hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破裂性脳動脈瘤患者に於ける脳血管攣縮とエンドセリン遺伝子に関する研究

昨年度申請した脳血管攣縮におけるエンドセリン遺伝子診断の研究を始めるにあたりもう一度基本に立ち返り、spasmogenとしていかなる物質が候補として上げられるかウサギ脳底動脈を用いて下記の血管作働性物質について等尺性張力測定を行い、また同時に血管収縮反応に及ぼす内皮の影響について検討を行った。研究方法標本はオスの家兎脳幹部より剔出した脳底動脈から作成したリング標本を用い、内皮正常標本と内皮障害標本を2種類-Triton-X-100(以後TX-100と略す)処理標本とL-N^ω-nitro-arginine(以後NNAと略す)処理標本-の計3種類を作成した。TX-100処理標本は内皮機能は全般的に障害されていると考えられ、一方NNA処理標本は内皮のEDR下(NO)の産生のみが障害されているものと考えられる。脳血管攣縮の原因物質の候補と言われているhistamine, noradrenaline,及びserotoninに対する各々の標本の収縮反応を等尺性に測定し、比較検討を行った。実験結果1)histamine: 1μM以下では内皮障害標本は内皮正常標本よりも大きな収縮がみられたが10μM以上の最大収縮では各標本間で差はなく、いずれもK収縮の130-140%の収縮を示した。2) noradrenaline:最大収縮では内皮正常標本の収縮が16%K収縮であるのに対して内皮障害標本では50%K収縮と約3倍の収縮を示した。しかし血管平滑筋に対するefficacyの差を考慮すると内皮の収縮に及ぼす影響はhistamineの場合とほぼ同等で比較的小さいといえた。3) serotonin:内皮正常標本の最大収縮は僅か13%K収縮だがTX-100処理標本での最大収縮はその6倍、NNA処理標本では8倍の収縮を示した。またNNA処理標本の収縮の方がTX-100処理標本の場合より1%以下の危険率で有意に大きな収縮を示し、この差はEDCFの放出を示唆していると考えられた。結論1)血管内皮が血管収縮物質の収縮反応に及ぼす影響は収縮物質によって異なり、このことから間接所見ではあるが血管内皮による血管作働性物質の収縮減弱作用にはEDRFの基礎分泌のみならずagonist-stimulated releaseも考えられた。2)従来serotonin収縮は内皮障害により2-3倍に増強するといわれてきたが今回の結果は6-8倍であり、従ってクモ膜下出血後遅発性脳血管攣縮における内皮障害の果たす役割は今まで云われていた以上に重要である可能性が示唆された。今後の展望今後さらにendothelinについても同様の実験を行い、遺伝子診断に発展させていく予定である。
高齢者のビタミンC欠乏がアルコール嗜好・依存性と認知機能に及ぼす影響

アルコールに対する好みはヒトの場合もげっ歯類も遺伝的に異なることが知られている。アルコール嗜好に関する研究でよく使われるマウスはアルコールを好みよく飲むとされているC57BL6Jマウスである。本研究では、ヒトと同様にアルコール嗜好性のばらつきが大きい(もしくは嫌悪性を示す)とされているC57BL6Nマウスを用い、吸収による影響を含む長時間にわたるアルコール嗜好性を二瓶選択法により観察し、post-ingeston効果を排除した短時間スケールでのアルコール嗜好性をリッキング行動観察により判定した。6ヶ月齢のC57BL6N雄マウスにエタノール溶液及び水の二瓶を慢性的に自由摂取させ、1週間毎にエタノール濃度を上げるEthanol Ramp法を用い、週毎のエタノール嗜好性(二瓶選択率)を測定したところ、2090%と大きなばらつきを示した。吸収後の生理的影響を受けない2分間におけるリッキング(舐める回数)を測定したところ、水だけを慢性的に飲んだ対照群に比べ、エタノール慢性摂取群はエタノールのリッキング数が多かった。数日数週間にわたるアルコール嗜好性は吸収・分解・代謝の影響を受けるため個体差が生じやすいが、摂取した瞬間から数分間におけるアルコール嗜好性はその味に対する親しみ(慣れ)と好き嫌いに直結することが示唆された。断酒後に生じる衝動的嗜好性を判定する上でもリッキング行動観察は有効と思われる。マイクロダイアリシスにより脳内報酬系ドーパミン放出を観察したところ、アルコール嗜好が高かった個体のドーパミン放出量が低く耐性形成が示唆された。ビタミンC生合成不全マウス(SMP30/GNLノックアウトマウス)雄10週齢及び16週齢を用いたところ、ビタミンCを欠乏するとアルコール嗜好(二瓶選択率)が亢進する可能性が示唆された。当研究課題を中断するため高年期の検討は実施できなかった。日本人の食事摂取基準2015年版(厚生労働省)では高齢者の低栄養・栄養失調に初めて警鐘を鳴らし、65才以上の15-20%はビタミンC欠乏といわれている。従来、加齢やアルコール摂取によって体内ビタミンCレベルが低下すると一般的に指摘されている。しかし、ビタミンC欠乏によってアルコール嗜好またはアルコール依存が助長されるか否かはわかっていない。本研究では、疾患プロセスの原因としてビタミンC欠乏を位置づけた視点から、ビタミンC欠乏がアルコール嗜好・依存性をもたらす可能性を追究することを目的とした。ヒトと同様にビタミンCを体内で生合成できない遺伝子組み換えマウス(SMP30/GNLノックアウトマウス)を用いて、思春期後期に当たる10週齢および若年期に当たる16週齢のタイミングにおけるアルコール嗜好を観察したところ、ビタミンC欠乏時に雄マウスの約半数において明らかにアルコール嗜好が亢進した。そこで、アルコールに対する欲求を調節している脳内報酬系と呼ばれる脳領域のドーパミン神経に着目し、自由行動下のマウスから脳透析液を持続回収できるマイクロダイアリシス法を駆使して細胞外ドーパミン放出量を測定する実験系を構築した。週齢の低いSMP30/GNLノックアウトマウスでの検討を先におこない、次に野生型マウスでの検討を遂行した。マウスは辛口のアルコールに対しては嗜好性が低く摂取量がばらついたが、甘みのあるアルコールを好んで摂取したため、今後の実験でも甘みを付けたアルコールを用いる予定でいる。マイクロダイアリシス実験でマウスにアルコールを飲ませることを試みたが、特殊な実験環境におかれた影響から警戒する個体が多く出現した。ドーパミン神経放出からアルコールに対する過敏性(耐性・逆耐性)をみるために、アルコール摂取量を均一にそろえることは困難であると判断し、均一濃度のアルコールを腹腔注射する方法を用いることにした。

