hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化LDLが個々の単球の浸潤及び内皮細胞VE-cadherin動態に及ぼす影響

動脈硬化初期過程における我々の研究から,酸化LDLは血管内皮細胞間隙分子の発現制御(PECAM-1の増強,VE-cadherinの抑制)により細胞間隙を単球が浸潤し易い状態に変化させ,それにより,単球の接着→浸潤開始のstepが特異的に促進されることが明らかとなった(Hashimoto K et al., Atherosclerosis 2007,in press).本研究では,単球浸潤時のPECAM-1,VE-cadherinの分子動態を生細胞において直接観察することを目的として,当初は3種類の分子(酸化LDL,単球CD14,VE-cadherinor PECAM-1)の同時抗体染色を想定していた.しかし,膜貫通タンパクであるPECAM-1(VE-cadherin)の抗体による細胞外ドメイン標識は,単球浸潤の障害になる可能性がある為,代替法として,これらの分子の細胞内ドメインに別色の蛍光タンパク(GFP, DsRed)を付加した組み換えベクターを作製し,内皮細胞及び単球に発現させることにより,細胞外での分子相互作用を阻害せずに両分子の動態を直接観察することを試みた.本年度は,PECAM-1に着目し,常法(RNA抽出,逆転写,PCR増幅,ベクターligation,コロニー選択,プラスミド精製,塩基配列確認)によりPECAM-1-GFP(緑)及びPECAM-1-DsRed(赤)の発現ベクターを構築した.次に,様々な遺伝子導入法を検討した結果,Nucleofection法(Amaxa社)により高効率・低毒性にてベクターを導入・発現させることに成功した.現在,これらを発現させた細胞の機能確認(形態,増殖能,発現分子の局在確認,分子量確認等)を行っており,これらの細胞を用いて,共焦点レーザー顕微鏡による3次元浸潤動態観察を行い,両分子の役割を直接的に検証する予定である.動脈硬化初期過程におけるこれまでの我々の研究から,酸化LDLは血管内皮に接着した単球の浸潤開始に至るまでの内皮上でのダイナミクスを特異的に促進するが,一度浸潤を開始した後のダイナミクスには影響を及ぼさないことが明らかとなった.我々はこのような酸化LDLの特異的な作用が如何なる機序で起こっているのかを解明する為,生細胞における3種類の異なる分子の同時染色というストラテジーを用い,リアルタイム観察による直接的な実証を試みた.本年度は,3種類のターゲット分子((1)酸化LDL:蛍光色素TRITC,最大蛍光波長:約570nm,(2)内皮細胞間隙VE-cadherin or PECAM-1:蛍光色素FITC,最大蛍光波長:約520nm,(3)単球CD14(蛍光色素:Alexa633,最大蛍光波長:約650nm)を生細胞において抗体標識し,現有の共焦点レーザー顕微鏡にて3次元観察を行う為の最適な条件設定を探求した.特に,VE-cadherin及びPECAM-1の抗体による標識は単球が内皮間隙を浸潤する際の障害になる可能性がある為,代替手法として,当該分子の細胞内ドメイン(C末端)に蛍光タンパクGFP又はDsRedを付加した融合遺伝子を発現ベクターに挿入して内皮細胞に導入し,GFP付加融合タンパクを発現させる系を構築した.これにより,生細胞において単球-内皮間の相互作用を邪魔せずに直接3次元観察が可能となった.また,酸化LDLが内皮細胞に作用する際の受容体として働くと考えられているLOX-1を阻害した場合の単球ダイナミクスについても詳細な検討実験を行っている.動脈硬化初期過程における我々の研究から,酸化LDLは血管内皮細胞間隙分子の発現制御(PECAM-1の増強,VE-cadherinの抑制)により細胞間隙を単球が浸潤し易い状態に変化させ,それにより,単球の接着→浸潤開始のstepが特異的に促進されることが明らかとなった(Hashimoto K et al., Atherosclerosis 2007,in press).本研究では,単球浸潤時のPECAM-1,VE-cadherinの分子動態を生細胞において直接観察することを目的として,当初は3種類の分子(酸化LDL,単球CD14,VE-cadherinor PECAM-1)の同時抗体染色を想定していた.しかし,膜貫通タンパクであるPECAM-1(VE-cadherin)の抗体による細胞外ドメイン標識は,単球浸潤の障害になる可能性がある為,代替法として,これらの分子の細胞内ドメインに別色の蛍光タンパク(GFP, DsRed)を付加した組み換えベクターを作製し,内皮細胞及び単球に発現させることにより,細胞外での分子相互作用を阻害せずに両分子の動態を直接観察することを試みた.本年度は,PECAM-1に着目し,常法(RNA抽出,逆転写,PCR増幅,ベクターligation,コロニー選択,プラスミド精製,塩基配列確認)によりPECAM-1-GFP(緑)及びPECAM-1-DsRed(赤)の発現ベクターを構築した.次に,様々な遺伝子導入法を検討した結果,Nucleofection法(Amaxa社)により高効率・低毒性にてベクターを導入・発現させることに成功した.現在,これらを発現させた細胞の機能確認(形態,増殖能,発現分子の局在確認,分子量確認等)を行っており,これらの細胞を用いて,共焦点レーザー顕微鏡による3次元浸潤動態観察を行い,両分子の役割を直接的に検証する予定である.
夫妻の生活時間の比較から見たタイ、インドネシア、日本のライフスタイルの性差

