hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス遅発性脊髄障害への硫化水素吸入の治療効果

マウス遅発性脊髄障害モデルは、大動脈の5分間遮断により作成し、その24時間後に硫化水素ガス80ppmを5時間吸入させた。治療効果の評価は、神経学的機能、病理組織学的評価により行った。この吸入療法により、約70%のマウスが遅発性脊髄障害を発症することなく経過した。病理組織学的に対照群と硫化水素吸入群で比較したところ、対照群で虚血後30時間目にアポトーシスの指標である活性型カスパーゼ3が発現したが、硫化水素吸入群ではその発現が認められなかった。さらに、培養細胞を用いカスパーゼ3の活性化に及ぼす硫化水素の影響を検討した結果、カスパーゼ3のs-sulfhydration化によりその活性が抑えられた。また、一酸化窒素合成酵素の活性化によりNO合成を介してカスパーゼのs-ニトロ化によるカスパーゼ活性抑制も認められた。また、硫化水素の代謝酵素であるローダネースにより産生されるチオ硫酸による脊髄神経保護効果も考慮され、遅発性対麻痺モデルにチオ硫酸を投与したが、遅発性脊髄神経保護効果は認められなかった。これらのことから、硫化水素による脊髄神経保護効果は、硫化水素分子それ自体あるいは一酸化窒素を介したアポトーシス関連因子であるカスパーゼ3の活性抑制が関与し、硫化水素の代謝産物であるチオ硫酸による効果は少ないと思われた。硫化水素吸入による細胞保護効果については、硫化水素本体の効果のみならず一酸化窒素を介した効果であるという報告もある。そこで一酸化窒素合成酵素の遺伝子改変マウスを用いることで特に誘導型一酸化窒素合成酵素が硫化水素による細胞保護効果に必須である可能性を示唆できた点で、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。硫化水素の神経細胞保護効果に誘導型一酸化窒素合成酵素が関与している可能性を示唆する結果を得ることができたことから、今後は免疫組織学的検討により硫化水素吸入マウスから摘出した脊髄において誘導型一酸化窒素合成酵素が誘導されているか確認する。さらに、合成された一酸化窒素がいかなるメカニズムにより細胞保護効果に寄与しているか、その下流の蛋白シグナルについて分子生物学的に検討する24年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周病発症におけるTRPチャネルを介した口腔上皮バリア機能破綻の関与

ヒト口腔上皮細胞株にRT-PCR法並びにカルシウムイメージング法を用いてTRPチャネルの発現を解析した結果、TRPV3並びにTRPV4の発現を認めた。ヒト口腔上皮細胞株を用いた3次元培養モデルを構築した。分化誘導後に雪片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い形態を観察した結果、顆粒層と角化層が観察されたが、角化層の厚さは薄く、角化の程度は弱いと考えられた。また、基底細胞層を除く正常扁平上皮細胞に発現するCK13で染色されることを確認した。この3次元モデルを歯周病原菌の1つであるPorphyromonas gingivalis(Pg菌)の死菌と共培養することで、in vitro歯周病モデルを作製した。まず、ヘマトキシリン・エオシン染色を行い形態を観察した結果、Pg菌群において上皮層の厚みが増大していたが、細胞間並びに層間に多くの間隙が認められた。このモデルの上皮細胞を摘出した後にRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。その結果、細胞増殖に関連する遺伝子群の発現量が上昇し、細胞間接着に関わる遺伝子群の発現量が減少していた。特にE-カドヘリンについて抗体を用いて免疫組織染色を行った結果、E-カドヘリンの発現がPg菌群で有意に低下していた。また、細胞増殖マーカーであるKi67についても抗体を用いて免疫組織染色を行った結果、Ki67陽性細胞数がPg菌群で有意に増加していた。Pg菌を共培養した3次元モデルに対する非選択的TRPチャネル阻害剤の作用を検討した結果、Pg菌群でみられた上皮層の厚みの増大が阻害剤によって抑制された。3次元培養系モデル並びに歯周病モデルの作製を行い、モデルにおける上皮細胞の変化を明らかにすることができたため。また、歯周病モデルにおけるTRPチャネルの役割を示唆する結果を得られたため、順調に進展していると考えられる。Lucifer Yellow並びにFITC-デキストラン等を用いて上皮バリア機能を評価する。OKF細胞の分化並びに細胞間接着に対する各TRPチャネルの活性薬もしくは阻害薬の作用を検討する。また、TRPチャネル発現量の変化をリアルタイムRT-PCR法並びにウエスタンブロット法を用いて検討する。また、遺伝子導入によるTRPチャネル過剰発現、siRNAによるノックダウンによるTRPチャネル発現量の違いと分化並びに細胞間接着の関係を検討することで、TRPチャネルの役割を明らかにする。TRPチャネル発現量変化、TRPチャネル遺伝子発現操作を次年度に実施することとなったため、次年度に使用することとした。
分子生物学的手法による植物栄養診断法の確立

これまでの研究は、主に様々な濃度のホウ素イオンや硫酸イオン濃度で成育させた植物よりmRNAを抽出し、これらとコントロールの植物より抽出したmRNAをもちいて、DO(ディフレンシャルディスプレイ)法による遺伝子断片の単離を目指してきた。また、特にイオウ応答プロモーターの解析によるイオウ欠乏症状の迅速な検出法の確立を目指してきた。これまでに、過剰のホウ素イオン存在下で成育させた植物中で発現が抑制される遺伝子断片が得られた。この遺伝子の塩基配列を決定したが相同性のある遺伝子は知られておらず、機能の推定には至っていない。しかしながら塩基配列の情報を基に、RT-PCR用のプライマーを合成できた。ノーザンハイブリの結果より、確かにこの遺伝子は、ホウ素イオンにより遺伝子発現が調節されていることが確認された。したがって、合成したプライマーを利用して、さまざまな地域から採取してきた植物が、どのようなホウ素栄養下で生育してきたものであるかを知る手がかりができた。また、砂地などホウ素が欠乏しやすい土壌で生育している植物における本遺伝子の発現状況をRT-PCRで簡便に確認することで、植物がおかれている栄養状況を知り、さらに適切な施肥をおこなうタイミングを知ることができるようになる。イオウ欠乏症状検出系には、イオウ欠乏応答性のプロモーターの単離とこのプロモーターにGUS遺伝子を連結して作成した遺伝子で形質転換した植物を使用できるようになった。作成した形質転換植物を利用することがイオウ欠乏の程度を簡単な染色により検出できる系が確立できる。これまでの研究は、主に様々な濃度のホウ素イオンや硫酸イオン濃度で成育された植物よりmRNAを抽出し、これらとコントロールの植物より抽出したmRNAをもちいて、DD(ディフレンシャルディスプレイ)法による遺伝子断片の単離を目指してきた。したがって,合成したプライマーを利用して,さまざまな地域から採取してきた植物が,どのようなホウ素栄養下で生育してきたものであるかを知る手がかりができた。また,砂地などホウ素が欠乏しやすい土壌で生育している植物における本遺伝子の発現状況をRT-PCRで簡便に確認することで,植物がおかれている栄養状況を知り,さらに適切な施肥をおこなうタイミングを知ることができるようなる。ただ,問題点は,得られた遺伝子がシロイヌナズナからのものであり,他の植物でも同様に発現調節されていることを確認しなければならないことであり,遺伝子のレベルで植物の栄養診断を行えるかどうかは慎重に検討する必要がある。さらに,イオウや他の微量要素についても遺伝子レベルで栄養診断を行えるための遺伝子単離を継続している。これまでの研究は、主に様々な濃度のホウ素イオンや硫酸イオン濃度で成育させた植物よりmRNAを抽出し、これらとコントロールの植物より抽出したmRNAをもちいて、DD(ディフレンシャルディスプレイ)法による遺伝子断片の単離を目指してきた。

