hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
LIMキナーゼによるアクチン細胞骨格の制御機構の解明

細胞外刺激に感応した細胞骨格系のダイナミックな再構築は、細胞の形態変化、運動、分裂など細胞の基本活動において重要な役割を果たしているが、その応答機構の多くは不明である。本研究では、私達が同定した新規プロテインキナーゼ、LIMキナーゼ(LIMK1,LIMK2)及びその類縁キナーゼであるTESKのシグナル経路を中心として、アクチン細胞骨格の再構築を制御する分子機構の解明を目的として、以下の成果を得た。1.LIMK1のLIMドメインは、キナーゼドメインと分子内相互作用によって、LIMK1のキナーゼ活性を負に制御していることを明らかにした。2.LIMKはRacだけでなく、Rhoの下流で活性化されること、ROCKによってキナーゼドメイン内のThr-508(LIMK1)、Thr-505(LIMK2)がリン酸化され活性化されることを明らかにした。3.TESK1はLIMKと同様にコフィリンをリン酸化し、アクチン骨格の再構築を誘導することを見い出した。TESK1は、インテグリンシグナルによって活性化されることを見い出した。4.ハエのLIMKを同定し、アクチン再構築を促進することを見出し、LIMK経路が無脊椎動物においても保存されていることを明らかにした。5.小脳顆粒細胞の神経軸索の形成および脊髄後根神経節細胞のセマフォリンによる突起退縮において、LIMKによるコフィリンのリン酸化が重要な役割を果たしていることを解明した。これらの成果は、LIMK/TESK経路が細胞骨格の制御を介して多くの細胞機能に重要な役割を果たしていることを明確に示している。今後はこれらの成果に基いて、LIMK/TESK経路の時間的空間的制御機構ならびに細胞の形態と運動性の制御におけるLIMK/TESK経路の役割を解明することが重要である。LIMキナーゼは、分子内にLIMドメインをもつ新規プロテインキナーゼである。我々は、LIMキナーゼが低分子量GTPaseであるRacの下流で活性化され、アクチン脱重合因子コフィリンのリン酸化を介して、アクチン骨格の再構築を制御していることを明らかにした。本研究では、LIMキナーゼの分子内相互作用による活性制御機構および上流キナーゼ(特にROCK)によるリン酸化による活性制御機構を解明することを目的とし、以下の結果を得た。1)LIMキナーゼの限定分解や、変異体のキナーゼ活性の測定、in vitro結合実験などの結果から、LIMドメインは、キナーゼドメインと分子内で直接相互作用することによって、LIMキナーゼの活性を負に制御していることが推定された。細胞内ではLIMドメイン結合蛋白質が活性化因子として機能している可能性が考えられる。2)LIMキナーゼの神経突起伸展・退縮における機能を明らかにするため、NlE-115神経芽細胞に野生型、ドミナントネガティブ型LIMキナーゼを導入した。その結果、ドミナントネガティブ型は、血清や活性型Rhoによる突起退縮を阻害した。LIMキナーゼは、Racだけではなく、Rhoの下流因子として神経突起の退縮にも関与することが推定された。3)Rhoの下流で働くセリン/スレオニンキナーゼROCK(Rho-kinase)により、LIMキナーゼのキナーゼドメイン内のThr-508が特異的にリン酸化され、活性化されることを見い出した。

本研究では、私達が同定した新規プロテインキナーゼ、LIMキナーゼ(LIMK)、及びその類縁キナーゼであるTESKのシグナル経路を中心として、アクチン細胞骨格の再構築を制御する分子機構の解明を目的として、以下の研究成果を得た。1.LIMK1はRacの下流因子PAKおよびRhoの下流因子ROCKにより活性化されることが知られているが、本研究において、LIMK2も同様にPAKとROCKによってThr-505のリン酸化によって活性化されることを明らかにした。また、LIMK2がコフィリン/ADFのリン酸化を介してストレスファイバーや膜泡の形成や接着斑の形成に関与することを明らかにした。2.TESK1はLIMKと同様にコフィリンのSer-3をリン酸化し、細胞に高発現させると、ストレスファイバーの形成、接着斑の形成などアクチン骨格の再構築が誘導されることを見い出した。TESK1はLIMKとは異なり、ROCK、PAKによって活性化されないが、インテグリンシグナルによって活性化されることを見い出した。3.ハエのLIMKを同定し、アクチン再構築を促進することを見出し、LIMK経路が無脊椎動物においても保存されていることを明らかにした。4.脊髄後根神経節細胞のセマフォリンによる突起退縮において、LIMKによるコフィリンのリン酸化が重要な役割を果たしていることを解明した。これらの成果は、LIMK/TESK経路が細胞骨格の制御を介して多くの細胞機能に重要な役割を果たしていることを明確に示している。今後はこれらの成果に基いて、LIMK/TESK経路の時間的空間的制御機構ならびに細胞の形態と運動性の制御におけるLIMK/TESK経路の役割を解明することが重要である。
異環境生物のエネルギー

この研究では、異常な環境に生息する微生物が工夫/改変して持つ独特のエネルギー転換系の構造と作動機作を解明することと、これを通して常環境の生物のエネルギー転換系についての理解を深めることを目的とした。本年度研究結果抜粋:高度好塩性細菌ハロバクテリアの新種からバクテリオロドプシン(bR)とも、前年度に発見のアーキロドプシン(aR)とも異なる光駆動H^+ポンプを同定し、アーキロドプシンー2と命名した。この新レチナールタンパク質の遺伝子をクローン化して、DNA塩基/アミノ酸配列を決めたところ、bRとの相同性は60%弱、aRとは90%弱であり、3者で特にH^+の通路を形成するC、F、Gの3本のヘリックスのアミノ酸の保存度が高かった。これらの結果からポンプタンパク質の必須立体構造についての多くの重要な示唆を得た。さらにATPアーゼ遺伝子をクローン化して、主2サブユニットのDNA塩基/アミノ酸配列を決定した。この配列は前年度に決定した好酸好熱性古細菌スルホロブスとメタン産生古細菌のATPアーゼ、および液胞のV型ATPアーゼのいずれのアミノ酸配列とも相同性が高く、ミトコンドリアのF型ATPアーゼのそれとは低くて、初年度に免疫交差反応で得た新知見が確証された。スルホロブスATPアーゼでは同一オペロン内の全遺伝子のDNA塩基/アミノ酸配列を決定し、ホロ酵素が、少なくとも膜内に1種、膜上に5種のサブユニットを持つと推定した。好酸性鉄酸化細菌から、前年度に同定したpH3を至適とするCyt552と対となる酸化酵素を精製して酵素化学的性質を精査し、この酵素が従来の予測とは逆のペリプラズマ側で機能していると推定した。植物液胞膜からH^+輸送性で73kDaのピロフォスファターゼを初めて単離精製した。この酵素は分子量、抗原性等で従来知られたものと異なることを見出した。これらの結果は極めて斬新なものである。
カーボンナノチューブを利用した自己集合型・腫瘍特異的超音波造影剤の開発

