hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口蓋扁桃は抗原特異的免疫応答の誘導部位さらに実効部位として機能しているか?-純系ミニブタモデルを用いた実験的検討-

ヒト口蓋扁桃が抗原特異的免疫応答の誘導部位さらには実効部位として機能しているかどうかについて、純系マウスやミニブタを用いた動物実験やヒトロ蓋扁桃リンパ球を受動移入したNOD-scidマウスでの免疫実験系を用いて、詳細な検討を加えた。(1)系統発生の点からみると、マウスには鼻咽頭管外側に前後に伸びるリンパ球集簇が存在し、ミニブタでは軟口蓋正中縫線の両側に扁桃組織が存在した。ヒトWaldeyer扁桃輪に相当すると考えられるこれらのマウスならびにミニブタ扁桃組織の形態学的特徴として、ヒトロ蓋扁桃組織と同様に、陰窩を有し、扁平上皮(ミニブタ)もしくは繊毛上皮(マウス)で被われ、実質内にリンパ瀘胞さらに胚中心が存在した。さらに免疫組織化学的検討より、瀘胞内外でのB細胞(IgM,IgG,IgA-陽性細胞)領域や瀘胞間のT細胞領域が存在していた。種々の系統のマウスを用いた検討では、いわゆるNasopharyngeal lymphoreticular tissue(NALT)が粘膜免疫の誘導部位として機能し、鼻咽腔粘膜が実効組織として機能していることが示された。さらにヒトロ蓋扁桃リンパ球を受動移入したNOD-scidマウスを用いた鼻局所感作の実験より、ヒトロ蓋扁桃に存在するBリンパ球やTリンパ球が共通粘膜免疫系の実効組織にホーミングし、抗原特異的免疫応答を誘導しうることが示唆された。すなわちヒトロ蓋扁桃が粘膜免疫応答の誘導部位になっていることがin vivoにおいて証明された。現在、外界からの免疫学的修飾の加わっていないSPF飼育の純系ミニブタを実験に用いて、経口免疫さらには扁桃組織に直接抗原刺激を加えた場合の、全身ならびに鼻咽喉粘膜での免疫応答につき、さらに検討を重ねている状況である。ミニブタの扁桃組織に関して解剖学的特徴を観察し、ヒトやゲッシ類の扁桃組織との比較検討を行った。その結果、ミニブタの鼻咽腔隣接リンパ装置(nasopharyngeal lymphoreticular tissue,NALT)は、軟口蓋正中縫線の両側に対で位置し、その肉眼的特徴は、表面に小さな陰窩様の小孔を有する赤色調の軟部組織であり、周囲の組織との境界も明瞭であった。組織学的には、扁平上皮を有しヒトと同様に陰窩が存在し、リンパ濾胞さらにgerminal centerが認められた。さらにブタ免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色を行ったところ、リンパ濾胞の周辺部を中心としてB細胞領域が存在した。現在、T細胞領域について検討を加えるため、ブタのT細胞に対するモノクローナル抗体を作成中である。ヒトの口蓋扁桃に類似した扁桃組織を有するミニブタを実験動物に用いて、上気道粘膜での免疫応答成立における扁桃の役割について検討した。そのため、まずミニブタ扁桃組織の組織学的構造を検討したが、ヒト口蓋扁桃と同様に、陰窩を有し、扁平上皮で被覆され、実質内にリンパ濾胞さらに胚中心が存在することが示された。さらにブタ免疫グロブリンに対する抗体を用いて扁桃リンパ球のB細胞サブセットについて検討した結果、B細胞サブセットが存在することがわかった。一方ミニブタT細胞に対するモノクローナル抗体の作製を試みているが、いまだにT細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が得られていない。次に、純系のミニブタを用いた検討により、扁桃リン球の受動移入実験が可能であるかどうか、さらに受動移入した扁桃リンパ球が鼻咽喉粘膜をはじめとした上気道の粘膜や扁桃組織にホ-ミング(帰趨)するかどうかについて検討した。

その結果、受動移入は可能であり、上気道粘膜に抗原刺激によりホ-ミングしうることがわかった。現在、抗原特異的な粘膜免疫応答における免疫相当細胞の動員について検討している。ヒトの口蓋扁桃に類似した扁桃組織を有するミニブタを実験動物に用いて、上気道粘膜での免疫応答の成立における扁桃の役割について検討した。ミニブタ扁挑の組織学的検討では、光学顕微鏡レベルならびに電子顕微鏡レベルの観察により、軟口蓋正中縫線の左右に存在するミニブタ扁桃組織が、ヒト口蓋扁桃を同様に、陰窩を有し、扁平上皮で被覆され、実質内にリンパ瀘胞さらに胚中心が存在することが示された。さらにブタ免疫グロブリンに対する抗体を用いて扁桃リンパ球のB細胞サブセットについて検討した結果、B細胞サブセットが存在することが示唆された。さらに純系のミニブタを用いた検討より、扁桃リンパ球の移入実験が可能かどうか、さらに受動移入した扁桃リンパ球の末梢粘膜組織へのホーミングについて検討し、受動移入は可能であり、ホーミングしうることもわかった。しかしながら、ミニブタT細胞に対するモノクローナル抗体の作製については、T細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を未だ確立していないため、T細胞の観点からみた検討には至っていない。
CFRPの面内非一様燃え拡がり挙動モデリング：汎用三次元燃え拡がりモデルへの展開

炭素繊維強化プラスチック(CFRP)は繊維配合方向に熱的異方性を有するため,均一な高分子材料を想定し,かつ面内の熱輸送は等方的に行われると仮定する従来の燃え拡がりモデルでは,CFRPの燃え拡がり挙動を予測することはできない.そこで,本研究では,炭素繊維配合方向の異なるCFRPを成形し,それらの燃え拡がり試験を行うことによって,熱的異方性が燃え拡がり挙動に及ぼす影響を明らかにする.そして,その影響を物理モデルとして定式化し,従来の燃え拡がりモデルに組み込むことにより,材料に依らない汎用な燃え拡がりモデルの構築を目指す.炭素繊維強化プラスチック(CFRP)は繊維配合方向に熱的異方性を有するため,均一な高分子材料を想定し,かつ面内の熱輸送は等方的に行われると仮定する従来の燃え拡がりモデルでは,CFRPの燃え拡がり挙動を予測することはできない.そこで,本研究では,炭素繊維配合方向の異なるCFRPを成形し,それらの燃え拡がり試験を行うことによって,熱的異方性が燃え拡がり挙動に及ぼす影響を明らかにする.そして,その影響を物理モデルとして定式化し,従来の燃え拡がりモデルに組み込むことにより,材料に依らない汎用な燃え拡がりモデルの構築を目指す.
老化と補綴装置の機能状態との関連の調査

