hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬剤感受性と耐性克服の分子生物学的研究

各種分子標的薬の抗腫瘍効果規定因子の検討をおこなった。(1)EGFR特異的チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブの感受性はがん細胞のEGFRの発現の有無、自己リン酸化に相関することを示した。(2)大腸がんおよび肺がんにおけるゲフィチニブとCPT-11の併用の有用性をin vitro, in vivoでしめした。EGFRの各リン酸化欠損株の樹立をおこない、EGFRリン酸化(特にTyr1068)が併用効果のバイオマーカであることを示した。(3)抗がん剤併用療法におけるcDNAアレイを用いた評価方法の確立を試みた。(4)細胞周期作用薬E7070に対する耐性細胞を樹立し、同薬剤の感受性マーカーとしてcyclin B2等を選択した。(5)血管新生阻害薬はVEGFあるいはオステオポンチンの過剰発現細胞による血管新生をより効果的に抑制することを示した。(6)細胞株レベルで各種がん細胞に薬剤接触し、遺伝子発現の変化をcDNAアレイで検討することで、薬剤特異的なバイオマーカーの選択をおこなった。また同法によって遺伝子発現変動に基づく微小管作用薬の分類をおこなった。(7)各種臨床検体のRNA抽出、保存、増幅、統計解析等の基礎的な検討をおこなった。統計解析では、再現性評価のためサンプルを測定し級内相関などによりアレイの評価をおこない、日間変動より日内変動が大きいことをしめし、必要なサンプル数が設定できた。また統計解析法、データの標準化の工夫をおこなった。(8)分子標的薬(各種チロシンキナーゼ阻害剤)の臨床第1相試験における薬物投与前後の患者末梢血単核球における遺伝子発現プロファイルをcDNA遺伝子発現アレイを用いて検討し薬剤が生物学的に適切と考えられる分子に作用している原理の証明が達成できた。有害事象に相関するバイオマーカを選択した。新規分子標的薬の適切なバイオマーカーを同定する目的で分子標的薬の抗腫瘍効果に関わる因子を検討した。1、各種細胞株の標的分子の変化と抗腫瘍効果との関連(1)、EGFレセプター(EGFR)特異的チロシンキナーゼ阻害剤ZD1839に対し、各細胞におけるEGFRの発現と自己リン酸化の程度と細胞増殖抑制能との相関を検討した。EGFRのmRNA発現レベルがrestoreされたK562/TPA細胞は、EGFR陰性のK562細胞に約千倍の高い感受性を細胞株及びマウス皮下腫瘍移植モデルで示した。同薬の抗腫瘍活性はがん細胞のEGFRの発現に規定されることが示された。(2)、細胞周期作用薬E7070に対する耐性細胞を樹立し、E7070接触時の細胞周期分布の違いから、E7070は直接的にはG1期集積、長期接触によるG2/M期への集積作用を有することを示し、バイオマーカーとしてサイクリンB2を選択した。(3)、細胞株をヒートストレス下で培養後の高分子および低分子HSP発現誘導がヒートショック蛋白質阻害剤で抑制されること、また各種血管新生関連遺伝子が抑制されることをcDNAアレイを用いて示した。2、cDNA発現アレイを用いた抗がん剤接触時の遺伝子発現変動についての検討(1)、既知遺伝子の発現を接触時と非接触時と比較し、各種抗がん剤により発現調節される遺伝子を選択した。プラチナ化合物、微小管作用薬、DNAアルキル化剤、フッカピリミジン剤、血管新生阻害剤、EGFR阻害剤などの各種抗がん剤に特徴づけされる遺伝子発現変動が示された。また、作用点を同じくする類薬間の遺伝子発現に対する影響の違いを検討することにより、発現プロフィールによる各薬物の特徴づけを行った。(2)同cDNA発現アレイの臨床使用にむけて、再現性、定量性などの基礎的検討を行い、増幅サンプルにおける良好な再現性、半定量性を示した。分子標的薬の抗腫瘍効果規定因子の決定と分子標的薬の作用機序を明らかにする、臨床試験において標的分子の発現測定をおこない、ヒトの体内で標的とする分子に作用しているか否かを明らかにする目的で以下の研究を実施した。I.分子標的薬(ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等)の投与をうけた患者の末梢血単核球の遺伝子発現変動解析により分子標的薬の評価を行った。機能的に類推可能な既知遺伝子から構成するcDNAフィルターアレイを作成し、遺伝子発現解析を行った。同薬剤投与前後の患者末梢血単核球の遺伝子発現変動を比較検討することで、本剤がヒトの体内で適切と標的(Ras関連遺伝子、Rhoファミリー関連遺伝子)に容量依存的に作用していること、また選択した遺伝子がサロゲート遺伝子となる可能性が示された。II.分子標的薬(EGFR特異的チロシンキナーゼ阻害剤ZD1839)の抗腫瘍効果規定因子の検討を、ヒト非小細胞肺癌株(高感受性および低感受性株)を用いておこなった。EGFR発現量およびその自己リン酸化に加えて、AKTシグナルとMAPKカスケードのバランスがEGFR特異的チロシンキナーゼ阻害剤の感受性・耐性を左右する要因として明らかになった。また、感受性株においては、ZD1839接触によるカスペース3、9の活性化とアポトーシス誘導がおこり、AKT、MAPKカスケードを通じたアポトーシスの経路が抗腫瘍効果発現の一因子であると示された。1.遺伝子発現解析(cDNAアレイ)の信頼性、検出能力の検討:アレイデータの誤差要因について級内相関係数(ICC)を指標に検討した。分子標的薬の投与前後の遺伝子発現変動を検討するために、末梢血単核球を各種濃度の薬物に暴露しcompletefactorial designに基づきcDNAアレイを実施した。

