hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エネルギーに立脚した応答評価と制御に関する研究

建築物の応答を制御するためには有効なエネルギー吸収が不可欠であり,また,その応答の低減効果を適切に評価することが重要である。特に,エネルギー吸収に伴う減衰による応答低減係数は,地震時における建物の応答低減効果を簡易に予測することができる有用な係数であることから,多くの研究者により検討されている。しかしながら,これら既往の応答低減係数の提案式は全て,統計的な計算により求められた回帰式であり,理論が確立しているとは言い難く,また,入力地震動や建物の復元力特性により,提案式と解析値との整合性にバラつきが大きいことが指摘されている。そこで,本課題では,応答低減係数の評価に関する研究と優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造の開発研究を進めてきた。応答低減係数に関する研究では,29年度において示した非定常弾性応答時における応答低減係数の理論式に弾塑性系の応答を弾性系の減衰定数で評価しうるエネルギー効率を考慮した等価減衰定数の補正係数を導入することにより,本課題の最終目標である非定常弾塑性応答時における応答低減係数を提示し,その提案式が応答解析結果とよく対応しうることを示した。また,優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造の開発研究では,小さな変形段階から良好なエネルギー吸収能力を有する構造である減振構造の実用化に向けた研究を行った。より実用的なモデルの開発及びその評価法の確立のため,29年度とは異なる配筋とした下端のみを減振としたモデルとせん断及び付着性能を改善した短スパン減振モデルの2つのモデルで実験を行い,両モデル共に早期降伏し良好な減衰能力を有することを示した。以上の研究成果をまとめ,応答低減係数に関する研究は学会学術講演会で発表し,減振構造に関する研究は学術論文(査読あり)に投稿し,現在審査中である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。近年,建築物には,大地震に対しても一定の機能維持や損傷の抑制が要求されている。また,超高層建物や免震構造では,長周期地震動への対策も喫緊の課題であり,応答を一定の許容値以下に制御することが建築物の耐震設計における,近年の最重要課題の一つであると言っても過言ではない。一方,応答を制御するためには有効なエネルギー吸収が不可欠であり,また,の応答の低減効果を適切に評価することが重要である。このため,制振・免震構造では種々のダンパーが開発され,そのエネルギー吸収による応答低減に関する研究が,耐震構造も含めて多くの研究者により行われてきた。これらの研究のうち,特に,エネルギー吸収に伴う減衰による応答低減係数は,地震時における構造物の応答,すなわち建物の応答低減効果,ひいては建築物の耐震性能を簡易に予測することができる有用な係数であることから,多くの研究者により検討されている。それらは限界耐力計算など多くの耐震規準に採用され,また,構造特性の位置づけなど多くの研究にも用いられている。しかしながら,これら既往の応答低減係数の提案式は全て,統計的な計算により求められた回帰式であり,理論が確立しているとは言い難い。また,入力地震動や建物の復元力特性により,提案式と解析値との整合性にバラつきが大きいことが指摘されている。そこで初年度にあたる29年度は,応答低減係数に関する研究として,非定常弾性応答時と定常弾塑性応答時における応答低減係数を,理論を基に提案した。また,優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造の開発実験を行った。これらの成果を学術論文としてまとめ,日本建築学会構造系論文集(査読あり)に1編,構造工学論文集(査読あり)に1編の論文が掲載され,コンクリート工学年次論文集(査読あり)に2編の論文を投稿し,現在審査中である。まず,非定常弾性応答時における応答低減係数の評価を行った。非定常応答時における弾性一質点系の応答低減係数の理論式は最大応答直前のピーク値から最大応答に至るまでの歪エネルギーの増分,定常ループを描く時の減衰による吸収エネルギーから与えられる。29年度では,この理論式に応答の非対称性を加味した減衰による吸収エネルギーの修正係数と減衰による周期の変動が応答低減係数に及ぼす影響を考慮しうる補正係数を用いた応答低減係数の修正式を提案し,応答解析結果との比較からその整合性を示した。次に,非定常弾塑性応答を評価する上で定常ループのエネルギーは重要な要因である。このため,29年度では復元力特性による応答への影響を定量的に捉えることを目的とし,弾塑性一質点系が共振する場合のエネルギーの釣合からRC造やS造の復元力特性に応じた応答低減係数の評価式を誘導し,評価式が定常応答時の応答解析結果と良く整合することを示した。さらに,優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造として,減振機能を有する鉄筋コンクリート造梁の応用開発研究を行った。減振構造とは通常の構造が一般的に部材長において耐力が一様な部材から構成されるのに対し,部材端部のヒンジ部の耐力がヒンジ部以外の部分の耐力より相対的に小さく,かつ,ヒンジ長さが短い部材からなる構造である。29年度では一般的に梁は鉛直荷重時の影響により,梁端部の下端筋が上端筋より少ないことに着目し,下端筋の一部を非定着とした減振梁及び減振構造のより有効的な活用法と考えられる建物の一部に減振梁を効果的に用いることを想定した短スパン梁の構造実験を行った。

実験結果より提示した減振部材は通常の配筋法とした部材に比べ初期剛性は変わることなく早期に降伏し,小さな変形段階から良好な履歴吸収能力を示した。建築物の応答を制御するためには有効なエネルギー吸収が不可欠であり,また,その応答の低減効果を適切に評価することが重要である。特に,エネルギー吸収に伴う減衰による応答低減係数は,地震時における建物の応答低減効果を簡易に予測することができる有用な係数であることから,多くの研究者により検討されている。しかしながら,これら既往の応答低減係数の提案式は全て,統計的な計算により求められた回帰式であり,理論が確立しているとは言い難く,また,入力地震動や建物の復元力特性により,提案式と解析値との整合性にバラつきが大きいことが指摘されている。そこで,本課題では,応答低減係数の評価に関する研究と優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造の開発研究を進めてきた。応答低減係数に関する研究では,29年度において示した非定常弾性応答時における応答低減係数の理論式に弾塑性系の応答を弾性系の減衰定数で評価しうるエネルギー効率を考慮した等価減衰定数の補正係数を導入することにより,本課題の最終目標である非定常弾塑性応答時における応答低減係数を提示し,その提案式が応答解析結果とよく対応しうることを示した。また,優れたエネルギー吸収能力を有する新たな構造の開発研究では,小さな変形段階から良好なエネルギー吸収能力を有する構造である減振構造の実用化に向けた研究を行った。より実用的なモデルの開発及びその評価法の確立のため,29年度とは異なる配筋とした下端のみを減振としたモデルとせん断及び付着性能を改善した短スパン減振モデルの2つのモデルで実験を行い,両モデル共に早期降伏し良好な減衰能力を有することを示した。以上の研究成果をまとめ,応答低減係数に関する研究は学会学術講演会で発表し,減振構造に関する研究は学術論文(査読あり)に投稿し,現在審査中である。29年度では,非定常弾性応答時の応答低減係数と定常弾塑性応答時の応答低減係数を,理論を基に示した。しかしながら,実際の建物の応答は,非定常弾塑性応答であることから,30年度は応答低減係数については,本課題の最終目標である非定常弾塑性応答時に対する検討を行うことを目的とし,平成29年度までの研究成果の提案式の修正を行うと共に,その修正式の検証を行う。検証において,解析対象モデルはRC造を想定した武田モデル,S造を想定したバイリニアモデル,木造及びブレース構造を想定した武田スリップモデルの3種類とし,入力波は告示波及び実地震動とする。減振構造に関しては,29年度では短スパン減振RC造梁の構造実験を行い,小さな変形段階から良好な履歴吸収能力有することを示した。しかしながら,変形角1/400(rad.)で付着ひび割れが発生した。このため,30年度はその改良により,十分な変形能の確保と復元力特性のモデル化を行う。具体的には,短スパン減振RC梁の付着性能を改善し,その実験結果より降伏変形角や等価減衰定数の定量化を図る。また,減振構造に優れた損傷軽減機能を付加するため,減振スリットを設けた非定着減振モデルの構造実験を行う。このモデルは,梁端部の主筋のうち内側に配した主筋を梁端部で非定着とし,梁端境界部にひび割れ誘発目地を設けたモデルであり,ひび割れ誘発目地はかぶり厚に影響を与えないように梁幅の中間部に設ける。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
有明海沿岸域における飛来塩分特性とその対策方法の検討

