hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞成長・シナプス可塑性・行動学習におけるmTORキナーゼの役割

mTORシグナルは結節性硬化症や自閉症といったヒトの疾患に深く関与することから、神経細胞において重要な役割を担っていることが考えられる。そこで、活性化型mTOR変異体を用いて、神経細胞において直接mTOR経路を亢進することができるトランスジェニックマウスの作製・解析を行った。前脳におけるmTORの活性化はてんかん発作および神経変性を引き起こし、小脳においてはプルキンエ細胞の形態とシナプス除去に異常が観察された。これらの研究を通してmTOR経路の破綻による疾患の理解が深まることが期待できる。本研究では、遺伝子操作マウスを用いた中枢神経系におけるmTOR機能の解析を通して、脳の発達やシナプス可塑性におけるエネルギー代謝調節の重要性を明らかにすることを目的とする。本年度は、研究実施計画に基づいて下記の研究を行った。テトラサイクリン応答因子(TRE)下流にFLAGタグのついた活性型mTOR cDNAを連結したトランスジーンを構築した。このトランスジーンをC57BL/6系統の前核期受精卵200個にマイクロインジェクションし、5匹の独立なTgマウスを得ることができた。次に.これらのTgマウスを野生型C57BL/6と交配し、Tgマウス系統の樹立を行った。その結果、独立に4系統のTgマウス系統を確立することができた。現在、これらのマウスを、CaMKII-tTA TgまたはL7-tTA Tgマウスと交配することによって、前脳あるいは小脳プルキンエ細胞特異的に活性型mTORを発現するマウスを作製している。すべての細胞で転写活性のあるCAGプロモーター下流にloxP-neo-loxPカセットおよびFLAG-活性型mTORを連結することによって、Cre-loxP組換え依存的に活性型mTORを発現誘導可能なトランスジーンを構築した。このトランスジーンをC57BL/6前核期受精卵にマイクロインジェクションすることによって、3匹の独立なTgマウスを得ることができ、それぞれ独立したTgマウス系統として樹立することができた。これらのマウスについては、現在、Emx1-Creマウスと交配することによって、胎生期の終脳において活性型mTORを発現するマウスを作製している。研究実施計画に基づいて、遺伝子操作マウスを用いて脳および神経細胞におけるmTORキナーゼの役割について下記の解析を行った。(1)活性化型mTORTgの組織学的解析昨年度に作製したTRE-mTORTgマウスをCamKII-tTATgマウスと交配し、Tet-offシステムによって生後7日齢以降に活性化型mTORを発現するTgマウス(CamKII-mTORTgマウス)を作製した。幼若CamKII-mTORTgマウスは、活性化型mTORの発現に伴って発育遅滞が引き起こされ、20日齢までに全て死亡した。生後12日齢におけるCamKII-mTORTgマウスの前脳の組織学的解析を行った結果、大脳皮質ニューロンにユビキチン陽性の細胞質封入体が多数見出された。このことから、生後脳におけるmTOR経路の活性化は、神経変性疾患様の表現型を引き起こすことが示唆された。(2)活性化型mTORTgのシナプスの解析TRE-mTORTgマウスをL7-tTATgマウスと交配することによって、小脳プルキンエ細胞特異的に活性化型mTORを発現するマウスを作出した。このマウスの小脳切片を観察したところ、細胞体が著しく肥大したニューロンが散在的に見出された。肥大化したプルキンエ細胞は樹状突起およびスパインの形態に異常が見られたことから、mTORは神経細胞のサイズ制御およびシナプス形成に重要であることが考えられた。上記の表現型を引き起こした分子メカニズムを明らかにするために、CamKII-mTORTgおよびコントロールマウスの大脳皮質抽出液を出発材料として、nano-LC-MS/SMによる定量的リン酸化プロテオミクス解析を行った。その結果、Tgマウスにおいてリン酸化量が上昇しているペプチドを多数同定することができた。研究実施計画に従って、小脳および終脳において活性化型mTORを発現するトランスジェニック(Tg)マウスについて下記の実験を行った(1)小脳における活性化型mTOR Tgマウスの解析プルキンエ細胞において活性化型mTORを発現するTgマウスを作製・解析を行った。このTgマウスは明らかな小脳失調は示さなかったものの、プルキンエ細胞の細胞体および樹状突起・スパインが著しく肥大していた。さらに、Tgマウスのプルキンエ細胞の電気生理学的解析を行ったところ、成熟マウスにおいても複数の登上線維による支配を受けていた。このことから、mTORの活性化はシナプス除去に異常をもたらすことが考えられた。また、Tgマウスは加齢とともにプルキンエ細胞の数が減少していることを明らかにした。

mTORの活性化はオートファジーを抑制することから、Tgマウスにおいては細胞質封入体の蓄積による神経変性が引き起こされていることが考えられた。実際、以下に述べる終脳における活性化型mTOR Tgマウスにおいては、大脳皮質ニューロンにおけるユビキチン陽性の封入体の蓄積が観察された。(2)終脳における活性化型mTOR Tgマウスの解析大脳皮質および海馬の興奮性ニューロンにおいて活性化型mTORを発現するTgマウスを作製した結果、大脳皮質が肥厚し神経細胞のサイズが増大していた。また、大脳皮質の層構造も乱れていた。このマウスは成長遅滞を起こし、生後15日齢前後で死亡する。そこで、Tgマウスの行動を詳細に記録したところ、重篤なてんかんを頻繁に起こしていることが明らかとなった。自由行動下において大脳皮質の脳波を記録したところ、てんかん発作時に著しい脳波の乱れが観察された。ヒトにおける結節性硬化症においてもmTOR経路の活性化とてんかんの関連性が指摘されていることから、このマウスはヒト疾患のモデルマウスとして有用であると期待できる。活性化型mTOR発現マウスの作製に成功し、表現型の解析もほぼ予定通り行い、mTOR経路の活性化による神経細胞の機能変化が認められたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。活性化型mTORTgマウスの表現型の可逆性の解析、CamKII-mTORTgでのmTOR複合体の解析、新規mTOR関連分子の遺伝子操作マウスの作製を行う。
種分化を引き起こす時計遺伝子の生態遺伝学的研究

