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関節リウマチ早期治療を目的とした抗ＰＡＤ４抗体医薬の検討

関節リウマチ(RA)早期診断マーカーとして抗CCP抗体がある。この抗CCP抗体産生に関与するPAD4を早期RAの標的タンパク質と考え、モデル動物(D1CCマウス)等を用いた以下の実験を行った。1)関節炎発症時におけるPAD4発現領域の免疫組織学的な検討、2)血清抗CCP抗体検出系の樹立、3)抗PAD4抗体投与による関節炎治療時における抗CCP抗体等RA血清マーカーの変動検討。その結果関節炎発症時PAD4は好中球の核に発現する事が明らかとなった。新たな血清抗CCP抗体測定系を樹立した。抗PAD4抗体は、関節炎発症に対し治療効果を示したが、抗CCP抗体は予後因子としては変動しないことが分かった。研究実績研究の目的)日本における高齢化社会の進行は、関節リウマチ(RA)患者数の顕著な増加(増加率約1.5万人/年)としても現れている。このため早期治療法を確立することは喫緊の課題の一つである。そこで早期ターゲットタンパク質の一つPAD4に対するマウスモノクローナル(MoAb)抗体を作製し、関節リウマチモデルマウス(D1CCマウス:(株)免疫生物研究所より販売開始、オリエンタル酵母工業へ権利委譲販売開始)において、関節炎治療を行ったところ顕著な治療効果が得られた(特許申請済み)。本申請では、1)PAD4の機能(活性)とRA発症との関連を明らかにする、2)より特異度、親和度の高いニワトリMoAb抗体を作製し、D1CCマウスを用い治療効果検討を行い、「RA早期治療法の基礎的な道筋」を確立する。これまでの実績概要)1.特許申請に関連し作製した4種類のマウスモノクローナル抗体を大量生産した。2.4種類のマウスモノクローナル抗体の生化学的な特徴を解析した。3.マウスモノクローナル抗体がD1CCマウス関節炎を抑制する事を追試し確認した。その際特許実施例で示したものは、4種類のマウスモノクローナル抗体を混合した混合抗体による関節炎抑制効果(現在国内特許出願中)であったため、個別抗体による抑制効果については不明であった。そこで個別抗体における関節炎抑制効果について検討した。単独抗体による抑制効果を確認した。4.この時の関節炎の組織学的な解析(抑制効果がみられる際の組織学的な特徴)5.マウスモノクローナル抗体解析結果を利用し、ニワトリモノクローナル抗体の絞り込みが可能となった。その結果ニワトリモノクローナル抗体が得られた。日本における高齢化社会の進行は、関節リウマチ(RA)患者数の顕著な増加(増加率約1.5万人/年)としても現れている。現在広く認められ、一般的にも使用される早期診断マーカーとして抗cyclic citrulinated peptide (CCP)抗体がある。抗CCP抗体は、RA特異的にシトルリン化された抗原群に反応性を示す抗体である。PAD4はこのシトルリン化を司るタンパク質で、連携研究者らによりそのタンパク質の立体構造が明らかとされた。構造解析データからCa2+が結合する領域に基質となるアルギニン残基認識部位が存在することが明らかとなった。そこでPAD4を早期RAにおけるターゲットタンパク質の一つと考え、PAD4に対するマウスモノクローナル(MoAb)抗体を作成し、抗体による治療効果を検討した。MoAb作成に関しては、アルギニン残基認識部位周辺に特異的に結合できる様抗体をデザインした。次に作成した抗体の効果検討として、本申請者が開発した関節リウマチモデルマウス(D1CCマウス:(株)オリエンタル酵母工業より販売)を用い予備検討実験を行った。抗PAD4抗体による顕著な治療効果が得られた(特許申請済み)。本研究では、1)PAD4の機能(in vitro活性測定)とD1CCマウスを用いたRA発症との関連を明らかにすることを目的とし、生化学的な解析および治療効果検討を行った。2)より特異度、親和度の高いニワトリMoAb抗体を作製し、生化学的な解析を行った。その結果抗PAD4抗体は、in vitro活性測定において強い阻害効果を持つことが明らかとなった。また抗PAD4抗体は、D1CCマウスにおけるRA発症に対し、治療効果を示した。加えて新たなニワトリMoAb抗体作成に成功し、マウスMoAb抗体より強い阻害活性を有することが明らかとなった。これら一連の研究により「RA早期治療法検討の基礎的な道筋」を確立することができた。抗CCP抗体産生に関わると考えられるPeptidyl argenine deiminases-4 (PAD4)を関節リウマチ早期ターゲットタンパク質と位置付け、PAD4に対するマウスモノクローナル(MoAb)抗体による治療を目指す。

これまでPAD4MoAbを作製し、関節リウマチモデルマウス、D1CCマウスにおいて、関節炎治療を行ったところ顕著な治療効果が得られている(特許申請済みである)。本申請では、1)PAD4の機能(活性)とRA発症との関連を明らかにする、2)より特異度、親和度の高いニワトリMoAb抗体を作製し、D1CCマウスを用い治療効果検討を行い、「RA早期治療法の基礎的な道筋」を確立する。以上2点を大きいな目標として実験を進めている。初年度は、1)に関しては関節炎早期から中期にかけてPAD4タンパク質の生産細胞と考えられる好中球の動きを細胞組織学的に捉える事ができた。またこの時好中球が特徴的な変化を示す事が明らかとなった。2)に関しては、ニワトリモノクローナル抗体の作成が順調に進んでいる。医歯薬学現在のところ概ね予定取りの進捗状況にある。特に1個別抗体による関節炎抑制効果の追試によりマウスPAD4モノクローナル抗体による抑制効果が確認できた、2マウスPAD4モノクローナル抗体の生化学的な解析を進めることで、ニワトリモノクローナル抗体のスクリーニングに関する基準を確立できた、3この基準を基に、ニワトリモノクローナル抗体の作成に入っている、4複数のニワトリモノクローナル抗体が得られた。関節炎早期から中期にかけてPAD4タンパク質の生産の場と考えられる好中球の動きを細胞組織学的に捉える事ができた。さらんに好中球の浸潤に先立つ細胞組織学的な特徴も合わせて解析できている。これらの結果から早期炎症の進展は、複数の異なる細胞群が連携を保ちながら進んでいる事が示唆された。また新規抗体作製も順調に進んでおり、複数のクローンが得られている。これらの事からおおむね順調に進展していると考える。現在のところ概ね予定取り進行している。本年度は、さらに以下の点について検討を加えていく。1早期関節リウマチにおける組織学的な特徴を明らかとし、抗CCP抗体産生のメカニズムを明らかとする。2関節リウマチ早期マーカーとして利用される抗CCP抗体のモデルマウスにおける新規検出系を確立する。3現在得られているニワトリモノクローナル抗体の生化学的な特徴を明らかとする。4現在得られているニワトリモノクローナ抗体をマウス化抗体とする。5現在得られているニワトリモノクローナル抗体を大量生産する。6現在得られているニワトリモノクローナル抗体をD1CCマウスに投与し、関節炎抑制効果を検討する。本年度は、引き続き細胞組織学的な解析を続ける。またニワトリを用いた新たな抗体の性能評価、および抗CCP抗体価のモニターリングシステムの改良と実際の抗体価の測定を進めて行く予定である。該当なし細胞組織学的な染色を中心とした実験に使用する染色関連試薬、抗体性能評価の際利用するビアコア等試薬、抗CCP抗体価測定システム改良の為のペプチド合成等の購入を計画する。
脱髄性神経疾患の発症機序に関する研究