インドネシアでは、インドネシア中央統計局の協力をえて、2004年911月に調査を実施した。調査はアフターコード方式の日記形式とし、「ペイド/アンペイド」「誰と」等を記述させるものとした。調査対象者は、ジャカルタの5地区から200世帯ずつ抽出した10歳以上の世帯員全員である。調査の配布と回収は、各地区40人の調査員が担当した。回収された4,151人のうち集計に使用したのは、平日2,408人、土曜3,253人、日曜2,343人である。タイでは、サワポーン(カサタート大学教授)を代表とするタイ生活時間調査チームを結成し、このチームと協力して、バンコック市内に住む住民の調査を実施した。調査は2005年12月3月に実施された。回収された300世帯のなかで、調査に協力してくれた人は1,244人であった。なお、日本の調査は資金等の関係から、事例的な調査とした。調査の結果、ペイド・ワークの時間は男性の方が長く、アンペイド・ワークである家事・育児の時間は女性の方が長く、インドネシア、タイにおいても性別役割分業は明確であった。ただし、ペイドワークにおいても、アンペイドワークにおいても、日本とは違う特徴があった。すなわち、女性がペイド・ワークに費やす時間は日本より多く、女性が社会的経済活動に参加しているが、家事の延長線上の小規模な生産活動が多く、インフォーマルな労働に多く携わっているという傾向があった。また、アンペイドワークにも、男性は日本より長く参画していたが、その内容は地域社会との交流に関わるものが多く、女性は炊事や洗濯などの家事雑事が多いなど、その内容に性による相違があることが明らかとなった。なお、これらの結果の一部は、2006年8月にデンマークで開催された国際生活時間学会で発表した。1インドネシアでの調査インドネシア統計局のMariet Tetty Nuryettyを協力者に、研究を進めている。本年度は調査票の検討、調査方法の確立、インドネシアでの調査協力体制の確立に重点を置いた。なお、調査は統計局社会経済統計課が引き受けてくれることとなった。本年度はインドネシアに赴き、本調査の打ち合わせを行い、以下のことを確定した。(1)調査対象者はインドネシアの首都、ジャカルタ住民とする。ジャカルタは5地域に分かれており、したがって、5地区から、国勢調査の調査世帯表を元に、200世帯づつ、計1000世帯を抽出する。調査は各地区の40人の調査員が5世帯づつを担当する。対象者は抽出した世帯に住んでいる10歳以上の全世帯員である。(2)日記形式の生活時間調査票により、24時間の全行動を記録する調査を行う。(3)抽出した世帯に調査員が赴き、調査内容を説明し、調査協力を要請する。了解が得られた世帯には、記録するために必要なメモ用紙をわたし、それに行動を記録しておいてもらう。再度調、査員が出向き、そのメモに基づいて日記式の調査票を調査員が記入する。その際、インタビューによって、不足部分を補う。(4)調査で使用する用語の定義を行った。(5)調査は、当初、2004年4月の予定であったが、総選挙が行われることから、6月に延期した。2タイ調査のためのプロジェクトチームの編成を要請するためにタイを訪れ、窓口のWAZAPONと協議を行った。その結果、RACHANI, WARAPONへプロジェクトへの参加要請を行うこととなった。

タイは現在、プロジェクト編成の要請中であり、現段階では調査内容の検討までには至っていない。1インドネシアでの調査インドネシアの調査は、2004年12月に実施した。インドネシア統計局経済社会福祉調査部局長Meity Trisnowatyを、研究協力者Mariet Tetty Nuryettyから紹介してもらい、契約書に基づいた調査実施を依頼した。契約内容は次のものである。(1)英文で作成した調査票をインドネシア語に翻訳して、調査票を作成、印刷する。調査票は世帯及び対象者個々人の属性等に関するアンケート調査部分と、24時間の行動を記録した日記式の生活時間調査部分に分かれる。(2)調査員を集め、訓練する。(3)5地区から、国勢調査の調査世帯表を元に、200世帯づつ、計1,000世帯を抽出する。(4)調査員が調査票を配布し、調査内容を説明し、調査票を回収する。不在の場合は再度訪問し、依頼する。不備の場合は、再度訪問し、聞き取りを行う。(5)回収した調査のうち、日記式の調査部分は、記述された行動を、本研究で検討した生活時間分類に沿って分類し、コード番号をつける。(6)アンケート調査部分と生活時間部分のデータを入力する。(7)データクリーニングを行う。(8)入力されたデータをファイル形式で提供する。(8)調査実施報告書を提出する。当初の予定では年度末までに全ての作業が終了する予定であったが、生活時間分類のコード化に手間取り、集計作業が進行中である。2タイでの調査SaowapornMuangkoe(カサタート大学)を長とし,Woraporn Tharawanich(カサタート大学),Rachini Lacharoj(元シーナカンウィロート大学),Chitinum Tejagupta(スコタイ・タマシラット・オープン大学),Wasaporn Nicharat(シーナカンウィロート大学)から構成されるタイ生活時間調査プロジェクトチームを編成した。このプロジェクトとがタイでの実際の調査を実施することとなり、インドネシアと同様の契約を交わした。なお、このプロジェクトと大竹、中山は共同研究をする形を取り、データは双方で共有し、研究成果も協同で発表することを契約の中に盛り込んだことが、インドネシアとは相違する。3タイ、インドネシア、日本に代表されるESCAP地域の生活時間調査実施の状況を調査するために、バンコックにある国連ESCAP統計局の生活時間調査のコンサルタント、Lene Mikkelsen, Pietro Gennari、および、タイの生活時間調査を実施した労働調査部長Neramit Dhanasakdiに面会した。その成果を論文に記した。インドネシアでは、インドネシア中央統計局の協力をえて、2004年911月に調査を実施した。調査はアフターコード方式の日記形式とし、「ペイド/アンペイド」「誰と」等を記述させるものとした。調査対象者は、ジャカルタの5地区から200世帯ずつ抽出した10歳以上の世帯員全員である。調査の配布と回収は、各地区40人の調査員が担当した。回収された4,151人のうち集計に使用したのは、平日2,408人、土曜3,253人、日曜2,343人である。
キセノンガスを利用した普遍的かつ容易な蛋白結晶構造解析法の開発

本研究の目的は、重原子として希ガス(キセノンとクリプトン)を用い位相決定のための重原子同形置換体を得ることである。そのために我々は、5MPa程度までの圧力に耐えられるガス封入装置を作製した。この装置はキャピラリーと市販の樹脂製T字コネクタを組み合わせた簡単な装置である。現在までにPFやSPring-8で、希ガスの圧を変化させ、リゾチーム、リボ核酸分解酵素、PCB分解酵素、およびトリプシンの蛋白質結晶に希ガスの導入を試みた。トリプシン以外の蛋白質結晶には、希ガスを導入することができた。しかし、リゾチーム、リボ核酸分解酵素については、単独で位相決定のために利用できるような重原子同形置換体は得られていない。一方、PCB分解酵素については、Spring-8のBL41XUにおいて、1つの結晶から、nativeとキセノン圧2.7MPaのデータを得ることが出来た。この重原子同形置換体は、分解能2.55A、completeness96.6%であった。このnatieveとキセノン同形置換体を処理した結果、パターソン図に明確なピークを得ることが出来た。3箇所のキセノンの座標を用いてプログラムMLPHAREにて重原子サイトの精密化を試みたが、電子密度分布図を解釈することはできなかった。そこで、この精密結果を用いて、プログラムSHARPを用いて更に、重原子サイトの精密化を行った。さらに、プログラムSOLOMONにて溶媒平滑化を行うことにより、分解能2.55Aで、蛋白質分子モデルを構築できる高品質な電子密度分布図を得ることに成功した。すなわち、希ガス単独で位相決定を行うという所期の目的を達成できた。キャピラリー付きキセノン封入装置の試作を行った。70気圧程度までの耐圧性のある市販の樹脂製T字ジョイントと2方コック、および溶融水晶キャピラリーを接続することで、ほぼ設計通りの装置の作製に成功した。キャピラリーの破損などの危険性が生じることはなかったが、接続部からの漏れのため内部圧力が必要とされる50気圧まで達することはなかった。現在、この問題を克服するため接続部に使用する接着剤の検討を行っている。一方、キセノンガスを低圧で高濃度の状態に保つためには、低温にすることが有効である。そこで、結晶の封入されたキャピラリーの先端を液体窒素温度に冷却することで、キャピラリー内部の温度を下げる予備実験を行った。ヘキシレングリコールから析出されたウシガエル卵由来レクチンでは、低温化による結晶への損傷は見られなかった。さらに、結晶がキャピラリーに接触している部分を外部から冷却することで結晶の温度を液体窒素温度にすることも試みた。フラッシュクーリングとは異なり、徐々に結晶の温度が低下するので凍結による破壊が懸念されたが、予想に反して良質なX線回折強度データを得ることができた。放射光研究施設において、キャラリー内で100Kに冷却した結晶からは1.2Å分解能を超える極めて高分解能のX線回折強度データを得ることに成功した。低温であるので、キセノン原子の解離を抑える効果を期待できる。また、多くの種類の蛋白質で予備実験を行うために、種々の結晶をルーチンに作製する条件を確立した。特に、ブタ由来トリプシンでは従来報告されていない晶系(正方晶系)の結晶を得ることに成功し、1.9Å分解能での構造解析を行った。セリンプロテアーゼの活性中心にはキセノンが結合するとの報告があるので、現在、ブタトリプシンを中心にキセノンガスの結合実験を行っている。高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設のBL18Bでキセノン封入の実験を20°Cにてニワトリ卵白リゾチームと牛膵臓由来リボヌクレアーゼAで行い、それぞれの結晶へのキセノンの導入を確認することができた。

