hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的プロテオーム解析を用いた膵臓癌の発癌と転移機序の解明とバイオマーカーの開発

膵臓がんはきわめて予後不良のがん腫であり、診断時にすでに遠隔転移を認めることが多い。本研究の目的は、最新のプロテーム技術を用いて、膵臓がんのバイオマーカーの開発と浸潤・転移機構の解明である。我々は、膵臓がん患者の迅速解剖を行った症例で、同一患者から樹立した1腹膜播種転移巣、2肝転移巣、3肺転移巣の細胞株を用いて、プロテームならびにチロシンリン酸化プロテオーム解析を行った。その結果、それぞれの転移巣で異なる発現パターンを示した。つまり、プロテオームレベルでも明らかながんの不均一性が存在した。さらに、転移巣ごとに、キナーゼ阻害剤に対する異なる治療効果を示した。膵臓癌の解剖症例で,同一患者(A38)の(1)腹膜播種転移巣,(2)肝転移巣,(3)肺転移巣から樹立した細胞株を用いて,網羅的なProteome解析を行った.Proteome解析は,タンパクの培養細胞からの回収方法の違いによって,Secretome解析とMembrane proteomic解析に分けて検討した.(1)腹膜播種転移巣,(2)肝転移巣,(3)肺転移巣のタンパク発現を相対的に比較することによって,それぞれの転移巣に特異的に高発現するタンパクを同定した.同一症例における,これまでのゲノムの突然変異に関するシークエンス解析で(1)腹膜播種転移巣は本患者の癌ゲノムの進化の過程で比較的早期のクローン,(2)肝転移巣と(3)肺転移巣はその最終段階のクローンで類似していることが判明している(Yachida S etal,Nature2010,467:1114-7).それらのゲノム解析の結果と同様に,(2)肝転移巣と(3)肺転移巣は類似したタンパク発現のパターンを認めた.興味深いことに,(2)肝転移巣と(3)肺転移巣はEpithelial-Mesenchymal Transition(EMT:上皮間葉移行)の間葉系マーカーの高発現を認め,逆に(1)腹膜播種転移巣では上皮系マーカーの高発現を,Secretome解析とMembrane proteomic解析の両解析で認められた.EMTの獲得が癌細胞の転移能と関連していることが強く示唆された.さらに,Secretome解析で(2)肝転移巣と(3)肺転移巣で高発現している新たなタンパクを発見し,転移に関する新しいバイオマーカーや転移機序の解明に有益である可能性が示唆された.さらに細胞株の培養細胞を回収してペレットを作り,ホルマリン固定した後,パラフィン包埋ブロックを作成した.網羅的なProteome解析でそれぞれの転移巣で高い発現を認めたタンパクに関して,市販の抗体を用いて免疫組織化学染色法を行い,そのタンパク発現を確認した.そして,それぞれの細胞株からRNAを抽出しDNA Microarray解析を行い,現在解析中である.平成25年度は、これらの同一患者の原発巣や転移巣のタンパク発現の差異は、がんゲノムの進化に伴う不均一性(Heterogeneity)と関連していると考え、タンパク発現レベルにおけるがんの不均一性(Heterogeneity)について検討した。網羅的なプロテオーム解析に加えて、研究試料として細胞株だけでなく、凍結やホルマリン凍結組織を用いて、免疫組織化学染色やウェスタン・ブロッティングで検証実験に行った。その成果は、連携研究者の米国・Johns Hopkins大学のIacobuzio-Donahue教授(現Memorial Sloan Kettering Cancer Center)とともに、"Heterogeneity of pancreatic cancer metastases in a singel patient revealed by quantitative proteomics"のタイトルで、Molecular & Cellular Proteomicsに投稿し、in pressになっている。平成23年度に、膵臓がんの解剖症例の細胞株(同一症例の1腹膜播種転移巣、2肝転移巣、3肺転移に3つの株)を用いて、網羅的なプロテオーム解析を行った。解析は抽出方法により、Secrotome proteomics(分泌タンパク)とMembrane proteomics(膜タンパク)に分けて解析した。平成24年度は、これらの網羅的なプロテオーム解析を、独自のアルゴリズムにしたがって、腹膜播種転移巣に特に高いもしくは低いタンパク発現、肝転移巣に特に高いもしくは低いタンパク発現、肺転移巣に特に高いもしくは低いタンパク発現を、分泌タンパクと膜タンパクに分けて、それぞれトップ20のタンパクをさらに詳しく検討した。解析方法は培養細胞株から抽出したタンパクを用いてWestern Blotting法と、同細胞株から回収したペレットをホルマリン固定、パラフィン包埋してスライドを作成し、免疫組織化学染色を行った。その結果、網羅的なプロテオーム解析の結果の多くは、Western Blotting法と免疫組織化学染色で同様な結果が得られることを確認した。さらに、これらのタンパク発現と遺伝子発現のレベルの関連性を検討するために、DNA Microarrayで解析した。さらに、次世代シークエンス技術で遺伝子変異の有無を解析した。

その結果、大変興味深いことに遠隔転移巣(肝転移と肺転移巣)の細胞株は、よく似たタンパクや遺伝子発現のパターンを示し、腹膜播種転移巣とは全く異なっていた。特に、遠隔転移巣ではVimentinなどの間葉系マーカーが高発現を示し、腹膜播種転移巣ではE-cadeheinなどの上皮性マーカーが高発現を示した。これらの所見は、がんの遠隔転移にはEMT(Epithelial-Mesenchymal-Transition)が関連していることを裏付ける所見である。おおむね順調であるが,当初の計画と比較すると遅れている.平成23年度末に所属施設の異動があり,その準備等で研究に専念し,計画通り研究を遂行する時間がとれなかった.25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、概ね順調に進んでいるが、個々のデータ解析(例えば、マイクロアレイのデータ解析など)はやや遅れている。また、本研究は米国・Johns Hopkins大学の試料を用いてスタートしたが、研究代表者の所属施設の異動(香川大学→国立がん研究センター・研究所)に伴い、本邦における膵臓がん症例の試料の収集が遅れている。平成24年度から国立がん研究センター・研究所に異動したことで,研究に専念できる時間が増え,研究の遅れを取り戻せると考えている.また,国立がん研究センター・研究所におけるプロテオーム解析の専門家や米国・ジョンズ・ホプキンス大学の研究者と協力しながら,研究を遂行する予定である.25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、これらの所見を多数例の膵臓がん症例で検証する予定である。これまでは主に研究対象を一症例にしぼって、出来るだけ深い検討を行ってきた。今後は、我々が作成したTMA(Tissue Microarray)等を用いて免疫組織化学染色法で、ターゲットとなるタンパクの組織内の発現を検討する。このTMAには、多数例(13例)の腹膜播種転移巣と肝転移巣、肺転移巣の組織切片が、1枚のスライドガラス上に整列固定させた我々のオリジナルのものである。また、ELISA法を用いて、患者血液内でターゲットとなるタンパク量が測定可能か否かについても検討する。これらの所見と臨床・病理学的因子を比較し、これらのタンパクの臨床的意義について検討する。さらに、本年度は本研究を総括し、膵臓がんのバイオマーカーの開発だけでなく、発癌や転移機序の解明に寄与したい。
クローン病に関わるオートファジー因子Atg16L WDリピートドメインの機能解析

