hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
培養角膜上皮細胞シートを用いた眼刺激性試験方法の開発

点眼薬や香粧品の眼刺激性試験にはウサギを用いるドレイズ眼刺激性試験が使用されてきた。この試験は動物に苦痛を強いること、そして感度が低いことから廃絶が求められている。我々は3次元的に再構築されたウサギ培養角膜上皮細胞シートを用いた動物実験を代替する試験方法を開発し眼刺激性の検出に成功した。本研究においては、角膜への毒性が疑われていたフルオロキノロン点眼薬が角膜に対して安全であることを明らかにした。さらに、産業動物の廃棄材料を用いた第二世代の試験方法の開発に成功した。この新しい試験方法では簡便性と再現性が向上し同時多検体の試験が可能となった。眼刺激性物質の網羅的評価を行う際、現在の評価系では1ウエルで1検体を評価する。培養角膜上皮細胞を1ウエル作製するためには多大な時間と労力を要する。さらに各ウエル間の性能のばらつきが大きいため被検物質の評価の際には多くの母数を必要とする。多数の培養角膜上皮を作製するとさらにばらつき大きくなるという悪循環が生じる。多数のウエルを使用する眼刺激性物質を網羅的に評価するのは困難である。そこで当該年度は安定しなおかつ同時多検体の評価が可能な評価系の作製を行った。従来法どおり6ウエルプレート内の各トランスウエルに培養角膜上皮シートを作製した。細胞シートはディスク様に直径2mmの皮膚生検用トレパンで打ち抜かれた。ディスク様の細胞シートは別に用意された6ウエルプレート内のコラーゲンゲル上に6つ静置された。被検物質の暴露は従来と同様に点眼の要領でおこなった。ディスク片縁から伸展する培養細胞を観察し1ウエル内に静置された6つのディスクからの平均伸展面積を比較した。被検物質には塩化ベンゼンザルコニウム(以下BAC)を0.01%から0.00001%までPBSで10倍階段希釈された溶液を使用した。正常対象にはPBSを使用した。その結果、0.00001%BAC溶液では正常対象のPBSと同様な伸展が見られた。0.0001%BAC溶液では伸展の障害が見られ、0.01%では伸展が見られなかった。伸展の障害の程度はBAC溶液の濃度に比例した。培養角膜上皮シートディスク片縁からの細胞伸展を観察することで被検物質の障害性を判定することができた。感度は従来法であるシート中央部にアルカリ処理で欠損部を作製しその修復を観察する方法と同等であった。1ウエルに複数のディスクを配置することで同一条件での母数の多い評価が可能であった。最終年度、本研究の主目的である眼刺激性試験は確立された。さらに、その過程で考案された次世代の試験方法の概念が実現可能であることが証明された。本年度は実際の香粧品に使用される界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウムの眼刺激性の検出をおこなった。培養角膜上皮細胞シートは従来のウサギ角膜ではなく豚角膜から作成した。トランズウエルの1ウエルには6枚の培養角膜上皮細胞シートから切り出された試験ディスクを設置した。各試験ディスクを被験物質の10-1から10-4溶液で暴露した。72時間の観察後、試験ディスク断端から伸展した細胞の面積を計測したところ10ー1溶液で有意な細胞伸展の抑制が観察された。この結果は生きたウサギを使用するドレイズ試験と同等の結果であった。以上の結果から当初の目的であった培養角膜上皮細胞シートを用いた眼刺激性試験の確立に成功した。この度確立された試験方法は産業動物の廃棄部位を使用するため完全な動物実験代替法である。1枚のシートから複数の試験ディスクを作成することでシート作成の労力を軽減すると同時に同時多検体の試験が可能となりシート間の感受性のばらつきに影響を受けない試験が可能となった。当初の目的は達成されたがいまだ多くの時間と労力を要する。本試験方法確立の過程でより少ない細胞数、より短い時間で実施可能な方法の発案に至った。原子間力顕微鏡は細胞の形、表面形状等の形態学的変化に加えて細胞表面の硬さ等の物理学的性状変化をリアルタイムに検出する。本装置を用いて塩化ベンザルコニウムに暴露した培養角膜上皮細胞を観察したところ、約2時間の測定で形態の変化に加えて表面の硬さの変化を検出することに成功した。細胞は100,000個から1個、そして検出が3日間から2時間になる可能性が示唆された。この新しい方法にさらなる改良を重ねより良い試験方法へと発展させてゆく。<背景と目的>

点眼薬の開発や臨床応用では角膜上皮への影響が問題となる。その評価にはin vitroで単層培養された細胞が用いられてきた。今回、より生体に近い重層化した培養角膜上皮シートを用いた障害修復の実験系を作成し、塩酸モキシフロキサシン点眼液(MFLX)とレボフロキサシン点眼液(LFLX)の角膜上皮障害に対する影響を検討した。<方法>角膜上皮細胞は白色ウサギの角膜組織片から取得し、air-lift培養で重層化を行った。上皮の欠損は水酸化ナトリウム水溶液を浸透させたスポンジの接触で作製した。スポンジの除去後、MFLXとLFLX点眼液を1日3回滴下して1分後に洗浄、air-lift培養を継続し、欠損部の被覆率を面積で評価した。MFLXとLFLX点眼液は原液と4倍希釈液を、陰性コントロールには培養液を、陽性コントロールには塩化ベンザルコニウム0.01%溶液を用いた。<結果>陰性コントロールでは4日後に上皮細胞による欠損部の完全な被覆がみられた。陽性コントロールでは被覆が抑制された。一方、MFLXとLFLXはいずれの濃度でも欠損部は被覆され、陰性コントロールと有意差はなかった。<考察>生体に近い、重層化された培養角膜上皮シートを用いた今回の実験系で、MFLXとLFLX滴下群ではコントロールと同様に欠損部が被覆された。MLFXとLFLXはいずれも角膜上皮障害の修復を阻害する点眼薬ではないと考えられた。<成果の報告>これらの結果は申請者がcorresponding authorとして投稿しGraefes Arch Clin Exp Ophthalmol (in press, DOI10.1007/s00417-011-1916-1)に受理された。安定して多くの被検物質を評価する系の開発に成功した。従来法では培養角膜上皮シート上の内方への欠損修復を観察した。新しい方法では外方への細胞伸展を観察することで同等の感度を得ることに成功した。東京工業大学での新研究部門立ち上げに期間を要したが概ね順調に進展した。この理由は従来法での欠点を明確にしていたこと、実験結果を正確に分析していたこと、発想を速やかに具現化したことが挙げられる。初年度、申請者は自身が開発した方法を用いて医薬品と香粧品の眼刺激性を明らかにすること、さらにより簡便で再現性の高い方法への改良を目指した。医薬品では角膜上皮細胞の単層培養系で強い角膜上皮毒性が指摘されているフルオロキノロン系抗菌薬の毒性を検証した。申請者が開発した生体に近い、重層化された培養角膜上皮シートを用いた方法で、MLFXとLFLXはいずれも角膜上皮障害の修復を阻害する点眼薬ではないことが明らかにされた。これの結果は申請者がcorresponding authorとして投稿しGraefes Arch Clin Exp Ophthalmol (in press, DOI 10.1007/s00417-011-1916-1)に年度内に受理された。香粧品では炭素鎖長は同じで不飽和のオレフィン2重結合の位置が異なる物質間での障害性の相違検出を目指した。より遠位に2重結合を有するもの2種、より近位に有するもの3種の計5種すべての入手を試みているが合成が困難なものがあり、手法の改善を検討している。簡便性、再現性の向上を行うためコラーゲンゲルのシート化を行っている。
矯正移動がヒト歯髄血流におよぼす影響に関する研究

