hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シナプス前グリシン受容体の機能性の証明

ウレタンで麻酔した5-8週齢のSDラットから脊髄スライス標本を作製した。脊髄後角の第2層にマイクロマニュピュレータを使用してガラス電極を刺入し、第2層の膠様質細胞からホールセルパッチクランプ記録を行った。-70mVの電位固定で膠様質細胞の膜電位を観察すると、微小興奮性シナプス後電流が観察された。-50mVの電位固定で0.4mM、2mM、4mMのグリシンを潅流投与したところ、外向き電流の発生が認められた。これは電流固定法における細胞膜の過分極を意味する。また微小興奮性シナプス後電流の発生頻度が抑制された。2mMでは発生頻度は約40-60%に低下した。0.4mMでは約85-95%に低下、2mMでは18-48%に低下、4mMでは7-38%に低下した。グリシン受容体拮抗薬であるストリキニンを10μM投与すると、微小シナプス後電流の発生頻度は約100-120%に増加した。このストリキニン作用下でグリシンを投与すると、0.4mM、2mM、4mMでは微小興奮性シナプス後電流の発生頻度は100-120%であり、抑制は認めなかった。微小興奮性シナプス後電流の発生頻度はシナプス前からの興奮性伝達物質の放出頻度を表している。シナプス外から投与されたグリシンが、シナプス前のグリシン受容体に作用し、膜を過分極させることで、シナプス前からの興奮性神経伝達物質の放出を抑制していることが明らかとなった。このことは末梢神経からの電気刺激によってシナプス前での活動電位を発生させずとも、刺激がない状態での自発性の神経伝達を抑制していることを意味している。仮説通りの結果となっているため。脊髄へのグリシンの灌流投与によって興奮性シナプス後電流の頻度が抑制されることが示された。容量依存性に頻度の低下が認められることが確実ならば、後根からの電気刺激による誘発性の興奮性シナプス後電流の変化を観察せずとも、シナプス前にグリシン受容体が存在しシナプス伝達における調整機能を証明しうる可能性が出てきた。さらに濃度の幅を広く設定して研究を継続する。
パーソナル調息法を用いた新しいメンタルマネジメントメソッド作成の試み

本研究では,各人固有のテンポ(パーソナルテンポ)を用いた刺激が運動行動に及ぼす影響を検討した.その結果,刺激は音として与えられるよりも(手指の打叩等の)運動として与えられる方が効果的であること,パーソナルテンポに基づいたリズムを取ることで脳波上でα波が強くなること,パーソナルテンポを聞きながら運動するよりもあらかじめ聞いてから運動する方が運動パフォーマンスが向上することなどが明らかになった.本研究では,各人固有のテンポ(パーソナルテンポ)を用いた刺激が運動行動に及ぼす影響を検討した.その結果,刺激は音として与えられるよりも(手指の打叩等の)運動として与えられる方が効果的であること,パーソナルテンポに基づいたリズムを取ることで脳波上でα波が強くなること,パーソナルテンポを聞きながら運動するよりもあらかじめ聞いてから運動する方が運動パフォーマンスが向上することなどが明らかになった.【本研究の目的と平成21年度の課題】本研究は、パーソナルテンポに基づいた聴覚刺激を聴取しながら行う調息法(以下、パーソナル調息法とする)のメンタルマネジメント効果を明らかにすることを意図したものである。この研究目的を達成するために、本年度は以下の2つの研究課題を遂行した。1)調息法の効果を高める「パーソナルテンポ」を明らかにする。特に行動課題に効果的なパーソナルテンポを明らかにする。2)上記の効果的なパーソナル調息法が中枢神経に与える影響を明らかにする。【本研究の意義と重要性】調息法はメンタルマネジメントのメソッドとしては一般的に使われているが、本研究で開発、効果検証を行うパーソナル調息法のようなパーソナルテンポを組み合わせたものは見当たらない。パーソナル調息法のような環境からの感覚刺激付与は、意識の拡散を防ぎ、より呼吸への注意を高めると考えられる。【平成21年度の研究成果】<研究1>実験協力者:高校生6名,大学生3名の合計9名(男子7名,女子2名)課題:事前にPTを付与した(メトロノームによる聴覚刺激と指先タッピングによる行動刺激によりPTを付与)調息法を行い,その後鏡像描写課題を行ってもらった.結果:統計的有意差は認められなかったが,指先タッピングを行いながら調息法を行った条件で鏡像描写課題の成績が良い傾向を示した.<研究2>実験協力者:大学生4名(男性1名,女性3名)課題:コントロール条件,呼吸法のみ条件,「聴覚刺激PT+調息法」条件,「指先タッピングPT+調息法」条件を3分間行った後,脳波を測定した.結果:指先タッピングをしながら調息法を行った条件において,α2波(10Hz13Hz)の平均振幅値が有意に高く変化したことが明らかになった.一方,メトロノームによる聴覚刺激を聞きながら調息法をした条件では,コントロール条件と同様にα2波の平均振幅値が低下した.〈研究の目的〉平成21年度の研究成果は,聴覚領域へのパーソナルテンポ(以下,『PT』とする)付与よりも行動領域への付与の方が,より調息法の効果を高める可能性が考えられたことから,本年度は行動領域のPTを付与した調息法の効果を明らかにした.さらに,効果を明らかにする指標は,平成21年度は鏡像描写という小筋運動および生体電気である脳波を用いたが,今年度は大筋運動であるバドミントンのショートサービスを用いた.〈研究の概要〉被験者:バドミントン競技者(市民大会上位進出レベルの男性)11名条件:コントロール条件(通常のショートサービスを行う),聴覚刺激(電子メトロノーム)を用いてパーソナルテンポを付与した上で調息法(腹式呼吸)を行う条件(テンポ条件),行動刺激(指によるタッピング)を用いてPTを付与した上で調息法を行う条件(タッピング条件)の3つの条件における課題成績の違いを検討した.結果:各条件におけるバドミントンショートサービスの成功数の比較および被験者の内観報告の結果,以下のことが明らかになった.1)統計的に有意なパフォーマンスの変化は認められなかった.2)パーソナル調息法によって運動パフォーマンスが向上した被験者の内観報告を分析した結果,彼らはパーソナルテンポに対して好意的な印象を報告した.3)パーソナル調息法によって運動パフォーマンスが低下した被験者の内観報告を分析した結果,彼らはパーソナルテンポに対して否定的印象を報告した.〈本研究の意義〉本研究は,パーソナル調息法が効果的に作用するには,実施者が主観的に「心地よさ」や「違和感のなさ」を感じる必要があるという仮説的知見を導出した点で意義を有する.被験者が心地よくパーソナルテンポを用いた調息法を行うためには,リズム化(Chunking)しやすいように聴覚刺激を工夫する,運動領域への刺激と合わせること等が考えられた.本研究は,パーソナルテンポに基づいた聴覚刺激を聴取しながら行う調息法(以下、パーソナル調息法とする)のメンタルマネジメント効果を明らかにすることを目的とした研究である.【平成23年度の研究課題】我々は聴覚刺激を聴取している際,なんらかの音のまとまりを感じながら聴取する傾向がある(以下,『リズム化』とする).今年度は,リズム化したパーソナルテンポに基づいた聴覚刺激とリズム化していないパーソナルテンポ聴覚刺激が行動課題に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.【平成23年度の成果】

