hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の温度ストレス応答におけるＲＮＡ分解酵素ＤＣＰ凝集の意義とその役割の解明

また、DCP1やDCP2のノックアウト変異体は致死となってしまいストレス実験に用いることができない。そこで私はDCP1のリン酸化に着目し、リン酸化を受けない変異体を用いることで、高温時のDCP1/2 body形成が異常となる植物の作出に成功した。DCP1/2bodyの集合が異常となる植物材料を作出できたことは、今後の解析に大いに役立つと考えられる。更に自主的な共同研究から次世代シークエンサー解析を成功させ、上記の植物を用い高温処理の前後のプロファイリングの差から、DCP2の集合を介したRNA制御メカニズムがあることを強く示唆するデータをえることに成功した。細胞学的な観察とゲノムワイドな解析を同時に用いて、より植物細胞内で起きている現象の深い理解をすることができた。また、以上の主要な結果だけにかぎらず、RNA分解系の不具合によって植物の高温応答能力が低下するという生理的な解析も相まって,RNA分解系の寄与が生存戦略を担うことが明確になってきた。当該分野で非常に大きな貢献をしていると考える。このことから、当初の計画以上に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で得られた実験結果から、植物の高温応答におけるDCP1とDCP2の働きを考察し、仮説を立てた。植物が高温状態を感知するとDCP1のリン酸化が起き、DCP1顆粒へのDCP2の集合が促進される(DCP1/2 bodyの形成)。その後DCP1/2 bodyに不要なmRNAが集められることで積極的な分解が可能となる。一方高温応答性の新規転写mRNAはDCP1/2 bodyに集められず、分解されない、というものである。このようにmRNA分解を介した高温応答メカニズムが示唆された一方で、一部のRNAだけが影響を受けた理由など不明な点はまだ残っている。更なる解析をすることで植物の環境応答機構の理解が深まり、様々な応用に結びつくことが期待できる。また、本研究のために作出した形質転換体などを用いて研究室内で様々な関連分野の実験が行われており、更なる広がりが期待できる。また、高温処理前後でのトランスクリプトーム解析に次世代シークエンサーを用いることで、元々予期していなかった事象も明らかとなってきた。植物に高温処理を行い、その後高温状態を解除して通常温度に植物を戻すと、大部分のRNAは高温処理前の量に戻ろうとする一方、一部のRNAだけは逆相関に変動しないことが分かった。このことから、植物は高温に晒されたことを"記憶"し、更に環境に適応する能力を保持することが示唆された。以上のように、高温時のDCP1とDCP2の詳細な挙動、DCP1SAを用いたトランスクリプトーム解析、この2点から、本研究の目的である高温応答におけるDCP1とDCP2の集合の役割が見えてきた。また、それだけに限らず、本研究結果をベースにした新たな研究が生まれることも期待できる。
ヒト脂肪組織中ダイオキシン類濃度及び起源と組織型別肺がんに関する環境疫学的研究

肺がんの最大の危険因子は喫煙である。しかし、最も発生頻度が高い腺がんは喫煙との関連が薄い。従って、喫煙以外の肺がん危険因子の検討が、年々増加する肺がんの一次予防に重要である。これまで、肺がん発生の集積地域が示唆される新潟県において、環境中濃度が高い鉱山由来の重金属を喫煙以外の要因として注目してきた。また、本研究者らにより、新潟県では30年前環境中濃度が最高であったと明らかにされたダイオキシン類を、ヒト肺がん発生過程のプロモーターとして着目した。肺は、ダイオキシン類によるがんの標的臓器である。本研究の目的は、喫煙以外の危険因子として従来から肺がんと関連があるとされている砒素をはじめとする重金属とプロモーターとしてのダイオキシン類との関連を明らかにすることである。本年度は、研究への参加のインフォームドコンセントが得られた肺がん患者の手術にて切除肺された肺組織の一部をサンプルとして、ダイオキシン類の138異性体を分析し、そのうち30異性体を解析対象とした。肺がん症例は、喫煙歴のある5070歳代の男性で、扁平上皮がん群及び腺がん群それぞれ4名の肺組織中ダイオキシン類濃度の測定を実施した。分析方法は、サンプル3gをホモジナイズし、凍結乾燥後、アセトン-ヘキサンを用いてソックスレー抽出を行った。次いで、濃縮を行い、脂肪分を測定し硫酸処理した後、シリカゲル、アルミナ、及び活性炭埋蔵シリカゲルそれぞれのカラムに通し、クリンアップした。さらに濃縮後、最終的にバイアルを作成し、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGC/HRMS)にて、異性体別濃度を測定した。その結果、多くのダイオキシン類異性体で、喫煙と関連が弱い肺腺がんにおけるダイオキシン類濃度は、喫煙と関連が深いとされる扁平上皮がんよりも低い傾向にあった。そのため、ダイオキシン類を喫煙以外の肺がんの危険因子である可能性には言及できなかった。しかし、脂肪組織中ダイオキシン類分析方法を習得でき、今後一気に例数を増やすことが可能になった。肺がんの危険因子として喫煙は重要である。従って、喫煙以外の肺がんの危険因子を検討することは、年々増加する肺がんの一次予防に重要である。これまで、新潟県において判明した腺がん発生の集積地域は、かつて鉱山が多く存在し環境中の重金属濃度が高い地域と一致し、喫煙以外の要因として重金属に注目した。また、ダイオキシン類は、ヒト発がん物質とされ、プロモーターとしての発がん過程における役割が示唆されている。肺は、ダイオキシン類のがん発生の標的臓器である。さらに、新潟県では農薬に含まれるダイオキシン類による196070年代の汚染が最も深刻であり、ダイオキシン類の人体への影響を調査する必要がある。本研究は、喫煙以外の危険因子として従来から肺がんと関連があるとされている砒素をはじめとする重金属とプロモーターとしてのダイオキシン類との関連を探る横断研究を行うことを目的とした。本研究への参加のインフォームドコンセントが得られた120名のうち、分析試料が収集され、病理診断が確定し、かつ患者惰報が揃った108例について分析を実施した。組織型では、扁平上皮がんが27.8%、腺がんが63.9%であった。