健康な成人の臨床的に健全な上顎左側中切歯に単発的および持続的圧下力を付与した際の歯髄血流(PBF)の応答を、レーザードップラー血流計を用いて調べた。被験歯の切縁中央部に歯軸の根尖方向に向け約500gfの単発的圧下力を約20秒間加え、その前後を通して、PBFを連続測定した。また、被験歯の唇側面および上顎両側第一大臼歯の頬側面にエッジワイズブラケットを接着し、矯正用ワイヤーを用いて被験歯に約50gfの持続的圧下力を加え、(1)圧下力付与前、(2)持続的圧下力付与中、(3)圧下力停止後のPBF測定を行なった。また。(1)(3)の各期間、被験歯にそれぞれ50gf、100gf、200gfの圧下力を約20秒間付与し、その際のPBF応答についても解析した。測定に先立ち被験歯唇側にアクリルチューブを接着固定しそこに血流計の測定プローブを挿入することで、常に一定の位置でPBFを測定した。さらに、歯周組織血流由来のノイズが歯髄血流信号に混入することを避けるために、遮光性の黒色ラバーダムシートを用いた。得られた結果は以下の通りであった。1)単発的圧下力の付与は統計学的には有意ではなかったものの、PBFを減少させることが示唆された。2)持続的圧下力の付与に伴うPBFの推移は、対象群と実験群との間に有意差が認められ、実験群のPBFは、持続的圧下力の付与により約30%減少し、その後付与以前と同程度まで回復した。3)単発的圧下力は、持続的圧下力付与の前、中、後のいずれの時期においてもPBFを一過性に減少させたものの、各期間を通してその減少率に有意差は認められなかった。以上の結果から、本研究において設定したPBF測定法は、矯正歯科治療時におけるPBFの経時変化の観察方法として有効であると考えられた。また、50gf程度の持読的圧下力はヒト左側上顎中切歯のPBFに可逆的な変化を生じさせることが推察された。また。矯正力を付与した際の歯髄の動態、特に,歯髄血流に関する報告は限られている。本研究では、ヒトの歯に圧下力を短時間付与した際の歯髄血流の変化を、レーザードップラー血流計を用いて検討した。測定は2630歳の健康な成人5名の、臨床的に健全な上顎左側中切歯5本について行った。測定に先立ち、被験者に本研究の目的と測定方法を説明し、インフォームドコンセントを得た。歯髄血流はレーザードップラー血流計(MBF3D;Moor lnstruments)を用いて測定した。被験歯唇側の歯頸部から2mm切縁方向で近遠心的に中央の位置に、歯科用セメントを用いて歯面に垂直方向に金属性チューブを固定し、そこに血流測定プローブを挿入した。測定の際、歯周組織への光の散乱を減ずるために、被験歯に遮光性のラバーダムシートを装着した。測定歯切縁

中央部から歯軸の根尖方向に、250g重の圧下力を約20秒間加え、加圧の間及びその前後を通して、歯髄血流を連続測定した。ラバーダムシートを装着した場合の歯髄血流指示値は、装着しない場合に較べて、圧下力を付与する間、およびその前後、それぞれ有意に小さかった(n=5,p<0.041:Wilcoxon signed rank test)。ラバーダムシートを装着した場合、圧下力の付与は、測定を通して歯髄血流指示値に有意の変動を生じさせた(n=5,p<0.040:Friedman test)。ラバーダムシートを装着しない場合は、有意な変化は得られなかった。以上の結果から、ヒト上顎中切歯に対して250g重程度の圧下力を与えた場合、歯髄血流に変化が生じる可能性が示唆された。ヒトの歯に単発的および持続的圧下力を付与した際の歯髄血流(PBF)の応答を、レーザードップラー血流計を用いて調べた。被験歯は、健康な成人の臨床的に健全な上顎左側中切歯とした。持続的圧下力の付与は、被験歯の唇側面および上顎両側第一大臼歯の頬側面にエッジワイズブラケットを接着し、矯正用ワイヤーを被験歯に約50gfの圧下力が加わるように調整した。PBF測定は、各被験者につき(1)圧下力付与前、(2)持続的圧下力付与中、(3)圧下力停止後に行なった。また、(1)(3)の各期間において、被験歯にそれぞれ50gf、100gf、200gfの圧下力を約20秒間付与し、その際のPBF応答についても解析した。測定に先立ち被験歯唇側にアクリルチューブを接着固定しそこに血流計の測定プローブを挿入することで、常に一定の位置でPBFを測定した。さらに、歯周組織血流由来のノイズが歯髄血流信号に混入することを避けるために、遮光性の黒色ラバーダムシートを用いた。得られた結果は以下の通りであった。1)持続的圧下力の付与に伴うPBFの推移は、対照群と実験群との間に有意差が認められ、実験群のPBFは、持続的圧下力の付与にともなって平均で約30%減少し、圧下力解放後は圧下力付与以前と同程度まで回復した。2)被験歯に、持続的圧下力付与の前、中、後の時期に単発的圧下力を付与したところ、いずれの時期においてもPBFは一過性の減少を示したものの、その減少率は、各期間を通して有意な変動は認められなかった。以上の結果から、本研究において設定したPBF測定法は、矯正歯科治療時におけるPBFの経時変化の観察方法として有効であると考えられた。また、50gf程度の持続的圧下力はヒト左側上顎中切歯のPBFに可逆的な変化を生じさせることが推察された。
住民コホート研究の追跡調査による脊椎退行性変化の危険因子と頚部痛・腰痛の解明