ウリミバエでは、交尾時刻において著しい種内変異があり、交尾開始時刻が5時間異なる同種内の系統間では有意な生殖隔離が生じた。この交尾時刻は概日リズムによって支配されると考えられる。時計タンパク質PERIODをコードするperiod遺伝子mRNAの発現周期が系統間で大きく異なるため、ウリミバエの交尾時刻変異にはperiod遺伝子群の関与が考えられた。そこでウリミバエの時計遺伝子period(per)及びdoubletime(dbt)の塩基配列を決定し、交尾時刻の異なるショート(S)系統とロング(L)系統間の比較を行った。dbt遺伝子がコードするキナーゼDBTは、ヒトのカゼインキナーゼIεの相同分子であり、ショウジョウバエの概日時計機構においてPERをリン酸化し、細胞質内のPERの蓄積を調節する。ウリミバエdbtcDNAの翻訳領域は1320b、コードしているキナーゼDBTの推定アミノ酸配列は440アミノ酸であり、ATP結合領域と触媒領域の配列は系統間で一致した。ショウジョウバエのDBTとは、84%の高い相同性を示した。3'非翻訳領域には数塩基の違いが検出されたが、転写に影響する変異とは考えにくかった。S系統とL系統で安定して異なるアミノ酸が1カ所あり、53番目のアミノ酸がS系統ではセリン、L系統ではロイシンに変化していた。この違いがS系統とL系統の概日リズムの違い、そして交尾開始時刻の違いに関与している可能性が示唆された。今後、キイロショウジョウバエのdoubletime欠失突然変異を用いて、このアミノ酸配列に着目したレスキュー実験を行うことで、交尾時刻を介した生殖隔離(種分化)に関与する遺伝子の特定が可能になる。一方、per遺伝子cDNAの翻訳領域は、S系統、L系統ともに3102b, PERタンパク質の推定アミノ酸配列は1034アミノ酸であり、機能性ドメインであるPAS領域PAS-A(アミノ酸193-242)、PAS-B(343-395)、核移行NLS(72-76)、細胞質局在ドメインCLD(398-457)は系統間で一致していた。S系統とL系統で異なるアミノ酸は3カ所あったが、PERタンパク質の機能に影響する変異とは考えにくい。スレオニン-グリシン反復配列についても多型は検出されなかった。cDANの3'非翻訳領域には系統間で大きな違いはなかったが、5'非翻訳領域ではスプライシングのバリアントが検出され、このバリアントと概日リズムの違いについて今後調べる必要がある。以上の結果と国内外での時計遺伝子と生殖隔離の関係についての報告事例をレビューし、アロクロニックな生殖隔離と生物の測時機構との関連についてのレビューを行った。LDサイクル下においてウリミバエは消灯1時間前に交尾活性が高まるが,その本来の交尾時刻より早い時刻に交尾するウリミバエのショート系統と遅い時刻に交尾するロング系統を確立した.

この系統の純系を得るために,シブ交配を5世代以上繰り返した.その結果,行動活性の高まる時間帯が揃ったショート及びロングの純系を作り出すことに成功した.これら純系の確立は,本研究の分子生物学的解析の飛躍的展開につながると期待できる.行動解析アクトグラフ装置を用いて,両純系統の自由進行周期を計測したところ,ショートは22時間,ロングは31時間と概日周期の長さに著しい分離の見られることが確認された.これらの純系統間及び系統内で交尾相手選択実験を行い,交尾を観察したところ,交尾時刻の異なる両系統間でのみ有意な生殖隔離が確認された.したがって,概日時計を支配する遺伝的要素が生殖隔離を引き起こすことが追認された.そこで本研究費で購入したPCR・電気泳動などの遺伝子解析装置により解析を進めたところ,ショウジョウバエの時計遺伝子perの相同配列が,ウリミバエにも存在すること.さらにウェスタンブロッティングにより,per遺伝子がコードする産物蛋白質の発現量が経時的に振動することを明らかにした.この振動はショウジョウバエのPER蛋白の周期振動と類似した.さらにガ由来のper遺伝子をプライマーとして,ウリミバエのper遺伝子をピックアップすることに成功し,ウリミバエ自身のper遺伝子プライマー(5'-GTCGGGACATTAAGTATGCCAAAA-3'及び5'-CCTAGACCATCGACGAAACCAG-3')の作成に成功し,このプライマーの実用性を確認できた.現在,このプライマーをベースにして,ウリミバエのper遺伝子全塩基配列(約4キロベース)の解読を進めている.今後,このper遺伝子のウリミバエ交尾行動の内因リズムに対する支配と種分化への関与について精査する予定である.昨年までにショウジョウバエの時計遺伝子perの相同配列が,ウリミバエにも存在することを確認した.さらにウェスタンブロッティングにより,per遺伝子がコードする産物蛋白質の発現量が経時的に振動することを明らかにした.この振動はショウジョウバエのPER蛋白の周期振動と類似した.そこで今年度は,昨年までに設計を完了したウリミバエの時計遺伝子perのプライマーを用いて,mRNAの周期的な発現量を定量的PCR法によって一定時間間隔でトレースした.すなわち,LD条件からDD条件に移行し,全暗条件でフリーランニングさせたウリミバエを4時間おきにサンプリングし,頭部よりmRNAを抽出し,per-mRNAの発現量を求めた.その結果,概日周期の短いショート系統では21時間おきに,また概日周期の長いロング系統では30時間おきにper-mRNAの発現ピークが認められた.これは両系統の表現型上の活動リズム周期と一致することから,per遺伝子が関与する時計遺伝子カスケードがウリミバエの概日周期を操作していることを示している.さらに,ショート系統とロング系統の交尾時刻の平均値の差が5時間であることを利用し,ショート系統をロング系統より5時間早い日長周期で飼育し(日長操作区),両集団の生殖隔離の程度を調べた.コントロールとして日長操作を施さないショート系統とロング系統の間では有意な生殖隔離が生じたのに対し,日長操作区ではこの隔離は消滅した.
一次元物資カーボンナノチューブのSTM/STSによる研究

