hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラファイト-フラーレンハイブリッド薄膜材料の超潤滑特性の理論研究

我々はまたグラフェンシートに挟まれた系の摩擦特性を動的に調べた。今回はOMCTS(オクタメチルシクロテトラシロキサン)溶液をグラフェンシートに挟み、グラフェンシートを一定速度で引きずった。引きずり速度を上げていくと水平力特性にカオス的特性が表れたので、これを一次元Tomlinson描像で説明した。(Applied PhysicsLetters89, pp. 2231041-2231043(2006))これら一連の研究に対して「イノベーション・ジャパン2006 UBSスペシャルアワードナノテクノロジー・材料部門賞(2006年9月)」が授与された。また、本研究の昨年度の成果(トライボロジスト49,553(2006))に対してトライボロジー学会論文賞が授与される事が決定した。
超短パルスレーザー照射によるガラス内部へのナノ構造形成と三次元集積化

申請者らは近年、フェムト秒レーザーの集光照射を用いて、ガラス内部に光の回折限界を超える精度で屈折率変化、イオンの価数変化、金属の析出、結晶化などの物理的・化学的性質の変化を誘起させることに成功した(誘起構造)。これらの現象を利用すると、三次元光導波路や三次元超高密度光メモリーなどの新規な光デバイスとしての応用が期待される。平成16年度は、このような誘起構造に加えて、フェムト秒レーザー光の干渉や偏光特性を活用して自己組織的に周期的ナノ構造を形成した。一つのフェムト秒レーザーをシリカガラス内部に集光照射し、その集光点近傍を走査型顕微鏡の反射電子像で観察すると、レーザーの偏光と垂直方向に数十数百nm周期のナノ構造が形成されていた。ナノ構造の周期はパルスエネルギーに依存しており、パルスエネルギーを増加するにつれて、周期が増加する傾向が見られた。この結果はフォトンとプラズモンの相互作用を想定したモデルで説明され、フェムト秒レーザーと透明物質の相互作用に関する新たな知見が得られた。同様の効果は、サファイアや二酸化テルル結晶などの透明な単結晶においても確認された。特に、二酸化テルル結晶においては、周期的なナノボイド(穴)が形成されており、フォトニック結晶などの応用が期待される。一方で、二つのフェムト秒レーザービームの干渉を利用すると、ガラス及びポリマーなどの透明物質内部にサブミクロンオーダーの周期構造が形成され、その周期長が入射光の角度に依存して変化することがわかった。また、回折ビームスプリッターを用いて複数のフェムト秒レーザーを干渉させると、1パルスの照射で複雑な形状のナノ構造の形成が観察された。光導波路とこれらの周期構造を三次元的に配列することにより、新規な波長分波デバイスを構築し、異なる波長の光の分離を可能にする超小型デバイスを開発した。平成15年度は、このような誘起構造に加えて、ガラス内部に周期的なナノ構造を形成させることを試みた。具体的には、フェムト秒レーザー光の干渉や偏光特性を活用して自己組織的に周期的ナノ構造を形成した。一つのフェムト秒レーザーをシリカガラス内部に集光照射し、その集光点近傍をオージェ電子分光の反射像で観察すると、数十nm周期のナノ構造が形成されていた。この結果はフォトンとプラズモンの相互作用を想定したモデルで説明することができ、フェムト秒レーザーと透明物質の相互作用に関する新たな知見が得られた。同様の効果は、シリカガラスに限らず、サファイアなどの単結晶においても確認された。平成16年度は、これらのナノ構造をガラス内部に三次元的に集積化する技術を開発する予定である。

申請者らは近年、フェムト秒レーザーの集光照射を用いて、ガラス内部に光の回析限界を超える精度で屈折率変化、イオンの価数変化、金属の析出、結晶化などの物理的・化学的性質の変化を誘起させることに成功した(誘起構造)。これらの現象を利用すると、三次元光導波路や三次元超高密度光メモリーなどの新規な光デバイスとしての応用が期待される。平成16年度は、このような誘起構造に加えて、フェムト秒レーザー光の干渉や偏光特性を活用して自己組織的に周期的ナノ構造を形成した。一つのフェムト秒レーザーをシリカガラス内部に集光照射し、その集光点近傍を走査型顕微鏡の反射電子像で観察すると、レーザーの偏光と垂直方向に数十数百nm周期のナノ構造が形成されていた。ナノ構造の周期はパルスエネルギーに依存しており、パルスエネルギーを増加するにつれて、周期が増加する傾向が見られた。この結果はフォトンとプラズモンの相互作用を想定したモデルで説明され、フェムト秒レーザーと透明物質の相互作用に関する新たな知見が得られた。同様の効果は、サファイアや二酸化テルル結晶などの透明な単結晶においても確認された。特に、二酸化テルル結晶においては、周期的なナノボイド(穴)が形成されており、フォトニック結晶などの応用が期待される。一方で、二つのフェムト秒レーザービームの干渉を利用すると、ガラス及びポリマーなどの透明物質内部にサブミクロンオーダーの周期構造が形成され、その周期長が入射光の角度に依存して変化することがわかった。また、回折ビームスプリッターを用いて複数のフェムト秒レーザーを干渉させると、1パルスの照射で複雑な形状のナノ構造の形成が観察された。光導波路とこれらの周期構造を三次元的に配列することにより、新規な波長分派デバイスを構築し、異なる波長の光の分離を可能にする超小型デバイスを開発した。
半夏の鎮吐作用成分の研究

東洋医学に使用される生薬の中で、半夏はその強い鎮吐作用を有する点で特徴づけられる。トノサマガエルによる鎮吐検定法を用い、その生理活性物質の本体を追求した。半夏を水で抽出し、透析、セファアクリルS-300ゲルクロマトグラフィー,高速液体クロマトグラフィー(カラム,TSK G-4000SW,移動相水)を使用し精製を試み、分子量80万の物質PT-F2-1を得た。本物質は、アポモルフィン,硫酸銅,さらには、中毒原因キノコの一種であるクサウラベニタケの毒成分、コリンおよびムスカリンに対しても、100μg/mlの濃度で、100%の鎮吐率を示した。PT-F2-1は、アラビノース50%,ガラクソロン酸16.5%,グルコース,フコースより構成され、さらにアセチル基2.3%,カルシウムイオン1.9%を含むペクチン様物質である。本多糖類について、【^(13)C】NMRによる解析,メチル化分析,酸部分加水分解により構造研究を行い、その化学構造を図のように推定した。又、市販されている半夏、西方半夏および切半夏半とん(修治した半夏)についても鎮吐率を検討したところ、その水エキスについて、本実験で得たものと同等の生理活性を示した。漢方医書においても、鎮吐作用を期待して使用されている場合も多く、又、上記の毒キノコの中毒症状を改善する作用が著明であることを考え合せ、本研究が、半夏の鎮吐作用について、1つの答を出したものと考える。
魚類において多様化した補体アイソタイプの時空間的機能分化とその分子基盤