いずれの結晶も、CuKα線では放射線損傷が激しく(キセノンの吸収による熱の発生のためと思われる)、1.0Åの放射光で初めて実験に成功した。リゾチームは約1.2MPaの圧力で3つのキセノンが結合していた。これはPrangeらの実験(Proteins 30,61-73(1998))の追試に当たる。さらに、リゾチームでは、同一の結晶から、常圧、キセノン1.0MPa、2.0MPa、および3.8MPaの4つのデータセットを大型イメージングプレートを使ってワイセンベルグ法で収集した。圧が強くなるにつれて、結晶が劣化する傾向が見られたが、いずれのデータセットも、2.4Å分解能以上の良質のデータであった。常圧のデータを用いて、結晶構造の精密化を行った後、他のデータとの差フーリエ図を作製した。キセノンの圧力の増加とともに、結合サイト数が増加し、占有率が高まっていることが分かった。リボヌクレアーゼAは高圧(IMpa以上)では結晶が壊れてしまったが、0.7Mpaで4つのキセノンの結合を確認できた。リボヌクレアーゼAの結晶では、キセノンが蛋白質分子間に結合しているので、圧が高まるとキセノンが分子間を押し広げて結晶を破壊するものと思われる。リゾチームでは蛋白質分子間への結合はないので、高圧にしても結晶は破壊されなかった。
魚類の微生物病に対する免疫防御に関する研究-とくにワクチンの実用化

サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ワクチン:弱毒変異伝染性造血器壊死症ウイルスのニジマスに対する免疫原性を検討した(長林)。サケ科魚類のヘルペスウイルス感染症の診断:血清学的方法および遺伝学的手法を用いて、サケ科魚類ヘルペスウイルスの型別を行なった(児玉)。タイ上皮嚢腫症の病原体に関する研究:鰓器官培養により、上皮嚢腫症病原体の増殖に成功し、タイに対する病原性を明らかにした。自然感染魚から得た精製シストを用いて免疫血清を作成し、病原体の抗原解析およびシスト形成過程の解析を行なった(平井)。ブリのレンサ球菌症ワクチン:強毒および弱毒変異レンサ球菌のホルマリン不活化菌体の、ブリにおける防御効果を検討した(北尾)。ブリの類結節症ワクチン:クロロホルム不活化パスツレラ菌体のブリにおける防御効果を検討した(佐々木)。ビブリオ病ワクチン:ビブリオ病不活化ワクチンの製造方法を改良した(佐々木)。ビブリオ病に対するニジマスの防御機構:ニジマスC反応性蛋白(CRP)の精製、およびその産生機構を解析し、感染防御における役割を追究した(児玉)。ニジマスのせっそう病に対するアジュバントの作用:ムラミル・ジペプチドのアエロモナス・サルモニシダに対する防御効果を検討した(児玉、服部、板倉)。アエロモナス・ハイドロフィラに対するコイの免疫機構:レバミゾ-ルによる免疫能増強と、本菌に対する防御との関連を検討した(馬場)。アジュバント:種々のアジュバントのマウスに対する生物活性、および感染症に対する免疫防御能を検討し、魚類へのアジュバントの応用の可能性を探った(東)。サケ科魚類のせっそう病ワクチンおよびビブリオ病ワクチンと、免疫予防効果判定法:Vibrio anguillarum.またAeromonas salmonicida不活化ワクチンはニジマスに予防効果をもたらすが、フロインド完全アジュバントはCRP(急性期蛋白)を顕著に上昇させたことから、ワクチンに用いるアジュバントの種類をよく検討する必要がある。(児王、板倉)ブリのレンサ球菌症および類結節症ワクチン:レンサ球菌症リ患ブリから分離した強毒および弱毒レンサ球菌株それぞれの不活化ワクチンの免疫予防効果を調べたところ、両者ともに強い防御効果を示した。(北尾)アジュバンドによるワクチン効果の増強:結核菌由来糖脂質、およびリポ多糖体リピドA誘導体のアジュバント活性とその機構を解析し、ワクチンへの応用を試みた。(東)魚類の微生物の人工培養:タイのエピテリオシスチス病の病原体の鰓器官培養による培養に成功し、分離株のタイに対する病原性を調べた。(平井)抗原の大量調製法および感染防御抗原の精製:ビブリオ病不活化ワクチンの製造方法を改良した。すなわち、V.anguillarumの培養過程において、培養液にブドウ糖と塩酸を連続して滴下することにより、抗原性を失なうことなく菌を増殖させることに成功した。(佐々木)魚類の防御免疫機構:A.hydrophilaに対するコイの防御免疫におけるワクチンとレバミゾール(免疫増強剤)の併用効果を検討し、レバミゾール投与によりマクロファージが活性化することを明らかにした。(馬場)サケ科魚類の伝染性造血器壊死症ワクチン:弱毒変異伝染性造血器壊死症ウイルスのニジマスに対する免疫原性を検討した結果、これをワクチンとして用いるためにはさらに弱毒化が必要であることが明らかとなった(長林)。サケ科魚類のヘルペスウイルス感染症の診断:

血清学的方法(中和試験、酵素抗体法)および遺伝学的手法(DNAハイブリダイゼ-ション、制限酵素切断パタ-ン解析)を用いて、サケ科魚類ヘルペスウイルスの型別を行なった(児玉)。タイ上皮嚢腫症の病原体に関する研究:自然感染魚から得た精製上皮嚢腫シストを用いて免疫血清を作成し、病原体の抗原解析およびシスト形成過程の解析を行なった(平井)。ブリのレンサ球菌症ワクチン:強毒および弱異変異レンサ球菌のホルマリン不活化菌体は、両者とも本病に対し良好な防御効果を示した(北尾)。ブリの類結節症ワクチン:クロロホルム不活化パスツレラ菌体はブリに防御能を付与し、ワクチンとしての実用化の可能性が示された(佐々木)。ビブリオ病に対するニジマスの防御機構:ニジマスC反応性蛋白(CRP)の精製、およびその産生機構を解析し、CRPはマクロファ-ジおよび補体を活性化することにより感染防御に重要な役割を果たすことを明らかにした(児玉)。ニジマスのせっそう病に対するアジュバントの作用:ムラミル・ジペプチドは単独で、ニジマスのアエロモナス・サルモニシダに対する防御をもたらすことを明らかにした(児玉、服部、板倉)。アエロモナス・ハイドロフィラに対するコイの免疫機構:レバミゾ-ルはマクロファ-ジの遊走能、食作用および殺菌能を高めることを明らかにし、本菌に対する防御との関連を検討した(馬場)。アジュバント:種々のアジュバントのマウスに対する生物活性、および感染症に対する免疫防御能を検討し、魚類へのアジュバントの応用の可能性を探った(東)。
過酸化水素に応答する新しい電位応答型

機能性修飾電極を用いた新しい電気化学バイオセンサの開発の観点から,本年度は, 1)先に開発した新しい電位応答型H_2O_2センサのバイオセンサへの応用における汎用化,微小化と高機能化について検討を加えるとともに, 2)蛋白質(酵素)の電子移動を基本とする新しい酵素センサーの開発をも試みた.これらはいずれも多機能酵素センサーの構成要素として重要な意味を有している.1.新しい電位応答型H_2O_2センサの開発とバイオセンサーへの応用:昨年度開発した電解重合ポリチラミン薄膜にフェロセンを導入したH_2O_2センサに各種酵素を固定化することによって,酵素反応で生成するH_2O_2を電位検出する酵素センサを得た.この原理を適用して昨年度のグルコースセンサ等に加えて, 50μM100mMの範囲で応答する乳酸センサを得た.またセンサの微小化の一つの方法として微小カーボンファイバー電極を用いたH_2O_2センサも作製した.さらに,ポリチラミン修飾電極上にフェロセンおよび酵素を固定化するに当り,チラミンを二重に修飾する方式を採用して,従来のものより約1ケタ高感度なグルコースおよび尿酸センサを得た.2.蛋白質(酵素)の電子移動を基本とした新しい酵素センサの開発:H_2O_2によって酵素活性が低下するような酵素のために,酵素と電気化学的に電子移動が可能な電極系を構築することは,いわゆる第二,第三世代のバイオセンサー開発の道程として重要である.本研究では,特に,サルコシンオキシダーゼに対してモリブデンシアノ錯体が,また,乳酸オキシダーゼについてはタングステンシアノ錯体が有効なメディエイターであることを見出した.これらを用いて酵素反応を詳細に解析するとともに,ポリーL-リジン膜を用いてメディエイター及び酵素を固定化した第二世代サルコシン及び乳酸センサを作製した.機能性修飾電極を用いた新しい電気化学バイオセンサの開発の観点から,本年度は, 1)先に開発した新しい電位応答型H_2O_2センサのバイオセンサへの応用における汎用化,微小化と高機能化について検討を加えるとともに, 2)蛋白質(酵素)の電子移動を基本とする新しい酵素センサーの開発をも試みた.これらはいずれも多機能酵素センサーの構成要素として重要な意味を有している.1.新しい電位応答型H_2O_2センサの開発とバイオセンサーへの応用:昨年度開発した電解重合ポリチラミン薄膜にフェロセンを導入したH_2O_2センサに各種酵素を固定化することによって,酵素反応で生成するH_2O_2を電位検出する酵素センサを得た.この原理を適用して昨年度のグルコースセンサ等に加えて, 50μM100mMの範囲で応答する乳酸センサを得た.またセンサの微小化の一つの方法として微小カーボンファイバー電極を用いたH_2O_2センサも作製した.さらに,ポリチラミン修飾電極上にフェロセンおよび酵素を固定化するに当り,チラミンを二重に修飾する方式を採用して,従来のものより約1ケタ高感度なグルコースおよび尿酸センサを得た.2.蛋白質(酵素)の電子移動を基本とした新しい酵素センサの開発:H_2O_2によって酵素活性が低下するような酵素のために,酵素と電気化学的に電子移動が可能な電極系を構築することは,いわゆる第二,第三世代のバイオセンサー開発の道程として重要である.本研究では,特に,サルコシンオキシダーゼに対してモリブデンシアノ錯体が,また,乳酸オキシダーゼについてはタングステンシアノ錯体が有効なメディエイターであることを見出した.これらを用いて酵素反応を詳細に解析するとともに,ポリーL-リジン膜を用いてメディエイター及び酵素を固定化した第二世代サルコシン及び乳酸センサを作製した.
シナプスと遺伝子発現を結ぶトラフィッキング・システムの研究-樹状突起流はあるのか?

前年度までの検討により、シナプス情報分子、シナプス蛋白などのトラフィッキング・システムにおいて、細胞骨格蛋白質が重要な役割を果たしていることが示唆された。その中でもMAP1Bは、細胞骨格の構成成分としてのみならず、ニューロン間のシナプス形成過程においても、エクト・プロテインキナーゼによるリン酸化-脱リン酸化機構を介して、密接に関与していることが判明した。本年度はこのMAP1B分子に関して、特異的抗体を作製して、免疫組織化学的に観察を行った。成熟したラット大脳皮質の切片を作製し、抗MAP1B抗体を用いて免疫組織染色し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察したところ、その多くは従来から報告されているように、細胞体あるいは樹状突起や軸索中に微小管に沿って存在していたが、後シナプス肥厚部にもMAP1B陽性の構造物が存在していることが認められた。しかも興味深いことに、このMAP1Bの後シナプス部位への局在は、全てのシナプスで共通して見られるわけではなく、およそ半数のシナプスにおいてのみで、残りのシナプスではMAP1Bは検出されなかった。シナプス部に見られるMAP1Bは、後シナプス側に存在しており、MAP1Bの存在しているシナプスを持つ樹状突起とそうでないものとの構造などでの差異から、樹状突起におけるトラフィッキング・システムについて新たな知見が得られる可能性もある。シナプス情報分子、シナプス蛋白などのトラフィッキング・システムの解析のために、まず実験系の確立を行った。ラット海馬及び大脳皮質神経細胞の初代培養系を用いて、軸索流観察に必要な1ケ月以上におよぶ長期培養をコンスタントに行えるように、培養細胞濃度、培養液などの検討を行った。さらに、培養した神経細胞をシナプトフィジン、シナプトタグミンなどのシナプス前蛋白質に対する抗体、及びMAP2抗体、ニューロフィラメント抗体などで免疫組織化学的に二重染色を行い、レーザーコンフォーカル顕微鏡を用いて観察をした。さらに、様々な培養日数で経時的な染色を行った結果、シナプトフィジン、シナプトタグミンに発達過程における分布の経時的変化が観察され、培養初期にはシナプトタグミンが、後期にはシナプトフィジンがシナプス観察に適していることが判明した。また、顕微撮影連続装置を用いて軸索流、樹上突起流を観察する予備実験を行い、種々の興味深い知見を得た。現在、シナプス形成に関与する分子としてそのメカニズムを研究しているMAP1Bについても抗体を作製するなどして、検討を進めている。
運動ニューロン疾患における軸索内輸送異常の発生機構に関する研究

