hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高空間分解能振動分布計測システムの開発と機械人工弁振動の解明

本研究は特殊な振動現象である機械人工弁の可聴領域閉鎖音(クリック)の発生メカニズム解明をめざし、汎用型の高感度・高空間分解能の振動分布センサシステムの研究開発を目的としたものである。具体的には送受光に光ファイバを使用した小型の光学式変位センサを開発し、これをアレイ化して振動分布の同時計測を実現した。また、測定環境下での校正機能をセンサ自体に組み込むことにより汎用型のセンサへの発展をめざしている。14年度は振動分布計測システムの基本機能の研究開発に重点を置き、特に基本となる光ファイバ式変位センサユニットの研究を中心に行った。各種構造パラメータを変えたセンサユニットを試作評価した結果、高空間分解能と高感度実現のためには適度な集光が必要であると結論された。その結果を基に15年度に光ファイバ式変位センサユニットの小型化を推進した結果、計測面のスポット径0.51mm,同時計測時の空間分解能5mmで、サブミクロンレベルの振動変位が検出可能な変位センサユニットが完成した。また、同ユニットをアレイ化した振動分布センサを可動ステージ上に固定して駆動し、移動量をレーザ変位計でモニタしながらセンサユニットのキャリブレーションを行う校正システムを開発した。この校正機能により、被計測面の反射特性に依存しない計測精度の確保を実現した。完成したセンサシステムを使用して、機械人工弁試験装置の弁保持部(シリコンゴム製)の振動分布を計測した結果、housingから離れるにつれ高周波数の振動成分が減衰していることが明らかとなった。この振動分布の空間的な不均一性が、可聴領域クリックの特殊性の原因と考えられた。これらの結果の詳細は、日本エム・イー学会,日本音響学会等で報告する予定である。本研究は特殊な振動現象である機械人工弁の可聴領域閉鎖音(クリック)の発生メカニズム解明をめざし、汎用型の高感度・高空間分解能の振動分布センサシステムの研究開発を第一の目的とするものである。具体的には送受光に光ファイバを使用した小型の光学式変位センサを開発し、これをアレイ化して振動分布を計測し可視化する。また、測定環境下でのキャリブレーション機能をセンサ自体に組み込むことにより汎用型のセンサへの発展をめざしている。本年度は振動分布計測システムの基本機能の研究開発に重点を置き、特に基本となる光ファイバ式変位センサユニットの研究を中心に行った。各種構造パラメータを変えたセンサユニットを評価した結果、高空間分解能実現のためには、隣接ユニット間の干渉を防止するための適度な集光が必要であると結論された。試作ファィバユニットと、人工弁試験装置を使用した計測で、感度・信号対雑音比ともに十分な性能が得られることを確認したが、集光レンズに汎用の部品を使用したために空間分解能は10mm程度しか得られなかった。平成15年度には小型の集光系を新たに設計し、少なくとも5mm以下の空間分解能を実現する振動分布センサシステム開発を目指す。汎用のレーザ変位計と可動ステージを使用したキャリブレーション機能に関してはその基本動作を確認し、センサユニットの感度・直線性の被測定反射面への依存性を補正可能との見通しを得た。平成15年度には、本計測システムを完成させ、機械人工弁可聴領域クリックの発生要因解明のための実験に取り組む計画である。

本年度は、昨年度の研究成果を基に光ファイバ式変位センサユニットの小型化を推進した結果、計測面のスポット径0.51mm,同時計測時の空間分解能5mmで、サブミクロンレベルの振動変位が検出可能な変位センサユニットが完成した。また、同ユニットをアレイ化した振動分布センサを可動ステージ上に固定して駆動し、移動量をレーザ変位計でモニタしながらセンサユニットのキャリブレーションを行う校正システムを開発した。この校正機能により被計測面の反射特性に依存しない計測精度の確保を実現した。完成したセンサシステムを使用して、機械人工弁試験装置の弁保持部(シリコンゴム製)の振動分布を計測した結果、housingから離れるにつれ高周波数の振動成分が減衰していることが明らかとなった。この振動分布の空間的な不均一性が、可聴領域クリックの特殊性の原因と考えられた。これらの結果の詳細は、日本エム・イー学会,日本音響学会等で報告する予定である。
顎顔面の形態異常に起因する口腔機能障害の解析と臨床機能検査システムの開発

1.骨格性不正咬合者と健常者の実音声(/asa/)を対象に音声分析を行った。音声分析は、分析フレームを1/8フレームずつ更新し、周波数領域10kHzまでの分析を行ったのち、隣接する2フレーム間のコヒーレンスを求めた。その結果、(1)母音では低周波数領域に、子音では高周波数領域にコヒーレンスが強い部分が認められた。(2)母音から子音へのわたりの部分について、コヒーレンスの強い部分を検討すると、健常者では、低域から高域へ比較的スムーズ移行しているのに対して、骨格正反対咬合者ではスムーズに移行しておらず、乱れが認められた。2.今回センサを口腔外に出し、大きくすることにより装置の改良を行った。その結果、舌運動の測定範囲は、前後的に0mm51mm、上下的に0mm51mm、左右的に0mm12mmに拡大された。また、計測誤差は、補正後では平均0.29mm標準偏差0.58であり、舌運動を計測するには十分な計測精度であった。また、その計測範囲は、口蓋の形態を計測するのに十分であり、経時的な重ね合わせに口蓋を用いることが出来るようになった。3.正常咬合者と骨格性反対咬合者を対象とし、/asa/、/usu/、/ese/、/oso/構音時の舌運動を計測した。その結果、(1)舌の運動速度は、両者とも先行母音→子音、子音→後続母音の移行時にピークが認められ、舌運動の最高速度の大きさは、/a/、/o/>/e/、/u/となっていた。(2)/s/構音時の舌の位置を舌の安静位と比較した結果、正常咬合者では上前方に、骨格性反対咬合者では下前方に位置していた。しかし、前後母音の違いにより子音/s/構音時の舌の位置も変化しており、/s/の構音位置はある領域を有していた。(3)/s/構音時のせばめの持続時間は、正常咬合者より骨格性反対咬合者の方が長かった。(4)先行母音の舌の構音位置は、音声生理学的に認められている基本母音の位置関係と類似していた。本年度はまず最初に申請者らが開発してきた小型磁気センサを用いた2つの三次元運動測定装置(下顎運動、舌運動)の測定範囲を拡大するための基礎実験を行った。今回は、一次コイルからの信号をより離れたところで感知出来るようにするために一次コイル、二次コイルともに自作し、一次コイルに印可する信号の周波数、両コイルのコアの材質、大きさ、長さ、エナメル線の巻き方について検討を加えた。その結果以下のことがわかった。1.一次コイルに印可する信号は、651kHzの時に最も二次コイルからの出力が大きかった。2.コアの材質としては一次、二次コイルともフェライトが適していることがわかった。3.二次コイルの出力はコアの長さが長ければ大きくなるが、その太さには影響されないことがわかった。4.巻き方については巻き数が多いほど、また二重に巻くよりは一重にした方が二次コイルの出力は大きくなることがわかった。

