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有用物質の効率的化学合成に向けた、新規酵素触媒反応の探索と応用

本課題期間では、生体内で重要な情報伝達を担う生物活性天然有機化合物、複合糖質関連化合物を主たる標的物質とし、天然界から動植物の生物生産によって容易かつ大量に得られる原料や発酵生産産物などに出発原料を求め、資源効率のよい合成を試みた。合成の鍵段階は、新しい機能、特色を持つ酵素(生物資源触媒)反応であり、これを探索開拓した。本研究には、酵素触媒の基質の分子設計、および新規酵素のスクリーニングという両方の側面が重要であった。具体的には、「立体障害が非常に大きいカルボニル化合物を不斉還元する微生物酵素の探索と応用」に、所定の成果を得た。カルボニル基にイソプロピル基、そして芳香環を有する側鎖が置換した基質を設定し、これを不斉還元する微生物酵素の探索により得られた微生物菌株4種が得られたので、分子の深い内部にアルキンと共役したカルボニル基が位置するケトンなど、関連する基質の還元を試みた。4菌株のうちP.minutaにより良好な反応性が示された。得られたプロパルギルアルコールは、別途、他種の微生物不斉還元により調製したキラルシントンを組み合わせ、十員環ラクトン天然物、modiolideAの全合成を達成した。後者では2-メチル-1,2,3-プロパントリオールの光学活性モノベンジルエーテル体合成に成功した。本課題期間では、生体内で重要な情報伝達を担う生物活性天然有機化合物、複合糖質関連化合物を主たる標的物質とし、天然界から動植物の生物生産によって容易かっ大量に得られる原料や発酵生産産物などに出発原料を求め、資源効率のよい合成を試みた。具体的には、「立体障害が非常に大きいカルボニル化合物を不斉還元する微生物酵素の探索と応用」に、以下のような成果を得た。カルボニル基にイソプロピル基、そして芳香環を有する側鎖が置換した基質を設定し、これを不斉還元する微生物酵素の探索を計画した。この化合物は、立体障害が大きく還元酵素の作用を受けにくいと推察されるため、スルポニル基を導入した。電子求引性の置換基を導入することにより還元を促進、さらに、反応進行および生成物の鏡像体純度分析を容易とする効果を期待した。この基質を用いたスクリーニングにより良好な反応選択性、立体選択性を示す微生物菌株4種が得られたので、不飽和ケトン、ジケトン、分子の深い内部にカルボニル基が位置するケトンなど、関連する基質の還元を試みた。4菌株のうちP.minutaは、イソプロピル基にとどまらず、立体障害が大きい鎖状ケトンを不斉還元しアルコールを与えた。得られたキラルシントンは、十員環ラクトン天然物、modiolide Aの合成に利用した。フェニルスルポニル基を、イソプロピルカルボニル基で置き換えると、3菌株でモデル基質と同じ傾向の立体選択性が観察されたが、P.angustaでは逆転していた。この際、還元はカルボニル基のうち一方が還元されたヒドロキシケトンで停止し、さらに還元が進行したジオールの生成は確認されなかった。本研究には、酵素触媒の基質の分子設計、および新規酵素のスグリーニングという両方の側面が重要であった。前年度、カルボニル基にイソプロピル基、そして芳香環を有する側鎖が置換した基質を設定し、これを不斉還元する微生物酵素の探索により得られた微生物菌株4種が得られたので、分子の深い内部にアルキンと共役したカルボニル基が位置するケトンなど、関連する基質の還元を試みた。

4菌株のうちP.minutaにより良好な反応性が示された。得られたプロパルギルアルコールは、別途、他種の微生物不斉還元により調製したキラルシントンを組み合わせ、十員環ラクトン天然物、modiolideAの全合成を達成した。
ウラン及び超ウラン化合物の強磁場磁性

ウラン化合物の中でも低温でバンドギャップを持つ半導体的な電気抵抗を示すβ-US_2に特に焦点を当て、強磁場を用いた実験装置を開発して、研究を行った。4.2Kの低温で磁場をかけることによって抵抗が急激に減少し、50テスラの強磁場下で電気抵抗は10万分の1以下にも減少し、電気伝導はもはや半導体的ではなく金属的であることを発見した。この金属化は、試料が磁場中での磁化の出現と相関があることを発見した。本年度はこれまで予備的に行ってきた実験を継続し、その結果をアメリカのヒューストンで行われた強相関電子系の国際会議(International Conference on Strongly Correlated Electron Systems,Houston,U.S.A.)にて発表した。これは、超ウラン化合物の磁性を理解する上で重要な、強相関電子系のメカニズムを明らかにするために必要な研究で、f電子のホールが一個であるYb^<3+>イオンを持ったYbCu_2Si_2の強磁場磁化を測定し、その磁性の一端を明らかにした。超ウラン化合物を調べる上で重要となる鍵が低温の磁性である。その磁性を理解する上で重要な鍵を握るので、パルス強磁場と^3Heを用いた低温装置を組み合わせることに多くの労力を割き、温度は目的の0.6Kに達した。ノイズの除去を現在進めており、下記に示す感度向上の取り組みとともに、来年度の測定の準備が整いつつある。本研究では、超ウランおよびウラン化合物の純良単結晶を用いた研究であるため残留抵抗が小さく、パルス磁場による渦電流の効果を避けるために薄く小さな資料を用いなければならない。そのため、磁化のシグナルが当然小さくなるので、今まで以上に感度を上げたピックアップコイルシステムの開発が必要である。パルス磁場による誘導起電力の上昇を避けるために、できる限りピックアップコイルは小さくしなければならない。そのために、線材の超極細化にとりくんだ。15μmの超極細導線を購入してシステムの改良に取り組んだが、開発中に更に細い、直径12μmという世界でも類を見ない細い導線を手に入れることが可能となったことがわかった。年度内納品が不可能となったので、研究を20年度に繰り越して継続したが、結局12μmの導線の開発に業者は失敗し、15μmので導線を用いて装置の改良を行った。これらの装置による実験は次年度で行う予定である。本年度では昨年度まで行ってきた準備を受けて超極細線のピックアップコイルの開発と、ウラン化合物β-US_2の磁性の研究に取り組んだ。超ウラン化合物の磁性の解明には純良単結晶の育成が欠かせないが、試料を純良科することに成功すると、金属化合物がほとんどであるため、試料の低温での電気抵抗が小さくなる特徴がある。残留抵抗の小さい試料のパルス磁場中での測定のためには、渦電流を避けるために磁場方向に垂直な方向に薄い試料を用いることになる。そのため試料の量がへってしまうため、今まで以上に巻数を増やした感度を上げたピックアップコイルシステムの開発を精力的に行った。磁場によるバランスと出力、ノイズの解明に努め一定の成果を上げた。ウラン及び超ウラン化合物の解明には同じf電子系で以前より詳細に調べられている希土類系の磁性と比べることが大切である。その一環としてRCu_2Si_2とCeAu_2Si_2の実験を行った。これらの系で磁気異方性が重要なキーワードであることが明らかとなった。これらの結果は秋の日本物理学会と英文誌に報告した。β-US_2は、ウラン化合物の中でも低温で80K位のバンドギャップを持つ半導体的な電気抵抗を示すことで注目される物質である。圧力下でこの半導体的な電気抵抗が壊され金属的になる報告があるが、磁場中での詳細な研究がなされてこなかった。そこで、原研の研究支援者との協力の下に単結晶を新たに育成し、50テスラまでの磁気抵抗の測定を行った。半導体的な温度変化を示す領域の一番高温側の83Kでは50テスラで約半分になる負の磁気抵抗が観察されたが、4.2Kでは50テスラで10万分の1以下にも減少する巨大な負の磁気抵抗が観察された。50テスラでの抵抗の温度変化はもはや半導体的ではなく、金属的な物であり、磁場によって半導体的なエネルギーギャップがつぶされていることを確認した。この結果は08年度最後の物理学会(3月27日から、立教大学)で報告する予定である。本年度では昨年度まで行ってきた研究を続けて、ウラン化合物β-US_2の磁性の研究等に取り組んだ。超ウラン化合物の磁性の解明に必要な純良単結晶は残留抵抗が小さいため、パルス磁場中での測定による渦電流を避けるために磁場方向に垂直な方向に薄い試料を用いることになるため、試料の量がへってしまい、今まで以上に高感度な測定システムを構築しなければならない。また低温での温度依存性がとても重要となるため、精密な温度測定ができる測定システムも重要である。

