hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍の特異的標的化を目指した遺伝子治療法の開発

標的抗原の系統的探索を目指して、抗体のFcドメインに結合するZ33モチーフを含むファイバー変異型Adv-FZ33アデノウイルスを用いて、抗体を介して腫瘍細胞への高いウイルス感染効率が得られる標的分子・抗体セットのパネル(約60種の抗原)を得た。また、標的化抗体にタンパク合成阻害トキシンを結合させてイミュノトキシン(iTox)を作製するEZiTox系を樹立し、難治性がんの新しい抗体医薬iTox治療樹立がを目指している。腫瘍細胞とZ33ファイバー変異アデノウイルスとを架橋することによって遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、腫瘍細胞に対して標的化の可能な表面分子と抗体の組み合わせの探索を開始した。先行しているヒト膵癌ならびに前立腺癌を標的化できる新規抗体作製のプロジェクトでは、すでに200種類以上の抗体産生ハイブリドーマ細胞株を樹立している。このうち、特に解析の進んでいるS11とT13モノクローナル抗体について紹介する。免疫沈降・質量分析により、抗原はPhosphatidic acid phosphatase type 2A isoorm 1(以下PAP2aと略す)であった。FACS解析、免疫組織染色、mRNA発現情報から、PAP2aは細胞表面に局在し、膵癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌などで発現の高い例が多く、正常細胞では発現が低い。抗PAP2a抗体を用いることにより、ハムスターHAS細胞、ヒト膵癌細胞に対するアデノウイルスAdv-FZ33の遺伝子導入・発現を著明に(70-100倍)、腫瘍選択的に高めることができた。平成17年度までの研究の進展により、Z33型ファイバー変異アデノウイルスAdv-FZ33ないしAdv-FdZを用い、癌に対する遺伝子導入効率を高めることのできる標的候補分子のスクリーニングが可能であることが示された。標的抗原の発現に関する個別診断と、抗体とアデノウイルスによる選択的遺伝子導入を組み合わせ、がんに対する選択的かつ効果的な標的化遺伝子治療法の開発が可能となった。腫瘍細胞とZ33ファイバー変異アデノウイルスとを架橋することにより遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体をスクリーニシグし、腫瘍細胞に対して標的化の可能な表面分子と抗体の組み合わせの探索を行った。その結果、以下の成果を得ることができた。1)当スクリーニングで樹立した抗PAP2a抗体を用いて、ヒト膵癌・前立腺癌を選択的に効率よく標的化できる新規治療法を樹立した。浸潤転移腺癌の診断法として開発を進めている(PCT出願済)。3)メラノーマの標的化に高い効率を示す抗体xx66の抗原として増殖因子受容体A*(cancer-testisAg)を同定した。これは新規メラノーマ抗原であり、新規のメラノーマ標的治療法の可能性が開けた(出願準備中)。さらに、同抗原をホルマリン固定パラフィン包埋組織標本で安直に染めることのできる抗体を自作し、臨床手術標本を用いた解析を開始した。4)標的抗原の発現に関する個別診断とStaab抗体を介した選択的遺伝子導入を組み合わせ、効果的な標的化治療法の開発を進めている。難治がん治療法の開発では,治療薬(遺伝子製剤など)の標的組織細胞に選択的な投与を可能とする效果的な方法を編み出すことが鍵となる。私たちは標的化治療法の開発を目指して,Protein AのZ33モチーフを含むAdv-FZ33ファイバー変異型アデノウイルスと腫瘍細胞とをモノクローン抗体で架橋することによって遣伝子導入効率力状きく増強するようなターゲット分子の系統的探索を行ってきた。1)悪性黒色腫・前立腺癌・膵癌・卵巣癌・多発性骨髄腫などに対しそれぞれ数十種の高効率標的化抗体を樹立し,免疫沈降・質量分析・cDNA強制発現解析を施行し,現在までに49種の抗原同定を終えた。その中には,EGFRやCD20などすでに抗体医薬として腫瘍の標的治療に用いられているもの,あるいはCD44,CD71,cA12,EpCAM,TROP2,MCSP,CD146,CD228,PSMA,CEAなど腫瘍標的治療の候補分子として注目され臨床開発途上のもの力弐,高い比率で含まれていた。2)メラノーマ標的化抗体NS-66の抗原として,サイトカイン受容体IL13Ra2を同定した。この分子は「腫瘍精巣抗原」に分類され,メラノーマ抗原としては新規なものである。次のステップとして,診断・治療のための基盤データの収集を容易にするため,同抗原をホルマリン固定パラフィン包埋組織標本で安直に染色できる抗体KH7B9を改めて自作した。このKH7B9染色で解析したところ,肝・腎・脳・肺・心血管・消化管・皮膚などのヒト正常組織の細胞表面にIL13Ra2発現は見られなかった。

一方,臨床手術標本ならびに市販メラノーマ組織アレイに対する染色では,メラノーマ症例の50%で陽性,しかも陽性のうち20%ではがん細胞の表面に極めて強い発現が見られ,発現診断と組み合わせたメラノーマ標的治療の可能性が開けてきた。3)今後,現在のターゲット分子の系統的探索を一層推し進め,難治進行がんに対する効果的な標的化治療の基盤を固めていく予定である。難治がん冶療法の開発では、治療薬(遺伝子製剤など)を標的組織細胞に選択的に投与する効果的な方法を編み出すことが大切である。私たちは、標的化治療の開発を目指して、Protein AのZ33モチーフを含むAdv-FZ33ファイバー変異型アデノウイルスと腫瘍細胞とをモノクローン抗体で架橋することによって遺伝子導入効率が大きく増強するようなターゲット分子の系統的探索を行ってきた。1)悪性黒色腫・前立腺癌・膵癌などに対し約500種の標的化抗体を樹立し、免疫沈降・質量分析cDNA強制発親解析を施行し、約60種の抗原同定を終えた。平成20年度か照はさらにヒト肺腺癌NCI-H322細胞大腸癌HCT116細胞を用いてそれぞれ73個・30個の標的化抗体を樹立し、EpCA・EGFRなどを含むそれぞれ13種・7種の抗原を同定している。2)メラノーマ標的化抗体4種(NS110・SHM44など)の抗原としてMCSPを同定した。SHM44による免疫組織染色で解析したところ、肝・腎・脳・肺・心血管・消化管・皮膚なとのヒト正1常組織にMCSP発現は見照れなかった。一方、臨床手術標本・市販メラノーマ組織アレイに対する染色では、メラノーマ症例の80%以上で細胞表面に強い発現が見照れ、メラノーマ冶療のよい標的候補であることが示された。3)得られた標的抗体(NS110など)を用いてプロドラッグ酵素冶療により特異的な抗腫瘍効果を得た。4)IL13Ra2を標的として、標的抗体NS66を用いて、サポリン・緑膿菌外毒素(PE)・ジフテリア毒素(DT)などを結合させたイミュノトキシンにより、標的IL13Ra2選択的に強力な腫瘍冶療効果を得た。今後、現在のターゲット分子の系統的探索に加えて、イミュノトキシンによる標的探索を組み合わせて、難治がんに対する効果的な標的化治療の基盤的研究を進めていく予定である。標的抗原の系統的探索を目指して、抗体のFcドメインに結合するZ33モチーフを含むファイバー変異型Adv-FZ33アデノウイルスを用いて、抗体を介して腫瘍細胞への高いウイルス感染効率が得られる標的分子・抗体セットのパネル(約60種の抗原)を得、臨床治療への応用を目指して研究を続けてさた。この研究の過程で、私たちは、標的化抗体にタンパク合成阻害トキシンを結合させてイミュノトキシン(以下iToxと略す)を作製する簡便な系を樹立し、EZiToxと名付けた。プロテインG由来の抗体結合ドメイン3Cを持つジフテリアトキシンDT3Cを大腸菌で作り、これ(DT3C)を用いて細胞毒性効果を指標に好適な抗体をスクリーニングする系である。これを用いて細胞傷害活性を調べたところ、肺がんや乳がんなどで高い発現を示すTAg2を標的化するA*抗体が、抗EpCAM抗体に比して数百倍のiTox活性を不した。A
両側下丘への中脳インプラントに関する基礎的研究～聴覚再獲得を目指して

