hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分散環境に適した効率的な暗号データ共有法の研究

特にデータの参照だけでなく更新まで含めた場合の適切なアクセス制御方式を実現することに成功した.また属性ベース暗号で暗号化されたデータに対し検索機能を追加する方式を提案した.今まではそれぞれが別個に考えられてきたが両方を同時に実現する際にどのような方式があるかを明らかにした.また重要なアプリケーションである暗号文検索においてブルームフィルタと呼ばれるデータ構造を用いることでより使い勝手のよい類似検索機能を実現し,より現実世界で採用される可能性の高い方式を実現した.また今まであまり考慮されていなかった攻撃の可能性を検索可能暗号において指摘し,実際に問題となりうることを検証した.検索可能暗号とその攻撃可能性に関する論文はジャーナル論文への投稿を行うため更なる推敲を行う.また属性ベース暗号に関する論文は現時点では公開鍵パラメータの数が多いという欠点があり,安全性の証明が未完成という状態であるため国際学会への投稿を目指し,完成へ向けて更なる検討と調査を進める.特に属性ベース暗号においては公開鍵パラメータをより減少させるためのヒントとなりうる既存研究を深く調査し,実用可能な方式の構成を目指す.検索可能暗号としてブルームフィルタを用いる方式の提案を行った.この結果はまだ国内でのみ発表した結果であるため国際会議での採択に向けて更なる論文の推敲を重ね,投稿を目指していく.更に検索可能暗号への攻撃論文は攻撃の具体的な脅威を実験によって確認し,結果を更に説得力のあるものにまとめジャーナル論文としての投稿を目指していく.また属性ベース暗号において複数の鍵発行機関が存在する場合の構成法が日本の研究者らによって提案されたため,その方式の調査を行い,更なる改良として利用者のリボケーション(取り消し)機能などの追加の検討を進めていく.また属性ベース暗号の検索以外での有用なアプリケーションの検討についても調査を進める.公開鍵暗号や暗号プロトコルに関する重要な研究結果が発表される国際学会などへの参加費用に用いる.また論文が採択された場合は論文掲載別刷代への使用も計画する.また研究の途中成果に関しては国内の研究集会へ参加し,他の専門家からの意見を得て研究の改良を進める.公開鍵暗号や暗号プロトコルのついてトップレベルの研究成果が発表される国際会議などへの参加費用に主に用いる.また研究の途中で得られた結果については国内の研究集会へ参加し,積極的に発表を行い,他機関の専門家たちからフィードバックを得て,研究の改良を進めていく.また属性ベース暗号のペアリング技術以外からの構成法を検討するためにLatticeと呼ばれる数学的構造を調査するための専門書などの購入についても計画する.
視床下部腹内側核に作用して走行運動を調節する物質を発見する

予備的な研究で、ラット脳の視床下部に自発的な運動を引き起こす部位が存在することを明らかとしていた。本研究ではその部位の活動を調節するような物質の探索を行った。その結果、下垂体後葉ホルモンであるオキシトシンがその脳部位の活動を高め、脂肪が分泌するホルモンであるレプチンが抑制し、運動の発現も調節することが明らかとなった。健康的な生活を送る上で運動を行うことはとても重要である。しかし実際に運動を始めるのは辛いものである。本研究で発見した知見が人に応用できるようになれば、容易に運動を始められるようになり、健康の維持に大きく役に立つことが期待できる。視床下部腹内側核に作用して走行運動を調節する物質を発見することを目的として、以下の実験を行った。まずは申請時の時点で、運動を調節する物質の候補としてレプチンを挙げていた。レプチン受容体の作動薬は以前から入手可能であったが、効果の期待できる阻害薬は手に入らなかった。しかし近年レプチン受容体阻害薬(super leptin receptor antagonist)が作成販売されるようなり、薬物による受容体の作用をブロックし効果を検討することが可能なったので、これを用いて実験を行った。回転かごが付属したケージを用いラットを飼育し、回転数を記録することにより行動量の測定を行った。ラットに72時間の絶食を負荷すると行動量が劇的に増加した。絶食の負荷と同時に浸透圧ポンプを用いて腹腔内に持続投与しレプチンを補うと、この絶食により引き起こされる行動量の増加は抑制された。我々の以前の研究より、視床下部腹内側核に走行運動の発現を調節する神経細胞群が存在することを明らかとしてきた。また視床下部腹内側核にはレプチン受容体が発現していることが明らかにされている。そこで絶食の負荷と共に視床下部腹内側核へのレプチンの局所投与を行ったところ運動量の増加が抑制された。このことは絶食により体内の白色脂肪の減少と血中レプチン濃度の低下が引き起こされ、それが視床下部腹内即を介して走行運動の増加を引き起こした可能性が考えられる。この仮説における視床下部腹内側核の役割を確かめるために、絶食の負荷と同時に浸透圧ポンプを用いて腹腔内に持続投与しレプチンを補い、視床下部腹内側核にレプチン受容体阻害薬を投与したが、生理食塩水を投与した対照群と比べて有意な差は得られなかった。絶食による行動変化やそれに対するレプチンの作用は、回転かごによる運動量の測定により明確に評価できている。一方、レプチン受容体阻害薬を用いた実験については、有意差のある結果は現時点では得られていない。これは実験条件を再検討し、追加実験が必要である。まずは申請時の時点で、予備実験でオキシトシンがラット視床下部に作用して走行運動を誘発するという結果を得ていた。そこでこのオキシトシンの作用を明確にするために詳細な実験を行った。そのためにオキシトシン作用の部位特異性、オキシトシン受容体阻害薬の同時投与、バゾプレシン投与による類似効果の有無、エストロゲン前投与による作用増強を検討した。その結果、オキシトシンの作用は視床下部腹内側核の背内側部で最も強い効果が得られ、一方視床下部外側野などの近傍では有意な効果は得られなかった。またオキシトシンの作用は受容体阻害薬の同時投与で有意に抑制された。またオキシトシンと構造が近似しているバゾプレシンでは同様の作用は得られなかった。オキシトシン受容体の発現を増加させる効果があるエストロゲンの前投与により、オキシトシンの作用は増強された。オキシトシンはホルモンや神経伝達物質をして作用しているだけでなく、経鼻投与により薬物と効果を発揮するという数々の研究が発表されている。今回発見されたオキシトシンの新しい効果についても、この方法により再現できる可能性が考えられる。そして自発運動量をオキシトシン処置によりコントロールすることが出来れば、生活習慣病や肥満など現代人が抱える健康問題を解決するのに大きく役立つことが期待できる。本研究の課題名の通り、視床下部腹内側核に作用して走行運動を誘発する物質として新たにオキシトシンを発見した。オキシトシンは初年度に報告したレプチンとあわせ、肥満や摂食調節、発達障害などに関与することが知られていて近年多くの注目を集めている物質である。これらの物質で、自発運動量を調節するという新たな作用が見つかったことは、大きな意義があると考えている。前年度までの研究成果で、オキシトシンをラット脳内の特定部位に投与すると、走行運動が誘発されるという知見が得られていた。この効果はオキシトシンを視床下部服内即核の腹外側部に投与したときに最も強くなった。これはこの部位にエストロゲン受容体が多く発現していること、エストロゲンがオキシトシン受容体の発現を促進することを併せて考えると、理にかなった結果であると考えられる。一方、バソプレシンはオキシトシンと同じく下垂体後葉ホルモンで構造も類似している。そして様々な行動発現に関与していることが報告されている。昨年度の結果では、視床下部腹内側核へのバソプレシンの投与により有意な走行運動の誘発は観察されなかった。