前年度から準備してきた実験装置を用いて、ノイズの低減とピックアップコイルによる磁場による出力をキャンセルするバランス回路の改善などに取り組み、一定の成果を上げた。これらの装置開発と平行して、前年度より取り組んできた超ウラン化合物の参照系としての希土類4f電子系での系統的な研究も行った。超ウラン化合物の5f電子系を扱うに当たって、Ceと同様に重い電子状態を示す4f電子系のYb化合物について系統的な研究を行った。最近、磁気秩序を示さない重い電子系Yb化合物として注目されるYbT_2Zn_<20>系化合物(T=Ir、Co、Rh)で強磁場磁化を用いたメタ磁性の研究を行った。重い電子系を示す化合物では、Ce系、U系、Yb系にかかわらず、帯磁率の温度変化が極大を示す温度、T_<xmax>とメタ磁性を示す磁場H_mに一定の関係があって、f電子の数や4f、5fの種類にはよらないことが明らかになった。これらの結果は2010年3月下旬に岡山で行われた日本物理学会で報告し、学会の英文誌にも発表する予定である。前年より取り組んできた、ウラン化合物の中でも低温でバンドギャップを持つ半導体的な電気抵抗を示すβ-US_2では、4.2Kでは50テスラで10万分の1以下にも減少し、強磁場中ではもはや半導体的ではなく金属的であることを示したが、それらの原因と磁化の出現を実験的に明らかにするために、磁化測定の温度変化を系統的に行い、磁化の出現と大きな磁気抵抗に一定の相関があることを解明し、2009年の秋の物理学会(熊本)で報告した。更に2010年の6月に米国のサンタフェで行われる強相関電子系の国際会議(SCES2010)で発表する予定である。
高次クロマチン構造変換を介した新たな先天性内分泌疾患の解明

転写因子SF-1の新たな標的遺伝子GST-Aファミリーの転写調節機構を3C assayなどの高次クロマチン構造解析により明らかにし、すべてのGST-Aファミリー(GSTA1A4)遺伝子が高次クロマチン構造変換を通してSF-1依存的に転写調節されていることが明らかになった。これはクラスターとして存在するGST-Aファミリー遺伝子が高次クロマチン構造変換を介して共通に転写制御されていることを示している。またGSTA1およびGSTA3はステロイドホルモンイソメラーゼとして働くことから、高次クロマチン構造変換の異常を介した先天性ステロイドホルモン産生異常症の原因となる可能性が示された。GSTAファミリーの全4遺伝子は250 kbにわたりクラスターを形成している。私どもは、これら全遺伝子がSF-1により制御されていること、genome-wideなChIP-on-Chip assayにより、GSTAファミリーのプロモーター領域では、GSTA3プロモーターにのみSF-1が結合していることを明らかにした。これらはGSTAファミリー遺伝子の転写が、クラスター全体の高次クロマチン構造の変換に依存していることを示している。また本研究ではクロマチン上でのlong-range interactionを検出できるChromosomal conformation capture (3c)assayを用いて、GSTAファミリー遺伝子のSF-1依存性高次クロマチン構造変換機構を解明した。また、ChIP-on-Chipによる解析から250 kbにわたるGSTA遺伝子クラスター領域に6か所のSF-1結合サイト(GSTA3プロモーター領域を含む)が存在することを確認し、それぞれ6カ所のSF-1結合領域と4カ所のプロモーター領域との間で、核内で3次元的に近接しているかを3C-qPCR法で検討した。その結果、GSTAファミリーの全遺伝子プロモーター領域が、SF-1依存的に3次元的に近接することを証明し、SF-1依存性に高次クロマチン構造変換が生じることを明らかにした。発生・分化に伴う遺伝子発現は、いくつかのマスター転写因子により制御されている。また発生・分化に関わる一部の遺伝子群(グロビン遺伝子やAPO遺伝子など)はクロマチン上でクラスターを形成し、マスター転写因子による高次クロマチン構造変換を介して転写制御されることが報告されている。私どもはステロイドホルモン産生におけるマスター転写因子であるSF-1により、染色体6p12にクラスターとして存在するGSTA遺伝子ファミリーに属する全4遺伝子が発現誘導を受けることを明らかにしている。本研究では、GSTA遺伝子ファミリーが、高次クロマチン構造変換を介して転写制御されている事を3C assayにより初めて明らかにした。さらに遺伝子導入実験により、GSTA遺伝子ファミリーのうちGSTA1およびGSTA3が、プロゲステロンやアンドロステンジオンの合成に必須のイソメラーゼ活性を有していることを、細胞レベルで初めて明らかにし、これらの遺伝子がステロイドホルモン合成関連遺伝子群の一員であることを示した。一方、ステロイドホルモン産生異常症では、ステロイドホルモン合成酵素の欠損により引き起こされるケースが数多く報告されているが、これらの酵素遺伝子に欠損が見られないステロイドホルモン産生異常症もまた多くの症例があり、原因不明のnon-classic typeとして分類されている。本研究では原因不明のnon-classic typeとして分類されている先天性ステロイドホルモン産生異常症の症例40例以上について、成育医療センターとの共同研究で、Comparative Genomic Hybridization (CGH)法により250 kbにわたるGSTA遺伝子クラスター領域における遺伝子変異及び欠失の有無を解析したが、それらの症例との関連性についてまだ有意な結果は得られていない。内分泌学Chip-on-chip assayをゲノムワイドに利用することで、GSTAfamilyのプロモーター領域では、GSTA3遺伝子プロモーターにのみSF-1が結合することを明らかに出来たことは、大きな成果であった。さらに、3C assayを確立し、GSTAファミリーの転写が、3次元的なクロマチン構造変化を介していることを証明できたことは大きな進展であった。今後はさらに領域を広げて、高次クロマチン構造変換の解析を行う。そのためには、未知近接領域を同定できる4C法が必要であり、本研究においては、GSTA1プロモーター領域と相互作用するクラスター外の領域を3C法に準じた実験プロトコールに従って4C法により解析し、GSTA遺伝子ファミリーの転写調節領域を同定する。上述により同定した、GSTA遺伝子クラスター外に存在するGSTA遺伝子転写調節領域に関して、本年度に行ったと同様の方法で、先天性ステロイドホルモン産生異常症との関連を明らかにする。原因不明のnon-classic typeとして分類されている先天性ステロイドホルモン産生異常症の症例40例以上について、新たに同定された領域全体をCGH法により解析し、転写調節領域の変異・欠失に伴う高次クロマチン構造形成の異常と、症例との関係を明らかにする。
肝の虚血・再潅流障害に肝組織中フォスフォリパーゼA_2活性が与える影響

