hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体1/fゆらぎの本質は何か

このための共通の背景を持つために、心臓血管系の制御機構に関するサーベイを行った。この枠組みに沿って、これまで心拍時系列の解析に用いられてきた解析手法に関する批判的な検討、大域的には1/fゆらぎを呈することが知られている心臓血管系信号の状態依存性の解析、および心拍時系列解析の臨床的意義の検討等が行われた。また新たに、脳死と心拍1/fゆらぎという重要な視点が加わり、この方向でのさらなる発展が期待される。3.神経インパルス系列、瞳孔径、活動量などにおける1/fゆらぎ現象の薬理学的、生理学的メカニズムの追究や解析に加えて、生体時系列データの長時間変動の中に、1/fゆらぎ現象が存在することを確かめるために、フリーラン下にあるネコの心拍時系列を数日間にわたって連続記録し、スペクトル解析を行った。この結果、日周性リズムが減弱した状態では、10^<-5>10^<-4>Hzの帯域スペクトルにおいても1/f構造が存在することが確認された。4.1/fゆらぎの数学的な解釈やモデリングについては、1/fゆらぎの独立増分過程としての数学的記述、1/fゆらぎを呈する点過程のバイスペクトルのモデル化などが行われた。1.今日最も関心が寄せられている心拍リズムの1/fゆらぎに関して、ネコを用いた動物実験によりその低周波限界についての検討を行った。まず、ネコの心耳に電極を直接取り付けることにより、P-P間隔を長時間にわたり安定に計測する技術を完成させ、連続4日間にわたる計測を下記の3つの異なる実験条件下で行った。(1)予備的実験として、実験者とネコとは、給餌・給水時に相互干渉し、外乱が頻繁に与えられた場合。(2)実験者とネコとは4日間のうち極く短時間2回接触した以外はフリーランの状態で計測が行われた。但し、ネコの可動範囲は(1)の場合より限局された状態であった。(3)(2)と同様にフリーランの状態で、ネコは相対的に広い範囲を動くことができた。2.上記の3条件下のP-P間隔の10^<-5>10^<-1>HZの帯域のパワースペクトル密度を計算したところ、いずれも極めて類似した1/fスペクトルパターンを示した。いずれの場合もハートレートがdampedoscillationを示しており、この帯域、この状態での1/fスペクトルパターンはロバストであると判断された。3.今回得られた3つの条件に対する計測は環境条件に対する順応過程においてなされたものであるので、順応時間を十分とった場合の、計測実験を継続しつつある。4.心臓血管系の制御システムにおいては、主として血圧の制御が重要であり、これが神経性、液性、局所性機構によって達成されている。それに対して、ハートレートの定置制御系は存在せず、それに影響を与える因子は非常に多い。すなわち、この様な心拍に影響を与える自由度の大きさが、それが1/fゆらぎすることの背景にあるだろうとの見通しを得つつある。5.本研究のもう一つの柱であるの脳単一ニューロン活動のレム睡眠時1/fゆらぎに付いては、実行系ニューロンにおけるその時間空間的な普遍性が確かめられた。数理的には、時系列に存在するクラスター構造が1/f特性を作り出していることが示された。また、物理的には、数多くのニューロン素子が非線形相互作用するネットワークを構成していることに、1/fゆらぎが現れる本質があるものとの仮説が提唱された。6.本年度は最終年度であるが、動物実験を追加した後に、成果報告書を提出する予定である。
摂食亢進ホルモン・グレリンによる自律神経の恒常性維持機構

本研究では、グレリンによって自律神経機能がどのように調節されるかを検討した。その結果、グレリンが血圧.心拍や体温を低下させ、消化管運動を亢進させることが明らかになった。本研究は、エネルギー代謝調節ホルモンのグレリンが自律神経機能を調節するメカニズムを明らかにすることを目的として計画した。平成20年度は、胃から分泌されたグレリンがどのような作用機序で体温調節を行うのかについての解明を中心に研究を進めた。夜行性であるマウスの体温は、行動期の暗期に高く休息期の明期に低い、明確な日内リズムを示す。しかしながら、グレリン遺伝子欠損マウスでは体温の変動が短い周期で起き、体温の日内リズムに乱れが観察された。一方、このマウスにグレリン受容体アゴニストを長期間投与することによって野生型に近い体温リズムを観察することができた。そこで、胃から分泌されたグレリンがどのような機構で体温調節を行うのかを検討したところ、グレリンによる食欲調節の場合と同様に、胃の迷走神経を介して延髄孤束核へシグナルを伝えることが明らかとなった。グレリンのシグナルが中枢内でどのような神経回路により伝わるのかについては現在解析中だが、免疫組織化学的実験から延髄縫線核を介することは示すことができた。褐色脂肪組織での発熱は、交感神経末端から分泌されるノルアドレナリンの刺激が褐色脂肪細胞のβ3アドレナリン受容体を介してアンカップリングプロテインの活性や発現を上昇させることにより生じる。そこで、まず電気生理学的な実験を行って褐色脂肪組織へ入力する交感神経活動を検討した結果、グレリン投与によって褐色脂肪組織へ入力する交感神経活動は減弱することが示された。さらに、グレリンの長期投与は交感神経末端のノルアドレナリン合成酵素系の発現も低下させ、絶食時のグレリン遺伝子欠損マウスでは血中のノルアドレナリン含量が高値を示すなど。褐色脂肪組織の発熱に対しグレリンは交感神経の入力系を総じて低下させることが示された。平成21年度は、グレリンによる血圧調節機構についても検討を進める計画である。本研究では、テレメトリー自動計測システムを用い、生体内に埋込んだ送信器によって動物にストレスを与えることなく、経時的にグレリン遺伝子欠損(KO)マウスの血圧や体温を観察した。(1)血圧・心拍に見られる基礎値と日内リズムの異常の解析:KOマウスでは血圧・心拍の基礎値と日内リズムに若干の異常が認められたが、高食塩食負荷実験では、野生型マウスとの間に大きな差を認めなかった。一方、KOマウスを用いて投与実験も行なったが、投与操作によるノイズが予想以上に大きく、有効な結果を得ることができなかった。現在投与法の検討を行っているが、代替実験として馴化した食塩感受性高血圧ラットを用いた実験を行なったところ、グレリン受容体拮抗薬の長期投与によって心臓の交感神経終末に存在するカテコールアミン合成酵素の遺伝子発現量が増加することなどが明らかとなった。(2)体温に見られる基礎値と日内リズムの異常の解析:KOマウスでは行動リズムに異常は認められなかった。一方で、KOマウスでは絶食時に見られる体温低下のないことが明らかとなったが、これはグレリンが褐色脂肪組織に入力する交感神経活動を抑制し、アンカップリングプロテイン遺伝子の発現を抑制する方向に働くためであることが見いだされた。(3)消化管の消化液分泌や蠕動運動の解析:KOマウスでは消化管運動が低下していた。一方、グレリンやグレリン受容体アゴニストの投与は消化管運動を充進した。以上、(1)-(3)の研究から、グレリンは自律神経機能と密接に関与していることが示された。今後、詳細なメカニズムの解明や、病態との関わりなどを明らかにしていきたい。
スズを含む特異なπ電子系の合成とその反応、構造及び物性