現在、若年期後期に当たる6か月齢の野生型マウスとSMP30/GNLノックアウトマウスを共同研究先(東京都健康長寿医療センター研究所老化制御研究チーム)に於いて用意している。今年度の春夏にビタミンCを生合成できる野生型マウスを飼育し、アルコール常飲群と非摂取群に分ける。より週齢を上げたマウス(12か月齢)を検討するため、共同研究先(上述)にマウス作出を依頼すしている。翌年度、ビタミンCを生合成できないSMP30/GNLノックアウトマウスを用いる検討を予定している。上記2群に加えて、ビタミンC充足群とビタミンC不足群に分ける。アルコール嗜好ならびに脳内報酬系ドーパミン神経放出の違いを検討し、加齢と体内ビタミンC状態による影響を調べる。
新規キレーション制御クライゼン転位反応を基軸とする天然物合成

高度に官能基化された複雑な生理活性天然物を立体選択的に合成するには様々な立体制御法を開発することが必要である。申請者らは昆虫摂食阻害物質アザジラクチンの合成の際、新規なキレーション制御法によるクライゼン転位反応にて望む生成物を選択的に与えることを見出した。これはルイス酸性を有するシリル基が遠隔位のカルボニル酸素とのキレーションすることが原因であると推測されたが、このような反応はこれまで例のない新規な反応であった。そこで、本研究では、本遠隔キレーション制御反応の応用として天然物クルチオリドの合成研究を行った。クルチオリドはトウダイグサ科の植物より単離されたジテルペン化合物であり、非インスリン依存性低血糖活性を有するサウジンと類似の構造を有することから、その生理活性にも興味が持たれている。本化合物の骨格も同様にラクトンカルボニルとの遠隔キレーション制御クライゼン転位反応により構築できると考えられる。前駆体であるエステルは分子内Diels-Alder反応により合成した。このエステルの転位反応を検討したところ、遠隔キレーション制御でクライゼン転位反応が進行し、55%で望む転位生成物が得られた。一方、α-ブロモエステルを用いるクライゼン転位反応は、Reformatsky-Claisen転位反応として知られているが、これまでにあまり応用されてこなかった。In, TMSCl, Et_3Nの存在下で転位反応を行うと、四級炭素を有する望む転位生成物が得られることを見出した。本反応は強塩基を使用しなくても良いという特徴を有する。13族のInは酸素原子と容易にキレーションすることが知られており、新たなキレーション制御反応に応用できる可能性を有している。本Reformatsky-Claisen転位反応の展開は今後の課題である。最近、申請者らは昆虫摂食阻害物質アザジラクチンの合成の際、新規なキレーション制御法によるクライゼン転位反応で望む生成物を選択的に与えることを見出した。すなわち、シリルケテンアセタール形成の際、LHMDS,Me_2SiCl_2を用いると遠隔位のカルボニル基とキレーションするため、シリルケテンアセタールの幾何異性が制御され、望みの転位生成物を生じた。遠隔カルボニルキレーション制御の反応はほとんど知られておらず、新規な立体制御法として大きな可能性を秘めている。本研究では、遠隔カルボニルキレーション制御反応の更なる検討を目的とし、天然物合成へ応用を行った。クルチオリドはトウダイグサ科の植物より単離されたジテルペン化合物である。非インスリン依存性低血糖活性を有するサウジンと類似の構造を有することから、その生理活性にも興味が持たれている。今回、クルチオリドを右部位と左部位に分割し、両者を本クライゼン転位反応で結合する合成戦略を計画した。実際、左部位は分子内Diels-Alder反応により短工程で容易に得ることができた。すなわち、無水マレイン酸とジエノールをエステル化し、生じた化合物を加熱することで、望む左部位トランスデカリン体を合成した。さらにこの化合物をアリルアルコールによりエステル化し、クライゼン転位反応の前駆体を得ることができた。これを塩基存在化でシリル化を行った後、加熱すると、クライゼン転位反応が進行し、望む立体化学を有する化合物を主生成物として与えた。本転位生成物からクルチオライドへの変換および本反応が遠隔キレーションで制御されているかについては来年度の課題である。

高度に官能基化された複雑な生理活性天然物を立体選択的に合成するには様々な立体制御法を開発することが必要である。申請者らは昆虫摂食阻害物質アザジラクチンの合成の際、新規なキレーション制御法によるクライゼン転位反応にて望む生成物を選択的に与えることを見出した。これはルイス酸性を有するシリル基が遠隔位のカルボニル酸素とのキレーションすることが原因であると推測されたが、このような反応はこれまで例のない新規な反応であった。そこで、本研究では、本遠隔キレーション制御反応の応用として天然物クルチオリドの合成研究を行った。クルチオリドはトウダイグサ科の植物より単離されたジテルペン化合物であり、非インスリン依存性低血糖活性を有するサウジンと類似の構造を有することから、その生理活性にも興味が持たれている。本化合物の骨格も同様にラクトンカルボニルとの遠隔キレーション制御クライゼン転位反応により構築できると考えられる。前駆体であるエステルは分子内Diels-Alder反応により合成した。このエステルの転位反応を検討したところ、遠隔キレーション制御でクライゼン転位反応が進行し、55%で望む転位生成物が得られた。一方、α-ブロモエステルを用いるクライゼン転位反応は、Reforrnatsky-Claisen転位反応として知られているが、これまでにあまり応用されてこなかった。In, TMSCl, Et_3Nの存在下で転位反応を行うと、四級炭素を有する望む転位生成物が得られることを見出した。本反応は強塩基を使用しなくても良いという特徴を有する。13族のInは酸素原子と容易にキレーションすることが知られており、新たなキレーション制御反応に応用できる可能性を有している。本Reformatsky-Claisen転位反応の展開は今後の課題である。
金属系過冷却液体の粘性の本質的解明

