hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タバコモザイクウイルス抵抗性遺伝子の転写調節と過敏感応答誘導機構の解明

N遺伝子のプロモーター上流領域に結合する転写因子として,Dofファミリーに属するBBF1, BBF2,及びBBF3を同定した。N遺伝子の約2.3kbの上流配列(NP2.3)にレポーター遺伝子GFPを接続してプロモーター解析を実施した結果,BBF1の一過的発現はN遺伝子の転写を増大させた。また,BBF1の過剰発現時により,ROS産生,及びHR誘導と関連遺伝子の転写増強がもたらされた。タバコモザイクウイルス(TMV)に対する抵抗性遺伝子(N)を有するタバコにおいては,感染時にウイルス複製酵素の一部(p50)がエリシターとして認識され,N遺伝子の転写増強が起こり,過敏感応答(HR)が誘導される。申請者らは,N遺伝子のエンハンサー配列(20bp)に含まれる2個のDOF結合モチーフ(AAAG)に着目し,これらに変異を導入した配列と野生型配列をレポーター遺伝子(GFP)に接続して,エリシターとなるp50,Nタンパク質及びDofタンパク質の転写活性可能を評価した。その結果,DOFの一種であるBBF1は単独でも転写活性化を起こすが,p50やNタンパク質と相乗的に働くことが明らかになった。BBF1と標的DNAの相互作用をin vitroで調べるために,エンハンサー配列を含む放射能標識したDNA断片をプローブとして,ゲルシフトアッセイやサウスウエスタン法を用いて結合能を解析した結果,野生型及び一部の変異型配列が結合能を有することが判明し,非放射性プローブによる競合実験により,シフトバンドの特異性を確認することができた。また,BBF1以外のタバコDOFタンパク質であるBBF2及びBBF3の完全長ORFを含むcDNAのクローニングに成功したので,これらの組換えタンパク質を作製し,BBF1と同様にゲルシフトアッセイを実施することが可能となった。さらに,in vivoでN遺伝子上流のシス配列と相互作用している転写因子の実体を明らかにして,これらBBFタンパク質とin vivoで相互作用している新規タンパク質の同定についての新しい研究を展開できる段階に達した。タバコモザイクウイルス(TMV)が抵抗性遺伝子(N)を有するタバコに感染すると,ウイルス複製酵素の一部(p50)がエリシターとして認識され,N遺伝子の転写増強が起こり,過敏感応答(HR)が誘導される。申請者らは,N遺伝子転写増強において,転写因子DOFタンパク質が関与することを新規に証明することができた。N遺伝子のエンハンサー配列(20bp)に含まれる2個のDOF結合モチーフ(AAAG)に着目し,これらに変異を導入した配列と野生型配列をレポーター遺伝子(GFP)に接続して,エリシターとなるp50,Nタンパク質及びDOFタンパク質の転写活性化能を評価した結果,BBF1はp50やNタンパク質と相乗的に働くだけでなく,BBF1単独でも転写活性化を起こすことが明らかになった。さらに,BBF1以外のタバコDOFタンパク質であるBBF2およびBBF3の完全長ORFを含むcDNAのクローニングを行い,これらの組換えタンパク質を作製し,これらBBFタンパク質とin vivoで相互作用している新規タンパク質の同定についての新しい研究を進めた。その結果,以下の3つの可能性が示された。(2)BBF1は,RNAポリメラーゼと他の転写因子をつなぐ役割が知られているBTF3という因子と相互作用する。(3)BBF1およびBBF2は,感染特異的タンパク質としてよく知られているPR-1と相同性を有するprb-1bと相互作用する。タバコにはタバコモザイクウイルス(TMV)に対する抵抗性遺伝子(N遺伝子)が存在する。細胞にTMVが感染すると,その複製酵素のヘリカーゼ領域(p50)をエリシターとして認識し,Nタンパク質の働きにより,細胞死を伴う過敏感応答(HR)と呼ばれる防御応答を誘導する。人為的にp50のみを発現させてもN遺伝子の転写増強が誘導されることが知られていたので, N遺伝子の約2.3 kbの上流配列にレポーター遺伝子GFPを接続してプロモーター解析を実施した結果,p50が関与する転写増強にはDofファミリー転写因子が関与している可能性が示唆された。そこで本研究では,タバコDofタンパク質の一つであるBBF1について,N遺伝子の転写増強とNを介した防御応答における役割を調べた。N遺伝子をもつタバコで,p50の非存在下でBBF1を一過的に過剰発現させると,HRは誘導されないが,内在性N遺伝子の発現が増加した。次に,BBF1とp50を一過的に共発現させた結果,p50の単独発現の場合と比べてHRが増強された。一方,HR誘導時における内在性BBF1の発現量の変化を調べたところ,TMV感染やp50によるHR誘導時において,N遺伝子の発現は増強されたが,BBF1遺伝子の転写量に変化は見られなかった。興味深いことに,N遺伝子の有無に関わらず,BBF1の過剰発現時では,p50発現に非依存的にROSの産生量が増大したが,ROS産生に関わるとされるNADPHオキシダーゼ遺伝子(NtrbohD)の発現は影響を受けなかった。

また,N遺伝子の非存在下でHRが誘導されない場合でも,BBF1を過剰発現時させると,サリチル酸やジャスモン酸を介したシグナル伝達経路のマーカー遺伝子(PR1a,PR1b)やHRマーカー遺伝子(Hsr203j,Hin1)の発現が増加した。N遺伝子の転写活性化に関与することを見つけたDOFタンパク質について,そのDNA結合能を詳細に解析することができ,さらにDOFタンパク質と相互作用するタンパク質因子についても解析が進んだから。24年度が最終年度であるため、記入しない。DOFタンパク質が他のタンパク質因子と相互作用する可能性が見出だされたので,3種のDOFタンパク質すなわち,BBF1,BBF2,BBF3について,それぞれが共通の因子と相互作用するのか,あるいは特異的な相互作用能を示すのかについて詳細な解析を進めたい。また,これらのタンパク質を一過的に過剰発現させたときのタバコ細胞内でどのような遺伝子発現の変動が起こるかについて,網羅的に調べる目的で次世代DNAシーケンサー(イルミナ)を利用した研究に着手したい。
哺乳動物における左右軸決定の機構

