hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類細胞の浸透圧応答の分子基盤解明を目指したゲノムワイドＲＮＡiスクリーニング

このことは、我々が構築したスクリーニング系が容易に他のスクリーニングに応用可能であるという汎用性を持つことを示しており、構築したスクリーニング系の有用性を示すという点でも当初の計画以上に進展している。現在までに実施したスクリーニングにより、計画通り高浸透圧ストレス時のシグナル伝達に関わると考えられるタンパクが複数得られている。今後は今年度解析したフォスファターゼを含めてこれらのタンパクの相互関係を解析していく。本研究のスクリーニングでは細胞の高浸透圧受容を担う分子から、ASK3の脱リン酸化(不活性化)までのシグナル伝達を担う分子が得られるはずであり、既に解析を行ったフォスファターゼはいわばASK3のすぐ上流の直接の制御分子と考えることができる。例えば、このフォスファターゼが高浸透圧ストレスでASK3との結合を促進させるために必要なタンパクを、スクリーニングで得られた候補分子の中から同定することで、このシグナル伝達のより上流で働くタンパクを明らかにできると考えられる。このようにして順次シグナル伝達を上に遡って明らかにすることで、最終的に高浸透圧ストレスを直接感知する"浸透圧センサー分子"に辿り着くことを目標に研究を進める。また、高浸透圧ストレスだけでなく、逆の低浸透圧ストレスのシグナル伝達を担うタンパクもASK3の活性を指標に探索でき、実際にそのスクリーニングも開始している。このように今後得られる低浸透圧のシグナル伝達分子の情報も合わせて、細胞の浸透圧ストレス応答の分子機構全体について明らかにすることを目指す。
一次運動野における入出力連関の解析

大脳皮質一次運動野は中心前回に存在し,その外側から内側にかけて口腔顔面,上肢,体幹,下肢という順で身体の各部位が再現されている.今回下肢支配域の体部位再現と皮質性入力について検討した.まずICMSにより,下肢近位部の支配域は半球の中心前回を含む外側面に位置し,遠位部の支配域を取り囲むように再現していることが確認された.半球内側壁の下肢支配域には主に近位部が再現されていた.同定された下肢支配域へ逆行性トレーサーを注入した結果,一次運動野下肢支配域は運動前野背側部,補足運動野,帯状皮質運動野からの強い皮質性入力を受けていることが明らかになった.また,下肢近位支配域と下肢遠位支配域の両者への逆行性蛍光トレーサー注入による二重標識法により下肢近位支配域投射ニューロンと下肢遠位支配域投射ニューロンが運動前野背側部と帯状皮質運動野において混在しており,二つの部位が下肢の近位-遠位の協調運動に関与していることが示唆された.同様の近位部遠位部への注入は過去に上肢支配域について行なったが,この場合運動前野では上肢近位支配域投射ニューロンと上肢遠位支配域投射ニューロンが別の領域に分布していた.したがって上肢運動に関しては近位遠位の運動を独立に制御する領域が運動関連皮質領野に存在しているのに対して,下肢運動に関しては近位遠位の運動を独立に制御する領域は存在していない可能性を見いだした.ニホンザルの補足運動野,腹側および背側運動前野の上肢支配域に刺激電極を慢性的に留置した。一次運動野出力細胞のうち錐体路細胞を細胞外記録を用いて延随錐体の電気刺激に対する逆行性応答の有無により同定し、錐体路細胞と非錐体路細胞の補足運動野、運動前野電気刺激に対する反応性を検索した。同定された錐体路細胞の高次運動野電気刺激に対する典型的な反応は,順行性の興奮性の応答と,それに引続く比較的長い期間(平均90-100ミリ秒程度)の抑制性の応答であった。抑制性の応答を示す錐体路細胞もまた多く見いだされたが,興奮性の応答のみを示す細胞は見いだされなかった。補足運動野,腹側および背側運動前野のすべての刺激に対して興奮性の応答を示す細胞の割合は,12,1%であったのに対して,3ヶ所すべての刺激に対して抑制性の応答を示す錐体路細胞の割合は70.4%の高率にもおよんだ。これらは皮質内では主としてV層に分布していた。一方,非錐体路細胞では順行性の興奮性の応答が確認され,補足運動野,腹側および背側運動前野のすべての刺激に対して興奮性の応答を示す細胞の割合は,13.9%であり,皮質内では主としてII-II1層に分布していた。多くの錐体路細胞が補足運動野,腹側および背側運動前野のすべての刺激に対して抑制性の応答を示したことは介在細胞がその軸索の分岐によって多くの錐体細胞を同時に抑制していることを示唆している。大脳皮質一次運動野は中心前回に存在し,その外側から内側にかけて口腔顔面,上肢,体幹,下肢という順で身体の各部位が再現されている.今回下肢支配域の体部位再現と皮質性入力について検討した.まずICMSにより,下肢近位部の支配域は半球の中心前回を含む外側面に位置し,遠位部の支配域を取り囲むように再現していることが確認された.半球内側壁の下肢支配域には主に近位部が再現されていた.同定された下肢支配域へ逆行性トレーサーを注入した結果,一次運動野下肢支配域は運動前野背側部,補足運動野,帯状皮質運動野からの強い皮質性入力を受けていることが明らかになった.また,下肢近位支配域と下肢遠位支配域の両者への逆行性蛍光トレーサー注入による二重標識法により下肢近位支配域投射ニューロンと下肢遠位支配域投射ニューロンが運動前野背側部と帯状皮質運動野において混在しており,二つの部位が下肢の近位-遠位の協調運動に関与していることが示唆された.同様の近位部遠位部への注入は過去に上肢支配域について行なったが,この場合運動前野では上肢近位支配域投射ニューロンと上肢遠位支配域投射ニューロンが別の領域に分布していた.したがって上肢運動に関しては近位遠位の運動を独立に制御する領域が運動関連皮質領野に存在しているのに対して,下肢運動に関しては近位遠位の運動を独立に制御する領域は存在していない可能性を見いだした.
非対称地理データの分析とその視覚化