また,砂地などホウ素が欠乏しやすい土壌で生育している植物における本遺伝子の発現状況をRT-PCRで簡便に確認することで,植物がおかれている栄養状況を知り,さらに適切な施肥をおこなうタイミングを知ることができるようになる。イオウ欠乏症状検出系には、イオウ欠乏応答性のプロモーターの単離とこのプロモーターにGUS遺伝子を連結して作成した遺伝子で形質転換した植物を使用できるようになった。作成した形質転換植物を利用することでイオウ欠乏の程度を簡単な染色により検出できる系が確立できる。
プロテアーゼインヒビターの阻害活性調節機構

安定同位体ラベル不活性型シスタチンA(Gly4-Val)の構造解析組換え体シスタチンAは大腸菌を用いた発現系を利用して調製した。安定回位体ラベルは、培地に[^<15>N]-NH_4Clおよび[^<13>C]-glucoseを栄養源として加え、発現されるシスタチンA分子に導入した。純化したシスタチンAを試料に、一連の多核種・多次元NMRを測定し、各シグナルを帰属した。NOEから得られる距離情報を基に、溶液構造を求めた。既に得られている野生型の平均構造は今回の不活性型の構造より精度が低いので、野生型の構造の精密化を行った後、比較した。シスタチンAの阻害活性は保存された第1ループQxVxG配列に加え、アミノ末端領域と第2ループが適当な配置で反応部位を形成しなければ発現されない。しかし、不活性変異体のN末端領域は、導入されたVal-4残基の効果でC末端部分の疎水性の部分に引き寄せられ、第1ループから離れた位置に固定されていた。これに伴い、第1ループの立体構造が変化し、さらに構造変化は第2ループにも波及したため、反応部位全体の構造が大きく変化し、シスタチンAは不活性化したと考えられる。N末端4残基あるいはC末端3残基の欠失に伴ってシスタチンAは不活性化するが、これらの機構は課題として残った。プロテアーゼインヒビター、シスタチンAの阻害活性発現には、分子のアミノ末端領域が必須であり、申請者らによる一連の逐次欠失変異体の研究から、Pro3-Gly4残基の重要性が明らかとなった。野生型インヒビターの溶液構造解析の結果、シスタチンAのN末端部位はインヒビター分子のC末端領域の方向に向き、分子内で相互作用していた。また、シスタチンAのGly4をVal残基に変異させると失活し、これに伴って反応部位(Val48付近)の骨格構造が変化した。そこで本研究では、N-C末端領域間の相互作用が阻害にどの様な効果を及ぼすかを検討するため、はじめにC-末端領域に変異を導入して、活性の変化、およびこれに伴う構造変化の追跡を開始し、以下のような成果を得た。1.安定同位体ラベル効率の改善シスタチンAは大腸菌を用いて発現され、培地に[^<15>N]-NH_4Clおよび[^<13>C]-glucoseを栄養源として加えることにより、シスタチンAに安定同位体ラベルを導入する。発現したタンパク質の約半分は不溶化するので、抽出法、および巻き戻し法を再検討した結果、精製手順の大幅な簡略化とラベル効率の上昇(約2倍)が達成された。2.C-末瑞領域へのアミノ酸置換導入シスタチンAのC-末端領域Gly97をAla、Val、Phe、Tyrにそれぞれ置換した。これらの変異に伴う阻害活性の変化は現在解析中である。また同時に、N-C末端領域間をS-S結合で共有的に結合させた上で、N-末端3ないし4残基を欠失させたときの活性変化を追跡する目的で、Gly4あるいはGly5とGly97をそれぞれCys残基に置換した変異体の発現ベクターを構築している。シスタチンAを^<15>Nおよび^<13>Cラベルし、3次元NMRを測定した結果、N-末端領域には化学シフトの変化が観察されたが、反応部位付近には、顕著な変化は見られなかった。現在より詳細に検討中。
内包膜プロテイントランスロケーターによるプラスチドの機能発現とその制御機構の解明

プラスチドは植物の器官・組織を構成する様々な細胞中に、機能的にも形態的にも多様に分化して存在し、生育段階や環境変化による時間的かつ空間的な複雑な制御を受けている。多様なプラスチドの機能維持には、適した蛋白質セットが、適時に発現、適所に配置され、色々な制御を受けて機能しているからに他ならない。このような複雑な蛋白質社会を形成維持することは、単に遺伝子発現レベルの調節だけでは不可能で、転写翻訳後の様々なレベルでの調節が必要である。その重要なひとつが、プラスチドへ蛋白質を輸送し配置する分子装置プロテイントランスロケーターによるものである。しかし、特に内包膜のトランスロケーターTic複合体に関しては、その構成因子も制御機構も不明の点が多い。我々は、Ticの中核がTic20である事、複数のTic20ホモログが異なる発現様式を示し、基質特異性の異なるTic複合体を形成する事を明らかにし、また、同じく基質特異性の異なる外包膜のToc輸送装置との物理的および機能的連携を示唆するデータも得ている。特に本研究では、Tic複合体の構成の全容を解明し、内包膜・外包膜における協調的輸送制御機構や、それがプラスチドの機能維持に果たす役割を明らかにすることを目的とする。われわれは、シロイヌナズナTic20ホモログに関して、アフィニティ精製用のタグが付加された形で発現するTic20の改変遺伝子を導入したラインの確立および、そこから得られた単離葉緑体を材料に、Tic20複合体の大量精製をおこなった結果、まったく新奇なコンポーネント3種類を同定することに成功している。平成23年度の研究においては、これら新奇3種類のコンポーネントに関して、膜上の配向性や必須性を生化学的および遺伝学的手法により詳細に解析した。また、精製した複合体に関して、電顕観察や再構成実験を行なった。平成24年度においては、成果を論文として纏める作業を進め、8月末に投稿、10月のRevisionの際には、いくつかの追加実験を行った。その結果、本研究により得られた成果は、論文審査員や編集者にも高い評価を得る事ができ、国際誌サイエンスに掲載される事となった。われわれは、シロイヌナズナTic20ホモログに関して、アフィニティ精製用のタグが付加された形で発現するTic20の改変遺伝子を導入したラインの確立に成功し、そこから得られた単離葉緑体を材料に、Tic20複合体の大量精製をおこなった結果、まったく新奇なコンポーネント3種類を同定することができた。現在、新奇3種類のコンポーネントの詳細な解析を進行中である。

