hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
健康行動理論に基づく風邪症状患者面談アルゴリズムの作成と有効性の検証

1薬局において薬剤師が風邪様症状の来局者に対して活用する面談アルゴリズムを実装したタブレット端末を「面談ツール」として開発した。また、研究協力薬局において、薬剤師が当該ツールを用いて接客した事例をデータとして蓄積し、来客者の予後や薬剤師の接客に対する満足度を含めて対応の妥当性を評価した。さらに、セルフメディケーション支援に対する薬剤師の意識・知識・自信の変化について精査した。これらの結果は学会にて発表し、鋭意論文投稿・執筆を進めている。2実践的な研修プログラムを作成した。現在、セルフメディケーション支援のための薬剤師向け生涯教育教材としてe-learningのコンテンツの開発を進めている。本研究の全体構想は、薬局等での風邪症状患者への対応アルゴリズムおよびその開発媒体を用いた研修プログラムを開発し、それらの有効性について検討することである。そこで、平成27年度は、薬剤師、登録販売者を対象に調査を実施した。調剤を主とする薬局薬剤師を対象とした調査と、ドラッグストアに勤務する薬剤師及び登録販売者を対象にした調査を各1回実施した。主な調査項目は、回答者属性、風邪様症状で相談を受ける患者の人数や様相、相談対応の概要、受診勧奨の経験有無と具体的な事例、セルフメディケーションの推進に係る課題と具体的方策とした。薬局薬剤師300名(保険薬局:80.7%、ドラッグストア(調剤併設):19.3%、回答者の58%は管理薬剤師)を対象とした調査では、要指導医薬品・一般用医薬品販売の経験年数は平均10.8年、月間約20名の相談を受け、1名あたり約6分で対応し、87.7%が受診勧奨の経験を有していた。受診勧奨事例には、脳梗塞の初期症状、マイコプラズマ肺炎、誤嚥性肺炎、肺気腫、COPD、結核、気管支炎、副鼻腔炎、インフルエンザなどの症例が含まれていた。相談対応時、症状や服用中の薬を常に確認している割合は高かったが、既往歴やアレルギー等の体質、年齢などの確認割合は低かった。説明項目では、用法・用量を常に説明している割合は高い一方、副作用の初期症状、何か発生した場合の連絡先、使用上の注意、症状が改善しない場合の対処方法の説明割合は相対的に低い結果であった。セルフメディケーション推進のための課題として、薬剤師等の知識や対応能力の向上、国民への啓発、医薬品購入にかかる家計負担への軽減措置、相談対応の実践に役立つツール、研修プログラムが多く挙げられたことから、次年度以降のツール・研修プログラムの開発の意義・必要性を確認できた。研究計画に沿って、すでにWeb調査を実施し、薬剤師:約350名、登録販売者:約50名から回答を得ており、鋭意解析を進めている。得られた知見は関連学会において発表すべく準備を進めている。また、平成28年度からパイロット運用を予定している風邪症状面談アルゴリズムを実装したツールの開発にも着手している。平成28年度は、「研究の目的」および「研究実施計画」に沿って下記の3点を実施した。1.風邪症状面談アルゴリズムの作成:これまで使用してきた、紙媒体での風邪様症状の生活者に対する面談アルゴリズムの見直しを行った。これは、呼吸器専門医監修の下、「面談ツール」として作成したもので、薬局やドラッグストアで薬剤師等が風邪様症状でOTC薬を求めにきた生活者といっしょに症状確認を行うと同時に対応記録も併せて効率的に行うためのものである。本研究では、これを基に危険な疾病が疑われる場合には受診勧奨で適切な情報提供の補助機能を付加したタブレット端末媒体を作成した。2.薬剤師・登録販売者向け研修プログラムの作成:タブレット端末を用いた面談アルゴリズムの開発に合わせ、研修プログラムを作成した。達成目標は、1「OTC薬を販売する上で、留意すべき点を知る」、2「重大な疾患の兆候を識別できる臨床知識を身につける」、3「患者から必要な収集を収集し、情報を適切に伝えることができるようになる」ことである。プログラム作成に際しては、認知行動理論・動機づけ面接などの健康行動理論に基づく、患者支援のコミュニケーションスキルと、OTC薬選択における、リスクマネジメントのチェックリストを作成する。また、実際に薬局等ですぐに患者に使用できるようなケーススタディやロールプレイを取り入れたワークショップ形式の研修プログラムにした。研修は、昨年全国3ヶ所、大学1ヶ所(申請者の大学)ですでに実施した1時間程度のプログラムを拡大し、10名程度の薬剤師を対象として3時間実施した。3.研究協力薬局におけるタブレット端末を用いた面談の実施:関西地域に所在する協力薬局の薬剤師9名及び登録販売者11名がタブレット端末を用いた面談を実施した。平成28年度に計画していた、1)タブレット端末を活用した「風邪症状面談アルゴリズム」のプログラム作成、2)薬剤師・登録販売者向け研修プログラムの作成と研修会の実施、3)タブレット端末を用いた面談の実施により、すでに事例(78名分)が登録済みである。平成29年度は、まず第一に、タブレット端末を用いた面談アルゴリズムの運用と最終効果の検証を行った。面談支援ツールを用いた接客の実施前後で、薬剤師・登録販売者(以下'専門家')の、風邪様症状の生活者支援に関する意識・知識・自信の変化を検証した。その結果、面談支援ツールの使用により、症状のスクリーニングに必要な知識の定着と「OTC薬と処方薬の相互作用をチェックする自信」、「咳・痰の症状に対するスクリーニングの自信」、「インフルエンザ、かぜ、花粉症を鑑別する自信」の向上が示唆された。また、接客データを用いた「症状のチャート化」により、風邪様症状の分類と勧奨したOTC薬成分を対応させ、その適切性の検証を試みた結果、インフルエンザ及び副鼻腔炎において類型化の可能性が示唆された。

