hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規還元剤のフッ化ジアンミン銀変色抑制効果：歯科保存修復への応用

当初計画していた、健全歯質及び脱灰象牙質に対するフッ化ジアンミン銀の変色の評価、またフッ化ジアンミン銀塗布後の接着への影響の評価は予定よりも速やかに進展し、国際学会にて2演題発表を行った。内1演題の内容については国際誌への学術論文の掲載も完了している。また、マイクロCTを用いたフッ化ジアンミン銀塗布歯面の脱灰抑制効果の評価及び人工口腔装置(OBR)を使用したバイオフィルム形成抑制効果の評価の研究についても順調に進展し、国内学会にて2演題発表を行った。実験においては38%フッ化ジアンミン銀群、3.8%フッ化ジアンミン銀群、38%フッ化ジアンミン銀塗布後にヨウ化カリウムを塗布した群、および38フッ化ジアンミン銀と同程度のフッ素濃度のフッ化カリウムをウシ抜去歯象牙質に対して塗布し、比較を行った。研究結果より、フッ化ジアンミン銀による変色は濃度に依存して変化すること、また変色抑制のためにフッ化ジアンミン銀塗布後ヨウ化カリウムを塗布する手法は変色抑制効果はあるものの、脱灰抑制効果およびバイオフィルム付着抑制効果は従来のフッ化ジアンミン銀塗布のみよりも劣ることが示唆された。また各群の象牙質塗布後の走査型電子顕微鏡像を確認すると、象牙細管の封鎖が38%フッ化ジアンミン銀以外は不十分であることが確認された。このとこから38%フッ化ジアンミン銀以外は十分な象牙質知覚過敏抑制効果が得られない可能性が示唆される。現在研究は順調に進展している。また今後も研究に使用する予定の機材は人工口腔装置(OBR)やμCT等の現有設備であるため、研究を遂行する上で大きな問題なく進展すると思われる。健全象牙質、および人工脱灰象牙質へのフッ化ジアンミン銀の影響の評価が計画よりも早期に終了したため、新規還元剤(グルタチオン)配合フッ化ジアンミン銀の評価をより積極的に行っていきたい。評価方法としては当初の研究計画通り、人工口腔装置及びTMR法、またはμCT(現有設備)等を引き続き用いていく予定である。さらに今後人工脱灰象牙質ではなく、天然のヒト抜去う蝕歯を使用して、より臨床に即したフッ化ジアンミン銀の影響評価を目指していく。近年、高齢者・要介護者の根面う蝕の1次予防処置としてフッ化ジアンミン銀の歯根面への塗布の有効性が国内外で高く評価されている。しかしながら、フッ化ジアンミン銀の根面う蝕へのメカニズムについての詳細は不明な点が多く、さらに銀の沈着による歯の変色(黒変)という審美上の問題が懸念される。申請者らは、還元剤の使用による酸化銀の生成抑制に着目し、フッ化ジアンミン銀塗布時に還元剤を併用することで変色抑制を得られることを確認した。本研究では、新規還元剤によるフッ化ジアンミン銀の歯質変色抑制効果、ならびに脱灰抑制効果へ及ぼす影響について検証し、臨床応用へつながる糸口を開くことを目的とする。本年度は根面う蝕へのフッ化ジアンミン銀塗布を想定し、脱灰後の色調変化を定量的に確認、学会発表を行った。今後は実験結果をふまえ、フッ化ジアンミン銀にグルタチオンを混和し、色調変化を評価する。臨床応用へとつなげるため、次年度以降は抗菌性の評価として、Streptococcus mutans MT8148 (S.mutans)とStreptococcus sobrinus 6715 (S. sobrinus)を培養させ、培養液にフッ化ジアンミン銀を含む試薬をけん濁させる。A LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kitにて生菌と死菌を容易かつ定量的に識別する。結果より、グルタチオン配合フッ化ジアンミン銀が従来のフッ化ジアンミン銀と同様の抗菌性を示すか検証を行う。変色抑制効果を持つフッ化ジアンミン銀のより積極的な永久歯への使用が可能となれば、根面う蝕の予防から歯の保存に貢献することで国民の健康長寿とQOLの向上を図ることができると考える。研究計画についてはすでにプレ実験が終了していたため、順調に本実験に進むことができた。一方、研究者の産前産後休業を挟んだため、後半実験が中断となっている。

また各群の象牙質塗布後の走査型電子顕微鏡像を確認すると、象牙細管の封鎖が38%フッ化ジアンミン銀以外は不十分であることが確認された。このとこから38%フッ化ジアンミン銀以外は十分な象牙質知覚過敏抑制効果が得られない可能性が示唆される。現在研究は順調に進展している。また今後も研究に使用する予定の機材は人工口腔装置(OBR)やμCT等の現有設備であるため、研究を遂行する上で大きな問題なく進展すると思われる。本実験によって、グルタチオンのフッ化ジアンミン銀変色抑制効果が期待できることが確認された。今後はグルタチオン添加によるフッ化ジアンミン銀の抗菌性への影響を確認し、臨床への応用を目指していく。健全象牙質、および人工脱灰象牙質へのフッ化ジアンミン銀の影響の評価が計画よりも早期に終了したため、新規還元剤(グルタチオン)配合フッ化ジアンミン銀の評価をより積極的に行っていきたい。評価方法としては当初の研究計画通り、人工口腔装置及びTMR法、またはμCT(現有設備)等を引き続き用いていく予定である。さらに今後人工脱灰象牙質ではなく、天然のヒト抜去う蝕歯を使用して、より臨床に即したフッ化ジアンミン銀の影響評価を目指していく。本年度は後半から産前産後休業の為、一定期間研究を進められなかったことで、次年度使用額が生じた。次年度は国際学会での発表、並びに国際雑誌への投稿が予定されており、翌年分と合わせた金額を過不足なく使用できる予定である。平成30年度は当初計画していた、健全歯質及び脱灰象牙質に対するフッ化ジアンミン銀の変色の評価、またフッ化ジアンミン銀塗布後の接着への影響の評価が予定よりも速やかに進展し、国際学会にて2演題発表を行ったため、フッ化ジアンミン銀塗布歯面の脱灰抑制効果の評価及びバイオフィルム形成抑制効果の評価の研究の予定を早めて研究計画を進展させるために必要な研究経費を前倒し請求を申請した。前倒し請求後、研究は順調に進行し、予定外の予算も発生しなかった。平成31年度は次年度使用額と合わせて、引き続き人工口腔装置(OBR)やμCT等の現有設備で、研究を遂行していく。健全象牙質、および人工脱灰象牙質へのフッ化ジアンミン銀の影響の評価が計画よりも早期に終了するため、変更後はより新規還元剤(グルタチオン)配合フッ化ジアンミン銀の評価をより積極的に行っていきたい。
脂肪細胞機能と代謝症候群の分子連関

