hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨芽細胞が発現する破骨細胞ニッチ形成因子の同定

生体内における破骨細胞分化を観察し、以前我々が同定した静止期破骨前駆細胞(QuOPs)の分化、骨組織への遊走、骨芽細胞による支持機構を調べた。QuOPsは骨髄および末梢血中に存在した。末梢血中のQuOPsは、低Ca食誘導性の骨吸収に伴い骨組織に遊走し、破骨細胞に分化した。血流中のQuOPsの分化にはc-FosとRANKLは必要なかったが、骨組織におけるQuOPsの成熟にはc-Fosが必要であった。破骨細胞の分化は、骨芽細胞が発現するM-CSF, RANKLおよびOPGにより調節される。我々は、骨芽細胞がこれらの因子非依存的に破骨細胞の形成場所決定する可能性を見出した。生体内では、細胞周期の停止した静止期破骨細胞前駆細胞(cell cycle-arrested quiescent osteoclast precursors, QuOPs)が骨芽細胞により、数週間支持されることを確認し、この支持環境を破骨細胞ニッチと名付けた(第29回米国骨代謝学会JBMR 22 Supple 1 : s082, 2007)。平成20年度は、pOCPから破骨細胞への分化に関与する因子を同定することを目的とし、本研究を計画した。実験計画は、以下のテーマを明らかにすることを目標とし、遂行した。(計画1)骨吸収に伴うQOPの挙動の解析: E-GFPを発現するマウスを用いて実験を試みたが、蛍光強度の減弱などにより、解析が困難であった。現在、全身性にDSRedを発現するマウスを用いて実験系の構築中である。(計画2)破骨細胞分化に伴うQuOPsの遊走機構の解析: RANKプロモーターの下流でGFPを発現するマウスを作製した。GFPの発現が弱いため、現在検出法を検討中である。(計画3)QuOPs支持因子の同定:現在、初代培養骨芽細胞と、MC3T3-E1のc-DNAライブラリーを作成中である。(計画4)QuOPs支持因子の機能解析:現在、QuOPs支持因子の同定(計画3)を行っている。破骨細胞の分化は、骨芽細胞が発現するM-CSF,RANKLおよびOPGにより調節される。生体内では、細胞周期の停止した静止期破骨細胞前駆細胞(cell cycle-arrested quiescent osteoclast precursors, QuOPs)が骨芽細胞により、数週間支持されることを確認し、この支持環境を破骨細胞ニッチと名付けた。平成21年度は、破骨細胞ニッチのQuOPs遊走因子を同定し、代謝性骨疾患における破骨細胞ニッチの変動を調べ、骨疾患への関与を明らかにすることを目指した。(計画1)全身性にDsRedを発現するマウスからQuOPsを分取し、破骨細胞形成不全マウスであるc-Fos欠損マウスの心臓から移植した。QuOPsは血流中から骨組織へ遊走し、破骨細胞に分化することが明らかとなった。さらに、低Ca食飼育によりQuOPsの骨髄への動因が亢進することが示唆された。現在、低Ca状態で発現が亢進するケモカインおよびその受容体を探索中である。(計画2)QuOPs遊走因子は研究期間内に同定することが出来なかった。計画2は現在進行中である。(計画3)破骨細胞形成不全マウスであるc-Fos欠損マウスの骨髄にはQuOPsが存在しないことを明らかにした(第27回日本骨代謝学会学術集会)。RANKの発現上昇にc-Fosが必要であると考えている。
「ヒトパピローマウイルスの口腔病理学」に基づいた細胞の寿命制御

臍帯血からの間葉系細胞のstrainの樹立さらに寿命を延長することに成功し、それぞれの細胞の特徴性格づけも行った。さらに月経血からの間葉系細胞の骨格筋への高率な分化誘導にも成功した。この技術はヒト正常体細胞を用いた将来の細胞移植治療の応用の際に大きな利益をもたらすと考える。本年度は細胞移植時に安全で安定かつ目的の臓器に目的の組織、さらには患者に十分に供給できるだけの細胞量の確保する系の確立することを目的として研究を行った。幹細胞が多く含まれていると考えられている臍帯血由来の間葉系細胞の分子レベルでの特徴及び増殖曲線などの解析結果に基づき、HPVの部分遺伝子およびhTERT(human telomerase reverse transcriptase)をレトロウイルスの細胞への感染により遺伝子導入を行い、細胞寿命の延長に成功しました。さらに分化後の移植された細胞が生体内でうまく機能するかどうかの有効性、腫瘍化しないかどうかの安全性について検討を行ってきた。機能については今後も引き続き検討していくが、腫瘍化は今のところ確認していない。臨床応用、細胞治療に十分な量の安全で品質の均質な細胞提供に向けてRNA干渉法、PTD(protein transduction domain)タンパクにより細胞周期の停止させる遺伝子をノックダウンして細胞の寿命延長にも取り組みました。RNA干渉法については細胞寿命を制御している新しい遺伝子領域についても今後検討していく。PTDタンパクについては細胞種、導入遺伝子によって多くの条件検討が必要であり、今後も検討が必要である。さらにヒト臨床検体、具体的には内分泌細胞の増殖能と機能を維持したまま細胞の寿命の制御することにも取り組んでおり、HPVの部分遺伝子を用いた細胞の寿命制御に関する研究は多くの疾患へのアプローチとしての細胞治療を一般的なものとするべく大きなステップとなると確信しております。「ヒトパピローマウイルスの口腔病理学」に基づいた細胞の寿命制御本年度はヒト骨髄間葉系幹細胞の寿命を腫瘍化させずに延長できる系として昨年から行なってきたHPVの実験系を月齊帯血・月経血由来の間葉系幹細胞についても応用した。それら細胞に関するバイオロジーを明らかにするとともに、細胞移植時に安全で安定かつ目的の臓器、組織に分化させる方法の確立、さらには患者に十分に供給できるだけの細胞量の確保する方法の確立を目指して研究を行った。再生医療の細胞治療のソースとして用いられる骨髄は採取時のドナーの感染の危険が伴う医療行為である。本年度の研究の中心である膀帯血・月経血は採取が容易であり、さらにインフォームドコンセントのもとで多数のヒトからの採取が可能であることから、膀帯血・月経血バンクの充実が予想される。さらに膀帯血・月経血由来の間葉系幹細胞がES細胞に近い多分化能をもつことが近年報告されている。これらの細胞は採取が容易で、バンクの充実が容易であるため、必要な時にバンクから必要な量だけの目的の細胞の利用が将来的に可能になると考えられる。しかしながら膀帯血・月経血由来の間葉系幹細胞は、現在までの方法では必要な量の細胞数を得るには至っていない。現在、膀帯血・月経血由来の間葉系幹細胞のstrainの樹立に成功している。さらに膀帯血由来間葉系細胞は心筋への分化を確認している。月経血由来の間葉系幹細胞については骨格筋への分化を認め、動物実験により宿主の細胞との融合現象を確認している。今後も引き続きヒト臨床検体を用いて細胞株の樹立、寿命の制御、確実な分化方法の確立に取り組む。特に内分泌細胞の増殖能と機能を維持したまま細胞の寿命制御に取り組んで行く。昨年度から引き続きヒト骨髄間葉系幹細胞の寿命を腫瘍化させずに延長できる系としてHPVの実験系を臍帯血・月経血・末梢血由来の間葉系幹細胞について応用してきた。細胞株の樹立に成功した臍帯血・月経血・末梢血由来の間葉系幹細胞を使って、確実な分化方法の確立に努めた。臍帯血由来間葉系幹細胞の心筋への分化、肝臓への分化の方法を確立し、論文発表した。月経血由来間葉系幹細胞の骨格筋への分化に関しても論文発表した。さらに樹立された初期培養細胞株ならびに寿命延長に成功した細胞株に関するバイオロジーを造腫瘍性実験、マイクロアレイで検討を進めてきた。ヒト臍帯血の間葉系幹細胞にテロメレースを活性化するhTERTを細胞内に遺伝子導入し、寿命を延長することに成功した臍帯血の間葉系幹細胞は骨、脂肪、心臓、肝臓、神経へ分化する能力が寿命延長された後も維持されており、細胞表面マーカーの違いも認めなかった。さらにヌードマウスへの移植による腫瘍形成能も認められなかった。さらにこの細胞は継代を重ねた後においても染色体異常をほとんど認めなかった。臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞移植医療で問題となる細胞数については、現在のところ遺伝子導入により解決することができるが、分化する能力を維持させることは可能である。しかし、導入する遺伝子の種類によっては染色体異常があることが明らかにされた。ウイルスを用いた遺伝子導入に変わる手段としてRNA干渉法、PTDタンパクによる細胞延命増殖の方法の確立、細胞培養時に用いる培養液の検討も進めてきた。