発現データの信頼性をICCにより評価した。真のバラツキを以下のモデルで推定した。Log2(測定値)=(遺伝子の真値)+(日間誤差)+(日内アレイ間誤差)+(測定誤差)(遺伝子の真値)N(μ,S2_LTCN)(日間誤差)N(0,S2_Day)(日内アレイ間誤差)N(0,S2_Day(array))(測定誤差)N(0,S2_Residual)。同変量効果モデルにおける推定値は、生データの場合ICCは0.525補正後のデータの場合ICCは0.654と改善され、信頼性基準の0.7に近似した。同法により薬剤接触前後の遺伝子発現変動を評価し得ると知れた。1000以下の評価遺伝子の中から、薬物のマーカー遺伝子を数個選択することが可能である。2.遺伝子発現解析を用いた分子標的薬のバイオマーカーの選択:分子標的薬の臨床試験における薬物投与前後の患者末梢血単核球における遺伝子発現解析を行った。統計解析中である。3.既存抗がん剤と分子標的薬の併用時のマーカーの探索:7種類の各種ヒト大腸癌細胞において、ZD1839とCPT-11はin vitroにおいて概ね相乗効果を示した。In vivoにおいて3種類の細胞株に相乗効果をみとめた。相乗効果は細胞のEGFRの発現レベルとリン酸化状態を特にTyr 1068が相関すると知れた。これらは本併用療法においてのバイオマーカーとなると期待される。併用時の相乗効果の作用機構は、CPT-11接触によるEGFRの自己リン酸化の亢進であることを示した。分子標的薬の抗腫瘍効果規定因子を決定し、臨床における分子標的薬のサロゲートマーカーの選択とその有用性を証明するためのcorrelative studyを実施することを目的として、以下の研究を実施した。1.ゲフィチニブ耐性肺癌に対するEGFR特異的チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブとトポイソメラーゼ1阻害剤CPT-11併用効果の評価:各種ゲフィチニブ耐性肺癌細胞において、ゲフィチニブ先行の併用スケジュールにおいて相乗効果をしめし、移植腫瘍モデルでは、同併用により治癒をもたらした。遺伝子発現解析により、相乗効果が期待される腫瘍を予測する遺伝子マーカの選択を実施している。2.遺伝子発現解析による分子標的薬、抗癌剤の効果規定因子の探索2-1広範多標的チロシンキナーゼ阻害剤の臨床第1相試験における遺伝子発現変動を検討し、同分子標的薬の薬力学的効果を証明し、有害事象に関連するマーカの選択と、治療効果に関わる遺伝子の選択をおこなった。治療反応性について病気進行(PD)とそれ以外を区別する遺伝子群を遺伝子発現日に基づくステップワイズ判別分析で、選択したところ、9遺伝子が抽出されたが、それらは血管新生に関与する特定のレセプター型チロシンキナーゼとその下流に位置する一連の遺伝子が特異的に抽出され、同薬物が血管新生の同経路に作用し、それらの遺伝子発現の変動がバイオマーカーとなりえることが示唆された2-2微小管作用薬ドセタキセルの進行非小細胞肺癌患者を対象とした臨床第2相試験において遺伝子発現変動を解析し、その薬力学的効果を証明した。治療効果の予測因子を解析中である。
高等植物におけるＣａ２＋シグナル・ＲＯＳシグナルの同時リアルタイムイメージング

細胞内シグナル伝達において、Ca2+およびROSはセカンドメッセンジャーとして、協奏的作用を伴って重要な役割を担っている。我々はこれまでの研究において、従来は不可能であった植物細胞内ROS濃度上昇=ROSシグナルのリアルタイム計測を実現する発光タンパク質プローブを実用化した。本研究では、(1)同プローブをCa2+レポーター発光タンパク質・エクオリンと試料中に共存させること、(2)発光基質アナログの選抜と利用によって発光波長特性を改変すること、(3)分光計測装置を開発することにより、Ca2+シグナル・ROSシグナルの同時計測システムを構築し、その評価を行った。活性酸素種(ROS)はDNAの損傷や細胞死を誘導する毒性物質として古典的に知られているが、近年の研究から細胞内ROS濃度([ROS]c</)上昇=ROSシグナルが細胞の分裂や分化、細胞内オルガネラ間のコミュニケーションに於いて極めて重要な役割を果たすことが明らかにされてきた。興味深いことに、気孔の閉孔や病原ストレス応答の初期過程に関与するCa2+シグナルの動因には細胞膜上の膜電位依存型Ca2+透過チャネルの活性化に先んじてROS生成が起こる。また近年、細胞膜上で活性酸素種生成を行うNADPHoxidaseの活性化にはCa2+の結合が必要であることが報告されている。これらの事象は、[Ca2+]c上昇とROS生成には双方向の関連性があり、両者が「Ca2+-ROSネットワーク」として協奏的に機能することを強く示唆しているが、同時計測による直接的証明が成されていないために、その分子機構は未だ明らかでない。この命題を解決するため、我々はこれまでの研究においてROS応答性発光タンパク質をコードする人工遺伝子を作成し、出芽酵母を用いたROSプローブ実証試験を行った。本研究ではCa2+との同時計測を可能とするための技術基盤を構築するため、微弱発光分光測定装置を開発するとともに、発光基質アナログの選抜および投与条件、試料生育条件について検討を行った。また、異種発現系における機能発現効率およびシグナルの増感に向けた基礎的知見を得るため、同タンパク質の翻訳後修飾機構および細胞内分布について、特異抗体を作成して検討した。1.フォラシン・エクオリン同時発光測定系の開発フォラシン・エクオリンの発光強度変化を同時計測するためには、両者の発光波長の重なりを解消し、分光計測することが必要である。エクオリンの発光基質として最大波長約400 nmを示すアナログ化合物を用いた場合にも野生型セレンテラジンと遜色ない発光強度が得られた。フォラシンの最大発光波長は約490 nmであるので、450 nm付近に反射域を有するバンドパスフィルターを導入し、2台のフォトン検出器でそれぞれエクオリン、フォラシンの発光強度変化を計測する発光分光計測装置を作製した。これまでに作製したフォラシン・エクオリン導入シロイヌナズナについて、耐性マーカーが示す分離比から単一コピー導入の系統を6種得ており、ホモ体の選抜を進めている。2.フォラシン発光メカニズムの解明フォラシン発光の効率・強度を高めることが出来れば検出感度の向上が望まれ、細胞・組織レベルでのバイオイメージングへの活用が期待出来る。これまでの研究に於いて、点変異導入遺伝子を発現させた出芽酵母を用いることにより、発光基質であるデヒドロセレンテラジンの結合部位を同定している。一方で、フォラシンの可溶化と安定に寄与すると考えられる糖鎖修飾部位は不明であった。そこでアミノ酸配列から推測された4カ所の予測配列に点変異を導入した蛋白質を出芽酵母に発現させ、ウエスタンブロット解析をおこなった。その結果フォラシンは少なくとも出芽酵母発現系において、2カ所の糖鎖修飾を受けていることが明らかになった。本年度の研究における最も主要な課題であった発光分光計測装置を設計し、その作製と評価を終えることが出来た。しかしながら今回作製した装置では外部からの光の侵入をなくすために光遮蔽を重要視しすぎたため、試料交換に過度の労力を要する。研究効率の向上、本研究により得られた実験技術の普及に向けては、より使い易く改良を進める必要がある。エクオリン・フォラシンを共発現するシロイヌナズナについて両遺伝子をそれぞれ単一コピー有する組換え体6系統を選抜した。ホモ体を含むと思われるT3世代の種子をそれぞれ20系統ずつ、独立して採集ずみである。出芽酵母発現系を用いた点変異導入解析を推進し、2カ所の糖鎖修飾部位を明らかにした。この実験は当初の研究計画には含まれていないが、得られた知見を基に糖鎖修飾がフォラシンの機能と性状、特に安定化と可溶化に与える影響を今後詳細に解析することで、高感度次世代プローブの開発に向けた基礎的知見を得られると期待される。これまでに得られたエクオリン・フォラシンをそれぞれ単一コピーで導入したシロイヌナズナ6系統よりホモ体を選抜したのち、ウエスタンブロット解析および発光強度測定によりエクオリン・フォラシンを共に強発現する、または同時計測に適した組換え体系統を確立する。