代謝症候群の基盤病態としての脂肪組織機能異常症に焦点を当て、細胞内グルココルチコイド活性化酵素、11β-HSD1の脂肪細胞やマクロファージにおける活性調節メカニズムを中心に検討した。即ち、(1)ヒト型の細胞内グルココルチコイド活性化酵素、11β-HSD1を強力な脂肪細胞特異的プロモーターの支配下に過剰発現させる新規の遺伝子操トランスジェニックマウスを確立した。(2)培養脂肪細胞において種々の炎症性サイトカインが11β-HSD1遺伝子発現を著明に誘導すること、PPARγアゴニストが11β-HSD1遺伝子発現を著明に抑制すること、11β-HSD1活性化がアデイポネクチンの分泌を著明に抑制することが明らかとなり、11β-HSD1阻害候補低分子化合物を作用させるとこのような脂肪細胞機能異常が是正されることが実証された。(3)ヒト皮下脂肪組織バイオプシーサンプルを用いた臨床研究において肥満者の11β-HSD1遺伝子発現が著明に亢進していることを明らかにした。(4)肥満の脂肪組織は低酸素や異栄養、炎症、酸化ストレス、小胞体ストレス、脂肪毒性など種々の代謝ストレスに暴露されていることが注目されていることを踏まえ、脂肪細胞におけるセラミドやAMPKシグナルの活性化やLPSによるマクロファージ活性化が11β-HSD1の酵素活性や遺伝子発現を著明に亢進させ、細胞機能異常や向炎症的形質を獲得することを新規に明らかにした。また、ChIPアッセイ等により細胞ストレスによって誘導される11β-HSD1の制御に転写因子、C/EBPβが関与することを明らかにした。さらに、低分子11β-HSD1阻害化合物を用いた11β-HSD1の薬理学的阻害がTNF-α、IL-1β,MCP-1などの炎症性サイトカイン、ケモカインの発現と分泌を有意に抑制することが明らかとなった。新規の遺伝子操作モデル動物の開発を主軸とする代謝症候群病態解明へのアプローチを進めた。即ち、(1)脂肪細胞グルココルチコイド活性化のメタボリック症候群における病態的意義を検討する目的で、ヒト型の細胞内グルココルチコイド活性化酵素、11β-HSD1を強力な脂肪細胞特異的プロモーターの支配下に過剰発現させる新規の遺伝子操トランスジェニックマウスの樹立を完了した。(2)培養脂肪細胞解析系において、種々の炎症性サイトカインが11β-HSD1遺伝子発現を著明に誘導すること、種々のPPARγアゴニストが11β-HSD1遺伝子発現を著明に抑制すること、脂肪細胞における11β-HSD1活性化がインスリン感受性ホルモン、アデイポネクチンの分泌を著明に抑制することを明らかにした。グルココルチコイドが過剰に活性化された培養脂肪細胞に11β-HSD1阻害候補低分子化合物を作用させるとこのような脂肪細胞機能異常が是正されることが明らかとなった。(3)培養脂肪細胞や代謝症候群モデルマウスに対する11β-HSD1特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加(投与)が脂肪細胞機能異常の改善(遺伝子発現プロファイルの正常化やアデイポサイトカイン分泌の正常化)や糖脂質代謝パラメーターの改善をもたらすことが確かめられた。(4)ヒト皮下脂肪組織バイオプシーにおいても肥満者の11β-HSD1遺伝子発現が著明に亢進していることを実証した。(5)メタボリック症候群の表現型と連鎖する11β-HSD1遺伝子多型を検索し、新規な多型の発見も含め我が国の遺伝的背景のスクリーニングを終了した。代謝症候群は心筋梗塞や脳卒中に代表される致死的心血管病発症の高リスク群である。

本研究では代謝症候群の基盤分子病態としての"脂肪細胞機能異常症"に焦点を当て、細胞内グルココルチコイド活性化酵素の脂肪細胞における活性調節メカニズムを中心とした"アデイポステロイドの作用機構"の全貌を明らかにすることにより、代謝症候群の病態解明、新規診断法の開発、我が国における遺伝的背景の解明、そして新規治療法の開発に直結する基礎研究を推進している。本年度は3T3-L1株化培養脂肪細胞、マウス内臓脂肪組織由来初代培養脂肪細胞を利用し、炎症性サイトカインやAMPキナーゼ、セラミド経路が11β-HSD1の遺伝子発現や酵素活性を誘導することを明らかにし、分子メカニズムを解析した。また、11β-HSD1阻害低分子化合物の探索研究を更に進め、天然物ライブラリーを用いてヒト型11β-HSD1強発現細胞由来マイクロソーム画分(酵素活性が存在する)、リコンビナント11β-HSD1、基質(3H-cortisone)、補酵素(NADPH)の混合物における特異的酵素阻害活性をSPAビーズの発光を指標としてスクリーニングするscintillation proximity assayを用いて複数の有力な候補化合物の選抜に成功した。遺伝子操作マウスを用いた応用研究ではadiponectin、adipocyte fatty acid binding proteinの2種類の強力な脂肪細胞特異的プロモーターの支配下にヒト型11β-HSD1を過剰発現させる新規の遺伝子操作トランスジェニックマウスを樹立し、これら遺伝子操作動物およびdb/dbマウスなどの遺伝性モデル動物に対するヒト型11β-HSD1アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与実験を行い、明らかなインスリン抵抗性改善、脂質プロファイルの改善効果を見出した。ヒト由来試料を用いた臨床的研究:ヒト皮下脂肪組織バイオプシーによる遺伝子発現プロファイリングにおいては内臓脂肪量や炎症の程度と関わる複数の脂肪細胞遺伝子を同定することに成功している。代謝症候群の基盤病態としての脂肪組織機能異常症に焦点を当て、細胞内グルココルチコイド活性化酵素、11β-HSD1の脂肪細胞、マクロファージにおける活性調節メカニズムを中心に検討した。肥満の脂肪組織は低酸素や異栄養、炎症、酸化ストレス、小胞体ストレス、脂肪毒性など種々の代謝ストレスに暴露されていることが注目されていることから本年度は3T3-L1脂肪細胞(前駆脂肪細胞および成熟脂肪細胞)、マウス由来マクロファージ細胞株、J774.1細胞を用い、炎症性サイトカインやLPSなどの炎症シグナル、血清除去、セラミドシグナル、AMPKシグナルの活性化に対する細胞応答における11β-HSD1の制御機構を解析した。その結果、脂肪細胞におけるセラミドやAMPKシグナルの活性化、ならびにLPSによるマクロファージ活性化が11β-HSD1の酵素活性や遺伝子発現を著明に亢進させ、細胞機能異常や向炎症的形質を獲得することを新規に明らかにした。また、ChIPアッセイ等により細胞ストレスによって誘導される11β-HSD1の制御に転写因子、C/EBPβが関与することを初めて明らかにした。
鋼構造物の長寿命化を実現するための新しい疲労損傷検査計画立案手法の構築