オートファジー関連蛋白質Atg16Lの1塩基多型と原因不明の炎症性腸疾患であるクローン病との関連が報告された。クローン病患者では過剰な炎症反応が引き起こされているが、そのメカニズムはこれまで不明であった。そこで我々は、Atg16Lのノックアウトマウスを作成しAtg16Lの役割を解析した。その結果オートファジーの欠損により、炎症性のサイトカインIL1-betaが過剰に産生されることを見いだした。また、我々はAtg16Lのクローン病型1塩基多型、またはWDリピートドメインの欠失は飢餓誘導性または病原性微生物に対するオートファジー能に全く影響を与えない事を見いだした。これより、Atg16Lのクローン病型1塩基多型は既知のオートファジー経路に大きな影響を与えることなく、過剰な炎症反応を引き起こしていると考えられる。ゲノムワイドな解析からAtg16Lの1塩基多型と原因不明の炎症性腸疾患であるクローン病との関連が示唆されている。クローン病に関連するAtg16Lの1塩基多型はC末端側のWDリピートドメイン中に存在する。クローン病患者では過剰な炎症反応が引き起こされているが、そのメカニズムはこれまで良く分かっていない。そこで我々は、Atg16Lのノックアウトマウスを作成し、炎症誘導制御におけるAtg16Lの役割を解析した。グラム陰性菌に対する自然免疫応答におけるAtg16Lの役割を調べるため、野生型とAtg16Lノックアウトのマクロファージをグラム陰性菌のエンドトキシン成分であるリポ多糖で刺激したところ、Atg16Lノックアウトの細胞は野生型に比べてIL-1βを過剰に産生した。IL-1βはリポ多糖などの刺激により転写が亢進され未成熟な前駆体として翻訳された後に、カスパーゼー1により切断を受け、成熟型のIL-1βとなり細胞外へと分泌される。また、カスパーゼー1自身もインフラマソームによる切断を受けて活性型(成熟型)へと変換されている。Atg16Lノックアウトの細胞において、IL-1β産生のどの段階に異常があるのか検討したところ、カスパーゼー1を活性化するインフラマソームが異常に活性化されていることが明らかになった。現在、オートファジーの不全がインフラマソームの過剰な活性化を引き起こすメカニズムを詳細に解析中である。さらに、Atg16Lノックアウト細胞を用いて、Atg16Lの機能解析も平行して進めている。これまでにAtg16Lのクローン病型1塩基多型、またはWDリピートドメインの欠失が飢餓誘導性のオートファジーに全く影響を与えない事を見いだしている。現在はバクテリアやウイルスの感染に対してクローン病型1塩基多型・WDリピートドメインの欠失が影響を与えるかどうか様々な手法を用いて検討している。ゲノムワイドな解析からAtg16Lの1塩基多型と原因不明の炎症性腸疾患であるクローン病との関連が報告された。そこで我々は、Atg16Lのノックアウト(KO)マウスを作成し、炎症誘導制御におけるAtg16Lの役割を解析した。グラム陰性菌に対する自然免疫応答におけるAtg16Lの役割を調べるため、野生型とAtg16L-KOのマクロファージをグラム陰性菌のエンドトキシン成分であるリポ多糖で刺激したところ、Atg16L-KOの細胞は野生型に比べてIL-1βを過剰に産生した。IL-1βはリポ多糖などの刺激により転写が亢進され未成熟な前駆体として翻訳された後に、カスパーゼ-1により切断を受け、成熟型のIL-1βとなり細胞外へと分泌される。また、カスパーゼ-1自身もインフラマソームによる切断を受けて活性型(成熟型)へと変換されている。Atg16L-KOの細胞において、IL-1β産生のどの段階に異常があるのか検討したところ、カスパーゼ-1を活性化するインフラマソームが異常に活性化されていることが明らかになった。この結果はオートファジーによる炎症反応抑制機構を明らかにした初めての報告である。さらに、Atg16L-KO細胞を用いて、Atg16Lの機能解析も平行して行った。予想に反して、我々はAtg16Lのクローン病型1塩基多型、またはWDリピートドメインの欠失は飢餓誘導性または病原性微生物に対するオートファジー能に全く影響を与えない事を見いだした。
地域密着型障がい者スポーツ活動の推進事業の展開とその社会的意義に関する縦断的研究

