hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｂｅｌｌｅ‐ＩＩ実験のための高性能新型粒子識別装置の開発

平成28年2月より高エネルギー加速器研究機構で稼働し始めたSuper KEKBを用いるBelle II実験において、粒子識別装置の性能は期待される物理成果を実現するためには非常に重要な要素となっている。本研究ではシリカエアロゲルを輻射体、光検出器としてHAPDを使用するリングイメージ型チェレンコフ検出器を開発し、4σでのπ/K分離を目指した。電子ビームを用いたプロトタイプ試験により、期待した性能が確認された。現在、シリカエアロゲル輻射体、HAPD、信号読み出し用ASIC、高電圧電源、モニター用光ファイバーシステムなど必要な要素がすべて整い、間もなく実機の建設が始まる。本研究の要である光検出器としてHAPDを使用するが、10年にわたる長期実験の間の放射線(中性子とγ線)損傷が懸念される。中性子への対策として、1)半導体中のp層を薄くすることで格子欠陥の確率を減少させること、2)読み出し電子回路のshaping時間を短くすることで漏れ電流による雑音を減少させること、などを検討した。また、γ線に関しは、ホールが絶縁層に蓄積するなどで、APDの正常動作を妨げることが考えられるが、これに関しても絶縁層の厚さ・配置などを最適化することで対処できると考えた。平成24年度はこれらの対策を施したHAPDを多数作成し、放射線損傷の評価を行った。その結果、10年の長期使用においても十分に性能が保持されることが確認された。HAPDの大量生産に備えて、高電圧試験、感度の一様性、ノイズ量、クロストーク等を自動的に測定するシステムの構築するために、その要となる分光光度計などを製作した。チェレンコフ検出器の輻射体として、屈折率が1.051.06の複層型のシリカエアロゲルを使用する。それらの製法に関しては、千葉大学で開発されたpin-hole乾燥法が有効であるため、pin-hole乾燥法で製作されたシリカエアロゲルの性能評価を行った。透過率は高いがクラックの入る確率が高いことが判明し、最終的にどの方法で製作するか再検討することになった。実機に搭載される480台のHAPDの感度や、シリカエアロゲルの透過率、ミラーの反射率などの経年変化をモニターするためのシステムを検討した。LEDを光源とし、光ファイバーを用いて一定量の光を測定器内の各所に入射することを考え、光ファイバーを用いた光分配システムを試作した。HAPDには8kVの高電圧が印加される。480台のHAPDに高電圧を印加出来るシステムが必要であるため、本年度はプロトタイプを製作しその性能評価を行った。本研究で要となる光検出器のHAPDは放射線損傷が予想されたが、浜松ホトニクス社によりそれらへの対策が取り入れられた48本のHAPDが製造され、KEKに納品された。そのために自動検査システムを完成させ、48本のHAPDの評価を実施した。評価内容は高電圧印加試験(リーク電流測定)、感度の一様性、ノイズ量、クロストーク等々である。若干の不一致はあったものの、ほぼ浜松ホトニクス社での検査結果と良い一致が見られ、大量生産開始にめどがついた。RICH検出器の輻射体として屈折率が1.051.06の複層型のシリカエアロゲルを使用する。今年度は最終仕様に従って、約50枚のシリカエアロゲルを製作・評価を行い、クラックの有無や屈折率の一様性などを測定し、実機に使用できる性能を有していることが判った。実機には480本のHAPDが搭載されるが、それらの感度や、シリカエアロゲルの透過率、ミラーの反射率などの経年変化をモニターするためのシステムの設計がH24年度に行われた。LEDを光源とし、光ファイバーを用いて一定量の光を測定器内の各所から入射させる方式を採用したが、当初予定した方法では十分な光分布の一様性が得られなかったので少し設計を変更して仕様にあうシステムを試作した。新しい試作品では十分な性能が得られることが判明した。480台のHAPDに高電圧を印加出来るシステムを試作しその評価を行ったが、ランプアップ・ダウンの時間が仕様通りにできていないことが判ったが、ソフトウェアの改良で対応できた。また、フロント・エンドとなるASICは、実機では約1800個を使用する。その受け入れ検査システムとして同時に6個のASICの性能検査ができるシステムを試作した。少し設計に不具合があったものの、性能検査には十分に使える物が完成した。本研究で開発されるシリカエアロゲルを輻射体とするリングイメージチェレンコフカウンター(A-RICH)の中で、最も重要な要素がチェレンコフ光を検出するHAPDである。装置全体で420本(設計変更により480本から420本になった)のHAPDを使用することになるが、共同開発を行ってきた浜松ホトニクス社で昨年度から大量生産が始まった。H26年度末までで約400本のHAPDが納品されたが、その内受け入れ検査で良品と判定されたのは約350本である。若干歩留まりが悪いが、平成27年度中には必要な420本すべて準備可能であると考えている。シリカエアロゲルの製造が終了し屈折率や透過率などの測定を終え、輻射体として使用できるものが準備できた。

HAPDからの信号読み出しに使用されるASICが2520個製造され、それらの性能評価を行い、実際に420本のHAPDの読み出しに必要とされる1680個以上を選別する作業を行った。評価項目は、増幅率の線型性、offset調節機能、波形整形時間などである。同時に6個のASICの評価が可能な評価ボードを3台製作し、8月から評価を開始し、11月に終えることが出来た。2081個のASICが正常と判定され、それらの中から1680が共同研究を行っているリュブリアナ大学で製作されている読み出し基板にマウントされることになっている。HAPDに8kVの高電圧を印加する高電圧電源システムが製造業者との間で共同開発されてきたが、最終的な長期試験などを行い、設定電圧と実測値の比較、ランプアップ・ダウンの性能、長期の電圧安定性などすべて仕様を満たす電源が完成した。HAPDやシリカエアロゲルの透過率などをモニターするシステムとして開発してきたLED+光ファイバーシステムも6台完成し、装置全体に一様な光を導入することが出来るようになった。HAPD以外、すべてのパーツがそろった。本研究で開発される高性能新型粒子識別装置A-RICHで使用される予定の光検出器HAPDが、製造業者の浜松ホトニクス(株)よりH27年度内に全数納品された。高圧印加試験、感度の一様性、ノイズ量、クロストーク量などの受け入れ検査で合格した数がA-RICH建設に必要な420台を超えている。1.5テスラの磁場中でHAPDの動作試験を行ったところ、一部のHAPDでdead timeが大きくなる現象が発見された。この問題はカソードとアノードの中間部分に有る電極に所定の電圧を印加することで解決されることが実験で示された。実際のA-RICHの組み立ては、プロジェクト全体のスケジュールの遅れによりH28年秋ごろを予定して居るが、読み出し回路の一部と高電圧電源を除いて、輻射体のシリカエアロゲル、HAPD、支持構造体などすべての準備が整っている。本研究で開発した信号読み出しのためのASICは総数2500個が製造され、性能評価の後に必要な1680個が選別され、回路基板への設置が終了した。A-RICHは組立終了後すぐにBelle II測定器内にinstallされるが、install後のHAPDの感度の経年変化をモニターするために、青色LEDを光源として光ファイバーシステムによって、一定の光量をHAPDに照射するモニターシステムを構築した。数か月にわたる試験において十分な光量の安定性やHAPDのゲイン変動のtraceabilityなどが示され、モニターシステムとしての機能が備わっていることが確認された。今後は実機にinstallしての性能評価を実施する。H27年度末に、本研究に携わった大学院生によりA-RICHのビーム試験による性能評価を含めた全体システムの構築を詳細に記述した博士論文が提出され、学位(理学博士)が授与された。平成28年2月より高エネルギー加速器研究機構で稼働し始めたSuper KEKBを用いるBelle II実験において、粒子識別装置の性能は期待される物理成果を実現するためには非常に重要な要素となっている。本研究ではシリカエアロゲルを輻射体、光検出器としてHAPDを使用するリングイメージ型チェレンコフ検出器を開発し、4σでのπ/K分離を目指した。電子ビームを用いたプロトタイプ試験により、期待した性能が確認された。
葬制・墓制にみる日本の死生観