広領域走査型の走査トンネル顕微鏡(STM)を用いることによって、一次元物質カーボンナノチューブのSTM像を観察した。カーボンナノチューブはその大きさがメゾスコピックサイズであるため、位置制御ができず、通常のSTMでは、カーボンナノチューブ像の観測だけでも大きな困難がある。本研究では、広領域走査型STMを用いた広い領域の探索ができたため、カーボンナノチューブを単に基板上に分散させただけで、基板上でカーボンナノチューブが確率的に存在するような試料を用いても、比較的容易に像の観測ができるようになった。基板としてグラファイトを用いることにより、基板に固定するためのバインダーを用いなくても再現性の良いSTM像が得られた。直径約300Å-500Å、長さ約1μmの範囲の大きさのカーボンナノチューブの像が得られた。この大きさが走査型電子顕微鏡(SEM)観察によって得られたものとほぼ等しいことから、STM探針の走査時の反応のタイムラグによる境界のなまりの影響は少なく、カーボンナノチューブの形状を忠実に観測していると推測される。トンネル分光(STS)実験では、現在のところ、状態密度がフェルミ準位でギャップのあるスペクトルのみが得られており、測定したカーボンナノチューブが半導体的な電子構造を有していることを示唆している。スペクトルの再現性にやや欠けるため、測定条件の最適化や様々な直径のチューブに対して実験を遂行していく必要があるが、カーボンナノチューブの結晶構造、特に、構造の特徴的なパラメーターである直径と電子構造の相関を明らかにするための基本技術が確立した。
実環境の音声信号に適した統計モデリングおよび最適化アルゴリズムの開発

本研究における第1年度目の主な計画は,線形な音響システムの同定において観測雑音が優ガウス性の分布に従うと仮定し,未知の有限インパルス応答(FIR)システムの次数と係数を同時に推定するアルゴリズムを実現することであった.このテーマに対して本年度は論文誌に1編,国際会議に2編の論文が採択された.さらに,研究成果の一部を国内の研究会で発表した.未知システムの出力に混入する雑音が従う分布には当初ラプラス分布を想定していたが,独立成分分析の分野で用いられてきた音源の分布と深い関連を持ち,ラプラス分布よりも最適化が容易な双曲線正割分布を用いて雑音をモデリングした.このモデルに基づいて本年度は以下の課題に取り組み,成果を上げた.(1)未知システムの次数が既知の場合における係数のオフライン推定(2)FIRシステムの係数のオンライン推定(3)未知システムの次数と係数の同時推定.(2)においては,音響システムに限らず,未知のシステムが1出力の線形状態空間モデルで記述できるシステムに対し定式化を行った.(3)では,次数についての何らかの尺度を用いて次数を事後的に求めるのではなく,ノンパラメトリックベイズモデルに基づいてFIRフィルタの各タップのアクティベーションに対する事前分布を導入することで次数と係数を同時に推定するアルゴリズムを導出した.これらの取り組みにおいて提案した手法は,実環境に近い条件下でのシミュレーションで従来の正規分布に基づく手法などと比較して高い推定性能を示した.優ガウス性の分布に基づくシステム同定について計画通りの成果を上げることができた.また,この課題に加えて,本年度は複素ラプラス分布に基づく非負値行列因子分解を前倒しして実施しており,雑音除去のタスクに対する性能を検証中である.現在,正弦波のパラメータ推定のためのベイズモデルにおける課題を保留している.しかし,これは他の研究課題との優先順位を考慮した上での判断であり,研究の進捗状況に影響はないと考える.まず,複素ラプラス分布に基づく非負値行列因子分解について検証を進め,国際会議での発表を目指す.さらに,この課題から得られた知見をもとにブラインド信号分離のための数理モデルとアルゴリズムを構築する.正弦波のパラメータ推定においては,当初想定したモデルが簡単な形の数式で記述できないことが本年度の調査で判明した.そのため,当初の想定と等価なモデルへの書き換え試み,最適化アルゴリズムを導出できる数理モデルを模索する.本研究における第1年度目の主な計画は,線形な音響システムの同定において観測雑音が優ガウス性の分布に従うと仮定し,未知の有限インパルス応答(FIR)システムの次数と係数を同時に推定するアルゴリズムを実現することであった.このテーマに対して本年度は論文誌に1編,国際会議に2編の論文が採択された.さらに,研究成果の一部を国内の研究会で発表した.未知システムの出力に混入する雑音が従う分布には当初ラプラス分布を想定していたが,独立成分分析の分野で用いられてきた音源の分布と深い関連を持ち,ラプラス分布よりも最適化が容易な双曲線正割分布を用いて雑音をモデリングした.このモデルに基づいて本年度は以下の課題に取り組み,成果を上げた.(1)未知システムの次数が既知の場合における係数のオフライン推定(2)FIRシステムの係数のオンライン推定(3)未知システムの次数と係数の同時推定.(2)においては,音響システムに限らず,未知のシステムが1出力の線形状態空間モデルで記述できるシステムに対し定式化を行った.(3)では,次数についての何らかの尺度を用いて次数を事後的に求めるのではなく,ノンパラメトリックベイズモデルに基づいてFIRフィルタの各タップのアクティベーションに対する事前分布を導入することで次数と係数を同時に推定するアルゴリズムを導出した.これらの取り組みにおいて提案した手法は,実環境に近い条件下でのシミュレーションで従来の正規分布に基づく手法などと比較して高い推定性能を示した.優ガウス性の分布に基づくシステム同定について計画通りの成果を上げることができた.また,この課題に加えて,本年度は複素ラプラス分布に基づく非負値行列因子分解を前倒しして実施しており,雑音除去のタスクに対する性能を検証中である.現在,正弦波のパラメータ推定のためのベイズモデルにおける課題を保留している.しかし,これは他の研究課題との優先順位を考慮した上での判断であり,研究の進捗状況に影響はないと考える.まず,複素ラプラス分布に基づく非負値行列因子分解について検証を進め,国際会議での発表を目指す.さらに,この課題から得られた知見をもとにブラインド信号分離のための数理モデルとアルゴリズムを構築する.正弦波のパラメータ推定においては,当初想定したモデルが簡単な形の数式で記述できないことが本年度の調査で判明した.そのため,当初の想定と等価なモデルへの書き換え試み,最適化アルゴリズムを導出できる数理モデルを模索する.
高分子ヒアルロン酸を用いた免疫学的肝細胞障害の治療法の研究

