hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞がん化に伴うアラキドン酸に対する増殖応答の変化

癌細胞は、正常細胞が複数の遺伝的変異を積み重ねて段階的な変化を起こした結果、異常増殖するようになった細胞と考えられている。私達は、ゴールデンハムスター(Syrian/golden hamster)胎児由来の正常2倍体細胞を継代培養すると、継代数に依存して悪性形質が発現するようになることを報告しており、この系を利用することにより、癌化の多段階発癌を細胞レベルで追うことを可能にした。本研究では、造腫瘍性を示さない継代数38のゴールデンハムスター細胞(GHEp38)と造腫瘍性を示すようになった継代数69の細胞(GHEp69)の増殖と運動性に対するアラキドン酸の作用を調ベた。アラキドン酸はp38細胞の増殖に影響を与えないが、p69細胞の増殖を促進し、がん化に伴いアラキドン酸に対する細胞の増殖応答が変化することが明かとなった。この増殖促進作用は、パルミチン酸では観察されないが、オレイン酸、リノール酸などでも観察された。また、プロスタグランジン合成酵素やCキナーゼのの阻害剤を用いた実験から、アラキドン酸などの作用はプロスタグランジン合成を介さずに、脂肪酸が直接Cキナーゼを活性化することにより引き起こされることが示唆された。一方、ヒト胃がん細胞に対しては、アラキドン酸は増殖促進作用を示さなかったが、ボイデンチャンバーを用いた実験から運動性を著しく促進することが分かった。アラキドン酸はp69細胞の運動性は促進しないので、アラキドン酸の細胞増殖や運動性に対する作用は、がん細胞の種類によって異なっていた。本研究は、プロスタグランジン、アラキドン酸、あるいはアラキドン酸を含めた多種類の脂肪酸が、細胞増殖・運動性に影響を与えることを明かにしており、ロイコトルエンも含めたこれら分子の細胞内シグナル伝達における役割は興味深い。一般にがん細胞は,正常細胞が複数の遺伝的変異を積み重ねて段階的な変化を起こした結果,異常増殖するようになった細胞と考えられている。がん化のメカニズムを明かにするためには、がん化とがん遺伝子などの関係を調べると同時に,がん化に伴い増殖に必要な細胞増殖シグナルがどのように変化していくか解析する必要がある。本研究では,この細胞増殖のシグナルの変化を調べるために次のことを行った。(1)試験管内でゴ-ルデンハムスタ-胎児細胞を継代することにより,造腫瘍性を獲得した細胞が得られることを見いだし,がん化の多段階性を細胞レベルで追える実験系を確立した。継代数38のゴ-ルデンハムスタ-細胞(p38)は軟寒天コロニ-中でのコロニ-形成能,造腫瘍性を示さないが,継代数69の細胞(p69)ではこれらの性質を獲得していた。(2)p38,p69細胞の増殖に対する上皮細胞増殖因子(EGF)および脂肪酸の影響を調べた。両細胞ともEGFにより増殖が促進され, ^<125>IーEGF結合量は変わらないことから,がん化の原因としてEGF受容体数,親和性の変化が起きている可能性は否定された。一方脂肪酸に関しては,アラキドン酸,エイコサペンタエン酸,リノ-ル酸,オレイン酸はp38の増殖に影響を与えず,p69の増殖を特異的に促進した。しかし,パルミチン酸はいずれの細胞の増殖も促進しなかった。アラキド酸などの脂肪のp69に対する作用は,プロスタグランジン合成阻害剤のインドメタシンにより抑えられず,アラキドン酸はプロスタブランジン合成を介さず細胞増殖を促進していると考えられる。Cキナ-ゼはアラキドン酸などの脂肪酸により活性化されるが,パルミチン酸によっては影響を受けないことが知られており,アラキドン酸などの脂肪酸はCキナ-ゼに作用してp69の増殖を促進している可能性がある。

本研究は、プロスタグランジン、アラキドン酸、あるいはアラキドン酸を含めた多種類の脂肪酸が、細胞増殖・運動性に影響を与えることを明かにしており、ロイコトルエンも含めたこれら分子の細胞内シグナル伝達における役割は興味深い。癌細胞は、正常細胞が複数の遺伝的変異を積み重ねて段階的な変化を起こした結果、異常増殖するようになった細胞と考えられている。私達は、ゴールデンハムスター(Syrian/golden hamster)胎児由来の正常2倍体細胞を継代培養すると、継代数に依存して悪性形質が発現するようになることを報告しており、この系を利用することにより、癌化の多段階発癌を細胞レベルで追うことを可能にした。前年度の研究より、造腫瘍性を示さない継代数38のゴールデンハムスター細胞(GHEp38)と造腫瘍性を示すようになった継代数69の細胞(GHEp69)の増殖に対するアラキドン酸の作用を比較すると、アラキドン酸はp38細胞の増殖に影響を与えないが、p69細胞の増殖を促進することが明らかになった。また、アラキドン酸はプロスタグランジン合成を介さずに作用を示すこと、オレイン酸などの他の脂肪酸でも同様の作用が観察されることも明かになっている。今年度は、Cキナーゼの阻害剤スタウロスポリンの使用により、アラキドン酸はCキナーゼの活性化を介して細胞増殖を促進している可能性を示した。また、アラキドン酸は低分化型、高分化型ヒト胃がん細胞に対しては、増殖促進作用を示さないが、ボイデンチャンバーを用いた実験から運動性を著しく促進することが分かった。アラキドン酸はp69細胞の運動性は促進しないので、アラキドン酸の細胞増殖や運動性に対する作用は、がん細胞の種類によって異なっていた。
カーボンナチューブの生成に及ぼす金属の効果

これらの金属を含まないグラファイト棒の蒸発による結果と対比して、金属の効果がそれをどのように変えるのかを明かにすることをその次のねらいとした。金属としては、金属内包フラーレンの研究(H.Shinohara et al.;Nature357(1992),pp.52-54)を行ったときに用いたScを原料グラファイト棒に混入して蒸発した。それによって、ナノチューブの生成がどのように変化するのかを主に分子研にあるFE-SEM(走査型電子顕微鏡)を借用して調べた。その結果、前からある程度は予測できていたように、Scを適当量混入することによってカーボンナノチューブの生成が著しく促進されることが明らかになった。(M.Ohkohchi etal.;Jpn.J.Appl.Phys.32(1993),pp.L1248-L1251)より長く太く成長したカーボンナノチューブを成長させるのにScが適していることが明らかになった訳である。ところが、他の金属(FeあるいはCo)を混入したグラファイト棒の蒸発では、全く逆の効果が得られることがNECやIBMのグループによって見いだされた。今後、金属の種類によってどうしてナノチューブの成長が促進されたり抑制されたりするのかを明らかにしていきたい。
亜鉛の恒常性の破綻とエキソソームを介した軟骨代謝異常の解析