喫煙歴は、男性では90.1%、女性では13.5%に認められた。肺組織中重金属分析の結果、主要な交絡因子である年齢及び喫煙係数とは関係が認められなかった。肺組織中砒素濃度に性差が認められ男性に高く、男性の扁平上皮がん群にて腺がん群より高値が得られた。肺腺がんが多く認められた2次医療圏居住者の砒素濃度は、男女ともにそれ以外の医療圏に比し高かったが、統計的有意差は認められなかった。砒素以外では、カドミウム濃度に有意差が認められた。注目すべきことは、喫煙歴のない腺がんでベリリウム、クロム、ニッケルが有意に高く、砒素も高い傾向であった。喫煙に由来しない重金属汚染が個人的にある可能性がある。今後、統計学的解析の精度を上げるため、肺腫瘍症例数及び剖検例の収集等によりコントロールとしての肺がん以外の肺疾患症例数を増やす必要がある。また、砒素の毒性を鑑み、砒素のスペシエーションが必要である。今年度までに、脂肪組織中ダイオキシン類の測定に取り掛かる準備が整った。肺がんの量大の危険因子は喫煙である。しかし、最も発生頻度が高い腺がんは喫煙との関連が薄い。従って、喫煙以外の肺がん危険因子の検討が、年々増加する肺がんの一次予防に重要である。これまで、肺がん発生の集積地域が示唆される新潟県において、環境中濃度が高い鉱山由来の重金属を喫煙以外の要因として注目してきた。また、本研究者らにより、新潟県では30年前環境中濃度が最高であったと明らかにされたダイオキシン類を、ヒト肺がん発生過程のプロモーターとして着目した。肺は、ダイオキシン類によるがんの標的臓器である。本研究の目的は、喫煙以外の危険因子として従来から肺がんと関連があるとされている砒素をはじめとする重金属とプロモーターとしてのダイオキシン類との関連を明らかにすることである。本年度は、研究への参加のインフォームドコンセントが得られた肺がん患者の手術にて切除肺された肺組織の一部をサンプルとして、ダイオキシン類の138異性体を分析し、そのうち30異性体を解析対象とした。肺がん症例は、喫煙歴のある5070歳代の男性で、扁平上皮がん群及び腺がん群それぞれ10名の肺組織中ダイオキシン類濃度の測定を実施した。分析方法は、サンプル3gをホモジナイズし、凍結乾燥後、アセトン-ヘキサンを用いてソックスレー抽出を行った。次いで、濃縮を行い、脂肪分を測定し硫酸処理した後、シリカゲル、アルミナ、及び活性炭埋蔵シリカゲルそれぞれのカラムに通し、クリンアップした。さらに濃縮後、最終的にバイアルを作成し、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計(HRGC/HRMS)にて、異性体別濃度を測定した。重金属濃度とダイオキシン類濃度に関する解析の詳細を研究成果報告書に掲載した。
骨髄由来MAPC類似幹細胞移植による肝不全治療と肝線維症予防の基盤研究

我々は、ラット骨髄からMAPC類似の間葉系幹細胞(CD29^+/CD44^+/CD49b^+/CD90^+/CD45^-、ビメンチン及びフィプロネクチン陽性)を単離、クローン化した。本細胞株は約24時間の倍加時間で対数増殖し、300PDLを越えても正二倍体性を維持した。本細胞をHGFおよびFGF-4を添加してマトリゲル上で1週間培養すると、アルブミン、AFP、G6Pase、TO、TAT、CYP1A1、CYP1A2、HNF1α、HNF4α、CK-8、CK-18を発現する肝細胞類似の細胞(類肝細胞)へほぼ100%の効率で分化する。この類肝細胞を90%肝切除による急性肝不全ラットモデルの脾臓に移植したところ、血中アンモニア濃度の増加が有意に抑制され、15匹中5匹が生還した。一方、対照ラットは術後48時間以内に全例死亡した。本類肝細胞はケモカインSDF-1のレセプターCXCR-4、肝再生因子(HGF、TGF-α)とそのレセプター(c-Met、EGFR)を発現することから、これらの分子が移植細胞の肝臓内へのケモタクシス・リクルートおよびオートクリン、パラクリン増殖促進に関与した可能性が考えられる。四塩化炭素誘導ラット肝線維症モデルに対し、未分化幹細胞クローンを脾臓内に移植した結果、Picrosirius Red染色およびα-Smooth Muscle Actin免疫染色により示されるように、肝臓の線維化が顕著に抑制された。未分化幹細胞クローンにMMP-9の活性が認められることから、本細胞移植による線維化抑制効果の一部はMMP-9の作用による可能性が考えられる。以上のとおり、本幹細胞クローン由来の類肝細胞は肝不全を救命するポテンシャルを有し、また元未分化幹細胞クローンは肝線維症の治療に有効であることがわかった。今後は、これらの細胞の組み合わせ移植による効果を検討したいと考えている。骨髄幹細胞移植は,急性,慢性肝不全の新規な治療法として期待されている。我々は,ラット骨髄からCD29+/CD44+/CD49b+/CD90+/CD45-,ビメンチンおよびフィブロネクチン陽性,且つ高い増殖能を有するMAPC類似の間葉系幹細胞を単離,クローン化した。この細胞クローンは約24時間の倍加時間で安定した増殖を続け,300PDLを越えても正二倍体性を維持した。本細胞をHGFおよびFGF-4を添加してマトリゲル上で1週間培養すると,アルブミン,α-フェトプロテイン,G6Pase, TO, TAT, CYPIA1, CYPIA2, CK-8, CK-1Sを発現する肝類似細胞へほぼ100%の効率で分化する。また,この肝類似細胞はケモカインSDF-1のレセプターCXCR-4,肝再生因子(HGF, TGF-α)とそのレセプター(c-Met, EGFR),さらに数種類の脂肪関連遺伝子(PPARγ, EAS, LPL, ALBPなど)を発現する。本研究では,上記のMAPC類似幹細胞を増幅,分化誘導した後に,肝不全や肝線維症ラットモデルに移植して,その効果を検討した。上記の肝類似細胞を90%肝切除による急性肝不全ラットモデルの脾臓に移植したところ,血中アンモニア濃度の増加が有意に抑制され,15匹中5匹が生還した。対照ラットは,術後48時間以内に全例死亡した。

また,四塩化炭素投与により作成したラット肝線維症モデルの脾臓内に上記の未分化幹細胞クローンを移植した結果,Picrosirius Red染色およびα-Smooth Muscle Actin免疫染色で示される肝臓の線維化が顕著に抑制された。この線維化抑制効果の一部は,MMP-9の作用による可能性が示唆された。本.幹細胞クローンおよびその分化誘導細胞は短時間に大量生産が可能であり,有用な移植細胞モデルと考えられる。我々は、ラット骨髄からMAPC類似の間葉系幹細胞(CD29^+/CD44^+/CD49b^+/CD90^+/CD45^-、ビメンチン及びフィブロネクチン陽性)を単離、クローン化した。本細胞株は約24時間の倍加時間で対数増殖し、300PDLを越えても正二倍体性を維持した。本細胞をHGFおよびFGF-4を添加してマトリゲル上で1週間培養すると、アルブミン、AFP、G6Pase、TO、TAT、CYP1A1、CYP1A2、HNF1α、HNF4α、CK-8、CK-18を発現する肝細胞類似の細胞(類肝細胞)へほぼ100%の効率で分化する。この類肝細胞を90%肝切除による急性肝不全ラットモデルの脾臓に移植したところ、血中アンモニア濃度の増加が有意に抑制され、15匹中5匹が生還した。一方、対照ラットは術後48時間以内に全例死亡した。本類肝細胞はケモカインSDF-1のレセプターCXCR-4、肝再生因子(HGF、TGF-α)とそのレセプター(c-Met、EGFR)を発現することから、これらの分子が移植細胞の肝臓内へのケモタクシス・リクルートおよびオートクリン、パラクリン増殖促進に関与した可能性が考えられる。四塩化炭素誘導ラット肝線維症モデルに対し、未分化幹細胞クローンを脾臓内に移植した結果、Picrosirius Red染色およびα-Smooth Muscle Actin免疫染色で示される肝臓の線維化が顕著に抑制された。未分化幹細胞クローンにMMP-9活性が認められることから、本細胞移植による線維化抑制効果の一部はMMP-9の作用による可能性が考えられる。以上のとおり、本幹細胞クローン由来の類肝細胞は肝不全を救命するポテンシャルを有し、また元の未分化幹細胞クローンは肝線維症の治療に有効であることがわかった。今後は、これらの細胞み組み合わせ移植による効果を検討したいと考えている。
対人関係のダイナミックスを規定する要因としての社会的スキルの機能に関する研究