このようにして得られたヒト臍帯血の間葉系幹細胞は細胞移植治療のための細胞ソースのみならず、ハイブリッド型人工臓器の開発やハイスループット系の薬物スクリーニングなどの研究開発にも応用可能である。臍帯血に含まれる間葉系幹細胞は再生医療への応用に大きく貢献できる貴重な細胞ソースである。昨年度から引き続きヒト骨髄間葉系幹細胞の寿命を腫瘍化させずに延長できる系としてHPVの実験系を臍帯血・月経血・末梢血由来の間葉系幹細胞について応用してきた。細胞株の樹立に成功した臍帯血・月経血・末梢血由来の間葉系幹細胞を使って、確実な分化方法の確立に努めた。樹立された初期培養細胞株ならびに寿命延長に成功した細胞株に関するバイオロジーを造腫瘍性実験、マイクロアレイで検討してきた。さらに臨床応用へ向けて細胞にダメージを伴わない遺伝子導入法による細胞延命増殖についてもPTDタンパクを使ったテロメラーゼの活性化などの可能と考えられる様々な方法を種々の正常組織に応用してきた。また遺伝子導入を伴わない手法、DNA複製時においてもテロメアの長さを維持し、かつ遺伝子発現も定常化したままで細胞分裂を続けさせるための、ストレスフリーの状態を作り出すべく培地の開発、および臨床応用へ向けた血清フリーの培地開発にも着手してきた。多分化能を有するヒト由来間葉系幹細胞(骨髄、臍帯血、月経血、末梢血など)については、寿命延長ならびに目的とする組織への最終分化させる手段を開発してきた。さらに皮膚、眼、歯牙組織、骨、軟骨、膵β細胞、肝臓などの実質臓器については構成組織、成分ごとの細胞の培養法、増殖法を確立してきた。将来的には、膵β細胞などの内分泌細胞については機能を損なわずに細胞数を確保することを目標にしていく。腫瘍化や染色体異常等を伴わないこと、さらに現在実験段階において行なっているウイルスを用いた遺伝子導入に変わる手段を開発することで細胞移植による再生医療の安全性を保証し、多くの患者に再生医療を臨床応用可能な段階へ医療全体、社会全体を導いていく。
Marginal donor過小グラフトにおける肝グラフト機能向上の試み

【背景目的】近年marginal donorとして心停止ドナ-(NHBD)からの肝移植の可能性が研究されている。NHBD肝グラフトでは、エネルギーステイタス(ES)の悪化や酸化ストレスに起因する様々な障害を認めることが知られている。NHBDからの膵ラ氏島においては、黒田らの二相法により、ESを心停止前に近い状態に引き上げることが可能と報告された。しかし臓器としての肝グラフトにおいては未だに有効な方法はない。今回我々は、二相法の考え方を応用し、冷保存前の酸素化灌流(前灌流)や抗酸化作用を持つビリベルジン(BV)添加により、マージナル肝グラフト機能向上効果を検討した(実験1)。また、やはり抗酸化作用を持つエダラボン(ED)についても同様に検討した(実験2)。【方法】実験1:ラット肝に心停止後30分間の温阻血を加え、6時間のUW液中冷保存後にKlebs-Henseleit(KH)液にて1時間ex vivo再灌流した。4群にわけ実験した。温阻血をおかないHB群、NHBD群は前述のとおり作成。前灌流群は温阻血後30分間酸素化KH液にて酸素化した後冷保存を行った。BV群は前灌流液にBVを加えた。実験2:同様に、30分温阻血後1時間のexvivo再灌流をした。NHBD群に対しEDを添加したED群を比較した。実験1・2ともに門脈流量、胆汁産生量、灌流液中サイトカイン、肝組織中energy charge(EC)、ATP量を検討した。【結果】実験1:前灌流群の門脈流量及び胆汁産生量はNHBD群に比し有意に改善。EC、ATP量も前灌流により0.41±0.028vs0.36±0.025、691.8±119.58vs494.1±76.44(pmol/g)と改善し、BV添加にて0.49±0.021、1036.2±109.77と更に改善。TNF-αは前灌流にて低下傾向を示した。実験2:門脈流量及び胆汁産生量はNHBD群に比しED群で有意に改善。IL-1β、TNF-αも有意に低下した。【結論】冷保存前の酸素化灌流および抗酸化剤のBV・EDはNHBDからの肝移植の成績向上に寄与する可能性がある。4群にわけ実験した。大量肝切除後、及び過小グラフト肝移植後には、肝不全など重篤な合併症が起きることもあるが、その原因の一つとして、術後肝容積の著しい減少状態において門脈血流は相対的に過剰であり、肝循環が破綻するためと考えた。ブタに対し、実験I:83%大量肝切除、実験II:25%部分肝移植を施行し、残肝およびグラフト肝の血行動態を評価した。また門脈下大静脈シャントを作成し、門脈血流を減少させたときの血行動態の変化と、過小グラフト肝移植が可能になるかを検討した。

