hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3次元マイクロレオロジーを用いたソフトマターの時空間階層構造の解明

本研究では、複雑な内部構造を持つソフトマターのメソスケールでの局所的相互作用や力学的性質を3次元かつメソスケールの分解能で測定可能な手法の開発を行った。そのために、三次元位置走査が可能な2ビーム光ピンセット、および三次元的に複数の位置での光トラップが可能なマルチビーム光ピンセットを新たに開発した。さらにこれらを用いて、(1)液晶中で粒子間に働く長距離相互作用の測定、(2)単一ベシクルの力学応答測定、(3)二分子膜ラメラ系のメソスケールでの線形・非線形粘性測定、(4)流体力学的に結合した粒子の集団運動の観察などに成功した。本研究では、複雑な内部構造を持つソフトマター中に分散したナノサイズのコロイド粒子をレーザートラップし、試料中の各点において、その交流刺激(力学振動あるいは電場)に対する複素変位を計測することで、試料の3次元的な構造や局所的ダイナミクスに関する情報をメソスコピックスケールの分解能で得ることを目指している。また、多粒子をレーザートラップし、その運動をリアルタイム観測することで、ソフトマター中でのダイナミクスの空間的不均一の可視化を実現することも目指している。平成20年度はこのための基礎となる電動蛍光顕微鏡、高出力赤外線レーザー、光回折素子、高感度カメラ、空間光変調器を導入して、シングルおよびマルチレーザートラップシステムの開発を行なった。開発されたシステムを用いた、単一光ピンセットによりプローブ粒子を周期的運動させて局所粘性測定を行なう能動的測定と粒子のブラウン運動追跡による受動的測定の結果を比較し、測定システムの検討を行なった。特に、内部構造を有するソフトマターである両親媒性2分子膜と水相が数百ナノメートルの周期で交互積層した構造を持つラメラ相において、膜間隔以下の蛍光プローブ粒子を用いて局所粘性測定を行なったところ、両者から得られる粘性率はいずれも水中における値の10倍程度の大きなものとなり、互いに良い一致を示した。更に、粒子の運動速度が極端に遅い場合には内部の欠陥構造に起因すると見られる非ニュートン流体的なシアシニング挙動を観察することができた。本年度は平成20年度に導入した空間光変調器(SLM)を用いて、位相ホログラムにより任意形状の光パターンを作成するマルチレーザートラップシステムの開発とその評価を行なった。任意の画像パターンからSLM上に表示する位相パターンを高速に作成するプログラム開発を行ない、数十個のコロイド粒子を同時捕捉し、これらを複雑なパターン上に配列することに成功した。さらに、レンズ効果を位相パターンに重畳することで3次元的な粒子トラップを実現した。開発したシステムを用いることで、任意の配置での3次元的な局所情報の計測が可能となった。さらに、レーザーの波面が回転する光渦を作成し、粒子に角運動量を与えることにも成功した。その際、同一半径の円周上に粒子をトラップしつつ、これらに角運動量を与え、その平均速度の充填密度依存性を調べた。その結果、流体力学的相互作用に起因した速度増加や特徴的なクラスター形成を観測することに成功した。これらの知見はマイクロ流路中での粒子操作の際の有用な知見を与えるものと考えている。本年度は、昨年度までに開発された光ピンセットシステムを用いてソフトマターの作る時空間構造の具体的な対象に対して以下のような研究を行なった。(1)円軌道を駆動される粒子の時空間ダイナミクスマルチレーザーピンセットシステムで作成した光渦を用いて、円軌道上に光トラップされた複数粒子に一定の角運動量を与えた際の粒子運動の研究を行なった。この系は粒子間相互作用がある非平衡開放系のモデル系として興味深い。その結果、各粒子には一定の駆動力が印加されているにもかかわらず、粒子を等間隔に配置した初期状態から実験を開始した場合にも、複数の粒子からなるクラスターの形成や破壊が自発的に起こり、隣接粒子間の角度差や各粒子速度の平均速度からのゆらぎにリミットサイクル振動が現れることがわかった。さらに、実験的に得られた結果を線形安定性解析および流体力学相互作用を考慮した運動方程式によるシミュレーションとの比較を行い、この系の時空間ダイナミクスを議論した。さらに、粒子の運動方向を周期的に変化させた場合やサイズの異なる粒子を用いた場合の運動に関しても実験を行い、新たな知見を得ることに成功した。

(2)有限サイズコロイド結晶の融解ダイナミクス光ピンセットはメソスコピックスケールの局所熱源として利用できる点に注目して、温度勾配により物質移動が誘起されるSoret効果を用いて、有限サイズの2次元コロイド結晶を作成した。結晶形成後、レーザー照射を止めて結晶の融解過程のダイナミクスを観測した。この際、局所粒子密度、局所隣接配置数、局所隣接配向秩序、局所短時間平均2乗変位の空間的・時間的変化を測定することに成功し、均一系での融解現象との違いを明らかにした。
SRP経路を介した膜局在化による熱ショック転写因子シクマ32の分解機構