マウス下丘の生理学的特性を検討すべく、神経細胞の音刺激に対する反応を細胞外記録で計測した。その周波数特性を検討したところ、4つのタイプに分類された。各々のタイプの分布は、Type Iが27%、Type IIが32%、Type IIIが27%、Type IVが14%であった。特徴として、Type IとIIに分類されるものはType IIIと比較すると、閾値が低く、かつ自発発火が乏しい傾向が見られた。今後、これらの下丘の生理学的特長を踏まえた上で、中脳プラントの実現をめざした研究が必要と考えられた。蝸牛神経の高度病変や中枢聴覚路に障害のある高度難聴者には、蝸牛神経核への聴性脳幹インプラントが現在臨床で施行されているが、現在のところ充分な語音明瞭度が得られていないのが現状である。これに代わり、蝸牛神経核より中枢側である下丘への電極インプラント(中脳インプラント)が近年、考案されている。本研究の意義は、下丘が左右近接した部位にあるために同一の手術野で展開できる利点を生かし、従来の人工内耳や聴性脳幹インプラントでは実現困難であった両側への中脳インプラント埋め込みをめざした基礎的知見の構築にある。上記目的にために、本年度は光学的イメージング法により大脳聴覚野の反応が測定できるシステムを構築した。本システムは大脳に対しては非侵襲的であり、将来、下丘への中脳インプラントが臨床応用される段階でも評価方法として有用であると予想させる。さらに、本年度は予備実験としてモルモットを用いて下丘に電極を挿入して音刺激に対する反応を観察し、背側から腹側にかけて周波数の層板構造があることを確認した。また、従来、頭蓋骨の薄いマウスを中心に施行されてきた大脳の光学的イメージング法が、主たる実験動物として使用予定のモルモットで可能か、検討した。モルモットはマウスに比べ、頭蓋骨が厚いため、イメージング法は困難とされているが、頭蓋骨をドリルで薄く削ることにより、反応がみられると考えられる。今後、下丘へのインプラント電極の改善をし、本格的な測定が必要である。本システムは大脳に対しては非侵襲的であり、将来、下丘への中脳インプラントが臨床応用される段階でも評価方法として有用であると予想される。さらに、本年度は、インプラントする電極の検討を行った。さらにマウスを用いて一側下丘と両側下丘刺激とを比較するプロジェクトを開始した。引き続き、本格的な測定が必要である。本研究の目的は、下丘が左右近接した位置にあるために同一の手術野で展開できる利点を生かし、従来の人工内耳やABIでは実現困難であった両側の聴覚経路を使用できるための知見を提供することにある。そのために、両側下丘へのインプラント埋め込みの基礎的実験として、マウスを用いて非侵襲的方法である光学的イメージング法による大脳聴覚野の反応測定を試みたが、予想されていた周波数選択性が得られなかった。そこで、マウスの下丘においてはこれまでに用いられてきたサルやモルモットなど異なる周波数特性を示すのが一因と考えられた。そこで、マウス下丘の周波数特性を検討すべく、神経細胞の音刺激に対する反応を細胞外記録で計測した。その周波数特性(frequency response map)を検討したところ、4つのタイプに分類された。Type Iは聴力神経と同様の特性、Type IIは鋭い周波数特性で周囲に抑制帯を持つもの、Type IIIは広い周波数特性で抑制帯のみられないもの、Type IVは複雑あるいは不規則な特性である。それごれのタイプの分布は、Type Iが27%、Type IIが32%、Type IIIが27%、Type IVが14%であった。今後、これらの下丘の生理学的特長を踏まえた上で、さらに中脳プラントの実現をめざした研究が必要と考えられた。
DNA修復蛋白質Adaの転写制御スイッチ機構の解明と亜鉛原子の役割

大腸菌のDNA修復蛋白質Adaの立体構造と修復機構の関連及び修復系の活性発現と制御の仕組みについて、蛋白質に含まれるZn原子に注目してNMRを用いて研究を行った。分子量16kDaのN末側機能ドメイン(N-ada16k)の分離と大量発現系の構築を行なった。NMR測定に必要な試料を効率的かつ経済的に得ることができる大量発現系構築の際の諸問題を検討解決し、M9最小培地で収量20mg/Lの系を構築した。N-ada16kはCys69がメチル化されると転写制御因子として働くので、反応条件の検討によりCys69が選択的にメチル化されたme-C69 N-ada16kを調整した。この系を用いて蛋白質を^<13>C,^<15>N安定同位体ラベルしNMRシグナルの帰属と2次構造の同定を行ないN末70残基はβシートを中心としたコンパクトな構造を形成していること及びLeu102からThr123がヘリックス-ターン-ヘリックス構造を形成していることが分かった。培養条件の工夫によりN-ada16kに含まれるZn原子を^<113>Cd原子に置き換えた。^<113>CdNMRを用いた配位状態と配位子の解析により、Cys69のメチル化によりZn原子の配位子が変化しないこと及び4個の配位子の一つはメチル基を受け取るCys69のチオール基であることが明らかとなった。以上の結果よりN-ada16kの機能スイッチ機構のモデルを提案した。さらに、me-C69 N-ada16kとDNA複合体の溶液中における立体構造決定を進めており、Adaの修復系の活性発現と制御の仕組みについて分子レベルでの詳細な解明を行っている。
情報遺漏のリスク認知に関する社会心理学的研究

