hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス歯根形成端周囲組織への直接的遺伝子導入法（GTPT）の開発と応用

本研究では、ヒトの歯根形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明を最終目標として、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子(DNA)を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索することを目的とした。また、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探った。piggyBac(PB)トランスポゾンシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討では、初代乳歯歯髄細胞に蛍光遺伝子(EGFP cDNA)内蔵のトランスポゾンとtransposase発現ベクターをNeon electroporation system(Invitrogen社)を用い共遺伝子導入を行った。その結果、効率的な遺伝子導入安定株の取得、導入遺伝子の長期発現が認められ、PBシステムの有効性が確認された。また、in vivoにおける歯根形成端周囲組織での持続的遺伝子(EGFP cDNA)発現を検討した。その結果、遺伝子導入後1.5ヶ月を経過すると遺伝子発現の程度は導入後1日目に較べると格段に低下するが、持続的なEGFP発現を認めた。更に、導入遺伝子の存在も歯根形成端周囲組織から抽出したゲノムDNAを用いたPCRで確認した。一方、標的遺伝子を破壊するためのCRISPR/Cas9系の作動性を検討するため、Cas9と表的遺伝子を含むguide RNA(gRNA)を同時に発現するベクターを構築し、ブタ細胞に遺伝子導入した結果、標的遺伝子破壊に成功した。故に、CRISPR/Cas9系を稼働させるための条件設定もその作動性も経験し、本番たるGTPTを用いたin vivoゲノム編集に十分準備が整った。歯根の形成に関するメカニズムは、歯冠形成に比べて研究報告が少ない。もとより、ヒトの歯形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明は、歯系分野では重要である。試験管内(in vitro)での遺伝子の機能解析は一般的だが、遺伝子を直接歯系組織に導入することにより、その効果を生体内(in vivo)で検討する行為は世界的に稀少である。本研究では、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子(DNA)を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索することを第一の目標に据える。さらに、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探ることを第二の目標に据える。平成28年度はpiggyBac(PB)トランスポゾンシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討とCRISPR/Cas9システムによる標的遺伝子のKOに関する検討をin vitroで行った。細胞に蛍光遺伝子を内蔵するトランスポゾンとPB transposase発現ベクターを共にelectroporation systemを用い、遺伝子導入を行った。その結果、効率的に遺伝子導入安定株が取得でき、且つ長期培養後も導入遺伝子が脱落せず、その発現が持続されることが示された。一方、Cas9とgRNA(dentin sialophosphoprotein [Dspp]遺伝子を標的としたguide RNA)を同時に発現するベクター+ HygromycinB耐性遺伝子発現ベクターを歯髄細胞に共遺伝子導入した。遺伝子導入後、Hygromycin Bでセレクションし、濃縮株についてゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。現在、2回目の実験を行っている。一般的に遺伝子導入効率が高いとされるPBによる遺伝子導入法を初代歯髄細胞に適用した。細胞に蛍光遺伝子を内蔵するトランスポゾンとPB transposase発現ベクターを共にInvitrogen社のNeon electroporationsystemを用い、遺伝子導入を行った。本研究では、ヒトの歯根形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明を最終目標として、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子(DNA)を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索する。また、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探る。具体的には、幼若(生後15日頃)B6C3F1メスマウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子(DNA)を注入し、直ちに注入部位周辺を電極で囲み、電気穿孔をかける方法(gene transfer toperipheral tissues surrounding tooth、GTPTと呼ぶ)を用いる。in vivoにおける歯根形成端周囲組織での持続的遺伝子発現法を確立するため、外来遺伝子を10100倍の効率で宿主細胞ゲノムに組み込ませることが可能なpiggyBac(PB)トランスポゾンシステムを用いて、導入遺伝子を導入部位で長く存在させ、持続的な発現を実現させることを目指す。一方、ゲノム編集法の一つCRISPR/Cas9系の核酸を導入し、生体内で標的遺伝子のKOが可能かを明らかにする。平成28年度にはPBシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討を行い、初代乳歯歯髄細胞に蛍光遺伝子(EGFP cDNA)内蔵のトランスポゾンとtransposase発現ベクターをNeon electroporationsystem(Invitrogen社)を用い共遺伝子導入を行った。

平成29年度は、前年度のPBシステムによる遺伝子導入実験を継続し、in vivoにおける歯根形成端周囲組織での持続的遺伝子(EGFP cDNA)発現を検討した。その結果、遺伝子導入後1週間、1.5ヶ月を経過しても遺伝子発現の程度は導入後1日目に較べると格段に低下するが、持続的なEGFP発現を認めた。更に、導入遺伝子の存在も歯根形成端周囲組織から抽出したゲノムDNAを用いたPCRで確認した。一方、標的遺伝子を破壊するためのCRISPR/Cas9系の作動性もヒトやブタの培養細胞を用いて検討した。標的遺伝子には、dentin形成に重要とされるdentin sialophosphoprotein(Dspp)遺伝子を選んだ。Cas9とgRNA(Dspp遺伝子を標的としたguide RNA)を同時に発現するベクターpCGSap1-Dsppを構築し、これとhygromycin B耐性遺伝子発現ベクター+ EGFP発現ベクターをヒト乳歯歯髄細胞に共遺伝子導入した。その後、細胞をhygromycin Bで選別。薬剤耐性株を取得した。この中には、pCGSap1-Dsppも導入され、宿主細胞ゲノム内のDspp遺伝子が破壊されることを期待し、ゲノム解析を行ったが、Dspp遺伝子に変異は認められなかった。おそらく、用いたgRNAがうまく機能しなかったと推定される。しかし、ブタ細胞では他のgRNAを用いて標的遺伝子破壊に成功している(Sato et al., Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2610)。故に、CRISPR/Cas9系を稼働させるための条件設定もその作動性も経験し、本番たるGTPTを用いたin vivoゲノム編集に十分準備が整った。本研究では、ヒトの歯根形成に関わる遺伝子の探索、その機能解明を最終目標として、独自に開発した方法を用いて幼若マウスの歯根形成端周囲組織に遺伝子(DNA)を直接注入することで、歯根形成に重要とされるFGF-10やIGF-Iの機能をin vivoで模索することを目的とした。また、トランスポゾンを用いた導入遺伝子の宿主染色体への挿入による遺伝子発現の定着化、最近開発された次世代型KO技術による標的遺伝子のKOの可能性を探った。piggyBac(PB)トランスポゾンシステムによる遺伝子の長期持続発現に関する検討では、初代乳歯歯髄細胞に蛍光遺伝子(EGFP cDNA)内蔵のトランスポゾンとtransposase発現ベクターをNeon electroporation system(Invitrogen社)を用い共遺伝子導入を行った。その結果、効率的な遺伝子導入安定株の取得、導入遺伝子の長期発現が認められ、PBシステムの有効性が確認された。また、in vivoにおける歯根形成端周囲組織での持続的遺伝子(EGFP cDNA)発現を検討した。
地域研究の成立

