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大学生に向けた金融リテラシー教育のプログラム開発に関する研究

大学生が学ぶべき知識及びスキルとして金融リテラシーがあると考える研究者らは、諸外国の金融教育事情を参考にしつつ、大学生が在学中に身に着けるべき金融リテラシーのカリキュラム開発を行った。同時に、実際に半期15回の講義を2回実施し、その内容の改善や定着を検証しつつ試行を行った。その結果、アクティブラーニングを活用とする講義形式の授業により、終了後には金融に関する行動変容が認められ、学生自身も広く多くの大学生に必須とすべきとの回答を得た。金融リテラシー教育の大学におけるニーズを把握し、そのプログラム開発を目的とする本研究の初年度の研究実績としては、英国のブリストル大学およびバーミンガム大学における金融リテラシー教育に関する専門家からのヒアリング、および金融サービス庁(FSA)や金融機関の支援を受ける個人金融教師グループ(pfeg)や国際消費者機構、市民相談所(CA)、金融相談所(MAS)における訪問インタビューが有効であった。金融教育への市民的ニーズがG20においても指摘されているように、金融危機以来のあまねくすべての人々への金融に関する基礎知識やスキルの必要性がどの訪問先からも聴取することができた。とくに、金融サービスへのアクセスが不十分な金融排除は世界的な問題となっており、課題意識も強く、バーミンガム大学では金融排除に関する年次報告書も出していた。また、それを裏付けるかのように、国際消費者機構(CI)は、東アフリカの金融排除問題の解決に向け、最大の努力を払っており、金融カウンセラーを育成し地域の金融リテラシー能力の底上げを図ることに最大の支援をしている状況を垣間見ることができた。一方、従来から小学生など学校教育の中で金融リテラシー学習の支援を行ってきたpfegでは、昨今は学校教育現場の教員を養成する課程を有する大学28大学と提携し、大学生向けの研究教育教材の提供を始めていることも聴取した。また、学校教育カリキュラム(ナショナルカリキュラム)への2014年からの金融教育導入など新たな動きを確認した。ただ、本研究が目的とする大学における金融リテラシー教育の導入や、実情については、イギリス国内ではあまり例がないようで、オープンユニバーシティ(放送大学のようなものか?)において、パーソナルファイナスの開講が行われている程度であることが確認された。今年度は米国大学等におけるパーソナルファイナンス教育の実情を調査するとともに、日本の大学における金融リテラシー教育へのニーズ調査、さらには韓国における実情調査を中心に行った。当初の予定では、米国の複数の大学を訪問調査により、パーソナルファイナンス教育の実施状況を把握するつもりであったが、米国大学のウェブシラバスによる情報収集が容易にできることとが判明したため、米国調査はウェブによるものとし、国内大学の調査を軸に研究を行うこととした。その結果、判明したことは、米国大学においてはファイナンシャルプランナー(FP)資格取得を目的とする職業教育的な教育が中心であり、社会人としてのキャリアアップとしての自己啓発を行う意味での生涯教育としての性格も併せ持つ内容として実施されていることが確認された。また、多くのパーソナルファイナンスの研究者がそれぞれの大学に配置され、専門的学問領域と地位が確保されているようであった。翻って、わが国ではパーソナルファイナンス教育は、家計管理論、生活設計論といった家政学系、生活科学系の一分野の一部に限られていて、少なくとも職業教育的色彩を帯びたファイナンシャルプランニング教育はごく一部の私立大学にとどまるものであることがわかった。しかしながら社会人になる前に必要な素質としての金融リテラシー教育へのニーズを大学教育に位置づける可能性を全国調査した結果(有効回答20%)、約半数は現在の学生へのニーズは高く、カリキュラムに組み込みたいという意思を持っていた。(但し、回答者は理事を含む教員と事務系職員の場合がある)韓国の大学教育においての扱いは、家政系学部消費者学科等において多くの大学で個人財務計画論が位置づけられている。キャリアとしての金融関係への就職に有利に働く国家公認の資産管理士、総合資産管理士などがこれに該当する。授業実践研究として、横浜国大における「金融リテラシー入門」の講義の改善を図る検討を講義終了後のテストにより行った。その結果、知識レベルはパーソナルファイナンスにある程度の理解力を高めることができたものの、係数を駆使した時間価値計算等においては、理解力に大きな格差が見られた。毎回の授業に関し復習ができる環境や個別質疑ができる環境など、大学の授業支援システムの活用などによる限られた講義時間外のサポートが必要とも思われた。(次年度に導入予定)知識理解の定着はグループワークやディスカッションといったアクティブラーニングを随所に取り入れて、内容理解を深めることに成功したものと判断した。徳島調査ではファイナンシャルプランナーで県消費生活審議会会長も務める教員の短大におけるライフプランニングならびにタックスプランニングの講義につきヒアリングを行った。いずれも社会人として必要となるための準備教育としての位置づけであった。社会保険、公的年金制度、リスクマネジメント、生命保険・損害保険などに加え、相続・遺言、成年後見までと幅広い扱いが印象的であった。タックスプランニングで学ぶ、所得税・住民税、不動産関連知識、各種金融商品などと合わせて、FP3級(国家資格)取得を目指すものとなっていた。金融リテラシー入門の実験講義を本学で昨年度より実施し、学生による評価なども参考にすると、学習意欲を高めることに役立っていると判断できる。

社会人として自立していく前の最終の教育機関として、大学において金融リテラシーについて学ぶことは、学生も意義があると感じている。国によるが海外においても、これまでの調査から重要性の認識は高まっており、ニーズ調査においても必要性認識も高く、今後さらに調査結果の分析等によって検証していく。以上のように、研究の当初の目的はおおむね順調に推移していると判断している。消費者教育予定の研究をさらに最終年度に向けて検証を進め、金融リテラシーを大学教育において実践する意義や、評価、関係者からのヒアリング等を通じて実証をすすめていく。また、それらの研究成果を学会発表あるいはシンポジウム開催を通じて、公表していくことも検討していきたい。キャリアプランニング能力の開発としての金融リテラシー教育の実情把握としてイギリス調査に関しては、政府や金融機関の支援を受けた団体が活発な活動を展開し、一定の成果を収めている状況が把握できた。しかし、一方で大学のシラバス調査については大学自体に、パーソナルファイナンスに関する講義の開設がほとんど確認できず、メディアを使った生涯学習的な学習科目としての開講がわずかに見られるにとどまった。さらに、インターネット検索などを通じて情報収集と分析を次年度において進める予定である。米国調査について、現地調査をweb調査に切り替えて実施したこと等による。米国および韓国の状況については2014年度の調査で明らかにする予定である。海外研究により、金融リテラシー教育の潮流の全体像を把握するとともに、大学における金融リテラシー教育推進の日本で可能性の検討を、昨今の国内動向に照らしつつ研究を進めていく。最終のまとめの作業において、ヒアリング等の協力者謝金に充当する予定である。
D加群のアルゴリズムの研究

