hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜七回貫通型のヒト・アドレナリン受容体の結晶化とX線結晶構造解析

細胞膜をαヘリックスが7回貫通する膜七回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,細胞内にリガンド結合の情報を伝達する。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の構造をX線結晶解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目的とした。メタノール資化性酵母Pichia pastorisの発現ベクターのpPIC9K(酵母のα-ファクターの分泌シグナルを利用)をこれまで調製したが,さらに,pPIC9とpPICZαのベクターに本受容体の遺伝子を組み込んだベクターを調製し,酵母のゲノム中に挿入した発現株を作製した。受容体のヒト遺伝子には,酵母では使用されないあるいは使用頻度が低いコドン(レアコドン)が含まれることから,酵母で使用されるコドンに置き換えたコドン最適化のコンストラクトを調製し,組換え株を得た。この最適化と培養法の改良により,糖タンパク質である本受容体の発現量を向上させた。ベクターをゲノム中にできるだけ多く組み込まれたpPIC9Kマルチプルコピー株を調製し,ホストとしてSMD1168株を用いたところ,従来の蛋白質発現株に比して,さらに数倍高い発現レベルが得られた。しかし,ファーメンター装置による高密度での細胞培養では,発現が著しく減少した。一方,pPIC9株あるいはpPICZα株の培養では,高密度でも発現は良好であった。精製では,PEGを用いて受容体を沈澱させて回収,種々の界面活性剤による可溶化,アフィニティーカラム,ゲル濾過カラムなどを用いる精製条件を種々検討した。また,受容体のリガンド結合活性を検定する方法を改良し,精製試料を短時間で大量に調製し,結晶化する見通しを得た。細胞膜をαヘリックスが貫通する膜七回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,細胞内にリガンド結合の情報を伝達する。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目指した。3年次の計画の研究の初年度として,アドレナリン受容体の発現レベルの改良,糖鎖の均一化処理と精製の手順を探った。まず,既に得ていた,ゲノム中に発現ベクターを組み込んだメタノール資化性酵母を10L規模のファーメンター装置で培養し,受容体を発現させた。受容体の安定性を維持するためにアンタゴニストを培養の段階で添加し,蛋白質発現を誘導するメタノール量などを最適化し,発現レベルを高めた。発現量が培養と精製のたびに大幅に変動した。これは,放射性リガンドを結合アッセイに使用しているため,その結合性と測定の方法に起因することが判った。そこで,リガンドを膜画分に低温で長時間インキュベートすることにより,定量的にアッセイできるようにした。培養細胞を細胞破砕装置を用いて処理し,沈殿として得られる膜画分を高収率で得るための条件を調べた。破砕後に結合活性が急速に失われてしまうので,種々のプロテアーゼ阻害剤の添加,膜蛋白質の可溶化条件の検討,破砕を行う器具とその使用条件の最適化により,受容体画分の安定性を高めた。糖切断酵素を用いて,受容体に付加されている不均一な糖鎖を,効率良く均一に短糖鎖化した。これにはエンドグリコシダーゼHfが有効であった。今後は,発現ベクターの改良と,精製に用いるクロマトグラフィー条件を種々検討し,結晶化用の大量サンプル調製を進める計画である。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の三次元構造をX線結晶構造解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目的とした。本年度では,3年次の計画の研究の第2年度として,アドレナリン受容体の発現レベルのさらなる向上を目指した。本受容体の遺伝子を,メタノール資化性酵母Pichia pastorisの発現ベクターpPIC9K(酵母のα-ファクターの分泌シグナルを利用)に組み込み,ベクターを酵母のゲノムに挿入した株を得た。受容体の遺伝子には,酵母では使用されないあるいは使用頻度が低いコドン(レアコドン)が含まれ,アミノ酸残基の約50%がレアコドンに相当している。このコドン使用の相違が,低い発現レベルしかもたらさないのではないかと考えられた。そこで,これらのコドンを酵母で用いられているコドンに置き換えたコドン最適化遺伝子を調製し,発現ベクターに組み込んだ。新たな組み換え体の株について,Geneticin耐性を利用して,ベクターができるだけ多くゲノムに組み込まれた株(マルチプルコピー株)を選択した。ホストとしてSMD1168株用いたところ,従来の高発現株に比して,約10倍高い発現レベルの株を得ることができた。培地4Lあたり,およそ20mgの発現量と推定される。今後は,精製に用いるクロマトグラフィー条件を種々検討し,結晶化用の大量サンプル調製と結晶化を進める計画である。

細胞膜をαヘリックスが7回貫通する膜七回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,細胞内にリガンド結合の情報を伝達する。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の構造をX線結晶解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目的とした。メタノール資化性酵母Pichia pastorisの発現ベクターのpPIC9K(酵母のα-ファクターの分泌シグナルを利用)をこれまで調製したが,さらに,pPIC9とpPICZαのベクターに本受容体の遺伝子を組み込んだベクターを調製し,酵母のゲノム中に挿入した発現株を作製した。受容体のヒト遺伝子には,酵母では使用されないあるいは使用頻度が低いコドン(レアコドン)が含まれることから,酵母で使用されるコドンに置き換えたコドン最適化のコンストラクトを調製し,組換え株を得た。この最適化と培養法の改良により,糖タンパク質である本受容体の発現量を向上させた。ベクターをゲノム中にできるだけ多く組み込まれたpPIC9Kマルチプルコピー株を調製し,ホストとしてSMD1168株を用いたところ,従来の蛋白質発現株に比して,さらに数倍高い発現レベルが得られた。しかし,ファーメンター装置による高密度での細胞培養では,発現が著しく減少した。一方,pPIC9株あるいはpPICZα株の培養では,高密度でも発現は良好であった。精製では,PEGを用いて受容体を沈澱させて回収,種々の界面活性剤による可溶化,アフィニティーカラム,ゲル濾過カラムなどを用いる精製条件を種々検討した。また,受容体のリガンド結合活性を検定する方法を改良し,精製試料を短時間で大量に調製し,結晶化する見通しを得た。
高多型反復DNA配列を用いた家畜・家禽の分子遺伝学的解析