本研究は、文学・仏教・インド学・哲学・社会学の各専門分野からの、葬制・墓制を通じての日本における死生観の探究を目的とし、平成14年度から15年度にかけて以下の資料研究と実地調査を各研究者が行った。資料研究においては、日本の葬送儀礼及び墓制の歴史的・民俗的考察に関する資料を収集・研究し、併せて、現代社会の家族形態における葬制・墓制の変容を考察した。また、仏教や文学資料のテキストクリティークを通じて、葬制・墓制との関連から窺い知りうる心情・死生観・信仰形態を検討した。西欧と日本における葬制・墓制の比較考察については、西欧の死生観に関わる資料を収集し、死生観の比較考察を重点的に行った。さらに、安楽死・尊厳死といった生命倫理の問題に関し、社会と死との関連を視野に入れつつ、葬制・墓制にみられる遺体観から研究資料を考察した。実地調査は、研究分担者の課題に基づき、北海道白老等のアイヌおよび開拓民の生活文化と墓制の調査、葬儀と埋葬の歴史的変遷に関する、仙台市泉区根白石地区の葬法の調査、岐阜県海津郡・三重県桑名郡における、中世中部地方の墓制にみる信仰の変遷の調査、大阪や京都における西鶴ら近世文学者の墓所の調査及び文献収集、松山・高知・徳島における札所の調査等を行った。こうした文献研究や調査の成果を踏まえ、2年間の研究成果を各研究者が各自の分担課題に即して論文や報告書にまとめ、研究成果報告書に集成することになった。研究の成果として、研究成果報告書にみられるように、挽歌表現における葬制・墓制のあり方、日本における葬儀と埋葬の慣行の歴史的な変遷と現状など、充実した研究成果をまとめることができた。日本の葬制・墓制についてはほんの一部分のみを検討したに過ぎないが、本研究の成果を足がかりとしてさらなる研究の進展への展望が見出され、そこに研究成果報告書に示された以上の成果があったといえる。本研究は、平成14年度から15年度にかけて、文学・仏教・インド学・哲学・社会学の各専門分野からの、葬制・墓制を通じての日本における死生観の探究を目的とする。平成14年度は、以下の資料研究と実地調査を行った。資料研究においては、日本の葬送儀礼及び墓制の歴史的・民俗的考察に関する資料を主に収集・研究した。また、ヒンドゥー教における葬制との比較研究においては、インドの火葬に関わる資料をもとに比較考察を行い、西欧と日本における葬制・墓制の比較考察については、西欧の死生観に関わる資料を収集し、死生観の比較考察を重点的に行った。そして、世界各地の死に関する文化の比較考察に際して、文字資料では把握できない部分を、不十分ながらもその各地の実践形態を収めたビデオの検討により補った。実地調査は、研究分担者の分担課題に基づき、ムラと教団宗教の関係に関する、仙台市泉区根白石地区の葬法の調査、宗像市での沖ノ島の祭祀等の調査、長楽寺や隠岐などでの姥捨山・山岳信仰を中心とした調査、大阪や京都における西鶴ら近世文学者の墓所の調査及び文献収集、天理図書館での芭蕉の墓碑や句碑に関わる資料の調査、金沢での鏡花や犀星の死生観、能登における折口信夫の死生観の探求など、墓所や文学者と関わる寺院等における日本近代文学にみる死生観の調査、奈良・徳島・淡路島などでの草木成仏と葬制・墓制との関連の調査、冥界信仰に関わる、淡路島の十三仏霊場の調査を行った。

研究の成果として、国内各地の習俗や各時代の葬制・墓制の特色をうかがい知ると同時に、実地調査により、文学者の時代及び習俗を背景とした死生観の一端を知ることができた。そのような特色をいかに比較考察において総合するかという問題は、次年度の課題となる。本研究は、平成14年度から15年度にかけて、文学・仏教・インド学・哲学・社会学の各専門分野からの、葬制・墓制を通じての日本における死生観の探究を目的とし、平成15年度は、以下の資料研究と実地調査を各研究者が行った。資料研究においては、昨年度に引き続き日本の葬送儀礼及び墓制の歴史的・民俗的考察に関する資料を研究したほか、併せて、現代社会の家族形態における葬制・墓制の変容を考察し、往生と死生観に関する考察を『往生要集』のテキストクリティークを通じて行い、現実の直視と浄土に関する知見を得た。また、安楽死・尊厳死といった生命倫理の問題に関し、社会と死との関連を視野に入れつつ、葬制・墓制にみられる遺体観から考察した。実地調査は、研究分担者の課題に基づき、戸隠における山岳信仰の調査、塩田平・小布施における仏教文化遺跡の調査、松山・高知・徳島における札所の調査、北海道白老等のアイヌおよび開拓民の生活文化と墓制の調査、岐阜県海津郡・三重県桑名郡における、中世中部地方の墓制にみる信仰の変遷の調査等を行った。こうした文献研究や調査の成果を踏まえ、2年間の研究成果を各研究者が各自の分担課題に即して論文や報告書にまとめ、研究成果報告書に集成することになった。研究の成果として、研究成果報告書にみられるように、挽歌表現における葬制・墓制のあり方、日本における葬儀と埋葬の慣行の歴史的な変遷と現状など、充実した研究成果をまとめることができた。日本の葬制・墓制についてはほんの一部分のみを検討したに過ぎないが、本研究の成果を足がかりとしてさらなる研究の進展への展望が見出され、そこに研究成果報告書に示された以上の成果があったといえる。
EDDPOを用いる新しい硬組織時刻描記法に関する研究

