hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
浸漬型膜分離システムにおける膜透過性能と生物処理性能に関する研究

これは,曝気停止後溶存酸素が完全に消費されるまで10分程度必要となるため,非曝気時間が15分では脱窒が不十分であったことに起因した。2)膜透過能への影響曝気サイクルが15-30分の系でのみ,設定フラックスを保つため操作圧力を上昇させる必要があったが,他系では操作圧力の上昇は僅かであった。浸漬型システムでは曝気時にのみ吸引を行うので15-30分の系では吸引時に高圧力を必要とし,膜面付着層の圧密が進行することが原因と考えられた。膜分離システムにおいて生物反応と膜分離を単一の槽で行わせる浸漬型膜分離活性汚泥法は膜ろ過に必要なエネルギーを大幅に削減可能である。また,有機性廃水処理においては富栄養化防止の観点から窒素除去も望まれるが,本法では間欠曝気により一槽で好気状態と無酸素状態を起こし硝化脱窒を行えるため,装置のコンパクト化という点でも注目されている。本研究では一槽間欠曝気式膜分離システムの効率的な運転条件を明らかにすることを目的として,曝気サイクルや汚泥負荷等の運転条件が窒素除去能及び膜透過能へ与える影響とそのメカニズムを連続実験と回分ろ過実験により検討した。昨年度は生物処理の汚泥負荷条件を一定にして曝気サイクルが及ぼす影響について検討し,各々の観点から効率的な運転条件を明らかにした。本年度は汚泥負荷条件が及ぼす影響について検討した。汚泥負荷条件として,一定の汚泥濃度で容積負荷の影響をみるとともに汚泥引き抜きを行わないClosedシステムでの運転も行った。その結果,以下の知見が得られた。1)窒素除去能への影響汚泥負荷が高すぎると,硝化反応が処理限界に達するため処理水中にアンモニア性窒素が残存し,除去率が低下する。しかし,汚泥を引き抜かないClosedシステムでの運転では,汚泥負荷が低いため,高い容積負荷であっても高い窒素除去率が得られる。2)膜透過能への影響膜透過能に関してもClosedシステムでの運転が有利であることが明らかとなった。汚泥負荷の高い条件で不利であるのは,活性汚泥に吸着・貯蔵されている有機物が多くなるため,汚泥の粘着性が増し,膜面に粘性の高い付着層が形成されるためと考えられる。一方,Closedシステムでの運転では,汚泥の粘性が低く,付着力の弱いケーキ層が膜面をコーティングするため膜透過流束の低下が抑制されると考えられる。
放射光を用いた単色X線CTの開発と応用

高分解能な画像を得るための放射光CT装置を作製し予備的な実験を施行した。実験装置は、X線モノクロメータ部(X線ミラー、X線シャッター、X線スリット)、資料部(資料の回転、移動(XYZ軸))、X線検出部(X線のコリメーション、X線遮蔽、高分解能なX線検出器)、計算機システムより構成されている。1)X線モノクロメータ部:3倍高調波を含まない単色X線を作り出す最も重要な部位である。被射体として、犬または猫が撮影できるように、これまでにない150mm幅の大型X線ミラーを作製し、その特性実験を施行した。2)高性能なX線検出器:BGOシンチレータに階調度(60000:1)のCCD検出器を接続されたもので、空間分解能は200μm、特別仕様で浜松ホトニクスで作製した。16bitアナログデジタル変換装置が内蔵されており、X線データを直接計算機に取り込む事が可能であった。この検出器は、5cmのline detectorを3個並べたものであるが、接続部でノイズが発生しア-テイファクトの原因となっており、補間撮影などを行ない画像を改良するための検討が必要と考えられた。3)計算機システム:workstationを使用した画像再構成は短時間に終了することが可能である。平成6年度の秋に装置がシステムとして完成し、動物を含めた本格的な実験をトリスタンAR加速器に設置してあるビームラインで実施する計画であった。しかし、AR加速器が実験途中から故障し、装置全体の特性を検討することしかできなかった。科研費の補助期間が過ぎてしまったが、本格的な実験はこれから始まる事になる。本年度は、放射光CT装置の設計と製作が主な研究項目となった。実験装置の構成は、X線モノクロメータ部(X線ミラー、X線シャッター、X線スリット)、資料部(資料の回転、移動(XYZ軸))、X線検出部(X線のコリメーション、X線遮蔽、高分解能なX線検出器)よりなる。1) X線モノクロメータ部:この部位は、単色X線を作り出す上で最も重要で、これまでの実験で問題になっていた3倍高調波を完全に消去するために、2枚の結晶格の異なるシリコン製のミラーを用いた。また、被射体として、犬または猫が撮影できるように、これまでにない150mm幅の大型X線ミラーを作製している。X線熱負荷を軽減するためミラーの冷却機構も内蔵している。また、画像収集時間を任意に設定できるX線シャッターが組み込まれている。2)高性能なX線検出器:本研究の要となるのが、検出器である。一般のX線CTで利用されている検出器を利用することが可能であれば問題がないが、X線のビームが平行光なので特別な線検出器を利用しなければならず選定に最も苦労した部位である。蛍光板に階調度(60000:1)のCCD検出器を接続させたもので、空間分解能は200μm、特別使用で浜松ホトニクスで作製した。16bitアナログデジタル変換装置がついており、本実験を遂行するうえで十分な性能を備えている。現在、装置が完成し、その装置間の接続と稼働状況を検査しているところである。本年度で、放射光CT装置を計算機等と接続し装置としてほぼ完成した。実験装置の構成は、X線モノクロメータ部(X線ミラー、X線シャツタ-、X線スリット)、資料部(資料の回転、移動(XYZ軸))、X線検出部( X線のコリメーション、X線遮蔽、高分解能なX線検出器)、計算機システムよりなる。

被射体として、犬または猫が撮影できるように、これまでにない150mm幅の大型X線ミラーを作製し、その特性実験を施行した。2)高性能なX線検出器:BGOシンチレータに階調度(60000:1)のCCD検出器を接続させたもので、空間分解能は200μm、特別使用で浜松ホトニクスで作製した。16bitアナログデジタル変換装置が内蔵されており、X線データを直接計算機に取り込む事が可能であった。この検出器は、5cmのline detectorを3個並べたものであるが、接続部でノイズが発生しア-ティファクトの原因となっている。3)計算機システム:workstationを使用した画像再構成は短時間に終了することが可能である。本年度は、トリスタンAR加速器が故障し十分な実験ができなかったが、装置全体の問題点、特性を検討することができた。
収穫後のウンシュウミカンにおいて発生する異味異臭の原因成分の特定と発生機構の解明