疲労損傷を事前に検知して適切な補修を行うことは構造物の安全上極めて重要であり,できる限り少ない検査回数で済む検査計画立案手法の構築が必要である。このためには,実働荷重下における対象構造物中の疲労き裂成長曲線を定量的に推定することが必要となるが,複数の荷重成分が重畳して作用する上に,各々の荷重成分の寄与割合を事前に把握することが困難なため,き裂成長曲線を決定論的に推定することが出来ない。そこで本研究では,この荷重成分の重畳割合を,(i)疲労き裂成長シミュレーション,(ii)適切な最適解探索手法,(iii)き裂観測結果(定期点検結果)から推定し,対象構造物の全寿命を供用期間の出来るだけ早期に推定する手法の構築を目指した。研究最終年度である本年度は,複数の目的関数,制約条件下で従来の遺伝的アルゴリズム手法による最適化より,高速かつ収束性の良い解をえるために,実数型遺伝子を導入すると共に収束アルゴリズムを改良することで,より高性能な最適解探索手法を構築した。また,文献調査により,大型鋼構造物中で成長する疲労き裂は,無き裂状態の弾性FEM解析から得られる最大主応力直角方向と同じ経路をたどる事を確認し,それぞれの荷重成分が単独で作用する場合の応力分布を適宜組み合わせ,各々の状態における主応力方向を求めることでき裂伝播経路を推定し,観測によられたき裂伝播経路と一致する荷重成分の割合を推定できる事を検証した。この時,あらかじめ予測される荷重成分の組み合わせは無数に存在するため,本研究で導出した最適解探索手法を利用した。すなわち,損傷実績であるき裂伝播経路の観察結果より,研究の大きな目標であった作用荷重成分間の割合の同定が可能となった。以上の結果,研究代表者がこれまでに構築してきた疲労き裂成長シミュレーションを適用すれば,損傷事故解析を従来以上に定量的に行う事が可能となったので,従来の手法では無視されていた,荷重履歴を考慮してき裂成長曲線を設定する手法を構築した。
脊椎動物の時間的ニッチの制御機構

生物にとって、周辺環境の変化に適応できるかどうかは死活問題である。自らの生存や種の繁栄に最も適した時期や時間帯に合わせて活動のタイミングを調節する適応戦略、あるいは現象そのものを「時間的ニッチ(temporal niche)」と呼ぶが、その制御機構は謎に包まれている。本研究では、生物の活動のタイミングを決定する様式として「概日リズムの同調」と「マスキング反応」に着目し、自然界における2大環境因子である「光」と「温度」の観点から、時間的ニッチの制御機構について検討した。過去の研究により、哺乳類における新規光受容タンパク質オプシン5を欠損するマウスでは、紫外光に対する概日リズムの光同調能が低下する可能性が示唆された。このとき、同じく紫外光感受性であるUV錐体オプシンの関与が疑われたことから、網膜の視細胞が退化・消失するrd1突然変異マウスとの交配によってオプシン5とUV錐体オプシンの両方を欠損するダブルミュータントマウスを作出した。このマウスを用いた行動解析により、オプシン5欠損個体における光同調能の低下、及びダブルミュータントマウスにおける相加的な光同調能の低下が確認された。環境温度変化に依存したマウスの活動抑制現象(ネガティブマスキング反応)について、昨年度の研究によりマスキング反応が生じる温度条件を明らかにした。哺乳類ではTRPチャネルというイオンチャネルファミリーが温度センサーとして知られていることから、マスキング反応を制御する温度受容体の特定を目的として、いくつかのTRPチャネル欠損マウスを用いた行動解析を行った。その結果、複数のTRPチャネルがマスキング反応の制御に関与している可能性が示唆された。現在、それらのTRPチャネルについてダブルノックアウトマウスの解析を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物にとって、環境の変化に適応できるかどうかは死活問題である。自らの生存に都合の良い時期や時間帯に合わせて活動を変化させる適応様式を「時間的ニッチ」というが、その制御機構は謎に包まれている。本研究では、光と温度という2つの大きな環境要因に着目し、脊椎動物における時間的ニッチの制御機構の解明を目的とした。哺乳類における新規光受容タンパク質オプシン5を欠損するマウスにおいて、紫外光に対する活動リズムの光同調能を検討した。このとき、同じく紫外光感受性であるUV錐体オプシンの関与が疑われた。本年度は、網膜の視細胞が退化・消失するrd突然変異マウスとの交配により、オプシン5とUV錐体オプシンの両方を欠損するダブルミュータントマウスを作出した。また、このマウスを用いて光同調能を検討した。哺乳類の脳内光受容能について検討するため、オプシン5陽性細胞に対するスライスパッチクランプ解析を計画した。本年度は、自然科学研究機構・生理学研究所主催の生理科学実験技術トレーニングコースに参加することにより、スライスパッチクランプ法の基礎技術を習得した。環境の温度周期がマウスの活動抑制現象(ネガティブマスキング反応)を引き起こすことを見出していたが、様々な温度条件下におけるマウスの活動パターンを比較・定量することにより、マスキング反応が生じる条件を明らかにした。現在、哺乳類の温度受容器として知られるTRPチャネルファミリーに着目し、いくつかのTRPチャネル欠損マウスを用いた行動解析を進めている。初年度に予定していた「オプシン5及びUV錐体オプシンのダブルミュータントマウスの光同調実験」、及び「マスキング反応の生じる温度条件の解明」については、計画通り遂行することができた。しかしパッチクランプ解析については、現時点では手法の習得に留まっており、計画に遅れが生じているため(2)と評価した。所属研究室で作製した、オプシン5ノックアウト(EGFPノックイン)マウスを用いたスライスパッチクランプ解析により、生体内のオプシン5陽性細胞における光応答能を明らかにする。TRPチャネル欠損マウスを用いた行動解析を更に進め、環境温度によるマスキング現象を制御する温度受容器を同定する。
発作性心房細動の臨床心臓電気生理学的持性およびその長期予後