本研究は、代表性が確立した住民コホート研究の追跡調査により、椎間板変性の発生率や進展様式、危険因子、頚部痛・腰痛、脊柱管狭窄との関連性を解明することが目的であった。われわれ研究チームは、2013年および2014年に和歌山県日高川町及び太地町にて1500名程度の新規参加者を含む第2次The Wakayama Spine Studyとして追跡調査をおこなった。調査から生活習慣を網羅した情報(年齢、身長、体重、既往歴の有無、喫煙歴、飲酒歴の聴取、血液検査(脂質、尿酸値など生化学))、及び身体機能テスト、骨密度検査、全脊柱Xp、全脊柱MRIデータの収集を行ない、申請者はこれらデータを蓄積し解析して、まず椎間板変性および脊椎退行性変化に関するデータベースの構築を完了した。続いて、現在は椎間板変性の新規発生率、椎間板変性から脊柱管狭窄への移行率と椎間板変性や脊柱管狭窄を促進させる危険因子、椎間板変性と頚部痛・腰痛の経時的変化を明らかにすべく解析を行なっている。これにより、全脊柱における椎間板変性の新規発生率を導き出すことが可能である。新規発生率を解明することによって、どの年代で有意に椎間板変性が発生するか、およびどのような被験者に椎間板変性が起こりやすいかなどが解明できる。加えて、ベースラインで得られた椎間板変性の関連因子である糖尿病患者や肥満の被験者を追跡することにより、椎間板変性を促進させる危険因子を解明することで、今後の椎間板変性の予防に関する有意義なデータを得ることが可能となる。前年度には、全脊柱MRIを使用した椎間板変性の全脊柱の椎間における有病率とその分布、加えて頸椎、胸椎および腰椎すべての分節における椎間板変性が加齢や肥満と強い関連があること、さらに椎間板変性と頸部痛もしくは腰痛との関連性を初めて示した。(Osteoarthritis and Cartilage 2014, 22: 104-110)。また、椎間板変性の危険因子を解明するために全脊柱における椎間板とメタボリックシンドローム(高血圧、高脂血症、糖尿病、肥満)との関連を検討した。結果は肋骨に囲まれた可動性の少ない胸椎において、力学的負荷以外の要因すなわち糖尿病と肥満が有意に椎間板変性と関連していることが明らかになり、国際雑誌に掲載された。(PLoS ONE 11(2): e0147565)従来、椎間板変性に関するMRIを用いた疫学研究は、莫大な費用や、胸椎には椎間板症が殆ど存在しないという認識のもと、腰椎あるいは頸椎のみに焦点が当てられ全脊柱を系統的に評価した報告は存在しない。そのため、本年度の研究の実績としては今まで明らかにされていなかった腰痛とMRIにおける画像変化のと関係、椎間板変性の危険因子を明らかにすることが可能であった。研究実績の概要で述べたように、本年度は多数の国際学会および国内学会にて研究計画の予定通りの内容を発表し評価を頂いた。また、国際的な高いインパクトのある雑誌にも掲載されており概ね計画通りであると考える。椎間板変性の予防につながる疫学データを提示するため、申請者は本研究のThe Wakayama Spine Studyの4年間における追跡調査を行い、現在までに以下のことを明らかにしておりインパクトのある学術論文に多数掲載している。さらに申請者は現在まで、横断的なデータ報告および4年間の短期の縦断調査にて得られた全脊柱における椎間板変性の基礎データの報告を日本および世界に先駆けて行い多くの賞を獲得し、反響を得ている(日本整形外科学会奨励賞2015,国際腰椎学会議(ISLLS)口演2013-2016,アジア太平洋整形外科会議(APOA)口演2013,2015,整形災害外科科学研究助成奨励賞2014,北米脊椎学会議(NASS)口演2013)。現在もデータの報告のために研究を邁進している。4年間における椎間板変性の新規発症率および進行率のデータを報告し、椎間板変性の危険因子の解明を当初の予定通り進歩している。このHIZは腰痛との関連があることが最近話題となっており、The Wakayama Spine Studyで作成した上記の分類を香港大学の一般住民コホートであるHong Kong Degenerative Disc Studyの1414名に対して腰痛、腰痛関連生活障害そして坐骨神経痛との関連を検討した。その結果、多椎間にわたるHIZは有意に腰痛や腰痛関連生活障害と関係があることを明らかにし、国際腰椎学会(ISSLS 2018)や日本脊椎脊髄病学会2019に報告そしてインパクトのある国際雑誌PLOSONE 2018に掲載した。本データは非常に重要なものであり今後の腰痛関連疾患の基本データとなる。さらにこの共同研究は引き続き行う予定であり、より大きな国際研究となる。予定通り、追跡調査のデータ収集および蓄積が完了し、椎間板変性および脊椎退行性変化に関するデータベースの構築を完了したため概ね順調に作業は進んでいる。また現在、椎間板変性の危険因子が肥満や糖尿病であることが解明されつつあり、研究は進展していると考えられる。今後は本研究の最終年度であるため、引き続き解析および検討を続けデータを生み出していく。そして、国際学会および雑誌に投稿を行ない世界に周知されるように発信していく。今後は10年間の追跡調査を継続し、よりエビデンスレベルの高いデータの収集を行ない報告を行なっていく。

脊椎今後はさらに研究を進めるため香港大学との共同研究を行なうこととなった。これによりHong Kong Degenerative Disc Studyとの相違を検討することから、椎間板変性を促進させる危険因子を解明することが可能であり、今後の椎間板変性の予防に関する有意義なデータを得る事が出来ると考える。本年度は、新たな設備への購入のための科研費使用が無かったため次年度使用額が生じた。研究は順調に進んでいるが、よりエビデンスの高いデータを得るために次年度も継続して研究を継続していくため。本年が第3次検診を行なうため旅費および検診のための物品などが必要と考えます。また同時に解析および論文投稿、海外での学会発表を行なう予定であります。次年度は、縦断調査を行なうため移動式MRIを賃貸する必要がある。そのための資金として使用する計画である。現在までの得られたデータをリンケージさせ解析を行なっていく計画。また得られたデータは国際学会で発表、そしてインパクトのある雑誌に掲載する。第3次検診は本年10月頃より和歌山県日高川町で開始し、2ヶ月ほど滞在する予定です。その際の旅費、検診のための物品の購入のため使用する計画です。
乳歯歯根吸収の制御を目的とした遺伝子治療のための基礎的研究