実験対象:大学生(女子)2名を対象とした.実験に対する動機の高さによる潜在的影響を排除するために,実験対象者の人数を限定し,各対象者に同様の実験を10回繰り返してもらった.実験条件:実験条件は,被験者本人が選択したパーソナルテンポを聴覚刺激としてメトロノームを用いて提示するテンポ条件,同じテンポに裏拍子を付与してリズミカルな音としてメトロノームを用いて提示するリズム条件,音刺激のない無音条件の3つであった.測定項目:行動課題としてダーツを行った.ダーツを測定項目として選定した理由は,被験者のねらいを限定しやすく,専門的なスキルがなくても高パフォーマンスを発揮することも期待できるためである.結果:1)x^2検定の結果,3つの条件間に独立性は認められなかった.2)x^2検定の結果,無音条件において呈示順序の違いによるパフォーマンスの違いが認められた.すなわち,リズム条件後の無音条件において,有意に高いパフォーマンスが認められた(p<.00).3)x^2検定の結果,リズム条件はリズム後の無音条件との独立性は認められなかった.リズム後無音条件は「自由選択テンポ」事態になっており,そのことが好影響を与えたと考えられた.
超音波を利用した悪性腫瘍治療法の開発に関する基礎的研究

1.目的超音波の非熱作用であるキャビテーション作用を利用して、効果的な腫瘍細胞の死を誘導する。2.方法(1)抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)と超音波照射併用による細胞死の誘導:細胞表面にCD20抗原を発現しているSU-DHL-4細胞を用いた。低濃度(0.1μl/ml)のrituximabを添加し、1MHzで0.25Wおよび0.5Wの超音波を20秒間照射した後さらに培養し、細胞増殖状態、細胞死について観察した。また、細胞死の機序について検討するため細胞内カルシウムイオン濃度を測定した。(2)超音波増感剤の細胞死誘導に関する検討:増感剤(Levovist, Optison, YM454)の超音波誘導細胞死に与える影響についてU937細胞を用いて検討した。(3)少量抗腫瘍薬と超音波照射併用による細胞死誘導に関する基礎的検討:白血病細胞に対するアポトーシス誘導効果が知られている亜ヒ酸を用いて、各種培養細胞での細胞死の機序について検討し、超音波併用療法への基礎的検討を行った。3.成果と今後の展開(1)超音波照射とrituximabの併用効果:低濃度の抗体と低い超音波強度の併用により細胞死が誘導されたが、相乗的効果は認められなかった。しかし、著明な細胞の増殖抑制効果がみられた。今後、効果的な併用条件を探るか、あるいは併用効果には一定の限界があるのかについて、検討する必要がある。なお、細胞内カルシウムイオン濃度は、併用により明らかに上昇し、細胞膜の変化を窺わせる結果であった。(2)超音波増感剤との併用:OptisonとYM454でアポトーシスの効果的な誘導がみられた。(3)亜ヒ酸の細胞死誘導効果:細胞によりアポトーシスあるいはオンコーシスが誘導され、細胞種によって死に方に差異のあることが明らかになった。今後、各種抗腫瘍剤で検討を試み、効果的な薬剤送達システムの開発を行う予定である。1.目的超音波を用いての新たな悪性腫瘍の治療法を開発する。2.方法(1)抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)と超音波併用による細胞死の誘導細胞表面にCD20を発現しているヒト悪性リンパ腫細胞由来の培養細胞株SU-DHL-4に低濃度(0.1μl/ml)から高濃度(10μl/ml)のrituximabを添加し、これに1.0Wで60秒間超音波を照射し、さらに5日間培養後生細胞数を算定し、rituximab非添加群と比較した。(2)超音波増感剤のアポトーシス誘導に関する検討3種類の増感剤(Levovist、OptisonおよびYM454)の超音波誘導細胞死(アポトーシス)に与える影響を培養細胞株(U937)を用いて検討した。(3)少量抗腫瘍剤と超音波併用による細胞死の誘導に関する基礎的研究白血病細胞に対するアポトーシスを誘導が報告されている亜砒酸(arsenic trioxide)を用いて、各種培養細胞での細胞死について超音波併用療法導入の基礎的検討を行った。3.成果と今後の展開(1)超音波とrituximabとの併用効果低濃度rituximabでは、併用群でより強い細胞増殖の抑制がみられ、併用効果が期待される結果であった。今後、細胞死のメカニズムの解明を行い、超音波と免疫学的機序の関係について検討する。

(2)増感剤との併用効果OptisonとYM454でアポトーシスの効果的な誘導が認められ、臨床応用への基礎的データが得られた。(3)亜ヒ酸の細胞死誘導効果培養細胞HL-60およびRLではアポトーシスが観察されたが、K562ではオンコーシスが誘導された。これらの結果を踏まえて、より効果的な併用薬剤の選択を進めるとともに、細胞死のメカニズムの解析を試み、効果増強法開発に資する。1.目的超音波と分子標的治療薬の併用による新たな悪性腫瘍の治療法を開発する。2.方法(1)分子標的治療薬である抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)と超音波との併用による細胞死の誘導恒常的に細胞表面にCD20を発現している細胞株であるSU-DHL-4細胞を用いた。これにこれまでの実験で得られた至適濃度である1.0μl/mlの抗体を加えた後、超音波単独では細胞傷害を来たさない2種類の強度の1MHz連続波を20秒間照射した。照射後24時間培養し、フローサイトメトリー法を用いてearly apoptosisを測定した。(2)超音波と抗体の併用による細胞増殖抑制効果の検討培養72時間後と照射直後の生細胞率との比較を行い、細胞増殖率を検討して併用による細胞増殖抑制効果について観察した。(3)誘導される細胞死のメカニズムの検討細胞膜の変化、とくに透過性の変化について、照射前後の細胞内カルシウム濃度の測定を行った。3.成果と臨床への応用に向けての検討(1)超音波による抗CD20モノクローナル抗体効果の増強超音波による増強効果が得られたが、その効果は超音波強度の低い(0.25W)でより高い傾向が認められた。このことは、今後超音波の強度(ワット)を選ぶ上で極めて重要な情報になると考えられる。(2)細胞死の誘導効果併用により、細胞死は増加したが相乗的な効果は得られなかった。このことから、今後効果的な併用条件の設定を探る必要があるのか、あるいは併用効果に限界があるのかを見極める必要がある。(3)細胞増殖抑制効果併用により細胞増殖が有意に抑制されることが明らかになり、臨床応用への根拠が得られた。(4)細胞膜透過性への影響併用により細胞内のカルシウム濃度の増加がみられ、細胞膜透過性の亢進作用が認められた。
反応拡散系の特異極限と自由境界問題の数理構造の解明

