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危険度レベル3に属する炭疽,ブルセラ症の診断および予防法に関する研究

病原細菌は危険度に従いレベル1から3に区分されているが、我国では危険度3以上の感染症の発生は激減し、ほとんど起きていない。そのため、レベル3の感染症が我国で発生した場合、その検査法や治療法などで大混乱が起きるのは必至である。さらに、世界規模で新興・再興感染症の発生が大きな問題として取り上げられ、その予防・診断面での対策および疫学調査の重要性が認識されている。特に問題となるのは人畜共通感染症で、それらの正確な診断・予防法の確立は、ヒトや動物のみならず安全な食料確保という点で、公衆衛生上重要である。本研究では、炭疽およびブルセラ症に焦点を当て、疫学調査研究およびワクチン開発を行った。野外における実用性を検討するため、モンゴル農業大学との共同研究を実施した。I.炭疽菌の迅速検出法の確立、炭疽菌の遺伝子型別、ワクチン開発我々は炭疽菌のPCR法による迅速同定法を確立し、特に土壌中の他の芽胞菌の混入、PCR反応阻害物質の混入などの試料のPCRに適した処理方法を確立した。更に、リアルタイムPCRによる迅速化を可能にし、この方法をモンゴル国の土壌をサンプリングし、応用可能であることを実証した。また、炭疽菌からDNAを分離精製し、ランダムPCR等の遺伝子型別を実施し、炭疽菌の遺伝子の安定性を確認した。また、炭疽菌の現行のワクチンは弱毒生や死菌ワクチンであるが、効果が出るまでに時間がかかり副作用も強く、一部の動物に毒力を保有している。そこで、安全で有効な防御抗原を用いた新たなワクチンの開発を企画した。実際には乳酸菌を用いたワクチンを作製したが、応用には至っていない。II.ブルセラの早期診断法の確立ブルセラの診断はWidal反応により行われるが、交叉反応が強く、陽性でも確定診断には至らない。そこで、ザルコシン抽出液を用いた迅速かつ正確な診断法を確立した。実際にモンゴルで応用し、実用化する予定である。1.炭疽菌の迅速検出法の確立:炭疽菌のヒトや動物への感染源は大気、肉類、土壌である。細菌感染症のうち、最も急性経過をとり宿主を死に至らしめる伝染病であるために迅速な診断法が必要である。今年度PCRを用いらた迅速検出法を確立した。しかし、大気及び肉からは僅かの混入炭疽菌の分離は出来たが、土壌から困難であった。我国では炭疽の発生が無いことから、今年度は共同研究国モンゴルでの炭疽の発生実態を現地で調べ、炭疽の検出方法の実際への応用について検討をした。2.炭疽菌のワクチン開発の試み:炭疽菌の現行のワクチンは弱毒生ワクチンもしくはその死菌ワクチンであり、それぞれ動物および人に使用されている。しかし、防御効果が出るまでに時間がかかり副作用も強い。さらには一部の動物には毒力を保有している。そこで、安全で有効な防御抗原を用いた成分ワクチンの開発を企画した。実際には防御抗原の遺伝子を高発現系を用い、発現する結果を得た。大量発現可能かについて今後検討する。3.ブルセラの早期診断法の確立:ブルセラの診断は通常Widal反応により行われるが、Yersinia pseudotuberculosisの血清型9との交叉反応が強く、陽性でも確定診断には至らない。そこで、モノクローナル抗体による検出系およびPCR法による特異的診断技術を確立する。

今年度は、ブルセラ症発症家畜の血清を用いて、現地でワクチン接種家畜血清との反応性の差を確認した。さらに、現在ブルセラ特異的外膜蛋白を遺伝学的に単離した。ブルセラ特異的かが今後の課題である。I.炭疽菌の迅速検出法の確立:炭疽菌のヒトや動物への感染源は大気、肉類、土壌である。細菌感染症のうち、最も急性経過をとり宿主を死に至らしめる伝染病であるために迅速な診断法が必要である。今年度PCRを用いた迅速検出法を確立した。しかし、大気及び肉からは僅かの混入炭疽菌の分離は出来たが、土壌から困難であった。我国では炭疽の発生が無いことから、今年度は共同研究国モンゴルでの炭疽の発生実態を現地で調べ、炭疽の検出方法の実際への応用について検討をした。II.炭疽菌のワクチン開発の試み:炭疽菌の現行のワクチンは弱毒性ワクチンもしくはその死菌ワクチンであり、それぞれ動物および人に使用されている。しかし、防御効果が出るまでに時間がかかり副作用も強い。さらには一部の動物には毒力を保有している。そこで、安全で有効な防御抗原を用いた成分ワクチンの開発を企画した。実際には防御抗原の遺伝子を高発現系を用い、発現する結果を得た。大量発現可能かについて今後検討する。III.ブルセラの早期診断法の確立:ブルセラの診断はWida1反応により行われるが、Yersinia pseudotuberculosisの血清型9との交叉反応が強く、陽性でも確定診断には至らない。そこで、モノクローナル抗体による検出系およびPCR法による特異的診断技術を確立する。病原細菌は危険度に従いレベル1から3に区分されているが、我国では危険度3以上の感染症の発生は激減し、ほとんど起きていない。そのため、レベル3の感染症が我国で発生した場合、その検査法や治療法などで大混乱が起きるのは必至である。さらに、世界規模で新興・再興感染症の発生が大きな問題として取り上げられ、その予防・診断面での対策および疫学調査の重要性が認識されている。特に問題となるのは人畜共通感染症で、それらの正確な診断・予防法の確立は、ヒトや動物のみならず安全な食料確保という点で、公衆衛生上重要である。本研究では、炭疽およびブルセラ症に焦点を当て、疫学調査研究およびワクチン開発を行った。野外における実用性を検討するため、モンゴル農業大学との共同研究を実施した。I.炭疽菌の迅速検出法の確立、炭疽菌の遺伝子型別、ワクチン開発我々は炭疽菌のPCR法による迅速同定法を確立し、特に土壌中の他の芽胞菌の混入、PCR反応阻害物質の混入などの試料のPCRに適した処理方法を確立した。更に、リアルタイムPCRによる迅速化を可能にし、この方法をモンゴル国の土壌をサンプリングし、応用可能であることを実証した。また、炭疽菌からDNAを分離精製し、ランダムPCR等の遺伝子型別を実施し、炭疽菌の遺伝子の安定性を確認した。また、炭疽菌の現行のワクチンは弱毒生や死菌ワクチンであるが、効果が出るまでに時間がかかり副作用も強く、一部の動物に毒力を保有している。そこで、安全で有効な防御抗原を用いた新たなワクチンの開発を企画した。実際には乳酸菌を用いたワクチンを作製したが、応用には至っていない。
炭素-塩素結合切断を鍵とする高選択的有機合成反応の開発