我々の研究は、代表的な地域研究の方法論的検討の段階と、その成果を総合して「世界認識の枠組みの変遷」を明らかにする段階との二段階からなる。本年度は、以下の方法で主に前者に属する研究をすすめた。1.個別研究:日本のアジア主義及び超国家主義研究や東洋史学史研究(筒井清忠)、フィリピン-アメリカ関係史研究(吉川洋子)、ベトナム-フランス関係史研究(菊地道樹)、オランダ構造主義人類学研究とインドネシア-オランダ関係史研究(宮崎恒二)、移民政策史研究(小川伸彦)。2.基本資料の収集:基本的文献の備品としての整備および、国会図書館、外交史料館および主要大学の蔵書や史料の複写収集を行ない、その有効活用のための整理を行なった。3.研究会の開催:地域研究に関連する文献・資料を検討しつつ、各自の研究の進捗状況の報告や情報交換を行ない、地域研究の方法論に関する議論を深めた。そのなかで、地域研究とは他者認識の一形態であるとの指摘や、地域認識の恣意性の問題、地域研究の道義性の問題、オリエンタリズム超克の必要性などについての議論がかわされた。また地域研究が、その学際的な立場から、近代の学問体系の組み替えという課題を背負っているという、今後の研究の方向性にもかかわる指摘があった。さらに、文化相対主義の問題や、研究者と研究対象との関係についての問題、また具体的な歴史事象としては、日本のアジア主義がはらんでいた対外的地域認識のありかたの問題性についても議論がなされた。全体を通しては、筒井がこれまで行なってきた比較歴史社会学および知識社会学的研究の成果を方法論的指針として本研究が進展しており、東南アジアを起点とした、「世界認識の枠組の変遷」を描き出すという最終的課題にむけて実績が畜積されつつある。
保育サービス提供における民間営利組織の政策的位置づけ及び政策理念に関する研究

平成19年度は、1990年代以降の規制改革の考察をとおして、保育サービス提供における民間営利組織の政策的位置づけおよびその背景にある理念について明らかにするために、1990年代以降の規制改革、民間営利組織による保育サービス提供に関連する文献研究・資料研究を進めた。1990年代以降の保育サービスにおける民間営利組織の政策的位置づけおよび政策理念は以下のような特徴をもつ。第1に、1990年代に入り、民間営利組織による保育サービスの提供を肯定的に評価し、保育サービス全体の中に位置づけて、健全育成していくという政策的な方向性がみられるようになったことである。第2に、1990年代後半には、規制改革と結びつくことにより、民間営利組織が認可保育所の運営へ参入するという政策的な方向性がみられるようになったことである。2000年3月には「保育所の設置認可等について」(児発第295号)が通知され、民間営利組織が認可保育所の運営に参入できるようになった。第3に、経済活性化を背景とした民間営利組織に対する政策の推進である。社会福祉分野の規制改革は,社会福祉の理念に基づいて推進されているというよりも、経済活性化の手段として推進されている。つまり、民間の活力を阻む規制・制度や政府の関与を取り除き,民間需要を創造するという基本的理念のもと、社会福祉分野においても規制改革を通じて新規事業の起業と雇用の拡大を図り、経済の活性化を推進されているといえる。平成18年度は、1980年代のベビーホテル対策の考察をとおして、保育サービス提供における民間営利組織の政策的位置づけについて明らかにするために、1980年代のベビーホテル対策、民間営利組織による保育サービス提供に関連する文献研究・資料研究を進めた。1980年代に入り、ベビーホテルが社会問題化したことを契機に、それまで政策的な対応が講じられてこなかった民間営利組織による保育サービスの提供に対して政策的対応が講じられることとなった。ベビーホテル対策における民間営利組織の政策的位置づけは以下の3点に特徴をもつ。第1は、認可外保育施設に位置づけられていたことである。民間営利組織による保育サービスの提供はあくまでも認可保育所の枠外に位置づけられ、現在のように認可保育所の運営へ民間営利組織が参入するという政策的意図はみられなかった。第2は、規制の対象であったことである。ベビーホテル対策では、多様化する保育ニーズに対応するために民間営利組織による保育サービスを積極的に活用するという政策的意図はみられず、あくまで民間営利組織は規制の対象として位置づけられていた。ただ、その規制の内容は安全面や衛生面等について悪質なものを規制するということに重点が置かれ、民間営利組織が保育サービス分野へ参入することそのものを積極的に規制するには至らなかった。第3は、法的位置づけの付与である。ベビーホテルの規制を強化するために、認可外保育施設に対する指導監督基準が設けられたことで、保育分野には児童福祉施設最低基準に規定される認可保育所の最低基準と無認可保育施設に対する指導監督基準の2つの基準が存在することになった。これにより、政策的意図にかかわらず、民間営利組織による保育サービスの提供に法的位置づけを付与する結果をもたらした。
オーストラリアの開発教育の教育方法学的研究-開発教育論の再構築と実践の探究-