本研究では、非対称な反応項を持つ反応拡散方程式系の急速反応極限を考察した。急速反応極限とは、反応拡散方程式系に含まれる反応項の反応率を十分大きくすることであり、例えば、ロトカ・ボルテラ方程式では競争率を大きくすることで、二相Stefan問題が出現することがHilhorst氏や三村氏、飯田氏などにより報告されている。同様に、他の反応拡散方程式においても、界面方程式や自由境界問題が出現することが確認されている。一方で、この手法はStefan問題や多孔質媒体流方程式など、自由境界問題の数値計算への応用として扱われていることが、中木氏、村川氏などにより報告されている。しかしながら、これらの研究結果の多くは、反応項にある対称性が解析をする上で重要な役割を担っているため、非対称な反応項をもつ反応拡散方程式系では解析が技術的に困難であることが予想されていた。本研究では、反応項が多項式で表される二成分の反応拡散方程式系を考え、その多項式の非対称性によって縮約方程式がどのように現れるかを解析した。この結果、多項式の指数の組み合わせによって、一相Stefan問題に収束する場合、ノイマン境界条件の熱方程式に収束する場合、ディリクレ境界条件の熱方程式に収束する場合、があることを確認した。この結果は、Journal of Differential Equationsに投稿し、アクセプトされた。今後は、この研究結果をより一般的な反応項に対しても応用出来ないか検討して行く。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
完全無血清培地の開発と基礎臨床研究への展開

本研究は、動物血清に含まれる細胞増殖に関わる因子を分析・プロファイリングして、牛胎児血清を代替し得る基礎培地の開発を目的とした。Jurkat, Molt-4などのT細胞株の増殖を指標に実験を進め、インスリン、トランスフェリイン、亜セレン酸(ITS)とリポタンパク質が、細胞増殖に有効であることや、脂肪酸を含有するアルブミンの存在が必須であることを見出した。また、血清中に多量に存在するアルブミン、フェツインなどのタンパク質に結合している新たな増殖因子の可能性を見出した。有機酸の中では、すでに培地に添加されているピルビン酸に高い増殖促進効果が見出され、脂肪酸の中ではオレイン酸が効果的であった。本研究は、動物血清に含まれる細胞増殖に関わるタンパク因子群および脂質,有機酸を、浮遊血球系細胞をモデルに同定・プロファイリングし、100%輸入牛胎児血清(FBS)に頼る、現在の細胞培養法の改善を図るものである。平成28年度は、FBSから必須のタンパク質因子群の同定と脂質,有機酸,微量元素,ホルモンの増殖効果を調べ、インスリン,トランスフェリン,亜セレン酸(ITS)とリポタンパク質(LDL, HDL)、組換えアルブミン,脂肪酸などの有効成分からなるプロト型無血清培地を構築することを主な研究実施計画とした。(1)T細胞株(Jurkat, Molt-4)をモデルに、FBS中の増殖因子群の分析を行ったところ、増殖活性は当初の予測に反し、40-55%硫安画分(主な血清タンパク質はフェツイン)と55-80%硫安画分(主な血清タンパク質はアルブミン)に見出され、アルブミンに結合している脂質が増殖に必須であることも予想された。増殖因子については分離/精製を進めているが、現在のまでにフェツイン、アルブミンとの分離ができていない。この増殖因子は還元アルキル化、95°Cの過熱、変性剤である6Mグアニジン塩酸塩などにも安定であることから低分子のペプチド性のものと予測された。(2)有機酸の中では基礎培地に添加されることの多い、ピルビン酸が無血清/低血清の場合に高い増殖促進効果を持つことがわかった。(3)脂肪酸の中ではオレイン酸が効果的で、必須脂肪酸であるαリノレン酸,リノール酸では効果より高濃度での毒性が顕著であった。微量元素については亜セレン酸以外では顕著な効果は認められなかった。(4)ホルモンについては検討できなかったが、本年度の研究成果から、ITSと組換えアルブミンあるいはBSAにコンジュゲートしたオレイン酸を含む脂肪酸、ピルビン酸からなるプロト型無血清培地のコンセプトが固まったと判断している。(1)本研究では、FBSから増殖因子群を同定することが一つの目標であるが現在まで成功していない。しかし、当面は無血清培地の構築には容易に入手出来る組換えインスリンを利用できる状況にある。(2)有機酸の中ではピルビン酸が無血清下の培養に有効であることが確認できたことから、無血清培地のコンセプトに加えることが妥当であると判断した。(3)脂質の中ではオレイン酸などの脂肪酸が必須であることがわかったが、これはFBS中のアルブミンと結合した状態で存在することが予測された。市販されている脂質混合物はこれまでの実験では細胞毒性が強く、アルブミンとコンジュゲートしない限り利用できないこともわかった。一方、市販の組換えアルブミンの中に脂肪酸を含むと考えられる増殖活性の高い代替品を見出せたので、当面は脂肪酸の供給源として組換えアルブミンが利用できる。(4)脂質のうちコレステロールは、T細胞株の中でJurkat細胞の増殖に必須であることがわかっていたが、今回、コレステロールの供給源として血清リポ蛋白質であるHDL,LDLに替わる代替品を見出すことができた。本研究は、動物血清に含まれる細胞増殖に関わるタンパク因子群及び脂質・有機酸を、浮遊血球系細胞をモデルに同定・プロファイリングし、100%輸入牛胎児血清(FBS)に頼る、現在の培養法の改善法を図るものである。平成28年度には、FBS中に存在する主要タンパク質であるフェツイン、血清アルブミンなどに結合して各種細胞株の増殖に関わる新たな増殖因子の存在を見出した。本増殖因子は還元アルキル化、95°Cの加熱、変性剤である6Mグアニジン塩酸に対して極めて安定であることがわかっていた。平成29年度はこの増殖因子の精製を進めるとともに、引き続き無血清培養系を確立するために、低濃度の血清(FBS: 0.5%-2%)存在下での、インスリン,トランスフェリン,亜セレン酸の混合物を加えることで、血球系細胞の増殖においてFBSを低減できることを確認し、さらに、インスリン,トランスフェリン,亜セレン酸(ITS)の個々の効果の原因を詳しく検討した。その結果、1Feと結合しているトランスフェリンは血中では30%以下で、飽和度が低いために、低血清下ではFeを結合した飽和トランスフェリンの添加が必要になること。2必須元素であるセレニウムは血液中ではセレノプロテインとして存在しているが、これも低血清下ではセレノプロテインの濃度低下によってセレニウムの添加が必要になること。3培養にはインスリンは比較的高濃度1-10μg/mlの添加が必要である。しかし、血中に存在するインスリン濃度はたかだか数十数百pg/ml程度なので、血清中のインスリンが増殖因子として機能していることは考え難いことが確認できた。結局、この新規増殖因子は、現在でも最終的な単離にまでは至っていない。