本研究の目的は、ウズラの連鎖地図を作成すること、褐毛和種に発生する軟骨形成不全症の原因遺伝子を同定すること、マーカー遺伝子を用いて特定の和牛の集団の遺伝的特徴を解析すること、の3点である。ウズラの連鎖地図を作成するため、マイクロサテライトDNAを豊富化した、ウズラゲノムライブラリーを作成し、ウズラのマイクロサテライトDNAのクローニングを試みた。その結果マイクロサテライトDNAを含むと思われるクローンを得たが、反復が分断されているようなものが多く、ウズラの連鎖解析における多型的なマーカーとして用いられる可能性は低いものと考えられた。褐毛和種に高頻度で発生し、産業上も重大な影響を与えている軟骨形成不全症について、発症家系を用いた連鎖解析により、疾患原因遺伝子を同定することを試みた。ウシの多型的なマーカー遺伝子であるマイクロサテライトDNAについて、同一の種雄牛に由来する49の発症個体と28の正常個体について各遺伝子座のタイピングを行い疾患の原因遺伝子との連鎖を解析したところ、ウシ第6染色体上のいくつかの遺伝子座と有為な連鎖が認められた。この染色体上にはヒトの軟骨形成不全症の1タイプの原因遺伝子FGFR3遺伝子が存在するため、本遺伝子が褐毛和種における軟骨形成不全症の有力な候補遺伝子であることが示唆された。褐毛和種の集団の遺伝的特徴を解析するために、ウシマイクロサテライトマーカーを用いての各遺伝子座についてタイピングを行った。集団内で多型性を示す189の遺伝子座では、各個体について何れも約50%の遺伝子座でホモ接合の状態となっていることが明かとなった。ホモ結合となつている遺伝子座は特定の染色体の領域に集中している傾向が認められた。以上の結果から、マイクロサテライト遺伝子座が家畜集団の遺伝学的解析を行う上での有用なマーカーとなり得ることが示唆された。本研究の目的は、反復DNA配列をマーカー遺伝子として用いた分子遺伝学的手法により、家畜、家禽の遺伝的形質の解析を行うことである。ウズラの連鎖地図を作成することを目的として、CA反復配列をプライマーとしたプライマー伸長法により反復配列を豊富化したウズラゲノムDNAライブラリーを作成し、CA反復配列をプローブとしてスクリーニングを行った。その結果、いくつかのCA反復配列を含むクローンを得たが、予想されたよりはるかに少ないクローンしか得られず、また、得られたクローンも典型的なマイクロサテライトではなく、マーカーとして用いることは困難であった。これは、哺乳類に比べて鳥類では反復配列が少ないことに起因しているものと考えられた。褐毛和種の軟骨形成不全症の疾患原因遺伝子を同定し、有効な遺伝子診断法を確立することを目的として、マイクロサテライトマーカー遺伝子を用いて、発症個体およびその近縁個体のタイピングを行い、疾患原因遺伝子のウシ染色体上の位置を同定した。さらに、ヒトおよびマウスの染色体地図と比較し、原因遺伝子の候補となるいくつかの遺伝子を特定した。ウシDNAライブラリより、上記候補遺伝子のウシにおけるクローンを単離し、その塩基配列を解析中である。比較的近交化が進んでいると考えられる特定の肉用牛の集団に着目し、集団内の任意の個体のDNAを用いて、各染色体上のマイクロサテライトDNAをタイピングすることにより集団内での各遺伝子座についての平均ヘテロ性を求め、各個体についてマーカー遺伝子のホモ化の程度を血統に関するデータより得られた近交係数と比較した。以上により、特定の和牛の集団の遺伝的な特徴の解析が可能であることが明らかとなった。本研究の目的は、反復DNA配列、特に個体間できわめて高い多型性を示すマイクロサテライトDNAをマーカー遺伝子として用いた分子遺伝学的手法により、家畜、家禽の遺伝的形質の解析を行うことである。

具体的にはウズラの連鎖地図を作成すること、褐毛和種に発生する軟骨形成不全症の原因遺伝子を同定すること、マーカー遺伝子を用いて特定の和牛の集団の遺伝的特徴を解析することの3点を目的としたが、今年度の研究では軟骨形成不全症の原因遺伝子を解析を中心に進めた。軟骨形成不全症の原因遺伝子の染色体上の位置を特定するため、ウシの各染色体に均等に分布する201のマイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析を行った。連鎖解析の対象となる家系は褐毛和種における軟骨形成不全症について同一の種雄牛に由来する71頭の発症個体、29頭の正常個体、および種雄牛を含む30頭のキャリアー個体を用いた。これらの個体のDNAを抽出し、上記マイクロサテライト用プライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたバンドにより各マーカーのタイピングを行った。上記の201のマイクロサテライト遺伝子座が褐毛和種の集団内にて多型性を示すか否かについて調べた結果、115の遺伝子座が本家系を用いた連鎖解析に用いることが可能であることが明らかとなった。そこで上記の家系において各遺伝子座のタイピングを行ったところ、ウシ第6染色体上のいくつかのマーカー遺伝子座と本疾患の発症との間に有為な連鎖が認められ、本疾患の原因遺伝子はウシ第6染色体上に存在することが明らかとなった。この染色体上にはヒトの軟骨形成不全症の1タイプの原因遺伝子であるFGFR3遺伝子が存在するためこれら遺伝子が褐毛和種における軟骨形成不全症の候補遺伝子であると考えられた。
子ども達の睡眠習慣の確立と心身の健康および学力への影響

先進国の中で最も睡眠不足だと言われる日本の子ども達の心身の健康や生活の質を向上させるために、小学生や未就学児を対象に、睡眠・生活実態調査と学力調査、および重心動揺による自律神経機能の測定を行い、それらの関連を分析した。その結果、子ども達の就寝時刻の遅延が、睡眠の質(寝つき、熟眠感、目覚めの気分)も、日中の生活(覚醒度、集中力、いらいら感、)の質も低下させることが判明した。そして子ども達の就寝時刻を遅れさせる最も大きな原因はTVやゲームであり、ついで、習い事の多さも原因となっていた。また、TVやゲームの時間は、試験の成績や健康状態とも有意に関連していた。とくに小学生では、4年生以上において生活習慣が悪化しやすいので、この時期に睡眠習慣を見直す科学的な指導が必要であるといえる。学力と生活習慣の関連では、4教科のうち、国語が最も多くの生活習慣項目(睡眠習慣、規範意識、家族関係、自尊感情など)と関連しており、また算数は、睡眠時間や食生活、健康状態と関連があり、健康状態が良いほど、思考力が必要な問題の正答率が良いことが判明した。また、起床困難を改善するために、小学4,5年生を対象に、子ども部屋に漸増光照射照明器具を設置して、その効果を検証したところ、起床時の気分や日中の気分を改善し、QOLを高める効果が認められた。最後に、学年進行とともに睡眠習慣が改善する児童と、改善しない児童の生活実態の10ヶ月間の変化を比較したところ、就寝時刻が遅延した児童ほど、日常生活(あくび、TV・ゲーム時間、服装など)も悪化し、生活の質が低下することが認められた。小学生までの間に、子ども達には、就寝時刻を乱さないように生活を見直し、TVやゲームの時間を自分で制限するなど、自分で考えて生活する力(自己管理能力)をつけることが重要であると考えられる。近年、危惧されている子ども達の心身の健康状態と体力や運動能力および学力の改善を、基本的生活習慣を見直し、発達段階に応じて生活の基本から改善することによって実現しようという総合的、体系的な研究である。とくに心身の発達の指標ともいえる睡眠・覚醒リズムの形成と、その乱れの程度から健康状態や学ぶ力・集中力を把握し、改善策を提案したい。また研究を推進する際に、子ども達の心と体や学ぶ力の状態をできるだけ簡便に、かつ楽しみながら、負担を軽減した方法で測定することを目指す。そして、より多くの子ども達の実態を把握し、それぞれの発達段階にある子ども達のQOLを最大限に向上させるための具体的対策を整理し、提案することを目的としている。本研究によって、これまでは曖昧になりがちであった家庭生活、学校教育、地域の教育力向上のために目指すべき方向性を明らかにし、子ども達の健やかな成長のためには、基本的生活習慣の確立が基盤となることを明示したいと考える。具体的には、睡眠の取り方、規則性、時間、睡眠の質等と、昼間の生活における子ども達の大脳の活動状況、集中力の持続時間、情緒の安定性等の関連を明らかにし、近年頻繁に報道される青少年の成長・発達の問題や様々な問題行動、ひいては成人の引き起こす様々な問題行動(事件・事故)の一部でも、生活構造の改善を図ることによって、解決に導けることを目標としている。子ども達の睡眠習慣の確立の遅れや未形成によって、社会的不適応や心の荒れ、学力や運動能力等への影響が現れるのではないかと考え、研究を進めてきた。本年度は、睡眠リズムを中心とした生活実態と心身状況の関連を確かめる目的で、調査研究の協力が得られた小学校において、生活実態調査、学力調査、重心動揺検査を実施し分析を行った。生活実態調査は1年生から6年生まで469名の有効票を分析した。

