hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
走査プローブ法による1生体分子操作・計測に最適な分子操作・計測に最適な分子固定法

本年度はまず、原子間力顕微鏡の探針への分子固定等を目的とするパターン化基板の作製を行った。位置決めをするための基板裏面へのパターニングと、分子固定のための表面へのパターニングの両方を施すという、従来にはなかった基板設計を行い、まず裏面へのパターニングについて試作品を作製、特許出願した。これに関連して、高分子薄膜上への原子間力顕微鏡を用いたナノパターニングも行い、学会・査読付論文発表を行った。探針先端に分子を固定するための基板としては、ディップ・ペン法のためのインク・ウェルが米国のグループからされているが、これは微量ではなくむしろ十分量の分子を吸着させるためのものである。従って、本研究で開発したパターン化基板は、独自性の高いものと考えられる。次に、目的の分子を探針先端に自由度を持たせて固定するためのスペーサー分子として、末端をビオチン等で修飾した3種類の2本鎖DNAを設計した。このスペーサーを介して分子認識能を持った分子を結合させることで、結合分子数の制御や、分子の活性維持、分子認識部位の表面への露出がしやすくなると考えられる。設計したDNAはPCR法によって合成し、電気泳動、顕微鏡観察等によって評価し、またビオチン化末端についてはストレプトアビジンとうまく結合することを確認した。次は上述の基板と組み合わせて、探針への分子固定を試みることになる。昨年度実施した1マイクロリットル試料からのセンシングの成果については、昨年度中に学会発表を行ったが、今年度はさらに査読付投稿論文としても発表することができた。3年計画の初年度に当たる16年度は、微量試料を原子間力顕微鏡(AFM)プローブに吸着・結合させる可能性のある方法を複数試した。まず、1マイクロリットルの極めて微量な懸濁液に含まれる大腸菌をAFMプローブに吸着させて検知させた。最終的には分子の吸着が目的であるが、吸着結果の評価をたやすくするため、まず菌体を用いた。実際の実験では疎水性の基板を作製し、懸濁液が基板表面に散逸しない工夫を行って、そこにAFMプローブをわずかに接触させることで微量な菌体を吸着させた。光学顕微鏡下でプローブの動きを確認しながら作業を行うことで、プローブの片面だけに菌体を吸着させることに成功した。菌体濃度を調節し、まばらに菌体が吸着する条件を見いだして吸着量をコントロールすることができた。吸着した菌体量をAFMカンチレバーの共振周波数から求めるバイオセンシング実験にも成功した。このほか、分子レベルでの実験を行うため、プローブ表面での自己組織化膜形成を行い、膜の形成前後での質量変化の測定をも試み、同様の方法で検知することができた。これらの結果については現在論文投稿中である。また、これとは別のアプローチとして、AFMのリフトモードと呼ばれる機能を応用して、一つの物体だけを直接プローブに吸着させる実験も行った。この手法では、DNAをプローブに吸着させた例が既報告にある。本研究では最初の試みとして、蛋白質をコートしたナノ粒子をプローブに取り付けることを試みた。結果は、プローブによる粒子の操作はある程度できたが、しっかり固定することは簡単でなく、なお改良が必要と考えられる。今後は、一分子の選択的な吸着・結合実験へと進めたい。
虚血性脳障害の修復過程におけるエンドセリンの役割

我々は、エンドセリン(ET)-1がラット初代培養グリア細胞(アストロサイト)に対して増殖作用(^3H-Thymidine uptakeの亢進)を持つことを見いだした。このET-1の増殖作用の発現にはET_B受容体刺激が介在しており、その際にPI代謝回転の亢進、Mitogenactivated protein kinase(MAPK)の活性化およびプロトオンコジーン、c-fosの誘導促進が観察された。そこで、脳損傷後の組織修復の過程に見られるアストロサイトの脱分化・増殖に際してET-1が重要な増殖因子の1つとして働くことが予想された。この点を明らかにするべく、coldinjuryによるラットの一過性虚血モデルを用いて検討を加えた。その結果、1)cold injuryにより、幼若化したグリア細胞を特異的に認識する抗体に対して陽性の細胞が、injury後1日から損傷部位に出現し2週間には反応性アストロサイトとして確認された。2)cold injury後、損傷部位の水溶性分画(brain extract)を経時的に調製し、初代培養グリア細胞(アストロサイト)に与えたところ、normal brainから調製したbrain extractではアストロサイトは分化形態を示したが、cold injuryb後13日後のbrain extractでアストロサイトは^3H-Thymidine uptakeの亢進を示し、増殖した。しかし、ETのC末を認識し、その作用を中和するモノクローナル抗体で、1日後のbrain extractによる増殖作用は有意に抑制された。3)injury後1日の損傷部位でET-1mRNAの発現が認められるとともに、組織中のET-1量も増加していた。これらのことから、ET-1は虚血性脳障害後のグリア細胞の脱分化、増殖に対し、その初期にgrowthfactorとして生理的役割を果たすことが示唆された。
遊離脂肪酸受容体GPR120遺伝子欠損マウスを用いた肥満と骨代謝の関連性の検討

H30年度の研究により、in vivoにおけるLPSにより誘導される破骨細胞形成が、GRR120刺激により抑制されるという成果を得ることができた。またin vitroにおいてもTNF-αにより誘導される破骨細胞形成がGRR120刺激により抑制されることが分かった。これまでに、in vitroにおいてRANKLに誘導される破骨細胞形成がGPR120アゴニストにより抑制されることは分かっていた。H30年度の研究では、野生型マウス由来破骨細胞前駆細胞において、RANKLおよびTNF-αにより誘導される破骨細胞形成がDHAにより抑制されたのに対し、GPR120ノックアウトマウスではこの抑制効果が確認できなかった。このことから、RANKLおよびTNF-αにより誘導される破骨細胞形成はGPR120刺激により抑制されることが明らかになった。また、in vivoにおいて頭蓋骨にLPSを5日間投与し、破骨細胞形成を検討した実験において、野生型マウスではDHAを同時に投与すると破骨細胞形成が抑制されたのに対し、GPR120ノックアウトマウスではこの抑制効果が認められなかった。以上のことから、in vivoにおけるLPSにより誘導される破骨細胞形成はGPR120刺激により抑制されることが明らかになった。さらに、in vitroにて腹腔内マクロファージにLPSを加えて培養した際、TNF-αmRNAの発現が上昇したが、DHAを同時に投与するとこれが抑制された。この際、GPR120アンタゴニストのAH7614を同時に投与することでTNF-αの発現は再び上昇した。以上から、LPSにより誘導されるTNF-αの発現上昇は、GPR120を介して抑制されることが明らかになった。in vivoにおけるLPSにより誘導される破骨細胞形成およびin vitroにおけるRANKLおよびTNF-αにより誘導される破骨細胞形成がGPR120刺激により抑制されることを明らかにすることができた。計画通りに進んでいる。これまでにin vivoにおいてLPSにより誘導される破骨細胞形成、in vitroにおけるRANKLおよびTNF-αにより誘導される破骨細胞形成がGPR120刺激により抑制されることが明らかになった。今後は、骨芽細胞におけるGPR120の機能解析をすすめていく。また、野生型マウスおよびGPR120KOマウスにて矯正学的歯の移動実験を行い、歯の移動量、圧迫側における破骨細胞形成、牽引側における骨形成の検討を行い、矯正学的歯の移動における肥満およびGPR120の働きについて明らかにしていく。全受領額使用しています。
医師卒後教育でのコミュニケーション技法・患者接遇法の確立