本研究は、これまでに同定されているコイ補体成分C3、C4、C5、B因子、C1r/s、I因子のアイソタイプ間の機能分化を、遺伝子およびタンパク質レベルで解析し、補体遺伝子多重化の生物学的な意義を解明することを目的とした。まず、各アイソタイプmRNAの組織分布を解析したところ、C4、C5、B因子、I因子でアイソタイプ間に発現部位の違いが認められた。さらに、C5、B因子については発現部位の違いだけでなく、細菌感染時の応答性もアイソタイプ間で異なっていた。特にB因子アイソタイプ(A1およびA3)については発現の部位と応答性に著しい違いが認められたので、このメカニズムを解明するために、コイゲノムDNAライブラリーをλFIXベクターを用いて構築し、両B因子アイソタイプの遺伝子をクローニング後、それらの上流領域(転写調節領域)の塩基配列を比較した。その結果、A1アイソタイプ遺伝子の上流領域には、A1の肝膵臓での構成的な発現を説明し得る転写調節エレメント(C/EBPαやHNF-1)が同定された。タンパク質レベルにおいては、B因子のA3アイソタイプがC3-Sアイソタイプとのみ、D因子非依存性のC3転換酵素形成能を示した。これは、A3アイソタイプが魚類に特有の補体活性化機構を付与していることを示唆する。補体レクチン経路構成成分については、糖鎖結合特異性が異なる2種類のマンノース結合レクチンアイソタイプ(MBL,GalBL)がコイ血清中に存在し、両アイソタイプ共にセリンプロテアーゼMASP2と会合して補体活性化能を有することが判明した。以上の結果から、魚類で高度に多重化した補体成分アイソタイプは、自然免疫による異物の認識と排除能力を増強していることが強く示唆された。本研究は、これまでに同定されているコイ補体成分C3、C4、C5、B因子、C1r/s、MASP、およびI因子のアイソタイプ間の機能分化を、遺伝子およびタンパク質レベルで解析し、補体遺伝子多重化の生物学的な意義を解明することを目的とした。まず、B因子アイソタイプとC3アイソタイプとのタンパク質間相互作用をQCM装置によって解析したところ、B/C2-A1よりもB/C2-A3の方が、C3に対して有意に高い親和性を示し、この高親和性が、B/C2-A3がC3-SアイソタイプとD因子非依存的にC3転換酵素を形成する現象を部分的に説明できる事が判明した。また、上記補体成分アイソタイプmRNAの組織分布をRT-PCR法によって検討したところ、C4、B因子、C1r/sおよびI因子のアイソタイプ間で、産生臓器に違いが認められた。さらに、これらアイソタイプ間の発現パターンの差異がどのような転写制御によるものかを解明するために、λFIXベクターを用いたコイゲノムDNAライブラリーを構築した。まずB/C2-A1アイソタイプ遺伝子を含む約15kbpのゲノムDNA断片をクローニングし、この遺伝子の上流領域の塩基配列を解析したところ、B/C2-A1の肝臓特異的な発現を裏付ける、いくつかの転写調節エレメントが同定された。さらに、B/C2-A1とは大きく異なる発現部位・応答性を示すB/C2-A3アイソタイプについても遺伝子上流領域の塩基配列を解析しB/C2-A1アイソタイプとはことなる転写調節エレメントが同定された。本研究は、これまでに同定されているコイ補体成分C3、C4、C5、B因子、Clr/s、I因子のアイソタイプ間の機能分化を、遺伝子およびタンパク質レベルで解析し、補体遺伝子多重化の生物学的な意義を解明することを目的とした。

さらに、C5、B因子については発現部位の違いだけでなく、細菌感染時の応答性もアイソタイプ間で異なっていた。特にB因子アイソタイプ(A1およびA3)については発現の部位と応答性に著しい違いが認められたので、このメカニズムを解明するために、コイゲノムDNAライブラリーをλFIXベクターを用いて構築し、両B因子アイソタイプの遺伝子をクローニング後、それらの上流領域(転写調節領域)の塩基配列を比較した。その結果、A1アイソタイプ遺伝子の上流領域には、A1の肝膵臓での構成的な発現を説明し得る転写調節エレメント(C/EBPαやHNF-1)が同定された。タンパク質レベルにおいては、B因子のA3アイソタイプがC3-Sアイソタイプとのみ、D因子非依存性のC3転換酵素形成能を示した。これは、A3アイソタイプが魚類に特有の補体活性化機構を付与していることを示唆する。補体レクチン経路構成成分については、糖鎖結合特異性が異なる2種類のマンノース結合レクチンアイソタイプ(MBL,GalBL)がコイ血清中に存在し、両アイソタイプ共にセリンプロテアーゼMASP2と会合して補体活性化能を有することが判明した。以上の結果から、魚類で高度に多重化した補体成分アイソタイプは、自然免疫による異物の認識と排除能力を増強していることが強く示唆された。
セロトニン神経作用薬による筋萎縮性側索硬化症の新規治療法の開発

