hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
三次元多重弾性散乱効果を考慮した構造部材の損傷評価の高精度定量化策に関する研究

研究計画に沿って得られた成果を要約すると次のようになる.1.三次元弾性多重散乱解析法の開発:数個のクラックに対して多重散乱効果を含んだ境界積分方程式系を定式化し,これをボルン級数型解法に変換し,多重散乱の影響を観察しながらクラックの開口変位を決定する方法を開発した.2.弾性散乱断面積の高速計算式の導出:散乱波の積分表現に遠方近似を導入することにより,弾性散乱断面積を散乱振幅の単位球面上の積分として計算する具体的表現式を導出した.3.複数クラックによる弾性散乱断面積の計算:入射波の進行方向に沿ってクラックが分布している場合,多重散乱効果は一般に大きいが,クラック間の距離がクラックの直径の2倍以上になると多重散乱効果はかなり小さくなることがわかった.4.部材内損傷,弾性散乱断面積及び散乱減衰間の関係式に関する検討:多重散乱の影響が小さい場合について,単位体積中の平均クラック個数,弾性散乱断面積および散乱減衰の関係式を示した.この関係式へのクラック間の多重散乱の影響度について検討し,上記3.の結果がこの関係式に対しても成立していることを確かめた.5.散乱減衰量の計測:分布クラックを有する供試体を作成して散乱減衰量を計測した.無欠陥供試体による参照波を利用して前処理を行った後の計測による散乱減衰量は解析による散乱減衰量と良く一致した.6.散乱減衰を利用した損傷度評価法の提案:上記の結果5.を基に,解析により弾性散乱断面積を計算しておき,散乱減衰量を計測して4.で求めたクラックの平均個数との関係式を利用することにより損傷量を推定する一手法を提案した.研究計画に沿って得られた成果を要約すると次のようになる.1.三次元弾性多重散乱解析法の開発:数個のクラックに対して多重散乱効果を含んだ境界積分方程式系を定式化し,これをボルン級数型解法に変換し,多重散乱の影響を観察しながらクラックの開口変位を決定する方法を開発した.2.弾性散乱断面積の高速計算式の導出:散乱波の積分表現に遠方近似を導入することにより,弾性散乱断面積を散乱振幅の単位球面上の積分として計算する具体的表現式を導出した.3.複数クラックによる弾性散乱断面積の計算:入射波の進行方向に沿ってクラックが分布している場合,多重散乱効果は一般に大きいが,クラック間の距離がクラックの直径の2倍以上になると多重散乱効果はかなり小さくなることがわかった.4.部材内損傷,弾性散乱断面積及び散乱減衰間の関係式に関する検討:多重散乱の影響が小さい場合について,単位体積中の平均クラック個数,弾性散乱断面積および散乱減衰の関係式を示した.この関係式へのクラック間の多重散乱の影響度について検討し,上記3.の結果がこの関係式に対しても成立していることを確かめた.5.散乱減衰量の計測:分布クラックを有する供試体を作成して散乱減衰量を計測した.無欠陥供試体による参照波を利用して前処理を行った後の計測による散乱減衰量は解析による散乱減衰量と良く一致した.6.散乱減衰を利用した損傷度評価法の提案:上記の結果5.を基に,解析により弾性散乱断面積を計算しておき,散乱減衰量を計測して4.で求めたクラックの平均個数との関係式を利用することにより損傷量を推定する一手法を提案した.研究の初年度に当たる本年度は,クラックによって全方向に散乱されるエネルギー総量をクラックの幾何学的断面積に換算表現した弾性散乱断面積の高速計算法の開発と予備実験計測を行い,以下のような知見を得た.1三次元弾性多重散乱解析法の開発この過程は散乱断面積を数値的に評価するための基本であり,クラックによる三次元多重散乱効果を含んだ解析法を如何に計算効率よく構築するかがポイントとなる.本研究ではボルン級数の算法を積分方程式の解法に採り入れ,(1)任意個数,任意配置のクラックに対する多重散乱を考慮した積分方程式系を導き,(2)積分方程式系のボルン級数型解法を構築し,(3)数値解析により解析法の有効性を確認した.2弾性散乱断面積の高速計算式の導出クラックの代表長に比べて遠方の球面上で散乱エネルギー総量の評価式を作成し,これをグリーン関数の遠方近似表現を利用して単位球面上の積分に変換することにより,散乱断面積の高速計算を実現した.一個のクラックに対する散乱断面積に関しては,MartinとWickhamによる半解析的結果が存在し,本研究による数値解析結果をこれと比較することにより,本方法による結果が十分な精度を有していることを確認した.3散乱減衰評価のための予備実験計測クラックを有しない供試体による参照波形の計測,分布クラックを有する供試体による散乱波形の予備実験計測を行った.このとき,分布クラックモデルの作成法が問題となったが,薄いゴムを利用してセメントペースト中に分布クラックモデルを実現し,供試体の厚さを調整することにより,散乱波形計測が可能となった.最終目標は局所域に分布して存在するクラックによる損傷の評価法を波動解析と減衰計測を組み合わせて提案することにあり,解析と計測の両面から研究を遂行し,次の知見を得た.1.局所的に分布したクラックによる弾性散乱断面積の計算:クラックが入射波の波面に沿って存在する場合には,クラック相互の多重散乱の影響は比較的少ないことが,また,クラックが入射波の進行方向に沿って存在している場合には,多重散乱の影響が大きくなることが明らかとなった.

後者の場合でも,クラック間の距離がクラック半径の4倍程度あれば多重散乱効果を近似的にではあるが無視して差し支えないことがわかった.2.部材内損傷,弾性散乱断面積及び散乱減衰の間に存在する関係式に関する検討:クラック間の多重散乱の影響が無視出来る場合について,単位体積中の平均クラック個数,弾性散乱断面積および散乱減衰の関係式を定式化した後,この関係式へのクラック間の多重散乱の影響度についても検討し,上記1.の結果がこの関係式に対しても成立していることを確かめた.3.計測による散乱減衰量の測定:分布クラックを有する供試体を作成して散乱減衰量を計測した.無欠陥供試体による参照波を利用して前処理を行った計測による散乱減衰量は解析による散乱減衰量と良く一致した.4.散乱減衰を利用した損傷度評価法の提案:上記結果3.を基に,解析による弾性散乱断面積,計測による散乱減衰量,及び2.で求めたクラックの平均個数との関係式を利用することにより,クラックによる損傷の一評価法を提案した.
軟骨・非軟骨細胞におけるコラーゲン分子の発現機構及び分子ドメインの機能解析