これを試料とし、今年度の研究において開発した微弱発光分光計測装置を用いることで病原菌エリシターであるflg22に応答したカルシウムシグナル、ROSシグナルの同時測定、阻害剤を用いた分子機構解析を進める。これまでの研究からflg22は細胞質におけるカルシウムシグナル、ROSシグナルを共に誘因することが知られているがその分子機構、特に両シグナルがどのように連携するのかについては明らかでない点が多い。本研究では、これまで不可能であった細胞質中ROS濃度変化のリアルタイム計測、カルシウムシグナルとの同時計測が可能であり、従来の手法では得られなかった新たな知見が得られると期待される。該当無し
高次組織化されたｄ‐π共役系ハイブリッドシステムの設計

π共役系高分子ポリアニリンに不斉中心および水素結合能を有するアミノ酸部位を導入することで、分子内水素結合の形成に基づくπ共役系部位の不斉構造規制が期待できる。また、アミノ酸部位の導入位置を制御することにより、ポリアニリンの立体構造を変化させることができると考えられる。これらの考えに基づき、アミノ酸部位を導入したポリアニリンおよびオリゴアニリン誘導体を合成し、分光学的見地からの検討を行った。モノマー単位として側鎖にアミノ酸部位を導入したアニリン誘導体を設計合成し、重合反応によるポリマー化を試み、得られた生成物における不斉構造特性および分子量等の検討を行った。紫外可視吸収スペクトルならびに円偏光二色性分光分析の結果より、導入したアミノ酸部位に基づく不斉構造が誘起されていることを示唆する結果が観測されており、ポリマー化体においてもアミノ酸部位の導入による不斉構造の誘起が行えることを示すことができたと考えている。また、分子量分析による重合度の検討について、重合化体の溶解度が低いことに起因する難溶性固体の発生が多くみられていることから、導入するアミノ酸部位の末端を修飾することにより溶解性の向上を計り、高重合化体の分析を行うことができると考えている。現在、重合化体ならびにユニット単位分子を不斉配位子として利用した不斉反応へと研究を展開しており、レドックスメディエーター機能を備えた新たな不斉触媒としての応用が期待できる。(抄録なし)π共役系高分子ポリアニリンにアミノ酸部位を導入することで、π共役系部位を不斉構造規制することが期待される。また、ポリアニリン部位の立体化学をsyn型に制御することで、ポリマー鎖がヘリセン型コイル状を形成すると考えられる。そこで、アミノ酸部位の導入位置とπ共役系部位の立体化学に関する知見を得るために、ポリアニリンのレドックス最小ユニットであるフェニレンジアミンおよびキノンジイミン部位に着目し、検討を行った。中央の芳香環の2,3位にカルボキシル基を有するフェニレンジアミン誘導体を出発原料とし、アミノ酸部位を導入した誘導体を設計合成した。分光学的分析を行ったところ、合成した誘導体について分子内水素結合の形成が明らかとなった。また、フェニレンジアミン部位が不斉構造制御に基づき誘起CDを示すことが観測された。また、1電子酸化剤を等モル量用いることで、ラジカルカチオン種を発生させ、電子的、不斉構造特性の検討を行った。その結果、分子内水素結合の形成により不安定ラジカル種の安定化およびπ共役系部位の不斉構造を保持することを示唆する結果が得られた。一方、キノンジイミン誘導体について、イミン窒素部位の持つ配位特性を利用することで、遷移金属原子との組み合わせによる不斉d-πハイブリッドシステムの構築を試みた。側鎖にアミノ酸部位を有するキノンジイミン誘導体を配位子として用い、酢酸パラジウム(II)と反応させることで、不斉二核錯体を得た。結晶構造解析および分光分析の結果から、得られた錯体のπ共役系部位が錯形成に基づいて不斉構造誘起されることを明らかとした。酸化還元特性について、電気化学的測定を行ったところ、還元電位がパラジウム(II)原子との錯形成によってアノードシフトすることを見出した。このことから、錯形成したキノンジイミン部位がエレクトロンシンクとして安定化されていると考えられる。ポリアニリンのユニット分子としてフェニレンジアミン骨格を用いることで、アニリン鎖の立体制御制御に関する検討を行い、アミノ酸部位導入位置によるアニリン鎖部位の立体制御についての知見を得ている。また、d-n電子系ハイブリッド型錯体に関する基礎的知見を得るために、アミノ酸部位を有するd-π共役系不斉二核錯体の合成を行った。構造特性・酸化還元特性の検討結果より、金属原子との錯形成に基づく構造および酸化還元特性について明らかとした。これらのことから、研究は概ね滞り無く進展していると考えられる。ポリアニリンユニット分子を用いたこれまでの研究により得られた知見から、アミノ酸部位の導入により分子内水素結合が形成し、アニリン鎖部位が不斉構造制御されることを明らかとしている。

そこで、側鎖にアミノ酸部位を有するアニリン誘導体を出発物としてポリアニリン誘導体の合成を試みることで、分子内水素結合の形成により不斉構造制御されるアニリン鎖について、不斉構造特性および酸化還元特性等に関する知見を得ることを目指す。また、得られた不斉d-πハイブリッド錯体について、配位子部位の不斉構造に由来する不斉空間場をレドックスメディエーターとして活用することで、酸化的不斉カップリング反応や、不斉アルドール反応などの触媒能に関する検討を試みる。(抄録なし)
精神神経疾患におけるクロモグラニンの機能の解明

