hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ムコ多糖症ＩＩ型に対する新生児スクリーニングと確定診断法の開発

ムコ多糖症は先天代謝異常症であり、これまでに7つの原因遺伝子が同定されている。日本及びアジアで発見されるMPSの50%はMPS-IIであり、原因遺伝子はイズロネート-2-スルファターゼである。分子標的が同定されたことにより、酵素補充療法を中心とした治療法が開発されている。一般的に、治療法が確立されている小児疾患においては、患者を早期発見し、治療を迅速に行うことが重要である。こうした背景から、新生児期に精度良く患者を発見する方法論の開発が希求されてきた。歴史的には、1960年代に考案された乾燥ろ紙血検体(一般にGuthrie cardとして知られる)から酵素を抽出し、蛍光物質である4MUと結合した基質を用いて、酸性条件下で酵素活性を測定する方法が考案されている。しかし、バックグラウンドが高いなどの問題点があり、特に酵素活性値が低い場合に判定が難しい場合が多いことが指摘されてきた。本研究では、高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を利用してムコ多糖症II型の臨床検査法の開発を行った。測定原理は、ワシントン大学のGelbにより開発された方法を利用した。本研究では、まず、MPS IIの原因酵素であるイズロネート-2-スルファターゼの酵素活性測定法を検討した。その後、MPS IやMPS VIIの原因酵素活性と合わせて、ライソゾーム病11疾患の原因酵素同時測定系を開発した。本研究で開発した定量分析手法は臨床検査領域での広い応用が可能である。具体的には、その迅速性を生かしたラボスケールにおける確定診断および新生児スクリーニングへの応用が期待される。ムコ多糖症II型(MPS-II)は日本では約5万人に1人の割合で発見される先天代謝異常疾患である。最近の研究成果により、酵素補充療法をはじめとした種々の治療法が開発されてきた。従って現在では、MPS-IIは早期に発見して治療する疾患である。この際に重要なことは早期発見の技術である。診断技術として、発症原因となる酵素イズロネート-2-スルファターゼの活性を測定する、もしくは尿中に蓄積するバイオマーカーであるグリコサミノグリカンの蓄積を測定する、の2つの方法が現在知られている。酵素活性の測定法は蛍光基質を用いた方法が現在主流である。またバイオマーカーの測定は、ターゲットとなるバイオマーカーを濃縮後、比色法で測定する方法が広く行われている。本年度は酵素活性測定法とバイオマーカー測定法のうち、バイオマーカーの測定法の開発に注力した。その結果、生体試料に含まれるグリコサミノグリカンを定量分析することが可能となった。具体的には先行研究に倣い測定条件を検討した。まず生体試料(尿、髄液)を窒素気流下で乾固し、塩酸メタノール中で化学分解反応を行った。その後得られた生成物を定量することで、生体試料中に含まれているグルコサミノグリカン量を算出した。この際、分析バリデーションとして日間誤差も検討した。最後に患者検体に含まれるグリコサミノグリカン量を測定したところ、健常人に含まれる量よりも多いことが確認できた。本研究ではムコ多糖症II型の酵素活性測定法の開発とバイオマーカー測定法の開発の2つを主な達成課題としている。このうち、本年度はバイオマーカー測定法の開発まで終了した。来年度以降についても、酵素活性測定法の開発を含めて申請時のタイムスケジュールにに従い、計画通り進めてゆきたい。本年度は、前年度に引き続きムコ多糖症II型の原因酵素であるイヅロネート-2ースルファターゼの酵素活性測定系の検討を進めた。、酵素源として、全血を臨床検査用のろ紙にしみこませることにより調製した乾燥濾紙血(dried blood spot, DBS)を用いた。酵素活性は、酸性条件下、内部標準物質を含む反応バッファーを用いて反応させた。反応生成物は、酢酸エチルを用いた液液分配により有機層に回収後、窒素吹付装置を利用して一度乾固し、最終的にはLC-MSの開始溶媒を用いて再溶解した。得られた酵素活性値が臨床検査学的に許容されるか検討するため、測定値の日内および日間誤差を検討したところ、おおむね30%以内であった。また、正常酵素活性に比して5%の酵素活性を含むQC検体を測定したところ大体予想される酵素活性値が得られたため、定量下限は正常酵素活性値の数%であることが確認された。また酵素活性値の直線性についても良好な値が得られた。さらに健常人DBSを用いて酵素活性の頻度分布を求めたところ、これまでに明らかにされている頻度分布と同様な結果が得られた。また、これまでに別の方法で罹患が確認されている検体の酵素活性値を本方法で測定したところ、酵素活性値は予想通り低値を示した。この時、別に測定した他の酵素活性値はいずれも正常であった。以上、ムコ多糖症II型の原因酵素イヅロネート-2ースルファターゼの酵素活性は、内部標準物質を用いたLC-MS/MSにて、正確かつ高感度に測定可能であることが明らかになった。現在まで、おおむね順調に計画が進行している。その理由は、平成29年度の目標は酵素活性測定系の検討を行うこととしたのに対して、当初の計画よりも少し早く日間誤差を含めた所定のバリデーションデータが取れ、健常人の酵素活性値の分布を大まかに知ることができたからである。

酵素活性測定用の基質はパーキンエルマー社(横浜)より購入した。質量分析装置はQuattro Premier XE (Waters社)を使用した。酵素反応生成物及び内部標準物質はMRM法を用いて高選択的に検出した。ムコ多糖症は先天代謝異常症であり、これまでに7つの原因遺伝子が同定されている。日本及びアジアで発見されるMPSの50%はMPS-IIであり、原因遺伝子はイズロネート-2-スルファターゼである。分子標的が同定されたことにより、酵素補充療法を中心とした治療法が開発されている。一般的に、治療法が確立されている小児疾患においては、患者を早期発見し、治療を迅速に行うことが重要である。こうした背景から、新生児期に精度良く患者を発見する方法論の開発が希求されてきた。歴史的には、1960年代に考案された乾燥ろ紙血検体(一般にGuthrie cardとして知られる)から酵素を抽出し、蛍光物質である4MUと結合した基質を用いて、酸性条件下で酵素活性を測定する方法が考案されている。しかし、バックグラウンドが高いなどの問題点があり、特に酵素活性値が低い場合に判定が難しい場合が多いことが指摘されてきた。本研究では、高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を利用してムコ多糖症II型の臨床検査法の開発を行った。測定原理は、ワシントン大学のGelbにより開発された方法を利用した。本研究では、まず、MPS IIの原因酵素であるイズロネート-2-スルファターゼの酵素活性測定法を検討した。その後、MPS IやMPS VIIの原因酵素活性と合わせて、ライソゾーム病11疾患の原因酵素同時測定系を開発した。本研究で開発した定量分析手法は臨床検査領域での広い応用が可能である。具体的には、その迅速性を生かしたラボスケールにおける確定診断および新生児スクリーニングへの応用が期待される。今後は、まず現在未了となっている酵素活性測定法の開発を進める。また、前年に開発したバイオマーカーの測定法に改良の余地が無いか検討し、さらに高感度かつ簡便な方法の開発を行う。合わせてムコ多糖症の他の病型の酵素活性測定法の検討を行う。今後の研究の推進方策は、平成29年度に検討した内部標準物質を利用したムコ多糖症II型の原因酵素イズロネートー2ースルファターゼの酵素活性測定法を臨床検体へ応用することである。酵素反応生成物の定量には、引き続きLC-MS/MSを用いる。本研究申請ではイズロネートー2ースルファターゼの酵素活性の測定法を確立することを目的としているが、これまでの進捗状況はおおむね順調であるため、今後、余裕があれば他の酵素活性を同時に測定できる分析条件の検討も進めたい。本年度は研究計画の初年度でもあり研究期間を通じて情報収集を先行して行った。その結果、全体として支出額が当初予定に到達せず、次年度使用額が発生した。旅費の支出につき、通常より経済的な交通経路や宿泊施設を利用したため次年度使用額が生じた。本年度に発生した次年度使用額は、翌年度として請求した助成金と合わせて当初の研究計画に従った使用を計画している。次年度使用額の使用計画として物品費の使用を予定している。前年度において収集した情報に基づいて研究計画を改善し、無駄無く効率の良い使用を計画している。
マツタケの特徴的な香りの生合成遺伝子を単離してヒラタケに導入し，その香りを作る