5.計測可能範囲は、一次コイルの軸上で二次コイルを動かした時は215mm,平行に動かした時は140mmと以前より広範囲の信号を感知できるようになった。以上の結果に基づいて、現在二次コイルの設置方法を検討し、三次元座標の演算アルゴルズム、三次元座標の時間歪みと空間歪みの解析、その補正手法のアルゴルズムの構築を行っている。また、舌運動と舌顎運動を同時計測できるようにするためには、複数の一次コイルが必要となるため、これに印可する交流電源の作製、多チャンネルの信号記録装置を組み込んだ信号処理方法についても検討している。1.骨格性不正咬合者と健常者の実音声(/asa/)を対象に音声分析を行った。音声分析は、分析フレームを1/8フレームずつ更新し、周波数領域10kHzまでの分析を行ったのち、隣接する2フレーム間のコヒーレンスを求めた。その結果、(1)母音では低周波数領域に、子音では高周波数領域にコヒーレンスが強い部分が認められた。(2)母音から子音へのわたりの部分について、コヒーレンスの強い部分を検討すると、健常者では、低域から高域へ比較的スムーズ移行しているのに対して、骨格正反対咬合者ではスムーズに移行しておらず、乱れが認められた。2.今回センサを口腔外に出し、大きくすることにより装置の改良を行った。その結果、舌運動の測定範囲は、前後的に0mm51mm、上下的に0mm51mm、左右的に0mm12mmに拡大された。また、計測誤差は、補正後では平均0.29mm標準偏差0.58であり、舌運動を計測するには十分な計測精度であった。また、その計測範囲は、口蓋の形態を計測するのに十分であり、経時的な重ね合わせに口蓋を用いることが出来るようになった。3.正常咬合者と骨格性反対咬合者を対象とし、/asa/、/usu/、/ese/、/oso/構音時の舌運動を計測した。その結果、(1)舌の運動速度は、両者とも先行母音→子音、子音→後続母音の移行時にピークが認められ、舌運動の最高速度の大きさは、/a/、/o/>/e/、/u/となっていた。(2)/s/構音時の舌の位置を舌の安静位と比較した結果、正常咬合者では上前方に、骨格性反対咬合者では下前方に位置していた。しかし、前後母音の違いにより子音/s/構音時の舌の位置も変化しており、/s/の構音位置はある領域を有していた。(3)/s/構音時のせばめの持続時間は、正常咬合者より骨格性反対咬合者の方が長かった。(4)先行母音の舌の構音位置は、音声生理学的に認められている基本母音の位置関係と類似していた。
頭頚部扁平上皮癌における癌転移抑制遺伝子の分析とその臨床応用

正常上皮でのnm23の発現は、上皮基底層に強くみられ有棘層、表層になるにしたがい減弱していた。個々の頭頚部扁平上皮癌組織でのnm23発現程度は様々であり、正常上皮と同様に強い発現がみられる例からまったく発現のみられない例まであった。これらの発現の多様性は、頭頚部扁平上皮癌の組織分化度の指標になるとされるcytokeratinの発現と関係がみられた。すなわち、cytokeratin1,13,19の免疫染色を同一の連続切片を用いて行うと、nm23の発現はcytokeratin13の発現と比較的良く相関した。cytokeratin19は比較的低分化の扁平上皮癌に発現するのに対し、cytokeratin13は分化度が高くなるに従い発現が多くなると報告されている。この事より、nm23の発現は組織分化度に関係していると考えられた。また、nm23の発現とリンパ節転移(N分類)、腫瘍の大きさ(T分類)との関係を調べると、発現が減弱している例でリンパ節転移が多い傾向がみられたが、腫瘍の大きさとは関係がみられなかった。これらより、nm23の発現は腫瘍の組織分化度に関係し、臨床的にはその発現の低下がリンパ節転移と関係することが示された。一方、同一の癌組織内でも、nm23の発現に違いがみられた。この事から、ひとつの癌組織の切片の中でもheterogeneityを示すnm23発現の解析は、細胞または細胞集団ごとにしなければならず、Northern HybridizationやWestern blotなどの生化学的手法は適当でないと考えられた。さらに、従来から行われている腫瘍全体に対する組織分化度の評価だけでは不十分で、患者の予後を推測するには個々の部分の腫瘍特性を考慮しなければならないと考えられた。また、nm23の発現が組織分化度と関連があるという知見は、他の部位の癌の検討でも今だ報告がなく、非常に興味が持たれた。平成4年度は本研究の初年度であり、頭頚部扁平上皮癌患者から手術時または生検時に新鮮材料の採取行い、OCT compoundに包埋した状態で-80°C保存を進めながら、以下のpreliminaryな実験を行った。腫瘍組織から6μmの凍結切片を作成し、免疫組織染色を行った。抗体は東京都老人総合研究所の木村博士から供与されたものを用いた。この抗体はヒト癌転移抑制遺伝子nm23-H1、nm23-H2のいずれの遺伝子産物も認識し、染色は細胞質に見られている。しかし、家兎で作成されたポリクローナル抗体でありパラフィン包埋した組織に対する反応性は確立されていない。また、乳癌などでは腫瘍によりその染色性が異なり、染色性が低下している症例で高率に転移が見られている。今回のpreliminaryな検討では、頭頚部扁平上皮癌においても個々の症例によって癌組織の染色性は異なっていた。しかし、周辺組織にnegativeまたはpositiveなコントロールが存在せず、染色性の違いを半定量化する事は難しかった。組織の固定条件としてはアセトンとパラホルムアルデヒドを用い固定時間を変化させてみたが、染色性の半定量化はやはり難しかった。さらに染色性には、扁平上皮癌組織の角化状態が影響を与えるようであり、ケラチンノとの非特異的な反応をどう処理するかを現在検討中である。また、もし可能ならばnm23遺伝子産物を認識する他の抗体を入手して同様の実験を試みたいと考えている。