私は、これまでの研究によりクロモグラニンB遺伝子(CHGB)のアミノ酸置換を伴う変異が、統合失調症を初めとする精神疾患と有意に関連することを報告した。さらにCHGBは、神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)において、異常凝集タンパクと共存し、病態の進展と増悪に関与することが示唆されている。本研究では、1chgb-KOマウスの行動解析、2ALSモデルマウスにおけるchgbの役割の検討、3CHGBの遺伝子型におけるストレス反応性の個人差の検討、について実験を行った。私はこれまでの研究によりクロモグラニンB遺伝子(CHGB)のアミノ酸置換を伴う変異が、統合失調症を初めとする精神疾患と有意に関連することを発見した。さらにCHGBは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患において、異常凝集タンパクと共存し、病態の進展と増悪に関与することが示唆されている。本年度は、(1) chgb-KOマウスの精神行動学的解析を行い、同遺伝子の精神疾患に対する関与を評価する(2) ALSモデルマウスとして確立されているヒト変異型SOD1-Tgマウスとchgb-KOマウスとの交配実験を行う(3)生体試料を用いて、ヒトの精神的ストレス反応性が、CHGB遺伝子型や発現量によって影響を受けるかを検討する。の三点についての実験を行った。(1)chgb-KOマウスの行動学的解析を行い、同遺伝子の精神神経系への影響を検討した。本年度行った解析は、自発的運動量の測定、PPIテスト、zero迷路である。現在結果の検討を行っている。(2)ヒト変異型SOD1-Tg雄マウスと、chgb-KO雌マウスとの交配を進め、ヒト変異型SOD1-Tg(+)/chgb(+, -)雄個体、およびコントロールとして、変異のないヒトSOD1-Tg(+)/chgb(+,-)を用意した。これから、Rotalodテスト、後肢伸長反応テスト行っていき、生存日数の比較も合わせて行う。(3)一般被験者に対してストレス反応性に対する質問紙を採血と共に施行し、各自のストレス状況、コーピング処方の評価を行った。評価は、HSCLおよびWCCLコーピングスケールを用いて行った。血漿サンプルについてはEIA法によりクロモグラニンBタンパクの定量を行った。血中CHGB濃度は統合失調症の男性で特に高かった。また、ストレスとの関係では、心身症状、対人関係過敏症、抑うつ症状の点数が高いほど、血中CHGBが高かった。私は、これまでの研究によりクロモグラニンB遺伝子(CHGB)のアミノ酸置換を伴う変異が、統合失調症を初めとする精神疾患と有意に関連することを発見した。また、クロモグラニンファミリータンパクは、ストレス負荷、特に精神的負荷により放出されるため、測定指標として実用化されている。前年度私は、一般被験者における各自のストレス状況、コーピング処方と血中CHGB濃度との評価を行い、血中CHGB濃度と統合失調症との関連、およびストレス症状との関係性を示した。本研究の目的の一つは、chgb-KOマウスの作製と行動学的解析を行い、CHGB遺伝子の精神神経系への影響を解明する事である。行った解析は、自発的運動量の測定、PPIテスト、zero迷路である。一次解析の結果、PPIテストにおいてはchgb-KO個体において変化が認められたが、いずれのテストにおいても、有意差には至らなかった。CHGBは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患において、異常凝集タンパクと共存し、病態の進展と増悪に関与することが示唆されている。そこで、ALS病態におけるCHGBの直接的な影響を検討するべく、ALSモデルマウスとして確立されているヒト変異型SOD1-Tgマウスとchgb-KOマウスとの交配実験を行った。前年度、ヒト変異型SOD1-Tg雄マウスと、chgb-KO雌マウスとの交配を進め、ヒト変異型SOD1-Tg(+)/chgb(+, -)雄個体、および、変異のないヒトSOD1-Tg(+)/chgb(+,-)を用意し、生存日数の比較とRotalodテスト、後肢伸長反応の観察を行った。一次解析では、いずれの項目についてもchgb-KO個体において改善傾向が見られたが、有意差までは至らなかった。現在、追加解析と結果の検討を行っている。今後は、採取保存している脳、脊髄、筋肉を用いて、組織学的検討を行う。1chgb-KOマウスにおいて、精神神経疾患様行動変化が現れるか、自発的運動量の測定、PPIテスト、zero迷路を行い検討した。解析の結果、PPIテストにおいてはchgb-KO個体において変化が認められたが、いずれのテストにおいても、有意差には至らなかった。2ALS病態におけるCHGBの直接的な影響を検討するべく、ALSモデルマウスとして確立されているヒト変異型SOD1-Tgマウスとchgb-KOマウスとの交配実験を行った。

ヒト変異型SOD1-Tg(+)/chgb(+, -)雄個体を用意し、生存日数の比較とRotalodテスト、後肢伸長反応の観察を行った。いずれの項目についてもchgb-KO個体において改善傾向が見られたが、有意差までは至らなかった。3統合失調症患者および一般被験者に対してストレス反応性に関する質問紙を採血と共に施行し、各自のストレス状況、コーピング処方の評価を行い、EIA法によりクロモグラニンAおよびBタンパクの定量を行った。血中CHGB濃度は統合失調症の男性で特に高かった。また、ストレスとの関係では、心身症状、対人関係過敏症、抑うつ症状の点数が高いほど、血中CHGBが高かった。またCHGAタンパクにおいては、望ましいコーピングスキルの点数高値群において濃度が低い傾向が見られた。私は、これまでの研究によりクロモグラニンB遺伝子(CHGB)のアミノ酸置換を伴う変異が、統合失調症を初めとする精神疾患と有意に関連することを報告した。さらにCHGBは、神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)において、異常凝集タンパクと共存し、病態の進展と増悪に関与することが示唆されている。本研究では、1chgb-KOマウスの行動解析、2ALSモデルマウスにおけるchgbの役割の検討、3CHGBの遺伝子型におけるストレス反応性の個人差の検討、について実験を行った。本年度途中に所属先が変更となり、新所属先での研究環境のセットアップを行った。研究方法を大幅に変更し、データ解析を中心に行ったが、十分な結果を出すまでには至らなかった。精神神経化学(1)chgb-KOマウスの行動解析については、追加実験の結果を加え、解析を行う。さらに、脳内でどのような変化が起こっているかを、採取保存している脳組織を使い、組織学的手法により検討を行っていく。(2)ヒト変異型SOD1-Tg(+)/chgb(+, -)雄と、変異のないヒトSOD1-Tg(+)/chgb(+,-)を用いて、ALS病態におけるchgbの影響を見る実験については、繁殖および個体数の確保に時間を要したが、今後は引き続き運動協調性についてRotalodテストによる評価、後肢引き延ばし反応を見る実験を行い、また、動物愛護の観点から実験のエンドポイントをマウスが30秒横たわったまま起き上がれなくなったときと定め、コントロールマウスとの生存期間比較を行い、追加解析を実施する。さらに、脳、脊髄、筋肉での変化を組織学的手法を用いて検討する。(1)chgb-KOマウスは順調に個体数を揃えることができ、行動解析バッテリーも予定通りこなした。解析の結果次第で追加実験を行う。(2)ALSモデルマウスとして確立されているヒト変異型SOD1-Tgマウスとchgb-KOマウスとの交配実験を行い、ALS病態におけるchgbの影響を見る実験計画であるが、ヒト変異型SOD1-Tg(+)/chgb(+, -)雄の個体数を揃えるのが難しかった。SOD-tgマウスの寿命が短いこと、交配を二回行い、望む遺伝子型の個体が少なくなってしまうことが原因であるが、順調に個体数も増えてきているので来年度は予定通り実験を行う。
老化とストレスによる神経伝達物質の変化に関する研究