まず、睡眠習慣では、小学生の就寝時刻が9時台36%、10時台32%、11時以降も13%と遅い傾向が認められた。そしてこの就寝時刻の遅れが、寝つきや熟睡感、朝の目覚め、昼間の眠気、朝からのあくびなどの睡眠および生活の質に有意に悪い影響を及ぼすことがわかった。また、就寝時刻の遅れは、テレビやゲーム等の時間や、塾・習い事の回数の多さと有意に関連し助長されることも判明した。さらに、日中の遊びや運動量が少ないことも就寝時刻を遅延させる一因となり、昼間の生活の質と夜間の睡眠の質が連動することもわかった。同様に、夜更かしを助長するテレビ視聴時間は、長いほど基本的生活習慣の未確立や、集中力の低下、イライラ感などの精神面、さらに夜更かし以外の睡眠習慣の悪さとも関連が認められた。ゲーム、パソコン、メールの時間と、生活習慣および精神面についても、テレビ視聴時間と同様の傾向が見られた。学力と生活調査との関連では、3年生と6年生において就寝時刻が遅いほどテストの平均点が低くなる傾向が認められた。また、テレビやゲーム等の時間の長さは、健康状態や学力とも有意に関連していた。重心動揺検査では、全体的に男子よりも女子の方が重心同様が小さかった。就寝時刻、起床時刻よりも、熟眠感の低い児童が重心動揺が大きくなる傾向が見られた。また、生活実態調査と重心動揺の関連を分析したところ、ここでもやはり、テレビ視聴時間が長い場合と、腹痛や頭痛を訴えやすい児童において、重心動揺が大きくなる傾向がみられた。子ども達の睡眠・覚醒リズムの形成は心身の発達の指標ともいえる。そのリズムの乱れが子ども達の健康状態や学力およびQOLに及ぼす影響を明らかにするために、生活習慣と学力調査の結果を詳細に分析し、子ども達自身にも睡眠習慣の重要性を理解してもらえる教材を提案したいと考えている。とくに本年度の分析では、生活習慣の乱れは、学年進行とともに、通じ、疲れやすさ、頭痛、腹痛等の体調面に影響が顕著であることが判明した。同様に授業への集中度も学年が上がるとともに低下傾向が見られるが、とくに4年生以上で集中力低下を自覚し、心配事や不安、イライラ感も増し、少々の失敗でも気になる傾向が認められた。このように小学生期6年間の生活習慣の変化は大きいが、13年生よりも、46年生で睡眠習慣が悪化しやすくなることも判明したので、小学校3,4年の時期に生活習慣の見直しや確認の機会を家庭や学校で設ける必要性を確信した。具体的には重心動揺において、就寝時刻が早い低学年と、起床時刻が早い児童の開・閉眼前後方向の軌跡長が長い傾向がみられ、とくに閉眼前後方向では、6時前起床で25%、5時半前起床で37.5%が20mm/sの最長軌跡長となった。軌跡長については、就寝時刻よりも起床時刻と有意な関連の認められた学年が多い結果となり、自律神経系の働きとの関連であることが推察できる。熟眠感についても、有る方が無いよりも開眼実効値面積が小さく、動揺が少ないという有意差が認められた。さらにTV視聴時間が少ないほど閉眼実効値面積が小さく、3時間以上になると動揺が有意に大きくなり、腹痛や頭痛が多い体調の悪い児童も閉眼前後方向の軌跡長が有意に長かった。さらに6年生について、重心動揺検査と2007年4月に実施された全国学力調査の結果を分析したところ、国語よりも算数で、とくに知識を問う問題よりも、考察の必要な活用問題の正答率と軌跡長に関連がみられ、さらに分析を進めている。
エピゲノム脆弱性とゲノム脆弱性の観点から見た生殖・発生異常未知因子の探索

