hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼吸鎖電子伝達系複合体II(コハク酸ーユビキノン還元酵素)中のb型チトクロムの機能

現在このcDNAをプロ-ブとして回虫cDNAライブラリ-を検索中であり、次年度においてこの塩基配列を決定し、両者の比較を行う予定である。以上複合体IIのシトクロムb成分の特性を明らかにするための準備段階としての初年度の研究はほぼ計画通りに進行した。複合体II(コハク酸ーユビキノン酸化還元酵素)はTCA回路の酵素中唯一の膜結合性酵素であり、同時に呼吸鎖電子伝達系の初発酵素として機能している。しかし回虫など嫌気的エネルギ-代謝を行う生物においては逆反応のフマル酸還元酵素を示し、NADHーフマル酸還元系の末端酸化酵素として機能している。申請者はこれまでにこの複合体IIにおける反応の方向性の決定要因のひとつが構成成分のシトクロムbにある事を明らかにしてきたが、平成2年度はこの点をより詳細に調べる目的で研究を行い、以下の結果を得た。各サブユニットからの複合体IIの再構成についてはコハク酸ーユビキノン酸化還元活性(SDH)を持つウシ心筋複合体IIとそれに加えてフマル酸還元活性(FRD)を持つ回虫複合体IIより各々のサブユニットを分離し、相互の再構成を試みた。ウシ心筋の酵素に関しては再構成能を保持した状態で分離することができたが、回虫筋の酵素は非常にサブユニット間の相互作用が強く、全てのサブユニットを解離すると再構成能は失われてしまっていた。そこで遣伝子の全塩基配列が判っている大腸菌のコハク酸ーユビキノン酸化還元酵素複合体の遣伝子(sdh)を制限酵素により分割し、同一細胞内で共存可能なpACYCおよびpUCの2種のプラナミドに挿入し、in vivoでの再構成を試みた。この結果細胞質膜に局在し正常な酵素肝性を示す複合体IIの再構成に成功した。これは活性発現と酵素反応の方向性の決定に関与する各サブユニットの役割を明確にするための系を確立できたという事であり、今後この再構成系の果たす役割は複合体IIの生合成の問題なども含め、極めて大きいと考えられる。またカナマイシン耐性遣伝子をsdh c領域に挿入した実験から複合体IIの生合成にsdh C遣伝子が不可欠である点が明らかになった。さらに回虫シトクロムb_<558>の酸化還元電位を測定し、哺乳類より高い車を見出した。
アポトーシス誘導型増感剤の開発とその放射線・温熱・化学複合治療への応用

本研究は、腫瘍を取り巻く微小環境の生理修飾に注目して放射線によるアポトーシス誘導を増強し、さらに低酸素細胞放射線増感剤活性を持つ新しい増感剤による放射線治療システムの開発と放射線・温熱・化学複合療法における応用について研究することを目的とした。マウス大腿皮下に移植したSCCVII腫瘍を用い放射線増感剤の3-nitrotriazolederivativeの一種AK-2123を前投与すると、AK-2123は放射線増感および温熱増感することを確認した。さらに放射線温熱化学複合療法としてマイトマイシンC、シスプラチン、あるいはアドリアマイシンを併用した場合にもAK-2123は増感効果を認めることを確認した。特にシスプラチンおよびマイトマイシンCとの併用効果が高く認められた。また各処理マウスの腫瘍および正常組織における血流量を検討したところAK-2123の投与により腫瘍組織特異的な血流量の減少が観察され、特に温熱処理の併用により強く観察された。したがってこれら複合療法においては癌組織が低酸素・酸性環境が作られているものと考えられるが、この結果酸性領域で活性の高いシスプラチンおよびマイトマイシンCや、低酸素で活性化されるマイトマイシンCの併用効果が高く出たものと考えられる。これら低酸素環境はアポトーシスを誘導することが知られているが増感効果の機序として腫瘍細胞致死におけるアポトーシスの関与について組織学的な検討を行ったがAK-2123の併用により有意な変化は認められなかった。本研究は、腫瘍を取り巻く微少環境の生理修飾に注目して放射線によるアポトーシス誘導を増強し、さらに低酸素細胞放射線増感剤活性を持つ新しい増感剤による放射線治療システムの開発と放射線・温熱・化学複合両方における応用について研究することを目的とした。マウス大腿皮下に移植したMM46乳癌腫瘍に対し、局所放射線療法あるいは局所温熱療法を行うに際し、3-nitrotriazo lederivativeの一種AK-2123を前投与すると、AK-2123は放射線増感および温熱増感することが確認された。さらにマウス扁平上皮癌株SCCVII脳腫を用い検討したところ、同様に放射線増感効果を認めた。また化学療法剤の代表である、マイトマイシンC、シスプラチン、あるいはアドリアマイシンを併用した放射線温熱化学複合療法においてAK-2123は増感効果を認めることを確認した。また各処理マウスの腫瘍および正常組織における血流量を86Rb extraction techniqueにより検討したところAK-2123の投与により腫瘍組織特異的な血流量の減少が観察され、特に温熱処理の併用により強く観察された。これらの成果についてインドで開催された、Symposium on Hyperthermia & Radiomodifiersにおいて発表した。ここまでの結果を踏まえ、次年度はこれら治療時の腫瘍細胞致死におけるアポトーシスの関与について組織学的な検討を継続する予定である。
柔軟なスピンクラスター配列からなる超高密度磁気記録メディアの研究

スピンクラスター配列を用いた記録メディアにおいて十分な熱安定性を得るための設計指針を明確にし、あわせて、ニュークリエーション型CoPrTbアモルファス薄膜を用いた垂直スピンクラスター配列の実現と、その磁気記録メディアの作製・基礎特性の評価について検討した。その結果、次のことが明らかとなった。1.CoCr系のグラニュラー型のスピンクラスターメディアについて熱擾乱の影響を補正した残留保磁力H_oの角度依存性を検討した結果、磁化機構を支配する磁気ポテンシャルの大きさは、S-W型の磁化機構により近似できることが明らかとなった。2.CoPt-Cr等のグラニュラー型スピンクラスター配列で実現可能なH_oの最大値は、異方性磁界H_kの7080%程度(膜厚20nmの場合)であり、十分な熱安定性を得るためには、垂直磁気異方性K_uの値を反磁界エネルギー2πM_s^2の3倍以上にする必要がある。K_u値の増加には、組成の最適化の他にhcp構造の安定形成の促進が必要である。3.ニュークリエーション型のCoPrTbアモルファス薄膜のK_u値は製膜条件により大きく依存する。製膜条件の最適化を行った結果、膜厚10nmにおいても4×10^6erg/cm^3の大きなK_u値を示すCoPrTb薄膜の作製に成功した。この値はCoPt-Cr等のグラニュラー膜に比べて23倍程度大きい。4.グラニュラー型のCoCrTa薄膜の上にニュークリエーション型のCoPrTb薄膜を積層した複合型の垂直スピンクラスターメモリーの信号品質(信号とノイズの比S/Nm)は、グラニュラー型のCoCrTa単一膜媒体よりも約10dB(300kFRPIの値)も優れていた。また、グラニュラー型媒体よりも優れた熱安定性を示し、例えば、CoPrTb(10nm)/CoCrTa(20nm)の複合膜では、再生信号の経時減衰が全く観察されなかった。従来とは異なるニュークリエーション的な磁化機構を示すスピンクラスター配列を実現するためには、磁化の熱情乱の影響を考慮しながら、粒子の大きさ・形状と、粒子の磁化機構、活性化体積等等の関係をまず明らかにする必要がある。本年度は、これらの関係を明らかにすることを目指した。まず、Tiシード層を用いて作製したCoCrTa垂直薄膜について、その構造、磁気特性の膜厚依存性を検討した。その結果、磁化の熱情乱を補正した場合の残留保磁力、異方性磁界の7090%に達することが明らかとなった。このことは、CoCrTa等のグラニュラー系垂直膜では、組成・構造などの制御により熱安定性を高くすることで、その残留保磁力を異方性磁界に近い値まで増加できる高いポテンシャルを持つことを示しており、安定なスピンクラスターの形成が可能であることを示している。また、30nm以下の膜厚では、膜厚の低下により、活性化体積が結晶粒体積の変化に沿いながら単調に減少することが明らかとなった。これらの試料の面内方向の平均粒径が10nm程度であることを考慮すると、このことは、粒子の寸法比が3程度以下になると粒子内部では、ほぼコヒーレントな磁化スイッチングを生じていることを示唆しており、薄膜の高保磁力化に優位であることを示している。