本研究は、社会的スキルの個人差が、対人的相互作用の調整にどのような役割を果たしているか検討する目的で行なわれた。まず、社会的に「適切な」行動をとることについての関心の個人差を表わす指標として、表出行動の基準を他者や状況に置くか自分に置くかに着目し(自己調整基準:外的ー内的)、これと自己の表出行動に関する自信の程度(自己安定感:HighーLow)を組み合わせ4類型を作成した。この分類は操作的には自己モニタリング尺度および同尺度に示される表出行動に関する満足感により測定された。一方で対人的相互作用の個人差に関わるスキルの側面として、符号化スキルと解読スキルを測定する尺度を作成した。因子分析および信頼性の検討により、それぞれの尺度は妥当な内的整合性を有することが明らかになった。これらの尺度間の関連を検討した結果、外的基準で行動し安定感の高い者ほど符号化や解読のスキルが高いことが明らかになった。また、スキル尺度の妥当性を検討するため、電話場面を写したVTRにより、話者の感情や意図を推測させたところ、解読スキルの高い者ほど正確な推測を行う傾向があった。さらに、実際の相互作用場面でのスキルの効用を検討するために、相互の印象評定をA/D変換によりリアルタイムでとりこめる継時的印象変化分析装置を作成し、前述の4類型に基づいて選択した96名の破験者を2人ペアにして相互作用実験をおこなった。実験は1)写真による印象形成、2)衝立をはさんだ自己紹介、3)通常の会話、4)良い印象を与えるように教示された会話という4段階で行われた。外的基準をもち安定感の高い者は、スキル行動が活発で、よい印象を与える傾向がみられた。一方内的基準をもち、安定感の低いものは、印象が変わりやすい傾向があった。全般に相互作用の進展とともに印象の好転がみられた。今回得た知見に基づきひきつづき対人的様互作用のモデル作成を検討中である。
神経細胞賦活を直接観る４次元的fMRI法の開発

常磁性分子はMRI信号の緩和時間を短縮させることでMRI信号強度を変える(常磁性MRI造影剤の原理)。酸素分子も常磁性であるが、水溶液中の溶存濃度は低く、酸素分子の存在によるMRI信号強度変化は、通常の撮像では無視できるとされてきた(Berman AJL, Magn Reson Med, 2016)。一方、細胞内のような高粘性状態では、酸素分子による効果の増強が予想される。そこで、細胞内粘度を模擬したグリセロール水溶液(91%(w/w))を対象に、3T MRI装置にて1HーMRスペクトロスコピーを用い、水分子からの信号の横緩和時間の酸素濃度依存性を精密に測定した。このとき、酸素ガスのバブリング時間により酸素濃度を制御したグリセロール水溶液をMRI測定用サンプル管に封入し、一連の実験は恒温装置を用い37°Cに保ち実施した。その結果、酸素分子による横緩和時間短縮効果がグリセロール水溶液(粘度:75 cP)では、生理食塩水(1 cP)の約200倍に増強されることが判明した。また、縦緩和時間も酸素分子により短縮するので、横緩和時間短縮による信号減衰効果と縦緩和時間短縮による信号増強効果が拮抗し、酸素分子によるMRI信号変化が現れない特異的撮像パラメータ(繰り返し時間(TR),エコー時間(TE))の組み合わせが存在する。このことを定式化し、実験により実証した。なお、その組み合わせは、TRが減少するに従い、酸素分子によるMRI信号変化が現れない特異的TEが約40 msに漸近的に増加し、理論的予想と矛盾のない傾向が確認できた。本研究の主な計画は下記の3項目である。I.高粘性状態で酸素分子がMRI信号に与える影響(緩和効果)の検証III.神経細胞からの信号を直接捉えるfMRI法の開発今年度は、ファントム実験によるIおよびIIの項目の遂行を予定し、人を対象とするIIIに取り組みたいと考えていた。IIIについてはファントムを用いた予備実験に留まったが、IおよびIIの項目は達成できたので、おおむね順調に遂行しているといえる。今後は、今年度の成果の学会発表および論文公表を行う。さらに、人を対象として「神経細胞からの信号を直接捉えるfMRI法の開発」に取り組むが、予備実験によりアーチファクトの発生が認められており、その対策が鍵となる。そのために、使用するMRI装置の撮像法開発ツールの研修を受けた研究分担者により新たな撮像法開発を行う予定である。今年度は、研究が大きく進展した場合に予定していた人を対象とするMRI実験までには至らなかったので、そのために確保していたMRI使用料と被験者への謝金を次年度に繰り越した。
神経組織の構築(発生)と再構築(再生)

本研究班は、「中枢神経系の構築と再構築」の問題を分析・検討し、究明するために組織された。近い将来、重点領域研究として申請することを念頭においた。平成5年度に以下の連絡会議・班会議・講演会を開催し、全班員が参加し班員以外の専門家も招待してこの分野の先端の諸問題を提起し、活発に討論することができた。それらの会合とは、1.班会議「神経組織の構築(発生)と再構築(再生)」(発表9題)、平成5年10月9日、東京2.公開講演会「神経の発生と再生をめぐって」(発表4題)、平成5年12月9日、名古屋3.公開シンポジウム「ニューロンネットワークの組織化とその可変性」(発表8題)、平成6年1月31日、大阪、であった。上記の研究討論会には多数の参加者があり、大脳皮質、脳幹、小脳、脊髄と中枢神経系の全領域が討論の対象となり、テーマとしては、シナプスの可塑性、特異的神経結合の形成機構、細胞接着因子、細胞間相互作用、脳特異的遺伝子の発現、細胞骨格の役割、損傷神経組織の再生など多方面の話題が提供された。以上の実績をもとに、本研究班員の川村と村上は、同じく平成5年度の総合研究B「神経活動による遺伝子応答」(代表者、三木直正)および「連合学習の比較分子生物学」(代表者、川合述史)と合同班会議を東京と大阪で数回行い、協力して研究体制を作ることになった。このように、研究者を結集し、総合的に討論し、組織化することで合意した結果、平成7年度発足重点領域研究として「神経回路の機能発達」(代表者、津本忠治)を申請する運びとなった。
転倒による外傷評価の基礎研究