本研究は、重度障がい者のスポーツであるボッチャの普及、選手の発掘・育成・強化を図り、障がい者スポーツの意義や機能について、障がい当事者のみならず、支援学校教員や理学療法士、作業療法士などの医療専門職者、そして広く一般市民に対して理解の推進を図るとともに、重度障がい者の潜在性を表出することでヒトの可能性について示すことを目的とした。結果、昨年のリオパラリンピックで銀メダルを獲得できたこと、全国肢体不自由特別支援学校ボッチャ大会“ボッチャ甲子園"を開催できたこと、新聞をはじめとするメディアにも多く取り上げられたこと、健常者のボッチャ大会が開催できたことなど、国内でのボッチャの認知度が高まった。本研究は、縦断的に重度障がい者のスポーツであるボッチャ競技を推進、実践し、障がい者のスポーツの意義や機能について明らかにするとともに、障がい当事者だけでなく、小・中学校・支援学校教員や理学療法士、作業療法士などの医療専門職者、そして社会福祉協議会職員やケースワーカーなどの専門職者にスポーツ活動の意義について理解を推進するとともに障がい者の可能性について具体的に示すことを目的としている。今年度は以下の事業を実施した。各都道府県別にボッチャ協会あるいは連盟等の組織があるかどうかについて調査した。現在、協会が設置されているのは、16都道府県に留まっている状況であることがわかった。1.普及活動の実施:地域におけるボッチャの状況を調査した。まだ、ボッチャ協会等の設立されていない都道府県に対して、普及講習会等を開催し、普及に努めた。結果、宮崎県、岡山県にボッチャ協会が設立され、引き続き、奈良県、岐阜県、香川県も設立の予定である。2.ボッチャの補装具であるランプについて、より精度が高く、かつ価格が安い普及型ランプを開発した。さらに、代表選手をめざすプレーヤーなどを対象としたプロトタイプも開発した。また、現在、2本のパイプを組み合わせたパイプ式ランプの開発中である。3.支援学校の教員を対象に、大阪府立大学オープン講座として、ボッチャについて講演を行い、参加した支援学校教員の理解を高めた。4.脳性麻痺選手において、視知覚の障がいがあることがわかり、深視力測定器により、強化指定選手の測定を行った。約80%の選手に距離等の把握、理解の問題があることがわかった。本研究は、縦断的に重度障がい者のスポーツであるボッチャ競技を推進、実践し、障がい者のスポーツの意義や機能について明らかにするとともに、障がい当事者だけでなく、小・中学校、支援学校教員や理学療法士、作業療法士などの医療専門職者、そして社会福祉協議会職員やケースワーカーなどの専門職者にスポーツ活動の意義について理解を推進するとともに障がい者の可能性について具体的に示すことを目的としている。ボッチャ競技の現状を調査すべく、日本ボッチャ協会に所属する登録選手数を調査し、都道府県別にまとめた。選手は主として、関東及び近畿地域に集中しており、他の都道府県は非常に少なかった。近畿地域でも、大阪、兵庫に集中しており、奈良、和歌山県の登録選手数はゼロであり、同様の傾向が全国的にも生じていた。1.普及活動の実施:地域におけるボッチャの状況を調査し、普及講習会等を開催し啓発に努めた。以下、今年度に実施した普及講習会等を記す。大阪市長居障がい者スポーツセンター(7月)、府立整肢学園(8月)、大阪府立大学オープン講座「支援学校教員を対象とした、重度障がい者スポーツのすすめ」(8月)、滋賀県ボッチャ協会(11月)、宮崎フェニックスシーガイヤリゾート(1月)、はびきの市民活動フェスタへの参加(3月)、大阪府理学療法士会主催重度障がい者スポーツ『ボッチャ大会』開催(3月)、奈良県障害者福祉協議会主催ボッチャ講習会(3月)2.ボッチャボールとランプ(スポーツ用補装具)の開発、研究現在市販されている競技用ボッチャボールは、一式約80,000円と非常に高価であるため、一層の普及を目的に、安価で高性能のボールの開発・研究に着手した。また、最重度の選手に必需であるランプについても、精度が保たれ、かつより安価な普及版を開発すべく、検討した。次年度完成させる予定である。前年度のボッチャ登録選手数の調査から、日本ボッチャ協会に登録している選手数は220名、そしてクラスの関係からパラリンピックを目標にできる選手が約150名と非常に少ないこと、また、各都道府県別の登録者数がいまだ0名の県が20もあり、主に地域の普及振興に努めた。結果、香川県にボッチャ協会が設立し、四国で初めて1名の選手登録を得た。また、特別支援学校の教員がボッチャ指導や審判の任にあたっている都道府県では、選手数が多いことが判明したため、全国特別支援学校及び特殊学級の生徒達によるボッチャ甲子園を提案し、全国特別支援学校肢体不自由教育校長会の会長の理解を得、次年度から支援学校等における積極的な普及振興活動へ協力していただけることになった。奈良県ニュースポーツ協会(4月)、大阪府立大学オープン講座「支援学校教員を対象とした、重度障がい者スポーツのすすめ」(8月)、三重県立特別支援学校北勢きらら学園(10月)、香川県ボッチャ協会設立委員会(2月)、徳島県鴨島病院リハビリテーション部(3月)、東京都立光明支援学校(3月):平成26年度東京都肢体不自由特別支援学校ボッチャ交流会。10チームの支援学校からの参加があり、ビギナーコースとアスリートコースにわけ競技を行った。支援学校の教員や家族へ啓発できた。

2.ボッチャボールとランプ(スポーツ用補装具)の開発、研究現在市販されている競技用ボッチャボールは、一式約80,000円と非常に高価であるため、一層の普及を目的に、安価で高性能なボールの開発、研究に着手した。結果、25,000円という安価で且つ競技にも使用可能なボールセットを販売できた。また、最重度のBCクラス選手に必需であるランプについて、スタンダードタイプ及びプロトタイプを開発でき、多くの選手が使用するようになっている。当該年度は、1)前年度から引き続き地域での普及振興、2)日本代表選手、強化指定選手へのアンケート調査を中心に実施した。1)前年度、一般社団協会日本ボッチャ協会に登録している会員が、前々年度から大きく変化なかったことも踏まえ、前年度から継続して出前普及講習や、大阪府内にある支援学校に出向いて、生徒・児童や教職員を対象に、ボッチャの体験会や講習会を行うなど、依頼に対して積極的に対応するよう努めた。出前普及講習として、大阪府松原市、兵庫県尼崎市などの近畿圏内だけでなく、宮崎県や徳島県での講習会の依頼にも対応した。中でも、松原市では市制60周年記念行事として本学協力のもと「障がい者スポーツボッチャ大会」を開催した。地元市民を中心に障がい者、健常者問わず参加出来る大会であったため、「ボッチャ」を通して地域のさまざまな人が交流できる良い機会となった。また、支援学校での講習会として、大阪府立岸和田支援学校、大阪府立茨木支援学校、京都府立南山城特別支援学校、瀬戸市立瀬戸特別支援学校(愛知県)で実施した。さらには、前年度から計画していた全国特別支援学校対抗選手権(ボッチャ甲子園)開催についても具体的に話が進み、平成28年度内に開催することが決定した。当該年度の日本ボッチャ協会の登録者数を調査したところ、456名から511名にまで増えていた。これまで継続的に実施してきた出前普及講習会等の成果として考えられる。2)継続的に日本代表選手、強化指定選手を対象に、日ごろの練習時間や練習環境、身体機能や自身の障がいについて調査を実施している。指導者の不足や十分な練習環境が確保できないこと、二次的な障がいによる身体機能の低下等が調査をする中での問題点として挙がってきているが、引き続き調査を行い、今後の課題と解決方法を検討していきたい。地域での普及振興に力を入れ、全国各地、支援学校等でも積極的に講習会た体験会を実施してきたが、先方とのスケジュール調整や他のイベントとの兼ね合いもあり、これらの活動を十分できたかと言うと、やや課題の残る部分もあると考える。また、ボッチャ選手を対象に実施してきたアンケートについても、強化合宿をはじめとする事業に合わせて調査を実施する機会が多く、時間的な制約もある中で進めているため、予定よりも時間を要した。全国特別支援学校校長会でのボッチャプレゼンや直接、支援学校に出向いてのボッチャに関する普及活動を積極的に行った結果、全国の肢体不自由特別支援学校を対象とした第1回ボッチャ甲子園を8月2日、ぶんぶ東京スポーツ体育館で開催できた。本大会には、全国から16校の重度障がい者、約50名が参加し、ボッチャ競技に親しんだ。
哺乳類における微量D-アミノ酸二次元一斉分析を基盤とする創薬の展開