本研究の目的は、高度情報化社会における情報遺漏に対するリスク認知を明らかにすることであった。西宮市在住の20歳以上の男女1000人を選挙人名簿からランダムに抽出し郵送法調査を行った。その結果210名の妥当な回答が得られた。質問紙の内容は、リスク認知尺度(恐怖次元と確率次元)、メディアリテラシー尺度、情報手段機器の利用と所有、高度情報化社会に対する態度、メディア接触量、モグラフィック要因等を含むものであった。とりわけ恐怖度得点の高い項目は以下である。「銀行のファイルが調べられ、自分の預金通帳が書き換えられる」「電話が盗聴される」「自分のクレジットカード番号が他人に知られる」「自分の日記や手紙が他人に見られる」「知られたくない悩み、心配事が他人に知られる」「自分の口座番号が他人に知られる」「匿名で利用できるコンピューターシステムで自分の名前が知られる」等々。逆に恐怖得点の低い項目は、「自分の出身学校が他人に知られる」「自分または配偶者の所属している会社の名前が他人に知られる」であった。恐怖得点の平均値と確率次元得点の平均値の間には負の高い相関関係が見出され、生起する確率の高い事象ほど恐怖度は低く、生起する確率の低い事象ほど恐怖度は高いことがわかった。リスク認知尺度を因子分析した結果、公的情報遺漏、私的情報遺漏、金銭に関わる情報遺漏の三次元が見出された。女性の方が男性よりも公的情報遺漏に対して強い恐怖感を持っていることが明らかになった。ただ今回のランダムサンプリング調査によれば、リスク認知を規定している特定の明確な要因はなく、リスク認知が均一的であることが明らかになった。ゼミの卒業生名簿をもとに514名に郵送法による調査を行った。その中から197名(男性100名、女性97名)の妥当な回答が得られた。質問紙の内容は、リスク認知尺度(恐怖次元と確率次元)、メディアリテラシー尺度、情報手段機器の利用と所有、高度情報化社会に対する態度、デモグラフィック要因等を含むものであった。「銀行のファイルが調べられ、自分の預金通帳が書き換えられる」「電話が盗聴される」「自分のクレジットカード番号が他人に知られる」「自分の日記や手紙が他人に見られる」「知られたくない悩み、心配事が他人に知られる」「自分の口座番号が他人に知られる」「匿名で利用できるコンピュータシステムで自分の名前が知られる」等々。逆に恐怖得点の低い項目は、「自分の出身学校が他人に知られる」「自分または配偶者の所属している会社の名前が他人に知られる」であった、恐怖得点の平均値と確率次元得点の平均値の間には負の高い相関関係が見出され、生起する確率の高い事象ほど恐怖度は低く、生起する確率の低い事象ほど恐怖度は高いことがわかった。三つの次元全てに性差が見られ、女性の方が男性よりも情報遺漏に対して強い恐怖感を持っていることが明らかになった。
民主化期インドネシアの地方王権ネットワークに関する人類学的研究

民主化・分権化期のインドネシアでは地方王権の復興が相次いでいる。地方社会で「復活」する王たちは、法的根拠がない点で極めて不分明で捉えにくい存在である。本研究では、現代地方政治のパトロン・クライアント関係と王を中心とした人的ネットワークという2つの異質な人々の関係が摩擦を生み出しつつも併存している状況を明らかにする。また、本研究課題で対象とするのはカリマンタンの在来民であるダヤック人の神聖王である。このダヤック人の王はインドネシア独立から現在まで断絶することなく存続してきた。本研究課題では、神聖王の特性および現代社会における神聖王の生存戦略についても明らかにする。
北方林における攪乱後の主要樹種の成長と死亡：長期ストレスとしての個体間競争の影響

2011年に食葉性昆虫(クスサン)の大発生したウダイカンバ二次林(林齢約100年)を対象に、食害後のウダイカンバ(Bm)の枯死パターンを食害前の成長履歴、個体間競争との関係から明らかにした。食害前(2004ー2010年)のBmの肥大成長量は、隣接するサイズの大きなミズナラからの一方向的競争効果によって制限されていた。食害後3年間(2012ー2014年)の死亡率は17%であり、食害前に低成長であった個体ほど死亡率が増加した。これらの結果は、長期間にわたる個体間競争がBmの肥大成長の低下をもたらし、この成長低下が食害に対する感受性を増加させ、食害後の死亡率の増加に影響したことを示している。本研究では、大型台風や食葉性昆虫の大発生などの攪乱を受けた天然林を対象に、攪乱が終息した後に継続して観察される残存木(成木)の死亡について、攪乱以前の成長履歴などとの関係から明らかにするとともに、成長に影響する要因を抽出することを目的としている。今年度は、2011年、2012年に食葉性昆虫の大発生と激しい食害を受けたウダイカンバ二次林(林齢約100年)において毎木調査を実施した。この二次林における20042014年までのウダイカンバの死亡率は約27%であった。これらの死亡にはサイズ依存性が認められ、胸高直径の大きな個体では死亡率が低い傾向が認められた。食害以前の肥大成長とウダイカンバの死亡との関係、および肥大成長に影響する要因を抽出するため、年輪解析用のコアサンプルを約150個体から採取した。年輪解析は次年度以降に実施する予定である。今年度は、2011年、2012年に食葉性昆虫の大発生と激しい食害を受けたウダイカンバ二次林(林齢約100年)から採取したコアサンプル(約150個体)の年輪解析を実施した。過去、20年間の平均年輪幅は樹種間で差が認められ、ウダイカンバの年輪幅はミズナラに比べて低い値で推移していた。ウダイカンバでは、加齢にともなう年輪幅の低下が認められたのに対し、ミズナラではそのような傾向は認められなかった。次年度は、年輪幅に影響する要因の抽出と成長履歴と死亡との関係について解析を進める予定である。食葉性昆虫が大発生し、激しく食害(攪乱)された広葉樹二次林におけるウダイカンバの死亡状況を把握できたとともに、攪乱以前の成木の成長履歴と撹乱後の死亡との関係、および成長履歴に及ぼす要因の抽出に関する解析を進めている。そのため、本研究の目的を達成するための準備が整いつつある。また、大型の台風被害を受けた天然林(針広混交林)についても年輪解析用のコアサンプル(アカエゾマツ)を採取しており、概ね計画通りに研究が進捗している。食葉性昆虫の大発生した広葉樹二次林におけるウダイカンバ(Bm)のその後の肥大成長、および死亡に及ぼす要因を明らかにするため、北海道の南富良野町に設置されている長期観察林分(樹齢約100年、50m×50m)において毎木調査を実施するとともに、胸高直径10cm以上の立木を対象に年輪解析を行った。食葉性昆虫の大発生は2011年の7月中旬に観察され、2011-2014年のBmの死亡率は17%であった。一方、この期間にミズナラ(Qm)の死亡は確認されなかった。BmとQmから採取したコアサンプルを用いて年輪幅の測定を行い、樹種ごとに年輪幅指数の時系列変動を算出した。肥大成長に対する気候応答を明らかにするため、食害を受ける以前(19782010年)の年輪幅指数と各生育年の月ごとの平均気温、降水量、日照時間との間で相関分析を行った。BmとQmの年輪幅指数はそれぞれ異なる月の気象と相関関係が認められた。Bmの年輪幅指数は6月と7月の日照時間と正の相関を示し、7月の降水量と負の相関が認められた。Qmでは3月の降水量と正の相関が認められた。食害後のBmの死亡パターンを食害前の成長履歴、局所的な競争効果との関係から解析した。食害前(1999-2003年)のBmの直径成長には、Bmの胸高直径(DBH)、サイズの大きなQmからの局所的な競争効果(Qm_oneCI)が影響しており、DBHが同じBmで比較した場合、競争効果を強く受けている個体ほど成長量が低下した。食害後のBmの死亡率は、食害前に低成長であった個体ほど高かった。また、直径成長の制限要因である個体のDBHとQm_oneCIも死亡率に影響しており、DBHが小さい個体、およびQmからの競争効果を強く受けている個体ほど死亡率が増加した。これらの結果は、長期的な個体間の競争効果が成長を制限させ、食害に対する感受性を増加させたことを示唆している。