ラットに段階用量のEDDPOを投与し、ヘマトキシリン(H)染色性のEDDPO線を観察した成績は以前に行った実験成績と同様であったので割愛するが、適切な投与量はリン(P)として10mg P/kgで、それ以上の用量ではH染色線に続いてH不染層が出現し、時刻描記には不適当であることが明らかになった。次に、家兎で行った実験成績について述べる。2kg前後のN.W.系雄性家兎を皮下注射と静脈注射に分け、各群にEDDPOを体重kgあたりP量として10,1,2,10+10mg Tc.,4,6,8mgの順番で3日間間隔で投与し、脱灰パラフィン包埋の切歯象牙質、頭蓋骨、脛骨骨幹部の横断および脛骨の縦断切片をH染色し、H染色性のEDDPO線の観察を行った。その結果、象牙質については1mg P/kg投与では両群とも±程度、2mg P/kgで+となり、静脈注射群で判然とした。410mg P/kg投与では両群とも鮮明な線が、家兎でみられる日周期性のH染色層とはっきり区別して観察された。なお、本実験で4番目に10gm P/kgのEDDPOとテトラサイクリン(Tc.)の混合液を投与したが、結果はEDDPO線は鮮明であり、同歯の反対側の非脱灰標本のTc.蛍光線も明瞭に観察された。すなわち、時刻描記線が脱灰と非脱灰切片で同時に観察できることを示した。この混合液投与法は有用な描記法になると思われる。象牙質以外の試料では、脛骨縦断切片でH線が観察されなかったが、他の試料ではすベて石灰化進行部位に明瞭な線として認められた。マウスでは8mg P/kg投与ではH線は現れず、20mg P/kgでは明瞭で、ラットにみられた不染層の出現もなかった。以上の成績より、EDDPOに対する動物の感受性はマウス、ラット、家兎の順に高くなり、時刻描記投与量としての適量は家兎で4mg P/kg、ラットで10mg P/kg、マウスで20mg P/kgと考えられる。なお、これらの投与量は毒性量ではないことを検討し確認した。本研究では近いうちに論文にまとめ投稿する予定である。
特発性血小板減少性紫斑病におけるT細胞エピトープの同定と新たな免疫療法の開発

本研究の目的は、ITP患者からGPIIbペプチドに反応するT細胞クローンを分離し、ITPにおけるGPIIb反応性T細胞の役割とドミナントエピトープを明らかにすることである。われわれは、ITP患者からGPIIb由来ペプチド(#429-443)を特異的に認識するHLA-DR^*0405拘束性CD4陽性T細胞株を樹立した。このT細胞は血小板を自己樹状細胞に取り込ませて抗原提示させた系においても細胞増殖反応とサイトカイン産生を示したことから、GPIIb#429-443が自己反応性T細胞エピトープとなりうることを証明した。この手法を用いて複数のITP患者からGPIIb反応性T細胞を分離することができた。また、ヘルパー活性を評価するために必要となる抗GPIIb抗体産生量の測定法として、抗GPIIb-IIIaモノクローナル抗体を用いた高感度ELISA測定系を確立した。ついで、GPIIb反応性T細胞の機能解析を行ったところ、ヘルパー活性を有するCD4陽性T細胞だけでなく、一部のITP患者には細胞障害活性を有するGPIIb反応性CD8陽性T細胞が存在していた。また、GPIIb-IIIaの機能解析を遺伝子組み換え蛋白を用いてすすめた結果、リガンド結合に重要なアミノ酸とGPIIb-IIIaの活性化を抑制しているアミノ酸配列を同定した。また、CD4陽性T細胞の機能解析のために、WT1に対するCD4陽性T細胞クローンを樹立して、その機能を解析したところ、このクローンはHLAクラスII抗原拘束性にWT1陽性白血病細胞に対して細胞障害活性を示した。また、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞のパーフォリン遺伝子の発現を比較したところ、CD8陽性T細胞ではパーフォリン遺伝子の恒常的発現がみられるのに対して、CD4陽性T細胞では細胞の活性化依存性に発現することが明らかになった。本年度は、GPIIb-IIIa蛋白(インテグリンαIIbβ3)の構造と機能を遺伝子組み換え蛋白発現の技術を用いて調べた。GPIIb-IIIa上のリガンド結合に重要であると考えられている領域のアミノ酸に対するアラニンスキャニングを広範囲に適用することによってインテグリンの活性化に重要な新たなアミノ酸を特定し、GPIIb-IIIaの構造をアミノ酸レベルで解析した。その結果、GPIIbのW2:2-3 loopに存在するQ111,H112およびN114がリガンド結合に重要であることを見出した。さらにGPIIb鎖細胞内ドメインにあるArg-Pro-Pro配列がGPIIb-IIIaの活性化を抑制していることを明らかにした。また、ITP患者からGPIIb由来ペプチド(#429-443)を特異的に認識するHLA-DR^*0405拘束性CD4陽性T細胞株を樹立した。そこで、現在、複数のITP患者からGPIIb反応性CD4陽性T細胞のクローニングを行っている。GPIIb反応性T細胞の分離効率を上げるため、当大学で開発された無細胞蛋白合成装置を用いてGPIIb蛋白を作成したところ、効率よくwhole GPIIb proteinを合成することができた。これを用いて、GPIIb反応性T細胞の樹立を試みている。ITP患者からGPIIb由来ペプチド(#429-443)を特異的に認識するHLA-DR^*0405拘束性CD4陽性T細胞株を樹立した。

このT細胞は血小板を自己樹状細胞に取り込ませて抗原提示させた系においても細胞増殖反応とサイトカイン産生を示したことから、GPIIb#429-443が自己反応性T細胞エピトープとなりうることを証明した。この手法を用いて複数のITP患者からGPIIb反応性T細胞を分離することができた。また、T細胞の抗GPIIb抗体産生に対するヘルパー活性を評価するために必要となる抗GPIIb抗体産生量の測定法として、抗GPIIb-IIIaモノクローナル抗体を用いた高感度ELISA測定系を確立することができた。T細胞のヘルパーおよび細胞傷害活性とエピトープ解析については、私どもがこれまでに行ってきた造血器腫瘍関連抗原特異的細胞傷害性T細胞の解析法を適用することとした。今年度においては、Wilms tumor gene1 product(WT1)に対するCD4陽性T細胞クローンを樹立した。このクローンはWT1蛋白由来ペプチド#337-347を認識し、HLAクラスII抗原DP5拘束性にWT1陽性白血病細胞に対して細胞障害活性を示すことを証明することができた。また、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞の細胞障害活性を比較するために、パーフォリン遺伝子の発現を比較したところ、CD8陽性T細胞ではパーフォリン遺伝子の恒常的発現がみられるのに対して、CD4陽性T細胞では細胞の活性化依存性に発現していた。これらの成果をふまえてGPIIb反応性T細胞の機能解析を行ったところ、ヘルパー活性を有するCD4陽性T細胞だけでなく、少なくとも一部のITP患者には細胞障害活性を有するGPIIb反応性CD8陽性T細胞が存在することを明らかにした。
褐色細胞腫腫瘍マ-カ-としてのエンケファリンの臨床的評価と病態生理上の意義