被験動物として9週齢と12月齢のWinstar系雄性ラットを使用した。ラットをペントバルビタールで麻酔下に,脳定位固定装置に固定し,脳内透析用プローブを視床下部前部に挿入し,術後24時間して人工脳脊髄液を用いて潅流を行い,回収された潅流液中のノルアドレナリン含量を電気化学検出器付きの高速液体クロマトグラフィーにより定量した。安定した基礎放出量が得られた後にストレス実験を開始した。ノルアドレナリンの基礎放出量は9週齢のラットでは2.11±0.22pg/sample(N=13),12月齢のラットでは2.29±0.34pg/sample(N=11)であり,基礎放出量については両群間に差がみられなかった。次にこれらのラットに心理的ストレスを負荷した。心理的ストレスには透明な壁で仕切られた9区画からなるコミュニケイション箱を用いた。この箱の床は電撃用の格子になっているが,中央部の区画にはプラスチックの板が敷かれており,そのためこの区画に入れられたラットは自分自身は電撃ストレスを受けることはないが,周囲のラットが電撃を受けて示す鳴き声,脱糞,排尿,もがき,跳び上がりなどの情動反応にさらされる。この心理的ストレス負荷により,潅流液中のノルアドレナリン含量は9週齢のラットでも,12月齢のラットでも有意に増加したが,増加の程度は12月齢のほうが低く両者間に有意な差がみられた。これらの結果から,心理的ストレスによって生じる視床下部のノルアドレナリン放出亢進が加齢により減弱してくることが示唆された。
川崎病の冠動脈病変および治療不応例における病態特異的マーカーのプロテオミクス解析

川崎病患者でプロテオミクスを用いて冠動脈病変合併例および免疫グロブリン不応例に特異的な抗血管内皮細胞抗体の対応抗原候補蛋白をそれぞれ検出した。病態に特異的な抗血管内皮細胞抗体が検出されたことから、これらが新規病態マーカーとなる可能性が考えられた。抗Peroxiredoxin2(Prx2)抗体は川崎病患者で認められる抗血管内皮細胞抗体の1つであり、抗Prx2抗体とPrx2蛋白の両者が炎症性サイトカイン産生や接着分子の発現を介して血管傷害に関与している可能性を示した。さらにPrx2蛋白の血管内皮細胞上における主なレセプターがToll-like receptor4であることを明らかにした。平成25年度はプロテオミクスで、冠動脈病変合併例の川崎病(KD)患者血清検体と冠動脈血管内皮細胞( Human Coronary Artery Endothelial Cells:HCAEC)を用いて抗血管内皮細胞抗体(anti-endothelial cell antibody:AECA)の対応抗原候補蛋白を検出・同定する。さらに同定された蛋白に対する自己抗体陽性率と冠動脈病変合併例におけるその臨床的意義について検討することを予定していた。予定している小児血清サンプルの準備が十分でないため、1抗peroxiredoxin2 (Prx2)抗体およびPrx2蛋白による血管内皮細胞(EC)の障害メカニズムの検討を昨年度に引き続き行った。2さらに、冠動脈拡張のみで冠動脈瘤を認めないKD患者血清とHCAECを用いたAECAの対応抗原の検出および治療抵抗性のKD患者血清とHCAECと大動脈血管内皮細胞を用いたAECAの対応抗原の検出を昨年に引き続き進めている。【結果】1(i)我々は蛍光抗体法に加え、cell ELISAを用いて抗Prx2抗体がEC上のPrx2蛋白と結合することを確認した。またECを炎症性サイトカインで刺激することでPrx2蛋白が細胞培養上清中に放出されることを確認した。(ii)ECをPrx2蛋白で刺激することで、特にIL-6, IL-8, TNF-αおよびGM-CSFのECからの産生が認められた。(iii)Prx2蛋白のEC上におけるレセプターの同定を試みたところ、主にToll-like receptor4であることが示された。21DE-WBで検出されたAECAの対応抗原候補蛋白において、WBで個々の患者血清を用いて個別に評価し、現在2DE-WBで同定を進めている。平成24年度は川崎病(KD)患者血清における抗Peroxiredoxin2 (Prx2)抗体陽性率の評価、さらに冠動脈病変合併症例および治療抵抗性症例におけるその評価より、抗Prx2抗体の臨床的意義について検討することを予定していた。しかしながら対照小児血清の準備に予定以上の時間を要しているため、1抗Prx2抗体およびPrx2蛋白における血管内皮細胞傷害のメカニズム2冠動脈拡張のみで冠動脈瘤を認めないKD患者血清と冠動脈血管内皮細胞を用いた、プロテオミクスによる抗血管内皮細胞抗体(AECA)の対応抗原の検出3治療抵抗性のKD患者血清と冠動脈血管内皮細胞および大動脈血管内皮細胞を用いた、プロテオミクスによるAECAの対応抗原の検出を進めている。【結果】1に関して、我々は抗Prx2抗体が血管内皮細胞に結合し、炎症性サイトカインの産生や接着分子の発現を誘導し、血管内皮細胞傷害を引き起こす可能性を報告している。今回、血管内皮細胞における炎症性サイトカインの産生や接着分子の発現がPrx2蛋白共存下において増強したことが示された。さらにPrx2蛋白のみを血管内皮細胞に添加した場合でも炎症性サイトカインの産生や接着分子の発現が認められた。2および3に関して、血管内皮細胞抽出蛋白を用いた2次元電気泳動(2-DE)とその後のKD患者血清を用いたウェスタンブロット法(WB)で評価する前に、条件検討を含めまず初めに1DE-WBをおこなったところ、病態特異的なバンドが検出された。【考察】抗Prx2抗体のみでなく、Prx2蛋白自身が血管内皮細胞傷害に関与している可能性が示唆され、現在その詳細なメカニズムを含め検討している。また1DE-WBの結果から、病態特異的なAECAの対応抗原候補蛋白が検出されており、その結果を踏まえて現在2DE-WBを進めている。平成26年度は、プロテオミクスで、免疫グロブリン不応例の川崎病(KD)血清検体と大動脈血管内皮細胞(Human Artery Endothelial Cells:HAEC)および冠動脈血管内皮細胞(Human Coronary Artery Endothelial Cells:HCAEC)を用いて、それぞれにおける抗血管内皮細胞抗体(anti-endothelial cell antibody:AECA)の対応抗原候補蛋白を検出・同定する。同定蛋白に対する自己抗体陽性率と免疫グロブリン不応例におけるその臨床的意義(人種差含め)について検討することを予定していた。小児血清検体数が予定数を大幅に下回り、詳細な検討が困難であったため、1抗peroxiredoxin2 (Prx2)抗体およびPrx2蛋白の機能、および他の小児リウマチ性疾患における抗Prx2抗体の陽性率2昨年に引き続き、冠動脈拡張のみで冠動脈瘤を認めないKD患者血清とHCAECを用いたAECAの対応抗原の検出および免疫グロブリン不応例のKD患者血清とHCAECとHAECを用いたAECAの対応抗原候補蛋白の検出を行っている。【結果】

