hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加速器質量分析法を用いた人為起源の長寿命放射性核種分析による環境影響評価

本研究課題では、大気核実験や原子力関連施設及び福島第一原発事故等で環境中に放出された人為起源の長寿命放射性核種であるC-14, Cl-36, I-129等を加速器質量分析法(Accelerator Mass Spectrometry: AMS)で高感度に検出する手法を開発して、環境中での放射性核種分布の状況調査と環境影響評価研究を実施する。環境中に放出された極微量の長寿命放射性核種について、高感度・高精度AMS測定による環境動態研究の総合的な展開を図る。昨年度から継続して、福島県及びその周辺地域の土壌及び河川での人為起源放射性核種の環境移行調査を実施した。福島県内の新田川及び請戸川の河川水及び溶存体中の放射性同位体と安定同位体の存在量について、その継時変化を観察した。また、福島県以外では千葉県の大堀川を対象河川として調査を実施した。福島第一原発事故起源の放射性核種の環境移行調査では、福島県内の原発周辺地域でのI-129の土壌中の深度分布について、AMSを用いて測定を実施した。新たな加速器質量分析法の開発では、東京大学タンデム加速器施設の5 MVタンデム加速器を用いて、Cl-36の高効率検出法の開発を実施した。ガス充てん電磁石と多電極型ガス検出器の最適パラメータを粒子・重イオン輸送計算コードPHITSにより計算して、測定効率の改善をおこなった。Sr-90のAMS法の開発では、SrF3-ビーム生成試験を実施した。福島第一原発周辺の帰還困難区域で採取した農耕地土壌30 gを用いたSr回収率は80%だった。精製したSrF2に重量比4倍のPbF2を加え、最大76 nAのSrF3-ビームが発生し、実用上求められる100 nA近いビームが得られた。東京大学タンデム加速器施設における試験測定では、90Zr6+ビームをガス検出器に導入してAMS測定の設定パラメータを確認した。本研究では、環境中に生成・放出された人為起源の長寿命放射性核種であるC-14, Cl-36, I-129等について、加速器質量分析法(AMS)による高感度検出法を開発して、環境影響評価に適用した。特に、福島第一原発事故に関連して、福島県周辺の環境試料採取と人為起源放射性核種の環境移行調査研究を実施した。福島第一原発事故起源のI-129については、土壌への浸透状況と河川への移行過程を明らかにした。表層土壌のI-129/I-131比は、26.0±5.7(2011年3月11日換算)となり、計算結果とよく一致した。これらの結果を基に、長寿命放射性核種分析のためのAMS装置を筑波大学において開発した。26年度が最終年度であるため、記入しない。加速器質量分析法26年度が最終年度であるため、記入しない。福島第一原発事故由来のI-129/I-131原子数比の関係を明らかにした。I-129のAMS測定結果から、福島第一原発事故により放出されたI-131の降下・沈着量の復元に向けて、大きく前進する研究成果を得た。福島第一原発事故前後の土壌中の放射性核種深度分布を明らかにした。放射性セシウムや放射性ヨウ素の土壌中での環境移行過程を明らかにした。その他、炭素14試料前処理システムの自動化を構築した他に、Cl-36及びSr-90等のAMS測定の実現可能性を見出した。本研究課題は、当初の計画以上に進展している。環境試料中のI-129分析について、試料処理方法と測定方法を確立した。I-129については、福島第一原発事故前後の土壌試料について約120試料の解析を進めた。特に、福島第一原発事故前のI-129及びCs-137について、福島第一原発事故起源の放射性核種に対して基準となるバックグラウンドデータを提供した。福島第一原発事故後については、I-129とI-131の相関関係を明らかにするなどして、I-131の降下・沈着量の復元に向けて大きく前進する研究成果を得た。
生体安全性を考慮した口腔内シリカコーティング法の開発

齲蝕に対する治療法,齲蝕により除去された歯質を補うための素材の研究は数多くなされているが,齲蝕予防に主眼を置いた予防処置法,それに関わる素材の研究は少ない。シリカ薄膜で歯面をコーティングできれば,歯質の性状を変えることなく耐摩耗性や齲蝕予防効果を示す.本研究の目的は,シリカ前駆体としてペルヒドロポリシラザン(PHPS)を用い,歯質表面に口腔内でシリカ薄膜を形成し,さらに生体への為害作用が少ないシリカ転化方法を開発することである.形成されたシリカの物性確認をフーリエ変換赤外分光光度計にて分析、検討した.その結果, 3%の過酸化水素水ペーストを塗布後,炭酸ガスレーザーを照射することにより,シリカ転化を示すピークが得られ,生体安全性を考慮したシリカ転化方法が可能となった。齲蝕は歯科における2大疾患の一つであるが,歯牙表面を物理・化学的に強固なシリカ薄膜でコーティングができれば,優れた齲蝕予防効果を示す.本研究の目的は,シリカ前駆体としてペルヒドロポリシラザン(PHPS : perhydropolysilazane)を用い,歯質表面に口腔内でシリカ薄膜を形成し,さらに生体への為害作用が少ないシリカ転化方法を開発することであり,これにより広く口腔の健康維持,増進に寄与し,国民福祉の向上の一助とするためである.その結果,以下の成果を得た.(1)PHPSに含まれる溶媒の生体への安全性を考慮し、口腔内で使用可能な溶媒の検討を行い、形成されたシリカの物性確認をフーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR)にて分析、検討した.その結果,シリコンウエハ上に塗布したPHPSは,FT-IR分析より830cm^<-1>i付近のSi-Nおよび880cm^<-1>付近のSi-Hに起因する未反応PHPSの残存を示すピークが得られた.さらにシリカ転化処理として3%の過酸化水素水ペーストを塗布後,炭酸ガスレーザーを照射することにより,1060cm^<-1>と800cm^<-1>付近にシリカ転化を示すSi-Oのピークが得られ,焼成用電気炉にて300°C,3時間焼成したシリカ膜と類似した膜質のシリカ薄膜を得られることを確認した.(2)また,3%過酸化水素水ペーストと炭酸ガスレーザー以外にも可視光線光照射を応用することによっても,シリカへの転化が確認された.今後も,さらに安全な溶媒を検討するとともに,エナメル質上に応用した場合の適切な転化条件,歯髄への温度の影響をモニタリングし,実際に応用可能か継続検討する.加えて,成膜されたシリカ薄膜によりエナメル質の耐酸性を付与することが可能であるかも分析検討する.齲蝕は歯科における2大疾患の一つであり,これまでに齲蝕に対する治療法,齲蝕により除去された歯質を補うための素材の研究は数多くなされているが,齲蝕予防に主眼を置いた予防処置法,それに関わる素材の研究は少ない.シリカに代表される無機材料の特徴は物理的に堅固であり,化学的にも安定である.このような優れた特徴を有するシリカ薄膜で歯面をコーティングできれば,歯質の性状を変えることなく耐摩耗性や齲蝕予防効果を示す.本研究の目的は,シリカ前駆体としてペルヒドロポリシラザン(PHPS:perhydropolysilazane)を用い,歯質表面に口腔内でシリカ薄膜を形成し,さらに生体への為害作用が少ないシリカ転化方法を開発することであり,これにより広く口腔の健康維持,増進に寄与し,国民福祉の向上の一助とするためである.その結果,平成23年度は以下の成果を得た.(1)PHPSによるシリカ薄膜のエナメル質への適応を含まれる溶媒の生体への安全性を考慮し、口腔内で使用可能な溶媒の検討を行い、形成されたシリカの物性確認をフーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR)にて分析、検討した.その結果,エナメル質上に塗布したPHPSは,FT-IR分析より830cm^<-1>訂1付近のSi-Nおよび880cm^<-1>付近のSi-Hに起因する未反応PHPSの残存を示すピークが得られた.

