hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖結合性天然物ＰｒａｄｉｍｉｃｉｎとＮ結合型糖鎖との結合様式の有機化学的解析

一方で、一年目に計画していなかった固体NMRに使用する13C標識体の調製条件の検討や近年明らかになった新たなタンパク質の糖修飾であるCマンノシルトリプトファンとPRMとの結合解析を行ったことから,最終的な目標である「PRMとN結合型糖鎖の結合様式の解明」に向けてはおおむね順調に研究が進展しているといえる。昨年度の研究により、PRM-Aは非還元末端マンノース(Man)残基を1つもつ直鎖型よりも複数もつ分岐型のオリゴ糖に強く結合し、特に非還元末端Man残基を3つもつ三分岐型にもっとも強く結合することが明らかになった。今年度は高マンノース型糖鎖から三分岐型のマンノオリゴ糖モチーフを合成して、PRM-Aの抗真菌作用に対する阻害試験および昨年新たに開発したPRM-FA1を用いた凝集試験の二種類の結合試験によって結合活性を比較した。その結果、両試験において同様の結果が得られ、PRM-Aはオリゴ糖に対してオリゴ糖の構造に関わらずほぼ同等の結合活性を示した。昨年度と今年度の結果をまとめると、PRM-Aの結合活性はオリゴ糖の構造に関わらずオリゴ糖のもつ非還元末端の数に依存して上昇することが明らかとなった。本結果から、PRM-AはN結合型糖鎖の中でも非還元末端Man残基を2つ有するハイブリッド型糖鎖よりも3つ有する高マンノース型糖鎖を選択的に認識している可能性が示唆された。今後はハイブリッド型糖鎖とハイマンノース型糖鎖の全長構造を用いてこの可能性を検証していく予定である。昨年度は、18位カルボキシ基、11-OMeおよび4'-NHMeの各炭素原子に選択的に13Cを導入したPRM-Aと二つの非還元末端Man残基を別々に13C標識した10との複合体をそれぞれ調製し、DARR (Dipolar Assisted Rotational Resonance : 6オングストローム以内の距離にある13C間の双極子相互作用をクロスピークとして検出する二次元固体NMR法)によって測定を行ったが、明確な結果は得られなかった。本年度は、昨年度に引き続きN結合型糖鎖の部分構造に対応するオリゴ糖の合成を進め予定していたオリゴ糖23種の合成を完了した。これらのオリゴ糖を用いてPradimicin(PRM)が非還元末端マンノース残基の多いオリゴ糖に強く結合することを明確にし、一年目の研究目標であった「PRMが高い親和性を示すN結合型糖鎖部分構造の特定」をほぼ達成した。一方で二年目の研究目標である「PRMとオリゴ糖の結合様式の解析」に関してはPRM/オリゴ糖複合体の固体サンプルを調製し固体NMRによる測定を試みているものの十分な進展が見られなかった。これらの状況を加味すると、研究は進展しているものの順調に進展しているとは言えず、やや遅れていると判断した。今後の研究としてはオリゴ糖の合成を半年以内に完了させたいと考えている。一方で、固体NMRによる解析はオリゴ糖合成が完了次第計画通り進行する予定である。現在、PRM/オリゴ糖複合体サンプルを調製し、DARR (Dipolar Assisted Rotational Resonance : 6オングストローム以内の距離にある13C間の双極子相互作用をクロスピークとして検出する二次元固体NMR法)によって測定を行っている。しかしながら、本法ではNMRシグナルがブロードしてしまい明確な結果を得ることはできなかった。本年度は、複合体サンプル調整時のpHなどの調製条件を変更し測定を試みたがシグナルの改善ができなかった。そこで今後は引き続きサンプル調製の条件を検討するとともに他の固体NMR手法も用いてオリゴ糖との複合体構造の解析を試みる予定である。
脳皮質形成制御因子リーリンと相互作用する分子の検索

前年度までに、リーリンと相互作用する分子を検索する過程で、リーリンは他のリーリン分子と会合すること、その会合は、機能阻害抗体CR-50の認識部位で担われており、CR-50抗体によって会合そのものも阻害されることを見いだした。本年度は、さらに、この会合体での分子数を調べたところ、全長リーリンは、2分子が会合して2量体を形成することを見いだした。また、リーリン蛋白質分子上のCR-50抗体認識部位を含むN末端領域を人為的に欠損させたコンストラクト(変異型リーリン)を作成し、これが全長リーリンやそれ自身と結合するか検討した。その結果、N末端領域を欠損させた変異型分子は全長リーリンと(少なくとも安定には)結合しないこと、また、変異型分子同士も安定な会合体は作らないことを見いだした。これらの結果は、リーリン同士の会合が確かにN末端領域で担われていることを支持する。次に、リーラーマウス胎児脳を培養し、この変異型リーリンを加えて、Dab1蛋白質のチロシンリン酸化が上昇するか検討したところ、チロシンリン酸化誘導能は著しく低下することがわかった。この結果は、このリーリン同士の会合体形成が機能上重要な役割を担っている可能性を強く示唆する。また、複数の受容体がクラスターをつくるようになる可能性が考えられるため、この点について免疫沈降法等により検討したところ、実際にクラスターを形成することを示唆する結果を得た。現在この現象へのリーリンの影響を検討中である。リーリンと相互作用する分子を検索する目的で、胎児脳由来のcDNA発現ライブラリーを作成し、リーリンをコートした培養皿にまいて、吸着する細胞を濃縮した。これよりDNAを回収し、同様の操作を繰り返したところ、意外なことにリーリンそのものが濃縮されてくることを見いだした。そこで、変性条件及び非変性条件下で胎児脳lysate及び培養上清をSDS-PAGEにかけ、Western解析を行ったところ、変性条件下ではリーリンに対応する分子量400kのバンドが検出されるのに対し、非変性条件では400kより高分子量域にwell下端までスメア状にシグナルが検出されることがわかった。そこで、リーリンを細胞表面に提示させた細胞を、リーリンをコートした培養皿にまいてその接着性を調べたところ、コントロールに比して有意に多くの細胞が接着することがわかった。この接着は、リーリンの機能阻害抗体であるCR-50で抑制された。また、上記の非変性条件下でのWestern解析で見られた、400kより高分子量域のスメア状のシグナルも、CR-50存在下では消失し、400kのバンドのみになることを見いだした。また、全長リーリンでなくCR-50エピトープ領域のみをコートした培養皿でも同様のリーリン提示細胞の接着がみられることがわかった。以上より、リーリン同士がCR-50認識部位を介してホモポリマーを作ることが示唆された。このポリマー形成は、機能阻害可能な濃度でのCR-50抗体の処理により完全に阻害されることから、機能上の重要性が示唆された。
超流動ヘリウム中における量子渦のケルビン波の検出とそのダイナミクスの解明

