hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
興奮性シナプスに発現するクラスタリング分子の神経薬理学的研究

本研究ではこれらの蛋白質複合体の形成が興奮性シナプス発達に伴って時間的、空間的にどのように制御されているのか。特に、シナプス活動依存性の制御機構について明らかにする。NMDA受容体のクラスタリング分子として、PSD-95/SAP90が知られているが、私達は新たにSAP102がNMDA受容体と結合することを明らかにした。培養海馬神経細胞ではNMDA受容体の発現に伴ってSAP102が発現し、免疫組織化学的検討ではシナプスにおいて共発現していた。CaMキナーゼIIはNMDA受容体と結合することが知られているが、SAP102をin vitro、in situでリン酸化することを明らかにした。さらに、海馬CAl領域の長期増強に伴ってSAP102がリン酸化されることを確認した。このリン酸化反応はCaMキナーゼIIによるものであり、CaMキナーゼIIの自己燐酸化反応と同様に、SAP102のリン酸化反応は持続的であった。in vitroの実験によってSAP102はリン酸化されると、NMDA受容体から解離することが解った。SAP102にはPSD-95との結合や一酸化窒素合成酵素などのシグナル伝達分子が結合している。海馬長期増強に伴うSAP102のリン酸化反応はNMDA受容体のクラスタリングとシグナル伝達分子のシナプスでの局在を変化させる可能性がある。さらに、リン酸化反応の機能的役割を追究する。齧歯類の中枢神経系の興奮性シナプスではNMDA受容体の構成サブユニットが発達に伴ってNMDAR2BからNMDAR2Aに変化することが知られている。同時にNMDA受容体の主要なクラスタリング分子はNE-dlg/SAP102からPSD-95に変化していく。福永、宮本らはNE-dlgとNMDAR2B受容体との結合様式をラット脳シナプトソームを用いて検討した。カルシウム/カルモデュリンはNE-dlgとNMDAR2B受容体結合を強化するが、CaMキナーゼIIによるリン酸化反応によってNE-dlg/SAP102はNMDAR2Bから解離した。培養海馬神経細胞をグルタミン酸で刺激した後に活性型CaMキナーゼII, NMDAR2B、NMDAR2A、NE-dlg/SAP102、PSD-95の細胞内局在について検討した。NMDA受容体阻害剤とCaMキナーゼII阻害剤で培養細胞を処理すると、NMDAR2B、NE-dlgとPSD-95の膜での発現が有意に阻害された。NMDA2Aの発現には影響しない。以上のことからCaMキナーゼIIは細胞膜におけるNMDAR2Bの発現とNMDA受容体のクラスタリングに関与することが明らかとなった。竹内らは細胞分子生物学的手法を用いてCaMキナーゼIIがドーパミン受容体のゴルジ装置から細胞膜へのトランスポートに関与するという新しい知見を得た。CaMキナーゼIIの膜への輸送にはドーパミン受容体のC末端のシークエンスが重要であること、そのC末端に結合する分子を同定した。
ＣｌＣ―３のアイソフォーム間における機能的差異に関する分子生理学的研究

Cl-チャネル/トランスポーターファミリーに属するClC-3は、ClC-3aから3fの6つのイソ型が存在すると考えられているが、ClC-3dについては詳細が不明だった。本研究では我々がクローニングしたClC-3dを用いて電気生理学的解析を行い、ClC-3dがCd2+感受性の外向き整流性アニオン電流を生じるチャネルで、その性質はClC-3aとよく似ていることを明らかにした。またClC-3dは酸感受性又は容積感受性アニオンチャネルの分子実体とは異なることを示した。ClC-3の電気生理学的特性については未だ不明な点も多いが、本研究の成果はそれらを解明するための一助となるだろうClCチャネル/トランスポータファミリーに属するClC-3は約15年前にクローニングされ、以降多くの研究・解析が行われてきたが、チャネルとしての機能については不明な点が多い。ClC-3にはそれぞれ異なるN末、C末アミノ酸配列を持つa-fの6つのアイソフォームが存在すると考えられているが、アイソフォーム間の機能的な差異や、その差異が生じるメカニズムについても多くが不明のままである。本研究はa-dの4つのアイソフォームにおいてN末、C末の違いがClC-3の機能をどのように制御するのか明らかにすることを目的としている。特にアイソフォームd(ClC-3d)はこれまでに調べられていない新規のC末バリアントであり、これを含めた解析を行うことで研究に独自性を持たせている。本研究では、まず、これまでに実験報告の多いClC-3aと新規バリアントであるClC-3dを比較しながら実験を進めた。それぞれの細胞内局在を調べ、ClC-3aと-3dでは顕著な差があることを示した。またパッチクランプにより電気生理学的な解析を試み、ClC-3dに由来する電流を記録し、Cd2+がClC-3電流をpartialに阻害することを新規に発見した。電流の性質についてはClC-3dと-3aの間で顕著な差異は認められなかった。従ってClC-3dと-3aに見られるC末アミノ酸配列の差異は、それぞれのタンパクの細胞内局在の制御に関わるものと考えられる。今回の成果は基礎的ではあるが、ClC-3のチャネル機能を議論する上で今後重要になると考えている。成果は24年度に日本生理学会大会に於いてポスターとして発表し、25年度にはCell Physiol Biochem誌に論文として受理された(Pub Med ID: 24603049)。ClCチャネル/トランスポータファミリーに属するClC-3は約15年前にクローニングされ、以降多くの研究・解析が行われてきたが、チャネルとしての機能については不明な点が多い。ClC-3にはそれぞれ異なるN末、C末アミノ酸配列を持つa-fの6つのアイソフォームが存在すると考えられているが、アイソフォーム間の機能的な差異や、その差異が生じるメカニズムについても多くが不明のままであり、本研究ではa-dの4つのアイソフォームにおいてN末、C末の違いがClC-3の機能をどのように制御するのか明らかにし、ClC-3の機能に関する理解を深めることを目的としている。特にアイソフォームd(ClC-3d)はこれまでに調べられていない新規のC末バリアントであり、これを含めた解析をおこなうことで研究に独自性を持たせている。これまでClC-3のCl-チャネルとしての機能については複数の研究グループから互いに矛盾するようなデータが報告されている。研究代表者が所属する研究室においておこなった予備実験では強制発現系においてClC-3に由来する電流は記録できなかった。しかし本課題採択後に、同じ研究室に所属していた秋田天平氏(現・浜松医大・准教授)の協力の下、改めてパッチクランプにより電気生理学的な解析を試みたところ、ClC-3dに由来する電流を記録することが出来た。ClC-3d電流は+60mV以上で活性化する急峻な外向整流性を示し、一般的なCl-チャネル阻害剤には殆ど反応しないことがわかった。さらに電流の性質について過去の様々な報告を検証した事に加えて、Cd2+がClC-3電流を阻害することを新規に発見した。今回の成果は基礎的ではあるが、未だ混乱しているClC-3のチャネル機能を議論する上で今後重要になると考えている。成果は24年度に日本生理学会大会に於いてポスターとして発表し、論文を現在準備中である。アイソフォームd(ClC-3d)は我々が新規にクローニングした分子で、これまでに比較的実験報告の多いClC-3a分子と比べた場合、C末のアミノ酸配列が異なっている。25年度までは、この新規分子であるClC-3dをClC-3aと比較しながら実験を進めた。その結果、細胞膜における電流の性質については顕著な差異が無いが、それぞれのタンパクの細胞内局在パターンは異なることを示した。