(1)金属-金属系のLa_<55>Al_<25>Ni_<20>とZr_<65>Al_<10>Ni_<10>Cu_<15>,金属-半金属系のPd_<40>Ni_<40>P_<20>とPt_<60>Ni_5P_<25>の過冷却液体の粘性の温度と歪速度依存性の構成式を求めることができた。粘性の歪速度依存性における拡張指数係数βを比較すると、金属系過冷却液体は0.820.9であり、高分子などに比べて低いことがわかった。このことから金属系過冷却液体は高分子などに比べて構造の均一性が高い液体であることがわかった。(2)金属系過冷却液体のフラジリテイーは、金属-半金属系のPd_<40>Ni_<40>P_<20>で54,Pt_<60>Ni_5P_<25>で46,金属-金属系のLa_<55>Al_<25>Ni_<20>で35,Zr_<65>Al_<10>Ni_<10>Cu_<15>で30であった。金属-半金属系過冷却液体の方が、金属-金属系過冷却液体に比べてフラジャイルな液体であることがわかった。金属系過冷却液体のフラジリテイーは、ストロングな液体であるSiO_2とフラジャイルな液体である高分子(o-terphenyl)との中間に位置することがわかった。また、金属系過冷却液体のフラジリテイーはGe_<10>As_<10>Se_<80>やNaO-2SiO_2やB_2O_3に近いフラジリテイーを持つことがわかった。(3)平衡粘性、すなわちニュートン粘性の温度依存性は、ガラス遷移温度近傍あるいは融点近傍の片方に対して有名なVogel-Fulcher-Tammannの式で記述できるが、ガラス遷移温度近傍から融点に至る広い温度範囲の記述はVogel-Fulcher-Tammannの式では不可能であり、自由体積モデルから求めたCohen-Grestの式で上手く記述できることが分かった。(1)これまで、Zr-Al-Ni-Cu合金とLA-Al-Ni合金の金属-金属系過冷却液体、ならびにPd-Ni-P合金の金属-半金属系過冷却液体の粘性を調査してきたが、金属過冷却液体の特徴を明らかにすることを目的に、金属-半金属系のPt_<60>Ni_<15>P_<25>過冷却液体の粘性を、等歪速度引張試験、等温クリープ試験、等速加熱定加重圧縮試験により調査した。その結果、Pt_<60>Ni_<15>P_<25>過冷却液体の粘性の温度と歪速度依存性を明らかにする共に、粘性の構成式を求めることができた。また、過冷却液体の平衡粘性を10^510^<14>Pasという広い範囲に渡って求めることができた。さらに、拡張指数係数βが0.9であり、Pt_<60>Ni_<15>P_<25>過冷却液体は、高分子などに比べて構造の均一性が高い液体であることが分かった。

また、平衡粘性の温度依存性を調査した結果、Pt_<60>Ni_<15>P_<25>過冷却液体のフラジリティーインデックスmの値は50であり、金属-半金属系のPd_<40>Ni_<40>P_<20>過冷却液体の46と近い値を示し、金属-金属系過冷却液体に比べてフラジャイルな液体であることが明らかになった。(2)金属過冷却液体のヤング率の温度依存性を調査することを目的に、Zr_<55>Al_<10>Ni_5Cu_<30>金属ガラスのヤング率を超音波伝搬法を用いて室温から結晶化温度まで調査した。その結果、ヤング率は温度の上昇に伴う変化率は、ガラス遷移温度以下のガラス固体状態では-14MPa/Kと小さいが、ガラス遷移温度以上の過冷却液体状態では-89MPa/Kと大きくなることが明らかになった。また、結晶化によって、ヤング率が約1.5倍に増加することも分かった。(3)金属過冷却液体のニュートン粘性変形と非ニュートン粘性の構造の違いを明らかにする目的で、Pd_<40>Ni_<40>P_<20>バルク金属ガラスを用いて、過冷却液体状態において非ニュートン粘性領域で変形させた試料と、それを熱処理により充分構造緩和させた試料の構造解析を中性子非弾性散乱法と中性子小角散乱法を用いて行った。中性子非弾性散乱実験の結果、両者にわずかながら構造の差が出ていることが分かった。また、中性子小角散乱実験の結果、両試料に差は認められなかったが、一般のガラスにはない小角散乱があることが分かった。(1)Pd_<40>Ni_<40>P_<20>金属ガラスの過冷却液体の応力緩和時間を調査した結果、ガラス遷移温度から融点に至る緩和時間を求めることができた。過冷却液体の粘性の温度依存性と緩和時間が比例することから、Pd_<40>Ni_<40>P_<20>金属ガラスの過冷却液体の応力緩和時間は、ガラス遷移温度では約400s、結晶化温度では10^<-3>s、共晶温度では10^<-9>sであることが分かった。(2)これまで薄帯の引張試験によって調査してきたPd_<40>Ni_<40>P_<20>金属ガラスの過冷却液体の粘性を、バルク材の圧縮試験によって調査した結果、薄帯の引張試験によって得られた結果とほぼ同じ結果が得られることが分かった。(3)Pd_<40>Ni_<40>P_<20>金属ガラスに対して3.3x10^<-5>?2x10^3s^<-1>という広い歪み速度における圧縮ならびに引張変形特性を調査した。その結果、圧縮試験下では荷重方向に対して42度の面で破断が生じ、引張試験下では荷重方向に対して56度の面で破断が生じた。破断応力と破断歪みは、歪み速度の増加に伴い減少したが、2x10^3s^<-1>という高速変形でも1.4GPaの高強度を示した。(4)金属ガラスの過冷却液体の高速超塑性に着目して、Pd基およびZr基金属ガラスの摩擦接合を試みた結果、結晶化させることなく強固に接合することに成功した。また、ガラス遷移温度差が約50K以下の金属ガラス同士でも、結晶化させることなく強固に接合できることが分かった。これによって、過冷却液体の粘性差が3桁以内なら、両方の金属ガラスが接合界面で変形して接合できることが分かった。さらに、金属ガラスの摩擦接合では、過冷却液体状態における粘性の温度依存性が極めて大きいために、接合界面において温度の自己制御が働いていることが分かった。平衡粘性の温度依存性は、ガラス遷移温度近傍あるいは融点近傍の片方に対してVogel-Fulcher-Tanmannの式で記述できるが、ガラス遷移温度近傍から融点に至る広い温度範囲の記述はVogel-Fulcher-Tanmannの式では不可能であり、自由体積モデルから求めたCohen-Grestの式で上手く記述できることが分かった。過冷却液体の粘性の温度ならびに歪速度依存性を等クロスヘッド速度引っ張り試験により調査した。
ワイドギャップ銅カルコパイライトの気相エピタキシャル成長