1)D-アミノ酸二次元一斉分析システムの構築本年度は平成14年度に検討した迅速光学分割と逆相ミクロカラムでのアミノ酸粗分画条件を組み合わせ、多種類のD-アミノ酸連続二次元分析を可能とするHPLCシステムを構築した。本システムはピークトラップ部に新たに開発したマルチループシステムを有しており、6本並列に組み込んだ400μLのループ切り替えにより、任意のループに目的とするアミノ酸分画を導入可能である。本システムを用いてDL-Val,-Ile,-Leu,-Phe混合標品を連続分析した結果、いずれのアミノ酸も良好な迅速光学分割が認められた。また、4種の疎水性アミノ酸全ての定量に要する分析時間は60分以内であり、迅速な二次元分析が可能であった。2)システムの評価本システムの評価を行った結果、4種の疎水性アミノ酸の検量線はいずれもD体が5-500fmol、L体が50-5000fmo1の範囲で0.999以上の良好な直線性を示した。また、4種全てのD体、L体について定量値の日内、日間変動について検討した結果、日内変動がn=5で1.5-3.0%(RSD)、日間変動が5日間で2.5-8.1%(RSD)であり、本二次元システムが良好な定量性と再現性を有することが示された。3)ラット及びマウスにおけるD-アミノ酸分析マウス大脳中の疎水性アミノ酸定量を行った結果、組織湿重量1g当たりddY/DAO+マウスでは1.23nmol、ddY/DAO-マウスでは10.85nmolのD-Leuが認められた。また、両系統とも微量のD-Val及びD-Ileが認められた。なお、マウス大脳試料における添加検量線の傾きはいずれのアミノ酸も標品について得られた傾きと良く一致しており、本システムを用いて生体試料中微量D-アミノ酸の迅速な連続二次元分析が可能であることが示された。1)各アミノ酸の迅速光学分割法の検討本研究達成の鍵は哺乳類における多くのD-アミノ酸について二次元一斉分析を可能とするシステムの開発であり、このためにはキラルカラムのハイスループット化が不可欠である。そこで平成14年度はまず疎水性D-アミノ酸4種(ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン)を分析対象とし、迅速光学分割の検討を行った。その結果、光学認識部位として疎水基性相互作用が可能なターシャリーブチル基と、αアミノ酸を認識するキニンを有するキラル固定相を用いることにより、高分離能での光学分割が可能となった。併せて移動相を検討し、クエン酸を含有するアセトニトリル、メタノール混液を移動相として分離能の低下をほとんど生じることなく迅速分析を可能とした。この時の各アミノ酸の分離度(Rs)はロイシンが3.44、バリンが2.95、イソロイシンが2.52、フェニルアラニンが4.04であり、いずれも10分程度での光学分割を達成した。2)全自動D-アミノ酸二次元一斉分析システムの構築キラルカラムのハイスループット化と併行し、各D-アミノ酸をDL混合物として分画する粗分離についても分析条件の検討を行った。ここで分画した各アミノ酸フラクションは順次ループを介してキラルカラムに導入し、上記で検討した条件により迅速光学分割を行う。上記4種のアミノ酸は高感度化を目的としてNBDプレカラム誘導体化を行い、逆相ミクロカラムにおける迅速分離について検討した。その結果、樹脂の粒径3μm、カラム内径1mmの逆相ミクロカラムを用い、TFAを含むアセトニトリル水溶液を移動相として40分でのベースライン分離を達成した。

なお、マウス大脳試料における添加検量線の傾きはいずれのアミノ酸も標品について得られた傾きと良く一致しており、本システムを用いて生体試料中微量D-アミノ酸の迅速な連続二次元分析が可能であることが示された。
FoxM1トランスジェニックマウスを用いた肝発癌の病態解明と新規治療法の開発

Forkhead Box M1 (FoxM1)は、主に細胞周期を制御し肝再生や肝発癌過程に関与する転写因子である。今回我々は、テトラサイクリンの制御下に肝細胞特異的にFoxM1の発現誘導可能なトランスジェニックマウスを作製し、肝細胞におけるFoxM1の役割を検討した。この結果、予想外に、肝細胞特異的なFoxM1の過剰発現は、肝細胞死や肝内炎症を誘導した。さらに、トランスジェニックマウスは、著明な肝線維化を自然発症した。この結果より、肝細胞FoxM1は、細胞増殖のみならず、細胞死、肝内炎症、線維化を経て、肝癌発症に寄与している可能性が示唆された。背景及び目的:ForkheadBoxM1(FoxM1)転写因子は、種々の癌組織で過剰発現しており、ヒト肝細胞癌手術組織を用いた検討により、腫瘍部では非腫瘍部に比してFoxM1の発現が約10倍と著明に亢進しており、腫瘍部におけるFoxM1発現が術後の生存率及び再発を規定する独立因子であることを明らかにしている(論文投稿中)。そこで、今回、FoxM1を肝臓特異的に発現誘導させることが可能なトランスジェニックマウスを作成し、FoxM1分子が発現することが肝発癌に関与するのかを明らかにすることを目的とした。方法:テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリン(DOX)投与により発現が誘導されるTet-Onシステムと臓器特異的Cre-LoxPシステムを組み合わせることにより、任意の時期に任意の組織でFoxM1の発現誘導が可能なトランスジェニックマウス(FoxM1 inducible Hepatocyte-specific transgenic mouse:FoxM1iHepTg )を作成した。結果:1)FoxM1iHepTgマウスにおいて飲水中DOXにより、FoxM1蛋白の発現誘導をウエスタンブロットにて確認した。2)FoxM1iHepTgに対して、飲水中DOXに加え、高脂肪食食餌負荷を行ったところ、負荷4週時点において、対照マウスに比し、脂肪蓄積の亢進を認めた。考察及び結論:肝細胞特異的、時期特異的にFoxM1を過剰発現可能なマウスの作製に成功した。FoxM1過剰発現は、肝脂肪蓄積に促進的に作用する可能性が示唆された。Forkhead Box M1(FoxM1)は細胞周期制御能を有するFoxファミリー転写因子で、我々は、これまで、FoxM1が肝癌(HCC)で過剰発現し癌進展や患者予後を規定することを、ヒトHCC手術症例の解析より明らかにしてきた。今回、肝特異的発現誘導型トランスジェニックマウスの作製を通じて、肝発癌の病態解析を試みることを目的とした。そのために、まずHCCの背景疾患として最近注目されている非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)におけるFoxM1の役割について検討した。肝細胞特異的にFoxM1を発現誘導可能なトランスジェニックマウス(TetO7-FoxM1/Rosa26-LSL-rtTA/Alb-Cre(+)、以下TGマウス)を作成し実験に用いた。出生時よりテトラサイクリン経口投与にて肝特異的にFoxM1を発現誘導後、高脂肪食(HFD32)を4週間摂取させ肝病態を評価した。対照としてTetO7-EGFP-FoxM1/Rosa26-LSL-rtTA/Alb-Cre(-)マウス(以下、WTマウス)を用いた。TGマウス肝組織においてのみFoxM1蛋白の過剰発現がテトラサイクリン依存性に誘導されていることをウエスタンブロット及び免疫組織学的に確認した。TGマウスではWTマウスに比し、高脂肪食負荷後の肝体重比が1.5倍(5.8% vs 3.9%, p<0.01)増加した。また、TgマウスではWTマウスに比し、血清ALT値が有意に増加し(74.1 U/L vs 21.5 U/L, p<0.01)、肝障害増強を認めた。組織学的には、Sirius Red陽性の肝線維化領域がTGマウス肝で既に出現していた。さらに、肝線維化関連分子の肝内遺伝子発現量を定量的リアルタイムRT-PCR法にて評価したところ、TGマウスでWTマウスに比し、Col1a1、Col1a2、αSMA、TGFβがそれぞれ6.6倍(p<0.05)、4.3倍(p<0.05)、3.1倍(p<0.01)、1.9倍(p<0.01)と有意に増加していた。前年度に引き続き、肝発癌過程におけるFoxM1転写因子の役割について、肝細胞特異的FoxM1TGマウスを用いて、解析を行った。特に、NAFLDを背景にする肝発癌過程における同分子の役割について、解析を行ったところ、FoxM1が、肝障害及び肝線維化に促進的に機能するという予想外の結果を得た。以上、本実験計画は順調に遂行できていると考えている。【目的】Forkhead Box M1(FoxM1)は細胞周期制御能を有するFoxファミリー転写因子であり、我々はこれまで、FoxM1が肝癌で過剰発現し癌進展や患者予後を規定することをヒト肝癌手術検体を用いて明らかにしてきた。今回我々は、肝細胞特異的にFoxM1の発現を調節可能なトランスジェニックマウスを作成し、肝細胞FoxM1の役割を解析した。【方法】

