hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子操作系を用いたロタウイルス感染過程の解明

私たちが世界に先駆けて開発に成功したヘルパーウイルスを用いるロタウイルスのリバースジェネティクス系を駆使して、未だその理解が不十分である、ロタウイルスの感染性獲得における外殻スパイク蛋白質VP4の役割を実際のウイルスで解析した。また、このシステムの適用が未だ報告されていない遺伝子分節についても組換えウイルスを単離するための選択条件の開発を試みた。さらに現在の系を発展させ、全11本の遺伝子分節がcDNA由来の組換えロタウイルスを作製しうる技術の開発を試みた。ロタウイルスのリバースジェネティクス系は、ヘルパーウイルスの利用を必要とし、cDNAのみによる系はまだ開発されていない。哺乳類オルソレオウイルス(レオウイルス)は、10本の分節二本鎖RNA(dsRNA)をゲノムとして保有し、多分節dsRNAウイルスの複製機構および病原性を解析する上で優れたモデルである。近年、cDNAのみから感染性レオウイルスの作製を可能にするリバースジェネティクス系が開発され、従来の系では困難であった任意のウイルスゲノム改変を可能にした。ロタウイルスのリバースジェネティクス系の改良にあたり、レオウイルスの系はそのモデルとなり得る。T7RNAポリメラーゼを発現している培養細胞にレオウイルスゲノムをコードするT7プラスミド(T7 RNAプロモーター下流に目的遺伝子とD型肝炎ウイルスリボザイム配列を配置)を導入することで、感染性レオウイルスを作製できる。これまで、T7 RNAポリメラーゼの供給は、組換えワクシニアウイルスrDIs-T7pol株あるいはBHK-T7細胞株の使用に限られてきた。今年度は、さらに幅広く応用できるT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドを用いたレオウイルスのリバースジェネティクス系の開発を試みた。レオウイルスをコードする10個のT7プラスミドとT7RNAポリメラーゼの発現プラスミド(pC-T7pol)を共導入したL929細胞では、ウイルス量は少ないものの、組換えレオウイルスが回収された。次に、インターフェロン産生能が欠損しているBHK-21細胞にこれら11個のプラスミドを共導入したところ、組換えレオウイルスの回収効率は著しく上昇した。こうして、これまで報告されていない、T7RNAポリメラーゼ発現プラスミドを用いたレオウイルスのリバースジェネティクス系が確立された。エンベロープウイルスの多くは、表面スパイク蛋白質が宿主プロテアーゼによって切断活性化されて感染性を獲得する。このため、宿主プロテアーゼによる表面スパイク蛋白質の切断は、多くのエンベロープウイルスの病原性獲得に深く関わっている。非エンベロープウイルスであるロタウイルスも外殻スパイク蛋白質VP4がトリプシンでVP8*とVP5*に切断活性化することで感染性を獲得する。VP4上のトリプシン切断領域には高度に保存された非連続の3個のアルギニン残基(R231、R241、R247)が存在し、異なる感受性でトリプシンにより切断される。発現蛋白質を用いた解析から、ロタウイルス感染性の獲得にはR247の切断だけで十分であり、残る2個のアルギニン残基の切断はロタウイルス感染には必要ではないと推測されている。しかし、全てのアルギニン残基はロタウイルス間で高度に保存されていることから、ウイルス感染において何らかの生物学的意義があるとも推測されてきた。今年度は、各アルギニン残基を単独あるいは同時にヒスチジン残基またはリシン残基に置換した組換えロタウイルスの作製を進めてきた。アルギニン残基とリシン残基を各々特異的に切断するアルギニルエンドペプチダーゼおよびリシルエンドペプチダーゼを用いることで、各残基における切断の重要性を実際のウイルスで明らかにできると考えている。これまでのアルギニルエンドペプチダーゼを用いた解析では、ロタウイルス感染性の獲得にはR247における切断が必須であるが、残る2個のアルギニン残基(R231およびR241)における切断は必須ではない可能性が示唆された。ロタウイルスのリバースジェネティクス系は、ヘルパーウイルスを必要とするため、組換えウイルスを単離するための選択条件が必要であり、その条件が確立されているのは、11本のセグメントのうちVP4、NSP2、NSP3の3本に過ぎない。今年度は、残る8本のセグメントについても組換えウイルスを単離するための選択条件を開発し、ロタウイルスにおけるリバースジェネティクス系を発展させることを目的とした。ヒトKU株の限界希釈から分離したKU-24株のセグメント11は3塩基欠失(Δ423-425)を起こしており、ロタウイルス株間で極めて高度に保存されているNSP5上のE135を欠失していた。KU-24株は野生型KU株と同程度の増殖能を示したが、ウイルス粒子へのパッケージング効率は、変異型セグメント11<野生型セグメント11であることが競合感染実験により示された。

KU-24株の2つのリバータントウイルスはともに423-425位置に遺伝子配列の挿入を有することから、この領域のシーケンスがセグメント11のパッケージングに重要なシグナルを含んでいる可能性が示された。リバースジェネティクス系の開発においては、野生型セグメント11をコードするプラス鎖RNA発現プラスミド(T7プラスミド)とともに、KU-24株をヘルパーウイルスとして利用することで、パッケージング効率の違いを選択条件としたNSP5/6遺伝子を標的とするリバースジェネティクス系の開発につながるものと期待される。研究期間全体では、現在のヘルパーウイルスを用いるリバースジェネティクス系をVP4遺伝子に応用し、VP4の限定切断によるウイルス感染性の獲得機構を解析するとともに、このシステムをNSP5/6遺伝子に応用するため、ヘルパーウイルスとしてのKU-24株を分離した。一方で、ヘルパーウイルスを必要としないシステムの開発に向け、これまで報告されていない、T7RNAポリメラーゼ発現プラスミドを用いたレオウイルスのリバースジェネティクス系を確立した。ウイルス学私たちが世界に先駆けて開発に成功したロタウイルスにおけるリバースジェネティクス系はヘルパーウイルスを用いるので、回収ウイルスから組換えウイルスを単離するための強力な選択条件が必要であり、変異導入で増殖能が低下した変異ウイルスの回収は困難である。また、目的とする遺伝子によってはその選択条件が存在しない。そこで、ヘルパーウイルスフリーでcDNAのみから感染性ウイルスの作製する系の開発を目指している。今回、ロタウイルスと同じレオウイルス科に属するレオウイルスをモデルとし、これまで報告されていないT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドを用いたリバースジェネティクス系を確立した。私たちが世界に先駆けて開発に成功したロタウイルスにおけるリバースジェネティクス系はヘルパーウイルスを必要とするために、組換えロタウイルス作製の効率の低さが問題であった。私たちは、組換えウイルスの選択条件として、従来の中和モノクローナル抗体にRNAiシステムを組み合わせることで効率を向上させることに成功した。この改良したリバースジェネティクス系を用いて短期間に以前よりも多くの組換えロタウイルスを作製することが出来るようになり、研究を効率的に進められるようになった。従来のヘルパーウイルスを用いるロタウイルスのリバースジェネティクス系をVP4遺伝子(外殻スパイク蛋白質VP4をコード)に応用し、VP4が関与するロタウイルス感染過程の各段階を実際のウイルスで解析する。また、この系の選択条件を改良することで、もう一方の外殻蛋白質であるVP7と非構造蛋白質NSP5におけるリバースジェネティクス系の開発を目指す。一方で、ヘルパーウイルスを必要とせず、cDNAのみから感染性ロタウイルスを作製するリバースジェネティクス系の開発を目指したい。今年度に作製した組換えウイルスを中心に解析中心の実験を行う。これにより、ロタウイルス感染におけるトリプシン切断領域の重要性が分子レベルで明らかになると考えられる。一方で、現在のリバースジェネティクス系をロタウイルスのもう一つの外殻蛋白質であるVP7に応用することを精力的に試みる。
リチウム二次電池用新規複合負極の開発