ラットを使用して、70%肝虚血モデルを作製し、肝における再潅流障害について検討した。ラットは麻酔され、開腹された。肝左葉、中葉に対する、門脈及び肝動脈をクランプし、1時間後に再潅流させ、24時間までの再潅流を行った。肝組織中のミトコンドリア分画、サイトゾール分画のフォスフォリパーゼA2活性、及び大動脈から採血した血液のフォスフォリパーゼA2活性の測定をRIを使用して行った。同時に肝機能障害の指標としてGPTの測定を行った。GPTは再潅流後、著明に増加した。肝組織中フォスフォリパーゼA2活性は、ミトコンドリア分画、サイドゾール分画ともに変化しなかった。しかしサイトゾール分画中にこれまで報告されていない新しい活性を見いだした。この活性が新しいフォスフォリパーゼA2であるかどうかについては、更なる研究が必要である。血清中のフォスフォリパーゼA2活性は再潅流後、増加するような傾向が認められている。肝虚血・再潅流に対して血清中のフォスフォリパーゼA2が関与しており、循環中のエイコサノイドの変化を裏付ける結果となった。この血清中の酵素の由来については、好中球など循環中の細胞より放出されたものか、肝組織中の酵素が貯蔵されることなく放出されたものなのかは不明である。
森田双対性をもつアルチン環の研究

環の森田双対性に関する重要な問題として、東屋の予想「すべてのexact環は自己双対性をもつであろう」がある。このexact環と密接な関係がある、環の有限三角拡大について、以前から基礎環の森田双対性が遺伝することは知られていたが、本研究において、対応する森田双対な環も有限三角拡大となるという結果を得た。また、斜体上のある種の有限三角拡大は自己双対性をもつことを示した。これらの結果は東屋の予想の傍証を与えるものである。本研究の目的は、森田双対性をもつアルチン環の研究である。特に「すべてのexact(アルチン)環は自己双対性をもつであろう」という東屋の予想や、その特別な場合である「すべての局所分配的環は自己双対性をもつであろう」という問題の解決に寄与することである。一方、局所分配的環は自己双対性をもつ部分環(より具体的には、局所中山環の有限直積環)の有限三角拡大環(特に有限正規拡大環)になっている。したがって、環の森田双対性や自己双対性が、有限三角拡大環や有限正規拡大環にどのように遺伝するかが重要な問題となる。昨年度に引き続き、本年度はこの問題の研究を行った。「2つの環A、Bが森田双対であれば、Aの任意の有限三角拡大環(有限正規拡大環)Rは、Bのある有限拡大環Sに森田双対であり、Bが基本的であれば、SはBの有限三角拡大環(有限正規拡大環)となる。特に、AとBが基本的であれば、AとBの有限三角拡大環(有限正規拡大環)は森田双対であるという関係のもとで、1対1に対応する」という結果を含め、2012年度日本数学会秋季総合分科会において発表した。この結果は、研究の主目的である東屋の予想と関連する問題の解決に寄与するものである。なお、これらの結果を含む論文"Morita duality and ring extensions"は、本年度学術雑誌Journal of Algebra and Its applications"に掲載された。1年目と2年目は、exact環と密接な関係がある、森田双対であるような2つの環の拡大環の森田双対性とそれらの対応について研究し、「2つの基本的環A、Bが森田双対であれば、Aの有限三角(正規)拡大環はBの有限三角(正規)拡大環と森田双対である」という結果を得た。特に、基本的環Aが自己双対性をもてば、Aの有限三角(正規)拡大はAの有限三角(正規)拡大と森田双対であることが分かった。これらの結果は、2012年度日本数学会秋季総合分科会において発表し、論文"Morita duality and ring extensions"として、学術雑誌Journal of Algebra and Its applicationsに掲載された。3年目の最終年度は、exact環の典型である斜体上の有限三角拡大の自己双対性について、拡大次元が小さい場合を中心に研究を行った。この問題意識の背景として、斜体上の有限正規拡大(有限三角拡大の特別な場合)の自己双対性については、Kraemerによって肯定的に示されていることがある。このような斜体上の有限三角拡大の自己双対性は、斜体の自己同型写像とそれに関する微分の問題に帰着される。東屋の予想の観点からは、自己同型写像や微分に関する制約条件無しに、自己双対性の存在が証明できるのが望ましいが、今年度はいくつかの条件をつけた上で、有限三角拡大環の自己双対性を証明することができた。研究成果を学術論文としてまとめるため、現在準備中である。特に「すべてのexact環は自己双対性をもつであろう」という東屋の予想や、その特別な場合である「すべての局所分配的環は自己双対性をもつであろう」という問題の解決に寄与することであるが、局所分配的環は自己双対性をもつ部分環の有限三角(特に有限部分正規)拡大環になっているので、環の自己双対性がこれらの拡大環にどのように遺伝するかという問題が重要になる。本年度は、この問題の研究を行い、以前から一部は得ていた「2つの環A,Bが森田双対であれば、それらのある種の拡大環は森田双対という関係で対応し、その対応は拡大環の圏の圏同値である」という結果について、より詳細に調べ、この結果と手法を応用することにより、「2つの基本的環A,Bが森田双対であれば、これらの有限三角(有限部分正規)拡大環は森田双対という関係で対応する」という結果を含め、いくつかの結果を得た。

