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転写制御因子群による光合成装置形成のオン・オフ制御の分子メカニズムの解明

光合成装置の形成は、光合成組織である葉では活発に起こるが、発芽の初期段階や非光合成組織では抑制されている。申請者らのこれまでの研究により、光化学系サブユニットやクロロフィル合成系酵素などの光合成関連タンパク質をコードする、核ゲノムの光合成遺伝子の協調的な転写調節が光合成装置形成のオン・オフを主に制御していることが明らかになってきた。本研究では、葉緑体分化において、光合成遺伝子の協調的な転写調節に関わる転写制御因子群による光合成装置形成のオン・オフ制御の分子メカニズムの解明を目的とする。最終年度は、光合成装置形成に関与する転写因子である、GARP型転写因子Goldenー2 like(GLK)とGATA転写因子であるGNC/GNLについて、それぞれの過剰発現株(GLK1ox, GLK2ox, GNCox, GNLox)を用いて、切除根における遺伝子発現変化についてRNAseq解析を行った。多くの遺伝子は両方の転写因子に依存して発現することが明らからとなった。しかし、一部の光合成遺伝子はそれぞれの転写因子に対して特異的に応答することが認められた。以上のことから、2つのタイプの転写因子に共通した情報伝達経路と、それぞれの転写因子に特異的な経路の双方が存在することが明らかとなった。さらに発現変化を起こした遺伝子のプロモーター領域で保存されている配列を解析したところ、GLKに関して従来予測されていたGLK結合配列(CCAATC)は有意性を示さなかったのに対して、申請者らが従来から予測していた配列(CCACGT)が有意に保存されていることが分かった。以上、本研究により、光合成遺伝子の協調的な転写調節に関わる転写制御因子群による光合成装置形成のオン・オフ制御について新たなモデルを提唱することができた。光合成装置形成に関わる転写制御因子群の同定切除根における葉緑体形成機構の解明を行い、葉緑体装置形成に関わるシグナル伝達機構を明らかにした。このシグナル伝達系には、障害誘導に関わるWIND1からのサイトカイニンシグナルの活性化が重要であり、サイトカイニンシグナル伝達因子であるARR1 ARR12を介して、GARP型転写因子Golden-2 like (GLK)およびGATA型転写因子GNC/GNLを活性化することを明らかにした。一方、オーキシンの地上部からの供給が途絶えることで、独立にオーキシンシグナルによる抑制が解除され、そのシグナルが転写因子の発現レベルで統御されることを明らかにした。また光シグナルは、光受容体を介して、根では特にHY5を介して、核コード光合成関連遺伝子の活性を引き起こすことを明らかにしている。以上の結果、核コードの光合成遺伝子が活性化され、ひいてはプラスチドコードの遺伝子も活性化されることで、光合成装置形成に関わる遺伝子群の共発現系が活性化され、葉緑体の構築が進むことがあきらかとなった。光合成関連遺伝子のプロモーター領域に対する転写因子の結合および転写調節機構の解析CHLH遺伝子のプロモーター領域にレポーター遺伝子(LUC)を連結させたコンストラクトの作製を行っている。これまでに作製したコンストラクトでは、十分な応答が認められなかったため、プロモーター領域を延長したコンストラクトの再作製を行い、現在解析を行っている。当初計画していたプロモーター・レポーターコンストラクトを植物体に導入したが、予想していた応答は認められなかった。そのため、さらに長いプロモーター領域を含むコンストラクトを再構築して、植物体への導入を行っている。光合成関連遺伝子のプロモーター領域に対する転写因子の結合および転写調節機構の解析光合成装置形成に関与する転写因子である、GARP型転写因子Goldenー2 like(GLK)とGATA転写因子であるGNC/GNLについて、シロイヌナズナ切除根における葉緑体形成に及ぼす影響を昨年度に引き続き解析した。それぞれの過剰発現株(GLK1ox, GLK2ox, GNCox, GNLox)および二重変異体(glk1glk2, gncgnl)を用いて、切除根における葉緑体形成ならびに光合成遺伝子発現について解析を行った結果、多くの遺伝子は両方の転写因子に依存して発現することが明らからとなった。さらにサイトカイニン処理を行った結果、GATA転写因子の過剰発現株で顕著な葉緑体形成が認められた。また核コードの光合成関連遺伝子の発現も有意に増加していた。一方、葉緑体コードの光合成遺伝子については、異なる応答が認められた。本結果から切除根におけるサイトカイニンに依存した光合成装置の形成には、GATA転写因子が主要な働きをすることが明らかとなった。これらの光合成遺伝子のプロモーター領域におけるシス配列の解析、さらにChIP-chip解析結果を含めて、これら転写因子に対する応答機構について解析を進めている。さらに平成30年度にはRNAseqによるトランスクリプトーム解析を行う予定であり、引き続き解析を進めていく予定である。プロモーター・レポーター系を導入した形質転換体の作製に時間が取られているが、他の実験結果により、有意な成果が得られており、総合的には順調に進展していると言える。

最終年度は、光合成装置形成に関与する転写因子である、GARP型転写因子Goldenー2 like(GLK)とGATA転写因子であるGNC/GNLについて、それぞれの過剰発現株(GLK1ox, GLK2ox, GNCox, GNLox)を用いて、切除根における遺伝子発現変化についてRNAseq解析を行った。多くの遺伝子は両方の転写因子に依存して発現することが明らからとなった。しかし、一部の光合成遺伝子はそれぞれの転写因子に対して特異的に応答することが認められた。以上のことから、2つのタイプの転写因子に共通した情報伝達経路と、それぞれの転写因子に特異的な経路の双方が存在することが明らかとなった。さらに発現変化を起こした遺伝子のプロモーター領域で保存されている配列を解析したところ、GLKに関して従来予測されていたGLK結合配列(CCAATC)は有意性を示さなかったのに対して、申請者らが従来から予測していた配列(CCACGT)が有意に保存されていることが分かった。以上、本研究により、光合成遺伝子の協調的な転写調節に関わる転写制御因子群による光合成装置形成のオン・オフ制御について新たなモデルを提唱することができた。研究計画に従って、研究を遂行する。来年度におけるRNAseqによるトランスクリプトーム解析のために多額の研究費を必要とするため、今年度は科研費の使用額を出来るだけ抑えることとした。
中近世移行期の絵屋の活動と大名コレクションにみるイメージ循環の研究

