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アジア太平洋における国際連盟―新たな国際連盟史研究の構築と発信

4月にこのプロジェクトの海外協力者であるLondon School of EconomicsのProf. Christopher Hughesを交えての研究会を行い、各自の研究テーマを確認するともに、このプロジェクトの全体の方向性を議論した。具体的には、歴史研究であるものの、国際連盟が現在のグローバルガバナンスにつながることを各研究者が意識し、そのうえで、研究を進めていくことが確認された。日本国際政治学会の学会誌『国際政治』193号「歴史のなかの平和的国際機構」特集号(2018年9月発行)において、研究代表者が編集責任者となり、研究分担者2名が寄稿した。研究代表者は序論において国際機構を歴史的に研究することの意義を論じ、2名の研究分担者は、それぞれ国際連盟の文化的活動および国際連盟の保健衛生活動について論文を記した。11月の日本国際政治学会の年次研究大会においてパネルを持ち、当科研費プロジェクトの全員がそれぞれ報告者、討論者、司会者となり、研究成果を発表し、また議論をおこなった。このパネルは「アジアからみた国際連盟ー設立100周年に向けた国際連盟史の再検討」と題され、国際連盟について欧米の研究者を中心に再検討が進みつつあるが、このパネルでは、連盟の活動の場であり連盟メンバーでもあった「アジア」に軸足を据えて連盟を再考した。「国際連盟保健機関(LNHO)極東支部の活動と遺産」、「国際連盟における国際法典編纂事業と日本」、「国際連盟の知的協力事業と日本・中国」というペーパーが発表された。討論者からは、「西欧・非西欧」、「技術協力の非政治性?」といった興味深い論点が提起され、またフロアからもアジアに重点をおいて連盟を考察することの意義が問いかけられるなど、充実したセッションであった。「研究実績の概要」で述べたように、2018年度は、海外からの研究協力者との議論、学会誌の編集および投稿、また学会での独立したパネルを設け発表するなど、各自メンバーがそれぞれ研究に励むとともに、その発表の機会が設けられ、本研究課題はおおむね順調に進んでいると思われる。2019度は、本研究課題を国際的に発信するための国際的ワークショップ開催を1月に計画している。そのために次のような方策が必要である。1.各メンバーが昨年度までに進めてきたペーパー等を英語に翻訳する。2.研究プロジェクトメンバー以外にも海外からの研究を招請するために、研究計画の方向性や全体を統括するテーマとの整合性をより明確に定める。3.2020年1月のワークショップメンバーを決定したので、その招請へ向けて、日程の調整、またロジスティックでの手配を進める。4.国際的ワークショップでの成果を英文編著にまとめて出版するため、出版社へbook proposalを提出し、出版助成の可能性を探る。本研究は、国際連盟設立100年に向けた共同研究である。国際連盟は長らく「失敗例」として扱われてきた。しかし、近年、連盟の専門機関の活動に着目し、第二次世界大戦後の国際連合体制の基礎を作り上げた点について、再評価の動きが高まっている。日本においても、アジアにおける国際連盟の展開という独自の視点から着実に研究が積み重ねられてきた。平成29年度には数回の研究会を持った。具体的な内容は以下の通りである。ヨーロッパの学会に出席した研究分担者から、ヨーロッパにおける国際連盟研究の現状を報告してもらい、国際連盟のアジアにおける活動については、まだまだ、研究蓄積の少ないことを学んだ。またヨーロッパにおいて、国際連盟のどのような側面が研究されているかについて情報の共有をした。さらに、共同研究の成果としての出版について、各自がどのような内容について研究を進めていくかを報告し議論した。具体的には、「インドにおける国際連盟情報局」、「国際連盟の対中国技術支援」、「日中と知的国際交流委員会」、「安達峰一郎と国際連盟」、「国際連盟における国際法典化事業と日本」、「アジアにおける伝染病対策事業」、「満州における領域管理問題」などの各自の研究テーマが決まり、これらのテーマについて、要約を提出し、議論を重ねた。また、研究分担者のうち2名が、学会誌の特集号に、国際連盟に関連するテーマで投稿し、査読を経たうえで、掲載が決定された。各自の研究テーマも決まり、それぞれが自己のテーマで研究を深め、積極的に学会誌などに投稿し、発表した。

「国際連盟保健機関(LNHO)極東支部の活動と遺産」、「国際連盟における国際法典編纂事業と日本」、「国際連盟の知的協力事業と日本・中国」というペーパーが発表された。討論者からは、「西欧・非西欧」、「技術協力の非政治性?」といった興味深い論点が提起され、またフロアからもアジアに重点をおいて連盟を考察することの意義が問いかけられるなど、充実したセッションであった。「研究実績の概要」で述べたように、2018年度は、海外からの研究協力者との議論、学会誌の編集および投稿、また学会での独立したパネルを設け発表するなど、各自メンバーがそれぞれ研究に励むとともに、その発表の機会が設けられ、本研究課題はおおむね順調に進んでいると思われる。1.各自テーマについて研究を進めていく。2.海外研究者との連携を深め、研究成果としての英語出版に向け、連絡と議論を強化する。実際に、平成30年度にはイギリスの研究者との研究会を予定している。英語論文集についても、出版社の選定を進め、ブック・プロポーザルを作成する。3.平成30年度秋に開催される日本国際政治学会で、独自のパネルを組織し、研究内容を発表する。2019度は、本研究課題を国際的に発信するための国際的ワークショップ開催を1月に計画している。そのために次のような方策が必要である。1.各メンバーが昨年度までに進めてきたペーパー等を英語に翻訳する。2.研究プロジェクトメンバー以外にも海外からの研究を招請するために、研究計画の方向性や全体を統括するテーマとの整合性をより明確に定める。3.2020年1月のワークショップメンバーを決定したので、その招請へ向けて、日程の調整、またロジスティックでの手配を進める。4.国際的ワークショップでの成果を英文編著にまとめて出版するため、出版社へbook proposalを提出し、出版助成の可能性を探る。
ACLYトランスジェニックマウスにおける腸内細菌叢変化および発がん機序の研究

