hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
致死性虚血性不整脈の予測因子の確立および原因遺伝子同定による病態解明と治療構築

また、虚血性心室細動を生じた約70症例の心電図を含めた臨床的特徴や遺伝子情報を集積し、解析結果を虚血性不整脈の治療方法を含めて学会報告した。1.J波を中心とした心電図所見と虚血性心疾患における心室細動との関連心電図上のJ波は一般健常人にも認める良性所見だが、我々はJ波に関連した致死性の心室細動症例を報告してきた(申請者ら、Pacing Clin Electrophysiol. 2011に掲載)。心筋梗塞や冠攣縮狭心症などの虚血性心疾患でも心室細動を伴うことが知られるが、J波との関連は明らかでない。我々は、当院と関連施設において冠攣縮誘発試験時に心筋虚血を生じた67症例のJ波の変化と心室細動の関連を検討した。結果は、検査前よりJ波を有した症例は14例で、残り53例にはJ波を認めなかった。心筋虚血に伴い7/14例でJ波が増大し、そのうち4例で心室細動に至った。一方、検査前にJ波を認めなかった53例の中4例で新たにJ波が出現したが心室細動は生じなかった。心筋虚血に伴う心室細動は、J波を有する症例およびJ波が増大する症例に発生率が高いことが示された。これは、J波が虚血性心疾患においても心室細動の危険予測因子になりうることを示している(申請者ら、Europace 2011に掲載)。また、急性心筋梗塞の急性期に心室細動を生じた症例を集積中であり、臨床データと心電図データを解析中である(平成23年3月31日時点で8症例)。2.虚血性心室細動の新たな原因遺伝子の検索我々は、特発性心室細動症例における遺伝子解析により、心臓NaチャネルをコードするSCN5Aの遺伝子変異を証明し報告した(申請者ら、Circulation Arrhythmia and Electrophysiology 2011に掲載)。虚血性心疾患における心室細動においても同様のイオンチャネルの遺伝子異常が関連している可能性がある。上記の集積中の8症例については、すでに血液中からのゲノムDNAを抽出しており、今後行う原因遺伝子のスクリーニングに用いる。J波を中心とした心電図所見と虚血性心疾患における心室細動との関連我々は一般外来の患者の心電図においても広くJ波が存在していることを報告した(申請者ら、JPN J Electrcardiology 2012に掲載)。心筋梗塞や冠攣縮狭心症などの虚血性心疾患でも心室細動を伴うことが知られるが、J波との関連は明らかでなかった。そこで我々は、冠攣縮誘発試験試験時に心筋虚血を生じた67症例のJ波の変化と心室細動の関連を検討した。結果は、検査前よりJ波を有する14例中、心筋虚血に伴って7例でJ波が増大し、4例で心室細動に至った。一方、検査前にJ波を認めなかった53例では、J波と無関係に心室細動を生じた1例のみであった。その結果から、我々は虚血性心室細動はJ波に関連していることを示した(申請者ら、Europace 2012に掲載)。さらにデータ解析を進めるため、急性心筋梗塞の急性期に心室細動を生じた症例を多数集積し、70症例以上の症例情報が得られた。それらの臨床データと心電図データを解析し、過去の研究結果を含めて報告した(申請者ら、日本心電図学会学術諮問委員会提言シンポジウム2013で発表)。平成26年度において、J波と虚血性心疾患に関連した特徴ある心電図所見を同定して報告した(申請者ら、Int J Cardiol 2014に掲載)(申請者ら、日本不整脈学会2014で発表)。さらに、心筋虚血にともなった心室性不整脈の発生とその治療方法について報告した(申請者ら、植え込みデバイス関連冬季大会2015で発表)。
臍帯血細胞移植による低容量肺血管床のリモデリングに関する研究

8週齢の免疫欠損(BALB/c Slc- nu/nu)マウスの気管内挿管下に人工呼吸器を装着し、小さな前側方開胸下に左肺動脈の上葉枝または主肺動脈をクリップして閉塞させ、低容量肺血管床モデルマウスを作製する左肺モデル作りを行った。しかし、安定した生存率を得られ、ヒト臍帯血細胞移植のレシピエントとして用いるには技術的な困難さがあった。そこで、本研究の肺血管床減少性レシピエント動物モデルとしては、モノクロタリン(MCT)誘発肺高血圧モデルマウスを用いることとした。本施設倫理委員会の承認下に、本研究に対する同意を得た産婦(ヒト)の分娩時に臍帯静脈血を採取した。ヒト臍帯血細胞の解析ではCD34+、CD45+、CD133+前駆細胞は全体の1.02%を占め、0.25ml中にそれらを2.57%に濃縮された1×107個の単核球細胞を含む投与液として調整している。免疫欠損(BALB/c Slc- nu/nu)モノクロタリン(MCT)誘発肺高血圧モデルマウスにヒト臍帯血細胞を眼窩静脈より移植すると、肺小動脈の数が増え、その中膜平滑筋層の肥厚が改善し、右室肥大が改善すること、つまり肺血管床を改善できることを確認した。また、その効果発現にはヒト臍帯血の血清成分ではなく移植細胞自体が必要であったが移植したヒト臍帯血細胞の役割については未だ不明である。そこで、移植したヒト臍帯血細胞をDi-I(カルボシアニン蛍光)にてラベルし、レシピエントマウス肺内での存在、動態(viability, activity)を、移植3時間後, 24時間後および7日後と経時的に追跡している。また、IVISバイオイメージング法やRT-PCR法にて肺組織内で血管新生のために動員された細胞の起源を特定する研究を行っている。平成30年度に得られた結果を基にして,当初の目的とした臍帯血細胞移植による未熟あるいは傷害された低容量肺血管床の改善効果機序について,特にパラクライン効果について,そして経静脈的に移植した臍帯血細胞あるいは骨髄幹細胞の体内動態と役割について補足研究を行う.蛍光色素(CMTMR)でラベルしたヒト臍帯血細胞を免疫欠損マウス(BALB/c Slc- nu/nu)のモノクロタリン誘発肺高血圧モデルに経静脈的に移植し,経時的な移植15分後,1日後及び5日後にレシピエントマウス体内での動態を追跡し,特に肺内での臍帯血細胞の動態追跡したデータを評価する。移植したヒト臍帯血細胞の体内動態とレシピエント内の動態分布を見るため,蛍光標識したヒト臍帯血単核球細胞をIVIS imagingを用いて追跡研究し,臍帯血を投与したモノクロタリン肺高血圧マウスと投与しない肺高血圧マウス群において,それぞれ臍帯血投与10分後,30分後,1時間後,3時間後,6時間後及び24時間後の体内臓器分布,特に肺組織への局在について検討しているので,その研究データを解析し、肺血管床改善効果の機序と移植細胞の役割について研究し,その臨床応用についても考察する.8週齢の免疫欠損(BALB/c Slc- nu/nu)マウスの気管内挿管下に人工呼吸器を装着し、小さな前側方開胸下に左肺動脈の上葉枝または主肺動脈をクリップして閉塞させ、低容量肺血管床モデルマウスを作製する左肺モデル作りを行った。