さらにシリカ転化処理として3%の過酸化水素水ペーストを塗布後,炭酸ガスレーザーを照射することにより,1060cm^<-1>と800cm^<-1>付近にシリカ転化を示すSi-Oのピークが得られ,焼成用電気炉にて300°C,3時間焼成したシリカ膜と類似した膜質のシリカ薄膜を得られることを確認した.(2)また,成膜されたシリカ薄膜によりエナメル質の耐酸性を評価するため0.1mMHCl溶液10ml中にサンプルを30分間浸漬し,溶液中に溶出したカルシウムを吸光光度法により測定した.その結果,シリカコーティングを施すことにより非処理エナメル質群と比較し,有意に低いカルシウムの溶出量を示し,優れた耐酸性を有することが示された.
ヒト腎疾患の発症・進展におけるアクチビンの役割

平成30年度は研究計画に従って、様々なヒト腎疾患におけるアクチビン・フォリスタチン系の関与について検討を開始した。具体的には、事前に同意の得られた患者の腎生検標本を用いて、各種腎疾患におけるアクチビン、アクチビン受容体、フォリスタチンの発現および局在を免疫染色またはIn situ hybridizationにより評価した。糸球体足細胞(Synaptopodin、WT1)、メサンギウム細胞(Vimentin)、近位尿細管(Aquaporin1、LTL)、遠位尿細管(Tamm-Horsfall Protein)、集合管(Aquaporin 2、DBA)、血管内皮(CD31)、血管平滑筋(alpha-SMA)などの各種ネフロンマーカーとアクチビンの2重染色を行い、アクチビン産生細胞を同定した。また、Bリンパ球(CD19)、Tリンパ球(CD3)、好中球(Gr-1)、マクロファージ(CD68)などの炎症細胞がアクチビンを産生している可能性についても検討を行った。一連の検討には、腎腫瘍手術にて摘出された腎臓の残余検体(正常腎組織)を対照コントロールとして用いた。その結果、腎障害の際は、尿細管細胞や炎症細胞がアクチビンを産生することが判明している。さらに、ヒト腎疾患における尿中アクチビン測定意義の検討を開始した。事前に同意の得られた腎疾患患者の尿をサンプリングし、分注して凍結保存した。尿中アクチビンの濃度をELISA法により測定し、検尿所見(蛋白尿、血尿、尿沈渣、尿中NAG、尿中beta2-microgloblin、尿中alpha1-microgloblin、尿中L-FABPなど)、腎組織障害の程度、腎機能(血清Cr、eGFR、クレアチニン・クリアランス)との相関の有無について検討中である。当初予定していたサンプル数も順調に集まり、研究計画を予定通り遂行できているため。研究計画の通り、実験を進めていく予定である。平成29年度は研究計画に従って、様々なヒト腎疾患におけるアクチビン・フォリスタチン系の関与について検討を開始した。

尿中アクチビンの濃度をELISA法により測定し、検尿所見(蛋白尿、血尿、尿沈渣、尿中NAG、尿中beta2-microgloblin、尿中alpha1-microgloblin、尿中L-FABPなど)、腎組織障害の程度、腎機能(血清Cr、eGFR、クレアチニン・クリアランス)との相関の有無について検討中である。当初予定していたサンプル数も順調に集まり、研究計画を予定通り遂行できているため。研究計画の通り、実験を進めていく予定である。平成30年4月1日に研究代表者の勤務先の異動があり、研究を一時中断していたため。事前に同意の得られた腎疾患者の尿のサンプリングがほぼ終了しつつある。今後はそのサンプルを利用して、各種バイオマーカーの測定を行い、統計解析のステップに移行していく予定である。
自己骨格筋を用いた心房ポンプ機能補助の実験的研究

[方法]雑種犬5頭を対象とし、広背筋を有茎で剥離し、電気刺激用ペーシングワイヤー2本を縫着したのち、両心室に反時計回りに巻き付けた。VVIペースメイカ-を埋め込み、2週間のvascular delayをおいた後、続く2-6カ月間,電気刺激トレーニング(rate50ppm)(preconditioning)した。BC-03電気刺激装置(日本光電)を用いて心拍同期刺激を行ない心補助効果を検討した。[結果]刺激出力電圧5V,R-delay 10msec,duration 100msecにて行なった。1;Burst刺激30HzでのRV圧は平均18.0%の圧上昇を認め、Ao圧11.5%,LV圧13.0%の圧上昇を認めた。Femoralarteryで測定した血液流量は25%の増加を認めた。2;Burst刺激50HzでのAo圧、LV圧はそれぞれ18.4%の上昇を認めた。3;刺激出力電圧を10Vへ増加することによりAo圧、LV圧は、12.2%,14.0%の圧上昇を認めた。4;モデル心臓は正常心でありかつ頻拍140-180/minであるためか従来言われているほどの十分な心補助効果は見られなかった。実験終了前の、徐脈時において圧低下はあるものの補助率では、むしろ増加する傾向にあった。[考察]電気刺激トレーニングにてpreconditioningした広背筋を用いて左室補助効果をみた。従来の急性期実験に比べ心補助効果は減少傾向にあった。このことは広背筋のトレーニングが不良であったこと以外に、慢性期実験に伴う様々な問題点、例えば、広背筋と心筋との密着が不十分であったり、使用したペーシングワイヤーが開心術後に用いる体外用で経時的にインピーダンスが上昇したり、広背筋が胸壁に癒着していたりしたことも大きな要因であった。心房補助に関しては、心房細動の作成が困難で今回は得られなかった。
現代中国における所有権改革の基礎的研究－基層社会の政治社会学的考察を通して―