既存の装置を改善することにより作製した金属塩化物原料と硫化水素の交互供給が可能な気相エピタキシャル装置を用いて、二硫化銅ガリウム(CuGaS_2)の原子層エピタキシャル成長(ALE)を目指した実験を行い、得られた層の特性測定から次の様な事柄が明かとなった。1.基板のエッチングを防ぎ均一な成長層を得るためにはGaAs基板は510°C以下、GaP基板は590°C以下の基板温度にすることが必要である。2.a軸およびc軸の2軸配向の可能性のあるCuGaS_2のエピタキシャル成長で、GaAs基板に対しCuCl/GaCl_3の供給比を最適化するとC軸配向の単結晶成長が可能と思われる結果を得た。3.GaP基板上への金属原料および硫化水素の繰り返し交互供給で、H_2S供給量に対し単位サイクル当りの成長層厚が一定と見なされる成長-ALE成長-を得た。更に、金属原料の量や基板温度についてもALE条件を充すかどうか調べてみる必要がある。4.3.の結果は二つの金属原料を同時に供給してもCu原子およびGa原子がカルコパイライト構造をとるように自己選択的な配列を生じていることを示していると考えられる。5.繰り返し交互供給で、H_2S供給時間と共に配向性が向上しc軸配向を示す結果を得た。CuとGa原子の成長中の再配列の可能性を示しており、カルコパイライト構造ALE特有の現象の可能性もある。6.3.で述べたALE成長層と見られる層は一様で、また低温で自由励起子が支配的なフォトルミネッセンススペクトルを示し光学的に良質と見なされる。以上のようにALE成長達成の可能性が高く、同一構造化合物の化学量論組成比を含む特性制御につながる基礎的成果を得たと考えている。本年度はまず金属塩化物(CuCl、GaCl_3)と硫化水素を原料とし,各原料を同時叉は交互に供給でき原子層エピタキシャル成長にも適用できるエピタキシャル成長装置を既存の装置の改造により作製した。この装置を用い,1.まず通勤のエピタキシャル成長(同時供給)で一様で良質な成長層の作製条件、2.交互供給での原料供給条件の決定とエピタキシャル成長の試み、3.X線回折による成長層の結晶性に関する検討とEPMAによる分折、4.1.および2.で得た成長層のフォトルミネッセンス(PL)の測定とストイキオメトリ制御に関する検討、を行った。1.については従来問題だった基板のエッチングを基板温度を十分に下げて薄い第一層を得、その後十分な成長速度の得られる高温で成長を行う2段階成長法が一様な成長層を得るのに極めて有効なことが分かった。2.についての実験例は少ないが、目下のところ原子層的成長は生じていないようで、成長層厚が厚いこと、1.で明かになった条件を踏まえてもエッチングが生じていること、またCuGaS_2層以外にCu_xSも存在していると見なされる結果が得られている。これらについては今後原料の分離、基板温度、薄いCuCaS_2層を持つ基板上への成長などを試み問題を明らかにする。3.1.で得られた2段階成長層はEPMA的にはストイキオメトリに近いが、X線的には第1層の配向性と第2層の配向性に変化が認められる場合があるなど今後検討を要する問題もある。4.についても従来の成長層と1.で得た成長層を比較し3.の分折との対応からも銅空孔がPLスペクトルと抵抗率を支配していると考えられる結果を得た。

更にAr^+レ-ザ励起下で吸収端近傍に何本かの共鳴的なラマン線が生じることや、自由励起子発光のエネルギ-が明確になった。昨年度に既存の装置を改良することにより作製した金属塩化物原料と硫化水素を交互に供給することの出来る気相エピタキシャル成長装置を用い、本年度は特に原子層エピタキシャル成長(ALE)条件を明らかにすることを目指し次のような結果を得た。1.GaAs基板については、基板のエッチングを防ぎ一様な二硫化銅ガリウム(CuGaS_2)の成長層を得るには510°C以下の基板温度が必要。2.GaP基板上への金属塩化物(CuCl、GaCl_3)と硫化水素の繰り返し交互供給を行い、硫化水素供給量に対し単位繰り返し当りの成長層厚がほゞ一定の見なされるCuGaS_2のALE成長を示唆する結果を得た。これは金属原料二種類を同時に供給してもCuとGa原子が自己選択的にカルコパイライト構造をとるよう配列することを示していると思われる。3.2.の際、硫化水素の供給時間の増加と共に配向性が向上しC軸配向を示す結果を得たが、これはCuとGa原子の再配列の可能性を示している。今後さらに金属原料供給量や基板温度に対しALE条件を示すかどうかを調べる必要がある。4.上記のALE成長と思われる成長層は低温で自由励起子発光が支配的で、光学的に良質なものと思われる。5.同時供給成長層を含むGaPおよびGaAs基板上のCuGaS_2成長層は低温でバルク結晶と共通の束縛励起子発光を示し、真性欠陥の関与が示唆される。また二種類の基板に共通でバルク結晶には見られない束縛励起子発光も存在する。これは不純物を含み本成長方法に直接関係したものと思われる。以上のような結果は、今後ALE成長層の化学量論組成比およびALE条件よりずれた成長層の化学量論組成比を調べるなど、今後の展開につなげる必要があると考えられる。
メタロチオネインの遺伝子発現に着目した悪性腫瘍の早期画像診断薬と治療薬の開発

悪性腫瘍に関しては、その早期における検出と治療が必要とされているが、早期検出のための放射性画像診断薬剤(イメージング剤)に満足すべきものがなく、早期適用抗癌剤とともにその開発がまたれている。本研究は、亜鉛(Zn)等の必須微量金属の恒常性維持に関与するとともに、細胞増殖に必須と考えられているメタロチオネイン(MT)の遺伝子発現に着目した新しい悪性腫瘍診断薬および治療薬の開発を検討した。すでにこれまでの研究によって、ラット、マウスにおいて、癌の発生・増殖時に肝臓においてZn-MTがその初期から特異的に増加することを見い出しており、本研究では、新たな診断薬の開発に資するために、まずその特徴と機構を検討した。その結果、癌の場合には炎症、拘束ストレス等の場合と異なってZnの肝への蓄積が最初に起こって持続的にMTを誘導するとの特徴がみられた。したがって、Znを核医学的に追跡することによって初期癌の診断が可能であることを示唆した。一方、Zn-MTは癌細胞の増殖にも必要であり、MTの遺伝子発現においてmRNAへの転写を阻害するMT-アンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)が細胞レベルで癌細胞の増殖を特異的かつ用量依存的に抑制することを明らかにし、MT発現の抑制という新しい方法による早期癌の治療が可能であることを示した。現在、MTに関してさらに診断・治療の両面から検討を加えているが、これは、これまでにない新しいアプローチである。
シンク能の向上を目指したアブラナ篩管でのRNAを介した情報伝達機構の解明