また、30nm以下の膜厚では、結晶粒径がスピンクラスターの最小構成単位となることを意味する。さらに、この結果は、膜厚を粒径の3倍程度の大きさに維持することで高い熱安定性を保つことが可能であることを示している。このような知見は、CoPt系グラニュラー薄膜でも同様であり、熱安定性に優れた柔らかいスピンクラスター配列を実現するためには、このような粒子形状・大きさ・膜厚の関係が重要であることが明らかとなった。スピンクラスター配列を用いた記録メディアにおいて十分な熱安定性を得るための設計指針を明確にし、あわせて、ニュークリエーション型CoPrTbアモルファス薄膜を用いた垂直スピンクラスター配列の実現と、その磁気記録メディアの作製・基礎特性の評価について検討した。その結果、次のことが明らかとなった。1.CoCr系のグラニュラー型のスピンクラスターメディアについて熱擾乱の影響を補正した残留保磁力H_0の角度依存性を検討した結果、磁化機構を支配する磁気ポテンシャルの大きさは、S-W型の磁化機構により近似できることが明らかとなった。2.CoPt-Cr等のグラニュラー型スピンクラスター配列で実現可能なH_0の最大値は、異方性磁界H_kの7080%程度(膜厚20nmの場合)であり、十分な熱安定性を得るためには、垂直磁気異方性K_uの値を反磁界エネルギー2πM_3^2の3倍以上にする必要がある。K_u値の増加には、組成の最適化の他にhcp構造の安定形成の促進が必要である。3.ニュークリエーション型のCoPrTbアモルファス薄膜のK_u値は製膜条件により大きく依存し、製膜条件の最適化を行った結果、膜厚10nmにおいても4×10^6erg/cm^3の大きなK_u値を示すCoPrTb薄膜の作製に成功した。この値はCoPt-Cr等のグラニュラー膜に比べて23倍程度大きい。4.グラニュラー型のCoCrTa薄膜の上にニュークリエーション型のCoPrTb薄膜を積層した複合型の垂直スピンクラスターメモリーの信号品質(信号とノイズの比S/Nm)は、グラニュラー型のCoCrTa単一膜媒体よりも約10dB(300kFRPIの値)も優れていた。また、グラニュラー型媒体よりも優れた熱安定性を示し、例えば、CoPrTb(10nm)/CoCrTa(20nm)の複合膜では、再生信号の経時減衰が全く観察されなかった。
3次元浮遊砂濃度分布計測法の開発による砕波下の浮遊砂輸送機構の解明

砕波下のような複雑かつ3次元的な流れの下での浮遊砂の輸送過程を明らかにすることを目的として3次元浮遊砂濃度分布の画像計測手法の開発を行った.開発する手法ではプロジェクターからカメラに対する奥行方向に色合いを変化させた照明を照射し,その浮遊砂による散乱光をカメラにより撮影する.これにより得られる各色の層内における浮遊砂の分布を合成することで3次元的な分布を取得する.適用試験を実施し,本手法により妥当に3次元的な浮遊砂濃度分布の時々刻々の変化を計測可能であることを示した.砕波下のような複雑かつ3次元的な流れの下での浮遊砂の輸送過程を明らかにすることを目的として3次元的な浮遊砂濃度分布の画像計測手法の開発を行った.開発する手法ではプロジェクターからカメラに対する奥行方向に色合いを変化させた照明を照射し,その浮遊砂による散乱光をカメラにより撮影する.撮影画像内での各色毎の輝度分布から各色の層毎に2次元的な浮遊砂濃度分布を取得し,これを予め取得しておく各色の奥行方向座標に基づいて合成することで,3次元的な浮遊砂濃度分布を決定する.本計測手法をマグネティックスターラーにより撹拌した小型水槽内の浮遊砂濃度分布計測に適用し,その実用性を確認した.本計測法により時々刻々と変化する浮遊砂濃度について,その瞬時の3次元的な空間分布を取得可能となった.ただし,カメラ撮影およびプロジェクター光照射方向に対して奥行方向に計測浮遊砂濃度が小さくなる傾向が明らかになった.これは水中の浮遊砂濃度が大きいとその奥側でカメラ撮影及びプロジェクター照明の陰になる領域が生じるためである.一方でカメラ撮影およびプロジェクターによる照明光の照射の手前側では影による影響がないため,手前側から順に浮遊砂濃度を決定し,決定した浮遊砂濃度を元にその奥側における浮遊砂濃度を補正する補正手法を開発した.これにより,奥行方向への浮遊砂濃度の不自然な減少が見られない妥当な分布を取得することが可能となった.また本手法により取得できる3次元浮遊砂濃度分布の時間変化から,浮遊砂フラックスの取得が可能となる.本研究で開発した計測手法は多様な移動床での水理実験における基礎的なツールとなりうるものである.前年度に引き続き,複雑で3次元的な流れ場による浮遊砂の輸送機構の解明と目的とし,3次元的な浮遊砂濃度分布画像計測法およびその計測結果を用いた浮遊砂フラックス推定手法の開発を実施した.はじめに浮遊砂濃度の画像計測精度を定量的に検証するため,水と比重が同じ粒子を水中に混入しその投入個数と,画像計測により取得した浮遊砂数密度の水槽全体にわたる積分値との比較を行った.その結果,カメラ撮影およびプロジェクター照明の陰となる領域に対する補正を加えた場合でも,全体の粒子個数を過小評価することが判明したため,画像中からの粒子(浮遊砂)検出手法の改良を行った.前年度に開発した手法では輝点として撮影される粒子と画像ノイズの判別に輝度の閾値を設定しており,これにより一部の粒子がノイズとして除去されていた.本年度は2次元正規分布関数との画像相関係数のピーク値として画像内の粒子を検出する手法を用いることで,正規分布の標準偏差に応じた特定の大きさの粒子のみを検出することを可能とした.これによりノイズと粒子をその空間スケールの違いにより判別することで,粒子の誤除去を減らすことができた.以上により浮遊砂濃度計測における粒子数の検出精度を改善することができた.つぎに,改善した手法を浮遊砂のこの手法により取得した浮遊砂濃度の3次元分布をもとに浮遊砂フラックス推定を実施し,これにより矛盾なく3次元的な流れ場の結果が得られた.本研究により開発された浮遊砂濃度計測手法およびその結果を用いた浮遊砂フラックス推定手法は多様な移動床水理実験における有用なツールとなるものである.砕波下のような複雑かつ3次元的な流れの下での浮遊砂の輸送過程を明らかにすることを目的として3次元浮遊砂濃度分布の画像計測手法の開発を行った.開発する手法ではプロジェクターからカメラに対する奥行方向に色合いを変化させた照明を照射し,その浮遊砂による散乱光をカメラにより撮影する.これにより得られる各色の層内における浮遊砂の分布を合成することで3次元的な分布を取得する.適用試験を実施し,本手法により妥当に3次元的な浮遊砂濃度分布の時々刻々の変化を計測可能であることを示した.本年度の目的である3次元浮遊砂濃度の画像計測手法について,一連の画像解析手法の開発を行い,その適用性の確認のための実験を実施済みである.浮遊砂濃度が大きくなるとその浮遊砂による影の影響でカメラ撮影およびプロジェクター光照射方向に対して奥側に位置する領域で浮遊砂濃度の過小評価が生じることが明らかになったが,これに対する補正手法を開発し,これに対応した.3次元浮遊砂濃度計測手法の開発については概ね実施できており,順調に研究が進展しているといえる.また,取得した3次元浮遊砂濃度分布計測手法から浮遊砂フラックスを取得する計算手法の開発を行っており,次年度の本手法の砕波実験への適用に向けた準備を進めている.海岸工学計測3次元浮遊砂濃度分布からの浮遊砂フラックス算定手法について精度検証を行い,必要に応じてその改良を行う.その後,開発した3次元浮遊砂濃度分布計測法およびこれに基づく浮遊砂フラックス算定手法を砕波実験に適用していく.
過疎地域におけるソフト施策の立案とその実効性に関する研究

