hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
相変化ナノ粒子の相界面現象の解明と革新的蓄熱技術の創成

さらに流動試験装置の製作に取り掛かり,一部試験を実施し,ナノエマルションの流動特性を明らかにすることができた点は,当初想定していた進度に合致している.前年度に引き続き,相変化ナノエマルションの凝固時における過冷却抑制を目的とした方法を探索する必要がある.特にナノ物質の混入や新たな方法について実験的な検討が必要と考えている.また流動装置について,小型流路を作成し,マイクロ伝熱に関する検討も合わせて行なう予定である.さらに当初の目的である,蓄熱温度を選択できることを明らかにするため,これまでのテトラデカンに加えてオクタデカンを用いて,室温程度の蓄熱媒体の可能性について検討する必要がある.昨年度同様,相変化ナノエマルションの物性測定を引き続き実施する.さらに相変化特性の制御を目的として,過冷却抑制効果を有する物質の探索を引き続き行う.一方,相変化ナノエマルションの熱流動特性の把握のため,管内流動と相変化現象を同時に検討・把握できる装置を新たに作製する.なおこの装置は,前年作製した流動試験装置を改良することで,実現可能である.また当初予定していた通り,解析的な研究に取り組む.具体的には,相変化ナノエマルションの相変化特性をMD法により予測すること,さらに流動試験装置内での相変化特性を数値解析的に予測する.研究謝金として研究室の大学院生に対して支出を予定していたが,予定該当者が急遽不在となったため,謝金の使用に至らなかった事による.次年度は,当該研究に関連する実験およびデータ整理を担当する大学院生に対して,確実に謝金を支出する予定である.昨年度使用した流動試験装置を基に伝熱試験および流動蓄熱試験が実施できる装置に改良する.そのための装置材料および各種測定装置に研究費を利用する.また前年度同様,相変化ナノエマルションの最適な生成プロトコルを作成するため,各種パラメータを変化させた状態でナノエマルションを生成し,その有用性を明らかにする.さらに前年度の研究成果を広く公表するため,成果発表のための旅費として使用する.
動脈硬化性小型低密度リポ蛋白(sLDL)の生成機構に関する分子生物学的研究

【目的】血清脂質代謝異常の1つである低比重リポ蛋白(LDL)の量的増加のみならずLDLの質的変化(small dense LDL:sLDL)が高頻度に冠動脈疾患患者に認められることよりsLDLが動脈硬化症への危険因子として注目されている。特に,高トリグリセリド(TG)血症状態でsLDLが出現しやすいことは知られているが,sLDLの生成機構に関しは不明な点が多い。本研究は高TG血症状態での動脈硬化性sLDLの生成機構をin vivoおよびin vitroの両アプローチにより解明することを目的としている。【平成6年度(初年度)の実績】LDL粒子サイズに影響を与える高TG血症の成因解析の結果,高TG血症はリポ蛋白リパーゼ(LPL)遺伝子異常ヘテロ接合体による低LPL症にTG合成亢進因子(アルコール等)の合併により発症することを明らかにした。高TG血症の持続はHDL粒子に結合している脂質転送酵素(LTP)の働きによりHDL粒子をTG-richHDLに変化させ,このHDLの変化によりLDL粒子をTG-richでコレステロールエステル(CE)-poorLDL粒子に変換させる。このTG-rich/CE-poorLDL粒子のTGが肝性トリグリセリドリパーゼ(HTGL)により水解され,sLDLが生成するものと推定された。【平成7年度の実績】VLDL→IDL→LDLへの異化代謝過程でIDL→LDLへの変換およびLDL粒子のTG水解はin vitro実験によりHTGL酵素によって行われていることが明かとなった。更に,これらの代謝過程の正当性はHTGL酵素完全欠損症患者のリポ蛋白分析により,IDLおよびTG-richLDL粒子が異常蓄積することにより確証された。正常血清TG値(50mg/dlから150mg/dl)の対象者から得たLDL粒子のTGをHTGL酵素で水解しても、TGのLDL粒子に対する占有体積が小さいためにLDL粒子サイズはほとんど変化しなかった。ところが,LDL粒子を高TG-richリポ蛋白(VLDL)粒子,HDL粒子およびLTP酵素の存在下で反応すると,LDL粒子はTGを受け取り,コレステロールエステル(CE)を失い,TGの占有体積が大きなTG-rich/CE-poorLDLに変化することが判明した。このようなTG-rich/CE-poorLDLをHTGL酵素でTGを水解した場合,LDL粒子サイズの小型化を始めてin vitro実験で証明することに成功した。正常LDLは超低比重リポ蛋白(VLDL)より3種類の酵素(リポ蛋白リパーゼ(LPL),肝性トリグリセリドリパーゼ(HTGL)や脂質転送蛋白(LTP))の関与より産生されると推定されている。sLDLの出現と高トリグリセリド(TG)血

症とは強く相関していることは知られているが,sLDLの生成機構に関し,上記酵素の寄与は不明である。本研究は高TG血症状態で動脈硬化性sLDLの生成機構を分子生物学的手法により解明することを目的とする。【実績1】健常者30名と高TG血症の代表としてIV型高TG血症30名,HTGL欠損症3名(健常者の20%程度のHTGL活性を示す2名と完全欠損の1名)を対象者とし,各リポ蛋白(VLDL,IDL,LDL,HDL_2,HDL_3)を分離し,脂質とアポ蛋白の定量,LPL,HTGL,LTPの定量,LDL粒子サイズをポリアクリルアミド濃度勾配電気泳動法(PAGGE)で解析した。LDLサイズに影響を与える高TG血症の病因はLPL酵素の低値が強く関与していた。LDL粒子サイズの変動は多変量解析により血清TG値,LPL,HTGL,LTP等の酵素因子により77%説明可能であった。【実績2】HTGL欠損症の患者SMのHTGL遺伝子解析の結果,エキソン2にミッセンス変異が認められ,本変異のホモ接合体であることが判明した。HTGL欠損患者の異常リポ蛋白と健常者のリポ蛋白との比較の結果,HTGLがVLDL→IDL→LDLへの異化代謝過程でIDL→LDLへの変換に関与していることが判明した。【目的】血清脂質代謝異常の1つである低比重リポ蛋白(LDL)の量的増加のみならずLDLの質的変化(small dense LDL: sLDL)が高頻度に冠動脈疾患患者に認められることよりsLDLが動脈硬化症への危険因子として注目されている。特に,高トリグリセリド(TG)血症状態でsLDLが出現しやすいことは知られているが,sLDLの生成機構に関しは不明な点が多い。本研究は高TG血症状態での動脈硬化性sLDLの生成機構をin vivoおよびin vitroの両アプローチにより解明することを目的としている。平成6年度(初年度)はin vivoのアプローチによりLDL粒子サイズに影響を与える高TG血症の病因がリポ蛋白リパーゼ異常であることを明らかにし,sLDLの生成機構にTG-richHDL,肝性トリグリセリドリパーゼ(HTGL)酵素,脂質転送蛋白(LTP)酵素,LCAT酵素等の関与を示唆した。本年度(平成7年度)はin vivoで推定されたsLDLの生成機構をin vitroで確認することを試みた。【実績】VLDL→IDL→LDLへの異化代謝過程でIDL→LDLへの変換およびLDL粒子のTG水解は主としてHTGL酵素によって行われていることが明かとなった。更に,これらの代謝過程の正当性はHTGL酵素完全欠損症患者のリポ蛋白分析により,IDLおよびTG-richLDL粒子が異常蓄積することにより確証された。正常血清TG値(50mg/dlから150mg/dl)の対象者から得たLDL粒子のTGをHTGL酵素で水解しても,TGのLDL粒子に対する占有体積が小さいためにLDL粒子サイズはほとんど変化しなかった。
マグネシウム輸送体のクローニングおよびその機能解析