本研究では、現代中国における所有権改革の問題に関して、法制度の改革とその試行によってもたらされる政治社会の変化との関係性に着目し、その基礎的な問題点を整理し、所有権改革の政治社会的な影響を考察した。とくに、2007年3月16日の物権法制定のプロセスを取り上げ、全人代において論議され、且つ改革派知識人による批判によって巻き起こった論争が社会主義体制の根幹を問うていることを明らかにした。また、物権法の施行によって、都市・農村の基層社会において、私有財産の保護、土地収用に伴う農民への補償が法的に明確化され、その社会矛盾が「法治」によって解決される方向性が出てきたことを明らかにした。平成24年度は、二年目の研究目的として、1本研究に関連する文献資料を収集・精読して研究状況を整理し、2海外でのヒアリング調査を実施して、実証研究を進めることに主眼を置いた。資料収集では、昨年度に引き続き、『郷鎮論壇』(民政部)、『社区』(民政部)といった雑誌資料、並びに『人民日報』『新華日報』等の新聞資料を整理するとともに、陳華彬『建築物区分所有権』(中国法制出版社、2011年)、張雲華『中国農地流転問題調査』(上海遠東出版社、2012年)などの新しく刊行された文献資料を精読し、逐次研究状況を確認した。また海外でのヒアリング調査では、中国の北京において、中国財政部財政科学研究所を訪問し、所有権改革問題に関する取り組みを聞き取りした。以上の研究活動を踏まえて、その研究成果として、『転形期における中国と日本ーその苦悩と展望ー』(共著、飯田泰三・李暁東編、国際書院、2012年10月、第5章「社会主義市場経済体制における所有権改革と基層社会の変容ー物権法と転形期の政治社会ー」を分担執筆)を公表した。本論では、2007年3月16日に制定された物権法をめぐって、その成立の過程におけるさまざまな論争を紹介しながら所有権改革が社会主義体制の根幹に関わっていることを紹介し、またそれが都市と農村の基層社会に与えた影響を明らかにしている。また、『NEAR News』第43号(島根県立大学北東アジア地域研究センター、2013年3月、1213頁)において、「北東アジア時事通信/中国共産党第18回党大会の開催と政治改革の行方」を公表し、本研究と関連する近年の政治改革の動向を紹介した。平成25年度は、本研究プロジェクトの最終年度の研究目的として、1本研究に関連する文献資料を収集・精読して研究状況を整理しながら、2学会・研究会報告および論文作成という形で、研究成果を公表することに主眼を置いている。資料収集では、これまでと同様に、『郷鎮論壇』(民政部)、『社区』(民政部)といった雑誌資料、並びに『人民日報』『新華日報』等の新聞資料を整理するとともに、王俊豊『集体建設用地使用権流転問題研究』(経済科学出版社、2013年)、呉敬璉・張維迎等『改革是最大政策』(東方出版社、2014年)などの新しく刊行された文献資料を精読し、逐次、研究動向を確認した。以上の研究活動を踏まえて、2014年2月14日、島根県立大学で開催された北京大学国際関係学院との合同国際シンポジウム「中国式発展の独自性と普遍性ー『中国模式』の提起をめぐってー」において、「現代中国の国家建設と『公民社会』のガバナンスー近代化のプロセスと基層社会の変容を焦点にしてー」を報告し、その成果の一部を公表した。この報告では、都市部の基層社会における所有権改革が、社区建設のプロセスにおける多様な利害関係を創出し、「社区協調理事会」をはじめとするコーポラティズム的な利害調整を行う統治システムが漸進的に構築されていることを明らかにした。なお、本研究で進めた現代中国の基層社会研究の動向を整理し、「菱田雅晴編著『中国ー基層からのガバナンス』法政大学出版局、2010年(書評)」(『中国研究月報』Vol.67 No.4(No.782)、一般社団法人中国研究所、2013年4月、所収)を公表した。平成23年度は、初年度の研究目的として、本研究に関連する文献資料を精読し、主として研究状況を整理することに主眼を置いた。とくに、『郷鎮論壇』(民政部)等の中国国内の学術雑誌や研究書、『人民日報』『新華日報』等の新聞資料、Jean C. Oi ed., Going Private in China: The Politics of Corporate Restructuring and System Reform, Walter H. Shorenstein Asia-Pacific Research Center Books, 2011.等の欧米諸国の新たな研究論文・研究書等を収集・精読し、本研究に関連する基礎的な研究状況を整理した。

また、海外でのヒアリング調査に関しては、北京において、農村・都市の基層社会の研究者にヒアリング調査を行い、農村・都市における社会変化に伴う所有権改革の実態と問題点に関する論点を整理した。以上の研究活動を踏まえて、2011年10月21日、島根県立大学で開催された、北京大学国際関係学院・島根県立大学・合同国際シンポジウム「転形期における中国と日本ーその苦悩と展望ー」において、「社会主義市場経済体制下における基層社会の近代化と所有権改革ー『物権法』と転形期の政治社会ー」と題する報告を行い、2007年の「物権法」の成立が基層社会における所有権改革に如何なる影響をもたらしているかを考察した。とくに、都市部の社区建設過程における業主委員会の活動、農村部における土地収用に関わる農民の権利意識の醸成についての現状と課題を論じた。また、都市部の社区建設における所有権改革の動向について、その一端を「現代中国における都市の社区建設と社会管理ー山東省の事例を中心にー」『総合政策論叢』第23号、島根県立大学総合政策学会、2012年3月、所収、で公表した。平成24年度の研究成果として、第一にあげられることは、『転形期における中国と日本ーその苦悩と展望ー』(共著、飯田泰三・李暁東編、国際書院、2012年10月、第5章「社会主義市場経済体制における所有権改革と基層社会の変容ー物権法と転形期の政治社会ー」を分担執筆)を公表できたことである。本研究の二年目において、当初の計画にはなかった学術書としての研究成果公表となり、この点に関しては、「(1)当初の計画以上に進展している」と言える。他方、海外でのヒアリング調査では、若干の遅れが出ており、この点に関しては「(3)やや遅れている」と言える。その原因としては、2012年度の日中関係の悪化や中国共産党第18回大会を控えて政治的に敏感な状況が続き、現地調査が難しい状況となったことがある。ただし、そのような状況のなかにおいて、中国財政部財政科学研究所を訪問して、所有権改革に関するヒアリング調査をできたことは、貴重な成果であった。以上の研究の進捗状況を総じてみると、「(2)おおむね順調に進展している」という状況にある。平成23年度は、当該研究に関連する文献資料を精読し、主として研究状況を整理することを目的とした。とくに、『郷鎮論壇』(民政部)、『改革内参』(国家発展和改革委員会)等の中国国内の学術雑誌、何一鳴『産権管制放松理論ー験証于中国的農地制度変遷(19582008年)ー』(中国経済出版社、2010年)をはじめとする中国国内の研究書、並びに『人民日報』『新華日報』等の中国の新聞資料、『アジア政経』(アジア政経学会)等の日本国内の研究論文・研究書、Jean C. Oied., Going Private in China: The Politics of Corporate Restructuring and System Reform, Walter H. Shorenstein Asia-Pacific Research Center Books, 2011.等の欧米諸国の新たな研究論文・研究書等を収集・精読し、本研究に関連する基礎的な研究状況を整理した。
骨髄由来間葉系幹細胞のc-Mycによる発癌モデル構築と発癌機構解明、その克服

