hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
可変波長密接型軟X線顕微鏡システムの開発

この研究は、1100Åの波長領域の軟X線による、実用的な直接照射型軟X線顕微鏡を開発して、(1)細胞などの試料を脱水や着色することなく、生きたまま、高分解能で、サブマイクロ秒以下の露光による観測を可能としてブラウン運動などからもたらされるブレを避けること。(2)元素分析の機能を持たせること。すなわち同一試料に対して波長を変えた多こま撮影を可能とすることにより、試料中の特定の元素による顕微鏡像を得ること。(3)目的に合わせた画像処理法を開発して、得られた顕微鏡像の処理を行なうことにより、より有意義たらしめること。などを目的とする。本年度は(1)昨年度の成果をふまえて18μF,50kv(エネルギー22.5kJ)の大電流放電装置を電源とするパフ型Z放電軟X線源を常時使用可能とした。(2)単色または準単色の軟X線を、その放出強度を定量的にモニターしながら試料の照射実験を行った。(3)得られた顕微鏡像を走査型電子顕微鏡および原子間力顕微鏡で観察し画質の検討を行った。その結果、厳密にはまだ予備実験に止まるが、感光材としてフォトレジスト(PMMA,OEBR-1000)を用いた場合、感光材の位置で一回の放電あたり10^3mJ/cm^2以上、の半値幅約20nsの軟X線パルスにより、可視光波長程度の空間分解能で顕微鏡像の記録が可能とされた。現在、空間分解能を上げるための軟X線源と感光材の配列法および画像処理方法の検討が進行中である。この研究は、100Å以下の軟X線による実用的な密接型軟X線顕微鏡を開発して、(1)細胞などの試料を脱水や着色することなく、生きたまま高分解能で、サブマイクロ秒以下の露光による観測を可能としてブラウン運動などからもたらされる画像のブレを避けること。すなわち同一試料に対して波長を変えた撮影を可能とすることにより、試料中の特定の元素による顕微鏡像を得ること。(3)目的に合わせた画像処理法を開発して、得られた顕微鏡像の処理を行なうことにより、より有意義たらしめることを目的とした。本年度は昨年度までの成果をふまえて、(1)ガスパフ付きプラズマフォーカス装置を開発する事によりN,C,O,Ne,Ar,Alなどの水素様、ヘリウム様、リチウム様などの高次電離イオンからなる密度10^<20>10^<21>/cm^3温度keV程度の安定なプラズマ生成法を確立した。(2)そこから放射されるパルス軟X線の波長、強度の空間分布およびその時間変化についての定量的測定法を開発した。(3)この測定法を用いてピンチプラズマから放射される軟X線の特徴、再現性を検討した。(4)試作した軟X線顕微鏡の空間分解能などの性能試験を行った。(5)得られた軟X線顕微鏡像を原子間力顕微鏡により可視化し、必要な画像処理を行った。例として、酵母菌およびとんぼのはねに生えている極めて微細な髭を観察対象とした。レジストとしてPMMAを用いた場合、一回の放電により内部構造を含む軟X線顕微鏡が得られた。この際の空間分解能は0.2μmであった。
刷り込みドメインの染色体構造に影響する、転写因子による調節中枢の役割

ヒト染色体15q11-q13に相補的なマウスのインプリンティングドメインの調節領域の機序解明をおこなってきた。当初の予定では、この調節中枢は何らかの転写因子やインスレーターの結合によりドメイン全体を調節するものと思われ、この転写因子の単離、その結合領域の欠失を作製し、機能解析を試みようとした。しかし、この調節領域を解析していくと、そのような単純な機序で作用するのではないことが明らかになり、より詳細な解析をおこなった。具体的には、この調節領域のヒト、マウスの塩基配列の相同性から、3種類以上の5箇所の転写因子結合領域を見つけた。そのうちのひとつはCTCF結合領域と同様の塩基配列をもち、In vitroのゲルシフトアッセイでも陽性バンドが認められた。したがって、ヒト染色体11番に位置するH19遺伝子上流付近に存在するインプリンティング調節領域のCTCFのインスレーター作用と同様な機序が示唆された。その後、このCTCF結合領域をレーポーターアッセイで、インスレーター活性を解析したところ、インスレートする機能は認められなかった。また、この結合領域は、調節領域のすぐ下流に位置するSnurf-Snrpn遺伝子の転写をエンハンスすることが認められた。他の2つの転写因子もレポーターアッセイで、遺伝子発現にエンハンスに働くことがわかった。これらの転写因子がインプリンティングドメインの調節因子としていると思われる。これらのことはglobin領域のLCR(locus control region)の機能と相似している。また、今後さらにマウスtransgeneによる解析を行うためのコンストラクトを作製し、解析を行っている。また、さまざまなインプリンティング遺伝子の解析もおこなった。ヒト染色体15q11-q13領域の刷り込みドメインにおける、父親由来エピジェネティックパターンを維持する中枢・PWS-IC領域を含むゲノムDNAと、レポーター遺伝子である、ルシフェラーゼ遺伝子の組み換えDNAを作製した。過去に明らかにしたように、NRF-1転写因子による、ルシフェラーゼ活性の明らかな調節は認められ、再現性を確認したが、その領域に含まれるインスレーター活性は、SV40エンハンサーに対しては認めなかった。このCTCF結合塩基配列領域は、インスレーター活性を持っていない可能性があるが、さらに詳細な解析が必要であり、現在進行中である。PWS-IC領域から、生殖細胞と脳特異的に発現する、Snrpnの多様なマウスisoform転写産物を同定した。PWS-ICに何らかの転写因子の結合により、ループ構造をとり離れた遺伝子も、調節領域の影響を受けると仮定し、Snrpn遺伝子や、このドメイン内の刷り込み遺伝子と、PWS-IC領域とのDNAコンストラクトを作製を計画したが、Snrpnの多様なisoform転写産物が、反対のエピジェネティックパターンを示すUbe3a遺伝子まで伸びている可能性があるため、このisoformの意義を明らかにするため全長cDNAの単離を試みている。このisoformは、ヒトの母親由来エピジェネティックパターンのプライマリーなマークを確立する調節中枢のマウス領域に相当する領域から発現しており、これがエピジェネティックスの生殖細胞での確立に関与している可能性がある。したがって、ヒト染色体11番に位置するH19