本年度は,平成9年度の研究方法である、有明海沿岸域における飛来塩分量の空間分布特性や透過性構造物によるその抑制効果についての現地観測と、海水滴の沈降速度や透過性構造物の除塩効果を考慮した数値シミュレーション手法の開発を継続して行うとともに、飛来塩分量の測定方法の検証や観測結果に基づいた飛来塩分の3次元数値モデルについても検討を行った。現地観測測においては、熊本県北部の玉名郡横島干拓で飛来塩分の現地観測を実施し、飛来塩分の空間分布特性と風向・風速および潮位変化などの関係について調査した。また、従来のガーゼ付着量による飛来塩分量の算定方法を検証するために、携帯型ガス採取装置を用いて空気中の塩分をばっ気することで蒸留水に溶け込ませ、両者の関係について調べた。さらに、数値解析では飛来塩分の沈降速度や拡散過程における降雨の影響を考慮した数値モデルを作成し、その数値モデルの検証を試みるとともに、マスコンシステント・モデルを用いて熊本県沿岸域での3次元風速場を再現し、飛来塩分の移流拡散についても3次元シミュレーションを行った。その結果、以下に示す結論を得た。・現地観測より、弱風時(23m/s)における飛来塩分の空間分布特性は、風向とともに、潮位変化の影響も強くいけていることがわかった。・観測値との比較検討を行うことで、現地に即した数値モデルを作成した。また、堤防背後域での3次元的な流速場の乱れが、飛来塩分の拡散機構に重要な役割をしていることを明らかにした。・マスコンシステント・モデルを用いた風速場の計算結果より、熊本県沿岸域ではかなり3次元性が卓越していることが確認でき、飛来塩分特性の解明には、風速場の3次元性を考慮する必要がある。本年度は,有明海沿岸域における飛来塩分量の空間分布特性や透過性構造物によるその抑制効果などについて現地観測を行うとともに,海水滴の沈降速度や透過性構造物の除塩効果を考慮した数値シミュレーション手法の開発を行った。現地観測側においては、熊本県北部の玉名群横島干拓で飛来塩分の現地観測を実施し、飛来塩分の空間分布特性と風向・風速の関係について調査した。また、沿岸部に防風ネットを設置し、ネット内外の飛来塩分量を実測・比較することで、防風ネットの定量的な効果について調べた。また、数値解析では、飛来塩分の沈降速度や拡散過程における降雨の影響を考慮した数値モデルを作成し、実測値との比較を行うことで、その数値モデルの検証を試みた。さらに、対策工として良く用いられる防風ネットの効果についても数値な検討を試みた。・現地観測により、弱風時(23m/s程度)における飛来塩分の空間分布特性は、風向よりも地形に起因した風速場の乱れの影響を強く受ける。・防風ネットによる飛来塩分の抑制効果を検証したところ、弱風時(23m/s程度)には2025%程度の抑制効果が得られることがわかり、その有効性が定量的に明らかになった。観測値との比較検討を行うことで、現地に即した数値モデルを作成した。また、堤防背後域での3次元的な流速場の乱れが、飛来塩分の拡散機構に重要な役割をしていることを明らかにし、マスコンシステント・モデルを用いた3次元の風速場を、観測結果に基づき再現した。
歯科診療室における高周波音源の音響インテンシティ

労働衛生学的観点から、歯科診療室における高周波音源になる歯科用エアータービンと超音波スケーラについて関心を持ち、可聴域から超音波域に至る範囲の周波数分析を手がけてきた。本研究は、音響インテンシティを計測することにより、騒音源のエネルギー場の可視化を計ることに主眼を置いた。初年度には、騒音の計測に先だち高周波振動を計測した。その後インテンシティ計測装置を購入し、教室所有の2チャンネルFFTアナライザに接続して、クロススペクトル法により音響インテンシティを計測するシステムを構築した。実験室において、エアータービン音に擬した57KHzの単連続音を発生させ、インテンシティベクトル図を作成した。この実験によって、歯科用エアータービンの様な小さな騒音源の計測においては、マイクロホンの微妙な位置決めが結果に極めて重大な影響を及ぼすことが分かった。また、この計測には、多点計測が必要であり、当初の予想以上に労力を要することが判明した。次年度は、多点計測を合理的に実施すべく、製図版を改造した格子点移動装置を作成し、約60cm四方の範囲で任意の格子点における計測が可能になった。また、FFTアナライザは、GPIB制御によりパソコンと接続し、半自動計測が可能となり計測時間の大幅な節約ができた。更に計測法は改良を加え、実験室において歯科用エアータービン音を実際に発生させ、スペクトル解析及び音響インテンシティ計測を行なった。その結果、歯科用エアータービンハンドピ-スからの騒音は、これまで考えられていた。回転部分を中心とした点音源ではなく、術者が手で持つ把持部分からも相当量の騒音が発生していることを可視化できた。以上を本補助金により、現在までに進めることができました。関係各位に篤く感謝致します。労働衛生学的観点から、報告者はかねてより歯科用エアータービンの騒音について関心を持ち、特に、可聴限界域から超音波域の周波数成分分析を手がけている。本申請の音響インテンシティによる音響パワー計測は、騒音源の騒音の強さそのものを計測するものである。本研究の目的は、この音響インテンシティ法により、歯科用エアータービンおよび超音波スケーラの音響パワーについて、各種条件のもとで計測し、これまでに明らかになっている騒音の周波数分布と比較検討することであった。本補助金により、インテンシティ計測装置(2マイクロフォンおよび専用アンプ)を購入した。このインテンシティ装置は教室所有の2チャンネルFFTアナライザに接続され、クロススペクトル法により音響インテンシティを計測するシステムを構築した。(将来は、この計測系はGPIB制御によりパソコンによって自動制御される予定である。)現在までに、実験室において、歯科用エアータービン音に擬した約7キロヘルツの単音を発生させてモデル音源とし、可聴域における高周波騒音について計測を重ねている。しかしながら、音響インテンシティベクトル図において必ずしも満足のいくものが得られていない。これは、音響インテンシティ計測の特徴(欠点)として挙げられているマイクロホンの位置決めが容易でないことと関連するのであるが、歯科用エアータービンのような、ほぼ点音源に等しい騒音源に対しては、マイクロホンの位置設定が計測結果に大きな影響を及ぼすことが判明し、現在、マイクロホンが計測空間内を水平および垂直方向に自由に位置決めしながら移動できる装置を制作中である。音響インテンシティ計測においては、このマイクロホンの位置決めの問題が実際の計測遂行上最大の重要ポイントとなることが分った。次年度は、マイクロホン位置決めの問題をまず解決し、インテンシティ装置の計測周波数範囲の拡大実験、歯科用エアータービンの音響インテンシティ計測、超音波スケーラの音響インテンシティ計測を行なう予定である。労働衛生学的観点から、歯科診療室における高周波騒音源となる歯科用エアータービンと超音波スケーラについて関心を持ち、可聴域から超音波域に至る範囲の周波数成分分析を手掛けてきた。