セロトニン1Aレセプターアゴニスト8-OH-DPATを用いて,筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウスでの発症遅延・進行抑制効果の検討,初代培養神経細胞障害に対する保護効果とそのメカニズムについての検討を行った.発症前および発症後からの8-OH-DPAT連日投与により,発症遅延・進行抑制効果が認められた.運動症状発現後からの8-OH-DPAT投与は,ALSモデルの頸髄・腰髄において運動神経保護効果を発揮した.また,その神経保護効果は,アストロサイトのセロトニン1Aレセプターとそれに続く転写因子Nrf2の活性化を介するアストロサイトでのメタロチオネインの発現・放出によることも明らかにした.セロトニン神経作用薬としてbuspironeを用いる予定であったが,昨年度は,セロトニン1Aレセプターフルアゴニストの8-OH-DPATがアストロサイトの抗酸化機構グルタチオン,メタロチオネインの発現を最も増加させる賦活化作用を有し神経保護効果を発揮することを明らかにできたので,本研究でのセロトニン神経作用薬として8-OH-DPATを用いることとした..また,筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスであるヒトSOD1G93A mutanttransgenic mice (G93A)を用いて発症時期,生存期間,罹病期間,体重変化,rotarod test等による運動機能の変化を評価し,8-OH-DPAT投与開始時期を発症前投与では8週齢からとした.今年度は,ALSモデルのヒトSOD1G93Amutantマウスに8-OH-DPATの発症前からの連日投与および発症後からの連日投与を行い,発症時期,生存期間,罹病期間,運動障害を評価した.8-OH-DPATの発症前(9週齢)からの連日投与により発症遅延効果が認められた.また,8-OH-DPATを運動症状発現後から連日投与したところ投与5-6周目から懸垂試験や開脚反射での運動障害の進行を抑制する効果がみられた.経時的(13週齢,16-17週齢)に,頸髄,胸髄,腰髄を取りだし組織切片を作成した.ALSモデルを用いた行動学的検討で,発症前および発症後からの8-OH-DPAT連日投与の発症遅延効果および進行抑制効果を明らかにすることができた.セロトニン1Aレセプターアゴニスト8-OH-DPATを用いて,筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウスでの発症遅延・進行抑制効果の検討,初代培養神経細胞障害に対する保護効果とそのメカニズムについての検討を行った.発症前および発症後からの8-OH-DPAT連日投与により,発症遅延・進行抑制効果が認められた.運動症状発現後からの8-OH-DPAT投与は,ALSモデルの頸髄・腰髄において運動神経保護効果を発揮した.また,その神経保護効果は,アストロサイトのセロトニン1Aレセプターとそれに続く転写因子Nrf2の活性化を介するアストロサイトでのメタロチオネインの発現・放出によることも明らかにした.セロトニン神経作用薬としてbuspironeを用いる予定であったが,セロトニン1Aレセプターフルアゴニストの8-OH-DPATがアストロサイトでのグルタチオン,メタロチオネインの発現を最も増加させることを見いだした.したがって,本検討でのセロトニン神経作用薬として8-OH-DPATを用いることとした.(1)8-OH-DPAT前投与による筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症遅延効果,進行抑制効果の検討:Non-transgenic mice (nonTg),ヒトSOD1G93A mutant transgenic mice (G93A)を用いて,発症時期,生存期間,罹病期間,体重変化,rotarod test等による運動機能の変化を評価し,8-OH-DPAT投与開始時期を発症前投与では8週齢からとした.経時的(10週齢-16週齢)に,頸髄,胸髄,腰髄の切片を作成し,運動ニューロンの変性を免疫染色で確認した.また,運動症状が発現した時点からG93Aマウスへの8-OH-DPAT(0.1 mg/kg/日)腹腔内投与を行い,生存期間,罹病期間,運動機能の経時的評価を開始した.(3)初代培養神経障害に対する保護効果の検討:神経アストロサイト共培養系において8-OH-DPAT処置が,酸化ストレスによる神経細胞死に対して保護効果を発揮すること,あらかじめ8-OH-DPATで処置したアストロサイトの培養液が酸化ストレスによる神経細胞死を有意に抑制し保護効果を有することを明らかにできた.さらに,その8-OH-DPATの神経保護効果は,アストロサイトのセロトニン1Aレセプターとそれに続く転写因子Nrf2の活性化を介する主にアストロサイトでのメタロチオネインの発現・放出によることも明らかにした.昨年度までに,セロトニン1Aレセプター作用薬のうちフルアゴニストの8-OH-DPATがアストロサイトの抗酸化機構グルタチオン,メタロチオネインの発現を最も増加させる賦活化作用を有し,培養細胞系において神経保護効果を発揮することを明らかにし,さらに筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルのヒトSOD1G93Amutantマウスへの8-OH-DPATの発症前(9週齢)からの連日投与により発症が遅延すること,運動症状発現後からの連日投与により運動障害の進行が抑制されることを見出した.今年度は,SOD1G93A mutantマウスに8-OH-DPATを運動症状発現後(10週齢)から連日投与し,経時的(3週後,6週後)に,頸髄,胸髄,腰髄の組織切片を用いて組織学的評価を行った.

Nissl染色を行った結果, 8-OH-DPAT投与3週後のマウスにおいて,頸髄・腰髄の前角における運動神経細胞数の低下が有意に抑制され,特に頸髄においては保護効果が顕著であった.また8-OH-DPAT投与6週後でも,頸髄前角の運動神経細胞数の低下が有意に抑制され,腰髄においても抑制傾向がみられた.胸髄では,神経細胞の保護効果は見られなかった.さらに, 8-OH-DPAT投与により, MTを発現しているGFAP陽性活性化アストロサイトの割合が,頸髄および腰髄の前角において有意に増加していた.本研究により, 8-OH-DPATはALSモデルマウスの頸髄・腰髄において運動神経保護効果を発揮することが明らかになった.また, 8-OH-DPAT投与によるアストロサイトにおけるMT発現誘導が,運動神経保護効果に関与する可能性が示唆された.神経薬理化学本年度は,筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウスを用いた行動学的検討により,8-OH-DPAT投与の発症遅延効果および進行抑制効果を明らかにすることができた.本年度は,セロトニン神経作用薬のなかでも,8-OH-DPATがアストロサイトの抗酸化機構に対して有意な賦活化作用を有し神経保護効果を発揮すること,さらにその保護効果のメカニズムを明らかにできた.また,筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスを用いて8-OH-DPATの発症遅延効果,進行抑制効果を評価する研究に先立ち,投与時期,投与量,評価法などを設定するための基礎検討を行い,モデルマウスへの投与実験を開始することができた.筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスにセロトニン1Aレセプターフルアゴニスト8-OH-DPATの発症前および発症後からの連日投与を行い行動学的に発症遅延効果および進行抑制効果がみられた検討において経時的に取り出した脊髄切片を用いて,脊髄運動神経の変性,アストロサイトの抗酸化分子およびグルタミン酸トランスポーターの発現変化を評価し,8-OH-DPATの発症遅延効果,進行抑制効果と組織学的な運動神経障害との関係について検討する.また,G93Aマウス脊髄からの運動神経+アストロサイト共培養系を作製し,運動ニューロン細胞死に対する8-OH-DPATの保護効果を検討する.筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスのヒトSOD1G93A mutanttransgenic mice (G93A)を用いて,セロトニン1Aレセプターフルアゴニスト8-OH-DPATの発症前からの連日投与および発症後からの連日投与を行い,発症時期,生存期間,罹病期間,運動障害,脊髄運動神経の変性,アストロサイトの抗酸化分子およびグルタミン酸トランスポーターの発現変化を評価し,8-OH-DPATの発症遅延効果,進行抑制効果について検討する.また,G93Aマウス脊髄からの運動神経+アストロサイト共培養系を作製し,運動ニューロン細胞死に対する8-OH-DPATの保護効果を検討する.次年度に行う予定にしていた培養実験を初年度に先に行ったために,動物実験に必要として計上していた経費の一部にあたる345,695円を次年度に使用することとなった.次年度平成26年度の請求研究費とあわせて,動物実験,培養実験のための消耗品費として使用する予定である.
広帯域計量魚群探知機による駿河湾のサクラエビの資源量調査手法の開発