D加群とは微分作用素環上の加群の総称であり,具体的には線型偏微分方程式系に対応する.D加群については1970年代からの佐藤・柏原・河合らの研究によって高度な理論体系が構築されていたが,具体的な計算方法についてのまとまった研究は最近までなされていなかった。このような状況の下で高山信毅氏と本研究代表者は,多項式環についてはその有用性が既に広く認知されているGrobner基底の方法を微分作用素環に適用することによって,D加群に対する種々の演算(関手)のアルゴリズムが得られることを見出した。その際中心的な役割を果たすのは,与えられた重みベクトル(の定めるフィルター)に適合した自由分解の計算であるが,実例の計算における自由分解は一般に非常に大きく,しばしばメモリ不足で計算不能に陥る。斉次化Weyl代数(微分作用素環)は非可換ではあるが、多項式環と同様に極小自由分解の概念が定義できることに着目し,特に与えられた重みベクトルに適合した極小自由分解の概念を定義し,かつその計算アルゴリズムを得た.このアルゴリズムは高山信毅氏により数式処理システムKanにインプリメントされ,インターネットで公開されている.この極小自由分解の計算アルゴリズムによって,従来はアルゴリズムは存在するが計算量が大きく実用化が阻まれていた,積分と制限に付随した高次コホモロジー群,代数的de Rhamコホモロジー群,代数的局所コホモロジー群などの計算が著しく効率化された.これによって今後D加群のアルゴリズムの実用化が促進されるものと期待される.またホロノミック系の有理関数解を求めるアルゴリズムをH.Tsai氏,高山氏との共同研究で見出した.その際,一般化されたb関数を求める大阿久によるアルゴリズムが有効に用いられた.D加群とは微分作用素環上の加群の総称であり,具体的には線型偏微分方程式系に対応する.D加群については1970年代からの佐藤・柏原・河合らの研究によって高度な理論体系が構築されていたが,具体的な計算方法についてのまとまった研究は最近までなされていなかった。本研究課題の今年度の研究においては,この方向の研究をさらに推し進め,次の2つの研究成果を得た。1.D加群のアルゴリズムにおいて中心的な役割を果たすのは,与えられた重みベクトル(の定めるフィルター)に適合した自由分解の計算であるが,実例の計算における自由分解は一般に非常に大きく,しばしばメモリ不足で計算不能に陥る。そこで多項式環における極小自由分解の概念をこの場合に拡張して定義し,その計算アルゴリズムを得た.これにより実際の自由分解の計算が著しく効率化されることが期待される。実際の計算実験は数式処理システムKanをネットワークで結合した複数のノートパソコン(OSとしてはLinuxを使用)上で稼働させて来年度に実施する予定である。2.ホロノミック系の非特異超曲面に沿っての決定多項式の計算アルゴリズムの応用として,ホロノミック系の有理関数解を求めるアルゴリズムを得た.常微分方程式の場合には効率的な方法が知られていて,例えば数式処理システムMapleで実現されているが,偏微分方程式の場合に有効な方法はほとんど知られていなかった。

このような状況の下で高山信毅氏と本研究代表者は,多項式環についてはその有用性が既に広く認知されているGrobner基底の方法を微分作用素環に適用することによって,D加群に対する種々の演算(関手)のアルゴリズムが得られることを見出した。その際中心的な役割を果たすのは,与えられた重みベクトル(の定めるフィルター)に適合した自由分解の計算であるが,実例の計算における自由分解は一般に非常に大きく,しばしばメモリ不足で計算不能に陥る。斉次化Weyl代数(微分作用素環)は非可換ではあるが,多項式環と同様に極小自由分解の概念が定義できることに着目し,特に与えられた重みベクトルに適合した極小自由分解の概念を定義し.かつその計算アルゴリズムを得た.このアルゴリズムは高山信毅氏により数式処理システムKanにインプリメントされ,インターネットで公開されている.この極小自由分解の計算アルゴリズムによって,従来はアルゴリズムは存在するが計算量が大きく実用化が阻まれていた,積分と制限に付随した高次コホモロジー群,代数的de Rhamコホモロジー群,代数的局所コホモロジー群などの計算が著しく効率化された.これによって今後D加群のアルゴリズムの実用化が促進されるものと期待される.
犬種特異的な炎症性腸疾患における炎症と癌化に関与する遺伝子の探索と機能解析

本年度は、症例対照研究を行い、PLG遺伝子を犬の炎症性結直腸ポリープ疾患感受性遺伝子の一つとして選定した。罹患したミニチュア・ダックスフント(症例群)と罹患していないミニチュア・ダックスフント(対照群)の血液からDNAを抽出し、これまでの研究で選定した候補遺伝子の変異領域をPCR法で増幅した後にシーケンス解析を行った。その結果、PLG遺伝子に認められたミスセンス変異(c.478A>T p.Asn160Tyr)のアレル頻度が疾患群で有意に高く、炎症性結直腸ポリープ発症との関連が示唆された。PLG遺伝子は、セリンプロテアーゼの一つであるプラスミンの酵素前駆体、プラスミノーゲンをコードする遺伝子である。プラスミノーゲンおよびプラスミンは線溶系において主たる役割を果たしている一方で、炎症細胞の遊走、腫瘍細胞の浸潤ならびに炎症性サイトカインの産生に関与していることが明らかになっている。そこで、炎症性結直腸ポリープの病変局所におけるプラスミン活性をザイモグラフィーにより検討した結果、病変部のプラスミン活性はコントロールに比べて有意に上昇していた。以上の結果から、PLG遺伝子に認められた変異は、プラスミン活性を増大させることで炎症性結直腸ポリープ発症と関連する可能性が考えられた。次に、PLG c.478A>T p.Asn160Tyrの病態における役割を明らかにするため、犬プラスミノーゲンの組換えタンパク質を作製した。犬PLG遺伝子をクローニングし、哺乳類細胞を用いてタンパク質を発現させた。発現させたタンパクを含む上清を用いてザイモグラフィーを行ったところ、プラスミン活性が確認され、今後の機能試験に使用できることを確認した。変異型に関しては、PCR法を用いたSite-directed mutagenesisによりc.478A>Tの変異を含むプラスミドを作製した。本疾患は単一遺伝子性疾患ではなく多因子性疾患であると考えられており、感受性遺伝子の同定は困難な可能性も考えられた。そのような状況の中で、疾患発症との関連を示唆する遺伝子を一つ選定できたことは大きな成果であると考えている。実際に本疾患の病変部においてプラスミンの活性が上昇していることも本年度中に確認することができた。遺伝子変異と疾患発症との関連を明らかにするためには機能的な解析が必要になるが、そのために必要な組換えタンパク質の作製についても順調に進んでいる。一方で、罹患犬の約半数はPLG遺伝子の変異を有していないことから、PLG遺伝子以外の感受性遺伝子の探索も必要と考えられる。以上の理由から、おおむね順調に進展していると評価した。今後は、炎症性結直腸ポリープとPLG遺伝子との関連性を詳細に検討するため、免疫組織化学を用いた解析および組換えタンパク質を用いた解析を行う予定である。免疫組織化学については、病変部におけるプラスミノーゲンの発現解析および局在解析を行う。また、野生型および変異型の組換えタンパク質のセリンプロテアーゼ活性をザイモグラフィーで比較するとともに、プラスミノーゲンレセプターを持つ細胞に対しての機能の違いを比較する。プラスミノーゲンレセプターは様々な細胞に発現していることが知られているが、その中でもプラスミンの刺激により炎症性サイトカインの発現が誘導されることが明らかになっている単球系の細胞を用いる予定である。さらに、PLG遺伝子以外の疾患感受性遺伝子に関しても、引き続き探索を行う予定である。これらに関しては、エクソーム解析の結果からミニチュア・ダックスフントに特異的に認められた変異に注目するとともに、犬のSNPデータベースも参照して候補遺伝子を選定する予定である。

