hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性犬移行上皮癌に対するNSAIDs治療における腫瘍随伴マクロファージの関連性

また犬の皮膚を無菌的に採取し、線維芽細胞の分化培養を行ったところビメンチン陽性、サイトケラチン陰性の細胞が採取されたため、今後はマクロファージ・線維芽細胞・腫瘍細胞の共培養を行っていく予定である。実験機器の故障が続き、新規購入やメンテナンス等、実験環境を構築するのに時間を要した。採血を行える犬が老齢であり、採取されるマクロファージの数が足りず、まとめて実験することができなかった。またプラスチック付着法では得られる単球の純度が低いため採血量でカバーするしかないが、実験犬は供血犬でもあるため採血量と回数を増やすことが難しかった。引き続き研究環境の整備を行う。また所属する岩手大学附属動物病院の症例数では予後調査が難しいため、一時保留とし、細胞関係の実験を進めていくこととする。実験環境が整いつつある。また若齢の犬を購入したため採取できるPBMCの数が増えた。しかし実験犬であるのと同時に動物病院の供血犬でもあるため、採血の回数には限界がある。そのため、病院の休診期間を利用して実験の計画を立てる必要がある。また、現在行っているプラスチック付着法ではロスが大きすぎるため、単球接着培地の使用を検討する。採取できる単球の数が増えたら予定している複数の化合物との共培養実験を同時並行で行っていく予定である。同時にマウスあるいはラットを使った実験にも着手する予定である。膀胱腫瘍を再現するため超音波検査機器を用いて経皮的に膀胱内への腫瘍細胞の移植を試みるが、複数回行っても不可能な場合は腹腔内や背部皮下への接種に変更する。本施設のオートクレーブが古いため、オートクレーブの購入を検討している。また細かい備品が欠如しているため適宜補充していく。実験環境の整備が遅れ、当初予定していた実験がまだ実施できていないために次年度使用額が生じている。必要な機器はだいぶ揃ってきたため、これから遅れている実験の実施が可能であると思われる。使用目的は主に消耗品であるが、使用状況に応じて吸光度計の購入を検討している。
好中球依存的肺転移促進機構を標的とした新たな腎癌治療法の開発

申請者のこれまでの研究から、腎癌細胞は腎微小環境内で好中球との相互作用を介して、腫瘍血管新生を亢進させ、転移能を獲得していると示唆されている。そこで、この相互作用を標的とする新規戦略を開発する。予備的検討ではサイトカイン・ケモカインなど、腎癌細胞と好中球との相互作用媒介分子の発現に、癌細胞上の特定のヒストン修飾やスーパーエンハンサー形成が寄与していることが示唆されている。これらのエピゲノムの機能を抑制し、統合的に相互作用媒介分子群の発現を阻害することで、腎癌細胞の肺転移が抑制できるか前臨床試験を行い、POC取得を目指す。
後伝期チベットにおける自己認識解釈の思想史的研究

申請者は博士論文において、ゲルク派の開祖ツォンカパ・ロサンタクパの高弟であり、ゲルク派を代表する思想家であるケードゥプジェ・ゲレクペルサンポ(以下ケードゥプジェ)の唯識思想と自己認識解釈の研究をおこなった。その結果、彼の自己認識理論や唯識思想における認識理論についてある程度の結論を得ることができた。その成果を踏まえ、本研究では、後伝期チベットにおいて自己認識理論がどのように理解されてきたかという問題を思想史的観点から研究し、特にゲルク派の解釈における独自性はどこにあったのか、あるいはまた、彼等の解釈がチベット仏教思想史上においていかなる意義を有していたのかを検討するとを目的としている。その研究成果として平成23年度は、『真宗総合研究所紀要』29号に「『ケードゥプジェ著『七部論理学書荘厳、心闇の払拭』「自己認識知覚」訳注研究」を公表した。本論はケードゥプジェの論理学に関する代表作である『七部論理学書荘厳、心闇の払拭』(以下『心闇の払拭』)のうち、自己認識知覚を扱った箇所の訳注研究である。ケードゥプジェは『心闇の払拭』において仏教論理学上のトピックを自身の視点からまとめて記述しているが、その記述の仕方として敵者の説を批判しながら自説を確立するという方法をとっている。従って、『心闇の払拭』は彼が活躍した当時、いかなる解釈が問題となっていたかを知る上で有用な著作であると考えられ、同書を研究することは思想史を構築する上で重要な作業である。本研究は同書のうちの自己認識知覚を扱う箇所の訳注研究であるが、これまで学会において同箇所が翻訳されたことはなく意義ある仕事であると思われる。本研究の目的は、後伝期チベットにおいて自己認識理論がどのように理解されてきたかという問題を思想史的観点から研究し、特にゲルク派の解釈における独自性はどこにあったのか、あるいはまた、彼等の解釈がチベット仏教思想史においていかなる意義を有していたかを検討することにある。このような研究を遂行するため、本年度は研究で使用する基本テキストの入力および翻訳につとめた。特に近年公刊されつつあるカダム派の文献を中心に作業をすすめた。カダム派の文献は手書きのウメ字で記述されており、その判読は容易ではない。このような難点を解消するため、広島在住のチベット人僧侶にウメ字判読の直接指導を受け、ある程度読解可能となった。このような作業の結果、カダム派を代表するチャパ・チューキセンゲが著した論理学書のうちの自己認識関連箇所のテキスト入力を行うことができた。また上記の作業と並行して、サキャ派のコラムパ・ソナムセンゲやセルドクパンチェン・シャーキャチョクデン、ポトン派のポトンパンチェン・チョクレーナムギェルといったゲルク派と対立する論師の自己認識解釈に関しても研究を行った。その結果、コラムパ、シャーキャチョクデン、チョクレーナムギェルなどは知覚の一つとして挙げられる自己認識知覚と単なる自己認識とを区別していることが明らかになった。このような彼等の分類はゲルク派の開祖ツォンカパ・ロサンタクパの影響を少なからず受けたものと考えられ、彼のチベット思想史上における影響の大きさを理解することができた。本年度は以上のような成果を得ることができたが、未だ公表するには至っていない。来年度も引き続き作業をすすめ、順次成果を発表していく予定である。このような研究を遂行するため、昨年度はゲルク派が興起する以前および以降にチベットにおいて活躍した学僧達の自己認識解釈を分析した。この作業によって、チベットにおける自己認識解釈史にある程度の見通しをたてることができたが、その成果を踏まえ、本年度はゲルク派による自己認識解釈の独自性および意義を検討するため、ツォンカパの高弟ケードゥプジェ・ゲレクペルサンポが著した『正しい認識に関する七部〔の論理学書〕の荘厳、心の闇を払拭するもの』を考察の中心に据えて研究をすすめた。同書はゲルク派の論理学を代表するテキストであり、論理学に対する見解が体系的に記されていることから、同書を研究することはゲルク派の論理学の全体像を理解する上で有意義であると考えられる。研究を進めるため、申請者はまず同書を和訳し、内容を理解することにつとめた。その結果、ほぼすべての翻訳を作成することができた。内容を理解することが困難な箇所については、ゲルク派の僧侶が滞在している広島の龍蔵院に出張し、チベット人から直接教示をうけ、ある程度の理解を得ることができた。また、研究の補助作業として、未だデータ化されていないケードゥプジェ著『広大な論書、量評釈を詳細に説明する正理の大海より量成就章の解説』のテキスト入力を行った。