遺伝子上流付近に存在するインプリンティング調節領域のCTCFのインスレーター作用と同様な機序が示唆された。その後、このCTCF結合領域をレーポーターアッセイで、インスレーター活性を解析したところ、インスレートする機能は認められなかった。また、この結合領域は、調節領域のすぐ下流に位置するSnurf-Snrpn遺伝子の転写をエンハンスすることが認められた。他の2つの転写因子もレポーターアッセイで、遺伝子発現にエンハンスに働くことがわかった。これらの転写因子がインプリンティングドメインの調節因子としていると思われる。これらのことはglobin領域のLCR(locus control region)の機能と相似している。また、今後さらにマウスtransgeneによる解析を行うためのコンストラクトを作製し、解析を行った。
新規炎症性腸疾患モデルマウスの樹立と解析

新しい炎症性腸疾患のモデルマウスを樹立するために、ヒトHLA-B52遺伝子を単離し、遺伝子構造、塩基配列を解析した。また、DNAマイクロインジェクション用の導入ベクターを作成した。さらに、日本人炎症性腸疾患とATG16L1遺伝子、MYO9B遺伝子、IRGM遺伝子について相関解析を施行し、欧米人とは異なりこれらの遺伝子は日本人の炎症性腸疾患の発症に関わらないことを明らかにした。新規炎症性腸疾患モテルマウスとして、ヒトHLA-B52遺伝子トランスジェニックマウスを樹立するために、まずヒトHLA-B52遺伝子の単離を開始した。当初ヒトHLA-B52遺伝子をホモにもつリンパ芽球培養細胞から、プロモーター領域を含むHLA-B52遺伝子フラグメントを得る予定であったが、ヒトHLA-B*52011cDNAプラスミドクローンが手に入ったため、これを用いることとした。プラスミドクローンに対し両端にリンカーを付けたPCRプライマーを設計し、cDNA配列を増幅後、pUC系プラスミドクローンに組み込んだ。さらにウサギのβグロビン遺伝子ポリAシグナルと、非古典的なHLAクラスI分子であるT3b遺伝子のプロモーター領域SphI-HindIII2.8-kbを各々有するプラスミドにサブクローンし精製した。インサート配列を310Genetic Analyzerを用い確認したところ、ライゲーション部において設計した配列と一部異なっており、塩基配列の脱落が推定された。そこでリンカー付きプライマーを再度設計し直して、PCR増幅後pUC系プラスミドクローンに組み込み、また、各サブクローン段階で塩基配列を確認した。最終的に同様の手順を踏み、DNAコンストラクトを作出し、制限酵素で切断・直線化し精製を行った。現在日本クレアよりC57BL/6JマウスとMCH-ICRマウスおよびBDF1マウスを購入し、DNAのマイクロインジェクションを計画している。新規炎症性腸疾患モデルマウスとして、ヒトHLA-B52遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを樹立するために、作成した導入ベクターのマイクロインジェクションを施行した。すなわち、過排卵を誘導したマウスから受精卵を取り出し、マイクロマニピュレーターシステムを用いて、マウス受精卵雄性前核に、顕微鏡下にDNA溶液を注入した。しかし、目的とする胎仔は得られず、培養、注入、移植条件を検討・変更し試みたものの結果は同様であった。高度な専門性を要する手技のため、この点に関し外注委託への切り替えを行い、目標を達成させたい。同時に並行し進めていた日本人炎症性腸疾患の感受性遺伝子解析では、日本人クローン病患者284例、潰瘍性大腸炎患者186例、健常人ボランティア282例の末梢血単核球からDNAを抽出し、欧米人を対象とした検討で強い相関を認めたATG16L1遺伝子とMY09B遺伝子について、PCR-RFLP法を用いてタイピングを施行した。その結果、ATG16L1遺伝子rs2241880 A/G SNPについては、Aアリルの頻度が、健常人ボランティア75.4%に対し、クローン病症例75.3%(p=0.967)、潰瘍性大腸炎症例78.6%(p=0.264)であった。また、MY09B遺伝子rs2305764 A/G SNPについては、Aアリルの頻度が、健常人ボランティア71.9%に対し、クローン病症例74.4%(p=0.353)、潰瘍性大腸炎症例73.4%(p=0.635)であった。すなわち、少数検体での検討ではあるが、日本人と欧米人の炎症性腸疾患感受性遺伝子は異なることを確認し報告した。
貧困・低所得者層に対する就労支援と社会的自立に関する実証的研究

本研究は、生活保護・ホームレス・母子世帯などを対象にし、貧困・低所得者層の就労支援と社会的自立に関する実証的研究である。近年の生活保護制度改革に基づく自立支援プログラムの検証を行うとともに、ホームレスあるいは母子世帯の就労支援に関する調査研究を実施した。定期的な研究会活動を行うとともに、施設や民間支援組織へのヒアリング調査なども実施した。生活保護制度における自立支援プログラムに関する研究では、生活保護見直しをめぐる政策動向をふまえつつ、平成17年度から実施された自立支援プログラムの効果や課題について検証した。ホームレス対策と自立支援に関する研究では、山田を中心としながら、名古屋市におけるホームレス自立支援センターを対象にし、退所者データや支援記録を元にした実証的な調査研究を行った。母子家庭における就労と自立に関する研究では、丹波を中心としながら、母子家庭の就労支援後の就労と生活の実態を把握することにより、自立支援の課題を検証した。具体的には、福島県母子家庭等就業・自立支援センターを平成15-17年度に利用した登録者全数を対象にし、アンケート調査によって利用後の追跡調査を実施した。その結果、207名(回収率31.6%)から回答を得た。こうした調査研究を通じ、近年の貧困・低所得者層に対する就労支援の効果を実証的に検証するとともに、自立支援の課題を明らかにすることができた。すなわち、就労支援に偏重した「自立支援」では、利用者の自立阻害要因を取り除くことができず、貧困脱却の効果は限定的であった。そのため、真に貧困・低所得者層の自立を支援するためには、就労だけに偏らない生活・健康・住居・社会参加などを含む総合的・包括的な支援内容の充実が必要であることが明らかとなった。本研究では、貧困・低所得者層に対する就労支援と社会的自立に関する実証的研究である。本研究の対象は、生活保護世帯・母子世帯・ホームレスなどの貧困・低所得者層である。具体的には、わが国でも始まりつつある貧困・低所得者層に対する就労支援策の実施状況を確認し、その適用可能性と課題を検証する。本年度の研究として、(1)ワークフェア政策の先行研究のレビューと各国の就労支援プログラムの検証、(2)わが国における就労支援プログラムを含む自立支援プログラムの実施状況の確認を行った。(1)では、先行研究のレビューをはじめとした定期的な研究会を開催した。また、各国の就労支援プログラムの検証として、アメリカ・イギリス・オランダ・韓国などの諸国における実際の就労支援策の状況を確認した。(2)では、横浜市寿町における「法外援護」とホームレス支援の現状、大阪市釜ヶ崎において、ホームレスへの自立支援策の一つであるサポーティブハウス、さらに母子世帯への自立支援として、大阪府母子就業・自立支援センターを運営する大阪府母子寡婦福祉連合会や「しんぐるまざーず・ふぉーらむ関西」などの支援機関等へのヒアリング調査を実施した。特に、わが国における自立支援プログラムでは、就労自立のみならず日常生活自立や社会生活自立と幅広く自立をとらえるとされているが、安定的な生活と雇用を支えるための就労以外の自立に向けた支援の必要性が、各ヒアリング調査から確認することができた。平成18年度は、(1)自立支援実施機関等へのヒアリング、(2)個別分野における調査研究、(3)定期的な研究会の開催と研究成果の公表、などを行った。(1)自立支援実施機関等へのヒアリング調査自立支援プログラムの実施機関等へのヒアリングを行い、自立支援のあり方とその支援体制について検討した。具体的には、生活保護の自立支援プログラムについては福島県所管局・横浜市、母子家庭等への就労支援については、大阪府と福島県の母子家庭等就業・自立支援センター、ホームレスについては名古屋市などの自立支援センターに、それぞれヒアリング調査を行った。(2)個別分野における調査研究生活保護・母子家庭・ホームレス等の個別分野について、調査研究を行った。