発作性心房細動(PAF)は頻度の高い重要な不整脈であるが、発作性上室性頻拍と比較するとその臨床電気生理学的な知見には乏しい。そこで、PAF例の心房筋の臨床電気生理学的な特性について検討し、さらに、得られた諸指標を用いて臨床電気生理学的な薬効評価を行った。1)発作性心房細動の発作歴のある40例(PAF群)と発作歴がない56例(対照群)について、右房内12点の洞調律時心房電位の記録を行い、心房電位の幅と棘波の数を測定した。その結果、(1)各症例における心房電位の最大幅と最多棘波数は、PAF群で有意に大で、この2つの指標は正相関した。(2)対照群の測定値をもとに異常電位を電位幅100ms以上あるいは棘波数8以上とすると、PAF群に多く出現し、sensitivity 70%、specificity 79%、positive predictive value 70%であった。また、この異常心房電位の1症例当たりの出現数もPAF群に有意に多かった。2)PAF群40例と対照群81例について、心房期外刺激法にて心房筋受攻性を示す諸指標を検討した。その結果(1)repetitive atrial firing(RAF)fragmented atrialactivity(FAA)、intraーatrial conduction delayの出現率はPAF群で対照群よりも有意に大であった。(2)また、これらの諸指標が誘発される心房期外刺激の連結期の幅(誘発域)もPAF群が対照群よりも大であった。以上の1)および2)の所見は、発作性心房細動例の心房筋の電気生理学的特性を示し、発作性心房細動の予知や薬効評価の指標となりうると考えられる。3)PAF群33例について、心房期外刺激法による諸指標を用いたdisopyramideの薬効評価を行った。心房筋有効不応期は延長し、PAFおよびFAAの誘発域は縮少する例が多く、心房内伝導時間は延長する例が多かったが、各指標は相互に関連ある変化を示したことから、薬効評価の指標としての有用性があると考えられる。発作性心房細動は、発作性上室性頻拍とともに頻度の高い上室性の発作性頻拍性不整脈である。しかし、後者については臨床心臓電気生理学的に詳細に解明されているが、発作性心房細動に関する知見には乏しい。そこで、発作性心房細動症例の心房筋の臨床心臓電気生理学的特性については検討し、以下のような知見を得た。2)af群20例、C群20例を対象に、右房内3点(高位側壁、右心耳、低位側壁)の不応期と、洞調律時に12点で記録した右房電位波形を検討した。その結果、不応期の最大値はaf群では高位側壁あるいは右心耳であったがC群には一定の傾向はなく、また、af群ではC群よりも最大不応期が大で、不応期の心房内での不均一性もaf群で大であった。洞調律時右房電位の異常波形(幅100msec以上、棘波数8個以上)は、af群の80%、C群の27%に認めた。

また、af群では高位の後壁、次いで側壁、中隔に異常電位波形を多く認めた。以上のように、af群の電気生理学的な心房筋異常が高位右房の異常を主とするものであることを示唆する知見を得た。以上、心房期外刺激法による心房筋受攻性の指標であるRAFZ、FAZ、CDZおよび洞調律時の心房内電位波形の異常の検討から、発作性心房細動の心房筋の電気的特徴および異常の局在性に関する知見が得られた。発作性心房細動は頻度の高い上室性頻拍性不整脈で臨床的に重要な不整脈であるが、発作性上室性頻拍と比較するとその臨床電気生理学的な知見には乏しい。そこで、発作性心房細胞例の心房筋の臨床電気生理学的な特性について検討し、以下の知見を得た。1)発作性心房細動の発作歴のある40例(PAF群)と発作歴がない56例(対照群)について、右房内12点の洞調律時心房電位の記録を行い、心房内電位の幅と棘波の数を測定して検討した。その結果、(1)各症例における心房電位の最大幅、最多棘波数は、PAF群で有意に大で、この2つの指標は正相関した。(2)対照群の測定値から、異常電位を電位幅100ms以上あるいは棘波数8以上とすると、PAF群に多く出現し、sensitivity 70%、specificity 79%、positive predictive value 70%であった。(3)PAF群の異常電位は右房内の高位、中位、低位の順に多く分布し、特に高位の後壁で最も多く記録された。以上の所見は、発作性心房細動例の心房筋の電気生理学的特性を示し、発作性心房細動の予知や薬効評価の指標となりうると考えられる。発作性心房細動(PAF)は頻度の高い重要な不整脈であるが、発作性上室性頻拍と比較するとその臨床電気生理学的な知見には乏しい。そこで、PAF例の心房筋の臨床電気生理学的な特性について検討し、さらに、得られた諸指標を用いて臨床電気生理学的な薬効評価を行った。1)発作性心房細動の発作歴ある40例(PAF群)と発作歴がない56例(対照群)について、右房内12点の洞調律時心房電位の記録を行い、心房電位の幅と棘波の数を測定した。その結果、(1)各症例における心房電位の最大幅と最多棘波数は、PAF群で有意に大で、この2つの指標は正相関した。(2)対照群の測定値をもとに異常電位を電位幅100ms以上あるいは棘波数8以上とすると、PAF群に多く出現し、sensitivity70%、specificity79%、positive predictive value70%であった。また、この異常心房電位の1症例当りの出現数もPAF群に有意に多かった。2)PAは群40例と対照群81例について、心房期外刺激法にて心房筋受攻性を示す諸指標を検討した。その結果(1)repetitive atrial firing(RAF)fragmented atrialactivity(FAA),intraーatrial conduction delayの出現率はPAF群で対照群よりも有意に大であった。(2)また、これらの諸指標が誘発される心房期外刺激の連結期の幅(誘発域)もPAF群が対照群よりも大であった。以上の1)および2)の所見は、発作性心房細動例の心房筋の電気生理学的特性を示し,発生性心房細動の予知や薬効評価の指標となりうると考えられる。3)PAF群33例について、心房期外刺激法による諸指標を用いたdisopyramideの薬効評価を行った。心房筋有効不応期は延長し、PAFおよびFAAの誘発域は縮少する例が多く,心房内伝導時間は延長する例が多かったが、各指標は相互に関連ある変化を示したことから、薬効評価の指標としての有用性があると考えられる。
DNA損傷依存的姉妹染色分体早期分離の、p53結合蛋白質1による抑制機構の解析