1)1-クロロシクロプロパンカルボン酸エステルのSmI_2によるReformatsky型反応(Org.Lett.2008,10,5453.)を見いだした。すなわち、ジクロロシクロプロパンのラジカル的ホルミル化反応の生成物をエステルに変換し、2つ目のC-Cl結合を高立体選択的にC-C結合へ変換することを達成した。これによりジクロロシクロプロパンの2つのC-Cl結合を高立体選択的にC-C結合へ変換する数少ない合成例を示すことができた。また、同様の反応中間体を利用して、2つ目のC-Cl結合を高立体選択的にアルキル化およびC-シリル化できることも見いだし、O-シリル化ではなくC-シリル化のみが進行する数少ない例を示すことができた。(Chem.Lett.2009,38,1078.)2)さらに、1)の反応の生成物にSc(OTf)_3を作用させると環拡大反応が速やかに進行し、ジヒドロナフタレンを与えるアリールヒドロキシメチルシクロプロパンカルボン酸エステルの環拡大反応(Chem.Lett.2010,39,194.)を見いだした。3)6'-Methoxyretrojusticidin B(Procumphthalide Aの構造として提案されていた構造)の全合成(Synlett 2010,15,2275.)を達成した。その結果、報告されていた構造(6'-Methoxy-retrojusticidin Bに相当する)が誤りで、天然物の真の構造は5'-methoxy-retrochinensinに相当することを明らかにした。1)ジクロロシクロプロパンの高立体選択的C-Cl結合変換反応の開発ジクロロシクロプロパンの高立体選択的ラジカル的アシル化反応すなわち、1段階目のC-Cl結合のアシル化反応(Org. Lett. 2007, 9, 563.)により得られる1-クロロシクロプロパンカルボン酸エステルのSmI_2によるReformatsky型C-C結合形成反応を見いだした(Org. Lett. 2008, 10, 5453.)。すなわち、ジクロロシクロプロパンの2つのC-C1結合の高立体選択的なC-C結合への変換反応を達成することができた。C-Cl結合はC-Br結合に比べ切断しにくく、ジクロロシクロプロパンのジクロロ炭素上の高立体選択的C-C結合変換は殆ど報告されていない点で、学術的にも非常に重要な成果である。有機合成化学的手法を用いて反応機構も詳細に解明しつつある。2) α-クロロエステルのReformatsky型C-C結合形成反応研究代表者はα-ブロモエステルのSmI_2による分子内Reformatsky型環化を鍵反応とするテオペデリンの最初の全合成を達成したが、これらの知見をさらに発展させ、α-クロロエステルの分子間Reformatsky型C-C結合形成反応を検討した。1)の2段階目の反応は、シクロプロパン環上の歪んだsp^3炭素のReformatsky型C-C結合形成反応と言えるが、得られた知見を一般的なsp^3炭素上へ展開したところ、銅触媒を用いることで立体的に込み合った系で収率が向上することが分かった。従来法では合成できなかった有機化合物を効率的に合成できることを示した。1)ジクロロシクロプロパンの高立体選択的C-Cl結合変換反応の開発2)光学活性ジクロロシクロプロパンの特徴を生かした不斉変換ipso-型ベンズアヌレーション申請者らが見いだした不斉変換ベンズアヌレーション(J.Am.Chem.Soc.2004,126,5358-5359.)ならびに、極最近見いだした異常な高位置選択的ipso-型ベンズアヌレーションの二つの反応をさらに展開した。昨年度は、これらの反応の詳細な反応機構の解明を行い、一般性について検討した。これらについては現在投稿準備中である。

さらに、2)の反応を鍵反応としてProcumphthalide Aの最初の全合成を達成した(現在投稿準備中)。また、コンピュータによる軸不斉構造の計算も行った。4)ジクロロシクロプロパンの特徴を生かしたジヒロドナフタレンの合成Sc(OTf)3を用いることによりエステル官能基を有するシクロプロパンカルボン酸エステルの環拡大反応が進行し、ジヒドロナフタレンを高収率で与えることを見いだした。(Chem.Lett.2010,39,194-195. open accessarticle.)この反応を鍵反応として不斉転写を含むジヒドロナフタレンリグナンラクトンの全合成へ応用できる。aryl(aryl^1)-2,2-dichlorocyclopropylmethanolの高位置選択的ベンズアヌレーションを鍵反応とする6'-methoxyretrojusticidin B(1) (procumphthalide Aとして報告された構造^1)の全合成を達成した。合成した6'-methoxyretrojusticidin Bの^1H-NMRとprocumphthalide Aの^1H-NMRを比較すると著しく異なることが分かった。6'-methoxyretrojusticidin Bの10H及び7'Hはジェミナルカップリングをしている点からも非対称で、6'-methoxyretrojusticidin Bには軸不斉が存在し、また、B3LYP/6-31G(d)レベルでの計算結果からも、28.4kcal/molの回転障壁があり.常温で軸不斉が存在することをが分かった。スペクトルの詳細な検討の結果、procumphthalide Aの真の構造は、報告されていた6'-methoxyretrojusticidin Bではなく、5'-methoxyretrochinensin(以前に我々のグループでも合成した化合物)であることを解明した。2)シクロプロパンの高位置選択的開裂-環拡大反応を鍵とするジヒドロナフタレンリグナンラクトン天然物の全合成Sc(OTf)_3を用いることによりエステル官能甚を有するシクロプロパンカルボン酸エステルの環拡大反応が進行し、ジヒドロナフタレンを高収率で与えることを見いだした(Chem.Lett.2010,39,194-195.open access article.)この反応を鍵反応として不斉転写を含むジヒドロナフタレンリグナンラクトンの全合成を検討し、3,4-ジメトキシベンズアルデヒドを出発原料とし、シクロプロパンカルボン酸メチルエステルのジヒドロナフタレンへの変換を鍵段階とすることで、8段階、全収率20%での1ーアリール-1,2-ジヒドロナフタレン系天然物Cyclogalgravinの新規全合成を達成した。さらに、同様の反応を利用するTrilobatin AおよびBのジヒドロナフタレンセグメント合成を達成した(投稿準備中)。
カロチノイド合成関与遺伝子を用いた光合成細菌の分類体系の再編