本研究では、オーストラリアにおける開発教育の理論と実践に関する研究蓄積を批判的に検討した。そして、「オーストラリアにおける開発教育に関する理論研究の到達点と課題の解明」「開発教育を実践する際の教育評価の方法論に関する取り組みの一端と今後の研究課題の明確化」「開発教育を学校づくりの基本方針として位置づけることの可能性の指摘」を行った。そしてさらに、それをふまえて、開発教育論の再構築に取り組んだ。本研究は、オーストラリアにおける開発教育の理論と実践に関する研究蓄積を批判的に検討することによって、開発教育論の再構築と新たな理論に基づく実践のあり方を探究することを目的としている。平成21年度の研究成果は、主に以下の3つにまとめられる。1つ目は、理論研究の進展である。オーストラリアの開発教育研究に大きな影響を与えているコルダー(Calder, M.)とフィエン(Fien, J.)の所論に関する資料収集と分析を行うとともに、コルダー氏へのインタビューも行った。この作業を通して、両者の所論の類似点と対立点を整理し、理論上の論点を明確にした。また、両者の所論においては評価方法に関する研究が不十分であることも明らかにした。2つ目は、来年度の現地での授業研究に向けた調査準備である。今年度の現地調査を通して、特徴的な取り組みを行っている3校から、授業研究実施の承諾をいただいた。現在、調査計画のさらなる具体化を行っているところである。3つ目は、人的ネヅトワークの拡大である。全豪社会科教育者学会(Social Educators Association of Australia)の研究大会への参加を通して、オーストラリアはもとより、イギリス、スウェーデン、イタリアなどのヨーロッパ諸国で開発教育の研究や実践を行っている研究者や教師たちとのネットワークを構築することができた。今後、国際比較研究や成果の交流などを行っていくための重要な礎となるだろう。来年度はこれらの成果に基づき、具体的な実践の観察と分析を行っていく。多様な実践を検討することにより、実践の特質を類型化することと、上記の評価研究の不十分さも含めて理論が抱えている課題を乗り越えるための具体的方策を明らかにすることが可能になるだろう。平成22年度の研究成果は、主に以下の2つにまとめられる。1つ目は、現地調査を通した実践分析の進展である。昨年度の調査をふまえ、Save the ChildrenAustraliaが主導するGlobal Peace School Program(以下、GPSP)への参加校(Thebarton Senior Collegeなど計6校)においてインタビュー調査や授業観察を行い、GPSPが実践に与える影響や意義、課題について分析した。また、南オーストラリア州の後期中等教育修了資格試験と関連づけた取り組みを行っているAdelaide High Schoolにおいて資料収集とインタビュー調査を実施し、特に開発教育における教育評価のあり方について検討した。2つ目は、実践分析をふまえた理論の再構築である。まず、GPSP参加校の取り組みの分析をもとに、これまでは主に「授業づくり」「カリキュラム編成」という視点から研究されてきた開発教育に、「学校づくり」という視点も含めた理論構築および実践が必要となることを明らかにした。また、Adelaide High Schoolでの取り組みの分析をもとに、従来の開発教育論が十分に扱ってこなかった教育評価の方法論について検討した。そして、評価課題と評価基準の開発を中心とする教育評価論の構築が今後の重要な研究課題の1つになることを明らかにした。現在、本研究の成果を論文にまとめる作業と、開発教育における教育評価論について探究するための研究計画を進行中である。今後、これらの作業を進めることにより、豊かな開発教育実践を実現するための方途を明らかにすることが可能になるだろう。
光受容蛋白質の初期分子ダイナミクス可視化をめざしたフェムト秒構造化学研究

極限まで高度化した独自のフェムト秒時間領域ラマン分光により、光受容タンパク質の初期の分子過程を生理条件のもとに観測し、解明した。特にイエロープロテインでは、励起状態の低波数ラマン信号の振舞いを初めて観測し、光吸収後の100 fsで発色団と隣接するアミノ酸残基との間の水素結合が弱くなることを示した。また、発色団が励起状態の間は初期のトランス型構造を保持するのに対し、最初の基底状態中間体では捩れたシス型に異性化していることを明らかにした。さらに、新規の2次元フェムト秒ラマン励起プロフィール分光を開発し、超高速異性化に伴う励起分子の振舞いを構造の観点から可視化することに成功した。独自のフェムト秒ラマン分光を開発することにより、光受容蛋白質の初期分子ダイナミクスの解明をめざした研究を推進した。まず時間分解インパルシブラマン分光を用いてイエロープロテインの初期構造ダイナミクスを研究した。この結果、特異的に強く観測される低波数バンドが他より速く1ピコ秒以内に減衰することを突き止め、光吸収の直後に、発色団周辺の水素結合構造の変化を伴った分子間の構造再構築が素早く起こると結論した。また、光サイクルの中で最初に現れる基底状態中間体(I0状態)の指標バンドを見出し、I0状態がフェムト秒時間領域からすでに生成され始めることを明らかにした。また量子化学計算結果との比較から、I0状態では発色団が歪みをもつシス型構造を有することが示唆された。これと並行して、発色団分子の電子緩和と構造ダイナミクスを解明するために、近赤外域でのフェムト秒誘導ラマン分光装置を開発した。この装置では、光パラメトリック増幅器(OPA)出力の第2高調波(8001200nm)を回折格子とスリットを用いて狭帯域化し、ラマン励起光として使用した。また試料の励起には別のOPA出力、プローブ光にはフェムト秒白色光を用い、InGaAs多チャンネル検出器で誘導ラマンスペクトルを取得した。バクテリオロドプシンの蛍光帯に共鳴する1100nmのラマン励起光を用い、初歩的データの取得に成功した。一方、発色団の近傍にあるアミノ酸残基側の構造応答をフェムト秒の時間スケールで研究するため、深紫外域での誘導ラマン分光の準備も進めた。特に実験上で重要となるプローブ光の発生方式について検討を重ねた結果、非同軸光パラメトリック増幅器の出力を極薄の光学結晶で第2高調波に変換する方法が最適であるとの結論に至った。またこの方式により、芳香族アミノ酸の吸収に共鳴する290nm領域でのフェムト秒ラマン測定が可能であることを確認した。独自のフェムト秒ラマン分光を開発し、光受容蛋白質の初期分子ダイナミクスの解明をめざした研究を推進した。時間分解インパルシブラマン分光による研究では、可変形鏡を用いた分散補償光学系を製作し、ラマン励起光をフーリエ限界(6フェムト秒)まで圧縮した。これにより、すべての振動基音を時間領域で観測できることを確認した。この装置を用いてイエロープロテインの初期ダイナミクスを研究し、指紋領域の時間分解ラマンスペクトルを十分なSN比で取得した。また励起光によるコヒーレンス生成を避けるため、パルス幅250300fsの励起光を用いることが最適であるとの結論に至った。実験の結果、この光受容蛋白質では光励起後に100fs弱の時定数で発色団周辺の水素結合構造変化が起こると結論した。また、最初の基底状態中間体であるI0状態のラマン信号の観測にも成功し、その詳細な振動構造を明らかにした。これにより、I0状態では発色団が捩れたシス型構造をもち、C=O基とタンパク主鎖との水素結合が保持されていることが分かった。これと並行して、発色団近傍のアミノ酸残基側の構造応答を研究するため、深紫外域誘導ラマン分光による研究も行った。芳香族アミノ酸残基の吸収に共鳴する条件で測定し、ダーク状態でのトリプトファンの信号を確認した。光励起状態の信号は予想以上に弱いため、検出法を含め検討している。一方、発色団のすばやい電子緩和とそれに伴う構造ダイナミクスの解明をめざし、独自に開発した近赤外フェムト秒誘導ラマン分光による研究も進めた。超高速光異性化を起こすシアニン色素をテスト試料とし、誘導放出帯に共鳴するラマン励起光を用いて測定した結果、1600cm-1付近のバンドの重心振動数がラマン励起波長によって異なることを見出した。これにもとづき、S0/S1ポテンシャル近接領域近傍のS1分子の構造ダイナミクスを考察した。フェムト秒パルス光を用いた独自のラマン分光を駆使し、光受容蛋白質の初期分子ダイナミクスの解明をめざした研究を推し進めた。時間分解インパルシブラマン分光を用いたイエロープロテインの研究では、46位のグルタミン酸をグルタミンに交換した変異体に対する測定を行った。この結果、野生種で光励起直後に強く観測される低波数モード(135 cm-1)のラマン信号が変異体では弱いこと、また、数百フェムト秒以降では両試料がよく似たスペクトルを示すことが分かった。これは、野生種において光励起後の数百フェムト秒以内に、発色団分子と46位グルタミン酸との間の水素結合が弱くなることを示している。