2011年に食葉性昆虫(クスサン)の大発生したウダイカンバ二次林(林齢約100年)を対象に、食害後のウダイカンバ(Bm)の枯死パターンを食害前の成長履歴、個体間競争との関係から明らかにした。食害前(2004ー2010年)のBmの肥大成長量は、隣接するサイズの大きなミズナラからの一方向的競争効果によって制限されていた。食害後3年間(2012ー2014年)の死亡率は17%であり、食害前に低成長であった個体ほど死亡率が増加した。これらの結果は、長期間にわたる個体間競争がBmの肥大成長の低下をもたらし、この成長低下が食害に対する感受性を増加させ、食害後の死亡率の増加に影響したことを示している。食葉性昆虫が大発生し、激しく食害(攪乱)された広葉樹二次林におけるウダイカンバの死亡状況を把握できたとともに、攪乱以前の成木の成長履歴と撹乱後の死亡との関係、および成長履歴に及ぼす要因の抽出を解析するための年輪解析用のコアサンプルを採取することができた。そのため、本研究の目的を達成するための準備が整いつつある。また、大型の台風被害を受けた天然林(針広混交林)についても年輪解析用のコアサンプルを採取する準備が整っており、概ね計画通りに研究が進捗している。大型の台風被害を受けた針広混交林における主要樹種(アカエゾマツ)についても年輪解析を進める。また、樹種ごとの成長履歴を把握するとともに、個々の樹木の空間的な位置情報を考慮し、主要樹種の成長パターン、およびそれに及ぼす気象要因、競争効果の解析を行うとともに、攪乱以前の成長履歴と撹乱後の死亡との関係について解析を実施する。農学大型の台風被害を受けた針広混交林における主要樹種(トドマツやエゾマツなど)についても年輪解析用のコアサンプルを採取する。今年度、採取したウダイカンバのコアサンプルとともに、年輪幅の測定を行い、主要樹種の成長に及ぼす気象要因、競争効果の解析に供する。また、攪乱以前の成長履歴と撹乱後の死亡との関係について解析を進める予定である。スケジュールの都合で、予定していた学会への参加をとりやめたことに加え、共同研究者とのミーティングの実施を次年度に延期したため。悪天候により予定していた現地調査と年輪解析用のコアサンプルの採取ができなかったため、次年度に実施することとしたため。次年度の研究費は、本研究課題の取りまとめに関する打合せや学会発表などを中心に使用する計画である。旅費は、データの解析手法の習得や関連する研究者との打合せ、学会発表のために使用する。また、データ解析に必要な消耗品や論文執筆にかかる英文校閲などに研究費を使用する予定である。過去に大型台風の被害を受けた針広混交林において毎木調査と年輪解析用のコアサンプルの採取を実施する。
高層高密度居住時の健康影響

都市への人口集中に伴って住宅の集合化、高層化が一般化しているが、このような急激な居住環境の変化が人間集団の健康状態にどのような影響を与えるかは必ずしも明らかでない。本研究は、高層高密度居住形態を現にとる住民がどのような適応、不適応を示しているかを調査し、居住環境の人間に対する健康影響を評価することを目的として、昭和62年度より開始された。すでに昨年度の調査から、高層階に居住する乳幼児は低層階居住の乳幼児に比べ、日常生活習慣の自立が遅れている可能性が示唆されている。そこで本年度は、小児の心身の発育・発達をはじめとして居住者のストレスと生活・環境との関連、居住者の住意識、高齢者の自立度等についての継続調査、並びに室内環境測定を行った。その結果、高層居住児にみられた日常生活習慣の遅れは、母親以外の観察者においても確認されたこと、自立の遅れが年齢と共に解消していくこと、高層居住家庭における母親と児との間の距離が、物理的にも心理的にも近いこと等が示唆された。このような幼少時期の母子関係が将来、どのような影響をもたらすか長期継続調査が必要であろう。主婦のストレスと、居住階や居住密度との間に一定の関係はみられないが、ライフイベント、趣味、室内騒音等と関連が示唆され、また、環境騒音から受ける不快さの程度は、住居の棟・間取り、ライフステージ、性格、居住階と関連していた。一方、対象地区の高齢者の住環境に対する評価は比較的高く、性別により違いはあるが、外出の簡単さ、日当り、静かさ、緑が見える等の項目を高く評価していた。高齢者の活動能力は、むしろ高層階居住者の方が高く、健康で自立度の高い老人が高層居住を好む、あるいは適応している可能性があると思われた。環境測定から、室内二酸化窒素濃度は住宅設備や居室の配置により分布に違いを生じること、ダニ等の分布についても居室、季節、駆除法により違いがみられた。
経済改革の諸類型の分析と進化ゲーム理論-中国・中東欧・ロシアの比較分析-