本年度は植物の成育に必要な元素の中でも多量必須元素の一つである窒素に着目し、窒素栄養条件を変えて生育したアブラナを材料に用い実験を行った。窒素栄養条件は篩管液採取前5日間、以下に示す条件に変え、植物体に処理を施した。1)水耕液中の窒素含量を標準区の5倍にしたもの2)水耕液中から窒素を除いたもの3)水耕液中のアンモニアと硝酸のモル比を標準区と逆にしたものこれらの処理を行った植物(アブラナ)より篩管液を切断法により採取した。今回行った各処理はアブラナ篩管液の滲出速度には影響を及ぼさないことを確認した。まず、これらの窒素栄養条件が篩管内を移行する窒素化合物に及ぼす影響を調べるため、篩管液中の硝酸濃度、アンモニア濃度、アミノ酸濃度を調べた。硝酸濃度は水耕液中の硝酸濃度に応答して、その量が増減をした。一方、アンモニアは窒素過剰条件および窒素欠乏条件でその濃度が減少しており、硝酸とは異なる応答をしていた。篩管液中のアミノ酸濃度には有意な変化は見られず、そのモル濃度(約200mM)から推察すると篩管内を転流する窒素化合物の総量には窒素栄養条件の影響が及んでいないことが確認できた。また、タンパク質のおいてもその濃度には有意な差は見られず、その組成に関してもSDS-PAGEによる解析では明確な差はなかった。アブラナ篩管液RNAの解析では、今回行ったポリアクリルアミド電気泳動で検出することができたバンドのパターンには明確な差はなかった。今後、篩管液RNAにわけて実験を進めていく必要があると思われる。研究成果の発表本年度に見られた研究成果は平成18年8月22日に日本土壌肥料学会東北支部会にて発表を行った。演題窒素栄養条件がアブラナ篩管液の組成に及ぼす影響アブラナ節管におけるRNAを介した情報伝達系の存在を検証するための端緒として、本年度はアブラナ筋管内に存在するRNAの検出を篩管内を転流する液(筋管液)を用いることにより行った。アブラナからの篩管液の採取は春化処理(連続光、4°C、4週間)を行い、花芽を誘導した植物体の蕾の下部を切断するインサイジョン法(切断法)により行った。また採取した筋管液は分析を行うまで-20°Cで凍結保存した。アブラナ節管液中には糖、アミノ酸、タンパク質など様々な物質が存在している。そこでクロロホルム-フェノール法がベースとなるRNA精製キットEASYPrep RNA(Takara, Shiga, Japan)を用い、アブラナ篩管液よりRNAの抽出を行った。20μLの篩管液を用いて抽出したRNAの260nmの吸光度の測定から篩管液中のRNA濃度を計算すると、その濃度は約16.8μg/mLであった。この値はこれまでに検出されているカボチャやイネの篩管液中に存在するRNA濃度とほぼ同じレベルであった。分析に必要な篩管液量(20μL)を採取するには30分程度の時間を要する。RNAは非常に不安定な物質であることからサンプリング中に分解し、損失している可能性が考えられた。そこでサンプリング時にRNAの安定化剤であるRNAlater^<TM>を使用したところRNAの分解が40%以上抑制されることが確認できた。この確認後はRNA実験用の篩管液のサンプリングにはこのRNAlater^<TM>を必ず用いることとした。ポリアクリルアミドゲル(濃度10%)を用いて、前記の方法で抽出した篩管液RNAをグリオキサールによる変成後、150V定電圧で電気泳動し、銀染色法により、ゲル上のRNAの検出を行った。その結果、100ベース付近及び400ベース付近にスメアなシグナルを検出することができた。前年度の実験結果によりアブラナ篩管液中にRNAを検出することができた。そこで本年度はアブラナ篩管においてRNAを介した情報伝達が存在することの検証を目指し、様々な生育条件がアブラナ篩管液RNAの組成に変化を及ぼす影響について調べた。まずはアブラナ篩管液の採取を通常とは異なる生育条件で栽培した植物体を用いて試みた。5°Cといった低温処理や、40°C程の高温処理など温度条件を変えた植物体からは篩管液を採取することはできなかった。一方、植物にとっての多量必須元素である窒素や硫黄に関して、欠乏状態にした植物体からは標準の生育条件で育てた植物体からと同様に篩管液を採取することができた。また、微量元素である銅や亜鉛を高濃度で処理した植物体や有害な重金属であるニッケルで処理した植物体からも篩管液の採取は可能であった。これらの様々な生育条件により栽培した植物体から採取したアブラナ篩管液からEASYPrep RNA(Takara, Shiga, Japan)を用いて、RNAの抽出を行った。各条件で栽培した植物から採取した篩管液は抽出操作を行うまではRNA保存溶液であるRNAlater中で-20°Cで保存した。尚、一処理区あたり20μLの篩管液をRNAの抽出に用いた。精製後のRNAは10%ポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動により分離し、銀染色によって検出を行った。

得られたバンドは全般にスメアになり、明確なバンドという形で泳動パターンの比較を行うことはできなかった。しかし、硫黄欠乏処理、窒素欠乏処理した植物体から採取した篩管液RNAの泳動パターンは、スメアなシグナルが得られた箇所が標準の生育条件で栽培した植物体の篩管液から得られるものと異なっていた。これらの結果は植物体の栄養条件がアブラナ篩管液の組成に影響を及ぼしている可能性を示している。本年度は植物の成育に必要な元素の中でも多量必須元素の一つである窒素に着目し、窒素栄養条件を変えて生育したアブラナを材料に用い実験を行った。窒素栄養条件は篩管液採取前5日間、以下に示す条件に変え、植物体に処理を施した。1)水耕液中の窒素含量を標準区の5倍にしたもの2)水耕液中から窒素を除いたもの3)水耕液中のアンモニアと硝酸のモル比を標準区と逆にしたものこれらの処理を行った植物(アブラナ)より篩管液を切断法により採取した。今回行った各処理はアブラナ篩管液の滲出速度には影響を及ぼさないことを確認した。まず、これらの窒素栄養条件が篩管内を移行する窒素化合物に及ぼす影響を調べるため、篩管液中の硝酸濃度、アンモニア濃度、アミノ酸濃度を調べた。硝酸濃度は水耕液中の硝酸濃度に応答して、その量が増減をした。一方、アンモニアは窒素過剰条件および窒素欠乏条件でその濃度が減少しており、硝酸とは異なる応答をしていた。篩管液中のアミノ酸濃度には有意な変化は見られず、そのモル濃度(約200mM)から推察すると篩管内を転流する窒素化合物の総量には窒素栄養条件の影響が及んでいないことが確認できた。また、タンパク質のおいてもその濃度には有意な差は見られず、その組成に関してもSDS-PAGEによる解析では明確な差はなかった。アブラナ篩管液RNAの解析では、今回行ったポリアクリルアミド電気泳動で検出することができたバンドのパターンには明確な差はなかった。今後、篩管液RNAにわけて実験を進めていく必要があると思われる。研究成果の発表本年度に見られた研究成果は平成18年8月22日に日本土壌肥料学会東北支部会にて発表を行った。演題窒素栄養条件がアブラナ篩管液の組成に及ぼす影響
タジキスタン拝火教遺構の発掘調査及び阿弥陀仏の起源としてのミトラ神についての研究