1.免疫系とオリゴデンドロサイト:髄鞘塩基性蛋白に対するT細胞(MBTーT)に対し,アストロサイト,ミクログリアともに,Ia抗原が誘導され得るにもかかわらず,抗原呈示をしなかった.MBPーTのうちオリゴデンドロサイトを傷害するクロ-ンはえられなかった.種々のサイトカインはオリゴデンドロサイトに対し傷害性には働かず,crude lymphokineはむしろオリゴデンドロサイトの分化を促進した.現在オリゴデンドロサイトのprecursorのcell lineを作成し詳細を検討中である.2.中枢神経系のサイトカインネットワ-ク:ミクログリアILー1,6,TNFαを産生し,アストロサイトはそのほかにMーCSF,GMーCSF,TGFβを産生するが,従来言われていたILー3は産生しなかった.このうち,CSFはミクログリアの増殖・活性化に,TNPはアストロサイトの活性化に働くことが明らかになった.更に,ミクログリアは上記サイトカインとは異なるアストロサイト増殖因子を産生しグリオ-ジスの機序に関与し,アストロサイトはミクログリアを不活化する因子と血管内皮細胞のtight junction形成を促進する因子を産生することが判明した.また,ILー3,6,GMーCSFは神経細胞の分化,生存を促進することも知られており,中枢神経系でグリア細胞由来のサイトカインが複雑なネットワ-クを形成していることが示唆された.3.ウイルスによるグリア細胞の変化:ヒトレトロウイルスHTLVー1のtax遺伝子を導入,誘導することによりグリア細胞に主要組織適合性抗原を誘導でき,同時にサイトカイン産生も誘導される.同様の現象はマウスレトロウイルスLPBMー5によるアストロサイトの感染でも起こるが,いずれの場合も,ILー6の産生が主体で,TNFαの産生は起こらなかった.これはウイルスによるグリア細胞のサイトカイン産生の機序はLPSやTPA等の非特異的刺激によるものとは異なることを示している.1.免疫系とオリゴデンドロサイト:髄鞘塩基性蛋白に対するT細胞(MBTーT)に対し,アストロサイト,ミクログリアともに,Ia抗原が誘導され得るにもかかわらず,抗原呈示をしなかった.MBPーTのうちオリゴデンドロサイトを傷害するクロ-ンはえられなかった.種々のサイトカインはオリゴデンドロサイトに対し傷害性には働かず,crude lymphokineはむしろオリゴデンドロサイトの分化を促進した.現在オリゴデンドロサイトのprecursorのcell lineを作成し詳細を検討中である.2.中枢神経系のサイトカインネットワ-ク:ミクログリアILー1,6,TNFαを産生し,アストロサイトはそのほかにMーCSF,GMーCSF,TGFβを産生するが,従来言われていたILー3は産生しなかった.このうち,CSFはミクログリアの増殖・活性化に,TNPはアストロサイトの活性化に働くことが明らかになった.更に,ミクログリアは上記サイトカインとは異なるアストロサイト増殖因子を産生しグリオ-ジスの機序に関与し,アストロサイトはミクログリアを不活化する因子と血管内皮細胞のtight junction形成を促進する因子を産生することが判明した.また,ILー3,6,GMーCSFは神経細胞の分化,生存を促進することも知られており,中枢神経系でグリア細胞由来のサイトカインが複雑なネットワ-クを形成していることが示唆された.3.ウイルスによるグリア細胞の変化:ヒトレトロウイルスHTLVー1のtax遺伝子を導入,誘導することによりグリア細胞に主要組織適合性抗原を誘導でき,同時にサイトカイン産生も誘導される.同様の現象はマウスレトロウイルスLPBMー5によるアストロサイトの感染でも起こるが,いずれの場合も,ILー6の産生が主体で,TNFαの産生は起こらなかった.これはウイルスによるグリア細胞のサイトカイン産生の機序はLPSやTPA等の非特異的刺激によるものとは異なることを示している.グリア細胞と免疫系の相互作用を検索し、以下の成績が得られた。1.髄鞘塩基性蛋白(MBP)に対するTcell lineを作製し、アストロサイト、ミクログリアのin vitroでの抗原呈示能を検索した。SJLマウスおよびLewisラットでMBP反応性Tcell lineが得られた。この両方の系において、アストロサイトとミクログリアには抗原呈示を行わなかった。しかしながら,アストロサイトとミクログリアにはγ-インタ-フェロンにより抗原呈示に必要なIa抗原が誘導されることをNorthern blotting法により確認でき、またミクログリアはインタ-ロイキン-1(IL-1)も産生することを確認できたため、これらの細胞の抗原呈示能につき、現在種々の状件下で再検討中である。2.グリア細胞のサイトカイン産生能の検討、分離・培養したミクログリア、アストロサイトと混合グリア細胞培養をin vitroでリポポリサッカライド(LPS)、ホルボ-ルエステル等で刺激した後に上清を集め上清中のサイトカインを検索中である。現在までに、アストロサイトがgranulocyte-macrophagecolony stimulatingfactor(GM-CSF)を産生すること、このGM-CSFがミクログリアの増殖に働くことなどをつきとめ投稿中である。このほかアストロサイトは1L-6、tumor necrosis factor-α(TNF-α)およびprostaglandin E_2(PGE_2)も産生した。ミクログリアは1L-1、1L-6、TNF-α、およびPGE_2を産生したが、1L-3、GM-CSFは産生しなかった。

