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重症筋無力症の胸腺におけるレトロウイルスの検索とその発症機構の解明に関する研究

重症筋無力症の胸腺に検出されるレトロウイルス様粒子の性状決定とその病的意義の解明を研究目的として実験を行った.レトロウイルス様粒子の性状決定には,いつでも充分なウイルスを得られるウイルス産生株の作成が必須であり,ウイルス産生株作成に関して二つの実験系を開発した.一つはヒトT細胞株への感染実験を経て得られるウイルス産生株であり,もう一つはSV40DNAトランスフォーメーション法にて作成したヒト胸腺上皮細胞株である.両者の培養上清中には逆転写酵素活性とウイルス粒子が証明された.培養(ことに大量培養)上,リンパ芽球系細胞の方が取扱いやすいことから,ウイルス産生T細胞株を主に用いてウイルスの性状決定を行った.現在,ウイルス遺伝子のクローニングを終え,塩基配列の決定にとりかかっている段階である.ウイルス核酸のsequence決定には至っていないが, HTLVfamily DNA探索子と本ウイルス産生細胞DNAとの間にハイブリダイゼーションが認められず,動物レトロウイルス抗体との血清反応も認められないことから,ヒト胸腺に検出されるレトロウイルスは既知のウイルスとは異なるウイルスと思われる.本ウイルス産生株より抽出したウイルスを抗原とするELISAにて,重症筋無力症患者血清中にウイルス抗体が高率に検出され,本ウイルスが重症筋無力症の病態に関与していることが示唆された.今後,本ウイルス遺伝子の分析を通じて,重症筋無力症における胸腺異常の解明にとりくんでいきたいと考えている.重症筋無力症の胸腺に検出されるレトロウイルス様粒子の性状決定とその病的意義の解明を研究目的として実験を行った.レトロウイルス様粒子の性状決定には,いつでも充分なウイルスを得られるウイルス産生株の作成が必須であり,ウイルス産生株作成に関して二つの実験系を開発した.一つはヒトT細胞株への感染実験を経て得られるウイルス産生株であり,もう一つはSV40DNAトランスフォーメーション法にて作成したヒト胸腺上皮細胞株である.両者の培養上清中には逆転写酵素活性とウイルス粒子が証明された.培養(ことに大量培養)上,リンパ芽球系細胞の方が取扱いやすいことから,ウイルス産生T細胞株を主に用いてウイルスの性状決定を行った.現在,ウイルス遺伝子のクローニングを終え,塩基配列の決定にとりかかっている段階である.ウイルス核酸のsequence決定には至っていないが, HTLVfamily DNA探索子と本ウイルス産生細胞DNAとの間にハイブリダイゼーションが認められず,動物レトロウイルス抗体との血清反応も認められないことから,ヒト胸腺に検出されるレトロウイルスは既知のウイルスとは異なるウイルスと思われる.本ウイルス産生株より抽出したウイルスを抗原とするELISAにて,重症筋無力症患者血清中にウイルス抗体が高率に検出され,本ウイルスが重症筋無力症の病態に関与していることが示唆された.今後,本ウイルス遺伝子の分析を通じて,重症筋無力症における胸腺異常の解明にとりくんでいきたいと考えている.重症筋無力症の胸腺を主たる対象にレトロウイルスの検索を行った。B細胞との混合培養法にて、培養37日目の胸腺細胞(主に上皮細胞に)レトロウイルス粒子が観察された。培養液中に、蔗糖密度勾配遠心上、比重1.151.17g/【cm^3】に位置する逆転写酵素活性も検出された。ヒト胸腺(胎児例を含む)レトロウイルスを用いて、ヒトT細胞株CCRF-HSBへの感染実験を施行し、レトロウイルス産生株を数株、作成した(KK-1など)。血清学的に本ウイルスがHTLVや動物レトロウイルス(MuLV,MMTV,FeLV,SMRV,MPMV,BLVなど)とは異なることを証明した。分子生物学的検討においてもHTLV-【I】、-【II】、-【III】DNA探索子とKK-1細胞DNAとのSouthern分析では、全くハイブリダイゼーションが認められないことより、HTLVfamilyとは異なるウイルスであることを明らかにした。SDS-PAGE上、8.68.8万、7万前後、4.3万、4.1万、3.6万、2.8万、1.6万の分子量蛋白がvirus-coded proteinあるいは感染実験後誘導された細胞蛋白と判定された。重症筋無力症患者血清とのWestern hlottingにて、ウイルス比重部蛋白とほぼ一致した分子量を示すバンドが認められた。重症筋無力症41症例の患者血清中本ウイルス抗体をELISA法にて探索し、高率にウイルス抗体の検出を認めた。SV40DNAトランスフェクションによるとヒト胸腺(重症筋無力症例を含む)土皮細胞株を作成した。
染色体凝縮に関わる遺伝子(RCC1)の機能の解明