次世代のリチウム二次電池負極材料として、本研究ではインターカレーション電極としての従来の容量を超える様々な候補材料に注目し、その利点を100%引き出そうとした。具体的には、1.炭素材料マトリックス中へのナノサイズ合金系負極の均一分散によるサイクル性向上容量の大きい合金系負極Siに注目し、それを炭素マトリックスに分散させることで、サイクル性の向上、初期不可逆容量の低減を目指した。サイズの異なるSi粒子を原料に、多くの熱分解炭素との複合化を行った。Poly Vinyl Chloride(PVC)を炭素前駆体として電極作成を行うことで、サイクル性と容量に優れた複合負極を得た。2.窒化物負極と合金系負極とのナノオーダーでの複合化合金系負極、その酸化物あるいは炭素材料と、窒化物を複合化することで初期不可逆容量を解消することが出来ることを利用し、メカニカルミリングを加味してナノオーダーで複合化することで、サイクル性の向上をえた。3.固体ポリマー電解質のための負極以上の検討の結果、1)炭素材料の表面改質、2)良好なSi分散と良好な電気的な接触;3)導電性でSiの膨張を吸収できる窒化物のような柔らかいマトリックスの実現が、安全性が高い固体ポリマー電解質とのリチウム二次電池実現に重要であり、そのような電極設計が可能となった。大きな理論容量ゆえ、次世代のリチウムイオン電池の負極としてSiが注目されている。我々は、今年度、放電、充電による電気化学的な処理で生成するLi-si合金生成機構について、その形態、構造等の変化をもとに検討した。その結果、Siのサイクルによる容量劣化を押さえるためには、Si/Cのような複合電極の設計が必要と思われた。そのため、Si/C複合負極の電気化学的な挙動に影響を及ぼす種々の因子について検討し、最適なSi/C複合負極の設計を行った。以下得られた知見を示す1)電気化学的なLi挿入によって生成する非晶質Siは、Li脱離反応により、一部は再結晶化する。しかし、挿入されたLi^+の一部が、不可逆のまま残ってしまう。体積膨張、体積収縮が繰り返されることで、Siはオニオン構造の10-15nm以下の小さなドメインを形成するようになる。このことから、Siのサイズが10-15nm以下になれば、本質的にサイクルによる形状変化の不安定要因から影響を受けなくなることが分かった。2)熱分解炭素と組み合わせたSi/C複合電極作成法はSiの容量劣化を抑えるのに優れた効果を示した。サイズの異なるSi粒子を原料に、様々な合成法を適用して作られた数種の複合電極についてその電池特性を測定し、このようなSi/C複合負極の特性に影響を与える様々な要因を検討した。そのうち、炭素プレカーサーとしてFやClを含むポリマーを用いた場合、Si表面が洗浄され、電気化学的特性が向上することが分かった。3)さらに、1)Siの体積変化を小さくする;2)良好なSi分散と良好な電気的な接触;3)導電性でSiの膨張を吸収できる柔らかいマトリックスの実現に向け、有望な複合電極の構造を提案した。大きな理論容量ゆえ,次世代のリチウムイオン電池の負極としてSiが注目されている。19年度は前年に引き続き,放電,充電による電気化学的な処理で生成するLi-Si合金生成機構について,その形態,構造等の変化をもとに検討するとともに,昨年見いだしたSi/Cのような複合電極の設計を基に,複合負極の電気化学的な挙動に影響を及ぼす種々の因子について検討し,最適なSi/C複合負極の設計を行った。さらに,ポリマー電解質への展開を図った。以下得られた知見を示す1)熱分解炭素と組み合わせたSi/C複合電極作成法はSiの容量劣化を抑えるのに優れた効果を示す。サイズの異なるSi粒子を原料に,多くの熱分解炭素との複合化を行った。それら複合電極についてその電池特性を測定し,Si/C複合負極の特性に影響を与える様々な要因を明らかにした。炭素プレカーサーの組成と,ハロゲンの含有量,熱分解後の炭素の構造など定量的な検討ができた。2)以上の検討の結果,1)Siの体積変化を小さくする;

2)良好なSi分散と良好な電気的な接触;3)導電性でSiの膨張を吸収できる柔らかいマトリックスの実現が,安全性が高い固体ポリマー電解質とのリチウム二次電池実現に重要であり,そのような電極設計が可能となった
義歯動揺量測定装置の開発-臨床応用への検討-

全部床義歯は維持および支持を被圧変位性と可動性に富む口腔粘膜に依存しているため、機能時における義歯床の動揺・変位は避けることができない。しかし、義歯の動揺を最小に抑え維持・安定の向上を図ることは咀嚼・発音などの機能の回復、顎堤の保護の観点からも重要なことである。従って、機能時の義歯の動揺を定量的に把握し、それを直ちに臨床操作に反映できるような手法を開発することは意義のあることと考える。その目的を実現するために、超小型加速度センサを用いた義歯動揺量測定装置の開発を行っている。本年度の実験計画は、平成7年度の加速度センサを1軸に設置した基礎実験で得た結果を踏まえて、(1)設定する実験義歯の形態と人口粘膜の厚さと粘弾性率を変化させて、重回帰式の当てはまり具合を検討する。2)加速度センサをX、Y、Z軸の3軸に設置し検討を行うことである。その結果、以下のことがわかった。1.義歯の形態がによって、加速度センサからの出力波形の形態が変化する。2.人工粘膜が厚くなると加速度センサからの出力波形の減衰率が低下する傾向が認められた。3.義歯の形態および人工粘膜の性状を変化させると、加速度から変位への重回帰式の決定係数が変化する。また今回、センサの再利用の方法(設置・除去)に問題が生じた。つまり、センサを除去する時にセンサに応力がかかり、故障する件が発生した。そのため、金属製ジグで被覆しごと義歯に取り付けるようにした。今後、1)義歯の形態および粘膜の性状が変化しても、一定の精度で適合する重回帰式を求めて行く。2)3軸の加速度センサを設置し、義歯の変位を3次元的に測定していくプログラムを開発して行く計画である。
難治性悪性リンパ腫細胞の免疫グロブリン発現遺伝子の解析と治療効果改善への応用