その成果を踏まえ、本研究では、後伝期チベットにおいて自己認識理論がどのように理解されてきたかという問題を思想史的観点から研究し、特にゲルク派の解釈における独自性はどこにあったのか、あるいはまた、彼等の解釈がチベット仏教思想史上においていかなる意義を有していたのかを検討するとを目的としている。その研究成果として平成23年度は、『真宗総合研究所紀要』29号に「『ケードゥプジェ著『七部論理学書荘厳、心闇の払拭』「自己認識知覚」訳注研究」を公表した。本論はケードゥプジェの論理学に関する代表作である『七部論理学書荘厳、心闇の払拭』(以下『心闇の払拭』)のうち、自己認識知覚を扱った箇所の訳注研究である。ケードゥプジェは『心闇の払拭』において仏教論理学上のトピックを自身の視点からまとめて記述しているが、その記述の仕方として敵者の説を批判しながら自説を確立するという方法をとっている。従って、『心闇の払拭』は彼が活躍した当時、いかなる解釈が問題となっていたかを知る上で有用な著作であると考えられ、同書を研究することは思想史を構築する上で重要な作業である。本研究は同書のうちの自己認識知覚を扱う箇所の訳注研究であるが、これまで学会において同箇所が翻訳されたことはなく意義ある仕事であると思われる。
走査トンネル顕微鏡を利用した1/f雑音発生機構の解明

超高真空中においたグラファイトと金の試料について、白金-イリジウム探針を用いて走査トンネル顕微鏡(STM)のトンネル電流の雑音を種々の条件で測定した。トンネル電流を固定してバイアス電圧を増やしていく(探針-試料間距離_zを増やしていく)と、雑音強度は増加した。金試料では、雑音強度は探針の試料上の位置こ依存し、その空間分布はトンネル障壁高φと正の相関を示した。また、_zを変調する方法でトンネル障壁高φを測定する際、φに比例する信号もトンネル電流とほぼ等しい強度の1/f雑音を示すことを見いだした。原子分解能を有する探針でグラファイト試料を観察した場合、しばしばランダムテレグラフィック雑音が観測された。ランダムテレグラフィック雑音の周波数特性はローレンツ型で、探針直下で起きる単一の原子の運動を探針がプローブしているためと考えられる。1/fゆらぎもローレンツ型ゆらぎも、トンネル電流のゆらぎの原因はトンネル障壁高φのゆらぎによると解釈することができた。トンネル電流雑音の温度依存性を、超高真空中のグラファイト試料とタングステン探針の組み合わせで測定した。測定温度範囲(65K室温)では、雑音スペクトルは周波数fに対し1/f^α(α=1±0.5)依存性を、100Hzにおける雑音強度は、温度に対し2つのピークを示した。後者の事実は、表面フォノンの数ゆらぎにもとづくモデルとは、定性的にも定量的にも矛盾する。実験結果は、多重緩和過程を考慮した熱活性化型ゆらぎモデルで最もよく説明できることが分かった。周波数因子が原子振動数程度であることから、STMトンネル電流の1/f雑音の原因は、探針から比較的遠方に分散する"欠陥"が種々の時定数で移動する結果、クーロン場のような長距離相互作用を介して、探針位置のトンネル障壁高が変動するためであると結論するに至った。走査トンネル顕微鏡(STM)のトンネル抵抗部分(走査用探針ー試料用)は、一般に1/f雑音が大きい微小抵抗体の極限にあること、探針走査により任意の場所に接合を形成できること、STMによって得られる顕微情報(表面の形状、吸着分子の存在、それらに付随する局所的電子状態など)を把握しながらーいわば雑音源の状態を微視的レベルで評価しながらーその場で雑音測定ができる、という種々のユニ-クな特徴を持つ。今年度は自作した現有のSTMユニットを使い、以下の実験を行った。1.トンネル電流Iの雑音パワ-スペクトルS_Iを、PtーIr合金探針とAu薄膜試料の組み合わせについて、周波数f(15kHz)に対して空気中で測定し、試料位置に依存するものの、強度にしてfS_I/I^210^<-5-4>オ-ダ-の、通常の電気抵抗体に比べ8桁以上も大きな1/f雑音が観察されること、2.適当な周波数帯域内にあるトンネル電流雑音強度の試料面内分布を、表面トポグラフと同時測定し、両者の2次元像の空間的対応を調べたところ、表面凹凸には特に対応しない雑音発生点が例外的にある他は、明白に試料表面段差部が高い1/f雑音発生箇所と対応している場合が多いこと、3.雑音強度が、あるバイアス電圧で最大になること、を見い出した。

