hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
紫外共鳴ラマン分光による調節蛋白一遺伝子相互作用とその動的過程

プリン塩基のC8位を重水素化したものを合成し,266nm励起ラマンスペクトルを測定して,基礎的検討を行った.1.マルチチャンネル検出器の高感度化、光学系の改良等により、213、240nmを励起光としたラマンスペクトルが測定できるようになった。今後、さらに多くの励起光を使用できるよう計画している。2.調節タンパク質の一つ、cAMP受容タンパク質(CRP)は、プラスミドを保有する大腸菌より単離・精製した。その希薄溶液の紫外共鳴ラマンスペクトルを240nm励起で測定すると、芳香族アミノ酸側鎖のうちトリプトファン、チロシンのバンドが主に観測された。その結果、2個のトリプトファン側鎖は親水環境にあること、6個のチロシン側鎖のうちいくつかは異常な状態(アニオン化状態など)となっていることを見出した。3.CRP-cAMP複合体の共鳴ラマンスペクトルの測定より、複合体形成にともなすCRP、cAMPの構造変化について調べた。240nm励起のスペクトルより、CRP主鎖は、複合体形成によりβシート構造が減少することがわかった。X線結晶解析により、cAMPはβシート構造より成るポケットに結合することが知られているので、cAMPが結合するとCRPのポケット構造が一部崩れると考えられる。チロシン側鎖はcAMP複合体となっても変化はない。また、266nmを励起光するとcAMPが強く共鳴効果を受けるため、複合体中でもcAMPのラマンバンドのみを選択的に観測することができた。これにより、cAMPは複合体中でCRPと強く相互作用していることが明らかになった。4.CRPのオペレーター部位にあたるDNA22マーの希薄溶液について紫外共鳴ラマンスペクトルを測定した。その結果、266nm励起ではアデニンについて、240nm励起ではグアニンについてのラマンバンドがかなり選択的に観測できることがわかった。1.光学系の改良等により、ラマンスペクトル測定の励起光を213nm300nmの範囲で約10nm毎に選択できるようになった。これにより、芳香族発色団(芳香族アミノ酸側鎖、核酸塩基)ついて、着目する発色団の共鳴ラマンスペクトルをほぼ選択的に観測することが可能となった。2.cAMP受容タンパン質(CRP)の240nm励起のラマンスペクトルが、その構成する芳香族アミノ酸のラマンスペクトルの和では再現できないという現象が観測できた。芳香族アミノ酸のモデル化合物の溶媒効果を検討した結果、側鎖の環境によってラマンバンドの強度が大きく変化することを見い出した。さらにCRPの場合では、いくつかのチロシン側鎖がかなり疎水的な環境にあることが解った。3.cAMPーCRP複合体では、266または253nmを励起光とすることで分子量46,000のCRPに取り込まれた1分子のcAMPのラマンスペクトルを選択的に観測できた。cAMPモデル化合物の同位元素置換、溶媒効果を検討した結果、cAMPはCRP結合時にNーグリコシド結合回りのコンフォメ-ションがsynとなっていることが明らかになった。4.選択的重水素ラベルしたオペレ-タ-DNAを合成した。今後、cAMPーCRPと結合した合成オペレ-タ-のラマンスペクトルを測定する。これにより、CRPの結合に伴うオペレ-タ-の構造変化を、特定の塩基について選択的に観測できるものと期待される。1.cAMP受容タンパク質(CRP)に種々の割合のcAMPを加えたラマンスペクトルを測定すると,cAMP添加により主鎖のアミドのバンド形が変化した。この変化を詳しく解析することにより,cAMP結合に伴うCRPのアロステリックな構造変化が非常に大きいことを見い出した。
多層膜化による非平衡相結晶薄膜の安定性の研究

清浄化した単結晶下地上に物質を真空蒸着すると、真空蒸着原子と下地原子との間の相互作用によって塊状では安定に存在できない構造の結晶が準安定に成長することがある。この結晶薄膜は通常、膜厚の増大と共に不安定になり、膜厚がある決まった値に達すると塊状で安定である構造に遷移する。膜厚増大に伴う非平衡相薄膜の構造不安定性を膜形成中のRHEEDその場観察と膜形成後の薄膜X線回折測定から調べられるように、本年度は主として実験装置の整備作業を行った。非平衡相結晶薄膜の成長に使用するために購入した実験装置は6基の蒸発源とRHEED電子銃と膜厚計センサ-を備えた超高真空蒸着装置である。清浄で且つ結晶性の良い下地表面上への蒸着が非平衡相を成長させるための必要条件なので、下地清浄化のためにイオン銃を、イオン衡撃によって導入された構造欠陥を除去するために直接通電と電子ビ-ム照射による加熱機構を装置に取り付け、イオン衝撃と焼鈍の繰り返しにより下地表面の調整を行えるようにした。6基の蒸発源を利用すると最大6成分の元素からなる薄膜を自由に作成できるが、そのためにはそれぞれの蒸発源に付設されたシャッタ-を指定された手順で次々と動かさねばならない。インタ-フェ-スボ-ドの整備とシャッタ-動作制御プログラムの開発を行い、パ-ソナルコンピュ-タからの指令で6ヶのシャッタ-を意図どうりに自由に動作させられるようにした。
魚類における日周リズムの発現機構と光覚器の役割

魚類の行動や生理現象にみられる日周リズムの発現機構における光覚器(網膜・松果体・脳組繊)の役割を明かにする目的で、実験魚を12Lー12Dで1週間あるいは1カ月以上飼育した後、明期および暗期に各々抽出固定し、明順応標本と暗順応標本を作製して、網膜および松果体の光受容細胞にみられる微細構造の日周変化を調べた。1.キンギョ網膜の光運動反応の観察には透過電顕および走査電顕を使用し、光周期に依存して生ずる視細胞の伸長および収縮とそれに伴う色素顆粒の拡散および凝集を二次元および三次元的に明かにした。2.キンギョの網膜の錐体小足に進入した水平細胞樹状突起先端の小棘は、明順応では錐体1個当り12個数えられ、暗順応では消失してほとんど見あたらなかった。したがって、夜間錐体の活動は休止状態にあり、昼間錐体の活動が盛んなときは、水平細胞との情報連絡が小棘の形成によって高められると推測される。3.アユの松果体光受容細胞の基底突起にみられるシナプスリボンの長さは、明順応で0.565±0.142μm(n:144)、暗順応では0.781±0.169μm(n:233)を示し、夜間には昼間の38%長いことが明かにされた。この差異はシナプスリボンがメラトニンの産生あるいは日周リズムの発現に何らかの役割を果たしていることを示唆している。4.明順応で抽出したキンギョの眼杯をDME培養液・cAMP添加液・メラトニン添加液にて2時間暗順応後に錐体ミヨイドの伸長を調べると、培養液のみではほとんど伸長しないが、cAMPあるいはメラトニン添加液では有意な伸長が認められ、錐体ミヨイドの伸長は網膜におけるcAMPおよびメラトニン量の夜間における増加と密接な関係があることがわかった。5.HRP法により、キンギョ松果体神経から手綱核・視床の背内側核・背外側核・間脳の脳室周囲灰白質・視蓋前野・中脳被蓋等への線維の走行がみられた。
肺癌の人種的な差異の解明と新たな治療戦略の開発

