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抗ガン治療の基礎研究 : 樹状細胞によるNK細胞活性化機構の解明

NK細胞は抗腫瘍効果を担う免疫細胞である.ウイルスゲノムを模したpolyl : CはNK細胞を主体とする強い抗腫瘍効果を誘導する.本研究はpolyl : Cを受容した樹状細胞(DC)によるアダプター分子TICAM-1とIPS-1を介したNK細胞活性化機構の解明を目的とした.特に, TICAM-1の下流で発現が制御される新規NK活性化因子IRF-3-dependent NK-activating molecule (INAM)に焦点を絞り,解析をおこなった.生体内におけるINAMを介したNK細胞の活性化機構を解析するために, INAM欠損マウスを作製した.その結果, NK細胞の初期IFN_Y産生にはINAMを介したNK細胞とアクセサリー細胞(DCやマクロファージ)の相互作用が必須であることを明らかにした.また, IFN_Y感受性メラノーマによる肺転移のpolyl : C治療にINAMが必須であることを明らかにした.以上のことから, INAMはIFN_Y感受性癌細胞に対する抗癌治療の新しいターゲット分子になることを示した.他方, TICAM-1およびIPS-1の下流で制御される遺伝子の探索過程で,自然免疫応答や骨形成に関与するTriggeringreceptor expressed on myeloid cells (Trem)ファミリーの中に,典型的なペア型レセプターが存在することを見出した.脊椎動物Tremの系統解析から,これらペア型Tremはマウス特異的な遺伝子群であり,抑制型Tremより誕生したことを明らかにした.また,これら遺伝子のうち,抑制型Treml6と活性型pDC-TremがTICAM-1や1PSの下流で発現されるI型IFNによって発現誘導されることを明らかにした.現在,これらレセプターの機能解析を遂行している.(抄録なし)NK細胞は抗腫瘍効果を担う免疫細胞である.ウイルスゲノムを模したpoly I:CはNK細胞を主体とする強い抗腫瘍効果を誘導する.この時,樹状細胞(DC)とNK細胞の細胞接着依存的な機構が必須である.本研究は樹状細胞のpoly I:C受容体からのシグナル伝達に必須なアダプター分子であるTICAM-1およびIPS-1に着目し,poly I:Cの認識からNK細胞の活性化へと至る分子基盤の全貌を明らかにすることを目的とする.加えて,前著を背景として同定されたNK活性化因子の1つであるINAMの生理的意義を明らかにする目的でその欠損マウスおよび抗体を作成し,解析を行なう.《今年度の実施計画と進捗状況》●INAM欠損マウスの作成●抗INAMポリクローナル抗体を用いた結合分子の探索と該当分子の質量分析解析●抗INAMポリクローナル抗体を用いた免疫シナプス形成機構の解析上記め研究を遂行するため,INAMを遺伝子導入したウサギRK13細胞を抗原とし,抗INAMポリクローナル抗体を作成した.●TICAM-1とIPS-1欠損マウス由来樹状細胞を用いたマイクロアレイ解析によるTICAM-1およびIPS-1依存的遺伝子群のカタログ化●NK活性化因子候補のスクリーニングTICAM-1およびIPS-1欠損マウス由来樹状細胞と野生型由来樹状細胞をpoly I:C刺激し,ジーンチップ解析をおこなうことで,網羅的にTICAM-1,IPS-1およびそれらにより発現誘導されるI型インターフェロン依存的遺伝子群を同定し,カタログ化した.現在,膜分子に着目し,NK活性化候補遺伝子をスクリーニングしている.NK細胞は抗腫瘍効果を担う免疫細胞である.ウイルスゲノムを模したpoly I:CはNK細胞を主体とする強い抗腫瘍効果を誘導する.この時,樹状細胞(DC)とNK細胞の細胞接着依存的な機構が必須である。本研究は樹状細胞のpoly I:C受容体からのシグナル伝達に必須なアダプター分子であるTICAM-1およびIPS-1に着目し,poly I:Cの認識からNK細胞の活性化へと至る分子基盤の全貌を明らかにすることを目的とする.加えて,前著を背景として同定されたNK活性化因子の1つであるINAMの生理的意義を明らかにする目的でその欠損マウスの解析をおこなう.《今年度の実施計画と進捗状況》●INAM欠損マウスの解析前年度,INAM欠損マウスの作成をおこなった.本年度はINAM欠損マウスを用い,生体内におけるNK細胞活性化能を評価した.その結果,INAM欠損マウスでは野生型マウスに比べ,部分的にサイトカイン産生および細胞傷害活性の低下が認められた.加えて,INAM欠損マウスおよび野生型マウス由来のNK細胞と脾臓DCの共培養実験から,NK細胞とDCで発現するINAMがサイトカイン産生に重要な役割を担うことを明らかにした.●抗INAM抗体を用いた結合分子の探索と該当分子の質量分析解析●抗INAM抗体を用いた免疫シナプス形成機構の解析上記の研究を遂行するため,INAM欠損マウスにINAM過剰発現B16D8細胞を免疫して,モノクローナル抗体の樹立を企画している.●NK活性化因子候補のスクリーニングおよびそれらの機能解析前年度,骨髄由来DCを用いたTICAM-1,IPS-1およびI型インターフェロン誘導性遺伝子群をカタログ化した.その結果,(1)新規ペア型レセプター群,および(2)CD8a陽性DCのみに発現が認められるレセプターを同定した.現在,これらの機能解析を遂行している.NK細胞は抗腫瘍効果を担う免疫細胞である.