3年間に、予定を超える36地域の訪問調査を行った。調査の結果、多くの自治体が多額の過疎債ソフトを充当している分野は、スクールバス運行等を含む公共交通の維持・改善、病院・診療所の医師確保、子供の医療費の助成を含む子育て対策等であることがわかった。すでにデマンド型のタクシー事業の導入もある。地域性を反映したものとしては、雪国の道路・家屋の除排雪補助、北海道の福祉灯油の支給、離島の輸送コスト補助などがあり、新鮮さを感じるものとしては、県立高校への支援、村づくり住民会議の育成、企業ビジネスコンテストの実施などがあり、あらためてソフト事業への過疎債の充当の意義が明らかになった。平成24年度は、大分県竹田市・豊後大野市・由布市、岡山県新見市・高梁市、長崎県小値賀町、岩手県西和賀町、徳島県上勝町・勝浦町・佐那河内村、沖縄県大宜味村・国頭村・宮古島市に、過疎対策ソフト施策の実施状況について、それぞれ現地調査を行った。22年度からソフト事業への過疎債の充当が可能になったため、23年度にはまだ経過措置的な立案が多かったのに対し、24年度には多くの市町村で新しいソフト事業が立案されている状況を確認することができた。豊後大野市では、旧緒方町で実施されていたコミュニティバス・スクールバス・患者輸送バスの統合によって公共交通の利便性を高める事業が、過疎対策事業として合併後の全市内で順次展開されることになった。また、上勝町では有名になった「いろどり事業」の経緯を映画化し、さらにその事業を支えるソフト施策が立案されていた。佐那河内村では、村づくり住民会議が、村とそれぞれの地区の方向を考える新しい中心組織として22年度につくられ、すでにかなりの成果を上げていた。国頭村では、へき地診療所の村負担分、やんばるの森ビジターセンターの管理委託に加えて、観光客の受け入れ窓口を過疎対策事業で開設した。宮古島市では旧町村では住民発の地区ごとの活性化事業に、旧平良市では公募型の活性化事業に過疎債を充てるほか、市立学校の選手派遣事業を過疎対策に追加した。離島としておおいにいみのある事業であろう。上記のように法律改正にあたって重要項目とされた、医療の確保、公共交通の活性化、集落への目配りなどにかかわる新規事業が生まれており、次第にソフト事業の立案が望ましい方向に向かっていることを確認することができた。なお使用経費に旅費が予定よりも大きな割合を占めるのは、同行した研究協力者が謝金を辞退したため、その分調査個所を増やしたためである。本研究の目的は過疎地域の過疎対策事業としてのソフト施策の実態をできるだけ多く調査し、その実効性を考えるところにある。平成25年度は、和歌山県田辺市ほか3町村、北海道白糠町ほか3町、石川県珠洲市、島根県江津市、群馬県みなかみ町、静岡県浜松市、長崎県対馬市の現地調査を行うことができた。23年度からの3年間の現地調査は計36市町村に上り、これは申請時の予定を大幅に上回る結果となったが、これが可能になったのは、近隣の複数の市町村を23泊の行程で訪れたこと、現地機関の配慮によってレンタカーのいらないケースがかなりあったこと、そして同行の補助員が謝金を辞退したこと等によって、より多くの調査旅費の使用が可能になったことによる。23年度は過疎法改正の翌年とあって、一般的には新しいソフト事業の立案が必ずしも活発ではなかった。しかしその中にあって、大分県豊後大野市の新しい公共交通体系の構築、島根県奥出雲町の高齢者のためのTV電話の導入、北海道喜茂別町のコミュニティデマンドタクシーの導入、徳島県佐那河内村の村づくり住民会議の費用の計上、産業振興では島根県江津市の中小企業競争力強化支援事業とコミニュティビジネス創業支援事業等が法改正の趣旨に副う新規事業として実施されているのが注目される。24年度以降になると、従来から行われてきた高齢者福祉、障害者福祉、子供の医療費の無償化等が多くの市町村で過疎債に転化されているのに加えて、長崎県対馬市の対馬観光リニューアル事業や「わがまち元気創出」支援事業などのように、地域の活性化に向けたソフト事業が新たに各地で生まれていることが、25年度の調査によって明らかになった。ソフト事業への過疎債の充当が、次第にオリジナルな事業の立案が増える形で推移していることを確認することができた。本年度は当初計画に従って、総務省過疎対策室の資料から、北海道・東北・中国の各地方から先進的な過疎対策ソフト事業を選び出し、現地調査を実施した。対象としたのは北海道ニセコ町・喜茂別町、青森県風間浦村、岩手県葛巻町・岩泉町、島根県雲南市・奥出雲町・飯南町の各市町村である。

