hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮体癌におけるＷｉｌｍｓ腫瘍遺伝子と細胞増殖及び血管新生での分子生物学的解明

WT1の発現は64症例(91%)に確認された。殆どすべての症例で、WT1発現は腫瘍細胞の細胞質に認められた。腫瘍細胞のWT1発現量はFIGO手術進行期分類stageII以上の進行群、子宮筋層浸潤を1/2以上認める群、分化度grade2以上の組織型高分化群で高値であった。MVDはFIGO手術進行期分類stageII以上の進行群、子宮筋層浸潤を1/2以上認める群、分化度grade2以上の組織型高分化群で高値であった。WT1とMVDとの間には正の相関関係が認められ、免疫組織化学染色でWT1とVEGFが同一部位に発現していることを確認した。本年度は、金沢大学婦人科において1995年から2002年までの間に初発子宮体癌に対して根治手術で摘出された70症例の標本における免疫組織染色(HER2、HER4、CD133、pFOX01s256、EGFR、PTEN、KRAS、PIK3CA、pErk、pFOX、FOX、pSGK、COX-2)に取り組み、これらの免疫組織染色とWT1の相対的発現量における関連性を検討した。よって、PIK3CAとWT1の免疫組織染色の相対的発現に関連性が認められ、HER2とWT1の免疫組織染色には発現量が関連する傾向が認められた。来年度は、平成23年度研究実施計画に加え、これらHER2、PIK3CAのウエスタンブロット法を行い、婦人科癌におけるWT1の役割について分子生物学的アプローチを用いた解明に取り掛かる予定である。来年度は、平成24年度研究実施計画に加え、上記研究を完了し、婦人科腫瘍におけるWT1の役割について、免疫染色における実際の検体でのWT1蛋白の存在がどの程度あり、実際の臨床データとの関連要因が何かを追求し、細胞株レベルからの分子生物学的アプローチによる婦人科腫瘍、特に子宮体癌とWT1との関連についての解明に取り掛かる予定である。子宮体癌に関連する癌細胞株(AN3CA、Hec-1-A、MFE280、MFE296、RL95-2、Ishikawa)のWestern blottingに関しては、表示するバンドが不鮮明であり、研究施設での冷凍庫の故障などが加わり、結果として不成功に終わっている。また、免疫染色(WT1、HIF-1、VEGF、HER2、CD31、PCNA)については免疫染色後のパラフィン切片標本を検鏡にて、WT1とCD31およびPCNAのlabeling indexとWT1発現には関連性が示されたが、その他については関連性は示されなかった。パラフィン切片標本を用いて免疫染色してから時間を経て検鏡したこともあり、評価が困難であったことは否めない。WT1は婦人科悪性腫瘍に広く分布したタンパク質であるが、正常細胞との比較検討を行うべきだったと考えられる。また、免疫染色は時間の経過とともに染色が薄くなり、評価を困難にさせていたことから、WT1の婦人科悪性腫瘍に対する客観的評価の更なる追加が今後の課題になると思われる。来年度は、平成25年度研究実施計画に加え、上記研究を完了し、婦人科腫瘍におけるWT1の役割について、免疫染色における実際の検体でのWT1蛋白の存在がどの程度あり、実際の臨床データとの関連要因が何かを追求し、細胞株レベルからの分子生物学的アプローチによる婦人科腫瘍、特に子宮体癌とWT1との関連についての解明に取り掛かる予定である。当初考えていたエフォートよりも少ないため。25年度が最終年度であるため、記入しない。臨床が多忙である点から研究成果が出せない状況で、研究が自身の思っている以上に進行できていない状況である。できる限りエフォートを増やせるよう、研究環境を漸次整える予定である。かつ、上記内容を遂行できるように、比較的時間に余裕を持ちつつ、綿密に計画して研究を滞りなく実施できるように努力する次第であります。
緑茶カテキンEGCGの細胞増殖に対する二面性制御機構の解明

本研究において、緑茶カテキンEGCGはその受容体である67kDaラミニンレセプター(67LR)を介してがん細胞増殖抑制作用を発揮する一方で、67LRの発現量が低い細胞に対しては逆に細胞増殖を促進するという二面性を明らかにし、それぞれのメカニズム解明を目指して検討を行った。《細胞増殖促進作用》がん細胞において、二面性制御因子67LR発現量を強制的に低減させることで緑茶カテキンEGCGの細胞増殖促進作用が観察されることを確認したが、十分なコンセンサスを得るには67LRを完全にノックアウトした細胞およびマウスの構築が必要不可欠であり、現時点では作製中である。評価系の構築中ということで、更なる検討が必要である。《細胞増殖抑制作用》67LRの発現が陽性であるがん細胞に対して、EGCGは細胞増殖抑制作用あるいはアポトーシス誘導作用といった抗がん作用を引き起こすことが明らかとなっている。当年は、EGCGによる抗がん作用の分子基盤の確立とともに、そうした情報を基に、EGCGの効果を増大させる組み合わせ効果について検討した。これまでに、遺伝子スクリーニングによりEGCGの細胞増殖抑制作用を仲介する因子として、Protein phosphatase 2A(PP2A)を同定している。一方、既存の抗がん剤の効果を弱めることが報告された因子がPP2Aにより負に制御される報告を受け、当年は、EGCG誘導性のPP2A活性化作用を活かし、EGCGによる抗がん剤の感受性増大を図った。結果、in vitroおよびin vivoにおいて、EGCGと既存の抗がん剤の併用効果の有用性を世界で初めて明らかにした。分子基盤情報を基に新たな組み合わせ効果を発見したことから、予定通り進展したといえる。【細胞増殖促進作用】遺伝子工学的手法を用い67LRの発現量を段階的に低減できるがん細胞株の構築に成功した。この細胞を用いることで、EGCGの二面性制御が67LRの発現に起因しているか否かを厳密に評価できるとともに、細胞レベルだけでなく動物レベルでの検証が可能になった。また、EGCGが細胞増殖を促進する正常ヒト末梢血リンパ球を用い、DNAマイクロアレイによりEGCGが及ぼす遺伝子変動を網羅的に検討した。正常リンパ球に対するEGCGのメカニズムに関しては不明であるため、本検討が新たな分子基盤の確立にあたって大きなインパクトを持っているといえる。【細胞増殖抑制作用】GSE法という網羅的解析を行い、EGCGのがん細胞増殖抑制作用を仲介している遺伝子を探索した。結果、18種類の候補遺伝子を見出し、中でもProtein kinase 2A(PP2A)に関しては、EGCGが67LRに結合した後のシグナル伝達において中心的役割を担っていることを世界で初めて明らかにした。さらに興味深いことに、難治性の皮膚がんであるメラノーマ細胞において、PP2Aの活性化を阻害するタンパク質が異常発現していることを発見し、このタンパク質をノックダウンすることで、EGCG誘導性のPP2Aを介した抗がん効果が顕しく増強されることを明らかにした。本検討を通して、EGCGの作用機序を解明し、PP2Aおよび上記のタンパク質がメラノーマ治療における新たなターゲットとして有効であることを明らかにしたことは大変意義深い。細胞増殖促進作用に関しては、新たな評価系の構築(細胞構築)が進んだが、具体的な関連性のある遺伝子の同定にまでは至っていないので、更なる検討が必要である。細胞増殖抑制作用に関しては、目的の遺伝子同定および新たながん治療戦略の標的因子を提示でき、予定通り進展しているといえる。【細胞増殖促進作用】新たに構築した細胞を用い、マウスに移植することで動物レベルでのEGCG誘導性細胞増殖促進作用を評価する。