2018年度前半は、前年度までの研究成果の一つとして、物語絵の普及と扇の関わりについての論文「扇と物語絵に関する一考察」(『金城学院大学論集(人文科学編)』第15巻第一号2018.9145156頁)を刊行した。大名道具に関する研究としては、「尾張徳川家の大名道具に見る八幡信仰家祖尊崇との関わりから」(『説話文学研究』第53号2018.8 3647頁)を刊行した。また、宇治市源氏物語ミュージアムの連続講座にて「描かれた光源氏のものがたり源氏絵の系譜」という講演を行い、同館所蔵の「源氏物語画帖」について他作品との比較研究を行った。発表内容は現在論文として執筆中である。後半は、アメリカにおける源氏絵の調査を集中的に行った。これまで詳細な研究がなされていない作品も多く、今後美術史的な位置づけを検討していく為に必要な基本的なデータを収集した。主な調査作品は以下の通りである。【フリーア美術館・ミネアポリス美術館・メトロポリタン美術館・ニューヨーク市立公共図書館・ハーバード大学美術館・フィラデルフィア美術館・ブリンマー大学図書館】調査作品のうち、ミネアポリス美術館の土佐光成筆「源氏物語色紙貼交屏風」、メトロポリタン美術館の伝海北友雪筆「源氏物語絵巻」に関しては、論文・口頭発表の形で成果を発表する準備を進めている。2018年度中、在米研究の成果の一部を、研究集会「フリーア美術館所蔵作品を通した日本絵ものがたり文化遺産の発見ー絵巻を中心にその世界を探求するー」(2019年3月20日・於フリーア美術館)において「フリーア美術館所蔵「酒呑童子絵巻」について」と題して発表した。同発表では、フリーア美術館所蔵の「酒呑童子絵巻」のディテール表現に着目し、絵巻の発注者に関する推論を述べた。2018年度は、計画段階から予定していた在米調査を行うことができた。海外調査は2017年度に予定していたが、2018年度に本務校での半期の特別研究期間(サバティカル)を取得することとなったため、2018年度に集中して行った。結果として、当初予定していなかった美術館等でも、関連作品を調査することができ、成果が得られた。最終年度となる今年度は、研究テーマに沿った作品調査を継続して行いつつ、これまでの調査結果をふまえて、論文等の形で成果を発表していく。現在、フリーア美術館所蔵「酒呑童子絵巻」、宇治市源氏物語ミュージアム所蔵「源氏物語画帖」、ミネアポリス美術館所蔵「源氏物語色紙貼交屏風」、メトロポリタン美術館所蔵「源氏物語絵巻」に関する論文・書籍の刊行に向けた準備を進めている。2017年度は、本研究が対象とする中近世移行期(1617世紀)のやまと絵作品のうち、主として源氏絵の作品調査を行った。調査を実施した作品は、「源氏物語図屏風」(今治市河野美術館蔵)、「白描源氏物語絵巻」(逸翁美術館蔵)、「源氏物語図屏風」(東京富士美術館蔵)、「源氏物語画帖」(宇治市源氏物語ミュージアム蔵)、「源氏物語図扇面貼交屏風」(和泉市久保惣美術館蔵)である。本研究の計画に掲げているテーマのうち、「流派間のイメージ循環と絵屋の活動の研究」に関しては、今治市河野美術館本と東京富士美術館本の調査を通じて、中近世移行期における土佐派と狩野派などの他流派の特色が交差する様相が看取され、さらに他の作例とも比較をしていく必要性が浮き彫りになり、研究を発展させる課題が得られた。また、「イメージ循環をもたらした媒体の研究」としては、本研究が重要な媒体として着目している扇面画に関して、久保惣本の調査を行ったほか、金城学院大学図書館所蔵の「源氏物語図扇面」を精査して、同作品は、室町時代以降の源氏絵の図様を継承する一方、歌絵の表現が見られるなど、扇という媒体そのものの特性とも関わる要素が見られることを指摘し、中近世移行期の源氏絵扇面の特色を示す作品であることを明らかにした。その内容については、論文「金城学院大学図書館所蔵「源氏物語図扇面」について」『金城日本語日本文化』第94号、金城学院大学日本語日本文化学会、2018年3月1日、pp.15-38)として発表した。「大名道具におけるイメージ循環の研究」に関しては、すでに調査を行っている尾張徳川家伝来の作品について、改めて画像を整理し、次年度以降の研究の準備を行った。2017年度に海外(アメリカ)の美術館での調査を予定していたが、2018年度に実施を延期したため。2018年度は、本務校において特別研究期間を取得できることとなり、より時間的な余裕をもって調査を行うことができると判断し、計画を変更した。

これまで詳細な研究がなされていない作品も多く、今後美術史的な位置づけを検討していく為に必要な基本的なデータを収集した。主な調査作品は以下の通りである。【フリーア美術館・ミネアポリス美術館・メトロポリタン美術館・ニューヨーク市立公共図書館・ハーバード大学美術館・フィラデルフィア美術館・ブリンマー大学図書館】調査作品のうち、ミネアポリス美術館の土佐光成筆「源氏物語色紙貼交屏風」、メトロポリタン美術館の伝海北友雪筆「源氏物語絵巻」に関しては、論文・口頭発表の形で成果を発表する準備を進めている。2018年度中、在米研究の成果の一部を、研究集会「フリーア美術館所蔵作品を通した日本絵ものがたり文化遺産の発見ー絵巻を中心にその世界を探求するー」(2019年3月20日・於フリーア美術館)において「フリーア美術館所蔵「酒呑童子絵巻」について」と題して発表した。同発表では、フリーア美術館所蔵の「酒呑童子絵巻」のディテール表現に着目し、絵巻の発注者に関する推論を述べた。2018年度は、計画段階から予定していた在米調査を行うことができた。海外調査は2017年度に予定していたが、2018年度に本務校での半期の特別研究期間(サバティカル)を取得することとなったため、2018年度に集中して行った。結果として、当初予定していなかった美術館等でも、関連作品を調査することができ、成果が得られた。当初の計画では、2017年度に海外調査を行う予定であったが、本務校にて2018年度に特別研究期間が得られることが決まったため、より時間的に余裕がある2018年度に延期した。2018年度は、フリーア美術館(アメリカ)にて長期の調査を行う予定である。同館には2017年度中に、本科研の研究を軸にした研究計画「A study on the effect of the circulation of imageson narrative paintings in seventeenth century」を提出し、受け入れが決まっている。同館が所蔵する、源氏絵や奈良絵本など中近世移行期の物語絵を中心に作品調査を行う予定である。その他、国内調査に関しては、海の見える杜美術館、熊本大学図書館(永青文庫)ほかを予定している。研究成果の発表については、宇治市源氏物語ミュージアムでの講演や、論文執筆を通じて行う予定である。最終年度となる今年度は、研究テーマに沿った作品調査を継続して行いつつ、これまでの調査結果をふまえて、論文等の形で成果を発表していく。現在、フリーア美術館所蔵「酒呑童子絵巻」、宇治市源氏物語ミュージアム所蔵「源氏物語画帖」、ミネアポリス美術館所蔵「源氏物語色紙貼交屏風」、メトロポリタン美術館所蔵「源氏物語絵巻」に関する論文・書籍の刊行に向けた準備を進めている。2017年度に予定していた海外調査を2018年度に延期し、PCの購入についても、海外調査にあたってより相応しいものを検討すべく2017年度の購入を見送ったため、次年度使用額が生じた。2018年度は、海外調査の準備(機材の購入等)や旅費等で使用する見込みである。旅程および資料所蔵先の都合により、2018年度の調査地をアメリカ東海岸を中心にまとめることとなったため、旅費として計上していた額を支出が下回った。
新言語形成の１類型－極北の言語ドルガン語をモデルとして－

