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単体的複体の部分構造および極小反例に基づく位相幾何学的組合せ論の研究

本研究は、単体的複体の組合せ的性質に関して、その部分構造および極小反例についての構造解析を軸に調べることを目的とした。特に、位相幾何学的組合せ論の観点から重要である、shellability, sequential Cohen-Macaulayness, partitionabilityに関して、頂点集合の制限操作に関する極小反例の性質を調べ、これらが2次元以下、または、flag complexの場合には一致することを示した。また、これらの極小反例のpure-skeletonについての考察や、その他応用的な研究も進めた。本研究は位相幾何学的組合せ論の研究として、単体的複体の組合せ構造の研究をマイナー操作に関する極小反例の研究を軸として進めることを目標としている。本年度の実施計画としては、1.扱う単体的複体の組合せ的性質としてshellability, sequential Cohen-Macaulayness, partitionabilityを取り上げ、2.研究開始時までに研究代表者が行っていた頂点集合の制限操作に関する2次元の極小反例の理論を固めることを出発点とし、3.リンク操作を加えた場合の極小反例の理論を試みる、を挙げていた。本年度は主に1.の立場に立ち、2.については、これまでの証明を改良し、見通しのよい証明を与えた。また、3.についてもこれまでに得ていた洞察に明確な証明を与え、リンクと制限に関する極小反例(strong obstruction)についての知見から制限のみに関する極小反例(obstruction)についての結論を得ることができることを示した。この一連の研究における副産物として、「shellability, sequential Cohen-Macaulay, partitionabilityの3性質に関してobstructionは等しい」という予想を立てるに至った。これはこの3種の全く異なる性質(特に2つ目は組合せ的ではなく代数的・位相幾何学的な性質)がhereditaryを要求すると等しくなるということを意味し、もし成立すれば位相幾何学的組合せ論の立場から極めて重要な結果となる。上記2次元に関する研究成果によってこの予想は2次元以下では正しいことが確認でき、また、本年度の研究成果により、flag complexと呼ばれる単体的複体のクラスにおいてもこの予想が正しいことが確認された。これらの成果は1本の論文にまとめ、投稿中である。また、本研究の応用を見据え、確率グラフの指標の期待値についての研究も進めた。昨年度は2次元の場合について、頂点集合の制限をマイナー操作とした場合の、shellability,partitionability,sequential Cohen-Macaulayness等の極小反例の理論を完成させたが、今年度は3次元以上についての理論を展開する手段を探ることを課題としていた。3次元以上の場合への取り組みについては、昨年度にリンクをマイナー操作として追加した場合の極小反例への影響から3次元以上への手掛かりを与えていたが、今年度はこれとは別の切り口で、単体的複体のpure-skeletonとの関係について研究を進めた。その中で、「Obstruction to shellability(shellabilityに関する頂点集合の制限をマイナー操作とした場合の極小反例)は最高次元のpure-skeletonのみnonshellableで残りの次元のpure-skeletonはすべてshellable」という予想を立て、これが3次元については成立することを示した。これは下記の口頭発表の1件目と3件目において発表した。この他、関連して、グラフのindependence complexという単体的複体のトポロジーを調べる研究もおこなった。また、これとは別に、昨年度投稿中であった論文については、改訂作業の中でさらにいくつか証明をクリアに書き換える改善を加えた。この論文は受理され、出版予定も決まっているが、23年度の出版となるため、来年度の実績報告書に記載されることになり、今年度の報告書には記載されない。また、今年度はこの他に23年3月に日本数学会での発表(招待)の予定があったが、震災により中止されたことを付記する。昨年度は、研究初年度に得ていた、頂点集合の制限をマイナー操作とした場合の、shellability partitionability,sequential Cohen-Macaulayness等の極小反例に関する2次元の場合の理論の高次元への拡張を目指し、「Obstruction to shellability (shellabilityに関する頂点集合の制限をマイナー操作とした場合の極小反例)は最高次元のpure-skeletonのみnonshellableで残りの次元のpure-skeletonはすべてshellable」という性質が3次元までは成り立つことを示した、としていた。が、今年度の研究中に、この証明に一部誤りがあり、この事実は3次元では成り立たないことが明らかとなった。

これを修正するため、当初の計画にも言及し、かつ、初年度にある程度の結果も出している、リンクをマイナー操作として追加した場合の極小反例の理論を取り入れ、「Strong obstruction to shellability (shellabilityに関する頂点集合の制限とリンクをとる操作をマイナー操作とした場合の極小反例)は最高次元のpure-skeletonのみnonshellableで残りの次元のpure-skeletonはすべてshellable」という性質が3次元までは成り立つ、という形に修正し、この事実の証明を与えた。証明法も昨年のものよりも議論をすっきりとした形にまとめなおした。この結果は、下記の口頭発表において発表した。この他、関連して、各pure-skeletonがマトロイドである単体的複体の性質や、グラフのindependence complexの性質、グラフ上のゲームの性質などについての研究も行った。なお、雑誌論文の項目に記載の論文は、初年度に得て投稿し、昨年度中に証明を改良して改版の上で受理された論文(昨年度の報告書中で言及しているもの)である。また、口頭発表の4項目目は、昨年度に予定されながら震災で延期されたものである(昨年度の報告書中で言及)。本年度は、本研究の最終年度を締めくくるため、一昨年から昨年にかけて得た、「Strong obstruction to shellability(shellabilityに関する頂点集合の制限とリンクをとる操作をマイナー操作とした場合の極小反例)は最高次元のpure-skeletonのみnonshellableで残りの次元のpure-skeletonはすべてshellable」という性質が3次元までは成り立つ、という結果を論文化する作業に取り組んだ。この過程で、この証明に用いる「2次元の単体的複体の任意の制限がshellableであると、その2次元pure-skeletonはextendably shellableである」という事実の証明をより分かり易く精緻にする作業が必要となり、これに多くの時間を割くこととなった。また、3次元以上のobstruction to shellabilityの理論にどのような含意を持つかの議論も行ない、今後の高次元のケースへの糸口となることを期待する結果となった。この論文は現時点でまだ執筆中ではあるが、アウトプットの形は完成しており、本研究の成果の一つとして形を作ることができた。一方、本年度の研究開始時に記載したもう一つの課題である、任意の制限がshellableである集合族のマトロイド的扱いについての考察の方は、論文として発表するほどの成果まではいたらなかったものの、任意のpure-skeletonがマトロイドとなる単体的複体の性質について若干の知見を得た。
中学校国語科書写における書字過程に着目した行書教材及び授業開発