さらに、励起光のパルス幅を変えた一連の測定も行い、この低波数モードの振舞いがパルス幅等の実験条件に依らず、タンパク質の本来のダイナミクスを反映していることを実験的に確認した。これらの結果から、イエロープロテインでは発色団分子が光を吸収後、隣接するアミノ酸残基との間の水素結合を変化させ、タンパク質全体の構造変化を引き起こすという描像が得られた。一方、発色団分子のすばやい構造ダイナミクスの解明をめざし、独自に開発した近赤外フェムト秒誘導ラマン分光による研究も進めた。特に、超高速光異性化を起こす代表的なモデル分子であるシアニン色素を試料として用い、近赤外域の幅広い誘導放出帯にわたってラマン励起波長を複数通り変えながらフェムト秒誘導ラマン測定を行った。その結果、同じ遅延時刻に1600cm-1付近に観測されるマーカーバンドの振動数が、ラマン励起波長の増加とともに高波数側へとシフトすることを見出した。これは、S1状態の構造の異なる分子を異なるラマン励起波長で区別して共鳴増強することにより、S1分子がS0/S1ポテンシャル近接領域に連続的に近づくダイナミクスを可視化できたことを意味する。極限まで高度化した独自のフェムト秒時間領域ラマン分光により、光受容タンパク質の初期の分子過程を生理条件のもとに観測し、解明した。特にイエロープロテインでは、励起状態の低波数ラマン信号の振舞いを初めて観測し、光吸収後の100 fsで発色団と隣接するアミノ酸残基との間の水素結合が弱くなることを示した。また、発色団が励起状態の間は初期のトランス型構造を保持するのに対し、最初の基底状態中間体では捩れたシス型に異性化していることを明らかにした。さらに、新規の2次元フェムト秒ラマン励起プロフィール分光を開発し、超高速異性化に伴う励起分子の振舞いを構造の観点から可視化することに成功した。時間分解インパルシブラマンを用いた研究では極限的に短いパルス光の発生に成功し、低波数高波数のすべての振動をフェムト秒時間スケールで観測可能とした。これにより、イエロープロテインの水素結合変化や発色団骨格のねじれなど、光受容タンパク質の初期構造ダイナミクスを特徴付ける核運動の解明が大きく進んだと考えている。また、近赤外誘導ラマンによる研究ではラマン励起波長に依存したスペクトル変化が実際に観測され、これまで実験研究が行われてこなかったポテンシャル近接領域の分子ダイナミクスの解明に向けて、研究の手がかりが得られたと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子分光学時間分解インパルシブラマンを用いたイエロープロテインの研究では、変異体に対する実験を行い、水素結合構造変化の具体的な描像を得る。これにより、光受容の初期過程において光吸収を生体信号に変換する精巧な分子メカニズムを考察し、その結果を論文にまとめる。アミノ酸残基の構造ダイナミクス解明をめざした深紫外誘導ラマンによる研究では、微弱な過渡信号を捉える高感度の測定が必要となっている。そこで、深紫外領域での時間領域ラマン分光による測定を検討する。時間分解インパルシブラマンを用いたイエロープロテインの研究では、十分な信号・雑音比で低波数領域を中心にフェムト秒ラマンスペクトルを取得することができ、この光受容タンパク質の初期構造ダイナミクスを特徴付ける核運動の解明が進んだと考えている。また、発色団分子から周辺アミノ酸残基への構造変化の伝播の解明をめざし、近赤外および深紫外での誘導ラマン分光装置の開発も順調に進んだ。時間分解インパルシブラマンに用いる光パルスを現在より短パルス化する。
湿原からのメタンガスの放散

地球温暖化に寄与しているメタンガスの自然発生源として、湿地や湖沼などがあるが、その発生量は不明確である。本研究では地下に大量の有機物を貯蔵している湿地からのメタンガスの大気中への放散量を明らかにする目的で、札幌市近郊の中緯度泥炭湿原の月ケ湖湿原を調査対象として、メタンガス発生に関与するメタン生成菌とメタン酸化菌の菌数および速度を明らかにし、発生量の推定を行った。(1)メタン生成菌は10^210^3個/ml土壌に生息し、地表から50100cmの地点で最大となった。一方メタン酸化菌の菌数は10^210^4個/mlであり、地表から10cm地点で最大となり、微好気性であることが判った。(2)土壌のpHは約5.5であり、微生物活動が十分に行われる環境であった。(3)メタン生成菌およびメタン酸化菌の最大活性はそれぞれ約1.0×10^<-12>g/cell・hrと約1.5×10^<-12>g/cell・hrであった。(4)チャンバー法によってメタンガスの放散量を実測した結果、夏期では約0.10mg/m^2・日、冬期では0.02mg/m^2・日以下であった。一方二酸化炭素の放散量は夏期と冬期でそれぞれ約5mg/m^2・日と12mg/m^2・日であり、メタンガス放散量の50倍以上であった。この結果は湿原土壌中で生成したメタンガスの大部分がメタン酸化菌によって二酸化炭素に酸化されることを示している。メタン生成菌とメタン酸化菌の菌数分布と最大活性および地中温度分布を考慮してメタン生成量、分解量と放散量を計算した結果から、生成されたメタンガスの70%がメタン酸化菌により分解され、10%が大気中に放散されるが、放散量の99%が植物の蒸散作用によるものであった。
光学的方法による動的熱物性計測技術の開発