そこで、移植したヒト臍帯血細胞をDi-I(カルボシアニン蛍光)にてラベルし、レシピエントマウス肺内での存在、動態(viability, activity)を、移植3時間後, 24時間後および7日後と経時的に追跡している。また、IVISバイオイメージング法やRT-PCR法にて肺組織内で血管新生のために動員された細胞の起源を特定する研究を行っている。8週齢の免疫欠損(BALB/c Slc- nu/nu)マウスの気管内挿管下に人工呼吸器を装着し、小さな前側方開胸下に左肺動脈の上葉枝または主肺動脈をクリップして閉塞させ、低容量肺血管床モデルマウスを作製する左肺モデル作りを行った。しかし、安定した生存率を得られ、ヒト臍帯血細胞移植のレシピエントとして用いるには技術的な困難さがあった。そこで、本研究の肺血管床減少性レシピエント動物モデルとしては、モノクロタリン(MCT)誘発肺高血圧モデルマウスを用いることとした。平成30年度に得られた結果を基にして,当初の目的とした臍帯血細胞移植による未熟あるいは傷害された低容量肺血管床の改善効果機序について,特にパラクライン効果について,そして経静脈的に移植した臍帯血細胞あるいは骨髄幹細胞の体内動態と役割について補足研究を行う.蛍光色素(CMTMR)でラベルしたヒト臍帯血細胞を免疫欠損マウス(BALB/c Slc- nu/nu)のモノクロタリン誘発肺高血圧モデルに経静脈的に移植し,経時的な移植15分後,1日後及び5日後にレシピエントマウス体内での動態を追跡し,特に肺内での臍帯血細胞の動態追跡したデータを評価する。移植したヒト臍帯血細胞の体内動態とレシピエント内の動態分布を見るため,蛍光標識したヒト臍帯血単核球細胞をIVIS imagingを用いて追跡研究し,臍帯血を投与したモノクロタリン肺高血圧マウスと投与しない肺高血圧マウス群において,それぞれ臍帯血投与10分後,30分後,1時間後,3時間後,6時間後及び24時間後の体内臓器分布,特に肺組織への局在について検討しているので,その研究データを解析し、肺血管床改善効果の機序と移植細胞の役割について研究し,その臨床応用についても考察する.
成人T細胞白血病に対する遺伝子工学を用いた治療法の開発

1)Fas陰性ATL細胞の抗癌剤耐性Fas陰性の表現形質と抗癌剤耐性の関連を検討するためFas陰性のATL細胞を用いてdoxorubicinによるアポトーシス誘導をin vitroで検討した。Fas抗原陽性のATL細胞ではdoxorubicin(4mM)の添加によって2時間後に16%、6時間後に52%のアポトーシスが観察されたのに対してFas陰性のATL細胞ではアポトーシスは誘導されなかった。コントロールである抗Fas抗体(CH-11)でも同様の結果であった。Fas抗原からのシグナルに対して抵抗性であるだけでなくアポトーシスの他のカスケードにも異常が存在することが明らかとなった。このような異常はATLにおける抗癌剤耐性とも関連していると考えられる。(ConA+PMA)も全く検出されずFas Lの発現抑制の機序があるのではないかと考えメチル化の有無を検討した。メチル化の検討はgenomic DNAをsodium bisulfiteで処理しCpGでメチル化が起こっている場合にはCのTへの変換が阻害されることを利用したmethylation specific PCR(MSPCR)を用いた。Fas Lではexon1にCpG islandが存在しておりMSPCRによってATLのFas L遺伝子ではメチル化が確認された。正常人単核球ではmethylationとunmethylationの混在するパターンでありmethylationのみが検出されるATL細胞とは明らかな相違が存在した。3)細胞レベルにおけるFas L遺伝子の発現制御を可能にするためにHIVベクターを用いて誘導可能なプロモタ-でFasL遺伝子の発現を誘導する系を作成した。HIVベクターのLTRはtatの非存在下では働かず導入細胞内では転写が起こらない。誘導可能な発現系としてはVP-16とmutant tetracyclinerepressorの融合遺伝子でtetracyclineで発現が誘導される系を用いた。tetOをFasL遺伝子の蒸留に連結しFasL遺伝子の転写をテトラサイクリンで誘導するベクターを作成した。
臨床応用を見据えた三次元培養による歯髄細胞分化誘導とそのシグナルネットワーク解析