核内低分子量GタンパクRanのグアニンヌクレオチド交換因子RCC1のハムスター由来温度感受性変異株tsBN2は、S期同調後制限温度下に移行させると染色体複製の未成熟なままMPFが活性化し、染色体凝縮を起こす。本研究ではRCC1と相互作用する因子を2-ハイブリッド法を利用して分離した。RCC1 cDNAとGAL4遺伝子のDNA結合領域に融合し、酵母内で発現させ、この融合タンパク質と結合する因子を転写活性化領域に融合したcDNAライブラリーから分離した。実際には、平板培地上でGAL1 promoterからの遺伝子の発現を検出して選択した。このスクリーニングから2つの遺伝子RanBP1、RanBP2由来のcDNAがクローン化された。これらは既にRanと結合する因子として報告されており、本研究でRan、RanBP1、RCC1 3者の相互作用を検討した結果、RanBP1はRanに依存してRCC1と複合体を形成し、RCC1によるRanからのグアニンヌクレオチド遊離反応を阻害することがわかった。一方、免疫蛍光抗体法によって、RanBP1は細胞質に局在することも明らかにした。RanBP2遺伝子は、当初、その遺伝子の一部だけがクローン化されていたが、約10.5kbの全長をλファージによるcDNAライブラリーからクローン化した。この遺伝子は358kDaのタンパク質をコードしており、その中にRanBP1と相同な領域を4つ、N端にロイシンに富んだ領域、C端にシクロフィリン相同領域、中央部に8つのZnフィンガー領域を持っていた。免疫蛍光抗体法および免疫電子顕微鏡観察によって、このタンパク質は核膜孔の細胞質フィラメントを構成することがわかった。さらに、この抗体によって核タンパク質の核内移行が阻害されることから、RanBP2は核内移行系に必須の因子であることを示した。非同調下及びM期同調下のHeLa細胞の全蛋白質を非平衡二次元電気泳動で展開し、RCC1蛋白質をイムノブロットで検出して比較した。RCC1蛋白質は6個のスポットとして検出されたが、M期では塩基性側の2個のスポットが弱くなり、残り4つのスポットのうち酸性側のスポットが強くなっていた。N端の8-29番目のアミノ酸を欠いたものでは非同調下では主に1個のスポットとして検出されたが、M期では酸性側にもう1個のスポットが生じた。酸性側のスポットはアルカリホスアターゼで処理すると消失した。これらの結果は、RCC1蛋白質がM期特異的にリン酸化されている可能性を強く示唆する。N端の11番目のSerは、M期に活性化するcdc2 kinaseのリン酸化部位となりうる。そこで、SerをAlaに置換したものではスポットの数が減少していた。この結果から11番目のSerがM期特異的な修飾部位の1つであると予測される。また、N端領域において、93bpのinsertionをもつcDNAが新たに見つかった。ヒトのゲノム中にinsertionと同一の配列がみつかり、alternative splicingが行なわれていることが明らかになった。ハムスターtsBN2 cell lineは、RCC1遺伝子座に点突然変異を持ち、温度感受性の増殖表現型を示す。この変異細胞をS期に同調した後、制限温度下にシフトすると、染色体複製が未成熟のまま染色体凝縮を起こす。このことは、RCC1遺伝子が複製終了と分裂期開始のタイミングを制御している事を示唆している。そこで、染色体凝縮の機構を解明するために、ヒトRCC1タンパクと相互作用する因子の分離を試みた。

まずそのために、N端の8番目から29番目のアミノ酸を欠いたRCC1cDNAをGAL4遺伝子のDNA結合領域に融合したプラスミドを構築して酵母細胞に導入し、2-hybrid法によるスクリーニングを行なった。ヒトB細胞由来のcDNAをGAL4の転写活性化領域に融合したライブラリーから2クローン、マウス胚由来のcDNAをウィルス由来の転写因子VP16に融合したライブラリーから4クローン分離したところ、前者からは、RanBP1とGAL4のコンタミネーション、後者からは、4つとも同じRanBP2がとれたことが分かった。RanBP1が、Ranを介してRCC1タンパクと結合する事、RanBP1が、RCC1によるRanからのグアニヌクレオチドの遊離反応を阻害することを試験管内の実験で明らかにした。また、細胞内でもRCC1を阻害することをtsBN2や出芽酵母のrcc1変異細胞内でヒトRanBP1を高発現させて示した。また、RanBP2は、核膜孔を構成するタンパクの一つで、RanBP1同様RCC1を阻害する事が分かった。分離した2遺伝子RanBP1、RanBP2のコードするタンパク質の機能についてさらに検討した。RanBP1タンパク質を特異的に認識する抗体を調製し、細胞内局在性について間接蛍光抗体法によって調べたところ、このタンパク質はヒト由来のHeLacell lineにおいて細胞質に存在することがわかった。昨年度、RanBP1タンパク質はRCC1によるRanのグアニンヌクレオチド交換反応を阻害することを報告したが、細胞内局在性の結果から、細胞内機能は核内タンパク質RCC1の阻害ではない可能性が高いといえる。RanBP1は、試験管内でRanのGTPase活性化タンパク質RanGAP1によるRanのGTP加水分解反応の促進をさらに増幅することが報告されており、細胞質因子RanGAP1と協調的に働く因子であることが強く示唆される。また、ヒトRanBP1は酵母相同体のnull mutationを完全に相補することから、この因子の機能の真核生物間における高い普遍性が示された。一方、RanBP2タンパク質に対する抗体を調製し、このタンパク質が核膜孔の細胞質フィラメントを構成するものの一つであることを明らかにした。さらに、核タンパク質の核内移行を観測する系を構築し、導入したRanBP2抗体が核内移行を阻害することから、RanBP2は核タンパク質の核内移行に必須の因子であることを示した。
一次資料に基づく世襲財産制の実証研究ープロイセン・ザクセン・南ドイツの比較地域史

計画調書記載の図書館調査については、主として、ドイツ「ベルリン図書館」(Staatsbibliothek zu Berlin)において、「ヨーロッパにおけるフィデイコミス=世襲財産の成立と展開ードイツ語圏を中心としてー」に関わる基礎文献の収集と資料化の作業を計三度行った。オーストリアのフィデイコミスの古典的文献であるイナマ-シュテルネグ(Inama-Sternegg)の1883年の論考、スイス史に関するフーバー(Huber)の重要論文、さらに、ポーランドとチェコスロヴァキアの問題をめぐるディーツェ(Dietze)の所説等を精読し、ノート化に努めた。海外研修では、図書館での基礎作業だけでなく、専門家のレビューを受けることも必須の課題となるので、2017年にフランクフルトで出版した『プロイセンの世襲財産』(独文)の評価について、ベルリン自由大学のフィッシャー(W. Fischer)教授と討論した。上記の二図書館ならびに「ドイツ図書館」(Deutsche Nationalbibliothek)をはじめ、キール、エアフルト、ミュンスター等のドイツの主要図書館のみならず、イギリス、イタリア、スイス、オランダ、ポーランドのヨーロッパ各国、そして、イェール(Yale)大学等のアメリカを含む合計40以上の世界各地の図書館所蔵を確認できたことが、その成果だった。研究成果として、「ドイツ語圏の世襲財産」と「ヨーロッパ信託遺贈制の基本問題」の二つの論考を公表した。当初の計画では、ドレスデンの「ザクセン図書館」(Saechsische Landesbibliothek)において、「ベルリン図書館」での前年度の文献調査を拡充する予定だったが、ザクセン史に関するフリーゼン(Friesen)の文献等の基礎資料については、その閲覧と資料化の作業を、すでに、平成29年11月のドレスデン研修の際に基本的に終えていたので、今年度は、次年度(令和元年)予定の課題、すなわち、南ドイツ、とりわけヴュルテンベルク(Wuerttemberg)の世襲財産を対象とする実証研究の準備に充てることができた。令和元年は、レーゲンスブルク(Regensburg)において、トゥルン・ウント・タクシス(Thurn und Taxis)侯爵家に視点を絞った文書館調査を行う予定であるが、ベーリンガー(Behringer)の通史的研究に触れるとともに、プロイセンのポーゼン州に所在した同家の大世襲財産の一次資料の在りかを突き止めて、実証課題が具体化し、研究は、当初の計画以上に進展した。平成31年度(令和元年度)の研究目的は、前年度同様、重要文献の閲覧と収集(図書館調査)、そして、未公刊一次資料の探索と解読(文書館調査)の二本柱の課題を中心とするが、今年度も前年度同様、次年度の課題を先取りするペースで仕事を進めることが、第一の推進方策である。さらに、単著『プロイセンの世襲財産』(2017年刊)に寄せられた内外からの様々なコメントを、レビュー同様、真摯に受け止めて活用しながら、本研究に直接関連する次の大きな中長期的テーマを具体化することが、第二の推進方策である。「一次資料に基づく世襲財産制の実証研究ープロイセン・ザクセン・南ドイツの比較地域史」に関する平成29年度の研究経過と成果は、次のとおりである。本課題の本格的な検討に進むための準備作業として、世襲財産問題に関する今までの研究成果を、プロイセン史に即して整理するドイツ語単著の一書にまとめて、考察の枠組み全体の基礎を提示した。比較を試みるための基準を得る必要上、ドイツ世襲財産制の基礎研究の一環として、その重要性が自明なプロイセンに注目することは、単なる参照系というよりもむしろ、本研究の出発点に位置づけられるべき積極的な意味を持つからである。さらに、「ベルリン図書館」と「ドレスデン図書館」において、ザクセンやヴュルテンベルク等のドイツ諸邦のみならず、スイスとオーストリアを含む「ドイツ語圏」諸地域のフィデイコミスに関する文献検索を行うとともに、視野をハンガリーにまで拡大して、ハンガリー世襲財産問題の重要性を認識した。研究実績の概要に記載のとおり、プロイセン世襲財産問題に関する単著をドイツで出版するとともに、ハンガリー世襲財産すなわち「父祖財産相続制=アヴィティツィテート」(Aviticitaet)をめぐる歴史問題の論考を執筆した。さらに、ドイツ語圏のスイスについても、ルツェルンに注目した草稿を用意して、研究は、当初の計画以上に進展した。