本研究は、音響インテンシティによる音響パワー計測により、騒音源の騒音の強さそのものを計測しようとするものである。初年度に購入した音響インテンシティ計測装置に、教室所有の2チャンネルFFTアナライザに接続し、クロススペクトル法により音響インテンシティを計測するシステムを構築した。その後、実験室において、歯科用エアータービン音に凝した57kHzの単音を発生させ、音響インテンシティベクトル図を作成した。この予備実験によって、歯科用エアータービンのような、点音源に等しい騒音源には、マイクロホンの微妙な位置決めが測定結果に影響することが分かった。また、インテンシティ計測は、多点計測が必要であり、それぞれの点ごとに正確な位置を決めること、そのつどのFFTアナライザの操作が煩雑を極めることなど、計測に予想以上の労力を要することが判明した。本年度は、多点計測を合理的に行なうために、製図版を改造した格子点移動装置を作成し、約60cm四方の範囲で任意の格子点における音響インテンシティベクトルを計測できるようになった。また、FFTアナライザーGPIB制御のパーソナルコンピュータにより半自動計測が可能になったため、多点計測に必要な時間が大幅に節約できるようになったのも成果の一つである。現在は、何種類かの歯科用エアータービン音をデジタル録音し、それを疑似的にスピーカーから流して、スペクトル解析および音響インテンシティ計測をしている。本年度はシステムの構築に多くの時間を費やしたため、初年度に予定した実際の歯科用エアータービン音の音響インテンシティ計測の学会報告等は、残念ながら次年度以降にならざるを得ないが、データを重ねて所期の目的を果たすべく実験継続中である。
ウシ黄体機能の調節機構に関する研究

1.ウシ黄体細胞のプロジェステロン(P)とオキシトシン(OT)分泌に及ぼすエストラジオ-ル(E)とOTの影響:単離した黄体細胞をホルモン無添加のものを対照とし、E(0.1,1,10,100pg/ml)またはOT(1,10,100,1000ng/ml)を黄体形成ホルモン(1ng/ml,LH)と共に、あるいは単独で添加して2時間培養したところ、P分泌量は、すべてのE(0.1pg/ml区を除く)、OT添加区において有意に低かった(P<0.05)が、添加濃度の違いによる差は認められなかった。しかし、LHと共に添加されたE,OTは、全ての濃度区においてLH単独添加の場合と比較してP分泌を有意に促進した(P<0.05)。一方、OT分泌はLH添加の有無にかかわらずE添加によって有意に抑制された(P<0.05)。以上の結果から、E,OTともに黄体機能の調節によって直接関与していることが示唆された。2.顆粒層細胞のP分泌によって及ぼすノルエピネフリン(NE)の影響:(1)ウシ未熟卵胞より単離した顆粒層細胞をFSH(10ng/ml),LH(10ng/ml)および無添加の3条件に010^<ー4>MのNEを添加して96時間まで培養した(48時間に培養液を交換)ところ、FSHの添加によりP濃度は最も高くなった。またNE添加濃度の増加に伴ってLH添加および無添加の場合にはP濃度の増加する傾向がみられたが、FSH添加の場合は減少した。(2)未熟卵胞より単離した顆粒層細胞を48時間FSH(10ng/ml)存在下で培養した後、NEとpropranolol(β阻害剤)またはisoproterenol(β作動剤)添加して96時間まで培養したところ、NE添加によるP濃度の増加はpropranololの添加によって制御され、isoproterenolの添加によって促進された。以上の結果から、NEは性腺刺激ホルモンの作用によって増減するβアドレノレセプタ-と結合して顆粒層細胞の黄体化を促進しP分泌を増大させることが示唆された。
神経伝達物質放出の修飾機構解明のための分子生理学的研究

