hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝硬変から脂肪肝まで、あらゆる肝臓の切除を容易にする新規パルスジェットメスの開発

研究開発しているパルスジェットメスの肝切除における肝障害の程度を評価するために、ラットを用いて肝部分切除を行い、他のデバイスと比較検討した。以前の研究課題において、パルスジェットでの肝部分切除では術後のAST,ALTが他デバイスと比較し低値であり、残存肝組織のHE染色で離断面近くの変性が軽度であることを証明していた。今回は、さらにGLDHの検討を追加し、これも低値であることを突き止めた。さらに残存肝組織のHE染色での変性が軽度であることを定量的にも証明した。つぎに、パルスジェットが他デバイスと比較して肝切離速さ、血管温存性、切離面の平坦さにおいて優位性があることを証明するために、摘出豚肝臓を用いた切除実験を計画した。その際に、駆動電圧や周波数を変えながら、他デバイスと比較する予定であったが、各電圧や周波数における最適な水量設定が未知であった。機器開発のコンセプトとしてより少ない水量で切除を行えることが挙げられていたので、まず各電圧の必要最低限の流量を求めた。具体的には、高速度カメラでパルスがノズルから噴射した直後の状態を観察し、液柱が1.5mmでジェットがノズルから噴射される各電圧の流量を必要最低限の流量とした。この実験により、周波数400Hzの際の駆動電圧10Vから140Vまで10V刻みの各電圧における必要最低限の流量を求めることができた。また、ジェット圧を測定することにより、ここで求めた必要最低限の流量で十分なジェット圧が得られていること、必要最低限の流量でも駆動電圧をあげるとジェット圧が高くなることを確認することができた。今後は今回求めた必要最低限の水量をもちいて、摘出豚肝臓を用いた切除実験でパルスジェットと他デバイスの比較実験を行う。当初予定であった組織障害の検討はほぼ完了した。また最適な条件の設定も必要最低限の水量やジェット圧測定など順調に進んでいる。今後は計画通り、豚摘出臓器やヒト摘出臓器実験を行う。豚摘出臓器を用いて、これまでに求めた条件のうち最適なものを検討する。さらに脈管温存性の検討も摘出臓器実験で行う。さらに人摘出肝を用いて非硬変肝や硬変肝を用いて、物性測定や切除実験を行い、その安全性・優位性が人のどのような肝臓においても期待できることを証明する。さらに、豚摘出臓器で得られたデータとヒト摘出臓器でえられたデータを比較し、豚を用いた実験結果をヒトに当てはめることができるかどうかを検討する。当てはめることが可能であれば、豚生存実験を行い、パルスジェットの安全性と優位性を証明することで、今後の臨床研究に向けての非臨床概念実証を確立する。

物品費用としてデータ解析用にコンピューターの購入を見込んでいたが、当年度は以前まで使用していたもので代用し購入を見送ったため、予定より支出が少なくなった。次年度に購入予定である。
異なる取引時間スケールをもつ投資主体の相互作用による株式市場の不安定化メカニズム

本課題研究では市場が不安定化する過程での価格変動を特徴づけ、大規模な価格変動の予兆は,価格時系列にどのような特徴が現れるのか,それはどのように変化していくのか,株式市場の取引データを用いた解析から明らかにする。その際、株式市場を異なる取引時間スケールを持つ複数の投資主体の集合とみなし,それらの投資主体の相互作用の結果として生じる非線形性(マルチフラクタル性)に着目した分析を行う。Random cascade modeは間欠性やマルチフラクタル性を含む金融時系列の多くのStylized factsを説明できる優れたモデルであるが、本研究課題において行なった2008年の株式市場の大暴落を含む期間の金融時系列への応用の妥当性の検証から、スケール間のカスケードを表す確率変数の独立性は成り立っていなかった。そこで、乗算的な確率過程であるRandom cascade modeに加法的な項を加える拡張モデルを提案し、その検証を行った。前記データによる実証研究と、モンテカルロ・シミュレーションによる検証によって、提案モデルは本研究課題で示した全ての実証結果と整合的であった。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告し、経済系の論文誌ににおいて報告した。本年度の研究成果は、スケール軸でのダイナミクスは連続的なマルコフ過程であると仮定して、Kramers-Moyal展開によって実証的にモデルを導いたことである。結果として、モデルはFokker-Planck方程式となった。得られた、Fokker-Planck方程式に対応する確率微分方程式は、乗算的なノイズ項と、付加的なノイズ項に対応する2種類のWiener過程を導入すると整合的である。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告し、経済系の論文誌に投稿準備中である。本年度の研究成果は、スケール軸でのダイナミクスは連続的なマルコフ過程であると仮定して、Kramers-Moyal展開によって実証的にFokker-Planck方程式を導いたことである。当初、金融時系列をウェーブレット変換する際の基底に依存した結果となったため、試行錯誤が必要であった。現在はほぼ方針が定まり、データ分析を継続中である。今年度は、2008年の株式市場の大暴落の前後で、提案したFokker-Planck方程式のパラメータにどのような変化があったのか、複数の株式市場で検証し、暴落に至る過程で起こったことを明らかにしていきたい。また、これらの成果は引き続き国際会議や国内の学会、物理系、経済系の論文誌で報告していく予定である。。本研究は,株式市場において,ニュースなどの外生的直接要因や,ニュースがもたらす印象の蓄積によって市場参加者間に醸成されたムードで内生的に引き起こされる市場の不安定化のメカニズムとそのプロセスを明らかにするものである。本課題研究では市場が不安定化する過程での価格変動と市場参加者の発注行動の特徴付け大規模な価格変動の予兆は,価格時系列,売買注文の時系列(オーダーフロー)のどのような特徴に現れるのか,それはどのように変化していくのか,株式市場の取引データを用いた解析から明らかにする。今年度は、時系列のマルチフラクタル性を再現するモデルと考えられているRandom cascade modelの金融時系列への応用の妥当性を検証した。ロンドン証券取引所に上場するFTSE100構成銘柄の、サブプライム問題に端を発する2008年の株式市場の大暴落を含む期間について、ティックデータを用いて詳細に分析した.結果として、Random cascadeモデルの理論的帰結である時系列のマルチフラクタル性は綺麗に成り立っているが、Random multiplicative cascadeの確率変数が互いに独立であるとする過程は成り立っていなかった。また、多くの実証研究で用いられているMultifractal random walkモデルは対数正規分布を仮定するものであるが、実際にデータから求めた分布は自由度1の非標準化t分布であった。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告した。価格時系列についての分析はほぼ順調に進んでいるが、オーダーフローの分析への拡張を行う前に、数理モデル化の構築に取り掛かったためオーダーフローの実証研究は遅れている。研究期間3年間の計画としてみれば、概ね順調であるといえる。本課題研究では市場が不安定化する過程での価格変動と市場参加者の発注行動を特徴づけ、大規模な価格変動の予兆は,価格時系列,売買注文の時系列(オーダーフロー)のどのような特徴に現れるのか,それはどのように変化していくのか,株式市場の取引データを用いた解析から明らかにする。Random cascade modeは間欠性やマルチフラクタル性を含む金融時系列の多くのStylized factsを説明できる優れたモデルであるが、前年度行なった2008年の株式市場の大暴落を含む期間の金融時系列への応用の妥当性の検証から、スケール間のカスケードを表す確率変数の独立性は成り立っていなかった。今年度は、乗算的な確率過程であるRandom cascade modeに加法的な項を加える拡張モデルを提案し、その検証を行った。