マウス骨髄ストローマ細胞にINK4a-/-、c-Myc過剰発現の条件を付加することにより骨肉腫の発生が確認された。single cell cloningにより骨肉腫のtumorinitiating cellとして骨、軟骨前駆細胞(AX細胞)と間葉系幹細胞(MSC)の性質を有する(AO細胞)2種の細胞が同定された。前者の分画は発癌能が高く骨肉腫幹細胞の性質を有していた。後者の細胞からの発癌には脂肪分化能の喪失が必要であった。また骨肉腫幹細胞にPPARγを導入し脂肪分化能の回復させたところ腫瘍形成能が抑制された。以上から脂肪分化は骨肉腫形成に負に働くことが解明され、発癌には分化の因子も重要であることが明らかとなった。腫瘍形成細胞の同定骨髄ストローマ細胞にINK4a-/-、c-Mycの過剰発現という条件を付加することにより骨肉腫の発生が確認された。single cell cloningにより骨肉腫のtumor initiating cellとして骨、軟骨前駆細胞と間葉系幹細胞(MSC)の性質を有する2種の細胞が同定された。MSCからの発癌の条件検討、モデルの確立MSCは多様な組織への分化能を有するため、形成する腫瘍の組織型は様々な条件により変化することが予想される。INK4a-/-、c-Myc過剰発現さらに脂肪分化能を喪失することによりin vivoで骨肉腫が発生することが明らかとなり発癌マウスモデルの確立に成功した。INK4a-/-、c-Myc過剰発現の遺伝子背景では移植部位を変えても骨肉腫形成が形成され、MSCからの腫瘍の組織型の決定因子としては遺伝子レベルでプログラムが重要であることが示唆された。一方で脂肪分化の条件下ではMSCは脂肪へ最終分化し細胞周期停止することが明らかとなった。腫瘍形成には最終分化が死を伴わない`方向付け'が重要であることが示唆された。本モデルを用いて骨肉腫の微小環境(cancerniche)にマクロファージが重要であることが明らかとなりJ. Exp. Medに発表した。骨髄ストローマ細胞の発癌機槽の解明昨年度までにInk4a/Arf欠損、c-MYUの過剰発現により骨髄ストローマ細胞から骨肉腫の発生が確認され、間葉系幹細胞、骨・軟骨前駆細胞が起源細胞となることが明らかとなった。野生型ストローマからもc-MYC過剰発現により長期間かけて骨肉腫発生がみられた。腫瘍形成後の細胞解析からInk4a/Arfの欠損がみられ、骨髄ストローマにおけるInk4a/Arf欠損、c-MYC過剰発現は骨肉腫発生を促進することが示唆された。しかし、ヒト骨肉腫をmicro array解析したところInk4a/Arfの発現抑制は一部であった。またc-MYCはヒト骨肉腫において遺伝子レベルでの増幅が示唆されたが他の臓器に比較して骨髄ストローマ細胞はもともとc-MYC発現が高く、発癌機構における意義について現在解析を行っている。これらの結果は現在Oncogeneに投稿中である(1^<st> revise)。構築したモデルの癌治療開発への応用本研究により槽築された骨肉腫モデルは正常免疫系のマウスに発生し極めてヒトの病態近い。腫瘍はヒト同様、未分化、骨分化部分から形成されるが組織像形成には腫瘍周辺の微小環境から産生される増殖因子が関わることが示唆された。さらにヒト骨肉腫同様、既存の抗癌剤(ADRなど)が転移巣には効果がないことも明らかとなった。転移巣と原発巣の細胞では増殖因子やmatrixリモデリングに関わる液性因子の産生に違いがあることが示唆され、治療の標的となり得るか解析を進めている。さらに、本学薬学部から供与されたサリドマイド誘導体を始め、骨肉腫克服に向けた新規薬剤のin vivoの効証試験を実施中である。
食品添加物・農薬からの銅の日常的微量摂取による生殖毒性発現と生殖ホルモン分泌

近年、日本など先進諸国で生殖機能および精子機能の低下が懸念されている。我々は、微量で精子機能を低下させる環境因子を明らかにする研究の一環として、農薬である塩化第二銅の短期間微量経口投与による精子毒性の発現を検討した。10週齢ddY系雄性マウスに、塩化第二銅の生理食塩水溶液を3日間または7日間連続経口投与し、銅欠乏飼料および精製水を自由摂取させた。銅投与量は、3日間実験では、0(対照)、16、100、600μg/kg体重/日、7日間実験では、0(対照)、16、100、600μg/kg体重/日、および、0(対照)、1200、2400、3600μg/kg体重/日、であった。心臓から脱血後、精巣および精巣上体尾部を摘出した。精巣上体尾部から精子を採り出し、位相差顕微鏡を用いて精子の性状(運動性および形状)を測定した。正常形直進精子(形状か正常で直進運動をする精子)を正常な生殖に関与する精子とみなし、この精子数の割合(正常形直進精子率)を精子性状の指標とした。また、各臓器のDNA濃度およびAlamarBlue蛍光強度を臓器毒性の指標として設定した。銅必要量はマウス体重1kg当たり780-875μgである。実験の結果、これより低い銅投与量(16、100、600μg)でも、高い銅投与量(1200、2400、3600μg)でも、3日7日間投与後、銅欠乏群とくらべて、正常形直進精子率は有意に低下し、銅は極微量でも精子性状にとって障害となることが示された。同時に、精巣のDNA濃度およびAlamarBlue蛍光強度に低下傾向が見られ、精巣毒性が示唆された。今後、塩化第二銅の生殖障害作用について検討すると共に、食環境中の精子障害因子・生殖障害因子の広範な探求が必要である。
T4ファージ分子シャペロンgp57Aの折りたたみと四量体形成