本研究課題では、Cre-loxPシステムを用いた骨・軟骨特異的ZIP10(亜鉛トランスポーター)欠損マウスを用いて、亜鉛トランスポーターZIP10の欠如に伴う骨格形成異常のメカニズムの解明を目的に解析を進めている。骨および軟骨特異的ZIP10欠損マウスはいずれも出生率が低く、胎生期より四肢の長さの短縮による骨格形成異常と顎顔面骨の形成異常を生じた。1年齢の軟骨特異的特異的ZIP10欠損マウスにおいても骨格成長障害は顕著であり亜鉛およびZIP10が骨格形成・維持に必須であることが明らかとなった。一方で、組織におけるZip10 promoterの活性化を確認するため、Zip10-GFP knock-inマウスを作製し、胎生期や成体でのZip10の活性化について解析を行った。さらに、次世代シークエンス法を用いたGene Ontology解析から、ZIP10を欠損した骨軟骨組織では、Vesicle (微小小胞体;MV)やExosome(細胞外小胞体/エキソソーム;MVB)に関わる遺伝子群の変動が高く、亜鉛が小胞輸送やタンパク分泌を制御する可能性が高いこと、また、細胞死やアポトーシスに関わる遺伝子群の変動が高く、ZIP10が直接的あるいは間接的に細胞の生存に関わることを見いだした。さらに、マウスから採取した初代培養細胞を用いて、さらに定常的に発現するZIP10の発現が破綻した際の細胞死やERストレス、細胞内シグナルの変化について培養細胞を用いてZIP10のgain-とloss- of functionを解析している。作製マウスの致死が多くみられ、解析に苦労し、実験を前後しながら計画にそって実験をすすめている。作製マウスの致死が多くみられるため、CreERシステムを用いることでタモキシフェンを用いて時期特異的な制御をすることで、in vitroの実験への応用を計画している。初代培養の未分化間葉系幹細胞や骨芽細胞、軟骨細胞を採取し培養中に形成されたExosomeの解析を行う。受託研究で行なったRNAシークエンスの請求が分割され年度をまたいだため差が生じたが、次年度に支払い予定である。
オルガネラ量の恒常性を保つシステムの根底原理の解明

真核生物において、好気呼吸によるATPの合成や細胞外へのタンパク質分泌、脂質の代謝などの細胞の生命機能に必須な反応は、ミトコンドリアや小胞体、ペルオキシソームなどの細胞内小器官(オルガネラ)で分担して遂行される。哺乳類を含む高等動物においては、同じ種類の細胞間では、各オルガネラの量は驚くほど類似している。この事実は、それぞれの種類の細胞に、オルガネラ量の正常範囲があり、この正常範囲内にオルガネラ量を戻す恒常性維持機構が存在することを示唆しているが、十分には研究されていない。本研究では、このオルガネラ量の恒常性を維持する機構の解明を目指す。
MUC-1抗原提示樹枝状細胞を用いた膵癌に対するCTL誘導の試み

ヒト膵臓癌患者末梢血より樹状細胞を分離し、ヒトIL-4及びGM-CSFにて7日間培養して成熟樹状細胞を誘導した。成熟樹状細胞の表面マーカーをFACSにて解析した結果、CDla,llb,14,16,80,83,86,HLA-A,B,C,HLA-DR,ICAM-1の表出を認めた。特にCD1a,14,16,83はその表出に個人差が認められた。成熟樹状細胞を合成MUC-1ペプチド(アミノ酸配列:C-PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)にてパルスし、患者自己リンパ球と混合培養してMUC-1特異的CTLを誘導した。In vitroでのCytotoxicity assayにてこのCTLはMUC-1陽性自己膵臓癌及びMUC-1陽性非自己膵臓癌株に対して高い細胞障害活性を示したが、MUC-1陰性大腸癌株及びMUC-1陰性肝細胞癌株に対しては細胞障害活性を示さず、MUC-1抗原特異的細胞障害活性を示した。さらにこの細胞障害活性は抗MUC-1抗体添加により著明に抑制された。また誘導されたMUC-1特異的CTLはMUC-1抗原に反応してTypelサイトカインの産生を認めた。当科における膵臓癌手術標本を用いて免疫染色とFACSにてMUC-1の発現を検討した結果、12例の膵臓癌全例にMUC-1抗原の発現を認めた。また膵臓癌以外に胆管細胞癌でも高率にMUC-1抗原の発現が確認された。以上本研究により合成MUC-1ペプチド捉示自己樹状細胞を用いてMUC-1抗原特異的CTLの誘導が可能であり、MUC-1陽性ヒト膵臓癌、胆管細胞痛癌に対する新しい免疫療法として臨床応用への期待が示された。本年度は最初にヒト膵臓癌患者からの自己樹状細胞の分離培養系の確立を研究した。膵臓癌患者自己末梢血よりFicoll-Perque比重遠心分離法にて単核細胞層を採取し、37度にて2時間静置培養し非付着細胞を取り除き、ヒトGM-CSF及びIL-4添加培養液にて710日培養して成熟樹状細胞を誘導した。この樹状細胞は樹枝状の突起を有し、CD11b,CD14,CD83,HLA-A,B,C,HLA-DR,CD80(B7.1),CD86(B7.2)の表出をFACSにて認めた。この樹枝細胞を自己膵臓癌でパルスして自己リンパ球と混合培養することにより自己腫瘍特異的な細胞障害活性を有するCTLが誘導可能であった。次に膵臓癌におけるMUC-1抗原の発現を調べるために、新鮮膵臓癌細胞をFACSにて解析したところMUC-1抗原の発現を全例に認めた。さらに過去の切除標本におけるMUC-1抗原の発現を免疫染色で検索中である。MUC-1抗原ペプチドの合成はすでにアメリカでFDAによる臨床使用の許可がおりているUniv.of Pittsburghの免疫学教室(Prof.Finn OJ)に依頼して合成した(アミノ酸配列:C-PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)。このペプチドは現在臨床試験が開始されており、今後我が国での臨床治療に向けて安全性の評価が可能なペプチドであると考えられる。平成10年度にはMUC-1抗原ペプチドにてパルスした自己樹状細胞を用いてCTLを誘導し、その自己膵臓癌、MUC-1抗原陽性膵臓癌株に対する細胞障害活性と抗原特異的Type1/Type2サイトカイン産生能を評価する予定である。
固体増殖材表面におけるトリチウムの移動現象