p53結合蛋白質1(53BP1)は、DNA二重鎖切断が発生すると損傷部位に集積して点状のフォーカスを形成することから、細胞周期チェックポイント、あるいはDNA:二重鎖切断修復に関与することが想定されている。私は、大腸癌細胞株SW48が53BP1蛋白質を発現していないことを見出し、この細胞を用いて、53BP1を誘導発現できる細胞株(SW48dox53BP1)を樹立した。53BP1非発現状態のSW48dox53BP1細胞では、X線照射後、細胞周期がmetaphaseに停止しているにも関わらず姉妹染色分体が分離する、姉妹染色分体早期分離が高率にみられた。この現象が、53BP1発現により抑制されることから、53BP1が姉妹染色分体の分離を制御している可能性が示唆された。一方、SW48dox53BP1細胞でX線照射後の染色体断裂数を定量すると、53BP1非発現細胞では、発現細胞に比べて染色体断裂数が増加していた。さらに53BP1が、DNA二重鎖切断の非相同末端結合修復で特異的に機能するDNA Ligase IV/Xrcc4複合体のライゲーション反応を増強させることがわかった。以上より、53BP1がDNA二重鎖切断の非相同末端結合修復に関与することが示唆された。さらに、ニワトリDT40細胞を用いた53BP1-/-細胞の樹立とその解析から、53BP1が、相同組換え修復経路、古典的非相同末端結合修復経路とは異なる、Wortmannin抵抗性の非相同末端結合修復経路に関与していることが明らかになった。p53結合蛋白質1(53BP1)は、DNA二重鎖切断が形成されると切断部位に集積し、免疫染色法で確認可能な核内のfocus (dot)を形成することから、DNA損傷の修復、またはチェックポイントに関与するものと考えられている。私は、大腸癌細胞株SW48が53BP1を発現していないことを見出し、SW48細胞に53BP1を発現させた細胞株を樹立した。親株SW48細胞と53BP1発現SW48細胞を用いて以下の結果を得た。1、X線照射後のSW48細胞をコルセミド処理すると、metaphaseに停止しているにも関わらず姉妹染色分体が分離する、いわゆる姉妹染色分体早期分離が高率にみられた。2.この姉妹染色分体早期分離は、X線照射しない場合、即ちコルセミド処理のみでは全く見られなかった。3、この姉妹染色分体早期分離は、53BP1を発現させると完全に抑制された。2.53BP1とlight chainはin vitroで直接結合した。3、light chainは、DNA損傷のチェックポイントにおいて中心的な役割を果たしているリン酸化酵素ATMにより、in vitroでリン酸化された。p53結合蛋白質1(53BP1)は、DNA二重鎖切断が形成されると切断部位に集積し、免疫染色法で確認可能な核内のfocus(dot)を形成することから、DNA損傷の修復、またはDNA損傷チェックポイントに関与するものと考えられている。53BP1について、以下の研究実績を得た。1.大腸癌細胞株SW48が53BP1を発現していないことを見出し、SW48細胞に53BP1を発現させた細胞株を樹立した。(1)X線照射後のSW48細胞をコルセミド処理すると、metaphaseに停止しているにも関わらず姉妹染色分体が分離する、いわゆる姉妹染色分体早期分離が高率にみられた。(2)この姉妹染色分体早期分離はDNA損傷依存性で、さらに53BP1を発現させると完全に抑制された。2.酵母two-hybrid systemを用いて、53BP1がモーター蛋白であるCytoplasmic dynein, light chain(CDL)と結合すること見出した。

CDLの16番目のトレオニン残基は、DNA損傷チェックポイントにおいて中心的な役割を果たしているリン酸化酵素ATMにより、in vitroでリン酸化された。3.細胞へのX線照射後、53BP1はクロマチンに結合した。クロマチン結合に必要な領域(10521709残基)からなるポリペプチドは、in vitroでDNAに結合し、さらにDNA損傷修復に直接関与するLigase IVの酵素活性を高めた。以上より53BP1は、DNA損傷修復、および有糸分裂期のDNA損傷チェックポイントに関与することが示唆された。
シェ-グレン症候群における耳下線・顎下線の超音波断層像について

昭和63年度は、1987年1月から1988年11月までの78症例の検討から、シェ-グレン症候群患者の耳下線・顎下線の超音波断層像には、正常者に見られない、内部エコ-の不均一性が見られ、この不均一性は唾液線造影像によるシェ-グレン症候群の唾液線組織の変性の進行の程度に平行することが明らかとなった。そこで、平成元年度では、超音波断層像所見と病理組織学的所見との関連、および、慢性上行性唾液線炎など類似疾患との鑑別診断の観点などから、研究初年度の観察方法を多少正し、資料の不十分な研究初期の症例を除き、1988年1月から1989年12月までの2年間における132症例を対象に検討した。結果は次の如くである。1).超音波断層像上の不均一性は、病理組織学所見における、脂肪化および線維化とはあまり関連せず、導管周囲の細胞浸潤の程度と関連していることが示唆された。しかしながら、この点に関しては、試験切除標本による観察という制限から、さらに多数例による追加研究が必要である。2).内部エコ-の不均一性はシェ-グレン症候群で高頻度に見られる他、慢性上行性唾液線炎においても軽度に見られることがある。しかしながら、顎下線のエコ-レベルの上昇、境界の不明瞭化、辺線の不規則化、haloなどの所見を加味することによって、鑑別診断がある程度可能であり、超音波断層像はシェ-グレン症候群の診断に有用な方法であることが明らかとなった。超音波診断法はほとんど非侵襲性に行えるため、今後、ますますの傷床利用が期待される。1987年1月から1988年11月までに北海道大学歯学部附属病院を受診し、シェーグレン症候群と診断された患者78症例(厚生省シェーグレン病研究班診断基準による確実例62例、疑い例16例)を対象とし、超音波断層像を中心に、唾液腺造影像および病理組織学的所見との関連を検討し、次のような結果(中間的)を得ている。1.シェーグレン症候群患者の耳下腺および顎下腺の超音波断層像に、病的変化として、内部エコーの不均一性が認められた。2.その内、点状の高エコー像が散在するものを「やや不均一」、点状の高エコー像のサイズが大きく、時に、線状を呈するものを「不均一」の2つのタイプに分類できた。3.超音波断層像と耳下腺造影像(福田らのシェーグレン症候群の唾影像分類による)との対比では、唾影像上の病的変化が進行するにつれて、「やや不均一」から「不均一」の比率が増し、最も進行したIV型ではほとんどすべてが「不均一」を呈した。4.耳下腺と顎下腺の超音波断層像の比較については、唾影像でI,II,IV型を示した群では両者に差がなかったが、III型群には差があり、顎下腺ではほとんどすべてが「不均一」を呈した。5.同一患者における耳下腺と顎下腺の比較では、顎下腺の方に、より強い変化を呈する傾向があった。今後、さらに多くの症例について検討すると共に、病理組織学上の所見(細胞浸潤、腺の破壊、線維化、脂肪化など)と超音波断層像上の変化との関連、また、他の病因による慢性唾液線炎の超音波断層像とも比較検討し、1の所見がシェーグレン症候群に見られる特異的な所見であるか否かについても検討したい。昨年の中間報告の結果を参考にして、他の唾液腺疾患との鑑別診断の観点から、観察方法を多少修正し、新たに、1988年1月から1989年12月までに当科を受診した132症例を対象として検討した。症例の内訳は厚生省シェ-グレン病研究班診断基準の確実例57例、疑い例47例、その他に、慢性上行性唾液腺炎28例である。

その結果、次のことが明らかになった。1)シェ-グレン症候群の超音波断層像では、耳下腺および顎下腺の内部エコ-の不均一性が高頻度に見られた。この内部エコ-の不均一性の程度は、唾液腺造影像にもとずくシェ-グレン症候群の病変の進行程度と強い相関関係が認められた。しかし、慢性上行性唾液腺炎においても内部エコ-の不均一性が軽度に見られる症例もあり、この所見がシェ-グレン症候群だけに、必ずしも特異的な所見ではなかった。したがって、内部エコ-の不均一性だけでは、特に、慢性上行性唾液腺炎とシェ-グレン症候群II型との鑑別はむずかしい。しかしながら、顎下腺のエコ-レベルの上昇、顎下腺の境界の不明瞭化、顎下腺の辺縁の不規則化、顎下腺のhaloなど顎下腺に関する所見が、シェ-グレン症候群には強く現われ、慢性上行性唾液腺とシェ-グレン症候群II型では様子が大きく異なっており、鑑別診断がある程度可能である。2)耳下腺および顎下腺の内部エコ-の不均一性の程度と耳下腺あるいは口唇腺の病理組織学的所見との関係を見ると、“Homo"から“Het-1"までは強い相関関係が認められるが、“Het-2"以上に関しては逆の相関となった。内部エコ-の不均一性の程度は病理組織学的変化の中でも、特に、導管周囲の細胞浸潤の程度と関連しているように思われた。
ephrinB2によるNOを介した血管新生作用と動脈硬化抑制