一方、腫瘍材料からmRNAを抽出してnm23癌抑制遺伝子のcDNAをプローブとしてNorthern Hybridizationを行い、遺伝子レベルでnm23の発現を調ベる実験は、頭頚部扁平上皮癌症例では、十分なmRNAが採取できる症例が少なく、現在の段階でははっきりとした結果は得られていない。今後、喉頭癌の生検材料の解析など場合にはRT-PCRのような新しいテクニックが必要かもしれない。これは2年度目の課題としたい。癌転移抑制遺伝子nm23は正常細胞にも存在し、本研究においてはその発現の減弱を調べる事が必要で、免疫組織染色で再現性のある結果を得るには細心な実験が必要である。平成4年度には、preliminaryな免疫組織化学的研究を行ったが、種々の問題点が明らかになった。そこで、平成5年度はそれらについて技術的に若干の変更を行い、さらに多くの症例について詳細に検討した。検討に用いたnm23に対する抗体は、昨年度と同様、東京都老人総合研究所の木村博士より供与されたものである。正常上皮でのnm23の発現は、上皮基底層に強くみられ有棘層、表層になるにしたがい減弱していた。個々の頭頸部扁平上皮癌組織の染色程度は様々であり、正常上皮と同様に強い染色がみられる例からまったく染色のみられない例まであった。これらの染色性の違いとリンパ節転移との関係を調べると、染色性の減弱している例でリンパ節転移が多い傾向がみられたが、はっきりとした有意な相違ではなかった。同一の癌組織でも、染色性の違いがみられた。H.E.染色の結果と比較すると、染色性の違いは組織分化度と関係があるようであった。そこで、頭頸部扁平上皮癌の組織分化度の指標になるとされる、cytokeratin1,13,19の免疫染色を同一の連続切片を用いて行った。すると、nm23の染色性はcytokeratin13の染色性と良く相関した。すなわち、nm23の発現は組織分化度に関係していると考えられた。上述の様に、ひとつの癌組織の切片の中でもnm23発現のheterogeneityがみられた事から、nm23発現の解析は細胞または細胞集団ごとにしなければならず、Northern HybridizationやWestern blotなどの生化学的手法は適当でないと考えられた。nm23の発現が組織分化度と関連があるという知見は、他の部位の癌の検討でも今だ報告がなく、非常に興味が持たれる。次年度はさらに詳細な検討を加え、nm23からみた頭頸部扁平上皮癌のheterogeneityや癌の細胞特性を調べ、予後診断など臨床応用できる知見を得たいと考えている。個々の頭頸部扁平上皮癌組織でのnm23発現程度は様々であり、正常上皮と同様に強い発現がみられる例からまったく発現のみられない例まであった。これらの発現の多様性は、頭頸部扁平上皮癌の組織分化度の指標になるとされるcytokeratinの発現と関係がみられた。すなわち、cytokeratin1,13,19の免疫染色を同一の連続切片を用いて行うと、nm23の発現はcytokeratin13の発現と比較的良く相関した。
希土類磁性薄膜を用いた高分解能局所磁場測定装置の開発

本研究では、希土類磁性薄膜のファラデー効果を用いた高分解能局所磁場測定を開発した。直線偏光した光を磁性薄膜に入射すると、局所磁場の大きさに比例して偏光面が回転する(ファラデー回転)。したがって、ファラデー回転角の大きい磁性膜を局所磁場測定したい試料の近傍に置き、偏光板を用いることにより、局所磁場の大きさを光の明暗のコントラストとして測定することができる。低温での測定が必要なため、ヘリウムガスフロー型クライオスタットと磁場発生用に銅線の空芯コイルを作製し、これらを偏光顕微鏡と組み合わせることにより高分解能局所磁場測定を構成した。磁性薄膜としては単位磁場あたりのファラデー回転角の大きいEuSe膜を高真空電子ビーム蒸着装置を用いて作製した。磁場の強弱に対応する光の明暗像をCCDカメラを用いて撮影し、コンピューターを用いてデジタル化し画像処理を行い、局所磁場分布に変換した。手始めとして、高温超伝導体単結晶の磁化過程の観測を行い、次のような知見を得た。・臨界状態における局所磁場プロファイルは試料の形状を反映し、従来の反磁場係数の無視できる場合に対するモデル(Beanモデル)よりも、最近解析的に計算された反磁場係数の大きい場合のモデル(Brandtの理論)との良い一致を示した。・実験データのBrandtの理論によるフィッティングから得られた臨界電流密度はこれまで知られている値と矛盾しない。・双晶境界が存在する試料では、10K程度の低温においてもこれに沿って磁束が超伝導体に侵入しやすくなることがあることが明らかになった。今後、低ノイズのCCDカメラを用い画像の積算を行うことにより、データの大幅な改善が期待される。
進行性多巣性白質脳症： JCウイルス感染グリア細胞のPML-NBs構成蛋白の変動

進行性多巣性白質脳症は、JCウイルス感染による脱髄脳症である。JCウイルスは多くのヒトに潜伏・持続感染し、免疫能の低下した宿主で再活性化し、乏突起膠細胞で溶解感染して脱髄、壊死を引き起こすが、細胞変性機序の詳細は明らかにはなっていない。近年我々は、JCウイルス感染が、宿主細胞核内のドット状ドメイン、PML-NBs(promyelocytic leukemia nuclear bodies)を標的に樹立することを明らかにした(Shishido-Hara et al, JV 2004, Shishido-Hara et al, JNEN 2008,他)。PML-NBsは急性前白血病で発見された核内ドメインで、転写因子を含む多数の核内蛋白が集積することが知られている。正常分裂細胞では、細胞周期に合わせて腫大し、G2期に最大となる。腫瘍抑制やアポトーシス、細胞周期制御など、重要な核機能に関与することが知られているが、JCウイルス感染におけるPML-NBsの機能解析に関しては、報告に乏しい。しかしながら、PML-NBsは、JCウイルス複製に必須ではないが、宿主細胞の変性に重要な役割を果たすことがわかってきた(Shishido-Hara et al, AJP 2012)。本研究では、PMLにおけるPML-NBsの機能を明らかにする為に、agnogeneをコードする野生型と、これを欠失した変異型の組み換えウイルス粒子(virus-like particles: VLP)をCOS-7細胞で作製した。野生型VLPは腫大化したPML-NBsで効率よく作製されたが、変異型はPML-NBs外でウイルス粒子形成がおこり、細胞変性にも乏しいことが明らかになった。マイクロアレイで2種類の細胞を比較すると、多数の転写因子の発現レベルに相違が認められた。JCウイルスは多くのヒトに潜伏・持続感染し、免疫能の低下した宿主で再活性化する。近年我々は、JCウイルスが、乏突起膠細胞のPML-NBs(promyelocytic leukemia nuclear bodies)と呼ばれる核内ドメインを標的に感染することを明らかにした(Shishido-Hara et al, JV 2004, Shishido-Hara et al, JNEN 2008,他)。PML-NBsは急性前白血病で発見されたドット状の核内構造で、p53などの腫瘍抑制因子、転写因子など80種以上の蛋白が局在し、腫瘍抑制やアポトーシス、細胞周期制御などの機能に関与する。さらにPML-NBsは、ウイルス複製に必須ではないが、宿主細胞の変性に重要な役割を果たす可能性が高い(Shishido-Hara et al, AJP 2012)。本研究の目的は、JCウイルス感染が誘導するPML-NBsの変化を、人体組織と培養細胞レベルで解明し、ウイルス感染が誘導する細胞変性・腫瘍化の機序を明らかにすることである。本年度の成果として、ウイルス後期領域のコードされるagnoproteinの重要性が示唆された。具体的に、感染細胞の細胞周期はS期からG2期へと移行するが、この過程でPML-NBsは腫大化して発達する。agnoproteinの欠失ウイルスでは、PML-NBsへのウイルスたんぱくの集積が起こらず、その後の細胞変性もおこらないことから、agnoprotteinが何らかの機序でPML-NBsの機能に関与し、細胞変性・腫瘍化を促す可能性があると考えられた。これを証明する為、現在、agnoprotein欠失状態でのPML-NBsの構成蛋白をアレイ解析するべく準備を進めている。近年、Translational researchが重要視されているが、培養細胞からヒト組織に至るまで一貫性のある研究データを得ることは極めて難しい。本研究では、ヒト脳組織標本を解析すると同時に、これより得られた知見をin vitroで遺伝子変異を導入してメカニズムの解明を試みている。現在のところ、ヒト脳組織と培養細胞において矛盾のない結果が得られているという点で、順調に研究が進行していると言える。最近の研究で、我々は、JCウイルスがpromyelocytic leukemia nuclear body(PML-NBs)と呼ばれる核内構造で複製し、感染初期にはドット状の核内封入体(dot-shaped inclusion)を形成することを明らかにした。PML-NBsは細胞周期や腫瘍抑制などに関係し、その機能破綻は、腫瘍発生や細胞変性に関連する。JCウイルスはG0期にある乏突起膠細胞の細胞周期を活性化し、細胞周期をSからG2に移行させるが、この過程でPML-NBsが腫大化することを明らかにした。JCウイルスは腫大化するPML-NBsで複製した後、やがて核全体に充満し(full inclusion)、PML-NB構造を破綻して細胞変性を誘導すると考えられる。PML-NBsは核内蛋白の集積の場であるが、主要構成成分であるPML蛋白を軸とし、状況に応じて構成蛋白の成分が変動することが明らかになっている。本研究でウイルス増殖に伴うPML-NBsの構成蛋白の変動をマイクロアレイ解析したところ、多くの転写因子の発現が低下することが明らかになった。また、S期において、細胞ゲノムの複製は行われず、ウイルスゲノムDNAのみの複製が起きていることもわかった。このため、感染細胞はM期に移行することなく変性・脱落すると推測された。今年度は、マイクロアレイの結果を得ることができ、暫くデータの解釈に悩んだものの、ほぼ予測通りの結果を得られたと考えている。培養細胞とヒト脳組織と比較して矛盾のない結果を得られたという点で、完成度は高い。