本研究計画では、良好な腫瘍集積性を示す薬物輸送担体として着目されており、かつ超音波造影効果を有することが知られている「多層カーボンナノチューブ(MWCT)」を母体化合物として選択し、腫瘍特異性、超音波造影能の増強および毒性低減を同時に達成するため、腫瘍に高発現している酵素により認識・切断を受けることで、腫瘍特異的に自己集合能を獲得する部位を付与した、MWCT誘導体を設計・合成し、新たな腫瘍特異的超音波造影剤としての有用性を検証を行う。自己集合を促す酵素としては、様々ながんで高発現することが知られている、furin、線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP-α)、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ(γ-GGT)の三種類を選択した。それぞれの酵素で認識・切断された後にシステイン残基を露出するペプチド配列、およびコントロールとして酵素によって切断されないペプチド配列を設計し、合成に着手した。また自己集合するためのモチーフとしては、酵素により切断された後のシステインを認識する部位(CABT)を挿入するが、このCABTを設計し、合成を行った。最終的には一つのカーボンナノチューブに対して、酵素により認識されるペプチド配列および自己集合するためのCABTを結合した分子を合成する予定である。また合成された分子の評価を行うために放射性ヨウ素標識を行う予定であるが、その標識部位としてD体のチロシンもカーボンナノチューブに結合した分子を設計した。化合物の合成に手間取っているため、当初の予定よりも進行は遅れている。化合物の合成を鋭意進めて、評価実験へと進む予定である。金額調整をしなかったため、わずかな残額が生じた。
ナノ分極型高選択反応性電極の創製

本研究では、電気化学セルが生成する活性酸素の驚異的に高い酸化力に着目し、酸素の活性化過程を理解するとともに、電気化学セルをナノサイズ化することによって、その酸化力を触媒反応に利用することを試みる。ターゲットとする反応は、ガソリン排ガスでの炭化水素燃焼であり、最終的な目標は貴金属をできるだけ使用せず、炭化水素を200°C以下で低温燃焼することである。具体的な手法として、プロトン導電体粒子に電極触媒クラスターを担持した局所電池型ナノリアクターを設計することで、表面積を触媒レベルまで高めるとともに、外部電源を不要化する。結果として、この技術は新たな触媒材料の創製につながり、レアメタルなどの希少資源の供給問題を解決する有効なアプローチとして期待される。本年度は二つの研究を主に行った。一つは高酸素イオン導電体であるセリア系電解質の燃料極側表面にBaCeO_3薄膜を成長させ、それがもたらす二つの効果(セリウム還元抑制及びアノード材レス化)を評価した。もう一つは新しい中温作動(200-300°C)型プロトン導電体を開発し、燃料電池用電解質としての適用を検討した。セリア系電解質としてCe_<0.8>Sm_<0.2>O_<1.9> (SDC)を使用し、この片面にBaOスラリーをスピンコートし、90°C乾燥後に1400-1700°C焼成した。これを高温作動(600-950°C)型水素-空気燃料電池の電解質に使用し、(1)ニッケル-SDCサーメットアノードを取り付け、電解質の還元状態及び界面のオーミック・分極抵抗等を評価した、(2)アノード材を取り付けずに、(1)と同様な評価を行った。またプロトン導電体としてcubicSnP_2O_7及びIn^<3+>ドープSnP_2O_7に着目し、空気中でのプロトン導電率及び中温作動(150-300°C)型燃料電池発電特性等を評価した。セリア系表面を各種分光法でキャラクタリゼーションしたところ、どの焼成温度でもBCS膜とSDC基板が一体化していたが、焼成温度の上昇とともにBaの揮発によって外表面が次第にセリアリッチになっていた。このため、低温焼成ほどセリウムの還元が抑制されたが、高温焼成ほどオーミック・分極抵抗が小さくなるといった結果が得られた。このため、燃料電池作動温度により、焼成温度の使い分けが必要であることが判明した。またアノードレス化の検討から、本電解質がニッケル等の電極材を取り付けなくても内部抵抗が低く抑えられ、これまで報告されているアノードレス電解質の中でトップレベルの発電特性を発揮できることが見出された。またこの場合の電解質特性も上と同様な焼成温度依存性が確認された。CubicSnP_2O_7は乾燥空気中ではホール導電率が主であるが、水蒸気分圧とともにプロトン導電率が高くなることが分かった。またドーパントカチオンとしてはIn_^<3+>が有効であり、10mol%が最適ドープ量であった(プロトン導電率は250°Cにおいて1.9×10^<-1>S cm^<1->)。これを電解質に使用した燃料電池は、250°C・無加湿雰囲気であるにも関わらず開回路電圧が約900mV、最大出力密度が264mW cm^2に達するまでに至った。本年度は昨年度に引き続いてヘテロ界面制御に関する研究として二つの課題を行った。以下にそれら二つの研究成果の概要を示す。電解質/電極界面制御に関する研究においては、昨年度までに厚膜セリア電解質(電解質厚さ0.5mm)を試験試料に使用し、その表面にバリウムセレート膜(膜厚さ15μm)を成長させることによつて、燃料ガスに対するセリアの耐還元力を大幅に改善させることに成功した。本年度はこの手法をさらに薄膜セリア電解質(電解質厚さ数十μm)にも適用することを検討した。電解質にはガドリニウムドープセリア(GDC)、アノードにはニッケル-サマリウムドープセリア(Ni-SDC)、カソードにはストロンチウムドープサマリコバルタイト(SSC)を使用した。また還元抑制膜としてイットリウムドープバリウムセレート(BCY)を選択した。これら電解質、BCY、およびアノードをテープキャスティング法でそれぞれシート化して、アノード30枚、GDC1枚、BCY1枚、GDC1枚の順でそれらのシートを積層した。この積層体を1450°Cで焼結させ、アノード支持電解質薄膜を作製し、最後にカソードを焼付けた。その結果、この燃料電池は500-700°Cの温度領域で水素燃料によってほとんど還元されることなく、1V近い開回路電圧を発生するまでに至った。