1血管内皮細胞以外の細胞、変形性関節症患者からの軟骨細胞および滑膜細胞をPrx2蛋白でそれぞれ刺激したところ、IL-6, IL-8, TNFαおよびGM-CSFの軟骨細胞および滑膜細胞からの産生が著しく増加した。若年性皮膚筋炎の患者13人(active;8, inactive;5)で抗Prx2抗体価を測定したところ全症例で陰性であった。2現在、2次元電気泳動(2-DE)とその後のKD患者血清を用いたウェスタンブロット法(WB) (2DE-WB)における条件検討を進めている。プロテオミクスを用いて冠動脈病変合併例および免疫グロブリン不応例の川崎病患者(KD)で、それぞれの病態に特異的な抗血管内皮細胞抗体(AECA)の対応抗原候補蛋白スポットを前者では17個、後者では32個検出した。病態に特異的なAECAが検出されたことから、これらが新規病態マーカーとなる可能性が考えられた。抗Peroxiredoxin2(Prx2)抗体はKDで検出されたAECAの1つで、今回Prx2蛋白の血管内皮細胞(ECs)上における主なレセプターがToll-like receptor 4であることを明らかにした。ECsにおける炎症性サイトカインの産生や接着分子の発現が抗Prx2抗体単独刺激に比べ、Prx2蛋白との共存下で増強した。Prx2蛋白のみをECsに添加すると、IL-6, IL-8, GM-CSFおよびTNF-αなどの炎症性サイトカインの産生が誘導され、その作用は抗Prx2抗体より強い傾向が示された。IL-6およびIL-8産生ではPrx2蛋白の添加濃度に依存して、またGM-CSFおよびTNF-αではPrx2蛋白の添加濃度が高濃度でその産生が認められた。さらに変形性関節症患者からの軟骨細胞および滑膜細胞とECsでその産生量を比較したところ、IL-6では滑膜細胞とほぼ同様であったが、GM-CSFでは滑膜細胞および軟骨細胞に比べ増加傾向であった。またECsを炎症性サイトカインで刺激することで、Prx2蛋白が細胞培養上清中に検出された。ECsにPrx2蛋白を添加した場合、抗Prx2抗体刺激に比べECs上のE-selectinおよびI-CAM1の発現は高度であった。これらの結果から抗Prx2抗体は、血管障害に伴い産生される自己抗体と考えられた。抗Prx2抗体のみでなく、Prx2蛋白自身が血管内皮細胞傷害に関与している可能性が示唆され、今後更なる検討が必要であると考えられた。川崎病患者でプロテオミクスを用いて冠動脈病変合併例および免疫グロブリン不応例に特異的な抗血管内皮細胞抗体の対応抗原候補蛋白をそれぞれ検出した。病態に特異的な抗血管内皮細胞抗体が検出されたことから、これらが新規病態マーカーとなる可能性が考えられた。抗Peroxiredoxin2(Prx2)抗体は川崎病患者で認められる抗血管内皮細胞抗体の1つであり、抗Prx2抗体とPrx2蛋白の両者が炎症性サイトカイン産生や接着分子の発現を介して血管傷害に関与している可能性を示した。さらにPrx2蛋白の血管内皮細胞上における主なレセプターがToll-like receptor4であることを明らかにした。KD患者
ヒト軟骨組織分化を制御する新規メカニズムの同定と解析

内軟骨性骨化は様々な因子によって複雑に制御されており、それらの異常が成長障害を来す骨系統疾患の原因となることが明らかにされてきた。一方で、ヒトの病態を解析する適切な実験モデルが無いことが長年の課題であった。これまでに我々はヒトiPS細胞から軟骨組織を培養下に作成する分化誘導法を確立し、in vitro疾患モデルとして病態再現と創薬研究に用いてきた。さらに、生体に近い病変軟骨の病態を再現するモデルを作るため、ヒトiPS細胞由来軟骨を免疫不全動物であるSCIDマウスの皮下に移植(Xenograft)したところ、内軟骨性骨化が起き、その軟骨ー骨境界部では成長軟骨板様の構造が作られていることが判明した。成長軟骨板の各層のマーカーであるII型コラーゲン、IHH,X型コラーゲンの免疫染色を行ったところ、ヒトiPS細胞由来軟骨xenograftの成長軟骨板様組織は、これらを層状に発現していた。また、扁平な軟骨細胞はカラム構造をとり、この部の細胞はKi67を高頻度に発現しており、増殖軟骨細胞層を形成していることが判明した。次にFGFR3異常症由来の疾患特異的iPS細胞を用いた解析を行ったところ、疾患の重症度に一致した肥大軟骨細胞の小型化と配列の乱れが認められた。それに対して移植マウスにFGFR阻害剤を投与したところ、肥大軟骨細胞径が回復し病態の回復まで観察することが可能であった。本モデルはiPS細胞を用いることにより、細胞リソースとして制限なく使用可能であり、疾患患者から細胞を作成すればそのまま疾患モデルとして応用できる利点がある。以上の成果をKimura et al., Osteoarthritis Cartilage, (2018).に報告した。研究の全体構想は、ヒトの運動器骨格が形成・維持される機序を分子レベルで解明することである。骨格を器官/組織としてとらえ、その制御機構を培養細胞のレベルではなく、生体の器官/組織の環境で理解することをめざす。生体の器官/組織を使った分子レベルの実験は遺伝子改変マウスモデルで行われてきたが、その知見がヒトに当てはまらないことが多々ある。ヒト器官/組織でのバイオロジーを知るためには、その構造と機能を誠実に再現するモデルをヒト細胞を使って作り、調べる必要がある。iPS細胞が開発されて以来、細胞リプログラミング技術を使うことで、誠実なヒト組織モデルを作ることが可能なことが示されつつある。このような目的の中で2018年度は、本研究計画の冒頭に挙げた、生体の内軟骨性骨化組織の発生を誠実に再現するようなヒトiPS細胞由来軟骨組織xenograftモデルを確立することに成功し、雑誌Osteoarthritis Cartilageに報告した。よっておおむね順調に進展していると判断した。全体構想は、ヒトの運動器骨格が形成・維持される機序を分子レベルで解明することを目指すため、ヒト細胞とマウスなどの動物の実験系、およびxenograftモデル実験の結果を比較し、治験を得ることを目指す。そのために、ヒトiPS細胞由来軟骨を免疫不全動物に移植して、in vivoにおけるふるまいを解析することを行う。ヒトiPS細胞由来軟骨のふるまいは、移植する場所の環境に依存することが考えられることから、皮下以外に、関節内への移植も行っていく。また、軟骨細胞分化の分子機序を解明するために、網羅的な遺伝子探索と、候補遺伝子のノックアウトによってヒト細胞とマウス個体での表現型を解析し、それらを比較することで目的を達成することを目指す。