本研究は、転倒による外傷リスクを数値にて評価することを目的に様々な転倒実験を行った。ダミーモデルおよび人を対象とした転倒時の姿勢変化を高速度カメラにて撮影し、転倒による衝突時加速度および角加速度から転倒による外傷リスクを数値にて提示した。次に、病院にて使用されている転倒外傷予防具の予防効果について、同様の実験を通じて予防具の有無による衝突時加速度から衝撃力を算出しその転倒外傷予防効果を提示した。これらの成果から、看護領域として転倒後の予防対策の必要性を示した。本研究は、転倒による外傷リスクを数値として具体的に示す事で患者などの対象に生じる転倒外傷の評価を目的としており、初年度はより人に近い構造のモデル人形を用いた転倒外傷リスクを評価する事を目的にモデルダミーの作成と作成ダミーによる転倒実験を行なった。作成されたモデルダミーはこれまでの先行研究にて用いていた衝突モデルダミーと比べ持ち運びが可能で安価であり、人の無防備時での転倒姿勢や転倒による頭部外傷評価に特化した評価を目的として、市販の人骨標本を基に米国のPlagenhoefらが掲載しているBoby segment dataを参考に身体各部位の重量に合わせてモデルを作成し、頭蓋内部に脳実質と同じ材質特性を持つ素材を充填することで、これまでのモデルダミーと異なり頭蓋内部における衝突加速度の計測が可能であり、このデータを基に転倒による外傷リスクの分析を行なった。初年度は、本格的な人の実験に先立ちモデルダミーを用いた実験を通じて、転倒時の転倒外傷リスクの再評価と人を対象とした転倒実験の実施にむけた安全性の確保を目的に予防対策の見直しも含めて実験を行なった。モデルダミーを用いた実験では、病棟施設に普遍的な環境化での転倒実験を行ない、その結果、転倒による頭部外傷は転倒による床面への直接的な接触による衝撃力だけでなく、首を基点とした角加速度によっても危険性が高くなることを明らかとした。このことから、転倒外傷予防対策として装着型予防具の使用を推奨する必要性を提示した。また、転倒時に衝撃を受けやすい頭部の部位を明らかとした。これらの成果については、平成25年度の日本職業災害医学会会誌にて論文掲載した。本研究の目的は、転倒による外傷リスクを数値として具体的に示すことで患者などの対象に生じる転倒外傷の評価を目的としており、最終年度となる平成26年度は人を対象とした転倒実験を行った。人を対象として、水面に向けての転倒実験(倫理審査:産業医科大学H24ー127)を行い転倒時おける人の床面への衝突時の衝突加速度を明らかとした。この結果より、前年度の計算式を用いて人における転倒時の身体外傷危険度を数値にて明らかとした。この結果については、平成26年度Inter national nursing care research誌にて論文掲載した。加えて、転倒外傷予防として用いられている頭部外傷予防具の予防効果について人を対象とした転倒実験より得られた外傷危険度を参考に評価を行った。その結果については、平成27年度日本職業災害医学会誌にて掲載決定している。基礎看護看護管理新しいモデルダミーの作成に関しては、日本人の身体寸法データベースの使用やPlagenhoefらのBody segment dataを用いることで市販されている人骨標本に錘をつけることで安価に作成する事が出来た。また、先行研究で用いた衝突モデルダミーの実験結果と相互参照することでモデルダミーの信頼性の担保を可能とした。加えて先行研究の経験と解析データや研究指導者(純真学園大学・中野正博教授)の意見とアドバイスが大いに役立った。モデルダミー実験を通じて転倒時の衝突部位や転倒姿勢などが明らかとなったことで、人を対象とした実験に先立って安全性確保に必要な対策を講ずることが可能となった。これらの結果などから、人を用いた実験での倫理審査(産業医科大学H24ー127)承認が認められ良好な結果を得る事が出来た。相対的な研究の達成度は、個々に過不足はあるものの順調に推移しており、本助成金は大いに役立った人における転倒時の姿勢変化と転倒時における腰を中心とした2軸での角加速度の計測を行なう。その結果より、先行研究での外傷評価モデルに当てはめ転倒による身体外傷評価を行なう。身体外傷評価にあたっては、データの分析と解釈が重要であり、この点については研究指導者(純真学園大学中野正博教授看護協会川本利恵子理事産業医科大学行正徹准教授)の意見を仰ぎながら行なっていく。必要に応じて、より詳細な転倒衝撃による頭蓋内部の衝撃加速度の計測をモデルを用いて行ない、転倒時における脳内部の衝撃伝播について解析を行なう。今年度は、日本看護研究学会や日本医工学会など学会に積極的に参加し、情報収集や研究発表を行なう予定である。これ以外にも論文掲載なども行なう予定である。
アミロペクチンの3Dクラスタ-モデルの構築-生合成酵素遺伝子の発現を探る

本研究では、アミロペクチンの分岐構造に関する基礎的情報を得るための分析手法を開発し、得られた情報に基づき分岐構造モデルの構築を試みた。1.アミロペクチンの分子量分布をHPSECで分析する諸条件を検討した結果、示差屈折計による重量分布では単一のピークしか示さないが、蛍光検出による数分布では2成分に分離可能であった。2.アミロペクチンのβ-アミラーゼ限界デキストリン(β-LD)の単位鎖長分布を微量で調製・分析するため、酵素の反応条件やマルトースの除去方法を検討した結果、45mgのアミロペクチンを用い、蛍光標識/HPSEC法で鎖長分布を測定する方法を確立した。β-LDの鎖長分布は植物種で異なり、鎖長分布をAおよびB1B3の4画分に分画して比較すると、A/B1や(A+B1)/(B2+B3)のモル比は植物種起源や澱粉粒の結晶形と関連性のあることが示唆された。つぎに、アミロペクチンをまずホスホリラーゼで、ついでβ-アミラーゼでそれぞれ限界まで分解して得られる、φ,β-限界デキストリン(φ,β-LD)の微量調製・分析法を確立し、その鎖長分布を調べた。φ,β-LDの鎖長分布は植物種で異なり、A/B1や(A+B1)/(B2+B3)のモル比は植物種起源や澱粉粒の結晶形との間に関連性が認められ、β-LDを用いた分析結果と矛盾しないこと、解析の目的によってこれらのデキストリンを使い分ける必要性が認められた。3.上の結果をもとに、側鎖の数や分岐の内部鎖長、分岐結合間隔などを考慮して、アミロペクチンのクラスターモデルを構築した。澱粉粒の結晶形がA形を示すものとB形を示すものとでは、構築したモデルの特長は大きく異なり、結晶形と分岐構造との関連としてこれまで知られていた、クラスターを構成する単位鎖の平均鎖長が異なるのみならず、クラスター内での分岐結合の位置とその分布も明確に異なると結論づけた。本年度はまず代表的な穀類(コメ、コムギ、トウモロコシ)と根茎類(ジャガイモ、サツマイモ)を選び、それらの澱粉を脱脂して、脱脂澱粉からブタノール(アミロース沈殿剤として使用)を用いてアミロペクチンを調製した。アミロペクチンの分子量分布を高性能サイズ排除クロマトグラフィーで分析するために、モチ種(ほぼ100%アミロペクチン)のコメ澱粉を試料として、分析用カラムの選定・カラム構成の検討と流速・カラム温度等の分析条件の検討を行った。その結果、示差屈折計で得られる重量分布では単一のピークしか示さないが、蛍光による検出で得られる数分布では2ないし3成分に分離可能であった。現在、さらに優れた分離を与える条件を検索中である。アミロペクチンのβ-アミラーゼ限界デキストリン(β-LD)の単位鎖長分布を微量で調製・分析するための条件を検討した結果、45mgのアミロペクチンで分析が可能であるとの見通しが得られた。また、β-LD調製の際に生ずるマルトースは単位鎖長分布の分析において妨げとなるので、これを除去する方法を検討し、75%エタノールでの洗浄と再溶解・エタノール沈殿を繰り返すことにより完全に除去できることを確かめた。