平成23年度の研究においては、これら新奇3種類のコンポーネントに関して、膜上の配向性や必須性を生化学的および遺伝学的手法により詳細に解析した。また、精製した複合体に関して、電顕観察や再構成実験を行なった。平成24年度においては、成果を論文として纏める作業を進め、8月末に投稿、10月のRevisionの際には、いくつかの追加実験を行った。その結果、本研究により得られた成果は、論文審査員や編集者にも高い評価を得る事ができ、国際誌サイエンスに掲載される事となった。
次世代拡散MRIおよび機械学習を用いた統合失調症新規診断基準の検討

一部の治療抵抗性/重症統合失調症患者において、ペントシジンが増加しピリドキサールが低下する、所謂「カルボニルストレス」が病態に関与するという日本独自の新しい知見が報告されている。本研究では、統合失調症と診断される患者のうちカルボニルストレス亢進が関連する一群を、次世代拡散MRI解析および機械学習を用いて同定し、カルボニルストレスと脳構造的・機能的結合性の異常、精神症状との関連を明らかにすることを目的とする。具体的には、a)カルボニルストレス関連マーカーの血中濃度測定を行い、b)次世代拡散MRI、心理検査との関連を調査し、c)機械学習を用いてカルボニルストレス亢進群の分離を試みる。
網羅的分子系統解析に基づく頭索動物亜門の種多様性と進化経路の解明

「ナメクジウオ系統研究プロジェクト」の最終段階として、本研究で新たに採集した試料とそれまでに入手し解析をすすめていたサンプルをあわせ、本動物群の3属すべてについて、ミトコンドリアDNA全ゲノム配列データにもとづいて、頑健な系統樹をえがくことができた。さらに、supermatrix法を駆使して解析をすすめた結果、隠蔽種9種を発見した。すなわち、全世界の約45個体群から、総計3属31種を分子系統学的に識別できたことになり、ナメクジウオ類全種の約8割を網羅していることになる。この膨大なデータを総合して分岐パターン解析することで、ナメクジウオ類全体の系統進化や多様化プロセスの解明が可能となり、本動物群の世界規模での種多様性把握にも大きく貢献することができる。繰越を行い、平成22年度にも研究を継続した。繰越分はおもに野外調査に支出した。1.標本採集:平成21年度は、21年5月にベトナム民主共和国ニャチャン、22年2月にオーストラリアシャーク湾(22年度計画を前倒し)、およびパラオ共和国(計画に追加)において、SCUBAによる潜水調査を実施した。前者では、Asymmetron lucayanum-species complex、Epigonichthys maldivensis(?)、およびBranchiostoma belcheri、オーストラリアでは、E. cultellus(?)とB. sp. cf. belcheri、そしてパラオではAsymmetronの他、E. cultellus(?)とB. malayanumを採集することができた。平成22年度は、22年9月にカナリア諸島・テネリフェ周辺およびセネガル共和国ダカール、23年3月にスリランカ共和国で野外調査を実施した。ダカールは当初の予定にはなかったものだが、カウンターパートが見つかったため、テネリフェから足を延ばした。テネリフェでは傭船して悪天候の中をドレッジし、またスリランカでは悪い海況のなかでSCUBA調査を強行したが、ともに標本は採集できなかった。他方ダカールでは、Branchiostoma属の2種を採集することができたが、B. senegalenseのタイプ産地(ダカール沖のゴレー島)が採集地に含まれていることは殊に意義深い。2.分子系統学的解析:上記標本を含め、Branchiostoma属の解析に重点を置いて実施した。一部の標本についてはミトゲノム全周の塩基配列を決定して頑健なバックボーンを構築し、そこに、多数のOUTで作成した系統樹を重ねた(supermatrix法)。その結果、B. belchieriの正体が確度高く明らかになるとともに、本属に多数の隠蔽種が存在することがわかった。3.研究発表:沖縄県那覇市で21年12月に開催された国際学会で、これらの成果の一部を発表した。また、論文投稿の準備をすすめた。1.標本採集:実施計画では、チリ共和国アントファガスタ周辺において野外調査を実施する予定であったが、現地研究者が予想外の好意で自ら標本採集を安価に請け負ってくれることになった。この結果、Branchiostoma sp. cf. elongatumの標本を入手した。他方、前年度繰り越し分で実施したセネガル共和国における調査の過程で、隣国ガンビア共和国での野外調査の伝手ができたので、計画を変更し、23年3月にガンビア調査を実施した。本海域から3種のナメクジウオが知られており、新規標本採集が期待された。予想外の海況悪化のなかでSCUBA潜水調査を強行したが、ついに良好な海底に辿りつくことができず、標本採集は成功しなかった。2.分子系統学的解析:カタナメクジウオ属Epigonichthysに重点を置いて、手持ちの多数の未解析資料の分析をすすめた。既知6種のうち5種(5地域個体群)について新たに決定したミトコンドリアDNAの全塩基配列(12,497塩基)による系統樹を作成してこれを頑健なバックボーンとし、そこに、他の地域個体群で決定した16SrRNA遺伝子部分塩基配列(565塩基)を加えて、supermatrix法による系統解析を実施した。その結果、インド-西太平洋に広く分布する2種のクレードと、オセアニア海域にのみ分布する3種のクレードの2つに深く分岐すること、また、これらのいずれの枝にも属さない系統(隠蔽種)が少なくとも2つあることが初めてわかった。3.研究発表:ナメクジウオ属Branchiostomaの系統解析結果を総まとめする論文発表は前年度からの課題であるが、補完的な解析を行いつつ原稿の執筆をすすめた。また、本年度のカタナメクジウオ属における研究成果(上述)については23年6月の日本動物分類学会・沖縄生物学会合同大会での発表、および論文執筆の準備をすすめた。