当該研究期間において以下の研究成果が得られた1、Con Aマウス肝炎モデルは雌マウスにおいて雄マウスに比べより重症の肝細胞障害が出現し、発症機序としてIFN-γ、TNF-α、CXCケモカインの一つであるMacrophage inflammatory protein-2(MIP-2)、CCケモカインであるMIP-1αなどの炎症性サイトカイン、ケモカイン産生能の性差が関与することが明らかとなり、本モデルが免疫学的肝細胞障害の検討に有用なモデルであると結論された。2、本モデルを用いてサイトカインやケモカイン産生抑制の面から肝障害発症を阻止しうる薬剤の検討を行った。その結果、細胞外マトリックスである高分子ヒアルロン酸や海藻由来の多糖体であるFucoidanがTNF-α、IFN-γ産生を抑制し、肝障害発症を阻止することを明らかにした。また、ヒアルロン酸の作用は分子量に依存することを見いだした。一方、FucoidanのCon A肝障害抑制効果としてKupffer細胞からMacrophage scavenger receptor Aを介し、IL-10産生を促進することにより、TNF-αやIFN-γ産生を抑制することを明らかにした。3、Con Aを繰り返し投与すると免疫学的寛容現象出現し、その機序としてTh-1サイトカインからTh-2サイトカインへサイトカイン産生がシフトすることを明らかにした。また、このサイトカイン産生シフトが脾細胞のTリンパ球レベルで生じ、免疫学的寛容動物の脾細胞の移入により、正常マウスにおいて免疫学的寛容が誘導可能であることを明らかにした。今年度の研究期間において以下の研究成果が得られた。1、Con Aマウス肝炎モデルは雌マウスにおいて雄マウスに比べより重症の肝細胞障害が出現し、発症機序としてIFN-γ、TNF-αの他、CXCケモカインの一つであるMacrophage inflammatory protein-2(MIP-2)などの炎症性サイトカイン産生能の性差が関与することが明らかとなり、本モデルが自己免疫性肝炎の有用なモデルであると結論された。また、これらのサイトカイン産生調節に性ホルモンが関与することを明らかにした。2、本モデルはIFN-γやTNF-αが肝細胞障害を引き起こすことがすでに報告されていたが、Kupffer細胞から産生されるマウスCCケモカインのMIP-1αがIFN-γやTNF-α産生を促進し肝障害発症に関与していることを明らかにした。3、本モデルを用いてサイトカインやケモカイン産生抑制の面から肝障害発症を阻止しうる薬剤の検討を行った。その結果、細胞外マトリックスである高分子ヒアルロン酸や海藻由来の多糖体であるFucoidanがTNF-α、IFN-γ、MIP-2産生を抑制し、肝障害発症を阻止することを明らかにした。一方、内因性プロスタグランジン産生を抑制するNSAIDsは、サイトカインやケモカイン産生を促進し、肝障害を増悪させることを明らかにした。1、Con Aマウス肝炎モデルはIFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10等のサイトカインや、CXCケモカインであるMacrophage inflammatory protein-2(MIP-2)やCCケモカインであるMIP-1αが肝障害発症に関与し、本モデルが免疫学的肝細胞障害の有用なモデルであることを明らかにした。2、Con A肝炎モデルを用いてサイトカインやケモカイン産生抑制の面から肝障害発症を阻止しうる薬剤の検討を行った。

3、高分子ヒアルロン酸やFucoidanはCon Aモデルの他D-galactosamin/Lipopolysaccharide肝障害モデルにおいても肝障害発症を抑制することを明らかにした。4、FucoidanのConA肝障害抑制効果としてKupffer細胞から抗炎症性サイトカインであるIL-10産生を促進させることを明らかにした。5、Con Aを繰り返し投与すると免疫学的寛容現象出現し、その機序としてTh-1サイトカインからTh-2サイトカインへサイトカイン産生がシフトすることを明らかにした。今年度の研究期間において以下の研究成果が得られた。1、Concanavalin A(Con A)マウス肝炎モデルはCXCケモカインであるMacrophage inflammatory protein-2(MIP-2)が好中球の遊走活性化を介して肝障害を増悪させる。一方、マウスCCケモカインであるMIP-1αがKupffer細胞から産生され、TNF-αやIFN-γなどの炎症性サイトカイン産生を促進し、肝障害発症に関与していることを明らかにした。2、Con A肝炎モデルを用いてサイトカインやケモカイン産生抑制の面から肝障害発症を阻止しうる薬剤の検討を行った。その結果、細胞外マトリックスである高分子ヒアルロン酸のほか、海藻由来の多糖体であるFucoidanがCon A肝障害を抑制することを明らかにした。3、FucoidanのConA肝障害抑制機序として、Kupffer細胞から抗炎症性サイトカインであるIL-10産生を促進し、TNF-αやIFN-γなどの炎症性サイトカイン産生を抑制することを明らかにした。また、Kupffer細胞へのFucoidanの作用はMacrophage scavenger receptor Aを介することが示唆された。4、Con Aを繰り返し投与すると免疫学的寛容現象出現し、その機序としてTh-1サイトカインからTh-2サイトカインへサイトカイン産生がシフトすることを明らかにした。また、このサイトカイン産生シフトが脾細胞のTリンパ球レベルで生じ、免疫学的寛容動物の脾細胞の移入により、正常マウスにおいて免疫学的寛容が誘導できることを明らかにした。
新規セントロメアタンパク質による紡錘体チェックポイント制御機構の解析

