hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フッ素徐放性修復材と象牙質内液移動による窩洞底部再石灰化に及ぼす影響に関する研究

従来確認した象牙質内液移動とフッ素徐放性歯科材料の複合因子による窩洞底部の再石灰化に及ぼす影響を確認し、最適な条件を検討する目的でin vitroでの検討を試みた。抜髄したウシ切歯の歯冠にモデル窩洞を形成し、窩洞内面に0.1M乳酸ゲル(pH5)で人工初期齲蝕を形成した。その後、各フッ素徐放性歯科材料(Fuji Ionomer Type II, Fuji Luting, Fuji II LC, Unifuil^【○!R】F, GC)をメーカー指定の方法で充填した。その試料の髄腔内に象牙質内液ミネラル基準溶液で満たし、隨腔内圧を±0mmHg(無圧),+20mmHg,(Fuji Ionomer Type IIのみ)に調節し、作用させた。7日後、窩洞底部のミネラル濃度分布をマイクロラジオグラフィと画像定量法により評価した。無圧条件の脱灰深度Ld,ミネラル喪失量ΔZは、各フッ素徐放性歯科材料において有意差が認められなかった。一方、Fuji Ionomer Type IIでは、マイクロラジオグラフィ像から、無圧条件に対し、生理的な条件(+20mmHg)において窩洞底部のミネラル回復傾向が確認された。生理的な条件と無圧条件間Ld,ΔZに有意差が認められた。このことから、フッ素徐放性歯科材料では少なくとも無圧条件で窩洞底部の再石灰化を促進することが確認され、窩洞内の保護に重要な役割を果たす可能性が示唆された。象牙質内液移動の有無が窩洞底部での再石灰化に大きく影響することが明らかであり、このことは、実験条件としても重視すべきであると考えられる。今後は、各フッ素徐放性歯科材料の生理的な髄腔内圧条件(+20mmHg, +30mmHg, +40mmHg)を追加し、最石灰化条件効果を検討するとともにこれらの窩洞底部の断層構造を共焦点レーザー顕微鏡で確認し、元素組成の分布プロファイルをFT-IRにより分析する。
炎症性の生理活性をもつ“新規アディポサイトカインとしてのHMGB1"の提唱

【目的】H21年度の研究成果として、肥大した脂肪細胞から分泌されたHMGB1はマクロファージを脂肪組織にリクルートし、このマクロファージと脂肪細胞の相互作用によるTNF、HMGB1などの分泌増加がさらに脂肪組織における炎症性変化を増大(vicious cycle)させていること、そしてこの慢性炎症性の脂肪組織からのHMGB1が動脈硬化を促進する要因のひとつとなっていることを証明できたため、H22年度はこの局所の脂肪細胞から分泌された"炎症性の生理活性をもつ新規アディポサイトカインとしてのHMGB1"が、全身性にどのようにインスリン抵抗性、糖代謝などメタボリック症候群の病態形成に関係しているのかについての研究を行った。(1)インスリン抵抗性の評価脂肪細胞(3T3-Lladipocyte)をHMGB1でpretreatしその後インスリン刺激したときp-AKTの低下を認め、HMGB1は脂肪細胞においてインスリン抵抗性の生理活性を持つアディポサイトカインであることを証明できた。また人肝細胞のHepG2についても現在インスリン抵抗性について評価中である。その他AMPKとHMGB1についても解析中である。これまでに我々は肥満マウスと糖尿病マウスでは、健常マウスに比べ、有意に血中HMGB1が高値になっており、これはアデノウイルスを使ったアディポネクチンの投与(im)より低下することを認めている。さらにこれら肥満マウスや糖尿病マウスに抗HMGB1中和抗体を用いて血糖値改善、インスリン抵抗性の改善、動脈硬化改善の有無を解析中である。その他HMGB1ノックアウトマウスへのHMGB1投与による血糖値上昇、インスリン抵抗性、動脈硬化進展の評価を行っている。以上の結果からH22年度の研究成果として、肥満マウスや糖尿病マウスでは局所の脂肪組織からHMGB1が分泌され、これが動脈硬化や全身性のインスリン抵抗性の原因のひとつとなっていることが証明できたと考察している。"炎症性の生理活性をもつ新規アディポサイトカインとしてのHMGB1"の観点から、脂肪細胞から分泌されたHMGB1がどのように糖代謝、脂質代謝などメタボリック症候群の病態形成に関係しているのかについて研究を行った。(1)脂肪組織における炎症性メディエーターとしての役割の解明では、HMGB1刺激による、脂肪細胞(3T3-Lladipocyte)からのアディポネクチン、PAI-1、TNF、MCP-1、IL-6などのアディポサイトカインの分泌動態を評価したが有意な変化は認めなかった。しかし、脂肪細胞の肥大化に伴うHMGB1の分泌増加の有無の評価では、脂肪細胞の肥大化とともにHMGB1の分泌が増加し、これはアディポネクチンの分泌とは逆相関の関係にあることを確認した。(2)インスリン抵抗性、糖尿病、糖・脂質代謝異常との関連についての解明では、HMGB1刺激による、膵β細胞(MIN6)からのインスリン分泌に変化は見られなかった。HMGB1刺激による、脂肪細胞(3T3-Lladipocyte)のシグナル伝達の評価では7.5分をmaxにP-ERK、P-JNKのシグナルが増大した。インスリン抵抗性の評価は、現在研究継続中である。以上の結果からH21年度の研究成果として、肥大した脂肪細胞から分泌されたHMGB1はマクロファージを脂肪組織にリクルートし、このマクロファージと脂肪細胞の相互作用によるTNF、HMGB1などの分泌増加がさらに脂肪組織における炎症性変化を増大(vicious cvcle)させていること、そしてこの慢性炎症性の脂肪組織からのHMGB1が動脈硬化を促進する要因のひとつとなっていることを証明できたと考察している。
いもち病菌エフェクターAVR-Pikとイネ因子Pik及びHMA相互作用の解明