本研究課題では、極北のチュルク系小言語ドルガン語の形成について、20世紀初頭にトゥルハンスク地方の言語調査記録を残したK.M.ルチコフによる資料に基づき分析した。これらの資料を詳細に分析することで、形成期のドルガン語は、現代ドルガン語文語(標準語)とは少なからぬ差異を有し、その形成に関わった異系統言語との接触の痕跡をよく反映していたことが明らかになった。また、言語生態、即ち、「形成ー発展ー衰退ー消滅の危機」に言語コミュニティの置かれた社会的政治的状況が及ぼす影響についても分析を進めた。計画の初年度である25年度はロシア科学アカデミー東洋文献研究所古文書部に所蔵されている20世紀初頭のルチコフ辞書カードに記載されたドルガン語彙と現代のドルガン語話者から得た語彙データを対照し、まず、現代ドルガン語とルチコフ辞書のドルガン語彙の差異を整理した。ルチコフ辞書のドルガン語も現代語と同じく、その形成の中心的基盤となったヤクート語来源の語彙が大多数を占めてはいるが、中にはルチコフ辞書のみに見られる来源不明の語彙もある。これらは、ドルガン語形成に関わった周囲に位置する言語にその来源を見出せる可能性もある。初年度は、主に、現代ドルガン語との差異を整理し、ルチコフ辞書に散見される現代ドルガン語あるいはヤクート語から逸脱した形式について、検討した。その際には、言語学的資料のみではなく、民族学などを中心した学術資料の他に、特に帝政ロシア時代のシベリア探検家の遺した資料や旅行記等も参照した。来源を求める作業については、アルタイ諸言語についての資料は数量は多くはないものの比較的利用し易かったが、当時のドルガン人等が比較的密に接触していたガナサン語の資料や、地勢的にみてかつて接触していた可能性のあるエニセイ諸言語についての資料に利用できるものが少なく、不明語彙についてあまりその来源を確認できたとは言えない。しかし、現代ドルガン語との語彙形式との相違から、ルチコフの調査した時期のドルガン語は、現在タイムル地方で使用されているヤクート語彙に非常に近いドルガン語彙とは異なる点が様々にみられることがわかった。今年度の成果の一部は10月に北京市の中央民族大学で講演した。また、ドルガン語をチュルク語の一つとして言語接触の観点から分析していく上で重要な歴史言語学的視点からの言語生態にも関わる分析研究を研究協力者等と数回の研究会を重ねて行い、成果をまとめることができた。26年度は予定どおり、20世紀初頭のドルガン語語彙を収録したルチコフ資料の分析を進めた。特に、26年度は、ドルガン語形成に関わった言語として常に挙げられているヤクート語(ドルガン語の基盤となって言語)、エベンキ語、さらにロシア語の関与に加えて、サモエード系のガナサン語の関与について分析を試みた。ルチコフによる調査当時のトゥルハンスク地方の地域事情をまとめた資料には、ドルガン人とガナサン人の接触が決して少なくはなかったことが記録されている。ルチコフ資料のドルガン語には現代ドルガン語にはない特徴がいくつかあり、これらの中にはガナサン語の影響と考えられる点もあり、ドルガン語形成に具体的に関与した言語の果たした役割が部分的に明らかにできた。これらについては、2本の論文にまとめて発表した。この研究課題の目的は、ドルガン語をモデルとして新言語の形成について一つの類型を提出することであるが、その様相を示す一例として、26年度後半には、ルチコフ資料にみる約100年前のドルガン語が現代の標準ドルガン語と異なる点に着目した。帝政ロシア時代にドルガン語形成の基盤となったヤクート語がソビエト政権樹立後にドルガン語に対して言語規範、即ち文語として「再」接触し、その結果、現代ドルガン語文語(標準ドルガン語)が成立するに至った。この、ルチコフ資料のドルガン語から現代ドルガン語成立への直線的ではない言語の発展について指摘した。この点については年度末のユーラシア言語研究コンソーシアム年次総会にて研究発表を行った。なお、昨年度に引き続き、チュルク系言語、特にウイグル語にまつわる言語接触に関する研究についても参加し、言語生態についての知見を得る機会を積極的に持つよう心がけた。本年は最終年度であるので、主に研究成果をまとめるための補充調査を行いつつ、研究成果の修正とデータ分析結果の構築を行った。また、本研究課題を含むユーラシア諸言語研究グループが構成しているConsortium for the Studies of Eurasian Languagesを拠点として、電子媒体による研究成果公表のためのプラットフォーム(HP)を、本研究課題並びに他のアルタイ諸言語研究プロジェクトともに共同で作成した。順次、研究成果を公開していき、さらなるユーラシア諸言語研究の発展につなげていきたい。今年度の成果をやや具体的に述べると、前年度に引き続き、ルチコフ資料の分析により、その反映しているドルガン語形成過程について具体的な知見を得ることができた。ドルガン語に関するK.M.ルチコフの収集した言語資料で現時点で閲覧可能であるのは1534枚から成るカード式辞書がそのほとんどである。前年度までは、主にこのカード式資料に基づいた分析を行い、今年度も継続して、これに取り組んだ。一方、ロシア科学アカデミー東洋文献研究所での補充調査の折に、ルチコフ資料の大半を占める北部域のツングース系言語(20世紀初頭当時のトゥルハンスク地方のエベンキ語)資料の中に、チュルク系言語の調査記録資料をみることができた。