平成18年度は、母子家庭については、福島県母子家庭等就業・自立支援センターを利用し就労支援を受けた利用者(平成1517年度)の全数を追跡調査し、207名(回収率31.6%)から回答を得た。また、ホームレスについても、名古屋市の自立支援センターを対象にし、その利用者の調査を行った。個別分野における利用者調査では、就労支援における阻害要因や支援体制のあり方など、社会的自立に向けたプログラム策定に向けた課題を析出することができた。(3)定期的な研究会の開催と研究成果の積極的な公表本年度は7月、8月、10月、1月の計4回の研究会を開催した。研究代表者および研究分担者による研究報告に加え、関連する研究分野における研究者からの専門的知見の提供も受けた。また、社会政策学会等に各種学会において研究成果の発表にも努めた。本研究では、生活保護・ホームレス・母子世帯などを対象にし、貧困・低所得者層への自立支援策に関する実証的研究を行ってきた。3年間の研究期間の最終年度として、本年度はとりわけ、昨年度の調査研究をふまえ、研究の総括と成果発表に心がけた。丹波は、福島県における母子家庭等就業・自立支援センターの利用者に関する追跡調査を行い、就労支援を受けた後の母子家庭の労働と生活の実態について調査を行い、その調査結果を公表した。山田は、名古屋市におけるホームレス自立支援センターの退所者に関する調査ないしはセンター利用中の支援記録の分析を通じて、自立に向けた阻害要因の分析等を行い、その成果を公表した。その結果、母子家庭あるいはホームレスに関する就労支援を中心とした「自立支援策」では、対象者の自立阻害要因を取り除くことはできず、就労に偏らない生活・健康・住居・社会参加等を含む総合的・包括的な支援内容の充実が必要であることが確認された。たとえば母子家庭の揚合、就労支援を受けた後の追跡調査の結果を見ると、求職活動中であった多くの利用者が就労につくことができ、就労支援策の一定の効果を確認することができた。しかし、その内容を具体的に見ると、6割の者が派遣や契約・パートなどの非正規雇用で働き、その月収は15万円未満を下回り「低所得構造」から抜け出せていないことがわかった。さらに約4割の者が就労支援後に転職を経験しており、不安定な労働生活にあった。また、本人が病気であったり、子どもが幼少であったり障がいがあるなどして、無理をしながら働いている実態が確認された。就労支援中心の自立支援策は、その効果が限定的であり、貧困・低所得からの脱却という点においては目的を果たし得ていない。その点で、今後包括的・総合的な自立支援策の開発が求められている。
証明スコアによる問題モデルの検証技術

「帰納法」と「場合分け」は、問題モデル(問題領域や応用領域におけるモデル)の証明スコアによる検証法の基本技術である。本研究では、多様な応用分野で有効な帰納法と場合分けについて以下の成果を得た。(1)帰納法をデータ型・プロセス型の帰納的な構造に基づき定式化した。(2)場合分けを構成子からの項の生成に基づき定式化した。(3)(1),(2)に基づき、汎用的な証明規則を定式化するとともに、推論と探索を融合した強力な検証法を開発した。ドメイン仕様や要求仕様などの問題モデルの検証技術の実用化を目指し、証明スコア法に基づく対話型検証法の最重要の技術課題である帰納法と場合分けに関し以下の研究開発を行う。(1)多様な問題領域で有効な帰納法の開発:証明スコア法による検証法の基本的な推論スキーマは、再帰的に定義されたデータ型やプロセス型に関する数学的帰納法である。すでに多くの応用領域において帰納法による検証事例を蓄積しているが、それらにおける帰納法は個々の問題ごとに個別的になる傾向がある。これを改善し、実用的な検証技術を開発するために、蓄積した事例における帰納法の適用法を分析・体系化することで、より汎用的な帰納法を開発する。(2)多様な問題領域で有効な場合分けの方法の開発:証明スコア法による検証の要点は、問題モデルの定義(形式仕様)に基づきすべての可能な場合を洗い出し、それらをもれ無く記述し、その各々について論理的なチェックを行うコードを確実に実行することで、検証を完成することである。このような場合分けに基づく証明スコア法が、多くの問題モデルに対して有効であることを事例研究で確認しているが、場合分けは個々の問題ごとに個別的で煩瑣になることが多い。これを改善し実用的な検証技術を開発するために、多様な問題領域で有効な汎用的な場合分けの方法を開発する。証明スコア法における,(A)帰納法の適用法、(B)場合分けの方法、の二つの課題について、(1)データ型とプロセス型、(2)推論型検証と探索型検証、の2つの観点から、いままでに蓄積した事例を解析することを中心に研究を進め,提案している研究計画の妥当性を確認した.具体的には,以下を行った.[A]事例の解析:(a)事例における「帰納法の適用法」を「データ型とプロセス型」ならびに「推論型検証と探索型検証」の観点から分析した.(b)事例における「場合分けの方法」を「データ型とプロセス型」ならびに「推論型検証と探索型検証」の観点から分析した.[B]帰納法の適用法の定式化:[A]の事例の解析結果に基づき汎用的な帰納法の適用法を定式化した.[C]場合分けの方法の定式化:[A]の事例の解析結果に基づき汎用的な場合分けの方法を定式化した.[D]検証方法論の体系化:[B]と[C]の定式化にも基づき証明スコア法による検証方法論を体系化し,その正しさ(健全性)を証明した.事例研究にもとづき,汎用的な帰納的と場合分けの手法を開発し,それに基づき「証明スコア作成支援ツール」を設計した。具体的には以下を行った。[A]仕様記述と検証の事例の解析を継続,深化し,証明スコアの標準的な記述法を開発した。[B]帰納法と場合分けの方法をより汎用し,それに対応する証明スコアの記述法を開発した。[C]検索(search)に基づく検証法と帰納法に基づく検証法を融合した検証例題を開発し,証明スコアとして定式化した。[D][A],[B],[C]の成果に基づき,証明スコアの作成においてシステムが支援できる事項を洗い出し,証明スコア作成支援ツールの設計を開始した。ッールの設計は,不完全な自動化を狙うのではなく,(1)人間の助けが必要な部分では「いかに人間に的確な判断をさせるか」に焦点を当て,(2)人間と機械が各々の優れた能力を発揮し協力して検証を遂行する,という方針に従い,会話型の使用形態を重視したものとした。以上の設計に際しては,今までに開発した事例が設計したツールで困難無く扱えるかについて思考実験を行いツールの有効性を検討した。また,設計したツールを使うことで,問題のモデル化法や仕様スタイルにどのような変化が起こるかについても検討した。さらに,検索に基づく検証法と帰納法に基づく検証法の連携に付いては,検索を用いて証明した事実を帰納法による検証に利用する方法と,帰納法による検証の結果を利用して検索による検証をより高速化する方法などについても検討した。H18年度とH19年度に開発した種々の形式仕様と証明スコアの分析に基づき、帰納法と場合分けの方法を整理しつつ、(帰納法に基づく)推論と探索を融合した検証法を体系化し、「証明スコア作成ツール」を設計し一部開発した。