左右非対称に発現するTGFβ関連遺伝子leftyを糸口として、哺乳類における左右の決定機構を解析した。1)マウスにおいては二つの保存された遺伝子(lefty-1,lefty-2)が存在し、同一染色体上に近接して存在し、それぞれ異なった組織で非対称な発現を示す事が判った。2)lefty-1,lefty-2の役割を知るため、各々を欠損する変異マウスを作製した。lefty-2欠損マウスの形質を解析したところ、多くの臓器の位置異常が認められ、少なくともlefty-1は身体の左右の決定に置いて必須の因子であることが判明した。3)Lefty蛋白質の作用機構を知るために、この蛋白質の活性をアッセイできる系の確立を試みた。その結果、カエル胚へ導入する事により神経誘導・二次軸誘導の活性を示した。このバイオアッセイ系は、今後Lefty蛋白質の作用機構を解析するための良い系であることが判明した。4)lefty-1,lefty-2遺伝子の転写調節領域をトンラスジェニックマウスの系を用いて解析し、左右非対称な発現を規定しているcis-elementを同定した。それらのcis-elementを約200-300bp以内に狭める事ができた。5)ヒトのlefty遺伝子を単離・解析した結果、複数の遺伝子が存在することが判った。
知識処理による学習機構を用いた大規模情報圧縮に関する研究

本研究では、平均ひずみの最小化の視点に立ち、あらかじめ設定された数の条件下で、神経細胞の削減による新たな手法を提案した。第一の手法は適応削減法であり、局所的な情報による学習ある。まず、多くの参照ベクトルが用意され、競合学習により処理される。そして、参照ベクトルは、部分ひずみの基準に従って、設定された数まで逐次的に削除される。第二の手法は感応削減法である。これは、大域的情報による学習過程で、神経細胞の貢献度により、冗長な参照ベクトルを削減する方法である。はじめに、多くの参照ベクトルが準備され、競合学習により処理される。つぎに、参照ベクトルを一旦削除して、最小の平均ひずみを与えるように冗長な参照ベクトルが削減される。数値実験として、様々な2次元パターンに対して、従来モデルと比較した。結果として、平均ひずみ及び部分ひずみの標準偏差に基づいて、提案手法は従来手法より有効であった。特に、適応削減法は感応削減法より少ない計算量で処理できる。また、感応削減法は適応削減法より平均ひずみが小さくなる。更に、両手法に関して初期のベクトル数に対する平均ひずみへの影響を調べた。様々な入力パターンに対して、平均ひずみは異なる傾向を示すことが分かった。ただし、削減手法を有することにより、従来手法より良い結果を示すことも分かった。更に、本研究では、部分空間の入力数が互いに等しいとき、部分ひずみは互いに等しくなることを示し、平均ひずみは漸近的に最小値を与えることを述べた。そして、この等入力原理に基づき、生成型の競合学習を提案した。本手法は近傍関係のないユニットで構成され、部分空間の入力数を等しくする方法である。まず、初期の段階で一つの出力ユニットが与えられ、そのユニットに対応した参照ベクトルが競合学習によって更新される。続いて、出力ユニットは等入力原理に基づいて、あらかじめ設定された数に到達するまで逐次的に生成される。そして、終了条件を満たすまで競合学習が実行される。数値実験は、人工的に作成された入力パターンによって、及び画像処理で用いられる画像データによって、達成される。神経回路網のベクトル量子化で高品質な従来のアルゴリズムと比較し、本手法の有効性を議論した。本研究では,平均ひずみの最小化の視点に立ち,あらかじめ設定された数の条件の基で,神経細胞の削除による新たな2つの手法を提案した.第一の手法は適応削減法である.これは,局所的情報(部分ひずみ)による適応的な学習であり,次のように記述される.まず,あらかじめ多くの参照ベクトルが用意され,競合学習により処理される.そして,参照ベクトルは,部分ひずみの基準に従って,設定された数まで,逐次的に削除される.第二の手法は感応削減法である.これは,大域的情報(平均ひずみ)による学習過程での神経細胞の貢献度により,冗長な参照ベクトルを削減する方法である.はじめに,多くの参照ベクトルが準備され,競合学習により処理される.つぎに,参照ベクトルは,一旦削除され,最小の平均ひずみを与えるように,冗長な参照ベクトルが削減される.数値実験として,様々な2次元パターンに対して,従来モデルと比較した.結果として,平均ひずみ及び部分ひずみの標準偏差に基づいて,提案手法は従来手法より有効であることが分かった.特に,適応削減は感応削減より,少ない計算量で処理できる.また,感応削減は適応削減より平均ひずみが小さくなる.更に,両手法に関して,初期のベクトル数に対する平均ひずみへの影響を調べた.これらに関しては,様々な入力パターンに対して,平均ひずみは異なる結果を示すことが分かった.ただし,削減手法を有することにより,従来手法より良い結果を示すことも分かった.更に複雑な入力パターンへの実験を継続中であり,パターンによる平均ひずみへの影響や,数に対する影響も調査中である.また,この問題に関しては,不連続かつ複雑な入力に対しても有効であると考えられる.このことは今後の課題としたい.本研究では、平均ひずみの最小化の視点に立ち、あらかじめ設定された数の条件下で、神経細胞の削減による新たな手法を提案した。

そして、この等入力原理に基づき、生成型の競合学習を提案した。本手法は近傍関係のないユニットで構成され、部分空間の入力数を等しくする方法である。まず、初期の段階で一つの出力ユニットが与えられ、そのユニットに対応した参照ベクトルが競合学習によって更新される。続いて、出力ユニットは等入力原理に基づいて、あらかじめ設定された数に到達するまで逐次的に生成される。そして、終了条件を満たすまで競合学習が実行される。数値実験は、人工的に作成された入力パターンによって、及び画像処理で用いられる画像データによって、達成される。神経回路網のベクトル量子化で高品質な従来のアルゴリズムと比較し、本手法の有効性を議論した。
AEコーン貫入試験の実地盤への適用に関する研究

本申請研究は、CPT(電気式コーン貫入試験)本体のロッド部分の表面にAEセンサーを取り付けることにより、従来のCPTでは不可能な地盤の粒度組成の推定や、ゆるい地盤における地震時の液状化ポテンシャルの予測に適用しようと試みたものである。以下に試験の概略および得られた結果を報告する。実験は土槽内に、珪砂4号と珪砂8号よりなる単層および互層の模型地盤(数種類の含水比)を作成し、コーン貫入試験を行った。得られた結果をまとめると次の通りである。(1)単層の場合、同一含水比の試料では、深度が大きいほど拘束圧が大きくAE発生レートも単調的に増加する。(2)粒径が大きいほどAE発生数も多くなる。(3)同一深度では、含水比が高くなればAE発生数は減少する。(4)拘束圧と粒径(今回の実験では2種類)とでは、AE発生に影響を与える度合いは粒径の法が大である。(5)含水比が10%程度では乾燥状態の試料とAE発生傾向に差異はないが、20%以上の含水比になるとAE発生数は急激に減少し、珪砂4号、珪砂8号のいずれの試料でも完全水侵状態では、乾燥状態の約70%前後の減となった。(6)今回使用した2種の試料では、層厚が5cm以上あれば試料の種類を明確に判定し得る。以上のような結果が得られたが、今後粘性土を含めた種々の試料を用い、定性的かつ定量的な考察を行うことによりAE内臓コーンの実用化に向けたいと考えている。
量子場の理論における数学的諸問題と無限次元解析