実験I:シャント非作成群は術後肝不全にて4例が24時間以内に死亡し、残りの3例は3日以内に死亡した。シャント作成群は全例4日以上生存しその内3例は7日以上生存した。大量肝切除1時間後の単位重量当たりの門脈血流量はシャント非作成群では開腹時の約7倍にまで上昇したが、シャント作成群では約1.8倍程度であった(P<0.05)。実験II:レシピエントの全肝を摘出後、後区域グラフトを移植。門脈下大静脈シャント作成群(n=11)と非作成群(n=11)の2群に分け比較検討した。非作成群は、1例を除いて移植後24時間以内に死亡したのに対し、作成群は8例が4日以上生存した。100g肝重量当たり門脈血流量は、シャント非作成群では再灌流1時間後に開腹時の約2.4倍にまで増加したが、シャント作成群では半分程度に減少していた(P<0.05)。再潅流1時間後に採取したグラフトの病理組織学的所見は、作成群で肝細胞構築がほぼ正常に保たれていたのに対し、非作成群では門脈域の出血と類洞内皮の脱落、ディッセ腔の開大など著明な類洞構造の破壊が認められた。以上より、過剰な門脈血流により惹起される類洞内皮障害、微小循環障害が回避されると、より安全に大量肝切除及び過小グラフト肝移植を施行できるようになることが示唆された。【背景目的】近年marginal donorとして心停止ドナー(NHBD)からの肝移植の可能性が研究されている。NHBD肝グラフトでは、エネルギーステイタス(ES)の悪化や酸化ストレスに起因する様々な障害を認めることが知られている。NHBDからの膵ラ氏島においては、黒田らの二相法により、ESを心停止前に近い状態に引き上げることが可能と報告された。しかし臓器としての肝グラフトにおいては未だに有効な方法はない。今回我々は、二相法の考え方を応用し、酸素化冷保存前灌流(前灌流)や抗酸化作用を持つビリベルジン(BV)添加により、マージナル肝グラフト機能向上効果を検討した(実験1)。【方法】ラット肝に心停止後30分間の温阻血を加え、6時間のUW液中冷保存後にKlebs-Henseleit(KH)液にて1時間ex vivo再灌流した。4群にわけ実験した。温阻血をおかないHB群をコントロールとし、NHBD群は前述のとおり作成。前灌流群は温阻血後30分間酸素化KH液にて酸素化した後冷保存を行った。BV群は前灌流液にBVを加えた。門脈流量、胆汁産生量、灌流液中サイトカイン、肝組織中energy charge(EC)、ATP量を検討した。【結果】前灌流群の門脈流量及び胆汁産生量はNHBD群に比し有意に改善。EC、ATP量も前灌流により0.41±0。028vs0.36±0.025、691.8±119.58vs494.1±76.44(pmol/g)と改善し、BV添加にて0.49±0.021、1036.2±109.77と更に改善。TNF-αは前灌流にて低下傾向を示した。【結論】冷保存前の酸素化灌流および抗酸化剤のBVはNHBDからの肝移植の成績向上に寄与する可能性がある。
土壌病害助長現象の解明による環境調和型の土壌病害防除体系の確立

環境調和型の土壌病害防除体系の確立には、適切な防除時期を把握し、農薬散布などの回数を極力少なくする必要がある。しかし農業現場では、病原菌密度が低いにも関わらず、激しく病害が発生することがあり、病原菌密度という指標のみでは土壌病害発生の説明が困難であった。そこで本研究では、土壌病害発生には病原菌以外の微生物の働きも関与するのではないかと考え、特に微生物の病害助長作用に着目し、土壌病害発生機構を解明することとした。最終的には、解明した病害発生機構に基づいて土壌病害発生の遺伝子診断技術を開発するなど、新規の土壌病害予察法への応用展開を考えている。
二酸化炭素のとり込み,電解還元触媒機能を有する金属錯体の合成・構造・反応性

1.【CO_2】の電解還元錯体触媒について。(1)【Zn^(II)】を含む1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン(cyclam)錯体が、水溶液中で、【CO_2】の電解還元触媒機能をもつことを新たに見出した。接触波の立上り電位は、-1.1V vsSCEであり、生成物は多量のCOを含む。この知見は、ひと月程前に見出したもので定性的であり、今後研究を継続する予定である。(2)【Ni^(II)】-1,4,8,12-テトラアザシクロペンタデカン錯体は、Ni【(cyclam)^(2+)】(Sauvage,1984)とほとんど同様な電解触媒機能をもつ。この接触過程はHg作用電極で起るが、グラッシーカーボン電極上では発現しない。13員環状の【Ni^(II)】錯体Ni【(〔13〕AT)^+】は、この機能をもたない。面内配位子場強度の増大が、axial位の反応性を低下させることがその原因であろう。2.【CO_2】とり込み機能をもつAl(【III】)錯体の探索とその周辺化学。(1)【^(27)Al】-NMR.【CO_2】を可逆的に吸脱着することが知られているAl(TPP)を含むメチラトおよびエチルチオラト錯体について、【^(27)Al】NMRの測定を行った。封管した試料の温度変化により、【CO_2】の吸脱着過程を明瞭に観測することができた。また、Al錯体の溶存構造を調べる目的で、約10種の錯体について【^(27)Al】NMRの測定を行った結果、化学シフトと配位数の間に明瞭な相関関係を見出した。(2)Al-C結合の光化学的活性化を調べる目的で、O-フェニレンジアミンとアセチルアセトンから誘導される環状配位子を含むAl-エチル錯体,Al(【C_(22)】【H_(22)】【N_4】)Et,の光化学的挙動を調べた。光塩素化,発光挙動,励起三重項の寿命などについて、新しい知見を得た。(3)【CO_2】とり込み機能をもつAl錯体の開発を目的としてAl-S結合を含む錯体の合成をめざした。種々の試みの末、Al(【C_(22)】【H_(22)】【N_4】)Etとチオフェノールの反応を詳しく調べた。チオフェノラト錯体は、極めて加水分解し易く、まだ単離に成功していない。
線溶系遺伝子変異マウスを用いた聴覚における線溶系の機能解析