勧奨したOTC薬は平均3.5日使用し、3.9日で回復していたことから、症状とOTC薬成分の対応も概ね適切であった。さらに、生活者の「専門家への相談意向」への影響要因を探ったところ、「説明への満足度」と「接客への満足度」が抽出された。ツールを用いた面談中に、そのOTC薬を勧める(受診勧奨する)理由や役立つ情報を添えることが相談意向に影響することが確認できた。第二に、上記成果を踏まえ、薬剤師及び登録販売者を対象としたセルフメディケーションに関する生涯教育用のe-ラーニングプログラムの開発に着手した。生涯教育用コンテンツには、大きく1「OTC薬を販売する上で、留意すべき点を知る」、2「重大な疾患の兆候を識別できる臨床知識を身につける」、3「患者から必要な収集を収集し、情報を適切に伝えることができるようになる」ことを目標に、薬局等で実践可能なケーススタディを取り入れた。今後は分析結果の論文化を鋭意進めると共に、e-ラーニングコンテンツをブラッシュアップし、生涯学習プログラムに組み込むべく準備を進める予定である。1薬局において薬剤師が風邪様症状の来局者に対して活用する面談アルゴリズムを実装したタブレット端末を「面談ツール」として開発した。また、研究協力薬局において、薬剤師が当該ツールを用いて接客した事例をデータとして蓄積し、来客者の予後や薬剤師の接客に対する満足度を含めて対応の妥当性を評価した。さらに、セルフメディケーション支援に対する薬剤師の意識・知識・自信の変化について精査した。これらの結果は学会にて発表し、鋭意論文投稿・執筆を進めている。2実践的な研修プログラムを作成した。現在、セルフメディケーション支援のための薬剤師向け生涯教育教材としてe-learningのコンテンツの開発を進めている。現在のところ、当初の予定通りに推移している。1年目に実施した調査について現在データ解析を進めており、薬局、ドラッグストア間において対応状況、セルフメディケーション推進に向けた課題に若干差がある傾向が見られる項目があるため、その原因や背景についても精査する予定である。また、現在進めている面談アルゴリズム及びツールの開発については、内容がほぼ固まった段階で、研究倫理審査にかかる申請書類を作成し、承認取得に目指す予定である。現在得られているデータの内容を精査し、適宜面談アルゴリズムの改善について検討を行う。また、生活者からのデータ収集は、現在返信用ハガキを利用しているが、本人による電子媒体による入力が可能かどうかを検討する。さらに、事例登録数増加に向けて、協力薬局を募り継続的に面談を実施する。社会薬学調査実施日が若干遅れたため、経費の支払い執行時期が次年度にずれ込んだため、研究費を繰越した。本年度の研究結果により、追加のシステム開発の必要性が生じ、最終年度に費用が必要と見込まれるため。平成28年度に27年度に実施した調査経費の拠出、面談ツール開発にかかる経費の拠出を予定している。面談システムの追加開発
イソプレノイド生合成におけるプレニル鎖延長酵素の触媒機能発現機構

シス型プレニル鎖延長酵素として初めて研究代表者らがクローン化した、Micrococcusluteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素のX線結晶構造解析を進め、2.2Åの分解能でホモ二量体構造の立体構造の解明に成功した。この酵素のコア構造は6本のβ-シートにより形成される、全く新しい折り畳み構造であった。興味深いことに、イソプレノイド生合成関連の多数の酵素の立体構造がα-ヘリックスのみによって構成される"Isprenoid Synthase Fold"と提唱されている共通の立体構造を持っているのに対し、このウンデカプレニル二リン酸合成酵素はβ-構造の多い、新規な折り畳み構造であることがわかった。部位特異的変異導入実験により、シス型プレニル鎖延長酵素の5つの保存領域中にある多くの保存残基が基質の結合や触媒機能発現に重要であることが明らかになった他、結晶構造解析でリン酸基の結合モチーフとして示唆されたP-ループ構造がアリル性基質FPPの二リン酸部の結合に関与しており、特に33位のアルギニンが直接結合していることが判明した。また、シス型鎖延長酵素反応が1回起こって生成されるシス-ゲラニルゲラニル二リン酸(Z-GGPP)は各変異導入酵素に対し、FPPと全く異なるKm値を与えることが明確になり、反応中間体となるZ-GGPPはP-ループとは結合せず、全く別の結合部位が存在する可能性を明確にした。ヒトのデヒドロドリキル二リン酸合成酵素(hds)の他、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)のゴム合成酵素(hrt2)およびゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素のcDNAクローニング、大腸菌細胞内での発現系構築に成功し、ヒトの糖タンパク質生合成の糖キャリアリピドや天然ゴム生合成に関与する重要な酵素の構造と機能の相関を追究する基盤を確立した。イソプレノイド化合物の生合成において最も基本的な過程である、C_5単位のプレニル鎖延長反応を触媒する酵素「プレニルトランスフェラーゼ」の内、シス型プレニル鎖延長酵素として初めて研究代表者らがクローン化した、Micrococcusluteus B-P26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)のX線構造解析を進め、2.2Åの分解能でホモ二量体構造の立体構造の解明に成功した。このUPSのコア構造は6本のβ-シートにより形成される、全く新しい折り畳み構造であった。興味深いことに、トランス型プレニル鎖延長酵素のファルネシル二リン酸合成酵素をはじめとする、イソプレノイド生合成関連の酵素の立体構造がα-ヘリックスのみによって構成される、"Isoprenoid Synthase Fold"と提唱されている共通の立体構造を持っているのに対し、このUPSはβ-構造の多い、新規な折り畳み構造であることが分かった。部位特異的変異導入実験により、29D,33R,80R,77N,78Wなどの保存残基がアリル性基質の結合に、さらに197R,203R,216E,73F,74Sがホモアリル性基質IPPの結合に関与している保存性残基として同定され、これらの残基はいずれも触媒活性発現にも非常に重要であることが明らかとなった。

一方、トランス型プレニル鎖延長酵素の中で特異なグループである、中鎖プレニル鎖延長酵素(ヘキサプレニル二リン酸合成酵素およびヘプタプレニル二リン酸合成酵素)の解離性ヘテロサプユニットの各々について、反応生成物のプレニル鎖長の決定に関与するアミノ酸残基を追究した結果、大きいサブユニット側で反応生成物の鎖長決定に重要とされるDDXXDモチーフの上流のAlaやSerの他に、小サブユニット側に保存されている領域についても基質の結合や反応生成物のプレニル鎖長決定に関与する部位があることが判明した。シス型プレニル鎖延長酵素として始めて研究代表者らがクローン化した、Micrococcus Iuteus B-P26のウエンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)のX線構造解析を進め、2.2Aの分解能でホモ二量体構造の立体構造の解明に成功した。このUPSのコア構造は6本のβ-シートにより形成される、全く新しい折り畳み構造であった。興味深いことに、トランス型プレニル鎖延長の酵素のファルネシル二リン酸(FPP)合成酵素をはじめとする、イソプレノイド生合成関連の酵素の立体構造がα-ヘリックスのみによって構成される"IsoprenoideSynthase Fold"と提唱されている共通の立体構造を持っているのに対し、このUPSはβ-構造の多い、新規な折り畳み構造であることが分かった。部位特異的変位導入実験により、29D,33R,80R,77N,78W,などの保存残基がアリル性基質の結合に重要であることが明らかになった他、結晶構造解析でリン酸基の結合モチーフとして示唆されたP-ル-プ構造がアリル性基質のFPPの二リン酸部の結合に関与しており、特に33位のアルギニンが直接に結合していることが判明した。さらに42位のアルギニンも結合に重要であり、他の生物由来の酵素で32位のグリシンと相補的な関係にあることも明らかになった。シス型鎖延長酵素反応が1回起こって生成されるシスーゲラニルゲラニル二リン酸(Z-GGPP)は各変位導入酵素に対し、FPPと全く異なるK_m値を与えることが明確になり、反応中間体となるZ-GGPPはP-ループとは結合せず、全く別の結合部位が存在する可能性を明らかにした。さらに、197R,203R,216E,73F,74Sがホモアリル性基質IPPの結合に関与している保存性残基として同定され、これらの残基はいずれも触媒活性発現にも非常に重要であることが明らかとなった。シス型プレニル鎖延長酵素として初めて研究代表者らがクローン化した、Micrococcusluteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)の部位特異的変異導入実験により、結晶構造解析でリン酸基の結合モチーフとして示唆されたP-ループ構造がアリル性基質FPPの二リン酸部の結合に関与しており、特に33位のアルギニンが直接FPPに結合していることが判明した。シス型鎖延長酵素反応が1回起こって生成されるシス-ゲラニルゲラニル二リン酸(Z-GGPP)は各変異導入酵素に対し、FPPと全く異なるK_m値を与えることが明らかになり、反応中間体となるZ-GGPPはP-ループとは結合せず、全く別の結合部位が存在する可能性を明確にした。ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の効果的阻害剤探索を抗菌活性を示す各種の生薬を対象にして進めたところ、リノール酸が阻害作用を示すことが明らかとなった。さらにリノール酸の類似化合物を各種合成し、この酵素の阻害剤の化学構造と阻害作用の関係を追究し、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に有効な阻害剤の構造を明らかにした。
低毒性であるピロリ菌リポ多糖の炎症反応惹起機構