また、DNAマイクロアレイで網羅的に解析した遺伝子情報から、EGCGの増殖促進作用に関連するものを絞り込む。【細胞増殖抑制作用】これまでに同定した候補遺伝子(PP2A)を中心に、文献情報からEGCGの作用機序を解明し、新たな分子基盤を確立する。さらに、EGCGが積極的にがん細胞の細胞死を誘導する作用も67LRを介していることが見出したことから、増殖抑制作用と共に致死活性の誘導作用についてもメカニズム研究を進める。
霊長類色覚視物質の赤外分光研究

本研究では色覚視物質に対する赤外分光法を用いた世界で唯一の構造解析を受けて、X線結晶構造解析により原子座標を決めることで色を識別するメカニズムをより詳細に理解することが目的である。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。霊長類(ヒト)の色覚を担う視物質は、試料調製が困難なことからX線結晶構造解析を含めた構造生物学的研究はこれまで皆無であった。そのような現状下、私は培養細胞により発現させた霊長類色覚視物質に対する赤外分光法を用いた構造解析を6年前に開始した。発現量の低さ、光退色や熱安定性、タンパク質の凝集など、数々の問題を克服することで、昨年末の青視物質のスペクトル測定の成功をもって、ついに赤・緑・青3色全ての色覚視物質のスペクトル解析を完了させることができた。そしていよいよ色覚視物質の原子座標を決めるという夢を実現するべく、今年の1月から米国のCase Western Reserve大学薬学部専攻長Palczewski博士の研究室に参入した。当研究室は分子基盤に基づいた視覚研究分野において世界をリードするラボであり、視覚研究に最適な研究環境が整っている。今回私は、これまでの経験からタンパク質の取り扱いが最も容易な霊長類(ヒト)緑感受性視物質の結晶化に向けた大量発現に取り掛かった。発現には昆虫細胞を用いた新たな発現システムを使用するなど、発現系の確立には困難をきわめたが、すでに培養溶液1Lあたりミリグラムオーダーのタンパク質の発現にも成功しており、結晶化という夢実現に向けて大きな一歩を踏み出すことができた。一方で、哺乳類細胞を用いた発現系と比較して、目的タンパク質の単離の際に不純物の混入による影響から純度が低い問題も生じてきており、タンパク質精製の最適化も今後行っていく予定である。色覚視物質も含めた膜タンパク質の結晶化は、親水性が小さいことや、不安定でゆらぎに富んだ構造を有することから結晶化には不向きとされている。そこで私は、親水性表面を拡張させる目的でモノクローナル抗体フラグメントとの複合体の結晶化にも取り組む。これには未変性のタンパク質の親水性表面の立体構造を特異的に認識して結合する抗体を産生する必要があるが、幸いタンパク質のゆらぎを最小限に抑えられる可能性がある抗体を産生することにも成功している。今後、色覚視物質との複合体検証実験を行うとともに、複合体の結晶化にも挑戦する予定である。最終的には、赤外分光解析から得た構造情報とX線結晶構造解析から得られる原子座標を組み合わせることで、色覚視物質の構造解析を完了させる。6年間の日本での赤外分光による構造解析を受けて、色覚視物質の原子座標を決めるという夢実現に向けて、今年の1月から米国に渡った。一般的に結晶構造解析には赤外分光解析の1桁以上の試料が必要となる。今回私は、大量の色覚視物質を獲得するため、昆虫細胞を用いた発現系の確立に取り組んだ。哺乳類細胞と違い、細胞の品質管理の難しさなど実験は困難をきわめたが、最終的に培養溶液1Lあたりミリグラムオーダーの色覚視物質の発現に成功し、Palczewski教授からも厚い信頼を得ることができた。目的タンパク質の大量発現は結晶構造解析における最初のステップであり、結晶化に向けての大きな第一歩である。昆虫細胞による発現系でミリグラムオーダーの色覚視物質を得ることができたことは、結晶化に向けての大きな第一歩である。今後は界面活性剤による色覚視物質の可溶化および精製条件の最適化を行う。可溶化でのタンパク質の抽出量は、その後の精製タンパク質の収量を左右するが、膜タンパク質の大半はこの可溶化ステップにおいて著しく構造安定性が低下し、変性や凝集の傾向が強まる。従って色覚視物質に適切な界面活性剤の選定を慎重に行う。また、親水性表面の拡張を目的に、色覚視物質とモノクローナル抗体フラグメントとの複合体の結晶化にも取り組む。すでにタンパク質のゆらぎを最小限に抑えられる可能性がある抗体を産生することにも成功している。今後、色覚視物質との複合体検証実験を行い、結晶化に挑む予定である。本研究では、霊長類色覚視物質の構造解析において残された青感受性視物質の大量発現系の確立および赤・緑感受性視物質と同程度の高精度なスペクトル測定を実現することが目的である。6年前より霊長類赤・緑視物質の赤外分光法による構造解析に取り組んできて、すでに両視物質問でタンパク質骨格や水分子を含む水素結合ネットワークの違いを見出してきた。さらに昨年度は部位特異的な変異タンパク質およびレチナールの同位体標識試料に対する高精度のスペクトル測定に挑戦し、構造の違いを生み出すアミノ酸や水分子の位置を特定し、構造基盤に立脚した波長制御メカニズムの理解をさらに深めることができた。今回私は残された青視物質の構造解析に向けた実験条件の確立、そして赤・緑視物質と同程度の高精度なスペクトル測定に挑戦した。青視物質の発現量は赤・緑視物質の1/10以下と報告されていることや、凝集しやすいタンパク質の特性など、構造解析に向けてさらなる困難を伴うことが予想されたため、、当初は実験条件の確立に2年は要することを覚悟していた。しかし発現量が多い霊長類間での種の選択や、これまでの赤・緑視物質に対する構造解析から得た知識と経験を活かすことで、昨年末にようやく1回分の測定に向けた試料を作製することに成功した(実験条件を最適化することで従来の3倍量の試料を得ることに成功)。

