hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聴覚系における時間情報伝達・解析機構の包括的研究

音の時間情報が様々な両耳間時間差に対応する神経回路で比較されることで、音源の方向を検知する機構を実現する。内側上オリーブ核に反対側の耳から入力する線維が梯子状の分岐を形成して、音源の方向の情報を内側上オリーブ核内の場所の情報に変換する。脳幹で左右の比較を行った結果が聴覚皮質で保存されている。負荷される雑音音源と信号音源の相対的な位置関係によって子音聴取の正答率のパタンが複雑に変化した。蝸牛における時間情報伝達機構の解明と実用的臨床検査の確立:自由音場での聴覚心理実験を行い、至適条件を決定し、実用的な評価法を確立した。特に日常環境のような雑音の多い環境下では言語音に含まれる時間情報を精確に解析・伝達する機構が不可欠であり、これを評価することは聴覚障害の臨床検査に応用できる。脳幹における時間情報伝達機構の解明:蝸牛・聴神経で処理された音の時間情報は脳幹に収束することでより精確になる。蝸牛神経核ニューロンが内側上オリーブ核に入力する神経線維の空間的配列を解析した。内側上オリーブ核に反対側の耳から入力する線維が梯子状の分岐を形成して、音源の方向の情報を内側上オリーブ核内の場所の情報に変換していた。内側上オリーブ核の同側の耳から入力する線維は外側から直接入力する経路と、より長いループを形成して入力する経路があった。このように時間情報が様々な両耳間時間差に対応する神経回路で比較されることで、音源の方向を検知する機構を実現していることが明らかになった。さらに蝸牛神経核ニューロンから記録された特徴周波数と空間配置の関係についても解析した。周波数情報も内側上オリーブ核の背側・腹側方向の位置情報として保存されていた。聴覚皮質における時間情報解析機構の解明:Binaural Beatを使って左右の耳からの時間情報を連続的に変化させて聴覚皮質の反応を脳磁図で解析した。脳幹で左右の比較を行った結果が聴覚皮質で保存されていることが明らかになった。時間情報伝達機構の実用的臨床検査の確立:雑音下の条件において信号の時間情報を検出する機能を評価した。時間情報の成分別の伝達機構を明らかにするため、前年に引き続き、聴覚心理学的測定を行った。語音がマスカーから空間的に分離されると、同じ方向の場合に比べて12dBほど聴取閾値が改善すること(Spatial Release from Masking (SRM))が確認された。破裂音、半母音、弾音は後続母音のフォルマントの移動パタンが利用でき、SRMが大きかった。両耳聴による音脈文擬が使いやすいためと考えられた。摩擦音はその周波数分布によってマスクされやすさが大きく異なり、SRMもおこりにくかった。信号音源と雑音音源の位置を入れ替えると、S/N比と正答率の関係が変化した。負荷される雑音音源と信号音源の相対的な位置関係によって子音聴取の正答率のパターンが複雑に変化した。聴神経・脳幹における時間情報伝達機構の解明:麻酔下の動物を脳定位装置に固定し、外耳に挿入したイヤホンで純音あるいはノイズを聴かせながら、聴神経あるいは脳幹の聴覚伝導路に刺入した微小電極で細胞外電位を記録するシステムを確立した。音刺激作成と活動電位記録を同一のPCで制御し、蝸牛神経核ニューロンの線維が台形体を通る所で細胞外電極によるsingle unit recordingを行い、音刺激に含まれる時間情報と活動電位の時間情報を比較してPhase lockingの精確さを評価した。微細な時間情報の解析機構と、包絡線で表される変調周波数の解析機構、音圧をコードする機構の間に相互作用があることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。
マイクロスポレーションポリマ粒子の直接噴出・溶発による直流アーク遮断の新技術創出

次世代高電圧直流給電システムの中枢基盤技術である大電流遮断技術への貢献のため,ナノ・マイクロスポレーション粒子分散ガスによる直流アーク遮断を提案した。アークを減衰させる新技術の検討を行った。アークにポリマーが接触するとポリマーは溶発し,アーク遮断性能が向上する。ポリアミド材の場合,さらにマイクロサイズの粒子が飛翔するスポレーション現象が生じる。この粒子は溶発ガスより質量密度が大きくアークにより深く侵入し熱を奪う。このポリマから自発的に粒子発生するスポレーション現象の発生機構と吸水量との関係を,誘導プラズマ装置を用い基礎解明し,本特長を活かしたポリマノズルによる直流アーク遮断性能を検討した。1.ポリアミド系バルクへの熱プラズマ照射によるスポレーション粒子飛翔の熱流量依存性ポリアミド材への熱流束を変更して,どの程度の熱流束でどの程度のスポレーション粒子が生じるかを検討した。粒子噴出の様子や,熱照射してからのスポレーション現象の持続性・即応性を高速度ビデオカメラを用いて測定した。さらにスポレーション粒子が飛翔する数を数値化し,その量的な比較を出来るようにした。2.分光スペクトル観測によるポリマー蒸発の確認ICCD付の分光装置を用いて,スポレーション・アブレーションが生じている蒸気に対して分光スペクトル観測を行った。その結果,C2分子スペクトルが高い強度で観測されることが分かった。これはポリマーが分解し,その分解ガスにC2が含まることを示しており,分解ガスと熱プラズマとの相互作用を検討できるようにした。3.ポリアミド材への吸水率制御実験ポリアミド系バルクのスポレーション現象には吸水率が関係することを予備試験から見出している。そこで吸水率を制御して熱プラズマを照射し,スポレーション現象の発生頻度,噴出粒子の大きさ・スピード,粒子密度を高速度カメラで観測した。デシケータに3日程度入れてポリマバルク乾燥後,ポリマを煮沸することで吸水量を制御した。吸水量を前後の質量から測定した。4.吸水率を変化させたポリアミド材への熱プラズマ照射によるスポレーションマイクロ粒子の発現数への影響Ar熱プラズマをポリマバルクに照射した場合,スポレーション粒子が飛翔する数へのポリアミド材吸水率の影響を確認した。特にポリマー壁から5mm以上飛翔するものを対象とし,確実に熱プラズマへの侵入が見込まれる粒子のみを対象とすることとした。その結果,吸水率が上昇することでスポレーション現象が促進されることが判明した。さらに分子性ガスとして酸素を混合した場合についても検討している。3.分子性ガス混入熱プラズマのポリマバルク照射による粒子発現数への影響これまで実験においてAr熱プラズマをポリアミドポリマバルクに照射すると,溶発するとともにスポレーション現象により,ポリママイクロ粒子が噴出する。このバルクに,ArだけでなくO2あるいはN2混合熱プラズマを照射した際のスポレーション現象の発生頻度を測定した。N2/O2を混合させた理由は気中遮断器を想定したためである。その結果これら分子ガスが導入されるとスポレーションが促進されることが分かった。4.スクリューディスクノズルの設計・製作ポリマからのスポレーション粒子を効果的にアーク遮断に応用するためには,アークへの接触面積を多くさせる必要がある。多数のポリマディスクを軸に通したものを想定し,スリットを入れたスクリューディスク型ポリマノズルの設計と制作した。5.熱プラズマ中におけるマイクロ粒子飛翔の数値解析による,粒子径,粒子アブレーション時間の検討高速度ビデオから粒子を観測すると,粒子は熱プラズマ中で溶発を起こし,その粒径を特定できない。そこで熱プラズマ中でのポリマ粒子の数値解析を行いその飛翔軌跡と溶発時間を計算し,この結果と実験で得られる飛翔軌跡の平均値とを比較することで噴出する粒子の平均的な粒子径を特定した。6.スペクトル観測によるポリマ混合アークプラズマ温度の把握ポリマ粒子混入によるプラズマ減衰効果を明らかにするためにプラズマ温度に着目し分光観測した。ポリマ蒸気からのC2分子スペクトルを捉え,その理論計算と実験データとのFittingによりアーク温度を求めた。その結果,上記温度は4000K程度になっていることがわかった。7.熱プラズマ照射・アーク実験のまとめ以上の熱プラズマ照射によるスポレーション粒子飛散,溶発の様子観察・アークへのポリマ混合実験,アーク温度への影響の結果をまとめた。電力・電気機器H25年度,最も懸案であったポリアミド材への吸水率制御が行え,吸水率の多寡による熱プラズマ照射時のスポレーション現象を基礎的に検討できるようになった。さらにカラー高速度ビデオカメラにより,粒子が飛翔する様子を鮮明にとらえられるようになっており,ポリマーバルクから5mm以上飛翔する粒子の数をカウントできるようにした。また分子性ガスを導入した熱プラズマ照射にも取り掛かっている。研究分担者の一人がH25年9月1日から所属が変更となり,ポリマー分析についてはH26年度に行うこととした。