4.以上の結果いずれもは、試料表面で気体分子の熱活性化型脱離吸着が起こり易い特異点が存在すること、これにより局所的に仕事関数が変動するためトンネル確率が変わること、探針が比較的太いため複数のトンネル経路があり脱離吸着の時定数に分布が生じる、というモデルで良く説明できることが分かった。現在、上記実験を更に理想的条件下で行うため、超高真空(UHVー)STM装置を組み立て中である。走査トンネル顕微鏡(STM)のトンネル電流Iには、雑音パワースペクトルS_Iを使って強度にしてfS_I/I^210^<-5-4>の著しく大きな1/f雑音が観察される。空気中でPt-Ir合金探針と金薄膜試料の組み合わせを用いて、適当な周波数帯域内にあるトンネル電流雑音強度の試料面内分布を調べると、表面トポグラフに対応して1/f雑音が特に強く発生する特異点があることが分かった。この結果は、試料表面上に気体分子の熱活性化型脱離吸着が起こり易い箇所が存在し、これにより局所的に仕事関数が変わるためトンネル確率が変動するためであると推定される。この実験結果を受けて、分子吸着脱離のない超高真空中で実験を行うため、新しく装置の立ち上げを行った。STMユニットは超高真空対応とするため新規に作り直し、同時に圧電駆動インチウォームを粗動機構に、積層圧電素子を試料・探針間距離の補助調整機構に採用した結果、制御系も含めた全システムの構成がかなり変更された。このため、Pt-Ir合金探針とグラファイトの組み合わせを用いて、改めてシステムのバックグラウンドノイズの評価も含めて基礎的データを測定しなおした。その結果、通常の固体抵抗素子と同じく、トンネル電流雑音の原因は「トンネル抵抗」の揺らぎに帰せられることが確認され、さらにz-変調法により仕事関数の時間的ゆらぎを直接測定したところ、これも1/f型の周波数スペクトルを示すことが分かった。これらの事実から、上記モデルの正しいことが実証されたが、1/fスペクトルを示す原因が、探針が比較的太いため複数のトンネル経路があって脱離吸着の時定数に分布が生じるためであるとの仮説に対しては未だ明確な解答を得ていない。原子分解能をもった鋭い探針を用い、超高真空下のクリーンな表面について測定を行う必要性は益々強まった。走査トンネル顕微鏡(STM)のトンネル電流Iに観察される著しく大きな1/f雑音の発生機構を調べるために、Pt-Ir合金探針と金薄膜試料および単結晶グラファイト試料の組み合わせについて次の実験を行なった。1.電流一定のもとで、雑音スペクトル強度はバイアス電圧の増加とともに増大する。この事実より、電流雑音の原因が探針-試料間距離のゆらぎではないことが結論された。2.z-変調法によりトンネル障壁高φの時間的ゆらぎを直接測定したところ、これも1/f型の周波数スペクトルを示すことが分かった。φの相対的ゆらぎ強度S_φ/φ^2は電流ゆらぎのそれS_I/I^2と定量的に一致し、このことから電流ゆらぎの原因はトンネル障壁高のゆらぎであると結論できた。3.金試料においては、適当な周波数帯域内にあるトンネル電流雑音強度に試料面内分布があり、トンネル障壁高φの空間分布と正の相関があることがわかった。この事実は、トンネル障壁高のゆらぎの原因が探針側のみにあるとしたのでは説明できない。4.以上の諸事実は、10^<-9>Torrの超高真空でも同様に観測されることから、雑音の原因が試料表面上での気体分子の脱離吸着による仕事関数の変動によるものでないことが結論される。5.超高真空中のグラファイトにおいては、原子像観察が可能なほど探針が鋭い場合に限り、2値の間を行き来するランダムテレグラフ型の電流ゆらぎが観測された。この場合の雑音スペクトルは1/fではなく単一緩和型(ローレンツ型)となった。
日本人と中国人の下顎骨形態の比較人類学的研究-とくにいわゆる咬筋肥大症の外科的治療法への応用

【目的】頭蓋顎顔面外科の臨床においてFacial HighlightとLowlightは東洋と西洋では逆転しておりこの領域の手術をする上で興味深いが、東洋における近年の頭蓋顔面計測およびその臨床応用に関する論文は少ない。日本人および中国人の下顎骨を中心とする正常頭蓋顔面骨の計測を無作為に選んだ25歳から45歳までの男女200名に対して比較人類学的に検討する。いわゆる咬筋肥大症の外科的治療法にとくに作製した器具を用いてこれらの正常値を適要する。【方法】1)正常頭蓋顔面計測器の開発;従来の顔面規格写真撮影装置に準じた頭蓋顔面計測のためのCephalometric System、Modified Face Bow、Facial Calipersを用いての正常頭蓋顔面骨計測、またその術後評価への利用を目的とする。2)正常者の頭蓋顔面骨矢状放射径と幅径の計測;今回は25歳から45歳までの日本人と中国人の男女をそれぞれ50名、計200名について下顎骨の計測を中心におこなう(Modified Face Bowによる頭蓋顔面矢状放射径、幅径およびFacial Calipersによる頭蓋顔面幅径の計測)。さらに下顎骨形態の把握のため咬合撮影、顔面規格写真よりの計測値を加味する。3)その臨床応用;上記1)の計測器具の術中使用をおこなう。下顎隅角骨切りに対してGonial Angle Stripperをとくに作成し、いわゆる咬筋肥大症の外科的治療に応用する。日本および中国の5つの頭蓋顔面外科施設での同器具のmonitoringを依頼する。【結果】正常日本人および中国人の計測による下顎枝角の平均値はそれぞれ、125.2゚、119.0゚であり、下顎隅角部の形態に関しては前者では後方突出が、後者では外側への突出がより顕著であった。臨床的には従って、日本人の下顎隅角骨切りにおいて今回作成したGonial Angle Stripperが有用でこれまでに15例の咬筋肥大症症例等に応用した。切除骨片の最大幅も上石の`K-line'の正常計測および臨床経験により、15mmをその最小限と設定した。なお本器具は日本(近畿大学等)、中国(台湾Chang-Gung Memorial Hospital等)にて臨床使用monitour中である。
マウス細胞によるヒトインターフェロンの大量生産法の開発