小児科卒後研修に関するアンケートを全国大学小児科教室に実施。回答率76.8%(63/82)。患者接遇法・コミューケーション技法など「医師の態度」に冠する教育を行っているのは67.2%。時期は小児科研修前か直後が殆ど(95.1%)で、教育時間としては23時間が多かった(35.7%)。方法は講義(87.8%)・実地見学(22.0%)が主であった。このアンケートをもとに、情意教育・態度学習・患者接遇法教育・臨床医学倫理学等の研修を積極的に取り入れた研修カリキュラムを作成し、パイロット研修を行った。施行し判明した問題点は、技術面より知識面の不足で、特に基本的知識の習得不足であった。次に卒前臨床研修中の5年生にアンケートを実施。患者さんとの接遇、コミュニケーションをとること、問診をとること等に自信があるか?に対しては、自信があるとしたのは11%のみで、18%はないと回答。実習中に、患者さんとの接遇・コミュニケーションで、困ったことがあるか?に対しては、75%が困ったことがあると回答。どのような教育方法が有意義か?では、実地見学(86%)、模擬患者利用(65%)、ロールプレー(47%)、ビデオ(35%)の順であった。これらをもとに研修カリキュラム改訂版を作成施行。研修医からのカリキュラムへの評価は、患者さんとのコミューケーション・接遇を実践していく上での基礎的知識・技術の確認ができ、また研修前後で客観的に自己評価できたこと、教育スタッフ、コメディカルスタツフとの相互評価が行えたことが好評であった。しかし卒前教育を含めまだ教育技法・研修内容等十分ではなく、さらに研究・改訂しなければならない。研修教育資料面では、近年各大学においてクリニカルクラークシップ、OSCE等が実施されるようになり、医学教育関係の参考書が多く刊行され、それらを中心に選定、収集を行った。小児科における卒後研修(特に外来小児科学研修)に関するアンケート調査(郵送)を全国の大学小児科教室(82大学小児科教室主任教授宛)を対象に実施。このアンケートに、特に患者接遇法・コミュニケーション技法など「医師の態度」に関する教育の項目を設けた。アンケート内容は、上記の他、研修医の研修方式、卒後研修カリキュラムの有無、大学病院で可能・不可能な研修分野、大学病院での外来小児科学の研修状況等である。回答率は、76.8%(63/82)。患者接遇法・コミュニケーション技法など「医師の態度」に関する教育を行っているのは67.2%。その時期は、小児科研修前か直後が殆ど(95,1%)で、教育時間としては23時間が最も多かった(35.7%)。教育担当者は教授が最も多く(51.2%)、研修医指導医、病棟医長(副医長)の順であった。教育方法としては、講義(87.8%)・実地見学(22.0%)が主で、ロールプレー、模擬患者、ビデオを回答したのは各々1-2施設だけであった。なお研修方式は、小児科のみ研修するストレート方式が最も多く35.5%。成文化した卒後研修カリキュラムがあるのは、準備中も含め72.9%。大学病院での研修対象疾患にかたよりがあると回答したのは43.3%であり、研修できない分野上位3つは、予防接種、乳幼児健診、心身症の順であった。

77.0%が大学病院研修に外来小児科学の研修が必要とし、66.8%が現在研修可能であると回答。上記のアンケート調査結果を基礎とし、小児科卒後研修で特に情意教育・態度学習・患者接遇法教育・臨床医学倫理学等の研修を積極的に実施している施設のカリキュラム及び一部その研修教育担当者の意見を参考に、小児科卒後研修カリキュラ.ムの検討を行った。またより効果的な教育法としてのビデオ、ロールプレー、模擬患者等の積極的な取り入れのための各種教育資料の収集を開始した。昨年度実施した全国の大学小児科教室を対象にした「小児科における卒後研修(特に外来小児科学研修)に関するアンケート調査」等を参考とし、小児科卒後研修に情意教育・態度学習・患者接遇法教育・臨床医学倫理学等の研修を積極的に取り入れた研修カリキュラムの検討・作成を行った。さらに研修医及び初期研修を終了した専修医に対し、新卒後研修カリキュラム、システムによるパイロット研修を行い、施行上の評価、問題点を検討した。施行の結果、判明した最も重要な問題点は、臨床上の技術面に関することではなく、コミュニケーション技法、患者接遇法等のいわゆる医療面接(メディカル・インタビュー)等の知識面の不足で、特に基本的知識の習得不足であった。この背景として現在ローテーション中の研修医・専修医における卒前での医療面接に関する教育が、殆ど行われていないことが考えられる。近年、日本における卒前医学教育カリキュラムは、講義中心の知識伝達型教育から、患者(症例)中心の臨床能力重点型に移りつつある。しかし、まだまだ教育方法並びにスタッフのマンパワー不足、このような教育に対する理解不足等の問題があり、卒前に充分に教育されているか?、また学生が習得できているか?等も疑問である。卒後教育でのコミュニケーション技法、患者接遇法の教育を進めていく上でも、今後卒前教育での教育状況、習得状況についても調査研究していく必要性がある。研修教育資料面では、教育手段としてのビデオカメラ・録音装置の設置場所、効果的使用方法、患者さんへの説明方法等について検討した。医療面接に関する基礎的知識不足を補充するための基本的なテキスト、ビデオ等の選定、収集も行った。昨年度までの研究で判明した研修医のコミュニケーション技法、患者接遇法等のいわゆる医療面接(メディカル・インタビュー)等の基本的知識面の習得不足に関する検討を行った。背景として現在ローテーション中の研修医・専修医における卒前での医療面接に関する教育が、十分行われてない可能性が心配された。今年度、卒前臨床研修(BSL)中の学生(5年生)(4年次後期に診断学実習として研修ずみ)を対象に、コミュニケーション技法、患者接遇法等のいわゆる医療面接(メディカル・インタビュー)及び医師の態度等の教育・研修に関するアンケート調査を実施した。患者さんとの接遇、コミュニケーションをとること、問診をとること等に自信があるか?に対しては、自信があるとしたのは11%のみで、18%はないと回答した。BSL中に、患者さんとの接遇・コミュニケーションで、困ったことがあるか?に対しては、75%が困ったことがあると回答している。この結果から、卒前教育でのコミュニケーション技法、患者接遇法の教育がまだ十分でないことがわかった。今後どのような教育方法が有意義(効果的)か?に対しては(複数回答可)、実地見学を最も良いとし(86%)、模擬患者利用(65%)、ロールプレー(47%)、ビデオ(35%)、講義(10%)、教科書(10%)の順であった。
選択的硫酸エステル化法によるヒトコレシストキニンの全合成

