hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中性子捕捉療法における腫瘍集積ホウ素量の非侵襲的測定

中性子捕捉療法は、「^<10>B(ホウ素)+n(中性子)→^7Li(リチウム)+α線」の反応によって放出されるα線により、がん細胞を破壊することを目的とした粒子線治療である。このα線の飛程は510μm程度と細胞の直径にほぼ等しく、ホウ素の入っていない細胞はα線のダメージを受けないため、細胞レベルの選択的放射線治療が可能となる。したがって、"がん細胞に取り込まれ、正常細胞には取り込まれない"好都合なホウ素化合物が必要になるが、そのような化合物として、ボロノフェニルアラニン(p-boronophenylalaine : BPA)が使用されている。しかし、この治療におけるα線線量(BPAのがん細胞への集積量)を測定する手法はいまだ確立していない。そこで本研究では、生体内の代謝物質を非侵襲的に測定できるという特徴をもつ磁気共鳴スベクトロスコピー(magnetic resonance spectroscopy : MRS)を用いて、BPAのがん細胞への集積量を定量化する手法の開発を目指し、2年間に渡り基礎的研究を行ってきた。昨年度はBPAのMRS取得に成功し、さらには、磁気共鳴現象の原理からJ-couplingという同様の特性を持ち、MRSを取得するうえではBPAと類似の挙動を示すlactateの定量化にも成功した。今年度はBPAの定量化を試みた。結果、濃度が5mMのBPAを定量することに成功した。臨床応用を想定した場合、2mM程度の定量が必要となる。しかし、本研究で使用した臨床普及型の磁気共鳴装置では磁場強度(1.5 Tesla)が低いという問題があり、2mMの定量は困難であると結論づけられた。この問題については、現在、臨床普及型の高磁場磁気共鳴装置の開発が進んでおり、今後、高磁場下で本手法を用いることにより解決でき、臨床で必要とされる低濃度のBPAを定量化できる可能性は高い。よって、本研究で確立した「MRSの手法を用いたBPAの定量化手法」は、"低コスI卜で・正確に・非侵襲的に"測定する手法として有用であり、その臨床的意義は高い。ホウ素中性子捕捉療法(Boron Neutron Capture Therapy: BNCT)は、熱中性子とがん細胞に取り込まれたホウ素化合物との核反応によって発生するα線によって、選択的にがん細胞を破壊するという原理に基づくがん冶療法である。近年、がん細胞に選択的に取り込まれるホウ素化合物であるボロノフェニルアラニン(p-boronophenylalaine: BPA)の開発によってこの治療法の有効性が高まり、日本においては、悪性脳腫瘍に対する細胞選択的次世代粒子線治療として期待されている。そこで本研究では、申請者が経験・熟知している磁気共鳴スペクトロスコピー(magnetic resonance spectroscopy:MRS)を用いて、BPAのがん細胞への集積量を"低コストで・正確に・非侵襲的に"測定する手法の開発を目指し、その基礎的研究を行った。本年度は、まずMR装置に適応した材質(非磁性体)でファントムを作成した。さらに、作成したファントムを用いて以下2つの成果を得た。(1)BPAのMRSを取得:これまでに、BPAのMRSの取得に成功したという報告はない。しかし、本研究では、BPAのMRSを取得し、そのピークを同定することに成功した。このことは、"BPAのがん細胞への集積量をMRSで測定する"という本研究の目的を達成するうえでの第一ステップとなる。(2)Lactateの定量化:Lactateを使用してその定量に関する検討を行い、1mMという非常に低濃度の定量に成功した。BPAとLactateは、磁気共鳴現象の原理からJ-couplingという同様の特性を持ち、MRSを取得するうえでは類似の挙動を示す。よって、lactateの定量化の成功は、BPAの定量化への成功につながると考える。

しかし、本研究で使用した臨床普及型の磁気共鳴装置では磁場強度(1.5 Tesla)が低いという問題があり、2mMの定量は困難であると結論づけられた。この問題については、現在、臨床普及型の高磁場磁気共鳴装置の開発が進んでおり、今後、高磁場下で本手法を用いることにより解決でき、臨床で必要とされる低濃度のBPAを定量化できる可能性は高い。よって、本研究で確立した「MRSの手法を用いたBPAの定量化手法」は、"低コスI卜で・正確に・非侵襲的に"測定する手法として有用であり、その臨床的意義は高い。
メタボリックシンドローム関連キナーゼDyrk1Bによる肝糖新生制御機構の解明

1.肝臓におけるDyrk1Bの発現調節機構の解析マウス肝臓におけるDyrk1Bの発現は、絶食時においてmRNA、タンパク質レベルで高く、再摂食により強く抑制された。初代培養肝細胞において、インスリンやグルカゴンがDyrk1Bの発現に与える効果を検討したところ、Dyrk1Bの発現はグルカゴン/cAMPによっては変化せず、インスリンによって強く抑制された。このことは再摂食時の肝臓で発現が強く抑制されることと一致する。更に、insulin-PI3K-Akt-FoxO1経路によって発現が制御されていることを明らかにした。また、正常マウスに比べ、肥満糖尿病(db/db)や高脂肪食負荷(HFD)マウスの肝臓においてDyrk1Bの発現が亢進していることを明らかにした。2.肝臓におけるDyrk1Bの活性制御の解析絶食/再摂食時の肝臓あるいは、インスリン又はcAMPで刺激した初代肝細胞でのDyrk1Bの活性を測定するため、MBPを基質としたキナーゼアッセイでDyrk1Bの活性を測定でできることを確認した。今後、ホルモンによって活性が変化するか検討する。初代肝細胞にDyrk1Bを発現抑制させると、cAMP誘導性の糖新生系酵素の遺伝子発現がDyrk1Bの発現量依存的、酵素活性依存的に促進されること、内在性のDyrk1Bをノックダウンするとそれらが抑制されることからDyrk1Bが糖新生の新たな制御分子であることを明らかにした。また。Dyrk1Bによる促進効果はGCN5やCITED2のノックダウンで抑制され、CITED2の強制発現で促進した。また、免疫沈降により、Dyrk1BはCITED2に加え、GCN5、PKA酵素サブユニット、制御サブユニットとモジュール(複合体)を形成していることを明らかにした。生理条件、病態条件(糖尿病肥満状態、インスリン抵抗性など)下における肝臓でのDyrk1Bの遺伝子/タンパク質発現を明らかにし、そのメカニズム(insulin-PI3K-Akt-FoxO1経路)の一端も示すことができた。更に、CITED2相互作用分子として単離したDyrk1Bが実際にcAMP誘導性の糖新生系酵素の遺伝子発現をその酵素活性(キナーゼ活性)依存的に促進する分子であることを示す一方、ノックダウンすることによって糖新生系酵素の発現が抑制されることから、生理的な条件下においてDyrk1Bが糖新生系酵素発現に必要な分子であることを明らかにした。また、GCN5やCITED2のノックダウンや過剰発現実験と組み合わせること、また、相互作用実験からDyrk1BがGCN5-CITED2-PKAモジュールと協調してcAMP誘導性の糖新生系酵素の発現を制御していることを明らかにした。これらの結果から、現在Dyrk1Bが1GCN5-CITED2-PKAモジュールの活性を制御することで糖新生系酵素の発現を制御する可能性、2逆にモジュールがDyrk1Bの活性を変化させることで糖新生系酵素の発現を制御する可能性について検討しており、Dyrk1Bのキナーゼ活性依存的にリン酸化される複数の分子を明らかにしており、それらが糖新生系酵素のぐる現制御に重要であるか検討している。以上のように、計画に沿って研究を遂行し順調に結果を積み重ねながらDyrk1Bによる糖新生系酵素発現制御機構を明らかにしてきていることから、おおむね順調に進展しているという評価とした。初代培養肝細胞においてDyrk1Bが新たな糖新生制御因子であることを明らかにし、その基質候補分子を同定している。現在その分子のリン酸化部位を明らかにすると同時に、そのリン酸化が糖新生制御に与える効果について検討している。このように今後も研究計画に沿って研究を推進し、Dyrk1Bによる肝糖新生制御の詳細な制御機構を明らかにしていく。同時に、マウスの個体内(in vivo)でDyrk1Bの発現制御によって個体としての血糖を調節しうるのかは依然不明であることから、マウスの尾静脈よりアデノウイルスを肝臓に感染させ、in vitroと同じ結果が得られるか、糖新生を介して血糖を変化させ得るかを検証する。更に、CRISPR/CAS9で作製したDyrk1BKOマウスやKIマウスの代謝表現系解析を進めていく。