本研究の目的は,広帯域音波を使用した計量魚群探知機によるサクラエビの資源量調査手法を開発することである。そのために,平成30年度は以下の3項目について研究を行った。1)小型広帯域送受波器を使用したターゲットストレングス(TS)スペクトル測定システムの構築:送受波器の性能評価を大型水槽で実施した。送信・受信感度の周波数特性を測定した結果,変動が見られたがおおむね20200 kHzに使用可能な周波数帯があった。感度の変動はTSスペクトル測定において誤差要因となる。そこで,感度の周波数特性を平坦にするため,振幅を変調した送信波形を作成した。次に,使用予定の小型水槽(1 m立法)にアルミ製フレーム等を使用して送受波器をセットアップした。また,測定対象の懸垂位置の決定を容易にするため,ラインレーザーを2方向から照射できるようにした。標準球による測定システムの較正まで実施可能となった。2)理論音響散乱モデルに必要なサクラエビの密度比・音速比の測定:密度比と音速比の測定方法(Density bottle法,Time-of-flight法)をそれぞれ確立・習得し,サクラエビに対して初めての測定に成功した。密度比はオキアミ類に近い値を示したが,音速比は非常に高い値を示した。音速比については測定誤差が大きかったと考えられた。3)広帯域計量魚群探知機と小型フレームトロールを使用したサクラエビの観測:駿河湾焼津沖における調査を9月下旬に東京海洋大学練習船神鷹丸で実施した。昼間にサクラエビらしき音響的特徴を有したエコーを計量魚群探知機で捉えることに成功した。夜間に表層へ移動したエコーに対してトロール曳網した結果,サクラエビが多量に採集された。以上から,昼間に観測したエコーはサクラエビのものであったと結論付けた。TSスペクトル測定システムの構築については進捗状況に遅れがある。小型水槽を利用することにより壁面,底面からの不要反射波によって測定誤差が大きく,この解決に時間を要しているためである。TSスペクトル測定システムの構築がやや遅れているので,令和元年度は引き続き研究を行って測定誤差に関する問題を解決し,さらに生きたサクラエビのTS測定を実施する。この他には昨年度と同様に理論音響散乱モデルに必要なサクラエビの密度比・音速比の測定,広帯域計量魚群探知機と小型フレームトロールを使用したサクラエビの観測を行って,資源量調査手法に必要な知見を蓄積する。そのために,平成29年度は以下の2項目について研究を行った。1)小型水槽を使用したターゲットストレングス(TS)スペクトル測定システムの構築研究代表者がすでに開発した積層圧電アクチュエータ(素子)を使用した広帯域送受波器を,小型水槽(1 m立法)でのTS測定に使用できるよう再設計した。従来の広帯域送受波器は52個の素子を使用して1つの送受波器を構成していたが,素子9個からなる送波器と受波器をそれぞれ構成することとした。送受を分離し,使用する素子数を少なくしてビーム幅を広げることで(120 kHzにおいて,6.6°から17.0°へ拡大),近距離でのTS測定に最適な送受波器の設計とした。当初の計画よりも設計に時間を要したため,TSスペクトル測定システムの構築までは行えなかった。平成30年度も引き続き研究する。2)音響理論散乱モデルに必要なサクラエビの体形状の測定生きたサクラエビを多く入手することは容易ではないので,小型水槽での測定実験だけではさまざまな体長のサクラエビのTSスペクトルを十分に明らかにできない。そこで,音響理論散乱モデルによる理論計算を行って実測を補うこととした。理論計算に必要なパラメータとして,サクラエビの体形状がある。漁期中に水揚げされた一部を測定サンプルとし,電子ノギスにより体長,体幅,体高を測定した。その結果,体形状は楕円体に近似でき,体高と体幅の体長依存性は線形的であることを明らかにした。また,音響理論散乱モデルによる理論計算を可能とした。密度比,音速比,遊泳姿勢角などのパラメータは,平成30年度以降に明らかにしていく。これは,送受波器の設計を進める段階で,より最適な設計アイデアが生まれ,当初の予定より設計に時間を要したためである。

2)理論音響散乱モデルに必要なサクラエビの密度比・音速比の測定:密度比と音速比の測定方法(Density bottle法,Time-of-flight法)をそれぞれ確立・習得し,サクラエビに対して初めての測定に成功した。密度比はオキアミ類に近い値を示したが,音速比は非常に高い値を示した。音速比については測定誤差が大きかったと考えられた。3)広帯域計量魚群探知機と小型フレームトロールを使用したサクラエビの観測:駿河湾焼津沖における調査を9月下旬に東京海洋大学練習船神鷹丸で実施した。昼間にサクラエビらしき音響的特徴を有したエコーを計量魚群探知機で捉えることに成功した。夜間に表層へ移動したエコーに対してトロール曳網した結果,サクラエビが多量に採集された。以上から,昼間に観測したエコーはサクラエビのものであったと結論付けた。TSスペクトル測定システムの構築については進捗状況に遅れがある。小型水槽を利用することにより壁面,底面からの不要反射波によって測定誤差が大きく,この解決に時間を要しているためである。TSスペクトル測定システムの構築がやや遅れているので,平成30年度も引き続き研究を行うこととする。この他に平成30年度は,理論音響散乱モデルに必要なサクラエビの密度比・音速比の測定,広帯域計量魚群探知機と小型フレームトロールを使用したサクラエビの観測,を行う。TSスペクトル測定システムの構築がやや遅れているので,令和元年度は引き続き研究を行って測定誤差に関する問題を解決し,さらに生きたサクラエビのTS測定を実施する。この他には昨年度と同様に理論音響散乱モデルに必要なサクラエビの密度比・音速比の測定,広帯域計量魚群探知機と小型フレームトロールを使用したサクラエビの観測を行って,資源量調査手法に必要な知見を蓄積する。
感染細胞内でのインフルエンザウイルス遺伝子の持続の様式とその機能に関する研究

インフルエンザウイルスA/WNSから、MDBK細胞に対する破壊能の弱い変異株AWBY-140を分離、これのMDBK細胞への多重感染と、生き残った細胞の継代を反複することによって、MDBK-RR細胞株を樹立した。細胞からは、ウイルスの排出は認められなかった。この細胞を用いてインフルエンザウイルスの潜伏感染を研究し、次の点を明らかにした。1.MDBK-RR細胞からRNAを抽出、インフルエンザウイルスRANの3'端に共通の基配列をもつ合成オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとしてDNAに変換、ついでインフルエンザウイルスの各遺伝子に特異的な合成プライマーを用いたPCRによって塩基配列の増幅をはかったところ、8種の遺伝子のすべてが検出された。このことは、細胞内にウイルス遺伝子のすべてが存在していたことを証明するものである。2.細胞内には、ウイルスRNA以外に、これと相補的なcRNA,mRNAも検出された。3.細胞内にあるMおよびNS遺伝子は、全長にわたって欠損がないことを明らかにした。但し、これらの遺伝子のいくつかのクローンについて、その塩基配を調べたところ、さまざまの部位に点変異をおこしていた。4.細胞内に存続しているウイルス遺伝子のコピー数を、競合的PCR法によって定量したところ、細胞2-6個あたり1コピーという値がえられた。この値は、細胞継代数の増加によって変らなかった。細胞内にmRNA,cRNAの両方とも検出されたという上記の所見とあわせて、細胞内のウイルス遺伝子は、増幅しながら潜伏しているものと思われる。インフルエンザウイルスA/WSNとB/山形との交配によって、M遺伝子に変異をもち、MDBKおよびMDCK細胞に対する細胞融解能の極めて弱いA/WSNの変異体AWBY-140を分離した。そして、AWBY-140のMDBK細胞への多重感染と生き残った細胞の継代を繰り返すことによって、ウイルスの感染は許すが、感染によって死滅することなく正常に増殖を続けるMDBK細胞株(MDBK-R)を樹立した。こうしてできたMDBK-R細胞に100PFU/cellのAWBY-140ウイルスを感染させ、以後通常の方法で継代を続けた。ウイルスの産生は、3代以降は認められなかった。1.25代継代した細胞(MDBK RR-25)内に、FB1,FB2,PA,HA,NA,NP,M,NSのウイルスの全遺伝子に特異的な塩基配列が、遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR法によって検出された。また、RR-27細胞内には、ウイルスのM遺伝子と相補的なRNA(cRNA)、およびそのmRNAも検出された。このことは、ウイルス感染によって細胞が死にさえしなければ、インフルエンザウイルスの遺伝子は単独で、ウイルスの産生なしに長期間細胞内に存続しうること、及び遺伝子は恐らく複製しながら存続しているであろうことを示唆している。2.M及びNS遺伝子について、存続している遺伝子はその全長に及んでいて欠損がないか否かを調べるために、それぞれの遺伝子の5'及3'端の特異的なプライマーを用いたPCRによって、塩基配列の増幅をはかったところ、RR-20から期待値通りの塩基数のDNAが増幅された。これらをプラスミドpUC19でクローニングし、それぞれの遺伝子について5クローンを選択してその塩基配列を決定したところ、潜伏遺伝子はいくつかの点変異を有していた。インフルエンザウイルスA/WNSから、MDBK細胞に対する破壊能の弱い変異株AWBY-140を分離、これのMDBK細胞への多重感染と、生き残つた細胞の継代を反復することによって、MDBK-RR細胞株を樹立した。細胞からは、ウイルの排出は認められなかった。1.MDBK-RR細胞からRNAを抽出、インフルエンザウイルスRNAの3'端に共通の基配列をもつ合成オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとしてDNAに変換、ついでインフルエンザウイルスの各遺伝子に特異的な合成プライマーを用いたPCRによって塩基配列の増幅をはかったところ、8種の遺伝子のすべてが検出された。このことは、細胞内にウイルス遺伝子のすべて存在していたことを証明するものである。