ACLYトランスジェニックマウスを長期観察すると自発腫瘍が多発する。24-30月齢のオス24匹を剖検すると14匹(58%)に血液系腫瘍(リンパ腫・白血病)、7匹(29%)に肺がん、各1匹(4%)に小腸がんと血管系腫瘍が認められた(重複がんは別個に計算。以下同)。特に血液系腫瘍の頻度が高い。これは背景として血液系腫瘍に感受性が高いC57BL/B6マウスを背景に用いたことによる可能性がある。そのため、肝がんや軟部肉腫に対する感受性が高く、血液系腫瘍の発生頻度が低いC3Hマウスにバッククロスを行って自発腫瘍の発生を観察した。オス35匹、メス32匹計67匹を無処置で15-24月観察すると、オスでは肝がんが12匹(34%)、リンパ腫が6匹(17%)、小腸がんが2匹(6%)、胃がんが1匹(3%)に認められた。メスではリンパ腫が6匹(19%)、肝がんが5匹(16%)、小腸がんが1匹(3%)に発生した。予想とは異なり、リンパ腫があわせて18%(12/67)の高頻度で発生した。これは肝がん(25%, 17/67)より低頻度であったが、軟部肉腫(発生無し)よりも高頻度だった。ACLYが系統差によらず血液系腫瘍の発生に関与することがわかった。一方、肺がんの発生は全く認められず、肺がんの発生に関してはC57BL/B6マウスに特有であることがわかった。さらにC3Hマウスにおける性差を見てみると、肝がんでは有意差はなかったが(p=0.18, Fishertest)オスに多く発生したのに比べ、リンパ腫では性差を認めなかった。肝がんがオスに好発することはよく知られた事実であるが、リンパ腫は性差においても肝がんと異なったメカニズムが示唆された。腸内細菌叢は系統によって異なることがわかっている。C3HとC57BL/B6に認められた発生腫瘍の差が腸内細菌叢とどのような関連があるか検討を続ける。研究者の移動に伴い、トランスジェニックマウスの移動を行っているが、トランスジェニックマウスの埼玉県立がんセンターへの搬入が、マウスのクリーンアップの遅れにより遅延し、埼玉県立がんセンターでの実験が開始できず、移動前の所属である(公財)がん研究会がん研究所で実験を行っているため。腸内細菌叢と発がんの関連を研究するうえで、コントロールマウスを慎重に選択する必要がある。これは、1.子供が母親の腸内細菌叢を受け継ぐこと、2.同じ飼育室で飼育する他のマウスの腸内細菌叢が別の個体の腸内細菌叢に影響を与えること、による。今回、研究者が施設を移動したために、研究の進捗に遅れが生じたが、逆に施設が変わったことにより、現在までACLYトランスジェニックマウスの飼育を行っていなかった飼育室で実験を再開することができるという利点を得た。ACLYトランスジェニックマウスの便に汚染されていない新たな環境で、ACLYトランスジェニックマウスの腸内細菌叢が生後いつから変化を生じるのか、いわゆる"悪玉"腸内細菌はACLYトランスジェニックマウスからコントロールマウスに移るのか、その際に母子関係の影響が出るのかを検討する。トランスジェニックマウスはホモでも生殖能等に全く異常が見いだされず、現在はホモで飼育を行っているが、ヘテロ(F1)マウスにもどして交配した時に、母親がトランスジェニクマウスであるかないかによって腸内細菌叢や腫瘍発生に差が出るか家系図を作成して検討する。また、これら変化が抗生剤投与により抑制されるか、あるいは、離乳後に飼育室を移動することにより防ぐことができるか検討する。別途購入し飼育したC57BL/B6およびC3HマウスについてACLYトランスジェニックマウスと飼育室を変えて飼育した場合と同じ飼育室で飼育した場合に腸内細菌叢や腫瘍発生にどのような変化が出るか検討する。さらに、C3HマウスとC57BL/B6マウスで腫瘍発生に特徴が認められたことから、これらマウスに共通する"悪玉"腸内細菌があるのか、あるいは両者では"悪玉"腸内細菌は異なっているのか検討する。以下同)。

予想とは異なり、リンパ腫があわせて18%(12/67)の高頻度で発生した。これは肝がん(25%, 17/67)より低頻度であったが、軟部肉腫(発生無し)よりも高頻度だった。ACLYが系統差によらず血液系腫瘍の発生に関与することがわかった。一方、肺がんの発生は全く認められず、肺がんの発生に関してはC57BL/B6マウスに特有であることがわかった。さらにC3Hマウスにおける性差を見てみると、肝がんでは有意差はなかったが(p=0.18, Fishertest)オスに多く発生したのに比べ、リンパ腫では性差を認めなかった。肝がんがオスに好発することはよく知られた事実であるが、リンパ腫は性差においても肝がんと異なったメカニズムが示唆された。腸内細菌叢は系統によって異なることがわかっている。C3HとC57BL/B6に認められた発生腫瘍の差が腸内細菌叢とどのような関連があるか検討を続ける。研究者の移動に伴い、トランスジェニックマウスの移動を行っているが、トランスジェニックマウスの埼玉県立がんセンターへの搬入が、マウスのクリーンアップの遅れにより遅延し、埼玉県立がんセンターでの実験が開始できず、移動前の所属である(公財)がん研究会がん研究所で実験を行っているため。腸内細菌叢と発がんの関連を研究するうえで、コントロールマウスを慎重に選択する必要がある。これは、1.子供が母親の腸内細菌叢を受け継ぐこと、2.同じ飼育室で飼育する他のマウスの腸内細菌叢が別の個体の腸内細菌叢に影響を与えること、による。今回、研究者が施設を移動したために、研究の進捗に遅れが生じたが、逆に施設が変わったことにより、現在までACLYトランスジェニックマウスの飼育を行っていなかった飼育室で実験を再開することができるという利点を得た。ACLYトランスジェニックマウスの便に汚染されていない新たな環境で、ACLYトランスジェニックマウスの腸内細菌叢が生後いつから変化を生じるのか、いわゆる"悪玉"腸内細菌はACLYトランスジェニックマウスからコントロールマウスに移るのか、その際に母子関係の影響が出るのかを検討する。トランスジェニックマウスはホモでも生殖能等に全く異常が見いだされず、現在はホモで飼育を行っているが、ヘテロ(F1)マウスにもどして交配した時に、母親がトランスジェニクマウスであるかないかによって腸内細菌叢や腫瘍発生に差が出るか家系図を作成して検討する。また、これら変化が抗生剤投与により抑制されるか、あるいは、離乳後に飼育室を移動することにより防ぐことができるか検討する。別途購入し飼育したC57BL/B6およびC3HマウスについてACLYトランスジェニックマウスと飼育室を変えて飼育した場合と同じ飼育室で飼育した場合に腸内細菌叢や腫瘍発生にどのような変化が出るか検討する。さらに、C3HマウスとC57BL/B6マウスで腫瘍発生に特徴が認められたことから、これらマウスに共通する"悪玉"腸内細菌があるのか、あるいは両者では"悪玉"腸内細菌は異なっているのか検討する。動物搬入が遅れたために解析費用等が翌年度に移行したため。
大腸腫瘍におけるGPR120経路の役割の解明とEPAによる化学予防の確立