我々はEphレセプターのリガンドであるephrin-B2がin vivo, in vitroで血管新生作用を有することを報告してきた。さらにその血管新生作用はPI3-キナーゼを介するものであることを、阻害薬を用いた実験で明らかにしたが、さらにPI3-キナーゼの下流でどのような分子機構で血管新生作用が惹起されるかの解明はできていなかった。血管内皮細胞を、増殖因子を除いた培地で12時間培養した後にephrin-B2/Fcキメラ蛋白を作用させると、用量依存的にeNOSのリン酸化が認められた。ephrin-B2/Fcキメラ蛋白を作用させる前にPI3-キナーゼ阻害薬のLY294002(10μg/ml)を30分作用させることによりeNOSのリン酸化が消失し、ephrin-B2/FcはPI3-キナーゼを介してeNOSを活性化することと考えられる。ephrin-B2/Fcキメラ蛋白が実際にNO産生を増加させるかどうかを、血管内皮細胞で調べた。ephrin-B2/Fc(1μg/ml)を作用させて48時間後に培地内のNOをGriess法で調べると、コントロールに比べ有意にNOの産生が亢進しており、さらにこのNO産生効果はPI3-キナーゼ阻害薬で減弱した。NO阻害薬であるL-NAMEで前処理すると、ephrin-B2/Fcによる血管内皮細胞のmigration促進効果が減弱しており、NOがephrin-B2による血管新生作用を媒介していると考えられる。さらに、マウスにL-NAMEを飲用水に混ぜて投与し、その後にephrin-B2による角膜血管新生を評価すると、有意に血管新生作用が減弱しておりin vivoでもNOがephrin-B2による血管新生作用を媒介していると考えられる。
Claudinの担う密着結合メカニズムの解明

本研究課題において、腸粘膜上皮間密着結合ストランドの構成分子であるヒトクローディン-4とウェルシュ菌毒素Clostridium perfringens enterotoxinのC末端ドメイン(C-CPE)との複合体の立体構造を、X線結晶構造解析により3.5オングストローム分解能で決定した。本複合体構造からヒトクローディン-4とC-CPE間の詳細な相互作用様式を解明し、さらに、C-CPE結合により惹起されるヒトクローディン-4の立体構造変化と、この構造変化に伴った密着結合ストランド崩壊の詳細なメカニズムを、既知であるマウスクローディン-15単体の立体構造との比較から明らかにした。平成25年度は、膜タンパク質クローディン-4のホモ多量体構造解析用発現プラスミド作成と大量調製条件検討を行った。『1、発現プラスミドの作成』クローディン-4ホモ多量体の結晶構造解析では、まずクローディン-4単体での精製を行うが、単体は緩衝液中で不安定である。加えて、クローディン-4は膜外領域が比較的小さく、単体ではCrystal contact不足による結晶化の困難も予想された。そこで、膜外領域のN末端やC末端に水溶性タンパク質であるT4ファージリゾチーム(T4L)や緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合させた発現プラスミドを作成し、単体での安定性とCrystal contactの改善を図った。なお、水溶性タンパク質とクローディン-4との間のリンカーには、グリシンとセリンを組み合わせて、07残基と長さの異なるものを作成した。『2、大腸菌無細胞タンパク質合成技術を利用したクローディン-4の調製』上記の水溶性タンパク質とヒトクローディン-4とのキメラタンパク質について、大腸菌無細胞タンパク質合成技術による発現と精製を行った。T4Lとのキメラタンパク質は、結晶化スクリーニングに十分耐えうる高い発現量を示し、ゲルろ過カラム上で単分散性の溶出ピークを示す程高品質であることが判明した。『3、水溶性タンパク質融合クローディン-4の性状評価』水溶性タンパク質とヒトクローディン-4とのキメラタンパク質が正常な構造を保持したものか否かを、野生型クローディン-4に対して強い親和性を示す毒素Clostridium perfringens enterotoxinのC末端側フラグメント(C-CPE)への結合性を指標に調べた。T4Lとのキメラタンパク質は野生型と同等の強い親和性を示したが、N末端側にGFPを融合させたキメラタンパク質はC-CPEへの結合を示さず、正常な構造を保持していないことが判明した。平成26年度は、膜タンパク質クローディン-4とクローディン-4ホモ多量体を認識する抗クローディン-4抗体との複合体調製に関する検討を行った。1、ヒトクローディン-4ホモ多量体認識抗体の発見:ヒトクローディン-4と抗体との複合体形成を反映した、サイズ排除カラム上での高分子量側への溶出ピークシフトの有無を指標とした、外部機関研究室から供与されたマウス抗ヒトクローディン-4抗体(マウス腹水より調製)のスクリーニングから、他の結合型クローンよりも顕著に高分子側へピークシフトする、ヒトクローディン-4のホモ多量体を認識する抗体を見出すことが出来た。2、抗クローディン-4抗体フラグメントの調製:ヒトクローディン-4のホモ多量体を認識する抗体の結晶構造解析に適した抗体フラグメント(Fab、Fv、一本鎖Fv)を作成し、大腸菌無細胞タンパク質合成技術を利用して発現を確認した。これらのうち、Fabと一本鎖Fvは結晶構造解析に耐えうる高い発現量であった。このFabと一本鎖Fvサイズについて排除カラム上の挙動を指標にヒトクローディン-4結合能を調べたところ、どちらも全長抗体と遜色ない高い結合能を確認出来たことから、大腸菌無細胞タンパク質合成技術を利用した大量調製に移行した。3、ヒトクローディン-4・抗クローディン-4抗体一本鎖Fv複合体の大量調製:主に、ホモ多量体を認識すると示唆されるクローンの一本鎖Fvとの複合体の大量調製を進めている。精製一回につき、約1.8 mgの精製標品が調製可能となっており、結晶化条件スクリーニング実施に向けた試料供給体制が整った。1、ヒトクローディン-4・抗クローディン-4ホモ多量体認識抗体複合体の結晶化条件スクリーニングとX線回折実験前年度発見した抗クローディン-4ホモ多量体認識抗体フラグメント(Fab、一本鎖Fv)とヒトクローディン-4との複合体について結晶化条件スクリーニングを実施した。これまでにミセル法とバイセル法による約10,000条件の一次スクリーニングを行い、十数条件から微結晶形成を確認している。このうち、結晶化条件最適化により10 μm超に成長した4条件分の結晶について放射光施設SPring-8 BL41XUにてX線回折実験を行い、収集した23オングストローム分解能のデータセットを解析した結果、抗体のみの結晶であることが判明した。現在は微結晶を得た別の条件について最適化中である。2、ヒトクローディン-1ホモ多量体認識抗体の発見と抗体フラグメント作成外部機関研究室から供与されたマウス抗ヒトクローディン-1抗体から、ヒトクローディン-1との複合体形成によりサイズ排除カラム上での溶出位置が著しく高分子量側へシフトした1クローンを発見した。