原因不明の発生異常症例から得た生体試料(胎盤、臍帯血、臍帯、末梢血等)から抽出したゲノムDNAを用い、DNAメチル化状態のスクリーニングを行った。スクリーニングには、DNAメチル化アレイ(バイサルファイト処理によって生じる非メチル化シトシンの多型を、SNPアレイを用いて網羅的に検出する手法)を用いた。生殖・発生の重篤な異常を呈する症例(次世代を生み育てることが困難な集団)では、仮にエピゲノムあるいはゲノムの病因変異が存在すれば、大部分はランダムに起こったde novo変異であると推測される。また、ゲノムと同様にエピゲノムにも多様性が存在するため、通常の解析では膨大な数の病的意義不明エピゲノム変異候補が見つかり、解析に苦慮する。実際に我々は、生殖補助医療(胚操作を含む治療行為)を受けた24症例と、自然流産12例の絨毛組織のDNAメチル化状態を評価した。症例数が少ないこともあるが、これらの群間比較では、明らかな有意差を呈する領域(生殖補助医療後の流産絨毛で特異的にDNAメチル化変化が起こる領域)は同定できなかった。そこで、我々が以前報告した手法(Kawai T, SciRep 2015)を用いてDNAメチル化外れ値検定を行い、その多寡を比較すると、生殖補助医療後の流産群で外れ値が多かった(すなわち、DNAメチル化状態が乱れていると考えらえた)。現在、外れ値を呈したプローブ周辺の遺伝子機能について、その詳細解析を継続中である。本研究は、原因不明の流産や胎児発育不全症例のエピゲノム解析とゲノム解析を行い、未知の分子病態を解明することを目的とする。ゲノム全体に複数のエピゲノム異常を有する症例(エピゲノム脆弱性を呈する症例)は、エピゲノムが乱れやすい素因を有していると予想され、それらの症例でレトロトランスポゾンの活性化とde novo挿入が起こり、ゲノム異常が惹起される可能性を検証する。ヒストン修飾やDNAメチル化等のエピジェネティックな修飾(エピゲノム)は、生殖・発生に必須の情報である。すでに様々なマウスモデルや、胎児発育不全を伴う一部の先天奇形症候群などで、エピゲノム異常がこれらの病因となることが証明されている。一方で、実際のヒト不妊症や不育症で、エピゲノム異常が証明された例は限られている。その理由として、「エピゲノムの多様性」が挙げられる。ゲノムの多様性はよく知られており、流産検体の高解像度な遺伝学的解析を行うと、膨大な病的意義不明の多型、いわゆるVariant of Uncertain Significance(VUS)が同定され、その中に仮に真の病因があったとしても確定診断に至らないことが多い。同様に、生殖・発生異常の検体をエピゲノム解析しても、多数の候補多型が見つかり、病因エピゲノム変異に辿り着くのは難しい。そこで本研究では、従来の疾患責任エピゲノム変異を探索する異常スクリーニングと異なり、我々の開発したエピゲノム異常の外れ値頻度を検出するという全く異なる戦略でエピゲノム異常スクリーニングを行う。本年度は、一塩基多型情報を利用した染色体構造解析と、バイサルファイト変換後にメチル化シトシンと非メチル化シトシン間で生じる一塩基多型を利用したDNAメチル化定量法を用い、染色体構造異常を持たず(ジェネティックな異常を持たず)にエピジェネティックな異常を有する症例のスクリーニングを行なった。初年度は、一塩基多型情報を利用した染色体構造解析を行った。数十kbの解像度でコピー数多型を検出できる同解析系では、病的意義不明なコピー数多型が多数同定されるので、我々が独自に解析して論文発表した「妊娠分娩歴および出生児に特段の異常を認めなかった日本人女性のコピー数多型参照情報」と比較し、病的意義のない多型情報を効率的に除去した。また、DNAメチル化変化のスクリーニングを行なった。確立された解析手法(バイサルファイト変換後にメチル化シトシンと非メチル化シトシン間で生じる一塩基多型を検出する手法)でハイスループット解析を行い、こちらでもこれまで我々が行ってきたインハウスDNAメチル化スクリーニングデータ(明らかなエピゲノム異常を原因としない疾患解析データを含む)を参照した。手技上の問題はなく、予定数の解析を終了した。

そこで、我々が以前報告した手法(Kawai T, SciRep 2015)を用いてDNAメチル化外れ値検定を行い、その多寡を比較すると、生殖補助医療後の流産群で外れ値が多かった(すなわち、DNAメチル化状態が乱れていると考えらえた)。現在、外れ値を呈したプローブ周辺の遺伝子機能について、その詳細解析を継続中である。原因不明の発生異常症例から得た生体試料(胎盤、臍帯血、臍帯、末梢血等)から抽出したゲノムDNAを用い、DNAメチル化状態のスクリーニングを行う。スクリーニングにはエピタイパー(バイサルファイト処理によって生じる非メチル化シトシンの多型を、質量分析器で解析する手法)あるいは、DNAメチル化アレイ(バイサルファイト処理によって生じる非メチル化シトシンの多型を、SNPアレイを用いて網羅的に検出する手法)を組み合わせ、効率的に行う。生殖・発生の重篤な異常を呈する症例(次世代を生み育てることが困難な集団)では、仮にエピゲノムあるいはゲノムの病因変異が存在すれば、大部分はランダムに起こったde novo変異であると推測される。また、ゲノムと同様にエピゲノムにも多様性が存在するため、通常の解析では膨大な数の病的意義不明エピゲノム変異候補が見つかり、解析に苦慮する。そこで、すでに論文発表済みの独自データ(正常分娩歴を有する集団のゲノム・エピゲノム情報)を利用し、エピゲノム異常とゲノム異常を同定する。さらに今後は、反復配列やレトロトランスポゾンのDNAメチル化状態を評価し、これらのde novo挿入によるゲノム変異同定法の検証を進める。これらの領域のDNAメチル化スクリーニングには、バイサルファイト処理後に次世代シークエンサーを用いたショットガンシークエンスを行う手法(バイサルファイトショットガンシークエンス法)を用いる。レトロトランスポゾンや反復配列はコピー数が多いので、通常のゲノム・エピゲノム解析より少ない情報量でDNAメチル化状態の定量が可能と期待される。これらのスクリーニングで同定した有力な候補症例は、全ゲノムシークエンスを行い、構造変異の有無を検証する。【次年度使用額が生じた理由と使用計画】当該助成金が生じた状況、及び、翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画について簡潔に入力してください。【次年度使用額が生じた理由と使用計画】
ヒト胃癌の主病巣および転移巣における癌遺伝子と癌抑制遺伝子の発現と機能解析