本年度はreceptor activator of NF-kappa B (RANK) ligand (RANKL)の真核細胞発現ベクターをマウス骨髄由来細胞ならびにマウス由来株化細胞(RAW264.7細胞、J774-1細胞)への遺伝子導入を行った。インデューサ(テトラサイクリン)を添加時にのみ目的遺伝子を発現するベクターを用いることによって、目的タンパク質の発現がコントロール可能となり、適切な時に適切な発現を可能とした。しかしながら、リポフェクション法、エレクトロポレーション法では、ともに導入率が0.01%以下であった。また、レトロウイルスベクターを用いた方法では導入率が0.01%程度であった。以上のように、遺伝子導入を効果的・効率的に行うことができなかった。予備実験の結果から炎症性サイトカインの1つであるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)はその濃度に依存して、TRAP陽性細胞の総核数を変化させることなく、マウス骨髄由来細胞から分化したTRAP陽性多核細胞の出現数を減少させることが判明した。そこで、MIFの真核細胞発現ベクターをマウス骨髄由来細胞ならびにマウス由来株化細胞への遺伝子導入を、上記と同様にリポフェクション法、エレクトロポレーション法、レトロウイルスベクターを用いた方法で行ったが、効果的・効率的に行うことができなかった。マウス由来株化細胞(RAW264.7細胞)にMIFを作用させると、TRAP陽性細胞の総核数を変化させることなく、マウス骨髄由来細胞から分化したTRAP陽性多核細胞の出現数は減少した。以上の結果より、MIFの作用はマウス骨髄由来細胞のみならず、マウス由来株化細胞においても確認され、真核細胞発現ベクターの新たな開発によって、歯根(骨)吸収の制御が効果的・効率的に行えることが可能となりうると考えられる。我々はヒト永久歯もしくは乳歯由来歯根膜細胞とマウス大腿骨由来の骨髄由来細胞との共存培養系、ならびに、マウス由来骨芽細胞様細胞とマウス骨髄由来細胞との共存培養系において、10%FBS、アスコルビン酸およびL-グルタミンを添加したαMEM培養液に活性型ビタミンD3とデキサメタゾンを添加することにより、破骨細胞のマーカー酵素の一つである酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)陽性の多核細胞を誘導することに成功した。また、マウス骨髄由来細胞を、セファデックスG10カラムを通すことにより得たmonocyteにreceptor activator of NF-kappa B (RANK) ligand (RANKL)とCSF-1 (M-CSF)を添加した培養液を用いることにより、TRAP陽性多核細胞を得ることに成功した。次に、象牙質切片上でこれら培養系を行い、骨吸収活性(吸収窩)を持つことを走査型電子顕微鏡で確認し、TRAP陽性の多核細胞が破骨細胞であることを確認した。以上の結果より、骨吸収制御機構を確認するための実験系が確立された。また、RANKLの真核細胞発現ベクター合成に成功し、大腸菌に蛋白質を発現させ、GSTカラムを用いて精製に成功した。SDS-PAGEにより、その分子量は目的のものであることが確認された。今後は、RANKLベクターの遺伝子導入を行い、歯根吸収の制御が効果的・効率的に行えうるか否かを評価する。また、RANKL以外の骨吸収制御因子の真核細胞発現ベクターの構築を行う。マウス骨髄由来細胞に、セファデックスG10カラムを通すことにより得た細胞に、CSF-1(M-CSF)と、昨年度合成することに成功したreceptor activator of NF-kappa B (RANK) ligand(RANKL)とを添加した培養液を用いることにより、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)活性陽性多核細胞を得ることに成功した。次に、象牙質切片上でこれら培養系を行い、骨吸収活性(吸収窩)を持つことを走査型電子顕微鏡で確認し、TRAP陽性多核細胞が破骨細胞であることを確認した。しかしながら、RANKLの真核細胞発現ベクターをマウス骨髄由来細胞ならびにマウス由来株化細胞への遺伝子導入を行ったが、効果的・効率的に行うことができなかった。また、予備実験の結果から炎症性サイトカインの1つであるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)に関する知見が得られた。セファデックスG10カラムを通すことにより得た細胞に、CSF-1とリコンビナントRANKLを加えた培養系を用いて、MIFの作用を検討した。MIFはその濃度に依存して、TRAP陽性細胞の総核数を変化させることなく、TRAP陽性多核細胞の出現数を減少させることが判明した。また、象牙質切片上に形成された吸収窩を観察したところ、MIF作用群では形成された吸収窩の大きさが明らかに小さかった。以上の結果より、MIFは分化・成熟過程にある破骨細胞の融合過程を阻害することで、成熟した破骨細胞の出現を抑制しているものと考えられた。今後はこれら遺伝子を強制発現させる系を利用して、培養系に応用し解析を行い、歯根吸収の制御が効果的・効率的に行えうるか否かを評価する。

しかしながら、リポフェクション法、エレクトロポレーション法では、ともに導入率が0.01%以下であった。また、レトロウイルスベクターを用いた方法では導入率が0.01%程度であった。以上のように、遺伝子導入を効果的・効率的に行うことができなかった。予備実験の結果から炎症性サイトカインの1つであるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)はその濃度に依存して、TRAP陽性細胞の総核数を変化させることなく、マウス骨髄由来細胞から分化したTRAP陽性多核細胞の出現数を減少させることが判明した。そこで、MIFの真核細胞発現ベクターをマウス骨髄由来細胞ならびにマウス由来株化細胞への遺伝子導入を、上記と同様にリポフェクション法、エレクトロポレーション法、レトロウイルスベクターを用いた方法で行ったが、効果的・効率的に行うことができなかった。マウス由来株化細胞(RAW264.7細胞)にMIFを作用させると、TRAP陽性細胞の総核数を変化させることなく、マウス骨髄由来細胞から分化したTRAP陽性多核細胞の出現数は減少した。以上の結果より、MIFの作用はマウス骨髄由来細胞のみならず、マウス由来株化細胞においても確認され、真核細胞発現ベクターの新たな開発によって、歯根(骨)吸収の制御が効果的・効率的に行えることが可能となりうると考えられる。
乾癬患者におけるTNFαアンタゴニスト二次無効のメカニズム解析