大腸菌の熱ショック応答転写因子シグマ32は、短寿命であり、膜結合型ATP依存性プロテアーゼFtsHによって主に分解を受けることが知られているが、そのメカニズムは不明な点が多い。最近、研究協力者の由良は、遺伝学的解析から、膜タンパク質の生合成に関わるSRP経路が、シグマ32の分解に関与するとの知見を得ていた。本研究では、シグマ32を対象として、部位特異的in vivo光架橋法を用い、シグマ32とSRPの構成因子Ffhが、生きた細胞内で直接近接していることを明らかにした。「細菌の熱ショック応答に関わる転写因子σ32の分解に、膜タンパク質の組み込み反応時に機能するSRP(シグナル認識粒子)、FtsY、SecYEGトランスロコンらの因子が関与する。」との由良隆博士らの提唱した新しい作業仮説の実証を目指して、σ32分子を対象としたin vivo光架橋実験を行った。その第1段階として、σ32の安定性に関与する事が知られている2.1領域と呼ばれる領域をターゲットに解析を進めた。この領域内に光反応性のアミノ酸アナログpBPAを部位特異的に導入したσ32変異体を細胞内で発現させ、光架橋実験を行った所、幾つかのpBPA変異体において、大腸菌の分子シャペロンDnaK, DnaJに加えて、SRPを構成するタンパク質因子Ffhとの架橋が観察された。これらの結果は、由良らのモデルを強く支持するとともに、σ32とFfhが生細胞内で直接相互作用している事を示す最初の例となった。更に、σ32の分子シャペロン発現に応答した負の制御が不全となるsecY40変異株や、FtsYの発現量低下変異株中で同様のin vivo光架橋実験を行うと、上記σ32とFfhとの間の架橋産物の形成効率や、架橋バンドの大きさが変化することを見いだした。これらの結果は、Ffhとσ32間の相互作用様式や程度が、FtsYやSecYの変異により変化している事を示唆しており、上記作業仮説と矛盾しない。また、σ32を負の制御が不全となる変異をcisに導入した場合においても、同様の架橋形成効率の変化が観察された。これらの結果も作業仮説を支持する。今後は、pulse-chase実験を組み合わせた架橋の経時的変化を追跡する事により、新規作業仮説の妥当性をより詳細に検討して行く予定である。熱ショック応答に関わる転写因子σ32は短寿命であり、膜プロテアーゼFtsHにより分解を受けるが、その分解機構は明らかではない。分子シャぺロンDnaKJ, GroEL等によりσ32の分解が制御されている事も知られているが、その役割も不明である。研究協力者の由良らは、「σ32は、SRP経路により細胞質膜上のトランスロコンにターゲットされ、その後FtsHに受け渡されて速やかに分解される。」との独創的な作業仮説を提唱した。本研究では、σ32を対象とした部位特異的in vivo光架橋実験を行い、上記作業仮説を分子レべルで裏付け、SRP、トランスロコンの新たな機能の解明を目指す。具体的には光反応性のアミノ酸アナログpBPAを部位特異的に取り込ませたσ32変異体を発現した大腸菌株を用いて、光架橋実験を進め、特異的抗体を用いたimunoblottingあるいは質量分析により相互作用因子を同定する。当該年度は、架橋産物の精製を視野に入れアミノ末端にHis6タグを持つHis6-σ32を構築した。作製したタグ融合体は、野生型σ32と同程度の転写活性を持ち、FtsHにより分解を受ける事を確認した。更に、このタグ付きσ32をコードするplamsidを材料に、σ32分子内の2.1領域(分子シャぺロンに応答した分解において重要な領域)を中心として19種類のpBPA導入体を作製し、予備的in vivo光架橋実験を行った。その結果、2.1領域を含む幾つかの部位において、UV照射に依存した複数の架橋複合体の形成を確認した。分子シャぺロンDnaK, DnaJに対する抗体、あるいはSRPの因子の1つであるFfhに対する抗体を用いたimmunoblottingの結果から、σ32分子は、分子シャぺロンDnaK, JやSRPと相互作用している事が明らかとなった。本年度は、上記研究目的達成の為の材料作りと、予備実験を行った。精製の為のタグ導入によっても野生型σ32とほぼ同程度の活性を保持していることも確認でき、作製した材料が今度の実験に使用可能性である事も解った。更に、19種類のpBPA導入体を作製した予備的なin vivo光架橋実験により、架橋形成が予測されたDnaK, DnaJタンパク質に加えて、本研究課題において最も注目しているSRP (signal recognition particle)のタンパク質構成因Ffhとの架橋も確認できた。この結果は、σ32の分解において、SRP経路が関与している事を強く示唆するものであり、本研究において極めて重要かつ大きな成果と言える。

その点で、本研究は概ね順調に進展していると言える。その一方、DnaK, DnaJ, Ffhの関与は明らかになったものの、それ以外にも複数の部位で多数の架橋複合体が得られており、その同定には未だ至っていない。これは、研究に用いる大腸菌株とpBPAをタンパク質内に取り込ませる際に使用するplasmidとの相性の問題等もあり、実験のセットアップの為に種々の株を検討する必要があり、多くの時間を必要とした為である。当初、架橋複合体をHis6タグ配列を利用して精製し、質量分析による解析の目処を研究1年目につけておく予定であったが、この部分の検討はまだ十分に行われておらず、質量分析用に予定していた予算を十分に消化することが出来なかった。この点は研究計画を見直して、2年目の24年度に速やかに進めて行く必要がある。上でも述べたように、平成24年度は、未同定の架橋複合体の質量分析による解析を中心の一つに据えて研究を推進する。具体的には、架橋産物をHis6タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーにより精製し、SDS-PAGEにより架橋産物を分離した後に、そのバンドをゲルから切り出し、質量分析で解析する。新規タンパク質因子が同定された際には、その因子に対する抗体を作製し、データの妥当性を評価する。SRPの関与を示唆する結果は既に得られているので、今後は、SecY, FtsHとの相互作用に特に着目して解析を進める。σ32の分解におけるSRP, SecY, FtsHの関与、並びに分子シャペロンが寄与する過程の同定を目指して、ftsY, secY, ftsH変異株中でのin vivo光架橋実験を進め、架橋複合体形成パターンの変化等を検討する。更には、σ32が合成されてから分解に至るまでの、SRP, SecY等の各因子との相互作用の移り変わりを、pulse-chase実験とin vivo光架橋実験を組み合わせる事により検証する。既に述べたように、架橋複合体の質量分析の遅れにより、平成23年度に申請した予算の多くを24年度に持ち越す事になった。初年度消費できなかった研究費の多くは、架橋複合体の質量分析解析用の費用に当てる。加えて新規のタンパク質が同定できる可能性もあるので、その場合には、そのタンパク質に対する抗体作製用の費用に当てる。各変異株を用いてのin vivo光架橋実験は、研究室の現有の機器で十分可能であり、新規の機器を導入する必要はない。そのため、平成24年度の研究費は、菌の培養に関するランニングコストや、プラスチック等の消耗品、変異体作製の為のオリゴプライマー合成の費用、変異の確認の為のDNA配列解析にかかる費用等に当てる。また、放射性同位元素を用いたpulse-chase実験を行う為に、35S標識したメチオニンの購入費用にも用いる。
３Ｄ超音波像のトラッキングによる循環動態の長時間モニタリング