Mg輸送体は植物や細菌では見つかっているが、哺乳類では未だ見つかっていない。植物のMg輸送体はAtMHXと呼ばれ、Mg/H交換体である。このAtMHXはヒトのNa/Ca交換体(NCX)に似ており、且つその細胞内ループ部位がNCXに比べて非常に短いという特徴を有している。これから、哺乳類のMg輸送体もNCXに相同性を持ち、且つその細胞内ループ部位が短いのではないかという仮説を立て、クローニングした(JSX)。JSXの一次及び二次構造を解析してみると、NCXに相同性を持ち、且つその細胞内ループ部位が非常に短いというAtMHX同様の特徴を有していた。JSXの組織分布を見てみると、腎臓、心臓、脳及び膵臓に発現しており、特に腎臓では近位尿細管、遠位尿細管にのみ存在していた。この部位は腎臓におけるMg再吸収部位と一致しており、JSXがMg輸送体である可能性を強く示唆していた。JSXを培養細胞に強制発現することにより、JSXの機能解析をおこなった。ある条件下ではNaが細胞内に流入し、Mgが細胞外へ排泄され、細胞内は脱分極を起こした。細胞外のMg濃度を低くすると、この交換体の動きが強くなった。低Mg血症は心不全、糖尿病や高血圧を悪化の方向に導くことが知られている。JSXは心臓、膵臓(β細胞)、血管平滑筋に存在している。これらを合わせると、JSXが心臓においては脱分極による不整脈(心不全悪化時)、膵β細胞においてはインスリンの過剰分泌(高インスリン血症およびインスリン分泌低下)、そして血管平滑筋においては過剰収縮(血圧上昇)に関与している可能性が示唆された。LamasonらはJSXがメラノサイトに存在し、色素沈着に関係するとの報告をおこなった(R.L.Lamason et al.,Science 310,1782(2005))。白色人種においてはJSXにmutationが起き機能不全となり、メラノサイトの活性が落ちて皮膚の色が薄くなるとの報告であった。彼らはJSXの機能解析はしておらず、我々の研究結果と併せて今後ともJSXの生理的意義を解明していく。蛋白質強制発現についてヒト、マウス及びラットのMg輸送体候補遺伝子のクローニングをした。この遺伝子をトランスファーベクターに挿入し、相同組換えによる組換えバキュロウイルスを作製した。このバキュロウイルスは昆虫細胞に特異的に感染するウイルスである。この組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、この蛋白質を強制発現させた。抗体作製についてこの候補遺伝子の蛋白質における抗原特異性の高い部分に合成ペプチドを作成し、これをウサギに免役することによりポリクローナル抗体を作製した。特異性を調べるため強制発現させた昆虫細胞を用いて、ウエスタンブロット法及び免疫染色を施行した。これにより抗体の特異性が確かめられた。電気生理学的実験について組換えバキュロウイルスにより強制発現させた昆虫細胞を用いてホールセルパッチクランプ法を施行した。長期間にわたり試行錯誤を繰り返しながら実験を試みたが満足する結果を得ることが出来なかった。これに関しては次項で述べる。蛋白質強制発現させた昆虫細胞による電気生理学的実験について昆虫細胞は非常に良く目的の蛋白質を強制発現することが出来る。しかし問題点も幾つかある。特に電気生理学的実験の場合大きな問題点は細胞内外の電解質組成が哺乳類と比べて著しく異なることである。特に細胞外溶液ではカルシウムおよびマグネシウム濃度が非常に大きいため、2価陽イオンを用いる実験を行う時大きな支障になる。また、ホールセルパッチクランプ法を施行する場合昆虫細胞は細胞膜に穴を開けることが容易ではなく非常に苦労する。このため昆虫細胞を用いることは妥当ではないと考え、哺乳類の細胞を用いて蛋白質強制発現させることに変更することにした。

LamasonらはJSXがメラノサイトに存在し、色素沈着に関係するとの報告をおこなった(R.L.Lamason et al.,Science 310,1782(2005))。白色人種においてはJSXにmutationが起き機能不全となり、メラノサイトの活性が落ちて皮膚の色が薄くなるとの報告であった。彼らはJSXの機能解析はしておらず、我々の研究結果と併せて今後ともJSXの生理的意義を解明していく。
しびれ動物モデルでの感覚神経線維特異的評価系の確立とその発症機序の解明