ウイルスゲノムを模したpolyl : CはNK細胞を主体とする強い抗腫瘍効果を誘導する.本研究はpolyl : Cを受容した樹状細胞(DC)によるアダプター分子TICAM-1とIPS-1を介したNK細胞活性化機構の解明を目的とした.特に, TICAM-1の下流で発現が制御される新規NK活性化因子IRF-3-dependent NK-activating molecule (INAM)に焦点を絞り,解析をおこなった.生体内におけるINAMを介したNK細胞の活性化機構を解析するために, INAM欠損マウスを作製した.その結果, NK細胞の初期IFN_Y産生にはINAMを介したNK細胞とアクセサリー細胞(DCやマクロファージ)の相互作用が必須であることを明らかにした.また, IFN_Y感受性メラノーマによる肺転移のpolyl : C治療にINAMが必須であることを明らかにした.以上のことから, INAMはIFN_Y感受性癌細胞に対する抗癌治療の新しいターゲット分子になることを示した.他方, TICAM-1およびIPS-1の下流で制御される遺伝子の探索過程で,自然免疫応答や骨形成に関与するTriggeringreceptor expressed on myeloid cells (Trem)ファミリーの中に,典型的なペア型レセプターが存在することを見出した.脊椎動物Tremの系統解析から,これらペア型Tremはマウス特異的な遺伝子群であり,抑制型Tremより誕生したことを明らかにした.また,これら遺伝子のうち,抑制型Treml6と活性型pDC-TremがTICAM-1や1PSの下流で発現されるI型IFNによって発現誘導されることを明らかにした.現在,これらレセプターの機能解析を遂行している.概ね,実施計画に沿った研究成果が得られている.抗INIW抗体の作成において,当初ハムスターを用いたモノクローナル抗体の作成を計画していたが,その樹立には至らなかった.そこで,ウサギを用いた抗INAMポリクローナル抗体作成に変更し,上記研究目標を達成した.申請時に提出した年次計画通りに研究を遂行し,その成果を得ている.INAMの生理的意義を明らかにする目的でその遺伝子欠損マウスおよび抗INAM抗体を作製した.今後,in vitroおよびin vivoでの解析を通して,上記目的を達成する.また,ジーンチップ解析から,NK活性化を担い得る候補遺伝子をスクリーニングしている.今後,これらの遺伝子を対象とした機能解析を行なう予定である.INAM欠損マウスの解析では,各種病態モデルを検索し,INAMの生理的意義を検討する.さらに,INAMを介したNK細胞の活性化機構を細胞・分子レベルで詳細に検討する.また,現在までにINAM以外のNK活性化因子候補のスクリーニングが終了している.これら候補遺伝子の機能解析も順次進める予定である.(抄録なし)
界面活性剤が気泡流の巨視的構造に与える影響の解明

垂直チャネル内上昇気泡流の3次元計測をスキャニングステレオPIVにより行うため,主流方向(x方向) 30mm,壁面垂直方向(y方向) 40mm,スパン方向(z方向) 20mmの計測領域を,ガルバノミラーを用いてレーザシートをz方向に走査し, x方向約0. 5mm, y方向0. 50m, z方向約1mmの空間分解能で約10万の速度ベクトルを取得し,流動構造の時間変化を約30Hzで捉えられる3次元計測系を構築した.この計測系で単相乱流場の計測を行い,従来の結果(実験および数値計算)と良好な一致を得た。さらに,この計測システムを利用して,数十個程度の気泡が集積した気泡クラスターが壁面近傍を上昇していく状態で速度場の計測を行い,これまでLDVの計測によってのみ,得られてきた気泡流乱流状態におけるレイノルズ応力の大幅な減少を計測することに成功した。また, PIV計測の特性を活かし,気泡クラスターの影響によりチャネル中央部の乱流構造が変化する様子を可視化することに成功した。チャネル内上昇気泡流乱流中における壁面近傍の気泡クラスター周りの流れの解明に向け,平成21年度は,液相速度場の三次元計測を行なうためのスキャニングステレオPIVの実験系の構築を始めた.まず,本研究で対象とする気泡流現象から計測で必要とされる時空間解像度を見積り,光源であるパルスレーザーやレーザー光を走査するガルバノスキャナ,高速度カメラ及びレンズ系の選定を行った.計測対象の気泡クラスタサイズはスパン方向に20-40mm程度であり,またチャネルの壁面間隔が40mmであることから,40mm立方という計測領域を設定し,1mm程度の厚みを持つレーザーシートにより高速度カメラの撮影速度限界までの計測が可能となるシステムを構築した.以上のセッティングにより,気泡クラスターによるチャネル内気泡流の乱流変調に関して,十分な時空間解像度をもって渦度場の可視化ができるものと期待される.本年度は,気泡-液相間相互作用及び気泡に働く3次元的な力を解析するための3次元計測システムの準備を進めたが,実際に計測を行なった系は,単一上昇気泡に関する2次元断面におけるデータに留まった.従来からレーザーシートを用いた気泡流の計測に置いては気泡極近傍における計測の困難が指摘されているが,本実験系においても同様の障害がある一方,既存の研究により気泡クラスターによる劇的な乱流変調が示唆されているチャネル中央部における計測に対しては支障がないことが確認された.また,21年度に取得したデータから,界面活性剤の違いにより単一気泡に働く揚力に違いが出ることを実験的に示した.さらに,揚力の定量的評価を行ない,界面活性剤中における揚力が界面の汚れ度を現す無次元抗力係数を用いて整理できることを再確認した.平成22年度は,スキャニングPIVを用いて垂直チャネル内上昇気泡流の3次元計測を開始した.主流方向(x方向)35mm,壁面垂直方向(y方向)40mm,スパン方向(z方向)20mmの計測領域を,ガルバノミラーを用いてレーザシートをz方向に走査し,x方向約0.35mm,y方向約0.50m,z方向約1mmの空間分解能で約18万の速度ベクトルを取得し,流動構造の時間変化を約30Hzで捉えられる3次元計測系を構築した.まずはじめに構築された計測系により,2次元チャネル内流れに関して,3次元単相乱流場の計測を行ない,他者により得られている従来の結果と良好な一致を得ることに成功した.次に,直径約1mmの気泡が上昇する系において,気泡から十分離れた領域において,良好な粒子画像を得るのに成功し.気泡が壁面近傍を上昇する場合に,チャネル中央部の大域的な乱流構造の計測が十分可能であることを確認した.