口腔の機能状況の良否は、口腔、顔面の運動の様相からも推測できるものと思われる。そこで、高速VTRシステムを用いて咀嚼時の切歯点と皮膚上の標点の運動様式を解析した。また、咀嚼機能の変化を評価するために各処置段階における発色チューイングガムと口腔運動経路を比較した。被検者に義歯装着状態で発色チューイングガム1.5gを自由に咀嚼させ、50ストローク毎の顔面正面と側貌を2台のテレビカメラで高速ビデオ(HSV-500、nac社製)に記録した。咀嚼後のガムの厚さを3mmにプレスし、今回科学研究費補助金で購入した色彩色差計(CR-300 MINORTA社製)で標準白色板上で測定し、CIE L^*a^*b^*表色系におけるa^*値を測定した。さらに続けて同一ガムを咀嚼させ、50ストローク毎に色を測定しながら計300ストロークの運動を記録した。記録したビデオテープを画像解析装置によりオートトラッキングして自動解析し、各標点の三次元座標を求めコンピュータに転送して立体構築した。その結果、義歯装着時には各段階でa^*値が大きくなり、咀嚼の進行に従い均等な咀嚼が行えている。切歯点では咀嚼の後半には左右方向への運動がリズミカルになる。モダイオラスでは上下的運動は切歯点とほぼ同調しているが、水平的運動は独自のパターンとなるものと思われた。TH、すなわち進行方向に対する立体的な方向変更角度は、一般的に咀嚼の進行に従って減少し、運動がスムーズになっていることが示唆された。
低環境負荷微生物農薬利用への昆虫病原性糸状菌代謝メカニズムのプロテオミクス研究

昆虫病原性糸状菌Nomuraea rileyiのC14スフィンゴシン存在下での発芽誘導機序の解明をプロテアーゼ解析手法を用いて試みた.スフィンゴシンで誘導発芽させた胞子について,二次元電気泳動により特異的なタンパク質を21個検出した.これらのタンパク質に対し質量分析を用いタンパク質の同定を試みた.その結果,15スポットについてタンパク質を同定した.また,機能未知であった6スポットはさらに相同性検索により機能性タンパク質の推定を行った.その結果,代謝関連酵素群および生体防御に関与するタンパク質群が同定され,発芽促進に際してこれらのタンパク質発現が亢進していることが明らかとなった.糸状菌Nomuraearileyiは生物農薬としての利用が期待されているが,その利用に不可欠な発芽促進はスフィンゴシンによって誘導されることが明らかとなっている.そこで本研究ではN.rileyi胞子の発芽促進機序の解明をプロテアーゼ解析手法を用いて試みた.まず,スフィンゴシン誘導型発芽胞子と通常発芽胞子の二次元電気泳動像をディファレンシャルディスプレイにより比較した結果,誘導発芽で特異的なタンパク質を21個検出した.そこで,スフィンゴシン誘導型発芽胞子の泳動像に観察された特異的発現スポット2個と特異的増加スポット19個に対し質量分析を用いタンパク質の同定を試みた.本糸状菌はゲノム未知であるため,通常のプロテオーム解析手法によるタンパク質同定は困難であった.そこで,タンパク質の同定はESI質量分析とMALDI質量分析によるデノボシークエンス手法を用い,特に,MALDI質量分析行う際には,本研究室で開発した前処理としてグアニジン化とスルホン化を組み合わせた二段階化学修飾を行った.同定されたタンパク質は,大きく分けて機能によって,代謝促進,タンパク質発現,およびタンパク質の保護に分類された.したがって,これらのタンパク質がスフィンゴシン誘導型発芽において複合的に作用し,発芽促進を引き起こしていると考えられた.特に,スフィンゴシン誘導において特異的に発現したPermeaseはMALDI質量分析によるデノボシークエンス手法において精度よく同定が確定し,その性質が生体膜において二次能動輸送に関与する膜輸送体であり,スフィンゴシンレセプターからのシグナル伝達に対して,何らかの輸送に関わることで発芽促進と関連していると推測された.本年度同定された他のタンパク質群においても糸状菌の発芽において,促進シグナルの伝達において何らかの関与があると推定される.昆虫病原性糸状菌Nomuraea rileyiのC14スフィンゴシン存在下での発芽誘導機序の解明をプロテアーゼ解析手法を用いて試みた.スフィンゴシンで誘導発芽させた胞子について,二次元電気泳動により特異的なタンパク質を21個検出した.これらのタンパク質に対し質量分析を用いタンパク質の同定を試みた.その結果,15スポットについてタンパク質を同定した.また,機能未知であった6スポットはさらに相同性検索により機能性タンパク質の推定を行った.その結果,代謝関連酵素群および生体防御に関与するタンパク質群が同定され,発芽促進に際してこれらのタンパク質発現が亢進していることが明らかとなった.昆虫病原性糸状菌Nomuraearileyiは鱗翅目昆虫の害虫管理法として期待されている.本菌胞子は寄主昆虫表皮抽出物を添加すると発芽促進することから,発芽促進因子はすでにD-erythro-C14-Sphingosine (スフィンゴシン)により発芽が促進されることを明らかにしている.そこで,本菌の発芽メカニズムを明らかにする目的で,二次元電気泳動を用いたディファレンシャルディスプレイを行い,観察された特異的スポットに対し解析を行った.タンパク質の抽出はフェノール法を用い,得られたタンパク質を2次元電気泳動に供した.その結果,それぞれ約600個のタンパク質スポットが得られた.発芽菌糸とスフィンゴシン誘導発芽菌糸の泳動像を比較した結果,スフィンゴシン誘導発芽菌糸の泳動像に21個の特異的スポットが観察された.すなわち,これらのタンパク質が,スフィンゴシン誘導発芽に特異的に関与していると推定された.そこで,スフィンゴシン誘導で特異的に発現するタンパク質について解析を行った.すなわち,これらのスポットについてトリプシンを用いてインゲル消化を行った.得られた消化物はZip-Tip処理後,ナノスプレーでQ-TOF (Quadrupole-Time Of Flight)型質量分析機を用い解析を行った.得られた二価または三価イオンに対しPMF (Peptide Mass fingerprint)解析を行った.その結果,主に微生物由来のタンパク質が同定され,これらのタンパク質がスフィンゴシン誘導発芽菌糸に特異的に発現していることが明らかとなった.また,MS/MS解析を行い,得られた配列に対しBLAST解析を行った.その結果,微生物由来のPermeaseなどが同定された.しかし,ほとんどのタンパク質が機能未知であったため,今後さらに詳しく構造解析を行う予定である.昆虫病原性糸状菌Nomuraearileyiは生物農薬としての利用が期待されているが,その利用に際して種々の制限があるため,利用普及に至っていない.主な問題点は,糸状菌の発芽に時間がかかり,湿度や日照条件で発芽率が上がらないである.これに対し申請者らはスフィンゴシンによって本菌の発芽が誘導されることを明らかにしている.本研究ではN.rileyi胞子の発芽促進機序の解明をプロテアーゼ解析手法を用いて試みた.スフィンゴシンで誘導発芽させた胞子と通常発芽胞子について,疎水性タンパク質も含めて抽出可能なフェノール法を用いて抽出を行い,二次元電気泳動により比較を行った.その結果,誘導発芽で特異的なタンパク質を21個検出した.