進行性多巣性白質脳症(Progressive Multifocal Leukoencephalopathy: PML)は、免疫能が低下した宿主において、持続・潜伏感染していたJCウイルスが再活性化するために発症する脱髄脳症である。当初はまれな疾患だったが、1980年代にはAIDSに伴うPMLが問題となり、その症例数が飛躍的に増加した。近年では免疫修飾薬の使用に伴ったPML発症が話題となっており、特に多発性硬化症で開発されたヒト化モノクローナル抗体によるPML発症は注目を集めている。本研究では、PMLにおけるPML-NBsの機能を明らかにする為に、agnogeneをコードする野生型と、これを欠失した変異型の組み換えウイルス粒子(virus-like particles: VLP)をCOS-7細胞で作製した。先行研究から、野生型はPML-NBsでウイルス粒子を形成するが、変異型はPML-NBs外でウイルス粒子を形成するため、宿主細胞は細胞変性に乏しいことが解っている。これら2種類の細胞を比較して、マイクロアレイにて遺伝子発現の変動を比較検討した。PMLのヒト脳組織を見てみると、様々な大きさの細胞核を有するグリア細胞が出現している。正常なoligodendrogliaは小型類円形、クロマチンに富んだ細胞核を示すが、PMLの病理診断の指標となるJCウイルス感染細胞は、大型腫大核にヘマトキシリンとエオシンに両染性となるウイルス封入体を有している。我々は、oligodendrogliaがJCウイルスの感染を受けると、細胞周期をSからG2にさせ、この過程で核内のPML-NBsを発達させることを明らかにした。腫大化するPML-NBsにウイルス蛋白が集積し、ここで子ウイルスが複製する。ウイルスが腫大核に充満すると、PML-NBsは崩壊・消失する。野生型および変異型VLPを形成した培養細胞からRNAを抽出してマイクロアレイで解析すると、野生型JCVを作製したCOS-7細胞では多数の転写因子のmRNA活性が上がっていることが明らかになった。JCウイルスの許容細胞は、JCウイルス転写活性をあげる転写因子を高発現していることが知られているが、マイクロアレイの結果は、ヒト脳組織(臨床検体)において、PML転写活性がPML-NBsで上がっていることともよく相関している。進行性多巣性白質脳症は、JCウイルス感染による脱髄脳症である。JCウイルスは多くのヒトに潜伏・持続感染し、免疫能の低下した宿主で再活性化し、乏突起膠細胞で溶解感染して脱髄、壊死を引き起こすが、細胞変性機序の詳細は明らかにはなっていない。近年我々は、JCウイルス感染が、宿主細胞核内のドット状ドメイン、PML-NBs(promyelocytic leukemia nuclear bodies)を標的に樹立することを明らかにした(Shishido-Hara et al, JV 2004, Shishido-Hara et al, JNEN 2008,他)。PML-NBsは急性前白血病で発見された核内ドメインで、転写因子を含む多数の核内蛋白が集積することが知られている。
腸管免疫賦活作用をターゲットとした米抽出物によるアレルギー予防の研究

