hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分光光度法による配位子の競合反応を利用した錯形成平衡解析

金属に対して,呈色錯体(MLn)と無色錯体(MA)を形成する二種の配位子(L,A)を競合させ,呈色錯体の吸光度の変化を測定して錯体種の解析を行った.新たに購入した分析用電子天秤やpHメータは,高感度呈色試薬の微量秤量や酸解離定数の決定などに用いられた.以下にその結果を報告する.1.希土類元素と2-(2-チアゾリルアゾ)-4-メチルフェノール(TAC,L)および18クラウン6(18C6,A)との錯体.実験は, [H^+]とイオン強度を一定としたメタノール溶液を用い1:1錯体, MLを生成する条件([M]>[L])で, L,Aの競合反応を行わせた. [A]の変化に伴う1/K_<ML'>(KML'=MLの条件生成定数)をプロットした結果, MA(1:1)錯体の生成を確認し,直線の切片と傾斜から各錯体の生成定数K_<MA>,KML'を求めることができた.KML'の値は,別にし単独の条件で求めた値とよく一致し,本法の妥当性を示した.またKMAは,希土類の原子番号の増加とともに減少することから,呈色試薬による希土類の個別定量において, 18C6が有効なマスキング剤となる可能性を示した.(分化第36年会講演). 2.亜鉛および希土類元素の2-(5-ブロモー2-ピリジルアゾ)-5-(N-プロピルー3-スルホプロピルアミノ)フェノール(5-Br-PAPS,L)錯体.高感度呈色試薬である5-Br-PAPS(L,ε_<ZnL2>=1.3×10^5M^<-1>cm^<-1>)に対して,競合する配位子(A)としてZnの場合ニトリロトリ酢酸(NTA)を,希土類の場合イミノジ酢酸(IDA)とシュウ酸とを用いた.実験は, [L]≫[M]の条件で[A]の増加に伴うMLn'の全濃度の減少量を測定し,グラフ上の解析から錯体種の組成を調べた.その結果, pH78の領域においてZnではほとんどML2錯体のみであるが,希土類ではMLとML_2錯体とが共存していることが判った. 1:2錯体の生成定数KML2は, Znの場合既知のK_<MA>(A=NTA)の値を,希土類の場合KMLの値をそれぞれ用いて決定することができた.すなわち, MLが共存する場合には, K_<MA>は未知のままでよく,実際に異なる二種の配位子(A), IDAとシュウ酸を用いて求めたKML_2の値はよく一致した.金属に対して,呈色錯体(MLn)と無色錯体(MA)を形成する二種の配位子(L,A)を競合させ,呈色錯体の吸光度の変化を測定して錯体種の解析を行った.新たに購入した分析用電子天秤やpHメータは,高感度呈色試薬の微量秤量や酸解離定数の決定などに用いられた.以下にその結果を報告する.1.希土類元素と2-(2-チアゾリルアゾ)-4-メチルフェノール(TAC,L)および18クラウン6(18C6,A)との錯体.実験は, [H^+]とイオン強度を一定としたメタノール溶液を用い1:1錯体, MLを生成する条件([M]>[L])で, L,Aの競合反応を行わせた. [A]の変化に伴う1/K_<ML'>(KML'=MLの条件生成定数)をプロットした結果, MA(1:1)錯体の生成を確認し,直線の切片と傾斜から各錯体の生成定数K_<MA>,KML'を求めることができた.KML'の値は,別にし単独の条件で求めた値とよく一致し,本法の妥当性を示した.またKMAは,希土類の原子番号の増加とともに減少することから,呈色試薬による希土類の個別定量において, 18C6が有効なマスキング剤となる可能性を示した.(分化第36年会講演). 2.亜鉛および希土類元素の2-(5-ブロモー2-ピリジルアゾ)-5-(N-プロピルー3-スルホプロピルアミノ)フェノール(5-Br-PAPS,L)錯体.高感度呈色試薬である5-Br-PAPS(L,ε_<ZnL2>=1.3×10^5M^<-1>cm^<-1>)に対して,競合する配位子(A)としてZnの場合ニトリロトリ酢酸(NTA)を,希土類の場合イミノジ酢酸(IDA)とシュウ酸とを用いた.実験は, [L]≫[M]の条件で[A]の増加に伴うMLn'の全濃度の減少量を測定し,グラフ上の解析から錯体種の組成を調べた.その結果, pH78の領域においてZnではほとんどML2錯体のみであるが,希土類ではMLとML_2錯体とが共存していることが判った. 1:2錯体の生成定数KML2は, Znの場合既知のK_<MA>(A=NTA)の値を,希土類の場合KMLの値をそれぞれ用いて決定することができた.
多様な雇用形態の看護師の活用に関する分析－専門化とモジュール化を焦点に