本研究の目的は、動的熱物性計測技術という新たな概念を提唱し、レーザーを用いた光学的方法により、高速・非接触・動的に多様な熱物性値(表面張力、粘性率、拡散係数など)をリモートセンシングできる技術を開発しようとするものであり、研究成果は以下のようにまとめられる。(1)表面光拡散法(表面張力および粘性率)液体表面レーザーを照射し、その散乱光を検知することによって、表面張力と粘性率を測定可能な表面光散乱法に改良を加え、新たな装置を開発した。この測定システムを利用して、以下の成果を得た。(a)高温媒体に関しては、塩化ナトリウムを対象として1000°C以上での測定精度の向上に関する検討を行い、溶融シリコンの表面張力・粘性率の測定を行った。温度範囲は融点(1685K)から1850Kであった。計123点の測定値から次の相関式を作成した。σ=800-0.13(T-1685)mNm^<-1>(b)クラスレート生成系に適用し、動的に表面張力と粘性率が測定可能なことを確認した。また、Xe-水系ではクラスレート解離後に界面張力と粘性率が数十%増加し、数時間という時定数で減衰している様子が初めて観測された。(2)動的光散乱法(粘性率、拡散係数)高温炉を導入し、溶融Li_2B_4O_7の粘性率を非接触で1000°C以上で測定し、本方法の適用性を確認した。また、Xe-水系のクラスレートハイドレート生成直前の拡散係数の変化を捕らえられるための装置を改良を行い、拡散係数の動的計測技術の可能性を検討した。本年度は、リプロンを利用した表面光散乱法をクラスレート生成系と溶融塩に適用し可能性を検討した。また動的光散乱法については、高温のLi_2B_4O_7に適用した。まとめると以下のような成果を得た。(1)液体表面にレーザーを照射し、その散乱光を検知することによって、表面張力と粘性率を測定可能な表面光散乱法に改良を加え、新たな装置を作製した。(2)上記装置をクラスレート生成系に適用し、動的に表面張力と粘性率が測定可能なことを確認した。(3)高温では、溶融塩化ナトリウムを対象として、1000°C以上での精度向上に関する検討を行った。(4)動的光散乱法については高温炉を導入し、溶融Li_2B_4O_7の粘性率を非接触で1000°C以上で測定し、本方法の適用性を確認した。本年度は,リプロンを利用した表面光散乱法を溶融シリコンとXe-水系に適用し可能性を検討した。また動的光散乱法については,高温のLi_2B_4O_7に適用した。(1)溶融シリコンの表面張力・粘性率の測定を行った。S=800-0.13(T-1685)mN瘡疥^<-1>標準偏差はア0.48%で、測定精度は74.4%と見積もられた。GDMSにより分析した測定終了後のシリコン中の残留酸素濃度は6.35×10^<17>atoms・cm^<-3>であり、CZにおける表面張力と酸素の関係を調べるうえで重要なデータを測定できたと考えられる。

(2) Xc-水系では,クラスレート解離後に界面張力と粘性率が数十%増加し,数時間という時定数で減衰していく様子が初めて観測された。(3)高粘性を有するLi_2B_4O_7融液の測定結果は、目的とする精度を達成できなかったが、他の測定例とオーダーが一致し、また温度上昇に伴う粘性率の減少傾向を確認した。本年度は、表面光散乱法および微粒子光散乱法の高精度化、高速化をさらに進める研究を行い、まとめると以下のような成果を得た。(1)表面光散乱法で製造プロセス中の表面物性を検知できるようにするために、装置全体を小型化した。その結果、従来は畳一枚程度の大きさだったものが、A4一枚程度にまで小型化できた。(2)微粒子光散乱法では、Xe-水系のクラスレートハイドレート生成直前の拡散係数の変化を捕らえるための装置の改良を行い、拡散係数の動的計測技術の可能性を検討した。
糖尿病末梢慢性炎症の脳内誘導の起因となる脳ペリサイトのＰＡＲ－１シグナル

糖尿病時には末梢だけでなく脳内でも炎症が見られ、糖尿病性認知機能障害が生じる。本研究は、糖尿病時末梢炎症の脳内伝播機構に対するトロンビン応答性脳ペリサイトの関与について明らかにすることを目的とした。高脂肪食負荷により作成した肥満・耐糖能異常モデルマウスの脳内でトロンビン量の増加が見られた。また、脳ペリサイトはトロンビンに反応して、血液脳関門の透過性を亢進すること、matrix metalloproteinase-9を産生・放出することが明らかとなった。これらの結果は、糖尿病時の脳内炎症形成過程にトロンビン応答性脳ペリサイトが重要な働きを持つことを示唆する。糖尿病病態時には末梢だけでなく脳内でも炎症が認められ、糖尿病性認知機能障害が生じることが知られている。本研究は、糖尿病病態時の末梢炎症の脳内伝播機構に対する脳ペリサイトのトロンビンーProtease Activated Receptors(PARs)シグナルの関与を明らかにすることを目的とし、前年度に引き続き、本年度は以下ことを明らかにした。1)2週間および8週間の高脂肪食負荷により2型糖尿病モデルマウスを作成し、末梢血中、肝臓、脳のトロンビン量を測定した。2週間負荷マウスでは末梢血中でのみトロンビン量が増加し、8週間負荷マウスではさらに肝臓および脳でも優位にトロンビン量の増加が見られた。糖尿病の進展に伴い、脳内のトロンビン量が増加することが示唆された。2)in vitroの実験において、脳ペリサイトがトロンビン濃度依存的にBBBの透過性を亢進させ、その際にタイトジャンクション蛋白の一つであるZO-1の局在変化が生じることが分かった。3)脳ペリサイトは、トロンビンに反応して炎症性物質であるTNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9を産生することが分かった。さらに、PARsの4種類のサブタイプのうち、MMP-9の産生にはPAR1が一部関与し、IL-1βの産生にはPAR1以外のPARsが関与することが分かった。以上の結果より、糖尿病病態時に脳内に増加したトロンビンに脳ペリサイトが反応し、BBB透過性亢進および炎症性物質産生を介して、脳ペリサイトが脳内炎症に関与する可能性が示唆された。つまり、本研究で得られた新規の知見は、糖尿病病態時の末梢炎症の脳内伝播機構に対して、脳ペリサイトのトロンビンーPARsシグナルがその起因となる可能性を示唆する重要な結果であると考えられる。また、糖尿病病態時にはトロンビンの末梢血中濃度が増加することが報告されている。本研究は、糖尿病病態時の末梢炎症の脳内伝播機構に対する脳ペリサイトのトロンビンーProtease Activated Receptors(PARs)のシグナルの関与を明らかにすることを目的とし、これまでに以下の1)3)のことを明らかにした。1)末梢ー中枢のインターフェイスであるBlood-Brain Barrier(BBB)を構成する脳血管内皮細胞、アストロサイト、脳ペリサイトにおいて、トロンビン受容体であるPARsの4種類のサブタイプのmRNA発現量比較を行ったところ、脳ペリサイトにおいてPAR1、PAR4が高発現であった。これらPARsのmRNA発現量はHigh-Glucose処理による変化は見られなかった。2)末梢炎症の脳内伝播時にはBBBの破綻が伴うと仮定し、BBB障害作用を持つMMP-9の産生についてBBB構成細胞間で比較を行ったところ、トロンビン処理によって脳ペリサイトでのみ顕著なMMP-9の産生が見られた。以上のことは、末梢炎症の脳内伝播機構に対して、脳ペリサイトのトロンビンーPARsシグナルがその起因となる可能性を示唆する重要な結果であると考えられる。糖尿病時病態時の末梢炎症の伝播機構に対する、脳ペリサイトのトロンビンーPARsのシグナルの関与を明らかにすることを目的とし本研究に取り掛かった。本年度は、in vitroによる実験に特化し、1)脳ペリサイトでトロンビン受容体PAR1、PAR4が高発現であること、2) BBB構成細胞のうち脳ペリサイトにおいてのみトロンビンによる顕著なMMP-9産生が見られること、3)脳ペリサイトがトロンビンによるBBB透過性の亢進に関わること、を明らかにすることができた。糖尿病病態との関連やin vivoでの評価が十分でない点は次年度の課題として残るが、脳ペリサイトがトロンビンに高感受性であり、トロンビンによるBBB透過性亢進に直接的に関わることを明らかにすることができた点は、本研究課題で着目した脳ペリサイトのトロンビンーPARsシグナルの重要性を提示するものと考える。以上のことから、本研究は現在まではおおむね順調に進展していると考える。