腸管には特殊な免疫組織であるパイエル板が点在し、産生される免疫グロブリンA(IgA)が、腸管免疫において重要な役割を果たしている。そこで、IgA産生亢進作用を指標として評価を行った結果、玄米タンパク抽出物(BRE)の高分子画分にIgA産生亢進作用があることを見出した。また、卵白アルブミンでアレルギーを惹起したマウスにBREを摂取させると、脾臓細胞のIFN-γ産生量は濃度依存的に上昇し、Th1/Th2バランスが有意に上昇していた。さらに、OVA特異的IgEは濃度依存的に低下していた。以上の結果から、BRE摂取により、アレルギー改善効果が期待できることが明らかとなった。腸管免疫系は、体内に侵入した有害微生物、病原菌などを認識し、生体を守る役割を果たしている。腸管にはパイエル板のような特殊な免疫組織が点在し、パイエル板から産生される免疫グロブリンA(IgA)が、腸管免疫において重要な役割を果たしている点に着目した。一方で、日本では食生活の欧米化により、1960年代中頃から米の生産量が消費量を上回るようになってきており、米の高付加価値化と有効利用が急務である。このため本研究は、米由来のタンパクや酵素分解ペプチドの腸管免疫系に関わる機能について、IgA産生亢進作用を指標として評価を行い、最終的には、米由来の機能性食品素材の開発を目指している。昨年度の結果から、米国産玄米タンパク抽出物に腸管免疫賦活作用があることが明らかとなった。本年度は、活性成分の同定とマウスを用いた腸管免疫賦活作用の評価を行った。米国産玄米タンパク抽出物を限外ろ過膜により分画し、活性成分の同定を試みた。抽出物を分子量30,000、10,000、3,000で分画し、マウスパイエル板細胞のIgA産生量を調べた結果、分子量30,000以上の画分に活性があることが明らかとなった。マウスに玄米タンパク抽出物を20 mg/kgまたは200 mg/kgの投与量で3週間経口投与を行った。糞中のIgA量を測定した結果、20 mg/kg投与群でコントロール群に比べてIgA量が高い傾向がみられた。また、パイエル板細胞培養上清中のIgA量は20 mg/kg投与群でIgA量が高い傾向がみられた。IL-12やIL-6産生量はコントロール群に比べて玄米タンパク抽出物投与群で上昇していた。脾臓細胞上清中のIFN-γ産生量はコントロール群に比べて上昇傾向を示しており、Th1/Th2バランスも上昇していることから、玄米タンパク抽出物摂取により、アレルギー改善効果が期待された。腸管にはパイエル板のような特殊な免疫組織が点在し、パイエル板から産生される免疫グロブリンA(IgA)が、腸管免疫において重要な役割を果たしている。日本産玄米、発芽玄米、米糠、米国産玄米タンパクを15hr、5%濃度で水抽出(40°C)し、抽出物を作製した。各抽出物の分子量分布をゲルろ過カラムを用いて測定した結果、各抽出物によってピークパターンが異なり、米糠抽出物に低分子のものが多く含まれていることが分かった。マウスパイエル板細胞のIgA産生誘導活性の評価は、BALB/cマウスから小腸パイエル板細胞を単離し、各抽出物を添加して培養を行った。培養7日目に培地上清を回収し、ELISA法によってIgA産生量を測定した。その結果、米国産玄米タンパク抽出物に強いIgA産生誘導活性があることが明らかとなった。さらに、米国産玄米タンパクの抽出方法の検討を行ったところ、抽出時間が長くなるほど分子量9800付近のピークが小さくなることが分かった。抽出方法の異なる米国産玄米タンパク抽出物のIgA産生誘導活性を調べた結果、15hr、5%濃度抽出物の活性が最も高かった。以上の結果から、米国産玄米タンパク抽出物に腸管免疫賦活作用があることが明らかとなった。昨年度の結果から、分子量30,000以上の玄米タンパク抽出物に活性成分が含まれていることが明らかとなった。

また、玄米タンパク抽出物について経口摂取した時の腸管免疫賦活作用について検討を行い、玄米タンパク抽出物摂取によりパイエル版細胞のIgAの分泌が上昇する傾向が見られた。分子量で分画した結果、玄米タンパク抽出物の約70%が分子量3,000以下の成分であることが明らかとなった。そこで本年度では、活性成分を含む分子量10,000以上のサンプルを調製し、腸管免疫賦活作用がみられるか検討を行った。マウスに玄米タンパク抽出物の分子量10,000以上の画分を2、20、200 mg/kgの投与量で3週間経口投与を行った。糞中とパイエル板細胞培養上清中のIgA量を測定した結果、コントロールと比較して有意な上昇はみられなかった。一方、脾臓細胞上清中のIFN-γ産生量はコントロール群に比べて濃度依存的に上昇しており、Th1/Th2バランスが有意に上昇した。この結果から、玄米タンパク抽出物の高分子画分摂取により、アレルギー改善効果が期待された。腸管免疫系は、体内に侵入した有害微生物、病原菌などを認識し、生体を守る役割を果たしている。腸管にはパイエル板のような特殊な免疫組織が点在し、パイエル板から産生される免疫グロブリンA(IgA)が、腸管免疫において重要な役割を果たしている点に着目した。一方で、日本では食生活の欧米化により、1960年代中頃から米の生産量が消費量を上回るようになってきており、米の高付加価値化と有効利用が急務である。このため本研究は、米由来のタンパクや酵素分解ペプチドの腸管免疫系に関わる機能について、IgA産生亢進作用を指標として評価を行い、最終的には、米由来の機能性食品素材の開発を目指している。昨年度の結果から、マウスに玄米タンパク抽出物の分子量10,000以上を3週間投与すると、脾臓細胞上清中のIFN-γ産生量はコントロール群に比べて濃度依存的に上昇しており、Th1/Th2バランスが有意に上昇することが明らかとなった。そこで本年度では、卵白アルブミン(OVA)を腹腔内投与してアレルギーを惹起したマウスを用いて、玄米タンパク抽出物のアレルギー改善作用について検討を行った。マウスに玄米タンパク抽出物の分子量30,000以上の画分を2、20 mg/kgの投与量で24日間経口投与を行った。10日目と17日目にOVAを腹腔内投与し、アレルギーを惹起した。一方、脾臓細胞上清中のIFN-γ産生量はコントロール群に比べて濃度依存的に上昇した。また、IL-4は低下しており、Th1/Th2バランスが有意に上昇していた。さらに、OVA特異的IgEは濃度依存的に低下していた。以上の結果から、玄米タンパク抽出物の高分子画分摂取により、アレルギー改善効果が期待された。腸管には特殊な免疫組織であるパイエル板が点在し、産生される免疫グロブリンA(IgA)が、腸管免疫において重要な役割を果たしている。そこで、IgA産生亢進作用を指標として評価を行った結果、玄米タンパク抽出物(BRE)の高分子画分にIgA産生亢進作用があることを見出した。また、卵白アルブミンでアレルギーを惹起したマウスにBREを摂取させると、脾臓細胞のIFN-γ産生量は濃度依存的に上昇し、Th1/Th2バランスが有意に上昇していた。以上の結果から、BRE摂取により、アレルギー改善効果が期待できることが明らかとなった。
脱灰切片による簡便な骨組織観察法の開発とその応用