本研究は、経済体制の諸類型を、主として中国の体制移行に焦点をあて、そして中東欧およびロシアを比較対照しながら分析をすすめたものである。本研究をつうじて明らかになった諸点特に中東欧やロシアと比較して特徴的な諸点は、(1)中国全体でみても、とりわけ長江デルタ地域の上海、浙江省、江蘇省に焦点をあててみても、そこに強い「経路依存性」が認められること、(2)中国の全体ならびに地域モデルに特徴的なのは、「華人ネットワーク」の存在が認められるということ、ただし、(3)強い「経路依存性」の存在は強い「内向性」の存在を意味しており、それは諸外国・外部諸地域との連携に際して大きな阻害要因となることを意味する。本研究では、そのことを直接投資を事例として示すことにつとめた。そして、いうまでもなく、(4)「新制度論」の視点からみると、「経路依存性」から脱却するためには、「内向性」から「外向性」への転換が不可欠であることが示される。そして(5)中国の経済モデル、政治モデルを検討してみると、「市場の失敗」と「政府の失敗」との複雑な関わりが観察されること、そして「権威主義開発体制」の変容のロジックが認められることがわかる。さらに本研究では、中国の経済、政治、そして中国の人々の行動を捉えることに主たる関心をおかれてすすめられた。そして、進化ゲームの理論を使って試みてみると、中国の先物市場参加者の行動は、今日「行動ファイナンス」として確立されている考え方と整合的であること、また同時にごく効率的に行われていることが示される。そうした枠組みおよびロシア・中東欧との比較という視点からながめてみると、中国の市場経済化は、大きくすすんでいるものと考えられる。中国とロシア・中東欧諸国(なかでもポーランド)における経済改革の諸類型の比較分析を試みた結果、次のような興味深い事実が明らかになった。中国における改革は、1990年代後半以降、(従来の広東モデルと江浙モデルのうち)江浙モデルが外資主導型の江蘇省モデルと民営企業主導型の浙江省モデルとに分化し、浙江省モデル地域の発展が著しい。当該地域の発展の動因は、戦後の計画経済のもとで消滅することなく、(市場経済を受容する土台としての)「商人が育つ文化」が根強く存在していたことであり、当該地域の歴史・文化・制度に「埋め込まれて」いる「経路依存性」の存在にほかならない。浙江省モデル地域の発展パタンを中東欧、ロシアで見出すことは困難であり、経済改革の類型の特徴的なパタンと位置づけることが出来る。外資主導型の広東モデル、江蘇省モデルにおける特徴もまた、中東欧、ロシアでは見出すことが困難である。それは、華人ネットワークであり、中国の対内直接投資のほぼ50%を占める香港、マカオ、台湾におけるネットワークの存在である。中国への対内直接投資が経済成長を牽引する働きをしたことは疑問の余地がなく、そうした華人ネットワークの存在は経済改革に大きな役割を果たしていると思われる。標準的な捉え方にしたがえば、中国は成長指向的な改革をすすめ、ポーランドはシステム変化指向的な改革をすすめてきた。そうした捉え方は適切である。そして改革の動きと関連して、中国では所得格差が、ポーランドでは失業率が大きな問題となってあらわれてきた。近年の動向は、中国においてシステム変化指向的な改革がみられるようになり、ポーランドにおいて成長指向的な性質の改革がみられるようになったといってよい。経済改革の諸類型はまたさまざまな変異をともなって新たな進化を遂げていると理解すべきものであろう。本年度の研究では、日本の対体制移行国直接投資に関する分析を試みた。体制移行国は概して、先進工業国に比べて、対内直接投資を阻害する諸要因を抱えているといってよいからである。

本年度の研究ではそうした体制移行国のうち、(それぞれ固有の阻害要因を抱えていると思われる)漸進的改革と採用している中国および中東欧とりわけ急進的改革を採用しているポーランドを主たる(投資受入国としての)分析対象として行なわれた。本年度の研究では、したがって、中国やポーランドに関わる体制移行に伴うリスクを念頭において、日本のそれら諸国への対外直接投資の進出パタンを模索し、そうした分析にもとづいて、中国やポーランドに関する、主として体制移行に伴うリスクを緩和する仕組みの検討を行なってみた。本年度の研究から得られた結論は、次のように要約される。すなわち、(1)進出パタンについてみると、日本の対ポーランド直接投資は輸出指向型にシフトする傾向が認められ、対中国直接投資は国内市場指向型にシフトする傾向が認められる。そして、日本の対ポーランドおよび対中国への直接投資の決定要因は、経営資源格差によるものと理解するのが適切である。(2)投資集中度指数および貿易結合度を使って再構成してみると、日本の対ポーランド直接投資の規模が相対的に小さいのではないかという主張を支持することは難しく、日本の対中国直接投資の規模が相対的に小さいのではないかという主張は支持されるように思われる。(3)経済が持続可能な成長軌道上にあるものと考えられること、およびWTO加盟・EU加盟をつうじて国際的に標準化されかつ透明性の高いルールが適用されることは、日本の対中国および対ポーランド直接投資をいっそう活発化させるものと考えられる。本年度は、中国の体制移行と資本市場に焦点をあて、進化ゲームの理論に照らして分析を試みることとした。本年度に得られた研究実績の概要はおおむね以下の2点である。すなわち、第1は、中国の資本市場とりわけ先物市場の発展の可能性に関する分析であり、次のような結論が得られた。「進化ゲームの枠組みに照らして判断すれば、国内市場の統合を比較的容易に実現することができ、かつ国内市場規模で均衡価格を模索することができる中国の商品先物市場の発展の可能性は、中央政府の政策としてもまた国民の選好としても、大きいと考えられるといってよい」、ということである。本研究は中国の人々のリスクに対する選好を述べ、次いでそうした選好にもとづいて進化ゲームの構造を定式化したものである。したがって、本研究の新しい視点は、進化ゲームのトゥールを用いて先物市場の機能と体制移行の成否とを結合させた点にあると思われる。そして第2点は、上海の不動産市場のバブル現象に焦点をあてることとした分析であり、得られた結論は、「中国のバブルの発生要因は東アジアモデル諸国に似通っているということ、そして持続可能なバブルが暫く続くものと考えられること、そしてバブルにどう対処するかということをつうじて中国の国家能力が大きく問われることとなる」、ということである。本研究は、日本のバブルとの比較をつうじて中国のバブルの特徴を補足し、分析を試みたものである。したがって、本研究の斬新な視点は、資本市場におけるバブル現象を、権威主義体制ならびに国家能力の観点から分析を試みた、という点に求められる。
心臓の自律神経調節における亜鉛シグナル伝達の分子制御機構の解明

心血管恒常性の維持に自律神経調節が重要な役割を果たしている。申請者はこれまでに、非選択的カチオンチャネルであるTRPC6が心臓におけるβ受容体シグナルを正に制御し、交感神経応答を増強させる可能性を見出した。そこで本研究では、TRPC6に特徴的な性質である亜鉛イオン透過性に着目し、TRPC6による亜鉛イオン輸送が心筋のβ受容体を介した交感神経活動応答にどう影響するか明らかにし、その臨床的重要性を示すことを目的とする。
新規高性能ベクターを生体イメージングで評価し血友病遺伝子治療に応用するための研究

