hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫の学習における報酬系と罰系の役割の解明

本研究では、コオロギの嗅覚および視覚学習において、ドーパミン作動性ニューロンが罰情報を伝え、オクトパミン作動性ニューロンが報酬情報を伝えるのみならず、それらのニューロンの正常な活動が、記憶の読み出しにも必須であることを薬理学的な解析により明らかにした。この現象を説明するために、新規学習モデル「水波-宇ノ木モデル」を提案し、2次条件づけを用いた行動薬理学的解析により、モデルを検証した。さらにコオロギにおいて一般に罰記憶は報酬記憶より減衰しやすいことを明らかにし、これがヒトを含む動物の記憶に共通する性質であるとの仮説を提案した。本研究の目的は、昆虫の脳には、様々な種類の学習においてその連合過程に共通して働く「報酬系」や「罰系」と呼べる神経システムが存在する、という研究代表者の仮説を実験的に検証することである。研究代表者はフタホシコオロギの嗅覚学習において報酬条件付けにはオクトバミン作動性ニューロンが、罰条件づけにはドーパミン作動性ニューロンが関わることを見いだしている。そこで本年度は、この発見が視覚的なパターン(模様)の学習にも一般化できるかについて調べた。オクトパミンおよびドーパミン受容体阻害剤を血中投与したコオロギに、視覚的なパターン(模様)を水(報酬)または塩水(罰)と連合させる条件付け訓練を行った。訓練の1時間前と1時間後にパターン選択テストを行い、条件付けが成立しているかを調べた。その結果、パターン学習においても、オクトパミン受容体阻害剤は報酬条件付けを阻害するが罰条件付けには影響を与えないこと、またドーパミン受容体阻害剤は罰条件付けを阻害するが、報酬条件付けには影響を与えないことがわかった。さらに、嗅覚学習と視覚学習の両方において、学習の1日後の記憶読み出しテストの30分前にオクトパミンまたはドーパミン受容体阻害剤阻害剤を投与し、これらの阻害が記憶の読み出しに影響するかを調べた。オクトパミン受容体阻害剤は報酬記憶の読み出し阻害したが、罰記憶の読み出しには影響を与えなかった。またドーパミン受容体阻害剤は、罰記憶の読み出しを阻害したが、報酬記憶の読み出しには影響を与えなかった。これらの結果は、オクトパミン作動性ニューロンおよびドーパミン作動性ニューロンがそれぞれ報酬記憶および罰記憶の読み出しに関わる事を初めて明らかにしたものである。初年度の研究により、オクトパミン作動性ニューロンおよびドーパミン作動性ニューロンがそれぞれ報酬記憶および罰記憶の読み出しに関わる事が示唆された。これは、従来の昆虫の学習モデルでは説明できなかった。そこで本年度は、この現象を説明するための新たなモデル(水波-宇ノ木モデル)を提案し、その検証実験を行った。具体的には、条件付けにより、脳内の匂いの情報を表現するニューロンと報酬や罰の情報を表現するニューロンとの間にシナプス接続が形成され、その経路の活性化が、記憶の読み出しには必須であるというモデルである。このモデルを2次条件付けという学習法を用いて検証した。2次条件付けとは、CS1とUSとの対提示の後に、CS2とCS1を対提示すると、CS1に対しても条件付け効果が見られるというものである。もし水波-宇ノ木モデルが正しければ、2次条件づけの第一段階においてオクとパミンやドーパミン受容体を阻害しても、2次条件付けは成立することが予想された。そこで、匂いをCS1、視覚的な模様をCS2とする2次条件付け法を開発し、薬理実験による解析を行ったところ、モデルを支持する結果が得られた。このモデルは、昆虫の古典的条件づけにおいて、外界の出来事の「内部モデル」が形成されることを初めて示唆するものであった。さらに、色学習にもオクトパミン作動性の報酬系、ドーパミン作動性の罰系が関わることを、行動薬理実験により明らかにし、昆虫の学習における報酬系、罰系の役割の普遍性を示した。前年度までの研究により、オクトパミンを伝達物質とする「報酬系」とドーパミンを伝達物質とする「罰系」の存在についての、確証が得られた。本年度はまず、報酬学習と罰学習では記憶のダイナミクスが異なるのか、という課題に取り組んだ。その結果、匂い学習、視覚的な模様の学習、色の学習の全てにおいて、罰記憶は報酬記憶より成立しやすいが減衰も早いことが分かった。

この違いは、報酬系と罰系の伝達物質の作用の違い、すなわち、オクトパミン受容体とドーパミン受容体の活性化に続く生化学的な過程のダイナミクスの違いに起因することが示唆された。この発見は、昆虫のみならず、ヒトを含めた哺乳類にも当てはまる可能性が指摘できる。次に、「学習行動の習慣化」について検討した。その結果、通常の学習後にはオクトパミン受容体阻害剤を投与すると記憶の読み出しが阻害されるが、過剰な報酬学習訓練をおこなうと、オクトパミン受容体阻害剤の存在下でも記憶の読み出しが出来るようになることが分かった。これは、過剰な学習訓練により、「内的表現」の読み出し過程が阻害されても、正常に学習行動が見られるようになることを示唆している。これは、昆虫の学習の認知的な側面についての更なる実験的な解析に道を拓く、画期的な成果と言える。
志賀直哉を中心とする奈良の文学空間の形成についての研究