著しく低いエンドトキシン活性しか示さないHelicobacter pyloriのリポ多糖LPS)がToll-like receptor 2(TLR2)からシグナルを入れ、TLR4発現の低い胃粘膜上皮細胞株のTLR4発現を上昇させた。H.pylori LPSがTLR4発現誘導により胃の上皮細胞の他の細菌由来LPSに対する感受性を増強させること、さらに細胞の増殖を亢進させることで、発癌をもたらす病原因子として関与していることが示唆された。ピロリ菌のリポ多糖(LPS)は、大腸菌などの典型的なLPSに比較して著しく低い内毒素活性しか示さない。一方、私達はピロリ菌LPSが胃上皮細胞株に対してToll-like receptor2(TLR2)を介してシグナルを入れ、TLR4の発現を誘導することを見出した。本年度の研究成果として、TLR4発現誘導機構の解析結果を報告する。胃癌由来細胞株MKN28とMKN45はTLR4の発現が低いために、大腸菌LPSに対する応答性が低い。細胞をピロリ菌LPSで処理すると、TLR4の発現上昇と大腸菌LPSによるinterleukin-8の産生誘導の増強が認められた。この活性は胃癌由来株の方が、他の疾患由来株に比較して有意に強かった。TLR4プロモーターのレポーター遺伝子解析では、転写因子NF-Yの結合配列に変異を入れた時のみ、ピロリ菌LPSによるプロモーター活性の上昇が認められなかった。NF-Yの活性化がピロリ菌LPS処理によって認められた。MEK阻害剤もしくはERK阻害剤の添加により、NF-Yの活性化とTLR4の発現誘導が有意に抑制された。TLR2のドミナントネガティヴ変異体を細胞に発現させておくとTLR4の発現誘導が抑制された。ピロリ菌LPS処理により胃癌由来細胞株の増殖速度が亢進した。この増殖充進はMEK阻害剤,ERK阻害剤により有意に抑制された。ピロリ菌LPSはTLR2およびMEK1/2-ERK1/2のMAPキナーゼ系を介してNF-Yを活性化し、TLR4の転写活性化を起こすと推定した。ピロリ菌LPSは単独では強い炎症反応を惹起しないが、LPS低応答性の細胞のLPS感受性を上昇させることが示唆された。更に、MEK1/2-ERK1/2系活性化が細胞増殖の促進に関与することが示唆された。胃癌由来株のLPSが、MEK1/2-ERK1/2のMAPキナーゼ系をより強く活性化することで、上皮細胞の増殖を促進し、さらにTLR4の発現増強により強い炎症反応を起こす素地を胃内で形成することが推察され、LPSが胃癌発症のひとつの因子になると考えられた。ヒト胃癌由来細胞株MKN28とMKN45はTLR4の発現が低いために、大腸菌LPSに対する応答性が低い。細胞をH.pylori LPSで処理すると、TLR4の発現上昇と大腸菌LPSによるinterleukin-8の産生誘導の増強が認められた。TLR4プロモーターのレポーター遺伝子解析では、転写因子NF-Yの結合配列に変異を入れた時のみ、H.pylori LPSによるプロモーター活性の上昇が認められなかった。NF-Yの活性化がH.pylori LPS処理によって認められた。MEK阻害剤(PD98059)もしくはERK阻害剤(FR180204)の添加により、NF-Yの活性化とTLR4の発現誘導が有意に抑制された。一方、SB202190(p38阻害剤)添加では有意な変化を認めなかった。TLR2の発現をsiRNAで抑制させておくとTLR4の発現誘導が抑制された。H.pylori LPS処理により胃癌由来細胞株の増殖速度が亢進した。この増殖亢進はMEK阻害剤,ERK阻害剤により有意に抑制された。胃癌由来株のLPSが、他の疾患由来株に比較して、MEK1/2-ERK1/2のMAPキナーゼ系をより強く活性化することで、上皮細胞の増殖を促進し、さらにTLR4の発現増強により強い炎症反応を起こす素地を胃内で形成することが推察され、LPSがH.pyloriによる胃癌発症のひとつの因子であることが示唆された。私たちはH.pyloriリポ多糖(LPS)がエピトープの性状から高抗原性と低抗原性の2種に分類できることを報告してきた。低抗原性LPS保有株は胃癌から分離された菌株に頻度多く認められる。

Toll-like receptor 4(TLR4)の発現が低く、大腸菌などの典型的なLPSに対する反応性の低い上皮細胞株に対して、H.pylori LPSがTLR4発現上昇を起こし、大腸菌等の典型的なLPSに対する反応性を増強することを見出したが、その増強活性は低抗原性LPS保有株の方が有意に高い。今回、H.pylori LPSのヒトに対してドミナントに働く2種のエピトープに関与する糖残基を明らかにするため、LPSに対するヒト血清中抗体の結合に対する単糖および単糖のメチルグルコシドの阻害活性を検討した。さらにLPSに各種グリコシダーゼ処理を行ったときの抗体の反応性の変化も検討した。その結果、高抗原性エピトープにβ結合のN-アセチル-D-グルコサミン残基が関与することが示唆された。この糖残基が欠失することで、露出したβ-D-ガラクトース残基が低抗原性エピトープに関与していることが示唆された。LPSに対して結合する宿主のレクチンをスクリーニングし、surfactant protein D (SP-D)が低抗原性LPSに有意に強く結合することを見出した。この結合は、メチル-β-D-ガラクトピラノシドによって最も強く阻害された。H.pylori LPS処理による胃癌上皮細胞における大腸菌LPS誘導性IL-8の産生増強は、SP-D添加によってさらに増強された。低抗原性エピトープに対してSP-Dが結合し、H.pylori LPSの生物活性を増強することが示唆された。
記憶喪失性貝毒生産珪藻の毒生産と光合成活性