株化マウス歯乳頭細胞を24時間三次元スフェロイド培養した後、細胞を回収、RNA抽出し定量的PCRで解析したところ、象牙芽細胞・骨芽細胞分化マーカーであるAlkaline phosphatase (Alp)、Bone morphogenetic protein2 (BMP2)の発現が亢進したことを確認した。一方で、インテグリンシグナル阻害剤を三次元スフェロイド培養した細胞に添加したところ、AlpおよびBmp2の発現が亢進しないことを確認した。以上より、三次元スフェロイド培養は株化マウス歯乳頭細胞を、インテグリンシグナルを介して象牙芽細胞・骨芽細胞分化誘導する可能性が示唆された。本研究では、特殊な細胞培養法である「三次元スフェロイド培養法」に着目し、歯髄細胞を三次元スフェロイド培養した場合に象牙芽細胞分化が促進されるメカニズムを解明することを目的としている。平成26年度は、不死化したマウス歯乳頭細胞を三次元スフェロイド培養専用の培養皿に播種した後、6時間、12時間、24時間経過後に細胞を回収し、RNA抽出を行った。象牙芽細胞・骨芽細胞分化を検討するため、分化マーカーであるDentine sialophosphoprotein (Dspp)、Alkaline phosphatase (Alp)、Bone morphogenetic protein2 (BMP2)の発現を、定量的PCRを用いて調べた。対照群として一般的な平面の培養皿でも培養を行った。その結果、三次元スフェロイド培養した細胞は、6時間後には培養皿中央に細胞の集積を認め、12時間、24時間と時間が経過するほどに細胞の集合体の透明性が低下していることが確認された。分化マーカーの発現は、三次元スフェロイド培養した細胞では12時間後にAlp、BMP2が、24時間後にはDsppの発現が上昇することを認めた。この結果、比較的早期に分化マーカーが上昇することから、三次元スフェロイド培養における象牙芽細胞分化の促進は、細胞が集積することによる細胞間の物理的な圧迫や酸素濃度の低下だけではなく、何らかのシグナルが関与している可能性が考えられた。本研究は、三次元的に細胞を培養する「三次元スフェロイド培養法」を用いて、歯髄細胞が象牙芽細胞に分化促進されるメカニズムを解明することを目的として行った。平成26年度は、不死化したマウス歯乳頭細胞を、三次元スフェロイド培養専用の底面が低接着加工された培養皿に播種し、24時間培養後、細胞を回収、RNA抽出した。抽出したRNAを定量的PCRで解析したところ、通常の培養皿で平面培養した細胞と比較し、象牙芽細胞・骨芽細胞分化マーカーであるDentin sialophosphoprotein (Dspp)、Alkaline phosphatase (Alp)、Bone morphogenetic protein2 (BMP2)の発現が亢進したことを確認した。平成27年度は、象牙芽細胞・骨芽細胞分化マーカーの発現が亢進したメカニズムの解明を主軸とし実験を行った。三次元スフェロイド培養では細胞・細胞間、細胞・細胞外基質間の接触が、平面培養と比較して密となり、分化シグナルが入りやすい環境となると仮定し、そのシグナルの一つとしてインテグリンシグナルに着目した。インテグリンシグナルを阻害するためFocal adhesion kinase阻害剤、Extracellular signal-regulated kinase 1/2阻害剤を三次元スフェロイド培養した細胞に添加したところ、添加しないものと比較し、AlpおよびBmp2の発現が抑制されたことを確認した。以上より、三次元スフェロイド培養した歯乳頭細胞の象牙芽細胞・骨芽細胞分化マーカー発現の促進には、インテグリンシグナルが関与している可能性があると考察した。平成26年度は今後の研究のための細胞数、培養期間、解析方法等、パラメーターを検討し、おおむね予備実験が完了した。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯内療法平成27年度は、平成26年度に検討した細胞数、培養期間をもとに、組織学的な解析および動物実験に移行する予定だ。また、結果を国際学会で発表予定としている。
肺がん患者における術中麻酔薬による免疫抑制メカニズムの機序解明と予後への影響

吸入麻酔薬とオピオイドはプロポフォールより細胞性免疫を抑制するといわれている。乳癌の再発や消化器癌の生存率に関しても、吸入麻酔よりもプロポフォールの方が有利であるという報告もみられる。肺がん手術患者を対象に、周術期の免疫抑制の機序の解明と麻酔薬(propofol=P, sevoflurane=S, desflurane=D)の違いを検討する。呼吸器外科において肺がん手術を受ける患者を対象とした。麻酔導入前と手術終了時に採血を行う。BDバキュテイナ採血管に血液を分注後、遠心し単核球を分離する。フローサイトメーターを使用し%CD3, %CD4, %CD8, %PD-1/CD4, %PD-1/CD8,%Tregを解析した。登録患者22人から検体を採取し、そのうち除外にならなかった14人の検体(S=5, D=4P=5)の解析を行った。検体の採取自体は3月の時点で50人程度、検体はすでに凍結保存)分析はEzRを使用し、Repeated-Measures ANOVAで行った。CD4、CD8は麻酔薬間の群間の差は有意傾向(P=0.05、0.07)があり、CD3、CD4、CD8は麻酔導入前と手術終了時で有意に異なる(P=0.01、0.01、0.02)手術終了時CD3、CD4は上昇、D8は低下しており手術侵襲の影響が示唆された。他の項目は有意差が見られていない。しかし、全項目において、麻酔導入前の値が麻酔群間でばらつきがあり、麻酔導入前値をそろえるために症例数を増やす必要がある。PD-1は抗腫瘍T細胞活性の抑制に関与し、Tregは抗腫瘍免疫応答を抑制に関与している。今後検体数を増やし、麻酔薬によってこれらの項目に変化がみられるかを解析し、免疫抑制との関連についてさらに研究していく。平成30年6月より患者募集を開始した。現在も募集中である。採血自体は三月末の時点で50例終了している。研究分担者の勤務形態の変更で、途中で血液分析の実施が困難になる見通しがあったので、研究助手を採用し31年2月より研究室での分析補助を行ってもらっている。途中で、消耗資材(吸引管・輸入)の調達困難があったが、他施設からの協力により順調に検体処理ができた。現在22例での解析の結果とパワーアナらイシスでは当初の症例数より、実施症例数を増やす必要が生じる可能性がある。全項目において、麻酔導入前の値が麻酔群間でばらつきがあり、麻酔導入前値をそろえるために症例数を増やす必要がある。現在も募集中である。

現在22例での解析の結果とパワーアナらイシスでは当初の症例数より、実施症例数を増やす必要が生じる可能性がある。全項目において、麻酔導入前の値が麻酔群間でばらつきがあり、麻酔導入前値をそろえるために症例数を増やす必要がある。PD-1は抗腫瘍T細胞活性の抑制に関与し、Tregは抗腫瘍免疫応答を抑制に関与している。今後検体数を増やし、麻酔薬によってこれらの項目に変化がみられるかを解析し、免疫抑制との関連についてさらに研究していく。本年度には、結果的に症例数が少なく、国際学会発表の旅費や雑誌発表の掲載料に到達しなかった。大型機器の購入もなかった。
腸管上皮細胞のタイトジャンクションにおける物質透過を抑制する食品由来因子の解析

1.ヒト大腸癌由来培養細胞株Caco-2の無血清培養株であるCaco-2-SFの機能特性について検討した。Caco-2-SFは培養4日目にコンフル-エントに達し、10日目にはスクラーゼ活性が顕著に発現した。Gly-Glyと共輸送されるH^+の細胞内濃度を蛍光色素により測定することでペプチド輸送活性を測定したところCaco-2-SFはCaco-2と同様な活性を示した。細胞を透過性膜上に3日間培養した後経上皮電気抵抗(TEER)を測定したところ、300Ω-cm^2以上の高いTEER値を示した。しかし、細胞層をハンクス液でリンスした後TEERを測定したところその値は100Ω-cm^2以下にまで減少していた。このことからCaco-2-SFはタイトジャンクション(TJ)を形成しているが不安定であることが明らかとなった。一方、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加し1時間インキュベートする事によりTJが安定化された。そこでこのCaco-2-SFを用いたアッセイ系によりTJ安定化活性を持つ食品蛋白質を検索した。2.様々な食品蛋白質あるいはその酵素分解物についてアッセイした結果β-カゼイン-トリプシン分解物(β-CN-T)に強いTEER上昇活性、即ちTJ安定化活性が見られた。そこで、β-CN-Tを逆相短カラムにより分画しアッセイした結果、50%アセトニトリルにより溶出された画分に強いTJ安定化活性が認められた。逆相HPLCによる分離なども試みたが活性ペプチドを単離する事は出来なかった。3.ロ-ダミン・ファロイジンによりアクチンリング(AR)を蛍光染色した結果Caco-2-SFもCaco-2と同様なARを形成していることが示唆された。また、サイトカラシンDにより細胞を処理したところβ-CN-Tの活性が抑制された。以上より、β-CN-TによるTJの安定化機構に細胞骨格を介した経路も関与していることが示唆された。各種TJ関連蛋白質のmRNA量の変化や蛋白リン酸化程度の変化については本年度内に完了することは出来なかった。
レーザー誘雷のためのディスク型ガラスレーザー発振器の開発