食用キノコにおいて,マツタケの独特の香りが日本人に大変好まれている.その香りの主成分は桂皮酸メチルであるが,この成分がなぜマツタケとその近縁種キノコのみで検出されるかは分かっていない.本研究では,フェニルアラニンから桂皮酸メチルの生合成経路において,桂皮酸から桂皮酸メチルの生成に関与する桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ(CCMT)に焦点を当てて,遺伝子レベル・タンパク質レベルから明らかにすることを目的とした.また,マツタケ風味の新品種キノコの作出の先駆けとして,ヒラタケにCCMTを付加して,ヒラタケにおけるマツタケの特徴香の生合成を調べる.平成29年度において,遺伝子の発現量の解析により,CCMT様遺伝子の候補の1つを選択した.平成30年度においては,「組換えCCMT様タンパク質の産出と性質化」を試みた.初めに,CCMT様候補遺伝子のcDNAとゲノムDNAをクローニングして,配列を決定した.cDNAとゲノムDNAの配列を比較したところ,この遺伝子は8個のイントロンを含み,487個のアミノ酸からなる分子量約54,000のタンパク質をコードしていた.また,このタンパク質にはクラスIS-アデノシルメチオニン(SAM)-依存性メチルトランスフェラーゼファミリーの保存配列が存在していた.次に,CCMT様候補遺伝子のcDNAとpET28a発現ベクターからなる組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株に導入し,形質転換体を得た.その後,IPTG誘導により,分子量約55,000の組換えタンパク質を得た.次に,大腸菌粗酵素液のCCMT活性測定を行った.しかし,明確な活性を検出することはできなかった.これより,このCCMT様候補遺伝子が桂皮酸メチルの生合成に関与するCCMT様遺伝子であることを明らかにすることはできなかった.香りは食品の価値を決める重要な要素の一つである.食用キノコにおいては,マツタケの独特の香りが日本人にたいへん好まれている.その香りの主成分は桂皮酸メチルであるが,この成分がなぜマツタケとその近縁種のキノコでのみで検出されるかは分かっていない.そこで,本研究では,桂皮酸メチルの生合成の制御機構(生合成機構)を,桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ(CCMT)に焦点を当てて,遺伝子レベル・蛋白質レベルから明らかにすることを目的とした.また,マツタケ風味の新品種キノコの作出の先駆けとして,ヒラタケにCCMTを付加して,ヒラタケにおけるマツタケの特徴香の生合成を調べる.平成28年度において,マツタケの桂皮酸メチル生合成におけるキー酵素CCMTをコードする遺伝子cDNAの単離を試みた.これまでに,マツタケ菌糸体の培養途中にPhe(桂皮酸メチルの材料)を添加したところ,菌糸体中の桂皮酸メチル生合成酵素の一つと考えられているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ2(TmPAL2)遺伝子の発現量が,桂皮酸メチル含量とともに増加することを明らかにしている.よって,CCMT遺伝子もPhe添加により発現量が増加すると考えられる.初めに,Phe(終濃度6 mM)添加及び無添加の培地で培養したマツタケ菌糸体よりトータルRNAを抽出した.その後,それらを用いて各菌糸体で発現する全mRNAの配列解読(次世代シーケンスRNA-Seq)を実施した.現在,配列の解読が終了し,Phe添加で発現量の増加する遺伝子cDNAの中からCCMT遺伝子に相当すると考えられるcDNAを選択している途中である.一方で,Phe添加で発現量の増加する遺伝子cDNA中にTmPAL2遺伝子が含まれていることを確認している.平成28年度の研究実施計画1『CCMT遺伝子cDNAの単離と配列解読』において,各菌糸体のトータルRNAサンプルより,純度や断片サイズなどが良好なライブラリーを調製した.その後,各菌糸体で発現する全mRNAの配列解読(次世代シーケンスRNA-Seq)を行った.リード配列のアセンブル,アセンブルContig配列へのマッピング,ヒートマップの作製まで順調に行えた.しかし,その後のアノテーションに予想以上の時間を費やしたため,Phe添加で発現量の増加する遺伝子の検出に時間を要した.計画2『桂皮酸メチルの材料添加による菌糸体の酵素CCMT活性と桂皮酸メチル生合成の効果の解析』及び計画3『CCMT遺伝子の子実体・菌糸体での転写量測定』において,計画1において,CCMT遺伝子cDNAの単離がなされていないため,未着手のままとなっている.食用キノコにおいて,マツタケの独特の香りが日本人に大変好まれている.その香りの主成分は桂皮酸メチルであるが,この成分がなぜマツタケとその近縁種キノコのみで検出されるかは分かっていない.本研究では,フェニルアラニン(Phe)から桂皮酸メチルの生合成経路において,桂皮酸から桂皮酸メチルの生成に関与する桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ(CCMT)に焦点を当てて,遺伝子レベル・蛋白質レベルから明らかにすることを目的とする.また,マツタケ風味の新品種キノコの作出の先駆けとして,ヒラタケにCCMTを付加して,ヒラタケにおけるマツタケの特徴香の生合成を調べる.平成29年度においては,「桂皮酸メチルの材料添加による菌糸体の桂皮酸メチル生合成の効果の解析」と「マツタケのCCMTをコードする遺伝子cDNAの単離と発現解析」を試みた.