運動ニューロン疾患(MND)において,これまで,遅い軸索内輸送の障害が知られているが,報告者は,速い軸索内輸送障害を伴っていることを明らかにした。2つの方法を用いたが,1つは免疫組織化学によるMND患者脊髄の検討である。速い軸索内輸送のモーター蛋白質であるキネシンと細胞質ダイニンに対するモノクローナル抗体により,抗ニューロフィラメント抗体で同定されたスフェロイドが強く染色された。速い軸索内輸送障害の結果と考えられる。この過程で,,抗ウシ細胞質ダイニン中間鎖モノクローナル抗体が5個得られたが,哺乳類細胞質ダイニンに対するモノクローナル抗体としては,これがはじめてである。もう1つの方法は報告者が新たに関発した,凍結乾燥切片を用いた定量的イムノブロットである。これにより,MNDの脊髄の各部で,キネシンと細胞質ダイニンが,単位重量あたりでも,単位体積あたりでも減少しているのが見出された。本法により,凍結乾燥切片から前角などを正確に切りとり,体積を,一定の厚さであることから面積測定により求め,モル濃度の算出が可能となった。組織学的なレベルでの蛋白定量法として今後の応用も期待される。実験モデルを用いての速い軸索内輸送障害の解析を試た。ビデオコントラスト増強微分干渉顕微鏡による観察を確立したが,蛍光顕微鏡によるトレーサー解析は途上である。主な原因は一般細胞で十分な標識が,培養ニューロンには入り難いことによるもので,平成6年度に申請したマイクロインジェクターによりそれが達成されることが十分に期待される。
睡眠病トリパノソーマにおけるGPIアンカー型タンパク質の生合成と機能に関する研究

睡眠病トリパノソーマ(Trypanosoma brucei)の血流型とプロサイクリック型の2つのステージのGPIの構造の違いは、イノシトールを脱アシル化するinositol-de-acylaseが働くか否かで決定される。本研究では、T.bruceiの主たるinositol-de-acylase遺伝子を同定し、両ステージにおける働きを解明しようとした。ヒトのGPI-inositol-de-acylaseであるPGAP1のT.bruceiホモログを見出し、GPIdeAc2と呼んだ。GPIdeAc2をノックダウンした原虫ではイノシトール脱アシル化がほとんど阻害されていたことから、GPIdeAc2が血流型原虫の主たるinositol-de-acylaseである事がわかった。両ステージでの発現を検討したところ、イノシトール脱アシル化の有無に対応し、GPIdeAc2は血流型で発現し、プロサイクリック型ではその6分の1しか発現していなかった。プロサイクリック型トリパノソーマは、トランスシアリダーゼを用いて宿主成分から自らのGPIアンカーの側鎖にシアル酸を付加する。T.bruceiは、トランスシアリダーゼと思われる遺伝子を少なくとも8つ持っており、このうちTSB38pだけがクローニングされ酵素活性が証明されていた。残りの遺伝子をクローニングし、それらが酵素であるかの検討をおこなった。TS550bとTS290bと付けたアイソフォームには、活性が認められなかった。TS270bと名付けたアイソフォームには、明らかな活性が見出された。トランスシアリダーゼが全く発現されないTbGPI8ノックアウト原虫に、可溶型にした各アイソフォームを発現させ、シアル酸の付加量を測定したところ、TSB38PとTS270bを同時に発現させると、相加的に原虫表面のシアル酸量が増加した。Trypanosoma bruceiの血流型とプロサイクリック型のGPIアンカーの差異に関する研究に関し以下の成果を得た。GPIアンカー生合成では、PIに順次成分が結合し、一旦糖脂質Aと呼ばれる中間体ができる。血流型では、糖脂質Aからイノシトールに結合しているパルミチン酸が除去され、その後PIの2本の脂肪酸が順にミリスチン酸に置き換えられて前駆体が完成する。一方、プロサイクリック型では、糖脂質Aのsn2位の脂肪酸が除去され、完成型の前駆体になる。これらの完成型前駆体が、GPIトランスアミダーゼによってタンパク質に付加される。2つのステージのGPIの構造の違いは、イノシトールを脱アシル化するinositol-de-acylaseが働くか否かで決定される。私たちはヒトのGPI-inositol-de-acylaseであるPGAP1のT.bruceiホモログを見出し、GPIdeAc2と呼んだ。GPIdeAc2が血流型原虫の主たるinositol-de-acylaseであるかを証明するために、テトラサイクリンでON-OFFが可能なRNAiによってGPIdeAc2をノックダウンした。RT-PCR法によって両ステージでの発現を検討したところ、イノシトール脱アシル化の有無に対応し、GPIdeAc2は血流型で発現し、プロサイクリック型ではその6分の1しか発現していなかった。

睡眠病トリパノソーマ(Trypanosoma brucei)は、シアル酸を合成できないが、トランスシアリダーゼを用いて宿主成分から自らのGPIアンカーの側鎖にシアル酸を付加する。トランスシアリダーゼによるシアル酸獲得の意義に関し、以下の成果を得た。T.bruceiは、トランスシアリダーゼと思われる遺伝子を少なくとも8つ持っており、このうち1つTSB38pだけがクローニングされ酵素活性が証明されていた。昨年度から、残りの遺伝子をクローニングし、それらが酵素であるかの検討をおこなった。クローニングした遺伝子のうち、TS550bとTS290bと名付けたアイソフォームには、トランスシアリダーゼ活性が認められなかった。TS270bと名付けたアイソフォームには、明らかなトランスシアリダーゼ活性が見出された。トランスシアリダーゼが全く発現されないTbGPI8ノックアウト原虫に、可溶型にした各アイソフォームを発現させ、シアル酸の付加量を測定したところ、TSB38pとTS270bを同時に発現させると、相加的に原虫表面のシアル酸量が増加した。このことは、2つの酵素が異なる特異性を持っていることを示唆しているので、さらに特異性の決定をおこなう予定である。
針葉樹林地残廃物の有効利用に関する研究