1.コラーゲンα1(XI)鎖、α1(V)鎖及びα3(V)鎖遺伝子の発現調節機構の解析:1)α1(XI)鎖:プロモーター上流-199が基本プロモーター領域であり、その中で-147-121に結合する因子が存在する。ルシフェラーゼやゲルシフトアッセイ等を用いて、ここにはCCAAT配列を認識するCBF/NF-Yが結合し、転写を正に調節をしていることを証明した。2)α1(V)鎖:同様にα1(V)解析を行い、最小のプロモーター活性を-250-80の領域に限定した。この領域内の三箇所に、Sp1、CBF/NF-Y、Sp1関連の因子が結合していることを見出した。その中でCBF/NF-Yは-134-106内にあるCAAAT配列を認識し正に調節していた。3)α3(V)鎖:ヒト遺伝子のプロモーター領域をカバーするゲノムDNAをクローニングし、この遺伝子の転写調節機構について解析した。基本的な転写には-129までの領域が必要であることがわかった。この領域には4箇所にタンパクが結合していた。その中で-122-117にはCBF/NF-Yで結合し、正の調節をしていることを示した。また、-101-96、-83-78にはレプレッサー因子が結合している可能性が強く示唆された。2.α3(V)鎖の組織分布及び機能:マウス胎盤組織において、羊膜や暖帯組織に発現が見られたが絨毛や脱落膜には見られなかった。胎児組織では転写産物は発生中の筋組織や腱組織或いは一部の骨形成に見られたが、タンパクは主に骨形成中の組織に見られた。N末端領域の23個のアミノ酸よりなる塩基性のペプチドには骨肉腫由来細胞株に対する細胞接着性があった。3.α1(XIX)鎖コラーゲン遺伝子欠損マウスの解析:下部食道括約部の電顕の観察で欠損マウスでは平滑筋周囲の基底膜の肥厚がみられ、平滑筋細胞周囲のスペースが広くなり、コラーゲン線維の増加が観察された。遺伝子欠損マウスでは神経自体の障害はみられないが、細胞外マトリックスを介した神経-筋肉間の刺激伝達の経路が障害を受けていると考えられた。α1(XI)鎖遺伝子のプロモーター領域の種々のDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に繋いだコンストラクトを用いて、その活性を調べたところ、-199-65に基本的な活性があることがわかった。この領域をカバーするいくつかのプローブを用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、-147-121に結合する因子を認めた。この領域だけを結合したコンストラクトを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行い、この領域のみで転写活性があることを確認した。この因子を同定する為に既知の因子のオリゴヌクレオチドを用いて競合アッセイ及び、抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行った。その結果、この因子は-136-132の逆向きのCCAATを認識するCBF(CCAAT binding factor)であることがわかった。

さらに、クロマチン免疫沈降アッセイ法により、in vivoにおいてもこの因子が結合していることがわかった。同様にα1(V)鎖においても、その基本的な活性領域を調べた。その結果、-231-80が基本プロモーター領域であることがわかった。この領域をゲルシフトアッセイを用いて、結合するタンパクの存在する領域を解析したところ、三箇所にタンパクが結合していることがわかった。これらのタンパクをオリゴヌクレオチド競合アッセイ法及びスーパーシフトアッセイ法を用いて調べ、上流側よりSp1/Sp3、CBF、Sp1関連因子が結合していることがわかった。その中でCBFが-121-117にある逆向きのCCAAT様因子であるCAAATを認識し、この活性に関与していることがわかった。2.プロα1(XI)鎖Nプロペプチド(Npp)の機能解析PCR法を用いてcDNAを増幅し、Npp(full length)及びその部分断片を含むGSTフュージョンタンパクを作製した。これらを用いてヘパリンとの結合能についてヘパリンカラムで調べた。その結果、Npp(full length)及びNppのC末1/3をカバーする領域にその結合能があることがわかった。また、可変酸性領域のエクソン6Bでコードされる領域も同様な結合能をもつことがわかった。1.α1(V)鎖及びα3(V)鎖コラーゲン遺伝子の転写調節機構の解析マウスα1(V)鎖遺伝子のプロモーター領域の解析において、基本プロモーター領域(_-231_-80)に、Sp1、CBF、Sp1様因子が結合することがゲルシフトアッセイの結果で明らかになった。更にこれらが機能的に働いているか解析する為に細胞を用いてCBFの変異型及びSp1の正常型を使って過剰発現の実験を行った。その結果、CBFの変異型ではドミナントネガティブ効果で活性の低下が有意に見られた。一方、Sp1の過剰発現においては効果は見られず、Sp1はα1(V)鎖遺伝子のプロモーター活性に寄与していないことが示唆された。私達はα1(V)鎖に類似の鎖であるヒトα3(V)鎖遺伝子のプロモーターをクローニングし、その構造及び機能解析を行った。TATAなしのプロモーターでフットプリンティングの結果、_-120及び_-70近傍にタンパクが結合している可能性が示唆された。スーパーシフトアッセイの結果、_-120近傍にはCBFが結合することがわかった。2.プロコラーゲン鎖のN末非コラーゲン領域の解析α3(V)鎖N末、非コラーゲン領域にある限局した塩基性領域にヘパリン結合性があり、骨細胞に対して有意に細胞接着活性があることがわかった。この領域には4カ所のヘパリン結合のアミノ酸配列が存在するが、実際に機能しているのは、その1カ所であることがわかった。1.V型collagen α3鎖遺伝子の転写調節及び骨組織における発現ルシフェラーゼアッセイを行い転写開始点より129bp上流までがヒトα3(V)鎖遺伝子のコアプロモーターであると推測された。この領域のDNA結合因子を調べるためにDNaseIフットプリンティングおよびゲルシフトアッセイを行った。-160-51bpに4箇所の核タンパクが結合する領域(上流よりA、B、C、D)が存在した。変異プロモーターを用いてその活性を検討したところ、タンパク結合領域Aには転写活性化因子が、タンパク結合領域B、Cには転写抑制因子が結合すると推測された。タンパク結合領域AにはCCAAT配列が存在しており、Competitionアッセイ、SupershiftアッセイおよびCHIPアッセイを行い、同領域にCBF/NF-Yが結合していることを証明した。
栄養教諭と連携した生活科・食育学習における保護者参加型授業デザインの開発と評価