また電解質のオーム抵抗もBCY層の挿入によって増大することがなかったため、電圧が高くなった分出力特性を向上させることが可能であった。またその他の特長として、この燃料電池は直接メタンSOFCや単室SOFCでも高出力密度を示すとともに、実用上十分な化学的安定性を有していることも判明した。新規プロトン導電体を使用した各種電気化学的デバイスの開発では、昨年度までにIn^<3+>ドープSnP_2O_7が無加湿の中温領域で高いプロトン導電率を示すこと、および燃料電池の電解質に適用した場合、最大出力密度が264mW cm^2に達することを報告した。今年度は本燃料電池の特長を活かしてアノードからのPtフリー化を試みた。遷移金属酸化物や炭化物などいろいろな材料を試験した結果、Mo_2CがPt並のアノード分極特性を示し、さらにこの燃料電池が十分高い出力特性を発揮できることも見出した。また、この電解質を使用して酸素過剰雰囲気下でのNOx分解リアクターとガスセンサーの開発も行った。両デバイスで作動極をPtRhBa/Cにした場合、分解反応の電流効率とガス検知の感度がともに最も高くなった。これはBa種が種々の雑ガスからNOxを選択的に吸着し、Rh種がPtのNOx分解反応を促したことに起因していた。ここで、一つの興味深い結果として、NOxガスセンサーがNOとNO2に対してともにポジティブ方向に起電力応答した点である。これは本ガスセンサーがYSZを使用したNOxセンサーと違ってトータルNOxを検知でき得ることを示唆している。昨年度までの研究で、In^<3+>をドープしたSnP207が無加湿の中温領域(150-350°C)で高いプロトン導電率を示し、電気化学デバイス(燃料電池、リアクター、ガスセンサー)の有望な固体電解質になり得るともに、これらのデバイスが中温作動の特長を活かして従来のものよりも特異な機能を持つことを報告してきた。具体的には、燃料電池において:(1)無加湿条件下で安定して放電すること、(2)PtアノードがCOに対して全く被毒されないこと、(3)Mo_2C-ZrO_2複合アノードが温度上昇とともにPtアノードと同レベルの水素酸化能を示すこと、またリアクターとセンサーにおいて:(1)中温領域になるとNOxが共存する大過剰O_2よりも選択的に電解質のプロトンと反応すること、(2)PtカソードにRhとBaを添加することでNOx分解の電流効率が数倍高まること、(3)その電極がNO_2だけでなくNOにもポジティブな混成電位を示すこと、などを見出した。今年度は、特に燃料電池とリアクターで中温作動のさらなる特長付けを検討した。まず燃料電池においては、非貴金属によるPtカソードの代替化、並びにジメチルエーテル(DME)を中心とした燃料多様性の評価を行った。またリアクターにおいては、電解質粒子表面上にナノサイズの局所電池を形成することで、NOx選択還元を高活性化する、新しい反応プロセスの開発に努めた。以下に得られた成果の概要を示す。・Pt代替カソードの開発では、正方晶ZrO_2がO_2還元反応に有効な触媒であった。そこで、前年度に見出されたPt代替アノードMo_2C-ZrO_2複合電極と組み合わせ、Ptフリー燃料電池を構成したところ、中温領域において良好な発電特性を示すことが分かった。・DME燃料電池の開発では、Pt-RuアノードがDMEの直接酸化反応に高い活性を示し、特に300°Cでは水素燃料に対する活性と同レベルであることが見出された。
超音波療法が腱組織コラーゲンの可溶性に及ぼす影響

本年度は,超音波療法が関節周囲の組織に及ぼす影響を検索する目的で実験を行った.実験動物として,正常ラットを用い,ラットのアキレス腱部に超音波照射を行い,その後の腱組織コラーゲン線維の可溶性変化を検討した.実験動物は8週齢のウイスター系ラット.超音波照射装置は日本メディックス社製・インタートロン6100を用いた.その結果,1.塩可溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する塩可溶性コラーゲンの割合は,非照射群と照射群間において有意差を認めなかった(p>0.05).2.酸可溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する酸可溶性コラーゲンの割合は,非照射群に比較し照射群が有意に増加した(p<0.05).3.不溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する不溶性コラーゲンの割合は,非照射群に比較し照射群が有意に減少した(p<0.05).4.不溶性コラーゲンのペプシン可溶化率:不溶性コラーゲンをペプシン処理し,可溶化したコラーゲンの割合は,非照射群と照射群間において有意差を認めなかった(p>0.05).以上の可溶性の変化に関する結果から,超音波照射により腱組織コラーゲンの可溶性は変化する可能性が示唆された.これにより,超音波照射はコラーゲン分子に形成される架橋結合に関しても影響を及ぼしていることが推察される.今後は関節拘後の腱組織に超音波照射を行い,コラーゲン線維の可溶性変化を検索し,正常とは異なる状態の組織に対する超音波療法の影響を検討する必要性があると考えられる.本年度は,超音波療法が関節周囲の組織に及ぼす影響を検索する目的で実験を行った.実験動物として,正常ラットを用い,ラットのアキレス腱部に超音波照射を行い,その後の腱組織コラーゲン線維の可溶性変化を検討した.実験動物は8週齢のウイスター系ラット.超音波照射装置は日本メディックス社製・インタートロン6100を用いた.その結果,1.塩可溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する塩可溶性コラーゲンの割合は,非照射群と照射群間において有意差を認めなかった(p>0.05).2.酸可溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する酸可溶性コラーゲンの割合は,非照射群に比較し照射群が有意に増加した(p<0.05).3.不溶性コラーゲン量:全コラーゲンに対する不溶性コラーゲンの割合は,非照射群に比較し照射群が有意に減少した(p<0.05).4.不溶性コラーゲンのペプシン可溶化率:不溶性コラーゲンをペプシン処理し,可溶化したコラーゲンの割合は,非照射群と照射群間において有意差を認めなかった(p>0.05).以上の可溶性の変化に関する結果から,超音波照射により腱組織コラーゲンの可溶性は変化する可能性が示唆された.これにより,超音波照射はコラーゲン分子に形成される架橋結合に関しても影響を及ぼしていることが推察される.今後は関節拘後の腱組織に超音波照射を行い,コラーゲン線維の可溶性変化を検索し,正常とは異なる状態の組織に対する超音波療法の影響を検討する必要性があると考えられる.
野生イネに潜む有用形質を支配する遺伝子の検出―野生種を利用した稲育種に向けて―