その代わりに,ポリマへ照射される熱流束の大小によりスポレーション粒子飛翔数を詳細な検討することを前倒しし,定量的に詳細に検討できるようになった。そのため総合的に進展はおおむね順調と考えた。今後も,計画書にあるように進める。具体的には,分子性ガスを導入した熱プラズマをポリアミド材に照射する実験,その際における熱流束の影響の検証実験,スペクトル観測からのポリマ蒸気温度の見積もり,アーク実験への適用を実験的に進めていく。さらに数値解析的に粒子飛翔プログラムを改良し,熱プラズマ照射時におけるポリマー粒子飛翔解析から,粒子の初期半径,初期速度を明確にすることで,どの程度のエネルギーがスポレーション粒子飛翔に使用されているのか,さらにスポレーション粒子飛翔によるアークの冷却効果を理論的に検討する。またH26年度はさらにポリマーの表面分析を進めていく。最も大きな理由は,研究分担者の一人が所属機関をH25年10月1日から変更し,そのためにポリマー分析装置の移動と再立ち上げを行ったために,本格的なポリマー分析実施をH26に移動させたことである。しかし,他の計画を前倒ししていることもあり,全体的には研究は進んでいる。H25年度に行ったポリマーの分析はFT-IRについては研究代表者が別途,依頼して行ったものでありその数は限られている。すでにポリマー分析装置の移動,再立ち上げを終えており,本格的なポリマー分析実施も研究代表者と研究分担者間で直接4月初旬に打ち合わせを終えている。このため,H26年度はポリマー分析を含めて使用計画通りに推進できるものと考えている。
AGEの蓄積における酵素的作用の解析とそのフラボノイドによる調節

非酵素的糖化反応(グリケーション)に対してフラボノイドが阻害効果を持つかどうか、ルチンを用いて検討した。糖尿病ラット筋肉、腎臓、血清タンパク質のグリケーション前期段階の指標となるフルクトースリジン含量は顕著に増加したが、0.2%ルチン食の摂食で有意に抑制された。さらに後期段階生成物(AGE)は腎臓や血清で顕著に抑制された。これらの結果から、フラボノイドは抗酸化だけではなく、グリケーションの多くのステップで阻害していることが示唆された。糖尿病ラットにおいてはきわめて反応性の高いα-ジカルボニル化合物量が増加した。α-ジカルボニル化合物の生成の律速酵素であるアルドース還元酵素活性は、多くの組織で糖尿病により増加したが、ルチンの摂取で減少した。また、ルチン以外にも、カテキンやアントシアニンを豊富に含むヤマブドウ抽出物でもアルドース還元酵素活性が抑制された。しかし、カテキンの阻害作用は弱かった。α-ジカルボニル化合物の分解に関わるグリオキザラーゼ活性は、糖尿病ラットで低下した。このことから、糖尿病ラットではα-ジカルボニル化合物が蓄積されやすい状況にあることが明らかになった。グリオキザラーゼ活性はin vitroではエピガロカテキンガレートやルチンでその活性が増加することを示したが、in vivoでは効果が今回の濃度では認められなかった。本研究において、プロテアソームはグリケーションに対して他のタンパク質より抵抗性があることが明らかになった。しかし、酸化修飾タンパク質とは異なり、AGE化されたタンパク質に対しては、ユビキチン化がされているものの、分解は増加しなかった。これは高度に架橋された場合にはもはや分解できず、蓄積されてしまうことを示している6以上のように、AGEの生成には酵素的な作用が重要であり、フラボノイドによりその一部が好ましい方向に制御できる可能性が示唆された。1.アルドース還元酵素活性に及ぼすフラボノイドの影響ラット肝臓および腎臓ホモジネート可溶性画分を粗酵素として、各種フラボノイドのアルドース還元酵素活性に及ぼす影響を検討した。対照として用いたスルフレチンは100μM程度で阻害活性を示した。ケルセチン、ルチン、G-ルチン、イソラムネチンは1000μM程度で阻害活性を示したが、ヘスペリジンとカテキンは阻害しなかった。これらから、フラボン、フラボノールの7位に水酸基をもつこと、2、3位に二重結合をもつことが必要であることが示唆された。2.糖尿病ラットにおけるアルドース還元酵素活性と食餌フラボノイドの影響5週齢Wistar系にストレプトゾトシンを投与し糖尿病を誘発させ、1月間0.2%G-ルチン含む20%カゼイン食を給与した。糖尿病の発症により肝臓、腎臓、眼球のアルドース還元酵素活性とAGE含量は1020%程度上昇した。骨格筋には影響を与えなかった。G-ルチンの摂取はアルドース還元酵素活性および抗AGEおよび抗ピラリン抗体を用いたウエスタンブロットにより求めたAGE蓄積量を正常レベルまで低下させた。またアルドース還元酵素により生成する3-デオキシグルコソン濃度も酵素活性と同様の変化を示し、食餌フラボノイドがアルドース還元酵素を阻害することを明らかにした。3.プロテアソームによるAGE化タンパク質の分解本年度は可溶性画分のAGE断片を検出するため、抗AGE抗体を用いたELISA法を構築した。また、モデルとして、酸化修飾した骨格筋タンパク質を用いて分解系の関与を検討した。その結果、プロテアソームが顕著に分解することと、プロテアソームそのものが活性酸素に対して抵抗性があることを認めた。

