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発現遺伝子の解析に基づく二段階水素発酵－メタン発酵システムの構築

バイオガス化の高度化を目的とした水素-メタン二段発酵プロセスの制御因子を解明するために、各々の発酵の制御因子の評価と各々の発酵に関与する微生物叢の分子生物学的解析を行い、ラボスケールの連続発酵プロセスを構築して運転状態を評価した。水素発酵の最適HRTは1日と判断され、水素発酵槽への基質の流入時にはpHを7.5付近に補正しておく方が良好な水素産生が維持でき、水素発酵槽とメタン発酵槽とでは10倍以上の容量差を持たせる必要であると結論された。リアルタイムPCRによりメタン発酵槽内のmcrA遺伝子量を定量することが可能であるが、mcrA遺伝子量だけでメタン産生活性を評価することは出来なかった。平成25年度の研究実内容:(1)ラボスケールの二段階水素発酵ーメタン発酵プロセスの連続運転平成24年度に引き続き、バイアル実験により、メタン発酵条件の決定と水素発酵条件の決定及び処理対象となる有機性廃棄物の前処理法を検討した。前処理方法としては、熱アルカリ処理と超音波破砕を比較し、超音波処理の有効性を明確にした。また、平成24年度末から開始した、仕込み容量10Lの連続発酵実験により、バイオガス収率は目標値に到達していないものの、安定してバイオガスを発生する処理系の確立が行えた。セルロースを主とする難分解性の有機物である紙繊維を含む排水の生物処理から生じる余剰汚泥のバイオガス化プロセスにおいて、バイオガス化効率の向上の為に用いる前処理法は、下水処理から発生する余剰汚泥の前処理で有効であった超音波破砕の方が熱アルカリ処理よりも有効であることが確認された。仕込み容量10Lの連続発酵処理系において、難分解性の紙繊維を含む生物処理から得られた余剰汚泥を混合して処理した場合、下水処理の余剰汚泥のみを処理する場合よりもバイオガス収率は落ちるものの、バイオガス化そのものは十分に行われることが認められた。また、紙繊維を含む余剰汚泥を混合する場合、前処理として超音波破砕処理を行うことでバイオガス収率は向上することが認められた。(2)分子生物学的菌叢解析:後段のメタン発酵において、16SrDNAをターゲットとするシーケンス解析により優占微生物と判断されたMethanococcus属に由来するMethylCoenzymeM reducte alpha subunit (mcrA gene)に着目してRealtime-PCR用のプライマーを設計した。バイアル試験によりMethanococcus属の活性をmcrA geneをターゲットとしてRealtime-PCRで評価した結果、メタンの発生に先立ちmcrA geneの発現量が増加する可能性が示唆された。このことから、mcrA geneの発現量により発酵過程を評価できると考えられた。平成24年度の研究実内容:(1)ラボスケールの二段階水素発酵ーメタン発酵プロセスの連続運転バイアル実験により、メタン発酵条件の決定と水素発酵条件の決定及び処理対象となる有機性廃棄物の前処理法を検討した。また、仕込み容量10Lの連続発酵装置を構築し広島県東部浄化センターの嫌気性消化汚泥を種汚泥とした連続メタン発酵実験を行った。一方、各種処理条件の決定のためのバイアル実験と連続メタン発酵装置の構築に時間がかかり連続水素発酵装置の構築には至らず次年度の実施課題になった。本内容に関する成果は、次の通りである。下水処理や各種の有機性廃水処理で発生する余剰汚泥の削減と有効利用を目的とするバイオガス回収プロセスを構築する場合、余剰汚泥の可溶化法として熱処理、熱アルカリ処理と超音波処理をバイアル実験により比較した所、超音波処理が最もメタンガス発生量が多く最適であると考えられた。また、超音波処理時間が長いほどメタン発生量は増加する傾向にあったが、可溶化に要するエネルギー量から見た最適点は存在した。5連続メタン発酵実験では、超音波可溶化処理を行った余剰汚泥と可溶化しない余剰汚泥とではメタン収率が異なり可溶化処理を行った場合に2530%メタン収率が高かった。(2)分子生物学的菌叢解析:余剰汚泥と超音波余剰汚泥を処理対象とする連続メタン発酵処理では、16SrDNAをターゲットとするシーケンス解析により取得された微生物叢は、真正細菌、古細菌に係らず多様であり、また、菌叢に大きな違いは認められなかった。なお、本年度導入したDGGE法では、習熟度の関係で十分な解析結果を得るに至らなかった。一方、上記の通りに連続水素発酵装置の構築が行えなかった事から連続水素発酵における微生物叢の変遷を把握することはできなかった。高効率なバイオガス回収プロセスの確立を目指し、水素-メタン二段発酵の各発酵段階におけるバイオガス産生に関与する微生物群の挙動を発現遺伝子レベルで解明し、水素-メタン二段発酵のプロセス制御因子を明らかとする事を目的とした研究を行った。