そこでバソプレシンの投与部位について詳細に組織学的検討を行うために、視床下部腹内側核を背内側部、中央部、腹外側部に分け、投与部位と走行運動発現との関連を再検討した。するとバソプレシンを視床下部腹内側核の背内側部、腹外側部に投与した場合、走行運動の変化は認められなかったが、中央部に投与した動物では統計学的な有意差は得られなかったが、走行運動の増加が認められた。オキシトシンとバソプレシンは構造が類似しているので、互いの受容体に親和性を持っている。そのためバソプレシンがオキシトシン受容体を介して効果を発揮した可能性が考えられる。本研究で得られた結果は統計学的な有意差が認められなかったので限定的な考察しか出来ないが、効果の得られた投与部位がオキシトシンは視床下部腹内側核の腹外側部、バソプレシンが中央部であったことを考えると、それぞれの作用機序が異なる可能性が考えられる。バソプレシンは神経伝達物質として概日リズムの発現など、様々な行動発現に関与していることが知られている。本研究の知見より、この概日リズムの発現にバソプレシンー視床下部腹内側核の神経経路が関与している可能性が考えられる。予備的な研究で、ラット脳の視床下部に自発的な運動を引き起こす部位が存在することを明らかとしていた。本研究ではその部位の活動を調節するような物質の探索を行った。その結果、下垂体後葉ホルモンであるオキシトシンがその脳部位の活動を高め、脂肪が分泌するホルモンであるレプチンが抑制し、運動の発現も調節することが明らかとなった。健康的な生活を送る上で運動を行うことはとても重要である。しかし実際に運動を始めるのは辛いものである。本研究で発見した知見が人に応用できるようになれば、容易に運動を始められるようになり、健康の維持に大きく役に立つことが期待できる。絶食による運動の増加が、視床下部腹内側核のレプチン受容体を介して発現することを明らかにする。そのために前年度より継続して、絶食を負荷したラットを用いてレプチン受容体阻害薬を用いた実験を行う。これが明らかとなれば、栄養状態により運動量が変化する機構を説明できる事が期待できる。またレプチン受容体の細胞内シグナル伝達にはJAK、PI3Kがあることが知られている。そのために薬物を用いてこれらシグナル伝達系の活性化もしくは阻害を行い、それらが運動量の調節に関わるか検討する。これが明らかとなれば、運動量を調節する薬物の開発につながることが期待できる。またレプチン以外の物質で視床下部腹内側かに作用して運動量を調節する物質を検索する。候補として行動量の調節に関与していると示唆されているいくつかのホルモンとそれら受容体の作動薬、阻害薬の候補をいくつか考えている。これらの実験により、内部環境の変化に応じて行動量が変化する機構を明らかにすることが出来る。今回明らかとしたオキシトシンの作用はラット脳内に直接薬物を投与する方法を用いている。一方、オキシトシンは噴霧などによる経鼻投与によっても特定の作用を発揮するという報告が出されている。そこで今後は、本研究で見いだしたオキシトシンの自発運動に対する効果がオキシトシンの経鼻投与によっても発揮されるか、実験動物を用いて検討する。この投与方法によっても有効な効果が得られるならば、人への応用に大きく前進することが期待できる。生理学おおむね予定通りの支出をしている。
HTLV-1中和エピトープの同定および抗HTLV-1ペプチドワクチンの開発

ヒト型の抗HTLV-1モノクローナル抗体(mAb)を用いて、HTLV-1の中和エピトープを詳細に解析した後、HTLV-1ペプチドワクチンの作製が可能か否かについて検討した。まず、HAM/TSP患者末梢血Bリンパ球にEpstein Barr virus(EBV)を感染させ、HTLV-1 envelope gl-ycoprotein(gp46)と結合する抗HTLV-1 mAbを多数作製した。153種のgp46と結合するmAbの内、24種が中和活性を有していた。これらの中和mAbの内、13種がgp46 peptide 175-199と反応し、1種がgp46peptide 213-236に,他の1種がgp46 peptide 288-317と結合した。9種のmAbは結合するpeptideが同定できなかった。また、gp46 pepti-de 175-199と結合するmAbを用いて、4つの異なる中和エピトープ;(1)187-193,(2)191-191,(3)193-199,(4)continuousconformat-ional Bcell epitope,をその領域内に同定し、gp46a.a.187-199をprinciple neutralizing determinant(PND)と命名した。液相のペプチドを用いた競合実験により、PND natural gp46 proteinの中和エピトープと極めて類似した構造をとることから、ペプチドワクチンの良い候補と考えられた。そこで、PNDを含む様々なペプチドワクチンを合成し、ラットあるいはラビットに免疫し、高力価の中和抗体を誘導することに成功した(J.Immunol in press,1994).今後、HTLV-1 T cell epitopeの解析をさらにすすめ、より効率良く中和抗体を誘導するペプチドワクチンの開発を目指す予定である。まず、種々のHTLV-I感染者末梢血のBリンパ球にEBVを感染させ、抗HTLV-I抗体産生Bリンパ球レパートリーを検討し、(1)HAM/TSPにおいてnon-HAM/TSP carrier、ATLLに比しHTLV-I抗体産生Bリンパ球の頻度が著しく増加していること、(2)これらの抗HTLD-I抗体はHTLD-Iに対し高アフィニティーで特異性が高いことが明らかとなった。また、(3)末梢血中のHTLV-I proviral DNA量と血清抗HTLV-I抗体価が正に相関することを見出した。これらよりHAM/TSPにおけるHTLD-Iに対する免疫応答の増強機序として、HTLV-Iウイルス量の増加による抗原依存性のメカニズムが示唆された。また、HTLV-I env及びgag蛋白を網羅した合成ぺプチドに対する血清抗体価の検討より、HAM/TSPにおいて特にHTLV-I envtransmembrane蛋白(P20E)に対する抗体価が上昇していることを見出し、HAM/TSPにおけるCTLの増加とHTLV-I感染細胞の破壊の増強が示唆された。また、HTLV-Iに対する血清中和抗体価もHAM/TSPにおいて著明に増加していることを見出した。次に、HAM/TSP患者末梢血よりヒト型抗HTLV-Iモノクローナル抗体を多数作製し、中和エピトープのマッピングを行った。