これは、グリケーションにいてもプロテアソームが関与できること示唆する。非酵素的糖化反応(グリケーション)は、タンパク質のアミノ基と還元糖のカルボニル基の間で起こる反応で、糖尿病による高血糖や老化により顕著に進行し、細胞の機能を損ない多くの合併症の原因となる。最近、酵素的に生成するグルコースの代謝中間体であり、きわめて反応性に富むジカルボニル化合物の役割が注目されている。ジカルボニル化合物の生成に関与するアルドース還元酵素は昨度検討を行い、糖尿病で増加した活性をフラボノイドが阻害することを明らかにした。本年度の研究では、分解に関わるグリオキザラーゼ活性の変化を解析した。グリオキザラーゼIはin vitroでフラボノイドにより活性化された。これは、この酵素が還元型グルタチオン依存性であるため、フラボノイドの抗酸化性によるもと考えられた。ストレプトゾトシンで誘発した糖尿病ラット肝臓のグリオキザラーゼ活性は健常ラットにそれに比べ半分程度に低下した。その結果、3-デオキシグルコソン濃度が増加した。グリケーション後期段階生成物(AGE)の生成を阻害するルチンなどのフラボノイドはグリオキザラーゼ活性に影響を与えなかった。非酵素的に修飾された細胞内タンパク質は、ATP-ユビキチン依存性のプロテアソームにより分解されやすくなると考えられている。プロテアソームをフレクトースを用いてグリケーションさせたが、高濃度のフルクトースでも活性は維持されており、グリケーションに抵抗性があった。このとき、フラボノイドはプロテアソーム活性に影響を与えなかった。したがって、プロテアソームはAGEの蓄積を抑制、すなわち除去する役割があるが、フラボノイドは除去に影響は与えないと考えられた。昨年度までの研究で、非酵素的糖化反応(グリケーション)において、きわめてグリケーションしやすい活性カルボニル化合物(α-ジカルボニル化合物)であるグリオキザール、メチルグリオキザール、3-デオキシグルコソンの生成に関わるアルドース還元酵素の活性が、糖尿病で増加し、それをカテキンやルチンのようなフラボノイドが阻害することを明らかにした。さらに、活性カルボニル化合物の分解をするグリオキザラーゼ活性が糖尿病で減少することも示した。その結果、糖尿病では生成が増加し、分解が減少するため活性カルボニル化合物が蓄積し、グリケーション後期段階生成物(AGE)の生成が増える可能性が考えられた。本年度は生成したAGEの分解について検討を行った。酸化修飾されたタンパク質はプロテアソームにより分解されやすいことが知られている。しかし、AGEをプロテアソームとインキュベーションしても顕著な分解は示さなかった。次にin vivoでプロテアソーム系の関与について解析した。SD系雄ラットにストレプトゾトシンを投与して糖尿病を発症させ、1か月間飼育した。その結果、肝臓や腎臓のAGEは顕著に増加した。さらに糖尿病ではユビキチン化タンパク質が増加するが、免疫沈降法で確認したユビキチン化されたAGEは増加していなかった。これらの変化にはフラボノイドの摂取は影響しなかった。
近赤外分光法による非侵襲的かつ連続的な心筋内酵素・代謝モンタリングの開発研究

近赤外分光法による非侵襲的かつ連続的な心筋内酸素・代謝モニタリングの可能性を確かめるため、次の3項目の検討を行った。(1)心筋内ヘモグロビン(Hb)、ミオグロビン(Mb)、チトクロムオキシダーゼ(Cyt.aa3)解析法の検討。(2)ラット拍動心での測定の検討。(3)ブタ心筋での測定、特に経食道的測定法の検討。方法および結果(1)解析法の検討:ラット潅流心に赤血球やMb溶液を潅流させ、Beer-Lambert則よりHb、Mb、Cyt.aa3を求める演算式を検討した。その結果、血液量や心筋内酸素化状態の変化を行ったところ、Hb、Mb、Cyt.aa3の変化を分離測定するが可能で、解析に要する演算式を確定した。(2)ラット拍動心での測定。(a)直接測定法:人工呼吸下に開胸し近赤外分光装置のプローブを心筋表面に直接装着した後、FlO2を変化させ心筋内酸素化状態を検出した。(b)間接測定法:人工呼吸下に胸壁上に近赤外分光装置のプローブを装着した後、FlO2を変化させ心筋内の変化を検出した。結果:HbはFlO2の低下とともに脱酸素化を受けたが、Mbは12%、Cyt.aa3は8%以下で脱酸素化または還元がはじまり、直接法および間接法ともに心筋内酸素化状態の変化を検出できた。(a)直接測定法:人工呼吸下に開胸し近赤外分光装置のプローブを心筋表面に装着した後、FlO2の変化や冠動脈閉塞時の心筋内酸素化状態を検出した。(b)間接測定法:人工呼吸下に経口的に経食道用プローブを挿入し、FlO2変化時の心筋内の変化を検出した。結果:直接法および間接法ともに心筋内酸素化状態の変化を検出できたが、食道の筋肉からのシグナルの影響を取り除くことが今後の課題であると考えられた。以上の結果より、近赤外分光法により非侵襲的な心筋内酸素化状態モニタリングは可能であると結論できた。また経食道的測定も可能であると思われ、臨床的な応用への展開が期待できると考えられた。計画(1):ヘモグロビン(Hb)とミオグロビン(Mb)の分離測定条件の検討【.encircled1.】in vitroの検討:<方法>Hb(ブタ赤血球)とMb(クジラ)を用い、酸化状態(100%酸素で飽和)と還元状態(Na_2S_2O_4で還元)を作製し、700nm,730nm,750nm,805nmにおける吸光度を測定した。<結果>HbとMbは酸化状態では700-805nmの吸収スペクトルは同様で区別できなかった。

還元状態では、740-760nm領域で吸収ピークの位相に10nmのずれがあり、両者を区別できた。in vivoの検討:<方法>ラットの摘出灌流心の冠動脈に酸化または還元状態のHbまたはMbを注入し両者を区別する。<結果>組織内のHbとMbを分離測定できた。計画(2):Hb,Mb,Cyt.aa_3解析に用いる演算式の決定.(i)<方法>ラット灌流心にHbを含まない灌流心を用いたラツト灌流心で、灌流液を酸素化状態(100%酸素で飽和)から脱酸素化状態(100%酸素で飽和)に変え、3者の変動を検討した。<結果>Hbは変動せず、MbとCyt.aa_3のみが還元された。(ii)<方法>ラツト灌流心にHbを含まない灌流液を用いたラット灌流心で、灌流液に赤血球を加えたときの変動を検討した。<結果>Hbのみが変動した。以上より、決定した演算式で心筋のHb,Mb,Cyt.aa_3は独立して測定できる。前年度はヘモグロビン(Hb)、ミオグロビン(Mb)、チトクロムオキシダーゼ(Cyt.aa_3)の分離測定方法を検討し、その正当性を確認した。本年度はその方法をもとに、(1)生体ラット心筋の酸素化状態測定を開胸による直接測定法および胸壁外からの間接測定法で検討した。さらに(2)生体ブタ心筋の直接測定法と本研究課題の最終目標である間接的測定法(経食道的心筋酸素代謝測定法)を比較し経食道的測定法の可能性を検討した。計画(1):生体ラット心筋測定法の検討。(1)直接測定法の検討:〈方法〉人工吸収下にラットを開胸し、近赤外分光装置のプローブを直接心筋表面に接着し、段階的にF_<102>を変化させ心筋内酸素化状態を検出した。(2)間接測定法の検討:〈方法〉人工吸収下にラットの胸壁上に近赤外分光装置のプローブを装着し、段階的にF_<102>を変化させ心筋内酸素化状態を検出した。さらに胸壁の影響を評価するため、胸壁と心臓の間を遮光し同様な実験を行った。〈結果〉直接法および間接法ともに心筋内酸素化状態の変化を検出できた。HbはF_<102>の低下とともに脱酸素化を受けたが、MbはF_<102>12%、Cyt.aa_3は8%以下で脱酸素化、還元がはじまった。胸壁の影響はHbだけであった。計画(2):生体ブタ心筋測定法の検討。(1)直接測定法の検討:〈方法〉人工呼吸下にブタを開胸し、近赤外分光装置のプローブを直接心筋表面に接着し、段階的にF_<102>を変化させ心筋内酸素化状態を検出した。(2)間接測定法の検討:〈方法〉人工呼吸下にブタの食道に経食道用プローブを挿入し、段階的にF_<102>を変化させ心筋内酸素化状態を検出した。近赤外分光法による経食道的測定法で心筋内酸素化状態を検出できたことより、無侵襲的心筋内酸素化状態モニタリングの臨床応用の可能性があるものと思われた。
ポリオーマウイルス関連腫瘍の腫瘍発生の機序解明：メルケル細胞ウイルスから迫る