初代肝細胞にDyrk1Bを発現抑制させると、cAMP誘導性の糖新生系酵素の遺伝子発現がDyrk1Bの発現量依存的、酵素活性依存的に促進されること、内在性のDyrk1Bをノックダウンするとそれらが抑制されることからDyrk1Bが糖新生の新たな制御分子であることを明らかにした。また。Dyrk1Bによる促進効果はGCN5やCITED2のノックダウンで抑制され、CITED2の強制発現で促進した。また、免疫沈降により、Dyrk1BはCITED2に加え、GCN5、PKA酵素サブユニット、制御サブユニットとモジュール(複合体)を形成していることを明らかにした。生理条件、病態条件(糖尿病肥満状態、インスリン抵抗性など)下における肝臓でのDyrk1Bの遺伝子/タンパク質発現を明らかにし、そのメカニズム(insulin-PI3K-Akt-FoxO1経路)の一端も示すことができた。更に、CITED2相互作用分子として単離したDyrk1Bが実際にcAMP誘導性の糖新生系酵素の遺伝子発現をその酵素活性(キナーゼ活性)依存的に促進する分子であることを示す一方、ノックダウンすることによって糖新生系酵素の発現が抑制されることから、生理的な条件下においてDyrk1Bが糖新生系酵素発現に必要な分子であることを明らかにした。また、GCN5やCITED2のノックダウンや過剰発現実験と組み合わせること、また、相互作用実験からDyrk1BがGCN5-CITED2-PKAモジュールと協調してcAMP誘導性の糖新生系酵素の発現を制御していることを明らかにした。これらの結果から、現在Dyrk1Bが1GCN5-CITED2-PKAモジュールの活性を制御することで糖新生系酵素の発現を制御する可能性、2逆にモジュールがDyrk1Bの活性を変化させることで糖新生系酵素の発現を制御する可能性について検討しており、Dyrk1Bのキナーゼ活性依存的にリン酸化される複数の分子を明らかにしており、それらが糖新生系酵素のぐる現制御に重要であるか検討している。以上のように、計画に沿って研究を遂行し順調に結果を積み重ねながらDyrk1Bによる糖新生系酵素発現制御機構を明らかにしてきていることから、おおむね順調に進展しているという評価とした。初代培養肝細胞においてDyrk1Bが新たな糖新生制御因子であることを明らかにし、その基質候補分子を同定している。現在その分子のリン酸化部位を明らかにすると同時に、そのリン酸化が糖新生制御に与える効果について検討している。このように今後も研究計画に沿って研究を推進し、Dyrk1Bによる肝糖新生制御の詳細な制御機構を明らかにしていく。同時に、マウスの個体内(in vivo)でDyrk1Bの発現制御によって個体としての血糖を調節しうるのかは依然不明であることから、マウスの尾静脈よりアデノウイルスを肝臓に感染させ、in vitroと同じ結果が得られるか、糖新生を介して血糖を変化させ得るかを検証する。更に、CRISPR/CAS9で作製したDyrk1BKOマウスやKIマウスの代謝表現系解析を進めていく。
チェックポイント遺伝子RAD24のDNA修復における作用機構の解明

真核生物においてDNA損傷が生じた場合、その修復が終了しない限り次の細胞周期は開始されない。このDNA修復が完了していないDNAの分配を防ぐ細胞周期停止機構はDNA損傷チェックポイントコントロールと呼ばれている。出芽酵母において、RFC5遺伝子は5つのサブユニットからなるReplication factor C(RFC)のサブユニットの一つをコードする。RFC5遺伝子がDNA修復に必須であるのみならずチェックポイントコントロールにも重要な役割を持つことを示してきた。RFC5のチェックポイントにおける作用機序を明かにするために、rfc5変異を大量発現したときサプレスする遺伝子を単離した。解析の結果、そのうち一つはDNA損傷チェックポイントコントロールに関与するRAD24遺伝子であった。Rad25遺伝子産物は、RFCと弱い相同性があり、RFCと結合していることが示された。遺伝学的解析からMEC3、RAD17は、DNA損傷チェックポイントコントロールにおいてRAD24と同じ機能をすると考えられている。Mec3、Rad17とRad24の結合を免疫沈降法で検討したが、Rad24の免疫複合体にMec3、Rad17とも検出されなかった。また、rad24変異のDNA損傷感受性は、その細胞周期をG1に停止させることにより回復されないので、RAD24遺伝子は、チェックポイントコントロール以外の、おそらくDNA修復そのものにも機能することが示唆された。
In vitro 実験系を用いた食品に含まれる匂い（香り）物質の輸送経路の解析