また,静止流体中を上昇する直径約10mmの大変形気泡の計測を行い,レーザシートの気泡への照射位置の違いによる気泡周囲の粒子画像への影響は見られるが,気泡後流部の3次元的な流動構造を十分な精度で計測できることを示した.以上,本年度は,当初予定していた複数(2100個程度)の気泡を含む乱流場の計測については,レーザーシートとガルバノミラーによるレーザーシートの制御および気泡表面からの反射光の影響など光学系の調整で手間取り,十分な精度での実験を達成できなかったが,単相の乱流場の測定および上昇気泡の後流構造の計測については,スキャニングPIVの実験系を構築し,目的の流れ場の計測に成功した.平成22年度は,レーザーシートとガルバノミラーによるレーザーシートの制御および気泡表面からの反射光の影響など光学系の調整で時間がかかり,十分な精度での実験を達成できず,単一気泡の計測にとどまった.これに対し,平成23年度は,光学系の細かな調整および統計量算出のためのソフトウェアの改良を行ない,単相乱流に関して従来得られてきた他者による結果(実験および数値計算)と良好な一致を得た.さらに,この計測システムを利用して,数個数十個個程度の気泡が集積した気泡クラスターが壁面近傍を上昇していく状態で,チャネル中央部における速度場および渦構造の瞬時空間分布の取得を目指し実験を行った.これまでの検討より,多数の気泡の存在下では,気泡からの反射光の影響で十分信頼できるデータの取得が困難と考えられた.そこで,ここでは,気泡クラスターの形成による乱流構造の変化を捉えることができ,かつ,レーザーシートによる照明光と計測領域外の気泡との干渉を極力回避することで十分な精度の計測が行なえる条件の搾り出しを行なった.その結果,壁面近傍から少ない数の気泡を注入することにより壁面近傍に気泡クラスターを安定に作り出し,結果として,これまでLDVの計測により得られてきた気泡流乱流状態におけるレイノルズ応力の大幅な減少を,構築されたPIVシステムにより計測することに成功した.さらに,PIV計測では,LDV計測とは異なり速度場の空間分布の情報が得られており,気泡クラスターの影響によりチャネル中央部の乱流構造が変化する様子を可視化することに成功した.
XAFSによる電極界面構造解析・銀単結晶上の臭素吸着系を中心として

表題の系は-0.76V(0.35ML)で秩序・無秩序転移が起こることが知られており、秩序層では、c(2x2)の臭素吸着層を形成している。我々はこの秩序層での臭素原子の周りの局所構造をXAFS法によって調べた。実験はin situ条件下で行い、、全反射法で散乱X線を抑えることにより、満足なXAFSスペクトル測定に成功した。BrK吸収瑞XANESからは、Brから電極基板への電荷移動がおこっていることが分かった。EXAFS解析からは、BrがAg(100)面上のfourfold hollow siteにR(Br-A9)=2.82Aの結合距離で吸着していることが分かった。以上の結果は、最近のX線表面回折の結果と定性的には一致しているが、定量的にはかなり異なり、我々の結果は、臭素原子が銀基板に強い共有結合性をもって結合していることを示している。(2)銅基板上のアルカンチオールの吸着構造代表的な自己組織化膜であるアルカンチオールが銅基板とどのように結合しているかを主として表面XAFSとSTMを用いて調べた。飽和吸着状態のCK-NEXAFSからは、アルカンチオールが基板表面から70度の傾きで立っていること、EXAFSからは、アルキルチオレイトとして基板に吸着し、Sが再配列しないCu(100)面上にfourfold hollow siteに吸着する構造をとること、Cu(111)面上では、基板の大きな再配列を伴い、S原子が基板に深く潜り込んだthreefold hollow siteに吸着する構造をとることが分かった。STMからは、アルカンチオールの被覆率によって、表面の吸着の振る舞いがどのように変わるかを詳細に調べることができた。これら2つの手法による結果をまとめることにより、アルカンチオールと金属基板との相互作用に関する詳細な描像を得ることができた。
インド・ゴア社会の大衆演劇「ティアトル」をめぐる実践と共同性の文化人類学的研究

本年度は、以下の2点を中心に研究を進めた。(1)ゴア社会の大衆劇「ティアトル(tiatr)」の劇団主宰者・俳優が物語・身体動作・歌(カンタール)で「ゴア性」を観客に喚起しようとする過程についての調査、(2)ゴア外、特にアラブ首長国連邦ドバイ・サルジャーにおけるゴア人コミュニティ内のティアトル受容の現状。現地調査を2回実施し(平成19年4月24日5月9目、8月27日9月10日)、具体的には、以下の作業を行った。第一回目の調査は、ゴアとアラブ首長国連邦ドバイで行った。ゴアでは、一つの劇団のある村落への出張公演に同行し、劇団員が舞台上で「ティアトル俳優になる」点を中心に舞台設営から終了までを観察した。ドバイの調査では、劇団の現地エージェントの男性にドバイにおけるティアトル受容の現状について、特にゴアからの公演招聘の手順を中心にインタビューを行った。第二回目の調査もゴアとドバイで行った。ゴアでは、ティアトルにおける身体動作を中心に俳優にインタビューを行い、ドバイでは、ティアトルの公演場所の調査を行った。本年度後半は、南アジアにおける演劇関連図書の収集・レビューを継続するとともに、調査成果のまとめを行った。その一部を日本文化人類学会、「宗教と社会」学会(2007年6月)と国立民族学博物館共同研究「キリスト教文明とナショナリズム-人類学的考察」研究会(2008年3月)で発表した。本年度はゴア社会の大衆劇「ティアトル(tiatr)」の流通と消費の実体を明らかにするために2回の現地調査を行った(平成17年8月13日9月13日、12月15日31日)。第一回目の調査では、アマチュアのコンテストに参加するティアトル劇団の脚本兼演出担当者と俳優にインタビューを行うとともに、その劇団の練習過程を参与観察した。この作業によって、ティアトルを実践する人々の社会的属性や社会の要請から何をくみ取って劇にメッセージ性を付与していくかというティアトルの社会的位置づけについての知見を得ることができた。ミュージカル劇の体裁を取るティアトルの幕間で歌われる挿入歌のカンタール(kantar)は、インド映画の挿入歌と同様の形で、ポピュラー音楽としてカセットテープやCDの形でも人々に消費される。ゴアの最初のレコード店(現在はカセットテープ・CD・ヴィデオCD(VCD)・DVDを販売)であるV.P.シナリ(Sinari)で販売されるカンタールのカセットテープ・CDとここ2、3年で出てきたティアトルの舞台映像を編集したVCDのリストを作成した結果、急速にティアトルのデジタル化が進んでいることが明らかになった。ティアトルの主要な観客であるゴアのキリスト教徒の多くが出稼ぎに出ている中東の国々(サウジアラビアやアラブ首長国連邦)では、ティアトルのVCDに対する受容が高い。だが、CDやVCDは海賊版の作成が容易であり、オリジナルの販売量が減っているという問題の存在がある。第二回目の調査では、近年ゴアの現地語コーンクニー語のローマ字筆記を公用語として政府に認めさせる運動にティアトリスト(ティアトルの脚本を書くとともに演じる人々)たちが関わり始めた状況に調査の焦点を絞った。現地語のローマ字筆記は、キリスト教会で主に使用されてきた。ティアトルがゴアのキリスト教徒を受容対象としていることが、この点からも明らかになった。本年度はゴア社会の大衆劇「ティアトル(tiatr)」の劇団の興行状況を明らかにするために2回の現地調査を行った(平成18年4月26日5月9日、8月618日)。第一回目の調査では、ティアトル劇団の劇団主宰者2名にインタビューを行った。元々ティアトル公演に関わる劇団主宰者や俳優はアマチュアであり、ティアトル自体が教会の祭の際に村の有志が上演する形式であった。しかし、最近20年間に商業化が進み、年間の全ティアトル劇団の興行売り上げが10クロール(約2.5億円)と言われるほどとなっている実態が明らかになった。また、ティアトル劇団の主宰者たちが現地語コーンクニー語で脚本執筆に使用する文字がローマ字であり、ローマ字コーンクニー語の州公用語化としての認定を目指す動きがあることが実際に確認された。更にティアトルの脚本を元に映画化された作品「パドリPadri」制作の背景とゴアでの興行状況に関する調査を行った。ティアトル挿入歌カンタール(kantar)CDとティアトル劇ヴィデオCDの制作・販売を行うゴア最大のレコード店(現在は主にCD・DVDの販売を行っている)V.P,シナリ(Sinari)の店主にインタビューを行い、店がティアトルのCDとヴィデオCDを制作するようになった経緯(売り上げよりも文化を守ることが大事である)が明らかになった。第二回目の調査では、ティアトル興行のチケット販売などの劇団主宰者や俳優以外の興行関係者の動きについての調査を行った。普段はアラブ首長国連邦のドバイに拠点を置き、ゴアに戻ったときにチケット販売を請け負う人物にインタビューを行った。その結果、アラブ首長国連邦でのティアトル興行の手配を行う仲介者の役割が重要であることが明らかになった。国内では、商品流通とイメージの拡大およびキリスト教宣教師の言語政策を専門とする研究者と意見交換を行い、演劇関連図書の収集・レビューを行った。