現在これらのグリア細胞の産生する免疫性サイトカインの脳内での生理学的および病理学的意義について検討中である。3.MBP感作により作製したT cell lineのうち、in vitroでオリゴデンドロサイトを傷害するlineは得られなかった。またリンホカインによるオリゴデンドロサイトの傷害も認められなかった。1.ウイルス感染の際のグリア細胞と免疫系の相互作用:神経系の細胞は主要組織適合性(MHC)抗原を表現しておらず,免疫系の統御を免れる特殖な細胞と考えられていた。我々は神経向性のコロナウイルスの感染の際に感染アストロサイト由来の液性因子がグリア細胞にclass I MHC抗原を誘導することを示したが,本年度はヒトレトロウイルスであるHTLVー1のtax遺伝子をグリア細胞にtransfectionすることによってもclass I MHC抗原の誘導がおこることをみいだした。この誘導には液性因子は関与せず,tax遺伝子とMHCをコ-ドする遺伝子との相互作用が推定された。MHC抗原の誘導によりグリア細胞も免疫系の標的となり得るようになり,現在オリゴデンドロサイト系の細胞に同様のtransfectionを行い,MHC抗原誘導の有無によるT細胞との相互作用の検討に着手している。2.ミクログリアの本能・機能に関する研究:ミクログリアに対するモノクロナル抗体(mAb)を作製した。これらのmAbはすべての組織のマクロファ-ジをも認識した。mAbを用いた組織学的検討から,胎生後期にくも膜下腔に出現した単球系細胞がしだいに脳実質に入りこみ,生後2週以降急速に数を減じ,枝わかれした(ramified)ミクログリアになることが判明した。またin vitroでの種々のサイトカインの効果の検討より,アストロサイト由来の未知の液性因子がミクログリアをramifiedに変化させること,さらにramifiedの細胞は分裂能をもたず,酵素活性も低い休止型の細胞であることが示された。これに対し,γーinterferonはミクログリアを活性化し,コロニ-刺激因子はミクログリアを増殖させた。以上より,ミクログリアとマクロファ-ジの類似性とともに種々のサイトカインがミクログリアの機能を調節していることが明らかになった。1.グリア細胞の産生する液性因子の検索とそれらによる細胞間相互作用の検討:ミクログリアとアストロサイトはともにILー1,ILー6,TNFαを産生するが,これらサイトカイン産生はミクログリアの方が迅速に反応する.さらにTNFα刺激でアストロサイトのILー6産生のみが誘導された.このことは炎症・脱髄の病態下でミクログリアの反応の方が早いことを考え合わせると,まずミクログリアが活性化され,サイトカイン産生がおこり,これがparacrineにアストロサイトを活性化する可能性を示唆している.ミクログリアの培養上清にはこれらのサイトカインとは異るアストロサイト増殖促進因子が存在することも判明し,さらに,アストロサイトの産生するTGFーβはミクログリアのサイトカイン産生を含めた活性化を抑制することも明らかになった。
マスク転写自己形成による光配線のための接続技術と光デバイスの研究

本研究では,光硬化樹脂を用いた自己形成光導波路による革新的な光接続技術の確立をはかった.これらの研究開発によって,従来の課題の抜本的な解決をはかり,光インタコネクション技術の普及を目指す.具体的には、光ピンの作製技術の確立、ポリマーV溝の作製技術の確立とピッチ変換機構の付与に成功した。さらにマイクロプリズム内に4チャンネルの90度光路変換技術の作製技術を確立した。これらの研究成果によって,従来の課題の抜本的な解決をはかり,光インタコネクション技術の普及へ貢献することが期待される.【はじめに】光接続の難しさゆえ、ボード内およびチップ内の光配線の導入には課題が多く残されている。そこで、光配線板と光ファイバとの接続を効率的に行うために、ファイバ多芯一括接続用に標準化されている4チャンネルのMTコネクタと、光硬化樹脂を用いた光ピンによるマイクロサイズの90度光路変換素子とを一体化することを提案試作した。さらに、フォトマスク転写法を用いたV溝基板作製を試みた。V溝の形状制御をはかるとともに、ピッチ変換や新たな付加価値を与えることを検討した。【90度光路変換コネクタ】光ピンはブルーレーザによる光硬化樹脂を用いた自己形成の原理によって作製する。ブルーレーザ光路の途中に45度ミラーを設置し、90度光路変換された光ピンを4チャンネル作製した。光ピンを埋め込むために、屈折率の低い別の樹脂を用い、マスク転写法により、紫外光(λ= 365 nm)で300sec照射した。光ピンの長さはミラー前後で405μmと628μmとなった。光コネクタ側の光ピンの径は光コネクタ側で43μm、接続側48μmとなっており、全体としてテーパ形状になった。波長850 nmのLDを用い、挿入損失法によりこの素子の光損失を測定した結果、受信では-3.18dB、送信では-3.39dBとなった。新たな光路変換素子を提案・試作し、実験によって有効性を確認することができた。【ポリマーV溝】まず開口部と遮蔽部がストライプ状に並ぶような開口パターンを設計した。フォトマスクの上に三角プリズムを設置し、従来同様1つの光源でV字型の形成を行うことを可能にした。V溝の高さは100μmとした作製されたサンプルの硬化部の上辺の幅(フォトマスクとの接触箇所)はおよそ101.5μmとなり、作製誤差は3.5μmになった。新たなポリマーV溝基板の作製に成功した。これらの研究成果によって,従来の課題の抜本的な解決をはかり,光インタコネクション技術の普及へ貢献することが期待される.【はじめに】LSIチップ間の信号伝送に電気配線に代わってシリコン導波路等の光配線の導入が検討されている。しかし,シリコン導波路の幅が狭く,光入出力がきわめて困難である。この問題を解決するために,自己形成導波路の技術を用いて作製する光ピンの導入を提案し,そのなかで光ピンの長さや直径,ストレートまたはテーパ形状,傾斜角度等の値を最適設計することを初年度の検討課題とした。【フォトマスク転写法による光ピンの作製と形状制御】今回、フォトマスク転写法を用いてオフセット角10°傾斜光ピンの作製を目的とし,2つの方法でスライドガラス及びシリコン基板上に,傾斜光ピンの作製を行った。フォトマスク上でのピンの開口径は50ミクロンである。実験1はライトガイドを直接傾けて照射する方法、実験2は計算で算出した任意の角度を持つプリズムをフォトマスク上に配置し,照射する方法である。実験1では直径50ミクロンから45ミクロンで,オフセット角11.5°の光ピンが作製できた。実験2では、光ピンは直径50ミクロンのストレート形状で,オフセット角9.7°を実現した。【ファイバ端面への自己形成ポリマー光ピンの作製】シリコン導波路からの入出力効率を評価するために,マルチモードファイバ(MMF)端面に光ピンを製作する必要が生じた。ブルーレーザ光の内部照射によって,MMF端面に自己形成ポリマー光ピンを作製し,形状制御の条件を検討し,さらにコアとの結合損失の測定評価を行った。目標とする光ピンの形状は,直径50ミクロンのストレート形状,およびファイバ側から先端に向かって太くなる先太りテーパ形状の2種類であり,長さは数百ミクロンである。それぞれの形状につき3個ずつ作製し,再現性及び形状制御の確認をした。本研究では,光硬化樹脂を用いた自己形成光導波路による革新的な光接続技術の確立をはかる.これらの研究開発によって,従来の課題の抜本的な解決をはかり,光インタコネクション技術の普及を目指す.本研究のキーテクノロジは、自己形成技術を応用したフォトマスク転写法である.