この資料は、「唄」と題した小見出しの下に収録されたもので、全体としてはドルガン語もしくはその基盤となったヤクート語で記録されたテキストであるが、随所にエベンキ語やロシア語の要素など、ドルガン語形成に関与した諸言語に来源を持つフレーズが観察された。内容としては婚礼にまつわる内容であるが、このようなチュルク系言語(ヤクート語)をベースにしながら、異系統言語を含むテキストはドルガン語形成期の記録として大変に貴重であり、3年間の研究成果の一端としても早期に出版する予定である。本研究課題では、極北のチュルク系小言語ドルガン語の形成について、20世紀初頭にトゥルハンスク地方の言語調査記録を残したK.M.ルチコフによる資料に基づき分析した。これらの資料を詳細に分析することで、形成期のドルガン語は、現代ドルガン語文語(標準語)とは少なからぬ差異を有し、その形成に関わった異系統言語との接触の痕跡をよく反映していたことが明らかになった。また、言語生態、即ち、「形成ー発展ー衰退ー消滅の危機」に言語コミュニティの置かれた社会的政治的状況が及ぼす影響についても分析を進めた。26年度も予定どおりルチコフ資料の言語学的分析と、ルチコフ資料のドルガン語に反映されている20世紀初頭の言語状況をもとに現代ドルガン語へ至る発展のプロセスの分析を進めることが出来ている。シベリアの諸言語研究27年度は最終年度であるので、ルチコフ資料ドルガン語辞典をその研究分析とともに公刊したい。そのために、26年度までの分析研究において確認、修正が必要な点を年度の早期にまとめ、秋以降にサンクトペテルブルグでの原典の補充調査を予定している。また、20世紀初頭から現代に至るロシア十月革命後のロシア・ソビエト時代の少数民族教育政策、行政区画再編その他のドルガン語コミュニティの置かれた言語外的環境についても調査分析を進める。国内では北海道大学スラブユーラシア研究所などの資料も利用する予定である。なお、言語生態の分析に資するため、古代チュルク語(ウイグル語古文献)資料の分析も引き続き行う。2016年初め頃までに1.ルチコフ資料解題、2.ドルガン語生態研究、3.少数民族言語の生態1類型提出、4.ルチコフ資料(ドルガン語辞書)語彙リストを骨子にまとめ、2016年度には研究資料成果公開促進費の取得につとめたい。ルチコフ資料の分析について順調に進めているが、言語資料不足、あるいは、19世紀20世紀初頭の雑誌や書籍の資料の入手が難しいなどにより、やや手間取ることがある。とはいえ、ドルガン語の言語生態について、サモエード系言語の影響が現れていると伺われる部分について具体的に分析を進めるなどが出来ている。また、これまで埋もれていたルチコフ資料について研究を公表する準備が進んでいるため、本研究課題の目的に向かって概ね順調に進展していると考えている。。欧州で最近出版された言語学関連書籍を購入予定であったが、当該年度内に注文した書籍が届かなかったため、その購入費用を支出することが出来ず、次年度に送らざるを得なかった。今後も引き続き、ルチコフ資料の分析を続けるが、26年度はさらにルチコフ辞書のドルガン語形式が得られた背景について考察を重ね、この資料を介して明かにできる、いわばプロト・ドルガン語の姿をまとめたい。
ニュ-メディア利用による健康管理システムの検討

本研究は、健康管理のための情報システムを構築するにあたり、その効用、効率を高めると思われるニュ-メディアを利用することを検討すると同時に健康管理に必要な情報は何かということを検討することを目的とし2年間の研究補助を受けた。健康管理情報の情報管理におけるニュ-メディアの利用方法としては「集中管理」と「分散管理」および「共通管理」の三部に分けて考えることを提唱し、その三種の管理の中で一年目は集中管理におけるニュ-メディアの利用法、二年目は分散管理における利用法を検討した。集中管理におけるニュ-メディアの利用は、大容量の記録媒体としての光ディスクや光磁気ディスクの利用が中心で、特にこれまで健康管理情報システムに不足していた画像情報の記録すなわち画像デ-タベ-スとして利用できるシステムを構築した。分散管理におけるニュ-メディアの利用としてはカ-ドメディアの利用の検討であり、そのカ-ドメディアとして光カ-ドとICカ-ドのどちらを採用するかという選択の問題があったが、記憶容量と価格で現在の状況では優れている光カ-ドを採用したシステムを構築した。このシステムのモデル運用として健康管理のモデル地域として検討を行ってきている住民の健康検診情報を対象としておこなった。問題としては、もう一つの管理方法である「共通管理」としてのデジタル通信網の利用の検討がされていないことと、本研究のもう一つの目的である「情報の選択」の検討結果がでていないことであるが、これ等はある程度の情報の量および質の蓄積が行われたの後の課題となる。本研究は、健康管理に必要な健康管理情報を処理するための手段として、技術革新がめざましいコンピュ-タを巡る、各種の新しい情報メディア(いわゆるニュ-メディア)の利用がどの様に有効であるかまたどの様に利用する事が効率的であるかを情報の集中管理と分散管理の両面に亙って検討するものである。本年度はその一面である集中管理におけるニュ-メディアの利用についての検討を中心に行った。具体的には、大量の情報を管理する媒体としてニュ-メディア記録媒体を利用した健康管理情報処理システムを構築することであった。本年度に構築を行ってきたシステムは、追加書き込みのできる光ディスクと書き直しも出来る光磁気ディスクの両方の記録媒体を用いたシステムである。二つのメディアを採用したのは多量の情報を記録することを優先すればアナログ記録方式の光ディスクが有利になるが、健康管理情報の中の画像情報の扱いは、いわゆる画像処理をも行えることを考慮してディジタル方式の記録も検討すべきと考えたからである。ソフトウエアについては、一般的なデ-タベ-スにおける検索の方法を中心に開発してきているが、将来ディジタル方式で多量の情報の記録が可能になった時には、画像処理技術を利用した検索のソフトウエアをも開発する事も考慮して置くべきと思われる。この構築にあたっての問題は、情報の長期利用という観点から、メディアの互換性というものが大きな比重を占め、メディアの標準化等の動きは本研究の進展およびその結果の将来性に大きく影響するので、そのため研究対象として試用すべきメディアの将来性を考慮しすぎて選択が慎重になるざるを得ない点である。本研究は、健康管理のため情報システムを構築すると同時に健康管理に必要な情報は何かということを検討することを目的とし2年間の研究補助を受け、今年は2年目にあたる。前年度は、我々が提唱している健康管理情報システム構想のなかで健康管理情報の集中的管理システムについて検討したが、本年は分散管理システムの検討をおこなった。研究内容は、まず分散管理のためのニュ-メディアとして光カ-ドとICカ-ドのどちらを採用するかという選択の問題があり、次にこのカ-ドメディアを利用した健康管理システムを作成し、実際にこのシステムを運用の中でその技術的問題と健康管理という医学的問題の両面での問題の検討を行った。具体的には、1)カ-ドメディアとしては記憶容量と価格でICカ-ドより光カ-ドの方が現在の状況では優れているので本研究では光カ-ドを採用した。2)この光カ-ドを利用したシステムは、我々が健康管理モデル地区として研究を続けている地域住民を対象にした健康管理システムのサブシステムとして作成した。