(1)量子系のハミルトニアンH(ヒルベルト空間上の自己共役作用素)と弱ウァイル関係式を満たす対称作用素はHの強時間作用素と呼ばれる.本研究においては,強時間作用素のスペクトルについて詳しい解析を行い,重要な結果を得た(A. Arai, Spectrum of time operators, Lett. Math. Phys. 80(2007), 11-17).(1)量子系のハミルトニアンH(ヒルベルト空間上の自己共役作用素)と弱ウァイル関係式を満たす対称作用素はHの強時間作用素と呼ばれる.本研究においては,強時間作用素のスペクトルについて詳しい解析を行い,重要な結果を得た(A. Arai, Spectrum of time operators, Lett. Math. Phys. 80(2007), 11-17).(1)原子物理学において現われるカイラル・クォーク・ソリトンモデル(CQSM)の数学的に厳密な解析を行い,新しい結果を得た.CQSMのハミルトニアンHはDirac型の作用素であるが,これは,質量項が行列値関数であるという点において,標準的なDirac作用素とは異なるものであり,これまでに数学的な研究はほとんどないといってよい.この意味でも,この研究は新規で真に独創的なものであり,得られた結果はまったく新しいものである.作用素Hについて,次の側面に関する結果が得られた:(i)超対称的構造;(ii)スペクトル;(iii)基底状態の存在;(iv)対称性による簡約;(v)ユニタリ同値なモデル;(vi)CQSMの拡張.(2)一般化された弱Weyl関係式と量子動力学の研究.量子力学の基本原理のひとつである正準交換関係を若干強くした関係式として弱Weyl関係式とよばれるものがある.ハミルトニアンに関して弱Weyl関係式をみたす作用素は時間作用素とよばれ,これは量子力学的状態の時間発展において,状態の遷移確率の時間減衰に関わることが知られていた.本研究では,弱Weyl関係式を一般化した,非常に普遍性の高い関係式として,一般化された弱Weyl関係式なるものを導入し,その作用素論的な内容を詳しく調べた.当然のことながら,時間作用素の概念も一般化された.特に,時間-エネルギーの不確定性関係の厳密な定式化と一般化,そして量子力学的状態の遷移確率の時間減衰がベキのオーダーで起こるための十分条件が,一般化された時間作用素を用いて見出されたことは特筆に値する.さらに,一般化された弱Weyl関係式の豊富な例の構成法を示したこと,またテンソル積表現や量子場の理論への応用上重要なフォック空間表現を構成したことも重要な成果である.(1)スピン1/2の荷電素粒子であるDirac粒子が量子電磁場と相互作用を行う系の時間発展について詳しい解析をおこなった。この系のハミルトニアンが生成する強連続1パラメーターユニタリ群は、Dirac粒子の位置作用素の定義域を不変にすることを証明した。さらに生き残り確率に対して、Dirac粒子の電荷qに関する漸近展開を導いた。(2)(1)の系で系の全運動量が一定の場合に、Dirac粒子はポラロンとよばれる状態を形成する。この状態を記述するハミルトニアン---相対論的ポラロンハミルトニアン---の非相対論的極限を考察し、それが非相対論的量子電磁力学のポラロンハミルトニアンに強擬レゾルヴェント収束の意味で収束することを証明した。(3)(1)の問題に関連して、ハイゼンベルク作用素の一般論を構成した。特に、積分方程式を用いてハイゼンベルク作用素を表す普遍的な公式を得た。(4)量子力学的ハミルトニアンに正準共役な対称作用素は時間作用素とよばれる。これには基本的に2種類あり、ひとつは弱時間作用素とよばれ、もうひとつは強時間作用素とよばれる。ハミルトニアンが下に有界であるか上に有界であるならば、強時間作用素は本質的に自己共役でないことが知られている。したがって、その場合、強時間作用素のスペクトルは、上半平面、下半平面、全平面のいずれかになる。研究代表者は、ハミルトニアンの構造と強時間作用素のスペクトルの関係を研究し、次の結果を得た:(i)ハミルトニアンが下に有界ならば、強時間作用素のスペクトルは上半平面か全平面かのどちらかである。(ii)ハミルトニアンが上に有界ならば、強時間作用素のスペクトルは下半平面か全平面かのどちらかである。(iii)ハミルトニアンが有界ならば、強時間作用素のスペクトルは全平面である。さらに、具体的で非自明な強時間作用素(アハラノフ-ボーム時間作用素や相対論的シュレーディンガー作用素の時間作用素)のスペクトルを正確に同定した。(1)量子系のハミルトニアンH(ヒルベルト空間上の自己共役作用素)と弱ヴァイル関係式を満たす対称作用素はHの強時間作用素と呼ばれる.本研究においては,強時間作用素のスペクトルについて詳しい解析を行い,重要な結果を得た(A. Arai, Spectrum of time operators, Lett. Math. Phys.80(2007),11-17).
教育財政におけるアカウンタビリティ(説明・応答責任)の理論的・比較的研究

本研究の遂行を通じて、明らかになったのは以下の諸点である。1アカウンタビリティの定義:アカウンタビリティ概念は、客観的な尺度に基づいて「成果を出すこと」、およびその成果について「説明すること」という二つの概念から構成されている。そこで、教育におけるアカウンタビリティとは、「教育に携わる人々がその活動を通じて、できる限り所与の教育目標を達成するといった成果を出すよう努力し、さらに生徒・学生や親・納税者に対して、その達成された成果について説明し、場合によっては弁明すること」と定義される。2高等教育におけるアカウンタビリティの内実:Kogan,M.によるアカウンタビリティの四分類に基づき、分析を行なった。(1)現状の大学評価をめぐる議論においては、高等教育におけるアカウンタビリティとは、公的統制モデルに基づくアカウンタビリティとして理解されている。(2)自己点検・評価を求める動向は、一般に公的統制モデルに基づくアカウンタビリティ要請と理解されているが、専門職的モデル、つまり専門職が専門職として自ら果たすべき責任として理解することが可能である。(3)学生による授業評価は、公的統制モデルとしてより、パートナーシップ・モデルあるいは市場機構モデルに基づくアカウンタビリティ要請と理解することが可能である。(4)市場機構モデルに基づくアカウンタビリティ要請は、日本の高等教育制度の下ではすでに受験システムとして機能している。
アニマルセラピーにおける動物由来感染症起因細菌の網羅的検索