収穫後のウンシュミカン果実において発生する異味異臭の原因成分を特定し、発生機構を解明するため、異味異臭を発生させる収穫後要因を調査した。収穫後温度は異味異臭の発生要因の一つであり、10°Cでは異味異臭が発生しないのに対して、5°Cでは異味異臭が発生するとともにオルニチンが顕著に集積した。しかし、オルニチンそのものは異味異臭の原因物質ではなく、オルニチンの集積を伴う代謝変化が異味異臭の発生に寄与していることが明らかとなった。さらに、オルニチンが集積しにくい温度で果実を保存すると、異味異臭の発生を抑制できる可能性が示唆された。収穫後のウンシュウミカン果実は、保存条件によっては異味異臭が発生して食味が大幅に低下する場合があるが、原因物質は解明されていない。本研究では、異味異臭の原因物質を特定し発生機構を解明するほか、制御方法を明らかにする。前年度までに、収穫後の果実を約3ヶ月保存すると、10°Cでは異味異臭が発生しないのに対し、5°Cでは明らかな異味異臭が発生して食味が大幅に低下し、ウレアサイクルのアミノ酸の一種であるオルニチンが顕著に集積することを明らかにした。そこで本年度は、収穫直後と5°Cで保存した果実についてCE/MSによるメタボローム解析を行い、オルニチンから派生する代謝物の変動を調査した。その結果、5°Cで保存した果実ではオルニチンから派生するポリアミンの一種が集積する傾向が見られた。次に収穫直後の果実と5°Cで保存した果実の遺伝子発現をマイクロアレイで解析した。その結果、オルニチン代謝周辺の生合成遺伝子の発現は、オルニチン生合成およびオルニチンからポリアミンへと代謝を促進する酵素群(3種類)が上昇する傾向(Log2 ratioで1.3以上の発現差)を示し、ポリアミンの分解に関与する酵素群(4種類)が下降する傾向(Log2 ratioでー1.3以下の発現差)を示した。この結果から、ウンシュウミカンを低温(5°C程度)で長期貯蔵すると、オルニチンが集積するとともに、集積したオルニチンの代謝が進み、オルニチンから派生するポリアミンの一種(腐敗臭の成分のひとつ)が集積しやすい可能性が示唆された。ウンシュウミカン果実は、収穫後の保存条件により、異味異臭が発生し食味が大幅に低下するが、原因成分は未解明である。本研究では、異味異臭の原因物質を特定し、異味異臭の発生機構および制御方法を解明する。本年度は、果実を異なる温度(5,10,20および30°C)で約3ヶ月間、保存した後、食味調査およびLC/MS/MSによるメタボローム解析(糖、有機酸、アミノ酸を測定)を実施し、異味異臭の発生果実と非発生果実を実験的に作成して成分プロファイルを比較した。さらに、ウンシュウミカン品評会で食味審査を受けた363点の果実試料の成分プロファイルを分析し、果実に対する審査員の食味評価結果で、異味異臭の発生により食味が悪いと判定された果実試料に特徴的な成分を調査した。その結果、異なる温度で保存した果実の中で、10°Cで保存した果実では、異味異臭の発生による食味低下はおこらず、収穫直後の果実に最も近い成分プロファイルを維持していた。一方、5°Cで保存した果実では、2ヶ月後から異味異臭が発生して食味が大幅に低下し、アミノ酸の一種であるオルニチンとグルタミンが顕著に集積していた。これらのアミノ酸の集積は、品評会の食味審査で異味異臭の発生により食味が悪いと判定された果実試料でも観察された。以上の結果から、収穫後のウンシュウミカンにおける異味異臭の発生には、オルニチンとグルタミンの集積が関与している可能性があり、TCA回路から派生する、ウレアサイクル周辺の代謝系の変動が関与している可能性が示唆された。そこで本研究では、異味異臭の原因物質を特定し発生機構を解明するほか、制御方法を明らかにすることを目的とした。収穫後のウンシュウミカンを果実を異なる温度で保存すると、5°Cでは果肉中のオルニチン(ウレアサイクルのアミノ酸の一種)の含量が、約1-2週間で収穫直後に比べて約3-5倍程度に増加し、その2-3ヶ月後には異味異臭が発生して食味が大幅に低下するのに対して、10°C程度の温度ではオルニチンの集積が見られず、2-3ヶ月後でも5°Cで見られた異味異臭が発生しないことを明らかにした。

しかし、オルニチンが集積した直後の果実(5°Cで約1-2週間保存)の食味に異常がないことから、オルニチンそのものは異味異臭の原因物質ではなく、オルニチン集積に伴って発生する代謝物が異味異臭に寄与している可能性があると推察された。マイクロアレイ解析の結果、5°C保存中に異味異臭が発生した果実では、オルニチン生合成およびオルニチンからポリアミンへと代謝を促進する酵素群の遺伝子発現が上昇する傾向が見られた。そこで本年度はポリアミンおよび関連代謝物の含量を詳細に調査したところ、異臭が発生した果実においてポリアミンの顕著な集積は確認されなかった。このことから、異味異臭の原因成分を特定するためには、ポリアミンから派生する代謝産物等についてより詳細に解析する必要があると考えられた。さらに、オルニチンが集積しにくい温度条件で果実を保存すると、収穫後の異味異臭の発生を軽減できる可能性が示唆された。農学本研究は、収穫後のウンシュウミカンにおいて発生する異味異臭の原因物質を特定し、異味異臭の発生機構および制御方法を解明することを目的とする。本年度は、メタボローム解析やマイクロアレイ解析などを用いて、ウンシュウミカンを低温で長期貯蔵した際に見られる異味異臭の発生に関与する酵素群を特定し、異味異臭の原因成分の特定と発生機構を解明することを研究目標としている。本年度の研究から、5°C保存により異味異臭が発生した果実では、オルニチンから派生するポリアミンの一種が集積する傾向が見られ、マイクロアレイ解析結果からも、異臭物質であるポリアミンを集積しやすい遺伝子発現プロフィールになる可能性が示された。異味異臭の原因成分の特定については、ポリアミンは有力な候補成分のひとつではあるが、近年、ポリアミンのさらなる分解代謝経路が報告されているため、今後、検証が必要である。以上の理由から、本年度の研究目的である、異味異臭の発生に伴い変動する酵素群の特定(オルニチン代謝およびポリアミン生合成系)と発生機構の解明(ポリアミン集積の可能性)が達成されているため、研究はおおむね当初の計画通り進展している。本研究では、収穫後のウンシュウミカンにおいて発生する異味異臭の原因物質を特定し、異味異臭の発生機構および制御機構を解明することを目的とする。一年目は、異味異臭の発生果実と非発生果実の成分プロファイルを比較し、異味異臭の発生に伴って変動する成分と代謝系をスクリーニングすることを研究目標としている。本年度の研究から、収穫後のウンシュウミカンにおける異味異臭の発生には、アミノ酸の一種であるオルニチンとグルタミンの集積が関与している可能性があり、TCA回路から派生する、ウレアサイクル周辺の代謝系の変動が寄与している可能性が示唆された。これらの研究成果は、国際学会で発表したほか、論文として発表し、国際誌(Journal of Agricultural and Food Chemistry)に掲載された。以上の理由から、本年度の研究目的である、異味異臭の発生に伴い変動する成分の特定(オルニチンとグルタミンの集積)と代謝系のスクリーニング(TCA回路から派生する、ウレアサイクル周辺の代謝系)が達成されており、論文として発表されているため、研究は当初の計画通り進展している。本年度までに、ウンシュウミカンを低温(5°C程度)で貯蔵するとオルニチンが集積し、さらに代謝が進んでオルニチンから派生するポリアミンの一種(腐敗臭の成分)が集積する傾向があり、これらの代謝変化が異味異臭の発生に寄与している可能性を見いだした。異味異臭の原因成分としてポリアミンは有力な候補成分のひとつではある。しかし近年、米などの作物において、ポリアミンの新たな分解代謝経路が解明され、ポリアミンの分解産物である香気成分が米の香りの原因成分であることが報告された。
生物機能を戦略基盤とする健康・環境センサーの開発