1984年,高橋らにより分子遺伝学的に構造が解明されたヒトCCK-33はブタCCK-33と同様27位Tyr残基が硫酸化されているため,その化学合成は困難である.我々はこのTyrを選択的に硫酸エステル化する方法を開発し,ヒトCCK-33を全合成した.1.全体を7個の区分ペプチドに分け, C端よりラセミ化の少ないアジド法によって順次縮合し,保護ヒトCCK-33を得た.3.どのような試薬を用いてもSer-OHはTyr-OHよりも硫酸エステル化が優位に進行するため,我々はまずSer-OHをtert-butyldiphenylsilyl(tBuPh_2Si)基で選択的に保護し,次いでTyr-OHを硫酸エステル化した後, SerのtBuPh_2Si基を除去する計画のもとにモデル実験を行なった結果,過剰のフェノールを添加することによりSer-OHが優位にシリル化されることを見出した.4.ヒト〔27-Tyr〕CCK-33のN^α及びLysのN^ε-アミノ基をfluorenyl-methyloxycarbonyl(Fmoc)化して保護し, 4個のSer-OHを選択的にシリル化した後, pyridine-SO_3により27位のTyr-OHを硫酸エステルとし,次いで1M Bu_4NFでFmoc及びtBuPh_2Si基を除去し,イオン交換クロマトグラフィー, HPLCにより精製し,高純度のヒトCCK-33を得た.上記方法により得た合成ヒトCCK-33は麻酔犬を用いたin vivo系のアッセイにおいてCCK-8とモル比で同程度の膵蛋白放出活性を示した.一方27位Tyrが硫酸エステル化されていないCCK-33はCCK+33の約1/10の活性しか示さず,本硫酸エステルの活性発現における重要性を合成化学的に明らかにした.1984年,高橋らにより分子遺伝学的に構造が解明されたヒトCCK-33はブタCCK-33と同様27位Tyr残基が硫酸化されているため,その化学合成は困難である.我々はこのTyrを選択的に硫酸エステル化する方法を開発し,ヒトCCK-33を全合成した.1.全体を7個の区分ペプチドに分け, C端よりラセミ化の少ないアジド法によって順次縮合し,保護ヒトCCK-33を得た.3.どのような試薬を用いてもSer-OHはTyr-OHよりも硫酸エステル化が優位に進行するため,我々はまずSer-OHをtert-butyldiphenylsilyl(tBuPh_2Si)基で選択的に保護し,次いでTyr-OHを硫酸エステル化した後, SerのtBuPh_2Si基を除去する計画のもとにモデル実験を行なった結果,過剰のフェノールを添加することによりSer-OHが優位にシリル化されることを見出した.4.ヒト〔27-Tyr〕CCK-33のN^α及びLysのN^ε-アミノ基をfluorenyl-methyloxycarbonyl(Fmoc)化して保護し, 4個のSer-OHを選択的にシリル化した後, pyridine-SO_3により27位のTyr-OHを硫酸エステルとし,次いで1M Bu_4NFでFmoc及びtBuPh_2Si基を除去し,イオン交換クロマトグラフィー, HPLCにより精製し,高純度のヒトCCK-33を得た.上記方法により得た合成ヒトCCK-33は麻酔犬を用いたin vivo系のアッセイにおいてCCK-8とモル比で同程度の膵蛋白放出活性を示した.一方27位Tyrが硫酸エステル化されていないCCK-33はCCK+33の約1/10の活性しか示さず,本硫酸エステルの活性発現における重要性を合成化学的に明らかにした.
尺度に不変な頑健統計量に基く統計的推測論

Y_iは応答変数,x_iは変数ではない説明変数,∈_iは誤差確率変数で独立で同一の連続型分布関数F(X,Σ)を持つとするモデルY_i=h(x_i,θ)+∈_i+∈_i,i=1,...,n,θ∈Θに含まれる二標本モデルや多変量二元配置モデルにおいて尺度について不変な頑健統計量を提案し,スチューデント化された頑健な検定と推定法について論じた,ただしΣは∈_iの分散共分散行列とする。多次元分布F(X,Σ)に連続性以外の仮定を必要とせずに,検討統計量については漸近多変量正規性を漸近的線形性の分布収束の理論を使って導いた。数式を基に正規分布のいずれによる漸近検出と漸近平均自乗誤差を多くの分布に対して調べ,観測地が正規分布以外の分布以外の分布に従っている場合に,これまでの検定や最小二乗推定量よりも提案した統計手法が非常に良く,正規分布のときは提案した手法がすこしだけ劣ることが解り,提案した手法の分布に対する頑健性が導けた。また観測値に異常値がある場合の漸近的頑健性も導けた。小標本の場合に,分布と異常値に関する頑健性が成り立つかを計算機シュミレーションによって調べ,漸近的結果と同様の結論を得た。これらのことから,提案した手法はすその重い対称な分布だけでなく,ゆがんだ対称でない分布に対しても頑健であることが示されたことになる。これまでの頑健統計論では分布の対称性が仮定されていたが、対象性をはずした多変量頑健理論が構築できたことになる。2票本モデルの場合,頑健検定は並べ替え検定として帰無仮説の下で分布に依存しない方法となる。順位検定との検出力の比較を計算機シュミレーションによって調べ,観測値が正規分布に近い分布に従っているときに,提案した検定は順位検定よりも優れていることが示された。推定量の分散を推定するEfron and Tibshirani(1993)のブートストラップ法を行ったが,小標本の場合には実際の分散とは異なることが示せた。データも基にEfton and Tibshirani(1993)のブートストラップ法,適合度検定,分布の探索法を使って頑健手法を選択するアルゴリズムを作成し,多くのモデルでの頑健統計手法のソフトプログラミングを行った。また回帰係数の縮小推定量について改良統計手法を導いた。Y_iは応答変数,x_iは確率変数ではない説明変数,E_i,は誤差確率変数で独立で同一の連続型分布関数F(x/σ)を持つとするモデルY_i=h(x_i,θ)+E_i,i=1,...,n,θ∈Θに含まれる2標本モデルと二元配置モデルにおいて尺度について不変な頑健統計量を提案し,Fisher's consistency ∫^∞_<-∞>ψ(x)dF(x)=0の条件を必要とせず,スチューデント化された頑健な検定と推定法について論じた。