代表的固体増殖材の候補であるLiAlO_2,Li_2ZrO_3およびLi_4SiO_4に対するトリチウム水の吸・脱着特性値を実験的に求め、世界で初めての相関式を得ることができた。この結果、固体増殖材表面におけるトリチウムの挙動がブランケットのトリチウムインベントリ-の主決定要因であることが確められた。また従来報告されているこれら固体増殖材グレイン内の拡散係数には表面反応の効果が大きく加味されていることも確めることができた。またブランケット材充填層に水素を含んだパ-ジガスを流通せしめると水分の発生することが認められたが、この現象は本研究によって世界で初めて見付けられたものである。代表的トリチウム増殖材の1つであるLiAlO_2に対するトリチウム水の吸・脱着特性値を実験的に求めることができた。この結果LiAlO_2におけるトリチウムベントリ-は増殖材表面の吸着量が支配的で従来言われていた粒子内拡散インベントリ-の影響は逆に少いことが確められた。また脱着破過曲線から求めた物質移動係数の傾向から判断して、従来報告されているLiAlO_2の拡散係数は表面反応による物質移動抵抗の影響を強く受けており、真の拡散抵抗はもっと小さいとみられることが判った。今年度は、前年度のLiAlO_2に続き、Li_4SiO_4およびLi_2ZrO_3についてトリチウム水の吸・脱着特性値を実験的に得ることができた。この結果、従来言われていたこととは異り、どの固体増殖材においても粒子内拡散よりは表面反応の方が支配的であるとの新しい知見を得ることができた。本研究によって得られた結果をLiAlO_2についてのin situ実験結果の解析に応用した所、今までまとめられなかった実験結果を精度良くまとめることができた。代表的トリチウム増殖材であるLiAlO_2,Li_2ZrO_3およびLi_4SiO_4に対するトリチウム水の吸・脱着特性値を実験的に求め、世界で初めての相関式を得ることができた。この結果、固体増殖材表面におけるトリチウム水の吸・脱着現象がブランケットにおけるトリチウムインベントリ-の主決定要因で、従来言われていた粒子内拡散インベントリ-の影響は特殊な場合を除いて少ないことが確かめられた。またトリチウム水の脱着破過曲線から求めた物質移動係数の傾向から判断して、従来報告されている固体増殖内の拡散係数の値は表面反応による物質移動抵抗の影響を強く受けており、真の拡散係数はもっと小さいとみられることが判明した。
ステップソルダリングを可能にする低温対応Sn-Bi系鉛フリーはんだの開発

エレクトロニクス実装において低耐熱性材料の実装やステップソルダリングなどに対応可能な低温実装プロセスの開発が要望されており、それに用いるはんだも、現在広く使用されている鉛フリーSn-Ag-Cuはんだより低い低融点はんだの開発が必要である。その一つであるSn-Bi共晶はんだは融点が139°CとSn-Pb共晶はんだよりも低いが、延性の低さが問題視されていた。本研究ではAgを添加することによりSn-Biはんだの組織が微細になり、延性が向上することを見出し、さらにそのSn-Bi系はんだを用いて低温実装した接合部でもSn-PbはんだやSn-Ag-Cuはんだ並の強度が得られることが明らかとなった。また、低温で実装することにより、基板の反りやパッド剥離が起こりにくいことも確認され、周囲への熱応力の少ない実装が行なえる可能性が示唆された。この効果を確認するため、基板とはんだとの界面反応の速度論的解析と、基板と基板との間に発生する残留応力解析を行なった。その結果、Sn-Bi系はんだとCu基板との界面に形成する金属間化合物反応層はSn-Pbはんだなどの場合と同じく、Cu6Sn5層であり、実装温度を低くすることによりその層厚を小さくすることができた。80-125°Cの高温放置に伴う反応層の成長も、そのメカニズムは他のはんだと同様であり、融点のわずか15°C下の温度でも反応が加速されることはなかった。このことにより、低温実装により反応層成長を抑制することができることが明らかとなった。また、Sn-Bi系はんだは、他のはんだと比べて熱膨張係数が小さいなど、溶融状態から室温までの冷却に伴う体積膨張は小さい材料であるため、結果として残留応力を小さくできることが確認された。以上の結果より、Sn-Bi系はんだの材料的特性と、低温実装による効果をあわせることにより、より低熱負荷実装が可能であることが確認された。エレクトロニクス実装において低耐熱性材料の実装やステップソルダリングなどに対応可能な低温実装プロセスの開発が要望されている。実装に用いるはんだも、現在広く使用されている鉛フリーSn-Ag-Cuはんだより低い低融点はんだの開発が必要である。低融点鉛フリーはんだの一つであるSn-Bi共晶はんだは融点が139°CとSn-Pb共晶はんだよりも低く、リフロー温度を大幅に下げることが可能である。延性の低さが大きな問題視されているがAgを添加することによりSn-Biはんだの組織が微細になり、延性が向上するという報告がある。本研究では、Sn-Bi共晶はんだにAgを微量に添加することによる、はんだおよびそれを用いた実装部特性への影響について検討行った。Sn-Bi系はんだの引張強度はSn-Pbはんだよりも強く、Agを0.22.5%添加するとひずみ速度が小さい場合にはSn-Pb共晶はんだ以上に延性が向上した。さらにSn-Bi-Ag系はんだの三元共晶点はSn-54.1Bi-0.3Ag付近に存在することが算出され、Ag量が0.3w%以下ではSnが初晶として晶出し、0.3w%以上ではAg_3Snが初晶として晶出することを明らかにした。

組織は組成だけでなく冷却速度にも大きく影響を受けるため、微細化には3元共晶組成に近づけることに加えて、冷却速度を早くする必要性が確認されたが。接合部の強度試験ではリフロー温度160°CでもSn-PbはんだやSn-Ag-Cuはんだと同程度以上の強度が得られ低温実装が可能であることが示された。また引張試験でSn-PbはんだとSn-Ag-Cuはんだでランド剥離が発生したが、Sn-Bi系はんだでは発生しなかったためランド剥離抑制の効果が期待できる。CSP接合部では温度サイクル試験による寿命はSn-Pbはんだに比べ長くなった。以上より、Sn-Bi系はんだは低温実装による接合部でもSn-PbはんだやSn-Ag-Cuはんだ並の十分な強度が得られることが明らかとなった。エレクトロニクス実装において低耐熱性材料の実装やステップソルダリングなどに対応可能な低温実装プロセスの開発が要望されている。実装に用いるはんだも、現在広く使用されている鉛フリーSn-Ag-Cuはんだより低い低融点はんだの開発が必要である。低融点鉛フリーはんだの一つであるSn-Bi共晶はんだは融点が139°CとSn-Pb共晶はんだよりも低く、リフロー温度を大幅に下げることが可能である。延性の低さが大きな問題視されているがAgを添加することによりSn-Biはんだの組織が微細になり、延性が向上する。昨年度までの研究によりSn-Bi系はんだは低温実装による接合部でもSn-PbはんだやSn-Ag-Cuはんだ並の十分な強度が得られることが明らかとなった。さらには、低温で実装することにより、基板の反りやパッド剥離が起こりにくいことも確認され、周囲への熱応力の少ない実装が行なえる可能性が示唆された。本年度はこの低熱不可実装の効果を確認するため、基板とはんだとの界面反応の速度論的解析と、基板と基板との間に発生する残留応力解析を行なった。Sn-Bi系はんだとCu基板との界面に形成する金属間化合物反応層はSn-PbやSn-Ag-Cuはんだの場合と同じく、Cu6Sn5層であり、実装温度を低くすることによりその層厚を小さくすることができた。80-125°Cの高温放置に伴う反応層の成長も、そのメカニズムは他のはんだと同様であり、融点のわずか15°C下の温度でも反応が加速されることはなかった。このことにより、低温実装により反応層成長を抑制することができた。Sn-Bi系はんだは、他のはんだと比べて熱膨張係数が小さく、またBiは溶融にともない体積膨張する数少ない元素であるため、溶融から室温までの冷却に伴う体積膨張は小さく、結果として残留応力を小さくできることが確認された。以上の結果より、Sn-Bi系はんだの材料的特性と、低温実装による効果をあわせることにより、より低熱負荷実装が可能であることが確認された。
英語表現力向上のためのポートフォリオ活用学習のカリキュラム開発研究