生物の有する特異機能を摸倣し,健康センサーとして一酸化窒素センサーを,環境センサーとしてVOCセンサーおよび微生物センサーを開発した.生物の有する特異機能を摸倣し,健康センサーとして一酸化窒素センサーを,環境センサーとしてVOCセンサーおよび微生物センサーを開発した.生体中に存在する金属酵素の諸機能を利用し、次の3つのセンサー、VOC(揮発性有機化合物)センサー、微生物センサー、NOセンサーを、生体系金属酵素を模倣した金属錯体を用い開発した。まず、(i)VOC(揮発性有機化合物)センサーは、シップインボトル法により、ゼオライトの細孔内にフタロシアニンをShip-in-bottle法により合成したフタロシアニン内包ゼオライトがトルエン、キシレン、ベンゼン、アセトアルデヒド、アルコールを分子レベルでセンシングできることを、QCM(水晶振動子)を用いた実験により明らかにした。アルコールセンサーについては、現在デバイス化を進めている。次に,(ii)微生物センサーは、細胞が有する鉄捕集化合物であるシデロフォアの機能を利用・発展させたものであり、ヒドロキサム酸型とカテコール型の人工シデロフォアの開発を行った。今年度は新しく取組んだカテコール型シデロフォアの合成に成功した。そして、3つ目の(iii)NOセンサーは、一酸化窒素分子が神経伝達物質であり、血管の弛緩作用を有するなど重要な役割をすることから、それらを認識する材料の開発は期待されていたが、本研究では、この一酸化窒素分子をセンシングする分子の開発に成功した。具体的には、N2S2系配位子を有するコバルト錯体と鉄錯体である。これらは高感度でしかも一酸化窒素のみを結合することが明らかとなった。【目的】生物機能を摸倣した幾つかのセンサーの機能をデバイス化し、その実用化開発を行うことを目的としている。【具体的内容】具体的には、生物における酵素の基質特異性とは、基質や反応物の高選択性と活性部位の高活性である。これら機能の追求の中で、幾つかのセンサーが見つけられた。(1)VOCセンサーは酵素における基質の認識機能である。具体的には、ゼオライトの細孔にフタロシアニン分子を内包したもので、VOCのセンシング機能を有する。(2)NOセンサーはニトリルヒドラターゼにおけるストッパーとして働く一酸化窒素に着目し、その金属との反応性を検討して行く中で見つかった機能である。(3)また微生物センサーは、動植物微生物に限らず全ての細胞がシデロフォアという鉄捕集分子を有し、これが鉄の捕集機能があり、シデロフォア機能の研究追求の中で見いだされた機能である。【意義・重要性】(1)VOCセンサーは、揮発性有機物が目や健康を害することはよく知られており、このセンサーの開発により、VOCの濃度チェックができる。(2)NOセンサーは、血管の弛緩作用はNOの生体中の濃度に依存する。そのため、この濃度を測定するデバイスができると、動脈硬化等の健康被害をチェックする事ができる。(3)微生物センサーは、空気中に浮遊するウイルス等の微生物を捕まえる事ができるため、病院等での環境チェックに使える。【進捗状況】(1)現在、アルコールセンサーとしての利用に注視し、現在ゼオライトの疎水化を進めており、感度と選択性の向上を図っている。(2)NOの高選択性は示されており、デバイス化が当面の課題である。(3)細胞により利用するシデロフォアが異なっており、現在そのライブラリーを作成中である。生体系金属酵素が有する特異な機能を模倣して,その活性中心である金属イオンが種々の分子と結合することを利用し,健康センサーおよび環境センサーを開発した。健康センサーとしては、血管の弛緩作用があることで知られる一酸化窒素(NO)センサーを開発した。このセンサーはコバルト(III)を含む平面性錯体で、酸素や一酸化炭素や硝酸イオンや塩化物イオンや水とは全く反応せず,一酸化窒素とのみ反応することが分かった。また、揮発性有機化合物(VOC)をセンシングする化合物の合成にも成功した。この物質はゼオライトにフタロシアニンを内包した物質で、臭い成分として知られるノネナール、ピリジン、アミン、インドール、アセトアルデヒド、アンモニア等をセンシングできることが分かった。この物質はアルコールもセンシングできることが分かり,現在アルコールセンサーとしての応用展開を目指している。3つ目は微生物センサーの開発に成功した。これは、あらゆる細胞が鉄を体内に取り込むことが知られており,この機能を果たしているのがシデロフォアであり、この鉄ーシデロフォアを細胞内に取り込む原理を使い、微生物をセンシングするセンサーを開発した。シデロフォアとしてはカテコール型やヒドロキサム酸型があるが、これらのハイブリッド型も含めて合成することに成功し、微現在、生物選択性を検討中である。3つの健康?環境センサーの開発を進めており、VOCセンサーは実用化に向けて進めており、NOセンサーは現在論文執筆中であり、微生物センサーは論文として掲載されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。VOCセンサーは実用化に向けて、企業と感度および選択性の向上を狙っており、NOセンサーはその選択性に優れており、論文執筆中であり、微生物センサーについてはライブラリー化を進めている。
FRP積層構造物の多目的最適設計法に関する研究