2018年度は、本研究の2つの目的の1つである「看護師のアイデンティティを「雇用されている施設」ではなく「専門性」へシフトさせる」ための研究に力を注いだ。とりわけ、アメリカの正看護師の専門性を高めた延長線上にあるNurse Practitioner(NP)、そしてPhysician Assistant(PA)という上級資格についての研究を進めた。現在、日本でも医師の過重労働が問題視され、医師業務を移譲することのできる職種として、特定看護師制度が設けられた。また、PAについても検討が進められている。このため、アメリカの同資格を分析するにあたっては、成熟期にある現在の状況を分析するよりも、揺籃期に当たる1960年代から70年代にかけて、どのように浸透していったのか、どのような課題を乗り越えたのか、という点を分析することが重要であり、示唆が大きいと考えた。そのため、当時の資料や先行研究を可能な限り集め、歴史的背景と照らし合わせながら整理する作業を行った。PAやNPの現在の働き方については、国内では、創設時からどのような道をたどって現在に至っているのかという点については、全く明らかにされていないため、これを詳らかにすることには意義があると考える。明らかになった事実を端的にまとめると、1PAとNPの誕生の背景には、公的保険制度の創設による医療需要の増大、医師の専門化に伴うプライマリ・ケア医の不足という共通の課題がある一方、PAについてはベトナム戦争の衛生兵をスムーズに市民社会に戻すことで、反戦の声を封じるというジョンソン政権の狙いが存在したという違いがあったこと、2開業権を有するNPについては医師からの反対があったことで、浸透が遅れたが、PAについては縦の主従関係を強調したことにより、医師会からの強いバックアップも得ることができ、スムーズに浸透したこと、以上2点が挙げられる。2018年の夏には、もう1つの研究の目的である「看護師の職務のモジュール化」に関する調査を、アメリカにおいて実施する予定であった。しかし、7月の豪雨災害によってスケジュール変更を余儀なくされ、渡米することが叶わなかった。このため、方向性を徹底した資料収集とその整理および分析に充てることに変更した。アメリカ調査は2019年に実行する予定であるが、そのために厚みのある予備知識を整理することができたため、結果としては良い方向へ順調に進んでいると思われる。とりわけ、看護師の職務のモジュール化を分析するにあたっては、看護師の派遣労働をポイントに据えていた。2018年度の後半はこの分析を、アメリカの派遣労働全体から見た看護師の派遣労働の位置付けという視点で捉えることに力を注ぎ、新たな視点を得ることができた。最終年度に当たる2019年度は前年度に十分に取り組めなかった「看護師の職務のモジュール化」に力を入れたいと考えている。2018年度の後半に進めたアメリカの派遣労働全体から見た看護師の派遣労働に関する分析は、2019年5月に行われる社会政策学会全国大会にて研究報告する。そして、この内容は同学会誌に投稿の予定である。また、2018年度に実施することができなかった海外調査についても、夏季に行う予定である。「看護師の職務のモジュール化」の鍵を握る、医療職種の派遣会社(フロリダ州)にインタビューを依頼している。ここではとりわけ、派遣会社の経営の狙いに焦点を置いた調査を行いたい。他職種の派遣会社とは、さまざまな経営戦略の違いが見られるだろう。常に需要が高く、専門的なスキルを持って高い賃金を得ることができる医療職種にあっては、派遣労働者の売り手市場である。このような状況にあって、人材派遣会社はどのように派遣先の病院に自らを売り込み、どのように派遣労働者を管理しているのかと言う点について、特色が見られるはずである。そして、もう1つの論点である「看護師の専門化」については、引き続きPAおよびNPの歴史的な展開について分析を行いたい。2018年度に1970年代までの先行研究はほぼ網羅し、整理することができたので、2019年度は1980年代から現在までの歴史に取り組む。最終的に、正看護師が大多数を占め、ゼネラリストとして育成されることの多い日本の看護師制度が、縦横に、より多様な広がりを持つことができ、さまざまなキャリアの選択をしながら長く働くことのできる制度について提言を行いたい。そのために、少しずつ始まっている看護師キャリアの複線化を導入している国内の病院において、現状を調査する必要があるであろう。また、日本版NPを目指して始まった特定看護師制度に関しても、現状をより詳しく把握する必要があると考えている。本研究は、「各医療施設が看護師を囲い込むことに尽力する」という方向性から、「国家資格を有する専門職人材は、国全体の財産であると捉え、より大きな視点で看護師の長期的なキャリア形成を可能にする方法の検討」という視点への、パラダイムシフトを提案する。そのために、組織横断的な働き方が可能となるシステムの構築を訴える。ポイントは、1看護師のアイデンティティを、「雇用先」ではなく「専門性」へシフトさせること、そして、2職務をモジュール化することである。これらが実現しているアメリカの正看護師の事例を採りあげ、分析を行う。NPが医師やRNとは異なる役割を果たしていることは、勤務場所に表れていた。医師やRNが病院を主たる勤務場所とする一方、NPはクリニックに活躍の場を見出していた。日常生活を送りながら慢性疾患と付き合う患者が増加した現在、他職種と連携しながら患者のQOL向上を目指す医療の形が主流となる。

NPはプライマリケア医の空席を埋める役割にとどまらず、患者や家族と深くコミュニケーションをとることで信頼関係を築き、医療を統合する役割を果たすべく前進していることがわかった。申請段階の計画では、初年度にあたる2017年度は、分析軸1にあたる、専門化の現状と過程に関する分析を、主に文献資料から行う予定であった。本年度は、予定通り、アメリカのNPに関する州法の規定を比較し、論点とされている職務範囲、各州の差異の比較を行うことができた。また、NPに関する先行研究を深めることで、NP増加の背景を整理し、そこから「求められる医療の形が変化したこと」という独自の仮説を導き、実証することができた。また、現地でのインタビュー調査により、NPのアイデンティティが医師やRNとは異なっていることも明らかにすることができた。NPはしばしば、「ミニドクター」等と揶揄されたり、医師の仕事を奪う存在として医師職業団体から反発を受けたりするが、その存在意義の違いは重要である。本年度計画に掲げながら達成できなかった課題には、労働協約におけるNPなどの上級看護師の規約の調査がある。こちらについては、今年度焦点を当てたのが、労働組合の影響力が小さいネブラスカ州であったことが原因である。職務範囲に関する州法の比較を見る限り、労働組合の影響力の強さと、職務範囲の広さは、必ずしも相関関係にない。むしろ、人口当たりの医師数、看護師数が少ない州において、より広い職務が許可されている傾向にある。次年度以降は、NPを含めた上級看護師やPhysician Assistantといった職種の職務範囲を決めるファクターについて、より視野を広げて調査を進めてゆきたい。2018年度は、本研究の2つの目的の1つである「看護師のアイデンティティを「雇用されている施設」ではなく「専門性」へシフトさせる」ための研究に力を注いだ。とりわけ、アメリカの正看護師の専門性を高めた延長線上にあるNurse Practitioner(NP)、そしてPhysician Assistant(PA)という上級資格についての研究を進めた。現在、日本でも医師の過重労働が問題視され、医師業務を移譲することのできる職種として、特定看護師制度が設けられた。また、PAについても検討が進められている。このため、アメリカの同資格を分析するにあたっては、成熟期にある現在の状況を分析するよりも、揺籃期に当たる1960年代から70年代にかけて、どのように浸透していったのか、どのような課題を乗り越えたのか、という点を分析することが重要であり、示唆が大きいと考えた。そのため、当時の資料や先行研究を可能な限り集め、歴史的背景と照らし合わせながら整理する作業を行った。PAやNPの現在の働き方については、国内では、創設時からどのような道をたどって現在に至っているのかという点については、全く明らかにされていないため、これを詳らかにすることには意義があると考える。
網羅的遺伝子変異検出法を活用したマウスの食餌性糖尿病および肥満遺伝子の同定