悪性リンパ腫細胞は同一の起源を持つ場合は発現形式の組織型が変化しても、リンパ腫細胞のγグロブリン産生遺伝子には変化がなく、オリジンとなった細胞の遺伝子を持ち続けることが知られてきた。本研究は、治療抵抗性リンパ腫のDNA塩基配列の変異の程度と治療に対する抵抗性の関連を明らかにし、治療成績を改善することを目的として検討を行った。まず、化学療法や放射線療法の効果を確認するため、過去の治療成績(BACOD-E療法)を再解析し、再発を起こす腫瘍について、臨床的検討を加えた。International Prognosis Index(IPI)やLDH値は、この検討では明らかな予後因子とはならなかった。リンパ腫の治療後骨髄異型性症候群から急性骨髄性白血病を起こした1例は、染色体にt(11;19)(q23;p13)の変異が見られた。さらに、組織型の再確認を行い、臨床所見との対比を行った。過去の症例全体を244例をREAL分類で検討すると、濾胞性リンパ腫は全体の4.4%しかなかった。多数例の検討では、IPIは予後因子となった。基礎的な検討としては、リンパ腫のうち、パラフィン切片標本から、顕微鏡下でリンパ腫の細胞を採取し、DNAを抽出した。このDNAをPCR法により増殖させ、Ig遺伝子解析を行なっている。これらの結果と組織型や予後との関連を検討しているが、現在までのところ、両者間の関連に関して明確な結論を出すまでには至らなかった。悪性リンパ腫細胞は同一の起源をもつ場合は発現形式の組織型が変化しても、リンパ腫細胞のγグロブリン産生遺伝子には変化がなく、オリジンとなった細胞の遺伝子を持ち続けることが知られてきた。本研究は、治療抵抗性リンパ腫のDNA塩基配列の変位の程度と治療に対する抵抗性の関連を明らかにし、治療成績を改善することを目的として検討を行った。本年度は濾胞性リンパ腫を対象として検討した。ろほう性がリンパ腫は数年の経過でびまん性化するという事象を始め再発時に細胞形態が変化するという事は、以前からよく知られている。しかし、この様ないわゆる`Histological Conbversion'が起こる分子機構についてはあまり知られていない。一方で、近年、細胞周期に関する様々な分子が同定され、腫瘍の悪性化との関連が研究されつつある。そこで我々は、教室に保存されている悪性リンパ腫症例の病理組織標本をreviewし、Histological Conversionに関する分子機構に付いて検討した。実際には、1990年から1996年の間に、投教室で診断した悪性リンパ腫症例743例の病理組織標本をreviewし、5症例にHistological Conversionを認めた。そのうち2例は典型的なMantle cell lymphomaがDiffuse large B-cell lymphomaへとTransformしたものであった。免疫グロブリン重鎖の遺伝子解析では、いずれの症例でもTransform前後で同一であった。悪性リンパ腫細胞は同一の起源を持つ場合は発現形式の組織型が変化しても、リンパ腫細胞のγグロプリン産生遺伝子には変化がなく、オリジンとなった細胞の遺伝子を持ち続けることが知られてきた。本年度は昨年度に引き続く、リンパ腫の治療に役立つ解析を行った。International Prognosis Index(IPI)やLDH値は、今回の検討では明らかな予後因子とはならなかった。

IPIは予後因子となった。基礎的な検討としては、リンパ腫のうち、パラフィン切片標本から、顕微鏡下でリンパ腫の細胞を採取し、DNAを抽出した。このDNAをPCR法により増殖させ、Ig遺伝子解析を行なっている。これらの結果と組織型や予後との関連を検討していが、結論を出すまでに至っていない。今後さらに検討を続けていく予定である。
ストレス応答を司る神経回路の動態と破綻機構の解明

本研究では、ストレス応答時の多数の脳活動パターンと末梢活動がどのように関連するか解明することを目的とした。ラットに社会的敗北ストレスを負荷し、心電図の変動を基に、動物群をストレス感受性群と非感受性群に分けて、大脳新皮質の複数領域および海馬から記録された脳波を解析した。解析の結果、ストレス感受性群ではストレス応答後に、ガンマ帯を除くほぼすべての周波数帯において、脳波パワーの変動が見られ、セロトニンの濃度の変動が大きく、こうした濃度変化が脳波パワーの変動につながる可能性を示唆した。ストレス応答による生体変化を病態生理学的観点から解明した新たな知見である。本研究では、ストレス応答における脳活動パターンと末梢活動の関連を解明することを目指した。はじめに実験技術を確立するために、マウスやラットにおいて、数十本の脳波測定用電極を脳に埋め込み、同時に、腹部に心電図測定電極を埋め込んだ。これらの電極の信号を1つの装置に効率的に取り込むために、動物の頭部に慢性的に設置できる電子回路基板を作成した。手術の訓練や電極位置の実験検討を繰り返し、現在では、ほぼ確実に生体電気信号の大規模測定が可能となっている。本方法論は、現在1つの論文としてまとめ、Journal of Pharmacological Science誌に投稿中である。多数の脳波と心電図を同時に記録する方法としては、最も簡便かつ効率的な計測法が確立できたと考える。この技術を用いて、ストレス応答に対する生体信号の変動を解析している。これまでに、ラットに社会的敗北ストレスを加える行動実験を行っても、本計測システムが安定であることを確認している。また、確立した脳波計測法の有効性を検討し、病態生理学研究に生かすため、脳が低還流状態に陥った際の局所場電位変動を調べた。その結果、大脳新皮質と海馬では、低還流状態に対し、異なった電気的応答の時間変化を示すことを見出した。本研究成果は、Neuroscience Research誌に掲載された(Nishimura et al, 2016)。さらに、実験に用いる齧歯目動物の行動学的特徴を明らかにするため、複数の選択肢が存在するような複雑な行動課題中の行動パターンを解析した。その結果、動物は試行錯誤を繰り返すほど、正しい解答に到達するまでの時間が短くなることを示した。この研究成果は、Scientific Reportsに掲載された(Igata, Sasaki*, Ikegaya*, 2016)。本研究課題の1つである(1)ストレス応答への順応過程については、動物の行動試験パラダイムを確立した。具体的には、ラットがストレス応答に順応しなければ報酬が得られないような行動タスクを設計した。通常、動物は一度ストレス刺激を体験してしまうと、二度とその環境には自ら入ることがなくなってしまうが、ストレス刺激として電気刺激の強度を様々に調節することで、どのような動物でも電気刺激に自ら順応しつつ、報酬を得るような行動を呈するようになった。現在は、こうした行動中のラットに大規模計測法(研究実績の概要に記述)を適用し、海馬の多細胞活動と自律神経活動の相関を調べている。もう1つの課題である(2)慢性応答による機能破綻については、他個体に攻撃されるような社会的敗北ストレスを用いた行動実験法を確立した。敗北ストレスに慢性的に暴露された動物において、様々な脳部位の電気的活動を計測したところ、海馬の歯状回において、顕著に活動レベルの低下が観察された。本成果は、現在1つの論文としてまとめ、学術誌に投稿中である。さらに本現象の生理メカニズムを詳しく調べるために、同様の計測法を適用して解析を行っている。本ストレスモデルでは、動物どうしの接触が必要であるため、計測法の安定性が懸念されていたが、適切な保護具を取り付ければ、電気ノイズがほとんどなく、安定した計測が可能である。特に着目しているのは、脳におけるストレス記憶の再生過程であり、海馬などの領域でストレス情報を表象するニューロンの活動が再生された際に、末梢の自律神経系にも影響が及ぶか調べている。得られる結果は、従来の仮説の妥当性を機能動態の観点から再検討し、根本療法の標的考案に貢献できると期待している。この1年間の研究では、2014年までの米国留学中に学んだ脳波計測法(マルチユニット計測法)を発展させて、最大100本の電極をラットの脳領域に埋め込み、また頸背部皮下から心電図、嗅覚神経から呼吸リズムを同時計測する方法を確立した(Okada et al., 2016)。このような方法を用いてストレス応答後の神経活動を解析した。他の動物個体から社会的敗北ストレス慢性的に受けたマウスの脳波のウェーブレット解析を行ったところ、海馬歯状回においてのみ、神経活動の顕著な減弱が確認された(Aoki et al., 2017)。現在は、自由行動中の動物から計測された生体電気信号について、さらに多変量の解析を進めている。これまでの研究結果としては、(1)社会的敗北ストレスを受けた直後から数十分にわたって、海馬や大脳新皮質の広範な脳領域において神経活動が顕著に減少していること、(2)こうした神経活動の減弱の後、ある程度の時間幅をもって不整脈や呼吸リズムの乱れが観察され始めるようになることなど、を確認している。おそらく、こうした時期は、脳と末梢臓器の恒常性が大きく変化する過程を反映しているものと推察される。