積極的にソフト事業を立案している自治体においては、従来一般財源で実施していたソフト事業を、過疎法改正を受けて過疎債の充当事業に切り替えた例が、共通点として多くみられ、その際に中身の拡充を行った例も多い。最も共通して見られたのは医療対策に関わる事業で、病院を持つ自治体であれば医師の確保対策、小さな診療所であればその運営の支援が立案されていた。交通対策に関しては、デマンド系のシステムについての実験事業が多く、弱者の移動に関して抜本的なシステムの確立が困難なことを示している。過疎地域にある高校は定員割れを起こしている例が多く、その存続は過疎地域の活性化には不可欠との認識は共通して見られ、直接的な支援事業が多く立案されていた。ユニークな事業としては、都市部に住む孫を祖父母のもとに引き取って学校に通わせることに対する補助事業で、農山村の教育力が肯定的に論じられている時代に一定の意義を持つと考えた。本年度は研究の初年度でもあり、大きな方向性を整理するには至っていないが、調査事例を増やす中で、意義ある過疎対策ソフト事業のあり方を検討していきたい。平成23年度と24年度ですでに北海道・東北・中国・四国・九州・沖縄の各地方の現地調査を実施し、新しく立案された過疎対策ソフト事業の傾向はかなり把握することができた。特に数か所で新しい過疎法のソフト事業の趣旨に沿う新規事業が立案されていることを確認することができた。当初の計画に従って、北海道・東北・中国の各地方の対象市町村の現地調査において、ヒアリング及び資料収集を順調に実施した。25年度は、残された関東・中部・近畿の各地方から調査地域を選定し、現地調査を実施する。最終年であることから調査は早目に実施し、さらに全国の注目すべき事例について、費用の許す限り補足調査を行う。すでに現地期間との関係が形成されているので、補足調査の一部は通信によっても可能である。年度の後半は23年度からの調査資料の体系的整理にかなりの時間を要する。新たなタイプの過疎対策事業の全国的傾向と地域的特徴を見出し、過疎地域の活性化に資する事業としてどのようなものが望ましいかについて、提言としてまとめる予定である。24年度は当初の計画通り、関東・四国・九州・沖縄の各地方の先進的な過疎対策ソフト事業の実施自治体を選定し、各地に3泊4日程度の現地調査を行う。さらに25年度は北陸・中部・近畿の各地方において同じような現地調査を実施し、その後3年度にわたる調査の結果を整理し、それぞれの自治体の類型化に基づき、どのような過疎対策ソフト事業が実効性を持つかについて論じたい。最終年度も現地調査のための旅費が大きな割合を占める。レンタカーの運転とヒアリングの記録のために同行する研究協力者の旅費と謝金を合わせて、77.5%を占める予定である。現地調査は4か所を予定しているが、現地機関の便宜によっては経費が節約され、その場合には調査地域を増やす予定である。当年度は現地調査が主体となるため、旅費がきわめて多くの割合を占める。なお、同行補助員の謝金の辞退があった場合には、調査地を増やすことで対応したい。
筋組織における脂質代謝関連遺伝子の発現調節に関する研究

本研究では、筋組織における栄養ストレス下、特にグルコース飢餓における脂質代謝関連遺伝子の発現誘導メカニズムを解析することによって、生体における代謝変換メカニズムを遺伝子レベルで明らかにすることを目的としている。我々は、骨格筋におけるAceCS2遺伝子の発現誘導にKLF15(Kruppel-like factor 15)が重要な役割を担っていることを明らかにした。このKLF15は絶食状態における骨格筋で数十倍にまで誘導され、これがSp1との協調的作用によってAceCS2遺伝子の転写調節を行っていることが示された。実際、KLF15を骨格筋由来の培養細胞に導入するだけで、これまで殆ど発現の見られなかったAceCS2遺伝子の発現が数倍にまで上昇した。また、KLF15はグルコーストランスポーターの一つ、Glut4遺伝子の発現誘導を担っていることからも、KLF15が絶食時における遺伝子の発現調節に重要な働きをしていることが予想された。一方、AceCS2は肝臓に於いては全く発現していない。この発現パターンは抹消組織におけるケトン体代謝の律速酵素である、スクシニルCoA:アセト酢酸CoAトランスフェラーゼと類似している。その生理的理由を解析する目的で、AceCS2を肝臓で高発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。また、同時にコントロールとしてAceCS1-Tgマウスも作製した。6ラインのAceCS2-Tgマウスが得られたが、見かけ上は野生型と区別することが出来なかった。また、絶食時における血中グルコース値及びコレステロール値も正常であった。筋組織、特に骨格筋はグルコースを最も消費するだけでなく、グルコースをグリコーゲンとして蓄積する最大の組織である。絶食や糖尿病など、生体内グルコースの利用に制限が加わり蓄積したグリコーゲンが枯渇すると、脂質代謝に関わる遺伝子群が発現誘導を受け、主要なエネルギー源をグルコースから脂肪酸へとシフトさせる。心筋においても同様で、通常より骨格筋と比べて脂肪酸の利用率は高いが、絶食状態が長く続くとその利用率はさらに高まる。本研究は、筋組織における栄養ストレス下、特にグルコース飢餓における脂質代謝関連遺伝子の発現誘導メカニズムを解析することによって、生体における代謝変換メカニズムを遺伝子レベルで明らかにすることを目的としている。骨格筋においてAceCS2遺伝子の発現は、絶食によって10倍数程度にまで増強される。この発現誘導を指標にAceCS2遺伝子の転写調節領域の解析を行った所、KLF15(Kruppel-like factor 15)がこの発現誘導に重要な役割を担っていることが明らかとなった。このKLF15は絶食状態における骨格筋で数十倍にまで発現が誘導され、これがSp1との協調的作用によってAceCS2遺伝子の転写調節を行っていることが示された。また、KLF15はグルコーストランスポーターの一つ、Glut4遺伝子の発現誘導を担っていることからも、絶食時における遺伝子の発現調節に重要な働きをしていることが予想された。本研究では、筋組織における栄養ストレス下・特にグルコース飢餓における脂質代謝関連遺伝子の発現誘導メカニズムを解析することによって、生体における代謝変換メカニズムを遺伝子レベルで明らかにすることを目的としている。

また、KLF15はグルコーストランスポーターの一つ、Glut4遺伝子の発現誘導を担っていることからも、KLF15が絶食時における遺伝子の発現調節に重要な働きをしていることが予想された。一方、AceCS2は肝臓に於いては全く発現していない。この発現パターンは抹消組織におけるケトン体代謝の律速酵素である、スクシニルCoA:アセト酢酸CoAトランスフェラーゼと類似している。その生理的理由を解析する目的で、AceCS2を肝臓で高発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。また、同時にコントロールとしてAceCS1-Tgマウスも作製した。6ラインのAceCS2-Tgマウスが得られたが、見かけ上は野生型と区別することが出来なかった。また、絶食時における血中グルコース値及びコレステロール値も正常であった。
アカハライモリをモデル動物としたオーガナイザー研究への新たなアプローチ