前記データによる実証研究と、モンテカルロ・シミュレーションによる検証によって、提案モデルは本研究課題で示した全ての実証結果と整合的であった。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告し、経済系の論文誌に投稿中である。金融時系列の実証分析、数理モデルの構築はほぼ順調に進んでいるが、オーダーフローの分析がやや遅れている。理由は、実証研究の結果が通常のRandom cascade modelでは説明不可能であったため、数理モデルを拡張する必要があり、その構築に時間がかかったためである。本課題研究では市場が不安定化する過程での価格変動を特徴づけ、大規模な価格変動の予兆は,価格時系列にどのような特徴が現れるのか,それはどのように変化していくのか,株式市場の取引データを用いた解析から明らかにする。その際、株式市場を異なる取引時間スケールを持つ複数の投資主体の集合とみなし,それらの投資主体の相互作用の結果として生じる非線形性(マルチフラクタル性)に着目した分析を行う。Random cascade modeは間欠性やマルチフラクタル性を含む金融時系列の多くのStylized factsを説明できる優れたモデルであるが、本研究課題において行なった2008年の株式市場の大暴落を含む期間の金融時系列への応用の妥当性の検証から、スケール間のカスケードを表す確率変数の独立性は成り立っていなかった。そこで、乗算的な確率過程であるRandom cascade modeに加法的な項を加える拡張モデルを提案し、その検証を行った。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告し、経済系の論文誌ににおいて報告した。本年度の研究成果は、スケール軸でのダイナミクスは連続的なマルコフ過程であると仮定して、Kramers-Moyal展開によって実証的にモデルを導いたことである。結果として、モデルはFokker-Planck方程式となった。得られた、Fokker-Planck方程式に対応する確率微分方程式は、乗算的なノイズ項と、付加的なノイズ項に対応する2種類のWiener過程を導入すると整合的である。これらの成果は、国際会議や国内の学会で報告し、経済系の論文誌に投稿準備中である。本年度の研究成果は、スケール軸でのダイナミクスは連続的なマルコフ過程であると仮定して、Kramers-Moyal展開によって実証的にFokker-Planck方程式を導いたことである。当初、金融時系列をウェーブレット変換する際の基底に依存した結果となったため、試行錯誤が必要であった。現在はほぼ方針が定まり、データ分析を継続中である。現在、時間スケール間のRandom cascadeについて、実証研究の結果を再現するような数理モデルを構築中である。その結果をオーダーフローの時系列に敷衍し、市場が不安定化する過程での価格変動と市場参加者の発注行動の特徴付けを行いたい。
膵臓癌の転移能および治療抵抗性獲得のメカニズム解析と新規治療法の開発

1.膵臓癌におけるglucose transporter type 1 (GLUT-1)の発現が化学放射線療法の効果予測因子として有用であり,術前の生検組織においてGLUT-1が低発現である症例は化学放射線療法の高い効果が期待されることを明らかにした.画像検査にて切除可能境界と診断された症例は外科的切除後の再発率が高く,有効な術前治療を行うことが重要である.GLUT-1低発現症例では術前化学放射線療法後の外科切除により高い根治切除率と予後向上につながる可能性があることを示した.一方,GLUT-1高発現症例では導入化学療法後の化学放射線療法が予後を改善する可能性があることを示した.2.切除可能膵癌において,術前の血清CA19-9値と術前生検組織におけるp53の発現が術後早期再発予測に有用であることを明らかにした.血清CA19-9値>85U/mLでp53高発現である症例は画像上切除可能と診断されても術後早期再発の高危険群であり,術前治療を加えることで再発率の低下と予後の向上につながる可能性があることを示した.3.膵臓癌におけるmicroRNA発現の網羅的解析により,膵臓癌組織においてはmiR148aが抑制されており,miR148aの強制発現により膵癌細胞の浸潤能が減弱することを明らかにした.更にmiR148aのターゲットの1つであるPHLDA2が癌遺伝子として膵癌細胞に作用することを明らかにした.膵臓癌における治療前の生検検体を用いた転移能や治療抵抗性の予測に関する研究および網羅的microRNAスクリーニングによる新規癌遺伝子の同定は順調に進展しているが,網羅的shRNAスクリーニングを用いた研究の進展はやや不良である.網羅的microRNAスクリーニングにて同定したmicroRNAや新規癌遺伝子の更なる解析を伸展させ,転移能や治療抵抗性獲得のメカニズを目指す.膵癌術前生検検体を用いた,治療抵抗性予測および転移能予測に基づいた術前治療を計画し,その効果を検証する.1.膵臓癌におけるglucose transporter type 1 (GLUT-1)の発現が化学放射線療法の効果予測因子として有用であり,術前の生検組織においてGLUT-1が低発現である症例は化学放射線療法の高い効果が期待されることを明らかにした.画像検査にて切除可能境界と診断された症例は外科的切除後の再発率が高く,有効な術前治療を行うことが重要である.GLUT-1低発現症例では術前化学放射線療法後の外科切除により高い根治切除率と予後向上につながる可能性があることを示した.一方,GLUT-1高発現症例では導入化学療法後の化学放射線療法が予後を改善する可能性があることを示した.2.切除可能膵癌において,術前の血清CA19-9値と術前生検組織におけるp53の発現が術後早期再発予測に有用であることを明らかにした.血清CA19-9値>85U/mLでp53高発現である症例は画像上切除可能と診断されても術後早期再発の高危険群であり,術前治療を加えることで再発率の低下と予後の向上につながる可能性があることを示した.3.膵臓癌におけるmicroRNA発現の網羅的解析により,膵臓癌組織においてはmiR148aが抑制されており,miR148aの強制発現により膵癌細胞の浸潤能が減弱することを明らかにした.更にmiR148aのターゲットの1つであるPHLDA2が癌遺伝子として膵癌細胞に作用することを明らかにした.膵臓癌における治療前の生検検体を用いた転移能や治療抵抗性の予測に関する研究および網羅的microRNAスクリーニングによる新規癌遺伝子の同定は順調に進展しているが,網羅的shRNAスクリーニングを用いた研究の進展はやや不良である.網羅的microRNAスクリーニングにて同定したmicroRNAや新規癌遺伝子の更なる解析を伸展させ,転移能や治療抵抗性獲得のメカニズを目指す.膵癌術前生検検体を用いた,治療抵抗性予測および転移能予測に基づいた術前治療を計画し,その効果を検証する.
糸状菌のバイオマス分解酵素生産制御機構と代謝経路の包括的解明