染色体の不安定性を防ぐために、細胞は様々なチェックポイント制御機構を備えており、紡錘体チェックポイント機構も近年注目を受けている。紡錘体チェックポイントに関与するタンパク質群は間期には細胞質や核膜に存在するが、M期の進行に伴いセントロメアに局在し、分裂中期から後期にかけて染色体から消失する。紡錘体が適正にセントロメアに結合していない染色体では消失しないことから、これらのタンパク質群はチェックポイントのセンサーと考えられる。我々はチェックポイント機構と染色体不安定性の関係を理解するために、新規セントロメアタンパク質ZW10およびそれと相互作用を行うタンパク質群に注目して研究を行っており、ZW10の条件的ノックアウト細胞株を作成して、ZW10がチェックポイントタンパク質であることを示した。さらにZW10と生化学的に相互作用するZW250を同定して遺伝子クローニングとノックアウト株の作成に取り組んだ。本年度の研究ではZW250のノックアウト株を完成させ、その表現型を解析することによって、ZW10とZW250を含む新たなチェックポイント制御機構を明らかにすることを目的とした。ZW250のノックアウト細胞の樹立に成功し、表現型の解析を行ったところ、予想に反して、ZW250をノックアウトした細胞でも紡錘体チェックポイントは正常に機能していた。これは、ZW10は複数の機能を持っており、ZW250との結合はチェックポイント機構とは別の機能発現に重要であると考察できる。現在、紡錘体チェックポイントと関連した異なるタンパク質群の解析を行っており、これまで得られた知見が充分に活かされると確信している。さらにZW10と生化学的に相互作用するZW250を同定して遺伝子クローニングとノックアウト株の作成に取り組んでいる。本研究ではZW250のノックアウト株を完成させ、その表現型を解析することによって、ZW10とZW250を含む新たなチェックポイント制御機構を明らかにすることを目的とした。ZW250は約6kbからなる長いcDNAからコードされており、cDNAクローニングに予想以上の時間がかかったが、全長のクローニングが終了した。完全長cDNAにGFPを融合させたコンストラクトを作成してDT40細胞へ導入して細胞内局在を詳細に解析した結果、中心体と紡錘体に局在していた。共免疫沈降や密度勾配遠心法による解析からZW10と結合することが確認できた。また、ノックアウトコンストラクトを作成して1アリルをノックアウトした細胞株が樹立できた。今後、条件的ノックアウト株を作成して制限条件下で表現型を解析したい。特に、ZW250がBubやMadファミリーと言った紡錘体チェックポイントにどのように関与するかを解析する予定である。
社会貢献事業を基盤とした社会的就労による自立支援に関する研究

わが国の生活保護制度の就労支援は、中間的就労に重点をおいているが受け皿が少ない。しかし、KPI指標を設定し成果を管理しようとするところに特徴がある。一方、韓国における就労支援は、成果主義であった希望リボンプロジェクトが廃止された。そして、福祉部と労働部の一体的包括的支援を行う雇用福祉プラスセンターが設立されている。また、南楊州市の独自の生活困窮者自立支援事業であった希望ケアシステムは、就労による自立が困難な者に対する包括的ケアを提供するために京畿道全域に拡大している。本研究は、生活保護制度に該当しないか、もしくは生活保護申請の意思のない生活困窮者に対し、社会貢献事業を基盤とする社会的就労を通じた就労自立支援の在り方、特に就労自立の前段階としての社会的就労の場の有効性について実証することを目的として実施した。本年度は、(1)韓国におけるワークフェア政策と社会的企業の動向把握を行うとともに、(2)自活事業を委託運営している地域自活センターに関して、自治体等との協力・連携に関する事例研究と、中央自活センター等の職員から地域自活センターの本来的役割についてヒアリング調査を行った。また、社会的企業の成功事例の要因分析を行った。その結果、a)扶助単給化やEITC導入などの国民基礎生活保障法の抜本的法改正が予定されていること。b)社会的企業と協同組合の積極的展開。c)希望リボンプロジェクトによる一部自治体での就労成功パッケージの導入が明らかになった。就労成功パッケージによる民間活力の導入は、日本における生活支援戦略の下での今後の就労支援の在り方に関して重要な示唆を与えてくれた。国内においては、(3)福祉事務所の就労支援員へ就労自立支援プログラムの運営・実施状況についてのヒアリング調査を行った。また、(4)社会貢献事業を基盤として既に社会的就労により福祉事務所の就労支援と協働しているフードバンクなどのNPO法人に対するヒアリング調査を実施した。生活保護利用者等に対する中間的就労の位置づけが明確にされ、本研究の意義が強まるなか、就労支援の先駆的取組をしている釧路市福祉事務所と協働して中間的就労実施ケースについてのケース分析を実施することとした。これまで統計的にのみ評価されてきた取組に関して、ソーシャルワークの質的面での評価に繋がるものであり、今後のNPO法人などの就労支援にとって重要な意義が見いだせるものとなるであろう。本年度、韓国調査に関しては、1.京畿道において地域自活センターや社会的企業の支援者側に対する希望リボンプロジェクト等のヒアリングを実施した。就労自活成功率が高い要因として、保護の停止や目標数値を掲げ、それを達成できない場合には財政的ペナルティが発生することなどを確認した。2.「社会的企業」および2012年に新しい事業形態として成立した「社会的協同組合」への移行が進んでいる地域自活センターについて調査し、その要因調査をソウル市庁社会的経済課で行った。そして、3.社会的経済のシステムに関し、ソウル社会的経済支援センターを視察しヒアリングを行った。また、4.扶助単給化が始まった国民基礎生活保障法の議論過程を調査した。さらには、5.2014年1月から新しくモデル事業として始まった韓国版「生活困窮者自立支援事業」である「希望ケアシステム」(Hope Care System)について、日本の研究者として初めて南楊州雇用福祉総合センターでヒアリング調査を行った。6.「社会的企業」の実態をより理解するためにフランスを視察し、主に若年層を対象とするフランスの公的扶助であるRSA(就業連帯所得)における就労支援との関連性についてもヒアリングを行うことができた。一方、日本国内においては、7.生活困窮者自立支援法の成立によるモデル事業の実施状況について、NPO法人やワーカーズコーポなどや生活保護の自立支援プログラムを先駆的に実施している自治体について調査を実施した。生活困窮者自立支援制度の2015年度本格実施を間近に控え、本研究の意義は強まっている。本研究は、生活保護制度に該当しないか、もしくは生活保護申請の意思がない生活困窮者に対し、社会貢献事業を基盤とする社会的就労を通じた就労自立支援のあり方、特に就労自立の前段階としてのの社会的就労の場の有効性について実証することを目的として実施した。本年度は、1.多様な就労支援の知見を得るためにノルウェーとスウェーデンを訪問し、オスロ大学及びストックホルム大学において福祉と雇用の一体的支援に関する多様な就労支援の知見を得た。そして、NAVなどの視察により就労支援現場担当者のインタビューを行った。2.韓国調査では昨年に続き、1)わが国の生活困窮者自立支援事業を一市レベルで先駆的に立ち上げた京畿道南楊州市の雇用福祉センター+と希望ケアシステム(Hope Care Center )を視察・調査した。2)ソウル市では恩平区を継続訪問し、希望リボンプロジェクト(Hope RE-born Project)の実施状況についてヒアリングを行った。また、就労支援のアウトソーシング先であるインジウス社の社長へのインタビューを実施した。そして、3)グローバル社会的経済フォーラムに参加し、就労支援や社会的自立支援に関する世界の取り組みについて知見を得た。3.日本国内においては、西日本に特徴的な町福祉事務所の生活保護や生活困窮者自立支援への取り組み(準備)状況について調査を行った。他には、ワーカーズコープやNPO法人など生活困窮者自立支援に取り組んでいる団体等への調査を実施した。