1.9,9,10,10-テトラハロ-9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンの合成と反応本研究では新規な9,10-ジスタンナアントラセンを合成標的化合物に設定し、その前駆体の合成に必要な9,9,10,10-テトラハロ置換体の合成を検討した。まずスズ上にp-メトキシ基を有する9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンを新規に合成し、そのハロゲン化によって初めての9,9,10,10-テトラハロ-9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンの合成に成功した。このうちヨウ素体に関してはそのX線構造解析にも成功し、中心の六員環部分が平面構造であることを明らかにした。さらに、得られたテトラハロ体と種々のアルキルリチウムの反応により、スズ上にアルキル基を有する9,10-ジハロー9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンの合成にも成功した。現在、この化合物の還元反応による9,10-ジスタンナアントラセンの合成を検討中である。2.初めてのスタンノールジアニオンの合成我々が先に初めての合成に成功したビ(1,1-スタンノール)は芳香族性を有するシクロペンタジエニルアニオンのスズ類縁体として興味深いスタンノールアニオンの前駆体になると予想される。そこで、ビ(1,1-スタンノール)にリチウムを作用させると、反応溶液はアニオン種の生成を示唆する濃赤色を呈した。この反応をNMRで追跡したところ、反応の初期段階ではスタンノールアニオンが生じているが、さらに還元反応が進行し、スズ上の置換基の脱離を伴い初めてのスタンノールジアニオンが合成できることがわかった。各種NMR測定の結果、得られたスタンノールジアニオンはかなりの芳香族性を有していることが示唆された。スタンノールジアニオンは芳香族性の概念が第5周期のスズの系にまで拡張できることを提示する重要な化学種といえる。1.9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンのハロゲン化本研究では新規な9,10-ジスタンナアントラセンを合成標的化合物に設定し、まず我々が合成に成功した新規な9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンのスズ上にハロゲンを導入することを検討した。スズ上にアルキル基を有する9,10-ジヒドロ-9,10-ジスタンナアントラセンの臭素及びヨウ素を用いたハロゲン化反応では、スズ-フェニル結合が選択的に切断され、アントラセン骨格が壊れることがわかった。そこで、スズ-メチル結合を切断してスズ上に塩素を導入する反応が知られている三塩化ホウ素及び四塩化ゲルマンとの反応を検討したところ、反応は速やかに進行し、単一の生成物を与えた。その質量スペクトルを測定したところ、アントラセン骨格を保ったままスズ上が塩素化された化合物に由来すると考えられるピークを観測した。現在、その生成物のX線構造解析を検討中である。2.ビ(1,1-スタンノール)及びスタンノールアニオンの合成これまでに合成例がないビ(1,1-スタンノール)を初めて合成することに成功した。この化合物はスタンノール骨格がスズ-スズ結合を介して繋がっている初めての化合物で、室温で可視部に蛍光を観測したことより、新規なπ電子系化合物として興味深い。ビ(1,1-スタンノール)は芳香族性を有するシクロペンタジエニルアニオンのスズ類縁体として興味深いスタンノールアニオンの前駆体になると予想される。そこで、ビ(1,1-スタンノール)にブチルリチウムを作用させたところ、反応溶液はスタンノールアニオンの生成を示唆する濃赤色を呈した。この反応混合物にヨウ化メチルを作用させたところ、1-メチル-1-フェニルスタンノールが得られたことから、反応の中間に初めてのスタンノールアニオンが発生していることが示された。

この反応をNMRで追跡したところ、反応の初期段階ではスタンノールアニオンが生じているが、さらに還元反応が進行し、スズ上の置換基の脱離を伴い初めてのスタンノールジアニオンが合成できることがわかった。各種NMR測定の結果、得られたスタンノールジアニオンはかなりの芳香族性を有していることが示唆された。スタンノールジアニオンは芳香族性の概念が第5周期のスズの系にまで拡張できることを提示する重要な化学種といえる。
ヘテロ核酸による肺細胞遺伝子制御

ビタミンEをDNA-RNA2重鎖に結合させたヘテロ2本鎖核酸(Toc-HDO)は、これまでのASOやsiRNAと比較してm-RNA遺伝子発現抑制効果が高く、これまでの方法と比較してより効果的に疾患治療が可能となり、また低投与量で作用するため副作用の低減が期待される。これので肺に対しての検討は肺組織全体での評価であり、肺のどのような細胞群でどの程度遺伝子を抑制できるかなどの詳しい事は解っていない。そのため肺の遺伝子治療として実用化するには、基礎的なデーターが欠如している。今回の研究は臨床応用研究を可能とする基礎的データーを提供することにある。まずヘテロ核酸静脈注射後の、肺内分布を検討した。その結果肺組織では、特にII型肺胞上皮細胞、樹状細胞、マクロファージに分布することが示された。次に肺組織における遺伝子発現とタンパク質発現の抑制効果を検討するため、ターゲットとなる遺伝子の異なる2種類のヘテロ核酸Toc-SR-B1-HDO, Toc-DMPK-HDOを用いて検討を行った。まずSR-B1はおもにII型肺胞上皮に発現する蛋白であり、DMPKは肺胞領域のII型肺胞上皮以外の細胞に発現することを二重蛍光免疫染色で示した。以上よりヘテロ2本鎖核酸(Toc-HDO)は、肺組織において特にII型肺胞上皮細胞に多く取り込まれて遺伝子発現および蛋白合成を強く抑えるが、その他の細胞にも取り込まれて作用することが判明した。当当大学神経内科教授横田先生が開発したヘテロ核酸は肺組織においても遺伝子発現抑制効果が強いことが判明した。さらに手法を増やして検討中である現在、ヘテロ2本鎖核酸(Toc-HDO)による肺の各組織におけるm-RNA抑制を検討するためにin situ hybridizationを行なっている。また蛋白質合成抑制の定量的評価のためWestern blottingを行なっている。今後、Toc-HDOによる臨床応用研究を可能とするためには、肺疾患のモデル動物および適切な遺伝子の抑制が必要であるが、現在検討中である。経費削減努力の結果、必要経費を抑制することが可能になった。次年度も引き続き経費削減努力を続けながら研究を遂行する。
メタボリックシンドロームに対する効果的な運動療法支援法の開発