(1)転写因子AmyRの誘導基質特異的な核移行と不安定性の一方で、MalRの構成的核局在および誘導基質存在下での安定性を明らかにした。AmyRとシャペロンであるHsp70およびHsp90との複合体形成を明らかにした。(2)マルトーストランスポーターMalPのグルコース存在下におけるエンドサイトーシス依存的な分解に関わる制御マシナリーとしてユビキチンリガーゼHulAとアレスチン様タンパク質CreDの関与を明らかにした。(3)DNAマイクロアレイによる標的遺伝子の網羅的同定、候補遺伝子産物の発現と基質特異性の解析などを通して、麹菌におけるペントース代謝系酵素遺伝子を全て同定した。(1)セルロース分解やアラビナン分解に関与する酵素遺伝子の発現制御に関わる転写因子XlnRとAraRの高発現株のアレイ解析により、発現上昇が認められたトランスポーター遺伝子の中から発現比の大きい上位の遺伝子をそれぞれ3個と2個選択し、遺伝子破壊株を作製した。得られた遺伝子破壊株をキシロースとアラビノース、これらの単糖から成るオリゴ糖を単一炭素源とする培地上での生育を観察したが、生育の低下は見られなかった。一方、それらの遺伝子のin silico解析により、XlnR支配下の1つがセロビオースの取り込みに関わるトランスポーターの可能性が示唆された。(2)マルトーストランスポーターMalPのN末端側にGFPを融合した融合タンパク質を作製し、各種の糖存在下での細胞内における局在様式を蛍光顕微鏡で観察した。マルトース存在下ではほとんどが細胞膜に局在しているが、グルコースを添加後に経時的な蛍光像を観察したところ、30分以内に細胞膜から液胞への移行が認められた。一方、フルクトースやスクロースにおいてもグルコースほど速やかではないものの液胞への移行が見られたが、ガラクトースやキシロースなどではMalPのエンドサイトーシスはほとんど認められなかった。(3)未同定であったレアラビノース代謝系のL-アラビノースレダクターゼ(Lar)とL-キシルロースレダクターゼ(Lxr)遺伝子を同定することにより、麹菌L-アラビノース代謝経路を解明した。また、D-キシロースレダクターゼとL-アラビノースレダクターゼが酵素学的にも生理的にも機能重複していること、L-キシルロースレダクターゼにはバイパス経路が存在すること、これらのペントース代謝系は転写因子XlnR、AraRによって制御されており、両転写因子の同時欠損により代謝系酵素遺伝子の全ての転写産物が激減することを明らかにし、D-キシロース、L-アラビノース代謝系とその制御が解明できた。MalPの細胞内局在変化を観察するためにGFP-MalP融合タンパク質をmalPプロモーター制御下で発現させ、共焦点顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。マルトース誘導条件下で細胞膜上へのGFP-MalPの局在化を確認した後に、アクチン重合阻害剤であるLatrunculin Bで処理し、グルコース添加後のGFP-MalPの局在変化を観察した。その結果、Latrunculin B処理を行った株ではグルコース添加後も細胞膜上のGFP蛍光が消失しないことが明らかとなった。このことから、細胞膜上から液胞へのGFP-MalPの輸送はエンドサイトーシス依存的な機構によるものであることが示された。また、MalPの液胞への輸送を誘起する炭素源は、malP遺伝子のカタボライト抑制にも関与することが明らかとなった。DNAマイクロアレイによる標的遺伝子の網羅的同定、さらに代謝系遺伝子産物については酵素学的解析を行い、ペントース代謝系酵素遺伝子を全て同定した。転写因子XlnRとAraRが制御する本代謝系酵素遺伝子には重複が見られ、両者は協調的に転写制御を行うと考えられた。また、XlnRとAraRの単独破壊株、二重破壊株におけるペントース代謝系酵素遺伝子群の転写誘導をリアルタイムPCR法によって解析した結果、二重破壊株では全遺伝子についてD-xylose、L-arabinoseによる誘導が消失した。また、L-arabinose reductaseの発現はAraRのみに依存した。一方、他遺伝子については、単独破壊は転写誘導の完全消失には至らず、誘導物質や遺伝子によっては発現レベルの上昇を引き起こした。従って、これら転写因子は協調的にも競合的にも機能すると考えられた。麹菌のアミラーゼ生産に関与する転写因子AmyRおよびマルトース資化に関与する転写因子MalRの炭素源に依存した核局在化を調べ、AmyRはグルコースやフルクトース存在下では細胞質内に局在しマルトース存在下で核移行するが、MalRはいずれの炭素源においても核に局在することを認めた。

マルトーストランスポーターMalPとGFPの融合タンパク質を作製し、各種の糖存在下での細胞内における局在様式を蛍光顕微鏡で観察したところ、マルトース存在下では細胞膜に局在しているが、グルコース添加後速やかに細胞膜から液胞への移行が認められ、エンドサイトーシス阻害剤により細胞膜から液胞への移行が見られなくなったことから、MalPはグルコース存在下でエンドサイトーシスにより分解制御されていることが分かった。また、creB破壊株ではMalPの液胞内移行が認められたが、creD破壊株ではMalPは細胞膜にとどまっていたことから、CreDがMalPのエンドサイトーシスに関わっていることが明らかになった。一方、セルロース分解に関与する酵素遺伝子の発現制御に関わる転写因子XlnRの高発現株のアレイ解析により、発現上昇が認められたトランスポーター遺伝子の中から発現比の大きい上位の遺伝子のin silico解析により、セロビオーストランスポーターとキシローストランスポーターの可能性が高い候補遺伝子が取得できた。麹菌のペントース代謝経路に存在するNAD依存型とNADP依存型の2種類のL-キシルロースレダクターゼ(Lxr)の遺伝子破壊株を作製したところ、それぞれの遺伝子破壊ではL-アラビニトール資化能には大きな影響は見られなかったが、lxrA/lxrBの二重破壊により資化能は消失した。しかし、2種類のキシリトールデヒドロゲナーゼの二重破壊によってもキシリトール資化には影響は認められなかった。マルトーストランスポーターMalPの炭素源依存的な分解機構については、順調に解析が進行し、遺伝子の転写に影響のある炭素源によってエンドサイトーシスが起こるという新知見も明らかになった。一方、キシロースなどの新規トランスポーターの同定と機能解析は候補遺伝子の絞り込みまではできたものの、同定までには至っていない。また、ペントース代謝経路に関しては、トランスクリプトーム解析による標的遺伝子の網羅的同定、代謝系遺伝子産物の酵素学的解析により、ペントース代謝系酵素遺伝子を全て同定することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。マルトーストランスポーターMalPのグルコースによるエンドサイトーシスに対するカーボンカタボライト抑制関連遺伝子、creA, creB, creDの関与について解析を行う。MalPのユビキチン化に関わるユビキチンリガーゼHulAとアレスチン様アダプタータンパク質CreDの相互作用を解析する。また、キシロースやアラビノース、セロビオースの細胞内取込みに関わるトランスポーターを探索・同定するとともに、これらのトランスポーターの炭素源依存的分解についても解析を行う。一方、ペントース代謝経路については、アレイ解析から見出されてきた本代謝経路を構成する遺伝子や新規候補遺伝子の単独破壊および多重破壊により、代謝経路に関わる遺伝子群の機能を明らかにする。
チオフラノイドグリカールを利用する4'-チオヌクレオシドの立体選択的合成研究