しびれは臨床上問題となることが多いが、その発症機構は全く解明されていない。本研究では、抗がん剤による急性末梢神経障害や正座後のしびれを模した急性しびれ動物モデルに加え、糖尿病性神経障害や末梢閉塞性動脈疾患等のしびれ病態モデルを用いて、感覚神経線維特異的な変化に着目し解析を行った。その結果、しびれの陽性症状は、オキサリプラチンや低酸素負荷(急性/慢性の虚血負荷、糖尿病性血流障害)によりプロリン水酸化酵素が抑制された結果、C線維のTRPA1が過敏化すること、一方、陰性症状(感覚鈍磨)は別の機構が関与することを明らかにした。また、ブラシなどの触刺激に応答するMrgprB4陽性神経についても解析した。しびれモデルとして、抗がん剤オキサリプラチンによる急性末梢神経障害モデルを用いて、C線維に発現するTRPA1の役割を解析した。その結果、代謝物oxalateがプロリン水酸化酵素(PHD)を抑制し、TRPA1のプロリン残基(Pro394)の水酸化が解除されることにより、ROSに対するTRPA1の感受性が増強されることを見出した。さらに、別のしびれモデルとして、マウス後肢の虚血/再灌流による自発的なlicking行動(自発的しびれ様行動)においてもTRPA1が選択的に関与することを見出し、同様に、低酸素負荷によるPHD活性抑制-TRPA1 Pro394の水酸化解除によりTRPA1が過敏化することを見出し、再灌流時に産生されるROSが過敏化したC線維のTRPA1を刺激することにより、自発的しびれ様行動を惹起することを明らかにした。また、このモデルでは、触覚刺激に対して感覚鈍磨が生じることを見出し、自発的しびれ様行動と感覚鈍磨が併発する珍しいモデルであることが判明した。さらに、周波数の違いによりC/Aδ/Aβ線維を個別に刺激できる装置を用いた所、いずれの神経線維も反応が低下しており、感覚鈍磨と符合する結果となった。また、新たなしびれ病態動物モデルを作成するため、大腿動脈を結紮/除去する慢性後肢虚血モデル、ストレプトゾトシンによる糖尿病性神経障害モデル、抗がん剤末梢神経障害モデルを作成し、いずれも後肢で持続的な血流低下を確認した。さらに、後肢血流低下時にTRPA1刺激による逃避行動が増強され、TRPA1が過敏化していることを明らかにした。一方、感覚神経線維特異的な刺激/抑制を行うため、Syn1プロモーター下あるいはCre/lox-pによりChR2を遺伝子導入できるアデノ随伴ウイルス(名古屋大学山中教授より)を用いたが、感覚神経特異的な発現は認められたものの、発現量が十分でないのか光刺激によっても何ら行動変化は見られなかった。本研究で計画している項目は下記の通りである。1)各感覚神経線維サブタイプ特異的な神経活動の評価法の確立2)急性しびれモデルおよびしびれ病態モデルでの各感覚神経線維の活動異常の分子機構の解析3)末梢神経障害および末梢血流障害による新たなしびれ病態動物モデルの開発上記の項目のうち、2)に関しては、TRPA1のオキサリプラチンあるいは低酸素による過敏化機構を1つのアミノ酸(Peo394)の脱水酸化という機構まで同定することができ、当初の計画以上に進展したと考えられる。3)についても、痺れ病態モデルをほぼ確立することができ概ね順調に進展している。一方、1)については、ウイルスベクターによるChR2/eArchの特異的な発現は認められたのの、十分な発現が得られず、当初計画より遅れていると言わざるを得ない。しびれモデルとして、抗がん剤オキサリプラチンによる急性末梢神経障害モデルを用いて、C線維特異的に発現するTRPA1の役割、特に長年議論の的となってきた冷感受性について解析した。その結果、通常は冷感受性を示さないヒトTRPA1が、オキサリプラチン、プロリン水酸化酵素阻害薬あるいはTRPA1 Pro394の変異により、冷刺激(25°C→16°C)に対して感受性を示すことを見出した。この応答は、冷刺激によりミトコンドリアで産生された活性酸素種を過敏化したTRPA1が感受するという間接的な経路であり、ヒトTRPA1の冷感受性の分子機構について明らかにすることができた。新たなしびれ病態動物モデルとして、大腿動脈結紮による慢性後肢虚血モデル、ストレプトゾトシンによる糖尿病性神経障害モデル、オキサリプラチン長期反復投与による抗がん剤誘発末梢神経障害モデルを作製し、いずれも後肢の血流量が低下すること、冷過敏応答や間欠跛行様行動がTRPA1遺伝子欠損マウスで消失すること、また、TRPA1アゴニスト足底内投与による疼痛様行動が増強されること、血管拡張薬の投与によりこれらの疼痛様行動が改善されることを明らかにした。一方、これらのモデルでの感覚神経の自発活動を、in vivoでの細胞外記録、アデノ随伴ウイルスによるGCaMP6の遺伝子導入、単離後根神経節細胞を用いたCaイメージングなどにより検出しようと試みたが、いずれも困難であった。細胞膜非透過性の局所麻酔薬QX-314と神経線維特異的な刺激薬を用いた神経線維サブタイプ特異的麻酔技術を再現することができた。また、ブラシによるstrokingを感知するとされるMRGPRB4陽性感覚神経をトランスジェニックマウスにより可視化し、Caイメージングを行ったところ、多くのMRGPRB4陽性神経がTRPA1アゴニストに感受性を示すC線維であることを明らかにした。

しびれは臨床上問題となることが多いが、その発症機構は全く解明されていない。本研究では、抗がん剤による急性末梢神経障害や正座後のしびれを模した急性しびれ動物モデルに加え、糖尿病性神経障害や末梢閉塞性動脈疾患等のしびれ病態モデルを用いて、感覚神経線維特異的な変化に着目し解析を行った。その結果、しびれの陽性症状は、オキサリプラチンや低酸素負荷(急性/慢性の虚血負荷、糖尿病性血流障害)によりプロリン水酸化酵素が抑制された結果、C線維のTRPA1が過敏化すること、一方、陰性症状(感覚鈍磨)は別の機構が関与することを明らかにした。また、ブラシなどの触刺激に応答するMrgprB4陽性神経についても解析した。上記の研究項目のうち、2)および3)についてはほぼ順調に進行していることから、当初計画通りに研究を実施する予定である。1)については、アデノ随伴ウイルスによる発現量を上げるよう様々な手を尽くしてみるが、万一、in vivoでの光遺伝学的手法や薬理遺伝学的手法を用いることが困難であった場合、感覚神経の初代培養系を用いて、神経線維サブタイプ特異的な発現とその機能解析を実施する。また、in vivoでの神経線維サブタイプ特異的な行動解析を行うため、2015年に報告された細胞膜非透過性の局所麻酔薬QX-314と神経線維サブタイプ特異的な刺激薬(実際にはカプサイシン(C線維)とToll-like receptor 5(A線維)アゴニストflagellin)を用いた神経線維サブタイプ特異的麻酔技術を用いて、薬理学的な解析を行う。Nat Commun 7: 12840 (2016):マスコミ報道(京都新聞9月16日25面、産経新聞9月21日23面、朝日新聞10月13日19面他)Sci Rep 6: 23261 (2016):マスコミ報道(京都新聞3月18日25面、産経新聞3月18日夕刊10面、毎日新聞3月26日30面に掲載、共同通信社、J-CASTニュース他)薬理学アデノ随伴ウイルスによるChR2/eArchの感覚神経線維サブタイプの十分な発現が得られなかったため、予定より実験計画が遅れたため。一方、しびれ発症におけるTRPA1の分子機構の解析が予定より進んだため、全体として残額は少額に抑えられた(8,400円)。次年度の消耗品として使用する。しびれ発症の分子機構にTRPA1が関与することをプレスリリース。京都新聞3月18日25面、産経新聞3月18日夕刊10面、毎日新聞3月26日30面に掲載、共同通信社、J-CASTニュース他多数にWEB掲載。
口腔癌における腫瘍内FDG集積の不均一性と治療予後との関連

本研究の目的は治療前の口腔癌患者のPET検査画像より、治療予後を予測することである。申請者は特に腫瘍内での放射線性薬剤(FDG)の不均一な集積を定量的に評価する指標である不均一指数(Heterogeneity index; HI)および不均一因子(Heterogeneity factor; HF)に着目した。本研究ではこれらの新たな集積指標と予後との関連を評価する事を目的とする。
学校歯科健康診断におけるGO,GのCAD結果に基づく診断標準化システムの構築