ヒトの細胞によって分泌される生理活性物質はほとんどの場合、糖タンパク質である。これまでにこれらのタンパク質のいくつかの遺伝子が単離され、遺伝子工学的手法により大腸菌で生産することが試みられた。しかし、大腸菌で合成されたタンパク質には糖鎖が付加されていず、種々の点で天然のタンパク質とは異なっている。本研究は研究代表者らによって単離されたヒトインターフェロン(IFN)-α,γ,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)遺伝子をウシパピローマウィルスをベクターとしてマウス細胞に導入し、マウス細胞によりヒト生理活性物質を大量に生産した後、精製し、その生理活性を、in vitro,in vivoで研究することを目的とした。ヒトIFN-γcDNAはConAにより刺激したヒト脾細胞mRNAからOkayama-Berg法を用いて単離した。またG-CSF cDNAはCSF産生腫瘍(CHU-2細胞)からのmRNAを材料とし、λgt10ベクター系を用いて単離した。その過程でヒトG-CSFには2種類のG-CSF mRNAがalternative splingの機構により生成されることが判明した。ついでヒトIFNα-5,γ,あるいはG-CSF cDNAの上流にSV40初期遺伝子のプロモーター、下流にグロビン遺伝子の介在配列およびSV40 poly(A)付加部位を配置し、ウシパピローマウィルスをベクターとしてマウスC127I細胞に導入した。その結果、IFNを1mg/ml,G-CSFを1020mg/lの高能率で生産、分泌する細胞株がそれぞれ樹立された。そこでその培養液よりヒトIFN-γ,G-CSFを均一タンパク質として精製した。これらのタンパク質は天然型と同等のN-末端アミノ酸配列をもっており糖鎖を付加されていた。ヒトIFN-α-5は大腸菌で生産されたIFN-α5とは異なり天然型IFNと同等の抗原性をもつことが2種のモノクローナル抗体の作製により明らかとなった。さらに精製G-CSFをマウスの皮下に投与したところ、その血中において顕著な顆粒球数の増加を促進し、本因子が生体内で作用することが明らかとなった。本研究では、ウシパピローマウィルスをベクターとして、クローン化したヒトインターフェロン(IFN)-αや-γ遺伝子、並びに、他のリンフォカインタンパク質を構成的に効率よく、分泌生産するマウス細胞の樹立を計画した。本年度は、59年度の本研究で確立されたヒトIFN-γを高能率で生産するマウス細胞株を無血清培地で、310lの規模で培養した。この培養液より、ヒトIFN-γを天然のIFN-γを精製するのに用いられた方法、あるいは抗IFN-γモノクローナル抗体を結合したSepharoseを用いることにより均一タンパク質にまで精製した。その結果、1lの培地から、約1mg近い精製IFN-γが得られた。このタンパク質には糖鎖が付加されていることがSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による移動度から予想された。また、その【NH_2】-末端は天然のIFN-γと同等のアミノ酸配列から始まっており、ピログルタミンとしてblockされていることが確認された。一方、IFN-γ産生マウス細胞を継代するにしたがい、IFN-γの産生量が低下することが観察された。

この原因を探る目的で生産量の低下したマウス細胞よりDNAを調製し、IFN-γcDNAをプローブとしたSouthern hybridizationにより解析したところ、IFN-γcDNAの上流に結合したSV40初期遺伝子のプロモーター部位に欠落がおこっていることが判明した。天然ヒトIFN-αおよび大腸菌で生産されたヒトIFNα-2に対する2種類のモノクローナル抗体を調製したところ、これら2種類のモノクローナル抗体は大腸菌で生産されたヒトIFN-α5とマウス細胞によって生産されたヒトIFNα-5とで異なる反応性を示した。この結果は、大腸菌および動物細胞によって合成されたIFN-α5タンパク質は、その一次構造が同じであるにもかかわらず、三次構造が異なっている可能性を示唆している。
X線顕微鏡用の大気中設置型ウェットセルの開発と窓用薄膜の作製

大気中で試料を観察するタイプのX線顕微鏡用のウエットな試料用セル(ウエットセル)の窓材の検討と、セルの作製を目的とし(1)ウエットセル窓用の材料の検討と作製(2)作製した薄膜を用いたウエットセルによる試料観察を行った。ポリイミド膜は生物への影響が無く、またサブミクロンの薄膜でも水分を保持するのに十分な強度があることがわかった。また、材料の濃度を変化させることにより、膜厚の制御が可能であり、これを材料とすることにした。ただし、セル全体をサブミクロン厚のポリイミド膜で作製したのでは、重力の影響が有り、膜自身が湾曲したり、破れることから、保持膜として、数十ミクロンのカプトンテープを用いた。カプトンテープに直径5mmの穴を開け、そこに、厚さ350nmのポリイミド膜をテープの粘着性を利用して張り付けた。350nm厚のポリイミド膜は、1nmのX線に対し十分に透過率を示した。このように作製した2枚のポリイミド膜の間にウエットな珪藻とホヤの血液細胞をはさみ、余分な水分を抜き膜をテープの粘着性を利用して密封し、観察した。十分なコントラストが得られ、鮮明な像が観察された。より、膜を密着させるため、中の空気をピストンで抜き取る機構を持った試料セルの作製も行った。
糖尿病性潰瘍対する慢性炎症を標的とした実用的細胞治療法の確立

申請者は、糖尿病皮膚に存在する慢性炎症制御機序を明らかにし、創傷治癒遅延の責任因子を同定した。さらに申請者が新規開発した「ハイブリッド型無血清生体外培養増幅法;Hybrid QQc」により培養した末梢血単核球は糖尿病皮膚を炎症から再生環境に変化させ創傷治癒を促進することを可能にした。本研究は糖尿病皮膚慢性炎症を制御でき、従来の治療効果を更に向上させた発展型の細胞移植治療法の開発の基盤を構築した。さらに細胞治療効果予測因子候補を同定し、今後、慢性炎症に起因する糖尿病性潰瘍に対する遺伝子特性に応じた治療戦略決定のための先進的診断法の開発への発展が期待される成果を見出した。糖尿病性潰瘍において壊死が進行すると、壊死組織の上流部を切断する治療選択を避けられず、20秒に1人の患者が下肢を切断されている(Lancet 2008)。難治性の患者に特異的なバイオマーカーは未だ開発されておらず、治療開始前の予後の的確な予見は、極めて困難である。本研究では、糖尿病性潰瘍におけるM1/M2マクロファージ(以下M1/M2細胞)が関与する慢性炎症の役割を解明し、細胞治療の効果をさらに発展させるための基盤を整える。平成26年度において糖尿病潰瘍モデルマウスを用いて、糖尿病性潰瘍部分の慢性炎症メカニズムを解明した。糖尿病性潰瘍の創傷治癒遅延の原因が皮膚のM1細胞(炎症マクロファージ)とM2細胞(抗炎症マクロファージ)の活性異常に着目し、潰瘍治癒と炎症を結ぶ因子について、糖尿病潰瘍モデルマウスを用いて検討した。潰瘍作成前の糖尿病マウス皮膚では炎症性サイトカインであるIL6の発現量が高く皮膚における慢性炎症が遷延していることが示唆された。正常マウス背部皮膚に潰瘍を作成6時間後、IL6のmRNA発現量は著しく増加し、3日後、抗炎症性サイトカインであるArginase(Arg)のmRNAの発現量が増加した。正常マウスに比較して糖尿病マウス潰瘍作成6時間後は、ArgのmRNA発現量とMAPKのリン酸化が有意に減少していた。以上の結果から、糖尿病の皮膚はM1細胞の活性による慢性炎症が遷延していることから、潰瘍作成後にM1細胞からの炎症シグナルが正常に惹起されないため、その後M2細胞からの皮膚再生シグナルの発現が遅延し、創傷治癒遅延が生じてしまうことを明らかにした。さらに糖尿病皮膚に生じるMAPKのスレオニン180とチロシン182番( Thr180/Tyr182)のリン酸化の減少は創傷治癒遅延の原因になる可能性が高いと考えられた。そして、糖尿病マウスにおいては皮膚の損傷前においてM1細胞からの炎症シグナルが正常に惹起されないため、その後M2細胞からの皮膚再生シグナルの発現が遅延し、創傷治癒遅延が生じてしまうことを明らかにした。(現在、PLOSOneに投稿準備中)平成27年度においては、糖尿病患者において末梢血CD34+細胞におけるPGC1αとNotchシグナルの障害が存在していることを明らかにし、Hybrid QQc培養においてはPGC1αとNotchシグナルの障害を改善し、血管新生能を改善、潰瘍モデルマウスにおいてHybrid QQc細胞は創傷治癒を促進することを明らかにし、潰瘍組織における抗炎症効果、血管新生効果があることを証明した。(現在Diabetes投稿準備中)本結果よりHybridQQc細胞は糖尿病潰瘍組織における慢性炎症を改善する可能性が示唆された。平成26年度にはHyQQcに含まれるサイトカインとNotchシグナルによるM1/M2細胞制御の役割を明らかにし、平成27年度以降は糖尿病潰瘍モデルマウスを用いて、糖尿病性潰瘍部分の慢性炎症メカニズムを解明する計画となっていた。平成26年度に糖尿病性潰瘍の慢性炎症による創傷治癒遅延の分子メカニズムを明らかにすることができ、現在論文が完成し、投稿を行っている段階である。また、平成27年度には糖尿病患者における末梢血CD34+細胞のNotch障害を明らかにし、HyQQcがその機能障害を改善し、HyQQc細胞が糖尿病性潰瘍における炎症制御に関与することを明らかにし、現在論文が完成し、Diabetesに投稿を行っている段階である。以上の結果から実験計画は順調に進んでいると判断する。