(1)ヒト胃癌の手術切除試料(高分化型管状腺癌および未分化型腺癌)から、それぞれRNAを抽出し、対応するcDNAライブラリーを作成した。(2)ヒト胃癌の肝転移年の手術切除標本(高分化型管状腺癌)から、同様にcDNAライブラリーを作成した。未分化型腺癌については、肝転移巣の切除試料が得られず、従ってライブラリーは作成し得ていない。(3)非癌部の胃試料より、対照とすべき正常cDNAライブラリーを作成した。(4)上記の計4種類のライブラリーについて、平均遺伝子長の検定を行なった結果、正常対照cDNAライブラリーの収量が極めて少なく、かつ平均長も短いため、これを3回作成し直した。およそ3,000塩基対を平均とするライブラリーが得られた。(5)ライブラリーをSV40プロモータを有する発現ベクタに組み換え、ラット線維芽細胞3Y1にトランスフェクトしたが、有意なトランスフォーマントを得られず、新たな癌遺伝子は得られなかった。(6)高分化型腺癌ライブラリーより、ランダムに遺伝子をピックアップし、高分化型と未分化型のそれぞれのライブラリー間に発現の差があるか否かを検討したが、調べた20種類の遺伝子のなかには差が認められなかった。(7)高分化型と未分化型のライブラリー間でサブトラクションを行なったが、サブトラクトされた遺伝子に有意なものはなかった。サブトラクションという技術で得られるほどに、発現に差のある遺伝子は存在しない可能性も否定できない。平成2年度は研究初年度であり、研究実施のための環境整備、研究試料の蓄積および遺伝子操作技術の安定性習得に努力を費やしている。(1)進行胃癌の手術症例について、それぞれの組織型(乳頭状腺癌、管状腺癌、印環細胞癌など)に従って組織片を採取し、DNAおよびRNA抽出のための試料として凍結保存している。更に転移を伴う症例においては、転移巣の組織片も凍結保存としている。試料数としては、主実験を開始するにはまだ不足なことから、平成3年度においても試料の収集、保存を続ける予定である。(2)ヒト胎盤を試料として、DNAおよびmRNAの抽出を行った。mRNAについては、およそ3000ないし5000塩基対のmRNAを安定して抽出することができ、ほぼ完全長mRNAの抽出が可能となった。胎盤抽出DNAおよびRNAは、胃癌組織との対照試料として使用する。(3) mRNAからcDNAを作成し、これを哺乳類細胞に於いて発現させ機能を解析する為に、SV40ウィルスの複製開始点を含んだ発現ベクタ-を調整した。主として岡山ーバ-グ法に従って、cDNAライブラリ-を構築する予定である。(4)現在本学ではアイソト-プを用いた実験の実施が困難な状況にあるが、平成3年度再開を目指して、試薬類、実験器具、試料などの整備を進めている。アイソト-プを用いて、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、およびディファレンシャルハイブリダイゼ-ションなどを行なう予定である。手術により切除された進行胃癌組織標本をただちに凍結させ、この癌細胞からグアニジンおよび塩化セシウムを用いた超遠心法により細胞内全RNA抽出を行い、oligo dT cellulose columnにてmRNAの精製抽出を試みた。抽出量は、胃幽門腺領域に発生した低分化型腺癌組織からは組織1g当たりmRNAは約2μg(全RNA量は50μg)であり、胃底腺領域発生の高分化型腺癌組織では組織1gについてmRNAは20μg(全RNA量として500μg)であった。すなわち、胃癌の組織型により同一方法にて抽出されるmRNA量に約10倍の差が認められた。これは低分化型腺癌においては間質細胞が豊富であり、相対的に単位体積当たりの癌細胞数が少ないことに起因すると考えられた。上記の知見より、サブトラクションを実施するための低分化型腺癌由来mRNAを手術検体より十分に入手することは現実的には不可能と判断した。そこで、in vitroでのmRNA合成を可能にするため、SP6およびT7の2つのプロモ-タ-を有し、この両プロモ-タ間にクロ-ニング領域を有するクロ-ニングベクタ-を作成した。先に抽出した2つの組織型胃癌mRNAをそれぞれcDNAに合成し、その両端にEcoRI切断部分を持つアダプタ分子を結合し、そしてこれをベクタ-に挿入して2種類のcDNAライブラリを構築した。得られたcDNAライブラリを検定したところ、およそ10^6個の組み替え体が得られ、更にcDNA長は平均2,000塩基対(最長約6,000塩基対)であることから、今後の検討に供し得るcDNAライブラリであると判定した。現在は、2つのライブラリからSP6およびT7RNA polymeraseを用いてin vitro RNA合成を行っており、更にこのmRNAと異なる組織型胃癌のcDNAとの間でサブトラクションを行い、胃癌組織型に特異的な遺伝子の同定を行う予定である。

およそ3,000塩基対を平均とするライブラリーが得られた。(5)ライブラリーをSV40プロモータを有する発現ベクタに組み換え、ラット線維芽細胞3Y1にトランスフェクトしたが、有意なトランスフォーマントを得られず、新たな癌遺伝子は得られなかった。(6)高分化型腺癌ライブラリーより、ランダムに遺伝子をピックアップし、高分化型と未分化型のそれぞれのライブラリー間に発現の差があるか否かを検討したが、調べた20種類の遺伝子のなかには差が認められなかった。(7)高分化型と未分化型のライブラリー間でサブトラクションを行なったが、サブトラクトされた遺伝子に有意なものはなかった。サブトラクションという技術で得られるほどに、発現に差のある遺伝子は存在しない可能性も否定できない。
シリルジエノールエーテル類のアルドール縮合型基転移重合における立体効果の研究

1.3種のシリルジエニルエーテルモノマー、CH_2=CR-CH=CH-OSi(CH_3)_3[I:R=H,II:R=CH_3,III:R=C_6H_5]、の臭化亜鉛を触媒とするアルドール縮合型基転移重合について研究した。これら3位置換基とは無関係に、いずれもそれぞれの幾何異性体によって大きく重合性が異なり、E体は良く分子量制御されたポリマーを与えるのに対し、Z体は重合しないことが分かった。重合開始剤であるベンズアルデヒドとの1:1アルドール付加物の形成反応でもE体からは好収率で単離できたが、Z体は正常反応生成物を与えなかった。これらの差異は開始および成長過程での末端ホルミル基/モノマー/触媒間での双環状多中心型遷移状態の形成を前提に、E/Zモノマー骨格の立体配置による適合性の差異と考えれば説明できる。2.上記3モノマーから得られるポリマーの付加様式を詳しく調べた。E体のみがポリマーに取り込まれる点では同じにも拘わらず、1,4-trans/1,4-cis付加選択比はI:100/0、II:69/31、III:17/83と異なり、1,2-付加はIにのみ約15%起こることが分かった。3位の置換基の種類によってジエン系ができるだけ長く共平面性を保持するために、基底状態での立体配座の分布は無置換のIはs-trans型が、フェニル置換のIIIではs-cis型が圧倒的に優勢である点を考慮すると、取り込まれたモノマーの立体配座が拘束されたままポリマーの立体配置が決まると見られ、ここでも上記1で提案した双環状多中心型遷移状態が最有力な説明となる。以上1、2の内容は2編にまとめて投稿し現在審査中である。3.遷移状態に関与する触媒の立体環境を変える試みも行った。一般式がC_2H_5AlCl(OR)で示される6種類のアルコキシド(例えばメントール誘導体)を合成したが、必要なルイス酸性度が不足して迅速開始にならず、基転移重合を特徴づける分子量制御は成り立たなかった。
雌の多回交尾の進化に関するbet-hedging仮説の実験的検証

雌の多回交尾は配偶者選択の一形態である。配偶者選択を行う雌が直面している問題は配偶者の質に関する情報の不確かさである。目の前の雄との交尾は繁殖の失敗につながるかもしれない。結果的に繁殖の失敗をもたらす雄を「ハズレ雄」と呼ぶが、その原因として、射精の失敗、後天的な不妊症、一時的な精子不足、突然変異や有害遺伝子、不和合因子、環境変動などが考えられる。もし雌が「ハズレ雄」1匹としか交尾しないなら家系の絶滅につながるが、複数の雄と交尾すれば危険分散(bet-hedging)を行うことができる。多回交尾は絶滅回避のための保険でありうるか?コオロギを用いた実験系でbet-hedging仮説を検証する。
新しい立体化学制御法の開発と有用生理活性物質合成への応用