抗TNF-a抗体製剤で治療されている乾癬患者において、その治療効果とTHP-1細胞をベースとしたIL-8レポーター細胞を用いて測定された患者血清中のTNF-a中和活性の間に有意な相関が認められ有用な試験系であることを見出した。また、患者血清中の抗TNF-a中和活性がELISAで測定した血清中の抗TNF-a抗体製剤の濃度と相関した。一方、ヒトT細胞JurkatをベースとしたIL-2レポーター細胞においてJAK阻害剤等の種々の薬剤によりIL-2レポーター活性の抑制が認められ、各種のレポーター細胞を用いることにより今後様々な薬剤の治療効果を類推できる可能性が示唆された。抗TNF-α抗体製剤(ATA)は関節性リウマチ、乾癬などの多くの免疫の関与する慢性炎症性疾患に対する治療の主流となっている。しかし、10年を超える臨床現場での使用の中でいくつかの問題点が明らかになってきた。1)反応性の個人差。2)効果の2次無効。3)全身性の感染症や投与時反応などの副作用。4)治療費用である。THP-1細胞を母細胞としたIL-8レポーター細胞であるTHP-G8細胞はTNF-αに反応し濃度依存性にIL-8レポーター活性を上昇させた。またその上昇はATAの前処理によりATAの濃度依存性に抑制された。THP-G8細胞を用いATAで治療中の乾癬患者の血清中の抗TNF-α中和活性を定量的に評価することを目的に以下の試験をおこなった。方法:THP-G8細胞を段階希釈した健常人または患者の血清の前処理後に10 ng/mLのヒトリコンビナントTNF-αを加え、6時間後ルシフェラーゼ活性を測定した。以下の式により血清中の抗TNF-α中和活性の指標となる%suppressionを計算した。% suppression = (1-血清存在下のTNF-α添加後のIL-8レポーター活性/血清非存在下のTNF-α添加後のIL-8レポーター活性)x 100。乾癬患者血清の%suppressionとATA療法によるPsoriasis Area and Severity Index (PASI)スコアの改善率との相関を検討した。結果:健常者の血清はTNF-αに誘導されたIL-8レポーター活性に影響を与えなかった。1または2週間前にATAを投与された患者の血清はTNF-αに誘導されたIL-8レポーター活性を有意に抑制した。ATA投与1週間後に採血された血清は投与2週間後に採血された血清と比べより強くIL-8レポーター活性を抑制した。東北大学病院皮膚科においてATAで治療されている乾癬患者において、PASIスコアの改善率と%suppressionの間に有意な相関が認められた。このことからTHP-G8細胞が個々の患者におけるATA療法の治療効果と相関する血清中の抗TNF-α中和活性を評価する有用な試験系であることが示唆された。平成27年度では、THP-G8細胞を用いて測定した患者血清のSLO-LA抑制能、従来のELISA法による血中TNF-αアンタゴニスト濃度、血中抗TNF-αアンタゴニスト抗体濃度を測定する。同時に患者の臨床症状を観察し、TNF-αアンタゴニストが二次無効になった症例とTNF-αアンタゴニストが奏功している症例との間、または同一患者でTNF-αアンタゴニストが奏功していた期間と二次無効の期間での測定値を比較することにより二次無効のメカニズムを明らかにすることを計画していた。平成27年度、東北大学病院皮膚科において抗TNF-α抗体製剤で治療されている乾癬患者についてTHP-G8細胞を用いた血清中の抗TNF-α中和活性の測定し、その中和活性と抗TNF-α抗体製剤療法の治療効果の相関が示唆されている。一方この系をその他の乾癬に対する生物学的製剤(抗p40抗体製剤、抗IL-17抗体製剤)、その他の疾患に対する生物学的製剤(抗IL-6抗体製剤)についても応用できるかを検討するため、THP-G8細胞およびヒト表皮細胞HaCaTをベースとしたIL-8レポーター細胞におけるIL-12, IL-23, IL-17, IL-6に対する反応性をアッセイしたがいずれもレポーター活性の上昇は認められなかった。また乾癬以外の他の疾患についても同様なことが認められるかを確認するため、他病院の内科にて抗TNF-a抗体製剤で治療されている関節性リウマチ患者の血清を供与して頂きTHP-G8細胞を用いてその抗TNF-a中和活性を測定し抗TNF-a抗体製剤の治療効果との間に相関があるかを検討する試験を計画し両施設の倫理委員会に計画書を申請、認可を受けている。東北大学病院皮膚科において抗TNF-a抗体製剤で治療されている乾癬患者において、その治療効果とTHP-G8細胞を用いて測定された患者血清中の抗TNF-a中和活性の間に有意な相関を認めBritish Journal of Dermatology誌に論文発表した。さらに患者血清中の抗TNF-a中和活性がELISAで測定した血清中の抗TNF-a抗体製剤の濃度と相関すること、抗TNF-a抗体製剤の濃度の低下が抗TNF-a抗体製剤抗体の産生と関連することが示唆された。

また、患者血清中の抗TNF-a中和活性がELISAで測定した血清中の抗TNF-a抗体製剤の濃度と相関した。一方、ヒトT細胞JurkatをベースとしたIL-2レポーター細胞においてJAK阻害剤等の種々の薬剤によりIL-2レポーター活性の抑制が認められ、各種のレポーター細胞を用いることにより今後様々な薬剤の治療効果を類推できる可能性が示唆された。平成27年度に引き続き当科乾癬外来通院中の抗TNF-α抗体製剤を投与された患者について採血を行い、THP-G8細胞を用いたIL-8レポーター活性抑制能の測定を継続する。加えて血中TNF-αアンタゴニスト濃度の測定、血中抗TNF-αアンタゴニスト抗体濃度の測定を行い、乾癬患者におけるTNFαアンタゴニスト二次無効のメカニズム解析を目指す。THP-G8細胞を用いて測定された患者血清中の抗TNF-a中和活性を測定することにより、臨床所見より早期にTNF-αアンタゴニスト二次無効例を予測できるを検討する。これについて、現在の患者への投与間隔に合わせた診察、測定では明らかな差は認められなかったが、可能であればこの間隔を短くして診察、測定を行い検討する。関節リウマチなど乾癬以外の抗TNF-a抗体製剤で加療されている疾患についても同様の結果が得られるかを検討する。皮膚科学
アフリカにおける障害者と社会の関わりに関する人類学的研究