1.移動距離(時間)データの時間地図研究計画・方法(平成18年度)で概略を述べた2種のモデルを用い、茨城県の通勤データを対象として時間地図を作成した。その結果、モデルに関しては、1)2種のモデルから得られる時間地図に大差がないこと、2)第1のモデルの計算時間が短いことなどが分かった。ただし、解くべき最適化問題には多くの局所解が存在し、初期点の与え方によって得られる解が大きく異なるという問題点も現れた。また、通勤データから見た茨城県の都市の関連の強さとその序列が観察された。2.多次元尺度法と半正定値計画問題対称行列の(i,j)要素が何らかの次元のユークリッド空間の2点x[i]とx[j]間のユークリッド距離で与えられるとき、この行列はユークリッド的であると言われる。時間地図の作成によく用いられる多次元尺度法は、通常与えられた行列がユークリッド的であるかどうかに拘わらず何らかの布置を出力する。しかし、与えられた行列を何らかの基準で近似するユークリッド的行列を初めに作り、それから布置を求めることが考えられるが、ユークリッド的行列を作る問題が半正定値計画問題に定式化できる。この定式化に基づいて、予備的な計算を行った。3.受賞上記の半正定値計画問題に関する論文で、研究分担者の吉瀬が日本オペレーションズ・リサーチ学会の文献賞を受賞した。4.研究会の開催「地理情報の解析と視覚化」についての研究会を開催した。「地理情報データの誤差分析」「平面格子状ネットワークにおける最適避難計画」「鉄道運賃計算と最短路問題」などの招待講演と一般発表があった。地理データに代表される大規模なデータに何らかの構造を見いだし、その視覚化を試みる場合、多くの問題は数理最適化問題に定式化できる。しかし、そうして得られた問題は凸性などの数学的に好ましく扱いやすい性質を持っていないことが多々ある。例えば、多次元尺度法の扱っている問題を素直に定式化した最適化問題ですらそうであり、そのため局所的最適解が複数現れ、最適化は困難となる。この問題を錐計画問題に定式化し、内点法によって解く試みが内外の研究者によって提案されており、そのための基礎研究を行った。さらに、定式化された数理最適化問題は相反する複数の基準を持つことがある。そのような問題には解の候補として認められているパレート最適解が複数存在するため、パレート最適解の中からさらに何らかの妥当な解を選ぶ追加的な基準の構築と、それを実行するアルゴリズムが必要である。一般に凸集合とならないパレート最適解集合を記述する方法として、ギャップ関数と呼ばれる関数を用いることが有効であるが、この関数は実行可能領域の外では定義されておらず、これがアルゴリズム構築の際に妨げとなっていた。多基準の線形最適化問題のパレート最適解集合上で線形関数を最適化する問題を取り上げ、ギャップ関数のこの問題点を解決するため、その拡張の方法を提案した。また、申請者が以前に提案した方法が、データマイニングの一手法である非負行列分解のために用いることができるとの提案があり、そのための実験も開始した。既存の多変量解析の手法と比較してその普及に遅れのある非負行列分解に対して効率的な手法を提案し、その計算実験による性能評価を行うことを本年度の研究の目標として設定した。非負行列分解の手法の多くは誤差尺度としてフロベニウス・ノルムを用いているが、座標軸の上下方向へのずれや回転などに起因するノイズに影響を受けやすいこのノルムの欠点にも対処したいと考えた。以上の目的のためにフロベニウス・ノルムに代えてEarth Mover's Distance(EMD)を誤差尺度として利用することを検討した。この場合、問題の構造を利用するとネットワーク最適化問題を繰り返し解くことによって非負行列分解を行うことができる。しかし、そのネットワーク最適化間題は原問題のサイズの2乗の大きさに比例するサイズとなり、小さな画像データでさえ容易に計算機の能力を超える大きさになる。このサイズの増大に対して、以下の成果を得た。1.EMDを計算する際の基礎となる距離に拘わらず、解くべきネットワーク最適化問題の制約本数を半分に減らすことができる。2.EMDを計算する際の基礎となる距離が1-ノルム、無限大ノルム、あるいはD-ノルムのいずれかである場合には、解くべきネットワーク最適化問題を、サイズが原問題のサイズの線形のオーダーである等価な問題に変換できる。線形オーダーに掛かる係数は4ないし8と小さい。3.手書き文字の判別問題に対して以上の結果を利用した実験では、計算時間を約10分の1に短縮できた。
水酸化酵素Phdの新規基質の同定を基盤とした低酸素応答システムの解明

細胞は低酸素環境にさらされると、低酸素応答を引き起こし、適応する。この適応過程では、代謝をはじめとして様々な細胞応答を調節する必要がある。前年度から引き続き、低酸素応答におけるピルビン酸脱水素酵素PDHの活性制御機構の解析を進めた。PDHの活性が低酸素下で減弱することを前年度までの研究で明らかにしていたことから、そのメカニズムを明らかにするための解析を進めた。細胞にPDHを強制発現させた後に精製して、質量分析を行ったところ、PDHはリン酸化をはじめとして様々な翻訳後修飾を受けることが判明したが、その中にはプロリン水酸化も含まれることが明らかになった。この翻訳後修飾を受ける領域を詳しく検証したところ、PDHの既知基質であるHIFの水酸化部位に存在するモチーフとは相同ではなかったことから、プロリン水酸化には既存のモチーフには依存しない様式でおこるものも存在する可能性が考察された。次に、PDHのプロリン水酸化の生理的意義を明らかにするために、水酸化されるプロリン残基の変異体を作製した。この変異体を細胞内に発現させたところ、変異体は野生型と比べて不安定なタンパク質であり、さらに、PDH複合体の他のサブユニットとの結合能も低下していることが明らかになった。したがって、このプロリン水酸化は、他のサブユニットとの会合を促進して、PDHの複合体の安定化に作用する役割を担うことが考えられた。そこで、PDHがノックダウンされPDH活性が抑制されている細胞株に、野生型およびプロリン水酸化の変異型のPDHを導入して、その酵素活性の回復能を検証した。その結果、野生型と変異型PDHを導入したどちらの細胞でもPDHの酵素活性の回復は認められたが、変異型PDHの方がその活性が低い傾向があることが明らかになった。今後、この解析を細胞系や導入する量を変化させて行い、PDHのプロリン水酸化の役割と、低酸素応答におけるその生理的意義を明らかにしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞は低酸素環境では、エネルギー代謝を解糖系に依存した状態へと変化させる。この代謝変化にはピルビン酸脱水素酵素PDCが関与している。PDCの低酸素下での活性制御にはPDCキナーゼの働きを介したPDCのリン酸化が重要であることがこれまでに報告されていた。まず、低酸素下でのPDCの活性制御機構の解析に着手して、PDCの発現が長期的な低酸素培養で減少することを明らかにした。さらに、この発現低下にはミトコンドリアマトリクスのプロテアーゼが作用していることを、ノックダウン実験により明らかにした。そこで、この発現低下の意義を追究するために、PDCをshRNAで構成的にノックダウンした細胞株を樹立したところ、この細胞はTCA回路の活性が顕著に低下しており、高度に解糖系に依存した典型的な低酸素性の代謝状態を示すことが明らかになった。さらに、PDCが産生するacetyl CoAの量もこのノックダウン細胞内では低下していることが明らかになった。この低酸素様の代謝状態ががん細胞の腫瘍形成能にどのような影響を示すのかを検証するために、PDCをノックダウンした乳がん細胞株を免疫不全マウスに移植したところ、その腫瘍形成能が有意に低下していることが明らかになった。したがって、PDCの発現が低下することによって形成される解糖系に依存した代謝状態は、がん細胞の腫瘍形成能には抑制的に働くことが示された。現在、PDCノックダウン細胞において、低酸素応答シグナルがどのように変化しているのかの解析を進めている。低酸素環境における代謝状態の解析、ならびに、そのがんにおける役割の解析を行い、研究成果を論文発表することができた。また、Phdの新たな基質の候補分子を、質量分析計を用いて探索して、絞り込みを進めることができた。