ツールの設計と開発は、「人間と機械が各々の優れた能力を発揮しつつ協力して行う検証を支援する」という方針に従い、探索を支援する機能に焦点を絞って行った。すなわち、帰納法に基づく推論を用いる証明スコアの作成は人間が行い、探索を用いる検証をツール(システム、機械)が支援する、という方針を採用した。具体的には、これまでの研究で得られた、(1)帰納法と場合分けの適用法、(2)推論と探索を融合した検証法、に関する以下のような知見に基づきツールの設計と開発を行った。[A]帰納法を用いた推論に基づく検証は、帰納スキーマの選択、帰納命題(帰納法で証明すべき命題)や補題の特定、などの検証すべき問題に関する深い理解を必要とするので、人間が証明スコアを作成しつつ対話的に行うのが適当である。[B]探索は、すべての可能な場合を網羅的に検査することにより、場合分けを自動化する。探索による網羅的な場合分けはツール化しシステムに支援させるのが適当である。[C]抽象化(abstraction)などにより、命題の検証を網羅的な場合分けの探索に帰着させるためには、一般的には帰納法による推論が必要である。この部分は人間が証明スコアを作成しつつ対話的に行うのが適当である。H21年度は、H20年度までに開発した形式仕様・証明スコアとそれらの解析結果に基づき、問題モデルの検証技術に関し、以下の2つの成果を得た。1.証明スコア法の完全性に関する理論的成果:CafeOBJ言語による証明スコア法の基本操作は、(1)帰納法、と(2)場合分け、の適用である。これらの操作(1),(2)が健全(sound)、つまり論理的に正しいものである、ことは検証法であるための必要条件である。一方、操作(1),(2)が検証操作としで完全(complete)、つまり検証可能な命題は操作(1),(2)により検証できる、ことは検証法が持つことが望ましい性質ではあるが、この性質を有する検証法は稀である。我々は、証明スコア法が完全であることを理論的に示した。この結果は、CafeOBJ仕様に基づく証明スコア法が、つ極めて強力な検証法であることを示すものである。2.証明メコア法と探索法を組み合わせた検証法に関する方法論的な成果証明スコア法は対話的検証法であり、その一部を自動化して検証の自動化率を向上することは本基盤研究の最大の目標の一つであった。(1)無限状態を有限状態に帰着させる抽象化の正しさを証明スコア法で検証し,(2)有限状態については全ての場合を探索ツールで網羅的調べる、ことで無限状態に対する検証を行う方法を発見し、定式化した。以上の1と2の成果のうち、1の理論的な成果は当初は予想しなかったものであるが、かなり一般的な形で証明スコア法の完全性を保証する理論的な成果を得ることが出来た。2は年度当初に計画したとおりの成果であり、4年間の本基盤研究の成果の中でも最も重要なものの一つである。これら2つの成果は、それらに基づきさらに強力な問題モデル検証技術を構築できる可能性があり、今後の発展が期待できる。
骨吸収抑制剤の休薬は顎骨壊死発症の予防に有効か？マウスによる検討