シナプス前終末の細胞内小器官に存在するカルシウム動態を調節する複数の機能分子の役割を明らかにするために、それらの分子の遺伝子改変マウスを用いて興奮性シナプス伝達を解析したところ、シナプス前性のシナプス可塑性に異常があることを見出した。また、神経伝達物質放出を制御する蛋白複合体と相互作用するシナプス前分子の機能解析を行ったところ、神経伝達物質の放出の制御とシナプス前終末内のシナプス小胞の動態に関与することが明らかとなった。さらに、シナプス前終末に存在する蛋白リン酸化酵素によるリン酸化により、シナプス前性の短期シナプス可塑性が修飾されることを見出した。(1)シナプス前終末におけるミトコンドリアの役割を明らかにするために、マウス海馬スライス標本を用いて、5Hz、3分の持続刺激をシャッファー側枝に与え、CA1領域にて興奮性シナプス応答を細胞外電位記録法により記録した。5Hz刺激により一過性のシナプス伝達増強が起こり、それに続いて、抑制が起こることを再確認した。5Hz刺激後には、シナプス伝達の急速な減弱とそれに引き続く抑制からの緩徐な回復が観察されたが、これらの時間経過はミトコンドリア機能阻害薬により有意な変化を示した。これらの結果から、シナプス前終末におけるミトコンドリアがシナプス伝達に関与することが明らかとなった。(2)海馬歯状回における興奮性シナプス伝達の長期増強(LTP)は、海馬CA1領域と同様、NMDA受容体依存的に誘導されるが、抑制性入力によるLTPの調節には両脳領域間で異なることが示唆されていたが、その詳細は不明であった。歯状回とCA1領域問でGABAによる抑制を比較したところ、高頻度刺激により誘発されるシナプス応答は、歯状回により強い抑制性の影響を与えることが明らかとなった。また、シナプス外のGABA_A受容体によるトニック抑制も歯状回により強い抑制性の影響を与えることも明らかとなり、これらの結果から、歯状回ではLTPの誘導の際の抑制性入力の関与が海馬CA1領域に比べてより大きいことが判明した。(3)IL-1受容体の機能を阻害する分子をノックアウトした慢性ストレス負荷モデルマウスの機能解析を行った。尾懸垂試験と強制水泳試験において、ノックアウトマウスでは週齢依存的にうつ様行動が減弱していた。それに伴い、アドレナリン受容体のα1Aサブタイプの発現が上昇し、それがうつ様行動と同様の週齢依存性を示すことを明らかにした。したがって、うつ様行動にα1Aサブタイプが関与することが明らかとなった。(1)シナプス前終末におけるミトコンドリアの役割に関する解析では、薬理学的な予備実験の結果を確認するとともに、CA1領域のシナプス前終末特異的なミトコンドリア機能阻害マウスの作製を終了し、電気生理学的な解析を進めている。現時点では、海馬スライス標本のCA1領域において、5Hz刺激後にみられるシナプス抑制に異常がある傾向がみられている。(2)シナプス前終末のアクティブゾーン蛋白であるCASTのノックアウトマウスの解析では、海馬スライスCA1領域の興奮性シナプスにおいて、CASTがグルタミン酸放出の基礎過程を調節していることが明らかとなった。具体的には、CASTが欠損すると、ひとつのシナプス小胞あたりに充填されるグルタミン酸量が増え、量子サイズが大きくなる。また、シナプスが持続的に活性化した際のシナプス抑圧がより大きくなり、これにシナプス前終末内の初期エンドソームを介した輸送の異常が関与していることを明らかにした。この研究については、すでに第一報を投稿し、現在、改訂中である。CA3苔状線維シナプスでの解析も進めており、シナプス可塑性に異常を見出している。(3)CaMKIIalphaのシナプス前終末における機能解析では、現在見られている表現型を媒介する分子の探索を進めている。(4)STIM1の前脳特異的なコンディショナルノックアウトマウスで、シナプス可塑性に異常があることを見出しつつある。(5)シナプス前終末での神経伝達物質放出を制御するSNAP-25の遺伝子改変マウスではPKCによるSNAP-25のリン酸化が起こらなくなっているが、海馬スライス標本CA1領域において、興奮性シナプス伝達の伝達効率が大きく減少しており、高頻度刺激後に観察されるテタヌス後増強が大きく亢進していることを見出した。現在、論文投稿準備中である。現時点では、海馬スライス標本のCA1領域における基本的なシナプス伝達機能について詳細な解析を進めているところである。また、シナプスが持続的に活性化した際のシナプス抑圧がより大きくなり、これにはシナプス前終末内の初期エンドソームを介した輸送の異常が関与していることを明らかにした。この研究については、この段階で第一報を投稿しているが、今後も他のシナプスでの解析や個体レベルでの解析を含め、精力的に解析を進めていく。

(3)CaMKIIalphaとSTIMのシナプス前終末における機能解析では、電気生理学的なデータが得られつつあり、今後、さらに研究を進展させていく。一方、シナプス前終末での神経伝達物質放出を制御するSNAP-25の遺伝子改変マウスを新たに入手したが、この変異マウスではPKCによるSNAP-25のリン酸化が起こらなくなっており、海馬スライス標本CA1領域において、興奮性シナプス伝達の伝達効率が大きく減少しており、高頻度刺激後に観察されるテタヌス後増強が大きく亢進していることも見出した。今後もさらに研究を進め、神経伝達物質放出の修飾機構の詳細を明らかにしたい。1CASTを欠損するノックアウトマウスを用いて伝達物質放出機構を検討した。(1)海馬CA1領域における興奮性シナプス伝達の入出力関係において伝達効率が野生型より高かった。(2)微小興奮性シナプス後電流の振幅が野生型より増大していた。(3)伝達物質の放出確率が低下していた。(4)シナプス間隙におけるグルタミン酸濃度が高いことがわかった。(5)5Hzの持続低頻度刺激後にみられるシナプス抑制が有意に大きかった。(6)Rab6が関与することを生化学的に明らかにした。(7)海馬CA3領域苔状線維シナプスでの可塑性の異常の可能性を見出した。2ミトコンドリアのカルシウム放出機構に関与する分子が海馬CA1シナプスの前終末でのみ欠損するマウスの作製に成功した。この変異マウスの海馬スライスでは、5Hz刺激後にみられるシナプス抑制に異常がある傾向がみられた。3海馬特異的にカルシウム放出調節機能分子が欠損する変異マウスの作製に成功した。これらの変異マウスを用いて、海馬における役割を電気生理学的に解析した。まだ例数は十分ではないものの、コンディショナルノックアウトマウスにおいて、LTPの減弱傾向とオープンフィールドテストでの多動がみられた。4CaMKIIalphaの酵素活性のみが消失しているノックインマウスにおいて、シナプス前性の短期可塑性であるテタヌス後増強が、特殊な条件下では野生型に比べて大きく増大していることを見出した。5SNARE蛋白分子の遺伝子改変マウスの海馬CA1領域において、入出力関係が大きく減少していることがわかった。それと合致し、2発刺激促通が大きく増大し、伝達物質の放出確率の低下が示唆された。1神経伝達物質放出に関与するアクティブゾーン蛋白であるCASTを欠損するノックアウトマウスを用いて神経伝達物質放出機構を検討し論文を投稿した。以下にその要約を記載する。(3)神経伝達物質の放出確率が低下していた。2細胞内小器官からのカルシウム放出機構に関与する機能分子が海馬CA1シナプスの前終末でのみ欠損するコンディショナル遺伝子改変マウスの作製に成功し、この変異マウスの海馬スライスで、まだ例数は十分ではないが、シナプス活動依存性のシナプス抑制に異常があることを見出した。
日本水稲農耕の起源地に関する総合的研究