呼吸器疾患の血清バイオマーカー値の有用性を日欧における人種的な違いに着目して検討を行ったところ,日本人と比較して欧米人の値は高い傾向を認め,異なるカットオフ値の設定が必要であると思われた.また,EGFR-TKI投与前の血清KL-6値が高値を示す症例では,正常値の症例と比較して,予後が優位に不良であった.さらに,EGFR遺伝子変異を認めない症例であっても血清KL-6値が正常値の症例は,EGFR-TKI治療の適応となる可能性が示唆された呼吸器疾患の血清バイオマーカー値の有用性を日欧における人種的な違いに着目して検討を行ったところ,日本人と比較して欧米人の値は高い傾向を認め,異なるカットオフ値の設定が必要であると思われた.また,EGFR-TKI投与前の血清KL-6値が高値を示す症例では,正常値の症例と比較して,予後が優位に不良であった.さらに,EGFR遺伝子変異を認めない症例であっても血清KL-6値が正常値の症例は,EGFR-TKI治療の適応となる可能性が示唆された本年度は、大きく以下の2つのアプローチを用いて検討を行った。1.肺癌の人種的な差異の解明本年度は肺癌患者症例の検体の収集を行い、日本人100症例の検体を収集した。すでに、収集済みの600症例(肺癌300症例、健常人300症例)の血清検体に関しては、血清KL-6値ならびにSLAK値の測定を終了した。現在、予後を含めた臨床病理学的因子の検討を行っているところである。80症例の肺癌組織を用いて、組織免疫染色を行い、各バイオマーカーの肺癌における発現と臨床病理学的因子の検討を行った。ムチン長の検討に関しては、肺癌細胞株30株、肺癌患者200症例、健常人200症例より、ゲノムDNAを抽出した。Real time定量PCRシステムを用いてムチンの遺伝子多型の検討を条件検討の済んだものから順次行っているところである。次年度以降には、海外の新たな共同研究者を含め、症例を増やして検討をおこないたいと考えている。2.肺癌マウスモデルを用いたEGFR-TKI耐性機序の解明と新たな治療戦略の開発本研究に際しては、抗KL-6抗体の精製が必要になるが、本年度はハイブリドーマより、抗体精製キット用いて、抗KL-6抗体の大量精製を行った。また、肺癌細胞株30株を用いて同所移植モデルの構築を行い、肺内に腫瘍を形成するとともに縦隔リンパ節転移を来すことについて確認した。また、肺癌細胞株30株を用いて、FACS解析を行いムチン関連分子の肺癌細胞株における発現を検討した。EGFR遺伝子変異の解析も行い、ムチン関連分子の発現は、野生型においてのみ、EGFR-TKIの感受性に関与することを見出した。多数の臨床検体を用いた確認を行っているところである。ムチン関連分子のEGFR-TKI耐性機構への関与、抗KL-6抗体によるEGFR-TKI耐性克服の可能性については、条件設定に時間がかかったが、次年度以降に明らかにしたいと考えている。本年度は,日本人の肺癌患者検体ならびに肺癌細胞株30株を用いて,大きく以下の3つの検討を行った.1.肺癌手術症例におけるKL-6/MUC1の発現と血清KL-6/MUC1値の関係2. EGFR-TKI投与症例におけるKL-6/MUC1モニタリングの意義EGFR-TKI投与症例におけるKL-6/MUC1モニタリングの意義をさらに症例を増やして,EGFR遺伝子変異の有無によるサブグループ解析を行った.血清KL-6/MUC1値のモニタリングは,特にEGFR遺伝子変異を認めない症例において極めて有用であることを明らかにした.3.肺癌細胞株を用いた検討肺癌細胞株30株を用いて,KL-6/MUC1の細胞表面での発現,MUC1遺伝子多型の関係について検討を行った.今後はEGFR遺伝子変異,EGFR-TKIに対する感受性などについても検討を行い,EGFR-TKIの耐性機序の解明を行いたいと考えている.EGFR-TKIを実際に投与した切除不能非小細胞肺癌症例における血清KL-6値測定の意義について,広島大学を中心とした多施設で検討を行った.登録された341症例の中で20症例にEGFR-TKIによる薬剤性肺障害を発症した.EGFR-TKIによる薬剤性肺障害を発症した20症例においては,治療開始前ならびにEGFR-TKIによる薬剤性肺障害発症時の血清KL-6の絶対値は,薬剤性肺障害の進展ならびに重症度を反映しなかった.しかし,治療開始前から薬剤性肺障害までの血清KL-6値の変化は致死的な症例とステロイド治療に反応する症例の鑑別に有用であった.次に,薬剤性肺障害を発症しなかった症例においては,EGFR-TKI投与前の血清KL-6値が500U/ml以上の症例では,500U/ml以下の症例と比較して,無増悪生存期間が優位に不良であった.さらにEGFR遺伝子変異を含めたサブグループ解析を行ったが,EGFR遺伝子変異を認めない症例であっても血清KL-6値が500U/ml以下の症例は,EGFR-TKI治療の適応となる可能性が示唆された.また,日欧の健常人ならびに慢性閉塞性肺疾患患者において血清KL-6値を測定し,その人種的な違いについて検討したが,日本人と比較して欧米人のKL-6値は明らかに高い傾向を認め,異なるカットオフ値の設定が必要であると思われた.

また,肺癌細胞株約30株を用いて,MUC1遺伝子多型(rs4072037)と細胞表面でのKL-6の発現について予備的な検討を行ったが,KL-6の発現とMUC1遺伝子多型の関係を検討することが可能であった.今後は,血清KL-6値とMUC1の遺伝子多型,MUC1長の関係について臨床検体を用いて検討を行い,肺癌の人種的な差異を解明したい.
量子スピン液体状態でのスピンゼーベック効果