本研究の研究成果は以下の4点である。一点目は、行書の書き方の課題解決法がわかる、書字動作に注目した資料集を作成したことである。二点目は、行書の書き方の課題解決法がわかる動画教材を作成したことである。三点目は、書字動作を理解しやすい行書規準文字(いわゆる手本)を提案したことである。4点目は、書字動作に注目した、行書の授業展開法を提案したことである。以上の研究成果により、課題解決学習の充実を目指した。本研究の目的は、中学校国語科書写教育において、書字過程に着目した行書教材および行書の授業を開発することである。そのために、平成22年度は、中学校国語科教諭を目指す学生や中学生の行書の書き方(書字動作)の問題点を明らかにするために、硬筆書字・毛筆書字の実態分析を行った。どんな筆脈(点画と点画との空中での見えないつながり)で書き、どんな運筆リズムで書いたかを、ビデオで撮影したり自分の書いた行書に筆脈を書き込ませたりして調査した。また、どこに筆圧をかけて書いたかを、カーボン紙を用いて調査した(硬筆のみ)。行書学習において学習者は、行書を次の三段階を経て書けるようになることが明らかになっている(樋口「大学の教員養成における行書指導法の授業改善」2009)。すなわち、全く書けない段階から、筆脈・筆圧はあまり理解できていないが形を真似することができている段階、筆脈・筆圧・運筆リズムを習得して整った行書が書けるようになる段階である。従来の行書指導では、筆脈・筆圧はあまり理解できていないが形を真似できている段階に対応した指導がなされておらず、この段階で指導が終了してしまうため、日常生活で行書を使いこなすまで指導を徹底することができなかった。本年度の分析作業によって、具体的な筆使いの問題が明らかになり、問題のパターン毎に具体的な改善法を提示するための基礎データを収集することができた。また、従来注目されることのなかった、筆管(筆を持つ部分)の傾きや、筆が紙面から離れたときの動きのデータも収集できた。本年度は、昨年度の実態調査の分析を受けて、指導上効果的な動画教材(毛筆・硬筆)と、問題のある行書の書き方が一覧できる資料集を作成した。まず、動画教材の内容は以下のとおりである。(1)行書の基本となる点画の筆使い(学習指導要領に示された行書の特徴の「点画の方向や形の変化」に対応)。(2)行書の直接連続・間接連続の筆使い(学習指導要領に示された行書の特徴の「連続」に対応)。(3)行書の部分形の筆使い(学習指導要領に示された行書の特徴の「省略」・「筆順の変化」に対応)。(4)一字をとおした書字リズム(教科書で教材化されることの多い文字で示した)。動画教材作成にあたっては、次の点に留意した。a基準となる書き方と問題のある書き方とを示し、問題点をわかりやすくした。b筆毛部分の穂先と腰の部分の動きが明瞭になるようにした。c筆管の動きや手首、腕の動きも見えるようにした。d点画や部分、一字を書き通すリズムがわかるようにした。e筆順にしたがって、筆脈(空間での筆の動き)が捉えられる工夫をした。筆使いについては、書道の専門的な筆使いではなく、小学校で学習した楷書の筆使いと隔たりがないよう、平易で硬筆との関連が図れるものにした。分析した学生・生徒の書き方を参考に、無理のない書きやすい筆使いを取り上げた。次に資料集であるが、動面教材とリンクさせて、有効な改善法を豊富に提示するようにした。硬筆においても、カーボン紙を使用し、自分の筆圧を確認しながら書字リズムを習得していく方法など、具体的ですぐに実践にうつせるものにした。開発した動画教材と資料集は、書写書道教育研究者や現場の先生方にご覧いただき、意見や感想を求めた。また、研究成果を、硬筆練習帳や書写の学習指導書等の著書に反映させるようにした。本年度は、昨年度に作成した行書動画教材(毛筆・硬筆)と、問題のある行書の書き方が一覧できる資料集をさらに改善するため、教員養成課程の学生を対象に中学校での授業展開を想定した授業を行い、授業の効果についてまとめた。また、現職教員対象の研修会や講演会でも資料を取り上げて説明し、広く意見を求め、それらを反映させてより効果的な教材にした。今後研究成果をさらに広めるため、改訂作業中の中学校の教科書・指導書およびDVDやデジタル教科書に反映させる予定である。行書基準文字(いわゆる手本)の字形や運筆も、研究成果を反映して、中学生が学習しやすい行書形を追究して書いた。本年度は、仙台市書き初め展硬筆

手本や、高等学校芸術科書道免許取得のための大学生用テキストにおいて、硬筆行書教材を、書写と書道の接続がはかりやすい、研究を踏まえた字形と運筆で書いた。研究を進めていくうちに、行書指導によって筆圧のかけ方と筆脈が合理的な動きになっていくと、楷書を書くときも、行書と関連させて指導することによって、筆圧のかけ方と筆脈が速書きに適した合理的な動きになっていくことがわかってきた。逆に、小学校段階で速書きに適した運筆リズムを身につけると、中学校でスムーズに行書学習にはいれるのではないかという仮説が成り立つ。本年度は、小学校での速書きに適した運筆研究も行い、学会で発表した。さらに、第27回全国大学書写書道教育学会シンポジウムにおけるラウンドテーブルでは、「テーブル2書写の内容論」を担当したが、世話人の話題提供として、研究成果を盛り込んだ資料を用意した。会場で寄せられた貴重な意見をふまえて、硬筆指導における筆圧と筆脈に着目した書字過程の研究の重要性についてまとめた提言は、学会誌に掲載された。開発した動画教材と資料集は、書写書道教育研究者や現場の先生方にご覧いただき、意見や感想を求めているが、予定よりも意見聴取の数が少ないので、もう少し広範囲に広げていきたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、開発した動画教材や資料集を実際に教員養成課程の学生や中学校国語科書写の授業で活用し、さらに改善を重ねる。研究の成果を報告書やDVDにまとめる。
ベストプラクティス・アプローチに基づく心理教育プログラムの評価研究