従来のファイバからの直接照射ではなく、UV光源と光硬化樹脂との間に遮蔽版フォトマスクを介し、UV照射を行う.光硬化樹脂はフォトマスクの持つ開口パターンに従い硬化する.開口パターンの設計次第で様々な端面形状の導波路を一括で作製できる特徴がある.(1)直径30μmから50μm、長さ300μmから500μmの光ピンを多数本、ピンポイントで所定の位置に一括作製する技術を確立した.(2)ポリマーV溝基板とピッチ変換用ポリマーV溝の作製に成功した。三角プリズムを用いることで照射光源を1個に減らし、作製プロセスの簡略化と柔軟性を与えることが出来た。V溝の角度はプロズムの頂角に依存することも確認した.またピッチ変換の機能を付与できることを確認した.(3)ファイバ端面からのブルーレーザ光照射による自己形成技術と、マスク転写による自己形成技術を併用して、90度光路変換機能を有する4チャンネルの光導波路を内蔵したマイクロプリズムをファイバコネクタ面に作製することに成功した.そのサイズは約1mm立方であり、実験によってその有効性を確認することができたこれらの研究成果によって、高い結合効率を有する光接続技術を簡易にかつ低コストで実現できる可能性を見出した.これによって、光インタコネクション技術の普及におおきく貢献すると期待される.今回の研究成果は主としてマルチモード系を対象としている.今後、システムやアプリケーションのニーズとして、シングルモード系が増えることが予測される。このためには斬新なアイデアで、対処することが必要であろう.光インターコネクション(理由)光硬化樹脂にブルーレーザによって光ファイバから内部照射を行うと、光照度に応じた形状に樹脂が硬化していく.したがって光ファイバの端面から光導波路が形成されるため、位置合わせが不要である特長を有する。今回、試作した素子の光損失が妥当であるか評価するために作製したものと同寸法のモデルを想定し、光線追跡法により求めた光損失を比較した。その結果、光損失の測定値は、理論値よりも大幅に大きかった。現状、実測値と理論値との差異は大きく、さらなる改善が必要である。一方、これまでこれらの光ピンは空気中に保持されて機械的な強度が危惧されたが、クラッド樹脂による埋め込みによって回避できる見通しを得た。今後、自己形成導波路の特長を生かして、光路変換素子と光配線板とのアライメント機能を与えるような工夫を検討していくことも実用上重要であることが分かった。マスク転写法は多種多様な応用が期待される魅力的な作製方法である。今回、三角プリズムを用いることで光源の数を減らし、作製プロセスの簡略化と柔軟性を与えることが出来た。フォトマスクを設置する高さや開口パターンの設計、プリズム、樹脂の選択により、従来のガラスやシリコン結晶のV溝では困難であった柔軟な作製を行うことが出来る等、さらなる発展が期待される。フォトマスク転写法は当研究計画書での要な技術である。本法を用いて作製できる光ピン長さや直径,ストレートまたはテーパ形状,傾斜角度等の値を最適設計することが検討課題として挙げられる。このため、入出力用のポリマー光ピンを作製し,再現性および形状制御の検討を目的として実験を遂行した。その結果、所望の形状を作製できることを確認した。とくにオフセット角度を有する光ピンについては、設計した角度のプリズムを採用することによって、容易に所望のオフセット角度を実現できることが分かった。また基板には反射防止膜を事前に形成しておくことが必須であることも明らかにできた。ブルーレーザ光による自己形成
ハイブリッド回転電界場の微小液滴の回転混合システムの研究

特定の周波数の交流電界下に置いた水滴の共振振動現象を利用して、数十μLの2種類の水滴を混合するために、超撥水性材料上の粘性水滴の挙動を明らかにした。100μLの水滴に加える交流電界の周波数を変化させて、水滴が伸びるときと縮む時の変形量を調査して、共振周波数を決定した。粘度を高めた水滴をとイオン交換水の水滴の攪拌する様子を明らかにするために、水滴に蛍光体を混入して水滴内の液体の動きと攪拌する速さを調べた。また、三次元電界により、水滴の変形量を大きくすることにより、攪拌性能が向上することを明らかにした。水滴との接触角が150°以上となる超撥水性材料上に置いた水滴の電界下での共振振動による挙動を明らかにすることを目的として,平行交流電界下および半波正弦波形による交互直交電界下での水滴の挙動を調査た。水滴の回転運動を観察できるように加工したアクリル板表面に超撥水性塗料を塗布し,その上にマイクロピペットにより体積50マイクロリットルの水滴を静かに置き,アクリル板と平行に電界を印加して,水滴の共振振動による水滴の変形を観察した。撥水性材料であるシリコーン(SiR)板およびPTFE板上の水滴の挙動との比較を行った。さらに蛍光体を混入した水滴とイオン交換水の水滴を電界により接触させて攪拌し,紫外線を照射して水滴内の蛍光体の分布から水滴内の液流の状態を観察し,撹拌性能を評価した。その結果,電界下の水滴は超撥水性材料を用いたとき最も大きく変形することが明らかになった。また,イオン交換水にポリエチレングリコールを混ぜて粘度を高めた水滴では,電界による共振時の変形量は小さくなった。蛍光体を混合させた水滴を接触させると電界により大きく変形し,水滴内の蛍光体を一様に攪拌できることが明らかになった。平成25年度中に行った研究は微小水滴の共振振動の把握、共振周波数以外の周波数での二種類の液滴の混合速度の確認、3次元電界による不規則な変形の確認である。液滴の共振振動周波数を把握するために、クモの糸に0.1mm以下の水滴を形成して電界を印加し、水滴の挙動を高速度ビデオカメラで観察することにより共振周波数を見出し、水滴の大きさと共振周波数との関係を求めた。絶縁板上に置いた水滴の共振振動と孤立した水滴の共振周波数は異なり、液滴の共振振動を3次元的に効果的に起こさせ、変形させる時には印加する電界周波数には異なる可能性があることを示した。このことは、液滴の共振振動を3次元的に効果的に起こさせて変形させる時には印加する電界周波数は、絶縁板上の共振周波数とは異なる可能性があることを示した。ポリエチレングリコールで粘度を高めた液滴と水滴との攪拌混合を行い、液滴内部の液体の動きを把握した。粘度の高い液滴には予め蛍光物質を導入し,水滴と合体後のを液流の流れを紫外線照射による発光分布状態の時間変化として高速度カメラにより3次元的に捉えた。共振周波数以外の周波数を印加した場合、蛍光物質を含む粘性液体の電界印加時の拡散速度は速く、液滴の振動以外に攪拌する可能性があることを示した。2種類の液滴を合体させ大きな共振振動を起こさせたときに、水平方向電界に垂直電界を加えたハイブリッド電界下での水滴には不規則な運動を起させることができることを確認した。水滴の共振周波数に対応した回転外部電界により水滴の液流の動きを制御することにより撹拌を促進することを目的としている。液体の種類はイオン交換水のほか,エチレングリコールで粘度を調整した水溶液を使用し,蛍光材料を混ぜることにより,液流の動き,2種類の液滴の攪拌の速度を明らかにする。撥水性の高いテフロン板上にマイクロピペットで10mmを越える大きさの水滴を置き,水滴の大きさに対応した共振周波数の回転電界を絶縁板表面に沿って加え,液滴に振動力と回転力を付加した。任意波形発生器で駆動する現有の高電圧増幅器を使用し,二相交流により、回転電界を形成する。水滴の形状変化を高速度カメラ(最大45,000フレーム/s)によりこの際、水滴内部の液体の流れの状態を捉えるために、紫外線で発光する蛍光物質を混入させた。