2.細胞内には、ウイルスRNA以外に、これと相補的なcRNA,mRNAも検出された。3.細胞内にあるMおよびNS遺伝子は、全長にわたって欠損がないことを明らかにした。但し、これらの遺伝子のいくつかのクローンについて、その塩基配を調べたところ、さまざまの部位に点変異をおこしていた。4.細胞内に存続しているウイルス遺伝子のコピー数を、競合的PCR法によつて定量したところ、細胞2-6個あたり1コピーという値がえられた。この値は、細胞継代数の増加によって変らなかった。細胞内にmRNA,cRNAの両方とも検出されたという上記の所見とあわせて、細胞内のウイルス遺伝子は、増幅しながら潜伏しているものと思われる。
「言葉と音楽とのつながり」に着目した、声による表現学習の研究

1研究目的我が国や世界の諸地域における様々な「歌」は、言葉と音楽とが密接なかかわりをもって形づくられており、その成り立ちにおいて両者を別々のものとして切り離して考えることはできない。本研究においては、言葉と音楽とをつなぐものとしての「声」に着目し、教科の枠組みを超えて、声による表現力を磨く学習を構想していくことを目的とする。2研究方法(1)文献研究を行い、各地の中学校における学習指導案、研究紀要、研究論文等の資料から指導計画の実際について考察したり、各地の中学校における音楽授業を参観し、単元構成の有効性について考察したりした。(2)研究内容の一部を取り入れた授業実践を近隣の学校に依頼したり、本校での研究成果を研修会等で紹介したり、本校での研究成果を研修会等で紹介したりすることで、地域の学校と連携を深めながら研究を進めた。(3)我が国の伝統的な音楽(筝曲,長唄、能等)や世界の諸地域の音楽(オルティンドー等)に関する講習会に参加し、演奏体験を重ねていくなかで文化的な背景についての理解を深めたり、演劇や詩に関する指導法を研究するためにワークショップに参加して朗読の技能を習得したりした。3研究成果歌に限定しない声の表現(例えば金魚売りや物干竿売りが行う「口上」や相撲の呼出が行う「呼び上げ」のように、独特の節回しや発声の仕方で表現するもの)や世界の諸地域の「コブシ」を伴う歌唱曲(オルティンドー、シキムセ、ゴスペル等)について調査・検討したことにより、教材として相応しいものを発掘することができた。また、音楽授業の中に「曲種に応じた発声」を取り入れ、継続的に指導を重ねていくことにより、生徒の表現力が高まり、音楽的な成長が見られた。
耐熱金属材料上への活性金属酸化物被履

実用耐熱合金,特に高温耐酸化性の優れたNi-20Cr-1SiおよびNi-20Cr-1Si-0.3Ce合金さらにY_2O_3,CeO_2,Al_2O_3およびSiO_2などの活性金属酸化物をSputteringにより約100nm被履したNi-20Cr-1Si合金のBr_2-O_2-Ar雰囲気における高温腐食(腐食温度;1073K,腐食時間;3.6Ks,臭素分圧9kPa,酸素分圧;5kPa,Arを加えて101kPa)を行い,つぎの結果を得た。2.SEM観察よりNi-20Cr-1SiおよびNi-20Cr-1Si-0.3Ce合金上に生成した腐食スケールはおおむね微細な粒状形態を示し,合金粒界三重点上で盛り上がり,その領域でクラックが認められた。このクラック起点として腐食スケールの剥離が冷却過程で生じるのであろう。これらの合金ではスケールの下地でも角錐状のスケールが観察された。このことはスケールの成長がスケール/合金界面でも生じていたことを示唆している。一方,Y_2O_3-およびSiO_2-被履Ni-20Cr-1Si合金表面では腐食スケールの生成も僅かであり,スケールの剥離はほとんど認められなかった。3.合金表面に生成したスケールはいずれの合金でもCr_2O_3が支配的であり,NiOも微量認められた。4.SiO_2-被履Ni-20Cr-1Si合金では高温腐食後合金表面に黒点が点在した。これはEPMAによるX線像観察よりSiO_2であると考えられる。
原因不明リソソーム病の遺伝子クローニング

原因不明だが、細胞内にリソソーム由来と考えられる封入体が認められる病気や変性疾患でリソソーム酵素の関与を思わせる疾患は多い。疾患は異なってもリソソームの酵素異常であれば、原因欠損酵素は変異によりレセプター結合能を失っていることが考えられる。そこで、レセプターの用いて変異タンパクの同定が可能かを今年度は検討した。牛肝臓よりマンノース6リン酸レセプターを精製を試みた。しかし、この材料では、今回の研究に十分な量のレセプターを得ることができなかった。そこで、牛胎児肝臓を材料に精製をおこない、十分量のレセプターを得ることができた。胎児肝は、マンノース6リン酸レセプターが多く発現している臓器であると考えられ、今後のレセプターの供給源として有用であることが示された。また数種のGM1ガングリオシドーシス患者変異遺伝子タンパクを検討して、本研究方法が変異タンパクの同定に有効であるかを検討した。多くの患者変異タンパクは分泌タンパクとして分泌しなかった。また頻度的に多い成人型の変異タンパクは分泌されるがリン酸化されない変異遺伝子であった。これは、レセプターを用いた変異遺伝子の同定が可能であることをしめす。しかし、モルキオB病と日本人幼児型変異遺伝子では前駆体は分泌タンパクはリン酸化されており、今回の研究システムでは、変異タンパクの同定はできないことも分かった。以上より、遺伝子変異を起こしている他の異常リソソームタンパクにおいてもレセプターとの結合能を失う可能性が高いことが考えられ、今回の検索方法で変異タンパクの同定が同定される可能であること思われた。しかし、同じ疾患であっても遺伝子変異によっては、今回の方法では変異タンパクの同定ができない例もあることがわかり、複数の症例を検討する必要があると考えられた。
におい源探知システムの研究

