hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
μCT-3D Visualization法を用いたレジンの重合収縮挙動解析と対策

本研究では、通常照射法とSlow-start curing法を用いて、各種レジンにおける接着システムを使用した窩洞内のレジン修復物の重合収縮量とレジン修復物の窩壁適合性を&micro;CT-3D Vusualization法と色素浸透試験により検討した。ウシ下顎前歯唇側歯頸部に直径3mm、深さ2mmの円柱窩洞を形成した。Clearfil Mega BondかClearfil tri-S Bond ND Quickを使用して、Clearfil AP-Xもしくは、Clearfil Photo Brightのレジンを充塞した。Clearfil AP-Xは、重合と共にコントラスト比(不透明度)が減少し、Clearfil Photo Brightは、重合と共にコントラスト比が増加する。その後、1通常光照射法:600 mW / cm2 40秒と2Slow-start curing法:270 mW / cm2 10秒照射、インターバル5秒、600 mW / cm2 30秒により重合硬化させた。この際、&micro;CT(Micro-focus X線CT)を用いてレジンの重合前後の試料を、断層撮影を行った。その変位前後のデータを3D Visualization Frameworkソフトウェアを用いて再構築することにより、レジンの重合収縮を3次元的に画像として可視化し、この方法により、窩洞内のレジン修復物の重合収縮量を数値化して、体積として算出する方法を確立した。また、この&micro;CT-3D Visualization法を使用して、Slow-start curing法(通常の出力の45%の光の強さで照射した後、100%の光の出力で光照射する)によりレジンを重合硬化すると、実際の接着材をした窩洞内の光重合型コンポジットレジン修復物の体積収縮量を半減できることも明らかにし、世界に先駆けて報告した。さらに、ボンディング材の厚みが薄い接着材より、ボンディング材の厚みが厚い接着材を使用した方が、コンポジットレジンの重合収縮量応力を減少させ、窩壁適合性が向上し、接着材をした窩洞内の光重合型レジン修復物の体積収縮量を減少できる可能性が示唆された。本研究では、通常照射法とSlow-start curing法を用いて、各種レジンにおけるレジン修復物の辺縁封鎖性と窩壁適合性を色素浸透試験により、また、接着システムを使用した窩洞内のレジン修復物の重合収縮量をμCT-3D Vusualization法により検討した。Clearfil tri-S Bond ND Quickを使用して、Clearfil AP-XかClearfil Photo Brightのレジンを充塞した。Clearfil AP-Xは、重合と共にコントラスト比(不透明度)が減少し、Clearfil Photo Brightは、重合と共にコントラスト比が増加するタイプのレジンである。この際、μCTを用いてレジンの重合前後の試料を断層撮影した。それらのデータを3D Vusualizationソフトを使用して解析し、窩洞内のレジン修復物の重合収縮量を算出した。試料にサーマルサイクルによる負荷試験を行った後、レジン修復物の辺縁封鎖性と窩壁適合性を色素浸透試験により評価した。光照射に伴いコントラスト比が増加する光重合型コンポジットレジンの方が、コントラスト比が減少するレジンよりも、Slow-start curing法を用いて重合すると、重合収縮応力を緩和し窩壁適合性が向上することが示唆された。μCT-3D Visualization法を使用し、Slow-start curing法によりレジンを重合硬化すると、接着材を使用した窩洞内の光重合型レジン修復物の重合収縮量を半減できることを明らかにした。既に、国際学会と国内学会で発表を行い、また、英文誌に論文が二編掲載され、一編がアクセプトされており順調に研究が進捗している。ウシ下顎前歯唇側歯頸部に直径3mm、深さ2mmの円柱窩洞を形成し、Clearfil tri-S Bond ND Quickを使用して、Clearfil AP-XかClearfil Photo Brightのレジンを充塞した。この際、μCTを用いてレジン重合前後の試料の断層撮影を行い、断層撮影により得られたデータを3D Vusualizationソフトを使用して解析し、窩洞内のレジン修復物の重合収縮量を算出した。半数の試料にサーマルサイクルによる負荷試験を行い、その後、レジン修復物の窩壁適合性を色素浸透試験により評価した。重合時にコントラスト比が減少するコンポジットレジンよりも、コントラスト比が増加するタイプのコンポジットレジンを用いて、Slow-start curing法により硬化すると、接着材を使用した窩洞内の光重合型レジン修復物の重合収縮量と残留応力を減少させることが可能となり、窩壁適合性を向上できることを明らかにした。

また、ウシ下顎前歯の健全歯と60Gyのγ線を照射した象牙質平坦面を作製した後、レジンを築盛硬化し、象牙質平坦面に対するレジンの微小接着強さを測定した。健全象牙質とγ線照射象牙質の接着強さに差は認められなかったが、SEM観察により、γ線を照射した象牙質の破断面のみにコラーゲン繊維が観察され、γ線照射は象牙質に何らかのダメージを与えることが示唆された。国内学会と国際学会で発表を行い、既に英文誌に論文が三編掲載されており順調に研究が進捗している。本研究では、通常照射法とSlow-start curing法を用いて、各種レジンにおける接着システムを使用した窩洞内のレジン修復物の重合収縮量とレジン修復物の窩壁適合性を&micro;CT-3D Vusualization法と色素浸透試験により検討した。ウシ下顎前歯唇側歯頸部に直径3mm、深さ2mmの円柱窩洞を形成した。Clearfil Mega BondかClearfil tri-S Bond ND Quickを使用して、Clearfil AP-Xもしくは、Clearfil Photo Brightのレジンを充塞した。Clearfil AP-Xは、重合と共にコントラスト比(不透明度)が減少し、Clearfil Photo Brightは、重合と共にコントラスト比が増加する。その後、1通常光照射法:600 mW / cm2 40秒と2Slow-start curing法:270 mW / cm2 10秒照射、インターバル5秒、600 mW / cm2 30秒により重合硬化させた。この際、&micro;CT(Micro-focus X線CT)を用いてレジンの重合前後の試料を、断層撮影を行った。その変位前後のデータを3D Visualization Frameworkソフトウェアを用いて再構築することにより、レジンの重合収縮を3次元的に画像として可視化し、この方法により、窩洞内のレジン修復物の重合収縮量を数値化して、体積として算出する方法を確立した。また、この&micro;CT-3D Visualization法を使用して、Slow-start curing法(通常の出力の45%の光の強さで照射した後、100%の光の出力で光照射する)によりレジンを重合硬化すると、実際の接着材をした窩洞内の光重合型コンポジットレジン修復物の体積収縮量を半減できることも明らかにし、世界に先駆けて報告した。さらに、ボンディング材の厚みが薄い接着材より、ボンディング材の厚みが厚い接着材を使用した方が、コンポジットレジンの重合収縮量応力を減少させ、窩壁適合性が向上し、接着材をした窩洞内の光重合型レジン修復物の体積収縮量を減少できる可能性が示唆された。ウシ下顎前歯唇側歯頸部に直径3mm、深さ2mmの円柱窩洞を形成する。Clearfil tri-S Bond ND Quickを使用して、Clearfil AP-XかClearfil Photo Brightのレジンを充塞する。Clearfil AP-Xは、重合と共にコントラスト比(不透明度)が減少し、Clearfil Photo Brightは、重合と共にコントラスト比が増加するタイプのレジンである。
大きくスピン偏極した低速不安定核ビームの生成とその応用