本研究を通じてメタボリックシンドローム患者の運動介入に関しては運動量増加という観点から歩数の増加、体力増加などを積極的に支援していくことの重要性が明らかとなった。ただ運動量の増加だけでは不十分で一方では血圧低下の観点からはリラックスを主目的とした東洋的運動の効果も重要であり、日常生活にこれらの有酸素運動と東洋的運動をうまく組み合わせることで効果的な運動療法になると考えられた。したがって運動療法支援にはこれらの運動を組み合わせて支援することが重要と考えられた。メタボリックシンドローム患者の食事ならびに生活活動量に関する基礎調査を行った。(対象)兵庫県下の医院に通院中のメタボリックシンドローム患者381例(男性:247例、女性134例)を対象とした。(方法)簡易食物摂取状況調査票を用いて、摂取エネルギー量、たんぱく質、糖質、脂質摂取量を算出した。身体活動量についてはIPAQ日本語版(short version)を用いて一日当たりの消費エネルギー量を算出した。(結果)総摂取エネルギー量は男性143.5±375.0Kcal、女性1503.3±348.2Kcalと良好な摂取量であった。総摂取エネルギー量に対する脂肪エネルギー比率は男性24.29±6.32%、女性23.97±6.63%といずれも25%未満であり良好な結果が得られた。次に身体活動量に関しては男性の消費カロリーは377.54±675.0Kca1、女性331.92±531.0Kca1と男性、女性の双方で300Kcalを上回っているものの、標準偏差が極めて大ぎかった。そこで身体活動量における詳細な検討を行うと、男性では247例中171例(69%)において消費カロリーが300Kcal以下となり、98名(40%)は消費カロリーが100kcal以下の極端な運動不足群となった。女性でも同様の傾向が見られ、134例中87例(65%)において消費カロリーが300Kcal以下となり、61名(46%)は消費カロリーが100kcal以下の極端な運動不足群となった。(結論)以上の結果よりメタボリックシンドローム患者の食生活は比較的良好な結果を示したものの、身体活動量においては個人によって差が大きく、極端に身体活動量の低い患者が多く見られた。従ってメタボリックシンドローム患者の生活指導においては身体活動量の指導において特に極端に身体活動量の低い患者に対する効果的な運動療法支援法の開発が必要と考えられた。メタボッリクシンドローム等の生活習慣病に対する運動療法としては一般的に有酸素運動が奨励されている。しかし我々の先行研究にて有酸素運動を日常生活に取り入れることは困難であることが明らかとなった。そこで我々は簡単に習得でき、日常生活に簡単に組み込む事が可能である東洋的運動の1つであるスワイショウに着目し、その効果についての基礎的検討を行った。50名の運動習慣のない健常者を対象に、19名はコントロール群とし16名は2ケ月間有酸素運動を施行させ、15名は2ケ月間東洋的運動スワイショウを施行させ介入前後で24時間心電図、並びに24時間血圧を測定し、それぞれの運動効果について比較検討を行った。コントロール群では2ケ月、24時間心拍、並びに24時間血圧、自律神経活動のいずれの指標においても変化なかった。一方有酸素群では24時間心拍が有意に低下し、昼間の交感神経活動が低下、副交感神経活動が増加したが、血圧に関して効果は認められなかった。一方スワイショウ群では心拍数の低下は有酸素群に比べ顕著ではなかったが、有意に血圧を低下させた。以上の結果より運動の種類によって効果が異なる事があきらかとなり、メタボッリクシンドロームを中心とする生活習慣病患者の中で高血圧を主体とする患者においては東洋的運動を取り入れることが有効である可能性が示唆された。職員健診を受診した者の内メタボリックシンドローム該当者・予備群15名を対象に参加者15名を、定期的に支援する「積極的支援群」(A群;n=6)と初回の動機付け支援のみを行う「非積極的支援群」(8群;n=9)に無作為に振り分け、3ヶ月間の実施後に、介入前後で評価・検討を行った。なお積極的支援群においては特に運動量の増加を冒指し、以下のような支援法を施行した。1.介入前に体力測定を行い、3ヵ月後に体力が増強することをも目標とした。2.万歩計を配布し、毎賃の歩数をセルフモニタリングし、2週間ごとに担当スタッフがアドバイスを行った。(結果)A群では開始時に比較して、3ヵ月後に、メタボリックシンドローム判定のための検査項目腹囲および中性脂肪の有意な減少が認められた。一方非積極的支援群ではすべての項目で変化は認められなかった。また積極的介入群においては上記の指標のみならず、総コレステロール、LDLコレステロール、γ-GTが有意に改善した。

(結論)積極的介入群と非介入群では介入群に有意な改善がみられた。特に運動実践への取り組みが積極的であったと感じられる。非介入群においても生活習慣改善に積極的に取り組まれていた被験者も多くいたが、実際の効果をだすためには定期的に専門スタッフが実践状況を確認し、その都度適切なアドバイスを行うことがモチベーションの維持、的確な行動目標設定には重要であると考えられる。今回の検討で、メタボッリクシンドローム患者に積極的介入を行い、歩数を増やし、体力増強を図ることにより腹囲、中性脂肪等の指標は比較的短期間に改善する事が明らかとなった。
短期記憶における大脳辺縁系諸核の機能的局在性に関する研究