組織プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)ノックアウトマウス、プラスミノゲン(Plg)ノックアウトマウス、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1)ノックアウトマウスについて、聴力と蝸牛組織標本の検討を行った。若月齢では野生型マウスと聴力に有意差が生じないことを確認したため、t-PAノックアウトマウスについては18カ月齢、24か月齢、Plgノックアウトマウス、PAI-1ノックアウトマウスについては8カ月齢を用意して解析を行った。しかし、これらの月齢においても聴力および蝸牛組織において、野生型マウスと有意差を確認することができなかった。今後は更なる加齢マウスの検討や、難聴に関する負荷からの回復など、新たな検討項目を加える必要があると考える。線溶系遺伝子変異マウスを用いて聴覚における線溶系の機能解析組織を行うため、フラスミノケンアクチベーター(t-PA)ノックアウトマウス、プラスミノゲンアクテベーターインヒビター1(PAI-1)ノックアウトマウスなどの各種線溶系遺伝子変異マウスについて、実験に必要十分な検体を確保するため、コロニーを確立した。実験として、まずt-PAノックアウトマウスに注目して、5週齢、10週齢、15週齢のマウスを作成した。マウスの聴力測定の一つとして、計画書にあった通り聴性脳幹反応検査を行ったが、検査の安定性、信頼性を確立させることと、コントロールとしての正常マウスの聴力を把握するため、C57BL/6Jマウスの5週齢、10週齢、15週齢を作成し、その聴力測定を行うこととした。聴性脳幹反応検査を進める段階で、システムがなかなか安定せず、聴力正常と考えられるC57BL/6Jマウスの5週齢のマウスを使用しても、強大音での聴性脳幹反応は問題なく測定できるものの、閾値付折での反応が不安定であり、他の文献で提示されている閾値よりも高いレベルで反応が消失してしまうことが判明した。若齢t-PAノックアウトマウスでは音による驚愕反射が認められたため完全な聾ではないことは明らかであり、正確な閾値測定が不可欠である。信頼できる聴力閾値付近のデータを得ることが急務であり、正常マウスとの差を明確に述べられるよう実験を継続している。システムの安定を図ると共に、音による驚愕反射が低下しているように観察されている15週齢マウスの聴覚検査を行い、正常マウスとの差を検討中である。また他の線溶系遺伝子変異マウスについても順次、検査を進めている。この研究では線溶系が聴覚にどのような影響を与えているかを、線溶系遺伝子変異マウスを用いて明らかにすることが目的となっている。このため、聴覚における線溶系の機能解析組織を行うため、プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)ノックアウトマウス、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1)ノックアウトマウスなどの各種線溶系遺伝子変異マウスについて、実験に必要十分な検体を確保するため、コロニーを確立し、その聴力閾値と聴力の異常が認められた場合原因部位を検索するため、組織学的な解析を行う方針としている。まずt-PAノックアウトマウスに注目して、5週齢、10週齢、15週齢のマウスを作成した。マウスの聴力測定の一つとして、計画書にあった通り聴性脳幹反応検査を行った。若齢マウスにおいて聴力に異常が認められず、用意した最も高齢の15週齢においても聴力は野生型のC57BL/6Jマウスと比較して差が認められず、正常聴力を呈することが確認された。このためさらなる老齢マウスを作成し、加齢の段階で聴力に差が生じるかどうかの確認を行っている。生後10カ月時点で聴力を確認した結果では、野生型のC57BL/6Jマウスが有する齢性変化と大きな差が認められなかった。さらに飼育を継続し、さらなる加齢による変化の差を観察している。この研究では線溶系が聴覚にどのような影響を与えているかを、線溶系遺伝子変異マウスを用いて明らかにすることが目的とした。このため、聴覚における線溶系の機能解析組織を行うため、プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)ノックアウトマウス、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1)ノックアウトマウス、プラスミノゲンノックアウトマウスの各種線溶系遺伝子変異マウスについて、コロニーを確立し、その聴力閾値と難聴の原因責任部位を検索するため、組織学的な解析を行う方針とした。まずはt-PAノックアウト

マウスに注目して、5週齢、10週齢、15週齢のマウスを作成し、計画書の通り聴性脳幹反応検査を行った。しかし、野生型のC57BL/6Jマウスと比較して15週齢でも差が認められず、正常聴力を呈することが確認された。このため老齢マウスとして、14か月齢、20カ月齢まで作成し、加齢の段階で聴力に差が生じるかどうか観察したが、野生型と有意な差を認めることはできなかった。これらについて蝸牛の切片標本を作成し、コルチ器、血管条などの所見を確認した。基底回転領域の変性は認めるものの、中回転から頂回転においては正常構造がほぼ保たれていた。プラスミノゲンアクチベーターインヒビター1(PAI-1)ノックアウトマウス、プラスミノゲンノックアウトマウスについては、若年で正常等力であることが確認されたため、生後5か月齢で検討を行ったが、やはり野生型と同様の聴力を呈し、その蝸牛組織所見は基底回転から頂回転までの全蝸牛領域で正常構造を呈していた。
ゴマ豆腐の力学的特性に及ぼすゴマ豆腐の焙煎条件の影響

ゴマを妙る時は「3粒はぜたら、火を止める」といわれている。あらい黒、白ゴマ、皮むき白ゴマ3種について電気オーブンにより160,170,180,190°Cにて加熱したゴマ材料を用いてゴマ豆腐を調製した。調製方法は、ゴマ40gに水250g加えて3分間ミキサーにて撹拌し、さらに200g加え50メッシュのフルイを通してゴマ乳435gを得た。ゴマ乳に本葛澱粉40gを加え、撹拌機を用いて250rpm25分間撹絆し、テフロン製円筒型(20×20mm)に流し入れ、凝固させた試料を15時間後、試料温度20°Cでレオナー(RE-3305,山電)を用いて破断測定を行ない寒天ゲルの破断特性も検討した。さらに、官能検査を行い、破断特性値と評点との相関性を求めた。その結果、あらい黒ゴマ豆腐は未加熱ゴマ、焙煎ゴマ共に、破断応力、破断歪率、破断エネルギーが最も高いことより最も硬く、破断しにくいゲルであることがわかった。ゴマ豆腐の破断曲線は典型的な延性破断を示し、皮むき白ゴマ豆腐は、破断応力、破断歪率、破断エネルギーが最も低かった。焙煎温度の影響では、170°C焙煎ゴマのゴマ乳中の平均粒子径(あらいゴマ21.5μm、むきゴマ40.4μm)は、190°Cゴマ乳中の粒子径(あらいゴマ86.4μm、むきゴマ110.3μm)よりも小さかった。170°C焙煎ゴマ豆腐は、硬さ応力、破断応力、破断歪率破断エネルギーが最も低く、190°C焙煎ゴマ豆腐の硬さ応力、破断応力、破断歪率、破断エネルギーは最も高かった(p<0.01)。破断応力の大きい190°Cゴマ豆腐は硬く、わずかに苦みやざらつき感があり、口ざわりが悪いために官能検査では総合的に好まれないが、170°C焙煎ゴマ豆腐は、破断応力、硬さ応力の小さい、すなわち、なめらかで軟らかく、弾力のあるゴマ豆腐特有のテクスチャーを形成し、皮むきゴマ豆腐(p<0.01)、あらいゴマ豆腐(p<0.05)は、170°C焙煎ゴマで調製された時に最も高く評価された。9.研究実績の概要本研究課題ではゴマを炒る時は「3粒はぜたら、火を止める」といわれている。