イネ抵抗性遺伝子Pik1及びRGA5のもつHeavy metal associated (HMA)ドメインは、直接的相互作用によっていもち病菌(Magnaporthe oryzae)から分泌されるエフェクターを認識する。いもち病菌のエフェクターAVR-PikDは、複数のHMAドメインを含む低分子タンパク質(sHMA)を、直接的相互作用によって安定化させることを見出した。sHMA遺伝子は、罹病性遺伝子として機能し、活性酸素種を負に制御することが明らかとなった。これらの発見は、いもち病菌エフェクターとイネタンパク質の間の進化モデルを考察する上で重要な知見となるものと考えられる。植物病原菌の分泌するエフェクターは、植物の基礎的抵抗性や代謝を操作することにより、病原菌感染の効率を高めていることが、近年示唆されている。しかしエフェクターの機能が詳細に明らかになっている例はまだ数少なく、イネ-いもち病菌においてはほとんど明らかとなっていない。AVR-Pikの相互作用因子として同定されたイネのsHMAタンパク質について、その機能解析をおこなった。1)sHMAタンパク質は、N末にHMA(Heavy Metal Associated domain)領域を含む低分子のタンパク質であり、イネにおいては100種類程存在している。いもち病菌から分泌されたAVR-Pikは、少なくとも8種類のsHMAとタンパク質相互作用することが、酵母Two-hybrid法或いは共免疫沈降法などにより明らかとなった。2)sHMA遺伝子の相同性の高い領域を利用した複数の遺伝子のノックダウン、或いはUTR領域を利用した個々ののsHMA遺伝子のノックダウンしたイネに、親和性のいもち病菌を接種する試験を行った。その結果、sHMA遺伝子のノックダウンにより、いもち病菌に対する罹病性が弱まり、その効果は複数sHMA遺伝子のノックダウンの方が高いことが確認された。以上のことから複数のsHMAが罹病性遺伝子(Susceptibility gene : S-gene)として機能していることが推定された。3)sHMAの過剰発現されたタバコ植物、或いはsHMAのノックダウンされたイネを用いた活性酸素種(ROS)の定量実験から、sHMAはROSスカベンジャーとして機能することで、PTIカスケードを負に制御している可能性が示唆された。植物病原菌の分泌するエフェクターは、植物の基礎的抵抗性や代謝を撹乱することで、植物病原菌の感染効率を高めていることが近年示唆されてきている。しかし、エフェクターの機能が詳細に明らかにされた事例は未だ数少なく、イネ-いもち病菌においてはほとんど明らかになっていない。先に申請者はいもち病菌由来の非病原力遺伝子AVR-Pikタンパク質の相互作用因子として、HMAドメインを含む低分子タンパク質"sHMA"を複数単離同定した。sHMA遺伝子のイネにおけるノックダウン個体を用いた試験の結果から、sHMA遺伝子はいもち病菌の感染を高める機能をもつ遺伝子(罹病性遺伝子)であることが推定された。また、いもち病菌から分泌された非病原力遺伝子AVR-Pikは、酵母Two-hybrid法や免疫沈降法によりsHMAのHMAドメインとタンパク質相互作用することが明らかとなった。そして、N.benthamianaタバコを用いた実験からAVR-Pikは、直接的タンパク質相互作用を通じて、sHMAタンパク質を安定化させていること(分解を抑制)が明らかになった。さらに、in vitroでの活性酸素種(ROS)蓄積量の測定によって、sHMA1或いはsHMA11は何らかのイネ因子とともに、ROSの蓄積を負に制御する機能を持つことが明らかとなった。ROSは植物細胞において基礎的抵抗性のシグナルとして働いていることから、このROS蓄積の抑制がいもち病菌の感染を高め、エフェクターとして働いていることが推察された。EDTA処理や熱処理でsHMAのROS蓄積抑制能は低下したことから、何らかの金属イオンを必要とし、イネ因子は酵素タンパク質であることが示唆された。罹病性遺伝子として機能するイネsHMA遺伝子産物は、活性酸素種ROS、特に過酸化水素の蓄積を負に制御することで基礎的抵抗性を抑えていることが示唆され、そのメカニズムが明らかにされつつある。しかし、このsHMAタンパク質とともに働くイネ因子は単離同定されていないこと、或いは細胞内のタンパク質局在性が不明のままで、機能の全体像が明らかになったとは言いがたい。いもち病菌由来の非病原力遺伝子AVR-Pikタンパク質の相互作用因子として、HMAドメインを含む低分子タンパク質"sHMA"遺伝子を複数同定した。イネにおけるノックダウン個体を用いた試験の結果から、sHMA遺伝子はいもち病菌の感染を高める機能をもつ遺伝子(罹病性遺伝子)であることが推定された。イネ葉或いはN. benthamianaタバコ葉の細胞溶解物を用いたin vitroの実験において、精製sHMA1タンパク質は活性酸素種ROSの蓄積を負に制御することが推定された。EDTAの添加によりsHMA1のROS蓄積の抑制は生じなかったことから、この抑制に金属の関与が考えられた。またさらに、sHMAタンパク質はそれ自体はROS蓄積抑制能がなかったことから、イネ或いはN.benthamianaタバコの何らかの因子とともにROS蓄積を抑制していることが考えられた。

そこで、ROS制御タンパク質群からの選抜、酵母two-hybrid法を用いたsHMA1結合タンパク質の選抜、或いはsHMA1を過剰発現させた植物体からMS/MS解析による選抜などをおこない、sHMA1との結合候補タンパク質を複数同定した。さらに、sHMAはイネにおいて100種類程の遺伝子から構成されるファミリーを構成しており、その中で葉身組織で発現量の高い遺伝子を複数選抜し、AVRとの相互作用及びノックダウンによるイネにおける機能を検討した。イネ抵抗性遺伝子Pik1及びRGA5のもつHeavy metal associated (HMA)ドメインは、直接的相互作用によっていもち病菌(Magnaporthe oryzae)から分泌されるエフェクターを認識する。いもち病菌のエフェクターAVR-PikDは、複数のHMAドメインを含む低分子タンパク質(sHMA)を、直接的相互作用によって安定化させることを見出した。sHMA遺伝子は、罹病性遺伝子として機能し、活性酸素種を負に制御することが明らかとなった。これらの発見は、いもち病菌エフェクターとイネタンパク質の間の進化モデルを考察する上で重要な知見となるものと考えられる。いもち病菌由来のエフェクターAVR-Pikは、イネにおいて少なくとも8種類のsHMAタンパク質と相互作用すること、さらにsHMAはROSスカベンジャーとして機能すること、などの新規な結果を得た。この点において概ね順調に進展していると思われる。しかし、AVR-PikとsHMAとの結合による細胞内局在性の変化、或いはsHMAがどのようなメカニズムでROSスカベンジャーとして機能するのかについては明らかになっておらず、課題として残っている。罹病性遺伝子として機能するイネsHMA遺伝子産物は、活性酸素種ROSの蓄積を負に制御することで基礎的抵抗性を抑えていることが推定された。このsHMAタンパク質とともに働くイネ因子を単離同定し、そのROS蓄積抑制のメカニズムを明らかにする。また、いもち病菌由来の非病原力遺伝子AVR-Pikは、いもち病菌の感染を高める機能をもつ遺伝子(罹病性遺伝子)であることから、いもち病菌由来のエフェクターとして機能することが推定される。AVR-Pik産物がsHMA産物と細胞内のどこで、どの様に相互作用しエフェクターとして機能するのかを明らかにする。さらに、sHMAはファミリーを構成しているが、sHMA1やsHMA11以外の他のsHMA遺伝子について、罹病性遺伝子として機能するのか、その機能メカニズムをイネ協働因子との関連から推定する。AVR-PikとsHMAタンパク質の相互作用について、結晶構造解析から詳細を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物病理学イネsHMAがどのようなメカニズムで罹病性遺伝子として機能しているのか、いもち病菌由来のAVR-PikのsHMAへのタンパク質相互作用にはどのような意味があるのか、について明らかにすべく研究を推進する。
北海道・東北を中心とする北方交易圏の理論的枠組み構築のための総合的研究