超音波による門脈の長時間モニタリングのために長時間の画像撮影法と得られた長時間3次元動画像解析法に関する検討を行なった.まず,ファントム実験により超音波による長時間撮像が可能であること,3D撮像と開発したトラッキングソフトウェアにより常に同じ位置を捉え続けることが可能であることを示した.次に,開発した簡易プローブ固定具を用いて健常被験者を対象として断続的に最長約1時間に渡る画像取得を行ない,トラッキングソフトウェアにより同じ位置を捉え続けることに成功した.超音波画像によって循環動態を長時間モニタリングする方法の開発を目的として研究をスタートした.まず,3D超音波装置を導入し,機器からのディジタルデータ取り出し方法とデータフォーマットの確認を完了した.また,準備段階で承認されていた倫理委員会への申請についても本課題用に変更申請を行ない受理されるなど,基本的研究体制の確立についてほぼ完了した.撮像法(主に固定法)に関する検討を開始し,ウレタンクッションを使った固定具により,70分間にわたってプローブを固定して門脈像を捉え続けられることを一人の被験者により確認した.プローブ固定の側面からは,固定の際の自由度を更に高めることが課題であった.また,画質の側面からは,呼吸の状況により発生する音響陰影が門脈像に重なる場合があり,撮像方向や体位など検討の余地があるものと考えられた.上記固定のもとで,70分間にわたりほぼ連続的(装置仕様により数分毎に短時間の中断を挟む)に門脈像を撮像し,得られた画像の解析と位置合わせ処理を行なった.この結果,70分間にわたって画質はほぼ維持されており,連続的に門脈の観測が可能であること,位置合わせ画像処理により呼吸動の影響を排除して一定位置を観測することが可能であることが示された.今後の課題としては,位置合わせ処理の更なる高速化と高精度化が挙げられる.また,位置合わせの際にトラッキングを用いた効率化も行なっているが,上記に述べた音響陰影の影響等により失敗することもある.この際の対策も含めた検討が必要である.発展形としては,門脈形態3D像の作成や径変化の計測など有用な情報の抽出が今後の課題となる.以上により,超音波画像による長時間モニタリングの可能性は十分に示せたと考え,他アプリケーションに関する検討も開始した.予想以上に固定がうまく行くので,2Dプローブによる可能性も含めて検討している.超音波画像による循環動態長時間モニタリング法の開発を目標に研究を進めている.門脈血流解析のための前段階として形態画像位置合せを具体的な対象として検討し,更に,長時間モニタリングが有用な他のアプリケーションの探索も行っている.まず,H26年度開発の画像位置合せプログラムの精度と速度の向上に取り組んだ.精度向上のためにそれまで考慮していなかった回転運動を考慮した.計算量が飛躍的に増加するため,探索範囲の絞り込み,効率的な探索順序の導入,プログラミング上の効率化等により高速化を図った.更に計算機の整備も加えて70分間データの処理時間を数日から半日程度まで短縮化した.H26年度に開発した固定具の有効性と長時間撮像時の画質変化の検討を超音波用腹部ファントムを用いて行った.この結果,6時間撮像で画像変化が許容範囲に収まることを確認した.また,画像位置合せプログラムの精度検証のため,プローブを用手法的に移動して相対的に画像上での動きを模したファントム実験で定量評価を試みた.この結果,対象を視野内に捉えている限りトラッキング可能であり,また,ターゲット画像とテンプレート画像の差異による誤差評価で雑音と同程度との結果を得た.健常被験者対象の検討では,1名の被験者による複数回の長時間撮像に成功した.複数回の撮像いずれにおいても約1時間の撮像の間に門脈形状を捉え続けていることを確認した.評価は位置合せ結果動画の目視により行った.この結果,健常被験者像においても対象を視野に捉えている限り位置合せ可能であることを確認した.長時間モニタリングが有用な他のアプリケーションとして,胃腸と心臓の可能性を見い出し検討を開始した.胃腸に関しては幽門部を3D動画像として捉えて蠕動運動の観察が可能であった.心臓については2D動画撮像による検討を開始した.腹部同様に簡易固定具の試作を行っている.実績の概要で述べたように,静止ファントムを用いた評価実験および健常被験者を対象とした撮像実験と画像解析結果評価により,長時間超音波によりモニタリングの可能性とその方法について予想以上に順調に検証できている.しかしながら動態ファントムを用いた検討のみについてが初年度から引き続き遅れている.H27年度は,静止ファントムを対象としてプローブを用手法的に動かすことによって相対的に画像上での動きを模擬する方法で評価を行って一定の進展を得ているものの,やや定量性に欠けるという欠点があり,やはり当初計画の動態ファントムによる評価が望まれる.ソフトウェア面ではオフライン処理ではあるが成果があがっている.循環動態を評価するためにはリアルタイム処理とオンライン化が必要であるが,本研究計画においては当初よりオンライン化は想定外でありこの点は予定通りである.以上のように計画以上に進展している部分が多数あるなかでやや遅れている部分もあり,全体としてはおおむね順調ということが言える.1.H27年度までにファントム実験により6時間にわたる超音波撮像結果において画像変化が許容範囲内にあることを確認していたが,H28年度には24時間にわたる撮像においても画像変化がやはり雑音程度であり許容範囲内であることが確認できた.ファントムによる結果ではあるが,ホルター心電図のように長時間適用が可能であることが示唆された.

2.開発してきたシステムの検証のために,これまで1名の健常被験者からのデータを用いていたが,新たに2名の健常被験者にてデータを取得し,撮像からデータ処理まで一連の流れを適用可能であることを確認した.3.新たな適用対象として候補にあげた心臓について,2Dではあるが撮像とデータ処理を試みた.門脈の場合と同様にポリウレタン製緩衝材を用いた自作の簡易固定具を心臓用に作成して撮像を行なった.この結果,30分程度の撮像が可能であり,同様の方法での長時間モニタリングの可能性を示すことができた.ただし,2D撮像のプローブであったため,呼吸性移動の影響による撮像断面の変化が心拍動による変形に重畳してしまうため,解析には課題が残る.本質的解決には門脈同様に3D撮像にて注目ボリュームの全てをカバーすることが望まれるが,2D撮像でも心電図同期・呼吸同期とプローブ位置の3D計測や画像解析の併用によるアプリケーションも考えられるかもしれない.4.トラッキング結果を用いて呼吸による門脈の移動の定量化と門脈径の変化の定量化を行なった.この結果,呼吸運動が3次元的に可視化され,また,血管径の変動に呼吸動および心拍とそれぞれ同期した成分が観測された.5.これまで安静仰臥位のみでの撮像を行ってきたが,将来の運動負荷試験への可能性を探る目的で,座位や立位での撮像を試み門脈・心臓ともに撮像可能であることを確認した.今後倫理委員会への申請・承認の後に負荷試験への適用可能性を検証したい.超音波による門脈の長時間モニタリングのために長時間の画像撮影法と得られた長時間3次元動画像解析法に関する検討を行なった.まず,ファントム実験により超音波による長時間撮像が可能であること,3D撮像と開発したトラッキングソフトウェアにより常に同じ位置を捉え続けることが可能であることを示した.次に,開発した簡易プローブ固定具を用いて健常被験者を対象として断続的に最長約1時間に渡る画像取得を行ない,トラッキングソフトウェアにより同じ位置を捉え続けることに成功した.実績の概要で述べたように,70分間のほぼ連続撮影とその結果画像の画像解析に成功しており,超音波画像による長時間モニタリングの可能性は十分に示すことができた.ハードウェア面およびファントム実験(定量評価)に関する検討のみやや遅れているが,定性的評価により有効性が確認でき,発展性が望めたために撮像およびソフトウェア面を優先したことによっており大きな問題はない.平成26・27年度と同様に臨床アプリケーショングループ・ハードウェアグループ・ソフトウェアグループの3グループ体制で研究を推進する.各グループが有機的に結合して連携しながら研究を進める.これまで順調に進んできている臨床アプリケーショングループとソフトウェアグループについては平成26・27年度と同様に研究を推進する.臨床アプリケーショングループは,胃腸蠕動運動および心臓の長時間撮像についても検討する.ソフトウェアグループはこれまでに開発してきた手法の高度化(高精度化と高速化,ロバスト化)を主たる目標とする.
Maass Koecher Seriesの研究