不安定核の電磁気モーメントを系統的に測定し、核構造の研究を広い核領域に拡大するために、不安定核に大きなスピン偏極を付与する方法の開発とβ-NMR法による核モーメント測定を行なった。これを実現する方法として、原子ビームを用いた方法が最も有力と判断され、これを採用することとした。この方法の成否の鍵は、大きなエネルギー幅を持った入射核破砕片ビームを高い停止密度で物質中に停止させることである。いくつかの停止方法を実機によるテスト実験と計算機シミュレーションにより検討した結果、気体中に荷電状態で停止させ電場で収集の後中性化した不安定核原子を気体とともに真空中に噴射する方法をとることとした。これに基づき気体箱・電極系と噴出ノズルを設計・製作し、不安定核の捕集試験、ノズルからの噴出テスト、および原子ビームのスピン分析系の設計、計算機シミュレーションを進めた。捕集試験は、^<17>Nビームを気体箱に入射させ、^<17>Nからのβ線を計数することにより行なった。ノズルからの^<17>Nの噴出はガス噴射の断続によるβ線計数の変化から観測した。その結果、気体箱内の電場を噴出口に向かって指数関数的に強くすることにより停止核の40%以上をノズル部に収集できることと、ノズルからの引き出しが確認された。またLaval型ノズルからのジェット噴射形状のレーザー光による観察および噴射後の原子の速度分布測定の実験に着手し、現在各装置の改良作業中である。これらの結果とスピン分析系の試作機完成を待って、本研究の目指す高偏極・低速不安定核ビームの全体試験を近々行ない、理研の現有加速器で質量数40程度までの不安定核に適用を始める。また、入射核破砕反応自身によって生成されるスピン偏極を用いた核モーメント測定も併せて実施し、^<17>C、^<15>Cのg因子と^<17>Bの四重極モーメントの測定に成功した。さらに、3年後に稼動開始するRIBFでさらに広大な領域の不安定核を対象として核モーメント、β崩壊、β-NMR法を通じた物質科学への応用を展開する予定である。本研究の目的は入射核破砕反応によって生成する広範な不安定領域の核を対象として、これに大きなスピン偏極を付与する方法を開発することである。これを用いて、磁気モーメントおよび電気四重極モーメントを系統的に測定し、これまで行なってきた不安定領域の核構造の研究をさらに広い核領域に拡大する。また、偏極放射性イオンをプローブとした凝縮系の研究への応用の道をひらく。偏極を生成するために、超低速の中性不安定核原子をノズルから噴射し(原子ビーム)、原子の磁気モーメントと磁場との相互作用を利用して原子スピンを選別した上で低磁場中の高周波遷移によって核スピンに偏極を移す。超低速の中性不安定核原子を得るためには、破砕片分離収集装置から得られる有限エネルギー幅を持った入射核破砕片ビームを一旦物質中に停止させる必要があるが、その際できるだけ物質量あたりの密度が高いことが重要である。これを実現する手段として、核種分類後の不安定核を超流動液体ヘリウム中に1価イオンとして止め、電場によってドリフトさせて液面下に収集したのち、電子との再結合によって中性化して液面から引き出す方法を検討した。

このために超流動He箱を含む原子ビームチェンバーおよびクライオスタットの設計・製作を行なった。性能テストの結果、液面を一定に保った1.4Kの超流動Heを得た。液体中性イオンをドリフトさせるための電場と液面における中性化のための電子放射用タングステン針(先の極率半径40nm)に電圧-2000Vをかけ、電子放出を確認した。今後、不安定核を用いて低速中性原子の引き出しについて調べる予定である。これと平行して、原子スピン選別のための磁場計算とその中での中性原子の軌道計算を行なった。これを用いて現在高磁場原子スピン分析系の設計を行なっている。入射核破砕反応によって生成する広範な不安定領域の原子核に大きなスピン偏極を付与する方法を開発し、これを用いて不安定核の磁気モーメントおよび電気四重極モーメントを系統的に測定し、これまで行なってきた不安定領域の核構造の研究をさらに広い核領域に拡大する。また、偏極放射性イオンをプローブとした凝縮系の研究への応用の道をひらく。これを実現するため、中性不安定核原子をノズルから噴射し原子の磁気モーメントと磁場との相互作用を利用して原子スピンを選別した上で低磁場中の高周波遷移によって核スピンに偏極を移す。本年度は、停止材気体中に不安定核を一旦停止させ中性原子となった不安定核を含む気体を噴射する方法を詳細検討し、その装置の設計・製作を行なった。ノズルの形状とサイズを適切に選ぶ事により、噴射後の原子の平均速度約320m/s、縦方向分布温度約2Kを狙う設計が得られている。また、こうして得られる原子ビームの速度分布をレーザー光を用いて調べる手法とその装置の整備を行なった。次いで昨年度に着手した磁場計算とその中での中性原子の軌道計算をより現実的な条件のもとで進めた結果、質量領域A40の不安定核原子に対して約30%の全系(ノズルからスピン分析後の収集点まで)収集効率が期待できる事がわかった。今後、不安定核ビームを用いたテストなど、より実際の状況に即した条件のもとでこれを検証、改良していく必要がある。また、入射核破砕反応自身によって生成されるスピン偏極を用いた核モーメント測定も併せて実施し、^<17>Cのg因子について|g|=0.5057±0.0037(暫定値)を得て、この中性子過剰核に関して論争となっていたスピン値が、I=3/2であることが明らかとなった。本研究は、大強度重イオンビームを用いて生成される不安定核に大きなスピン偏極を付与する方法を開発し、もって核磁気モーメント・電気四重極モーメント測定を通じた不安定核の構造の系統的研究と、短寿命核をプローブとした物質科学への応用の道をひらくことを目的としている。これを実現するため、核種分離した入射核破砕片を気体中に停止し、ついでこれを中性原子として引き出して原子ビーム法による偏極生成を行なうこととした。本年度は、これに基づき平成12年度までに設計・製作した原子ビーム用ガスチェンバーと噴出ノズルを用いて、不安定核の捕集試験、ノズルからの噴出テスト、および原子ビームのスピン分析系の設計、計算機シミュレーションを進めた。まず不安定核の捕集試験は、理化学研究所の不安定核ビーム分離装置RIPSからの^<17>Nビームを減衰板で23MeV/uに減速してガスチェンバーに入射させ、^<17>Nからのβ線を計数することにより行なった。ノズルによる^<17>Nの噴出はガス噴射の断続によるβ線計数の変化からこれを観測した。
加齢に伴うヒト舌粘膜上皮細胞動態の分子病理学的変化 -特に細胞増殖能とアポトーシス