高出力ガラスレーザー増幅器を再構成してレーザー誘雷基礎実験用のガラスレーザー発振器(波長1μm)を構成した。要求されるレーザーの特性は集光点で10^<12>W/cm^2(気体絶縁破壊強度)以上のレーザー強度を得ることであった。1μmの光は現在誘雷用に研究が進んでいる10μmの光より高密度のプラズマを生成することが可能である。高強度のジャイアントパルスを発生させるために発振器内にQスイッチ用のポッケルスセルを導入した。平行平板ミラーを用いた安定共振器では,この増幅器の利得が68倍と評価されている事から,発振器内の損失(約10%)を考慮し,反射率約20%の出力ミラーが最適であると見積もった。実際に構成した結果,出力25J,パルス幅50nsが得られた。しかし,安定共振器では空間的,時間的に多くのモードが発生するために,一点で集光されず十分な強度が得られない事がわかった。そこで,凹凸面ミラーを用いた不安定共振器を構成した。この場合,レーザー発振に寄与するのは媒質を通る中心部の光のみであるため,空間モードは制限され単一モードとなる、出力されたレーザー光の近視野像は,中心部のないド-ナッツ状の空間強度となるが,レンズによって集光された遠視野像では近似ガウス型の空間強度が得られる。不安定共振器の場合,出力エネルギーを決定するのは凹凸面ミラーの曲率半径と共振器長である。凹面鏡の曲率半径は共振器長の約4倍,凸面鏡の半径は凹面鏡と共焦点で,出力ビームの面積に対してその占有面積が約20%になるように決定した。この結果,出力25J,パルス幅50nsと安定共振器の場合と同等のエネルギーが得られた。また,Fナンバー56のレンズで集光した結果,最長3cmのプラズマチャンネルが生成された。しかも,この生成プラズマはCO_2レーザーの場合とは異り,連続プラズマであることを確認した。
高精度VLBI観測によるオリオン座・いっかくじゅう座分子雲複合体の立体構造の解明

国立天文台によって開発された高精度位置天文VLBIネットワークVERAを用いて、太陽系から最も近い巨大分子雲であるオリオン座・いっかくじゅう座分子雲複合体にある星形成領域の水メーザーと呼ばれる強力な電波源をモニター観測し、過去の観測の10倍以上の高精度で年周視差と固有運動を計測する。それにより、オリオン座分子雲といっかくじゅう座分子雲の距離を誤差1%以上の精度で決定し、これまでは不可能だった分子雲複合体の3次元立体構造・3次元運動の解明を目指す。初年度には、オリオン座・いっかくじゅう座分子雲複合体の星形成領域20天体程度のサーベイ観測を行い、4天体(Orion KL,OMC-2,HH1,Mon R2)でVERAによる相対VLBI観測が可能であることを確認した。そこで、これらについて月に1回のVERAによるモニター観測を開始した。2年目には、初年度からのモニター観測で明らかになった相関器モデルの再計算について、補正のためのソフトウェアを開発し、観測天体で最も明るい水メーザー源であるOrionKLについて重点的に解析を行った。その結果、大気による遅延の効果を補正することによって水メーザー源のイメージの質、位置決定精度が飛躍的に向上した。現在までに、Orion KLの年周視差は2.3mas、距離に換算すると430pcであることが初めて得られている。この結果は、過去のOrion KLの距離測定(480pc)と矛盾はしない。ただし、年周視差計測結果にはまだシステマチックな誤差が含まれている可能性もあり、さらなる補正の検討、継続的な観測による年周視差の再現性の計測を行ったうえで、査読論文として投稿予定である。年周視差計測は、測定期間が長ければ長いほど精度が向上するため、本研究の終了後もモニター観測は継続される予定である。本年度は、オリオン座・いっかくじゅう座分子雲複合体の星形成領域20天体程度のサーベイ観測を行い、4天体(Orion KL, OMC-2, HH1, Mon R2)は水メーザーの強度が十分強く、かつ近傍に参照電波源を伴い、VERAによる相対VLBI観測が可能であることを確認した。そこで、これら4天体で月に1回のVERAによるモニター観測を開始した。本年度の観測では、4天体のうちOMC-2を除く3天体で相対VLBIによるイメージングに成功している。Orion KL、Mon R2については、固有運動も測定できているが、年周視差測定のためには、相関処理のためのモデル計算の高精度化が必要であることが明らかになった。また、天体の年周視差計測のためには最低でも1年間は観測を継続する必要があるが、これまでの観測によってメーザー源が1ヶ月程度のタイムスケールで大きく変動することが明らかになっており、年周視差計測のためには、さらにモニター観測を継続する必要があることもわかった。本年度の成果は、EVN(ヨーロッパVLBIネットワーク)国際シンポジウムを始め、国内外の学会で発表されている。また、本研究に関連するVERA、VLBIによる観測成果の一部は以下の査読論文に発表されている。

国立天文台によって開発された高精度位置天文VLBIネットワークVERAを用いて、太陽系から最も近い巨大分子雲であるオリオン座・いっかくじゅう座分子雲複合体にある星形成領域の水メーザーと呼ばれる強力な電波源をモニター観測し、過去の観測の10倍以上の高精度で年周視差と固有運動を計測する。それにより、オリオン座分子雲といっかくじゅう座分子雲の距離を誤差1%以上の精度で決定し、これまでは不可能だった分子雲複合体の3次元立体構造・3次元運動の解明を目指す。昨年度から、Orion KL、HH1、Mon R2の3天体で相対VLBIによるモニター観測を開始しており、相対VLBIイメージングに成功している。昨年度に問題点が明らかになった相関器モデルの再計算について、補正のためのソフトウェアを開発し、観測天体の中では最も明るい水メーザー源であるOrionKLについて重点的に解析を行い、精度検討が進められている。その結果、水蒸気による遅延の効果を補正することによって水メーザー源のイメージの質、位置決定精度が飛躍的に向上した。現在までに、Orion KLの年周視差は2.3mas、距離に換算すると430pcであることが初めて得られている。この結果は、過去のOrion KLの距離測定(480pc)と矛盾はしない。Orion KLの距離測定の成果は、日本天文学会をはじめ、国内外の学会で発表されており、現在論文執筆の準備を進めている。ただし、年周視差計測結果にはまだシステマチックな誤差が含まれている可能性もあり、さらなる補正の検討、継続的な観測による年周視差の再現性の計測を行ったうえで、査読論文として投稿予定である。HH1、Mon R2についてもほぼデータ取得が終わり、解析が続けられている。年周視差計測は、測定期間が長ければ長いほど精度が向上するため、本研究の終了後もモニター観測は継続される予定である。
抗原抗体反応を利用したナノ磁気微粒子によるアトモル微量化学分析の研究