そのような状況の中で、疾患発症との関連を示唆する遺伝子を一つ選定できたことは大きな成果であると考えている。実際に本疾患の病変部においてプラスミンの活性が上昇していることも本年度中に確認することができた。遺伝子変異と疾患発症との関連を明らかにするためには機能的な解析が必要になるが、そのために必要な組換えタンパク質の作製についても順調に進んでいる。一方で、罹患犬の約半数はPLG遺伝子の変異を有していないことから、PLG遺伝子以外の感受性遺伝子の探索も必要と考えられる。以上の理由から、おおむね順調に進展していると評価した。今後は、炎症性結直腸ポリープとPLG遺伝子との関連性を詳細に検討するため、免疫組織化学を用いた解析および組換えタンパク質を用いた解析を行う予定である。免疫組織化学については、病変部におけるプラスミノーゲンの発現解析および局在解析を行う。また、野生型および変異型の組換えタンパク質のセリンプロテアーゼ活性をザイモグラフィーで比較するとともに、プラスミノーゲンレセプターを持つ細胞に対しての機能の違いを比較する。プラスミノーゲンレセプターは様々な細胞に発現していることが知られているが、その中でもプラスミンの刺激により炎症性サイトカインの発現が誘導されることが明らかになっている単球系の細胞を用いる予定である。さらに、PLG遺伝子以外の疾患感受性遺伝子に関しても、引き続き探索を行う予定である。これらに関しては、エクソーム解析の結果からミニチュア・ダックスフントに特異的に認められた変異に注目するとともに、犬のSNPデータベースも参照して候補遺伝子を選定する予定である。
低線量放射線照射による自己免疫疾患改善機構の解明

これまでに自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス様モデルマウス(MRL-lpr/lpr)において低線量放射線照射による病態改善および寿命延長効果が報告されている。低線量放射線照射による病態改善機構には、異常T細胞の減少が一因として考えられているが、その機序は未だ明らかとなっていない。また病態の発症および改善に重要な異常T細胞の性状および機能も未だ詳細は不明である。そこで、異常T細胞の新規分離系を確立し、異常T細胞の性質と機能、さらに低線量放射線照射による影響について検討することを目標とした。MRL-lpr/lprマウス(530週齢)から脾臓細胞を調製し、フローサイトメーターを用いて異常T細胞(CD3^+CD4^-CD8^-B220^+)の発現増加時期および低線量放射線照射による影響を検討した。その結果、異常T細胞は照射開始時期から増加しないことが明らかとなった。次に、脾臓細胞より異常T細胞の単離を試みた。脾臓細胞を調製後、モノクローナル抗体および磁気ビーズを用いて異常T細胞以外の細胞を全て標識し、標識された細胞を磁気カラムにより取り除いた。フローサイトメーターによりカラムを通過した細胞中のCD3^+CD4^-CD8^-B220^+の純度を検討した結果、90%以上が異常T細胞であることを確認した。この異常T細胞の膜抗原の発現を検討した結果、CD3^+CD4^-CD8^-TCRαβ^+TCRγδ^-CD40L^-B220^+CD19^-CD38^-CD40^-であることが明らかとなった。単離した異常T細胞においてIL-6産生を測定した結果、IL-6の産生が認められた。さらに、照射マウスの異常T細胞では産生能が低下していることが明らかとなった。以上より、照射により異常T細胞の細胞数の増加が抑制され、異常T細胞のサイトカイン産生能も低下することが示された。今後は、異常T細胞の機能抑制の原因を解明する予定である。
人工知能による建築企画意思決定支援システムの構築

本研究は、建築企画を建築主と関係計画者の意思決定の視点から捉え、その意思決定を、人工知能等コンピューターを使って支援するシステムを構築するための基礎的な研究である。研究は、大きく、二つの部分から成っている。一つは、建築企画のプロセスにおける、関係主体間のコミュニケーションを、実際の建築企画事例の調査を通して、そこで流通する情報、適応される知識を分析する基礎的調査研究である。いま一つは、建築企画の意思決定のプロセスを計算機上でシミュレートして、支援システムのモデルを構築する研究である。昨年度は、建築企画プロセスの実態調査から、(1)企画に関係する各種情報が、敷地、立地コストなどの企画の環境条件となる収集情報、企画の課程で生成されるプロジェクト内容を規定していくプロジェクト情報、企画者個人・組織に蓄積された知識情報に分類できる事、(2)企画プロセスが、組織化、方針の決定、具体化と何段階かのプロセスで構成される事、(3)知識情報は、個人・組織に蓄積されたもので、直感的・経験的なものから論理的なものまでを幅広く含む事などを明らかにし、意思決定のプロセスを詳細に分析した。また、支援システムのモデル構築に関して、Prologを用いて、「土地が決定している場合、その有効利用の為に適合する建築種類を探索する」という企画者の経験による判断に多くを依存する決定問題を取り上げ、エキスパートシステムのモデル構築を行った。本年度は、より具体的なモデル検討のために、「M教会」建築という実際のプロジェクトを取り上げ、その企画プロセスを、エキスパートシステムに置き換え、質問による基本情報をインプットし、建築概要をアウトプットさせるコンサルテーションシステムの検討を行い、全体を取りまとめた。(1)建築企画は、建築の設計に先立ち、建築・事業経営等の諸情報から建築計画の諸条件の情報を生み出す情報変換のプロセスである。このような視点から建築企画プロセスの詳細な実態調査を行い、次にような結果を得た。(1)企画プロセスで新たに入手すべき情報(入手情報)、企画プロセスで生成する各段階でのプロジェクト情報(プロジェクト情報)、企画者・組織に蓄積された知識情報(知識情報)の3種類に大別できること、(2)入手情報は、敷地、立地環境、事業環境、費用、設計者・施工者・テナントなどの関係主体の情報からなり、一般化・形式化したものと調査結果などから成っていること、(3)プロジェクト情報は、最終的な企画案に至るまでの中間アウトプットであり、プロジェクトのプログラミング、開発方針、事業経営、空間、技術などの内容に分類できること、(4)知識情報は、個人・組織に蓄積された情報で、必要に応じて引き出されるものだが、直感的な処理に関わるものから論理的なものまで様々なものを含むこと、また、企画プロセスの観察から引き出しにくいこと、(5)これらの諸情報と、それらが企画者・建築主・設計者等の主体間でやり取りされ企画がまとめられるプロセスの分析を行った。(2)意思決定支援システム構築の為に、複雑な企画プロセスを一度単純化したモデルとして捉える必要がある。ここでは、企画者の経験に依存する判断の部分の内から「土地が決定している場合のその有効利用の為の建築種の範囲の一次的想定」を取り上げ、専門家の知識と経験に基づく判断を、エキスパ-トシステムに置き換えるモデル検討を行った。また、数理的アプロ-チの可能な部分として、採算計算プログラムを検討し、エキスパ-トモデルと組み合わせる検討を行った。モデルの有効性を確かめつつあるが、専門家の判断に関する情報入手の困難という問題を残している。本研究は、建築企画を建築主と関係計画者の意思決定の視点から捉えその意思決定を、人工知能等コンピューターを使って支援するシステムを構築するための基礎的な研究である。