2005年の食育基本法の制定,2008年の日本学術会議「食生活の教育」の提言により,子どもの食育における保護者や教育関係者の役割が示され,子どもを対象とした食育が重要視されている。学校現場において行われている食に関する教育では,家庭科以外に生活科の中で食物の内容を扱っている事例は多い。生活科における食育指導については,内容構成の具体的な視点及び生活科の8つの内容と食育を関連付けたり(林,2006),生活科における食育の有効性・可能性を授業実践例に即して明らかにしたりされている(野田ら,2007)。これらの先行研究を通して議論されているように,生活科における食育の授業開発は,重要な課題である。小学校学習指導要領生活編では,具体的な活動や体験を通して,自分自身や自分の生活について考えることが目標とされている。そこで,本研究では,栄養教諭と協同で「3色栄養(黄・赤・緑)」を軸にした生活科・食育学習における学校と家庭が連携した授業デザインの開発を行った。また,研究の目的は,栄養教諭の役割や指導内容および保護者参画授業の有効性を,実験授業および事前事後調査の結果に基づいた分析と考察により明らかにすることであった。具休的には,以下のことに取り組んだ。(1)生活科において食育学習を題材として,保護者と児童が協力して取り組むことのできる親子参加型授業のデザイン指針(目的・内容・方法・評価)を提案した。(2)栄養教諭の専門性を生かした授業デザインを開発し,学校・家庭連携型の食育学習の実験授業を神戸大学附属小学校で行われた研究発表会で公開し,分科会において,有効性を検討した。研究方法は,授業実践を通したデザイン実験アプローチであった。授業は,申請者が計画し,実施した。研究期間における具体的内容は,2つのフェーズにより構成された。第1フェーズ(4月8月)では,先行研究の検討を通して,授業デザインの基本的な方針を決定した。第2フェーズ(9月2月)では,実際に学校・家庭連携型の食育学習の授業を実践し,その成果に基づいて学習コミュニティの拡張性と親子それぞれの3食栄養についての知識深化との相関を分析的に評価し,授業デザインの精緻化を図った。本研究の成果は,論文化し,日本教科教育学会に投稿し(平成22年12月27日に受理),現在は審査中である。
グラフェントランジスタを用いたバイオセンシング技術の開発

現在最も移動度が高いグラフェンをチャネルとしたトランジスタを用いたバイオセンサの開発を行った。作製したデバイスは溶液のpHを0. 025の分解能を持って検出することが可能であることが分かった。また、抗体を用いたバイオセンシングは電界効果トランジスタを用いたセンサでは難しいため、代わりにアプタマーまたはフラグメント抗体を用いたバイオセンシングを行い、グラフェンがバイオセンサに適していることを証明した。本年度の研究成果として、まず何も修飾していないグラフェンを用いた行った、溶液pHの測定において、その解像度が0.03以下の高感度であること、またタンパク質の電荷の正負を変化させて測定した場合、電流の増減が変化することから、修飾をしないグラフェンは電荷の種類を検出できることを示した。その後レセプター分子をグラフェン上に修飾し、選択的なバイオセンシングを試みた。レセプター分子として、溶液中で形成される電気8重層の厚さ(約5nm)よりも小さな物質を選ばなければならないため、本研究では大きさが2-3nmであるアプタマーというオリゴヌクレオチドの一種を用いた。アプタマー修飾後、原子間力顕微鏡観察により高さ約3nmの物質がグラフェン上に隙間なく存在することが確認された。また、電気特性より、負に帯電したアプタマーの存在が正孔伝導を増大させることが証明された。修飾前後での移動度にも目立った変化は観測されず、アプタマー修飾がグラフェンに欠陥を導入していないことが分かった。アプタマー修飾したグラフェンはターゲット分子である免疫グロブリンEのみを検出することに成功した。免疫グロブリンEの濃度を変化させて解離定数を見積もった結果は、他の手法で検出されたものと同等の値を得ることができ、グラフェンによる生体分子検出の信頼性を示している。以上の結果は5件の国際会議(内招待講演1件}で発表を行い、2009年のインパクトファクターが5.429および8.580の学術論文雑誌に掲載を許可された。本研究機関内で抗原抗体反応の検出を行った。通常電界効果トランジスタを用いたバイオセンシングでは、溶液内に形成される電気二重層の厚さ(5nm)を超える大きさを持つ抗体(1015nm)をレセプターとしては利用できないという問題点があったが、本研究ではフラグメント抗体を用いることで解決を試みた。フラグメント抗体とは抗体の抗原と結合する部分のことを言い、抗体を酵素で分解することで得られるものであり、大きさは3皿程度であることから、デバイ長内で抗原抗体反応が起きることが予想される。フラグメント抗体をグラフェン上に固定化するために、1-ピレンブタン酸スクシンイミジルエステルという物質をリンカーとして用いた。この物質はピレン基がグラフェン上にπ相互作用によって強く結合し、スクシンイミドの部分がフラグメント抗体のアミノ基と反応する。このリンカーを用いることで、グラフェン上に欠陥を生じることなくフラグメント抗体を固定化することに成功した。この固定化はグラフェン電界効果トランジスタの伝達特性の変化からも確認された。その際、ほとんど伝達特性に劣化が見られないことから、本研究で用いた固定化方法は欠陥を生じさせず、結果移動度の減少が見られない優れた方法であることが分かった。最後に抗原を投入するとその濃度に応じた電流の変化が観測され、抗原抗体反応を検出できていることが分かった。また、カリウムイオノフォアであるバリノマイシンを含んだ塩化ビニル膜をグラフェン上に成膜し、カリウムイオンの選択的検出に成功した。本研究課題遂行により、グラフェン電界効果トランジスタが高感度バイオセンサとして期待できることを示すことができた。また、上記の結果は学術雑誌論文、国際会議上で発表を行い広く研究者・企業開発担当者に向けた報告を行った。
乳がん患者に対する情報提供を中心としたセルフケア支援プログラム開発に関する研究

本研究は、乳がん患者が治療に納得し主体的な療養行動を支援するために、"乳がん患者に対する情報提供を中心としたセルフケア支援プログラム"を開発することを目的とした。我々が行った初期治療過程にある乳がん患者および外来化学療法を受けている乳がん患者の情報ニードと情報探求行動の実態調査をもとに、本プログラムは以下の要素で構成した:つまり、(1)チーム医療を基本的スタンスとし、チームでの合意と協働で進める。(2)患者の情報ニードを踏まえたFace to faceの情報提供を重要視する。(3)患者がいつでも、必要としたときに、簡便に使用できる電子媒体およびリーフレットを活用できるようにする。本プログラム全体の情報提供の目標は、治療への意思決定と納得の援助、治療に取り組む内的エネルギー支援、および療養生活を組み込んだ日常生活の支援である。直接的な情報提供は、がんの診断時期、治療方法の選択時期、および補助療法中の時期に患者の情報ニードを視野におき実施する。情報提供のためのCDおよびリーフレットは、以下の様式を備えたものにした:具体的な情報を伝えるために文字情報だけでなく画像や動画情報を使用、乳がんに関する他の団体や組織にアクセスできる。また、情報内容は以下のもので構成した;つまり乳がんの基礎知識、検査・治療方法、乳がんの予防と早期発見(自己検診方法)、ストレス対処方法、など。本プログラムの効果についての検証結果を待たなければならないが、本プログラムは、情報提供を単ある知識やデータの伝達でなく、現実と治療への納得、医療者との信頼関係の確立、およびがんサバイバーとして生き抜くファイティングスピリットをケアすることにつながるケアプログラムとして意義があると考える。また、情報提供の質と提供方法を検討した本プログラムは、医療者主体ではなく患者の主導権が重要視される今日においてがん患者に対する重要なアプローチ視点であるといえる。今年度は以下の2点について調査を行い、グログラムの構成・内容を検討中である。1.初期治療を受けている乳がん患者を対象に情報ニードと情報探求行動を分析した結果、<乳がん診断時>、<術式選択時>、<術後補助療法中>が情報提供時期として重要な時期となっていた。<乳がん診断時>には死を払拭し恐怖を軽減して[ショックを和らげる情報]を必要としていた。また、[乳がんに対する基本的知識][病気の程度]を知ることは衝撃から回復し現実感覚を取り戻すために重要な情報となっていた。<術式選択時>は、[助かる保証]、[治療方法のメリット・デメリット]、[長期的な治療計画と見通し]を必要としており、生き残るため治療選択と同時に療養生活を見通すための情報も重要であった。<補助療法中>は、[治療の方法]、治療の[期待される効果とリスク]や[副作用と対処方法]を必要としていた。また、[再発予防の方法]、[受けている治療の妥当性を確認する方法]を求めていた。一方、対象者はインターネットや同病者など様々な情報探求行動をとっていたが、医師からの情報を最も信頼出来る情報として重視していた。以上より、治療時期を考慮した情報提供が重要である。2.米国メイヨークリニックにおいて、乳がん患者に対する情報提供の実際について情報収集した。診断時には、病気や治療方法についてパンフレットや治療成績に基づいて詳細な情報提供がされており、その中心はナースプラクティショナーが担っていた。患者が自分のニードに応じて情報収集するための施設設備も充実しており、プログラム作成するうえで重要な資料が得られた。今年度は以下の2点について実施した。1.乳がん患者に対する情報提供を中心としたプログラムの「乳がん体験者のための情報ファイル」の作成と評価方法の検討乳がん患者の情報ニードに対応するための情報提供プログラムの一つとして、以下の様式を備えた「乳がん体験者のための情報ファイル」を作成した:

(1)年齢を問わず簡便に使用できる(2)文字情報だけでなく画像や動画情報を入れることでより実際的で現実的な情報提供ができる(3)写真などの画像が鮮明でリアルな事実を伝えることができる、例えば乳房再建をしたときの審美性など(4)乳がんに関する情報提供をweb上で公開している団体や組織にアクセスできる(5)乳がん患者が長期に抱える不安やストレスに対する対処方法を取得するための情報を組み込むなど患者のセルフケア向上に繋がる情報提供となること。また、情報内容の構成は、(1)乳がんの基礎知識(2)乳がんの検査(3)乳がんの治療方法(4)乳がんの予防と早期発見のために(5)術後の上肢運動の意義と方法(6)リンパ浮腫と対策(7)日常生活について(8)ストレス対処方法(9)外観を整えるグッズ(10)サポートの活用とした。これらを乳がん患者に適用し、有益性、使いやすさ、セルフケアへの影響などの評価視点から有効性を調査する準備中である。2.乳がん患者に対する情報提供のあり方に関する調査乳がん患者の情報ニードに対応する看護の役割責任について検討するために、乳がん患者の看護に3年以上携わっている看護師を対象に、乳がん患者に対する情報提供の実態と情報提供に対する認識についてアンケート方式による調査計画を実施中である。今年度は以下の点について研究を進めた。1.乳がん患者への情報提供プログラムとしての「乳がん患者のための情報ファイル」の有用性の検証有用性の検証に先立ち、作成したファイルについて、わかりやすさ、有用性、内容の妥当性などについて検討し、文字情報をイラストへの置き換え、文字情報に写真情報の追加、わかりやすいイラストへの置き換えなどを行い、内容の一部を修正した。予定より遅れているが、これらをもとに検証にむけた調査の準備中である。2.乳がん患者に対する看護職による情報提供の実態調査本調査では、乳がん患者の看護に携わっている看護師を対象に、乳がん患者に対する情報提供の考えとその実際を調査し、看護職による情報提供の実態を明らかにすることを目的とした。乳がん手術の年間100件以上の140施設を対象に本調査への協力依頼を行い、68件の回答を得た。医師による患者説明時の看護師の関与については「病名告知」で"いつも・ほとんど同席する"が36%と最も高く、次いで「手術の説明と同意」、「手術結果の説明」、「化学療法の説明と同意」、「放射線療法の説明と同意」の順であった。看護師が乳がん患者に対して行う情報提供内容で、「術後の日常生活の注意点」は"いつもしている"80.3%と最も多く、次いで「術前患者に対する手術後の経過」「化学療法実施中の健康管理方法・副作用対策について」の順であった。
単離細胞系による腎膜輸送機構とその病態生化学的研究

腎尿細管由来の樹立細胞系であるLLC-PK_1細胞の〔^<14>C〕-α-メチルグルコシド取り込みに対して,腎近位尿細管局在性のD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)とD-プロパルギルグリシンの反応生成物が約95%阻害することが判明した. 320nm附近に吸収極大をもつこの物質は不安定で,構造決定に到らなかったが, NMRによる分析で2-アミノー4-ヒドロキシー2, 4-ペンタジエノエートーγ-ラクトンであることが強く示唆された.また, LLC-PK_1細胞膜をニトロセルロース膜上に単層作成し,この単層細胞膜を介してのNMRによるイオン輸送測定のための装置を開発した.腎尿細管膜輸送の病態を研究する目的で,ブタ腎臓からDAO-cDNAのクローニングを行い,その構造を決定した.このクローンを用いて, DAOの試験管内合成に成功し,また,単アミノ酸置換DAO変異体の試験管内合成にも成功した.さらに, ddY系マウス腎ホモジネートのDAO活性について,ほとんど活性を示さないものから,通常の活性を示すものまで,種々存在することを見出し,サザンおよびノザンブロットによる分析の結果, ddYマウスに見られる種々のDAO活性は遺伝子発現の場合の転写調節に由来する可能性が示された.ヒト尿プロカリクレインの活性化機構について,トリプシンを活性化酵素のモデルとして用いて検討した.トリプシンとプロカリクレインの反応初期における急激なカリクレイン活性の出現はプロペプチドの遊離によること,それに続くゆっくりとした活性上昇は1本鎖カリクレインの二本鎖への変換によることが示された.さらに,プロカリクレインの全アミノ酸配列を決定し,初期の活性出現がArg(-1)-Ile(1)の,二本鎖への変換がArg(87)-Gln(88)の水解によることが判明した.また, Asn(78),(84), (141)が糖鎖結合部位であることが示唆された.プロカリクレインとカリクレインの分子構造上の差は僅かであるが,免疫化学的性質に明らかな差のあることも示された.腎尿細管由来の樹立細胞系であるLLC-PK_1細胞の〔^<14>C〕-α-メチルグルコシド取り込みに対して,腎近位尿細管局在性のD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)とD-プロパルギルグリシンの反応生成物が約95%阻害することが判明した. 320nm附近に吸収極大をもつこの物質は不安定で,構造決定に到らなかったが, NMRによる分析で2-アミノー4-ヒドロキシー2, 4-ペンタジエノエートーγ-ラクトンであることが強く示唆された.また, LLC-PK_1細胞膜をニトロセルロース膜上に単層作成し,この単層細胞膜を介してのNMRによるイオン輸送測定のための装置を開発した.腎尿細管膜輸送の病態を研究する目的で,ブタ腎臓からDAO-cDNAのクローニングを行い,その構造を決定した.このクローンを用いて, DAOの試験管内合成に成功し,また,単アミノ酸置換DAO変異体の試験管内合成にも成功した.さらに, ddY系マウス腎ホモジネートのDAO活性について,ほとんど活性を示さないものから,通常の活性を示すものまで,種々存在することを見出し,サザンおよびノザンブロットによる分析の結果, ddYマウスに見られる種々のDAO活性は遺伝子発現の場合の転写調節に由来する可能性が示された.ヒト尿プロカリクレインの活性化機構について,トリプシンを活性化酵素のモデルとして用いて検討した.トリプシンとプロカリクレインの反応初期における急激なカリクレイン活性の出現はプロペプチドの遊離によること,それに続くゆっくりとした活性上昇は1本鎖カリクレインの二本鎖への変換によることが示された.さらに,プロカリクレインの全アミノ酸配列を決定し,初期の活性出現がArg(-1)-Ile(1)の,二本鎖への変換がArg(87)-Gln(88)の水解によることが判明した.また, Asn(78),(84), (141)が糖鎖結合部位であることが示唆された.プロカリクレインとカリクレインの分子構造上の差は僅かであるが,免疫化学的性質に明らかな差のあることも示された.人尿からプロカリクレイン及びカリクレインを同時にかつ迅速に純化する方法を開発した。両標品ともSDS-ゲル電気泳動上単一であり、プロカリクレインは完全に不活性で、N末端に7-アミノ酸残基からなるプロペプチドを有することが明らかとなった。また、活性化の機構を検討するために、トリプシンを活性化酵素のモデルとして用い検討を加えた。プロカリクレインに対するトリプシンの作用は特異的であり、Arg(7)-Ile(8)が速かに水解され活性化された。その後Arg(87)-Gln(88)が徐々に水解され、豚膵カリクレインに見られているように2本鎖カリクレインとなった。このものは1本鎖カリクレインに比して活性が高いことも判明した。レニン及びレニン結合蛋白質(RnBP)の腎内組織局在性を蛍光杭体法により検討した。