本研究の目的は,エビデンスベースド・アプローチ(EBA)による評価研究が倫理的あるいは技術的に困難である心理教育プログラムの評価アプローチの検討を行うことである。そのために,主に経営学領域で開発されたベストプラクティス・アプローチ(BPA)を活用したプログラム評価のあり方を検討し,EBAを補完する体系的な方法論を開発する。2018年度は,対人・コミュニティ援助を目的として実施されるプログラムの成功事例の検討を開始したと同時に(例:自治体・企業におけるキャリア支援),BPAの基礎となるベンチマーキングの方法論に関するレビューを行った。その結果,心理学諸領域の研究において活用されるEBAと本研究の対象であるBPAとは,理論(基礎)および方法論(応用)の多くの側面で異なるアプローチをとることが明らかになった。具体的には,EBAを活用したプログラム評価では因果関係の特定・査定に重点が置かれ,根拠となる結果を重視するなどアウトカム志向が強い。一方,BPAはむしろプログラムによる介入や実践活動の過程を明らかにする点などプロセス重視であることが確認された。プロセス重視の評価研究のあり方を模索するために,本年度は「優れた実践」を意味するベストプラクティスの実践過程(プログラム介入・サービス提供のプロセス)をどのようにベンチマーキングによって可視化し,その後の評価モデルの開発につなげるかの検討を行った。ベストプラクティス・アプローチ(BPA)の理論・方法論に関するレビューを継続的に実施しつつ,自治体・企業組織において実施される個人・集団に対しての心理教育プログラム(例:キャリア支援)の成功事例の検討を開始した。またベンチマーク指標の作成(ベンチマーキング)に向けた第一段階の作業として,プログラムの実施過程(プロセス)を可視化するツールの開発・修正を行った。ベストプラクティス・アプローチ(BPA)をプログラム評価研究に導入する意義は,多領域のベストプラクティスを領域横断的な視点から考察し(評価し),自他ともに,多領域のプログラムの改善(質向上)につなげていくことである。従って,今後の展開として,心理学諸領域を基本としつつ複数の領域への応用性が高いBPAを検討する必要があることが確認された。また,心理学を含む社会科学領域で広く活用されるエビデンスベースド・アプローチ(EBA)の枠組みやモデル(例:因果モデル)には,アウトカム重視であるが故に,プロセスの可視化が十分伴わないことが多いという課題がある。そこで,アウトカムである介入の効果・成果と共に,プロセスである介入の質(quality)の維持・向上のためのプログラム評価研究のあり方を,BPAの枠組みから検討していく。
新規小胞体ストレスセンサーOASISの生体内における機能解明

転写因子として機能するOASISおよびBBF2H7の標的遺伝子を同定する目的で、既に作成している各々のノックアウトマウスから初代培養法によって細胞を抽出し、その標的遺伝子を同定することを試みた。具体的には、野生型マウスとノックアウトマウスにおける遺伝子発現レベルを、マイクロアレイプロファイリングによる網羅的解析によって比較検討した。その結果、OASISおよびBBF2H7がノックアウトされることによって、mRNAおよびタンパクの発現が野生型と比較して明らかに異なっている候補遺伝子のピックアップすることに成功し、OASISおよびBBF2H7の直接的な標的遺伝子を同定することに成功した。これによってOASISおよびBBF2H7の生体内における機能の一端を明らかにすることができた。さらにノックアウトマウスで著明な異常が見られた組織以外でも、細胞の分化・成熟を始めとした様々な異常を確認している。現在、OASISもしくはBBF2H7ノックアウトマウスの特定部位のみで、OASISもしくはBBF2H7が発現するよう改変したトランスジェニックマウスを用いる等して、各組織におけるOASISおよびBBF2H7の機能を明らかにすることを試みている。本研究によって明らかにしたOASISおよびBBF2H7から発信される小胞体ストレス応答シグナルは、細胞の分化・成熟を担う新たな役割を有している可能性を示唆しており、複雑な小胞体ストレス応答機構の解明に、大きな進展をもたらすことが期待できる。さらにはOASISおよびBBF2H7が制御する新たな小胞体ストレス応答が関与していると疑われる、様々な疾患の治療戦略を開発するための重要な突破口となることも期待できる。さらにOASISおよびBBF2H7を強制発現させるアデノウイルスベクターを作成することに成功した。これを用いてノックアウト細胞にウイルスを感染させ、このサンプルと未処理のノックアウト細胞における遺伝子発現レベルをマイクロアレイによって比較した。その結果、OASISおよびBBF2H7がノックアウトされることによって、mRNAおよびタンパクの発現が野生型と比較して明らかに異なっている候補遺伝子のピックアップに成功した。この結果を元に、reporter assay、electrophoretic mobility shift assayおよびchromatin immunoprecipitation assayを行い、OASISおよびBBF2H7の直接的な標的遺伝子を同定することに成功した。
二核細胞集団の増殖分化と存在意義

本研究では、ショウジョウバエ雄の内部生殖器官である附属腺細胞(二核細胞)をモデルとし、核分裂と細胞質分裂の連動性の放棄がどのような細胞周期制御によってもたらされるのか、さらに二核細胞の存在意義は何か、という二つの問題について追及する。平成20年度の研究において、附属腺の二核細胞集団は、少数の二核細胞の増殖により生まれるのでなく、通常存在する一核の増殖細胞集団が最終細胞周期を同調化させ、低分子Gタンパク質Rhoの不十分な活性化のために、細胞質分裂を放棄することによって二核化することが明らかとなっていた。平成21年度の研究においては、Rhoの不十分な活性化が、分裂後期に通常発達する中央紡錘体の不全によることが分かった。以上までの研究が、附属腺細胞の二核化のメカニズムを明らかにしたものである。さらにこの二核化細胞は、インスリンシグナルの影響を受け、栄養状態が良好な時にはサイズが大きくなり、交尾直後にはサイズが小さくなるサイズの可塑性をもっていることが明らかとなった。それは、1核の倍数化細胞よりもサイズを増大でき、1核の2細胞よりもサイズが縮小できる、より可塑性が高い方法であって、結果として器官の分泌物貯蔵量の変化に対し、より対応できるという特性をもつことが分かった。以上は、二核細胞の意義を明らかにしたものである。さらに平成22年度に繰り越した研究において、附属の二核化状態に影響を及ぼす新規突然変異体を分離し、解析中である。ほとんどの真核細胞はただ一つの核が存在するが,特定の細胞種には、積極的な二核状態の形成と維持が認められ、それは広範な生物群にわたって見出すことができる。それを可能にする仕組として、通常の体細胞分裂の際に続けて起きる核分裂と細胞質分裂が、その連動性を失うために生じることが想定される。本研究では、核分裂と細胞質分裂の運動性の放棄がいかなる細胞周期の制御によってもたらされるのかを、ショウジョウバエ附属腺における二核細胞集団をモデルとした実験系を用いて解明することを目指し、以下のような実験を計画し、行った。1.細胞周期に依存した細胞質分裂制御因子Rhoの活性を上昇させることにより、二核化形成を人為的にスキップさせることに成功した。これにより、附属腺における細胞質分裂の非共役は、核分裂後に中央紡錘体周辺でRhoの活性化が起きないことによることが明らかとなった。2.ショウジョウバエ・ゲノムの8割をカバーする、各種の染色体欠失異体のコレクションを順次検索し、二核形成不全をみせる細胞(一核化している細胞)の頻度が上がる系統を複数同定した。これにより、附属腺における細胞質分裂停止を制御する遺伝子の同定に迫れることが期待される。3.細胞種特異的な二核形成不全をみせるトランスポゾン・タギング変異体"monos"の遺伝子座マッピングを進めた。これにより、附属腺における細胞質分裂を細胞種特異的に制御する遺伝子の同定に迫れることが期待される。
軟骨に特異的に発現する線維性コラーゲン分子の発現調節機構の解析と軟骨再生への応用