そこで,特異的な発現スポットおよび顕著に増加したスポットに対し質量分析を用いタンパク質の同定を試みた.本菌はゲノム未知であるため,通常のプロテオーム解析手法によるPMF法でのタンパク質同定は困難であり,21スポット中,PMF解析で同定できたタンパク質は2種であった.そこで,本研究室で開発したグアニジン化とスルホン化の二段階化学修飾ペプチドに対するMALDI質量分析によるデノボシークエンス手法(MS/MS)を用い解析を行った.その結果,20スポットについてタンパク質を同定した.また1スポットは機能未知タンパク質であったため,さらに相同性検索により機能性タンパク質の推定を行った.以上の結果,代謝関連酵素群および生体防御に関与するタンパク質群が同定され,発芽促進に際してこれらのタンパク質発現が亢進していることが明らかとなった.一方,発芽促進活性を示さない糸状菌beauveria bassianaに関して,同様の発芽検体について二次元電気泳動により比較を行ったが,Nomuraea rileyiとタンパク質組成が大きく異なり,特異的レセプターの検出には至らなかった.本研究で明らかとなった糸状菌発芽促進関連タンパク質については,現在論文投稿準備中である.タンパク質化学本菌はゲノム未知の菌種であるため,最初に通常のプロテオーム解析手法であるペプチドマスフィンガープリント法を適用したが,設定した21個のタンパク質スポットで,有意な同定はほとんど不可能であった.したがって,データベースとのパターンマッチングによる手法ではなく,質量分析によるアミノ酸配列を推定できるデノボシークエンス法についてエレクトロスプレー型質量分析器での解析を試みた.この手法はある程度のアミノ酸配列を推定できたが,データベースが存在しない場合は信頼性に欠ける.したがって,本研究室で開発した2段階化学修飾を用いたマトリクス支援レーザー型質量分析機を用いたデノボシークエンス法により,正確なアミノ酸配列を決定し,その配列を元にBLAST検索によるタンパク質の同定を進めた.その結果,配列相同性からタンパク質の特定が可能となったが,その大半は機能未知のタンパク質であった.したがって,スポットに含まれるタンパク質の機能推定は,同定したタンパク質のアミノ酸配列をさらにBLAST検索することで相同性の高い機能タンパク質を検索した.その結果,ほぼすべての特異的スポットについて機能を推定することができ,ほぼ同定は達成できたと考えられる.しかし,予定していた他の昆虫病原性糸状菌とのプロテオーム比較ならびに発芽促進物質に対するレセプタータンパク質の同定は,菌の培養が遅延したため,次年度にタンパク質の抽出を実施し,今後スポットの増減と機能との相関について検証を進める予定である.糸状菌は極めて固い胞子を形成し,また菌糸もタンパク質含有量が低い.
植物の動的防御機構に関する生物有機化学的研究

植物が病原菌の感染時に新たに生合成する抗菌活性物質であるフィトアレキシン(PA)について,イネを材料として研究を行った.その結果,従来は知られていなかった新たなPAとしてジテルペン化合物であるent-10-oxodepressinを発見した.また,既知のPAの関連化合物として新規化合物を一つ発見した.さらに,イネの重要病原菌であるいもち病菌によるPAの分解・解毒経路についての研究も行った.植物が病原菌の感染時に新たに生合成する抗菌活性物質であるフィトアレキシン(PA)について,イネを材料として研究を行った.その結果,従来は知られていなかった新たなPAとしてジテルペン化合物であるent-10-oxodepressinを発見した.また,既知のPAの関連化合物として新規化合物を一つ発見した.さらに,イネの重要病原菌であるいもち病菌によるPAの分解・解毒経路についての研究も行った.これまでの研究で,イネフィトアレキシンの未知の生合成中間や代謝産物,または未知のフィトアレキシンの探索を行い,紫外線照射イネ葉中から分手量300と推定される化合物(PA-300)を見いだしていたが,その構造は明らかになっていなかった.本年度の研究では,PA-300の構造解析を目的として,紫外線照射イネ葉片400gから,各種クロマトグラフィーによってPA-300を2.1mg単離した.PA-300の分子式は高分解能質量分析によって,C_<20>H_<28>O_2と推定された.各種NMRスペクトルを用いて,その平面構造を推定したところ,イネが生合成するジテルペン化合物として既に知られているものとは異なるcasbane骨格を有していた.その構造をもとに文献を精査したところ,軟質サンゴSinularia depressaの産生するテルペノイド10-hydroxydepressinの酸化物として既に報告されている10-oxodepressin(1)とPA-300の^1Hおよび^<13>C NMRスペクトルが一致した.さらに,旋光度を測定した結果,PA-300の比旋光度の符号は化合物1のものとは異なり,PA-300は化合物1のエナンチオマーであるent-10-oxodepressinであることが明らかとなった.Casbane骨格を有するジテルペン化合物の報告は天然では比較的稀であり,トウダイグサ科の植物およびSinularia属の軟質サンゴからの報告例しか知られていない.イネは構造的に多様なフィトアレキシンを生産することが知られているが,今まで報告されているジテルペン系フィトアレキシンはすべてent-またはsyn-コパリル二リン酸を経由して生合成される三環性ジテルペンであり,ent-10-oxodepressinは新たなイネの二次代謝産物として非常に興味深いものである.22年度の研究で紫外線照射イネ葉中から発見した新規ストレス誘導性化合物であるent-10-oxodepressin (1)について,イネいもち病菌胞子発芽阻害活性を調べた結果,化合物1は胞子発芽阻害活性を示し,IC_50は31 ppmであった.いもち病菌を接種したイネ葉中の化合物1の蓄積量を測定したところ,化合物1はいもち病菌接種後96から120時間で約6μg/gF.W.の蓄積量を示した.この蓄積量はモミラクトンAやサクラネチンと比較すると少なかったが,オリザレキシンAおよびCと同程度であった.また,フィトアレキシンの蕃積を誘導することが知られているエリシターである塩化銅(II)およびジャスモン酸によっても化合物1の蓄積が誘導されることを確認した.以上の結果から,化合物1はイネの16番目の新規フィトアレキシンであることが明らかとなった.化合物1はイネの既知フィトアレキシンとは基本炭素骨格が異なっており,この結果はイネの二次代謝産物生合成および病害抵抗性機構の研究において大変興味深い発見である.モミラクトンBのイネいもち病菌による代謝についての研究を行った結果,すでに知られているモミラクトンAと同様に変換されて,3β,20-epoxy-3α-hydroxy-6-oxo-19-nor-9β-pimara-7,15-dieneへと代謝されることを明らかにした.また,モミラクトンAの代謝産物である3,6-dioxo-19-nor9β-pimara-7,15-dieneがいもち病菌によってさらにどのような化合物に変換されるかについても検討したところ,分子量が304と推定される代謝産物を確認した.この化合物についてはまだ単離に至っていない.紫外線照射イネ葉片400 gから各種クロマトグラフィーを用いて新規ストレス誘導性化合物1.9 mgを単離した.質量分析やNMRスペクトルなどによって構造解析を行った結果,この物質の構造を1α,2α-dihydroxy-ent-12,15-cassadiene-3,11-dione (1)であると決定した.化合物1はすでにイネのフィトアレキシンとして知られているファイトカサン類の類縁化合物であったが,未だ報告されていない新規化合物である.化合物1もイネのフィトアレキシンの一種としてはたらいていることを想定して,イネいもち病菌に対する抗菌活性を測定したが,予想に反して全く抗菌活性を示さなかった.