さらに緻密な波長依存性の実験など、十分な光照射条件の検討を重ねることで、世界で初めて霊長類青視物質の構造スペクトルを得ることに成功した。現在は赤・緑視物質の野生型および変異体のスペクトルとの比較考察により、赤・緑・青視物質が全く同一の発色団分子11-シスレチナールを用いていながら、いかにして異なる波長の光吸収を実現しているのか、それぞれに特異的なタンパク質ーレチナール問相互作用(波長制御メカニズム)を分子基盤に立脚して議論した論文を作成中である。本研究では色覚視物質に対する赤外分光法を用いた世界で唯一の構造解析を受けて、X線結晶構造解析により原子座標を決めることで色を識別するメカニズムをより詳細に理解することが目的である。本年度の研究成果の概要を以下に記述する。霊長類(ヒト)の色覚を担う視物質は、試料調製が困難なことからX線結晶構造解析を含めた構造生物学的研究はこれまで皆無であった。そのような現状下、私は培養細胞により発現させた霊長類色覚視物質に対する赤外分光法を用いた構造解析を6年前に開始した。発現量の低さ、光退色や熱安定性、タンパク質の凝集など、数々の問題を克服することで、昨年末の青視物質のスペクトル測定の成功をもって、ついに赤・緑・青3色全ての色覚視物質のスペクトル解析を完了させることができた。そしていよいよ色覚視物質の原子座標を決めるという夢を実現するべく、今年の1月から米国のCase Western Reserve大学薬学部専攻長Palczewski博士の研究室に参入した。当研究室は分子基盤に基づいた視覚研究分野において世界をリードするラボであり、視覚研究に最適な研究環境が整っている。今回私は、これまでの経験からタンパク質の取り扱いが最も容易な霊長類(ヒト)緑感受性視物質の結晶化に向けた大量発現に取り掛かった。発現には昆虫細胞を用いた新たな発現システムを使用するなど、発現系の確立には困難をきわめたが、すでに培養溶液1Lあたりミリグラムオーダーのタンパク質の発現にも成功しており、結晶化という夢実現に向けて大きな一歩を踏み出すことができた。一方で、哺乳類細胞を用いた発現系と比較して、目的タンパク質の単離の際に不純物の混入による影響から純度が低い問題も生じてきており、タンパク質精製の最適化も今後行っていく予定である。色覚視物質も含めた膜タンパク質の結晶化は、親水性が小さいことや、不安定でゆらぎに富んだ構造を有することから結晶化には不向きとされている。そこで私は、親水性表面を拡張させる目的でモノクローナル抗体フラグメントとの複合体の結晶化にも取り組む。これには未変性のタンパク質の親水性表面の立体構造を特異的に認識して結合する抗体を産生する必要があるが、幸いタンパク質のゆらぎを最小限に抑えられる可能性がある抗体を産生することにも成功している。今後、色覚視物質との複合体検証実験を行うとともに、複合体の結晶化にも挑戦する予定である。最終的には、赤外分光解析から得た構造情報とX線結晶構造解析から得られる原子座標を組み合わせることで、色覚視物質の構造解析を完了させる。6年間の日本での赤外分光による構造解析を受けて、色覚視物質の原子座標を決めるという夢実現に向けて、今年の1月から米国に渡った。一般的に結晶構造解析には赤外分光解析の1桁以上の試料が必要となる。
染色体1q21領域の増幅を認める多発性骨髄腫の臨床病態および分子病態の解析

ヒト骨髄腫細胞株を用いた検討では、染色体1q21領域の増加/増幅の多くは1番染色体そのものまたは長腕の増多に伴って起きたものであり、jumping/tandem translocationといった複雑な転座様式をとったものは約30%であった。未治療MM例とは異なり細胞株においては1q21の増加の有無や増幅様式の差と、13q14欠失、17p13欠失、Ig領域との染色体転座で脱制御されるCCND1やFGFR3、c-MAF、MAFBなどとの間に有意な相関は認めなかった。このことは、細胞株は進行期の病変から樹立されることが多いためと思われるが、MMにおいて1番染色体長腕その中でも特に1q21は特異な領域であることが改めて示唆された。20種類のヒト多発性骨髄腫(multiple myeloma; MM)細胞株のカルノア標本を作製し染色体1q21領域の転座様式について検討した。1q21領域は19細胞株で3コピー以上であった。検討したMM細胞株の分裂期核標本では、1q21領域の増幅は約半数以上でtandem duplicationまたはjumping translocationの形式であった。現在、MM細胞株を用いて1q21領域の増幅形式と、del13やIgH splitの有無との相関や、1q21領域増幅と相関性の高い染色体欠失領域の同定を試みている。またcytoplasmic Ig FISH法(MM細胞の細胞質Igをdouble-color FISHと同時に行い観察する手法)の確立をMM細胞株を用いて行った。今後は施設IRBで承認された臨床検体を用いて行う予定である。これらの研究成果は、極めて予後不良である染色体1q21領域の増幅を認めるMMの分子病態および臨床病態の解析にむけて必要なことであり重要なものである。平成20年度は平成19年度に行ったこれらの研究を推し進めると同時に、1q21増幅に関連性の高い特定遺伝子の同定やその機能解析を行う予定である。その他、一部のMM株および患者検体においてNF-κBの上流遺伝子であるNIK遺伝子がIg領域との転座により高発現しMM細胞におけるNF-κB pathwayの恒常的活性化を引き起こしていることを報告した(Cancer Cell 2007)。また1q21領域のコピー数の増加を認めるMM患者は、主に1番染色体の短腕に座位する遺伝子の発現低下と長腕遺伝子の発現増加を伴っていること、またこのような1番染色体上の遺伝子発現パターンの変化を認めるMM患者群は予後不良群を形成することを報告した(Blood 2007)。まずはヒト骨髄腫細胞株における1q21領域コピー数増加のパターンを検討するとともに、1q21領域のコピー数や増幅パターンに関連した他の細胞遺伝学的異常の検討を分裂期核FSIH法を用いて試みた。検討するに十分な分裂期染色体像が得られた11株のヒト骨髄腫細胞株において1q21領域のコピー数の増加は80%以上で認められ、その約半数以上が染色体数の増加に伴う比較的単純な増加であると考えられ、複雑な増幅形態をとることは比較的少ないと考えられた。ヒト多発性骨髄腫細胞株や臨床検体を用いたarray CGHの研究結果などから、1q21領域のコピー数の増加・増幅は1p、11q、13、16qのlossやdeletionおよび3、5、7、9、15、19染色体数増加との相関が示唆されていたが、多発性骨髄腫における代表的なコピー数異常の領域である13q14領域および17p13領域のコピー数と1q21領域のコピー数や増幅様式との相関を分裂期核FSIH法により検討したが有意な関係は認められなかった。他の領域に関しては現在検討中である。また臨床検体での実施を想定したcytoplasmic Immunoglobulin staining FISH(CIg FISH)の条件設定を細胞株を用いて行った、現在は症例の蓄積を試みているところである。1q21領域コピー数増加を有する症例ではサリドマイド投与の効果が得難いことが示唆されているため、今後は症例を用いて行う予定である。その他、新規の骨髄腫細胞株を樹立し現在解析中である。
ニワトリ砂のう筋ミオシン重鎖の構造分析