本研究では、超高感度磁気センサーである高温超伝導SQUID(超伝導量子干渉素子)と、ナノサイズの磁性体微粒子をポリマーコーティングした磁気ビーズという2つの最先端技術を組み合わせ、マーカーとしての磁気ビーズを磁気的に検出する方法による超希薄溶液中の定量分析の研究を実施した。超微量分析の基礎研究として、まずSQUID装置による磁性体微粒子検出技術の研究を行った。磁化コイルの配置、静磁場法、変調法及び永久磁石による残留磁化測定など、磁化方法の検討を行った。さらに磁気ビーズの種類、大きさについて検討し、超常磁性体、強磁性体ビーズそれぞれについて最適磁化方法での検出を試みた。その結果、デキストランコートFe_2O_3ビーズ(磁性体直径約10nm)を用いて、1.4T永久磁石による残留磁化測定により、5.8ngの検出限界を達成した。また、ストレプトアビジンを付与した直径2.8μmの磁気ビーズを用いた測定では、5zmolの磁気ビーズを検出した。高速で走行する糸に付着した多種の磁気マーカー試料をSQUIDで連続的に検出するという技術を考案し、糸に付着させた磁性微粒子の定量分析を試みた。開発したSQUIDセンサー及び糸巻取装置で、10m/minまでで高速走行による分析が可能であることを示した。1.4T磁石を用いた残留磁化測定では3桁の範囲で検出信号強度が試料中酸化鉄重量に対して再現良く線形性を示し、分析の定量性を確認した。検出感度をさらに向上させるために、RF-SQUIDマグネトメーターを導入した。従来のDC-SQUIDマグネトメーターに比較してノイズレベルが2桁以上低減するものである。これにより、1.4T永久磁石による残留磁化測定において、デキストランコートFe_2O_3ビーズ(磁性体直径約10nm)40pgの検出限界を達成した。現在、化学分析特に細菌、遺伝子などのバイオ分析において、超希薄溶液中の定量分析の必要性が強く求められている。開発したSQUIDセンサー及び糸巻取装置で、糸の走行速度はノイズに影響を与えないことを確認した。また2.5m/minから10m/minの範囲で検出信号強度に走行速度依存性はなく、高速走行による分析が可能であることが示された。
次世代マッキベン人工筋の実現

現在の人型ロボットと実際の人の身体の駆動機構は大きく異なっており,これが両者の運動特性に様々な違いを生んでいる.しなやかで「生き物らしい」運動特性を持ったロボットを実現するには,十分な収縮能力を持ち,集積して超多自由度機構を駆動できる「人工筋肉」の実現が鍵になる.本研究では,1「電気駆動」と「多繊維構造」を特徴とする「次世代マッキベン人工筋肉」を実現し,2「筋骨格ロボット機構」に適用してその可能性を実証することを目的としている.1マッキベン人工筋肉の電動化に関しては,本年度は,プロトン交換膜表面の電極形成の工夫により,12秒程度の速さで動作する「電動細径マッキベン筋肉」の動作に成功した.電気駆動に関しては,安定した製造方法と反応速度の向上については今後検討する必要があるものの,ほぼ当初の目的であった動作性能を実現することができた.多繊維化に関しては,紡錘状筋肉を対象に多繊維化に伴う筋肉間の干渉をモデル化し,細径人工筋肉単体の特性と多繊維化した場合の特性を理論と実験から検討し,多繊維化により収縮率が10%程度上昇することを示した.2筋骨格ロボット機構に関しては,一昨年度の脚,腕,昨年度の顎の動作実現に加え,首および脛骨へ適用,動作に成功し,超冗長駆動システムの駆動が本多繊維人工筋で行えることを実証した.以上のように,2については,研究が当初計画より約1年前倒しに当初目標を達成し,1の電動化については安定した製造方法と反応速度の向上については今後検討する必要があるものの,4年間でほぼ当初の目的を達することができた.今後はさらに高性能化を目指して油圧駆動に取り組みたい.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。現在の人型ロボットと実際のヒトの身体の駆動機構は大きく異なっており,これが両者の運動特性に様々な違いを生んでいる.しなやかで「生き物らしい」運動特性を持ったロボットを実現するには,十分な収縮能力を持ち,集積して超多自由度機構を駆動できる「人工筋」の実現が鍵となる.本研究では,1「電気駆動」と「多線維構造」を特徴とする「次世代マッキベン人工筋」を実現し,2「筋骨格ロボット機構」に適用してその可能性を実証することを目的としている.1マッキベン人工筋の電気駆動と多繊維構造化に関しては,本年度はナフィオン膜の両面に電極形勢ならびに白金メッシュを組み込んだ構造とすることで,発生した酸素と水素をナフィオン膜表面に保持することを可能とし,その結果,それまで数10秒かかった気液変換応答を,1秒程度の応答に向上させることができた.これにより実用的な応答速度を持つ電気駆動マッキベン人工筋の実現に目処がたった.また,多繊維化に関しては,数10本100本程度の集積化と端末処理技術を確立し,その特性を明確にした.2筋骨格ロボットに関しては,人体の下肢および上肢を真似た冗長駆動の筋骨格ロボット機構を試作し,実際の人体に近い動作特性を示すことを実証した.現在の人型ロボットと実際のヒトの身体の駆動機構は大きく異なっており,これが両者の運動特性に様々な違いを生んでいる.しなやかで「生き物らしい」運動特性を持ったロボットを実現するには,十分な収縮能力を持ち,集積して超多自由度機構を駆動できる「人工筋」の実現が鍵となる.本研究では1「電気駆動」と「多繊維構造」を特徴とする「次世代マッキベン人工筋」を実現し,2「筋骨格ロボット機構」に適用してその可能性を実証することを目的としている.1マッキベン人工筋の電気駆動と多繊維構造化に関しては,本年度は新たにプロトン広間膜とその電極形成の専門家を研究分担者として追加し,柔軟で薄肉円筒状のプロトン交換膜の形成,ならびに,収縮/弛緩(水分解/合成)のどちらの過程においてもある程度早い反応を行うデバイスの開発に注力した.その結果,数秒10秒程度の応答性を持つアクチュエータの開発に成功した.また,弛緩時にエネルギー回収を行うことによりエネルギー効率の向上も実証できた.2筋骨格ロボットに関しては,上腕,下肢の筋骨格駆動系を構成した.下肢については,人間の下肢とほぼ同様の筋骨格駆動系を実現した.この際,整形外科医にもアドバイスをもらい進めた.その結果,冗長駆動が良好に行え,特に膝において人間と極めて近い運動学特性の実現に成功した.また支えながらではあるが,歩行にも成功した.上肢についても,尺骨/橈骨のツイスティングによる前腕の旋回動作など,筋骨格駆動系特有の運動の実現に成功した.1マッキベン人工筋の電気駆動と多繊維構造化に関しては,柔軟で薄肉円筒状のプロトン交換膜の形成,ならびに,収縮/弛緩(水分解/合成)のどちらの過程においても数秒10秒程度の応答性を持つアクチュエータの開発に成功した点,また,弛緩時にエネルギー回収を行うことによりエネルギー効率の向上も実証できた点を評価する.ただし,性能特性についてはさらに改善の余地があるので,引き続き継続する.2筋骨格ロボットに関しては,上腕,下肢の筋骨格駆動系を構成し,人間の下肢,上肢とほぼ同様の筋骨格駆動系を実現した.具体的には,良好な冗長駆動の実現,人間と極めて近い運動学特性の実現,歩行,前腕の旋回動作など,筋骨格駆動系特有の運動の実現に成功した点を評価する.現在の人型