光合成細菌と非光合成細菌との進化的関係を明らかにし、αProteobacteriaの光合成細菌の分類学的再編を目的に、イソプレノイド合成系酵素、Farnesyl diphosphate synthase(FPPS)に注目し、本酵素をコードする遺伝子を決定し、分子系統解析を行った。紅色非硫黄光合成細菌Rhodobacter属、Rhodovulum属、Rhodopsudomonas属、これら光合成細菌と16S rDNAの近縁性が示唆されている非光合成細菌Agrobacterium ferginum、Bradyrhizobium属、さらに、同じくαProteobacteriaに属する根粒形成菌Rhizobium属、Shinorhizobium属、Mesorhizobium属、さらにAgrobacteirum属についてFPPS遺伝子の塩基配列を決定した。データバンク上のFPPS遺伝子も含めて分子系統解析を行った結果、下記のことが明らかとなった。1)FPPS遺伝子は16S rDNA.とほぼ同様の系統進化を辿っており、2)16S rDNAlこ比べて、進化速度が非常に速い。3)そのことより、FPPS遺伝子は、科以下の階層の分類に有効な分子マーカーとなりうる。4)Rhodobacter属とRhodovulum属とAgrobacterium ferginumとの近縁関係は、FPPS遺伝子からも示唆された。5)Rhodopseudomonas属とBradyrhizobium属との近縁関係は、FPPS遺伝子からは示されず、この点において、16S rDNAの結果とは異なる。6)根粒菌は2種類のFPPSを有している可能性が示唆され、根粒菌に特有のFPPSは共生プラスミドもしくは共生領域に存在することを明らかにした。このことより、根粒形成能の水平移動説を支持する結果を得た。以上のことより、αProteobacteriaの光合成細菌の分類体系は一つの科には統合するべきではなく、16S rDNAではその近縁性が示唆されているRhodopseudomonas属とBradyrhizobium属は別属として扱うべきであると考えられた。また、根粒形成菌に共通したFPPSホモログが見つかったことから、根粒形成能との関連について今後、新規イソプレノイド化合物の発見が期待できる。紅色非硫黄光合成細菌であるRhodobacter capsulatusとRba.sphaeroidesが有するFPP合成酵素遺伝子をクローニングした。さらに、これら2種以外のαプロテオバクテリアのFPP合成酵素を特異的に増幅するプラーマーを設計し、その他光合成細菌と分子系統学的にその類縁性が示唆されているAgrobacterium feruginumと大豆マメ科根粒菌についてFPP合成酵素遺伝子のPCR増幅を行い、それらの塩基配列を決定した。得られた塩基配列に加え、遺伝子バンクに登録されている塩基配列およびアミノ酸配列との比較、ならびに分子系統解析を行った。その結果、ほぼ16S rDNAに基づく系統関係と一致したが、一部異なっていた。αプロテオバクテリアにおいて、光合成細菌のFPP合成酵素は、非光合成細菌のそれとは異なる分子系統をなしていることを明らかにした。特に、Rhodopseudomonas palustrisのFPP合成酵素遺伝子は、根粒形成菌であるBradyrhizobiumと全く系統が異なり、根粒形成菌においてfirst-growing typeとslow growing typeのFPP合成酵素は起源が同じである可能性が示唆された。これは、根粒形成菌の根粒形成能が水平移動によってもたらされた可能性とあわせて、FPP合成酵素の水平移動の可能性も示唆された。しかし、FPP合成酵素は細菌にとって必須遺伝子の一つであり、それが水平移動するということについてそのメカニズムはさらに興味深い。近年分類学において、細菌の分類は、16S rRNA(DNA)による分子系統解析の結果に大きく依存しているが、16S rDNAは全DNAの一部にすぎない。FPP合成酵素やその他遺伝子の分子系統解析を比較検討することにより、系統関係や細菌の進化を明らかにし、それを分類体系に反映されるべきであるという結論を得た。

このことより、根粒形成能の水平移動説を支持する結果を得た。以上のことより、αProteobacteriaの光合成細菌の分類体系は一つの科には統合するべきではなく、16S rDNAではその近縁性が示唆されているRhodopseudomonas属とBradyrhizobium属は別属として扱うべきであると考えられた。また、根粒形成菌に共通したFPPSホモログが見つかったことから、根粒形成能との関連について今後、新規イソプレノイド化合物の発見が期待できる。
常時大気自由振動の検出と地球・大気系常時自由振動論の展開

未発見の常時大気自由振動の検出を試みるために、昨年度までに東大千葉演習林の南北方向にのびる林道に沿って低消費電力型の超高精度気圧測装置20台、直行方向に7台を等間隔に設置し十字アレーを完成させた。現在、これらは順調に稼動しており、2-3ヶ月に1度データ回収と稼動状況のチェックを兼ねて現地を訪れ観測を継続して、観測データを収集した。そこで本研究では,収集した気圧計アレーのデータを解析し、長周期大気音波の検出およびその分散の測定を試み、3種類の大気波動(1)大気重力波(5mHz),(2)長周期大気音波(0.010.1Hz),(3)音波の脈動(0.10.5Hz)の検出に成功した。特に長周期大気音波は正の分散を示しており,位相速度は0.1Hzで400m/s程度,0.01Hzでは1500m/sに達していることが分かった.つまり0.1Hz付近で音波は水平方向に伝播しているが,0.01Hz付近の音波は鉛直に近い角度で伝播していることが分かる.そのため長周期になるほど,観測された音波はリーキーであると考えられる.また固体地球と共鳴している音波(3.7mHz 4.4mHz)はアレーのスケールが小さ過ぎるため,大気重力波など他の現象と分離することができず検出にはいたらなかった。長周期大気音波の励起源として有力なのは山岳地域の大気乱流である[Bedard,1978].山岳地域起源の音波は,(1)0.015Hzから0.04Hzの帯域で観測され,(2)その位相速度は350m/sから400m/s程度であり,(3)持続時間は3時間程度で,(4)到来方向は変化せず,(5)冬に振幅が大きいという特徴を持つ.これらの結果は今回の観測と調和的である。また観測期間中、火山噴火に伴う周期5秒程度の低周波音波発生イベントや、十勝沖地震に伴う気圧変動や火球に伴う衝撃波などのイベント記録の収録にも成功した未発見の常時大気自由振動の検出を試みるために、昨年度までに東大千葉演習林の南北方向にのびる林道に沿って低消費電力型の超高精度気圧測装置20台、直行方向に7台を等間隔に設置し十字アレーを完成させた。また観測期間中、火山噴火に伴う周期5秒程度の低周波音波発生イベントや、十勝沖地震に伴う気圧変動や火球に伴う衝撃波などのイベント記録の収録にも成功した今年度、常時地球自由振動の励起源の探索と未発見の常時大気自由振動の検出とを目的として、地球自由振動帯域における大気圧変動の高分解能アレー観測のための計測システムを開発した。今後、人工擾乱がなく、且つ風による動圧擾乱を木々が有効に軽減する絶好の観測サイトである東大農学部千葉演習林に南北10km、東西5kmに0.5km感覚で高分解能気圧計を展開する。演習林内ではAC電源は取ることができないため、バッテリー駆動による現地収録型システムである。観測システムについて周波数1-10mHzの帯域における高分解能気圧変動観測を目指し、センサーには気圧変化に敏感な水晶振動子の周波数を出力するパロサイエンティフィック社のMODEL216B-250を採用した。記録計は適当な市販品がないため自作設計した。その概要はつぎの通り:(a)センサーは圧力測定用水晶と温度測定用水晶を内臓しそれぞれの発振パルス(約35kHz及び147kHz)を出力する。本記録計では出力された2種のパルスの周波数から温度補正して気圧をもとめるため高精度で測定できる。周波数から気圧値を求める作業は研究室でパソコンを用いて行う。