当初の計画では、ドレスデンの「ザクセン図書館」(Saechsische Landesbibliothek)において、「ベルリン図書館」での前年度の文献調査を拡充する予定だったが、ザクセン史に関するフリーゼン(Friesen)の文献等の基礎資料については、その閲覧と資料化の作業を、すでに、平成29年11月のドレスデン研修の際に基本的に終えていたので、今年度は、次年度(令和元年)予定の課題、すなわち、南ドイツ、とりわけヴュルテンベルク(Wuerttemberg)の世襲財産を対象とする実証研究の準備に充てることができた。令和元年は、レーゲンスブルク(Regensburg)において、トゥルン・ウント・タクシス(Thurn und Taxis)侯爵家に視点を絞った文書館調査を行う予定であるが、ベーリンガー(Behringer)の通史的研究に触れるとともに、プロイセンのポーゼン州に所在した同家の大世襲財産の一次資料の在りかを突き止めて、実証課題が具体化し、研究は、当初の計画以上に進展した。平成30年度の研究目的としては、前年度同様、重要文献の閲覧と収集(図書館調査)、ならびに、未公刊一次資料の探索と精読(文書館調査)の二本柱を中心とするが、今年度以降は、昨年出版した単著に対して寄せられたドイツ人専門研究者からの様々なコメントを、レビュー同様に受け止めて活用しながら、次年度以降の継続課題を一年ずつ先取りするペースを推進方策として研究を進める。平成31年度(令和元年度)の研究目的は、前年度同様、重要文献の閲覧と収集(図書館調査)、そして、未公刊一次資料の探索と解読(文書館調査)の二本柱の課題を中心とするが、今年度も前年度同様、次年度の課題を先取りするペースで仕事を進めることが、第一の推進方策である。さらに、単著『プロイセンの世襲財産』(2017年刊)に寄せられた内外からの様々なコメントを、レビュー同様、真摯に受け止めて活用しながら、本研究に直接関連する次の大きな中長期的テーマを具体化することが、第二の推進方策である。
BCC型水素貯蔵合金のナノ構造および反応機構に関する基礎的研究

本年度は、ナノ構造をもつマグネシウム基BCC(体心立方)型合金の合成過程と、水素吸蔵量とBCC格子の大きさの関係を明らかにすることを目的とした。マグネシウムとニッケルをボールミリングすることで、FCC(面心立方)型構造をもつニッケルにマグネシウムが固溶した後、BCC型構造が生成した。また、マグネシウムとコバルトをボールミリングした場合には、HCP(六方最密充填)型構造をもつコバルトはFCC型構造に変化し、マグネシウムと混合した後にBCC型構造を生成することが分かった。BCC型構造をもつマグネシウムーニッケル系合金は100°Cで1.94質量%の水素を吸蔵した。また、マグネシウムーコバルト系合金は、これまで水素の吸蔵が起こりにくかった-15°Cの氷点下の温度において2.67質量%の水素を吸蔵した。X線および中性子回折実験により得られたBCC型合金の回折プロファイルを解析することでBCC型合金の格子定数を算出し、BCC格子の大きさと水素吸蔵量の関係をまとめた。0.3000.308nmの格子定数をもつBCC型合金は1.5質量%以上の水素を吸蔵するが、格子定数が0.313nmを超えると合金はほとんど水素を吸蔵しないことが分かった。体心立方(BCC)型構造は面心立方(FCC)あるいは六方最密(HCP)型構造に比べて結晶格子内の空隙が広い構造であり、格子間位置を占有する水素が多量に吸蔵される可能性を有する。マグネシウムは軽量であることから高性能水素貯蔵材料として期待されているが、水素放出温度が高いことおよび水素ガスとの反応速度が遅いことなどが課題とされてきた。本研究分担者は、機械的合金合成法の1つであるボールミリングを用い、室温にてHCP型構造をもつマグネシウムをベースとしたマグネシウム-コバルト系およびマグネシウム-ニッケル系などのBCC型合金を合成した。X線回折実験を用いてマグネシウム-コバルト系合金の合成プロセスを調べた結果、HCP型構造をもつマグネシウムおよびコバルトの結晶子サイズはボールミリングによりnmオーダーにまで減少することが分かった。その後、コバルトの結晶構造がFCC型構造に変化し、マグネシウムと混合されBCC型合金が合成されることが明らかになった。マグネシウム-コバルト系BCC型合金の格子定数は約0.300nmであり、結晶子サイズは15nmであった。この合金は室温を含む低い温度の下でも水素を吸蔵し、30°Cにおいて2.42質量%の水素吸蔵量をもつことが確認された。マグネシウム-コバルト系合金の格子定数から水素が占有する格子間位置の大きさは37.8pmと見積もられた。この値は室温にて水素を吸蔵放出することができる他の水素吸蔵合金のものと同程度であることが分かった。合金の格子定数を制御することで合金の水素吸蔵量、水素吸蔵放出温度および反応速度などの諸特性が向上されることが期待される。現在は、合金の構成元素および組成などを変化させることでさらに高い吸蔵量をもつマグネシウム系BCC型合金の合成を目指すと共に、水素吸蔵放出反応機構の解明を進めている。
アブラナ複二倍体種成立機構の解明