1.標本採集・入手:実施計画どおり、平成23年8月に、モルジブ共和国のハニマドゥ(ハー・ダール環礁)において、現地で傭船して潜水調査を行い、オナガナメクジウオ属のAsymmetron orientaleの新規標本を多数採集することに成功した。この地点は本種のタイプ産地であるから、オナガナメクジウオ種群隠蔽種(我々のプロジェクトで発見)の学名決定が可能となった。また、平成22年9月に採集をこころみたが成功しなかったカナリア諸島・テネリフェ島の当時傭船した会社から、たまたま採集できたとしてナメクジウオ属Branchiostomaの標本が好意で送付された。さらに、カタナメクジウオ属Epigonichthysの標本を沖縄島沿岸から新規に入手できた。2.分子系統学的解析:懸案のナメクジウオ属の系統解析結果を総まとめする論文については、上記のカナリア諸島産新規標本、および既に解析した個体群についても可能な限り個体数を増やして解析と系統地理学的議論をより精緻に行い、原稿をほぼ完成することができた。なお、上記ハニマドゥで採集した標本については解析を継続中である.また、カタナメクジウオ属についても、supermatrix法を使って昨年度にすでにほぼ完成していた本属の網羅的な分子系統樹に上記沖縄産標本の分子データを加えて解析した結果、本標本はE. cultellusのクラスターに入った。すなわち、本種の日本沿岸初記録であることが示された。この結果、日本沿岸にはナメクジウオ類が全部で6種生息することがわかった。3.研究発表:カタナメクジウオ属における研究成果(上述)は、平成23年6月の沖縄生物学会大会でポスター発表した。また、ナメクジウオ属の系統解析結果を総まとめする論文について、投稿を準備中である。
空間グラフのグラフホモロジー類の分類

与えられた空間グラフに対して,その空間グラフのdisk/band-曲面全体から得られる行列(ザイフェルト行列と呼ばれる)全体の集合はグラフホモロジーの完全不変量である.つまり,このザイフェルト行列の集合を分類することは,グラフホモロジー類を分類ことと同値である.ところが,このザイフェルト行列の集合は無限個の元からなるうえに有限の表示さえもできないので,このままではいささか扱いにくい.従って私は次の2つの条件に沿ってザイフェルト行列を制限し研究を進めた.1.空間グラフのdisk/band-曲面のトポロジカルタイプを1つに固定する.2.disi/band-曲面の1次元ホモロジー群の生成系を1つ固定する.これらの条件を考慮して得られるザイフェルト行列の部分集合に対して,本研究では次の新しい結果を得ることに成功した.[定理]上で得られた部分集合は,各成分が多変数の整数係数1次式からなる行列1個で表現できる.この結果により,本研究の目標は達成されたことになる.実際,空間グラフのグラフホモロジー類の分類問題は,整数係数の連立1次方程式が整数解をもつか否かに帰着できることがこの結果からわかる.与えられた空間グラフに対して,その空間グラフのdisk/band-曲面全体から得られる行列(ザイフェルト行列と呼ばれる)全体の集合はグラフホモロジーの完全不変量である.つまり,このザイフェルト行列の集合を分類することは,グラフホモロジー類を分類ことと同値である.ところが,このザイフェルト行列の集合は無限個の元からなるうえに有限の表示さえもできないので,このままではいささか扱いにくい.従って私は次の2つの条件に沿ってザイフェルト行列を制限し研究を進めた.1.空間グラフのdisk/band-曲面のトポロジカルタイプを1つに固定する.2.disi/band-曲面の1次元ホモロジー群の生成系を1つ固定する.これらの条件を考慮して得られるザイフェルト行列の部分集合に対して,本研究では次の新しい結果を得ることに成功した.[定理]上で得られた部分集合は,各成分が多変数の整数係数1次式からなる行列1個で表現できる.この結果により,本研究の目標は達成されたことになる.実際,空間グラフのグラフホモロジー類の分類問題は,整数係数の連立1次方程式が整数解をもつか否かに帰着できることがこの結果からわかる.
新しい致死性・神経向性ヘルペスウイルスの神経病原性に関する分子病態学的研究