本年度は、昨年度までの(1)PROLOGによる「土地が決定している場合のその有効利用のための建築種類の一次的決定」モデルの検討、(2)建築企画プロセスの実態調査による企画情報(収集・入手情報、プロジェクト情報、知識情報)の分析を踏まえて、主に、エキスパートシステム構築用のソフトウェアを用いて、具体的な「M教会」建築の企画事例の実態を明らかにし、そのプロセスをシミュレートするという方法で、支援システムのモデル構築の検討を行った。敷地面積、地域・地区、司祭数、信徒数、聖堂の形の好み、会衆席、必要付属施設等の質問項目に対する回答をインプット情報として入力すれば、聖堂の規模、香部屋、告解室、小聖堂、司祭室等の建築概要が得られるシステムを構築した。また、一義的確定的に取り扱う事の出来ない聖堂の会衆席の規模決定に関して、都心・郊外、住宅地・商業地、開発動向、土地柄のパラメーターを用いた確信度計算を検討した。これらを通じて、建築企画の意思決定を支援するエキスパートシステムの基本構造とその有効性を明らかにした。企画専門家や利用者の知識情報を取り込む事によって、実際的なシステムへ発展させる事は今後の課題である。
内因性ＡＧＥをコアとする組織リモデリング病態の発症機序解明と新規標的治療法開発

組織リモデリング病態の形成に関わる因子を見出すために,タンパク質アレイ解析を実施し,HMGB1結合因子としてTWEAKを見出した。TWEAKは,血管内皮細胞のIL-8産生を増大させた。また,AGEは特異的にTWEAKと結合し,これによってTWEAK誘導性IL-8産生応答を含むTWEAKの生理活性を抑制した。本知見から,組織リモデリング病態の制御のための新たな治療標的分子として,TWEAKーAGEsから成る複合体が重要な役割を示す事が示唆された。組織リモデリング病態の進行組織病片から内因性AGEを単離し,配列情報を基にして組換え体を調製し,これをプローブとして細胞外インフラマソーム構成分子群の網羅的探索と同定をはかった。また,内因性AGEの病態生理学的意義を明らかにし,内因性AGE遮断に基づく治療効果を検証する目的で,異物埋設法に基づいた炎症病態モデルの開発に取り組み,その有用性についての検討を行った。内因性AGEを特異プローブに用いて,内因性AGEをコアとする機能複合体の存在の可能性について検討した。本プローブを肺臓の水溶性画分と反応させることによって親和性因子をアフィニティ精製したところ,得られた精製画分は電気泳動によって複数個のバンドに分離され,質量分析によって,これらは主にribosomal proteinに関連した因子であることがわかった。本知見は,内因性AGEが他の生体因子と共に複合体を形成し得る可能性を示唆するものであり,組織リモデリング病態形成における意義を明らかにするための新たな糸口を見出すことができた。また,異物埋設に基づいた炎症病態モデルを開発し,異物埋設による血管新生反応の亢進や肉芽組織の出現を認め,内因性AGEの病態生理学的意義や内因性AGE遮断による治療効果の解明を行うための研究環境を作ることができた。アレイ解析や親和性クロマト等の手法を用いてAGEに相互作用を示す因子の網羅的探索を行い,AGEをコアとする複数個の因子群によって構成される起炎性複合体形成の組織リモデリング発症・増悪化プロセスにおける病態生理学的意義について検討した。また,より広い視点でAGEに相互作用を示す因子の起炎性活性を明らかにするために,培養免疫細胞などを用いた炎症応答解析や組織リモデリング病態モデルの確立に取り組んだ。具体的には,第一の探索系としてAGE自体でアミノ基を持った担体とカップリングし,AGEを特異プローブにした不溶性担体を開発し,これを用いて動物組織ホモジネートを原材料として相互作用因子の探索と起炎性複合体形成について検討した。AGE化担体を組織ホモジネートと反応させ,洗浄後に高塩濃度溶液で溶出した画分を電気泳動分離し,質量分析にて分子同定をはかった。その結果,AGEと相互作用を示す複数個の因子が検出され,一次配列レベルでの類似性からリボソーム由来と想定される複数個の因子がAGEと相互作用することが明らかとなった。本因子の組換え体を作製し,培養細胞を用いた炎症性サイトカインmRNAの発現誘導を指標にして炎症賦活化作用を評価したところ,有意な起炎性応答を誘導することが明らかになった。また,第二探索系としてタンパク質アレイ解析によるAGE相互作用因子を検討したところ,複数個の因子が見出され,その中にTNF類似の因子が存在することがわかった。この相互作用因子の作用様式を検討すると共にAGE共存による影響も解析した。これらの知見からAGEをコアとする起炎性複合体形成の可能性がより鮮明なものとなり,新たな創薬標的としての意義付けに繋げることができた。AGEを特異プローブにした不溶性担体を開発し,相互作用因子の探索と起炎性複合体形成について検討したところ,一次配列レベルでの類似性からリボソーム由来と想定される複数個の因子がAGEと相互作用することが明らかとなった。また,タンパク質アレイを用いてAGE相互作用因子を検討したところ,複数個の因子が見出され,この中から高親和性を示す因子を調製して詳細に検討したところ,アレイ解析によって見出された因子はTNF類似の因子であり,TNFの部分作動薬様の作用形式を示すことが明らかとなった。加えて,この因子の作用に対してAGEは干渉することも明らかとなった。これらの知見は,AGEと他因子との複合体形成を示唆するものであり,各因子間の相互作用による炎症応答の変化などの病態生理学的意義の一端を明らかにすることができた。AGEsと相互作用し得る因子を探索するためにアレイ解析を実施し,腫瘍壊死因子(TNFα)に類似配列を持った因子(TNF様因子)を見出した。このTNF様因子とAGEsとの相互作用について,血管内皮細胞を用いた炎症応答を評価系に用いて解析した。実際には,内皮細胞株でのTNFαおよびTNF様因子誘導性のIL-8遺伝子発現に及ぼすAGEsの効果を,リアルタイムPCRによって測定した。プルダウンアッセイは,組換えHisタグ付きTNF様因子を調製し,これとAGEsを用いて行った。NF-κB活性化は,古典経路ならびに非古典経路に特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングによって検討した。その結果,AGEsはTNF様因子誘導性のIL-8 mRNA発現を濃度依存的に抑制する事が明らかとなった。その際,AGEs自体ではIL-8発現応答に影響を与えなかった。