文科省は「学力向上アクションプラン」や「『英語が使える日本人』の育成のための行動計画」を示しているが、本研究の主な目的は「教授ツールとしてのポートフォリオを活用し、看護学生を対象に、英語の実践的コミュニケーション能力の向上に実証的に取り組む」ことであり、同プランや行動計画の趣旨や目標を看護学生を対象とし具現化することを目指している。一般的に、看護学生の「英語の学習意欲や運用力」は十分であるとは言い難いが、外国人看護士の導入も想定されていることから、看護の現場においてもコミュニケーションの手段として英語が用いられる機会が今後さらに増大していくことが予想される。本研究はそのような社会的ニーズに応えていくことを目指している。同時に英語を自律的に学ぶ態度が身につくことをねらいとしている。昨年度は自己調節学習者の育成を目指す英語表現(英作文・スピーチ)を題材とし、show and tellの手法を用いてポートフォリオ活用した学習を実施したが、学習全体への評価は必ずしも高いとは言えず、さらに内容を改善することが今年度の課題として残された。そこで、今年度は昨年度の改善版を準備し、2006年5月から7月まで、研究協力校の新潟県内看護学校1年生39名を対象に、ポートフォリオを教授ツールとして用いた授業を行った。今年度の主な改善点は、学生同士の協同学習の時間を増やし、また教員からの支援の機会も多くしたことである。授業終了後事後アンケートを実施し、昨年度と今年度の事後アンケートの結果を比較分析したところ、show and tell手法を用いた今年度の学習において、学習者の協同に関する方略の使用意識に向上がみられ、その結果として学習全体への評価も向上していたことがわかった。本研究の成果であるが、本研究を行ったこの2年間をとおして、看護学生を対象とした英語表現力(英作文・スピーチ)向上のためのポートフォリオ活用学習のカリキュラムと教材を開発した。この学習は約3ヶ月をかけて実施するものである。「教授ツールとしてのポートフォリオを活用し、看護学生を対象に、英語の実践的コミュニケーション能力の向上に実証的に取り組む」ことが、本研究の主な目的である。既に文科省から「学力向上アクションプラン」や「『英語が使える日本人』の育成のための行動計画」が示されている。本研究は、同プランや行動計画の趣旨や目標を、看護学生を対象とし具現化することを目指している。一般的に、看護学生の「英語の学習意欲や運用力」は十分であるとは言い難い。一方、看護の職場においてもコミュニケーションの手段として英語が実用される機会が今後も増大することが予想されている。今年度は、そのためのトライアル版として、新潟県内の看護学校1年生36名を対象に、自己調節学習者の育成を目指して、英語表現(英作文・スピーチ)力を題材に、show and tellの手法を用いて2005年5月から7月までの期間、ポートフォリオを教授ツールとして用いて授業を行った。事前・事後アンケートの結果を分析したところ、show and tell手法を用いた本学習において、特にスピーチ方略使用への意識が高まっていた。入学後すぐに、英語のスピーチの比重が多い内容を扱ったため、不安傾向の強い、英語でのスピーチ活動に学習者の注意が向いたためであると考えられる。しかし、学習全体への評価は必ずしも高いとは言えず、成人対象のshow and tellの手法は必ずしも適切であったとは言えなかった。スピーチの内容をみると、ペットや高校時代などであったことから、show and tellの手法は必ずしも学習者の知的のレベルに合致していなかったと判断される。

次年度は、スピーチの教材として看護学生の知的レベルに合致する内容を工夫する予定である。文科省は「学力向上アクションプラン」や「『英語が使える日本人』の育成のための行動計画」を示しているが、本研究の主な目的は「教授ツールとしてのポートフォリオを活用し、看護学生を対象に、英語の実践的コミュニケーション能力の向上に実証的に取り組む」ことであり、同プランや行動計画の趣旨や目標を看護学生を対象とし具現化することを目指している。一般的に、看護学生の「英語の学習意欲や運用力」は十分であるとは言い難いが、外国人看護士の導入も想定されていることから、看護の現場においてもコミュニケーションの手段として英語が用いられる機会が今後さらに増大していくことが予想される。本研究はそのような社会的ニーズに応えていくことを目指している。英語を自律的に学ぶ態度が身につくことをねらいとしている。昨年度は自己調節学習者の育成を目指す英語表現(英作文・スピーチ)を題材とし、show and tellの手法を用いてポートフォリオ活用した学習を実施したが、学習全体への評価は必ずしも高いとは言えず、さらに内容を改善することが今年度の課題として残された。そこで、今年度は昨年度の改善版を準備し、2006年5月から7月まで、研究協力校の新潟県内看護学校1年生39名を対象に、ポートフォリオを教授ツールとして用いた授業を行った。今年度の主な改善点は、学生同士の協同学習の時間を増やし、また教員からの支援の機会も多くしたことである。授業終了後事後アンケートを実施し、昨年度と今年度の事後アンケートの結果を比較分析したところ、show and tell手法を用いた今年度の学習において、学習者の協同に関する方略の使用意識に向上がみられ、その結果として学習全体への評価も向上していたことがわかった。本研究の成果であるが、本研究を行ったこの2年間をとおして、看護学生を対象とした英語表現力(英作文・スピーチ)向上のためのポートフォリオ活用学習のカリキュラムと教材を開発した。この学習は約3ヶ月をかけて実施するものである。
大腸菌のSOS応答における細胞増殖の制御機構