本年度は、「π電子のスピン自由度」と「水素結合上のプロトン自由度」がカップリングした新しいタイプの量子スピン液体候補物質の理解を深めるために、4つの置換体(1H-ST、2H-EDT、3H-EDT-d4、4H-EDSe)に関して極低温で磁気トルク測定を行った。これらの物質の磁気トルク測定は2年前に行なっていたが、カンチレバーなどのバックグランドの影響が大きく、試料の磁気信号を評価できていなかった。今回はバックグランドの影響を取り除くことで、精密に試料の磁気トルク信号を抽出しすることに成功した。具体的には、強強磁場ステーションの低温物性マグネットを利用し、幅広い温度磁場範囲で磁気トルク測定を行い、磁化率の温度依存性を評価した。その結果、上記4つの置換体全てにおいて、極低温までスピン自由度が凍結することなく揺らぎ続けていることが分かった。また、そのような状態でギャップレスのスピン励起が存在していることが明らかになった。ギャップレスの量子スピン液体が元素置換による影響を受けずに安定し続けるのは、従来の量子スピン液体の枠組みでは説明できない。これまでに我々が行った誘電率の測定結果を踏まえると、プロトンの量子揺らぎが新しい量子スピン液体の実現に重要な役割を果たしていることが分かった。この内容は、既に物理学会で発表しており、近日中に論文としてまとめて投稿する予定である。今後は、現在進行中のCat系の熱測定(熱伝導率測定や比熱測定も含む)を行う予定である。本年度は、「π電子のスピン自由度」と「水素結合上のプロトン自由度」がカップリングした新しいタイプの量子スピン液体候補物質であるCat系の研究を行った。しかし、当初予定していたこれらの物質の熱測定は現在進行中であり、研究進捗状況はわずかに遅れていると考えている。本年度購入予定だった装置があったが、実験の進捗状況にあわせて来年度購入することになった。
重力波望遠鏡KAGRAの観測デッドタイムの解消

日本のオリジナル技術である極低温レーザー干渉計型重力波検出器には、クライオポンプ効果による鏡の汚染という特有の問題がある。このため、日本の重力波望遠鏡KAGRAでは1年に2ヶ月の鏡のクリーニング期間が必要となるが、突発イベントを狙う重力波検出器にとって、この観測デッドタイムは致命的であり、可能な限り短縮することが求められる。本研究では、まず、このクライオポンプ効果による鏡の汚染メカニズムを実験的に再評価し、吸着する残留ガスの主成分が水であり、その成長速度は26.8nm/dayであることを突き留めた。また、低温鏡の冷却昇温時間を、高効率熱伝導体の開発や昇温仮定の工夫で半減させる事に成功した。KAGRAでは極低温鏡を収納するクライオスタットと真空ビームダクトがウィンドウ無しに繋がっているため、常温部から極低温鏡に残留ガスの吸着が起こり、干渉計性能を低下させる事が分かっている。このため、定期的な鏡の昇温(クリーニング)が必要であるが、KAGRAのクライオスタットは1回の熱サイクルで2ヶ月を必要とし、突発重力波イベントを検出し損なう可能性がある。そこで本研究では、CO2レーザーによる鏡の局所昇温で鏡クリーニングを実現し、必要な時間を大幅に短縮することを目指している。本年度は、出力100WのCO2レーザーを導入し、鏡にレーザー照射する準備を進めた。まず、KEKでは安全基準が高く、100Wレーザーの使用には高度な安全対策が要求される。そこで、CO2レーザーを用いる光学定盤の回りにインターロック付のシールドとレーザー光ダンパーのための耐熱レンガ板を設置した。テスト環境を整えた上でまずはZnCeウィンドウへのCO2レーザー照射試験を実施した。これは、レーザー照射による熱でウィンドウが破壊されない事を確認するためである。熱破壊を避けるため、ビーム径はビームエキスパンダーで8倍に拡大して用いた。この試験でZeCeウィンドウは十分な熱耐性を持つことを確認した。また、本年度は試験で用いるクライオスタットの改造にも力を入れた。本実験ではKAGRAの極低温鏡テスト用クライオスタットを流用する予定であるが、CO2レーザー導入のためにはウィンドウの設置および内部の拡張が必要である。今年度はこれらの改造を行い、クライオスタットの冷却試験を行った。しかしながら、クライオスタットが充分低温に到達しない問題に直面し、現在原因の調査を行っている最中である。次年度は引き続きクライオスタットの整備を行い、極低温サファイアサンプルへCO2照射と局所昇温の実験室テストを行う予定である。本研究は、大型低温重力波望遠鏡KAGRA特有の残留ガスによる鏡の汚染、および、これに起因する観測時間の減少を改善する研究に関するものである。具体的には、CO2レーザーにより低温鏡の局所昇温・冷却を実現し、観測デッドタイムの大幅な改善を目指すものである。H27年度は、KAGRA本体の最初の試験運転であるiKAGRAの準備が遅れたことからこの回復に忙殺され、本実験にもやや遅れが生じてしまった。まず、鏡を模した小さなサファイアサンプルを極低温まで冷却し、CO2レーザー照射で局所昇温させる実験までは到達出来なかった。しかしながら、すでにサンプルやCO2レーザー、テスト用クライオスタットは準備が完了しており、実験に取りかかれるところまで到達している。H28年度に速やかに実験を実施する予定である。次に70K以上で黒体輻射を利用して急速に鏡を冷却する技術に関しては、計算および実験で実証済みである。しかし、黒体コーティングに残留磁化があることが分かり、この低減が必要となった。黒体コーティングの非磁性化についてはメーカーと共同研究を実施中で、ようやく非磁性化の目処がたち、SQUID式の高感度磁束計で磁化率を計測評価中である。最後に、70K以下で効果を発揮する機械式ヒートスイッチを用いた急速冷却技術については、モーターを用いて高純度アルミニウムを接触させるタイプのヒートスイッチデザインが終わり、製作に入ったところである。以上のように実験には遅れが生じているが、着実に準備は進んでおり、H28年度中に予定通り実証試験を完了させる予定である。H27年度は、本研究の主体である重力波望遠鏡KAGRAの最初の試験運転iKAGRAの実施に遅れが生じ、この挽回に忙殺されてしまった。この影響を受け、本研究の推進にもやや遅れが生じている。しかしながら、実験を行うための準備はほぼ終了しており、H28年度中に充分巻き返しは可能である。具体的には、新たに研究支援員を雇用し、また、学生を確保するなどマンパワーの増強を図った。この結果として、当初予定通りH28年度中に研究を完了出来る見込みである。KAGRAのような低温重力波望遠鏡では、鏡の周辺だけが極低温であり、レーザービームダクトは常温の真空である。このため、常温真空部の残留ガスがクライオポンプ効果で極低温鏡表面に吸着し、レーザー干渉計の性能を低減させてしまう。この回復のために、2ヶ月近い観測の中断が予測されており、大きな問題である。本研究は、この低温鏡のコンタミネーションによる重力波望遠鏡の観測デッドタイムを低減させようとするものである。具体的には、昇温・冷却のスピードアップにより、鏡のクリーニング時間の短縮を行う。H28年度は、1)低磁性黒色コーティングによる効率的な輻射冷却、2)鏡コンタミネーションの評価、3)ヒートスイッチの再設計などを実施した。1)については、低磁性のステンレス鋼と比肩しうるレベルまでニッケル-リン黒色被膜を低磁性化することに成功した。