骨組織を塩化シアヌルで処理した後に脱灰切片を作製するとヘマトキシリン・エオシン染色で類骨組織を簡単に識別でき、この方法は吉木法として多くの研究者により利用されている。本研究では、吉木法を基にして簡便で優れた骨組織観察法を開発することを目的として、実験を行い、以下の結果を得た。1)組織化学的検索法の検討:破骨細胞を同定するのに利用されている酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)活性を通常の脱灰切片で検出すると、破骨細胞に同酵素の強い活性が認められたが、その他の細胞にも活性が検出された。一方、塩化シアヌル処理後の脱灰切片でTRAP活性を検出すると、TRAP活性は破骨細胞に特異的に認められた(J.Histochm.Cytochem.(39:1415-1420,1991))。2)骨標識法の検討:従来の方法で作製した脱灰切片ではテトラサイクリン(TC)などによる骨標識の観察ができないため、骨形態計測における動的パラメーターの解析が困難であった。そこで、TCとカルセインを投与したラットを用いて、塩化シアヌル処理が骨標識にどの様な影響を及ぼすかを検討した。塩化シアヌル処理を行った骨組織では、カルセインの標識線が脱灰切片でも観察できた例があったが、TCの標識線の観察は不可能であった。3)免疫組識学的検索:EDTAで脱灰後、塩化シアヌル処理した骨切片を用いてI型コラーゲン、オステオカルシンの免疫染色を試みたが、バックグラウンドが強く、良好な染色結果が得られなかった。4)In situ hybridization法の検討:EDTAで脱灰後、塩化シアヌル処理した骨切片で非放射線標識リボプローブ(オステオカルシン、I型コラーゲン)を用いてin situ hybridizationを行った。その結果、塩化シアヌル処理を施してもmRNAのシグナルが検出できる可能性が示唆された。通常の脱灰切片では石灰化骨組織と類骨が識別できないため、骨組織における石灰化の程度を検索できない。研究代表者の吉木はこの点を改良すべく種々の方法を検討し、塩化シアヌル処理後に脱灰切片を作製すると類骨組織を簡単に識別できることを見いだし、1973年に報告した。その後、この方法は吉木法として多くの研究者により利用されているが、さらに改良すべき点も残されている。そこで、本年度は現在までの吉木法に関する研究を基にして、簡便でさらに優れた骨組織観察法を開発することを目的として、実験を行い、以下の結果を得た。1)組織化学的検索法の検討:破骨細胞を同定するのに利用されている酒石酸抵抗性酸フォスファタ-ゼ(TRAP)活性を通常の脱灰切片で検出すると、破骨細胞に同酵素の強い活性が認められたが、その他に肺や脾臓のマクロファ-ジおよび骨芽細胞にも活性が検出された。一方、塩化シアヌル処理後の脱灰切片でTRAP活性を検出すると肺・脾臓のマクファ-ジや骨芽細胞はTRAP陰性となり、破骨細胞が特異的に染色された。この方法は破骨細胞を組織化学的に同定するのに有用な方法と考えられたため、J.Histochm.Cytochem.(39:1415-1420,1991)に報告した。2)骨標識法の検討:従来の方法で作製した脱灰切片ではテトラサイクリン(TC)などによる骨標識の観察ができないため、骨形態計測における動的パラメ-タ-の解析が困難であった。

そこで、本年度はTCとカルセインを投与したラットを用いて、塩化シアヌル処理が骨標識にどの様な影響を及ぼすかを検討した。そして、塩化シアヌル処理を行うことによって、カルセインの標識線を脱灰切片でも観察できる可能性を示唆する所見が得られた。現在、マイクロウェ-ブ固定後に塩化シアヌル処理を行い、さらに効率よく骨標識を観察できる方法を検討中である。3)免疫組織学的検索:EDTAで脱灰した骨切片を用いてI型コラ-ゲンとオステオカルシンを免疫組織化学的に検出するのに適した抗体を検討し、良好な染色結果が得られる抗体を入手することができた。それらの抗体を用いて塩化シアヌル処理した骨切片で免疫染色を試みたが、バックグラウンドが強くなりすぎて良好な染色結果が得られなかった。現在、種々のプロテア-ゼで処理した切片での免疫染色を検討中である。通常の脱灰切片では石灰化骨組織と類骨が識別できないため、骨組織における石灰化の程度を検索できない。研究代表者の吉木はこの点を改良すべく種々の方法を検討し、塩化シアヌル処理後に脱灰切片を作製すると類骨組織を簡単に識別できることを見いだし、1973年に報告した。その後この方法は吉木法として多くの研究者により利用されているが、さらに改良すべき点も残されていた。そのため本研究において我々は、現在までの吉木法に関する研究を基にして、簡便でさらに優れた骨組織観察法を開発することを目的として種々の実験を行い、以下の結果を得た。1)組織化学的検索法の検討:破骨細胞を同定するのに利用されている酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)活性を通常の脱灰切片で検出すると、破骨細胞に同酵素の強い活性が認められたが、その他に肺や脾臓のマクロファージおよび骨芽細胞にも活性が検出された。一方、塩化シアヌル処理後の脱灰切片でTRAP活性を検出すると肺・脾臓のマクファージや骨芽細胞はTRAP陰性となり、破骨細胞が特異的に染色された。この方法は破骨細胞を組織化学的に同定するのに有用な方法と考えられたため、J.Histochm.Cytochem.(39:1415-1420,1991)に報告した。この方法がヒトの骨組織でも応用可能か現在検討中である。2)骨標識法の検討:従来の方法で作製した脱灰切片ではテトラサイクリン(TC)などによる骨標識の観察ができないため、骨形態計測における動的パラメーターの解析が困難であった。そこで、本年度もTCとカルセインを投与したラットを用いて、塩化シアヌル処理が骨標識にどの様な影響を及ぼすかを検討した。我々は昨年度の本報告書で、塩化シアヌル処理を行うことによって、TCとカルセインの標識線を脱灰切片でも観察できる可能性があることを報告した。しかし、本年度の実験からこの結果は再現性が低いことが明かとなった。そのため、現在、塩化シアヌル処理標本をさらにマイクロウェーブ処理することなどにより、より効率よく骨標識を観察できるか否かを検討中である。3)免疫組織学的検索:EDTAで脱灰した骨切片を用いてI型コラーゲンとオステオカルシンを免疫組織化学的に検出するのに適した抗体を検討し、良好な染色結果が得られる抗体を入手することができた。4)最近、我々は脱灰切片で遺伝子の発現を検索できるin situ hybridization法を開発した。現在、塩化シアヌル処理切片でもこの方法の応用が可能か否かを検討中である。
複数のプロモーターによる脂肪酸活性化酵素mRNAの転写とその制御

脂肪酸活性化酵素は脂肪酸代謝の初発反応を触媒する鍵酵素で、その生成物であるアシルCoAは脂肪酸の分解系と脂質合成系という相反する2つの代謝系で利用される重要な代謝中間体である。本酵素のmRNAは5′非翻訳領域が異なる3種類が存在し、発現の組織特異性が異なる。本酵素の発現調節機構を解析するため、著者らは研究計画に掲げた以下の項目について研究を行なった。1.脂肪酸活性化酵素遺伝子の単離と解析ラットの本酵素遺伝子を単離し、その転写調節領域の構造を明らかにし、その結果、本酵素遺伝子の3つのmRNAの5′非翻訳領域はそれぞれ別々のエクソンに由来しalternative splicingにより3種類のmRNA(フォームA、BおよびC)が転写されることが明らかになった。2.脂肪酸活性化酵素遺伝子のプロモーター機能の解析それぞれのエクソンの上流域(A、B、C)とレポーター遺伝子を結合させた融合遺伝子を肝癌細胞に導入し、3つの領域ともブロモーター活性を有することを明らかにした。さらに、肝臓の脂肪酸活性化酵素mRNAはペルオキシソーム誘導剤であり肝臓のβ-酸化系を亢進させるdi-(2-ethylhexyl)-phthalate(DEHP)により誘導されるが、この時に誘導されるmRNAはフォームBおよびC-mRNAであることを明らかにした。これらの結果より、分解されてβ-酸化系で利用されるアシルCoAの生成がブロモーターB、Cにより、脂質生合成に利用されるアシルCoAの生成がブロモーターAにより主として制御されていることが示唆された。
膵癌術後再発予防のための新規治療の開発‐癌幹細胞マーカーDclk1に注目して‐