本研究では、糖尿病患者末梢血・潰瘍局所での抗炎症性を規定するM1/M2マクロファージ比率の制御因子(Notchシグナル、サイトカイン等)の同定、及び糖尿病性潰瘍の慢性炎症環境と遺伝子特性(エピジェネティクス)の制御機構を解明することを目的とする。申請者が開発した「ハイブリッド型無血清生体外培養増幅法Hybrid QQc」は、末梢血の血管内皮前駆細胞(EPC)とM2マクロファージの量・質を増幅することで、高い創傷治癒効果を有する細胞移植治療を可能としたが、一部の治療抵抗群では細胞と宿主側の慢性炎症の影響が示唆される。この為、慢性炎症制御機序を解明し、従来の治療効果を更に向上させた発展型の細胞移植治療法の開発が重要となる。本研究で移植細胞の分子生物学的特性、移植床の慢性炎症環境の解明により治療抵抗性の主因を明らかにし、効果的治療法の開発を目指す平成26年度において糖尿病潰瘍モデルマウスを用いて、糖尿病性潰瘍部分の慢性炎症メカニズムを解明した。糖尿病マウスにおいては皮膚の損傷前においてM1細胞からの炎症シグナルが正常に惹起されないため、その後M2細胞からの皮膚再生シグナルの発現が遅延し、創傷治癒遅延が生じてしまうことを明らかにした。(現在、PLOSOneに投稿中)平成27年度のおいては、糖尿病患者において末梢血CD34+細胞におけるPGC1αとNotchシグナルの障害が存在していることを明らかにし、Hybrid QQc培養においてはPGC1αとNotchシグナルの障害を改善し、Hybrid QQc細胞は高い血管新生・創傷治癒効果を有することを明らかにした。平成28年度から平成29年度は、HyQQc培養不適合患者における責任因子を同定し、効果的治療バイオマーカーの開発を行う。平成26年度にはHyQQcに含まれるサイトカインとNotchシグナルによるM1/M2細胞制御の役割を明らかにし、平成27年度以降は糖尿病潰瘍モデルマウスを用いて、糖尿病性潰瘍部分の慢性炎症メカニズムを解明する計画となっていた。平成26年度に糖尿病性潰瘍の慢性炎症による創傷治癒遅延の分子メカニズムを明らかにすることができ、現在論文が完成し、投稿を行っている段階である。また、平成27年度には糖尿病患者における末梢血CD34+細胞のNotch障害を明らかにし、HyQQcがその機能障害を改善し、HyQQc細胞が糖尿病性潰瘍における炎症制御に関与することを明らかにし、現在論文が完成し、Stem Cell Translational Medicineに投稿した。平成28年度平成29年度は、糖尿病患者のHyQQcによる組織再生・慢性炎症制御不能患者の責任因子を同定する。約20%の糖尿病患者では慢性炎症制御不能によってHyQQc法が適用不可、ならびに、ヌードマウス潰瘍へのHyQQc細胞移植で血管再生・組織再生・抗炎症効果が有意に低いという課題(Circulationに投稿中)を受けて、これらの責任遺伝子の同定を行っている。昨年度はRNASegによる網羅的遺伝子解析による数個の候補遺伝子を同定することが出来た。今年度中にさらなく解析を行う。以上の結果から実験計画は順調に進んでいると判断する。申請者は、糖尿病皮膚に存在する慢性炎症制御機序を明らかにし、創傷治癒遅延の責任因子を同定した。さらに申請者が新規開発した「ハイブリッド型無血清生体外培養増幅法;Hybrid QQc」により培養した末梢血単核球は糖尿病皮膚を炎症から再生環境に変化させ創傷治癒を促進することを可能にした。
近赤外光に応答する一酸化炭素放出鉄錯体の合成とタンパク質との複合化