本研究では、古代から近代初期において、本州(主に東北地域)と北海道との間で行われた交易について、資料の所在に関する目録を作成し、かつそれらの資料の分析を行った。特にアイヌとの交易では、威信財に関し、装飾品であるガラス玉を越田が、陶磁器に関して関根が、菊池が煙草等の嗜好品に関して分析した。さらに遠藤は、災害時等にアイヌが管理していた物品(馬を含む)をめぐり、アイヌ・和人双方がどのような行動を行ったかを明らかにし、品田が口頭伝承において、交易物資がどのように扱われているかを研究した。百瀬は漁場労働での支給品やアイヌによる購入品に関し論文を発表し、本研究における資料目録・論文集を作成した。研究代表者の百瀬は、明治初期に開拓使からの委託を受けてアイヌとの交易を担った「広業商会」についての調査を行った。いまだ調査の途上にあるが、現時点で、広業商会の本務であった清国貿易においても、アイヌとの交易品が漢方薬原料として大きな地位を占めていたことが判明した。ほかにも本研究の意義の一つでもある、アイヌ交易の実態を教授する方法論についても、学校教育から高等教育における現状とより歴史に即した形で提示する必要性を、学会・論文双方で発表した。研究分担者の関根は、考古学の分野から、静内シベチャリ遺跡における近世の陶器資料の分析について記し、和人ーアイヌ間の交易のあり方の実態を、論文に作成した。同じく、研究分担者の遠藤は、地理学の分野において、アイヌ集落の現状について近世史料を精査することによって、アイヌー和人間の交易がどのように浸透していたかを、論文・学会発表、講演などを通じて明らかにした。越田は、考古学の分野において、北海道・東北で出土したガラス玉の基礎研究を行い、本州との交易物資の中継地である平泉に関する研究を、論文にまとめるとともに、講演を行った。さらにアイヌ文化に先行するオホーツク文化/擦文文化についても、土器形態の変容が本州の文化の影響下にあることを、著書(共著)で発表した。研究協力者の菊池は、近世史の立場から、松前藩とアイヌの交易の実態を著書で発表した。さらに19世紀後半の記録から、アイヌの物質文化を浮かび上がらせるという手法によって、論文(共著書)を発表した。以上、核研究分野において、アイヌ交易を物質文化から実態を明らかにしようとする、新しい試みがなされ、多数の成果が提出された。平成26年度は、研究代表者・分担者および協力者による会議において、これまでの研究成果を発表し、来年度のシンポジウムにそなえた。代表者の百瀬は、幕末の余市場所に関する文書および近代の例としては明治初期にアイヌ交易をおこなった「広業商会」文書を精査し、アイヌー和人間の交易物資、数量(年間)、労働対価を明確化した。この研究内容については、いまだ調査継続中であるが、今年度中に論文化する予定である。またこの研究の応用として、高等教育におけるアイヌ文化教材化に関して、従来の授業による学生のアイヌイメージ形成の現状・改善点を含めた論功を発表したほか、『アイヌの民俗』の著者である早川昇ノート整理を遺族らから託され、現在、幕末から近代の交易や威信財に関する資料の解読を進めている。研究分担者の越田は、ガラス玉(アイヌ玉)に関する研究において論文を発表したほか、製作地を調査し、近世以来の伝承・技術のほか、製作者らによる玉の分類法とそのサンプル採取を行った。同じく分担者の遠藤は、近世の請負場所において、災害時の被害状況とアイヌー和人の協同の状況について、とくに財産としては、飼育していた馬の扱いをめぐる行動様式を明確化した。また、分担者の関根は、中世から近代初期の長いスパンにおいて、東北・北海道にみられる特定の陶器(油瓶ほか)の分布から、交易ルートを明確化した。研究協力者の菊池は、近世東北において生産された物質を中心として、近世北海道全域の請負場所で流通した実態を明確化した。同じく協力者の品田は、金田一文庫の悉皆調査結果から、交易に関する記述を近世から近代にいたるまで明らかにした。平成27年度は、研究代表者・分担者および協力者により、北海道余市町教育委員会の協力のもと、「北海道・東北を中心とする北方交易圏の理論的枠組み構築のための総合的研究」シンポジウムを、余市中央公民館(11月29日)において開催した。シンポジウム開催地の資料を主な研究対象として、それぞれのメンバーが、古代から近世末期までの同地が、本州以南・樺太との交易がおこなわれていたかに関し、研究発表を行った。同地での資料収集・研究を地元の郷土研究に興味のある人々に還元する、というのがシンポジウム地選定の理由であったが、余市以外にも北海道各地から参加者が集まり盛況を呈した。考古学分野では、通時的な余市への外部からの物質文化流入の概観(研究協力者・乾)とアイヌ玉(越田)・交易に用いられた酒樽・徳利の研究(関根)成果が発表された。これらの研究によって、具体的な交易物資の確認とその数量の概算から、交易量を推定する試みがなされた。歴史・地理分野からは、酒と並んで場所経営に重要な役割を果たした、煙草と馬に関する研究成果が提出された。前者は、北海道で使用された煙草の種類(生産地)と当時の値段を東北・北海道の双方から検討した(研究協力者・菊池)。後者は、災害時に馬守り役であったアイヌと和人の行動から、両者の関係性をさぐるというユニークなものであった(遠藤)。口頭伝承研究では、余市を舞台にした交易が明記されている伝承を分析した(研究教両者・品田)。

幕領化時代の林家文書を用い、年間の漁場労働・儀礼日程とその労働の種類の特定から、和人による物品支給、アイヌの給与と和人商人からの購入品およびその価格、漁場でのアイヌの自分稼ぎや他の労働賃金を計算した(百瀬)。以上は余市を中心とした研究成果であるが、この基礎研究を通して、他の地域のアイヌー和人間の関係性を研究する上でも有効となる新しい手法を提示しえたと考える。昨年度、研究代表者が親族の介護・葬儀および自身の入院を経て、時間的な不足を生じたにもかかわらず、平成27年度11月末に予定通りシンポジウムが開催され、予想していた以上の成果を出すことができたと考える。シンポジウムは余市町の資料から、北海道と本州・樺太との交易の実態を明確化しようとしたが、一地域に限ったことによって、むしろアイヌー和人間の交易の具体的研究を、各分野で提示・比較検討することができた。交易物資として何を対象化すべきかという問題についても、ある程度明確化することができた。また、この作業によって、今後、各時代・各地を通時的に研究し、それを複数の学問分野から総合的に精査することによって、より「現実」に近いアイヌー和人間の関係性を理解する手法の確立が可能になったと考える。また、社会還元という意味では、余市におけるシンポジウムでは、一般市民の生涯学習への還元をすることができ、研究者のみではなく、一般の参加者からの反応も良かった。以上のような理由で、研究成果としては、今後の発展性という面では、予想をはるかに上回る成果を出し得たと考える。しかしながら、本研究の今後の研究者が利用しうる「基礎資料」の提示という面では、収集資料の資料目録作成が途上であることから、「おおむね順調に進展している」とした。最終年度は、研究成果報告書『北海道・東北を中心とする北方交易圏の理論的枠組みのための総合的研究』(全278頁)を作成して、アイヌの威信財や交易品に関わる資料目録と論文を発表した他に、研究代表者・研究分担者の成果として、研究論文4本の成果を発表している。本研究成果のまとめである報告書では、アイヌ-和人間の交易に関わる資料目録を作成し、基礎資料調査の結果を示すとともに、論考により分析的研究を行っている。アイヌの威信財に関する考古学成果として、2名の研究分担者が、ガラス玉および陶磁器について、各自出土遺跡地名表を著し、特定の遺跡出土品の分析をするとともに、後者では「蝦夷地の内国化」に関する論述を行った。他に協力者である乾は、余市地方とアイヌ文化に関する古代から近代までの通時的な実態を論実して明確化した。歴史学では、研究協力者である菊地が、嗜好品(煙草)の種類・東北との流通経路の分析を行い、他にも「高島場所」に関する、漁場経営における配布物を分析する論考の寄稿を受けた。地理学分野では、災害等の危機的状況の際に、物やアイヌが管理していた馬をどう扱ったかを含め、近世有珠山噴火の被災状況からその実態を分析した。文化人類学分野では、研究代表者が、近代初期の物品交換に関する史料目録を作成した他、近世余市場所での幕府・場所請負人からのアイヌへの給与・配布物の分析を行い、和人への販売価格と比較して分析した。さらにアイヌへの物品販売について、特定の物資に関する交換レートが二重に存在する可能性について指摘した。
生体環境の若返りによる傷害中枢神経系の修復促進