4-チオフラノイドグリカールの糖部水酸基をt-butyldimethylsilyl基(1)、1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl基(2)およびdi-t-butylsilyl基(3)で保護した三種類の基質を合成した。グリカール1をアセトニトリル中、シリル化したウラシルの存在下,フェニルセレネニルクロリドとの反応を行ったところ目的とするβ-4'-チオヌクレオシド(4)とその立体異性体であるα-4'-チオヌクレオシド(5)の混合物が得られ、生成比は4/5=4/1であった。一方、環状の保護基で保護した2あるいは3に対して、同様の反応条件下親電子付加反応を行ったところ、TlPDS-グリカール2の場合、β-ヌクレオシドとα-ヌクレオシドの生成比は18:1仁改善され、更に、DTBS-グリカール3に対する親電子付加反応では2'-デオキシ-β-4'-チオ-2'-フェニルセレノヌクレオシドを単一の立体異性体として得ることに成功した。本反応は核酸塩基としてチミン、親電子剤としてN-ヨードコハク酸イミドを用いても進行することが判り、対応するチミンヌクレオシドあるいは2'-デオキシ-2'-ヨード誘導体を得ることができた。本合成法により得られた4'-チオヌクレオシドはフェニルセレノ基あるいはヨード基のラジカル的な還元により2'-デオキシ体へ変換可能であった。また2'-デオキシ-2'-ヨード体を塩基で処理することによりO^2,2'-シクロ誘導体を得ることができ、このものの酸処理によりアラビノ体へ、塩基処理によりリボフラノシル体へ変換することができた。
セフェム系抗菌薬に対して触媒効率を高めたメタロ－β－ラクタマーゼの物理化学的解析

KHM-1は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解するメタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)である。KHM-1は、他のMBLと比べるとセフェム系抗生物質に対して非常に触媒効率が高い。そこで本研究は、KHM-1の高触媒効率機構の解析を目的とした。KHM-1の結晶構造から、活性中心にある2つのZnイオンの一つが解離しやすく、X線小角散乱解析による溶液構造から、構造が非常に類似したMBL(IMP-1酵素)と比べると粒径が小さいことが分かった。さらにKHM-1の活性中心近傍にあるHis170の変異酵素の速度論的パラメータから、KHM-1のHis170は加水分解活性に影響を与えることが分かった。メタロ-β-ラクタマーゼであるKHM-1は、セフェム系β-ラクタム剤に対して、非常に効率よく加水分解を行うZn含有酵素である。本研究では、同じメタロ-β-ラクタマーゼであるIMP-1と比較して、KHM-1の高効率加水分解機構を分子レベルで理解することが目的である。そのために、IMP-1とKHM-1のアミノ酸配列を比較して、高効率加水分解に重要そうなKHM-1のアミノ酸を特定した。このアミノ酸の役割を、KHM-1遺伝子に変異導入を行い、速度論的解析とX線小角散乱による液体構造の比較によって、KHM-1の高効率加水分解反応のメカニズムを解明する。平成26年度は、X線小角散乱を使ってKHM-1の溶液構造を調べるために、KHM-1の高純度精製条件の検討を行った。今までは、大腸菌内で大量発現させたKHM-1は、イオン交換カラムとゲルろ過カラムで、精製を行ったが、さらに疎水性カラムを使うことで、より高品質・高純度のKHM-1を精製することができた。精製度の確認は、今までのSDS-PAGEだけでなく、MALDI-TOF/MSを利用することで、高品質の確認が行えるようになった。またKHM-1変異酵素の調製を行うために、KHM-1遺伝子に変異を加える実験を行った。しかし、市販の変異実験用キットや実験条件を検討したが、KHM-1遺伝子に目的の変異導入ができなかった。現在、primer設計とサブクローニングの見直しを行っている。本研究は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解する酵素メタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)の中で、特にセフェム系を非常に効率よく加水分解するKHM-1の機能解析を物理化学的手法を用いて行うことを目的としている。KHM-1は、MBLであるIMP-1とアミノ酸相同性が約59%であるが、結晶構造の比較では、主鎖と二次構造ではほとんど差が見られなかった(論文執筆中)。IMP-1では基質がペニシリン系からセフェム系に変わると触媒活性が約10倍上がるが、KHM-1では約100010000倍上がる。このことから、KHM-1はセフェム系β-ラクタム剤を好んで加水分解することが知られている(J. Sekiguchi, et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2008)。平成27年度は、KHM-1の構造解析において高触媒に影響を与えていると考えられるアミノ酸残基に変異を加える実験を行った。KHM-1遺伝子を遺伝子操作用プラスミドに組み込み、変異を加えて大量発現系プラスミドに再度、組み直した。この変異プラスミドを大量発現用の大腸菌に導入し、KHM-1変異体の発現と可溶化、精製を行った。その結果、WildType(WT)と同様に高純度で大量精製することができた。そこでKHM-1変異体のセフェム系β-ラクタム剤に対する加水分解活性を測定した。対照実験として、KHM-1(WT)とIMP-1で行った。現在、ペニシリン系β-ラクタム剤に対する活性と比較検討を行っている。本研究は、MBLの基質認識機構と触媒機構の解明を目的としている。この研究成果は、未だ臨床上にないMBL阻害剤の開発につながることを期待している。平成26年度は、KHM-1の変異体調製に時間が掛かったが、平成27年度でようやくKHM-1変異体の調製を行うことができた。このことで、他の変異体調製を行う基盤ができた。幸い、KHM-1変異体は、WildTypeと同様に高純度で大量(数十mg)に調製することができた。さらにKHM-1変異体の速度論的解析を行うことができた。このことから、KHM-1の基質認識機構の解明ができると考えられる。ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解する酵素メタローβーラクタマーゼ(MBL)を研究対象としており、MBLであるKHM-1のセフェム系β-ラクタム剤に対する高触媒活性の要因について、変異酵素を調製して、Native型KHM-1(Native)と速度論的解析によって比較した。なお、変異のアミノ酸位置は、KHM-1の結晶構造(未公表)から選定した。KHM-1は、MBLであるIMP-1とのアミノ酸相同性は約59%であるが、KHM-1はIMP-1に比べてセフェム系に対して高い触媒効率を示すことが報告されている。しかし、両結晶構造を比較したが、KHM-1の高触媒効率の要因を特定できるような差は観察できなかった(未公表)。