ロボットと実際のヒトの身体の駆動機構は大きく異なっており,これが両者の運動特性に様々な違いを生んでいる.しなやかで「生き物らしい」運動特性を持ったロボットを実現するには,十分な収縮能力を持ち,集積して超多自由度機構を駆動できる「人工筋」の実現が鍵となる.本研究では1「電気駆動」と「多繊維構造」を特徴とする「次世代マッキベン人工筋」を実現し,2「筋骨格ロボット機構」に適用してその可能性を実証することを目的としている.1マッキベン人工筋の電気駆動と多繊維構造化に関しては,本年度は,前年度までに開発したプロトン交換膜を,筋肉やロボットに適用した.具体的には,バックス型人工筋,マッキベン型人工筋,自立型ロボットに適用し,電気でコントロールできる人工筋,ならびに完全自立のガス圧駆動ロボットの動作に成功した.2筋骨格ロボットに関しては,顎関節機構を実現し,従来のモータでは不可能であった省スペースへの配置,ならびに,冗長駆動を実現し,人間の顎と類似した動きの実現に成功した.また,多繊維化に伴う筋肉間の干渉をモデル化し,多繊維紡錘筋の動作モデルを作り上げた.1マッキベン人工筋の電気駆動と多繊維構造化に関しては,バックス型人工筋,マッキベン型人工筋,自立型ロボットに適用し,電気でコントロールできる人工筋,ならびに完全自立のガス圧駆動ロボットの動作に成功した点を評価する.2筋骨格ロボットに関しては,顎関節機構を実現し,従来のモータでは不可能であった省スペースへの配置,ならびに,冗長駆動を実現し,人間の顎と類似した動きの実現に成功した点,ならびに,多繊維化に伴う筋肉間の干渉をモデル化し,多繊維紡錘筋の動作モデルを作り上げた点を評価する.現在の人型ロボットと実際の人の身体の駆動機構は大きく異なっており,これが両者の運動特性に様々な違いを生んでいる.しなやかで「生き物らしい」運動特性を持ったロボットを実現するには,十分な収縮能力を持ち,集積して超多自由度機構を駆動できる「人工筋肉」の実現が鍵になる.本研究では,1「電気駆動」と「多繊維構造」を特徴とする「次世代マッキベン人工筋肉」を実現し,2「筋骨格ロボット機構」に適用してその可能性を実証することを目的としている.1マッキベン人工筋肉の電動化に関しては,本年度は,プロトン交換膜表面の電極形成の工夫により,12秒程度の速さで動作する「電動細径マッキベン筋肉」の動作に成功した.電気駆動に関しては,安定した製造方法と反応速度の向上については今後検討する必要があるものの,ほぼ当初の目的であった動作性能を実現することができた.多繊維化に関しては,紡錘状筋肉を対象に多繊維化に伴う筋肉間の干渉をモデル化し,細径人工筋肉単体の特性と多繊維化した場合の特性を理論と実験から検討し,多繊維化により収縮率が10%程度上昇することを示した.2筋骨格ロボット機構に関しては,一昨年度の脚,腕,昨年度の顎の動作実現に加え,首および脛骨へ適用,動作に成功し,超冗長駆動システムの駆動が本多繊維人工筋で行えることを実証した.以上のように,2については,研究が当初計画より約1年前倒しに当初目標を達成し,1の電動化については安定した製造方法と反応速度の向上については今後検討する必要があるものの,4年間でほぼ当初の目的を達することができた.今後はさらに高性能化を目指して油圧駆動に取り組みたい.1本研究の成功の鍵となるナフィオン膜を用いた気液化学反応を1秒程度の応答性でコントロールできるようになった.2数10本100本程度の集積化と端末処理技術を確立した.3人体の下肢および上肢を真似た冗長駆動の筋骨格
分子種の異なるヘムを有する呼吸鎖末端酸化酵素の機能部位の解析

古細菌Halobacteriumhalobiumに存在する末端酸化酵素(aa_3型)は、大腸菌のユビキノール酸化酵素(bo型)と共に、ヘム・銅末端酸化酵素のスーパー・ファミリーに属する。しかしながら、両者の間には、構成サブユニットの遺伝子配列や生理的な呼吸基質、第二の活性中心における銅原子の有無、結合するヘムの種類といった違いがあり、反応機構上の相違を反映している可能性がある。また、別の分子種のヘムを活性中心に持つ末端酸化酵素も本研究室で精製されている。そこで、本研究では、呼吸鎖電子伝達系の末端酸化酵素の機能部位の構造と機能の相関性を知ることを目的として、PCR法によってまず未同定のタイプの末端酸化酵素遺伝子のクローニングを行った。好アルカリ菌のあるものはaco型の、磁性細菌Magnetospirillumではcbb型の末端酸化酵素が当研究室で精製されている。これら新しいタイプの末端酸化酵素の遺伝子を単離した。前者については、さらにその転写単位を構成する構造遺伝子群が遺伝子ライブラリーより得られており、その構造解析を行った結果、活性中心近傍のアミノ酸配列からはヘムOの存在を規定する分子構造は特定されない一方で、3つのサブユニットの構造遺伝子の5'側にヘムO合成酵素が、またそのしばらく上流にヘムA合成酵素(HAS)がコードされていた。HASの生化学的研究は、本酵素の金属中心に配位するヘムの分子種の選択性を決定する要因を解明する手がかりを提供するものと期待される。他方、サブユニットIIに融合したチトクロムc部分の塩基性アミノ酸残基の置換はアルカリ適応への寄与を、膜表在領域の残基のBacillus PS3酵素との酷似は蛋白の耐熱性を示唆するものである。今後は大腸菌の発現系を用いて、変異導入やキメラ作製による触媒活性の変化を調べ本酵素の作用機構を明らかにする予定である。
プロテオミクスをベースにした化学シグナル解析技術開発