様々な疾患により脳や脊髄が傷つくと、運動機能麻痺、感覚機能麻痺、認知機能障害など、多彩な症状があらわれる。疾患の種類や個人差はあるが、症状はわずかに自然に回復する。ただ、症状の改善は、歳を重ねるとともに難しくなる。症状の改善には、疾患により傷ついた神経回路が修復する必要であり、加齢とともに神経回路は修復しにくくなる。本研究では、加齢に伴う神経回路の修復力低下の分子メカニズムを探求した。加齢に伴い、組織の修復力は低下する。脳と脊髄から成る中枢神経系においても、様々な病態により傷ついた神経組織の修復力は、加齢に伴って低下する。本研究では、幼若期における高い組織修復力を解明し、その分子メカニズムを加齢環境に還元することで、傷ついた組織の修復力の増進を促すことを目的としている。中枢神経疾患の後遺症を軽減する方法の一つに、神経回路の修復が挙げられる。本け乳では、神経回路の修復過程の中でも、特に髄鞘修復に着目した。髄鞘は、オリゴデンドロサイトから形成される構造物であり、オリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖、遊走、分化することで、成熟オリゴデンドロサイトへ発達して髄鞘が完成する。これらのオリゴデンドロサイト前駆細胞の発達過程に対して、幼若期と老齢期の全身環境の差がいかなる影響を与えるか検討することを目的とした。全身環境の因子として、それぞれの週齢、月齢のマウスから採取した血液を用いた。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、マウス脳からオリゴデンドロサイト前駆細胞の細胞表面に発現する分子を認識するビーズを用いて単離、培養した。それぞれの血清を添加して、オリゴデンドロサイト前駆細胞の発達過程に対する影響を評価したところ、加齢マウスの血液にオリゴデンドロサイト前駆細胞の遊走を阻害する働きがあることがわかった。薬理学的なスクリーニングを実施し、オリゴデンドロサイトの遊走阻害に関する分子メカニズムの一端を解明した。今後、遊走阻害因子の同定を進め、さらに同定因子が個体レベルでの髄鞘修復の阻害にも寄与するか検討する予定である。当初の予定よりも早く、オリゴデンドサイト前駆細胞の発達阻害に関する現象の同定と、関連分子メカニズムの一端を解明することができたから。脳脊髄の疾患に羅漢すると、病巣が形成された部位に応じて、様々な症状があらわれる。症状はわずかではあるが、自然に改善する。症状の改善には傷害後に細胞死を免れた神経系細胞が、傷ついた神経組織、例えば神経回路を修復することで促される。ただ、加齢とともに、症状は自然回復しにくくなり、神経回路の修復も起こりにくくなる。一方、幼若期では、旺盛な神経回路の修復が見られ、また動物実験レベルではあるが、症状の回復も非常に顕著と知られる。神経回路の修復には、末梢に備わるホルモンの一部が関わっている。また、ホルモンの産生や全身の血液の組成は、加齢とともに変化する。。これらのことから、老齢個体の中に含まれ幼若期にはその量が少ないホルモンが、神経回路の修復を抑制するため、加齢にともない神経回路の修復力が低下すると考えた。本仮説を検証するため、幼若マウス由来の血液と老齢マウス由来の血液を採取し、神経回路の修復に関する作用を検証した。その結果、老齢マウスの血液は、髄鞘を形成するオリゴデンドロサイト前駆細胞の遊走を阻害する作用をもつことがわかった。またその分子メカニズムについて検討し、老齢血液に含まれるオリゴデンドロサイト前駆細胞遊走阻害因子を同定し、同定因子の受容体がオリゴデンドロサイト前駆細胞に発現することも突き止めた。同定因子の受容体の発現は、中枢神経系に限らず、末梢臓器に認められた。そのため、老齢マウスの脊髄に傷害を加え、患部に局所的に同定因子の受容体阻害剤を投与し、オリゴデンドロサイトの集積や髄鞘修復を検討した。その結果、同定因子の受容体の働きを抑制すると、老齢マウスでの髄鞘修復が促進した。これらの結果から、同定した受容体は、老齢における髄鞘障害に対する治療標的分子となりうる可能性が示された。オリゴデンドロサイト前駆細胞の遊走を阻害する分子の同定を行う。加齢マウスの血液および幼若マウスの血液をそれぞれ採取し、生化学的な分画実験と薬理学的なスクリーニングを組み合わせて、分子の同定を目指す。生化学的な手法は、密度勾配遠心法やHPLC、二次元電気泳動法など複数のアプローチを試み、又組み合わせて実施する。また質量分析による候補分子群の解析も実施して、候補分子の活性についてin vitroでスクリーニング実験を行う。上記手法において同定した分子の発現パターンおよび受容体の発現について、種々の週齢、月齢のマウスを用いて検討する。同定分子の発現は、血漿と脳脊髄液内でELISA法により検討し、受容体発現は免疫染色法により評価する。さらに、同定した因子の受容体発現を抑制させたマウスにおける、加齢における髄鞘の修復力の低下に対する効果についても検討する。

髄鞘の修復は、組織学的な評価に加え、生化学的な(髄鞘関連タンパク質量の変化)検討も実施する。また髄鞘の脱落・修復と関連する行動試験も実施し、加齢にともなう神経組織修復力の低下に伴う症状軽快の抑制に対して、同定因子の寄与を検証する。神経科学
珠皮と葉の平行進化過程の解明