近年、一酸化炭素(CO)が示す生理活性の医学・生物学への応用が期待されており、生体適合性の高いCO放出分子(CORM)の開発が急務である。平成30年度は生体適合性の高いCORMの開発を目指し、プロトン受容部位を有するリン配位子をもつ鉄(III)錯体を新たに設計・合成し、酸存在下および非存在下における光応答性CO放出能について検討した。その結果、以下の研究成果を得た。(1)リン配位子上のプロトン受容部位のプロトン化/脱プロトン化によって鉄(III)錯体における中心金属の電子密度を変化させることができ、鉄-CO結合強度を変化させることができることが明らかとなった。(2)プロトン付加後の鉄(III)錯体において、Fe-CO結合が弱まることにより、近赤外光に応答する光応答CO解離能を示すことが明らかになった。これは昨年度までに開発したホスファイト配位子を有する鉄(III)錯体におけるCO脱離の近赤外光応答性の賦与について提案した機構を支持する。(3)以上の結果から錯体からの光CO脱離の波長依存性をpHで制御できる可能性が示唆された。用いたリン配位子の共役酸の酸解離定数の対数値pKaは6程度であり、これは正常細胞と病変細胞の酸性度(それぞれのpHは約7および5)の中間程度に相当する。ここから、近赤外光照射によって正常細胞内ではCO放出せず病変細胞においてのみCO放出可能なCORMの開発につながることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。「近赤外光に応答する一酸化炭素放出鉄錯体の合成とタンパク質との複合化」に向けて、平成29年度は以下の研究成果を得た。(1)生体透過性の高い領域(650ー1000 nm)の光の照射によって一酸化炭素放出を誘起できるN,C,S-ピンサー配位子を有する鉄カルボニル錯体の開発に向けて、軸位にホスフィンもしくはホスファイト配位子を有する鉄(III)カルボニル錯体を合成し、その性質と光反応性について調査した。合成した各鉄(III)カルボニル錯体の光応答性一酸化炭素放出能を調査した結果、軸位にホスフィン配位子を有する鉄(III)錯体では500 nmよりも長波長の光では一酸化炭素の放出が確認されなかった。その一方で、ホスファイト配位子を有する鉄(III)カルボニル錯体では392ー800 nmの光によって一酸化炭素の放出を誘起できることを見出した。800 nmの光は高い生体透過性を示す"生体の窓"と呼ばれる領域にあり、外部からの近赤外光の照射によって生体内における一酸化炭素放出の誘起が期待できる。(2)上記の特異な光反応性について知見を得るべく量子化学計算を行った。その結果から、軸位のリン配位子が有するπ受容性が光反応性に大きな影響を与えることが示唆された。また、鉄(III)カルボニル錯体の特異な電子状態によって初めて実現される励起状態が、鉄(III)カルボニル錯体における長波長光によって誘起可能な一酸化炭素放出の鍵となることが示唆された。(3)タンパク質との複合化に向けて、リンカー部位を導入した配位子前駆体の合成と、その配位子前駆体を用いて鉄(III)錯体の前駆錯体となるN,C,S-三座配位子を有する二核鉄錯体の合成に成功した。N,C,S-三座配位子を有する鉄(III)カルボニル錯体を利用することで、本研究の第一の目標である「近赤外光に応答して一酸化炭素を放出可能な鉄錯体」の開発に成功した。一方で、軸位にリン配位子が存在することでリン配位子による毒性が懸念され、実用的な一酸化炭素放出分子としての利用が困難であることが指摘された。量子化学計算の結果から光反応に対して軸配位子が与える影響についての知見が得られており、これは今後のリン配位子を含まない近赤外光応答性一酸化炭素放出分子の設計につながる重要な知見である。また、タンパク質との複合化に向けてリンカー部位を導入した前駆錯体である二核鉄錯体の合成にも成功した。総合的に判断するとおおむね順調に進んでいるといえる。

(3)以上の結果から錯体からの光CO脱離の波長依存性をpHで制御できる可能性が示唆された。用いたリン配位子の共役酸の酸解離定数の対数値pKaは6程度であり、これは正常細胞と病変細胞の酸性度(それぞれのpHは約7および5)の中間程度に相当する。ここから、近赤外光照射によって正常細胞内ではCO放出せず病変細胞においてのみCO放出可能なCORMの開発につながることが期待される。鉄(III)カルボニル錯体による近赤外光応答性一酸化炭素放出分子の合成について成功し、量子化学計算を用いた反応機構の解明についても順調に進んでいる。そこで、これまでの研究で得られた知見をもとに、毒性が懸念されるリン配位子を含まない鉄(III)カルボニル錯体の開発を試みる。また、本研究の目標であるタンパク質との複合化に向けたリンカー部位をもつ錯体の合成を進めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
医薬資源として有望なヒドロキサム酸を合成する酵素の機構解明と合理的改変法の確立

ヒドロキサム酸基をもつ化合物はヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤として知られ、そのため遺伝子発現調節を介して働くエピジェネティックな医薬品としても期待される。しかし、従来の有機化学的なヒドロキサム酸基の合成法は、収率の低さや使用する有機溶媒と高濃度の塩基による環境負荷などの問題があった。本研究では、放線菌由来の天然物であるトリコスタチンAのヒドロキサム酸基の生合成に関わる酵素を改変することで、様々な化合物に酵素的にヒドロキサム酸基を導入する方法の確立を目指す。そのために、酵素と基質複合体の結晶構造解析と立体構造に基づいた基質特異性改変を行う。
結核菌糖脂質とマクロファージ受容体間のクロストークの分子論

本研究では、結核菌を始めとする抗酸菌の表層に存在するミコール酸含有糖脂質をどのようなToll-like receptors(TLRs)が認識し、その認識にミコール酸鎖長の違いが反映するかについて検討した。Rhodococcus sp.4306株(Rho)由来のミコール酸の鎖長はM.tuberculosis(Mtb)のミコール酸の鎖長の半分(約40)であることから、それぞれからtrehalose 6,6'-dimycolate(TDM)およびtreharose6-monomycolate(TMM)を調製し、マクロファージ活性化作用およびNF-kB活性化を指標にして比較した。Rho-TDMとMtb-TDMのTNF-α産生の誘導能を比べると、Mtb-TDMの方が高い活性を示した。鎖長の長い方の活性が高かった。TMMのTNF-α産生誘導能は、Mtb-TMMおよびRho-TMM共にTDMより低かった。Mtb-TDMは、TLR4が欠損したマウスの腹腔マクロファージをTLR4が正常なものより強く刺激した。一方、TLR2ノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージを用いた場合、今回用いたすべてのミコール酸含有糖脂質はTNF-α産生を誘導しなかった。TLR2を過剰発現したHEK293細胞を用い、NF-kBの活性化を指標としたレポーターアッセイの結果から、TMMはTLR2を介してNF-kBを活性化したが、Mtb-TDMおよびRho-TDMのNF-kBの活性化能は極めて弱かった。ミコール酸含有糖脂質はTLR2を介してシグナルを伝達していることが分かった。TLRがリガンドを認識した後のシグナル伝達機構に関して急速に解明されてきているが、脂質ラフトの関与についての報告は少ない。マクロファージをLPSで刺激すると、TLR4が脂質ラフトに集積することを見出したので、結核菌糖脂質のlipoarabinomannan(LAM)でマクロファージを刺激すると、同様にTLR2が脂質ラフトに集積することが分かった。細胞膜のコレステロールを除去することにより脂質ラフトを破壊すると、LAMのマクロファージ活性化作用が消失したことから、TLRによるシグナル伝達機構には脂質ラフトの集積が重要であることが明らかとなった。結核菌糖脂質のLAMは主にTLR2により、結核菌の細胞壁骨格(CWS)はTLR2およびTLR4の両者により認識されることが報告されている。それがどのような成分によるかについて明らかにするため、脂質成分をカラムクロマトグラフィーにより分画したところ、TLR4で認識される物質が存在していた。MALDI-TOF/MASSで解析したところ、数種の化合物が混在していたので、TLR4で認識される物質の単離とその構造について解析中である。