数学の内容的な面については次のような研究をおこなった。(1)ジーゲルアイゼンシュタイン級数のケッヒャ-マ-ス級数について、正則なものだけでなく、実解析的なものについても記述できることを示した。(2)保型形式の空間の次元公式を記述する核関数による積分と概均質ベクトル空間のゼータ関数の間の関係の一般論に必要となるポアソン公式について一般的な公式を導いた。これは任意の形式的実ジョルダン代数のゼータ積分と核関数の関係を論ずるさいのもととなるものである。(3)ジーゲルパラモジュラー群でレベル2のものに属する保型形式のなす環構造を求めた。(小野寺文枝との共同研究)(4)ジーゲル上半空間の2つの直積上の関数に作用する微分作用素で保型的な作用と対角成分への制限が可換になるようなものを具体的に求めた。これはいわゆるRankin Cohen operatorとよばれるものの高次元化であり1990年頃筆者のおこなった研究の発展でもある。近年物理学との関連がいわれている。(W.Eholzerとの共同研究)以上の数学的内容について、立教大学、九州大学、Berlin Humboldt大学、Mannheim大学、Heidelberg大学、マックスプランク数学研究所に招待され講演を行った。
ミトコンドリア・ダイナミクスを標的としたグレリンによる慢性腎臓病新規治療戦略

グレリン(Ghr)は腎障害をミトコンドリア(Mit)由来酸化ストレス低下を介して治癒する。一方腎障害におけるMitダイナミックスの意義が注目されている。糖尿病の腎障害において、Ghrの有効性を検証した。8週齢のC57BL/6マウスへストレプトゾトシンを投与し糖尿病発症を確認した後、12週間Ghr (300μg/kg)を連日腹腔投与した。その結果Ghrが糖尿病におけるMitの膨化、クリステの断裂を軽快させた。GhrはMitのfissionおよびfusionに影響を与えなかったが、マイトファジー関連分子であるPINK1およびParkinの発現を上昇させた。グレリンが糖尿病性腎症の悪化を抑制する。グレリンの腎保護作用を糖尿病性腎症のモデルマウスを用いて検証した。肥満型の糖尿病性腎症モデルでは食欲亢進のため肥満が増強され尿蛋白の増加を抑制されなかった。より消耗状態の東如お病腎症モデルを用いる必要があった。そこでストレプトゾトシン投与によるI型糖尿病モデルマウスを用いた検討を行った。その結果糖尿病性腎症による尿蛋白の増加はグレリン投与により有意に抑制された。そこで腎近位尿細管のミトコンドリアの形態異常を電子顕微鏡で確認した。その結果糖尿病マウスで認められるミトコンドリアの膨化が認められたが、この形態異常が軽快していることが明らかとなった。現在ミトコンドリオートファジー、ミトコンドリア癒合分裂に関わる分子の発現状況を詳細に検討にしている。この作用の近位尿細管特異的であるかどうかに関して近位尿細管細胞を用いた検討を行った。近位尿細管細胞株であるHK-2細胞を高糖状態で培養し、そこにグレリンを追加し細胞の筐体、分子変化を測定した。その結果ミトコンドリアアートファジーにかかわる分子であるBeclin1やPerkin、Bimip3といいた分子の変化が認められた。これまでの検討ではアンジオテンシンII投与による腎障害モデルマウスにグレリンを投与し、ミトコンドリアを標的とする抗酸化ストレス作用を介して腎保護作用があることを報告した(PLoS One, 2014)。今回、末期腎不全の最大原因疾患である糖尿病性腎症に対するグレリンの長期投与の効果を検討した。C57BL/6JJマウス(雄)をControl群・STZ+NS群・STZ+G群の3群に分け、12週齢から連日12週間、STZ+G群にグレリン(ラット)10μg/日を、Control群およびSTZ+NS群に生理食塩水を腹腔内注射した。24週齢にて腎機能を中心に検討した。その結果STZ+NS群では尿アルブミンの排泄が増え、STZ+G群では尿アルブミン排泄が抑制された。STZ+NS群では体重減少したが、STZ+G群では体重減少が抑制された。腎病理像ではシリウスレッド染色において、STZ+NS群で線維化が亢進していたが、STZ+G群で線維化が抑制されていた。電子顕微鏡の所見では、STZ+NS群では近位尿細管細胞のミトコンドリアの膨化が認められたが、STZ+G群ではこの変化が抑制された。rtPCRではマイトファジーの因子であるPINK1およびParkinがSTZ+NS群で低下し、STZ+G群でこの低下が抑制され、ミトコンドリアの変化との関連が示唆された。面積、周囲長、最小径、最長径はSTZ投与でミトコンドリアの拡大を認めますが、最長径と最小径の比であるAspectRatioは差が小さく、elongationという言葉よりはenlargement、swellingといった表現が当てはまる現象と考えられた。一方でミトコンドリアのfusionを司るMfn2、Mfn1、OPA1を測定したが、有意差はなかった。fissionの因子としてはDrp1やFis1を測定したが、有意差はなかった。以上より糖尿病性腎症の進行抑制に対するグレリン長期投与の有効性が示唆された。モデルの確立に時間がかかった。肥満型マウスについてはネガデータであった。腎臓病学、内分泌学、代謝学、GHSR欠損マウスの腎臓の尿細管においてMitが伸長化していることを発見した。一般的に、Mitは分裂しているとオートファジーが活性化し、癒合しているとオートファジー抵抗性となる(Nature Cell biology 2011)。したがってGhrはオートファジーを亢進させる働きがあるといえる。糖尿病性腎症の尿細管細胞ではオートファジーの活性が低下している(Diabetes 2010)。

そこでGhr欠乏状態であるGHSR欠損マウスにおいて糖尿病性腎症、5/6腎摘マウスの腎障害が増悪するか検討する。その際の腎臓形態学的に光顕、電顕の両面から検討する。さらにZigmann教授より供与されたGHSR欠損マウスはGHSR遺伝子の上流にtranscription blocking cassette (TBC)がlox-P siteに挟まれた形で挿入されている。したがって組織特異的にGHSRの発現を回復させることができる。GHSRは近位尿細管に強く発現するのですでに保有するタモキシフェン誘導型近位尿細管特異的Cre発現マウスであるNDRGCreマウス(京都大学柳田素子教授より供与)との交配でGHSRの回復をタモキシフェンにより誘導できる。すでにこの2系統が交配されたマウスを得ており、腎不全モデルを作成する予定である。上述のマウスにタモキシフェンを投与したのち病態が変化するか、Mitの形態が変化するか検討する。
アポトーシス関連分子による放射線増感作用の研究