3-panel runway装置ならびに2-または3-lever operant装置を用いて、短期記憶における大脳辺縁系諸核の機能局在性を脳の局所破壊ならびに脳内微量注入法を用いて明らかにした。1)嗅球摘出によって3-panel runway taskでの参照記憶ならびに作業記憶は共に著しく障害された。また3-lever operant装置を用いての遅延見本合わせ課題(DMTS)および2-lever operant装置を用いての逆転学習は共に障害された。2)背側海馬(DH)破壊によって作業記憶及びDMTSは著しく障害されたが参照記憶には影響なかった。またmuscarinic antagonistスコポラミン、nicotinic antagonistメカミラミン、BZD/GABA_Aagonistムシモールおよびクロルジアゼポキサイド、5-HT_<1A> agonist 8-OH DPAT、NMDAantagonist CGS 19755およびCPP、NO合成阻害剤L-NAMEのDH内微量注入によって、作業記憶は障害された。DH破壊による記憶障害はcholinesterase阻害剤フィゾスチグミンおよびテトラヒドロアミノアクリジン(THA)によって改善された。3)乳頭体(MB)破壊によって作業記憶・参照記憶は共に障害されたが、DMTSや逆転学習には影響なかった。一方、視床背内側核(DMT)破壊によってDMTSだけが著しく障害された。MBまたはDMT破壊によって惹起される記憶障害はTHAによって改善されなかった。4)扁桃体基底外側部(BLA)破壊によって作業記憶は著しく障害されたが、参照記憶は変化なかった。この障害は扁桃体皮質腹側部破壊では認められなかった。スコポラミンおよびCPPのBLA内微量注入により、参照記憶には影響なかったが作業記憶は障害された。5)大脳基底部破壊により作業記憶・参照記憶及びDMTSは著しく障害された。また逆転学習も障害された。このように脳の局所破壊によって、破壊部位に依存した特徴的な記憶障害が惹起された。これらの成果は脳における記憶の機能的局在性を理解する上において有用な糸口を与えてくれた。前年度の研究は、海馬・扁桃体および嗅球の破壊に基づく短期および長期記憶におよぼす影響を明らかにする事に焦点をあて試行した。3-panel runway装置を用いてのrepeated acquisition課題での作業記憶(短期記憶)は,背側海馬および扁桃体外側基底核の破壊によっていずれも著しく障害されたが,その障害は再frainingによって対照群レベルまで回復した。しかし,参照記憶(長期記憶)はいずれの破壊によっても影響を受けなかった。一方,嗅球摘出により3-lever operant装置を用いての遅延見本合わせ課題(短期記憶)も著しく障害されたが,この障害はその後再trainingを重ねても対照群レベルまで回復しなかった。3-panel ranway装置を用いての長期記憶も嗅球摘出によって著しく障害された。これらの事から,本学習課題における短期記憶には海馬・扁桃体・嗅球が共に重要な役割を演じているが,長期記憶の維持には海馬・扁桃体の関与が薄い事が明らかとなった。これの脳局所破壊に基づく短期記憶障害は新規コリンエステラーゼ阻害剤テトラヒドロアミノアクリジン(THA)およびNIK-247によって改善された。

また本課題での短期記憶は抗コリン剤スコポラミンやNMDA受容体の拮抗剤CGS-19755によって誘発された。さらにCGS-19755を海馬に微量注入しても同様の短期記憶障害が認められたが,長期記憶には影響をおよぼさなかった。これらの事から,短期記憶はAch受容体およびNMDA受容体を介した神経機構(少なくともその一部は海馬)の関与が示唆される。一方,THAやNIK-247の薬物弁別学習を試み,これらの薬物がAch神経系および一部dopamine神経系の活動性を増強する作用を有することを明らかにした。また幻覚剤メスカリン誘発head-twitchは一連の脳代謝改善薬やTHAによって抑制された。これらの結果は臨床上の治療効果のいかなる所見と相関するのか,今後の興味ある問題を提起した。本研究は学習・記憶における脳の特定の部位がどのような神経機構を介して記憶のメカニズムに関与するのかを、主に脳の局所破壊及び脳実質内微量注入によって明らかにせんとした。背側海馬及び扁桃体basolateral部位の破壊によって3-panelrunway課題での作業記憶は著明に障害されたが、参照記憶は影響されなかった。これらの障害はその後訓練を重ねると、破壊前の状態に回復した。一方、扁桃体corticomedial部位の破壊ではそのような障害は認められなかった。この事より作業記憶における海馬・扁桃体の重要性と扁桃体の中でも局在性があることがわかった。一方、大脳辺縁系諸核と密接な連絡を有する嗅球の摘出によって、作業記憶及び参照記憶は共に著しく障害され、その後訓練を重ねてもその回復は困難であった。本研究から作業記憶に重要な関与が示唆される背側海馬に諸種薬物の微量注入を試みた。その結果、Ach antagonist scopolamine、NMDA antagonist CGS19755、CPP及びAP-5は共に作業記憶を障害したが、参照記憶には影響なかった。同様にBZP agonistmuscimol、5-HT_<1A> agonist 8-OH-DPAT微量注入によっても作業記憶は障害され参照記憶には影響なかった。さらにNO合成阻害剤L-NAME海馬内微量注入によっても、作業記憶は障害された。一方、海馬破壊によって惹起される作業記憶障害は中枢性Cholinesterase阻害剤tetrahydroaminoacridine及びNIK-247によって改善された。以上、脳局所破壊による作業記憶と参照記憶の障害の程度ならびに回復経過は破壊部位によって異なり、学習・記憶における脳の機能局在性があることがわかった。また海馬破壊による作業記憶障害には、Ach神経系の機能低下に基因していることが示唆された。
ヒトiPS細胞由来肝細胞の動物生体内大量培養システムの構築

ヒトiPS細胞からヒト肝細胞(iPS-Heps)を大量に作成する方法ができれば、肝移植におけるドナー不足や拒絶反応等の問題を解決できる。我々は、これまでピッツバーグ大学により作成されたiPS-Heps培養プロトコールを利用して、ゲノム編集により作製した免疫不全ラットの肝臓に細胞移植することで、世界で初めて動物肝内でヒトiPS-Heps細胞の大量培養に成功した。本研究では、ラット肝臓内から大量に増殖したiPS-Hepsを100%回収することを目的として、自殺遺伝子iCasp9を導入した免疫不全ラットを作製し、全てのラット肝細胞を細胞死させることで、ヒトiPS-Heps細胞のみを生成する方法を確立する。本研究により、肝不全に対する革新的新規治療法を開発するだけでなく、創薬でのヒト肝細胞の大量利用を実現することが可能となる。本研究では、Bioreactorとしてラット肝臓内でiPS-Hepsを成熟させ、ヒト肝細胞を大量に作り出す方法の確立を目指している。これまでの研究成果は、論文として投稿するための準備を開始している。関連する研究内容は、国内学会で4回、国際学会で1回報告している。大阪大学において、ゲノム編集技術CRISPR-Cas9を利用してIl2rg,Rag2ダブルノックアウトラットを作製し、系統の確立、繁殖維持コロニーの確立を行った。我々が新規に開発したゲノム編集による効率的なノックイン法Combi-CRISPRを使って、肝臓特異的発現iCasp9遺伝子をノックインラットの作製を試みている。九州大学においては、ヒトiPS細胞の培養を行い、内胚葉に分化させることでヒトiPS-Heps細胞の作製を試みている。本年度は初年度であり、平成30年度開始当初の研究計画に従って、おおむね順調に進展していると自己評価する。平成31年度は、大阪大学においてIl2rg,Rag2ダブルノックアウトラットコロニーの繁殖維持を行う。効率的なノックイン法Combi-CRISPRを使って、iCasp9遺伝子あるいはCas9ノックインラットの作製を行う。最終的に、iCasp9ノックインラット重度免疫不全ラットを作製する。九州大学においては、培養したヒトiPS細胞を内胚葉に分化させて、HGF、DMSOにて10日間さらに培養しヒトiPS-Heps細胞を確立する。分化後の細胞のHNF4α、FOXA2、アルブミン等の発現量を免疫染色およびqPCRを用いて評価し、iPS-Hepsの分化能を確認する。吉見研究分担者が、実際にピッツバーグ大学に滞在して、iPS-Hepsの作成方法、分化能評価方法等についての研究を推進する。大阪大学および九州大学において完成したIl2rg Rag2 iCasp9免疫不全ラットの肝臓内にヒトiPS-Hepsを経門脈的に細胞移植することで、ヒト肝細胞を大量に作り出す方法の確立を目指す。