しかし、FBSの主要タンパク質であるフェツイン、アルブミンを除去する方法を確立し、29年度にHPLCによる精製に至るまで進展することができた。本研究は、動物血清に含まれる細胞増殖に関わる因子を分析・プロファイリングして、牛胎児血清を代替し得る基礎培地の開発を目的とした。Jurkat, Molt-4などのT細胞株の増殖を指標に実験を進め、インスリン、トランスフェリイン、亜セレン酸(ITS)とリポタンパク質が、細胞増殖に有効であることや、脂肪酸を含有するアルブミンの存在が必須であることを見出した。また、血清中に多量に存在するアルブミン、フェツインなどのタンパク質に結合している新たな増殖因子の可能性を見出した。有機酸の中では、すでに培地に添加されているピルビン酸に高い増殖促進効果が見出され、脂肪酸の中ではオレイン酸が効果的であった。(1)FBS中の増殖因子群の精製を進めるとともに、FBS中のアルブミンに結合している脂肪酸の分析を進め、必須の脂肪酸の同定とその有効量の絞り込みを行う。(2)組換えインスリン、組換えトランスフェリン、亜セレン酸(ITS)、ピルビン酸、脂肪酸含有組換えアルブミン、コレステロールから構成される血清に由来しない無血清培地の最適な組み合わせ(無血清基礎培地)を検討し構築する。(3)さらに、無血清基礎培地にホルモン類を添加して、ホルモンの増殖に及ぼす効果と無血清培地に適用可能なホルモンの絞り込みを行う。(4)T細胞株以外の各種腫瘍細胞(浮遊細胞、接着細胞)や実験動物の正常細胞に対する無血清基礎培地の効果を検証する。(5)無血清基礎培地を使って、酸化LDLなど生体の動脈硬化の発症/進展に関わる細胞毒性を検証する。細胞生物学有機酸、脂質成分の分析のための外注費を予定していたが、新たに分析しなかったためにその費用は次年度に繰り越した。有機酸、脂質成分の包括的な分析は当該研究室では行なえないため外注を予定していたが、高額であるために予算に見合った分析成分の絞り込みを行って、次年度に繰り越し予算を執行したいと考えている。
子宮内膜間質細胞の浸潤能に対する血小板由来遊走因子の促進機序の解析

以前我々は子宮内膜症性嚢胞の破裂により血中D-dimerが急激かつ異常な高値を示した症例を経験したが、D-dimerの検出は凝固反応とその後の線溶反応の存在を示しており、血液凝固融解分解産物が様々な)cytokineやprostaglandinの局所産生を促進して炎症を誘導し、さらにはfibrin分解産物が生物活性を有し動脈硬化症の発生に関わっていることを考え合わせると、血小板や血液凝固融解分解産物が子宮内膜症の病進展に重要な働きをする可能性が考えられた。そこでそれを抑制することが子宮内膜症の保存的治療法の開発につながるとの発想に至り本研究を計画した。実験は婦人科良性手術時に患者の同意のもとに採取した子宮内膜組織より子宮内膜上皮細胞および間質細胞を先に報告した方法で分離し、血小板および子宮内膜症性嚢胞内容液が子宮内膜上皮細胞と間質細胞の増殖能と接着能に及ぼす効果をWST-1assay法を用いて、またMatrigel invasion assayに改良を加えた子宮内膜間質細胞の浸潤モデルを用いて検討した。その結果、活性化した血小板が細胞遊走因子を分泌してヒト子宮内膜間質細胞の浸潤を促進すること、さらにその作用をインテグリン阻害抗体が抑制すること、また血小板の遊走促進作用にはMMP分泌促進が関与している可能性が示され、血小板が子宮内膜症の病巣進展に重要な働きをするという本研究の仮説を支持する知見が得られた。これらの成果から今後血小板の活性阻害などが子宮内膜症病変の進展に対する新しい治療法となる可能性が新たに示された。
新しい特異的なコリンアセチルトランスフェラ-ゼ活性測定法の開発とその応用

アセチルコリン(ACh)の合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラ-ゼ(ChAT)の活性は、現在のところ主としてFonnum法(1975)により測定されている。すなわち、放射標識した〔^<14>C〕acetyl CoAとコリンを用いて〔^<14>C〕AChを合成させ、Kalignostを含む有機溶媒中に抽出して放射活性を測定する方法である。抽出段階で、種々の放射標識物質が混入する可能性が考えられ、Fonnum法には問題があると考えられる。この研究課題では当研究室で独自に作製した抗ACh抗体を用いて、新しい特異的なChAT活性の測定法の開発を試みた。まず家兎で作製した抗ACh抗血清より、抗ACh抗体を硫安分画法により調製した。家兎の血液より採取したバッフィ-コ-ト分画をホモジェネ-トし、〔^3H〕acetyl CoAおよびコリンと37°Cで一定時間インキュベ-ションした。氷水中につけて反応を停止させ、抗ACh抗体を加えて生成した〔^3H〕AChを抗体に結合させた。抗体と結合した放射活性を液体シンチレ-ション法で測定した。同じサンプルをFonnum法を用いてACh合成活性を測定した。抗体に結合した〔^3H〕AChはサンプルのインキュベ-ション時間に比例して増大した。Fonnum法で得られた測定結果、この抗ACh抗体を用いて得られた結果とほぼ相関した。ラット脳サンプルにおいても同じ様な結果が得られた。抗ACh抗体はAChに対する特異性が高いので、この抗体と結合した放射活性はACh生成量を反映するものである。したがって家兎バッフィ-コ-トにACh生合成活性が存在することが確認された。抗ACh抗体を用いる方法は、ACh生合成活性の存在が未確認のサンプルにおいて有用な方法である。
肝炎ウイルス非感染肝細胞癌発生の分子機序の解明