食品に含まれる匂い(香り)物質ヘキサナールは、ラット脳線条体からのドーパミン放出を促進する。食品と共に摂取されたヘキサナールは、小腸から吸収され、血流を介して脳内に移行すると考えた。本研究では、ヘキサナールの腸管から脳内への輸送経路をin vitro実験系を用いて検討した。ヘキサナールは、腸管吸収モデルとして汎用されているCaco-2細胞単層膜、及び、in vitro血液脳関門モデル膜を透過した。また、血液中の輸送タンパク質であるアルブミンに一部のヘキサナールが結合した。これらの結果は、食品中のヘキサナールが体内を移行し、脳内で直接機能する可能性を示した。野菜や果物に含まれる匂い(香り)物質である炭素数6のアルコール及びアルデヒド類が、ラット脳線条体からのドーパミン放出を促進することを報告している。しかし、摂食した匂い(香り)物質の吸収、標的組織・細胞への移行は明らかになっていない。本研究では、ドーパミン放出促進活性の強いヘキサナールを中心に用い、in vitro実験系で、匂い(香り)物質の小腸吸収上皮細胞での吸収、血液・リンパ液中の輸送、脳を構成するグリア細胞を介した匂い(香り)物質によるドーパミン放出作用を明らかにすることを目的としている。27年度は、匂い(香り)物質であるヘキサナールの測定系の確立、及び、小腸上皮細胞およびグリア細胞での匂い(香り)物質の吸収について検討した。試料(細胞、測定液など)中のヘキサナール量は、ヘキサナールを2,4-ジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離、吸光度から測定することができた。このヘキサナールの測定系を用いて、匂い(香り)物質を体内に取り込む小腸吸収上皮細胞、及び、標的組織である脳で神経細胞への輸送にかかわるグリア細胞のヘキサナールの輸送活性を測定した。小腸上皮モデルとして広く使われているヒト結腸癌由来細胞Caco-2をトランスウェル膜上に培養した。単層細胞層ができたことを確認後、トランスウェル内をヘキサナールを含む緩衝液に置換し、Caco-2単層細胞層を通過したへキサナール量を測定した。また、Caco-2細胞、あるいは、アストロサイトのマーカーとされるグリア細胞線維性酸性タンパク質陽性細胞株ラットグリオーマC6細胞を培養プレート上に培養し、細胞に取り込まれたヘキサナール量を測定した。その結果、ヘキサナールは、小腸上皮細胞層を通過し、グリア細胞内に取り込まれることが示唆された。27年度は、1)ヘキサナールの測定系の確立、2)小腸上皮細胞、および、グリア細胞のヘキサナール輸送活性の測定を行った。試料(細胞、測定液など)中のヘキサナールは、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化し、ODSカラム及び移動相にアセトニトリル水溶液(100%アセトニトリル:20%アセトニトリル水溶液=80:20)を用いたHPLCで分離した。試料に含まれるヘキサナール量は、365 nmの吸光度から求めることができた。小腸吸収上皮細胞を介したヘキサナールの輸送は、トランスウェル膜上に単層培養したCaco-2細胞を用いて検討した。トランスウェル膜上にCaco-2単層細胞層ができたことを確認後、トランスウェル内をヘキサナールを含む緩衝液に置換した。そして、Caco-2単層細胞層を通過したヘキサナール量を測定した。また、Caco-2細胞、あるいは、C6細胞を培養プレート上に培養し、培養上清をヘキサナール含む緩衝液に置換し、一定時間(0-10分)に細胞に取り込まれたヘキサナール量を測定した。これにより、ヘキサナールはCaco-2単層細胞層を通過し、Caco-2細胞内には取り込まれないが、グリア細胞内には取り込まれることが示唆された。In vitro測定系を用いて、摂食後のヘキサナールの体内移行を検討している。実験には、腸管吸収モデルとして汎用されているヒト結腸癌細胞Caco-2細胞、及び、アストロサイトのマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質を発現するラットグリオーマC6細胞を用いた。これまでに、ヘキサナールはCaco-2細胞には取込まれないが、C6細胞に取込まれること、また、Caco-2単層細胞膜を透過することを示した。すなわち、食品中のヘキサナールは、小腸から吸収され、脳組織に取込まれると考えられる。小腸から取込まれたヘキサナールは、血液中、及び、グリア細胞内で結合タンパク質に結合して存在している可能性がある。そこで、本年度は、1)ヘキサナールと結合するタンパク質を同定するため、アルデヒドを基質とするルシフェラーゼによる発光の検出、2)脳に発現する脂肪酸結合タンパク質7(FABP7)をヘキサナールと結合する候補タンパク質として、ヘキサナールとの結合を検討した。また、血液中から脳内へヘキサナールが移行する際、血液脳関門(BBB)を通過する必要がある。3)C6細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を単一膜上に両面培養したBBBモデルの構築も手掛けた。その結果、炭素数4-9の直鎖アルデヒドを基質に用いてもルシフェラーゼによる発光は検出されず、また、ヘキサナールの取込量も、His-tagを融合したFABP7(His-tag FABP7)を安定発現させたC6細胞とC6細胞の間に差はみられなかった。

また、BBBモデルとして、HUVEC/C6両面培養細胞膜を作成したが、細胞同士が密着した両面細胞膜にはならず、ヘキサナールの膜透過性実験に至っていない。ヘキサナールがC6細胞に取込まれ、Caco-2単層細胞膜を透過する結果を得ることができた。学会では発表しているが、論文としての報告が遅れている。また、本年度になり、思わしくない結果が続き、研究に遅れが生じている。これまでの結果から、食品に含まれるヘキサナールは小腸で吸収され、脳内に移行、神経細胞の周辺細胞であるグリア細胞に取込まれると考えられる。体内移行の際、ヘキサナールはタンパク質に結合すると仮説を立てた。そして、ヘキサナールと結合するタンパク質を同定するために、アルデヒドを基質としたルシフェラーゼによる発光の検出を試みた。しかし、炭素数4ー9の直鎖アルデヒドを基質としたルシフェラーゼによる発光は、ブロットスキャナーC-DiGitを用いても検出することができなかった。また、C6細胞はヘキサナールを取込むことから、グリア細胞にはヘキサナールを結合するタンパク質が存在し、ヘキサナールの細胞内への取込み・蓄積に関与すると考えられる。FABP7をヘキサナール結合タンパク質の候補タンパク質として、ヘキサナールとの結合を検討した。実験計画では、大腸菌のタンパク質発現系を用いる予定であったが、タンパク質の高次構造を保つため、His-tag FABP7を発現するC6細胞発現系を構築した。His-tag FABP7安定発現C6細胞を用いてヘキサナールの細胞内への取込量を測定したが、C6細胞との差はみられなかった。また、ヘキサナールのBBBの透過性を検討するため、BBBモデルとしてC6細胞とHUVECの両面培養細胞膜の構築を進めたが、ヘキサナールの移行を検討することのできる細胞の密着した両面培養細胞膜は作れていない。ヘキサナールを結合するタンパク質の同定、及び、BBBモデルの構築はさらなる検討が必要である。食品に含まれる匂い(香り)物質ヘキサナールは、ラット脳線条体からのドーパミン放出を促進する。食品と共に摂取されたヘキサナールは、小腸から吸収され、血流を介して、脳に輸送されると考えられる。ヘキサナールの体内動態を、in vitro測定系を用いて検討した。小腸上皮細胞層のヘキサナールの透過性は、腸管吸収モデルとして汎用されているヒト結腸癌由来Caco-2細胞の単層膜を用いて測定した。ヘキサナール量は、ジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化後、高速液体クロマトグラフィーで分離し、365 nmの吸光度より求めた。その結果、ヘキサナールはCaco-2細胞単層膜を透過することが示された。小腸上皮細胞層を透過したヘキサナールは血液中に移行する。血液中に存在する輸送タンパク質アルブミンとヘキサナールの結合を測定した。ヘキサナールの一部はアルブミンに結合するが、多くは、結合せずに存在する可能性を示した。血流中のヘキサナールが脳内に移行するためには、血液脳関門(BBB)を通過する必要がある。ラット血液脳関門BBBキットを用いて、ヘキサナールのBBB透過性を検討した。それにより、ヘキサナールはBBBを透過することが示された。ヘキサナールのBBBの透過量は、血液側にアルブミンが存在すると減少した。
迅速な細菌検出のための蛍光顕微鏡画像解析システムの開発