従ってClC-3dと-3aに見られるC末アミノ酸配列の差異は、それぞれのタンパクの細胞内局在の制御に関わるものと考えられる。成果は26年度に論文として発表した(昨年度の報告書に記載済み)。細胞内局在の違いはClC-3aと、ClC-3aと比較した場合にN末のアミノ酸配列がそれぞれ異なるClC-3b, -cの間でも観察される。26年度はアイソフォーム間の細胞内局在に違いが生じるメカニズムを調べるために、ミュータント分子の作成を行った。ClC-3dとClC-3aのC末アミノ酸キメラ分子及びClC-3b, -cのN末アミノ酸デリーション分子を数種類ずつ作成した。ClCチャンネル/トランスポーターファミリーに属するClC-3は約20年前にクローニングされ、その後多くの研究が行われてきた。その過程でClC-3は容積感受性アニオンチャネルであるという説や酸感受性アニオンチャネルであるという説が提唱された。しかしそれらの説はコンセンサスが得られたとは言えず、ClC-3の電気生理学的な性質については不明な点が今なお多い。ClC-3は、少なくともマウスにおいては、N末、C末アミノ酸配列の異なるa-fの6つのアイソフォームが存在すると考えられているが、アイソフォーム間の機能的な差異やその差異が生じるメカニズムについても多くが不明だった。本研究ではまず、我々が新規にクローニングしたアイソフォームClC-3dとこれまでに実験報告の多いClC-3aを比較しながら研究を進め、ClC-3dとClC-3aでは電気生理学的な性質は似通っていること、新規アイソフォームが容積感受性や酸感受性チャネルではないこと、ClC-3dとClC-3aでは細胞内におけるタンパクの局在パターンに違いがあることを見出した。次に各アイソフォームの局在性に差異を生じるメカニズムを探索するため、ClC-3a,-3b, -3c, -3dのN末、C末改変分子を数種類作成した。研究期間最終年度である27年度は、ClC-3aとClC-3dを主に取り扱った。これらのC末キメラ分子をさらに数種類作成し、タンパクの局在パターンを数種の細胞内小器官マーカーとともに観察した。これまでのところ一部の改変分子で局在パターンに変化が観察されたが、そのような分子では細胞内におけるタンパクの発現量が野生型に比べて減少しているように見えた。局在性の違いはタンパク量の多寡と相関し、またC末端のアミノ配列はClC-3タンパクの安定性に関与している可能性が考えられる。今後、時間が許せばこの点をもう少し明らかにして成果の取りまとめを行いたい。Cl-チャネル/トランスポーターファミリーに属するClC-3は、ClC-3aから3fの6つのイソ型が存在すると考えられているが、ClC-3dについては詳細が不明だった。本研究では我々がクローニングしたClC-3dを用いて電気生理学的解析を行い、ClC-3dがCd2+感受性の外向き整流性アニオン電流を生じるチャネルで、その性質はClC-3aとよく似ていることを明らかにした。またClC-3dは酸感受性又は容積感受性アニオンチャネルの分子実体とは異なることを示した。
頭頸部癌における新規セリンプロテアーゼインヒビター;headpinの生物学的役割-その遺伝子治療への応用に関する研究-

また、headpin同様、maspin、SCCA1も正常扁平上皮に比し、頭頸部扁平上皮癌組織ではその発現は抑制されており、頭頸部扁平上皮癌患者の進行症例における血清SCC抗原上昇は癌におけるSCCA発現とは無関係であり、癌組織周囲のTリンパ球におけるSCCA1発現が寄与していることも報告した。headpinはdifferential display法を用いてわれわれがクローニングした新しいセリンプロテアーゼインヒビター:serpinであり、頭頸部扁平上皮癌組織において正常上皮に比しその発現はmRNA、タンパクレベルともに抑制されている。headpin遺伝子が存在する染色体18q21には同じserpin familyに属するmaspin, Squamous Cell Carcinoma Antigen(SCCA)の直伝子座が存在する。headpin発現の癌細胞に対する影響を調べる目的にheadpin cDNAを頭頸部扁平上皮癌由来の培養細胞株に導入し(stable transfection)、その表現型の変化を解析した。headpin発現株はベクターコントロール株に比し、in vitro細胞増殖能に変化はみられなかった。しかし、matrigelを用いた浸潤能の解析では、headpin導入株はコントロールに比し浸潤能が抑制されていた(P<0.05)。さらにnude miceの口腔底モデルを用いてheadpin導入株のin vitroにおける浸潤能について実験をおこなったところ、ベクターコントロールに比し、headpin導入株は浸潤能が抑制されていることが明らかとなった。また、購入したエレクトロポレーター(遺伝子導入装置)により、headpin cDNAをmiceに移植した腫瘍に導入しその抗腫瘍効果を調べる実験を行ったが、導入効率が悪く安定したheadpin移植腫瘍内の発現が得られず、headpinを標的とした遺伝子治応について効果を判定できるような結果は現在のところ得られていない。遺伝子導入のためのVectorを替えるなどして、実験を継続している。
構造刈り込み学習による淘汰結合と抽象化内部モデルの自律形成に関する研究