森田双対性をもつ環の有限三角(有限部分正規)拡大環が森田双対性をもつという事実はすでに知られていたが、この結果は対応する拡大環も同じ形であり、自己双対性の存在と近い状況にあることを意味する。これは研究の主目的である東屋の予想と関連する問題の解決に寄与するものである。なお、これらの結果は論文"Morita duality and ring extensions"としてまとめ、学術雑誌Journal of Algebra and Its Applicationsに投稿し受理されている。森田双対性をもつ環の有限三角拡大環(有限正規拡大環)が森田双対性をもち、環が基本的であるという条件のもとでは、森田双対で対応する環も有限三角拡大環(有限正規拡大環)であるという結果を学会で発表することができたが、それ以上改良することができなかったため。【研究実績の概要】で述べたように、森田双対性をもつ環の有限三角(有限部分正規)拡大環について、森田双対で対応する環も同じ形の拡大環であるという結果は、森田双対性に関する新しい知見であると思われるため。今年度、一昨年度に引き続き、拡大環への遺伝を中心に森田双対性の研究を行う。環論および表現論シンポジウムや日本数学会に参加し、最新の研究成果を収集するとともに、近接研究者との情報交換を行う。今年度に引き続き、拡大環への遺伝を中心に森田双対性の研究を行う。今年度得た結果については、学会等で発表を行う予定である。次年度に繰り越した研究費の主な内容は、研究計画にも記載していた、環論及び表現論シンポジウムの報告集の印刷費であるが、これは講演原稿の集まりが遅れたため、今年度内に執行できなかったものであり、次年度早々には執行できる予定である。「次年度使用額(BーA)」は1516円ときわめて少額であり、おおむね当初の予定通り研究費を使用している。2013年度分の研究費は、環論および表現論シンポジウムや日本数学会への出張旅費を中心に支出する。2011年度の環論及び表現論シンポジウムの報告集の印刷経費を繰り越し分によって執行することを除けば、おおむね当初の計画通り執行する。すなわち、主に、学会・研究集会への参加旅費や、他の研究者との研究打ち合わせの旅費を使用し、2012年度の環論及び表現論シンポジウムの印刷経費等の補助も行う。その他、図書や文房具等の購入に使用する。
細菌感染時の樹状細胞による自然免疫系と獲得免疫系の連結機構の解明

消化管の細菌感染症に対する免疫反応がどのように誘導されるかを検討した。胃炎を誘導するピロリ菌に特異的な免疫反応が、胃ではなく、小腸のパイエル板という組織で、樹状細胞という白血球に捉えられることで開始されることを明らかにした。また、消化管から体内に侵入して食中毒を起こすリステリア菌が、小腸のパイエル板から体内に侵入すること、その際にリステリア菌が持つインターナリンBと名付けられた侵入因子が重要であることを明らかにした。腸管における病原細菌の検知機構として、樹状細胞、上皮細胞、肥満細胞、そして抗原の補足を主たる目的とすると思われる器官としてパイエル板や孤立リンパ小節などの腸管関連リンパ組織(GALT)が挙げられる。Listeria monocytogenes(以下リステリア)感染において上皮細胞が破壊されることや上皮細胞が生産するサイトカインが炎症に重要である可能性は高いが、同時に樹状細胞やマクロファージを介した感染の検知も重要である。しかしその経路がGALTを介するのか、上皮の間隙から突起を伸ばす樹状細胞などが重要なのか、明らかではない。これまでで樹立した様々な遺伝子改変マウスと上記のトランスジェニックマウスと交配したマウスを利用してこれらの問題に迫る。どのような細胞が感染を検知し、初期には炎症性サイトカインによって増殖を抑えつつ、抗原特異的な反応の起動につなげ、さらに長期にわたる記憶の成立につなげるか、その分子機構を明らかにすることを目指す。これらの研究を推進することで、細菌と宿主の相互作用の本質を理解するための研究を展開する。リステリアの腸管感染を検知する細胞を特定するためのマウスの樹立を行った。リステリアは経口感染時にlnlA遺伝子産物と宿主腸管上皮のE-カドヘリンの結合を介して細胞内へ侵入するが、マウスのカドヘリンはヒトのそれとアミノ酸配列が異なるためにlnAが結合できず、菌は効率良く侵入できない。そこでヒトE-カドヘリンを腸管上皮細胞に発現するトランスジェニックマウスを用いて経口感染系を樹立した。さらにリステリアはInB遺伝子産物を介して宿主細胞のPI3K系を活性化する。リステリア感染における宿主PI3Kの機能を明らかにするためにヒトE-カドヘリントランスジェニックマウスとPI3Kのノックアウトマウスの交配を行い、目的のマウスを得た。また、ヒトE-カドヘリンと結合するInA遺伝子産物のアミノ酸部位が明らかになり、変異を導入することでマウスのE-カドヘリンにも結合が可能になることが明らかになった。そこで、マウスのE-カドヘリンに結合できるInAを持ったリステリア菌株の作成を開始した。この変異株を用いることでより多くのマウスもでるの利用が可能になると期待される。感染後のリステリア特異的記憶細胞の誘導を検討するために、卵白アルブミンを発現するリステリアの感染系を確立し、感度の高いアッセイ系を構築した。また、リステリアの脳内感染系を樹立し、脳内感染の制御にCD4T細胞が重要であること、また末梢のリステリア感染によって形成された記憶細胞が脳内感染においても感染防御能を発揮することを明らかにした。また、この時に炎症を誘導するIL-17が脳内のT細胞によって生産・分泌されることを明らかにした。Listeria monocytogenes(以下リステリア)の腸管感染の成立にはリステリア菌のinlA遺伝子産物と腸管上皮細胞のE-カドヘリンの結合が重要である。マウスのE-カドヘリンのアミノ酸配列はヒトのE-カドヘリンのアミノ酸配列と異なっており、それゆえにマウスにおいては腸管感染が成立しない。この問題を回避して腸管におけるリステリア感染動態と免疫記憶の成立機構を解析するために、これまでヒトのE-カドヘリントランスジェニックマウスを用いた系を構築してきた。しかし、構造生物学的解析からマウスのE・カドヘリンに結合が可能なInlAの作製が可能となったことを受けて、本年度はjnlA変異株の作製を行った。遺伝子配列上は目的の変異株を得ており、今後経口感染系を確立する予定である。これにより本研究で使用予定の様々な遺伝子改変マウスをE-カドヘリントランスジェニックマウスに交配することなく実験を進めることが可能になる。同時に、リステリア感染における宿主PI3Kの機能を明らかにするために、c-Metに結合することで宿主細胞のPI3K経路を舌性化するといわれているInlBを欠損するリステリアも上記の変異株から構築した。リステリアの脳内感染系の検討から、炎症時にはCD4陽性のTh17細胞よりもγδ型T細胞が主としてIL-17を発現することが明らかとなった。MHCテトラマーを用いた解析からは、脳内に多数のリステリア特異的なCD8陽性細胞が浸潤することが明らかになり、今後免疫記憶の成立の解析に有用な手法が確立できた。また、脳内においてリステリアの処理にかかわると推定されるミクログリアの初代培養系を用い、ミクロクリアがリステリアの殺菌能を有することを明らかにした。