平滑筋の収縮機構を分子レベルで明らかにする研究の基礎となるミオシンの構造分析を行った。ミオシンは2種類の軽鎖4本と重鎖2本から構成される巨大分子である。軽鎖については我々がすでにその全構造を決定し報告しており、本研究では重鎖について分析を行った。1.ニワトリ砂のう筋ミオシンをATP存在下でIAEDANSによって修飾し、トリブシンで限定消化した。分解物から、Sephadex G-100のゲル濾過およびCM52カラムクロマトグラフィーを用いて、重鎖のN末端部に由来する分子量約24000のフラグメントを単離し、その全一次構造を一般的な方法を用いて決定した。このフラグメントは203残基のアミノ酸から構成され、N末端αアミノ基はブロックされていた。翻訳後に修飾されて生じたε-N-トリメチルリジンが骨格筋のものと相同する位置に存在していたが、ε-N-モノメチルリジンは存在していなかった。また、骨格筋ミオシンでATP結合部位の1つと報告されているTrp-130は、砂のう筋ミオシンではグルタミンに置換されていた。IAEDANSで修飾されたシステインはN末端から93番目に存在していたことから、この近傍の立体構造の変化がATPの結合と加水分解に伴って起ることが示唆される。2.ミオシンをATPの非存在下でIAEDANSで修飾し、パパインで限定分解した。分解物から上記同様な方法でミオシン頭部の重鎖のC末端に位置する203残基からなるフラグメントを単離し、その全一次構造を決定した。このフラグメントのC末端部53残基には酸性アミノ酸はまったく存在せず、塩基性アミノ酸が13残基存在するという特徴的な構造をしていた。3.現在、上記1と2のフラグメントの間に位置する50kDaフラグメントの構造分析を進めており、近い将来、砂のう筋ミオシン頭部の重鎖の全一次構造を決定できると考えている。
肺体血流連続測定装置の開発

昨年度までに作製した超小型血流測定プローベでは十分な信号受信が叶わなかったため、センサ部分の大きさの再考を要した。6mm角(前回の3倍に相当)のセンサを考案・作製し、工学的摸擬回路を用いた実験を行った。前年度までに作成した、Matlabにおける測定プログラムを使用し、シリコン樹脂を用いた工学的摸擬血流回路を用いた信号送受信の実験を行った。本回路においては前回同様信号の送受信は可能であることを確認し、その精度も前回同様10%程度であり、許容範囲内と考えられた。引き続き人工血管を用いた信号送受信の実験を行ったが、前回同様ePTFE人工血管部分における信号減衰が著明で、十分な信号を受信することができなかった。原因としては微小な空気の混入等が考えられ、疑似血液の塗布やエコーゼリーの十分な使用等行ったが、その改善には至ることはできなかった。一方、シリコンおよびニチノール製の形状記憶合金でセンサを支持できるかの検討を行った。ニチノールでの骨格及びセンサへの導線を内包したシリコン製カバーの設計を東北大学大学院工学研究科機械システムデザイン工学分野の協力を得て行ったが、高度な作製技術を要する形状となり、専門企業へのコンサルトを行い、センサの形状が確定した後に具体的な作製案を作成し、3Dプリンターでの作製を検討することとなった。計画では動物の血管組織を使用した測定実験を考慮していたが、生体血管に十分適する構造がまだ構想段階であったため本年度に施行することは見合わさざるを得なかった。当初の計画通りポリフッ化ビニリデン(PVDF)製のトランスデューサを作製するため、PVDFで直径2mmのトランスデューサを作製した場合のシミュレーションを行ったところ、多重積層構造でないと十分な信号が発生できないことが分かった。また、十分なS/Nを確保するためには1000V程度の高電圧をかける必要があり、体内で発生させる電圧としては過剰であると考えられた。シミュレーションの結果をうけ、PVDFで今回の目的に合致する、小型血流センサーを作製するのは技術的に困難と考えた。代替素材としてはセラミックを考えたが、従来広く使用されているPZTは鉛含有セラミックであり、体内留置を行う素材としては好ましくないと考えた。そこで協力企業である本多電子が作製した非鉛セラミックを使用してのトランスデューサの作製を検討した。この非鉛セラミックで得られる音圧はPZTと遜色なく、小型化が可能であると考えたため、非鉛セラミックでのprototypeの作製を開始した。当初径2mmの丸形のトランスデューサを作製したが、対象血管に接着する面を完全に平面化させるために電極を対側に設置する工夫を行ったところ、電極付着強度が足りず構造として困難であることが判明した。そこで2×2mmの角型のトランスデューサを設計し、金を使用してのはんだ付けを行うことで強度を確保した。トランスデューサを支える冶具に関しては、ノリル樹脂で作製し一対のトランスデューサを完全に対向させた位置で固定することにした。このprototypeを用いて、シリコン樹脂で作製した模擬回路での測定実験を行った。トランスデューサに電圧をかけ、もう一方のトランスデューサで信号を受信させ、デジタルオシロスコープで表示させたところ良好な信号の受信が可能であった。模擬回路を定常流で循環させ、⊿tをMatLabで計算させることが可能であった。当初計画していたポリフッ化ビニリデンでのトランスデューサの作製がシミュレーションの結果、困難であることが判明したため、当初の計画を見直し、新素材の選定を行う必要があった。今回協力企業である本多電子株式会社で特許取得している、非鉛セラミック素材を用いたトランスデューサの作製を検討した。まず初めに丸形で作製したが、電極のはんだ付けの強度がとれず、再度形状の変更を要した。結果一辺2mmの正方形型で作製しかつはんだ付けを金スパッタで行うことで強度を確保しえた。トランスデューサを固定する土台をノリル樹脂にて6mmの円柱状の菅腔構造物を挟み込めるように設計・作製した。このprototype作製に約1年を要した。作製したprototypeを用いて、まずシリコン樹脂にて作製した模擬循環回路での測定実験を行った。シリコン樹脂内に水を用いて定常流を生じさせ、測定を行ったところ良好な信号受信が可能であった。しかし目的の人工血管であるePTFEを回路に組み込んで測定を行ったところ、信号受信ができなくなった。現在原因を検索中であり、動物実験へ進めておらず、計画よりやや遅れている原因となっている。昨年度作製した血流測定プローベのプロトタイプを使用し、工学的摸擬血流回路にて血流測定実験を継続した。人工血管の血流測定は、エコー用ジェリーを人工血管内に充満させたりや十分長時間水に浸したりすることでporosity内の空気の除去を試みたが、受信信号の強度に改善が得られず、人工血管自体での超音波信号の減衰が予備実験の結果から得られた想定より強いことが考えられた。この克服のためには発信信号自体の強度を強めることが考えられたが、2mm角大の小型センサを作製したため、実験機材の最大出力を超過することが問題となった。また、体内留置を想定しているため、高い電圧は現実的ではなく、再考を要した。一方、シリコン樹脂を用いた工学的摸擬血流回路にてはやや弱いながらも信号を受信することができた。Matlabを用いたプログラムを医工学研究科の協力を得て作成し、流速測定の正確性を検証した。