アカハライモリは古典的な発生生物学の研究材料であるが,初期発生に関与する遺伝子の研究はほとんど進んでいない。本研究では,初期発生で有名な遺伝子Lim1,Chordin,VegT,Wnt8,Vg1をイモリから初めてクローニングし,その発現パターンと機能を調べた。また,卵片を用いた新たな遺伝子アッセイ系の確立を試みた。その結果,これまで常識とされていた知見とは異なる新たな発見ができた。今年度はアカハライモリ初期胚の形態形成に関与する遺伝子のcDNAのクローニングを試み、次の5つの遺伝子のクローニングに成功した。1内胚葉形成に関与すると報告があるSox17、2神経形成に関与するオーガナイザー活性の中心として働くChordin (AB922014)、3頭部神経形成に必須とされるLim1、4体節形成に関わるTbx6、5神経分化に関与するSox14。これらの遺伝子について、イモリ初期胚での発現パターンをRT-PCR法とWhole mount in situ hybridization法を用いて調べた。Sox17については、後期胞胚から植物半球に発現が見られ、原腸陥入と共に胚内へ潜り込み、内胚葉形成への関与が示唆された。Chordinについては、有尾両生類では初めてクローニングされた。その発現は、初期原腸胚ではオーガナイザーに局在し、神経胚期では脊索で発現が確認された。Lim1については、オーガナイザーに発現が見られるが、ゼノパスで報告されているような脊索前板での発現は検出されなかった。イモリ胚での遺伝子発現の解析に用いるPBE実験系(Permanent Blastula type Embryo)では、受精後すぐに植物局細胞質を除去し、体軸をもたない、将来は不整形表皮に分化する胚を用いる。この胚では、遺伝子の機能解析やその袋状の形態から移植実験の有用な実験系になると考えている。その有効性の解析の一端として、背側化関連遺伝子や内中胚葉遺伝子の発現をRT-PCR法で解析した。その結果、いずれの遺伝子の発現も検出できなかったので、今回クローニングした体軸の形成に関与する遺伝子のアッセイ系として十分利用できることが判明した。また、その性質を保証するためには、植物局を表面積で70%除去することが必要だった。今後、このPBEを用いて過剰発現系を試みる予定である。昨年度、完全長のcDNAのクローニングに成功した形態形成関連遺伝子のセンスmRNAを合成し、2から4細胞期胚の腹側帯域にマイクロインジェクションした。そのうちChordinについては、低い確率ではあるが、二次的な神経板の形成を引き起こし、過剰な外鰓およびバランサーの形成を引き起こした。明確な頭部や尾部構造は全く形成されなかった。Lim1のセンスmRNAを注入した場合は、体軸形成を示す構造体は全く形成されなかった。mRNAの注入量を変化させても、全く効果が得られなかった。一方、Lim1のアンチセンスmRNAを注入することで機能阻害を試みたところ、実験例数が少ないが約50%の確率で、下顎の欠損と胸部の分離が見られ、心臓が二箇所に形成されていた。Lim1は頭部形成だけではなく、腎臓の形成にも関与すると報告されているので、今後、更に例数を増やし検証したい。昨年度、PBE実験系が有効であることが明らかになったので、その前段階として、アニマルキャップでの過剰発現系を試行している。ChordinのセンスmRNAを注入した場合は、神経マーカーとして使用したOtx2やSox2、Sox3の発現が確認された。その他、オーガナイザー遺伝子であるGoosecoidの発現も確認されたが、神経や体軸構造の形成は確認されず、不整形表皮様に分化した。これまでイモリでは、センスmRNAの過剰発現系による二次軸の形成は全く報告されておらず、組織を移植したときのみ確認できる。現在、LiCl処理胚を作成し、帯域を全体をオーガナイザーに誘導し、その胚での遺伝子発現を確認している。また、LiClやクローニングした遺伝子同士をco-injectionして、その効果を確認している。本研究では、申請者がクローニングしたイモリの形態形成に関わる遺伝子(Wnt8, VegT, Lim1,Chordin, Otx2, Tbx6)の発現および機能解析を行った。まず、一般的な遺伝子発現のアッセイ系として、正常胚の腹側割球で各遺伝子のセンスmRNAを過剰発現させて、その後の形態変化を調べた。Chordinについては、二次的な神経板の形成を引き起こし、過剰な外鰓およびバランサーの形成を引き起こした。明確な頭部(眼を含む)や尾部構造は形成されなかった。Lim1については、体軸形成を示す構造体は全く形成されなかった。また注入量を変化させても、濃度依存的な効果は得られなかった。ChordinとLim1を一緒に発現させるとバランサーと外鰓の形成率が上昇した。ゼノパス胚への異種間での発現解析では、Chordin単独では神経を形成し、ChordinとLim1を一緒に発現させるとセメント線の形成が見られた。神経組織の前方化を引き起こした可能性がある。体軸を形成しない胚が新たな遺伝子発現のアッセイ系として使用できることを確認した。この胚の本来の分化能は表皮であり、イモリで明らかにされているオーガナイザー因子や神経マーカーなどの遺伝子の発現が見られなかったので、遺伝子発現の機能解析に有用であることが分かった。現在、このアッセイ系を用いて上記の遺伝子について個別に機能解析を行っている。

イモリ初期原腸胚での遺伝子マッピングについては、これまで知られているゼノパスでの知見と大きく異なる発見があった。Wnt8は植物極から内胚葉にかけて発現し背腹の偏りは見られなかった。Chordin,Lim1,Otx2の原腸蓋での発現は一般的に頭部オーガナイザーと言われている前方では確認できず、実際に神経誘導能をもつ後半で確認された。有尾両生類の造形運動の特異性の解明の基礎的な知見を得ることができた。アカハライモリは古典的な発生生物学の研究材料であるが,初期発生に関与する遺伝子の研究はほとんど進んでいない。本研究では,初期発生で有名な遺伝子Lim1,Chordin,VegT,Wnt8,Vg1をイモリから初めてクローニングし,その発現パターンと機能を調べた。また,卵片を用いた新たな遺伝子アッセイ系の確立を試みた。その結果,これまで常識とされていた知見とは異なる新たな発見ができた。mRNAを過剰発現させる強制発現系は様々な脊椎動物で行われ実績を挙げているため、イモリでも可能であると考え実行したが、Chordinでのみ低確率で外鰓やバランサーが形成されているだけで、明確な二次軸形成の成果が出ていない。その他、Lim1、Sox3、Otx2などでは、mRNAの過剰発現系およびアンチセンスmRNAによる発現阻害を行ったが効果が確認されなかった。また、二年間で採集された天然イモリの産卵数が少なかったため、さらに実験を遅らせる結果の一因となり、研究課題全般の遂行が計画通りに進まなかった。発生生物学mRNAの強制発現系が効果を発揮しない可能性の一つとして、イモリ特有の外来mRNAの分解機構の存在が示唆される。合成したmRNAが実際に細胞内で発現し、形態形成への効果を調べるために、実績のある他の脊椎動物(アフリカツメガエル)で実験の有効性を確認したいと考えている。イモリでは初期発生で有名な遺伝子のクローニングが大幅に遅れている。そのため、今年度はオーガナイザー因子を中心として体軸形成に関与する遺伝子のクローニングに時間がかかった。その後、クローニングした遺伝子の完全長cDNAからのmRNA合成が成功していないので、過剰発現の解析に至っていない。mRNAを過剰発現させる強制発現系は様々な脊椎動物で行われ実績を挙げているため、イモリでも可能であると考え実行したが、これまで明確な成果が出ていない。そのため遺伝子合成や解析に使用する試薬類や消耗品の使用が予定よりも大幅に少なく済んだため、未使用金が発生した。現在、クローニングしたcDNAからのmRNA合成を行っている。それが成功した後、PBE系での過剰発現系を実施し、機能解析を行う予定である。次年度、内中胚葉形成の相違性を解析する目的でVegTを中心に調べる予定だったが、今年度内胚葉形成に関与すると考えられているSox17のクローニングに成功できたので、まずは、それと合わせて発現パターンの解析を行いたい。
ヒト消化器癌におけるアポトーシス関連遺伝子発現と制御因子に関する分子病理学的研究