増加する大腸癌の予防に向けて、疫学研究で大腸癌の予防効果が報告されているω3多価不飽和脂肪酸のひとつEPAとその受容体と考えられているGPR120に注目し、その予防効果の機序解明をGPR120欠損マウスを用いて行った。野生株マウスではEPA投与により大腸腫瘍が抑制されたが、GPR120欠損マウスではEPA投与による腫瘍抑制効果は認めず、その機序はGPR120を介したMAPK経路の抑制であることを示した。またヒトを対象として直腸ACFを主要評価項目としたRCTを施行し、EPAはヒトACFを抑制することを示した。本研究によりEPAを用いた大腸腫瘍化学予防の可能性が示された。1.大腸前癌病変(ACF)及び大腸腫瘍におけるGPR120経路の役割の解明とEPA効果の検討我々は、野生株マウスにアゾキシメタンを投与し、大腸前癌病変を誘導し、EPAを投与することでACFが減少すること、特に高脂肪食摂取において活性化しているJNKをEPAは抑制することで抗腫瘍効果を示すことを既に確認している。今回はGPR120欠損マウスを用いて同様の実験を行ったところ、EPAを投与してもGPR120ノックアウトマウスではACFおよび大腸腫瘍の減少が認められなかった。野生型マウスではEPA投与によりJNKなどのMAPキナーゼ経路の抑制が認められたが、GPR120ノックアウトマウスではMAPK経路の抑制が認められず、GPR120を介した経路が役割を果たしていることが免疫組織学的手法および生化学的手法を用いて明らかにされた。2-2 EPAを用いたヒト散発腫瘍への化学予防の確立大腸癌をエンドポイントとした臨床研究は長期間の観察期間と多くの研究対象者を必要とするといった問題がある。今回、私たちは大腸癌の代替指標であるACFを対象とした臨床研究を実施した。ACFは、大腸腫瘍リスクと相関し、定量性に優れ、比較的短期間に変化する有用なバイオマーカーである。今回は長期試験の前段階としてACFを対象とした臨床研究を実施した。対象は切除予定の大腸ポリープを有する30名を対象とし、無作為割り付けを行い内視鏡切除までの間にEPA2.7g/day内服もしくはプラセボの内服を行った。1か月の内服後に内視鏡切除時にACFの測定を行った。現在結果を解析中である。動物実験の解析は順調に進んでいる。臨床試験でも症例の組み入れは順調に進んでいる。脂質異常症、閉塞性動脈硬化症において既に実地臨床で使用されているエイコサペンタエン酸(EPA)は、近年家族性腺腫症患者の大腸腺腫を減少・縮小させたという報告やマウス大腸腫瘍モデルにおいても腫瘍を抑制したという報告があり、大腸腫瘍の化学予防薬としての可能性を有している考えられている。EPAの化学予防作用機序としては、既に存在する大腸腫瘍に対してはCOX-2の抑制作用が主経路と考えられているが、正常大腸上皮でのCOX-2の発現は低く、腫瘍の発生予防機序としては別の経路が関与している可能性が高い。近年EPAを含むω3系不飽和脂肪酸の受容体としてG蛋白共役受容体120(GPR120)が発見され注目されている。我々はこのEPA/GPR120経路に注目し、EPAの大腸腫瘍化学予防効果をGPR120欠損マウスを用いて明らかにする基礎研究/臨床研究を計画した。我々は、野生株マウス/GPR120欠損マウスにアゾキシメタンを投与し、大腸前癌病変/大腸腫瘍をそれぞれ誘導し、EPAを投与することでACFが減少すること、さらに大腸腫瘍が減少することを確認したが、これらはGPR120欠損マウスにおいては腫瘍抑制作用は認められなかった。これにより、EPAはGPR120を介して抗腫瘍作用を発揮していることが示された。さらに臨床研究においては、大腸癌のサロゲートマーカーである直腸のACFをエンドポイントとしたRCTを実施し、EPA内服によりACFが有意に減少することがしめされた。EPAなどは循環器領域で既に心疾患の予防として多く使用されているが、本研究によりさらに大腸腫瘍まで抑制できる可能性が示された。H28年度はH27年度の成果をもとのに基礎研究では前がん病変のACFに加えて、大腸腫瘍の発生/進展におけるGPR120の役割の解析を行う。臨床研究においては、組み入れは終了しているので結果の解析を進めていく大腸癌化学予防
脳梗塞後の骨髄由来血管血球系幹細胞の単離と前臨床試験

脳梗塞後遺症の再生治療法を確立するため、本年度では、1.マウスHemangioblast-like cell (HLC)の特性の解析と、本細胞の増殖法やペリサイトや内皮細胞など血管細胞への特異的分化誘導法の確立、2.ヒトHLCの同定・抽出、3.脳卒中の細胞移植治療の前臨床試験を行う目的で、マウスHemangioblast-like cellの脳梗塞マウスへの投与を行った。その結果、HLCはCD45hi/CD44+分画(HLC:CD45hi)と、CD45lo/CD44-分画(HLC:CD45lo)、そして接着細胞であるHLC:DISHに分類され、HLC:CD45loは、in vitroおよび移植皮下組織においても血管内皮細胞と血管周皮細胞に分化することが示唆された。特に皮下組織においては管腔構造を呈する血管様のネットワークを構築しており、生体組織において血管新生に関与することが強く示唆された。一方、移植されたHLC:DISHの一部はCD31陽性、PDGFRbeta陽性を示す細胞も存在したが、多くは繊維芽細胞様の形態を示していた。ヒト-HLCに関しては、脳梗塞患者骨髄の入手に手間取っているため、ヒト臍帯血からの抽出同定を試みる予定である。中大脳動脈を閉塞した脳梗塞(MCO)マウスに、HLC:CD45lo (MCAO-HLC群)およびVehicle (PBS) (MCAO-Vehi群)を脳梗塞作製後7日目に静脈内投与し、行動テスト(オープンフィールド、高架式十字迷路、ワイアハングテスト、ホットプレートテスト、Y字型迷路、水迷路学習、受動的回避学習、強制水泳テスト、尾懸垂テスト、オープンスペース水泳テスト)を施行した。その結果、HLC:CD45loに脳梗塞後神経障害の改善効果があることが明らかとなった。研究計画では、1)マウスHLCの特性(遺伝子プロファイルや分化能)解析と、本細胞の増殖法やペリサイトや内皮細胞など血管細胞への特異的分化誘導法の確立、2)ヒトHLC (h-HLC)の同定・抽出、3)脳梗塞マウスを用いたHLC移植治療の前臨床試験、が目標であるが、2)に関しては脳梗塞患者骨髄の入手に手間取り、年度内の試験施行は難しい状況にある。ヒト組織からのHLCの抽出同定が完了すれば目的はほぼ達成できると思われる。HLCのうち、機能的にはHLC:CD45loがtube formation/血管新生に関与する可能性が高いことが示唆された。遺伝子解析で、その基本性格は『活性化された細胞』であり、Hematopoietic potentialを持った造血幹細胞と、間葉系・内皮細胞系のCommon precursorであるMesenchymoangioblastの特性を併せ持つことがわかった。HLC:CD45loの薬効試験では、脳梗塞後の運動機能改善や不安軽減効果が認められた。しかし、HLC:CD45loの出現は一過性であり、これを選択的に誘導増殖することが必要という課題が生じてきている。その対策として、HLC:DISHやHLC:CD45loに発現している遺伝子・蛋白をBM培養時に添加することを考えている。当初の目標であるヒト組織からのHLCの抽出同定は脳梗塞患者骨髄の入手に手間取ったため、年度内の試験施行は難しい状況にあるが、入手できれば達成できると思われる。