T4ファージの尾繊維及び小尾繊維の形成に必須でファージにコードされている分子シャペロンgp57A(gp=gene product、57Aは遺伝子名)につき、これまでに以下のことが明らかになった。本タンパク質は円2色性(CD)スペクトルによれば約94%がαヘリックスからなり、沈降平衡法に基づく超遠心分析の結果、4量体を形成していることが明らかとなった。超遠心分析の結果と配列解析から本蛋白質は4ヘリックスバンドルを形成する細長い分子と考えられる。gp57Aは熱変性やグアニジン塩酸などの変性剤による変性がきわめて可逆的であり、示差走査型微少熱量測定(DSC)および円2色性(CD)により、1つの中間体を経る三状態転移が観測された。現在の問題点はgp57Aがターゲット蛋白質gp12とは直接相互作用しないことがほぼ明らかになったことである。本蛋白質を共発現しないとgp12が活性を持たないことから、本蛋白質がgp12の折りたたみに必須であることは明らかである。おそらく、gp57Aはいわゆるco-シャペロンを必要とすると考えられる。一昨年報告された大腸菌GrpEはやはり4ヘリックスバンドルを持ちgp57A類似した構造を持つように思われるので、gp57AにもGrpEのDnaKに対応するco-シャペロンの存在が予想される。そこで、Far-Westernプロット法によりco-シャペロンの検索を行ったが、明快な答えを得ることができなかった。現在、以下のアプローチによってco-シャペロンの検索を行っている。即ち、大腸菌に変異を持ち、57Aアンバー株の増殖可能な変異株が報告されているので、これを新たに作成し、この変異株の変異部位をマッピングすることによってgp57Aのco-シャペロンを検索する計画を進めている。
アルツハイマー病関連タンパク質タウの凝集体形成と神経変性の関係

微小管結合タンパク質タウは、アルツハイマー病を始め一群の神経変性疾患脳で様々な修飾を受け構造変化を起こして蓄積しており、それが神経細胞死を引き起こすと考えられている。しかしタウのどのような変化がその蓄積と神経細胞死につながるのかは明らかではない。本研究では、そのタウの凝集と毒性の関係をin vivoで明らかにするため、凝集性が変異することが知られる変異を導入したタウを発現するトランスジェニックショウジョウバエを7種類作成し、それらによる細胞死の程度を比較した。すると、特にCys291とCys322のAla置換変異(C291/322A)により、タウの神経細胞死が抑えられることを見出した。またC291/322A変異の導入により、タウのタンパク質量が減少しており、分解が早まることが示唆された。マウス初代培養神経細胞でも、C291/322Aタウは、野生型タウより分解されやすいことがわかった。培養神経細胞内で、タウはCys291とCys322を介してジスルフィド結合を形成していたので、ジスルフィド結合がタウの安定性に関わると考えられた。Cys291/Cys322はダイマー形成の促進によりタウ毒性に関わることが報告されている。しかし、本研究でみられたC291/322Aによる神経細胞死の抑制は、ダイマー形成よりむしろタウモノマーの安定性を減少させるという、新規な経路であることが示唆された。これらより、神経細胞内でタウのシステインを介したジスルフィド結合が増加することで、タウの量が増加し、細胞死が引き起こされることが示唆された。タウのジスルフィド結合は酸化ストレスによって増加するため、本研究はタウのジスルフィド結合が酸化ストレスと神経変性疾患発症をつなぐメカニズムである可能性を示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。微小管結合タンパク質タウは、神経変性疾患脳で蓄積し神経細胞死を引き起こす。タウはモノマー、ダイマー、オリゴマー、繊維など様々な凝集体として蓄積するが、疾患脳でタウの代謝が変化し、毒性を獲得する課程には不明な点が多い。本研究では、そのタウの凝集と蓄積、毒性の関係をin vivoで明らかにするため、凝集性が変化することが知られる変異を導入したタウを発現するトランスジェニックショウジョウバエを七種類作成し、それらによる細胞死の程度を比較した。すると、微小管結合領域に位置するCys291とCys322をAlaに置換した変異(C291/322A)により、タウの神経細胞死が特に抑えられることを見出した。また、C291/322A変異体タウでは、タウのタンパク量が劇的に減少していた。Cys291/Cys322はジスルフィド結合を分子間で形成することでタウのダイマー形成、さらにオリゴマー形成を促進することで、タウ毒性を悪化させることが報告されている。しかし、ショウジョウバエモデルではダイマーの量は非常に少ないため、C291/322A変異の導入によるタウのタンパク量の減少と神経細胞死の抑制は、ダイマー形成よりむしろタウモノマーの安定性が減少するためであることが示唆された。また、このC291/322A変異によるタウタンパク量の減少は、マウス初代培養神経細胞でも見られ、さらに、タウタンパク量の減少は、C291AまたはC322Aの単独の変異でも見られた。これらの結果より、Cys291/Cys322の分子内相互作用が、タウモノマーの安定性に重要な役割を果たすことが示唆された。さらにCys291/Cys322が関わるタウの構造変化や代謝を明らかにすることで、タウ蓄積を阻害する新たな戦略の開発に役立つと期待される。1年目の結果から、C291/322が凝集体形成ではなくモノマーの安定性に関与していることがわかった。これは予想外の結果であったが、これまでに報告のある凝集に関する効果とは異なり、新たなタウの代謝メカニズムの解明につながると期待される。さらに、この変化はマウス初代培養神経細胞でも見られることがわかったため、ショウジョウバエモデルでのin vivoでの解析に加え、マウス神経細胞でのin vitroでの解析も合わせて進行させることができた。また、C291/C322は、分子間、分子内でのジスルフィド結合を形成することが知られている。これまでの結果からモノマーの安定性に関わることが示唆されたため、C291/C322は分子間での結合より分子内の構造変化に関わる可能性が高いことが示唆された。実際、タウタンパク量の減少は、C291AまたはC322Aの単独の変異でも見られたことからも、この二つのcysteineの分子内の相互作用が重要であることが考えられる。ところで、タウには複数のスプライシングアイソフォームがあるが、C322が存在する微小管結合リピートを含む4Rタウは、それを含まない3Rタウより毒性が高いことが知られている。しかしなぜ4Rタウが3Rタウより毒性が高いのかは不明であった。今回の結果から、4Rタウの毒性が高いことには、C291とC322の相互作用が関与している可能性が考えられた。このように、1年目に予定した実験が順調に進んだだけでなく、その結果からプロジェクトがさらに進展したと考えている。