Cre-LoxPシステム、Tet-onシステムを用いて、テトラサイクリン経口投与にて肝細胞特異的にFoxM1を発現誘導可能なトランスジェニックマウス(TetO7-FoxM1/Rosa26-LSL-rtTA/Alb-Cre(+)、以下TGマウス)を作製した。出生時より肝特異的にFoxM1を発現誘導し、8週齢及び24週齢で肝病態を評価した。対照としてTetO7-EGFP-FoxM1/Rosa26-LSL-rtTA/Alb-Cre(-)マウス(以下、WTマウス)を用いた。【成績】TGマウスでは血清ALT値(75.2 U/L vs 15.9 U/L、p<0.05)、TUNEL陽性細胞数が増加(p<0.05)し、肝障害増強を認めた。肝内炎症関連分子のTNFα、CCL2に関して、それぞれ3.1倍(p<0.01)、14.9倍(p<0.05))と有意に遺伝子発現の増加を認め、これらの遺伝子発現の増加は、FoxM1発現誘導の解除により有意に低下した。TGマウスから初代培養肝細胞を単離してFoxM1蛋白発現を誘導したところ、CCL2遺伝子発現の有意な増加を認めた。さらに、24週齢の検討では、WTマウスに比しTGマウスで肝線維化が有意に亢進した。【考案及び結語】肝細胞FoxM1がCCL2を介して肝内炎症の増強に寄与し、その後の肝線維化に寄与している可能性が示唆された。FoxM1は肝発癌のみならず、炎症、線維化にも寄与している可能性が示唆された。Forkhead Box M1 (FoxM1)は、主に細胞周期を制御し肝再生や肝発癌過程に関与する転写因子である。今回我々は、テトラサイクリンの制御下に肝細胞特異的にFoxM1の発現誘導可能なトランスジェニックマウスを作製し、肝細胞におけるFoxM1の役割を検討した。この結果、予想外に、肝細胞特異的なFoxM1の過剰発現は、肝細胞死や肝内炎症を誘導した。さらに、トランスジェニックマウスは、著明な肝線維化を自然発症した。この結果より、肝細胞FoxM1は、細胞増殖のみならず、細胞死、肝内炎症、線維化を経て、肝癌発症に寄与している可能性が示唆された。今回、肝細胞特異的、時期特異的にFoxM1を過剰発現可能なマウスの作製に成功し、計画通り、脂肪肝モデルにおいて、その影響について検討を加えることができた。この結果、予想外に、FoxM1が肝脂肪蓄積に対して促進的に作用することを見出した。実験系の確立とともに、その表現型の結果も得ている点、実験計画は順調に遂行できていると考える。今後、FoxM1が肝傷害や肝線維化に作用する詳細な分子機構について、in vivo及びin vitroの実験系を用いて検討を行っていく予定である。FoxM1が肝発癌のみならず、その母地である肝線維化進展にも寄与していることが明らかになれば、慢性肝疾患/肝細胞癌に対するFoxM1を標的とした新規の分子標的治療の開発につながると確信している。肝臓病学今回、確立したマウス実験系を用いて、今後、1)FoxM1が肝脂肪蓄積に与える影響とその分子機構2)脂肪性肝炎を背景とした肝発癌に対する影響を詳細に検討する。さらに、マウス及びヒト肝癌細胞株を用いて、その詳細な分子機構を解析することを計画している。
カドミウムフリー量子ドットの表面修飾による高機能化

小さな半導体である量子ドットは、優れた蛍光体であり、色合いを重視する高価格帯の液晶ディスプレイに搭載されている。カドミウム化合物が多く、代替材料の開発が急がれる中、我々は硫化銀インジウム量子ドットの表面を非晶質の硫化ガリウムでコーティングすることにより、大幅な発光特性改善に成功した。現在実用化に向け、同材料の特性を損なうことなく様々なデバイスに組み込むための研究を続けており、今までとは違ったコンセプトで表面修飾を行う必要性を感じている。本研究は、無機材料に加え有機無機ハイブリッド材料を用いることで、光の波長変換やエレクトロルミネッセンスなど、様々な用途に適合可能な量子ドットの開発を行う。
亜鉛欠乏予防に効果ある食品因子の探索とその効果の実証