研究計画では、1)マウスHLCの特性(遺伝子プロファイルや分化能)解析と、本細胞の増殖法やペリサイトや内皮細胞など血管細胞への特異的分化誘導法の確立、2)ヒトHLC (h-HLC)の同定・抽出、3)脳梗塞マウスを用いたHLC移植治療の前臨床試験、が目標であるが、2)に関しては脳梗塞患者骨髄の入手に手間取り、年度内の試験施行は難しい状況にある。ヒト組織からのHLCの抽出同定が完了すれば目的はほぼ達成できると思われる。HLCのうち、機能的にはHLC:CD45loがtube formation/血管新生に関与する可能性が高いことが示唆された。遺伝子解析で、その基本性格は『活性化された細胞』であり、Hematopoietic potentialを持った造血幹細胞と、間葉系・内皮細胞系のCommon precursorであるMesenchymoangioblastの特性を併せ持つことがわかった。HLC:CD45loの薬効試験では、脳梗塞後の運動機能改善や不安軽減効果が認められた。しかし、HLC:CD45loの出現は一過性であり、これを選択的に誘導増殖することが必要という課題が生じてきている。その対策として、HLC:DISHやHLC:CD45loに発現している遺伝子・蛋白をBM培養時に添加することを考えている。当初の目標であるヒト組織からのHLCの抽出同定は脳梗塞患者骨髄の入手に手間取ったため、年度内の試験施行は難しい状況にあるが、入手できれば達成できると思われる。次年度の前臨床試験で、費用がかかるため。
焼却灰循環利用型バイオ燃料生産技術の開発

本研究では、焼却設備から排出される焼却灰を原料に用いて、微細藻類及び水素発酵菌で油分(脂質)と水素を生産するバイオ燃料生産技術の開発を目的として、平成28年度から平成30年度の3年間で研究を行った。平成28年度は、鶏糞焼却灰を原料に用いて、微細藻類のクロレラ(Chlorella vulgaris)を培養するための焼却灰培地の調製法について検討した。塩酸水溶液に溶解する焼却灰の添加量を調整すると、生育に必要な鉄及び各種元素を含有する焼却灰溶解液が得られ、焼却灰溶解液に窒素源として硝酸カリウムを添加して調製した焼却灰培地はクロレラの培養に適することを明らかにした。平成29年度は、クロレラの生育と脂質生産において、焼却灰培地に添加する窒素源及び有機性炭素源の種類と濃度の影響について検討した。焼却灰培地にグルコースを添加すると生育速度及び脂質生産速度が大幅に増大し、グルコースと硝酸カリウムの添加濃度の影響を調べて、クロレラの脂質生産に最適な焼却灰培地の組成を明らかにした。最終年度は、脂質生産に最適な焼却灰培地でクロレラを培養し、脂質を抽出した後の藻体残渣を培地成分に用いて、水素発酵菌(Clostridium beijerinckii)で水素を生産する方法について検討した。脂質抽出後の藻体残渣は水素発酵の培地成分として利用でき、藻体残渣を添加する培地での水素生産に及ぼす他の培地成分、培地pH及び培養温度等の影響を調べて、水素生産に最適な培地条件及び発酵条件を明らかにした。本研究課題の実施により、有効利用が求められている焼却灰をクロレラの脂質生産のための培地原料に用い、さらに脂質抽出後のクロレラの藻体残渣を水素発酵菌の水素生産のための培地成分に活用し、焼却灰を循環利用して油分と水素のバイオ燃料を生産する方法を開発した。本研究では、焼却設備から排出される廃棄物の焼却灰を有効利用するために、焼却灰を原料とする微細藻類培養用の新規な培地を開発し、焼却灰培地で微細藻類のChlorella vulgarisを培養して藻体から油分(脂質)を抽出・生産するとともに、脂質を抽出した藻体残渣を原料に用いて水素発酵により水素をさらに生産する新しいバイオ燃料生産技術の開発を目的として研究開発を行う。これまでの研究において、焼却灰を鉱酸の混合酸で溶解して得られる溶解液に鉄塩を添加するとC. vulgarisの培地として利用できることを見出している。しかし、焼却灰には元々鉄分が酸化物として存在することから、焼却灰の有効活用を図るために、平成28年度は鉄塩の添加が不要な「鉄塩無添加焼却灰培地」の開発を目的に研究を行った。まず、鉄分を含有する焼却灰溶解液を得るための溶解条件を検討した結果、50mLの0.1mol/L塩酸に0.2gの鶏糞焼却灰を添加して溶解すると焼却灰溶解液中に鉄が含まれ、さらに微細藻類の生育に必要なリンやその他の元素も含まれていることが分かった。次に、この焼却灰溶解液を蒸留水で10倍に希釈後、微細藻類の培養に用いられるMBM培地に窒素源として添加されている硝酸カリウムを同じ濃度となるように添加して「鉄塩無添加焼却灰培地」を調製し、光照射下で5%の二酸化炭素を含有する空気を通気しながらC. vulgarisを培養すると、MBM培地と同様の生育経過及び生育度が得られた。従って、新規に調製した「鉄塩無添加焼却灰培地」は、C. vulgarisの培地として利用できることが明らかとなった。3年間の研究において、初年度の研究目的は、これまでに開発してきた焼却灰培地の調製法を改良して、鉄塩を別途に添加する必要のない新規な「鉄塩無添加焼却灰培地」の調製法を明らかにすることである。本年度の研究において、まず鉄を含有する焼却灰溶解液を得るための焼却灰の溶解条件を明らかにし、さらに焼却灰溶解液に窒素源を添加して調製した「鉄塩無添加焼却灰培地」を用いてC. vulgarisを培養すると、微細藻類培養用のMBM培地と同等の生育特性を得られることが分かった。以上のように、C. vulgarisの培養に利用できる「鉄塩無添加焼却灰培地」を開発できたことから、現在までの研究の進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断される。本研究は、焼却設備から排出される焼却灰を原料に用いて、微細藻類のChlorella vulgarisを培養できる新規な培地を開発し、焼却灰培地で培養した藻体から油分(脂質)を抽出・生産するとともに、脂質を抽出した藻体を培地原料に用いて水素発酵により水素も生産する新しいバイオ燃料生産技術の開発を目的としている。二年目の平成29年度は、初年度に開発した「鉄塩無添加焼却灰培地」をもとにして、C. vulgarisの培養で脂質を生産するための最適な培地条件について検討を行った。まず、光照射下で5%の二酸化炭素を含有する空気を通気しながらC. vulgarisの培養を行い、生育と脂質生産に及ぼす鉄塩無添加焼却灰培地に添加する窒素源の影響について検討した。C. vulgarisは硝酸カリウムと尿素で良好に生育するが、細胞内の脂質含有率は尿素よりも硝酸カリウムの方が高く、脂質生産には窒素源として硝酸カリウムが適すると思われた。