本研究では新しいヘルペスウイルスであり,強い神経病原性を示すウマヘルペスウイルス9型(EHV-9)に焦点をあて,特異的な神経病原性を示す本ウイルスのウイルス増殖制御ならびに病原性発現に関わる遺伝子を明らかにすることを目的とした.(1)EHV-9ウイルスゲノムを細菌性人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome : BAC)としてクローニングするため,今年度はトランスポソン(Tn)による導入を試みた.TnにE. coli細胞で複製するために必要な遺伝子領域を組み込みTn-OriRを構築した.この複製領域はRプラスミドに由来する.このTn-OriRを試験管内でEHV-9ゲノムDNAに導入後,E. coliに形質転換した.その結果,BACとしてEHV-9ゲノムをクローニングできることがわかった.Tnであるため,特定の領域に導入することはできず,EHV-9ゲノム上の様々な部位にTn-OriRが挿入されたBACクローンライブラリーとして得られた.このライブラリーは各種遺伝子の機能解析に有用であると考えられる.今回得られたBACクローンについて,Tnが挿入された遺伝子の同定には至らなかったが,さらに解析を進めている.(2)EHV-9のgE変異体は完全に病原性を消失したが,復帰体は親株と全く同じ病原性を有することを確認した.この結果から,gE遺伝子産物が病原性発現に決定的な役割を担っていることが明らかになった.本研究により大型ウイルスゲノムをBACクローンする新たな手法が確立された.また,病原性発現に関与する遺伝子の一つを特定することができた.本研究では新しいヘルペスウイルスであり,強い神経病原性を示すウマヘルペスウイルス9型(EHV-9)に焦点をあて,特異的な神経病原性を示す本ウイルスのウイルス増殖制御ならびに病原性発現に関わる遺伝子を明らかにすることを目的とした.(1)EHV-9ウイルスゲノムを細菌性人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome : BAC)としてクローニングするため,今年度はトランスポソン(Tn)による導入を試みた.TnにE. coli細胞で複製するために必要な遺伝子領域を組み込みTn-OriRを構築した.この複製領域はRプラスミドに由来する.このTn-OriRを試験管内でEHV-9ゲノムDNAに導入後,E. coliに形質転換した.その結果,BACとしてEHV-9ゲノムをクローニングできることがわかった.Tnであるため,特定の領域に導入することはできず,EHV-9ゲノム上の様々な部位にTn-OriRが挿入されたBACクローンライブラリーとして得られた.このライブラリーは各種遺伝子の機能解析に有用であると考えられる.今回得られたBACクローンについて,Tnが挿入された遺伝子の同定には至らなかったが,さらに解析を進めている.(2)EHV-9のgE変異体は完全に病原性を消失したが,復帰体は親株と全く同じ病原性を有することを確認した.この結果から,gE遺伝子産物が病原性発現に決定的な役割を担っていることが明らかになった.本研究により大型ウイルスゲノムをBACクローンする新たな手法が確立された.また,病原性発現に関与する遺伝子の一つを特定することができた.ウマヘルペスウイルス9型(EHV-9)は動物園で集団発生したトムソンガゼルの脳炎から分離された新しいウイルスである.EHV-9は強い神経毒性と広い宿主域を有している.本研究ではEHV-9の強い神経向性および神経病原性のメカニズムを分子レベルで明らかにしようとしている.本年度は,ウイルス改変の基盤作りとして細菌性人工染色体(Bacterial Artificail Chromosome, BAC)としてEHV-9ゲノムを大腸菌にクローニングすることを目指した.BACクローニングを行なうため,初めに非遺伝子領域に発現マーカー遺伝子(緑色蛍光タンパク質遺伝子,Green Fluorescence Protein gene, GFP gene)を挿入した.このGFP発現カセットは両端にloxP配列を含んでいる.GFP発現カセットはORF62と63の間にある大きな非遺伝子領域のほぼ中央に挿入された.このウイルスをEHV-9-GFPとした.Cre組換え酵素を用い,EHV-9-GFPからGFP発現カセットを削除した.このウイルスはGFP発現カセットが挿入された部分にloxP配列を1コピー有する.これをEHV-9-loxPとした.Cre組換え酵素によりEHV-9-loxPへloxP配列をもつpBeloBACプラスミドDNAの挿入を行なった.しかしながら,本報告書作成までにBACが挿入されたEHV-9は得られていない.組換えの条件を種々検討している.本研究では新しいヘルペスウイルスであり,強い神経病原性を示すウマヘルペスウイルス9型(EHV-9)に焦点をあて,特異的な神経病原性を示す本ウイルスのウイルス増殖制御ならびに病原性発現に関わる遺伝子を明らかにすることを目的とした.(1)EHV-9ウイルスゲノムを細菌性人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome : BAC)としてクローニングするため,今年度はトランスポソン(Tn)による導入を試みた.TnにE.coli細胞で複製するために必要な遺伝子領域を組み込みTn-OriRを構築した.この複製領域はRプラスミドに由来する.このTn-OriRを試験管内でEHV-9ゲノムDNAに導入後,E.coliに形質転換した.

その結果,BACとしてEHV-9ゲノムをクローニングできることがわかった.Tnであるため,特定の領域に導入することはできず,EHV-9ゲノム上の様々な部位にTn-OriRが挿入されたBACクローンライブラリーとして得られた.このライブラリーは各種遺伝子の機能解析に有用であると考えられる.今回得られたBACクローンについて,Tnが挿入された遺伝子の同定には至らなかったが,さらに解析を進めている.(2)EHV-9のgE変異体は完全に病原性を消失したが,復帰体は親株と全く同じ病原性を有することを確認した.この結果から,gE遺伝子産物が病原性発現に決定的な役割を担っていることが明らかになった.本研究により大型ウイルスゲノムをBACクローンする新たな手法が確立された.また,病原性発現に関与する遺伝子の一つを特定することができた.
癒着性中耳炎の病態と術後変貌の相互関係

癒着性中耳炎モデル作製実験結果より次の結論を得た。耳管鼓室口の完全閉鎖のみでは癒着性中耳炎は作り得ない。中耳粘膜上皮のガス代謝の存在があるためと思われる、ガス代謝を消失さすための上皮剥脱、肉芽形成が必要となる。耳管の完全閉鎖では三種の病態が起こった。真珠腫、コレステリン肉芽腫、それと鼓膜肥厚と中耳腔の線維化であり、後二者の成因については今後追求すべきである。鼓膜癒着の経過は、耳管機能障害・中耳腔内滲出液貯留と感染の出現・粘膜上皮の剥脱と肉芽発生・ガス代謝の抑制・鼓膜脱線維化かつ膠原線維の増殖による肥厚→癒着という経過をとる。その間肉芽形成にともなう耳小骨融解が起こる。内耳窓窩には直ちに癒着は起こらず、濃縮された貯留液、その組織化が起こって肉芽形成の増殖を促す。この減少は感音難聴を促す原因となる。癒着鼓膜の上皮下は慢性炎症像を呈し、皮膚上皮基底細胞の粗面小胞体は発達し細胞表面に多くのpinocytesの像が見られる。基底膜は連続性であるが、細胞浸潤の部位では消失し基底細胞は突起を伸ばし、何物か放出しているようである。本症は幼児時代に発症し、病態は生涯続く。加齢と共に内耳窓よりの影響により感音灘聴が加わるので、壮年期に手術的に治癒させることが理想と言える。耳管鼓室口部分の開存がみられれば聴力改善は理論上可能である。聴力改善率の低い原因は術後の中耳、形成耳小骨ならびに鼓膜の変貌である。これらは耳管機能の低下、中耳粘膜の再生遷延、肉芽形成、中耳腔深度の不足、アブミ骨ないし、卵円窓の位置が中耳の辺縁に存在していること、等に基づく。これら不利な条件を除去するような手術の実施が望まれる。今後臨床病態の深い追求と実験モデルの作製ならびに手術手技の開発が望まれる。
火山と硫体との相互作用-活動的火口湖における諸過程の研究-