本研究は、志賀直哉を中心とする高畑周辺に在住した文学者たちの作り上げた文学空間の消長と、志賀に師事した奈良女子大学ゆかりの作家、池田小菊についての検討考察の二つを眼目として出発した。17年度には、奈良女子大学記念館一般公開に伴う、「特別展示池田小菊の奈良志賀直哉に師事した女性教育者」(2005.4.29-5.5)を催し、調査で知りえた事柄を奈良という地域や人々と深く関わらせて展示した。展示の企画段階で調査した有田市文化福祉センター寄託の池田小菊関連資料は、志賀直哉の全集未収録の書簡を含み、それらを翻刻し、弦巻克二・吉川仁子「池田小菊関連書簡-志賀直哉未発表書簡を含めて-」(『叙説』2006)に詳しく紹介した。18年度は有田市寄託の小菊関連資料のうち、17年度に未調査の資料について引き続き調査をした。有田市寄託の資料は、戦争前後の、小菊が作家として活動した時期のものが主で、小菊の日記類とあわせ読むことで、彼女の当時の文筆活動、また、志賀の書籍の出版も手がけた全国書房と小菊との関わりも窺える。これらの調査を通して、志賀的リアリズムの手法が、その弟子筋も含めて「奈良派的」という言葉で評されるものであり、当時の文壇において、奈良という地が、志賀的リアリズムを象徴する空間としてあった可能性を見出した。その他、小菊の門下生で、作品のモデルでもあったと思われる都築光子についての調査、また、志賀直哉の最新全集で不明となっている、加納和弘の生没年、及び直哉の「怪談」の初出誌を明らかにするなどした。以上の研究成果は、弦巻克二・吉川仁子「池田小菊関連書簡補遺・その他」(『叙説』2007)に詳しく紹介した。17、18年度ともに、池田小菊の基礎資料の整理検討に、かなりの時間を割くことになったが、彼女の周辺を丹念に調べることで、志賀の研究上の穴のいくつかを補うことができた。志賀を、そして、奈良の文学空間を考察していく大きな手がかりとして、池田小菊を見出したといえ、引き続き研究していきたいと思う。本研究は、志賀直哉を中心とする高畑周辺に在住した文学者たちの作り上げた文学空間の消長と、志賀に師事した奈良女子大学ゆかりの作家、池田小菊についての検討考察を二つの眼目とする。本年度は、奈良女子大学記念館一般公開に伴う、「特別展示池田小菊の奈良志賀直哉に師事した女性教育者」(2005.4.29-5.5)を催し、これまでの調査で知りえた事柄を奈良という地域や人々と深く関わらせて展示し、成果の発表の場とすると同時に、新たな情報発掘の契機とすることができた。展示の企画段階で調査した有田市文化福祉センター寄託の池田小菊関連資料は、志賀直哉の全集未収録の書簡を含み、志賀研究においても、また、池田小菊研究においても、興味深いものであった。有田市文化福祉センター寄託資料のうち、書簡類は、翻刻し、弦巻克二・吉川仁子「池田小菊関連書簡-志賀直哉未発表書簡を含めて-」(『叙説』2006)に詳しく紹介した。これらの書簡類は、戦争前後の、池田小菊が作家として活動した時期のものが主で、今年度翻刻を進めている小菊の日記類とあわせ読むことで、小菊の当時の文筆活動、また、志賀の書籍の出版も手がけた全国書房と小菊との関わりも窺い知ることができる。

池田小菊の原稿、草稿、日記、メモ類の調査、奈良在住の志賀門下の人々の調査は、まだ途中の段階であるが、これらの精査により、志賀全集で未定となっている事項のいくつかは確定できる見通しである。小菊についての調査をすすめることが志賀の空白を埋めることにつながるのである。本研究は、志賀直哉を中心とする高畑周辺に在住した文学者たちの作り上げた文学空間の消長の考察と、志賀に師事した本学ゆかりの作家、池田小菊についての検討考察を二つの眼目としてきたが、18年度は主に池田小菊に焦点をあて、彼女の自筆資料である原稿、草稿、日記、メモ類の翻字、整理、調査を進めた。それにより、小菊の活字化されていない作品原稿のかなりの部分をデジタルデータ化することができた。また、有田市文化福祉センターに寄託されている小菊関連資料のうち、昨年度調査が及ばなかった資料について引き続き調査をした。小菊の門下生で、小菊作品のいくつかのモデルであると考えられる都築光子について調査し、小菊周辺の人物関係の解明を進めた。また、志賀直哉の最新全集では、加納和弘の生没年、及び直哉の「怪談」の初出誌が不明となっているが、前者については空海寺にある加納家の墓石を調べることにより解明、後者については、小菊がスクラップしていた当該作品の裏面記事を手がかりに、再掲である可能性はあるものの掲載紙名を特定した。さらに、小菊の作品評の中に、志賀的リアリズムの手法を、その弟子筋も含めて「奈良派的」という言葉で評したものがあることから、当時の文壇において、奈良という地が、志賀的リアリズムを象徴する空間としてあった可能性を見出した。以上の研究成果については、弦巻克二・吉川仁子「池田小菊関連書簡補遺・その他」(『叙説』2007)において詳しく紹介、発表した。
環境配慮型生活様式の構築のための都市とライフスタイルの相互依存に関する国際比較

本研究では、第1に日本と生活水準が同レベルの先進欧米諸国との二酸化炭素排出構造を時系列で比較し、最終需要構造、産業連関、輸出入にともなう二酸化炭素排出を、生活様式と財の消費構造、国内産業間波及構造、国際間の生産消費構造の各断面からみた都市社会経済とライフスタイルとの環境負荷の相互依存構造を分析し、第2に環境生活様式の領域と指標を評価フレームとして設定した後、日英における環境ライフスタイルの都市レベルでの比較をおこない、生活時間利用、生活空間利用、生活社会システム利用について都市生活空間・行動とライフスタイル変化と環境負荷の相互依存関係を解析評価した。OECDのI-Oデータベースが提供する36部門産業連関表による日本、イギリス、西ドイツ、オランダ、米国の197090年の最終需要にともなう内包二酸化炭素排出量変化を解析した結果では、社会的成熟に伴い民間最終需要のシェアが増大し、各産業の単位生産額あたりの直接排出量の減少にも関わらず、商業・サービス等の3次産業への需要を通じて波及伝搬する間接的な二酸化炭素排出量の増大が認められた。その変化は緩やかに社会的成熟を遂げている欧米に比べ日本の急速な変化が対照的に示された。また、日英の生活社会システムの比較では、生活時間利用、空間利用、社会システム利用の各領域に評価指標と尺度を設定して、定量的な比較評価をおこない、英国におけるトラベルカード(オフピークを利用したマス・トランジットの優遇利用措置)や都市計画における緑地保全のネットワークなどの独自性とともに、循環社会システムとしてのレンタル制度や郊外公園や農場利用のリサイクル市と日本の有価物集団回収のしくみとが特徴的に比較対照して示された。
カンキツの染色体地図作成に関する研究