FRP積層構造物の多目的最適設計法に関する研究を進めるにあたり,まず構造解析に用いられる各種理論について検討を加えた.従来のFRP積層構造物の構造解析においては,まず構造物の等価剛性を算出し,その後に異方性弾性論により解析を行なうことが多いが,積層構造物を構成するFRPラミナ間に剥離がある場合やラミナ間に減衰材を挟んで成形したものに関してはこれまでの理論(積層理論)では十分とは言いがたい.そこで,積層構造物を構成するラミナごとに基礎方程式を考え,変位・応力の連続性により全体の系を定式化(多総理論)する解析を行ない,積層理論から得られる固有振動数,応答曲線との比較により積層理論の適用範囲を明らかにした.また,積層円筒殻に関する自由振動特性,弾性座屈特性を明らかにすると共に,殻が軸圧縮荷重を受ける場合の自由振動特性も明らかにした.そして,この解析法が比較的小さい規模の計算機(例えばパソコン等)で精度の高い解が求まることがわかった.したがって,このような計算コードをサブルーチン化することにより,最適設計プログラムに組み込めると考えられる.以上のように,FRP積層構造物の構造解析において,その目的にあった各種理論を展開してその適用範囲を明らかにした.今後はここで得られた知見・解析コードをもとに現実の設計において利用できるような多目的最適設計手法を開発していく予定である.FRP積層構造物の多目的最適設計法に関する研究を進めるにあたり,まず構造解析に用いられる各種理論について検討を加えた.従来のFRP積層構造物の構造解析においては,まず構造物の等価剛性を算出し,その後に異方性弾性論により解析を行なうことが多いが,積層構造物を構成するFRPラミナ間に剥離がある場合やラミナ間に減衰材を挟んで成形したものに関してはこれまでの理論(積層理論)では十分とは言いがたい.そこで,積層構造物を構成するラミナごとに基礎方程式を考え,変位・応力の連続性により全体の系を定式化(多総理論)する解析を行ない,積層理論から得られる固有振動数,応答曲線との比較により積層理論の適用範囲を明らかにした.また,積層円筒殻に関する自由振動特性,弾性座屈特性を明らかにすると共に,殻が軸圧縮荷重を受ける場合の自由振動特性も明らかにした.そして,この解析法が比較的小さい規模の計算機(例えばパソコン等)で精度の高い解が求まることがわかった.したがって,このような計算コードをサブルーチン化することにより,最適設計プログラムに組み込めると考えられる.以上のように,FRP積層構造物の構造解析において,その目的にあった各種理論を展開してその適用範囲を明らかにした.今後はここで得られた知見・解析コードをもとに現実の設計において利用できるような多目的最適設計手法を開発していく予定である.
コンビナトリアル計算化学による複合的触媒機能の原子レベル制御

研究代表者らは、コンビナトリアルケミストリーの概念を計算化学に取り入れた「コンビナトリアル計算化学」という新しいコンセプトを提唱している。このコンビナトリアル計算化学では、周期表のありとあらゆる元素の機能、特性を計算化学により予測することによって、全く新しい触媒材料の研究開発を推進しようというものである。つまり、実験的にすでに明らかにされている機能や特性を計算化学を用いることによって、原子・分子レベルでの理解を深めるのではなく、計算化学を材料探索のための高速なスクリーニング手法として活用することを目的とする。この方法論の実践には高速な計算手法の開発が必須であり、一昨年度に従来の第一原理分子動力学法に比較し、約5000倍の高速計算を実現した高速化量子分子動力学計算プログラムColorsの開発に成功した。本年度は、本プログラムの予測性と精度を向上させるために、本計算に使用するパラメータを第一原理的に決定する方法論の開発に成功した。これにより、高速かつ高精度な電子状態ダイナミックスの解明が可能になった。さらに、開発した上記プログラムや第一原理計算を活用することにより、メタノール合成触媒、ダイオキシン分解触媒、クリーン燃料合成用硫化物触媒、燃料電池用アノード触媒など様々な触媒系に対して、研究代表者らの提唱するコンビナトリアル計算化学の有効性を示すことに成功した。特に、実験的には未だ明らかになっていない新触媒の提言にも成功した。著者らは、コンビナトリアルケミストリーの概念を計算化学に取り入れたコンビナトリアル計算化学という新しいコンセプトを提唱している。このコンビナトリアル計算化学では、周期表のありとあらゆる元素の機能、特性を計算化学により予測することによって、新しい材料開発を推進しようとするものである。つまり、実験的にすでに明らかにされている機能や特性を計算化学を用いることによって、原子・分子レベルでの理解を深めるのではなく、計算化学を材料探索のための高速なスクリーニング手法として活用することを目的としている。この方法論の実践には高速な計算手法の開発が必須である。昨年度は、従来の第一原理分子動力学法に比較し、約5000倍の高速計算を実現した高速化量子分子動力学計算プログラムColorsの開発に成功した。本年度は本プログラムを活用し、Pd水素吸蔵合金上での水素分子の解離吸着反応ダイナミックス、AlPO系触媒上でのフロン分子の分解反応ダイナミックス、担持金属触媒の結晶成長過程ダイナミックスなどを世界的にも初めて解明することに成功した。さらに、上記プログラムや従来の第一原理計算手法を活用することにより、メタノール合成触媒、Fischer-Tropsh合成触媒、燃料電池、NOx分解触媒など様々な触媒系に対して著者らの提唱するコンビナトリアル計算化学の有効性を示すことに成功した。
消化管分泌細胞の細胞膜機能変化を介しインクレチン分泌量を変化させる食品成分の研究