すなわち毎年この地域で行っている集団健康健診の情報を住民一人一人に発行する光カ-ドに転送し、この光カ-ドの中の情報を使って、健康指導を効果的かつ効率的に行えるプログラムを作成した。このシステムの運用の利点としては1)住民の健康健診のデ-タの理解が深まった。2)このカ-ドを利用するという過程のなかで、集団健康健診自体の運営のあり方を再検討する必要があることが認識された。
腎細胞癌に対する血管新生阻害剤の効果

転移性腎細胞癌に対する標準的治療法は確立されておらず、現時点では、主にIFN-αが有効とされて臨床で使用されているが、その有効率は20%以下であり、決して満足すべき成績とはいえず、腎細胞癌に対する新たな治療法(薬)の開発は、焦眉の急となっている。本研究では,IFN感受性および抵抗性ヒト腎細胞癌株を用いて,血管新生阻害剤TNP-470の抗腫瘍効果を評価し、TNP-470の有用性について検討した。まず、In vitroにおける血管新生阻害剤TNP-470の細胞増殖抑制効果を細胞数カウントおよびMTT assayで測定し比較検討したところ、IFN抵抗性および感受性ヒト腎細胞癌株ともに、高用量では細胞増殖抑制がみられた。低用量では静細胞的抑制であったが、高用量では殺細胞的抑制が認められた。また、IFN感受性および抵抗性ヒト腎細胞癌株をヌードマウスの皮下に移植し、皮下腫瘤を形成させ、形成された腫瘤に対するTNP-470の腫瘍縮小効果を検討した。無処置群のコントロールに比べ、TNP-470投与によって、IFN感受性のみならずIFN抵抗性ヒト腎細胞癌株においても著明な腫瘍縮小効果が観察された。以上より、血管新生阻害剤TNP-470は、IFN感受性のみならずIFN抵抗性ヒト腎細胞癌株に対しても著名な抗腫瘍効果を発揮することが確認され、腎細胞癌に対する新たな治療薬として期待し得ることが示唆された。
オンライン・コンディンションモニタリングのためのハイブリッド油中粒子分析装置の開発

(1)油中摩耗粉の粒子径計測情報に粒子形状パラメータを付与して、高度な潤滑診断システムを構築することを目的に、オンライン計測可能な画像処理装置を試作した。種々の形状の計測管路を製作試行し、画像処理装置の計測精度の確認と摩耗粉の計測時の姿勢が計測精度に与える影響を明らかにした。その管路を用いた画像処理システムを製作し、オンライン計測に対応できることを示した。(2)粒子形状特徴から気泡と摩耗粉の識別を可能にするプログラムソフトを完成させた。(3)パーティクルカウンターと画像処理装置を複合化したハイブリッド油中粒子分析装置を試作し、そのコンピュータ処理のアルゴリズムを完成させた。(4)(3)の試作装置を、軸受メタル(WJ2)の潤滑摩耗試験に適用した。その結果をSEM観察などの結果と比較して、ハイブリッド分析装置が摩耗粉と気泡を判別し、また個数分布の変化と形状情報(摩耗粒子のアスペクト比と複雑度)を結合することにより、摩耗の経時変化を検知できることを明らかにした。(5)摩耗粉形状と摺動部の損傷状態に関するデータベース構築のために、試作した画像処理装置を用いて、摩耗粉の個数分布の変化と形状情報(アスペクト比、複雑度)を集積した。以上より、試作の画像処理装置を用いて、潤滑油中の特徴的な形状の摩耗粉をモニタリングしその発生割合を把握すれば、摺動面の摩耗状態を診断できることが明らかになった。(1)オンライン油中粒子計測情報に摩耗粉の形状パラメータを付与し、高信頼性の潤滑診断システムの構築を目的に、オンライン計測可能な画像処理装置を試作した。画像処理のための種々の形状の計測管路を製作試行し、球形、不定形の粒子を用いた較正試験により、画像処理装置の計測精度の確認と摩耗粉の計測時の姿勢が計測精度に与える影響を明らかにした。その管路を用いた画像処理システムがオンライン計測に対応できることを示した。(2)形状特徴から気泡と摩耗粉の識別を可能にするプログラムソフトを完成させた。(3)パーティクルカウンターと画像処理装置を複合化したハイブリッド油中粒子分析装置を試作した。その結果をSEM観察などの結果と比較して、ハイブリッド分析装置が摩耗粉と気泡を判別し、また個数分布の変化と形状情報(摩耗粒子のアスペクト比と複雑度)を結合することにより、摩耗の進行に伴う摩耗状態の変化を検知できることを明らかにした。(1)オンライン油中摩耗粉計測情報に摩耗粉形状のパラメータを付与し、高度な摺動面劣化診断システムを構築するために、昨年度試作した摩耗粉画像処理装置の改造を行った。さらに、パーティクルカウンタと結合するためのコンピュータ処理のアルゴリズムを完成させハイブリッド分析装置の試作を行ったが、当初の計測仕様を満足させる装置の完成には至らなかった。(2)摩耗粉形状と摺動部の損傷状態に関するデータベース構築のために、軸受メタル(WJ2)の潤滑摩耗試験を広範な摩擦条件下で行った。(1)で試作した画像処理装置を用いて、摩耗粉の個数分布の変化と形状情報(アスペクト比、複雑度)を集積した。また、並行して、軸受メタル摩耗面のすベリ距離による変化を観察し、特徴的な摩耗形態(凝着摩耗、溶融摩耗)を判別して、全摩耗面積に占める割合を定量化し、摩耗粉形状のそれとの相関性を考察した。その結果、厳しい摩擦条件下の負荷荷重500N(面圧13.1MPa)では、摩耗面の75%が溶融摩耗、20%が凝着摩耗であり、それに対応して特徴的な摩耗粉(溶融摩耗粉:丸みを帯びた粒子、凝着摩耗粉:アスペクト比が大きく複雑度が小さい粒子)が発生していることがわかった。以上より、試作の画像処理装置を用いて潤滑油中の特徴的な形状の摩耗粉をモニタリングしその発生割合を把握すれば、摺動面の摩耗状態を診断できることが明らかになった。
冷陰極型薄膜電子放射素子の研究