学校歯科健診でGO(要観察歯肉炎),G(歯肉炎)の指標を使用する場合,検者間で判定基準を統一する必要がある。本研究では,39名の研修歯科医を対象に,各スライドの判定分布を基に,専門家と一致した判定には他の2つの判定より重み付けしたスコアを与えるコンピュータトレーニングソフトを開発した。このソフトは,複数の学校歯科医が一堂に会して練習したり,個々人で利用することも可能である(1回の練習時間5分,レベル510で判定)。本研究では,歯肉炎のコンピュータ画像診断支援システム(CAD)を構築し,児童・生徒の「口腔」画像を数量化することによって,検者(学校歯科医)がG,GO,健全歯肉の3状態をCADシステムと同程度もしくはそれ以上のレベルで篩い分けできる能力を身につける(高い信頼性を得る)ことを目的とする。そのため,平成20年度は,まず,経験豊富な歯科医3名によって,学校歯科健診における歯周疾患の“診断基準"をもとに,健全歯肉,GO,Gについて再確認した。次に,保管されている口腔写真を利用して,キャリブレーション(診断標準化)した。さらに,口腔画像(前歯部および臼歯部の歯肉が確認できる画像)を収集し,歯肉の状態がよく確認できる画像写真を選択した(25症例)。その後,スキャナーで個人の写真を1セットとしてコンピュータに取り込んだ。液晶プロジェクタで25症例をおのおの「健全」,「GO」,「G」の3段階に区分した。一方,コンピュータプログラムの観点から,見やすく分かりやすい口腔画像の提示方法を具体的に検討した。平成19年の時点で,コンピュータが歯と歯肉を自動鑑別し,歯肉についてはその良否(2段階)を専門家と同程度まで判別できるようになっているが,今年度の研究結果から,本来連続量的な「歯肉の状態」を,CAD結果をもとに3段階(健全歯肉,GO,G)に分類することができれば,従来,検者間のバラツキが大きかった学校歯科健診で有用な歯肉炎のスクリーニング基準を確立することができる可能性が示唆された。本研究では,歯肉炎のコンピュータ画像診断支援システム(CAD)を構築し,児童・生徒の「口腔」画像を数量化することによって,検者(学校歯科医)がG, GO,健全歯肉の3状態をCADシステムと同程度もしくはそれ以上のレベルで篩い分けできる能力を身につける(高い信頼性を得る)ことを目的とする。そのため,平成21年度は,昨年度の研究結果をもとに,本来連続量的な「歯肉の状態」を,3段階(健全歯肉,GO, G)に分類し,歯肉判定に習熟した歯科医師50名を対象に,彼らが各々の画像(口腔内状態)をどのような判定をするか基礎データを収集した。その結果,検者間のバラツキが大きかった画像,バラツキが少なかった画像について,ゴールデンスタンダードとの一致率から正解率を算出し,歯肉状態の判定評価の難易度を推定した。この難易度を各画像の重み付け指標とすることによって,学校歯科健診での歯肉炎のスクリーニング基準を作成した。これとは別に,口腔内規格写真(症例写真)を追加するため,さまざまな口腔内状態の歯肉写真撮影を継続した。また,Windows ExcelのVBA言語を用いて,歯肉画像をランダムに表示していくプログラム,画像を保護するプログラム,重み付けプログラム等を加え,研修医がどの適度「歯肉状態判定の正確性」を習得したかを評価するためのプログラムの構築を進めている。なお,近年MacBookコンピュータのVBA機能は削除されたことから,検討の結果,旧Macでのプログラム開発は無意味であることが判明した。現在学校の健康診断で使用されているGO,Gが画像診断的にどのような数値として把握できるか,数値的に把握された症例写真に対して,検者(本研究では卒後1年目の研修医)がどこまで的確に健全,GO,Gとして篩い分けできるようになるかという2点について検討した。専門家3名から得られた歯肉炎の程度(ゴールデンスタンダード:GS)をもとに,各症例写真を確率であらわされた3段階に篩い分けし,基準となるゴールデンスタンダードと研修医による判定の一致性の程度を算出することによって,各症例写真の判定の難易度を計算した。研修医の判定がGSと一致した場合の得点は(1+分布割合)/2とし,GSと一致しなかった場合の判定には,分布割合/2を得点として与えることによって補正できることがわかった。24枚のスライドに対し,それぞれの分布割合から計算した得点を合計した値を基に研修医の判定レベルとすることが理にかなっていることが示唆された。以上の結果を基に,その難易度から判定基準の再評価(補正)を行い,最終的に(研修医がどの程度,歯肉の状態を的確に判定し,健全,GO,Gとして篩い分けする能力があるかを)評価し,歯肉炎評価の向上のためのトレーニングソフトを開発した。

このトレーニングソフトは,一回5分程度の短時間で能力判定ができ,ExcelのVBAを用いたプログラムであるため,自宅のコンピュータにインストールすることによって手軽に使用できる利点がある。また7回程度の練習で統一した判定が可能であることが示唆された(キャリブレーション)。
マウス胎児開口制限による顎関節組織形成およびその発生に関する分子機構に及ぼす影響