本研究では、細胞分裂阻害蛋白質SulAに着目している。DNAが紫外線や放射線、変異原物質などで傷つけられたとき、大腸菌においては、SOS応答と呼ばれる一連の転写調節機構を発動させて、DNAの修復を行う。この応答には、細胞増殖を一時的に停止させるために、分裂阻害蛋白質SulAの一過的な産生がみられる。SulA蛋白質による細胞分裂阻害の機構は、細胞分裂に関わるFtsZ蛋白質をその標的にしていることが、これまでの遺伝学的研究から報告されているが、その生化学的詳細は不明であった。そこで本研究において、maltose binding protein (MBP)のfusion SulA蛋白質とFtsZ蛋白質とを精製し、in vitro系で両者の相互作用について検討した。その結果、(1)FtsZ蛋白質とSulA蛋白質はGTPの存在下で安定な複合体を形成すること。(2)この反応にはGTPの水解が必要であること。(3)また複合体は両蛋白質分子1:1で形成されること。などが明らかになった。また遺伝学的手法によりプラスミド上にsulA遺伝子をclone化し、SulA蛋白質が多量生産される条件下でも細胞増殖が阻害されないsuppressor変異株を約20株分離した。それらの変異位置を決定したところ、一つのグループはプラスミドのコピー数を制御するpcnB遺伝子であり、もう一方は、ftsZ遺伝子の変異であった。前者はプラスミドのコピー数を低下させ、その結果SulA蛋白質の多量生産を抑制する変異であった。後者のftsZ変異は、SulA以外にも、大腸菌が先端部で分裂しないように制御しているもう一つの細胞分裂阻害因子MinCDに対しても阻害がかからなくなる変異であった。以上の結果から、細胞分裂阻害因子SulAは直接的にFtsZと相互作用すること、また別の細胞分裂阻害因子MinCDもSulAと何らかの類似する機構によりFtsZをターゲットとして細胞分裂の制御を行っていることが示唆された。さらにSulAは特異的なプロテアーゼにより速やかに分解されることが知られている。生体内ではこの積極的な分解機構により、DNA修復後の細胞分裂周期の再開が保証されている。SulAの機能領域の分子解剖の結果、そのC末端の数アミノ酸残基がこの分解に重要な領域であることがin vitroとin vivoの両系で証明できた。この応答には、細胞増殖を一時的に停止させるために、細胞分裂阻害蛋白質SulAの一過的な産生がみられる。SulA蛋白質による細胞分裂阻害の機構は、細胞分裂に関わるFtsZ蛋白質をその標的にしていることが、これまでの遺伝学的研究から報告されているが、その生化学的詳細は不明である。そこで本年度の研究では、maltose binding protein(MBP)のfusion SulA蛋白質(ref.Sonezaki et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.in press)とFtsZ蛋白質とを精製し、in vitro系で両者の相互作用について検討した。

その結果、(1)FtsZ蛋白質とSulA蛋白質はGTPの存在下で安定なcomplexを形成すること。(2)この反応にはGTPの水解が必要であること。(3)またcomplexは両蛋白質分子1:1で形成されること。などが明らかになった。またプラスミド上にSulA遺伝子をclone化し、遺伝学的手法により、SulA蛋白質が多量生産される条件下でも細胞増殖が阻害されないsuppressor変異株を約20株分離した。それら変異の位置をtransposon Tn10によるmapping法(ref.A.Higashitani et al.,(1994)Nucl.Acids Res.22、2426-2427)で決定した。遺伝子DNAが紫外線や放射線、変異原物質などで傷つけられたとき、細菌から人に至るまで全ての生物は、細胞増殖を一時的に停止させ、それらDNA損傷を修復する機構を保持していることが知られてきた。DNAの損傷を修復することなしに細胞増殖を続けると、娘細胞に突然変異が蓄積し、癌化や細胞死へとつながる。大腸菌においては、DNAに損傷を受けたときSOS応答と呼ばれる一連の転写調節機構を発動させて、DNAの修復を行う。この応答には、細胞増殖を一時的に停止させる為に細胞増殖阻害蛋白SulAの一過的な産生がみられる。今年度までの本研究により、SulA蛋白による細胞増殖阻害の機構は、細胞分裂に関わるFtsZ蛋白をその標的にしていることが、生化学的にも遺伝学的にも明らかになった。また細胞増殖阻害蛋白SulAのC末端から種々の欠失変異を作成し、in vivoにおける細胞増殖阻害活性を調べ、活性に必要な領域を検討した。その結果、C末端から21アミノ酸残基の欠失においては細胞増殖阻害活性が認められたが、34残基以上の欠失においてはその活性が失われた。大腸菌のSOS応答においては細胞分裂を一時的に停止させるために、169アミノ酸残基からなる細胞分裂阻害蛋白質SulAの一過的な産生が生じる。本年度はSulAのN末端30番目から130番目までにおける全ての塩基性アミノ酸とleu 67,glu 76,trp 87,val 115,glu 126とをそれぞれアラニンに置換した変異体を作成し、それら置換変異体の細胞分裂阻害活性を調べた。その結果,arg 62,leu 67,trp 77,lys 87の4箇所のアラニン置換変異体は細胞分裂阻害活性を失うことが明らかになった。arg 39,lys 72,arg 75,glu 76,his 98,arg 105,arg 108,val 115,gly 117,glu 126,his 128の11の置換変異体においては分裂阻害活性が認められた。すなわちSulAの中央部の領域は分裂阻害活性に重要な領域であることが示唆された。
看護技術パフォーマンス監査-気管内吸引技術の安全性に関する研究-

健常者120名の自己排痰をパパニコロ-染色で分析した結果より、強制排痰により気管支粘膜から剥奪される喀痰には線毛円柱上皮細胞がほとんど存在しないことが確認できた。また、模擬痰による吸引予備実験の結果より、通常利用されている3孔式吸引チューブを使用すると痰で全孔が閉塞している時にのみ設定圧で吸引されることが分かり、高い圧でも気管支粘膜が損傷していない可能性が得られた。そこでK大学病院内で最も多く使用されている圧400mmHgと、文献記載の最小圧である100mmHgで3孔式吸引チューブを用い、呼吸器疾患を除く気管切開中の患者27名を対象に吸引を実施したところ、得られた細胞数にはばらつきが大きかったが両者とも腺毛の脱落した細胞はほとんど認められなかった。更に、吸引中に前者では200mmHg台、後者では6070mmHgに吸引圧が低下し、特に後者では痰が引ききれず効果的な吸引とは言い難い結果であった。細胞数のばらつきに関してはその後ラットを用いた基礎実験により強制的に剥奪された細胞が集塊で存在することが判明したため、分析方法を変更し固定後の細胞から切片を作成し検鏡することとした。対象は前回と同様の条件で患者2名を選定し、400mmHgの圧で各3回の吸引を実施したところ、6検体中4検体には集塊で存在する細胞が認められなかった。残りの2検体については集塊は存在していたが、融解、変性が進んでいたことから吸引前に脱落していた細胞群であると判断した。以上の結果を総括すると看護技術としての吸引は、圧の上昇により危険性が加速度的に増加するのではなく、対象のその時々の粘膜の状態・痰の量・性状等を把握し、更に、チューブの材質等の諸条件を考慮した上で短時間で効率良く痰を取り除こうとしたときに、安全で効果的な技術の提供に結びつくといえる。したがって例え高圧で吸引したとしても以上のような留意点が考慮されていれば、安全で効果的な吸引が行える可能性があることが示唆された。健常者120名の自己排痰による喀痰を採取し検鏡した結果、21名の対象者の喀痰中に円柱上皮細胞が2.14±1.64/10視野存在した。また、その内の1名の対象者の喀痰中には、絨毛が1個/10視野認められた。以上より、強制排痰によって気管支粘膜から剥奪される喀痰には絨毛円柱上皮細胞がほとんど存在しないことが確認できた。次に、模擬痰を使用した吸引圧と吸引される喀痰の量、吸引カテーテルと吸引圧の変化に関して予備実験を行った。その結果、3孔式吸引カテーテルの3孔全てが喀痰中にあるときにのみ設定圧そのままで吸引され、吸引圧を高くするに伴い吸引される喀痰の量が増加した。また、2孔が喀痰中にあるときでは吸引圧、吸引される量ともに約1/2に減少し、1孔では両者ともに0であることが確認できた。K大学病院