検定統計量については漸近カイ自乗性を,推定量については漸近正規性を漸近的線形性や分布収束の理論を使って導いた。数式を基に正規分布のずれによる漸近検出力と漸近平均自乗誤差を多くの分布に対して調べ,観測値が正規分布以外の分布に従っている場合に,F検定や最小二乗推定量よりも提案した統計手法が非常に良く,正規分布のときは提案した手法がすこしだけ劣ることが解り,提案した手法の分布に対する頑健性が導けた。また観測値に異常値がある場合の漸近的頑健性も導けた。小標本の場合に,分布と異常値に関する頑健性が成り立つかを計算機シミュレーションによって調べ,漸近的結果と同様の結論を得た。これらのことから,提案した手法はすその重い対称な分布だけでなく,ゆがんだ対称でない分布に対しても頑健であることが示されたことになる。2標本モデルの場合に,頑健検定は並べ替え検定として帰無仮説の下で分布に依存しない方法となる。順位検定との検出力の比較を計算機シミュレーションによって調べ,観測値が正規分布に近い分布に従っているときに,提案した検定は順位検定よりも優れていることが示された。推定量の分散を推定するEfron and Tibshirani(1993)のブートストラップ法を行ったが,小標本の場合には実際の分散とは異なることが示せた。ブートストラップの改良は模索中である。提案した計算機アルゴリズムを作り,ソフトプログラミングも行った。以上の結果を基に現在2標本モデルや二元配置モデルよりももっと一般の場合を考察中である。Y_iは応答変数,χ_iは確率変数ではない説明変数,ε_iは誤差確率変数で独立で同一の連続型分布関数F(χ,Σ)を持つとするモデルY_i=h(χ_i,θ)+ε_i,i=1,・・・,n, θ∈Θに含まれるシェルサイズが不揃いの多変量ニ元配置モデルににおいて尺度について不変な頑健統計量を提案し,スチューデント化された頑健な検定と推定法について論じた,ただしΣはε_iの分散共分散行列とする。多次元分布F(χ,Σ)に連続性以外の仮定を必要とせずに,検定統計量については漸近カイ自乗性を,推定量については漸近多変量正規性を漸近的線形性や分布収束の理論を使って導いた。数式を基に正規分布のずれによる漸近検出力と漸近平均自乗誤差を多くの分布に対して調べ,観測値が正規分布以外の分布に従っている場合に,これまでの検定や最小二乗推定量よりも提案した統計手法が非常に良く,正規分布のときは提案した手法がすこしだけ劣ることが解り,提案した手法の分布に対する頑健性が導けた。これまでの頑健統計論では分布の対称性が仮定されていたが,対称性をはずした多変量頑健理論が構築できたことになる。データも基にEfron and Tibshirani(1993)のブートストラップ法,適合度検定,分布の探索法を使って頑健手法を選択するアルゴリズムを作成し,多くのモデルでの頑健統計手法のソフトプログラミングを行った。回帰係数の縮小推定量について改良統計手法を導いた。
CRISPRシステムを用いた内視鏡的膵癌治療法開発の基礎検討

膵癌をコントロール出来る遺伝子を探索する中で、代謝に重要な遺伝子の一つであるPKMに焦点を絞り、検討した。PKM2の膵癌細胞での役割を検討するために、siRNAあるいはshRNAを膵癌細胞に導入し、マイクロアレイ・フラックスアナライザー・メタボローム解析を施行した。PKM2をノックダウンすると、細胞増殖能・移動能・造腫瘍能が減少した。また、解糖能の減少がみられた。マイクロアレイの結果、細胞周期関連遺伝子に変動があった。これらの結果、PKM2は膵癌細胞の悪性度および代謝能に重要な役割を果たすことが示唆された。本邦において2003年2005年に診断された膵癌患者の5年相対生存率は7%と報告されている。この生存率はあらゆる癌種の中で最も低く、20%を下回るのは膵癌のみである。その予後改善には従来にない画期的な治療法が必要である。最近の遺伝子改変マウスを用いた研究により、K-rasの活性化によって発生した膵癌においてK-rasを不活性化すると腫瘍が消褪すること、しかし、そこにわずかに残存する細胞の悪性度が高いことが明らかとなった。また、CRISPRシステムの開発により容易に遺伝子編集が可能となった。申請者らは、CRISPRシステムを用い、膵癌のK-rasを正常化させるとともに残存する腫瘍に特異的に発現する分子を標的とした、同時攻撃による治療法を着想した。このシステムにより、EUSを用いて膵腫瘍に直接ベクターを注入するといった臨床応用が可能である。本研究は、その可能性を、PDX腫瘍と遺伝子改変マウスを用いて基礎的に検証することを目的として研究を開始した。本年度は、Patient-derived xenograft(PDX)の作製とK-ras遺伝子のコドン12を含む領域を標的としたgRNAを作製し、Cas9も発現する同一ベクターの作製を試みた。PDX細胞株は現在までのところ2株作製した。ベクターに関しては現在も作成中である。また、治療効果判定のための遺伝子改変膵癌マウスPdx-1-Cre; LSL-KrasG12D/+を多数作製中である。PDXの作製に時間を要している。この残存腫瘍は、がん幹細胞に代表される特異な悪性化機構が働いていると推測される。本年度は、K-rasG12Vによる膵癌モデルマウスをまず作製した。得られた膵癌から、膵癌細胞株を樹立することができた。これを用いて、現在、解析を進めている。腫瘍特異的分子を同定するために、mRNA・miRNA・代謝プロファイルの検討を進めている。また、がん幹細胞様形質をもつかどうかの検討も進めている。膵癌マウスモデルを樹立することが本課題の実現に重要であることが判明し、実験を始めたため、実験計画にやや遅れがある。本年度は、膵癌の悪性化機構には代謝能が重要な役割を果たすことに気づき、その検討を行った。特に、ワールブルグ効果に重要とされるPKMに着目し、膵癌細胞株およびin vivoモデルを用いて解析を行った。siRNAを用いてPKMをノックダウンし、悪性形質(細胞増殖能・転移浸潤能等)の変化を検討した。

膵癌をコントロール出来る遺伝子を探索する中で、代謝に重要な遺伝子の一つであるPKMに焦点を絞り、検討した。PKM2の膵癌細胞での役割を検討するために、siRNAあるいはshRNAを膵癌細胞に導入し、マイクロアレイ・フラックスアナライザー・メタボローム解析を施行した。PKM2をノックダウンすると、細胞増殖能・移動能・造腫瘍能が減少した。また、解糖能の減少がみられた。マイクロアレイの結果、細胞周期関連遺伝子に変動があった。これらの結果、PKM2は膵癌細胞の悪性度および代謝能に重要な役割を果たすことが示唆された。PDX株の作製とベクターの作製を行う。K-ras遺伝子不活性化によって残存する膵癌細胞を分離し、その細胞における分子動態を解析する。樹立した膵癌マウスモデルを用いて、研究を進める。腫瘍学PDX株とベクターの作製に遅れが生じているため。膵癌マウスモデルを樹立し解析するため、予算計画を見直した。ベクター作成後、PDX株の作製が予定より遅れても遺伝子改変マウスを材料に実験を施行する。繰り越し分は、マウスの解析に多くを当てる。
マウス精巣内精細胞の体外培養技術の確立と細胞分化に関する研究