したがって,1はイネのフィトアレキシンではなく,ファイトカサン類の活性のない代謝産物であると考えられる.イネいもち病菌によるモミラクトンAの代謝産物として,すでに3,6-dioxo-19-nor-9β-pimara-7,15-diene (2)を同定しているが,2はモミラクトンAと同程度の抗菌活性を有し,蓄積後速やかに減少することが明らかになっているため,いもち病菌によるモミラクトンAの解毒代謝の中間体であると考えられている.今年度は2のいもち病菌による代謝産物の単離・同定を目指して実験を行った.化合物2(10 mg)をいもち病菌培養液に添加して8時間培養し,その培養液および菌体から2.2 mgの代謝産物と想定される化合物を各種クロマトグラフィーによって単離した.化合物2はポジティブESI-MSによりプロトン付加分子と推定されるm/z 321のイオンを示し,分子量は320であると推定している.現在,NMRスペクトルなどによって,この物質の構造解析を進めているところである.新規のイネフィトアレキシンを発見したことは大きな研究成果であり,いもち病菌によるフィトアレキシンの代謝についても一定の進展があった.しかし,サクラネチンのいもち病菌による代謝については当初の計画通りには進まなかったため,総合的には(2)の評価とした.24年度が最終年度であるため、記入しない。紫外線照射イネ葉中の新たなストレス誘導性化合物とフィトアレキシンのいもち病菌による代謝産物のどちらについても,すでにLC/MSのピークとしては有力な候補物質を見つけているため,これらの単離・構造解析を目指す.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ＨＳＰ９０阻害剤を用いたＫＲａｓ変異型非小細胞肺癌に対する新規分子標的療法の開発

HSP90は悪性腫瘍に恒常的に発現され、癌化にかかわる多くのタンパク質と相互作用することから悪性腫瘍に対する新規治療のターゲットとして注目されている。新規HSP90阻害剤:AUY922はKRas依存型肺腺癌に対しapoptosis誘導による抗腫瘍効果を誘導した。また当該阻害剤は、EGFR変異型肺腺癌や、EML4-ALK発現型肺腺癌に細胞死を誘導した。AUY922はKRas変異型肺腺癌を含む非小細胞肺癌に対し有効な治療法となる可能性が示された。非小細胞肺癌、特に腺癌に対する分子標的治療研究が進み、EGFR-TK変異型肺癌に対するgefitinibやelrotinibさらにALKfusion遺伝子、ROS1 fusion遺伝子発現肺癌などへのcrizotinibの有効性が報告されてきている。一方喫煙との関連が報告されているKRas変異型非小細胞肺癌は、前2者とは排他的関係にあり、その治療法は未だ確立されていない。2009年Sosらは遺伝子背景の異なる肺癌細胞株を用いた検討よりKRas変異型非小細胞肺癌に多く特定HSP阻害剤が高い感受性を示すことを報告している(Sos M et al. J Clin Invest. 119:1727-40. 2009)。HSP90阻害薬は癌における多数のシグナル伝達経路を阻害し、細胞周期、細胞分裂、apoptosis、ストレス耐性などに関わる複数のクライアント蛋白を同時に阻害し、癌の増殖を抑制する。我々は、Ras変異型肺腺癌に対する新しい治療法開発を目的とし、新規HSP90阻害薬AUY922の抗腫瘍効果を検討した。当該阻害剤は、Ras変異型肺腺癌株: H358、H441における細胞増殖を抑制し、細胞死を誘導した。一方でRas変異型肺腺癌株A549に対する増殖抑制効果は微弱であった。細胞死を解析するためにImmunoblot法を行ったところ、AUY922はH358細胞においてcaspase3の活性化を誘導したのに対し、A549およびヒト正常肺線維芽細胞株ではcleaveageは認められなかった。以上より、AUY922は一部の肺癌株に細胞死を誘導しその機序はcaspaseを介したapoptosisであることが示された。肺腺癌に対する分子標的治療研究が進み、EGFR-TK変異型肺癌に対するelrotinib、EML-4ALK発現型肺癌へのcrizotinibの有効性が明らかとなった。また次世代シーケンサーの台頭によりさらに多くのdriver oncogeneが報告され、新しい肺癌標的療法が樹立されてきている。一方でRas変異型肺腺癌に対する有効な標的療法は確立されておらず、未だundrugable targetと言われている。当該阻害剤は、Ras変異型でRas依存型である肺腺癌株: H358、H441における細胞増殖を抑制し、細胞死を誘導した。一方でRas変異型ながらRas非依存型である肺腺癌株A549に対する増殖抑制効果は微弱であった。さらにKRas野生型であるH322株は本薬剤に対して抵抗性であった。さらに他のdriver変異を持つ肺癌に対する抗腫瘍性を解析するために、EGFR変異型肺腺癌株H1690、H1975およびEML4-ALK肺腺癌株H2220を用いた検討を行ったところこれらのすべての株は、AUY922に対してsensitiveであった。以上より新規HDAC阻害剤:AUY922は、Ras依存性のRas変異型肺腺癌株に対して、さらに他のdriver変異を持つ肺癌に対しても抗腫瘍性を示す可能性があることが示唆された。非小細胞肺癌、特に腺癌に対する分子標的治療研究が進み、EGFR-TK変異型肺癌に対するgefitinibやelrotinibさらにEML-4ALK発現型肺癌へのcrizotinibの有効性が報告されてきている。一方喫煙との関連が報告されているKRas変異型非小細胞肺癌は、前2者とは排他的関係にありKRas変異型非小細胞肺癌に対する治療法が未だ確立されない中、2009年Sosらは遺伝子背景の異なる肺癌細胞株を用いた検討よりKRas変異型非小細胞肺癌に多く特定HSP阻害剤が高い感受性を示すことを報告している(Sos M et al. J Clin Invest. 119:1727-40. 2009)。