我々は、マウスSM/J系統とA/J系統を用いた遺伝解析により高脂肪食摂取下において糖尿病、肥満、脂肪肝を引き起こす遺伝子の存在領域(QTL)を両マウスのゲノムの10箇所にマップした。本研究では、次世代シーケンサーを用いたSM/JとA/J系統間の網羅的な遺伝子変異検出により、10箇所の領域内の候補遺伝子を選抜した結果、第12番染色体に脂肪肝感受性遺伝子としてIah1を選抜した。この遺伝子を肝細胞に過剰発現させると細胞内脂肪量を減少させ、この遺伝子が脂質代謝関連遺伝子の発現を変化させる機能を持つことを初めて示した。現在はIah1ノックアウトマウスを作製してその脂肪肝発症の確認を進めている。申請者は、現在までにSM/JとA/J系統のゲノムに、糖尿病あるいは肥満を支配する遺伝子の存在領域を10箇所マップした。本研究では、両系統間の網羅的な遺伝子変異検出の結果を利用して各マップ領域内の候補遺伝子を選抜した上で、それらの遺伝子の作用を検証して糖尿病および肥満遺伝子として同定する。平成24年度の実績(1)SM/JとA/J系統のエキソン領域の塩基配列解読と、両系統間の遺伝子変異の検出両系統のそれぞれのゲノムDNAを専用機器(Covaris)を用いて150180bpに断片化し、そのDNAフラグメントの塩基配列を次世代シーケンサー(Life Technologies社,5500x1 SOLiD)にて解読した。この解読作業によってエキソン部分の配列が決定され、両系統間の遺伝子変異を検出した。(2)両系統間の遺伝子変異の検出結果を利用した、糖尿病および肥満遺伝子の候補の選抜両系統間で遺伝子変異(欠失、挿入、アミノ酸置換を伴う変異)が検出された遺伝子の内、10箇所のマップ領域内に存在する遺伝子を抽出した。第2番染色体の糖尿病遺伝子(T2dm2sa遺伝子座)の候補遺伝子としてRapgef4を選抜した。(31両系統間で発現レベルの異なる遺伝子の検出結果を利用した、糖尿病および肥満遺伝子の候補の選抜全染色体において、両系統間で発現レベルの異なる遺伝子を選抜した。このSM/JとA/J系統間で発現レベルが異なる遺伝子の内、10箇所のマップ領域内に存在する遺伝子を抽出した。第12番染色体の脂肪肝遺伝子(Fllsa遺伝子座)の候補遺伝子としてIah1を選抜した。申請者は、現在までにマウスSM/JとA/J系統のゲノムに、糖尿病あるいは肥満・脂肪肝を支配する遺伝子の存在領域を10箇所マップした。平成25年度の実績は以下のとおりである。(1)両系統間の遺伝子変異の検出結果を利用した、糖尿病および肥満遺伝子の候補の選抜第2番染色体の糖尿病遺伝子座(T2dm2sa遺伝子座)について、糖尿病遺伝子が存在する69.6Mb75.4Mb領域の中で両系統間で遺伝子変異(欠失、挿入、アミノ酸置換を伴う変異)を検出し、候補遺伝子としてItga6,Zak,Gpr155,Mtx2の4遺伝子を選抜した。(2)両系統間で発現レベルの異なる遺伝子の検出結果を利用して選抜された脂肪肝遺伝子の候補であるIah1の機能の解析第12番染色体に存在するIah1遺伝子を、マウス肝癌細胞であるHepa1細胞に過剰発現するcell lineを確立した。通常Hepa1細胞とこのIah1過剰発現Hepa1株の細胞内脂肪の蓄積を比較した結果、過剰発現株で蓄積が低下しており、このことよりIah1の脂肪蓄積抑制効果が明らかとなった。このことは、Iah1発現レベルの低いA/Jマウスで脂肪肝が発症することと一致しており、Iah1の脂肪肝遺伝子としての同定において有力な結果を得た。(研究実施項目)Iah1の脂肪感受性遺伝子としての同定(1)Iah1の脂質代謝調節作用の実証→マウス肝癌細胞(Hepa1細胞)に、マウスSM/J系統型とA/J系統型のIah1遺伝子を過剰発現するプラスミドを導入して両型のIah1の恒常的過剰発現株の樹立に成功した。これらの両株では、Iah1の型に関係なく対照のHepa1細胞に比べて細胞内トリグリセリド含量が低下した。この両タイプの過剰発現細胞株では、脂肪酸取り込みを行うCD36脂肪酸合成の鍵因子であるSREBP1のmRNAレベルが対照株に比べて有意に低下していることも見出した。これらのことから、Iah1の高発現は肝細胞内トリグリセリド含量を低下させることが実証され、Iah1の脂肪肝制御機能の一部が明らかとなった。(2)Iah1ノックアウトマウスの作製と、このマウスにおける脂肪肝発症の検討

→Iah1をノックアウトした受精卵から、ノックアウトマウス個体の作製を進めた結果、全身性のIah1ノックアウトマウスの作製に成功した。現在、そのマウスにおける高脂肪食摂取下における脂肪肝発症の有無の検討を開始している。また、同時に肝臓特異的Iah1ノックアウトマウスの作製も進めており、あと数ヶ月で目的のノックアウト個体が得られる段階である26年度が最終年度であるため、記入しない。栄養生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の実績により、10箇所のマップ領域のうちの2つの領域に存在する糖尿病遺伝子と脂肪肝遺伝子の候補遺伝子を選抜することができ、目標に達していると判断している。本研究での網羅的遺伝子変異検出法を用いなければこれらの選抜はできなかった。第12番染色体の脂肪肝遺伝子の候補であるIah1の脂肪代謝に対する役割の解明については、肝癌細胞を用いた系においてほぼ順調に進んでおり、Iah1の脂肪蓄積抑制作用の証明へと進める予定である。第2番染色体の糖尿病遺伝子の候補遺伝子として選抜した4つの遺伝子は、インスリン感受性に寄与していると推測されるが、培養細胞を用いてインスリン感受性を検討する実験系の確立の検討を進めているが現在のところ達成できていない。具体的には、これらの遺伝子を細胞内で過剰発現させる方法とノックアウトする方法の確立を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。選抜した候補遺伝子の糖尿病関連機能と脂質代謝関連機能を証明する実験を、培養細胞系において集中して推進する。また一方で、平成24年度には候補遺伝子の選抜に至らなかった8箇所のマップ領域について、糖尿病あるいは肥満遺伝子の候補遺伝子の選抜を継続して行なう。(1)Iah1の脂肪肝遺伝子としての同定マウス肝癌細胞(Hepa1細胞)を用いて、Iah1の脂肪蓄積抑制作用を脂質代謝遺伝子の発現に対する作用を明らかにすることで証明していく。Iah1ノックアウトマウスを作成中であり、マウス確立の後に、このマウスでの脂肪肝発症の証明を目指す。(2)糖尿病遺伝子の候補遺伝子の機能の検討マウス脂肪細胞(3T3-L1細胞)を用いて、siRNA法にて候補遺伝子をノックアウトした場合にインスリンによるグルコース取り込み能が低下するかについて検証する。平成24年度の次世代シーケンサーによるエキソン配列の解読作業が極めて効率よく進んだことにより試薬代が節約でき、その費用を次年度の候補遺伝子の機能解析に充当することが可能となった。具体的には、T2dm2sa候補遺伝子の糖尿病関連機能と、Fllsa候補遺伝子の脂質代謝関連機能の解析に使用する。糖尿病遺伝子の機能を検討するための実験系の確立が計画よりも若干遅れたために、この確立に用いる消耗品の費用分が次年度の使用となった。糖尿病遺伝子の候補遺伝子の機能の細胞系での検討のために速やかに使用する。
口腔扁平上皮癌のΔNp63βを介したEMTにおけるmiR-205の役割について