生体の器官/組織を使った分子レベルの実験は遺伝子改変マウスモデルで行われてきたが、その知見がヒトに当てはまらないことが多々ある。ヒト器官/組織でのバイオロジーを知るためには、その構造と機能を誠実に再現するモデルをヒト細胞を使って作り、調べる必要がある。iPS細胞が開発されて以来、細胞リプログラミング技術を使うことで、誠実なヒト組織モデルを作ることが可能なことが示されつつある。このような目的の中で2018年度は、本研究計画の冒頭に挙げた、生体の内軟骨性骨化組織の発生を誠実に再現するようなヒトiPS細胞由来軟骨組織xenograftモデルを確立することに成功し、雑誌Osteoarthritis Cartilageに報告した。よっておおむね順調に進展していると判断した。全体構想は、ヒトの運動器骨格が形成・維持される機序を分子レベルで解明することを目指すため、ヒト細胞とマウスなどの動物の実験系、およびxenograftモデル実験の結果を比較し、治験を得ることを目指す。そのために、ヒトiPS細胞由来軟骨を免疫不全動物に移植して、in vivoにおけるふるまいを解析することを行う。ヒトiPS細胞由来軟骨のふるまいは、移植する場所の環境に依存することが考えられることから、皮下以外に、関節内への移植も行っていく。また、軟骨細胞分化の分子機序を解明するために、網羅的な遺伝子探索と、候補遺伝子のノックアウトによってヒト細胞とマウス個体での表現型を解析し、それらを比較することで目的を達成することを目指す。
PDK1制御による多発性骨髄腫の疾患形成分子異常と腫瘍環境支持の包括的制御

本研究では、分子生物学的異常が多様で複雑な多発性骨髄腫において普遍的にPDPK1(PDK1)と、その下流キナーゼであるRSK2が活性化し、腫瘍細胞の増殖や生存に重要な役割を担うこと、PDPK1/RSK2経路の活性化は病態形成の初期から進行期まで普遍的に認められることを見出した。また、PDPK1の過剰発現はmiR-375のepigenetic制御異常による発現低下が原因であることを明らかにした。今後、骨髄腫に対するmiR-375/PDPK1/RSK2標的治療の開発を展開するうえで、礎となる研究結果であるとともに、他の造血器悪性腫瘍にも対象を拡大し研究を展開中である。多発性骨髄腫は造血器悪性腫瘍の一つであり、根治をもたらしうる治療薬が未だ不在の難治性疾患である。高度難治性の原因としては、染色体異常や遺伝子異常、分子異常の多様性が高度であることが挙げられるが、くわえて、このことは普遍的な治療標的分子の童貞が困難であることの原因ともなってきた。本研究では、10種類以上の染色体異常や遺伝子異常のパターンが異なる多発性骨髄腫細胞株を詳細に検討することで、これらの分子生物学的に不均一なコホートにおいても共有される分子異常を特定し、その細胞生物学的な意義を明らかにすること、くわえて臨床検体での解析を加え、臨床的意義、すなわち、予後推定におけるバイオマーカーとしての意義と治療標的分子としての可能性を追求することが目的である。こうしたスローガンのもと、本研究において我々は、セリン・スレオニンキナーゼであるPDK1 (PDPK1)が、MM細胞株において恒常的に活性化しており、骨髄腫細胞においてRSK2 N末端、AKT両分子の活性化を制御していることを見出した。つまり、各種の遺伝子変異や染色体異常、ならびにサイトカインなどを介した腫瘍環境由来シグナルの多くが重複してRSK2とAKTを集約的に活性化するが、この過程において最終的にPDK1による活性化が必須であり、PDK1がRSK2、AKTの両者を制御することで多発性骨髄腫の病態形成を支配していることが想定され、実際、さらに下流の分子であり骨髄腫の病態形成に重要な役割を担うcyclin D、MYC、MCL1,IRF4などの多くの分子を制御することで多発性骨髄腫細胞の生存と増殖を支配することを見出した。多発性骨髄腫は造血器悪性腫瘍において2番目に多い疾患であるが、いまだに完治が困難な難治性疾患である。高度治療抵抗性の原因としては、病態形成に関わる染色体異常や遺伝子異常など分子生物学的異常が極めて多彩であるうえ、症例間における不均一性が高度であり、普遍的な治療標的分子を同定することが困難であることが一因と考えられる。本研究課題において、我々は多発性骨髄腫細胞の生存や増殖に、セリン・スレオニンキナーゼであるPDK1(PDPK1)、ならびにその下流キナーゼであるRSK2が極めて重要な役割を担うこと、cyclin D1、c-Myc, IRF4など疾患形成に重要な役割を担う分子の活性を制御すること、PDK1やRSK2の恒常的活性化は病態形成の初期から進行期において認められ、かつ、約90%以上の症例に認められる疾患に普遍的な細胞現象であることを見出した。さらに今年度は、PDK1恒常的発現の分子メカニズムの解析に臨み、ノンコーディングRNAであるmiR-375の骨髄腫細胞における発現低下が、その原因であること、miR-375の発現低下には、そのプロモーター領域における高メチル化やアセチル化異常などエピジェネティック異常が重複して関与していること、こうした異常は骨髄腫症例においてもほぼ普遍的に認められることを突き止めた。また、脱メチル化剤やヒストン脱アセチル化阻害剤などの治療薬により、こうした異常を解除しうる可能性が示唆されており、現在、その詳細についてさらに解析を継続中である。これまでの研究により、分子生物学的異常の不均一性によって普遍的な治療標的分子の同定が困難であった多発性骨髄腫において、PDPK1/RSK2シグナル経路、ならびにその異常をもたらすエピジェネティック制御機構の普遍的な制御異常の関与を明確にすることができた。今後、こららがもたらす病態形成への本質的意義や、治療標的としての可能性についてさらに詳細に研究を展開する礎となる研究が進められているものと考える。本研究課題では、高度難治性造血器悪性腫瘍である多発性骨髄腫において、普遍的に治療標的となりうる分子制御異常の同定に取り組んだ。その結果、骨髄腫細胞では、セリン・スレオニンキナーゼであるPDPK1(PDK1)と、その下流キナーゼであるRSK2がcyclin D、c-Myc, IRF4などの活性を制御し、腫瘍細胞の増殖や生存に重要な役割を担うこと、PDPK1/RSK2経路の活性化は約90%以上の症例において病態形成の初期から進行期まで普遍的に認められる現象であることを見出した。さらには、PDPK1恒常的活性化はPDPK1の発現亢進と分子内自己リン酸化によるものであること、PDPK1の過剰発現はmiR-375の発現低下が原因であることを見出した。また、miR-375の発現低下はメチル化やアセチル化異常などエピジェネティック異常が重複して誘導していること、こうした異常は病初期から普遍的に認められるものであること、miR-375発現低下はPDPK1に加え、JAK2やIGF-1Rなどの分子の発現も制御することで病態形成の根幹を担う異常であることも見出した。