場の風向及び濃度勾配を検出してにおい源の探知を行う方法を用いて、以前の実験により風洞及びクリーンルームにおいてその探知実験に成功している。平成7年度は、探知時間の高速化を図った。今まで用いていた半導体ガスセンサは応答速度、応答回復速度が遅いといために、移動台車の速度を上げると追従できないという問題点があった。応答速度の速いセンサは、風が少し強くなると応答が不安定になる。そこで、センサは従来のものを用いてカルマンフィルタ理論を用い速い半導体センサの応答を推定することを行い、センサの動作速度を向上させた。その結果、台車速度を従来の3倍に上げて探知を行うことに成功した。上記のシステムは自動測定システムであるが、人間が持ち歩いて探索するツールとして、能動サンプリング方式によるにおいコンパスを試作した。このコンパスは常ににおい源の方位を指し示すもので、2次元、3次元のコンパスの試作に成功した。さらに、適応制御理論を組み合わせることにより、高速ににおい源の方向に向きを変えることができる2次元コンパスを実現できることがわかった。センサとして理想的な感度、応答速度をもつのは、生体感覚器であろう。そこで、カイコガの触角の電位(EAG)を測定し、それと能動サンプリング方式を組み合わせてフェロモン源の方向を推定する基礎的研究を行い、方向探知能力があることを確かめた。
希土類金属化合物触媒による新規な重合反応の開発

希土類金属錯体のイオン性、立体化学を制御して、ビニルケトンや、シリル、アルキルビニルエーテルの立体特異的リビング重合触媒を開発することを第一の目的とした。ランタニドトリフラートがビニルケトンの重合に対して活性を示したが再現性に乏しかった。ランタニドアルコラートや、トリフラートを用いる反応では、これらモノマーがテトラヒドロフランなどの溶媒中で重合することを見いだしたが、重合度の制御にまでは至らなかった。しかし、この反応は、カチオン重合に重要な知見を提供すると思われるため、安定な錯体を合成するために、新たに、ヘキサ(ペンタフルオロフェニル)ホスフェートを対イオンとする錯体の研究を続行中である。希土類金属化合物の含シリコン化合物との反応の解明を第二の目的とした。チタノセンやジルコノセンがシランの脱水素カップリングに有効な触媒となることを見いだすことができた。この反応を用いて両末端に種々の2官能性のシラン化合物より重合度が低いながらもポリマーを合成することができた。特に、芳香族系のジシランの反応は、新規な導電性ポリマーなどを与える可能性があり、研究をさらに継続している。また、官能基を同一シリコン原子上にもつ化合物からは、枝分れ型のポリマーを合成できることが分かった。これらの研究の過程で、パラジウムなどの貴金属の触媒作用が顕著であることが認められたので、これら金属とランタニド金属との違いについても検討した結果、ランタニド金属の活性は必ずしも高いものでないことが分かった。
「福祉地理学」の構築と「持続可能な福祉コミュニティ」に関する研究

本調査研究は、福祉の分野に「地理」あるいは空間(ないし場所、土地)の視点を導入するとともに、「持続可能な福祉コミュニティ」とも呼ぶべきモデルを構想していくことを内容としている。こうした問題意識を踏まえ、全国の自治体を対象とする「地域再生・活性化に関するアンケート調査」を実施し、特に「都市政策と福祉政策の統合」、地域内経済循環、成長・拡大志向と定常化志向、地域の自立と再分配といった観点から分析を行い、今後の政策の基盤となる考察や提言をまとめた。これまでの福祉研究は、概して普遍的ないし一般的な「福祉」概念が基礎に置かれ、あらゆる場所を貫通して一義的な「福祉」概念が妥当するものと考えられる傾向があった。しかしながら、たとえば郊外のニュータウンと、伝統的な人間関係が濃密に残る下町(旧市街地)とでは、自ずとそこで求められる「福祉」(たとえば高齢者介護サービスのあり方、コミュニティ形成のための方策)も異なってくるのはないか。したがって、福祉の分野に「地理」あるいは空間(ないし夢所、土地)の視点を導入し、新たな統合を図っていくことが、これからの福祉を考え政策展開を行っていく場合に重要となる。以上のような問題意識を踏まえ、平成20年度においては、(1)「福祉地理学」という新たなコンセプトに関する吟味を行い、福祉政策と都市政策、土地政策等の融合に向けた基本的な枠組みを整理するとともに、(2)「福祉と環境の統合」を通じた「持続可能な福祉コミュニティ」という新たなコンセプトとその内容の定式化・深化に向けた概念整理等を実施し、また若干のデータ整理を行った。本調査研究は、これまでの「福祉」概念が概して普遍的かつ「場所」を超越したものとして想定される傾向が強かったのに対し、たとえば郊外のニュータウンと、伝統的な人間関係が濃密に残る下町(旧市街地)とでは、自ずとそこで求められる「福祉」(たとえば高齢者介護サービスのあり方、コミュニティ形成のための方策)も異なる面を有するのではないかという問題意識に立ち、福祉の分野に「地理」あるいは空間(ないし場所、土地)の視点を導入するとともに、「持続可能な福祉コミュニティ」とも呼ぶべきモデルを構想していくことを内容としている。平成21年度においては、特に都市政策と福祉政策の統合という問題意識を踏まえた研究成果の一部を広井良典『コミュニティを問いなおす』(筑摩書房)として公刊するとともに、特に地域経済や地域再生との関連を視野に入れ、検討している自治体アンケート調査の基礎となる概念的な枠組みの整理を行った。こうした問題意識を踏まえ、平成22年度においては全国の自治体を対象とする「地域再生・活性化に関するアンケート調査」を実施し(対象は(1)全国市町村の半数(無作為抽出)及び政令市・中核市・特別区で計986団体、(2)全国47都道府県に送付し、(1)については返信数597(回収率60.5%)、(2)については返信数29(回収率61.7%)、特に「都市政策と福祉政策の統合」、地域内経済循環、成長・拡大志向と定常化志向、地域の自立と再分配といった観点から分析を行い、今後の政策の基盤となる考察や提言をまとめている。特に、(1)大多数の市町村が「成長・拡大」よりも「定常型」の地域社会モデルを志向していること、(2)ローカル化とグローバル化という二つの方向については自治体の規模によって差が見られること、(3)地域における優先課題は大都市圏、地方都市、農村部で大きな違いがあること、(4)高福祉・高負担か低福祉・低負担かという選択を今後は自治体において議論していく必要があること、(5)地域の「自立」のためには、大都市と地方・農村部の間にある不等価交換的な構造を是正すべく何らかの再分配政策が求められるべきこと、等の点が分析と考察の結果得られた知見である。これらの結果は今後の地域再生・活性化政策のみならず、震災を受けた後の日本社会における地域コミュニティのあり方や政策立案においても意義を有するものと考えられる。
トゲウオ淡水進出の鍵形質の遺伝基盤