平成5年8月2日から9月6日までの期間、ロシア、カムチャッカ半島において、火山の熱水系の調査研究を行った。ロシア側からは共同研究者2名の他同国火山研究所の多数の研究員の協力が得られた。調査地域は主要都市であるペテロパブロフスク・カムチャツキ-市の南方に位置する活火山、ムツノフスキー火山火口およびその周辺の熱水帯、同市周辺の温泉鉱泉地域、同市北方のカリムスキー火山周辺の熱水帯、隣接のマリ-、セミアチク火山の火口湖の四地域である。当初予定したウゾンカルデラ地域はロシア側の事情で調査はできなかった。全体としてほゞ予定通りの日程で計画した調査を終了することができた。調査中の事故などは皆無であった。1.ムツノフスキー火山地域この火山の火口には、かつて火口湖が存在した。現在は湖底が露出し高温の火山ガスが放出されている。その中には泥水中に放出しているものも多数あり主としてガス一水相互作用を調べる目的で水および残ガスの採取を行った。火山ガス一水の反応で生じるポリチオン酸はこの地域の水のなかにはほとんど検出されなかった。これは水温が沸点と高く、pHは0.3という強酸性であるため、ポリチオン酸の安定生成条件をはづれているためと思われる。また水中への元素硫黄の析出がほとんど見られなかったことから火山ガスのSO_2/H_2S比が高いことも一因であろう。火山ガス中の^3He/^4He比は6.47.8(R/Ra)の範囲であった。2.ペトロパブロフスク周辺地域この地域の温鉱泉水の採水およびガスの採取を行った。ガスを伴うのは鉱泉であり、特にこの地域の地震予知に用いられている鉱泉3カ所のガスの採取を行い、^3He/^4He比を測定した。その比の範囲はであった。3.カリムスキー火山周辺地域カリムスキー火山南麗の低温の重炭酸鉄泉の採水およびガスの採取を行った。温泉水は単純泉であり特に特徴は見られなかったが温泉ガス中の^3He/^4He比は島孤としては異常に高い(8.078.66)値を示した。温泉自身は活動を長期中止した火山に特徴的な泉質を示しているが、ヘリウム同位体比は高いので、不治性ガスの注入があるものと思われる。この地域の希ガス同位体比の測定データはほとんど無く、今後のこの地域の火山活動の全体像を理解する資料として貴重である。4.マリ-.セミアチク火山地域1992年夏に第1回目の調査を行ったが、その調査を踏えてこの火山の山頂に存在する火口湖の観測を行った。火口湖の湖盆形態の調査を現地で組み立てたボ-トを使用して行ったが、まづ超音波測深器による連続深度測定を実行した。別にロープによる測深を行い、総合的な湖盆形態の把握が可能となった。この結果、この火口湖は直径550mのほゞ円形をしており、最大深度は117mであった。湖心やや西北よりの最深部よりガスが放出されており、このガスの採取も行われた。またこの最深部には溶融硫黄のプールが存在し、その温度は155°Cであった。昨年度は164°Cであった。湖水温度は昨年の10°Cから8°Cに低下している。また溶存ガス(湖水)のSO_2/H_2S比はやはり昨年度(2.33.2)から低下して0.0660.11の範囲となっている。つまりこの火口湖の活動は昨年より低下しているが、この傾向は1990年以降の一般的傾向と一致している。このことは湖水のポリチオン酸濃度変化にも現われており、さらにロシア側から提供された1986年以降の湖水試料および観測記録のつき合わせからも推測される傾向である。湖水の深度方向の重金属(V,Cr,Fe,Ni,Cu,Zn,Pb)の分布はほゞ均一であると言ってよいが、1020m付近および湖底でやゝ薄くなる傾向が認められた。1992年の夏の測定ではこの湖における硫黄バクテリアの活動は湖底の噴出孔付近の1点のみで認められたが、1993年夏の測定では湖のほゞ全域で活動が認められた。1993年夏のバクテリア濃度は10^4/ml程度であり、国内の火口湖におけるバクテリア濃度とほゞ同じくらいであることがわかった。湖底の噴出孔からのガスの^3He/^4He比はカリムスキー火山地域とほゞ同様であり、島孤地帯の値としては異常に高いことが明らかとなった。現在試料の分析がほゞ終了しているので、今後全体像、特に火口湖について、を構築してゆく。

当初予定したウゾンカルデラ地域はロシア側の事情で調査はできなかった。全体としてほゞ予定通りの日程で計画した調査を終了することができた。調査中の事故などは皆無であった。1.ムツノフスキー火山地域この火山の火口には、かつて火口湖が存在した。現在は湖底が露出し高温の火山ガスが放出されている。その中には泥水中に放出しているものも多数あり主としてガス一水相互作用を調べる目的で水および残ガスの採取を行った。火山ガス一水の反応で生じるポリチオン酸はこの地域の水のなかにはほとんど検出されなかった。これは水温が沸点と高く、pHは0.3という強酸性であるため、ポリチオン酸の安定生成条件をはづれているためと思われる。また水中への元素硫黄の析出がほとんど見られなかったことから火山ガスのSO_2/H_2S比が高いことも一因であろう。火山ガス中の^3He/^4He比は6.47.8(R/Ra)の範囲であった。2.ペトロパブロフスク周辺地域この地域の温鉱泉水の採水およびガスの採取を行った。ガスを伴うのは鉱泉であり、特にこの地域の地震予知に用いられている鉱泉3カ所のガスの採取を行い、^3He/^4He比を測定した。その比の範囲はであった。3.カリムスキー火山周辺地域カリムスキー火山南麗の低温の重炭酸鉄泉の採水およびガスの採取を行った。温泉水は単純泉であり特に特徴は見られなかったが温泉ガス中の^3He/^4He比は島孤としては異常に高い(8.078.66)値を示した。温泉自身は活動を長期中止した火山に特徴的な泉質を示しているが、ヘリウム同位体比は高いので、不治性ガスの注入があるものと思われる。この地域の希ガス同位体比の測定データはほとんど無く、今後のこの地域の火山活動の全体像を理解する資料として貴重である。4.マリ-.セミアチク火山地域1992年夏に第1回目の調査を行ったが、その調査を踏えてこの火山の山頂に存在する火口湖の観測を行った。火口湖の湖盆形態の調査を現地で組み立てたボ-トを使用して行ったが、まづ超音波測深器による連続深度測定を実行した。別にロープによる測深を行い、総合的な湖盆形態の把握が可能となった。この結果、この火口湖は直径550mのほゞ円形をしており、最大深度は117mであった。湖心やや西北よりの最深部よりガスが放出されており、このガスの採取も行われた。またこの最深部には溶融硫黄のプールが存在し、その温度は155°Cであった。昨年度は164°Cであった。湖水温度は昨年の10°Cから8°Cに低下している。また溶存ガス(湖水)のSO_2/H_2S比はやはり昨年度(2.33.2)から低下して0.0660.11の範囲となっている。つまりこの火口湖の活動は昨年より低下しているが、この傾向は1990年以降の一般的傾向と一致している。このことは湖水のポリチオン酸濃度変化にも現われており、さらにロシア側から提供された1986年以降の湖水試料および観測記録のつき合わせからも推測される傾向である。湖水の深度方向の重金属(V,Cr,Fe,Ni,Cu,Zn,Pb)の分布はほゞ均一であると言ってよいが、1020m付近および湖底でやゝ薄くなる傾向が認められた。1992年の夏の測定ではこの湖における硫黄バクテリアの活動は湖底の噴出孔付近の1点のみで認められたが、1993年夏の測定では湖のほゞ全域で活動が認められた。1993年夏のバクテリア濃度は10^4/ml程度であり、国内の火口湖におけるバクテリア濃度とほゞ同じくらいであることがわかった。湖底の噴出孔からのガスの^3He/^4He比はカリムスキー火山地域とほゞ同様であり、島孤地帯の値としては異常に高いことが明らかとなった。
神経因性疼痛における精神・情動行動異常の発症メカニズム解明に関する研究