送受信のドップラー効果による時間差⊿tを測定することができ、摸擬回路内の流速計との誤差は10%程度であり、許容範囲内と思われた。これにより信号の送受信が体内留置を想定した許容範囲内で、十分なS/N比をもって行われれば、測定が可能であることが確認された。この課題に対する今後の計画としては、測定対象を大きい血管に絞り、センサを大型化(6-10mm)をすることにより受信信号強度の改善を図ること、人工血管ではなく生体の血管を利用し工学的摸擬血流回路にて流量測定を試みることを現時点では検討している。人工血管を通過したセンサ受信信号が想定外に微弱であり、現在のプロトタイプでは工学技術的な課題を克服できていない。現時点で生体内で使用する品質まで至っておらず、動物実験が開始できておらず、計画より遅れている。昨年度までに作製した超小型血流測定プローベでは十分な信号受信が叶わなかったため、センサ部分の大きさの再考を要した。6mm角(前回の3倍に相当)のセンサを考案・作製し、工学的摸擬回路を用いた実験を行った。前年度までに作成した、Matlabにおける測定プログラムを使用し、シリコン樹脂を用いた工学的摸擬血流回路を用いた信号送受信の実験を行った。本回路においては前回同様信号の送受信は可能であることを確認し、その精度も前回同様10%程度であり、許容範囲内と考えられた。引き続き人工血管を用いた信号送受信の実験を行ったが、前回同様ePTFE人工血管部分における信号減衰が著明で、十分な信号を受信することができなかった。原因としては微小な空気の混入等が考えられ、疑似血液の塗布やエコーゼリーの十分な使用等行ったが、その改善には至ることはできなかった。一方、シリコンおよびニチノール製の形状記憶合金でセンサを支持できるかの検討を行った。ニチノールでの骨格及びセンサへの導線を内包したシリコン製カバーの設計を東北大学大学院工学研究科機械システムデザイン工学分野の協力を得て行ったが、高度な作製技術を要する形状となり、専門企業へのコンサルトを行い、センサの形状が確定した後に具体的な作製案を作成し、3Dプリンターでの作製を検討することとなった。計画では動物の血管組織を使用した測定実験を考慮していたが、生体血管に十分適する構造がまだ構想段階であったため本年度に施行することは見合わさざるを得なかった。現在のところePTFE人工血管を通しての信号受信が困難である原因は、素材内のごく小さなprosityと呼ばれる構造内の気泡もしくは信号強度の問題と考えている。人工血管を水に十分浸したが、改善が得られなかったため、porsityを埋めるため、コロイド成分を有した人工血液に十分浸しての測定実験を計画している。人工血液での測定が可能であれば、当初より予定していたブタを用いた動物実験を開始する予定である。人工血液を用いても信号が得られない場合、トランスデューサの大きさをまた、現在はノリル樹脂を用いた土台を用いているが、この土台では当初の予定である、着脱可能という要件を満たせない。そこで形状記憶合金であるニチノールおよびシリコン樹脂を用いて要件にあうセンサの土台を計画中である。現時点ではセンサの送信信号を増強させることが解決策の一つとして考えられている。
左右軸形成を制御するCaronteの左側特異的発現機構と下流遺伝子の探索

ニワトリ胚における左右軸形成は、ノード左側の限局したShhシグナルが側板中胚葉に広がり、Nodal発現を誘導するカスケードである。この過程において、BMPアンタゴニストであるCaronteは傍軸中胚葉左側で発現し左右対称に存在するBMPシグナリングを左側で抑制することでShh-Nodalシグナリングを仲介することが明らかになっている。しかしながら、Caronteの左側特異的発現制御機構はこれまで十分に検討されてこなかった。昨年度、我々はCaronteの発現誘導にはBMPシグナリングの阻害が必要であることを発見した。さらに新規BMPアンタゴニストであるDAN関連遺伝子Danaeを同定し、本遺伝子がnode近傍で発現しCaronteの左側特異的発現を制御する因子であることを発見した。本年度はそのBMPアンタゴニストとしての性質を証明するためにXenopus胚を用いた解析を行った。まず全胚に対する効果を解析した。二細胞期の両割球にDanae mRNAを注入したところ、注入胚において弱い背側化が誘導された。このDanaeによるXenopus胚の背側化は、Bmp-2 mRNAの共注入によって回復した。次にanimal cap assayを行った。Bmp-2 mRNA注入animal capは腹側中胚葉マーカーであるT4-globinを発現する。このときDanae mRNAの共注入によってその発現は濃度依存的に阻害された。以上の結果はDanaeが他のDAN関連遺伝子同様にBMPアンタゴニストとして機能することを強く支持する。ニワトリ胚における左右軸形成は、ノード左側の限局したShhシグナルが側板中胚葉に広がり、Nodalの発現を誘導するカスケードであるとみなすことができる。この過程において、BMPアンタゴニストであるCaronteはPAM左側で発現しBAPシグナリングを抑制することでShh-Nodalシグナリングを仲介することが明らかになっている。しかしながら、その詳しい左側特異的な発現制御機構は未だ明らかにされていない。これまでCaronteの発現はノード左側で発現するShhによって直接制御されていると考えられたが、Shhの直接のターゲット遺伝子であるptc1の発現とCaronteの初期の発現パターンは一致しなかった。このことは、Caronteが何らかの別の因子によって制御されている可能性を示唆する。また既知因子を用いてCaronte、の発現を制御する因子を探索したところ、BMPアンダゴニストがCaronte誘導能を持つことが明らかになった。このことはCaronteの発現誘導は何らかのBMPアンタゴニストによって制御されていることを示唆する。この仮説に該当する遺伝子を同定するために、ニワトリ初期胚で発現するCerberus/DAN関連遺伝子を探索したところ、新規DAN関連遺伝子Danaeが同定された。本遺伝子はノードの左側でCaronteより早く発現した。また、本タンパク発現細胞をノード右側に移植すると異所性のCaronteの発現が誘導された。このことよりCarontoはDanaeによって発現制御されていることが明らかになった。
炭素線ビームの輸送コードに関する高度化研究