超流動ヘリウム中量子乱流生成の原因の一つである、振動流によって量子渦上に誘起されるケルビン波を超伝導細線振動子で観測するため、希釈冷凍機を用いて10mKで実験を行っている。ケルビン波を検出するために、ピエゾアクチュエータ(PAB4010)の先に直径70μm金属線(針)をつけ、その先と細線振動子の間の距離を100μm以内に近づけた実験装置を作成した。このことにより、振動子と針の間に橋渡しする付着渦糸を実現できる。この渦糸を振動子によって振動させた状態でPAB4010を駆動し、振動子-針間距離を変化させることで、ケルビン波の共鳴モードを観測することができると期待される。まず、ヘリウム減圧排気冷却用冷凍機を用いて1.2K超流動^4He中でこの実験装置の駆動テストを行い、その後、実験装置を希釈冷凍機に組み込むためのセル容器を作成した。容器下部には、熱交換率を向上させるため銀パウダーを焼結させ、渦を減らすため実験装置が入る容器上部との間を小さい穴でつなぐ構造にした。実験セル容器完成後、容器単体で真空漏れテストを行い、その後希釈冷凍機に設置した。液化速度を調節するための流量調節弁付流量計をとりつけ、配管やバルブ、配線を増設した。希釈冷凍機で実験セルを10mKまで冷却し、まず真空でPAB4010駆動テストを行った。この温度でも一昨年の1.2Kでの予備実験の時と同様、±60μm程度変動可能であることが新たにわかった。その後、ヘリウム注入ラインに真空漏れが見つかったため、室温に戻し、修理を行った。現在、再度10mKまで冷却し、ケルビン波探索実験が進行中である。超流動ヘリウム中量子乱流生成の原因の一つである、振動流によって量子渦上に誘起されるケルビン波を超伝導細線振動子で観測するための実験法の開発を行った。ケルビン波検知のためには、振動子の頂点と天井の間に橋渡しする渦糸を実現させ、振動子まわりの余分な渦をできるだけ少なくする必要がある。そこで、新しい引き抜きダイスによりこれまで以上に細い直径2μmの細線を作ることで表面がよりなめらかなものを作る技術を得、この細線振動子を銅箱で覆い超流動転移点前後を2時間かけてゆっくり冷却した。その結果振動子に付着する渦を減らすことに成功した。さらに、この条件のもと、振動子頂点に天井を100μm以内に近づけた状態で冷却したところ、振動子の頂点と天井の間に橋渡しする渦糸を確実に付着させることに成功した。以上の条件をもとに、ピエゾアクチュエータを用いて振動子と天井の間の距離を変えて測定すれば、渦糸上に励起されるケルビン波の高次モードの検出が期待される。そこで予備実験として、超流動温度でピエゾアクチュエータがどの程度可動領域を持つかをキャパシタンス法で測定したところ、±60μm動くことがわかった。これは数倍モードのケルビン波共鳴を観測するのに十分な可動領域である。したがってケルビン波検出のための実験手法がすべて整った。これらの実験法を取り入れた実験セルを作成し、まず超流動ヘリウム高温領域(1K)でケルビン波探索実験を行った。しかし、ケルビン波による信号を得ることはできなかった。この理由として高温領域では超流動ヘリウム中に常流動成分が存在し、それが渦との間に相互摩擦を起こしてケルビン波が減衰してしまっている可能性が考えられる。よって、常流動成分が存在しない、より低温で実験を行う必要があると判断し、現在低温領域(50mK)での測定を行うための実験セルの設計・作成が進行中である。
選択的な神経路標的法による大脳皮質-基底核ループ回路の機能に関する統合的研究

大脳皮質前頭葉と大脳基底核を連関するループ回路は、行動の学習、発現、組織化に重要な役割を果たす。行動制御を媒介する神経回路メカニズムの解明において、回路を構成する特定の神経路がコードする情報やそれらの相互作用に基づいて情報を処理する機序の解明が必須である。本研究では、イムノトキシン細胞標的法を改変し、ある脳領域から別の脳領域へ入力する特定の神経路を除去する技術(イムノトキシン神経路標的法)を開発する。本年度は、特に、逆行性に導入遺伝子を発現させるための組換え体ウイルスベクターシステムについて検討した。GFPあるいはヒトIL-2Rα/YFPを導入遺伝子とするHIVタイプ1由来の組換え体レンチウイルスを作製した。これらの組換え体ウイルスは培養細胞において高い感染効率を示した。組換え体ウイルスをマウスあるいはサルの線条体に注入し、さまざまな脳部位での導入遺伝子の発現を解析した。マウスでは、注入部位である線条体において多数の細胞にウイルスの感染が観察された。GFPを導入遺伝子とした場合は、黒質網様部や淡蒼球に順行性の標識が観察された。サルでは、線条体や順行性の投射領域への感染に加え、黒質緻密部や大脳皮質などの領域へ逆行性に感染し、これらの領域において導入遺伝子を発現することが観察された。以上の結果は、サルではHIVタイプ1由来のレンチウイルスを用いることによって、逆行性に導入遺伝子を発現させることが可能であることが示された。しかし、マウスでは同じ組換え体ウイルスでも逆行性の感染の効率は低いようであった。イムノトキシン神経路標的法を利用する場合、マウスでは神経細胞に対してより高い親和性を持つ組換え体ウイルスの開発が必要である。
脂質ラフトにおけるグリア増殖因子シグナル発信機構の解明