本研究の目的は、ΔNp63βを介したEMTに関連するmiRNAとして着目したmiR-205のOSCCにおける役割を解明することにより、OSCCに対する分子標的治療薬の開発や新たなバイオマーカーの確立を実現する基盤となる研究を行うことである。そのため、ΔNp63βを介したEMTに関連するmiRNAとして着目したmiR-205が、OSCCの浸潤や転移に関与するために標的とする遺伝子として、ZEB1およびZEB2との関係性について研究を行い、miR-205がZEB1およびZEB2を介して、OSCC細胞の遊走能・浸潤に影響を与えているという結果を得たが、果たしてmiR-205が直接的にZEB1およびZEB2に働きかけているかどうか確認する必要があると考えた。そこで、まずTargetScan softwareを用いて、ZEB1とZEB2それぞれのmRNA 3'末端にあるmiR-205の結合部位となりうる配列を予測し、さらに、その配列を含む領域にのみ特異的に結合するよう設計したtarget protectorを合成した。合成したtarget protectorとmiR-205を強制発現させるmiR-205mimicを、miR-205の発現がほとんど認められないSQUU-B細胞へ共導入することで、miR-205の標的遺伝子への結合の阻害がZEB1とZEB2の発現に与える影響をwestern blotting法にて検討した。その結果、miR-205mimicとtarget protectorを共導入したSQUU-B細胞では、ZEB1およびZEB2の発現抑制効果が弱まっていたことから、miR-205はZEB1およびZEB2に直接結合することで発現をコントロールしていることが示された。これらの分子の関係性のさらなる確証を得たことに本研究の意義があったと考えている。研究実施計画に基づいて研究を進めていく上で、確認しておくべき段階から先に実証していたため、期間を要してしまったため。当初の予定通り、miR-205の標的遺伝子として、ZEB1およびZEB2以外で重要な鍵となりそうな遺伝子のピックアップとその発現解析を進めていく。また、可能な限り同時進行でin vivoの実験も進めていく予定である。予定よりも参加ができなかった学会もあり、旅費が予定より下回ったため。翌年度の学会参加を当初の予定よりも多くし、研究に役立てる機会を積極的に増やしていく計画である。
モルモット内耳有毛細胞の再生に関する研究

今回は、モルモットの実験については前庭の球形嚢、卵形嚢、半軌管膨大部を取り出して走査型電子顕微鏡で観察するにとどまった。聴器毒性をきたすことが知られているストレプトマイシン、シスプラチンを投与された症例に対して投与前後で誘発および歪音耳音響放射を測定することにより薬剤による内耳の特に蝸牛の有毛細胞の障害についての評価をおこなった。ストレプトマイシンを投与され長期経過を追えた症例は1例であったが純音聴力検査、耳音響放射ともに変化は認められなかった。シスプラチンを投与された症例は15例経過を追うことができた。シスプラチン投与量は1ク-ルあたり100ないし130mgで、2から4ク-ル投与されている。純音聴力検査では8000Hzがわずかに低下する傾向が認められただけであるが、耳音響放射の変化を検討したところ2000および4000Hzの蝸牛機能を反映すると考えられている反応の低下傾向が認められた。シスプラチンによる外有毛細胞の機能低下が純音聴力検査に現れない部位においても生じている可能性が示唆された。2ク-ル以上経過を追えた症例においてはシスプラチンの影響が可逆的かどうか検討したがはっきりしなかった。今回検討した症例においてはストレプトマイシン、シスプラチン投与による前庭機能の異常は認められなかった。今回はヒトによる蝸牛機能の変化を生理学的手法で経過を追っただけであるが、今後前庭機能も合わせて形態学的な検討をしていく予定である。
限定空間において超高選択的な触媒反応を実現するナノスペースマテリアルの創製

昨年度までの研究から,メソ多孔質アルミノシリケートの細孔壁を原料として,部分的なゼオライト構造を構築させることに成功した。本年度着目した点は,酸性質発現のメカニズムである。上記方法では気相よりゼオライトへの構造指向剤を供給し結晶化を促進している。この構造指向剤を変化させることで,様々なゼオライト構造が得られる。よって本研究では,それぞれ構造指向剤を用いて,どのようなゼオライトが合成可能か検討した。一方,ゼオライトの大きな特徴は上記固体酸性質とともに均質な分子レベルのミクロ細孔が開孔している点にある。そこで,上記結晶成長法を利用して,メソ細孔壁にミクロポケットを作製し,分子認識ミクロ細孔を開けることを試みた。気相から供給可能なアミン類を用いることで,MFI, MOR, MWWといった工業的に実用化されている重要なゼオライト郡がメソ多孔体から作成できることを確認した。また,蒸気圧の低い4級アンモニウム塩を用いると,BEA, MFI, MELといった細孔径および構造が異なるゼオライト群を作り分けることができた。またビルディングユニットまでで結晶成長を止め,ゼオライトの酸性質とメソ多孔質のコンポジット材料となることがわかった。上記により得られた強酸性質およびミクロポケットによって,ミクロ-メソヒエラルキカル細孔ネットワーク構造を実現するだけでなく,分子サイズを認識して働く吸着剤,触媒として適用し,分子サイズに高選択的な分子認識材料としての有効性を検討した。本研究では,アンモニアあるいはトルエン分子吸着実験によって,酸点周りの環境整備および酸点周りのミクロ空間の形成を経時的に追跡した。ゼオライトのような強酸性質が発現した後にミクロポケットなどミクロ構造が構築されることが明らかとなった。その結果,芳香族分子に選択的な吸着剤の開発可能性が示された。本研究では,ミクロ-メソ-マクロの異なる細孔径領域を階層的につなぐ材料の創製とその応用を指向している。本年度の成果として,ミクロ多孔体=ゼオライト,メソ多孔体=メソポーラスシリカとし,メソポーラスシリカを原料としてその細孔壁を部分的にゼオライトへと結晶化させる有機アミン分子を気相から供給する方法(Vapor-Phase Transport : VPT)を開発した。この方法により,ゼオライトライクな強酸性質を有する均質メソポーラス物質が調製できることが確認された。酸触媒もしくは炭化水素の吸着剤として,原料のメソポーラスシリカやゼオライトには無い特異的な性質を示すことを明らかにした。他にも様々なミクロ-メソナノコンポジット材料をVPTにより合成することに成功した。例えば,ゼオライトとしてはZSM-5,Ferririteといった様々な酸性質や細孔径をもっゼオライトのVPTを試みた。一方メソポーラスシリカには,一般的なMCM-41やMCM-48といったアルカリ条件下で合成される高表面積なもの,SBA-15,SBA-16など酸性条件下で合成される壁厚の大きいもの等,様々なメソ構造や細孔壁厚をもつ材料を適用することができた。合成のポイントはアルミニウムであり,アルミニウムを起点としたゼオライト核形成およびゼオライトのビルディングユニットが成長するモードがあることを明らかにした。これらメソおよびマクロ構造を限定させるために,ナノポーラスカーボンを型材として適用し,その回りにミクロ構造体を結晶化せしめることに成功し,得られた物質群にZMM-nと命名した。
上皮細胞の形態形成に関わるタンパク質群の同定と機能解析