加齢に伴うヒト舌粘膜上皮細胞動態の変化をGl後期からS期の細胞核に存在する増殖細胞マーカーの増殖細胞核抗原(PCNA)と糖鎖を抗原決定基とする血液型関連抗原で,近年アポトーシス関連抗原として注目されているLewis^Y(Le^<YP>)抗原の組織内分布を調べることにより検索した。【材料および方法】剖検例より得られた肉眼的に病変のみられない舌を舌尖部と舌盲孔を結ぶ中点で前頭断し,10%中性ホルマリンにて固定後,通法に従い,パラフィン包埋,3μmの連続切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色を施し,病変のみられない舌,20歳代,50歳代,80歳代,各10例(男性,女性,各5例)を検索の対象とした。抗PCNAマウスモノクローナル抗体(DAKO社)および抗Le^Yマウスモノクローナル抗体BM-l/JIMRO(日本抗体研究所)を用いてストレプトアビジン・ビオチン法にて免疫染色し,顕微鏡下(x400倍)にて舌背部の粘膜上皮細胞(基底層・有棘層・角化層)500個中の陽性細胞の分布と数を計測した。【結果】抗PCNA陽性細胞は20歳代,50歳代では基底層と一部有棘層に,80歳代では基底層にのみみられた。2)抗PCNA陽性細胞率は20歳代:23.2%±11.3%,50歳代:9.7%±4.7%,80歳代:5.6%±2.4%で加齢とともに有意(p<0.05)に減少していた。3)抗Le^Y抗原陽性細胞は20歳代,50歳代,80歳代のいずれにおいても,有棘層・角化層に多数みられ,わずかに基底層にも認められた。4)抗Le^Y抗原陽性細胞率は20歳代:84.1%±7.0%,50歳代:83.6%±8.4%,80歳代:84.3%±6.7%で加齢による有意差はみられなかった。【考察】舌粘膜上皮の老化は抗Le^Y抗原の発現ににより示されるアポトーシスの亢進よりは,PCNAの発現による示される細胞増殖能の低下を意味し,それが舌乳頭の減少や上皮の菲薄化などの老化に伴う肉眼および組織形態的変化として表現されると考えられた。
昆虫の概日時計―神経分泌細胞連関を中心とした光周性機構の解析

2 )神経分泌細胞の電気的性質チャバネアオカメムシ:パッチクランプ法によりハエPDFペプチドの脳間部細胞に対する影響を調べた結果、予備的な実験ではあるが、顕著な響はみられていない。また、脳側方部細胞からの電位記録方法を確立した。今後、脳側方部神経細胞の電気的活動を短日と長日条件で比較する。3 )時計細胞ー脳側方部細胞間の接続形態ルリキンバエ:バックフィルと免疫組織化学の二重染色により、アラタ体側心体へ投射する脳側方部細胞とPERIOD陽性細胞(DN)は異なる細胞で隣接して存在することがわかった。;チャバネアオカメムシ:バックフィル法による脳側方部細胞の染色がうまくいかなかった。引き続き染色方法の確立につとめる。バックフィル法による脳側方部細胞の染色など一部予定通り進まなかった部分はあるが、チャバネアオカメムシのPlast-MIPと時計遺伝子のノックダウンの結果が論文発表されたことや、光周性に対するPDFシグナルの役割が見え、おおむね順調に進展している。特に大きな計画変更はせずに、進める。具体的には、1)光周性関連分子の探索では、クリオスタットを新たに導入することができたので、これを用いてルリキンバエのace発現細胞を調べるために、凍結切片を作製しISH法を実施する。チャバネアオカメムシのRNA干渉実験の最終段階として、実験区の目的mRNAの発現量が対照区よりも減少しているか確認実験を行う。また、光周期を変化させたときにpdfペプチドあるいは受容体遺伝子の発現量が変化するかを調べる。UPLC-MSを用いて、チャバネアオカメムシのPlast-mip発現抑制個体(RNA干渉)について、血中JH濃度にどのような影響があるか調べる。2)電気的性質を調べる実験では、チャバネアオカメムシのPDFを新たに合成し、脳間部、脳側方部細胞のPDFに対する応答を電気生理学的に調べる。3)時計細胞ー脳側方部細胞間の接続形態を調べる実験では、チャバネアオカメムシの脳側方部細胞の染色法を確立し、MIP,PDF細胞との位置関係を調べる。チャバネアオカメムシ:1)抗Plast-MIP1抗体を用いて脳とアラタ体を含む後脳神経複合体の免疫組織化学染色をパラフィン切片で行った結果、脳間部、前大脳、視葉基部、食道下神経節に陽性細胞が存在し、比較的強く染まる細胞が頭部神経節内に約50個存在した。また、Fourier transform mass spectrometry (FT-MS)解析により、前大脳背側測方部からはPlast-MIP1-9に相当する分子イオンピークが、脳間部および側心体・アラタ体からはPlast-MIP1-5、7-9に相当するピークが検出された。2)RNA干渉法により、plast-mipのノックダウンを行った結果、短日条件において弱い休眠率の低下が見られたが、幼若ホルモンの合成活性には顕著な効果は見られなかった。一方、時計遺伝子cycleのノックダウンを行うと長日条件における休眠率の上昇と幼若ホルモン合成活性が低下する傾向が見られた。3)pdfr (pdf受容体)のノックダウンを行ったところ、短日から長日への切り替えによって起こる産卵までの期間が長くなった。4)パッチクランプ法により、脳間部大型細胞の電気活動を長日と短日条件で比較した結果、自発発火が見られた個体の割合、自発発火のスパイク頻度、静止膜電位はいずれも短日条件の方が長日条件よりも有意に高かった。また、記録後に細胞へ色素を注入した結果、染色に成功した細胞すべてにおいて、アラタ体・側心体へ投射するNCC1が染色された。ルリキンバエ:5)angiotensin-converting enzyme(ACE)に対する抗体を用い、免疫組織化学染色を行ったところ、食道下神経節の背側領域に1対の大型の細胞が染色された。6)ACE免疫陽性細胞を外科的に除去し卵巣発達を調節する光周性に対する影響を調べた結果、有意な効果は見られなかった。ルリキンバエでは、ACE抗体による染色が通常よりも早く進んだため、次年度に計画していたACE細胞の除去実験も終了させることができた。チャバネアオカメムシにおいて、電気生理記録を新たに開始した。初年度は記録方法の確立のみを計画していたが、方法の確立も順調に進み、細胞の活動を短日と長日条件で比較する実験も終了させることができた。さらに、ノックダウン実験により、PDFシグナリングの光周性における関与を示唆することができたため、電気生理実験の発展型としてPDFの薬理実験を新たに組み込む計画を立てる事ができた。