セラピー犬、及びその飼い主様の口腔内から分離した好気性並びに通性嫌気性細菌については犬由来668菌株、及び人由来803菌株の計1471菌株について、MALDI Biotyperによる菌種同定を行った結果、犬由来菌株では423株が属レベルで同定され、そのうち290株については種レベルで同定された。人由来菌株では774株が属レベルで同定され、そのうち711株については種レベルで同定された。犬と人の双方で認められた菌種はNeisseriaflavescens、Staphylococcus epidermidis、Sta. schleiferi、Streptococcus sanguinisなど11菌種で、このうちN. flavescens及びSta. schleiferiの2菌種はセラピー犬とその飼い主のペアで検出された。セラピー犬、及びその飼い主様の10ペアを選び、次世代シークエンサー(NGS)により得られた菌検出データとBiotyperによる同定結果を比較したところ、犬と人の双方で認められた菌種はAggregatibacter segnis、Peptostreptococcus aerobiusなど22菌種が認められた。また、NGS及びBiotyper双方における好気性並びに通性嫌気性細菌検出頻度に明らかな違いは認められなかった。特に人由来菌株において、近似性が高かった。このことから、Biotyperは人由来菌株だけでなく、動物、少なくとも犬由来菌株の同定においても有用であることが示された。現在、NGSデータについてはさらなる解析を実施中である。一方、嫌気性細菌については新たに採取したセラピー犬、及びその飼い主様の口腔内から749株を分離菌株として確保した。また、新たに通性嫌気性細菌162株を分離した。以下の理由により、(3)と判断した。セラピー犬、及びその飼い主様の口腔内細菌の検索について、好気性並びに通性嫌気性細菌についてはMALDI Biotyperによる菌種同定作業をほぼ完了した。但し、Biotyperが人由来菌株のデータを基に菌種同定を行うことから、犬由来菌株の同定結果については、16S rRNA領域のシークエンスなどによる確認同定を行い(実施中)、より確度の高いデータの収集が必要であること。セラピー犬、及びその飼い主様の10ペアを選び、双方の口腔内細菌叢について次世代シークエンサーにより得られたデータを解析中であるが、全てを整理できていないこと。一方、嫌気性細菌については1回目採材分のスワブから菌株の単離が終了し、漸くMALDI Biotyperによる菌種同定作業を開始したところで、菌種同定結果が得られていないこと。セラピー犬、及びその飼い主様の口腔内細菌の検索について、嫌気性細菌についてMALDI Biotyperによる菌種同定を完了する。双方の口腔内細菌叢について次世代シークエンサーにより得られたデータを解析セラピー犬由来の、MALDI Biotyperによる同定菌株について、16S rRNA領域のシークエンス解析による確認同定を行うとともに、可能であれば同種の菌における株レベルでの同定を進める。研究の主旨を維持しつつ、研究対象については、物理的な処理能力の観点からセラピー犬とその飼い主に焦点を絞ることとした。2017年9月、および2018年3月に行われたセラピー犬適性試験に参加したイヌ57匹、ならびにその飼い主56名から口腔内スワブサンプルを採材した。飼い主及びその家族からの採材については、研究者所属機関の倫理審査委員会で実施承認された後、採材時には、本研究の趣旨について説明を行った後に、飼い主から口腔内スワブ採取、そこから得られる分離菌株ならびに抽出DNAの使用・保管について承諾を得た上で、イヌおよび飼い主からスワブ採材を行った。また、採材時には各飼い主にアンケート調査(居住地域、イヌの使用頭数・年齢・性別、イヌの歯の手入れの状況、イヌとの接触様式、飼い主の歯磨き状況・年齢層)を行った。得られたスワブを用いて、5%馬脱繊維血液加ブレインハートインフュージョン寒天培地に画線塗抹し、37°Cで7日間培養した。さらに、塗抹後のスワブから市販のキットを用いてDNA抽出を行った。DNAは使用時までー30°Cで保管した。2017年9月採材分ではイヌ口腔内から179菌株、ならびにヒト口腔内から157菌株を、2018年3月採材分ではイヌ口腔内から218菌株、ならびにヒト口腔内から213菌株をそれぞれ分離した(総計767菌株)。現状までのBiotyperによる菌種同定の結果、イヌ・ヒト共にナイセリア属菌、ブドウ球菌属菌、連鎖球菌属菌が主な分離菌であった。但し、いずれの菌属においても、イヌ・ヒトに共通する菌種は見つかっていない。例えばナイセリアの場合、イヌ口腔内からはNeisseria weaveriやN. zoodegmatisが、ヒト口腔内からはN. flavescensが検出されている。イヌ口腔内から、人獣共通感染症細菌であるBergeyella zoohelcumが検出された。進行状況は「おおむね順調」から、「やや遅れている」の中間程度であるとみている。「おおむね順調」と判断する理由としては、Biotyper(MALDI-TOF MSを応用し、リボソーム蛋白画分のプロファイルから迅速・正確に菌種を同定する)によって着実に菌種同定の結果が蓄積されてきている点をあげることが出来る。

その一方で、「やや遅れている」と判断する理由としては、大量の分離菌の菌種同定において、その使用が大前提となるBiotyperと、その駆動装置であるAutoflexの稼働状況が時折不安定になることがあり、作動状況の確認作業が必要となったため。そのことによって、一時的にではあるが、菌種同定のために本機材を使用出来ない時期があったことがあげられる。セラピー犬、及びその飼い主様の口腔内から分離した好気性並びに通性嫌気性細菌については犬由来668菌株、及び人由来803菌株の計1471菌株について、MALDI Biotyperによる菌種同定を行った結果、犬由来菌株では423株が属レベルで同定され、そのうち290株については種レベルで同定された。人由来菌株では774株が属レベルで同定され、そのうち711株については種レベルで同定された。犬と人の双方で認められた菌種はNeisseriaflavescens、Staphylococcus epidermidis、Sta. schleiferi、Streptococcus sanguinisなど11菌種で、このうちN. flavescens及びSta. schleiferiの2菌種はセラピー犬とその飼い主のペアで検出された。セラピー犬、及びその飼い主様の10ペアを選び、次世代シークエンサー(NGS)により得られた菌検出データとBiotyperによる同定結果を比較したところ、犬と人の双方で認められた菌種はAggregatibacter segnis、Peptostreptococcus aerobiusなど22菌種が認められた。また、NGS及びBiotyper双方における好気性並びに通性嫌気性細菌検出頻度に明らかな違いは認められなかった。特に人由来菌株において、近似性が高かった。このことから、Biotyperは人由来菌株だけでなく、動物、少なくとも犬由来菌株の同定においても有用であることが示された。現在、NGSデータについてはさらなる解析を実施中である。一方、嫌気性細菌については新たに採取したセラピー犬、及びその飼い主様の口腔内から749株を分離菌株として確保した。また、新たに通性嫌気性細菌162株を分離した。以下の理由により、(3)と判断した。セラピー犬、及びその飼い主様の口腔内細菌の検索について、好気性並びに通性嫌気性細菌についてはMALDI Biotyperによる菌種同定作業をほぼ完了した。但し、Biotyperが人由来菌株のデータを基に菌種同定を行うことから、犬由来菌株の同定結果については、16S rRNA領域のシークエンスなどによる確認同定を行い(実施中)、より確度の高いデータの収集が必要であること。セラピー犬、及びその飼い主様の10ペアを選び、双方の口腔内細菌叢について次世代シークエンサーにより得られたデータを解析中であるが、全てを整理できていないこと。一方、嫌気性細菌については1回目採材分のスワブから菌株の単離が終了し、漸くMALDI Biotyperによる菌種同定作業を開始したところで、菌種同定結果が得られていないこと。Biotyperによる菌種同定を推進し、イヌ口腔内、およびヒト口腔内細菌叢構成菌に関するデータ収集を完了させる。イヌおよびヒトの口腔内細菌叢について全体的な比較を行い、セラピー犬及びその候補犬と飼い主における細菌の動態について検証する。ヒトと動物の口腔内
テロメア反応トランスアクションの研究