イネ野生種が持つ栽培種に存在しない有用遺伝子を検出するため、以下の実験を行った。まず、野生イネの材料としてミヤンマー由来のOryza rufipogon W630を用い、2種類の典型的な栽培品種(O. sativa Japonica cv. NipponbareおよびO. sativa Indica cv. IR36)で交雑し、それぞれ約200個体からなるBC_2戻し交雑集団を作成した。次に、これらを圃場に展開し、出穂期、最大光合成能、桿長、穂長、有効分げつ数、、種子100粒重、籾長、籾幅、玄米長、玄米幅、収量の11形質について調査した。BC_2集団は様々な形質を調査し終わる登熟期まで、葉を大量にサンプリングできなかったので、各BC_2自植後代約15系統の幼葉をまとめて回収しDNAを抽出した。これらのDNAは鋳型として調整し、マイクロサテライトマーカー座についての遺伝子型を調べるためにPCRを行った。なお、使用したマイクロサテライトマーカーは交配親間で多型がみられ、ほぼゲノムをカバーしている約75マーカーであった。11形質についてのデータならびに分子マーカー座の遺伝子型のデータをもとに、量的形質遺伝子座(QTL)解析を行ったところ、有意となった領域はNipponbare戻し交雑集団では55ヶ所、IR36戻し交雑集団では51ヶ所見出された。これらのうち、それぞれ半数強の領域において、野生種の対立遺伝子が各形質の計測値を増加させる効果を持っていた。2つの異なった栽培品種の遺伝的背景においては、野生種由来のQTLは6領域で共通していた。収量に関しては、第1染色体上の1領域で検出された野生種のQTLが両集団において収量を向上させる効果を持っていた。従って、この野生種由来のQTLは栽培イネのJaponicaおよびlndica双方において収量を向上させる効果を持つ可能性が示唆された。今年度、イネ野生種が持つ栽培種に存在しない有用遺伝子を検出するため、以下の実験を行った。まず、野生イネの材料としてミヤンマー由来のOryza rufipogon W630を用い、2種類の典型的な栽培品種(O.sativa Japonica cv.NipponbareおよびO.sativa Indica cv.IR36)で交雑し、それぞれ約200個体からなるBC_2戻し交雑集団を作成した。BC_2集団は様々な形質を調査し終わる登熟期まで、葉を大量にサンプリングできなかったので、BC_2植物自体からのDNA抽出は不可能であった。そこで、各BC_2系統についてそれぞれ自殖種子を15粒まき、幼苗期に葉をまとめて回収し、それらからDNA抽出した。なおこれ以外にDNAの抽出手法については、ごく少量の葉から簡単に抽出できる方法を、今後の実験に応用するために開発した。来年度はゲノム全体をほぼカバーする約100個のマイクロサテライトマーカーを用いて上記のBC_2自殖後代からのDNAを用いて、各BC_2個体における全ての分子マーカー座の遺伝子型を調べる。さらに、これらを形質についてのデータと比較し量的形質遺伝子座(QTL)解析を行う。これにより、野生種と栽培種間で違いのあらわれた様々な形質についてのQTLが同定でき、また同時に野生種に存在していた栽培種より優れたQTL遺伝子についても明らかにする計画である。
哲学的自然主義の可能性と限界

本年度は、おもに二つの問題にかんして研究を行った。初年度に研究を予定していた哲学的自然主義の定式化と、第二年度に研究を予定していた人間の自然主義的理解における中心的課題の一つである、意識の自然化である。これらの研究の成果は、本年度に東京大学に提出した博士学位論文「表象理論にもとづく現象的意識の自然化」としてまとめられている。本年度の具体的な研究成果は以下の通りである。まず、第一の哲学的自然主義の定式化にかんしては、上記学位論文の第一章において詳細な検討を行い、以下のことが明らかになった。哲学的自然主義とは、世界にはミクロ・マクロという階層構造が成り立ち、マクロな存在者のあり方はよりミクロな存在者のあり方によって必然的に決定されると考える立場である。ミクロ物理的な存在者を基礎としてあらゆる存在者を統一的に理解することを目指すのが哲学的自然主義なのである。第二に、意識の自然化にかんしては、上記学位論文の第二章以降において詳細な検討を行い、その結果次のようなことが明らかになった。われわれの意識経験はすべて一種の知覚、いいかえれば外的世界の表象として理解可能である。したがって、表象を自然主義的に理解することを手がかりとして、意識の自然化が可能になる。このような理論、すなわち意識の表象理論によれば、われわれが意識経験を有することは、われわれの脳が世界を表象することとして、自然主義的な世界観のなかで理解可能なのである。以上が本年度の研究成果であり、これらの研究成果は、さらなる検討を行ったのちに来年度以降研究論文などの形で発表を予定している。
ミクロスケールの化学ポテンシャル勾配を利用して駆動する両親媒性分子集合体

従来の化学プロセスがシステムの維持のためにマクロなポテンシャル勾配を必要とするのに対し、生物は等温系で化学反応から直接仕事を得て機能している。本研究では、等温系において化学走性機能を持つ分子集合体システムの創製にとって必要最小限の物理的要素の解明を目指す。そのモデル系として低pH領域に向かう両親媒性分子集合体を簡単な人工系で構築し、数理モデルを用いて化学走性が能動輸送機能に与える影響を検討する。また、分子集合体の周囲のpH勾配やpHを独立に変えることで、pH勾配下における分子集合体の自律運動に必要な駆動力の熱力学的な発生機構を理解する。このように、化学走性機能の解明と応用への知見を得る。
薬物による血清尿酸値変動機構の解明とその情報に基づいた評価系の構築

本研究は尿酸値を管理する新しい医薬品の創出に貢献し、また現在用いられている医薬品の適正使用を達成するために、尿酸値調節機構の解明、尿酸調節因子に対する既存薬物の影響解析、及び尿酸動態変動予測モデルの構築に取り組んだ。今年度は、尿酸値調節因子の一つである有機アニオントランスポーターOAT2(SLC22A7)の単離、及び機能解析を行い、尿酸値調節機構の一部を解明した。またOAT2を含め、尿酸値調節に働くトランスポーターの輸送機能に対するアンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)、利尿薬が及ぼす影響を検討し、これらの薬物による尿酸値変動は尿酸トランスポーターの輸送活性、あるいは発現量を変動させることに起因することを見いだした。また尿酸動態予測変動モデルとしてのラットの有用性について検討した。はじめにラットの尿酸値調節因子として働く2つのトランスポーターUrat1(Slc22a12)、Uratv1(Slc2a9)を単離、機能解析した。これらのトランスポーターの輸送特性はヒトのオルソログと近似していたが、尿酸及び薬物のこれらのトランスポーターに対する親和性はヒトと比較して低いことが明らかとなった。したがって、薬物の親和性の違いを考慮することによって、ヒトの尿酸動態変動予測モデルとしてのラットが有用であることを示唆することができた。実際にARBをラットに投与して尿酸動態変動を観察したところ、ヒトと同様にトランスポーターの活性を変動させることによって尿酸値が変動する結果が得られた。本研究によってヒトの尿酸値調節機構の一部が明らかとなり、また実験モデル動物としてのラットの有用性が示唆された。本成果は尿酸値を管理する医薬品の創出や、医薬品の適正使用に貢献する重要な情報となると考えられる。
ロボットと位置認識システムによる腫瘍追尾型の体幹部定位放射線治療の開発