(b)記録計は超高精度基準クロック(10MHz,0.1ppm,TEMEX社QEM77)を内臓し、出力パルスの第0番目/n番目の立ち上がりと、1/nカウンターのゲートのON/OFFの同期を高精度で制御し、ゲートON期間中の基準クロックのパルス数を1パルス(50nsec幅)以下の誤差でカウントする。サンプリング時間(=ゲートON+待機時間)は0.1s,1s,10sの3種とし、待機時間が最小となるようにn値を手入力する(10sの場合の分解能は約0.01ppm)。(c)コンパクトフラッシュに書き込むデータフォーマットは、時刻ラベルなどのヘッダ情報を含んだ4Kバイト固定長ブロック。(d)サンプリング速度1sの場合で全消費電流は35mAh以下、DC12Vのエアアルカリ電池により約10,000時間駆動、128MBコンパクトフラッシュで40日以上記録。本計画の目的は、1,常時地球自由振動の励起源としての大気擾乱の性質を明らかにし、2,未発見の常時大気自由振動の検出を試みることにある。このため昨年度末、東大千葉演習林の南北方向にのびる林道に沿って、低消費電力型の超高精度気圧測装置20台を等間隔にアレーとして設置した。本年度はそれに続き、7台の気圧計を直行方向に展開し、十字アレーを完成させた。また別途科研費により購入した超音波風速計を十字アレーの基点(交流電源使用可)に設置し連続観測を開始した。回収したデータを、波動現象に注目して解析した。解析によって同定された波動は大きく3種類に分類できる。(1)周期約5秒の音波の脈動が、南東方向から到来していることが明らかになった。観測された脈動の振幅は近傍の海洋波浪に強く影響されおり、脈動の起源は海洋波浪であると考えられる。(2)北東方向から到来する周期50秒程度の音波を検出した。観測された音波は常に励起されている。その励起源は現在のところ分かっていない。(3)局所的な構造を反映した重力波が北西方向から到来していることがわかった。その活動は局所的な大気の成層度に強く依存している。また観測期間中、火山噴火に伴う周期5秒程度の低周波音波発生イベントを観測した。このイベントは愛知教育大学キャンパスにあるパイプアレー観測システムにも記録されていた。それぞれの観測点で観測された音波の野到来方向、到来時刻から桜島の噴火イベントを検地していたと推測される。未発見の常時大気自由振動の検出を試みるために、昨年度までに東大千葉演習林の南北方向にのびる林道に沿って低消費電力型の超高精度気圧測装置20台、直行方向に7台を等間隔に設置し十字アレーを完成させた。現在、これらは順調に稼動しており、2-3ヶ月に1度データ回収と稼動状況のチェックを兼ねて現地を訪れ観測を継続して、観測データを収集した。そこで本研究では,収集した気圧計アレーのデータを解析し、長周期大気音波の検出およびその分散の測定を試み、3種類の大気波動(1)大気重力波(5mHz),(2)長周期大気音波(0.010.1Hz),(3)音波の脈動(0.10.5Hz)の検出に成功した。特に長周期大気音波は正の分散を示しており,位相速度は0.1Hzで400m/s程度,0.01Hzでは1500m/sに達していることが分かった.つまり0.1Hz付近で音波は水平方向に伝播しているが,0.01Hz付近の音波は鉛直に近い角度で伝播していることが分かる.そのため長周期になるほど,観測された音波はリーキーであると考えられる.また固体地球と共鳴している音波(3.7mHz4.4mHz)はアレーのスケールが小さ過ぎるため,大気重力波など他の現象と分離することができず検出にはいたらなかった。
CXCL12-CXCR4経路を介した新規褐色脂肪活性化メカニズムの解明

褐色脂肪細胞は、ブドウ糖や脂肪酸をエネルギー基質として非ふるえ熱産生をする臓器である。本研究で我々は、CXCL12-CXCR4が新規の褐色脂肪細胞活性化因子の一つであることを明らかにした。褐色脂肪細胞特異的にCXCR4を欠損したマウスにおいて、高脂肪餌を与えると糖代謝を悪化させた。また、褐色脂肪培養細胞に対してCXCL12を添加すると、褐色脂肪細胞活性化マーカーであるUCP-1とPGC-1aが有意に増加し、脂肪合成関連と脂肪酸取り込み遺伝子の増加を認めた。以上のことより、CXCL12-CXCR4経路は、褐色脂肪活性化に関与し生体内では糖代謝に影響を与える可能性がある。糖尿病、脂質異常症の増加を防ぐためには、肥満の解消が効果的である。減量を促す治療戦略の点から、エネルギー消費が有効であることから、熱産生臓器である褐色脂肪細胞が注目されている。我々は褐色脂肪細胞活性化の新規因子としてCXCL12-CXCR4経路を見出した。これまで、不死化した褐色脂肪培養細胞を用いた実験のみであっため、より整体に近い褐色脂肪初代培養細胞を用いて、CXCL12ペプチドを濃度、作用時間を変えながら添加実験を行った。褐色脂肪細胞活性化マーカーであるUCP-1の遺伝子発現がCCL12添加により増加したことを確認した。発現上昇のピークはCXCL12の濃度が50nM、作用時間は4時間であった。CXCL12が褐色脂肪細胞を活性化することは確認できたが、もう一つの脂肪細胞である白色脂肪細胞のベージュ化(褐色脂肪細胞の性質を持つ)に関してはCXCL12の作用が不明である。したがって、白色脂肪初代培養細胞を用いて、分化誘導後の脂肪滴を蓄積した成熟した培養細胞を用いて、褐色脂肪細胞の実験と同様の条件で実験を行った。CXCL12の添加濃度、時間を変えてUCP-1遺伝子の発現を見たが、増加は認められなかった。したがって、CXCL12は白色脂肪細胞のベージュ化は促進しないという結論に至った。野生型マウスを用いて、今後の実験条件検討のために寒冷刺激により褐色脂肪組織が活性化する条件を設定することができた。当初の予定では、動物実験を行う予定であったが、遺伝子改変マウスの供給が遅れたため、購入できず施行できなかった。しかしながら、動物実験を遂行する際の条件の基礎検討は、野生型マウスを用いてすでに確認を行っている。したがって、やや遅れていると自己評価したい。糖尿病、脂質異常症などの生活習慣病が増加している原因として、肥満の増加が考えられる。肥満解消の治療戦略の一つとして、エネルギー消費を増加させる概念がある。褐色脂肪細胞は、その活性化によりエネルギーが消費され非ふるえ熱産生を行う機能を有する。我々は、褐色脂肪細胞活性化因子としてCXCL12を見出し、研究を進めている。これまでの研究で、不死化した褐色脂肪培養細胞および褐色脂肪初代培養細胞を用いて、検討して来たことを報告した。今年度はUCP-1 CreマウスとfloxCXCR4マウスを用いて、褐色脂肪細胞特異的CXCR4受容体欠損マウスを作成して、表現型を調べ始めた。まず、通常の状態である室温25°Cの段階で、体重、摂餌量を1週間ごとに記録した。さらに20週齢において糖負荷試験、インスリン負荷試験を行い、糖代謝とインスリン感受性の変化について同胞野生型と比較検討した。野生型対照群と有意な差は認められなかった。欠損マウスの数はオス1匹、メス1匹のため、今後実験数を増やしていく予定である。褐色脂肪細胞の強力な活性化の手段は寒冷刺激を与えることである。4°C寒冷暴露と、25°Cの室温で褐色脂肪組織の活性化を遺伝子発現で検討した。欠損マウスはまだ1匹のみの検討であるが、対照群と比較してわずかにUCP-1, GPC-1aの発現が低下していた。さらに検討数を増やす予定である。4°Cの寒冷刺激が強すぎて、差が出にくい可能性を考え、今後25°Cと30°Cの条件下で褐色脂肪組織の活性化を検討する予定である。野生型で検討したパイロットスタディでは、30°C条件下では褐色脂肪組織はほとんど不活性化されていることを確認している。そのほかの条件として、高脂肪食を与えて、3週間飼育後褐色脂肪組織の活性化を検討する予定である。現在、マウスの表現型を検討している段階である。マウスの出生数が少ないため、十分な数が確保できていないが、ブリーディングを進めているので、いずれ十分な数は供給できるものと予想している。したがって、この臓器を利用して糖尿病の治療あるいは脂質異常症の治療、肥満の解消に利用することができるのではないかと考えられている。近年、新しい活性化因子の報告や褐色脂肪細胞様の性質を持つベージュ細胞への分化促進因子などが報告されている。本研究で我々は、CXCL12-CXCR4が新規の褐色脂肪細胞活性化因子の一つであり、糖代謝に関連していることを明らかにした。褐色脂肪細胞特異的にCXCR4を欠損したマウスにおいて、通常餌では体重、摂餌量、糖代謝に変化は診られなかった。一方、高脂肪餌を与えたCXCR4欠損マウスでは、体重と摂餌量の変化は認めなかったが、糖代謝を悪化させた。