1.褐色細胞腫におけるエンケファリンの免疫組識化学的検討26例の褐色細胞腫摘除標本(ホルマリン固定パラフィン包理)を用い、メチオニンおよびロイシンーエンケファリンに関して免疫組識化学的検索を行なった。その結果、強弱の差はあるものの,すべての症例の褐色細胞腫がエンケファリン陽性であることが判明した。このことは褐色細胞腫が、その発生母地である副腎髄質あるいは髄外クロ-ム親和組識の性質を依然保持していることを示している。また、ノルアドレナリンよりもアドレナリン分泌型褐色細胞腫において、エンケファリンは強陽性のことが多いことも判明した。また、尿中メタネフリン排泄がこのエンケファリン陽性度と相関が認められることも判明した。2.褐色細胞腫患者における術前・術中・術後の血中エンケファリン動態最近手術を施行した褐色細胞腫患者14例を対象とし、対照群6例とともに,術前・術中・術後の血中ロイシンーエンケファリンと血中カテコ-ルアミンを測定し、比較検討した。褐色細胞腫群患者の血中エンケファリン濃度は、術前・術中においてカテコ-ルアミンとともに対照群と比べ有意に高値を示した。さらにカテコ-ルアミンと同様、術後は低下し、対照群と差を認めなくなった。従来,主に腫瘍中濃度で報告されているように、NA型よりA・NA型、非発作型より発作型のほうが血中でも高値を示す傾向が見られたが、統計学的には術前・術中・術後を通じて有意差を認めなかった。以上のごとくエンケファリンはカテコ-ルアミン放出に密接な関係を持つことが示唆され、血中半減期が非常に短いことを考え合わせると、カテコ-ルアミン分泌に何らかの調節的役割を演じているのではないかと考えられる。また、臨床的重症群と軽症群との間には、術中エンケファリン濃度の変動に関して明らかな差を認め、褐色細胞腫における重症度の指標の手助けになりうる可能性が示唆された。過去に手術を行った26例の褐色細胞腫については、ホルモン固定パラフィン包理した標本を用い、メチオニン・エンケファリンとロイシンエンケファリンに対して免疫組織化学を行った。その結果、強弱の差はあるものの、すべての褐色細胞腫がエンケファリン陽性であることが判明した。このことは褐色細胞腫がその発生母地である副腎髄質及び髄外クロ-ム親和組織の性質を依然保持していることを示している。組織培養においてはエンケファリンがカテコ-ルアミン分泌に対して抑制的に作用すること、アドレナリン分泌型では発作性高血圧が多いことなどを考え合わせると、生理的条件下においてエンケファリンがアドレナリン分泌に対して調節的役割をしていることを示唆しているものと解釈できる。最近の7例に関しては、手術前、術中、術後に採血し、血中エンケファリン濃度の測定を試みた。採血条件として血清と血漿(クエン酸とアミノペプチダ-ゼ・インヒビタ-であるベスタチンをそれぞれ加えて採血)で行い、同時にカテコ-ルアミンを測定して比較した。ラジオイムノアッセイとしては問題ないという結果が出ているにもかかわらず、いずれの条件下でも血中濃度はあまり高くないということが判明しつつある。これは褐色細胞腫組織中に大量のエンケファリンが含まれていることと、いかにも対照的である。

なお実験を続行し確認を要するが、以上のことはエンケファリンというペプタイドは血中に放出されてホルモンとして作用するのではなく、副腎髄質などの組織中で極めて局所的な作用を営んでいることを示唆するものと考えている。1.褐色細胞腫におけるエンケファリンの免疫組織化学的検討26例の褐色細胞腫摘除標本(ホルマリン固定パラフィン包埋)を用い、メチオニンおよびロイシンーエンケファリンに関して免疫組織化学的検索を行なった。その結果、強弱の差はあるものの、すべての症例の褐色細胞腫がエンケファリン陽性であることが判明した。このことは褐色細胞腫が、その発生母地である副腎髄質あるいは髄外クロ-ム親和組織の性質を依然保持していることを示している。また、ノルアドレナリンよりもアドレナリン分泌型褐色細胞腫において、エンケファリンは強陽性のことが多いことも判明した。また、尿中メタネフリン排泄がこのエンケファリン陽性度と相関が認められることも判明した。2.褐色細胞腫患者における術前・術中・術後の血中エンケファリン動態最近手術を施行した褐色細胞腫患者14例を対象とし、対照群6例とともに、術前・術中・術後の血中ロイシンーエンケファリンと血中カテコ-ルアミンを測定し、比較検討した。褐色細胞腫群患者の血中エンケファリン濃度は、術前・術中においてカテコ-ルアミンとともに対照群と比べ有意に高値を示した。さらにカテコ-ルアミンと同様、術後は低下し、対照群と差を認めなくなった。従来、主に腫瘍中濃度で報告されているように、NA型よりA・NA型,非発作型より発作型のほうが血中でも高値を示す傾向が見られたが、統計学的には術前・術中・術後を通じて有意差を認めなかった。以上のごとくエンケファリンはカテコ-ルアミン放出に密接な関係を持つことが示唆され、血中半減期が非常に短いことを考え合わせると、カテコ-ルアミン分泌に何らかの調節的役割を演じているのではないかと考えられる。また、臨床的重症群と軽症群との間には、術中エンケファリン濃度の変動に関して明らかな差を認め、褐色細胞腫における重症度の指標の手助けになりうる可能性が示唆された。
高齢者福祉問題解決に向けた住民のパワー測定尺度とエンパワメント・アプローチの開発