メルケル細胞ポリオーマウイルスは、日光露出部の高悪性度腫瘍であるメルケル細胞癌で近年腫瘍化に関連しているとして報告された。メルケル細胞癌を含めた皮膚腫瘍においてこのウイルスの関与に関して検討した。古典的PCR、最近開発されたデジタルPCR、免疫組織化学的検討を施行した。メルケル細胞癌全例と基底細胞癌1例が上記の3つの方法で陽性となった。古典的PCR法陽性になった光線性角化症はデジタルPCR、免疫組織化学的検討でをあわせた検討では総合的に陰性と考えられた。千葉大学医学部附属病院にて切除された腫瘍性病変のうち、頭頸部や日光露出部に頻度の高い皮膚腫瘍や比較的皮膚に近い頭頸部腫瘍を主体に検討した。これまでの検討で、メルケル細胞ポリオーマウイルスの感染の有無を組織レベルで検出する最も簡便な方法は、病理組織検体を用いた免疫組織化学によることがわかっている。また当初このウイルスが発見されるきっかけになったメルケル細胞癌の陽性率は高いが、この腫瘍以外での検出率は、諸家の報告からも低い。そのため検討する腫瘍の種類、症例数はできる限り多くの症例数を検討することとした。千葉大医学部附属病院でのメルケル細胞癌は7例あり、そのうち4例が免疫組織化学による検討で陽性になった。陽性率は57%と、これまでの東京大学医学部附属病院や虎の門病院での症例を用いた検討での9例中8例陽性(78%陽性)と比較してやや低いが、これまでの諸家の報告の陽性率の範疇に収まる結果であった。他の皮膚腫瘍は、東京大学医学部附属病院での症例で検討した疾患である光線性角化症22例、ボーエン病16例、基底細胞癌60例、悪性黒色腫14例をさらに加え、かつ他の病変として血管肉腫10例、リンパ腫(濾胞性リンパ腫6例と血管内大細胞リンパ腫2例)、毛包上皮腫11例、木村病13例を追加し検討した。今回の検討では腫瘍細胞自体はいずれも陰性であった。腫瘍部またはその周囲の領域の背景細胞としてのリンパ球に陽性像が観察された症例が、光線性角化症2例、ボーエン病2例、基底細胞癌3例、悪性黒色腫1例、毛包上皮腫1例になった。さらに、リンパ増殖病変としては濾胞性リンパ腫6例中5例、木村病13例中8例が陽性になった。腫瘍領域のおけるリンパ球中のウイルスは、局所的な免疫低下状態におけるウイルス感染細胞の再活性化が原因と考えられており、メルケル細胞ポリオーマウイルスの腫瘍化おにおいても今後の課題である。千葉大学医学部附属病院にて切除された腫瘍性もしくは腫様様病変における解析を継続して施行した。昨年度までの症例と合わせるとメルケル細胞癌7例、光線性角化症22例、ボーエン病44例、基底細胞癌112例、悪性黒色腫29例、血管肉腫10例、リンパ腫(濾胞性リンパ腫6例と血管内大細胞リンパ腫2例)、毛包上皮腫11例、木村病13例と皮膚腫瘍主体に症例数を増やし検討した。メルケル細胞癌以外では、腫瘍細胞自体はいずれも陰性であった。腫瘍部またはその周囲の領域の背景細胞としてのリンパ球に陽性像が観察された症例が、光線性角化症2例、ボーエン病5例、基底細胞癌8例、悪性黒色腫3例、毛包上皮腫1例で、リンパ増殖病変としては濾胞性リンパ腫6例中5例、木村病13例中8例が陽性になった。集塊状の陽性像は木村病と濾胞性リンパ腫であった。木村病で特徴的な好酸球浸潤近傍のリンパ濾胞間のリンパ球に高率にメルケル細胞ポリオーマウイルス陽性細胞の集簇が見られ、リンパ濾胞部やマントル層にはごくわずかに観察されるのみである。木村病の組織像の特徴であるリンパ濾胞胚中心の好酸球膿瘍形成部では、濾胞胚中心に陽性細胞が多数観察される。木村病の特徴である好酸球の分布と同じく、メルケル細胞ポリオーマウイルス陽性細胞が観察されることは、病態形成に関わっている可能性を示唆する。さらにこのメルケル細胞ポリオーマウイルス陽性リンパ球のサブセット解析を、リンパ球マーカーを用いて検討した。CD3陽性でT細胞と考えられる。その他のマーカーとしてはCD5陽性、CD4陽性、CD8陰性、CD10陰性、Bcl-6陰性、GranzymeB陰性、TIA1陰性であった。木村病の背景リンパ球に観察される、ポリオーマウイルス陽性細胞はCD4陽性のヘルパーT細胞であることがわかった。今後その病変形成への関与について解析する予定である。東京大学医学部附属病医院の皮膚腫瘍や、虎の門病院のメルケル細胞癌を用いた検討をした。メルケル細胞ウイルスが検出できるか否かを、PCRはKatanoら6つのNested PCRのセットと条件を利用した(J. Med. Virol. 81:1951-1958)。