本研究では、食品に含まれるスフィンゴ脂質やポリフェノール、多糖が消化管内分泌細胞の細胞膜機能をどの様に変化させるのか、また、食品成分受容体の活性化キネティクスにどの様な影響を与えるのかを細胞レベル、分子レベルで明らかにする事を目的とした。具体的には長鎖脂肪酸受容体GPR120に焦点をあて、まず簡便で、定量性の高いアッセイ方法の確立を目指し、「TGFα切断アッセイ」を導入した新規方法を確立した。この方法を用いて、1.新規リガンド探索と、2. αリノレン酸/GPR120シグナリングに影響を与える分子の探索、を行い、いくつかの新規リガンド、シグナル制御分子を見出す事に成功した。メタボリックシンドロームの患者は、国内で940万人にのぼり、その治療/予防法の開発は社会保障費抑制の観点からも社会的急務と言える。本症候群は、医薬品による治療が難しく、その為予防研究の重要性も高い。本症候群は食生活の改善/運動等が有効とされる事から、これら生活習慣を科学的に検証する必要がある。近年、食品由来の糖、脂肪酸、ペプチド等が消化管分泌細胞上に発現する受容体を刺激し、インクレチンと呼ばれるホルモンの分泌を介してインスリンの分泌促進や食欲抑制等に働く事が明らかになってきた。インクレチンの一つGLP-1は、インスリンの分泌促進や食欲抑制等に働く事が知られ、現在、GLP-1受容体やその分解酵素がII型糖尿病改善薬のターゲットとして注目を集めている。GPR120は、脂肪酸の受容体として知られ、小腸内分泌細胞において脂肪酸をセンシングし、GLP-1の分泌を促す事が知られている。本年度は、このGPR120の活性化を定量的に検出する方法を開発した。具体的にはGPCRの活性化によるTGFαの分解を指標したアッセイ系をGPR120に応用した。その結果、従来法のウエスタンブロットに比較して、感度も、定量性もかなり優れたアッセイ系が完成した。研究代表者は、近年、細胞膜スフィンゴミエリンの合成代謝が、細胞膜の機能を変化させ、細胞膜上の受容体の制御に関わる事を見出した。一方でスフィンゴミエリン合成酵素欠損マウスは、高脂肪食誘導性の肥満、糖尿病といった代謝性疾患の発症に対して抵抗性が見られた。これらの事は、細胞膜上のスフィンゴ脂質の合成代謝により、食欲抑制やインスリンの分泌に関わるインクレチンの分泌や働きが変化している事を示唆していた。本研究では、食事中の脂肪酸を認識し、インクレチンの分泌を促進させる受容体の一つGPR120に注目し、その簡便な活性検出方法の開発や、その活性に影響を与える食品成分の探索を行った。その結果、興味深い事に、海苔に含まれる硫酸化多糖であるポルフィランが、GPR120の働きを強く促進する事を見出した。当初の研究計画では、26-27年度でGPR120の新規アッセイ系を確立し、このシグナルに影響を与える分子の探索をスタートさせる予定であった。現在、この計画通りに進行している。メタボリックシンドローム該当者及びその予備軍は900万人を超えると考えられ、社会保障費低減の観点から、その治療法及び予防法の開発が望まれている。インクレチンは抗メタボリックシンドローム効果を持つことから、注目されている。当研究では、食品に含まれるスフィンゴ脂質やポリフェノール、多糖が消化管内分泌細胞の細胞膜機能をどの様に変化させるのか、また食品成分受容体の活性化キネティクスにどの様な影響を与えるのかを細胞レベル、分子レベルで明らかにする事を目的とした。具体的には長鎖脂肪酸受容体GPR120に焦点をあて、まず簡便で、定量性の高いアッセイ方法の確立を目指し、オーファンGPCRのリガンドスクリーニング法として開発されたTGFα切断アッセイを、適用した新しい方法を確立した。この方法を用いて、1.新規リガンド探索と、2. αリノレン酸/GPR120シグナリングに影響を与える分子の探索、を行った。その結果、食品成分の中からいくつかの新規リガンド、シグナル制御分子を見出す事に成功した。今回の研究で、スサビノリに含まれるポルフィオランや、発酵茶に含まれるポリフェノールが、αリノレン酸/GPR120シグナリングを増強/減弱させる事を見出した。小腸内分泌細胞は、脂肪酸や糖、アミノ酸といった栄養成分以外にも、様々な非栄養成分に暴露されている。今回の発見は、非栄養成分が、インクレチンシグナリングの調整に関わっているという事を示唆し、これらの全く新しい機能性の可能性を示している。申請者らは、これまで食品に含まれるスフィンゴ脂質の食品機能性の研究を行って来た。その中で、穀物や酵母に特異的に含まれるスフィンゴ脂質分解物ファイトスフィンゴシンが、細胞のスフィンゴミエリン(SM)の生合成を活性化させる事を明らかにした。

近年、ミカンの果皮に含まれるリモノイドの一種がSMの合成を阻害する事も報告された。興味深い事に、ミカンの皮は陳皮と呼ばれ、食欲を改善する漢方薬として古くから知られている。また、海藻に含まれるカロテノイドが細胞膜のSMに結合し、細胞膜機能を変化させる事も報告された。この様に、食品成分の中には、SMの生合成を変化させたり、細胞膜上のSMに直接働く物質が少なからず存在する事が明らかになってきた。私は、食品に含まれるスフィンゴ脂質やリモノイド、カロテノイド等が消化管分泌細胞のSM組成や細胞膜機能をどの様に変化させるのか。それによってインクレチンの分泌量等にどの様な影響を与えるのかを細胞レベル、分子レベルで詳細に明らかにし、メタボリックシンドロームを未然に防ぐ食品成分群の全容を解明したいと考えている。当研究では、食品に含まれるスフィンゴ脂質やリモノイド等が消化管分泌細胞の細胞膜機能をどの様に変化させるのかを細胞レベル、分子レベルで詳細に明らかにする。その為に脂肪酸受容体GPR120に焦点を当て、A. GPR120の脂肪酸による活性化キネティクス解析実験系の確立が最初の関門となる。本年度の研究で、この部分をクリアでる事が決定し、その為この様な評価を行った。これまでの研究で、GPR120の安定したアッセイ系が確立した。本年度は、これを活用して様々な食品成分の中から、脂肪酸が誘導するGPR120シグナリングに影響を与える分子を探索し、それらがどの様なメカニズムでシグナルに影響を与えているのかを詳細に検討する。これにより、食品に含まれている非栄養成分の新しい生理機能を明らかにしたい。生化学本年度、GPR120の活性化を評価する実験系が確立した。今後は、SM合成に影響を与える分子がGPR120の活性化キネティクス/インクレチン放出に与える影響の詳細な解析を行う。具体的には、SM合成を阻害する事が知られているミカンの果皮に含まれるリモノイドと、細胞のSMに作用する事が知られている海藻由来のカロテノイドがGPR120の活性化キネティクスに与える影響を検討する。さらに、将来的には、対象物質を広げ、食品抽出物や、食品から精製した物質の中からGPR120の活性化キネティクスに影響を与える物質群をスクリーニングする。我々は以前の研究でSM合成酵素の一つSMS2を欠損したマウスは高脂肪食誘導性の肥満/糖尿病に耐性を示す事を明らかにした。SMS2を阻害する物質は、細胞膜のSM量を減らし、抗肥満/抗糖尿病効果を持つ事が期待される。しかし、これまでの所、SMS2を直接阻害する物質は見つかっていない。そこで、これらの研究に加えて、上記研究で用いた食品抽出物や、食品から精製した物質の中からSMS2阻害物質に関してもスクリーニングを行う。昨年度は、研究が順調に進み、予定していた消耗品試薬の消費が少なかった。本年度は、研究計画がスムーズに進行し、予想以上に残金が生じた。しかし、その分の研究は次年度に行う予定ある。本年度は、探索研究を行う為に、出来るだけ多くの種類の試薬を揃える必要がある。よって、これらの研究費を有効に活用し、少しでも多くの探索研究を行いたい。次年度に使用する額が生じたが、最終的には計画にある研究を全て行い、同額が必要になる。
被爆者病理標本における残留放射能の検出と内部被曝の分子病態解明