1.放射線照射後のアポトーシス関連蛋白の挙動について1)放射線照射後に生じるアポトーシスは、カスペースの活性化非依存性に生じうるものであることを見出した。2)カスペースの活性化を抑制された細胞で、コントロールと同程度に放射線照射後にミトコンドリア膜電位の障害が起こることから、カスペース活性化とミトコンドリア膜電位の障害は独立した二つのシグナル経路によって活性化されているものと思われる。3)TPAによるMEK/ERK活性化シグナルによって、放射線照射後に生じるアポトーシスが阻害されることを見出した。MEK/ERK活性化シグナルは、カスペースの活性化を阻害するのみならず、ミトコンドリア膜電位の喪失を阻害し、放射線照射後に生じるアポトーシスを抑制していた。したがって、MEK/ERKシグナルは二つの独立した経路を抑制しているものと思われる。また、MEK/ERKシグナルによるアポトーシス抑制効果は、カスペース非依存性であること、さらにミトコンドリア膜電位の喪失と細胞死が、明らかな関連性を示していたことなどから、放射線照射によるアポトーシスは、ミトコンドリア膜電位の喪失が決定的要因となるものと思われる。従って、放射線誘発アポトーシスの過程において、ERKの活性化によりカスペースの活性化とミトコンドリア傷害の双方が抑制され、癌細胞の放射線感受性が低下することを見出した。また、本研究によって放射線誘発アポトーシスは、カスペース非依存性のミトコンドリア傷害に依存しており、カスペースの活性化は必須でないことが示唆された。これらの分子機構を調節することによってアポトーシスを利用した放射線感受性の調節法が開発されることを見出すことができた。2.遺伝子導入ウイルスベクターの作製BAD遺伝子導入ワクシニアウイルスを製作したが、ウイルス自体による細胞毒性が強く現段階ではBADの放射線誘発アポトーシスにあたえる影響を評価することは困難であった。1.遺伝子導入ウイルスベクターの作製BAD遺伝子導入ワクシニアウイルスを作製したが、ウイルス自体による細胞毒性が強く、現段階ではBADの放射線誘発アポトーシスに与える影響を評価するのは困難であることが判明した。一方、我々は下記のごとく、Caspase8が放射線誘発アポトーシスに関与することを見出した。そこで、Caspase8遺伝子導入アデノウイルスベクターを濱田教授(札幌医大)との共同研究で作製した。このベクターは上皮性細胞に高効率に感染することから、放射線誘発アポトーシスに感受性の低い細胞にCaspase8高発現することが可能となった。現在、このウイルスベクターを用いて放射線感受性を高めるか否かを検討中である。2.放射線照射後のアポトーシス関連蛋白の挙動について放射線誘発アポトーシスの過程におけるCaspaseファミリーの活性化を観察した。その結果、Fas誘発アポトーシスの過程に関与することが知られているCaspase8が放射線誘発アポトーシスの過程におていも活性化されることを見出した。さらに、Caspase8 inhibitorを用いることによって放射線誘発アポトーシスが抑制されることが示されたことから、Caspase8活性を調節することにより放射線誘発アポトーシスに対する感受性を調節できる可能性が示された。MEK/ERK活性化

シグナルは、カスペースの活性化を阻害するのみならず、ミトコンドリア膜電位の喪失を阻害し、放射線照射後に生じるアポトーシスを抑制していた。したがって、MEK/ERKシグナルは二つの独立した経路を抑制しているものと思われる。また、MEK/ERKシグナルによるアポトーシス抑制効果は、カスペース非依存性であること、さらにミトコンドリア膜電位の喪失と細胞死が、明らかな関連性を示していたことなどから、放射線照射によるアポトーシスは、ミトコンドリア膜電位の喪失が決定的要因となるものと思われる。従って、放射線誘発アポトーシスの過程において、ERKの活性化によりカスペースの活性化とミトコンドリア傷害の双方が抑制され、癌細胞の放射線感受性が低下することを見出した。また、本研究によって放射線誘発アポトーシスは、カスペース非依存性のミトコンドリア傷害に依存しており、カスペースの活性化は必須でないことが示唆された。これらの分子機構を調節することによってアポトーシスを利用した放射線感受性の調節法が開発されることを見出すことができた。2.遺伝子導入ウイルスベクターの作製BAD遺伝子導入ワクシニアウイルスを製作したが、ウイルス自体による細胞毒性が強く現段階ではBADの放射線誘発アポトーシスにあたえる影響を評価することは困難であった。
脳疾患に対する3次元自動組織分画定量的プロトン磁気共鳴スペクトロスコピーの検討

2028歳の正常男性3名を対象に脳の3次元T1強調画像を撮像した。撮像は2日間(2回/日)にわたって施行され、得られたデータから自動3次元組織分画プログラムおよび定量的^1H-MRS解析プログラムの精度ならびに再現性の検討を行った。得られた定量化の精度と再現性は、それぞれ1019%と±12.8%で、これは平成14年度に施行したファントムにおける精度と再現性(712%と±8%)と比較してともに低く、白質よりも灰白質において低かった。ポジショニングや設定した関心領域の位置のずれや体動の影響による誤差が主たる原因と考えられた。上記20歳台正常男性3名の他に40歳代3名と50歳代3名、70歳代3名の無症候の正常男性に対して自動3次元組織分画定量的^1H-MRSを施行し、加齢現象に伴う脳の代謝基質の変化を検討した。灰白質および白質ともに加齢に伴う脳の萎縮傾向が見られ、白質におけるN-acetylasparatate (NAA)の減少傾向が見られた。灰白質ではばらつきが大きく、加齢による各代謝其質の一定の変動は得られなかった。FLAIR画像および磁気移動コントラスト(MTC)情報による脳虚血巣の定量化を行ったが、加齢による有意差は得られなかった。対象の選択法や測定法の精度の低さが原因と考えられた。インフォームドコンセントの得られた2例の脳疾患症例(粗大病変を有する陳旧性脳梗塞例(65歳男性)とHIV関連脳症(58歳男性))に対して3次元自動組織分画定量的^1H-MRSを行い、関心領域内において正常部と比較して病巣部におけるNAAの低下が認められた。今後は微細脳病変における3次元自動組織分画定量的^1H-MRSの臨床応用が可能となる測定法精度の向上が必要である。脳の代表的代謝基質であるN-acetylasparatate(NAA)、creatine(Cr)、choline(Cho)、myoinositol(mI)、lactate(Lac)、glutamine(Glx)、glutamate(Glu)が1050mM濃度で、KH2PO4(1050mM濃度)に溶解させて、PHを7.07.1に調整した定量的^1H-MRS用の基準ファントム1を作製し、新規に開発した定量的^1H-MRS解析プログラムの精度評価と再現性評価を検討した。定量化については712%の誤差範囲の精度が達成でき,2日間(5回測定/日)での再現性も±8%の範囲であった。また種々のT1、T2値の成分および脳内の代謝基質成分の既知量(T1、T2値は常磁性金属イオンを用いて調整し、代謝基質の濃度は1050mMとし、PHを7.07.1に調整)がランダムに配置されている基準ファントム2を作製し、新規に開発した3次元組織分画解析用プログラムの精度評価と再現性評価を検討した。精度ならびに再現性はスライス厚に強く依存し,12mmの薄いスライス厚ではそれぞれ5%以内、±3%の範囲であったが、通常臨床で用いられている5-7mmのスライス厚では10%以上、±11%の範囲であった。これらの結果から来年度の正常者ならびに症例における研究では12mmの薄いスライス厚での高速映像法を用いるよていである。使用装置は東京大学医科学研究所附属病院放射線科が現有する静磁場強度1.5テスラのGE社製超伝導MR装置(Signa Horizon Lx,8.25v)と臨床用頭部用バードケージ型コイルで、データ解析はSun Spark Station 20及びSilicon Graphics O_2を使用して行った。
神経回路モデルによる感覚系及び記憶系における情報の時間コーディングの研究

