hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
事務機器から発生する超微小粒子による室内空気汚染がヒトの自律神経機能に及ぼす影響

複写機やレーザープリンタが稼働する際には直径がナノメートルサイズのごく小さな超微小粒子が発生する。一般的な使用条件下でこれらの粒子が人間の自律神経機能に影響を与えるかに関して、心拍変動性と唾液中のクロモグラニンAを測定して実験的に検討した。8人の男性被験者では、超微小粒子の最大個数濃度20000/ml、1.5時間の実験で、超微小粒子の発生前後では心拍変動性及び唾液クロモグラニンA量に有意差は認められなかった。本研究は、事務機器を使用するオフィスにおいて2年に分けて実施するフィールド研究であり、本年度はその一年次として、まず超微小粒子(UFP)の発生と室内の空気環境に関する評価を行うとともに、その評価に基づき、UFPの曝露が比較的多いと考えられる職種の作業者に対して、自覚症状の調査と健康・疾病状況に関する情報収集を行い、次年度に実施を予定する心拍変動性(HRV)測定調査のための準備を行った。その結果、複写機の作動中にUFPの発生が起こることが確認され、また発生量は機器の運転開始直後にとくに顕著であった。機器の連続運転に伴う室内のUFP濃度は、機器の種類、稼働の状況(複写枚数、速度など)、空気環境(温度、湿度、気流)などによって影響を受け、必ずしも一定の濃度レベルになるものではなかったが、定点における簡易連続測定器を用いた相対的な濃度変化の時系列的な記録は可能であった。一方場所を移動する作業者の個人曝露を連続的にモニタリングすることは技術的に困難であることが判った。UFP曝露を受けやすい対象として、複写機の保守・メンテナンスを行う作業者を抽出し、調査したところ、典型的なシックビル症候群と判断されるものは認められなかったが、UFP曝露が少ないコントロール作業者に比較して、せき、たんなどの呼吸器刺激症状や、眼や皮膚のアレルギー症状を有する者がやや多く認められるなどの差異が認められた。以上の結果を踏まえて、来年度はUFP濃度をある程度コントロールする条件を定め、急性の症状が出ない程度の濃度において、HRVとの関連性を検討する予定である。本課題の最終目的である事務機器稼働時のエミッション曝露と心拍変動性(HRV)の関連を検討した。昨年度の検討から、超微小粒子(UFP)の連続的な個人曝露モニタリングは技術的に困難であるのて、当初予定していたオフィスでの実際の作業下における測定を断念し、人工環境室内で曝露濃度を制御しながら行う志願者曝露実験として、事前に昭和大学医の倫理委員会の審査を受けその承認のもとに実施した。被験者は本研究に関する十分な説明を行った上で参加することの同意が得られた男性8名(2158歳)で合計12回の測定を実施した。実験時間は曝露の前後を含め90分とし、そのうち60分間に複写機の稼働、停止、強制換気を行い、曝露濃度を制御した。室内気の連続モニタリングを行い、UFP及びオゾン(O3)曝露濃度の最大値はそれぞれ20000個/cm3、0.002ppm前後であった。被験者の心拍間隔はホルター心電計により連続測定し、HRVを単位時間当毎の標準偏差成分として算出した。合わせて自覚症状のVAS測定と唾液中クロモグラニン量を測定した。複写機稼働開始前の値をベースライン値としたとき、稼働開始後のHRVは、ベースライン値との有意な差を示さなかった。また自覚症状として、匂いの感覚は稼働後に増加するものの、刺激感や不快感の訴えは少なく、ストレス感覚を反映するクロモグラニンAにおいても複写機稼働の影響は認められなかった。以上のことから、今回の曝露実験では、UFP等の複写機エミッションがヒトのHRVや自律神経系活動に影響を与えるという結果は得られなかった。しかし稼働開始後の推移に限定すると、HRVのパターンには曝露濃度変化に関連づけられる変化も認められることから、UFP濃度の時間変化データとHRVデータに対する数理モデルを用いた直接分析を含め、今後被験者数を増やすなど、なお検討を継続する必要があると考えられる。
企業間情報ネットワーク組織の理論的・実証的研究

本研究は、日本的経営の特徴の一つである企業の集団化が、従来の系列融資、株式の相互持合、役員派遣などを基軸とした結合形態から、情報の収集、交換を目的とするネットワーク組織に変遷しつつあると言われていることの実態を明らかにし、それを説明する理論モデルを構築することを目的に始められたものである。研究に着手してみると、企業集団および情報ネットワーク組織という言葉が実にさまざまな意味で用いられていて、非常にあいまいな概念であることが明らかになった。そこでまず両者の概念規定を行い、次いで企業間情報ネットワーク組織の実態の把握と、それを説明する理論モデルの構築に取組んだ。これらは文献研究、研究会におけるディスカッション、聞き取り調査などによって行った。その結果、企業間情報ネットワーク組織は、数年前のNTTによる高速ディジタル回線のサービス開始を契機としてスタートしたばかりで、本格的発展の準備段階にあることが明らかになった。したがって、企業集団が情報ネットワーク組織に変遷しつつあると言えるためにはもっと時間の経過をみる必要があることがわかった。一方、企業間情報ネットワーク組織の理論面については、それはここ数年間において新たに提唱された範囲の経済、ネットワーク外部性、連結の経済といった概念でよく説明されることがわかった。これらの概念はそれぞれ独立に提唱された概念であるが、それはいずれも情報とかノウハウとかいった経営資源を共通のキー概念としているので、決して独立の概念でなく、企業間情報ネットワーク組織の理論として妥当性をもつのである。また、企業間情報ネットワーク組織の料金負担問題の解決には、ゲーム理論の解概念が有効であることが分かった。
急性および慢性機械的圧迫による神経細胞障害メカニズムの解析-培養細胞系圧迫モデルを用いて-