近年、脂肪肝から肝硬変および肝癌への進展が問題視されています。脂質代謝に関連のある血管内皮リパーゼ(Endothelial lipase; EL)をKnock outしたマウスに高脂肪食を与えると、単なる脂肪肝ではなくNASHが発生することを見出し、このマウスの病態を解明することによりヒトにおけるNASHの病態解明の一助になると考える。このマウスにおける脂肪性肝炎の発生機序としてELが欠如しているため脂肪細胞での脂肪分解が低下し脂肪細胞の肥大化と脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの分泌異常が起こりインスリン抵抗性を惹起したと考えられた。それに伴い高インスリン血症が誘導され、肝臓での脂肪酸の流入増加と酸化ストレスの上昇から脂肪性肝炎を引き起こした可能性が考えられた。脂肪性肝炎の発症機序としてすでに2ヒットセオリーが提唱されている、これは1st Fitとして脂肪肝やそれに伴うインスリン抵抗性のある状態に2nd Fitとして酸化ストレスや脂質過酸化、炎症性サイトカインが加わり脂肪性肝炎を発症するとされるものである。このモデルにおいても普通食のKOマウスにおいては脂肪性肝炎は認めず高脂肪食負荷のKOマウスに脂肪性肝炎を認めたことから1st fit 2^<nd> fit両者の存在で脂肪性肝炎を発症することが証明された。結論Endothelial lipaseKO mouseにおけるNASH発生機序としてインスリン抵抗性、炎症性サイトカインの増加、アディポネクチンの低下が関与している可能性が示唆された。その背景には、食生活の欧米化や生活様式の変化に伴う肥満により引き起こされるメタボリック症候群や、その一環として非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の存在が挙げられます。NASHは飲酒歴がないにも関わらずアルコール性肝炎と極めて類似した肝組織像を呈する疾患であり、ウイルス性肝炎が制圧されつつある現在、NASHは非常に亜要な疾患概念となってきていますが、その発症機序については十分には明らかになっていません。我々は脂質代謝に関連のある血管内皮リパーゼ(Endothelial lipase)をKnockout(K.O)したマウスに高脂肪食を与えると、単なる脂肪肝ではなくNASHが発生することを見出しました。この機序を解明することでNASHの診断・治療に繋がると考えています。血管内皮リパーゼ(EL)は血管内皮細胞よりクローニングされた、500アミノ酸よりなる分泌蛋白であり、これまでの研究によりEL K.OマウスではHDL-Cholが上昇し動脈硬化の進展を抑制することがわかっています(J Clin Invest 2003,111:347-355)。このため,このK.Oマウスを用いることによって、脂質代謝異常がNASHにどのように関わるかを解明することが可能になるものと考えます。Wild typeマウスに高脂肪食を負荷すると脂肪肝になるのに対して、EL K.Oマウスでは高脂肪食負荷により高率にNASHに進展します。この二つを遺伝子、分子レベルで解析することにより脂肪肝からNASHに関わる進展因子(adipocytokine、酸化ストレス、炎症性サイトカイン)を解明できると考えています。このモデルを解析することにより病態を形成している因子が明らかになり、病態の進展を抑制することで発癌抑制も可能になります。肝癌発生の主な原因は、ウイルス性肝炎によるが、肝炎ウイルスが撲滅された後も、肝癌がなくなるわけではない。アルコール肝障害のみでなく、アルコールを飲まない成人にも肝癌が発生する可能性がある。肝癌を誘発する因子として、肥満や糖尿病と関係する非アルコール脂肪性肝炎が、メタボリック症候群とともに注目を浴びてきた。本研究は、肝炎ウイルス非感染肝癌の発生の分子機序を解明し、その制御を目的としている。3つの研究の柱があり、1.非アルコール脂肪性肝炎モデル動物を作成し、発生の分子機序の解明と薬剤による治療効果の判定を目指している。既に人とほぼ同様の動物モデルをendothelial lipase遺伝子を改変することにより作成し、人と同様のインスリン抵抗性の出現、肝臓での中性脂肪の蓄積などが確認されている。今後、本動物も出るを使用して癌の発生、薬剤介入による病態の制御を目指している(三木章、11回日本肝臓学会大会発表)。2.肝炎ウイルス非感染肝細胞癌のモデル動物としてDEN誘発肝発癌を作成し、前癌病変におけるNotch・1シグナルの活性化と酸化ストレスの蓄積が肝細胞癌の進展に重要であることを明らかにした(Miki A, Int J Oncol)。3.肝炎ウイルス非感染肝細胞癌発生には、脂肪性肝炎や、糖尿病発生と密接に関与し、インスリン抵抗性、酸化ストレスの惹起、食欲などが関係している。これらをひとつにつなぐ転写制御因子として注目したのが、Fox01である。インスリンからのシグナルを伝え、酸化ストレスの惹起にも関わるFox01は、さらに食欲などとも関係している。肝炎ウイルス非感染肝細胞癌発生の中心では、ないが、少なくともある種の肝炎ウイルス非感染肝細胞癌発生に関わっていると考え、その分子機序の解明を進めている(中江淳、19回分子糖尿病学シンポジウム発表;Nakae J, Diabetes)。

このマウスにおける脂肪性肝炎の発生機序としてELが欠如しているため脂肪細胞での脂肪分解が低下し脂肪細胞の肥大化と脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの分泌異常が起こりインスリン抵抗性を惹起したと考えられた。それに伴い高インスリン血症が誘導され、肝臓での脂肪酸の流入増加と酸化ストレスの上昇から脂肪性肝炎を引き起こした可能性が考えられた。脂肪性肝炎の発症機序としてすでに2ヒットセオリーが提唱されている、これは1st Fitとして脂肪肝やそれに伴うインスリン抵抗性のある状態に2nd Fitとして酸化ストレスや脂質過酸化、炎症性サイトカインが加わり脂肪性肝炎を発症するとされるものである。このモデルにおいても普通食のKOマウスにおいては脂肪性肝炎は認めず高脂肪食負荷のKOマウスに脂肪性肝炎を認めたことから1st fit 2^<nd> fit両者の存在で脂肪性肝炎を発症することが証明された。結論Endothelial lipaseKO mouseにおけるNASH発生機序としてインスリン抵抗性、炎症性サイトカインの増加、アディポネクチンの低下が関与している可能性が示唆された。
壁面近傍を流動する生体高分子の一分子計測と数理モデルの構築