本研究においては,カオスと学習との関係,カオス等の動力学的様相と時間コーディングとの関係を明らかにすることを目的とし,以下の主要な結果を得た。1.カオスによる学習の増進。2.周期信号のカオスへの非線形変換。3.学習によるカオス状態の秩序化およびカオス化の増大。以下順次これらを説明する。1.対称ヘブ型結合回路に他のニューロン群によるゆっくり変化する場が影響を与える非平衡神経回路において,学習実験を行なった。この結果,カオス的応答の場合が,それ以外のいずれの場合よりも学習可能なパターン数が,増加することが示された。2.情報の時間コーディングの問題を匂い情報処理を例として研究した。今回は嗅球での情報表現に焦点をしぼった。匂い情報は吸念においてのみ回路網に受け渡されるので,この系においては,回路網への入力は周期振動である。嗅球内の二層回路モデルを構築した。僧帽細胞同志の結合をパラメーターとして分岐を調べた。抑制性結合においては,定常スパイク応答,周期スパイク応答のみであり,興奮性結合の強度のある範囲でカオス応答がみられた。そこで,このようなカオス応答を行なうパラメーター値に固定し,以下のシミュレーションを行なった。3.顆粒細胞から僧帽細胞へのネガティブフィードバックの結合強度を,ヘブ学習のアルゴリズムで変化させた。学習は嗅球がカオス状態であるときに行なった。異なる入力パターンの学習に対して,多くの実験を行なった。実験の度にリアプノフ指数を計算し,動的状態を決定した。その結果,70%のサンプル入力で,学習後のリアプノフ指数は低下した。つまり,カオス性が弱まり,より秩序化した。しかし,残りのサンプルにおいては,逆に学習によりカオス性が増し,軌道の多様度が増大した。このことは,カオス的活動の中にパターンを埋め込めることを示している。
口腔上皮におけるTRPV4の機能調節と食嗜好の決定の関係

口腔上皮細胞が口腔内の状態を感じ取ることができると仮説を立てて、温刺激・物理刺激および化学刺激のセンサーとして知られているTRPV4チャネルの発現をラットを対象として調べた。ラット口腔粘膜上皮におけるTRPV4の発現をmRNAレベルおよび蛋白レベルで確認した。また機能的な特徴を知るために電気生理実験法およびCa2+imaging法を行い、TRPV4の作用薬剤と阻害剤を利用し、TRPV4が誘発した電流とCa2+の移動を観察することができた。口腔は、食物や飲み物を取り込み、化学的・物理的・浸透圧変化あるいは温度など実にさまぎまな刺激に恒にさらされている組織である。この口腔での感覚が円滑に行われることは、私たちが食べ留ことや呑み込むことあるいは、話をすることなど人間としての基本的な行動をする上で重要である。このこうくうにおける感覚に、口腔粘膜上皮が口腔内環境変化や刺激を感受する最前線として働いていると仮定し、口腔上皮におけるTRPV4 (transient receptor potential channel vanilloid subtype 4)の発現と機能を解析した。Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction法および免疫組織化学的方法で、ラットおよびマウスの口腔粘膜上皮におけるTRPV4の発現を確認した。また、カルシウムイメージング法により培養ラット頬粘膜上皮細胞において、TRPV1, TRPV2, TRPV3の作用薬である、2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB)やTRPV4の作用薬である4 a-phorbol-12, 13 didecanoate (4a-PDD)が細胞内カルシウム濃度の上昇を促し、その反応はTRPチャネルの拮抗剤であるruthenium redにより阻害された。またホールセルパッチクランプ法により、TRPV4作用薬により膜電流が観察された。また低浸透圧の刺激で膜電流が増強されることや、その電流が部分的にTRPチャネルのブロッカーに抑えられることがわかった。このことから、TRPV4が低浸透圧より誘発された膜電流の増強にも関与することが示唆された。以上の結果から、口腔粘膜上皮細胞自体が、外界のセンサーとしての機能が報告されているTRPチャネルを発現していることや、口腔内への刺激に対して、機能的に作用していることが考えられた。口腔はさまざまな刺激に常にさらされ、口腔の適切な感覚受容が咀嚼や嚥下・会話を可能にしている。私は口腔上皮細胞が口腔内の状態を感じ取ることができると仮説を立てて、外界環境センサーとして知られているTRPチャネルファミリーの発現をラットやマウスを対象として調べた。また機能的な特徴を知るためにホールセルパッチクランプ法による電気生理学実験法をおこなった。TRPV4は特異的な作用薬あるいは阻害薬がなかったが、最近同定されたTRPV4特異的な作用薬GSK1016790Aにより内向き電流が認められ、阻害剤であるRN1734によりその電流は阻害された。単離した口腔粘膜上皮細胞のカバーグラスへの接着性を改善し、カルシウムイメージングによりTRPV4作用薬により細胞内カルシウム濃度が上昇し、TRPV4の阻害剤によりこの上昇が抑制された。また低浸透圧刺激によっても細胞内カルシウムの増強が見られ、この増強がTRPV4の特異な阻害剤に抑えられた。さらに、浸透圧刺激は口腔上皮からのATP遊離を促すこと、このATP遊離はTRPVチャネル阻害薬により抑制されることを示すことができた。以上のことから、口腔の上皮にはTRPV4チャネルが機能的な受容体として発現していること、さらに、口腔粘膜上皮細胞が浸透圧刺激に対してTRPV4を介して細胞内へとカルシウムを流入させることを示すことができた。また伝達物質の候補としてATPも考えられた。これらは、口腔にはいってくる飲み物や食物の刺激に対して上皮が関わっていることを示唆している。
膠原病疾患の組織リモデリングにおける上皮・血管内皮－間葉転換機構解明と治療展開