大乗仏教経典成立の背景にはインド文化の他にイラン文化も存在した。特に、ガンダーラ地域ではゾロアスター教の影響があった。クシャーン王朝は紀元後1世紀から3世紀までガンダーラを中心に統治したが、この王朝のふるさとは中央アジアのタジキスタン・ウズベキスタン周辺であった。その地域の宗教はゾロアスター教であった。この研究では、タジキスタンの遺跡発掘によって、イスラーム化前の中央アジアにおけるゾロアスター教の存在を検証した。ゾロアスター教と仏教の混合によって阿弥陀仏信仰が成立したことを明らかにすることができた。その宗教的交渉においては、インドとイランに共通する神格であるミトラ(ミフル)が仲介となった。タジキスタンのカラ・イ・カフィルニガン遺跡における5月の発掘調査では、城砦址の外壁を確認するために遺跡の北西側を発掘した。その結果、外壁遺構は確認することができず、カフィルニガン川側に向けて東に下降する緩やかな斜面を検出することができた。この斜面層は7から8世紀の床面と同じものと見られる。このことから城砦は川の増水による氾濫で削られたことが想定できた。もとの城砦は現在の遺跡の範囲より川岸に向けて広がっていたようで、遺跡全体が川下の南方向へ傾斜し、南西部分の小高い丘の手前に溝状に窪地があることも氾濫の痕跡と考えられる。この城砦址において、2007年度から2013年度までに十数体の小型塑像と2点の塑像型を得ることができた。2013年度末のタジキスタン国立博物館における調査では12体の小型塑像と2点の塑像型を3Dスキャナーで計測し、詳細なデータを入手した。具体的には、ネクスト・エンジン社の3Dスキャナーを使用し、資料一点につき縦横2面を各22.5度の十六方向から測定した。レザー測定の速度は最も遅い高精度の設定で実施したため、一体につき約3時間を要した。理工学部との連携作業によって、3Dで表示できるPDFファイルに変換して広く公開する予定である。これまでの調査ではカラ・イ・カフィルニガンの都城遺跡を発掘してきたが、今年度より新たに仏教僧院遺跡とみられる場所に移動して発掘調査を継続することとなった。2・3月の調査ではヒサールの城砦遺跡周辺に位置する石窟寺院を視察し、周辺の遺跡との関連性についても検討をおこなった。玄奘三蔵『大唐西域記』にも若干の記述が見られる遺跡であり、当時の仏教文化の一端を明らかにすることができるものと期待される。現在、来年2014年度内の完成を目途に、2007年から2013年までのカラ・イ・カフィルニガン遺跡で実施した調査に関するカタログを作成中である。8月の発掘調査では、昨年度2・3月に予備調査をおこなったタジキスタンのヒサール城砦遺跡周辺、城砦から南西へ23Kmほどの場所に位置する石窟遺構の測量と隣接する空き地(イスラーム墓地)の発掘調査を実施した。ヒサール城砦はブハラ・ハン王国(16C20C)の遺跡とされているが、それ以前から交通の要衝として栄えていた。今回の調査中にも城砦内の泉周辺の沼地からヘレニズム様式の直径70cm、高さ100cmの柱頭部分が出土し、ヒサール遺跡の起源が紀元前後のグレコ・バクトリア期にまで遡ることが明らかとなった。前述の二つの石窟遺構は、両者とも崖面の南西斜面に入口があり、方向角55°で6mの間隔、横断面がカマボコ状の半円形で、床部分が幅3m、高さ約2mである。奥行は、北にある窟が約20m、もう一つの窟が約25mで、全体的にわずかに奥の方が高くなるように開鑿されている。壁画などは残されていず、仏像を安置するための中心柱も見られないが、一番奥には高さ70cmと80cm、奥行約50cmの壇が設けられ、その上は半円形の龕となっている。この壇と龕による構造は西域北道の石窟寺院の後室と同じである。中心柱はイスラーム期に撤去された可能性もあり、石窟寺院の伝播を考える上での重要な遺構として評価できる。石窟遺構の周辺にある空き地はイスラーム期以降、墓地として使用されているが、クシャーン朝期やトハーラ時代の遺跡であったと考えられ、僧院址であった可能性も指摘されている。4900m2と1200m2の二か所で地形図作成のための測量を実施した。前者で1100、後者で320の測点を観測し、等高線の自動算定ソフトで地形図の基本的部分を完成させている。それぞれの空き地で3m×6mの試掘溝を地表より2m程度の深さまで掘り下げた。衛星写真との照合のため、衛星写真で確認可能な電柱などの目標物の座標もあわせて記録する。3Dプリンターによる復元は一体の作業に56時間を要する。また、出土したままの未補正の状態では一般への提示には説得力を欠くと思われる。これらの理由から補正・欠損部補修を加えた陶土素焼きのレプリカを作成した。基本的処理については理工学部岡田教授から教示を得た。菩薩像の一部補正を加えたレプリカは作成済みである。工程としては、先ず3Dプリンターで作成したプラスチック製のレプリカを加工する。薄れた輪郭、例えば眉根やまぶた、唇などをヤスリ等で刻む。

また、鼻梁などの磨滅した部分はエポキシ樹脂系のボンドで盛りあげ、成形する。この補正済みプラスチック・レプリカから工芸用簡易陶土(ヤコ・オーブン陶土「紅陶」瀬戸産蛙目粘土使用)を使用して、型を作成する。焼成加工すれば何度も塑像を成型することが可能となる。復元塑像には以下の文書を添付して配布している。「タジキスタン出土吐火羅菩薩(原寸大一部補正)科研費(課題番号25300041)助成による成果発表、吐火羅(トハーラ)は中央アジア一帯の古い呼び名で、トハーラ族の故地でした。クシャーン朝やソグド商人もその子孫です。タジキスタン出土の遺物(8世紀前後)は仏教美術にも影響を与えたと思われます。3Dスキャナーを使って原像を作成し、一部補正を加えて型を取りました。表面の図は補正前のものです。型で耕作用オーブン陶土を加工して180度で40分焼成しました。」また、神像の欠損部補修を加えたレプリカについては、頭部が欠けているミトラ塑像と同遺跡から出土したミトラ神像(完形)の頭部を合成して作成する。ただしその工程の途中にあり、WebサイトからフリーソフトAutodesk Mesh mixerをダウンロード、二体の塑像の3Dデータ(stlファイル)から合成した神像を作成している。3Dプリンターのソフトにもデータを読み込ませ、作成可能な段階にある。当該研究題目「タジキスタン拝火教遺構の発掘調査及び阿弥陀仏の起源としてのミトラ神についての研究」に挙げたミトラ神は、仏教では良く知られた弥勒菩薩、「弥勒」の語源である。弥勒に対応する梵語マーイトレーヤがミトラから派生した語であることは言語学的に確かめられている。さらに音写による訳語「弥勒」がミトラのイラン語形ミフルから転訛したミーローであることには注目すべきである。そのような弥勒菩薩が『無量寿経』においては、釈尊の教法を後世に伝えるために委託(付嘱)する相手となっている。さらには同経中、ゾロアスター教の留置天(ハミスタガーン)と関わると思われる疑城胎宮の教説は釈尊と弥勒菩薩の対話の中で示される。ここに、弥勒という語をゾロアスター教との関連を示す指標として想定できるように思う。クシャーン朝下の宗教的背景が大きな影響力をもっていたことを考慮すれば、阿弥陀仏信仰という限定された問題としてではなく、大乗仏教という大きな枠組みの中でゾロアスター教との交渉を考える必要がある。その指標として弥勒という語を想定することができる。本来、大乗仏教の教義において、最初から深遠で精緻な教義が展開したとは考えられない。仏教が異宗教と出合い融合する。それによって、多くの人々が仏教に帰依することとなる。そして、仏教と異思想が融合するとき、当然のこととして不整合面が生じたことであろう。その矛盾を止揚(会通)するために深遠で精緻な教義が展開したのである。例えば、華厳教義には「三界虚妄但是一心作」の所説に基づき、全てが心からの顕現であるとする。汚染された衆生と清浄なる仏とは同じく一心の現れに他ならないと説くのである。あるいは、その汚染と清浄の二元性はさらに精緻さを加えて、縁起と性起の教義へと展開する。これがゾロアスター教の善悪二元論と仏教が融合、その止揚・会通の結果だと考えられる。現在までに収集した遺物図像データをもとに、中央アジアの宗教的背景を明らかにすることができた。特に、研究課題に掲げたミトラ神の存在は大きく、仏教と習合する中で、様々な形でシルクロードを経て日本まで伝来したことを検証することができた。
スーダンにおける戦後復興と平和構築の研究