すでによく知られているように、レニンが傍糸球体細胞に局在していることが観察されたが、RnBPについては、ウサギ腎臓から精製した標品を羊に注射して得た杭羊杭血清でウサギ腎組織におけるRnBPの局在性をしらべたが、局在性は不明瞭であり、今後さらに詳細な検討を必要とするものであった。腎尿細管由来の樹立細胞系であるLLC-P【K_1】細胞のグルコース取リ込みに対するD-プロパルギルグリシン(D-PG)の作用について、LLC-P【K_1】細胞にも存在するD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)を豚腎から精製し、1夜D-PGと反応させ、除蛋白後反応生成物を逆相クロマトグラフィーで分離した。320nmでモニターした溶出液の1分画が〔【^(14)C】〕-α-メチルグルコシドのLLC-P【K_1】細胞内への取込みを約95%阻害し、NMRによる分析で、この成分が2-アミノ-4-ヒドロキシ-2,4-ペンタジエノエート-γ-ラクトンであることが強く示唆された。
糖類を不斉源としパラジウム触媒を用いる生理活性物質の高選択的合成プロセスの開発

環化反応は複雑な骨格を合成するのに有効な手段である。特にパラジウム触媒による中性条件下での環化反応は、官能基選択性が高く、しかも温和な条件下で進行するので、分子内に不安定な官能基を持つ場合などに優れた方法となりうる。今回は本研究テーマの基礎研究として、光学活性なエンオキシドや炭酸アリルエステル類のPb触媒による不斉環化反応を検討した。1.エンオキシドの不斉環化反応と1,25-【(OH)_2】-ビタミン【D_3】の合成(図-1)に示す4種類のキラルなエンオキシド【1!】,【2!】,【3!】,【4!】を合成し、Pb触媒による環化反応を検討した。その結果、総ての系において高い位置、立体選択性が得られた。これらの結果を基にしてエンオキシド【4!】を、(式-2)に従ってステロイドCD環並びに側鎖を合成した。またA環部分【9!】はマニトールよりシアンヒドリン【8!】を導き、その分子内アルキル化反応より合成した。2.炭酸アリルエステルの不斉環化反応(図-4)に示す4種類のキラルな炭酸アリルエステル【(10)!】【(13)!】を合成し、Pb触媒による環化反応並びにπ-アリルパラジウム錯体のラセミ化機構について検討した。
回転円柱面上の薄層水流に発生する波の研究