我々は非小細胞肺癌に対する新しい治療法開発を目的とし、新規HSP90阻害薬AUY922のRas変異型肺癌を含む非小細胞肺癌株への抗腫瘍効果を検討した。Cellviability assayの結果より当該阻害剤は、Ras変異型肺腺癌株: H358、H441に対し細胞増殖抑制効果を示し、A549株に対して増殖抑制効果は低値であった。Hoechst染色による解析にて、AUY922は前2者に対し、クロマチン凝集を伴うapoptosisを誘導したが、後者ではこの変化は認められなかった。3種のRas変異型株においてH358、H441はRas依存性、A549細胞はRas非依存性であることが報告されており(Singh A etal. CancerCell 15: 489-500,2009)、AUY922は前者に対し抗腫瘍性を示す可能性が示唆された。平成24年度まで研究計画である、AUY922の作用機序の検討に関し、一部の肺腺癌、正常細胞における下流シグナルの解析を終了している。現在細胞種を増やしEGFR-TK変異型およびEML4-ALK発現型肺癌での抗腫瘍性の検討を進めており解析終了までに暫くの期間を要する見込みである。初年度の研究計画として、in vitroの研究を中心とし、遺伝子背景の異なる肺癌細胞におけるHSP90阻害剤の抗腫瘍性の検討と作用機序の解析を予定していたが、現在後者の検討を継続して行っており、解析終了までに暫くの期間を要する見込みである。AUY922の作用機序の解析を終了後、細胞株を選定し、in vivoでの制癌効果の解析ならびに正常組織障害の評価さらに他種抗癌剤・分子標的薬剤と併用効果の検討を行う。平成23年度研究計画におけるHSP90阻害剤の作用機序の解析を終了後、当初の予定通りin vivoでの制癌効果の解析ならびに正常組織障害の評価を行う。研究計画最終年度において、他種抗癌剤・分子標的薬剤と併用効果の検討をin vitro, in vivo双方で行う。次年度使用額は、25年度請求額とあわせ、AUY922のin vivoでの抗腫瘍効果の解析および他種薬剤と併用効果の検討に必要な細胞・分子生物試薬費、実験動物購入費を使用する。研究計画の遅れから、次年度使用予定助成金が生じている。次年度使用額は、24年度請求額とあわせ、現在取り組んでいる、HSP90阻害剤の作用機序解析に必要な細胞・分子生物試薬費また、当初の研究計画にあるin vivoでの抗腫瘍効果の解析、正常組織障害の評価に必要な細胞・分子生物試薬費、実験動物購入費を使用する。研究計画の遅れから、肺癌細胞におけるHSP90阻害剤の作用機序の解析を現在行っており、次年度使用予定助成金が生じている。
無動力で風追従する新しい係留方式を用いた浮体式洋上風力発電に係る研究

昨年度は風や流れの中で一点係留式浮体式風車の挙動を実験的に明らかにした。これを受け本年度は風・波・流れの中での振れ回り挙動を解析できる時系列解析プログラムを構築した。係留索、係留用ブイ、浮体式風車の挙動を連成させる時系列解析プログラムである。風車に生じる風荷重は送風装置を用いて計測を行い、データベース化およびモデル化を行っている。送風試験の結果、鉛直軸周りのモーメントが正面向かい風であっても生じていることが明らかになった。また、係留ブイと浮体式風車を接続する際にベアリング等が必要となるが、これによる反力モーメントも本時系列解析プログラムは考慮されている。時系列解析プログラムはRunge-Kutta-Gill法によって解かれる。昨年度取得した風および流れが共存する場における1/200スケールモデル実験との検証を行った。検証においてSpar型およびSemi-Submersible型の一点係留式浮体式風車モデルを用いた。最初に風だけの試験の時、数値計算の方が少し回頭に要する時間が短くなっていることを確認したが定性的には良い一致を示した。風・流れが共存する場においても定量的、定性的に概ね良い一致を示すことが分かった。特に、Semi-Submersible型の時、流れの速い条件下では、流れに追従してしまうことが実験的に明らかになったが、数値計算においてもそれを確認した。但し、Spar型では流れと風が相対する方向の際には、不安定挙動を実験的に明らかにしたが、本解析法ではその現象の原因については十分に明らかにすることができなかった。本年度は、アドバンストスパーと呼ばれ、近年浮体式洋上風車の分野で用いられるようになった特殊形状浮体の波力推定手法の確立および流体力学的なメカニズムの解明を行った。中でも波浪による浮体表面波圧計測に着目した。特殊形状浮体に圧力計を多数埋め込み、Radiation圧力、Diffraction圧力の直接計測を行った。計測結果はMorison式、ポテンシャル理論により得られる圧力場との比較検証を行った。円筒に作用する波力はChakrabarti(1980)によって詳細な実験が行われている。Chakrabartiによってまとめられた質量力係数をもとに実験データと比較した。しかし、実験を行った波条件の全ての周波数帯で過大評価となった。そこで、計測した圧力場と波ポテンシャルによって得られる波圧とを比較した。波ポテンシャルによって算出した入射波との位相差と実験によって得られた位相差に大きな違いが生じていることが明らかになった。本年度はさらに新しい一点係留型浮体式風車を研究開発した。係留部と浮体部が着脱可能な機構になっており、着脱試験を水槽で実施した。また、風のみならず波が回頭現象にどのような影響を与えるかの基礎データを取得した。実験的にではあるが、波と風が共存する方が風追従がよくなることが分かった。本年度さらに実施した項目として、ピッチコントロール可能な模型風車を浮体に載せて浮体と風車の連成挙動を確認するべく基礎的実験を行った。浮体に載せて風および波浪中の実験を行った結果、風車の回転と浮体動揺との連成により長周期動揺が励起され、不安定な挙動を示すことが明らかになった。申請書の予定通り、アドバンストスパーと呼ばれ、近年浮体式洋上風車の分野で用いられるようになった特殊形状浮体の波力推定手法の確立および流体力学的なメカニズムの解明を行った。圧力場を計測可能な浮体式風車の浮体を製作して圧力場を詳細に計測できた。これまで浮体に作用する波浪荷重を計測する先行研究例は多数あるが、圧力場まで詳細に検討した事例はない。その意味で本研究は有意義なものであると考える。理論計算との差がまだ見受けられるが、比較検証を実施できた。本年度は風や流れの中で一点係留式浮体式風車がどのような挙動を示すのかに焦点を当て研究を実施した。海流という流れ場を再現する為に実験は回流水槽を用い、そこに送風機を設置して風・流れ共存場の海象を模擬し試験を実施した。浮体式風車の浮体模型は2種類用いた。一つ目はSPAR式である。もう一つはセミサブ式である。この2種類の浮体式風車モデルを緊張係留されたブイに係留した一点係留方式浮体式風車モデルを本実験では用いた。SPAR式モデルは浮体側の係留点とブイの係留点との距離による挙動の違いを調べるために2種類(SPAR-short型、SPAR-long型)を用意した。実験における風の条件は、風車が定格で発電している際の風条件を模擬している。また、流れの条件は実海域で3knot程度を模擬したものである。風と流れは正対している条件下での実験を行った。風だけの条件であるとき、セミサブ型は回頭時間が非常に長くなることが分かった。3種の模型で比較すると、実機換算にして、SPAR-longモデルは2分35秒の正対時間を、SPAR-shortモデルは1分38秒の正対時間を、セミサブモデルは6分35秒の正対時間を要することが分かった。これは風車がアップウインドの状態から風圧のみでダウンウィンドになるために必要な時間である。風と流れの共存場における実験では、セミサブは流れの影響を大きく受けることがあり、流れに追従しやすいという結果を得た。