カンキツの染色体地図作成には、母樹の栄養器官を材料として比較的長い染色体の標本を作製し、それぞれの染色体を明瞭に識別できなくてはいけない。そこで、本研究では幼葉を用いて比較的長い染色体の標本作製技術を確立するとともに、CMAバンドパターンに基づく数種カンキツの染色体構成を明らかにし、同一のCMAバンドパターンをもつ染色体の識別はGISH法により行なった。1.1.染色体標本作製では、35mmの幼葉を用い、0.3%セルラーゼ+0.2%ペクトリアーゼで37°C、120180分処理後、固定液で洗浄して懸濁細胞を滴下する方法により、比較的長い染色体像が多く得られた。2.CMA染色によってカンキツ染色体は5種類のバンドパターンが得られた。すなわち、CMA(+)領域が染色体の両端と動原体付近にあるもの(A型)、一方の端部と動原体付近にあるもの(B型)、両端にあるもの(C型)、一方の端部にあるもの(D型)、CMA(+)領域がないもの(E型)であった。3.CMAバンドパターンによる染色体構成は、ブッシュカンが2B+8D+8E、コウジが1C+8D+9E、ウンシュウミカンが1A+1C+8D+8E、'ワシントン'ネーブルオレンジが2B+2C+7D+7E、'ダンカン'グレープフルーツが2A+1B+1C+6D+8D、'土佐文旦'が1A+1B+5C+2D+9E、'水晶文旦'が3A+3C+3D+9E、'晩王柑'が2A+1B+3C+3D+9E、'晩白柚'が1A+2B+2C+4D+8E+1A or B、カラタチが4B+8D+6Eであることが明らかとなった。4.'南柑20号'ウンシュウミカン染色体にDig標識した'南柑20号'DNAとBio標識した'土佐文旦'DNAでGISHを行い、坑DigローダミンとアビジンFITCで蛍光染色すると、8本のD型染色体は、黄色の大きなシグナルをもつ1本、黄色の小さなシグナルをもつ1本、橙色の大きなシグナルをもつ3本、橙色の小さなシグナルをもつ1本、赤色の小さなシグナルをもつ2本の染色体に識別できた。また、8本のE型染色体はギムザ染色体により長い2本、中程度の2本、短い4本の染色体に識別できた。カンキツの染色体地図作成には、染色体の識別に基づく染色体構成を明らかにする必要がある。しかし、染色体識別に有効な比較的長い染色体像では、2次狭窄部分が伸長するため、染色体数の特定が困難となる。そこで、蛍光染色法を用いて染色体数の特定を行い、数種類のカンキツの染色体構成を明らかにした。`土佐文旦'、`ワシントンネーブル'オレンジ、カラタチ、`水晶文旦'および`南柑20号'ウンシュウミカンの成木から幼葉を採取し、酵素解離法により染色体標本を作製した。

標本は、(1)2%ギムザ、(2)50μg/mlキナクリンマスタード/ヘキスト33258(QM/H)、(3)0.12mg/mlクロモマイシンA3(CMA)で順に染色し、染色パターンを比較・調査して、染色体構成を決定した。QM/H染色は動原体部分の染色が暗く、動原体の位置の確認には有効であった。CMA染色では、A)染色体の両腕端部と動原体付近に蛍光の強いCMA(+)、B)一方の端部と動原体付近にCMA(+)、C)両端にCMA(+)、D)一方の端部にCMA(+)の領域をもつ、E)CMA(+)の領域を持たない、の5種類のバンドパターンが観察された。CMAバンドパターンに基づき、染色体構成は`土佐文旦'が1A+1B+5C+2D+9E、`ワシントンネーブル'が2B+2C+7D+7E、カラタチが4B+8D+6E、`水晶文旦'が3A+3C+3D+9E、`南柑20号'が1A+1C+8D+8Eであることが明らかとなった。この染色体構成に基づき、染色体数の算定が困難な核板においても染色体数を2n=18と特定することが可能となった。また、算定困難な染色体はほとんどが動原体付近にCMA(+)の領域を持っていた。以上より、蛍光染色により染色体数の特定が可能となり、5種類のカンキツではCMA染色に基づく染色体構成が明らかとなった。カンキツの染色体地図作成には、染色体の識別に基づく染色体構成を明らかにする必要がある。昨年度にはCMA染色は染色体の識別に有効なことを認め、5種類のカンキツでCMA染色に基づく染色体構成を明らかにした。しかし、同一のCMAバンドパターンをもつ染色体間の識別は困難である。そこで、これらの識別に有効なGISH(Genomic in situ Hybridization)法を検討した。'南柑20号'ウンシュウミカン、'土佐文旦'、'ワシントンネーブル'オレンジ、ブッシュカンの葉からDNAを抽出し、ニックトランスレーション法によりビオチン(Bio)またはディゴキシゲニン(Dig)標識した。Bio標識した'土佐文旦'DNAプローブ(以下、Bio'土佐文旦')10μlを単用で'南柑20号'染色体標本にハイブリダイズすると、シグナルはほぼ同様であり、染色体の形態も不明瞭であった。Bio'南柑20号'10μl+Dig'土佐文旦'5、2.5、1μlおよびBio'土佐文旦'10μl+Dig'南柑20号'5、2.5、1μlの組み合わせでは、Bio'南柑20号'10μl+Dig'土佐文旦'1μlで色調の異なる特異的なシグナルが検出されたが、染色体の形態は不明瞭であった。Bio'土佐文旦'10μl+Dig'南柑20号'5μlでは色調の強い特異的なシグナルが検出され、染色体の形態は明瞭であり、染色体の識別に有効であった。Bioブッシュカン10μl+Dig'南柑20号'5μl、Bio'ワシントンネーブル'10μl+Dig'南柑20号'5μlおよびBioブッシュカン10μl+Dig'土佐文旦'5μlについて検討すると特異的なシグナルは検出されるが、染色体の識別にはやや劣った。Bio'土佐文旦'10μl+Dig'南柑20号'5μlでは、CMA染色による'南柑20号'ウンシュウミカンの8本のD型染色体は、シグナルの色調と大きさから黄大、黄小、橙大、橙小、赤小の5グループに分類することができ、GISH法の有効性が認められた。
非周期ドメイン反転構造を有する非線形光学結晶を用いたフェムト秒光パルスの時空間制御