本年度は初年度であり、平成30年度開始当初の研究計画に従って、おおむね順調に進展している。次年度にノックインラットの作製および系統の確立、繁殖コロニーの拡大などが予測されるため、旅費および消耗品等の費用を計上する。
生体免疫機能に対する半導体センサの試作

生体免疫機能計測用半導体センサの製作プロセスにつき,基礎的検討を行った.免疫センサは,抗体固定化薄膜を半導体デバイス上に作成する技術の開発で鍵である.本研究では,従来の電子デバイス製作プロセスとの整合性に優れたプラズマ重合法を用いて,半導体上に,抗体固定化の担体となる有機薄膜を作成し,その上に抗体分子を固定化するプロセスにつき,検討した.このプロセスにおいて, (1)プラズマ重合膜の電子材料としての安定性, (2)分子の配向性をそろえた抗体の高密度固定化技術,が必要である.プラズマ重合膜は,ピンホールの少ない有機薄膜を得る手法として最も有望なものであるが,放電現象を利用するプロセスに特有の荷電現象が存在する.この現象は,センサデバイスへの応用においては,動作の不安定性を引き起こす原因となる.この点につき,本研究では,プラズマ重合膜を用いたMISキャパシタのCV特性と, ESRによる測定結果との比較を行い,原因が,プラズマ重合膜中に残留するダングリングボンドに基づくキャリアトラップの充放電であることを明らかにした.さらに,ダングリングボンドを減少させる手段として,重合反応後の熱処理を試み,窒素雰囲気中, 200°C程度での処理が有効であることを示した.抗体分子の固定化に関しては,反応性ガス中での担体プラズマ重合膜表面への感応基の導入と,固定化分子の前処理とを組み合わせたプロセスを開発した.アンモニアガス中でのグロー放電処理により,有機膜表面には,アノミ基(NH_2)が導入される.一方,抗体分子は,抗原認識機能を保持したFab'-SH分画のみを精製することができる.担体表面の-NH_2と固定化分子中の-SHとを特異的に架橋することにより,配向性をそろえた固定化反応が可能になる.この手法により, 6×10^<11>cm^<-2>という高密度固定化が可能であることが実験的に明らかになった.生体免疫機能計測用半導体センサの製作プロセスにつき,基礎的検討を行った.免疫センサは,抗体固定化薄膜を半導体デバイス上に作成する技術の開発で鍵である.本研究では,従来の電子デバイス製作プロセスとの整合性に優れたプラズマ重合法を用いて,半導体上に,抗体固定化の担体となる有機薄膜を作成し,その上に抗体分子を固定化するプロセスにつき,検討した.このプロセスにおいて, (1)プラズマ重合膜の電子材料としての安定性, (2)分子の配向性をそろえた抗体の高密度固定化技術,が必要である.プラズマ重合膜は,ピンホールの少ない有機薄膜を得る手法として最も有望なものであるが,放電現象を利用するプロセスに特有の荷電現象が存在する.この現象は,センサデバイスへの応用においては,動作の不安定性を引き起こす原因となる.この点につき,本研究では,プラズマ重合膜を用いたMISキャパシタのCV特性と, ESRによる測定結果との比較を行い,原因が,プラズマ重合膜中に残留するダングリングボンドに基づくキャリアトラップの充放電であることを明らかにした.さらに,ダングリングボンドを減少させる手段として,重合反応後の熱処理を試み,窒素雰囲気中, 200°C程度での処理が有効であることを示した.抗体分子の固定化に関しては,反応性ガス中での担体プラズマ重合膜表面への感応基の導入と,固定化分子の前処理とを組み合わせたプロセスを開発した.アンモニアガス中でのグロー放電処理により,有機膜表面には,アノミ基(NH_2)が導入される.一方,抗体分子は,抗原認識機能を保持したFab'-SH分画のみを精製することができる.担体表面の-NH_2と固定化分子中の-SHとを特異的に架橋することにより,配向性をそろえた固定化反応が可能になる.この手法により, 6×10^<11>cm^<-2>という高密度固定化が可能であることが実験的に明らかになった.1.プラズマ重合法による有機薄膜作成技術本研究の中心テーマである、生体物質固定化担体の作成手法について検討した。MISダイオードのCV特性の評価を通じて、電子材料としてのプラズマ重合膜の特性及び、プロセス技術としてのグロー放電処理に関して、二つの知見を得た。第一は、プラズマ重合法に特有の、長寿命残留ラジカルの問題である。膜中に残留するラジカルがイオンラジカルである場合、MISデバイスに対して、フラットバンド電圧のシフト、ヒステリシスという形で動作の不安定性を生じる。これに対し、窒素雰囲気中、200°Cでの熱処理を施すことにより、ラジカル濃度が減少することを、ESRの測定により確かめた。同時に、CV特性の改善、安定化も確認できた。第二は、グロー放電処理に伴って基板に生ずる欠陥である。この欠陥は、キャリアのトラップとして働くため、MISデバイスとしての正常な動作が妨げられる。放電電力1w/【cm^2】が、基板に損傷を与える臨界の値であるとの見通しを得たが、この値は、雰囲気ガスの成分にも依存することがわかっており、この点は、今後さらに詳細に検討する予定である。2.配向性を制御した抗体の固定化免疫機能計測を目的とするセンサを想定する場合、抗体を素子表面に、高密度かつ配向性をそろえて固定化することが望ましい。本研究では、プラズマ重合有機薄膜を担体として、アンモニアガス中でのグロー放電処理により表面官能基としてアミノ基を導入する。一方、抗体は、抗原との結合能力を有するFa〓部分のみを精製して、ヒンジ部のチオール基を、担体表面のアミノ基と架橋、固定化することにより、配向性の制御を試みた。酵素免疫法を用いた評価により、約6×【10^(11)】
G蛋白質の網膜での機能的局在の検討

G蛋白質は細胞膜に存在し、細胞間の情報伝達に関与している。網膜では、シナプスの多い内・外網状層に多いことから、我々はその機能はシナプス伝達に関与するのではないかと考えている。しかし、実際にシナプス部にG蛋白質が存在することを、直接証明したような仕事はみられていない。そこで、免疫電顕法、フリーズフラクチャー免疫電顕法(フリップフラクチャー法)を用いて、網膜の内・外網状層のシナプス部の膜にG蛋白質が存在することを直接証明することができたが、詳細については更なる検討が必要と考えられた。
衝撃波と粉塵層との干渉による異常圧の発生機構