我々は,感染症流行の予防や医薬品や食品の製造過程における微生物学的な安全管理を目的として,微生物を迅速かつ簡便に検出するシステムを構築した.まず蛍光顕微鏡下で細菌数を測定する直接計数法や特定細菌を検出するための蛍光抗体法および遺伝子型に基づいて検出する蛍光insituハイブリダイゼーション法の最適化を行った.また生理活性を有する細菌の検出にはCTC-DAPI二重染色法を用いた.大腸菌O157をモデル微生物をし,CTC染色およびFITC標識した抗体を用いた蛍光抗体法により,生理活性をもつ大腸菌O157を特異的に検出することができた.またCy3標識したオリゴヌクレオチドプロープおよびFITC標識した抗O157抗体を用いることによりO157抗原をもつ大腸菌を特異的に検出することが可能となった.つぎに冷却CCDカメラにより得られる蛍光顕微鏡画像を解析するプログラムの開発を行った.最近の顕微鏡像をコンピュータのディスクにデジタル画像として保存し,スムージング,二次ディファレンシャルフィルタリング,エッジディテクションの一連の処理を行うことで,個々の細菌を自動的に識別することを可能とした.本研究において我々は,蛍光顕微鏡像を解析するためのソフトウエアを開発し,さらに日常的に利用可能とする総合システムとして機能できるようユーザインターフェースを構築した.本年度は,個々の細胞より遺伝情報,抗原性および生理活性に関する情報を同時に得ることを試みた.用いた細菌はEscherichia coli ATCC 43888である.この大腸菌はベロ毒素遺伝子をもたないが細胞表面にO157をもつ株である.本菌のもつリボソームRNAを検出するために蛍光色素cy3で標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いた.また細胞表面のO抗原を検出するためにFITC(fluoresceine isothiocyanate)標識した抗O157抗体を用いた.蛍光抗体を反応させた細胞に対しCy3標識されたオリゴヌクレオチドを用いたin situハイブリダイゼーションを行った.これをレーザー顕微鏡で観察したところ,青色励起光下でFITC由来の緑色蛍光が見られた.また同一細胞を緑色励起光下で観察したところcy3由来の赤色蛍光が認められた.すなわち,単一の細胞から系統発生に関する遺伝情報および表面抗原に関する情報を得ることを可能とした.CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)は細菌の呼吸により還元され,赤色蛍光を発する.本色素と先に述べた蛍光抗体を用いることにより,呼吸活性をもつ,すなわち生きている大腸菌O157を特異的に検出することを可能とした.次に環境試料として,大阪府を流れる神崎川に設置したスライドグラス上に形成されたバイオフィルムを供した.用いた蛍光色素は,SYBR Green Iおよびオリゴヌクレオチド標識のためのcy3である.In situハイブリダイゼーションののちSYBRGreen Iによる染色を行った.レーザー顕微鏡で観察した結果,SYBR Green I由来の蛍光によりバイオフィルム中の全細菌を,またcy3由来の蛍光により16SリボソームRNAを発現している細菌のみを検出することが出来た.我々は,感染症流行の予防や医薬品や食品の製造過程における微生物学的な安全管理を目的として,微生物を迅速かつ簡便に検出するシステムを構築した.まず蛍光顕微鏡下で細菌数を測定する直接計数法や特定細菌を検出するための蛍光抗体法および遺伝子型に基づいて検出する蛍光insituハイブリダイゼーション法の最適化を行った.また生理活性を有する細菌の検出にはCTC-DAPI二重染色法を用いた.大腸菌O157をモデル微生物をし,CTC染色およびFITC標識した抗体を用いた蛍光抗体法により,生理活性をもつ大腸菌O157を特異的に検出することができた.またCy3標識したオリゴヌクレオチドプロープおよびFITC標識した抗O157抗体を用いることによりO157抗原をもつ大腸菌を特異的に検出することが可能となった.つぎに冷却CCDカメラにより得られる蛍光顕微鏡画像を解析するプログラムの開発を行った.最近の顕微鏡像をコンピュータのディスクにデジタル画像として保存し,スムージング,二次ディファレンシャルフィルタリング,エッジディテクションの一連の処理を行うことで,個々の細菌を自動的に識別することを可能とした.本研究において我々は,蛍光顕微鏡像を解析するためのソフトウエアを開発し,さらに日常的に利用可能とする総合システムとして機能できるようユーザインターフェースを構築した.本年度は,蛍光顕微鏡画像より個々の細菌像を抽出し,自動的にその形態学的特徴,蛍光強度を解析し,計数するプログラムの開発を行った.細菌の核酸を蛍光色素により染色し,蛍光顕微鏡下で観察した.顕微鏡像のサンプリングにあたっては,冷却CCDカメラを用い,コンピュータのディスクにデジタル画像として保存した.イメージデータを内部メモリーに移し,スムージング,二次ディファレンシャルフィルタリング,エッジディテクションの一連の処理を行うことで,個々の細菌を自動的に識別することを可能とした.本プログラムを用いることにより,細菌の計数と同時に個々の細菌の形態の特徴(長径,短径,面積)や平均蛍光強度を同時に知ることが出来る.システムは高価な機器を必要とせず,操作は窮めて簡単であり,また結果を得るまでに要した時間約10秒であった.本システムは,より一般に日常な迅速な細菌検出を可能とするものである.本システムを用いて,大阪府下を流れる神崎川より採取したバイオフィルム試料をDAPI染色し,UV励起光下で観察し,本システムを用い細菌の計数を行ったところ,目視により認識された細菌と高い相関が得られた.
平成6年11月3日南米日食による太陽コロナの観測