風車を支持する浮体を出来るだけコンパクトにし、流れの影響を受けにくい浮体構造にすることが求められる。SPAR-shortは流れと風の共存場において長周期のふれ回り不安定挙動が生じることが分かった。この現象は浮体式風車の構造に与える影響がとても大きいと予想される。しかし、SPAR-longは同条件であってもこのような現象は確認されなかった。すなわちSPAR-long型によりこの長周期不安定挙動を解消することができることが分かった。海域の条件に合わせてSPAR-short、SPAR-long、セミサブ型を選択することが望ましい。一点係留方式を採用した浮体式洋上風車の様々な環境因子の中での挙動を明らかにすることができた。これまでは風の中だけでの実験や実海域試験が主であった。しかし、5MW級モデル風車の1/200スケール模型という非常に小さな浮体式風車模型を開発することができた為、回流水槽の中で流れと風の影響による一点係留式浮体式風車の挙動を詳細に把握できたことは大きな成果である。さらに、SPAR-short、SPAR-long、セミサブといったいくつかの模型による違いを系統的に把握できたことも大きな成果である。シミュレーションベースによる研究は他機間でも少しずつ成果が報告されてきているものの、我々のように流れと風の共存場で精巧な実験模型を通しての実験結果は報告されてきていない。一点係留式浮体式風車の大きな懸念材料は海流という流れの中での挙動である。その影響について詳細に調査した研究成果が挙げられたと考えている。SPAR-shortの浮体式風車は風と流れの正対する条件下で不安定な長周期動揺が観察された。このような現象が継続して起きると風車に大きな構造的負担を強いることになる。この改善策として考えたSPAR-longは、その点このような不安定な長周期動揺が観察されないことが分かった。流れと風の中での時系列シミュレーションプログラムを構築しこの物理的メカニズムについても考察することができた。一方、セミサブ型は流れの影響を大きく受け、風に追従できないことがあることが分かったことも本年度の成果として挙げられる。浮体のコンパクト化を図り、流れの影響を受けにくくすることが、一点係留方式のセミサブ型浮体式風車には強く求められることが分かった。以上述べたように、一点係留式浮体式風車について、これまで明らかにされてこなかった風と流れの中での挙動を本年度は初めて明らかにすることが出来た。研究の進捗としては順調に進展していると考えている。昨年度は風や流れの中で一点係留式浮体式風車の挙動を実験的に明らかにした。これを受け本年度は風・波・流れの中での振れ回り挙動を解析できる時系列解析プログラムを構築した。係留索、係留用ブイ、浮体式風車の挙動を連成させる時系列解析プログラムである。風車に生じる風荷重は送風装置を用いて計測を行い、データベース化およびモデル化を行っている。送風試験の結果、鉛直軸周りのモーメントが正面向かい風であっても生じていることが明らかになった。また、係留ブイと浮体式風車を接続する際にベアリング等が必要となるが、これによる反力モーメントも本時系列解析プログラムは考慮されている。時系列解析プログラムはRunge-Kutta-Gill法によって解かれる。
口腔扁平苔癬の発症および病態形成の分子機構におけるT細胞マイクロキメリズムの関与

本研究の目的は、T細胞マイクロキメリズムによって移植片対宿主反応(GVHR)が引き起こされ、その結果口腔扁平苔癬(OLP)とシェーグレン症候群(SS)の両疾患の発症が惹起されるという仮説を証明することである。1.男児出産歴のあるOLP患者の頬粘膜生検組織からゲノムDNAを抽出し、リアルタイムPCR法を用いてY染色体特異的配列を増幅検出した。結果、27例のうち6例(22.2%)でY染色体特異的配列が検出された。2. 1でY染色体特異的配列を増幅検出し得た6例において、FISH法を用いたT細胞マイクロキメリズムの検出を行った。この男児の出産歴があるOLP患者3例の病変部の凍結切片において、FISH法を用いてY染色体陽性細胞の存在が同定できた。しかし、FISH法と免疫組織化学染色の二重染色を用いたY染色体陽性T細胞の同定を進めているが、現在のところその同定が確認された。3.研究に対して同意が得られれば、患者本人とご子息(男女問わず)のHLAタイピングを行い、OLP患者のHLA遺伝子解析を行うことで、子供の性別を問わずに、胎児由来の細胞の移入があるかどうかを検討する予定であった。最終的には、標的抗原が同定されることで、SSやOLP発症のメカニズムを解明できるだけでなく、有効的な治療法も開発できると考えているが、その治療法までは今回至らなかった。結果、13例のうち3例(23.1%)でY染色体特異的配列が検出された。次年度は、さらに症例を増やして検討していく。2.1でY染色体特異的配列を増幅検出し得た3例において、FISH法を用いたT細胞マイクロキメリズムの検出を行った。しかし、FISH法と免疫組織化学染色の二重染色を用いたY染色体陽性T細胞の同定を進めているが、現在のところその同定はできていない。3.研究に対して同意が得られれば、患者本人とご子息(男女問わず)のHLAタイピングを行い、OLP患者のHLA遺伝子解析を行うことで、子供の性別を問わずに、胎児由来の細胞の移入があるかどうかを検討する予定である。また、病変局所からT細胞クローンを樹立し、T細胞マイクロキメリズムを細胞レベルで証明後、その標的抗原を同定する。併せて、SSの導管上皮やOLPの粘膜上皮での標的抗原の発現を検討する。最終的には、標的抗原が同定されることで、SSやOLP発症のメカニズムを解明できるだけでなく、有効的な治療法も開発できると考えている。2. 1でY染色体特異的配列を増幅検出し得た3例において、FISH法を用いたT細胞マイクロキメリズムの検出を行った。この男児の出産歴があるOLP患者3例の病変部の凍結切片において、FISR法を用いてY染色体陽性細胞の存在が同定できた。