現在、ヒトを含めた哺乳動物の精子生殖細胞(精細胞)を体外培養(in vitro culture)により精原細胞から完全な成熟細胞(精子)まで完成させることはできていない。そこで生殖細胞の体外培養系を確立することを目的に研究を行ってきた。精細管腔の疑似的構造をアガロースカプセルで代用することを考えアガロースカプセルを作製した(共同研究者)。しかし、カプセル内に精巣内細胞を注入して培養を試みたが分化細胞を得ることはできなかった。血清の代替物質も試みたが良い結果が得られなかった。そこで、カプセルに乏精子症の精子を注入し、液体窒素で保存し融解精子を検査した結果、効率良く生存精子を得ることに成功した。この結果は乏精子症や無精子症の少ない精子を保存して臨床応用に役立てることが可能となった。また、精液中のRNAから精巣内細胞の存在を検索できるcDNAを作製して精巣内細胞の分化度を検討した結果、精祖細胞の存在を確認できることが判明した。それゆえ、精液中に存在する精巣内細胞の存在を推定することより精巣内精子を外科的に取り出す治療の前に役立つ検査になりうると考えられた。特に臨床において乏精子症や無精子症男性の生殖細胞成熟に関する知見は乏しく治療を困難にしている原因でもある。それゆえ、生殖細胞の体外培養技術を深めて新たな培養系を開発・研究していくことは不妊治療の観点からも研究意義は高く継続していかなければならない。異なる分化段階の精細胞がin vitrocultureで作出可能となれば生殖細胞の分化に関する細胞・分子レベルの研究が飛躍的に進むことになる。そのためには体外培養技術法が確立され、かつ生殖細胞分化のメカニズムの研究が推し進められなければならない。特に乏精子症や無精子症男性の生殖細胞成熟に関する知見は乏しく治療を困難にしている原因でもある。それゆえ、生殖細胞の体外培養技術を開発し研究を深めることは不妊治療の根幹知識を集積するもので研究意義は高いと考えられる。本研究は精巣細胞の体外培養技術の開発を目的とするものである。これまで精細管内精細胞の培養は器官培養で成功しているが、精細胞をバラバラにした状態では体外培養は難しいことが示されてきた。そこで、疑似的な精細管になる容器としてアガロースゲルカプセルを作製した。その中に精細管細胞を詰め込んで精細管構造を構築できるかどうかは未だ結果は出ていないが、精原細胞をゲルカプセルに入れて培養する道は開けた。マウス精原幹細胞のドロップ培養に成功した。このことより極微小環境での細胞の増殖動態の観察につながると糸口ができたと考えている。ネガテッブ結果ではあるが、ゲルカプセル内に精細管のセルトリー細胞と他の精細胞を注入し観察したが分化する所見は得られていない。クリーンベンチ、顕微鏡の準備、撮影装置の準備、ふ卵器の調達、ガスボンベをはじめとする培養環境整備に費やした。その他、試薬の調達、消耗品の調達など研究環境整理に時間がかかったが、培養環境は整備できた。また、現在、ここでマウスが直接飼育不可能であり、マウス関連材料の定期的購入準備と飼育代用を行っていただける施設との契約もできた。数回の培養を試みた結果、準備した機器材は作動することを確認できているので、今後に期待できると考えている。しかしながら、最近の報告ではin vitroの研究が進みマウスにおいて始原生殖細胞から卵子も精子も成熟させた後、その成熟配偶子を受精させて受容雌マウスに移植しで次世代の胎仔が生誕している。しかし、完全なin vitro cultureでなく一部は生体組織の培養過程が必要のようである。それゆえ完全なin vitro系において幹細胞から成熟配偶子までの体外培養は成功していないといえる。それゆえ、生殖細胞の体外培養技術を深めて新たな培養系を開発・研究していくことは不妊治療の根幹知識を集積するもので研究意義は高いと考えられる。具体的には体外培養に適した培養条件を決めることであり、培養液の組成の検討、培養温度、精細胞以外との共細胞条件など検索することは多い。要するに本研究は精巣細胞の体外培養技術の開発を目的とするものである。クリーンベンチ、顕微鏡の準備、撮影装置の準備、孵卵器の調達、ガスボンベをはじめとする培養環境整備に費やした。その他、試薬の調達、消耗品の調達など研究環境整理に時間がかかった。精細胞を選別すべき細胞同定に各精細胞に特異的に発現する蛋白の同定を行った。マウスの細胞に対する抗体は少なく、将来ヒトに応用することを考慮してヒトの各精細胞に発現する特異的抗体を検索して市販品を求めて確認実験を行ってきた。精子、円形精子細胞、精母細胞は鑑別できる抗体が確認できた。

精祖細胞、ライデッヒ細胞の鑑別すべき特異抗体を探さなければならない。ヒトの各精細胞に対するが、培養環境は整備できた。また、現在、ここでマウスが直接飼育不可能であり、マウス関連材料の定期的購入準備と飼育代用を行っていただける施設も新たに契約しなおさなければならない。数回の培養を試みた結果、準備した機器材料は作動することを確認できているが長期的な基本となる体外培養系はできていない。また、各段階の精細胞を更に染色体レベルで決めるには、精細胞を卵子細胞内に注入して染色体を展開するなど考えなければならない。それには新たな装置、ピエゾマニュピレーターも視野に入れなければならない。本装置は研究費範囲内で決められないかもしれない。現在、ヒトを含めた哺乳動物の精子生殖細胞(精細胞)を体外培養(in vitro culture)により精原細胞から完全な成熟細胞(精子)まで完成させることはできていない。そこで生殖細胞の体外培養系を確立することを目的に研究を行ってきた。精細管腔の疑似的構造をアガロースカプセルで代用することを考えアガロースカプセルを作製した(共同研究者)。しかし、カプセル内に精巣内細胞を注入して培養を試みたが分化細胞を得ることはできなかった。血清の代替物質も試みたが良い結果が得られなかった。そこで、カプセルに乏精子症の精子を注入し、液体窒素で保存し融解精子を検査した結果、効率良く生存精子を得ることに成功した。この結果は乏精子症や無精子症の少ない精子を保存して臨床応用に役立てることが可能となった。また、精液中のRNAから精巣内細胞の存在を検索できるcDNAを作製して精巣内細胞の分化度を検討した結果、精祖細胞の存在を確認できることが判明した。それゆえ、精液中に存在する精巣内細胞の存在を推定することより精巣内精子を外科的に取り出す治療の前に役立つ検査になりうると考えられた。特に臨床において乏精子症や無精子症男性の生殖細胞成熟に関する知見は乏しく治療を困難にしている原因でもある。それゆえ、生殖細胞の体外培養技術を深めて新たな培養系を開発・研究していくことは不妊治療の観点からも研究意義は高く継続していかなければならない。これまでの報告から直接、精細胞をバラバラに細分化した状態では分化は見られていないつまり器官培養が必要であることより精細管に近い疑似精細管としてアガロースゲルカプセル(カプセル)に細切した精細管細胞を封入して培養を試みることを考えている。挿入したカプセル内細胞が生存、かつ分化できる培養液組成の検討、ガス濃度、温度の最適環境条件を検討しなければならない(長期培養可能条件の検討)。長期培養に成功すれば、減数分裂をして半数体に分化していることが期待されるので核染色で確認したいと考えている。
マーブルクレイフィッシュ光走性スイッチング機構に関する行動生理学的解析