近年の地球環境への関心から、再生可能である森林の有効利用が叫ばれている。現在、林地で廃棄されている樹木の樹皮や葉の有効利用のため和紙の製造、スギ、ヒノキ針葉の抽出成分からゴキブリ忌避剤、残渣のプラスチック化を検討した。スギ、ヒノキの樹皮をアルカリ処理して繊維化することによって手すき和紙風の興味あるシートができた。これを漂白すると裂断長および比破裂度が増加し、またネリの添加量を10%にすれば強度が上昇する。スギに比べヒノキの方が破裂強さ、耐折強さが大きい。またヒノキの内皮の手すき和紙は市販で最も高い強度の雲竜紙に比べ、裂断長、破裂強さは同等であるが、耐折強さが劣る。スギ、ヒノキの針葉油からゴキブリ忌避効果がある成分を見出した。そして得られた成分は市販されているゴキブリ忌避剤であるN,N-Diethyl-toluamide(DET)よりも優れた忌避効力を示す。ヒノキ葉油成分を沸点別に分画した結果、モノテルペン類(α-ピネン、サビネン等)などの低沸点部の成分が大きい忌避効果があることが明らかとなった。またβ-サイクロデキストリンで包接すると6ヵ月程度までは高いゴキブリ忌避性の持続が可能となった。スギおよびヒノキ針葉から精油を抽出した残渣に化学修飾を試み、シアノエチル化が可能となった。スギおよびヒノキ針葉では、それぞれ約130、90°Cで熱流動を起こした。またシアノエチル化針葉はアセトン、アセトニトリルに溶解させたあと、粘着性の黄色いフイルムを作成することに成功した。近年の地球環境の面から限りある森林資源の有効利用は重要な課題である。一方,森林,木の国といわれるわが国も国産材は外国産材との市場競争に押され,林業をとりまく情勢は厳しい立場にある。このような状況のものにあるわが国の林業環境の一助として林地残廃物として出てくるスギおよびヒノキの樹皮と針葉についての活用のための研究を行った。樹皮は抽出物と残渣に分けて検討した。樹皮のメタノール抽出残渣からアルカリ抽出し,フェノール類を核交換反応を行ないフェノール化した。メタノール抽出物の収率はスギ樹皮は23%,ヒノキのそれは5%程度である。またその残渣のアルカリ抽出物はヒノキに比べてスギの場合の方が収率もよいので,これからタンニンのフェノール化し,合成条件を変えて接着剤化できることがわかったが,木材の接着性能はまだ十分ではない。一方,スギの内皮をアルカリ処理して繊維化し,漂白,解繊,叩解をしたあと,紙を漉くようにして製紙を試みた。その結果,洋紙状ではないが,クラフト紙,和紙風のものが出来ることが明らかとなったが,繊維の種々の強度,結合状態,漂白による色差状態などを調べる必要がある。針葉の利用としてスギ,ヒノキ針葉の抽出分離をし,精油抽出物のゴキブリ忌避性と残渣のプラスチック化を検討した。精油成分のゴキブリ忌避性はヒノキの方がスギの場合よりも効果があることが判明したが,その残効性能,有効成分の特定は現在まで明らかではない。また精油残渣の化学組成の結果,スギ,ヒノキとも可溶性無窒素物,粗繊維は約80%含有されており,木材に比べてセルロース含有量は小さいが,多糖類がかなり含有されているので,化学修飾することによって針葉精油残渣物のプラスチック化の可能性が明らかとなった。次年度は上記内容の研究をさらに進行させる予定である。

現在、林地で廃棄されている樹木の樹皮や葉の有効利用のため、和紙の製造、スギ、ヒノキ針葉の抽出成分からゴキブリ忌避剤、残渣のプラスチック化を前年に続き検討した。スギ、ヒノキの樹皮をアルカリ処理して繊維化し、手すき和紙風のシートを作成した。漂白することによって、裂断長および比破裂度が増加し、またネリの添加量を10%にすれば強度が上昇した。スギに比べヒノキの方が破裂強さ、耐折強さが大きい。またヒノキの内皮の手すき和紙は市販で最も高い強度の雲竜紙に比べ、裂断長、破裂強さは同等であるが、耐折強さが劣る。スギ、ヒノキの針葉油は市販されているゴキブリ忌避剤であるN,N-Diethyl-toluamide(DET)よりも優れた忌避効力を示す。ヒノキ葉油成分を沸点別に分画した結果、モノテルペン類(α-ピネン、サビネン等)などの低沸点部の成分が大きい忌避効果があることが明らかとなった。またβ-サイクロデキストリンで包接すると6カ月程度までは高いゴキブリ忌避性の持続が可能となった。スギおよびヒノキ針葉から精油を油出した残渣に化学修飾を試み、シアノエチル化が可能となった。スギ針葉では約130°Cで熱流動を起こした。またシアノエチル化針葉はアセトン、アセトニトリルに溶解させたあと、粘着性の黄色いフイルムを作成することに成功した。
２型糖尿病の膵β細胞不全におけるRAGE・糖脂肪毒性・レプチンの役割の解明