最終年度は、以下に要約する5つの研究成果を得た。(1)ニレプロスとはプロスタサイクリン安定類緑体であり、新していタイプの抗潰瘍剤として期待されている物質である。しかしながらその工業的合成法に難があった。我々は、共役ジエンのパラウジウムー炭素触媒による還元ー異性化反応を見いだし、本手法を用いてニレプロストの大量合成法を確立した。(2)上記手法は、ニレプロストの関連関質であるエステル置換プロスタサイクリンの合成にも適用することができた。(3)シリルジエノ-ルエ-フルは、ジ-ルス・アルタ-反応のジエンとして活用されている物質であるが、その立体化学を制御した合成はこれまでのところかなり因難であった。我々は、ナフタレンクロムトリカルホニル錯体を用いた共役ジエンの高選択的異性化反応により、本問題点を解決した。(4)βーアミノチオ-ルエステルからβーラクタムを合成する手法の開発は、抗生物質合成上極めて重要な工程である。我々は、本問題点をコッパ-トリフレ-トを活性することにより解決し、βーラクタム抗生物質の合成をかなり容易なものとすることができた。(5)触媒的不斉合成の開発は、現代の有機合成化学の研究中大きな研究課題の一つである。我々は、触媒的不斉合成のうち、炭素ー炭素結合生成反応に焦点を紋り検討を続けてきたが、平成元年度においてヘック反応を適用する触媒的不斉炭素ー炭素結合生成反応に成功し、本手法を用いて二環式化合物の触媒的哲斉合成に成功した。今後は、天然物の触媒的不斉合成への応用、モルヒネの触媒的不斉合成へ展開してきたいと考えている。本研究課題中,昭和62年度は, 2つの研究プロジェクトで大きな成果をおさめることができた.以下,順次概要を記す. 1.新しい世代のβーラクタム系抗生物質として期待されているカルバペネムおよびペネム抗生物質は,合成による生産が必須である.これら2つの抗生物質合成上の録中間体は, 4ーアセトキシー2ーアゼチジノン誘導体3である.今回,我々は,安価なる(R)ーヒドロキシ酪酸より3を効率よく合成するルートを開発した.鍵となっている反応は,ボロンエノラートーイミン縮合反応と2から3への電解酸化反応である.2.ニレプロスト6は,新しいタイプの抗潰瘍剤として,現在開発段階にある.しかしながら,未だ優れた合成法は開発されておらず, 6の合体法開発研究は,極めて意味のある研究テーマである.6合成上の最大の問題点は,シアノ基が置換したエノールエーテルの立体化学をいかに望みの形に制御するかである.我々は,今回,共没ジエン4を水素下pdーcで還元ー異性化させる新反応を開発し, 6の高効率合成法を開発した.1.シアノ基置換エキソシクリックエノールエーテルの高選択的合成法の開発上記エキソシクリックエノールエーテルは、抗潰瘍剤として開発段階にあるニレプロスト3に含有される官能基であり、高効率合成法の開発が望まれていた。この点を念頭に置き、一般性のある方法論を確立すべくまず2の高選択合成法を詳細に検討した。種々検討した結果、共役ジェン1を水素気流下Pd-Cで還元を行なうと、収率よくしかも高い立体選択性で2が生成することを見い出した。本反応を利用してニレプロスト3の高効率合成法も確立することができ、工業的合成法への展開を期待しているところである。2.シリルジエノールエーテルの高選択的合成法の開発naphthalene・Cr(CO)_

3錯体を用いる共役ジエンの立体特異的異性化反応を利用して5のタイプのシリルジエノールエーテルの100%立体選択的な合成法を確立した。本タイプのシリルジエノールエーテルの高選択的合成法はこれまで見い出されてなく、今後の合成的展開が期待される。一例としてDicls-sider反応への応用(4a+6→7)を以下に示す。平成元年度は、以下に要約する5つの研究成果を得た。(1)ニレプロストはプロスタサイクリン安定類縁体であり、新しいタイプの抗潰腐剤として期待されている物質である。しかしながらその工業的合成法に難があった。我々は、共役ジエンのパラジウム-炭素触媒による還元-異性化反応を見い出し本手法を用いてニレプロストの大量合成法を確立した。(2)上記手法は、ニレプロストの関連物質であるエステル置換プロスタサイクリンの合成にも適用することができた。(3)シウルジエノ-ルエ-テルは、ジ-ルス・アルダ-反応のジエンとして活用されている物質であるが、その立体化学を制御した合成はこれまでのところかなり困難であった。我々は、ナフタレンクロムムトリカルボニル錯体を用いた共役ジエンの高選択的異性化反応により、本問題点を解決した。(4)β-アミノチオ-ルエステルからβ-ラフタムを合成する手法の開発は、抗生物質合成上極めて重要な工程である。我々は、本問題点をコッパ-トリフレ-トを活用することにより解決し、β-ラフタム抗生物質の合成をかなり容易なものとすることができた。(5)触媒的不斉合成の開発は、現代の有機合成化学の研究中に大きな研究問題の一つである我々は、触媒的不斉合成のうち、炭素-炭素結合生成反応に焦点を絞り検討を続けてきたが、平成元年度においてヘック反応を適用する触媒的不斉炭素-炭素結合生成反応に成功し、本手法を用いて二環水化合物の触媒的不斉合成に成功した。今後は、天然物の触媒的不斉合成への応用、モルヒネの触媒的不斉合成へ展開していきたいと考えている。
動物モデルを用いたうつ病の病因と治療についての研究

うつ病の病因・治療にbrain-derived neurotrophic factor(BDNF)が関与していることが明らかとなってきている。本研究ではBDNF以降の細胞内情報伝達系のひとつであるmitogen-activated protein kinase(MAPK)系のうつ病への関与を検討した。最も有効なうつ病治療である電気けいれん療法の動物モデルを用いた。まず、抗うつ効果との関連が示唆されている海馬歯状回での神経新生に対する電気けいれんとMAPK阻害の効果を調べた。単回の電気けいれんにより海馬歯状回の新生細胞数は2倍に増加していたが、U0126の前投与により、その増加は有意に抑制された。また、U0126投与反対側の海馬歯状回においては抑制を認めなかった。続いて、神経細胞マーカーであるNeuNを用い、新生細胞の細胞分化に対する影響を検討した。電気けいれん、U0126による神経細胞分化の割合に変化はなく、新生細胞の多くは神経細胞に分化していた。さらに、行動学的にMAPE系の関与を検討するため、強制水泳試験における電気けいれんとMAPK阻害の効果を検討した。電気けいれんにより強制水泳時の無動時間は、対照群と比較し短縮していた。U0126を両側海馬に前投与することにより、電気けいれんによる無動時間の短縮効果は対照群と同等まで抑制された。一方、自発運動量は電気けいれん群、U0126前処置群でも差はなかった。これらの結果より、電気けいれんによる海馬歯状回の神経新生増加および行動学的な抗うつ効果が、MAPK系を介していることが明らかとなった。このことはヒトのうつ病にも鮎PK系が重要な役割を果たすことを予想させる。また、MAPK系を特異的に活性化する薬物は、新しい抗うつ薬となる可能性を持つと考えられる。Mitogen-activated protein (MAP)kinase系のうつ病への関与を検討するため、うつ病治療のひとつである電気けいれん療法の動物モデルを用いた。電気けいれんのラット海馬歯状回での細胞新生に対する効果とMEK阻害薬の前処置の効果を調べた。まず、MEK阻害薬U0126をラット片側海馬歯状回に局所投与することで同側のextracellular signal-regulated kinase(ERK)1、2の電気けいれんによるリン酸化亢進がほぼ完全に抑制されることを確認した。ラットにU0126あるいは溶媒を一側海馬歯状回局所投与後、電気けいれんあるいは通電無しの疑似処置を与えた。その後、bromodeoxyuridine(BrdU)を投与し、新生細胞DNAをラベルした。4週後、灌流固定し、抗BrdU抗体を用いて免疫染色を行い、新生細胞を定量化した。溶媒投与けいれん無しでは1858±232cells/DG、けいれん有りでは3672±446cells/DGと単回の電気けいれんにより海馬歯状回の新生細胞数は2倍に増加していた。MEK阻害薬の前処置+けいれんでは2489±184cells/DGであり、その増加は有意に抑制された。また、対側の海馬歯状回においては電気けいれんにより細胞新生はおよそ4倍に増加していたが、U0126投与による抑制効果は見られなかった。このことにより、電気けいれんによる海馬歯状回の新生細胞増加がMAP kinase系を介していることが示された。今後は得られたサンプルを用い各種細胞マーカーを調べることによりMEK阻害薬の海馬での細胞分化に対する影響を検討する予定である。また、強制水泳試験など抗うつ効果に関連する行動の変化を検討していきたいと考えている。
アデール上の確率過程の解析