膵癌は予後不良な疾患であり、予後改善のために新規治療法の開発が急務である。本研究では、膵癌におけるDclk1に注目し、Dclk1をターゲットとした膵癌術後における新規治療法の開発を進める。Dclk1阻害薬であるLRRK2-IN-1(LRRK)によって、p-Chk1の発現がLRRKによって有意に減少した。GEMとLRRKの併用はGEM単剤に比べて有意に細胞生存率を減少させた。当科で手術を行った膵癌症例でのDclk1の発現を免疫染色で評価した。OSではDclk1高値群で有意に予後不良だった。膵癌においてDclk1はMAPキナーゼ経路を介した増殖に関与し、予後不良因子となり得ると思われた。Dclk1は大腸癌の癌幹細胞マーカーとして報告されたが、膵癌の前癌病変であるPanINの増殖にも関与するリン酸化蛋白である。膵癌は未だに予後不良の癌であり、膵癌に対する抗癌剤として従来からGemcitabineが用いられているが、その効果は十分とはいえない。本研究は膵癌術後再発予防を目的とした新規治療の開発のため、GemcitabineにDclk1阻害薬を併用することで増殖抑制効果が増強されるか否かを評価した。2016年度は、ヒト膵癌細胞株であるMiaPaca2、AsPC1、BxPC3を用いて、GemcitabineにDclk1阻害薬であるLRRK2-IN-1を併用した効果をCell proliferation assay、Western Blot(WB)、Flow cytometry(FC)などで評価した。Gemcitabine単剤に比べ、Dclk1阻害薬を併用すると細胞生存率やコロニー形成能は有意に低下した。我々はその機序として細胞周期に関与するChk1のリン酸化(pChk1)に注目した。WBではGemcitabine単剤によりpChk1の発現は亢進し、Dclk1阻害薬を併用するとpChk1の発現は抑制された。FCでは、GemcitabineによりDNA損傷を生じた細胞(H2AX陽性細胞)がpChk1の上昇により細胞周期が停止し、S期に留められていた。しかし、Dclk1阻害薬を併用するとDNA損傷を受けた細胞は、修復されることなく細胞周期が進行し、細胞死が引き起こされることが明らかとなった。以上より、従来から用いられているGemcitabineにDclk1阻害薬を併用することにより、膵癌細胞の増殖抑制効果が増強した。2017年度は動物モデルおよび臨床検体を用いた検討を行う予定である。1マウス担癌モデルの確立に時間がかかっている。2臨床での膵癌手術症例が少ないため、手術検体の確保が困難な状況である。2016年度は、膵癌細胞株を用いてGemcitabineにDclk1阻害薬であるLRRK2-IN-1を併用した効果をCell proliferation assay、Western Blot(WB)、Flow cytometry(FC)などで評価した。Gemcitabine単剤に比べ、Dclk1阻害薬を併用すると細胞生存率は有意に低下した。その機序として細胞周期に関与するChk1のリン酸化(pChk1)に注目した。WBではGemcitabineによりpChk1の発現は亢進し、Dclk1阻害薬を併用するとpChk1の発現は抑制された。Dclk1阻害薬を併用するとDNA損傷を受けた細胞は、修復されることなく細胞周期が進行し、細胞死が引き起こされることが明らかとなった。以上よりGemcitabineにDclk1阻害薬を併用することにより、膵癌細胞の増殖抑制効果が増強した。2017年度は当科の膵癌手術症例においてDclk1の発現が予後に相関するか否かを検討した。臨床検体は2005年4月2017年12月までに当科で膵癌に対して手術を行った35症例を対象とした。Dclk1・Ki67・pMEKの発現は免疫染色を行い、Histoscoreを用いて定量化した。中央値をcut-off値としてDclk1高値群(n=18)、Dclk1低値群(n=17)に分けた。患者背景や手術因子では両群間に有意差はなかった。予後に関しては、RFSは有意差がなかったが、OSはDclk1高値群が有意に不良だった。多変量解析を行うとDclk1発現と術後合併症が独立した予後不良因子となった。Dclk1が癌増殖に与える影響をみるためにpMEKとKi67の発現を評価したが、Dclk1高値群ではpMEKおよびKi67の発現が高値だった。以上より、膵癌手術症例においてDclk1は癌の増殖を介して予後不良因子となりうる可能性があると思われた。

当科で手術を行った膵癌症例でのDclk1の発現を免疫染色で評価した。OSではDclk1高値群で有意に予後不良だった。膵癌においてDclk1はMAPキナーゼ経路を介した増殖に関与し、予後不良因子となり得ると思われた。1皮下腫瘍など様々な担癌モデルでの作製を試みる。2過去の手術検体でのDclk1の発現を免疫染色で評価してみる。消化器外科学本年度の実験内容に変更はなかったが、当初予定していた実験試薬の変更により、2706円未使用額が生じた。この未使用額については、平成29年度の実験試薬の購入に充てる。
単純ヘルペスウイルス変異株を用いた膵癌腹膜播種モデルの治療

4.Parent virusへのreversionを防ぎ、安全性と腫瘍選択性の増強を目的として複数箇所のgene mutationを施行した新たなHSVベクターを開発中である。5.単純ヘルペスウイルス変異株(hrR3,L1BR1)の実験モデル系をヌードマウスからハムスターに応用し、よりhumanに近い免疫体系における実験を行い、遺伝子治療としての臨床応用に向けて検討中である。2.hrR3は単純ヘルペスウイルス(HSV)のICP6 geneを,L1BR1はHSVのUS3 geneをそれぞれinactivatedしたベクターであるが,更にparent virusへのreversionを防ぎ、安全性と腫瘍選択性の増強を目的として、同時に複数箇所のgene mutationを施した、新たなHSVベクターを開発中である。3.実験モデル系を、T-cell系の免疫系統を持たないヌードマウスから,ハムスターに応用し、よりhumanに近い免疫体系において、syngeneicなハムスター膵癌の腹膜播種モデルを作製し,これに対して単純ヘルペスウイルス(HSV)変異株であるhrR3,L1BR1を腹腔内投与して腫瘍を選択性に抑制する遺伝子治療実験を施行、臨床応用への実用化に向けて検討中である。
てんかんの形成過程における脳内モノアミンの役割ー脳内微量透析法を用いた検討ー