1994年11月3日に起こった皆既日食は、南米大陸のペル-、チリ、ボリビア、パラグアイ、ブラジル等の国々を50分足らずの時間で通過した。皆既日食は、普段地球大気の散乱光に埋もれて、見ることの出来ない太陽コロナを観測する上で、絶好のチャンスである。国立天文台からは4名のスタッフがチルのプレト町に出かけて観測を行った。コロナは太陽の光を散乱することによって輝いている。よく知られているように太陽スペクトルには無数の吸収線が見られるが、コロナのスペクトルには吸収線が殆どなく連続的な分布を示す。これはコロナの温度が非常に高いため、電子の熱運動によってスペクトルが波長方向に馴らされてしまったためである。ところが太陽スペクトルの3900Åと4300Åあたりには、もともと強い吸収線がたくさん集まっており、これらの波長帯にはコロナの連続光スペクトルにも浅いへこみとしてその痕跡が残っている。そしてそのへこみ具合いはコロナの電子温度を反映し、波長のわずかなずれはコロナの運動を反映していると考えられる。我々の目的は連続光スペクトルの形から、コロナの温度と運動を調べることであり、太陽風のしくみを理解するための基礎的な情報を得ようというものである。この観測を実現するために我々は2つの望遠鏡を用意した。1つは口径28cmのカセグレン望遠鏡に透過型回析格子からなる小型分光器を取り付けたもので、これによてスリット上のコロナのスペクトルを撮影する。スペクトルは512×512素子の冷却CCDカメラで撮影され、波長方向には3600-4700Å、空間方向には太陽直径の約1.3倍の範囲をカバーする。もう1つは口径18cmのカセグレン望遠鏡にフィルターレットとCCDカメラを取り付けたもので、これによって太陽直径の約4倍の視野でコロナの2次元像を撮影する。2つのフィルタータレットには、中心透過波長が3980,4100,4220,4310Åの4枚の干渉フィルターと、それぞれ120°ずつ方向を違えた3枚の偏光板が装着された。観測機材を載せた船は8月中旬横浜港を出航した。我々はこれを10月7日に現地で受け取り設営を開始した。途中いくつかの予期していなかった機器のトラブルも発生したが、チリ大学の研究者達の協力も得て大事にはいたらず、予定どうりの準備を整えて日食を迎えることが出来た。残念ながら皆既日食は早期より発生した薄雲の中での観測となった。光量が少なく空が一様でないことは観測にとってはありがたくないことであるが、とにかく予定どうりの観測を行った。すべての装置は順調に動作した。3分間の皆既時間に得られたデータは、撮像望遠鏡によるコロナの偏光画像が合計36枚、分光望遠鏡によるコロナのスペクトが計5枚である。スリットは月を含む太陽の南極域コロナホール、東のストリーマ-の低高度(0.1太陽半径)と光高度(1太陽半径)領域の計3つの場所にあてられた。また、日食の前後に、データ更正用の空と太陽のスペクトルを取得した。得られたデータの解析は現在進行中である。全体的にも撮像観測の方はやはり多少光量不足であるが、東西に延びた3本のストリーマ-をきれいに促えている。スペクトルには、高温コロナの成分、ダストによる成分、輝線スペクトルによる成分が見事に描き出されている。これからコロナの温度や運動を求めるためには、装置の感度や波長特性を慎重に更正し、モデルとの詳しい比較を行わなければならない。現在までに、コロナの電子温度について以下のような結果が得られている。・東のストリーマ-の電子温度は約300万度であり、太陽から離れるにつれて増加する傾向がある。・電子温度はストリーマ-の外側で低くなる傾向を示す。・極域のコロナホールの下の方は明らかに低い電子温度(約200万度)を示すが、そこでは高さに伴うかなり急速な上昇がみられる。ここで得られた電子温度は、これまで他の方法で得られたものよりもかなり高い値を示しており、コロナの加熱や太陽風のモデルに与えるインパクトが大きい。今後さらに比較検討する必要がある。また、コロナの運動に関する解析も進めていく予定である。

1つは口径28cmのカセグレン望遠鏡に透過型回析格子からなる小型分光器を取り付けたもので、これによてスリット上のコロナのスペクトルを撮影する。スペクトルは512×512素子の冷却CCDカメラで撮影され、波長方向には3600-4700Å、空間方向には太陽直径の約1.3倍の範囲をカバーする。もう1つは口径18cmのカセグレン望遠鏡にフィルターレットとCCDカメラを取り付けたもので、これによって太陽直径の約4倍の視野でコロナの2次元像を撮影する。2つのフィルタータレットには、中心透過波長が3980,4100,4220,4310Åの4枚の干渉フィルターと、それぞれ120°ずつ方向を違えた3枚の偏光板が装着された。観測機材を載せた船は8月中旬横浜港を出航した。我々はこれを10月7日に現地で受け取り設営を開始した。途中いくつかの予期していなかった機器のトラブルも発生したが、チリ大学の研究者達の協力も得て大事にはいたらず、予定どうりの準備を整えて日食を迎えることが出来た。残念ながら皆既日食は早期より発生した薄雲の中での観測となった。光量が少なく空が一様でないことは観測にとってはありがたくないことであるが、とにかく予定どうりの観測を行った。すべての装置は順調に動作した。3分間の皆既時間に得られたデータは、撮像望遠鏡によるコロナの偏光画像が合計36枚、分光望遠鏡によるコロナのスペクトが計5枚である。スリットは月を含む太陽の南極域コロナホール、東のストリーマ-の低高度(0.1太陽半径)と光高度(1太陽半径)領域の計3つの場所にあてられた。また、日食の前後に、データ更正用の空と太陽のスペクトルを取得した。得られたデータの解析は現在進行中である。全体的にも撮像観測の方はやはり多少光量不足であるが、東西に延びた3本のストリーマ-をきれいに促えている。スペクトルには、高温コロナの成分、ダストによる成分、輝線スペクトルによる成分が見事に描き出されている。これからコロナの温度や運動を求めるためには、装置の感度や波長特性を慎重に更正し、モデルとの詳しい比較を行わなければならない。現在までに、コロナの電子温度について以下のような結果が得られている。・東のストリーマ-の電子温度は約300万度であり、太陽から離れるにつれて増加する傾向がある。・電子温度はストリーマ-の外側で低くなる傾向を示す。・極域のコロナホールの下の方は明らかに低い電子温度(約200万度)を示すが、そこでは高さに伴うかなり急速な上昇がみられる。ここで得られた電子温度は、これまで他の方法で得られたものよりもかなり高い値を示しており、コロナの加熱や太陽風のモデルに与えるインパクトが大きい。今後さらに比較検討する必要がある。また、コロナの運動に関する解析も進めていく予定である。本年度は日食観測を実施する観測地点の調査を行った。観測地には日食当日に於て高い晴天率が望めること、観測機材を設置することができ観測者が3週間にわたって滞在できること、約1.5トンに及ぶ機材を問題なく搬入できること、が要求される。今回の皆既日食は南米のペル-、チリ、ボリビア、パラグアイ、ブラジル国と、天候面でも地理的、風土的にも
焼畑地域固有の価値基準にもとづく地域発展の検討―カリマンタンの事例より―