本研究では,微小流路における界面動電現象の計測技術および生体高分子の粗視化モデルを構築し,壁面に拘束されたナノスケール流動場における生体高分子の挙動について詳細に考察した.そして,界面動電現象を好適に利用した新しい単一分子計測法の可能性を示した.本研究では,微小流路における界面動電現象の計測技術および生体高分子の粗視化モデルを構築し,壁面に拘束されたナノスケール流動場における生体高分子の挙動について詳細に考察した.そして,界面動電現象を好適に利用した新しい単一分子計測法の可能性を示した.固液界面近傍において,生体高分子の流動は表面電荷やその周囲のイオン雰囲気が形成する電気二重層や界面動電現象に大きく影響をうける.したがって固液界面近傍における生体高分子の流動を明らかにするためには,界面近傍における電場を定量的に計測する方法の開発が必要である.そこで,本年度は異なる移動度を有する蛍光粒子を用いて界面近傍の電場を計測する方法を考案した.考案した方法は電気泳動速度が,移動度および電場に比例することを利用して,粒子間の流動速度差から電場を算出する方法である.計測原理を検証するために,まず,直線形状の微小流路において二種類の粒子間に流動速度が生じることを示した.そして,T字形状の微小流路における電場計測を行い,一般的な微小流路に対する計測技術の適用性について検討した.また,対向する電気二重層が重なる条件に着目し,ナノメートルオーダの微小流路内部におけるイオンの流動特性を解析した.そして,表面電荷および電気二重層が微小流路の電流・電圧特性に及ぼす影響を詳細に考察し,電流-電圧特性表、面電荷に支配されることが明らかとなった.さらに,粗視化モデルを用いた数値解析法により,微小流路内の電場,流れ場および生体高分子の流動を解析する方法を構築し,界面動電位や電気浸透流が生体高分子の流動特性に与える影響について考察した.そして,界面電位を制御することで生体高分子を伸張させることが可能であることを示した.微小流路内部の電場および界面動電現象は,固液界面近傍における生体高分子流動に多大な影響を及ぼす.しかし,微小流路内部の電場計測法は未だ確立されておらず,その手法の構築は重要な課題であるといえる.そこで,本研究課題では昨年度より,移動度の異なる蛍光粒子を用いた電場および界面動電現象の計測技術を開発している.本計測技術は電気泳動速度が,移動度および電場に比例することを利用して,粒子間の流動速度差から電場を算出する方法である.これにより,実用的形状を有するマイクロ流路内部における電場および界面動電現象を定量的に計測できることを示した.これらの成果は国内外の専門会議で高い評価を得ており,また,学術論文としての発表も予定している(採録決定1件,投稿準備中1件).本年度は,さらに微小なスケールの流動現象に着目し,ナノメートルオーダの流路深さを有するナノ流路を作製した.ナノ流路内部には, MEMS技術を駆使して,透明性導電物質であるITOの微小電極を設置しており,これを用いた生体高分子流動の電気的計測法の確立を目指している.微小電極をITOで構成することにより,電極表面近傍における生体高分子流動を可視化観察することが可能である.そのため,これまで不明であった電気計測結果と生体高分子流動の対応関係について詳細に明らかにすることが可能であると考えられる.すでにプロトタイプの基本的電気特性については詳細に検討しており,目的の計測に十分な精度を確保できることを示している.昨年度より進めている粗視化モデルによると,ナノ流路中に拘束された生体高分子が構造緩和に要する時間を計測することにより,分子の電荷, Persistence length等の生体高分子の情報が抽出できると予測されている.この予測と電気的および光学的計測結果を付き合わせることにより,従来にない新たな分子計測技術の確立が期待できる.本研究では,壁面近傍における生体高分子の流動性を明らかにすることを目的として,固液界面近傍における超高精度の可視化計測技術を開発すると共に,生体高分子のダイナミクスを記述する数理モデルの構築に取り組んできた.これまでに,マイクロ流路における電場および界面動電現象を対象とした計測技術の確立に成功している.また,粗視化モデルに基づく流動解析により,ナノメータスケールの代表寸法を有する微小流路中における鎖状生体高分子の自発伸張現象について詳細に明らかにしている.これらの成果を基盤として,昨年度は,実際にナノ流路を作製し,その内部における生体高分子の流動性について実験的に検討した.ここでは特に,電場印加条件において観測される生体高分子の電気泳動に着目し,生体高分子の流動性が流路からの幾何学的拘束に依存して変化することを明らかにした.また,流路の代表寸法を系統的に変更し,拘束の強度と生体高分子の流動性について定量的に検討した.さらに,本実験条件における電気浸透流の影響について検討するため,独自に開発した電場および界面動電現象の計測方法をナノ流路へ適用し,多角的な考察を与えた.一方,数理モデルの開発では,DNAを対象としたモデルについて検討し,一塩基分解能で流動現象を解析することが可能な独自の解析手法の構築に成功した.これにより,鎖状分子の詳細構造を考慮した流動解析を可能とした.
コエンザイムQ10の生合成に関わる新規因子の解析とその応用

CoQ生合成に関わる様々な新規因子の解析を行った。これまでに、CoQ10の新規生合成因子であるCoq12がCoQ10の生合成に関わることが明らかとなっている。平成30年度は、Hisタグを付加したCoq12を大腸菌もしくは分裂酵母から精製し、生化学的な解析を行った。その結果、分裂酵母から精製したCoq12タンパク質に分裂酵母のエタノール抽出物を基質として添加した際にNAD+の還元活性が検出された。野生株と比較して、coq12破壊株より得た抽出物を基質にすると高い活性が得られた。現在、その基質の特定を試みている。また、分裂酵母におけるCoQ10の生合成はグルコース応答により制御されていることが示唆されたため、その主要経路であるcAMP/PKA経路に着目した。3%グルコースを含むYES完全培地でcgs1, cyr1, git3, gpa2, pka1の各遺伝子単独破壊株のCoQ10量を測定したところ、cyr1, git3, gpa2, pka1の単独破壊株におけるCoQ10量は野生株の約1.52倍に増加し、cgs1破壊株では0.7倍に減少した。この結果は、グルコース濃度依存的にCoQ10量が変化する結果と一致する。このことから、分裂酵母においてCoQ10の生合成はPKAによって負に制御されている可能性が示唆された。また、pka1を破壊すると、グリセロール・エタノールを炭素源とする非発酵性炭素源培地において生育が向上し、野生株と比較してCoQ10量も増加した。cgs1やpka1の単独破壊株においてウエスタンブロッティングによる発現解析を行ったところ、いくつかのCoQ生合成酵素の発現が変動した。これらを学会発表で報告し、学術論文へも投稿中であり、平成31(令和元)年度の公表が決定している。さらに、共同研究として、CoQとホスポリパーゼA1の代謝系の関連性の解析において学術論文の公表、顕微ラマン分光法を用いたCoq-GFP融合タンパク質の検出系の検討において国際学会発表を行った。研究実績の概要に示したとおり、CoQに関する様々な研究課題において、成果が得られた。今回、新規CoQ生合成タンパク質であるCoq12の精製が可能となり、Coq12の推定基質が分裂酵母エタノール抽出物の中に含まれていることが明らかとなった。また、CoQ10の生産性を調節するcAMP-PKA経路の因子が、CoQの生産性や、CoQ生合成酵素の発現調節に関わっていることを見いだした。また、培養条件の検討やcAMP-PKA経路の因子の遺伝子破壊株を用いることなどにより、CoQ10の高生産に成功した。今後は、Coq12の基質の同定を中心として解析を行う予定である。Coq12の推定基質を含む分裂酵母のエタノール抽出物を用い、その推定基質を含む画分を分離する。さらに、その物質の同定をHPLCやLC-MS解析等を活用して進める。同様に、coq12の破壊株で蓄積する代謝物を解析する。また、coq12の破壊株の表現型をより詳細に解析し、低下したCoQ10量がストレス耐性や呼吸能に与える影響等も評価する。さらに、coq12破壊株における、他のCoQ生合成酵素の発現等に与える影響を評価する。Coq12以外の新規に単離されたCoQ生合成タンパク質や、その遺伝子破壊株に関しても解析を行っていく予定である。

さらに、共同研究として、CoQとホスポリパーゼA1の代謝系の関連性の解析において学術論文の公表、顕微ラマン分光法を用いたCoq-GFP融合タンパク質の検出系の検討において国際学会発表を行った。研究実績の概要に示したとおり、CoQに関する様々な研究課題において、成果が得られた。今回、新規CoQ生合成タンパク質であるCoq12の精製が可能となり、Coq12の推定基質が分裂酵母エタノール抽出物の中に含まれていることが明らかとなった。また、CoQ10の生産性を調節するcAMP-PKA経路の因子が、CoQの生産性や、CoQ生合成酵素の発現調節に関わっていることを見いだした。また、培養条件の検討やcAMP-PKA経路の因子の遺伝子破壊株を用いることなどにより、CoQ10の高生産に成功した。今後は、Coq12の基質の同定を中心として解析を行う予定である。Coq12の推定基質を含む分裂酵母のエタノール抽出物を用い、その推定基質を含む画分を分離する。さらに、その物質の同定をHPLCやLC-MS解析等を活用して進める。同様に、coq12の破壊株で蓄積する代謝物を解析する。また、coq12の破壊株の表現型をより詳細に解析し、低下したCoQ10量がストレス耐性や呼吸能に与える影響等も評価する。さらに、coq12破壊株における、他のCoQ生合成酵素の発現等に与える影響を評価する。Coq12以外の新規に単離されたCoQ生合成タンパク質や、その遺伝子破壊株に関しても解析を行っていく予定である。物品費の購入が当初予想より少なく済んだため。受賞等:特定非営利活動法人日本コエンザイムQ協会第16回研究会奨励賞受賞学会等での役割:生物工学会第4回西日本支部講演会座長担当
木造密集市街地における延焼シミュレーションの活用と防火対策