Brassica属の複二倍体種の成立機構を解明するため、種間不和合性や雑種胚崩壊に関与する遺伝子の解析や複二倍体種における自家和合性機構の解析等を3研究室の協力により行った。種間不和合性や雑種胚崩壊性のQTLを検出し、関与遺伝子解明のための糸口を見出した。複二倍体種それぞれにおいてS遺伝子型を複数見出し、それらがいずれも優性側Sハプロタイプの突然変異により自家和合性になったと推定した。アブラナの種間不和合性遺伝子を解明するため、Brassica rapaとBrassica oleraceaの種間交雑において柱頭側で種間不和合性を示すB. rapa系統と示さないB. rapa系統のF2個体を用いて、種間不和合性のQTL解析を行った。102個のDNAマーカーを用いて、F2の125個体の遺伝子型と種間不和合性強度を調査した結果、第2連鎖群に主要なQTLがあることが分かった。種間不和合性強度はS遺伝子やM遺伝子とは連鎖していなかった。B. napusはB. rapaとは交雑が容易であるが、B. oleraceaの間では雑種胚崩壊が起こる。両組合せ間の胚嚢での遺伝子発現の差異をSSH法で調査し、雑種胚崩壊が起こらない組合せに特異的な245のESTsを同定した。その内5つのESTについては、種子稔性の高い組合せの胚嚢で高い発現がRT-PCRで確認された。種子親側の属間交雑親和性遺伝子を解明するため、聖護院カブ(属間交雑親和性が高い品種)とチーフハクサイ(同低い品種)のF2120個体を育成した。これらの聖護院ダイコンとの間で属間交雑による稔実性を調査中である。花粉親側の親和性の高低を明らかにするための組合せのF1も作成した。B. napus種内の6種類のS遺伝子型のうちBnS-1,BnS-6型はBnS-1のSP11内へのDNA挿入によりSP11が発現しないことが自家和合性の原因と推定していたが、BnS-1と類似したBrS-47のSP11遺伝子を導入した形質転換体を作成し、自家不和合性が回復することを見出し、SP11の機能不全が自家和合性の原因であることを証明した。複二倍体ゲノムの安定性の解析のため、種内のSNPを同定し、B. rapaとB. oleraceaでSNPマーカーを作成し、既存のCAPSマーカーやSSRマーカーと合わせて連鎖地図を構築した。種間不和合性に関わる遺伝子を明らかにするため、Brassica rapaとBrassica oleracea間の種間不和合性において柱頭側で不和合性の程度が異なるB. rapa品種間のF_2を用いてQTLを解析したところ、異なる両親品種間の集団では第2染色体と第9染色体の異なる位置にQTLが検出され、種間不和合性に関わる効果の大きい遺伝子が複数あることが示唆された。Brassica carinataはBrassicanigraとB. oleraceaの雑種から成立した複二倍体種であるが、B. nigraとの交雑では比較的種子が得られ、B. oleraceaとは雑種が得にくいことを見出したが、B. junceaでは両親種との間で明確な差異は見いだせなかった。一方、複二倍体種と両親種を用い花粉数及び花粉/胚珠比等を含む花の形態を調査したところ、複二倍体種は花のサイズが両親種の中間であったのに対し花粉/胚珠比は両親種より低いことを明らかにした。このことは複二倍体種が成立後自家和合性を獲得したことにより花粉/胚珠比を低下させているものと推察した。聖護院カブとチーフハクサイを種子親としたときにダイゴンとの属間雑種形成能に差があることを見出し、そのF_2での遺伝変異を明らかにした。交配花あたりの平均獲得種子数は0.34±0.49粒であり、雑種形成率(交配花あたりの雑種率)は大半が00.2であったが、2.12.3と、きわめて高い個体も見出した。Sハプロタイプ同定技術を改良し、効率よくS遺伝子型同定が可能となったことから、B. rapa集団におけるSハプロタイプの頻度を明らかにし、新たな12種類のSハプロタイプを見出した。B. rapaでは220、B. oleraceaでは113の遺伝子のDNA多型マーカーの連鎖地図を構築した。B.rapaの約300のEST-SNPマーカーの連鎖地図を構築し、シロイヌナズナゲノムとのシンテニーを明らかにした。複二倍体種Brassicanapusの祖先ゲノム種であるBrassica rapaのAゲノム種とBrassica oleracesのCゲノム種の種間不和合性程度の系統間差の主要なQTLが第2連鎖群にあることをB_1F_2集団でも確認した。

その領域のシンテニー解析により、雌蕊側で働く種間不和合性遺伝子の候補を推定した。B.rapaには、ダイコンとの種間交雑で雑種胚退化が起こりやすい系統と起こりにくい系統があるが、雑種胚退化に関わるQTLを第10連鎖群に見出した。B.napusは、片親のB.oleraceaとの間ではほとんど雑種が得られず、雑種胚崩壊が起こる。SSH法により雑種胚崩壊が起こる組合せに特異的な202のESTsを単離した。相同性検索で機能推定したところ、これらのうち19.3%は新規な遺伝子であり、14.7%が機能未知であった。雑種胚崩壊が起こる組合せでは受粉後10日目から胚発達が遅延し、珠心細胞の退化の遅延と異常増殖が見られた。複半数性F_1個体からの次代種子の獲得は極めて低く、高雑種形成能を示す個体とその次代の種子稔性には相関がみられなかったことから、F_1雑種形成に関わる遺伝因子と次代を得るための稔実性の因子は別であると考えられた。一方、F_1雑種集団内から、ゲノム構成AARRの複二倍体が6個体、AARの二基三倍体が1個体見出され、F_1雑種集団中の自然倍加個体の発生率は0.28%であった。自家不和合性遺伝子の複対立遺伝子の簡易同定技術を開発してきたが、その利用により、アブラナ遺伝資源の遺伝的多様性が評価できることを示した。また、高効率種判別技術を開発し、Brassica属の二倍体種と複二倍体種を効率よく同定出来るようになった。
細胞内の特定の生体分子の温度を測定する