本研究は、山東半島における先史時代の水田探索調査、膠東半島の石器の実測調査、黒陶の安定同位体比分析、山東半島先史時代古人骨の形質人類学的分析、遼東半島四平山積石塚の分析の5分野から構成されている。これらの調査研究は、研究代表者が提起する東北アジア初期農耕化4段階説における第2段階と第3段階の実体を解明するための研究である。まず第1の水田探索調査では、これまで山東で水田遺跡が発見されていなかったが、楊家圏遺跡と両城鎮遺跡でボーリング調査と試掘調査を行うことにより、楊家圏遺跡では龍山文化期に畦畔水田が存在する可能性が高まった。また膠東半島の趙家荘遺跡では龍山文化期の不定型な畦畔水田が発見されており、水田のような灌漸農耕が山東において始まった可能性が明らかとなった。さらに黒陶の安定同位体比分析により、山東東南部の黄海沿岸では龍山文化期にイネがアワ・キビより主体であることが明らかとなった。これはフローテーションによる出土植物遺体分析と同じ結果を示している。さらにこの分析によってイネであるC3植物が膠東半島、遼東半島と地理勾配的に低くなっていることが確かめられ、このルートでイネが龍山文化期に伝播した可能性が高まった。これは東北アジア農耕化第2段階にあたる。第5の研究テーマで分析した四平山積石塚の分析により、この段階に膠東半島から遼東半島に人が移動し在来民と交配していく過程が明らかとなった。さらに石器の分析により、石器もこの段階から膠東半島から遼東半島への伝播が存在することが証明された。さらに東北アジア農耕化第3段階である岳石文化期には、多様化した加工斧と農具が伝播しており、木製農具などの定型化した農具と水田など灌概農耕が、この段階に人の動きとともに膠東半島から遼東半島へ拡散した可能性が高い。なお、形質人類学的な分析では限られた資料数のため人の系統に関する決定的な証拠を得ることはできなかった。1.山東半島南海岸から東端にかけて、龍山文化の遺跡の地形環境や立地条件を調査するため、研究メンバーほぼ全員による踏査(ジェネラルサーベイ)を行った。また集落遺跡周辺の生産遺跡の存在を立地条件から推測することとし、特に水田の存在の可能性を注目した。さらにGPSで遺跡の位置を記録し、遺跡のGIS分析のための基礎資料を収集した。2.この踏査の際に、龍山文化の各遺跡で黒陶片を採集し、小池裕子を中心とするグループが黒陶内の炭素の安定同位体分析を行った。その結果、山東半島南海岸では、C3植物とC4植物が黒陶の製作に使われている可能性があるが、南海岸でもより南に行くに従いC3植物である稲籾を使っている可能性が高まった。3.山東半島の東端に位置する楊家圏遺跡の調査を行った。この遺跡は龍山文化期のコメが検出された中国大陸の東端に位置し、山東半島東端部を弥生時代の水田の起源地として我々は推定している。しかし現状では水田などの生産遺跡は未だ発見されていない。そこで、イネの生産の可能性のある楊家圏遺跡で、地形環境から推定した生産地域をボーリング調査することとした。合計50ヶ所あまりのボーリングで土壌を採取した。それを分析した宇田津徹朗の初歩的分析結果によると、地表下2メートルの地点で、安定的にイネのプラントオパールが検出できた。

現在、ボーリング土壌内の炭素年代測定を行っており、年代の特定が待たれるが、龍山文化時期の可能性が高く、水田土壌である可能性が高い。4.山東半島東端である膠東半島を弥生時代稲作農耕の起源地と考える根拠の一つに、弥生時代の農工具である石器の形態や種類の祖形が膠東半島にあると考えるからである。しかし比較資料がこれまでごく少数にとどまっていた。そこで、膠東半島の龍山文化や岳石文化を中心とする新石器時代の石器の実測調査を行い、資料を収集することとした。これは主に宮本一夫が中心に行い、石器資料の写真と実測を150点以上行い、基礎資料を充実させた。5.また、このような弥生時代水稲農耕起源地に関しては人の動きが注目される。そのため古人骨の形質学的分析を行うこととし、中橋孝博を中心として丁公遺跡の古人骨資料の分析を開始した。6.さらに、比較資料として水田遺跡である韓国春川市泉田里遺跡で調査を行うとともに、UCLA大学で調査成果の報告を行った。1.山東大学、煙台市博物館の研究者とともに、日本における水田調査の実体を知るため、大阪や三重県での水田発掘調査現場に赴き、共同してその調査法や問題点を把握し、今後の調査に生かそうと試みた。2.山東省龍山文化期から商代にかけての遺跡である丁公遺跡の出土古人骨資料を、昨年に引き続き形質人類学的計測調査を行い、ほぼ全個体数の計測を終え、分析中である。3.山東済南市大辛荘商代墓の古人骨の歯における歯冠計測を行い、縁家族関係が被葬者集団間に存在するかなど、家族や集団構造に関する分析を行った。4.山東楊家圏遺跡で昨年ボーリング調査を行い、プラントオパール分析を行った結果、谷部で稲作を行っていた可能性が高いことが明らかとなった。そこで、今年度は谷部の一部にトレンチを入れ、試掘調査を試みた。その結果、水田耕作面は龍山文化期に属する可能性が想定された。また、水田耕作面は平坦面を形成しており、さらに畦畔状の高まりが認められた。平面的な発掘を行っていないため、最終的な判断は難しいが、畦畔をもつ無文土器時代や弥生時代の水田が山東半島に存在する可能性が高まった。もし、これが正確であるならば、弥生文化の水田の起源は山東半島になることになり、大発見となる。引き続き全面発掘調査への努力が必要である。なお、試掘調査時には合わせてボーリングの補足調査も行った。なお、昨年度のボーリング調査におけるプラントオパールの分析成果は、中国の権威ある雑誌『考古』に今年中に掲載される予定である。5.山東半島の東端である膠東半島の先史時代の石器の実測・写真撮影の調査を昨年に引き続いて実施した。150点あまりの石器を資料化することができ、本地域の比較資料の集成を行うことができた。6.山東龍山文化の黒陶の安定同位体分析を昨年に引き続き行い、その結果、山東の北部ではアワ・キビ、山東半島の南岸部ではイネが主体であるという生業の差を示すことができつつある。7.山東の先史農耕との比較を行うため、長江上流の四川盆地における先史農耕文化に関して現地観察を行った。1.畠遺構や水田遺構が発見されている韓国無文土器時代の発掘調査状況を把握するため、科研研究グループと山東大学の研究協力者によって合同で韓国において2006年8月に踏査を行った。高麗大学古環境考古研究所ではセミナーを行うなど、韓国の研究者を含めた三カ国の研究者によって、東北アジアにおける農耕の伝播に関する最新の研究情報を交換することができた。
虚血後の再潅流障害における白血球の関与(微小循環における検討)