Listeria monocytogenes(以下リズテリア)の腸管感染の成立にはリステリアのinlA遺伝子産物と腸管上皮細胞のE-カドヘリンの結合が重要とされ、マウスのE-カドヘリンのアミノ酸配列がヒトの配列と異なるためマウスにおいては腸管感染が成立しないと考えられてきた。しかし,実際には経口投与によって各臓器への菌の一過的な播種が観察され、その後に免疫系によって排除され,菌は腸管内にのみ存在するようになる。一昨年マウスのE-カドヘリンに結合可能なInlAの変異が報告されたため、同様なinlA変異株を作製した。しかし、この変異体はマウス腸管上皮細胞株への感染効率は野生型の2倍程度に上昇したが、その効率はヒトの細胞株には遠く及ばず、また経口感染を行っても顕著な差がなかった。更に、inlA欠損株を作製したが、感染効率に大きな差は見られなかった。一方、InlBを欠損するリステリアを構築したところ、野生型に比較して10倍から100倍低い感染効率を示した。これらの結果、マウス経口感染系においてはInlBが重要であることが明らかになった。さらに、感染経路を検討する中で宿主の胆嚢が経口感染後の初期のリステリア増殖に重要な臓器として浮かび上がり、現在胆嚢摘出マウスを作製し更に検討をしている。一方、リステリア脳症の新たなモデルを開発し、リステリアの排除にCD4陽性細胞に比較してCD8陽性細胞が重要であり、リステリアに感染したミクログリアをFas-FasL系を介して殺傷することを明らかにした。これまで脳炎においてCD4陽性のTh17細胞の重要性が示唆されてきたが、本モデルにおいてはTh17細胞よりもγδ型T細胞が主にIL-17を発現することが明らかとなった。MHCテトラマーを用いた解析から、脳内に多数のリステリア特異的CD8陽性細胞が浸潤することが明らかになり、今後免疫記憶の成立の解析に有用な手法が確立できた。Listeria monocytogenes(以下リステリア)の腸管感染の成立にはリステリア菌のinlA遺伝子産物と腸管上皮細胞のE-カドヘリンの結合が重要とされ、マウスのE-カドヘリンのアミノ酸配列がヒトのE-カドヘリンのアミノ酸配列と異なるがゆえにマウスにおいては腸管感染が成立しないと考えられてきた。2007年にマウスのE-カドヘリンに結合が可能なInlAの変異が報告されたことから、同様なinlA変異株を作製したが、マウスへの経口感染を行っても著しい変化は見られなかった。また、inlA房欠損株においても感染効率に大きな差は見られなかった。これらの事から、マウスにおいてはInlAは機能しないと結論した。一方、InlBを欠損するリステリアを構築したところ、野生型に比較して10倍から100倍低い感染効率を示したことから、マウスの経口感染系においてはInlBが重要な働きをすることが明らかになった。さらに、リステリア感染によってGr-1弱陽性の単球様細胞が脾臓内に新たに出現するが、InlBの欠損株が感染した場合にこの単球用細胞の数が増大する事を見いだしている。一方、リステリア脳症の新たなモデルを開発し、リステリアの排除にCD4陽性細胞ではなくCD8陽性細胞が重要であり、リステリアに感染したミクログリアをFas-FasL系を介して殺傷することを明らかにした。
中世フランスにおける紛争解決法の研究

本研究は、法人類学の成果を援用して(1)これまで別個に研究されてきた「古き良き法」と称される中世の法観念を巡る思想史的研究と、法制度、具体的には法定立過程と裁判過程に関する制度史的研究を統合するとともに、(2)従来注目されてこなかった(1)国王恩赦や(2)住民集会などの裁判外紛争処理の実態を解明することで、中世における紛争解決システムの構造的把握を目指すものである。本研究は平成11年度より開始されたものであり、平成11年と12年の二年間は当初の研究計画では研究動向の把握や史料データベースの作成を目的とする準備段階であったが、これまでに以下の諸点が明らかになってきている。(1)成文化された法規範は、王国レヴェルでもまた領邦・都市レヴェルでも現実の裁判過程及びその結果に決定的な影響力を及ぼしてはいない。法規範は選択肢の一つに過ぎない。(2)上級権力の下に置かれる裁判所は紛争解決機関としては未熟であるが、そのことは中世人の紛争解決能力の低さを意味するものではなく、地縁共同体や結社的団体の内済による調停・和解型紛争解決は高度に機能している。(3)これまで裁判権の質的強化と量的集積が支配権拡大の指標とされてきたが、中世フランス王権は罪を赦す恩赦行為にも裁判と同等の重要性を認めている。王の権力と権威は、一見すると相矛盾する「(厳格な)裁き」と「(寛大な)赦し」の相補的関係の中で確立されていく。本研究の目的は、前近代ヨーロッパとりわけ中世フランスにおける紛争解決の具体像、及び紛争解決システム全体に占める中世国家の位相を明らかにすることにある。二年の研究期間の一年目に当たる本年度の研究は、主として当該研究分野に関する研究動向の把握や関連資史料の網羅的収集にあてられた。しかし他方で、具体的な実証研究としては、国王裁判の実態を複数の年代記史料を用いて解明するための試論的考察「ルイ9世の裁判を巡る一考察」を纏めるにとどまった。以下その内容を要約する。この論文では、在地の裁判証書、国王の書簡や国王裁判所裁判記録を用いて、中世歴史叙述の著しいイデオロギー的性格を指摘した。ルイ9世治世期のフランスにおいて、王の紛争解決能力を誇示しようとする国王廷臣集団は、厳格であると同時に慈悲溢れる国王像を演出し、王の裁きの物語を創造していったのである。この点において本研究は今後、資料論にまで踏み込んだ慎重な検討が必要となるであろう。また彼らの理想の国王像から明らかになるのは、中世国家は法・裁判制度の集権化と並行して、罪に対する赦免、即ち「恩赦」行為を重視していたという事実である。この上級権力者が持っていた、あるいは持っているとされた、罪を「罰する」機能だけではなく「赦す」機能にも着目することで、中世フランスの紛争解決システムを、より構造的に把握することが出来るだろう。なかば制度化した王の恩赦こそ、国王裁判制度と王の裁きの実態との交点であり、権力把持の要であると思われる。次年度は本年の研究を更に押し進め、ヨーロッパ世界でカロリング帝国の解体以後一時中断していた恩赦が中世フランスでいち早く再開され、その後王が恩赦権を独占していく具体的過程を明らかにしたいと考えている。
スンクスにおける抗内臓脂肪蓄積のメカニズムの解析