本研究では,主に神経芽細胞腫N1E-115細胞などの培養細胞への強制発現系を用い,メルトリンβによるグリア増殖因子ニューレグリンの脂質ラフトにおけるプロセシング活性を指標にその制御機構を明らかにすることにより,グリア増殖因子シグナルが神経筋結合部の形成と維持に果たす役割に関する知見を得ることを目的とした.昨年度までに申請者は,メルトリンβを強制発現させた培養細胞を用いたパルスチェイス実験,培養下の後根神経節ニューロンを用いたメルトリンβと各種細胞内小器官に対する抗体染色により,メルトリンβが細胞内の脂質ラフト,「特にゴルジ装置膜においてニューレグリンをプロセシングすることを示唆する知見を得た.このことを直接的,かつ詳細に検証するため,超遠心分画怯を用いた小胞体,ゴルジ装置などの膜性細胞内器官における発現,およびニューレグリンプロセシング活性の検討を行った.さらに,野生型,あるいはプロテアーゼ活性欠損型メルトリンβを強制発現させた.COS7細胞に対し,アミノ末端に蛍光タンパク質を付加したニューレグリンを同時に強制発現させ,蛍光相関分光法による観察を行うことにより,メルトリンβによるニューレグリンのプロセシングの「場」がゴルジ装置膜であることを示すことができた(Yokozeki, T. et al.2007).メルトリンβと同様にADAMファミリーに属する膜型プロテーゼTACE(TNF-αconverting enzyme)はニューレグリンをプロセシングするが,上記の解析系ではTACEはむしろ細胞表層におけるプロセシングに関わることから,プロテアーゼを細胞内の異なる領域に局在させることが増殖因子の放出を制御する機構のひとつとして想定できることが分かった.上記に加えて,メルトリンβ欠損マウスの性状について報告することができた(Komatsu, K.,et al.,2007).平成17年度は,私が脂質ラフトでのメルトリンの機能解析に使用した神経芽細胞N1E-115などの培養細胞への強制発現系を用い,脂質ラフトでのメルトリンによるグリア増殖因子ニューレグリンのプロセシング活性を指標にその制御機構を明らかにすることにより,グリア増殖因子シグナルが神経筋結合部の形成と維持に果たす役割に関する知見を得ることを目的とした.まず,メルトリンを強制発現させた培養細胞を用いたパルスチェイス実験,培養下の後根神経節ニューロンを用いたメルトリンと各種細胞内小器官に対する抗体染色により,メルトリンが細胞内の脂質ラフト,特にゴルジ装置膜においてニューレグリンをプロセシングすることが示唆された(未発表).このことをより直接的に確かめるため,野生型,あるいはプロテアーゼ活性欠損型メルトリンを強制発現させたCOS7細胞に対して,アミノ末端に蛍光タンパク質を付加したニューレグリンを同時に強制発現させ,そのプロセシングとゴルジ装置との関連について,蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)等を用いたより詳細な検討を行った.さらに,超遠心分画法を用いた小胞体,ゴルジ装置などの膜性細胞内器官を分画とウェスタンブロットを組み合わせて行い,メルトリンによるニューレグリンのプロセシングがゴルジ装置で起こるという結果を得た.今後はこれらの知見について初代培養神経細胞を用いて検証する。また,メルトリン欠損マウスを用いることで,メルトリンによるニューレグリンプロセシングの活性依存的な制御機構について調べる計画である.本研究では,主に神経芽細胞腫N1E-115細胞などの培養細胞への強制発現系を用い,メルトリンβによるグリア増殖因子ニューレグリンの脂質ラフトにおけるプロセシング活性を指標にその制御機構を明らかにすることにより,グリア増殖因子シグナルが神経筋結合部の形成と維持に果たす役割に関する知見を得ることを目的とした.昨年度までに申請者は,メルトリンβを強制発現させた培養細胞を用いたパルスチェイス実験,培養下の後根神経節ニューロンを用いたメルトリンβと各種細胞内小器官に対する抗体染色により,メルトリンβが細胞内の脂質ラフト,「特にゴルジ装置膜においてニューレグリンをプロセシングすることを示唆する知見を得た.このことを直接的,かつ詳細に検証するため,超遠心分画怯を用いた小胞体,ゴルジ装置などの膜性細胞内器官における発現,およびニューレグリンプロセシング活性の検討を行った.さらに,野生型,あるいはプロテアーゼ活性欠損型メルトリンβを強制発現させた.COS7細胞に対し,アミノ末端に蛍光タンパク質を付加したニューレグリンを同時に強制発現させ,蛍光相関分光法による観察を行うことにより,メルトリンβによるニューレグリンのプロセシングの「場」がゴルジ装置膜であることを示すことができた(Yokozeki, T. et al.2007).メルトリンβと同様にADAMファミリーに属する膜型プロテーゼTACE(TNF-αconverting enzyme)はニューレグリンをプロセシングするが,上記の解析系ではTACEはむしろ細胞表層におけるプロセシングに関わることから,プロテアーゼを細胞内の異なる領域に局在させることが増殖因子の放出を制御する機構のひとつとして想定できることが分かった.上記に加えて,メルトリンβ欠損マウスの性状について報告することができた(Komatsu, K.,et al.,2007).
HBウイルス感染細胞における細胞障害の機序の検討

B型慢性肝炎患者の肝浸潤リンパ球からのHB特異的CTLの分離とクローニング:B型慢性肝炎患者の肝生検組織片より浸潤リンパ球を採取し、一週間の培養後、限界希釈法にてクローンを作製した。それらをFACscanにて解析し、CD8陽性クローンのみを選択し、2週間毎にフィーダーを加え培養を継続。そのクローンにつき、CTL活性を測定した。ターゲットとしてautoもしくはHLA-A遺伝子表現型が一致したalloにEBウイルスを感染させたB-LCLを用い、アッセイを行なう12時間前にadr-もしくはadw-typeのpreS2の最初の14mer合成ペプチドをパルスした。その結果、患者1よりadr-type preS2 peptide pulsed auto B-LCLに対してのみCTL活性を持つ2つのクローン、C-4,C-49が得られ、それぞれの培養上清中のgamma-IFN濃度は活性を持たないクローンのものより高値を示した。また、患者2からはadr-type preS2 peptide pulsed allo B-LCLに対してのみCTL活性を持つクローン、3-44が得られ、その培養上清中のgamma-IFN濃度も活性を持たないクローンのものより高値を示した。これらの結果を94年7月の第30回日本肝臓学会総会にて発表した。現在ひきつづき、ターゲットエピトープの検索をすすめている。
対話を通して問いを創出し追究する聴覚障がい児の数学授業におけるICT活用の可能性

本研究の目的は、聴覚障がい児を対象とした数学の授業での問いを創出し、追究する過程におけるICT活用の可能性について明らかにすることである。具体的には、次の3つ;1聴覚障がい児を対象とする数学の授業過程における問いの創出・追究プロセスの分析、2ICT活用の可能性についての理論的検討、3ICT活用の可能性についての実証的検討、を下位目標として設定した。本研究は、次のような方法で進めた。文献講読によって授業を観察するための理論を構築した。構築した理論をもとに、授業観察・分析を行った。授業観察・分析からみえてきた課題を解決するための1つの方策として、ICT活用の果たす役割は何かを理論的に検討するために、文献講読や情報収集を行った。それらによって得られた知見をもとに、検証授業を行った。その際、講師を招聘し、ご助言をいただいた。それらをもとに、理論を再構築し、2回目の検証授業を行った。文献講読によって構築した理論をもとに行った授業観察・分析から、聴覚障がい児を対象とした数学の授業での問いを創出し、追究する過程における困難性の一端が次の2つ; 1表面化されていない生徒の問いをどのように顕在化するか、2顕在化している生徒の問いを、教師と生徒、あるいは生徒同士でどのように共有するか、であることが示唆された。ICTは、教師と生徒、あるいは生徒同士のコミュニケーションを保障するために有効であること、思考過程を視覚化するために有効であることから、上記の困難を克服するための方策として、有効であることが理論的に明らかになった。ICTを活用することで、教師と生徒、あるいは生徒同士の対話を、教師が注意深く聞き取る契機となっていること、生徒がどのような問いを創出し、それをどのように追究しているか、その過程を、視覚化し共有する契機となっていることが示唆された。
仙骨部表面電気刺激による新しい神経調整的不妊症治療法の研究