しかし、FISH法と免疫組織化学染色の二重染色を用いたY染色体陽性T細胞の同定を進めているが、現在のところその同定はできていない。3.研究に対して同意が得られれば、患者本人とご子息(男女問わず)のHLAタイピングを行い、OLP患者のHLA遺伝子解析を行うことで、子供の性別を問わずに、胎児由来の細胞の移入があるかどうかを検討する予定である。また、病変局所からT細胞クローンを樹立し、T細胞マイクロキメリズムを細胞レベルで証明後、その標的抗原を同定する。併せて、SSの導管上皮やOLPの粘膜上皮での標的抗原の発現を検討する。最終的には、標的抗原が同定されることで、SSやOLP発症のメカニズムを解明できるだけでなく、有効的な治療法も開発できると考えている。本研究の目的は、T細胞マイクロキメリズムによって移植片対宿主反応(GVHR)が引き起こされ、その結果口腔扁平苔癬(OLP)とシェーグレン症候群(SS)の両疾患の発症が惹起されるという仮説を証明することである。1.男児出産歴のあるOLP患者の頬粘膜生検組織からゲノムDNAを抽出し、リアルタイムPCR法を用いてY染色体特異的配列を増幅検出した。結果、13例のうち3例(23.1%)でY染色体特異的配列が検出された。次年度は、さらに症例を増やして検討していく。2. 1でY染色体特異的配列を増幅検出し得た3例において、FISH法を用いたT細胞マイクロキメリズムの検出を行った。この男児の出産歴があるOLP患者3例の病変部の凍結切片において、FISH法を用いてY染色体陽性細胞の存在が同定できた。しかし、FISH法と免疫組織化学染色の二重染色を用いたY染色体陽性T細胞の同定を進めているが、現在のところその同定が確認された。3.研究に対して同意が得られれば、患者本人とご子息(男女問わず)のHLAタイピングを行い、OLP患者のHLA遺伝子解析を行うことで、子供の性別を問わずに、胎児由来の細胞の移入があるかどうかを検討する予定であった。併せて、SSの導管上皮やOLPの粘膜上皮での標的抗原の発現を検討する予定であった。最終的には、標的抗原が同定されることで、SSやOLP発症のメカニズムを解明できるだけでなく、有効的な治療法も開発できると考えているが、その治療法までは今回至らなかった。
サハリンの白亜系の層序・古生物学的研究と北太平洋地域の白亜紀事変の検討

研究実績報告1.平成6年度は、サハリン州マカロフおよびシネゴルスク地域を中心に調査をおこなった。調査にあたっては、それぞれの地域で本研究の目的に合ったルート(ビクトリア川流域、スズヤ川流域)を選定し、約50日間にわたって詳細なルートマップの作成、化石の連続的な採取、古地磁気測定用試料の採取をおこなった。2.マカロフ川流域には、サントニアン階からマストリヒシアン階にわたる連続層序が確認され、下位のプイコフ層(北海道の上部蝦夷層群上部に相当する)には4つの化石群で特徴づけられる群集が認められ、上部のクラスノヤルカ層(北海道の函淵層群に相当する)には3つの化石群で特徴づけられる群集が認められた。カンパニアン階上部からマストリヒシアン階の幾つかの層準に、日本列島の白亜系で知られている特異な化石群(例えば稚内の宗谷ファウナや淡路島の和泉層群のファウナ)と同じ内容のものが確認され、今後の日本とサハリン地域の生物相の比較する上で重要な発見となった。3.マカロフ地域では白亜系と古第三系の接触関係は直接示す露頭はなかった。いることが分かり、白亜紀・第三紀境界は存在しないことが明らかとなった。また、この地域にはサントニアン階より下位の地層の分布がないことがわかった。4.古地磁気学的研究は現在進行中であるが、これまでの測定結果から、サハリン地域では白亜紀末期から古第三紀に反時計回りに、それ以降後期中新世なで連続的な時計回りの回転運動があったことがわかりつつある。研究成果の概要本研究では、戦前日本人研究者によって調査され、その後ロシア共和国の研究者によって引き続き研究されているサハリン南部の白亜系を、北海道や日本の他の白亜系との関連で調査をおこなった。1.ナイバ川流域およびアイ川流域には、アルビアン階からマストリヒチアン階にわたる連続層序が確認され、4累層を区別した。アイ層上部とナイバ層下半は、平行葉理の発達した黒色泥岩を主体とし、生痕や大型化石にきわめて乏しい。おそらく、白亜紀中期に発達した海洋無酸素事変の影響下で堆積したものと考えられる。ブイコフ層下部は、Planolitesを含む泥岩や青灰色縞状泥岩、主部は生物攪乱を強くうけた泥岩で特徴ずけられ、後者からは豊富なアンモナイト類やイノセラムス類を産する。クラスノヤルカ層は、火山岩片質の砂質層が多くはさまれ、やや砂質の泥岩で特徴づけられる。古地磁気学的研究によると、ブイコフ層上部はサントニアン層に、クラスノヤルカ層最下部はカンパニアン階に対比できる。これはアンモナイトやイノセラムス類による対比と矛盾しない。クラスノヤルカ層中には、カンパニアン階からマストリヒチアン階までの3つの化石群が認められた。このうち、カンパニアン階上部の化石群(Canadoceras multicostatum群集)は稚内の宗谷ファウナと、またマストリヒチアン階の化石群(Zelandites varuna群集)は淡路島の和泉層群のファウナと同じ内容のものが確認された。アンモナイトが産出しなくなってから古第三系に不整合で覆われるまでの間(クラスノヤルカ層最上部)には、厚さ200300mにわたって砂質泥岩が堆積している。時代対比に有効な化石は発見できなかったが、ダニアンを含む可能性もあり、古地磁気学的研究を進めている。2.シネゴルスク地域では、サントニアン階からマストリヒチアン階にわたる連続層序が確認され、ナイバ地域と同様の層序と化石群を認めた。また、クラスノヤルカ層最下部(Inoceramus schmidti帯最下部)に豊富な化石群を認めた。3.マカロフ川流域には、サントニアン階からマストリヒシアン階にわたる連続層序が確認され、2塁層を区別した、下位のブイコフ層は、生物攪乱を強く受けた暗灰色の塊状泥岩よりなり、4つの化石群が認められた。古地磁気学的研究によると、下位のAnapachydiscus sutneri群衆とA.naumani-Inoceramus orientale群集はサントニアン階に、上位のEupachydiscus haradai-I-shmidti群衆とCanadoceras kossmati群衆はカンパニアン階に対比できた。これは、大型化石による対比と矛盾しない。Inoceramus schmidtiは、ナイバ地域やシネゴルスク地域ではクラスノヤルカ層下部より産出するが、マカロフ地域ではブイコフ層上部より産出し、岩相と化石帯の斜交が認められた。クラスノヤルカ層は、安山岩質の火山岩片に富む緑色砂岩、砂質泥岩、砂岩泥岩互層よりなり、3つの化石群が認められた。下位のCanadoceras multicostatum群集は宗谷ファウナと同じ内容のものであり、ナイバ地域においても全く同じ化石群が産する。Inoceramus hetonaiaus群集および最上部にPachydiscus cf.flexuosus群集が認められた。後者の群集は、約50km南のプガチェヴォ地域においても確認できた。北海道では断片的にしかわからなかったマストリヒチアン階の化石群の産出順序や内容が一つのルート内で確認でき、化石層序的に重要な発見となった。向斜構造のためクラスノヤルカ層の上限は不明であるが、アンモナイトが産出しなくなってからさらに500m以上の厚さの地層が堆積している。時代対比に有効な化石は発見できなかったが、ダニアンを含む可能性もあり、。