アルシアンブルーとアリザニンによる軟骨・骨分別染色では,上下顎間結紮群は非結紮群に比較して肉眼的には全身的な発育に特に明らかな発育制限は認めなかった。しかし顎関節では下顎頭軟骨と頸部の石灰化骨の境界は不明確となり,幅が広くなっていた。光学顕微鏡的には,増殖層と肥大層に異常石灰化が認められ,それ故あたかも軟骨,骨移行部は不連続であるかに見え,幅も広いと判断された。基本的に正常な顎関節部の線維芽細胞増殖因子(b-FGF),およびその受容体(FGFR-3)の発現状態を胎児マウス,発育過程にあるマウス,成熟マウスについてウエスタンブロット法で検討すると,b-FGFは15.5日目マウス,胎性17.5日目マウス,生後11日目マウス,いづれにも下顎頭に発現したが,成熟親マウスにはオス,メスともに発現していなかった。FGFR-3についてはすべての時期に発現していたが,胎性15.5日,胎生17.5日目マウスでは著明に発現していた。免疫組織学的検討では胎児マウスの顎関節最表層部における末分化領域は染色性が低く,その下層において染色性が強くなり,分化とともにb-FGFおよびFGF-3が次第に発現している。成熟マウス顎関節では,免疫染色においてb-FGF, FGFR-3ともに最表層部に染色性が認められるが,より下層の細胞群の染色性は低いか染色性はなかった。即ち軟骨細胞の骨化が行われる部位には,いづれの蛋白分子も何らかの関与が考えられた。初年度はまず実験手技の確立に時間を要した。即ち胎児13.5日15.5日の胎児マウスの開口制限のため、子宮外へ取り出した胎児マウスを下顎より上顎に向かって8-0黒ナイロン糸を貫通させ、固定し、子宮外発育させたが残念ながら胎生17.5日18日の取り出す時点で生存している例は非常に少なく、実験にならなくなる。そこで、子宮外より、よく見さだめて、同様な処理を施行することにした。この方法では生存数は増加したが、時々17.5日目にはすでに分娩してしまっているものもあり、かつ子宮外より開口制限したにもかかわらず、母親マウスを開腹すると、ナイロン糸のみが子宮壁についていたり、完全に分娩できず、顔面部が子宮壁にくっついていたりして、胎児マウス身体は母親の体外に出ていて、動くたびに引きずられ死亡している子マウスも認められたこともあった。開口制限したナイロン糸が理想的に下顎運動を抑制していたか否かは、しかし正確には指摘できない部分もあった。また肉眼的に開口制限群、未処置群、sham operationのグループの差異は明らかとすることはできなかった。取り出したマウスは通法により組織標本を作製し、H-E染色により、顎関節の状態を観察した所、顎関節部表層部間葉系細胞には配列のみだれより生じている所見を得た。免疫組織学的検討として、Fibroblast Growth Factor Receptor(FGFR)を検討したが、未処置群に比較して、開口制限群で染色性が低いのではないかとの所見を得た。顎関節頭でのFGFR発現の発生・発育過程中の変化をウエスタンブロットにて検討したが、胎児顎関節頭ではFGFRの発現を認めたものの、親マウスでは発現を認めなかった。これらより、顎関節頭の形成および骨化過程においてFGFRが重要な役割を果たすことが示唆された。実験最終年度であるが,研究分担者の変更のため下顎運動制限マウスの作製にもやはり時間を要した。子宮外発育の期間を,できるだけ長期間としたいためJcl/ICRマウス妊娠の13.5日,14.5日での上下顎間結紮を試みたが,13.5日目の処置は著しく困難であり,確実なる結紮固定は困難と判断された。

アリザニンレッド及びアルシアンブルーで骨・軟骨を染色して検討すると,非結紮群に比較して発育遅延が認められた。光学顕微鏡的観察にては,骨・軟骨移行部は重なり,その境界が不明瞭となった。即ちperichondoriumの間葉細胞は未処置群ではスムースであるが,処置群では同部はスムースでなく,配列が不規則となり,変形している様に観察される。同時にproliferating層,prehypertrophic zoneには不均一な石灰化が認められた。次に線維芽細胞増殖因子(b-FGF)及びそのレセプター(FGFR-3)の正常顎関節の発育における発現状況を検討した所,ウエスタンブロット法で,胎児マウス,生後11日目マウス顎関節頭では成熟マウス顎関節部に比較して,b-FGF, FGFR-3ともに著明な発現を認めた。両者の免疫組織化学において胎児マウスおよび成熟マウス顎関節頭におけるb-FGF, FGFR-3の局在を確認することができたが,明らかにその染色性に差があることが明確となった。
カイメン襟細胞トランスクリプトームに多細胞動物の起源と幹細胞の起源をさぐる

H23年度に引き続きカワカイメンの芽球からの個体形成個体を用い、23年度に確立したFACSとラベリングの組み合わせにより、アーキオサイト(幹細胞)画分、襟細胞画分、その他の細胞の混合画分を分収、RNAを抽出した。SMARTer^<TM>UltraLowRNAKitfor Illumina^<○!R> Sequencingに用いられる質も良いRNAを得られたと判断出来、illuminaシークエンサーでの塩基配列決定を外注、7月にデータを得た。アセンブル(referenceとして、当研究室のESTライブラリーの配列、OISTの佐藤矩行研究室に配列決定していただいた454配列データを用いた)、アノテーションを行った。特に難しかったのは、3つの細胞画分において、発現量がどの程度差があれば「差がある」とするかという点である。様々な検討とこれまでの論文を参考にしてディスカッションを重ね、2倍以上の差を有意とした。現在、定量的な解析はさらに検討中であり、結果はまだプレリミナリーではあるが、アーキオサイトでは、DNA修復、テロメアーゼ活性、分裂中におけるゲノムの保護などに関与すると報告されている遺伝子を多く発現していると示唆されている(Figure4.B)。これは芽球からの個体形成過程において、アーキオサイトは非常に活発に分裂、自己複製と分化を行っている事実、特に自己複製の際には、幹細胞としてゲノムの保護が必要と考えられることと一致する。さらなる解析が必要であるが、、アーキオサイトにおいて、他の動物で生殖系の細胞で特異的な発現のある遺伝子について高い発現が示されたことは、これまでの当研究グループのWISHによる解析(unpublished data)と一致する傾向である。ただし、WISHによる解析と一致しない、例えばWISHでは明瞭にアーキオサイトと襟細胞の両方で特異的な発現が見られるものの、本研究では一方での発現しか見られないという例も複数あり、本研究の解析をより詰めた後に、WISHと細胞分収の個体形成過程の違いを考慮し、より深くアーキオサイトと襟細胞の分子基盤を解析・解明する手がかりとしたい。Alie博士は、平成22年11月30日に来日した。これまでに、分子生物学的な手法に関して、フランスではその一部をテクニカルスタッフに頼っており、Alie博士の経験がない部分もあったため、カワカイメンの基本的な培養法やESTクローンからプラスミド抽出、RNAプローブ作成、Whole mount in situ hybridization法など基本的な手法を習得した。さらに。多数の文献によりカイメン、カイメン幹細胞、襟細胞に関する知見を深めている。襟細胞特異的なトランスクリプトームに先立ち、カワカイメンの個体形成過程で発現している遺伝子のトランスクリプトーム解析を行うこととし、個体形成過程を大きく4つに分け、それぞれの段階のカワカイメンよりRNAを抽出に成功、何度か試みた後に品質の高いtotal RNAが得られたので、さらにoligo dTカラムを2回かけることで、mRNAを抽出、トランスクリプトームに用いるに充分量のmRNAを得ることが出来た。現在、トランスクリプトーム解析に協力してくださる、沖縄科学技術基盤整備機構佐藤矩行先生のもとに、mRNAを送付したところである。また、トランスクリプトームのアセンブル、その後のアノテーションといった作業に必要なコンピューター、ソフトウエア等の検討もすでに行っている。さらに、襟細胞をFACSでソートする為の準備を進めており、23年度早々にソートの条件検討を行う予定である。昨年度に引き続き、トランスクリプトーム解析に必要な、襟細胞分画、幹細胞(アーキオサイト)分画、その他の細胞として基底上皮細胞分画のFACSによる分取を進めた。襟細胞分画分取に関しては、すでに方法が確立していたが、カワカイメン幹細胞分画については、細胞内構造の複雑さ(SSC),細胞の大きさに基づく「幹細胞に富む分画」に留まっていたため、出来るだけ純粋な幹細胞分画を取るため、試行錯誤を繰り返した。特に困難であったのは、FACSのゲートの範囲であるが、Alie博士がFACSの技術を高める共に、経験値もあげ、最終的には大型で栄養顆粒仁富む、芽球からの個体形成過程の初期における幹細胞(アーキオサイト)のみからなる分画を得ることに成功した。比較トランスクリプトームの為には、襟細胞、アーキオサイトの試料の精製度が重要であるが、細胞種特異的な細胞表面マーカーなどが無い状況で、最大の努力いより、比較トランスクリプトーム解析を行えるだけの精度の細胞分画を得ることができた。この様にゲートを狭めたこともあり、予想よりも1度のFACSで得られる細胞数が少ないこと、平成22年度につづき、平成23年度も試料であるカワカイメン芽球の収穫量が少なく、ハッチ率も低く、成長が同調しないため、発生段階のそろった試料からのFACSが非常に困難であった。このため、SMARTer^<TM> Ultra Low RNA Kit for Illumina^<[○!R]> Sequencingを用いることとした。また、基底上皮細胞は非常に扁平な細胞であり、1個体から得られる量が少ないこと、他の細胞を吹き飛ばすという方法ではく充分に純度の高い基底上皮細胞が得られない為、分化細胞コントロールとして基底上皮細胞を用いることは断念、襟細胞、幹細胞分画以外の細胞分画を分取した。平成23年度末には、SMARTer^<TM> Ultra Low RNA Kit for Illumina^<[○!R]> Sequencingに用いられる質も良いmRNAを得られ、平成24年度にすぐにilluminaシークエンサーでの塩基配列決定を外注する予定である。