水分子O-H伸縮振動のラマンスペクトルは幅広いスペクトルとなり、大きく分けて2つのピークが観測されること、isosbestic pointが3419 cm-1にあることが知られている。高温になるほど低ラマンシフト側のピークが小さくなり、高ラマンシフト側のピークが大きくなるため、この性質を利用して温度を計測できた。また、C-C-N変角振動(458 cm-1)、ジフェニルジテレニドのTe-Te伸縮振動(150 cm-1)などの低周波振動のラマンスペクトルを計測し、ストークス光とアンチストークス光も強度比を計算することによりマイクロメートルの微小領域の温度を計測することができた。温度は基本的な物理量の一つであり、細胞機能に大きく影響すると考えられている。細胞内の生体分子のラマン散乱光を測定することにより、生体分子の温度を直接計測する技術を開発するため、今年度は以下の2項目について研究を行った。1.顕微ラマン分光装置の組み立て現有の1分子蛍光顕微鏡システムに分光システムを組み込み、ラマン散乱光を分光できるようにした。まず、細胞を明視野または位相差顕微鏡で観察し、ラマン散乱光を測定する領域を決定した。次に光路を分光側に切り換え、球面レンズまたはシリンドリカルレンズを用いて、レーザーを一点または線上に照射した。試料から出た光のうちレイリー散乱光をノッチフィルターで除き、ラマン散乱光をポリクロメーターに導入し、回折格子によって分散した光を、高感度EMCCDカメラを用いて撮影した。これにより、細胞の一点または線上に沿ってラマン散乱光のスペクトルを取得することができた。2.標準試料溶液の温度測定と分光装置の校正水分子O-H伸縮振動のラマンスペクトルは幅広いスペクトルとなり、大きく分けて2つのピークが観測されること、isosbestic pointが3419 cm-1にあることが知られている。高温になるほど低ラマンシフト側のピークが小さくなり、高ラマンシフト側のピークが大きくなるため、この性質を利用して温度を計測できる。インキュベータで試料(水)の温度を変えながら水分子のラマンスペクトルを測定し、分光装置の校正を行った。次に、COS7細胞のラマンスペクトルを測定した。20 mWの出力、60秒の露光でラマンスペクトルを取得し、温度を計測することができた。1.顕微ラマン分光装置の組み立て現有の1分子蛍光顕微鏡システムに分光システムを組み込み、顕微ラマン分光装置を組み立てることが出来た。細胞の明視野または位相差像とラマンスペクトルを、光路を切り換えることにより、1台の高感度EMCCDで取得できるように工夫した。球面レンズまたはシリンドリカルレンズを用いて、レーザーを一点または線上に照射し、細胞の一点または線上に沿ってラマン散乱光のスペクトルを取得することができた。本年度内に装置の組み立てが終わり、細胞内の特定の領域のラマンスペクトルを取得できるようになった。よって、予定通りに研究が進捗していると言える。これらは水素結合の状態を表しており、高温になるほど低ラマンシフト側のピークが小さくなり、高ラマンシフト側のピークが大きくなる。これを利用して細胞内の局所温度を顕微計測できる。またCOS7細胞のラマンスペクトルを測定することができ、内部の生体分子の温度を計測する準備が整った。細胞が機能を発揮する上で、温度は重要な物理的パラメータである。本研究は、細胞内の生体分子のラマン散乱光を測定することにより、細胞内局所温度を直接計測する技術を開発した。昨年度は、水分子のO-H伸縮振動のラマンスペクトルに注目したが、この場合は約3400 cm-1となり、アンチストークス光がストークス光に比べて著しく微弱であり、正確な温度計測が困難だった。また、シトクロムcを用いてミトコンドリアの温度を計測するため、シトクロムcに特徴的なヘムの伸縮振動に注目した。しかし、シトクロムcに特徴的な伸縮振動も指紋領域にあるため、アンチストークス光が微弱であるという点が問題となった。これらの問題点を解決するため、ブラッググレートのノッチフィルターを使用してテラヘルツ領域でのラマン散乱測定を可能にした。この顕微鏡装置を用いて指紋領域の境界における低周波ラマン散乱測定を行うことにした。培養細胞のラマン散乱を計測した結果、数百カイザーまでは特徴的なラマン散乱は見られず温度計測に適していた。ただし、100 cm-1までは種々の分子に由来するベースラインの増加が見られた。検討の結果、δ(C-C) aliphatic chainsの250 - 400 cm-1が細胞内局所温度の測定に適していた。これを含む化合物とミトコンドリアなどの細胞小器官に集積する化合物を結合させたプローブを合成することにより、細胞内のナノスペースにおけるラマン温度計測が可能になると期待される。

高温になるほど低ラマンシフト側のピークが小さくなり、高ラマンシフト側のピークが大きくなるため、この性質を利用して温度を計測できた。また、C-C-N変角振動(458 cm-1)、ジフェニルジテレニドのTe-Te伸縮振動(150 cm-1)などの低周波振動のラマンスペクトルを計測し、ストークス光とアンチストークス光も強度比を計算することによりマイクロメートルの微小領域の温度を計測することができた。1.蛍光標識したミトコンドリアの温度測定培養細胞(HeLa細胞、COS7細胞など)の培地にMitoTrackerプローブを加え、ミトコンドリアの膜に選択的に結合させる。測定したストークス光とアンチストークス光の強度比からMitoTrackerプローブ(ミトコンドリア)の温度を求める。次に、脱共役剤FCCP(Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)を加えてミトコンドリアにおけるATP合成を阻害する。温度感受性蛍光ポリマーなどによる測定結果では、この条件下でミトコンドリア周辺の温度が上昇することが観察されている。実際に、温度上昇が起こっているかラマン散乱による温度測定法で検証する。2.細胞内のシトクロムcの温度測定シトクロムcは、ミトコンドリアの内膜に弱く結合しているヘムタンパク質の一種である。このヘムに由来するラマン散乱を測定し、シトクロムcの温度を測定する。シトクロムcの温度は、ミトコンドリア周辺の温度を反映していると期待される。前述のように、FCCPを加えてATP合成を阻害し、ミトコンドリア周辺の温度が上昇するか検証する。3.核内と細胞質の温度のラマン分光による同時測定温度感受性蛍光ポリマーを用いた計測によりG1期では細胞の核が細胞質より0.7°C温度が高いことを報告した。これを検証するため、核内と細胞質のラマン散乱による同時温度測定を行う。核内に局所的に存在するものとしてDNA、細胞質に局在するものとしてシトクロムcを測定する。これ以外の方法として、ラマン散乱の強いプローブ(アルキン分子)を細胞内にマイクロインジェクションにより導入し、核内と細胞質に分布するプローブを同時にラマン分光することも検討する。生物物理学
kai時計遺伝子によるシアノバクテリア概日振動メカニズムの数理的予測