原爆被爆者について放射性物質が体内に取り込まれたという証拠はない。放射性物質の経口摂取や吸入は発がんリスクの増加に深く関わっている。1945年死亡した長崎原爆被爆者の保存試料に長崎原子爆弾の原料プルトニウムが存在し、70年経った今もなお被爆者の細胞からアルファ放射線を出し続けている画像を撮影した。原爆被爆者の肺、肝臓、骨等のパラフィン標本からは239、240Pu特有のアルファ飛跡パターンが得られ、内部被曝の放射線量は対照群に比べ高く、被爆時の遮蔽と死亡日に関与していた。我々の結果は原子爆弾による内部被曝の科学的証拠を世界に提示し、被爆者の内部被曝の影響を病理学的に研究するひとつの橋頭保となる。本研究の目的は、人体内残留放射能の病理学的研究を行うことである。長崎原爆被爆者の体内残留放射能を検出し、放射線が人体に及ぼす内部被曝の影響を病理学的に検討する。1945年に亡くなられた長崎原爆急性被爆症例ではオートラジオグラフィー法による検討で、肺、腎、骨等のパラフィン標本について長崎原子爆弾の核種である239Puから放出される特有のアルファ粒子飛跡パターンが認められることを報告した。これは、原爆被爆者における初めての内部被曝の証拠となった。今年度は、1)長崎急性原爆被爆者病理標本で認められたアルファ放射体の核種同定を行うこと、2)放射線ゲノム不安定性に関わる分子病理学的側面から、内部被曝の病理学的指標として、DNA二重鎖切断部位に集積して核内フォーカスを形成するp53 binding protein 1 (53BP1)の発現について検討した。結果1)1979年に長崎西山から採取された土壌サンプル、210Po. 241Am, 243Amのアルファ放射体標準品を用いたオートラジオグラフィー法による飛跡の解析で、各々の核種はアルファ粒子のエネルギーと飛跡の長さの関係を成立させた。得られた飛跡の長さは長崎土壌サンプルでは長崎急性原爆被爆者病理標本と一致した。トロトラスト症患者症例(アルファ放射体である二酸化トリウムを含む血管造影剤で内部被曝)標本において、購入したアルファグリッドチャンバーで線量が測定された。2)トロトラスト症患者症例の肝臓標本を用いて53BP1の免疫染色を行った。結果、標本内に局在するトロトラスト顆粒(アルファ放射体)周辺の肝細胞に53BP1の核内フォーカス形成が認められた。53BP1の核内異常フォーカス形成が内部被曝の影響として考えられた。長崎大学原爆後障害医療研究所にて、長崎原爆被爆者病理標本の残留放射能を検出し、放射線が人体に及ぼす内部被曝の影響を分子病理学的に解明する。原爆被爆者における放射線障害は外部被曝線量によって厳密に評価されている。しかしながら、外部被曝のみの範疇で入市被爆者における染色体異常(鎌田他、2006)などの報告を説明することは不可能であり、内部被曝の人体に及ぼす重要性が示唆される。原爆投下後70年余たった今、高齢化する被爆者救済の社会的世論を踏まえ、この領域の人体病理学的研究を急務と考え、原爆被爆者について新たな突破口としての研究を行い科学的証拠を提唱したい。長崎の原子爆弾はプルトニウム爆弾である。核分裂によって核分裂生成物とならなかった量的に少ない燃え残りのプルトニウムが放射性降下物(フォールアウト)として、大気圏あるいは地上を汚染した。半減期は約2万年で壊変時には生物学的に危険なアルファ粒子が放射される。米国変換資料の中から、長崎原爆被爆者として被爆距離1km以内の急性被爆症例7症例、内部被曝例としてトロトラスト症例1症例、対照として国立長崎医療センター病理解剖例4症例、九州大学病理解剖例3症例を用いて、骨、骨髄、肺、肝臓、腎臓などの病理標本についてオートグラフ法を行った。得られたアルファ粒子飛跡の長さを計測し、被爆者標本について、1.Zeiglarの方法により239Pu放射線核種の同定をした。2.ヒトゲノム不安定性のマーカーであるがん関連たんぱく53BP1に着目した免疫組織化学では、高発現が認められた。3.放射線検出器による放射線核種の同定については現在進行中である。以上より、長崎原爆被爆者について放射性物質が人体内に存在したという内部被曝の科学的証拠が被曝後70年余たった現在になって初めて提示された。長崎大学原研施設にて、長崎原爆被爆者病理標本の残留放射能を検出し、放射線が人体に及ぼす内部被曝の影響を分子病理学的に解明する。

