能性膜の開発とその応用

本研究ではカスケード増幅反応系としてカブトガニ血液凝固系を選択しこれを用いて増幅機能を有する生物素子を作製した.カブトガニ血液凝固系はリポポリサッカロイド(LPS)が初期因子として作用し,連鎖的な反応を引き起こし最終的にコアギュローゲンのゲル化が進行する.この反応はカスケード的に著しく増幅されるため, 1ピコグラム/mlのLPSを検知することができる.この増幅反応を利用すれば,特定の信号の増幅を行うことが可能と考えられる.そこで, LPSに抗体を結合した生物素子の作製を試みた.まずLPS懸濁液にNaIo_4を加え,室温で1時間反応させ脱塩後, IgG溶液と反応させた.次に0°CでNaBH_4溶液と2時間反応後,セファロースCL-4Bカラムでゲルロ過した.これによって得られた各フラクションをローリー法により蛋白質を,フェノールー硫酸法により糖を測定したところ, LPSとIgGの結合体と考えられるフランクションが得られた.このLPS-IgG結合体のユアギユローゲンゲル凝固活性を調べたところ,十分な活性を示すことが明らかとなった.またIgGに結合したLPSの量を測定したところ, IgG1分子に対して5分子程度のLPSが結合していることが示唆された.次に作成した生物素子を測定する信号検索システムにつて検討した.すなわちコアギュローゲンのゲル化反応に伴う粘性の変化を連続的に測定するシステムとして水晶振動子に着目した.水晶振動子の等価回路のパラメーターをインピーダンスアナライザー及びマイクロコンピューターによるデーター処理によって求めたところ, R_1が溶液の粘度によって変化することがわかった.そこで,次にLPSによるゲル化反応を本システムを用いて測定した.その結果, 1ピュグラム/mlの高感度測定が可能であることが明らかとなった.本研究ではカスケード増幅反応系としてカブトガニ血液凝固系を選択しこれを用いて増幅機能を有する生物素子を作製した.カブトガニ血液凝固系はリポポリサッカロイド(LPS)が初期因子として作用し,連鎖的な反応を引き起こし最終的にコアギュローゲンのゲル化が進行する.この反応はカスケード的に著しく増幅されるため, 1ピコグラム/mlのLPSを検知することができる.この増幅反応を利用すれば,特定の信号の増幅を行うことが可能と考えられる.そこで, LPSに抗体を結合した生物素子の作製を試みた.まずLPS懸濁液にNaIo_4を加え,室温で1時間反応させ脱塩後, IgG溶液と反応させた.次に0°CでNaBH_4溶液と2時間反応後,セファロースCL-4Bカラムでゲルロ過した.これによって得られた各フラクションをローリー法により蛋白質を,フェノールー硫酸法により糖を測定したところ, LPSとIgGの結合体と考えられるフランクションが得られた.このLPS-IgG結合体のユアギユローゲンゲル凝固活性を調べたところ,十分な活性を示すことが明らかとなった.またIgGに結合したLPSの量を測定したところ, IgG1分子に対して5分子程度のLPSが結合していることが示唆された.次に作成した生物素子を測定する信号検索システムにつて検討した.すなわちコアギュローゲンのゲル化反応に伴う粘性の変化を連続的に測定するシステムとして水晶振動子に着目した.水晶振動子の等価回路のパラメーターをインピーダンスアナライザー及びマイクロコンピューターによるデーター処理によって求めたところ, R_1が溶液の粘度によって変化することがわかった.そこで,次にLPSによるゲル化反応を本システムを用いて測定した.その結果, 1ピュグラム/mlの高感度測定が可能であることが明らかとなった.