本申請研究は、Pseud-nitzschia multiseriesの単種、無菌培養問でのgrowthの差から出発して、定常期以降のエネルギーが枯渇した時期に同種がheteritrophicなエネルギー獲得を行う際にドウモイ酸生産が起こる可能性を実証すべく、まず本種のドウモイ酸生産が光合成活性に依存しないことの証明を試みた。その結果、1)単種培養においては溶存鉄の枯渇に呼応するようにドウモイ酸が急激に増加した。また定常期に達し鉄が枯渇した培養に鉄-EDTAを添加するとドウモイ酸生産は抑制された。無菌培養の場合は溶存鉄が枯渇してもごく微量のドウモイ酸しか生産されなかった。また溶存鉄枯渇後の藻体の鉄含量は単種培養の方が増加し続けたが無菌培養では増加しなかった。これらはドウモイ酸の生産と鉄の枯渇との密接な関係およびその際の細菌の重要な働きを示唆する。2)同種の無菌株を、分画分子量約12,000の透析膜で細菌と隔てて培養した場合、ドウモイ酸の生産は認められなかったが、それより分画分子量の遙かに大きな0.2...mのメンブレンフィルターで隔てた場合にはドウモイ酸の生産が見られた。3)本種の単種培養を遮光するとドウモイ酸生産が停滞したが、遮光中の培養にATP、NADP、NADPHなどをそれぞれ添加してもドウモイ酸生産の上昇は認められず、本種のドウモイ酸生産は光合成依存的な可能性が示唆された。以上より、ドウモイ酸隼産は珪藻の生命維持に不可欠な鉄の取り込みに関連して起こるが、その過程は単純ではなくある程度分子量の大きいシデロフォアが細菌と珪藻の双方の関わりで生産され、鉄とともに珪藻に取り込まれ分解される過程で生成してくるという仮説を再構築するに至った。Pseudo-nitzschia multiseriesのドウモイ酸(DA)生産機構を解明する一環として、本種のバッチ培養におけるドウモイ酸生産と鉄の関連を調べた。単種培養において本種はまずSi濃度の減少によって定常期に達し、その後細胞は漸減した。DAはその間徐々に増加するが、特に培地中の可溶鉄濃度が激減したあとに急激に増加することが観察され、培地の鉄の枯渇に呼応してDAが生産されることが示唆された。また同株の単種培養の定常期初期にEDTA-鉄を添加した場合は添加量が多いほどDA量が少なかった。培養最終日については細胞のChl. a含量および光合成活性についても調べたところ、いずれもDA含量の高い方が高い結果が得られた。またP. multiseriesの無菌培養に添加した場合そのDA生産能を高度に上昇させることを確認しておいた細菌を用いて培養実験を行い鉄の取り込みを調べたが、明確な結果は得られなかった。そこでP. multiseriesの無菌培養を作製し、単種培養と比較しながら培養を行った。両培養とも同様な細胞密度の推移を示したが、0.8μmのフィルター捕集画分(藻体および一部の細菌画分)の鉄含量は珪藻の増殖とともに増加し、定常期に入って停滞した。無菌培養はほぼそのままのレベルで推移したが、単種(有菌)培養の方はその後も上昇を続けた。鉄を多く消費するのは珪藻自身か細菌かについては不明であるが、単種培養の方が無菌培養より鉄の消費が大きいことが示唆された。培地中の可溶鉄の推移については目下分析中であるが、単種培養の方が低く推移することが予想される。また培養期間中のChl.a含量は単種培養の方が高く推移した。

この結果から、単種培養中の細菌がDA生産上昇を促進する理由として、細菌自身がある程度鉄を消費し鉄欠乏状態を作り出す可能性とともに、細菌が珪藻細胞のChl.a合成を促し光合成活性を活発化させることにより、珪藻細胞自身も鉄をより消費し、鉄欠乏状態が作られる可能性が示唆された。Pseudo-nitzschia multiseriesのドウモイ酸(DA)生産と光合成の関係を追求する過程で、培養液中の溶存鉄の枯渇とDA生産が密接に関連していることを昨年見いだした。また無菌培養細胞を鉄欠乏培地に移して培養を続けるとDA生産がおこる結果も得た。本年度行った再現実験では、鉄欠乏培地に移した無菌培養細胞が急激なDA生産を行うことはなく、DAの生産が見られたのは全て細菌が混入した場合であった。また鉄欠乏培地中で約3週間培養した同無菌培養に、これまでDA生産上昇能が確認されている細菌を添加したところ、Chl.aの増加と急激なDA生産が確認され、DA生産には鉄欠乏に加えて細菌の存在が重要なことが確認された。次に透析膜やmembrane filterを用いて細菌の関与の仕方を追求したところ、細菌と本藻無菌培養を分画分子量12,000の透析膜で隔てた場合はDA生産は見られなかったが、細菌を通さず分画分子量は透析膜よりずっと大きい孔径0.2μmのfilterでろ過したろ液中では無菌細胞でもDA生産上昇が見られた。また本藻のnon-axenic培養の途中で遮光を行ったところ、光照射下では見られるDA生産が見られなかった。また遮光中の培養にATP、NADP、NADPH、glucoseをそれぞれ添加した場合でもDA生産は認められなかった。今回は機器の精度の関係で光合成活性との関係がはっきり見られないなど、詳細や結果の再現性の確認が必要であるが、以上の結果が正しいとすると本種のDA生産は光合成に依存している可能性が強く、以下の仮説を導くことが可能である。すなわち培地中の溶存鉄の枯渇をきっかけに細菌が関与してDA構造を有するある程度高分子の化合物が作られ、それが鉄をキレートして藻体に取り込まれ鉄を分解放出する過程でDAが析出する。分解反応には何らかの形で光合成が関与し遮光下ではDAは生産されない。
地下空間火災のシミュレーションに関する研究