シアノバクテリアの概日リズムを司る時計タンパク質KaiCは、発現レベルおよびリン酸化レベルが24時間周期で変動する。特にリン酸化レベルの振動は、3種類のKaiタンパク質を試験管内にて混合することで再現され、新しい概日機構解析モデルとして注目されている。これらの自律振動現象について、比較的簡単な数理モデルを構築し、振動が起きうる条件を網羅的に解析することで、分子機構の予測を試みた。まず発現レベルの振動について、kai時計遺伝子の自己転写制御機構を予測した。次にリン酸化レベルの振動について、KaiCが多様なリン酸化状態を有することが発振に必要であることを予測し、多様な状態間の機能的差違と、その振動制御における重要性を示した。実際、その後の実験グループの研究により、KaiCは多様なリン酸化状態を示すことが明らかとなっている。昨年度学術誌に発表したこれらの研究は、申請者の平成19年度博士論文として修められ合格している。最近になって、KaiC六量体間の単量体交換によってリン酸化状態の同調が起きることが報告された。個々の分子が自律的にリン酸化発振しうるならば、単量体交換による同調によって全体のリン酸化レベルの振動が現れている可能性がある。一方で我々は先の研究において、Kaiタンパク質複合体からリン酸化反応に対する負のフィードバックを発振原理として仮定してきた。本年度の研究では、同調とフィードバックという、2つの発振原理仮説を検証した。KaiC分子について個体別モデルを作成し、シミュレーションを行った。その結果、リン酸化レベルの同調だけでは振動は起こせないこと、リン酸化反応へのフィードバックは振動を起こせること、同調は周期を安定化させる効果があることが分かった。本研究は現在投稿準備中であり、20年度中の発表を予定している。シアノバクテリアの概日リズムを司る時計タンパク質KaiCは概日周期に従ってリン酸化・脱リン酸化を繰り返す。KaiA、KaiBはKaiCリン酸化を調節しており、概日周期に伴いKaiCと複合体を成す。KaiCはリン酸化状態に依存して自身の発現を調節することが示唆されており、この転写制御機構について、数理的解析からリン酸化KaiCが発現を誘導していると予測した研究をJournal of Theoretical Biology誌に発表した。KaiCのリン酸化振動は、KaiA、KaiBの共存下、in vitroで再構成できることが明らかになっている。本年度はこのKaiCリン酸化発振機構を数理的に解析した。KaiAはKaiCのリン酸化を促す。KaiCはリン酸化が進むにつれて、KaiAと複合体を成すことが観察されている。したがって、複合体形成により遊離KaiAが減少することで、KaiCリン酸化に負のフィードバックが働き、振動を生み出している可能性がある。しかしシミュレーションを行った結果、既知の相互作用を取り込んだ4変数モデルは、振動を示さないことがわかった。そこで制御構造に依る一般的な性質を解析するために、ある分子が全体の量を保ったまま、複数の状態を順番に遷移する系を考えた。このような閉鎖系で各状態の濃度が振動するには、状態間のフィードバックが必要であり、フィードバックを受ける反応と与える因子は、一定の状態数以上離れている必要があるとわかった。この結果を基に、改良版モデルによってKaiCのリン酸化振動を解析した。その結果、KaiCは振動の際に5つ以上の異なる状態を経る必要があることがわかった。またKaiCがリン酸化された後、KaiAとの複合体を形成する前に別のリン酸化状態が存在すると示唆された。本研究はJournal of Biological Rhythms誌に発表した。
時効効果論の沿革的・比較法的研究－「実体法と訴訟法」の問題の観点から－

民法学には、時効取得又は時効消滅が生じた権利・義務関係それ自体の当事者となっている者(直接当事者)以外の者に、どの範囲で、そして、いかなる基準の下で時効援用権が認められるのかという問題がある。判例は「直接利益者基準」を採用していると言われているが、その内容や具体的帰結については疑義も多い。多くの学説がこの基準の定式化を試みてきたが、理論的なコンセンサスは成立していない。本年度の報告者の研究は、この直接利益基準の定式化のために従来の議論が見落としてきた学説史の展開に着目し、その理論的基礎を与えることを目的として行われた。見落とされてきたのは、次のような学説史的事実である。つまり、旧民法ではフランス法のayant cause概念を用いることで、直接当事者のayant causeと評価される者が、直接当事者に介入し、直接当事者に代わって時効を主張できるという仕組みが用意されていたのである。ayant cause概念とは、ある者Aが他人Bの行為に依存する利害を持つことを要件とし、その利害をBに尊重させる権利がAに認められることを効果とする法的概念である。直接当事者のayant causeが当該直接当事者に代わって時効を主張できる権利は、ayant causeに認められる権利のひとつである。この考え方を再び参照することができれば、時効援用権者の範囲確定基準はayant cause概念によって定式化できる。更に、直接利益者基準によって時効援用権を否定するという解決に疑義が残る者、例えば後順位抵当権者に対しても、時効援用権を認めるという解決が可能となる。旧民法やフランス法において後順位抵当権者は、抵当権設定者のayant causeと評価されているからである。29年度が最終年度であるため、記入しない。報告者は、本年度において、消滅時効及び取得時効の時効援用権の理論構成について比較法的検討を行った。その結果、1.時効援用権の理論構成の問題について新たな知見が得られただけでなく、2.当該問題が更に大きな問題の一現象であることが明らかになった。第一の成果については、次の通りである。日本における消滅時効の時効援用権の構成が比較法的に見て特殊なものであるということである。確かに、消滅時効を援用できる者の範囲についての理解には共通性があり、例えば日本法においては、フランス法やドイツ法におけるのと同様に、保証人に対して主債務に関する時効援用権を認めている。しかし、その理論構成が異なる。日本法は、その理論構成として、保証人が主債務者に代わって主債務の時効を援用すると考えられており、主債務が消滅する結果保証債務も消滅すると考えられている。しかし、ドイツ法やフランス法においては、主債務に時効が完成した事を口実として、主債務者に立ち代わることなく、保証債務それ自体について時効の抗弁を主張することができるとされている。第二の成果については次の通りである。少なくとも19世紀のフランス法においては、取得時効が完成した者の「承継人(ayant cause)」が、当該取得時効の援用権を持つという議論が展開されていることが明らかになった。例えば、不動産の占有者から当該不動産を買った者は、当該占有者の「承継人(ayant cause)」であるが、日本法を研究する者の理解からすると、なぜ占有者から不動産を買って所有権の移転を受けたという一事を以って、時効援用権が買主に対して当然に与えられるのかが明らかではない。しかし、19世紀のフランス法においてayant causeという概念は、ある者とayant causeとの地位の同一性を示す概念である可能性が高いことが明らかになった。時効援用権の理論構成についての研究成果は、想定の範囲内であった。しかし、報告者の研究においては、単に時効援用権の理論構成の問題という個別具体的な問題が、ヨリ大きな法学的問題の中に位置付けられていることを見出した。この法学的問題こそがフランス法におけるayant cause概念の問題である。ayant causeという語は、日本語においては「承継人」と訳されることが通例であり、権利の移転という要素が本質的規定となっていると考えられる。しかし、報告者は、少なくともayant cause概念の本質的規定が権利の移転という要素ではないというという点をある程度明らかにすることができた。日本法における「承継人」概念が沿革的にはフランス法におけるayant cause概念に由来すること、及び、日本法における「承継人」概念の登場の頻度に照らすと、本研究の意義は小さくないと考えられる。