その結果env gP46 175-199の部位に中和エピトープが集中し、中和エピトープはgP46 187-193を認識するKE36-11type、gP46 191-196を認識するLAT-27type、gP193-199を認識するT-2type及びgP46 175-199の立体構造を認識するB1-1typeに分類できることを世界で初めて明らかとした。以上、HTLV-I中和抗体の約60%以上は、gP46 175-199上の10-20merのlinear epitopeと反応することから、この部位はHTLV-Iペプチドワクチン開発の良い候補と考えられる。そこで、上記中和エピトープを含む様々な合成パプチドをデザインし、ウサギやラットに免疫し、その中和抗体誘導能について現在詳細に検討を開始している。ヒト型の抗HTLV-1モノクローナル抗体(mAb)を用いて、HTLV-1の中和エピトープを詳細に解析した後、HTLV-1ペプチドワクチンの作製が可能か否かについて検討した。まず、HAM/TSP患者未梢血Bリンパ球にEpstein Barr virus(EBV)を感染させ、HTLV-1envelope g1-ycoprotein(gp46)と結合する抗HTLV-1 mAbを多数作製した。153種のgp46と結合するmAbの内、24種が中和活性を有していた。これらの中和mAbの内、13種がgp46 peptide 175-199と反応し、1種がgp46 peptid 213-236に,他の1種がgp46 peptide 288-317と結合した。9種のmAbは結合するpeptidが同定できなかった。また、gp46peptid 175-199と結合するmAbを用いて、4つの異なる中和エピトープ;(1)187-193,(2)191-196,(3)193-199,(4)continuous conformationalBcell epitope,をその領域内に同定し、gp46a. a.187-199をprinciple neutralizing determinant(PND)と命名した。液相のペプチドを用いた競合実験により、PNDはnatural gp46 proteinの中和エピトープと極めて類似した構造をとることから、ペプチドワクチンの良い候補と考えられた。そこで、PNDを含む様々なペプチドワクチンを合成し、ラットあるいはラビットに免疫し、高力価の中和抗体を誘導することに成功した。(J.Immunol inpress,1994)今後、HTLV-1 T cell epitopeの解析をさらにすすめ、より効率良く中和抗体を誘導するペプチドワクチンの開発を目指す予定である。
免疫グロブリン遺伝子導入マウスを利用したヒト型高親和性抗体の作製と抗体遺伝子解析

我々は、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスを用いて、ヒト型抗TSH受容体抗体の作製と同抗体遺伝子解析を試みている。本年度は、抗原であるTSH受容体の精製と解析をさらにすすめた。TSH受容体蛋白として、バキュロウイルス系のシステムによつて大量発現精製し、これを精製している。すなわち、我々はこれまでに以下の方法によりC末端にHis tagを融合させた可溶型TSHRの作成を行った。この方法によつて、我々は初めて細胞の培養上に可溶性TSHRを分泌させることに成功した。また、ヒトTSHRあるいはバキュロウイルスgp67蛋白質のシグナル配列を付加したTSHRの細胞外ドメインをコードするsTSHR-Wild(aa1-410)、sTSHR-gp(aa21-410)を作製し、その発現、性状を比較検討した。その結果、sTSHR-Wild及びsTSHR-gpは細胞上清画分から約58KDa、細胞抽出画分から約62、49KDaの蛋白質として検出された。両面分の可溶型TSHRのサイズの違いを検討するため、グリコシダーゼを用いて糖鎖の同定を行ったところ、細胞抽出画分の可溶型TSHRはハイマンノース型糖鎖を、細胞上清画分の可溶型TSHRは欠失型ハイマンノース型糖鎖を持っていた。さらにバセドウ病患者血清中の抗TSHR抗体との結合性を検討したところ、両面分から得られたsTSHR-Wild、sTSHR-gpどちらも抗TSHR抗体と結合したが、sTSHR-gpの方が抗体結合が高かった。また、TSHに対する結合性はsTSHR-gpの細胞上清画分にのみ確認された。これらのことから可溶性TSHRの細胞上清の分泌性には付加される糖鎖が重要であるが、抗体との結合には影響を与えないものと思われた。しかしシグナル配列の違いにより抗体結合性に差が生じたことから、バキュロウイルスのシグナル配列を付加した方がよりnativなTSHRを作製できるものと考えられた。ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XenoMouse II)供給を日本たばこ産業株式会社医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。今回我々は、これらのヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスを用いて、ヒト型抗TSH受容体抗体の作製と同抗体遺伝子解析を試みることにした。この研究によって、以前困難であつた高親和性ヒト型抗TSH受容体抗体の作製や抗体産主に使用される可変部遺伝子断片を解析の検討を予定している。本年度は、以下の点を研究した。1.抗原(TSH受容体)の準備トランスジェニックマウス疫するTSH受容体蛋白として、バキュロウイルス系のシステムによつて大量発現精製し、これを精製したらすなわち、我々はこれまでに以下の方法によりC末端にHis tagを融合させた可溶型TSHRの作成を行った。すなわちHisを6個コードしているオリゴヌクレオチド及び、それの相補的なオリゴヌ・クレオチドを作成し、これらをアニールさせpBac PAK9トランスファーベクターに組み込んだ。さらにヒトTSHRの細胞外ドメインをコードするcDNAをPCR法により増幅し、His tagを組み込んだトランスファーベクターに組み込み、His thg融合可溶型TSHR cDNAを作成した。そして作成したトランスファーベクターとpBac PAK6ウイルスDNAをSf9昆虫細胞にリポフェクション法によりトラシスフェクトし、これらDNAを昆虫細胞内で相同性組み替えを起こさせ、可溶型TSHRcDNAを組み込んだウイルスを作成した。そのウイルスを夕冫パクの発現量が高いHi five昆虫細胞に感染させ、可溶型TSHRを発現させた。そして発現させた細胞の培養土清画分、細胞抽出画分を作成しHistagを利用したニッケルアフィニティカラムによりそれぞれ精製を行い、可溶型TSHRの発現をウエスタンブロットはより確認した。2.抗体遺伝子導入トランズジェニツクマウスの準備ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XehoMouse II)供給を日本たばこ産巣(株)医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。今後、TSH受容体蛋白をゼノマウスに免疫し、ハイブリドーマ法によるヒト型モノクローナル作製の予定である。