骨吸収抑制剤であるビスフォスフォネート製剤やヒト型抗RANKLモノクローナル中和抗体製剤の服用者に発症する顎骨壊死(Medication related osteonecrosis of the jaw; MRONJ)は、これらの骨吸収抑制剤の副作用として起こることが知られている。臨床的に、これらの骨吸収抑制剤の休薬がMORONJの発症を抑えるとの報告もあるが、休薬の有効性については様々な議論が存在している。骨吸収抑制剤の休薬が顎骨壊死の発症リスクを低減するか、マウスを用いて検討を行った。マウスに対して抗マウスRANKLモノクローナル抗体を投与し、投与2ヶ月後および6ヶ月後に抜歯を行いMORONJが発症しているか検討したところ、投与2ヶ月後および6ヶ月後に抜歯を行った両方の実験群において抜歯窩の上皮は閉鎖していたが、病理切片において歯槽骨中の骨細胞の消失という典型的なMRONJの所見を発症していることが観察された。骨細胞の消失範囲について測定したところ、休薬期間が長いほどその範囲が小さいことから、骨吸収抑制剤の休薬は、MRONJの発症を完全に抑制することは出来ないが、症状を緩和する効果があることが判明した。抗マウスRANKLモノクローナル抗体投与後のマウスの変化について検証したところ、抗マウスRANKLモノクローナル抗体を投与したマウスでは、胸腺が萎縮していることが観察された。この胸腺の萎縮は、休薬6ヶ月後のマウスにおいても胸腺の大きさは萎縮したままであった。胸腺は免疫担当細胞の分化と成熟に関与していることから、MRONJの発症における免疫担当細胞との関連性について、現在検証中である。当初の研究計画に沿って順調に研究が進んでいる。国内外の有識者との研究内容の討論を活発に行っている。今年度の実験を継続することでさらなる成果を上げられる可能性があると考えている。胸腺は免疫担当細胞の分化と成熟に関与していることから、MRONJの発症における免疫担当細胞との関連性について、詳細な検討を行う予定である。また、国内外の有識者からの意見を参考に研究を進めたいと考えている。骨吸収抑制剤であるビスフォスフォネート(BP)やデノスマブに関連した顎骨壊死(Medication related osteonecrosis of the jaw; MRONJ)は、蓄積された多くの症例による疫学的ならびに病理学的な解析により、予防策あるいは対応策が少しずつ明らかになりつつあるが、未だに統一見解のある治療法は確立していない。特に、すでに骨吸収抑制剤服用中の患者に対する、骨吸収抑制剤の休薬の有効性については様々な議論が存在している。そこで本研究では、骨吸収抑制剤の休薬が顎骨壊死の発症リスクを低減するか、顎骨壊死発症モデルマウスを用いて、検討を行った。実験には抗マウスRANKLモノクローナル抗体(デノスマブはヒト型抗RANKLモノクローナル抗体製剤で、マウスのRANKLとは結合しないので、抗マウスRANKLモノクローナル抗体を使用)を腹腔内に投与した。抗RANKL抗体投与直後、2ヶ月後、6ヶ月後のマウスに対して、それぞれ上顎第1臼歯の抜歯を行い、抜歯4週後に安楽死させ、抜歯部位に発症する顎骨壊死の状態について検討を行った。抗体投与直後に抜歯を行った群では、抜歯窩閉鎖不全を伴う歯槽骨の露出と、病理切片において抜歯窩周囲の歯槽骨における骨細胞の消失といった典型的な顎骨壊死の所見が観察された。一方、抗体投与2ヶ月後および6ヶ月後に抜歯を行った群では、全てのマウスにおいて抜歯窩の上皮は完全に閉鎖し歯槽骨の露出は確認されなかったが、病理切片において歯槽骨の一部に骨細胞が消失していることが観察された。以上の結果から、抗マウスRANKLモノクローナル抗体の休薬後もMRONJの症状が発症する可能性があることが示唆された。国内外の有識者との研究内容の討論も行っている。また、抗RANKL抗体投与後の休薬期間を継続している。

抗マウスRANKLモノクローナル抗体投与後のマウスの変化について検証したところ、抗マウスRANKLモノクローナル抗体を投与したマウスでは、胸腺が萎縮していることが観察された。この胸腺の萎縮は、休薬6ヶ月後のマウスにおいても胸腺の大きさは萎縮したままであった。胸腺は免疫担当細胞の分化と成熟に関与していることから、MRONJの発症における免疫担当細胞との関連性について、現在検証中である。当初の研究計画に沿って順調に研究が進んでいる。国内外の有識者との研究内容の討論を活発に行っている。今年度の実験を継続することでさらなる成果を上げられる可能性があると考えている。抗マウスRANKLモノクローナル抗体の休薬後における免疫学的解析、組織学的解析を進め、細胞レベルでの詳細な検討を行う予定である。胸腺は免疫担当細胞の分化と成熟に関与していることから、MRONJの発症における免疫担当細胞との関連性について、詳細な検討を行う予定である。また、国内外の有識者からの意見を参考に研究を進めたいと考えている。消耗品費においてキャンペーン品や特別価格などがあり、当初予定額より支出が抑えられ、経費の節約ができ、次年度使用額が生じた。未使用額14,878円については、平成30年度の実験のための消耗品費に使用する。
水晶体の透明性維持におけるリン酸化-脱リン酸化調節機構の関与-ホスホチロシンホスファターゼ活性を中心とする検討-

我々は鶏胚水晶体中のある種の酸性ホスファターゼがホスホチロシルプロテインホスファターゼ(PTPase)活性を持つことを以前に見い出した。この酵素が水晶体の細胞分化、細胞接着あるいはアポトーシス等の制御を介して水晶体の透明性を制御している可能性を想定し、本研究を進めた。1.鶏胚水晶体中のPTPPaseの分離精製微量で不安定な酵素であるため、短時間でステップの少ない精製方法を検討した。分取用高性能ゲル濾過カラムと容量1mLの高性能陽イオン交換カラムで精製を行い、さらにSDS電気泳動を行うことより、ほぼ単一の蛋白質にまで精製することができた。2段階のカラム精製で比活性は520倍に上昇し、活性回収率は8.1%であった。2.生化学的性質等の検討この酵素の分子量は約18kDaであり、ホスホチロシンやFMNに対する基質特異性が高く、バナジン酸やSH阻害剤、PAOにより強い活性阻害を受けた。ペプチドや蛋白質のチロシン残基に結合するリン酸基を特異的に加水分解することも確認できた。これらの性質は、最近性質が明らかにされつつある低分子型PTPPaseに類似し、この範疇に属するものと思われる。3.他組織、他動物での検討鶏胚水晶体の酸性ホスファターゼ活性の大半はこの酵素であることを明らかにした。それに比べ、高い酸性ホスファターゼ活性を有する肝臓や脳では、この酵素が占める比率はわずかであった。また鶏胚のみでなくウシ、ウサギおよびマウス水晶体中にもこの酵素の存在を確認した。4.アミノ酸一次構造解析精製標品を用いて部分一次構造の決定を試みたが、N末端がブロックされており、現時点では成功していない。今後デブロッキング等を行って再試行の予定である。5.機能解析現時点ではこの酵素の水晶体での機能の解析には至らなかったが、この酵素に対するモノクローナル抗体を現在作成中であり、機能解析の大きな武器になるものと期待している。
腎移植におけるTotal Lymphoid Irradiationの免疫抑制効果