新規ベクターを用いて、培養細胞にヒト第Vlll血液凝固因子遺伝子を発現(分泌)させることが可能であった。完全長型遺伝子を用いた場合にも、Bドメイン欠失型と同等の活性を得られ、従来の搭載遺伝子サイズ上限を上回った。次いで、上記のヒト第VIII血液凝固因子分泌細胞を血友病Aマウスに移植したところ、マウス血中第VIII凝固因子活性が有意に上昇した。一方で、近赤外蛋白であるiRFPの遺伝子を搭載した本ベクターを用いて、マウスにin vivo法およびex vivo法によって遺伝子治療を実施し、経時的に近赤外蛍光を観察したところ、ベクターまたは遺伝子導入細胞を投与した局所以外への蛍光拡散は確認されなかった。使用する新規RNAベクターに搭載する第VIII血液凝固因子遺伝子のうち、完全型、Bドメイン欠失型および部分Bドメイン欠失型を選び、コドンの最適化を行ったのちに、完全型を含めて、その遺伝子を新規ベクターに搭載可能であることを確認した。ヒト脂肪細胞に遺伝子を導入するための培養条件を検討し、それぞれの方法で得られた細胞に含まれる間葉系幹細胞の表面形質および分化能を比較検討し、質的な差がみられないことを確認した。蛍光色素であるiRFPを膵限定的に発現させたマウスを作成した。これによって近赤外線検出装置を使用した生体イメージング技術を本研究に利用可能となった。即ち、新規RNAベクターを使用してiRFP遺伝子を導入したマウス脂肪細胞を、膵限定iRFP発現マウスに皮下移植し、体内動態を継時的に追跡評価するための方法を確立した。血友病モデルマウス(第VIII血液凝固因子遺伝子ノックアウトマウス)を輸入し、繁殖させる一方で、日常的な飼育環境での出血症状等に関する確認作業を開始した。新規RNAベクターを用いて、完全型(全長型)のヒト第VIII血液凝固因子遺伝子を用いても、Bドメイン欠失型遺伝子を用いた対照実験と同等に、標的細胞に遺伝子の導入が可能であり、更に培養上清中に安定的に第VIII血液凝固因子を分泌させることが可能であることを確認した。全長型第VIII血液凝固因子をこのように取り扱うことは、従来は全く不可能であった。上記は、「ヒト細胞ーヒト第VIII血液凝固因子」、および「マウス細胞ーマウス第VIII血液凝固因子」のいずれの組合せでも可能であることを確認した。更に、この培養上清を血友病Aマウスに投与することによって薬理効果を確認することができ、細胞から分泌されたタンパクが正常な凝固能を有することが証明された。同時に、複数の投与経路を比較検討して、効率の良い安定した投与経路を検討した結果、静脈注射または腹腔内注射が実用的であることを確認した。生体イメージング技術を応用して、マウスを生存させたままで遺伝子導入細胞の生体内動態を追跡する手法を、新規RNAベクターを用いたシステムでも実施可能であることを確認した。近赤外蛍光蛋白であるiRFPの遺伝子をRNAベクターに搭載し、マウスに局所投与した後、投与部位に蛍光を検出することが可能であることを確認した。更に、培養系でRNAベクターを用いてiRFPを発現させた細胞をマウスに移植しても、蛍光の検出が可能であった。生着促進・長期維持のための手法として、PDL1他の遺伝子を同時に搭載したRNAベクターを作成した。第VIII血液凝固因子を分泌する細胞を血友病Aマウスに移植した後、マウス血中への第VIII血液凝固因子の活性検出が不十分であり、使用する細胞、移植方法、生着促進方法など、検討中である。この工夫がうまくいけば、いっそうの進展が期待できる。ヒト完全型第VIII血液凝固因子の遺伝子を搭載した新規高性能ベクターを作用させた細胞を培養し、上清中の凝固因子活性および抗原を定量した。Bドメイン欠失型(BDD)第VIII血液凝固因子の遺伝子を用いた場合と比較検討した。完全型およびBDDのいずれにおいても、培養上清中の第VIII血液凝固因子活性および抗原の定量値はほぼ同等であった。更に、上記のヒト第VIII血液凝固因子分泌細胞を血友病Aマウスに移植したところ、マウスの血中第VIII凝固因子活性の有意な上昇があり、薬理効果が確認された。近赤外蛋白であるiRFPの遺伝子を搭載した本ベクターを用いて、in vivo法およびex vivo法による遺伝子導入の効果および有害事象を生体イメージングの手法を用いて経時的に検討した。iRFP搭載ベクターをマウスに直接投与する際(in vivo法)の注射部位による効果発現状況のデータを蓄積し、比較検討した。一方で培養条件下でiRFP搭載ベクターを作用させて作成したiRFP産生細胞を、マウスの身体各部に移植(ex vivo法)して、蛍光検出状況を継時的にデータを蓄積した。in vivo法およびex vivo法のいずれにおいても、ベクターまたは遺伝子導入細胞を投与した局所以外への蛍光拡散はなく、病理組織の評価によっても投与部位以外の組織からベクター遺伝子が検出されることはなかった。従来のベクターでは、搭載可能な遺伝子サイズの上限が6kbであったが、本ベクターでは13.5kbまで緩和されたことにより、約7kbの全長型ヒト第VIII血液凝固因子の遺伝子を搭載し、細胞に作用させることによって凝固活性を有するタンパクを分泌させることが可能となった。このベクターを用いた遺伝子治療の血友病Aマウスに対する薬理効果・安全性を確認した。以上、産官学共同研究の一部分として実施した。

新規ベクターを用いて、培養細胞にヒト第Vlll血液凝固因子遺伝子を発現(分泌)させることが可能であった。完全長型遺伝子を用いた場合にも、Bドメイン欠失型と同等の活性を得られ、従来の搭載遺伝子サイズ上限を上回った。次いで、上記のヒト第VIII血液凝固因子分泌細胞を血友病Aマウスに移植したところ、マウス血中第VIII凝固因子活性が有意に上昇した。一方で、近赤外蛋白であるiRFPの遺伝子を搭載した本ベクターを用いて、マウスにin vivo法およびex vivo法によって遺伝子治療を実施し、経時的に近赤外蛍光を観察したところ、ベクターまたは遺伝子導入細胞を投与した局所以外への蛍光拡散は確認されなかった。ベクターに搭載可能な遺伝子サイズを緩和可能であるか否かが最大のハードルであったが、完全型の第VIII血液凝固因子遺伝子の遺伝子をそのまま搭載することが可能であることを確認したことである。ベクターの性能を評価する方法として蛍光色素遺伝子を利用するために、膵限定で蛍光色素iRFPを発現させて、この色素を異種蛋白として認識しないマウスを作成した。通常のエサは、蛍光物質を多量に含むため、解析上のノイズにならないエサの開発にも成功した。これによって蛍光色素遺伝子発現脂肪細胞を同系移植して、解剖せずに継時的に蛍光脂肪細胞の動態を確認することが可能になった。今後の動物実験を当初の計画以上に能率的に進めることが可能になった。ヒト脂肪細胞の培養実験では、当初は天井培養の安定性が課題であったが、通常の培養法によって得られる間葉系幹細胞との質的差がないことを確認し、間葉系幹細胞自体を標的として遺伝子導入することによって、非常に効率的にヒトの細胞を用いた遺伝子導入・発現実験を行うことが可能になった。動物実験によって、第VIII血液凝固因子を分泌する細胞を血友病Aマウスに移植して薬理効果を検証する。使用する細胞の種類、移植方法(細胞数や場所、足場など)、生着促進方法を検討する。同時に生着した細胞が長期的に機能するための条件を検討する。ヒト細胞にヒト第VIII血液凝固因子遺伝子を効率よく分泌させるための検討は、主に培養系において実施する。小児科学蛍光マウスを利用して、iRFP遺伝子発現脂肪細胞を同系移植し、同じ個体を継時的に生体イメージングで評価し、移植脂肪細胞の動態を追跡する。血友病Aモデルマウスに対して、マウス第VIII血液凝固因子遺伝子導入・発現脂肪細胞を同系移植し、薬理効果(治療効果)を評価する。ヒト脂肪組織由来の細胞(間葉系幹細胞を含む)に、効率良く遺伝子導入・発現させるための培養条件を検討する。経費の有効利用に心がけた結果として、当初の計画より支出が抑制された結果、3,948円の次年度使用額が生じた。14,201円の繰り越しが生じた。主に消耗品購入の際の値下げ交渉によるものである。平成28年度の研究において物品購入に充てる。主に消耗品(文具・OA関連物品類)購入のため、有効利用を計画している。
非適合要素を用いた混合型有限要素法への内部ペナルティ法の適用