ニューラルネット(NN)工学で周知の「刈り込み」による淘汰原理は、自然脳の機能究明のためにも、結合・統合や内部モデル生成との関係で重視する必要がある。この具体化が本研究全体に共通する目的である。安井のCSDFと呼ぶアルゴリズムを軸に、以下に取り組んだ。(1)アナロジー学習・類推用ニューラルネットワークアナロジーによる理解や発想は、分析や論理を伴わず瞬時的であることが多く、脳機能の何かを反映している。NNによる従来の試みはAI的に硬直した処理形態を残し、「組み合せ爆発」の問題をかかえながら中途半端に終わっている。我々は本格的なアナロジー学習NNを開発した。この鍵となるのは、「CSDF刈り込み」で、これにより抽象化内部モデルが自律形成され、それはアナロジー記憶として新規データに対しての選択的アトラクターとして柔軟に働く。本テーマは、複数アナロジーや無関係データを含むDBを対象にした発展研究であり、抽象化モデルや記憶アクセス・照合を包含した結合・統合の脳モデルの例として一定の成功を収めたと考える。(2)独立成分分析(ICA)用オートエンコーダ・ニューラルネット我々のICA方式は、砂時計型NNにCSDF刈り込み機構を施したもので、他法とは異質の非情報理論的、非恣意的なアプローチである。刈り込みに生き残った非線形隠れ素子で源信号が自動再生される。外界における信号の混合状況は内部モデルとしてデコーダ部に自律生成される。次の観点より本方式の発展的応用を概ね成功裏に行った。◆ロバスト性/適応性(センサ突然故障、源信号突然増加)◆時変混合◆コンボリューション混合。(3)SOMにおける「刈り込み」の試みSOMを一般化した「mnSOM」というものを我々は最近提案したが、そこでの競合学習にCSDF刈り込みを用いることを考えた。この部分の実績は未だ出ていない。本研究は、その題目に沿って概ね順調に進んでいる。ただし、本調書の「11.研究発表」にあげた論文は2種類に分かれる。本科研費交付以前に研究内容自体は得られた完成度の高いもの(論文番号5,6,9,14,15)、そして、これら以外の現在進行中で途中段階を報告したものとである。論文のうち1-4,8,10,11,13などは従来のSOMを関数空間に拡張した我々独自のモジュラーネット型SOMに関するもので、一見すると、本研究題目にあまり関係がないようであるが、実は、今後「CSDF構造刈り込み」を適用することによりネットワークの性能や安定性を大きく改善できるものと期待している。その他、この約1年間に渡って「CSDF構造刈り込み」の応用として途中結果は一部報告しているものの、実情は苦闘中で未だ本格的な成果としては物足りず来年度に持ち越される課題も多々ある。この代表的なものは、(1)独立成分分析オートエンコーダのアイデアをコンボリューション混合の場合に対処可能なように発展させること、(2)アナロジー学習において複数アナロジー群が或る要素を共有する状況について抽象化モデルや結合・統合が如何なる影響を受けるか究明すること、(3)CSDFの画像圧縮あるいは画像欠損補填への試み、および、その関連でKL展開との理論的関係付けなどである。脳・神経系の究明のためにも、「刈り込み」による淘汰原理は、結合・統合や内部モデル生成の問題と連動させて活用できる筈である。安井が開発したCSDFと呼ぶアルゴリズムを軸に、以下のようなサブテーマに取り組んだ。

(1)アナロジー学習・類推アナロジーによる理解や発想は、分析や論理を伴わず瞬時的であることが多く、脳機能の何かを反映している。NNによる従来の試みはAI的に硬直した処理形態を残し、「組み合せ爆発」の問題をかかえながら中途半端に終わっている。我々の方式はアナロジー用の本格的なNNといえる。この鍵となるのは、「CSDF刈り込み」で、これにより抽象化内部モデルが自律形成され、それはアナロジー記憶として新規データに対しての選択的アトラクターとして柔軟に働く。本テーマは、複数アナロジーや無関係データを含むDBを対象にした発展研究であり、抽象化モデルや記憶アクセス・照合を包含した結合・統合の脳モデルの例として一定の成功を収めたと考える。(2)独立成分分析オートエンコーダ・ニューラルネット我々のICA方式は、砂時計型NNにCSDF刈り込み機構を施したもので、他法とは異質の非情報理論的、非恣意的なアプローチである。刈り込みに生き残った非線形隠れ素子で源信号が自動再生される。外界における信号の混合状況は内部モデルとしてデコーダ部に自律生成される。次の観点より本方式の発展的応用を概ね成功裏に行った。◆ロバスト性/適応性(センサ突然故障、源信号突然増加)◆時変混合◆コンボリューション混合。(3)SOMにおける「刈り込み」の試みSOMを一般化した「mnSOM」というものを我々は最近提案したが、そこでの競合学習にCSDF刈り込みを用いることを考えた。この部分の実績は未だ出ていない
酸化ストレスセンサーと選択的蛋白質分解系によるシグナリング複合体の構造と機能

本研究は酸化ストレスセンサーKeap1が関わるシグナル伝達機構を明らかとする目的で、転写因子Nrf2を分解抑制するE3酵素複合体の核となるKeap1-Cul3複合体、およびNrf2の活性化に関わるKeap1-p62-LC3複合体について、それぞれ相互作用解析および結晶構造解析を目指すものである。転写因子Nrf2はストレスに応答して酸化ストレスを消去する様々な酵素の発現に関わる生体防御因子である。これらの解析を通して、酸化ストレスから細胞を守るシグナリング系の構造生物学的な理解を深めることを目指したものである。Keap1-Cul3複合体の構造解析を行うために、Keap1-Cul3複合体について様々な条件で相互作用解析を実施した。Keap1のセンサーシステインに結合する阻害薬剤の有無、またこれら阻害剤が結合した状態を模倣したセンサーシステインへの部位特異的変異導入が複合体の安定性に与える影響を解析した。マウスCul3は溶解度が低く結晶構造解析には適さないことが明らかとなった。そこで、既に結晶構造が報告されているヒトCul3の発現系を構築した。Keap1-p62-LC3複合体については、定量的な相互作用解析を行った。結晶化に適した三者複合体を調製する条件検討を実施した。またKeap1-p62複合体の結晶構造解析を進めた。抗合成リン酸化p62ペプチド抗体を用いて、ストレス条件下でのリン酸化の有無についても検討を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、酸化ストレスセンサーKeap1が関わる二つの蛋白質分解シグナリング複合体の構造解析を目指すものである。一つはKeap1の直接のターゲットである転写因子Nrf2を分解する際にE3酵素複合体を形成するKeap1-Cul3複合体である。Nrf2は酸化ストレスを消去する様々な酵素群を活性化する転写因子であるが、ストレスの無い状態では常に分解されている。このNrf2の抑制機構を考える上でKeap1-Cul3複合体の構造解析は重要である。もう一つは、このNrf2と競合的にKeap1に結合する選択的オートファジー基質p62が関わる複合体についてであり、Nrf2の活性化機構の解明に重要な複合体である。Keap1-Cul3複合体の調製に向けて、Keap1のカルボキシル末端欠損変異体およびマウスCul3のカルボキシル末端欠損変異体について大腸菌での発現系を作成した。それぞれ可溶性の発現とKeap1-Cul3複合体形成を確認した。しかし、マウスCul3は溶解度に問題があり、結晶構造解析や定量的な生化学解析を行うためには条件の検討が必要であることが明らかとなった。Keap1-リン酸化p62-LC3複合体の調製に向けて、マウスKeap1アミノ末端欠損変異体について大腸菌での発現を行った。アミノ末端のタグを切断しない方がKeap1は安定であり結晶化に適していることが明らかとなった。また、p62についてはペプチド合成によって調製した。マウスCul3C末端欠損変異体の組換タンパク質は発現量が少なく、さらに溶解度が低く結晶構造解析には適さないものであった。機能解析については問題なく進めることができた。マウスCul3が結晶構造解析に適さないことが明らかとなったため、既に単体での結晶構造解析が報告されているヒトCul3C末端欠損変異体の発現ベクターを合成することとした。
真核生物染色体DNAの複製開始・伸長のMcm10タンパク質によるモニター機構