ayant cause概念とは、ある者Aが他人Bの行為に依存する利害を持つことを要件とし、その利害をBに尊重させる権利がAに認められることを効果とする法的概念である。直接当事者のayant causeが当該直接当事者に代わって時効を主張できる権利は、ayant causeに認められる権利のひとつである。この考え方を再び参照することができれば、時効援用権者の範囲確定基準はayant cause概念によって定式化できる。更に、直接利益者基準によって時効援用権を否定するという解決に疑義が残る者、例えば後順位抵当権者に対しても、時効援用権を認めるという解決が可能となる。旧民法やフランス法において後順位抵当権者は、抵当権設定者のayant causeと評価されているからである。今後は、次の3点に重点をおいて研究を進める予定である。第1に、19世紀のフランス法におけるayant cause概念がどのように規定されているのかという点について、より具体的に研究を進めたい。第2に、ayant cause概念の研究によって得られた知見を、再び時効の問題に照らして再検討したい。研究実績の概要で見たように、取得時効の援用権の問題とayant cause概念の問題との関係性はある程度明らかになっていた。しかし、消滅時効の援用権の問題との関係は更に検討する必要がある。第3に、20世紀以降のフランス法学説についても研究を進めたい。19世紀におけるayant causeの理解や時効援用権の理解が20世紀以降も受け継がれているのかという点は、重要な比較法的意義を有する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
内分泌因子の皮脂腺に及ぼす影響 -培養ヒト脂腺細胞による検討-

今回われわれは、脳下垂体で生成される各種ホルモンの皮脂腺に及ぼす影響を明らかにする目的で、甲状腺刺激ホルモン(TSH)およびα-メラニン細胞刺激ホルモン(α-MSH)の皮脂腺に及ぼす影響を、培養ヒト脂腺細胞を用いて細胞増殖、脂質生成を指標として検討した。その結果、TSHは培養ヒト脂腺細胞の細胞増殖を濃度依存性に有意に増加させることが判明した。THSと皮脂腺の関係に関しては、現在までほとんど報告はなく、唯一ラットを用いた実験で、TSHが甲状腺からの甲状腺ホルモンの分泌を亢進させることにより間接的に皮脂腺に影響を及ぼしている可能性が示唆されている。今回の結果より、ヒトにおけるTSHの皮脂腺に対する作用機序の一つとして、皮脂腺に対する直接作用が示唆される。α-MSHに関しては、ラットにおいてその生理作用がよく研究されている。ラットでは、α-MSHばsebotrophic hormone゙、すなわち、゙皮脂腺の男性ホルモンに対する感受性を増強させるような因子゙として考えられており、tes tosteroneと相乗的に作用することにより、皮脂分泌を促進する可能性が、また皮脂腺に対して直接的に影響を及ぼす可能性が示唆されている。われわれの実験結果より、α-MSH単独では、培養ヒト脂腺細胞の細胞増殖に著明な影響を及ぼさないことが判明した。また、testosteroneによる培養ヒト脂腺細胞への細胞増殖促進作用に対するα-MSHの影響を検討したところ、その増殖促進作用をさらに促進することが判明した。この事実は、α-MSHがヒトにおいても゙sebotrophic hormone゙として働いている可能性を示唆するものと考える。またその作用機序に関しては、α-MSH単独では培養ヒト脂腺細胞の細胞増殖に著明な影響を及ぼさなかったことより、α-MSHが脂腺細胞の男性ホルモンに対する受容体に何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆される。TSHおよびα-MSHの培養ヒト脂腺細胞の脂質生成に及ぼす影響については、現在検討中である。
北アメリカ北西海岸先住民言語の緊急調査研究