今後は、生化学的手法や解剖学的アプローチを融合しながら、こうした脳波減弱と末梢臓器活性の変化について、時間相関の解析を進めていくことで、分子メカニズムを亜衣明したいと考えている。また、さらに脳の神経活動を操作したり、動物の行動環境を変化させることによって、ストレス応答後の全身臓器の乱れを抑制できるか検証する予定である。本研究では、まず脳波計測実験系の構築を試みた。3Dプリンタを用いてラットやマウスの頭部に設置する電極固定具の造形を行い、複数の脳領域に多くの電極を埋め込む実験法を確立した。また、心電図計測用の電極と、呼吸リズムを計測するための電極をそれぞれ生体に埋入した。これにより、脳波、心電図、筋電図、呼吸リズムといった全身の生体電気信号を記録装置に集約させる方法を確立した(Okada et al., 2016)。以上にて、ストレス応答に関与する中枢神経細胞の活動パターンと、末梢臓器活性を網羅的に計測するという実験系が構築された。ストレス応答としては、社会的敗北ストレスモデルを用いた。このモデルは、一方の身体が小さいラットが、もう一方の身体の大きいラットから攻撃を受ける。多くのラットでは、社会的敗北ストレス経験の直後から、脳の神経活動が減弱することを見出した。これは従来知られているような脳波の状態変化といった緩やかな変化ではなく、神経ユニット活動が限りなくゼロになってしまうような著しい減弱であった。この期間は、中枢から末梢への信号がほとんど送られていない状態にあり、中枢とは独立に、ストレス負荷前と同等の末梢臓器活動が保持されている時期と考えられる。次に、この神経活動の回復期が始まると、心拍数が500回/分から400回/分程度にまで減少し、さらに個々の心拍間隔が一定ではなくなり、いわゆる不整脈となった。この生理現象はストレス応答直後ではなく、ストレス応答後、数分から数十分の時間差をもって発生するものであり、従来考えられていたストレス研究の理論とは異なる。詳細な生理機構は不明であるが、1つの可能性として、中枢の神経活動が停止状態から回復し、末梢へ再び信号を送り始めたが、その信号が未だ不安定であるため、末梢臓器の活動の不安定性に繋がっているのではないかと考えられる。本研究では、ストレス応答時の多数の脳活動パターンと末梢活動がどのように関連するか解明することを目的とした。ラットにおいて、数十本の脳波測定用電極を脳に埋め込み、同時に心電図測定電極、呼吸リズム測定電極を埋め込んだ。これらの電極の信号を1つの装置に効率的に取り込むために、動物の頭部に設置できる電子回路基板を作成した。これまでに、ラットに社会的敗北ストレスを加える行動実験を行っても、本計測システムにて脳波と心電図、呼吸リズムが安定に記録できることを確認している。本研究成果を、Biological and Pharmaceutical Bulletin誌に発表した。また、詳細な実験手順を動画として記録し、この動画をJournal of Visualized Experiments誌に発表した。さらに、心臓を同時に電気刺激するなど臓器活動の操作も同時にできる方法を開発し、本研究成果を、Neuroscience Research誌に発表した。ラットに社会的敗北
ニュ-ロインテリジェントにおいセンサの開発と洋酒品質管理への応用

本研究では、においに対して感度が少しずつ異なるガスセンサ(水晶振動子ガスセンサ)群の出力パタ-ンをニュ-ラルネットワ-クで識別することを原理とする「においセンサ」を作り、これを洋酒品質管理に応用することを目的とする。洋酒品質管理に使用するにおいセンサを開発するためには、微妙なにおいの違いを識別する必要がある。そこで、本研究では洋酒類似臭の識別能力向上を主眼におき研究を行った。そのために、洋酒識別に適したセンサ用の吸着膜材料を選択し、測定系を改良しデ-タのバラツキを低減することにより微小な信号変化でも識別できるようにした。吸着膜材料の選択に関しては、当初GC(ガスクロマトグラフ法)固定相材料及びセルロ-ス系材料の中から統計的手法により選び出し、後に生体細胞膜の構成要素である脂質膜を加えた。測定系の改良としては以下のことを行った。サンプルフロ-系全般の材料をステンレスに変更して余分な吸着をなくし、空気の流量をマスフロ-コントロ-ラにより制御してにおい蒸気の供給を一定にし、恒温水槽により洋酒を入れたサンプル管とセンサの温度を一定に保ちにおい蒸気圧とセンサ感度を一定に保った。その結果、センサ出力の変動を約0.3%(従来の数分の一)に抑えることができた。以上の改良により、従来難しかったウイスキ-の類似臭について9割以上の識別正解率が得られるようになった。これらの結果をもとに、さらに改良を加えて実用化プロトタイプの装置を試作した。試作した装置を洋酒メ-カに設置し洋酒類似臭の識別実験を行ったところ、9割近い認識正解率が得られた。現在、装置運用に必要なデ-タをさらに収集している。本研究では、においに対し感度が少しづつ違うガスセンサ群の出力パタ-ンをニュ-ラルネットワ-クで識別することを原理とする「においセンサ」を作り、これを洋酒品質管理に応用しようとする。本年度は先ず、洋酒の香りをセンサ表面に供給するフロ-系について、以下の改良を行った。即ち、フロ-系全般の材料をステンレスに変更し余分な吸着をなくし、空気の流量をマスフロ-コントロ-ラにより制御してにおい蒸気の供給を一定にし、恒温水槽を購入しウイスキ-を入れた試験管とセンサ-を一定温度に保ち、におい蒸気圧とセンサ-感度を一定に保った。これらの処置によりセンサ出力の変動(標準偏差/平均値)を0.3%(従来の数分の一)程度に押えることができた。次に、ニュ-ラルネットワ-クの初期学習にはパソコンを使用していたため、計算に数時間程度を要していたが、ワ-クステ-ションの購入により15分程度に短縮され、研究の能率が大幅に改善された。最後に、本システムのガスセンサは水晶振動子に吸着膜を塗ったものであるが、吸着膜材料に天然及び人工脂質膜材料を一部使用したところ、センサ出力のパタ-ン分離が改善されることがわかった。以上の改良により、ウイスキ-の識別正解率が74%(本研究開始前)から90%以上に向上した。特にフロ-系の改良によるデ-タ変動減少の寄与が大きく、約15%の向上をもたらし、残りの数%の向上が脂質膜のよると思われる。本年度の成果により、本システムが研究室内においてウイスキ-の香り識別に充分な能力を有していることが分ったため、来年度は品質管理用のシステムを製作し現場において実用試験を行いたい。洋酒工業では人間の嗅覚を使った官能検査が工程管理などに広く使われているが、本システムがこれを代行し得るかどうか評価し、改良を重ねる予定である。現在、食品、飲料、化粧品などの工業及び環境計測においては、人間の嗅覚を使った官能検査によりにおいの測定を行っている。