本年度に主に実施した項目と研究成果を要約すれば以下のようである。1.ダクト状空間におけるPMMA丸棒の燃焼特性地下空間火災のシミュレーションのための基礎資料の一環として、地下の共同溝などにおける、ケーブル火災の特性を調べるために矩形ダクト内でPMMA(合成樹脂)丸棒を燃焼させ、その燃え広がり速度や火災、火災ガスなどの様子を観測した。この結果、1)水平ダクト中で無風状態では、直径が10mmの丸棒の燃焼は継続できない。2)風速が0.5m/sになると激しく燃焼するようになる。3)ダクトを傾斜させると丸棒が天盤側にある場合には、その燃え広がり速度は増加する傾向が認められるが、その他の場合は余り変化しない。2.レーザーライトシートを用いた流れのシミュレーション本年度は支保がある坑道模型を作成し流れの解析を行った。この結果、壁面での流れは異なるものの、主流は余り変化しないことがわかった。また、坑道に機械などの障害物がある場合の流れについても解析を行った3.火災現象シミュレーションプログラムの開発数値シミュレーションの場合、プログラム作成そのものの他に、モデル作成時に注意すべき点があり、モデルの境界と通気の吹き出し口の距離があまり小さいと正しい結果が得られず、また、グリッドが大きすぎると精度がかなり悪くなることがわかった。1.模型燃焼ダクトによる火災実験本研究の基礎となる従来から行ってきた燃焼実験結果の再確認と留意事項の抽出検討のため、ほぼ同じ手法を用いて模型燃焼ダクト内で燃料材焼として紙を燃焼させた。紙面の都合上この記述は省略するが、ほぼ既燃焼実験と同様な結果が得られた(平成3年度科研費報告書;内野健一・試験B(2)02555133)。2.地下空間(限られた空間)における火災現象のシミュレーションプログラムの開発乱流や浮力を考慮できる非定常3次元流体解析用プログラムを開発した。このプログラムによる限られた空間内の空気の流れの数値解析例を、抗道堀進先の風管通気をモデルとして示すと、(1)風管が抗道の天井に密着している場合、吹出す噴流は典型的な壁面噴流となり、切羽面からの戻りの流れの影響を受けにくく、両者の流れの間にかなり明確な境界が認められる。(2)抗道の断面形状の違いによよりり風の流速分布に顕著な違いが認められる。(3)抗道の幾何学的条件が同一であれば、吹出す噴流の流速によらず流れのベクトルの方向は等しい。レーザーライトシートを用いた流れの可視化実験アルゴンイオンレーザー流速計と堀進抗道を模した水槽を用いて流れの可視化実験を行い、上記2.のシミュレーション結果との比較検討を行った。これによれば、ほぼ同じ流れの現象を確認することができ、開発したプログラムの妥当性を確認できたが、風管吹き出し口付近や風管部分の戻りの流れについては、更に複雑な流れが生じていることが解った。来年度はこの点についてのプログラムの修正改良を行う予定である。3)ダクトを傾斜させると丸棒が天盤側にある場合には、この燃え広がり速度は増加する傾向が認められるが、その他の場合は余り変化しない。また、坑道に機械などの障害物がある場合の流れについても解析を行った。

3.火災現象シミュレーションプログラムの開発数値シミュレーションの場合、プログラム作成そのものの他に、モデル作成時に注意すべき点があり、モデルの境界と通気の吹き出し口の距離があまり小さいと正しい結果が得られず、また、グリッドが大きすぎると精度がかなり悪くなることがわかった。
型付き項書き換え系の停止性自動証明とそのプログラム検証への応用

書き換え理論において近年注目されている自動証明向き停止性判定法として,依存対法という手法が知られている。この停止性証明法は,十分広いクラスの書き換え系に対して,効率的で強力な自動判定のできる手法であるが,高階関数のあるプログラムには使えない,という問題点があった。高階関数とは,データとして関数を受け渡しできる関数であり,プログラムの汎用性を高めるための,関数型言語の本質的な機能の1つである。そこで、より広範囲のプログラムに対して,書き換えによる停止性自動証明法が使えるよう,高階性を考慮して依存対法の理論を拡張し,その成果を,書き換えに関する国際会議であるRTA2005で発表した。具体的には,まず,高階関数が許される場合の極小な無限書き換え系列の基本性質を詳細に解析し,依存対の定義を高階性を考慮したものに拡張した。これにより,関数型の項が許される場合に,プログラムの停止性判定問題が関数定義間の依存関係を考慮した順序制約の解消問題に変換できるようになった。停止性に関連する項書き換えの基礎理論についても考察を深めた。まず,木準同型写像による書き換え系の変換によって,停止性を保証する手法を新たに提示した。また,自動証明向きの停止性証明法の基礎付けを与える木の埋め込み定理を,型付き項へ適用できるように拡張した。さらに,書き換えによる到達可能性の決定可能性と決定不能性の問題についても,従来研究が十分でなかった準構成子項書き換え系のクラスに対する新たな結果を得た。この研究結果は,停止性だけでなく,単一化問題などへの適用が期待できる。到達可能性に関する研究成果は,学術誌Information Processing Lettersに公表予定である。関数型のプログラム言語を対象とし,等式により記述されたプログラムの性質の正当性を自動証明する方法を研究した.関数型プログラムを扱う自動証明に適した計算の理論としては,単純型付き項書換え系を採用した.プログラムを,型付き項上の等式で記述された関数定義の集合としてとらえ,その実行を,定義に基づく式の書き換えととらえる.この定式化のもとでは,プログラムの性質は,関数定義の等式集合を公理とした帰納的定理に相当する.そこで,まず,単純型付き項書き換え系における,帰納的定理の自動証明について研究した.関数の同等性を扱う際の帰納的定理である「高階帰納的定理」の概念を新たに導入し,帰納的定理を導くための十分条件を明らかにした.これにより,一階項書き換えの自動証明法として知られる潜在帰納法を,単純型付きの体系へと拡張できた.さらに,プログラム検証や定理自動証明で重要な役割を果たす,書き換え系の停止性の自動証明法についても研究した.一階項書き換え系の停止性自動証明法として有効であることが知られている依存対の手法を,単純型付き項書き換え系向けに拡張した.依存対や推定依存グラフなどの基本概念を拡張し,高速な判定が可能な構文的な判定条件である部分項規準が,型付きの書き換え系に適用可能であることを明らかにした.また,関数型プログラムのための停止性証明システムを試作し,その有効性を実験により確認した.書き換え理論において近年注目されている自動証明向き停止性判定法として,依存対法という手法が知られている。
3層神経回路網による連続写像の近似に関する研究

成果の1部は、すでに2編の論文にまとまり、その内の一網は1993年中に、学術誌に掲載される予定である。標準的な3層の神経回路網により、コンパクトな集合上の関係を、導関数も込めて近似することが可能であることは、最近、ホルニックなでにより証明されたが、彼らの証明は関数解析を使うもので、直ちには応用できない。それにたいして、非常に易しい別証明を発見し、その結果、その証明の手続きにしたがって神経回路網を組み上げれば自然に関数近似が実現されることになった。証明の本質的な部今は、拡張された多項式近似定理の応用である。他の一編は、1994年に掲載される。この論文においては、全空間で定義された関数の、導関数を込めての近似が可能であることを証明した。この事が証明されたのは、これが最初である。証明には、ラドン変換、ハーン・バナッハの定理、リースの表現定理を使っている。一般の場合はおける証明は、数学的であるが、特殊な場合には、構成的な証明が可能であることを示し、具体的な応用に配慮した。そのほか、非標準的な3層神経回路網による関数近似の理論も完成させ、投稿中である。この場合には、神経回路網構成に必要なユニットの数が求まった。補助金申請の際、研究目的の締めくくりとして、「問題自体を拡張して、より峠軟な応用を可能ならしめるのを当研究の目的とする」、と書いたが、この拡張と応用の二点に関しては、かなりの成果が得られたことになる。研究の方法は、多項式近似定理など上記の数学的定理を応用するもので、本質的なところで、計画通に成果をあげた。コンピュータシュレイションの進め方は、計画書と多少の違いを生じたが、マクロにみれば、基本的な考え方は計画にそぐうもので、計画は成果をあげるにの非常に有効であった。
小頭症を発症する遺伝性疾患の鑑別診断技術開発