その結果、野生型と変異型PDHを導入したどちらの細胞でもPDHの酵素活性の回復は認められたが、変異型PDHの方がその活性が低い傾向があることが明らかになった。今後、この解析を細胞系や導入する量を変化させて行い、PDHのプロリン水酸化の役割と、低酸素応答におけるその生理的意義を明らかにしたい。Phdの水酸化基質の探索をさらに進めて、低酸素応答に働く新たなシグナル経路の同定をめざす。今年度の研究成果に基づき、特に低酸素下での代謝変化に着目し、Phd3が低酸素下で代謝調節に関与する可能性を、PDCとの相互作用の変化に焦点を当てながら解析する。さらに、PDC活性の低下によりacetyl CoA量が減少することを見出したことから、低酸素性の細胞内事象の変化をタンパク質のアセチル化状態を解析することで明らかにしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
炭素繊維によって補強された部材に生じる熱応力低減工法の開発

炭素繊維材料を接着することによる,社会基盤構造物の補修・補強では,一般的な材料である鋼やコンクリートの線膨張係数(1012μ/°C)と比べ炭素繊維材料の線膨張係数がほぼ0μ/°Cと大きく異なるため,温度変化を受けるだけで,構造物に熱応力が生じることが問題として挙げられている.本研究では,この課題を解決するために,炭素繊維材料と共に,線膨張係数が23μ/°Cの構造用アルミニウム合金を接着して,構造部材にに生じる熱応力自体を低減させる新たな工法を提案し,温度変化試験によりその効果を明らかにした.また,炭素繊維接着に対するはく離評価法についても提案した.炭素繊維材料を接着することによる,鋼やコンクリートの社会基盤構造物の補修・補強が行われ始めている.この工法の課題としては,鋼あるいはコンクリートの線膨張係数(1012μ/°C)と炭素繊維材料の線膨脹係数(ほぼ0μ/°C)が大きく異なるため,温度変化を受けて鋼あるいはコンクリート部材に内部応力(熱応力)が生じること,ならびに当て板のはく離が問題となることが挙げられている.本研究では,この課題を解決するために,炭素繊維材料と共に,線膨張係数が23μ/°Cの構造用アルミニウム合金を接着して,鋼あるいはコンクリート部材に生じる熱応力自体を低減させる新たな工法を提案した.また,当て板接着に対するはく離評価法についても検討を行った.平成25年度は,温度低下(20°C→ー10°C)によって炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された鋼板に生じる熱応力の検証実験を行った.また,炭素繊維とアルミニウム合金材が部材の片側に接着された鋼板の長期暴露試験を行い,季節の気温の変化によって,炭素繊維のみを片側に接着した場合は鋼板に熱応力が生じるが,提案した炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された鋼板では熱応力が大幅に低減していることを確認した.温度変化量と材料定数から,理論解析あるいは理論に基づく固有値解析手法(簡易計算手法)を行って,実験結果を概ね再現できるこを確認した.炭素繊維接着補修・補強の課題の一つである,当て板接着に対するはく離評価法に関して,理論解析や理論に基づく固有値解析法を用いて計算される接着剤に生じる応力を用いた評価を行った.その結果,当て板の端部の接着剤に生じる主応力によって,ある程度はく離を評価できることが明らかとなった.炭素繊維材料を接着することによる,社会基盤構造物の補修・補強では,一般的な材料である鋼やコンクリートの線膨張係数(1012μ/°C)と比べ炭素繊維材料の線膨張係数がほぼ0μ/°Cと大きく異なるため,温度変化を受けるだけで,構造物に熱応力が生じることが問題として挙げられている.本研究では,この課題を解決するために,炭素繊維材料と共に,線膨張係数が23μ/°Cの構造用アルミニウム合金を接着して,構造部材にに生じる熱応力自体を低減させる新たな工法を提案し,温度変化試験によりその効果を明らかにした.また,炭素繊維接着に対するはく離評価法についても提案した.現在,劣化の進んだ鋼あるいはコンクリート部材へ炭素繊維材料を接着する補修・補強が行われ始めている.しかし,この工法では,鋼あるいはコンクリートの線膨張係数(1012μ/°C)と炭素繊維材料の線膨脹係数(ほぼ0μ/°C)が大きく異なるため,温度変化を受けて鋼あるいはコンクリート部材に内部応力(熱応力)が生じることが課題の一つとして挙げられている.本研究では,この課題を解決するために,炭素繊維材料と共に,線膨張係数が23μ/°Cの構造用アルミニウム合金を接着して,鋼あるいはコンクリート部材に生じる熱応力自体を低減させる新たな工法を提案した.平成24年度は,炭素繊維とアルミニウム合金材が部材の両側に接着された場合の部材に生じる熱応力,および炭素繊維とアルミニウム合金材が部材の片側に接着された場合の部材に生じる熱応力に対して,理論的な解明を行った.また,理論に基づく固有値解析手法(簡易計算手法)の開発も行った.そして,炭素繊維とアルミニウム合金材が両側あるいは片側に接着された鋼部材に対して,2030°Cの温度上昇によって生じる熱応力を計測し,理論および理論に基づいた固有値解析手法による解とほぼ一致することを確認した.また,有限要素解析の結果も,固有値解析手法による解と同様な傾向を示した.平成24年度は,炭素繊維のみによって鋼やコンクリート部材が補修・補強された場合に,温度変化を受けると熱応力が生じる課題に対して,本研究で提案する炭素繊維とアルミニウム合金材を用いることによって,部材に生じる熱応力を低減させることができるかどうかを明らかにすることを目的に以下の研究を実施した.1)炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された部材に生じる熱応力の理論的解明と理論に基づく固有値解析を用いた解法の提案.2)炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された鋼部材の温度上昇試験

.3)炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された鋼部材のFEM解析1)の理論的解明と理論に基づく簡易な固有値解析手法を提案し,その結果が,2)と3)の温度上昇試験結果およびFEM解析結果と同様であったので,提案工法の妥当性の確認が行えており,概ね順調であると考えている.今年度も,引続き炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された部材に対して実験およびFEM解析を行う.平成24年度は,2)において,炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された部材の温度上昇試験を行ったが,温度低下が生じた場合に対しても同様に検討する.また接着のみの補修・補強では,接着剤層で,炭素繊維やアルミニウム合金材のはく離に対する懸念があるので,はく離に着目した評価についても検討を行う.さらに,はく離に対する評価についてもFEM解析を行い,その妥当性を確認する.本工法に対して,温度履歴を繰り返し受けた場合の影響を明らかにするために,炭素繊維とアルミニウム合金材が接着された部材の暴露試験も実施する.研究費としては,平成25年度も引き続き,試験の実施に必要な試験体や試験治具の製作費,ひずみゲージ費,論文投稿費を計画している.また,旅費としては,最新の研究の情報の入手のための委員会や講習会への参加,および研究成果発表としての国内外のシンポジウムへの参加を考えている.また,実験に際して,学生アルバイトをお願いする予定である.
慢性期脊髄損傷の薬物治療；骨格筋萎縮と軸索断裂を改善する生薬医薬品の開発研究