2005年包括的平和協定が締結され、内戦から平和へというおおきな転換期にあるスーダン共和国において、(1)戦争から平和へという歴史的転換が、スーダンの国家と社会に現在進行形で与えるインパクト、および(2)持続的平和を実現するため実行・計画されている平和構築プログラムの実態と評価の2点を主要な課題として、文献研究と現地調査を実施し、綿密かつ動態的な記述と分析をおこなった。研究代表者の栗本英世は、南部スーダンの首都ジュバと、主要都市ルンベックにおいて、スーダン共和国第一副大統領兼SPLM/SPLA最高指導者ジョン・ガラン事故死直後の政治的混乱と、当時樹立の過程にあった南部スーダン政府の構成について、および国連機関と国際NGOの戦後復興支援活動について、資料と情報を収集した。また、ルンベックでは、欧米・スーダンの研究者、およびNGO職員と、スーダンの現状と将来に関する集中的な討議と情報交換をおこなった(2005年7、8月)。研究分担者の太田至は、ケニア北部のカクマ地域において、スーダン難民と地元のトゥルカナ人との社会・経済関係について調査をおこなうとともに、スーダン難民の帰還計画に関する情報を収集した。また、太田と栗本は、南部スーダン東エクアトリア州において、家畜と放牧地をめぐる民族集団間の武力紛争の実態と平和構築の可能性、およびSPLMによる地方行政の現状に関する調査に従事した(2005年8月9月)。研究分担者の岡崎彰は、南北の諸勢力が激しくいまでも拮抗している青ナイル州ダマジン地区において、諸政治・軍事勢力間の関係、帰郷したSPLAの兵士達が地域社会に与える影響に関する調査に従事した。また、ハルツーム大学アフリカ・アジア研究所との研究連絡をおこなった(2005年12月2006年1月)。研究分担者の栗田禎子は、首都のハルツームに成立した国民統一政府の構成と、南北および北部内の諸政治勢力間の緊張・均衡関係について、文献資料をもとに研究をおこなった。研究代表者の栗本英世は、調査研究プロジェクトの統括を行うとともに、2006年5月には、南部スーダン、ルンベックで開催されたセミナーに参加し、欧米・スーダンの主要なスーダン研究者、および国際機関、国際NGOの専門家と情報交換と研究連絡を行った。2006年12月から20O7年1月にかけては、南部スーダン政府救援復興コミッションの協力のもと、南部の首都ジュバと東エクアトリア州において、平和構築・戦後復興の現状と課題に関する調査、およびパリ人の村落において、内戦期の変容と平和構築をテーマとするフィールドワークを実施した。また、南部スーダンにおけるJICAと日本のNGOの活動について情報と資料を収集し、在ハルツーム日本大使館との研究連絡を行った。研究分担者の太田至は、ケニア共和国北西部のカクマ難民キャンプに居住するスーダン難民の帰還の状況、およびスーダン難民と地域住民であるトゥルカナ人のあいだの相互関係に関する資料を収集し、分析した。その結果、難民と地域住民は、言語や文化の違いを乗り越えて個人レベルでさまざまな友好的関係を構築していることが明らかになった。研究分担者の栗田禎子は、包括的平和協定成立後のスーダンの政治状況について情報収集・分析に努めると同時に、紛争後の社会における和解、信頼醸成プロセスの重要な要素としての「歴史」叙述の問題に着目し、周辺化された諸地域や、女性の視点から、スーダン史の叙述を再構成する可能性を探った。研究分担者の岡崎彰は、北部の周辺地域であり、包括的平和協定で特別な地位が付与された青ナイル州において、州政府の協力のもと、平和維持のメカニズムと、地域住民による権利回復運動に関する調査を実施した。また、2006年4月にドイツのマックス・プランク社会人類学研究所において開催された国際ワークショップにおいて、研究発表「ガムク人における権力、宗教、暴力と『新スーダン』の祝祭」を行った。三年度目である本年度は、過去二年の調査研究の成果を踏まえた上で、スーダンにおける戦後復興と平和構築について、各分担者がフィールドワークおよび文献調査を行った。研究分担者の岡崎彰は、南北の諸勢力が激しくいまでも拮抗している青ナイル州ダマジン地区およびインゲサナ山地において、新州政府のガバナンス、諸政治・軍事勢力間の関係、帰郷したSPLAの兵士達が地域社会に与える影響といったテーマに関する調査に従事した。研究分担者の栗田禎子は、北部の反政府勢力の動向と、南北および北部内の諸政治勢力間の緊張・均衡関係について、インタビュー調査および文献資料をもとに研究をおこなった。また、ハルツーム大学アフリカ・アジア研究所との研究連絡をおこなった。研究分担者の太田至は、ケニア北部のカクマ地域において、スーダン難民の帰還の状況と、難民の減少が地元のトゥルカナ人に与えるインパクトについて調査をおこなった。研究代表者の栗本英世は、プロジェクト全体の調整と総括をおこなうとともに、南部政府と東エクアトリア州政府のガバナンス、国連機関や国際NGOが戦後復興に果たしている役割について資料と情報を収集した。来年度は、本研究プロジェクトの最終年度であるとともに、スーダンの包括的平和協定から丸三年が経過し、六年間の暫定期間のちょうど折り返し点に相当する。今年度までの成果をもとに、戦後復興と平和構築の動態と今後の展望について総括する予定である。