葉と珠皮(=種皮)はともに扁平な器官で,それぞれ種子植物の代表的な適応形質である.また,両器官は今から約3.8億年前に同時に枝から進化した.珠皮と葉の起源には共通のメカニズムが用いられたようで,このことが両器官の同時出現につながったらしい.一方で,葉と珠皮は,器官を扁平にするメカニズムをそれぞれに洗練させており,この違いが,珠皮らしさ,葉らしさの創出に寄与しているのかもしれない.葉と珠皮(=種皮)はともに扁平な器官で,それぞれ種子植物の代表的な適応形質である.また,両器官は今から約3.8億年前に同時に枝から進化した.珠皮と葉の起源には共通のメカニズムが用いられたようで,このことが両器官の同時出現につながったらしい.一方で,葉と珠皮は,器官を扁平にするメカニズムをそれぞれに洗練させており,この違いが,珠皮らしさ,葉らしさの創出に寄与しているのかもしれない.種子植物の葉は,軸(茎)の側部に着く扁平な器官である.葉が扁平になるためには,向背軸(茎から遠い側と近い側を結ぶ仮想軸)に垂直な方向への葉身伸長が不可欠であり,向背軸の確立は葉の形態形成における要と言える.また,種子植物において大胞子嚢を包む珠皮も扁平で軸(珠心軸)の側部に着く器官であるが,その形態形成に向背軸の確立が果たす役割は良く理解されていない.特に,種子植物の中で祖先的な体制を保持している裸子植物においては,珠皮だけでなく,葉についても,その形態形成に関する理解が遅れている.私たちは,被子植物のシロイヌナズナにおいて,葉の向軸側性質決定に関与することが明らかな,Class III HD-Zip遺伝子の発現を,裸子植物グネツムの胚珠およびシュート頂で観察した.その結果,シュート頂においては,シロイヌナズナと同様に葉の向軸側組織のみで発現することが明らかとなり,Class III HD-Zip遺伝子の向背軸形成における働きが種子植物全体で保存されている可能性が示された.また,胚珠においても,Class III HD-Zip遺伝子は,珠皮の向軸側組織での発現が観察された.この結果は,珠皮と葉が,部分的に,同じ形態形成機構を採用している可能性を示唆しており,このことが,約4億年前に,葉と珠皮が同時に獲得された一因となっているかもしれない.今後,さらなる珠皮と葉の発生機構の比較解析を行うことで,両者の平行進化過程についての理解が進むと期待される.〈シロイヌナズナbel1(bel1)変異体に関する解析〉シロイヌナズナのbel1変異体は,内・外珠皮の代わりに心皮を形成する.しかし,内珠皮,外珠皮のどちら(あるいは両方)が心皮に変異するのかは不明だった.本研究では,bel1-6変異体と外珠皮を形成しないinner no outer(ino)-1変異体を交配し,bel1-6 ino-1二重変異体とbel1-6変異体の表現型が同じであることを示した.つまり,内珠皮領域が心皮に変化すると考えられ,BEL1は内珠皮と心皮のアイデンティティの切り替えを行う,一方,bel1変異体で外珠皮が形成されない理由は,WUSCHEL遺伝子の異所的発現に起因すると推定された.また,内珠皮原基が形成される段階までは,bel1変異体の胚珠形成様式は正常であることから,内珠皮/心皮どちらにもなり得る原基がBEL1の働きで内珠皮へと分化すると推定される.この結果は,内珠皮と心皮(=胞子葉)の起源が同一であることを示唆し,内珠皮と葉の平行進化仮説を支持する(種生物学会シンポジウムにて発表).YAB遺伝子は,真正双子葉類において葉身伸長を促進する.しかし,初期の被子植物のYAB遺伝子に関する情報は少なかった.そこで,原始的被子植物のハゴロモモ(スイレン目)においてYAB遺伝子の網羅的発現解析を行い,同遺伝子が真正双子葉類と同様の発現様式を持つことを明らかにした.一方,YAB遺伝子は内珠皮では発現していなかった.これらの結果は,YAB遺伝子が現生被子植物の共通祖先の段階で葉身伸長に関与していたことを示唆する.また,内珠皮と葉身での発現様式の違いは,側方への器官伸長の有無に起因すると推定され,YAB遺伝子は葉特異的な機能を獲得したと考えられる(Yamada et al. 2011).
生分解吸収性材料と細胞成長因子を応用した新しい顎骨再生法の確立

1.骨髄骨源性幹細胞(BMSC)の増殖・分化におよぼすbFGFの影響1)成犬の腸骨骨髄細胞の単層培養においてbFGF、dexamethazone(Dex)、活性型ビタミンD3の細胞増殖能(DNA合成能)と分化能(ALPase活性)を検討した。その結果、bFGFとDexの併用はBMSCの増殖と分化を著明に促進することが示唆された。2)BMSCをコラーゲンスポンジ内で、3次元培養したところ、bFGFとDexの併用はBMSCの増殖と分化を促進するが、スポンジの収縮により期待したほど細胞増殖はみられなかった。現在、吸収性ポリマーを併用したコラーゲンスポンジを検討している。2.bFGFの徐放システム.含水率7595%、φ<0.5mmの凍結ゼラチン粒子(IEP:5.0)を作製し、bFGF含浸ゼラチン粒子(bFGF-GMs)を調整した。生体内でゼラチンが分解されるに伴いbFGFが放出され、その徐放速度はゼラチン含水率によって制御された。3.骨髄海綿骨細片(PCBM)移植の骨形成に及ぼすbFGF-GMsの影響1)ビーグル成犬下顎骨欠損腔へのbFGF-GMsの移植実験により、bFGF-GMsは骨修復を促進すること、2)bFGF-GMsとPCBMの混合物のラット皮下移植実験によりbFGF-GMsはPCBMの異所性骨形成を促進し、最適のbFGF-GMs含水率は90%であることが分かった。4.成犬の下顎骨連続欠損におけるPLLAメッシュとPCBM及びbFGF-GMs移植による顎骨再生実験.PCBM単独では下顎の連続性が回復できない少量のPCBM移植でも、含水率90%bFGF-GMsとの併用により連続性が回復する可能性が示めされた。5.PLLAメッシュのラット皮下埋入実験では、30か月後、PLLAメッシュの分解、吸収が継続しているが組織為害性はみられず、異物発癌も認められなかった。1.細胞増殖因子bFGFのcarrierの検討。1)carrierとして等電点5.0の酸性ゼラチンを牛骨から分離精製、glutaraldehydeで架橋し、含水率98-85wt%の粒状ゼラチン(<500μm)を得た。ゼラチンは水洗後、凍結乾燥後、EOGで消毒された。ゼラチンはin vivoで5日-5週間で分解吸収されるが、含水率が高いほど速く吸収される。2.bFGF-ゼラチン複合体とbFGFの徐放について。1)bFGF水溶液を凍結乾燥ゼラチン粒子に滴下し、500G、5分間遠沈すると、bFGFを不活化せずにゼラチンに定量的に結合できた。2)in vitroではゼラチンが分解されずbFGFは徐放されないが、in vivoでは分解したゼラチンとともbFGFが徐放され、徐放期間はゼラチンの分解速度に依存した。3.骨髄海綿骨細片PCBMの骨形成に及ぼすbFGF-ゼラチン複合体の影響。含水率92.2%、93.0%のゼラチン粒子20mgにbFGF100μg/PBS200μ