現地調査を2回実施し(平成19年4月24日5月9目、8月27日9月10日)、具体的には、以下の作業を行った。第一回目の調査は、ゴアとアラブ首長国連邦ドバイで行った。ゴアでは、一つの劇団のある村落への出張公演に同行し、劇団員が舞台上で「ティアトル俳優になる」点を中心に舞台設営から終了までを観察した。ドバイの調査では、劇団の現地エージェントの男性にドバイにおけるティアトル受容の現状について、特にゴアからの公演招聘の手順を中心にインタビューを行った。第二回目の調査もゴアとドバイで行った。ゴアでは、ティアトルにおける身体動作を中心に俳優にインタビューを行い、ドバイでは、ティアトルの公演場所の調査を行った。本年度後半は、南アジアにおける演劇関連図書の収集・レビューを継続するとともに、調査成果のまとめを行った。その一部を日本文化人類学会、「宗教と社会」学会(2007年6月)と国立民族学博物館共同研究「キリスト教文明とナショナリズム-人類学的考察」研究会(2008年3月)で発表した。
黄体由来血管内皮細胞におけるプロスタグランジンおよび活性酸素作用機序の解明

哺乳動物の黄体は、妊娠の成立と維持に必須の分泌期間であり、妊娠が成立しなかった場合には退行し次の発情発期が回帰する。プロスタグランジンF2α(PGF)によって誘導される黄体退行は、プロジェステロンの減少を主徴とする機能的退行と黄体内細胞死による構造的退行の二つの局面からなる。こうしたPGFのウシ黄体退行作用は、PGFの活性酸素(ROS)の発生を刺激する事が示唆示されているが、その作用機序について明らかにされていない。本研究では、PGFによる黄体退行メカニズムを明らかにし、PGFのウシ黄体由来血管内皮細胞およびステロイド合成細胞におけるROS発生刺激作用について明らかとなった。PGFはROSとの相互作用を介して、機能的退行(2時間)時の初期増加および構造退行(24時間)時の減少という二相性的にSODを調節することが示された。【目的】ウシを含む多くの哺乳動物において排卵後形成される黄体は、子宮からのPGF2αにより退行することが知られている。PGF2αと同様に子官ならびに黄体において産生されるPGE2は、多くの哺乳動物において黄体維持ならびに妊娠の成立に重要である。黄体退行因子であるPGF2αならびに黄体維持因子であるPGE2の産生量の相対比(PGF2α/PGE2)の変化は黄体退行に重要であることが考えられる。最近、退行時のウシ黄体においてアポトーシス誘導因子として知られる活性酸素種(ROS)の増加が報告されているが、ROSの黄体退行時における詳細な役割は明らかにされていない。また、我々の研究室は黄体を構成する細胞の大半を占める血管内皮細胞(LEC)において、PGF2αがROSの一種であるNO合成能を刺激することを明らかにした。これらのことから我々は、PGF2αとROSとの局所的な相互作用により黄体が退行するという仮説を立てた。これまで黄体細胞におけるPGF2α産生に及ぼすROSの影響は明らかにされているが、LECのPGF2α産生に及ぼすROSの影響は明らかにされていない。そこで本研究は黄体退行機構におけるROSの役割を明確にすることを目的とし、ウシ中期LECのPGF2αおよびPGE2合成調節機構に及ぼすNOならびにH2O2の影響について検討を行った。【方法】ウシ中期黄体より単離したLECを播種し、コンフルエントになるまで培養後以下の実験に用いた。(1)H2O2(1-100μM)またはNOドナーであるNONOate(1-100μM)を添加し、2または6時間培養した後、培養上清中のPGF2αならびにPGE2量の変化をEIAにより測定した(n=3)(2)H2O2(100μM)およびNONOate(100μM)を添加し、6時間培養した後、PGF2αおよびPGE2それぞれの合成酵素であるPGFSならびにPGES mRNA発現量の変化を半定量的RT-PCRにより測定した(n=3)。【結果】(1)PGF2α/PGE2は、1および10μM H2O2添加後2h培養した区において減少したが、1μM H2O2添加後6h培養した区において有意に増加した。NONOate添加区においては、いずれの時間区においても有意に減少した。(2)PGFS mRNA発現量はH202およびNONOate添加区において無添加区と比較して有意に刺激されたが、PGES mRNA発現量に有意な差は見られなかった。以上、ROSがPGF2α/PGE2を低下させたことから、黄体退行時に増加するROSは、LECのPGs合成に及ぼす影響から黄体退行へ関与している可能性は少ないことが示された。【目的】ウシを含む多くの哺乳動物において排卵後形成される黄体は、子宮からのプロスタグランジン(PG)F2α(PGF)によりプロジェステロン(P4)分泌能が衰退し退行することが知られているが、培養黄体細胞にPGFを添加してもP4分泌量は減少せずむしろ増加することから、PGFの黄体退行作用は他の経路の一つとして、黄体内における一酸化窒素(NO)ならびに過酸化水素(H2O2)を始めとする活性酸素種(ROS)の増加がある。さらにNOおよびH2O2は培養黄体細胞におけるP4分泌の抑制することから、黄体退行にROSの関与している可能性が考えられる。