これまでに,マツタケ菌糸体の培養途中にPhe(Pheアンモニアリアーゼ[PAL]の基質)を添加したところ,桂皮酸メチル生合成酵素の一つであるPAL2(TmPAL2)の遺伝子の発現量が,桂皮酸メチル量と共に増加することを明らかにしている.よって,CCMTもその基質である桂皮酸の添加により,その遺伝子の発現量が増加すると考えられる.そこで初めに,桂皮酸を添加した培地で培養したマツタケ菌糸体の桂皮酸メチル量が,無添加の培地で培養した菌糸体より,約30倍増加することを明らかにした.次に,マツタケの公開ゲノム配列(DOE Joint Genome Institute)より,CCMTの候補となる10個のメチルトランスフェラーゼの遺伝子を選択した.桂皮酸添加及び無添加の培地で培養したマツタケ菌糸体の総RNAを用いて,リアルタイムRT-PCRで各遺伝子の発現量を調べた.その結果,一つの遺伝子の発現量が桂皮酸の添加により約4倍増加したため,これをCCMTの候補遺伝子とした.平成29年度の研究実施計画2『桂皮酸メチルの材料添加による菌糸体の酵素CCMT活性と桂皮酸メチル生合成の効果の解析』において,マツタケ菌糸体の培養途中に桂皮酸メチルの材料の一つと考えられる桂皮酸を培地に添加して,菌糸体中での桂皮酸メチルの合成量が増加することを明らかにした.これより,桂皮酸が桂皮酸メチルの材料(中間産物)であることが推定できた.しかし,菌糸体中には,他のメチルトランスフェラーゼが多数含まれるため,特異的にCCMTの活性を測定することはできなかった.計画3『CCMT遺伝子の子実体・菌糸体での転写量測定』において,計画2の結果に基づいて,培地への桂皮酸の添加により,菌糸体中での発現が約4倍増加した一つのCCMT候補遺伝子を選択できた.現在,マツタケ子実体のおける発現量の解析を行っている.計画4『CCMT遺伝子を導入したヒラタケにおける桂皮酸メチル生合成の調査』において,CCMT候補遺伝子の単離が遅れたため,未着手のままとなっている.食用キノコにおいて,マツタケの独特の香りが日本人に大変好まれている.その香りの主成分は桂皮酸メチルであるが,この成分がなぜマツタケとその近縁種キノコのみで検出されるかは分かっていない.本研究では,フェニルアラニンから桂皮酸メチルの生合成経路において,桂皮酸から桂皮酸メチルの生成に関与する桂皮酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼ(CCMT)に焦点を当てて,遺伝子レベル・タンパク質レベルから明らかにすることを目的とした.また,マツタケ風味の新品種キノコの作出の先駆けとして,ヒラタケにCCMTを付加して,ヒラタケにおけるマツタケの特徴香の生合成を調べる.平成29年度において,遺伝子の発現量の解析により,CCMT様遺伝子の候補の1つを選択した.平成30年度においては,「組換えCCMT様タンパク質の産出と性質化」を試みた.初めに,CCMT様候補遺伝子のcDNAとゲノムDNAをクローニングして,配列を決定した.cDNAとゲノムDNAの配列を比較したところ,この遺伝子は8個のイントロンを含み,487個のアミノ酸からなる分子量約54,000のタンパク質をコードしていた.また,このタンパク質にはクラスIS-アデノシルメチオニン(SAM)-依存性メチルトランスフェラーゼファミリーの保存配列が存在していた.次に,CCMT様候補遺伝子のcDNAとpET28a発現ベクターからなる組換え
小腸移植の拒絶反応に対する新しいアプローチ：リンパ球トラフィッキングとホーミング

消化吸収機能や経口免疫機能に重要な働きを示す小腸の大部分を何らかの原因で切除された状態である短腸症候群の患者にとっては,腸管およびその付属器に大量に存在すべきリンパ球がほとんど枯渇している状態であるため,本来機能すべき経口免疫やlgA分泌の代償機能が働いている.本年度の研究経過として,当院第1外科にて大量小腸切除がなされ,短腸症候群の病態を臨床例で検討しているが,免疫学的には代償機構が検査上ほぼ保たれているものの,消化吸収障害や排便障害等の生理機能障害が顕性となっており,これは術後早期から発現し数年経っても改善傾向が乏しく,また,症例症例の個体差が大きかった.これは短腸症候群の病態が必ずしも一定でなく,個々の症例の年齢,性差,原疾患,術後経過の多様性などに起因する順応の程度に関連するものと考えられるが,客観的な証左はまだ得られていない.症例数を増やし,新しい臨床観察方法の考案を行っている.さらに臨床症例の病理学的,免疫組織化学的検索に関しては,貴重な生検組織の収集と観察を継続している.短腸症候群に近似した動物実験モデルによる実験では,グラフト中の分泌型lgAの動向を観察するに,レシピエントlgA含有細胞から分泌されたlgAがドナーsecretorycomponentによって結合され,マイクロキメリズムといえる分泌型lgAが免疫機能を果たしていることなどを観察している.このように本年度の研究経過としては,臨床例の検索と動物実験を並行して実施して,短腸症候群の病態を明らかにしつつ,移植後のリンパ球トラフィッキングと新しく形成されるホーミング機構の解析を継続して,小腸移植に特異的な拒絶反応を解明しつつある.正常小腸粘膜や腸間膜リンパ節に大量に存在するリンパ球は,短腸症候群の患者ではほとんど存在せず,本来機能すべき経口免疫やIgA分泌の代償機能が働いている.本年度の研究経過としては,まず,短腸症候群の病態を臨床例で検討した.当院第1外科にて大量小腸切除がなされ,中心静脈栄養の有無に関わらず経過観察されている症例について,病歴や手術後経過の聴取と消化管免疫系検査や生理機能検査を行ったところ,免疫学的には代償機構が検査上ほぼ保たれているものの,消化吸収障害や排便障害等の生理機能障害が顕性となっており,これは術後早期から発現し数年経っても改善傾向が乏しかった.経過観察中の臨床例における組織学的検索は,生検組織がわずかしか採取できず詳細な観察はまだ終了していないが,今後症例数を増やして,組織学的検索に加えて免疫組織化学的観察を継続している.次に,短腸症候群に近似した動物実験モデルの作成と評価に関しては,純系繁殖ラットを用いた回腸切除やパイエル板切除を行い,術後数週間の小腸粘膜に於けるIgA含有細胞数やリンパ球サブセットの量的・質的変化を免疫組織化学的に観察中である.このように本年度の研究経過としては,臨床例における生理学的,免疫学的,病理組織学的検索と動物実験を並行して実施している.短腸症候群の病態を明らかにしつつ,移植後のリンパ球トラフィッキングと新しく形成されるホ-ミング機構を解析することによって,小腸移植に特異的な拒絶反応解明に近づきつつあると考えられる.消化吸収機能や経口免疫機能に重要な働きを示す小腸の大部分を何らかの原因で切除された状態である短腸症候群の患者にとっては,腸管およびその付属器に大量に存在すべきリンパ球がほとんど枯渇している状態であるため,本来機能すべき経口免疫やlgA分泌の代償機能が働いている.本年度の研究経過として,当院第1外科にて大量小腸切除がなされ,短腸症候群の病態を臨床例で検討しているが,免疫学的には代償機構が検査上ほぼ保たれているものの,消化吸収障害や排便障害等の生理機能障害が顕性となっており,これは術後早期から発現し数年経っても改善傾向が乏しく,また,症例症例の個体差が大きかった.これは短腸症候群の病態が必ずしも一定でなく,個々の症例の年齢,性差,原疾患,術後経過の多様性などに起因する順応の程度に関連するものと考えられるが,客観的な証左はまだ得られていない.症例数を増やし,新しい臨床観察方法の考案を行っている.さらに臨床症例の病理学的,免疫組織化学的検索に関しては,貴重な生検組織の収集と観察を継続している.短腸症候群に近似した動物実験モデルによる実験では,グラフト中の分泌型lgAの動向を観察するに,レシピエントlgA含有細胞から分泌されたlgAがドナーsecretorycomponentによって結合され,マイクロキメリズムといえる分泌型lgAが免疫機能を果たしていることなどを観察している.このように本年度の研究経過としては,臨床例の検索と動物実験を並行して実施して,短腸症候群の病態を明らかにしつつ,移植後のリンパ球トラフィッキングと新しく形成されるホーミング機構の解析を継続して,小腸移植に特異的な拒絶反応を解明しつつある.
ミトコンドリアDNAの塩基配列を指標とした日本産肝蛭の分類・同定の試み