「ChemProteoBaseの拡充化・高度化、並びに、改変CETSAの開発」:昨年度に引き続き、ChemProteoBase(間接法)解析の精度向上のために、作用標的の明らかな標準化合物のプロテオーム解析を行い、ChemProteoBaseのデータベース拡充を行った。解糖系やTCA回路などのエネルギー代謝に関わるたんぱく質に着目して解析する手法を開発した。同定済みの274スポットのうち解糖系の24スポット8たんぱく質、並びに、TCAサイクルに関与する12スポット9たんぱくの薬剤処理による変動をスコア化して、簡便に評価できるシステムを作成した。本系を用いて、スクリーニングで得られた天然物並びに、化合物バンクの化合物を評価し、Unantimycin A, NPL40330がミトコンドリアに作用することを見出した(Biochim Biophys Acta, 1867: 28-37, 2019)。また、癌幹細胞様細胞を用いたスクリーニングによって取得された化合物NPD2381がセリン合成経路内の酵素の発現量を増加させることを見出し、ミトコンドリアを標的とすることを示した(FEBS Lett, 593:763-776, 2019)。昨年度、コントロール化合物を用いて2DE-CETSAの解析系を構築したが、スクリーニングで得られた化合物について解析を進めた。「有用生物活性リガンドの開発」:細胞の代謝制御機構を標的とした標的ベースの探索、あるいは、セルベースの探索を行った。ユニークな化学構造をもつキノコの新規生理活性物質ヒトヨポディンAを単離した(Org Lett, 20: 6294-6297, 2018)。また、上記システムから得られた結果に基づく解析を行い、Unantimycin A, NPL40330の標的がそれぞれ複合体III、複合体Iであることを明らかにした。作用標的の明らかな既知物質を用いたChemProteoBaseのデータベースの拡張やシステムの開発は順調に進んでおり、様々な標的に対応する可能性を高めている。これらの解析系を用いて生理活性物質を解析することによって、共同研究を通した幾つかの成果に結びついた(Biochim Biophys Acta, 1867: 28-37, 2019; FEBS Lett, 593:763-776, 2019; Mol Pharm, 16: 1423-1432, 2019)。また、2-D DIGEを利用した2DE-CETSAの解析系の構築については、スタンダードの化合物を用いた条件検討がすみ、その条件を用いて、探索研究で得られた化合物について解析を行った。、化合物の標的に対する実証実験も進みつつあることは、予想以上に計画が進んでいることを示している。さらに、系の構築を進め、今までのChemProteoBaseと組み合わせることによって、より多様な標的に対応した解析が可能となることが期待される。1)引き続きChemProteoBaseの拡張のための既知化合物の解析を行うほか、スポットの同定情報を考慮した解析法を改良することによって、迅速でより情報量の多い結果を返すシステムの構築を行う。2)2DE-CETSAの解析系については改良を行うことによって、より良い解析系を構築していく。新規化合物の解析に応用することによって、化合物の標的たんぱく質を明らかにすることを通して、解析系の有用性を示す。3)有用生物活性リガンドの開発のために、化合物アレイによる標的ベース探索・細胞表現型に基づくセルベース探索を行い、そこで得られた化合物について、ChemProteoBase解析や2DE-CETSAの解析系を適応し、解析系の有用性を示すほか、新規化合物の標的を解析する。さらに、プロジェクト内の新規化合物の解析を行うことによって、プロジェクトに貢献する。「ChemProteoBaseの拡充化・高度化、並びに、改変CETSAの開発」:新たに2-D DIGEを利用した2DE-CETSAの解析系(直接法)を構築するために、まず、標的既知の化合物について、HeLaライゼートを用いて化合物存在下・非存在下のサンプルについて45°Cから65°Cの範囲で熱処理した。変性たんぱく質を遠心で除去したのち、1次元のSDS-PAGEを行い、抗体を用いて検出することによって、化合物の標的たんぱく質の安定性に変化があることを確認した。検討した化合物の1つであるゲルダナマイシンを用いてサンプルを調製し、2次元電気泳動を行い、2-D DIGEのシステムを用いて定量解析を行なったところ、阻害剤の標的分子であるHSP90ファミリーたんぱく質の熱安定性が他のタンパクに比べ顕著に増加した。この結果により本解析系が化合物の標的解析に有効であることが示唆された。「有用生物活性リガンドの開発」:細胞の代謝制御機構を標的とした生物活性リガンドを効率的に取得する目的で、化合物アレイを用いた標的ベースの探索や細胞表現型を指標としたセルベースの探索を行なった。作用標的の明らかな既知物質を用いたChemProteoBaseのデータベースの拡張は順調に進んでおり、様々な標的に対応する可能性を高めている。以前からの共同研究が、幾つかの成果に結びついた(Angew Chem Int Ed Engl 2017, J Antibiot 2017)。また、2-D DIGEを利用した2DE-CETSAの解析系の構築については、スタンダードの化合物を用いた条件検討を行い、条件がかなり絞り込めたことは、予想以上に計画が進んでいるところである。