また、褐色脂肪培養細胞に対してCXCL12を添加すると、褐色脂肪細胞活性化マーカーであるUCP-1とPGC-1aが有意に増加した。また、エネルギー基質として使用される脂肪酸代謝関連の遺伝子変化において、脂肪合成関連と脂肪酸取り込み遺伝子の増加を認めた。以上のことより、CXCL12-CXCR4経路は、褐色脂肪活性化に関与し生体内では糖代謝に影響を与える可能性がある。本経路が糖代謝に関連することが明らかとなり、脂質代謝と基礎エネルギー代謝に関与する可能性があることが検討できた。今後、この経路を用いた糖尿病、脂質異常症、肥満の治療に応用できる可能性があり、さらに研究を推進し臨床応用に貢献できると考えられた。褐色脂肪細胞は、ブドウ糖や脂肪酸をエネルギー基質として非ふるえ熱産生をする臓器である。本研究で我々は、CXCL12-CXCR4が新規の褐色脂肪細胞活性化因子の一つであることを明らかにした。褐色脂肪細胞特異的にCXCR4を欠損したマウスにおいて、高脂肪餌を与えると糖代謝を悪化させた。また、褐色脂肪培養細胞に対してCXCL12を添加すると、褐色脂肪細胞活性化マーカーであるUCP-1とPGC-1aが有意に増加し、脂肪合成関連と脂肪酸取り込み遺伝子の増加を認めた。動物の購入ができずに遅れてしまったが、供給体制が整い遺伝子改変マウスの購入がすでに終了し、当動物実験施設で飼育中である。現在Creマウスとfloxマウスをそれぞれ繁殖させ、数が揃ったところで順次交配し、目的とするコンディショナルノックアウトマウスを創出する予定である。野生型マウスを用いて、実験条件の基礎検討は終了できているので、ノックアウトマウスが出来次第、即座に実験できる状態であることから、当初の予定に追いつくことができると予想している。表現型を確定したのちに、細胞内シグナルなども評価してく予定である。受容体CXCR4欠損マウスで検討しているが、もう一つの受容体であるCXCR7はCXCR4と逆の遺伝子発現を示している。当初の予想していなかった動きであるが、今後、in vitro, in vivoの両方で、CXCR7の働きも検討していく予定である。代謝内分泌今年度予定していた遺伝子改変動物の購入が先方の都合により不可能であったため、その分の費用が次年度に持ち越しとなってしまいました。マウスの出生数が予想よりも少なかったために、実験し使用する物品が少なく済んだため。遺伝子改変動物の購入は確定できていますので、次年度に合わせて動物購入費用を請求できると考えております。今後、マウスの検討数が増える予定で、血糖測定やインスリン測定、遺伝子発現、タンパク発現などに用いる物品購入費に充てる計画である。
女子大学生の月経・基礎体温を利用した生活習慣・食習慣改善プログラムの構築

平成29年度までの調査により、月経周期異常の82.4%が無排卵周期の可能性が高く、「うつ傾向」が有意に高いことが確認できた。睡眠時間の長期的な障害は、生活習慣病やうつ病の発症と密接に関係しているとの報告があり、良好な睡眠は、人々の健康や生活の質の維持・向上において重要な課題であると考える。夜型傾向の生活リズムは、月経随伴症状などの女性特有の心身の不快な症状とも関連しているとの報告もあることから、女子学生の月経随伴症状、メンタルヘルスおよびストレスの内容に焦点を当て、睡眠に影響する要因について分析を行った。月経周期は、頻発月経が6人(6.7%)、稀発月経が9人(10.0%)であった。月経持続日数は、過短月経はおらず、過長月経が7人(7.8%)であった。月経中のmMDQと睡眠の量、月経後のmMDQと睡眠の位相に負の相関がみられた。GHQ28の「身体的症状」「不安と不眠」と睡眠の質・量、GHQ28の合計得点と睡眠の位相・質・量に負の相関がみられた。ストレッサーと睡眠の質に負の相関がみられた。ストレッサー項目との関連では「自分の勉強、試験、卒業などがうまく進まない」「家族と過ごす時間が減った」「自分の経済状態(生活費、交際費など)が悪くなった」と睡眠の質に負の相関がみられた。以上のことより、月経随伴症状と睡眠が関連していることから、良好な睡眠を保つためにも、月経随伴症状を軽減させ、ストレスに対するコーピングを身につけていくことが必要と考える。女子大学生を対象に、月経・基礎体温と生活習慣や食習慣との関連を検討し、生活習慣・食習慣の問題点を提示して改善を促した後に、月経・基礎体温がどのように変化するかを明らかにする事を目的に縦断的に調査を実施する予定であった。しかし、基礎体温を継続的に測定することが難しいとの理由により、有効回答数が予定よりも少ない状況にある。そこで、平成30年度は、基礎体温測定はせず、月経周期・月経持続日数および月経随伴症状と生活習慣・食習慣との関連を明らかにすることを目的に調査を実施した。次年度は、研究期間を延長し、その結果をもとに、月経周期および月経持続日数に異常がみられる対象者を縦断的に調査し、生活習慣・食習慣の問題点を提示して改善を促した後に、月経がどのように変化するかを明らかにする事を目的に縦断的な調査を継続する必要がある。基礎体温のパターン分析により、女子大生の月経周期が正常のものが年々減少し、異常と正常を繰り返している不安定な学生が増加していることがわかっている。そこで、近い将来、妊娠・出産をする年代である女子大学生を対象に、月経・基礎体温と生活習慣や食習慣との関連を検討し、生活習慣・食習慣の問題点を提示して改善を促した後に、月経・基礎体温がどのように変化するかを明らかにする事を目的に縦断的に調査を実施する予定であった。しかし、基礎体温を継続的に測定することが難しいとの理由により、有効回答数が当初予定よりも少ない状況にある。そこで、平成29年度までの調査結果により、月経周期異常である対象者の基礎体温測を分析したところ、82.4%が無排卵周期の可能性があり、「うつ傾向」が有意に高いことが確認できたことから、平成30年度の調査対象者のうち、月経周期および月経持続日数に異常がみられる対象者が少なかったため、研究期間を延長し、対象を拡充して、生活習慣・食習慣の問題点を提示して改善を促した後に、月経・基礎体温がどのように変化するかを明らかにする事を目的に縦断的な調査を継続する。本研究は、月経・基礎体温の変化と生活習慣・食習慣との関連を明らかにし、月経・基礎体温を使用しての健康管理プログラムを作成することを目的としている。対象は、本年度当学科に在籍していた女子学生である。研究内容の説明会を2回開催し、同意を得たものは88人であった。そのうち基礎体温記録および質問紙を提出したものは21人(回収率23.9%)27周期であった。基礎体温記録を松本の分類により7型に分類した。I型2周期(7.4%)、II型1周期(3.7%)、III型1周期(3.7%)、III ́型2周期(7.4%)、IV型3周期(11.1%)、V型5周期28.5%)、VI型3周期(11.1%)、判別不可10周期(37.0%)であった。月経周期が正常であったものは18人(85.7%)、稀発月経は2人(9.5%)、正常と稀発月経両方あるものは1人であった。月経持続期間が正常であったものは17人(81.0%)、過長月経は1人(4.8%)、記録なしが3人(14.3%)であった。排卵の可能性の有無については、排卵の可能性が高いものは8人(38.1%)、排卵と無排卵の両周期があるものは1人(4.8%)、無排卵の可能性があるものは6人(28.6%)、不明のものは6人(28.6%)であった。