β-LDを枝きりする条件を検討した結果、イソアミラーゼもしくはプルラナーゼ単独では枝きりは完全ではないことが判明した。現在、両枝きり酵素による逐次分解により、β-LDを完全に枝きりする条件をさらに検討中である。アミロペクチンの分子量分布を高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)で分析する条件の検討を昨年度に引き続き行った。標準物質として用いる合成アミロースについては定量分析が可能な条件を確立できた。アミロペクチンを同条件下で分析すると、二成分以上に分離することは困難であったので、さらに検討が軽要である。アミロペクチンのβ-アミラーゼ限界デキストリン(β-LD)の単位鎖長分布を測定するために、β-LDを枝切りする条件を検討し、イソアミラーゼとプルラナーゼを逐次作用させて完全に分解できる条件を確立した。枝切りしたβ-LDの還元末端基を2-アミノピリジンで蛍光標識し、HPSECで鎖長分布を測定した。β-LDの鎖長分布は植物種で異なり、鎖長分布をAおよびB1B3の4画分に分画して比較すると、A/B1や(A十B1)/(B2+B3)のモル比は植物種起源や澱粉粒の結晶形と関連性のあることが示唆された。アミロペクチンをまずボスホリラーゼで、ついでβ-アミラーゼでそれぞれ限界まで分解して得られる、φ,β限界デキストリン(φ,β-LD)について、ホスホリラーゼ限界デキストリンの微量調製法を検討した。A鎖が限界まで分解されて生ずるマルトテトラオースのモル%を指標として分解の程度を評価すると、従来一般的に行われてきた、グルコース1-リン酸の生成量もしくは残存デキストリンの炭水化物量による評価では限界に達したと判断される場合であっても分解は限界に達していないことが分かった。ほぼ限界まで分解できる条件を見出しているが、さらに検討が必要である。1.アミロペクチンの分子量と数分布の測定蛍光標識したアミロペクチンをHPSEC法により測定し、数分布を調べる方法の検討を前年度に引き続き行った。溶媒組成、添加する塩の種類・濃度等、種々の条件を検討したが、二成分以上に分離する条件を見出すことは困難であった。2.アミロペクチンの分岐構造の解析アミロペクチンのホスホリラーゼ・β-アミラーゼ限界デキストリン(Φ,β-LD)の微量スケールでの調製方法およびこれを完全に枝切りする条件を確立し、蛍光標識/HPSEC法により鎖長分布を調べた。Φ,β-LDの鎖長分布は植物種で異なり、鎖長分布をAおよびB1B3の4画分に分画して比較すると、A/B1や(A+B1)/(B2+B3)のモル比は植物種起源や澱粉粒の結晶形との間に関連性が認められた。この結果は、以前に行ったβ-アミラーゼ限界デキストリンあるいはホスホリラーゼ限界デキストリンを用いた解析結果と矛盾しないことが確かめられた。また、解析の目的によって、これらのデキストリンを使い分ける必要があることが判明した。3.クラスターモデルの構築上の結果をもとに、B鎖に結合する側鎖の数や分岐の内部鎖長、分岐結合間隔などを考慮してアミロペクチンのクラスターモデルを構築した。澱粉粒の結晶形がA形を示すものとB形を示すものとでは、構築したモデルの特徴は大きく異なり、結晶形と分岐構造との関連としてこれまで知られていた、クラスターを構成する単位鎖の平均鎖長が異なるのみならず、クラスター内での分岐結合の位置とその分布も明確に異なると結論づけた。
リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素からみた髄液リンパ系ドレナージの検討

本研究では,くも膜下出血代謝産物のクリアランスにリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)が輸送蛋白として関与し,その排泄経路を調べることにより,髄液のリンパ系ドレナージの存在と役割を明らかにするのが目的である.諸般の事情によりモデル動物をラットからマウスに変更した.そのため今年度はマウスくも膜下出血モデル作成の準備を行った.種々のモデルを検討した結果,頸動脈から挿入したナイロン糸による動脈穿通モデルが最も生理的くも膜下出血に近く,かつ再現性のある病態が得られるとことが明らかとなり,採用することに決定した.マウスLーPGDSモノクロナール抗体については研究協力者より入手予定で,現在その抗体の検証準備中である.また髄液リンパ系ドレナージに関する情報収集を目的として国際学会に参加し,世界各国の研究者と積極的に意見交換を行った.当初,モデル動物としてラット用いる予定であった.しかしラットLーPGDS抗体の入手が困難で,また抗体を新規作成するのにはコストと時間がかかることが明らかとなった.マウスLーPGDS抗体は研究協力者より入手可能なので,モデル動物をラットからマウスに変更した.マウスくも膜下出血モデルについて情報収集を行い,再現性と汎用性のあるモデルを決定するのに時間を要した.2)マウスくも膜下出血モデルの作成を開始し,頭蓋底部硬膜,嗅粘膜,頸部リンパ節を経時的に採取し,免疫染色と抗体カラムを用いてL-PGDSを取り出す.3)採取し精製したLーPGDSに結合する蛋白をmass spectroscopyで同定する.4)可能であれば同様の実験をノックアウトマウスで行う5)結果を論文化する.本研究では,くも膜下出血代謝産物のクリアランスにリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)が輸送蛋白として関与し,その排泄経路を調べることにより,髄液のリンパ系ドレナージの存在と役割を明らかにするのが目的である.諸般の事情によりモデル動物をラットからマウスに変更した.そのため今年度はマウスくも膜下出血モデル作成の準備を行った.種々のモデルを検討した結果,頸動脈から挿入したナイロン糸による動脈穿通モデルが最も生理的くも膜下出血に近く,かつ再現性のある病態が得られるとことが明らかとなり,採用することに決定した.マウスLーPGDSモノクロナール抗体については研究協力者より入手予定で,現在その抗体の検証準備中である.また髄液リンパ系ドレナージに関する情報収集を目的として国際学会に参加し,世界各国の研究者と積極的に意見交換を行った.当初,モデル動物としてラット用いる予定であった.しかしラットLーPGDS抗体の入手が困難で,また抗体を新規作成するのにはコストと時間がかかることが明らかとなった.マウスLーPGDS抗体は研究協力者より入手可能なので,モデル動物をラットからマウスに変更した.マウスくも膜下出血モデルについて情報収集を行い,再現性と汎用性のあるモデルを決定するのに時間を要した.2)マウスくも膜下出血モデルの作成を開始し,頭蓋底部硬膜,嗅粘膜,頸部リンパ節を経時的に採取し,免疫染色と抗体カラムを用いてL-PGDSを取り出す.3)採取し精製したLーPGDSに結合する蛋白をmass spectroscopyで同定する.4)可能であれば同様の実験をノックアウトマウスで行う5)結果を論文化する.L-PGDS抗体の準備が間に合わず動物実験が開始できなかったため,実験に関する支出は本年度はほとんどなかった.次年度は動物モデルを用いた実験を開始する.次年度使用額は実験動物や種々の試薬,薬品など,動物実験に関連した費用に使用する.
新規バイオマテリアルを用いた脊髄損傷治療の可能性－細胞外環境操作と炎症制御解析－