本研究では日本産肝蛭、F.hepaticaおよびF.giganticaのミトコンドリアDNAのcytochromec oxidase subunit I(COI)およびNADH dehydrogenase subunit I(NDI)遺伝子座、さらに核リボソームDNAのsecond internal transcribed spacer(ITS-2)領域の塩基配列を決定することにより、日本産肝蛭の同定の基準となり得る配列が識別できるか否かを明らかにすること、さらに日本産肝蛭の集団にDNA多型が存在するか否かを明らかにすることを目的として実施した。その結果、1.ミトコンドリアDNAの制限酵素切断パターンによる解析から、日本産肝蛭の三倍体固体集団には少なくとも2型のミトコンドリアDNA多型が存在し、両型の母方祖先種はF.hepaticaではなく、F.giganticaと考えられること、さらにはその内の1型と韓国産肝蛭(単為生殖を行う二倍体)はF.giganticaの共通祖先に由来すると考えられること、2.ミトコンドリアDNAのCOIおよびNDI遺伝子座における塩基配列の比較から、日本産肝蛭の三倍体固体はF.giganticaとほぼ一致しF.hepaticaとは異なること、3.核のリボソームDNAのITS-2領域の塩基配列から、日本産肝蛭の三倍体固体には異なる2型が認められ、1型はF.hepaticaとほぼ一致し、他型は東南アジア(インドネシア、マレーシア)産F.giganticaと一致することが明らかとなった。本研究は、ミトコンドリアDNAのチトクロームcオキシダーゼI(COI)及びNADHデヒドロゲナーゼI(NDI)遺伝子領域の塩基配列によって、日本産肝蛭を含めた肝蛭種間を識別することができるか否かを明らかにすることを目的とする。現在までに日本産肝蛭(三倍体個体)、ウルグアイ産F.hepatica(二倍体個体)、サンビア産およびインドネシア産F.gigantica(二倍体個体?)および韓国産肝蛭(二倍体個体)について、COI領域の474bp及びNDI領域の145bpにおける塩基配列を決定した。COI領域の474bpでは、日本産肝蛭はザンビア産F.giganticaとほぼ一致した配列を示し、これらとウルグアイ産F.hepaticaとの間には4塩基(0.8%)に違いが認められた。一方、NDI領域の145bpの配列では、F.giganticaにおいて3型(A、B、C型)の種内変異が認められた。その内の2型(A、B型)はザンビア産F.giganticaで見られ、両型間の塩基置換率は8.3%であった。C型はインドネシア産F.giganticaで認められ、A型とは5.7%の塩基置換率、4塩基欠損が見られ、B型とは塩基置換率6.4%、4塩基欠損であった。またF.giganticaのA型と日本産肝蛭とは配列が一致した。これらとウルグアイ産F.hepaticaとは1.4%の塩基置換率であった。以上の結果から、日本産肝蛭(三倍体個体)とF.giganticaは、CO1領域及びNDI領域の塩基配列の違いによってウルグアイ産F.hepaticaとは明らかに識別できると考えられた。本年度の目的は、日本産肝蛭集団内にミトコンドリアDNAの種内変異が存在するか否かを制限酵素切断パターンによって明らかにすること、さらに日本産肝蛭、F.hepaticaおよびF.giganticaのリボソームDNAのITS-2領域の塩基配列を決定し、それらを比較検討することであった。今回、屠蓄場で採集した日本産肝蛭虫体は全て3倍体個体であった。各虫体より抽出したゲノムDNAを8種類の制限酵素(BamH I,Bgl II,Dra I,EcoR I,EcoR V,Hind III,Mfl IおよびSca I)で切断し、PCRで増幅したミトコンドリアDNAをプローブとしてサザンブロットハイブリダイゼーション法によって制限酵素切断パターンを検出した。また、F.hepaticaおよび韓国産肝蛭(単為生殖の二倍体)の切断パターンと比較した。

その結果、日本産肝蛭の三倍体個体集団には少なくとも2型のミトコンドリアDNA多型が存在し、両型の母方祖先種はF.hepaticaではなく、F.giganticaと考えられること、さらにはその内の1型と韓国産肝蛭(はF.giganticaの共通祖先に由来すると考えられることが明らかとなった。一方、核リボソームDNAのITS-2領域の塩基配列から、日本産肝蛭の三倍体個体には異なる2型が認められ、1型はF.hepaticaとほぼ一致し、他型は東南アジア(インドネシア、マレーシア)産F.giganticaと一致することが明らかとなった。
地形解析に基づく土地生産力モデルの新たな方法論的展開とその検証