1)XXVII型コラーゲン遺伝子の選択的プロモーターの基本転写調節機構を調べる。XXVII型コラーゲン遺伝子は、軟骨組織に発現している事は分かっているが、その発現調節機構についての情報は全くない。申請者は、この遺伝子の基本転写調節機構の解析を進めたところ、2つの転写産物が存在し、その発現が異なっている(軟骨・皮膚)事を見出した。一方、この遺伝子の選択的プロモーターのメカニズムおよび関与する転写因子については全くわかっていない。そこで、1:基本プロモーター領域をルシフェラーゼアッセイにより決定し、2:関与する転写因子をゲルシフトアッセイ、特異抗体を用いたChipアッセイ等で同定する。2)発見したXIおよびXXVII型コラーゲン遺伝子に存在する軟骨特異的エンハンサー領域を導入したトランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンを解析する。2つの軟骨特異的シスエレメントの個体レベルでの活性を検討するために、1:エンハンサー領域を含んだコンストラクトDNAを構築後、作製したコンストラクトDNAを、マイクロインジェクション(または、CRISPR-Cas9システム)により受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作製する。2:トランスジェニックマウスは、胎生13.516.5日で取り出し、Xgal染色後(又はGFP)にホールマウントまたは切片を作製し、エンハンサー活性の発現パターンを解析すると共に、免疫染色により関与する因子の生体内での作用機序を明らかにする。申請者は、まず最初にXI型コラーゲンα1鎖の軟骨細胞における基本転写調節機構を解析し、転写因子NF-YおよびSp1による発現調節機構のメカニズムを明らかにする事ができた。そこで、XXVII型コラーゲンα1鎖の転写調節機構を解析したところ、2つの選択的スプライシング産物が存在しており、それぞれの転写産物が選択的プロモーターにより制御されていることを見出すことが出来た。次に、XI型およびXXVII型コラーゲンα1鎖の軟骨特異的発現機構を検討したところ、軟骨細胞特異的に発現を増強する調節因子が存在していることが見出された。そこで、XXVII型コラーゲン遺伝子の2つの選択的プロモーター、特に軟骨組織に関与しているプロモーターについて、その基本転写調節機構について解析した結果、2つの軟骨特異的エンハンサー活性発現に重要な結合配列及び結合する因子を同定すると共に、強制発現およびノックダウン等による機能解析を行った。更に、トランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンの解析を試みると共に、見出した軟骨特異的発現調節因子が、未分化間葉系幹細胞やES細胞からの分化過程(軟骨分化誘導や骨分化抑制等)にどのような役割を果たしているかを検証し、non-coding RNAによる遺伝子発現調節機構との関連を検討すると共に、エンハンサー活性に重要な結合配列や結合因子と軟骨形成不全症との関連を調べた。まず、XI型およびXXVII型コラーゲンの軟骨特異的発現機構を検討した結果、軟骨細胞特異的に発現を増強する調節因子の存在を示すことができた。しかし、XXVII型コラーゲン遺伝子の2つの選択的プロモーター、特に軟骨組織に関与しているプロモーターについて、その基本転写調節機構について解析し、2つの軟骨特異的エンハンサー活性発現に重要な結合配列及び結合する因子を同定を試みたが、明らかに出来ていない。このために、強制発現およびノックダウン等による機能解析実験も検討中であるので、トランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンの解析への移行が当初計画より遅れている。<XXVII型コラーゲン遺伝子の選択的プロモーターの基本転写調節機構の検討>XXVII型コラーゲン遺伝子は、軟骨組織に発現している事は分かっているが、その発現調節機構についての情報は全くない。<XXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的エンハンサー領域の発現調節機構の検討>発見したXIおよびXXVII型コラーゲン遺伝子に存在する軟骨特異的エンハンサー領域を導入したトランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンを解析する。2つの軟骨特異的シスエレメントの個体レベルでの活性を検討するために、エンハンサー領域を含んだコンストラクトDNAを構築後、作製したコンストラクトDNAを、マイクロインジェクションにより受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作製する。トランスジェニックマウスは、胎生13.516.5日で取り出し、Xgal染色後にホールマウントまたは切片を作製し、エンハンサー活性の発現パターンを解析すると共に、免疫染色により関与する因子の生体内での作用機序を明らかにする。申請者はこれまでに、マウスXXVII型コラーゲンα1鎖遺伝子に選択的スプライシング産物が2つ存在しており、この転写産物が選択的プロモーターにより制御されていることを見出した。そこで、XXVII型コラーゲンα1鎖遺伝子の選択的プロモーターの中で、新しく見出した軟骨組織への関与が示唆されている基本プロモーターの転写調節機構について解析した。その結果、軟骨特異的エンハンサー領域に関わる2つの重要な結合配列及び結合している調節因子の存在を明らかにすることが出来たので、この調節因子の強制発現もしくはノックダウンコンストラクトを作製し、軟骨細胞における機能解析を行った。更に、見出した軟骨特異的発現調節因子が、軟骨分化過程や骨分化過程にどのような役割を果たしているかを検証しつつある。