真核生物共通の染色体複製のメカニズムと複製開始・伸長のモニター機構を解明するために出芽酵母をモデル系として、染色体DNAの複製に必要である幾つかの因子について遺伝学的、生化学的、および細胞生物学的なアプローチを行ってきた。Mcm10は核内に局在してORC(Origin Recognition Complex)と共局在し、G1期においてはMcm7の局在とも一致するので核内の複製開始場所をつかさどってことが示唆された。mcm10変異との合成致死変異を分離することにより遺伝学にMcm10と相互作用する因子をスクリーニングしたところ、6種類の相補群に分けられる変異を分離することができた。そのうち、複製開始に関与する因子の変異が分離され、これはMcm10が複製開始に関与することを積極的に支持した。Mcm10は複製フォークの機能に積極的に関与し、Mcm10の欠損がS期の進行全体に影響を及ぼす可能性が示唆された。得られた新規の遺伝子SLM2、SLM6については、mcm10変異株では複製フォークの進行がゲノム上の至る所で妨げられ、異常な複製中間体が蓄積することを考えあわせると、Slm2/Slm6はこの様な複製異常を認識、修復している可能性がある。一方、出芽酵母のタンパク質抽出液を用いた試験管内複製開始複合体形成系を導入・改良し、複製開始に必須な役割を持つCdc7/Dbf4タンパク質リン酸化酵素の複製開始複合体への結合を解析した。今までのところ、S期に入ってからCdc7/Dbf4複製開始複合体へ結合し、その結合はS期チェックポイントの制御下に置かれていることを示唆する結果が得られている。真核生物共通の染色体複製のメカニズムを解明するために出芽酵母をモデル系として、染色体DNAの複製に必要である幾つかの因子について遺伝学的、生化学的、および細胞生物学的なアプローチを行ってきた。Mcm10タンパク質は真核生物間で保存されているMcm2-7蛋白質ファミリーと物理的に相互作用しており、複製開始に必須な因子であることがわかっている。また、以前の解析から、Mcm10は複製開始複合体の活性化および活性化されなかった複製開始複合体の解離に必要であることを示唆する結果が得られている。我々は、Mcm10は常に核内に局在してORC(Origin Recognition Complex)と物理的にも機能的にも相互作用していることを見い出した。我々はmcm10変異株では複製開始のみならずS期の完了も正常に行われていないことを見い出したので、伸長過程における役割を調べるためにDNAポリメラーゼII(ε)、DNAポリメラーゼII(δ)等、複製フォークの構成因子の欠損株とmcm10変異との二重変異株を作成して解析したところ、多くの二重変異株で生育異常が増強されることが分かった。また、チェックポイントに異常があるrad53変異とmcm10変異との二重変異株も生育異常が見られて非許容温度では、異常な細胞分裂が起っていた。これはmcm10変異では染色体複製が正常に行われず、チェックポイント機能無しでは生育できないためと考えられる。一方、mcm10変異との合成致死変異を分離することにより遺伝学にMcm10と相互作用する因子の分離を進めており、その一つが新生鎖のプロセシングに関与していると考えられているDna2であることがわかった。以上の様に、Mcm10は複製フォークの機能に積極的に関与している可能性と、Mcm10の欠損がS期の進行全体に影響を及ぼす可能性が示唆された。我々はMcm10の機能をさらに詳細に解析するために、mcm10変異との合成致死変異を分離することにより遺伝学にMcm10と相互作用する因子の分離を進めきた。6種類の相補群に分けられる変異を分離し、それぞれの遺伝子を同定した。そのうち、複製開始に関与するMCM2、MCM7、CDC45の変異が分離され、これはMcm10が複製開始に関与することを積極的に支持するものであった。また、一つが新生鎖のプロセシングに関与していると考えられているDna2であることがわかった。また、新規の遺伝子、SLM2、SLM6が得られ、それらの機能を解析中である。今までのところ、これらはDNA修復やチェックポイントに関与していることを示唆する結果が得られている。以上の様にmcm10欠損下でどのような異常が細胞内で起っているか、多面的に知ることが出来たので、今後はそれらを基に複製開始、進行のメカニズムについて新しい知見が得られると考えられる。真核

生物共通の染色体複製のメカニズムを解明するために出芽酵母をモデル系として、染色体DNAの複製に必要である幾つかの因子について遺伝学的、生化学的、および細胞生物学的なアプローチを行ってきた。Mcm10は核内に局在してORC(Origin Recognition Complex)と共局在し、G1期においてはMcm7の局在とも一致するので核内の複製開始場所をつかさどっていることが示唆された。mcm10変異との合成致死変異を分離することにより遺伝学的にMcm10と相互作用する因子をスクリーニングしたところ、6種類の相補群に分けられる変異を分離することができた。そのうち、複製開始に関与する因子の変異が分離され、これはMcm10が複製開始に関与することを積極的に支持した。また、一つが新生鎖のプロセシングに関与していると考えられているDNA2であることがわかった。Mcm10は複製フォークの機能に積極的に関与し、Mcm10の欠損がS期の進行全体に影響を及ぼす可能性が示唆された。また、新規の遺伝子SLM2、SLM6が得られ、それらの変異株の表現型を解析したところ、DNA傷害剤に感受性を示した。mcm10変異株では複製フォークの進行がゲノム上の至る所で妨げられ、異常な複製中間体が蓄積することを考えあわせると、Slm2/Slm6はこの様な複製異常を認識、修復している可能性がある。一方、アフリカツメガエルのMcm10ホモログを分離することが出来たのでその解析を進めている。アフリカツメガエルMcm10の抗体を作成し、卵抽出液を用いた試験管内複製系でMcm10を免疫除去しても予想に反してDNA複製は進行した。しかし、複製に伴ってMcm10がクロマチン画分に蓄積していくという興味深い現象が見られ、複製開始から複製フォークの形成に関与していることを示唆する結果を得た。真核生物共通の染色体複製のメカニズムを解明するために出芽酵母をモデル系として、染色体DNAの複製に必要である幾つかの因子について遺伝学的、生化学的、および細胞生物学的なアプローチを行ってきた。Mcm10は核内に局在してORC(Origin Recognition Complex)と共局在し、G1期においてはMcm7の局在とも一致するので核内の複製開始場所をつかさどってことが示唆された。mcm10変異との合成致死変異を分離することにより遺伝学にMcm10と相互作用する因子をスクリーニングしたところ、6種類の相補群に分けられる変異を分離することができた。
多相生命表を用いた要介護者数の推計と介護サービスの効果に関する研究