交流冷陰極型電子放射素子は筆者等とMuller等の2つのグループから同時に提案された。本研究は、その動作機構の解明と、これに適した材料探索を目的とした研究の一環である。交流型薄膜電子放出素子について、我々は次のような動作モデルを考えている。電子加速層と絶縁層(電子ブロック層)の2つの薄膜を上下の電極で挟んだ構造の素子に、ピーク値が加速層の耐電圧を越える交流電圧を加えたとき、上部電極が負のときに注入された電子は加速層を横断し、絶縁層との界面に蓄積される。続く後半の半サイクルで電界が反転し耐電圧を越えたとき、蓄積電荷は電子雪崩による増培を受けつつ上部電極へ到達し、高エネルギーの電子の一部は極めて薄い金属膜の上部電極を抜けて真空中へ放出される。今回の試作素子の加速層には硫化物、セレン化物、有機LB膜、酸化物を用い、それらの蓄積電荷量と放出電子電流などの測定から、動作特性を調べた。その結果、硫化物、セレン化物、有機LB膜を加速層とした素子では、加速層の電界が耐電圧を越えたところで蓄積電荷量の急激な増大と電子放射が認められ、モデルが検証された。酸化物を加速層とする素子では、先の3種とは違った特性を示した。すなわち電圧に対する蓄積電荷の増加はなだらかで、雪崩電圧のようなものは認められず、電子放出も比較的低い電圧で起こる。また、放出電流が高周波で減少することも他の材料とは逆である。これらの結果は、時間応答が遅く閾値電圧を持たない吸収電流が電子放射に関与していることを示唆している。よって、酸化物の場合には一層構造の非絶縁型素子でも電子放出が可能と考えられたので、素子を試作し測定したところそれが確認された。このように無機物、有機物の誘電体薄膜について電子放射が確認されたことから、交流駆動型の電子放射現象は広く誘電体一般について起こり得る現象と考えられる。本研究は、新しい冷陰極型電子放射素子に関する基礎研究であるが、先ず、素子の試作を行うために、平成4年度は、素子製作のための設備の整備に当てた。試作素子は、ガラス基板上に蒸着で作られた上下電極層、絶縁層、電子加速層などの結晶薄膜により構成されるので、各層の製膜のために、次の二つの蒸着装置を製作した。また、試作素子の電子放射特性や電子エネルギー分布の測定のための装置も準備した。1.加速層蒸着装置硫化物薄膜結晶の電子加速層の製膜には電子ビーム(EB)蒸着法が適しており、このため手持ちの真空排気装置にEB蒸着装置を付設した。電子銃には市販の2kWのものを用い、ビームターゲットの部分を特殊構造に改めることにより、4種類の薄膜を連続作製できるようにした。また、ビームスポットの移動により蒸着効率を高めるために、加速電圧が可変なEB電源を設計製作した。2.絶縁層蒸着装置絶縁層には、自作の高周波スパッタ装置により酸化タンタル膜を製膜する計画であったが、製膜効率が良くないので、当面はEB蒸着の酸化イットリゥム膜を用いる事にして、酸化物用のEB蒸着装置を用意した。しかしこの材料は絶縁性能が酸化タンタルに劣るので、スパッタ装置の改良も続けている。3.電子エネルギー分布測定装置試作素子の放射効率や放射電子エネルギー分布を測定するための装置(高真空装置、パソコン利用データ収録装置)も大部分が完成した。平成5年度以降も予定通り、素子の製作と放射特性の測定に進めると思われる。

本研究は、課題担当者らが提案している誘電体薄膜を用いる交流冷陰型電子放射素子について、その動作機構の解明、放射効率の改善、これまでに動作が確認されている硫化物結晶以外の薄膜材料の探索などの研究の一環である。2年目(最終年度)に当たる本年度の具体目的は、平成4年度に製作した電子ビーム蒸着装置を用いて放射素子を試作し、その動作機構や材料による特性の違い等を明らかにすることであった。結論としては、十二分にその目標を達成することが出来たといえる。試作した交流型薄膜電子放出素子は、硫化物、セレン化物、酸化物、ポリイミドLB膜等の種々の誘電体膜を電子加速層とし、これと絶縁層との積層膜を上下の電極で挟んだ構造である。これら試作素子について真空中への放出電子電流や1サイクル毎に素子内を移動する電荷量などを測定し、その動作特性を調べた。その結果は、ZnS、ZnSeを用いた素子では、印加電圧が加速層の電子雪崩電圧を越えると移動電荷量の急激な増加と電子放射が起こることが確認された。また、ポリイミドLB膜を電子加速層に用いた素子でも同様の動作が認められたが、効率はかなり低い。酸化物(Al2O3、Y2O3)を電子加速層とする素子は、先の3つとは違った特性を示した。すなわち印加電圧に対する移動電荷の増加はなだらかであり、雪崩電圧のようなものは認められず、電子放出も比較的低い電圧で起こる。また、放出電流が高周波で減少することも他の材料とは逆であり、これらの結果は、時間応答が遅く閾値電圧を持たない吸収電流が電子放射に関与していることを示唆している。以上の結果は、応用物理学会とうの学術講演会や論文誌に報告すべく準備中である。
新規白血球表面抗原ＬＲ１１の白血病および正常造血における役割の解明

LR11はこれまで動脈硬化やアルツハイマー病などとの関連が報告されている分子であるが、我々はLR11が白血病細胞においても高発現する事を明らかとした。このため、白血病細胞においてどのような機能を持つのか以下の解析を行った。レンチウイルスによるLR11のノックダウンにより接着能や遊走能の低下を認めた。また過剰発現系では接着能および遊走能の亢進を認めた。細胞株を低酸素環境に置くことによってLR11の発現が亢進することが判明し、HIF-1が関与することを明らかにした。また、LR11をノックダウンした細胞株を免疫不全マウスに移植したところ、コントロール群に比べ、明らかに生存期間の延長を認めていた。1.白血病細胞株を用いた検討:レンチウイルスによるLR11のノックダウンにより接着能や遊走能の低下を認めた。細胞株を低酸素環境に置くことによってLR11の発現が亢進することが判明し、これにHIF-1が関与することを明らかに出来た。また、LR11をノックダウンした細胞株を免疫不全マウスに移植したところ、コントロール群に比べ、明らかに生存期間の延長を認めていることが分かった。白血病細胞株を移植した後の生着に関する検討では、LR11をノックダウンすることによって、生着細胞の頻度が低下することが分かった。これらの結果からはLR11が接着や遊走に関与し、それが移植後の生着に関わっている可能性が考えられる。LR11の中和抗体を用いてLR11を中和した際に白血病の進展にどのような影響を与えるのか検討を行っている。2.LR11ノックアウトマウスを用いた検討:LR11ノックアウトマウス由来の造血前駆細胞を用いてレトロウイルスを用いたMLL-AF9白血病モデルを作成し、移植を行う実験系を確立した。現在生存期間などに与える影響を解析中である。白血病細胞株を用いた検討:レンチウイルスによるLR11のノックダウンにより接着能や遊走能の低下を認めた。細胞株を低酸素環境に置くことによってLR11の発現が亢進することが判明し、これにHIF-1が関与することを明らかに出来た(Nishii et al. J Biol Chem. 2013Apr 26;288(17):11877-86.)。また、LR11をノックダウンした細胞株(U937)を免疫不全マウスに移植したところ、コントロール群に比べ、明らかに生存期間の延長を認めていることが分かった。この際、LR11ノックダウンをした細胞とコントロール細胞とで細胞増殖に差がなかったことから、移植後の生着に差があるのではないかと考え、追加検討を行った。U937を用いたマウス移植モデルにおける生着の検討の結果、LR11をノックダウンすることによって、骨髄および脾臓への生着細胞の頻度が低下することが分かった。これらの結果からはLR11が接着や遊走に関与し、それが移植後の生着に関わっている可能性が考えられた。(2012年米国血液学会総会および2013年日本血液学会学術集会にて発表)さらに、MLL-AF9を用いたマウス白血病モデルにおいてもLR11ノックアウトマウス由来の細胞を用いた場合とコントロール群とで差が起こるか解析を行っている。(未発表データ)LR11はこれまで動脈硬化やアルツハイマー病などとの関連が報告されている分子であるが、我々はLR11が白血病細胞においても高発現する事を明らかとした。2.LR11ノックアウトマウスを用いた検討:LR11ノックアウトマウスからCD34-KSL細胞をソーティングし、Ly45.2マウスに移植を行ったところ、LR11ノックアウトマウス由来の細胞は移植後早期は高いクローナリティを示すことが判明した。一方、LR11ノックアウトマウスの骨髄よりc-kit