2.胃癌、大腸癌培養細胞株では種々の程度にFAS抗原が発現していた。抗FAS抗体誘発アポトーシスは胃癌ではp53遺伝子とは関係なく、他方、大腸癌では野生型p53遺伝子を有するLoVoのみで誘発された、アデノウイルスベクターを用いて野生型p53遺伝子を導入するとFAS抗原の発現が亢進した。3.胃癌培養細胞株を44°C、30分間培養するとアポトーシスが、60分間培養するとネクローシスが誘導された。アポトーシス誘発系ではp53蛋白の発現が亢進した。4.長径5mm以下の微小胃癌26例、早期胃癌29例、進行癌33例のアポトーシス・インデックス(AI)と増殖活性細胞(KI)を比較すると、AIに差はなかったが、KIは有意差をもって進行胃癌で高かった。アポトーシスは胃癌の初期から生じていることが示された。5.大腸癌の術前に5FU座薬を投与すると、大腸癌細胞のアポトーシスが有意に増加し、増殖活性は低下した。他方、腫瘍内微小血管数が有意に減少した。6. dThdPaseは消化器癌細胞のみならず、間質細胞や平滑筋細胞でも発現している。胃癌(124例)および大腸癌(97例)を検討して所、dThdPase発現症例では深達度に関係なく、腫瘍内微小血管数が有意に増加していた。また、dThdPase発現大腸癌では非発現大腸癌に比較して、有意にアポトーシス細胞が少なかった(P<0.05)。アポトーシスとp53蛋白との関連はなく、p53遺伝子非依存性と見なされた。(1)ヒト胃癌培養細胞株に5%エタノールを添加すると種々の程度にアポトーシスが、10%ではネクローシスが誘発された。アポトーシス誘発系では添加後、1時間からc-myc遺伝子の発現が低下した。この時カルモジュリン阻害剤を投与してもアポトーシス誘導に変化はなかった。(2)胃癌、大腸癌培養細胞株では種々の程度にFAS抗原が発現していた。抗FAS抗体誘発アポトーシスは胃癌ではp53遺伝子とは関係なく、他方、大腸癌では野生型p53遺伝子を有するLoVoのみでアポトーシスが誘発された。アデノウイルスベクターを用いて野生型p53遺伝子を導入するとFAS抗原の発現が亢進した。(3)胃癌培養細胞株を46°C、30分間培養するとアポトーシスが、60分間培養するとネツロ-シスが誘導された。(4)アデノウイルス-p53遺伝子を導入すると、ベクター数に比例してp53蛋白の発現が亢進した。50MOIを導入すると、胃癌ではMKN-1のみアポトーシスが誘発され、その他6株では細胞周期停止が生じた。この時、BAX,Bcl-2蛋白の発現に差はなかった。(1)長径5mm以下の微小胃癌26例、早期胃癌29例、進行癌33例のアポトーシス・インデックス(AI)と増殖活性細胞(KI)を比較すると、AIに差はなかったが、KIは有意差をもって進行胃癌で高かった。(2)大腸癌の術前に5FU座薬を投与すると、大腸癌細胞のアポトーシスが数的に増加した。非癌部粘膜では腺底部にアポトーシス細胞が散見された。(2) Thymidine phosphrylase(dThdPase)は胃癌(6株)および大腸癌(6株)培養細胞で種々の程度に発現していたが、dThdPase発現とp53遺伝子変異に関連はなかった。

dThdPase高発現株のTMK-1細胞では温熱処理により酵素活性が上昇し、5'-deoxy-5-fluorouridineに対する感受性が亢進して、アポトーシス細胞が増加した。(1) dThdPaseは消化器癌細胞、のみならず、間質細胞や平滑筋細胞でも発現している。胃癌(124例)および大腸癌(97例)を検討した所、dThdPase発現症例では深達度に関係なく、腫瘍内微小血管数が有意に増加していた。また、dThdPase発現大腸癌では非発現大腸癌に比較して、有意にアポトーシス細胞が少なかった(P<0,05)。アポトーシスとP53蛋白との関連はなく、p53遺伝子非依存性と見なされた。(2)口腔扁平上皮癌15例において、術前抗癌剤投与および放射線照射の効果を検討したところ、癌細胞のアポトーシスを有意に増加させ(P<0.05)、細胞増殖活性を抑制した。
粒子形状および堆積環境に基づいた沖積砂質地盤のせん断強度の推定