本研究室に存在するイトヨの全集団のddRAD解析を実施し、これまでに本研究室で採集した全ての淡水イトヨは、ニホンイトヨ系統でなく、イトヨ系統から由来していることを確認した。ついで、ある不飽和脂肪酸代謝酵素のコピー数がイトヨにて高いこと、当該遺伝子発現量もイトヨにて高いこと、ある不飽和脂肪酸合成能力もイトヨで高いことを見出した。そこで、淡水餌からの不飽和脂肪酸合成能力の違いが、淡水進出能力を規定していると考えられた。日本と北米とヨーロッパのトゲウオ試料を集め、これらよりDNAを精製した。これらについて定量PCR法にてfads2のコピー数変異を解析した。その結果、淡水化に伴ってfads2のコピー数が上昇する傾向を複数の独立した系統で観察した。また、日本の太平洋イトヨについて、多価不飽和脂肪酸合成酵素を含むfosmidを同定し、シークエンスを実施した結果、当該fosmidは染色体19番(X染色体)由来であることが明らかになった。さらに参照配列(アラスカ湖産)と配列を比較したところ、一部、配列の異なる領域も見つかっており現在詳細な解析を実施中である。また、淡水進出に伴って変化する甲状腺刺激ホルモンの解析のためにイトヨの下垂体を太平洋集団のイトヨから採取し、高い生存率を保って細胞を分離する方法を見いだした。これはトリプシンとEDTAを用いたものである。その結果、イトヨの下垂体の多くの細胞のサイズが直径10 um以下と小さいことが明らかになった。その後、Fluidigm C1を用いてcDNAを合成した。これらcDNAのいくつかについて、下垂体に発現するホルモンの遺伝子の複数について定量PCRを実施した結果、PRL産生細胞などに加えて、TSHB2発現細胞も確認できた。さらにこれらを次世代シークエンサーで解析し、下垂体のTSH産生細胞のキャラクタライズに成功した。すでに不飽和脂肪酸代謝の違いが淡水進出に果たす役割について、海外のトゲウオ集団、並びに近縁のカジカなどでの検証でも実施し、最初の論文執筆に取りかかれる状況になったから。また、トランスジェニクの系統樹立にも既に成功しているから。さらに、下垂体の一細胞解析に成功したが、下垂体の一細胞解析はトゲウオに限らずこれまでに世界で実施された例はないと考えられるから。未開拓の新規ニッチへの進出は、新しい豊富な資源の利用を可能にし、その後の適応放散を誘導しうる。また、新規ニッチを利用可能にする形質が生殖隔離にも貢献する場合、祖先集団と新規集団の間で交雑率が低下し、多様性が維持されうる。しかし、新規ニッチへの進出の鍵となる形質の遺伝基盤について、実際の野外集団で解明された例は極めて少ない。本課題では、申請者がこれまで詳細に記載してきた日本産トゲウオにおいて、多様な淡水域に進出して表現型多様化を遂げた系統と淡水に進出できず均一な表現型にとどまった系統を利用して、その背景にある淡水餌資源の利用能力の違いの鍵となる遺伝基盤、及び、その鍵遺伝子と生殖隔離との関連性について、遺伝子操作、連鎖マッピング、集団ゲノミクス、半野外生態実験、配偶行動実験などを駆使して解明する。本年度は、淡水実験池に太平洋イトヨと日本海イトヨの雑種を放流した。また、日本海イトヨと太平洋イトヨが同所に生息している交雑域において、遺伝子浸透の低下しているゲノム領域を特定し、不飽和脂肪酸の合成酵素のローカストの一致を検証した。また、分類群を超えた共通性の検証として、淡水進出した淡水型トミヨと淡水進出しなかった汽水型トミヨ、ハゼやカジカなどについても不飽和脂肪酸の合成酵素を解析した。当初の予定どおり、淡水池の実験を開始することができ、また、別分類群の解析結果も得たから。これらの成果は平成29年度中に論文投稿予定であるから。本課題では、申請者がこれまで詳細に記載してきた日本産トゲウオにおいて、多様な淡水域に進出して表現型多様化を遂げた系統と淡水に進出できず均一な表現型にとどまった系統を利用して、その背景にある淡水餌資源の利用能力の違いの鍵となる遺伝基盤を同定した。具体的には、不飽和脂肪酸合成酵素のコピー数変異が鍵となることを見出し、多くの実証データを蓄積し、論文準備中である。これまでの成果をひとまず論文にまとめる。fads2のトランスジェニクイトヨとTHSB2のノックアウトイトヨを利用して行動や生殖などの表現型への影響、および、環境適応能力についての検証実験を実施する。まず、不飽和脂肪酸の合成酵素のコピー数変異、および、遺伝子浸透の成果に関して早々に論文化する。

淡水実験池に放流した雑種の生存率のマッピングを行うことで、不飽和脂肪酸の合成酵素の役割を解明する。系統化したトランスジェニックを利用して行動解析を実施する。29年度が最終年度であるため、記入しない。進化遺伝29年度が最終年度であるため、記入しない。
各種ヒト胎盤アミノペプチダーゼの生理的意義