また,プルダウンアッセイによって,AGEsがTNF様因子に直接的に結合する事も見出された。TNFαはIL-8産生を誘導し,その際の古典的NF-κB活性化はTNF様因子を前処置する事によって抑制されたが,その一方でTNF様因子自体による非古典的NF-κBの活性化はTNF様因子を前処置することによって亢進した。さらにTNF様因子の前処理による亢進反応は,AGEsを共存させる事によって抑えられる事も明らかとなった。これらの知見は,AGEsとTNF様因子との相互作用が内皮細胞の炎症応答に影響を与え,組織リモデリング病態の形成に寄与している可能性を示唆しており,新たな創薬標的になり得るものであると考えられた。組織リモデリング病態の形成に関わる因子を見出すために,タンパク質アレイ解析を実施し,HMGB1結合因子としてTWEAKを見出した。TWEAKは,血管内皮細胞のIL-8産生を増大させた。また,AGEは特異的にTWEAKと結合し,これによってTWEAK誘導性IL-8産生応答を含むTWEAKの生理活性を抑制した。本知見から,組織リモデリング病態の制御のための新たな治療標的分子として,TWEAKーAGEsから成る複合体が重要な役割を示す事が示唆された。これまでの検討によって見出された炎症性機能複合体の構成分子と内因性AGEとの相互作用を明らかにするために,その病態生理学的意義について解析を行う。実際には,組織リモデリング病態の病態モデル動物やレポーター遺伝子を導入した培養免疫細胞を用いて,複合体形成に伴うサイトカイン様活性の変動や病態指標の増悪化などの検証を,個体レベル・細胞レベルの両面から行うこととする。更に,組織リモデリング病巣での複合体形成の実体を明らかにするために免疫組織学的な検討も実施していく。これまでに見出したAGE相互作用因子の生物活性について,起炎性活性を別の評価系を用いて広範に解析すると共に,既に複数個の相互作用因子の存在を見出しているので,複合体を構成するこれら因子の種類の違いによる細胞応答の変化を検討し,組織リモデリングの発症・増悪化における病態生理学的意義について究明していく。実際には,組織リモデリング病態モデルや培養免疫細胞を用いた起炎性評価,病態局所における複合体形成の可視化,重症度との相関性などの検証を,細胞レベル・個体レベルの両面から検討していくこととする。薬理学,応用薬理学研究計画が当初の見込みよりも支障なく円滑に進行したこともあり,これによって詳細な条件設定などの再検討の必要性が無かったこと,更に購入品の値引き等も加わったために,次年度使用額が生じることとなった。研究計画を当初の見込みよりも円滑に進めることができ,データ取得のための細かな条件設定の必要性が最小限度で済んだことや試薬等の物品購入の値引きも重なったために,次年度使用額が生じることとなった。次年度の研究費と合わせて,次年度の主たる課題である炎症性機能複合体の病態生理学的解析研究のために,薬品類,抗体類などの購入を充実させ,活発に研究を進めていく予定である。主たる研究課題として掲げている起炎性複合体の病態生理学的意義をより詳細に究明するために,免疫組織学的解析のための抗体類等を充実させ,より広範な視点を持って研究に精励する予定である。
分化および未分化組織におけるヒトホメオボックス蛋白の発現に関する分子病理学的研究

1.抗体によるホメオボックス蛋白の発現の検索。HOXD4のN末端側のアミノ酸配列に対する抗体を用いて、マウス胚におけるHOXD4蛋白の発現を調べた。抗HOXD4抗体の特異性は、13日齢マウスのホモジネートを用いてイムノブロットで確認した。11日,13日,15日,17日令のマウス胎児のパラフィン包埋標本を作成し、矢状面と横断面のパラフィン切片を抗HOXD4抗体で免疫染色を行なった。[結果](1)皮膚:上1/3の層が染り、下3/4の層は増殖細胞の抗原マーカーであるPCNA陽性であった。特に注目されたのは、抗PCNA抗体では手足の水かき部分が染まらないのに対して、抗HOXD4抗体ではよく染った。(2)軟骨:骨化部に近接した軟骨細胞が染色された。一方、抗PCNA抗体ではその外側の増殖している未熟軟骨細胞が主に染色された。(3)腎臓:腎臓の髄質特に集合管が染色された。2.培養細胞へのHOXD3(旧名HOX4A)遺伝子の導入による生物学的変化とその解析。赤芽球系白血病細胞HEL細胞に動物細胞発現ベクターに組込んだHOXD3遺伝子を導入して過剰発現させた。センストランスフェクタントのE1とE6のクローンはHOXD3 mRNAを7-10倍も過剰発現していていた。一方、アンチセンストランスフェクタントのHOXD3の発現レベルは全て親株HEL細胞とほとんど同じ低レベルであった。このうちC1とC2のクローンをコントロールとして実験に用いた。[結果]E1とE6クローンでは細胞-細胞および細胞-細胞外外基質の接着性が著しく高まった。HOXD3の過剰発現はHEL細胞の増殖速度には影響を及ぼさなかった。RNAブロット解析ではインテグリンβ3のmRNA量が増加していた。FACS解析では、ヒト血小板インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)複合体(フィブロネクチン・レセプター)がE1とE6クローンで高発現していることが証明された。ホメオボックス遺伝子群は個体発生のプログラムだけでなく、出生後の細胞分化・成熟にも関与している転写調節遺伝子群であることが次第に明らかになってきている。我々は遺伝子組替え技術によって免疫組織化学染色に使用できる抗ヒト・ホメオボックス蛋白抗体の作成に初めて成功し、受精後11,13,15,17,19日令のマウス胎児をモデルとして未分化組織におけるホメオボックス蛋白の発現を調べた。その結果、脳および脊髄神経細胞は弱く染り、皮膚、骨化中の軟骨細胞、心筋細胞、腎および副腎髄質は強く染色された。増殖細胞のマーカーとしてPCNA(DNAポリメラーゼdelta補助蛋白)を免疫染色した結果、抗HOX4B抗体で免疫染色される細胞は、PなCNA陰性あるいは弱陽性の細胞で細胞周期の静止期(G0)あるいはG0期に入りつつある細胞と判定された。注目されたのは手足の水かき部分の皮膚で、プログラム細胞死の領域が強く染色されたことである。マウスでの染色結果に基づいて、ヒト成人の副腎組織を染色したところ、強く髄質が染色され、皮質は全く染色されたなかった。HOX4B蛋白は出生に近づくに従ってその発現は強くなった。