介護サービス利用の効果測定と要介護者の将来推計は人口の高齢化ともに重要な政策課題となっている。本研究では、要介護者に関する性・年齢別、要介護度の変化に関するデータを用い、介護サービス利用が要介護度の悪化に与える影響を評価するとともに、多相生命表の原理を用いて将来推計を行った。その結果、在宅高齢者が何らかの介護サービスを利用する場合、要介護度の悪化を防止することを示唆する結果が得られた他、多相生命表の原理を用いた要介護者数の推計と実際の値の比較を行うことが可能となった。介護保険制度が導入されて10年以上が経過し、課題点はあるものの、制度自体は定着してきているといえる。要介護度の改善・悪化に着目して、高齢者の自然経過や、介護サービスの介入効果について評価を行うことは、現在の介護保険制度の評価・改善にとって極めて意義の高いものである。3年計画の初年度である平成22年度の本研究では、東京都内の1保険者を対象として介護保険サービス利用状況、要介護認定に関するデータについて、当該保険者の「情報公開制度及び個人情報保護制度運営審議会」の審査・承認を得て、介護保険サービス利用状況別、性・年齢別、要介護度に関するデータを入手・分析し、高齢者の要介護度の悪化・改善に、介護サービスが及ぼす影響について検証を行うこととした。サービス利用の有無が要介護度の悪化に与える影響を検証にあたっては、要介護度の悪化をエンドポイント、要介護認定間隔を観察期間とし、性、年齢階級、要介護度を調整したCOX回帰分析を行った。本研究の結果、高齢になるほど、要介護認定を受ける者の割合も、サービス利用割合も増加すること、また、何らかの介護サービスを利用する場合には、要介護度の悪化に影響を与えうる調整可能な因子について調整を行った場合でも、サービス利用がない利用者に比較して要介護度の悪化に歯止めがかかる可能性が示唆された。本年度の研究では、1保険者のみを対象にしている点で限界はあるものの、介護サービスの効果に関して定量的な知見を得たことは、今後の介護保険制度の評価を行う上で高い意義があったと考えられた。介護保険制度が始まって10年以上が経過し、制度としても定着が見られるが、要介護度の観点から高齢者の自然経過や介護サービスの介入効果について評価を行うことは、現在の制度の評価や今後の制度設計・評価にとってますます重要となっている。平成23年度の本研究では東京都内の保険者に関する要介護認定の状況及び介護サービス利用状況についてのデータを分析資料として、要介護度の悪化・改善に介護サービスが及ぼす影響について明らかにすることを目的とした研究を実施した。研究実施にあたっては東京大学大学院医学系研究科・医学部倫理委員会の承認を得た他、要介護度・利用サービスに関するデータの利用に当たって当該保険者の「情報公開制度及び個人情報保護制度運営審議会」の審議・承認を得ている。解析にあたっては2009年10月と2010年10月の2時点において、双方とも有効な要介護認定を有する者を対象とし、要介護認定間隔を観察期間としてCOX回帰分析を行い、性、年齢階級、要介護度を調整した際の、介護サービス利用が要介護度の悪化に及ぼす影響について検証を行った。本研究の結果、年齢が上がるほど要介護認定を受ける割合が増加すること、在宅・施設系サービスともにサービス利用割合も増加していることを明らかにした他、性、年齢、要介護度といった因子の調整を行っても、介護サービスを利用している場合、介護度の悪化が抑えられる可能性が示唆される結果を得た。本研究は1保険者のみを対象にしている点で限界はあるものの、介護サービスの効果に関して定量的な知見を得られたものであり今後の介護保険制度の評価を行う上で高い意義があったものと考える。我が国の高齢化のスピードは世界でも類を見ないものであり、平成24年には65歳以上人口が初めて三千万人を超え、さらに今後「団塊の世代」が65歳になり始めた点を考慮すれば、我が国の人口の高齢化はますますそのスピードを上げることが見込まれている。このような状況を踏まえると、制度の持続可能性を維持する上では、質の高い介護サービスの提供とともに、要介護者の将来推計の重要性は益々増しており、介護サービス利用の効果と要介護者の将来推計に関する研究は、ますます重要な研究課題となっている。このような状況を踏まえ、平成24年度の本研究では、保険者のもつ要介護高齢者に関する性・年齢別、要介護度に関するデータを用い、多相生命表の原理を用いて将来推計を行い、実際の要介護者数と比較することで、その特徴と課題を明らかにすることを目的とした。その結果、要介護者全体の推計としてはほぼ実際の値に近い結果を得たものの、要介護度区分別には一定の誤差が出るという結果を得た。

多相生命表の原理を用いた将来推計は、現状の要介護認定の申請状況・介護サービスの提供パターンや効果が今後も継続するならばら、わずかな変化を検知することができるため、前提条件となる事象が安定している場合や比較的短期の推計に特に有利である可能性がある一方、小さな変化が一時的なものであった場合や、サンプル数が少ない場合に、小さな変化による影響が過大に推計結果に影響を与える傾向がある点には留意が必要である。要介護者数の推計に多相生命表の原理を用いた将来推計の精度を向上させる上では、客対数の増加とさらなる観察期間が必要である他、制度変更の影響や、介護サービスの利用意向といった情報も加えて一層の検討が必要であるものと考えられた。第70回日本公衆衛生学会総会において発表した内容を発展させ、英文原著論文として投稿したが、査読に時間がかかったため、同年度中には掲載に至らなかった点において、若干当初計画に比較して遅れているが、その他についておおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。要介護度の悪化・改善に影響を及ぼす因子に関する検討については、平成24年度中に原著論文として掲載されることを目指すとともに、平成24年6月に開催される国際学会であるAcademy Healthで発表を行い、専門家との意見交換や、最新情報の収集を行い、さらに研究を深化させてゆくこととしている。また、要介護者の将来推計に関しては、平成24年度に、平成23年度に実際に申請・認定が行われた要介護者数のデータとして公表されることを踏まえ、平成22年度に行った推計結果と実際の要介護者数を比較することによって、要介護者数の推計精度の検証と、さらなる推計精度の向上のための検討を行うこととしている。
最高エネルギーでの新粒子および新しい素粒子現象の探索