遺伝性小頭症には、DNA損傷応答・DNA修復システム(DDR)の異常により発症しているケースが見られる。DDRの異常により発症する疾患には先天性小頭症を含み多くの種類が知られているが、それぞれの疾患に症状のオーバーラップが見られること、また個々の疾患が非常にまれであることから、鑑別診断が難しく、長期間診断不能となるケースも多い。我々は、DNA修復活性を精密に評価する技術と次世代ゲノム解析(全エキソーム解析、全ゲノム解析)を併用することで、遺伝性小頭症の鑑別診断技術の開発を目指した。小頭症は、複合要因によって発症することから、その鑑別診断には困難を伴うケースが多々ある。長期間確定診断がつかない症例や、誤診を受ける患者も少なくない。遺伝性小頭症が疑われる症例では、DNA損傷応答・DNA修復システムの異常により疾患を発症しているケースが比較的多く存在することから、これらの症例に対する正確な診断のための技術開発に取り組んだ。疾患発症の原因となった異常をきたしているDNA損傷応答・DNA修復システムが異なる場合、病状を悪化させる要因や治療方針、予後予測も大きく異なることから、疾患原因を正確に突き止めることが、患者にとって非常に重要である。研究代表者はこれまで、DNA損傷応答・DNA修復システムの異常によりゲノム不安定性を示す国内外の遺伝性疾患の診断・解析を行っており、本診断ネットワークを利用して、新たに小頭症症例の収集を実施した。これらの症例は、既存の症例と合わせて、小頭症以外の病態・症状により分類を行った。我々が解析している小頭症を示す遺伝性疾患の中で、細胞レベルで確定診断が可能な疾患の代表例として、転写と共役したヌクレオチド除去修復(TC-NER)の異常により発症するコケイン症候群があり、TC-NERの活性を簡便かつ迅速に評価するシステムを確立したことで診断を可能とした。この診断方法を基本として、簡便・迅速・正確・客観的・多検体比較可能という5つの基準をクリアするDNA二重鎖切断(DSB)修復の活性評価法の確立に取り組んだ。国内外より、遺伝性小頭症の疑いがある症例を収集し、既に確立済みのヌクレオチド除去修復(NER)活性評価法により、NER関連疾患であるかの調査を行った。NERの欠損が検出された症例は、NER関連遺伝子の野生型cDNAを組み込んだウイルスを感染させることにより、欠損したNER活性が回復するかを指標として疾患原因を特定するウイルス相補性試験を実施し、既知のNER関連遺伝子の異常による遺伝性疾患であるかの検討を行った。新たに収集した症例のおよそ半数がTC-NER欠損性のコケイン症候群であることが判明し、遺伝子変異特定までを終了した。残りのNER活性が正常であった半数の症例の疾患原因を特定するため、臨床診断に応用可能なDSB修復の活性評価法確立に取り組んだ。指標には、DSBを顕微鏡下で観察する際に頻繁に使用される、リン酸化H2AXおよび53BP1の蛍光免疫染色で検出される粒(foci)を選択した。マルチウェルプレート上で、患者由来細胞のリン酸化H2AXあるいは53BP1を蛍光免疫染色し、自動蛍光画像取得装置を使用して、画像観察とDSBの存在を示すfociの定量を自動で実施することとした。蛍光顕微鏡を使用した目視での結果と、仕様の異なる複数の自動蛍光画像取得装置とで、同様の結果となることを条件とし、検討を行った。マルチウェルプレートを使用することで、多検体比較を可能にし、自動観察と自動foci計測により、簡便性・迅速性・客観性を実現し、自動化による人為的ミスの軽減により、正確さも高まったと考えられる。本評価法を使用したところ、放射線感受性を示す症例の抽出が可能であったことから、非常に有用な評価法と考えられた。引き続き、細胞周期を加味したDSB修復活性評価法について検討を進めているところであり、本研究は順調に進展している。小頭症は様々な要因により発症するため鑑別診断には困難を伴うことが多い。遺伝性小頭症の症例には、DNA損傷応答・DNA修復システムの異常を疾患発症原因とするケースが比較的多く含まれる。そこで、これらの症例を対象として、正確な診断に役立つ技術の開発を目指した。DNA損傷応答・DNA修復システムには様々な経路があり、増悪因子の排除や予後予測には疾患原因となる破綻したDNA修復経路の特定が不可欠である。本研究では特に、DNA二重鎖切断(DSB)経路の異常を指標とした診断システムの開発を目指した。自動蛍光画像取得装置とマルチウェルプレートを用い、患者由来細胞でDNA損傷処理後のリン酸化H2AX及び53BP1の核内局在(foci形成)を計測することで、簡便・迅速・正確・客観的・多検体比較可能なシステムを構築した。本システムを用いたスクリーニングでは、放射線感受性を示す症例の抽出が可能であり、有用な評価法と考えられた。また、国内外より遺伝性の小頭症疑い症例を収集し、確立済みのヌクレオチド除去修復(NER)活性評価法及び上述のDSB修復活性評価法により調査を行った。DNA修復活性の低下が認められた症例では、関連する遺伝子の強制発現により欠損した修復活性が回復するかを指標として、疾患原因変異を持つ遺伝子を特定する相補性試験を実施した。収集症例には、NER欠損性のコケイン症候群が多数含まれており、遺伝子変異特定までを終了した。一方、DSB修復活性の低下が見られたものの疾患原因変異を持つ遺伝子が特定できない症例や、中間的なNER活性の欠損が見られる症例等が抽出された。