あらい(白)ゴマ、皮むき白ゴマ2種について電気ガスオーブン(リンナイRCK-7N)により、160、170、180、190、200°Cで天板上で10分間加熱して焙煎温度の増加に伴う着色の変化、及び、蛋白(ケルダール法)、脂質(ソックスレー法)、炭水化物(フェノール硫酸法)などの成分分析の検討を行い、ゴマ表面(測色色差計((株)日本電色工業、ZE-2000)を明度(L)、色差について測定した。また、ゴマの表面、及び縦断面はチルドSEM(日立、S-3500N)を用いて500倍、1000倍で観察した。2品種共に縦断面は、焙煎に伴って残存胚乳部と子葉細胞の間隙が大きくなった。焙煎ゴマ200°Cでは、子葉細胞にぎっしりとつまっている油滴が細胞から流出し、細胞膜が不明瞭になるのが観察された。さらに、焙煎温度の異なる各種ゴマ材料を用いて調製したゴマ豆腐のテクスチャー測定(RE-3305,山電)を行った。2種のゴマ共にL値は焙煎に伴って低下し、皮むきゴマの方が焙煎に伴う変化が大きかった。脂質、蛋白質は洗いゴマよりも皮むきゴマに多く含まれ、2品種共に焙煎に伴って脂質の変化は少ないが、蛋白質は減少した。炭水化物は洗いゴマの方に多く含まれ、2品種共に焙煎に伴って増大した。あらいゴマの表面には亀甲状の表皮細胞に蓚酸カルシウムが沈着し、焙煎に伴って膨張し、200°Cでは細胞が一部損傷するのが観察された。2種のゴマ豆腐の硬さ、ガム性の値は170°Cで最も小さく、凝集性の値は逆に170°Cで最も大きく、付着性の値は焙煎温度の増大に伴って減少し、「あらいゴマ豆腐」が「皮むきゴマ豆腐」よりも高い値を示した。官能検査では両方共に170°C焙煎ゴマを用いた試料の硬さが最も低く、口ざわり及び総合的な好ましさの評価が最も高くなった。「あらいゴマ豆腐」では、総合的な好ましさと口ざわり及び弾力性の関係に正の高い相関(r=0.91)が得られた。ゴマを炒る時は「3粒はぜたら、火を止める」といわれている。あらいゴマ、皮むき白ゴマ2種について電気ガスオーブンにより、160、170、180、190、200°Cで10分間加熱して焙煎温度の異なるゴマ材料を用いて試料を調整した。クリープ測定(RE-305,山電)の結果、瞬間弾性率(EO)、遅延弾性率(E1)、遅延粘性率(η1)、定常粘性率(ηN)の4要素モデルとして解析され、それらの値は、あらいゴマ豆腐、皮むきゴマ豆腐共に、170°C焙煎ゴマ豆腐が最も低かった。割断面の観察では、170°C焙煎ゴマは最も空砲が大きく、190°C焙煎ゴマ豆腐は170°Cの試料よりも小さく、構造は緻密になった。官能検査の結果から、170°Cあらいゴマ豆腐、皮むきゴマ豆腐が最も軟らかく、弾力、口ざわりも最も高く評価された。これらゴマ豆腐の力学的な性質は、ゴマ成分が影響していると考えられる。さらに、2種のゴマ材料を用いてゴマ豆腐を調製する際にゴマ油を添加して調整した試料の経時的変化について、テクスチャーとクリープを測定し、油脂含量の影響を調べた。その結果、油脂含量が増加するほど、硬さ、ガム性は、保存日数に伴い、高くなるが、凝集性、付着性は低下した。また(EO)、(E1)、(η1)、(ηN)すべてにおいて、油脂含量の高くなるほど、値も高く、貯蔵日数に伴って増大した。官能検査から、おいしいと感じる油脂含量は、3.4%6.4%であり、その油脂濃度は、ゴマ豆腐として最も基本的な配合割合であるゴマ40g、葛40g、水450gで調製された試料であることがわかった。あらい黒、白ゴマ、皮むき白ゴマ3種について電気オーブンにより160,170,180,190,200°Cで10分間加熱したゴマ材料を用いてゴマ豆腐を調製した。調製方法は、ゴマ40gに水250g加えて、3分間ミキサーにて攪拌し、さらに200g加えて、50メッシュのフルイを通して、ゴマ乳435gを得た。ゴマ乳に本葛デンプン40gを加え、攪拌機を用いて、250rpmで25分間攪拌し、テフロン製円筒型(20×20mm)に流し入れ、凝固させた試料を15時間後、試料温度20°Cでレオナー(RE-3305,山電)を用いて、破断測定を行ない、あわせて、寒天ゲルの破断特性も検討した。さらに、官能検査を行い、破断特性値と評点との相関について検討した。その結果、あらい黒ゴマ豆腐は、未加熱ゴマ、焙煎ゴマ共に、破断応力、破断歪率、破断エネルギーが最も高いことから、最も硬く、破断しにくい、噛みごたえのあるゲルであることがわかった。次に破断応力が高いのはあらい白ゴマ豆腐であった。
値最適化による有向マトロイドの構造解析とその実代数幾アルゴリズムへの展開

まず、研究計画にも挙げた有向マトロイドの自己同型群の研究を進めた。昨年度、マトロイドとしての対称性を幾何的に実現できないような点配置を複数発見し、マトロイドの自己同型群とアフィン対称性で定義される幾何的対称性で定義される自己同型群には大きな差がありそうであることを発見したが、本年度はそれをさらに拡張し、任意の非自明な回転対称性を持つ2次元点配置からそのような性質を持つ3次元点配置を構成する手法を提案し、マトロイドの自己同型群と幾何的対称性の間に大きな差があることを明確にした。また、その原因がマトロイドに対し、非自明2次元回転の不動点は唯一存在するという性質に対応する性質がないことを特定し、有向マトロイドに対し、そのような性質に対応する性質を証明した。これは、有向マトロイドの自己同型群が幾何的に定義される自己同型群と似た構造を持つことを示唆するとともに、これから不動点定理を元に自己同型群の解析を行うという方針を与える結果である。次に、前年度に引き続き、線形計画グラフの組合せ的性質を研究した。前年度までは、線形計画グラフの組合せ的性質としてのシェリング性の有用性を示すため、他の3つの知られている性質(非閉路性、唯一シンク性、Holt-Klee性)を満たすがシェリング性を満たさない多面体グラフの無限族の構成法を研究したが、本年度は、別の角度から有用性を示した。具体的には、十字多面体上の線形計画グラフがシェリング性で完全に特徴づけられることを示した。また、他の3つの性質では特徴づけが不可能なことも示し、さらに、他の3つの性質を満たすがシェリング性を満たさない向き付けの数を十字多面体上で具体的に評価した。この結果により、シェリング性を用いた線形計画の研究がより促進されることが期待できる。まず、研究課題として挙げていた要素数8・ランク4、要素数9・ランク3、要素数9・ランク6の有向マトロイドの実現可能性の分類に取り組み、実現可能性を証明する新たな代数的手法の開発を行うことで、それらの分類を完全に解決した。その結果、退化を含んだ点配置の初めての大規模なデータベース作成に成功した。また、その結果から9頂点からなる5次元多面体を完全に分類した。この結果は、これからより大きなサイズのデータベースを用いて、計算幾何・離散幾何の予想の妥当性の検証、反例の構成、性質の発見を可能にする非常に意義のある研究である。この結果は、Canada-Japan Workshop on Discrete and Computational Geometryで発表した。また、有向マトロイド理論と密接に関連しながら研究が発展してきた線形計画問題の研究も開始し、線形計画問題における単体法の可能なピボット規則全体を表すLP digraphの持つ性質の1つであるシェリング性に関して、その有用性を示した。線形計画問題の強多項式時間アルゴリズムは今日、組合せ最適化における一大未解決問題であるが、LP digraphのよい特徴づけを与える問題もそれと関連して重要な未解決問題である。現在、シェリング性を含めた4つの必要条件が知られているが、シェリング性については、ほかの3つの条件と比較したときにどれほど有用なのか知られていなかった。そこで、シェリング性を満たさないが、他の3つの条件を満たす多面体グラフの無限族を構成し、シェリング性がLP digraphの必要条件を非常に強めるものであることを示した。この結果は6th Japanese-Hungarian Symposium on Discrete Mathematics and Its Applicationsで発表した。本研究は有向マトロイドの実現可能性分類を通じて、さまざまな対象の組合せ構造の分類を行い、その性質解明を行うことを目的とする。昨年度は実現可能性判定の強力な手法を提案し、点配置・多面体・超平面配置の組合せ構造の大規模な分類を行ったが、本年度は次のように新たな対象を研究対象とし、次のような新たな展開が得られた。まず1つに、幾何的に実現できない組合せ的対称性を持つ(無向)マトロイドを実現可能性問題の変形版を考察することにより7つ構成した。これらはいずれも現在知られている例で最も小さな要素数をもつものである。さらにそれらがある共通の性質を持つことを見出し、超平面配置の自己同型群との比較により、研究計画に挙げた有向マトロイドの自己同型群の解析に向け、重要な手がかりを得た。また、有向マトロイドの実現を与える手法を少し変更し、組合せ球面の多面体実現を与える手法を考え、2-simple,2-simplicialな4次元多面体の頂点数分類を完結した。2-simple,2-simplicialな4次元多面体は"極端な"面の数を持つ多面体としてさかんに研究されてきたものであり、本結果は多面体の複雑性への理解を深める結果である。さらに、有向マトロイドの部分列挙と実現可能性分類を通じて、超立方体上の線形計画向き付け・P行列により定義される線形相補性向き付けの列挙のアルゴリズムを与えたほか、全く別のアプローチとして、有向マトロイド補完問題を通じて任意の多面体上の線形計画向き付けの列挙を行う手法を考案し、それぞれ実際の分類を開始した。さらに、有向マトロイドの実現可能性分類を通じて、超平面配置の平均直径に関するある予想を反証した。