微小管結合タンパク質タウは、アルツハイマー病を始め一群の神経変性疾患脳で様々な修飾を受け構造変化を起こして蓄積しており、それが神経細胞死を引き起こすと考えられている。しかしタウのどのような変化がその蓄積と神経細胞死につながるのかは明らかではない。本研究では、そのタウの凝集と毒性の関係をin vivoで明らかにするため、凝集性が変異することが知られる変異を導入したタウを発現するトランスジェニックショウジョウバエを7種類作成し、それらによる細胞死の程度を比較した。すると、特にCys291とCys322のAla置換変異(C291/322A)により、タウの神経細胞死が抑えられることを見出した。またC291/322A変異の導入により、タウのタンパク質量が減少しており、分解が早まることが示唆された。マウス初代培養神経細胞でも、C291/322Aタウは、野生型タウより分解されやすいことがわかった。培養神経細胞内で、タウはCys291とCys322を介してジスルフィド結合を形成していたので、ジスルフィド結合がタウの安定性に関わると考えられた。Cys291/Cys322はダイマー形成の促進によりタウ毒性に関わることが報告されている。しかし、本研究でみられたC291/322Aによる神経細胞死の抑制は、ダイマー形成よりむしろタウモノマーの安定性を減少させるという、新規な経路であることが示唆された。これらより、神経細胞内でタウのシステインを介したジスルフィド結合が増加することで、タウの量が増加し、細胞死が引き起こされることが示唆された。タウのジスルフィド結合は酸化ストレスによって増加するため、本研究はタウのジスルフィド結合が酸化ストレスと神経変性疾患発症をつなぐメカニズムである可能性を示した。目的1.タウの凝集体形成と細胞毒性の相関異なる凝集体を形成する変異を導入したタウ7種類のうち、3種類でタウの毒性が大きく減少していた。そのうちの一つは目的2で調べるC291/322であるが、他の2つについても、タウの凝集活性と代謝が変化しているかを調べ、神経細胞死との相関を調べる。目的2.タウのCys291/322のタウの安定性における役割一年目の結果から、Cys291/322残基をAla置換した変異体でタウモノマーの安定性が減少することが示唆された。本年度はそのメカニズムを以下のように検討する。a.タウのリン酸化はタウ代謝を変化させることがわかっているので、リン酸化とC291/322Aによるタウの安定性減少との関係を調べる。b.タウは微小管への結合によってその代謝が変化するが、これらのCysはタウの微小管結合領域にあるため、微小管への結合変化によりタウの代謝に関与している可能性が考えられる。そこで、C291/322A変異により微小管への結合能が変化するかを調べる。c. Cysは分子内また分子間ジスルフィド結合を作ることでタウの構造を変化させる。そこで、C291/322の酸化ストレスによる分子内ジスルフィド結合の形成が単量体タウを安定化するという仮説を培養神経細胞で検討する。d.タウのアイソフォームのうち、C322が存在する微小管結合リピートを含む4Rタウは、それを含まない3Rタウより毒性が高いことが知られている。この毒性の違いにC291とC322の相互作用が関与している可能性を検討する。C291AとC322A単独変異を導入したタウを発現するショウジョウバエを作成し、タウの代謝変化と毒性を、同時に作成する4Rタウ、3Rタウを発現するショウジョウバエと比較する。
ゴルジ体膜におけるリン脂質の配向性と制御タンパク質の解析

出芽酵母のゴルジ体を初期ゴルジ、後期ゴルジに分けて単離し、それぞれのリン脂質種及び脂肪酸の鎖長、不飽和度を測定することでゴルジ体の層板ごとにリン脂質の非対称な分布が見られるかを検討するために研究を行った。さらに、単離したゴルジ体におけるリン脂質のフリップ・プロップ運動と脂質二重層の内層と外層での脂質の分布状態を解析する方法を解析する手法を確立するために、解析が比較的容易な哺乳類培養細胞を用いた系での確立を行った。NBD標識したホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンを培養細胞の形質膜外層に挿入させ、一定時間のインキュベーションの後外層のNBDを亜ジチオン酸で消光させることで外層から内層へ転移したリン脂質の割合を測定する方法を確立した。その結果、ホスファチジルセリンは30度、30分で、ホスファチジルエタノールアミンは30°C、120分で大半が内層へ転移し、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンは殆ど転移しないことが分かった。また、アミノリン脂質のフリップ・フロップに関わる出芽酵母Ros3pの哺乳類ホモログであるmROS3をノックダウンした細胞では、形質膜におけるアミノリン脂質の外層から内層への転移効率が大幅に低下することを明らかにした。さらに、各種リン脂質結合プローブを用いて形質膜の内層、外層の脂質の分布状態を調べた結果、mROS3ノックダウン細胞ではホスファチジルエタノールアミン特異的結合プローブであるSA-Roの形質膜外層への結合量が野生株と比べて二倍程度上昇していることがわかり、mROS3のノックダウンにより形質膜のホスファチジルエタノールアミンの非対称分布が一部解消されていることが示唆された。今後これらの方法を単離ゴルジ体に応用していく予定である。生体膜は脂質分子の自己会合により形成される脂質二重層を基本構造とするが、それら脂質分子の種類は一つの細胞内においてもオルガネラごとに異なり、また同じ膜系においても二重層の裏表で異なっている。このリン脂質の非対称な分布は小胞体においては未発達であると考えられているが、細胞内小胞輸送により脂質が形質膜に運ばれる間には厳密な制御を受けて形成されている。このことから、リン脂質非対称性の形成にゴルジ体が重要な役割を担っていると考え、リン脂質非対称性の形成におけるゴルジ体の分子メカニズムの解明を目指して研究を行っている。本研究では出芽酵母ゴルジ体をそのサブコンパートメントであるearly Golgiとlate Golgiに分けて免疫学的に単離・精製し、ゴルジ体のサブコンパートメント単位での脂質組成、および、リン脂質の膜内外での分布を解析している。初めに単離したゴルジ体サブコンパートメントがintactな状態で回収されていることをプロテアーゼプロテクションアッセイにより調べた。単離したゴルジ体をProteinase Kで処理し、ゴルジ体に局在する一回膜貫通型糖鎖修飾酵素であるMnn9pをウェスタンブロッティングで検出した結果、Mnn9pの細胞質側のみが切断され、ゴルジ体内腔はプロテアーゼから保護された。このことから、単離したゴルジ体は膜の破裂や膜の裏表が反転したりしていないことが分かり、リン脂質の配向性の解析に利用可能であることが分かった。また、単離したゴルジ体の脂質組成をガスクロマトグラフィーにより解析した。現在、単離したゴルジ体サブコンパートメントにおけるリン脂質の配向性をリン脂質結合プローブを利用して解析している。
擬微分作用素と異空間解析の局所的研究