今後は、in vitroとin vivoの両方の手段を用いて、脳ペリサイトのトロンビンーPARsシグナルを起因とする末梢炎症の脳内誘導機構の解明に取り組む。以下の1)4)について研究を実施する計画である。1)トロンビンにより脳ペリサイトで産生されるMMP-9のBBB透過性亢進における関与を検討する。さらに、その他の炎症性サイトカイン等についても検討を行う為、トロンビン処理した脳ペリサイトの培養上清を採取し、マルチプレックスELISAキットを用いて産生増加する炎症性サイトカイン等を同定し、それらの物質のBBBに対する作用を検討する。2)当初はPARsのサブタイプの中のPAR1に着目して研究を行う予定であったが、脳ペリサイトにおいてPAR1、PAR4が高発現していることが明らかになった。そこで、トロンビン処理によるBBB透過性亢進に関与する脳ペリサイトのPARsのサブタイプを同定するため、PAR1およびPAR4に対する活性化ペプチドやアンタゴニストを用いてin vitro BBBモデルで評価を行う。3)糖尿病モデルマウスとコントロールマウスの末梢血中および脳内のトロンビン濃度を比較する。また、糖尿病モデルマウスで亢進しているBBBの透過性が、トロンビンの直接的阻害剤であるアルガトロバンの静脈内注射あるいは脳内投与により抑制されるかどうかを評価する。4)トロンビンにより活性化された脳ペリサイトが脳内炎症を誘導する可能性を検討するために、トロンビン処理した脳ペリサイトの培養上清液をアストロサイト、ミクログリア、脳神経細胞に処理し、それらに対する活性化作用および障害作用を評価する。以上のことを明らかにすることにより、糖尿病病態時の脳ペリサイトに起因する末梢炎症の脳内誘導機構について新たな知見を提供できる。該当なし
地域単位の健康余命算定システムとその活用に関する研究

地域における「健康日本21の健康戦略」の有力な評価指標獲得を目的とした本研究は、群馬県の2000年確定人口を利用した70市町村別の0,20,40,65,75(女は80プラス)歳の各年齢別平均余命と,19962000年の死亡数と2000年度介護保険者数・要介護支援認定者数を使用した65,75(女は80プラス)歳の健康余命の試算について、データ入手方法の段階から利用方法ならびに健康余命改善のための効果的政策戦略探求まで段階的に実施してきた。平成14,15年度は、健康余命算出とその解釈留意事項を中心に検討してきた。平成16年度は群馬県70市町村の0歳平均余命(平均寿命)試算値の統計量の男77.42±1.62年(Mean±SD),女83.68±1.23年と対応年の厚生労働省による2000年完全生命表(第19回生命表)の平均寿命値の男77.72年,女84.60年との比較で,女のみ群馬県が有意に低値(母平均の検定)、同様な比較を20歳,40歳65歳にも行ない、いずれの年代においても女子の有意に低値な所見が対応年の第19回生命表に対して認めた。さらに、同年齢における男女差で群馬県が全国平均に比べて0.8年以上少なく、女子の生命力に劣勢のあることが示唆された。健康余命に関しても同様な傾向が認められた。かかる知見から、女子の生涯にわたる体力作りや健康造りに寄与する健康政策の探求が群馬県の地域単位の研究課題として必須になることを窺わせているように思われ、その検討解明を優先実施した。検討の結果、地域共同研究として併行実施してきた中学生期の運動クラブ活動参加と体格・体力の発育発達との関連の研究にプロジェクトをリンクさせて相互利益を得られるように研究計画に修正を加え、有益な知見追加を得た。具体的には縦断的データ解析(二元分類の分散解析における混合計画でのASBタイプの分散分析手法)により、男子では認められない運動能力面の女子での発育発達が、運動クラブでの活動機会の活用で有用なものとなるとの示唆である。それは、本報の健康余命を検討中の年齢層での中学生期の運動活動が全国に比して低迷していた知見と合わせると対策究明の糸口ともいえる所見である。今後の課題として、得られた知見をさらに解明をつづけることはもちろんであるが、本研究課題のもう一方の主題でもある開発中の県広報活動のインターネット情報サービスシステムに活用しながら有効で有益な健康づくり活動に寄与できればと考えている。「健康日本21」政策において,推奨されている健康指標のひとつに「健康余命」がある。これは長寿社会の生活の質(Quality Of Life)を考慮したものであり,単なる生命の長さの視点から「健康(健常)で過ごせる余命」(Disease Free Life Expectancy)を基本理念に提唱したものである。しかし健康余命を推賞しているものの,その算出方法,活用・評価方法については具体的に示されていない。そこで,本研究は地域レベルの健康づくり活動を効果的に達成できるように,効果判定に使用できる県内の地域単位レベルでの健康余命を算出システムを構築することを目的した。健康余命の算出方法は,WHOの推奨する障害調整平均余命算出法、Sullivan法、Katz法、瀬上清貴および切明義孝の介護保険を利用する算定法の4種類に大別された。そのうち,本報の目的と現状に即したものとしては介護保健統計を利用する方法が最適と判断された。ただ,データ入手に際して介護保険に関する統計が市町村により差があること,特にデータが男女別に入力されていない事実が判明し,その調整解消が,本研究の第1段階の障壁となった。今回の試算では平成12年国勢調査報告をベースに,平成12年群馬県の70市町村別,二次医療圏別,および県全体の健康余命を算出し,その結果を県の保健予防課を経由して県内の70市町村に報告し,利用説明と現場からの意見聴取を行った。今後の検討課題としては,データのやり取りシステム構築と,単純計算による平成12年70市町村別65歳健康余命の最高は男16.9年、女20.1年であり、最低は男13.7年、女16.7年であったが,この差は生活環境の違い以上に,人口規模の違い(65歳以上人口規模:7,547の1人の人口増減影響:約9時間に対して,人口規模:92人の1人の増減影響:24日)が影響していると考えられた。すなわち,単純計算による健康余命を活用・評価する際には何らかの人口補正をする必要のあることが示唆され,その補正方法を検討中である。「健康日本21の健康戦略」の政策も3カ年の経過に伴い,市町村レベルでの実施が本格化されてきた。健康戦略の健康指標のひとつとして推奨されている「市町村ごとの健康余命試算」に関する研究報告も第62回日本公衆衛生学会では,前年の1題(本報)から5題に,また関連研究を含めると10題以上となり,ニードの高まりが生じていることが窺われる。そこでの本報関連の研究発表は群馬県の平成12年確定人口をベースにした,70市町村別の0,20,40,65,75(女は80プラス)歳の各年齢別平均余命と,平成812年の死亡数と平成12年度介護保険者数・要介護支援認定者数を使用して65,75(女は80プラス)歳の健康余命の試算値を計算方法やデータ入手方法を含めて報告した。