周期分極反転ニオブ酸リチウム(PPLN)による擬似位相整合(QPM)素子を用いた、2次カスケーディング非線形効果による、フェムト秒パルスの断熱ソリトン圧縮の実験及び理論的研究を行った。中心波長1560nm付近で100フェムト秒程度のパルスを40fs程度に、エネルギーロスなく、断熱的に圧縮することを目標としている。光ファイバーを用いたソリトン圧縮に比べ、数cmの短い素子長で同等の圧縮が行えることが特徴である。一定周期のQPMデバイスを用いた場合はパルスの前後に副次的なピーク(ペデスタル)が現れ、その分のエネルギーがロスとなるが、周期を変調したQPM素子によりベデスタルを減少させた、断熱的な圧縮が可能となる。また、2次カスケーディング非線形光学効果を用いた圧縮法では、基本波のみの入力で、第二高調波と基本波の両方がソリトン圧縮される。今年度は、数値シミュレーションにより、周期が一定のQPM、一次関数及び二次関数的に周期を変化させたQPMによる断熱圧縮のシミュレーションを行い、デバイスパラメータの最適化を行った結果、長さ50mmのニオブ酸リチウムQPMデバイスでほぼ断熱的な圧縮が可能であることを示した。またシミュレーションにより、QPMデバイス中を伝播中の基本波及び第2高調波の空間波形・時間波形の変化を明らかにした。現在設計したデバイスの製作が終了し、実証実験を行っている。以上に加えて、傾斜QPM素子を用いた群速度整合法と2次カスケーディング非線形光学効果を組み合わせたソリトン圧縮法も検討し、これも数値シミュレーションによりソリトンパルス圧縮が可能であることを示すと同時に、系の最適化によるデバイスの設計を行った。この方法により長さわずか3mmのデバイスにより、100fsの基本波入力から、40fsの基本波及び第二高調波出力が得られることを明らかにした。近年、強誘電体分極反転素子中で波長変換の多段階の誘起過程であるカスケーディング非線形光学効果により、超短光パルスの波長変換と同時に、光パルス圧縮が可能であることが研究代表者らにより見出され、実証された。これは2次非線形光学媒質中での光パルスのソリトン伝播を利用したものであるが、これをさらに進め、超短光パルスの時間波形だけでなく空間波形も同時に制御することを目的として研究を行っている。現在、非線形光学材料としては時間・空間的に一様であるにもかかわらず、わずかな入力光の揺らぎから時間・空間的な規則パターンが出現する現象であるmodulation instabilityについて、数値計算と実験の両面から解析を進めつつある。本研究の目的である時空間波形制御にとって、この現象は一つの大きな鍵となる。カスケーディング非線形光学効果は、位相整合条件からのわずかなずれにより、基本波、第2高調波の双方が変調される現象であり、その変調度は位相整合を満足する中心の時間周波数、空間周波数からのずれに依存する。その結果時間・空間双方のスペクトルの形状が変化し、フーリエ合成の結果時間・空間波形も変化する。われわれは基本波・第2高調波の入出力関係をゲインで表わし、これを時間・空間周波数の関数として数値的に求めた。現在この結果を検証する実験の準備中である。非線形結晶としては、周期分極反転LiNbO_3を用いる。また、より基礎的な検討として、実際に作製される周期分極反転素子の設計値とのずれが波長変換の効率、スペクトル幅、パルス幅等に及ぼす影響に関してシミュレーションを行っている。光の伝播方向に対しては周期の揺らぎ、素子の深さ方向には分域壁の垂直からのずれが問題となる。結晶としてはLiNbO_3およびLiTaO_3を想定している。
新規ロイシンリッチリピート蛋白ファミリーの神経可塑性における役割

ロイシンリッチリピート構造を有する蛋白はショウジョウバエ神経系の発声過程で多くのインベントに関与していることが知られているが、哺乳類ではほとんど同定されていない。我々はexpressed sequence tagクローンの中にロイシンリッチリピート構造を有するものが存在することに着目し2種類のESTクローンを基にマウスcDNAライブラリースクリーニングを行い、3種類のロイシンリッチリピート蛋白(NLRR-1,-2,-3)を同定した。このうちNLRR-1,-3については全長cDNAを単離しコードする蛋白を推定したところどちらも細胞膜を一回貫通し細胞外にLRR構造を有する事が判明した。これら3種類の遺伝子発現はどれも神経系を中心に発現しているもののお互いに発現パターンを異にしていること、及び成熟神経系では海馬、小脳というような可塑性に富んだ領域に強く発現することから可塑性形成に何らかの役割を担っていることが示唆された。またNLRR-3は機械的損傷を加えられた大脳皮質で有意に発現上昇していることから損傷修復にも機能していることが考えられた。これら3種の蛋白とは別に胚性癌細胞株P19の神経分化の際に発現上昇する遺伝子として我々が同定したクローンGA3-43は構造解析の結果膜を一回貫通する蛋白で細胞外領域にLRR構造とイムノグリブリン様ドメインを合わせ持つことが明らかとなりLRRとIgGドメインを合わせ持つことからLIG-1と名付け、組織における発現解析をしたところ先の3種とは異なり主にグリア細胞で発現していた。特に小脳ではバーグマングリアに発現しておりこの蛋白がプルキエンエ細胞の樹状突起とバーグマングリアの間の細胞接着等の現象を制御することにより長期抑制などの可塑性に対して影響を与えていることが考えられた。今後は各LRR蛋白の抗体を作成し蛋白レベルでの発現局在を検討していく予定である。
神経芽細胞腫骨転移の臓器特異的治療法の開発

神経芽細胞腫はしばしば骨に転移する。我々は、ヒト神経芽細胞腫細胞株とマウス骨髄細胞との共存培養下で破骨細胞形成因子RANKLの発現が上昇し、破骨細胞形成が促進することを見い出し、報告した。前立腺癌や多発性骨髄腫等の骨転移においても、RANKLシグナルの関与が示唆されている。そこで、骨転移に対する臓器特異的治療法の開発を目的として、動物モデルを用いてRANKLに対するデコイ受容体であるosteoprotegerin(OPG)の発現プラスミドを用いた遺伝子治療を試みた。発現ベクターとしては種々の臓器で高い発現が得られるpCAGGSを用い、検出のためにFLAGタグをC端側に融合させた(pCAGGS-OPG-FLAG)。OPG-FLAGの活性については、COS7にpCAGGS-OPG-FLAGを導入し、培養上清をin vitro破骨細胞形成系に添加することにより確認した。動物への遺伝子導入にはnaked DNA筋注法に電気穿孔法を併用した。まず、正常ラットの筋肉内にpCAGGS-OPG-FLAGを導入し、経時的に採血を行い、OPG-FLAGの発現、分泌を確認した。神経芽細胞腫骨転移と同様に融解性骨病変を有する腫瘍随伴性高カルシウム血症の動物モデルにpCAGGS-OPG-FLAGの筋肉内遺伝子導入を行ったところ、高カルシウム血症が是正された。また、骨粗鬆症のモデルであるOPGノックアウトマウスにpCAGGS-OPG-FLAGの筋肉内遺伝子導入を行ったところ、骨量の増加を認めた。これらの結果から、神経芽細胞腫骨転移などにおける融解性骨病変に対して、OPGを用いた遺伝子治療の可能性が示唆された。我々は以前、ヒト神経芽細胞腫細胞とマウスの骨髄細胞との共存培塞を行い、この共存培養下で破骨細胞が形成されること、また破骨細胞誘導因子であるRANKLの発現が上昇していることを報告した。そこで、RANKLに対するデコイ受容体であるosteoprotegerin(OPG)を用いて、神経芽細胞腫骨転移マウスモデルに対する治療を試みることとした。まず、OPG発現ベクターの筋肉内遺伝子導入法を行うため、ラット腎臓より得たcDNAを鋳型として蛋白コード領域をPCRクローニングし、種々の細胞で高発現が得られるpCAGGSに組み込み、さらにタグとしてOPGのC端にFLAGを付加した。作製したratOPG-FLAGをCOS7細胞に導入して培養上清を回収し,発現は抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、破骨細胞形成に対する阻害活性はin vitroの破骨細胞形成実験により確認した。次に動物の筋肉内に遺伝子導入した際の、発現及び分泌、骨吸収抑制作用を検討するため、PTHrP産生腫瘍をヌードラットに移植した腫瘍随伴性高カルシウム血症動物モデルに対してpCAGGS-ratOPG-FLAGの筋肉内遺伝子導入を行った。その結果、遺伝子導入後1週間以内に高カルシウム血症の是正を認めた。抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、遺伝子導入を行った動物の血清中にはratOPG-FLAGの存在が確認された。しかし、ratOPGに対するアッセイ系がavailableではないため、新たにヒト骨芽細胞株よりhuman OPG cDNAをクローニングし、pCAGGSに組み込んだ(pCAGGS-humanOPG)。哺乳類細胞における発現及び破骨細胞形成阻害活性については確認したので、現在、マウス筋肉内へのpCAGGS-humanOPG遺伝子導入を行い、血中への分泌についてELISAによる検討を行っている。神経芽細胞腫はしばしば骨・骨髄に転移し、骨転移のある症例は高用量の化学療法、骨髄移植などの治療に抵抗する。このことから、骨を標的とする臓器特異的治療の開発が急務であると考えられる。