2005年に内戦が終結したスーダンに関して以下の2点を柱とする調査研究を継続した。(1)戦争から平和へという歴史的転換が、スーダンの国家と社会に現在進行形で与えるインパクト。(2)持続的平和を実現するため実行・計画されている平和構築プログラムの実態と評価。研究代表者の栗本英世は、研究全体の統括とともに、南部スーダンの首都ジュバと東エクアトリア州において約3週間の現地調査と研究連絡を実施し、研究協力者の岡崎彰は、首都ハルツームと青ナイル州、および南部スーダンの首都ジュバにおいて約2週間の現地調査、文献資料収集と研究連絡を行った。研究協力者の栗田禎子は、北部スーダンの政治的動態に関する資料収集と文献研究に従事した。研究協力者の太田至は、ケニア北西部の難民キャンプを対象に、南部スーダン難民帰還とそれが地元民に与えるインパクトについて調査研究を行った。各自は、包括的平和協定(CPA)の実施と国連.国際社会の関与・介入がローカルからナショナルに至る各レベルに与えているインパクトを見極めつつ、以下の五つの調査課題について総合的な分析と考察を行った。(1)ローカルなレベルで存在する民族集団間の敵対・緊張関係と、和解と平和構築の試み、(2)帰還民・元兵士の再統合、(3)地方政府のガバナンスと新旧エリート層の動態、(4)ナショナルなレベルでの権力分有、権力闘争の動態、(5)復興・人道援助の経済学と政治学。本研究によって、スーダンにおける復興と平和構築はいかに進められるべきか、それを担う主体はだれか/なにかという、スーダン人自身にとって、また社会科学的にもきわめて重要な問題に関する実証的データの蓄積が達成されたとともに、理論的考察を深めることができた。
遺伝性膵炎患者由来iPS細胞を用いたヒト膵炎細胞モデルの構築と創薬への応用

本年度は、昨年までに樹立した遺伝性膵炎患者由来iPS細胞株の維持管理を継続するとともに、引き続き膵腺房細胞への最終分化誘導法開発を継続した。前年までの解析で膵外分泌組織の形成がみられた分化誘導法について条件検討を行い、PRSS1を発現する膵外分泌組織をさらに増殖させ得る手法の確立を試みたが、依然困難であった。新たな遺伝的背景(PRSS1以外の遺伝子変異を確認済み)を有する新規膵炎患者二名については末梢血検体からiPS細胞を樹立することが可能であり、細胞株化ののちに維持・保管を継続している。以上の結果はiPS細胞からの完全な膵外分泌細胞モデルの確立は依然ハードルが高いことを示唆しており、実現のためには今後更なる技術革新が必要と考えられる。一方、遺伝的背景を有する膵炎患者からの末梢血検体を用いたiPS細胞樹立は技術的にほぼ確立した。検体の採取・輸送についても安定的な実施が可能となっており、将来的な解析に備えて検体を集積する基盤を構築することができた。今後は明らかな遺伝的背景を有しながら既知の遺伝子異常が同定されない膵炎患者について、iPS細胞株化による検体保存を行うことも考慮している。未知の原因遺伝子を含む膵炎iPS細胞ライブラリ構築は、病態解明のみならず遺伝子異常を直接ターゲットとする新規治療法開発のプラットフォームとなることが期待される。本研究計画の実施により特定済み遺伝子変異を持つiPS細胞株が複数作成できたことはその最初の一歩であり、有意義な結果であると考えられる。分担研究者の長船らは、これまでにヒトiPS細胞から膵臓発生過程を再現し、二次元培養にて胚体内胚葉、膵前駆細胞を経てAMYLASE陽性の膵外分泌細胞を分化誘導する方法を開発した(Funato M., et al.投稿準備中)。本研究では、遺伝性膵炎の患者体細胞から樹立されるiPS細胞に本分化誘導法やその改良版を適用して、疾患膵腺房細胞の作製とそれを用いた病態解析を行う。H28年度には、PRSS1遺伝子変異を有する遺伝性膵炎患者2名よりiPS細胞を樹立し、初期化6因子の導入のためのエピゾーマルベクターの組み込みの無いiPS細胞株の選択を行うことを予定した。本年度は検体採取と輸送・iPS細胞化の手順が適切に実施可能であるかの検証も含め、東北大学病院に通院するPRSS1遺伝子変異を有する遺伝性膵炎患者2名(45歳女性と53歳男性。共にP.R122H変異ヘテロ。)より同意取得の後に末梢血液を採取した。東北大学から京都大学への検体輸送は適切に実施可能であった。分離した単核球に初期化6因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, shp53)を遺伝子導入することでiPS細胞の樹立を行った。いずれの症例についても継代可能なiPS細胞の樹立が可能であった。2症例からそれぞれ10および11のiPS細胞株をストックし、ゲノムPCRを行い、エピゾーマルベクターの染色体への組み込みのない株が、それぞれ8および11株あることを確認した。現在、作製したiPS細胞株の維持培養と保管を継続している。今後は樹立したiPS細胞株を用いた胚体内胚葉への分化誘導実験や樹立細胞株のキャラクター解析を実施する予定である。また、膵前駆細胞の樹立・膵腺胞細胞への分化誘導包の改良・技術確立を並行して行う。本年度は実際の遺伝性膵炎患者からの検体採取と東北大学・京都大学間の検体輸送を適切に実施することが可能であり、採取検体全例でiPS化が可能であった。エピゾーマルベクターの組み込みがないiPS細胞の樹立も確認されており、次年度以降の分化誘導実験・疾患細胞モデル解析のための基盤形成は十分と思われる。以上の結果から、本研究の進捗状況はおおむね順調と考えられる。本年度は、昨年度に樹立した遺伝性膵炎患者由来iPS細胞株におけるエピゾーマルベクターの組み込みのないことを確認するなどのクオリティーコントロールを実施した。細胞株の維持培養は本年度も問題なく継続可能であった。また、並行して同iPS細胞株を膵腺房細胞へ分化誘導する方法の開発を行った。まず、研究分担者の長船らが既に確立している二次元培養で新規低分子化合物を用いたヒトiPS細胞から膵腺房細胞への分化誘導法の詳細な検討を行った。その結果、Amylaseをはじめとする複数の膵腺房細胞のマーカー遺伝子の発現が認められたが、本疾患の原因遺伝子の1つであるPRSS1の十分な発現が認められず、本疾患の解析に適した分化誘導系ではないことが判明した。そのため、既報の分化誘導法やそこで使用されている複数の化合物や増殖因子の組み合わせを検討したが、膵腺房細胞の分化誘導は依然困難であった。しかし、長船らが既に報告しているヒトiPS細胞から膵前駆細胞までのin vitroでの分化誘導(Toyoda T., 2015, 2017)を行った後に、独自の方法でさらなる分化を進めたところ約1カ月後に一部にPRSS1を発現する膵外分泌組織が形成されることを確認した。現在、本分化誘導系で作製される膵外分泌組織のさらに詳細な遺伝子発現解析を行っている。また、新たな遺伝的背景を有する遺伝性膵炎患者についてもiPS細胞作製を検討中であり、該当患者のリクルートを行ったのちに検体採取・東北大学から京都大学への輸送を予定している。