粒状体の内部摩擦角は,粒径加積曲線の縦軸に土粒子全体の個数に対する通過個数百分率をとり調整した粒度分布に影響を受けること,DEMより,粒子形状FUに比例することが確かめられた。濃尾平野のボーリング試料の熱田層下部の砂質土を分析し,場所は異なっても粒度分布と母岩が同じであれば,鉱物含有率も同じである可能性があることを明らかにした。本研究では,粒状体の粒子形状という一つの物理的性質から内部摩擦角というせん断強度を推定する精度を上げる,さらには,わが国の代表的な沖積平野である濃尾平野を研究対象にして,自然に堆積する土の特徴を平面的および深度方向に分析し,運搬に伴う淘汰や海進・海退に伴う上方粗粒化・細粒化などの堆積時あるいは堆積後の環境を推定することの2点を研究目的とする。そして濃尾平野沖積層の砂質土について,堆積土の平面位置と深度から,堆積環境の把握→物理的性質の推定→せん断強度の推定を目的としている。具体的な研究項目は以下に示すとおりである。(1)既存ボーリング試料の理学的・工学的分析(2)地盤の生成過程と堆積環境の検討(3)地盤の生成過程と堆積環境を考慮した工学的性質の推定(4)せん断強度推定の精度向上と粒子形状・粒子表面粗度がせん断特性に与えるメカニズムの検討(5)既存ボーリング試料の理学的・工学的分析の継続(6)新データの分析の蓄積(7)せん断強度推定の精度向上と粒子形状・粒子表面粗度がせん断特性に与えるメカニズムの継続的検討(8)理情報等から物理的・力学的性質の推定の試みと濃尾平野の工学的性質の図化上記1)7)の成果に基づき理学・工学の両面から得られた地盤情報を総合的に判断し,地盤の生成過程,堆積環境を考慮して,粒度分布や粒子形状などの物理的性質の推定,さらには液状化判定,深度や位置のみからせん断強度の推定を試みる。推定した濃尾平野の液状化危険度,沖積砂層のせん断強度などの工学的性質を,平面的できれば3次元的に図化して視覚的に表す。これにより,本研究の2つの目的(1)粒状体の物理的性質からせん断強度を推定,(2)運搬に伴う淘汰や海進・海退に伴う上方粗粒化・細粒化などの堆積時あるいは堆積後の環境を推定するに基づいて,最終目的である堆積環境→物理的性質の推定→せん断強度の推定が達成する。仮に,研究が予定どおりに進まず研究期間の4年間で最終目標まで到達しない見込みとなった場合でも,途中で軌道を修正し,上記8)の2つの目的のいずれかを中心に研究を実施することが可能である。そして濃尾平野沖積層の砂質土について,堆積土の平面位置と深度から,堆積環境の把握→物理的性質の推定→せん断強度の推定を最終目的としている。本年度は,1.既存ボーリング試料の理学的・工学的分析,2.地盤の生成過程と堆積環境の検討,3.地盤の生成過程と堆積環境を考慮した工学的性質の推定,4.せん断強度推定の精度向上と粒子形状・粒子表面粗度がせん断特性に与えるメカニズムの検討の4項目について研究を実施した。その結果,1.および2.については,分析を継続して行いデータを蓄積する必要はあるが,堆積時代に対応した進度方向へ砂質土,粘性土とも連続性が見られることが明らかになりつつあり,さらなる検討を必要とするが,3.については例えば液状化発生の可能性の大小の予測は可能になると考えられる。4.については,砂のような粒状体のせん断強度へ及ぼす影響を粒子形状・粒子表面粗度,相対密度に絞って検討を行ってきたが,粒度分布を地盤工学会基準の質量ではなく,個数で表すと無視できないことが明らかとなった。これは,これまでの研究成果とは異なる新しい知見であり,追加実験やDEMでの検証などの必要性が認識された。そして濃尾平野沖積層の砂質土について,堆積土の平面位置と深度から,堆積環境の把握→物理的性質の推定→せん断強度の推定を目的とする。

本研究の2年度目となる本年度はその試料の分析を継続するとともに粒状体のせん断強度試験を中心に研究を行うことを目的として,1.既存ボーリング試料の理学的・工学的分析の継続,2.地盤の生成過程と堆積環境の検討,3.地盤の生成過程と堆積環境を考慮した工学的性質の推定,4.せん断強度推定の精度向上と粒度分布がせん断特性に与えるメカニズムの検討の4項目について研究を実施した。その結果,1.および2.については,分析を継続して行いデータを蓄積する必要はあるが,堆積時代に対応した進度方向へ砂質土,粘性土とも連続性が見られることが明らかになりつつあり,さらなる検討を必要とするが,3.については例えば液状化発生の可能性の大小の予測は可能になると考えられる。4.については,砂のような粒状体のせん断強度へ及ぼす影響を粒度分布に絞って検討を行ってきたが,粒度分布を地盤工学会基準の質量ではなく,個数で表すと無視できないことが明らかとなり,これはこれまでの研究成果とは異なる新しい知見であり,追加実験や行った。その結果,せん断強度に関して,供試体作成方法による異方性の問題や供試体の状態を相対密度あるいは初期間隙比で整理すべきかなど,いくつかの課題が見つかったので,次年度への課題としたい。本研究では,粒状体の粒子形状という一つの物理的性質から内部摩擦角というせん断強度を推定する精度を上げる,さらには,わが国の代表的な沖積平野である濃尾平野を研究対象にして,自然に堆積する土の特徴を平面的および深度方向に分析し,運搬に伴う淘汰や海進・海退に伴う上方粗粒化・細粒化などの堆積時あるいは堆積後の環境を推定することの2点を研究目的とする。そして濃尾平野沖積層の砂質土について,堆積土の平面位置と深度から,堆積環境の把握→物理的性質の推定→せん断強度の推定を最終目的としている。本研究の3年度目となる本年度はその試料の分析を継続するとともに粒状体のせん断強度試験を中心に研究を行うことを目的として,1.既存ボーリング試料の理学的・工学的分析の継続,2.地盤の生成過程と堆積環境の検討,3.地盤の生成過程と堆積環境を考慮した工学的性質の推定,4.せん断強度推定の精度向上と粒子形状・粒度分布がせん断特性に与えるメカニズムの検討の4項目について研究を実施した。その結果,1.および2.については,分析を継続して行いデータを蓄積する必要はあるが,堆積時代に対応した進度方向へ砂質土,粘性土とも連続性が見られること,運搬河川が異なっても分布が類似であれば粒度組成が似ていること等,新たな事実が明らかになりつつある一方で,3.についてはほとんど進展は見られなかった。4.については,砂のような粒状体のせん断強度へ及ぼす影響は粒子形状ばかりではなく,粒度分布,特に粒度分布を地盤工学会基準の質量ではなく,個数で表すと無視できないことが明らかとなった。また,せん断強度は,供試体作成方法による異方性の影響を大きく受けること,供試体の状態を相対密度よりも初期間隙比で整理したほうが望ましい場合もあることが明らかとなった。そして濃尾平野沖積層の砂質土について,堆積土の平面位置と深度から,堆積環境の把握,物理的性質の推定,せん断強度の推定を最終目的とする。最終4年度目となる本年度はこれまで3年間の研究成果のとりまとめと検討が主たる研究内容になるが,(1)既存ボーリング試料の理学的・工学的分析の追加分析,(2)せん断強度推定の精度向上と粒子形状・粒度分布がせん断特性に与えるメカニズムの検討を行った。
房水生理活性物質の相互作用による緑内障発症機序の解明