体幹部の定位照射で問題となる呼吸性移動を自動的にロボットで予測して照射するトラッキング治療が新しい治療方法として期待される。ロボットとアモルファスシリコンディテクタを使った体幹部トラッキング照射について検証した。腫瘍の内部あるいは近傍に純金製のマーカを刺入する。一方、皮膚表面に発光ダイオードを貼り付ける。治療前に透視を行い、発光ダイオードの位置と金属マーカの位置関係を数式化しておく。透視にはアモルファスシリコンディテクタを使用しているためCCDカメラと異なり、体幹部でも金属マーカの位置確認が容易である。治療中は発光ダイオードの位置を連続してモニターし、前述の数式を利用して腫瘍の位置を評価する。アモルファスシリコンディテクタからのデータ取り込み、処理あるいはロボット制御のタイムラグがあるため、呼吸による動きを予測してロボットを制御する。本治療法の精度確認のためにQAツールを開発した。患者の呼吸および腫瘍の動きをコンピュータに取り込み、3次元で移動可能なボールに腫瘍と同じ動きをさせた。このボールを腫瘍に見立て、サイバーナイフによるトラッキング照射の精度を確認した。精度確認には照射筒の先端にCCDカメラを装着し、ボールの位置を連続的に取り込んだ。最初の設定位置との誤差がトラッキングによる照射の誤差となる。この誤差の累積値を評価した。3例の患者の呼吸状態でシミュレーションを行ったところ、治療中の90%は1例で誤差5mm以内、2例で誤差3mm以内の照射が可能であった。呼吸性移動があってもトラッキングによって補正が可能であり、極小照射野での体幹部定位照射が可能である。腫瘍の限局させ大線量を投与する3次元の原体照射が注目されている。この際、治療中の患者の動きを監視し、補正を行う事は放射線を局所に限局する意味で重要である。ロボットにリニアックを搭載し装置では従来のリニアックと比べて動きの自由度が大きい。治療中にX線透視で患者の位置認識を行い、患者の動きをロボットで自動補正する装置を使った転移性脳腫瘍の治療効果について評価した。その結果では約90%に腫瘍増大を抑制する効果を認めた。この効果は従来の他の装置とほぼ同様の効果であった。一方、脱毛以外の有害事象を認めていない。また従来の治療装置では適応が困難な頚部腫瘍に対しても定位放射線治療が安全に施行できた。重篤な有害事象も認めていない。胸部や腹部では呼吸などの動きを考慮する必要がある。呼吸移動の補正についてはいろいろな方法が考えられている。患者の呼吸を強制的に制限する方法、呼吸に同期させて照射のオン、オフを切りかえる方法、あるいは体内に刺入した金属をモニターし、一定の範囲内に入った時に照射を行う方法などである。最も理想的な方法は患者の動きに合わせて、装置を移動させ、連続的に照射を行う方法である。通常のリニアックでは患者の動きに合わせて動かすことはできない。しかし、ロボットにリニアックを搭載した装置であれば、患者の動きに合わせてロボットを移動させることが可能である。具体的な方法として、患者の体表面の動きを体表面に貼付した発光ダイオードによって数量化する。一方で、腫瘍内に金属マーカを刺入し、金属マーカを透視で確認する。腫瘍の位置と体表面の発光ダイオードとの関係を数量化する。これによって発光ダイオードの位置を評価することによって、腫瘍の位置を数量化することが可能となる。今後、この動態追跡についてのモデル実験によって動態予測の評価を行う。
セルロース繊維に蛋白質機能を付与する基盤技術開発

研究最終年度に当たる本年度は、抗体利用に特化した研究を進めた。昨年度の抗GFP VHH抗体の他に、抗RNaseA VHH抗体を用いた、抗RNaseA VHH-C Linkを新たに作製し、抗RNaseA VHH/紙ハイブリッドを作製した。これを用いてモデル抗原蛋白質RNaseA-EGFPに対して抗原捕捉性能を検討した。予想通り、抗GFP VHH/紙ハイブリッドと同様に安定した抗原捕捉性能を発揮することを確認した。これにより、VHH-C Link技術は、他の任意のVHH抗体への適用可能性が示唆された。また、昨年度作製した抗GFP VHH/紙ハイブリッドに関し、室温下での乾燥保管を56週間経た後でのEGFPの捕捉性能を確認し、当該手法が1年間を越えるVHH抗体の長期保管形態としてもVHH抗体の利用技術としても実用に耐えることを明らかにした。プロテアーゼ活性センサー技術に関しては、捕捉側を抗GFP VHH-C Linkとしたラテラルフローデバイスとし、サンプルパッド上にHRV-3Cプロテアーゼの切断配列を有するBAF-C Linkを付着させ、サンプルパッド上でのプロテアーゼ反応を試みた。その結果、プロテアーゼ反応とラテラルフローを併行させることは、高感度検出の観点から非効率的であることが判明した。試験管内でのプロテアーゼ切断反応と、その後のラテラルフロー検出の2段階構成が適当であると結論した。SARS3CLプロテアーゼのプロテアーゼ処理による成熟化に関しては、意図しない部分分解の問題は解決できず、今後の課題として残された。本年度は、4件の学会発表を行った。超耐熱性キチン/セルロース結合ドメイン(hCBD)を蛋白質機能のアダプターとして用いて、1)オリジナル技術の“hCBD-BAF/セルロース基材複合材"を活用したプロテアーゼ活性センサー技術を実用化レベルに高める、2)hCBDを介して“蛋白質機能"をバイオマス繊維基材に付与する成功事例を増やし、バイオマス繊維素材の高機能化技術としての汎用可能性を検討することを目的として当該課題を遂行した。1)に関しては、一般的な風邪ウィルスのプロテアーゼであるHRV-3Cを対象とした予備研究から抽出された、プロテアーゼセンサー技術の最大課題である、セルロース基材からのセルロース繊維の脱落に依存する、発光活性の高いバックグラウンド軽減の取組を市販セルロース基材製品から、ベターな製品を選択するに至った。また、風邪ウィルスよりも社会的な訴求性があるSARSコロナウィルスを対象としたプロテアーゼ活性の検出系の検討のため、SARS-3CLプロテアーゼの大腸菌での発現と精製を開始し、プロテアーゼ活性の確認には至っていないものの、概ね順調に進めることができた。2)に関しては、ストレプトアビジン(SA)派生体を最初の候補蛋白質として考え、Strep-tagIIを有する“蛋白質を選択的に捕捉する紙"の開発を狙ったが、hCBD-SA派生体融合蛋白質の大腸菌発現が不調であり、当該課題解決に難航している。劇的な改善の見通しが立たないため、当該年度途中に当初次年度計画に想定していた“hCBDを介して紙素材に抗体を選択的に固着させる取り組み"を前倒しして開始した。これまでのところ、概ね順調に進められている。研究1)に関しては、予備的研究からプロテアーゼ反応条件下での激しい振盪によるセルロース繊維の濾紙からの脱離に依存する、高いバックグラウンドの問題があり、激しい振盪条件下でもhCBD-BAF/紙複合材から繊維脱落を最小にするセルロース素材の選定を進めた。その結果、年度末に漸く市販の製品サンプルから、適当な紙素材を見出すに至った。また、同素材の最適化を進めつつ、大腸菌におけるSARS-3CLプロテアーゼの安定発現系と精製系の構築を併行して検討した。先行文献(Akaji K et.al., Bioorg. Med. Chem., Vol 16, 9400-9408, 2008)を参考にしたが、大腸菌内での発現用融合タグや蛋白質発現条件の違いがあり、ほぼ一からの検討となった。結果として、可用性画分からの精製が可能で、収量も期待出来ることが判明した。一方で、精製度合を何処まで上げるか、と発現用タグを切り離した際の実際のプロテアーゼ活性の確認は、次年度の課題として残された。研究2)に関しては、SAm2の人工遺伝子合成から検討し、当初hCBD-SAm2の大腸菌での発現量が僅かであったため、SAm2に該当する塩基配列を複数検討することとなった。予想よりも難航する可能性が危惧されたため、次年度の計画を一部前倒しして、hCBDを介して抗体をセルロース基材へ吸着・利用する課題検討を併行して開始した。最終目標は、市販のIgG抗体を広く利用可能な基盤技術開発であるが、差し当たり、特定の抗原に対する抗体分子を直接hCBDに融合利用する検討を進めた。抗体としては、ラクダ抗体に由来するナノボディで、緑色蛍光蛋白質・GFPに特異結合してGFPの蛍光輝度を上げる抗体を試した。予想以上に順調であり、当該抗体/濾紙ハイブリッドを乾燥保存させた後にも抗体活性が十分維持されることを確認した。これを用いてモデル