我々はこれまで、ヒト神経芽細胞腫細胞とマウスの骨髄細胞との共存培養を行い、この共存培養下で破骨細胞が形成されること、また破骨細胞誘導因子であるRANKLの発現が上昇していることを報告した。本研究においては、この結果にもとづき、RANKLに対するデコイ受容体であるosteoprotegerin (OPG)を用いた治療の可能性を検討することとした。NakedのOPG発現ベクターの筋肉内遺伝子導入法を行うため、ラット腎臓より得たcDNAを鋳型として蛋白コード領域をPCRクローニングし、pCAGGSに組み込み、タグとしてOPGのC端にFLAGを付加した。作製したratOPG-FLAGの発現と生物活性を検討するため、プラスミドをCOS7細胞に導入し、培養上清を回収した。発現は抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、破骨細胞形成に対する阻害活性はin vitroの破骨細胞形成実験により確認した。実際に動物の筋肉内に遺伝子導入した際の、発現及び分泌、骨吸収抑制作用を検討するため、腫瘍随伴性高カルシウム(Ca)血症動物モデルにpCAGGS-ratOPG-FLAGの筋肉遺伝子導入を行った。その結果、遺伝子導入後1週間以内に高Ca血症の是正を認めた。また、Ca値の低下に伴い、腎臓での1α位水酸化酵素の発現が増強された。抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、遺伝子導入を行った動物の血清中にはratOPG-FLAGの存在が確認された。さらに、骨粗鬆症を呈するOPGノックアウトマウスに対して本ベクターの筋肉内遺伝子導入を試みたところ、骨量の増加をみとめ、本遺伝子治療の効果が確認された。
ウィリアム・モリスおよび近代の生活芸術思想史に関する建築論的研究

今年度前半には,大きく三つの研究成果を得た。(1)「手工芸」に関わるウィリアム・モリスの言説を解読することを通して,かれの芸術理解と社会理解に通底する思索の構造を明らかにし,モリスの制作論における共同性の問題とともに,日本建築学会計画系査読論文としてまとめた。(2)前年度明らかにしたモリスの1880年代の制作論がアーツ・アンド・クラフツ運動の創始期に英国の装飾芸術家,建築家,都市計画家にどのように受容されたかということを〈life〉という概念をめぐって研究し,その成果を論文として執筆し,その内容に基づいた口頭発表を行った。モリスが1880年代に提示する「慎みある生活」には人間の主体性と生活環境の美化が求められること,モリスらは,「慎みある生活」に伴う外的環境を包括する全体的な「生命」を措定していること,アーツ・アンド・クラフツ運動では諸物の関係性についての「構成的感覚」が重要視されていることを取り上げた。(3)モリスの1890年代の制作論を研究し,論文執筆および口頭発表した。主として1890年代のモリスの書物に関する論考を取り上げ,その倫理的側面の一端を明らかにした。今年度後半,2010年12月に,「ウィリアム・モリスの生活芸術思想に関する建築論的研究」という題目により京都大学博士学位請求論文を提出し,2011年3月に京都大学博士(工学)の学位を取得した。これまでの研究成果をモリスの装飾芸術論,住まい論,社会主義論,書物論という四つの枠組みによりまとめ,最終章において,モリスの生活芸術思想における倫理的内容を整理し,その倫理性に依拠する制作のあり方を提示するとともに,それが現代の生活環境や地球環境の問題に反省的視座を与える可能性を論じた。今年度は,ウィリアム・モリスの1880年代の制作論を中心に研究し,その成果を論文として執筆し,その内容に基づいた口頭発表を行った。まず,日本建築学会近畿支部における論文(発表)では,アーツ・アンド・クラフツ展覧会とモリスの関係を検討したのち,機械と手工の問題および制作における人間の問題について論じた。1880年代,モリスは芸術運動だけではなく社会主義運動にも関与しているが,両運動を貫いているのは,制作(生産)における人間の主体性への着目である。モリスは人間の主体性の問題を「デザイン」(制作における芸術的側面)と「職人技術」(制作における技術的側面)の不可分性として捉えていた。本論において,アーツ・アンド・クラフツ運動の初期にモリスが「デザイン」と「職人技術」という観点から建築および装飾芸術の本質について言及していることを指摘したが,この内容はモリス以後のアーツ・アンド・クラフツ運動の展開を研究する上で重要であると考える。次に,日本建築学会2009年度大会における論文(発表)では,モリスの「手工芸」についての言及が上述のような技術論的内容に止まらず,環境論的内容を含んでいることに注目し,アーツ・アンド・クラフツ運動と「美しい環境」の関係について「工場」に関する記述に即して論じた。本論によって,制作環境を生活環境として構築するというモリスの考え方が明らかとなったが,ラスキンやマルクスの思想とモリスの思想との連関についての研究が課題として残った。また,2009年9月,英国において,アーツ・アンド・クラフツ運動に関与した建築家の情報収集,建築作品の現地調査を行った。次年度,アーツ・アンド・クラフツ運動における<life>の概念を中心に分析する際に有意義となると思われる資料および情報を得た。
ゴリラとチンパンジ-及び各種霊長類間の種間関係と森林との相互作用に関する総合研究