本研究は緑内障発症に関わる房水流出調節機序を解明するため、緑内障患者房水で高値のTGF-β2とTGF-β2に誘導されるサイトカインとの相互作用を検討した。線維柱帯細胞にてTGF-β2刺激によりIL-6が誘導され、さらに緑内障患者房水内においてIL-6、sIL-6Rの産生が認められた。我々の研究にてTGF-β2はアクチン重合やα-SMAを誘導し、線維柱帯細胞の線維化を生じさせたが、IL-6とsIL-6Rを同時刺激によりTGF-βシグナルを抑え、線維化を抑制した。さらにIL-6シグナル下流のSTAT3ノックダウンにより抑制効果は解除され、これら相互作用が房水流出調節に関与していることが示唆された。我が国において失明原因の一つとして眼圧上昇による緑内障が危険因子として知られている。今までに緑内障における眼圧上昇は房水流出抵抗が増大することに起因していると報告されている。この房水流出調節のメカニズムを探るため、申請者は現在まで緑内障患者房水内で非患者と比較して高値であるTGF-β2に着目し、房水流出に関わる細胞である線維柱帯細胞を用い、TGF-β2によって誘導されるアクチン重合やコラーゲン発現に対するROCK阻害剤の効果について検討を行ってきた。さらにTGF-β2により誘導されてくるサイトカインを調べ、本研究においてはTGF-β2と誘導されるサイトカインといった生理活性物質の相互作用について検討することを目的に研究を行うこととした。眼圧上昇は線維柱帯細胞内における細胞外マトリックスの沈着、アクチン重合などが一因となっていることが示唆されており、TGF-β2もこれらの誘因物質であることが報告されている。申請者はTGF-β2とTGF-β2によって誘導される生理活性物質が協調的に働き、線維柱帯細胞における細胞外マトリックスの沈着やアクチン重合に寄与しているのではないかと考え、現在までサイトカインの一つであるIL-6がTGF-β2によって発現上昇していることを見い出した。次にTGF-β2シグナルに対するIL-6シグナルの影響について検討した結果、TGF-β2によって発現誘導されるα-SMAの発現がIL-6/solubleIL-6Rの添加により抑制され、同じくアクチン重合に関わるMLC2のリン酸化についても抑制されることがわかった。さらにTGF-β2下流シグナルである転写因子の活性化も抑制傾向にあることが示唆された。このことから、房水生理活性物質の相互作用が房水流出路に関わる細胞に影響を及ぼす事が示唆され、房水流出調節のメカニズムを明らかにすることが出来ると考えている。線維柱帯細胞においてマルチプレックスアッセイを用いTGF-β2刺激によって上清中に有意に誘導されてくるサイトカインとしてIL-6を見出した。その後、TGF-β2シグナルによって誘導されるタンパク発現に対するIL-6シグナルの影響についてreal-time RT-PCRやWestern blot法を用い検討した。その結果、癌細胞の転移にも関わっていることが知られ、TGF-β2によって誘導されるタンパクの一つであるα-SMAの発現がIL-6/solubleIL-6存在下で抑制されており、またアクチン重合に関わるROCKシグナルの下流で機能しているMLC2のリン酸化についてもIL-6/solubleIL-6によって有意に抑制されていた。さらにTGF-β2の下流である転写因子Smad2の活性化について検討したところ、タンパク発現、および転写活性化について抑制傾向にあることが示唆された。現在IL-6下流の転写因子であるSTAT3の機能とTGF-β2シグナルの相互作用についても分子生物学手法を用い検討を行っている。以上の結果から房水流出調節においてサイトカインといった生理活性物質が相互作用し、線維柱帯細胞細内のアクチン重合や特定のタンパク発現に関与している可能性が示唆された。申請者はこの房水流出調節メカニズムを探るため、TGF-β2に着目した。今までの報告により、TGF-β2は緑内障患者房水内において非患者と比較して高値であり、房水流出調節に関わる線維柱帯細胞において細胞外マトリックスの沈着、アクチン重合を生じさせることから、眼圧上昇の一因として示唆されている。申請者はこれまで線維柱帯細胞を用いて、TGF-β2により誘導されるアクチン重合やコラーゲン発現に対するROCK阻害剤とp38阻害剤の効果について検討を行ってきた。本研究にてさらに房水流出調節メカニズムを理解するため、房水中のTGF-β2とTGF-β2によって誘導される生理活性物質が線維柱帯細胞において協調的に働き房水流出調節に影響を及ぼす可能性について検討した。まず線維柱帯細胞上清中においてTGF-β2によって誘導されるサイトカインを調べた。申請者はTGF-β2によって有意に上昇したサイトカインの一つであるIL-6に着目し、線維柱帯細胞を用い、TGF-β2シグナルとIL-6シグナルの相互作用について検討した。その結果、TGF-β2により発現誘導されるα-SMAやアクチン重合に関わるMLC2のリン酸化がIL-6/sIL-6Rの添加により抑制され、TGF-β2シグナルの下流因子に対しても同様の結果が確認された。このことから房水生理活性物質の相互作用が、房水流出経路に関わる細胞に影響を及ぼすことが示唆され、今後も房水流出調節メカニズムを明らかにすることが出来ると考えている。

現在まで線維柱帯細胞においてマルチプレックスアッセイを用いてTGF-β2刺激によって上清中に有意に発現誘導されてくるサイトカインの一つとしてIL-6を見出した。TGF-β2は他の細胞では線維化や癌細胞の浸潤、転移に関わっており、眼圧上昇に関わる線維柱帯細胞においてもそれらに関わるα-SMAの発現を誘導し、線維化に似た形態に変化させる。申請者はまず始めに、TGF-β2によって誘導されるIL-6シグナルがTGF-β2シグナルに対し、どのような影響を及ぼすのか検討した。線維柱帯細胞にTGF-β2とIL-6シグナルを活性化させるためIL-6とsolubleIL-6receptor(sIL-6R)を同時添加し、発現誘導される因子について検討した。その結果、IL-6/sIL-6R添加により、TGF-β2によって発現誘導されるα-SMA、アクチン重合に関わるMLC2のリン酸化、さらにTGF-β2シグナル下流の転写因子Smad2やp38リン酸化が有意に抑制された。その結果からIL-6シグナル下流で機能している転写因子STAT3の活性化が関わっているのではないかと考え、細胞内にてSTAT3をsiRNAを用いノックダウンさせ、その効果について検討した。その結果、STAT3を細胞内にて欠損させることで、TGF-β2シグナルに対するIL-6/sIL-6Rの抑制効果が消失した。よって、TGF-β2シグナルに対する抑制効果には転写因子STAT3の活性化が必要であることが今回の研究において明らかとなった。またIL-6/sIL-6RはTGF-βシグナルのレセプターに対しても抑制効果があることが明らかになった。以上の結果から、線維柱帯細胞においてサイトカイン等の生理活性物質が相互作用し、アクチン重合、線維化に影響を及ぼしていることが示唆され、房水流出調節において新たなシグナル伝達経路を見出した。我が国において失明原因の一つとして緑内障があげられる。今までに緑内障を生じる要因として眼圧上昇が房水流出抵抗の増大に起因していると報告されている。申請者はこの房水流出調節メカニズムを探るため、TGF-β2に着目した。これまでTGF-β2は緑内障患者房水内において非患者と比較し、高値であることが報告されている。TGF-β2は房水流出調節に関わる線維柱帯細胞において、細胞外マトリックスの沈着、アクチン重合を生じさせ、眼圧上昇の一因であると示唆されている。申請者はこれまで線維柱帯細胞を用い、TGF-β2により誘導されるアクチン重合やコラーゲン発現に対するROCKおよびp38阻害剤の効果について検討を行ってきた。本研究において、さらに房水流出調節メカニズムを理解するため、房水中のTGF-β2とTGF-β2によって誘導される生理活性物質が線維柱帯細胞において協調的に働き房水流出調節に影響を及ぼす可能性について検討した。まず、線維柱帯細胞上清中においてTGF-β2によって誘導されるサイトカインを調べた。申請者はTGF-β2によって有意に上昇したサイトカインの一つであるIL-6に着目し、TGF-β2シグナルとIL-6シグナルの相互作用について検討した。