PCRの系ではメルケル細胞癌9例(9/9)、基底細胞癌1例(1/46)、光線性角化症3例(3/52)が陽性であった(テーブル1,図3)。他の代表的皮膚腫瘍は陰性であった。(ボーエン病(0/34)、悪性黒色腫(0/5)、母斑(0/7)、脂漏性角化症(0/5)、原発性皮膚未分化大型リンパ腫(0/5)。また皮膚原発の神経内分泌癌であるメルケル細胞癌と比較のため他の臓器の代表的神経内分泌腫瘍である肺小細胞癌の皮膚転移の症例も検討したが陰性であった(0/4)。6つのPCRプライマーのうち、large T抗原でのC末端側に相当するLT2の領域の検出率が低く、メルケル細胞癌(4/9)、基底細胞癌(1/1)、光線性角化症(2/3)であった。広範囲の欠失突然変異は報告されていないため、LT2の5'側の、既報における遺伝子変異の多い領域を検討した。LT2の増幅が検出できなかったメルケル細胞癌5例のPCRで増幅されず、微小病変の基底細胞癌1例はサンプルの残存がなく検討できなかったが、メルケル細胞癌4例、光線性角化症3例は一定の領域で検討できた。メルケル細胞癌の2例では既報と同様、または新規のTruncation mutationが検出された。C末端が欠損したlarge T抗原が細胞内で発現することは腫瘍の癌化に重要な役割を果たすとされており、今後さらなる解析を進めたい。メイルケル細胞ポリオーマウイルスの腫瘍関連性に関しては未だほとんどわかっていない。多くの疾患、症例、特に原因不明とされている、稀な病変に関しても検討を広げることにより新たな方向性を生み出すことができるのはないかと考えている。メルケル細胞ポリオーマウイルスの腫瘍ウイルスとしての腫瘍発生メカニズムを研究課題としている。関連腫瘍の検出と、腫瘍で検出されたメルケル細胞ポリオーマウイルスの遺伝子配列の解析から、既報と同様または新規のTrancation mutationが検出されており、おおむね順調に進展している。皮膚腫瘍をはじめとした様々な病変でのポリオーマウイルスの関与がいかなるものであるかを解明することが当初の目標である。さらには今回観察された、背景リンパ球におけるポリオーマウイルスの関与、特に非常に多くの細胞で観察された、低悪性度リンパ腫の一つである濾胞性リンパ腫、原因のわかっていない病変である木村病への関与は非常に興味深く、併せて検討していきたいと考えている。千葉大学医学部附属病院での皮膚腫瘍における、メルケル細胞ポリオーマウイルス感染の有無の検出を検討し、さらなる変異や、コピー数解析につなげる。皮膚腫瘍または頭頸部腫瘍を主体に解析をしているが、今後病変数、症例数も増やし、どのような病変にポリオーマウイルスが関与しているのか検討する。症例数の準備や、染色条件再検討に時間を要し、未使用額が生じたが、今後精力的に症例を検討する。リンパ増殖病変のついては、感染細胞の同定や、その分布の検討をする。また、上記の症例に関して、ウイルすコピー数解析、ウイルスの変異部の解析を計画している。皮膚腫瘍をサンプルに、免疫染色やPCRでの検出、遺伝子変異や、コピー数解析を検討する。時に、免疫染色は、これまでの結果から、特異度が高く、スクリーニングの方法と適していると考える。より感度の高い方法を模索したい。
非水溶媒を用いた閉サイクル型濃度差発電によるエネルギー変換法の研究

60°C以下の温排水など,エネルギー回収が困難であった低品質の熱源から,熱サイクルによらず電気化学的に電気エネルギーを連続的に取り出す新しい発電方式を研究中である。非水系溶媒系電解質溶液を高濃度/低濃度の2通り準備し,イオン選択膜により発生する膜電位に基づく発電を行った後,溶媒の蒸発温度以上の低温熱源により純溶媒を蒸発させることで2通りの電解質濃度を再生する。これにより閉サイクル運転が可能となり,環境への影響もない化学発電方式が可能となる。平成30年度は1)セルの4倍の大型化2)拡散濃度分極の程度を把握するための流速変化試験3)発電セルの内部抵抗の低減のための抵抗構成因子の定量的な把握と内部抵抗の低減対策の検討を実施した。1)セルの大型化については通電有効面積を平成29年度の5.3cm2から平成30年度は約4倍の21.2cm2に拡大した。この目的は大型化することで電流の計測精度を上げることと流速の設定範囲を広げることで濃度分極を正確に計測するためである。2)槽内の空塔流速を0.007から0.072m/sの範囲で変化させ特性の変化を把握した。メタノールの物性を用いたレイノルズ数は0.3から30である。この範囲の電流電圧特性を取得したところ,流速として0.005m/s(レイノルズ数2)以上あれば発電特性に変化がない結果を得た。すなわち,微流速で良い。3)セルの抵抗については小型セルで電極,膜,溶液の個別の抵抗を直流及び交流で計測し,非水溶媒系においては膜の抵抗が他の抵抗と比較して大きい結果を得た。溶液抵抗については混床イオン交換樹脂を挿入することで抵抗を約10%低減できた。以上まとめると本年度成果としてセルの大型化に成功し,濃度分極や抵抗の内訳を従来より正確に計ることができ,性能向上指針を得ることができたことが挙げられる。本研究で狙う非水溶媒系での濃度差発電が成立するための条件としては,内部抵抗を減少させて得られる発電電力を実用的な範囲であるmW/cm2程度まで増加することにある。平成30年度までの成果では数十μW/cm2程度の出力密度が得られている。さらに発電性能を工場するためには抵抗の構成因子を分解解析し,適切な対策をとることが必要である。そのためにはある程度大きな発電セルを対象として計測を行い,計測の精度を高めるとともに,実用化に向けて大型化が可能なことを示す必要がある。平成30年度は一気に4倍=21cm2のセル面積の拡大に成功し,これを用いて発電特性や濃度分極などを精度良く計測できた。なお,セルの大型化に伴い,発生した課題としてはセルを周辺から貫通ボルトで締めつける構造であるので,締めつけに伴ってセル筐体が変形し,シール性が低下する問題が発生した。そこで締めつけ力が各部で一定になるようにセル枠外部に締めつけ寸法維持のためのスペーサを挿入するとともに,セルの通液部にも網状のスペーサをおくことでセルの間隔を一定に保つようにして解決した。また,このセル通液部にスペーサを入れる副次的な効果としてセル内部の溶液流れを分散させ,均一流に近くなることが挙げられる。これはインクを用いた流れ試験により効果を確認した。このような実験とともに,平成30年度は流れ,電気化学,熱などの連成問題を解くことができるソフトウェア(COMSOL)を導入し,まずセル内部の流れの解析を行うことができた。今後の予定としては電気化学反応との連成を目指している。令和元年度の具体的な研究推進内容は以下の通りである。平成30年度の試験結果より,イオン交換膜の抵抗が全体抵抗に占める割合が大きいことが判明したため,イオン交換膜を薄膜化し,抵抗の低減度合い把握する。具体的には従来使用してきた150μm程度の厚さのイオン交換膜ではなく,フッ素系の25μm厚さの陽イオン交換膜を使用して試験を行うことにより,膜厚さが抵抗に及ぼす影響を定量的に把握する。陰イオン交換膜については20μm程度の厚さの薄膜は市販されていないため,可能な限り薄い膜を入手して供試する。この試験は従来同様,非水溶媒系で実施するが,これに加えて新たに水溶媒を対象として大型セルを用いて濃度差発電を実施し,非水溶媒との差を明らかにする。電解質の溶解度は非水溶媒と比較すると水溶媒系は数倍大きいので,発電性能に直接関係する高濃度/低濃度の濃度比も大きくとれることになる。水系は蒸発温度(沸点)が約100°Cとなるため,使用できる熱源は非水溶媒と比較すると限られるが,性能向上度の度合いおよび地熱発電など適用先の熱源温度によっては可能性もある。具体的には抵抗の差,起電力の差,発電電力の差を非水溶媒と水系とで比較する予定である。さらにこれまで得た抵抗,発電特性を理論的に解明するために流れ,物質移動,電荷移動の連成解析を目指す。現在までの3年間の成果を踏まえて物質移動と発電のシミュレーションを実施し,システムの最適化を図る。60°C以下の温排水など,エネルギー回収が困難であった低品質の熱源から,熱サイクルによらず電気化学的に電気エネルギーを連続的に取り出す発電方法の研究を実施中である。