しかし、この測定は客観性に乏しく、個人差や日々の体調の影響を受けるなどの問題があり、人間感覚を代行する人工測定装置の開発が望まれている。そこで、簡便で信頼性の高いにおいセンサの開発を目的として研究を行った。このセンサは生体の嗅覚機構を模したものであり、においに対して選択性が少しずつ異なるセンサ群の出力パタ-ンをニュ-ラルネットワ-クでパタ-ン認識して識別するもので、原理的に嗅覚機能に近い性能が期待できる。本研究では、具体的応用として洋酒の香りの識別を行い、品質管理に利用できるシステムの試作を行った。前年度、測定系の改良及びセンサ感応膜の一部に脂質膜を導入することで、従来識別が困難であった洋酒の類似臭を約9割の確率で識別できるようになった。本年度は、さらに測定装置の改良を進め実用化プロトタイプの開発を行った。実用化プロトタイプでは、サンプル蒸気発生部分の構造をサンプルの入れ替えが容易で信頼性の高い構造に変更し、ガスフロ-を切り替える電磁弁を耐圧、動作温度範囲の優れた種類に変え、配管はステンレス、テフロンで行い、配管とフロ-系各部との接続にはフレキシブルチュ-ブを使わずにコネクタ接続を用いる等の改良を加えた。森泉、中本が実用化プロトタイプを製作し、東工大で動作試験を行った後に洋酒品質管理を行う現場に装置を設置し、朝倉が装置の立ち上げを行った。その結果、洋酒の類似臭に対して9割近い認識率が朝倉のもとでも得ることができた。現在、装置運用に必要な実験デ-タを朝倉が収集している。
チタンアレルギーの病態機序および生体反応に関わる免疫学的研究

チタンは科学的根拠に基づいた安全性が確立された金属として歯科領域や整形外科領域で広く使用されている.しかしながら,チタンアレルギー反応に対する特異的T細胞の同定,誘導機構やT細胞による抗原認識機構などの詳細は全く不明であり,さらには金属が如何なる生体内蛋白と関係して抗原性を有するのか解明すべきことが多い.本チタンアレルギーモデルマウスにおける解析により, NK T細胞およびMAIT細胞による自然リンパ球がチタンアレルギーの病態発症および免疫制御に関与している可能性が示唆された.チタンはオッセオインテグレーションという性質を有することから、科学的根拠に基づいた安全性が確立された金属として歯科領域や整形外科領域で広く使用されている。しかし、生体内での骨接合を阻害するチタンアレルギー反応の報告が散見されるようになり、その免疫学的な解明が急務とされている。しかしながら、チタンアレルギー反応に対する特異的T細胞の同定、誘導機構やT細胞による抗原認識機構などの詳細は全く不明であり、さらには金属が如何なる生体内蛋白と関係して抗原性を有するのか解明すべきことが多い。申請者はIV型アレルギー反応の中枢を担い、チタンアレルギー発症に直接関与するT細胞の特異性と免疫学的病態の解明が急務と考え、本研究の立案に至った。本研究では世界に先駆けてチタンアレルギー動物モデルを確立し、チタンアレルギーに関わるT細胞受容体遺伝子(TCR)による獲得免疫機構に主眼を置いた研究を行う。さらに、チタンアレルギーが疑われる患者の末梢血およびチタン製インプラント周囲組織からTCR遺伝子を抽出して臨床検体を用いた解析を行う。これらのマウスおよびヒトのTCR遺伝子発現解析情報は、チタンアレルギー発症に関与するT細胞の抗原特異性遺伝子ライブラリ構築を可能とし、パッチテストに代替する新たな診断体系の確立を目的とする。初年度はチタンアレルギー動物モデル確立のために、感作・誘導回数、およびチタンの濃度の条件検討を行った。その結果、アレルギー炎症局所の腫脹および病理学的にもT細胞の集積を確認したことから、チタンアレルギーモデルマウスの確立に成功した。アレルギー炎症局所の腫脹および病理組織学的にもT細胞の集積を確認したことから、チタンアレルギーモデルマウス作製のプロトコルが完成したことにより、再現性のある疾患モデル動物が確立された。これは今後のチタンアレルギーの病態解明に向けて大きな前進をしたと考えられる。チタンは,科学的根拠に基づいた安全性が確立された金属として歯科領域や整形外科領域で広く使用されている.しかし,骨接合を阻害するチタンアレルギー反応の臨床報告が散見されており,その免疫学的解明が急務となっている.今年度は世界に先駆けてチタンアレルギー動物モデルを確立し,チタンアレルギーに関わるT細胞受容体遺伝子(TCR)による獲得免疫機構に主眼を置いた研究を行った.チタン特異的T細胞由来TCRの機能および性状解析チタンによる生体内での影響の解明には,モデル動物を用いた検討が必須であるが,霊長類でのチタン動物モデルが存在しなかった.昨年度までに,マウスにチタン溶液を感作および誘導させることで,チタンアレルギー発症状態を示す動物モデル系の作製を行った.今年度はアレルギー炎症局所組織へのチタン溶出の含有量の測定と各種サイトカイン・ケモカインの遺伝子発現解析を行った.また,免疫組織学的検討からT細胞の性状や機能解析を行って多方面からチタンに対する生体内の獲得免疫機構の解明を行った.その結果,チタンアレルギーマウスの炎症局所に高頻度で特異的なTCR Vα遺伝子を有する自然リンパ球であるNK T細胞およびMAIT細胞が検出された.NK T細胞およびMAIT細胞は自然リンパ球として知られており,自然免疫細胞と獲得免疫細胞の中間的性質を持ち,クローン増殖を介さずに迅速にエフェクター機能を発揮し,自然免疫と獲得免疫の橋渡しを担うユニークな細胞として様々な免疫応答に関与している.本チタンアレルギーモデルマウスにおける解析により, NK T細胞およびMAIT細胞による自然リンパ球がチタンアレルギーの病態発症および免疫制御に関与している可能性が示唆された.現在までにチタンアレルギーモデルマウスの確立,ならびにアレルギー炎症局所組織への各種サイトカイン・ケモカインの遺伝子発現解析を行った.また,免疫組織学的検討からT細胞の性状やTCR解析を行って多方面からチタンに対する生体内の獲得免疫機構の解明を行うことで,NK T細胞およびMAIT細胞による自然リンパ球がチタンアレルギーの病態発症および免疫制御に関与している可能性が示唆された.チタンは優れた生体親和性および骨誘導能を有する金属であるが,生体内でのチタンアレルギー反応の臨床報告が散見されており,その免疫学的解明が急務となっている.昨年までに報告したチタンアレルギー動物モデルを用いて,チタンアレルギー免疫応答に関与するT細胞をT細胞受容体(TCR)の見地から解明することを目的とした.今年度は作製したモデルマウスを用いて,遅延型アレルギー性皮膚炎(ACD)マウスモデルとして,BALB/c (6週齢,雌) 5匹の鼠径部にTiCl3・LPS混合溶液を注射することで感作し,足底部へのTiCl3溶液の皮内注射で誘導を行った.刺激性皮膚炎(ICD)マウスモデルとして,感作をせずに足底部へのTiCl3溶液の皮内注射を行ったBALB/c 5匹を用い,足底部への注射から1,3,7日後の腫脹を測定した.TCRレパトア解析:誘導後7日目のICDおよびACDマウス足底部に存在するT細胞のTCRレパトアならびにCDR3領域について次世代シークエンサーを用いて解析を行った.