ストリップ連鋳法による薄版の製造においては,自由表面に発生する波は製品の湾曲,ヒビ割れなどに関係するため,その発生は極力抑えねばならない.溶湯と水は凝固点が全く異なるが,過去の計算及び実験により,薄層流の速度境界層,温度境界層ともきわめて薄く,自由表面に発生する波は,ポテンシャル流の領域での現象であることが分かった.そのため,研究は先ず,円柱面上の薄層水流で行った.本水面の不安定現象は外力型不安定性によるもので,水面の曲率半径,水塊の角位置,水の密度,表面張力,速度,重力の加速度などが関係する主要なファクターである.簡単な近似を行なうことにより,水面が不安定にならない水面波の波長と角位置の関係が得られた.一方で,円柱面上の薄層水流の実験により,波の波長と不安定化する角位置の関係を求めた.波高が100分の1mmのオーダーの波の測定は困難をきわめたが,結果として,かなり精度のよい測定ができた.これらの理論計算結果と実験値を比較した結果,両者はよく一致した.ストリップ連鋳法による薄版の製造においては,自由表面に発生する波は製品の湾曲,ヒビ割れなどに関係するため,その発生は極力抑えねばならない.溶湯と水は凝固点が全く異なるが,過去の計算及び実験により,薄層流の速度境界層,温度境界層ともきわめて薄く,自由表面に発生する波は,ポテンシャル流の領域での現象であることが分かった.そのため,研究は先ず,円柱面上の薄層水流で行った.本水面の不安定現象は外力型不安定性によるもので,水面の曲率半径,水塊の角位置,水の密度,表面張力,速度,重力の加速度などが関係する主要なファクターである.簡単な近似を行なうことにより,水面が不安定にならない水面波の波長と角位置の関係が得られた.一方で,円柱面上の薄層水流の実験により,波の波長と不安定化する角位置の関係を求めた.波高が100分の1mmのオーダーの波の測定は困難をきわめたが,結果として,かなり精度のよい測定ができた.これらの理論計算結果と実験値を比較した結果,両者はよく一致した.回転円柱面上で、直接薄板を製造するストリップ連鋳法の試みの中で、重要な問題の一つは、液面に発生する波と流れの乱流遷移である。このうち本研究では乱流遷移よりも小さいレイノルズ数(或いはブルード数)で発生する水面波の測定を行った。微小振幅波の測定は、レーザ・ビームを円柱表面に垂直にあて、その拡散反射波の光路が水面で屈折するという原理を用いて行った。この光学的方法は、数値シミュレーションにより、測定値の精度がよいことは分かっていた。しかし、測定値のFFT処理の結果及び更に詳細な数値シミュレーションにより、測定値は円柱が回転しているときには回転振動の影響を受け、更に2種類の波が共存するときには、非測定対象の波の影響も予想以上に大きいことが明らかとなった。そのため円柱を止めた状態で光学的方法と探針法の両方法による同時測定を行い、コヒーレンス関数、位相遅れ角などを比較した結果、波長が10mm程度以上(実験では300Hz程度以下)の波であれば探針法でも光学的方法と比べて遜色ない程度の精度で微小振幅波を測定できることが分かった。円柱表面上の薄層水流に発生する水面波は波長が比較的長いものから順次発生することが従来の実験から分かっているので、以後探針法を用いて実験をすすめた。簡単な安定性解析の予想どおり、波長の長い波ほど増幅しやすいことが分かった。一方、Pedley(J.Fluid Mech.,Vol.30,Part I(1967))は無重力下の回転自由表面の水面安定性解析を行っているが、本研究でもこれを参考にして重力下の円柱面上の水流の自由表面の安定性解析を行った。しかし、解析の途上Pedleyの考え方に欠陥があることが判明したので、現時点では安定性解析をやり直している。回転円柱面上で,直接薄板を製造するストリップ連鋳法の試みの中で,重要な問題の一つは,液面に発生する波と流れの乱流遷移である.このうち,本研究では乱流遷移よりも小さいレイノルズ数で発生する液面波の研究を行っている.しかし,溶湯の薄層流に発生する波の実験的研究は,極めて困難である.一方薄層水流の理論的・実験的研究の結果(機論(B),54-502),境界層厚さは厚くて0.5mm程度で,温度境界層を考えても水深方向の深さの大部分はポテンシャル流であることは明らかであり,レイノルズ数その他の諸パラメータも溶湯と水は非常に近い.そのため薄層水流で波の研究を行うことになった.その結果,種々の興味ある波の発生が観察された(機論(B),56-522,57-535).その中で,もっとも低速で発生する波は円柱周方向進行波と軸方向定在波である.この波の測定そのものが困難を極めたが,研究の結果(ASME,FED-Vol.229(95年8月),機論(B),63-605(97年1月),写真測量とリモートセンシング,36-1(97年3月)),探針法でも必要な精度で測定できることが明らかになった.これらの研究と並行して水面安定性解析の理論的研究を行ってきている.

筆者らは,この波の成長は外力形不安定現象によるものと理解している.すなわち,円柱頂点から流下するに従い,遠心力はやゝ増加する程度であるが,重力の円柱半径方向成分は急速に小さくなり,真横で零になる.このアンバランスを表面張力がどこまで補えるかという問題である.近似を可能な限り少なくした理論解析の結果の式は得ているが,複雑を極めたものであるため,高速パソコンを2台購入して計算をしている.しかし,計算は遅々として進まない.一方,かなり大胆な近似を行えば,水面安定のための解析解が得られ,その結果は実験結果とかなりよく一致する.これに関しては学会に報告する準備を進めているところである.
垂直磁化膜を有する強磁性トンネル接合を用いた次世代磁気センサの開発

強磁性トンネル接合(MTJ)の電気抵抗は,トンネル磁気抵抗(TMR)効果によって外部磁場に応じて変化するため,磁気センサ(いわゆるTMRセンサ)に応用できる.TMRセンサは,高感度・低消費電力・微小サイズといった優れた特長を持つことから,自動車産業における各種磁気センサへの応用が期待されている.本研究では,±1 kOe以上の広いダイナミックレンジが必要とされる,バッテリの電流検出に用いる車載用磁気センサへの適用を目指し,面内磁化-自由層と積層反強磁性(SAF)構造を用いた垂直磁化-固定層を有するTMRセンサを世界で初めて開発した(本構造に関連する2件の特許を出願中).また,その実験結果を,本研究で構築した理論モデルと比較することで,TMRセンサの性能を決めるメカニズムを明らかにした.本研究で作製したTMRセンサは,そのSAF構造の大きな反転磁場に由来して,±2.5 kOe以上の極めて広い磁場範囲において,線形な磁気抵抗曲線を示した.このダイナミックレンジの大きさは,目標値である±1 kOeを十分に満たし,かつ,これまでに報告されているTMRセンサの中で世界最大である.また,そのセンサ性能を評価したところ,その感度と非線形性はいずれも,自由層の異方性磁界の増大とともに,単調に減少した.この実験結果は,本研究で構築した理論モデルと定量的に良く一致した.したがって,この理論モデルは,所望の性能を示すTMRセンサを設計するための指針として利用できると結論づけられる.これらの研究成果は,SAF構造を用いた垂直磁化-固定層を有するTMRセンサが,広いダイナミックレンジが必要な磁気センサのための,最も有力な構造であることを実証するものである.車載応用以外にも,広いダイナミックレンジを有する磁気センサとして,既存のホール素子などを置き換え,幅広い用途で活躍することが期待できる.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
逆ミセル系における液滴合一挙動