そこでKHM-1の活性中心近傍にあるHis170に着目し、IMP-1では170位はAspであることから、KHM-1のH170D変異酵素(Mutant)を調製した。報告されたNativeのアンピシリンに対する触媒効率(Km/kcat,単位:/(M・s))は1.9×10の4乗であり、セフォタキシムでは1.7×10の8乗であったが、Mutantはそれぞれ2.8×10の4乗、8.7×10の5乗であった。これはIMP-1で報告されている触媒効率と同等であった。Mutantの触媒効率が低下した理由は、Km値はあまり変化はないが、kcat値が低下していることが分かった。このことから、KHM-1のHis170は、加水分解機構に影響を与えていることが分かった。しかしNativeの触媒効率は、私たちの実験ではアンピシリンに対して1.8×10の5乗であり、セフォタキシムでは2.6×10の6乗であった。これは報告されている値とかなり違うことから、酵素精製中においてKHM-1の触媒効率を低下させる要因があると考え、その原因を調べている。KHM-1は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解するメタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)である。KHM-1は、他のMBLと比べるとセフェム系抗生物質に対して非常に触媒効率が高い。そこで本研究は、KHM-1の高触媒効率機構の解析を目的とした。KHM-1の結晶構造から、活性中心にある2つのZnイオンの一つが解離しやすく、X線小角散乱解析による溶液構造から、構造が非常に類似したMBL(IMP-1酵素)と比べると粒径が小さいことが分かった。さらにKHM-1の活性中心近傍にあるHis170の変異酵素の速度論的パラメータから、KHM-1のHis170は加水分解活性に影響を与えることが分かった。KHM-1遺伝子の変異導入の位置は特定したが、市販キットによる変異導入ができなかった。これは、KHM-1遺伝子が、大腸菌内で大量の蛋白質を発現させるためのpETベクターに組み込まれている可能性が考えられた。またprimer設計を見直す必要がある。その他は、x線小角散乱のための高純度精製法を確立することができた。平成28年度は、本研究課題の最終年度である。KHM-1のセフェム系高触媒機構を解明するために、平成27年度とは違う変異体を調製して、そのアミノ酸の役割を検討する。またKHM-1の高触媒機構は、KHM-1の活性中心にあるZn(II)イオンの影響も考えられる。キレート剤を使って、KHM-1の活性中心からZn(II)イオンを脱離させ、時間に対するキレート剤を入れていない時の相対活性から、KHM-1から脱離するZn(II)イオンの脱離速度を算出する。この結果から、同じMBLであるIMP-1と比較して、Zn(II)イオンの役割を検討する。酵素化学連携研究者と連携して、KHM-1遺伝子の変異実験を進めて行く。また研究協力者である学生と共に、KHM-1遺伝子の変異実験の加速を図りたい。KHM-1遺伝子に変異導入することができれば、HKM-1変異酵素を調製して、速度論的解析を行う。これも研究協力者の学生と共に行う。X線小角散乱によるKHM-1の実験では、KHM-1変異酵素が大量に必要となる。これも研究協力者の学生と共に、精製法の検討を行う。
シリコン・ゲルマニウム規則混晶からの光第二高調波発生に関する研究

Si分子線セルの検討固体ソースSi分子線エピタキシャル成長では,従来Siを蒸発させる手段として電子銃加熱が用いられてきたが成長速度の安定性に問題があり,成長速度の制御も容易ではない。そこでこれに代わる方法として,高温まで使用可能なSi分子線セルを用いてSiGeヘテロ構造の作製を行った。Si分子線セルは13501650°Cの範囲で使用した。これは5×10^<-3>0.5Å/secの成長速度に対応し、2桁にわたって成長速度の制御が可能であることがわかった。分子線セルでは成長速度の制御性が高く,本研究で対象とする短周期超格子構造の作製に最適な成長技術を確立することができた。SiおよびGeは反転対称性を有するため双極子近似による光第二高調波発生は禁止されているが,奇数原子層からなるSi_nGe_n超格子においては反射対称性が崩れるための光第二高調波発生が期待される。本研究ではSi(111)基板上にSi_3Ge_3超格子を作製し、光第二高調波の測定を行い,超格子からの寄与と考えられる光第二高調波発生を初めて観測した。この試料を850°Cでアニールすると光第二高調波の強度が急激に減少した。これはアニールによって原子の拡散が起こり、超格子構造が壊れたためと考えられる。比較のために反転対称性を有するSi_4Ge_4超格子で同様の測定を行った結果,光第二高調波の強度は弱く,アニールによる強度変化はほとんどなかった。しかたがってこの場合の光第二高調波は表面からの寄与によると考えられる。今後は,成長中に形成される規則混晶からの光第二高調波発生について研究を進めたいと考えている。
蛍光クエンチ解消原理に基づく生物計測の新展開