加えて、最近注目されている、non-coding RNAによるXXVII型コラーゲンα1鎖遺伝子発現調節機構および軟骨分化誘導機構への関与を検討すると共に、軟骨形成不全症などの関連疾患への作用機序を検討している。1)XXVII型コラーゲン遺伝子の選択的プロモーターの基本転写調節機構を調べる。XXVII型コラーゲン遺伝子は、軟骨組織に発現している事は分かっているが、その発現調節機構についての情報は全くない。申請者は、この遺伝子の基本転写調節機構の解析を進めたところ、2つの転写産物が存在し、その発現が異なっている(軟骨・皮膚)事を見出した。一方、この遺伝子の選択的プロモーターのメカニズムおよび関与する転写因子については全くわかっていない。そこで、1:基本プロモーター領域をルシフェラーゼアッセイにより決定し、2:関与する転写因子をゲルシフトアッセイ、特異抗体を用いたChipアッセイ等で同定する。2)発見したXIおよびXXVII型コラーゲン遺伝子に存在する軟骨特異的エンハンサー領域を導入したトランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンを解析する。2つの軟骨特異的シスエレメントの個体レベルでの活性を検討するために、1:エンハンサー領域を含んだコンストラクトDNAを構築後、作製したコンストラクトDNAを、マイクロインジェクション(または、CRISPR-Cas9システム)により受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作製する。2:トランスジェニックマウスは、胎生13.516.5日で取り出し、Xgal染色後(又はGFP)にホールマウントまたは切片を作製し、エンハンサー活性の発現パターンを解析すると共に、免疫染色により関与する因子の生体内での作用機序を明らかにする。XXVII型コラーゲン遺伝子の2つの選択的プロモーター、特に軟骨組織に関与しているプロモーターについて、2つの軟骨特異的エンハンサー活性発現に重要な結合配列及び結合する因子を同定を出来る限り急いで解析する。同時に、強制発現およびノックダウン等による機能解析実験も平行して検討する。トランスジェニックマウスを作製し、個体レベルでの発現パターンの解析への移行を出来る限り早急に進めると共に、見出した軟骨特異的発現調節因子が、未分化間葉系幹細胞やES細胞からの分化過程(軟骨分化誘導や骨分化抑制等)にどのような役割を果たしているか、non-coding RNAによる遺伝子発現調節機構との関連を検討する。最初に、明らかにした軟骨特異的エンハンサー領域に関わる2つの重要な結合配列及び結合している調節因子について、強制発現もしくはノックダウンコンストラクトを軟骨細胞に遺伝子導入することによって、これら因子の役割を早急に明らかにする。同時に、見出した軟骨特異的発現調節因子が、軟骨分化過程や骨分化過程にどのような役割を果たしているかについても、未分化間葉系幹細胞の実験系を用いて検討する。
イルカ腹腔内精巣の細胞・分子生物学的解析

哺乳類の精巣は通常陰嚢内に存在し、体温よりも数度低い温度に保たれることにより正常な精子発生が行われている。一方鯨類、ゾウなどは陰嚢をもたず精巣は腹腔内に位置する。こうした腹腔内精巣動物の精子発生が、いかなる温度調節機構によって行われているかについては未だ不明である。本研究では腹腔内精巣と熱ショックタンパク質(HSP)およびレクチンの発現性との関連を検討した。材料としてはイルカ精巣に加えて、実験的腹腔内精巣マウス、非繁殖期ハムスターの精巣および胎生期、生後初期のマウス腹腔内精巣を用いた。実験的腹腔内精巣マウスでは、多数の変性精細胞が観察され、それらには核濃縮、細胞質の好酸性変化および濃縮が認められ、またTUNEL陽性細胞も観察された。HSP70.2の発現はバキテン期以降の精細胞に観察され、腹腔内精巣マウスでは反応は認められなかった。非繁殖期のハムスター精巣では、レクチンDBAが精祖細胞に特異的な結合を示した。DBAは繁殖期ではA型精祖細胞にのみ反応するのに対し、非繁殖期ではA型、中間型、B型の各精祖細胞に反応した。胎生期および生後初期のマウス腹腔内精巣では、レクチンsWGA,VVA,LEAが精細胞に特異的な結合を示し、これらのレクチンが精細胞の分化に関わっている可能性が考えられた。バンドウイルカ、ハナゴンドウ、ヤギのHSP84,86発現を検討した結果、HSP84と86では明らかな相違が認められた。84はB型精祖細胞に強い反応性を示したのに対し、86は精母細胞ないし精子細胞に強い反応性を現した。これらの反応性の違いから、84と86は精細胞分化の異なる過程でそれぞれ役割を担っている可能性が示唆された。また、特に86において種間差が認められた。ヤギではバキテン期以降の精母細胞および円形精子細胞に、バンドウイルカではザイゴテン期以前の精母細胞および円形精子細胞に、またハナゴンドウではすべての精母細胞が反応したが、精子細胞は反応性を示さなかった。本年度はスジイルカ、ハナゴンドウおよびバンドウイルカの3種のイルカの精巣組織について、その微細構造を比較検討した。同時に腹腔内精巣をもつイルカ類に対するモデルとして、実験的腹腔内精巣による精子発生不全マウスを作出し、その細胞動態について観察した。加えて精子発生不全ハムスターも作出し、比較観察の材料とした。今回用いた3種のイルカの共通した特徴として、まず白膜の延長が精巣実質内に侵入し、精巣の支柱となっていることが上げられる。イルカの精巣は、ウシ、ウマといった大型家畜にそれに比べてもはるかに大きく、こうした結合組織の侵入により精巣の形状が維持されていると思われる。間質の占める領域は比較的乏しく、精細管断面においてはしばしば複数の精上皮ステージが認められた。またバンドウイルカの精上皮は、その細胞層が他の2種のイルカに比べて薄い形態を示した。実験的腹腔内精巣処置を施したマウス精上皮は、処置後1週の間に大きな形態学的変化を起こし、多数の変性精細胞に核濃縮、細胞質の好酸性変化および濃縮が認められた。

TUNEL法を用いた結果、検出される細胞が確認された。電子顕微鏡による微細形態の観察でも、細胞質の凝縮、核の濃縮などが認められ、これらの変性細胞はアポトーシス様の過程を経て死に至っている可能性が示唆された。処置後8週になると、精上皮は薄層化し、セルトリ細胞、精祖細胞および少数の精母細胞を残すのみとなった。HSP70.2に対する抗体を用いて、その発現の変化を観察したが、この系における精細胞の変性・脱落には直接関与しないものと考えられた。短日条件により精子発生不全としたハムスターの精巣について検討した。精巣重量、精細管径は処置後13週で最小となり、この時期、精上皮はセルトリ細胞、精祖細胞および少数の精母細胞からのみ構成されていた。哺乳類の精巣は通常陰嚢内に存在し、体温よりも数度低い温度に保たれることにより正常な精子発生が行われている。一方鯨類は、水中という特殊な環境に適応しているため、体は流線型を呈し、陰嚢をもたず精巣は腹腔内に位置する。そのためどのような温度調節機構によって精子発生が行われているかについては未だ不明である。本研究ではまず、マウスを用い実験的に腹腔内精巣を作り出し、精巣の温度上昇に伴う変化について検討した結果、著明な変化は処置後1週で起こり、多数の精細胞に核濃縮、細胞質の好酸性変化および濃縮が認められ、TUNEL陽性細胞も観察された。次に精巣が未だ腹腔内にある前精子発生期のマウス精巣をレクチン染色により観察した結果、sWGA,VVA,LEAが精細胞(gonocyte)に特異的な結合を示した。さらに短日条件飼育により、精巣が著しく萎縮し陰嚢が不明瞭となるハムスターの精巣を観察したところ、レクチンの1種、DBAが非繁殖期の精祖細胞に特異的な結合を示した。イルカ類の精巣については、バンドウイルカおよびハナゴンドウを用い、熱や種々のストレスから細胞自身を防御するため誘導、産生される熱ショックタンパク質(HSP)の発現を、ヤギとの比較の上で検討した。HSPfamilyのうち、HSP84および86を取り上げ、抗体を用いた免疫組織化学を行った。その結果、HSP84と86では明らかな相違が認められた。84はB型精祖細胞に強い反応性を示したのに対し、86は精母細胞ないし精子細胞に強い反応性を現した。これらの反応性の違いから、84と86は精細胞分化の異なる過程でそれそれ役割を担っている可能性が示唆された。また、特に86において種間差が認められた。ヤギではパキテン期以降の精母細胞および円形精子細胞に、バンドウイルカではパキテン期精母細胞では反応が認められず、それ以前の精母細胞および円形精子細胞に、またハナゴンドウではすべての精母細胞が反応したが、精子細胞は反応性を示さなかった。
微生物ゲノム情報に基づいた新規代謝機構の解明