最重要課題であるヒッグス粒子の探索や超対称性粒子の探索の包括的な解析を行なってきた。常に新しいアイデアを取り入れるよう心がけ、かつ重点項目に研究を集中するように留意した。ヒッグス粒子の探索では、素粒子物理にインパクトを与える重要な結果を得ている。平成15年度には標準模型ヒッグス粒子探索に関してLEP4実験の結果を統合した最終論文を発表した。標準理論的なヒッグス粒子の質量をほぼ115GeV付近まで棄却し、電弱統一ゲージ理論の精密測定から約200GeV以上の質量を持つヒッグスボゾンを棄却したことは特筆に値する。これは将来の最高エネルギーでの研究の指針となり、LHCやリニアコライダーでの発見と詳細研究にますます期待がかかる。標準理論を超える理論として最も有力で、重力も含む4つの力の統一を実現する可能性を持つ超対称性理論の予言する新粒子群を系統的に探索し、理論に対して更に強い制限を課した。これらをいくつかの論文に纏め、投稿した。研究班「精密測定による素粒子相互作用の研究」と協同で、最近理論的研究の進む余剰次元に対する研究も行なった。精密測定の結果を用い、余剰次元のサイズが大きいと見えてくる重力子などの影響をOPALデータを用いて詳細に調べ、超次元の次元数とその大きさに制限をつけ論文を準備中である。昨年からNon-commutableのQEDのような新しい理論的提案に対する実験的研究も進めている。現在、我々の銀河系はおとめ座の方向に重力によって落ちているため、宇宙の2.7°K背景輻射の絶対静止系に対して我々の銀河系は動いていると考えられる。Non-commutableのQEDではこの様な運動をe+e-衝突実験の精密測定で測定できる可能性があるため、e+e-→γγのデータを用い、この理論におけるエネルギースケールの下限値を求める論文を発表した。本年度、ヨーロッパ素粒子研究所CERNの世界最大の電子・陽電子衝突型加速器LEPは衝突エネルギー192GeVでの運転に成功した後、段階的にエネルギーを上げ、9月には電子・陽電子衝突で202GeVという前人未踏のエネルギーを達成した。OPAL検出器は鉛ガラス電磁シャワーカロリメターを始め全ての基幹測定器が正確に動作し、データの収集に成功した。ビームの衝突頻度は昨年度を上回り、このため加速器によるバックグラウンドが心配されたが、これは解析に支障ない範囲に収まっていることがバックグラウンド・モニター装置からの情報でわかった。データ量の増大に伴いデータ記憶及び解析装置を増強し、解析を計画通りCERNと日本で分担して行なうことができた。既に第一段階の物理解析は終了し、結果はOPAL実験内の全体会議、国際/日本物理学会等で当研究担当者により発表された。最重要課題であるヒッグス粒子及び超対称性粒子の探索可能領域は、衝突エネルギーの増大に伴い急速に拡大した。特に標準理論的なヒッグス粒子探索においてはLEPの4実験で合わせた結果、その質量の下限値をほぼ110GeV付近まで上げることに成功したことは特筆に値する。更にこの結果から超対称性理論のパラメーターである二つのヒッグス場の真空期待値の比tanβで約3以下の領域も排除することができた。OPAL実験の結果には再構成された質量分布の106GeV付近にわずかではあるがデータ点の集中が見られ、超対称性理論的なヒッグス粒子によるものである可能性が残されている。チャージーノ・スカラートップ等超対称性粒子も今までの探索領域から約10GeV近く更に高い質量まで探すことができた。宇宙論で問題とされるダークマターの候補であるニュートラリーノの質量にも更に強い制限を与えることができた。又、来年度の実験に対する準備も順調に進められている。本年度、欧州素粒子研究所CERNの世界最大の電子・陽電子衝突型加速器LEPは設計値を越えて、電子・陽電子衝突で209GeVという正に前人未踏のエネルギーを達成した。新しい加速スキームによりエネルギーが数時間毎に変化し、必要なシミュレーション・データの量が倍増した。加速器からのバックグラウンドが増加したが、解析を改良することで補えた。既に第一段階の物理解析を終え、結果はOPAL実験内の全体会議、国際/日本物理学会等で当研究担当者により発表された。新粒子生成のいかなる兆候も見逃さないように、実験結果を常時アップデートし、LEP実験全体でつき合わせた。エネルギーが上がったことで、新粒子探索の質量領域が更に広がった。チャージーノ・スカラートップ等超対称性粒子では、昨年までの探索領域から約10GeV近く高い質量まで探すことができた。更に、今まで探されていなかった新しいモードも調べられた。特に注目すべき結果が、最重要課題であるヒッグス粒子探索において得られた。標準理論的なヒッグス粒子探索において、LEPの4実験で合わせた結果、115GeV付近にシグナルの兆候が見られている。現在までの結果では、ヒッグス粒子生成に対応するバックグラウンドからの超過が主要2モードで見られており、ALEPH,L3,OPALの独立な3実験でも兆候が見えている。9月及び11月に発表されたこの結果は世界中の新聞で報道され、大きな反響を得た。