これまで,カメルーン東部熱帯雨林地帯の農村部を中心に身体に障害のある人びとの生活実践を,狩猟採集民バカ・ピグミーと近隣農耕民という大きく異なる生業活動と社会関係を築いている民族集団の関係性に着目しながら,断続的に現地調査を続けてきた。一方で,調査地のようなカメルーン農村部においても,近代的な潮流にのって障害者のための公的サービスが実施されつつある。特に,カメルーンでは,国連主導によっておこなわれている『アフリカの障害者年(2000年-2009年)』の後押しを受け,都市部を中心に障害者運動の活発化や政策転換がおこなわれている。そこで本年度は,障害者を取り巻く現代的問題に取り組むため,これまでの研究を踏まえながら地域内「ケア」に着目した。ケアが担われ,遂行される規範的・経済的・社会的枠組みのもと障害者と周囲の人びとの社会関係を検討することを目的に,カメルーン農村部に加えて,東部州ブンバ・ンゴコ県の県庁所在地および首都で,2010年6月から2月までの計10ヶ月間にわたり現地調査をおこなった。2011年3月に,『アジア・アフリカ地域研究』誌10-2号に,この研究内容を発表した論文を提出した。同年3月には,京都大学で開催された"Pre-Forum Session for the 7th International Research Meeting : The Role of African Studies for" African Crisis""で,これまでの研究にジェンダーの視点を取り入れ,障害者の生活変容とそのアクターに関する研究を発表した。また本年度は,これまで研究協力を続けてきたカメルーン・ヤウンデ第一大学人類学教室のギマ教官に研究指導委託をお願いし,2010年6月から2月の10ヶ月間にわたり現地の大学に通いながら研究をおこなうことができた。それにより,現地調査で収集した調査事項を随時,ギマ教官と検討・修正することができ,長期にわたる現地調査がより実りのある内容となった。現地の大学に通うことで,研究者との意見交換がスムーズになり,現地の研究活動における自らの研究の意義および問題点もより明確になった。近年,「障害と開発」分野の研究と実践の必要性が唱えられている.先進諸国とは異なる途上国の障害者の生活実態を,規地調査に基づいて明らかにすることは急務である.そこで,カメルーンにおける障害者の生活実践に関して調査をおこない,その社会的コンテクストを明らかにすることを目的として,本年度の研究をおこなった.昨年度までに,カメルーン東部の農村社会で,狩猟採集民と近隣農耕民を対象に身体に障害のある人びとの生活実践に着目し計9ヵ月間の現地調査をしてきた.この研究を博士予備論文(修士論文に相当)として提出し,さらに出版のための書き換えをおこなっている.また,本年度11月,第19回国際開発学会で,これまでの現地調査を踏まえ,開発分野におけるフィールドワークの重要性を,『開発とフィールドワーク』という題で,共同セッションを開き研究報告をおこなった.さらに,国連主導によっておこなわれている『アフリカの障害者年(2000年-2009年)』の後押しを受け,カメルーンで活発化している政府系またミッション系の障害者団体の動きについて調査するため,平成20年11月から平成21年9月を予定にカメルーンの首都ヤウンデと東部州の農村で調査をおこなっている.首都ヤウンデでは,行政機関や国際機関での情報収集,ミッション系の慈善団体のCBRプログラムに同行しスラム街での障害者の生活調査,障害者団体の活動を調べている.一方,カメルーン東部州では,農村部の身体障害者に家で住み込み,彼らの生計活動を調査するとともに,ライフヒストリーの聞き取りをおこなっている.これらの調査により,障害者とコミュニティのかかわりを動態的に捉える手掛りになると考える.また,本年度から『アジアとアフリカのケアの実践』をテーマに共同研究をおこなっている.現在までの調査報告をかねて,2009年2月26日に,エチオピアのアディスアベバにて共同研究者と共に英語での口頭発表をおこなった.2009年度まで特に,カメルーン東部熱帯雨林地帯の農村部を中心に身体に障害のある人びとの生活実践を,狩猟採集民バカ・ピグミーと近隣農耕民という大きく異なる生業活動と社会関係を築いている民族集団の関係性に着目しながら現地調査をしてきた。この研究をまとめ,2010年3月に『森棲みの社会誌』(京都大学学術出版会)に「カメルーン熱帯雨林地帯の「障害者」:身体障害を持つ人びとの生活実践とその社会的コンテクスト」として出版した。そこで,本年度は地域内「ケア」に着目し,それが担われ,遂行される規範的・経済的・社会的枠組みのもと障害者と周囲の人びとの社会関係を検討することを目的に約10カ月の長期に渡り、現地調査をおこなった。さらに、アジアで調査をおこなっている他地域の学生と「ケア」テーマに共同研究をおこなっており,本年度はカメルーンの障害者当事者やカメルーン政府のソーシャルワーカーと共にカメルーン西部州でワークショップを開催した。今年度12月には、これらを報告書としてまとめ、京都大学で院生発案共同研究報告会を実施した。研究内容をHPで公開し、JICA関係者や日本の障害者団体に向けて発表(2009年12月)をおこなうなど、アウトリーチ活動にも力を入れながら、開発分野に視野を入れための研究を遂行するための活動をおこないつつある。

これまで,カメルーン東部熱帯雨林地帯の農村部を中心に身体に障害のある人びとの生活実践を,狩猟採集民バカ・ピグミーと近隣農耕民という大きく異なる生業活動と社会関係を築いている民族集団の関係性に着目しながら,断続的に現地調査を続けてきた。一方で,調査地のようなカメルーン農村部においても,近代的な潮流にのって障害者のための公的サービスが実施されつつある。特に,カメルーンでは,国連主導によっておこなわれている『アフリカの障害者年(2000年-2009年)』の後押しを受け,都市部を中心に障害者運動の活発化や政策転換がおこなわれている。そこで本年度は,障害者を取り巻く現代的問題に取り組むため,これまでの研究を踏まえながら地域内「ケア」に着目した。ケアが担われ,遂行される規範的・経済的・社会的枠組みのもと障害者と周囲の人びとの社会関係を検討することを目的に,カメルーン農村部に加えて,東部州ブンバ・ンゴコ県の県庁所在地および首都で,2010年6月から2月までの計10ヶ月間にわたり現地調査をおこなった。2011年3月に,『アジア・アフリカ地域研究』誌10-2号に,この研究内容を発表した論文を提出した。同年3月には,京都大学で開催された"Pre-Forum Session for the 7th International Research Meeting : The Role of African Studies for" African Crisis""で,これまでの研究にジェンダーの視点を取り入れ,障害者の生活変容とそのアクターに関する研究を発表した。また本年度は,これまで研究協力を続けてきたカメルーン・ヤウンデ第一大学人類学教室のギマ教官に研究指導委託をお願いし,2010年6月から2月の10ヶ月間にわたり現地の大学に通いながら研究をおこなうことができた。それにより,現地調査で収集した調査事項を随時,ギマ教官と検討・修正することができ,長期にわたる現地調査がより実りのある内容となった。現地の大学に通うことで,研究者との意見交換がスムーズになり,現地の研究活動における自らの研究の意義および問題点もより明確になった。
ヤドリバエの聴覚器を模倣した超小型音源定位センサの研究

本研究の目的は,非常に小さな体長でありながら優れた音源定位能力をもつヤドリバエの聴覚器官に着目し、この構造を適切にモデル化、一般化した新しいセンサ構造を導入することにより,従来のマイクロフォンアレイ技術では困難な超小型音源定位センサの実現を目指すものである。昨年度は新たな音源定位センサ構造としてジンバル型振動板を提案し,リン青銅箔を用いた試作センサによりその原理を確認し、また半導体微細加工によるセンサの設計を行なった。これをうけた本年度の成果は以下の通りである。1)半導体微細加工によるセンサの試作とその評価昨年度、A)表面マイクロマシニング、B)Niの無電解メッキ、の2つのプロセスを想定して設計した静電容量型のセンサを試作し、評価を行なった。どちらのプロセスでも今回の試作では成功には至らなかったが、エッチングで構造をリリースする点に問題があることを確認し、これをクリアするために1)背面に音響孔をあけた構造、2)エッチング方法の改善、等、次の試作への検討を行なった。2)超小型音源分離センサシステムの理論の構築と実験本研究で提案するセンサは、原理的に高い時間分解能で音源位置の定位が可能である。これを、近年音響の分野で活発に研究が行なわれている音源分離への応用を行なった。具体的には、音源位置情報を既知とした条件での音源分離のアルゴリズムを新たに構築し、1)音源が有限距離(無限遠とはみなせない)の場合を含む最適分離フィルタの導出、2)原理的に分離が不可能となる周波数とアイクロフォンアレイの関係の導出、を行なった。また予備実験として、2×2の小型マイクロフォンアレイを用い、実環境でも音源信号が分離されることを確認した。具体的には予備実験を踏まえ,新たな音源定位センサ構造の設計理論の確立と,センサの試作・実験による検証までを目標としている。本年度の成果は以下の通りである。1)ジンバル型振動板の設計ヤドリバエの鼓膜の中央支持型振動板構造を2次元的に拡張したジンバル型振動板構造を提案した。また、センサのダイアフラム領域を質量、ジンバル部のビーム、リングをばねと考える振動モデルに基づき、センサの各部形状パラメータと、センサの同相振動/逆相振動の共振周波数の関係式を導出した。また、これらの共振周波数間での、センサの運動方程式に基づき、センサの3つの振動モードの振動変位から、音源方向を検出するアルゴリズムを構築した。2)センサの試作と音源定位実験による原理の確認リン青銅箔をエッチングにより加工し、厚さ30μm/直径21.6mmのジンバル型振動板を試作した。また、これを用いた実験により、本センサにより音源定位が可能であることを確認した。3)半導体微細加工によるセンサの設計音声周波数帯域をターゲットとし、半導体微細加工によるセンサの実現を目指して設計を行なった。具体的には、A)表面マイクロマシニング、B)Niの無電解メッキ、の2つのプロセスにより静電容量型のセンサを設計、試作した。設計にあたっては1)前述したモデルを用いたほか有限要素法も用いて各形状パラメータを決定し、振動版周辺に壁を配置したり背面に音響孔をあけることにより、感度低下を防ぐ構造を導入した。
翻訳後修飾による新規膜輸送体制御系を基軸とした腎疾患の基盤病態解明と応用の探求