抗原蛋白質RNaseA-EGFPに対して抗原捕捉性能を検討した。予想通り、抗GFP VHH/紙ハイブリッドと同様に安定した抗原捕捉性能を発揮することを確認した。これにより、VHH-C Link技術は、他の任意のVHH抗体への適用可能性が示唆された。また、昨年度作製した抗GFP VHH/紙ハイブリッドに関し、室温下での乾燥保管を56週間経た後でのEGFPの捕捉性能を確認し、当該手法が1年間を越えるVHH抗体の長期保管形態としてもVHH抗体の利用技術としても実用に耐えることを明らかにした。プロテアーゼ活性センサー技術に関しては、捕捉側を抗GFP VHH-C Linkとしたラテラルフローデバイスとし、サンプルパッド上にHRV-3Cプロテアーゼの切断配列を有するBAF-C Linkを付着させ、サンプルパッド上でのプロテアーゼ反応を試みた。その結果、プロテアーゼ反応とラテラルフローを併行させることは、高感度検出の観点から非効率的であることが判明した。試験管内でのプロテアーゼ切断反応と、その後のラテラルフロー検出の2段階構成が適当であると結論した。SARS3CLプロテアーゼのプロテアーゼ処理による成熟化に関しては、意図しない部分分解の問題は解決できず、今後の課題として残された。本年度は、4件の学会発表を行った。Strept-tagとストレプトアビジンを利用した系の検討が行き詰まったため、戦略を一部変更し、hCBDを介して紙素材に抗体を選択的に固着させる試みを実施した。検討は2系統で進めた。即ち、ペプチドタグと従来のIgG抗体を利用する試みと、アルパカ由来の抗GFP VHH抗体を用いる試みである。前者は未だ途上で明確に良好な結果は得られていないが、後者は予想以上に優れた結果に結実しつつある。研究代表者は、VHH抗体とhCBDを融合した新規人工蛋白質をVHH-C Linkと命名した。抗GFP VHH抗体を用いた抗GFP VHH-C Linkに関して、当該VHH-C Link/濾紙ハイブリッドを作製し、室温下での長期に渡る乾燥保管後のEGFPに対する当該VHH抗体の抗原結合性能を検討し、7ヶ月以上の保管後も十分なVHH抗体の抗原結合性能を安定保持することを確認した。使用した抗GFP VHH抗体は、EYFPよりもEGFPへの結合親和性が高く、また、EGFPを含むBAFをも捕捉し、且つ化学発光活性を阻害しないことを新たに明らかにした。更に、従来のニトロセルロース膜ではなく、新たにペーパークロマトグラフィー専用紙を展開膜とし、テストラインに抗GFP VHH-C Linkを塗布したラテラルフローデバイスを試作し、当該デバイスにEGFPをフローさせ、テストライン上でEGFPを確実に捕捉可能なことも確認した。この成果は、サンプルパッド上に固相化したhCBD-(プロテアーゼ切断配列)-BAFを適当なプロテアーゼで切断し、その結果、遊離するBAFを効率良く捕捉する本研究で目指すデバイスの性能を十分満たすものである。1件の特許出願と3件の学会発表を行った。一方、大腸菌で作製したSARS-3CLプロテアーゼ前駆体の成熟化に関して、プロテアーゼ消化条件が整わず、最終年度の課題として委ねることにした。本研究の目的は、“hCBD-BAF/セルロースハイブリッド"を利用した、プロテアーゼ活性センサー技術を実用化レベルに高めることである。そのため、研究
物理的刺激が骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響-情報伝達系に対する分子生物学的検討-

1)骨芽細胞はヒト正常皮質骨より、破骨細胞はマウス由来骨髄細胞に1,25(OH)_2D_3を添加して採取した。2)力学的刺激:500から1500回転の遠心力を12時間ごとに20分間負荷した。電気的刺激:0から7ガウスのパルス電磁場を連続的に負荷した。3)細胞のmRNAを抽出し、ノーザンブロッティング法で各種細胞内情報伝達物質のmRNAの同定を試みた。4)骨芽細胞の評価:ALPase活性、BGP産生能を測定し、分化過程を評価した。さらにVon Kossa染色を施し、石灰化量を測定した。破骨細胞の評価:TRACP染色を行いその形成数を測定し形成能を評価した。さらに破骨細胞をdentine slice上で培養してその吸収窩を染色し、吸収面積を測定した。5)結果ならびに考察:遠心力負荷により、骨芽細胞のALPase活性、BGP産生能は強度依存的に上昇したが、石灰化能に顕著な変化は認められなかった。また、破骨細胞形成能と吸収能にも変化は認められなかった。パルス電磁場負荷により、骨芽細胞のALPase活性は強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。骨芽細胞の石灰化能ならびに破骨細胞の形成能と骨吸収能は、わずかに上昇する傾向が認められた。パルス電磁場を負荷した骨芽細胞にindomethacinを添加すると、濃度依存的に反応性が減少した。しかし、Calphostin Cには反応しなかった。以上より、物理的刺激は、骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。この系を検証するため細胞内情報伝達物質のmRNAを抽出したが、細胞数の不足から、同定には至らなかった。Prostaglandin産生が関与していたことから、骨芽細胞を介して破骨細胞に作用している可能性も示唆された。両刺激により骨芽細胞が異る反応性を示したことから、反応経路が異る可能性も示唆された。1)骨芽細胞はヒト正常皮質骨より初代培養法にて採取した。破骨細胞は、1,25(OH)_2D_3を添加してマウス由来骨髄細胞を培養し、形成させた。3)各種細胞内情報伝達経路の特異的阻害剤を添加し、反応性の変化を検討した。骨芽細胞培養系にindomethacinを添加すると、濃度依存的に物理的刺激に対する反応性が減少した。また、Calphostin Cを添加しても変化は認められなかった。以上の結果から、物理的刺激は、骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。破骨細胞培養系に顕著な変化は認められなかったが、prostaglandin産生が関与していたことから、骨芽細胞を介して応答している可能性が示唆された。また、両刺激により骨芽細胞が異る反応性を示したことから、反応経路が異る可能性も示唆された。来年度は、反応経路の違いや細胞内情報伝達物質について、ノーザンブロッティング法を用いさらに詳細な検討を加えて行く予定である。