渡辺はおよそ6ヶ月のカナダ滞在をし、そのうち多くをセイリッシュ語(スライアモン語およびホマルコ語)の現地調査に費やした。特に今回の調査ではテキスト収集をおこないながら、複雑な形態統語構造をみせる関係節について多くのデータをえた。そこから解明できた文法構造はこれまで特にスライアモン語・ホマルコ語にかんしては詳しい記述がなかったものであり、今後の研究の発展の基礎作りができた。その他でもこれまで記述が充分ではなかった点について、さらにデータを集め分析を進めた。新たなデータから闡明された点も多い。例えば複数を表わす二種の重複法はどのような時にどちらが使われるか不明だったが、このうち一種は状態アスペクトの語幹に対して施されることが分かった。弓谷は夏の現地調査では、トワ語の動詞と動詞に関係することを中心に調査した。一つは文法関係を表す動詞接頭辞で、特に受益接頭辞について調べた。受益接頭辞は受益者だけでなく所有者や、また一部の動詞につくと動作主も表すという特異なものである。また、前年度の調査では存在の表現に関する基礎的データを集めたが、今回は表現形式の各タイプについて、より多くの具体例を収集し、いくつか新しい発見もした。例えば、有生物の存在を示すのに、ある動詞を使うと、その生物が動いていることを示唆するのに対し、別の動詞を用いると、それがじっとしていることを示唆するそうである。さらに、今回の調査では、場所や方向を表す後置詞についても多くのデータを得た。本研究では今年度,予定通り渡辺がコモックス語,そして弓谷がトワ語の現地調査をおこなった.渡辺はコモックス語のボイスを中心に調査研究を進めた.形態法にかんしては,渡辺のこれまでの調査研究ですでに基礎的な記述はある程度形をなしている.しかし,それぞれのボイスとアスペクトの関係が,未だ明確に解明されていない.本年度は中動態と他動詞のそれぞれについて,時間的な意味を担う副詞的要素との共起性を調査した.その結果,従来記述されてきたよりも,特に中動態についてはアスペクトとの関係が複雑であること,そして他動詞については他動詞化接尾辞のうちのひとつが,行為がおこなわれた結果を含意することから,アスペクトとの関係が密接であることが分かった.この他,その存在がこれまで必ずしも明らかではなかった,受動態語幹を(再)他動詞化する形態法にかんして,新たな資料をえることができ,その文法性が確認できた.弓谷はトワ語調査の中でも,主に以下のふたつの事柄に焦点を置いた.ひとつはスペイン語からの借用語で,もうひとつは動詞の活用である.前者については,プエブロインディアン諸語の中では,これまでニューメキシコ州で話されているテワ語が最もスペイン語からの借用語が多いと考えられてきたが,今回の現地調査の結果,トワ語の方が借用語がはるかに多いことがわかった.えられたデータから,借用語の伝播の道筋,つまり,スペイン語から直接入ったか,それとも別のインディアン語を経由して入ったかについて研究を進めている.動詞の活用については,不規則動詞のタイプが依然多すぎると思われる.少数のタイプにまとめるためには,さらに新しいデータが必要である.今年度渡辺は夏期に2ヶ月弱,弓谷は約1ヶ月,それぞれスライアモン・セイリッシュ語とトワ語の現地調査をおこなった.渡辺の調査では,ここまでスライアモン語にかんする先行研究のいずれもが見落としていたアスペクトを示す接尾辞について重点的に資料を集めた.この接尾辞は完了の一種を表わすと考えられるが,形式的にも意味機能的にも非常に似通った他の接尾辞,倚辞が複数個ある.問題の接尾辞を形式には同定できたと考えるが,その意味機能の解明には未だ資料が足りない状態である.来年度も引き続きこの接尾辞の調査を続ける.その結果を踏まえた,スライアモン語のアスペクトにかんする体系的な記述を準備しつつある.その他,原語テキストの収集,書き起こしに努めた.弓谷のトワ語の現地調査では、主に二つの事柄に焦点を置いた.一つは存在・位置に関する表現の研究で,もう一つは民話の収録である.トワ語では「にがある」と言いたい場合,存在するものは,生物,非生物とも,大きく3つのタイプに分類される.すなわち,「立っているもの」「座っているもの」「横になっているもの」である.この分類方法にはヘメス族の人たちの世界観が現れているようで,興味深い.それから,民話にかんしては,今回は長めのものと短めのものを一つずつ収録し,音声記号で書き表した.ヘメス族では,民話を語れる人が年々減っており,現在80歳代以上の年長者しか語れなくなっている.両名とも調査対象の言語を流暢に話せる話者がますます減ってきていることを痛感し,細かい文法事項の調査や民話等の原語テキストの収録の緊急性がさらに高まっていることを感じている.渡辺はおよそ6ヶ月のカナダ滞在をし、そのうち多くをセイリッシュ語(スライアモン語およびホマルコ語)の現地調査に費やした。

例えば複数を表わす二種の重複法はどのような時にどちらが使われるか不明だったが、このうち一種は状態アスペクトの語幹に対して施されることが分かった。弓谷は夏の現地調査では、トワ語の動詞と動詞に関係することを中心に調査した。一つは文法関係を表す動詞接頭辞で、特に受益接頭辞について調べた。受益接頭辞は受益者だけでなく所有者や、また一部の動詞につくと動作主も表すという特異なものである。また、前年度の調査では存在の表現に関する基礎的データを集めたが、今回は表現形式の各タイプについて、より多くの具体例を収集し、いくつか新しい発見もした。例えば、有生物の存在を示すのに、ある動詞を使うと、その生物が動いていることを示唆するのに対し、別の動詞を用いると、それがじっとしていることを示唆するそうである。さらに、今回の調査では、場所や方向を表す後置詞についても多くのデータを得た。
チミングリコール修復酵素、エンドヌクリエ-スIII、欠損の分子病態

大腸菌nth欠損株は、過酸化水素やx-線照射に野生株と同じように耐性である。そこで、Endonuclease VIIIをコードするnei遺伝子をクローニングし、nei遺伝子破壊大腸菌を作った。nth nei二重変異株は、チミングリコールに対するDNA glycosylase活性が野生株の1%以下となった。二重欠損株は、過酸化水素やx-線に対して感受性となった。従って、大腸菌では、Endonucleae III/VIIIの2つのシステムで損傷ピリミジン塩基の修復を行っていることが明かとなった。nth欠損大腸菌は、従来から弱いmutatorであることが知られていた。nth nei二重変異株は、nth欠損株より強いmutatorとはならなかった。supF遺伝子を標的として突然変異のスペクトルを調べたところ、二重欠損株で観察される塩基置換変異では、G:C対での変異だけが観察され、A:T対では変異は観察されなかった。従って、チミングリコールには強い変異原性があるとは言えないことが明かとなった。5-ヒドロキシシトシン等のシトシン損傷が、突然変異損傷であることが示唆された。チミングリコールの致死性については、二重変異株を用いることで、確かめることができた。今後はオスミウム酸処理したプラスミドを用い、誘発突然変異を解析することで、チミングリコールの変異原性を明らかにしたい。次ぎに、5-ヒドロキシシトシンの変異原性についても、同様に明らかにする。分裂酵母の、nth欠損株を作成した。この変位株は、過酸化水素に強い感受性を示した。分裂酵母では、Endonuclease VIII型の酵素は持ってないのかも知れない。今後は、酵母でのチミングリコールの修復についても明らかにする。