lを含浸したものとPBS200μlのみ含浸したもの(コントロール)を調整し、それぞれ成犬のPCBM2.0gと混和したものをPLLAメッシュ製中空シリンダー内に充填し、これを同背部皮下に埋入した。埋入2-6週後の組織学的観察では、bFGF群はコントロールに比べ、活発な骨形成を示し、bFGF-ゼラチン複合体がPCBM移植における骨再生に促進的に働くことが示唆された。PLLAメッシュの吸収過程における組織的、電顕的観察。ラット皮下入30か月後もPLLAメッシュの分解が継続するが、周囲組織には炎症性細胞浸潤はみられず、モノフィラメント周囲のマクロファージの胞体内には微小化したPLLL細片と多数の空胞が認められ、PLLAメッシュは生体内で加水分解とマクロファージの貧食により極めて緩徐に吸収されることが示唆された。5.吸収性骨結紮糸については、PLLA単独およびPLLAとcaprolactoneのより糸を試作し、成犬下顎骨におけるPLLAメッシュと骨との結紮糸として使用し有効性を検討している。2. BMOSCの3次元培養。継代2代目のBMOSCの1x10^7/ml細胞浮遊液をコラーゲンスポンジに注入し,培養したところ,培養21日目には膠原繊維増生が著しかったが、期待したほどの細胞増殖は認められなかった。現在、bFGF+Dexを添加し,BMOSC+コラーゲンスポンジ複合体の培養を行っている。3.骨髄海綿骨細片(PCBM)移植の骨形成に及ぼすbFGF-ゼラチン結合体の影響。含水率95%ゼラチン粒子(φ<0.Imm)を用い,PCBM+bFGFゼラチン複合体のビーグル犬背部皮下移植による追加実験を行った。その結果,移植2週後95%ゼラチン粒子はほとんど吸収消失し,骨形成に関しては対照群(PCBM+神ゼラチン)との間に差はみられなかった。含水率95%ゼラチンではゼラチンの吸収に伴うbFGFの放出が速すぎる可能性が考えられ,追試検討中である。4.下顎骨欠損腔の骨再生におけるbFGF-ゼラチン複合体の効果。ビーグル犬下顎骨下縁の欠損部(5x10mm)にPLLAメッシュシートをframeworkとして、A群:ゼラチン(含水率92%)+bFGF(100μg)複合体、B群ゼラチン(含水率93%)+bFGF(100μg)複合体,対照群:ゼラチン(含水率92%、93%)を充填し,術後4,12週に骨再生状態を軟X線的,組織学的に比較観察した。その結果,A,B群で差は認められず、4週後、骨切除断端よりゼラチン粒子を囲むように新生骨が形成され、12週後骨欠損腔は縮小し、残存する粒子周囲に骨形成が認められた。ゼラチン含水率とPCBMの配合比についてさらに検討したい。5. bFGF担体のゼラチン粒子の調製。兎頭頂骨に6mmΦの欠損.bFGF100μg-ゼラチン複合体を移植したところゼラチン含水率が低くなるほど(95→85%)骨再生量は増加した。含水量が低く、ゆっくり分解するhydrogelは骨欠損における骨芽細胞の存続期間を延長させ、含水率の高いhydrogelsに比べ骨再生を増長することを示唆した。1.ビーグル成犬の腸骨より骨髄を採取し、bFGF、Dex、V.D3の単層培養(passage2)におけるbone marrow osteogenic stem cell(BMOSC)の増殖・分化におよぼす影響をDNA量とALPase活性により検討した。その結果,bFGF+Dex群がBMOSCの増殖と分化を最も促進することがわかった。2.1と同様に骨髄細胞を採取して、初代培養時よりDexを添加した後,コラーゲンスポンジ内三次元培養にて、Dexのみ(A群)とDex+bFGFを添加した群(B群)について、ALPaseと^<45>Caの取り込みを調べたところ、A群はB群に比べALPaseと45Caの取り込みが有意に高い値を示した。
反芳香族サーキットを利用した狭バンドギャップ大環状共役系の創製

N-混乱ポルフィリン(NCP)は一種のポルフィリンの異性体で、結合様式の異なるピロール環(混乱ピロール)に由来した環内炭素原子と環外窒素原子を有する。NCPはその非対称な骨格に由来した特異な性質を有する。例えば、二つの異なるNH互変異性体(2H型及び3H型)を有し、二価及び三価の配位子として機能する。また、混乱ピロールの反転、それに続く近接するピロール環との縮環により、N-フューズポルフィリン(NFP)を形成することが知られている。このようにNCPは構造転換により通常のポルフィリンとは異なる性質を示し、新たな応用を可能にしている。本研究では、NCPの(1)新規ルテニウム錯体の合成及び(2)NFPのタングステン及び白金錯体の合成に成功したので、以下に詳細を示す。(1)種々のルテニウム試薬を作用させることでNCPのσ-及びπ-配位型ルテニウム(II)錯体の合成に成功した。また、メソ位のアリル基がかさ高い場合にRuCp*(Cp*:ペンタメチルシクロペンタジエン)試薬を作用させると、Cp*の1,3位の二つのメチル炭素がNCPのメソ位に結合したN-混乱カリックスス[4]フィリンルテニウム(IV)錯体が得られた。立体障害が大きく連結部位のC-C単結合距離は、通常の単結合に比べ伸長していた。(2)NFPにWCl2O2及びPtCl2を作用させることで、NFPタングステン(V),(VI)錯体及び白金(IV)錯体の合成にそれぞれ成功した。これらの錯体は高酸化で電気陰性な金属により、その他の報告されているNFP金属錯体に比べて、狭いHOMO-LUMOエネルギーギャップを有した。26年度が最終年度であるため、記入しない。
3次元アッセンブリによる環境ホルモンターゲティング系の構築

bRとリポソームを混合した3次元アッセンブリのUV-VISスペクトルは、300700nmの範囲全体に変化がみられ、短波長側程その変化は大きい。これは静電相互作用で形成されたアッセンブリの光散乱である。ここにnonylphenol(NP)を加えると、570nmよりも短波長側の領域でさらに吸収スペクトルのみかけの上昇が見られた。通常、bRの吸収スペクトルでは、吸収が減少する450480nm附近でもほとんど、減少がみられず、短波長側程みかけのOD値が大きくなった。一方、benzophenone(BP)は350700nmの範囲ではスペクトルに変化が見られず、350nmより短波長側で大きな変化を見せた。一方、河川などの環境中に比較的多く排出されているものの、環境ホルモン作用が認められていない化合物である、lauric acidについても同様に比較したところ、lauric acidはスペクトルに変化を示さなかった。NPについて300nmにおける吸収変化の経時変化を調べた。3次元アッセンブリ、bRとNP,liposomeとNpの経時変化を比較したところ、3次元アッセンブリのみ増加が見られ、24時間で最大であった。この変化はbRやliposomeにNPを作用させたものには見られず、3次元アッセンブリのみに、NPが作用していることが示された。さらに、NPの濃度を変えてこの変化との関係を調べた。この結果、37°Cで作用させたものの24時間後の変化は、NPの濃度に依存していることがわかった。さらに、BPについても同様の実験を行った結果、3次元アッセンブリの粒径が減少していることを示唆する結果がえられた。これらの物質が3次元アッセンブリの構造に変化をもたらしていることが示唆されたため、構造の変化を顕微鏡で観察した。NPを加えたものを顕微鏡で見ると、3次元アッセンブリには見られない枝別れした構造が見られた。
脊髄損傷後の過活動膀胱の発生機序の解明:膀胱求心性神経の可塑性と神経成長因子の関与