本研究計画では、1、同所的に生息するゴリラとチンパンジ-の比較生態学的研究、2、熱帯森林の構造の解析をおこない、熱帯林の果実生産様式と霊長類コミュニティ-との相互作用の研究、3、ザイ-ルに生息する、グエノン類の形態学的研究を行なった。また、ザイ-ルから、N.ムワンザ博士とM.ムワンガ研究員を日本国に招へいし成果のとりまとめを行った。ザイ-ルのゴリラとチンパンジ-の間には生態学的地位の相違が見られた。ゴリラは、いたるところで多量に採食可能な繊維質のツルや草木を基礎食料資源として、それに大量に生産されるいくつかの果実を組み合わせていた。一方、チンパンジ-は、主に多種類の果実を離合集散しながら採食し、繊維質の草本を加えていた。2種が採食する植物種間には、大幅な重複が存在するが、その組み合わせや土地利用様式には相違が見られた。ザイ-ルにおいて、低地熱帯林のゴリラの生息密度は、山地林の約半分程度と推測された。低地のゴリラの主食は、山地林と同じように繊維質の草本類と潅木の葉であるが、同時に多種の果実を日常的に摂取していた。果実の多い時期には、ゴリラの一日の遊動距離は長い。低地林のゴリラは、大きく季節移動をおこない、年間の遊名域面積は、山地林に比べると十倍にもなると推測された。ゴンゴの調査地でも、ゴリラの基本食料は、草本の髄や若芽など繊維質に富んだ植物に果実を組み合わせていた。ザイ-ルとの比較から、コンゴのゴリラの生態的特色は、湿原での水草の多量摂取であった。コンゴの調査地での生息密度は非常に高く、この生態学的特質を背景としていると考えられる。ザイ-ルの山地林では、チンパンジ-による、肉食や道具使用が確認された。また、ゴリラによる薬用植物利用と推測される行動が世界で初めて発見された。チンパンジ-でも同様な薬用植物利用と推測される採食行動が、糞分析から確認された。また、採集した百個体以上の毛のDNA解析を行い、ゴリラの種分化の過程を明らかにしてゆきたい。ザイ-ルの低地林の構造は、複数の優占種が一様に分布しているのではなく、主要樹種の一種ないし二種が優占する小規模な林分が、モザイク状に複雑に組み合わさっていることが明かとなった。北コンゴの熱帯林は、ザイ-ルとは全く構造を異にし、3つの植生帯に明瞭に区別できた。熱帯林の果実生産の様式を、散布者との関連で3型に分類することができる。1、林冠を構成する主要樹種、2、林冠に低密度で混じる高木種や蔓植物、3、林内に比較的高密度に生息する中、低木種や蔓植物の3型である。果実の諸特質と散布者との間には、食うものと種子散布されるものとの間での共進化を示す諸特質の関連が見られた。熱帯林に同所的に生息する霊長類コミュニティ-を構成する、ゴリラとチンパンジ-、マンガベイ類、グエノン類、コロブス類は、それぞれ、どの型の果実とその他の食料資源を組み合わせるかによって、明瞭にグル-プ分けることができた。グエノン類の、体サイズと頭蓋骨容量との間のアロメトリ-関係の解析から、脳サイズは体サイズが小さくなるにしたがって、相対的に大きくなっていた。グエノン類の進化においては、小型のものが派生的であると言われるが、脳サイズは正比例的に小型化していなかった。平成2年度に日本国に招へいしたN.ムワンザ博士は、同年に名古屋で開かれた国際霊長類学会に参加し、共同研究の成果を発表した。また、屋久島において野生ニホンザルの生態調査を行った。平成3年度に招へいしたM.ムワンガ氏は、分担者である浜田博士の指導のもと、グエノン類の毛の色の種内および種間比較を行ない、論文の草稿を完成させた。ゴンゴの調査地でも、ゴリラの基本

食料は、草本の髄や若芽など繊維質に富んだ植物に果実を組み合わせていた。ザイ-ルとの比較から、コンゴのゴリラの生態的特色は、湿原での水草の多量摂取であった。コンゴの調査地での生息密度は非常に高く、この生態学的特質を背景としていると考えられる。ザイ-ルの山地林では、チンパンジ-による、肉食や道具使用が確認された。また、ゴリラによる薬用植物利用と推測される行動が世界で初めて発見された。チンパンジ-でも同様な薬用植物利用と推測される採食行動が、糞分析から確認された。また、採集した百個体以上の毛のDNA解析を行い、ゴリラの種分化の過程を明らかにしてゆきたい。ザイ-ルの低地林の構造は、複数の優占種が一様に分布しているのではなく、主要樹種の一種ないし二種が優占する小規模な林分が、モザイク状に複雑に組み合わさっていることが明かとなった。北コンゴの熱帯林は、ザイ-ルとは全く構造を異にし、3つの植生帯に明瞭に区別できた。熱帯林の果実生産の様式を、散布者との関連で3型に分類することができる。1、林冠を構成する主要樹種、2、林冠に低密度で混じる高木種や蔓植物、3、林内に比較的高密度に生息する中、低木種や蔓植物の3型である。果実の諸特質と散布者との間には、食うものと種子散布されるものとの間での共進化を示す諸特質の関連が見られた。熱帯林に同所的に生息する霊長類コミュニティ-を構成する、ゴリラとチンパンジ-、マンガベイ類、グエノン類、コロブス類は、それぞれ、どの型の果実とその他の食料資源を組み合わせるかによって、明瞭にグル-プ分けることができた。グエノン類の、体サイズと頭蓋骨容量との間のアロメトリ-関係の解析から、脳サイズは体サイズが小さくなるにしたがって、相対的に大きくなっていた。グエノン類の進化においては、小型のものが派生的であると言われるが、脳サイズは正比例的に小型化していなかった。平成2年度に日本国に招へいしたN.ムワンザ博士は、同年に名古屋で開かれた国際霊長類学会に参加し、共同研究の成果を発表した。また、屋久島において野生ニホンザルの生態調査を行った。平成3年度に招へいしたM.ムワンガ氏は、分担者である浜田博士の指導のもと、グエノン類の毛の色の種内および種間比較を行ない、論文の草稿を完成させた。ザイ-ル国では、カフジ国立公園の山地林におけるゴリラの分布調査を行い、ベッド調査法により25グル-プ、9頭のソリタリ-の生息が推計された。11年前の同様の調査と比較すると、総個体河数は若干増加している一方、グル-プの平均サイズは際だって小さくなっていた。イテベロ地区の低地熱帯林では、平成元年度の調査時に見られた多種の果実生産は、平成二年度はほとんどみられず、周年変化の著しく大きいことが明らかとなった。また、ゾウによる種子散布の研究および蟻植物の研究も行なった。コンゴ国ウェッソ地区では、ゴリラのハビチュエ-ションが進行している。ゴリラによる湿地草原の集中利用は、他地域の西ロ-ランドゴリラでは報告されていない新知見である。分布様式の特色として、連続する熱帯林のなかで数グル-プが集中している一方、分布の空白域が存在することが明かとなった。この地域の森林構造の研究のため幅15m長さ約4kmのトランセクト調査を行なった。この地域にはGilbertiodendronの純林に近い林が分布する一方、Gilbertiodendronの存在しない、種多様度高い森林も広大に存在することが明かとなった。また、ホオジロマンガベイの一群のバビチュエ-シヨンを行い、採食行動や種子分散の研究を行なった。日本国に招へいしたN.ムワンザ博士は、国際霊長類学会のシンポジウムで口頭発表を行い、彼が第一著者の論文1編および共著論文3編を完成させた。
テラビット級超高繰り返しパルス波技術の研究