陽性細胞を分離し、MLL-AF9遺伝子をレトロウイルスにて遺伝子導入したところ、colony assayやreplating assayではコントロールと比べ細胞数に変化は認めなかったものの、この細胞をLy45.2マウスに移植したところ、白血病細胞株と同様に、LR11ノックアウトマウス由来の細胞を移植した群は白血病を発症せず、生存期間が延長することが判明した。これらの結果を総合すると、LR11遺伝子は白血病細胞において、接着や遊走などの制御に関わっている分子の一つであると考えられ、このことから、白血病治療のターゲットになり得るものと考えている。今後化学療法などを組み合わせた実験を行っていく予定である。低酸素環境におけるLR11発現亢進と接着能に関する解析についての解析は既に論文化し、The Journal of Biological Chemistryに受理されている。現在は、白血病マウスモデルを用いた検討を継続しており、共同研究を行っている製薬メーカーから中和抗体の供与を受け、治療ターゲットになりうるかどうかの検討を行っており、これらの作業についても順調に進捗していることから、概ね順調に進展していると考えている。低酸素環境におけるLR11発現亢進についてと、LR11による細胞接着や遊走能の制御に関しては現在論文を作成中であり、今年度中に投稿予定である。LR11ノックアウトマウスを用いたMLL-AF9による白血病モデルは当初の予定では2年目以降に行う予定であったが、すでに二次移植まで行ってデータ収集を行っているところである。今後も繰り返して実験を行い再現性を確認する必要があるものの、当初の予定よりも進展していると考えている。LR11ノックアウトマウスや白血病細胞株を用いた移植実験を繰り返し行い、再現性を確認するのと同時に、LR11の中和抗体や抗がん剤による治療を組み合わせて行い、抗がん剤への感受性に変化が起きるのかどうかを確認する予定である。LR11ノックアウトマウスや白血病細胞株を用いた移植実験を繰り返し行い、再現性を確認するのと同時に、抗がん剤による治療を組み合わせて行い、抗がん剤への感受性に変化が起きるのかどうかを確認する予定である。また、MLL-AF9による白血病モデル以外にもBCR-ABLによる慢性骨髄性白血病モデルも構築中であり、MLL-AF9による急性骨髄性白血病モデルで認められた生存率の差が慢性骨髄性白血病モデルにおいても認められるか検討する。さらに、白血病細胞株の移植モデルにおいてコントロールに比べLR11をノックダウンした細胞の生着率が悪かったことから、生存率の差が、単純に生着率の差によるものなのかどうなのか確認する事を目的として、tali veinからの経静脈的な移植とintra bone marrow法による骨髄内への直接的な移植での生存率の差を、コントロール群とLR11ノックダウン群の計4群で行う予定である。該当なしLR11の過剰発現させるレトロウイルスやLR11ノックダウン用のレンチウイルスを作成する際や、白血病細胞株を培養する際にウシ血清をはじめとする試薬などを必要とする。また、FACSによる細胞分離を行う際に抗体やMACSビーズなどが必要となる。LR11ノックアウトマウスを用いた移植実験を行う際には、マウス飼育用の飼料などが必要である。研究の成果については現在2本の論文を作成中であり、低酸素によるLR11の発現亢進とLR11による接着や遊走の制御については今年度中に投稿予定である。
大腸癌幹細胞に関るＣＤ１３３／ＰＴＰＲＫ経路を標的としたゲノム・プロテオーム解析