脊髄損傷後の過活動膀胱の発生に膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性と神経成長因子(NGF)がどのように関与するのかを解明することを目的とした.1)ラットの第8胸髄を完全切離し,膀胱機能の経時的変化を観察したところ,ヒトと同様に,脊髄損傷後、当初は排尿筋無反射となるが,術後4週までに徐々に反射性膀胱収縮(RC)が回復し、ついには膀胱過活動を示すことが確認できた.2)慢性脊髄損傷および正常ラットを用いて,カプサイシンおよびレジニフェラトキシンを膀胱内に注入した場合のRCに対する抑制効果を検討した.カプサイシン溶液を膀胱内に注入すると、いずれの群においても,膀胱充満によって誘発されるRCは用量依存的に少なくとも注入後24時間まで抑制された.レジニフェラトキシンも同様の抑制効果を示したが,その効力はカプサイシンの約100倍強かった.3)慢性脊髄損傷および正常ラットの脊髄クモ膜下腔内にニューロキニン(NK)受容体阻害薬を投与し、RCに対する効果を検討したところ、選択的NKl受容体阻害薬は用量依存的にRCを抑制したが、選択的NK2受容体阻害薬は効果を認めなかった。正常ラットにおいても、同様の結果で、2群間で各々の阻害薬の効果に有意差を認めなかった。4)過活動膀胱による難治性尿失禁を示す慢性脊髄障害患者6名を対象として,カプサイシン膀胱内注入療法(2mM,100ml,30分間)を行ったところ,全例で尿失禁は消失し,膀胱内圧検査上も過活動膀胱が抑制されることが確認できた.また,その抑制効果は少なくとも3カ月は持続した.以上の結果から,脊髄損傷後の過活動膀胱の発生には膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性が関与することが示唆された.当初計画したNGFの関与については今後の課題としたい.脊髄損傷後の過活動膀胱の発生に膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性と神経成長因子(NGF)がどのように関与するのかを解明することを目的とした.1)ラットの第8胸髄を完全切離し,膀胱機能の経時的変化を観察したところ,ヒトと同様に,脊髄損傷後、当初は排尿筋無反射となるが,術後4週までに徐々に反射性膀胱収縮(RC)が回復し、ついには膀胱過活動を示すことが確認できた.2)慢性脊髄損傷および正常ラットを用いて,カプサイシンおよびレジニフェラトキシンを膀胱内に注入した場合のRCに対する抑制効果を検討した.カプサイシン溶液を膀胱内に注入すると、いずれの群においても,膀胱充満によって誘発されるRCは用量依存的に少なくとも注入後24時間まで抑制された.レジニフェラトキシンも同様の抑制効果を示したが,その効力はカプサイシンの約100倍強かった.3)慢性脊髄損傷および正常ラットの脊髄クモ膜下腔内にニューロキニン(NK)受容体阻害薬を投与し、RCに対する効果を検討したところ、選択的NKl受容体阻害薬は用量依存的にRCを抑制したが、選択的NK2受容体阻害薬は効果を認めなかった。4)過活動膀胱による難治性尿失禁を示す慢性脊髄障害患者6名を対象として,カプサイシン膀胱内注入療法(2mM,100ml,30分間)を行ったところ,全例で尿失禁は消失し,膀胱内圧検査上も過活動膀胱が抑制されることが確認できた.また,その抑制効果は少なくとも3カ月は持続した.以上の結果から,脊髄損傷後の過活動膀胱の発生には膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性が関与することが示唆された.当初計画したNGFの関与については今後の課題としたい.本研究の目的は、脊髄損傷後の過活動膀胱の発生機序に脊髄損傷後の膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性と神経成長因子(NGF)がどのように関与するのかを解明することにある。1)脊髄損傷後の膀胱機能の経時的変化雌ラットを用いて、第8胸髄の高さで脊髄を完全切離して脊髄損傷を作成した。脊髄損傷作成後、経時的に、膀胱充満に伴う反射性膀胱収縮(RC)を無麻酔下での膀胱内圧測定法にて検討したところ、術後1週ではRCは誘発されなかったが、2週後には低振幅のRCが出現するようになり、その振幅はその後経時的に増大し、術後4週で最大となり、以降定常となった。この脊髄損傷ラットにおいて観察されるRCは、対照ラットと比較すると、RCを誘発する域値膀胱容量が有意に大きく、収縮持続時間が有意に長く、振幅が大きかった。以上の結果から、ラットにおいても、ヒトと同様に、脊髄損傷後、当初は排尿筋無反射となり、その後、徐々にRCが回復し、ついには膀胱過活動を示すことが確認できた。2)脊髄内ニューロキニン(NK)受容体の関与脊髄損傷作成後4週を経過したラットの脊髄クモ膜下腔内にNK受容体阻害薬を投与し、RCに対する効果を検討したところ、選択的NK1受容体阻害薬は用量依存的にRCを抑制したが、選択的NK2受容体阻害薬は効果を認めなかった。対照ラットにおいても、同様の結果で、2群間で各々の阻害薬の効果に有意差を認めなかった。以上の結果から、ラットの膀胱充満によって誘発されるRCには、脊髄内NK1受容体が促進性に働いており、その作用は脊髄損傷の回復期においても維持されることが示唆された。

今後は、脊髄損傷後の膀胱組織内NGFの径時的変化を検討するとともに、膀胱を支配する後根神経節細胞内のNGF受容体および各種知覚神経ペプチドの局在が脊髄損傷後どのように変化するのかを免疫組織化学的に検討する予定である。脊髄損傷後の過活動膀胱の発生に膀胱カプサイシン感受性求心性神経の可塑性と神経成長因子(NGF)がどのように関与するのかを解明することを目的とした.1)ラットの第8胸髄を完全切離し,膀胱機能の経時的変化を観察したところ,ヒトと同様に、脊髄損傷後、当初は排尿筋無反射となるが,術後4週までに徐々に反射性膀胱収縮(RC)が回復し、ついには膀胱過活動を示すことが確認できた。2)慢性脊髄損傷および正常ラットを用いて,カプサイシンおよびレジニフェラトキシンを膀胱内に注入した場合のRCに対する抑制効果を検討した.カプサイシン溶液を膀胱内に注入すると,いずれの群においても,膀胱充満によって誘発されるRCは用量依存的に少なくとも注入後24時間まで抑制された.レジニフェラトキシンも同様の抑制効果を示したが,その効力はカプサイシンの約100倍強かった.3)慢性脊髄損傷および正常ラットの脊髄クモ膜下腔内にニューロキニン(NK)受容体阻害薬を投与し、RCに対する効果を検討したところ、選択的NK1受容体阻害薬は用量依存的にRCを抑制したが、選択的NK2受容体阻害薬は効果を認めなかった。正常ラットにおいても、同様の結果で、2群間で各々の阻害薬の効果に有意差を認めなかった。4)過活動膀胱による難治性尿失禁を示す慢性脊髄障害患者6名を対象として,カプサイシン膀胱内注入療法(2mM,100ml,30分間)を行ったところ,全例で尿失禁は消失し,膀胱内圧検査上も過活動膀胱が抑制されることが確認できた.また,その抑制効果は少なくとも3ヵ月は持続した.以上の結果から,脊髄損傷後の過活動膀胱の発生には膀胱力プサイシン感受性求心性神経の可塑性が関与することが示唆された.当初計画したNGFの関与については今後の課題としたい.
外部刺激により調整可能な突発性脊椎側弯症のためのインプラントデバイスの開発