H23年度に引き続きカワカイメンの芽球からの個体形成個体を用い、23年度に確立したFACSとラベリングの組み合わせにより、アーキオサイト(幹細胞)画分、襟細胞画分、その他の細胞の混合画分を分収、RNAを抽出した。SMARTer^<TM>UltraLowRNAKitfor Illumina^<○!R> Sequencingに用いられる質も良いRNAを得られたと判断出来、illuminaシークエンサーでの塩基配列決定を外注、7月にデータを得た。アセンブル(referenceとして、当研究室のESTライブラリーの配列、OISTの佐藤矩行研究室に配列決定していただいた454配列データを用いた)、アノテーションを行った。特に難しかったのは、3つの細胞画分において、発現量がどの程度差があれば「差がある」とするかという点である。様々な検討とこれまでの論文を参考にしてディスカッションを重ね、2倍以上の差を有意とした。現在、定量的な解析はさらに検討中であり、結果はまだプレリミナリーではあるが、アーキオサイトでは、DNA修復、テロメアーゼ活性、分裂中におけるゲノムの保護などに関与すると報告されている遺伝子を多く発現していると示唆されている(Figure4.B)。これは芽球からの個体形成過程において、アーキオサイトは非常に活発に分裂、自己複製と分化を行っている事実、特に自己複製の際には、幹細胞としてゲノムの保護が必要と考えられることと一致する。さらなる解析が必要であるが、、アーキオサイトにおいて、他の動物で生殖系の細胞で特異的な発現のある遺伝子について高い発現が示されたことは、これまでの当研究グループのWISHによる解析(unpublished data)と一致する傾向である。ただし、WISHによる解析と一致しない、例えばWISHでは明瞭にアーキオサイトと襟細胞の両方で特異的な発現が見られるものの、本研究では一方での発現しか見られないという例も複数あり、本研究の解析をより詰めた後に、WISHと細胞分収の個体形成過程の違いを考慮し、より深くアーキオサイトと襟細胞の分子基盤を解析・解明する手がかりとしたい。材料であるカワカイメン芽球の質が、平成22年、平成23年と余り良くなく、芽球からのハッチ率が非常に低く、また成長が同調しなかったこと、また、FACSによるソートには、予想以上に技術習得が必要であり、トランスクリプトームに足りるだけの試料を得る為に非常に時間がかかった。最近開発された通常よりも一桁以上少ない量のmRNAからilluminaシークエンサーでの配列決定の為のライブラリーを作製出来るキットにより少ない量のmRNAでも配列決定が可能となり、平成23年度末にこのキットを用いることの出来るだけの量のmRNAを得たので平成24年度4月には早々にトランスクリプトーム解析の為の配列決定を発注する予定である。Alie氏が国内外のこの分野での研究者とのディスカッションの結果、平成23年12月に当初の454シークエンサーによる配列決定から、より正確なデータ取得が期待出来る
マイクロマシンによる流体運動動的制御の基礎研究

本研究の目的はマイクロマシンにより固体表面を微小運動させることにより,流れ場全体を制御するという目標に向けた基礎的な実験を行うことにあった.具体的には2次元キャビティーを通過するいわゆる「笛吹き」状態の流れの空力的発生音を上流側の角を微小振動させることにより制御する試み,前向きステップを越える流れに伴う剥離をステップの角を微小振動させることにより制御する試みの2つの風洞実験および数値シミュレーションにより平行して行った.2次元キャビティーの上流側の角を微小振動させることにより空力的発生音の周波数および大きさを制御する基礎実験を行った.さらにスパン方向に異なる位相で振動させ,流れ場の構造並びに空力音がどのように変化するかの実験も行った.熱線流速計による速度変動の測定結果から判断すると流れ場の構造の制御の点ではかなり成功をおさめた.しかしながら,角を微小振動させることで発生する音が流れから発生する空力音よりも大きく,空力音の制御の点ではは満足な結果が得られなかった.引き続き前向き段差を越える流れの制御も試みたが結果は2次元キャビティー同様,流れ場の構造の制御はできたが,空力音の制御はできなかった.実験と平行して数値シミュレーションによる研究を行った.この種の流れの数値シミュレーションはかど部の微小振動から流れの中に形成される大規模な渦まで,かなりスケールの異なる現象を取り扱わなければならないため困難が予想されたが,結果的には流れ場から音が発生するレベルの精度の計算コードを開発することはできなかった.しかしながら,その主な原因は計算機の計算能力の問題であり,現在の計算機の進歩の速度から考えると数年後には実用レベルに達するとの感触を得た.本研究の目的はマイクロマシンにより固体表面を微小運動させることにより,流れ場全体を制御するという目標に向けた基礎的な実験を行うことにあった.具体的には2次元キャビティーを通過するいわゆる「笛吹き」状態の流れの空力的発生音を上流側の角を微小振動させることにより制御する試み,前向きステップを越える流れに伴う剥離をステップの角を微小振動させることにより制御する試みの2つの風洞実験および数値シミュレーションにより平行して行った.2次元キャビティーの上流側の角を微小振動させることにより空力的発生音の周波数および大きさを制御する基礎実験を行った.さらにスパン方向に異なる位相で振動させ,流れ場の構造並びに空力音がどのように変化するかの実験も行った.熱線流速計による速度変動の測定結果から判断すると流れ場の構造の制御の点ではかなり成功をおさめた.しかしながら,角を微小振動させることで発生する音が流れから発生する空力音よりも大きく,空力音の制御の点ではは満足な結果が得られなかった.引き続き前向き段差を越える流れの制御も試みたが結果は2次元キャビティー同様,流れ場の構造の制御はできたが,空力音の制御はできなかった.実験と平行して数値シミュレーションによる研究を行った.この種の流れの数値シミュレーションはかど部の微小振動から流れの中に形成される大規模な渦まで,かなりスケールの異なる現象を取り扱わなければならないため困難が予想されたが,結果的には流れ場から音が発生するレベルの精度の計算コードを開発することはできなかった.しかしながら,その主な原因は計算機の計算能力の問題であり,現在の計算機の進歩の速度から考えると数年後には実用レベルに達するとの感触を得た.
蛍光標識した歯根膜幹細胞による骨芽細胞分化誘導法の確立