このIgG配列を基に結晶構造解析に適した抗体フラグメントを作成し、ヒトクローディン-4との複合体との複合体形成能をサイズ排除カラムやBlue Native-PAGEにより解析したところ、ヒトクローディン-1との複合体は推定約400 kDa超の多量体として溶液中に存在することを確認した。3、抗体フラグメントの動物細胞発現系を利用した大量調製これまで、結晶化用の抗体フラグメントの調製には大腸菌無細胞タンパク質合成を利用してきたが、Fabに関しては発現量が乏しかった。調製量効率化を目的とした発現系の再検討の為、今回新たに昆虫細胞とExpi293Fを検討したところ、後者の発現系にて培地1リットル当たり60 mgのFabフラグメントが調製可能となった。昨年度の研究実施状況報告書内で予定した通り、ヒトクローディン-4・ホモ多量体認識抗体複合体の結晶化条件スクリーニングへ進めることが出来たが、複合体の構造解析へ進めることが出来ていない。このことから、平成28年度が本課題の最終年であることを考慮するとやや遅れていると言わざるを得ない。一方で、クローディン-4での状況を補填する為に開始したヒトクローディン-1においても、良好なホモ多量体認識抗体を発見し、複合体の結晶化条件スクリーニング開始の準備が整えることが出来たことから、平成28年度内での達成も十分可能であると考えている。クライオ電子顕微鏡を利用したヒトクローディン・抗クローディンホモ多量体認識抗体複合体の単粒子解析前年度まで進めていた、ヒトクローディン・抗クローディンホモ多量体認識抗体フラグメント(Fab、一本鎖Fv)複合体のX線結晶構造解析では、抗体フラグメントのみの結晶しか得ることが出来なかった。抗クローディン抗体フラグメントは抗体のみで著しく結晶化し易く、結晶化条件下において複合体を安定的に保てないことが原因の一つであると考えている。この為、結晶化工程を伴うX線結晶構造解析から電子顕微鏡による単粒子解析に立体構造解析手法を変更した。電子顕微鏡による単粒子解析では、比較的安定な多量体複合体を形成する、ヒトクローディン-1・Fabフラグメント複合体について、界面活性剤存在下で精製した試料を作成し、ネガティブ染色法とクライオ電子顕微鏡法による観察を実施した。さらに、しばしば電子顕微鏡観察の妨げになる試料中の界面活性剤ミセルを除去する目的として、膜蛋白質の膜貫通領域上の界面活性剤と置き換わる、約8 kDaの水溶性蛋白質サポシン(Nat. Methods, 2016Apr;13(4):345-51)を利用した界面活性剤非存在下での精製試料を作成し、同様に観察を実施した。これまでのところ、界面活性剤存在下/非存在下のどちらの精製試料においても、2分子のクローディン-1に2分子のFabフラグメントが結合した複合体と推測されるY字状粒子を観測した。一方で、どちらの精製試料も、クライオ電子顕微鏡法用試料の作製時に凝集を生じる傾向があり、立体構造解析に充分な粒子数を得ることが出来ていないことが課題となっている。現在は、立体構造解析に利用する粒子数の改善の為、界面活性剤の種類と濃度などの試料条件を最適化中である。
ヒト型抗ＧＴＦ抗体をイネに産生させた食べるう蝕予防ワクチンの開発

S. mutans菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ(CA-GTF)を抽出精製した.GTFの活性ドメインである触媒(CAT)領域とグルカン結合(GBD)の組換えタンパクに対する抗血清のグルカン合成抑制能は低く,両者は標的として適切でなかった.Parker法での抗原解析で抗原性の高く機能が特定されていないN末端側の多様性領域(VR)に対するDNAワクチンプラスミドを構築しマウスに免疫した.マウス抗血清はGTFBのみと反応し抗CA-GTF抗血清と同程度のグルカン合成抑制能を示した.この抗体を産生するモノクロナル抗体の作成を試みたが有効なクローンが得られず,以後の計画が達成されなかった.本研究の目的はう蝕予防のためのワクチンを作成する試みとして,一般的には抗原を投与して,抗体誘導をはかるが,いろいろな副作用が考えられる抗原を免疫するのではなく,抗体を利用する受動免疫によるワクチネーションの手段を想定している.さらに.利用する抗体も安全性に疑問があるがん細胞由来のハイブリドーマーなどではなく,最終目標はヒト型抗体をイネに産生させるという食べるワクチンをめざしている.前年度からの課題として抗原性の高い領域の解析を行うなかで,他のレンサ球菌や乳酸桿菌が保持しているグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)の遺伝子配列の比較を行った.その解析の過程でS. mutansのGTF遺伝子の祖先は乳酸桿菌のものと想定され,遺伝子の水平伝播によって口腔のレンサ球菌に取り込まれた可能性が高いことがあきらかとなった.この結果はGTFを保持しているレンサ球菌(S.mutans, S. sobrinus, S.oralis, S.sanguinis, S. salivarius)は全て口腔由来であることと一致している.これらの結果は,今後ミュータンスレンサ球菌のGTF特異的なワクチン標的部位を選定する上で,大きな手がかりを提供するものと考えられた.本研究の目的は,う蝕予防のためのワクチンを作成する試みとして,一般的に行われている抗原の投与による能動的な免疫誘導ではなく,抗体を投与することによる受動的免疫を手段として想定している.さらに投与する抗体は,一般に用いられる羊,馬,やウサギ,ラットといった動物由来ではなく,より安全性の高い食物として用いられているイネにヒト型抗体を産生させることを最終目的とした.前年度にターゲットとするグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子(gtf)の解析を行い,この遺伝子が,口腔由来のレンサ球菌に特異的に局在して存在していること,進化論的にStreptococcus mutansのgtf遺伝子の由来が,乳酸菌に存在するよく似たグルコシルトランスフェラーゼの遺伝子にあることをあきらかにした.このことは,う蝕の予防のためには,S.mutansだけでなく,古くからう蝕原因菌の1つと言われてきた乳酸菌についても,再評価する必要性を示唆することとなった.そこで今年度では,小児の口腔内の乳酸菌のレベルの再評価をおこなった.またクローニングしたgtf遺伝子を植物に組み込む手法の確立を目指したものの,十分な結果を得ることができなかった.S. mutans菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ(CA-GTF)を抽出精製した.GTFの活性ドメインである触媒(CAT)領域とグルカン結合(GBD)の組換えタンパクに対する抗血清のグルカン合成抑制能は低く,両者は標的として適切でなかった.Parker法での抗原解析で抗原性の高く機能が特定されていないN末端側の多様性領域(VR)に対するDNAワクチンプラスミドを構築しマウスに免疫した.マウス抗血清はGTFBのみと反応し抗CA-GTF抗血清と同程度のグルカン合成抑制能を示した.この抗体を産生するモノクロナル抗体の作成を試みたが有効なクローンが得られず,以後の計画が達成されなかった.本研究はう蝕予防のためのワクチンを作成する試みとして,これまで数多く行われてきた能動免疫による抗体の誘導ではなく,抗体を作成して,これを直接作用させる受動免疫によるワクチネーションの手段をとっている.また最初に誘導する抗体はマウス由来であるが,このマウス型抗体から遺伝子組換えを行ってヒト型抗体に改変し,ヒトにおける適応性の向上を図る.さらに抗体の作用手段として,最終的には植物(イネ)に抗体産生遺伝子を導入し,米に抗体を産生させて,食べられる安全性の高いワクチンをつくりだすことを目的としている.今年度は,計画にしたがい,Streptococcus mutansのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子(gtf)のシグナル配列直下の可変領域(VR)に対するDNAワクチンプラスミドを作成し,マウスに免疫を行った.免疫したマウス抗体価を調べると,抗体価の比較的高い個体が認められ,その血清ではグルコシルトランスフェラーゼの活性の抑制も認められた.(研究発表の1)そこで,この抗体価高い個体からハイブリドーマ作成を試みた.しかしながら,年度内には結果としてハイブリドーマを得るに到らなかった.今年度は,研究室の移転が春にあり,研究環境の再構築に時間がかかってしまったため,研究の中心がin silico(計算機上)のものとなった.最初の段階であるハイブリドーマの作成が終了せず,その先に進めなかった.