バックフィル法による脳側方部細胞の染色など一部予定通り進まなかった部分はあるが、チャバネアオカメムシのPlast-MIPと時計遺伝子のノックダウンの結果が論文発表されたことや、光周性に対するPDFシグナルの役割が見え、おおむね順調に進展している。チャバネアオカメムシ1)Plast-MIP免疫陽性細胞のうち、アラタ体あるいはその周辺へ投射する細胞を突き止めるため、アラタ体・側心体からのバックフィルとPlast-MIP免疫組織化学との二重染色を行う。2)現在実施している放射化学アッセイ法では幼若ホルモン合成活性の測定値のばらつきが大きく、このためにノックダウンの効果が正しく評価できていない可能性がある。そこで、幼若ホルモン測定をUPLC-MS法に切り替えることを検討する。次年度は、この方法を用いて無処理個体の幼若ホルモン量を測定する。3)本種のpdfrノックダウンの光周性に対する影響と、ハエやカメムシにおいてPDF細胞は概日時計細胞自身あるいはその近辺に存在することを考慮すると、PDFシグナルが日長切り替えの情報処理に関与する可能性が考えられる。そこで、短日から長日、長日から短日の二種類の日長切り替え実験を行い、両条件においてpdfrノックダウンの影響が見られるか検討する。4)脳間部大型細胞にPlast-MIP陽性細胞が含まれる可能性が高い。Plast-MIP`を持つ脳間部大型細胞が短日条件で幼若ホルモン合成を抑制するPlast-MIPを分泌すると仮定すると、脳間部大型細胞はPDFシグナルの下流に位置する可能性がある。そこで、脳間部大型細胞の電気活動に対するPDFペプチド投与の影響を調べる。また、脳間部大型細胞にpdfrが発現しているか調べる。ルリキンバエ5)ACE陽性細胞は頭部神経節内に1対しか観察されなかった。mRNAの発現量を考えると、より多くの細胞がaceを発現している可能性がある。そこで、ace発現細胞をin situ hybridization法を用いて調べる。6)バックフィルと免疫組織化学の二重染色により、休眠誘導に必要な脳側方部ニューロンの中で、概日時計遺伝子periodを発現している細胞を突き止める。特に大きな計画変更はせずに、進める。具体的には、1)光周性関連分子の探索では、クリオスタットを新たに導入することができたので、これを用いてルリキンバエのace発現細胞を調べるために、凍結切片を作製しISH法を実施する。チャバネアオカメムシのRNA干渉実験の最終段階として、実験区の目的mRNAの発現量が対照区よりも減少しているか確認実験を行う。また、光周期を変化させたときにpdfペプチドあるいは受容体遺伝子の発現量が変化するかを調べる。UPLC-MSを用いて、チャバネアオカメムシのPlast-mip発現抑制個体(RNA干渉)について、血中JH濃度にどのような影響があるか調べる。2)電気的性質を調べる実験では、チャバネアオカメムシのPDFを新たに合成し、脳間部、脳側方部細胞のPDFに対する応答を電気生理学的に調べる。3)時計細胞ー脳側方部細胞間の接続形態を調べる実験では、チャバネアオカメムシの脳側方部細胞の染色法を確立し、MIP,PDF細胞との位置関係を調べる。
生物活性天然有機化合物の構造と機能

ヤップ島(1994年)、ポナペ・パラオ島(1995年)で採集した海洋糸状菌の培養液、海綿、ホヤの抽出液の殺がん細胞活性及び有糸分裂阻害物質の簡便な検出法として開発した稲イモチ病菌胞子発芽管形態異常のスクリーニングアッセイで活性を示した培養液、抽出液の分離を行った。平成8年度には、2種の既知化合物とともに3種の新規化合物を単離し、その構造を明らかにした。一つはVerticillium属と同定した糸状菌が作る化合物で、弱い微小管重合阻害活性を示した。残りの2種の新規化合物は互いに二重結合の立体異性体であったが、ブタ脳より精製した微小管タンパク質の重合を強く阻害した(IC_<50>はそれぞれ約20μM)。これらの化合物の生産菌はPhomopsis属とTrichoderma属と同定し、化合物の構造決定とともにChemistry Lettersに投稿した。その他の生物活性物質の分離の引き続き行っている。アオコの増殖を阻害する水生植物成分の研究のため、平成8年度は生物検定法の確立を目指した。種々検討した結果、48穴アッセイプレートの中央部の24穴(6×4)をプレートシートで覆って使用する方法が最も再現性が良いことが分かった。アッセイプレートの周縁部は一週間の培養期間中に培養液の蒸発が観察された。アッセイは、検定試料と一定細胞数の検定用らん藻を各ウェルに総量1.2mLになるように入れ、一定の光源下に定温で静置培養して行った。一週間後、検定ウェルの細胞数を顕微鏡下で計数し、コントロールの細胞数と比較して増殖阻害活性を検定した。検定用らん藻としてMicrocystis aeruginosaの3株を検討したが、M.aeruginosaTAC20が最も感受性が高かったので、これを用いてその後の検定を行った。千葉県印旛沼で採集したホテイアオイ、ヒシ、ボタンウキクサの3種の水生植物の根の抽出物を検定し、50%阻害率を求めた。その結果、ホテイアオイとボタンウキクサでは24.3μg/mL、ヒシでは37.5μg/mL出会った。現在この増殖阻害活性物質の分離を開始している。
口腔を用いたリラクセーションのストレス予防効果に関する研究