MALDI-TOF/MASSで解析したところ、数種の化合物が混在していたので、TLR4で認識される物質の単離とその構造について解析中である。TDM、LAMおよびPIMをw/o/wエマルジョンとしてマウス尾静脈に投与するとTNF-α依存的に肺に肉芽種を形成した。肉芽種形成能は、TDMが最も強く典型的な肉芽種を形成した。LAMおよびPIMによる肉芽種形成は、一過性であった。LAMおよびPIMを経気道投与し、4時間および8時間後の肺胞洗浄液中の細胞を解析したところ、LAMおよびP1M投与により好中球の浸潤が認められた。LAM投与により強い炎症反応が認められた。LAMおよびPIMのマクロファージ活性化能を肺胞マクロファージおよび腹腔マクロファージを用いて、TNF-α誘発活性を指標として比較したところ、LAMが強いTNF-α誘発活性を示した。LAMおよびPIMによるマクロファージ活性化のシグナルがどのTLRを介して起きるかを検討するため、各TLRのトランスフェクタントを用いてNF-κB依存的ルシフェラーゼアッセイを行った。LAMおよびPIMは、CD14依存的にTLR2を介してシグナル伝達することが明らかとなった。構造が異なるPIM-1およびPIM-2の生物活性はほぼ同等であり、アシル基の数は生物活性にあまり影響がないことが明らかとなった。現在、LAMおよびPIMに特異的な単クローン抗体を作製しており、さらにTLCでRf値が異なるより親水性であるPIMを単離・精製中である>これらを用いてPIMの構造と生物活性の比較を行う予定である。本研究では、結核菌を始めとする抗酸菌の表層に存在するミコール酸含有糖脂質をどのようなToll-like receptors(TLRs)が認識し、その認識にミコール酸鎖長の違いが反映するかについて検討した。Rhodococcus sp.4306株(Rho)由来のミコール酸の鎖長はM.Tuberculosis(Mtb)のミコール酸の鎖長の半分(約40)であることから、それぞれからtrehalose 6,6'-dimycolate(TDM)およびtreharose 6-mono- mycolate(TMM)を調製し、マクロファージ活性化作用およびNF-κB活性化を指標にして比較した。Rho-TDMとMtb-TDMのTNF-α産生の誘導能を比べると、Mtb-TDMの方が高い活性を示した。鎖長の長い方の活性が高かった。TMMのTNF-α産生誘導能は、Mtb-TMMおよびRho-TMM共にTDMより低かった。Mtb-TDMは、TLR4が欠損したマウスの腹腔マクロファージをTLR4が正常なものより強く刺激した。一方、TLR2ノックアウトマウスの骨髄由来マクロファージを用いた場合、今回用いたすべてのミコール酸含有糖脂質はTNF-α産生を誘導しなかった。TLR2を過剰発現したHEK293細胞を用い、NF-κBの活性化を指標としたレポーターアッセイの結果から、TMMはTLR2を介してNF-κBを活性化したが、Mtb-TDMおよびRho-TDMのNF-κBの活性化能は極めて弱かった。ミコール酸含有糖脂質はTLR2を介してシグナルを伝達していることが分かった。TLRがリガンドを認識した後のシグナル伝達機構に関して急速に解明されてきているが、脂質ラフトの関与についての報告は少ない。
歯科用合金の接合利用における耐食性評価の研究

補綴物用の貴金属合金、人工歯根用のチタン合金、クラスプ及び金属床用合金、ろう材、磁性アタッチメント用ステンレス鋼などは、歯科用金属材料の中でも歯科臨床的に接合利用される可能性の高い合金である。本研究では、これらの合金を互いに接合し、電気化学的挙動と溶出イオン量から異種金属の接触によるガルバニ腐食について調べ、異種金属の接合における腐食挙動を新たな観点から解明し、接合による腐食損傷がより少なくなるような金属材料の組み合わせを検討した。その結果、歯科用貴金属合金と卑金属合金を接合すると1)陶材焼付用金合金とSUS430系ステンレス鋼のように、従来通り貴金属合金の腐食が抑制され、その反対に卑金属合金の腐食が加速されるもの、2)金銀パラジウム合金とSUS316Lステンレス鋼のように、両者から溶出する金属イオンが増加し、貴及び卑に関わらず両者の腐食損傷が加速されるもの、3)ステンレス鋼と純チタンのように電位の卑な純チタンが腐食せずに、電位の高いステンレス鋼の腐食が促進されるものがあることがわかった。2)の腐食機構については、金属の電位が経時的に変化し、貴金属に分類されている合金であっても卑金属合金よりも電位が低くなる場合があることが明らかになった。3)については、不動態化するまで非常に電位の低い純チタンとの接合により、ステンレス鋼の電位が活性溶解域に長時間保持され、不動態化しにくくなることに起因することがわかった。以上より、現実の接合による腐食は、従来の単純な腐食機構、すなわち貴な合金の腐食が抑制され、卑な合金が優先腐食することと大きく異なることが示唆された。従って、今後これらの実験結果を基に、接合による腐食損傷のより少ない合金の組み合わせを把握し、補綴物の設計及び接合を前提にした合金開発の基礎データを作成する予定である。
細胞工学並びにオミックス解析を用いたTNF受容体周期性症候群の診療基盤構築

TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)は5日以上持続する弛張熱、漿膜炎を特徴とする自己炎症性疾患で、炎症の分子機序ならびに診断に有用なバイオマーカーが未同定である。本研究では、TRAPSの患者検体、疾患特異的iPS細胞に対してオミックス解析を行うことにより、TRAPS炎症病態の解析ならびに再現系構築を行う。また、疾患特異的iPS細胞より漿膜マクロファージを作成、臓器特異的炎症における臓器特異的マクロファージの関与について検討する。以上の研究により、TRAPSの炎症病態の分子機序解明、TRAPSの診断法を確立、TRAPSの診断ならびに治療の基盤構築を目指す。
昆虫脳-中腸-生殖腺のインドールアミンN-アセチル転移酵素の機能と構造