スギおよびカラマツ人工林を対象として、立地条件によって決定する成長の良さ(地位指数)を地形から推定するモデルを開発した。これまで地位指数を推定するモデルを開発するためには非常にコストが掛かる厳密な地位指数の測定が必要であったが、新たな統計学的手法を適用することでこれらの欠点を改善した。この新たに開発した方法により推定した地位指数は、従来の方法と比較して同等程度の精度をもっていた。このモデルによって従来よりも簡便に地位指数の推定モデルを開発することが可能となり、より効率的な人工林経営の達成に貢献することが期待できる。スギを対象樹種として、どのような場所で成長が良いのか、地形との関係を解析した。宮崎大学田野演習林において、様々な林齢のスギ人工林に試験地を設定して樹高を計測した。また、高精度GPSを使って正確な地理座標を取得した。試験地の地理座標を利用して、試験地について直達光の強度および土壌水分の集まりやすさの観点から地形解析を行った。それぞれの試験地で上位3本の樹高を平均したものを上層木樹高として、スギの成長の良さを計る指標とした。この上層木樹高を地形と林齢から上層木樹高を推定するモデルを開発した。その結果、直達光の強度が弱く、土壌水分の集まりやすい地形でスギの成長が良いことが分かった。また、地形解析を広範囲に行うことによって、スギの成長が良い場所を推定することが可能となった。上層木樹高を地形と林齢から推定するモデルの開発に先立って、地形から土地の良さ(地位指数)を推定するモデルと、地位指数と林齢から上層木樹高を推定するモデルとを、ベイズ統計学を利用した新しい統計手法により結合する手法を開発した。新たに開発した手法を利用して、地形から地位指数を推定するモデルを開発した。宮崎大学田野演習林のスギ人工林を対象として、2011年に撮影されたデジタル航空写真から高さ情報を抽出し、地盤高データとの差分から樹高を計測した。そのデータを用いて、地位指数を推定するモデルを開発した。現地調査を行ったモデルと同様の傾向となったが、モデルの推定精度は劣るものとなった。これは地盤高データに含まれる誤差の影響で樹高が正しく計測できなかったことによると考えられる。さらに、林野庁が実施した森林資源モニタリング調査のデータを利用して、九州全体について地位指数を推定するモデルを開発した。対象範囲が九州全体と広くなったことから、地位指数を地形だけで十分に説明することはできず、気象の影響が大きいことが明らかとなった。カラマツを対象樹種として、どのような場所で成長が良いのか、地形との関係を解析した。九州大学北海道演習林において、様々な林齢のスギ人工林に試験地を設定して樹高を計測した。試験地の地理座標を利用して、試験地について日射の強度および土壌水分の集まりやすさの観点から地形解析を行った。それぞれの試験地で最も樹高の高いものを上層木樹高として、カラマツの成長の良さを計る指標とした。この上層木樹高を地形と林齢から推定するモデルを、昨年度開発したベイズ統計を利用したパラメータ推定手法を用いて開発した。その結果、日射の強度が弱く、土壌水分の集まりやすい地形でカラマツの成長が良いことが分かった。また、地形解析を広範囲に行うことによって、カラマツの成長が良い場所を推定することが可能となった。このモデルを利用して、地形から地位指数(40年生時の上層木樹高)の空間分布を推定した。また比較対象として、様々な林齢のデータを取り扱う古典的な解析手法を適用したが、地位指数と地形との関係を上手く表現することができず、本研究による手法の必要性が明らかとなった。スギおよびカラマツについて、既往の研究成果である利用データに制限のあるモデルと新たに開発したモデルとを比較したところ、同等の推定精度であった。旧来の手法では厳密に地位指数を測定するため、データの取得に多大なコストがかかる一方、モデルの信頼度は高くなる。本研究による手法ではどのような林齢のデータを利用することが可能であるにもかかわらず、旧来のモデルと同等の推定精度を確保できた。このことから、モデルを開発する際に用いるデータに制約がない本研究による手法の優位性が示された。森林計画学計画通りに林齢から上層木樹高を推定するモデルと、地形から地位指数を推定するモデルをマルコフ連鎖モンテカルロ法の利用により結合して、地位指数を推定する新たな手法を開発した。これまで地位指数を推定するためには決まった林齢(40年や50年)のデータしか用いることができなかったが、この手法を用いることにより上層木樹高、林齢および地理座標の測定値があれば、どのようなデータでも地位指数推定モデルの開発に用いることができるようになった。この成果を利用して、スギを対象として、試験地データおよびデジタル航空写真測量データを用いた地位指数モデルの開発を計画通り行った。

さらに、林野庁が森林資源モニタリング調査データを公開したことから、そのデータを利用した地位指数推定モデルの開発を行い、計画以上の成果を得ることができた。一方で、カラマツに関しては、職場を移籍した初年度で見通しが立たないこともあり九州大学北海道演習林での現地調査の日程調整が上手くいかなかったこともあり、モデルの開発は次年度に行うこととした。しかし、既存現地調査データの整備、デジタル航空写真測量による樹高データ整備および地形解析については今年度に終了しており、九州大学北海道演習林における現地調査を行えば、すぐにモデルの開発が可能となる状況にある。昨年度の反省を踏まえて、九州大学北海道演習林との日程調整を早期に行って現地調査を行い(4月23日時点で調整済み)、カラマツについてスギと同様の解析を行う。また、開発したモデルについて、検証データにあてはめてモデルの検証を行う。なお、スギについては検証データも取得済みであり、カラマツについては昨年度予定の調査と検証データ取得のための調査を同時に行う。モデルの検証結果に基づく精度比較およびモデル開発にかかる費用、労力および時間といったコスト比較の両面から、地位指数推定モデル開発のためのデータソース選択について得失を明らかにする。データの取得およびモデルの開発を9月には終了し、年度の後半は学会発表(10月に国際学会発表予定)や論文発表による成果の公表を積極的に行う。高精度GPSを購入する予定であったが、所属組織内に購入予定機器の所有があり無償で利用することが可能となったので、研究費をより有効に活用するため購入を取りやめた。予算は不足していた測量機器の購入や、解析ソフトのアップデートにあてたが、それでも残額が生じることとなった。繰り越しに関しては、九州大学北海道演習林での調査費用にあてる予定である。昨年度できなかった調査と今年度予定の調査の両方を行う必要が生じたことから、調査に必要な労力が大きくなる。調査期間を計画よりも延長し、また調査人員を計画よりも多くすることで対応することが必要となったため、その経費に繰り越し分をあてる計画である。
胃癌腹膜播種に対する腫瘍細胞と腫瘍ストローマを標的とした分子生物治療の開発