これまでROSが黄体細胞のPGFならびに黄体維持因子として知られるPGE2産生を刺激することが明らかにされているが、黄体血管内皮細胞(LEC)の分泌機能に及ぼすROSの影響は明らかにされていない。本研究目的は黄体退行機構におけるROSの役割を解明する目的とし、ウシLECのPGFおよびPGE2合成調節機構に及ぼすNOならびにH2O2の影響について検討した。【結果】(1)PGFおよびPGE2産生量は、NONOateまたはH2O2(100μM)添加後2、6ならびに24時間培養した区において無添加区無添加区と比較して有意に増加した。(2)Liver type PGFSおよびmPGES-1 mRNA発現量はH2O2またはNONOate添加区において無添加区と比較して有意に刺激されたが、COX-1、COX-2、mPGES-2ならびにcPGESmRNA発現量に有意な差は見られなかった。本研究の結果においてROSは黄体ならびにLECのPG産生を刺激することでLECのROS産生を刺激し、黄体組織中のROS濃度を急激に高めることで黄体退行を誘導している可能性がある。哺乳動物の黄体は、妊娠の成立と維持に必須の分泌期間であり、妊娠が成立しなかった場合には退行し次の発情発期が回帰する。プロスタグランジンF2α(PGF)によって誘導される黄体退行は、プロジェステロン(P4)の減少を主徴とする機能的退行と黄体内細胞死による構造的退行の二つの局面からなる。こうしたPGFのウシ黄体退行作用は、PGFの活性酸素( ROS)の発生を刺激する事が示唆示されているが、その作用機序について明らかにされていない。本研究では、PGFによる黄体退行メカニズムを明らかにし、PGFのウシ黄体由来血管内皮細胞およびステロイド合成細胞におけるROS発生刺激作用について明らかとなった。PGFはROSとの相互作用を介して、機能的退行(2時間)時の初期増加および構造退行(24時間)時の減少という二相性的にスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)を調節することが示された。計画通り実験を行っている。得られた結果の一部は既に専門雑誌に発表済み、印刷中、あるいは原稿作成中となっている。平成24年度の実験実施については計画通り行う予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究では、分子生物学的なアプローチによる細胞内シグナル伝達経路をも含めて検討する必要がある。
オートマトンに基づく部分文字列検索に対応した検索可能暗号に関する研究

2018年度は下記の事項を実施した。1.並列化および動的データに向けた省スペースな検索可能暗号の改良:並列化および動的データに向け,階層型ブルームフィルタと転置索引を組み合わせた手法の改良を行った。並列化に関しては,索引の構造をリストから木構造に変えることにより,並列検索を可能とした.動的データとは,データの更新が行われるデータである.従来法は,動的データに対応していなかったため,動的データを扱えるように改良を行った.動的データに対する検索可能暗号の安全性に関し,前方安全性および後方安全性が考えられているが,提案法はこれら両方を満たすように,従来法の改良を行った.2.部分文字列検索に対応した検索可能暗号の改良:申請者は、部分文字列検索可能暗号に対し、DAWG(directed acyclic word graph)と階層型ブルームフィルタを組み合わせた手法を提案したが、提案法は効率さと安全性おいて問題があった。この問題を解決するため、DAWGの改良を行い、新たに検索可能暗号に適した改良型DAWGを開発した。改良型DAWGは、その動作を状態遷移がもつ記号だけを使って模倣することができる。この性質を使うと、従来法に比べ、安全性の高い、省スペースな検索可能暗号を設計することができる。今年度は、改良型DAWGの基本的性質を明らかにするとともに安全で効率的な部分文字列検索暗号を設計した。3.より省スペースなデータ構造および高度なパターン検索に向けたアルゴリズムの開発:部分文字列検索可能暗号の安全性,効率さはベースとなるデータ構造に関係してくる.そのため,DAWGよりもさらに効率的なデータ構造を求め,ファクターオラクルの拡張版を設計した。申請者が提案した省スペース型検索可能暗号に対し、さらなる効率化および動的データに向けた改良を行った.また,DAWGを用いた部分文字列検索可能暗号に対し,DAWGを改良することにより、申請者が提案した従来手法よりも、安全で効率的な手法を設計することができた。さらに,暗号化データに対するより高度な検索に向けた基礎研究として,ファクターオラクルを用いた新たなデータ構造の提案,XMLデータの検索に向けた高速な正規表現検索アルゴリズムの提案を行った。下記の点について研究を進める。1.部分文字列検索可能暗号の拡張と実験的評価:DAWGを用いた部分文字列検索可能暗号として,文字列をブロック化し暗号化DAWGを構成する手法を提案したが,この手法は安全性や索引サイズにおいて問題があった.2018年度はDAWGを改良することにより、これらの問題を解決する新たな部分文字列検索可能暗号を設計した.今年度は,提案法の性質を詳細に解析するとともに実験的な評価を行う.さらに,強固な安全性を求め,不正な動作を行うサーバに対しても安全性を確保できるように提案法を改良する。2.動的データに対応した検索可能暗号の設計:提案法は静的データに向けた手法となっている。すなわち、あらかじめ、すべてのデータが与えられ、追加・削除等は考えていない。多くの応用においてデータの更新が行われる。そこで、本研究では、データの更新が発生する動的なデータに対応した部分文字列検索可能暗号の開発を目指す。3.省スペース化に向けた部分文字列検索可能暗号の改良:ファクターオラクルはDAWGよりもサイズの小さい有限オートマトンとして実現できる。この結果を利用し,ファクターオラクルを用いて,さらなる省スペース化が可能かどうか検討する。4.より柔軟な検索クエリに対応した検索可能暗号の構築:ブルームフィルタを用いた有限オートマトンの暗号化を応用し,正規表現などのより柔軟な形をしたクエリに対する検索可能暗号の構築を目指す。本年は下記の事項を実施した。1.効率的な検索可能暗号の提案:階層型ブルームフィルタと転置索引を組み合わせた手法である。転置索引だけで暗号化索引を構成する従来の手法は、単純な配列で実現しようとすると、暗号化索引のサイズがセキュリティパラメータに依存する。そのため、安全性を高めようとすると、暗号化索引のサイズが大きくなってしまう。研究代表者は、階層型ブルームフィルタと転置索引を組み合わせることで、セキュリティパラメータのサイズに依存しない暗号化索引の構成法を示した。提案法は、キーワードの個数分のサイズの整数型配列によって実現することができるため、コンパクトな暗号化索引を実現できる。実際、実データを用いた実験において、従来法と比べ、暗号化索引のサイズがかなり小さくなることを確認した。また、従来法はランダムオラクルを利用することで適応的安全性を実現していたが、提案法は、通信回数を1回増やすことにより、ランダムオラクルを用いない適応的安全なシステムとなっている。2.部分文字列検索に対応した検索可能暗号の改良と実験的評価:DAWG(Directed Acyclic Word Graph)は、対象となるドキュメントのすべての文字列を認識するコンパクトな決定性有限オートマトンである。研究代表者は、DAWGと階層型ブルームフィルタを組み合わせた手法を提案したが、従来法では、アルゴリズムの評価と実験的な評価が十分になされていなかった。本研究では、従来法では不十分であったDAWGによる暗号化索引の構成アルゴリズムを改良するとともに、実験的に提案法を評価した。実験により、検索時間は早いが、暗号化索引のサイズに改良の余地があることが分かった。通常の検索可能暗号について、ランダムオラクルを用いない効率的なシステムを構築することができた。また、部分文字列検索に対し、DAWGと階層型ブルームフィルタを組み合わせた手法について、理論的評価だけでなく、実験的な評価ができた。この結果は、現時点での問題点を明らかにするだけでなく、改良に向けた研究の足掛かりとなっている。