脊髄損傷および中枢神経損傷後、神経再生に向けた治療方向性を検討している。そのなかでも神経再生に最大の阻害作用を持つコンドロイチン硫酸(CS)の発現を、新しい遺伝子治療とバイオマテリアルを用いて抑制することにより再生環境を整えるという、応用に向けた研究を推進してきた。また中枢神経再生治療において、iPS細胞などを神経組織移植部に保持し、再生環境を整えるためのシステム構築をマウス・ラットモデルにて遂行している。そのためにも、CSがいかに生体組織の炎症系の制御を行っているかという大きな課題を明確化することともに、上記治療応用を推進している。1)CS発現と上皮および組織構築と炎症性解析: CS発現を抑えることで、生体内の炎症性全般に関わることが明らかとなった。とくに、細胞外マトリックスに対して、なかでもコラーゲンの配向だけではなく構築に機能していることを高調波2波長レーザー顕微鏡解析などから明らかにした。さらにコラーゲンの発現そのものにもCSが必要であることを報告した(Sci.Rep2018)。組織発生及び再生にCSが重要であることを示した2)CS合成阻害薬物のDDS効果と生体内炎症性解析:フィブロインスポンジを徐放剤として用いたsiRNA投与で、炎症領域特異的に蛍光標識核酸医薬がデリバリーされることも確認し、炎症におけるCS制御機構とともに遺伝子レベルでの網羅解析を行った。炎症鎮火におけるCS発現量の調整とともに、核酸医薬でのDDSの優位性とともに、炎症制御における薬剤としての可能性を示すことが出来た。3) iPS細胞および多くの幹細胞(間葉系幹細胞・ES細胞)移植とともに、周囲の細胞外環境をCS制御の観点から解析を開始した。幹細胞の定着活性やそこでの分化活性を定量化し、CSの発現量による分化能変化が少ないことと、バイオマテリアルによる影響も検討を開始した。CSの発現による細胞外環境操作を薬剤によって行う可能性を明確にしたこと、薬剤のDDSによる、炎症部特異的な再生誘導が可能であることを見出したことは、今後の研究においても大きな進展である。メカニズム解明を進めるとともに、今後動物実験での例数を増やすことで、炎症制御能と神経再生による生理機能回復を前倒しで検討できるようになった。研究成果に則り、脊髄損傷治療においては、マウスの生理機能解析を進めている。さらに、脊髄損傷後の損傷部へのiPS細胞および幹細胞移植による、評価をさらに前倒しで進める。その際に、移植領域の細胞外マトリックスの発現などの解析を、CSだけではなくコラーゲンなど網羅的に解析することを可能とした。また、中枢損傷後の慢性期患者を想定し、脊髄損傷後、一定期間経過後の経過したマウスを用い、薬剤投与および細胞移植による生理的回復がどの時点まで可能かという、治療におけるタイムウインドウの検証を開始した。脊髄損傷後の神経再生に対し阻害作用を持つコンドロイチン硫酸(CS)発現を、新しいバイオマテリアル・フィブロインスポンジを用いて抑制することにより、再生環境を整える基礎研究を推進することを目的としてきた。さらにiPS細胞を移植部に保持するための基材として、上記の再生環境整備と併用したシステムをマウスモデルにて遂行している。siRNAノックダウンによって治療効果が上がることはすでに実証してきたが、CS発現を抑えることで、別の糖鎖であるヘパラン硫酸(HS)が誘導され、神経伸長活性を増強することで再生をさらに促進する。この遺伝子発現制御の一端を明らかにすることができた。炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインがこれら糖鎖合成遺伝子の発現制御に効いていること、そのシグナル伝達経路についてRT-PCRによる網羅的発現解析から示した。さらに、フィブロインスポンジを徐放剤として用いたsiRNA投与で、炎症領域特異的に蛍光標識核酸がデリバリーされることも確認した。炎症が起きている組織領域では盛んな核酸取り込みが起こること、それを利用したDDSの可能性を示すことができた。2) iPS細胞および多くの細胞(神経系細胞・骨細胞)が長期にフィブロインと相互作用した際に、細胞分化能や細胞の性質が変化しないことを確認した。これは生体材料としての安定性を確認することにつながった。さらに、この生体材料でCSGalNacT1を発現抑制するあるいは遺伝子発現を止めた場合の骨形成に与える影響を発生学的に追跡し解析した(論文投稿中)。また炎症との相関をみるために脊髄損傷だけではなく皮膚再生に与える影響をサイトカインの遺伝子発現の網羅的解析から遂行を開始している。当初計画にあげていた核酸医薬のDDSに関しては、炎症領域では盛んな核酸取り込みが起こること、それを利用したDDSの可能性を示すことができたことは今後の研究においても大きな進展となった。そのメカニズムを明らかにするために細胞のピノサイトーシスあるいは核酸取り込み能の定量解析の方法を確立できたため、多くの汎用性を持たせることが可能となった。さらに、骨形成についても詳細な発生学的解析を進めることができ、計画以上に興味深い知見を得ることができた。