ストレスは人体に影響を与え,ストレスから様々な疾患になると言われている。我々は,口腔をリラックスさせれば全身の健康へ繋げることができると考え,口腔リラクセーション法を考案した。本研究では,口腔リラクセーション時の末梢血管幅と唾液中の抗酸化力および酸化ストレスの測定を行い,その効果と有用性について検討した。その結果、舌のリラクセーションはストレス耐性向上に役立つ可能性が示唆された。申請者は、「口腔リラクセーション法」を考案し、研究を行っており、口腔リラクセーションは、口腔内の唾液分泌を促進し、さらに全身の緊張も緩められ、心と身体がリラックスできる方法であると考えている。本研究では、メタボリックシンドロームを悪化させるといわれているストレスを、口腔リラクセーションにより、緩和できるのではないかと考え、心理的または、生理的な面からの成果を明らかにすることを目的として行っている。本年度行った具体的な内容1.口腔リラクセーション時の唾液分泌量と唾液中のクロモグラニンAの測定本学学生に調査内容を説明し、承諾の得られた者20名に対して、ストレス負荷時(暗算)と口腔リラクセーション時に唾液を採取し、唾液分泌量と、ストレス指標として、唾液中のクロモグラニンAの測定を行った。ストレスに対する口腔リラクセーションの効果を検討した結果、唾液量は口腔リラクセーションで増加し、ストレスで増加すると言われているクロモグラニンAは口腔リラクセーションで減少傾向を示した。2.口腔リラクセーション時の酸化ストレス度の測定口腔リラクセーション前後の分泌唾液を用いて、フリーラジカル自動分析装置FRAS4(SEAC社(イタリア))により、酸化ストレス度(d-ROMs)と抗酸化力(BAP)の基礎的検討を行った結果、刺激時唾液と比較して舌のリラクセーションは、酸化ストレス度(d-ROMs)は低い傾向にあり、抗酸化力(BAP)は高い傾向であった。今後、分析し検討していく予定である。申請者は、生体に生じるストレスを、口腔リラクセーションにより、緩和できるのではないかと考え「口腔リラクセーション法」を考案し研究を行っている。口腔リラクセーションは、口の周りおよび舌を筋弛緩法により緩和することで、心と身体がリラックスできる方法である。本研究では、口腔リラクセーションの心理的または、生理的な面からの成果を明らかにすることを目的として行っている。1.口腔リラクセーション時の酸化ストレス度の測定口腔リラクセーション前後の分泌唾液を用いて、フリーラジカル自動分析装置FRAS4(SEAC社(イタリア))により、酸化ストレス度(d-ROMs)と抗酸化力(BAP)の基礎的検討を行った結果、ワッテ方にて採取した唾液と比較して舌のリラクセーションは、酸化ストレス度(d-ROMs)は低い傾向にあったが有意差は認められなかった。一方、抗酸化力(BAP)は有意に高い結果であった。また、口腔リラクセーションを毎日3回行い、2週間後に安静時唾液を採取し実験前と比較したが有意差は認められなかった。2.口腔リラクセーション時の血管幅の測定ストレスで収縮しリラックス状態で拡張するといわれている血管幅について、口腔リラクセーションを行うことで変化するかを検討するために、末梢血管モニタリング装置ASTRIM SU(シスメックス株式会社)を用いて、指先静脈血管の幅を測定している。安静時から口腔リラクセーションを行っている間の連続測定を行い、変化を検討している。今後被験者数を増やして検討を続けていく予定である。申請者は、「口腔リラクセーション法」を考案し、その効果について研究を行っている。口腔リラクセーションは、口腔内の唾液分泌を促進し、さらに全身の緊張も緩められ、心と身体がリラックスできる方法であると考えている。本研究では、メタボリックシンドロームを悪化させるといわれているストレスを、口腔リラクセーションにより、緩和できるのではないかと考え、心理的または、生理的な面からの成果を明らかにすることを目的としている。本年度行った具体的な内容1、口腔リラクセーション時における中指末梢血管幅の測定口腔リラクセーション時のリラックス状態を検証するために、末梢血管モニタリング装置ASTRIM SU(シスメックス株式会社)を用いて,非侵襲近赤外分光画像法による指静脈の可視化を行い,画像中の特定解析部分を決めて中指静脈血管幅を測定した。測定時間は安静時(座位にて静止状態)を80秒間連続測定(20秒間隔)し,続いて舌のリラクセーションを行った。この間の160秒間において連続測定(20秒間隔)を行い,変化を検討した。その結果、舌のリラクセーションを行うことで,中指静脈の血管幅は漸進的に拡張した。2、口腔リラクセーション時の抗酸化力の測定口腔リラクセーション前後の分泌唾液を用いて、フリーラジカル自動分析装置FRAS4(SEAC社(イタリア))により、酸化ストレス度(d-ROMs)と抗酸化力(BAP)の基礎的検討を行った結果、刺激時唾液と比較して舌のリラクセーションは、抗酸化力(BAP)は有意に上昇した。
口腔がんにおけるmicroRNAの抗がん剤抵抗性への関与の検討

平成23年度は、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤である5-FUおよび白金製剤のシスプラチン(CDDP)は、頭頸部がんをはじめ、様々な固形がんの治療に使用されてきたが、薬剤耐性により十分な治療効果が得られないことがある。近年、タンパク質発現を制御する因子としてmicroRNA (miRNA)が注目されている。本研究は口腔がんにおけるmicroRNAの5-FUおよびCDDP抵抗性への関与を明らかにすることを目的とした。各種DNA修復酵素欠損Chinese hamster lungfibroblast由来の細胞を用いて、DNA修復経路における5-FUの殺細胞効果を高める標的候補を検討した。Chinese hamsterlungfibroblast由来のBRCA2 deficient細胞およびku80 deficient細胞とそれぞれの親株細胞を用いて、生存率の測定:各種濃度の5-FUを培地中に添加して24時間、37°C処理し、コロニー形成法にて生存率を算出した。また、DNA二本鎖切断量の測定:フローサイトメトリーによって、5-FUによる24時間添加処理後のγH2AX量を経時的に測定し、DNA二本鎖切断量を比較検討した。結果として、BRCA2 deficient細胞は、5-FUにより約2.5倍の高い殺細胞効果を認めた。また、BRCA2 deficient細胞では、その親株細胞に比べて、5-FU処理によって生じるDNA二本鎖切断の修復遅延も確認された。平成24年度は、Chinese Hamster Lung Fibroblast (BRCA2野生型)由来の細胞と舌癌細胞であるSAS細胞を用いて、BRCA2と関わりのあるChk1阻害薬であるUCNを用いて5-FUの増感効果を確認した。両細胞において5-FUの単独使用に比べて、UCNを併用することにより有意に細胞の生存率を低下認めた。つまり、相同組み換え修復を阻害することにより5-FUの感受性を上げることができた。フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤である5-FUは、約半世紀にわたり頭頸部がんをはじめ、様々な固形がんの治療に使用されてきたが、薬剤耐性により十分な治療効果が得られないことがある。本研究は、この耐性を克服することにより5-FUの感受性を向上させ、5-FUによる化学療法の効果のさらなる向上を目指すことにある。