液滴内部の液体の動きおよび微小液体の混合速度を把握するために,片方の粘性液滴には予め蛍光物質を導入し,イオン交換水と液滴を合体させたときの回転運動を調べた結果、回転運動により、撹拌による混合は促進されるが、水滴自体が回転することはないことを明らかにした。1.粘性液体の電界中の挙動解明と混合可能な粘度の把握平成23年度に検討した水滴の挙動を踏まえ,エチレングリコールを混ぜて粘度を高めた液滴を絶縁板上に置き,粘度および液滴の導電性と電界による変形の大きさの関係、混合可能な液滴の粘度の上限を実験的に明らかにすることができた。2.二種類の微小液体の混合速度の把握2種類の液滴を合体させたときの回転運動により大きな変形を起こさせるために直交電界を用いて混合速度を把握する。水滴を静置した場合,液滴内部の液体の動きを把握するために,片方の液滴には予め蛍光物質を導入し,蛍光物質を加えた液滴内の紫外線照射による発光分布状態の時間変化を高速度カメラにより捉えることができ,時間変化を把握することができた。液滴内部の液体の動きおよび微小液体の混合速度を把握するために,片方の粘性液滴には予め蛍光物質を導入し,イオン交換水と液滴を合体させたときの回転運動を調べた結果、回転運動により、撹拌による混合は促進されるが、水滴自体が回転とが明らかになった。水滴の回転を起こさせるために、表面の摩擦力が少ない超はっ水性材料を探索した。結果として、接触角が150度の材料HIRECを探し当て、HIRECをアクリル板表面に塗布することで水滴が回転できるようにした。この結果、水滴自体が回転電界で回転することはないが、水滴の変形が大きく、変形を利用した買う半に切り替えることが必要であると判断し、HIRECを用いて水滴の共振周波数や変形の時間変化を調査する事で時間を費やした。1.絶縁板上の液滴のハイブリッド電界下での挙動テフロン板上に置いた共振周波数の回転電界と垂直あるいは斜め方向から独立した電界を加え、規則的な回転電界に不規則な擾乱を与え、水滴内の液体の流れを乱すことにより撹拌を促進する。2.撥水性の絶縁板上に置いた直径20500マイクロメートル程度の大きさの微小水滴を変形させる方法について検討する。このとき、ペルチェ素子で絶縁板の温度を変化させることにより、微小水滴の粘度や表面張力を変え、水の物理的特性の変化と変形の大きさとの関係を把握する。また、撥水性の膜で塗布した針電極先端に微小水滴を導入し、強い電界のハイブリッド電界中で、回転運動を起す方法について検討する。水滴自体がコマのようにその場で回転させることを意図していたが、回転運動による撹拌混合の促進というよりもむしろ、水滴の外形の変化による撹拌混合に切り替える。より大きな変形を作り出すために、これまでの二相電界によるなめらかな回転電界ではなく、半波整流波形のように一方向にダイナミックに変化する垂直電界を加え、水平面内で水滴が交互に伸縮、伸長を繰り返すことができる波形を印加するとともに、三次元に変形する電界を加えることで撹拌を促進する事を試みる。撥水性絶縁板情上に置いた水滴の水滴の表面張力や粘度を調整しながら,水滴の撹拌性能を調べるために,温度を調整できるような温度調節可能なステージを備えた顕微鏡を購入する。電界を印加した状態で観察できるように長焦点のレンズを使用する。研究成果の発表のために,旅費,印刷費として研究費を使用する。物品費として蛍光体、絶縁材料、回路部品のほか、粘性液体の粘度を温度変化により変化させるために、絶縁板全体の温度を調整できる温度調整器を購入する。また、国内会議、国際会議での研究発表、謝金に研究費を使用する。
長距離相互作用をもつ系の解析とその物性物理への応用

ハルデイン・シャストリー型スピン系に代表される1次元長距離相互作用をもつ可積分系の研究を行った。1.一般に距離の逆二乗の相互作用をもつ系(Calogero-Sutherland系)の波動函数は超幾何型函数によってあらわされることが知られており、2次元共形場理論にあらわれるKnizhnik-Zamolodchikov(KZ)方程式と呼ばれる1次偏微分方程式と密接な関係がある。われわれはBabujianによって提唱された代数的なBethe仮設法に基づく方法によって三角函数型の一般的なKZ方程式の積分表示解を構成した。2.Calogero-Sutherland系の解析にはDunkl演算子という微分差分演算子を用いるのが便利である。Yang-Baxter方程式、およびReflection方程式の無限次元表現をあたえることによって、古典ルート系に不随するDunkl演算子がきわめて簡単に与えられることを示した。さらに、三角函数型の場合の固有値を計算した。3.ハルデイン・シャストリー型スピン系の重要な性質としてヤンギアン対称性をもつことがあげられる。われわれはmotifとよばれるヤンギアン不変な基底の表現がq-多項式の一種であるRogers-Szego多項式から得られることを示した。
高清浄鋼2次精練用酸化物融体中の酸化鉄および酸化マンガンの活量測定