さらに、焼却灰培地中の硝酸カリウムの添加濃度が高いほど生育量が増加し、脂質生産量も増大することが分かった。次に、鉄塩無添加焼却灰培地に有機性炭素源を添加して光照射下でC. vulgarisの通気培養を行い、生育と脂質生産に及ぼす影響について検討した。鉄塩無添加焼却灰培地にグルコース、グリセリン及び酢酸を添加すると生育の促進効果が認められ、特にグルコースを添加した場合には生育速度及び脂質生産速度が大幅に増大することが分かった。また、鉄塩無添加焼却灰培地中の硝酸カリウムとグルコースの濃度を高くするとクロレラの生育量及び脂質生産量が増加し、1000mg/Lの硝酸カリウムと10g/Lのグルコースを添加したときに脂質の生産特性が最も良好であることが明らかとなった。二年目の研究目的は、初年度に開発した鉄塩を添加する必要のない鉄塩無添加焼却灰培地を用いて、C. vulgarisを培養して藻体と脂質を生産する上での最適な培地条件を明らかにすることである。鉄塩無添加焼却灰培地に添加する窒素源としては硝酸カリウムが適し、有機性炭素源として特にグルコースを添加すると、C. vulgarisの生育量と生育速度、並びに脂質の生産量と生産速度が増大することが分かった。さらに、脂質生産に適する硝酸カリウムとグルコースの添加濃度を明らかにした。以上のように、鉄塩無添加焼却灰培地に添加する窒素源と有機性炭素源の種類と濃度を検討して藻体及び脂質を良好に生産するための培地条件を明らかにしたことから、現在までの研究の進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断される。本研究では、焼却設備から排出される焼却灰を原料に用いて、微細藻類及び水素発酵菌で油分(脂質)と水素を生産するバイオ燃料生産技術の開発を目的として、平成28年度から平成30年度の3年間で研究を行った。平成28年度は、鶏糞焼却灰を原料に用いて、微細藻類のクロレラ(Chlorella vulgaris)を培養するための焼却灰培地の調製法について検討した。塩酸水溶液に溶解する焼却灰の添加量を調整すると、生育に必要な鉄及び各種元素を含有する焼却灰溶解液が得られ、焼却灰溶解液に窒素源として硝酸カリウムを添加して調製した焼却灰培地はクロレラの培養に適することを明らかにした。平成29年度は、クロレラの生育と脂質生産において、焼却灰培地に添加する窒素源及び有機性炭素源の種類と濃度の影響について検討した。焼却灰培地にグルコースを添加すると生育速度及び脂質生産速度が大幅に増大し、グルコースと硝酸カリウムの添加濃度の影響を調べて、クロレラの脂質生産に最適な焼却灰培地の組成を明らかにした。最終年度は、脂質生産に最適な焼却灰培地でクロレラを培養し、脂質を抽出した後の藻体残渣を培地成分に用いて、水素発酵菌(Clostridium beijerinckii)で水素を生産する方法について検討した。脂質抽出後の藻体残渣は水素発酵の培地成分として利用でき、藻体残渣を添加する培地での水素生産に及ぼす他の培地成分、培地pH及び培養温度等の影響を調べて、水素生産に最適な培地条件及び発酵条件を明らかにした。本研究課題の実施により、有効利用が求められている焼却灰をクロレラの脂質生産のための培地原料に用い、さらに脂質抽出後のクロレラの藻体残渣を水素発酵菌の水素生産のための培地成分に活用し、焼却灰を循環利用して油分と水素のバイオ燃料を生産する方法を開発した。今後の研究は、当初の研究実施計画通り、以下のように推進する予定である。
高発がん性遺伝病の原因遺伝子NBS1の機能解析

ナイミーヘン症候群(NBS)は高発がん性や電離放射線高感受性そして染色体不安定性を特徴とするヒト劣性遺伝病である。原因遺伝子NBS1がヌクレアーゼ活性もDNA結合領域も有しない修復蛋白をコードしている事を我々は既に報告した。本研究では、NBS1蛋白C末側の真核生物で保存されている領域で相同組換えに重要なMre11/Rad50ヌクレアーゼ複合体と結合していることを示した。また、我々はヒストンH2AバリアントのH2AXが放射線照射後直ちにリン酸化を受けることに注目して、細胞内でH2AXとNBS1蛋白が結合していることをin vitro実験や細胞を用いた実験で示した。特にNBS1蛋白N末側のFHA/BRCTドメインとピストンが直接結合していることを確認した。この結果、FBS1はMre11/Rad50複合体をリン酸化ヒストンを目印として放射線誘発のDNA二重鎖断部位にリクルートして相同組換えを開始するモデルが提示された。実際、NBS患者細胞およびNBS1ノックアウト動物細胞では相同組換え能が顕著に低下していることがSCneoなどのレポーター遺伝子を用いた解析から明らかになった。また、NBS1蛋白のN末およひC末側の欠失は、コヒーシンSMC1との結合ならびにS期チェックポイントに必要なSMC1リン酸化の阻害をもたらした。さらにNBS1はBRCA1やワーナー症候群の蛋白WRNとも結合して損傷部位で巨大複合体を形成する事、そしてこの複合体形成の阻害が染色体不安定性をもたらす事が判明した。今後、この複合体形成が修復Fidelityやチェックポイントとのロストークに果たす役割およびその発がんにおける意義について解析する。1)NBS1遺伝子の機能ドメイン:NBS1遺伝子のN末側は多くの生物種で保存されていることから重要機能を持ったドメインと考えられている。このため、N末側蛋白を欠損したdeletion mutant実験を行い、その核移行能力やシグナル伝達、DNA鎖切断点でのフォーカス形成能に与える効果を検討する。また、これらのドメインDNAをtwo hybridアッセイ系に組み込んで相互作用する遺伝子をスクリーニングした。2)NBS1のシグナル伝達:一方、放射線照射後のNBS1遺伝子発現誘導とその蛋白質並びにp53リン酸化能をアッセイする。放射線5Gy照射後18時間経時的にNBS細胞及び正常リンパ芽球細胞蛋白のサンプリングを行って、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離、続いてNBS1及びp53リン酸抗体(N末側認識)を用いてウェスタンブロットによりその変化をser343及びp53(ser15)リン酸化をNBS及び正常リンパ芽球細胞リン酸化能について比較検討した。3)テロメアー短縮:さらに正常線維芽細胞をネガティブコントロールそしてA-T細胞をポジティブコントロールとしてテロメアー短縮を比較する。テロメアー短縮は抽出DNAをHinflそしてRsal酵素処理後電気泳動して(CCCTAA)3オリゴヌクレオチドをプローブとしたサザンブロッティングによりテロメアー長(TRF)を測定する。またテロメアー短縮に対する放射線効果も同時に検討した。4)抗体を用いたdsb認識フォーカス形成:また、放射線照射後のNBS1フォーカス形成の局在と経時変化、並びにDNA-PKcsフォーカスとの集合離散によりdsb再結合に於ける両遺伝子の細胞内機能を推定する。放射線2Gy照射後8時間迄のNBS患者及び正常ヒト線維芽細胞を固定、DNAをDAP1、NBS1抗休をFITC,DNA-PKcsをテキサスレッド標識により染色後レーザー顕微鏡でフォーカスを検出する。また、解像度を上げるために低張処理によるDNA繊維上のNBS1蛋白及びDNA-PKcsの会集合がdsb部位で起こっていることを確認した。5)nbs1遺伝子ターゲッティング:最後にNBS1のエキソン34の2候補部位について変異をPGK-neo-polyAとHSV-tk遺伝子を用いてターゲッティングベクターに導入する。