昨年度、マトロイドとしての対称性を幾何的に実現できないような点配置を複数発見し、マトロイドの自己同型群とアフィン対称性で定義される幾何的対称性で定義される自己同型群には大きな差がありそうであることを発見したが、本年度はそれをさらに拡張し、任意の非自明な回転対称性を持つ2次元点配置からそのような性質を持つ3次元点配置を構成する手法を提案し、マトロイドの自己同型群と幾何的対称性の間に大きな差があることを明確にした。また、その原因がマトロイドに対し、非自明2次元回転の不動点は唯一存在するという性質に対応する性質がないことを特定し、有向マトロイドに対し、そのような性質に対応する性質を証明した。これは、有向マトロイドの自己同型群が幾何的に定義される自己同型群と似た構造を持つことを示唆するとともに、これから不動点定理を元に自己同型群の解析を行うという方針を与える結果である。次に、前年度に引き続き、線形計画グラフの組合せ的性質を研究した。前年度までは、線形計画グラフの組合せ的性質としてのシェリング性の有用性を示すため、他の3つの知られている性質(非閉路性、唯一シンク性、Holt-Klee性)を満たすがシェリング性を満たさない多面体グラフの無限族の構成法を研究したが、本年度は、別の角度から有用性を示した。具体的には、十字多面体上の線形計画グラフがシェリング性で完全に特徴づけられることを示した。また、他の3つの性質では特徴づけが不可能なことも示し、さらに、他の3つの性質を満たすがシェリング性を満たさない向き付けの数を十字多面体上で具体的に評価した。この結果により、シェリング性を用いた線形計画の研究がより促進されることが期待できる。
イヌ第VIII因子蛋白の発現と乳化及びその性状

本研究はイヌモデル血友病Aの遺伝子治療をめざして、イヌ第VIII因子蛋白についての研究をおこなうものである。本年度の研究実績は下記のとおりである。1、イヌ第VIII因子抗原の測定系の確立。約10000Bu/mlの高力価ヒト同種抗体を用いたサンドウイッチELISAで測定したイヌ血漿の第VIII因子抗原(FVIII:Ag)はイヌ血漿の100%でヒト血漿の約12.5%のODしか得られなかった。最近発売された第VIII因子の測定キットAsserachrome(Diagnostica,Stago)にて測定したところ、イヌ血漿でもヒト血漿同様のODを得られた。奈良医大小児科にて飼育中の血友病A犬のFVIII:Agは1%以下で重症型のcross-reacting material negativeであることが判明した。またこのキットで測定した正常マウス血漿のFVIII:Agは1%以下でマウスとのcross reactivityは無く、マウスを使用したイヌ第VIII因子を使った基礎的実験にもこの測定系は有効だと思われた。2、イヌ第VIII因子蛋白の発現実験。E1a,E1bとE3の部分を除いたアデノウイルスベクターpAxCAwt(TAKARA)にBドメインを除いたイヌ第VIII因子を組み込み293cell上でDNA-TPC法用いてイヌ第VIII因子を作るアデノウイルスを作製した。このアデノウイルスをCOS1細胞に感染させin vivoでのイヌ第VIII因子蛋白の発現実験を行った。4日目の上清で測定したイヌ第VIII因子活性(FVIII:C)は200%、イヌ第VIII因子抗原(FVIII:Ag)は18%であり、活性と抗原値に解離はあったがまずまずの発現が認められた。Accumulation studyでは4日目の上清で測定したイヌ第VIII因子活性(FVIII:C)は300%とさらに高い活性値が得られる事ができた。今後このベクターを用いマウスやイヌを用いたin vitroの実験を行う予定である。
Ｇタンパク質シグナル複合体の解析