さらにバセドウ病患者血清中の抗TSHR抗体との結合性を検討したところ、両面分から得られたsTSHR-Wild、sTSHR-gpどちらも抗TSHR抗体と結合したが、sTSHR-gpの方が抗体結合が高かった。また、TSHに対する結合性はsTSHR-gpの細胞上清画分にのみ確認された。これらのことから可溶性TSHRの細胞上清の分泌性には付加される糖鎖が重要であるが、抗体との結合には影響を与えないものと思われた。しかしシグナル配列の違いにより抗体結合性に差が生じたことから、バキュロウイルスのシグナル配列を付加した方がよりnativなTSHRを作製できるものと考えられた。ヒト免疫グロブリン遺伝子導入ゼノマウス(XenoMouse II)供給を日本たばこ産業株式会社医薬研究所・久保田から供給してもらうめどがついた。
Th_3P_4型三元系化合物の合成と物性に関する研究

補助金で購入した消耗品(原料粉末Eu, Yb等)および設備備品(赤外線ゴールドイメージ炉等)は試料合成に十分に活用され、次の成果を得るに至った。また補助金の一部は、成果の学会発表のための旅費として使用した。1.Th_3P_4型既知化合物MnGd_2S_4およびMgGd_2S_4の試料合成に成功し、各化合物の磁化率測定から次の新たな知見を得た。MnGd_2S_4は約40K以下の低温において強い磁気的フラストレーションを有しており、Mnを非磁性のMgで置換すると、この温度域におけるフラストレーションからは解放される。MnGd_2S_4ではさらに低温の約4Kで磁気モーメントがグラス凍結することが判明した。興味深いことに、MgGd_2S_4においても同様のグラス転移が約4.5Kで発現した。このことは、磁性元素を含む三元系で構成されるTh_3P_4型化合物において、磁気的フラストレーションがintrinsicなものであることを示唆している。2.MnGd_2S_4においてMnやGdを他元素で置換した未知のTh_3P_4型化合物は得られず、三元系でこの構造を形成するためには、カチオンの波動関数が球形に近いことが強く要請されると考えられる。3.Th_3P_4型結晶構造をとると言われるYbSb_4Te_7が、立方Th_3P_4型構造から菱面体晶型へと構造相転移している可能性が示唆され、現在、引き続き検討中である。4.anti-Th_3P_4型のEuあるいはYbを含む数種の三元系未知化合物の合成を試みたが、目的物質を得るには至らなかった。これは合成方法の改良により遂行可能と考えており、既知のanti-Th_3P_4型化合物を含めた系統的な物性研究を継続して行っていく予定である。上の成果や関連したスピネル型MnYb_2S_4に関する研究について、現在2編の論文を投稿準備中である。Th_3P_4型結晶構造をとることが報告されている三元系化合物から合成に着手し、周辺の関連構造をとる化合物も含めて研究を遂行中である。補助金で購入した消耗品(原料粉末Eu,Yb等)および設備備品(赤外線ゴールドイメージ炉等)は試料合成に十分に活用され、次の成果を得るに至った。1.Th_3P_4型既知化合物MnGd_2S_4の合成に成功した。磁化率の温度依存性を2Kまで測定した結果、低温においては強いフラストレーションの存在が認められ、スピンのグラス凍結も確認された。これは、Curie的な磁化率という従来の報告とは異なる新しい知見である。2.Th_3P_4型結晶構造をとる可能性が強いと考えた未知化合物MnEu_2S_4の合成は、現段階で成功に至っていない。3.Th_3P_4型に圧力誘起構造相転移すると知られる正スピネル型MnYb_2S_4の合成に成功し、磁化率測定による新たな知見として、低温でのフラストレーションが確認された。また合成実験の過程において、新規のfcc相も確認された。正・逆スピネル型では説明できないこの新規相の構造に関しては、継続して解析中である。4.Th_3P_4型結晶構造をとると言われるYbSb_4Te_7の合成を試行し、ほぼ単相の目的化合物が生成されたと考えられるのであるが、この化合物はTh_3P_4型構造をとっていないことが判明した。菱面体晶型へと構造相転移している可能性を検討中である。次年度は逆Th_3P_4型化合物の合成に重点を置き、上記の継続課題と併せて、研究の遂行・研究成果の発表を行う。

3.Th_3P_4型結晶構造をとると言われるYbSb_4Te_7が、立方Th_3P_4型構造から菱面体晶型へと構造相転移している可能性が示唆され、現在、引き続き検討中である。4.anti-Th_3P_4型のEuあるいはYbを含む数種の三元系未知化合物の合成を試みたが、目的物質を得るには至らなかった。これは合成方法の改良により遂行可能と考えており、既知のanti-Th_3P_4型化合物を含めた系統的な物性研究を継続して行っていく予定である。上の成果や関連したスピネル型MnYb_2S_4に関する研究について、現在2編の論文を投稿準備中である。
高分子電解質溶液における電気的・流体力学的相互作用の寄与する非平衡現象の研究

異方的な相互作用ならびに静電相互作用が本質的な寄与を果たす系の非平衡ダイナミクスを、特に不均一性という観点から研究した。まず、粒子の形状異方性が本質的な寄与を果たす系のガラス転移現象において、回転運動が非常に盛んな領域と、まれな領域とが不均一に存在しており、並進運動と密接に関連していること、回転運動の拡散と緩和の分離の起源になっていることを明らかにした。一般に配向の自由度を有する分子性液体などのガラス転移現象において、分子回転の運動不均一性という新たな知見を示唆するものであると考えている。次に、静電相互作用が本質的な寄与を果たす粒子系における数値計算方法の構築を行い、電場下の動力学を調べた。その結果、電極表面での電荷が不均一に分布しており、その不均一性に由来する系内部の不均一な電場を、連続体極限の理論と整合する形で得ることができた。ここで構築した手法は静電相互作用をする系に広く適用可能であり、多くの応用例が期待できるとともに、媒質中の電磁気学や、電極表面での分子の振る舞いに関する、基本的な問題を考察するうえで有用な概念を有する結果であると考えている。さらに、その方法を用いて、電気双極子を有する楕円体と不純物との混晶において、配向秩序の振る舞いを調べた。そこでは、秩序が巨視的には消失しているが、数粒子程度の短いスケールでは分極秩序が生き残り、不均一に分布していることが分かった。また、外部電場に対して大きな分極・ひずみの応答を、顕著な周波数分散をもちつつ示すことを発見した。これらはリラクサー強誘電体に類似の性質であり、複雑な不均一構造・ダイナミクスが上記の簡略化したモデルでよく再現できるという驚くべき発見である。不均一性が本質的な寄与を果たす物理系の機構を解明するうえで示唆に富む結果である。(抄録なし)異方性を有する粒子からなる系における相転移とガラス的挙動は、広く観測される現象であり、高分子における結晶化やガラス転移に留まらず、形状に弱い異方性のある分子によるプラスチック結晶の形成、細長い分子による液晶相の発現、また形状記憶合金におけるマルテンサイト相変態など、枚挙にいとまがない。また不純物を混入した系においては、不純物が大域的な秩序を破壊し、ガラス状態が実現されることが良く知られている。しかるにこのような系の理論的研究は各論によっている場合がほとんどであり、内部自由度を有する系の統一的な取り扱いによる理論的研究はされていなかった。そこで我々は、近似的に楕円体とみなせるような粒子と球形粒子の混合系を数値的に研究するために、粒子の配向を考慮した分子間相互作用のモデルを提案した。分子動力学シミュレーションを行った。その結果、単成分の楕円体粒子系においては、配向秩序の相転移とそれに伴う弾性率のソフト化、また特異な力学応答としての形状記憶効果を見出した。これは冶金においては有名な力学応答であるが、分子性あるいは高分子結晶においても同種の効果が観測されうることを示した最初の研究になっている。また不純物として球形の粒子を混入した系において、不純物の濃度を増やしていくと、配向秩序が消失し、配向ガラスを形成することを見出した。また、そのようなガラス化した結晶においても、配向秩序結晶と同様に形状記憶効果を示すことを発見した。この効果は高分子や分子性結晶においては観測されていないが、形状記憶合金に欠陥を導入したストレインガラスにおいては観測されており、ガラス性結晶一般の力学応答でも同様の効果がみられることを示唆している。