ACD群では誘導後7日目で足蹠部の腫脹は最大となり,CD3陽性T細胞は浮腫や海綿状変化を伴った上皮基底層周囲への浸潤が最大となった.一方,ICD群では誘導後7日目にかけて少量のT細胞浸潤が認められたが,対照群では認められなかった.TCR解析により誘導後7日目ではICD, ACD群の各個体ともにTCR VA14Ja18/VB8-2を有するNKT細胞が各種抗原特異的T細胞を伴って検出されたことより, NK T細胞はチタンアレルギーが発症した際の生体防御・免疫制御機構に関与している可能性が示唆された.チタンは科学的根拠に基づいた安全性が確立された金属として歯科領域や整形外科領域で広く使用されている.しかしながら,チタンアレルギー反応に対する特異的T細胞の同定,誘導機構やT細胞による抗原認識機構などの詳細は全く不明であり,さらには金属が如何なる生体内蛋白と関係して抗原性を有するのか解明すべきことが多い.本チタンアレルギーモデルマウスにおける解析により, NK T細胞およびMAIT細胞による自然リンパ球がチタンアレルギーの病態発症および免疫制御に関与している可能性が示唆された.次年度では前年度までに行ったチタンアレルギー動物モデルを用いて、チタン特異的T細胞由来TCRの機能および性状解析アレルギー炎症局所組織へのチタン溶出の含有量の測定と各種サイトカイン・ケモカインの遺伝子発現解析を行う。また、免疫組織学的検討からT細胞の性状や機能解析を行って多方面からチタンに対する生体内の獲得免疫機構の解明を行う。チタンイオンに対してどのような特徴を持つT細胞がどれくらい誘導され,また,そのうちどの程度のT細胞が他の金属に交差反応し,増殖するか明らかにしていく.様々な歯科用充填金属との組み合わせを検証しT細胞/NK T細胞の増殖や機能および性状の違いを明らかにする.シーケンス解析によって増殖の程度を明らかにするとともに,同じ試料から限界希釈法による細胞障害性Tリンパ球(CTL)のクローン化を試みる.樹立されたCTL細胞を用いて,抗原特異性,他種金属との交差性あるいは親和性を調べ,チタンイオン特異的T細胞の性状や特性を明らかにしていく.口腔外科初年度ではモデルマウス確立のみであったため、アレルギー発症部位における炎症性サイトカインやT細胞関連遺伝子発現解析に供する消耗品が少なかったため、物品費が余剰となり次年度への繰り越しとなった。解析するサンプル数が想定よりも少なく,研究試薬および消耗品の購入が予定金額よりも低くなったため.確立されたモデルマウスを用いて、アレルギー発症に関わる炎症性サイトカインおよびT細胞関連遺伝子発現解析を行っていく予定である。TCR解析用の研究試薬に使用する予定である.
遺伝子発現に関与する核酸の特異構造と金属イオンの役割

リボザイムは、核酸の切断や連結反応などの触媒機能を有するRNA分子である。さらにリボサイムと同様に機能を有する機能性DNA(デオキシリボザイム)も、インビトロ選択法などを用いて人工的に作られている。このような機能性核酸は、その機能の重要性や、遺伝子発現・タンパク質機能との関連などから、エイズやガンなどの遺伝子を切断する新しいタイプの分子として、またあらゆる生体反応を触媒できる可能性を秘めた新しい機能性材料として期待されている。本研究では、新たな機能を有するデオキシリボサイムの開発を試みた。その結果、RNA切断機能を有するカルシウムイオン特異的な小型デオキシリボサイムの開発に成功した。我々はPb^<2+>イオンによって12塩基からなる基質RNAを部位特異的に切断する小型リボサイムの開発を行っていたが、今回新たにRNAを部位特異的に切断するデオキシリボサイム(bGCCTGGCA-G_1G_2C_3T_4A_5G_6C_7T_8A_9C_<10>A_<11>A_<12>C_<13>G_<14>A_<15>GTCCCT;下線はループ部位を示す)を基本型とし、ダウンサイジング法によるデオキシリボサイムの小型化と各種金属イオンによる活性効率の検討を行った。その結果、基本型デオキシリボザイムのループから4塩基を取り除いた11塩基(dG_1G_2C_3T_4A_9C_<10>A_<11>A_<12>C_<13>G_<14>A_<15>)からなる小型デオキシリボザイムを創製できた。また、この小型デオキシリボザイムは、Ca^<2+>存在下でのみ活性を示すカルシウムイオン特異的な新型核酸酵素であることもわかった。
モデルマウスを用いた孤発性筋萎縮性側索硬化症の上位運動ニューロン障害の原因解明