神経組織の圧迫病変における神経系細胞障害のメカニズムを理解するために、培養細胞を用いて、圧迫時におけるセカンドメッセンジャーの変化を測定した。細胞培養系として1)アストロサイトcell line、2)神経細胞cell lineを使用した。培養は密封可能なフラスコで行い、圧力計でモニターしながら、適当量のHeをボンベからフラスコ内へ圧出することにより加圧した。この条件において、培養細胞に加わる酸素分圧は一定である。加圧の強さとして、(1)760mmHg(コントロール)、(2)800mmHg、(3)880mmHg、(4)920mmHgの4種類を設定した。約5秒で設定した加圧量に達し、その後その圧を維持した。加圧して(1)1分、あるいは(2)10分(それぞれ急性、慢性モデルとする)後、最終濃度1NになるようにTCA液を加え、反応を停止させた。細胞およびメディウムを取り出し、ソニケイション後、遠心し上清液を抽出した。これにRIAを用いてセカンドメッセンジャー(cyclic-AMP,IP3)の測定を行い、蛋白補正して最終値を算出した。なお、圧迫時における細胞のviabilityは確認している。さらに各cell lineについて、顕微鏡下で上記と同様の方法で加圧しながらリアルタイムで細胞内Caの変化を測定できるチャンバーを作成した。細胞内Ca測定には蛍光プローブとしてFura-2を用い、細胞内Ca上昇により励起されたFura-2蛍光を、アルガス50(現有)を用いて視覚経時的に測定した。アストロサイトでは、加圧量の増加に伴いcyclic-AMP,IP3の変化に有意差を認めなかった。それゆえ、現在加圧量および加圧時間に変化を加え検討中である。また、アルガス50を用いた実験では加圧量に応じた細胞内Caの低下が認められ、これが加圧に応じたカバーガラスの歪みに起因するか否かについて、硬質の石英のカバーガラスおよびlong distanceの対物レンズを使用して検討している。神経細胞および両者の共存培養については、現在測定中である。
サービス品質の変動要因を考慮する高品質サービスの設計支援環境に関する研究

サービスを構成する要素の属性は,サービスの提供状況によって容易にばらつき,このばらつきがサービスの品質を低下・変動させている.本研究の目的は,シミュレーションによるサービスの仮想的な試行により,高い品質を安定的に提供可能なサービスを設計できる設計支援環境を開発することであった.本研究はこの目的を達成するために,顧客の主観に基づく品質評価値と各要素の属性値の関係を非線形関数により,サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係をモデル化する手法を開発した.また,サービスの品質値の変化を事前評価するために,経時変化する品質値を試算するシミュレータを開発した.今年度は,サービス技能間の依存関係を,当該現場の技能を熟知する現場従業員の認識に基づいて俯瞰する手法を提案した.システムモデリングの手法であるInterpretive Structural Modeling(ISM)法を適用し,サービス現場の特徴を踏まえた技能習得の順序を明らかにし,OJT計画書の記述を支援する手法を開発した.提案手法を実際に介護老人保健施設による介護サービスへ適用し,本手法により元来チェックリスト内で並列に扱われていた技能に習得上の順序関係を付与し,OJTの計画立案を支援可能であることを確認した.技能階層モデルが示す技能および技能間の依存関係は,当施設の特徴を反映したものであることも確認した.本手法により作成可能な技能階層モデルは,どの従業員がどの技能を習得しているのかを明らかにできることから,効果的なOJT支援が可能であることを併せて確認した.また,シミュレータによりサービスの品質値を算出可能とするために,複雑なネットワークを記述し,非線形関数や確率分布モデルの表現する機能を付与するために,場面遷移ネットの記述能力を拡張した.サービスが含むプロセスは,「独立プロセス」,「並行プロセス」,「割り込みプロセス」に分類されるという先行定義に基づき,それらのプロセスを記述可能とするように既存シミュレータに対する拡張を行った.そして,部品搬送システム,生産システム,作業者の習熟度関数を導入したメンテナンス現場のモデリング・シミュレーションによって,シミュレータの動作確認を行った.また,複雑な非線形関数,確率関数,および各種最適化アルゴリズムを場面遷移ネットで記述するための拡張として,場面遷移ネットと種々のサブモデルシミュレータを組み合わせによる大規模システムシミュレータを提案した.今年度は、「サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係のモデル化手法」および「サービス品質を事前評価するためのシミュレーション手法」の二つの手法を開発した。これら二つの手法を開発するにあたり、「各要素の属性のばらつきを表現する確率分布モデル」と、これにより表現する「分布関数をシミュレータ上で設定するための方法」を併せて開発した。「各要素の属性のばらつきを表現する確率分布モデル」の開発に際しては、対象サービスの業務データを統計処理し、属性値のばらつきを適切に表現する分布関数を複数の分布関数の組合せにより構成した。この結果を品質評価値と要素属性値の関係モデルに挿入し、サービスの品質と属性の関係モデルを構成した。「分布関数をシミュレータ上で設定するための方法」の開発に際しては、場面遷移ネットの拡張として構成したシミュレータにおいて、属性値が一定であるという条件のもと、サービス提供の場面ごとに経時変化する品質値を計算した。さらに、属性値がばらつく条件のもとで、サービス品質値を計算可能とするための追加拡張を行った。対象サービスにおける品質が、特定の属性の影響を受けることを前提に、属性値のばらつきを表現する分布関数をシミュレータに導入し、このような属性値を統計的根拠に基づいて確率的に決定できるようにした。これにより、品質の変化式における属性値が、分布関数に従ってシミュレーション毎に変化し、最終的に出力される品質値もこれに追従して変化することを表現した。このシミュレーションの繰返しにより算出される品質値を集計し、属性値のばらつきの影響を受けて品質値がどの程度変動するのかを可視化した。今年度は、「サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係のモデル化手法の開発」および「サービス品質を事前評価するためのシミュレーション手法の開発」の二つの手法の開発に取り組むとともに、これら二つの手法を開発するにあたり、その要素技術である「要素の属性のばらつきを表現する確率分布モデル」を構成し、これにより表現する「分布関数をシミュレータ上で設定するための方法」を整備した。確率分布モデルの開発に際しては、対象サービスの業務データを統計処理し、属性値のばらつきを適切に表現する分布関数を複数の分布関数の組合せにより構成した。本シミュレータは、,場面遷移ネット(STN)と呼ばれるシミュレーション技法を拡張し用いたが、STNによりサービス提供の場面を記述し、各場面の活動に関わる人や製品等の要素をアクタとして記述するとともに、アクタにはその状態を示す変数として品質値や属性値保持させた。さらに、サービス提供の場面ごとに、各種変数の経時変化の数学モデル(微分方程式)と場面の遷移条件を設定し、簡易な微分方程式と条件式を記述可能な既存のSTNを拡張し、複雑な数学モデルで構成されるサービス品質値を計算することを可能にした。さらに適用可能な対象サービスの範囲をより拡大するために、広域エリアにおいて提供される公共サービスに対する受給者の行動を把握するために不定点観測システムの構成を方法を新たに考案し、携帯端末上に開発したソフトウェアをインストールすることにより、特殊で高額な計測装置を用いることなく、当該サービスに対する顧客の評価結果を客観的かつ効率的に収集する手段を確保した。

「サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係のモデル化手法の開発」および「サービス品質を事前に評価するためのシミュレーション手法の開発」の二つの手法の要素技術である「要素の属性のばらつきを表現する確率分布モデル」を再構成し、これを用いて表現する「分布関数をシミュレータ上で設定するための方法」の改善を行った。上記の確率分布モデルの再構成に際して、広域エリアにおいて提供される公共サービスに対する受給者の行動を把握する不定点観測システム用いて、対象サービスに関する基礎データを獲得した。同システムは、携帯端末上に開発したソフトウェアをインストールすることにより、特殊で高額な計測装置を用いることなく、当該サービスに対する顧客の評価結果を客観的かつ効率的に収集すること可能とする手段であり、これを用いて獲得したデータを統計処理し、属性値のばらつきを適切に表現する分布関数を複数の分布関数の組み合わせとして再構成した。その後、上記により得られた結果を品質評価値と要素属性値の関係モデルに挿入し、サービスの品質と属性の関係モデルを構成し、サービス品質の変動に関するシミュレーションを実施した。シミュレーションに用いたシミュレータは、今回新たにマルチエージェントシミュレーション用の汎用ツールであるArtisocによる再実装を行った。これまで場面遷移ネット(STN)により記述していたサービス提供の場面をArtisoc上で再構成し、各場面の活動に関わる人や製品等の要素をアクタとして記述するとともに、アクタにはその状態を示す変数として品質地や属性値を保持させた。簡易な微分方程式と条件式が記述可能であった従来のSTNベースのシミュレータの機能を拡張し、より複雑な数学モデルで構成されるサービス品質値を計算することを可能にした。サービスを構成する要素の属性は,サービスの提供状況によって容易にばらつき,このばらつきがサービスの品質を低下・変動させている.本研究の目的は,シミュレーションによるサービスの仮想的な試行により,高い品質を安定的に提供可能なサービスを設計できる設計支援環境を開発することであった.本研究はこの目的を達成するために,顧客の主観に基づく品質評価値と各要素の属性値の関係を非線形関数により,サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係をモデル化する手法を開発した.また,サービスの品質値の変化を事前評価するために,経時変化する品質値を試算するシミュレータを開発した.今年度は,研究計画に基づき,サービスの品質とそれに影響を与える属性の関係のモデル化手法の開発と,サービス品質を事前評価するためのシミュレーション手法の開発に銃的に取り組んだ.まず,前者のサービスの品質とそれに影響を与える属性の関係のモデル化を実現するために,サービス技能間の依存関係を,当該現場の技能を熟知する現場従業員の認識に基づいて俯瞰する手法を提案し,さらに開発した手法を介護老人保健施設による介護サービスへ適用し,本手法がOJTの計画立案を有効に支援可能であることを確認した.
Cadm1 機能シナプス形成に関与するタンパク複合体の解析と機能障害の研究

自閉性障害の患者のシナプス接着蛋白SynCAM/RA175(Cadm1)遺伝子に2つの変異を同定し(2009)。細胞培養系を用いた実験では変異Cadm1は小胞体に蓄積し、小胞体ストレスを誘導し、神経細胞のデンドライト形成を抑制する(2010)。Cadm1-KOマウスは不安、攻撃性の増大する他、小脳に軽い発達異常が見られること、また、ヒト言語障害に対応する超音波コミュニケーション障害が存在すること、またマウス小脳では、Cadm1はGABAB2受容体と小脳プルキンエ細胞とParallelファイバーとのシナプスに局在した(2012)。Cadm1-複合体の分離およびCadm1のPDZ結合モチーフに結合するScaffold蛋白を解析したところ、Mupp1と結合する一方、NeuroliginはMupp1と結合しないことから、NeuroliginとCadm1は異なったシナプス複合体を形成していると考えられた。また、Cadm1-KOマウスではGABAB2受容体のレベルが増大していることを明らかにした(2012)。一方、実験計画に従い、正常および変異Cadm1-MycTagを導入したROSA26遺伝子のBacクロンに-Cadm1-Mycを挿入し、ROSA26-Cadm1-Myc-BacTgトランスジェニックマウスを作製したが、正常および変異Cadm1分子が脳内で切断されており、Myc抗体を用いて解析することが困難であり、そこで、CADM1(Y251S)KIマウスを作製中であり、Cadm1-KOマウス、CADM1(Y251S)KIマウスを用いてLoss-of-functionとGain-of-functionの両面からASDの分子病態の解析を行うことにした。1) Pull-down法によりCadm1のPDZ結合モチーフに結合するScaffold蛋白の同定を試みた。2)正常および変異Cadm1-MycTagを導入したトランスジェニックマウスを作製した。3) MycTagの抗体カラムを用いて、脳からの複合体を単離Cadm1シナプスにおける複合体の構成蛋白を解析し、自閉性障害生化学的解析を行なった。その結果、1) Cadm1はGABAB2受容体との結合が知られているMulti-PDZ蛋白Mupp1と結合し、脳で複合体として存在し、小脳プルキンエ細胞とParallelファイバーとのシナプスに局在すること、また、海馬神経細胞の樹状突起のスパインにも局在することが明らかになった(Jimbo-Fujita et al.投稿中)。3) MycTagの抗体カラムを用いて、小脳よりCadm1-Mupp-複合体を分離することができた。今後は、特異抗体を用いてのイムノブロット、およびTOFF-MASSによる複合体構成蛋白の解析を行い、抑制系シナプスにおけるCadm1-Mupp-受容体複合体の解明とASDの病態との関連を解析する予定である。2)Cadm1のC末端をリガンドとしたPull-down法、およびMycTagの抗体カラムを用いて、小脳のCadm1-複合体の分離およびCadm1のPDZ結合モチーフに結合するScaffold蛋白の同定を試みた。本年度はCadm1-KOマウスは不安、攻撃性の増大する他、自閉性障害の患者にしばしば観察されるように、小脳に軽い発達異常が見られること、また、ヒト言語障害に対応する超音波コミュニケーション障害が存在すること、またマウス小脳では、Cadm1はGABAB2受容体と小脳プルキンエ細胞とParallelファイバーとのシナプスに局在することが明らかになった。一方細胞培養系を用いた実験では変異Cadm1は小胞体に蓄積し、小胞体ストレスを誘導し、神経細胞のデンドライト形成を抑制することが明らかになった(Fujita et al.,2010)。

細胞培養系を用いた実験では変異Cadm1は小胞体に蓄積し、小胞体ストレスを誘導し、神経細胞のデンドライト形成を抑制する。実験計画に従い、正常および変異Cadm1-Mycを挿入したトランスジェニックマウスを作製したが、正常および変異Cadm1分子が脳内で切断されており、Myc抗体を用いて解析することが困難であった。そこで、CADM1(Y251S)KIマウスを作製し、Gain-of-functionとCadm1-KOのLoss-of-functionとの両面からASDの分子病態の解明を試みた。Cadm1-KOマウスは不安、攻撃性の増大の他、自閉性障害患者にしばしば観察されるような小脳での軽い発達異常の観察、ヒト言語障害に対応するマウス超音波コミュニケーション障害の存在、マウス小脳におけるCadm1(プルキンエ細胞)とGABAB2受容体(Parallelファイバー)とのシナプスでの局在(PLOS One 2012)を明らかにした。Cadm1をリガンドとしたPull-down法、および免疫沈降法で、Cadm1-複合体の分離およびCadm1のPDZ結合モチーフに結合するScaffold蛋白を解析したところ、PSD95に結合せず、Mupp1と結合すること、逆にNeuroliginはMupp1と結合しないことから、NeuroliginとCadm1は異なったシナプス複合体を形成していると考えられた。また、Cadm1-KOマウスにおいてGABAB2受容体のレベルの増大を明らかにした(J Neurochem. 2012)。また、作製したCADM1(Y251S)KIマウスを解析し、小胞体ストレスとASDの病態との関与を示唆した。今後小胞体ストレスのシグナルを制御するTSC1,2との関連についての解明を行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
センチネルリンパ節への微量癌細胞転移の分子遺伝学的迅速診断法の確立と臨床への展開