しかしながら、外部被曝のみの範疇で入市被爆者における染色体異常(蒲田他、2006)などの報告を説明することは不可能であり、内部被曝の人体に及ぼす重要性が示唆される。原爆投下後66年たった今、高齢化する被爆者救済の社会的世論を踏まえ、この領域の人体病理学的研究を急務と考え、原爆被爆者について新たな突破口としての研究を行い科学的証拠を提唱したい。長崎の原子爆弾はプルトニウム爆弾である。核分裂によって核分裂生成物とならなかった量的に少ない燃え残りのプルトニウムが放射性降下物(フォールアウト)として、大気圏あるいは地上を汚染した。その壊変時にはアルファ粒子が放射される。米国変換資料の中から、長崎原爆被爆者として被爆距離1km以内の急性被爆症例7症例、内部被曝例としてトロトラスト症例1症例、対照として国立長崎医療センター病理解剖例4症例、九州大学病理解剖例3症例を用いて、骨、骨髄、肺、肝臓、腎臓などの病理標本についてオートグラフ法を行った。得られたアルファ粒子飛跡を基に放射性核種の局在と病理所見について検討した。結果1.アルファ粒子飛跡の長さを計測し、乳剤内におけるエネルギーと飛程の関係により、Zeiglarの方法に基いた放射線核種の同定をした。2.放射線検出器による放射線核種の同定については現在進行中である。3.in vitroでの正確なBIODOSIMETRY(生物学的線量評価)の必要性に伴い、ゲノム不安定性のマーカーであるp53関連たんぱく53BP1に着目した免疫組織化学では、被爆者標本について高発現が認められた。1)今回、購入したアルファグリッドチェンバー検出器を用いて、トロトラスト内部被曝症例の肝臓病理標本ではアルファ線量測定は可能であった。しかし、長崎急性原爆被爆者症例では、未だ検出不可能である。フリッシュグリッドチャンバー検出器を付したアルファ分光システムは、最も感度の高いアルファ検出器(2πステラジアン)であり、自動電空制御測定サイクルを有し、分解能は35 keV ( Pu-239)である。バックグラウンド:< 1カウント/時(4 - 6 MeV)と記載されている。今までに得られている原爆被爆者のデーターでは、8日間測定で、Pu-239と思われる5.306MeVでは約13カウントであった。バックグラウンドは35カウントで高いので今後検討の余地がある。検出感度の限界かもしれない。2)放射線ゲノム不安定性を評価するための内部被曝の病理学的指標として、DNA二重鎖切断部位に集積して核内フォーカスを形成する53BP1の免疫染色を検討した。トロトラスト内部被曝症例では、標本内に局在するトロトラスト顆粒周辺の肝細胞に53BP1の異常核内フォーカスの形成が認められ、顆粒の存在しない肝細胞ではほとんど認められなかった。一方、長崎急性原爆被爆者症例では肝標本などで53BP1の核内発現細胞数の増加は認められた。原爆被爆者症例における53BP1核内フォーカス形成の解析は遅れている。また、遠距離被爆者、入市被爆者については病理標本の抽出が不完全で症例を収集中である。1.オートラジオラフ法によるアルファ粒子の飛跡長を基にした較正標準曲線を得るために、環境サンプル及び標準放射線源についてアルファ放射体の核種の同定を検討した。
超・極低出生体重児における口腔形態の特徴と音声の音響学的分析

これまで3歳から8歳の小児の音声を周波数解析し,小児構音発達の特徴を研究してきた。その結果,各年齢群に性差は認められなかったものの,母音間と年齢間には有意な差があることが明らかになった。一方,超・極低出生体重児は正期産児に比べると口腔機能発達が遅れる傾向がみられるため,その保護者は出生直後から育児不安を抱いていることが多い。そこで,構音発達の初期となる3歳児における正期産児と極低出生体重児について比較,検討した。方法は,母音+子音+母音(VCV音節)の構造をもつ無意味音節構音22語を発声させ発語明瞭度検査,周波数分析を行った。発語明瞭度検査は各子音部の不明瞭度を歯科医師5名が聴取して,各々明瞭を0,不明瞭を1として2段階評価で判定した。また周波数分析は子音の後続母音の第1フォルマント周波数(F1)および第2フォルマント周波数(F2)を計測した。その結果,発語明瞭度は超・極低出生体重児で有意に不明瞭であり,周波数分析についても正期産児のF1およびF2値の平均より1S.D.以上外れていた音節が極低出生体重児では多くみられた。以上のことから3歳児は正期産児と比較して極低出生体重児の構音発達が遅い傾向がみられた。咀噛機能や咬合力といった口腔機能は6歳頃に追いついてくるため,構音についても同時期に明瞭になってくると考えられた。しかし,個人差も大きいことから今後も被検児数を増やして検討を行っていく必要があると考えられた。超・極低出生体重児の口腔形態の発達について、幼児期から学童期前半にかけてフォローアップしてきた超・極低出生体重児の乳犬歯間幅径、咬合力、筋活動量について観察した結果、幼児期には乳犬歯間幅径が小さく、咬合力が弱かったが、学童期に入り身長や体重は標準よりまだ低い値であるものの、咬合力や咀嚼機能についてはともにキャッチアップしてきていることが明らかとなってきた。また、発音障害を主訴として来院する患者が増加している中、その原因は様々で確定することが困難であり、このような患者への対応や治療はいまだ確立されていない。測定方法の検討と発音異常児への臨床応用例として、発音異常を有する患児において音声の音響学的分析を行い、視覚的かつ定量的な治療評価を行った。さらに、舌強直症が原因と思われる構音障害を有する患児が来院したので、舌小帯切除前後で構音検査を行い、解剖学的・機能的改善、また切除後の舌機能訓練により、客観的な発音の変化を比較した。方法として、舌運動の訓練を行った後、局所麻酔下にて舌小帯切除術を行った。録音は舌運動訓練開始前、舌小帯切除術直前、術後1週間、1か月、3か月において行った。検査音は、52語の単語と22種のVCV語文構造をもつ無意味音節構音検査音、文章、単音節を順番に読んでもらった。聴覚的な評価方法には単音節明瞭度検査を用い、録音した患児の音声を3人の聴取者に聞かせ、正しく聞き取られた単音節の割合の平均値を単音節明瞭度とした。これによって聴覚的異常が認められた単音節について、それぞれの検査音の原音声をパーソナルコンピューター内で音声分析可視化ソフトを使用し分析を行った。その結果、舌小帯切除術および舌運動の訓練によって、〔s〕音・〔r〕音構音時における舌の動きが前方および低位に変化して構音障害が改善してきたことを音響学的に確認した。小児の成長による発音の変化を視覚的かつ定量的に評価することを目的として,発語明瞭度検査・持続母音およびVCV音節語後続母音のフォルマント周波数分析および時間要素分析からみた小児構音発達の特徴について検討を行った。被検児の咬合状態,う蝕罹患状態,歯の欠損,歯冠修復状態,歯列不正,口蓋形態,舌小帯の付着位置,舌の随意運動の状態については口腔内で検査を行い,摂食機能,嚥下機能,言語発達,精神心理学的発達,発音への不満度,聴覚等の既往歴については保護者に面談とアンケートで尋ねた。その結果,36名(各年齢男児3名,女児3名)の小児が選択された.音声の検査項目として持続母音とVCV音節語について行った。持続母音では5母音を各々23秒間続けて発声させ周波数分析を,またVCV音節語として母音+子音+母音の構造をもつ無意味音節構音22語を発声させ発語明瞭度検査,周波数分析,時間要素分析を行った。結果として,3歳児から8歳児において持続母音のFO,F1値は増齢により低下することが明らかになった。またVCV音節語後続母音の内,年齢とF1,F2値との間に相関がみられた音節語と,年齢にほとんど影響されない音節語が存在することが明らかとなった。また今回の構音の検査方法や結果は,小児の構音発達や構音障害の診察に有用であることが示唆された。