70市町村の0歳平均余命(平均寿命)試算値の統計量は,男77.42±1.62年(Mean±SD),女83.68±1.23年であった。これは対応年の厚生労働省による平成12年完全生命表(第19回生命表)の平均寿命値の男77.72年,女84.60年と比べると,女のみ群馬県が有意に低値であった(母平均の検定)。同様に20歳の男58.24±1.23年,女64.15±1.08年も,40歳の男39.10±1.05年,女44.58±1.00年も,65歳男17.47±O.54年,女21.52±0.66年も,対応年の第19回生命表の20歳平均余命の男58.33年,女65.08年,40歳平均余命の男39.13年,女45.52年,および65歳平均余命の男17.54年,女22.42年と比べるといずれの年齢も群馬県の女のみが有意に低値であった。健康余命は65歳男15.88±0.57年,女18.36±0.66年,75歳男8.91±0.59年,女10.24±0.61年,さらに女80歳が6.64±0.61年と,男と女の健康余命は女が男に比べて長命方向へ5年程度ズレがあるような所見を得た。また,健康余命の市町村のちらばり範囲Rangeは,65歳男13.7516.95年,女16.7120.08年,75歳男6.2910.17年,女8.3511.66年,さらに女80歳が4.767.68年と平均余命同様(両端は町村部)の傾向のあることが認められた。一方,算出過程における検討で,人口規模に関する影響の関与を検討しておくことが必要と思われたので,特に介護保険認定者1人の健康余命に及ぼす影響をシミュレーションする方法で検討することにした。その結果,1人の影響が市部では1日未満,町部では10日,村部では20日程度に拡大するとの知見を得たといえる。今後の課題としては,各市町村が自己評価の必要性から,県内の他市町村と余命計算値で比較する場合,人口補正をすることがどうしても必要になるので,その簡便な方法についてさらに検討しなければならないと考えている。地域における「健康日本21の健康戦略」の有力な評価指標獲得を目的とした本研究は、群馬県の2000年確定人口を利用した70市町村別の0,20,40,65,75(女は80プラス)歳の各年齢別平均余命と,19962000年の死亡数と2000年度介護保険者数・要介護支援認定者数を使用した65,75(女は80プラス)歳の健康余命の試算について、データ入手方法の段階から利用方法ならびに健康余命改善のための効果的政策戦略探求まで段階的に実施してきた。平成14,15年度は、健康余命算出とその解釈留意事項を中心に検討してきた。平成16年度は群馬県70市町村の0歳平均余命(平均寿命)試算値の統計量の男77.42±1.62年(Mean±SD),女83.68±1.23年と対応年の厚生労働省による2000年完全生命表(第19回生命表)の平均寿命値の男77.72年,女84.60年との比較で,女のみ群馬県が有意に低値(母平均の検定)、同様な比較を20歳,40歳65歳にも行ない、いずれの年代においても女子の有意に低値な所見が対応年の第19回生命表に対して認めた。さらに、同年齢における男女差で群馬県が全国平均に比べて0.8年以上少なく、女子の生命力に劣勢のあることが示唆された。健康余命に関しても同様な傾向が認められた。かかる知見から、女子の生涯にわたる体力作りや健康造りに寄与する健康政策の探求が群馬県の地域単位の研究課題として必須になることを窺わせているように思われ、その検討解明を優先実施した。
蛋白欠損GPIによるインフラマソーム活性化：PIGT-PNHの自己炎症機序の解明

平成30年度はPIGT-PNH患者、PIGA-PNH患者、健常人の末梢血単核球を用いたインフラマソーム活性化実験により、PIGT-PNH患者では著明にIL-1βが上昇することをELISA法ならびにWestern blot法により確認した。さらに血管内溶血を伴う未治療のPIGA-PNH患者3名の血清を用いてIL-1β、IL-6、IL-18、血清アミロイドAを測定し、PIGT-PNH患者との比較も行い、いずれもPIGT-PNH患者で高値であることを確認した。しかし、現在までに新たなPIGT-PNH患者の集積は進んでおらず、複数のPIGT-PNH患者血球を用いたインフラマソーム活性化の個体差の評価、具体的にはフローサイトメトリーによる蛋白欠損GPIの割合とIL-1β発現量の相関性の評価は実行できていない。よって、本研究は概ね順調に進展していると判断する。患者血球を用いたインフラマソーム活性化の評価方法は確立できており、この方法によりPIGT-PNH患者で特異的にIL-1βの発現が亢進することを確認した。今後、Pro-IL-1β、NLRP3のprimerを用いたqPCRにより、蛋白欠損GPIがインフラマソーム活性化の1次シグナル、2次シグナルのいずれに強く関与しているかを確認できると考える。しかし、対象となるPIGT-PNH患者の集積が進んでおらず、PIGT-PNH患者におけるインフラマソーム活性化には、蛋白欠損GPIが発現量依存性に関与していることは確認することができなかった。本年度はPIGT-PNH患者の症例集積を継続し、インフラマソーム活性化の個体差の評価ならびに蛋白欠損GPI発現量との関連性を確認したい。さらに、PIGT-PNH患者の単核球から蛋白欠損GPIを切断し、同一患者間で蛋白欠損GPIの有無によるインフラマソームの活性化を評価したい。また、ヒト単球細胞株を用いて、蛋白欠損GPIによる補体活性化を介したインフラマソーム活性化機序の解明も試みたい。試薬、器具、培養液などの消耗物品が充足しており、当初予定していた物品の購入を行う必要がなかったため、次年度使用額が生じた。今年度は消耗物品、研究打ち合わせや国内外出張のための旅費、成果発表(論文投稿)に関連する諸経費などで直接経費1,300,000円を予定している。研究室の維持管理や事務経費などの間接経費は390,000円を使用する。
イオン注入と蒸着による表面改質と新機能薄膜形成技術の開発