慢性活動性EBウイルス感染症の病態解明とその展開

慢性活動性EBウイルス感染症(chronic active EBV infection:CAEBV)において、ウイルス学的、免疫学的、病理学的検討を中心に、その発症機序に関して研究を行った。その結果、EBVの著しい活性化と異質性のある免疫不全、そして主にT細胞あるいはNK細胞におけるEBV感染を認めた。なお、樹立細胞株での各種薬剤感受性では一定の結果は得られなかった。本研究成果は、今後のCAEBVの病態解明と対処に関してひとつの礎となると思われた。研究代表者らが作成した診断指針(Amer J Hematol,80:64-69,2005)を用い、慢性活動性EBウイルス(EBV)感染症患者の検討を行い、以下の主な結果を得た。1.PCR法による末梢血単核球および組織(主にリンパ節)におけるEBVゲノムは、全例で同定された。加えて、末梢血単核球でのコピー数は著しい増加をみた。2.EBVゲノム陽性細胞における潜在関連抗原の発現は、EBV-determined nuclear antigen(EBNA)-1およびlatent membrane proteins(LMPs)が陽性であった。また、主なEBV感染細胞は、NK細胞あるいはT細胞であった。3.これらの細胞では、EBV増殖関連抗原(viral capsid antigenおよびearly antigen)の発現を認めなかった。4.末梢血および組織では、共通する特異な染色体異常を認めなかった。5.末梢血単核球自然培養系では、前記2の抗原発現が、経時的に減少した。6.末梢血単核球IL-2添加培養系では、前記2の抗原発現の経時的増加を認め、EBV陽性細胞株が樹立した。7.臍帯血単核球との混合培養では、株化は認められなかった。なお、対照としたEBV抗体陽性健康人では、末梢血単核球においてEBVゲノムを認めなかった。末梢血単核球自然培養、臍帯血単核球との混合培養でもEBV陽性細胞株は樹立されなかった。加えて、主な免疫学的解析では、対照としたEBV抗体陽性健康人ではいずれもGranzyme B、IL-12、インターフェロン-ガンマの発現を伴うEBV特異的細胞障害性Tリンパ球およびNK細胞活性を認めたが、患者では、Granzyme Bの発現は低下し、NK細胞活性も低値であった。この結果は、従来の検討結果に相応し、慢性活動性EBV感染症患者における一般的な病態を反映しているものと思われた。研究代表者らが作成した指針(Amer j Hematol, 80 : 64-69, 2005)を用いて診断された慢性活動性EBウイルス(EBV)感染症患者の検討を引き続き行い、以下の主な結果を得た。1.末梢血単核球および組織(主にリンパ節)におけるEBVゲノムは、全例陽性であった。また、末梢血単核球でのゲノムコピー数の増加をみた。4.特異的染色体異常を認めなかった。5.自然培養系では、前記2の抗原発現が、経時的に減少した。6.IL-2添加培養系では、前記2の抗原発現の経時的増加を認め、EBV陽性細胞株が樹立した。加えて、主な免疫学的解析では、対照としたEBV抗体陽性健康人ではいずれもGranzyme B、IL-12、インターフェロンーガンマの発現を伴うEBV特異的細胞傷害性Tリンパ球およびNK細胞活性を認めたが、患者では、GranzymeBの発現は低下し、NK細胞活性も低値であった。これらの結果は、従来の検討結果と同様であり、慢性活動性EBV感染症患者における一般的な病態を示しているものと思われた。このことは、今後のより詳細な継続検討の礎となるものと思われた。研究代表者らが作成した診断指針(Amer J Hematol, 80 : 64-69, 2005)を用い、さらに慢性活動性EBウイルス(EBV)感染症患者の検討を行い、以下の主な結果を得た。1.末梢血単核球および組織におけるEBVゲノムは、全例で同定された。末梢血単核球でのコピー数は著しい増加をみた。2.EBVゲノム陽性細胞における潜在関連抗原の発現はII型潜伏感染型を示し、EBV-determined nuclear antigen (EBNA)-1およびlatent membrane proteins (LMPs)が陽性であった。主なEBV感染細胞は、従来同様NK細胞あるいはT細胞であった。3.EBV増殖関連抗原(viral capsidantigenおよびearly antigen)の発現を認めなかった。4.特有の染色体異常を認めなかった。

なお、対照としたEBV抗体陽性健康人では、末梢血単核球においてEBVゲノムを認めなかった。7.主な免疫学的解析では、対照としたEBV抗体陽性健康人ではいずれもGranzyme B、IL-12、インターフェロン-ガンマの発現を伴うEBV特異的細胞傷害性Tリンパ球およびNK細胞活性を認めたが、患者では、Granzyme Bの発現は低下しEBV特異的細胞傷害性Tリンパ球不全の存在が示唆され、NK細胞活性も低値の傾向であった。この結果は、これまでの検討結果とほぼ同様で、慢性活動性EBV感染症患者における病態を反映しているものと思われた。