スンクスに高脂肪食投与実験の結果より,餌・食のことはスンクスの肥満・腸間膜脂肪蓄積に対する明かな影響はない。むしろ抗肥満現象はスンクスの脂肪代謝に関わるかと推測される。スンクスの消化管におけるY4 receptorの分布範囲は広く,分布の密度も高いことを明らかにし,スンクスの抗肥満のメカニズムに関わるかと考えられる。全身の脂肪と比べて,スンクスの腸間膜組織では脂肪前駆細胞の分布と分化能がほとんど欠如していることがわかった。今後更なる推進する課題になる。本年度は、高脂肪食の投与によるスンクスの内臓脂肪蓄積など生理学的変化についての実験を行い、子猫の餌を選定し、摂食・体重など安定なデータを収集しており、来年度中にさらに例数を増やして、データの解析に進めたい。さらに、スンクスにおける肥満因子の分布局在の解析について、pancreatic polypeptide(PP)familyとそのreceptorsの消化管における免疫局在について調べた。その結果、それらの因子は集中的に直腸に分布しており、PPのreceptorであるY4の消化管における分布範囲は特に広く、他のreceptorsに比べ、分布の密度も高いことを明らかにした。これらの知見が、スンクスの抗肥満・抗内臓脂肪蓄積現象と関連がないか、来年度からの更なる解析が必要と考えられる。来年度から、新たに展開する実験として、スンクスにおける脂肪前駆細胞の局在と分化能の解析を予定している。本年度中に行った予備実験の結果では、ほかの部位の脂肪組織と比べて、スンクスの腸間膜組織では脂肪前駆細胞の分布と分化能がほとんど欠如しているようなデータがでており、スンクスの抗内臓脂肪蓄積のメカニズムの解析につながることが予想され、検討を続ける計画である。スンクスにおける肥満因子の分布局在の解析について、pancreatic polypeptide (PP) familyとそのreceptorsの消化管における免疫局在について調べた。その結果、それらの因子は集中的に直腸に分布しており、PPのreceptorであるY4の消化管における分布範囲は特に広く、他のreceptorsに比べ、分布の密度も高いことを明らかにし、その研究結果を国際誌に発表した。新たに展開する実験として、スンクスにおける脂肪前駆細胞の局在と分化能の解析を行った。皮下脂肪、精巣上体脂肪、後腹壁脂肪および褐色脂肪の脂肪組織と比べて、スンクスの腸間膜組織では脂肪前駆細胞の分布と分化能がほとんど欠如していることがわかった。これより、スンクスの抗内臓脂肪蓄積のメカニズムの解析につながることが予想され、検討を続ける計画である。本年度は、新たに展開する実験として、スンクスにおける脂肪前駆細胞の局在と分化能を解析するための予備実験を行った。対照的に、マウスでは腸間膜組織にCD34+CD29+Ly6A/E(Sca1)+CD24+細胞が一番多く存在していた。脂肪組織より単核細胞を分離して脂肪細胞への分化誘導培地で2週間培養しても、スンクス腸間膜組織由来の細胞はOil Red O染色陽性となる成熟脂肪細胞には全く分化しなかった。さらに、脂肪幹細胞の分化誘導実験を行い、pioglytazoneを餌から投与する予備実験を実施した。その結果、スンクスの腸間膜脂肪の分化誘導、生成ができなかった。腸間膜の前駆細胞の分布と分化能が欠如していることをさらに裏付けました。以上の結果から、スンクスは内臓脂肪、特に腸間膜脂肪の無い動物モデルとして肥満研究に有用と考えられ、脂肪幹細胞の発生、遊走、維持、分化のメカニズムを考える上でも重要であると考えられた。これらの結果をまとめ、第85回日本生化学学会大会(題名:スンクスには腸間膜脂肪細胞が存在しない)および第56回日本糖尿病学会(題名:成熟分化脂肪細胞を欠損するスンクス腸間膜には脂肪幹細胞も存在しない)にて、その成果を発表する予定である。これまでの2年間(平成22と23年度)の研究は、予定のとおり、研究計画の1、2、3および4の項目は既に完成しており、更にスンクスの脂肪幹細胞の分布と分化能を解析する追加研究を行い、異なる視点からスンクスの抗内臓脂肪蓄積のメカニズムの解析を得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、これまでには、おおむね研究計画の通りに展開しており、さらに、スンクスたおける肥満因子の分布局在の解析について、glucagons-like peptide 1(GLP-1), cholecystokinin (CCK), serotorinとそのreceptorsの消化管における免疫局在について調べ、加えて、スンクスの脂肪前駆細胞の分布特徴や分化能の解析より、スンクスの抗内臓脂肪蓄積のメカニズムの解析に、更なる展開を行いたい。
非修飾RNAをプローブとした遺伝子配列センシングと細胞間相違解析への展開

従来の修飾人工核酸を用いるアプローチとは一線を画し、「非修飾RNAを利用した新しい診断・検出系の構築」を目指し、下記2テーマに関する実験を実施した。(目的1:原核細胞適合型プローブ:非修飾RNA(MB-mRNA)を用いた細胞適合型遺伝子診断。検出系の構築)ゲノム・プラスミドから直接転写可能な天然型RNAをプローブとするモレキュラービーコン(MB)-RNA最適化に向け、大腸菌を用いたin vivoセレクションを実施してきた。一方、本システムはリボソーム結合サイトへのアクセシビリティーを利用しており原核システムにのみ適応可能であった。そこで、上記に加え、真核システムにも同コンセプトを拡張した新しいMB-RNAの構築と実証を行った。具体的には細胞内機能であるRNAiに着目したプローブ設計を実施した。(目的2:RNA特定配列結合型蛍光性小分子の設計ストラテジー)昨年度までに、第一世代であるHoechst形色素を用いた蛍光RNAアプタマーの創製、及び、結合解析に成功している。本年度は、得られた修飾Hoechst-RNAアプタマーペアを用いたmRNA検出系への応用展開を実施するとともに、細胞内応用に向けた種々の条件検討を実施した。また、蛍光強度だけでなく、Hoechst-RNA結合時における蛍光寿命変化にも着目した研究を展開した。本結果をもとに、より長波長域で駆動する蛍光色素をクロモフォアとする光る核酸材料創製に向けた研究にも着手した。[目的(1):MB-mRNAシステム]ゲノム・プラスミドから直接転写可能な核酸検出プローブであるMB-mRNAシステムの設計指針確立に向け、in vivo selectionを計画した。互いにcompatibileなColE1,p15A複製起点を有するplasmidsそれぞれに、標的RNA、loop-stem部にランダム配列を含むMB-mRNA libraryを組み込んだ2種のplasmids (pRNA, pMB-RNAlib)を用いた(pMB-RNAlibはMB-domain下流にレポーターとなるGFP遺伝子(AcGFP1)を有するよう設計)。大腸菌に2種のplasmidsを導入し、GFPを指標としたin vivo selection系を構築した。[目的(2):蛍光RNAタグ]有機合成化学、進化工学をもとに環境応答性蛍光色素を進化させ、特定RNAに結合したときにのみ蛍光強度を強める蛍光タグRNAの創製、系の最適化、応用を目指した実験を実施した。第1世代であるHoechst系青色蛍光RNA-tagに関する結合モードの解析に加え、更なる展開に向け、in vitro転写系における特定mRNA検出系への最適化、細胞内状況下での応用に向けた予備実験等を行った。また、フィードバックされた問題点をもとに、蛍光RNA-tagの改良/最適化に向けた研究を展開した。
アイソジオメトリック解析と機械学習による多導体ケーブルの特性解明と形状最適化