Gタンパク質を介するシグナルは、数多くのホルモンや神経伝達物質によって誘導される様々な細胞応答において働いており、そのシグナル伝達構成因子を標的とした薬剤が広く使用されている。近年、私共の研究等から新しいGタンパク質シグナル制御機構が見つかってきた。本研究は、新たなGタンパク質シグナル複合体を同定し、その構造と機能を明らかにして、創薬研究の基盤を築くことを目的としている。本年度、以下の成果が得られた。(1)リガンド不明のオーファンGPCRの一つであるヒトGPR56に対するモノクローナル抗体の作成と評価を行ったところ、ヒトグリア腫細胞U87-MGの遊走を阻害する抗体がいくつか得られた。(3)GPR56の細胞外ドメインをN末及びC末より順次部分欠失した変異体をHEK293細胞に発現させ免疫染色とウエスタンブロット解析を行ったところ、アゴニスト様に働く3つの抗体はN末側100アミノ酸あるいは細胞膜近傍の100アミノ酸を認識していることが明らかとなった。(3)抗体による細胞遊走阻害作用はGq特異的阻害剤YM-254890、Rhoキナーゼ阻害剤によりキャンセルされた。(4)これらの抗体が細胞内カルシウム上昇を引き起こし、その効果がYM-254890により阻害されることも判明した。以上、GPR56を介してGqが活性化されカルシウム応答が引き起こされるとともにRhoキナーゼの活性化が起こると遊走が阻害されることが明らかとなった。(5)ショウジョウバエの原腸陥入に異常を示すGタンパク質制御分子Ric-8の変異体atxを用いた解析を進めたところ、atx変異により哺乳動物Gα12のショウジョウバエホモログCtaとRic-8の相互作用が減弱することが明らかとなった。(6)ショウジョウバエS2細胞を用いた解析から細胞形態変化やミオシンとCtaの局在をRic-8が調節していることが判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。Gタンパク質シグナルは脳神経系、循環器系など数多くの生体調節システムにおいて働く重要な情報伝達系である。Gタンパク質共役受容体(GPCR)を標的とした薬剤が世界中で使用され、このシグナル伝達系の構成因子をターゲットとした新しい薬剤の開発が望まれている。本研究では、新たなGタンパク質シグナル複合体の同定、およびその複合体の構造と機能を明らかにして、創薬研究の基盤を築くことを目的としている。リガンド不明であるオーファンGPCRに属するGPR56,Latrophilin1,LGR5に対する抗体の作成を行った。マウスGPR56の細胞外ドメイン(ECD)を抗原としてラットに免疫して、いくつかのハイブリドーマを得ることに成功した。ウエスタンや免疫染色に使用可能の抗体が得られたが、GPR56の機能に影響を与える抗体は未だ得られていないので、さらなるハイブリドーマのスクリーニングを行っている。一方、ヒトGPR56に関してアゴニストのように受容体を活性化するモノクローナル抗体が2種類得られた。また抗体と受容体細胞外ドメインの複合体の構造解析を行うために必要な量を得るためハイブリドーマの培養条件や精製法を検討して、一つの抗体においてミリグラム単位での収量が実現した。Latrophilin1ECDに関して発現用バキュロウイルスが得ら精製条件の検討を、LGR5に関してLGR5ECDをマウスに免疫してELISAで陽性を示すクローンをいくつか得る段階にまで進んでいる。一方、Gタンパク質と相互作用してGタンパク質シグナルを制御するRic-8に関してRic-8AおよびRic-8Bを過剰発現、ノックダウンできるアデノウイルスの作成に成功し、神経前駆細胞の増殖、分化、遊走にRic-8A/Bが関与していることが明らかとなった。またGαsのユビキチン化を触媒するE3 ligaseの探索を250種類のRing fingerモチーフを持つ候補分子とAlphaScreenという高感度蛍光相互作用解析系を用いて行い30種類の候補分子を見出した。今後、新たな生理機能を持ったGタンパク質複合体が明らかになる可能性が示された。

以上、GPR56を介してGqが活性化されカルシウム応答が引き起こされるとともにRhoキナーゼの活性化が起こると遊走が阻害されることが明らかとなった。(5)ショウジョウバエの原腸陥入に異常を示すGタンパク質制御分子Ric-8の変異体atxを用いた解析を進めたところ、atx変異により哺乳動物Gα12のショウジョウバエホモログCtaとRic-8の相互作用が減弱することが明らかとなった。(6)ショウジョウバエS2細胞を用いた解析から細胞形態変化やミオシンとCtaの局在をRic-8が調節していることが判明した。24年度が最終年度であるため、記入しない。ほぼ予定通りに進んでおり、次年度のさらなる発展が期待されます。E3 ligaseに特徴的なRing fingerモチーフを持ちGタンパク質αサブユニットGαsと相互作用する可能性のある候補分子が30種類見つかった。複数のE3 ligaseによってGαsがユビキチンン化される可能性、あるいはGαsの下流で働く新たなシグナル伝達分子の可能性が出てきた。今後、個々の候補分子の機能解析により大きな発展に結び付く予想以上の結果が得られ、大きな発展に結びつく可能性が見出された。
移流項を含む反応拡散方程式による集合パターンの漸近解析

1.走化性-増殖モデル方程式の三叉交差をもつ2次元進行パターンの存在について、界面の運動を支配する方程式を用いて、近似解の構成、進行波解の速度と走化性の強さを示すパラメーターとの関係を特異摂動法を用いて示した。2.金属触媒反応のモデル方程式を2次元有界領域で扱う。周期境界条件を課したとき、関数空間を適切に選ぶことにより時間大域解と指数アトラクターが存在することを、Squeezing Propertyが成り立つことを用いて示した。3.金属触媒反応のモデル方程式を2次元平面全体、無限遠方で発展解は平衡解に近づくという境界条件の下で扱う。この場合、時間大域解の存在を示すことが出来た。しかし、コンパクト性が成り立たないことから、指数アトラクターの存在については考察する必要がある。4.金属触媒反応のモデル方程式を2次元有界領域で扱う。ノイマン境界条件を課したとき、時間大域解と指数アトラクターの存在を示した。また、数値計算により定数定常解の分岐点の近傍でHexagonalパターン、stripeパターンを求めた。5.走化性-増殖モデル方程式について、2次元有界領域とNewman境界条件の下で扱う。モデルを考える上で、走化性を表現する感度関数形は一般に原点近傍で特異性を持つ場合がある。この関数を、特異性を持たない関数の極限として扱うことにより、時間大域解の存在を示すことが出来た。また、初期値が小さい場合、解は漸近的に自明解に近づくが、その他の場合は空でないω極限集合を持つ。1.走化性を持つ生物の個体群密度の時間・空間変化を記述するモデル方程式に関して、増殖項が常微分方程式の意味で単安定系である場合、生物の集合パターンについて考察した.サルモネラ菌等はある環境下でスポットターゲットパターンを作ることが知られている.ウッドワードたちは、実験と数値計算によりこのようなパターンの存在を示した.彼らは安定定数定常解が走化性により不安定化することから、このようなパターンが出現することを説明した.我々の扱うモデルでも同様のパターンが不安定化により存在することを示したが、走化性の効果をより強くすることで、規則的な定常スポットパターンがカオス的な振る舞(スポットの衝突・合体と出現)をすることを示した.これは新しい現象であり、走化性を強くするとき、複数の異なった不安定化が同時に起こることにより出現することが数値計算から予想される.2.酸化還元反応の1つであるBZ反応において、フィードバックによる興奮性の光制御を用いて、スパイラルパターンが消滅して進行(アイランド)パターンが出現することを、実験及び数値計算によりショーウォルターのグループが示した.そのような進行パターンの存在を理論的に示すために、スパイラルパターンを近似するのに用いられているキネマティック方程式を考察した.特に、この進行パターンの存在条件を光制御のパラメーターを用いて示したことは重要である.3.ミカイロフらにより、金属触媒による気体分子の反応現象を記述した反応拡散方程式が提唱された.空間1次元、周期境界条件の下でこの方程式が大域解と指数アトラクターを持つことを示した.重要な点は、周期境界条件の下で微分作用素の分数ベキの定義域を特徴付けることである.1.走化性一増殖モデル方程式の三叉交差をもつ2次元進行パターンの存在について、界面の運動を支配する方程式を用いて、近似解の構成、進行波解の速度と走化性の強さを示すパラメーターとの関係を特異摂動法を用いて示した。