黄体機能が正常である可能性が高いものは3人(14.3%)、黄体機能が低下している可能性があるものは12人(57.1%)、不明のものは6人(28.6%)であった。月経周期や月経持続日数は正常であるものが多かった。無排卵の可能性が高いもの、黄体機能が低下している可能性が高いものが多く、現在生活習慣・食習慣との関連を分析中である。次年度は、分析結果を元に生活習慣・食習慣を改善するための介入研究を実施する予定である。本研究は、月経・基礎体温の変化と生活習慣・食習慣との関連を明らかにし、月経・基礎体温を使用して健康管理プログラムを作成することを目的としている。対象は、当学科の女子学生であったが、本年度の臨床研究倫理審査委員会において、所属の学科生を対象とすることを禁じられ、対象を看護専門学校生に変更し112名より同意を得た。有効回答は56名112周期であった。基礎体温からの推定結果は、無排卵の可能性がある周期63周期(56.3%)、黄体機能が低下している可能性がある周期81周期(72.3%)であった。低体重・肥満・現在ダイエット中の場合、無排卵・黄体機能低下の可能性がある周期が多かった。簡易型食事歴質問票を使用して栄養素摂取状況を調査した結果、ほとんどの栄養素摂取量が食事摂取基準を下回っていた。無排卵の可能性がある周期においてはビタミンB12の摂取量が有意に少なかった。日本版精神健康調査紙GHQ28を用いて精神健康と無排卵の可能性・黄体機能低下の可能性との関連を調査した。GHQ28における4因子「身体的症状」「不安と不眠」「社会的活動障害」「うつ状態」の中等度以上の症状を示す割合が高かった。また、対人・領域別ライフイベント尺度を使用し、ライフイベントと無排卵の可能性・黄体機能低下の可能性との関連を調査した結果、家族とのトラブルを体験をした周期において、無排卵の可能性・黄体機能低下の可能性が高い傾向にあった。先行研究に比較し、無排卵・黄体機能低下の可能性がある周期が明らかに増加している。月経の問題には、ビタミン・ミネラル類・たんぱく質の摂取が潜在的要因として関係している。今回の調査では無排卵・黄体機能低下の可能性がある周期との関連はビタミンB12以外は見られなかったが、ほとんどの栄養素摂取量が摂取基準以下であったので、今後妊孕世代となる本研究対象者の食生活が危惧される結果となった。当初の計画では、対象は当学科に在籍している女子学生であり、H27年度は、新1年生を対象者に追加することとH26年度の結果を踏まえて継続対象者への介入研究を実施する予定であった。しかし、今年度の臨床研究倫理審査委員会において、研究者所属の学科学生を対象とすることを禁じられ、今年度より対象を看護専門学校生に変更し、昨年度実施した介入前の調査を再度実施することに計画を変更した。そのため、介入研究が遅れることとなった。本研究は、月経・基礎体温と生活習慣や食習慣との関連を検討し、生活習慣・食習慣の問題点を提示して改善を促した後に、月経・基礎体温がどのように変化するかを明らかにすることを目的としている。対象は、看護専門学校の女子学生である。H28年度に同意を得られた101人のうち有効回答は27人30周期であった。H26年度6月H28年度11月で83名144周期の有効回答を得た。測定した基礎体温を松本の分類に従って評価した結果、無排卵の疑いがある周期は72周期(50%)であり、黄体機能不全の疑いがある周期は102周期(70.8%)であった。無排卵と黄体機能不全の疑いがある周期と食習慣の関連は見られなかったが、対象の食事バランスは、主食や副菜・乳製品・果物は目安量以下の摂取で、主菜・お菓子等は目安量以上の摂取であり食事バランスに問題があった。また、肥満度分類との関連をみてみると、低体重と肥満に無排卵の疑いがあるものが多く、低体重8人と肥満5人は全員が黄体機能不全の疑いがあるものであった。低体重・肥満を改善する食習慣を送ることで、月経異常の改善が図れると推測する。
高感度感圧塗料を用いた高精度・高時間応答性壁面上圧力分布計測システムの開発