平成23年度は、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤である5-FUおよび白金製剤のシスプラチン(CDDP)は、頭頸部がんをはじめ、様々な固形がんの治療に使用されてきたが、薬剤耐性により十分な治療効果が得られないことがある。近年、タンパク質発現を制御する因子としてmicroRNA(miRNA)が注目されている。本研究は口腔がんにおけるmicroRNAの5-FUおよびCDDP抵抗性への関与を明らかにすることを目的とした。平成23年度は各種DNA修復酵素欠損Chinese hamster lungfibroblast由来の細胞を用いて、DNA修復経路における5-FUの殺細胞効果を高める標的候補を検討した。Chinese hamsterlungfibroblast由来のBRCA2 deficient細胞およびku80 deficient細胞とそれぞれの親株細胞を用、生存率の測定:各種濃度の5-FUを培地中に添加して24時間、37°C処理し、コロニー形成法にて生存率を算出した。また、DNA二本鎖切断量の測定:フローサイトメトリーによって、5-FUによる24時間添加処理後のγH2AX量を経時的に測定し、DNA二本鎖切断量を比較検討した。結果として、BRCA2 deficient細胞は、5-FUにより約2.5倍の高い殺細胞効果を認めた。また、BRCA2 deficient細胞では、その親株細胞に比べて、5-FU処理によって生じるDNA二本鎖切断の修復遅延も確認された。がんの代表的な治療法のひとつに化学療法がある。その際、化学療法に抵抗性を示すものがあることが問題となっている。この抵抗性を克服し、がん治療効果のさらなる向上を目指している。平成23年度は、まずDNA修復経路における5-FUの殺細胞効果を高める標的候補を検討した。DNA修復経路におけるBRCA2は、5-FU増感の標的になることを明らかとし、その阻害により5-FUによるより効果的ながん治療の可能性を示唆することができた。標的遺伝子を網羅的に検索をするマイクロアレイは本年度はできなかったが、DNA二本差切断量の測定により標的遺伝子を明らかにすることができた。5-FU感受性の異なる細胞に各種抗がん剤を作用させ、miRNAの発現の度合いについてマイクロアレイを用いて明らかにする。発現に差を認めたmiRNAについて、リアルタイムRT-PCR法でmiRNA発現変化を確認して感受性の低下に関連するmiRNAおよび感受性を上げるmiRNAを同定する。同定した5-FUの感受性をあげる、または下げると考えられるmiRNAの効果を、5-FU抵抗性口腔がん細胞を用いて確認する。さらに、5-FU感受性を低下させるmiRNAの効果を抑制する塩基配列を作製し、ベクターに組み込み5-FU抵抗性細胞株内に導入し発現させ、5-FUの殺細胞効果が向上するかどうか検討する。
MDMX/MDM2癌遺伝子産物によるがん幹細胞の制御機構

大腸がん幹細胞のin vitroスフェロイド培養系を樹立し、その生化学的、生物学的解析を行なった。とりわけ、この培養系を用い、p53がん抑制因子、及びその主要制御因子であるMDMX/MDM2発がん因子による、がん幹細胞の制御機構について細胞分子生物学的研究を行なった。実験系としては、大腸がん幹細胞の培養系において、これらがん幹細胞の血清添加による分化誘導前後における各種がん関連因子の変化をウエスタン法等により検討した。複数のがん幹細胞で確認を行なったが、p53の発現には明らかに変化は認められないものの、その下流因子であるp21の発現の増加が分化誘導時に認められた。さらに、これら因子を含めた、発がん制御因子の解析を進めた。その結果、がん幹細胞において、がん増殖促進に働くAkt経路の活性化や、HGF-cMet経路の活性化、さらには、解糖系酵素の活性化等が認められた、これら発がん経路のダイナミックな制御が、幹細胞性を制御している事が示唆された。国立がん研究センター消化器外科、及び病理部門の協力をもとに得られたヒト大腸がん標本を、コラゲナーゼ、DNaseによる酵素処理の後、大腸がん幹細胞に特異的な表面マーカー(CD133、CD44)の発現を指標として、がん幹細胞を精製した。精製したがん幹細胞は、低吸着性プレートを用い、改良したES用培地中でスフェロイドの状態で培養、継代を行った。がん幹細胞としての正統性は、主に以下の実験により検証した。1)大腸がん組織由来の精製がん幹細胞及び非がん幹細胞の一部を、免疫不全マウス(NOD-SCID)に皮下注射し、がん幹細胞の特異的腫瘍形成能を検証。2)生成したスフェロイドの一部を血清の存在下で培養し、分化能を有する事を確認。3)継代培養後に、1)の実験及び、表面マーカー発現の再確認を行い、幹細胞としての性質がin vitro培養により変化しない事を確認。このようにして樹立された大腸がん幹細胞のin vitroスフェロイド培養系を用い、がん幹細胞におけるがん抑制経路破綻の有無、さらに破綻が有ればその機能的役割を明らかにする目的で種々の検討を行った。とりわけMDM2/MDMXと機能的に密接な関係があるp53がん抑制経路の解析に重点を置き、ウェスタン法による個々の蛋白レベルにおける解析を行った。その結果、p53の蛋白レベルでの発現は、大腸がん幹細胞の分化前後で大きく変動しないが、一部の下流遺伝子に関しては発現の上昇が認められた。下流遺伝子の発現誘導がp53に依存しているか現在解析中である。又、遺伝子発現マイクロアレイによる、網羅的な発現解析を行い、その結果を現在検討中である。MDM2/MDMXと機能的に密接な関係があるp53がん抑制経路の解析を目標とし、ウェスタン法による個々の蛋白レベルにおける解析を、大腸がん幹細胞のin vitroスフェロイド培養系において行った。さらに、がん幹細胞におけるがん抑制経路破綻の有無、さらに破綻が有ればその機能的役割を明らかにする目的で種々の検討を行った。遺伝子発現マイクロアレイによる、網羅的な発現解析を行い、その結果を検討した。MDM2/MDMXの発現解析は現在進行中である。最近申請者らは、大腸がん幹細胞のin vitroスフェロイド培養系を樹立したが、この系を用い、p53がん抑制因子、及びその主要制御因子であるMDMX/MDM2発がん因子による、がん幹細胞の制御機構について細胞分子生物学的研究を行なった。交付申請書に記載した実験内容にそった研究が進行中であるため24年度が最終年度であるため、記入しない。
シミュレーション・観測から迫る太陽風駆動メカニズムの理解

地球や惑星は太陽から常に多大な影響を受けている。太陽からは電磁波だけでなく超音速のプラズマ流が恒常的に惑星に吹き付けられ、これを太陽風と呼ぶ。特に近年では太陽風が地球や惑星の居住環境に及ぼす影響が幅広く議論されている。太陽風が強すぎると地球の磁気圏が圧縮され、大気の流出や高エネルギー放射線の流入に繋がりかねない。生物がなぜ地球に居住できるか理解するためには、太陽風がどのようなメカニズムで駆動され、どのような歴史を経てきたか理解しなければならない。このような研究背景のもと、研究代表者はスーパーコンピュータによる大規模シミュレーションや最新探査機の観測結果を用いて太陽風の駆動メカニズムに迫る。
代理変数を含む回帰モデルの推計方法に関する統計的分析(賃金関数への応用)