受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素PTPRKの大腸がん進展における機能を解析した。shRNAを用いたPTPRKのノックダウン(PTPRK-KD)は、ヒト大腸がん由来細胞株のヌードマウス皮下腫瘍の形成ならびに低栄養条件下での増殖を促進したが、その効果はCD133に依存していた。さらに、PTPRK-KDとCD133発現は大腸がん細胞において協調してAKTを活性化し、その下流分子のBadを強く活性化した。その結果、抗がん剤による細胞死誘導を相乗的に抑制した。したがって、PTPRK-CD133制御系はがん細胞の悪性化を高め、大腸がん進展における重要な機能を担う可能性が示唆された。近年、がんの難治性を説明しうる「癌幹細胞仮説」が提唱される中、申請者らは当該細胞を標的とした新規治療法の開発を目指している。申請者らは、癌幹細胞マーカーCD133がそのチロシンリン酸化を介して大腸癌細胞の腫瘍形成を亢進することを見いだした。さらに、申請者らの実験系において、受容体型チロシン脱リン酸化酵素(PTPRK)が脱リン酸化を介してCD133の機能を抑制する可能性が示唆された。そこで平成26年度は、大腸癌におけるCD133/PTPRK経路の臨床的意義の検討を中心に行った。代表的なヒト大腸癌細胞株(Caco-2、HT-29、LoVo、SW480)のPTPRK発現レベルを検討した結果、全ての細胞株でその発現が確認された。特にHT-29のPTPRK発現レベルは非常に高かったが、その他の細胞株ではほぼ同程度であった。そこで、CD133陽性のLoVoのPTPRK発現レベルをRNA干渉法によって人為的に低下させた。その結果、当該細胞を軟寒天培地中あるいは低接着型培養プレート中で3次元的に培養すると増殖速度の亢進が観察された。さらに、外因性CD133を強制発現させ、同時にPTPRKをノックダウンしたSW480細胞でも、前述した3次元培養下での増殖速度の上昇が確認された。我々の先行研究から、CD133はチロシンリン酸化を介してPI3K・AKT経路を活性化する機能を持つことが示されている。そこで、外因性CD133の強制発現によって亢進したAKTリン酸化レベルがPTPRKのノックダウンによってさらに上昇するかどうかを検討した。その結果、我々が予想したように、PTPRKのノックダウンはCD133に依存的なAKTリン酸化を増強した。すなわち、PTPRKはCD133依存的な大腸癌細胞増殖を直接的に抑制している可能性が示された。近年、がんの難治性を説明しうる「癌性幹細胞仮説」が提唱される中、申請者らは当該細胞を標的とした新規治療法の開発を目指している。この基盤研究において、申請者らは癌性幹細胞マーカーCD133がチロシンリン酸化を介して大腸癌細胞の異種移植腫瘍形成能力を高めること、さらに蛋白質チロシン脱リン酸化酵素の一つであるPTPRKがCD133の脱リン酸化を触媒することを見出している。そこで、昨年度に引き続きPTPRKがチロシン脱リン酸化を介して大腸がん細胞のCD133依存的な腫瘍形成を増強するかどうかを検討した。CD133陰性であるヒト大腸癌SW480細胞にPTPRK遺伝子を標的するshRNAを導入し、当該遺伝子の内在性発現レベルを低下させた。次に、CD133遺伝子を導入し、PTPRKならびにCD133の発現量が異なる4種類の細胞を樹立した。これらの細胞のCD133依存的反応(AKTリン酸化、足場非依存的増殖、スフェア形成、および異種移植腫瘍成長)を検討した結果、PTPRKは上記のCD133依存的反応を抑制することで大腸癌進展に関与する可能性が示唆された。一方、前述した先行研究ではPTPRK遺伝子の高発現は大腸癌の予後良好因子である可能性が示された。また、PTPRKは細胞膜上に存在することから、腫瘍細胞の増殖を促進する液性因子からの増殖シグナルを制御する可能性が考えられる。そこで、PTPRK遺伝子の発現量を低下させたヒト大腸癌HT-29細胞を作製し、腫瘍増殖を促進する受容体型チロシンキナーゼ(EGFR、IGFR、FGFR、およびPDGFR)を介したシグナル伝達経路の活性化レベルを検討した。その結果、コントロール細胞と比較してPTPRKを発現低下させたHT-29細胞においてチロシンリン酸化が亢進している蛋白質を複数同定し、当該蛋白質群がPTPRKの標的分子である可能性が示唆された。前述の実績に示したように、大腸癌進展におけるCD133/PTPRK制御経路の機能が明らかになりつつある。さらに、PTPRKの新たな基質として2つの候補分子を見出した。これらは年度当初に申請した計画が適切に実施された成果である。臨床検体を用いた検討に関しても症例を重ねている段階であり、当初の予定通りである。したがって、現在の達成度は概ね順調であると判断する。近年、がんの難治性を説明しうる「癌性幹細胞仮説」が提唱される中、当該細胞を標的とした新規治療法の開発を目指している。本研究で我々は受容体型チロシン脱リン酸化酵素K(PTPRK)が癌性幹細胞マーカーCD133の脱リン酸化を介してヒト大腸癌細胞の異種移植腫瘍形成能力を抑制する可能性を検討している。昨年度に引き続き、CD133/PTPRK経路が大腸がん進展に寄与する仕組みの一端を明らかにするべく解析を重点的に行った。

昨年度の研究で樹立済みのPTPRKノックダウンとCD133強制発現を同時に導入したSW480(SW480/CD133/KD)細胞を用いて、低栄養条件下(1%ウシ胎児血清存在下)における増殖速度を解析した。対照群となるPTPRKノックダウンのみ、あるいはCD133強制発現のみを導入したSW480細胞では低栄養条件に応答して増殖速度が遅くなったのに対して、SW480/CD133/KD細胞は低栄養条件下でも活発に増殖し続けた。このとき、大腸がん細胞内のCD133リン酸化レベルはPTPRKノックダウンによって上昇していた。CD133リン酸化はAKT活性化を介して腫瘍形成やスフェア形成を促進することを我々は見出している。そこで、SW480/CD133/KD細胞においてAKTの下流標的分子を観察したところ、抗アポトーシス作用を持つBadが著しく活性化しており、その結果当該細胞のオキサリプラチンに対する抵抗性が増強していた。興味深いことに、上記の形質は対照群の細胞では観察されなかった。以上から、CD133CD133-PTPRK制御系は大腸がん細胞の悪性度(細胞生存能力と薬剤耐性)を高める仕組みの中で重要な役割を担っている可能性が示唆された(第25回日本癌病態治療研究会にて発表、論文投稿準備中)。受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵素PTPRKの大腸がん進展における機能を解析した。shRNAを用いたPTPRKのノックダウン(PTPRK-KD)は、ヒト大腸がん由来細胞株のヌードマウス皮下腫瘍の形成ならびに低栄養条件下での増殖を促進したが、その効果はCD133に依存していた。さらに、PTPRK-KDとCD133発現は大腸がん細胞において協調してAKTを活性化し、その下流分子のBadを強く活性化した。その結果、抗がん剤による細胞死誘導を相乗的に抑制した。したがって、PTPRK-CD133制御系はがん細胞の悪性化を高め、大腸がん進展における重要な機能を担う可能性が示唆された。前述の実績に示したように、ヒト大腸癌培養細胞を用いた解析については年度当初に申請した計画内容を実施することができ、ヒト大腸癌細胞の進展におけるCD133とPTPRKの役割が明らかになりつつある。したがって、現在の達成度は概ね順調であると判断する。1)PTPRK特異的基質蛋白質の探索(担当:早田、下里、上條):昨年度の研究で見出した基質となりうる候補蛋白質群とPTPRKとの分子間結合については免疫沈降法やGSTプルダウン法などを用いて詳細に解析する。また、これらの候補蛋白質が酵素反応の基質であるかどうかの検討は、PTPRKによる当該蛋白質の脱リン酸化反応を試験管内で調べる。さらに、大腸癌進展におけるこれらの候補蛋白質群の機能・意義をヒト大腸癌細胞を用いて細胞生物学的な手法で解析する。2)癌性幹細胞の制御におけるCD133/PTPRK経路の機能解析(担当:早田、下里):昨年度同様に培養細胞株を用いた実験に加えて、大腸癌初代培養細胞を用いてCD133/PTPRK制御経路の意義を検討する。さらに、PTPRKの機能亢進による治療効果の可能性を検討する。