これらのターゲッティング・ベクターDNAをエレクトロポレーション法によりES細胞に導入後、G418及びGANC選択を行う。続いて相同組換え体を確認した変異ES細胞を増殖後、C57BL/6の3.5日胚から回収したブラストシスト内に注入用ピペットを用いて移入する。さらに偽妊娠ICRマウスの子宮内に戻して、17日後に生まれて来るキメラマウスの交配によりF_1を得る。最終的にはマウス尾DNAを抽出し、PCR法によりNBS1変異マウスを同定した。1)NBS1遺伝子のN末側FHA/BRCTドメインは多くの真核生物種で保存されていることから重要機能を持っていると考えられる。このためFHA/BRCT部位を含むdeletion mutant細胞を使って外部導入X染色体のHPRT座位での放射線誘発突然変異並びに自然発生及び放射線誘発染色体異常頻度の比較測定、ならびにG1/G2細胞周期チェックポイント異常をFACSで解析した2)放射線アポトーシスはATMの下流にあるH2AXを介すると言われており、同様にATM下流のNBS1がどのようにしてアポトーシスを誘発するか不明である。このためNBS細胞に於けるヒストンH2AXリン酸化、及びp53とChk2に対するATMキナーゼ活性を検証してそのフィードバック機構を明らかにした。3)正常線維芽細胞をコントロールとしてAT及びNBS細胞の細胞分裂によるテロメア短縮の促進を比較する。Hinf1/RsaI酵素処理後電気泳動したゲノムDNAを(CCCTAA)オリゴヌクレオチドをプローブとしたサザン法によりテロメア長(TRF)を測定した。さらに、TRAP法によるNBS細胞のテロメレース活性及びテロメレース欠失細胞にみられるALT(Alternative lengthening of telomere)をNBS1フォーカス形成により検討した。4)NBS1ノックアウトマウス肺線維芽細胞を樹立後、放射線致死感受性や遺伝子突然変異頻度をscid細胞(DNA-PKcs^<-/->)やKu70^<-/->細胞と比較する。続いて、既に海外の研究室から譲渡を受けているKu^<-/->マウスやAtm^<-/->との交配により得られるダブルターゲッテイング細胞を用いて、Atm機能がDNA二重鎖切断の再結合以外にも機能するのか、あるいはNbs1がNHEJとHRのいずれの再結合経路に関与しているかを検討した。ナイミーヘン症候群(NBS)は高発がん性や電離放射線高感受性そして染色体不安定性を特徴とするヒト劣性遺伝病である。歴史的には毛細血管拡張性運動失調症のバリアントとして分類されてきた経緯がある。
難分解性細胞外マトリックスタンパク質への好熱性微生物酵素による実用的アプローチ

(1)コラーゲン分解性酵素に関する研究(Geobacillus collagenovorans MO-1株を用いて)MO-1株が生産するコラーゲン分解性酵素について触媒ドメインを中心にコラーゲン分解の作用機構の解明を行った。本酵素とコラーゲンとの結合性を調べ、C末端機能未知ドメインの中央部に集約されていることが判った。N末端触媒ドメインにはコラーゲン結合性は見られず、活性と連動していないことが判った。(2)Pz-ペプチダーゼに関する研究抗原性の異なる2つのPz-ペプチダーゼA,Bの遺伝子単離をMO-1株から完成させ、塩基配列決定、大腸菌での発現を行った。2つのペプチダーゼ間の一次配列の相同性は22%と低く、活性残基周辺は高い相同性を持つことが判ったが、基質特異性の類似性を説明するには至らなかった。(3)難分解性動物タンパク質の分解産物の生理活性についてMeiothermus属細菌H328株を用いてケラチン分解産物に対し、(1)ラット大脳皮質由来神経細胞の生存率に及ぼす影響と(II)抗酸化効果を調べた。(I)は顕著な生理活性を持たなかったが、(II)については、4-6日培養後の培養上清を用いたとき、有意な細胞死抑制効果が認められた。(4)コラーゲン分解に関わる酵素タンパク質の機能と構造解析Geobacillus collagenovorans MO-1株が生産するPz-ペプチダーゼ、Anurinibacillus属細菌AM-1株が生産するアミノペプチダーゼについて、大量発現、精製を行い、京都大学薬学研究科と共同研究としてX線結晶構造解析を行い、現在、前者酵素についての結晶化条件を決定し、位相決定のための重原子置換を行っているところであり、後者酵素に対しては、セレノメチオニン含有酵素結晶を用い、2.0Å分解能での初期モデルを構築中である。そして本酵素タンパク質がもつコラーゲン結合性を、酵素タンパク質とコラーゲンを共存させた後、コラーゲン画分に酵素タンパク質が移行することを、本酵素に特異的な抗体を用いて調べた。その結果、本酵素は確実にコラーゲンを結合する能力があることが判った。(2)Pz-ペプチターゼに関する研究(Geobacillus collagenovorans MO-1株を用いて)抗原性の異なる2つのPz-ペプチダーゼA,Bの遺伝子単離を完成させ、塩基配列決定、大腸菌での発現を行った。A酵素について、6個のCys残基をSer残基に置換したが、活性・構造に大きく影響を与えるものではないことが判り、動物由来の相同酵素thimet oligopeptidaseとは大きく異なる性質を持つことが判った。(3)エラスチン分解性酵素に関する研究(Meiothermus属細菌328株を用いて)有馬温泉土壌より分離しているエラスチンを分解する3菌株のうち、特に328株について、その酵素の同定を試みた。本菌株のもつエラスチン分解活性を指標に酵素を精製しようとしたが、複数の活性画分に分かれることから精製ができず、セリンプロテアーゼの保存残基からの情報を元に遺伝子クローニングを行った。