子宮の蠕動運動の強さおよびその周波数は仙骨部表面電気刺激により半減した。子宮平滑筋の収縮原因物質とされるPGF_<2α>の尿中濃度は、電気刺激によっては変化しなかった。仙骨部表面電気刺激による子宮平滑筋の蠕動運動活動性の低下はニューロモジュレーション効果によるものと考えられ、胚移植などに対して着床率の向上が認められた。子宮の過度な活動性を抑える作用により、不妊症治療に対して補助的効果があるものと考えられる。本研究の主目的は、仙骨部皮膚表面から第24後仙骨孔の脊髄神経を電気刺激する仙骨部表面電気刺激(ssES : saoral surface electrical stimulation)によって、子宮の収縮・蠕動運動や循環動態を制御し、仙骨部電気刺激が不妊症治療の-選択肢として適応可能かどうか検討することである。本年度においては、健常者の排卵期における子宮の形態・動態・循環の状況を画像医学的に確認することを主な目的とした。無作為に抽出した健常ボランティア(研究協力者)を、電気刺激を与えないコントロール群と電気刺激を与える刺激群(ES祥)の2群に分け、static MRI, cine mode MRI,超音波ドップラーにより検討を行った。さらに、子宮平滑筋の収縮物質とされるプロスタグランディンF2α(PGF2α)の尿中濃度測定を行い、ssESによってその体内濃度がどのように変化するのか生化学的に検討した。これまでの我々の研究において、ssESは全月経周期で子宮の筋緊張を低下させ、蠕動運動の周期が約2倍に延長しかつ収縮強度が50%減少させることがわかっている。排卵期においてもこれまで同様、ssESによる子宮平滑筋の筋緊張低下が認められた。排卵期における子宮平滑筋の蠕動運動は月経期に比べ早い活動が記録されており、ssESにより緩徐になることが確認できた。周期および収縮強度の解析は現在も継続中である。PGF2αの尿中濃度に関しては、排卵期に明らかな濃度上昇傾向を認めたが、ssESによる明らかな濃度低下は現在認められておらず、計測を継続中である。本研究の主目的は、仙骨部皮膚表面から第24後仙骨孔の脊髄神経を電気刺激する仙骨部表面電気刺激(ssES : sacral surface electrical stimulation)によって、子宮の収縮・蠕動運動や循環動態を制御し、仙骨部電気刺激が不妊症治療の一選択肢として適応可能かどうか検討することである。本年度においては、前年度の研究結果をふまえ、複数回の体外受精を行っても妊娠に成功しなかった難治性不妊症の患者を対象とした。電気刺激を与えないコントロール群と電気刺激を与える刺激群(ES群)の2群に分け、static MRI, cine mode MRI,超音波ドップラーにより検討を行った。さらに、子宮平滑筋の収縮物質とされるプロスタグランディンF2α(PGF2α)の尿中濃度測定を行い、ssESによってその体内濃度がどのように変化するのか化学的に検討した。排卵期における子宮平滑筋の蠕動運動は月経期に比べかつ健常者に比して早い活動が記録されており、ssESにより緩徐になることが確認できた。PGF2αの尿中濃度に関しては、健常者同様排卵期に明らかな濃度上昇傾向を認めたが、ssESによる明らかな濃度低下は現在認められておらず、計測を継続中である。本研究の主目的は、仙骨部皮膚表面から第24後仙骨孔の脊髄神経を電気刺激する仙骨部表面電気刺激(ssES:sacral surface electrical stimulation)によって、子宮の収縮・蠕動運動や循環動態を制御し、仙骨部電気刺激が不妊症治療の一選択肢として適応可能かどうか検討することである。前年度の研究結果をふまえ、排卵期において「形態」「動態」「血流」の解析を行い、難治性不妊症例における子宮の状態を確認した。同時に尿中プロスタグランジン濃度をELISAを用いて測定し、電気刺激が子宮の収縮に関与するとされるプロスタグランジンF2αに与える影響を検討した。さらに、本年度においては前年度までの体外受精は目的とせず、自然妊娠を主たる対象として検討した。すなわち、胚移植等高度かっ複雑な医療行為を行わずに、電気刺激によって簡便かつ自然に、難治性不妊症患者の妊娠が確立できるかを検討した。

排卵期における子宮平滑筋の蠕動運動は月経期に比べかつ健常者に比して早い活動が記録されており、ssESにより緩徐になることが確認できた。PGF2αの尿中濃度に関しては、健常者同様排卵期に明らかな濃度上昇傾向を認めたが、ssESによる明らかな濃度低下は認められなかった。電気刺激による自然妊娠確立の可能性は50%程度で概ね良好な結果であった。
天然油脂の酵素的変換による機能性高分子の合成