亜鉛は様々な生体機能を担う必須栄養素であるため、その欠乏は身体機能に大きな影響を与える。従って、亜鉛を十分摂取してその予防に努めることが重要となるが、亜鉛の吸収効率は約30%と低く、その実現は容易ではない。本研究では、消化管において亜鉛吸収に機能する亜鉛トランスポーターZIP4の発現を増加させる食品因子を見出し、亜鉛吸収効率を改善させる基盤を確立することを試みた。大豆抽出物がZIP4発現促進活性を有することを見出し、活性因子の一つとしてソヤサポニンを同定した。これら大豆抽出物は、細胞膜のZIP4発現を増加させ、細胞内への亜鉛取り込み量を増加させたため、亜鉛吸収促進因子としての効果が期待された。亜鉛は、味覚、免疫、神経機能に重要な必須微量栄養素である。そのため、亜鉛の不足は、これら機能に重篤な影響を与える。近年、我が国では高齢者を中心に潜在的な亜鉛欠乏患者が増加していることが明らかにされており、その数は国民の2割を超えると試算されている。従って、亜鉛欠乏を効果的に予防することが健康社会の実現に重要となっている。亜鉛の吸収は、小腸上皮細胞に発現する亜鉛トランスポーターZIP4が必須の役割を果たすため、本研究では、ZIP4の発現を増加させる食品因子(亜鉛吸収促進因子)同定し、その効果の作用メカニズムについて詳細な解析を実施した。昨年度の解析から、大豆抽出物にZIP4の発現を促進し、かつ細胞内の亜鉛量を増加させる活性を認めていたため、活性性分の単離同定を試みた。単一成分にまで精製できた分子の構造をNMR分析や質量分析、ガスクロマトグラフィーなど各種機器分析に供した結果、大豆サポニン類であることを突き止めた。さらに、大豆サポニン類のZIP4発現促進効果のメカニズムを詳細に解析した結果、大豆サポニン類は、ZIP4のエンドサイトーシスを抑制して分解を妨げ、細胞膜に留まらせることで亜鉛取り込みを高めていることを示唆する結果を得た。さらに、大豆サポニン類は細胞毒性をほとんど示さず、恒常的にエンドサイトーシスされる膜タンパク質の制御に大きな影響を与えなかったことから、その効果はZIP4特異的な効果であることが予想される。大豆サポニン類は、亜鉛吸収促進因子として非常に有用な成分であると考えられた。亜鉛は、生命活動に必須となる微量栄養素である。そのため、亜鉛の不足は、味覚障害、免疫機能低下、創傷治癒力低下などを引き起こす。そのため、日々の食事により亜鉛を充足させ、その予防を実践することは極めて重要である。しかしながら、亜鉛の吸収効率は約30%と低く、すべての亜鉛が効率よく吸収されているわけではない。亜鉛の吸収を促進する食品由来の因子を見出すことが、亜鉛欠乏を効果的に予防するために重要となっている。これまでの解析で、大豆サポニン類が消化管上皮細胞に発現して亜鉛吸収に必須の役割を果たす亜鉛トランスポーターZIP4の発現を促進し、かつ細胞内の亜鉛量を増加させることを突き止めていたため、今回、食品添加物として使用される他のサポニン成分の活性について解析した。その結果、これらサポニンの中には、大豆サポニン類と同様の活性を有する成分が存在することが見出された。大豆サポニン類は、ZIP4のエンドサイトーシスを抑制して分解を妨げ、細胞膜に留まらせることで亜鉛取り込みを促進させていたが、このエンドサイトーシス抑制効果が、他の膜タンパク質の発現に大きな影響を与えないことを具体的に示し、その効果がZIP4特異的な効果であることを明らかにした。動物実験を用いて大豆サポニン類の亜鉛吸収促進因子としての効果を確認中であると同時に、各種サポニン類のZIP4発現促進効果についての構造活性相関に関する解析を進めており、できるだけ早く亜鉛吸収促進因子として有用性を決定させたい。高齢者に増えつつある亜鉛欠乏を予防する食成分として、サポニン類は非常に有用であると考えられる。近年、我が国では高齢者を中心に潜在的な亜鉛欠乏患者が多数いることが明らかにされ、その拡大が懸念されている。現在、亜鉛欠乏に対する効果的な予防法の確立が望まれている。亜鉛の吸収は、小腸上皮細胞に発現する亜鉛トランスポーターZIP4を介して行われており、ZIP4は体内亜鉛含量を統括する鍵分子である。そのため、本研究は、ZIP4の発現を増加させる食品因子(亜鉛吸収促進因子)同定し、その効果について詳細な解析を実施することを目的に実施した。様々な食材・食品から酸・アルカリ、メタノール、酢酸エチルなどを用いて抽出画分を調整し、先に樹立した培養細胞を用いたin vitro

screening系を用いてスクリーニングした結果、幾つかの大豆抽出物にZIP4の発現を促進させる活性を見出した。ZIP4の発現増加に応じて、細胞内の亜鉛含量が増えるかどうかについて、亜鉛濃度に応じて発現が上昇するメタロチオネインプロモーターを用いたアルカリフォスファターゼ活性を測定した結果、大豆抽出物の濃度依存的にアルカリフォスファターゼ活性を増加させることが判明した。従って、この抽出物中には、ZIP4発現を促進させ、細胞内亜鉛量を増加させる活性を有する因子が含まれることが期待される。現在、活性成分の単離同定を進めているところである。大豆抽出物からZIP4発現促進因子を同定し、その作用メカニズムに関する解析も順調に進展しているため食品素材の中から、大豆抽出物にZIP4発現を促進させ、細胞内亜鉛量を増加させる活性が含まれることを見出し、その精製を開始するまでに進展しているため。見出した大豆因子の効果を動物実験にて評価すると同時に、より強力な活性を有する新たな因子の探索にも着手する。中圧カラム等を用いたクロマトグラフィーによって、大豆抽出物中の分画を進める。最終的には、HPLCカラム等を用いて単一成分まで精製した後、NMR解析を行って構造決定する計画を立てている。さらに、動物実験にて活性因子の亜鉛吸収促進効果を検証する予定である。見出した大豆因子の効果を動物実験にて評価するために必要な試薬類、及び、より強力な活性を有する新たな因子の探索に必要となる試薬類の購入費として使用。また、研究成果発表のための学会参加費や論文投稿費としても使用する予定。最終的には、HPLCカラム等を用いて単一成分まで精製した後、NMR解析を行って構造決定を行う。
ガラス合金の構造緩和に伴う局所構造変化