とくに、細胞外マトリックスに対して、なかでもコラーゲンの配向だけではなく構築に機能していることを高調波2波長レーザー顕微鏡解析などから明らかにした。さらにコラーゲンの発現そのものにもCSが必要であることを報告した(Sci.Rep2018)。組織発生及び再生にCSが重要であることを示した2)CS合成阻害薬物のDDS効果と生体内炎症性解析:フィブロインスポンジを徐放剤として用いたsiRNA投与で、炎症領域特異的に蛍光標識核酸医薬がデリバリーされることも確認し、炎症におけるCS制御機構とともに遺伝子レベルでの網羅解析を行った。炎症鎮火におけるCS発現量の調整とともに、核酸医薬でのDDSの優位性とともに、炎症制御における薬剤としての可能性を示すことが出来た。3) iPS細胞および多くの幹細胞(間葉系幹細胞・ES細胞)移植とともに、周囲の細胞外環境をCS制御の観点から解析を開始した。幹細胞の定着活性やそこでの分化活性を定量化し、CSの発現量による分化能変化が少ないことと、バイオマテリアルによる影響も検討を開始した。CSの発現による細胞外環境操作を薬剤によって行う可能性を明確にしたこと、薬剤のDDSによる、炎症部特異的な再生誘導が可能であることを見出したことは、今後の研究においても大きな進展である。メカニズム解明を進めるとともに、今後動物実験での例数を増やすことで、炎症制御能と神経再生による生理機能回復を前倒しで検討できるようになった。研究成果に則り、脊髄損傷治療においては、当該基材をの長期(1年間以上)留置したマウスのさらに詳細な追跡解析を免疫組織から解析する。さらに、脊髄損傷後の損傷部へのiPS細胞および幹細胞移植を行い、細胞の留置能を検証する。さらに脊髄損傷後の慢性期患者を想定し、脊髄損傷後3か月以上経過したマウスを用いる。この脊髄損傷部の線維性瘢痕を除去後、実際の脊損後慢性期患者治療を想定し瘢痕部を除去して移植領域を確保する手技を確立し、iPS細胞移植を行う。核酸治療での可能性と材料としてのDDSおよび細胞留置を詳細に解析する研究成果に則り、脊髄損傷治療においては、マウスの生理機能解析を進めている。さらに、脊髄損傷後の損傷部へのiPS細胞および幹細胞移植による、評価をさらに前倒しで進める。その際に、移植領域の細胞外マトリックスの発現などの解析を、CSだけではなくコラーゲンなど網羅的に解析することを可能とした。また、中枢損傷後の慢性期患者を想定し、脊髄損傷後、一定期間経過後の経過したマウスを用い、薬剤投与および細胞移植による生理的回復がどの時点まで可能かという、治療におけるタイムウインドウの検証を開始した。
中枢神経疾患治療薬の新しい脳内移送評価系の開発-in vitro血液脳関門モデルの実用化-

本研究においては、多大な経費と労力を要する動物実験の代替となるBBBモデル系の実用化を図る、すなわち、新規の中枢神経薬の探索範囲を拡大しさらに現在使用されている薬剤の効果評価にも利用できる簡便な「スクリーニング系」を確立することに目的に研究を進めた。脳毛細血管内皮細胞は、初代培養が難しく、大量に入手することは困難を極める。そこで、脳毛細血管内皮細胞を安定かつ大量に供給するために、ウシ脳毛細血管内皮細胞にSV40large T抗原遺伝子を導入し不死化したtBBEC117細胞株を樹立した。この不死化脳毛細血管内皮細胞をダブルチャンバー培養器の内側チャンバーに培養し、外側チャンバーにアストロサイトを離して共培養することにより、不死化脳毛細血管細胞株でもBBB特異的機能発現(密着帯、mdr、Glut-1、透過性の低下など)があることを確認した[Sobue,K.etal.Neurosci.Res.35:155-164,1999]。このことはアストロサイトが何らかの液性因子を分泌し脳毛細血管細胞にBBB特異的形質の発現を誘導している可能性を示している。このように、アストロサイトからの液性因子によりBBB特異的形質が誘導されことより、BBBモデルにおいて再現性良く実験を進めるために、アストロサイトの安定供給を計る必要も出てきた。そこで、申請者らは、ラット大脳皮質から初代培養したアストロサイトにSV40large T抗原遺伝子を導入し不死化した細胞株を樹立した。ACT-57と名付けた細胞株は、アストロサイトのマーカータンパクであるGFAP(グリア線維性酸性蛋白)を発現しており、さらにNGF(神経成長因子)を高発現していることが判明した[Morikawa,M.etal.Neurosci.Res.39:205-212,2001]。今後、これら、不死化毛細血管内皮細胞及び不死化アストロサイトを使用し研究を進める予定である。脳損傷・虚血や中枢神経変性疾患など、すべての脳機能障害の治療には、まず、ニューロン死を抑える神経栄養因子をはじめシナプス形成を促進する薬剤を同定することが一義的であり、次には、これらの因子や薬剤が有効に脳組織へ移行するか否かを判定するための血液脳関門(BBB)モデル系を開発する必要がある。当該研究者は、脳血管内皮細胞とアストロサイトを二重層共培養することにより選択的透過機能をもつBBBモデルを作成した。そこで平成11年度は、多大な経費と労力を要する動物実験の代替となるBBBモデル系の実用化を図るための簡便な「スクリーニング系」の確立することに成功した[Sobue K et al.Neurosci.Res.in press]。具体的には、ウシ脳毛細血管内皮細胞にSV40 large T抗原遺伝子を導入し不死化したtBBEC117細胞株を樹立した。ダブルチャンバー培養器に不死化脳血管内皮細胞(外側チャンバーをアストロサイト(内側チャンバー)とを離して共培養することにより、不死化脳毛細血管細胞株でもBBB特異的機能発現(密着帯、mdr、Glut-1、透過性の低下など)があることを確認した。このことはアストロサイトが何らかの液性因子を分泌し脳毛細血管細胞にBBB特異的形質の発現を誘導している可能性が示された。現在このアストロサイト産生性因子の同定を試みている。

今回確立できたBBBモデル系を用いれば、アルツハイマー病や脳血管痴呆の治療・予防のための新規薬剤の探索範囲は格段に拡大し、さらに現在使用されている薬剤の効果評価にも利用でき、中枢神経疾患治療薬の開発は飛躍的に発展することを確信する。本研究においては、多大な経費と労力を要する動物実験の代替となるBBBモデル系の実用化を図る、すなわち、新規の中枢神経薬の探索範囲を拡大しさらに現在使用されている薬剤の効果評価にも利用できる簡便な「スクリーニング系」を確立することに目的に研究を進めた。脳毛細血管内皮細胞は、初代培養が難しく、大量に入手することは困難を極める。そこで、脳毛細血管内皮細胞を安定かつ大量に供給するために、ウシ脳毛細血管内皮細胞にSV40 large T抗原遺伝子を導入し不死化したtBBEC117細胞株を樹立した。この不死化脳毛細血管内皮細胞をダブルチャンバー培養器の内側チャンバーに培養し、外側チャンバーにアストロサイトを離して共培養することにより、不死化脳毛細血管細胞株でもBBB特異的機能発現(密着帯、mdr、Glut-1、透過性の低下など)があることを確認した[Sobue,K. etal.Neurosci.Res.35:155-164,1999]。このことはアストロサイトが何らかの液性因子を分泌し脳毛細血管細胞にBBB特異的形質の発現を誘導している可能性を示している。このように、アストロサイトからの液性因子によりBBB特異的形質が誘導されことより、BBBモデルにおいて再現性良く実験を進めるために、アストロサイトの安定供給を計る必要も出てきた。そこで、申請者らは、ラット大脳皮質から初代培養したアストロサイトにSV40 large T抗原遺伝子を導入し不死化した細胞株を樹立した。ACT-57と名付けた細胞株は、アストロサイトのマーカータンパクであるGFAP(グリア線維性酸性蛋白)を発現しており、さらにNGF(神経成長因子)を高発現していることが判明した[Morikawa,M. etal.Neurosci.Res.39:205-212,2001]。今後、これら、不死化毛細血管内皮細胞及び不死化アストロサイトを使用し研究を進める予定である。
高温固気流動層内の非球形粒子群輸送に対する数値解析手法の開発とその応用