当研究では1.消化器癌手術時の拡大または縮小郭清の指標となるセンチネルリンパ節(SLN)の同定2.SLNの微小転移診断3.術中迅速遺伝子診断法の開発4.SLNが予後に及ぼす影響の評価を行ってきた。1.消化器癌手術時の拡大または縮小郭清の指標となるセンチネルリンパ節(SLN)の同定について胃癌症例52例のうち従来の病理学的診断にてリンパ節転移陰性である30症例の微小転移状況の評価を行った。#7リンパ節がSLNとなりうるかという評価においては#7リンパ節が他の2群リンパ節転移状況を反映しうる結果を得た(偽陰性率:16.7%,正診率:88.9%)。2.SLNの微小転移診断について微小転移診断についてはヘマトキシリンエオジン(HE)染色法、免疫染色法、RT-PCR法の3者について検討を行ってきた。そこで従来のHE染色法のみによる評価に加え、免疫染色法、RT-PCR法による評価を併用することでSLNの転移陽性例の検出率を向上させることに成功した(SLN同定率:95→98%;Int. J, Oncol.16,1147-52 2000)。3.術中迅速遺伝子診断法の開発について従来のRT-PCR法による遺伝子診断では診断結果を得るのに約8時間要していた。現時点ではRNA抽出法の改善、リアルタイムPCRの導入にて診断結果を得るのに約75分と時間を短縮することに成功した。現在、新たなRNA抽出法からcDNA合成、リアルタイムPCR法による検出に至る手法を確立中であり、この手法が確立した際には診断結果を得るのに約50分となると推定している。4.SLNが予後に及ぼす影響の評価について胃癌症例52例のうち臨床病期がI, IIで絶対的治癒切除を行うことができた症例28例に関して#7リンパ節の転移状況(RT-PCR法にて診断)と予後に関しての解析を行ったところ、転移陽性例は陰性例に比べ有意に予後不良となることが明らかになった。【対象と方法】胃癌根治手術54例の全郭清リンパ節に対して、病理組織学的診断とCEAに特異的なRT-PCR法による微小転移診断の両方を行った。特に、解剖学的なkey nodeである#7リンパ節に着目して、#7リンパ節の転移状況と他のリンパ節の転移状況、予後とを比較した。また、RT-PCR法の時間短縮を試みた。【結果】(1)#7への病理組織学的転移状況;#7転移陽性は3例(5.9%)で、単独転移はなく、いずれも1群リンパ節転移陽性で、2例(66.6%)は#7以外の2群リンパ節にも転移があった。#7が陰性の場合、1群リンパ節陽性は8例(33.3%)、#7以外の2群リンパ節陽性5例(10.4%)であった。(2)#7への微小転移状況;#7転移陽性率は16例(44.4%)で、#7以外の2群,3群リンパ節への病理組織学的転移は5例(31.2%)、微小転移は8例(50%)あった。#7陰性であれば、#7以外の2群リンパ節への病理組織学的転移はなく、微小転移が#8aに1例のみであった。(3)#7の転移予測正診率;病理組織学的診断で90.2%、RT-PCT診断で97.2%。

(4)#7転移と予後(観察期間:中央値3.8年);Stage I,IIの#7への微小転移陰性19例の再発はないのに対し、微小転移陽性11例中に再発が2例みられた。病理組織学的転移陽性は1例のみで再発した。(5)術中迅速RT-PCR;組織採取から判定までの全行程を90分以内に短縮できた。【まとめ】リンパ系路の複雑な胃癌でも、#7をセンチネルリンパ節と想定すると、リンパ節転移の広がりを予測しうることが示された。とくに、病理組織学的診断にRT-PCR診断を加味することで予測正診率は向上し、#7微小転移陰性であれば、それ以上のリンパ節への反跳転移率は低いと考えられた。逆に、#7が微小転移陽性であれば、それ以上の微小転移の広がりや予後不良が予想され、D2以上の郭清と補助療法の追加が必要と考えられた。また、RT-PCR診断にかかる時間が大幅に短縮できたことから、#7リンパ節の術中の微小転移診断を指標にして至適郭清範囲を決定することへの可能性が示された。当研究では1.消化器癌手術時の拡大または縮小郭清の指標となるセンチネルリンパ節(SLN)の同定2.SLNの微小転移診断3.術中迅速遺伝子診断法の開発4.SLNが予後に及ぼす影響の評価を行ってきた。1.消化器癌手術時の拡大または縮小郭清の指標となるセンチネルリンパ節(SLN)の同定について胃癌症例52例のうち従来の病理学的診断にてリンパ節転移陰性である30症例の微小転移状況の評価を行った。#7リンパ節がSLNとなりうるかという評価においては#7リンパ節が他の2群リンパ節転移状況を反映しうる結果を得た(偽陰性率:16.7%,正診率:88.9%)。2.SLNの微小転移診断について微小転移診断についてはヘマトキシリンエオジン(HE)染色法、免疫染色法、RT-PCR法の3者について検討を行ってきた。そこで従来のHE染色法のみによる評価に加え、免疫染色法、RT-PCR法による評価を併用することでSLNの転移陽性例の検出率を向上させることに成功した(SLN同定率:95→98%;Int. J. Oncol. 16,1147-52 2000)。3.術中迅速遺伝子診断法の開発について従来のRT-PCR法による遺伝子診断では診断結果を得るのに約8時間要していた。現時点ではRNA抽出法の改善、リアルタイムPCRの導入にて診断結果を得るのに約75分と時間を短縮することに成功した。現在、新たなRNA抽出法からcDNA合成、リアルタイムPCR法による検出に至る手法を確立中であり、この手法が確立した際には診断結果を得るのに約50分となると推定している。4.SLNが予後に及ぼす影響の評価について胃癌症例52例のうち臨床病期がI, IIで絶対的治癒切除を行うことができた症例28例に関して#7リンパ節の転移状況(RT-PCR法にて診断)と予後に関しての解析を行ったところ、転移陽性例は陰性例に比べ有意に予後不良となることが明らかになった。
AMPA受容体traffickingにおけるO-GlcNAc化の分子制禦機構