高齢者福祉問題の解決に向け、地域住民のパワーを高めようとするアプローチが行われているが、その効果については十分に検討されていない。本研究は、地域住民の高齢者を支援するパワーを測定する尺度(地域住民の高齢者支援パワー尺度)を開発すること、その尺度を活用して地域住民のエンパワメント・プログラムを開発することを試みた。地域住民の高齢者支援パワー尺度は、「地域の高齢者福祉に対する影響力意識」と「地域の高齢者福祉問題の共有意識」の2因子による構成概念妥当性および信頼性が確認された。この尺度を活用して、地域住民の立場で地域住民の支援を行っている民生委員を対象に高齢者支援パワーの測定を行い、パワーを高めることを意図したプログラムを実施、評価を試みたところ、プログラムによる尺度得点の有意な影響は認められなかった。平成18年度は,社会調査を実施した.本調査はA県B町在住の20歳から75歳の地域住民16,443人から系統無作為抽出法により1,818件を抽出し調査の対象とし,郵送留置法により実施,調査期間は平成18年11月20日から12月3日,回収件数は1,170件(64.4%),有効回答数は1,121件.調査票には,主観的暮らしやすさ,地域の集まりへの参加,経験,行なったことのある高齢者の生活支援,生活満足度(LSI-K),経済的ゆとり,主観的健康,基本的属性などを採用した.すでに行った分析として,次の結果を報告したい.【分析方法】「高齢者へのサポート提供」の項目について因子分析(主因子法,プロマックス回転)を行い,3因子(日常生活支援,見守りや気遣いによる支援,生活を豊かにする支援)が抽出され,それぞれ従属変数とした.「生活を豊かにする支援」は90%以上の回答者が偏ったため従属変数から除外.独立変数として,「経験(身近で介護が必要になった人がいた,定年退職をした,他)」,基本属性(年齢,性別,永住希望,経済的ゆとり,主観的健康観,職業,他)を投入し,ロジスティック回帰分析を行った.【結果】1.日常生活支援:身近で介護が必要になった人がいた(+),高齢者が困っているところを見た(+),祖父母と同居していた(+),公的サービスの認知(+)が1%水準で,性別(女性)が5%水準で有意という結果であった.2.見守りや気遣いによる支援:身近で介護が必要になった人がいた(+),高齢者が困っているところを見た(+),高齢者福祉や介護、医療などに関する講演会や勉強会に参加した(+),近所の人との井戸端会議をした(+),何か大きな病気やケガをした(+),年齢(+),公的サービスの認知(+)が1%水準で,親しい友人や家族が福祉関係の仕事に就職した(+),性別(女性)が5%水準で有意という結果であった.1.高齢者福祉問題の解決に向けた住民のパワー測定尺度の開発に向け、尺度開発に必要な確証的因子分析について専門的知識の提供を受けた。AMOSによって18年度に収集した調査データの分析を行った結果、高齢者を支援する地域住民のパワーが「地域の高齢者福祉への影響力意識」「地域の高齢者問題の共有意識」から構成され、一定の構成概念妥当性及び信頼性を有していることが示された。この結果から、高齢者を支援する地域住民のパワーの高低の測定に本尺度の合計得点が役立つことが考察された。今後も交差妥当性の検討などを通して尺度の改訂を実施したい。2.高齢者福祉問題の解決に向けた地域住民のエンパワメント・プログラムの開発については、社会福祉協議会の協力を得て地域福祉活動計画策定のプロセスが地域住民のパワーに与えた影響について検討を行った。2地区を選定し、地域福祉活動計画の策定にかかわった地区とかかわらなかった地区にたいして同様の調査票を配布し、郵送調査を行った。先に開発した高齢者を支援する地域住民のパワーの評価尺度の測定を行ったが、有意差は認められなかった。これには、それぞれの地域性が強い影響を与えていると考えられ、調査の対象や方法など再検討を要する。3.特に高齢者福祉問題の影響が大きいと考えられる高齢化率50%以上の集落に生活する一人暮らし高齢者にインタビュー調査を行った。その結果、地域住民からのサポート受領の大きさとサポート提供の継続困難状況が明らかになった。この地域で生活する住民の高齢者支援のパワーについて、今後継続して検討をしていきたい。1.平成18年度・19年度で開発を試みた「高齢者福祉問題の解決に向けた住民のパワー測定尺度」を活用し、エンパワメント・プログラムの開発・評価を試みた。

また、尺度の精緻化を図るべく、尺度項目の見直し及び追加に取り組んだ。2.スケールの活用によるエンパワメント・プログラムの開発・評価については、近隣の地域包括支援センターの社会福祉士と研究会を組織し検討を行った結果、民生委員児童委員のパワー測定及びエンパワメント・プログラムを考案していく必要性が示唆された。そこで、全4市町村の民生委員児童委員協議会において、「高齢者福祉問題の解決に向けた住民のパワー測定尺度」を使用して横断的なアンケート調査を実施した。また、そのうち1市については、4回の縦断的アンケート実施を行い、2回目・3回目に民生委員のエンパワメントに向けたアプローチ(社会福祉士からのプレゼンテーション)を実施し、パワーの変化の測定を試みた。尺度項目の見直し及び追加について、地域の高齢化率50%を超える地域を対象に「高齢者福祉問題の解決に向けた住民のパワー測定尺度」を活用してパワーの測定を試みた。「高齢者福祉問題の解決に向けた住民のパワー測定尺度」に複数の項目を追加した。3.エンパワメント・プログラムの開発について、アンケート調査によって得られたデータの分析を行った結果、各市町村で平均点に差があることが明らかになった。また、縦断的な調査を行った市では、13回目(4回目は集計・分析中)の調査結果において、平均点に有意な差は認められなかった。これらの要因等については、現在検討中である。尺度項目の見直し及び追加については、現在、アンケート調査によって得られたデータを集計・分析中である。これまで行った地域との得点の比較、新しく加えた尺度項目を含む尺度全体の信頼性および妥当性の検討を行う予定である。
自己免疫病発症の分子機構:自己反応性T細胞の制御機構について

正常マウス末梢CD4T細胞の約10%を占めるCD25(IL-2 α鎖)発現細胞を除去すると、ヒトの自己免疫病と免疫病理学的に酷似した様々な病変(胃炎、甲状腺炎、副腎炎、糖尿病、卵巣炎等)が高率に発症し、CD25+細胞を一定期間内に補えば病変発症は阻止される。これは、末梢における自己反応性T細胞の活性化・増殖が、他のT細胞による制御を受けており、その制御機構の破綻は様々な自己免疫病の直接的原因と成りうることを意味する。CD25+T細胞による自己寛容維持の分子的機序およびCD25-T細胞自己免疫病発症機序を解明するため、本年度はサイトカインの関与について検討した。まず、単一リンパ球について約30種のmRNAをRT-PCRで同時に検出する新しい方法を確立した。この方法を用いて胃炎局所に浸潤しているT細胞を解析した結果、約40%の細胞が何らかのサイトカインを産生しており、IL-4/IL-10あるいはIL-2/IFN-gを同時に産生している所謂TH1,TH2タイプのT細胞も検出された。それぞれのタイプについてT細胞抗原レセプター(TCR)Vα/Vβ領域を解析、有意に増加している群について個々のT細胞のTCRV領域の塩基配列を決定した。その結果同一のTCRを発現するT細胞のクローン性増殖が認められた。現在これらのTCR遺伝子をT細胞ラインにトランスフェクションし、それらがどのような自己抗原ペプチドを認識するのか検討している。さらに、正常個体中のCD25陽性T細胞の自己免疫制御能を解析するため、個々のCD25+T細胞が構成的に産生しているサイトカインを検索したところ、IL-4,IL-10,TGF-βが範疇に入ることを見い出した。これらのサイトカインが自己寛容の維持に関与している可能性について現在検討している。
温度環境に依存する性スペクトラム