我々が最近開発した,部位特異的に蛍光修飾した組換え抗体断片を使って各種抗原検出を高感度かつその場で迅速に行うことができる,新規免疫測定素子Quenchbody (Q-body)の基礎原理の確立と,各種の応用を目的として検討を行った。従来の無細胞系に加えて細胞系でのFab型Q-body合成に成功し,これらを用いて新規な色素の発見,新規な修飾部位の発見,GFP変異体を用いた遺伝子にコードされたQ-body構築原理の発見,ビーズを用いたアッセイの成功,細胞分泌ペプチドの顕微可視化の成功,抗体以外のタンパク質を用いた同様の検出素子(Q'-body)の構築の成功,といった成果を得た。本研究の目的は,我々のこれまでの抗体工学研究を基盤とした,バイオテクノロジーの幅広い領域で応用可能な新規蛍光免疫測定原理の確立と応用にある。本年度は新規免疫測定素子Quenchbody(Q-body)に関し,新規に購入した蛍光分光光度計を用いて以下の検討を行った。まず色素としてこれまで用いてきたTAMRA以外にATTO520,R6Gといったローダミン系色素が使え,R6Gはより良い応答を示し,ATTO520はより親水性で扱いやすいことがわかった。また新規に数種のscFv型Q-bodyを作製し,蛍光色素ならびにTrp蛍光の抗原結合依存的変化を検出した。また,新たな試みとしてscFv類似の構造をもつリガンドrapamycin依存的に会合するFKBP-FRBのQ-body化を試行し,高感度なrapamycin検出に成功した。次に,合成量の少ない無細胞タンパク質合成系によらずに大量にQ-bodyを合成する方法の検討を行い,色素導入用にN末側にCys残基をもつタグ配列を導入したFab断片を大腸菌で大量発現・精製し,これにマレイミド修飾色素をラベルし,精製することで合成可能なことを見出した。抗オステオカルシン抗体FabをTAMRAでH鎖1箇所ラベルした場合に最大3倍,ATTO520でH/L鎖をダブルラベルした場合,最大7倍の応答性を得ることが出来た。特に後者ではダブルラベルで顕著に応答性が向上したが,これは色素間クエンチの効果と考えられる。さらにこれを用いてU2OS Osteosarcomaのオステオカルシン産生の蛍光顕微鏡観察を試み,Vitamin D3依存的な蛍光のイメージングに成功した。1.ライブラリからの各種一本鎖抗体(scFv)の取得抗体チップ作成のため,抗原添加によってより蛍光が高まる(Q-bodyとして性能の高い)組換え抗体断片の取得を試みた。このため,CDRに変異を加えたscFvライブラリを作製し,ファージ提示法を用いて抗原BGPで選択することにより,抗原特異的に結合する抗体断片を得た。得られた抗体断片について,備品として購入したタンパク質パーソナルアッセイシステムBLItzを用いて抗原結合能の定量的・速度論的解析を行い,高い結合能を示すクローンにつき,それらをQuenchbody化して性能を評価した。2.診断用プロテインチップの構築BGP認識Fab型Q-bodyをビーズに固定し,これを顕微鏡観察することにより,抗原依存的な蛍光上昇が検出できた。次にVitamine D3を添加し分化誘導するとBGPを産生するU2OS細胞を用いて,これにQ-bodyを添加し直ちに蛍光顕微鏡観察を行ったところ,分化誘導を行った場合のみに細胞内外で顕著な蛍光が観察された。今後この知見をもとに,アルブミン,がん抗原などで同様の検出を試みる。またこれらのビーズをスライドガラス上に配置することで,チップとして具体化する。3.抗体以外のタンパク質のQ-body化モデル結合タンパク質として免疫抑制剤ラパマイシン結合タンパク質ペアFKBP12-FRBを一本鎖化したものを用い,無細胞タンパク質合成系を用いてこれらのN末に蛍光色素を導入した。この結果,複数のコンストラクトと色素のペアでラパマイシン依存的な蛍光強度上昇を確認でき,ラパマイシンセンサーの構築に成功した。これについて蛋白質科学会でポスター発表を行った。1.ライブラリからの高性能Q-bodyの取得大阪大学大学院薬学研究科近藤昌夫博士より供与いただいた,がん関連膜タンパク質クローディンに対するモノクローナル抗体6種を材料に,これらのFab Q-body化を試みた。この結果,特にアフィニティの高い2種のクローンで,最大3倍の抗原依存的蛍光増大を示すQ-bodyが得られた。さらに,これらを用いた洗浄操作なしでの細胞イメージングに成功した。これに対し,Alexa488で通常の蛍光標識を行ったFab断片では明瞭な染色像が得られなかった(河村ら,化学工学会学生賞受賞)。2.Quenchbodyチップの作製検討Flag抗体ビーズにFlagタグを持つFab型Q-bodyを固定した状態で,通常の蛍光分光光度計を用いて遊離のQ-

bodyとほぼ同じ感度で抗原(BGPペプチド)濃度測定が可能なことを確認した。これにより,原理的に多波長フローサイトメトリー,Luminex等を用いる事で原理的に低分子抗原の同時多サンプル検出が可能と考えられる。3.細胞からのタンパク質分泌過程の可視化U2OS骨肉腫細胞をVitamine D3で骨芽細胞に分化させ,Fab型Q-bodyでBGP産生細胞を顕微鏡で同定することに成功した。また,蛍光タンパク質同士のFRETを利用した,細胞で発現可能なQ-body構築法を確立し,血清アルブミンの蛍光検出に成功し論文発表した(Open Flower Immunoassay)。4.免疫抑制剤ラパマイシン依存的に相互作用するFKBP12-FRBを一本鎖リンカーで結合させ,N末端近傍を蛍光標識してQ-body様分子(Q'-body)を構築し,その蛍光強度のラパマイシン濃度依存性を確認し論文発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質工学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度実施予定項目のうち,蛍光寿命については装置の都合で測定ができていないものの,その他の項目では予定通りか期待以上の結果が得られている。さらに,最終年度に実施予定であった細胞イメージングについても,細胞は異なるが原理的に可能な事を示す事ができた。抗体選択については本年度はFabからscFvの選択に変更し,より応答性の高い抗体を選ぶ方向に若干の方針転換を行ったが,抗体以外の結合タンパク質での結果も出ており,概ね計画通り進んでいると判断している。計画は順調に推移しており,来年度以降も基本的に計画通りに研究を推進する。加えてライブラリから取得した新規抗体の性能評価のため,来年度はそのための設備(タンパク質パーソナルアッセイシステムBLITz)を購入し,解析に用いる。抗体選択に関しては,現状では大規模ライブラリの構築と選択には技術的困難が伴うことから,目標を既存の抗体の応答性向上に変更し,更に複数の抗体で選択を試みる。また新たに,最近報告されたタンパク質のN末標識法を応用した,既存の抗体を用いたQ-body構築の可能性についても検討する。チップの具現化に関しては,アレイヤーと読み取り機が調達できればこれらを用いるが,それまでは384ウェルプレートでの測定,Quantusでの測定,ウェル印刷スライドガラスの顕微鏡観察等で微量蛍光測定における感度を評価する。得られた結果については,順次学会発表ならびに論文発表を行っていく。東工大への異動に伴い,これまで利用してきたBiacoreの利用が難しくなると予想され,本年度の支出を少し抑えて次年度に代替品(BLITz)を購入することとした。本年度に予定していた試薬の納入が次年度になったため,そのための費用を残した。納入予定の試薬(蛍光色素)を用いて,より応答性の高いQ-body構築の可能性を探る。
熱力学モデルおよびデータベース連携による新しい金属ガラス、ナノ結晶合金の開発