自然界に存在する生体触媒や天然油脂を利用し、新規硬化性高分子材料の合成を行った。本研究では天然油脂を出発物質に用い、シランカップリング剤との混合により有機-無機ナノコンポジット(グリーンナノコンポジット)塗膜を合成し、得られた塗膜の物性評価を行った。本研究では有機成分として主に天然物由来のエポキシ化大豆油(ESO)を用いた。シランカップリング剤存在下、少量のカチオン性熱潜在性開始剤を添加し熱処理を行ったところ、硬化が進行し透明な塗膜が得られた。本反応ではシランカップリング剤とESOのエポキシ基が共重合し、さらにシランカップリング剤のアルコキシシラン部位の重縮合により無機成分が凝集したナノドメインを形成していると考えられる。ここで得られたナノコンポジットは無機成分の種類や添加量により膜物性や力学強度、熱安定性等の調節が可能であった。両親媒性分子は容易に自己集積し、その結果、ナノファイバー等の高い軸比に特徴付けられるナノ構造材料を形成すると報告されている。しかし、一般に超分子集合体では化学結合を介していないため、熱等の外部刺激によりその集合体が容易に崩壊する。本研究では親水部に糖鎖、疎水部に植物油脂由来の長鎖不飽和基を有する硬化性両親媒性分子を合成した。本両親媒性分子は水/メタノール(1/1)混合溶媒中で容易に自己集積が起こり、ファイバー状超分子集合体が形成された。また、水中で本ファイバーをリポオキシダーゼ酵素により処理したところ、不飽和基の硬化が進行し、形態変化せずに不溶化した。これまでリパーゼ触媒を用い、不飽和脂肪酸存在下、グリセロール、セバシン酸ジビニルを反応させ、側鎖に不飽和基を有するポリエステルの合成を行ってきた。本年度はジカルボン酸誘導体の検討やプレポリマー中存在する不飽和基を酵素的にエポキシ基に変換し、その硬化を行った。その結果、芳香族ジビニルエステルと比較し、脂肪族ジビニルエステルを用いた場合に最も効率よく反応は進行し、不飽和基含有ポリエステルが得られた。また、リパーゼを触媒に用いてエポキシ基への変換を行った結果、80%以上の高い転化率でエポキシ基含有ポリエステルが得られた。その後硬化を行ったところ、不飽和基含有ポリエステルを用いた場合と比較し、硬度の上昇が見られた。また、本塗膜が生分解性を有することも確認された。また、人工漆の開発を行った。ウルシオール類似体を新規に合成し、その硬化挙動について検討を行った。芳香環骨格にナフタレン環を導入したウルシオール類似体をペルオキシダーゼのモデル錯体である鉄サレンを用いて重合すると官能基選択的に芳香環のみで反応は進行した。その後硬化を行ったところ、天然漆やこれまでの人工漆と比較し、著しい硬度の上昇が見られた。長鎖不飽和アルキル部に天然のアマニ油や魚油を用いていることから本塗膜は環境調和型塗料材料として期待される。さらに疎水部に天然油脂に含まれる不飽和脂肪酸を用いた硬化性両親媒性分子の合成を行った。グルコサミンとリノール酸から合成した両親媒性分子では自己集積が起こり、ファイバー状超分子集合体が形成することが確認された。酸化還元酵素であるリポキシダーゼの添加により本ファイバーは形態変化せずに不溶化した。エポキシ基含有シランカップリング剤(GPTMS)存在下、少量のカチオン性熱潜在性開始剤を添加し熱処理を行ったところ、硬化が進行し透明な塗膜が得られた。本反応ではGPTMSとESOのエポキシ基が共重合し、さらにGPTMSのアルコキシシラン部位の重縮合により無機成分が凝集したナノドメインを形成していると考えられる。ここで得られたナノコンポジットはシランカップリング剤の添加量に伴い、膜物性や力学強度、熱安定性等の向上が見られた。また、生分解性も保持されていることが確認された。無機成分に有機修飾クレイを用いた場合にも力学強度等の向上が見られ、油脂単独硬化物と比較し、高いガスバリア性を示すこともわかった。また、自然界に存在するフェノール脂質の硬化により新規環境調和型塗料の開発を検討した。具体的には中国産やベトナム産、ミャンマー産の漆に含まれているフェノール脂質を用い、その硬化を行った。ベトナム産漆やミャンマー産漆は乾燥が非常に遅く、得られる膜物性も日本産漆と比較し劣っているため、我が国ではそのまま塗料として使用される場合はほとんどない。第三成分としてタンパク質加水分解物存在下、ラッカーゼ触媒を添加したところ中国産、ベトナム産漆では速やかに硬化が進行し、日本産漆と同等の膜物性を有する塗膜が得られた。産出量の減少が懸念されている日本産漆の代替原料として期待される。

本研究では有機成分として主に天然物由来のエポキシ化大豆油(ESO)を用いた。シランカップリング剤存在下、少量のカチオン性熱潜在性開始剤を添加し熱処理を行ったところ、硬化が進行し透明な塗膜が得られた。本反応ではシランカップリング剤とESOのエポキシ基が共重合し、さらにシランカップリング剤のアルコキシシラン部位の重縮合により無機成分が凝集したナノドメインを形成していると考えられる。ここで得られたナノコンポジットは無機成分の種類や添加量により膜物性や力学強度、熱安定性等の調節が可能であった。両親媒性分子は容易に自己集積し、その結果、ナノファイバー等の高い軸比に特徴付けられるナノ構造材料を形成すると報告されている。しかし、一般に超分子集合体では化学結合を介していないため、熱等の外部刺激によりその集合体が容易に崩壊する。本研究では親水部に糖鎖、疎水部に植物油脂由来の長鎖不飽和基を有する硬化性両親媒性分子を合成した。本両親媒性分子は水/メタノール(1/1)混合溶媒中で容易に自己集積が起こり、ファイバー状超分子集合体が形成された。また、水中で本ファイバーをリポオキシダーゼ酵素により処理したところ、不飽和基の硬化が進行し、形態変化せずに不溶化した。
サマリウムエノラートの触媒的不斉プロトン化反応の研究

我々は、ヨウ化サマリウムを用いて非対称ジアルキルケテンをアリル化し、サマリウムエノラートを生成させ、これに触媒量のC_2対称なキラルジオールと反応系内で触媒を再生させるアキラルプロトン源としてトリチルアルコールを反応させることでサマリウムエノラートの触媒的不斉プロトン化反応を達成した。しかしながら、この反応では、トリチルアルコールを-45°Cで26時間かけて加えなければ、高い光学収率で生成物を得ることができなかった。そこで、高度にフッ素化されたアルキル基を有するフルオラスキラルおよびアキラルプロトン源を用いて、フルオラスニ相系で反応を行い、キラルプロトン源の共役塩基からアキラルプロトン源によるキラルプロトン源の再生がフルオラス相で効率良く進行すれば、効果的に触媒的不斉プロトン化反応が進行するのではないかと考えた。このような考えに基づき、検討を行った結果、サマリウムエノラートの触媒的不斉プロトン化反応においてフルオラスニ相系での反応が有効であることを明らかにすることができた。また、サマリウムエノラートの生成法を拡張して、Molanderらにより報告された、α-ヘテロ置換ケトンとヨウ化サマリウムによる還元反応に着目し、この反応をエナンチオ選択的反応に変換するため、研究を行った。その結果、2-ヘテロ置換-2-アリールシクロヘキサノンを基質として、C_2対称なキラルジオールの共存下で反応を行うと最高94%eeで相当する2-アリールシクロヘキサノンが得られることを明らかにした。また、2-ヘテロ置換2-アルキルシクロヘキサノンを基質としても、同様に不斉プロトン化反応が進行することも判明した。さらに、これらの結果から、この不斉プロトン化反応の反応遷移状態モデルを提唱することができた。SmI_2存在下、種々のジアルキルケテンとハロゲン化アルキルを反応させて生成させたサマリウムエノラートを、C_2-対称キラルジオール(DHPEX)を触媒にして不斉プロトン化する際に、DHPEXの共役塩基を有効に再生するためには、アキラルプロトン源をゆっくり加えながら反応を行わなければならない。これまでで、最も良い結果を与えたのは、トリチルアルコール(26時間、93%ee)である。これ以外の種々のアキラルプロトン源を用いて、反応時間の短縮と不斉収率の向上を計ったが、現在までにトリチルアルコールを凌ぐものは見つかっていない。例えば、2,6-ジクロロフェノールやベンゾピナコールでは不斉収率はそれぞれ82%ee(12時間)、68%ee(25時間)であった。トリチルアルコールのオルト位にフッ素の入ったものの合成には、未だ成功していない。基質のジアルキルケテンについては、イソプロピルフェニルケテンでは量論的不斉プロトン化と同程度の%eeが得られたが、メチルフェニルケテンでは触媒的な反応では大幅に%eeが低下した。HMPAを大量に加えると若干%eeは向上したが、量論的反応と比べて低い値であった。触媒条件下でのこれらの違いが何によってもたらされるのか、現在のところ不明である。今後は、引き続き触媒のキラルプロトン源を有効に再生できるアキラルプロトン源の探索を行うが、サマリウムエノラートの生成法を拡張して、α-ヘテロ置換ケトンとSmI_2の反応による方法(Molanderの反応)も取り入れる。また、キラルプロトン源もDHEPXに限らず、新しいものを合成する。このように、サマリウムエノラート、キラル及びアキラルプロトン源の種類を大幅に拡張することによって、触媒的な反応に適する組み合わせを見いだし、その構造的な特徴を把握することによって、この不斉触媒反応をコントロールしているファクターを明らかにする。