これらの症例については、次世代ゲノム解析(全exome解析および全ゲノム解析)により疾患原因変異の同定を試みたところ疾患原因変異の候補が得られ、一部の症例では疾患責任遺伝子変異の特定に至った。遺伝性小頭症には、DNA損傷応答・DNA修復システム(DDR)の異常により発症しているケースが見られる。DDRの異常により発症する疾患には先天性小頭症を含み多くの種類が知られているが、それぞれの疾患に症状のオーバーラップが見られること、また個々の疾患が非常にまれであることから、鑑別診断が難しく、長期間診断不能となるケースも多い。我々は、DNA修復活性を精密に評価する技術と次世代ゲノム解析(全エキソーム解析、全ゲノム解析)を併用することで、遺伝性小頭症の鑑別診断技術の開発を目指した。引き続き、国内外より、DNA損傷応答・DNA修復メカニズム異常による遺伝性小頭症症例の収集を進める。NER活性が正常であった症例および、既存の症例で疾患原因が特定されていない遺伝性小頭症疑い症例について、DSB修復活性評価を進める。DSB修復活性が欠損した症例を選出し、DSB修復活性を指標としたウイルス相補性試験を実施することで、疾患原因変異を持つ遺伝子を特定する。既知の遺伝子に異常が見られない場合には、次世代ゲノム解析(exome解析あるいは全ゲノム解析)にて疾患原因の特定を試みる。並行して、指標等を再検討し、細胞周期を考慮したDSB修復活性評価法の開発に取り組む。適切な指標に細胞周期を加味することで、DSB修復の中でも、非相同末端結合(NHEJ)と相同組替え(HR)の活性を分離して評価することが可能になると期待される。NER活性評価とDSB修復活性評価のいずれも、完全自動化には至っておらず、改善の余地が残されていることから、より一般的な手法となるよう改良を進める。人類遺伝学本研究にて確立したDSB修復活性評価法は、当初予定していたよりも比較的早い段階で診断に応用可能なレベルに達したため、既に遺伝性小頭症症例のスクリーニングを開始しており、このスクリーニングによって興味深い症例が複数抽出されている。これらの症例のうちいくつかはexome解析も実施済みであるが、現段階では有力な候補は得られておらず、より確実な遺伝子変異同定のため、全ゲノム解析を追加で実施する必要が生じた。効率的に全ゲノム解析を実施するため、複数の類似症例を収集する必要があり時間を要した。次年度、全ゲノム解析を実施し、疾患責任遺伝子変異同定を試みる。追加での小頭症症例の収集にかかる経費及び、DSB修復活性評価法によるスクリーニングに使用する消耗品や試薬類などの費用のほか、次世代全ゲノム解析の候補となる症例の抽出・解析に伴う消耗品類等に使用する予定である。次世代全ゲノム解析のための候補症例が集まったのち、解析実施のための費用に充てる計画である。
開発途上国におけるジェンダー格差が母子の健康に与える影響

本研究は、途上国におけるジェンダー格差と母子の健康との関連性について、ラオス全土を対象とした二次データと、ビエンチャン県郊外の農村で行ったフィールド調査を通じて、明らかにした。主な成果は以下の3点である。第一に、ラオスにおける家庭内のジェンダー格差の現状について、ジェンダー格差の多次元性を配慮した上で、基礎的な統計データが整備された。第二に、ラオスの子どもの貧困におけるジェンダー格差の存在が、子どもによる食事摂取と生活時間配分というユニークなデータによって確認された。第三に、ラオスにおける家庭内の多面的なジェンダー格差が母子の健康に与える影響が明らかにされた。本研究の目的は、開発途上国における家庭内のジェンダー格差と母子の健康との関連性について、ラオスを事例に検証することである。2013年度は、ラオス全国において2007年から2008年にかけて実施された大規模消費・生活実態調査(Lao Expenditure & Consumption Survey 4)の個票データをラオス政府統計局から入手して分析を行い、ラオスにおける子どもの貧困とジェンダー格差の現状について明らかにした。分析対象は約20,000人の18歳未満の子どもであり、彼らの栄養摂取、生活時間配分、健康状態、教育といった子どもの権利剥奪に関連する変数について、世帯所得や親の属性別にみた男女間の差異を検証した。栄養摂取に関しては、低所得層の子どもは、高所得層と比べて肉・魚・果物の摂取量が少ない一方、米と野菜の摂取量が多いこと、生活時間配分に関しては、低所得層の子どもほど賃金・家事労働時間が長い一方、学校で過ごす時間が短く、かつ、これらの傾向は女子ほど強いことが明らかとなった。これまでラオスでは、子どもの貧困の実態とそのジェンダー格差に関する実証研究は行われておらず、本結果は本分野における今後の研究の嚆矢となる。また、2013年度は、ラオス農村部でのフィールド調査遂行のための現地研究体制の構築と調査マテリアルの作成を行った。年度内に計3回ラオスを訪問し、現地研究機関とフィールド調査実施のための協力関係を築いた。さらに、2013年10月にビエンチャン市で開催された「第7回ラオス保健研究フォーラム」にて本研究についてのプレゼンテーションを行った。その後、ラオスの倫理審査委員会からフィールド調査実施に係る承認を得た。今後、2014年8月と2015年2月にビエンチャン近郊の農村部にて現地調査を実施し、独自のパネルデータを構築して、さらなる分析を進める予定である。本研究では、開発途上国におけるジェンダー格差と母子の健康との関連性について、ラオスを事例に検証した。2013年度は、ラオス全国にて2007年に実施された大規模消費・生活実態調査(Lao Expenditure & Consumption Survey 4)の個票データを入手・分析し、子どもの貧困とジェンダー格差の現状について明らかにした。約2万人の18歳未満の子どもの栄養・健康、生活時間、教育の状況について、世帯所得や親の属性別の男女間の差異を検証した結果、低所得層の子どもは、高所得層と比べて肉・魚・果物の摂取量が少ない一方、米と野菜の摂取量が多いこと、賃金・家事労働時間が長い一方、学校で過ごす時間が短く、かつ、これらの傾向は女子ほど強いことが明らかとなった。2014年度は、2011年に実施された社会指標調査(Lao Social Indicator Survey)の個票データを入手・分析し、夫婦間のジェンダー格差が、妻の母子保健サービスの利用や育児に影響を与えているどうかの実証分析を行った。そうした二次データ分析の結果を用いて、2014年8月9月には、ラオス国立公衆衛生院を現地協力研究機関とし、首都ビエンチャン市近郊の4つの農村にて、幼い子どもを持つ夫婦の住む約200世帯を対象に、質問票、経済実験、身体測定の3つの柱から成るフィールド調査を実施した。質問票では、基本的な社会・経済属性に始まり、女性のエンパワーメント、家事・育児、各世帯員の社会的ネットワーク、栄養摂取、生活時間、健康希求行動といった詳細な質問項目を含めた。これらの調査より、対象農村では、夫婦間、また、子どもの男女間において、既存研究では十分に明らかになっていない、多次元的なジェンダー格差が存在することが確認された。開発経済学ラオス現地の研究協力機関の都合により、ラオス農村部でのフィールド調査の日程が2013年度から2014年度となったが、全体の研究計画に遅延はなく、今後もスムーズに研究が実施できる見込みである。2014年8月に、ラオスのビエンチャン郊外の農村部にて、フィールド調査を行う予定である。その後は、2015年1月にフォローアップ調査を行い、パネルデータを構築する。天候や交通事情等により、フィールド調査の日程が遅れることもありうるが、調査日程を予め余裕を持ったものにすることで、大幅な遅延は防ぐことはできる。

また、本研究は同一世帯を対象とした追跡調査を行うが、対象の世帯員の一部もしくは全員が何らかの理由でサンプルから脱落してしまう可能性がある。ただし、フォローアップまでの期間は半年と短いため、脱落ケースは非常に少ないと考えられる。2014年度に現地調査を実施するため。ラオス渡航のための旅費、ラオス国内でのフィールド調査実施のための物品費と人件費・謝金に係る支出。
初期胚転写コアクティベーターUTF1のレチノイン酸レセプター補助因子としての役割