我々はこれまでにアメリカアリゲーター(Alligator mississippiensis)性決定の温度感受性期における発生時系列トランスクリプトーム解析を実施し、生殖腺分化カスケードの決定など爬虫類の温度依存型性決定(TSD)の分子基盤を構築した。本年度は、アカミミガメ(Trachemys scripta)を用いてde novo RNAシークエンス(RNAseq)解析を実施し、TSDに普遍的に適用できるかを検討した。両者の比較解析の結果、DMRT1など既知の性分化マーカーのほか、KDM6B(ヒストン脱メチル化酵素)などエピジェネティック制御に関わる複数の因子がクサガメとアメリカアリゲーターの温度感受期において共通して変動していることを見出した。さらに、クサガメ(Mauremys reevesii)を対象にTRPチャネルに関連する薬剤の暴露実験を実施し、性分化におけるTRPの寄与の一般性を検証した。その結果、一部のTRPチャネルアゴニストあるいはアンタゴニストを曝露した卵から得られた胚の生殖腺において、性マーカー遺伝子の発現が、オス産生温度あるいはメス産生温度によって予想された性での発現と逆のパターンを示した。さらに少数の個体ではあるが、組織レベルでの性転換も確認された。これらの結果は、温度依存型性決定において、TRPチャネルが普遍的な環境受容因子であることを示唆する。さらに本年度は、未分化生殖腺のメタボローム解析を実施しており、現在トランスクリプトーム解析とともにデータ解析を進めている。カメの温度感受性TRPチャネルの温度感受域はまだ決定できていないものの、薬剤投与実験によって性マーカー遺伝子発現変動を明らかにすることができたため、おおむね順調であると判断した。カメの温度感受性TRPチャネルの温度感受域を電気生理学的に明らかにする。カメ卵への薬剤(TRPチャネルアゴニスト・アンタゴニスト)塗布実験も引き続き行い、カメの性分化に関与するTRP群の全容を明らかにする。カメ同様に温度依存型性決定をおこなうワニなどの結果と比較するほか、トカゲ類(遺伝的性決定と温度依存型性決定を行う種がある)やメダカを含む魚類や両生類(遺伝型性決定を行うが、発生中に温度を人為的に変えることで性転換するものがある)も解析に供し、TRPチャネルを中心とする温度感受性の観点から、環境受容システムが性スペクトラムをどのように動かしうるかの理解を深める。なお、既に魚類やその他の爬虫類(トカゲ類)の飼育を始めている。また、カメの生殖腺のトランスクリプトーム解析及びメタボローム解析について、前年度から引き続きデータ解析をおこなう。両者を関連付けて解析を進めていく予定である。メタボローム解析では、すでに興味深い標的代謝物を見出しており、質量分析計によるより詳細な解析を進めていくほか、その代謝物に関連する薬剤塗布実験をおこなう。さらに今年度は、アデノ随伴ウイルスを用いたin vitro(器官培養)あるいはin ovo遺伝子操作実験系の確立を目指す。本研究はカメ及びワニを始めとする爬虫類の温度依存型性決定をモデルとして、温度環境シグナルを受容した後、そのシグナルがどのように生体内シグナルに変換され、性決定・分化の実行因子が作用するか、性決定過程の全容を明らかにする。複数の動物種の性決定のシグナリングカスケードを比較解析することで、環境依存型性決定の分子機構の包括的な理解を図る。平成29年度はRNAseqの解析を進めた。クサガメはドラフトゲノムが存在しないためTrinityを用いて解析した。その結果、脊椎動物の性決定への関与が示唆されているlysine demethylaseの一種であるKDM6Bや、カミツキガメの性分化への関与が示唆されているcold inducible RNA binding protein (CIRBP)がなどを雌雄産生温度で発現差がある遺伝子として見いだした。また、オスの発生ステージに沿って発現上昇する遺伝子の中には、AMHやDMRT1といった既知のオス性分化遺伝子が含まれていたほか、pantetheinaseと呼ばれるパントテン酸(ビタミンB5)を作り出す遺伝子がA有意に発現変動していることを見出した。我々のグループはこれまでに環境依存型性決定を示すミジンコのオス性決定因子としてパントテン酸を見出しており、カメのオス性決定にもpantetheinaseを介したパントテン酸の蓄積が関与しているのかもしれない。また、各種TRPチャネルのアゴニストあるいはアンタゴニストを温度感受期にあるクサガメの卵に塗布し、その性比の変動を遺伝子マーカーでかいせきしたところ、ある薬剤によって遺伝子マーカーの発現が変動することを見出し、このTPRがカメの温度依存型性決定に関連するTRPタンパクであることが示唆された。カメの雌雄性決定に関与する温度域で活性化されるTRPチャネルについては、in vivoの解析によって同定しつつある。また、トランスクリプトーム解析のランを終え、我々が以前行ったワニのトランスクリプトームとも比較しながら解析を順調に進めている。一方で研究代表者が所属変更することなどもあり、メタボローム解析は顕著な雌雄差を本年度のサンプルでは見出すに至らなかったが、全体としては概ね順調に進展していると判断した。

本年度は、アカミミガメ(Trachemys scripta)を用いてde novo RNAシークエンス(RNAseq)解析を実施し、TSDに普遍的に適用できるかを検討した。両者の比較解析の結果、DMRT1など既知の性分化マーカーのほか、KDM6B(ヒストン脱メチル化酵素)などエピジェネティック制御に関わる複数の因子がクサガメとアメリカアリゲーターの温度感受期において共通して変動していることを見出した。さらに、クサガメ(Mauremys reevesii)を対象にTRPチャネルに関連する薬剤の暴露実験を実施し、性分化におけるTRPの寄与の一般性を検証した。その結果、一部のTRPチャネルアゴニストあるいはアンタゴニストを曝露した卵から得られた胚の生殖腺において、性マーカー遺伝子の発現が、オス産生温度あるいはメス産生温度によって予想された性での発現と逆のパターンを示した。さらに少数の個体ではあるが、組織レベルでの性転換も確認された。これらの結果は、温度依存型性決定において、TRPチャネルが普遍的な環境受容因子であることを示唆する。さらに本年度は、未分化生殖腺のメタボローム解析を実施しており、現在トランスクリプトーム解析とともにデータ解析を進めている。カメの温度感受性TRPチャネルの温度感受域はまだ決定できていないものの、薬剤投与実験によって性マーカー遺伝子発現変動を明らかにすることができたため、おおむね順調であると判断した。昨年度の解析で明らかとなったカメの温度依存型性決定に関与するTRPについて電気生理学実験や、in vivo実験、器官培養実験などを駆使して、詳細な機能解析をおこなう。さらに、カメの様々な発生段階におけるRNA-seq解析のほか、メタボローム解析も行うほか、それらのオミクス解析に基づく機能解析を実施するために、カメの生殖腺から株細胞の樹立を試みる予定である。カメの温度感受性TRPチャネルの温度感受域を電気生理学的に明らかにする。カメ卵への薬剤(TRPチャネルアゴニスト・アンタゴニスト)塗布実験も引き続き行い、カメの性分化に関与するTRP群の全容を明らかにする。カメ同様に温度依存型性決定をおこなうワニなどの結果と比較するほか、トカゲ類(遺伝的性決定と温度依存型性決定を行う種がある)やメダカを含む魚類や両生類(遺伝型性決定を行うが、発生中に温度を人為的に変えることで性転換するものがある)も解析に供し、TRPチャネルを中心とする温度感受性の観点から、環境受容システムが性スペクトラムをどのように動かしうるかの理解を深める。なお、既に魚類やその他の爬虫類(トカゲ類)の飼育を始めている。また、カメの生殖腺のトランスクリプトーム解析及びメタボローム解析について、前年度から引き続きデータ解析をおこなう。両者を関連付けて解析を進めていく予定である。メタボローム解析では、すでに興味深い標的代謝物を見出しており、質量分析計によるより詳細な解析を進めていくほか、その代謝物に関連する薬剤塗布実験をおこなう。さらに今年度は、アデノ随伴ウイルスを用いたin vitro(器官培養)あるいはin ovo遺伝子操作実験系の確立を目指す。
神経細胞死制御標的-14-3-3蛋白/HMGB1/Beclin1-解析