本年度引き続き、多孔板塔を用いた逆ミセルからのタンパク質の逆抽出を想定して、水滴の油水界面との合一挙動を調べた。前年度の塩の影響を踏まえてタンパク質の影響を調べた。考慮したファクターについては、タンパク質の種類、タンパク質濃度、タンパク質の移動方向を変えて合一実験を行った。まずはモデルタンパク質としてリゾチームを用いて行った。油水界面に付着させる水滴の溶液条件はリゾチームが油相から逆抽出する条件としない条件に設定し油相から水相へのタンパク質の移動がある場合とない場合を比較した。逆抽出移動がない場合は、油相中リゾチーム濃度の増加に伴って合一時間は長くなった。これは逆抽出移動がなければタンパク質を含む逆ミセルが水滴と油水界面間により多く存在することになり、そのミセルが界面と相互作用を及ぼすことにより油相排除が抑制された結果ではないかと考えられる。逆抽出がある場合は、合一時間が小さくなる結果となった。これは油相から水滴へタンパク質の移動が起こり、界面変形が盛んになり合一しやすくなった効果と、界面間の逆ミセル数が減少し障壁が少なくなった効果ではないかと考えられる。タンパク質の性質の違いの合一時間への影響を調べるためにリボヌクレアーゼAを用いて合一実験を行った。リボヌクレアーゼAはリゾチームに比べて全体的に合一時間が長くなる傾向があった。原田ら(表面,1997)の研究より、それぞれのタンパク質の逆ミセル内での存在位置は、タンパク質表面の疎水性と親水性のバランスの違いによりリボヌクレアーゼAは内核水の中心部に、リゾチームは界面活性剤壁近傍に可溶化していることが分かっている。この事実から、界面活性剤壁近傍に存在することによりリゾチームが系の界面張力低下に及ぼす影響はリボヌクレアーゼAよりも大きく、界面変形をより容易にしていると考えられる。このことが合一促進の原因ではないかと考えられる。この知見を基にして多孔板塔設計を行っていこうと考えている。逆ミセル系における液滴の合一について各種条件を検討した。本年度は、多孔板塔を用いた逆ミセルからのタンパク質の逆抽出を想定して、水滴の油水界面との合一挙動を調べた。現有の合一モジュールを用いて界面での合一現象をデジタルビデオカメラを用いて記録することにより、その画像を解析ソフトで画像処理し、滴合一時間、滴径を求めた。界面活性剤としてAOTを含むAOT逆ミセル系で、水相の塩には塩化カリウム、タンパク質には卵白リゾチームを届いた。タンパク質の正抽出が起こる系では、リゾチームが水滴や合一界面から逆ミセルを形成することによる界面間の合一に対するバリア的効果と、塩濃度増大による界面張力増大の効果がバランスした結果となった。タンパク質の逆抽出が起こる系では逆にタンパク質を含む逆ミセルが界面で破壊する効果が合一を促進させた。塩の存在の影響を調べるために、塩を含まない系を行ったが界面活性剤の水相への溶解、タンパク質の沈殿・凝集が起こりそれがバリアとなり合一時間は増加した。タンパク質が存在しない系では、塩濃度増加が合一時間を著しく増加させた。これはタンパク質が界面に対して積極的な変形を促していることを示唆する。界面活性剤のバリアの影響を調べるために界面活性剤を含まない系を行った。存在する系に比べ当然の結果として界面張力が20倍大きくなり、それに伴って水滴自体が3倍大きくなり、重力による界面間油相排除により合一時間は2/3秒ほどと小さくなった。実際の多孔板塔を用いた抽出装置を想定した場合、滴径が小さく界面積が大きいことが望ましい。しかしながら今回の結果から、ある程度の滴径を形成し合一時間を小さくすべきで、さもなければ塔操作を安定に行えないことが導き出された。従って今後、各溶液条件、滴を生成するノズル径、滴生成速度についても検討が必要に考える。

原田ら(表面,1997)の研究より、それぞれのタンパク質の逆ミセル内での存在位置は、タンパク質表面の疎水性と親水性のバランスの違いによりリボヌクレアーゼAは内核水の中心部に、リゾチームは界面活性剤壁近傍に可溶化していることが分かっている。この事実から、界面活性剤壁近傍に存在することによりリゾチームが系の界面張力低下に及ぼす影響はリボヌクレアーゼAよりも大きく、界面変形をより容易にしていると考えられる。このことが合一促進の原因ではないかと考えられる。この知見を基にして多孔板塔設計を行っていこうと考えている。
低応力レベルでの2次圧縮が粘性土の強度特性に与える影響

本研究では、時間による2次圧縮(時間効果)履歴を受けた正規圧縮(擬似過圧密)粘土について,特に低応力レベルにおける2次圧縮による強度増加の大きさの応力レベル依存性,強度面での降伏応力の変化について検討・考察し,また応力履歴を受けた過圧密粘土との比較を行うことを目的としている.今年度は予圧密土層を用いて時間効果を受けた供試体の作成と,それから得られた粘土を三軸非排水圧縮せん断試験に供して非排水せん断強度特性についての実験的な研究を行った.間隙比と圧密圧力の関係:予圧密土層内で2次圧縮履歴を受けた粘土の間隙比と圧密圧力の関係は,履歴を受けていない粘土に比べて明瞭に間隙比が低下しており,一方圧縮指数はほぼ等しいことがわかった.また,履歴を受けた粘土を三軸セル内で先行圧密圧力で等方圧密すると,履歴を受けていない粘土の間隙比と圧密圧力の関係に近づいてゆくが一致せず,2次圧縮履歴は等方圧密によって消えていないと思われる.強度増加率:2次圧縮履歴を受けた粘土強度増加率は,圧縮圧力が大きくなるほど小さくなり,その先行圧密圧力よりもさらに大きい圧密圧力になると履歴を受けていない粘土のそれに近づいてゆく傾向を示した.また先行圧密圧力よりも小さい領域では,圧密時間が長いほど強度増加率は大きくなることがわかった.非排水せん断強度比:2次圧縮履歴を受けた粘土と履歴を受けていない粘土の非排水せん断強度比は,予圧密レベルに依存しないことがわかった.つまり深さ方向で非排水せん断強度に与える2次圧縮履歴の影響は,それほど大きく違わないと思われる.以上に示した2次圧縮履歴を受けた正規圧密粘土についての強度特性をもとに,応力履歴を受けた過圧密粘土の強度特性との比較,および不撹乱供試体から得られた実験結果との比較・評価を行う予定である.本研究では、時間による2次圧縮(時間効果)履歴を受けた正規圧縮(擬似過圧密)粘土について,特に低応力レベルにおける2次圧縮による強度増加の大きさの応力レベル依存性,強度面での降伏応力の変化について検討・考察し,また応力履歴を受けた過圧密粘土との比較を行うことを目的としている.今年度は予圧密土層を用いて時間効果を受けた供試体の作成と,それから得られた粘土を三軸非排水圧縮せん断試験に供して非排水せん断強度特性についての実験的な研究を行った.間隙比と圧密圧力の関係:予圧密土層内で2次圧縮履歴を受けた粘土の間隙比と圧密圧力の関係は,履歴を受けていない粘土に比べて明瞭に間隙比が低下しており,一方圧縮指数はほぼ等しいことがわかった.また,履歴を受けた粘土を三軸セル内で先行圧密圧力で等方圧密すると,履歴を受けていない粘土の間隙比と圧密圧力の関係に近づいてゆくが一致せず,2次圧縮履歴は等方圧密によって消えていないと思われる.強度増加率:2次圧縮履歴を受けた粘土強度増加率は,圧縮圧力が大きくなるほど小さくなり,その先行圧密圧力よりもさらに大きい圧密圧力になると履歴を受けていない粘土のそれに近づいてゆく傾向を示した.また先行圧密圧力よりも小さい領域では,圧密時間が長いほど強度増加率は大きくなることがわかった.非排水せん断強度比:2次圧縮履歴を受けた粘土と履歴を受けていない粘土の非排水せん断強度比は,予圧密レベルに依存しないことがわかった.つまり深さ方向で非排水せん断強度に与える2次圧縮履歴の影響は,それほど大きく違わないと思われる.以上に示した2次圧縮履歴を受けた正規圧密粘土についての強度特性をもとに,応力履歴を受けた過圧密粘土の強度特性との比較,および不撹乱供試体から得られた実験結果との比較・評価を行う予定である.
末梢血リンパ球を指標とした脳機能評価のためのin vitro実験系の確立