入院中の気管切開中の患者を対象に100mmHgと400mmHgの吸引圧で喀痰を採取し、検鏡を行った。その結果、400mmHgの設定圧で吸引を実施したときは200mmHg台、100mmHgの設定圧で吸引を実施したときは6070mmHgの吸引時の圧が急激に低下した。採取した喀痰中の円柱上皮細胞の存在は健常者に比べて多量に認められたが、絨毛の脱落はほとんど認められなかった。採取量に関しては、100mmHgの吸引圧では喀痰が吸引容器に入らず、吸引カテーテル内にとどまる例が多く、患者にとって吸引が効果的に行われたとは言い難い結果であった。100mmHgで吸引した68検体の円柱上皮細胞数は、11.45±21.52個/10視野、400mmHgでは24.08±42.96個/視野とばらつきが大きく、低い圧で吸引したときの方が細胞数が多い対象もあった。このことは吸引時の患者の状態や喀痰の性状など個別性が大きく影響していることが考えられ、この結果だけからは適切な吸引圧を検討することができず、対象数を増やしていくことが必要と考える。昨年度に気管切開中の患者から採取した喀痰を再度検鏡し分析を行ったところ、線毛円柱上皮細胞数に大きなばらつきがあった。確認できた細胞は、線毛が脱落して単独で存在しているものがほとんどで、集塊で存在するものや線毛があっても単独で存在しているものがわずかに認められた。この結果からは、喀痰中の細胞が強制的に剥奪されたものか否かの鑑別ができないと考え、ラットを使って偽的に剥奪された細胞がどのような状態で存在し、気管支にどのようなダメ-ジを与えるかを確認するため基礎実験を行った。実験は麻酔をかけたラットの気管支を露出、切開して吸引チューブを挿入し、吸引厚400mmHgで吸引を行い、その吸引物の細胞の状態を位相差顕微鏡で確認した。その結果、多数の赤血球の存在と集塊となった細胞の存在が確認できた。更に1μmの切片を作成し検鏡した結果、赤血球に囲まれた細胞が集塊で存在することが確認できたが、この赤血球が吸引によるものか、解剖の時流れ込んだものかは明らかでない。またラットの気管支を切開し、肉眼的に観察したところ出血の跡が確認でき、切片にして検鏡した結果、肉眼的に出血の跡が見られた部分の気管支粘膜が広範囲に剥がれていることが確認された。以上ラットの実験より、人為的に剥奪した細胞は集塊で存在すること、剥離後の気管支の出血と気管支粘膜に損傷が起こることが明らかになった。よって、患者を対象に400mmHgで吸引した場合、局所に高い圧がかかり気管支粘膜の損傷の可能性が否定できない。従って昨年まで実施していた染色による細胞の検鏡では、自然剥離した細胞と吸引により剥奪された細胞を鑑別することが困難であると思われる。今後は、ラットの実験で用いた方法で対象者からの喀痰を検鏡することができるか否かの実験を行い、対象者の炎症症状などを合わせて研究を進めていくことが必要と考える。昨年度のラットを用いた実験から、吸引により人為的に剥奪した細胞は集塊で存在することが確認できた。そこで今年度は呼吸器疾患がなく気管切開後1週間以上を経過している患者2名を対象に、研究の趣旨を説明し承諾を得た上で、必要が生じたときに各3回、計6回の吸引を実施した。吸引方法は昨年度と同様で吸引圧は400mmHgとし、吸引チューブは3孔式を用いた。標本の作成方法としては、吸引された痰に等量の2%グルタールアルデヒドを加え、冷蔵庫で24時間固定した後2500回転で10分間遠心し、粘膜に包まれた状態で細胞を沈殿させ、0.1Mリン酸緩衝液で3回洗浄し、過剰のグルタールアルデヒドを除去した。その後、70、80、90、95%エタノールで脱水し、グリコールメタクリレート樹脂で包埋した。この痰の全範囲をガラスナイフを用いて厚さ1μmに薄切しマロリ-アザン法により染色した。また、一部の標本についてはアルシアンブルー染色法により粘液多糖を染め出した。
遷移金属によるアルカンCーH結合の熱的活性化を経る合成反応

本研究は飽和炭化水素(アルカン)のCーH結合を遷移金属錯体で直接活性化して官能基を導入し機能性物質を合成する新反応の開発を目的としており,2年間の研究により1)シクロアルカンとCOより脂肪酸の合成および2)メタンとCOより酢酸を合成する新反応の開発に成功した。1.シクロアルカンとCOより脂肪酸の合成シクロヘキサンをpd(OAc)_2/K_2S_2O_8/CF_3COOH系でオ-トクレ-ブ中80°CでCO(20気圧)と反応させるとシクロヘキサンカルボン酸が19,000%(pd基準)収率で生成した。しかし,シクロヘキサン基準の収率は2.1%と低い。そこで添加剤を用いて検討した結果,pd(OAc)_2にCu(OAc)_2を50当量添加すると収率は20,000%(Pd基準)でしかも基質基準の収率も8.8%と高い値が得られた。さらに基質をメチルー,tーブチルー,cisー1,3ージメチルー,transー1,4ージメチルーシクロヘキサンおよびアダマンタンに拡張して反応性を検討した結果,シクロアルカンのCーH結合の反応性は3級>2級>1級炭素の順に低下し,またCOOH基は全てエクアトリアル位に導入されることが明らかになった。重水素化シクロヘキサンを用いた同位体実験よりkH/kD=3が得られ,本反応の律速段階はアルカンCーH結合のパラジウムによる切断反応であることがわかった。以上の結果より本反応はPd(II)のCーH結合に対する親電子攻撃を経て進行すると考えられる。2.メタンとCOより酢酸の一段階合成上の反応をメタンに適用することによりメタンとCOより直接酢酸を合することに成功した。触媒はPd(OAc)_2,Pd(OCOEt)_2あるいはCuSO_4でもよく,メタンとCOを2040気圧の加圧下で反応させると酢酸が高収率で得られた。以上の反応はアルカンの熱的活性化を経る合成反応では最初のものであり,特にメタンとCOより酢酸を一段階で合成する反応は工業的にも画期的なものであり今後の発展が期待される。本研究では飽和炭化水素(アルカン)のCーH結合を金属錯体で直接活性化して,これにCOを反応させることにより脂肪族カルボン酸を直接合成する反応の開発を目的として検討を進めており,本年度は以下の成果を得ることができた。1.シクロヘキサンのCOによるカルボキシル化反応Pd(OAC)_2/CF_3CODH/K_2S_2O_8系触媒を用いてオ-トクレ-ブ中,シクロヘキサンをCOと80°Cで20時間反応させるとシクロヘキサンカルボン酸がPd基準で19.616%収率で得られることが分った。このような高収率(タ-ンオ-バ-数:200)が得られたのは,攪〓効率とPdの再酸化剤の効果が向上したためと考えられる。さらに,58員環シクロアルカンで同様な反応を試みた結果,6員環が最も反応性が高く,それより環が大きくても小さくても反応性が低下することが明らかになった。2.アダマンタン,メチルシクロヘキサンおよびtransー1,4ージメチルシクロヘキサンとCOの反応