2.さらに術前照射回数を10日間計1500radに増量し、術後AZA 1mg/kg/日を90日間投与したところ、AZA対照群の約3-5倍の生着延長効果があった。また90日後AZAを中止しても生着し続ける症例も得られた。3.すでに皮膚移植実験において、この免疫不応性はFLIやAZA単独または両者併用のみでは得られず、さらに臓器donorからのIa陽性骨髄細胞移植が加わることが必須の条件であったが、腎移植でも全く同様の結果であった。4.骨髄細胞の代りに血液(buffy coat cells)を用いたところ、皮膚移植の場合と異なりやや生着が延長したが、骨髄移植の効果には及ばなかった。6.現在、生着促進因子の解明、また前感作などの条件を加え、最適の術前照射条件、CYA投与法の工夫、さらに新しい免疫抑制剤FR900506の併用効果について検討を進めている。
集約型都市構造に向けた城趾周辺地区の持続的な再生計画と開発手法

本研究は、集約型都市構造に向けて、重要な歴史文化的資源及び耐用年数が過ぎて更新が必要な公的施設が数多く存在する、城趾周辺地区及び地域拠点の開発手法に着目し、その持続的な再生計画と開発手法に関する知見を得ることを目的としている。本年度は下記の研究を進めた。1.「(3)城趾周辺地区における都市空間整備と都市機能の集約化の実態と変遷」に関して、次の研究を行った。1公的施設の集約化として全国の公立小中学校に着目し、その立地動向と、富山市の中心市街地についてモデルプロジェクトとして分析を行った。「公立小中学校の再編による地域拠点への集約実態」では、過去30年間で多くの統廃合を行った都市を対象とし、休閉校とその移転先の立地及びその要因から集約化の動向を明らかにした。2中心市街地での再編例として富山市の事例を調査した。「公立小中学校再編に伴う学校跡地の整備状況」では、過去30年間で多くの学校を再編した48の地方都市の跡地活用の有無や機能などを調査し、富山市中心市街地における小中学校の跡地活用としてコミュニティの核としての活用実態を調査した。2.「(4)城趾周辺地区の計画・事業推進手法の現状と効果の分析」に関して、次の研究を行った。城址周辺地区に特定しているわけではないが、集約化の方策として立地適正化計画における地域拠点に着目した。全国の立地適正化計画策定都市24都市を対象として、自治体担当者ヒアリングや文献調査から、地域拠点の立地や中心となる都市機能、及びその圏域などについてデータベースを作成するとともに、地域拠点の位置付け方針と集約化の方針を明らかにした。当初計画の遅延の具体的理由は、研究代表者の公私の多忙による研究のエフォート率の低下である。一方、当初の研究計画も、まとめの作業を行っている過程で見直しが必要となり変更が余儀なくされたため、遅れている。1.「(3)城趾周辺地区や地域拠点における都市空間整備と都市機能の集約化の実態と変遷データベース作成」を引き続き行う。公的施設の集約化の実態や官民による都市空間整備プロジェクトを調査する。2.「(5)地区特性に対応した城趾周辺地区や地域拠点の再生手法の提案」を進めていく。3.国内外の専門家とのディスカッション上記で得られた、モデルプロジェクトや再生手法について先進的な都市デザインを実践している国内外の専門家とのディスカッションを行い、知見を得る。本研究は、集約型都市構造に向けて、重要な歴史文化的資源及び耐用年数が過ぎて更新が必要な公的施設が数多く存在する、城趾周辺地区の開発手法に着目し、その持続的な再生計画と開発手法に関する知見を得ることを目的としている。本年度は、福井市を題材として、2つの研究を進めた。1.都市機能の集約化に向けた城趾周辺地区の土地の権利移動の実態分析福井城趾周辺地区約58haにおける過去50年間の登記簿の分析により、1303筆の土地の売買、相続の実態を経年的に明らかにした。その結果、所有者の共有している土地の増加や分筆による権利の細分化、所有者の居住地の広域化が進んでいること、近年の土地取引では、低未利用地に用途変更されている土地が多いことがわかった。しかし、一方で、個人所有や区域内居住者といった地元につながりのある所有者の存在が大きく、今後の土地の有効活用にあたっては、これら地元所有者の土地活用に対する意識付けが重要であることが明らかになった。こうした、土地所有の問題を経年的にあるいは広域的に登記簿データから明らかにした研究はみられず、土地所有実態把握の有用な資料と考えられ、他都市でも土地所有の実態と所有意識の実態把握に基づいた、再生手法の検討の必要性を明らかにした。2.地区特性に対応した城趾周辺地区の再生手法の提案福井市城趾周辺地区で、中心拠点として都市機能を集約化しながらも歴史的な資源や構成原理に立脚して、魅力的な都市空間を再生して行く都市デザイン面からの手法の検討を行った。福井市は戦災震災を受けて復興区画整理を行い、また駅が城址に近接してできたことにより、市街化が著しく進んだ都市である。江戸時代から現在に至る、その時々の歴史を読み取り、その都市特性に応じた再生手法の検討の必要性を指摘し、そのための都市デザインの手法を提案した。本研究は、城趾周辺地区特性に対応した望ましい計画と持続的な開発手法の提案を行うことを目的としており、そのため、H27年度は、研究(1)「全国地方都市における城趾周辺地区の歴史的変遷と現況分析による地区特性データベース作成」及び研究(2)「城趾周辺地区における自治体による再生計画データベース作成」を行うことを予定していた。このため人口5万50万人の全国402都市(東京を除く)について、都市の中心部に城趾が含まれている都市、全119都市を研究対象都市として研究を進めてきたが、研究を進めて行く課程で、下記のことが課題となった。1研究対象都市には、研究すべき再生計画を持たない都市、再生事業を持たない都市が多く含まれていること。2研究対象都市でない都市に、研究すべき計画や事業があること。3研究対象都市におけるデータ収集が訪問しなければ得られないデータが多くあること。以上より、研究対象都市を見直し、あるいは絞り込む作業をまず行うことが必要となった。そのため、平成28年度以降に行う予定の調査であった、「福井市での城趾周辺の現状の詳細分析」「地区特性に対応した城址周辺地区の再生手法の提案」について平行して行い、城趾周辺地区の実態把握と再生計画の着目点を整理することを行った。