床面に堆積した粉塵層上を衝撃波が伝播するとき,粉塵層と床面との境界において測定された圧力は入射衝撃波背後の圧力の数倍の値に達する場合がある.本研究では,この異常圧の発生機構を明らかにすることを最終的な目的として,以下のような衝撃波管実験を行った.まず,衝撃波管(内面寸法100mm×30mm)を用いて衝撃波(伝播マッハ数1.10,1.20,1.30,1.40)が粉塵層上を伝播する際の粉塵層下での圧力測定実験を行った.粉塵層は球形粒子(イオン交換樹脂,粒径0.370.90mm)を衝撃波管下壁に堆積させて形成されたものである.また,粉塵層と圧カセンサとの間に金網を張ることによって気体圧力の測定を行った.次に,粉塵層内を伝播する応力波の挙動を明らかにするため,縦型衝撃波管(内面寸法20mm×20mm)を用いて,粉塵層に衝撃波(伝播マッハ数1.30)が垂直に入射する場合の圧力測定実験を行った.上述の実験度と同様の球形粒子(粒径0.66mm)を用い,粒子層の厚さを570mmまで変化させて実験を行った.これらの実験から得られた重要な知見をまとめると以下のようになる.1.粉塵層に衝撃波が入射すると,粉塵層内において局所的に高い応力が発生し,その領域が波のように層内を伝播する.2.粉塵層下で発生する異常高圧は,気体の圧力波によるものではなく,上述の応力波が床面に達することによって発生する.3.粉塵層下で発生する異常圧の大きさは粉塵層厚さに依存し,最大圧力値を与える粉塵層厚さが存在する.4.粉塵層内で発生する応力波の伝播速度は気体の圧力波のそれよりも小さい.床に堆積した粉塵層上を衝撃波が伝播する際,粉塵層と床面との境界における圧力が入射衝撃波背後の値の数倍に達することが知られている.この粉塵層と衝撃波との干渉による異常高圧の発生機構を明らかにすることを目的として,本年度は以下の研究を行った.1.多数のスリットを有する平板を隙間を設けて層状に配置した多孔板層を衝撃波管観測部床面に設けたキャビティ内に置き,衝撃波がその上を伝播・干渉する様子を影写真法により可視化することによって,透過性媒質である粉塵層内における衝撃波の伝播機構を調べた.その結果,複雑な反射・回折を経験した衝撃波は多孔板層内で一つの波面を形成するがその伝播速度は層外を伝播する衝撃波よりも遅いことがわかった.さらに,スリット平板を1枚だけ設置した場合に対して数値シミュレーションを行い、実験で観測された波面形状を再現できることを確認した.2.球形粒子で粉塵をモデル化して衝撃波管観測部床面にモデル粉塵層を設置し,衝撃波と干渉させた際の粉塵層下での圧力測定実験を行った.実験では,球形粒子径,密度,粉塵層厚さ,入射衝撃波マッハ数をパラメータとし,粉塵層下での圧力に及ぼすこれらの因子の効果を調べた.その結果,(1)粒子径が小さくなる程,また粉塵層が厚くなる程,粉塵層内を伝播する気体圧力波の速度が遅くなること,(2)入射衝撃波背後の圧力に対する粉塵層下での最大圧力の比は,入射衝撃波マッハ数が大きくなる程大きくなり,粉塵層厚さが5mmの場合よりも10mmの場合の方が大きな値となること,(3)実験の範囲内で,粒子径の違いによって最大圧力に有意な差は認められなかったこと,(4)粒子密度が大きくなると粒子によって伝えられる圧力派の伝播速度は小さくなること,等の知見を得た.床面に堆積した粉塵層上を衝撃波が伝播するとき,粉塵層と床面との境界において測定された圧力は入射衝撃波背後の圧力の数倍の値に達する場合がある.本研究では,この異常圧の発生機構を明らかにすることを最終的な目的として,以下のような衝撃波管実験を行った.まず,衝撃波管(内面寸法100mm×30mm)を用いて衝撃波(伝播マッハ数1.10,1.20,1.30,1.40)が粉塵層上を伝播する際の粉塵層下での圧力測定実験を行った.粉塵層は球形粒子(イオン交換樹脂,粒径0.370.90mm)を衝撃波管下壁に堆積させて形成されたものである.また,粉塵層と圧カセンサとの間に金網を張ることによって気体圧力の測定を行った.次に,粉塵層内を伝播する応力波の挙動を明らかにするため,縦型衝撃波管(内面寸法20mm×20mm)を用いて,粉塵層に衝撃波(伝播マッハ数1.30)が垂直に入射する場合の圧力測定実験を行った.上述の実験度と同様の球形粒子(粒径0.66mm)を用い,粒子層の厚さを570mmまで変化させて実験を行った.これらの実験から得られた重要な知見をまとめると以下のようになる.1.粉塵層に衝撃波が入射すると,粉塵層内において局所的に高い応力が発生し,その領域が波のように層内を伝播する.2.粉塵層下で発生する異常高圧は,気体の圧力波によるものではなく,上述の応力波が床面に達することによって発生する.

3.粉塵層下で発生する異常圧の大きさは粉塵層厚さに依存し,最大圧力値を与える粉塵層厚さが存在する.4.粉塵層内で発生する応力波の伝播速度は気体の圧力波のそれよりも小さい.
「アドバンシング物理」を用いた高大連携による新しい高校物理コースの開発