マーブルクレイフィッシュは光刺激に対し、日中は負の光走性を示し、夜間は逆に正の性質を示すことをまず明らかにした。次に、その光走性の性質逆転が脳内セロトニン・ドーパミン濃度変動に基づくサイクリックAMP濃度の違いに変動に依っていることを明らかにした。そして、日中負の光走性を示すマーブルクレイフィッシュに対し、T字迷路の片側から餌のけん濁液を流すと同時に光を与え条件付けすることで、光=餌と学習し、餌の匂いなしでも光側に定位するようになることを明らかにし、遺伝的にプログラムされた光走性の性質が学習によって可逆的に変化可能であることが確かめられた。マーブルクレイフィッシュの光走性の性質が昼夜で負から正へ逆転する神経機構を解明する第一歩として、H25年度は(1)逆転現象を定量的に解析し、(2)逆転を引き起こす神経化学的基盤を薬理行動学的に解析した。(1)12L/12Dの明暗サイクルで飼育したマーブルクレイフィッシュ、LD個体を用い、明期から暗期への移行時、あるいは暗期から明期へ移行時のLD個体の光に対する応答性をT字迷路を用い解析した結果、i)移行後応答性は徐々に逆転し、4時間後には完全に逆転すること、ii)日中4時間暗黒下に置き暗順応させたLD個体は、正の光走性を示すこと、iii)恒暗下で飼育したDD個体は、日中の実験でも正の光走性を示すが、4時間光環境においた後実験すると負の光走性を示すようになることがわかり、外部光環境に同調して、光走性の性質が切り替わることが明らかとなった。(2A)脊椎動物や節足動物において生体アミンが様々な神経修飾作用を持つことが知られている。この光走性応答切り替えに生体アミンが関与していると想定し、ザリガニ体腔内にセロトニン等の生体アミンを注射し、光刺激に対する応答変化を解析した結果、i)1μMセロトニン投与により、LD個体の光応答が負から正へ切り替わった、ii)節足動物においてよくセロトニンと拮抗的に作用するオクトパミン投与は、LD個体、DD個体共に全く影響を持たなかった、iii)脊椎動物においてよくセロトニンと拮抗的に作用するドーパミン投与はLD個体の応答性には効果はなかったが、DD個体の光応答が正から負へ逆転、セロトニンとドーパミンが拮抗的に作用していることが明らかとなった。(2B)更に、LD個体の暗順応時にセロトニン受容体ブロッカーを、一方、DD個体の明順応時にドーパミン受容体ブロッカーを注射し、解析した結果、LD,DD個体共に順応に伴う光走性逆転は起こらないことが明らかとなった。マーブルクレイフィッシュの光走性の性質が光環境によって正・負が逆転する神経機構解明の第2段階として、H26年度では光走性逆転の神経化学的基盤に関して、薬理行動学的解析を行い、(1)セロトニン、ドーパミン受容体の性質、(2)その下流の信号伝達経路を明らかにした。(1)生体アミンの一種、セロトニン投与により、マーブルクレイフィッシュの光走性の性質が負から正へ切り替わり、別の生体アミン、ドーパミン投与によって正から負へ切り替わる。セロトニン、ドーパミン受容体はGタンパク共役の代謝型受容体であり、それぞれの受容体サブタイプ特異的阻害剤投与による光走性切り替えへの抑制効果をまず解析した。セロトニン受容体には二次メッセンジャーcAMP濃度を低下させることのできる5HT1受容体とIP3レベルを上昇させる5HT2受容体が知られているが、1型受容体のブロッカー投与時にのみ、負から正への応答切り替えは見られなくなった。一方、ドーパミンの受容体には、cAMP濃度を上昇させるD1受容体と逆にcAMP濃度を低下させるD2受容体が存在するが、D1受容体特異的ブロッカー投与時にのみ、正から負への応答逆転は起こらなかった。(2)セロトニン、ドーパミン受容体の収斂点はどちらも二次メッセンジャー系cAMP信号伝達経路であり、セロトニンはcAMP濃度レベルを下げ、ドーパミンは逆に上昇させる。そこで、cAMPレベルの増減がマーブルクレイフィッシュの光応答の性質を決定しているのではと考え、cAMPアナログを投与したところ、ドーパミン投与同様に、マーブルクレイフィッシュの光走性の性質は正から負へ切り替わった。また、細胞内cAMPはアデニル酸シクラーゼによってATPから合成される。そこで、アデニル酸シクラーゼブロッカーを投与したところ、セロトニン同様、負から正へ光走性の性質が切り替わった。走性とは遺伝的にプログラムされた生得的行動の基本要素の一つであり、条件付けという学習経験を通じて、その性質が可逆的に変化し得るのか検証を行った。マーブルクレイフィッシュは光刺激に対し、日中は負の光走性を示し、夜間は逆に正の性質を示すことをH25年度の研究遂行により明らかにした。そして、その光走性の性質逆転が脳内セロトニン・ドーパミン濃度変動に基づくサイクリックAMP濃度の違いに変動に依っていることをH26年度の研究遂行から明らかにした。最終年度は日中負の光走性を示すマーブルクレイフィッシュに対し、T字迷路の片側から餌のけん濁液を流すと同時に光を与え条件付けすることで、光=餌と学習し、餌の匂いなしでも光側に定位するようになるか、解析した。