活量測定実験に先立ち、フロート式ガス流量計を用いた二酸化炭素、一酸化炭素ガス混合装置、および、ジルコニア固体電解質を用いた酸素センサーを作製し、混合ガス比とセンサー起電力との間にネルンストの関係が成立する事を実験的に確認し、雰囲気制御技術を確立した。また、数回の予備実験により、白金坩堝、ムライト支持台の形状、急冷操作などの実験手法を決定した。鉄+白金合金と均一液体カルシア+シリカ+アルミナ系フラックス間の鉄の分配平衡実験を行い、1873Kにおける同フラックス中の酸化鉄の活量を測定した。ガス混合比、初期配合フラックス組成を変化させた実験を行い、酸素分圧、フラックス組成依存性を検討した。現地点で得られた実験事実は以下のとうりである。1.同一酸素分圧、フラックス組成ではフラックス中の酸化鉄の活量は濃度に比例すると見なしうる。2.同一酸素分圧下では酸化鉄の活量係数はフラックス組成によって0.5から1.4まで変化する。3.同一フラックス組成では酸化鉄の活量係数は酸素分圧の低下とともに上昇する。4.同一酸素分圧、フラックス組成ではフラックス中の鉄の価数は酸化鉄濃度に依存しない。5.フラックス中の鉄の価数は酸素分圧、カルシア濃度の上昇ととともに増加する。さらに、酸化鉄の活量係数の組成依存性を定量的に記述するためラムズデンモデルの適用を試み、これまで報告されている比較的酸化鉄濃度が高い領域で決定された相互作用エネルギーから算出した酸化鉄の活量係数は実測値から求めた値より低くなる傾向があることがわかった。
一様等方性乱流におけるマイクロバブルと乱流微細構造の相互作用

マイクロバブルと乱流構造との相互作用を解明するため,多数の上昇気泡を含む一様等方性乱流の直接数値計算をいかなる近似も用いずに行った.不純物を含む水中のマイクロバブルを想定して,気泡は低密度の球形固体粒子のようにふるまうと仮定した.昨年度に開発した計算法を用いて,最大1000個の気泡を乱流中に投入して計算を行い,気泡上昇速度,気泡および液相速度変動,気泡の空間分布,液相乱流エネルギーおよびエンストロフィーの変化,乱流渦構造の変化,伝熱特性の変化などについて調べた.比較のため,静止流体中の上昇気泡が誘起する擬似乱れに関する計算や,気泡の運動に質点近似を用いた計算もあわせて行った.乱流中の平均気泡上昇速度は,静止流体中のそれに比べ低下することが質点近似を用いた計算により既に示されているが,直接数値計算により得られた気泡上昇速度はそれよりもさらに低下することがわかった.その原因として,乱流渦構造の影響の他に,気泡後流構造の変化があることを示唆する結果を得た.また,気泡上昇速度が乱流の速度変動と同程度のときには,気泡混入による乱流エネルギーの変化は小さいが,気泡上昇速度が乱流速度変動に比べ高い場合は,擬似乱れの乱流エネルギーと同程度の大幅な増加を示すことがわかった.さらに,鉛直方向,もしくは水平方向に一様な温度勾配がある場合の対流熱伝達について調べ,気泡の混入により,温度勾配が鉛直方向にある場合の対流熱伝達は増加するが,温度勾配が水平方向にある場合の熱伝達に関しては,乱流構造の変化に伴い減少する場合があることを見出した.マイクロバブル(微小気泡)と乱流微細構造(渦構造)との相互作用を解明するための第1段階として,2次元Taylor-Green (TG)渦と微小気泡の相互作用を直接数値計算により調べた.ここでは、少量の不純物を含む水の中に存在する微小気泡を想定して,気泡は球形固体粒子のようにふるまうと仮定した.滝口らが固体粒子の解析のために開発した計算法をもとに,気泡への適用を可能とするいくつかの改良を行い,系の運動量が保存され安定な計算が可能なスキームを完成させた.静止流体中での気泡の終端速度を計算したところ,その値は理論値とほぼ一致することを確認した.この計算方法を用いて,TG渦流れの中を上昇する気泡のシミュレーションを行った。TG渦のレイノルズ数は,乱流中の渦のレイノルズ数と同程度になるように設定した.比較のために,質点モデルを用いた計算も行った.気泡に働く力としては,抗力,浮力,圧力勾配力,付加質量力のみを考えた場合と,それらにAuton型の揚力を加えた場合について考察した.TG渦流れの長さ,時間スケールで規格化される重力加速度の値を1程度に固定し,気泡の大きさ(ストークス数)を変えて何種類かの計算を行った.その結果,(1)気泡に働く力のバランスによって決まる平衡点がTG渦内に存在すること,(2)質点モデルの場合、平衡点は揚力の効果によって、鉛直下向きおよび渦外向きに移動すること,(3)直接数値計算により得られる平衡点は,揚力を考慮した質点モデルの場合に比べて、さらに鉛直下向きにずれること,(4)直接数値計算における平衡点は,同時に渦中心方向にもずれており,その程度は気泡が大きいほど顕著であること、が分かった.マイクロバブルと乱流構造との相互作用を解明するため,多数の上昇気泡を含む一様等方性乱流の直接数値計算をいかなる近似も用いずに行った.不純物を含む水中のマイクロバブルを想定して,気泡は低密度の球形固体粒子のようにふるまうと仮定した.昨年度に開発した計算法を用いて,最大1000個の気泡を乱流中に投入して計算を行い,気泡上昇速度,気泡および液相速度変動,気泡の空間分布,液相乱流エネルギーおよびエンストロフィーの変化,乱流渦構造の変化,伝熱特性の変化などについて調べた.比較のため,静止流体中の上昇気泡が誘起する擬似乱れに関する計算や,気泡の運動に質点近似を用いた計算もあわせて行った.乱流中の平均気泡上昇速度は,静止流体中のそれに比べ低下することが質点近似を用いた計算により既に示されているが,直接数値計算により得られた気泡上昇速度はそれよりもさらに低下することがわかった.その原因として,乱流渦構造の影響の他に,気泡後流構造の変化があることを示唆する結果を得た.また,気泡上昇速度が乱流の速度変動と同程度のときには,気泡混入による乱流エネルギーの変化は小さいが,気泡上昇速度が乱流速度変動に比べ高い場合は,擬似乱れの乱流エネルギーと同程度の大幅な増加を示すことがわかった.さらに,鉛直方向,もしくは水平方向に一様な温度勾配がある場合の対流熱伝達について調べ,気泡の混入により,温度勾配が鉛直方向にある場合の対流熱伝達は増加するが,温度勾配が水平方向にある場合の熱伝達に関しては,乱流構造の変化に伴い減少する場合があることを見出した.
磁気浮上遠心補助人工心臓の多機能化・高信頼化の研究