残念ながら、CERNの次期計画に与える影響などから11年間に渡るLEPの運転は本年度で終了することになったが、正に世界中の素粒子物理学者の関心を集めている特筆すべき結果である。現在、最終結果を得るため更に詳細な解析を行なっている。平成12年末のLEPの運転終了後、最重要課題であるヒッグス粒子の探索や超対称性粒子の探索の包括的な解析を行なってきた。常に新しいアイデアを取り入れるよう心がけ、かつ重点項目に研究を集中するように留意した。この結果、OPALの他の外国の協同研究者がなし得なかった非常に重要な貢献を物理解析において成し遂げることが出きた。ヒッグス粒子探索の探索では、素粒子物理にインパクトを与える重要な結果を得ている。\item今までの解析結果から、標準理論的なヒッグス粒子探索においてはLEPの4実験で合わせた結果、その質量の下限値をほぼ114GeV付近まで上げることに成功したことは特筆に値する。これは将来の最高エネルギーでの研究の指針となり、非常に重要である。\item超対称性で預言されるヒッグス粒子の探索を結果から超対称性理論のパラメーターである二つのヒッグス場の真空期待値の比tan$\beta$で約3以下の領域も排除することができた。標準理論を超える理論として最も有力で、重力も含む4つの力の統一を実現する可能性を持つ超対称性理論の予言する新粒子群を系統的に探索した。\itemチャージーノはほぼ全ての超対称性パラメータ領域で質量の下限を103GeV程度まで上げることができた。\item宇宙論で問題とされるダークマターの候補であるニュートラリーノの質量にも更に強い制限を与えることができた。\item従来の超重力に起因するモデルだけでなく、Gauge mediated SUSY breakingでの超対称性粒子の探索も精力的に行なわれ、強い制限を得ることができた。研究班「精密測定による素粒子相互作用の研究」と協同で、最近理論的研究の進むextra dimensionに対する研究を行なった。精密測定の結果を用い、extra dimensionの効果で見えてくると期待される重力子などの影響をデータの中で詳細に調べた。これにより、超次元の次元数とその大きさに制限をつけることができた。この結果、OPALの他の外国の協同研究者がなし得なかった非常に重要な貢献を物理解析において成し遂げることができた。ヒッグス粒子の探索では、素粒子物理にインパクトを与える重要な結果を得ている。平成14年度には標準模型ヒッグス粒子探索に関する最終論文を発表した。この結果をLEPの他の3つの実験と合わせ、標準理論的なヒッグス粒子の質量の下限値をほぼ114GeV付近まで上げることに成功したことは特筆に値する。これは将来の最高エネルギーでの研究の指針となり、非常に重要な成果である。
向精神薬のin vivo micro-dialysisによる薬理学的研究

本研究の目的は次の3点であった。1.マイクロダイアリーシスの方法論の完成2.向精神薬の薬理効果のマイクロダイアリーシスを用いた検討3.脳内ドーパミン放出の調節に関する部位差の検討以下にそれぞれについての成果を概説する。1.着脱可能なマイクロダイアリーシス用のプローベを開発し、同一個体での慢性実験を可能にした。またプローベの試験管内でのテストを行い、その回収率が、(1)還流液の流速、(2)半透膜の部分の長さ、(3)半透膜周囲の温度の影響を受けることを明らかにした。以下の成果はこのプローベを応用して得られたものである。2.代表的な向精神薬であるハロペリドールを投与したところ、線条体、側坐核においてドーパミン自己受容体遮断効果によると思われるドーパミンの遊離促進、DOPAC,HVAの増加を確認した。一方自己受容体に対してはアゴニストとして働くと考えられている新しい向精神薬であるOPCー4392では、線条体、側坐核においてドーパミンの遊離の減少が見られた。3.ドーパミンレセプターのアゴニストであるアポモルフィンを投与したところ、線条体のみならず、前頭葉においても容量依存的に、DA,DOPAC,HVAの減少を来した。このことは、従来自己受容体の存在が否定されてきたmedial prefrontal cortexにおいても自己受容体を介するドーパミン遊離の調節が行われている可能性を示唆するものであると考えられる。以上、安定したマイクロダイアリーシス法が確立されたことにより、ln vivoで脳内伝達物質と向精神薬との関係を明らかにすることができるようになったが、今後種々の方面に応用が可能であると考えられる。
ラットに馴化したSARSコロナウイルスの分離

重症急性呼吸器症候群(SARS)の原因ウイルスであるSARSコロナウイルス(SARS-CoV)は、ラットへ実験的に感染させてもウイルスが十分に増殖できない。本研究では、ラットに馴化したSARS-CoVを分離することを目的とし、SARS-CoVをラット型レセプター(ラットACE2)を発現する哺乳培養細胞で継代培養した。また、得られたウイルスの変異を解析し、SARS-CoVが異なる動物種へ馴化する分子メカニズムについて検討した。ラットACE2発現細胞で15代継代したウイルス(ratP15)は、ラットACE2発現細胞では、親株であるFrankfurt-1に比べ100倍以上高い増殖効率を示した。一方、mutantラットACE2発現細胞では、ratP15とFrankfurt-1は同程度に増殖した。ratPl5のS遺伝子にはS1ドメインのレセプター結合部位(RBD)に変異がなく、S2ドメインに2カ所アミノ変異が認められた。そのうち1カ所はHeptad repeatドメインに位置していた。また、SARS-CoVS蛋白質を被ったVSVシュードタイプを用いた解析では、これらの変異S蛋白質を被ったシュードタイプはratACE2発現細胞に高い感染性を示した。本研究により、ラットACE2発現細胞に高い感染性を示すSARS-CoVを得ることができた。従来、S1ドメインのRBDの変異が馴化に重要であると考えられていたが、ratP15ではS2ドメインにアミノ酸変異が認められたことから、SARS-CoVの他動物種への馴化には、RBDの変異のみならず、S2ドメインの変異によるS蛋白全体の構造変化なども関与すると考えられた。本研究は、重症急性呼吸器症候群(SARS)の病原体であるSARSコロナウイルス(SARS-CoV)を、ラット型レセプター(ラットACE2)を発現する哺乳培養細胞で継代培養し、ラットに馴化したSARS-CoVを分離することを目的とする。平成17年度は1.ラットACE2のクローニングとラットACE2発現細胞の作製および、2.ラットACE2発現細胞におけるSARS-CoV増殖効率の解析を行った。ラット腎よりRT-PCRにて得られたラットACE2 cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクターpcDNA3.1にクローニングした。また、ラットACE2の一部のアミノ酸配列をヒトACE2のアミノ酸配列に置き換えバリアント型ラットACE2を作製し、同様にクローニングした。CHO細胞にこれらの発現プラスミドを導入後、SARS-CoVを感染させたところ、バリアント型ラットACE2発現細胞ではウイルスは効率よく増殖したのに対し、ラットACE2発現細胞では、増殖効率はバリアント型ラットACE2発現細胞の約1/100と低いレベルであった。このことから、ラットACE2はSARS-CoVのレセプターとして十分に機能しないことが示された。本研究から、SARS-CoVはラット由来細胞に侵入する際にラットACE2を効率よく利用することができないと推測された。しかし、SARS-CoVなどのRNAをゲノムとして持つウイルスは培養細胞を用いて複数回継代することにより、ゲノムに変異を生じることが多い。このことから、ラットACE2発現細胞でSARS-CoVを複数回継代培養することにより、ラットACE2に依存したウイルスゲノムの変異の蓄積あるいはセレクションによりラットACE2に馴化したウイルスが分離される可能性が高い。今後、ラットACE2発現CHO細胞を用いたウイルスの継代培養を行い、分離されたウイルスの性状解析を行う予定である。本研究では、SARS-CoVをラット型レセプター(ラットACE2)を発現する哺乳培養細胞で継代培養し、ラットに馴化したSARS-CoVを分離するとともに、SARS-CoVが異なる動物種へ馴化する分子メカニズムについて検討した。