本研究では、モンテカルロ法を用いた炭素線治療用ビームのシミュレーションシステムを構築した。Geant4ベースのPTSIMを利用し、炭素線治療の特徴である生物線量を計算する機能を追加した。またシミュレーションの結果の妥当性を評価するため実測との比較を行った。また初期ビームエネルギーの揺らぎも実測との評価で行った。その結果、飛程や深部線量分布に関しては僅かな差があるもののよく一致している。幾つか課題点が残るものの、本システムは治療ビームのシミュレーションシステムとして要望なものであり、今後も研究を進めていく予定である。炭素線治療は優れた線量分布と生物学的効果という特徴を持ち、効果の高いがん治療法として期待されている。しかしその機序は物理的な部分、生物学的な部分を含めて未解明で単純なモデルを仮定し適用している部分もあり、研究的な立場からも実用的な立場からもその解明が期待されている。炭素線ビームの物理的特性の空間的な構造は従来のペンシルビーム計算法では比較的単純な近似をおこなってきた。しかし、実際の炭素線ビームは物質と核破砕反応等の相互作用を起こすため、ペンシルビームの空間的構造はより複雑であることが予想される。また線質についてもそのスペクトル構造や、空間的な構造も現状では平均化した一定の値として仮定して用いられている。解決の手法として物理過程を確率論的に追えるGeant4などのモンテカルロコードの利用が有効である。25年度は生物学的効果を取り入れたモンテカルロシミュレーションコードの開発を行った。Geant4でトラック毎にLETを算出する関数を作成し、放射線の線量と生物細胞の生残率のモデルであるLQモデルのα及びβパラメータのLETとの対応関係から生物学的効果RBEを算出するプログラムを作成した。その検証を行っている。上記作業の中で、今後調達を予定している計算機の仕様を検討するために計算所要時間についても同時に計測している。またGeant4のシミュレーション結果が実際とどの程度合うか確認検証するために、本学の炭素線治療装置でのビームを用いた測定を行い、シミュレーションと比較する作業を開始した。途中ではあるが、上記内容について「名古屋陽子線治療センターPTSIM応用研究会」で報告発表を行った。炭素線治療は優れた線量分布と生物学的効果の特長をもち、効果の高いがん治療法として期待されている。しかしその機序は物理的な側面、生物学的な側面を含めて未解明で単純なモデルを仮定し適用している部分もあり、研究的な立場からも実用的な立場からもその解明が期待されている。平成26年度は高性能計算機を導入し、並列処理計算システムを構築した。また25年度より継続してプログラムの構築を行っている。炭素線治療は優れた線量分布と生物学的効果の特徴を持ち、効果の高い治療法として期待されている。しかしその物理学的生物学的学的機序は未解明で、単純なモデルを仮定している部分がある。炭素線ビームの輸送についても単純な近似を仮定してきたが、実際はより複雑であることが予想される。本研究では、炭素線治療のビームについてモンテカルロ法を用いたシミュレーションツールを構築し、そのために平成26年度に高速計算機を導入し効率化を図った。27年度はシミュレーションの妥当性を検証するために計算と実測を比較した。その結果、飛程は±0.5mm以内で一致している、一方多重散乱についてはGeant4の計算結果が実測より小さくなる傾向がある。この点についてGeant4の開発者グループに問い合わせをしているところである。またフラグメンテーション粒子の発生についてもモデル依存性や実測と違いがある。今後新規に採択された課題(基盤C「モンテカルロ法を用いた炭素線治療シミュレーションシステムの開発」(16K10385))でこれらの問題を追求する予定である。ビーム輸送におけるの位相情報を管理するツールがあることを本研究課題の実施機関中に判明した。今後本目的に利用できるか検討する予定である。尚、この研究内容については富山高専で行われた「富山PTSIM研究会」で発表し、更に2016年5月にプラハで開かれるParticle Therapy Co-Operative Group(PTCOG)で発表することが確定している。25年度より継続して構築しているソースコードについてGeant4のバージョンによる計算結果の違いがでてその検証の必要性がでてきた。特に阻止能の計算に影響している。この件については今後も調査する予定である。

尚、高速演算計算機を導入したものの、計算機を置く部屋の空調が故障し、計算機を稼働できなかった分、研究の進捗が遅れた。医学物理前年度より継続でシステムコードの構築を行う。またGeant4のバージョンのちがいのよるシミュレーション結果について引き続き検証を行う必要がある。実験的な検証は今回の課題の範疇ではない。実験的な検証を行うために別途課題を申請する予定であるが、そのための実験計画を最終年度で行う予定である。生物学的効果を取り入れた線量分布の計算コードの構築できた。現在その検証と計算速度の改善を検討している。実測との比較によるシミュレーションの検証についても本学の炭素線治療装置のビームを使った測定を開始している。2014年初めに新しいバージョンのGeant4がリリースされた。このバージョン変更によりプログラムの仕様が変更になりそれに合わせて本研究で開発しているコードの変更作業を行っている。また物理プロセスのシミュレーションの結果への影響も調査している。検証作業について既存の測定装置で十分かを検討している。他施設の研究成果との比較が可能か文献調査を行っている。以上を総合すると、現状では概ね順調に進展しているといえる。26年度は25年度の研究内容を継続しておこなうことになる。物理プロセスすなわち多重クーロン散乱や阻止能、核破砕反応のシミュレーションの検証を行うこと、MKMやLEMなど別の生物モデルを取り入れること、それらを取り入れたペンシルビームモデルを構築することである。GPUを使った計算の高速化については、他機関からの情報によると現状ではGeant4との親和性がよくないということあり、状況によっては別の高速化の手段を検討する可能性がある。早い計算速度を達成させるには、計算機のリソースの向上が必要となる。新しい高速CPUがリリースされるという情報があり、その発売を待つため予算を繰り越すことにした。新しい高性能CPUを掲載した計算機や、検証実験で新たに必要な装置の調達に充当する。
半導体ナノグレインの光散乱