体内植込補助人工心臓は,日欧米で既に本格的な臨床応用の段階に入り,今後,年間の症例数では,心臓移植を超える治療となることが予想される.本研究では,耐久性,生体適合性の観点で優れる磁気軸受搭載の遠心血液ポンプシステムを対象に,流量推定,粘度推定などの多機能化の研究,装置に不具合が発生した場合でもポンプ機能を維持する高信頼化の研究,さらに,子供への適用も含め,小型化の研究を実施したので報告する.体内植込補助人工心臓は,日欧米で既に本格的な臨床応用の段階に入り,今後,年間の症例数では,心臓移植を超える治療となることが予想される.本研究では,耐久性,生体適合性の観点で優れる磁気軸受搭載の遠心血液ポンプシステムを対象に,流量推定,粘度推定などの多機能化の研究,装置に不具合が発生した場合でもポンプ機能を維持する高信頼化の研究,さらに,子供への適用も含め,小型化の研究を実施したので報告する.本年度,従来研究から世界最先端の小型化を実現,低溶血性が実証された2自由度制御型磁気軸受を搭載した遠心血液ポンプを対象に,磁気軸受の外乱オブザーバを応用した血液流量推定,磁気軸受制御系のロバスト設計,および,磁気軸受用電磁石の不具合に対するフォルトトレランスなどの高信頼化の研究を実施した.さらに,血液ポンプのさらなる小型化を目指すため,1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプの設計,試作も目指した.その結果,1)外乱オブザーバによりインペラの半径方向力を推定し,流量を測定する方法を新たに提案した.拍動流ポンプと遠心血液ポンプを組み合わせた循環補助シュミュレータを構築し,流量推定実験を実施したところ,医療用超音波流量計との誤差は15%以内であった.2)H∞制御や外乱オブザーバを用いた磁気軸受のロバスト制御系の適用を検討し,血液未充填,充填にかかわらずインペラの安定した磁気浮上を実現した.3)磁気軸受の構成する4個の電磁石のうち,3つまでも破損しても,非接触浮上が可能な制御法を開発した.また,電磁石が13個破損した状態でも,循環補助シュミュレータに接続した拍動流下において,インペラの非接触回転が実現された.4)1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプを試作し,特定の回転領域において非接触浮上を確認した.但し,組み立て精度不足による磁気アンバランスのため,動圧効果の少ない低速回転域,不釣り合い力の大きな高速回転域での非接触回転は未達成であり,22年度はその問題の解決を目指す.本研究グループが従来研究開発した,世界最先端の小型化,低溶血性が実証された2自由度制御型磁気軸受を搭載した遠心血液ポンプを対象に,磁気軸受の外乱オブザーバを応用した血液流量推定,粘度推定,磁気軸受システムのロバスト設計,および,磁気軸受用電磁石の不具合に対するフォルトトレランスなどの高信頼化の研究を実施している,さらに,血液ポンプのさらなる小型化を目指すため,1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプの実現も目指している.これに対して,H22年度の主要な研究成果は,以下の通りである.1)補助人工心臓における血栓形成を高感度に検出するため,血液の粘度変化を,2自由度制御型磁気軸受を搭載した遠心血液ポンプを利用して検出する方法を検討した.その結果,模擬血液の粘度変化を,磁気浮上遠心血液ポンプの動特性,特に,100Hz近傍のゲイン,位相特性の変化から,高感度に計測可能なことを予備実験から見出した.2)東工大のスーパーコンピュータ(TUBAME2)を用いたCFD解析により,インペラに働く流体力を詳細に計算するための流体モデルを検討した.これにより,フォルトトレランスのため,電磁石故障時も動圧効果によりインペラを非接触支持可能な血液ポンプの形状を今後,探索する.3)1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプを試作し,非接触回転成人の補助循環に必要な吐出流量・圧力を達成した.但し,磁気軸受消費電力が高く,今度,ポンプ内の流体によるアキシャルスラストカの低減策を検討する.また,ポンプ効率が10%以下と低く,モータ効率の向上,流体効率の高いインペラ形状の検討が必要である.本研究グループが従来研究開発した,世界最先端の小型化,低溶血性が実証された2自由度制御型磁気軸受を搭載した遠心血液ポンプを対象に,磁気軸受の外乱オブザーバを応用した血液流量推定,粘度推定,磁気軸受システムのロバスト設計,および,磁気軸受用電磁石の不具合に対するフォルトトレランスなどの高信頼化の研究を実施した.さらに,血液ポンプのさらなる小型化を目指すため,1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプの実現も目指し,研究を実施した.これに対して,H23年度の主要な研究成果は,以下の通りである,1)補助人工心臓における血栓形成を高感度に検出するため,血液の粘度変化を,2自由度制御型磁気軸受を搭載した遠心血液ポンプを利用して検出する方法を検討した.本年度は模擬血液として用いたグリセリン溶液の濃度と温度を変化させ,粘度を変化させることにより,インペラの動特性にどのような影響を与えるかインペラの周波数特性を計測し,詳細に調べた.

2)東工大のスーパーコンピュータ(TUBAME2)を用いたCFD解析により,1自由度磁気軸受および2自由度制御型磁気軸受を搭載した血液ポンプのインペラに働く流体力,2次流れを詳細に解析した.これにより,フォルトトレランスのため利用可能な軸受力の評価や,溶血・血栓に関連する2次流れの様子を可視化した.3)1自由度制御型磁気軸受モータを搭載した血液ポンプの磁気軸受の消費電力が大きい問題を解決するため,インペラに働く流体力をバランスさせるハウジング,ロータ形状を探索した.
多段階的な細胞内動態制御を可能とする肝標的型多重コーティング遺伝子ナノ粒子の開発