1.上皮細胞における細胞内局在を指標とした新規タンパク質群スクリーニング系の確立培養上皮細胞であるMDCK細胞やCSG細胞に由来するポリ(A)RNAを用いてマウスレトロウイルスによる発現cDNAライブラリーを作製した。また、マウスレトロウイルス受容体を安定に強制発現させたMDCK細胞を樹立し、これをスクリーニングに用いた。小規模スクリーニングにより、クローディン、オクルディン、JAMといった上皮細胞接着に関わる既知分子がクローニングできることを確認した。数回の試行を通じて効率よいスクリーニングのためのプロトコールを確立した。2.細胞間接着部位に濃縮する新規タンパク質の同定MDCK細胞およびCSG細胞由来cDNA発現ライブラリーを用いたスクリーニングから、上皮細胞間接着部位に濃縮する新規なタンパク質として、homer2,abLIM3,新規コイルドコイルタンパク質を同定することに成功した。個々のタンパク質に対する抗体を作製するとともに、細胞間接着部位への局在化に必要なドメインを決定し、さらに機能解析を続けている。その中でabLIM3は、神経系、あるいは網膜においてアクチン繊維と相互作用して機能することが知られているabLIMのサブタイプである。私たちはこの分子が肺、および筋組織の血管内皮細胞のアドヘレンスジャンクションに局在することを明らかにし、in vitroにおけるアクチン繊維との相互作用を示した。その組織発現パターンから、著しい伸縮を余儀なくされる血管内皮細胞の細胞間接着構造の強化との関連に興味がもたれる。その他のタンパク質についても機能解析を継続している。当初の研究計画のうち、平成15年度分のほとんど全てを予定通り遂行できた。詳細は以下の通りである。1.cDNAライブラリーの作製とスクリーニング用上皮細胞株の確立まず培養上皮細胞であるEph4,MDCK細胞から単離したpoly (A)+ RNAを用いて、C末端側にGFPを結合させた形の融合蛋白質を発現できるcDNAライブラリーを、レトロウイルスベクターの系で作製した。さらに、マウスレトロウイルス受容体を安定に強制発現させたMDCK細胞を樹立し、実際にレトロウイルスベクターを高い感染効率で導入できることを確認した。2.スクリーニング条件検討のためにEph4細胞由来cDNAライブラリーを用いて小スケールでスクリーニングを試行した。この過程で検鏡、細胞培養法等、今回のスクリーニングの中で工夫の必要なステップについて現実的な手順を確立した。その結果を取り入れて、MDCK細胞由来cDNAライブラリーを用いた中規模のスクリーニングを3回行った。手順は、1)スクリーニング用MDCK細胞へのcDNAライブラリーの導入、2)セルソーターによるGFP融合蛋白質発現細胞の選別と培養、3)蛍光顕微鏡観察による局在スクリーニング、4)細胞のクローニングとストック、5)ゲノムDNAの回収とPCRによるcDNAの同定、6)全長cDNAのクローニングと強制発現による細胞内局在の確認、とした。この過程で、既知の蛋白質に加えて、細胞間接着構造、アピカル側細胞膜、中心体といった細胞内構造に局在する未知の(塩基配列の報告はあっても局在として未知)蛋白質がこの方法で実際に同定できることが明らかになった。現在、このスクリーニングで得られた分子の機能解析を開始するとともに、さらに大規模なスクリーニングを予定している。平成16年度は、上皮細胞に特有な構造の中でも細胞間接着構造濃縮するタンパク質を同定することにターゲットを絞りスクリーニングを行った。発現cDNAライブラリーとして、新たにマウス唾液腺由来細胞株であるCSG細胞から作製したものを用いたところ、前年度に作製したマウス乳腺由来上皮細胞株Eph4のcDNAライブラリーに比較してクローニングされる既知タンパク質のバックグラウンドが低いことが明らかになったため、専らこのcDNAライブラリーを使用した。その結果、細胞間接着構造に濃縮するという意味で新規なタンパク質を数種類同定することに成功し、前年度に得られたものと合わせて解析を行った。個々のタンパク質に対する抗体を作製してマウス組織における発現と細胞内局在を調べるとともに、様々な欠失変異体を作製して細胞間接着構造への局在化に必要な領域を決定した。個々のタンパク質に関する詳細は以下の通りである。1)homer2シナプス後膜に局在し様々なタンパク質を集積させる裏打ちタンパク質のサブタイプ。

上皮細胞間接着構造のうちアドヘレンスジャンクション(AJ)に局在することを明らかにした。2)abLIM3神経系、あるいは網膜においてアクチン繊維と相互作用して機能することが知られている未発表のabLIMのサブタイプ。肺、および筋組織の血管内皮細胞のAJに局在することを明らかにした。3)新規コイルドコイルタンパク質多くの上皮細胞、血管内皮細胞のAJ付近に局在する。小胞状にも分布することから、細胞間接着と小胞輸送の未知の相互作用を担うことが期待される。現在これらの分子について、培養上皮細胞における強制発現およびRNAiによる発現抑制を行い、機能解析を進めている。
染色体傷害応答によるテロメア維持機構に関する研究

テロメレースに依存せずテロメアを維持しているALT細胞において、損傷チェックポイント機構のテロメア維持機構における役割について解析を行った。まずDNA上の傷害部位の認識に関与するチェックポイントRadタンパク質群(Rad9-Hus1-Rad1クランプ様複合体、Rad17-RFC)が、ALT細胞で特異的にテロメアと共局在し、細胞核内でフォーカス状の構造体ALT-associated PML body(APB)を形成することを明らかにした。一方リン酸化Rad17やDNA損傷のマーカーであるγ-H2AXもAPBに局在が観察されるが、それは一部のAPBに限られていた。これはALT細胞の損傷応答が、チェックポイントRadタンパク質の局在と、ATM/ATRキナーゼすなわち損傷応答機構の活性化という二段階の制御が存在することを示唆している。一部のAPBではBrdUの取り込みが検出され、実際にDNA合成が起こっているが、これはATM/ATRの阻害剤であるカフェインに感受性であった。このことから損傷応答機構の活性化が、ALT細胞でのテロメア複製に必須であることが示唆された。次にこのようなテロメアにおける損傷応答が誘発される要因を明らかにするため、ALT細胞テロメアDNAの構造的特徴について検討を行った。その結果、ALT細胞では、テロメレース陽性細胞に比べ、高頻度にDNAに単鎖切断が生じていることを見いだした。これはALT細胞のテロメアではnickやgap等の損傷部位が存在すること、またそれらが修復されずに保持されていることを示唆している。ALT細胞では複製フォークがテロメアで一時停止し、それがテロメア間の組換えを誘発してテロメア維持を行う、という機構が考察できる。テロメレースに依存せずテロメアを維持しているALT細胞において、損傷チェックポイント機構のテロメア維持機構における役割について解析した。はじめにDNA上の損傷部位の認識に関与するチェックポイントRadタンパク質群(Rad9-Hus1-Rad1クランプ様複合体、Rad17-RFC)が、ALT細胞で特異的にテロメアと共局在し、細胞核内でフォーカス状の構造体を形成することを明らかにした。またBrdUのパルス標識の実験から構造体の一部ではDNA複製が起こっていること、さらにこの複製はカフェインに感受性であることから、チェックポイントkinaseであるATM/ATRに依存することを示した。このようにテロメアにおいて障害応答が誘発される要因を明らかにするため、ALT細胞テロメアDNAの構造的特徴について検討を行った。その結果、ALT細胞では、ALT陰性であるテロメレース陽性細胞に比べ、高頻度にDNAに単鎖切断が生じていることを見いだした。単鎖部分のほとんどはテロメア末端の一本鎖部分(G-tail)に由来しないこと、単鎖DNAの平均長はG鎖よりもC鎖の方が短くより多くの損傷が生じていることも明らかにした。この損傷の差は、C鎖が複製時にラギング鎖として新規合成されることに関係していると示唆される。以上の結果から、ALT細胞では複製フォークがテロメアで一時停止して単鎖切断が確率的に生じ、それがテロメア間の組み換えを誘発してテロメア維持を行う、という機構が考察できる。テロメレースに依存せずテロメアを維持しているALT細胞においては、DNA上の損傷部位の認識に関与するチェックポイントRadタンパク質群(Rad9-Hus1-Rad1クランプ様複合体、Rad17-RFC)が、ALT細胞で特異的にテロメアと共局在し、細胞核内でフォーカス状のAPB構造体を形成している。このAPBの一部にのみリン酸化Rad17が局在していたことから、DNA損傷応答の誘発は制御を受けている可能性が示された。実際にリン酸化Rad17は細胞周期のS期後期からG2期にかけて高頻度に観察されたことから、DNA複製にともない誘発される機構であると考えられた。