1.線型常微分方程式のモノドロミー保存変形理論を異空間解析の方法を用いて解析するとWKB解の主要部の定めるリーマン面の退化が起こり,しかも重複した変わり点においてもとの線型微分方程式は簡単な標準型を持つことを示した.(青木ー河合ー竹井)2.C^nの解析集合の芽Xが与えられたとき,Xが代数的集合の解析的既約成分となることと,多項式函数のX上の消減位数がその多項式の次数の定数倍で一様に上から評価されることが同値であることを示した.3.形式的複素解析空間における爆裂操作は,複素解析空間のそれと同様に定義され,同様な性質を持つことが予期されるが,位相的手段やワイエルシュトラスの準備定理がうまく働かないために確認することが必要であるが,その定義と基本的性質をどのような順で扱えばよいかを考察し、理論の構成を行なった.4.Φを複素解析空間のモイシェゾン空間に沿う完備化の間の,ある条件を満たす形式射とするとΦは至る所収束するか,どこでも収束しないことが示された.(2,3,4:泉)5.SL(2,9)の有限体上の4次の表現およびよく知られたクライン対応を使って,SL(2,9)を自己同型群にもつ位数7^2と11^2のすべてのtranslationplanesを構成,分類した.6.同位数の2つの群G,Hに対しGからHへの平面関数があれば,Gは位数が素数巾の巡回群ではないことを示した.8.正則な奇関数が一方向凸型となるための種々の条件を与えた.(尾和,ー福井ー坂口)1.線型常微分方程式のモノドロミー保存変形理論を異空間解析の方法を用いて解析するとWKB解の主要部の定めるリーマン面の退化が起こり,しかも重複した変わり点においてもとの線型微分方程式は簡単な標準型を持つことを示した.(青木ー河合ー竹井)2.C^nの解析集合の芽Xが与えられたとき,Xが代数的集合の解析的既約成分となることと,多項式函数のX上の消減位数がその多項式の次数の定数倍で一様に上から評価されることが同値であることを示した.3.形式的複素解析空間における爆裂操作は,複素解析空間のそれと同様に定義され,同様な性質を持つことが予期されるが,位相的手段やワイエルシュトラスの準備定理がうまく働かないために確認することが必要であるが,その定義と基本的性質をどのような順で扱えばよいかを考察し、理論の構成を行なった.4.Φを複素解析空間のモイシェゾン空間に沿う完備化の間の,ある条件を満たす形式射とするとΦは至る所収束するか,どこでも収束しないことが示された.(2,3,4:泉)5.SL(2,9)の有限体上の4次の表現およびよく知られたクライン対応を使って,SL(2,9)を自己同型群にもつ位数7^2と11^2のすべてのtranslationplanesを構成,分類した.6.同位数の2つの群G,Hに対しGからHへの平面関数があれば,Gは位数が素数巾の巡回群ではないことを示した.8.正則な奇関数が一方向凸型となるための種々の条件を与えた.(尾和,ー福井ー坂口)
自己組織化を利用した金属クラスター錯体の配列制御に基づく新奇ナノ材料の創製

モリブデンクラスター錯体は、表面に置換可能な6つの配位子を有する全長0.81 nmの錯陰イオンであり、金属クラスター特有の光電子機能と柔軟な組成設計性をあわせもつ巨大構造素子である。本研究は、錯体表面に長鎖炭化水素を修飾し、炭化水素鎖同士の分子間相互作用を利用して、固体結晶中で錯体を自己組織化的に整列させる。錯体間のナノ空間や異方性など錯体配列の構造を配位子組成で制御し、物質吸着やイオン電導等をターゲットに新奇物質機能を開発する。
交差分子線法によるクラスター反応場の解析

高輝度パルス水素原子線源の開発と散乱実験を行った。水素原子は、HIまたはH_2S分子を分子線中で光分解することにより生成し、水素原子は無衝突でこの分子線を脱出した後、30mm離れた衝突領域に到達する。前駆体分子が分子線中で極低温に冷却されていることと、解離のエネルギー放出が大きいことから、この水素原子の速度は極めて単色性が高く、その時間幅は前駆体分子線の空間的な大きさ(直径1ミリ)によって決まっている。水素原子線パルスの時間幅は35nsであった。水素原子の検出には、243nmの紫外光による2s←←ls共鳴〔2+1〕イオン化、あるいは、真空紫外レーザー光(Lyman α)による〔1+1'〕REMPIを行った。真空紫外光は、Krを用いた3倍波発生または共鳴四光波混合を用い、Ar添加による位相整合により変換効率を最適化した。この際、散乱チャンバーの残留気体が検出光により光分解、イオン化され、水素原子の背景雑音が発生したが、焼きだしと液体窒素パネルの使用によって散乱チャンバーの背景圧を10^<-8> Torr程度に下げ、低減させた。衝突領域に第二の標的分子線として、Arや重水素分子を導入したが、散乱された水素原子や化学反応によって生成する重水素原子は検出されなかった。これは、未だ、背景雑音の強度が充分抑え切れていないためであり、さらに低減する作業を行っている。
高性能サボニウス風車の試作研究

サボニウス風車の性能改善を図るために風車ロータに集風装置を付加して空洞模型実験を行い、集風装置の特性ならびに集風装置を付加したときの効果を調べた。ステッピングモーターにより風車の回転を制動する方法と、ヒステリシス型の電磁ブレーキによる方法の、二通りの方法で負荷をかけ出力を測定した。主な結果は以下の通りである。1.各種のロータを制作して実験を行ったところ、ほぼすべての実験条件において、2枚羽根のバッハ型ロータが良好な出力特性を示した。2.風車の3倍の断面積を持つ集風装置を取り付けることにより出力が最大で1.6倍に増し、集風装置の効果が認められた。これにより可動部の大きさを変えることなく、またサボニウス風車の特徴である無指向性を維持したまま、出力を増大させ得ることが確認できた。3.集風装置の断面積を基準にして、パワー係数を計算すると、集風装置を装着することにより、パワー係数は低下した。従って集風装置の形状に改良の余地があると判断された。4.集風板の偏角は、45゚のときに最も大きな出力が得られた。5.集風板の枚数が3,4,6および8枚の4種類の中では、枚数が最大の8枚のときに出力が最も大きく、相対風向の角度変化に対しても安定した出力が得られた。6.電磁ブレーキによって負荷をかけた測定では、ステッピングモータを用いた場合より、出力が小さく測定された。ベアリングでの摩擦損失などが原因であると推定されるが、更なる検討が必要である。7.ほぼ風速の3乗に比例して、風車の最大出力が増加した。最大出力を与える周速比は実験条件の範囲内では風速に関わらずほぼ一定であった。本研究は、サボニウス風車の集風装置を開発し、低風速で始動し、強風にも強いサボニウス風車の特色を生かしながら、高い効率のシステムを開発しようとするものであるが、本年度は集風装置およびこれに適合したサボニウス風車羽根の開発研究を中心とし次のように研究を進めた。集風装置は、風車の軸に対し点対称の固定円形式で、集風板の数と風向に対する角度(偏角)を調整可能に設計試作し、試験を行った。その結果、羽根枚数8、偏角45度で最大の集風効果を得た。また、風車ロ-アについては、性能の良いとされる円弧と直線を組み合わせた形状のBach形ロータを中心として、枚数、配列等を変えた各種ロータを試作し、試験を行った。まず、基本形である2枚羽根ロータについて角羽根の相対位置関係を変えて一連の試験を行い、最大出力を得る配置を求めた。次いで羽根枚数を3、4と増やしたロータを試作し、試験を行ったが、枚数が増えるに従って出力は低下した。さらに、位相に90度差がある2組の2枚羽根ロータを同軸上に2段に重ねた2段形ロータを試作し、試験した。その出力は2枚羽根ロータの最適形よりも、わずかながら高かったが、構造の複雑さとコストの増大を正当化できる程大きくはなかった。前年度までに様々な羽根形状のサボニウス風車の基本特性を調べ,集風装置を付加することによる出力向上を確認した。しかし計測,制御装置に問題があり,精密な負荷調整が困難であった。これを踏まえ今年度は,より再現性の高い実験データを取得するため,実験装置の改良を行うとともに、更に性能を向上させるための集風板の形状について検討した。具体的には,以下の通りである。(1)高速回転時の風車の安定性を向上させるため,中心軸を取り付けた。中心軸により羽根のギャップで空気の流れが阻害されるが,実験ではこのことの悪影響はほとんどみられなかった。