ノイマン境界条件を課したとき、時間大域解と指数アトラクターの存在を示した。また、数値計算により定数定常解の分岐点の近傍でHexagonalパターン、stripeパターンを求めた。5.走化性一増殖モデル方程式について、2次元有界領域とNewman境界条件の下で扱う。モデルを考える上で、走化性を表現する感度関数形は一般に原点近傍で特異性を持つ場合がある。この関数を、特異性を持たない関数の極限として扱うことにより、時間大域解の存在を示すことが出来た。また、初期値が小さい場合、解は漸近的に自明解に近づくが、その他の場合は空でないω極限集合を持つ。
高等植物Ca^<2+>チャネル遺伝子とCa^<2+>シグナル関連遺伝子群の単離と解析

本研究の目的は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のCa^<2+>流入欠損株(midl変異株)の致死性を相補する高等植物のcDNAをスクリーニングすることにより、高等植物のCa^<2+>チャネルcDNA、およびそれと関連してはたらくCa^<2+>シグナルの受容・伝達因子やCa^<2+>チャネル制御因子などのcDNA群を単離し、解析することである。本重点領域研究により、出芽酵母のmidl変異株の条件致死性を部分的に相補するcDNAを、シロイヌナズナ実生のcDNAライブラリーから6個、タバコ培養細胞BY-2のcDNAライブラリーから6個を単離することができた。それらの塩基配列を決定した結果、シロイヌナズナ実生のcDNAライブラリー由来のクローンには、Ca^<2+>チャネルのcDNAは含まれていなかったが、低分子量Gタンパク質の一種であるADP-リボシレーションファクター1(ARF1)のアラビドプシスホモログ、UDP-グルコースエピメラーゼ、セルラーゼ、グルタルレドキシン(superoxide scavenging system)および機能不明のタンパク質(2種)のcDNAが含まれていた。また、タバコ培養細胞BY-2のcDNAライブラリーからは、β-チューブリン、UDP-グルコースエピメラーゼ、システインプロテアーゼインヒビター(シスタチン)、25SrRNA(2個)および機能不明のタンパク質(1種)のcDNAが得られた。
動物細胞におけるADPリボシル化反応の生理的役割と制御機構の解析

申請者は昨年度の本研究に於いて、細胞におけるADPリボシル化反応の機能を解明することを目的として、ADPリボシル化されたarginine残基からADPリボースを遊離する酵素(ADP-ribosylarginine glycohydrolase;ARGと略記)と相互作用する蛋白質のスクリーニングを行い、既存の蛋白質とは相同性を有さない新規遺伝子(ARGIP)のクローニングに成功した。本年度の研究に於いてはARGの周辺分子をさらに検索し以下の知見を得た。1.これまで動物細胞にはARGは1種類しか報告されていなかったが、データベースを用いた検索及びマウスcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ARGと相同性を有する2種類の新規ARG類似蛋白質(ARP1、ARP2)をクローニングした。2.ARP2には、ARGにおいて種間を越えてよく保存されている活性に重要なアミノ酸が存在したが、ARG1では別のアミノ酸に置き換わっていた。そこでリコンビナント体のARP1を大腸菌の発現系を用いて調整し脱ADPリボシル化活性を測定したところ、予想通り活性は検出されなかった。3.次にARP1の様々な点変異体を作製し酵素活性を持つようになるかを検討したところ、ARGで保存されているアミノ酸に置き換えた点変異体でも、酵素活性は検出できなかった。つまり脱ADPリボシル化活性にはこれまでに報告されているアミノ酸残基以外の部分も重要であることが示唆された。4.さらにARP1およびARP2は、先にクローニングしたARGと相互作用する分子であるARGIPとは相互作用しなかったことから、これら類似分子は細胞内でARGとは異なった局面で機能しているのではないかと推察された。先に申請者らのグループはシグナル伝達系におけるNAD代謝酵素の役割に興味を持ち、細胞表層のNAD水解酵素の実体が細胞表面抗原CD38であることを明らかにすると共に、NADを基質とするADPリボシル化反応の生理的意義についての研究を行ってきた。本研究ではADPリボシル化されたarginine残基からADPリボースを遊離する酵素(ADP-ribosylarginine glycohydrolase;ARGと略)についての検討を行い、以下の知見を得た。1)これまでにARGの活性調節因子や相互作用する蛋白質の存在に関する知見はなく、そららの分子の同定はその機構を検討する上で有用な手がかりを与えると考え、酵母two-hybrid systemによる相互作用分子の検索を行ったところ、既存の遺伝子とは相同性を示さない新規の蛋白質をコードするcDNAを得た(以下ARGIPと呼ぶ)。2)蛋白質レベルでの相互作用を調べる目的で、GST-ARGを用いて共沈降実験を行ったところARGIPとARGはin vitroで結合することが確認され、さらに興味深いことにこの相互作用は酵素活性が低下したARGでは減弱する傾向が見られた。2)ARGIPの欠損変異体を用いた検討により、この結合にはARGIPのC末端約30アミノ酸が重要であることが明らかとなった。3)ラット各臓器よりtotal RNAを調製し、ノーザンブロッティングによりARGIPのmRNAの発現分布を調べたところ、すべての臓器について発現が見られたが、特に脳で発現量が多く、ついで精巣、肝臓で発現量が多かった。4)共焦点顕微鏡によりARGとARGIPの細胞内局在を検討したところ、ARGは細胞内全体に存在したが、ARGIPは核内に多く存在することが明らかになった。
低酸素誘導性転写因子に拮抗する新規蛋白IPASのがん増殖、進展における役割

低酸素誘導性転写因子(HIF-1)は低酸素分圧下における多くの遺伝子の発現を制御し、細胞、組織、個体レベルの適応に重要な役割を果たしている。近年、固形がんにおいてHIF-1システムの異常が見い出され、HIF-1はがん治療の新たな標的分子の一つとして位置付けられる。申請者らは、最近、HIF-1機能を抑制性に調節する新規分子IPAS (=inhibitory PAS protein)を発見した。・IPAS遺伝子のクローニングとそのプロモーター解析、ならびにmRNA産生機構を解析した。IPAS mRNAはHIF-3αmRNAと共通の遺伝子から産生されることがわかった。さらに、IPAS mRNA発現は、低酸素分圧で誘導され、その際、選択的スプライシングのレベルで興味ある制御を受けていることが示唆された。かかる低酸素分圧下におけるスプライシング制御は世界でも初めての発見であり、その分子機構解明に向けて取り組んでいる。・IPAS特異的抗体をGST融合IPASを用いて作成中である。今後、IPAS蛋白の分布、発現量を解析する。ii)IPASによるHIF-1機能抑制の分子機構・HIF-1にIPASが蛋白蛋白相互作用し、HIF-1のDNA結合活性ならびに転写活性を抑制することがわかった。・現在、HIF-1の転写コファクターリクルートに与えるIPASの作用についても興味ある結果が得られつつある。iii)がんの増殖・進展におけるIPASの意義の解明(牧野とPoellingerが共同で実施)・がん細胞の増殖・血管新生に対してアンチセンスIPASが抑制性に作用することがわかった。RNAiを用いてHIF-1αのノックダウンも試みており、IPASアンチセンスの結果と対比して検討予定である。