さらにこの誘発される要因を明らかにするため、ALT細胞テロメアDNAの構造的特徴について検討を行った。これまでALT細胞では、高頻度にDNAに単鎖切断が生じていることを見いだしてきている。これはALT細胞のテロメアではnickやgap等の損傷部位が存在すること、またそれらが修復されずに保持されていることを示唆している。この単鎖構造は単鎖特異的なエキソヌクレアーゼに耐性であることから、テロメア末端の一本鎖部分(G-tail)に由来しないこと、すなわちgap状、またはHolliday junctionの様な組換え中間体であることが示唆された。二次元ゲル電気泳動とサザン法による解析から、この構造はALTで観察される染色体外リピートでなく、線状DNA上、つまり染色体上に存在することが明らかとなった。これらはテロメア間の組換えを反映した構造で、ALTのテロメア維持機構を解明する上で重要な意味を持つ可能性がある。
細胞治療薬としての幹細胞の特性マーカー探索とAIによるバリデーション精度の向上

細胞組織加工製品として幹細胞を使用する際に、幹細胞はあらゆる細胞に分化する可能性があるため、製品(=細胞)の品質を評価するための細胞特性解析指標の設定、およびそれら指標に基ずいた規格の設定がレギュラトリーの面から重要になる。本研究は、細胞の遺伝的因子、サイトカイン等の生化学的因子、さらには画像による形態学的特性を人工知能(AI)を用いた解析を行うことで、AIが持つ高い精度の予測能から細胞バリデーションの精度を向上させ、実際に臨床応用する際の細胞組織加工製品の安全性を向上させるバリデーションシステムの構築により、再生医療における幹細胞の品質管理法の確立および安全性確保の基盤を形成する。
分子輝線観測による大質量星なしクランプ内部での分子雲コア形成過程の解明

大質量星形成を理解するためには、まだ活発な星形成活動が起きていない極低温な大質量クランプを観測することが重要である。昨年度に得られたアルマによる低温大質量クランプに対する観測データを詳細に解析したところ、星形成活動によって重水素化分子の存在量が変化し、その振る舞いが分子種によって異なることがわかった。例えば、N2D+とDCO+は星形成によって減少するが、N2D+の方が減少の度合いが大きい。この結果は、N2H+は高温領域ではCOによって壊されるが、DCO+はDとHCO+との反応によって比較的高温でも生成されるためであると考えられる。また、DCNは、逆に星形成によって増加していることがわかった。これは、星形成の加熱によりダストから蒸発するためと考えられる。モデル計算の結果と比較した結果、観測結果と同様の傾向が見られた。一方で、星形成がまだ起きていない領域においてもN2D+とDCO+の分布に違いが見られた。これは、分子雲コアが形成されてからの時間の違いによるものと考えられる。以上のように、重水素化分子が分子雲コアの進化を知る上で重要な手法となることを示すことができ、大質量分子雲クランプ内部での星形成活動の様子を明らかにすることができた。また、電波干渉系VLAを用いた赤外線暗黒星雲に対するアンモニア輝線の観測データを解析したところ、NH3 (J,K)=(3,3)輝線のメーザーが検出された。アンモニアメーザーはショックで励起されると考えられているが、メーザー源はこれまでに認識されていた分子流とは異なる位置で検出された。これは、分子雲クランプ内部にこれまでに認識されてい無い分子流が存在することを示唆している。また、このことは、アンモニアメーザーを観測することで、分子雲クランプ内部の星形成活動に関する新たな情報が得られることを示している。大質量星の形成過程を明らかにするためには、その初期状態を理解することが重要である。しかし、最近まで、大質量星形成以前の状態にある分子雲クランプのサンプルが少なく、大質量星形成の初期状態は未だ明らかにされていない。最近、Traficanteら(2015)は、Herschel望遠鏡による銀河面サーベイのデータから、大質量星形成を起こす可能性が高く、かつ星形成を伴わないと考えられる分子雲クランプ、171天体を同定した。我々は、それら分子雲クランプから、距離が5 kpc以内、質量> (1300(半径/pc)1.33)Msunの条件を満たす55天体を選び、野辺山45m望遠鏡を用い、DNC J=1-0, HN13C J=1-0, SiO J=2-1, N2D+ J=1-0, H13CO+ J=1-0, H13CN J=1-0輝線のサーベイ観測を行った。観測の結果、55天体中51天体でHN13C輝線を検出し、32天体でSiO輝線を検出した。SiOが星形成に起因すると考えると、多くの低温大質量クランプで既に星形成が起きていることを示唆している。さらに、DNC/HN13C比を見ると、同じような温度(10 K)にある天体でも、その値に有意なばらつきがみられた。このばらつきの原因として、分子雲クランプの形成タイムスケールの違いなどが考えられる。さらに、この観測で得られた結果をもとに、DNC/HNC比の異なる8天体を選び、ALMAを用いた観測提案を行っている。今後、野辺山45m望遠鏡の結果をもとに、マッピング観測などさらに展開していく予定である。野辺山45m望遠鏡を用い、大質量かつ低温な分子雲クランプ、55天体を観測した。水素濃縮度(DNC/HN13C比)の多様性など、興味深い結果が得られた。野辺山45m望遠鏡で得られた結果は、今後のALMAなどを用いた観測計画立案などにも大きく役立つものであり、おおむね順調に進展していると考えている。大質量星の形成過程を明らかにするためには、大質量星形成前の段階にある低温な大質量高密度分子雲クランプを観測することが重要である。本年度は、低温で70ミクロンでも暗く見える大質量分子雲クランプに対するアルマ望遠鏡を用いた観測データを得た。観測データから、N2D+、DCO+、DCNといった重水素化分子の分布を明らかにした。その結果、イオン分子であるN2D+とDCO+は分布が大きくことなり、重水素化分子は、それぞれ異なる振る舞いをすることがわかった。この結果については、現在さらに解析を進めており、今後、モデル計算との詳細な比較を行う予定である。また、赤外線暗黒星雲内部の極く若い原始星近傍の化学組成を、アルマ望遠鏡を用い詳細に調べた。その結果、この天体では、複雑な有機分子の存在量は、他の大質量星形成天体と同程度にもかかわらず、重水素化分子であるD2CO(とCH3OHの比)が他の大質量星形成天体と比較して、有意に多いことがわかった。有機分子は、主に星形成後にダスト上で形成されると考えられており、他の大質量星形成天体と、有機分子の存在量が似ていることは、星形成後の環境が他の大質量星形成天体と似ていることを示唆している。一方、D2COは星形成前の低温期に生成され、星形成後もある程度の時間星形成前の値を保持すると考えられる分子である。したがって、この結果は、大質量星形成の初期状態に多様性があることを示唆する結果と言える。