AMPA受容体は興奮性シナプス伝達ならびに学習・記憶の細胞モデルであるシナプス伝達長期増強現象(LTP)発現に最も重要なイオンチャネル型グルタミン酸受容体の一つである。LTP発現の一要因としてAMPA受容体traffickingが注目されているが、その作用機序の詳細は不明である。本研究はAMPA受容体traffickingにおけるO-GlcNAc化の役割解明を目的とした。O-GlcNAc化はAMPA受容体の細胞膜表面への特異輸送ガイダンスシグナルとして働き、AMPA受容体エンドサイトーシスを阻害することによって細胞膜表面AMPA受容体数を増加させた。この作用はLTP維持に重要であることが示唆された。(1)AMPA受容体反応に対するアロキサンの効果AMPA受容体サブユニットGluR1をアフリカツメガエル卵母細胞膜に発現させた。Two-electrodevoltag-clamp法を用いてカイニン酸によって誘発されるGluR1電流を測定した。GluR1反応はO型N-アセチルグルコサミン化(O-GlcNAc化)転移酵素の阻害剤であるアロキサン処理後80分で約150%の増大を認めた。(2)長期増強現象(LTP)に対するアロキサンの効果ラット海馬切片のCA1領域よりfield EPSPを記録した。LTP維持相において、アロキサン処理群はコントロール群と比較して約75%の増大効果が認められた。(3)AMPA受容体traffickingに対するアロキサンの効果ラット海馬切片をショ糖密度勾配遠心法で分画し、抗GluR1抗体、抗GluR2抗体を用いてウェスタンブロッティングした。アロキサン存在下でLTPが誘導された海馬切片におけるGluR1、GluR2細胞内分布はともに,コントロール群の分布と比較して細胞膜分画(ラフト含有分画)に移行していた。以上の結果は、O-GlcNAc化抑制によりAMPA受容体の細胞膜上の発現が増加し、それがAMPA受容体反応増大ならびにLTP発現促進の誘因となることを示唆している。従って、O-GlcNAc化はAMPA受容体エンドサイトーシスの促進シグナルとなる、あるいはAMPA受容体燐酸化は細胞膜へのAMPA受容体輸送シグナルとなる、という2つの可能性が推定できた。当該研究により下記の結果が得られた。(1)O型N-アセチルグルコサミン化(O-GlcNAc化)転移酵素の阻害剤であるアロキサンはGluR1受容体反応を増大させた。(2)アロキサンはラット海馬切片のCAl領域より得られた長期増強現象(LTP)を増大した。(3)アロキサン存在下でLTPが誘導された海馬切片におけるGluR1、GluR2の細胞膜(ラフト分画)発現はともに,コントロール群と比較して増加していた。(4)アロキサンはPC-12細胞膜発現GluR1、GluR2のエンドサイトーシスを阻害していた。(5)アロキサンのエンドサイトーシス阻害効果はセリン/スレオニン燐酸化部位除去GluR1、GluR2で認められなかった。(6)アロキサンのエンドサイトーシス阻害効果はO-GlcNAc化転移酵素ノックダウンにより消失した。これらの結果は、(1)セリン/スレオニン蛋白質燐酸化酵素によるAMPA受容体燐酸化は細胞膜表面への特異輸送ガイダンスシグナルとして働き、細胞膜表面の受容体発現数を促進する、(2)細胞膜表面発現AMPA受容体に付加された燐酸基がO-GlcNAcに変換される(O-GlcNAc化)とAMPA受容体エンドサイトーシスを阻害する、(3)AMPA受容体のO-GlcNAc化はLTP維持に必要である、ことを示している。本研究は、AMPA受容体traffickingにおけるO-GlcNAc化の役割を解明し、認知機能の細胞モデルであるLTPの発現機構に斬新な概念を提示している。本研究成果は現在、大きな社会問題であり、急務であるアルツハイマー病を含めた様々な認知症に対する新規治療薬・治療法開発の戦略基盤となり、世界に先駆けるものとなる。このように、当該研究成果の社会的貢献度・その意義は極めて高い。
PDGFが誘導する幹細胞を標的とした神経組織の再生と修復