本研究では、脊椎側弯症のインプラントデバイスの前段階として、脊柱部の側弯を外部から矯正するためのコルセットを開発する。基本的に従来のコルセットは基本的に24時間装着することが望ましいが、従来のコルセットは固いプラスティック製のコルセットを腰部から胸部にかけて捩じりながら締め上げることで矯正しており、患者にとっては窮屈で長時間の使用に不向きであった。また外見も目立ってしまい、装具として好ましい形態とはいいがたい。そこで本プロジェクトでは、メッシュ素材や人工筋肉等のデバイスを多用することで下着感覚での矯正が可能となるような装具を目指す。脊椎側弯症とは脊椎がねじれながら左右に曲がってしまうような症状を指す。特に、学童期から思春期の女子に多く発生すると言われる特発性側弯症は、痛みや呼吸困難などの自覚症状が乏しく、発症当初は外見的にも判りにくいため、発見が遅くなる。したがって、初期段階での対処が難しく、重症化しやすい傾向がある。本症状は中度の症状であればコルセット等で対処可能であるが、湾曲の大きさを指す「コブ角」が50度以上の重度の症状の場合、外科手術による矯正固定術を施す必要がある。この矯正固定術は、脊椎の後方側にネジとフックとワイヤーからなるインプラントを設置し、これらをロッドで連結することで弯曲した脊椎を矯正する。さらに、インプラントを設置した範囲に骨盤から採った骨を置き、脊椎を矯正した状態で骨癒合を図る。本術は世界的にみても一般的な方法である。しかしこの矯正術は多くのリスクを伴うとともに心的ダメージも大きいしたがって、本研究では、成長期における重度の突発性脊椎側弯症に対する矯正固定術のために、熱や磁界等の外部刺激により特性が変化する機能性材料を用いた可変調節インプラントデバイスを開発する。本デバイスの開発によって、多くの切開手術をすることなく、成長に合わせて外部刺激によりインプラントの調整が可能となり、患者の負担が劇的に減少する。本年度は、病院の医師からのアドバイスをうけ、まず手始めとして外部からの力学的作用によって脊椎側弯の症状を軽減する手法について検討し、コルセットと人工筋肉によってより機能性の高い補助装具の設計検討に入った。現在医師および義肢装具士を交えた議論を行っており、基本的な設計が完了した。病院の医師と接触する時期が遅れてしまい、アドバイス等をもらう時間が不足してしまったことが原因である。本研究では、成長期における重度の脊椎側弯症に対する矯正固定術のために、熱や磁界等の外部刺激により特性が変化する機能性材料を用いた可変調節インプラントデバイスを開発する。現在本研究プロジェクトは医師、義手装具士、メーカとの共同研究で遂行されている。この中で、本プロジェクトでは将来的にはインプラントデバイスを開発する前段階として、脊柱部の側弯を外部から強制するためのコルセットを開発していく方針となった。そこで本プロジェクトでは、人工筋肉やMRデバイスといったスマートデバイスを用いて外見がスマートで空気圧や電磁場等による外部刺激によって容易に調整可能なコルセットを開発する。特に、患者に思春期の女性を多くいることを考慮し、従来のコルセットに比べ、メッシュ素材やゴム素材を多用することで下着感覚での矯正が可能となるような装具を目指している。現在、一部に固い骨格の残すものの大半が柔軟素材で構成することが可能となる装具が完成しており、2017年度中に実際の患者への試着を試みる予定である。装着具の腰部固定装置の開発に時間がかかり若干研究の進展が遅れている。現在、医師および義肢装具士との連携が密に取れる状態になったので、まずは外部コルセット方式による脊椎側弯症の軽減化を目指す。その外部強制具として人工筋肉を用いた柔軟なコルセットを開発するにあたり、この試作品の評価をより簡便に行うため、脊椎部位の筋骨格モデルを構築する。背骨は脊椎湾曲が生じた骨を参考に3Dプリンタにより構築する。また、力学的解析が進んでいる場合、モデル化の情報に従って、そのモデルが単純化できると考えている。さらに脊椎湾曲は背骨周辺の拮抗筋肉の作用も非常に重要であり、これは応募者によって多くの研究がなされている空気圧ゴム人工筋肉を適用する。この人工筋肉の適用により、よりリアルな脊椎モデルの構築が可能であると考える。

また人工筋肉のコンポーネント化を行うことによりレゴブロックのように自由に入れ替えができるようなシステムを開発し、医師および技師装具士が患者の症状に合わせて自由に人工筋肉アクチュエータの配置ができるようなシステムを構築することで、よりフレキシブルな装具の開発を目指す。本年度は、薄型軽量のスマートなコルセットの開発を目指し、以下の手順で研究を推進する。1脊椎側弯症のための人工筋肉とメッシュ素材・ゴム素材等を用いた薄型コルセットを開発する。この際、医師・義手装具士・メーカとの連携により腰部から胸部にかけての捻転を矯正するようにトルクをかけるアイディアについて複数提案する。2マネキンに提案されたコルセットを装着し、人工筋肉による調整機能の効果と、体幹のトルクについて計測する。3患者にコルセットを装着し、装着感や圧迫感等のアンケートを行い、実証実験に入る。ロボット工学研究の進度が若干遅れていたため、次年度における研究費として使用することとなったため。腰部固定装置の設計に時間がかかりその使用額を次年度に繰り越した。本年度は、人工筋肉を用いたコルセット型矯正器具を医師と義肢装具士とともに開発するため、その開発費用に充てる予定である。腰部固定装置と軽量のコルセットの開発費(含外注)に使用する。
多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

本研究者はタンパク質を安定化する戦略として、タンパク質を多糖化することが有効であると考え研究を行い、卵白リゾチームを酵母発現系で多糖化すると熱安定型リゾチームが得られることを報告している。リゾチームの分子表面β-ターン領域の部位指定変異によりN-グリコシル型糖鎖結合認識配列Asn-X-Thr(Ser)を作成し、酵母中で発現させると元の立体構造や活性を保持した状態で、約300個のマンノース残基が結合したhigh mannose型の多糖鎖が結合した多糖化リゾチームが高含量で分泌した。この多糖化リゾチームはpH2.5から9.0までの広いpH領域下で100°Cに加熱しても不溶化せず安定であり、その構造安定性の熱力学的解析をするのに都合の良い研究試料である。今回はリゾチームの19位および49位のAsnにN-結合型ポリマンノシル基が結合した多糖化リゾチームを用いて、DSCによる熱測定などにより、熱安定化機構の解明を行った。その結果、多糖化により変性分子の凝集が抑えられ、変性の可逆性が著しく増加することが明らかになった。しかしながら、多糖化によりリゾチームの変性転移点(Tm)は低下し、また変性のエンタルピー変化、エントロピー変化も低下した。これらの結果から、蛋白質は多糖化により、その立体構造の安定化は得られないが、変性状態の挙動が異なり、リフォールディングが容易になり、見かけの安定性が高まるものと考えられる。