副腎髄質腫瘍を抗体HOX4B抗体で染色したところ、その発現が極めて低下しているのが観察された。現在、ヒト成人の剖検組織のパラフィン切片で、主要臓器におけるHOX4B蛋白の発現をスクリーニングしているが、現時点ではHOX4B蛋白はヒト成人の泌尿・生殖器に多く発現されており、白血病細胞にわずかに発現している。腎臓で発現されているHOX4Bホメオメイン蛋白が結合する標的遺伝子を見出すために、腎で発現しているグルタチオン・ペルオキシダーゼ遺伝子の転写調節領域さの塩基配列を調べた。その結果、ホメオドメイン蛋白結合コンセンサス配列C/TAATTAAAに一致するTAATYTAAA配列が見出された。1.抗体によるホメオボックス蛋白の発現の検索。HOXD4の末端側のアミノ酸配列に対する抗体を用いて、マウス胚におけるHOX4D蛋白の発現を調べた。抗HOXD4抗体の特異性は、13日齢マウスのホモジネートを用いてイムノブロットで確認した。11日,13日,15日,17日令のマウス胎児のパラフィン包埋標本を作成し、矢状面と横断面のパラフィン切片を抗HOXD4抗体で免疫染色を行なった。[結果](1)皮膚:上1/3の層が染り、下3/4の層は増殖細胞の抗原マーカーであるPCNA陽性であった。特に注目されたのは、抗PCNA抗体では手足の水かき部分が染まらないのに対して、抗HOXD4抗体ではよく染った。(2)軟骨:骨化部に近接した軟骨細胞が染色された。一方、抗PCNA抗体ではその外側の増殖している未熟軟骨細胞が主に染色された。(3)腎臓:腎臓の髄質特に集合管が染色された。2.培養細胞へのHOXD3(旧名HOX4A)遺伝子の導入による生物学的変化とその解析。赤芽球系白血病細胞HEL細胞に動物細胞発現ベクターに組込んだHOXD3遺伝子を導入して過剰発現させた。センストランスフェクタントのE1とE6のクローンはHOXD3 mRNAを7-10倍も過剰発現していていた。一方、アンチセンストランスフェクタントのHOXD3の発現レベルは全て親株HEL細胞とほとんど同じ低レベルであった。このうちC1とC2のクローンをコントロールとして実験に用いた。[結果]E1とE6クローンでは細胞-細胞および細胞-細胞外外基質の接着性が著しく高まった。HOXD3の過剰発現はHEL細胞の増殖速度には影響を及ぼさなかった。RNAブロット解析ではインテグリンβ3のmRNA量が増加していた。FACS解析では、ヒト血小板インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)複合体(フィブロネクチン・レセプター)がE1とE6クローンで高発現していることが証明された。
都市沿岸域における新たな流動・水質制御方策の提案と効果検証

本研究は、沿岸域に立地する事業所の取放水や排水を積極的に利用した総合的な流動制御により、閉鎖性水域の水交換を促進し、劣化した水環境の改善を目指すものである。本年度は、以下のような研究成果が得られた。(1)大阪湾東部の堺港に位置する発電所周辺海域の流況・水質調査を実施した。調査は取水口が位置し親水空間の整備が進められている堺旧港側の海域と放水口が設置されている浜寺水路側の海域で実施した。堺旧港側では、水質定点観測および船舶を用いた流況・水質の現況調査を、貧酸素水塊が発達する8月から解消する11月まで実施した。観測の結果、この港湾域の底層約4m以深には10月まで貧酸素水塊が滞留し、発電所冷却水として高栄養塩濃度の貧酸素水が取水されていることがわかった。また、温排水が放流されている浜寺水路側の海域で実施した12月の水質調査結果から、放流口前面海域では水温・栄養塩濃度の上昇や貧酸素水の影響が見られたが、混合拡散による水質改善効果は認められなかった。(2)昨年度実施したシミュレーションの沿岸地形データの精緻化と各種パラメータの修正を行い、発電所周辺海域の流動・水質シミュレーションを実施した。また、深層学習手法による水質計算の高度化も検討した。その結果、30m3/s程度の放流量では、潮流が卓越するこの海域の残差流構造には大きな変化は見られなかった。しかし、放流口を港域奥に変更することにより、停滞性の強い浜寺水路の流動を促進し、港内の栄養塩を港外に流出させる効果も認められた。さらに浜寺水路底層から放流した場合は、鉛直混合が促進され溶存酸素濃度に一部改善が見られ、さらに冷却水取水後に曝気して温排水を放流した場合には、より改善効果が大きくなり、放流水の水質が水温にもまして海域の水環境改善に大きな影響を及ぼすことがわかった。北部港湾域の解析がほぼ完了し、本年度は東部港湾域の調査解析を行った。現地調査において、9月に大阪湾を直撃した台風21号により計器流出が発生したが、11月に計器の回収ができデータ損失も最小限に抑えることができた。昨年度より精緻な地形データを作成し流動シミュレーションの精度向上が図られ、種々のケース計算と詳細な影響解析が可能となった。当初予定していた3カ所の発電所の取放水の影響については、ほぼシミュレーションが可能となった。研究最終年度である次年度は、港域の水交換をより定量的に把握するために、残差流解析に加え水粒子挙動シミュレーションにより栄養塩等の物質輸送解析も行い、発電所をはじめとする事業所等の水輸送システムを活用した実現可能な水環境改善策の検討を行う。また、大阪湾で実施または審査中のアセスメント関係の資料を収集し、海域の環境改善の視点から環境影響評価の課題と改善策を検討する。3年間の研究期間でこの目的を達成するために、(1)資料の収集分析、(2)現地調査、(3)数値シミュレーション、(4)環境改善策の検討、の各事項について研究を推進し、本年度は、以下のような研究成果が得られた。(1)発電所の取放水の放流形式と流量・水質、大阪湾沿岸に位置する他の事業所の排水流量・水質に関するデータの収集と解析を行い、大阪湾奥部の沿岸域に位置する事業場からの全排水量は、流入する河川流量に匹敵し、そのうち発電所排水量の割合は約80%と極めて大きく,沿岸域の流況改善に利用できる可能性が示唆された。(2)流動・水質シミュレーションの実施に向けて、新たなモデル(FVCOM)を導入し、各機関で観測されている対象海域の水質データや気象・海象データを計算条件として、発電所の取放水が周辺海域の流況と海水交換に及ぼす影響を解析した。その結果、港域の流況改善のためには,その場における支配的な残差流系を十分に考慮し、取放水の量とともに取放水口の位置や形状を決定する必要があることがわかった。(3)現地観測については、環境アセスメントの公開データ等により当面必要な水質データが入手できたことと、分析機器の不調を考慮し、船舶による観測は次年度に実施することとした。一方、海象海域の衛星データの検索から有用なデータが見つからなかったことから、UAVを用いた沿岸域における面データの観測手法の検討を始め、マルチスペクトルカメラを搭載した試行観測を実施し、観測システムの構築を行った。流動シミュレーションは、当初予定していたモデル(ROMS、EFDC)より汎用性を有し、さらに再現性の向上も期待できるモデル(FVCOM)の導入と流動解析を行うことができ、研究が大きく前進した。さらに、水質モデルの導入も終えており、次年度はその再現性の検証を行ったのち、水質改善の方策を検討する予定である。本年度は現地観測の予定を変更し、広域の面的観測が可能なUAVを用いた観測システムの構築を行った。次年度は船舶とこのシステムを用いて水質観測を実施する予定である。