本研究は、治療が極めて困難とされている慢性期脊髄損傷を回復する薬物を開発することを目標とする。申請者は、脊髄損傷を改善しうる生薬の研究を進めてきた中で、骨格筋萎縮を改善しかつ軸索伸展も促す肉従蓉エキスの活性とその活性成分acteosideの知見を得ている。その成果にもとづき本研究は2つのゴールを設定する。1Acteosideが骨格筋と神経細胞に及ぼす機序を明らかにする。特にacteosideによる刺激で骨格筋から分泌されることが分かったPKM2が、筋増殖や軸索伸展を促進するメカニズムを明らかにする。2肉従蓉エキスをBotanical Drug(生薬単味エキスを成分とする新効能の医薬品)として開発するため、非臨床試験、臨床試験を進める。平成30年度は、大脳皮質神経細胞のライセートを用いたDARTS法によって、PKM2が神経細胞中で直接結合する分子、すなわちシグナリングの起点分子の同定を試み、候補分子を同定した(論文発表前につき未公表)。PKM2が当該分子に結合するとその分子のどのような活性がどう変化するかについて検討中である。また、in vivoにおいてもPKM2が骨格筋から分泌されるかについてを検証するため、マウス後肢骨格筋にacteosideを注射し、一定時間ごとに採取した血漿中のPKM2量をWestern blotting法により検討した。さらに、ニクジュウヨウエキスによる、筋萎縮抑制や運動機能改善効果を評価する臨床研究の準備を終了し被験者リクルートを終えた。1)骨格筋細胞のライセートを用いたDrug Affinity Responsive Target Stability (DARTS)法によって、PKM2が神経細胞中で直接結合する分子、すなわちシグナリングの起点分子を同定する実験を行い候補分子を得た(論文発表前につき未公表)。また、in vivoにおいてもPKM2が骨格筋から分泌されるかについてを検証するために、マウス後肢骨格筋にacteosideを注射し、一定時間ごとに採取した血漿中のPKM2量をWestern blotting法により測定した。2)ニクジュウヨウエキスによる、筋萎縮抑制や運動機能改善効果を評価する臨床研究の実施を前倒しで開始した。ニクジュウヨウエキスは食薬区分の食に属しており、かつ高い安全性を担保するヒトでの前例があるため食品レベルで臨床研究を進めることとした。脊髄損傷患者に対する臨床研究の前段階の臨床研究の位置づけと、同時にサルコペニアなどの筋萎縮予防薬としての一般用医薬品の出口も見据えた重要な臨床研究として「ロコモティブシンドロームに対するニクジュヨウエキスの予防及び改善効果の研究」の二重盲検法による研究計画を富山大学倫理委員会に提出し承認を得た(臨30-90)。被験者リクルートを終了した。この試験薬に必要なニクジュウヨウエキスは製薬企業A社の協力により、また試験薬と偽薬の製造はヒトGMP適合基準を満たす製薬企業B社の協力により行った。試験は12週間の服薬の前後にて行い、第1回の試験日は2019年5月11日である。1) PKM2が神経細胞で直接結合する分子、すなわち軸索伸展シグナリングの起点分子として同定した分子の、軸索伸展促進に至るシグナリングパスウェイを解析する。同定済みの候補分子は、これまで軸索伸展に関与することは知られていない分子であるので、既知の軸索伸展メカニズムとは異なるシグナリングが発見される可能性がある。2)PKM2が骨格筋から分泌されたあと、脳内に移行して作用するmyokineであるのかを明らかにするために、リコンビナントPKM2を蛍光標識し、それを尾静脈注射して5-20分後の脳内の蛍光標識PKM2濃度を免疫組織染色にて検出する。この実験により、PKM2が血流にのって遠隔臓器にまで作用しうる新しいタイプのmyokineであるかどうかを明らかにする。3)ニクジュウヨウエキスによる、筋萎縮抑制や運動機能改善効果を評価する臨床研究を進め解析結果を得る。試験参加者は20名である。検査項目は、体幹および四肢の筋肉量、握力、立ち上がりテスト、2ステップテスト、6m歩行テスト、ロコモチェック25(自覚的運動機能評価)、身長、体重、体脂肪、体水分量、基礎代謝量、内臓脂肪レベルである。平成29年度は、骨格筋細胞のライセートを用いたDDARTS法によって、PKM2およびperiostinが筋細胞中で直接結合する分子、すなわちシグナリングの起点分子の同定を試みた。候補分子の再現性を確認している。また、in vivoにおいてもPKM2が骨格筋から分泌されるかについては検証するため、マウス後肢骨格筋にacteosideを注射し、一定時間ごとに血漿と大腿二頭筋を採取し、その中のPKM2濃度をELISAにより測定した。

その結果、acteoside注射後、大腿二頭筋内のPKM2量がまず増加し、その後血漿中内の濃度が増加する傾向を得た。さらにリコンビナントPKM2を尾静脈注射して20分後の脳内のPKM2濃度をELISAによって定量した結果、有意に脳内PKM2濃度が増加していた。これらの結果により、PKM2が血流にのって遠隔臓器にまで作用しうるmyokineとしての機能を持つことが示唆された。また、これら成果を特許として出願した。(国内出願:特願2017ー201435、出願日:平成29年10月17日、出願人:国立大学法人富山大学)骨格筋細胞のライセートを用いたDrug Affinity Responsive Target Stability (DARTS)法によって、PKM2およびperiostinが筋細胞中で直接結合する分子、すなわちシグナリングの起点分子を同定する実験を行った。候補分子の再現性を確認しているところである。また、in vivoにおいてもPKM2が骨格筋から分泌されるかについては検証しするために、マウス後肢骨格筋にacteosideを注射し、一定時間ごとに血漿と大腿二頭筋を採取し、その中のPKM2濃度をELISAにより測定した。(国内出願:特願2017ー201435、出願日:平成29年10月17日、出願人:国立大学法人富山大学)本研究は、治療が極めて困難とされている慢性期脊髄損傷を回復する薬物を開発することを目標とする。申請者は、脊髄損傷を改善しうる生薬の研究を進めてきた中で、骨格筋萎縮を改善しかつ軸索伸展も促す肉従蓉エキスの活性とその活性成分acteosideの知見を得ている。その成果にもとづき本研究は2つのゴールを設定する。1Acteosideが骨格筋と神経細胞に及ぼす機序を明らかにする。特にacteosideによる刺激で骨格筋から分泌されることが分かったPKM2が、筋増殖や軸索伸展を促進するメカニズムを明らかにする。2肉従蓉エキスをBotanical Drug(生薬単味エキスを成分とする新効能の医薬品)として開発するため、非臨床試験、臨床試験を進める。平成30年度は、大脳皮質神経細胞のライセートを用いたDARTS法によって、PKM2が神経細胞中で直接結合する分子、すなわちシグナリングの起点分子の同定を試み、候補分子を同定した(論文発表前につき未公表)。PKM2が当該分子に結合するとその分子のどのような活性がどう変化するかについて検討中である。また、in vivoにおいてもPKM2が骨格筋から分泌されるかについてを検証するため、マウス後肢骨格筋にacteosideを注射し、一定時間ごとに採取した血漿中のPKM2量をWestern blotting法により検討した。
世界的ツバキ名花‘玉之浦'を通した複色花発生機構およびヤブツバキ遺伝的分化の解明