CST複合体はCtc1, Stn1, Ten1の三因子からなる一本鎖DNA結合蛋白質複合体である。本複合体は出芽酵母、分裂酵母から哺乳類、植物まで保存されているが、その詳細な機能については不明な点が多かった。分裂酵母において同複合体は生存に必須であるが、本研究において我々は、先ず分裂酵母Stn1をコードするstn1遺伝子の温度感受性変異株stn1-1を取得した。次にstn1-1を許容温度、半許容温度、非許容温度において本複合体機能を低下させたときに、サブテロメアおよびリボソームRNA遺伝子における複製フォークの進行に必要なことを明らかにした。哺乳類CST複合体は、Ctc1, Stn1, Ten1からなる1本鎖DNA結合蛋白質複合体である。従来、CSTはDNA合成酵素αの活性化を介して、特にテロメアDNAの複製に必要であるとされていた。しかし、我々は以前より、CST複合体はテロメアに加えて非テロメア領域にも局在することを見出しており、CSTのテロメアに限らないゲノム全体にわたる機能が示唆されていた。本年度の本研究によって、CSTはテロメアのみならず、グアニンに富む領域、特にグアニン4重鎖構造をとる領域に局在することが分かった。Ctc1欠損マウスMEF細胞は、野生型と同程度の増殖速度を示すが、抗8オキソグアニン抗体を用いることで、ゲノム全体にわたる8オキソグアニン量が増加していることが明らかになった。8オキソグアニンはグアニン塩基の酸化によって生じ、生体内においては塩基除去修復によって修復される。質量分析法によるCST複合体と結合する因子の検索によって、XRCC1をはじめとする塩基除去修復に必要な因子が複数同定された。また、試験管内塩基除去修復反応によって、人工基質を用いた場合に、Ctc1を免疫除去した細胞抽出液は、除去していない抽出液に比べて、塩基除去修復反応効率が低いことが明らかとなった。これらの結果は、CST複合体が塩基除去修復に必要であることをはじめて明らかにしたものである。CST複合体がテロメアDNA複製以外の機能をもつことは、我々が示した従来からの知見によりある程度予想されていた。本年度の研究により、CST複合体が塩基除去修復反応に必要であることを試験管内修復反応系などの生化学的手法で示すことができたことは、本研究開始時には想定していなかった成果であり、当初の計画以上に進展していると自己評価できる。今年度は、分裂酵母テロメア結合Stn1-Ten1複合体について機能解析を行った。Ctc1-Stn1-Ten1複合体は各サブユニットがOB foldドメインをもつ1本鎖DNA結合蛋白質複合体であり、出芽酵母、動物、植物に広く保存されている。しかし、分裂酵母においては、Stn1とTen1のホモログは存在するものの、Ctc1のホモログがいまだ見出されておらず、Stn1-Ten1複合体(以下、ST複合体)として知られていたものの、その機能は明らかにされていなかった。stn1あるいはten1欠損は稀におこる自己環状化サバイバーを除くと致死であるため、まずstn1の温度感受性株stn1-1を作出同定した。stn1-1はI177MおよびM180Iの2アミノ酸置換をもち、25度では野生株とほぼ同じように増殖するのに対して、36度では増殖しないことが分かった。許容温度から制限温度に温度を変化させると、stn1-1は4時間でほとんどのテロメア配列を失なった。さらにサブテロメア配列においても、テロメア配列から30 kbにわたってテロメアからの距離と逆比例して、DNAを失っていた。このテロメア・サブテロメア欠失は、細胞をS期に入らせないようにすると起こらず、二次元電気泳動によってサブテロメアにおける複製フォークの進行停止によって起こることが明らかになった。以上の研究から、分裂酵母ST複合体は、従来知られていたテロメア配列のみならず、サブテロメア領域における複製フォークの進行に必要であることが分かった。今後、他生物のCST複合体についても同じことが言えるのか検証する必要がある。今年度においては、CST複合体(分裂酵母ST複合体)がテロメアおよびサブテロメアにおける複製フォークの進行に必要であることが明らかになった。しかし、前年度で明らかにしたCST複合体の塩基除去修復反応における役割がいまだ論文として発表できておらず、早急にまとめる必要がある。昨年度の本研究により、分裂酵母stn1遺伝子の温度感受性株stn1-1を用いて、Stn1はサブテロメア領域のDNA複製に必須であり、その機能廃絶は直ちにサブテロメアの欠失をもたらすこと、しかし欠失後の最初の細胞周期においては、DNA損傷チェックポイントは活性化を受けず細胞増殖を持続することを見出していた。三本の染色体をもつ分裂酵母において、第3染色体の両末端部分には数百kbにわたって1リピートが約10 kbのリボソームRNAをコードするrDNAがタンデムに数十リピート存在することが知られている。

今年度の本研究において、stn1-1においてはrDNAのDNA複製における複製フォークの停止が起こりやすく、その結果、DNA相同組換えが好発すること、1細胞由来のクローン集団のrDNA長を経時的に測定すると、正常対照群に比べて明らかに遺伝的不安定性を示すことを見出した。CST複合体はCtc1, Stn1, Ten1の三因子からなる一本鎖DNA結合蛋白質複合体である。本複合体は出芽酵母、分裂酵母から哺乳類、植物まで保存されているが、その詳細な機能については不明な点が多かった。分裂酵母において同複合体は生存に必須であるが、本研究において我々は、先ず分裂酵母Stn1をコードするstn1遺伝子の温度感受性変異株stn1-1を取得した。次にstn1-1を許容温度、半許容温度、非許容温度において本複合体機能を低下させたときに、サブテロメアおよびリボソームRNA遺伝子における複製フォークの進行に必要なことを明らかにした。本研究のもう一つの研究の柱である超解像度顕微鏡による細胞内テロメア構造の観察が、顕微鏡の完成に予想以上の時間を要したために、進捗が遅れ気味である。H28年度には、この研究の推進を期する。既に明らかにされているCST複合体の塩基除去修復反応における役割を論文として発表するとともに、その他のDNA修復反応に関わる可能性を検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
非正規雇用看護師の就業上のニーズに関する研究