異方的な相互作用をする粒子系の分子動力学計算という、これまでに確立されていなかったモデル化を行い、その数値シミュレーションにより、実験において確認されている性質のみならず、実験に対して示唆を与える結果も見出した。また現在静電相互作用の寄与する現象のモデル化を進めており、高分子電解質溶液の電場応答や流動についての分子動力学計算という、これまでに類のない計算を行うことが可能になりつつあるという点で、進展が著しいと考えている。今後はこれまでに培ってきた異方的粒子系の動力学を、静電相互作用のある系に拡張し、外場下における非平衡ダイナミクスを調べる。具体的には分極粒子系の強誘電秩序が、不純物混入により、どのように影響されるかを調べる。また、高分子電解質の外場応答、流動場の寄与を、分子シミュレーションにより調べ、高分子の形態変化や、電荷の不均一な分布が、非平衡条件下ではどのように振舞うのかを明らかにしていく。(抄録なし)
血行不良部位における移植自家真皮の肉芽組織再生能のメカニズムの解明

現在、腱や骨の血行不良部位には、人工真皮による真皮様肉芽組織の構築後、植皮術を行っている。しかし、安定した生着は得られず、やはり人工真皮移植に比べ、自家真皮移植がより生物学的かつ理論学的に優れていると考えられる。そこで血行不良部位への自家真皮移植は可能か否かについて、ウイスター系ラットを用い、実験を行った。ラットの前頭部に1×1.5大の骨露出部を作成し、次のごとく5群に分け植皮を行い生着状況等の比較、検討を行った。1群:骨露出部を作り、そのまま放置とした。2群:骨露出部に人工真皮(ペルナック^R、興和)を貼付した。1週間tie over固定後、肉芽組織の増殖の程度を観察し、さらに、臀部より採皮し分層植皮術を行った。3群:臀部より自家真皮を採皮し骨露出部に縫着した。1週間tie over固定後、肉芽組織の増殖の程度を観察し、さらに、分層植皮術を行った。4群:骨露出部に分層植皮術、tie over固定を行った。5群:骨露出部に全層植皮術、tie over固定を行った。1週間後、それぞれの生着状況を比較し、組織学的検討を行った。1群では、骨露出部は2ヶ月半の間、上皮化せず骨が露出したままだった。2群では、1例中1例の分層植皮の生着を認めた。3群では4例中、2例の分層植皮が生着し、1例は現在、分層植皮を行っている。4群、5群では、それぞれ1例実験を行ったが、生着は認めなかった。それぞれについて、直下の頭蓋骨とともに植皮片を取り出し、組織学的検討を行っている。ラットは創傷治癒が早く、骨露出部の維持と決定に難渋した。途中経過ではあるが、血行不良部位への真皮移植の可能性を認めた。実験モデルとして、ウイスター系ラットを用いた。腹腔内にペントバルビタールを注射し麻酔を行った。その後、清潔野において、頭蓋骨の2×1cm大の骨露出を作成した。骨露出部前側には、臀部より採皮した真皮成分を、後側には人工真皮をそれぞれ移植した。湿潤環境を保つため、移植した真皮上にはシリコンシートを縫着し、タイ・オーバーによる固定を行った。真皮移植と表皮移植の時期の違いで次のように、5グループに分けた。(1)真皮移植と同時に表皮移植を行うグループ(2)真皮移植後24時間後に表皮移植を行うグループ(3)真皮移植後3日後に表皮移植を行うグループ(4)真皮移植後7日後に表皮移植を行うグループ(5)真皮移植後14日後に表皮移植を行うグループ現在、それぞれのグループで真皮および表皮移植を行い、表皮移植後1週間経過した時点でラットを安楽死させ、直下の頭蓋骨とともに移植片を摘出した。摘出した検体を20%ホルマリンで固定し、組織学的検査を行っている。これまでに得られた知見は、肉眼的評価ではあるが、骨露出部に移植した真皮が生着したラットもあった。これが骨表面から起きた新生血管と移植片の微小血管の再構築によるものであるのか、周囲組織からのbridge phenomenonであるのか、組織学的評価を行う予定である。当初の実験計画から変更した事柄としては、移植部位を脛骨前面から頭蓋骨へ変更した点である。脛骨前面では充分な骨露出表面は得られず、最も平坦な頭蓋骨を選択した。
Ire1による小胞体ストレス感知機構の解明