まず,アダマンタンとCOを同様な条件で反応させると,1ーアダマンタンカルボン酸が938%収率で得られ,対応する2ーカルボン酸は全く検出されなかった。これはPdの親電子攻撃の容易さに起因すると考えられる。次に,メチルシクロヘキサンの反応では,4ーメチルシクロヘキサンカルボン酸が主生成物として得られたが,3級炭素での反応生成物は得られなかった。また,transー1,4ージメチルシクロヘキサンの反応では高選択的にtrans,cisー2,5ージメチルシクロヘキサンカルボン酸が得られ,さらにその芳香族化したものが副生した。以上の結果より,本反応ではカルボキシル化は,位置的には3ー〉2ー〉1ー級炭素の順で起こることが明らかとなった。しかし,メチル置換シクロヘキサンでは立体障害のため,3級炭素での反応は起こらないで,優先的に2級炭素上で起こることが分った。本研究はアルカンのCーH結合を遷移金属で活性化して,これにCOを反応させることにより脂肪族カルボン酸を直接合成する反応の開発を目的として前年度より検討を進めており,本年度は1)シクロヘキサンとCOの反応に硫酸銅などの銅塩を添加することによりタ-ンオ-バ-数(触媒の)を100から200に向上させることに成功した。また,2)本反応をメタンに適用することにより酢酸を直接合成する新しい反応の開発に成功した。1.シクロヘキサンとCOよりシクロヘキサンカルボン酸の合成Pd(OAc)_2/K_2S_2O_8/CF_3COOH系を用いることによりシクロヘキサンとCOよりシクロヘキサンカルボン酸が得られることは既に報告した。また,基質をメチルシクロヘキサン,ジメチルシクロヘキサン,アダマンタンなどに変えても同様な反応が進行することも報告した。本研究ではシクロヘキサンの反応における添加剤を検討することにより,硫酸銅を共存させるとカルボン酸の収率が10,000%から20,000%(タ-ンオ-バ-数200)に飛躍的に向上することが明らかになった。また,重水素化シクロヘキサンを用いた同位体実験によりkH/kD=3が得られ,本反応の律連段階はアルカンCーH結合のパラジウムによる切断反応であることが明らかになった。これらの結果を総合すると本反応はPd(II)の親電子攻撃を経て進行すると考えられる。2.メタンとCOより酢酸の一段階合成現在,酢酸は主にモンサント法によりメタノ-ルとCOより工業的に合成されている。もしメタノ-ルの代りに天然に豊富に存在するメタンを原料に出来れば,省資源の点あるいは未利用資源の有効利用の点からもその意義は大きい。我々は(1)の反応をメタンに適用することにより直接酢酸を合成することに成功した。触媒はPdでもCuでもよく,CO圧は40気圧,反応温度は80°Cでオ-トクレ-ブを用いる。収率は3,000%(Cu基準)。
高分子ナノシートを用いた新規集積型ナノデバイスの創製

本研究はわずか数ナノメートルの高分子ナノシートを集積組織化することにより、新規なナノデバイスを構築することを目的とする。本年度は磁性ナノ粒子表面よりナノシート形成能を有する高分子をグラフト重合することでハイブリッド高分子ナノシート集積体の構築を試みた。1.磁性ナノ粒子表面からの反応性高分子のグラフト重合ポリオール還元法により作製した酸化鉄磁性粒子から原子移動ラジカル重合法により反応性高分子であるpoly(N-hydroxysuccimide methacrylate)(pSucMA)をグラフト重合した。透過型電子顕微鏡により磁性ナノ粒子コア(5nm)からpSucMAのシェルが1nm形成されていることが明らかとなった。さらに末端にアミノ基を有する分子とSucMAとの置換反応により光機能性、生体適合性、高分子ナノシート製膜性などの機能を有する磁性ナノ粒子を容易に作製することができた。2.磁性ナノ粒子高分子ナノシートの作製1.で作製した磁性ナノ粒子を用いた高分子ナノシートの作製を行った。置換反応により種々のアルキル側鎖を有するpoly(alkylmethacrylamide)をシェルに有する磁性ナノ粒子の水面上単粒子膜挙動を検討したところ、単粒子膜形成能にアルキル側鎖依存性が見いだされ、アルキル側鎖がtetradecylのものがもっとも安定な単粒子膜を形成した。この単粒子膜は基板に転写可能であり、厚さが5-6nmのハイブリッド高分子ナノシート集積体の構築に成功した。本研究はわずか数ナノメートルの高分子ナノシートフォトダイオード(PNPD)を集積化し、光入出力駆動型論理演算素子の作製を目的とする。すなわち、異なる波長で駆動するPNPDを組み合わせ、それらの励起波長を入力信号とし、光電変換に伴い発生する電子を用いて液晶分子の配向をコントロールする。本年度はスイッチ素子の作製と高分子ナノシートによる液晶配向について検討を行った。1、励起波長を入力信号とした高分子ナノシートswitching素子の作製異なる波長を用いて各々独立に励起可能な色素、フェナンスレンとアントラセンの組み合わせを用いて二つのPNPDの作製を行った。これら二つのPNPDをお互いの光電流方向が逆になるようにLangmuir-Blodgett法を用いて積層した。この積層体にフェナンスレンの励起波長を照射しフェナンスレンPNPDを活性化するとカソード電流が一方でアントラセンの励起波長を照射しアントラセンPNPDを活性化するとアノード電流が発生し、励起波長により光電流の方向が制御可能なスイッチ素子を作製した。2、高分子ナノシートを用いた液晶分子の配向処理液晶分子を配向させるにはラビング処理が必要であるが、本研究で作製を試みる光入出力駆動型論理演算素子はナノ領域での光誘起電子移動を応用するためにラビング層が素子を駆動する際の問題と考えられる。そこで高分子ナノシート自体をラビング層として用いることを試みた。高分子ナノシートを積層したITO基板2枚をガラスビーズスペーサーにより張り合わせ、その空隙に液晶分子を表面張力により充填した。充填された液晶分子は基板に対して垂直に配向し、さらにITO基板間に電圧を印可することによりその配向をスイッチングすることが可能であった。本年度は共役系高分子の一つであるポリアルキルチオフェンのナノシート化について検討を行った。1.混合LB法によるπ共役高分子ナノシートの作製水面上で安定な単分子膜を形成するpoly(dodecylacrylamide)(pDDA)とpoly(hexylthiophene)(PHT)を混合することで、共役高分子ナノシートを水面上に形成させることが可能となった。このナノシートはLangmuir-Blodgett法を用いることで固体基板上に転写させることが可能だった。転写したナノシートの膜厚を原子間力顕微鏡(AFM)により測定したところ2.5nmと求められた。2.π共役高分子ナノシートの電気化学特性の検討得られたπ共役高分子ナノシートをITO電極上に積層し、サイクリックボルタンメトリーにより検討を行ったところ、報告されているPHTキャスト膜と同様な酸化還元挙動を示し、混合ナノシートにおいてもPHTが電気化学的に活性であることが示された。酸化還元に伴うπ共役高分子ナノシートの吸収スペクトル変化を測定したところ、酸化に伴いPHTのπ-π^*に由来する吸収が減少し、近赤外にポーラロン、バイポーラロンに由来する吸収が観測された。この吸収変化は酸化還元を繰り返すことで可逆に変化することからナノ薄膜による光フィルターとして用いることが可能となる。2.磁性ナノ粒子高分子ナノシートの作製