数値シミュレーションは,天気予報や自動車の衝突解析などで用いられ,製品開発や現象解明において,現代では欠かせない技術である.その数値シミュレーション技術は今もなお発展し続けているが,今後もさらに発展させ,これまで数値シミュレーションが難しかった現象の数値シミュレーションを可能にし,人々に豊かな生活をもたらすための寄与をしなくてはならない.このような状況の中,本研究では,地震波やビルの振動現象の数値シミュレーションの基礎技法となる新たな数値解法を数学的品質保証付きで確立し,数値シミュレーション技法の基礎をより強固にすることに貢献することを目指す.数値シミュレーションは,天気予報や自動車の衝突解析などで用いられ,製品開発や現象解明において,現代では欠かせない技術である.その数値シミュレーション技術は今もなお発展し続けているが,今後もさらに発展させ,これまで数値シミュレーションが難しかった現象の数値シミュレーションを可能にし,人々に豊かな生活をもたらすための寄与をしなくてはならない.このような状況の中,本研究では,地震波やビルの振動現象の数値シミュレーションの基礎技法となる新たな数値解法を数学的品質保証付きで確立し,数値シミュレーション技法の基礎をより強固にすることに貢献することを目指す.
糸球体RASのペプチドミクス/プロテオミクス解析と小児慢性腎臓病の診断治療法開発

本研究は小児慢性腎臓病患者の新しい治療法、診断法を開発するために糸球レニンアンジオテンシン系(RAS)をペプチドミクス解析した。その結果、小児CKD患者ではメサンギウム細胞(MC)とポドサイト(POD)におけるACE2依存性のAng II分解系が作動しており、その発現量が腎炎重症度と相関していた。また、CKD患者の尿中ACE2排泄量が腎炎重症度(細胞増殖、タンパク尿)と相関しており新たなCKDの重症度診断のためのバイオマーカーとなりうることが示唆された。本研究の目的は、慢性腎臓病(CKD)の進展阻止を図るために糸球体レニン・アンジオテンシン系(RAS)の活性化やアンジオテンシンII(AngII)ペプチドの代謝機構(断片化機構)をペプチドミクス/プロテオミクス解析し、現存するRAS阻害薬では得られない糸球体特異的なRAS阻害手段や新規のCKDバイオマーカーを探索することにある。われわれは従来より、ELISA法や免疫組織化学法を用いてRASの産物であるAng IIが糸球体局所でRAS基質、アンジオテンシノーゲン(AGT)より産生されておりCKDの進展に関わっていることを報告してきた。今回は、糸球体特異的なAng II分解経路の検討方法を確立するために、培養ヒト糸球体メサンギウム細胞(MC)を用いてペプチドミクス/プロテオミクス解析を行った。ペプチド分子のMS/MS分析により、培養上清中にはAGTや想定される代謝分解成分ペプチドAng I(1-9)、Ang1-9、Ang II(1-8)、Ang1-7、Ang2-10、Ang III(2-8)、Ang IV(3-8)の他に、Ang1-5、Ang1-4、Ang3-10を検出することができた。MC培養環境でRASを作動させる多種のpeptidaseが存在し多様なペプチド断片が生じることが判明した。今回、確立した解析法を単離糸球体培養に応用しRAS代謝経路の検討を進める予定である。また、CKD患者の尿を用いて同様の解析と腎臓内のRASプチド断片の比較検討を行う。研究は、慢性腎臓病(CKD)の進展を左右する腎臓糸球体レニンアンジオテンシン系(RAS)の活性化・Angペプチド断片化機構を網羅的解析(ペプチドミクス/プロテオミクス解析)することにより、現存するRAS阻害薬では得られない糸球体特異的なRAS阻害手段や新規のCKDバイオマーカーを探索することを目的に行われた。平成26年度検討の糸球体細胞Angペプチド断片化経路の基本データを基にして、CKD進行時の新規ペプチド断片の検出並びに各種Angペプチド断片の蓄積レベルやRAS関連酵素の変化を検索した。IgA腎症患児糸球体では、正常糸球体に比しAng 1-7、Ang IIが増殖部位に蓄積していた。同時に、蓄積部位にはAng I(1-10)を分解する酵素、Carboxypeptidase AとAng IIを分解する酵素ACE2が強く発現していた。腎炎進行に働くAng IIを糸球体内で減少させる防御機構が存在することが明らかとなった。この防御機構を治療応用に展開するに必要な基礎データを得る為に、現在、進行性CKDモデルラットを用い糸球体Angペプチド断片化プロファイルの変動、ペプチド分解酵素発現と蛋白尿、病理組織変化との関係を検討している。MS/MS分析にて得た糸球体細胞Angペプチド断片化経路に一致したAng分解産物を腎炎糸球体で検出することができている。さらにAng分解酵素(Carboxypeptidase A、ACE2)のPCRによる発現同定にも成功している。現在、進行性CKDモデルラットを作製に成功しており、ヒトと同様のアプローチで、Ang IIを糸球体内で減少させる防御機構の詳細を解明する予定である。本研究は、慢性腎臓病(CKD)進展を左右する腎糸球体レニンアンジオテンシン系(RAS)の活性化・アンジオテンシン(Ang)ペプチド断片化機構を網羅的解析(ペプチドミクス/プロテオミクス解析)することにより、現存するRAS阻害薬では得られない糸球体特異的なRAS阻害手段や新規のCKDバイオマーカーを探索することを目的に行われた。平成2627年度に得られた糸球体ペプチド断片化経路の基本データと糸球体RAS関連酵素発現プロファイルとの実質的関係を小児CKD患者において組織科学的に検討した。その結果、IgA腎症を代表とする慢性・進行性の小児CKD患者では糸球体内皮細胞(GEC)のACE依存性Ang II産生系、メサンギウム細胞(MC)とポドサイト(POD)におけるACE2依存性のAng II分解系が同時に作動しており、その発端は障害GECのアンジオテンシノーゲン発現上昇にあることを見いだした。特に、IgA腎症患児糸球体では、正常糸球体に比しAng 1-7、Ang IIが増殖部位に蓄積していた。同時に、蓄積部位にはAng I(1-10)を分解する酵素、Carboxypeptidase AとAng IIをACE2が強く発現していた。また、尿中ACE2排泄量は腎炎重症度(細胞増殖、タンパク尿)と相関しており新たなCKDの重症度診断のためのバイオマーカーとなりうることが示唆された。今後は、GEC、MC、PODそれぞれの細胞レベルでのRAS活性化機構と糸球体全体としてのRAS制御機構を解析することにより、腎炎進行性病変形成を阻止しうるAngペプチド作用阻害法の開発に取り組む予定である。