本研究では,まず「アイソジオメトリック解析に基づく電磁界シミュレーション」によって多導体ケーブルの電気的特性を効率的かつ高精度に算出する.そして,算出された特性と「機械学習」を組み合わせたクラスタリングと回帰モデル生成によって,ケーブルの形状が伝送/放射特性に及ぼす影響を検証・解明すると共に,最適なケーブル形状を導き出す設計技術を創出する.このようなシミュレーションと機械学習を組み合わせた検証・最適化システムを構築することで,複雑多様化する電磁環境下における多導体ケーブルの性質を理論的に明らかにし,電磁環境両立性を考慮した実用的な設計技術に貢献することを目指す.本研究では,まず「アイソジオメトリック解析に基づく電磁界シミュレーション」によって多導体ケーブルの電気的特性を効率的かつ高精度に算出する.そして,算出された特性と「機械学習」を組み合わせたクラスタリングと回帰モデル生成によって,ケーブルの形状が伝送/放射特性に及ぼす影響を検証・解明すると共に,最適なケーブル形状を導き出す設計技術を創出する.このようなシミュレーションと機械学習を組み合わせた検証・最適化システムを構築することで,複雑多様化する電磁環境下における多導体ケーブルの性質を理論的に明らかにし,電磁環境両立性を考慮した実用的な設計技術に貢献することを目指す.
超音波タグ蛍光検出法による生体内蛍光レポータ遺伝子,蛍光マーカの画像検出法の研究

蛍光を利用して,生物が生きた状態(in vivo)でその遺伝子発現や生理機能の発現を観察する技術は,生命科学におけるきわめて重要なツールとなっている。最近,各種レポータ遺伝子を組み込んだトランスジェニック生物を利用した遺伝子発現の分析法が広く普及してきている。これは光イメージング技術の有する非侵襲性,リアルタイム性といった特長を生かした技術である。しかしながら生体組織の多重光散乱により,生体組織内部を実用的分解能で画像計測することは非常に困難であった。われわれは,マウスなどの小型実験動物を対象として生体に侵襲を与えず,その内部における遺伝子発現や生理機能発現の動態計測を行うための新規技術の研究開発を目指して,超音波を援用した超音波タグ蛍光検出法の研究開発を行った。この手法は超音波の生体透過性と音響光学効果を利用し,集束超音波焦点での光学特性を空間選択的に計測するものである。平成17年度は,本原理に基づく散乱体内部の蛍光分布画像化の可能性について,コンピュータシミュレーションや液体光散乱媒質を用いた基礎検討により明らかにした。その結果に基づき平成18年度は生体模擬試料を用いた実験,および使用波長領域を生体に対する親和性の高い近赤外領域に変更し,実際の生体組織を用いた計測実験と計測装置のシステム化研究を行った。その結果,50mW CW近赤外光を励起光として,ブタ筋肉を生体試料に用い,深さ20mmの位置に設置した直径3mmの円柱型蛍光体を蛍光断層画像計測することに成功した。検出SN比の評価検討から,蛍光体波長,量子収率を選定することにより,深さ30mm程度まで約1mmの分解能で画像計測が可能であるとの見積りを得た。このことから,遺伝子発現に限らずヒト生体を対象にした蛍光ラベル法によるがんなどの異常細胞の検出や物質代謝計測など,幅広い応用が可能であるとの結論を得た。今後さらにこの研究成果を,臨床応用を目指した実用レベルに引き上げるため,専用の超音波・光照射プローブの開発など実用装置化研究を行い,広く医療応用を目的とした診断装置としての実用化研究として継続する予定である。ポストゲノムのための遺伝子機能の分析,解析技術が求められている。蛍光や生物発光を利用して生物が生きた状態(in vivo)でその遺伝子発現を観察する技術は,生命科学におけるきわめて重要なツールとなっている。最近,各種レポータ遺伝子を組み込んだトランスジェニック動物や植物が作出され,これを利用した遺伝子発現の分析法が広く普及してきている。これは光計測技術の有する非侵襲,リアルタイム,イメージング,といった特長を生かしたものである。しかしながら生体の光散乱特性により,その観察対象は組織切片や,細胞,あるいは開腹した臓器などの透明な試料や組織表面に限られ,計測方法も旧来の蛍光・発光画像計測技術の域を出てはいない。生体の,in vivo, in situ計測という点においてまだ多くの技術的課題を残しているといえる。われわれは,マウスなどの実験動物を対象に,生体に侵襲を与えず,生体内部における遺伝子発現の動態計測を行うための新規技術の研究開発を目指し,超音波を援用した超音波タグ蛍光検出法の研究開発を行っている。これは,超音波の生体透過性と超音波-光相互作用を利用し,生体内部の光学特性を光散乱による効果を排除して計測しようとするものである。本年度研究ではその原理に関する検証として,集束超音波での音場焦点における蛍光強度変調効果の分析と,この原理に基づく画像化の検討を行った。その結果,生体模擬試料を用いて散乱体内部における蛍光物質分布の検出に成功した。