全国の自治体への普及が望まれている「市街地火災シミュレーションプログラム」を典型的な金沢の木造密集市街地に適用した研究である。併せて「避難シミュレーションプログラム」も適用した。その結果、対象地域において、延焼の危険範囲を明らかにするとともに、建物の壁面および開口部の防火性能向上、塀および樹木による延焼の遮蔽、防火造建築の配置による延焼の遮蔽等の防火対策を提案するとともに、それぞれの効果を検証した。また、避難については、延焼時における大通りの混雑、高齢者・身障者におけるタンカ搬送の困難、避難者同士の衝突問題等を明らかにし、避難誘導のあり方について検討した。重要伝統的建造物群保存地区である金沢の「ひがし茶屋街」は、防火対策が希求される一方、木造建築の正面外観上、最も防火対策が難しい対象として研究的意義は大きい。茶屋街の外で出火した場合、火勢が増して延焼するため、より被害が大きくなると仮定したが、延焼シミュレーションの結果、茶屋街端部から延焼するため延焼に時間がかかり、むしろ茶屋街中心部からの出火において延焼は最も早くなった。また、正面開口部の木製を維持するために、2階開口部だけに防火対策を施した場合に較べ、1階正面にも防火対策を施した方が圧倒的に効果的であり、木造が密集する当地区では、放射熱の影響が無視できないことを認識した。最も防火対策が難しい対象に対して研究の端緒を開いた点で重要である。次いで金沢市における典型的な木造密集市街地として防災重点地区の「幸町・菊川地区」を対象とした。ここでは、まず、平均開口率を用いた簡便な延焼シミュレーション手法について検証した。平均開口率を採用した場合は、実測開口値を用いた場合より延焼が56%77%程度早くなった。その原因が無開口壁面の存在にあることを突き止め、平均開口率を用いた場合にも同様に現実の無開口壁面を設定した結果、実測開口値の延焼性状に近似させることができた。全国の自治体への普及に有効となる解決法として意義は大きい。具体的な防火対策の延焼シミュレーションでは、1階開口部のみの防火対策では効果は乏しいものの、2階開口部のみに防火対策を施した場合には顕箸な効果が認められ、全開口部への防火対策に比して実用性を高めた意義は大である。避難誘導については、指定避難場への経路に地震被害を想定した障害を設けたシナリオのもとで避難シミュレーションを実施した結果、避難者の渋滞による混乱および避難遅延等の支障を確認することができ、研究の展望を開いた点で重要である。重要伝統的建造物群保存地区である金沢の「ひがし茶屋街」は、防火対策が希求される一方、木造建築の正面外観上、最も防火対策が困難な対象として研究的意義は大である。隣接建築と側壁を接した建築形式が、防火上の弱点である。そこで、この側壁を耐火構造と想定してシミュレーションを行った結果、裸木造では7分であった延焼時間を9分に遅延させることができた。また、茶屋街の端部に位置する建物のみを防火構造に置き換えた場合は、全焼時間を231分から273分へと大幅に遅延させることができた。また、それぞれ異なる建築形状を単純化して複雑な解析を回避する「典型モデルによるシミュレーション方法」を開発した。以上、最も防火対策が難しい対象に対して端緒を開いた意義は大である。次に典型的な木造密集市街地である防災重点地区の「幸町・菊川地区」を対象とし、まず、細街路を拡幅せずに「空間の隔て効果」を高める前庭の効果を確認した。足軽地区としての伝統から、道路幅員2.9mでも向かい合う前庭をそれぞれ奥行1.8m(1間)程度確保した箇所では、延焼が遮断された。さらに、延焼が広がりやすい危険箇所をシミュレーションに見つけ出し、その要因として、木造家屋の密集、付近に耐火構造建築や空間地が存在しないという共通点を明らかにした。また、昭和戦後に防火木造に建て替わった家屋も増えているため、耐火建築の効果的な配置方法をシミュレーションにより検討した。その結果、耐火建築は少数でも延焼遅延効果が認められ、とりわけ規則的に防火帯を構成した場合は延焼を遮断することが可能となった。同地区における避難誘導シミュレーションでは、小学校の建物から多人数の児童が避難する時間を含めて、街路への誘導を図る必要性を認識することができた。以上、典型的な木造密集市街地に対する防火対策の可能性を見いだした意義は大きい。延焼シミュレーションを用いた防火対策の研究である。重要伝統的建造物群保存地区である金沢の「ひがし茶屋街」は、最も防火対策が困難な対象であり、研究的意義は大である。延焼シミュレーションによれば、同茶屋街で火災が発生し、地震等により消火活動が行えない場合は118分間で全焼する。そのため、景観に支障のない街区の背割線位置で防火対策を検討した。茶屋街の空間モデルを作成して実験シミュレーションを行った。動勢を観察するため無風状態とした。

コンクリート等の防火塀を設けた場合、高さを2.5mにすると裏家の1階開口部に効果がある。塀のない場合の17分を20分に遅延した。同じく高さ6mの樹木で遮れば4分の遅延効果が得られる。土蔵を設ければ、6分以上の遅延効果がある。また、隣家間の側壁に防火性能をもたせれば、4分の遅延効果がある。次に防災重点地区に指定されている「菊川地区」で検討した。典型的な木造密集市街地の実例として意義は大きい。無風時での火災発生後120分たっても延焼を広げる危険区域がある。城下町時代には足軽が居住した土地柄である。当時の足軽居住地(平屋)を空間モデルで再現した。前庭に高さ3mの緑樹帯を設定すると延焼を完全に妨げた。明治から昭和戦前にかけて建てられた足軽屋敷を祖型とする2階建の木造家屋が残っている。隣家の2階側面開口部を網入ガラスにすると17分が20分に延長され3分の遅延効果を得た。同じく1・2階とも網入ガラスにすると実に14分の遅延効果を得た。さらに側面に開口部が無い場合は28分の遅延効果を得た。以上のように、文化財を含む「ひがし茶屋街」では、防火対策により3分から6分の遅延効果を得、同様に「菊川地区」では3分から28分の遅延効果を得た。避難シミュレーションでは、地震時等の同時多発火災において避難場所が使えなくなる場合を想定して、どこに問題点が存在するかを明らかにした。
ジェミニ型分子による表面キラル認識と光学分割