1.で作製した磁性ナノ粒子を用いた高分子ナノシートの作製を行った。置換反応により種々のアルキル側鎖を有するpoly(alkylmethacrylamide)をシェルに有する磁性ナノ粒子の水面上単粒子膜挙動を検討したところ、単粒子膜形成能にアルキル側鎖依存性が見いだされ、アルキル側鎖がtetradecylのものがもっとも安定な単粒子膜を形成した。この単粒子膜は基板に転写可能であり、厚さが5-6nmのハイブリッド高分子ナノシート集積体の構築に成功した。
酸化ストレスによる網膜毛細血管細胞死の防御機構に関する研究

平成16年度は,ラット網膜毛細血管を用いて酸化ストレスによるアポトーシスと細胞死を誘導し,チオレドキシン(TRX)が網膜血管周皮細胞の酸化ストレス死を遅らせ防御的に作用することを明らかにした。システインをセリンに置換したmutant TRXにおいて細胞死を抑制できなかったことより,このシステイン残基が細胞防御作用,抗アポトーシス効果を発揮したものと考えられた。平成17年9月に,この研究成果を第15回欧州眼科学会(ベルリン)で発表した。平成17年度は,酸化ストレスが網膜毛細血管死に及ぼす因子として個体の加齢が影響するかどうかを調べた。Long-Evansラットの新鮮網膜毛細血管を摘出後,trypan blue assayで毛細血管細胞の死亡率を確認した。2ヶ月齢の若年ラット群と15ヶ月齢の高齢ラット群で比較した。薬物無投与にも関わらず5時間後に2ヶ月例に比較し,15ヶ月齢では高率の細胞死が観察された。2ヶ月齢ではTRXは酸化ストレス死を遅らせ防御的に作用したが,15ヶ月齢ではTRXの細胞死抑制効果は軽微であった。TRX自体は体内で誘導されるも直接内服摂取は困難なため,今後,TRX以外の抗酸化作用を有する薬物を投与し,酸化ストレスによる網膜毛細血管細胞死が抑制されるかどうかを検索して行く。現在,循環器作動薬である塩酸カルテオロール,カルベジロール,抗生剤である塩酸ミノサイクリンを用い,人体における有効血中濃度で細胞死の抑制効果がみられるかどうかを実験中である。我々の実験系は,薬物が網膜毛細血管に及ぼす功罪を検証することが可能であり,種々の薬物の毒性実験に供与できるものである。ラット網膜毛細血管を用いて酸化ストレスによる細胞死と,チオレドキシン(TRX)による細胞保護作用を検討した。まず,6-7週齢のLong-EvansラットをCO_2で安楽死後,網膜を摘出した。Papain, DNaseで処理後,表面処理を施した円形カバーグラスを用い網膜毛細血管を圧着採取した。Trypan blue assayで毛細血管細胞の死亡率を確認し,生細胞率95%以上の検体を用いた。50μM H_2O_2投与後,毛細血管細胞死を経時的に測定したところ,4時間後に61.2%の細胞死が観察され,その大多数は網膜血管周皮細胞であった。H_2O_2処理後の死細胞の多くは抗single-strand DNA抗体で陽性に染色された。H_2O_2と10μg/ml TRXの共存下で,死細胞率は29.8%と有意に低下がみられた。H_2O_2投与による血管細胞死をTRXはdose-dependentに抑制した(1μg/ml TRXの細胞死抑制効果は39.9%)。しかしながら,H_2O_2投与後5時間以降では死細胞率が80%を越え,TRXの細胞死抑制効果も観察されなくなった。対照群としてTRXの活性部位の2つのcysteineをserineに置換した10μg/ml mutant TRXを投与したところ,4時間後のH_2O_2による細胞死は52.6%と高率であった。新鮮摘出網膜毛細血管において,H_2O_2投与による周皮細胞死にアポトーシスの関与が示唆された。TRXは網膜血管周皮細胞の酸化ストレス死を遅らせ,防御的に作用した。平成16年度は,ラット網膜毛細血管を用いて酸化ストレスによるアポトーシスと細胞死を誘導し,チオレドキシン(TRX)が網膜血管周皮細胞の酸化ストレス死を遅らせ,防御的に作用することを明らかにした。平成17年9月には,この研究成果を第15回欧州眼科学会(ベルリン)にて発表した。

Long-EvansラットをCO_2で安楽死後,網膜を摘出した。Papain, DNaseで処理後,表面処理を施した円形カバーグラスを用い網膜毛細血管を圧着採取した。Trypan blue assayで毛細血管細胞の死亡率を確認した。2ヶ月齢の若年ラット群と15ヶ月齢の高齢ラット群で比較した。薬物無投与にも関わらず5時間後に2ヶ月例では5.2%の細胞死が,15ヶ月齢では14.5%の細胞死が観察された。50μM H_2O_2投与群とH_2O_2と10μg/ml TRXの共存下を比較したところ,2ヶ月齢ではTRXは酸化ストレス死を遅らせ防御的に作用したが,15ヶ月齢ではTRXの細胞死抑制効果は減弱していた。TRX自体は体内で誘導されるも直接内服摂取は困難なため,TRX以外の抗酸化作用を有し,酸化ストレスによる網膜毛細血管細胞死が抑制する薬物を検索した。循環器作動薬で,抗酸化作用を有する塩酸カルテオロールは,血管細胞死を抑制しなかった。