本研究の目的は難治性である胃癌腹膜播種の新規治療開発として,ウイルス療法に着目した.当該研究期間3年(平成17年-19年)の初期目標である腫瘍特異的溶解型ヘルペスウイルスの開発を達成できた.腫瘍溶解型ヘルペスウイルスの開発にあたっては,腫瘍細胞に対する殺細胞効果の増強だけではなく,ヒト臨床応用を想定した場合の安全性の確保が問題である.当初の研究計画では,ある種のviral fusogenic membrane glycoprotein(FMG)は標的細胞に対してsyncytial formation(細胞融合)を引き起こすことが知られており,中でもgibbonape leukemia virus envelop glycoprotein(GALV.fus)のC-terminalを欠失させた蛋白は非常に強力なsyncytiumを形成することが可能であると考え,腹膜播種という病態を考えた場合,このGALV.fusがoncolytic HSVにおいて発現出来るように改変出来れば,腹腔内投与で合理的かつ有効な効果を期待出来ると予想し,この分子を発現するウイルスを開発した.それに加えて,腹膜播種の進展に強く関係する結合組織にも着目した.腫瘍辺縁ストローマ(stroma)とは,正常宿主組織と腫瘍細胞の間に発生してくる結合組織で,線維芽細胞とコラーゲンを主とする細胞外より成る.stroma組織は腫瘍が栄養・ガス交換に必要とする血管系を供給する.事実,腫瘍が一定のサイズの塊を形成した後さらに増殖する時には,必ずstromaを必要とする.そこで,腫瘍だけに治療のtargetを絞らずに,腫瘍stromaを崩壊させる治療が開発出来れば,腫瘍の進展を抑制出来る可能性がある.本研究では,腫瘍辺縁stromaにbindingする分子として注目されているtumor-necrosis factor superfamily memberのひとつであるLIGHに着目し,これを強発現するoncolytic HSVを作成して,腫瘍辺縁stromaの崩壊から誘導される一連の殺腫瘍効果と効率の良い腫瘍免疫の誘導効果を証明し,その機序についても解明する予定としたが,開発の初期段階において,このLIGHTが予想よりも腫瘍間質に対する効果が弱いことが判明した.これに対する改善策としてoncolyticherpes simplex virus-2(HSV-2)に着目し,米国ベイラー医科大学との共同研究として,FusOn-H2というヘルペスウイルスを開発し,基礎実験において強力なウイルスとして期待できることを確認した.以上,研究期間において,若干の修正は必要としたが,新規ヘルペスウイルスを2種類開発したことになり,将来の臨床応用に向けて更なるウイルス改変作業を継続している.本研究の目的は難治性である胃癌腹膜播種の新規治療開発として,ウイルス療法に着目した.当該研究期間3年(平成17年-19年)の初期目標である腫瘍特異的溶解型ヘルペスウイルスの開発を達成できた.腫瘍溶解型ヘルペスウイルスの開発にあたっては,腫瘍細胞に対する殺細胞効果の増強だけではなく,ヒト臨床応用を想定した場合の安全性の確保が問題である.当初の研究計画では,ある種のviral fusogenic membrane glycoprotein(FMG)は標的細胞に対してsyncytial formation(細胞融合)を引き起こすことが知られており,中でもgibbonape leukemia virus envelop glycoprotein(GALV.fus)のC-terminalを欠失させた蛋白は非常に強力なsyncytiumを形成することが可能であると考え,腹膜播種という病態を考えた場合,このGALV.fusがoncolytic HSVにおいて発現出来るように改変出来れば,腹腔内投与で合理的かつ有効な効果を期待出来ると予想し,この分子を発現するウイルスを開発した.それに加えて,腹膜播種の進展に強く関係する結合組織にも着目した.腫瘍辺縁ストローマ(stroma)とは,正常宿主組織と腫瘍細胞の間に発生してくる結合組織で,線維芽細胞とコラーゲンを主とする細胞外より成る.stroma組織は腫瘍が栄養・ガス交換に必要とする血管系を供給する.事実,腫瘍が一定のサイズの塊を形成した後さらに増殖する時には,必ずstromaを必要とする.そこで,腫瘍だけに治療のtargetを絞らずに,腫瘍stromaを崩壊させる治療が開発出来れば,腫瘍の進展を抑制出来る可能性がある.本研究では,腫瘍辺縁stromaにbindingする分子として注目されているtumor-necrosis factor superfamily memberのひとつであるLIGHに着目し,これを強発現するoncolytic HSVを作成して,腫瘍辺縁stromaの崩壊から誘導される一連の殺腫瘍効果と効率の良い腫瘍免疫の誘導効果を証明し,その機序についても解明する予定としたが,開発の初期段階において,このLIGHTが予想よりも腫瘍間質に対する効果が弱いことが判明した.これに対する改善策としてoncolyticherpes simplex virus-2(HSV-2)に着目し,米国ベイラー医科大学との共同研究として,FusOn-H2というヘルペスウイルスを開発し,基礎実験において強力なウイルスとして期待できることを確認した.以上,研究期間において,若干の修正は必要としたが,新規ヘルペスウイルスを2種類開発したことになり,将来の臨床応用に向けて更なるウイルス改変作業を継続している.研究代表者が開発したGALV.fusによるsyncytial formationを有するSynco-2Dのヒト胃癌細胞での効果を検討した結果,ヒト胃癌に対する増殖抑制効果を確認できた.GALV.fusのreceptorであるPit-1,Pit-2は恒常的にヒト細胞において発現されていると報告されており,今後の臨床応用を考えた場合,正常細胞に対する毒性や腫瘍細胞でのPit-1,Pit-2の発現量により治療効果の差がある可能性がうる.ヒト

消化器癌細胞や新鮮分離腫瘍細胞でのPit-1,Pit-2の発現量とSynco-2Dの感受性や治療効果の違いを検討したが,ヒト胃癌細胞株ではPit-1,Pit-2の発現には大きな差がないことがほぼ判明した.現在,ヒト胃癌新鮮分離腫瘍細胞でも同様の結果が得られるかを検討中である.oncolytic HSVを用いたウイルス治療は動物実験レベルではanti-HSV immunityの前存在下でも,ウイルスの治療効果は減弱しないと報告されているが,実際のヒトでの臨床応用では治療効果の減弱が生じる可能性がある.そこで,ウイルスの直接投与ではanti-HSV immunityを回避して腫瘍局所にウイルスが到着する前に免疫系に排除されてしまうことを想定し,oncolytic HSVそのその,もしくはoncolytic HSV-DNAをliposomeやPEG (polythylene-glycole)などのbiomaterialにconjugationすることで,DDSを用いた改変型ウイルス療法の基礎的研究を行った.現時点ではliposomeはある程度のDDSとしての効果があることが判明したが,PEGについては我々の予想よりはDDSとしての優位性は証明出来ない.現在,他のbiomaterialでの検証を進めている.総評:本年度は予定研究内容をほぼ達成出来たが,oncolytic HSVに新規遺伝子を搭載した新たな戦略を次年度研究項目に組み入れる必要性がある.前年度研究実績報告書に基づき,当該年度は新規oncolytic HSVの開発に重点を置いた.概要:総評・展望:ほぼ満足のいくpreliminaryな結果が出たところであり,次年度(最終年度)で本研究をまとめる予定である.現時点では,新世代ウイルスの治療効果ならびに安全性を検証している段階である.したがって,本年度(当該年度)は,腫瘍ならびに腫瘍ストローマを標的とした機能分子搭載型ウイルスに搭載する分子の撰択に重点を置く.現時点では,taxan系抗癌剤の耐性機構獲得分子として注目されているTxrl遺伝子のrepression moleculeであるthrombospondin-1(Gene and Dev.20:1975-1981,2006)のexpression cassetteを作成したところである
甲状腺におけるガレクチン‐３の過剰発現は甲状腺癌を誘発するのか？