ただし、輻射率測定では磁性を有する黒色被膜よりも性能がやや劣ることが分かり、現在は輻射率向上を目指して配合比の微調整を実施しているところである。2)の鏡のコンタミメーション評価では、まず、KAGRAと同じ構成の小型の極低温装置を製作し、残留ガスによる各エリアへの吸着量評価を実施し、計算と一致することを確認した。さらに、鏡表面に高分子微粒子を分散させた上で光学損失を計測し、コンタミネーションのモデル実験を行ったが、これはロスが大きすぎてうまく行かなかった。現在実験を修正中である。3)のヒートスイッチについては、複雑な鏡懸架周りに合わせてデザインを修正中である。以上のように、現在はまだ鏡コンタミネーション評価とヒートスイッチの研究を行っており、進展は少し遅れている。この評価後に、CO2レーザーによる局所昇温やヒートスイッチによる冷却加速実験を進展させる予定である。本実験では高出力レーザーを用いるためにその安全対策等で多大な労力が必要となった。研究支援員の雇用などで整備を進め、レーザー実験室の完全なインターロック化を実現した上でレーザー実験をスタートした。このため、実験開始に遅れが生じた。この他学生の卒業などに伴うマンパワー不足も響いたが、新たな学生の獲得などで巻き返しをはかっている。このため、研究期間の1年延長を申請し、研究を完了させる計画である。なお、本研究は、学生の博士論文のテーマの1つになっている。本研究の目的は、鏡の低温汚染を調査し、その解決を目指すものである。研究期間を1年延長し、H29年度には2つの研究を行った。まず、鏡の汚染問題について詳細な計測を実施した。方法は、フィネス50,000程度のrigidな小型光共振器をKAGRAのIYCクライオスタット内に導入し、片側の鏡だけに残留ガスが吸着されるよう配置した。定期的に共振器のフィネスを計測する事で表面反射率の変化を評価した。実験はトータルで70日ほど行い、低温実験期間は約1ヶ月、到達温度は47Kであった。この結果、冷却によりフィネスは49,000から46,000に低下し、また、低温試験中にフィネスの振動が見られた。これは、残留ガスの主成分である水分子の膜厚成長により、光の半波長ごとに反射率の増減が生じたものである。この結果をKAGRAに当てはめると、1年の運転期間中にpower recycling gainが10から5に低下してしまう事が分かった。一方で、真空圧力を1x10^-7 Paまで上げれば、1年間でのpower recycling gainの低下は1程度に抑えられ、大きな問題とならないことが分かった。また、クリーニング後の鏡の効率的な冷却についても研究を行った。クライオスタット内部をDiamond Like Carbonおよびニッケルリンメッキで黒色化し、輻射冷却を効率良く用いるようにした。また、超高純度アルミニウム伝導冷却体を開発し、効率を上げた。これにより、当初の設計冷却時間40日から20日まで改善することが出来た。鏡の局所的な昇温・クリーニングに関しては、未だ思考錯誤を行っており、今後の課題として残った。
動物内での生理活性ポリマー合成による生体内合成化学治療

報告者はこれまでに、生きているマウス内で高選択的かつ迅速に疾患臓器をターゲティングする糖鎖アルブミンDDS(ドラッグデリバリーシステム)を開発している。さらにこのDDSに対して金(III)触媒を担持することにより、望む臓器で選択的に金触媒反応を実現している。この独自の技術を展開して、本年度は次の2点に絞って生体内でのクラスター形成や重合反応によるがん治療の検討を行った。(1)Au触媒によるがんでの生理活性分子クラスター形成による治療通常がんに対して、がん抗原やレセプターを強く認識する生理活性分子や薬剤を作用させることにより、がんを治療する。しかし、細胞を使用した研究では有効性が確認されているものの、動物レベルでは、薬剤の有効濃度が薄まるために顕著な効果が得られることが少ない。そこで報告者は、がんで選択的に薬剤をクラスターさせることができれば、動物内でも効果的にがん治療が可能ではないかと考えた。そこで、がんを認識する糖鎖アルブミンを用いて、まずヌードマウスに播種したがんにAu(III)触媒を担持した。次いで金触媒に反応する官能基を有する生理活性分子を作用させた。目的とする金触媒反応を進行させて、がんで直接、生理活性分子のクラスターを形成させることにより、治療することに成功した。(2)Ru触媒によるがん付近での生理活性分子の重合反応による治療報告者は、上記の金触媒の手法を他の遷移金属触媒にも展開することで、生体内で様々な金属触媒反応が行えることを見出した。そこで、フラスコ内で確立されている各種の金属触媒による生理活性分子や薬剤の重合反応を検討した。しかし、多少の重合が進行するものの、金属触媒の反応場の空間が小さいために、現在用いた系では効果的な重合が行えないことが判明した。金触媒による生理活性分子や薬剤のクラスター形成を動物内で実現し、がん治療に繋げることができた。動物内でのクラスター形成を治療に展開できることを世界で初めて明確に示した例となった。一方、一般的な遷移金属触媒を用いた重合反応の成功には至らなかったものの、報告者が開発した反応場のscope and limitationを具体的に知ることができた。この反応場は次年度から、さらに生物学的、工学的、あるいは有機合成的に拡張することが可能である。以上のことから、研究課題は当初の計画通りに進展していると評価する。平成30年度に実現した生体内での遷移金属触媒反応によるクラスター形成を基にして、平成31年度では下記の点に焦点をおいて検討する。(2)Ru触媒によるがん付近での生理活性分子の重合反応による治療報告者が開拓した触媒の反応場を生物学的、工学的、あるいは有機合成的に拡張することにより、重合反応が可能な革新的触媒を開発する。まずは細胞を用いて検討する。さらにマウス内で遷移金属触媒をがん細胞に送り込んだ後、がん付近で官能基したモノマーの重合反応を行い、生理活性分子や薬剤ポリマー分子の生体内合成によるがん治療を試みる。(3)がんで発生するアクロレインの新規8員環重合反応による転移抑制報告者は、がん組織でmMレベルで異常発生するアクロレインは近傍の生体アミノアルコールやジアミンと反応し、中間体イミンを経由して8員環ポリマーを与え酸化ストレスを亢進させることを発見した。そこで、生理活性分子や薬剤候補分子にbis-アミノアルコール部位を導入したモノマーをがんモデルに導入し、がん組織付近で過剰に発生するアクロレインと効率・選択的に反応させる。その結果生じるポリマー分子によるがん治療を試みる。