孤発性ALSの患者の運動ニューロンでは,グルタミン酸受容体サブユニットであるGluA2のRNA編集異常が疾患特異的に生じていました.そして,この分子異常が運動ニューロン死の直接原因になることをRNA編集異常を利用したコンディショナルノックアウトマウスの動物実験から明らかにし,孤発性ALSの疾患モデルマウスを開発しました.一方でALSにおいて上位運動ニューロンの変性の原因は未解明です.そのため,本研究ではこのモデルマウスを用いてRNA編集異常が上位運動ニューロンの細胞死の原因となっているかどうか検討することで,上位運動ニューロンの変性の原因と病因的意義を明らかにすることを目的としています.孤発性ALSの患者の運動ニューロンでは,グルタミン酸受容体サブユニットであるGluA2のRNA編集異常が疾患特異的に生じていました.そして,この分子異常が運動ニューロン死の直接原因になることをRNA編集異常を利用したコンディショナルノックアウトマウスの動物実験から明らかにし,孤発性ALSの疾患モデルマウスを開発しました.一方でALSにおいて上位運動ニューロンの変性の原因は未解明です.そのため,本研究ではこのモデルマウスを用いてRNA編集異常が上位運動ニューロンの細胞死の原因となっているかどうか検討することで,上位運動ニューロンの変性の原因と病因的意義を明らかにすることを目的としています.
異なるCTLの機能成熟を誘導するIL-2とIL-15のシグナル伝達機構の解明

本年度は、IL-2あるいはIL-15依存性に細胞傷害性T細胞(以下、CTL)に発現誘導されCTLの分化・機能に重要な分子を同定し、同分子の発現調節機構を分子レベルで明らかにすることを目的とした。MHCクラスI拘束性で単一のTCRを発現するIL-2欠損マウス(IL-2KO-TCR)とIL-15欠損マウス(IL-15KO-TCR)由来のT細胞を抗原ペプチドで刺激して様々な分子の発現を検討したところ、T細胞活性化の負の調節分子Cytotoxic Tlymphocyte associated antigen-4(CTLA-4)がIL-2依存性に誘導されることが明らかになった。さらにCTLA-4分子の発現調節機構を解析したところ、IL-2はCTLA-4分子の細胞内から細胞表面への輸送ではなくCTLA-4遺伝子の発現を正に調節していることが示された。またCTLA-4遺伝子の発現調節を担うIL-2の標的分子としてStat5の機能に着目し検討した。レトロウイルスベクターを用いて恒常活性型Stat5をIL-2RβKOCTLに発現させたが、CTLA-4の有意な発現誘導は観察されなかった。以上の実験結果から、IL-2はCTLの細胞障害活性とIFN-γの生産を誘導するだけでなく、CTLA-4を発現誘導することによってCTLの過剰な活性化を制御するという、CTLの活性化に関する極めて巧妙なオートクリン調節機構の存在を明らかにすることができた(論文投稿中)。
微量温室効果ガスの環境中における動態と制御

地球温暖化をもたらす大気中微量温室効果ガスの環境中における動態を明らかにするとともに、人工のガスについては防除を、生物圏に発生源のあるものについては発生要因を解析し、発生制御の可能性を検討する。またこれら微量温室効果ガスによる地球環境への影響評価も行う。平成4年度は、(1)グローバルな大気中および局地的な大気中における微量温室効果ガス[各種ハロカーボン(フロン、ハロン、低級ハロゲン化炭化水素)、メタン、窒素酸化物、対流圏オゾン、硫黄化合物など]の分布および動態の測定(巻出、青木、近藤、秋元、藤原)、(2)メタンの主要な発生源である水田・低湿地などにおけるメタン発生放出機構の解明と支配要因の解析ならびに制御の基礎的検討(古賀、和田、犬伏)(3)ハロカーボン類の大気中への放出を抑制するための除去・回収システムの検討(浦野)、(4)微量ガスの増加による気候への影響評価(松野)などについて重点的に研究し、成果をあげた。(1)ではハロカーボンの高精度分析により対流圏内の特定フロンの北半球での濃度増加傾向が減少していることを見出し、生産消費の国際的規制との関係を調ベた。ハロンについても初めて濃度増加傾向を明らかにした。南極でのメタン濃度連続精密測定の結果から増加傾向が近年大きく変動していることを明らにした。航空機で対流圏オゾンの分布は窒素酸化物に支配されることを示した。地表での観測データの解析からも対流圏オゾンの濃度増加は窒素酸化物によると推定した。(2)では、レーザー法により実際の水田の上でメタン濃度の経時変化を連続測定した。メタン発生放出過程の解析から水田における各種の管理によるメタン放出量制御の可能性を検討した。(3)ではフロンや代替フロンの最善の除去回収装置を提案した。(4)では大気の放射対流平衡モデルにおける微量ガスによる大気の温度構造と水循環・湿度分布の変化を調ベた。
肺疾患における一酸化窒素NOによる核酸ニトロ化を介した酸化ストレス制御

ニトロ化をうけた修飾核酸である8ニトログアノシンは発癌や遺伝子変異に関与した核酸損傷の指標として注目されている。私どもは、8ニトログアノシンに対する特異性の高い抗体を世界に先駆けて作成したので、本研究では、ヒトの様々な肺疾患における8ニトログアノシンの生成、局在について解析を行った。免疫組織化学的解析から、肺線維症ではマクロファージや気道上皮の他、特に化生再生上皮の細胞質に本因子の強い陽性所見が認められた。共焦点レーザー顕微鏡による二重染色では、本因子は、iNOS、eNOS、hemoxygenase-1、8ニトロチロシンおよびp53と共局在する所見が得られた。肺癌組織を用いた検討では、癌細胞の細胞質のみならず腫大した核内に本因子の局在を認めた。以上の結果から、過酸化物質のみならず、本因子のようなNOによって生成されるニトロ化化合物が、肺胞上皮の傷害に関わるとともに発癌にも関与する可能性が示唆された。次に高濃度酸素暴露マウス傷害肺やブレオマイシン傷害肺の解析では、傷害された気道や肺胞の上皮とマクロファージに本因子の生成が認められ、ニトロ化化合物の病態形成への関与が示唆された。私どもは、NOにより生成されるニトログアノシン誘導体である8-nitro-cyclic GMPがhemoxygenase-1などの細胞保護酵素を誘導し、細胞内生存シグナルを活性化することを明らかにしており、ニトロ化合物は細胞傷害作用のみならず細胞保護作用を有する可能性が考慮される。8ニトログアノシンは単なる損傷塩基ではなく、高い化学反応性を持つ生理活性物質であり、NOの下流のシグナル伝達分子として、重要な役割を果たすものと考えられる。今後、本因子の細胞傷害作用ならびに細胞保護作用の両面から、更に検討を進めたい。我々のグループが世界に先駆けて開発作成した本因子の抗体を用い、ヒトの様々な肺疾患における8ニトログアノシンの生成、局在について解析した。正常のヒトの肺では気管支上皮やマクロファージに軽度の生成所見がみられたが、喫煙の有無についての大きな影響は見いだせなかった。一方ヒト肺線維症ではマクロファージや気道上皮の他、特に化生上皮の細胞質に本因子の強い生成を見いだした。共焦点顕微鏡による2重染色で本因子生成はiNOS、eNOS, hemoxigenase-1、8ニトロチロシンやp53の局在と共通する所見が見られ、免疫電顕では細胞質内の核周囲のミトコンドリア表面に本因子の強い発現が見られた。肺癌では癌細胞の細胞質のみならず特に腫大した核に本因子の発現を認めた。また高濃度酸素暴露マウス傷害肺やブレオマイシンマウス傷害肺でも傷害された気道や肺胞の上皮とマクロファージに本因子の強い生成を確認した。我々のグループは、また本因子の強力なレドックス活性やHepG2細胞での細胞保護作用を見いだしているので、この結果は、肺傷害上皮細胞にも本因子に細胞保護作用がある可能性を考えた。以上は、本因子が単なる損傷塩基でなく、高い化学的反応性を持つ生理活性分子であり、NOの下流のシグナル伝達分子として、生存シグナルへの関与を示すものと思われた。傷害を受けた上皮の再生や化生における変異原性や遺伝子傷害、更には発癌機構に本因子を介した活性酸素の関与が示唆された。