本研究は,生活保護制度に該当しないか,もしくは生活保護申請の意思がない生活困窮者に対し,社会貢献事業を基盤とする社会的就労を通じた就労自立支援のあり方,特に就労自立の前段階としての社会的就労の場の有効性について実証することを目的として実施した.本年度は,1)かつて「民主主義の実験室」と称されたアメリカ合衆国ウイスコンシン州ミルウォーキー市を訪問した.workfare政策の最前線であるWisconsin Works(W-2)の実際を唯一の非営利組織であるTANF窓口のUMOSにおいて,TANF委託の運営・財政面の実態やその影響についてヒアリングを実施した.また,シカゴ市では,シカゴ・ジョブセンターを訪問し,WIAから2014年に改正されたWIOA等についてシカゴ大学のEvelyn B.博士から知見を受けた.そして,シカゴ市のダウンタウンで移民等の生活困窮者が生活する地域で,若者に対する教育プログラムの開発により,就労支援を行っている支援団体を視察した.2)ベーシックインカム(以下,「BI」)導入に向けた社会実験を2017年度から開始するフィンランド調査では,雇用産業省の政策担当者たちからフィンランドの失業者や非正規雇用に関する動向や長期失業者に対する積極的労働政策について知見を得た.また,先進的に就労支援を行っているバンタ市のRAHOS「TYP」において,保健と雇用等のワンストップ型支援について知見を得た.また,KELAではBIの政策責任者であるOlli K.博士から,導入の背景と導入後の生活困窮者対策との関連について知見を得ることができた.また,フィンランドの社会的企業研究ネットワーク会長のPekka氏から社会的企業(SE)の4つのタイプについて説明を受け,社会連帯の必要性について知見を得た.本研究は,平成27年度で完了予定であったが,調査研究の韓国南楊州市における希望システムの実施機関である希望ケアセンター(Hope Care Center)の職員に対する個別ヒアリング調査を実施することができなかった.これは,日本における生活困窮者自立支援事業の運営に関する行政(福祉事務所)職員と社会福祉協議会やNPO法人職員との協働の可能性を検討する際の重要な位置を占めるものであったが,韓国内の感染症の発生により調査の時期を逸した.しかし,日本における生活保護の「改正」や生活困窮者自立支援事業の展開が進められるなか,就労支援に関する各種調査報告書による知見の確保は進めることができた.また,山梨県内の自立支援相談機関を対象にした実態調査も進めることができた.さらには,workfareが進行しているアメリカのTANFと実施機関であるW-2の調査,及びフィンランドのBIと導入後の生活困窮者対策に関してNPO法人等就労支援機関の実態と動向について調査を進めることができた.これにより,日本における民間支援団体がどのように就労支援の役割を担うべきかについての示唆を得ることができた.研究の成果については,ホームページを開設したことで,成果の更新は遅れ気味であるものの活用を開始した.
各種の睡眠薬（オレキシン阻害、メラトニン、BZ賦活作用）が健常高齢者に及ぼす影響

目的:オレキシン受容体拮抗薬のスボレキサント、メラトニン受容体作動薬のラメルテオン、汎用される非ベンゾジアゼピン(以下BZ)系睡眠薬のゾルピデムに対して、高齢者の運動・認知機能からその残余効果を調べ、安全な睡眠導入剤を検討する。方法:高齢健常者14名を対象とし、秋田大学倫理審査を経て書面で同意を得た。スボレキサント(ベルソムラ、MSD社)10mg、ラメルテオン(ロゼレム、武田)4mg、ゾルピデム(マイスリー、アステラス社)5 mgの一回服用における運動機能と認知機能を二重盲ランダム比較試験にてプラセボと比較した。対象者は、1週間毎に睡眠導入剤かプラセボのいずれかを就寝時(23時)に服用し、就寝した。翌日4時に起床させ、客観的評価(フリッカー検査(CFF)、Functional reach test、Timed Up & Go Test、重心動揺テスト、単純弁別反応課題、記憶テスト)や主観的評価をした後再び6時まで就寝させた。就寝中は簡易脳波計を装着し、睡眠の評価を行った。客観的評価は服薬前後から翌日まで5回、主観的評価は7回実施した。結果:反復測定二元配置分散分析により、薬(4条件)と時間の主効果および交互作用を検討したところ、重心動揺テストの閉眼において薬の主効果(p=0.012)が認められた。多重比較(Bonferroni)を行った結果、ゾルピデムは、スボレキサントやラメルテオンに対して有意に動揺が小さかった。主観的指標では、有意水準には満たないが、ゾルピデムが良好であった。11時から朝4時までの睡眠指標は、4条件間に有意な差は認められなかった。考察:オレキシン受容体拮抗薬やメラトニン受容体作動薬は、従来の睡眠導入剤で懸案だった筋弛緩作用を伴わないため、高齢者の転倒を予防できる可能性が期待されている。本結果からは、半減期の短いゾルピデムが概ね良好であった。実験は無事に終了し、学会発表も行ったが、英語論文作成および投稿が遅れている。英語論文を作成し、インパクトファクターの高い論文から投稿し、今年度一杯でアクセプトされるように尽力する。睡眠導入剤の残余効果を明らかにするため、二重盲ランダム比較試験によって、スボレキサント(ベルソムラ)10mg、ラメルテオン(ロゼレム)4mg、ゾルピデム(マイスリー)5 mgの一回服用における翌日の運動機能と認知機能をプラセボと比較した。事前に健康診断を実施し、深刻な疾患に罹患していない65歳以上の健常高齢者14名(男性6名,女性8名,68.0±3.4歳)で、睡眠導入剤をはじめとする向精神薬の薬剤処方がないものを対象とした。実験日の昼寝や居眠り、喫煙、カフェインの摂取は禁じた。実験目的および手続きについては十分に説明し、書面によって同意を得た。本実験は、秋田大学倫理委員会の承認を受けた。実験方法は、対象者に、睡眠導入剤かプラセボのいずれかをランダムに就寝時(23時)に服用してもらい、就寝させた。翌日4時に起床させ、評価をしたのち、6時まで再度就寝させた。客観的評価(TUG,FRT,重心動揺、記憶、手の反応)と主観的評価(眠気、気分、疲労感)は、服薬前後と翌日、それぞれ5回と8回測定した。各実験の間隔はwash-outのため1週間とし、実験の間の6日間は平常の生活を指示した。実験場所は、宿泊施設を利用し、医師が立ち会い、服薬後の観察と実験の安全管理を徹底させた。結果は、反復測分散分析により、薬(4条件)と時間の主効果および交互作用を検討した。重心動揺の閉眼時の動揺距離において薬の主効果(p=0.012)が認められ、多重比較(Bonferroni)で、ゾルピデム<スボレキサント、ゾルピデム<ラメルテオンであり、ゾルピデムが有意に好成績であったが、プラセボとは差がなかった。他の指標には有意差は認めなかった。以上より、いずれの薬剤でも今回検討した用量では、転倒等の危険性が増すような可能性は認めなかった。ゾルピデムは他の2薬に比べて、重心動揺の閉眼時において好成績であった。実験を全て終え、一部を残して解析は終了した。現在は、学会などで実験結果について、様々な関係者と意見交換し、考察を深めている。