<目的>虚血・再潅流時の臓器障害を白血球と血管内皮相互作用の面から検討する。さらにその相互作用に及ぼすエンドトキシンの影響についても同様の方法を用いて調べる。<実験方法>ゴ-ルデンハムスタ-の背部に観察用のskin fold chamberを装着し、同時に内頚動脈と外頚静脈にカテ-テルを挿入した。手術後48時間以上の回復期をおいた後chamber内を圧迫することにより組織を虚血状態とし、2時間後に虚血解除した。観察は虚血開始前1時間、再潅流後30分、2時間、24時間に行い、生体顕微鏡を用いて細静脈での白血球の血管壁への粘着の程度を観察した。白血球の染色にはacridine orangeを用いた。同時に血流速度、血管径を測定した。エンドトキシン(0.1μg/kg)は虚血開始10分前に静脈内投与し、生理食塩水を投与したコントロ-ル群と比較した。<結果>(1)細静脈の血管径は両群共に再潅流30分後より拡張が認められ、24時間後まで血管径の増加が持続した。(2)細静脈の血流速度は両群で再潅流30分後より低下が認められ、24時間後にも回復は見られなかった。(3)単位面積あたりの血管壁に粘着する白血球数は生理食塩水投与群では再潅流30分後より増加し、2時間まで持続して24時間後にほぼ虚血前の状態に回復した。エンドトキシン投与群では生理食塩水投与群に比べて2時間後で粘着する白血球が有意に増加しており、また24時間後の回復も生理食塩水投与群に比べて遅延がみられた。<結論>虚血・再潅流後早期より微小循環不全が起こり、その機序の一つとして白血球と血管内皮相互作用の関与が示唆された。またエンドトキシンはその作用を増強する可能性があると考えられた。
経頭蓋磁気刺激による運動関連領野機能の解明および治療応用に関する研究

今年度は、経頭蓋磁気刺激(TMS)によって得られる筋電図反応(MEP)の波形解析を行うことにより大脳機能についてより詳細な検討が行える可能性を示した。前年度には、MEPの大きさを主要な評価項目に用いて補足運動野(SMA)と一次運動野(M1)との関連を明らかにしたが、MEPは様々な脳内過程から生じる複合的な反応であるため、MEP形成にかかわる個々の成分に関する情報を得ることが望ましい。本研究では、独立成分分析(ICA)をMEP波形に対してほどこすことで、M1から脊髄を下行する活動に対応する成分が抽出できることを示唆した(第42回日本臨床神経生理学会学術大会において招待講演として発表)。本内容は当初の研究計画では必ずしも明示的に述べていないが、MEPをもちいてTMS研究を行う場合により精密な解析が可能になるという点で画期的と考えている。以上、当初計画から派生した研究において重要な知見が得られたと同時に、当初計画についても学会発表を行えるレベルのデータが得られるなど、順調に研究が進展した。当初予定した計画からのスピンオフとして、TMS-MEP実験系における重要な解析手法となりうる方法を開発したため。また、当初予定についても過去の病巣研究を裏付ける形でrTMSの効果を示唆することができたため。反復TMSが反応時間に与える影響については、過去の病巣研究を裏付ける結果が得られており、今後は論文発表につなげると同時に、反応時間課題遂行中にTMSを施すことでどのような結果が得られるかなど、さらに詳細な検討を行う予定としている。実際の治療応用を見据えた臨床研究についても関与を深めてゆきたい。1年度目に当たる本年度は、健常人を対象に補足運動野(SMA)に対する単発経頭蓋磁気刺激(TMS)の効果を、一次運動野(M1)に対するTMSにより誘発される筋電図反応である運動誘発電位(MEP)の大きさを指標として主に検討した。一般には同じ強度の刺激に対するMEPの大きさがM1の興奮性を反映すると考えられているため、様々な刺激条件下でのMEPの大きさを比較することにより、当該刺激がM1の興奮性にどのような影響を与えたかを推察することが可能である。M1内には、TMS二発刺激法により明らかとなる様々な抑制性・促通性の神経回路が存在することが知られており、M1単発刺激に対するMEPの大きさのみならずこれらの回路の挙動をも調べることにより、SMAに対する単発TMSがM1に与える影響をより詳細に検討できると考え研究を遂行した。その結果、SMAに対するTMSは主としてM1内の促通性神経回路の働きを増強させることを示唆するような結果が得られた(論文修正中)。一方で、SMA刺激は、M1単発刺激に対するMEPの大きさを変えず、M1内の抑制性神経回路にも影響しなかった。過去の動物実験からは、SMA内の神経細胞に対する電気刺激がM1の神経細胞に対して与える影響のうちで最も短潜時のものは促通性であることが知られており、今回の結果はこのような動物実験の結果をヒトで裏付けるものと考えられた。更に、2年度目に向けた予備的な検討として、SMAに対する反復TMS(rTMS)が運動課題に対する反応速度に与える影響につき検討した。視覚的キューを元に右か左かを判断するような比較的単純な課題においては、rTMS前後で有意な反応時間の変化を生じないことを示唆する実験結果が得られており、2年度目に向け基礎的な知見が得られた。「研究の目的」のうち、運動誘発電位(MEP)を測定項目として補足運動野(SMA)に対する経頭蓋磁気刺激(TMS)の効果を検討する部分については、主要なデータを得て論文投稿に至っており、当初の予定通り研究が進んでいると考えられるため。また2年度目の研究に関する予備的な検討を行う予定であったが、これについても進展が見られたため。補足運動野(SMA)に対する反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)が反応時間課題に与える影響を検討すべく、さらに健常被験者を対象とした研究を継続する。「研究計画」にある機能画像や脳波との関連を検討する前に、1年度目に行った運動誘発電位(MEP)振幅の検討をさらに推し進めて、筋電図波形そのものの解析を行う可能性がある。

反復TMSが反応時間に与える影響については、過去の病巣研究を裏付ける結果が得られており、今後は論文発表につなげると同時に、反応時間課題遂行中にTMSを施すことでどのような結果が得られるかなど、さらに詳細な検討を行う予定としている。実際の治療応用を見据えた臨床研究についても関与を深めてゆきたい。
ドイツ連結申告納税制度論の研究