また、本研究では、こうした異常は脱メチル化剤やヒストン脱アセチル化阻害剤などのエピジェネティック治療薬により制御可能な可能性も示された。一方、循環血液中のtumor-derived circulating DNAにおけるPDPK1発現や、circulating miR-375の検討を進めたが、これらの診断バイオマーカーの臨床応用は適切ではないことが示され、あくまで治療標的としての研究の発展が望ましいことが方向性として示された。今後、骨髄腫に対するmiR-375/PDPK1/RSK2標的治療の開発を展開するとともに、他の造血器悪性腫瘍にも対象を拡大し、本経路の機能的意義、治療標的としての可能性について研究を展開中である。本研究では、分子生物学的異常が多様で複雑な多発性骨髄腫において普遍的にPDPK1(PDK1)と、その下流キナーゼであるRSK2が活性化し、腫瘍細胞の増殖や生存に重要な役割を担うこと、PDPK1/RSK2経路の活性化は病態形成の初期から進行期まで普遍的に認められることを見出した。また、PDPK1の過剰発現はmiR-375のepigenetic制御異常による発現低下が原因であることを明らかにした。今後、骨髄腫に対するmiR-375/PDPK1/RSK2標的治療の開発を展開するうえで、礎となる研究結果であるとともに、他の造血器悪性腫瘍にも対象を拡大し研究を展開中である。これまでの研究により、我々は既にPDPK1が約90%以上の骨髄腫症例で活性化しており、くわえて予後と関連することを見出した。また、治療標的となるべく、骨髄腫細胞の生存や増殖を支配することを明確にした。こうしたことから、現在の研究の進捗は順調であり、くわえて今後も計画通り、さらなる応用に向けた研究を推進することが妥当であることを示している。1.骨髄腫瘍環境における骨髄腫細胞中のPDK1恒常的活性化の意義について、in vitro骨髄擬似環境モデル、in vivo骨髄腫モデルを用いて明らかにする。具体的には、薬剤抵抗性、腫瘍環境と骨髄腫細胞のシグナルクロストークなどについて明らかにする。造血器悪性腫瘍1.骨髄腫瘍環境における骨髄腫細胞のPDPK1発現、制御の意義の検討を行う。具体的には患者骨髄由来の骨髄間質細胞を、CD138陰性分画のプレート付着法により単離し、MM細胞株との共培養によるin vitro骨髄擬似環境モデルを作成し、PDPK1の骨髄腫瘍環境における機能的意義を明らかにする。この際、MMではBMSCにも形質変異が生じていることが近年知られており、本検討に用いるBMSCの起源としてMM患者由来細胞を用いることが重要である。2.In vivo MMモデルにおけるPDK1の機能的意義の検討を行う。現在、in vivoで継続的に使用可能なPDK1阻害小分子化合物は明らかでないため、治療モデルの確立は困難である。一方、RNAiによる治療モデルでは安定的drug deliveryモデルが未確立である。そこで、以下の方法により、骨髄環境におけるPDPK1のMM病態形成の意義について明らかにする。3.PDPK1活性化メカニズムの解明を行う。特にnon-coding RNAの関与が示唆されており、重点的に検討を行うとともに、治療応用について検討する。
抗炎症剤による消化管粘膜障害の機構解明:フリーラジカルによる細胞障害

(1)フェニルブタゾン(PB):非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)の中でもPBは消化管粘膜障害に加えて顆粒球の著しい減少や肝障害など副作用が際だって著しい。一般に、ペルオキシダーゼによって酸化されるNSAIDsはいずれもNSAIDsラジカルとなって、細胞障害を引き起こす。しかしながら、他のNAIDsに比してのPBの際だった副作用が、何に由来するのか明らかではない。一方、α_1一アンチプロテアーゼ(AT)は種々の酸化ストレスに対して感受性があるので、PBの酸化に際して引き起こされる障害のマーカー分子として用いた。ペルオキシダーゼによって活性化されたPBはATのプロテアーゼ阻害能を著しく障害したが、この障害は嫌気的な条件下では惹起されず、PBのスペクトルは好気的条件でのみ著しく変化した。これらのことから好気的条件下、PBが分解される過程でAT障害が引き起こされているものと考えた。ラジカル消去剤を用いて検討したところ、ラジカル消去剤はATの不活性化を強く抑制した。反応途中にカタラーゼを添加して、ペルオキシダーゼによるPBの酸化を停止させてもATの不活性化が進行したこと、およびヨードメトリー反応では過酸化物生成が検出されたので、ATの不活性化はPBのペルオキシラジカルとその過酸化物によっていると結論した。ペルオキシダーゼによるNSAIDsの酸化反応で過酸化物生成が検出されるのはPBのみであり、そのことがPBの際だった障害作用に関係しているものと考えられる。実際、その他のNSAIDsではATの不活性化は認められなかった。(2)スルファサラジン(SA):SAはペルオキシダーゼによって活性化され、マーカー分子として用いたlactatedehydrogenase(LDH)の不活性化を引き起こした。しかしながら、SAの構成成分である5-アミノサリチル酸(5AS)は、このLDHの不活性化を競合的に抑制した。SA自身は腸管中で活性化されて生体成分を障害するが、SAの分解で生成された5SAは障害作用をブロックしかつ顆粒球の作用を抑制して大腸炎を抑制しているものと考えられる。詳細は投稿中である。詳細は投稿中である。非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDs)の細胞障害機構のうち、今年度は主としてピロキシカムとメフェナム酸を用いて組織障害について研究した。NSAIDsの副作用としての胃粘膜障害におけるマーカー分子として、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)またはクレアチンキナーゼを用い、ペルオキシダーゼ(HRP)によって活性化されたピロキシカム(1)とメフェナム酸(2)による不活性化の機構について調べた。(1)ピロキシカムはペルオキシダーゼ(HRP)で酸化的に活性化されてADHを不活性化した。この過程は好気的条件下で顕著におこり、Superoxide dismutase (SOD)には阻害効果が認められたが、ヒドロキシルラジカル消去剤には影響が認められなかった。この結果は、明らかにスーパーオキシド(O_2-)がADHの不活性化を引き起こしていることを示すものであった。ADHのSH基の減少が認められること、グルタチオン(GSH)がADHの阻害を強く防御すること、その他のSH酵素であるクレアチンキナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼも同様にピロキシカム-HRPによって不活性化されたので、酵素の不活性化はSE基の酸化によっているものと考えられる。