1)ワモンゴキブリ精巣からN-アセチル転移酵素(NAT)を完全精製し、アミノ酸部分配列を決めた。この結果はJournal of Biochemistrryに投稿準備中。酵素はモノクロン抗体の作成のために蓄積中である。2)ワモンゴキブリ卵巣附属腺からNATを精製した。附属腺にはアイソフォームがあり、そのうちの一つは精巣のものと同じと考えられた。もう一方は失活し易いが現在精製を継続中である。3)ワモンゴキブリの脳-食道下神経節のNATの活性は明暗周期に対して2山型の活性変動を示し、全暗で3サイクル以上自由継続(周期27時間)したが、全明で減衰した。脳のNATの特徴付けについてはApplied Entomology and Zoologyに投稿中である。4)中腸のNATも明暗条件で活性変動を示したが、脳のものより急激に減衰し、一山のピークしか無かった。また、絶食後再摂食をさせると、セロトニンが4時間くらいの後ピークを示し、その後急激に減少する。この上昇につれNATの活性が増加し高い価を保つ。これがセロトニンの急激な増加に引き続く急激な減少を作るのではないかと考えられる。絶食したゴキブリにセロトニンとセロトニンの枯渇を引き起こすPCPAを注射すると、セロトニンに期待された細胞増殖は見られなかったが、PCPAは有意に中腸を小さくした。中腸上皮の細胞増殖部にムスカリン性アセチルコリン受容体の免疫組織学的反応が見られた。これらの結果は、中腸の細胞増殖の制御には複雑な機構が関わっていることをうかがわせる。
病原体の危険度を下げた教育用病原微生物株の作成に関する研究

医学教育の中で病原微生物に関する教育は重要な位置を占める.日本細菌学会では医学教育に使用する病原体をレベル3までと勧告している.この中には結核菌、チフス菌、ペスト菌、野兎病菌、炭疽菌、恙虫病原体、等が含まれる。このうち結核菌やチフス菌は臨床医が日常の診療で頻回に遺遇する病原体である。しかし我が国の医学教育現場ではレベル3の病原体を取り扱う施設が整備されている教育機関は皆無に近い。学生の教育に使用している実習室の大半はレベル1の徽生物しか取り扱えない劣悪な環境である。そこでレベル2およびレベル3の病原体を安全に取り扱うためには、これらの病原体から病原因子を欠損させた菌株を使用して、安全教育に利用する環境が必要になる。本研究を通じて、我々はレベル3の病原体を中心に病原因子をノックアウトさせた菌株を作成した。また既に国際的に利用されている菌株でレベルダウンが可能な菌(株)の情報を収集した。集落、生化学的性状検査が目的の場合、表現系に影響を与えない変異株の選択が必要である。遺伝学的な検出方法の教育のためには遺伝子の部分欠損が識別出来る配列を明示する等、目的に応じた遺伝子の欠損株を選択できる情報を収集した。そのため一つの菌種から複数の変異株を作成し、目的に応じて使い分ける選択が出来るようにした。病原因子欠損株は今後、これらの菌株の安全度を日本細菌学会で審議してもらい、安全性を確認し公式にレベルダウンを認可してもらう作業が残されている。特に教育上重要な炭疽菌、赤痢菌、チフス菌、類鼻祖菌、ペスト菌、野兎病菌、ボツリヌス菌、コレラ菌についてレベルダウン候補株の安全性を第三者が検証することが必要になると考えている。危険度の高い病原体に関しては国内外で詳細な病原因子の解析が進んでいる。我が国でも国際的に優れた病原性の研究が進行しているが、これらの研究で得られた菌株を系統的に保存する恒久的な機関が我が国には存在しない。病原体の病原因子を脱落させ危険度を落とした菌株を作成し教育、研究に安全に使用するのが本研究の目的で、今年度は2つの活動を行った。1.一つは分担している病原菌の病原性遺伝子を脱落させ、安全な株を作成すること。2.二つ目は国内の研究者が所有している菌株情報の収集と菌株の収集。1)江崎はレベル3の病原体であるチフス菌の侵入因子、分泌蛋白、きょう膜遺伝子を欠落させた菌株を作成した。同じく牧野はレベル3の炭疽菌の病原因子の脱落株を作成した。分担者倉園はレベル2のClostridiumを中心に病原因子の欠落株を収集している。特にボツリヌス菌の遺伝子操作は承認されていないので、毒素遺伝子を保有しない株、あるいは部分的に欠落している変異株を成する実験を行っている。分担者飯田は下痢の病原体であるレベル2のコレラ菌及び腸炎ビブリオの毒素遺伝子の欠損株を作成した。2)国内の研究者がこれまで作成した株が研究室で埋もれていることから病原因子欠落株を積極的に調査収集することとした。この株は将来レベルダウンを審議すると同時に教育用菌株として日本の研究者が誰もが入手出来るような保存分譲体制を構築する必要が有ることを認識し、その対策を協議した。医学教育の中で病原微生物に関する教育は重要な位置を占める。日本細菌学会では医学教育に使用する病原体をレベル3までと勧告している。この中には結核菌、チフス菌、ペスト菌、野兎病菌、炭疽菌、恙虫病病原体、等が含まれる。このうち結核菌やチフス菌は臨床医が日常の診療で頻回に遭遇する病原体である。

しかし我が国の医学教育現場ではレベル3の病原体を取り扱う施設が整備されている教育機関は皆無に近い。学生の教育に使用している実習室の大半はレベル1の微生物しか取り扱えない劣悪な環境である。そこでレベル2およびレベル3の病原体を安全に取り扱うためには、これらの病原体から病原因子を欠損させた菌株を使用して、安全に教育に利用する環境が必要になる。本研究を通じて、我々はレベル3の病原体を中心に病原因子をノックアウトさせた菌株を作成した。また既に国際的に利用されている菌株でレベルダウンが可能な菌(株)の情報を収集した。集落、生化学的性状検査が目的の場合、表現系に影響を与えない変異株の選択が必要である。遺伝学的な検出方法の教育のためには遺伝子の部分欠損が識別出来る配列を明示する等、目的に応じた遺伝子の欠損株を選択できる情報を収集した。そおため一つの菌種から複数の変異株を作成し、目的に応じて使い分ける選択が出来るようにした。病原因子欠損株は今後、これらの菌株の安全度を日本細菌学会で審議してもらい、安全性を確認し公式にレベルダウンを認可してもらう作業が残されている。特に教育上重要な炭疽菌、赤痢菌、チフス菌、類鼻祖菌、ペスト菌、野兎病菌、ボツリヌス菌、コレラ菌についてレベルダウン候補株の安全性を第三者が検証することが必要になると考えている。