非正規雇用看護師の就業上のニーズを、質的記述的に明らかにすることを目的とした。研究協力の得られた2施設4名の非正規雇用看護師を対象に、インタビューガイドに基づき、インタビューを実施した。調査内容は、非正規雇用を選択した理由、業務内容、就業上の困難、正規雇用看護師との連携、研修内容等とした。分析方法は、録音したデータの逐語録を作成し、一次コードとして、非正規看護師の就業上のニーズに該当する内容を抽出した。二次コードとして、類似する内容をカテゴリ化した。対象は、非正規雇用看護師4名の内、病棟勤務が3名、外来勤務が1名であった。4名全員が子育て中であり、育児と家庭との両立を理由に、一度離職した後、病院を替え、非正規雇用を選択していた。就業上のニーズとして、非正規雇用看護師が離職後、新たに就業を開始する時期は、「ブランクによる不安」「慣れない環境への戸惑い」を感じており、「部署の業務内容に応じた研修」「正規看護師に直ぐに確認できる雰囲気」を希望していた。勤務時間数が少ないことによる「患者情報不足への不安」に対して、「正規雇用看護師との情報共有」を図っていた。受け持ち業務により「時間内に帰れない」困難があるが「正規雇用看護師の理解」「先輩ママナースの存在」が働く上での安心感に繋がっていた。「今までの経験を生かす」ことや「正規雇用看護師からのプラスのフィードバック」は、看護師として働く自信に繋がっていた。また、師長からは、「雇用形態や勤務時間の調整」を受けていた。非正規雇用として働くことに「今の働き方への満足」を感じつつ、育児や家庭、今後の看護師としての働き方を考え「今後の働き方を模索」していた。本調査より、非正規雇用看護師の就業上のニーズとして、部署の業務内容に応じた研修や、「時間内に帰れない」困難に対する業務内容の調整、正規雇用看護師との連携の必要性が示唆された。平成30年度は、非正規雇用看護師へヒアリングした結果を元に、非正規雇用看護師および正規雇用看護師へ質問紙調査を実施する予定であったが、まだ実施できていない。非正規雇用看護師へのインタビュー調査から明らかになった就業上のニーズを加味した質問紙票を作成する。関東地区の病院に勤務する非正規雇用看護師約500名、および正規雇用看護師約500名へ、質問紙調査を実施する。回収率に応じて、調査規模を拡大する。質問紙調査の結果を元に、双方の就業ニーズに沿う働き方を提案する。提案先は、調査協力をいただいた病院および、学会発表や論文の投稿を行う。本研究の目的は、近年増加しつつある非正規雇用看護師の就業上のニーズを明らかにし、非正規雇用看護師が個々の能力を発揮し、正規雇用看護師と連携をとりながら、患者・家族へよりよい医療を提供するための基礎資料とすることである。研究の実施計画は、非正規雇用看護師へヒアリングを行い、質問紙を作成する。非正規雇用看護師および正規雇用看護師へ質問紙調査を実施し、双方の就業ニーズに沿う働き方を提案する。今年度は、非正規雇用看護師の就業上のニーズを明らかにするために、非正規雇用看護師へインタビュー調査を行った。調査内容は、非正規雇用選択の理由、現在の業務内容、職場のオリエンテーションや研修制度、職場のサポート、情報共有の方法等である。現在、対象者数が不足していることから、若干名追加し、必要な対象者数となり次第、分析を行う。分析結果を基に、質問紙を作成する。非正規雇用看護師は、就業の特性上、育児中の女性が大半である。そのため、インタビュー調査にかかる時間を確保することが難しく、対象者数の確保が困難であった。

本調査より、非正規雇用看護師の就業上のニーズとして、部署の業務内容に応じた研修や、「時間内に帰れない」困難に対する業務内容の調整、正規雇用看護師との連携の必要性が示唆された。平成30年度は、非正規雇用看護師へヒアリングした結果を元に、非正規雇用看護師および正規雇用看護師へ質問紙調査を実施する予定であったが、まだ実施できていない。現在、機縁法も含めて調査地域を拡大し、対象者数の確保に努めている。分析に必要な対象者数が確保でき次第、速やかに分析を行い、質問紙調査票を作成する。非正規雇用看護師へのインタビュー調査から明らかになった就業上のニーズを加味した質問紙票を作成する。関東地区の病院に勤務する非正規雇用看護師約500名、および正規雇用看護師約500名へ、質問紙調査を実施する。回収率に応じて、調査規模を拡大する。質問紙調査の結果を元に、双方の就業ニーズに沿う働き方を提案する。提案先は、調査協力をいただいた病院および、学会発表や論文の投稿を行う。調査費用として旅費を計上していたが、近隣病院の非正規雇用看護師の調査協力が得られたため、使用しなかった。次年度は調査地域を拡大し、実施するため、今年度分と合わせて調査費用として使用する。平成30年度に実施予定であった、非正規雇用看護師および正規雇用看護師への質問紙調査が実施できていないため。今後の使用計画は、郵送法による質問紙調査を実施するため、質問紙の印刷および郵送代、データの入力代に用いる。また、調査結果の報告のための旅費、学会発表等の旅費に使用する。
TRPチャネルを介したがん組織微小環境ストレスによる癌細胞形質への影響の解明