本研究では、細胞内動態をコントロールすることによりin vivo肝臓で治療効果が得られる遺伝子キャリアの構築を目指し、本研究室で開発されている遺伝子キャリアであるMENDの改良を行っている。MENDは、プラスミドDNAとポリカチオンを凝縮化させたコアを脂質エンベロープにより封入した構造を有する。昨年度までに、細胞内環境応答性を有する脂質様物質を用いた脂質エンベロープを用いたMENDを作製し、機能評価を行った結果、肝臓において一週間以上もの間遺伝子発現が持続した。本結果は、多くが慢性の疾患である肝疾患の治療において本MENDが非常に有用であることを示唆している。本MENDを臨床応用するためには、2つの点の改良が必要である。1つは、遺伝子発現活性の絶対値を向上させ、治療遺伝子を搭載した際に、より強い薬理効果を得られるようにすることである。2つ目は、ヒト肝臓にナノ粒子が到達可能となるように、粒子径を100nm以下に制御することである。現在のMENDは、DNAとポリカチオンを凝縮化させたコア(100nm程度)を脂質エンベロープで封入した構造を有しており、MENDの粒子径は須らく100nmを超えることとなる。そこで本年度は、ポリカチオンを用いずにMENDを調製する方法の検討を行った。その結果、塩を用いることによりポリカチオンを用いずにDNAをMENDに封入することに成功し、粒子径80nm程度のヒトに応用可能な粒子の調製に成功した。また、細胞内環境応答性物質の搭載量を増加させると、粒子径の増大が起きたものの、遺伝子発現活性が従来のMENDよりも10倍程度高いものが得られた。ヒトにおいて高い薬理効果を得るため、100nm以下の粒子径と高い活性を兼ね備えたキャリアの作製が今後の課題となると考えられる。(抄録なし)本研究では、細胞内動態をコントロールすることによりin vivoで治療効果が得られるキャリアの構築を目指している。良好な細胞内動態を得るためには、遺伝子キャリアが細胞に取り込まれたのちに遺伝子発現に至るまでの障壁となるエンドソーム脱出、核移行過程を改善する必要がある。そこで、これらそれぞれの段階を突破するために特化した2種類の異なる脂質膜でコーティングされた遺伝子キャリアであるdual-coated MENDの作製を目指している。本年度の計画では、dual-coated MENDの外側膜の最適化と、作製したキャリアの2種の脂質膜の分離の確認を行う予定であった。dual-coated MENDの外側膜として、体内で生体分子と相互作用しにくい中性電荷の脂質様物質を用いた。その結果、遺伝子発現活性のピーク値は従来のカチオン性脂質に匹敵する値となった。さらに予想外なことに、従来の人工遺伝子キャリアでは遺伝子発現活性が持続しないことが問題であったが、本中性脂質様物質を用いたキャリアでは、1週間以上も遺伝子発現が持続した。本結果は、多くが慢性の疾患である肝疾患の治療において本キャリアが非常に有用であることを示唆しており、今後も検討を続け、現在論文化を進めている。2種の脂質膜の分離の確認は今年度の予定に含めていたが、現在まだ行えていない。この成否には脂質の種類が非常に影響すると考えられるため、外側膜の最適組成が決定した後に検討する予定である。昨年度において、中性電荷を有する脂質様物質を用いた脂質エンベロープを用いたMENDを作製し、機能評価を行った結果、予想外なことに肝臓において一週間以上もの間遺伝子発現がピーク値で持続し、二週間後まで検出された。本年度は、遺伝子発現の持続に関わるメカニズムの検討と、血中における中性・カチオン性MENDの動態の評価を行った。その結果、遺伝子発現の持続には、表面電荷が中性であることと共に、導入遺伝子配列にCpG配列を含まないことが必須であることが明らかとなった。さらに、カチオン性MEND、またCpG配列をもつDNAを封入した中性MENDでは、それぞれ特徴的なサイトカイン産生がみられたため、従来型MENDにおいてサイトカインが遺伝子発現の持続を妨げていた可能性が示唆された。また、遺伝子発現の持続性と、肝臓内の導入遺伝子量の推移に相関はみられなかったため、遺伝子発現が持続しない原因は導入遺伝子の消失ではなく、サイレンシングが起こっているためであることが示唆された。さらに、中性MENDとカチオン性MENDの血中における動態を比較した。カチオン性MENDは血中で凝集し、血管内で滞っている様子が観察されたのに対し、中性MENDは凝集が観察されず、血中をスムーズに流れていた。これらの内容について論文執筆を行った。(平成25年度初めに投稿済)本研究では、細胞内動態をコントロールすることによりin vivo肝臓で治療効果が得られる遺伝子キャリアの構築を目指し、本研究室で開発されている遺伝子キャリアであるMENDの改良を行っている。

本結果は、多くが慢性の疾患である肝疾患の治療において本MENDが非常に有用であることを示唆している。本MENDを臨床応用するためには、2つの点の改良が必要である。1つは、遺伝子発現活性の絶対値を向上させ、治療遺伝子を搭載した際に、より強い薬理効果を得られるようにすることである。2つ目は、ヒト肝臓にナノ粒子が到達可能となるように、粒子径を100nm以下に制御することである。現在のMENDは、DNAとポリカチオンを凝縮化させたコア(100nm程度)を脂質エンベロープで封入した構造を有しており、MENDの粒子径は須らく100nmを超えることとなる。そこで本年度は、ポリカチオンを用いずにMENDを調製する方法の検討を行った。その結果、塩を用いることによりポリカチオンを用いずにDNAをMENDに封入することに成功し、粒子径80nm程度のヒトに応用可能な粒子の調製に成功した。また、細胞内環境応答性物質の搭載量を増加させると、粒子径の増大が起きたものの、遺伝子発現活性が従来のMENDよりも10倍程度高いものが得られた。ヒトにおいて高い薬理効果を得るため、100nm以下の粒子径と高い活性を兼ね備えたキャリアの作製が今後の課題となると考えられる。当初の計画では、外側脂質膜組成の決定、キャリアの二重膜構造の確認までを本年度に行う予定であったが、外側脂質膜組成がそれ自体有用であることが示唆されたため、そちらを優先して論文化を目指している。よって、当初の計画をポジティブな意味で変更したと考えているのでおおむね順調に進展していると考えている。本年度は、持続性を有する遺伝子キャリアについて、持続性をもたらす要因やメカニズムの検討を行い、論文投稿を行うことを目的としていた。その結果、遺伝子発現の持続に必要な遺伝子キャリアの構成要素が明らかとなり、関与していると思われるメカニズムについての情報も得られた。これらの内容について現在までに論文投稿を終えることができたため、おおむね順調であると考えている。外側膜の脂質組成を決定した後、二重構造のキャリアの作製と構造の確認に移る。二重膜キャリアの作製の際に問題となりうるのが、内側膜組成である。これに求められるのは、調製段階で外側膜と融合を起こさないこと、また、細胞質内での適度な安定性である。ことに後者は核移行の成否を決定する重要なパラメータであり、きわめて遺伝子発現活性との相関が高いと考えられる。これについては細胞系を用いて検討を行い、最も活性が高かったものをin vivoに適用する。当初、二種の異なる組成の脂質膜で封入された多重構造のMEND(dual-coated MEND)の作製方法の検討を行う予定であったが、その過程で見出された脂質組成を用いた中性MENDが、予想外にも持続的な遺伝子発現をもたらすことが明らかとなった。