4級アミン界面活性剤をアルキルスペーサーで結んだ『ジェミニ型ジカチオン分子』は、4級アミン間の距離の制御により様々な分子集合体の形成を可能にし、コロイド分散系の分野において注目を集めている。本研究では、このジェミニ型分子のチオール誘導体を新規に合成し、ジェミニ型分子の特長を活かしながら固体表面に自己組織化膜として固定させ、新しい機能性表面を創製する検討を行った。1.ジェミニ型チオール誘導体の合成と評価:ジェミニ型四級アンモニウム基を含む新規チオール誘導体を合成し、金単結晶上に自己組織化膜を形成した上、膜の物性について、反射赤外分光法(FTIR-RAS),表面プラズモン分光法(SPR)、X線光電子分光法(XPS)、ケルビンプローブ(KP)法で確認した。特にケルビンプローブ法では、ジェミニ分子の高い表面電荷密度に対応するデータを得ることができた。2.酒石酸によるキラル表面の作製と光学分割に関する検討:金表面に形成したジェミニ型自己組織化膜表面にL-,D-あるいはメゾ-酒石酸を吸着させ、その膜構造の違いをFTIR-RAS及びSPRにより評価するとともに、それぞれの表面上ヘキラリティの一致する同種分子が優先的に共着することをマイクロコンタクトパタン上への結晶析出のAFM観察により実験的に確認した。3.ナノ微粒子合成:ジェミニ型チオール誘導体をキャップ剤とする金ナノ微粒子の合成について検討し、チオールとアンモニウム基の相補的効果により1ステップで安定な微粒子合成が可能であることを実験的に確認した。4級アミン界面活性剤をアルキルスペーサーで結んだ『ジェミニ(双児)型ジカチオン分子』は、4級アミン間の距離の制御により様々な分子集合体の形成を可能にし、コロイド分散系の分野において注目を集めている。本研究では、このジェミニ型分子のチオール誘導体を新規に合成することにより、ジェミニ型分子の特長を活かしながら固体表面・ナノ微粒子表面へと導入し、新しい機能性分子の創製を狙うものである。本年度の成果は以下の通りである。1.ジェミニ型チオール誘導体の合成と評価:ジェミニ型四級アンモニウム基(直列に結合した2個のアンモニウム基)が1本鎖の末端にある新規チオール誘導体を合成し、金単結晶上に自己組織化膜を形成した上、従来のジェミニ型分子からなる自己組織化膜との物性の違いについて、反射赤外分光法(FTIR-RAS),表面プラズモン分光法(SPR)、X線光電子分光法(XPS)等で確認した。その結果、分子鎖中の電荷量の増加により膜密度が低下する傾向が確認された。2.自己組織化膜表面におけるキラル分子吸着状態の評価:金表面に形成したジェミニ型自己組織化膜表面にL-D-あるいはメゾ-酒石酸を吸着させ、その膜構造の違いをFTIR-RAS及びSPRにより評価するとともに、それぞれの表面上へキラリティの一致する同種分子が優先的に共着することを実験的に確認した。3.効率のよい蛋白質の精製法の確立:酒石酸類似化合物のD、L体を特異的に認識し結合できる酵素蛋白質として、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を精製処理し、ジェミニ型チオール誘導体上にイソプロピルリンゴ酸(IPM)を固定化した基板上への酵素蛋白質の吸着挙動をSPRにて検討した。非特異結合と特異結合の識別等の詳細は今後の課題であるが、表面の作製法、酵素蛋白質の取り扱い、SPRによるその場観察法については今期確立することができた。1.微粒子合成昨年度より着手しているジェミニ型チオール誘導体をキャップ剤とする金ナノ微粒子の合成(液中還元法)について、従来のアミン系チオール誘導体に比べて優れた特性をもつことを実験的に確認した。これは平面基板上の実験で確認されている通り、ジェミニ型チオール自己組織化膜の表面電荷密度が従来のアミン系チオール自己組織化膜よりも高いことによる効果と考えられる。

しかし、表面電荷密度の直接測定は、イオン性表面が真空中で不安定である(吸着水によると考察される)ため、まだ確かなデータが得られておらず、今後も検討を続ける。2.気液界面単分子膜の金基板表面への移し取りと、化学吸着反応の確認ジェミニ型チオール誘導体は気液界面に単分子膜として展開可能であるが、非常に不安定で、表面圧が経時的に変化し、金基板への安定な移し取りが困難であった。温度調整・水中への対イオンの添加(低分子)でも顕著な変化はみられなかった。今後高分子電解質の利用等をさらに検討する。3.界面における単結晶成長による光学分割の検討ジェミニ型自己組織化膜上にL-あるいはD-酒石酸を単分子層として固定化した表面を鋳型とし、界面における単結晶成長による酒石酸分子の光学分割の可能性を検討した。飽和溶液中へ鋳型表面を静置した際、表面への結晶析出が得られたものの、結晶サイズが小さく、従来のX線等による構造解析では分子種の同定が困難であったため、走査型顕微鏡による分析に来期以降着手する。4.蛋白質の選択吸着と2次元結晶化本年度は特に非特異吸着と特異吸着との識別化に注力した。酵素タンパク質はジェミニ型チオール自己組織化膜に高効率で吸着するものの、PEGチオール自己組織化膜、アルカンチオール自己組織化膜表面にも同様に吸着し、選択吸着の証拠は得られなかった。選択吸着はリンス処理による脱着過程で識別できる可能性が高く、今後条件をふっての検討を追加で実施する。1.ジェミニ型分子を用いた微粒子合成と表面電荷密度の定量ジェミニ型および従来の1本鎖型カチオン分子からなる自己組織化単分子膜、および酒石酸分子を選択吸着させた表面について、ケルビンプローブ法により表面電荷密度の直接測定(大気中)を行った。大気中測定では真空中とは違い安定したデータが測定でき、それぞれの表面間で、これまでの表面プラズモン法での結果によく対応する特徴的な表面電位の違いを得ることができた。データの定量的な解釈についてさらに検討を加えた後に論文化を検討する。2.カチオン系分子との混合による気液界面への単分子膜作製とチオールと金の化学反応の確認分子での気液界面への展開については不安定であったため検討を中止し、昨年度の合成に成功している同分子をキャッピング剤として用いた金ナノ微粒子について検討を開始した。計画変更により今期中に成果をまとめるには至っていないが、今後引き続き検討を続ける。3.界面での単結晶成長のAFM観察による確認溶液中への長期浸せき中に金が剥離する問題が生じたため、ナノメーター以下の均一性を保ちつつ基板から剥離しない金基板の作製について追加検討し、接着金属層(クロムあるいはチタンで数nm)の上に金を遠距離から極微量蒸着する(数nm)手法を確立した。この基板を用いてのAFM観察の結果について今期学会発表する予定。4.マイクロアレイ法による酵素蛋白質の表面への特異吸着の確認表面への自己組織化膜によるパターニングのためのマイクロコンタクトプリント法について、抗体抗原反応としてよく知られているアビジンービオチンの系を用いて技術確立した。また表面プラズモン顕微鏡でその場観察する手法を確立した。アレイ化による酵素蛋白質実験については現在進行中。