原子寸法差、混合熱および周期律表における構成元素の周期によりバルク金属ガラス(BMG)の分類を行った。井上により与えられた以前の結果を基に、今日までに見出されたバルク金属ガラスを7つのグループに分類した。7つのグループは以下のようである。(G-I)ETM/Ln-LTM/BM-Al/Ga,(G-II)ETM/Ln-LTM/BM-Metalloid,(G-III)Al/Ga-LTM/BM-Metalloid,(G-IV)IIA-ETM/Ln-LTM/BM,(G-V)LTM/BM-Metalloid、(G-VI)ETM/Ln-LTM/BMおよび(G-VII)IIA-LTM/BMであり、ETM、Ln、LTM、BMおよびIIAは、それぞれ、前期遷移元素、ランタノイド金属、後期遷移金属、IIIB-IVB金属およびIIA族金属である。バルク金属ガラスの主要元素は、三元系のG-I、G-VおよびG-VII、三元系のG-IIおよびG-IVおよび三元系のG-VIで、それぞれ、最大原子半径、中間原子半径および最小原子半径をもつ元素となる。G-I、G-VおよびG-VIIに属する三元系バルク金属ガラスの主要合金化元素は、負に最大の混合熱値をもつ特徴を有する原子対の原子であるが、一方、G-IIおよびG-IVに属する三元系バルク金属ガラスはその特徴の原子対に関与しない。G-III、G-IV(Be含有Zr基バルク金属ガラス)およびG-VIに属する多元系バルク金属ガラスでは、主要元素は上述の特徴をもつ原子対で原子寸法の大きい方の元素もしくはその元素と周期律表で同じ族にある元素である。本研究で得られたバルク金属ガラスの分類結果は、新しいバルク金属ガラス合金組成の開発の道筋を与える結果ゆえ、さらなる金属ガラスの開発に対して重要である。平成15年度では研究計画に従い金属ガラスを研究対象とした理論的解析を行うとともに、実際に合金開発を行った。具体的には、ミーディマ法を多元合金系に応用することにより、典型的な金属ガラス生成合金系を含む種々の三元系合金のアモルファス相の生成組成範囲を算出した。また、自由体積理論に基づき金属ガラスのガラス遷移現象の解析を行い、金属ガラスの粘性を用いることにより、ガラス遷移温度、結晶化温度さらにはこれらの温度間隔で定義される過冷却液体域を算出することに成功した。また、同じく金属ガラスの粘性を用いた均一核生成-成長理論に基づき、典型的な金属ガラス生成系に対して、結晶化の時間-温度-変態曲線を算出し、各種金属ガラスの熱的安定性を解析した。さらに、アモルファスおよび金属ガラスに見られるランダム原子構造のキャビティー生成エンタルピーから結晶化温度を算出するミーディマ法を多元系合金に始めて適用し、得られた結果から、金属ガラスの形成能因子として知られる換算ガラス化温度に対応する換算結晶化温度を算出し、金属ガラスの熱的安定性の評価を行った。これらの解析結果をまとめることにより、金属ガラスの形成能を評価する際のパラメータとして知られている臨界冷却速度、換算ガラス化温度および過冷却液体域の関係を理論的・計算科学的観点からまとめ、実験結果との比較、検討を始めて可能とした。さらに、実際の合金開発では、計算機科学の観点から、新規非平衡材料の候補をピックアップし、電着法により合金を作成し、アモルファス合金の作製に成功した。
計算機による全身PET画像のがん自動診断システムの開発

本年度は,以下の活動を行った.・昨年度作成したがん診断システムの欠点を洗い出した.その結果,昨年の手順で診断を行うとなると,疑陽性陰影を多数拾いすぎ,診断結果があまり芳しくないことが確認できた.そこで本年度は,健常者のPET画像の情報を用いることで疑陽性陰影を削減する手法について検討を行った.・疑陽性陰影削減手法については,PET画像の持つ濃度値の微分幾何学特徴を基に候補領域を抽出後,健常者のPET画像との位置合わせを行うことで,疑陽性陰影を削減させた.位置合わせに用いたアルゴリズムはSID法であり,局所領域内の濃度値の2乗誤差が最小となる領域を探し出すものである.これを3症例に適応した結果,どれも概ね良好な結果が得られ,疑陽性陰影削減に成功したものと考える.・H16年8月に開催された日本医用画像工学会大会で発表を行った.・削減されたがん候補中からがん陰影を絞り込む手法については,がん候補の存在する位置,形状や解剖情報等を基にGA手法を用いて行うことを引き続き検討中である.本年度は,以下の活動を行った.・先端医療センター映像医学研究部・千田道雄部長および坂本攝主任研究員の協力の基、がん検診用全身PET画像を収集した.・収集したデータをデータ保存及び解析用に購入したワークステーションに保存し,医師と協力して特徴を解析し,自動診断プログラムのプロトタイプを作成した.・候補領域の抽出は,画像の持つ微分幾何学的特徴を基に,ガウス曲率と平均曲率を算出し,それらの情報から濃度分布がpit状になるものを選択することで行った.・選択された候補領域からがん陰影を絞り込むためには,候補領域の形状,存在位置,最大濃度値,SUV値を診断ルールとして行った.・体の部位ごとの解剖学的特徴を知ることが必要であったため,上記と並行して解剖画像による腹部と胸部の解析を行った.・解剖画像を用いた腹部と胸部の解析結果は,H14年11月に開催された電気学会関西支部で発表を行った.・医師と議論を重ねた結果,頚部および腹部では左右差が重要な情報となり,また健常者との位置合わせにより疑陽性陰影を軽減することができるのでは,との意見が出,現在それらについて調査中である.本年度は、以下の活動を行った。・昨年度に引き続き、先端医療センター映像医学研究部・千田道雄部長および坂本攝主任研究員の協力の基、がん検診用全身PET画像を収集した。・がん診断プログラムの欠点を洗い出した。現行の手順で診断を行うとなると、疑陽性陰影を多数拾いすぎ、診断結果があまり芳しくないことが確認できた。・がん診断の前処理として、疑陽性陰影削減手法についての検討を行った。これは、PET画像の持つ濃度値の微分幾何学特徴を基に候補領域を抽出後、健常者のPET画像と位置合わせを行うことで、疑陽性陰影を削減するものである。位置合わせには、局所領域内の濃度値の2乗誤差が最小となる領域を探し出すSID法を採用した。このSID値を基に、疑陽性陰影か否かの判断を行う。すなわち、SIDが高すぎれば位置合わせを行うことができないとしてがん候補領域とするものである。・位置合わせを行う画像として、健常者の画像、および同一患者のスライス位置の違う画像を適応し、その両者において良好な結果が得られた。・これらの結果をH16年3月に開催された電子情報通信学会全国大会で発表を行った。・がん陰影の絞込みについての新しい手法については、SUV値、がん候補陰影の存在する位置や形状等を考慮して画像の最適化問題として置き換え、GA等を用いる手法を検討中である。本年度は,以下の活動を行った.・昨年度作成したがん診断システムの欠点を洗い出した.その結果,昨年の手順で診断を行うとなると,疑陽性陰影を多数拾いすぎ,診断結果があまり芳しくないことが確認できた.そこで本年度は,健常者のPET画像の情報を用いることで疑陽性陰影を削減する手法について検討を行った.・疑陽性陰影削減手法については,PET画像の持つ濃度値の微分幾何学特徴を基に候補領域を抽出後,健常者のPET画像との位置合わせを行うことで,疑陽性陰影を削減させた.位置合わせに用いたアルゴリズムはSID法であり,局所領域内の濃度値の2乗誤差が最小となる領域を探し出すものである.これを3症例に適応した結果,どれも概ね良好な結果が得られ,疑陽性陰影削減に成功したものと考える.・H16年8月に開催された日本医用画像工学会大会で発表を行った.・削減されたがん候補中からがん陰影を絞り込む手法については,がん候補の存在する位置,形状や解剖情報等を基にGA手法を用いて行うことを引き続き検討中である.
河川等に排出される抗生剤濃度と薬剤耐性菌に関する研究