本年度は,これまで未調査であった地域から収集したヤブツバキ(Camellia japonica)集団の葉緑体DNA分析と,'玉之浦'花弁における色素生合成酵素遺伝子のさらに詳細な発現量解析を行った.【葉緑体DNA変異】福井県高浜町産3集団71系統,京都府舞鶴市産1集団35系統,沖縄県石垣島産1集団6系統,尖閣諸島産1集団2系統のヤブツバキを供試し,葉緑体DNAのハプロタイプを調査した.高浜町および舞鶴市集団の系統におけるハプロタイプは,日本本土で優先的に存在するHaplotype Iaであったのに対し,沖縄諸島集団の系統では,これまで九州西部の島々のみで見られていたHaplotype Ibであった.前年度までの結果から,前氷河期における我が国のツバキ属植物のレフュージアは九州西部の地域に存在していたと推察していたが,今回の調査結果によりレフュージアが現在の沖縄諸島にまで及んでいた可能性が示唆された.【'玉之浦'花弁白覆輪形成機構解明】前年度は,色素生合成酵素6遺伝子について設計したdegenerate primerを用いたRT-PCRにより,白覆輪部位においてCHS遺伝子め発現量が部位特異的に低下していることを明らかにした.今年度は,6遺伝子のうち4遺伝子(CHS, F3H, DFR, ANS)のクローニングを行なってgene-specific primerを設計し,これらのプライマーを用いたRT-PCRによってもCHSの部位特異的発現量低下を認めた.次に5',3'RACE法を援用しCHSのcDNA全長配列を単離したところ,'玉之浦'花弁両花色部位においてCHS遺伝子の長さに違いが見られなかったことから,転移因子の挿入や重複・欠失といった遺伝子構造の変化は起きていないと推察された.本年度はヤブツバキ(Camellia japonica)の葉緑体DNAタイプのさらに詳細な調査・分類と,ヤブツバキ花弁の色素生合成酵素遺伝子の単離および'玉之浦'花弁におけるそれら遺伝子の発現量解析を行った.【葉緑体DNA変異】葉緑体DNA2領域のPCR-RFLP分析によりヤブツバキの葉緑体DNAを3種類(Haplotype Ia,Ib,III)に分類することができ,さらにヤブツバキの葉緑体DNA変異には地理的に大きな偏りがあることが明らかになった.日本本土の集団では,ほとんどあるいはすべての系統の葉緑体DNAがHaplotype Iaであったのに対し,長崎県壱岐,対馬ではHaplotype IaとHaplotype Ibが,長崎県五島列島では3種類すべてのハプロタイプ(Haplotype Ia,Ib,III)がみられた.これらの結果は,九州西部の地域が,我が国のツバキ属植物の進化過程において非常に重要な地域,例えば,最終氷期におけるレフュージアであった可能性を示唆していると考えられた.【'玉之浦'花弁白覆輪形成機構解明】色素生合成酵素遺伝子のうち,CHS,F3H,DFR,ANSの計4遺伝子の一部をクローニングすることができた.これらの遺伝子配列はチャ(C.sinensis)などの木本性植物のそれと高い相同性を示した.また高等植物の遺伝子配列に基づいて設計したdegenerate primerを用いた色素生合成酵素遺伝子のRT-PCRの結果,白覆輪部位においてCHS遺伝子の発現量が著しく低下していることが明らかになった.以上のことから,'玉之浦'花弁の覆輸化は,花弁周縁における部位特異的なCHSの発現量低下によるアントシアニン蓄積の欠如によって引き起こされていると考えられた.本年度は,これまで未調査であった地域から収集したヤブツバキ(Camellia japonica)集団の葉緑体DNA分析と,'玉之浦'花弁における色素生合成酵素遺伝子のさらに詳細な発現量解析を行った.【葉緑体DNA変異】福井県高浜町産3集団71系統,京都府舞鶴市産1集団35系統,沖縄県石垣島産1集団6系統,尖閣諸島産1集団2系統のヤブツバキを供試し,葉緑体DNAのハプロタイプを調査した.高浜町および舞鶴市集団の系統におけるハプロタイプは,日本本土で優先的に存在するHaplotype Iaであったのに対し,沖縄諸島集団の系統では,これまで九州西部の島々のみで見られていたHaplotype Ibであった.前年度までの結果から,前氷河期における我が国のツバキ属植物のレフュージアは九州西部の地域に存在していたと推察していたが,今回の調査結果によりレフュージアが現在の沖縄諸島にまで及んでいた可能性が示唆された.【'玉之浦'花弁白覆輪形成機構解明】前年度は,色素生合成酵素6遺伝子について設計したdegenerate primerを用いたRT-PCRにより,白覆輪部位においてCHS遺伝子め発現量が部位特異的に低下していることを明らかにした.今年度は,6遺伝子のうち4遺伝子(CHS, F3H, DFR, ANS)のクローニングを行なってgene-specific primerを設計し,これらのプライマーを用いたRT-PCRによってもCHSの部位特異的発現量低下を認めた.次に5',3'RACE法を援用しCHSのcDNA全長配列を単離したところ,'玉之浦'花弁両花色部位においてCHS遺伝子の長さに違いが見られなかったことから,転移因子の挿入や重複・欠失といった遺伝子構造の変化は起きていないと推察された.
微弱電波を活用した多重周波数によるセンサネットワークの構築