今後、HPLCを用いた本因子の定量化や培養肺上皮細胞、培養肺癌細胞を用いた状況での本因子の生成動態を解析し、更に本因子添加による細胞保護作用も検討する予定である。ニトロ化をうけた修飾核酸である8ニトログアノシンは発癌や遺伝子変異に関与した核酸損傷の指標として注目されている。本年度の検討では、我々のグループで世界に先駆けて開発作成した8ニトログアノシンに対する抗体を用い、ヒト特発性肺線維症ならびに肺癌組織における8ニトログアノシンの生成と局在について解析した。ヒト肺線維症ではマクロファージや気道上皮の他、特に化生再生上皮の細胞質に本因子の強い生成を見いだした。肺癌組織では癌細胞の細胞質のみならず特に腫大した核に本因子の発現を認めた。このような結果から、過酸化物質のみならずNOによって形成されるニトロ化化合物が、肺胞上皮の傷害過程に関わるとともに、発ガンにも関わる可能性を示した。また高濃度酸素暴露マウス傷害肺では傷害された気道や肺胞の上皮とマクロファージに本因子の強い生成を確認した。このような組織傷害の課程では、肺胞組織へのマクロファージ浸潤がその後の組織修復や線維化の課程に重要な役割を果たすことを明らかにした。私どもグループではNOにより産生されるニトログアニン誘導体である8-nitro-cyclic GMPがヘムオキシゲナーゼ1などの細胞保護酵素を誘導し、細胞内生存シグナルを活性化することを明らかにしており、ニトロ化化合物は、肺胞上皮細胞に対しても細胞保護作用を示す可能性が考慮される。すなわち、8ニトログアノシンは単なる損傷塩基でなく、高い化学的反応性を持つ生理活性分子であり、NOの下流のシグナル伝達分子として、生存シグナルへの関与を示すものと思われ、今後、HPLCを用いた本因子の定量化や培養肺上皮細胞、培養肺癌細胞を用いた状況での本因子の生成動態を解析し、更に本因子添加による細胞保護作用の検討を進めたい。
半導体超微粒子を固定した電極の調製とその光電気化学特性

これまでの研究により、TiO_2超微粒子コロイドを電気泳動することによって、陰極表面に固定したTiO_2超微粒子ゲル膜を光触媒として用い、2-プロ-パノールのアセトンへの酸化反応によって光生成する正孔を消費させると、炭酸プロピレン中でNO_3^-のアンモニアへの光還元およびCO_2のメタノールへの光還元反応が極めて高い選択性で進行することが明らかとなった。そこで本年度の研究では、二酸化炭素と種々の窒素酸化物とを同時に光還元することを試みた。CO_2とNO_3^-の両者が存在する反応溶液を用いてTiO_2超微粒子ゲル膜による光還元反応を行ったところ、CO_2とNO_3^-との結合過程の存在を意味するC-N結合を有する尿素が主生成物として得られ、メタノールとアンモニアが副生成物として得られた。還元生成物と酸化生成物であるアセトンの生成比より、1分子の尿素の生成に16電子が関与していることがわかった。NO_3^-の濃度を変化させて反応を行ったところ、濃度の増加に準じて尿素の生成量が増加したことより、同時光還元反応においてNO_3^-の還元過程が反応速度を決定しているとの示唆が得られた。そこで、NO_3^-の6電子還元生成物であるNH_2OHを窒素酸化物として用いてCO_2との同時光還元反応を行ったところ、尿素の生成速度は7倍以上となり、上記の考えを指示する結果を得た。いっぽう窒素酸化物にNOガスを用いると、尿素の生成速度はNH_2OHを用いた場合と同程度となり、かつ副生成物であるメタノールとアンモニアの生成は大きく抑えられるという結果を得ており、この方法が大気中の汚染物質であるCO_2とNOxの両者を同時に還元することによって、固体状態の尿素を得るという、環境問題の視点からも興味深いものであることがわかった。これらの反応を、通常のTiO_2バルク粒子を光触媒に用いて行っても尿素の生成は極めて少なく、半導体超微粒子の特異的な反応性が発現した結果であると言える。
アルコールにより再生するキラル金属アルコキシド触媒の開発

本研究ではまず、キラルなスズジメトキシドの開発に先立ち、様々なアキラルスズメトキシドについて検討した結果、ジブチルスズジメトキシドがメタノール存在下でのエノールトリクロロアセテートのアルドール反応において、最も高い触媒活性を示すことがわかった。そこで、最適条件を用いて種々のアルデヒドとのアルドール反応を行うことにより、いずれも高収率で目的とするアルドール付加体を得ることができた。特に芳香族アルデヒドからは、対応するアルドール付加体がほぼ定量的かつsyn選択的に得られた。一方、脂肪族アルデヒドも本反応において顕著な反応性を示したが、芳香族アルデヒドとは逆の、anti選択性を与えたことが注目に値する。さらに、色々なケトンから誘導したエノールトリクロロアセテートを用いて、基質一般性の検討を行ったところ、環状ケトンのみならず鎖状ケトン誘導体も良好塗収率と高い立体選択性で、生成物を与えることがわかった。また、それまでに得たアキラルスズジメトキシドの知見を基に、現在、光学活性ビナフトールから目的とするキラルスズジメトキシド触媒の合成を試みているところであるが、まだ、合成に至っていない。しかし、その化合物の前駆体であるキラルスズジブロミドを不斉触媒に用いて、エノールトリクロロアセテートのアルドール反応を試みたところ、80%eeを超える不斉誘導が見られた。さらに、ジブチルスズジメトキシドによる上記アルドール反応の触媒システムを利用して、ホモアリルアルコールのトリクロロ酢酸エステルからのアリル基移動反応によるアルデヒド類のアリル化反応を試みたが、良い結果は得られなかった。一方、イミン類とエノールトリクロロアセテートとのいわゆるマンニッヒ型反応では、ジブチルスズジメトキシドがアルコール再生型触媒として機能することが見い出された。