本遺伝子は大腸菌で発現するが、主に不溶性画分として回収されるため、確実な酵素を同定することが出来なかった。(1)コラーゲン分解性酵素のコラーゲン結合性の追究本酵素がもつ機能未知のC末端ドメイン約500アミノ酸について、実際にコラーゲンとの結合性を、グルタチオンSトランスフェラーゼと遺伝子融合した状態で調べた。その結果、コラーゲン結合性は、このドメインの中央部160アミノ酸に集約されていることが判った。N末端にある触媒ドメインにはコラーゲン結合性は見られず、活性と連動していないことが判った。(2)難分解性動物タンパク質の分解産物の生理活性についてMeiothermus属細菌H328株を用いてケラチン分解産物に対し、(I)ラット大脳皮質由来神経細胞の生存率に及ぼす影響と(II)抗酸化効果を調べた。(I)は、37°C,4日後の生細胞数を測定したところ、いずれの培養液上清を用いても要領依存的な減少が認められたが、500倍希釈を行うとその減少効果がなくなることが判り、顕著な生理活性を持たないことが判った。(II)については、4-6日培養後の培養上清を用いたとき、有意な細胞死抑制効果が認められた。しかし、ケラチン試料が諸事情により生産できないことからトリ羽毛を直接分解した溶液を用いて再度生理活性を調査しているところである。(3)コラーゲン分解に関わる酵素タンパク質の機能と構造解析Geobacillus collagenovorans MO-1株が生産するPz-ペプチダーゼ、Anurinivacillus属細菌AM-1株が生産するアミノペプチダーゼについて、大量発現、精製を行い、京都大学薬学研究科と共同研究としてX線結晶構造解析を行っている。現在、前者酵素についての結晶化条件を決定し、位相決定のための重原子置換を行っているところであり、後者酵素に対しては、セレノメチオニン含有酵素結晶を用い、2.0Å分解能での初期モデルを構築中である。
胃内容物の逆流防止機構に及ぼす静脈麻酔薬の影響

下部食道括約筋(LES)の収縮・弛緩の調節因子として、筋層間神経叢から放出されるNOが注目されている.本研究者はケタミン及びミダゾラムがNO-cGMP系の調節作用を介して、内因性NOを介するLESのNANC弛緩反応を抑制することを明らかにし、これらがNO産生過程を抑制する可能性について報告した.本研究は、これら静脈麻酔薬およびI群抗不整脈薬メキシレチンによるNANC弛緩反応の抑制機序について検討した.マグヌス法による等尺性張力変化を記録し、NANC弛緩反応はatropine、guanethidineの存在下にKClで誘発した.NOS活性は[^3H]-arginineから[^3H]-citrullineへの転換反応、筋肉中cGMP濃度はradioimmunoassay法で測定した.ケタミンによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復し、ケタミンはNO donorであるdiethylamineNONOate(DEA/NO)による弛緩反応を抑制した.ミダゾラムはNOS活性を抑制したが、ミダゾラムによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復しなかった.またsuperoxide産生薬であるpyrogallolはNANC弛緩反応を濃度依存的に抑制し、pyrogallolによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復した.DEA/NOによる弛緩反応はpyrogallolにより抑制された.メキシレチンはNANC弛緩反応、KCl刺激後の筋肉中cGMP濃度を濃度依存的に抑制した.しかしメキシレチンはDEA/NOによる弛緩反応およびNOS活性に影響しなかった.以上より、ケタミンは細胞外でのsuperoxide anionの産生、ミダゾラムはNOS活性の抑制を介してNANC弛緩反応を抑制する.メキシレチンはNO-cGMP系の調節作用を介してNANC弛緩反応を抑制することが示唆された.下部食道括約筋(lower esophageal sphincter ; LES)の収縮・弛緩の調節因子として、筋層間神経叢から放出される一酸化窒素(NO)が注目されている.われわれはウサギLESを用いた実験系で、ミダゾラム及びケタミンがNO-cGMP系の調節作用を介して内因性NOを介するNANC弛緩反応を抑制することを明らかにし、これらの静脈麻酔薬がNO産生過程を抑制する可能性について報告した.本研究では第一に、これら静脈麻酔薬によるNANC弛緩反応の抑制がNO合成酵素(N0S)阻害作用に基づくものかどうかを検討した.第二に、1群抗不整脈薬メキシレチンがNANC弛緩反応に及ぼす影響について検討した.NOS活性は、[^3H]-arginineから[^3H]-citrullineへの転換反応を利用して測定した.マグヌス法により輪状筋方向の等尺性張力変化を記録し、atropine、guanethidineの存在下にKClを投与してNANC弛緩反応を誘発した.外因性NO供与体としてdiethylamine NONOate (DEA-NONOate)を用いた.ミダゾラムは濃度依存的にNOS活性を抑制し、3×10^<-5>Mではnegativecontrollevelまで抑制した.ケタミンおよびメキシレチンはNOS活性に影響しなかった.メキシレチンはNANC弛緩反応を濃度依存的に抑制したが、DEA-NONOateによる弛緩には影響しなかった.メキシレチンのNANC弛緩反応抑制のED50値は4.4×10^<-6>Mであり、ミダゾラムによるED_<50>値と近似していた.以上の結果より、ミダゾラムによるNANC弛緩反応の抑制はNOS活性の抑制に基づくことが明らかになった.ケタミン及びメキシレチンによるNANC弛緩反応の抑制には、NOSを介さないメカニズムが考えられた.下部食道括約筋(LES)の収縮・弛緩の調節因子として、筋層間神経叢から放出されるNOが注目されている.本研究者はケタミン及びミダゾラムがNO-cGMP系の調節作用を介して、内因性NOを介するLESのNANC弛緩反応を抑制することを明らかにし、これらがNO産生過程を抑制する可能性について報告した.本研究は、これら静脈麻酔薬およびI群抗不整脈薬メキシレチンによるNANC弛緩反応の抑制機序について検討した.マグヌス法による等尺性張力変化を記録し、NANC弛緩反応はatropine、guanethidineの存在下にKClで誘発した.NOS活性は[^3H]-arginineから[^3H]-citrullineへの転換反応、筋肉中cGMP濃度はradioimmunoassay法で測定した.ケタミンによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復し、ケタミンはNO donorであるdiethylamineNONOate(DEA/NO)による弛緩反応を抑制した.ミダゾラムはNOS活性を抑制したが、ミダゾラムによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復しなかった.またsuperoxide産生薬であるpyrogallolはNANC弛緩反応を濃度依存的に抑制し、pyrogallolによるNANC弛緩反応の抑制はSODで回復した.DEA/NOによる弛緩反応はpyrogallolにより抑制された.