高濃度/低濃度の非水系溶媒電解質溶液と,イオン選択膜により発生する膜電位に基づく発電を行った後,低温熱源により純溶媒を蒸発回収することで電解質溶液の濃度を再生する。これにより,閉サイクル運転が可能となり,環境への影響もない化学発電方式が可能となる。平成29年度は国産アニオン膜2種類を対象とし,塩化リチウム,塩化マグネシウム,塩化カルシウム各々を, 0.001モルから0.5モルの量でメタノール1kgに溶解して電解質溶液を作成した。先行する研究成果に基づいて溶液電位の計測方法を実験的,理論的に詳細に検討し,溶液と計測電極との間に発生する液間電位を,溶液濃度に基づいて補正することで,正確な膜電位が得られることを明らかにした。本手法により,膜の種類と電解質塩の種類を変えて膜の輸率(選択性指標であり, 0.5は選択性なし1.0は完全な選択性)を測定した。輸率の値は0.9以上となり1.0に近い値を得,供試したアニオン膜は全て完全なイオン選択性を示すことが明らかになった。カチオン膜に対しても輸率が1.0に近い値が得られることを確認した。アニオン膜,カチオン膜を組み合わせて直流通電試験を行うとともに,交流インピーダンスを計測した。直流抵抗が大部分を占めることが判明したため,膜間にイオン交換樹脂や繊維を挿入して直流抵抗が下げられるかどうかを検討したが,効果を確認するまでには至っていないので今後も継続する。本年度は最重要課題であった膜電位の流動条件下での正確な計測方法を確立できたことと,イオン交換膜が非水溶媒系においてもほぼ完全なイオン選択性を示すことが明らかになったことが成果である。本研究で狙う非水溶媒系での濃度差発電が成立するための条件としては,膜を介して高濃度/低濃度溶液を通液した場合,(1)アニオン交換膜,カチオン交換膜がイオン選択性を発揮するか否か,その選択性は膜や電解質によって大きく異なるか否かと言う点と,(2)発生する起電力は理論的にはNernst電位であるが,現実に発生する起電力はいくらかという点にある。そのためには非水溶媒中での電位を正確に計測する必要があるが,本年度研究により,電極にAg/AgCl可逆電極を用い,計測された電位を,電極が置かれた溶液濃度にしたがって発生する液間電位の補正を行うことで正確に計測できることを明らかにしたものである。その手法に基づいて膜の種類の影響や塩の種類の影響を検討したところ,膜は最も1価イオン選択性膜などの特殊な膜でなく,一般的なイオン交換膜で良く,また電解質塩としても一般的な塩化リチウムで十分なことがわかった。これにより,低コストな膜と塩を選択できることが判明した。なお,交流インピーダンスの結果,直流抵抗成分が抵抗の大部分を占めることがわかり,その大部分は膜抵抗と低濃度側の溶液抵抗であるため,それらの抵抗を下げる検討が課題として残った。本年度はこれらの抵抗要因を明らかにする事ができた。60°C以下の温排水など,エネルギー回収が困難であった低品質の熱源から,熱サイクルによらず電気化学的に電気エネルギーを連続的に取り出す新しい発電方式を研究中である。非水系溶媒系電解質溶液を高濃度/低濃度の2通り準備し,イオン選択膜により発生する膜電位に基づく発電を行った後,溶媒の蒸発温度以上の低温熱源により純溶媒を蒸発させることで2通りの電解質濃度を再生する。これにより閉サイクル運転が可能となり,環境への影響もない化学発電方式が可能となる。平成30年度は1)セルの4倍の大型化2)拡散濃度分極の程度を把握するための流速変化試験3)発電セルの内部抵抗の低減のための抵抗構成因子の定量的な把握と内部抵抗の低減対策の検討を実施した。
魚卵卵外被の分子構造とその構築

平成6,7両年度にわたった本研究の当初の目的は、従来ともすればその生物学的意義が充分認識されなかった動物の卵外被の機能を分子レベルで理解する為に、又、高度にオルガナイズされた一種の細胞間基質としての卵外被を理解する為に、卵外被の構造を分子レベルで明らかにすることであった。その方法は以下の三種であった。(1)卵外被内層サブユニットの前駆体の構造を知る、(2)未硬化卵外被内層サブユニットの単離・分析と、卵外被硬化機構の解析を通じて内層構造を理解する、(3)孵化酵素によるサブユニットの限定分解を利用してサブユニットの構造に関する知見を得る。この結果、以下の様な成果を得た。(1)卵外被サブユニット前駆体の精製・解析が進み、そのcDNAのクローン化と分析も行った。これによりZI-3の前駆体,L-SF、は401個のアミノ酸より成り分子量約4000のN-グリコシド糖鎖を含むこと、哺乳類透明帯と相同性を持つタンパク質である事等が解った。又、ZI-1,2の前駆体、H-SF、も約600余りのアミノ酸より成る一次構造が明らかにされつつある。(2)未硬化卵外被内層サブユニット、ZI-1,2とZI-3,のそれぞれの一次構造を損なわないで単離する方法が見出された。それにより得たサブユニットと前駆体を比べると、前駆体のC末端側ペプチドの欠失が起ることが前駆体タンパク質の内層への分子集合に必要であろうと考えられる。又、付活に際しトランスグルタミナーゼによりサブユニット間にγ-Glu-ε-LYS架橋が形成されることが明らかとなった。(3)孵化酵素(HCE)はZI-1,2サブユニットを限定分解し、プロリン含量が多く(30%以上)、γ-Glu-ε-LYS架橋に富むペプチド部域を遊離する。本研究の結果を総合し、未硬化及び硬化卵外被の分子構築に関する知見が極めて豊富になった。当初,1994年度の研究計画は主に3点からなり,(1)メダカ卵膜サブユニットZI-3の前駆体タンパク質であるL-SFの一次構造の決定.(2)3種のサブユニットZI-1,2及び3の単離と部分的特徴づけ,及び(3)孵化酵素HCEにより切り出される硬化卵膜断片の構造分析であった。(1)に関してはL-SFのcDNAをクローン化することにより一次構造が明らかとなった。すなわち,L-SF41は1473bPより成り,19アミノ酸のシグナルペプチドと420アミノ酸のL-SFタンパク質を含んでいた。N末端はアスパラギン酸であるがアミノ酸分析が不可能であるので何らかの修飾を受けていると思われる。約4000の分子量の糖鎖を含むと考えられる。(2)未硬化メダカ卵膜をGu-Hclで溶解することにより,SDS溶解と殆んど同一のサブユニット,ZI-1,2およびZI-3が電気泳動により分離し,さらにカラムクロマトグラフィーによりそれらが単離出来ることが明らかとなった。この結果、卵膜サブユニットとその前駆体の分子構造の比較が可能となった。