本研究の目的は大規模アブラヤシ農園開発に代わる焼畑地域固有の価値基準に基づく地域発展の検討を目的としている。目的達成のための課題として1.大規模アブラヤシ農園開発が計画されているB村において、生活実態調査を実施し、村人の多様な価値基準を明らかにすること、2.すでにアブラヤシ生産を導入したD村で同様の生活実態調査を実施し、アブラヤシ生産導入による焼畑社会への影響を明らかにすること、3.課題1と2の成果をもとに、B村村人と今後の発展の方向性、具体的は発展方策を議論し、それをサポートするための政策提言を構築すること、の3つを掲げていた。本年度の研究実施計画として、1.調査結果(課題1、2)のまとめと公表(日本熱帯生態学会、環境社会学会において学会発表)、2.約一か月のフィールドワークの実施による補足データの収集、3.論文執筆と研究結果をアカデミズムの世界へ還元、4.B村の具体的発展方策の検討と政策提言の作成、を計画していた。1に関しては計画通り、日本熱帯生態学会および環境社会学会において研究発表を行った。2に関しては計画通り、2012年2月3月にかけて約1か月のフィールドワークを実施し、補足的な調査を実施した。3に関しては課題1の一部を国際学会誌へ論文を投稿することはできたが、使用できていない調査結果が多く、十分な形で投稿論文化できていないと感じている。4に関してはNGOニュースレター、本の分担執筆において具体的な発展方策を検討し提示、政策提言している。しかし、まだ、実際の現場(B村およびインドネシア政府)への発展方策、政策提言は十分に行えていないと感じている。目的達成のために設定した3つの課題のうち、課題1,2(現地調査)を実施することはできた。しかし、課題3(調査結果のアカデミズム界、現場への還元)に関しては不十分であると感じているから。今後、調査結果を投稿論文化し、アカデミズムの世界へ還元する必要がある。また、具体的な地域の発展方策、政策提言をNGOニュースレター、書物などで公表はしているが、その内容を調査地域、インドネシア政府へ伝える作業を行う必要がある。インドネシアにおけるアブラヤシ農園開発は大規模な熱帯林の破壊と焼畑先住民の生活の改変を引き起こすと懸念されている。本研究は大規模アブラヤシ農園開発に代わる焼畑地域固有の価値基準に基づく地域発展の検討を目的としている。そのための課題は以下の3点である。1.大規模アブラヤシ農園開発が計画されているB村において、生活実態調査を実施し、村人の多様な価値基準を精緻化する。2.すでにアブラヤシ生産を導入したD村で同様の生活実態調査を実施し、アブラヤシ生産導入による焼畑社会への影響を明らかにする。3.課題1と2の成果をもとに、B村村人と今後の発展の方向性、具体的は発展方策を議論し、それをサポートするための政策提言を構築する。平成22年度においては長期のフィールドワークを実施し、課題1.2を明らかにし、論文発表することを計画していた。計画通り約8カ月の長期フィールドワークを実施した。課題1に関しては家計調査、焼畑労働調査、焼畑面積測量、10の生計手段を比較する総当たりランキング調査を実施した。これらの調査により、B村の現状把握と村人たちの求める生活スタイルを考察するための基礎データを収集することができた。この成果は平成24年5月、6月の学会にて発表する予定である。また、課題2に関しては、D村におけるフィールドワークから、村人たちがアブラヤシ生産を導入することによって経済的便益を享受していること、農園企業に従属しないで独立してアブラヤシ農園を造成し、生産していることを明らかにした。村人たちの求める生活スタイルにそくして、うまくアブラヤシ生産を取り込んでいたのである。これらの成果は雑誌「海外の森林と林業」に投稿し、出版されている。

しかし、課題3(調査結果のアカデミズム界、現場への還元)に関しては不十分であると感じているから。今後、調査結果を投稿論文化し、アカデミズムの世界へ還元する必要がある。また、具体的な地域の発展方策、政策提言をNGOニュースレター、書物などで公表はしているが、その内容を調査地域、インドネシア政府へ伝える作業を行う必要がある。
細胞死のターンアウトスイッチの分子機構の解明

細胞の自殺であるプログラム細胞死にはアポトーシスとオートファジー細胞死が存在する。本研究は、細胞が「死に方」を選択する際にどちらの経路へ進行するかを制御するターンアウトスイッチ(分岐器)の分子機構を明らかにすることを目的に、Type2Aタンパク質脱リン酸化酵素であるPP2AとPP6およびオートファジー制御に重要な役割を果たすBeclin1に注目して行った。具体的には、1) Beclin1新規リン酸化サイトの同定と機能解析、2) PP6によるBeclin1複合体構成の制御機構の解析、3) PP2A活性の制御によるアポトーシス制御機構の解析を行った。発生や発がんにおいて重要な役割を果たすプログラム細胞死は、主にアポトーシスを用いて実行されていると考えられてきた。しかし近年、プログラムされた細胞死のなかには、オートファジー細胞死などの非アポトーシス細胞死が存在し、アポトーシス機構が機能しない場合でも、細胞はオートファジー機構を活性化することで細胞死を誘導することが明らかになってきた。アポトーシスとオートファジーは相互に抑制し合うことが知られており、本研究は、細胞にはアポトーシス経路とオートファジー経路のどちらへ進行するかを制御する機構(ターンアウトスイッチ/分岐器)が存在との仮説のもと、その分子機構の解明を行うことを目的にオートファジーとアポトーシスの双方を制御するBeclin 1と脱リン酸化酵素Protein Phosphatase 6(PP6)の相互作用に着目し研究を遂行している。本年度は、Beclin 1の新規リン酸化サイトを同定し、その特異的抗体を作成した。作成した特異的抗体を用いて、Beclin 1のリン酸化がマウス生体および培養細胞において飢餓刺激や栄養刺激によって変化することを確認した。また、上流のリン酸化酵素を阻害剤およびin vitroのキナーゼアッセイにより同定した。さらに、Beclin1リン酸化サイトの変異体を用いた検討から、この新規リン酸化サイトのリン酸化がオートファジーを抑制すること、およびその分子機構を明らかにした。アポトーシスとオートファジーは相互に抑制し合うことが知られており、細胞にはアポトーシス経路とオートファジー経路のどちらへ進行するかを制御する機構(ターンアウトスイッチ/分岐器)が存在すると考えられるが、その分子機構は明らかになっていない。本研究ではアポトーシスとオートファジーの双方の制御に関与するBeclin 1に着目し、本年度は我々が同定した新規リン酸化サイトの制御機構についての解析を行った。その結果、マウスを飢餓状態にした際に、骨格筋において当該リン酸化サイトのリン酸化レベルが上昇することが明らかになった。さらに我々は、このリン酸化サイトがBeclin 1とAtg14Lとの結合を促進することでオートファジー活性を上昇させることを確認し、当該リン酸化サイトを制御するリン酸化酵素キナーゼと脱リン酸化酵素ホスファターゼを明らかにした。一連の研究成果については現在論文投稿中である。獣医薬理学本年度は、項目A「PP6の発現変化がBeclin1複合体の構成と局在を変化させる分子機構の解析」と項目B「PP6がBeclin1から解離する分子機構の解析」の2項目を研究項目として立てたが、項目Aについてはすべて達成し、かつ次年度の研究計画に記載した事項についても研究を開始している。項目Bについては、結合因子の同定において対照となる変異体の作成に時間がかかっており、当初の予定より遅れる結果となった。研究は概ね順調に進んでおり、本年度はオートファジーに関連する論文を1報投稿した。未だ採択はされていないため、今後は追加実験を行うことで論文の採択につなげたい。また、アポトーシス関連の仕事については、変異体の作成を終了させ、当初研究計画に追い付きたい。
在宅療養者・家族の自己決定を支える訪問看護に関する研究