H29年度に確立した高繰り返し光パルスからフォトミキシングにより100GHz高繰り返しパルス波を生成し、そのパルス波形の測定法を確認した。空間に放射されたテラヘルツ波は電波であるため、波形測定するためには一度アンテナで受信して電気信号に変換し、この電気信号が伝送線路上で発生する電界を検出するのが従来の方法であった。この方法では高感度な電界検出のために非線形光学結晶と組み合わせた高出力短パルスレーザなどの大規模な設備が必要であり、また伝送線上では電気信号の高周波成分が減衰し正確な波形測定ができないという問題がある。H30年度はこの問題点を根本的に解決するために、テラビット級パルス波形を空間に存在した状態で測定する方法を開発した。その測定系はフォトミキサを介して光ファイバと電波空間を接続した経路から成るマッハツェンダ干渉計という新たな構成である。さらにこの実験系を用いて100GHz, 200GHz, 300GHzの高繰り返しパルス波の波形測定に成功した。これらの成果を国際会議に5件、国内学会に6件発表した。そのうちの国内研究会において2回優秀発表賞を受賞した。H30年度の計画として掲げていた、高繰り返し光パルスからのフォトミキシングによる100GHz高繰り返しパルス波生成、およびそのパルス波形測定をするために、パルス波を二分岐し、一方を光の段階で遅延させておいて自己遅延干渉により波形を測定するという準光学的手法を基盤技術として確立し、標準的手段として利用できる体制を構築している。この方法のキー技術となるパルス波の分岐と干渉は、研究代表者らが開発したUTC-PDアレイによる空間合波技術を用いた。複数のUTC-PDアレイから空間にパルス状の電磁波を放射しこれらを空間合波する系に光遅延器を追加して自己遅延干渉計を構成したものである。この実験系を用いて実際に分解能0.1psで繰り返し周期300GHzのパルス波を波形測定が可能な段階に達しており、H31年度の最終目標に向けた準備が整えられた。計画は順調に進んでいるが、今後は最大の課題である一つ一つのパルスに変調をかける研究に取り組む。変調をかける方策として当初計画にあげていた、パルス列に直接変調をかける方法に加えて、バックアップとして別の変調方法を並行して進める。この方法は目的とする繰り返し周波数よりも低い周波数のパルス列を生成し、そこに変調をかけた後にパルス列どうしの間に遅延時間の差を付けて合波する、いわゆる時間多重である。この方法を用いて最終年度は高繰り返しパルス列に確実に変調がかけられることを実演する。無線通信システムの高速化技術として、テラヘルツ領域の繰り返し周期を持つパルス波キャリアに着目し、このテラヘルツ波パルス波生成法として、周波数の異なる複数の光波を重ね合わせて生成した高繰り返し光パルス波を、フォトダイオード(UTC-PD)を用いて光電変換するシステムを検討した。また、生成した光パルス波と光電変換後のテラヘルツ波パルスを自己遅延干渉により評価する方法を考案した。今回高繰り返し光パルス波を生成し、本測定法を用いてその光パルス幅を評価した。具体的には。高繰り返し光パルス波を、フォトダイオード(UTC-PD)を用いて光電変換するテラヘルツ波パルスの生成法と、生成した高繰り返し光パルス波と光電変換後のテラヘルツ波パルスを自己遅延干渉により評価する方法を考案した。さらに原理確認として、50GHz間隔の複数の光波を重ね合わせて高繰り返し光パルス波を生成し、本測定法を用いてその光パルス幅を評価した。シミュレーションで得られたパルス幅の理論値と測定値はほぼ一致しており、本測定法を用いた光パルス幅測定が有効であることを確認した。さらに、光電変換後のテラヘルツ波パルスの測定システムにおいては、フォトミキシング技術では、入力光波の差周波数成分と位相差成分をもつフォトカレントがUTC-PDに流れ、アンテナから放射される。そのため光パルス波の自己遅延干渉と同じ原理を用いて、片側のUTC-PDに入力される光パルス波を遅延させることで、空間合波により自己遅延干渉を起こせる見込みを得た。当初計画では、高繰り返し光パルス波を、フォトダイオード(UTC-PD)を用いて光電変換するテラヘルツ波パルスの生成法と、生成した高繰り返し光パルス波と光電変換後のテラヘルツ波パルスを自己遅延干渉により評価する方法を考案し、さらに原理確認として、50GHz間隔の複数の光波を重ね合わせて高繰り返し光パルス波を生成し、本測定法を用いてその光パルス幅を評価する予定であった。実際に計画通り、生成したパルスは50GHzで繰り返し、シミュレーションで得られたパルス幅の理論値と測定値はほぼ一致しており、本測定法を用いた光パルス幅測定が有効であることを確認した。

その測定系はフォトミキサを介して光ファイバと電波空間を接続した経路から成るマッハツェンダ干渉計という新たな構成である。さらにこの実験系を用いて100GHz, 200GHz, 300GHzの高繰り返しパルス波の波形測定に成功した。これらの成果を国際会議に5件、国内学会に6件発表した。そのうちの国内研究会において2回優秀発表賞を受賞した。H30年度の計画として掲げていた、高繰り返し光パルスからのフォトミキシングによる100GHz高繰り返しパルス波生成、およびそのパルス波形測定をするために、パルス波を二分岐し、一方を光の段階で遅延させておいて自己遅延干渉により波形を測定するという準光学的手法を基盤技術として確立し、標準的手段として利用できる体制を構築している。この方法のキー技術となるパルス波の分岐と干渉は、研究代表者らが開発したUTC-PDアレイによる空間合波技術を用いた。複数のUTC-PDアレイから空間にパルス状の電磁波を放射しこれらを空間合波する系に光遅延器を追加して自己遅延干渉計を構成したものである。この実験系を用いて実際に分解能0.1psで繰り返し周期300GHzのパルス波を波形測定が可能な段階に達しており、H31年度の最終目標に向けた準備が整えられた。H29年度に生成に成功した50GHzの高繰り返し光パルスを高速フォトダイードで電流信号に変換し、光路をに分岐した後、二つのアンテナからテラヘルツ波パルス列として放射し、テラヘルツパルス列のパルス幅を自己遅延干渉法により測定する。さらに繰り返し周波数を300GHz, 600GHzへ増大し、同様の実験を行う。計画は順調に進んでいるが、今後は最大の課題である一つ一つのパルスに変調をかける研究に取り組む。変調をかける方策として当初計画にあげていた、パルス列に直接変調をかける方法に加えて、バックアップとして別の変調方法を並行して進める。この方法は目的とする繰り返し周波数よりも低い周波数のパルス列を生成し、そこに変調をかけた後にパルス列どうしの間に遅延時間の差を付けて合波する、いわゆる時間多重である。この方法を用いて最終年度は高繰り返しパルス列に確実に変調がかけられることを実演する。
品質管理機構の担い手としての小胞体内シャペロンの解析