結果から次の四点が明らかになった.第一に,我々の環境はすでに抗生剤に汚染されており,その濃度はLC-MS/ MSによる検出限界未満である.第二に,これらの薬剤が水再処理施設において適切に排除されていない可能性がある.第三に,環境水中のグラム陰性桿菌は, LC-MS/ MS検出限界未満の濃度の抗生剤に対しても耐性を獲得する.第四に,環境水中の細菌の多くはキノロン系およびカルパペネム系薬剤にも耐性を獲得しており,これらのMDROsはヒトの健康を脅かす状況にある.結果から次の四点が明らかになった.第一に,我々の環境はすでに抗生剤に汚染されており,その濃度はLC-MS/ MSによる検出限界未満である.第二に,これらの薬剤が水再処理施設において適切に排除されていない可能性がある.第三に,環境水中のグラム陰性桿菌は, LC-MS/ MS検出限界未満の濃度の抗生剤に対しても耐性を獲得する.第四に,環境水中の細菌の多くはキノロン系およびカルパペネム系薬剤にも耐性を獲得しており,これらのMDROsはヒトの健康を脅かす状況にある.予定では病院・家畜飼育施設・人口密度などの地域的特性を考慮して,都市部と郊外の二つの地域に分けてそれぞれ1年目と2年目にサンプルを採取する予定であった.研究準備を進めていく段階において,1本の河川の上流から下流域に沿ってサンプルを採取し,周辺施設や人口密度などとの関連を探る方が,より意義があるとの考えに至り,2009年11月に多摩川の上流から下流にいたる10箇所で河川水サンプルを採取した.それぞれのサンプルを培養し合計162株の細菌を単離した.このうち,菌の種類と薬剤耐性,採取場所の3点が同一であったものを除き,最終的に144株の細菌を今後の分析対象とした.API StaphとAPI 20E(BIOMERIEUX社)による同定の結果,主な菌はAeromonas sp.,Klebsiella sp.,Staphylococcus sp.,Escherichia coli,Vibrio sp.で,それぞれ64,18,22,10,8検体であった.これらの菌以外のその他は22検体であった.目下,これらの菌よりGenomic DNAを抽出し,菌についてのより詳細な情報解析を実施しているところである.また,あわせてPlasmid DNAも抽出し,次年度は菌種間での耐性菌情報についても比較・検討し,環境要因による影響とあわせてデータを解析する予定である.このDNA解析については,当初の計画にはなかったが,前述のとおりサンプル採取方法を変更したことを踏まえ,新たな菌の採取よりも,その予算と時間をPlasmid DNAも含めた詳細なデータ解析にあてる方が意義深いと考え計画を一部変更した.菌の採取地点における抗生剤濃度については,LC-MS/MSによる濃度測定を実施したが,上流域では,検出限界未満のものが多かった.下流域で濃度が測定できたのは,アモキシシリン,スルファメトキサゾール,トリメトプリムの3種類であった.これら濃度と薬剤耐性情報の関係についても今後,解析を進めていく.多摩川の水から分離した144株のうち120株がグラム陰性桿菌であった.今年度はこれら120検体を分析対象とした.これまでの同定はAPI StaphとAPI 20E(BIOMERIEUX社)によるものであったため,16S rRNA系統解析による遺伝子レベルでのより正確な同定を行った.結果は,API検査キットによるものと一致し,菌はAeromonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Vibrio sp., Pseudomonas sp.,その他で,それぞれ64,18,10,8,5,15検体であった.その他に分類されたものは,Acinetobacter sp., Citrobacter sp., Enterobactor sp., Serratica sp.等であったオキサシリン,アンピシリン,セファロチン,セフォタキシム,セフトリアキソン,セフロキシム,イミペネム(IPM),クラブラン酸+アモキシシリン(AMFC),タゾバクタム+ピペラシリン,ゲンタマイシン,エリスロマイシン,テトラサイクリン,ドキシサイクリン,シプロフロキサシン(CPFX),レボフロキサシン(LVFX),スルファメトキサゾール(S)+トリメトプリム(T)の16種類の薬剤に対する耐性試験をおこなったところ,120検体中106検体が3種類以上の抗生剤に感受性を示さなかった.25検体がIPMに感受性がなく,このうち6検体がCPFXあるいはLVFX非感受性菌で,17検体が対象としたセファロスポリン系薬剤の少なくとも1つに感受性がなかった.また,2検体はすべての抗生剤に感受性がなかったこのことは,河川における事故や洪水・津波などの自然災害で人々が受傷した際に,抗生剤による化膿創の治療が無効となる場合があること示唆している。また,検体採取場所の抗生剤濃度は,下流域のAMPC,S,Tを除けば,全て検出限界未満であったにも関わらず,分離した菌が多くの薬剤に耐性を示していたことから,環境水中の抗生剤濃度をモニタリングしても,抗生剤による汚染レベルあるいは薬剤耐性菌の存在を予測することは困難であると考えられる.今後,得られた耐性遺伝情報の解析を進めるとともに,結果を早急にとりまとめ,投稿する予定である今年度は,データ解析とそのとりまとめ,国内外での学会発表等を行った。