条件付けトレーニングを一回し、10分後にメモリーテストを行ったところ、65%以上のマーブルクレイフィッシュは光点灯側の出口を選択するようになり、遺伝的にプログラムされた光走性の性質が学習によって可逆的に変化可能であることが確かめられた。しかし、条件付け30分後に行ったメモリーテストでは、白色光選択率は30%以下に減少した。一方、10分間隔で3回条件付けトレーニングを行った場合には、60%以上のザリガニが30分後のメモリーテストで白色光側の出口を選択、記憶の強化が起こっていることも併せて明らかとなった。また、マーブルクレイフィッシュは緑色光・青色光に対しては日中でも正の光走性を示し、両者の光を同時に与えると、緑色光をより好んで定位する。そこで青色光と報酬を結びつけ条件付けしたところ、ザリガニは有意に青色光側の出口を選択するようになった。マーブルクレイフィッシュは光刺激に対し、日中は負の光走性を示し、夜間は逆に正の性質を示すことをまず明らかにした。次に、その光走性の性質逆転が脳内セロトニン・ドーパミン濃度変動に基づくサイクリックAMP濃度の違いに変動に依っていることを明らかにした。そして、日中負の光走性を示すマーブルクレイフィッシュに対し、T字迷路の片側から餌のけん濁液を流すと同時に光を与え条件付けすることで、光=餌と学習し、餌の匂いなしでも光側に定位するようになることを明らかにし、遺伝的にプログラムされた光走性の性質が学習によって可逆的に変化可能であることが確かめられた。今年度の実験遂行を通じ、当初我々が描いていた仮説『外部光環境に依存した正・負の光走性応答逆転はcAMPレベルの増減に基づいている』がほぼ実証できたため。行動生理学走性とは遺伝的にプログラムされた生得的行動の基本要素の一つである。一方、動物は経験を通じてその応答パターンを可塑的に変化させる能力を備えている。光刺激を餌の匂いのような報酬と、あるいは忌避性の匂い刺激もしくは電気ショックのような罰と組み合わせて条件付けを行うことで、遺伝的にプログラムされている走性の性質が学習によって可逆的に書き換えられるのか、検証する。(1)マーブルクレイフィッシュは白色光に対し、負の光走性の性質を示す。そこで一本道迷路にザリガニを入れ、光点灯と同時に餌の懸濁液をゴール側から流し、光=餌と条件付ける。その後、T字型迷路にザリガニを映し、片側のゴールのみ光を点灯し、ザリガニが光アリ側、光ナシ側どちらの迷路を選択するか、解析する。(2)T字迷路の光ナシ側ゴールに刺激電極をセットし、光点灯時ザリガニがそちらに定位したとき、電気ショックを与える。その後、ザリガニがT字迷路の光アリ側、光ナシ側どちらの迷路を選択するか、解析する。今回、1)なぜマーブルクレイフィッシュの光走性の性質が昼夜で逆転するのか?それがザリガニ自身の内因性変化なのか、それとも環境に依存したものなのか、また、2)どのようなスイッチング機構が働いているのか?初年度解き明かそうと考えていたこの2つの研究目的について、当初の研究計画どおり、概ね順調に研究を遂行することができた。光に対するザリガニの応用逆転が環境への順応に基づいていること、更に、生体アミンのセロトニンとドーパミンが拮抗的に作用し、光走性の性質が切り替わることを薬理行動学的に明確に証明できた。
ゼオライト固定金属錯体をキャリヤーとする省エネルギー型酸素分離膜の開発

(1)シップインボトル法により、Y型及びMCM-41などのゼオライト細孔内へコバルト(II)錯体を固定化した。系内への酸素分子導入に伴う、酸素の吸着脱離挙動を探査した。特に、コバルト(II)フタロシアニン(Co(II)Pc)錯体に対する酸素分子アダクトESR強度の軸配子、酸素圧力、反応温度依存性等を詳細に評価した。その結果に基づき、ゼオライト固定Co(II)Pc錯体と酸素分子の吸着脱離反応の最適化条件を検討した。また、排気-酸素導入に伴う反応の可逆性と軸配子の関係、系内の未反応酸素の拡散と吸着部位等につき検討した。(2)ゼオライト固定系との比較を行うために、多孔質高分子膜にコバルト(II)錯体を保持させた酸素促進輸膜の酸素/窒素分離特性を検討した。例えば、軸配位子として4-ジメチルアミノピリジン、ピラジン及びジメチルスルホキシドを配位したN,N'-ビス(メトキシサリチリデンメチルプロピレンジアミミナトコバルト(II)錯体酸素促進輸送膜の酸素分離係数は、各々、160、2.2、3となり、大きな軸配位子依存性が観測できた。これらの実験結果に基づき、酸素の吸着速度及び脱着速度が軸配位子の相違により如何に変化するかを考察した。(3)金属イオン交換ゼオライトへの常磁性酸化窒素NOx(x=1,2)の吸着-脱離挙動に関する実験および理論の両面での基礎的研究を行ない、ミクロ多孔体中での酸素類似気体分子の吸脱着反応と吸着分子の静的-動的構造との関係につく幾つらの重要な知見を得た。本年度は、コバルトフタロシアニン錯体(Co^<2+>Pc)のY型ゼオライトへの固定化と酸素分子吸脱着挙動に関するESR分光法による研究を行った.1.シップインボトル法を用いY型ゼオライト細孔中にCo^<2+>Pcを合成した.2.ゼオライト固定Co^<2+>Pc-Yに、室温で軸配位子(アンモニア,n-ブチルアミン)次に酸素を導入後,Co^<2+>PcにO_2分子が結合したCo^<3+>Pc-O_2^-(酸素アダクト)の生成が観察できた.3.排気・酸素再導入に伴う酸素アダクト生成の可逆性を検討した。排気・酸素導入回数の増加に伴う可逆酸素アダク量の低下は排気操作に伴う軸配位子の脱離に起因することが分かった.4.酸素アダクト量の観測温度依存性をESRで観測した.77K-130Kの温度域では酸素アダクト量に変化はなかった.130K以上に昇温すると、急速にアダクト量は増加し190Kで極大に達した.その後減少した.このアダクト量の増減現象は系内の未反応酸素の拡散による,Co^<2+>pcへのO_2付加と,Co^<3+>pc-O_2^-からの酸素脱離の競争反応を仮定し説明できた.5.相異なる構造と金属イオンを持つゼオライトに吸着したNO_x(x=1,2)のESR研究を行い、ゼオライトの構造・交換金属イオンと分子吸着・分子運動の関係につき詳細な基礎的知見を得た。口頭発表(1)日本化学会代75秋季年会(松山、1998年9月)「ゼオライト固定コバルト錯体の酸素吸脱着挙動:ESR法による研究」中貴史、塩谷優、八尋秀典(2)日本化学会代76春季年会(東京、1999年3月)「ゼオライト内のコバルト-酸素錯体のESR法による研究」中貴史、塩谷優、八尋秀典、新田昌弘