一方、一般的な遷移金属触媒を用いた重合反応の成功には至らなかったものの、報告者が開発した反応場のscope and limitationを具体的に知ることができた。この反応場は次年度から、さらに生物学的、工学的、あるいは有機合成的に拡張することが可能である。以上のことから、研究課題は当初の計画通りに進展していると評価する。平成30年度に実現した生体内での遷移金属触媒反応によるクラスター形成を基にして、平成31年度では下記の点に焦点をおいて検討する。(2)Ru触媒によるがん付近での生理活性分子の重合反応による治療報告者が開拓した触媒の反応場を生物学的、工学的、あるいは有機合成的に拡張することにより、重合反応が可能な革新的触媒を開発する。まずは細胞を用いて検討する。さらにマウス内で遷移金属触媒をがん細胞に送り込んだ後、がん付近で官能基したモノマーの重合反応を行い、生理活性分子や薬剤ポリマー分子の生体内合成によるがん治療を試みる。(3)がんで発生するアクロレインの新規8員環重合反応による転移抑制報告者は、がん組織でmMレベルで異常発生するアクロレインは近傍の生体アミノアルコールやジアミンと反応し、中間体イミンを経由して8員環ポリマーを与え酸化ストレスを亢進させることを発見した。そこで、生理活性分子や薬剤候補分子にbis-アミノアルコール部位を導入したモノマーをがんモデルに導入し、がん組織付近で過剰に発生するアクロレインと効率・選択的に反応させる。その結果生じるポリマー分子によるがん治療を試みる。「Ru触媒によるがん付近での生理活性分子の重合反応による治療」に関するテーマにおいて、遷移金属触媒を用いた生理活性分子や薬剤の重合反応を検討したが、金属触媒の反応場の空間が小さいために、本年度に用いた系では効果的な反応を行うことができず一時的に研究を停止させた。そこで、当初予定していた令和1年の研究計画(がんで発生するアクロレインの新規8員環重合反応による転移抑制)に加えて、次年度に再度、反応場を生物学的、工学的、あるいは有機合成的に拡張することで重合反応に挑戦し、全ての計画を遂行する。
エピジェネティックな転写制御による新たな多発性骨髄腫の治療法の開発

多発性骨髄腫は大量化学療法を前処置とする造血幹細胞移植をもってしても治癒の期待できない難治な造血器腫瘍である。本疾患の治癒を目指した治療法を開発するためには、分子レベルでの詳細な病態を明らかにし、それらに基づく新たな治療法を開発する必要がある。本研究は、これまでにない骨髄腫細胞のエピジェネテイックな転写制御を基にした治療法を開発するために、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI)による治療の可能性について検討し、その分子作用機構の解明をも目的とする。HDACIを用いて種々の骨髄腫細胞の増殖抑制、アポトーシス誘導に及ぼす効果について検討したところ、HDACI活性を有するトリコスタチン(TSA)は種々の骨髄腫細胞株(U266,RPMI8226,IM9)および患者検体の増殖を濃度および時間依存性に抑制した。Propidium iodide (PI)を用いた細胞周期解析では、TSAは骨髄腫細胞を細胞周期G1期に停止させた。さらに、annexin Vを用いたFACSによる解析で、TSAは骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導し、その増殖を抑制した。興味深いことに、骨髄腫細胞の増殖に関与する転写因子NF-κBの発現誘導がTSAにより認められが、TSAによるNF-κBのアセチル化やIκ-Bのリン酸化は認められなかった。しかしながら、TSAとNF-κB阻害剤の併用により骨髄腫細胞のアポトーシスは相乗的に誘導された。以上の結果より、TSAによるNF-κBの活性増加はアポトーシス誘導による細胞死の結果としてのシグナル伝達の結果と考えられた。さらに、その分子機構を明らかにするために骨髄腫細胞の増殖分化に関与するJAK/STAT系、MAPキナーゼ系などの種々のシグナル伝達分子を検討したところ、TSAによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導にはAKTが関与することが明らかになった。すなわち、活性型AKT導入細胞ではTSAのアポトーシス誘導は阻害されず、野生型あるいはドミナントネガテイブ型AKT導入株では阻害された。今後、HDACIの臨床応用を目的にin vivoでの実験を継続する予定である。多発性骨髄腫は抗がん剤による化学療法では治癒の期待できない難治な造血器腫瘍である。本研究は、これまでに明らかでない骨髄腫におけるエピジェネテイックな異常を来たしている遺伝子群を明らかにし、新たな骨髄腫の病態解析を行う。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI)による治療の可能性について検討し、その作用機構の解明をも目的とする。本年度は、HDACIを用いて種々の骨髄腫細胞の増殖抑制、アポトーシス誘導に及ぼす効果について検討した。代表的なHDACIであるトリコスタチン(TSA)は種々の骨髄腫細胞株(U266,HS-sultan, RPMI8226,IM9)の増殖を濃度および時間依存性に抑制した。Propidium iodide(PI)を用いた細胞周期解析では、TSAは骨髄腫細胞を細胞周期G1期に停止させた。TSAによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導機構を解明するために、種々の細胞増殖や細胞周期に関与するタンパクの発現をウエスタンブロッテイングにて解析した。興味深いことに、骨髄腫細胞の増殖に関与する転写因子NF-κBの発現誘導が認められた。また、TSAによる処理にてNF-κBのアセチル化は確認できなかった。さらに、Iκ-Bのリン酸化も認められなかった。NF-κBは骨髄腫細胞の増殖に必須な分子であるため、TSAにて増殖抑制をきたすにもかかわらず、発現が誘導される意義について今後さらに分子レベルで検討する予定である。また、次年度はTSA処理により変化する遺伝子群をcDNA microarray法を用いて解析し、さらに詳細な骨髄腫の病態やHDACIの作用機構について解析する予定である。

以上の結果より、TSAによるNF-κBの活性増加はアポトーシス誘導による細胞死の結果としてのシグナル伝達の結果と考えられた。さらに、その分子機構を明らかにするために骨髄腫細胞の増殖分化に関与するJAK/STAT系、MAPキナーゼ系などの種々のシグナル伝達分子を検討したところ、TSAによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導にはAKTが関与することが明らかになった。すなわち、活性型AKT導入細胞ではTSAのアポトーシス誘導は阻害されず、野生型あるいはドミナントネガテイブ型AKT導入株では阻害された。今後、HDACIの臨床応用を目的にin vivoでの実験を継続する予定である。
非放射性Thalliumの細胞内局在に関する電子顕微鏡的研究

心臓核医学の代表的放射性な診断用同位元素であるT1-201の心筋細胞内における分布を主として形態学的な面から検討した。T1は可溶性、拡散性の物質であり、電子顕微鏡による観察は困難だが、我々はVanadiumにより細胞内にT1の不溶性沈殿を得る方法を開発して、電子顕微鏡観察でRat心筋細胞内におけるT1の分布の時間経過に従った観察を行った。負荷後後期(2時間以降)では細胞内のmyofibrilへの分布は減少し、相対的にmitochondriaへの分布は微増傾向を示した。nucleusには早期、後期ともに一定量の分布を認めた。これら細胞内小器官への分布はコンピュータによる画像解析で定量され、併せて行われたradioisotopeであるT1-201の細胞内小器官への分布を遠心分離により定量したdataとよい相関関係を認めた。これらの結果は心筋細胞における結果であり、腫瘍核医学におけるT1-201の腫瘍細胞内での分布とは、細胞内小器官の存在比率が同一でないので同一視できない。結論として心筋細胞内でT1は広く分布するが、時間の経過に従いmitochondriaに相対的に集積する可能性が得られた。
歯肉間葉系幹細胞による象牙質硬組織の誘導・形成に関する挑戦的研究