古地磁気学的研究を進めている。ロシアの研究者はクラスノヤルカ層の最上部に古第三紀最初期のダニアン階を認めているが、今後北海道根室地域の根室層群の生物相との比較する必要が出てきた。仮にロシアの研究者の見解が正しいとしても、白亜紀・古第三紀境界の重大な事変を示すような証拠は、ナイバ地域では見られなかった。研究実績報告1.平成6年度は、サハリン州マカロフおよびシネゴルスク地域を中心に調査をおこなった。調査にあたっては、それぞれの地域で本研究の目的に合ったルート(ビクトリア川流域、スズヤ川流域)を選定し、約50日間にわたって詳細なルートマップの作成、化石の連続的な採取、古地磁気測定用試料の採取をおこなった。2.マカロフ川流域には、サントニアン階からマストリヒシアン階にわたる連続層序が確認され、下位のプイコフ層(北海道の上部蝦夷層群上部に相当する)には4つの化石群で特徴づけられる群集が認められ、上部のクラスノヤルカ層(北海道の函淵層群に相当する)には3つの化石群で特徴づけられる群集が認められた。カンパニアン階上部からマストリヒシアン階の幾つかの層準に、日本列島の白亜系で知られている特異な化石群(例えば稚内の宗谷ファウナや淡路島の和泉層群のファウナ)と同じ内容のものが確認され、今後の日本とサハリン地域の生物相の比較する上で重要な発見となった。3.マカロフ地域では白亜系と古第三系の接触関係は直接示す露頭はなかった。いることが分かり、白亜紀・第三紀境界は存在しないことが明らかとなった。また、この地域にはサントニアン階より下位の地層の分布がないことがわかった。4.古地磁気学的研究は現在進行中であるが、これまでの測定結果から、サハリン地域では白亜紀末期から古第三紀に反時計回りに、それ以降後期中新世なで連続的な時計回りの回転運動があったことがわかりつつある。研究成果の概要本研究では、戦前日本人研究者によって調査され、その後ロシア共和国の研究者によって引き続き研究されているサハリン南部の白亜系を、北海道や日本の他の白亜系との関連で調査をおこなった。1.ナイバ川流域およびアイ川流域には、アルビアン階からマストリヒチアン階にわたる連続層序が確認され、4累層を区別した。アイ層上部とナイバ層下半は、平行葉理の発達した黒色泥岩を主体とし、生痕や大型化石にきわめて乏しい。おそらく、白亜紀中期に発達した海洋無酸素事変の影響下で堆積したものと考えられる。ブイコフ層下部は、Planolitesを含む泥岩や青灰色縞状泥岩、主部は生物攪乱を強くうけた泥岩で特徴ずけられ、後者からは豊富なアンモナイト類やイノセラムス類を産する。クラスノヤルカ層は、火山岩片質の砂質層が多くはさまれ、やや砂質の泥岩で特徴づけられる。古地磁気学的研究によると、ブイコフ層上部はサントニアン層に、クラスノヤルカ層最下部はカンパニアン階に対比できる。これはアンモナイトやイノセラムス類による対比と矛盾しない。クラスノヤルカ層中には、カンパニアン階からマストリヒチアン階までの3つの化石群が認められた。
昆虫の休眠制御機構の分子神経生理学的研究

カイコ脳のcDNAを調整し、これをテンプレートに、複眼のオプシンを増幅したプライマーを用いてPCRをおこなった。その結果、約200baseのバンドが増幅されたので、サブクローニングを行い、210base(70アミノ酸)のオプシン様遺伝子のフラグメントを分離同定した。この核酸配列をもとにレース法を行い、その後ORF全長を増幅した。cDNAのシークエンスは約1.6kbaseでORFは377アミノ酸配列をコードしていた。これを他の昆虫の視物質のアミノ酸シークエンスと比較すると、タバコスズメ蛾の複眼で報告されているManop1とかなり高い相同性をしめすことが分かった。これの類縁性から推定するとこの色素はグリーンンレセプターと思える。このカイコ脳内のオプシン様タンパク質(Bombyx cerebral opsin)を、Boceropsinと呼ぶことにした。BoceropsinのC末端付近の25アミノ酸配列をもとにペプチドを合成し、これに対するマウスの抗体を作成し、これを1次抗体としてカイコ脳を材料に、免疫組織学的実験をおこなった。その結果脳に複数対染色される細胞が観察されたので、時間生物学会等で発表した。論文としては現在準備中である。本研究の目的は、昆虫の光周受容物質の本体が、視物質ロドプシン様のものであろうと推定し分子生理学的手法でもって、光周受容機構の分子メカニズムを解明することである。本年度は、まず実験昆虫のカイコを用いて、幼虫脳から調整したcDNAをテンプレートにして、PCR法でオプシン様蛋白のクローニングの完成を試みた。その結果、3′Race,5′Race法によって昆虫オプシン様の全長クローン遺伝子を1つ得た。このクローンcDNAは約1.6KbascでORFは377aaをコードしていることが判明した。アミノ酸シークエンスを他の昆虫の既知オプシンと比較ずるとManducaの複眼視物質manopIと70%の高い相同性と示していることがわかった。これのC末端ペプヂド部分を発現ベクター系を用いて、発現・精製したものに対してマウス抗体を作製し、.免疫組織学的に実際の発現部位を検討した。対照として用いた単眼のラブドーム部分は、はっきりと染色されるが、問題の脳では、いまのところ再現性のある結果は得られていない。材料の調整法を工夫しつつ、再現性のあるデーターを得るように、研究を進行している。cDNAのシークエンスは約1.6KbaseでORFは377アミノ酸配列をコードしていた。これの類縁性から推定するとこの色素はグリーンレセプターと思える。