(1)大阪湾東部の堺港に位置する発電所周辺海域の流況・水質調査を実施した。調査は取水口が位置し親水空間の整備が進められている堺旧港側の海域と放水口が設置されている浜寺水路側の海域で実施した。堺旧港側では、水質定点観測および船舶を用いた流況・水質の現況調査を、貧酸素水塊が発達する8月から解消する11月まで実施した。観測の結果、この港湾域の底層約4m以深には10月まで貧酸素水塊が滞留し、発電所冷却水として高栄養塩濃度の貧酸素水が取水されていることがわかった。また、温排水が放流されている浜寺水路側の海域で実施した12月の水質調査結果から、放流口前面海域では水温・栄養塩濃度の上昇や貧酸素水の影響が見られたが、混合拡散による水質改善効果は認められなかった。(2)昨年度実施したシミュレーションの沿岸地形データの精緻化と各種パラメータの修正を行い、発電所周辺海域の流動・水質シミュレーションを実施した。また、深層学習手法による水質計算の高度化も検討した。その結果、30m3/s程度の放流量では、潮流が卓越するこの海域の残差流構造には大きな変化は見られなかった。しかし、放流口を港域奥に変更することにより、停滞性の強い浜寺水路の流動を促進し、港内の栄養塩を港外に流出させる効果も認められた。さらに浜寺水路底層から放流した場合は、鉛直混合が促進され溶存酸素濃度に一部改善が見られ、さらに冷却水取水後に曝気して温排水を放流した場合には、より改善効果が大きくなり、放流水の水質が水温にもまして海域の水環境改善に大きな影響を及ぼすことがわかった。北部港湾域の解析がほぼ完了し、本年度は東部港湾域の調査解析を行った。現地調査において、9月に大阪湾を直撃した台風21号により計器流出が発生したが、11月に計器の回収ができデータ損失も最小限に抑えることができた。昨年度より精緻な地形データを作成し流動シミュレーションの精度向上が図られ、種々のケース計算と詳細な影響解析が可能となった。当初予定していた3カ所の発電所の取放水の影響については、ほぼシミュレーションが可能となった。次年度は、導入された水質モデルを用いた流動・水質シミュレーションを行い、その再現性について十分な検証を行い、発電所からの取放水や事業所からの排水による流況・水質改善の効果について定量的評価を行う予定である。また、シミュレーションの検証にはUAVと組み合わせた現地観測データを用いる予定である。研究最終年度である次年度は、港域の水交換をより定量的に把握するために、残差流解析に加え水粒子挙動シミュレーションにより栄養塩等の物質輸送解析も行い、発電所をはじめとする事業所等の水輸送システムを活用した実現可能な水環境改善策の検討を行う。また、大阪湾で実施または審査中のアセスメント関係の資料を収集し、海域の環境改善の視点から環境影響評価の課題と改善策を検討する。
光合成生物のレドックスネットワークを支える還元力の分配ルールの解明

光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するために、1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイムの解析、2光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析、3レドックス関連小分子の動態解析、4チオレドキシンのレドックスに応じた動態のリアルタイム解析、5植物細胞内の酸素濃度測定系の開発、の5項目について研究を実施した。その結果、葉緑体のレドックス制御の鍵タンパク質であるチオレドキシンの特異性とNTRCタンパク質のレドックス制御因子としての重要性の解明、細胞内におけるグルタチオンの制御因子としての機能の解明、新規酸素センサータンパク質の開発などの成果を上げた。光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するためには、生体内酸素濃度の動態、光合成系に関わる酵素のレドックス動態、非光合成条件下で酸化に関わる因子の動態、さらに、レドックス調節の主役であるチオレドキシンの動態など電子の流れの情報が必須である。そこで、以下の5項目について、研究を実施した。1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイム解析については、レドックス応答蛋白質の例としてシアノバクテリアの炭酸同化系の酵素であるホスホグリセレートキナーゼ分子のグルタチオン化されるシステインの同定、および、その生理的な意義を調べた。2光合成生物の細胞内のレドックス動態のリアルタイム解析については、緑藻クラミドモナスのべん毛に酸化還元応答蛍光蛋白質Oba-Qを導入し、細胞内の酸化還元状態を外因的に変えたときの鞭毛内の酸化還元変化をリアルタイムに解析した。3光合成生物細胞内のレドックス関連小分子の動態の解析では、NADPHやグルタチオンなどの細胞内小分子の動態解析を試みている。4レドックス制御に中心的な役割を果たすTrxの細胞内動態のリアルタイム解析では、ヒメツリガネゴケ原葉体をアンピシリン添加培地で培養することで細胞内に巨大葉緑体を形成した試料を用いた。ヒメツリガネゴケにチオレドキシンーGFP融合蛋白質遺伝子を導入し、葉緑体内で発現させ、チオレドキシンの酸化還元による葉緑体内での動態変化の可視化を試みた。5植物細胞内あるいはオルガネラ内の酸素濃度の測定系の開発では、酸素応答性の蛋白質と蛍光蛋白質の融合蛋白質を作成し、酸素濃度に応じた蛍光変化を引き起こす蛋白質の分子設計を試みている。1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイム解析については、当初網羅的な解析を目指したが、レドックス応答蛋白質の持つシステインが複数であり、網羅的な追跡を行うための情報収集に手間取ることから、まずはすでに組み換え体蛋白質および抗体を用意している蛋白質試料による動態解析に切り替えた。2光合成生物の細胞内のレドックス動態のリアルタイム解析については、実際に酸化還元変化によるべん毛内の特異な応答を観察することに成功した。3光合成生物細胞内のレドックス関連小分子の動態の解析については、まだ具体的な成果があがっていない。4レドックス制御に中心的な役割を果たすTrxの細胞内動態のリアルタイム解析では、ヒメツリガネゴケ原葉体の形質転換、および、過剰発現したGFPの蛍光顕微鏡観察を行うことには成功した。今後、導入した蛋白質のレドックス応答を生化学的、および形態学的に追跡する必要がある。5植物細胞内あるいはオルガネラ内の酸素濃度の測定系の開発では、酸素応答性の蛋白質と蛍光蛋白質の融合蛋白質を作成し、実際に酸素の付加によって蛍光変化を示す蛋白質を得ることに成功した。現在、ダイナミックレンジを大きくするための試行を行っている。光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するためには、生体内酸素濃度の動態、光合成系に関わる酵素のレドックス動態、非光合成条件下で酸化に関わる因子の動態、さらには、レドックス調節の主役であるチオレドキシンの動態など、電子の流れ情報が必須である。そこで、本年度も以下の5項目について研究を実施した。1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイムの解析については、緑色植物ミトコンドリアのレドックスタンパク質であるリンゴ酸脱水素酵素の活性制御の分子機構を解明した。また、緑色植物とシアノバクテリアにおける新規レドックス制御タンパク質NTRCの機能解析を行った。その結果、緑色植物葉緑体では、従来知られているチオレドキシンとNTRCがそれぞれ独立に還元力伝達経路を持っており、生存に重要な役割を果たしていること、シアノバクテリアでは抗酸化ストレスシステムの維持にNTRCが重要な役割を果たしていることを明らかにした。2光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析については、新規のレドックス応答蛍光タンパク質を開発し、植物細胞内への導入を試みた。3レドックス関連小分子の動態解析については、還元型グルタチオンの生体内での機能解析を行った。4チオレドキシンのレドックスに応じた動態のリアルタイム解析では、前年度に引き続き、ヒメツリガネゴケへのチオレドキシン-蛍光タンパク質融合タンパク質を導入し、アンピシリン培地での巨大葉緑体の作成による葉緑体内での観察を実施した。5植物細胞内の酸素濃度測定系の開発では、新規に細菌ヘムタンパク質とGFPの融合タンパク質を設計し、フォトクロミックFRETの原理による高感度酸素測定を行った。1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイム解析については、NTRCやチオレドキシンなど既知のタンパク質、および、これらから電子を受け取るタンパク質群の解析については順調に研究が進展し、それぞれについて論文発表を行った。