脳卒中、外傷、種々の変性疾患など、多数の神経組織疾患のほとんどが重篤で機能回復が困難です。本研究課題では、マウスを用いた研究において、脳に豊富に発現する血小板由来増殖因子が神経細胞の幹細胞を刺激し、脳卒中後の神経細胞の再生を誘導しました。さらに血小板由来増殖因子が動員する新しい幹細胞が、神経細胞の活動に必須である髄鞘を形成する細胞の維持や再生に関与しました。今後の神経疾患の治療に向けて、血小板由来増殖因子は重要な標的であり、さらに研究を継続することが必要です。脳梗塞や脱髄性疾患等により、損傷された神経組織への再生や修復の誘導は医学上の喫緊の課題である。脳には血小板由来増殖因子(PDGF)発現が豊富である。本研究は、脳に発現するPDGFが幹細胞で高発現しているPDGF受容体(PDGFR)の活性化を介して、脳組織の再生や修復を誘導する機序を解明する。この目的のために、PDGFRの条件的ノックアウト(KO)マウスを用い、1PDGFR-βが梗塞脳において、脳室下帯(SVZ)からの神経新生と新生神経細胞の病変への動員、骨髄から脳病変への幹細胞の動員、同細胞による病変の血管周囲の特殊な微小環境形成等の各過程ではたす役割を、また、2PDGFR-αがマウスの脳脱髄巣に対して、Oligodendrocyte前駆細胞がSVZより分化・増殖し、髄鞘形成細胞に成熟し、脱髄病変を修復する過程ではたす役割を、それぞれ明らかにすることを計画した。初年度は、1と2のいずれにおいても研究が進捗した。1ではSVZから脳梗塞部位への神経幹細胞の動員が観察できるマウス大脳基底核に広く梗塞を誘導するモデルでの実験を実施した。脳にもっとも高いPDGFRーβ発現がみられるSVZの神経幹細胞と血管周囲細胞の二種類の細胞のうち、神経幹細胞でのみ選択的にPDGFRーβ発現を抑制することによって同神経細胞の生理的な嗅脳への細胞移動が梗塞巣方向にシフトすること、血管周囲細胞に残存するPDGFRーβが虚血により活性化され神経幹細胞の虚血巣への遊走を亢進させるという事実を見出した。現在、投稿の準備中である。2ではPDGFR-αの発現をTamoxifenの投与により生後マウスで抑制することによりPDGFR-αを発現している稀突起膠細胞の動態が大きな影響を受ける事実を見出し、学会発表を実施した。傷害された神経組織の再生や修復の誘導は医学上の喫緊の研究課題である。本研究は、脳に発現する血小板由来増殖因子(PDGF)が、脳組織の再生や修復を誘導する機序を解明する。同受容体(PDGFR)の条件的ノックアウト(KO)マウスを用い、1PDGFR-βが側脳室脳室下帯(SVZ)由来の新生神経細胞の脳梗塞病変への動員、また、2PDGFR-αが、稀突起膠細胞の前駆細胞(OPC)がSVZより分化・増殖し、髄鞘形成細胞に成熟し、脱髄病変を修復する過程ではたす役割を、それぞれ明らかにすることを計画した。1では、一昨年、脳で元来PDGFR-βを豊富に発現する血管周囲細胞とSVZの神経幹細胞のの内、神経幹細胞で選択的にPDGFR-βを不活性化すると同細胞の梗塞巣への遊走が高度に促進することを示した。昨年は、mRNAのマイクロアレイ解析により、当該モデルにおける神経幹細胞の遊走が、病変での特定の遊走促進因子の過剰発現によることを見出した。さらに当該モデルマウスから分離、培養した神経幹細胞には特定の接着因子の発現誘導があり、これが細胞の遊走を促進することも明らかにした。これらの機序を介して、PDGFR-βは、虚血巣への神経幹細胞の遊走に関与していることを提示することができた。再生医療に基礎的な知見を与えるものであり、現在論文投稿の準備中である。2の実験では、成熟マウス個体にTamoxifenを投与して、PDGFR-αの遺伝子を不活性化すると、同遺伝子を元来豊富に発現しているOPCが髄鞘形成細胞へと急激な分化を遂げる、これと同時に遺伝子の不活性化を免れた脳に広く分布すると考えられる未分化な幹細胞成分からPDGFR-α依存性に新たなOPCが分化誘導されてくるという全く新しい事実を見出しつつあり、その詳細を検証中である。これまで全く知られていない神経組織の再生機序である可能性がある。同受容体(PDGFR)の条件的ノックアウトマウス(KO)を用い、1)PDGFR-bが側脳室下帯(SVZ)由来の新生神経細胞の脳梗塞病変への動員、2)PDGFR-aが、稀突起膠細胞の前駆細胞(OPC)がSVZより分化、増殖し髄鞘形成細胞に成熟し、脱髄疾患を修復する過程で果たす役割を、それぞれに明らかにすることを計画した。1)ではNestin Promoterにより誘導されるCre recombinaseが誘導する神経細胞特異的なPDGFR-b KOマウスの脳梗塞巣に、これまでに報告のない高度の神経新生が見られることを見出した。この高度の神経新生は神経幹細胞におけるIntegrin発現の亢進の結果として見られる細胞遊走能の亢進と、脳梗塞巣における神経幹細胞の増殖因子であるCXCL12

発現の亢進という要因が複合してもたらされたことを示唆するDataとともに論文として報告した(Sato et al., Stem cells, in press)。梗塞脳にはこれまでの予想を上回る再生能力があることを示したもので、社会的な反響も大きく、患者様からの問い合わせも頂いた。Mediaからの反応も複数あり、読売新聞では全国版に報道されている。2)ではGenetic mapping, Virus vectorを用いたLineage tracing等の手法により髄膜や脳実質の血管周囲に分布する間葉系幹細胞由来の未熟な細胞がPDGFR-a依存性に脳に動員されてOPCの欠失を補うことを示した。Adult brainでOPCの全Populationが一度に置き換わる規模の再生能力であり、髄鞘が傷害される疾病の治療に道を開くものである。論文の投稿中で、受理に向けて努力をしているところである。二種類のPDGF受容体がそれぞれ独立して、これまでに報告がない新しい様式の脳神経組織再生に寄与する経路を見出しており最終年度での完成を目指している。本研究は、脳に発現する血小板由来増殖因子(PDGF)が、脳組織の再生や修復を誘導する機序を解明するものである。同受容体(PDGFR)の条件的ノックアウトマウス(KO)を用い、1)PDGFRbが側脳室下帯(SVZ)由来の新生神経細胞の脳梗塞病変への動員、2)PDGFRaが、稀突起膠細胞の前駆細胞(OPC)がSVZより分化、増殖し髄鞘形成細胞に成熟し、脱髄疾患を修復する過程で果たす役割を、それぞれに明らかにすることを計画した。1)ではNestin Promoterにより誘導されるCre recombinaseが誘導する神経細胞特異的なPDGFRb KOマウスの脳梗塞巣に、これまでに報告のない高度の神経新生が見られることを見出した。論文発表が終了したことは、社会的な反響も多かった事と共に、前年に報告した(Sato et al., Stem cells, in press)。2)では全く新しい事実として、成熟年齢のマウス脳で、PDGFRa遺伝子発現を抑制することにより、同遺伝子を発現するOPCが急速に髄鞘形成性の細胞成分に分化することと平行して、脳髄膜や血管周囲等の様々な局所から新しいOPCが再生される事実を見出しつつある。脳卒中、外傷、種々の変性疾患など、多数の神経組織疾患のほとんどが重篤で機能回復が困難です。本研究課題では、マウスを用いた研究において、脳に豊富に発現する血小板由来増殖因子が神経細胞の幹細胞を刺激し、脳卒中後の神経細胞の再生を誘導しました。さらに血小板由来増殖因子が動員する新しい幹細胞が、神経細胞の活動に必須である髄鞘を形成する細胞の維持や再生に関与しました。今後の神経疾患の治療に向けて、血小板由来増殖因子は重要な標的であり、さらに研究を継続することが必要です。全体の4年計画の2年を経た段階で、二種類のPDGFR受容体がそれぞれ、独立して脳の再生現象に深く関与する証拠を得ることができた。さらにPDGFR-βの条件的KOが誘導する神経幹細胞の病変への遊走はこれまでに報告がないほど強いものである。また、PDGFR-αの研究では、PDGFR-αに依存する未知の幹細胞が稀突起膠細胞の再生を非常に強力に誘導するというこれまでに全く知られていない新しい事実である。脳の再生機序を新たに見出すことが出来ており、順調に研究が進捗していると判断している。我々が提示している間葉系幹細胞の脳実質への動員と稀突起膠細胞の動員という経路は全く新しい細胞動態であり、雑誌への受理に困難をきたしている。
クローン化した遺伝子の維持と利用