本研究は、集約型都市構造に向けて、重要な歴史文化的資源及び耐用年数が過ぎて更新が必要な公的施設が数多く存在する、城趾周辺地区の開発手法に着目し、その持続的な再生計画と開発手法に関する知見を得ることを目的としている。本年度は、下記の研究を進めた。(1)全国地方都市における城趾周辺地区の歴史的変遷と現況分析による地区特性データベース作成1研究対象都市:政令指定都市を除き、明治維新まで存城していた169都市174城(明治維新廃城一覧を参考に抽出)を研究対象都市とする。2対象城趾周辺地区の歴史的資源データベース:濠、天守、櫓の現存状況を示し、「天守」と「櫓」の位置のマップ作成。人口、面積、緑地及びアメニティ空間の分布、公的施設をはじめとする都市機能の集積状況とその変遷など。(2)城趾周辺地区における自治体による再生計画データベース作成1城趾周辺の計画データベース作成・城趾周辺地区の都市計画上の位置づけ、整備方針、計画、事業を抽出しまとめる。都市計画マスタープラン策定の有無、中心市街地活性化基本計画(認定)の有無、歴史的風致維持向上計画策定の有無、景観計画策定の有無を集計した。都市再生整備計画は、策定の有無をみるとともに、整備方針概要図を参考に実施事業箇所図と整備範囲を図化した。2地区特性と計画とプロジェクトの整合性の分析研究対象都市のうち、旧城郭地区とその周辺で都市再生整備計画事業が行われ、かつ旧城郭地区とその周辺で景観計画の景観形成重点区域を設定している都市を抽出し、景観形成重点区域の範囲を都市再生整備計画事業の実施箇所図の上にレイヤとして重ねることで、市街地整備と景観形成との連動性について分析した。(3)「城趾周辺地区の計画・事業推進手法の現状と効果の分析」を行うため、金沢市「まちなか住宅団地整備費補助金」を対象として、まちなか居住の誘導に関する研究を行った。H28年度は、H27年度に行うことを予定していたが行うことができなかった「(1)全国地方都市における城趾周辺地区の歴史的変遷と現況分析による地区特性データベース作成及び研究」「(2)城趾周辺地区における自治体による再生計画データベース作成」を主に行った。そのため当初H28年度に行う予定であった(3)城趾周辺地区における都市空間整備と都市機能の集約化の実態と変遷データベース作成が遅れてしまった。「(4)城趾周辺地区の計画・事業推進手法の現状と効果の分析」として、1城址周辺地区の計画においては全国の景観計画における眺望景観に着目して研究を行った。城址周辺地区が景観形成重点区域に指定され、かつ歴史的資源の復元・保全・活用を図っている27都市中、眺望保全を掲げている23都市を対象とした。これらについて文献調査やアンケートにより眺望保全の方針とこれを実現するための規制項目について明らかにした。2城址周辺地区の事業推進方法については、小規模なインフィル型開発に着目して研究を行った。
海洋軟体動物後鰓類タツナミガイの体表組織に存在する新規抗真菌物質の研究

本研究の目的は、海洋軟体動物タツナミガイDolabella auriculariaの体表・体壁部分に活性を見いだした抗真菌物質の精製とその構造決定である。貝殻の退化した巻き貝であるタツナミガイは、体表面に粘液を分泌し、海底の砂を被って生活をしている。よってタツナミガイは、貝殻におおわれた一般的な貝類に比べて微生物感染につながる微細な外傷を負うリスクが高いことが想像されたので、その体表、体壁部分に細胞傷害物質の存在を期待して検討を行った。タツナミガイ体表・体壁部を細切り、はじめたリン酸緩衝生理食塩水で、続いてアセトニトリル・トリフルオロ酢酸/水で抽出をおこない、リン酸緩衝生理食塩水画分に強力な抗腫瘍活性を、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸/水画分には抗真菌活性を各々検出した。本報告書に関わる研究では、有機溶媒に安定なペプチド性生体防御因子に着目する方針であったので、抗真菌活性を担う物質の精製を行った。抗真菌活性を示す画分を限外濾過、逆相カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーで分画する事により、目的物質を電気泳動上単一のバンドとなるように精製した。その物質は約40μg/mL程度で酵母に殺菌的に作用し、また、ヒト真菌症の主要病原菌であるCandida albicansにも同濃度域で静菌的に作用した。精製物質の他の作用としては、抗腫瘍性は示さないが、抗バクテリア作用は真菌に対してより低い10μg/mL以下の濃度で認められることなどが分かった。精製した抗真菌物質のアミノ酸配列を決定したところ、システイン2残基を含む全長15残基の新規ペプチドであることが分かり、ドラベラニンB2と命名した。現在はドラベラニンB2の大量調製と、分子内ジスルフィド結合の有無の解析、遺伝子クローニングの準備等を進行中である。
家庭科男女共修におけるコンピュータソフト教材に関する開発・実証的研究

本研究は、家庭科教育における男女共修が高等学校まで一貫して本格的にスタートし、新しい教育内容や指導法が模索されている中で、「家庭科教育におけるコンピュータソフトを利用した授業は、従来の教材や指導法に比べ、どのような効果があり、またどうあるべきか」を追究することを目的としたものである。本研究目的に従い、各種文献からコンピュータソフト及びコンピュータを導入した授業に関わる評価項目を抽出・整理するとともに、全都道府県の家庭科担当指導主事及び各都道府県においてコンピュータを導入した家庭科の授業に先駆的・意欲的に取り組み、その成果を専門誌に発表、あるいは指導主事よりその活躍を認められ推薦を受けた家庭科現職教員を対象に、郵送法によるアンケート調査を行った。また、参考資料として、アンケート用紙とともに、本研究者らの開発による家庭科教育に関わるコンピュータソフトを添付した。調査内容は、教師による指導上の効果が高められるかどうかに関する項目、学習者とソフトのインターフェースの良否をチェックする項目、コンピュータソフトに組み込まれている各種機能・技術をチェックする項目、コンピュータソフトの流通・管理に関する項目、コンピュータ導入の理念の是非をチェックする項目、等であった。結果、(1)家庭科コンピュータソフトの選択基準(チェックリスト)、(2)コンピュータを導入した家庭科授業の評価項目を明らかにし、それぞれの評価チェックリスト表を作成した。
コレラ菌による NLRP3 活性化新規経路の解析