膠原病の組織リモデリングにおける上皮間葉および血管内皮間葉転換の病態形成への関与を検討した。膠原病リウマチ性疾患の組織においては、線維化・血管リモデリングの進行を認めている部位にはmyofibroblastの増生が認められ、これらのmyofibroblastおよび血管内皮細胞上にはWnt10Aが強く発現しており、組織における線維化病態に関与している可能性が示唆された。また、腎間質由来線維芽細胞へのWnt10A強制発現は、ファイブロネクチン産生を増強し、腎障害に関与することが示唆された。以上から、Wnt10Aを介する間葉転換の制御が膠原病における組織リモデリングの治療標的となることが示唆された。膠原病の組織リモデリングにおける上皮間葉転換および血管内皮間葉転換の2種の間葉転換の病態への関与、調節機序の解明とその制御による治療創生を目的として研究を行った。膠原病において間質に顕著な線維芽細胞・血管内皮細胞の増成が認められる組織におけるWntファミリー発現状況を病理学的に検討し、関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、血管炎症候群に認められる間質性肺炎、肺高血圧症における血管病変の生体および剖検病理試料におけるWntファミリー発現細胞、間葉転換細胞を免疫組織学的染色にて同定し単位面積あたりの発現細胞数、存在範囲、周囲細胞との分布などを解析した。評価においては、組織スライドをNanoZoomer Digital Pathologyを用い、標本面積に占める間葉転換細胞、Wntファミリー発現細胞の分布などを検討した。間葉系細胞マーカーとしてはαSMを,上皮・血管内皮系細胞マーカーとしてはβ-cateninを用いた。また、上皮間葉、血管内皮転換と密接に関与し、血管リモデリングと閉塞、肺・皮膚硬化に関わるTGFβ発現も検討した。その結果、上記の膠原病リウマチ性疾患の組織においては、線維化・血管リモデリングの進行を認めている部位に組織にはmyofibroblastの増生が認められた。この組織をWnt10に対する抗体で組織染色したところ、血管内皮に加えてmyofibroblastも染色された。すなわち、これらのWnt10陽性myofibroblastが組織における線維化病態に関与している可能性が示唆された。また、原病の種類によりWnt10陽性myofibroblastの単位面積あたりに存在する細胞数が異なり、細胞密度と線維化病態は必ずしも相関していなかった。また、耳下腺をはじめとした組織に強い線維化病変をもたらすIgG4関連症候群組織での検討においても同様の所見が得られた。膠原病において間質に顕著な線維芽細胞・血管内皮細胞の増成が認められる組織におけるWntファミリー発現状況を病理学的に検討した。関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、血管炎症候群に認められる間質性肺炎、肺高血圧症における血管病変の生体および剖検病理試料におけるWntファミリー発現細胞、間葉転換細胞を免疫組織学的染色にて同定し単位面積あたりの発現細胞数、存在範囲、周囲細胞との分布などを解析した。評価においては、組織スライドを3分間で19億画素の高解像度デジタルスライドに変換・記録し、NanoZoomer Digital Pathology (NDP)を用い、標本面積(mm2)に占める間葉転換細胞、Wntファミリー発現細胞の分布などを検討した。現在完成したWnt10ノックアウトマウスを用いて実験的間質性肺炎、皮膚硬化に対する同遺伝子の関与の検討を行っている。

評価においては、組織スライドをNanoZoomer Digital Pathologyを用い、標本面積に占める間葉転換細胞、Wntファミリー発現細胞の分布などを検討した。間葉系細胞マーカーとしてはαSMを,上皮・血管内皮系細胞マーカーとしてはβ-cateninを用いた。また、上皮間葉、血管内皮転換と密接に関与し、血管リモデリングと閉塞、肺・皮膚硬化に関わるTGFβ発現も検討した。その結果、上記の膠原病リウマチ性疾患の組織においては、線維化・血管リモデリングの進行を認めている部位に組織にはmyofibroblastの増生が認められた。この組織をWnt10に対する抗体で組織染色したところ、血管内皮に加えてmyofibroblastも染色された。すなわち、これらのWnt10陽性myofibroblastが組織における線維化病態に関与している可能性が示唆された。また、原病の種類によりWnt10陽性myofibroblastの単位面積あたりに存在する細胞数が異なり、細胞密度と線維化病態は必ずしも相関していなかった。また、耳下腺をはじめとした組織に強い線維化病変をもたらすIgG4関連症候群組織での検討においても同様の所見が得られた。膠原病リウマチ性疾患の線維化病態の形成におけるWnt10陽性myofibroblastの関与が確認された。この点の確認が必須であり慎重に評価するために時間を要した。今後は、in vivoでの検討、さらにはWnt10ノックアウトマウスの作成を行っており、これを用いた実験的間質性肺炎、皮膚硬化に対する同遺伝子の関与を検討へと展開する予定である。本年度は、膠原病リウマチ性疾患の線維化病態の形成におけるWnt10陽性myofibroblastの関与が確認された。疾患病理組織での解析で得られた事実をもとにin vitroで滑膜細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、間葉幹細胞などとWntファミリー強制発現細胞共培養して、in vitroにおける間葉転換の再現を確認する。その際に間葉転換に関わるWntシグナル伝達系の決定、転換細胞への生存シグナルや細胞周期への影響、血管新生、間葉転換にかかわる液性因子、細胞表面機能分子、シグナル伝達系、転写因子活性化への関与等を明らかにする。また、これまでに得られた情報をもとに、in vitroで上皮間葉転換・血管内皮間葉転換に対する薬剤の効果を検討するとともに、ヒト臓器移植SCIDマウスを用いた線維芽細胞・血管内皮細胞ー間葉形質転換におけるex vivoでの解析を行う。
MIDCAB,OPCAB術後心房細動の発生機序と治療に関する研究