本研究では陣痛発来機序や妊娠中毒症の病因など妊娠の生理・病態のメカニズムをペプチドホモンと胎盤プロテアーゼの相互関係から解明することを目指している。[基礎的研究]P-LAPの新たな生理作用として、胎児が分泌する脳消化管ホルモンの一つのソマトスタチン分解を介して、胎児発育調節因子として働く可能性を見出した。2.胎児に存在するオキシトシン、バゾプレシンの分解酵素(オキシトシナーゼ)はP-LAPであることを明らかにした。3.胎盤に存在するアンジオテンシンIIの分解酵素(アンジオテンシナーゼ)はアミノペプチダーゼAとアミノペプチダーゼN(AP-N)であることを明らかにした。4.AP-Nがタフトシン、サイモペンチン、スプレノペンチンなどの免疫調節ペプチドを強力に分解することを見出した。AP-NはCD13と同一の物質である。従ってAP-Nの妊娠時の免疫調節因子としての関与が示唆された。ブラジキニン分解酵素の一つと考えられている胎児アミンペプチダーゼPの酵素学的諸性質を明らかにした。6.P-LAPの構造を分子レベルで明らかにした。P-LAPは944個のアミノ酸より構成されるII型の膜結合蛋白質であることが判明した。[臨床的研究]1.アミノペプチダーゼPの妊婦血中動態を明らかにした。2.過期妊娠・切迫早産におけるP-LAPの動態を明らかに、これら病態におけるP-LAP活性測定の臨床応用の可能性を明らかにした。3.正常妊婦血中P-LAP活性と臍帯動脈パルスドプラーS/D比との関係を明らかにし、妊婦血中P-LAP活性は臍帯動脈の血管抵抗(S/D比)を反映していることを見出した。P-LAPが胎児が分泌するバゾプレシンを分解を介して、胎児胎盤循環調節にも関与することが示唆された。(1)我々が長年検討している胎盤アミノペプチダーゼN(AP-N)がCD13と同一物質であることが見い出され、免疫学の分野からもAP-Nは近年注目されている。しかしながら本酵素の生理的基質は未だ不明確である。我々の研究によって、AP-Nは免疫調節ペプチドSplenopentin,Thymopentin,Thymic humoralu factor γ2,Tuftsin,Rigin,を分解・不活化することが明らかになった。さらにAP-Nは、Met-enkephalin,Somatostatin,Neurokinin A,Lysyl-bradykinin,Angiotenshin IIIなども分解・不活化する。従ってヒト胎盤AP-Nは、胎児・胎盤系における血管作動ペプチド、神経ペプチド、さらには免疫調節ペプチドを代謝・分解・不活化することにより、妊娠の生理・病態へ関与することが示唆された。(2)ブラジキニン分解・不活化酵素の一つである胎盤アミノペプチダーゼPの酵素学的諸性質を明らかにし、また妊婦血中のアミノペプチダーゼPの動態を明らかにした。(3)オキシトシン、バゾプレシン、を分解・不活化するP-LAPのクローニングを現在行なっている。1.本研究の主要テーマであった胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP)の構造を遺伝子レベルで明らかにした。すなわち胎盤後血より精製し、得られたアミノ酸配列をもとに、そのcDNAを取得することに成功した。その結果、本酵素は944個のアミノ酸より構成される、II型の膜結合蛋白質であることが明らかとなった。ざらに本酵素の発現部位をノーザンブロット法により解析した結果、胎盤のみならず、心臓や筋肉にも発現していることを見出した。

従って本酵素は、妊娠の維持のみならず、他にも何らかの重要な機能も有するものと考えられる。2.胎児は、成長ホルモン、インスリンの他にソマトスタチンやグルカゴンなどの脳消化管ホルモンを分泌し、これらペプチドは胎児発育調節因子としての重要性が示唆されている。In vitro実験ではあるが、胎盤に存在するソマトスタチン分解酵素はP-LAPであることを明らかにした。ソマトスタチン分解を介して、P-LAPが胎児発育調節因子として働く可能性を見出した。3.P-LAPが胎盤に存在するオキシトシン及びバゾプレシン分解酵素あることをIn vitroで明らかにした。4.切迫早産患者のP-LAP活性(オキシトシナーゼ)の動態を検討し、切迫早産では血中P-LAP活性が、正常妊娠と比べ減少していることを見出した。従って切迫早産の病因の一つとして内因性オキシトシンのクリアランスが減少することによって、オキシトシン作用が増強し、妊娠子宮が収縮傾向になることが示唆された。5.正常妊婦血中P-LAP活性と臍帯動脈パルスドプラーS/D比との間に有意な相関を見たことから、胎児が分泌するバゾプレシンやオキシトシンを胎児に存在するP-LAPが分解を介して、それらペプチドの濃度を調節し、胎児・胎盤循環の調節因子として働く可能性を見出した。
環境ストレス応答遺伝子エレメントの探索とその応用

自然環境には生物に対して多くのストレス要因が存在する。それらは、温度、浸透圧、紫外線、圧力等の物理的な環境ストレスがあるが、近年では様々な化学物質もストレスの要因となっている。微生物は、これらのストレスに遺伝子レベルで敏感に応答することによって生体の維持を行っている。これらの環境からのストレスに対する応答を司るエレメントの探索を目的とした。初年度は、海洋シアノバクテリアSynechococcus sp.の小断片ゲノムライブラリーの構築を、海洋シアノバクテリアを直接宿主として構築することを試みてきた。しかしながら、シアノバクテリアへの遺伝子導入効率が低いために十分なライブラリーの構築を行うことが困難であることが示唆された。これらのことから、次年度は、まず遺伝子導入効率が高い大腸菌を宿主として、海洋シアノバクテリアSynechococcus sp.の網羅的なゲノムライブラリーの構築を目指した。その際に使用するベクターとしてシアノバクテリアで複製可能で且つ、クローニングされるエレメント断片の下流にレポーター遺伝子としてluxABを配置したものを作製した。このベクターを用いて大腸菌で海洋シアノバクテリアSynechococcus sp.の小断片(0.52.0kb)のゲノムライブラリーの作成を試みた。その結果、作成したゲノムライブラリー2000クローンのうちから、任意に84クローンに対して挿入されているエレメント長を調べたところ、0.52.0kbの断片を含むものは全体の25%程度であり、残りは目的としている断片より短い断片が挿入されていることが認められた。また、今回作成したベクターを用いて環境応答エレメント検索の評価を行うために、挿入された断片がプロモーター活性を有するかをレポーター遺伝子であるluxABによる発光を測定した。その結果、20%のクローンについてプロモーター活性による発光が確認された。このことから、本ベクターを用いることにより環境応答エレメントの探索が可能であることが示唆された。それには、温度、浸透圧、紫外線、圧力等の物理的な環境ストレスがあるが、最近では、様々な化学物質もストレス要因となっている。微生物は、これらのストレスに遺伝子レベルで敏感に反応する事によって生体の維持を行っている。海洋は、陸水に比べて多様性に富んだ環境が存在し、そこにはそれらの環境に適応進化して来た様々な生物が生息している。特に、海洋微細藻類は、海洋バイオマスの大部分を占めており、遺伝的にも多様な種が存在する。微細藻類の一種でもあり、原核生物として位置づけられる藍藻(シアノバクテリア)は、高等生物と同様な光合成系を有しており、かつ細菌としての形態を持つことより様々な遺伝子解析のモデルとして利用されて来た。本年度は、このような海洋藍藻における各ストレス応答遺伝子エレメントのスクリーニングとタイピングを目的として、海洋藍藻Synechococcus sp.の小断片ゲノムライブラリーを構築し、プロモーター活性を有するDNAエレメントの検索を行った。Synechococcus sp.NKBG042902は広範囲の塩濃度に適応し生育するが、これより塩濃度に対応して発現制御を行うたのDNAエレメントが検索された。しかし、海洋藍藻を直接的に宿主とした場合、大腸菌を用いる場合より形質転換頻度が非常に低く、効率的なエレメントスクリーニングが難しいことが示唆された。そこで、小断片化ライブラリーをいったん大腸菌で構築し、それらをグルーブ化し、大量に調整して藍藻を宿主としてスクリーニングを行うこととした。それらは、温度、浸透圧、紫外線、圧力等の物理的な環境ストレスがあるが,近年では様々な化学物質もストレスの要因となっている。