アデール環上のマルコフ過程を構成し,その各p成分のp進整数環からの脱出時刻と、脱出時刻におけるp成分のp進ノルムの分布を解析した。また、アデール値マルコフ過程の有限整アデールからの脱出時刻の分布を決定した。それらの脱出時刻および脱出時刻のp成分のp進ノルムを用いて、リーマンのゼータ関数をはじめとするオイラー積表示をもつ関数の表示を行った.さらに、リーマンのゼータ関数のある点とその複素共役における値,あるいはその実部における値との関係についての関数等式を導いた.20072008年度に、アデール上のマルコフ過程の構成と、その特性量の計算を行う.2009年度にマルコフ過程を用いたゼータ関数やオイラー積の表示について研究する.2010年度には,得られた表示式を応用した関数解析を進める.アデール環上のマルコフ過程を構成し,その各p成分のp進整数環からの脱出時刻と、脱出時刻におけるp成分のp進ノルムの分布を解析した。それらの脱出時刻および脱出時刻のp成分のp進ノルムを用いて、リーマンのゼータ関数をはじめとするオイラー積表示をもつ関数の表示を行った.さらに、リーマンのゼータ関数のある点とその複素共役における値,あるいはその実部における値との関係についての関数等式を導いた.素数pについて、固定した半径r(p)のp進円板の集合S(p,r(p))を考える。各素数pごとに、S(p,r(p))からひとつの円板を選んでそれらの直積として表されるようなp進体の直積空間IIQpの部分集合の全体D({r(p)})は可算集合であるが、まず、D({r(p) })の上にコルモゴロフの微分方程式の解としてマルコフ過程を構成した。各p進円板の半径r(p)を0に近づけるとき、このマルコフ過程の極限として、直積空間IIQpの上のマルコフ過程が得られる。この過程はただその存在が示されたのみでなく、すでに研究されているp進体上の加法過程の独立な直積であることが分かり、したがって推移確率が明示的に与えられる。さらに、ある条件の下で、この過程がp進体の整数環に関する制限直積A'中の点から出発するとき、すべての時刻において過程がA'上に存在することを証明し、したがって、これに任意の実数値マルコフ過程をつけ加えて、アデール環上の確率過程が構成された。特に各p成分が準安定過程である場合に着目し、そのp進単位円板からの脱出時刻に関係するある確率変数の期待値が、オイラー積の収束領域においてリーマンのゼータ関数を与えることを示した。この表示式から、複素数sと、その実部や複素共役におけるゼータ値の比が簡潔に表現される。また今後、この式を用いて、ゼータ関数をアデール環上の確率過程の確率論的性質で記述し、解析する方法を確立できることが期待できる。また、この手法は他のゼータ関数やL関数にも適用することができると考えられ、これらの関数の解析にも応用できると考えられる。アテール環を可算無限個のp進円板の直積に分割し、それらを状態空間とするマルコフ連鎖を、微分方程式の解として得た。円板の半径を無限小とする極限をとることにより、アデール上のマルコフ連鎖が構成され、そのp成分は従来のp進値マルコフ過程であることが示された。またその特別な場合として、アデール上の準安定過程が構成された。この準安定過程について、整アデールからの脱出時刻を求め、それがオイラー積表示をもつ複素関数と興味深い関係にあることが分かった。各p成分のp進整数環がらの脱出時刻も、リーマンのゼータ関数のオイラー積と関連することが分かり、これらの結果を論文として投稿し、受理された。一方、視点を局所体に戻すと、p進整数環と1対1に対応するユークリッド空間内の自己相似図形の上のジャンプ過程を構成できる。つまり、自己相似図形のそれ百身との直積空間から対角線を除いた集合の上に確率測度が構成され、それをジャシプ測度とするマルコフ過程が存在するか否かの判定条件(必要十分条件)を与えることができた。カントール集合について得られたこの結果は、シルピンスキー・カーペットなどの平面内のフラクタル図形にも拡張でき、さらにはより一般に、正多角形からその縮小図形をいくつか多角形内に配置し、その補集合を切り抜く作業を無限に繰り返して得られる「ダスト」図形に一般化できた。この中には、シルピンスキー・ガスケットなども含まれる。縮小図形が多角形の頂点にのみ配置される場合には、図形のハウスドルフ次元とp進上の準安定過程の指数の間に、密接な関係があることも判明した。2008年度までに構成したアデール準安定過程のいくつかの領域からの脱出時刻を用いたリーマンのゼータ関数,およびオイラー積表示をもつ一般の複素数値関数の表現式を得た.これはまず,脱出時刻の分布式の形に注目し,目標とする関数に応じて準安定過程の指数を適切に選ぶことによって成し遂げられた.この表現式が、今後アデール上の確率解析の手法を用いて数論的関数を解析するための基礎となる.上で得た複数の表示式を比較することにより,リーマンのゼータ関数に関するいくつかの関数等式を得た.