2型糖尿病では膵ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌が徐々に低下し膵β細胞疲弊が生じる。このメカニズムを解明するため、高血糖による糖毒性物質advanced glycation end-products (AGE)とその細胞膜受容体receptor for AGE (RAGE)に着目し、レプチンシグナル不全のdb/dbマウスを使って検討した。また、マウス膵β細胞由来MIN6細胞を用いて糖脂肪毒性の影響を調べた。レプチン受容体シグナルの遮断と、遊離脂肪酸の暴露によって膵β細胞膜上のRAGE発現誘導が生じ、さらにAGE刺激によって膵β細胞はアポトーシス、インスリン分泌不全に陥ると結論された。糖尿病が進行すると、2型糖尿病においてもインスリン産生膵ランゲルハンス島β細胞が徐々に機能不全に陥り、1型糖尿病と同様、インスリン投与が必要となる。このような膵β細胞障害のメカニズムの解明を目的とする。本研究者らは、これまでに糖化タンパク(advanced glycation end-products, AGE)とその受容体(receptor for AGE, RAGE)相互作用が糖尿病血管合併症の発症進展に関わることを提唱してきた。本研究においては、RAGEが膵β細胞機能不全にどう関わるのかをin vitro/in vivoの両面からのアプローチにより調べた。まず、膵β細胞上にRAGEが発現しているかどうかを検討するため、各種2型糖尿病モデルマウス[ob/ob, db/db, diet-induced obese (DIO)マウス]から膵ランゲルハンス島を分離し、酵素で単一細胞にまで分散後、フローサイトメトリーを用いて定量評価した。対照の非糖尿病野生型マウス、RAGE欠損マウス由来の膵β細胞においてはRAGEの発現は認められなかったが、ob/obマウス、db/dbマウス、DIOマウスでは膵β細胞にRAGE発現を認めた。マウス膵β細胞由来MIN-6細胞でも、遊離脂肪酸である0.2 mMパルミチン酸、あるいは0.2 mMオレイン酸の24時間暴露によりRAGEが細胞膜上に発現誘導されることが分かった。RAGE欠損マウスをdb/dbと掛け合わせることで、RAGE欠損db/db (RAGE-/-db/db)マウスとRAGE野生型db/db(RAGE+/+db/db)マウスを作製し調べると、耐糖能、インスリン分泌能はRAGE-/-db/dbマウスにおいてより良好で、アポトーシス細胞数、膵β細胞容積・数も保たれ、膵β細胞疲弊から免れていることが分かった。血糖コントロール状態が悪い2型糖尿病においては、膵ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌が徐々に低下し、β細胞の量自体も低下することが知られている。本研究は、このような膵β細胞疲弊とも呼ばれるβ細胞障害のメカニズムの解明を目的とする。本研究者らは、これまでに糖化タンパク(advanced glycation end-products, AGE)とその受容体(receptor for AGE, RAGE)の相互作用が糖尿病血管合併症の発症進展に関わることを提唱してきた。昨年度までの研究によって、RAGEノックアウトマウスと肥満糖尿病モデルマウス(ob/ob, db/db,高脂肪食負荷)を使用した検討、さらにマウス掛け合わせ実験の結果から、膵β細胞におけるRAGE発現はレプチンシグナル不全に依存すること、RAGE発現を無くすることでβ細胞障害が防止できることを明らかにしてきた。本年度においては、さらにフローサイトメトリーを用いてtoll-like receptor (TLR)2, 4の発現を調べたが、膵β細胞疲弊に陥ったβ細胞においても発現はみられず、TLR2, 4の関与は大きくないものと予想した。マウス膵β細胞由来MIN-6細胞を用いた検討すでは、0.2 mMパルミチン酸あるいは0.2 mMオレイン酸の24時間暴露に加えてレプチン受容体阻害薬の処理によりさらにMIN-6細胞表面のRAGE発現が増えた。このような状態で培養培地中に50 μg/ml AGEを添加すると、MIN-6細胞のインスリン分泌能は低下しアポトーシス細胞数が急激に増加することが分かった。対照の50 μg/ml BSAコントロールではインスリン分泌障害やアポトーシスは生じなかった。以上、膵β細胞における脂肪毒性、糖毒性とRAGE、さらにそこにレプチンシグナルが関わることが明らかとなった。2型糖尿病では糖毒性・脂肪毒性によって膵β細胞疲弊が引き起こされる。本研究の目的は、その分子メカニズムを解明することである。これまでに、レプチンシグナル不全のob/ob、db/dbマウスから膵ラ島を単離し、酵素処理によって単一細胞にしたものをフローサイトメトリーで解析した結果、膵β細胞の細胞膜上でのreceptor foradvanced glycation end-products (RAGE)発現が確認できた。続いて、培養マウス膵β細胞由来のMIN6細胞に0.2 mMパルミチン酸あるいは0.2 mMオレイン酸を24時間暴露することでRAGEが細胞膜上に発現誘導し、0.2 ug/mlレプチン受容体アンタゴニスト(D23L/L39A/D4A/F41A; PLR Ltd)を前処理することにより、RAGE発現はさらに有意に増強した。次に、MIN6細胞でインスリン分泌能を調べると、0.2 mMパルミチン酸あるいは0.2 mMオレイン酸の24時間処理によって有意にインスリン分泌能は低下した。さらに0.2 ug/mlレプチン受容体アンタゴニスト前処置と50 ug/ml AGE-BSA暴露がそこに加わることでさらに悪化した。

細胞内Caspase-3/7の活性化を指標にしてアポトーシス細胞を検出すると、0.2 mMパルミチン酸あるいは0.2 mMオレイン酸の処理によってアポトーシス細胞数が有意に増加したが、0.2 ug/mlレプチン受容体アンタゴニスト前処置と50 ug/ml AGE-BSAが加わることでその数は著増していた。レプチン受容体シグナル遮断と遊離脂肪酸の暴露によってRAGE発現誘導が生じ、さらにそこに糖化タンパクAGEが加わることにより膵β細胞由来MIN6細胞はアポトーシスに陥り、インスリン分泌不全になることが分かった。2型糖尿病では膵ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌が徐々に低下し膵β細胞疲弊が生じる。このメカニズムを解明するため、高血糖による糖毒性物質advanced glycation end-products (AGE)とその細胞膜受容体receptor for AGE (RAGE)に着目し、レプチンシグナル不全のdb/dbマウスを使って検討した。また、マウス膵β細胞由来MIN6細胞を用いて糖脂肪毒性の影響を調べた。レプチン受容体シグナルの遮断と、遊離脂肪酸の暴露によって膵β細胞膜上のRAGE発現誘導が生じ、さらにAGE刺激によって膵β細胞はアポトーシス、インスリン分泌不全に陥ると結論された。当初の計画通りに研究は進行している。2型糖尿病の膵β細胞疲弊における、膵β細胞の脂肪毒性、糖毒性とRAGE、さらにそこにレプチンシグナルが関与するという新しい概念が明らかとなった。糖尿病学、生化学今後は、新たにRAGE発現の誘導メカニズムの解明を行い、RAGEを標的とした膵β細胞障害保護効果をさらに追及していく。特に、新規RAGEアンタゴニストの開発や、RAGE sheddingを誘発するユニークな方法論にも挑戦していく。当初の研究計画の通り、in vitro/in vivoの系において、膵β細胞上でのRAGE発現の確認とRAGE発現誘導の系を確立した。今後は、新たにRAGE発現誘導のメカニズム解明を行い、さらに、それを標的とした抑制実験とRAGE抑制による膵β細胞障害保護効果を検証していく予定である。膵β細胞上でのRAGE発現誘導機構にパルミチン酸やオレイン酸の遊離脂肪酸の刺激が関わることが明らかになったので、脂肪酸トランスポーターやToll-like receptor (TLR)、G protein-coupled receptors (GPRs)などの関与を調べる。また、レプチン受容体(LepRb)、レプチン受容体細胞内シグナルの効果も検討する。また、各種RAGEリガンドが膵β細胞機能障害に与える影響も調べる。
動的速度論的制御を基盤とするビアリール化合物の触媒的アトロプ不斉合成反応