Gli1陽性細胞がGFP蛍光を発するマウスを用い、歯根膜からGli1陽性細胞を分取する。このマウスは、骨芽細胞へ分化するとTomato蛍光を発現する遺伝子も導入されており、分化誘導の効果を蛍光タンパク質で可視化できる。そこで、現在、臨床応用されている12種類の骨形成性サイトカインとホルモンを用い、Gli1陽性歯根膜細胞を効率的に骨芽細胞へ分化させる組合せを検索する。さらに、明らかになった組合せを歯槽骨欠損部に応用し、歯根膜幹細胞の分化誘導に注目した歯周組織再生療法の開発を目指す。
ラット臼歯モデルでの歯質吸収の発症機構:破歯細胞の分化・歯面への付着・活性化

3ヵ年での申請課題についての研究成果として、ラット臼歯外傷実験モデルと体内埋入型浸透圧ポンプの応用法を確立した。この実験系で得られた結果から、浸透圧ポンプによる可溶性因子の局所的・持続的投与法は、in situで局所環境を制御し、誘起される組織細胞応答を調べる上で有用であると結論できた。臼歯根尖部に生理活性因子(FGF2、ヘパリン、デキサメタゾン、ビスフォスフォネートHEBP)を持続投与した実験では、各生理活性因子による破骨細胞と破歯細胞の分化・活性化に及ぼす影響が異なることが確かめられた。また、オステオポンチン(OPN)の特異抗体を用いた免疫電顕での検討結果から、OPNは歯槽骨表面への破骨細胞の接着に寄与しているが、破歯細胞の象牙質表面への接着には必須因子ではない、ただし、接着後の破歯細胞自身はOPNを賛成して、歯質との強固な接着を達成していることを明らかにした。これらの成果を発展させる目的で、肉芽組織の増生とTRACP陽性細胞の集積をもたらすFGF2とともに、レチノイン酸、骨シアロ蛋白(BSP)、farnesolを投与物質とした新たな実験を開始している。レチノイン酸については濃度依存的にポンプ挿入部の周囲歯槽骨で破骨細胞性吸収が亢進しているのを確かめている。BSPについては、nativeな蛋白とともにアミノ酸配列のなかのポリグルタミン酸領域をポリアラニンに置換したリコンビナント材料も併用し、活性化サイトが破骨細胞の骨表面への付着に大きな役割を果たしている証拠を得ている。今後、この浸透圧ポンプの応用による病的環境下での歯槽骨と歯質の吸収細胞の分化・活性化の制御機構を明らかにする研究の展開を計画している。本研究の到達目標は、ラット臼歯に外傷刺激を与えた後の歯質吸収の発症機序を分子・細胞レベルで明らかにすることにある。本年度においては、当初の計画に従い、ラット上顎第一臼歯を脱臼・再植、根尖切除を施し、所定の観察期間を置いて実験動物を灌流固定した。光顕観察のために、TRAP/ALPの酵素組織化学二重染色、循環系より集積してきたマクロファージの同定にED1抗体、歯髄在住の組織球の同定にED2抗体、破歯細胞の分化・活性化の制御因子(リガンド、受容体、サイトカイン)の候補としてOPG、RANKL、RANK、IL-1、M-CSFに対する抗体を用いた免疫染色を施し、歯根膜側(セメント質/象牙質表面)と歯髄腔側(前象牙質/象牙質表面)で誘起されてくる多核の破歯細胞の分化、歯質表面への細胞付着と活性化の一連の過程を観察した。また、透過電顕post-embedding colloidal gold法により、細胞・歯質との接着に働くオステオポンチン(OPN)に着目し、セメント質、前象牙質、露出された象牙質、比較の目的で歯根膜側の歯槽骨でのOPNの局在を調べた。注目された結果として、象牙芽細胞の生存能は高く、循環系が確保された状態では外傷後に機能回復し、虚血状態においても長期間にわたり細胞形態とALP活性を保ちうることが判明した。変性に陥った象牙芽細胞は、好中球あるいは線維芽細胞様の単核細胞が象牙前質表面に侵入することにより脱落する。その後の象牙前質表面では、侵入してきた細胞群が産生するOPNなどの接着分子によって修飾される。これらの結果については、論文報告を行った。次年度に向けて、体内埋入型浸透圧ポンプを使用したラット臼歯根尖部への生理活性因子の持続投与法を確立し、象牙前質表面での細胞動態の解明を計画している。