翌日4時に起床させ、客観的評価(フリッカー検査(CFF)、Functional reach test、Timed Up & Go Test、重心動揺テスト、単純弁別反応課題、記憶テスト)や主観的評価をした後再び6時まで就寝させた。就寝中は簡易脳波計を装着し、睡眠の評価を行った。客観的評価は服薬前後から翌日まで5回、主観的評価は7回実施した。結果:反復測定二元配置分散分析により、薬(4条件)と時間の主効果および交互作用を検討したところ、重心動揺テストの閉眼において薬の主効果(p=0.012)が認められた。多重比較(Bonferroni)を行った結果、ゾルピデムは、スボレキサントやラメルテオンに対して有意に動揺が小さかった。主観的指標では、有意水準には満たないが、ゾルピデムが良好であった。11時から朝4時までの睡眠指標は、4条件間に有意な差は認められなかった。考察:オレキシン受容体拮抗薬やメラトニン受容体作動薬は、従来の睡眠導入剤で懸案だった筋弛緩作用を伴わないため、高齢者の転倒を予防できる可能性が期待されている。本結果からは、半減期の短いゾルピデムが概ね良好であった。実験は無事に終了し、執筆段階にある。目的:オレキシン受容体拮抗薬のスボレキサント、メラトニン受容体作動薬のラメルテオン、汎用される非ベンゾジアゼピン(以下BZ)系睡眠薬のゾルピデムに対して、高齢者の運動・認知機能からその残余効果を調べ、安全な睡眠導入剤を検討する。方法:高齢健常者14名を対象とし、秋田大学倫理審査を経て書面で同意を得た。スボレキサント(ベルソムラ、MSD社)10mg、ラメルテオン(ロゼレム、武田)4mg、ゾルピデム(マイスリー、アステラス社)5 mgの一回服用における運動機能と認知機能を二重盲ランダム比較試験にてプラセボと比較した。対象者は、1週間毎に睡眠導入剤かプラセボのいずれかを就寝時(23時)に服用し、就寝した。実験は無事に終了し、学会発表も行ったが、英語論文作成および投稿が遅れている。平成29年度は、米国睡眠学会、日本睡眠学会、アジア理学療法学会の発表を予定している。広く意見を集め、考察を深め、論文執筆に取り掛かる予定である。平成30年度で英語論文を作成し、海外のジャーナルに掲載されるように努める。英語論文を作成し、インパクトファクターの高い論文から投稿し、今年度一杯でアクセプトされるように尽力する。対象者数を増やすために追加実験を行う予定がある。交通費に変動があり、予定よりも安価に済んだため。英語論文作成にかかる英訳のサポート費用、学会参加費用を計画している。
グローバルにおけるメタン放出異常地域の原因分析とメタン収支の推定