本研究では、口腔扁平上皮がん細胞において、Transient receptor potential (TRP)チャネルが機械刺激受容体として微小環境に応答することによりシグナル伝達が活性化することによって腫瘍形成に関与するのか、TRPチャネルシグナル伝達とHippoシグナル伝達が機械刺激を受容し協調的に相互作用することによってがん形成に影響を与えるのか、について検討することを目的としている。平成30年度は以下の研究結果を得た。1口腔扁平上皮がん細胞株において、siRNAを用いてあるTRPVチャネルをノックダウンしたところ、AKTのリン酸下が抑制され、増殖能が抑制された。2上記の実験にて用いたsiRNAの配列を基にshRNAを設計し、レンチウイルスを用いた感染により、恒常的にあるTRPVチャネルがノックダウンされた細胞株を樹立した。3発現抑制株においてYAP/TAZ下流転写因子Teadの標的遺伝子(CTGFまたはANKRD1)の発現はコントロール群と変わらなかった。4発現抑制株をヌードマウスに移植した(ゼノグラフトモデル)ところ、移植片の体積と重量が減少した。5この細胞株を浮遊培養、二次元培養(プラスチック培養皿)または三次元培養(マトリゲル)培養したところ、三次元培養条件下のみにてtumor sphereの大きさが減少しするとともにKi67陽性細胞数が減少した。これらの結果から、あるTRPVチャネルが口腔扁平上皮がん細胞において発現し、その発現が細胞外の環境を感知することが明らかとなった。また、あるTRPVチャネル野発現がin vitroおよびin vivoにおいて腫瘍形成に関与することが示唆された。平成28年度は以下の研究結果を得た。16種類の口腔扁平上皮がん細胞株における、あるTRPVチャネルのmRNA発現について検討した。最も高く発現している口腔扁平上皮がん細胞株において、siRNAを用いてあるTRPVチャネルをノックダウンしたところ、mRNAおよびタンパクレベルにて発現が抑制した。ウエスタンブロット法にて市販物と私共の作製物の中で最適な抗体について検討すると、私共が作製した抗体が最もバックグランドの低い特異的な抗体であることが明らかとなった。2予備的に舌がん生検標本におけるこのTRPVの発現を前述の抗体を用いて免疫染色にて検討したところ、腫瘍細胞において発現していた。しかし、まだ症例数が少ないため今後検討数を増やす必要がある。3口腔扁平上皮がん細胞株においてこのTRPVをノックダウンしたところ、増殖細胞数および運動能が減少した。また、このTRPVのノックダウンまたは特異的阻害剤を用いた機能阻害を行ったところ、特異的にある細胞内シグナル伝達のリン酸化が減弱した。これらの結果から、あるTRPVチャネルが口腔扁平上皮がん細胞において発現し、その発現が腫瘍形成に関与することが示唆された。これまで口腔扁平上皮がん細胞株におけるTRPVチャネルの発現と腫瘍形成への影響について詳細に解析されていなかった。また、あるTRPVチャネルに対する特異的抗体が入手できず、がん組織における発現について不明であった。平成28年度内の私共の研究結果から、あるTRPVチャネルに対する特異的抗体を自ら作製して入手できた。このため、来年度以降、がん組織における発現について詳細に解析できると予測される。また、あるTRPVチャネルの発現が口腔扁平上皮がん細胞株の腫瘍形成(増殖能・運動能)に関与することが明らかとなった。平成29年度は以下の研究結果を得た。1口腔扁平上皮がん細胞株において、siRNAを用いてあるTRPVチャネルをノックダウンしたところ、mRNAおよびタンパクレベルにて発現が抑制した。2口腔扁平上皮がん細胞株においてこのTRPVをノックダウンしたところ、細胞数、Ki67陽性増殖細胞数および運動能が減少した。3レンチウイルスを用いた感染により2で用いたsiRNAによるTRPVチャネルの発現および表現型(細胞数、Ki67陽性増殖細胞数および運動能)が回復した。4上記の実験にて用いたsiRNAの配列を基にshRNAを設計し、レンチウイルスを用いた感染により、恒常的にあるTRPVチャネルがノックダウンされた細胞株を樹立した。この細胞株では特異的アゴニスト依存的な細胞内Caイオンの流入が抑制された。平成29年度内の私共の研究結果から、in vitro実験系において、あるTRPVチャネルに対するsiRNAおよびレンチウイルスを用いた恒常的安定発現株を用いてその機能、すなわち増殖能・運動能に関与することが明らかとなった。またshRNAを用いた恒常的安定発現抑制株が作製できたことから、来年度以降、in vivoにおけるTRPVチャネルが腫瘍形成に与える影響について詳細に解析できると予測される。

本研究では、口腔扁平上皮がん細胞において、Transient receptor potential (TRP)チャネルが機械刺激受容体として微小環境に応答することによりシグナル伝達が活性化することによって腫瘍形成に関与するのか、TRPチャネルシグナル伝達とHippoシグナル伝達が機械刺激を受容し協調的に相互作用することによってがん形成に影響を与えるのか、について検討することを目的としている。平成30年度は以下の研究結果を得た。1口腔扁平上皮がん細胞株において、siRNAを用いてあるTRPVチャネルをノックダウンしたところ、AKTのリン酸下が抑制され、増殖能が抑制された。2上記の実験にて用いたsiRNAの配列を基にshRNAを設計し、レンチウイルスを用いた感染により、恒常的にあるTRPVチャネルがノックダウンされた細胞株を樹立した。3発現抑制株においてYAP/TAZ下流転写因子Teadの標的遺伝子(CTGFまたはANKRD1)の発現はコントロール群と変わらなかった。4発現抑制株をヌードマウスに移植した(ゼノグラフトモデル)ところ、移植片の体積と重量が減少した。5この細胞株を浮遊培養、二次元培養(プラスチック培養皿)または三次元培養(マトリゲル)培養したところ、三次元培養条件下のみにてtumor sphereの大きさが減少しするとともにKi67陽性細胞数が減少した。これらの結果から、あるTRPVチャネルが口腔扁平上皮がん細胞において発現し、その発現が細胞外の環境を感知することが明らかとなった。また、あるTRPVチャネル野発現がin vitroおよびin vivoにおいて腫瘍形成に関与することが示唆された。1口腔がん組織におけるTRPVチャネルの発現と臨床病理学的な相関について検討する。具体的には、がん病理組織を用いて、口腔がん組織(舌・歯肉等)における発現を免疫組織化学的に検討する。また、Hippoシグナル伝達の下流増殖因子YAP/TAZについて免疫染色を行い、両陽性、すなわちTRPチャネルとYAP/TAZが核に局在する症例について、その臨床病理学的な相関(がんの分化度、5年生存率、無再発生存期間等)も併せて、計50症例程度ずつ検討する。2これまでのところ、がん細胞においてTRPVチャネルが細胞外環境を感知する機械刺激受容体として機能するかは不明である。そこで、TRPVチャネルを高発現する口腔扁平上皮がん細胞株の浮遊培養、二次元培養(プラスチック培養皿)または三次元培養を行う。三次元培養では、コラーゲン、フィブロネクチン、または基底膜タンパク質(マトリゲル)基質中で培養しこれらの硬さを変化させる。がん細胞を基質上や基質内で培養し微小環境が増殖に与える影響ついて検討する。
センチネルリンパ節における微小環境および癌転移成立機構の解析とその臨床応用