本研究では、代理変数を含む回帰モデルにおける推定量の統計的性質と代理変数の質の関係を明らかにし、実証分析へ応用することを目的とした。推定量の理論的分析に関しては、各種縮小推定量を用いて研究を行った。分析結果より、用いる代理変数の質が推定量の統計的性質の評価に影響を与えることが明らかになった。さらに、評価基準である損失関数を考慮すると、用いる損失関数によっても推定量に関する評価が異なることが明らかになった。これら結果より、推定量の統計的性質に着目した場合、代理変数の質が良い場合であってもその代理変数を用いないほうが望ましい場合があり、観測不可能な変数が回帰モデルに含まれる場合には、推定量の評価基準や代理変数の質を考慮した上で推定方法の選択を行うべきであることが明らかになった。これら結果は、論文1にもまとめられている。さらに、今年度はこれら理論分析による結果を考慮した賃金関数の実証分析、および実証分析を行う上でさらに必要となる推定量の理論分析を行っている。実証分析においては、研究対象を大卒男性とし、賃金センサスによるデータを用いている。実証分析を行う際には、得られた推定量の有意性について仮説検定を行う必要がある。しかし、本研究で用いている各種推定量については、その密度関数を理論的に求めることは難しく、仮説検定を行うことが極めて困難である。本研究では、この点にも着目し、推定量の密度関数に関してブートストラップ法を用いた分析を行っている。ブートストラップ法を用いることで、密度関数がわからない推定量についても、有意性の検定を行う際の棄却域を数値計算により求めることが可能であり、本研究や用いている各種推定量をより適切に実証分析に応用することが可能になる。論文1.非対称な損失関数に基づく代理変数の統計的性質、国民経済雑誌2005年観測不可能な変数が含まれる線形回帰モデルの推定方法について、統計理論の側面から研究を行った。小標本を前提とし、観測不可能な変数に対して、代理となる変数を用いる場合と、その変数を省いてしまった場合の推定量の性質について、推定量の評価基準と代理変数の質を考慮した上で、シミュレーション実験により分析を行った。ここでは、過大推定と過小推定の重要性の違いを考慮するために、評価基準として、通常の二次の損失関数、及び非対称な線形損失関数を用いた。また、代理変数に関しては、観測不可能な元の変数に対して望ましい代理変数であるかどうかといった、代理変数の質を考慮した。その結果、代理変数の質が良い場合でも、用いる評価基準によってはその代理変数を用いないほうが望ましいケースがあるなど、評価基準と代理変数の質が、代理変数の選択、及び推定方法の選択に影響を及ぼすということが明らかになった。現在は、これらの理論的関係をより明確にし、さらに、用いる代理変数が説明変数として望ましいかどうかという予備検定を考慮した推定方法について研究を継続中である。予備検定を行うことにより、代理変数の質がわからない場合の推定方法の改善が期待される。また、これら推定方法に関する理論的研究と並行して、賃金関数の推定方法に関する研究を進めている。賃金関数の推定においては、説明変数として個人の学歴、労働市場での経験年数が用いられることが多い。これらは、いずれも「個人の能力」を表す代理変数であると解釈できる。このように、賃金の決定要因にはいくつかの質的変数が含まれており、それら質的変数に対してはさまざま代理変数が用いられる。現在は、賃金関数の推定において用いられる代理変数とその推定方法に関する文献のサーベイを行っており、代理変数に関する上記の理論的結果の応用を検討中である。論文1.非対称な損失関数に基づく代理変数の統計的性質、国民経済雑誌2005年
地震断層,あるいはクラックの動力学的特性に関する基礎的研究

地震断層とクラックはそのスケールこそ違うものの、同一の物理モデルで説明することができ、同じ解析法を適用して解析することができる。そこで本研究では、理論的解析においては境界積分方程式を用い、実験的解析においては、アコースティック・エミッション(AE)計測装置を用いて断層,あるいはクラックの動力学的特性を解明したものである。本研究の内容は大きく二つに分れる。一つは、地震断層やクラックによる弾性波動の散乱問題の解析であり、もう一つは、断層面あるいはクラック面上の応力分布を与えて断層並びにクラックの破壊過程を追跡する動的破壊問題である。まず、弾性波動の散乱問題の理論的解析においては、二つの相向い合う面を持った理想的なクラックを境界積分方程式により解析した。理想的なクラックに対しては、通常よく用られているGreenの変位公式のみならず、Greenの応力公式も必要であることがわかった。これは、相向い合うクラック面上には二つの未知数が存在するためである。数値解析においては境界積分方程式を一定要素近似により離散化して、平面実体波や表面Rayleigh波の散乱現象を様々なパラメータを変化させて計算した。これらの理論解析に合わせて、モデル実験も行った。PMMA板でできた供試体を用いて波動伝播実験を行い、波形処理をした後に得られた周波数応答を理論解と比較した。両者は完全には一致しなかったたが、大体の傾向は一致している。一方、断層,クラックの動的破壊問題に関しても理論と実験の両面から解析を行った。理論的解析においては、前と同様な境界積分方程式を構成し、進行する破壊現象を移動境界値問題として解析し、妥当な結果を得た。また、実験的解析においては、アクリル板の破壊実験から検出されたAEに、地震学でよく用いられる転位理論を適用して、発生したクラックの動力学的パラメータを決定した。
メキシコ発見－日本人美術家たちのメキシコ体験の研究

本研究は、美の表現の原点に話しかけるメキシコの風土を改めて知り、究めること、そして1多くの日本人が何をメキシコに見出し、どういう体験をし、どういう表現を獲得してきたかをメキシコそのものの研究からと、2いろいろな作家の個別研究の両面から追求することを目的とする。すなわち、(A)メキシコの風土、メキシコの美と特色のベースである自然、空気、色彩、神話的歴史的風土の解明と、(B)北川民次の先取的仕事からはじめ、岡本太郎、深沢幸雄、利根山光人、吉田穂高ら、メキシコにのめり込んだ美術家たちの心情、方法、作品等々の歴史的美術的考察、そして(C)日本メキシコ両国の美の交流史の構築、これらが本研究の概要である。
細胞老化による発癌促進機構の解明