感圧塗料は機能性塗料の一種で,この塗料に外部から紫外光を照射すると塗料を構成している分子が励起され,失活するときに燐光を発する.このとき燐光は塗料に接している気体中の酸素による消光作用を受けるため,酸素分圧が高いほど燐光強度は低くなる.このことを利用し,塗料を非測定物体の表面に塗布し,外部から紫外光を照射して,塗料の発する燐光強度を観測することにより,物体表面上の圧力分布を計測することができる.本研究は,この感圧塗料に関し,励起光強度と燐光強度の関係を初め,時間応答特性や気流温度と塗布面温度との関係など圧力測定上問題となる点を明らかにし,感圧塗料を実用レベルまで立ち上げることを目的とする.本研究においては,感圧塗料PtOEP, PtTFPP, H_2TFPP, H_2TCPPをTLCプレート上に塗布した実験を行い,次の成果を得た.(1)分光器により各種塗料の発する燐光のスペクトル成分を測定したところ,その強度が温度と圧力に依存することが分かった.そこで,燐光スペクトルの温度と圧力による変化の状態に関する基礎データを蓄積した.(2)感圧塗料には経時変化が存在し,励起光強度が一定でも塗布後の経過時間によって燐光強度が異なる.そこで,各種塗料に対してこの経時変化の特性を詳細に調査し,計測システム構築に不可欠な,塗料の経時変化の時定数を実験的に確定した.(3)気流の圧力が瞬間的に変化する場合の燐光強度特性を明らかにするため,衝撃波菅を用いた実験を行い,入射衝撃波通過時の圧力変化を利用して塗料の過渡応答特性を明らかにした.(4)衝撃波菅で得られる接触面通過前後の温度差を利用し,気流の温度と塗装面の温度が異なる場合の圧力-燐光強度特性を明らかにした.感圧塗料は機能性塗料の一種で,この塗料に外部から紫外光を照射すると塗料を構成している分子が励起され,失活するときに燐光を発する.このとき燐光は塗料に接している気体中の酸素による消光作用を受けるため,酸素分圧が高いほど燐光強度は低くなる.このことを利用し,塗料を非測定物体の表面に塗布し,外部から紫外光を照射して,塗料の発する燐光強度を観測することにより,物体表面上の圧力分布を計測することができる.本研究は,この感圧塗料に関し,励起光強度と燐光強度の関係を初め,時間応答特性や気流温度と塗布面温度との関係など圧力測定上問題となる点を明らかにし,感圧塗料を実用レベルまで立ち上げることを目的とする.本研究においては,感圧塗料PtOEP, PtTFPP, H_2TFPP, H_2TCPPをTLCプレート上に塗布した実験を行い,次の成果を得た.(1)分光器により各種塗料の発する燐光のスペクトル成分を測定したところ,その強度が温度と圧力に依存することが分かった.そこで,燐光スペクトルの温度と圧力による変化の状態に関する基礎データを蓄積した.(2)感圧塗料には経時変化が存在し,励起光強度が一定でも塗布後の経過時間によって燐光強度が異なる.そこで,各種塗料に対してこの経時変化の特性を詳細に調査し,計測システム構築に不可欠な,塗料の経時変化の時定数を実験的に確定した.(3)気流の圧力が瞬間的に変化する場合の燐光強度特性を明らかにするため,衝撃波菅を用いた実験を行い,入射衝撃波通過時の圧力変化を利用して塗料の過渡応答特性を明らかにした.(4)衝撃波菅で得られる接触面通過前後の温度差を利用し,気流の温度と塗装面の温度が異なる場合の圧力-燐光強度特性を明らかにした.感圧塗料は機能性塗料の一種で,この塗料に外部から紫外光を照射すると塗料を構成している分子が励起され,失活するときに燐光を発する.このとき燐光は塗料に接している気体中の酸素による消光作用をうけるため,酸素分圧が高いほど燐光強度は低くなる.このことを利用し,塗料を非測定物体の表面に塗布し,外部から紫外光を照射して,塗料の発する燐光強度を観測することにより,物体表面上の圧力分布を計測することができる.本研究は,この感圧塗料に関し,励起光強度と燐光強度の関係を始め,時間応答特性や気流温度と塗布面温度との関係など圧力測定上問題となる点を明らかにし,感圧塗料を実用レベルまで立ち上げることを目的とする.本研究においては,感圧塗料PtOEP,PtTFPP,H2TFPP,H2TCPPをTLCプレート上に塗布した実験を行い,これまでに次の結果を得ている.(1)塗料分子は紫外線により励起されるが,通常は取扱いの容易さと価格面からキセノンアークランプなどが使用される.このランプに起因する迷光を防止するため,分光器を用いて励起光源のスペクトルを分析し,光源に設置する光学フィルター選定のための資料を得た.また,各種塗料の発する燐光のスペクトル成分を分光器により詳細に測定し,主要な成分のみを通過させる光学フィルター選択のためのデータを得た.(2)静止気体セルにペルチェ素子を組み込み,気体温度が圧力-燐光強度特性に与える影響を系統的に明らかにした.(3)本研究の中で,感圧塗料は経時変化があり,塗料ごとにその時定数が大きく異なることが分かってきた.このため各塗料について経時変化の状態を測定し,時定数についての基礎データを蓄積した.感圧

塗料は機能性塗料の一種で,この塗料に外部から紫外光を照射すると塗料を構成している分子が励起され,失活するときに燐光を発する.このとき燐光は塗料に接している気体中の酸素による消光作用をうけるため,酸素分圧が高いほど燐光強度は低くなる.このことを利用し,塗料を非測定物体の表面に塗布し,外部から紫外光を照射して,塗料の発する燐光強度を観測することにより,物体表面上の圧力分布を計測することができる.本研究は,この感圧塗料に関し,励起光強度と燐光強度の関係を始め,時間応答特性や気流温度と塗布面温度との関係など圧力測定上問題となる点を明らかにし,感圧塗料を実用レベルまで立ち上げることを目的とする.本研究においては,感圧塗料PtOEP, PtTFPP, H2TFPP, H2TCPPをTLCプレート上に塗布した実験を行い,これまでに次の結果を得ている.(1)分光器により各種塗料の発する燐光のスペクトル成分を測定したところ,その強度が温度と圧力に依存することが分かった.そこで,光電子増倍管を熱雑音を低減するための高性能電子冷却器(で冷却し,燐光スペクトルの温度と圧力による変化の状態に関する基礎データを蓄積した.(2)感圧塗料には経時変化が存在し,励起光強度が一定でも塗布後の経過時間によって燐光強度が異なる.そこで,各種塗料に対してこの経時変化の特性を詳細に調査し,計測システム構築に不可欠な,塗料の経時変化の時定を実験的に確定した.(3)静圧の面測定を可能とするためには,CCDカメラをコンピュータに連結し,燐光強度分布から高精度で圧力を決定するためのソフトウェアが必要となる.そこで,昨年度購入した超高感度CCDカメラで面測定を行うための特殊なソフトウェアを開発した.感圧塗料は機能性塗料の一種で,この塗料に外部から紫外光を照射すると塗料を構成している分子が励起され,失活するときに燐光を発する.このとき燐光は塗料に接している気体中の酸素による消光作用をうけるため,酸素分圧が高いほど燐光強度は低くなる.このことを利用し,塗料を非測定物体の表面に塗布し,外部から紫外光を照射して,塗料の発する燐光強度を観測することにより,物体表面上の圧力分布を計測することができる.本研究は,この感圧塗料に関し,励起光強度と燐光強度の関係を始め,時間応答特性や気流温度と塗布面温度との関係など圧力測定上問題となる点を明らかにし,感圧塗料を実用レベルまで立ち上げることを目的とする.本研究においては,感圧塗料PtOEP, PtTFPP, H2TFPP, H2TCPPをTLCプレート上に塗布した実験を行い,これまでに次の結果を得ている.(1)現在,パルス光源に対する燐光強度の応答特性は全くわかっていない.このことが,ターゲットが高速で飛翔する実験において,ある瞬間のターゲット表面圧力を感圧塗料により測定することを不可能にしている.そこで,本研究では,励起光源にパルス幅の短い(7ns)Nd : YAGレーザーの第三高調波(355nm)を使用し,パルス光に対する塗料の発光応答特性を明らかにした.(2)気流の圧力が瞬間的に変化する場合の燐光強度特性を明らかにするため,衝撃波菅(既設)を用いた実験を行い,入射衝撃波通過時の圧力変化を利用して塗料の過渡応答特性を明らかにした.(3)衝撃波菅で得られる接触面通過前後の温度差を利用し,気流の温度と塗装面の温度が異なる場合の圧力-燐光強度特性特性を明らかにした.
ラットの根尖病変の形成におよぼす外傷性咬合の影響