α位にハロゲンや酸素官能基を有するα-ヘテロ置換ケトン類をヨウ化サマリウムで処理すると、サマリウムエノラートを経由して、還元反応が進行する。筆者は、この反応を2-ヘテロ置換-2-アリールシクロヘキサノンを基質として、C_2対称な光学活性ジオール(DHPEB)の共存下で行うと、高エナンチオ選択的不斉プロトン化反応が進行し、最高94%eeで相当するアリールシクロヘキサノンが得られることを明らかにしている。そこで、本反応の触媒的不斉プロトン化反応が高エナンチオ選択的に進行するか否かを明らかにするため検討を行った。筆者は既に、ヨウ化サマリウムを用いて非対称ジアルキルケテンをアリル化し、サマリウムエノラートを生成させ、その反応溶液中で、キラルプロトン源をアキラルプロトン源で再生する触媒的不斉プロトン化反応を実現していることから、この方法論を応用して検討を行った。すなわち、2-メトキシ-2-フェニルシクロヘキサノンを基質として、0.2モル当量のキラルプロトン源の存在下、-45°Cでヨウ化サマリウムと反応させた後、アキラルプロトン源として2,6-ジ-t-ブチル-p-クレゾールをゆっくりと加えた。しかし、複雑な混合物を与え、相当する生成物を単離することができなかった。そこで、基質を2-ブロモ-2-フェニルシクロヘキサノンとして、同様の検討を行ったところ、2-フェニルシクロヘキサノンを収率良く与えた。しかしながら、その光学収率は30%ee程度と化学量論的な反応と比較して、大幅に低下した。したがって、これまでの不斉プロトン化反応の触媒化の方法論をそのまま適用しただけでは、高エナンチオ選択的な不斉プロトン化反応を行うことは困難であり、ヨウ化サマリウムの触媒化とあわせて、今後の検討が必要であることが明らかとなった。筆者の研究室では、SmI_2を用いて非対称ジアルキルケテンをアリ化し、サマリウムエノラートを生成させ、これに触媒量のC_2対称なキラルジオールと反応系内で触媒を再生させるアキラルプロトン源としてトリチルアルコールを反応させることでサマリウムエノラートの触媒的不斉プロトン化反応を達成した。しかしながら、この反応では、トリチルアルコールを-45°Cで26時間かけて加えなければ、高い光学収率(93%ee)で生成物を得ることができなかった。そこで、高度にフッ素化されたアルキル基を有するフルオラスキラルおよびアキラルプロトン源を用いて、フルオラスニ相系で反応を行い、キラルプロトン源の共役塩基からアキラルプロトン源によるキラルプロトン源の再生がフルオラス相(または界面)で効率良く進行すれば、効果的に触媒反応が進行するのではないかと考えた。このような考えに基づき、検討を行った。THF中で,調製したサマリウムエノラートと触媒量のフルオラスキラルプロトン源を-45°Cで反応させた後、フルオラスアキラルプロトン源のFC-72(ぺルフルオロヘキサン)溶液を一気に加え、液-液二相系で反応を行ったところ、最高60%eeで相当するアリルケトンが得ちれた(化学量論的な反応では66%ee)。また、キラルプロトン源としてC_2対称なキラルジオール(DHPEX)を用い、フルオラスアキラルプロトン源のTHE溶液を加えて検討を行った。その結果、驚くべきことに、以前の検討と同等の高いエナンチオ選択性(90%ee)で生成物を与えた。この系では、フルオラスアキラルプロトン源の添加により、反応混合物が懸濁することから、固-液二相系で反応が進行していることが考えられる。
鉄欠乏オオムギ根特異的発現遺伝子のイネへの導入