本研究においては、象牙質などの歯牙硬組織形成能を有する間葉系幹細胞を歯肉組織から探索した。WistarRatより採取した歯肉組織より間葉系細胞を培養し、培養細胞中に数は少ないもののSTRO-1抗体陽性細胞が認められた。また、osteogenicdifferentiationの検索よりこのような細胞が硬組織形成能を有する事が認められた。以上の結果より歯肉由来間葉系幹細胞の存在が明らかとなり、また、このような細胞から将来的には歯牙硬組織形成細胞への分化の可能性が示唆された。本研究の目的は歯肉由来間葉系幹細胞から歯牙硬組織を誘導・形成させる新たな技法の確立を行うものである。すなわち、ラット歯肉組織から間葉系幹細胞マーカー(STRO-1)を用い幹細胞を分離、同定し、そのような細胞の硬組織形成能を以下の方法で探索した。歯肉組織における間葉系幹細胞の分離、同定:4、6または16週齢のWistar Ratの歯肉組織を採取し、F-12 HAM培地を用い、分離した線維芽細胞様細胞を用いて、蛍光免疫染色によりSTRO-1の発現をまたウェスタンブロッティング法によりSTRO-1タンパクの発現を確認した。幹細胞の多分化能の確認:分離した線維芽細胞様細胞を用いosteogenicdifferentiationならびにchondrogenic differentiationについて検索した。その結果、Wistar Ratより採取した歯肉組織より間葉系細胞を分離、培養し、分離した線維芽細胞様細胞中に数は少ないもののSTRO-1抗体陽性細胞が認められまた、STRO-1タンパクの発現が認められた。さらに、osteogenic differentiationの検索より、このような細胞がAlizarin Red染色やOsteopontin免疫染色で陽性所見がみられ、骨様組織の形成が確認された。また、chondrogenic differentiationの検索においては、トルイジンブルーでメタクロマジーを示す軟骨様基質の形成が認められた。以上本研究より、歯肉由来間葉系幹細胞の存在および硬組織形成能が明らかとなり、このような細胞から将来的には歯牙硬組織形成細胞への分化の可能性が示唆された。本研究の目的は歯肉由来間葉系幹細胞から象牙質を誘導・形成させる新たな技法の確立を行うものであり、平成23年度は以下の研究を遂行した。1.歯肉由来間葉系幹細胞の確認:10週齢のWistar Ratよりエーテル麻酔下で、上・下顎臼歯部より歯肉組織を切除し、凍結切片およびホルマリン固定パラフィン切片を作成し、間葉系幹細胞マーカーであるSTRO-1抗体を用い免疫組織化学的に検索した。その結果、数は非常に少ないものの歯肉組織にSTRO-1抗体陽性細胞が認められた。2.歯肉由来間葉系幹細胞の樹立:10週齢のWistar Ratよりエーテル麻酔下で、上・下顎臼歯部より歯肉組織を切除し、PBS中で無菌的に細切後、MF-start medium中で培養した。培養後1週目の細胞を用い、間葉系幹細胞マーカーであるSTRO-1抗体を用い免疫組織化学的に検索した。その結果、少ないものの培養細胞中にSTRO-1抗体陽性細胞が認められた。また、細胞増殖活性の検索より増殖活性が明らかになった。また、osteogenic diiferentiationの検索より一部の細胞が硬組織形成能を有する事が認められた。以上の結果より歯肉由来間葉系幹細胞の存在が明らかとなり、またこのような細胞がin vitroで増殖活性を持つことが明らかとなり、このような細胞から硬組織形成細胞への分化の可能性が示唆された。当初の研究計画では平成23年度において、歯肉由来間葉系幹細胞の樹立およびTGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験を行う予定であったが、間葉系幹細胞マーカーであるSTRO-1抗体を用いた歯肉由来間葉系幹細胞の同定にかなり時間がかかり、TGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験は次年度に繰り越しになってしまった。今後の研究計画として昨年度より持ち越したTGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験を含め以下のような実験計画で行う。1.TGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験2.生体内での硬組織誘導実験:平成23年度に作成した各グループ21日目の細胞をtrypsin処理により収集し、リン酸カルシウムScaffold(Skelite)に細胞を付着させ、24時間静置後、エーテル麻酔下で生後8週齢のwild-typeラットの背部皮下にScaffoldを埋入し、埋入後2,4,6,8週目にScaffoldを摘出し以下の検索を行う。1)組織学的検索:摘出したScaffoldを4% paraformaldehydeで固定し、10%EDTAにて脱灰後、通法に従いパラフィン切片を作成しHE,AZAN,EVG,TRAPなどの染色を施し、基質形成を中心に組織学的に検索する。また、一部のサンプルは凍結切片作成に用いる。

2)免疫組織学的検索:上記のパラフィン切片あるいは凍結切片を用い、象牙芽細胞マーカーに対する1次抗体を用い、細胞の形質発現および産生された細胞外基質の性状を検索する。3)電顕的検索:一部のScaffoldは2%glutaraldehyde固定後、未脱灰のまま通法に従いSEMおよびTEM観察を行い、細胞および基質の微細構造を検索する。4)RT-PCRによる遺伝子発現の検索:一部のScaffoldは粉砕後、TRIZOLを用いRNAを抽出し、象牙芽細胞マーカーの発現をGAPDHを基準に検索する。平成23年度の実験において、間葉系幹細胞マーカーであるSTRO-1抗体を用いた歯肉由来間葉系幹細胞の同定にかなり時間がかかり、TGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験は次年度に繰り越しになってしまった。そのため次年度に使用する予定の研究費が生じた。次年度においては、繰り越したTGC-CMによる幹細胞の象牙芽細胞への分化実験および当初の生体内での硬組織誘導実験を遂行する予定であり、繰り越した研究費は次年度の研究費と合わせ、これらの実験に必要な試薬類消耗品などに使用する計画である。
ナノ反応場制御に基づくジアルキル多環芳香族炭化水素の選択的生成・分離