DNAワクチンのマウスへの免疫は動物実験,DNA組換え実験であり,多数の個体を行うためには費用がかかるため,数多く行えなかったことが理由の1つと考えられる.またより抗原性の高い領域を再検討する必要もあると考え,抗原決定部位の再解析をおこなった.ハイブリドーマーの構築と植物への遺伝子組換えの体制を構築するハイブリドーマの作成を進めるとともに,先に植物への遺伝子導入法の確立を進める予定であるが,予算的に今年度以上の個体数を行う事は困難かもしれないので,先に植物への遺伝子導入法の確立をめざす.植物への遺伝子組換えのに必要な試薬,器材の購入技術導入の情報収集,および学会での成果発表のための旅費等植物への遺伝子導入に必要な試薬,器材の購入.および情報収集のための旅費等
遷移金属触媒による水素-ホウ素交換反応を基軸とした高効率分子変換

炭素-炭素二重結合上での水素-ホウ素交換反応を高効率で達成する白金触媒系を見出し、位置および立体選択的な有機ホウ素化合物構造の構築法を確立した。さらに、本反応の進行により副生する水素化ケイ素化合物を、炭素-炭素二重結合に効率よく付加させるロジウム触媒系を明らかとした。これら二つの反応を応用し、二重結合の幾何異性と連続する不斉炭素中心の立体化学を高度に制御しながら複数の結合形成を行う、連続分子変換を達成した。二重結合の幾何異性や連続する不斉炭素中心の立体化学を高度に制御しながら複数の結合形成を達成するカスケード型反応の開発を目的として、触媒的な水素-ホウ素交換反応を基軸とするカスケード反応系「不飽和炭化水素の遠隔ビスメタル化」の開発に取り組んだ。交付申請書に記載の「研究項目1.遷移金属触媒による水素-ホウ素交換反応および水素-ケイ素付加反応の検討」において、モデル基質を用いた水素-ホウ素交換反応の反応条件最適化を行った。触媒金属や配位子、反応温度、溶媒等について検討した結果、電子供与性の弱いトリス(p-トリフルオロフェニル)ホスフィンを配位子に有する白金触媒を用い、トルエン中80°Cで反応を行うことにより効率よく水素-ホウ素交換反応が進行し、多置換アルケニルホウ素化合物が収率よく生成することを見出した。次にケイ素-水素の分子内付加について検討を行ったところ、トリメチルホスフィンを配位子に有するロジウム触媒存在下テトラヒドロフラン中室温において効率よく反応が進行し、環状シリルエーテルを良好なジアステレオ選択性で与えたのに対し、白金触媒では十分なジアステレオ選択性を得ることができないことが明らかとなった。これらの知見を基に、交付申請書に記載の「研究項目2.触媒的カスケード遠隔ビスメタル化の開発」においては、白金とロジウムの二種の触媒系を段階的に適用し検討を行った。対称型の1,4-ペンタジエン-3-オール誘導体および1,6-ヘプタジエン-4-オール誘導体を基質に用いて反応を行ったところ、二段階の反応によりそれぞれ1,5-位および1,7-位にボリル基とシリル基が立体選択的に導入された遠隔ビスメタル化生成物を収率よく得ることに成功した。これらの知見は、精密な構造制御と多様な誘導体合成への応用が可能な、鎖状分子骨格の新しい構築法確立に資すると考えられる。平成21年度は、まず平成20年度に実施した「遷移金属触媒による水素-ホウ素交換反応および水素-ケイ素付加反応の検討」において知見を得た、ロジウム触媒による分子内ヒドロシリル化における配位子効果についてさらに詳細な検討を行った。その結果、リン配位子の電子的要因が反応の効率と立体化学に大きく影響を与えることが明らかとなり、電子供与性の弱いトリフルオロメチルフェニル基を有するリン配位子を用いることで、第3級アリル型アルコール誘導体の分子内ヒドロシリル化が高収率かつ高ジアステレオ選択的に進行することを見出した。次に、交付申請書に記載の「触媒的カスケード遠隔ビスメタル化の有機合成への応用」に取り組んだ。対称な構造を有する1,4-ペンタジエン-3-オール誘導体の遠隔ビスメタル化により立体選択的に調製した化合物に対し、まずボリル基部位におけるハロゲン化アルケニルとの鈴木-宮浦カップリングにより、多置換1,3-ジエンへ誘導する反応条件を明らかとした。さらに、得られた生成物に対し玉尾酸化条件を適用し連続的にシリル部位の水酸基への変換を行うことで、1,3-ジオール構造と1,3-ジエン構造を有する非対称な化合物へ誘導することに成功した。この2段階の変換反応は、いずれも前駆体の立体化学を保持して行うことができたため、単純な対称型構造の出発化合物から遠隔ビスメタル化を経由する非対称型構造の多官能性化合物への効率的かつ立体選択的変換が達成された。本変換反応は、天然物に含まれる鎖状分子骨格の新しい構築法として応用が期待できる。