本研究は、アダプター蛋白であるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化するコレラ菌の因子を同定し、活性化経路を明らかにすることを目的とした。2010年度2012年度までの間に、コレラ菌のいくつかの因子を候補としてあげ、その中で溶血毒素であるHlyAが有力な候補であることを明らかにし、またこの活性化機構は他の菌の膜穴形成毒素・溶血毒素では代用できない特異性のあるものであることを明らかにした。しかしながら、これをさらに裏付ける十分な証拠を得ることができなかった。本研究の目的はコレラ菌培養上清中にあるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化する因子を同定し、その活性化機構を解明することにある。実験計画に従い、C57BL/6マウス由来骨髄マクロファージ(WT-Mφ)及び、MyD88/Trifダブルノックアウトマウス由来骨髄マクロファージ(DKO-Mφ)にリピートトキシンRtxA欠損変異株(ΔrtxA),ヘモリジンHlyA欠損変異株(ΔhlyA)単独あるいはRtxA/HlyAダブル欠損変異株(ΔDMと略)の培養上清を反応させ、IL-1β、IL-18、Caspase1の産生をウエスタンブロット法で調べた。その結果、WT-Mφに対しΔrtxAの培養上清は各因子を産生したが、ΔhlyAとΔDMの培養上清はどの因子も産生しなかった。これに組換hlyAを添加したところどの因子も産生された。このことはIL-1β、IL-18、Caspase1の産生にはRtxAよりHlyAのほうが重要であることを示している。次にDKO-Mφに対する反応を調べて見ると、WT-Mφと同じ結果を示したが、ΔDM培養上清にATPを加えてもIL-18の産生は見られなかった。このことは、HlyAはMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化し、その活性化経路はATPの添加によるP2X7の経路を利用していないことを示唆している。この活性がHlyAのpore forming活性によるものかを調べるため、組換hlyAを100°C、10分の加熱で不活化し同様の実験をしたところ、IL-18の産生は見られなくなった。このことはHlyAによるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化するには、HlyAが活性化できる状態が必要であると思われたが、今回使用した組換HlyAはHis-tag HlyAであり、常法通りNi-アフィニティーカラムで精製したが、わずかに他の蛋白の混入がみられ純品にはいたってない。現在組換HlyA粗製品をイオン交換カラム、ゲル濾過カラム、疎水性過アラムなどにかけ、さらなる純化を試みている。また、他の細菌が産生するpore forming toxinも同様に作用するのかをみるため、現在黄色ブドウ球菌α溶血毒、肺炎球菌溶血毒Pneumolysin、リステリア菌Listeriolysin Oなどの精製を試みている。本研究の目的は、コレラ菌培養上清にあるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化する因子を同定し、その活性化機構を解明することにある。これまでMyD88/Trifダブルノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージを使い、MyD88/Trif非依存性のNLRP3活性化にコレラ菌の細胞性の毒であるRtxAと溶血毒であるHlyAの内、HlyAが重要であることを明らかにしてきた。しかし同じVibrio属であり、同じ毒素構成をしているバルニフィカスではそのような現象は見られない。実験計画に従いバルニフィカスのRtxAとhemolysinであるVvhAのダブル欠損変異株にコレラ菌のHlyAを発現させ、コレラ菌と類似した現象が見られるか検討した。エレクトロポレーション法、Ca法などでトランスフォメーションを幾度となく試みたが、バルニフィカスにコレラ菌のHlyAを導入することはできなかった。おそらくバルニフィカスが好塩性でコレラ菌がそうではないことに何らかの原因があるのではないかと思われる。コレラ菌の野生株から精製したHlyAと組換えHlyAの活性の比較を行ったが、両者に有意な差はなかった。次にコレラ菌独自のHlyAによる活性化を確認するため、黄色ブドウ球菌α溶血毒、肺炎球菌ニューモリジン、Listeria monocytogenesリステリアリジンの組換え蛋白質を作成し検討した。組換え体の溶血活性は、野生株のものと比べ極めて弱かった。この製品を、MyD88(-/-)/Trif(-/-)ダブルノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージと反応させ、IL-1βの産生とcaspase 1の活性化の有無を調べた。この場合でもやはりコレラ菌のようなNLRP3の活性化は見られなかった。

これは溶血活性が弱いためなのか検証する必要があるが、活性がコレラ菌溶血毒と同程度の量を用いても観察できなかったことから、MyD88/Trif非依存性のNLRP3活性化はコレラ菌独特のものと推測される。だとすればバルニフィカスのRtxA/vvhAダブル欠損変異株や、今回用いた菌の溶血毒にコレラ菌の溶血毒を添加することによりMyD88/Trif非依存性のNLRP3活性が見られる可能性がある。現在これを確認するための実験を進めている。本研究の目的は、コレラ菌培養上清にあるMyD88/Trif非依存性にNLRP3を活性化する因子を同定し、その活性化機構を解明することである。前年度異なる病原菌の細胞膜破壊毒素の組換え蛋白を調整し、それをMyD88/Trifダブルノックアウトマウス由来マクロファージに投与した際コレラ菌と同様なNLRP3活性化の痕跡を見つけることができなかった。この結果からコレラ菌のもつヘモリジンHlyAによるNLRP3はコレラ菌独自の現象であることが確認できた。そこでこの現象が見られないビブリオバルニフィカスのRtxA /vvhAダブル欠損変異株に大腸菌に発現させ精製した遺伝子組換えコレラ菌HlyAを添加したところ、結果のバラツキが観察された。すなわちカスパーゼ-1のp10成分が出たり出なかったりした。LPSでプライミング後ATPで誘発したポジティブコントロールには確かにでており、ネガディブコントロールには出てないので、反応系の問題ではなく、調整品の不都合による可能性が考えられた。組換えHlyAの溶血活性を知調べたところ若干溶血活性の低下がみられた。さらにこの組換えHlyAの他、組換え体でないHlyAの精製も試みた。しかしながら、SDS-電気泳動で精製品を調べるとどうしてもわずかな余分な蛋白が紛れ込み、高純度の精製品をえることができなかった。結果的に研究期間内に計画通りの研究は進展しなかった。また実験中、動物管理施設の改装工事がありMyD88/Trifダブルノックアウトマウスの繁殖が不可能になり、新たに調整することが必要になり研究の進展の妨げとなった。現在MyD88/Trifダブルノックアウトマウスも手に入り、新たに実験を再構築している段階である。研究費申請時に提出した実験目標に基づいた研究計画に照らし、概してその通りに進んでいる。RtxAを欠損するコレラ菌培養上清からHlyAを精製し得たし、大腸菌にも組み込みこれを精製した。バルニフィカスにコレラ菌のHlyAを発現させることはできなかったが、研究の目的から見て、このことは実験の進行を妨げない。24年度が最終年度であるため、記入しない。コレラ菌の溶血毒にさらに焦点をあわせ、溶血毒の特性と細胞内シグナル伝達の特殊性を明らかにする方向へ進む予定である。研究計画についての大きな変更点はまだないが、研究を遂行する上でさらに新たな実験手技と知識を必要とする場合が想定される。その場合これに関連する情報を学術論文やインターネットから収集したり、研究者が所属している機関で専門的に扱っている研究者に相談したり、技術指導を仰ぐことで対応する。