小胞体は分泌系タンパク質の高次構造形成が行われる細胞内小器官である。小胞体ストレス状態ではこのプロセスが阻害され、構造異常タンパク質が小胞体の内部に蓄積する。あらゆる真核生物の小胞体に存在するI型膜貫通タンパク質Ire1は、小胞体ストレスに応じて活性化し、小胞体ストレス応答を誘起する。代表的な小胞体ストレス応答としては、小胞体内在性分子シャペロン遺伝子の発現誘導を挙げることができる。本研究では、Ire1が小胞体ストレスを感知する、すなわち、小胞体ストレスに応じてIre1が活性化するメカニズムの解明を目指した。まず私は、小胞体ストレスに応じてIrelが多量体化することを見いだした。多量体化に関わる領域を欠失させ、恒常的に多量体化しているIrel変異体も活性化に関しては小胞体ストレス依存的であったことから、多量体化は活性化の十分条件では無いと考えられた。次に私は、Ire1の小胞体内腔ドメインに構造異常タンパク質が直接的に相互作用することを明らかにした。Ire1小胞体内腔ドメイン変異体の表現型は、この相互作用がIre1の活性化にとって必須であることを強く示唆している。すなわちIre1は、「多量体化」そして「構造異常タンパク質の直接的結合」という2段階で制御されているのである。この2段階の制御により、「応答の正確性」すなわち「Ire1は小胞体ストレスに対しては鋭敏に応答するが、他のストレスに対しては応答しない」ということが保証されていると考えられる。小胞体内のタンパク質高次構造形成に異常をきたすと、小胞体分子シャペロンなどの遺伝子の転写が誘導される。小胞体内の異常を小胞体外に情報伝達するタンパク質はすでに発見されており、そのひとつが小胞体局在I型膜貫通タンパク質Ire1である。Ire1が小胞体内に蓄積した構造異常タンパク質を認識する機構を明らかにすることが、本研究の目的である。Ire1には通常時には小胞体内在性分子シャペロンであるBiPが結合しており、小胞体内への構造異常タンパク質の蓄積に応じて解離する。いくつかの知見から、BiPの結合がIre1の活性を抑えているのは確かなようである。そこで、このシステムでは構造異常タンパク質を認識するのはIre1ではなくBiPであり(BiPは分子シャペロンなので、当然構造異常タンパク質との結合能を有する)、構造異常タンパク質へのBiPの結合はそのまま、Ire1からのBiPの解離およびIre1の活性化をもたらすというモデルが考えられた。しかし、BiPとの結合ドメインを欠失させたIre1変異体も恒常的な活性型ではなく、野生型と同程度に、小胞体への異常タンパク質の蓄積の度合いに応じて制御されていた。そこで今回私は、BiPの解離以外にIre1の活性化を促す要因を探した。まず、Ire1小胞体内腔ドメイン内で折りたたみが緩い領域のひとつ、すなわちサブ領域IIIと名付けた領域を欠失させたIre1変異体(ΔIII変異体と命名した)は、活性が著しく低下していた。ΔIII Ire1は、BiPの結合と解離については正常であった。一方、Ire1小胞体内腔ドメインから成る組換えタンパク質は、in vitroで変性タンパク質の凝集を阻止する、すなわち構造異常タンパク質と直接的に相互作用することが分かったが、ΔIII変異により、その能力が失われた。よって、Ire1は構造異常タンパク質を直接的に認識し、BiPにとは独立した様式でも、自らの活性化をもたらすと考えられる。

代表的な小胞体ストレス応答としては、小胞体内在性分子シャペロン遺伝子の発現誘導を挙げることができる。本研究では、Ire1が小胞体ストレスを感知する、すなわち、小胞体ストレスに応じてIre1が活性化するメカニズムの解明を目指した。まず私は、小胞体ストレスに応じてIre1が多量体化することを見いだした。多量体化に関わる領域を欠失させ、恒常的に多量体化しているIre1変異体も活性化に関しては小胞体ストレス依存的であったことから、多量体化は活性化の十分条件では無いと考えられた。次に私は、Ire1の小胞体内腔ドメインに構造異常タンパク質が直接的に相互作用することを明らかにした。Ire1小胞体内腔ドメイン変異体の表現型は、この相互作用がIre1の活性化にとって必須であることを強く示唆している。すなわちIre1は、「多量体化」そして「構造異常タンパク質の直接的結合」という2段階で制御されているのである。この2段階の制御により、「応答の正確性」すなわち「Ire1は小胞体ストレスに対しては鋭敏に応答するが、他のストレスに対しては応答しない」ということが保証されていると考えられる。
超多収イネ育種のための理想的草型決定機構の生物学的解明

イネの収量性に直結する草型決定に関わる突然変異体を用いて原因遺伝子を同定し、その遺伝要因を明らかにすることを目的に研究を進めた結果、Ssi1やS1r1-dは草丈を優性形質として抑制するが、草型自体は大きく変更しないことが判明した。一方、既知のブラシノライド関連変異体や、本研究で対象としたTLA変異体などでは、直立葉やその逆の形態的特徴を表現し、草丈の制御とともに草型を大きく変更する機能を示すことが判明した。Ssi1とTla1の原因遺伝子を単離し前者については既に成果を公表した。開始初年度は以下の方法で研究を推進した.1.草型関連変異体の育成・形質評価当研究室で保有している突然変異体系統の中から研究開始前年度において選定した多数の草型決定に関わると思われる変異体を圃場に展開し、茎葉の伸長パターン、葉身の開葉性、稈強度と稈構造、収量などに関する諸形質を定性、数量的に測定し変異体の特性形質について評価を行った.2.遺伝子単離のための雑種集団(F1およびF2)の育成これらの変異体の中から上記形質に関して最も注目される表現形質を示した変異体の一部を対象に、遺伝子単離を行うためのF1およびF2集団の育成を行った.このうち、稈の構造変異を伴う強稈変異体、および長葉身変異体とカサラスの交配F2分離集団を用いてラフマップを行い、変異体遺伝子の座乗位置を特定した.現在大規模解析集団を用いてファインマップを作成中である.3.変異体の相互交雑による系統の育成変異体遺伝子間の相互作用の関連性を明らかにするため、注目する変異体間の相互交雑を行い、数種の異なる組み合わせで二重変異体を育成した.また、遺伝子単離を対象とする変異体と草型と関連の深い植物ホルモンに関与する既知の変異体との間でも交雑を行い、F1およびF2雑種集団を育成し、F2集団から二重変異体を選抜した.4.植物ホルモンに対する反応試験原因遺伝子の機能を予測することを目的に、遺伝子単離を対象とする変異体を中心に各種植物ホルモンに対する反応や生理実験を行い、変異体遺伝子の作用に見られる特徴を解析した.以上の他に、実用試験に供試する変異体遺伝子を導入した系統の育成作業を進めた.また、草型に関連する実用形質を有する育成品種を用いたOTL解析用の交配集団を育成し、表現形質調査によるデータを取得した.本年度は、初年度に実施した草型形質に関するラフマップの結果にもとづき大規模F2集団を圃場に展開してファインマップを作成し常法に従って遺伝子の特定作業を進めた。その結果、強稈性の半矮性変異体および長葉身変異体についてはその原因遺伝子の単離作業がほぼ完了し、前者についてはこれまでの研究結果を取りまとめて論文を投稿した。また後者については、原因遺伝子の候補領域を特定する段階まで進めた。一方、草型関連形質を示す変異体のうち、直立葉を示す変異体を中心に変異体およびそれらの交雑後代を展開して得た二重変異体を用いて表現型に見られる形態的特徴を組織、細胞レベルで解析した。その結果、原因遺伝子の作用性が茎葉の組織構造に対して細胞の数や大きさなどの定量的な変異に留まる系統と、組織構造に明瞭な変異を示す系統が存在することが明らかとなった。これらの解析については、次年度においてもさらに進める予定である。草型関連変異体のストックの中から既知の変異体遺伝子に対する表現力の異なるアリールの探索を行った結果、既知のジベレリンやブラシノライド関連遺伝子座における比較的微弱なアリールを複数同定した。また、これまでに単離した変異遺伝子との関連性を検討することを目的に、既存の穂重型、直立多収品種の雑種集団を用いて草型関連形質の遺伝様式を調査するとともに、QTL解析を行ったが、検出されたQTLと既知の遺伝子座との関連性については有効な情報を得るには至っておらず、これらの課題については次年度においても引き続き検討を進める予定である。イネの草型は収量性に直結する重要形質であるが、本形質を支配する遺伝要因はこれまで明らかにされて来なかった。本課題では、茎葉の伸長性や葉身の開帳性に関係する遺伝変異に着目し、原因遺伝子を単離・同定して機能解析を行うことにより超多収イネの理想的草型決定に重要な役割を果たす遺伝要因を明らかにすることを目的に研究を推進した.本年度は、草型に関わる変異体を用いて原因遺伝子を同定しそれらの機能を解析するとともに草型形質に対する作用性を調査した。その結果、本研究で解析対象としたSsilやSlrl-dは草丈を優性形質として抑制するが、草型自体は大きく変更しないタイプであることが判明し、これらの遺伝子座の遺伝子変異は母本の草型を維持して生育を制御する有用遺伝子として利用価値があると判断された。