本研究の目的は,半導体ナノグレインの特異な光散乱特性を明らかにし,光散乱法のグレイン表面の研究に対する有効正を実証することである.本年度は,この目的に沿って以下のような研究を実施し,以下の結果を得た.1.SiGe混晶膜でのグレイン成長と光散乱Si及びGeターゲットを同時スパッタして得られるSiGe混晶膜を熱アニールし,高分解能電顕観察及びラマン測定を行った.as-depositedのSiGe膜の電子線回折はハローパターンとなり,いわゆるアモルファス膜である.しかし高分解能TEM像には,約2nmの結晶グレインに対応した格子縞が明確に現われており,この膜がナノグレインの集合体であることが判明した.膜を熱アニールすると,ラマンスペクトルはブロードなものからシャープなものに変化する.これはナノグレインが約20nmの大きさまで成長したことによる.これらの結果は,ブロードなラマン成分がナノグレイン表面からの信号であることを示唆している.2.半導体ナノグレイン上での表面増強ラマン散乱通常,表面増強ラマン散乱は金属表面に吸着した分子についてしか観測されていないが, GaP, ZnTe, ZnO等のナノグレイン上に銅フタロシアニンを蒸着してラマン散乱を観測した所,最大700倍におよぶ強度増大が観測できた.この増強の大部分は,グレイン表面での電場の増強によって説明できる.3.マトリックス中のナノグレインSiOとCuClの同時蒸着, SiO_2とCdSeの同時スパッタリングにより,それぞれSiOx膜に埋め込まれたCuClグレイン, SiO_2膜に埋め込まれたCdSeグレインの良好なサンプルが得られた.今後これらの光吸収,発光,光散乱の測定を行う予定である.本研究の目的は,半導体ナノグレインの特異な光散乱特性を明らかにし,光散乱法のグレイン表面の研究に対する有効正を実証することである.本年度は,この目的に沿って以下のような研究を実施し,以下の結果を得た.1.SiGe混晶膜でのグレイン成長と光散乱Si及びGeターゲットを同時スパッタして得られるSiGe混晶膜を熱アニールし,高分解能電顕観察及びラマン測定を行った.as-depositedのSiGe膜の電子線回折はハローパターンとなり,いわゆるアモルファス膜である.しかし高分解能TEM像には,約2nmの結晶グレインに対応した格子縞が明確に現われており,この膜がナノグレインの集合体であることが判明した.膜を熱アニールすると,ラマンスペクトルはブロードなものからシャープなものに変化する.これはナノグレインが約20nmの大きさまで成長したことによる.これらの結果は,ブロードなラマン成分がナノグレイン表面からの信号であることを示唆している.2.半導体ナノグレイン上での表面増強ラマン散乱通常,表面増強ラマン散乱は金属表面に吸着した分子についてしか観測されていないが, GaP, ZnTe, ZnO等のナノグレイン上に銅フタロシアニンを蒸着してラマン散乱を観測した所,最大700倍におよぶ強度増大が観測できた.この増強の大部分は,グレイン表面での電場の増強によって説明できる.3.マトリックス中のナノグレインSiOとCuClの同時蒸着, SiO_2とCdSeの同時スパッタリングにより,それぞれSiOx膜に埋め込まれたCuClグレイン, SiO_2膜に埋め込まれたCdSeグレインの良好なサンプルが得られた.今後これらの光吸収,発光,光散乱の測定を行う予定である.
癌ワクチン開発を目指したバクテリア表層化学改変

本研究は、人間にとって有効な機能を有する生きたバクテリアの細胞表層を修飾し、新しい癌ワクチンなどの開発に役立てること目的としている。これまでに貞許らが開発た手法では、合成が容易ではなく大量合成が不可能な化合物を使っていた。本研究により、これに替わり簡単に大量合成できるグルコサミン誘導体を用いることができるようなった。今後は経口ワクチンへの応用などを目指した機能評価への展開が期待。本年度は、H17-18科研費若手研究A(課題番号16685016)「バクテリア表層化学改変法を利用したドラッグデリバリーキャリアの開発」の成果をもとに、より効率的な化合物の表面提示を目指して、細胞壁前駆体誘導体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc-1-phosphate)誘導体の利用を検討した。機能性官能基としてケトン基を導入したN-レブリノイル型の誘導体を用いた。乳酸菌(L.plantarum JCM1149)をMRS培地で3時間培養後、誘導体を培地に添加して15時間培養した。乳酸菌を遠心して回収しPBSで洗浄後、biotin-hydrazideおよびstreptavidin AlexaFluor 488 conjugateを順次用いて表面に提示されたケトン基を蛍光ラベルした。PBSで洗浄後、フローサイトメーター(FACS)を用いて菌の蛍光強度を測定した。FACSにより取り込みを評価した結果、水酸基をアセチル基で保護して疎水性を上げた誘導体が適していることがわかった。またグルコース0mMの人工培地を用いた場合、MRS培地だけで培養したときより3倍の蛍光強度が観測された。以上から、これまでのムラミルペンタペプチド誘導体よりも構造のシンプルなN-アセチルグルコサミン誘導体を用いて、効率的にバクテリアの表面修飾が可能となった。この結果について、2007年2月の高分子学会北海道支部会、2007年3月の日本化学会において発表した。投稿論文準備中である。シンプルな化合物でバクテリア表層の化学改変が可能になったことは、来年度からの癌抗原による修飾効果のアッセイ実験へとつながる成果である。昨年度の成果をもとに、乳酸菌の表面修飾の研究を進めた。細胞壁前駆体誘導体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)誘導体を用い、機能性官能基としてケトン基を導入したN-レブリノイル型の誘導体を用いた。論文投稿し、審査意見に基づいた追加実験を終了し、投稿準備中である。一連の実験により、より効率的な化合物の表面提示の系が確立できた。適切な前駆体構造(水酸基をアセチル基で保護し1位にリン酸基を導入したもの)を持った細胞壁前駆体を用いることで、より効率的なバクテリア表層修飾が可能となった。菌株の種類については8種程度新たに検討し、さまざまな株に有効であることが判明した。菌株は、特に細胞壁のタイプの違うものを含めて選定した。前駆体の取り込み経路については、リン酸基のないコントロール化合物との比較により、細胞壁生合成経路を通っていることが強く示唆された。さらに、細胞壁への取り込みの直接的な証拠として、ペプチドグリカンをリゾチーム処理し、質量分析によりペプチドグリカン構成成分にとりこまれた細胞壁誘導体の検出を検討した。天然型のピークが大きくでることにより、質量分析による検出はやや困難であったが、特異的に人工誘導体成分を濃縮することにより、とりこまれた成分が検出できつつある。また、この実験により、新たにペプチドグリカン構造の分析法としてこれまでになく小スケールの培養でできる質量分析が開発できたので、これについても論文投稿準備中である。このように、シンプルな化合物でバクテリア表層の化学改変が可能になり、応用可能性が広がったので来年度の研究に活かしてさらに研究を進めていく。生きたバクテリアの表層に目的の機能性官能基を提示する「バクテリア表層化学改変技術」を開発・改良してきたが、これまでは高度な合成を行う必要があった。そこで、昨年度にひきつづき、合成が比較的容易な化合物を使用した手法の確立をめざした。細胞壁前駆体誘導体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)誘導体を用い、機能性官能基としてケトン基を導入したN-レブリノイル型の誘導体をいくつか合成して比較検討し、より効率的な化合物の表面提示の系が確立できた。適切な前駆体構造(水酸基をアセチル基で保護し1位にリン酸基を導入したもの)を持った細胞壁前駆体を用いることで、効率的なバクテリア表層修飾が可能であることがわかった。また、前駆体の取り込み経路については、リン酸基のないコントロール化合物と比較することにより、細胞壁生合成経路を通っている可能性が高いことを示すことができた。これらの結果を整理して、ワクチン開発をめざしてin vivoへの応用も可能になる系として論文にまとめ、Chem.Eur.Jに投稿し、掲載された。