近年、新規に合成されたタンパク質が異常分子のため本来の高次構造が形成されなかったり、サブユニット会合型タンパク質で余剰の生成サブユニットが蓄積された場合は、分泌経路から除外され速やかに分解されることが明らかになった。これは「小胞体の品質管理機構」と呼ばれ、カルネキシン(CNX)・カルレティキュリン(CRT)など小胞体内シャペロンが異常分子認識を行うと考えられている。我々は、遺伝的異常アンチトロンビンやチログロブリン、抗血栓薬であるワルファリン投与下でのビタミンK依存性凝固因子などの分泌タンパク質が本機構によりプロテアソーム分解されることを見いだした。さらに、この分解は、CNX・CRTと糖タンパクとの相互作用を阻止するグルコシダーゼ阻害剤(カスタノスペルミン)下でも起こるが、小胞体マンノシダーゼ1剤の阻害剤(キフネンシンやデオキシマンノジリマイシン)では阻止されることを見いだした。特に、異常チログロブリンはキフネンシン添加により完全に分解阻止され、小胞体内に蓄積した。連続免疫沈降法によりCNX・CRTとプロテインCの相互作用時間を調べたところ、新生プトテインCは約1時間でCNX・CRTから解離した。しかし、小胞体マンノシダーゼ1阻害剤の効果は、CNX・CRT解離後においても見られた。以上の結果は、CNX・CRT非依存性で、糖鎖中のマンノースに依存する新規の異常タンパク認識機構が存在することを示唆している。
細胞壁構築と形態形成

本研究では、シロイヌナズナを用いて細胞壁構築過程の研究を行い、以下の点を明らかにした。(1)EXGTのホモログcDNAを5種類クローニングし、塩基配列を解読した。アミノ酸水準の相同性は50-80%と互いに大きく異なるが、基本構造がよく似ていることから、これらはキシログルカンの転移酵素もしくは加水分解酵素であると考えられる。また、器官毎の発現を調べたところ、発現様式は互いに大きく異なることが明らかとなった。以上から、細胞壁のキシログルカン代謝は複数の酵素により精妙に制御されていると考えられる。(2)EXGT-A1の遺伝子発現及び整理機能の解析のために形質転換シロイヌナズナを作成した。現在、T1世代を生育中である。また、これに先立ち行った実験によりEXGT-A1の5'上流0.4kbの領域にはプロモーターとしての基本的な情報が、上流0.4kb1.0kbの間には強いプロモーター活性のためのエンハンサーが存在することが明らかになった。
ビタミンK合成機構の統一的理解を目指したビタミンK側鎖切断酵素の解明

ヒトやマウスの生体内では、摂取したPKは小腸で側鎖が切断され側鎖を持たないMDとなり、各組織中でUBIAD1によってMK-4へ変換される。これまでにビタミンK側鎖切断機構は全く明らかでない。そこで、ビタミンKの変換基質とならない2',3'-PKH2の生体内代謝機構の解明を行った。その結果、ビタミンK側鎖切断酵素はPKの側鎖に存在する2位と3位の2重結合を選択的に認識し、切断することが分かった。今後、ビタミンK側鎖切断酵素を同定することが出来れば、摂取したビタミンKがどのようなメカニズムで代謝吸収され、生理機能を発揮しているかが明らかになる。ヒトが主に食事から摂取するビタミンKはphylloquinone(PK)であるが、組織中に存在するビタミンKの大部分はmenaquinone-4(MK-4)である。これまでに我々は、PKを摂取後、小腸で側鎖が切断され側鎖を持たないmenadione(MD)となり、各組織中でUbiA prenyltransferase domain containing protein 1(UBIAD1)によってMK-4へ合成されることを科学的に証明した。しかし、PKからMDへの側鎖切断反応は全く明らかでない。そこで、本研究では食事から摂取したビタミンKがMK-4へ合成されるビタミンKの生体内代謝機構を統一的に理解するため、in vitroやin vivo解析を行いビタミンK側鎖切断酵素の同定を目指している。本年度は、側鎖切断反応を受けないビタミンK誘導体の探索を行った。ビタミンK誘導体の合成は芝浦工業大学の須原教授に合成していただき、in vitroおよびin vivoの実験系を用いて評価を行った。新たに合成したビタミンK誘導体の中で、PKの2位と3位の側鎖が飽和したビタミンK誘導体では、PKと同様にGGCX活性を示しSXRとは反応しなかった。この誘導体を培養細胞に添加した結果、MK-4への変換反応は認められず、マウスに投与した結果組織中のMK-4濃度の上昇は認められなかった。さらに、腸からの吸収経路である門脈およびリンパ管をカニュレーションしたラットでは、PKを投与した際にリンパ液中にMDが確認されたが、ビタミンK誘導体ではMDが全く検出されなかった。以上のことから、合成したビタミンK誘導体は側鎖切断を受けないビタミンK誘導体であることが分かった。またビタミンK側鎖切断反応様式では、2位と3位の側鎖部位が不飽和化していることが重要だということがわかった。次年度は、側鎖切断酵素の探索に注力する。本年度中に、側鎖切断反応を受けないビタミンK誘導体を同定することに成功した。小腸の初代培養系の樹立に時間がかかっているが、同時にオミクスの手法を用いて、側鎖切断酵素の遺伝子およびタンパク質の網羅的解析を行う目処がついたため。また、関連する内容で論文を発表したため。本年度は、ビタミンK側鎖切断酵素の解明を目指し、マウスから小腸上皮細胞の単離を試みた。難航し多くの時間を要してしまったが、腸内細菌や粘液成分の混入を除いた小腸上皮細胞を採取に成功した。得られた小腸上皮細胞を用いてトランスクリプトーム解析やプロテオーム解析を行った。その結果、複数の候補タンパク質が得られた。また、同時にin silico解析から複数の酵素が見い出さたれた。これらの酵素を培養細胞に強制発現させたが、PKからMDへの側鎖切断反応は認められなかった。現在、オミクス解析より見い出された複数の酵素を、今後ゲノム編集法を用いて発現させ、最終的に側鎖切断酵素を同定する。オミクスの手法を用いて、側鎖切断酵素の遺伝子およびタンパク質の網羅的解析を行い側鎖切断酵素の同定を試みる。また、本年度明らかになったビタミンK側鎖切断反応様式から、類似の反応を行う酵素が見い出されているので、予想される酵素に関して遺伝子改変を行うことで、酵素の同定を目指す。いずれの方法から見い出された酵素に関して、ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムを用いて目的酵素をノックアウトしたマウスを作出し、ビタミンK合成を評価することによって最終的に側鎖切断酵素を同定できると考える。