筋萎縮性側索硬化症脊髄前角細胞での14-3-3白eta isoform発現を確認し、リン酸化TDP43との共局在も確認した。リン酸化TDP-43の細胞質移行と前角神経細胞死関与にeta isoformの関連を指摘。脳梗塞急性期虚血コア周辺神経細胞でのHMGB1の細胞質での局在を確認。新規脳梗塞治療法に寄与できる。対照例29例、アルツハイマー病例84例、パーキンソン病例8例、DLB例25例の血液中HMGB1濃度をELISA法で測定。順に、5.4, 6.6, 10.7, 8.1ng/mlで有意に増加。オートファジー関連物質Beclin1の頸動脈病変での発現を確認しオートファジーの関与を指摘した。1血液中および髄液中の14-3-3蛋白各isoform濃度とHMGB1濃度をELISA法にて測定するための血液サンプル27例(アルツハイマー病例15例、パーキンソン病例3例、レビー小体型認知症例5例、脊髄小脳変性症1例、脳梗塞例3例)と髄液サンプル8例(アルツハイマー病例3例、パーキンソン病例1例、レビー小体型認知症例2例、脊髄小脳変性症1例、脳梗塞例1例)の採取を行い測定用にー80°Cで冷凍保存した。正常ボランティア例の血液サンプルを用いHMGB1濃度測定のためのをELISA法の検量線作成を行った。2血管内治療にて回収した血栓の14-3-3蛋白各isoform/HMGB1/Beclin-1での免疫組織化学分析を行うことを計画していたが、回収血栓の組織固定が困難であったため、ろ紙等を用いての回収血栓組織固定手技を確立した。3内頸動脈内膜剥離術8例の組織を用い抗HMGB1抗体を一次抗体として免疫組織化学的検討を行い、その局在様式を明らかにし、蛍光2重染色にてマクロファージの標識物質であるCD68との共局在を検討し、「頸動脈プラーク内のCD68陽性細胞では染色性には差があるが全細胞でHMGB1陽性」、「CD68はマクロファージが大きくなるほど高発現となり、HMGB1は50-150μmのマクロファージ(中間大)で最も発現」の結果をえたので現在投稿論文作成中。4脳卒中剖検例(脳梗塞例、出血性梗塞例、脳出血例、くも膜下出血例)を、HMGB1抗体を一次抗体として免疫組織化学的検討を行い、その局在様式を明らかにし、蛍光2重染色にてマクロファージの標識物質であるCD68との共局在を検討し、日本脳卒中学会学術集会にて発表した。神経細胞死と14-3-3蛋白の関連として、筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角細胞での14-3-3白eta isoform発現をヒト剖検脳で確認した。そして、筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角細胞死に重要と考えられているリン酸化TDP43とeta isoformの共局在も確認した。そしてリン酸化TDP-43が核より細胞質に移行し前角神経細胞死に関与する課程に14-3-3蛋白eta isoformが重要な働きをになう可能性を考察した。現在論文投稿中。また、筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角細胞14-3-3蛋白とHMGB1との共局在を検討中。アルツハイマー病、レビ-小体型認知症、パ-キンソン病例の血漿成分の凍結サンプルの収集が終了した。ELAISA法による血中HMGB1濃度測定を継続中。脳梗塞急性期の虚血コア周辺の神経細胞でのHMGB1の細胞質での局在を確認した。現在抗HMGB1中和抗体による脳梗塞治療の可能性がアニマルモデルの結果より指摘されている。われわれの結果は、虚血コア周辺の神経細胞の生存補助としての、この新規脳梗塞治療法のヒトでの研究に対して橋渡し研究として寄与できる。現在論文作成中。以前に脳梗塞と14-3-3蛋白の関連性はすでに論文として発表しているが、ヒト脳梗塞急性期のHMGB1と14-3-3蛋白の相互作用を念頭においた共局在について現在検討中。オートファジー関連物質であるBeclin1の頸動脈硬化病変での発現を確認に、マクロファージと形質転化した血管平滑筋細胞に局在していることを確認した。すでに、14-3-3蛋白とHMGB1蛋白の同部位での局在はは論文にしており、3物質の共局在を現在確認中。HMGB1のELISA測定において検量線の策定で再検討が必要となり、測定が予定期間内に終了していない。ただし現在は問題は解決しており、本研究期間内には全サンプルの解析が可能である。血管内治療症例が予定より少なく、治療血管内血液サンプル採取の確保が遅れている。Brain Researchに掲載された。