癌の原発巣から多くのリンパ流がセンチネルリンパ節に流入することにより、リンパ節内リンパ管内皮細胞の生物学的特性の変化が起こり、癌細胞との接着能が亢進するのではないかという仮説を立て、私共はすでに癌転移成立機序をリンパ節内の微小環境変化の視点から研究を進めていた。具体的には、悪性度の異なるヒト癌細胞株の培養上清刺激において培養リンパ管内皮細胞表面の接着分子の発現が変化するか否か、また、生体内でもリンパ節内の接着分子発現が変化するか否かにつき検討を行ったところ、リンパ管内皮細胞表面の接着分子であるICAM-1の発現が亢進し、さらにリンパ管内皮細胞と癌細胞の接着能が亢進することも確認できた。また、センチネルリンパ節の超音波造影剤を用いたエコーでの描出法をすでに確立していたため、リンパ節内の環境変化に応じて造影剤の到達度や滞留時間が変化するよう造影剤表面にさまざまなリガンドを発現させたり、造影剤内部に抗癌剤を封入して、リンパ節に集簇する造影剤の特徴を生かし癌転移のあるリンパ節に特異的にかつ高濃度に投与できるドラッグデリバリーシステムの構築ができるよう、実験を進める予定である。さらに、研究を進めるうえで、初めにセンチネルリンパ節生検後のリンパ管再疎通現象がどのような要因により変化するか、さらには術後のリンパ浮腫が惹起される病因について、リンパ浮腫モデルとなり得る遺伝子改変マウスを用いて検討を行った。平成30年度は主にセンチネルリンパ節生検後のリンパ管再疎通現象がどのような要因により変化するかについて、正常のマウスおよびリンパ浮腫モデルとなる遺伝子改変マウスを用いて研究を進めることとした。そのために、まずリンパ管再疎通現象が最もよく観察できる手術部位と手術法、および経時的変化の解析法について検討を行った。具体的には、MonoMac症候群やEmberger症候群の原因とされるGATA遺伝子改変マウスを用い、リンパ節切除後のリンパ管の再疎通を観察した。方法は、全身麻酔下のマウスにおいて、ヒトリンパ節生検と同様の手技でリンパ節のみを摘出し、3週間後のリンパ管の状況を確認した。その結果、正常マウスではほぼ全例に再疎通が認められたが、遺伝子改変マウスにおいては再疎通の遅延が認められた。また、リンパ節切除後の肉芽を採取し、RNA発現を解析中である。さらに、どのような因子により遺伝子改変マウスのリンパ管再生遅延が改善するかについて検討を進めている。リンパ節やリンパ管描出のための造影剤開発については研究の遅れがややみられるものの、リンパ浮腫を惹起する遺伝子異常のモデル動物を用いてリンパ管再疎通現象の解析方法を確立できたことから、この点においては順調に進展している。リンパ節生検後やリンパ廓清術後のリンパ浮腫の発症を少しでも抑制できるよう、リンパ管再疎通を亢進させる因子の解析を進め、臨床応用を可能にするような基礎研究を進める。さらに、リンパ管の再生を遅延させるような環境要因を探索し、正常マウスと遺伝子改変マウスから病態解析に有用な細胞を培養系に移行し、その遺伝子発現につき解析を行いたい。リンパ管・リンパ節の可視化の点からは、センチネルリンパ節の超音波造影剤を用いたエコーでの描出法はすでに確立し、リンパ管への移行が惹起されやすい物質特性は解明されてきたため、さらにその造影剤に加工を加えることによってCT・MRIを用いたセンチネルリンパ節描出用の造影剤を開発し、臨床応用に向けて研究を進めたい。そのために、本学薬学部リポソーム研究者や薬剤の安全性に明るい研究者と共同研究を組みたいと考えており、学内の研究会で現在までの研究結果を積極的に配信していきたいと考えている。本研究チームの最大の特徴は、多角的にリンパ管の再生やリンパ流についての解析を進められるところにあるので、そのメリットを最大限に生かし進めていきたい。

平成30年度は主にセンチネルリンパ節生検後のリンパ管再疎通現象がどのような要因により変化するかについて、正常のマウスおよびリンパ浮腫モデルとなる遺伝子改変マウスを用いて研究を進めることとした。そのために、まずリンパ管再疎通現象が最もよく観察できる手術部位と手術法、および経時的変化の解析法について検討を行った。具体的には、MonoMac症候群やEmberger症候群の原因とされるGATA遺伝子改変マウスを用い、リンパ節切除後のリンパ管の再疎通を観察した。方法は、全身麻酔下のマウスにおいて、ヒトリンパ節生検と同様の手技でリンパ節のみを摘出し、3週間後のリンパ管の状況を確認した。その結果、正常マウスではほぼ全例に再疎通が認められたが、遺伝子改変マウスにおいては再疎通の遅延が認められた。また、リンパ節切除後の肉芽を採取し、RNA発現を解析中である。さらに、どのような因子により遺伝子改変マウスのリンパ管再生遅延が改善するかについて検討を進めている。リンパ節やリンパ管描出のための造影剤開発については研究の遅れがややみられるものの、リンパ浮腫を惹起する遺伝子異常のモデル動物を用いてリンパ管再疎通現象の解析方法を確立できたことから、この点においては順調に進展している。リンパ節生検後やリンパ廓清術後のリンパ浮腫の発症を少しでも抑制できるよう、リンパ管再疎通を亢進させる因子の解析を進め、臨床応用を可能にするような基礎研究を進める。さらに、リンパ管の再生を遅延させるような環境要因を探索し、正常マウスと遺伝子改変マウスから病態解析に有用な細胞を培養系に移行し、その遺伝子発現につき解析を行いたい。リンパ管・リンパ節の可視化の点からは、センチネルリンパ節の超音波造影剤を用いたエコーでの描出法はすでに確立し、リンパ管への移行が惹起されやすい物質特性は解明されてきたため、さらにその造影剤に加工を加えることによってCT・MRIを用いたセンチネルリンパ節描出用の造影剤を開発し、臨床応用に向けて研究を進めたい。そのために、本学薬学部リポソーム研究者や薬剤の安全性に明るい研究者と共同研究を組みたいと考えており、学内の研究会で現在までの研究結果を積極的に配信していきたいと考えている。本研究チームの最大の特徴は、多角的にリンパ管の再生やリンパ流についての解析を進められるところにあるので、そのメリットを最大限に生かし進めていきたい。今年度はすでに飼育中の遺伝子改変マウスを用いた実験をメインで試行したため、当初予定していた使用額を下回ることとなった。しかしながら、順調に研究が進んでいることから次年度には造影剤の改変の実験を進めることができる素地ができた。よって、今年度の繰り越し分を有効に使用することができると考える。具体的には、リンパ管再疎通を、より正確に解析するための超音波造影剤ソナゾイドやPDEカメラで探索できるインドシアニングリーンに改良を加えて局所投与し、リンパ流をリアルタイムで、より正確に確認できる手技を確立する。