末梢血単核球(PBMC)の遺伝子発現に関する初年度の基礎的検討をもとに、1.覚醒剤によるPBMCのドーパミン再取り込み機構の変化、2.バルプロ酸による遺伝子発現の変化について調べた。いずれの研究にも健常男性20名から得たPBMCを用い、培養条件下に薬剤を加えて、24時間後の遺伝子発現の変化を検討した。1.覚醒剤によるPBMCのドーパミン再取り込み機構の変化覚醒剤添加によるドーパミントランスポーターと小胞モノアミントランスポーター2の遺伝子発現変化について一定の傾向を捉えることはできなかった。しかし遺伝子発現量は覚醒剤濃度依存的に増減し、この濃度反応性には個体問で大きなバラツキが認められた。両遺伝子プロモーター領域のハプロタイプの違いがこのような個体差に影響する可能性があり、今後、遺伝子型解析を含めて再検討する必要があると考えられた。2.バルプロ酸による遺伝子発現の変化バルプロ酸はピストン脱アセチル化酵素阻害剤である。バルプロ酸の標的遺伝子を検索するため、バルプロ酸服用中の統合失調症および双極性障害患者20例と非服用群19例の末梢血を用いて、遺伝子発現プロファイリング解析を行ったところ、43の遺伝子がバルプロ酸と関連して変動することが分かった。これらのうち11遺伝子についてPBMCにおけるバルプロ酸反応性を検討した。TaqMan PCR法による遺伝子発現解析の結果、9遺伝子ではバルプロ酸濃度依存的に210倍の発現量増加が認められた。一方、1遺伝子では逆に濃度依存的な発現低下がみられた。これらの遺伝子はバルプロ酸感受性遺伝子として、精神疾患のエピジェネティックな異常に関与している可能性がある。以上の結果から、PBMC培養は向精神薬による遺伝子発現変化を検討するうえで有用な実験系であることが確認された。バルプロ酸実験の結果については、現在論文作成中である。本研究課題については、すでに新潟大学の遺伝子倫理委員会による承認を得た。現在は、対照群となる健常者の末梢血収集をすすめている。末梢血リンパ球からの単核球(PBMC)の単離も順調に進行している。従来の研究では、PBMCにおけるドーパミン関連分子の測定に、免疫細胞化学的手法や、ラジオアイソトープを用いた実験が行われる。しかし、これらの手法では一検体の測定に長い時間をようするため、多検体の処理には適していない。そこで本研究では、より簡便な方法で、PBMCにおける遺伝子発現量の測定が可能かどうか検討した。PBMCからmRNAを生成し、cDNAの合成後にリアルタイムPCR法を行った。リアルタイムPCRは、アプライドバイオシステムズ社の、Assay on Demand遺伝子発現キットを用いた、TaqMan PCR法により行った。ドーパミン関連分子の発現量測定を行ったところ、ドーパミントランスポーターと小胞モノアミントランスポーター2については、この方法でも測定可能であることが分かった。しかし、チロシン水酸化酵素は測定感度以下であった。TaqMan PCR法を用いた測定はきわめて簡便であるため、このような遺伝子発現量の少ない分子についても、測定条件の工夫により定量化が可能ではないかと考えている。一方、本研究の目的であるPBMCの培養については、既にその実験環境が整っている。今後は、臨床サンプルの収集を急ぐとともに、培養条件下での、薬剤や生理活性物質による遺伝子発現量の変化を検討していく予定である。
適応的形質獲得のゲノム基盤

本研究は大きくシクリッドと哺乳類全般の適応進化の分子基盤について研究を進めた。シクリッド:雑種F2系統を作製した親種Haplochromis chilotesとH. sauvageiを含む計7種に関して、方法開発班の援助を受けIllumina Hiseq2000を用いた全ゲノム配列データの収集をおこない、研究者内においてのみ公開されているPundamilia nyerereiの概要配列へmappingした。現在は全SNPや、それらの中で祖先多型に由来するSNPを抽出している段階であるが、我々の予想通り、シクリッドゲノムには多数の祖先多型由来SNPが存在することが明らかになった。また、遺伝子地図作成と、それに基づくQTL解析の結果、2か所検出された性決定候補領域のうちの1つは、我々がこれまで注目してきたフェロモン受容体(V1R)遺伝子の近傍(約3cM付近)に位置すると推定された。この連鎖群にはLWSなど適応や種分化に関与する遺伝子が集中して存在しているため、適応をもたらした遺伝子配列レベルでの大規模な多様化が、性染色体の誕生に伴う組換えの制御に起因した可能性を示唆した。哺乳類:これまでに5遺伝子座のAmnSINE1由来のエンハンサーを発見し、今年度は特にその中の1つ(AS071遺伝子座)が複数の機能エレメントから成る多機能エンハンサーであることを報告した。一方、哺乳類の大脳新皮質特異的なエンハンサー(AS021)に結合する転写因子を発見し、またエンハンサー機能の成立過程を詳細に明らかにした。また哺乳類の二次口蓋形成に関与するAS3_9エンハンサーに関しても結合因子の同定、およびノックアウトマウスの解析を行った。このように、哺乳類の様々な形態形成に関与するSINE由来エンハンサーについて詳細な分子機能を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。シクリッド:HaplochromischilotesとH. sp. "rockkribensis"の雑種F2系統を飼育し始めてから2年が経過し、形態測定に適当なサイズ(9cm以上)まで成長したため収獲を開始した。F1集団では形態的にも一様であったが、F2集団は形態的に非常に大きなvariationを保持しており、様々な形質について(唇、歯列、頭部形状、吻角、吻サイズなど)QTL解析がおこなえる事が期待される。またビクトリア湖産シクリッドの連鎖地図作成とQTL解析に用いる150個のマイクロサテライトマーカーを準備し、現在はgenotypingを続けているところである。さらに、総括班の支援を受けて東アフリカ三大湖のシクリッド計7種(唇の肥大化し3種を含む)の全ゲノム配列決定に向けたシーケンスライブラリの作製をおこなった。哺乳類:哺乳類の形態進化のゲノム基盤に関しては、SINEに由来する哺乳類特異的なエンハンサーの探索、およびその発現制御対象となる遺伝子との比較を中心におこなった。特にAS021と名付けられたエンハンサーは、大脳新皮質の深層におけるcallosal neuron(脳梁へ軸索を投射するニューロン)にてSatb2の発現を促進させる働きを持つことが明らかとなった。Satb2は脳梁の発生に重要な機能を持つ遺伝子として知られている。このことから、真獣類特異的に進化した脳梁の形成に、SINE由来エンハンサーが関与した可能性が示された。シクリッド:初年度が経過した時点で、リンケージマップの作製はおおよそ完成の見通しがたち、今後はQTLの結果を待つ状態であることから、当初の目標に沿っている。

哺乳類:satb2の論文が出版され、これからはさらにこの詳細を解析していく方向性が打ち立てられていることから研究は順調であると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。シクリッドに関しては、このままgenotypingを進め、目的の遺伝領域の特定を目指す。マウスに関しても、引き続いてsatb2のノックアウトマウスを用いた詳細な解析を進めていく予定である。