1.今年度は窒化ボロンの被覆膜の作成から始めた。窒化ボロンには白色石墨といわれるグラファイト型結晶、ウルファイト型、および立方晶型の閃亜鉛鉱型の三種類の結晶型があり、グラファイト型のものは摩擦係数が小さく表面が滑かであるのに対し、閃亜鉛鉱型はダイヤモンドと殆んど同じ硬度を持つ超硬物質として注目されており、通常十万気圧、千六百度の高温高圧下でのみ作られる。我々はボロンを蒸着すると同時に、窒素分子イオンを注入して膜をシリコン板、アルミニウム膜、および岩塩の上に作成した。イオンの加速電圧は2540KVで基板温度は約200度であった。イオンの量および蒸着速度を制御して膜の成分比を変えた。ボロンと窒素の成分比はアルミニウム膜上の生成膜について2.0MeVヘリウムイオンの散乱強度で測定、生成膜の結晶構造はシリコン基板上のもののX線回折、赤外吸収分光で、また岩塩上のものは剥離して電子顕微鏡により膜の状態、また回折線より微小部分の結晶構造を調べた。結果はボロン/窒素成分比が0.9以上で、また低電圧で作成したものに立方晶型のものが多く含まれていることを見出した。高い電圧で作成したものおよびボロン/窒素比が小さいものはグラファイト型のものが多く見られた。2.窒化チタン膜の作成も行った。チタンを蒸着しながら窒素イオンを注入してステンレス板上に膜を作成した。イオンのエネルギーの変化による基板との界面の状態に特に注目し、RBSとスパッタリングと光電子分光により深さによる成分の変化を調べた。結果は30KVのとき基板と窒化チタンとの混合層が約440Åであり、10KVでは300Åであった。この混合層の厚さは基板との付着力に対し重要である。また作成された膜は殆んど窒化チタン結晶の100軸方向が基板に関係なく表面に垂直であることが見出された。
マラリア肝内型原虫のメロゾイトへの分化に必須な分子の探索と機能の解析

肝内型原虫調整の方法を研究し、短時間で効率的調整する方法を確立した。この調整原虫を用いて感染初期(スポロゾイト)から末期(メロゾイト)までの間に発現するすべての遺伝子を解析しデータベースを作成した。この研究ではその中から転写因子の一つに注目してその機能を解析し、この分子がスポロゾイトからメロゾイトへの分化に重要な働きをしていることを明らかにした。また、ワクチンターゲットとして有望であることも示した。マラリア原虫のステージ特異的遺伝子発現機構を解明することは、感染の分子基盤を理解するための重要な手掛かりとなる。ネズミマラリア原虫Plasmodium bergheiにおいて、肝臓に侵入するステージであるスポロゾイトの転写因子AP2-Sp(AP2 in sporozoites)を同定した。AP2-Spはスポロゾイト期特異的に発現し、スポロゾイトの侵入、感染に必要な遺伝子群のほぼすべてを誘導するマスター転写因子であった。今回我々は、AP2-SpのDNA結合ドメインを有するキメラ転写因子を蚊侵入ステージであるオオキネートに発現させることで、多数のAP2-Sp標的遺伝子をオオキネート期に誘導することに成功した。この方法により新たに同定されたAP2-Sp標的遺伝子の一つASA1(AP2-Sp activated gene 1)は細胞膜結合蛋白質をコードしている遺伝子であり、肝臓感染ステージである唾液腺スポロゾイトで特異的に発現される。ASA1遺伝子ノックアウト原虫は正常にマウスの血液、蚊の唾液腺に感染したが、肝臓への感染性が数千分の一に低下していた。HepG2細胞を用いたin vitro侵入アッセイでは、ASA1ノックアウト原虫の肝細胞侵入能が十分の一以下に低下していることが分かった。さらにHepG2細胞に侵入した少数の原虫もその後の細胞内でのEEF(exoerythrocytic form)へのdevelopmentに異常が認められた。一方、HepG2細胞通過(障害)活性は野生型の約三倍に増加していた。以上の結果は、ASA1が肝実質細胞の認識に必要であること、ASA1を介したコミットメントがその後の肝細胞内ステージへの移行に重要な役割を担っていることを示唆している。ネズミマラリア原虫Plasmodium bergheiにおいて、肝臓に侵入するステージであるスポロゾイトの転写因子AP2-Sp(AP2 in sporozoites)を昨年までに同定した。本年の研究によってAP2-Spはスポロゾイト期特異的に発現し、スポロゾイトの侵入、感染に必要な遺伝子群のほぼすべてを誘導するマスター転写因子であることを明らかにした。昨年に引き続き我々は、AP2-SpのDNA結合ドメインを有するキメラ転写因子を蚊侵入ステージであるオオキネートに発現させること研究を継続し、多数のAP2-Sp標的遺伝子をオオキネート期に誘導することに成功した。新たに同定されたAP2-Sp標的遺伝子の-つASA1(AP2-Sp activated gene 1)は細胞膜結合蛋白質をコードしている遺伝子であり、肝臓感染ステージである唾液腺スポロゾイトで特異的に発現される。ASA1遺伝子ノックアウト原虫は正常にマウスの血液、蚊の唾液腺に感染したが、肝臓への感染性が数千分の-に低下することを明らかにした。以上の結果は、ASA1が肝実質細胞の認識に必要であること、ASA1を介したコミットメントがその後の肝細胞内ステージへの移行に重要な役割を担っていることを示すkとができたと考えている。ネズミマラリア原虫をモデルとして、肝臓に侵入するステージであるスポロゾイトで同定された転写因子AP2-Sp(AP2 in sporozoites)について解析を進めてきた。昨年の研究によってAP2-Spはスポロゾイト期特異的に発現し、スポロゾイトの侵入、感染に必要な遺伝子群のほぼすべてを誘導するマスター転写因子であることを明らかにした。今年度はこのことを更に確認する実験を行った。この転写因子をノックアウトした原虫は、肝細胞への感染に必要な遺伝子の発現が出来す、結果として感染が成立しないことも明らかになった。一方我々は、AP2-SpのDNA結合ドメインを有するキメラ転写因子を蚊侵入ステージであるオオキネートに発現させる研究を継続し、多数のAP2-Sp標的遺伝子をオオキネート期に誘導することに成功した。新たに同定されたAP2-Sp標的遺伝子の一つASA1(AP2-Spactivated gene 1)は細胞膜結合蛋白質をコードしている遺伝子であり、肝臓感染ステージである唾液腺スポロゾイトで特異的に発現される。

ASA1遺伝子ノックアウト原虫は正常にマウスの血液、蚊の唾液腺に感染したが、肝臓への感染性が数千分の一に低下することを明らかにした。HepG2細胞を用いたin vitro侵入アッセイでは、ASA1ノックアウト原虫の肝細胞侵入能が十分の一以下に低下していることが分かった。さらにHepG2細胞に侵入した少数の原虫もその後の細胞内でのEEF (exoerythrcytic form)へのdevelopmentに異常が認められた。一方、HepG2細胞通過(障害)活性は野生型の約三倍に増加していた。以上の結果は、ASA1が肝実質細胞の認識に必要であること、ASA1を介したコミットメントがその後の肝細胞内ステージへの移行に重要な役割を担っていることを示すことができたと考えている。