2018年度は下記の事項を実施した。1.並列化および動的データに向けた省スペースな検索可能暗号の改良:並列化および動的データに向け,階層型ブルームフィルタと転置索引を組み合わせた手法の改良を行った。並列化に関しては,索引の構造をリストから木構造に変えることにより,並列検索を可能とした.動的データとは,データの更新が行われるデータである.従来法は,動的データに対応していなかったため,動的データを扱えるように改良を行った.動的データに対する検索可能暗号の安全性に関し,前方安全性および後方安全性が考えられているが,提案法はこれら両方を満たすように,従来法の改良を行った.2.部分文字列検索に対応した検索可能暗号の改良:申請者は、部分文字列検索可能暗号に対し、DAWG(directed acyclic word graph)と階層型ブルームフィルタを組み合わせた手法を提案したが、提案法は効率さと安全性おいて問題があった。この問題を解決するため、DAWGの改良を行い、新たに検索可能暗号に適した改良型DAWGを開発した。改良型DAWGは、その動作を状態遷移がもつ記号だけを使って模倣することができる。この性質を使うと、従来法に比べ、安全性の高い、省スペースな検索可能暗号を設計することができる。今年度は、改良型DAWGの基本的性質を明らかにするとともに安全で効率的な部分文字列検索暗号を設計した。3.より省スペースなデータ構造および高度なパターン検索に向けたアルゴリズムの開発:部分文字列検索可能暗号の安全性,効率さはベースとなるデータ構造に関係してくる.そのため,DAWGよりもさらに効率的なデータ構造を求め,ファクターオラクルの拡張版を設計した。申請者が提案した省スペース型検索可能暗号に対し、さらなる効率化および動的データに向けた改良を行った.また,DAWGを用いた部分文字列検索可能暗号に対し,DAWGを改良することにより、申請者が提案した従来手法よりも、安全で効率的な手法を設計することができた。さらに,暗号化データに対するより高度な検索に向けた基礎研究として,ファクターオラクルを用いた新たなデータ構造の提案,XMLデータの検索に向けた高速な正規表現検索アルゴリズムの提案を行った。下記の点について研究を進める。1.暗号化索引の改良:現在の提案法は、暗号化索引を構成するとき、文字列をブロック化し、暗号化DAWGを構成している。この手法は、安全性を高めることはできるが、任意の部分文字列を検索できるようにするために、DAWGに多くの状態を追加する必要がある。そのため、理論的には元のファイルのサイズのオーダーで暗号化索引を構成できるが、通常のDAWGよりも多くの状態および状態遷移が必要となり、暗号化索引のサイズが大きくなる。このことは実験でも確認している。そこで本研究では、よりサイズの小さい暗号化索引を構成するためDAWGの構成法を改良する。
日本語の話し言葉における文末表現の使用実態