1.GNU RADIOによる、MAD-SS通信の実現手法の調査:ソフトウェア無線の一手法であるGNU RADIOを用い、多重通信する手法の考察:ソフトウェアラジオでなぜうまくMAD-SSが動作しないのかを考察した。ソフトウェアラジオでは、復調する際に、バンドパスフィルタを通った後、A/D変換を行う。MAD-SSで、動作させる場合は、AD返還後のデータを復調するのに、MAD-SS帯域のバンドパスフィルタを通過した後、BPSK復調、MAD-SS復調を行う。しかし、複数チャンネルでの復調を同時並行するために、MAD-SSのバンドパスフィルタを通すための、データを保存しているメモリとバスの速度が間に合っていないのではないかと考察している。現在、このことを検証し、本手法の問題点を追求している。2.小型マイコンとの連携手法での解決:ソフトウェアラジオ1台でどうさせることが難しい場合、安価なマイコンボード(RaspberryPi)のソフトウエアラジオを並列して動作させ受信回路を設計した。1.の高性能なソフトウェアラジオを使うのに比べ、消費電力が下回れば、この手法でも実質的な問題はなくなる。3.本手法の応用例:本手法を活用した応用例について、平行して研究を行った。IoT機器との連携を行う際に、そのデータ送信をMAD-SSで行うことを考察した。特に、一番成果が上がったのが、ホテル、旅館での鍵の位置情報提示システムである。ホテル、旅館などの大きな施設内で、鍵の位置情報を知りたい場合が多々存在する。その鍵の位置情報を、電波を使って予測して、利用者に提示するシステムを構築した。本システムは、bluetoothで実装したが、鍵の本数が多くなると電波の衝突が起こりやすくなるために、微弱電波とMAD-SSに置き換えたいと考えている。提案手法では、無理があることが、判明してきた。(ハードウェアのボトルネックを解消できていない。)従来のGNU RADIOの装置を使うより、良い方法を探っている。マイコンを利用したソフトウェアラジオが安価になってきたために、ハードウェア的に並列受信する方が、安価に低電力で作れるようになってきた。別の手法を手早く試して、本来の目的を達成することを目指す。既存のMAD-SSは、TCXOで基本周波数を作成し、3逓倍もしくは、9逓倍を行い、搬送波を作成していた。しかし、この方法はTCXOを交換しないと、周波数を変更することは不可能で有り、多重通信を実現するには、多数のTCXOを利用した回路を制作する必要があり、現実的ではなかった。そこで1年目は、次の3点に重点を置き、研究を進めた。1.GNU RADIOによる、MAD-SS通信の実現手法の調査:ソフトウェア無線の一手法であるGNU RADIOを用い、多重通信する手法を検討した。特に、周波数帯域が10MHzを超える場合の処理方法について、FFTの処理量が、演算能力を超えてしまう可能性が有り、その部分について詳細な検討が必要なことが分かった。2.位相同期回路(PLL回路)による、周波数変更手法の検討:TCXOを使わず、PLLによって送信機を構築する手法を研究協力者と共に検討を行った。TCXOを利用した場合に比べて、温度による周波数安定度を得ることが難しいと考えている。今後は、利用する場面を考慮しTCXO利用の場合と同じレベルの性能を目指す。3.LinuxでのMAD-SSの受信プログラムの開発およびFPGA Linuxの利用の検討:MAD-SSは、Windowsのみで動作していたが、汎用Linux(組込Linuxではない)での動作を行えるように、ソースの見直しを行い、移植作業を行い、動作確認を行った。ソフトウェア無線のハードウェアにFPGAが搭載されるようになってきているので、FPGA Linuxでの動作を検討した。現在所有しているGNU RADIOの装置では、処理速度が間に合わない事が分かってきた。根本的にやり方を変える必要がある。本研究を実現するために、gnu radio側で、すべての処理を行うのをやめ、2段階にシステムを分けることにした。(1)GNURADIO側は、純粋にMAD-SSの搬送波をからMAD-SSの信号波を取り出すことのみを行う。(2)複数のMAD-SSの信号波を複数のMAD-SS復調器から信号を取り出す。そこで、以下の事を行った。MAD-SSは、直接拡散法式を用いたスペクトラム拡散通信方式(DS-SS)である。DS-SSの受信を行う際には、受信器側が持つM系列の信号と受信波で相関を取るために、たたみ込み積分を行い、信号の検証、データの取り出しを行う。2016年から、いくつかの企業からARM Cortex-M7Fが出荷され、組込マイコンにおいても不動小数点を扱うことが可能になった。そこで、Cortex-M7FでのMAD-SS受信器の構築を行った。具体的には、STマイクロエレクトロニクス社から発売されている、組込マイコンボードSTM32F769I Discovery Board上に、uClinux(EmCraft uCLinux)を導入し、その上でMAD-SS受信プログラムの構築を行った。GNU RADIOで構築したシステムからMAD-SSの音声信号を本誌ステムに取り込むためには、音声信号を取り込むためのプログラムを構築する必要がある。その部分に関しては、2017年に継続して行う。2. RaspberryPi3での受信プログラムの最適化RaspberryPiの性能が向上することによってsoftware radioのホストとして活用することが進んできた。よって、従来のPCベースではなく、Raspberry Pi +. software radioでMAD-SSを扱うことが見えてきた。そこで、RaspberryPi3でのMAD-SS受信の最適化を行うことで、システムの負荷をさげ、将来的にRaspberry Pi3での実現を目指す。

1.ソフトウェア無線の安定動作従来のハードウェア無線機と違い、受信器が安定して動作しない。理由を突き止める必要がある。2.微弱電波を評価するための実験環境構築の問題大学に設置されている電磁波シールドルームは、前任者が地磁気計測のためのアンテナを構築、評価するため構築した物である。よって、本研究で利用する周波数帯の電波を完全にシールドすることができない。そこで、シールドルームの電波シールドの改良およびシールドルームの評価を行い、本研究の性能評価に問題が発生しないようにする。1.GNU RADIOによる、MAD-SS通信の実現手法の調査:ソフトウェア無線の一手法であるGNU RADIOを用い、多重通信する手法の考察:ソフトウェアラジオでなぜうまくMAD-SSが動作しないのかを考察した。ソフトウェアラジオでは、復調する際に、バンドパスフィルタを通った後、A/D変換を行う。MAD-SSで、動作させる場合は、AD返還後のデータを復調するのに、MAD-SS帯域のバンドパスフィルタを通過した後、BPSK復調、MAD-SS復調を行う。しかし、複数チャンネルでの復調を同時並行するために、MAD-SSのバンドパスフィルタを通すための、データを保存しているメモリとバスの速度が間に合っていないのではないかと考察している。現在、このことを検証し、本手法の問題点を追求している。2.小型マイコンとの連携手法での解決:ソフトウェアラジオ1台でどうさせることが難しい場合、安価なマイコンボード(RaspberryPi)のソフトウエアラジオを並列して動作させ受信回路を設計した。1.の高性能なソフトウェアラジオを使うのに比べ、消費電力が下回れば、この手法でも実質的な問題はなくなる。3.本手法の応用例:本手法を活用した応用例について、平行して研究を行った。IoT機器との連携を行う際に、そのデータ送信をMAD-SSで行うことを考察した。特に、一番成果が上がったのが、ホテル、旅館での鍵の位置情報提示システムである。ホテル、旅館などの大きな施設内で、鍵の位置情報を知りたい場合が多々存在する。その鍵の位置情報を、電波を使って予測して、利用者に提示するシステムを構築した。本システムは、bluetoothで実装したが、鍵の本数が多くなると電波の衝突が起こりやすくなるために、微弱電波とMAD-SSに置き換えたいと考えている。提案手法では、無理があることが、判明してきた。(ハードウェアのボトルネックを解消できていない。)従来のGNU RADIOの装置を使うより、良い方法を探っている。FPGAを利用したGNU RADIO送受信装置を用いたMAD-SS送受信システムの確立を急ぐ。
父親の児童虐待予防を考慮した育児支援のための育児期夫婦に対する基礎的調査