本研究ではアーキアの未知の代謝に着目し、ゲノム情報を利用して新規代謝経路の解明に努めてきた。特に超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisの中央代謝の一つであるアミノ酸異化代謝についてより深い理解を目指した。本代謝は3段階の反応で行われる。まず初段階のアミノ基の酸化反応を触媒するaminoacid dehydrogenase活性を細胞抽出液を用いて検討したところ、Gluに対する高い活性とAla,Val,Gln,Cys,Thrに対する弱い活性が検出された。一方ゲノム情報からはglutamate dehydrogenase (GDH)のみ存在が推定されていた。そこでGDH遺伝子を破壊したところ、Thr以外のアミノ酸に対する活性が検出されず、これらがGDHによるものであったことが明らかとなった。さらにアミノ酸のみに依存した生育条件ではGDH破壊株は全く生育せず、GDHが全ての異化代謝されるアミノ酸の初期酸化を担っていることが明らかとなった。またGDH破壊株はpyruvateを添加した培地では通常通り生育した。この時培養液のアミノ酸および対応する有機酸を定量すると、宿主株よりもアミノ酸全体の分解がより進んでいた。つまりpyruvateのような2-オキソ酸が豊富に存在する時、GDHはアミノ酸の異化代謝を全体的に抑える役割を持っていることが明らかとなった。次にGluの異化代謝の2,3段階目について遺伝学的解析を行った。ゲノム上にそれぞれ5つ存在するホモログ遺伝子のうち、生化学的解析により同定されていた2-oxoglutarate : ferredoxin oxidoreductaseおよびsuccinyl-CoA synthetaseのみがGluの異化代謝に寄与していることを破壊株の生育の観察と培地中のアミノ酸・有機酸の定量により明らかにした。本研究ではゲノム情報を利用して、超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisの糖代謝やアミノ酸代謝を中心とした生命機構の解明に努めている。これまでに解糖系におけるglyceraldehyde 3-phosphateと3-phosphoglycerateとの間の3つの変換経路の生理的意義を解明し、Mol.Microbiol.誌に論文を発表した。次にglutamate(Glu)の代謝について、それに関連する可能性のある遺伝子をゲノム情報から見出し、その生理的役割の解明を目指してきた。具体的な成果としては、glutamate dehydrogenase(GDH、glutamate〓2-oxoglutarate)、2-oxoglutarate:ferredoxin oxidoreductase(OGOR、2-oxoglutarate〓succinyl-CoA)、succinyl-CoA synthetase(SCS、succinyl-CoA〓succinate)の3種の酵素遺伝子の破壊株を作製し、形質評価を行った。その結果、異化代謝の観点からは、OGOR・SCS両遺伝子がGluの酸化分解に確かに関わっていることが明らかとなった。また特にGDH破壊株はアミノ酸異化代謝に依存した生育条件では全く生育せず、GDHがGluの異化だけでなく、他のアミノ酸の酸化分解にも必須であることが明らかとなった。またこの結果は、本菌には他のアミノ酸酸化酵素の寄与がほぼないことも示しており、よってGDHは本菌のアミノ酸異化代謝において、aminotransferaseと共役しながら、全ての異化代謝されるアミノ酸からのアンモニアと電子の遊離を行う実質的に唯一の酵素であることが明らかとなった。生合成の観点からは、3遺伝子ともにGluの生合成に必須ではないことが明らかとなった。本研究ではThemococcus kodakarensisのglutamateに関する代謝の解明を目的としている。特にglutamateとsuccinateを結ぶ経路について、glutamateの生合成および異化に対する寄与を検証してきた。

その結果、本経路はglutamate生合成には少なくとも必須でないことが明らかとなり、また本経路を担う酵素がglutamateの異化代謝のみならず、他のアミノ酸の異化代謝についても重要であることが初めて証明された。今後の取り組みとしては、glutamateの代謝経路について異化代謝・生合成の両面からさらに検討を進めていく。また今回明らかとなったglutamateや他のアミノ酸異化代謝について、その全容解明に向けて研究を推進する。
潜在的・顕在的態度を自己制御する方法