本研究では、初級修了レベル(6名)および中級レベル(2名)の中国人日本語学習者(計8名、2030代)を調査対象とし、日本語の会話において学習者たちが日本人母語話者(4名、20代)に助言(アドバイス)する状況におちいる際、どのような表現が用いられるのか、またこれらの表現が中国語母語による干渉があるのかを考察し、助言(アドバイス)の場における日中言語行動を分析した。会話の時間は約20分、テーマは「来日後、生活や勉強や人間関係に困ったことや問題点について」および「中国や日本での旅行について」とした。分析の結果、初対面および面識のある日中両グループの間では、事実提示による助言の方法(中国人学習者59%)がもっと多く用いられている。例として以下のようものが挙げられる。(1)「ぜひぺきんぺきんもいろいろばんりのちょうじょうもこせきがあります」(中国人学習者)(2)「そりゃひとことみたい{両者笑い}でもいまいろんなサポートがあるからそういうのどんどんせっきょくてきにさんかさせればぜったいりょうほうのぶんかをたかいれべるで(そうですか)かくほできる」(日本人母語話者、収集したデータには2例しかなかった)事実提示による助言は、ネガティブポライトネスの観点から言うと、話者がそれほど親しくない間柄の相手に、直接自分の意見を助言(アドバイス)として相手に提示し、相手の行動を指示することを避け、むしろ相手にとって役に立つと思われる関連情報を提示することにより、相手に思考や判断の余地を与えることができると考えられる。なお、事実提示の表現は「ほうがいい」「てください」とともに現れる傾向がある。この場合、事実提示は一種の補足説明(理由)として用いられると考える。一方、収集した会話データでは、中国人学習者が「ほうがいい」(13%)「てください」(13%)「ましょう」(9%)を助言(アドバイス)の表現として用いた。副詞「ぜひ」が「ましょう」とともに用いられることもある。これらの表現はポジティブポライトネスの観点から言うと、会話が進み次第、話者が相手との心理的な距離が狭められ、相手に積極的に自分の意見を助言(アドバイス)するときに用いられると考えられる。日本語教科書には、「てください」および「ましょう」は助言の表現として掲載されていない。平成15年10月に東京学芸大学留学生センターにファイルサーバーを新規に設置し、日本語教育支援システム研究会が開発したCASTEL/J CD-ROMに載っている映画(『男はつらいよ』)の台詞をテキストシァイルに変換し、サーバーに載せた。このサーバー上に載っている話し言葉のデータのファイルは研究のため、学内者のみに閲覧や検索に提供し、学外者には非公開のものとなっている。今後、調査で収集した会話のデータもテキストファイルにし、サーバーに載せる予定である。サーバーの設置作業と並行して、話し言葉に現れる「といえば(と/って言えば)」「といったら(と/って言ったら)」の意味機能の変化について考察した。その考察結果をまとめ、平成15年12月7日に香港で行われた第6回国際日本研究・日本語教育シンポジウムで発表し、その発表結果をシンポジウム論文集にまとめた。考察結果をまとめると、話し言葉に現れる「といえば(と/って言えば)」「といったら(と/って言ったら)」は大きく「仮定条件を表すもの」(「話し手のdesirabilityを表す」、「アドバイスを表す」、「話題を提示する」)と「話し手の強い主張を表すもの」という2つに分けられることがわかった。また、どうして仮定条件を表す「ば/たら」からアドバイスという用法が派生したのかについては、次のように考える。話し手は仮定条件を含む命題を考え、その仮定条件のみ取り上げて示し、相手がその条件の通りにすれば、相手にとって何か望ましい結果になることを暗示する。そこにアドバイスするという用法が派生したと考える。文末の「ってば/ったら」は「といえば/といったら」の形から変化し、相手を非難するときに使われることが多くみられる。今後、収集した会話のデータに基づき、日中対照研究の観点から他の文末表現(「だろう」「はずだ」「べきだ」など)の意味機能を考察したい。(1)「ぜひぺきんぺきんもいろいろばんりのちょうじょうもこせきがあります」(中国人学習者)(2)「そりゃひとことみたい{両者笑い}でもいまいろんなサポートがあるからそういうのどんどんせっきょくてきにさんかさせればぜったいりょうほうのぶんかをたかいれべるで(そうですか)

かくほできる」(日本人母語話者、収集したデータには2例しかなかった)事実提示による助言は、ネガティブポライトネスの観点から言うと、話者がそれほど親しくない間柄の相手に、直接自分の意見を助言(アドバイス)として相手に提示し、相手の行動を指示することを避け、むしろ相手にとって役に立つと思われる関連情報を提示することにより、相手に思考や判断の余地を与えることができると考えられる。なお、事実提示の表現は「ほうがいい」「てください」とともに現れる傾向がある。この場合、事実提示は一種の補足説明(理由)として用いられると考える。一方、収集した会話データでは、中国人学習者が「ほうがいい」(13%)「てください」(13%)「ましょう」(9%)を助言(アドバイス)の表現として用いた。副詞「ぜひ」が「ましょう」とともに用いられることもある。これらの表現はポジティブポライトネスの観点から言うと、会話が進み次第、話者が相手との心理的な距離が狭められ、相手に積極的に自分の意見を助言(アドバイス)するときに用いられると考えられる。日本語教科書には、「てください」および「ましょう」は助言の表現として掲載されていない。
蛍光分析を利用したメタボロミクスによる新規癌治療効果判定法の開発