尿細管を構成する多様な細胞群は翻訳後修飾をスイッチとするタンパク質相互作用のカスケードによって選択的に制御されており、異なる尿細管細胞の機能が適切に連関することで腎臓の応答が誘導されるものと考えられる。本研究では、腎臓における新規膜輸送体制御系のカスケード(mTOR/ULK1/MR系・PKC/KLHL3/WNK系)に着目し、その異常に伴う尿細管機能連関の障害が腎臓病の病態に果たす役割の解明を目指すとともに、一連の研究を通じて新しい診断法や創薬へと結びつけるための基盤となる知見を集積する。
拡散メカニズム解析に基づく３次元トランジスタ局所領域におけるドーパント分布制御

次世代3次元構造トランジスタの特定の微細領域におけるドーパント拡散過程を明らかにするために、最新のUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて、粒界、粒内、ゲート酸化膜界面を区別してドーパント分布の900°Cでの熱処理時間依存性を調べた。n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることが明らかになった。多結晶Siゲート中のPの拡散は粒界拡散が支配的であった。一方、Bは粒界拡散だけではなく粒内拡散も支配的であり、Pの粒界拡散よりもBの拡散のほうが速いこともわかった。次世代3次元構造トランジスタの特定の微細領域におけるドーパント拡散過程を最新のUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて明らかにするために、ルネサスエレクトロニクスと協力して次世代3次元トランジスタ試料であるトレンチ構造トランジスタを作製した。本研究では、トレンチ構造トランジスタにおける多結晶Siゲートにおけるドーパントの拡散を対象とした。この多結晶Siゲートにおいて、ドーパントは熱処理によってどのような経路をたどって再分布するのか?主な拡散経路として界面拡散、粒界拡散、粒内拡散が考えられる。この問題に対して、3次元アトムプローブを用いて粒界、粒内、ゲート酸化膜界面でのドーパント拡散を調べるためには、集束イオンビーム加工装置による3次元アトムプローブ用針試料作製方法の検討が非常に重要である。特に、直径100nm程度の針状試料の狭い領域に界面や粒界を入れる必要があり、技術的な検討を行い、狭い領域に界面や粒界を入れることができることを確認した。さらに、測定データのS/N比はアトムプローブの測定条件(測定温度、レーザーパワー)によって大きく左右されるため、3次元アトムプローブの測定条件の最適化を行った。次世代3次元構造トランジスタの特定の微細領域におけるドーパント拡散過程を最新のUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて明らかにするために、ルネサスエレクトロニクスと協力して作製したトレンチ構造トランジスタを作製し、トレンチ構造トランジスタの多結晶Siゲート中のドーパントの拡散経路について、最新のレーザーパルス型局所電極3次元アトムプローブを用いて調査した。この問題に対して、3次元アトムプローブを用いて粒界、粒内、ゲート酸化膜界面を区別してドーパント分布の熱処理依存性を調べた。まず、集束イオンビーム加工装置による3次元アトムプローブ用針試料作製方法の検討や3次元アトムプローブの測定条件の最適化などを行った。そして最適化した条件を使用して、トレンチ構造トランジスタの多結晶Siゲート中のドーパント分布を3次元アトムプローブで取得した。3次元アトムプローブ測定で得られる3次元アトムマップは、原子の3次元位置と元素情報を含んでおり、粒界、粒内、酸化膜界面に注目し、プロセス熱処理におけるそれぞれのドーパント分布の変化を調べることでドーパントの拡散経路を調べた結果、n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることが明らかになった。Pは多結晶Siの粒界拡散が酸化膜界面拡散や粒内拡散よりも速く、多結晶Siゲート中のPの拡散は粒界拡散が支配的であった。これらの結果は論文としてまとめた。当初の予定通り、次世代3次元構造トランジスタ(トレンチ構造トランジスタ)の特定の微細領域(多結晶Siゲート)におけるドーパント拡散過程をUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて調査し、3次元アトムマップの粒界、粒内、酸化膜界面領域におけるドーパント分布の熱処理温度依存性から、どの拡散経路(界面拡散、粒界拡散、粒内拡散)が支配的か明らかにした。このためには針試料作製が肝であり、針先先端(直径100nm、深さ200nm)領域にトレンチ構造トランジスタの多結晶Siゲートを持ってくる必要があり、集束イオンビーム加工装置によるアトムプローブ針試料の加工方法の検討を行った。またアトムプローブの測定条件を検討して、測定の最適条件の検討を行った。その検討した方法や最適化した条件を使用して、トレンチ構造トランジスタの多結晶Siゲート中のドーパント分布を3次元アトムプローブで取得でき、さらに、プロセス熱処理におけるドーパント分布の変化を調べドーパント拡散経路を評価した。n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることを明らかにした。一方、Bは粒界拡散だけではなく粒内拡散も支配的であり、Pの粒界拡散よりもBの拡散のほうが速いことなど、今後プロセスを改善する上で大変重要な知見を得た。次世代3次元構造トランジスタの特定の微細領域におけるドーパント拡散過程を最新のUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて明らかにするために、トレンチ構造トランジスタの多結晶Siゲート中のドーパントの拡散経路について、最新のレーザーパルス型局所電極3次元アトムプローブを用いて、粒界、粒内、ゲート酸化膜界面を区別してドーパント分布の熱処理依存性を調べた。