さらに、細胞壁への取り込みの直接的な証拠を得るため、ペプチドグリカンをリゾチーム処理し、質量分析によりペプチドグリカン構成成分にとりこまれた細胞壁誘導体の検出を検討する実験を昨年度に引き続いて行った。しかし天然型のピークがかなり大きくでることにより、質量分析による検出は困難であったのでこれについては今後の研究でも検討する予定である。また、これらの研究のなかで、ペプチドグリカン構造がこれまでになく小スケールの培養で質量分析により解析可能であることが判明したので、論文投稿予定である。以上、シンプルな化合物でバクテリア表層に目的化合物を提示させることができるようになったので、バクテリア表層化学改変という本手法の応用可能性が大きく広がったと言える。
αヘリックスを構成要素とする人工チトクローム系(電子チャネル)の設設・合成

昨年度電子チャンネルのアポ蛋白質部分の埋め込みに成功したので、9年度には金属ポルフィリン錯体をαヘリックスペプチド鎖の中にうめこみ、分子膜を貫通させる必要がある。ヘリックスペプチドあるいは金属ポルフィリン錯体を分子膜中で膜平面に対して平行ではなく垂直に配向させる方法が確立されれば、昨年度成功したような複雑な調製方法を行わずとも電子チャネル系を設計できると考え、以下の実験を推進した。疎水性ヘリックスペプチド(単純な系としてポリメチル-L-グルタメートを使用)のN-末端に親水基としてポリエチレングリコールを結合させた分子で気水界面における単分子膜を作成した。その結果、この系では表面圧の上昇にともない疎水部のヘリックスペプチドが界面に対し、はじめは平行な状態から立ち上がることが分子断面積から推定された。現在、ヘリックスペプチド部分の界面に対する角度を金基板上に作成したLB膜のRAS-FT-IRにより解析を行っている。さらに長鎖アルキル基の側鎖をもつ金属ポルフィリン錯体の気水界面での配向性を検討した。この際、通常の卵黄レシチン等のリン脂質を併用すると気水界面での単分子膜のUV-Vis測定(反射型セル部をもつ瞬間マルチ分光測光)では、金属ポルフィリン錯体は界面に対して平行に配向してしまい、電子チャネルとしては望ましくない配向になることがわかった。それに対し長鎖アルキル基(ステアリル)をもつ金属ポルフィリン錯体の場合、表面圧の上昇にともない、水界面での単分子膜のUV-Vis測定でFace to Face型のソレ-バンドのエクサイトンカップリングが測定された。このとき金属ポルフィリン錯体は界面に対して立ち上がっていると考えられる。我々は当初、電子チャンネルの設計を目指し、いくつかのαヘリックスペプチドを合成した。そのうちの一つがNP25である。両親媒性オリゴペプチドNP25 (EELGLLLHALAKLKGALLHLLAGEE)は常法により合成・精製・同定したものであるが、このペプチドはリポソームと共存させるとリポソームの膜融合活性があることが判り、まず、膜融合ペプチドモデルとして研究を行った。NP25に疎水部に2つのヒスチジンがあり、2つとも同じ方向を向いているように設計された。設計の段階では2本のヘリックスが2つのヘムによりバンドルされた構造を考えている。レシチンリボソームはリン酸緩衝液(50mM)中、超音波法により調製し、ゲルろ過により精製した平均粒子径100nmのものを用いた。膜融合過程は光散乱(DLS)、濁度、共鳴エネルギー移動(RET)法などで追跡した。卵黄レシチンリポソーム(EggPC)リン酸緩衝液中に25度でNP25を添加し、融合反応をDLSで追跡すると平均粒子径は時間とともに増大する。膜融合過程の詳細から最初リポソームにNP25を加えたとき、NP25は膜に水平になっていると考えられるが、一度膜融合を起こしたNP25は二分子膜リポソームを貫通し、安定な機能化リポソームを得ることができた。このことは電子チャンネルのアポ蛋白質部分の埋め込みに成功したといえる。
多色発光性有機ソフトクリスタルの創製と機械的刺激応答性の定量解析

「こする」などの機械的刺激に応答して蛍光やりん光の発光色が変化する「メカノクロミック発光」は、ソフトクリスタルが示す代表的な外部刺激応答特性の一つである。本研究では、機械的刺激に応答して多色間で発光色が変化する新規有機ソフトクリスタル群の創製、及び、機械的刺激に対する応答性を定量的に評価する手法の確立を通して、メカノクロミック発光性有機ソフトクリスタルの構造開拓と機構解明を行うことを目的としている。平成30年度の研究では、まず、新規に合成したジピレニルビチオフェン誘導体とN,N'-ジメチルキナクリドンからなる二成分系ソフトクリスタルが示す三色間メカノクロミック発光について、詳細な解析を行った。粉末X線回折、示差走査熱量分析、固体13C NMRスペクトルの測定から、ジピレニルビチオフェン誘導体が結晶状態と二種類の非晶質状態との間で相転移することが発光色変化の要因であることを明らかとした。次に、多彩なメカノクロミック発光特性を示す種々のイミダゾリルベンゾチアジアゾール誘導体の創製にも成功した。各種誘導体の単結晶X線構造解析、時間依存密度関数法による量子化学計算、領域内共同研究による1粒子蛍光観測等を通して、置換基の電子効果ではなく立体効果によって、機械的刺激を加えた際に発光波長が変化する方向が決まることを明らかとした。これらの知見は、新規のメカノクロミック発光性ソフトクリスタルを創製する上で有用となる設計指針を与える。一方、各種ソフトクリスタルの機械的刺激に対する応答性の違いを定量的に評価することを目的として、粉末試料に加える荷重と回転速度を制御した上で発光スペクトルをリアルタイムで観測することのできる自動回転装置を作製した。本装置を用いることで、イミダゾリルベンゾチアジアゾール誘導体の機械的刺激に対する応答性を定量的に評価することに成功した。当初の計画通り、二成分系有機ソフトクリスタルによる三色間メカノクロミック発光の機構を明らかとしただけでなく、新規に合成した各種イミダゾリルベンゾチアジアゾール誘導体の多彩なメカノクロミック発光特性を解析することで、機械的刺激に応答した発光波長の変化方向に関して興味ある知見を得ることができた。また、自作の自動回転装置を用いた機械的刺激に対する応答性の定量解析では、当初の計画とは異なる解析手法を考案・適用することで、定量評価法を確立することに成功した。さらに、複数の領域内共同研究を促進することで、当初の計画では想定していなかった新たな知見を得ることにも成功している。以上のように、本研究課題は当初の計画以上に進展している。平成31年度は、当初の計画通り、二成分系ソフトクリスタルについて種々の組み合わせを検討することで、幅広い波長範囲で多色間メカノクロミック発光を示すソフトクリスタルを見出す。また、平成30年度に得られた知見に基づき、多彩なメカノクロミック発光特性を示す新規ソフトクリスタルの創製にも取り組む。さらに、領域内共同研究により、種々のソフトクリスタルについて機械的刺激に対する応答性を定量的に評価することで、メカノクロミック挙動と機械的刺激に対する応答性との間に相関を見出す。