多環芳香族炭化水素は石油重質留分、タールサンドおよび頁岩油に大量に含まれ、未利用資源の有効活用の観点から、その高度利用は今後の重要な課題と考えられる。特定の位置にアルキル基を有する芳香族炭化水素、例えば2,6-ジアルキルナフタレンは極薄絶縁膜あるいは耐熱性有機材料の原料として極めて有効であるため、その効率的製造法の確立が強く望まれている。これに応えるためには、選択的アルキル化反応条件の探索、ジアルキル多環芳香族異性体の効果的分離法の開拓が必要であろう。本研究においては、合成雲母の一種であるフッ素四ケイ素雲母(マイカ)を母材としてピラー導入量を制御しつつアルミナ架橋マイカを調製し、それらへのかさ高い色素分子の吸着特性を調べることによりアルミナ架橋マイカの細孔構造の検討を行った。その結果、クリスタルバイオレットに対して分子ふるい的挙動が観測されたことから、アルミナ架橋マイカのピラーは比較的均一に分布し、そのピラー間隔は簡単なモデルによって推定できることが明らかになった。また、アルミナ架橋マイカを触媒として、ナフタレンのt-ブチル化反応を行い、2,6-ジ-t-ブチルナフタレンの生成反応における選択性と、吸着における選択性との間には明瞭な相関関係が存在することを明らかにした。さらに、ジアルキルナフタレン異性体の中から、2,6-体を分離するために、種々のジアルキルナフタレンのチオ尿素付加反応の平衡定数を測定し、チオ尿素付加法による2,6-体の分離シミュレーションを検討した。多環芳香族炭化水素は既存の有機資源や石油精製プロセスなどの副生物に大量に含まれいるが,その高度利用は,未活用資源の有効利用の観点から,これからの触媒・化学プロセスの重要な課題の一つである。本研究は,分子サイズの異なる種々のアルキル多環芳香族の選択的生成・分離に関する基礎的知見を得ることを目的に,(1)細孔径および酸性質を制御した架橋粘土触媒を調製し,(2)架橋粘土触媒による選択的アルキル化条件の検索,(3)分子錯体形成試薬を用いるアルキル多環芳香族の分離法の開拓を企図している。本年度は本研究の開始年度あたり,主として架橋粘土の調製とそのキャラクタリゼーションを行った。1.架橋粘土触媒の調製に関する検討架橋粘土の母材には酸性質の異なるフッ素四ケイ素雲母とモンモリロナイトを用い,イオン交換法によってアルミニウム多核水酸化物カチオンを粘土層間に導入した。調製した架橋粘土は主としてミクロ孔を有するが,細孔径分布は導入されるイオンの均一性と導入量に影響されることを,ガス吸着法および分子径の異なる有機分子をプローブとした吸着の観察から見いだした。これは,前述の二つのパラメータによってミクロ孔の分布が制御される可能性を示唆するものであり,さらに具体的な検討を続ける計画である。2.分子錯体形成試薬による分離の検討異なる種類のアルキル基を有するジアルキルナフタレンのチオ尿素付加性を,付加反応の平衡定数を測定することによって検討した。チオ尿素は2および6位にアルキル基を有するナフタレンと付加物を形成するが,その安定性はアルキル基の嵩高さと対称性に依存し,対称性がよく,二つのアルキル基の嵩高さが類似しているほど,付加性に富むことが明らかになった。多環芳香族炭化水素は,化石エネルギーに代表される有機資源に大量に含まれており,その高度利用は,未活用資源の有効利用の観点から,これらの触媒・化学プロセスにおける重要な課題である。本研究は,アルキル多環芳香族の選択的生成・分離に関する基礎的知見を得るために,(1)細孔経および酸性質を制御した架橋粘土触媒を調製し,(2)架橋粘土触媒による選択的アルキル化条件の検索,(3)分子錯体形成試薬を用いるアルキル多環芳香族の分離法の開拓を企図している。

本年度は,主として架橋粘土の調製とそのキャラクターリゼーション,およびアルキル多環芳香族の分離について検討を行った。1.架橋粘土触媒の調製に関する検討架橋粘土の母材にはナトリウム型フッ素四ケイ素雲母を用い,イオン交換法によってアルミニウム多核水酸化物カチオンを粘土層間に導入した。架橋粘土の細孔構造は層間に導入される多核カチオンの量に強く依存するので,その制御は極めて重要である。イオン交換時に,酢酸アンモニウムあるいはアンモニアを添加すると多核カチオンの導入量は増大するが,一方,多価の金属カチオンを共存すると多核カオチンの導入量は減少することが認められた。このことは,多核イオンの電荷制御,あるいは共存カチオンとの競争的な交換反応が導入量の調節に有効であり,架橋粘土のミクロ細孔経分布が制御される可能性を示唆している。2.分子錯体形成試薬による分離の検討ジアルキルナフタレンのチオ尿素付加性を,付加反応の平衡定数を測定することによって検討した。チオ尿素は2および6位にアルキル基を有するナフタレンと選択的に付加物を形成するので,平衡定数を用いて、2,6-ジアルキルナフタレンの分離に関するシュミレーションを行い,付加物形成の条件と回収率および純度との関係を明らかにした。多環芳香族炭化水素は石油重質留分,タールサンドおよび頁岩油中に大量に含まれ,未利用資源の有効活用の観点から,その高度利用は今後の重要な課題と考えられる。本研究では,(1)多環芳香族炭化水素を対象とする選択的アルキル化触媒の開発,および(2)生成したアルキル多環芳香族異性体の効率的分離法の開拓に関する基礎的知見を得ること目的としている。本年度は,架橋粘土鉱物の嵩高い分子対する新規な分子篩いとしての可能性を検討し,分子錯合体形成試薬によるジアルキルナフタレンの分離について総括した。1.架橋粘土鉱物の新規分子篩いとしての可能性:二,三の色素分子に対する吸着挙動を調べたところ,メチレンブルーは吸着可能であったが,クリスタルバイオレットに対しては架橋粘土鉱物が分子篩いとして作用することを見いだした。また,架橋粘土鉱物に気相からアルキルナフタレン類を吸着させたところ,吸着質のアルキル基が嵩高いほど吸着速度と吸着量が制限されることが観測された。これらのことから,架橋粘土鉱物は色素およびアルキルナフタレン類のような嵩高い分子に対して,分子篩い的な挙動を示すことが明らかになった。2.分子錯合体形成試薬によるジアルキルナフタレン類の分離:2,3-ジメチルナフタレン,2-メチル-7-1-ブチルナフタレンおよび種々の2,6-ジアルキルナフタレンのチオ尿素付加反応を行い,室温付近における平衡定数,反応熱.付加物の組成などを明らかにし.チオ尿素付加法によってこれらのジアルキルナフタレンを効率的に分離するための基礎的データを蓄積することができた。
電気スイッチによる微生物の代謝制御：その基礎と応用