3次元アトムプローブ測定で得られる3次元アトムマップは、原子の3次元位置と元素情報を含んでおり、粒界、粒内、酸化膜界面に注目し、プロセス熱処理におけるそれぞれのドーパント分布の変化を調べることでドーパントの拡散経路を調べた結果、n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることが明らかになった。Pは多結晶Siの粒界拡散が酸化膜界面拡散や粒内拡散よりも速く、多結晶Siゲート中のPの拡散は粒界拡散が支配的であった。一方、Bは粒界拡散だけではなく粒内拡散も支配的であり、Pの粒界拡散よりもBの拡散のほうが速いこともわかった。またAsの粒界拡散におけるPやBのpre-dopingの効果を調べ、Pをpre-dopingした場合にはAsの粒界拡散は促進され、一方、Bをpre-dopingした場合にはAsの粒界拡散は抑制されることがわかった。3次元アトムプローブ測定におけるSi中のB分布のレーザーエネルギー依存性についても詳細に調べ、レーザーエネルギーが高い場合には、Si中のB分布にアーティファクトが生じることがわかった。Si中のB分布は、あるレーザーエネルギー以下であれば、アーティファクトが生じないことを明らかにし、Si中のBの測定におけるレーザーエネルギーの上限を提案した。上述の測定はその条件を満たしており、アーティファクトによるものではないことも確認した。次世代3次元構造トランジスタの特定の微細領域におけるドーパント拡散過程を明らかにするために、最新のUVレーザー型3次元アトムプローブ法を用いて、粒界、粒内、ゲート酸化膜界面を区別してドーパント分布の900°Cでの熱処理時間依存性を調べた。n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることが明らかになった。多結晶Siゲート中のPの拡散は粒界拡散が支配的であった。当初の予定通り、集束イオンビーム加工装置によるアトムプローブ針試料の加工方法やアトムプローブの測定条件を検討して、加工および測定の最適条件を見つけ出せており、さらにトレンチ構造トランジスタを問題なく測定を行えることも確認できており、研究が順調に進展しているため。ルネサスエレクトロニクスと協力して作製した次世代3次元トランジスタ試料(トレンチ構造トランジスタ)の多結晶Siゲート中のドーパントの拡散経路について、最新のレーザーパルス型局所電極3次元アトムプローブを用い、粒界、粒内、酸化膜界面に注目してプロセス熱処理におけるそれぞれのドーパント分布の変化を調べ、ドーパントの拡散経路を調べた結果、昨年度までに、n-typeトランジスタのゲートドーパントのPとp-typeトランジスタのゲートドーパントのBでメインの拡散メカニズムが異なることが明らかになった。今年度は、詳細な拡散メカニズムを求めるために、ドーパントの粒界拡散係数を高精度で決定しようとする。
放射線誘発乳がんの起源細胞と表現型・遺伝子型に関する研究

放射線が特定の分化段階の細胞から特に多くの乳がんを発生させるかどうかはわかっていない。無処理、γ線照射あるいは化学物質投与したラットに発生した乳がんを、5種の抗原の免疫組織化学及びマイクロアレイによる遺伝子発現データによってクラスタリングすると、乳がんは数個のクラスターに分割され、放射線誘発乳がんが早発を特徴とする特定クラスターに偏ることがわかった。過去にこのタイプが乳腺の前駆細胞を起源とすることが示唆されており、これが放射線誘発乳がんに特徴的な起源細胞であると推測される。乳腺は放射線発がんリスクが高い組織の一つであるが、放射線単回照射によるラット乳がん誘発モデルを用いた研究代表者らの研究等から、放射線誘発乳がんの起源となる細胞種は自然発生乳がんのそれとまったく同一ではないと予想されている。一方ヒト及びマウスの研究で、乳がんの起源細胞は腫瘍のサブタイプに反映するというモデルが提示されている。そこで本研究では、ラット乳がんのサブタイプ判定法を構築し、これによって放射線単回照射誘発乳がんの特徴を明らかにするとともに、ラット乳腺の未分化段階の細胞を濃縮する方法を開発し、放射線誘発ラット乳がんの起源細胞を推定することを目的とした。動物実験は所属機関の動物実験委員会において承認された計画に従って実施した。本年度は、ヒト乳がんにおいてサブタイプ判定に有用な免疫組織化学的マーカーのうち、サイトケラチン5(CK5)、上皮成長因子受容体2(ERBB2)、p63がラット乳がん標本の一部で発現していることを確認した。また、Benitoら(2004)のアルゴリズムを用いてヒト及びラットのマイクロアレイデータ間の組織的バイアスを除去した後にTibshiraniら(2002)の分類アルゴリズムによってサブタイプを判定する方法を検証し、バイアス除去の有無によって分類結果に変動があることを確認した。免疫組織化学的マーカー(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及び上記の3つ)を使用したサブタイプ解析として、ラットに自然発生した乳がんと、成体期ラットにγ線照射した後に発生した乳がん検体について、免疫染色を開始した。アノイキス耐性によって濃縮した未分化細胞の再生能検定の条件検討を開始した。放射線誘発乳がんの起源細胞種はよくわかっていない。本研究では、ラット乳がんのサブタイプ判定法を構築し、サブタイプの起源細胞に関する知見から放射線単回照射誘発ラット乳がんの起源細胞を推定することを目的とした。ラット乳腺未分化細胞を用いた移植実験による起源細胞の推定も検証した。動物実験は動物実験委員会において承認された計画に従い実施した。初年度及び次年度は、1サブタイプ判定に有用なマーカー5種の予備検討及び一部検体の免疫組織化学的染色を開始した。2マイクロアレイデータからの組織的バイアス除去法及び学習・分類アルゴリズム(いずれも既報のもの)の実行システムを構築した。3アノイキス耐性を利用した未分化細胞濃縮の検討を開始した。最終年度は、小児期γ線照射により誘発した乳がんを追加した計42個のラット乳がんの免疫染色陽性率データを得、これを用いたクラスター解析によって数種類に分類した。また、これら検体中24個の新規アレイデータを得た。さらに、クラスター化の統計学的有意性を検定する既報アルゴリズム2種を実行する情報処理システムを整備した。ラット乳がん84個(新規データ含む)のアレイデータから組織的バイアスを除去すると、クラスター化の有意性に基づいて数種類に分類された。サブタイプ既知のヒト乳がん等337個の公開アレイデータを元に、学習・分類アルゴリズムによってラット乳がんクラスターを特徴付けした。免疫染色とアレイの解析結果はいずれも、放射線誘発乳がんが特定クラスターに偏っており、他より早発することを示した。アノイキス耐性により濃縮された細胞は移植再生能が低く、予定した実験に適さなかった。放射線誘発ラット乳がんの偏るサブタイプは、ヒト及びマウスでは特定細胞系譜の前駆細胞を起源とすることが過去に示唆されていることから、放射線はこの前駆細胞を起源とする発がんを特によく誘発すると推定される。本年度は、ヒト乳がんにおいてサブタイプ判定に有用な免疫組織化学的マーカーのうちエストロゲン受容体α及びプロゲステロン受容体が大多数のラット乳がんにおいて発現していることを確認した。またTibshiraniら(2002)の報告しているマイクロアレイデータの分類