これは従来の関数等式と異なり,複素数とその共役複素数での値や,複素数とその実部での値の間の関係を記述している.こうした関数等式も,関数の解析を進める上で大きな足がかりになると期待できる.さらに,リーマンのゼータ関数の非零領域と密接に関係するチェビシェフ関数が,アデール上の準安定過程の有限整アデールからの脱出時刻の分布を用いて表されることを発見した.このことから,ゼータ関数の非零領域の問題が,アデール上の準安定過程の列における脱出時刻の期待値の漸近挙動として表現できることが分かった.すなわち,ゼータ関数に関する未解決問題がアデール上の確率過程の列に関する命題と同等であることが示されたため,確率解析の手法を応用して数論的命題にアプローチできる可能性が得られた.この同値関係は,確率過程の脱出時刻の期待値という単純な式で与えられるため,具体的な解析ができる見込みは十分にあると考えられる.本研究では、前年度までに、有理数体上のアデール環を状態空間とするマルコフ過程を構成した。22年度には、その有限整アデールからの脱出時刻を用いた数論的関数の表現を実現した。過程の構成のために以前に得ていたマルコフ連鎖の最初のジャンプ時刻が、すなわち、この研究で必要となるマルコフ過程の有限整アデールからの脱出時刻Tとなることから、その分布およびジャンプ直後の位置の原点からの距離dの分布を計算により求めることができた。この構成法で得られた過程では、各p成分が互いに独立となることから、dの期待値やモーメントがpに関する積の形を取ることが判明した。この事実を利用し、リーマンのゼータ関数をはじめとするオイラー積表示を持つ数論的関数について、Tやdの期待値やモーメントによる表示式、さらには関数等式をいくつか得ることができた。これらの途中経過と成果について、国内で開催された国際研究集会とセミナーで講演し、論文にまとめ発表した。また、この研究をさらに発展させるため、上述のマルコフ過程の再帰性などの確率論的性質についてより詳細な計算を行い、その特有の性質を利用した数論への応用について考察した。関連した研究として、2次元ユークリッド空間上のultrametricなジャンプを持つマルコフ過程の正則性について、共著論文として発表した。さらにこの過程について、非正則な場合のpathの特徴と生成作用素の固有値について解析を行い、従来になかったタイプの過程としての特性が判明した。
光渦励起パラメトリックレーザーに立脚するトポロジカル非線形光学

光渦パラメトリックレーザーにおけるシグナル光とアイドラー光の感じるパラメトリック利得を積極的に非対称にすることで、シグナル光のトポロジカルチャージを多値(励起光のトポロジカルチャージが1に対して、0, 1, 2の3値)に変調できることを発見した。また、1オクターブを超える波長可変幅(0.67um - 2.57 um)を持つ光渦の発生を実証した。さらに、シグナル光とアイドラー光の差周波光をZnGeP2結晶もしくはAgGaSe2結晶を用いて発生させることで、6-18umの中赤外域全域で波長可変ができる中赤外光渦レーザーを実現した。パルスエネルギーは0.1-0.4 mJに達した。円筒座標系の周期的境界条件に由来する量子数(トポロジカルチャージ)は光渦の軌道角運動量を決定する基本パラメーターである。本研究は、光渦励起パラメトリック発振器(光渦パラメトリックレーザーと呼ぶ)においてトポロジカルチャージ分配則で決まる光の軌道角運動量の本質を解明する。また、フォノンポラリトンへトポロジカルチャージを分配することで波面変調技術が確立されていない中赤外テラヘルツ波帯の波長域において光渦を自在に発生する。平成27年度はナノ秒グリーンレーザーを1次光渦に変換して非線形光学結晶LiB3O5(LBO)結晶からなる光渦パラメトリックレーザーを励起し、発振したシグナル光、アイドラー光がともに非整数光渦(トポロジカルチャージ0.5)になることを実証した。また、光渦パラメトリックレーザーの共振器を安定共振器にすること、シグナル光だけを発振させる単共振型共振器にすることで、ガウスモードと1次ラゲールガウスモード間の「デコヒーレンス」を誘導し、0.7um1.9umのオクターブを超える波長可変範囲を持つ光渦パラメトリックレーザーの開発に成功した。発振した光渦のパルスエネルギーは波長可変範囲全域で0.2mJを超えた。さらに、非線形光学結晶KTiOPO4(KTP)結晶を用いた光渦パラメトリックレーザーとZnGeP2結晶による差周波光発生によって2-12um帯で波長可変な中赤外光渦発生にも成功した。平成27年度はナノ秒グリーンレーザーを1次光渦に変換してLiB3O5(LBO)結晶からなる光渦パラメトリックレーザーを励起し、発振したシグナル光、アイドラー光がともに非整数光渦(トポロジカルチャージ0.5)になることを実証した。また、光渦パラメトリックレーザーの共振器を安定共振器にすること、シグナル光だけを発振させる単共振型にすることで、ラゲールガウスモード間の「デコヒーレンス」を誘導し、0.7um1.9umのオクターブにも及ぶ波長可変域を持つ光渦パラメトリックレーザーの開発に成功した。発振した光渦パルスエネルギーは波長可変範囲全域で0.2mJを超えた。さらに、KTiOPO4(KTP)結晶を用いた光渦パラメトリックレーザーとZnGeP2結晶による差周波光発生によって2-12um帯で波長可変な中赤外光渦発生にも成功した。当初の目的である中赤外光渦発生はすでに達成した。今後はより長波長における遠赤外テラヘルツ波帯の光渦発生を目指す。本研究では、光渦励起パラメトリック発振において、1「通常の量子論ではありえない非整数のトポロジカルチャージを持つ光渦がなぜ発振するのか?」2「整数のトポロジカルチャージを持つ光渦が発生する条件は何か?」3「シグナル光波長が励起光波長に近づいた場合にフォノンポラリトンへトポロジカルチャージが分配できるのか?」を解明する。「励起光のトポロジカルチャージが2つの光(シグナル・アイドラー)にどのように分配されるのか?」未だ大きな謎である。本研究はトポロジカルチャージ分配則で決まる光の軌道角運動量の本質を解明する。また、フォノンポラリトンへトポロジカルチャージを分配することで波面変調技術が確立されていない中赤外テラヘルツ波帯の光渦を自在に発生する。本年度は、励起光スペクトル線幅、非線形パラメトリック利得、共振器フレネル数をパラメーターにして、励起光のトポロジカルチャージがシグナル光、あるいは、アイドラー光へ転写する条件を実験的に解明した。その結果、0.62.6umの3オクターブを超える波長可変幅を有する光渦パラメトリックレーザーを開発するとともに、シグナル光、アイドラー光の波長が縮退する近傍の領域で、非整数のトポロジカルチャージを持つ光渦が発生することを観測した。さらに、6-18um帯波長可変中赤外光渦発生にも成功した。本研究では、光パラメトリック発振におけるトポロジカルチャージ分配則を体系づける統一的研究「トポロジカル非線形光学」を確立した。また、波面変調素子が乏しい中赤外域(6-18um)でミリジュールに迫る実用性の高い光渦光源の開発に成功した。これらの光源開発技術を用いて、新奇物質科学カイラル・フォトニクス(生体分子のカイラル構造体・高分子結晶の構造的カイラリティー制御・超解像テラヘルツ顕微分光)への展開が可能になる。円筒座標系波動方程式の固有解であり螺旋波面を持つ光渦は、軌道角運動量とドーナツ型光強度分布の二つの特徴を持つ。