【◯!1】本研究班では先にX染色体特異的DNAライブラリーをリーティングしたX染色体を用いて作成した。そのライブラリーよりいくつかのX染色体特異的断片を分離し、更に制限部位のポリモルフィズム(RFLP)を示すものをその中から見い出した。【◯!2】先に確立した家族性アミロイドーシス(FAP)患者のDNA診断法を更に発展させ、患者プレアルブミン遺伝子の解析から第18番染色体のマーカーとなるRFLPを3つ見い出した。【◯!3】ヒトのアルドラーゼA型の遺伝子のマッピングをヒト・マウス雑種細胞を用いて、サザーン及びノーザンブロッティング法で行ない第16番染色体にアルドラーゼA遺伝子が存在することを明らかにした。【◯!4】HTLV-1のpXたんぱく質によって誘発される遺伝子として、従来知られていたIL-2リセプター遺伝子の他に、カルパイン(カルシウム依存性中性プロセアーゼ)遺伝子を同定した。【◯!5】G1期の進行が停止する温度感受性(KS)株を分離し、それを用いてその度異を正常化するヒトDNA断片を分離した。【◯!7】細胞周期を通して、ほとんど凝集しているヘテロクロマチンの特色を明らかにする目的でニワトリのW染色体に特色的な反復DNA配列の構造とそれに結合するたんぱく質の解析を行った。【◯!8】ヘルペスウィルスDNAの間の細胞内組換元機構について解析し、ヘルペスDNAではhomologous recombinationがどの領域でも均等に生ずることを明らかにした。
くも膜下出血後early brain injuryに対する電気生理学的解析

SDラットを用いて開頭を行い脳表にdirect currency (DC)電極(皮質電位測定)、レーザードップラープローベ(脳血流測定)、頭蓋内圧センサー(脳圧測定)、骨表に脳波電極(脳波モニタリング)を設置した。採取しておいた自己血を環椎後頭間膜から注入し、くも膜下出血モデル(1回注入モデル)を作成した。皮質電位測定において脱分極時間を脱分極からコントロール値の80%まで回復した時間と定義した。さらに脳波抑制時間を脳波が減弱してからコントロール値の40%まで回復した時間と定義し、脱分極時間と脳波抑制時間の関係を評価した。くも膜下出血モデル作成後1週間で脳の灌流固定を行いHematoxylin-Eosin染色でDC電極部の組織障害を評価した。DC電極刺入部の大脳皮質第5層(錐体細胞)で核の凝集、細胞質の空砲化を組織障害とみなし組織障害度(障害を受けた細胞数/全細胞数×100 (%))を算出した。16か所の電極挿入部で皮質電位測定と脳波モニタリングが可能であった。全ラットにおいて1時間でくも膜下出血前の膜電位に回復した。すべての脳波においてくも膜下出血作成後超急性期に脳波の平坦化、徐波化が確認された。脳波の減弱は数分持続し、最終的にくも膜下出血前の脳波に回復する例もあったが、回復しない例も存在した。4か所でcortical spreading depressionのパターンを呈した。これらの平均脱分極時間は0.55±1.3分であり、脳波は平均23.4% ±7.1%まで低下したがすべてコントロールレベルまで回復した。脱分極時間と脳波抑制時間は有意な相関を示した。さらに脳波抑制時間と組織障害度においても有意な相関を認め、プロビット分析により組織障害度50%をきたす脱分極時間は15.9分、脳波抑制時間は53.7分であった。現在投稿に向け、原稿を執筆中である。SDラットに全身麻酔を行い腹臥位で環椎後頭間膜を露出し大槽に30G針つきチューブを留置。続いて開頭を行い脳表にdirect currency (DC)電極(皮質電位測定)、レーザードップラープローべ(脳血流測定)、頭蓋内圧センサー(脳圧測定)、骨表に脳波電極(脳波モニタリング)を設置した。採取しておいた自己血を環椎後頭間膜から注入し、くも膜下出血モデル(single injection model)を作成した。具体的にはDC電極刺入部の大脳皮質第5層(錐体細胞)で核の凝集、細胞質の空砲化を組織障害とみなし組織障害度(障害を受けた細胞数/全細胞数×100 (%))を算出した。中にはcortical spreading depressionのパターンを呈する例も存在した。脳波においてくも膜下出血作成後超急性期に脳波の平坦化、徐波化が確認された。さらに脳波抑制時間と組織障害度においても有意な相関を認め、プロビット分析により組織障害度50%をきたす脳波抑制時間は54分であった。当初の予定通り実験が進められ、有意な結果も得られているため。続いて開頭を行い脳表にdirect currency (DC)電極(皮質電位測定)、レーザードップラープローベ(脳血流測定)、頭蓋内圧センサー(脳圧測定)、骨表に脳波電極(脳波モニタリング)を設置した。

さらに脳波抑制時間と組織障害度においても有意な相関を認め、プロビット分析により組織障害度50%をきたす脳波抑制時間は54分であった。現在投稿に向け、原稿を執筆中である。データは揃っているものの、論文化に時間を要している。SDラットを用いて開頭を行い脳表にdirect currency (DC)電極(皮質電位測定)、レーザードップラープローベ(脳血流測定)、頭蓋内圧センサー(脳圧測定)、骨表に脳波電極(脳波モニタリング)を設置した。採取しておいた自己血を環椎後頭間膜から注入し、くも膜下出血モデル(1回注入モデル)を作成した。皮質電位測定において脱分極時間を脱分極からコントロール値の80%まで回復した時間と定義した。さらに脳波抑制時間を脳波が減弱してからコントロール値の40%まで回復した時間と定義し、脱分極時間と脳波抑制時間の関係を評価した。くも膜下出血モデル作成後1週間で脳の灌流固定を行いHematoxylin-Eosin染色でDC電極部の組織障害を評価した。DC電極刺入部の大脳皮質第5層(錐体細胞)で核の凝集、細胞質の空砲化を組織障害とみなし組織障害度(障害を受けた細胞数/全細胞数×100 (%))を算出した。16か所の電極挿入部で皮質電位測定と脳波モニタリングが可能であった。全ラットにおいて1時間でくも膜下出血前の膜電位に回復した。すべての脳波においてくも膜下出血作成後超急性期に脳波の平坦化、徐波化が確認された。脳波の減弱は数分持続し、最終的にくも膜下出血前の脳波に回復する例もあったが、回復しない例も存在した。4か所でcortical spreading depressionのパターンを呈した。これらの平均脱分極時間は0.55±1.3分であり、脳波は平均23.4% ±7.1%まで低下したがすべてコントロールレベルまで回復した。脱分極時間と脳波抑制時間は有意な相関を示した。さらに脳波抑制時間と組織障害度においても有意な相関を認め、プロビット分析により組織障害度50%をきたす脱分極時間は15.9分、脳波抑制時間は53.7分であった。脱分極時間と脳波抑制時間及び脳波抑制時間と組織障害度の相関関係に関して論文化に向け準備を進めている。脳波解析は臨床においても可能であり、本研究から脳波解析によりくも膜下出血症例の早期脳損傷に伴う重症度評価が可能であることが示唆された。今後はくも膜下出血重症例に対する治療法の開発が課題となり、本実験系を用いて電気生理学的観点から治療法を模索したい。脱分極時間と脳波抑制時間及び脳波抑制時間と組織障害度の相関関係に関して論文化に向け準備を進めているが時間を要している。完成に向け邁進する所存である。本研究から脳波解析によりくも膜下出血症例の早期脳損傷に伴う重症度評価が可能であることが示唆された。脳波は実臨床においても使用しており、くも膜下出血における臨床応用を検討したい。さらに今後はくも膜下出血重症例に対する治療法の開発が課題となり、本実験系を用いて電気生理学的観点から治療法を模索したい。
シングルイオン卓上顕微照射装置の開発とその利用による放射線生物影響の解析