現在抗HMGB1中和抗体による脳梗塞治療の可能性がアニマルモデルの結果より指摘されている。われわれの結果は、虚血コア周辺の神経細胞の生存補助としての、この新規脳梗塞治療法のヒトでの研究に対して橋渡し研究として寄与できる。論文投稿し、査読に対しての修正後論文を再投稿中。オートファジー関連物質であるBeclin1の頸動脈硬化病変での発現を確認に、マクロファージと形質転化した血管平滑筋細胞に局在していることを確認した。さらにBeclin1と14-3-3蛋白、およびBeclin1とHMGB1蛋白の同部位での局在が確認できた。現在は論文作成中。脳血管障害におけるHMGB1の局在様式の論文を作成し投稿したが、動物実験での結果と異なる点も多く、それが今回の成果と考え強調したが、査読者より強い反発があり、追加研究と論文修正に予定外のエフォートを必要とし、研究全体の進行が遅延した。現在は最終原稿を投稿中。HMGB1のELISA測定において検量線の策定で再検討が必要となり、測定が予定期間内に終了しなかったが、ただし現在は問題は解決しており、全サンプルの解析がほぼ終了した。現在は結果の解析中。血管内治療症例が予定より少なく、治療血管内血液サンプル採取の確保が遅れている。最終年度に実施した研究の成果対象例、AD例、PD例、DLB例の血液中HMGB1濃度をELISA法にて再検定した。頸動脈硬化病変でのBeclin1・14-3-3蛋白・HMGB1蛋白の局在を確認した。血管内治療の回収血栓の、アテローム動脈硬化巣よりの血栓、心原性塞栓の判定を行った。組織を14-3-3蛋白各isoform/HMGB1/Beclin-1で免疫組織化学を行った。少数例でHMGB1陽性所見を認めた。研究期間全体を通して実施した研究の成果神経細胞死と14-3-3蛋白の関連で、筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角細胞での14-3-3白eta isoform発現を確認。リン酸化TDP43とeta isoformの共局在も確認。pTDP-43が核より細胞質に移行し前角神経細胞死に関与する過程にeta isoformの関与を指摘した。Brain Researchに掲載。脳梗塞急性期の虚血コア周辺神経細胞でのHMGB1の局在を確認。抗HMGB1中和抗体による脳梗塞治療が注目されている。橋渡し研究として寄与できる。Histology and Histopathologyに掲載。対象例29例、AD84例、PD8例、DLB25例の血液中HMGB1濃度をELISA法で測定した。順に、5.4, 6.6, 10.7, 8.1ng/mlでパーキンソン病例とレビー小体型認知症例で有意に増加していた。オートファジー関連物質Beclin1の頸動脈硬化病変で、マクロファージと血管平滑筋細胞に局在を確認。14-3-3蛋白/HMGB1/Beclin-1の局在を確認。血管内治療にて回収血栓の組織固定が困難で、ろ紙を用いた組織固定手技を確立。脂肪組織含有アテローム硬化巣血栓と、含まれない心原性塞栓と判定した。血栓形成にHMGB1の関与が示唆された。筋萎縮性側索硬化症脊髄前角細胞での14-3-3白eta isoform発現を確認し、リン酸化TDP43との共局在も確認した。リン酸化TDP-43の細胞質移行と前角神経細胞死関与にeta isoformの関連を指摘。
ARMSと発達障害特性を中間表現型とした統合失調症大家系の遺伝子解析

本研究で我々は、統合失調症のrare-risk variantを同定することを目標として、統合失調症の多発大家系を対象として、遺伝学的解析を行った。統合失調症多発大家系に属する10名に全エクソン解析を行った。同定された2つの候補遺伝子に関して、統合失調症288名、健常者419名のtarget sequencingを行った。その結果、候補遺伝子はGene Aだけに絞られた。Crispr-cas9にて作成した遺伝子改変マウス(Gene Aのノックインマウス)の行動解析を行った。行動解析の結果、遺伝子改変マウスは活動性が低いまたは運動機能が減衰している可能性が示された。我々は大統合失調症家系の詳細な解析により、家系特異的なエフェクトサイズの比較的大きな遺伝子を絞り込み、統合失調症の病因解析について次の一歩を踏み出すことを研究の目的としている。現時点で、我々は、長崎県内で、3世代で統合失調症関連障害の家系メンバー13人を含む大家系を発見している。これは全国的にも最大規模の家系と思われる。現時点で家系メンバー10名の採血、DNA抽出を終えている。統合失調症とその関連障害について、その発症脆弱性にかかわる遺伝子を同定するため、我々は統合失調症大家系に対して、次世代シーケンサーillumina HiSeq2500を用いたエクソーム解析を行った。現在我々は、統合失調症発症脆弱性にかかわる可能性のある遺伝子として2つの遺伝子(Gene A、Gene Bとする)を同定している。Gene Aではwild typeではC/Cとなる遺伝子多型が、家系内の統合失調症罹患者ではC/T、非罹患者ではC/Cで一致していた。またGene Bでは同様に統合失調症罹患者ではA/G、非罹患者ではA/Aであった。Gene Aに関しては、神経細胞の分化にかかわる機能を持つことがわかっており、機能的にも統合失調症発症脆弱性に関係している可能性が考えられた。今後はできるだけ多くの統合失調症罹患者/非罹患者を対象として、関連研究を行い、これらの2つの遺伝子が統合失調症の発症に関連している可能性を検討する予定である。また家系内の自閉スペクトラム症を持つ対象者についても検討を続ける予定である。統合失調症の患者が多発する3世代の大家系から、罹患者・非罹患者それぞれから血液を採取しDNAを採取した。採取されたDNAを用いて全エクソン解析をおこない、候補遺伝子の選定を行った。結果として2つの遺伝子の2変異が選定された。統合失調症発症発症における関与を解析するため、多検体解析を行った。SeqCap EZ Library SRシステムを用いて上記2遺伝子全体(exon/intron全体を含む)をカバーするDNA濃縮キットを作製し、統合失調症288名、健常対照群419名を用いて解析を行った。1つの変異に関しては健常対照群で2名同様の変異をもつsampleが確認され、統合失調症サンプルにおいては変異を持つsampleは確認されなかった。そのため、病原性をもたないpolymorphismと考えられ、候補遺伝子から除外することとした。一方の変異に関しては、解析したすべてのサンプルにおいて確認されなかった。また関連解析の結果、この変異は統合失調症と関連があるものと考えられた。上記結果より、本家系における最終的なrare candidate mutationとして一つの変異が同定できており、今後機能解析を進めていく予定である。関連解析の結果、2つの候補遺伝子が1つに絞ることができているため。平成28年度は、mutation2を含むGene Xの成長・発達、並びに脳機能に与える影響を解析するため、Gene Xのノックアウトマウス(Gene X KO mouse並びに本家系と同一の変異を導入したノックインマウス( mutation2 KI mouse)の作成を計画した。Methodとしては以下の通りである。1mutation2の周辺領域にgRNA並びにmutation 2を導入した1本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)を設計、2TracrRNAとcrRNAならびに上記gRNA/ssODNをC57BL/6受精卵にマイクロインジェクション法により導入、3受精卵をレシピエントマウスに移植、4出生した仔マウスよりDNA抽出し、Sanger法にて変異導入を確認。予想以上にマウスの作成に時間がかかった。解析に必要な頭数まで繁殖させることについても時間がかかっている。平成28年度までの進捗状況として、統合失調症多発家系よりDNA採取、Hiseq2500(illmina)を用いてWhole-exome-sequence行い、本家系におけるpathogenic substitutionsを検索した。上記解析により、当家系におけるcandidate subsections(患者特異的変異)として2 SNVs(mutation 1, mutation2)が検出された。長崎県内の統合失調症患者277名、コントロール429名より検体を収集し、上記変異の頻度を解析した。結果として、mutation1はコントロール群のみ2名にて検出され、mutation2はコントロール群・統合失調症群共に検出されなかった。家系情報からは、本家系におけるpathogenic substitutionsは高いphenotypic effectを持つことが予想され、そのような変異のHaplotype Allele Frequency(HAF)は一般集団においても極めて低頻度であることが予想された。そのため、本家系におけるcandidate SNVsとしてはmutation2が適当であると考えられた。