さらに、その条件を用いて、探索研究で得られた化合物について、解析を進めているが、熱安定性に変化があるたんぱく質が化合物によって異なることが明らかになっており、幾つかの候補たんぱく質も見出されている。系を確立し解析を進め、今までのChemProteoBaseと組み合わせることによって、より多様な標的に対応した解析が可能となることが期待される。「ChemProteoBaseの拡充化・高度化、並びに、改変CETSAの開発」:昨年度に引き続き、ChemProteoBase(間接法)解析の精度向上のために、作用標的の明らかな標準化合物のプロテオーム解析を行い、ChemProteoBaseのデータベース拡充を行った。解糖系やTCA回路などのエネルギー代謝に関わるたんぱく質に着目して解析する手法を開発した。同定済みの274スポットのうち解糖系の24スポット8たんぱく質、並びに、TCAサイクルに関与する12スポット9たんぱくの薬剤処理による変動をスコア化して、簡便に評価できるシステムを作成した。本系を用いて、スクリーニングで得られた天然物並びに、化合物バンクの化合物を評価し、Unantimycin A, NPL40330がミトコンドリアに作用することを見出した(Biochim Biophys Acta, 1867: 28-37, 2019)。また、癌幹細胞様細胞を用いたスクリーニングによって取得された化合物NPD2381がセリン合成経路内の酵素の発現量を増加させることを見出し、ミトコンドリアを標的とすることを示した(FEBS Lett, 593:763-776, 2019)。昨年度、コントロール化合物を用いて2DE-CETSAの解析系を構築したが、スクリーニングで得られた化合物について解析を進めた。「有用生物活性リガンドの開発」:細胞の代謝制御機構を標的とした標的ベースの探索、あるいは、セルベースの探索を行った。ユニークな化学構造をもつキノコの新規生理活性物質ヒトヨポディンAを単離した(Org Lett, 20: 6294-6297, 2018)。また、上記システムから得られた結果に基づく解析を行い、Unantimycin A, NPL40330の標的がそれぞれ複合体III、複合体Iであることを明らかにした。作用標的の明らかな既知物質を用いたChemProteoBaseのデータベースの拡張やシステムの開発は順調に進んでおり、様々な標的に対応する可能性を高めている。これらの解析系を用いて生理活性物質を解析することによって、共同研究を通した幾つかの成果に結びついた(Biochim Biophys Acta, 1867: 28-37, 2019; FEBS Lett, 593:763-776, 2019; Mol Pharm, 16: 1423-1432, 2019)。また、2-D DIGEを利用した2DE-CETSAの解析系の構築については、スタンダードの化合物を用いた条件検討がすみ、その条件を用いて、探索研究で得られた化合物について解析を行った。、化合物の標的に対する実証実験も進みつつあることは、予想以上に計画が進んでいることを示している。さらに、系の構築を進め、今までのChemProteoBaseと組み合わせることによって、より多様な標的に対応した解析が可能となることが期待される。
炎症シグナルと接着シグナルのクロストーク

インテグリンからのシグナル伝達を行う蛋白質について、炎症シグナルへの反応にどのように関わっているのかを調べた。Cas-L/Hefl/Nedd9は、インテグリン下流のアダプター分子p130Casのファミリー蛋白質である。これまでにリンパ球での機能は報告されていたが、好中球での役割は不明であったので解析した。Cas-Lは、好中球において、LPS,TNF,fMLPなどでチロシンリン酸化を受けた。TNF,fMLPによるリン酸化は、細胞接着によって増強した。また、Cas-L,ノックアウトマウス由来の好中球は、fMLPによる細胞運動の亢進が認められた。p130Cas結合分子で、マトリックスメタロプロテアーゼやコラーゲンを転写調節し、BMPシグナルに関与して骨量を抑制するCIZについても解析を行った。CIZは蛋白質レベルでもコラーゲンのC末端と核内で結合し、この結合が、コラーゲン自身の転写を抑制していることが示唆された。CIZノックアウトマウスに血清移入関節炎を適用したところ、野生型よりも関節炎が軽度であった。炎症細胞浸潤、関節面破壊、破骨細胞活性化を見ても、野生型よりも軽度であった。関節炎部位での種々の遺伝子の発現を調べたところ、CIZノックアウトマウスにおいて、IL-1β,RANKL,MMP3などサイトカイン、ケモカイン、タンパク分解酵素などの発現誘導が低下していた。一方で、炎症性の遺伝子でも、同様に誘導されているものもあり、転写因子としてのCIZの転写制御がこの表現型に関わっている可能性が示唆された。インテグリン下流のドッキングタンパク質Cas-L/Hef1/Nedd9が、好中球で発現し、fMLP,TNF,LPSなどの刺激でチロシンリン酸化を受けることを見いだしていたので、さらに解析を行った。Cas-Lのチロシンリン酸化は、fMLP,TNF刺激においては、細胞接着によって大幅に増大したが、LPS刺激においては、接着による差は少なかった。接着させる基質の種類によりリン酸化の増大の程度に差を認めた。好中球において、Cas-Lの細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いた蛍光免疫染色によって解析したところ、接着斑に局在していた。これらのことから、Cas-Lが、好中球においても、接着斑からのシグナルに関与していることが示唆された。Cas-Lノックアウトマウスから骨髄の好中球を分離し、fMLPで刺激したところ、Cas-L-/-の好中球は、形態変化の程度がCasL+/+の好中球よりも有意差をもって小さかった。K/BxN血清やコラーゲン投与によるリウマチ発症モデルを計画していたが、マウスの繁殖が一時的に困難となったため、計画が遅れている。2006年末には繁殖が再開したので、現在は、コラーゲン投与リウマチモデル(CIA)を行い、リウマチ発症の経過を観察しているところである。Cas-Lに関する研究の過程で、カルパイン阻害剤が、単独で、ヒト末梢血好中球で、ERKのリン酸化を引き起こすことを偶然見いだしていたが、その後の研究でERKだけでなく、p38,JNK,Aktなどのリン酸化も引き起こすことが判明した。ヒト末梢血単球においても同様の現象が認められたが、リンパ球ではカルパイン阻害剤によるこれらの変化は認めなかった。このことから、貪食細胞において、カルパインの基礎活性がシグナルの非特異的な活性化を抑制していることが示唆された。インテクリンからのシグナル伝達を行う蛋白質について、炎症シグナルへの反応にどのように関わっているのかを調べた。Cas-L/Hef1/Nedd9は、インテグリン下流のアダプター分子p130Casのファミリー蛋白質である。これまでにリンパ球での機能は報告されていたが、好中球での役割し不明であったので解析した。

TNF,fMLPによるリン酸化は、細胞接着によって増強した。また、Cas-Lノックアウトマウス由来の好中球は、fMLPによる細胞運動の亢進が認められた。p130Cas結合分子で、マトリックスメタロプロテアーゼやコラーゲンを転写調節するCIZについても解析を行った。CIZは蛋白質レベルでもコラーゲンのC末端と核内で結合し、この結合が、コラーゲン自身の転写を抑制していることが示唆された。CIZノックアウトマウスに血清移入関節炎を適用したところ、野生型よりも関節炎が軽度であった。炎症細胞浸潤、関節面破壊、破骨細胞活性化を見ても、野生型よりも軽度であった。関節炎部位での種々の遺伝子の発現を調べたところ、CIZノックアウトマウスにおいて、IL-1beta, RANKL, MMP3などサイトカイン、ケモカインタンパク分解酵素などの発現が低下していた。一方で、MMP-13, CXCL-12, CCL-2など炎症性の遺伝子の中でも、同様あるいはさらに誘導されているものもあり、転写因子としてのCIZの転写制御がこの表現型に関わっている可能性が示唆された。