オルトアザキノンメチドは、含窒素環状化合物の構築において有用な合成中間体であり、天然物合成に広く用いられている。一方、パラアザキノンメチドは、アニリン類のベンジル位に新たな炭素-炭素結合を構築するための有効な合成中間体であるが、パラアザキノンメチドの有効な発生方法が少ないため、それを用いる反応は数例に留まっている。本研究では、より温和な条件下でパラアザキノンメチドを発生させるための前駆体の合成およびパラアザキノンメチドに対してマロン酸エステルが付加するエナンチオ選択的反応の開発を行った。まず、パラアザキノンメチド前駆体として種々のパラクロロメチルアニリン類の合成を行ったところ、窒素原子をTs基とFmoc基で保護したパラクロロメチルアニリンが有効なパラアザキノンメチド前駆体となることがわかった。触媒量の光学活性銅錯体およびジイソプロピルエチルアミン存在下、パラクロロメチルアニリンに対し、マロン酸ジメチルを作用させたところ反応が進行し、アニリン類のベンジル位にマロン酸ジメチルが付加した生成物が得られた。本反応では、アミン塩基によりFmoc基の脱保護が起こると同時に反応活性なパラアザキノンメチド中間体が生成し、光学活性銅錯体により活性化されたマロン酸ジメチルがエナンチオ選択的に付加していると考えられる。従って、アミン塩基およびマロン酸エステル類が収率およびエナンチオ選択性に大きく影響すると考えられるため、アミン塩基およびマロン酸エステル類のスクリーニングを行った。その結果、トリエチルアミン存在下、パラクロロメチルアニリンに対し、アルファ位にメチル基を有するマロン酸ジメチルを作用させて反応を行った場合、エナンチオ選択的に高収率で生成物が得られた。本研究により、パラアザキノンメチド中間体を用いる初のエナンチオ選択的反応が達成された。ビアリールラクトン類の動的速度論的光学分割を伴う立体選択的開環反応は、軸不斉ビアリール類の合成法として有効な手法である。すなわち、ビアリールラクトン類の2つの芳香環は、ほぼ同一平面に存在するため、M体およびP体のビアリールラクトン類の異性化障壁は小さく、両者の平衡は非常に速いと考えられる。このとき、どちらか一方の軸不斉異性体を認識する適切な求核剤により、ラクトン開環反応が起これは、開環後は軸不斉に関する異性化障壁が増大するため、両エナンチオマー間の異性化は起こらず、軸不斉ビアリール類が得られる。本研究では、触媒量の光学活性ケトイミナトコバルト錯体と修飾水素化ホウ素ナトリウムを作用させると、ビアリールラクトン類の動的速度論的光学分割を伴うアトロプ不斉還元反応が進行することを見いだした。HPLC分析により、M体およびP体のビアリールラクトン類の速い異性化平衡を維持しうる温度条件を確認した上で反応を行ったところ、様々なビアリールラクトン類の動的速度論的光学分割が円滑に進行し、高エナンチオ選択的に対応する軸不斉ビアリールジオール類が得られた。さらに、光学活性なルイス酸触媒によって活性化されたラクトンカルボニルに対し、アルコールが求核攻撃するエナンチオ選択的ラクトン開環反応を設計し、より一般性に優れた軸不斉ビアリール類合成法の開発に着手した。その結果、光学活性な銀-ホスフィン錯体触媒存在下、ビアリールラクトン類に対して求核剤としてメタノールを作用させると、ビアリールラクトン類の動的速度論的光学分割を伴うアトロプ不斉開環反応が進行し、軸不斉ビアリールエステル類が高エナンチオ選択的に得られることを見いだした。この反応では、ビアリールラクトン類の種類によってはトリイソブチルアミンの添加が反応性の向上に効果的であり、様々な軸不斉ビアリールエステル類が高収率かつ高エナンチオ選択的に得られた。

その結果、トリエチルアミン存在下、パラクロロメチルアニリンに対し、アルファ位にメチル基を有するマロン酸ジメチルを作用させて反応を行った場合、エナンチオ選択的に高収率で生成物が得られた。本研究により、パラアザキノンメチド中間体を用いる初のエナンチオ選択的反応が達成された。
光干渉計を用いた高次スペクトル測定装置の開発

2光束を重ね合わせる光路差可変のマイケルソン型干渉計を試作し、その基本性能を調べた。光路長の変化はステッピングモーターを用いた微動ステージで行う。本研究で開発する予定の3光束を合わせる干渉計では、2つの光路の光路長を可変とし、1つのビームを掃引している間は、他方を固定しておく必要があるため、光路長をステヅプ的に掃引できなければならないからである。ステッピングモーターの刻み幅は50nmに固定されているため、ピェゾアクチュエーターを用いて誤差の補正を行う。試験用にフーリエ分光装置を組み上げた。光源からの光を広帯域ビームスプリッターで2つのビームに分割し、微動ステージ上に取りつけた2つのコーナーキューブ・プリズムで反射させる。干渉計の一方のアームはステッピングモーターによって光路長を変化させ、他方のアームはピエゾアクチュエーターで位置の微調整や位相変調を行う。ステッピングモーターを2ステップずつ動かすことにより光路長は200nmずつ変化し、400nmまでの分光の帯域幅を得た。He-Neレーザーを測定し、FFTをかけて周波数データに直して、分解能および絶対精度の確認を行った。測定点数を増やしていくと、絶対精度は向上していくが、スペクトルは、ステッピングモーターの移動量の揺らぎなどによってむしろ拡がる傾向があった。光路差可変のマイケルソン型干渉計を試作し、その基本性能を調べた。2光束を重ね合わせる際に、一方の光ビームの光路長をステップモーターを微動ステージで変化させ、スペクトルを得る。ステップモーターの刻み幅が大きいため、ピエゾアクチュエーターを用いて微調整し、補正もおこなった。両方組み合わせたときのバンド幅は、ピエゾアクチュエーターを駆動するDAコンバーターの精度で決まるが、バンド幅はまだ正確に見積もっていない。ステップモーターおよびピエゾアクチュエーターの簡単な制御と、繰り返しスペクトル測定を行って積算するシステムを開発し、基本性能をチェックしている段階である。現時点での問題点は、ステップモーターを1ステップ動作させると、安定するまでに時間がかかるため、データ取り込みレートおよび繰り返しレートが高くできない点である。駆動パワーと駆動部分の質量を適当に選ぶことにより、機械的な減衰振動を除去し、ステップモーターの時間応答性を改善する必要があることがわかった。一方、ステップモーターの繰り返し位置再現性をかなり良いことがわかった。性能試験として、水銀546.1nm線の超微細構造スペクトルをファブリ・ペロー干渉計で分離し、上記のマイケルソン干渉計で可視度を測定している。ビームの平行度を改善するために、ピンホール、微動ステージ、アクロマティックレンズによる、空間フィルターを構成したため、光学系の調整がきわめて容易になった。今年度は、光路長の可変に主にピエゾアクチュエーターを用いる、2光束の通常のマイケルソン型干渉計を作成し、ピエゾ駆動システムのチェックを行った。性能試験として、ファブリ・ペロー干渉計を併用しながら上記のマイケルソン干渉計により、水銀の超微細構造スペクトルの可視度を測定した。広い波長帯域で干渉度を上げるために、ビームスプリッターを広帯域ハイブリッド・キューブプリズム型に変更し、ほぼ可視全域で100%の干渉度を得ることができた。問題は、コーナーキューブプリズムを駆動するピエゾアクチュエーターのヒステリシス特性が大きく、DAコンバーターで制御する場合、移動距離を大きくするとリニアリティに問題があることである。そのため、位置の分解能の点では十分なのにもかかわらず、フーリエ変換によるスペクトルを得ることができなかった。He-Neレーザーをリファレンスとしてフィードバックをかけられるよう、ピエゾ駆動システムをクローズドループ型に変更することにより、この問題は解決できる見込みである。干渉計を用いたスペクトル測定においては、駆動システムの精度が性能を左右する。本研究の目的には3光束を重ね合わせる干渉計が必要であり、可変光路長のうち少なくとも1つはステップ的に光路長を変化させなくてはならないことが、基礎実験の段階に時間がかかった理由である。