1.面接調査の実施本調査は,(1)療養者や家族の意思表示や自己決定を支援するための訪問看護婦の方略と,(2)訪問看護場面におけるインフォームド・コンセントの実態を明らかにすることを目的に実施した。対象は東京都および神奈川県内の6カ所の訪問看護ステーションに勤務する28名の訪問看護婦であった。調査の同意が得られた訪問看護婦に対し,半構成的な面接法によりインタビューガイドを用いながら実施した。1回の面接時間は30分90分であった。2.結果・考察(1)対象者の概要:対象者の平均年齢は35.4歳(2651歳)であった。看護婦の経験年数の平均は11年1カ月であり,また訪問看護婦としての経験年数の平均は2年10カ月であった。(2)療養者や家族の自己決定を支援するための訪問看護婦の関わりに視点を当てて分析した結果,(1)療養者と家族,または家族間で意思が異なった場面とその際の訪問看護婦の対応および心理状況の特徴,(2)療養者や家族の自己決定後の“ゆらぎ"と“ゆらぎ"がみられた場合の訪問看護婦の対応および心理状況の特徴が明らかになった。(分析結果の詳細は省略する。)(3)療養者・家族へのインフォームド・コンセントの実施状況とそれに対する訪問看護婦の思いを分析した結果,訪問看護婦は病棟の臨床看護婦から訪問看護婦への申し送りや,療養者・家族への退院指導が不十分なためと思われるトラブルが多いと感じていることがわかった。また医師の説明不足による療養者や家族の誤った理解が原因でトラブルが生じる傾向が強いこともわかった。医療処理や看護ケアに限らず,ターミナル期にある療養者の予後に関する説明を行う際に訪問看護婦が心がけていることとして,(1)説明の時期やタイミングの見極め,(2)療養者や家族が希望しているかの確認,(3)療養者や家族が納得しているかの確認を特に重視していることが明らかとなった。1.先行研究の整理:療養者や家族の自己決定や訪問看護におけるインフォームド・コンセントに関する文献から「在宅での意志決定者」、「自己決定を支援するために訪問看護婦に求められる役割と機能」、「自己決定にかかわる看護婦の人間性と積極性」、「訪問看護婦の葛藤」を中心に整理した。その結果、(1)在宅での意志決定権は基本的には療養者・家族に属しており、この点が病院と明らかに異なるところである。病院のように医師に多くの決定権が集中しているわけではなく、看護婦は、療養者・家族の自己決定を支援しようとする姿勢を明確に持っていることが多い。(2)自己決定を支援するために訪問看護婦の役割と機能として、(1)療養者・家族の意思の表出と医師とのコミュニケーションを助ける、(2)情報を交換・共有、そして提供する、(3)職種間のコーディネートと仲間へのサポートする等が求められる。(3)インフォームド・コンセントを、「患者の権利」のひとつである「患者の自己決定権」を保障するためのものとして理解すると、それはあくまで療養者本人の意思を尊重することが前提となるが、療養者と家族でまるで反対の意思が存在した場合、訪問看護婦は葛藤が生じる。ことなどがわかった。2.調査票の作成:上記の結果を踏まえ、予備調査用の調査票(半構成面接調査用)を作成した。在宅療養における自己決定の状況、心情、訪問看護婦のインフォームド・コンセントの実施状況、それに対する思い等を質問項目として用いることにした。本年度実施予定であったタイプの異なる訪問看護事業システム(病院・白治体等)における参与観察は次年度に実施し、その結果で調査票を追加・修正する予定である。医療処理や看護ケアに限らず,ターミナル期にある療養者の予後に関する説明を行う際に訪問看護婦が心がけていることとして,(1)説明の時期やタイミングの見極め,
活性酸素に応答し細胞死を防ぐニューログロビンの作用機序の解明

ヒトのニューログロビン(Ngb)の神経細胞死抑制活性には、三量体G蛋白質αサブユニット(Gα)に対するGDP/GTP交換反応阻害因子(GDI)としての活性が重要である。今回、これまでに報告されているGαと結合能を有するペプチドとの配列を比較検討した結果、ヒトNgb内にGα結合モチーフが含まれていることが明らかになった。特にそのモチーフ内のEをQに置換したヒトNgb変異体を作製したところ、細胞保護できないことが明らかになった。この実験から、ヒトNgb内のGα結合モチーフが実際Gαとの結合及びGDI活性に重要な配列であることを実証できた。また、ゼブラフィッシュNgbのモジュールM1を使った蛋白質工学による「細胞膜貫通特性を有する新規ミオグロビン(Mb)」の創製にも挑んだ。我々は最近、ゼブラフィッシュNgbに細胞外から細胞質内に移行する「細胞膜貫通特性」があることを発見した。ゼブラフィッシュNgbは構造単位「モジュール」M1からM4で構成されている。ゼブラフィッシュNgbの細胞膜貫通特性に重要なモジュールM1を完全長のMbのN末端に融合したキメラ蛋白質を作製したところ、このキメラMbは天然のMb同様ヘムを取り込み安定な構造を形成し、ゼブラフィッシュNgb同様の細胞膜貫通特性を持つことが明らかになった。さらに、グリコサミノグリカンなどを合成不能な欠損細胞株を用いてNgbの細胞内導入メカニズムを検討した結果、このキメラMbは、ゼブラフィッシュNgb同様、細胞表面に存在する負電荷を帯びたグリコサミノグリカンと結合し細胞膜貫通することが明らかになった。以上の実験から、ゼブラフィッシュNgbのモジュールM1は、細胞膜貫通能を付与できる"取り付け可能な"「構造及び機能単位」として機能することを実証できた。近年、神経細胞に特異的に発現し、可逆的に酸素を結合できる「ニューログロビン(Ngb)」が報告された.このNgbを過剰に発現させると虚血・再灌流に伴う細胞死が減少し、逆に発現を抑制すると細胞死が増加することから、酸化ストレスによる細胞死を抑制する働きがNgbにあることが示唆されている.Ngbは通常の酸素濃度下においてはヘモグロビンなどの他のグロビン同様、ヘムの片側よりヒスチジンが配位し、他方から酸素分子が配位する構造をとっている.しかし、酸化ストレス下ではヘモグロビンなどとは異なり、ヘムの両側からヒスチジンが配位することによって大きな構造変化を生じる.我々は以前、この酸化ストレス時の大きく構造変化したヒトNgbがシグナル伝達タンパク質であるヘテロ三量体Gタンパク質のαサブユニット(Gα)と特異的に結合して「GDP解離抑制タンパク質(GDI)」として機能することを発見し、このGDI活性がヒトNgbによる細胞死抑制に重要であることを明らかにした.今回、我々は酸化ストレス下におけるヒトNgbの構造変化が細胞死抑制に重要であることを検証するため、酸化ストレス下でヘムに配位する64番目のヒスチジン(His64)をヘムに配位できないバリンに置換したH64VNgb変異体、およびヘムを亜鉛ポルフィリンで置換することにより酸化ストレス下でHis64が配位できないようにした亜鉛ポルフィリン置換Ngbを作製し、これらがPCI2細胞の酸化ストレスに伴う細胞死を抑制するかを調べた.その結果、H64V Ngb変異体および亜鉛ポルフィリン置換Ngbは共に細胞死をほとんど抑制しなかった.このことは、酸化ストレス下におけるNgbの構造変化が細胞保護に重要であることを示している.ヒトのニューログロビン(Ngb)の神経細胞死抑制活性には、三量体G蛋白質αサブユニット(Gα)に対するGDP/GTP交換反応阻害因子(GDI)としての活性が重要である。
心筋梗塞の壊死進展における白血球リポキシゲナーゼ活性亢進の意義と制御に関する研究