甲状腺癌におけるガレクチンー3の強発現の意義を解明するために甲状腺でガレクチンー3を過剰発現するトランスジェニックマウスを開発した。マウスが3ヵ月齢になった時点で甲状腺を取り出し、顕微鏡下で観察したが明らかな形態学的異常や甲状腺癌の発癌は認められなかった。観察期間が短いため結論付けられないが、甲状腺癌におけるガレクチンー3の強発現は発癌因子ではなく、発癌した結果、何らかの要因で発現誘導されることが示唆された。ガレクチン-3の過剰発現が甲状腺癌を誘発するかどうかを検討するために、甲状腺特異的にガレクチン-3が過剰発現するようなトランスジェニックマウスの作成を計画した。ヒトのガレクチン-3には機能が異なる一塩基多型があることが知られており2種類のトランスジェニックマウスを作成してそれぞれの発現形を比較することにしていた。まず、トランスジーンの構築から開始し、これは平成24年度中に完成予定であったが細胞レベルでの発現が確認できず試行錯誤を繰り返していた。平成25年度になり2種類のトランスジーンがようやく完成したが、当初の予定通りの2種類のトランスジェニックマウスを作成し維持するためには予算が足らない可能性が高いと判断し、wild typeの1種類のみのトランスジェニックマウスだけを一旦作成する方針にした。現在、受精卵にトランスジーンをマイクロインジェクションしトランスジェニックマウスが誕生するのを待機しているところである。ガレクチン-3という分子が正常甲状腺組織にはほとんど発現を認めず、甲状腺癌組織においてのみ過剰に発現していることを発見し、この分子が発癌過程において必須の分子であるのか、もしくは発癌したあとで過剰に発現をするようになるのかを解明するために、甲状腺特異的にガレクチン-3を強発現するトランスジェニックマウスを開発することを目的とした。確実に甲状腺で安定した発現を得るためにCre-loxPシステムを用いたトランスジェニックマウスの作成を計画し、平成24年7月までに、トランスジーンの構築(2種類)を完成し、平成25年3月までに、目的となるトランスジェニックマウスを作成する予定であった。しかし、現時点でトランスジーンの構築は理論上完成しているが、細胞レベルでの発現が想定通りに確認できず、実験が進んでいない。また、掛け合わせをするためのトランスジェニックマウスの移譲も遅延している状況である。ヒトのガレクチン-3には機能が異なる一塩基多型があることが知られており2種類のトランスジェニックマウスを当初は作成予定であったが、トランスジーンの導入がうまくいかず試行錯誤を重ねて実験を繰り返したところ、予算が足らないと判断して、1種類のみ(wild type)のトランスジェニックマウスを作成する方針に変更した。甲状腺特異的に発現を誘導するプロモーターに問題があることが判明したため、プロモーターを変更して作成を継続しているところである。ヒトのガレクチンー3には機能が異なる一塩基多型があることが知られており2種類のトランスジェニックマウスを作成してそれぞれの発現形を比較することにしていた。しかし、トランスジーンの構築及び目的タンパクの発現確認に時間を要してしまい、2種類のトランスジーンが完成したのは平成25年度であった。その時点で、当初の予定通りの2種類のトランスジェニックマウスを作成し、維持するためには予算が足らない可能性が高いと判断し、wild typeの1種類のみのトランスジェニックマウスだけを作成する方針に切り替えた。また、発現力を重視するために全身の組織で安定した発現が得られることが判明しているpCAGGSベクターをバックボーンとして選択し、ガレクチンー3にHisタグを組み込んだトランスジーンを作成し、トランスジェニックマウスの作成を行った。この系では、想定通りにトランスジーンが組み込まれたトランスジェニックマウスが得られ、マウスが3ヵ月齢になった時点で甲状腺を取り出し顕微鏡下で観察したが明らかな形態学的異常や甲状腺癌の発癌は認められなかった。当初の計画では平成24年7月までにトランスジーンの構築を完成し、平成25年3月までに目的となるトランスジェニックマウスを作成する予定であった。しかし、当初計画していたトランスジーンの作成に予測以上の時間がかかった上に、作成できたトランスジーンをマウス胚に導入しても目的の産仔が得られないことからトランスジーンのデザイン変更を余儀なくされ、ほとんど目的が達成できていない状況である。頭頸部癌樹立したトランスジェニックマウスの解析のために、もともと計上していた予算を使用していないため、補助事業期間を延長して、デザインを変更したトランスジーンを用いて再度トランスジェニックマウスを作成する予定である。

当初の計画では平成24年7月までにトランスジーンの構築を完成し、平成25年3月までに目的となるトランスジェニックマウスを作成する予定であった。トランスジーンの構築に予測以上の時間がかかったため、現在のところトランスジェニックマウスの作成ができていない状況である。また、トランスジーンも当初の計画では2種類作成予定であったが、トランスジーンの構築や細胞レベルでの発現チェックなどを施行している過程で見積もっていた以上の経費が必要になってしまったため2種類ものマウスの作成費用自体が捻出出来ない可能性が高い状況である。平成24年7月までに、トランスジーンの構築(2種類)を完成し、平成25年3月までに、目的となるトランスジェニックマウスを作成する予定であった。しかし、現時点でトランスジーンの構築は理論上完成しているが、細胞レベルでの発現が想定通りに確認できず、実験が進んでいない。また、掛け合わせをするためのトランスジェニックマウスの移譲も遅延している状況である。もともと作成を予定していたトランスジェニックマウスは2種類であったが、作成過程が順調にいかず予算のことを考慮して早期の時点で1種類だけの作成に変更したことと、現時点でトランスジェニックマウスの作成がうまくいっておらず、解析するために計上していた予算を使用していないため。もともと作成を予定していたトランスジェニックマウスは2種類であったが、予算の都合上wild typeの1種類に限定して一旦作成することにした。現在、マイクロインジェクションを終えてトランスジェニックマウスの誕生を待機しているところであり、今後目的のトランスジェニックマウスが誕生すれば順次解析をしていく予定である。当初の目的では、2種類のトランスジーンを構築し、3種類のトランスジェニックマウスを掛け合わせる必要があったが、この方法はタンパク質の安定した発現が期待できるもののやや煩雑で困難であり、実際に作成に難航している状況である。甲状腺特異的に発現するトランスジーンとしては他にも数種類候補があるため、研究計画を多少変更し、異なるトランスジーンを使用したトランスジェニックマウスの作成を考慮中である。新たにデザインを変更したトランスジーンを作成済みであり、補助事業を延長して、目的トランスジェニックマウスを作成し、解析含めて予算を使用する予定である。当初はトランスジェニックマウスの作成に大部分の予算を見積もっていたが、現時点でその作成に至っていないため使用額が予定より少ない結果となった。トランスジェニックマウスの作成が完了すれば次年度に繰り越した予算がほぼすべて使用される事になる。当初はトランスジェニックマウスの作成のために初年度に多くの予算を見積もっていたが、現時点でその作成に至っていないため使用額が予定より少ない結果となった。次年度に使用しなかった予算を繰り越して、トランスジェニックマウスの作成のために使用する予定である。
コンプトン散乱による高温高圧アルコール水溶液の溶液構造解析