実験にはラット30匹を使用し、処置法の違いによりA群、B群、C群、D群の4群に分類した。A群では、何も処置を行わず対照群とした。B群では、下顎左側第一臼歯の歯髄の露出を行った。C群では、上顎左側臼歯部に咬合挙上板を装着して、動物に実験的な片側性の外傷性咬合を引き起こした。D群では、上顎左側臼歯部の咬合挙上板の装着と下顎左側第一臼歯の歯髄の露出を同時に行った。各群の動物は処置後、1日あるいは、3日後に屠殺して、下顎骨を摘出し、通法に従い、連続組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施し、第一臼歯の近心根および根分岐部歯周組織を組織学的に検索した。A群では、全実験期間で、何も変化はみられなかった。B群では、1日では、歯髄組織は露髄部に強い炎症性細胞浸潤がみられた。根尖部歯周組織には特に変化は認められなかった。3日では、歯髄組織は1日より強い炎症性細胞浸潤がみられた。根尖部歯周組織では、1日と同様であった。C群では、1日では、歯髄組織では特に変化は認められなかった。根尖部歯周組織では歯根膜線維の圧平がみられた。3日では、歯髄組織は1日と同様であった。根尖部歯周組織では歯根膜線維の圧平は1日より強くなっていた。D群では、1日および3日で、歯髄組織ではB群の同じ時期と同程度の炎症性細胞浸潤がみられた。根尖部歯周組織では歯根膜線維の圧平はC群と同程度であった。以上の結果から、根尖病変の形成におよぼす外傷性咬合は、本実験期間では、あまり影響をおよぼさないことが示唆された。これは1日および3日では、炎症性細胞はまだ根尖部歯周組織に到達していないためであると思われる。今後は、抜髄処置を施した後に外傷性咬合を引き起こし根尖病変の形成におよぼす影響を検索して行くつもりである。
感作性金属による生体影響に関する実験的並びに免疫的研究

1.マウス・マクロファ-ジ(Mφ)のインタ-ロイキン-1(MIL-1)産生に対する感作性金属(Be、Zr、Pt、Co、Ni)の影響について検討した。各金属によるMIL-1産生については、Mφの培養液中にBe、Zr、Pt、Co(最終濃度:0,0.5,1.0,5.0,10.0μM)、Ni8最終濃度:0.5,10,50,100μM)を添加した。コントロ-ルに対してBe、Ptでは、1,10μMにおいて活性値の上昇を示した。Zrでは、この濃度においてはいずれも活性値の低下を認めた。Coでは、濃度による活性値の変化が認められた。また、Niでは、10μM異常で活性値の上昇を認めた。LPSによるMIL-1産生に対する感作性金属の影響について、Beでは、コントロ-ルとの間に差は認められなかった。Zrでは、5μMまでは増強反応が認められた。Ptでは、低下反応を認めた。Coでは、0.5,1.0μMで増強傾向がみられ、これに対して,5.0,10.0μMでは低下傾向がみられた。Niでは、50,100μMで活性値の上昇に認めた。2.ヒツジ赤血球を抗原としたマウス初期免疫応答と、抗原比感作マウスのIgG抗体産生に対するCo並びにNiの影響について検討した。Coの短期投与におけるSRBC-IgM抗体産生応答は、低温度レベルでは、影響を認められないが、投与量を増加すると反応は増強した。抗原無感作マウスのIgG抗体産生は、投与によって認むべき変化はなかった。長期投与では、SRBC-IgM抗体産生応答に抑制が見られた。抗原無感作マウスのIgG産生は、抑制効果が認められた。Ni短期投与におけるSRBC-Ig抗体産生応答は、特記すべき反応は認められなかった。抗原無感作マウスのIgG抗体産生では、一部のマウスで増強効果を認めた。抗原無感作マウスのIgG抗体産生では、既して抑制効果が認められた。しかし一部のマウスでは増強効果を認めた。
清・琉球を中心として見た近世東アジア国際関係の比較研究

近世琉球に漂着した外国人(その多くは中国人・朝鮮人)及び清代中国に漂着した琉球人の処置を分析することによって、清・琉球関係の内実に迫り、さらにそれが当時の東アジアの中でどのような意味を持っていたのかを論証せんと試みた。そのため4月初めから七月上旬に掛けて中国(福建省福州市)に赴いて史料収集とフィールドワークを行った。特に琉球人漂着民が関与した当時の衙門(役所)の位置の割出、及び彼の地に眠る琉球人の墓碑の調査を重点的に行った。また当地での成果を利用して論文「琉球と中国-近年の研究動向-」(『中国史学』13)を執筆した。また2003年11・12月及び2004年1月の各月に沖縄を訪問し、那覇の旧跡の調査及び沖縄県立博物館・沖縄県立図書館・浦添市立図書館・琉球大学において史料収集を行った。また12月と1月の訪問の際には、琉球大学のワークショップにおいて中国人・朝鮮人漂着民と琉球列島の関わりについて報告した。さらに東京大学の科研「8-17世紀の東アジア地域における人・物・情報の交流-海域と港市の形成、民族・地域間の相互認識を中心に-」(代表:村井章介)の成果報告書に論文「近世琉球における外国人漂着民の処置の諸相-「介抱」と「管理」の狭間で-」を、琉球大学の科研「琉球と日本本土の遷移地域としてのトカラ列島の歴史的位置づけをめぐる総合的研究」(代表:高良倉吉)において論文「近世トカラと漂流漂着」「県立博物館所蔵『琉球國圖』」を執筆した(今年度中に刊行予定)。近世琉球に漂着した外国人漂着の事例を中国人漂着民中心に分析することで、清・琉球関係の内実に迫り、さらにそれが当時の東アジアの中でどのような意味を持っていたのかを論証せんと試みた。そのため8月下旬に沖縄本島及び久米島に、8月末からは中国(福建省)に赴いて史料収集とフィールドワークを行った。その結果、琉球王国内部において清との対外関係がどのような意味を持ち得たのかを解明すると同時に、琉球使節が清(特に窓口であった福建省福州)において行っていた活動、及びそれを受け止める清側の構造を部分的にではあるが明らかにすることができた。その成果は、論文「近世琉球における外国人漂着民収容センターとしての泊村」(別紙参照)、「近世琉球における中国人漂着民の船隻・積荷の処置の実態-日本と中国の狭間で-」(別紙参照)、及び報告「『唐人の手紙』-近世琉球における漂着民の処置とキリシタン禁制-」(:海域アジア史研究会例会)「近世琉球における外国人漂着民の処置と泊村-特に朝鮮人との関わりを通じて-」(シンポジウム「朝鮮と琉球」:浦添市立図書館)、で発表した。