メタボロミクスによる癌治療効果判定法の開発を目指し、以下に記す各種代謝物の蛍光分析法を開発した。(1)ポリアミン分析:エキシマー蛍光誘導体化により遊離体及びアセチル体の同時分析を達成(2)有機酸分析:開発したFSD(FluorousScavengeingDerivatization)法により、糖尿病モデルマウス尿中の有機酸を分析し、主成分分析を行ったところ、比較対照群と異なるスコアプロットを取得(3)アミノ酸分析:NBD-F試薬を用いたオンラインプレカラム誘導体化により健常人血中アミノ酸を分析(4)ペプチド分析:Arg含有ペプチドのポストカラム分析を達成メタボロミクスによる癌治療効果判定法の開発を目指し、以下に記す各種代謝物の蛍光分析法を開発した。(1)ポリアミン分析:エキシマー蛍光誘導体化により遊離体及びアセチル体の同時分析を達成(2)有機酸分析:開発したFSD(FluorousScavengeingDerivatization)法により、糖尿病モデルマウス尿中の有機酸を分析し、主成分分析を行ったところ、比較対照群と異なるスコアプロットを取得(3)アミノ酸分析:NBD-F試薬を用いたオンラインプレカラム誘導体化により健常人血中アミノ酸を分析(4)ペプチド分析:Arg含有ペプチドのポストカラム分析を達成1.アミノ酸分析AccQ・Tag^<TM>法による蛍光誘導体化-HPLC法を用いて、ヒト神経芽細胞株SH-SY5YをDMEM培地にて培養し、その培養培地中のアミノ酸21種およびNH_3について一斉分析することができた。また、各培養時間(072時間)での定量結果を主成分分析による多変量解析を行うことで検体情報の視覚化を行った。得られた主成分のうち、PC1およびPC2を軸とする二次元グラフ(スコアプロット)を作成した。このとき、各検体のもつアミノ酸情報がグラフ上の1点に集約され、各検体の培養時間の違いを座標位置の違いとして視覚的に理解することができた。またローディングプロットより細胞増殖においてGly、Ala、Pro、Ornの4種が影響を与えていることが分かった。2.ポリアミン分析エキシマー蛍光誘導体化-HPLC法によるポリアミン(Put、Cad、Spd、Spm)分析を行った。蛍光誘導体化試薬に試薬の安定性に優れた4-(1-pyrene)butanoic acidを用いた。標準系において直線性、再現性ともに良好であり、細胞中ポリアミンの分析に十分な感度を有していた。生体や細胞中ではアミン性夾雑物に比べポリアミン類は極微量でしか存在せず、実試料を直接誘導体化してもSpd、Spmが十分に誘導体化できなかった。そこで、前処理操作の最適化を行った。細胞を分取後、過塩素酸処理により細胞を溶解し、弱陽イオン交換カートリッジによる固相抽出を行うことで細胞中Put、Spd、Spmを分離・検出することができた。今後、白血病培養細胞中ポリアミン分析を行っていく。3.有機酸分析Fluorous Scavenging Derivatization(FDS)法を用いた有機酸分析法の確立を行った。これまで報告されていた蛍光誘導体化試薬は未反応試薬ピークにより高極性、短鎖有機酸の検出が妨害されていたが、今回、フルオラス分離技術の応用により試薬ピークを除去し、高感度かつ高精度にTCAサイクル中間体などの体内に存在するモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸を一斉分析することができた。平成22年度までに構築した分析法を用いて、種々の実試料を分析した。そのうち有機酸分析の結果を元に主成分分析によるデータ解析を行った。ポリアミンのエキシマー蛍光分析:培養した白血病細胞9種および乳癌細胞3種を各1x10^6個採取し、過塩素酸にて細胞を溶解し、ポリアミン4種(Put、Cad、Spd、Spm)を分析した。その結果、内在性のPut、SpdおよびSpmを定量でき、いくつかの細胞株で特徴的なポリアミンの発現パターンがあることが分かったが、薬剤耐性や癌種、細胞の大きさ等との関連性を明らかにすることは出来ていない。有機酸のFSD-蛍光分析:2型糖尿病モデルTSODマウスと、比較対象としてTSNOマウスの24時間尿中有機酸を蛍光誘導体化後、オンラインFSD-HPLC分析したところ、酒石酸およびリンゴ酸を除く12種の各有機酸においてTSODマウスとTSNOマウスの間にはt検定において有意差(p<0.01)が認められた。その定量結果を元に主成分分析を行ったところ、スコアプロット上でTSODマウス群とTSNO群は離れた位置にプロットされ、それぞれの尿中に含まれる有機酸量に違いがあることが視覚的に示された。ローディングプロットでは乳酸、3-フェニル乳酸、ピルビン酸およびオキサロ酢酸等がPC1およびPC2に大きく寄与しており、これらはいずれも糖新生、解糖系に関与する化合物であることから、2型糖尿病モデル動物であるTSODマウスの糖代謝異常を有機酸レベルで示すことができる可能性が示唆された。Arg含有ペプチドの分析:Pyrene-4,5-dioneを用いてArgを2つ含有するニューロテンシンを誘導体化したところ、ジピレン誘導体は形成しておらず誘導体の分解物由来のエキシマー蛍光が確認された。本反応はアルカリ条件下で進行するが同時に分解も起こっており、ペプチドの分離検出が困難なため、今後ポストカラム誘導体化法を適用する。平成23年度までに構築した分析法を基盤とし、以下の研究を行った。(1)ポリアミン分析:

これまで、アセチル体は高温で長時間の加水分解処理を行った後にエキシマー蛍光誘導体化後アセチル体及び遊離体の総量として測定し、遊離体のみの測定値を差し引いて求める必要があったため、煩雑で再現性が悪いという問題点があった。そこで、アセチル体及び遊離体を直接ピレン誘導体化し、エキシマー蛍光波長(475 nm)及びモノマー蛍光波長(375 nm)で同時測定することでアセチル体の3種(AcSpd, AcSpm及びDiAcSpm)及び遊離体の4種(Put, Cad, Spd及びSpm)を分離・検出し、分析の短時間化・再現性の向上が達成された。同時定量法をバリデートできたが、癌患者血液分析を行うに至らなかった。(2)アミノ酸分析-主成分分析:ヒト神経芽細胞由来細胞株に分化誘導剤であるATRA及びAm80処理を行った。形態学的分化誘導すなわち神経突起進展作用を示すことができた。そのNH-12培養培地中アミノ酸12種及びNH3の定量結果に神経突起長を加えて主成分分析を行ったところ、無処置群を化法に、分化誘導剤処置群を上方に座標位置の違いとして細胞分化における変化を理解することができた。(3)アミノ酸オンライン分析:NBD-F(4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole)を用いたオンラインプレカラム誘導体化分析法を開発した。NBD-F誘導体化後、イオン交換と逆相のミックスモードカラムをトラップカラムとしてアミノ酸を捕集、モノリス-ODSカラムを用いて健常人血中アミノ酸を分析することができた。(4)ペプチド分析:Arg含有ペプチドであるTuftsin、AngiotensinII、Neurotensin及びDynorphin Aをピレン試薬によるポストカラム誘導体化法を開発した。アミノ酸分析において、神経芽細胞に分化誘導剤処置を行い、アミノ酸メタボロミクスによる解析を行ったところ、分化誘導およびそれに基づく形態学的変化に寄与したアミノ酸を抽出することができなかった。また、ポリアミン分析についても各ポリアミン量と癌の状態の相関性を捕らえられていないため、ポリアミンのアセチル体測定法を確立し、患者血漿試料へと適用する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。ポリアミン分析については、癌患者尿中で見出されることが知られているジアセチルポリアミン測定法を確立し、癌細胞および患者血漿中アミノ酸メタボロミクスにファクターとしてポリアミンおよびアセチルポリアミンを加え、主成分分析による統計解析処理を施し、癌の状態を二次元グラフ上で視覚的に判断できる診断法を確立する。また、並行して神経芽細胞種のアミノ酸メタボロミクスおよびArg含有ペプチド分析法の開発も引き続き行っていく。