ラット左扁桃体に電極を、反対側同部位にガイドカニューラを植え込み、キンドリング形成過程における電気刺激前後のモノアミン代謝産物の変動を脳透析法により測定した。その結果、電気刺激後(200μA、2sec)1020分においてDOPAC、HVAの上昇を認めたが、5HIAAは変動を示さなかった。この所見はキンドリング形成初期(stage0)より認められたが、キンドリング全身痙攣時(stage5)においても形成初期と変動の幅はほとんど差がなく、痙攣の強さとDA放出、あるいは代謝亢進との相関は認められなかった。(第15回脳研究会において報告)。この結果の意義をさらに確認するため、キンドリング形成初期に種々の強さの刺激電流を与え、モノアミン代謝産物の変化とafterdischarge、痙攣出現の有無との相関を検討したが、一定の結果は得られなかった。扁桃体での脳透析ではDAを直接検出できないため、キンドリング形成に伴うDA系の機能変化を知る目的で、扁桃体キンドリング全身痙攣完成後のラットに対しメトアンフェタミンを投与し、投与後のモノアミン代謝産物の変化を反対側扁桃体で測定し、コントロール群と比較した。両者において差は認められず、ラット扁桃体キンドリングにおいてはDA系の機能変化が生じないか、あるいは脳透析法ではその検出に限界があるものと考えられた。扁桃体における実験に引き続き、同様の手法を用いて、扁桃体キンドリング形成過程に伴う線条件モノアミン代謝産物の変動を測定しているが、形成初期における所見は扁桃体での結果とほぼ同様で、部位の違いによる差を認めていない。麻酔下において,ラット扁桃体,線条体に微量透析プローベを植え込み,透析液中のモノアミン代謝物をHPLC法により測定したが,扁桃体では線条体のそれと比較してDOPAC,HVAは約10分の1,5HIAAは2分の1程度の回収量であった. DAは微量で検出できなかった.また向精神薬投与(haloperidol,desmethylimpramine)によるモノアミンイ謝物の変動を経時間に調べたが,麻酔からの覚醒,麻酔薬の再投与の時間設定による個体差のあることがわかった.次いで,ラット扁桃体にガイドカニューラを植え込み,ジャケットを装着し,無麻酔,無拘束で透析液よりモノアミン代謝物の測定を可能とした.明暗条件下において飼育中のラットにおいて扁桃体透析液中アミン体謝物には,日内変動のあることがわかった.ラット扁桃体キンドリング実験を行うにあたり,まず実験条件の設定と標準的薬物に対する扁桃体モノアミン代謝物の変化を知るため,無麻酔,無拘束で生理的食塩水,haloperidol,diazepamの腹腔内投与を行い,モノアミン代謝物を経時間に測定した.生食投与によって, DOPAC,HVA,5HIAAは変動しないこと,haloperidol(0.5mg/kg)ではDOPA,HVAは基礎値の約2倍に上昇するが,5HIAAは変動しないこと, diazepam(5mg/kg)では,いずれの代謝物にも変動が認められないことなどが明らかとなった.次いでラット扁桃体に電極を植え込み,電気キンドリングを行った場合,初期の段階では, DOPAC,HVAの上昇を認めるものの, 5HIAAの変動は殆んどないことが明らかとなった.以後の痙攣段階については現在検索中である,以上基礎実験をほぼ終了し,新年度より本実験にかかる予定である.ラット左扁桃体に電極を、反対側同部位にガイドカニューラを植え込み、キンドリング形成過程における電気刺激前後のモノアミン代謝産物の変動を脳透析法により測定した。
海産頭足類スルメイカ鰓組織に局在する塩濃度依存型トランスグルタミナーゼの生理機能

1.本酵素の生体内における真の基質の検索と同定......昨年度に引き続き、スルメイカ鰓組織トランスグルタミナーゼの生体内基質の探索を行った。すなわち、エラ組織全体をホモジネートし、蛍光性アミンであるMDC共存下で、トランスグルタミナーゼ反応を行い、取り込み反応に預かったイカ鰓組織のタンパク質を10%および3%ゲルを用いて電気泳動分析した結果、MDCの取り込みは、濃縮ゲルに入らない成分、分離ゲルに入らない成分に強く取り込まれており、ついで、200kDa,180kDa,100kDaの各タンパク質バンドに取り込まれていた。すなわちこれらが生体内の基質であると推定された。鰓タンパク質の主成分は、200kDaおよび40kDa成分であり、180kDaと100kDaのタンパク質は特に、酵素との親和性が高いと考えられた。ついで、MDC非存在下で架橋重合反応を行うと、180kDaと100kDa成分が架橋の進行とともに減少しており、この両成分が生体内の基質であると推定された。2.酵素の発現調節......イカ鰓組織の発現レベルを解析するに先立ち、酵素活性の変動を調べた結果、活性はイカの状態によらずほぼ一定レベルであった。この結果、本酵素は、刺激に応じて、遺伝子が活性化され発現する可能性は少なく、むしろ始めから損傷に対する備えとして組織内に蓄えられていると考えられた。すなわち、本酵素は遺伝子発現レベルでの調節は受けていないと考えられる。ただし、遺伝子レベルの解析については今後、更に詳細な検討が必要であると思われる(継続する予定)。3.酵素の生理機能に関する総合考察......イカ鰓トランスグルタミナーゼは、海水程度の0.5M Na Cl、10mMCa Cl_2によって著しく活性化し、鰓組織のタンパク質を、短時間に高度に架橋重合させた。鰓は常に海水や血液などの外的環境に晒されており、本酵素は、創傷時に組織に流入した塩によって活性化することで、血液凝固系を持たない海産軟体動物の止血因子として機能している可能性が非常に高いと考えられた。1.酵素の精製スルメイカ鰓を5倍量の20mM HEPES buffer、pH7.5-5mM EDTA-10mM 2MEで抽出し、60%飽和硫安塩析、Sephacryl S-300,ヒドロキシアパタイトの各クロマトグラフィーに供して精製した。分子量は約9万でこれまで報告の組織型トランスグルタミナーゼ(TG)と類似していた。2.酵素学的特性酵素活性は、サクシニル化カゼインとMDCを基質としpH-7.5,25゚Cで測定した。(1)イカ鰓TG活性は0.5MNaCl濃度付近で急激に活性化し、0.8M付近で約10倍となった。また、同濃度のKClでは活性化が小さかった。(2)活性発現にはCa^<2+>が必須で、Ba^<2+>,Mg^<2+>,Mn^<2+>,Sr^<2+>には活性発現効果が見られなかった。(4)反応至的pHは7.5-8.0付近にあり、25゚C.1時間のincubationではpH8.5-9.0で安定であった。(5) 0.5M NaCl存在下での熱安定性は25゚C,90minの加熱でも50%程度の活性が残存しており、ホタテTGよりNaClに対して安定であった。3酵素の生体内基質の検索イカ鰓タンパク質を基質として10mM CaCl_2,0.6MNaCl存在下、25°Cでincubateすると経時的に多くのタンパク質にMDCの取り込みが見られた。また、MDC非存在下では反応開始5分でSDS-PAGEゲルに入らない巨大なタンパク質架橋体の形成が見られた。イカ鰓水溶性タンパク質を基質とした場合も同様の架橋体が形成されたことから生体内での反応には水溶性タンパク質の関与も示唆された。