平成11年度には,イネへの導入用プラスミド,鉄欠乏オオムギの根からムギネ酸合成系酵素のうちニコチアナミン合成酵素(NAS),ニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)の遺伝子,また,鉄欠乏時にムギネ酸生合成に大きく関わっているであろうアデニン・リボースリン酸転移酵素(APRT)遺伝子を鉄欠乏特異的発現遺伝子Ids3のプロモーター領域約2.2kbpの下流につないだコンストラクト(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS),(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS-Ids3 5'-APRT)を作成し,これらをアグロバクテリウム法にてイネカルスに導入し,さらに薬剤(ハイグロマイシン)を用いた耐性カルスの選抜,再分化個体の育成までを行った.本年度では,これらの植物体を成熟させ,それぞれのコンストラクトを持つ形質転換イネをそれぞれ数数十系統得ることができた.それぞれ数系統ずつを選び,抗生物質の入った選択培地で発芽させ,発芽したものをさらに育成し,草丈が約2030cmになったものを石灰質アルカリ土壌に植え,鉄欠乏耐性試験を開始した.石灰質アルカリ土壌での生育試験開始後2週間は野生型と形質転換体で大きな差は見られなかった.しかし,その後の生育では,形質転換体のうちのいくつかの系統は野生型と比較して良好な生育を示すものがあった.とくに,NAATを導入した系統では生育がよかった.また,APRTを導入したものでは,初期の生育は良く,分けつも盛んであったが,鉄欠乏耐性能を得ることはなかった.NASを導入した系統では,生育の良いものと悪いものとができて,この遺伝子の発現制御が非常に微妙であることが分かった.現在,今回の石灰質アルカリ土壌検定試験で良好な生育を示した系統についてさらなる解析を行っている.これまでにオオムギから得られたムギネ酸生合成系の酵素の遺伝子(NAAT,NAS)、鉄欠乏オオムギ根で強く発現する遺伝子(APRT)を単独で、あるいは複数個まとめてイネに導入し、形質転換イネを作成し、各遺伝子の鉄欠乏時のムギネ酸分泌に対する重要性、そしてこれらを強く発現することによる鉄欠乏耐性イネの作成を目標とした。また、この際それぞれの遺伝子の発現にはオオムギから得られた鉄欠乏特異的発現遺伝子Ids3遺伝子の5'上流領域2.2Kbpを用い、この上流領域の鉄欠乏応答性についても検定を行うこととした。1)イネへの導入用プラススミドの作成・鉄欠乏オオムギの根からムギネ酸合成酵素のうちニコチアナミン合成酵素(NAS)、ニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)の遺伝子が得られている。また、鉄欠乏時におそらくムギネ酸生合成に大きく関わっているであろうアデニン・リボースリン酸転移酵素(APRT)遺伝子も得られている。これらの遺伝子を鉄欠乏特異的発現遺伝子Ids3のプロモーター領域約2.2Kbpの下流につないだコンストラクトをそれぞれ作成した。これらのいくつかを組み合わせたもの(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS)、(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS-Ids3 5'-APRT)を一つのプラスミドに入れたものを作成した。2)形質転換イネの作成。上で作成した各コンストラクトをアグロバクテリウム法にてイネカルスに導入し、さらに薬剤(ハイグロマイシン)を用いた耐性カルスの選抜、再分化個体の育成を行っている。平成11年度には,イネへの導入用プラスミド,鉄欠乏オオムギの根からムギネ酸合成系酵素のうちニコチアナミン合成酵素(NAS),ニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)の遺伝子,また,鉄欠乏時にムギネ酸生合成に大きく関わっているであろうアデニン・リボースリン酸転移酵素(APRT)遺伝子を鉄欠乏特異的発現遺伝子Ids3のプロモーター領域約2.2kbpの下流につないだコンストラクト(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS),(Ids3 5'-NAAT-Ids3 5'-NAS-Ids3 5'-APRT)を作成し,これらをアグロバクテリウム法にてイネカルスに導入し,さらに薬剤(ハイグロマイシン)を用いた耐性カルスの選抜,再分化個体の育成までを行った.本年度では,これらの植物体を成熟させ,それぞれのコンストラクトを持つ形質転換イネをそれぞれ数数十系統得ることができた.それぞれ数系統ずつを選び,抗生物質の入った選択培地で発芽させ,発芽したものをさらに育成し,草丈が約2030cmになったものを石灰質アルカリ土壌に植え,鉄欠乏耐性試験を開始した.石灰質アルカリ土壌での生育試験開始後2週間は野生型と形質転換体で大きな差は見られなかった.しかし,その後の生育では,形質転換体のうちのいくつかの系統は野生型と比較して良好な生育を示すものがあった.とくに,NAATを導入した系統では生育がよかった.また,APRTを導入したものでは,初期の生育は良く,分けつも盛んであったが,鉄欠乏耐性能を得ることはなかった.NASを導入した系統では,生育の良いものと悪いものとができて,この遺伝子の発現制御が非常に微妙であることが分かった.現在,今回の石灰質アルカリ土壌検定試験で良好な生育を示した系統についてさらなる解析を行っている.
建築環境マイクロバイオームの実態把握による集団感染機構のモニタリング

本研究は、学校や公共施設、老健施設など、感染症の感染リスクがあると考えられる場所での感染リスクを、空気中及び建具や家具表面などに存在するウイルスや細菌など、従来はその直接的観察評価が困難であった病原物質を、次世代シーケンサによる全ゲノム(メタゲノム)解析が可能としたこれら微生物叢(MicroBiome、マイクロバイオーム)の解析から感染リスクを評価し、有効な感染防止策(消毒など)に繋げることを目的とする。室内環境中のマイクロバイオームの実態調査は、北海道から九州までの日本の主要な都市をカバーする。建物用途としては、感染リスクの高い不特定多数の人々が集まる病院待合室、免疫が低く感染リスクの高い老健施設、小学校、一般のオフィス環境を想定した大学研究室などを対象とする。マイクロバイオームの実態調査は、人由来のマイクロバイオームの多様性を排除するため、多数の人の接触が予測される室内の接触面(ドアノブなどが代表的)や多数の人々が存在する室内空気を対象とする。本年度は、その二年目として、保育施設、小学校、病院、バス車内などの室内における室内空気中及び室内表面のマイクロバイオームを採取し、その組成を遺伝子解析した。その結果、腸内細菌や皮膚常在菌を含むグループであるフィルミクテス門Firmicutesが多く検出され、大腸菌や緑膿菌を含むグループや、腸内や土壌などに広く存在するバクテロイデス門Bacterioidetesも検出された。日和見感染症や呼吸器系疾患の原因菌も検出され、室内環境における疾患リスクが明らかとなった。研究はおおむね、順調に推移している。研究代表者および分担者は、当初の計画通り各担当地域におけるサンプルの採取および解析・分析を進めている。本年度の研究結果は、令和元年度(2019年)の日本建築学会大会論文において、公表予定である。本研究は、海外からの人から人への感染症侵入のリスクの高まる2020年の東京オリンピック開催までに一応の結果を出すことを念頭にまず3年間の研究を予定しており、現在までに研究は順調に進捗している。室内環境中のマイクロバイオームの実態調査は、北海道から九州までの日本の主要な都市をカバーし、建物用途としては、感染リスクの高い不特定多数の人々が集まる病院待合室、免疫が低く感染リスクの高い老健施設、小学校、一般のオフィス環境を想定した大学研究室などを対象としているが、この方針は変わりない。今後は、検出されたマイクロバイオームの地域特性や、周囲環境条件との相関を分析することを目指す。本研究は、学校や公共施設、老健施設など、感染症の感染リスクがあると考えられる場所での感染リスクを、空気中及び建具や家具表面などに存在するウイルスや細菌など、従来はその直接的観察評価が困難であった病原物質を、次世代シーケンサによる全ゲノム(メタゲノム)解析が可能としたこれら微生物叢(Micro-Biome、マイクロバイオーム)の解析から感染リスクを評価し、有効な感染防止策(消毒など)に繋げることを目的とする。研究チームは、日本建築学会内に設置された特別研究委員会「建築環境における呼吸器系病原体モニタリング法の確立に関する特別研究委員会(H28-H29、委員長加藤信介)」におい、「建築環境呼吸器系病原体の実態把握に基づく集団感染機構のモニタリング法の確立」をーマとして活動している委員を基礎とした。この特別研究委員会の委員の間で、サンプル法のラウンドロビン試験を実施し、そのバラツキを評価し、全国調査を行う際の、各研究者間のサンプル法のバラツキを把握し、バラツキ補正の必要がないことを確認した。マクロバイオームの実態調査は、人由来のマイクロバイオームの多様性を排除するため、多数の人の接触が予測される室内の接触面(ドアノブなどが代表的)や多数の人々が存在する室内空気を対象とする。本年度は、その一年目として、保育施設、小学校、大学研究室、病院などの室内における室内空気中及び室内表面のマイクロバイオームを採取し、その組成を遺伝子解析した。共同研究はおおむね、順調に推移している。本年度の研究結果は、平成30年度(2018年)の日本建築学会大会論文において、公表予定である。