メタンは二酸化炭素の次に地球温暖化に寄与する温室効果ガスである。しかし、メタンの発生源の特定は実験レベルによる結果でありグローバルを対象とした研究は少ない。そこで、本研究はSCIAMACHYを用いてグローバルなメタン発生地の抽出について調べた。雲の影響を取り除き欠落したデータを補間するために3段階処理を行った。また、大気循環モデルを簡略化し海域のメタン濃度を陸域のバックグラウンド濃度として仮定した。陸域メタン濃度と同緯度のバックグラウンド濃度の差を陸域のCH4発生濃度として用いた。その結果、北半球低緯度の水田域と赤道付近の熱帯常緑広葉樹林域がCH4ソースであることがわかった。地球規模の気温上昇の原因として、人間活動による温室効果ガスの増加が挙げられる。人間活動による化石燃料の使用、森林の減少や都市化などにより大気中の温室効果ガス濃度の急激な増加が主な原因である。メタンの場合、長寿命温室効果ガス全体放射強制力の18%をしめる(IPCC, 2007)。また同報告書によると、大気中の滞留時間は約12年と推測されている。そのため、メタンは二酸化炭素に次ぐ地球温暖化の影響を持つ温室効果ガスとして重要である。従来のメタンの放出源(ソース)として動物の腸内発酵、自然の湿地及び水田などにおけるいろいろな種類の嫌気性微生物(空気が完全に又は部分的に存在しない状態で生存できる微生物)の活動、天然ガス採掘、バイオマス燃焼などが主であると思われた。本研究では衛星データ(GOSATとSCIMACHY)を用いてメタン発生濃度を推定した結果、水田のみならず熱帯林で多くのメタンが発生していることがわかった。既存のメタン発生地域と大きく異なった結果が出た。そこで、熱帯林のメタンの発生原因を調べるために植生指数(MODIS/EVI)や降水量(GSMap)などのデータを用いて調べた。本研究ではメタン放出濃度を求めるために陸域のメタン濃度とバックラウンド濃度(同緯度の海域のメタン濃度)との差を提案した。メタン放出濃度が高い地域がメタンソースである。メタンソースと世界土地被覆図との比較によって東南アジアの水田地域と中央アフリカの熱帯雨林と南米の熱帯雨林が主なメタン発生源であることがわかった。東南アジアの水田におけるメタン放出濃度と植生指数(EVI)との正の相関が強いことがわかった。植物の光合成活動が活発になるにつれメタン放出濃度も増加している。主に植物の蒸散活動による影響であると考えられる。中国南部の水田では8月に90ppbを示した。熱帯雨林は年間のEVIが0.5と高くあまり変化しない。しかし、メタン放出濃度は10月から3月まで高く6月に低くなる。また、EVIとの高い相関が見られない。そこで、南米の熱帯雨林のメタン放出濃度と降水量との相関を調べた。その結果、熱帯雨林ではEVIより降水量の方が高い相関を示した。熱帯雨林では植生活動によるメタン生成よりは雨季の嫌気性菌によるメタン生成が多いと考えられる。衛星によって得られた熱帯雨林の地表面水指数とは地面ではなく植物の葉の水分状態を示すため本研究では降水量データを用いた。昨年の研究成果で熱帯雨林地域(南アメリカと中央アフリカ)と東南アジアがメタンソース(メタン発生地)であることが分かった。南アメリカや中央アフリカは常緑広葉林域が広く分布しているため自然的要因、東南アジアは主に水田域が広がっているため人為的要因によってメタンが発生していることが分かった。水田が多く分布している東南アジアは多くの先行研究から土地利用によるメタン発生が大きく認められた。しかし、南アメリカと中央アフリカにおけるメタン発生の研究は少なく現在その原因は不明である。そこで、2003年から2010年までのSCIAMACHYデータ(メタン発生濃度)、MODISデータ(植生指数と地表面温度)とGSMAPデータ(降水量)の解析を行った。その結果、メタン発生量と降水量が密接な関係であることが分かった。メタン発生は雨季に多く発生し乾季になると少なくなることが分かった。衛星データ解析の検証のために地上観測データであるWDCGGデータとの比較を行った結果10ppb程度の誤差でメタン発生濃度が一致した。GOSATデータ処理が予定より遅れている。SCIAMACHYデータとの形式が異なり処理のためのプログラムを作成に時間がかかった。また、国際学会に提出する論文に時間がかかった。主に衛星データの検証のための地上データと他の論文の検証を調べるのに時間がかかっている。本研究では2003年から2011年までの時系列SCIAMACHYデータを用いて地上のメタン発生濃度を推定し、CH4ソースを抽出した。既存の研究では困難であった地上のバックグラウンドCH4濃度を、同緯度の海域のCH4濃度とみなし、地上のCH4発生濃度を求めた。また、CH4ソースの地理的特徴を植生図と比較し、CH4発生の原因について調べた。その結果、自然起源のCH4ソースの土地被覆特徴は主に常緑広葉樹林であることが分かった。CH4発生量の季節変動が生じるが、この季節変動は光合成活動に起因したCH4の生成ではない。常緑広葉樹林の時系列NDVIは年間変化が少ないため、光合成活動も年間変化が少ないと考えられる。また、常緑広葉樹林がすべてCH4ソースではない。常緑広葉樹林からCH4が生成するのであればCH4ソースがもっとブラジルまで広く分布しなければならない。中部、西部アフリカや南アメリカのCH4発生濃度の季節変動は雨季と密接な関係がある。

3つの地域はケッペンの気候区分によると熱帯雨林気候、サバンナ気候や熱帯モンスーン気候になる。熱帯雨林気候は年中多雨であり、サバンナ気候や熱帯モンスーン気候は雨季(中部アフリカは5月から7月まで雨季)と乾季(ブラジルは5月から9月まで乾季)に分かれている。雨季になると十分な雨によって地面の状態は一時的に嫌気的環境に変わり、その結果CH4が生成しやすくなる。地下で発生したCH4は植物の蒸散活動によって植物の葉から地上に放出される(Megonigal and Guenther, 2008)。また、地面近くで生成されたCH4はそのまま大気中に放散されたと考えられる。また、アジアの高緯度地域(シベリア)で高いCH4発生濃度が観測された。シベリアは緯度が高いため3月から9月までデータが観測されるが、その中で4月のメタン発生濃度が一番高い(4060pb)。シベリアの膨大な面積は自然の湿地でありメタン発生源である。メタンは二酸化炭素の次に地球温暖化に寄与する温室効果ガスである。しかし、メタンの発生源の特定は実験レベルによる結果でありグローバルを対象とした研究は少ない。そこで、本研究はSCIAMACHYを用いてグローバルなメタン発生地の抽出について調べた。雲の影響を取り除き欠落したデータを補間するために3段階処理を行った。また、大気循環モデルを簡略化し海域のメタン濃度を陸域のバックグラウンド濃度として仮定した。陸域メタン濃度と同緯度のバックグラウンド濃度の差を陸域のCH4発生濃度として用いた。その結果、北半球低緯度の水田域と赤道付近の熱帯常緑広葉樹林域がCH4ソースであることがわかった。メタン放出濃度を求めることによって、既存の水田以外に赤道付近の熱帯雨林で多くメタンが発生していることがわかった。水田以外のメタン発生源がわかったためIPCCのメタン収支の計算を変える必要がある。本研究の大きな目的の一つがメタン発生源の抽出である。また、メタン収支における発生量の推定はこれから研究を行うため概ね順調に進んでいると考えている。GOSATデータによるメタン発生濃度結果と地上データとの比較を行う。また、3年間の研究成果を論文として提出することを最優先で考えている。リモートセンシング今後の研究の進め方は、メタン発生濃度からメタン発生量を計算することである。また、2007年からメタン発生が増加した原因をこれから雨との因果関係について調べる必要がある。インドネシアや中国で発生するメタンを現地で測定できず日本に持ち帰る必要があった。しかし、大気を容器に入れて日本に送った場合気体濃度の変化の恐れがあるため諦めた。そこで、現在現地の気象庁でメタン濃度を測定しデータを用いる方法を考えている。同時に熱帯雨林近くに気象観測所があればそのデータを送ってもらうことも調べている。ヨーロッパ衛星(SCIAMACHY)と日本衛星(GOSAT)との補正に時間がかかった。2つの衛星に関する比較や検証論文が少ないため自分で処理しながら検証を行う必要がある。