ゼオライトヘの遷移金属錯体の固定化と酸素分子吸・脱着挙動に関する研究を行った.(1)MCM-41等のゼオライトにコバルトフタロシアニン錯体(Co^<2+>Pc)等の遷移金属錯体を固定化した。アミノ基やシアノ基を持つ化合物を配位子として添加し、ESR、IRなどの分光法により構造を確認した。(2)合成した遷移金属錯体/ゼオライト複合体の酸素吸・脱着能の温度および各ガス分圧依存性を検討した。さらに、排気・酸素再導入に伴う酸素アダクト生成の可逆性を検討した。排気・酸素導入回数の増加に伴う可逆酸素アダク量の低下は排気操作に伴う軸配位子の脱離に起因することが分かった。(3)ゼオライト系との比較を行うために、多孔質高分子膜にコバルト錯体を保持させた酸素促進輸膜の酸素/窒素分離特性を検討した。(4)金属イオン交換ゼオライトに吸着したNO_x(x=1,2)のESR研究を行い、ゼオライトの構造・交換金属イオンと分子吸着・分子運動の関係を検討した。学会口頭発表(1)日本化学会第76春季年会(東京、1999年3月)「ゼオライト内のコバルト-酸素錯体のESR法による研究」中貴史、塩谷優、八尋秀典、新田昌弘(1)昨年度に引き続き、シップインボトル法によるY型,MCM-41などのゼオライト細孔内へのコバルト(II)錯体の固定化と酸素分子吸着-脱離挙動を探査した。(2)特に、コバルト(II)フタロシアニン錯体の酸素分子アダクトのESR強度およびESR線形の軸配子、酸素圧力、反応温度依存性を詳細に測定した。その結果に基づき、コバルト(II)錯体と酸素分子の吸着-脱離反応に対する最適化条件を検討した。また、排気-酸素導入に伴う反応の可逆性と軸配子の種類に関係、系内の未反応酸素の拡散と吸着部位等につき検討した[学会発表(a),(b)]。(3)関連する基礎研究として、金属イオン交換ゼオライト中での酸化窒素(NO)の吸着-脱離挙動を探査した。単離NOラジカルおよびNOラジカル対のESR観測に基づき、ゼオライトの構造・交換金属イオンとNO分子状態と温度による回転運動の関係を検討した[学会発表(c),(d)]。学会発表(b)"ゼオライト固定コバルト錯体への酸素分子吸脱着挙動",倉本哲次・八尋秀典・塩谷優,日本化学会第79春季年会(神戸),平成13年3月.
海洋天然物の誘導するタンパク質－タンパク質相互作用の解明

本研究では、強力かつ特異な生物活性を持つ天然物の中から、抗腫瘍性および腫瘍細胞増殖阻害活性を持つ研究代表者独自の化合物であるアプリロニンAに注目し、その新型作用機序を解明するとともに、同様な作用機序を持つ天然物の探索と人工類縁体の合成を通じて、高活性アナログの発見、開発を目的とした。これまでに、アプリロニンAのアクチンとの結合に重要な側鎖部とチューブリンとの結合に重要なアミノ酸エステル部を連結した鎖状分子を設計したが、タンパク質間相互作用を誘導する活性はほとんど確認できなかった。鎖状分子の立体配座の制御に問題があると考えられるので、アミノ酸エステル部を複数持つ誘導体を用いることにより、活性に重要な空間にアミノ酸エステルを配置できると予想できる化合物を合成したが、期待される生物活性は見られなかった。アクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用を検定する簡便な方法として、遠心沈殿法による方法を開発した。この方法を用いて、海洋動物からの活性天然物の探索を行い、上記の生物活性試験を行った。アプリロニンAと同程度のアクチン脱重合活性を有する海洋天然物である、サイトファイシン類はアプリロニンAと類似の側鎖構造を持つが、マクロラクトン部分がかなり異なる。そこで、サイトファイシン類を含めた構造活性相関研究を推進するために、収束的合成戦略による合成研究を行い、重要合成中間体の合成経路を開発した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質間相互作用は、生物活性発現において重要な現象である。我々の発見したアプリロニンAは、細胞骨格タンパク質のアクチンと結合した後、さらに別の細胞骨格タンパク質のチューブリンと結合し、紡錘体の形態異常を引き起こすことにより、有糸分裂を阻害する。アプリロニンAが誘導するアクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用の詳細を明らかにするために、表面プラズモン共鳴を用いて解析を行った。まず、アプリロニンAを誘導してセンサーチップに固定したところ、アクチンを注入すると大きなセンサーグラム変化が見られた。しかし、ここにチューブリンを注入しても、チューブリンの結合をSPRにより確認することができなかった。そこで、アクチンを結合させた後、アクチンとチューブリンの混合物を注入すると、センサーチップ上に三元複合体が形成したと考えられる変化が見られた。しかし、この状態が不安定であるためか、速度論解析を行うことはできなかった。そこで、センサーチップ上にチューブリンを固定し、ここにアプリロニンAとアクチンの複合体を注入したところ、三元複合体の形成と考えられるSPRの変化が確認でした。この条件を用いて、速度論解析を行ったところ、アプリロニンAーアクチン複合体とチューブリンの解離定数は、1.8μMであり、かなりの会合能力を持つことがわかった。一方、アクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用を誘導する人工類縁体を設計し、合成を進めた。現在までに、その重要中間体を合成することができた。海洋天然物アプリロニンAは、アクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用を誘導することにより、強力な抗腫瘍性を発現する。本研究では、この活性発現機構の詳細を明らかにしつつ、その情報により高活性アナログの開発を目指している。平成27年度には、以下の結果を得た。まず、アプリロニンAの量的供給を視野に入れた合成研究を行い、以前の合成経路の収率を大幅に改善した経路を確立した。この方法を用いることにより、部分構造を改変した人工類縁体も効率的に合成できることとなった。また、これまでの構造活性相関研究より得られている情報より設計した簡略化アナログの合成を行い、生物活性を検定した。その結果、この化合物はアクチンとは結合するが、もう一つの標的タンパク質であるチューブリンとは作用しないことが分かった。計算化学により複合体の立体配座を検討した結果、構造を簡略化したために期待される分子構造とならないことが示唆されたため、新たなアナログの設計を行っている。さらに、天然物をリガンドとする光親和性プローブを開発し、標的タンパク質のチューブリンを標識することを示したが、その効率が非常に低く、さらなる展開研究に使うことができなかった。標識効率を高めるために、光親和性基以外の反応性基を用いる設計を行っている。一方、ヒトと酵母のキメラチューブリンの作成については、必要とするキメラチューブリンを作成することはできたが、その効率と選択性に問題があったので、他の方法を検討している。化学的研究は順調に進行している。標的タンパク質の標識効率の問題があったが、反応性基の性質によると考えられる。アクチンとチューブリンとの三元複合体を形成する人工化合物については、アプリロニンAのマクロラクトン部とスウィンホライドAの側鎖部から設計したハイブリッド化合物の合成を達成できた。その生物活性を評価したところ、アプリロニンAに相当するアクチン脱重合活性を示すとともに、チューブリンとの三元複合体の形成に対応する腫瘍細胞増殖阻害活性が確認できた。この結果により、チューブリンと結合するマクロラクトン部とアクチンと結合する側鎖部を適切に組み合わせることにより、アプリロニンAに匹敵する強力な腫瘍細胞増殖阻害活性化合物を開発できることがわかった。アプリロニンAの簡略化アナログについては、チューブリンとの結合に不要であると考えられるマクロラクトン部の一部と側鎖部の一部の置換基を取り除いた類縁体を合成したが、腫瘍細胞増殖阻害活性は確認出来なかった。