先進工業国のなかで、ドイツ税制は、租税法律主義のもとで連邦議会によって制定される異なった税によって構成されている。そのなかに法人税制も存在しており、法人の事業活動に対して課せられる単一税でなく多様な法人の税負担のなかの1つとして法人税がある。法人の税負担は、所得、資本、消費を課税ベースとして行なわれるが、法人税は、法人の所得を課税ベースとしている。近年、この法人課税ベースに関して、ヨーロッパ連合加盟国域内で税制のハ-モナイゼーションが起きている。それは、ヨーロッパ連合加盟国において、企業結合が進んできたことを背景とした税制の調和化であるが、ドイツにおいても、このヨーロッパ税制調和化を受けて、税制の再編が焦眉の課題となっている。法人格を有する企業は、法人税の対象とされ、株主が自然人であれば、所得税、そして、法人が株主であれば、法人税が課せられるが、法人税の課税ベースである所得の算定は、所得税法に適用されるのと同じ企業会計の方法が原則として準用される。この法人税のなかで、企業結合の課税システムとして、ドイツで認められているのが機関制度(オルガンシャフト/0rganschaft-Fical Unity)と呼ばれるものである。機関制度とは、親子会社の課税関係を捉えるために設けられたもので、親会社と子会社がドイツ国内で事業活動行い、子会社が財務的、経済的及び組織的に親会社に編入され、さらに、親子会社の間に5年間の利益供与契約が締結されていることを要件として、子会社の損益を親会社に移転させ、親会社側で損益合算をして、親会社が納税の義務を負うというドイツ方式の連結納税制度である。ドイツの法人税制のなかで企業集団に対する現行課税方式が単独納税方式によっているが、これはヨーロッパ連合加盟国のなかでむしろ少数派に属している。今年度の研究は,このドイツの企業集団課税がヨーロッパの他の国に比べてどのような特徴があるか、またドイツが現在どのような法人税制に向かおうとしているのか、この2点について取り上げた、つぎのような成果を挙げることができた。(1)ドイツは単独納税方式のもとで、企業集団課税方式として、機関制度納税方式と呼ばれる独自のシステムを採用している。これは、ヨーロッパ連合のなかでも特異な課税システムである。企業集団課税方式として、一般の採用されている連結納税方式とは計算構造的に違ったものである。この点の研究成果として、「ヨーロッパにおけるコンツェルン課税方式とドイツ税制の特徴」(産業経理、第55巻2号、1996年)を発表した。(2)ドイツの機関制度納税方式に関する研究を進め、連結納税方式との違いとして、親子会社関係の課税所得計算がそれぞれの単独決算をベースとした合算所得課税にその特徴があることを明らかにすることができた。連結決算ベースの連結納税方式でなく、機関制度納税方式がなぜドイツで採用されているのか、連結納税方式導入がどのような問題点をドイツ税制に投げかけているのか、これらの点を研究することで、わが国における今後の議論への新たな論点を提供することができた。この研究成果として、「連結納税方式めぐるドイツの論点とわが国制度へのインプリケーション」(JICPAジャーナル、第8巻5号、1996年、発表予定)を纏めることができた。先進工業国のなかで、ドイツ税制は、法人税制のなかに企業集団課税システムを設けている国の1つである。近年、この企業集団課税システムに関して、ヨーロッパ域内の税制のハ-モナイゼーションが起き、グローバルな企業集団に対する課税ベースの算定方式をめぐって議論が起きている。本研究では、この企業集団課税システムのドイツ方式を取り上げ、そこでの検討課題を考察し、我が国における企業集団税制の整備に向けたアカディックな論点を以下の2点について明らかにしている。第1に、ドイツは単独納税方式を原則として採用するとともに、企業集団課税システムとして、機関制度納税方式を特例的に認めている国である。

この機関制度納税方式とは、親子会社の課税関係を捕捉し、親会社と子会社がドイツ国内で事業活動行い、子会社が財務的、経済的及び組織的に親会社に編入され、さらに、親子会社の間に5年間の利益供与契約が締結されていることを要件として、子会社の損益を親会社に移転させ、親会社側で損益合算をして、親会社に納税の義務を負わせるというものである。本研究では、この機関制度納税方式というドイツの企業集団課税システムの特徴が親子会社間の内部取引の消去を認めていない点で、欧米各国が採用している連結納税方式と決定的に異なっていることを明らかにしている。第2に、機関制度納税方式から連結納税方式への以降に関して、ドイツで検討されている機関制度修正方式が内部取引の消去をも認めるかたちで、実質的に連結納税方式と変わらないことを明らかにしている。これは、「機関制度のヨーロッパ化」と呼ばれ、国境を越えた企業集団課税にも適用が可能である。本研究の成果として、「ヨーロッパにおけるコンツェルン課税方式とドイツ税制の特徴」(『産業経理』産業経理協会刊、第55巻第2号、1996年)及び「連結納税方式をめぐるドイツの論点と我が国制度へのインプリケーション」(『JICPAジャーナル』日本公認会計士協会刊、第8巻5号、1996年)の2つの論文を公刊することができた。
アンチセンス核酸の活性と水素結合の機能の研究

核酸の分子認識にはワトソン-クリック型水素結合が重要な役割を果たしている。これが複製や転写の機構の基本であることは論を持たないが、一方ではアンチセンスRNAというメッセンジャーRNAと相補的RNAが遺伝子の発現調節を行なっていることが発見されている。人工的に外部から相補的なオリゴヌクレオチドを加えて遺伝子やメッセンジャーRNAの発現を抑制する試みも行なわれているが、その際の水素結合形成についての詳細な研究はほとんどない。本研究は塩基配列の差による水素結合の性質の変化などを合成誘導体を用いて、分光学的方法などによって詳細に調べることを目的とし、有機化学者と物理学、生物学、臨床医学の専門家との討論を重ねた。その経果、RNA及びその誘導体の構造研究、非典型的核酸の高次構造の研究が必要であることが明かとなった。それらの研究には核酸合成を中心とする化学が、重点領域研究申請に向けて、研究課題とすべき問題点を討論した。同日午後には、研究課題のシンポジウムを行なった。演題は次ぎのとおりである。「核酸構造の多様性と水素結合」(阪大・蛋白研・教授・京極好正)「リボザイムの機能構造とその分子進化」(京大・理・教授・井上丹)「アンチセンス核酸の分子設計とその機能」(京都工繊大・繊維教授・村上章)「HIV-1ウィルス発現抑制剤としてのアンチセンス核酸への期待」(東京医科歯科大・医・教授・山本直樹)核酸の分子認識にはワトソン-クリック型水素結合が重要な役割を果たしている。「核酸構造の多様性と水素結合」(阪大・蛋白研・教授・京極好正)「リボザイムの機能構造とその分子進化」(京大・理・教授・井上丹)「アンチセンス核酸の分子設計とその機能」(京都工繊大・繊維教授・村上章)「HIV-1ウィルス発現抑制剤としてのアンチセンス核酸への期待」(東京医科歯科大・医・教授・山本直樹)
クライオストップトフローX線散乱法による蛋白質フォールディング初期中間体の解析