本研究ではShewanella oneidensis MR-1株をホストとし、電気スイッチ(電位依存性プロモーター)を利用した新規物質生産系の確立を目指して研究を行っている。本年度は上記の目的の達成のため、下記の3つの解析を行った。1つ目はNADH脱水素酵素の電位依存性の解析である。MR-1株はゲノム上に4つのNDHを持ち、電子受容体によって異なるNDHを利用することが予想されるが、その詳細は明らかになっていない。そこで各NDH三重破壊株を作製し、様々な電子受容体存在下で培養してその形質を解析した。その結果、電子受容体の酸化還元電位に依存してNDHの寄与率が変化することが明らかになった。過去の研究から、MR-1株はArc systemと呼ばれる3成分制御系が細胞外に存在する電子受容体の酸化還元電位の変化を認識し、異化代謝系遺伝子の発現を制御することが明らかになっている。そこでArc systemのresponse regulatorであるArcAとNDH遺伝子上流領域との相互作用解析を行ったところ、3つのNDHの発現がArcAに依存していることが示された。2つ目はNaCl濃度依存性の解析である。電気培養条件では電解質として1%の濃度でNaClを添加する必要があり、淡水域で単離されたMR-1株には負荷になる可能性がある。一方でMR-1株は海洋性細菌が保持するNa+ポンプ活性を示すNDHを持つため、高Na+濃度条件下ではこれを利用して代謝を行う可能性がある。そこで様々なNaCl濃度条件でNDH三重破壊株を作製し、その形質を解析した。その結果、高NaCl濃度条件ではNa+ポンプ活性を持つNDHのみが機能していること明らかになった。この結果はMR-1株が海洋性細菌と同様のエネルギー保存機構を備えていることを示唆する。3つ目は電気スイッチの創生である。昨年度までに得られた知見を基に、NDHの一つであるnuo上流域から他の発現制御因子の結合領域を除いた改変プロモーターを作製した。当初の計画通り、NADH脱水素酵素(NDH)の一つであるnuo上流域の改変プロモーターを作製し、電極電位依存的な遺伝子発現制御機構(電気スイッチ)の構築を行った。また、電気スイッチ導入株を用いた実験から、目的遺伝子の発現は細胞内酸化還元バランスの変化に依存していることが示唆された。またMR-1株のArcAは大腸菌のArcA結合配列も認識することを明らかにした。この結果は既に大腸菌で同定されているArcAプロモーターをMR-1株に導入し、電気スイッチとして利用できることを示唆する。これらに加えて、MRー1株が異なる電子受容体(酸化還元電位)に依存して、いくつかのNDHを使い分けることを明らかにした。NDHはMR-1株が低電位電極から受けとった電子(還元力)を細胞内に伝達するための鍵酵素であり、これらの発現制御機構等の解明は電気化学活性細菌の電子受容能力の向上に寄与すると考えられる。よって今年度の研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度の研究により、多くの知見が集積されている大腸菌ArcAプロモーターをMR-1株に適用できることが明らかになった。そこで次年度はこれらプロモーターを利用することにより、高活性でかつON、OFFが明確な改変プロモーターの作製を目指す。またMR-1株の電子受容能力向上のための基礎的な知見が得られたことから、次年度は遺伝子破壊株を用いてより詳細に解析を行い、電子受容条件で機能するNDHを同定する。その後、同定した遺伝子の発現を制御することで電子受容能力の向上を目指す。これらを組み合わせることでMR-1株をホストとした新規物質生産系の構築と高効率化を目指したい。本研究ではShewanella oneidensis MR-1株をホスト菌株に用いて、電極電位による遺伝子発現制御系(電気スイッチ)と物質変換に必要な還元力を電極から供給する微生物電気合成(MES)を組み合わせた新規物質生産法を構築することを目的とした。MR-1株をMESのホストとして利用するための基礎的知見を得るため、今年度は以下の3つの解析を行った。1つ目はエネルギー獲得経路の電極電位依存性の解析である。これまでにMR-1株がArc systemを介して電位依存的にエネルギー獲得経路を切り替えることは示されていたが、Arc systemのsensorkinaseであるArcSが活性化される電位は不明であった。そこで複数の電極電位条件(+0.5 V, +0.2 V, 0 V)でMR-1株を培養し解析を行った結果、0 +0.2 VでArcSが活性化されることが示唆された。2つ目はArc systemのresponse regulatorであるArcAの結合配列の同定である。Arc system依存的に電位応答を示した遺伝子の上流領域を解析した結果、複数のArcA結合領域を見出し、さらに複数のArcA結合領域を並べることでプロモーター活性を増強できることが示唆された。3つ目はMESにおけるMR-1株へのエネルギー供給経路の構築である。これまでにMESにおいてMR-1株へエネルギー(ATP)を供給する経路は構築されていなかった。そこで電極を電子供与体、酸素を電子受容体とした条件で培養し、菌体増殖を調べた。その結果、非電位印加条件と比べて電位印加条件において有意に菌体量が増加した。このことからMR-1株は電極から電子を受容し酸素還元を行う過程でエネルギーを保存しATPを生産できることが示された。

またMR-1株はカソード表面で発生する水素を酸化し、アノードへ電子を伝達する過程で同様にATPを生産することを明らかにした。当初の計画通り、複数の電極電位におけるMR-1株のエネルギー代謝経路を同定し、ArcSが活性化され代謝経路の切り替えを行う電極電位を推定した。またいくつかの電位応答性遺伝子上流のArcA結合配列周辺には酸素を認識し転写制御を行うEtrAの推定結合配列が見出され、これらの遺伝子の発現はArcAとEtrAによって協調的に制御されていることが示唆された。さらにプロモーター解析によってArcAが2箇所の結合配列に結合すると1箇所の場合よりも転写制御が強固になることが明らかになった。これらに加えてMR-1株が電極から供給される電子もしくは電極表面で発生する水素をエネルギー源として利用できることを見出した。この発見によりMESプロセスにおいてATP依存的な反応の進行が可能であることが示され、MR-1株において広範囲な物質の生産が可能であることが示唆された。以上の研究成果はMR-1株をMESのホストとして利用する上で非常に重要な知見である。よって今年度の研究は当初の計画以上に進展していると考える。本研究ではShewanella oneidensis MR-1株をホストとし、電気スイッチ(電位依存性プロモーター)を利用した新規物質生産系の確立を目指して研究を行っている。本年度は上記の目的の達成のため、下記の3つの解析を行った。1つ目はNADH脱水素酵素の電位依存性の解析である。MR-1株はゲノム上に4つのNDHを持ち、電子受容体によって異なるNDHを利用することが予想されるが、その詳細は明らかになっていない。そこで各NDH三重破壊株を作製し、様々な電子受容体存在下で培養してその形質を解析した。その結果、電子受容体の酸化還元電位に依存してNDHの寄与率が変化することが明らかになった。過去の研究から、MR-1株はArc systemと呼ばれる3成分制御系が細胞外に存在する電子受容体の酸化還元電位の変化を認識し、異化代謝系遺伝子の発現を制御することが明らかになっている。そこでArc systemのresponse regulatorであるArcAとNDH遺伝子上流領域との相互作用解析を行ったところ、3つのNDHの発現がArcAに依存していることが示された。2つ目はNaCl濃度依存性の解析である。電気培養条件では電解質として1%の濃度でNaClを添加する必要があり、淡水域で単離されたMR-1株には負荷になる可能性がある。一方でMR-1株は海洋性細菌が保持するNa+ポンプ活性を示すNDHを持つため、高Na+濃度条件下ではこれを利用して代謝を行う可能性がある。そこで様々なNaCl濃度条件でNDH三重破壊株を作製し、その形質を解析した。その結果、高NaCl濃度条件ではNa+ポンプ活性を持つNDHのみが機能していること明らかになった。この結果はMR-1株が海洋性細菌と同様のエネルギー保存機構を備えていることを示唆する。3つ目は電気スイッチの創生である。