本研究においては、病的環境下における歯質吸収の発症機序を分子・細胞レベルで明らかにするため、ラット臼歯の外傷モデルにおいて歯根膜と歯髄腔での破歯細胞の分化、歯質表面への細胞付着と活性化について検討を進めている。本年度においては、体内埋入型浸透圧ポンプを応用して、臼歯根尖部に生理活性因子(FGF2、ヘパリン、デキサメタゾン、ビスフォスフォネートHEBP)を持続投与し、根尖切除後の創傷治癒にともなう硬組織吸収活性を比較検討した。実験動物には前年度に準じて、5週齢(体重150g)の雄性SD系ラットを用いた。今回の実験から、上顎骨の所定の位置に実験溶液(制御因子)を一定の供給速度で7日間から14日間持続的に送り込むことが可能なことを実証できた。臼歯根尖部に供給された制御因子(その作用効果)は、主に組織問隙と重力方向に依存して槽内中隔の歯槽骨に波及することと、広く開削された歯根断端から根管内歯髄組織にも影響を及ぼすことが確かめられた。FGF2持続投与群では、肉芽組織の増生とTRACP陽性細胞の集積、歯槽骨表面での破骨細胞の活性化と骨吸収の亢進が認められた。FGF2/ヘパリン混合投与群においては、組織内でのFGF2の安定化を反映して、FGF2によるTRACP陽性細胞の集積効果の増強と歯槽骨吸収の波及範囲の拡大が認められた。デキサメタゾン投与群では、炎症抑制効果とともにTRACP陽性細胞の数的減少と小型化・TRACP異染などで示される機能抑制効果が顕著であった。HEBP投与群では、骨基質の産生と石灰化阻害による類骨形成が顕著であり、既存の歯槽骨(石灰化骨質)と添加された類骨の近傍でのTRACP陽性細胞では、細胞質の大きさと波状縁の発達に明らかな相違が認められた。本年度での結果から、浸透圧ポンプによる可溶性因子の局所的・持続的投与法は、in situで局所環境を制御し、誘起される組織細胞応答を調べる上で有用であると結論できた。最終年度においては、体内埋入型浸透圧ポンプを応用して臼歯根尖部に生理活性因子(FGF2、ヘパリン、デキサメタゾン、ビスフォスフォネートHEBP)を持続投与した実験結果を論文発表した。肉芽組織の増生とTRACP陽性細胞の集積、歯槽骨表面での破骨細胞の活性化と骨吸収の亢進を示したFGF2持続投与群を継続するとともに、レチノイン酸、骨シアロ蛋白(BSP)、farnesolを投与物質とした新たな実験を開始した。レチノイン酸については濃度依存的にポンプ挿入部の周囲歯槽骨で破骨細胞性吸収が亢進しているのを確かめている。BSPについては、nativeな蛋白とともにアミノ酸配列のなかのポリグルタミン酸領域をポリアラニンに置換したリコンビナント材料も併用し、活性化サイトが破骨細胞の骨表面への付着に大きな役割を果たしている証拠を得ている。また、昨年度までに破歯細胞が歯質表面に接着、吸収窩を成立させる過程でオステオポンチン(OPN)の局在を免疫電顕で調べてきたが、OPNのエピトープの異なる3種類の抗体、およびBSPに対する2種の抗体を用いた免疫電顕での観察を継続している。これらの研究成果については、平成15年6月のIADR国際学会で発表する。3年間の研究成果として、浸透圧ポンプによる可溶性因子の局所的・持続的投与法は、in situで局所環境を制御し、誘起される組織細胞応答を調べる上で有用であると結論できた。この実験モデルを応用して、病的環境下における歯槽骨と歯質の吸収細胞の分化・活性化の制御機構を明らかにする研究の展開を計画している。
共同所有制度による景観・環境等の保全

この研究は、共同所有という制度によって、景観・環境等を保全することができるかを明らかにすることを目的とした。マンションの法制度、沖縄久高島の土地所有制度、ドイツ法などを検討した結果、次のような結論が得られた。共同所有という制度があれば、ただちに、景観・環境等を保全することができるわけではない。複数人が、景観・環境等を保全する意思・目的を持っている場合に、これを持続させるための手段として、共同所有という制度が活用できる。本研究は、「紛争の母」といわれてきた共同所有制度が、景観・環境等を保全できる制度となり得ることを明らかにすることを目的としている。平成25年度は、3カ年計画の2年目にあたり、日本における具体的な問題状況の検討、区分所有についての実態調査(聞き取り調査)、ドイツにおける共同所有制度の理論的検討を行った。第1に、区分所有制度について、多くの紛争が生じている一つの原因として、権利構造が複雑であり、その理解不足があることを明らかにした。第2に、円滑・適正な管理が行われているマンションについての聞き取り調査を行った。そこでは、コミュニティ形成が、日常的な管理はもちろん、震災等の非常事態からの回復に際しても重要な役割を果たすことが明らかとなった。さらに、区分所有法等の法制度に対する正確な知識を有することが、紛争を未然に防止しうることもわかった。管理・コミュニティ形成の関係について、さらに検討を深めることが今後の課題である。第3に、沖縄久高島について、島の長年の歴史からくる「島民の意識」により景観・環境等が保全されているのであり、歴史等の特殊性がない限り、他の地域に応用することは難しいとの結論に至った。第4に、日本の共同所有制度に大きな影響を与え続けているドイツ共有法について、現地で文献収集等を行い、近時の議論を検討した。日本と異なり、ドイツでは、共有者に共有物の管理義務が負わされている。このことにより、共有物の適切な維持管理がなされ、その結果、共有による景観・環境等が保全されている可能性がある。この点、さらに検討を深めたい。本研究は、共同所有制度が、景観・環境等を保全できる制度となりうることを明らかにすることを目的とする。平成24年度は、3カ年計画の初年度にあたり、第1段階として、日本における具体的な問題状況の検討、および、特殊な共同所有制度を採用する沖縄・久高島での実態調査(聞き取り調査)を行った。第1に、区分所有制度について、景観・環境等を保全するための機能を果たしうる諸制度についての比較・検討作業を行った。その結果、日常的な管理、さらには、そのためのコミュニティ形成が、景観・環境等の保全のために何よりも重要であることが明らかとなった。そこから、法律上「管理」を義務化することが考えられる。ただ、共有制度において、管理を義務化することが理論的に問題を生じさせないかが今後の検討課題である。第2に、沖縄・久高島について、共同所有制度により景観・環境等の保全が行われている理由を検討した。従来、その理由は「総有」という共同所有制度だといわれてきた。しかしながら、実態調査の結果、島の人々の島に対する「意識」こそが景観・環境等の保全の真の理由であり、「総有」は意識を明確化するための法的手段に過ぎないことが明らかとなった。今後は、久高島の状況を参考にしながら、どのように共有制度を維持するための意識を醸造できるかについて検討する必要がある。第3に、日本の共同所有制度に大きな影響を与えてきた、ドイツ共同所有法について文献収集を行った。ドイツにおいて共同所有関係は主に債権関係として規定されているが、物権関係の観点から捉える新たな見解が生じている。この点、さらに詳しく検討を行いたい。本研究は、従来、「紛争の母」といわれてきた共同所有制度が、景観・環境等を保全できる制度となり得ることを明らかにすることを目的とした。平成26年度は、3カ年計画の最終年度にあたり、共同所有理論を再構成するための比較法的研究と、共同所有制度の現代的意義を明らかにすることによって、研究全体のまとめを行った。第1に、区分所有制度について、紛争を防止し、景観・環境等を保全できる法制の構築を目指した。景観・環境等の保全、その前提となるマンション管理を円滑化するためには、コミュニティ形成を促すことが必要となる。しかし、国土交通省が定める標準管理規約のコミュニティ条項は、このために機能していないどころか、紛争を誘発する手段となり得ることが明らかになった。第2に、沖縄久高島においては、歴史・島民の意識が、島全体の景観・環境等を保全していること、それを継続させるための手段して、共同所有制度が選ばれていることを確認した。第3に、ドイツ法との比較を通じて、団体法制と共有法制には連続性があること、構成員に団体・共有財産の管理義務を負わせることが重要であることが明らかになった。構成員に財産管理義務を負わせることにより、景観・環境等を含めた財産状態が維持できるといえる。第4に、共同所有という法形式をとれば、必ず景観・環境等が保全できるわけではない。