しかし、まだサンプル数が少ないため、今後、サーベイ観測などを行い、この結果についてより詳しく調べる予定である。今年度は、極く若い大質量星形成天体の化学組成について詳細に調べ、有機分子と重水素化分子の存在量について興味深い結果が得られた。これは、今後のサーベイ観測などさらに発展が期待できる成果である。さらに、アルマ望遠鏡による、低温な赤外線暗黒星雲に対する重水素化分子輝線の新しい観測データを得ることができた。これについては、現在解析中であるが、興味深い結果が得られつつある。したがって、概ね順調に進展していると考えている。大質量星形成を理解するためには、まだ活発な星形成活動が起きていない極低温な大質量クランプを観測することが重要である。昨年度に得られたアルマによる低温大質量クランプに対する観測データを詳細に解析したところ、星形成活動によって重水素化分子の存在量が変化し、その振る舞いが分子種によって異なることがわかった。例えば、N2D+とDCO+は星形成によって減少するが、N2D+の方が減少の度合いが大きい。この結果は、N2H+は高温領域ではCOによって壊されるが、DCO+はDとHCO+との反応によって比較的高温でも生成されるためであると考えられる。また、DCNは、逆に星形成によって増加していることがわかった。これは、星形成の加熱によりダストから蒸発するためと考えられる。モデル計算の結果と比較した結果、観測結果と同様の傾向が見られた。一方で、星形成がまだ起きていない領域においてもN2D+とDCO+の分布に違いが見られた。これは、分子雲コアが形成されてからの時間の違いによるものと考えられる。以上のように、重水素化分子が分子雲コアの進化を知る上で重要な手法となることを示すことができ、大質量分子雲クランプ内部での星形成活動の様子を明らかにすることができた。また、電波干渉系VLAを用いた赤外線暗黒星雲に対するアンモニア輝線の観測データを解析したところ、NH3 (J,K)=(3,3)輝線のメーザーが検出された。アンモニアメーザーはショックで励起されると考えられているが、メーザー源はこれまでに認識されていた分子流とは異なる位置で検出された。これは、分子雲クランプ内部にこれまでに認識されてい無い分子流が存在することを示唆している。また、このことは、アンモニアメーザーを観測することで、分子雲クランプ内部の星形成活動に関する新たな情報が得られることを示している。野辺山45m望遠鏡で得られた結果をもとに、ALMAに観測提案中である。今後、ALMAのデータが得られれば、分子雲クランプ内部の個々の分子雲コアの重水素濃縮度を明らかにし、大質量分子雲クランプ内部での分子雲コア形成のタイムスケールを見積もることができる。また、分子雲クランプ内部のホットコア天体における重水素濃縮度の違いについても、新たに着目し、研究を進めていく。最近の我々の観測から、重水素化分子の存在量がホットコアごとに異なる可能性が示唆された。このことをより詳しく調べるため、ホットコアに対する重水素化分子輝線のサーベイ観測を行う。得られた結果は、速やかに論文として報告する。これまでの結果、ある赤外線暗黒星雲内部の原始星近傍でD2COが多いことがわかったが、その天体の内部構造は、これまでの観測では明らかにされていない。この天体の内部構造を明らかにするためのアルマ望遠鏡を用いた観測提案を行っている。
個性が群れをつくる：イカ類の行動遺伝子の探索

本研究では、発達した感覚・神経系を持ち、群れという機能的な社会システムを作るイカ類の行動の個体差、すなわち個性に注目し、その背景となる遺伝子の探索を目指した。アオリイカを飼育して個体ごとの社会行動を評価し、それらの個体の遺伝子型判定を行い、ホタルイカ、スルメイカとも比較した。マイクロサテライト、ミトコンドリアDNAにおいて、地域差や個体差が認められ、行動データとの関連も見いだされた。本研究により個体の行動に関与する遺伝子が存在する可能性が示された。今後は候補遺伝子を探索し、遺伝子型を選抜指標として、資源管理や養殖技術開発への応用をはかる。本研究では、発達した感覚・神経系を持ち、群れという機能的な社会システムを作るイカ類の行動の個体差、すなわち個性に注目し、その背景となる遺伝子の探索を目指す。「海の霊長類」と称されるイカ類について、その複雑で発達した社会システムを「個性」という観点から詳らかにする。遺伝子型が選抜指標となれば、資源管理や養殖技術開発、水族館学に多大な貢献が期待される。これまでに行った、遺伝子解析および行動評価の条件検討にもとづき、24年度は、行動評価データのあるアオリイカ多数個体の遺伝子型判定を主として行い、ホタルイカ、スルメイカとも比較した。アオリイカは、沖縄島由来の飼育集団(25個体)と長崎県対馬由来の天然個体(1個体)を用いて、近縁種より得られたマイクロサテライトマーカー5種類の型判定、およびmtDNAのCOI領域の塩基配列の決定を行った。マイクロサテライト解析の結果、1種類のマーカーでアオリイカ集団内に多型が認められた。また、mtDNAのCOI領域の塩基配列を解析した結果、沖縄島由来のアオリイカでは、3種類のハプロタイプ、H1, H2, H3が確認され、対馬由来の個体では異なるタイプ、H4がみられた。沖縄島由来のアオリイカ飼育集団については、順位およびソーシャルネットワークにおける中心度合いを分析した。マイクロサテライトで他個体と異なるアリルが見られた1個体は、体サイズが2番目に大きかった。COI領域のハプロタイプH2を有する個体は、体サイズが大きく、順位と中心度合いが高い傾向が見られた。以上から、アオリイカでは、社会関係を維持する上での行動の違いに遺伝的背景が関わっている可能性が示唆された。ホタルイカ(2個体)とスルメイカ(2個体)は、富山湾由来の天然個体を使用した。種内のmtDNA塩基配列には、種内多型は見られなかった。前年度までに、行動評価データのあるアオリイカ多数個体の遺伝子型判定を行い、ホタルイカ、スルメイカとも比較した。沖縄島由来25個体と対馬由来1個体で、マイクロサテライトマーカー1種類でアオリイカ集団内に多型が認められている。また、mtDNAのCOI領域の塩基配列には、沖縄島由来のアオリイカでは3種類のハプロタイプ、対馬由来の個体では異なるタイプがみられている。25年度は、沖縄島由来のアオリイカの飼育集団の個体数を増やして、近縁種より得られたマイクロサテライトマーカー5種類の型判定、およびmtDNAのCOI領域の塩基配列の決定を行った。前年度までと比較して新たな型は見いだされなかった。これまでの飼育集団の行動解析により、高順位個体やネットワーク内で中心的な位置を占める個体を多く含む血縁集団が存在する可能性が明らかになった。25年度は、飼育集団内での個体の行動と出生環境との関係を調べたところ、遺伝的交流がなく、出生地域の異なる個体が作る群れでは、捕食時の積極性や防衛時の過敏さなどについて、異なる行動特性を示す傾向が認められた。霊長類や鳥類の社会行動に関する情報の蓄積により、オキシトシン受容体などの候補遺伝子がピックアップできた。ホタルイカでも個体数を増加してmtDNA塩基配列を調査したが、種内多型は見られなかった。今後、さらに試料数を増やして調べる必要がある。23年度は、遺伝子解析の条件検討と、行動評価の検討を主として行った。1.遺伝子解析の条件