16年度行動科学的手法による異常行動検出後、神経因性疼痛モデル動物および対照動物より海馬を取りだし、抽出したRNAの分析を網羅的に行うため、DNAチップを用いて解析した。17年度1.行動学的手法による疼痛および抑うつ、不安行動検出神経因性疼痛モデルには、マウスの左第5腰神経を結紮するChungモデルを用いた。Chungモデル群およびその対象(神経非損傷)群をそれぞれ8匹ずつ作成し、温熱刺激、機械刺激に対する疼痛反応および情動行動の変化を観察した。2.DNAチップ結果の解析DNAチップ解析にはアマシャム社CodeLink(マウス用:約20,000遺伝子)を用いて委託解析した。2倍以上の発現増加もしくは、1/2以下の発現低下を示した遺伝子は約400抽出された。発現変化を示したそれら遺伝子について当モデルとの機能関連についての情報を収集し、それら遺伝子群の相互関係を検討した結果、構造上、機能上に重要な遺伝子の変化が検出された。上記1よりさらに選出した約100遺伝子について、海馬における遺伝子発現変化を確認するため、RT-PCR法を用いて2群間の発現変化を調べた。4.海馬における限局的遺伝子発現変化を検討さらに海馬全体ではなく、海馬の限局した遺伝子発現変化を検討するため、モデル動物および対照動物より作製した海馬凍結切片から顕微鏡下で海馬組織の一部分を正確に切り取り、上記2の作業を平行して行った。1.行動学的手法による異常行動検出神経因性疼痛モデルには、マウスの左第5腰神経を結紮するChungモデルを用いた。Chungモデル群およびその対象(神経非損傷)群をそれぞれ8匹ずつ作成し、情動行動の変化を観察した。情動行動変化の検出にはオープンフィールドテスト、明暗実験箱、高架式十字迷路、強制水泳試験を行った。両群で不安・うつ行動に明らかな差が検出された。2.海馬の取りだしおよびRNAの抽出それぞれの群のマウスから左全海馬を取りだし、Qiagenキットを用いてRNAを抽出し、精製した(約5μg)。3.DNAチップ解析Chungモデル群からは最も不安・うつ行動の増強が検出された1匹のRNAを選出し、対照群からは任意の1匹のRNAを選出した。DNAチップ解析にはアマシャム社CodeLink(マウス用:約20,000遺伝子)を用いて委託解析した。現在は発現変化を示したそれら遺伝子について当モデルとの機能関連についての情報を収集し、それら遺伝子群の相互関係を検討している。今後は400の遺伝子からさらに選別し、RT-PCR法を用いて2群間の海馬における遺伝子発現変化を確認する作業に取りかかる。
ポスト九学会連合調査の宗教学的奄美研究

本研究で明らかになったことは、(1)Iターン者たちが島の生活環境に適応しつつ、自らの価値観に沿って既存の社会のあり方に「介入」的に関わる様態、(2)神社については維持管理状況に神社ごとの差があり、神社の盛衰は個人の病気治療や祖先祭祀といったミクロな要因が相互に関連して生じていること、(3)カトリックと創価学会のアンケート調査から、島を離れUターンした信者たちが比較的短期間のうちに、家族や郷土愛に基づいて帰島し、その後信仰の深まりを経験している信仰実態が見えたこと、(4)プロテスタントについては、歴史的に台湾から朝鮮半島に及ぶ福音主義的傾向の強い伝道圏に奄美も位置付けられること、にまとめられる。平成26年度は、調査準備とパイロット調査の実施を行った。調査項目1「個人の宗教性・スピリチュアリティ研究」「3神社神道研究」「4仏教研究」「6プロテスタント研究」「7新宗教研究」について着手した。特に1に関しては、10人近くのインタビューデータを収集し、それをもとに次年度以降の方針を検討することができた。また、3の神社神道研究に関しては、研究分担者によって、パイロット調査のために各市町村の郷土史等の資料を収集した。現在その整理中である。与論島の神社については、神主と連絡を取り、来年度(平成27年度)の聞き取り調査を予定している。他の島々の神社については、先述した資料をもとに、調査対象となる神社や神主を選定中であり、来年度には本調査を行う予定である。さらに、6プロテスタント研究」については2014年10月29日から11月3日まで奄美群島の徳之島で文献調査と聞き取り調査を行った。徳之島町立図書館では地域研究を中心に文献を収集した。また、日本基督教団徳之島伝道所で聞き取り調査を行い、島内にあるカトリック教会や戦前の教会跡などで実地調査を行った。前年度の調査を踏まえ、調査項目1「個人の宗教性・スピリチュアリティ研究」「2民間信仰研究」「3神社神道研究」「4仏教研究」「5カトリック研究」「6プロテスタント研究」「7新宗教研究」について研究を遂行した。調査項目1については、前年度のパイロット調査を踏まえ、本調査を開始した。研究代表者の西村および研究協力者の大学院生が、2015年7月20日から23日にかけて加計呂麻島に滞在し、約40人のインタビューデータを収集・整理した。調査項目2および調査項目4については、研究代表者の西村が研究協力者の財部めぐみとともに、これまでの研究成果をもとに論文「奄美の宗教についてー島の精神史的動態」をまとめ『鹿児島の島々』に掲載した(研究発表・〔図書〕参照)。調査項目3については、研究分担者の町が2016年3月に旧笠利町の調査を実施した。調査項目5および調査項目7については、研究分担者の田島が2015年7月27日から8月4日まで、鹿児島市、奄美市、瀬戸内町を対象として、当該行政機関とカトリック教会および新宗教の教団に赴き、人口統計資料と定住化促進政策および国内移動と信者数の増減に関するパイロット調査を実施した。調査項目6については、研究分担者の一色が2016年1月8日から14日に鹿児島県立図書館(鹿児島市)と鹿児島県立奄美図書館(奄美市)で文献調査を行った。また、鹿児島市と奄美市名瀬で研究者等と意見交換を行い、聞き取り調査を実施した。それらの成果とこれまでの研究を元に、現在『福音と世界』誌に連載中の「南島キリスト教史入門」で、徳之島と喜界島における戦前のキリスト教伝道の経緯と特徴について論じた(13.研究発表〔雑誌論文〕参照)。加えて、日本基督教学会で戦前の奄美群島の軍事化による伝道への影響について、研究成果を発表した(13.研究発表〔学会発表〕参照)。「8柳川啓一資料の整理」については、十分な実施に至らなかった。主な理由として、研究代表者は、当該年度において「宗教と社会」学会の大会開催(実行委員)、同学会会長就任、および一年間総長補佐として大学本部の運営業務に多くの時間を割かねばならなくなり、当初予定していた研究時間を十分確保できなくなったためである。平成28年度は、前年度に引き続き、各分担テーマについての調査を継続した。前年度までの研究の蓄積と反省を踏まえつつ、それぞれに調査地や調査方法など新たな要素を取り入れた点に意義が認められる。代表者の西村明は、研究協力者の大学院生たちとともに平成28年9月上旬に徳之島において、宗教者を含むIターン・Uターン者の価値観に関するインタビュー調査を実施した。当初は奄美大島内で調査地を設定する予定でいたが、LCC(格安運賃の航空会社)による東京ー奄美大島の定期便就航による影響の有無を考慮に入れるために、別の島での調査実施を判断した。併せて、柳川啓一資料における九学会関連資料の所在調査を実施した。分担者の田島忠篤は、奄美大島において、平成28年11月と平成29年2月に、創価学会およびカトリック教会へのアンケート調査を実施した。併せて、新宗教教団の施設等を訪問し、現状把握を行った。分担者の一色哲は、平成29年1月上旬に鹿児島県立図書館(鹿児島市)と鹿児島県立奄美図書館(奄美市)で文献調査を行った。