(3)HCEにより硬化卵膜は部分分解を受け膨潤するが,この際,多量のプロリンとグルタミル-リジン架橋を含む領域が特異的に切り出されることが判明した。以上ほぼ当初の目的を達成しつつある。平成7年度の研究計画は次の三点から成っていた。即ち(1)卵膜主要サブユニットの内のZI-1, 2群の前駆体のcDNAをクローン化し、その分析を行う、(2)メダカ(及びニジマス)の未硬化卵膜のZI-1, 2及びZI-3を精製し構造を調べる、および(3)硬化卵膜タンパク質構造の中で特に硬化に関係し、又は孵化酵素作用に敏感な部分の構造を明らかにする、ことであった。(1)に関してはZI-1, 2の前駆体であるH-SFを腹水から単離・分析しているが、3種の分子量の近接した(74-76K)タンパク質群であるために個々のタンパク質に関するcDNAはクローン化していない。しかし、この3種とも、ペプチド構造はほとんど同一ではないかと思われる。現在、全長に近いcDNAクローンが得られており、1795bpより成っている。この中にN-グリコシド糖鎖結合可能部位は3ヶ所あるがグリコシダーゼ消化実験によると、大型糖鎖存在の可能性は低い。ノザン解析の結果、L-SFと同様、産卵雌およびエストロゲン処理雄の肝臓にのみ発現する。(2)未硬化卵膜サブユニットからGuHclにより自然状態に近く溶解され単離されたZI-3は、その前駆体であるL-SFとほぼ等しい一次構造を持つがC-末端側にL-SFに存在するペプチド鎖を欠いている。このことは、前駆体のこの部分の除去が分子集合に必要であろうことを予想させる。付活による卵膜硬化機構はメダカ及びニジマスについて共通の原理によって行われる可能性が見えてきた。即ち、ZI-1, 2サブユニットの部分的分解と、それによって低分子化したサブユニット間にトランスグルミナーゼにより架橋が形成されることである。(3)孵化酵素(とくにHCE)により硬化卵膜からプロリンとグルタミンの含量が高く、γ-Glu-ε-Lys架橋に富むドメインが切り出されるが、これは主にZI-1, 2サブユニットに含まれることが判明した。(4)上記(1)、(2)、(3)の結果に基づいてメダカ卵膜内層の構造とその構築に関する仮説を作りつつある。
炎症性腸疾患の病態におけるガレクチンの免疫調節機能とその治療戦略

小児炎症性腸疾患(IBD)腸管粘膜におけるGalectin(Gal)-1、-3、-9の発現について検討した。対象は初発IBD患児22例(Crohn病: CD10例、潰瘍性大腸炎: UC12例)と正常対照延べ24例。内視鏡検査にCDでは回腸末端、UCではS状結腸、正常対照では両部位の粘膜生検を採取、real time-PCRにてGal-1、-3、-9の発現を比較検討した。炎症粘膜におけるGal-1、-3の発現は有意差を認めなかった。Gal-9の発現は、CDにおいて有意に高かった(p=0.009)が、UCでは有意差はなかった。Gal-9は、Tim3を介して炎症抑制に関わる蛋白である。Gal-9はCrohn病の病態に関与し、炎症粘膜において炎症の波及を抑制している可能性が示唆された。炎症性腸疾患(IBD)は腸管に慢性炎症をきたし再燃寛解を繰り返す慢性炎症性疾患であり、最近では自然免疫や遺伝的背景の関連が注目されてきている。一方、ガレクチンは糖を認識するドメインを持つ蛋白で自然免疫系細胞と獲得免疫細胞の両者に関与していることが報告されている。ガレクチンとIBDの関連についてさらなる検討が必要であるが、その報告は1つのみである。そのさらなる検討のため、ガレクチン-1、-3、炎症性サイトカインであるIL-6、Th1サイトカインであるIL-12、IFN-γ、TNF-α、Th2サイトカインであるIL-4、IL-5、Th17サイトカインであるIL-17、IL-23、調節性T細胞のサイトカインであるIL-10、TGF-β、単球系のGM-CSF、MCP-1などの種々のサイトカインや、転写因子としてTh1細胞はT-bet、Th2細胞はGATA3、調節性T細胞はFoxp3、Th17細胞はRORγtなどのシグナル分子の発現をreal-time PCRやELISAを用いて解析する。本研究は、これらの実験によりIBDの病態とガレクチンとの関連性について解析し、IBDの病態を明らかにする検討である。現在までに、検体採取・保存、細胞培養、real-time PCR解析、ELISA解析を実施できるような準備を行っている。また、潰瘍性大腸炎群、クローン病群、コントロール群の粘膜検体の採取を開始している。採取した一部の検体をreal-time PCRによりガレクチン、サイトカインを確認している。しかし、検体数が少ないために、比較検討し統計学的有意差を解析するまでには至っていない。今後は、検体数を増やしていくことによりガレクチンとIBDの病態について比較検討できるものと考えている。【背景・目的】β-ガラクトシドに親和性のあるペプチド配列を分子内に有することで定義される一連の蛋白質であるGalectinは、免疫細胞の恒常性や炎症の調節、がん転移などに重要であることが示唆されている。哺乳類では15種類が存在しているGalectinの中でGalectin-1(Gal-1)、Galectin-3(Gal-3)、Galectin-9(Gal-9)は、感染症や自己免疫疾患などの炎症性疾患の病態への関与についても報告されているが、未だ不明な部分も多い。今回、小児炎症性腸疾患(IBD)腸管粘膜におけるGal-1、Gal-3、Gal-9の発現について検討した。【方法】対象は初発IBD患児22例(Crohn病10例、潰瘍性大腸炎12例)と正常対照延べ24例。下部消化管内視鏡検査中に粘膜生検にて、Crohn病では回腸末端、潰瘍性大腸炎ではS状結腸、正常対照では両部位の粘膜を採取した。生検した粘膜からcDNAを抽出し、real time-PCRにてGal-1、Gal-3、Gal-9、GAPDHの発現を測定、比較検討した。【結果】炎症粘膜におけるGal-1の発現は、Crohn病、潰瘍性大腸炎において、両者とも発現増加傾向であったが、正常対照と比較し有意差を認めなかった(CD; p=0.507,UC; p=0.153)。Gal-3の発現は、Crohn病、潰瘍性大腸炎において、両者とも発現低下傾向であったが、正常対照と比較し有意差を認めなかった(CD; p=0.268,UC; p=0.063)。Gal-9の発現は、Crohn病において有意に高かった(p=0.009)が、潰瘍性大腸炎において差はなかった(p=0.244)。【考察】Gal-