研究代表者は、博士論文において妊娠期から産後の夫婦を対象とした縦断調査を実施し、量的データと質的データをもとに、父親の抑うつ症状は身体機能と育児不安に関連すること、さらに、心身の健康度が低いと父母ともに子に対して回避的な感情を抱く傾向にあることを明らかにした。育児期の夫婦を対象として、心身の健康度と育児を中心とした生活の要因との関連を明らかにし、父親虐待予防を考慮した育児支援の基礎的データを収集するために、質問紙調査およびインタビュー調査を実施する。夫婦の人間関係と育児は人類の普遍的な課題であり、国内外の知見をもとに調査を実施し、成果を発表する予定である。
システムに埋め込まれた意図の観察

二人の乳児(1歳3か月から4歳までと2歳3か月から4歳まで)の食事行為の発達を縦断的に観察した。観察は対象児の家庭での、一カ月で一回の食事をビデオで記録する方法で行った。記述した項目は、両親と乳児の距離、両親の発話、両親による乳児の食事の手や発話によるサポート、食材の種類と配置、乳児の両手の動き(相互の協調)、乳児自信の発話、乳児による食具の使用、乳児の手のマイクロな動きなどである。昨年の報告では一児(T)の食事行為の発達を縦断的に観察し、このような栄養学で言うところの「口内折衷」が、ほぼ4年間の時間をかけて成立することを明らかにした。一方、本年度分析した乳児(H)では、そのような転換は45カ月に至っても十分には成立していなかった。Tがどの時期でも一分あたりほぼ2回つまり30秒に一回の割合で食材を転換しているのに対して、Hではほぼ80秒に一回の割合でしか食材を転換していない。またTにはよく見られた次の食材を探索する手による微小行為がHには稀に観察されただけであった。この事実の背後にある「環境」が検討された、上述した事実に関連することとして両親による介入の方法(Tではほとんど介入がない。あっても言葉によるものが多い。Hでは手で食物を口に運ぶなどの介入が多い)、用意された食材の配置(T家では食材はめいめい配置され、Hでは大皿から両親が取り分ける)などが分析された。食事時の乳児の「意図の発生」が大きな意味での「環境の設計」と関連していることが示唆された。
篩管内高分子を基盤とする全身性シグナル伝達機構の研究

植物は篩管を介してmRNAやタンパク質などの高分子を長距離輸送し、それら高分子のもつ働きによって、離れた器官間で情報伝達を行い、周囲の環境に適応した個体発生を果たしている可能性がある。本研究では、この仮説にアプローチするため、長距離輸送されるmRNAの網羅同定を行った。同定には、モデル植物シロイヌナズナとタバコの異種間接木法と高速シークエンサーを利用し、138分子種の長距離移行性のmRNAを同定し、Plant Cell Physiology誌に公表した。輸送経路の可視化システムも構築し、今後輸送様式の時空間的理解へと繋げ、植物がどのようにして環境応答しているかを考察する。本研究は、この仮説にアプローチするため、長距離輸送される高分子の網羅同定と、輸送経路の可視化を実現することを目指す。平成25年度は、申請書で記した計画にのっとり、植物の長距離移行性高分子の網羅的同定を目的に、実験系の確率と同定を行った。mRNAの同定には、モデル植物シロイヌナズナとタバコの異種間接木法と高速シークエンサーを利用した。高速シークエンサーによる解析では、はじめに組織のサンプリング方法を最適化した。cDNAライブラリーの解析の際は、今回接木に用いた異種植物に由来するmRNAを区別するために、リード長を100塩基以上の長さとすると良いことが分かった。以上を踏まえて、100分子種を超える長距離移行性のmRNAを同定した。タンパク質の同定には、ウリ科植物の異種間接木法を利用し、質量分析機を用いて篩管液を対象に解析を行い、これまでに篩管中に存在することが示唆されている複数のタンパク質を同定することに成功した。いずれの場合も、接木法を適用したことで、長距離移行性高分子についてはじめて疑いない情報を網羅的に得ることができた。得られた結果は、植物における全身性の情報伝達に関する今後の研究の基盤情報となる。本研究では、この仮説にアプローチするため、長距離輸送されるmRNAの網羅同定を行い、輸送経路の可視化システムを構築した。まず、植物の長距離移行性高分子mRNAの網羅的同定のための実験系を確立した。同定には、モデル植物シロイヌナズナとタバコの異種間接木法と高速シークエンサーを利用し、138分子種の長距離移行性のmRNAを同定した。70分子種については、RT-PCR法により再現性を検討した。また、qPCR法およびデジタルPCR法により、微量標的の定量化も試みた。一部の移動性mRNAについては、遺伝的リソースを用いて接木実験を行い、その意義についても考察した。以上の結果を、Plant Cell Physiology誌に公表した(Notaguchi et al., 2015)。輸送経路の可視化システムについても構築が終了し、既に植物に導入済みである。これらのシステムは今後、候補シグナル高分子にフォーカスした研究へ適用してゆく予定である。植物長距離シグナル伝達平成25年度における研究目標は、植物の長距離移行性高分子の網羅解析法を確立し、同定することと、それら高分子の可視化システムを構築することであった。現在までに、移行性高分子、具体的にはmRNAとタンパク質について、それぞれ網羅同定を可能とする実験系を確率した。mRNAについては、モデル植物シロイヌナズナとタバコの異種間接木法を適用し、次世代シークエンサーによる解析の最適化を通して、長距離移行性のmRNAを網羅同定することに成功した。タンパク質については、ウリ科植物の異種間接木法を適用し、篩管液サンプルをMS解析することが有効であることを確認した。しかし、既知の代表的な篩管タンパク質の同定には成功したものの、網羅同定には多大な人的・物的コストが必要であることが判明し、本格的な解析には別に準備が必要と判断した。高分子の可視化システムについては、予定していたmRNA、タンパク質それぞれの可視化システムの構築が終了し、近く植物に形質導入する予定である。このように、平成25年度に計画していた一連の研究について、そのほとんどを達成することができた。