パルス電磁場負荷により、骨芽細胞のALPase活性は強度依存的に上昇したが、BGP産生能は抑制された。骨芽細胞の石灰化能ならびに破骨細胞の形成能と骨吸収能は、わずかに上昇する傾向が認められた。パルス電磁場を負荷した骨芽細胞にindomethacinを添加すると、濃度依存的に反応性が減少した。しかし、Calphostin Cには反応しなかった。以上より、物理的刺激は、骨芽細胞の分化を促進すること、この反応にprostaglandin産生が関与しており、protein kinase Cは関与していないことが示唆された。この系を検証するため細胞内情報伝達物質のmRNAを抽出したが、細胞数の不足から、同定には至らなかった。Prostaglandin産生が関与していたことから、骨芽細胞を介して破骨細胞に作用している可能性も示唆された。両刺激により骨芽細胞が異る反応性を示したことから、反応経路が異る可能性も示唆された。
ヘリカルプラズマにおける電磁波反射法のシミュレ-ション実験

本研究では、電磁波反射法を次期大型ヘリカル装置に適用する場合の問題点を明らかにすることを目的として、シアのアるプラズマ中での電磁波の波動伝搬解析を行った。現有装置への適用の可能性も考慮し数値解析では、京大ヘリオトロン核融合研究センタ-のヘリオトロンE装置を対象とした。電磁波の伝搬解析の計算では、幾何光学近似の成り立つカットオフ点近傍までを扱い、ポアンカレ球表示による偏波べクトルを伝搬路に沿って数値積分し求める手法を用いた。入射波は直線偏波をもつものとし、電界べクトルの向きをト-ラス軸に平行にあるいは垂直にした場合をまず解析した。この時、入射波電界はプラズマ中を伝搬しながら回転角および楕円度を大きく変化させカットオフ点に至ることがわかった。したがって正常波モ-ドでの反射計でこのような入射波電界を用いた場合には、カットオフ点で磁場に垂直な成分はそのまま透過し、プラズマ内部に存在する異常波モ-ドのカットオフ点に至り、そこで再び反射される可能性があることを見出した。この場合の対策としては、人射波電界をプラズマ境界での磁場の向きに対して、純粋に正常波、あるいは異常波モ-ドとなるように調整することによって振動の幅を小さく抑えることができ、カットオフ点を通過する成分を無視できるレベルにまで軽減することができることを示した。また本研究では、偏光測定と組み合わせることにより、プラズマ境界で測定される回転角の値から逆にプラズマ内部での局所磁場の方向を求める手法の検討を行った。予め、電子密度および磁場強度の空間分布が正常波および異常波を用いた反射計により既知であるとし、数値計算で得られたプラズマ境界での反射波電界の回転角を観測値と見立て、プラズマ境界から逐次微小量だけ内部での局所磁場の方向を求めた。現在、計算誤差の異積効果をなくす計算手法を開発中であり、その結果が期持される。
脂溶性EGCg誘導体を利用した脳内カテキン受容体・結合タンパク質の同定と解析

先行研究で、アルキル鎖の導入で脂溶性を付与したカテキン誘導体が、アルツハイマー病の原因物質アミロイドβペプチド(Aβ)の主要分解酵素であるネプリライシンやAβ産生を抑制するαセクレターゼ、さらにAβ産生酵素βセクレターゼの遺伝子発現をそれぞれ上方・下方調節する能力があることを見出した。本研究では、これらの発現制御に関わるカテキン結合タンパク質をカテキン結合ビースによる精製とLC/MSMS法を用いて二種類同定した。これらのカテキン結合タンパク質過剰発現細胞では、mock細胞に比較して脂溶性カテキン誘導体処理によるネプリライシン活性増強効果がさらに増大し、βセクレターゼ活性の減弱を引き起こした。研究の年次計画に従って実験を進めた。代表的なカテキンである(-)-epigallocatechin-3-O-gallate(EGCg)のA環に長鎖アルキル基を持つカルボン酸を結合させた誘導体を化学合成し、二種類の磁気ビースにN-ヒドロキシスルホスクシンイミドと1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを用いて脱水縮合によりカップリングさせた。ネガティブコントロールとしてアルキル鎖のみを固定化させた磁気ビーズを作製した。これらの磁気ビーズと神経系細胞抽出液(膜画分)を反応させ、カテキン結合タンパク質を塩濃度勾配で溶出させた。各画分のサンプルをSDS-PAGEで分離後、バンドをゲルから抽出後トリプシン消化して質量分析法によりタンパク質を解析した。その結果、ネガティブコントロール用磁気ビーズには結合せず、二種類のカテキン磁気ビーズの両方に結合する複数のタンパク質を同定した。同定したタンパク質のうち複数回行った実験で再現性が得られた分子の中から二つの分子(遺伝子Aと遺伝子B)に着目し、これらのタンパク質をコードする遺伝子を安定的に発現する過剰発現細胞を作製した。これらの細胞を用いて、我々が見出した脂溶性カテキン誘導体によるネプリライシンおよびαセクレターゼ活性増強作用およびβセクレターゼ活性抑制作用を評価した。現在までに、遺伝子Aはβセクレターゼ活性抑制作用に、遺伝子Bはネプリライシン活性増強作用に関与する可能性を示唆するデータを得ている。現在、この結果を確認するため、これらの遺伝子の過剰発現細胞の複数のクローンとRNAiを用いたノックダウン細胞を用いた解析を行っている。さらに、より網羅的にカテキン結合タンパク質を同定するために、様々な界面活性化剤で可溶化した膜画分や可溶性画分を用いて、引き続きカテキン結合タンパク質の同定を進めている。申請者は、アルキル鎖の導入で脂溶性を付与したカテキン誘導体が、アルツハイマー病(AD)の一次原因分子アミロイドβペプチド(Aβ)の主要分解酵素であるネプリライシンやAβ産生を抑制するαセクレターゼの活性とAβ産生に関わるβセクレターゼの活性を遺伝子発現を介して、それぞれ増強・抑制することで、効率的にAβレベルを低下させる能力があることを見出した。本研究では、脳内カテキン結合タンパク質(受容体)を同定し、これらの誘導メカニズムを明らかにすると共にこの結合タンパク質を介する創薬研究の基盤構築に資することを目的とした。幸いにも初年度において、ネプリライシンまたはβセクレターゼ活性に影響を与えるカテキン結合タンパク質の同定に成功しており、研究計画に照らし合わせても当初の目的を達成していると言える。また、上述のように本年度も引き続き、より網羅的にカテキン結合タンパク質を同定するために、様々な界面活性化剤で可溶化した膜画分や可溶性画分を用いて、カテキン結合タンパク質の同定を進めている。また、候補遺伝子のcDNAおよびsiRNAを株化神経系細胞だけでなくマウス初代培養細胞へトランスフェクションする条件等も確立しており、解析を待つ状態になっている。このように、本研究は当初の計画通り順調に進んでおり到達度は高い。研究申請書の年次計画に従って実験を進めた。代表的なカテキンである(-)-epigallocatechin-3-O-gallate(EGCg)のA環に長鎖アルキルカルボン酸を結合させた誘導体を化学合成し、二種類の磁気ビーズにNHSエステルとカルボジイミドを用いてカップリングさせた。ネガティブコントロールとしてアルキル鎖のみを固定化した磁気ビーズを作製した。これらの磁気ビーズを用いて神経系細胞抽出液(膜画分)からカテキン結合タンパク質を精製し、質量分析法によりタンパク質を解析した。複数回行った実験で再現性が得られたタンパク質の中から二つの分子(遺伝子Aと遺伝子B)に着目し、これらのタンパク質を安定的に発現する過剰発現細胞を作製した。初年度までの研究で、遺伝子Aは脂溶性カテキン誘導体によるβセクレターゼ活性抑制作用に、遺伝子Bはネプリライシン活性増強作用への関与を示唆するデータを得たが、本年度は遺伝子Aもネプリライシン活性増強作用に関与することが分かった。現在、RNAiを用いたノックダウン細胞で整合性のある結果が得られるかを確認している。さらに、様々な界面活性化剤で可溶化した膜画分や可溶性画分を用いて、引き続きカテキン結合タンパク質の同定を進め、上記遺伝子Bに関連するタンパク質を新たなカテキン結合分子として同定した。また、遺伝子A、遺伝子Bのリコンビナントタンパク質の精製も行っており、今後Biacore等を用いて分子間相互作用を詳細に解析していく予定である。先行研究で、アルキル鎖の導入で脂溶性を付与したカテキン誘導体が、アルツハイマー病の原因物質