細胞老化を起こした細胞では発がんの原因となるDNA損傷を引き起こす活性酸素種(ROS)のレベルが恒常的に高くなることが知られているが、そのメカニズムについては不明なままであった。今回我々は、細胞老化が起きると、p16がRB-E2F経路を介してFoxM1の発現を抑制すると同時に、AKTによりFoxO3aが失活することでROSの産生を抑制するSOD2の発現レベルが低下するためにROSレベルが恒常的に上昇することを明らかにした。更にこのメカニズムが培養細胞のみならずマウスの肝臓でも働いていることを確認しており、生体内で起こりうる発がん促進機構の一つである可能性が高い。細胞老化はこれまで重要な発癌防御機構として働いていると考えられてきた。しかし、我々は細胞老化を起こすと、染色体不安定性が亢進し、悪性腫瘍細胞としての形質を獲得しやすくなることを見出した。つまり細胞老化は短期的には癌抑制機構として働くが、長期的には発癌を促進してしまう諸刃の剣として働いている可能性が考えられる。そこで、本研究では細胞老化が有する発癌促進作用の分子機構を解明することで、未だ不明な点が多い発癌メカニズムのより完全な理解と、細胞老化の発癌促進機構のみを阻害することで効果的な癌治療法の開発に貢献できる基礎的な知見を得ることを目的とした。本年度は先ず、老化細胞が染色体不安定性を引き起こす最大の原因と考えられる活性酸素種(ROS)レベルの上昇が起こる分子メカニズムの解明と、それによるDNMT1の発現低下との関係解明を試み、次の結果を得た。(1)細胞老化を起こすとp16^<INK4a>などのCDKインヒビターの発現によりRB蛋白質が活性化されて、E2F/DP転写因子の転写活性が抑制される。このため、Lamin B1やFoxM1などの転写因子の発現レベルが低下することでROSの産生を抑制する働きがあるMnSODの発現が低下することで細胞内のROSレベルが上昇することを見出した。(2)ROSレベルの上昇は転写因子であるAP1の活性低下を起こすためにDNMTI遺伝子の転写の抑制を引き起こす。また同時に、APC/C-Cdh1の活性化を介したDNMT1の蛋白分解も引き起こすためにDNMT1の発現レベルが著しく低下することでDNA損傷シグナルが活性化されて染色体不安定性が促進されることを見出した。これまでの研究により細胞老化を起こした細胞(老化細胞)では細胞内の活性酸素種(ROS)レベルが著しく上昇するためにDNA損傷が起こり、発がんに必要な遺伝子異常が起こりやすくなることを見出してきた。本年度は細胞老化が起こると、なぜROSレベルが上昇するのか、そしてどのようにして細胞老化の不可逆性が規定されているのかについて解析を行い、以下の研究結果を得た。(1)化合物ライブラリーを用いたスクリーニングによりp16INK4aによるRBの活性化のみならず、AKTが活性化されることもROSレベルの上昇に必要であることを見出した。これはROSの産生を減らすSOD2遺伝子の発現がRBによって抑制されるFoxM1とAKTによって抑制されるFoxO3aにAKTによって維持されているためで、RB-経路だけでなくAKT-経路も活性化されることで初めてSOD2の発現が低下するためであることを見出した。(2)老化細胞ではROSレベルが高くなることにより、DNAダメージが蓄積することでATMキナーゼの活性化を通してRBが恒常的に活性化され、細胞周期が不可逆的に停止するようになることを明らかにした。AKTシグナルの存在下でRBが活性化されると、(1)に述べたメカニズムでSOD2の発現レベルが低下し、ROSレベルが更新することで、DNAに修復不可能なほど大きな損傷が起こることで細胞周期が不可逆的に停止するようになることを明らかにした。(3)上記のメカニズムは培養細胞だけでなく老齢マウスの肝臓の実質細胞でも起こっていることが明らかとなり、単なる細胞培養のアーティファクトではなく生体内でも働いているメカニズムであることが強く示唆された。このため、今後上記の細胞内シグナル経路を調節することで発がん、特に細胞老化が関与する可能性が高い加齢に伴う発がんの予防法や診断法の開発につながる可能性が期待される。これまでの研究により、細胞老化を起こした細胞(老化細胞)では細胞内の活性酸素種(ROS)レベルが著しく上昇するために、DNA損傷が起こり、発癌に必要な遺伝子異常が起こりやすくなることを見出してきた。そこで本年度は、細胞老化が起こると何故ROSレベルが著しく上昇するのかにについて、その分子メカニズムの解明を試み、以下の研究結果を得た。(1)ホルモン投与によりp16を活性化できるヒト正常繊維芽細胞を樹立し、この細胞を用いて、ホルモン投与により簡単に細胞老化を誘導できることを確認した。

さらにこの細胞を用いて、細胞老化の誘導に伴いROSレベルが上昇するメカニズムの解析を行い、細胞増殖シグナル伝達因子であるAKTと細胞周期制御因子として知られるE2Fの相互作用が重要な役割を果たしていることを見出した。(2)更に細胞老化の誘導に伴い、AKTにより活性が変化する転写制御因子群を見出し、、それらの中にはROSの産生を抑制する転写因子(JFCR311)が含まれれていることを見出した。(3)一方、細胞老化の誘導過程でp16によりE2Fの転写活性が著しく低下することが知られているが、増殖中の細胞においてはE2FがJFCR311と機能および構造が類似した別の転写因子(JFCR312)の発現を促進することでROSの産生を抑制していることを明らかにした。以上の研究結果から、細胞老化の誘導過程でAKTシグナルの活性化に伴うJFCR311の機能低下とE2Fの活性低下に伴うJFCR312の発現低下によりROSの産生を抑制する機能が破たんするために細胞内のROSレベルが著しく上昇するようになることが強く示唆された。当初目標にしていた細胞老化におけるROS産生機構の中心部分を明らかにしたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。細胞老化に伴う発癌促進機構の重要な要素の一つと考えられるROSの産生メカニズムの一端を明らかにすることができたため。今後は、Lamin B1やFoxM1の発現を調節することでROSの産生を抑制し、老化細胞における染色体不安定性を抑制できるかどうかについて検討を行う予定である。これまで明らかにした細胞老化に伴うROS産生機構とそれに伴う染色体不安定性誘発機構について、(1)先ずそれらの分子機構が培養細胞だけでなく、生体内でも起こっている現象かどうかについて、実験動物(病態モデルマウス)やヒトの臨床サンプルを用いた解析により明らかにしてゆく。(2)次にこれらの分子機構を調節する方法を開発するために、化合物ライブラリーやshRNAライブラリーを用いた解析を行い、細胞老化に伴うROSレベルの上昇を抑制する分子標的の探索を行う。
薬物代謝関連酵素の遺伝子多型解析とその個別化がん化学療法への応用

薬効や副作用には個人間変動が大きい。その要因の一つとして、薬物代謝酵素の遺伝子多型に基づく酵素活性の差が挙げられる。イリノテカンは各種腫瘍に対して高い抗腫瘍活性を示すが、骨髄抑制や下痢などの重篤な副作用が報告されている。イリノテカンによる副作用の個人差は、その活性代謝物であるSN-38の薬物動態に関連があると推測されている。SN-38の代謝的解毒過程であるグルクロン酸抱合は、グルクロン酸転移酵素(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)の分子種であるUGT1A1によって行われる。UGT1A1のプロモーター領域やエクソン領域に遺伝子多型が存在し、酵素活性が異なることが示されている。体重や体表面積によらない個別化(テーラーメード>薬物療法の確立を目指し、抗腫瘍剤イリノテカンの代謝酵素であるUGT1A1の多型別に、シスプラチン併用時のイリノテカンの第一相試験を計画した。施設内倫理委員会審査、施設内IRB審査を経て、臨床試験を開始した。これまでに3例の遺伝子解析を行ったが、現在までに第一相試験の登録に合致する症例は認められていない。本研究の要である遺伝子多型の決定を、できるだけ迅速に、かつ正確に、しかも検査室レベルで安定して判定できるシステムを確立する目的で、インベーダー法によるグルクロン酸転移酵素遺伝子多型検査法の開発を行った。1塩基多型のUGT1A1*6ならびにUGT1A1*27ばかりでなく、2塩基多型のUGT1A1*28においても、シークエンスの結果と100%の一致率で遺伝子多型検出が得られた。