平成26年度は、1年目で用意した長距離移行性高分子の網羅同定の解析手順に従って、様々な環境要因ごとにプロファイルを得る。緊急性を要する課題を優先し、高温,乾燥,高塩など地球温暖化に伴う一連のストレスと、それに関連してストレス応答時に働く植物ホルモン・アブシジン酸の投与の影響について調べる。一方、土壌栄養が貧しい地域の農業苦難を鑑み、窒素やリンなどの主要栄養素について欠乏時の応答様式を調べ、将来の技術革新へ繋げる。長距離移行性高分子の可視化システムについては、1年目で作製したコンストラクトを植物に形質転換し、得られた形質転換体について胚軸接木法(Notaguchi et al., 2009)と顕微技術を併活用して解析する。構成的な発色条件で対象高分子の移行経路を検討し、くわえてFRAP蛍光回復法を用いてライブイメージング解析を行い、通過する組織ごとに対象高分子の移行速度を調べる。特に、1年目で同定したうちの一部の長距離移行性高分子に着目して解析を行い、長距離移行性高分子に関する生物学的な意義を問う。以上をモデル研究とし、1年目であるいは今後新たに同定される移行性高分子の円滑な解析を促進する。一部の物品について、見積額よりも実際の購入額が安かったため。次年度の物品費に含めて、有効に使用します。
流雪溝の設計方法

1、北海道から北陸に至る7市2町をモデル都市として選定し,現行流雪溝の運用状況と問題点を整理した。青森県内の各市町村の流雪溝諸元(流量,水路勾配,幅,急変箇所数,運用状況)調査を実施し、現行流雪溝の特性を抽出した。この結果、利用条件が気象、水理,地形,街区都市化進行状況でまとめられることが明らかとなり,流雪溝の設計条件の分類をした。2、水路屈折部の雪塊流動現象および停滞・閉塞現象を室内実験で観測し,水路屈曲部における雪塊流動機構を検討した。これにより、屈折部を有する流雪溝の送雪能力推定式を提案した。3、雪水二相流管内流動の観測を室内実験により行った。その結果、以下の点が明らかとなった。(1)乱流による圧力変動は低速域では清水の圧力変動とほぼ同じであり,高速域では清水の圧力変動よりも小さくなる。(2)雪塊の代わりにポリスチレン粒子(比重0.97,1.04)を用いての流動観測により,低速域では上層に浮遊集積層、下層に、沈降集積層ができるためにエネルギ-損失は清水時よりも大きく,高速域では固体粒子が断面全体に広がるために清水時のエネルギ損失とほぼ同一となる。また、この観則により、管内混相流の固体粒子速度の分布形が解明された。4、排雪限界と流雪溝の設計条件に関する検討の結果,街区の条件によっては、水路の高さが排雪限界量を決めてしまう場合があり,この点の設計条件を明確にする必要があることがわかった。本研究の目的達成には、今後,(1)曲部・断面変化部の流雪能力の推定式およびその実験的検討,(2)雪水混相の乱流抵抗則,(3)直線部排雪限界と必要最低水深および雪塊投雪時の抵抗則を明らかにする必要がある。
肺線維症における新規サーファクタントSCGB3A2の抗線維化作用機序の解明

ブレオマイシン(BLM)誘導性肺線維症モデルを用いて、SCGB3A2が肺線維症を改善することを明らかにし、その作用機序の解明を試みた。マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングによりSCGB3A2がプロコラーゲン遺伝子群の発現を抑制することを明らかにした。このとき、サイトカインシグナル遺伝子発現が亢進することも明らかになった。本研究助成を受け、平成19年度は、主に肺線維症での発現遺伝子プロファイリングを行った。BLM投与後3週目に肺組織からのtotal RNAを採取してマイクロアレイを行った。すなわち、BLM投与2週から3週目までPBSもしくはSCGB3A2を投与したマウス肺における遺伝子発現をマイクロアレイにて検索した。その結果、BLM投与肺では、プロコラーゲン遺伝子群の顕著な発現増加が見られ、SCGB3A2投与によってそれらは抑制されていた。この結果は既に組織化学的解析によって得られているSCGB3A2がBLM誘導性肺線維症を改善する現象と一致する。また、SCGB3A2投与によってサイトカイン遺伝子群の遺伝子発現が認められた。この結果は、我々が報告したSCGB3A2が肺組織において抗炎症作用を持つことを裏付けた(Am J Respir Crit Care Med. 2006 173(9):958-964.)。加えて、肺組織の線維化は細胞の損傷をきっかけに炎症を経過して発症されることから、SCGB3A2が肺組織の線維化抑制に効果を持つことを示唆した。さらに、マイクロアレイの解析からSCGB3A2によって有意に高発現した遺伝子として肺上皮細胞マーカー遺伝子が認められた。私は、SCGB3A2の受容体は肺上皮細胞ではなく、間充織細胞に存在する可能性が高いという結果を得ていることから、この結果に対し、SCGB3A2による直接的な制御作用によるものか、現象にすぎないのかという疑問が残る。そこで、SCGB3A2の作用部位が肺上皮マーカー遺伝子上流域に存在するか否かを検討していく。また、SCGB3A2によって代謝経路を制御する遺伝子群に変動がみられており、SCGB3A2による遺伝子発現変動からPathway解析を行っているところである。今後、マイクロアレイ解析における遺伝子抽出条件を変更し、再抽出することも試みたい。線維症患者数は世界規模で年々増加し、深刻な問題になっている。また、癌治療のための放射線照射や抗癌剤として使用されるブレオマイシン(BLM)の副作用として肺組織の線維化が認められるが、決定的な治療薬は存在しない。線維症は、細胞の損傷をきっかけとして、炎症、コラーゲン・マトリックス沈着を経過して発症する。本研究で注目するSCGB3A2は、抗炎症作用および増殖作用を持つため、線維化を抑制する可能性が考えられた。そこで、BLM誘導性肺線維症モデルマウスを用いてSCGB3A2の効果を検討し、SCGB3A2が肺線維症を改善することを明らかにした。特に、SCGB3A2の抗線維化における作用機序の解明を目指し、マイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを中心に行った。続いて、遺伝子プロファイリングの結果を受け、SCGB3A2下流因子の特定と肺線維症におけるSCGB3A2の作用機序を決定していくことに重点を置いた。プロファイリングの結果、SCGB3A2の刺激によって、プロコラーゲン遺伝子発現が顕著に抑制される他、アデニル酸シクラーゼ遺伝子群とその下流に位置するexchange protein for Rapl directly activated by cAMP (EPAC1)遺伝子発現の亢進が明らかになった。プロファイリングの結果を証明するために、先行実験として成獣肺より単離した線維芽細胞をSCGB3A2で刺激した時のmRNAおよびタンパク質に対し、定量PCRおよびウエスタンブロットによって検討し、プロファイリングが正しいことが決定されてきている。