一方、葉緑体内のレドックス応答タンパク質の網羅的な解析については、明条件で還元されるシステイン残基の適切な化学標識方法、および、この標識に基づくタンパク質の捕捉方法など、研究手法の開発に手間取っており、まだ成果を上げるには到っていない。2光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析では、新規に還元によって蛍光が消光するタンパク質、および、酸化状態と還元状態で蛍光スペクトルが変化するタンパク質の開発に成功したため、これらを光合成生物の細胞内に導入することにより、リアルタイム観察する実験系を開発中である。3については、グルタチオンに着目し、酸化的修飾を受けた酵素の再還元に働くシステムの存在を動物細胞で確認した。4では、葉緑体自家蛍光の影響を無視できる程度に蛍光強度の強いチオレドキシンーGFP融合タンパク質を発現するヒメツリガネゴケ形質転換体が未だに得られないため、導入するタンパク質の基本設計を再度検討中である。5については、新規に設計したフォトクロミックFRETによる高感度酸素測定蛍光分子の基本設計を終えた。光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するためには、生体内酸素濃度の動態、光合成系に関わる酵素のレドックス動態、非光合成条件下で酸化に関わる因子の動態、さらには、レドックス調節の主役であるチオレドキシンの動態など、電子の流れ情報が必須である。そこで、本年度も以下の5項目について研究を実施した。1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイムの解析ついては、葉緑体チオレドキシンアイソフォームの還元系路、およびチオレドキシンから下流への電子伝達経路の速度論的解析を行った。2光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析については、新規に開発したレドックス応答蛍光タンパク質を利用して、f型およびm型のチオレドキシンアイソフォームの酸化還元動態を調べた。3レドックス関連小分子の動態解析では、動物細胞の実験系を利用して、引き続き還元型グルタチオンによる酸化型酵素の生体内での還元とその機能解析を行った。4チオレドキシンのレドックスに応じた動態のリアルタイム解析では、前年度に引き続き、チオレドキシンf型あるいはm型と蛍光タンパク質の融合タンパク質を作成し、遺伝子レベルでヒメツリガネゴケに導入した。蛍光レベルで発現の強いものを選抜し、アンピシリン培地での巨大葉緑体の作成による葉緑体内での観察を実施した。5植物細胞内の酸素濃度測定系の開発では、細菌ヘムタンパク質とGFPの融合タンパク質のリンカー部分の構造に着目し、酸素の有無による蛍光強度比が2倍以上の高感度なセンサータンパク質の作成に成功した。光合成の制御に特に重要な要素である「還元力の分配機構」を理解するために、1光合成生物のレドックス応答タンパク質の動態のリアルタイムの解析、2光合成生物の細胞内レドックス動態のリアルタイム解析、3レドックス関連小分子の動態解析、4チオレドキシンのレドックスに応じた動態のリアルタイム解析、5植物細胞内の酸素濃度測定系の開発、の5項目について研究を実施した。
悪性胸膜中皮腫における末梢血液中の循環中皮腫細胞の検出

研究目的:末梢血液中の循環中皮腫細胞を検出することにより、悪性胸膜中皮腫の早期発見・治療効果判定に役立てることを目的とした。研究方法:(1)血液中の循環腫瘍細胞(CTC : Circulating Tumor Cell)検出システムであるCellSearchのCTC検出能を確認し、中皮腫の診断マーカーとしての有用性を検討、検出方法の改良を試みた。(2)中皮腫細胞に対する、より特異的なその他の検出法を検討した。研究成果:<CellSearchのCTC検出能の検討>・CellSearchによる悪性胸膜中皮腫症例のCTC検出率悪性胸膜中皮腫と非悪性疾患におけるCTC陽性率(CTC>1)はそれぞれ32%、23%であった。・悪性胸膜中皮腫におけるCTCの診断マーカーとしての検討ROC曲線による解析では、CTCは非悪性疾患との鑑別に有用であるとはいえなかった。結果として転移が認められない早期の症例に対してセルサーチによるCTCの検出率は低く、診断マーカーとしては感度が不十分であると考えられた。そこで、性質の異なる中皮腫細胞に対して1つの抗原をターゲットにして循環中皮腫細胞を捕捉するのでなく、遺伝子発現による検出方法の検討を行った。<遺伝子発現による検出法の検討>末梢血より腫瘍細胞が含まれる単核球層を分取し、この分画で発現しているRNAを抽出後RT-PCRにより遺伝子発現を確認した。中皮腫のマーカーとしてmesothelinの発現を検討した。まず中皮腫細胞株における解析では3株中全ての株にmesothelinが発現し、更にその感度は末梢血8mLあたり10個まで検出可能であった。早期の悪性胸膜中皮腫症例の末梢血ではmesothelinの発現は確認できなかったが、今後、複数のマーカーを組み合わせて感度を向上させられる可能性があり、新しい検出法として有用であると考えられた。