1)冠動脈バイパス術後に発生する心房細動は血行動態を悪化させ回復を遅れさせる.低侵襲手術MIDCAB, OPCABでは従来の人工心肺使用し,心筋保護液で心停止下に行う従来の方法と異なる機序が予想された.我々の施設のMIDCAB138例,OPCAB129例の計267例では59例(22.1%)に心房細動を認めた.そこで年齢,性別,手術時期,バイパス部位,完全血行再建,左室駆出率(35%未満),Ca拮抗剤,β遮断剤,利尿剤,糖尿病,高血圧,腎不全,術式,左主幹部病変,右病変のどの危険因子が関与したかをSPSSロジステック多変量解析で検討した.その結果,心房細動の発生頻度が有意に高かったのは術前の糖尿病の合併(CR4.844,95%CI2.3569.958,P=0.00),腎不全の合併(CR2.845,95%CI1.1766.884,P=0.02)と右冠動脈へのバイパス(CR3.540,95%CI1.02012.279,P=0.046)であった.高い傾向にあったのは,左室駆出率の低下と術前Ca拮抗剤投与のみであった.2)術中電気生理学手法を用い心房細動の機序の解明を試みた.細動波の周期長に注目し周波数解析を行い最大パワー部位よりリエントリー,異所性中枢の関与を検討するため装置を開発した.しかし術中心房細動の発生は無く,洞調律時に肺静脈,大静脈,心房筋にトリガーとなりうる異常電位は捕らえられなかった.3)ホルター心電図波形からQRS波をサプトラクションし心房細動波のみにし周波長を分析する方法を見出し,細動の停止様式について検討しえた.1)冠動脈バイパス術後に発生する心房細動は血行動態を悪化させ回復を遅れさせる.低侵襲手術MIDCAB, OPCABでは従来の人工心肺使用し,心筋保護液で心停止下に行う従来の方法と異なる機序が予想された.我々の施設のMIDCAB138例,OPCAB129例の計267例では59例(22.1%)に心房細動を認めた.そこで年齢,性別,手術時期,バイパス部位,完全血行再建,左室駆出率(35%未満),Ca拮抗剤,β遮断剤,利尿剤,糖尿病,高血圧,腎不全,術式,左主幹部病変,右病変のどの危険因子が関与したかをSPSSロジステック多変量解析で検討した.その結果,心房細動の発生頻度が有意に高かったのは術前の糖尿病の合併(CR4.844,95%CI2.3569.958,P=0.00),腎不全の合併(CR2.845,95%CI1.1766.884,P=0.02)と右冠動脈へのバイパス(CR3.540,95%CI1.02012.279,P=0.046)であった.高い傾向にあったのは,左室駆出率の低下と術前Ca拮抗剤投与のみであった.2)術中電気生理学手法を用い心房細動の機序の解明を試みた.細動波の周期長に注目し周波数解析を行い最大パワー部位よりリエントリー,異所性中枢の関与を検討するため装置を開発した.しかし術中心房細動の発生は無く,洞調律時に肺静脈,大静脈,心房筋にトリガーとなりうる異常電位は捕らえられなかった.3)ホルター心電図波形からQRS波をサプトラクションし心房細動波のみにし周波長を分析する方法を見出し,細動の停止様式について検討しえた.心房細動は冠動脈バイパス術後に見られる不整脈の中で最も多い不整脈である.これまでの胸骨正中切開,人工心肺を使用し,心停止下に行う手術では心房細動は2040%に見られると報告されてきた.原因として脱血管挿入,体外循環,心筋保穫が考えられてきた.今回取り上げたMIDCAB,OPCAは冠動脈バイパスを体外循環無しで心拍動下に行うため低侵襲であり様々な長所が期待された.1)我々の施設における低侵襲冠動脈バイパス手術の早期手術成績は死亡率0.4%,合併症としての脳梗塞1.2%と良好であった.問題とされる術直後の心房細動は全体で27%に見られた.本来MIDCABは左前下行枝を目標とした左開胸による小切開手術として開発されたが,我々は胸骨下切開の併用,開胸線の延長により右冠動脈と左回旋枝を目標はとした多枝バイパス手術を行ってきた.また最近では胸骨正中切開によるOPCABを第1選択として積極的に症例数の増加を図っている.2)冠動脈バイパス後の心房細動の病態を理解する上で電気生理学的検討は重要である.このため我々は新しい電気生理学的手段として心電図f波の波形解析する定量的方法の開発を進めている.本法は体表面心電図V1誘導f波の周波数解析から心内心房細動の変化を推定する方法で,MIDCAB,OPCABの術後に生ずる心房細動の病態の指標となる可能性もあり有望と思われる.なお,体表面心電図V1誘導を1K HzサンプリングでA-D変換しQRS波の加算

平均心電図からテンプレートを作成し,これを利用しQRS波成分を除きf波をFFT解析し最大パワーを求めている.3)冠動脈吻合前後に心表面マッヒングを行い虚血が心筋に与える影響を電気生理学的に検討した.心筋の走行によって生ずる縦,横方向の伝導速度を測定し異方向性の変化を調べた.プレコンデショニングのみでは吻合時の虚血が問題となる症例がありかかる症例ではシャントチューブによる潅流が安全と思われた.我々は小切開で心臓に到達するMIDCABと胸骨正中切開で到達するOPCABを267例に行った.内訳は,76歳以上が51例を占め,男女比208対59で,術式はMIDCAB138例,OPCAB129例であった.うち59例(22.1%)に心房細動を認めた.そこで心房細動発生の危険因子として年齢,性別,手術時期,バイパス部位,完全血行再建,左室駆出率(35%未満),Ca拮抗剤,β遮断剤,利尿剤,糖尿病,高血圧,腎不全,術式,左主幹部病変,右病変の何れが関与するかをSPSSロジステック多変量解析法を用い検討した.その結果,心房細動の発生頻度が有意に高かったのは術前の糖尿病の合併(CR 4.844,,95%CI 2.356 9.958, p=0.00),腎不全の合併(CR 2.845, 95%CI 1.176 6.884, p=0.02)と右冠動脈へのバイパス(CR 3.540, 95% CI 1.020 12.279, P=0.046)であった.また高い傾向にあったのは,左室駆出率の低下と術前Ca拮抗剤投与であったが,他の因子は無関係であった.次いで心房細動の発生機序を解明すべく心房の心表面マッピングを試みた.しかし術前洞調律時に心房,肺静脈,大静脈に異常電位は捕らえられなかった.このマッピングは弁膜症,心房中隔欠損症に伴う心房細動には有用であり,特に,周波数解析による最大パワーの分布がmaze手術に代わる心房細動の簡易手術のためのガイドになる可能性があり注目された.またホルター心電図波形からQRS波をスブトラクションし心房細動波のみにし周波長を分析する方法を見出し,細動の停止様式につき検討しえた.
リアル・バーチャル連成MEMSレゾネーターによる細胞力学特性計測

細胞の特性を知るための指標として、その硬さがある。硬さを調べる方法はさまざま存在するが、細胞など微小な測定物の弾性を精度よく計測することは、従来法の延長では不可能である。そこでお互いに力を及ぼし合う2つの同一の振動系を用意する。何も力が作用していない場合は、二つの振動系の振幅比は1:1である。これに対して、2つの内の一つの振動体に力が加わると、たとえそれが極めて小さい力であっても、振幅比が1:1から大きくずれる。この現象を使った、高感度な弾性計測システムを本研究では構築していく。