分担者の町泰樹は、奄美大島の神社に関して郷土史の記述を整理しつつ、奄美北部の旧笠利町(現奄美市)の神社に関する現地調査を行った。分担者の研究はそれぞれ順調に進んでいるが、研究代表者が担当している柳川啓一九学会資料については、当初想定したほどの内容がある資料を見つけ出すことができず、その点で十分な成果が期待できないため。可能であれば、進捗状況の報告検討会を実施したいと考えていたが、日程の調整ができず、研究代表者と各分担者とのメール等での個別のやりとりに止まった。最終年度は全体として最終的な調査のまとめと成果発表を行い、併せて追加調査を行った。とりわけ、前年度中に研究分担者の田島忠篤と研究協力者の李賢京を中心に実施した創価学会とカトリック教会の信者における社会移動に関するアンケートのデータ分析と学会や現地での報告が大きな成果として挙げられる。移動(離島・帰島)に際しての各宗教の役割や信者の社会移動について分析を行ったが、いずれの教団においても帰島後の信仰の深まりについて有意な結果が示された。個人のスピリチュアリティーについては、島外出身のIターン者にとって、島での生活の不便さや厳しさにまして、自然環境の豊かさや都市生活とは異なるリズム・人間関係の濃さといった生活環境が価値の高いものとして受け取られていた。また神社についての調査からは、外部から移入された宗教としての神社神道の理解があるものの、とりわけ法人化していない神社を支えているのは、シャーマニズムや祖先崇拝といった現地の民俗信仰の枠組みであることが明らかとなった。その他各自で発表の機会を見つけて学会発表等を行ったが、島嶼研究分野での国際的な場における発表については計画通りにはいかなかった。それに代えて2018年2月の東アジア宗教研究フォーラムの場でまとまった成果報告ができた。成果の社会還元については、当初の報告書作成に代えて、2017年11月に奄美大島および鹿児島において現地報告会(カトリック教会、創価学会および一般向け報告会)の機会を設けた。本研究で明らかになったことは、(1)Iターン者たちが島の生活環境に適応しつつ、自らの価値観に沿って既存の社会のあり方に「介入」的に関わる様態、(2)神社については維持管理状況に神社ごとの差があり、神社の盛衰は個人の病気治療や祖先祭祀といったミクロな要因が相互に関連して生じていること、(3)カトリックと創価学会のアンケート調査から、島を離れUターンした信者たちが比較的短期間のうちに、家族や郷土愛に基づいて帰島し、その後信仰の深まりを経験している信仰実態が見えたこと、(4)プロテスタントについては、歴史的に台湾から朝鮮半島に及ぶ福音主義的傾向の強い伝道圏に奄美も位置付けられること、にまとめられる。「2民間信仰研究」と「5カトリック研究」については、現地での滞在時間の制約などもあり、今年度は実施に至らなかった。滞在場所や移動の問題など現地における物理的制約の面が大きい。「8柳川啓一資料の整理」については、個人の宗教性のインタビューデータの整理に時間がかかり、十分な整理の時間が取れなかった。当該年度の調査の成果を踏まえて、論文や学会発表等の成果発表に着手しながら、本調査を継続する。これまでの未着手課題「8柳川啓一資料の整理」については、研究代表者の研究室内での支援体制も確保できたので、計画的に進める。
インスリン分泌とその異常におけるRab蛋白の役割

ラットの膵ランゲルハンス島(ラ氏島)からcDNAを合成し、rab familyで保存されている領域をもとに作成したプライマーを用いてpolymerase chain reaction(PCR)によりcDNAを増幅た。そしてその塩基配列を決定した。その結果、ラットラ氏島にはrab 3A,8,10のmRNAの発現が認められた。最近、rab 3Aの標的蛋白であるrabphilin-3AのcDNAがShiratakiらによって単離されたが、rabphilin-3Aには、分泌顆粒蛋白であるsynaptotagminと同様に、protein kinase CのCa^<2+>結合領域(C2ドメイン)の繰り返し配列が存在し、Ca^<2+>依存性の開口放出に関与している可能性が示唆されている。そこでrabphilin-3Aとsynaptotagminに共通なアミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ラット脳RNAより作成したcDNAを用いてPCRを行った。増幅したDNAの塩基配列により、synaptotagminの新たなサブタイプと思われる蛋白をコードする部分cDNAが得られた。次に部分cDNAでプローブとしてラット脳cDNAライブラリーより全長のcDNAを単離した。このcDNAによってコードされる蛋白は588個のアミノ酸からなり、すでに報告されているSynaptotagmin I,IIとそれぞれ41%、38%のアミノ酸の同一性を示し、Synaptotagmin IIIと命名した(Mizuta,M.et al. JBC.1994 in press)。このSynaptotagmin IIIのmRNAはSynaptotagmin I,IIと異なり、ラット膵ラ氏島を初め種々の内分泌組織や内分泌細胞由来の細胞株に発現が認められた。