メキシレチンはNANC弛緩反応、KCl刺激後の筋肉中cGMP濃度を濃度依存的に抑制した.しかしメキシレチンはDEA/NOによる弛緩反応およびNOS活性に影響しなかった.以上より、ケタミンは細胞外でのsuperoxide anionの産生、ミダゾラムはNOS活性の抑制を介してNANC弛緩反応を抑制する.メキシレチンはNO-cGMP系の調節作用を介してNANC弛緩反応を抑制することが示唆された.
即時硬化性リン酸カルシウム系硬化体の小児歯内治療応用に関する実験的研究

歯科臨床で行われる断髄法の糊剤として即時硬化性で理工学的にも優れ、生体親和性を持つ材料があれば、既存の材料より好ましい断髄糊剤になると考えられる。そこで、即時硬化性リン酸ニカルシウム・二水塩(DCPD)系硬化体を基本とし、これに理工学的性質を賦与する目的で他のリン酸カルシウム硬化体を加えた複合硬化体を作成し、生体親和性、化学安定性、硬組織形成誘導能などについて検索した。初年度研究で磁性体化した水酸化アパタイトが複合硬化体に利用できるかを確認するためラットに移植した。その結果、骨誘導能は極性によって異なることが示されたため積極的な活用は保留にした。次に、リン酸三カルシウム結晶の活用を検討したところ、含有率69%の場合に最も良好な理工学的性質になることが示され、同時にラット皮下移植実験で、この硬化体は生体親和性を持つと共に、生体内では水酸化アパタイト硬化体へ転化することがわかった。そこで、2年目から、この複合硬化体をラット臼歯の露髄面に置き、経時的な歯髄の組織変化を観察した。その結果、庇蓋硬組織形成の初期応答は水酸化カルシウム糊剤の方が早いものの、術後5週になると硬組織形成量は複合硬化体の方が勝り、構造もより象牙質に近いものであることが示唆された。これらの結果を受けて、実験動物数と観察時間を増やし、この硬化体の庇蓋硬組織形成能について確認したところ、形成された硬組織は水酸化カルシウムに比べ、正常な象牙質により近い構造になっており、優れた生体親和性と硬組織誘導能を持つことが確認され、臨床応用の可能性が強く示唆された。歯科臨床では水酸化カルシウム製剤が断髄糊剤として広く用いられている。この製剤は庇蓋硬組織形成に関して優れた性質を持っているが、生体親和性や科学安定性では問題がある。ところで、断髄糊剤には包帯としての役割もある。そこで、もし糊剤が即時硬化性で生体親和性と機械的強度を持つものであれば、生活断髄糊剤としての役割を果たせると考えた。我々はすでに粉液練和法による即時硬化性のリン酸二カルシウム・二水塩(DCPD)系硬化体を生成させる方法を開発している。そこで、このDCPD系硬化体を基本に、他のリン酸カルシウム硬化物との組み合わせで適切な生体材料学的性質と庇蓋硬組織誘導能を付与し、生活断髄糊剤として臨床応用可能な新しい材料の開発を目指した。この場合、DCPD系硬化体をmatrixとし、他のリン酸カルシウム系硬化体をcoreとする複合硬化体になることを基本戦略とした。今年度はまず、リン酸三カルシウムをcoreとする場合の配分比について検討した。その結果、含有率が69%の場合に崩壊率と圧縮強さの関係から最も好ましいことが明らかになった。つぎに、この配分比の複合硬化体を生体に用いた場合の生体親和性と結晶安定性、水酸化アパタイト(HA)への転化の有無についてラット皮下移植実験による検討を行った。その結果、この硬化体は十分な生体親和性と安定性を持つと共に、当初リン酸八カルシウム結晶が生成され、後に全体がHA硬化体へ転化することがわかった。これらの結果をふまえ、今回の複合硬化体の歯内治療応用の可能性をさぐる実験を開始した。まず、ラットの臼歯に生活歯髄切断法を行い、経時的に歯髄の組織変化を観察したところ、まだ予備実験の段階ではあるが、庇蓋硬組織形成の初期応答は水酸化カルシウム糊剤より遅いものの、術後5週になると形成量および、構造において今回の複合硬化体の方が優れていることを示唆する結果が得られた。この製剤は庇蓋硬組織形成に関して優れた性質を持っているが、生体親和性や化学安定性に問題がある。

そこで、もし糊剤が即時硬化性で適切な生体材料学的性質を持つものであれば、硬組織形成能に関わらず、断髄糊剤としての役割を果たせると考えた。我々はすでに粉液練和法による即時硬化性のリン酸二カルシウム・二水塩(DCPD)系硬化体の生成法を開発している。そこで、この硬化体を基本に、他のリン酸カルシウム硬化物との組み合わせで適切な生体材料学的性質を付与し、生活断髄糊剤として臨床応用可能な材料の開発を目指した。この場合、DCPD系硬化体をmatrixとし、他のリン酸カルシウム系硬化体をcoreとする複合硬化体になることを基本戦略とした。初年度はまず、リン酸三カルシウムをcoreとする場合の配分比について検討し、含有率69%の場合に最も好ましい理工学的性質になることが明らかとなった。つぎに、この配分比の複合硬化体を生体に用いた場合の生体親和性と結晶安定性ついてラット皮下移植実験による検討を行った。その結果、この硬化体は十分な生体親和性を持つと共に、生体内では全体がHA硬化体へ転化することがわかった。これらの結果をふまえ、今回の複合硬化体の歯内治療応用の可能性をさぐる実験として、ラット第一臼歯の近心隣接面に窩洞を形成して露髄させ、直接覆髄処置を行い、経時的に歯髄の組織変化を観察した。その結果、庇蓋硬組織形成の初期応答は水酸化カルシウム糊剤の方が早いものの、術後5週になると硬組織形成量は今回の複合硬化体の方が多くなり、構造もより象牙質に近いものであることが示された。これらのことから、今回の複合硬化体は水酸化カルシウムよりも歯内療法剤として優れていることが考えられた。歯科臨床では断髄糊剤として水酸化カルシウム製剤が広く用いられている。この製剤は優れた庇蓋硬組織形成能を持っているが、生体親和性や化学安定性に問題がある。ところで、断髄糊剤には包帯としての役割もあることから、もし即時硬化性で理工学的にも優れ、生体親和性を持つ材料があれば、より好ましい断髄糊剤になると考えた。そこで、すでに生成法を開発している即時硬化性リン酸二カルシウム・二水塩(DCPD)系硬化体を基本とし、これに理工学的性質を賦与する目的で他のリン酸カルシウム硬化体を加えた複合硬化体を作成し、生体親和性、化学安定性、硬組織形成誘導能などについて検索した。初年度は、まず磁性体化した水酸化アパタイトが複合硬化体に利用できるかを確認するためラットに移植した。その結果、骨誘導能は極性によって異なることが示されたため積極的な活用は保留にした。そこで次に、リン酸三カルシウム結晶の活用を検討した。まず、配分比について調べたところ、含有率69%の場合に最も良好な理工学的性質になることがわかった。そこで、この配分比の複合硬化体の生体親和性と結晶安定性をラット皮下移植実験で検討した。その結果、この硬化体は生体親和性を持つと共に、生体内では水酸化アパタイト硬化体へ転化することがわかった。2年目には、この複合硬化体をラット臼歯の露髄面に置き、経時的な歯髄の組織変化を観察した。その結果、庇蓋硬組織形成の初期応答は水酸化カルシウム糊剤の方が早いものの、術後5週になると硬組織形成量は複合硬化体の方が勝り、構造もより象牙質に近いものであることが示唆された。