イギリスの新しいAレベル物理コース「アドバンシング物理」を日本の高校と大学の物理教育の中で活かすために,複数の高校と大学をつなぐ新しい高大連携を構築し,継続的な研究会活動を行う中で,公開授業を核とした実践的な研究を行ってきた。本年度は,これまでに行った4回の公開講座の成果や特徴的な単元についての検討結果が研究会会員の個別の授業に与えた影響について,研究会内外に明らかにすることを目的として,平成18年7月に「公開ミニシンポジウム-アドバンシング物理に学んだ授業実践-」を開催した。シンポジウムには,北海道,東京都を含む他府県より物理教育関係者36名の参加者があった。はじめに,8高校,2大学の物理教員による個別の実践報告を行い,続いて,質疑応答を含む全体討論を行った。そこでは,探究実験の具体的なノウハウに関する質問から,現在のカリキュラムに関する議論まで,幅広い活発な意見が出た。また,終了後に行った参加者に対するアンケート調査の結果,今後の本研究会の活動に期待することとして,「すぐに使える実験書の発行」や「教員対象のワークショップの開催」など,本研究成果の現場へのより積極的な還元を求める要望が多いことがわかった。ミニシンポジウムの結果,本研究成果が多くの会員の学校において,部分的ながらも様々な形で授業に組み込まれていることがわかった。中でもセンサーを用いた電流回路学習の単元は,複数の学校で実践されており,実践におけるノウハウや生徒の反応等の情報が蓄積されていた。そこで,現行の高校物理カリキュラムに対応した同単元の授業プランを試作し,パイロット校にて実践を行った。実践後の生徒の自己評価の結果では,9割以上の生徒が興味関心を示し,理解度については約半数の生徒が肯定的な回答をしたが,実際の理解度は生徒が自己評価するほどには高くなかった。これは,生徒の興味関心の高まりが,理解度を過剰評価させたと考えることもできるが,詳細についてはまだまだ検討の余地がある。今後,実践校を増やし,実践と検討を繰り返しつつ,授業展開を確定していく必要がある。イギリスの新しいAレベル物理コース「アドバンシング物理」を日本の高校と大学の物理教育の中で活かすために,複数の高校と大学をっなぐ新しい高大連携を構築し,継続的な研究会活動を行う中で,公開授業を核とした実践的な研究を行っている。本年度は,公開授業のテーマとして「アドバンシング物理」ASコース第4,5章に設置されている「デザイナー・マテリアル」を主な研究テーマとして取り上げ,毎月1回開催する研究会の中で実践的に検討を行った。これらの章では,さまざまな物質(材料)の機械的,光学的,電気(熱)的性質などの簡単な材料試験から最新の物質科学の話題までを取り上げながら,物質の巨視的な性質を微視的な内部構造と関連づけるなど,生徒たちを現代の工学の観点に触れさせる工夫がなされている。このような「物質科学」的な内容や実験は,日本の高校物理ではほとんど取り上げられていない。そこで,「アドバンシング物理」の取り上げるこれらの「物質科学」的な実験や授業内容が「日本の高校生の興味関心をどの程度引き,理解を得ることができるのか」,「これらの内容を扱う授業をどのように指導できるか」,また「これらの題材を活かした探究活動の可能性」などを実践的に検証するために,8月中旬に高校生,大学生を対象とした2日間の公開授業を行った。参加生徒の反応や生徒アンケートを分析した結果,日本の高校理科ではほとんど扱っていない内容であったが,興味関心が高く,内容もある程度,理解可能であることがわかった。また,探究活動は,内容の深さ,豊富さに比較して時間的な制約が厳しく,生徒の探究へのモチベーションの低下が懸念されたが,生徒たちは積極的に取り組み,教員の準備段階では予想もしていない展開や結果がいくつも見られた。本年度,「アドバンシング物理」における「物質科学」の内容と展開を実践的に検討した結果,生徒の興味関心と理解を得ることができ,日本の高校物理においても十分に扱える内容であることがわかった。しかし,中学の学習内容の一部が高校へ上がり,現代物理の取り扱いも増えている現行カリキュラムの中で,さらに新しい内容を付け加えることの至難さや,実験器具の整備や,現場教員が高大連携などを通して研修できる環境の充実などの問題点も浮き彫りになった。

ミニシンポジウムの結果,本研究成果が多くの会員の学校において,部分的ながらも様々な形で授業に組み込まれていることがわかった。中でもセンサーを用いた電流回路学習の単元は,複数の学校で実践されており,実践におけるノウハウや生徒の反応等の情報が蓄積されていた。そこで,現行の高校物理カリキュラムに対応した同単元の授業プランを試作し,パイロット校にて実践を行った。実践後の生徒の自己評価の結果では,9割以上の生徒が興味関心を示し,理解度については約半数の生徒が肯定的な回答をしたが,実際の理解度は生徒が自己評価するほどには高くなかった。これは,生徒の興味関心の高まりが,理解度を過剰評価させたと考えることもできるが,詳細についてはまだまだ検討の余地がある。今後,実践校を増やし,実践と検討を繰り返しつつ,授業展開を確定していく必要がある。
HIV感染細胞の致死機構に関する研究

本年度はまずTNFによるHIV感染細胞の致死機構が所謂アポトーシスであることを電子顕微鏡による形態変化の観察、ならびにヌクレオソームリンカーサイズでのDNA切断の検出と言う2点から明かにした。さらにアポトーシス関連遺伝子Fasの発現がHIV感染細胞で有意に上昇していることをFas遺伝子cDNAを用いたノーザンブロッテング法及び細胞膜上のFas坑原をフローサイトメトリイーにより検出する事により明かにした。そこでHIV感染そのものがFas遺伝子の誘導を行なうかいなかを検討したところ、ヒトT細胞MOLT-4においてHIV感染ごFas遺伝子の誘導が細胞死に先だって起こることが明かとなった。一方HIV感染者の末梢血細胞の細胞表面をフローサイトメトリイーで調ベたところ、健常人ではほとんど検出されないFas坑原が12例中4例で有意に検出された。これらの結果はHIV感染者でのCD4陽性細胞の減少がFas坑原を介したアポトーシスに拠っていることを強く示唆するものであると思われる。次の実験計画としてHIV感染によるFas遺伝子によるFas遺伝子誘導機構を明かにすることを目的として、現在Fas遺伝子プロモーター領域のクローンニングを行なっている。またHIV遺伝子中にFas遺伝子誘導に関与するものが存在するかを明かにしていく計画である。さらにTNF受容体とFas坑原の関連を詳細に検討して行く予定である。アポトーシスという細胞死は従来ネクローシスに対比させて考えられてきたものであり、ウイルス感染に拠る細胞死は典型的なネクローシスに分類されてきている。我々の結果はしかしながらウイルス感染に拠る細胞死が生理的な意義を持つアポトーシスに分類される可能性を強く示しており、今後HIV以外のウイルス感染細胞死の機構に関しても詳細に検討をしていきたいと考えている。
心停止後腎移植モデルにおける間葉系幹細胞の組織再生効果の検討