琉球語の敬語・指示詞の体系解明と南琉球八重山地方諸方言の総合的記述を行う研究

本年度は、全国学会誌に論文が掲載されたことが大きな成果であった。南琉球の八重山石垣宮良方言の謙譲語について、新しい特徴を指摘した。ウヨーフンは謙譲語として補語を高める機能を持ち、直訳では共通語の「差し上げる」に相当する。だが、補語を高く位置づけるのと同時に、主語も軽度に高めることができる。つまり、謙譲語でありながら、同時に主語尊敬機能も持つことを明らかにした。「主語=補語」まで主語を高めることが分かった。ウヨーフンは「下位者→上位者」の授与を優先するため、一人称が補語に含まれ、自敬に相当する現象でも許容する場合があることも分かった。これらは古代語の自敬を考える上でも、参考となる現象である。さらにウヨーフンは、補助動詞「なさる」に相当する尊敬語オールンを下接して、ウヨーホールンという複合動詞でも使用される。そのとき、主語尊敬機能が強化され、「主語>補語」の関係で使用できる。例えば「知事が私の伯父に花束をウヨーホーッタ(差し上げなさった)」と使用できる。当初は宮良方言の敬語と古代語の敬語との比較を試みていたが、査読により宮良方言に絞るように指摘をうけた。その結果として、古代語との比較や宮良以外の周辺の地域での謙譲語ではどうなっているのかを調査する時間が取れなかった。南琉球の八重山郡竹富町の黒島では、宮良方言と同様の現象も見られるが、一部異なる現象もある。その原因がまだ分かっていない。北琉球語での敬語研究に関しては,喜界島で動詞の語幹に形態素eerが下接するときの機能について、日本語学会2018年度秋季大会(岐阜大学)で口頭発表をした。聞き手上位者の場合に使用されるので、一見、丁寧語のように見えるのだが、そうではなく、聞き手が上位者であることを示す尊敬語であることを指摘した。謙譲語の機能について、ウヨーフンの他に、謙譲語として、ッサリスン(申し上げる),シケーフン(ご案内する),クヨームン(お目にかかる)がある。現在、これらの語にも主語尊敬機能があるのか調査を行っている状況である。また、周辺地域の方言との比較を十分に行う必要がある。南琉球語の竹富町黒島方言では、宮良方言と一部異なる現象が見られ、その原因を調査中である。また、南琉球の八重山地方だけでなく、北琉球語の喜界島方言の謙譲語でも、「主語>補語」で使用できる場合が見られることが調査にて分かっている(未発表)。今後、発表にむけて、南琉球語と北琉球語との比較も必要であり、今年度、可能な限り調査をする予定である。指示詞研究では、石垣市宮良方言と八重山郡竹富町黒島の指示詞用法を比較し、研究会にて発表を行った。現場指示では,共通語の指示詞と用法が異なる用法があり,「相対的距離」や「対表現」と名付けて定義づけた。地域差があるため、今年度、地域差をまとめることを予定している。北琉球語の喜界島の敬語に関して昨年度、全国学会での発表を行った。聞き手が、話し手一人称に影響を与えていると存在と考え、聞き手は「与影者」となるという考え方を示した。「与影者」が上位者であれば、上位者であることを示すマーカーが必要となり、それが動詞語幹につく、形態素eerの役割であると考えた。共通語の敬語にはない現象のため、今後、追加調査を行う予定である。また,授受動詞体系全体に関する研究も進めている。北琉球語の喜界島方言では、本動詞と補助動詞の用法で,異なる動詞が用いられている。共通語のヤルークレル対立に対して、喜界島でもクレルークレルの対立であるが、補助動詞用法では、トラスが用いられる。トラスは古典語との関連があるのか、トラスの用法を調査している最中である。2018年度の12月に全国学会誌に論文が掲載された。論文執筆に時間がかかり、追加調査を行う時間がなかったため、一年の延長を申請した。この一年の間に、調査中の事項を一度まとめることとする。まず、謙譲語に関しては、宮良方言のウヨーフン以外の謙譲語4語について、主語尊敬機能がどの程度許容されるのか、また、「謙譲語+尊敬語」という二方面敬語が、どのような人物関係で許容されるのかという調査を、今進行中であり、今年度で終わらせることを目指している。また、宮良方言と黒島方言での「差し上げる」相当の謙譲語の相違点も今年度、明らかにすることを目指す。北琉球語の喜界島方言に関しては、授受動詞の調査では補助動詞用法を中心に記述を行うこととする。喜界島方言での授受動詞は、共通語のヤルークレルの対立に対し、本動詞はクレルークレルの対立を持つ。しかし、補助動詞ではトラスが使用される。歴史的に見て、トラスはどのように位置づけられるのか、現在、古典語でのトラスの用法を調査しており、今年度、口頭発表をする予定である。また、北琉球語の与論島方言の謙譲語の調査に関して、昨年度、上位者をどのように認定するかで、宮良方言と共通する現象と異なる現象が見られることが分かったので、その点の追加調査を行うこととする。指示詞に関する研究では,黒島方言と船浮方言での調査を追加する。可能であれば、北琉球語の喜界島方言でも現場指示と文脈指示の概要をまとめる。