一方、既知のブラシノライド関連変異体や、本研究で対象とした長葉身で開帳性を示すTLA変異体などでは、直立葉やその逆の形態的特徴を表現し、草丈の制御とともに草型を大きく変更する機能を示すことが判明した。SsilとTLAの原因遺伝子をマップベースクローニングにより同定し、前者については既に成果を公表した。また、後者については原因遺伝子の同定を完了し現在成果公表の準備を進めている。さらに、既知の遺伝子情報を利用して実用的なイネ品種におけるこれらの遺伝子座における有用アリールの探索を試みたが、現在までに候補を特定できる成果を上げることはできなかった。また、草型に特徴を示す品種間交雑集団を用いた草型関連形質のQTL解析を試みたが、検出されたQTL座と既知情報が対応する事例を見出すことはできなかった。
海洋漂流プラスチック摂食による、海鳥への化学物質曝露の毒性影響の解明

1海鳥への添加剤含有プラスチック投与実験、化学物質蓄積の分析:野外におけるプラスチック投与実験でプラスチックに添加して投与した5種の化学物質(ポリ臭素化ジフェニルエーテル(PBDEs)1種類、ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤3種類、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤1種類)について、オオミズナギドリの肝臓、腹腔内脂肪、尾腺ワックス、投与プラスチックの化学分析を行い、プラスチック由来の化学物質が海鳥の体に移行、蓄積することを明らかにした。2海鳥への添加剤含有プラスチック投与実験、毒性影響の分析:1と同じ試料について肝臓での遺伝子発現解析を行った。肝臓から抽出したTotal RNAをプールしたサンプルについて次世代シークエンサーでの分析、de novo解析、データベースからのアノテーションをつけることによって、遺伝子の配列等を明らかにし、さらに発現が変動している遺伝子を抽出した。その結果、薬物代謝に関連する酵素などが誘導されている可能性が示唆された。3オオミズナギドリの室内飼育、プラスチック投与実験の方法の検討:野生のオオミズナギドリの卵を北海道大学獣医学部の動物飼育実験室に搬入し、孵卵器での孵化、二ヶ月間の飼育の方法を検討した。餌はイカナゴ、魚油、ビタミン剤等を与えた。はじめは1日5回程度、後期は1日2回(朝、夜)とした。体重の増加は野生個体と比べて遅かった。糞の状態等から消化の不良等も疑われた。最終的に孵化に成功したうちの半分の個体が実験終了までの間に死亡し、飼育方法の確立には至らなかったが、死亡の原因等については解剖によって組織の状態を調べ、改善すべき点を明らかにした。化学分析について、メソッド作成に時間を要したものの、最終的に高い質で実際のサンプルの分析を行うことができた。分析の結果、目的としていた物質の蓄積を明確に検出することができ、発表に向けて採取段階の準備を進めている段階である。次世代シークエンサーでのRNA sequenceは、肝臓については完了し、続く詳細な分析に入っている。加えて、海鳥に投与していたプラスチックの分析も、分析法の開発を含め進めてきており、投与実験で得られた試料についてはすでに完了した。鳥の体内での化学物質溶出促進機構に重要な示唆となる結果が得られており、今後さらに研究を進めていきたいと考えている。予定より大きな遅れはなく、確実に進めており、進捗状況としては順調である。1平成29年度に行ったプラスチック投与実験試料の毒性影響の分析肝臓での遺伝子発現解析(次世代シークエンサーでの分析)により、多くの遺伝子の配列等を明らかにし、さらに発現が変動している遺伝子を抽出した。その結果にもとづき、今後は特に注目すべき遺伝子の発現の変化を個体ごとに定量していく。甲状腺ホルモン関連、薬物代謝酵素関連の遺伝子、あるいは次世代シークエンサーでの分析で変動が示唆されたものに注目し、リアルタイムPCRでの分析を行っていく。さらに、同様の分析を多臓器についても行っていく。甲状腺、副腎などを予定している。2遺伝子発現による最終産物の分析遺伝子発現の変動が見られた遺伝子について、その最終産物として変動する生体の因子について調べることを予定している。生体内での実際の影響を見ることを目的とする。例としては、ステロイドホルモン濃度の変動、たんぱく質濃度の変動、酵素活性の変動などが考えられる。各組織について遺伝子発現解析を進め、その結果に基づき、ターゲットとする対象など内容を検討する。1投与実験に用いる化学物質の簡易な分析法の開発海鳥を用いたプラスチック投与実験で、プラスチックに添加する化学物質について、海鳥組織(特に肝臓)の分析方法を開発した。分析法では、はじめにシリカゲルへの吸着性の違いから、ポリ臭素化ジフェニルエーテル(PBDEs)、ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤と、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤を分けた。PBDEsとベンゾトリアゾールについては、各種カラム担体、水分含量、用いる溶媒を検討し、10%水不活性化フロリジルの9cmカラムを用いて脂質と分ける方法を作成した。これにより、ゲル浸透クロマトグラフィーの必要がなくなり、分析の手間が大幅に縮小できた。ベンゾフェノン系紫外線吸収剤の一部では、前処理の間に分解することが明らかとなり、これの解決法として前処理の早い段階でアセチル化により安定化することで、分析の再現性が確かめられた。2海鳥を用いたプラスチック投与実験の実施新潟県粟島でオオミズナギドリへのプラスチックの投与実験を行った。8月下旬から粟島に入り、11月初めまで滞在した。実験では、実験開始後5日ごとにBody weight, Bill length, Bill depth, Head length, Wing length, Tarsus length, Tail length(生えてきたら)を計測、尾腺Wax採取、糞採取を行い、実験開始時と中間、実験終了時に血液を採取した。解剖個体については、各組織を、主に化学分析用に-20°C、酵素活性、ホルモン等分析用に-80°C、RNA分析用にRNAlaterにそれぞれ採取した。化学分析については一部の個体を分析したところまでであるが、プラスチック由来の化学物質の蓄積を示唆する結果を得ている。海鳥を用いた投与実験では、数、クオリティともに十分な試料を得ることができた。投与実験の試料の分析について、内部標準物質の作成が予定より遅れており、化学分析を進めることを据え置いている状態である。次世代シークエンサーでのRNA sequenceについては、化学分析の結果を受けて進めることとしており、こちらも発注まで進めることができていない状況である。