古くからレチノイン酸レセプター(RAR)によって自己調節されるRARβ遺伝子の発現には初期胚特異的に発現する転写補助因子が必要であることが知られている。私たちは、自分たちがクローン化した初期胚特異的転写補助因子UTF1の中にステロイドホルモンレセプターの補助因子として機能するタンパク質に共通してみられるLxxLLモチーフが2つ存在しており、かつ、それらがヒトUFT1でも保存されるという事実から、UFT1がそのタンパク質に相当するのではないかと考えこの研究に着手した。事実、この研究費を補助された平成11年度の間に、私たちはGSTプルダウン法等によりUTF1とRARが直接結合することを明らかにした。また、このUTF1のRARとの結合は、SRC-1等の他のステロイドホルモン補助因子とは違ってリガンド及びレセプターのAF2領域、いずれに対しても非依存性であることが明らかになった。また、トランスフェクションを用いた実験系により、UTF1が確かにRARβ遺伝子プロモーター上にあるRAR結合配列を介して転写を促進する性質を持つことを明らかにした。また、これらとは別の角度からの研究としてジーンターゲティングを用いた解析も行っている。すなわち、UTF1遺伝子破壊用のターゲティングベクターを構築し、それを用いて一対のUTF1遺伝子のうち、1つが欠失したF9EC細胞を樹立した。現在、高濃度のG418を用いる方法等を用いて2番目のUTF1遺伝子座の破壊を試みてる。以上、要約すると、現在までにUTF1がRARと結合し、RARβ遺伝子プロモーターを活性化するという能力を持ったタンパク質であることを明かにすることができた。今後、UTF1遺伝子ダブルノックアウトEC細胞を樹立することにより、現在までに得ているデータの生理的意義を確定したいと考えている。
イノシトールリン脂質3キナーゼの分子多様性とそれらの活性化機構

先に我々は,チロシンキナーゼ型とG蛋白質共役型という2種の異なる受容体刺激によって相乗的に活性化されるイノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)として,110-kDaβ触媒(p110β)/85-kDa調節(p85)サブユニットからなる2量体型PI3Kを同定した。本研究では,この分子種のPI3Kを中心にさらに解析を進め,以下の知見を得た。1.構成的に活性化型のp110β-PI3Kと相互作用する分子を酵母のtwo-hybrid系を用いて検索し,低分子量GTPaseファミリーのRab5を同定した。2.Ser/ThrキナーゼのAkt(PKB)は,PI3Kの産物であるPIP3により活性化されるが,インスリン刺激に応答するAktの活性化は,活性化型Rab5の遺伝子導入で増強され,不活性化型Rab5により抑制された。すなわち,チロシンキナーゼ受容体からPI3Kを介するAktの活性化に,Rab5の介在が初めて示された。3.活性化型Rab5の相互作用分子をtwo-hybrid系を用いて検索し,SH2ドメインをもつ新規分子群を同定した。4.エフェクターとしての役割が期待される新規Rab5結合蛋白質群は,初期エンドソームに局在化することが示され,小胞輸送におけるRab5の機能解析の基礎が築かれた。5.リンパ球細胞において,Fcγ受容体刺激でチロシンリン酸化されるPI3Kのアダプター分子として,癌遺伝子産物p120^<c-cbl>と100-kDa蛋白質を同定した。100-kDa蛋白質は、G蛋白質共役型受容体刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化されるというユニークな挙動を示し,Gab2であることを見出した。
支台歯形成に影響を及ぼす因子に関する研究

1.全部被覆冠(上顎前歯における歯肉の形態による影響、審美的材料を用いたDicorクラウン応用の研究)(1)臨床的歯頸線の深さと歯肉縁下削除量とは負の相関があり,ブラックラインとしてみられるマージン露出の原因は歯肉縁下削除の不足に起因しておりすでに支台歯形成時に生じていることが示唆された。(2)上顎小臼歯にDicorクラウン装着を想定した場合、クラウンやアンレーではエナメル質が外周にわずかしか残存しないので、エナメルエッチング以外の象牙質接着システムが必要であると指摘された。2.部分被覆冠(ラミネートベニア修復を想定した場合のエナメル質削除の状態と、色調回復・遮蔽との関係)(1)上顎小臼歯にDicorラミネートを想定した場合、臨床的歯頸線付近では象牙質露出の危険性がかなり高くなるので、象牙質接着システムを応用するための象牙質面処理が必要であると示唆された。(2)均一な支台歯形成を行った場合には支台歯の色調、合着材の色調およびベニアの厚みが影響していた。3.スリー・ユニット・ブリッジ(近心傾斜歯シミュレーションによるブリッジ支台歯形成の削除傾向を検討)実際の臨床例に対応させて下顎右側第2大臼歯を3段階に近心傾斜させた模型で検討した結果、第2小臼歯に変化は少なく、第2大臼歯の歯肉縁下削除や各軸面のテーパー度に影響を及ぼすことが示唆された。4.今後の研究計画について(1)支台歯形成のアプローチの違いによる影響を検討するため、支台歯形成中のタービン用ポイントの移動方向(アップカットとダウンカット方向)による削除傾向を計測し、いままでの研究の原因考察を行う。(2)支台歯形成中のレスト指(第3指および第4レスト)の違いによる削除傾向を検討する。1.全部被覆冠の場合1)小臼歯部の全部鋳造冠支台歯形成をマネキンに装着した顎歯模型上と、同部位の口腔内にて同一術者に行わせたところ、従来行っていた模型上での計測方法が口腔内でも使用可能で、同一基準にて比較検討できることが判明した。2)上顎中切歯にジャケットクラウンのショルダー形成を行わせ、歯頸線が深くなると歯肉縁下削除量が少なくなる傾向があり、フィニシュラインは歯肉縁上に設定される傾向があった。3)上記の傾向は臨床経験の長さに関わらず、各術者に共通する傾向であった。2.ブリッジの場合1)第86回日本補綴歯科学会(平成3年、9/21、広島)にて下顎第1大臼歯欠損のスタディキャスト上における第2小臼歯と第2大臼歯の歯冠軸傾斜角度を計測した報告を行い、両歯のなす角度は〓舌的に520゚、近遠心的に530゚の範囲にあった。2)前述の計測結果より、第2大臼歯を近心に10゚、20゚および30゚歯冠傾斜させたシュミレーションモデルを製作した。3)シュミレーションモデル上で3ユニットブリッジの支台歯形成を行わせて計測方法の検討を行い、歯冠傾斜が支台歯のテーパー度や歯肉縁下削除量に影響することが示唆されたので、平成4年度日本補綴歯科学会関東支部学術大会(平成5年、2/20、新潟)にて報告した。1.全部被覆冠(上顎前歯における歯肉の形態による影響、審美的材料を用いたDicorクラウン応用の研究)(1)臨床的歯頚線の深さと歯肉縁下削除量とは負の相関があり、ブラックラインとしてみられるマージン露出の原因は歯肉縁下削除の不足に起因しており、すでに支台歯形成時に生じていることが示唆された。