高LET放射線の低線量被ばく影響を分子・細胞レベルで明らかにするには、特定の細胞や細胞内小器官に対して局所的に放射線を照射し、照射後の損傷シグナル伝達機構や損傷修復過程にかかわる生体分子の挙動を詳細に解析・評価する必要がある。そこで我々は、顕微鏡下で視認しながら任意の標的細胞に対してHeイオンを照射することが可能な新たな照射装置の開発が必須であると考え、ミクロンサイズのPo-210微小線源を装着した卓上型Heイオン顕微照射装置の開発を行った。本装置を実際に用いてヒト培養細胞に対する照射実験を行い、照射後細胞のタイムラプス画像の連続撮像を行ったところ、DNA損傷修復関連因子の時空間的な挙動変化を観察することに成功した。この結果は本装置の有用性を十分に示すものであった。α線(He^<2+>イオン)のような高LET放射線による内部被ばくは重篤な影響を及ぼすこともあって、その影響を分子・細胞レベルで理解することが、求められている。既に、低LET放射線であるX線照射による生体影響解析分野においては、顕微鏡下で細胞単位での照射が行なわれ、解析が進められている。また、高LET放射線の一つである粒子線照射の分野では、加速器によるイオンビームを細胞一個のスケールまで照射範囲を倭小化することに成功している。しかし、加速器利用は高度な専門知識と大型の照射施設を要し、多くの研究者にとって敷居が高いのが現状である。そこで、我々は、顕微鏡下でも簡便に細胞照射に用いることのできるマイクロα線源の作成を試みたところ、マイクロレジンカラムを用いてPb-210よりα線放出核種であるPo-210を分離し、これを直径数数百μmのPt芯線先端に電着することにより、Po-210マイクロα線源の作成に成功した。このPo-210線源から放出されるα線(5.3MeV)をHEK293細胞に対して空気中で近接照射(約5mm)を行い、数種のDNA修復関連蛋白質に対する蛍光免疫染色を行ったところ、110cpsのPo-210α線を30秒間照射した後に30分間培養した細胞群において、γ-H2AX及びTP53BP1の蛍光免疫染色スポットの形成が観察された。これら蛍光スポットは全て核内でのみ形成されていた。またγ-H2AXについては、蛍光スポットが細胞中で直線状に配向することを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて確認でき、α線が細胞を通過する際の飛程を示していると考えられた。この結果により、作成に成功したPo-210マイクロα線源を用いて簡便に細胞へ照射でき、DNA修復関連蛋白質の挙動の解析を行える可能性を示すことができた。既に、低LET放射線であるX線照射による生体影響解析分野においては、顕微鏡下で細胞単位での照射が行なわれ、解析が進めちれている。また、高LET放射線の一つである粒子線照射の分野では、加速器によるイオンビームを細胞一個のスケールまで照射範囲を矮小化することに成功している。そこで、我々は、顕微鏡下でも簡便に細胞照射に用いることのできるマイクロα線源の作成を試みた。平成23年度は、時空間的解析の対象細胞としてGFPとDNA損傷修復関連蛋白質RPA70との融合蛋白質が発現するヒト培養細胞を用意し、マイクロα線源を用いて、主に、一細胞に照準を定めて照射を行う「ーターゲット細胞への照射実験」を試みた。水中で1数cpm程度の強度のマイクロα線源を、マイクロマニピュレーターを用いて標的細胞から数μmの距離に近接させ、その細胞核に対して1数個のα粒子を液体培地中でヒシトさせた。その結果、照射後のα線照射細胞において、RPA70の集積を示すGFP蛍光スポットの形成が観察された。これにより、本研究課題において開発中の卓上顕微照射装置を用いることで、一個の細胞に照準を定めてα線照射を行える可能性が示せ、その際、一標的細胞あたり1数個のイオンを照射できること、などが示された。α線のような高LET放射線が生体に及ぼす影響に関する研究分野では、分子・細胞レベルでの理解が現在求められている。既に、加速器によるイオンビームを用いた粒子線照射の分野では、細胞一個のスケールまで照射範囲を矮小化することに成功している。しかしながら、加速器利用は高度な専門知識と大型の照射施設を要し、多くの研究者にとって敷居が高いのが現状である。

そこで本研究において我々は、より簡便に細胞に対してα線照射を行える卓上顕微照射装置の開発を行った。今回開発した照射装置では、顕微鏡下でマイクロα線源の精密な位置制御を行い、視認しながら細胞スケールでのα粒子照射を行えるようにした。マイクロα線源は、直径5μmの白金線の先端部に、カラムクロマトグラフィーにより精製した高純度のPo-210を電着させて(水中で数cpm程度の強度)作成した。そして、このマイクロα線源を、マイクロマニピュレーターを用い、標的から数μmの距離に近接させて照射を行えるようにした。今回開発した照射装置により、一細胞を標的とした照射や照射後の解析が可能かどうかを検討するために、平成24年度では、MDC1とDsRed2の融合蛋白質が発現するヒト培養細胞をターゲットとした「一細胞照射実験」を試みた。その結果、MDC1とDsRed2の融合蛋白質は数分30分後の間に細胞核内で集積することが標的細胞において確認できた。これらのことから、本研究課題で開発した卓上顕微照射装置が、任意の一細胞を標的としたα線照射を行うことができる性能を有し、照射後の解析に用いることができることを示すことができた。マイクロα線源から放出されるHe2+イオンを、時空間的解析用に用意した標的細胞の一細胞に照準を定めて照射し、その影響を観察することができた。本課題申請時は、ガイドやコリメータを用いて放出イオンの指向性を集束させることを予定していたが、現在使用のマイクロα線源であればそのような仕組みを用いずとも、液体培地を遮蔽として利用することで照射径を一細胞スケールまで矮小化できる可能性があることも判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度α線照射後の影響解析の指標として用いたRPA70は、DNA損傷部位への集積までに一時間以上を要した。そこで、より多角的に照射細胞たおける影響観察ができるよう、他の指標因子を検討する。また、細胞にヒットするエネルギーやイオン数を事前に推定できるよう、新たなマイクロ線源性能評価方法の確立を目指す。