検討:ケンサキイカ、アオリイカ、ホタルイカ、スルメイカ、モンゴウイカ、ソデイカの外套膜の組織よりDNAを抽出し、ミトコンドリアのCOI領域の762塩基の配列を解析して、登録塩基配列との比較により、実験条件の信頼性を確認した。遺伝子型解析を行うための実験条件を検討した。さらに、非侵襲的なDNA抽出条件を検討するために、表面の粘膜を綿棒でぬぐう方法法についても検討した。アオリイカの種内で、対馬と沖縄に由来する個体間に塩基配列の差異が見られた。さらに、飼育アオリイカ25個体から試料を採取し、8個体で解析を行ったところ3ハプロタイプが見いだされ、この領域の多型を指標として母系の血縁と行動との比較ができることがわかった。2.飼育個体の行動評価法の検討:個体差の評価基準の作成:アオリイカ個体の群れにおける順位やネットワークでの位置付け(ハブ個体、周辺個体など)をもとにShy, Bold等の性格の評価基準を作成し、評価値の高い個体、低い個体からそれぞれDNAを抽出した。遺伝子解析については、アオリイカの行動データのある集団内でマイクロサテライトおよびミトコンドリア塩基配列の多様性を見いだし、体サイズや社会関係と関連する傾向が見られたのは大きな進歩であった。以上より、研究は順調に進展している。遺伝子解析については、DNA抽出、PCR等の条件を確定することができ、さらにアオリイカ種内でのミトコンドリア塩基配列の多様性を利用して地域差や母系の血縁の推定がでたのは大きな進歩であった。行動解析については、飼育下での個体識別にもとづく観察と実験により、社会関係の解明がすすみ、個体の行動特性をスコア化できた。これまでの成果にもとづき、25年度は試料数を増やして個体ごとの行動評価を行い、遺伝子型を解析する。また次世代シーケンサーを用いて、行動特性の候補遺伝子の探索を行う。1.行動評価:個体数を増やして、飼育下のアオリイカの行動評価を行う。具体的には、ソーシャルネットワーク分析や行動実験に基づいて、より精密な指標によるスコア化を目指す。2.遺伝子解析:アオリイカの卵塊、ホタルイカの群など、野生下のグループ内の構成個体の血縁関係を解析し、野生群内の遺伝的構造を明らかにする。遺伝子型や血縁関係の、行動特性や社会関係への影響について考察する。3.新規候補遺伝子の探索:また次世代シーケンサーを用いて、行動特性の候補遺伝子の探索を行う。23年度の成果にもとづき、24年度は試料数を増やして個体ごとの行動評価を行い、遺伝子型を解析する。またまた次世代シーケンサーを用いて、行動特性の候補遺伝子の探索を行う。1.行動評価:飼育下のアオリイカの行動評価を行う。社会ネットワークや行動実験に基づいて、より精密な指標によるスコア化を目指す。2.遺伝子解析:行動を評価した個体からDNAを抽出し、ミトコンドリアのCOI領域、マイクロサテライトの遺伝子型を解析する。生体からの非侵襲的なDNA抽出と型判定の条件を検討する。またアオリイカの卵塊、ホタルイカの群など、野生下のグループ内の構成個体の血縁関係を解析し、野生群内の遺伝的構造を明らかにする。
チューブリン重合阻害剤の抗腫瘍効果発現機構に対する再検討

1.ERK-MAPキナーゼ系が恒常的に活性化されている癌細胞株において、MEK阻害剤でそれを選択的に遮断した際、顕著なG1期集積に伴う増殖停止を認めたが、それだけでは有意なアポトーシス誘導に至らなかった。そこで、他の作用機構を持つ薬剤と併用することでその抗癌作用が増強される可能性を検討した結果、MEK阻害剤とチューブリン重合阻害剤を組み合わせた際にのみ、極めて顕著なアポトーシス誘導の増強を認めた。これまでチューブリン重合阻害剤によるアポトーシス誘導に関しては、G2/M期における紡錘体微小管の機能阻害(染色体分配阻害)が主な原因とされていたが、上述のよう癌細胞をG1期に集積させた際にその作用が増強されたことより、チューブリン重合阻害剤は紡錘体微小管の機能阻害というよりも、間期に存在する細胞質微小管の機能阻害を契機として、何らかの細胞死誘導シグナルを惹起することでその抗腫瘍効果を発現する可能性を見出した。2.MEK阻害剤とチューブリン重合阻害剤の併用による癌細胞のアポトーシスは、微小管構造に顕著な影響を及ぼさない低濃度のチューブリン重合阻害剤によっても引き起こされることを見出した。これは、チューブリン重合阻害剤の抗腫瘍効果が、紡錘体微小管の崩壊を介して引き起こされるのではない可能性を側面から支持するものである。3.MEK阻害剤とチューブリン重合阻害剤を併用投与した癌細胞において特徴的に、c-Jun N-terminal kinase (JNK)の極めて顕著な活性化を認めた。さらに、JNKのDominant-negative変異遺伝子の導入、あるいはanthrapyrazolone誘導体、SP600125(JNK特的阻害剤)を利用してその経路を遮断すると、MEK阻害剤とチューブリン重合阻害剤の併用によるアポトーシス誘導は大幅に抑制された。すなわち、MEK阻害剤とチューブリン重合阻害剤の併用によるアポトーシス誘導の増強において、JNKが重要な役割を果たしていることを明らかにした。