今回の重点研究の私の研究課題はフォールディング初期中間体として表出すると思われる2次構造形成過程と球状化過程を-50°C近くの温度環境下で直接検出しようとする試みである。2次構造形成は,もしそれがヘリックス・コイル転移速度と同じとすれば,常温でμsのオーダーと思われる。これは温度を下げることにより,遅くすることが可能(?)で、-50°C付近まで下げられれば,ストップフロー法の不感時間(数ms)内で充分観測可能となることが期待される。以上の問題意識に則って,今年は次のような研究を行った。(1)-50°Cにおける蛋白質のフォールディングの研究のために,CDとX線散乱用の装置を組み立てた。ストップトフローCDについては,既に組み立て終えた。一方,ストップトフローX線散乱装置については,1月末に組み立てが終わった。装置の性能テストが当面する課題である。(2)ポリペプチド溶液をモデル物質そひて,コイル→ヘリックス転移をヘリックス安定溶剤を用いて起こさせ,ヘリックス・コイル転移をストップトフローCD法で検出すること,ミオグロビンを対象に,低温においてフォールディング,アンフォールディングをおこさせるよい条件を探すこを試み始めている。まだやっと手がけ始めたところで,現在の所,報告できる成果はまだない。場合によっては,ヘリックス安定剤(例えば,トリフルオロエタノール)を加えることにより,フォールディングをさせる必要があると思われる。
小分子RNAを含むリボヌクレオプロテイン複合体の機能の構造基盤の解明

高度好熱菌Thermus thermophilusに由来するtRNAメチル化酵素TrmFOの結晶構造を決定し,TrmFOが葉酸/FAD依存的にtRNA U54をメチル化する反応メカニズムを解明した.好熱性古細菌PyrocuccushorikoshiiとMehtanococcus jannaschiiに由来するtRNA修飾酵素TYW2の結晶構造を決定し,TYW2がS-アデノシルメチオニンのα-アミノα-カルボキシプロピル基をtRNA imG-14に転移する反応メカニズムを解明した.高度好熱菌Thermus thermophilusに由来するtRNAメチル化酵素TrmFOの結晶構造を決定し,TrmFOが葉酸/FAD依存的にtRNA U54をメチル化する反応メカニズムを解明した.好熱性古細菌PyrocuccushorikoshiiとMehtanococcus jannaschiiに由来するtRNA修飾酵素TYW2の結晶構造を決定し,TYW2がS-アデノシルメチオニンのα-アミノα-カルボキシプロピル基をtRNA imG-14に転移する反応メカニズムを解明した.ショウジョウバエの生殖細胞で発現するpiRNAは、Piwiサブファミリータンパク質と結合し、レトロトランスポゾンの発現抑制を介して、生殖細胞の新生と維持に関与する。piRNAの3'末端2'-OH基は新規のメチル化酵素Pimetによりメチル化されることが報告されているが、その機構はまったく不明である。そこで、PimetがpiRNAを認識して、メチル化する機構を明らかにすることを目指し、結晶構造解析を推進した。ショウジョウバエ由来Pimetを、N末端にHis-tagを付加して大腸菌で大量発現させ、Ni-NTAカラム、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いてSDS-PAGEで単一になるまで精製することに成功した。PimetはS-アデノシルメチオニン(SAM)をメチル基供与体として3-26塩基長piRNAの3'末端2'-oH基を配列非特異的にメチル化することが報告されている。そこで精製したPimetを用いて、(1)Pimet単独、(2)SAM存在下、(3)SAMと一本鎖RNA存在下で結晶化条件のスクリーニングをおこなった。しかし、全く結晶は得られなかった。そこで、保存性が低くディスオーダーしていると予想されるC末端部分を削った種々のコンストラクトを作製し、大腸菌で発現を検討し、C末端を40残基削った変異体が全長と同様に発現することを見出し、単一になるまで精製することに成功した。精製したPimet変異体を用いて、結晶化条件のスクリーニングを行っている。ショウジョウバエPimetに加えて、ヒト由来Pimet、マウス由来Pimet、およびディスオーダー領域が少ないと予想された昆虫Tribolium castaneum Pimetに関して、大腸菌での発現を検討した。しかし、ショウジョウバエPimetと異なり、どれも可溶性が低く精製途中で沈殿してしまうことがわかったグラム陽性細菌ではフラビン酵素TrmFOが5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸(MTHF)をメチル基供与体としてT54形成を触媒する.しかし,その触媒機構は不明だった.そこで,高度好熱菌由来TrmFOの結晶構造を決定し,TrmFOが2つのドメインからなり,基質MTHFがFADの近傍に結合することを明らかにした.変異体解析を行い,ドメイン間のクレフトにtRNAが結合し,基質MTHFからメチル基が転移される反応機構を提唱した.TrmFO酵素は広く細菌に分布していることから,抗菌剤開発へとつながる可能性も期待される.TYW2酵素はS-アデノシルメチオニン(SAM)のα-アミノα-カルボキシプロピル基(acp基)を,三環構造をもつ塩基imG-14に転移し,塩基yW-86を合成する.通常のメチル化酵素(MTase)と異なり,TYW2がSAMのメチル基ではくacp基を基質に転移する機構は謎だった.そこで,古細菌由来TYW2の結晶構造を決定し,立体構造に基づいた変異体解析を行い,TYW2の全体構造は通常のMTaseと類似しているが,SAMのacp基を基質分子に転移するのに適した構造をもつことを明らかにした.本研究により,活性部位構造のわずかな違いが,TYW2とMTaseの全く異なる酵素活性を規定していることが判明した.ショウジョウバエAGO1,PIWI,AUB,AGO3を含む複数の真核生物由来Argonauteタンパク質を、バキュロウイルス/Sf9昆虫細胞系でHis-tag融合蛋白質として発現させ,NiNTAカラムで可溶性画分に精製することに成功した.ショウジョウバエに由来するAGO1,AGO2,PIWI,AUB,AGO3,ヒトに由来するAGO1,回虫に由来するAGO,カビに由来するAGO,酵母に由来するAGO1を含む複数種類のArgonauteタンパク質のN末端にHisタグ,Strepタグ,TARGETタグなどのアフィニティータグを付加してSf9昆虫細胞やショウジョウバエS2細胞を用いて発現を試みた.その結果,Sf9昆虫細胞においていくつかのAgoタンパク質を可溶性画分に発現させることに成功した.N末端に付加するタグの種類によってAgoタンパク質の発現はおおきく変化することがわかった.今後はコンストラクション,発現条件(培養時間,培養温度感染させるバキュロウイルスのタイターなど)のさらなる検討を行うことによって結晶化実験に十分なAgoタンパク質を調製することを目指す.ショウジョウバエに由来するDicer1のN末端にHisタグを付加して大腸菌やSf9昆虫細胞を用いて発現を試みた.

全長に加えて,ヘリカーゼドメイン,二本鎖RNA結合ドメイン,PAZドメイン,RNaseIIIドメインを含む複数種類の領域の発現を試みた。その結果,どの領域も大腸菌で発現させると不溶性画分に蓄積することがわかった.今後はさらにコンストラクションを作製するとともに,Sf9昆虫細胞での発現条件の検討を行い,結晶化実験に十分なDicerタンパク質を調製することを目指す.