その結果、小児CKD患者ではメサンギウム細胞(MC)とポドサイト(POD)におけるACE2依存性のAng II分解系が作動しており、その発現量が腎炎重症度と相関していた。また、CKD患者の尿中ACE2排泄量が腎炎重症度(細胞増殖、タンパク尿)と相関しており新たなCKDの重症度診断のためのバイオマーカーとなりうることが示唆された。ヒト糸球体MCにおけるRAS由来ペプチド断片化経路をMS/MS分析により検討することができた。本手法を応用することにより糸球体RAS代謝機構を検討することは可能であると思われた。現在、RAS代謝に関わる酵素(ACE,ACE2,アミノペプチダーゼA(APA),ネプリシン(NEP),プロリルカルボキシプチダーゼ(PCP), Chymase,Cathepsin)について発現分析(PCR法)するためのプライマー設計は終了している。速やかに、培養MC/単離糸球体を用いた検討に入る予定である。CKDにおける尿中ペプチドバイオマーカーを検索するために、MS/MS分析での測定系の確立が必要である。ヒト尿では分解酵素の影響や蓄尿状態の安定化が困難であるため、まず動物モデル腎炎由来の尿成分からバイオマーカー検出法の確立に取りかかる予定である。ここでの基礎データを基にヒト尿バイオマーカーの同定に応用する。医歯薬学尿中バイオマーカーを検討するために、尿中RAS代謝由来の断片ペプチドの検出が必要である。今回、蓄尿した尿を用いてMS/MS分析を試みたが有意なピーク(RAS由来ペプチド)は検出できなかった。これは、腎尿路系に存在する多様なぺプチダーゼにより分解されたり、蓄尿過程での分解があるためと考えた。そこで次回は、採尿時やサンプル処理過程にぺプチダーゼインヒビターを加えることにより酵素分解を抑制してMS/MS分析を行う予定である。現存するELISA法によるAngIIペプチド検出法を並列で行い、われわれの手技に誤りがないかどうかも検討する。平成28年3月に修理が完了したが,支払いが4月になったため。平成28年4月に支払い完了である。
膵癌の発生・進展に関与する遺伝子異常の解析

膵癌における高頻度欠失領域と予後との関係を検討し、3か所(12q、17p、18q)か予後不良と相関することを明らかにした。膵の前がん病変として考えられる粘液産成膵腫瘍(IPMT)では18qの欠失が高頻度に見られたが、SMAD4には全く異常が見られなかった。また、膵癌株に正常18番染色体を導入すると、SMAD4の異常の有無に無関係に増殖抑制効果が見られた。このことから、18qにはSMAD4以外にも癌抑制遺伝子が局在し、この機能の喪失が膵癌発生の初期変化として重要であると考えられた。12qにはKRASのルートでERKに特異的に脱リン酸化作用を示すDUSP6が局在する。膵のdysplasia/cisではDUSP6の発現の増強が見られるのに対し、浸潤癌では発現が高度に抑制され、特に低分化型の癌において顕著であった。アデノウイルスベクターにDUSP6遺伝子を組み込み、膵癌細胞に導入し強制発現させると細胞増殖は抑制され、アポトーシスが誘導された。本遺伝子を用いた遺伝子治療が可能であるとの可能性を示している。BAI1(brain specific angiogenesis inhibitor 1)は本来脳で特異的に発現し血管新生抑制作用があるが、これを膵癌細胞に導入すると血管新生が抑制され、腫瘍細胞の増殖は抑制された。tumor dormancyによる遺伝子治療の可能性がある。多くの腫瘍において異常が報告されている1p36-p35領域においてBACによるcontigを作成し解析を進めた。同領域のRIZ遺伝子はタンパクコード領域にマイクロサテライトがあり、各種がんにおいて異常を検討したところ、胃癌、大腸癌、子宮内膜癌などのMSI陽性の癌のみならず、これまでMSI陽性であっても標的遺伝子が不明であった膵癌においても、本遺伝子の異常が同定された。本遺伝子は、1pの標的遣云子である可能性がある。膵癌において高頻度に欠失の見られる領域のうち3か所(12q、17p、18q)の染色体欠失が予後不良と相関することを明らかにし、これらのうち膵の発癌過程で初期変化と考えられる18qにおける標的遺伝子と考えられるSMAD4遺伝子がホモに欠失している膵癌株に正常SMAD4遺伝子を導入しても増殖能は抑制されなかったことをふまえ、膵の前がん病変と位置づけられる粘液産成膵腫瘍(intraductal papillary-mucinous tumor、IPMT)を解析した。その結果、全くSMAD4の異常は見られず、18qにはSMAD4以外にもがん抑制遺伝子が局在する可能性が考えられた。膵癌はじめ、多くの腫瘍において異常が報告されている1p36-p35領域においてBACによるcontigを作成し、同領域の解析を進めた。同領域に局在するRIZ遺伝子を解析し、胃癌、大腸癌、子宮内膜癌などのMSI陽性の癌で高頻度に異常が見られるのみならず、これまでMSI陽性であって標的遺伝子の不明であった膵癌においても異常を同定し、これらの腫瘍における発がんの標的遺伝子である可能性が示唆された。1.これまでに我々は、膵癌において18qの欠失は高頻度に見られる初期変化であり、かつ予後不良と相関することを報告してきた。しかし、SMAD4遺伝子に異常の見られない膵癌細胞株とホモ欠失のある膵癌細胞株とにSMAD4遺伝子を導入しても増殖制御が見られないことも発見していたため、18qの標的遺伝子はSMAD4以外である可能性も考えられた。

そこで、膵の前がん病変と位置づけられる粘液産成膵腫瘍を解析したところ、18qの欠失は高頻度に見られ、欠失のfocusはSMAD4遺伝子近傍であるにも拘わらず、同遺伝子ならびにタンパク発現には全く異常が見られなかった。また、膵癌株に正常18番染色体を導入すると、SMAD4遺伝子の異常の有無に無関係に増殖抑制効果が見られた。このことから、SMAD4近傍に未知の癌抑制遺伝子が局在し、この遺伝子機能の喪失が膵癌発生の初期変化として重要であるという可能性が示唆された。また、BAI1(brain specific angiogenesis inhibitoe 1)による膵がんの遺伝子治療への可能性を示した。2.1p36-p35領域では多岐に渡るヒトがんにおいて異常が報告されている。同領域の40Mb近くのBAC contigを作成し、同領域の解析を進めた。同領域に局在するRIZ遺伝子を解析し、胃癌、大腸癌、子宮内膜癌などのMSI陽性の癌で高頻度に異常が見られるのみならず、これまでMSI陽性であっても標的遺伝子が不明であった膵癌においても異常を同定し、これらの腫瘍における発がんの標的遺伝子である可能性を示唆した。