アルコール水溶液のマクロ物性は非理想性を示すことが知られており、その挙動はミクロ的な不均一混合に起因するものと考えられている。本研究では、ミクロ的な溶液構造に対応する電子状態を反映したX線のコンプトン散乱に着目した。350 °C、20 MPaのメタノール水溶液を対象とし、高温高圧下におけるコンプトン散乱測定を可能にするベリリウム窓付きセルの開発およびコンプトン散乱の測定を行った。さらに、MDシミュレーションならびに量子化学に基づく理論的検討と比較することで溶液構造の検討を行った。その結果、実験および理論計算共に、低メタノール組成領域で溶液構造が劇的に変化する傾向を確認した。アルコール水溶液の溶液構造の理解は、工学・理学的に重要である。アルコール水溶液の水素結合は組成の変化により大きく変化し、また溶液構造に大きな影響を与えるため、その解明に向けて多くの試みがなされてきた。しかし、電子状態に基づいて厳密に水素結合を検討することは困難であり、共有結合や静電相互作用との本質的な差異の有無、また水素結合が溶液構造に与える影響、およびこれに起因したバルク物性の変化など、水素結合の本質に関しては明らかではない。本研究では電子状態を直接測定する手法であるコンプトン散乱法に着目し、測定および理論計算によりアルコール水溶液の水素結合状態および溶液構造の溶液構造の評価を行った。測定条件を水の臨界点近傍を含む高温高圧下まで考慮することで、温度圧力効果を含めた検討を目的としている。本課題の採択前に行った実験により、X線源にSPring-8のビームライン(BL08W)、測定セルにSUS製のチューブを用いることで、350°C-20MPaにおけるメタノール水溶液のコンプトン散乱のスペクトルが測定できることを確認した。しかし、このとき得られるスペクトルは高温高圧流体の測定であるためS/N比が小さく、また多重散乱の影響も大きいという問題があった。そこで、これらの問題を解決するセルの開発を行い、多重散乱の影響を考慮した高精度な測定手法の確立に取り組んだ。さらに、確立した手法を用いて、350°C-20MPaにおけるメタノール水溶液のコンプトン散乱スペクトルの組成依存性に関するデータの蓄積を行った。常温常圧下におけるアルコール水溶液は局所的に不均一な混合となり、その混合状態も組成に応じて変化することが知られている。この現象は水素結合が大きな役割を果たしていると考えられているが、これまで当研究グループによる体積挙動の解析結果より、水素結合の影響が弱化する亜臨界・超臨界状態といった高温高圧下でもこの局所的な不均一性は残存している可能性について報告している。この現象をコンプトン散乱スペクトルから得られる電子状態についての情報から解析するため、平成24年度に開発した高温高圧流体用測定セルおよびSPring-8のビームライン(BL08W)を利用してアルコール水溶液を対象としたコンプトン散乱スペクトル測定を行った。また、詳細な体積挙動との比較を行うため、高温高圧流体用の高精度密度測定装置の開発を行うとともに、高温高圧アルコール水溶液の密度データの蓄積を行った。コンプトン散乱スペクトルの測定条件は、メタノール水溶液は常温常圧下から350°C、20MPa、エタノール水溶液は常温常圧から150°C、20MPaとすることで、電子状態の温度圧力および組成に対する変化を解析した。その結果、メタノール水溶液、エタノール水溶液共に、高温高圧下における電子状態は、純成分の測定値から予想される状態(理想混合)から偏倚したものとなり、その偏倚の挙動もアルコール組成0.04から0.2を境にして大きく変化することを確認し、これまでの実験および分子シミュレーションによる解析結果を支持する結果が得られた。X線の出入口にベリリウム製の窓を用い、さらに多重散乱光の影響を抑える形状をしたセルを開発した。このセルを用いて、350°C-20MPaにおけるメタノール水溶液のコンプトン散乱実験を行った。新規に開発したセルを用いることにより、ステンレスに起因した多重散乱を大幅に減少させることができ、またS/N比の大幅な向上を確認した。多重散乱の減少により、当初予定していたモンテカルロ計算による多重散乱の考慮を行わなくても十分な精度で測定できる可能性が示唆された。また、S/N比の向上により、測定時間を既往のセルを用いた場合に比べて約1/3まで短縮することが出来た。得られたコンプトン散乱のスペクトルは、メタノール組成の増加によって低組成領域で挙動が大きく変化する傾向が確認できた。これは体積挙動をはじめとする他物性でも確認されている傾向であり、今後実施を予定している理論計算との組み合わせにより、ミクロ物性とマクロ物性の関連性を解明できる可能性が示唆された。上述の結果は、本課題の申請時に予定した実験結果より得られたものであり、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。

量子化学計算により原子座標配置に対応したコンプトン散乱のスペクトルが求められることから、原子座標を仮想的に摂動させながらこのスペクトルを算出し、実測値との比較を行う。さらに分子シミュレーションから一部領域内の分子を抽出し、その座標情報からコンプトン散乱のスペクトルを求めて実測値との比較を行うことで、分子内および分子間の構造を解析する。コンプトン散乱のスペクトルは、分子内よりも分子間の位置関係を強く反映するという特徴を持つため、測定する温度圧力範囲を変化させることにより、メタノール水溶液の溶液構造、分子間距離を大きく変化させ、特に低い密度領域で組成を変化させることで、分子内構造の微小な変化を抽出して検討する。アルコール水溶液の理解を一般化するため、対象をエタノール水溶液まで拡張し、メタノール水溶液と同様の条件でコンプトン散乱実験と理論計算による解析を行う。これより温度、圧力、組成の他にアルコール種、つまりアルキル基が変化したときの水素結合状態および溶液構造の変化に伴うコンプトン散乱のスペクトルの挙動を確認する。25年度が最終年度であるため、記入しない。