申請者らは心停止後の腎臓移植モデルを確立し、心停止後腎臓の保存法として常温保存法が有効である事を明らかにした(Iwai S. et al. PLoS One. 2012;7(3):e33157., Kaimori J. et al. PLoS ONE. 2012;7:e45833.)。このモデルに間葉系幹細胞を投与したところ、損傷部位である尿細管周囲への集属、静脈内投与による肺血栓塞栓症誘発の可能性を示唆し、局所投与が移植後の腎機能を早期に回復させることを確認した(Iwai S. etal. Transplantationproceedings, 2014;46:1578-84.)。生体間や脳死ドナーからの臓器と比較して、適用境界症例(marginal)にあたる臓器は深刻な虚血/再灌流傷害が生じ、機能不全や遅延が高率に発生する。そこで平成25年度の研究では、様々な機能を有している事で知られている間葉系幹細胞(MSC)をmarginal腎臓に適用し、移植時における機能改善効果についてラットの腎臓移植モデルを用いて検討する事を目的とした。細胞移植に使用したMSCは、LacZ-Luciferase double Transgenic ratの組織から採取、培養された細胞株であり、バイオイメージングシステムIVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA)を用いて生きたままMSCの体内動態を経時的に画像として追跡する事とLacZ染色により組織での局在を病理組織学的に解析可能である。実験方法は、以前報告したラットマージナル腎移植モデル法(Iwai S. et.al. PLoS One. 2012;7:e33157.)を用いて、MSCを移植直後に陰茎静脈から全身性投与(全身投与)または移植直前に腎動脈から局所性投与(局所投与)することにより、その効果を検討した。全身投与ではIVISにて肺に集積する像が得られ、肺塞栓症の発生が器具された。一方、局所投与では再還流後も移植腎に留まる像が得られた。局所投与では生存性が高い傾向にあり、腎機能も早期に改善された。移植後1日目の移植腎におけるLacZ染色では、MSCが損傷を受けやすい尿細管周囲に集蔟している可能性を示す所見が得られた。以上より、MSCを移植直前の腎動脈から直接投与することによって、安全に腎機能の改善効果が得られる可能性を示唆した(Iwai S. et.al. Transplantatio Proceedings, in press)。生体間や脳死ドナーからの臓器と違い、適用限界症例(marginal)からの臓器は深刻な虚血/再還流障害が生じ、機能不全や遅延が高率に起こる。先ずはmarginal腎臓移植モデルを作成し(Iwai S., et al. PLoSOne. 2012;7:e33157)、間葉系幹細胞(MSC)を適用して移植時における機能改善効果について検討することを目的とした。細胞移植に使用したMSCはLacZ-Luciferase double transgenic ratの脂肪組織から採取、培養された細胞株であった。このラットより得られたMSCは、バイオイメージングシステムIVISを用いて細胞の存在する位置を画像で検出することが可能であり、ラットが生存している状況下でMSCの体内動態を経時的に追跡した。また、LacZ染色により組織でのMSC局在を病理組織学的検査によって解析した。MSCの投与方法は、1ラットマージナル腎移植モデルを用いてMSCを移植直後に陰茎静脈より全身投与または、2移植直前に腎動脈から局所投与することでその効果を検討した。一方、局所投与では再還流後も移植腎に停留する像が得られた。全身投与と比較して局所投与では、マージナル腎を移植されたレシピエントでより生存性が高まる傾向と腎機能の早期改善傾向が示された。MSCは局所投与では静脈内投与よりも安全に使用することが可能である可能性を示唆した(Iwai S. et al. Transplantation Proceedings. 2014;46:1578-84.)。これを受け、腎臓病の多い猫へスケールアップしての実験を試みた。ラットで実施したような実験のプロトコールを応用し、猫でもマージナル腎移植モデルを作成した。移植手技は確率できたが、脂肪由来間葉系幹細胞の樹立に予想以上の時間を要し、移植手技とマージナル腎への適応まで至らなかった。今後の検討課題が明確化してきた段階である。現在まで、マージナル腎移植モデルを用いて、MSCの投与法、投与細胞数などの安全性の確認はある程度確定できたと考えられる(Iwai S., et al. PLoSOne. 2012;7:e33157, Iwai S. etal. Transplantation Proceedings. 2014; 46(5): 1578-84.)。これを受けて本年度は、中型実験動物である猫においての実験を試みた。猫も腎臓病の多い動物である。そのため、人の腎移植モデルとしては適切であると考えられている。

今後の検討課題が明確化してきた段階である。過去、申請者はマイクロサージェリー技術を修得し、ラット腎移植モデルを確立した(Iwai S. et. al. Transplantation. 2006;82(6);27;804-812.)。この腎移植法は、顕微鏡下手術による手縫い法で、血管や尿管を縫合するという臨床に近い、極めて高度な技術を必要とする方法を採用した。この後、このモデルを応用した心停止後の腎臓移植モデルの確立にも成功している(Iwai S. et. al. PLoSOne. 2012;7(3):e33157., Iwai S. et. al.Transplantationproceedings, 2014;46(5):1578-1584.)。従来、摘出臓器や組織の代謝または酸素要求量を減少させるために低温保存する事が臨床現場において一般的であるが、申請者らは心停止後のmarginal臓器の保存法として常温保存法が有効である事を明らかにした(Iwai S. et. al. PLoS One. 2012;7(3):e33157., Kaimori J. et. al. PLoSONE. 2012;7(10):e45833. )。この方法をブタを用いて検証することを実施した。ブタを心停止したのち長時間(90分以上)経過した腎臓を摘出し、灌流液で灌流した。されに、この腎臓をブタへ移植し、レシピエントの腎臓を摘出して、その後の経過を観察した。排尿状況、生体内での移植腎の状態(超音波検査、MRI検査)、血液検査(血清尿素窒素、クレアチニン、全血球検査)を実施したところ、排尿は認められ、一時的な血液生化学的検査値の上昇はあったものの正常値近くまで回復し、ブタを用いたモデルの確立の可能性が示唆された。申請者らは心停止後の腎臓移植モデルを確立し、心停止後腎臓の保存法として常温保存法が有効である事を明らかにした(Iwai S. et al. PLoS One. 2012;7(3):e33157., Kaimori J. et al. PLoS ONE. 2012;7:e45833.)。このモデルに間葉系幹細胞を投与したところ、損傷部位である尿細管周囲への集属、静脈内投与による肺血栓塞栓症誘発の可能性を示唆し、局所投与が移植後の腎機能を早期に回復させることを確認した(Iwai S. etal. Transplantationproceedings, 2014;46:1578-84.)。中型動物である実験猫を用いたマージナル腎移植モデルの作成まではほぼ確立することができたと考えている。そこに用いる脂肪組織由来間葉系幹細胞の樹立に想定以上の時間を要したため、このMSCをマージナル腎移植モデルに適用するところまでいたることができなかった。本年度は、これらを組み合わせるところまで推進・実施することができれば、実用的な結果として得られるものと考える。腎移植平成25年度の目標は、ラットマージナル腎臓移植モデルとしてIwai S. et.al. PLoS One. 2012;7(3):e33157.にて報告した方法と同様の移植法を用い、間葉系幹細胞の投与法を検討することであった。間葉系幹細胞は既に共同研究施設(自治医科大学)で樹立・保存されているLacZ-Luciferase double Transgenic ratの脂肪組織