平成17年度の研究からSARS-CoVはラットACE2を効率よく利用することができないことが明らかになった。しかし、SARS-CoVなどのRNAをゲノムとして持つウイルスは培養細胞を用いて複数回継代培養することにより、ゲノムに変異を生じることが多い。このことから、ラットACE2発現細胞でSARS-CoVを複数回継代培養することにより、ラットACE2に依存したウイルスゲノムの変異の蓄積あるいはセレクションが生じ、その結果ラットACE2に馴化したウイルスが分離される可能性が高い。そこで、平成18年度は、ラットACE2を発現するCHO細胞で継代した。ラットACE2発現細胞で15代継代することにより、ラットACE2発現細胞で高い増殖性を示すウイルス(ratP15)を得ることが出来た。ratP15のS遺伝子にはS1ドメインのレセプター結合部位(RBD)に変異がなく、S2ドメインに2カ所アミノ変異が認められた。従来、S1ドメインのRBDの変異が馴化に重要であると考えられていたが、ratP15ではS2ドメインにアミノ酸変異が認められたことから、SARS-CoVの他動物種への馴化には、RBDの変異のみならず、S2ドメインの変異によるS蛋白全体の構造変化なども関与すると考えられた。
神経網膜におけるフリーラジカル制御機構に対する硝子体手術の影響の解析

(1)研究計画1.過酸化水素感受性蛍光色素のキャリブレーション2.網膜細胞内過酸化水素定量3.光照射による網膜細胞内過酸化水素活性への影響4.人工潅流液中グルタチオンの網膜保護作用(2)方法1.過酸化水素感受性蛍光色素のキャリブレーション過酸化水素感受性蛍光色素には2、7-ジクロロフルオレセイン(DCF)を用いるためフルオロトロンマスター(コヒレント社、現有設備)におけるDCF濃度の測定範囲を10-9-10-5Mの間でキャリブレーションキュベットを用いて蛍光強度を計測する。2.硝子体手有色家兎(2.3-2.5kg)をミドリンPにて散瞳後、全身麻酔下に硝子体手術を施行。手術用顕微鏡(現有設備)下で開瞼器にて開瞼の後、結膜切開し強膜を露出。輪部より4mmの部位にMVRナイフを用いてinfusion port作成しinfusion tubeを縫合固定。約90度離れた部位にsuction-cutter portを作成しオキュトーム10000(アルコン社、現有設備)を用いて約1分間硝子体切除術施行。硝子体切除後、潅流速度を1.0cc/min.に調節する。3.網膜細胞内過酸化水素定量網膜細胞内過酸化水素の定量には過酸化水素と反応し蛍光を発する2、7-ジクロロフルオレッセイン(DCF)を指標に用いる。網膜の神経細胞に取り込ませるために、細胞膜を容易に透過するDCFの前駆体、2、7-ジクロロフルオレッシンジアセテート(DCFH-DA)を用いる。硝子体手術後、5オMDCFH-DAにて潅流すると網膜細胞内に拡散したDCFH-DAは細胞内のエステラーゼにより膜を透過しない無蛍光の2、7-ジクロロフルオレッシン(DCFH)に代謝され細胞内にトラップされる。DCFHは細胞内に生じた過酸化水素によって酸化され蛍光を発するDCFになりピコモルレベルの過酸化水素を検出できる。これをフルオロトロンマスター(コヒレント社)を用いて490nmで励起すると520nmにピークを持つ蛍光を発する。これを利用して網膜細胞内過酸化水素活性を定量する。4.光照射負荷手術顕微鏡による光照射を1800luxおよび3600luxに設定しそれぞれ10分、20分、30分の条件で網膜を照射し、その後の網膜細胞内の過酸化水素活性を定量する。5人工潅流液中グルタチオンの網膜保護作用対照の潅流液にはBSSを用いる。これに酸化型グルタチオンを添加したBSSplusは角膜保護作用があることは確認されているが、網膜保護作用については明らかではない。網膜細胞内過酸化水素定量により、保護作用の有無を確認する。(3)研究結果1.通常の硝子体手術野の後30分間の硝子体潅流液潅流では網膜に2.2+1.1pMDCFが認められたが、30分間の光照射を行うと21.7+4.8pMDCFを認め、これは統計学的に有意であった。2.潅流液に酸化型グルタチオンを投与することにより、網膜内DCFは4.9+4.1pMに抑制され、これは統計学的に有意であった。(4)結論1.硝子体手術における顕微鏡光刺激により網膜内過酸化水素は有意に増加した。2.潅流液中のGSSGは光刺激による網膜の過酸化を有意に抑制した。3.潅流液中のGSSGは網膜内に移行しGlutathione redox cycleに利用されている可能性が示唆された。

硝子体手術後、5オMDCFH-DAにて潅流すると網膜細胞内に拡散したDCFH-DAは細胞内のエステラーゼにより膜を透過しない無蛍光の2、7-ジクロロフルオレッシン(DCFH)に代謝され細胞内にトラップされる。DCFHは細胞内に生じた過酸化水素によって酸化され蛍光を発するDCFになりピコモルレベルの過酸化水素を検出できる。これをフルオロトロンマスター(コヒレント社)を用いて490nmで励起すると520nmにピークを持つ蛍光を発する。これを利用して網膜細胞内過酸化水素活性を定量する。4.光照射負荷手術顕微鏡による光照射を1800luxおよび3600luxに設定しそれぞれ10分、20分、30分の条件で網膜を照射し、その後の網膜細胞内の過酸化水素活性を定量する。5人工潅流液中グルタチオンの網膜保護作用対照の潅流液にはBSSを用いる。これに酸化型グルタチオンを添加したBSSplusは角膜保護作用があることは確認されているが、網膜保護作用については明らかではない。網膜細胞内過酸化水素定量により、保護作用の有無を確認する。(3)研究結果1.通常の硝子体手術野の後30分間の硝子体潅流液潅流では網膜に2.2+1.1pMDCFが認められたが、30分間の光照射を行うと21.7+4.8pMDCFを認め、これは統計学的に有意であった。2.潅流液に酸化型グルタチオンを投与することにより、網膜内DCFは4.9+4.1pMに抑制され、これは統計学的に有意であった。(4)結論1.硝子体手術における顕微鏡光刺激により網膜内過酸化水素は有意に増加した。2.潅流液中のGSSGは光刺激による網膜の過酸化を有意に抑制した。3.潅流液中のGSSGは網膜内に移行しGlutathione redox cycleに利用されている可能性が示唆された。