アミロイドβペプチド(Aβ)の主要分解酵素であるネプリライシンやAβ産生を抑制するαセクレターゼ、さらにAβ産生酵素βセクレターゼの遺伝子発現をそれぞれ上方・下方調節する能力があることを見出した。本研究では、これらの発現制御に関わるカテキン結合タンパク質をカテキン結合ビースによる精製とLC/MSMS法を用いて二種類同定した。これらのカテキン結合タンパク質過剰発現細胞では、mock細胞に比較して脂溶性カテキン誘導体処理によるネプリライシン活性増強効果がさらに増大し、βセクレターゼ活性の減弱を引き起こした。上記の研究成果を踏まえ、まずは最初に同定したネプリライシンとβセクレターゼの遺伝子発現に関わる二種類のカテキン結合分子にターゲットを置き、磁気ビーズによる共沈実験だけでなく、表面プラズモン共鳴法を用いた分子間相互作用解析装置を用いて脂溶性カテキン誘導体や既存薬との結合親和性などを明らかにするとともに、その分子機構をin vitroだけでなく、in vivoも含めて明らかにすることにより、副作用が少なく安全性が担保される創薬を目指す。一方、申請者らが合成した脂溶性カテキン誘導体によるネプリライシン、αセクレターゼおよびβセクレターゼに対する作用は一様ではなく、またそれぞれの作用機序も複数存在すると推測されるため、網羅的にカテキン結合タンパク質を同定することが必要であり、引き続きこの実験を進めていく。神経薬理学
上顎洞原発小細胞癌培養細胞株における生物学的特性と分化誘導の検討

小細胞癌(SmCC)は、まれではあるが頭頸部領域においても発生し、放射線や抗癌剤に容易に耐性を獲得し、血行性転移を来しやすく、また主要臓器に容易に浸潤することから著しく予後不良である。われわれは上顎洞を原発とする小細胞癌の患者より培養細胞株を樹立した。本培養細胞株は免疫細胞化学染色においてNSE、GRP、CD56(N-CAM)を発現しており、肺原発小細胞癌と比較的類似した性質を持っていた。しかし、その細胞形態や増殖様式は肺原発のものと異なり、肺原発小細胞癌は浮遊細胞でコロニーを形成して増殖するのに対し、本培養細胞株は接着性を有し、上皮系悪性腫瘍培養細胞に似た増殖形態を示した。培養細胞を電子顕微鏡で観察すると、細胞質内に神経分泌顆粒の存在が示された。細胞の倍加時問は70.4時間で、immunoradiometric assay法を用いて培養上清中のNSEを測定したところ、細胞増殖と相関してNSEの増加を認めた。本培養細胞株はヌードマウス可移植性を有し、腫瘍重量とNSEとの間に相関関係が見られた。このように本培養細胞株は、肺原発小細胞癌培養細胞としての性質と上皮系悪性腫瘍の性質の両方を有しているものと考えられた。また、本培養細胞株は予備実験においてdb-cAMPを作用させると形態学的に神経細胞様に形態変化をすることが確認された。この細胞の形態変化に対するdb-cAMPの至適濃度は100250μg/mlであった。この現象を解析するために神経細胞に特異的に認められるneurofilament-Hの細胞内の発現を免疫細胞化学染色を用いて検討すると形態変化後に有意に強発現していた。さらに、未分化神経細胞から成熟神経細胞に分化する際に特異的に形成されるmicrotubule-associated protein (MAP)-2が経時的に増加していくことがウエスタンブロット法にて明らかとなった。このように本培養細胞株はdb-cAMPによって神経細胞に分化誘導される可能性が示唆された。以前より細胞における分化誘導では細胞内シグナル伝達系のp27の関与が報告されており、本細胞株の分化誘導に対してもp27の関与を検討したが、本細胞株の分化誘導にはp27の関与は認められなかった。最近、肺小細胞癌の分化誘導にはc-mycの関与が報告されたことから、現在われわれも本細胞株に対するmyc familyの関与を検討中である。細胞の倍加時間は70.4時間で、immunoradiometric assay法を用いて培養上清中のNSEを測定したところ、細胞増殖と相関してNSEの増加を認めた。このように本培養細胞株は、肺原発小細胞癌培養細胞としての性質と上皮系悪性腫揚の性質の両方を有しているものと考えられた。この細胞の形態変化に対するdb-cAMPの至適濃度は100-250μg/mlであった。さらに、未分化神経細胞から成熟神経細胞に分化する際に特異的に形成されるmicrotubule-associated protein (MAP) -2が経時的に増加していくことがウエスタンブロット法にて明らかとなった。