3は炎症性腸疾患の上皮細胞において発現が低下していたとの報告があるが、本検討では有意差を認めなかった。Gal-9は、Tim3の介して過剰なTh1細胞や好酸球を抑制しており、炎症抑制に関わる蛋白であることが報告されているが、今回の検討ではCDの回腸末端粘膜においてGal-9の発現が有意に高かった。炎症が惹起されている局所粘膜において、さらなる炎症の波及を抑制している可能性がある。【結語】Gal-9はCrohn病の病態に関与しており、Gal-9がCDの活動性を抑制することが示唆され、今後治療法の選択肢の1つになる可能性があると考えられた。
血液培養に由来する緑膿菌に対する抗菌薬の適正使用と耐性菌出現に関する研究

〈目的〉緑膿菌は日和見感染症の起因菌の一つで、多くの抗菌薬耐性機構の研究が報告されている。緑膿菌感染症治療に際し、感受性検査の結果から耐性化を誘導しやすいか否かを事前に把握することを目的にhypermutable株の検出行った。〈方法〉当該機関で、血液培養にて分離・同定された緑膿菌を対象とした。同一患者の血液培養に由来する緑膿菌に対し、アミカシン、シプロフロキサシン、イミペネムの感受性試験をe-testにて実施し,hypermutable株の検出および評価をMacia'ら^1)の報告に準じ行った。なお、感受性試験の培養時間は、18時間および40時間で判定を行った。感受性試験の精度管理にはPseudomonas aeruginosa(ATCC27853)を用いた。なお、抗菌薬処方歴および投与歴、詳細な患者情報の検索は当該機関の倫理規定により、検索が不可能であった。〈結果〉4例の血液培養から分離・同定された11株を用いた。培養時間の延長で感受性試験結果の判定に変化があった株はなかった。また、培養延長後(40時間での判定)に、阻止円内に発育した株のうち、純培養が可能であった株を用いて感受性試験を実施した結果、18時間判定の結果と同様の結果であった。よって、本研究の対象株からは上記3抗菌薬に対するhypermutable株を分離することはできなかった。〈考察〉嚢胞性繊維症(CF)に緑膿菌が関与することから、抗緑膿菌作用のある抗菌薬の長期的な投与が必要であり、CF患者の37%はhypermutable緑膿菌が分離される。しかし,ICUに収容される急性感染症患者では、hypermutable緑膿菌の分離率は1%以下^<2)>である。本研究は、血液培養より継続的に分離された緑膿菌を対象に、hypermutable株の検出を実施したが、hypermutable株は分離されなかった。上記の抗菌薬に耐性を示した株は、各々の耐性機序が関与していた。〈結論〉血液培養由来株でhypermutableの検出から耐性化の関与を見出すことはできなかった。
日米両国の消化器癌における環境因子と癌遺伝子、その他の遺伝的因子に関する比較研究

本研究では,日米の消化器癌発生率の大きな相違に着目し,両国間の癌遺伝子及びその関連物質,食生活,便通・便の性状の異同を調査し,これらが消化器発癌に関与している可能性につき多面的に検討することを目的とした。これまで,平成4年5月に研究代表者の吉田豊がテネシー大学に出向き,テネシー大学側研究者3名と今後の研究内容やその手順につき話し合った。その際,食生活,嗜好品アンケートの英語版,日本語版の原案の作成,及び癌遺伝子,グルタチオンS-トランスフェラーゼの測定方法,分担等の打ち合わせを行った。また,平成5年1月にこれまでの研究の進渉状況等の相互確認,協議,情報・資料の交換ならびに次年度以降の研究展開上必要な打ち合わせのため,研究分担者である土田成紀講師をテネシー大学に派遣した。その後,食生活・嗜好品アンケートの英語版,日本語版の作成,およびこのアンケートを用いた調査,青森県・テネシー州の消化器癌の発生率調査,および遺伝子,グルタチオンS-トランスフェラーゼ測定のためのサンプル収集が続けられた。平成6年度は,本研究の主眼である以下の3点の検討を行った。(1)1990年の青森県,テネシー州の消化器癌の年齢調整罹患率調査:両地域の癌登録を資料にして両地域の1990年(単年度)の消化器癌の年齢調整罹患率を調査した。世界人口を基準人口とした場合,人口10万人当たり,青森県では胃癌50.4(男性62.5,女性40.1),結腸癌20.8(男性23.2,女性18.9),直腸癌15.8(男性21.2,女性13.5),肝臓癌15.3(男性20.1,女性10.1),膵臓癌10.3(男性12.3,女性8.1),胆道癌9.0(男性10.1,女性9.1),食道癌8.9(男性10.1,女性8.9),テネシー州では,胃癌4.2(男性5.9,女性2.5),結腸癌24.6(男性29.6,女性19.6),直腸癌9.6(男性11.3,女性7.8),肝臓癌1.4(男性1.9,女性0.9),膵臓癌6.0(男性7.1,女性4.9),胆道癌1.2(男性1.5,女性1.0),食道癌2.3(男性3.5,女性1.1)で,胃癌は青森県がテネシー州の約12倍と両地域で大きな差が存在し,他の消化器癌の年齢調整罹患率もおおむね青森県の方がテネシー州より高かった。しかし,結腸癌は青森県がテネシー州よりやや低く,直腸癌はやや高かったが大腸癌全体ではほぼ同程度であった。(2)食生活・嗜好品摂取頻度,及び便通調査:日米両国で胃癌,大腸癌患者のアンケートによる食生活,嗜好品摂取状況調査を行った。対象は日米ともに,胃癌30名,大腸癌30名であった。また,各々の症例につき対照群は性と年齢(5歳以内),職業をマッチさせた(各々男女比は1:1,平均年齢は,胃癌で48.6歳,大腸癌で49.5歳,対照群50.0歳)。その結果,米飯,パン,肉,ミルク,バタ-,チーズ,調理した魚,薫製魚介類,生魚,焼き魚,卵,果物,じゅがいも,野菜,つけもの,海草,豆,その他の食品の摂取頻度は両群間で差はみられなかった。一方,嗜好品では,コーヒー,紅茶,緑茶の摂取頻度にも両群間で差はみられなかった。また,喫煙,飲酒状況にも差はみられなかった。一方,胃癌患者の1日当たりの排便回数は大腸癌患者より有意に頻回であったが,残便感,便の性状等には差はみられなかった。この傾向は,日米間でまったく同様な傾向であった.(3)消化器癌の遺伝子及びその関連物質の比較検討:日米の消化器癌患者の癌組織中のグルタチオンS-トランスフェラーゼの発現を検討した。まず,大腸ポリ-プの大きさとグルタチオンS-トランスフェラーゼ-π発現の関係を免疫組織化学的に検討した。その結果,ポリ-プの直径が5mm以下では多くがグルタチオンS-トランスフェラーゼ-π陰性であったのに対し,6mm以上では全例陽性を示した.また,PiクラスのグルタチオンS-トランスフェラーゼ分子種の遺伝子が,その発現調節領域にTPA-応答配列を有することから,癌組織での同遺伝子の発現にc-Junやc-Fosなどの癌遺伝子産物が関与するか検討した。その結果,Piクラス分子種の発現にc-Junが関与していることが示唆されたが,これらの結果に関しては日米両国間で有意な差はみられなかった。