本研究は、強い情動価を持たない条件刺激が、快および不快な情動価を有する視覚刺激群に混じって出現する時、観察者が条件刺激と快刺激の出現ペアもしくは条件刺激と不快刺激の出現ペアに注意を集中することによって、その条件刺激に対して肯定的あるいは否定的態度を形成することを発見し、またこの現象の頑健性を確認した。この過程による態度形成は、与えられる刺激ペアの出現率からある程度まで自由であることを見出した。たとえば、ある条件刺激に対して多数の不快刺激が組み合わされて出現する状況下であっても、条件刺激と少数の快刺激の出現ペアに注意を集中することによって、観察者は条件刺激への肯定的態度を形成した。情動的に中性的な刺激の呈示に続いて、快あるいは不快な情動価を有する刺激を対呈示する手続きを繰り返すと、情動的に中性的な刺激(条件刺激)に対する実験参加者の態度が、対呈示された刺激の情動価と同方向に変化する。このような実験手続きを評価的条件づけと呼ぶ。当該年度においては、性格特性として楽観的な参加者と、悲観的な参加者が、これらの手続きにおいて、情動刺激に対して異なる方向の態度を形成することを明らかにした。実験では、性格特性としての楽観性を測定する尺度を実施してスクリーニングを行うことにより、参加者を楽観主義者と悲観主義者に分類した。これらの参加者に対して、ある条件刺激の直後に必ず快語を、べつの条件刺激の直後に必ず不快語を対呈示する学習フェイズを実施した。この学習フェイズでは、いずれの群の参加者も、条件刺激と情動語の関係に気付くことのないよう、認知資源を制限するための認知不可課題を同時に課した。学習フェイズ終了後の獲得フェイズでは、2つの条件刺激とフィラー刺激を次々に呈示し、これらに対する態度を2肢選択課題によって測定した。その結果、悲観主義者は、対呈示通りの態度を形成した。すなわち、快語の直前に呈示された条件刺激を好み、不快語の直前に呈示された条件刺激を嫌うとの反応を示した。これに対して楽観主義者はこれとは逆に、快語の直前に呈示された条件刺激を嫌い、不快語の直前に呈示された条件刺激を好むとの反応を示した。以上の結果は、単純な対呈示による態度形成において、楽観主義者が環境からの入力を逆転させる自動的態度形成を行っていることを示唆した。人は、快情動的事象あるいは不快情動的事象のいずれかに対して持続的に注意を集中させることによって、それらの事象に先行する対象に対する肯定的態度あるいは否定的態度を形成する。申請者が本研究課題開始に先立って発見した以上のような効果を“態度形成の意図的探索効果"と呼ぶ。平成24年度の研究目的は、この効果の再現性を3つの実験によって検証することであった。実験における獲得フェイズでは、強い情動価を持たない無意味図形を呈示し、その直後に、快刺激と不快刺激(いずれも情動画像)を等確率で対呈示した。快刺激探索条件の参加者は、ターゲットとなる無意味図形の直後の快刺激の出現に対してキーを押すよう求められた。不快刺激探索条件の参加者は、ターゲットとなる無意味図形の直後の不快刺激の出現に対してキーを押すよう求められた。以上の獲得フェイズ終了後、テストフェイズでは、ターゲット刺激であった無意味図形に対する態度測定を、潜在的測度と顕在的測度の両方によって実施した。以上の測定の結果、ターゲットの直後に快刺激探索を行った参加者は、ターゲットの直後に不快刺激探索を行った参加者に比べて、ターゲットを有意に好むことが見いだされた。この効果は、獲得フェイズ後に30試行からなる消去フェイズを経た後でも維持され、また、刺激呈示順序に関する変化を加えた条件下でも観察された。以上のように、平成24年度の研究においては、態度形成の意図的探索効果の再現が確認され、その効果の頑健性を示すことに成功した。平成26年度の研究目的は、この効果の再現性と頑健性を明らかにするために、被験者間計画での実験を試み、被験者内計画での結果と比較した。従来確認されている被験者内計画による実験では、1名の参加者に対して2つの無意味図形を呈示した。いずれの無意味図形が出現したときも、その直後に快画像と不快画像がそれぞれ50%の確率で出現した。参加者は、片方の無意味図形(Sp)の出現直後に快画像が出現したときと、他方の無意味図形(Sn)の出現直後に不快画像が出現したときにのみ、手元のキーを押すよう指示された。これにより、参加者はSpをSnよりも安定的に好むことが明らかにされた。だが平成26年度はこの比較を被験者間で実施した。すなわち、半数の参加者には無意味図形Spと、その対照条件となる別の無意味図形を呈示し、Sp出現直後の快画像に対してのみキーを押すよう指示した。また、残り半数の参加者に対して無意味図形Snと、その対照条件となる別の無意味図形を呈示し、Sn出現直後の不快画像に対してのみキーを押すよう指示した。以上の被験者間計画による実験を繰り返した結果、被験者間計画では、態度形成の意図的探索効果が安定して得られないことが明らかとなった。

この結果が意味することは、従来の被験者内計画による頑健な態度形成効果は、被験者内での何らかの対比効果に負うところが大であったのではないかということである。実験では、実験群の参加者に対して、「この実験は人が宣伝に抵抗できるかを調べるための実験である。ある図形の直後に快画像が、別の図形の直後に不快画像が出現するが、図形と情動画像の間には合理的な関係性はなにもないため、図形を好きに、あるいは嫌いになってはいけない」と教示した。統制群の参加者にはこれらの教示を一切与えなかった。獲得フェイズでは、これらの教示下にて、評価的条件づけの典型的な繰り返し対呈示を行った。その後のテストフェイズでは、これらの図形に対する態度を測定するための顕在的指標(二肢選択課題)と潜在的指標(情動的プライミング課題)を用いた課題を実施した。その結果、顕在的指標においては、実験群・統制群ともに対呈示方向に一致した態度を示したものの、実験群ではその傾向は小さく、参加者による意図的抵抗の効果が示唆された。しかしながら潜在的指標においては、実験群と統制群は、ともに対呈示方向に一致した態度を示していた。この結果は、参加者による対呈示への意図的抵抗は、態度の形成に際して大きな影響を及ぼさないことを示唆していると考えられる。家族の病気により週末に十分な研究時間が取れず、必要な実験を実施することができなかったためである。強い情動価を持たない中性的刺激と快および不快情動価を有する刺激が次々に出現するとき、観察者の注意を中性刺激といずれかの情動価を有する刺激に対して集中させることにより、中性的刺激に対して形成される態度を制御することが可能であることを心理学実験によって実証した。本研究の複数の実験では、中性的刺激として無意味図形を使用し、快刺激および不快刺激として快情動価もしくは不快情動価を有するカラー画像を使用した。実験では、参加者に対して中性的刺激と快刺激および不快刺激との対呈示を繰り返し行なった。その際に、参加者に対して、特定の中性刺激と、特定の情動価を有する刺激がペアとなって出現した際にのみ、キーを押す、言語報告を求めるなどのやり方で反応するよう指示した。この指示によって、参加者は特定の対呈示に対して注意を集中しなければならない。この指示の結果、参加者は、ある対象の後に出現する快刺激への反応を求められた際にはその対象への肯定的態度を形成し、また、ある対象の後に出現する不快刺激への反応を求められた際にはその対象への否定的態度を形成することが明らかになった。このような「態度の自己形成効果」は、中性的刺激と情動的刺激の出現率を超えた態度形成を可能にすることが明らかになった。たとえば、ある中性的刺激に対して快画像が0.2の確率で、不快画像が0.8の確率で対呈示される場合、参加者はその中性的刺激に対して比較的否定的な態度を形成していく。しかし、ここで参加者に対してその中性的刺激と快画像の対呈示に対してのみ反応するよう教示すると、その中性的刺激が主に不快画像を伴うにも関わらず、参加者はその中性的刺激に対して比較的肯定的な態度を形成するのである。以上の研究により、人は何らかの対象への態度を環境に抗って形成する、あるいは調整することが可能であることが示された。
多自由度マニピュレータの進化的最適経路計画