ガラス合金の構造緩和のうち可逆構造緩和(reversible structural relaxation)に関連した非晶質構造変化を調べた。今まで行われてきた実験室系でのX線散乱実験(Ordinary X-ray scattering)では各部分相関の寄与を平均的に見ているため構造緩和の際の微視的な構造変化まで立ち入って議論することが困難であった。今回、高エネルギー物理学研究所の放射光施設を利用してガラス合金を構成する特定元素のX線異常散乱実験を行い部分相関の変化をより詳しく調べることができた。可逆構造緩和に伴う構造変化をX線異常散乱実験から調べた報告はまだないようである。用いた試料は液体急冷法により作製したPd_<58>Ni_<25>Si_<17>および(Pt_<0.5>Ni_<0.5>)_<75>P_<25>ガラス合金である。前者はNi原子の、後者はPtおよびNi原子の異常散乱実験を行った。3元系ガラス合金の6個の部分相関の中で異常散乱実験により3個の部分相関のみを取り出すことが出来る。すなわち、Pd系では(Ni-Pd、Ni-Ni、Ni-Si)相関を、Pt系では(Pt-Pt、Pt-Ni、Pt-P:Pt原子の異常散乱)および(Ni-Ni、Ni-Pt、Ni-P:Ni原子の異常散乱)である。得られた結果を簡単に要約すると次の通りである。何れの場合も低温で長時間試料を焼鈍して化学的短範囲規則性を形成した試料では静的構造因子、動径分布関数ともにそれらの第一ピーク強度が、急冷したままの試料を前焼鈍して凍結自由体積を減少させた試料に比べて増加する。また、再度ガラス転移温度まで加熱して短範囲規則性を壊すとピーク強度は前焼鈍した状態に戻る傾向を示した。これらの変化は、単に焼鈍による原子間の距離の分布変化からでは説明が困難であり、現在これらの結果を説明しうる構造モデルを考慮中である。
焼酎蒸留廃液の高度処理システム

本研究では焼酎蒸留廃液を流動床(AFBR)による嫌気性処理の後に脱窒硝化のためのベンチプラントを用いて有機物並びに窒素除去のための連続処理試験を実施し、有機物と窒素の同時除去が効率的に行なわれるための操作条件について検討した。この結果、以下のことが判明した。(1)嫌気性処理においては流入廃液濃度の処理性能に及ぼす影響が大きく、12倍希釈の廃液ではTOC容量負荷9.0g/l・dにおいてTOC除去率が50%を維持したのに対して5倍希釈の廃液では30%近くまで低下し処理性能に明確な差が見られた。(2)12倍希釈の廃液で処理試験を続けた結果、脱窒槽のアンモニア性窒素濃度は返送による希釈効果で返送比の上昇とともに減少し、硝化槽内の硝酸性窒素濃度も返送比の上昇とともに次第に低下し、返送比10で最大の窒素除去速度が得られた。一方、返送比10として廃液の供給量を上げることによって硝化槽でのHRTを減少させていくと、最大の窒素除去率を示したHRT5hを下回ったときアンモニア性窒素濃度が急上昇しアンモニア転換率の低下をきたした。(3)脱窒槽内におけるTOC除去速度と脱窒反応速度の関係から、脱窒槽内には脱窒菌のほかに嫌気性処理槽より流出したメタン菌が共存していることが示唆された。(4)高度処理システムに12倍希釈の麦焼酎蒸留廃液を最大2,000ml/d供給することによりTOC除去率98%を達成した。また、返送比を10に設定することにより約90%の窒素除去率が得られた。1)実容積600mlの流動床型リアクターに担体として水洗した120gクリストバライトを入れ反応温度を30°Cとして、IN塩酸によりpHを7に制御しながら、炭素源としてプロピオン酸ナトリウム、窒素源として過剰量の硝酸カリウムを含有する合成廃水を用いて、活性汚泥を馴養したところ廃水滞留時間(HRT)20時間にて有機酸(VFA)は完全に除去され90%以上のTOC除去率が得られた。今後は、さらにHRTの短縮を検討するとともに、プロピオン酸と硝酸イオンとの最適な比率についても検討する。2)実容積400mlの曝気槽に活性汚泥を入れ硫酸アンモニウムと無機塩のみを含有する合成廃水を用いて反応温度を30°Cとして硝化菌を馴養した。また、0.5M-NaHCO_3を添加することで槽内phを7で制御したところ、アンモニウムイオンの減少量と重炭酸イオンの添加量は一定の比率で推移した。今後は、馴養した汚驚を流動床と固定床の両者にて固定化し、硝化反応速度を比較する。3)以上の結果より、脱窒槽及び硝化槽のpH制御方法についての目処が得られたので、脱窒反応における最小のHRT及び最適な硝化反応条件が決定された時点で、脱窒槽と硝化槽を連結し、硝化反応液を脱窒槽に返送するシステムを構築し、これによりプロピオン酸、硫酸アンモニウム及び無機塩から成る合成廃水を用いて連続処理を実施する。4)pH調整のための脱窒槽における酸添加量ならびに硝化槽におけるアルカリ添加量は、実廃水を対象とした場合、脱窒処理水のメタン発酵槽への返送や、硝化槽への重炭酸イオンの流入などにより、かなり緩和されることが示唆された。平成4年度に実施した実験に基づいて小型のベンチモデルを設計、製作し平成5年度よりこれを用いて処理試験を実施し、嫌気性処理、脱窒および硝化の各反応について下記の結果を得た。1.脱窒反応と硝化反応について(1)脱窒はシリカ系担体を用いた流動床法を採用し反応温度30°Cにて硝酸塩を含む合成廃水を供給し負荷上昇試験を実施した。