方法は,母音+子音+母音(VCV音節)の構造をもつ無意味音節構音22語を発声させ発語明瞭度検査,周波数分析を行った。発語明瞭度検査は各子音部の不明瞭度を歯科医師5名が聴取して,各々明瞭を0,不明瞭を1として2段階評価で判定した。また周波数分析は子音の後続母音の第1フォルマント周波数(F1)および第2フォルマント周波数(F2)を計測した。その結果,発語明瞭度は超・極低出生体重児で有意に不明瞭であり,周波数分析についても正期産児のF1およびF2値の平均より1S.D.以上外れていた音節が極低出生体重児では多くみられた。以上のことから3歳児は正期産児と比較して極低出生体重児の構音発達が遅い傾向がみられた。咀噛機能や咬合力といった口腔機能は6歳頃に追いついてくるため,構音についても同時期に明瞭になってくると考えられた。しかし,個人差も大きいことから今後も被検児数を増やして検討を行っていく必要があると考えられた。
RNA結合蛋白質の発現異常に伴うヒト遺伝病の分子機能解析

我々はトリプレットリピート病の代表例である脆弱X症候群の分子機序の解析を行っている。脆弱X症候群は最も高頻度に精神遅滞を伴う遺伝性の病気である。大部分の脆弱X症候群患者では、X染色体上に存在する遺伝子FMR1の5'非翻訳部位にある(CGG)nリピートが伸長し、その結果FMR1遺伝子産物の発現が転写レベルで抑制される。つまり、この病気はFMR1の機能欠損によるものである。FMR1の発現は健常人では脳神経系で非常に高く、一方、FMR1の発現のない脆弱X症候群患者は脳神経系の形態異常、特にシナプス形成の場であるスパインの形態異常を示す。FMR1蛋白質はRNA結合蛋白質で、しかもリボソームと相互作用していることからある種のmRNAの翻訳を直接叉は間接的に調節していると考えられているが、標的mRNAは今だ同定されていない。したがって、FMR1蛋白質の標的mRNAの同定はFMR1研究の最重要課題となっている。FMR1の標的mRNAを同定するために、我々はFMR1遺伝子の発現の変化に伴いその動態を変化させる蛋白質の同定をプロテオミクス解析法を用いて進めている。この研究を推進していくために、脆弱X症候群患者から樹立した各種細胞株と患者の正常な兄弟から同様に樹立した培養細胞株を用いている。この研究過程において、我々は、FMR1蛋白質はリボソームと相互作用していることから、患者由来と正常細胞におけるリボソーム分画の蛋白質レベルでの比較を行い、顕著な違いがあることを見い出した。この結果はFMR1蛋白質の有無がリボソームに構造的または質的な変化を与えることを示唆している。これは、ひいてはこのリボソームの構造的または質的な違いが翻訳するmRNA種のセレクターとして働いている可能性を示唆する。正常細胞においても、刺激に応じたFMR1蛋白質の修飾がリボソームとの相互作用を変化させ、その結果、リボソームの構造的または質的な変化を誘導することが考えられる。現在、両者で発現量に違いの見られる蛋白質の二次元電気泳動法による分離と質量分析による同定を進めている。さらに網羅的にFMR1蛋白質の有無により動態変化の見られる蛋白質の探索を進め、FMR1蛋白質の『標的遺伝子』を同定し、それらの発現調節機構の解析を通して脆弱X症候群の分子機序を明らかにしていきたい。
マルチモーダルネットワークを用いたアクセシビリティ評価と市街地変容の関係性の研究

本研究は,人口減少型社会において都市の縮退や集約の必要性がある中で,マルチモーダルネットワーク(様々な交通手段を組み合わせた複層的交通網)の持つアクセシビリティの特性が,市街地の変容(都市化・都市維持・都市撤退)にどのような影響をもたらしてきたのかを時系列的に明らかにすることを全体構想とするものである.本研究は,人口減少型社会において都市の縮退や集約の必要性がある中で,マルチモーダルネットワーク(様々な交通手段を組み合わせた複層的交通網)の持つアクセシビリティの特性が,市街地の変容(都市化・都市維持・都市撤退)にどのような影響をもたらしてきたのかを時系列的に明らかにすることを全体構想とするものである.
新規核膜蛋白質Nemp1の核内膜特異的な遺伝子制御機構の解明

本研究は、核内膜蛋白質Nemp1の核膜内の局在と遺伝子発現制御における分子メカニズムを明らかにし、胚発生においてNemp1がどのように関わるのかを解明するものである。それにより、核内膜蛋白質の機能と胚発生における役割に新たな概念をもたらすことが期待される。Nemp1の系統解析を進め、脊椎動物においてNemp1に加え、パラログのNemp2を同定し、さらにNempがシロイヌナズナ(At)まで保存していることを見出した。興味深いことにAt_Nempには明確な領域Bの保存性が認められなかったが、At_Ranとは結合することから、NempとRanとの相互作用は生物界に広く保存されていることが示された。次に進化的に保存されている領域Aと領域Bの解析を進めた。まず、領域Aについては先行研究によりシグナルペプチドと領域AがNemp1の核膜局在に重要であることが示された。そこで、Nemp1が既知の核膜タンパク質と相互作用するかを共免疫沈降法により検討した。その結果、Nemp1はNemp1自身と複合体を形成することが示された。欠失コンストラクトを用いた解析により、この複合体形成には、領域Aを含む膜貫通領域が必要かつ十分であった。次に領域Bについては、領域BとRanとの結合はRanの効果ドメインを介していること、同じ効果ドメインを介して結合するImportinβとRanとの結合を競合阻害することを見出した。これらの結果からNemp1は核輸送を調節しているのではないかと推察された。現在、実際に核輸送を制御しているかを、Nemp1機能低下における内在性のOtx2に対する効果で検討中である。本年度、領域Bの結合蛋白質としてRanを同定し、さらに変異体のRanを用いて、GDP型ではなくGTP型のRanと結合することを明確に示した。これは、GDP型は細胞質側に、GTP型Ranは核内に存在することを考えると、Nemp1の機能を明らかにする上で重要な知見である。またRanの結合領域を同定するため、領域Bをさらに欠失させたコンストラクトを用いて、共免疫沈降法を行った。その結果、領域BがRanGTPと結合するためには、領域B全長が必要かつ十分であった。また興味深いことに、BAFとの結合に必要なBBS(BAF binding site)を欠失させたコンストラクトとも、RanGTPは結合しなかった。次に、Nemp1が制御している遺伝子の候補として、rax遺伝子に着目して解析した。ChIP法により、raxが発現を開始する神経胚初期においてOtx2がraxのエンハンサーに結合していることを初めて示した。またNemp1の過剰発現により、raxエンハンサーをつないだレポーター遺伝子のOtx2による活性化が阻害された。現在Nemp1が核内移行に関わるRanと結合することから、Otx2の核内輸送と核内分布におけるNemp1の影響を検討中である。