マニピュレータの障害物回避動作計画においては一般に複数の障害物回避経路が存在し,その最適性についても様々な評価基準が考えられる.しかも,実用的な3次元6自由度のマニピュレータの場合は環境物体と干渉しない経路を求めること自体困難な問題である.本研究では,マニピュレータの障害物回避経路の最適化に遺伝アルゴリズム(GA)を用いる一手法を新たに提案した.すなわち,障害物回避動作計画問題をマニピュレータの関節角度空間(Configuration Space:C-Space)内の曲線の形状最適化問題と捉え,曲線の遺伝子表現としてBezier曲線のコントロールポイントを利用する方法を提案し,遺伝オペレータとして,コントロールポイントに対する交配,突然変異を定義し,適合度関数として,曲線長が短いほど良い値となり,障害物との干渉の深さをペナルティーとするような関数を設定してGAを適用した.そして,大域的探索力に優れているとされるGAと局所的探索法である山登り法のハイブリッド化によって,従来の探索手法と比較してより良い解が求められることを示す結果がシミュレーションによって得られ,本手法が有効であることを示した.また,本手法は基本的に障害物との干渉チェックの手続きにあたる部分を変更するだけで他の型のマニピュレータや障害物形状へ容易に拡張,適用できるであろうと思われる.マニピュレータの障害物回避動作計画においては一般に複数の障害物回避経路が存在し,その最適性についても様々な評価基準が考えられる.しかも,実用的な3次元6自由度のマニピュレータの場合は環境物体と干渉しない経路を求めること自体困難な問題である.本研究では,マニピュレータの障害物回避経路の最適化に遺伝アルゴリズム(GA)を用いる一手法を新たに提案した.すなわち,障害物回避動作計画問題をマニピュレータの関節角度空間(Configuration Space:C-Space)内の曲線の形状最適化問題と捉え,曲線の遺伝子表現としてBezier曲線のコントロールポイントを利用する方法を提案し,遺伝オペレータとして,コントロールポイントに対する交配,突然変異を定義し,適合度関数として,曲線長が短いほど良い値となり,障害物との干渉の深さをペナルティーとするような関数を設定してGAを適用した.そして,大域的探索力に優れているとされるGAと局所的探索法である山登り法のハイブリッド化によって,従来の探索手法と比較してより良い解が求められることを示す結果がシミュレーションによって得られ,本手法が有効であることを示した.また,本手法は基本的に障害物との干渉チェックの手続きにあたる部分を変更するだけで他の型のマニピュレータや障害物形状へ容易に拡張,適用できるであろうと思われる.
話しことばの認識と生成におけるリズムの役割

平成元年度以来,次の事項を明らかにした。1.人のリズム知覚にはholisticとanalyticな知覚の2つの形態があり,両者は神経心理学的に互いに異質である。前者は音節問隔が330ms以内の速いリズムに接したときの知覚方法であり,後者は450ms以上の遅いリズムを処理するときにみられる。4.PSUとPrSUは互いに類似した性格をもっていることを実証した。6.ジェスチャーと音声言語の関係をある程度解明した。以上をふまえて,平成4年度は次の事項を明らかにした。7.英語(stress timed),西語(syllable timed),日本語(mora timed)を素材にして,音声分析を行った結果,(1)どの言語も,そのPSUは330ms以内の間隔で結ばれた7±2以内の音節数から成る意味単位という共通の性格をもっていた。これはuniversal ej現象である。(2)日本語の音節の平均長は120150msであり,これを2倍にしても上記のholisticな知覚域におさまる。これがmoraという現象を生んだ原因と考えられる。(3)英語のように,音節長がバラバラな言語は,holisticな知覚域におさまっていても知覚しにくいので,PSUの末尾を音節を延ばしたりしてPSUの単位を示す。これがstress timedを生んだ原因である。8.国語研究所のスタッフと討議を重ね,上記の研究の日本語教育への応用法を,8つの視点から掴え,国際シンポジアムで発表した。9.4年間の研究成果を理論的に整備して筋のとおったものにし、近刊予定の研究成果報告書で開陳する。そのため、最低限度の図書が必要であったので購入した。
急性肺傷害発症機転における各種炎症細胞とアポトーシスの関連

本研究は臨床面と基礎実験から急性肺傷害の発症機転におけるアポトーシス関連因子の関与を解明することを目的としたtraslational researchである。1)急性肺傷害患者のマイクロサンプリング液中のアポトーシス関連因子発現の検討臨床的にARDSと診断された患者を対象にして、新しく開発したBronchscopic microsampling法を用いて肺胞上皮被覆液を採取してその経日的変化を検討した。本方法は新規に我々が開発した全く新しい肺胞被覆液採取法である、従来の肺胞洗浄(BAL)ではわからなかった肺胞被覆液の絶対濃度を得ることができる画期的な方法である。現在近年アポトーシスとの関連が深いと言われているHMGB1などの濃度を検討している。その結果、血中HMGB1濃度は重症度に比例して高値を示すことなどが明らかとなった。またヒトARDS症例の剖検肺でもFas, FasLなどが高濃度で発現していることを示した。2)急性肺傷害に関する基礎的実験これまで報告したとおり現状ではmutant mouseの供給が困難であったため、対象をLPS投与マウスに変更した。基本的は、Fas, FasL, perforin, granzymeなどのアポトーシス関連因子は強く発現した。また上記の臨床結果を参考に、急性肺傷害に伴うHMGB1の発現をRT-PCR、免疫染色等で検討したところ、HMGB1は肺胞マクロファージを中心とした炎症細胞に強く発現し肺傷害の病態に深く関与していることが示唆された。一方、アポトーシスに陥った細胞群ではHMGB1は核内に閉じこめられた状況に陥っておりこのような所見から急性肺障害におけるアポトーシスは細胞傷害に単に関わっているだけでなく、生体防御反応、また組織修復反応にも強く関与していることが示された。本研究は臨床面と基礎実験から急性肺傷害の発症機転におけるFas/FasL系をはじめとするアポトーシス関連因子の関与を解明せんとするものである。本方法は新規に我々が開発した全く新しい肺胞被覆液採取法である。従来の肺胞洗浄(BAL)ではわからなかった肺胞被覆液の絶対濃度を得ることができる画期的な方法である。現在可溶性Fas, FasLなどの濃度を検討している。また同時に20ml×5回のBALも可能なら施行し得られたサンプルの細胞成分の免疫組織染色などの可否について検討中である。2)急性肺傷害に関する基礎的実験アポトーシス関連因子異常マウス(FasLおよびFas mutant)を用いた急生肺傷害実験のための予備実験を繰り返した。さらにこれらの実験動物において前記の肺胞マクロファージの一時的な根絶を行い、その上でエンドトキシンへの反応を検討した。各マクロファージ根絶マウス、アポトーシス関連因子欠損マウスに対して経気管的にエンドトキシンを投与しそのlethal daseを決定した。研究途中でmutaht mouseの供給が一時ストップしたためさらなる検討は来期以降に持ち越した。本研究は臨床面と基礎実験から急性肺傷害の発症機転におけるアポトーシス関連因子の関与を解明せんとするものである。