しかしながら、これまでに分析法の習得や、分析環境の構築等、必要な準備作業を順調に進めることができており、4月中旬に標準物質が届き次第、分析を進めることができる体制は整っている。予定より大きな遅れはなく、確実に進めており、進捗状況としては順調である。1海鳥への添加剤含有プラスチック投与実験、化学物質蓄積の分析:野外におけるプラスチック投与実験でプラスチックに添加して投与した5種の化学物質(ポリ臭素化ジフェニルエーテル(PBDEs)1種類、ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤3種類、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤1種類)について、オオミズナギドリの肝臓、腹腔内脂肪、尾腺ワックス、投与プラスチックの化学分析を行い、プラスチック由来の化学物質が海鳥の体に移行、蓄積することを明らかにした。2海鳥への添加剤含有プラスチック投与実験、毒性影響の分析:1と同じ試料について肝臓での遺伝子発現解析を行った。肝臓から抽出したTotal RNAをプールしたサンプルについて次世代シークエンサーでの分析、de novo解析、データベースからのアノテーションをつけることによって、遺伝子の配列等を明らかにし、さらに発現が変動している遺伝子を抽出した。その結果、薬物代謝に関連する酵素などが誘導されている可能性が示唆された。3オオミズナギドリの室内飼育、プラスチック投与実験の方法の検討:野生のオオミズナギドリの卵を北海道大学獣医学部の動物飼育実験室に搬入し、孵卵器での孵化、二ヶ月間の飼育の方法を検討した。餌はイカナゴ、魚油、ビタミン剤等を与えた。はじめは1日5回程度、後期は1日2回(朝、夜)とした。体重の増加は野生個体と比べて遅かった。糞の状態等から消化の不良等も疑われた。最終的に孵化に成功したうちの半分の個体が実験終了までの間に死亡し、飼育方法の確立には至らなかったが、死亡の原因等については解剖によって組織の状態を調べ、改善すべき点を明らかにした。化学分析について、メソッド作成に時間を要したものの、最終的に高い質で実際のサンプルの分析を行うことができた。分析の結果、目的としていた物質の蓄積を明確に検出することができ、発表に向けて採取段階の準備を進めている段階である。次世代シークエンサーでのRNA sequenceは、肝臓については完了し、続く詳細な分析に入っている。加えて、海鳥に投与していたプラスチックの分析も、分析法の開発を含め進めてきており、投与実験で得られた試料についてはすでに完了した。鳥の体内での化学物質溶出促進機構に重要な示唆となる結果が得られており、今後さらに研究を進めていきたいと考えている。1平成29年度に行ったプラスチック投与実験試料の化学分析:プラスチックを摂食した海鳥への添加由来化学物質の蓄積があるのかを明らかにするため、平成29年度に行ったプラスチック投与投与実験の海鳥試料の各組織、消化管内プラスチック中の投与化学物質の分析を行う。
X連鎖無γ-グロブリン血症における好中球減少のメカニズムの解明

X連鎖無γグロブリン血症(XLA)はBTK遺伝子の異常により骨髄におけるB細胞の分化障害を来す原発性免疫不全症で、末梢血B細胞の欠損による抗体産生不全と易感染性とを特徴とする。診断後は免疫グロブリン置換療法が行われるが、診断前(免疫グロブリン置換療法前)には約20%で重症感染症に伴う好中球減少の合併を認めることがあり、そのメカニズムは明らかでない。骨髄での好中球の成熟障害および末梢血への好中球の動員に関与するサイトカイン、ケモカインの産生異常が疑われている。そこでXLA患者末梢血におけるサイトカイン、ケモカイン産生能を検討し、単球や骨髄系細胞におけるBTKの機能的役割を明らかにすることを本研究の目的とした。昨年度,BTK遺伝子変異が証明されたXLA患者ならびに正常対照よりインフォームドコンセントを得て静脈血をヘパリン加採血し,大腸菌由来のリポ多糖体(LPS)にて刺激培養を行い、上清中におけるG-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-8の濃度をELISAで測定し,その結果、G-CSF、IL-6、IL-8についてはXLAと正常対照とで差を認めなかったが、GM-CSFについては、一部のXLAにおいて正常対照に比べ低下を認めたことを報告した。このことより,XLAにおけるGM-CSFの産生障害が疑われたため,次に,フローサイトメトリーによる単球内サイトカインの動態について検討した。XLAならびに正常対照の末梢血をLPSにて刺激培養後、細胞を固定し,膜透過性を高め,抗CD14単クローン抗体および抗サイトカイン単クローン抗体にて二重染色を行い、フローサイトメトリーにて解析した。その結果,XLA患者と正常対照では,単球内におけるGM-CSFの発現に差を見いだすことができず,今後,研究方法の再検討を行う必要があると考えられた。BTK遺伝子変異が証明されたXLA患者ならびに正常対照より、インフォームドコンセントを得て、静脈血をヘパリン加採血した。大腸菌由来のリポ多糖体(LPS)にて刺激培養を行い、上清中におけるG-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-8の濃度をELISAで測定した。その結果、G-CSF、IL-6、IL-8についてはXLAと正常対照とで差を認めなかったが、GM-CSFについては、一部のXLAにおいて正常対照に比べ低下を認めた。このことよりXLAにおける単球由来GM-CSFの産生障害が疑われ、現在、フローサイトメトリーによる単球内GM-CSFの発現を検討中である。またDNAマイクロアレイにより単球由来のサイトカイン、ケモカインの発現を検討することも計画中である。