(2)負荷装置として,電流により制御されるヒステリシス電磁ブレーキを取り付けた。これにより高精度のトルク制御が可能となった。(3)微小トルクセンサとフォトインタラプタによる計測装置を製作した。これにより高精度で応答特性のよい出力測定が可能となった。(4)実験により平板型集風装置の限界が明らかになったので曲面型集風装置を設計するための数値計算を行った。その結果,定性的に実験データとある程度一致したが,定量的には大きな開きがあった。その原因として,実験装置の摩擦損失等を組み込んでいないこと,乱流モデルの不適合,離散化格子の荒さ,などが考えられた。サボニウス風車の性能改善を図るため、サボニウス風車に全方向型の集風装置を付加して風洞模型実験を行い、集風装置の効果を調べた。ロータはバッハ型の2枚羽、もとくは3枚羽とし、集風装置は8枚の集風板で構成した。集風面積はロータの面積(0.045m^2)の約3倍とした。負荷装置にはヒステリシス型の電磁ブレーキを用い、トルクはひずみゲージ式の微小トルク計で、回転速度はフォトインタラプタで計測した。主な実験結果は以下の通りである。○製作した試験装置により、4.2m/sから7.2m/sの風速範囲で出力を行った、この範囲で安定した計測試験を行うことができた。○2枚羽のロータのみを取り付けた場合、風速を7.2m/sとしたときの出力は最大で約0.33Wであった。パワー係数は約0.033であり、ベアリングでの摩擦などの影響が大きいと思われた。このときの回転速度は約280rpmであり、トルクは11.3mNmであった。○集風装置を取り付けた場合の最大出力は約0.42Wとなり、集風装置の効果が認められたが、集風面積に対するパワー係数は約0.014であり、ロータのみの場合よりも小さくなった。集風装置の形状に改善の余地があると思われた。○3枚羽のロータを用いた場合は2枚羽よりも出力が小さく、集風装置の効果も認められなかった。
皮膚樹状細胞の形態および接着分子の解析

免疫染色法および免疫電子顕微鏡法で皮膚における樹状細胞の形態および接着分子の解析を試みた。免疫電子顕微鏡法では抗体の染色性不良に加えて細胞変性が強く樹状細胞の形態を判別することは困難であった。免疫染色法ではランゲリン陽性真皮樹状細胞は毛嚢周囲に多く認められ、真皮における遊走中のランゲルハンス細胞が複数のランゲリン陽性真皮樹状細胞と密に接していることが観察された。局所で樹状細胞サブセットが密に接触し、何らかの情報を交換している可能性が示唆され、今後の研究につながる重要な知見が得られた。平成21年度は樹状細胞サブセットの局在を把握するためにマウス耳介の表皮・真皮シートを作成し、whole mountで安定した免疫染色を得ることのできる系を整えた。BL-6マウスから作成した表皮シートを抗MHC-class II抗体、抗Cadherin抗体、抗EpCAM抗体で染色し、真皮シートを抗MHC-class II抗体、抗CD103抗体、抗Langerin抗体で染色した。表皮シートの観察からはこれまでに得られた知見と矛盾しない所見が確認され、真皮シートの観察からは特にランゲリン陽性真皮樹状細胞は毛嚢周囲に多く認められる事が判明した。次に電子顕微鏡レベルで樹状細胞を同定するため、pre-embedding法による免疫電顕を施行した。予備実験としてpre-embedding法を選択したのは、手技的には容易であり、多数の切片観察が可能となるためである。具体的にはC57 BL-6マウスの耳介より採取した皮膚をwhole mountでpre-embedding免疫電顕の基質として使用し、一次抗体として抗MHC-class II抗体、抗EpCAM(CD326)抗体をそれぞれ反応させた後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合させて、過酸化水素とジアミノベンチジン(DAB)で発色させた。透過型電子顕微鏡にて免疫染色を施した切片を観察したが、表皮細胞の変性が強く、表皮内・真皮内の樹状細胞で明らかな陽性細胞は見られなかった。抗体の深達度が問題と考えられ、今後はwhole mountではなく真皮シートにして使用するか、また表皮と垂直方向の切片にするか、平行の切片にするか、免疫電顕に最適の条件を探る予定である。そして、標的抗原の樹状細胞における詳細な局在を明らかにし、その細胞膜表面および細胞内分布の特徴を把握する。平成22年度は電子顕微鏡レベルで樹状細胞を同定するため、post-embedding法での免疫電子顕微鏡を継続した。しかし、表皮細胞の変性が強く細胞形態が保たれないこと、および抗体の染色性不良があり、表皮および真皮の樹状細胞を判別することが困難であった。樹状細胞の観察のためには、目的以外の樹状細胞をノックアウトし、ターゲットを絞る必要があると考えた。そこで、我々は皮膚に存在する3つの樹状細胞サブセット(Langerhans細胞、langerin+真皮樹状細胞、langerin-真皮樹状細胞)をノックアウトする系を用いて皮膚樹状細胞の形態を解析することを試みている。具体的には、樹状細胞全般に発現する表面マーカーであるCD11c遺伝子、およびLangerhans細胞に特異的に発現するLangerin遺伝子にジフテリア毒素をノックインしたCD11c-DTRマウス、Langerin-DTRマウスを用い、以下に述べる3群のマウスを作成した。1:野生型マウスにLangerin-DTRマウスの骨髄を移植、2:野生型マウスにCD11c-DTRマウスの骨髄を移植、3:Langerin-DTRマウスにCD11c-DTRマウスの骨髄を移植した。骨髄移植の結果、真皮樹状細胞はドナー由来に置換されるが、表皮内のLangerhans細胞は放射線感受性が低いためレシピエントのままである。ジフテリア毒素を投与すると、各々の群のマウスは1:langerin+真皮樹状細胞のみ、2:langerin+およびlangerin-の真皮樹状細胞、3:皮膚樹状細胞サブセット全てが除去される。すでに骨髄移植は終了し、高い生存率を得られている。このマウスの皮膚をwhole mountでpost-embedding免疫電顕の基質として使用し、樹状細胞の形態および局在を詳細に検討する予定である。