今後は,実際の生体組織を用いた計測,さらにGFPなどの蛍光レポータ遺伝子導入マウスを用いてシステム化研究を行う予定である。この技術は,蛍光レポータ遺伝子だけでなく,各種の外因性蛍光マーカを用いた生体機能計測への応用が可能であり,新しい生体の生理・機能情報計測技術として,将来的には基礎研究としての分子生物学から遺伝子治療などの医療応用にわたる広範な研究分野に対し,強力な計測ツールとなりうると考えられる。蛍光を利用して,生物が生きた状態(in vivo)でその遺伝子発現や生理機能の発現を観察する技術は,生命科学におけるきわめて重要なツールとなっている。最近,各種レポータ遺伝子を組み込んだトランスジェニック生物を利用した遺伝子発現の分析法が広く普及してきている。これは光イメージング技術の有する非侵襲性,リアルタイム性といった特長を生かした技術である。しかしながら生体組織の多重光散乱により,生体組織内部を実用的分解能で画像計測することは非常に困難である。われわれは,マウスなどの小型実験動物を対象として生体に侵襲を与えず,その内部における遺伝子発現や生理機能発現の動態計測を行うための新規技術の研究開発を目指して,超音波を援用した超音波タグ蛍光検出法の研究開発を行ってきた。この手法は超音波の生体透過性と音響光学効果を利用し,集束超音波焦点での光学特性を空間選択的に計測するものである。平成17年度での検討により,本原理に基づく散乱体内部の蛍光分布画像化が可能であるとの結果が,生体模擬試料を用いた実験を通じて得られたことから,今年度は実際の生体組織を用いた計測と計測装置のシステム化研究を行った。その結果,50mW CW近赤外光により,生体試料(ブタ筋肉)を用いて,深さ20mmの位置に設置した直径3mmの円柱型蛍光体の蛍光断層画像計測に成功した。検出SN比の評価検討から,蛍光体波長,量子収率を選定することにより,深さ30mm程度まで約1mmの分解能で画像計測が可能であるとの見積りを得た。このことから,遺伝子発現に限らずヒト生体を対象にした蛍光ラベル法によるがんなどの異常細胞の検出や物質代謝計測など,幅広い応用が可能であることがわかった。この研究成果を,今後さらに臨床応用を目指した実用レベルに引き上げるため,専用の超音波・光照射プローブの開発など実用装置化研究を行い,医療応用を目指した研究として今後継続するつもりである。
疾患特異的iPS細胞由来網膜色素上皮細胞を用いたCINCA症候群の病態解明

CINCA症候群はNLRP3遺伝子の変異によるNLRP3インフラマソームが活性化し、過剰なIL-1βやIL-18が産生されることが病態であり、これらの炎症性サイトカインによる眼内炎症が原因となり網膜色素上皮細胞(RPE)の萎縮などの不可逆的な視機能低下を来す。本研究ではモザイク変異を有するCINCA症候群患者由来のiPS-RPE細胞を用いてNLRP3インフラマソームによるRPE障害の機序と治療薬の検討を行う。平成30年度は遺伝子変異を有するiPS-RPE細胞と変異を有さないiPS-RPE細胞が様々な化合物の暴露に反応してIL-1β及びIL-18を分泌する程度にどれ程の差が生じるか検討する予定であった。しかし、iPS細胞からiPS-RPEに分化誘導を行うのに6ヶ月以上を要するため実験の遂行に時間を要している。また過去にARPE-19細胞を用いた研究で報告されている刺激化合物の濃度を用いてもiPS-RPE細胞ではIL-1β及びIL-18の過剰分泌が確認できなかった。さらにiPS-RPEへの分化誘導後の時間経過とともに細胞の刺激に対する反応が大きく変化していくことが分かったため、最適な刺激物質、刺激時期と刺激濃度などの条件の設定を行っている。細胞の供給不足については、実験遂行に必要なiPS-RPEを質・量ともに安定的に供給するための体制が整いつつある。これらのことは次年度以降につながる成果であったといえる。疾患特異的iPS由来RPEは分化に非常に時間を要している。そのため最適な刺激物質、刺激時期と刺激濃度などの条件の設定にも時間を要している。実験遂行に必要なiPS-RPEを質・量ともに安定的に供給するための体制が整いつつある。(理由)当初予定していたよりも消耗品が必要でなかった。(使用計画)次年度以降に最適な刺激物質、刺激時期と刺激濃度などの条件の設定実験や細胞機能評価を行う予定であり、これらに科研費を使用する予定である。
海洋における粒子態有機物の大規模な溶存化現象の微生物・地球化学的な支配機構

本研究では海洋における有機物の変質分解にかかわる微生物・地球化学的な過程を、野外調査、実験、モデルの3つのアプローチを複合的に組み合わせて、新たな観点から解明することを試みた。野外調査では、学術調査船白鳳丸KH-05-2次航海(平成17年8月1日9月16日)に参加し、西経160度に沿って、南緯10度から北緯55度までの縦断観測を行い、中部北太平洋の表層から深層における微生物諸パラメータの大規模南北断面を明らかにすることに成功した。また、中深層におけるロイシン取り込み速度の鉛直的・水平的な分布パターンの解析を進め、中層の細菌生産が高緯度海域と赤道海域に顕著な極大を示すことを明かにした。これにより、海洋の中層においては、沈降粒子→溶存有機物→浮遊性細菌という経を経て有機物の分解・無機化が進行するという本研究の仮説が、炭素フラックスの観点からみて矛盾なく説明できることが示されたのは大きな成果である。しかし、水深1、000m超の大深度においてみられた、複雑な南北分布パターンに関しては、細菌が消費する炭素のフラックスが、通常のモデルから推定される沈降粒子束を上回ることから、堆積物の巻き上げや移流による有機物の供給が、深層における有機物分布パターンに影響を及ぼしていた可能性が示唆された。実験的な研究としては、大槌湾におけるメソコスム実験を実施し、微生物と有機物の相互作用系の機構論的な解明を進めた。その結果、有機物分解の鍵となる微生物系統群の解明が大きく進展した。また、理論面では、微生物群集の相互作用(多様性)と物質循環を関連づける新たな数理モデルを構築し、それを用いた海洋物質循環機構の検討が進められた。以上の成果を総説や原著論文としてまとめるとともに国際学会などで発表した。また、一般むけのわかりやすい論文も出版した。本研究では太平洋における広域観測と沿岸メソコスムを用いた野外実験から、海洋における粒子状有機物の大規模な溶存化現象の支配機構を明らかにすることを目的としている。今年度得られた成果は以下のとおりである。1)5月に大槌湾で野外実験を実施し、珪藻ブルームの生成・消長にともなう細菌群集の変動の解析を行った。同時に昨年度と一昨年度に実施されたメソコスム実験で得られた試料の解析を進めることで、新たな知見を集積した。その結果、珪藻ブルームの崩壊期に粒子表面に多量の糸状菌・連鎖菌が現れる現象が見いだされた。蛍光現場交雑法による解析の結果その大部分がサイトファガ・フラボバクテリウムクラスターに属する細菌であることが示された。付着性細菌と浮遊性細菌では群集組成が明らかに異なったことから、粒子表面には固有の細菌群集が発達し、粒子状有機物の溶存化を駆動していることが示唆された。2)8月8日から9月21日にかけて実施された学術研究船白鳳丸KH05-2次航海に乗船し、中部太平洋南緯10度から北緯57度にかけての広域南北断面観測を行った。表層から深層にかけて層別採水された試料についてロイシン取り込み速度を測定し、細菌生産活性の地理変異を調べた。その結果、中層においては亜寒帯域で高く亜熱帯域で低いという明瞭な緯度傾向が見られたが、深層においては中緯度海域で最大になるという変則的なパターンが見いだされた。この結果は、中層においては、沈降粒子の溶存化により生成された溶存有機物に依存した細菌生産が卓越しているが、深層では、それ以外の炭素源が細菌生産に影響を及ぼしている可能性を示唆している。以上の結果をAGU海洋科学会議その他の学会で公表した。