本研究では,高温の固気流動層内における非球形粒子の挙動を明らかにするために,低マッハ数圧縮性流れと非球形粒子の力学・熱連成計算手法を開発する.本手法では,広範な温度差の問題に適用するために気体の圧縮性を考慮する.また,流体計算はオイラー格子上で行う一方で,固体粒子形状は四面体要素の集合体として表現され,この四面体要素と接触判定球を用いて各粒子に働く流体力,接触力を計算する.以上の手法を用いて大規模数値実験を行い,非球形粒子層の流動化メカニズムや流動状態での伝熱機構について詳細な検討を行う.加えて,工学上の実用問題(例えば粉体乾燥など)に開発した手法を適用し,その応用性についても検討を行う.本研究では,高温の固気流動層内における非球形粒子の挙動を明らかにするために,低マッハ数圧縮性流れと非球形粒子の力学・熱連成計算手法を開発する.本手法では,広範な温度差の問題に適用するために気体の圧縮性を考慮する.また,流体計算はオイラー格子上で行う一方で,固体粒子形状は四面体要素の集合体として表現され,この四面体要素と接触判定球を用いて各粒子に働く流体力,接触力を計算する.以上の手法を用いて大規模数値実験を行い,非球形粒子層の流動化メカニズムや流動状態での伝熱機構について詳細な検討を行う.加えて,工学上の実用問題(例えば粉体乾燥など)に開発した手法を適用し,その応用性についても検討を行う.
新規アルコール脱水素酵素による超臨界二酸化炭素中での酸化還元反応の開発

超臨界二酸化炭素中でのGeotrichum candidum由来の新規アルコール脱水素酵素による酸化還元反応の検討を行った。また、本反応に関与する2種類の酵素の単離精製に成功し、諸性質の解明を行った。1種類については、ほぼすべてのDNA配列を決定することができた。さらに、酵素の固定化法の検討を行い、超臨界二酸化炭素存在下での酵素の安定性を大幅に向上させことに成功した。申請者は、これまでに、チチカビ(Geotrichum candidum)由来のアルコール脱水素酵素を超臨界二酸化炭素中で用いる研究を行い、不斉還元反応に成功している。そこで、本研究では、分子生物学的手法により本アルコール脱水素酵素を超臨界二酸化炭素中での反応により適するものへと改良することを目的としている。さらに、どのような性質の酵素が超臨界二酸化炭素中での反応に適するかの系統的な検討も行う予定である。そのために、本年度は、本酵素の大腸菌内での大量発現系の構築へ導くために、チチカビからの酵素の単離精製を行い、さらに、本酵素の諸性質を検討した。チチカビ中には、アセトフェノン誘導体を立体選択的に還元し、光学活性アルコールを生成する酸化還元酵素が、2種存在する。それらはNADH及びNADPH依存性で高い立体選択性、広い基質特異性を有しており、さらに基質中のフッ素置換数を認識するなど、それぞれ異なった立体選択性を示す。それらの酵素の単離精製のために、チチカビの乾燥菌体から両酵素を硫安分画(30-70%)及び各種クロマトグラフィー(HQ:強アニオン交換カラム、HP:疎水カラム、Blue:アフィニティーカラム、ResouceQ:ア、ニオン交換カラム、HAP:ハイドロキシアパタイトカラム、Ge1:ゲルろ過カラム)により単離精製した。その結果、NADH依存酵素が回収率7.1%、NADPH依存酵素が回収率1%で、121倍、131倍に精製された。また、NADH依存酵素については、内部アミノ酸配列の決定にも成功した。申請者は、これまでに、チチカビ(Geotrichum candidum)由来のアルコール脱水素酵素を超臨界二酸化炭素中で用いて、不斉還元反応に成功している。現在までに、チチカビからの酵素の単離精製を行い、さらに、本酵素の諸性質を検討した。NADH依存酵素は回収率7.1%, NADPH依存酵素は回収率1%で、121倍, 131倍に精製された。また、NADH依存酵素については、N末端及び内部アミノ酸配列の決定にも成功した。アセトフェノン還元酵素のN末端アミノ酸配列は12残基はXGKVPETXKGYVFTと決定された。FASTA分析により、10アミノ酸は、Saccharomyces bayanus由来のアルコール脱水素酵素1と80%の類似を示し、Geotrichum capitatum由来のN-benzyl-3-pyrrolidinol脱水素酵素ともいくつかの一致もみられた。内部配列の15残基はAENRTNYGLGYPGGYと決定され、その配列はFASTA分析によって、13アミノ酸はGeotrichum capitatum由来のN-benzyl-3-pyrrolidinol脱水素酵素と、69%の同一性を示した。本酵素をイオン交換樹脂に固定化し、ケトンの不斉還元反応を行ったところ、固定化前よりもエナンチオ選択性、耐熱性、耐酸性、及び耐アルカリ性が向上し、超臨界二酸化炭素中でも高い不斉収率を維持できることも確認できた。さらに超臨界二酸化炭素中で使用した固定化酵素でも数回の再利用が可能であった。このように生体触媒を用いた二酸化炭素を原料とする反応の効率化、光学活性体の合成に成功した。申請者は、これまでに、チチカビ(Geotrichum candidum)由来のアルコール脱水素酵素を超臨界二酸化炭素甲で用いて、不斉還元反応に成功しており、本研究は、このアルコール脱水素酵素を超臨界二酸化炭素中での反応により適するものへ改良することを目的としている。現在までに、チチカビ中から、アセトフェノン誘導体を立体選択的に還元し、光学活性アルコールを生成する酸化還元酵素を2種類単離精製し、諸性質を検討した。アセトフェノン還元酵素のアミノ酸配列の多くが解明され、さらにこの酵素をコードするDNA配列のほぼ全てを決定することができた。このDNA配列をFASTAによる相同性検索を行ったところG. capitatum由来のN-benzyl-3-pyrrolidinol還元酵素と62%の相同性を示した。一方、フルオロケトン還元酵素も収率5.0%、131倍に精製、単離された。

分子量を測定した結果、ヘテロ二量体であると思われる。速度論的解析により、本酵素はジフルオロメチル基>トリフルオロメチル基>モノフルオロメチル基の順にVmaxおよびkcat/Kmが高いことがわかった。内部配列の解析のため、ペプチドシークエンサやMALDI-TOF-MASによる分析を試みたが、既知の酸化還元酵素などとの相同性の一致が見られず、本酵素は新規酵素である可能性が高いと考えられる。また、本酵素を、補酵素であるNADPHを再生するGlucose-6-Phosphate Dehydrogenaseとともに固定化することに成功し、合成に容易に利用することを可能にした。特にセラミック担体にアルデヒド基とPolyethylenimineを付加した担体(Toyonite-200AGA-PEI)を用いた固定化法により、pH安定性と熱安定性が向上した。この固定化酵素の高圧CO_2条件下での安定性を評価したところ、圧力に対して非常に高い安定性を示し、臨界点7.3MPa以上の条件下では、固定化していない酵素と比較して酵素の安定性が著しく向上しており、超臨界CO_2中での酵素利用への可能性を高めることができた。