急性心筋梗塞における心筋壊死進展の病態には,欠陥攣縮・血栓形成,並びに続発する微小循環障害に基づく虚血性心筋障害,及び虚血心筋内への炎症細胞の浸潤が重要な役割りを果たす.従来炎症反応は,心筋組織の損傷治癒過程の一環としてのみ把えられてきたが,最近白血球細胞の活性化が心筋壊死進展の病態進行を増幅し,ひいては心筋梗塞巣の拡大をもたらす可能性が指摘されつつある.本研究は,微小循環障害を惹起するとともに炎症反応の重要なメディエーターとなるアラキドン酸リポキシゲナーゼ代謝物質(ロイコトリエン,ヒドロキシエイコサテトラエン酸)に注目し,1.心筋虚血時の白血球並びに心筋リポキシゲナーゼ代謝活性の測定,2.リポキシゲナーゼ代謝物質と白血球機能・心筋壊死進展との相関解析を行い,3.抗炎症剤である選択的リポキシゲナーゼ阻害剤による心筋梗塞の壊死進展抑制効果について,実験的心筋梗塞(左冠動脈閉塞1.5時間,再潅流5時間)モデルを用いて検討した.その結果, 1.虚血部心筋では非虚血部心筋に比しリポキシゲナーゼ代謝活性が顕著に亢進し,これらは心筋梗塞量並びに虚血部心筋への白血球浸潤度と正相関を示し(AHA・日循総会1986発表, Cardiovasc Res1987;21:551)2.心筋虚血作成後,時間経過とともに末梢血多核白血球数が上昇し,白血球凝集能並びに白血球ロイコトリエンB4産生能が有意に亢進し(Jph Circ J1987;51:465),3.リポキシゲナーゼ阻害剤AA-861は虚血心筋における白血球浸潤を抑制し,末梢血中白血球の機能亢進を低下させるとともに二重色素法(エバンスブルー,トリフェニールテトラゾリウム)により評価した心筋梗塞量を有意に縮小する(AHA,日循総会1987発表, J Am Coll Cardiol1988 in press)という新しい知見を得た.急性心筋梗塞における心筋壊死進展の病態には,欠陥攣縮・血栓形成,並びに続発する微小循環障害に基づく虚血性心筋障害,及び虚血心筋内への炎症細胞の浸潤が重要な役割りを果たす.従来炎症反応は,心筋組織の損傷治癒過程の一環としてのみ把えられてきたが,最近白血球細胞の活性化が心筋壊死進展の病態進行を増幅し,ひいては心筋梗塞巣の拡大をもたらす可能性が指摘されつつある.本研究は,微小循環障害を惹起するとともに炎症反応の重要なメディエーターとなるアラキドン酸リポキシゲナーゼ代謝物質(ロイコトリエン,ヒドロキシエイコサテトラエン酸)に注目し,1.心筋虚血時の白血球並びに心筋リポキシゲナーゼ代謝活性の測定,2.リポキシゲナーゼ代謝物質と白血球機能・心筋壊死進展との相関解析を行い,3.抗炎症剤である選択的リポキシゲナーゼ阻害剤による心筋梗塞の壊死進展抑制効果について,実験的心筋梗塞(左冠動脈閉塞1.5時間,再潅流5時間)モデルを用いて検討した.その結果, 1.虚血部心筋では非虚血部心筋に比しリポキシゲナーゼ代謝活性が顕著に亢進し,これらは心筋梗塞量並びに虚血部心筋への白血球浸潤度と正相関を示し(AHA・日循総会1986発表, Cardiovasc Res1987;21:551)2.心筋虚血作成後,時間経過とともに末梢血多核白血球数が上昇し,白血球凝集能並びに白血球ロイコトリエンB4産生能が有意に亢進し(Jph Circ J1987;51:465),3.リポキシゲナーゼ阻害剤AA-861は虚血心筋における白血球浸潤を抑制し,末梢血中白血球の機能亢進を低下させるとともに二重色素法(エバンスブルー,トリフェニールテトラゾリウム)により評価した心筋梗塞量を有意に縮小する(AHA,日循総会1987発表, J Am Coll Cardiol1988 in press)という新しい知見を得た.炎症反応の一環として虚血心筋に浸潤する白血球が心筋壊死の病態進行を増幅し、心筋梗塞の拡大に寄与し得ると考えられている。実際、虚血心筋への白血球の動員・浸潤を抑制する事によって、心筋梗塞の進展防止が可能であることが実験的に示されている。この際、白血球由来アラキドン酸代謝物質〔ロイコトリエン,ヒドロキシ酸(HETE)〕が微小循環障害の進展因子として介在する可能性が示唆されている。本研究では、心筋梗塞発症早期における虚血心筋でのアラキドン酸代謝物質(アイコサノイド)がどのように変動するかを実験的に追求し、冠微小循環系において、白血球・血小板の相互間で如何なる病態代謝を構成するかを考察した。その結果、実験的心筋梗塞(大冠動脈閉塞一再灌流モデル)において、虚血心筋にはアラキドン酸代謝物質の産生亢進を認め、特に12-HETE、5-HETE、トロンホキサン【B_2】(TX【B_2】)は正常心筋に比して顕著に増大した。アラキドン酸代謝亢進は、二重染色法(Evans Blue,TTC)より判定した心筋障害の進展度や虚血心筋への白血球の浸潤度と有意な正相関を示した。

流血中の白血球に関しても、虚血作成後、白血球数の増大やカルシウムイオノフア【A_(23187)】に対する白血球凝集能の亢進を認めた。これらの実験事実は、アラキドン酸代謝物質の産生亢進を伴った白血球の活性化が、虚血性心筋障害の進展と密接に関連する事を示唆すると考えられる。12-ないし5-リポキシゲナーゼ代謝物質は白血球遊走・血管収縮作用を、TX【B_2】は血小板凝集亢進・血管収縮作用を各々有しており、これらの生理活性物質がかかる病態進展のメディエーターとして関与していることが示唆された。今後、抗炎症剤であるリボキシゲナーゼ阻害剤或いはトロンボキサン【A_2】阻害剤による心筋梗塞量の縮小効果への基礎的検討を行う必要がある。