1N硝酸を添加することによて槽内pHを7に制御し硝酸イオン濃度が律速しない条件下で連続処理した結果、TOC容量負荷5.2g/1・dにおいてTOC除去率93%が得られた。しかし硝酸によるpH制御によりNO_3^-イオンの除去率は45%と低かった。(2)硝化はシリカ系担体を充填した固定床型反応槽を採用し反応温度30°CにてHRTの影響について検討した。槽内pHは5%重炭酸ソーダ溶液を添加することによりpHを7に制御した。この結果HRTを230hから60hまで短縮することができ、NH_4^+イオンの除去率は98%で安定的に推移した。2.嫌気性処理についてシリカ系担体を用いた流動床法により反応温度30°Cに設定して6倍希釈した麦焼酎蒸留廃液を処理した結果、TOC容量負荷6.0g/1・dにおいてTOC除去率84%を達成し、処理水TOC濃度として1000mg/1となった。平成5年度より脱窒、硝化の各リアクターの処理試験は合成廃水を用いて、またメタン発酵は6倍希釈した麦焼酎蒸留廃液を用いて実施し、それぞれの性能を評価した。これらの知見に基づいて、平成6年度はメタン醗酵・脱窒・硝化の各リアクターを連結した一貫システムにより麦焼酎蒸留廃液の連続処理試験を実施した。基本的には各リアクターのpHを7に制御し、脱窒処理水と硝化処理水は一定の返送比でそれぞれメタン発酵槽と脱窒反応槽に返送するシステムとし、下記の結果を得た。1.実容量1160mlのメタン発酵槽に6倍希釈した焼酎蒸留廃液(TOC濃度約8000mg/l)を供給量約300mlより開始し、定常状態を達成した後約1.5ずつ供給量をステップ的に上昇させながら行なった。この結果、廃液供給量約500ml/dまでは各リアクターとも安定して推移し、TOCと窒素除去はほぼ完全に達成された。2.しかしこれ以降、供給量を1200ml/dまで上昇させた時には各リアクター内のTOC濃度は急速に増加し、最終の処理水質となる硝化反応槽内のTOC濃度は200mg/l以上に上昇し同時にアンモニア濃度も急激に増加した。この急速な窒素除去能の低下は主として硝化反応の有機物による阻害に起因していると考えられた。また、その後廃液の供給量を低減しても硝化機能の回復は困難であった。以上の結果より、焼酎蒸留廃液をメタン発酵・脱窒・硝化の一貫システムで安定的に処理するためにはメタン発酵槽での安定した有機物除去とともに硝化槽への有機物流入を極力避けるようなシステムが必要であると判断された。この観点から現在、脱窒槽と硝化槽との間に有機物除去を目的とした好気性処理槽を設置したシステムで処理試験を継続している。
直線的合成戦略を活用したセンブラン系ジテルペンの網羅合成と新物質・新化学の開拓

進化の過程で生き残った生物が生産する生物活性有機分子は、生存競争で活躍してきた機能分子であり、長い年月をかけて選び抜かれた特徴的な分子構造を有する。本研究は、重要天然物の未解明生合成経路に隠された機能分子の発見と有用分子の供給を目指し、センブラン系ジテルペンの生合成模倣型全合成を検討した。鎖状分子であるゲラニオール2分子を出発原料とし、加藤らの報告に従い14員環センブラン骨格を合成した。センブラン骨格からカスバン骨格への合成経路は未踏の分子変換だったが、ヨウ化サマリウムを用いた還元的ジメチルシクロプロパン化反応を独自に開発し、続く脱酸素化反応によってカスバン骨格の効率合成に成功した。また、C9位の立体化学が14員環形成時のジアステレオ選択性を制御することを見出し、光学活性なカスバン骨格の合成に目処がついた。次いでカスバン骨格からラチラン骨格へ誘導すべく、炭素ー炭素結合形成を含む分子内渡環反応を検討した。センブランおよびカスバン骨格の位置選択的な酸素官能基化は、通常の反応条件では困難であったが、βーヒドロキシニトリルの酸化によって1,2-ジケトンが得られることを見出し、C8およびC9位の酸素化に成功した。しかしながら、モデル合成で成功していた1,2-ジケトンからの5員環形成反応は、14員環大環状骨格では進行しないことがわかった。ラチラン骨格の形成にはC5位のさらなる活性化が必要であることが判明した。
テトララジカル性芳香族炭化水素の合成と電子状態の解明

近年、一重項ジラジカル性を有する芳香族炭化水素の合成と電子状態に関する研究が行われるようになったが、一重項テトララジカル性を有する芳香族炭化水素の研究は全くなされておらず、基礎有機化学において取り組むべき重要な課題となっている。本研究では、環状のテトララジカル性を有する芳香族炭化水素の合成と電子状態の解明を目的としている。内側が8員環、外側が20員環で形成される環状のテトラシクロペンタテトラフェニレンに注目した。このものは閉殻の2回対称の構造と開殻の4回対称の構造が考えられ、4回対称の構造ではテトララジカル性を示すと期待される。昨年度、テトラメシチル誘導体の合成を行い、単離することに成功したが、温度可変NMR測定および温度可変単結晶X線構造解析から、合成した化合物は2回対称の閉殻構造が基底状態であることが明らかとなった。本年度は置換基が分子構造に与える影響について調査するため、他の誘導体の合成に取り組んだ。効率よく様々な誘導体を合成するために、合成法を見直し、トリイソプロピルシリルエチニル誘導体の合成に成功した。単結晶構造解析では、メシチル誘導体と異なり、このものは結晶中で二量体あるいは三量体として存在し、いずれの分子構造も4回対称の構造を取っていた。これは反芳香族分子が重なり合うことで芳香族性を示しているためだと考えている。また、合成した化合物の電気化学特性、電子吸収スペクトルを調査したところ、可逆な酸化還元特性を示し、小さなHOMO-LUMOエネルギー差を有することが明らかになった。メシチル誘導体と同様に、金属カリウムによる還元を行った結果、ラジカルアニオン、ジアニオン、トリアニオン、ならびにテトラアニオン種の生成と同定に成功した。28年度が最終年度であるため、記入しない。テトラメシチル誘導体の合成を行い、単離することに成功した。しかし、温度可変NMR測定および温度可変単結晶X線構造解析から、合成した化合物は閉殻の2回対称の構造が基底状態であることが明らかとなった。一方、再結晶溶媒を換えることにより解析精度は低いものの、4回対称の構造が結晶のパッキングフォースにより捕捉されていることを示唆する4回対称の空間群をもつ結晶が得られた。現在、詳細について検証している。また、合成した化合物の電気化学特性、電子吸収スペクトルを調査したところ、可逆な二電子の酸化還元を示し、小さなHOMO-LUMOエネルギー差を有することが明らかになった。可逆な二電子の酸化還元を示したことから、還元種の性質も調査した。金属カリウムによる還元を行った結果、ラジカルアニオン、ジアニオン、ならびにテトラアニオン種の生成と同定に成功した。すでに目的としていたテトラシクロペンタテトラフェニレン誘導体の合成と基底状態の電子状態の解明に成功した。基底状態は閉殻構造であったが、結晶のパッキングフォースによりテトララジカル性を示すと期待される4回対称の構造の捕捉に成功していることを示唆する実験結果が得られている。また、可逆な二電子の酸化還元を示したことから、還元種の性質について調査したところ、ラジカルアニオン、ジアニオン、ならびにテトラアニオン種の生成と同定に成功した。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断できる。

メシチル誘導体と同様に、金属カリウムによる還元を行った結果、ラジカルアニオン、ジアニオン、トリアニオン、ならびにテトラアニオン種の生成と同定に成功した。4回対称の空間群をもつ結晶について、得られた結晶のより高い精度でのX線構造解析に加え、結晶のESR測定、電子吸収スペクトル、IRおよびラマンスペクトルの測定を行い、2回対称の結晶との電子状態の違いの有無を検討する。また、還元種の更なる分光学データを取得するとともに、酸化種の性質についても調査する。28年度が最終年度であるため、記入しない。