その結果、腸内細菌や皮膚常在菌を含むグループであるフィルミクテス門Firmicutesが多く検出され、大腸菌や緑膿菌を含むグループや、腸内や土壌などに広く存在するバクテロイデス門Bacterioidetesも検出された。日和見感染症や呼吸器系疾患の原因菌も検出され、室内環境における疾患リスクが明らかとなった。研究はおおむね、順調に推移している。研究代表者および分担者は、当初の計画通り各担当地域におけるサンプルの採取および解析・分析を進めている。本年度の研究結果は、令和元年度(2019年)の日本建築学会大会論文において、公表予定である。本研究は、海外からの人から人への感染症侵入のリスクの高まる2020年の東京オリンピック開催までに一応の結果を出すことを念頭にまず3年間の研究を予定しおり、現在その初年度として研究は順調に進捗している。室内環境中のマイクロバイオームの実態調査は、北海道から九州までの日本の主要な都市をカバーし、建物用途としては、感染リスクの高い不特定多数の人々が集まる病院待合室、免疫が低く感染リスクの高い老健施設、小学校、一般のオフィス環境を想定した大学研究室などを対象としているが、この方針は変わりない。2年目の平成30年度からは、地域としてカバーされていなかった北陸・中部地方をカバーするため、研究分担者を増やして、検討を行う予定である。本研究は、海外からの人から人への感染症侵入のリスクの高まる2020年の東京オリンピック開催までに一応の結果を出すことを念頭にまず3年間の研究を予定しており、現在までに研究は順調に進捗している。今後は、検出されたマイクロバイオームの地域特性や、周囲環境条件との相関を分析することを目指す。
魚類感染防御に働く糖鎖認識受容体と標的糖鎖の解明

病原体が保有する糖鎖構造の白血球による認識は、魚類感染防御の誘導・成立に重要であることがわかってきた。本研究は、培養下で白血球の異物包囲化を誘導するモデル(in vitro白血球包囲化モデル)を用い、異物包囲化を誘導する糖鎖認識機構の解明(糖鎖認識受容体および標的糖鎖構造の解明)を目指した。ニジマス腎臓由来白血球をin vitro白血球包囲化モデルに供し、各種糖類の包囲形成阻害効果を確認したところ、フコイダンおよびヘパリンの多糖類が白血球による異物包囲化を阻害した。本効果はフコイダンと事前に反応させた後洗浄した白血球を用いても認められたことから、ニジマス白血球膜上へのフコイダンの結合が包囲化の阻害要因と考えられた。フコイダンのニジマス白血球への作用について検討したところ、フコイダンの刺激によりIL-1βおよびTNFαの発現誘導が確認された。以上の結果から、ニジマス白血球膜表面にはフコイダン様糖鎖認識受容体が存在し、本受容体は異物包囲化の制御およびサイトカイン発現を伴う細胞の活性化に関与しているものと考えられた。包囲化試験の異物として用いるIchthyophonus hoferiに結合するニジマス白血球膜タンパクについて調べたところ、分子量約180kDa(非還元下)のタンパクがフコイダンにより結合阻害を受けた。また、フコイダンで刺激された白血球膜タンパクのチロシンリン酸化について検討したところ、類似サイズの膜タンパクでチロシンリン酸化を受けていることが示され、サイトカイン誘導等の活性化に関与するシグナル受容体であることが示された。以上のことから、分子量約180kDaの膜タンパクが魚類感染防御に関わる糖鎖認識受容体である可能性が強く示唆された。病原体(I.hoferi)が保有する標的糖鎖に関する知見は、本研究期間中に得ることはできなかった。現在、数種のレクチンを用い、標的糖鎖の特定を目指している。
放射性ハロゲンを用いた包括的癌診断・治療法（ラジオセラノスティクス）の確立

211Atはアルファ線放出核種として注目されている核種である。一方、RGDペプチドは癌への輸送担体として多くの研究がなされてきている。しかし、これまでに211At標識RGDペプチドの報告はなされていない。本研究では、211At標識RGDペプチドの合成、評価を目的とした。211At標識のために、フェニルアラニンにヨウ素を導入した4ーヨードフェニルアラニンのアミノ基をFmoc保護した化合物[Fmoc-D-Phe(4-I)-OH]を合成し、この化合物を用いてFmoc固相合成、環化を行い、ヨウ素を導入したペプチドc[R(Pbf)GD(OtBu)f(4-I)K(Boc)]の合成に成功した。アミノ酸の保護基を脱保護後、ヨウ素をトリブチルスズ化することにすることによりc[RGDf(4-nBu3Sn)K]を合成し標識前駆体とした。次いで、トリブチルスズと211Atとの交換反応により[211At]c[RGDf(4-At)K]ペプチドの合成に成功した。[211At]c[RGDf(4-At)K]のU87MGヒトグリオーマ細胞を担癌した担癌マウスにおける体内放射能分布を調べたところ、腫瘍への高い集積を示し、非標的組織への高い集積や滞留は観察されなかった。また、同時に合成した[125I]c[RGDf(4-I)K]と類似した体内動態を示したことにより、放射性ヨウ素(I-123標識SPECT用プローブ)とアスタチンを組み合わせたラジオセラノスティクス用プローブとしての有用性が示されたと考えられる。研究代表者の研究環境においては、211Atの入手が容易でないことから211Atを用いた実験自体は限定されるが、本年度は、計画通りに進展しており、問題はない。本ペプチド標識法の汎用性の評価、そして、より優れた標識ペプチド開発を行っていく。