本研究では、プロセスの制御因子を解明するために、回分実験による各々の発酵の制御因子の評価と各々の発酵に関与する微生物叢の分子生物学的解析を行い、ラボスケールの連続発酵プロセスを構築して運転状態を評価した。本研究の結果、水素発酵の最適HRTは1日と判断され、水素発酵槽への基質の流入時にはpHを7.5付近に補正しておく方が良好な水素産生が維持できると判断された。また、最適の負荷量等から考えて、水素発酵槽とメタン発酵槽とでは10倍以上の容量差を持たせる必要であると結論された。水素発酵にはClostridialesが関与することが示唆されたが水素産生に関与すると考えられるHydrogenase遺伝子の定量手法の確立は出来なかった。一方、メタン発酵では、MethanocullesのmcrA遺伝子用のプライマーによってmcrA遺伝子量を定量することが可能であった。しかしながら、単純にmcrA遺伝子量だけではメタン産生活性を評価することは出来なかった。本研究における回分試験の情報を利用して水素-メタン二段階連続発酵装置を構築することができた。構築したプロセスは、水素発酵槽のpH制御を行わなかったことから水素産生は認められないものの、メタン発酵は十分なメタン収率を示していた。このことから、本研究で行った回分実験や分子生物学的手法を用いた評価を行うことにより実用的な水素-メタン二段階発酵プロセスを構築するための情報を取得することができると考えられる。環境衛生工学1)H24年度末から開始した連続運転において、バイオガス化効率は目標に届かないものの、安定した処理プロセスを構築することができた。2)後段のメタン発酵系ではあるが、mcrA geneの発現量によりバイオガス化の発酵過程を評価ことができると判断されたことから、水素発酵系においても同様のアプローチにより発酵過程を評価できる可能性が認められた。3)ほぼ1年間の安定運転が継続できたことから、二段発酵により高効率なバイオガス化プロセスを構築できることが示唆できた。1)H24年度にラボスケールの二段階水素発酵ーメタン発酵プロセスを構築し連続運転を行う予定であったが、処理困難物として有効利用が求められている有機性廃棄物の一つである余剰汚泥の発酵処理性を高める為の前処理条件決めに手間取り、水素発酵装置と連結した二段階水素発酵ーメタン発酵装置を構築しきれなかった。最終的には最適の前処理条件は見出されたことから、連続メタン発酵装置による実験のみを先行して実施し、安定した連続メタン発酵装置が構築できると共に連続水素発酵装置の組み立ては行えた。2)先行研究により、水素発酵槽内の細菌叢は大きく変遷することが伺えている。この事から、バイアル試験等の短期間の発酵系では把握できなダイナミックな菌叢の変遷とそこで機能する遺伝子の探索を本研究の目的の一つにしている。上記の通りに連続の水素発酵装置を運転することができなかった事から、この点に関しては成果が得られていない。3)一方、各種の有機性廃棄物の削減と有効利用を目的とする安定した高効率なバイオガス化プロセスの構築も大きな目的の一つであるが、プロセスの安定化に役立つメタン発酵槽内の菌叢の把握と高効率化の為の前処理法に関する情報は満足すべき結果が得られた。
マンソン住血吸虫の宿主皮膚侵入時の樹状細胞の抗原取り込みとT細胞の抗原認識

マンソン住血吸虫の紫外線照射(18mJ/cm^2)および非照射セルカリアのモルモット皮膚侵入に伴う皮膚およびその潅流リンパ節での免疫応答誘導機序を検討することを目的として、モルモット免疫系細胞に対する6種のマウスモノクローナル抗体を作製した。その認識する細胞は、(1)MHC class II陽性細胞、(2)濾胞胚中心以外のリンパ節細胞/表皮ランゲルハンス細胞、(3)T細胞/Mφ、(4)B/T細胞、(5)T/B細胞、(6)Mφで、(6)以外の抗体は細胞表面抗原を認識する。作製したモノクローナル抗体をフローサイトメトリー法に応用して、紫外線照射・非照射セルカリア感染後の皮膚潅流リンパ節の細胞構成を経時的に観察した。FITCとRPE標識二次抗体を用いた二重染色法でリンパ節細胞のグループ分けを試み、上記(1)と(4)の抗体を用いることで、2つのT細胞領域、Mφ領域、B細胞を含むMHC class II陽性細胞領域が区別された。MHC class II陽性細胞領域はside scatterに基づいて、B細胞とそれ以外の細胞(主に樹状細胞と考える)に区別できた。いずれの感染でもMHC class II陽性細胞の占める割合が増加したが、ほぼ一定した値を示す非照射セルカリア感染と異なり、紫外線照射セルカリアの感染では4-8日目に特に高くなる点が確認された。この点は、樹状細胞と考えられる細胞群の推移においても認められた。以前に、ATPase染色を指標として感染部位表皮シートのランゲルハンス細胞の動態を検討し、照射セルカリア感染では4日頃から血流を介して新たな樹状細胞の動員が起こることを示唆しているが、この所見を裏付ける結果であった。T細胞の抗原認識の違いについては検討を終えていないが、少なくとも、紫外線照射・非照射セルカリア感染後の皮膚潅流リンパ節で誘導される免疫応答には宿主樹状細胞動員数に起因する差異が推測される。
β－ＦｅＳｉ２表面磁性発現の研究

鉄シリサイドFeSi2に対しての、表面観察と第一原理シミュレーションを合わせることで各表面構造に対応する電荷密度分布と原子位置の対応を可能とした。また、磁性発現の仕組において原子の表面や界面における乱れとの対応を可視化し、第一原理計算における粒界や表面における電荷密度分布評価が有効かどうかを評価するため、金属表面における偏析元素による電荷密度分布と照らし合わせ実験結果との比較も行った。鉄シリサイドFeSi2に対しての、表面観察(STM像)と第一原理計算シミュレーションをあわせることで、鉄シリサイド系の一つであるβーFeSi2の表面及び界面における磁性機能発現の仕組み(原子と磁性構造の関係)を第一原理計算において、可視化を実施した。その様子は応用物理学会および応用物理学会シリサイド系半導体と関連物質研究会において報告した。また、第一原理計算における粒界や表面における電荷密度分布からくる評価が有効かどうかを評価するために、金属粒界における偏析元素による電荷密度分布と比較検討した。その結果、粒界面における原子位置、その比を評価することが可能と分かり、その構造解析を研究会におけるSTMデータと比較検討した。これをもとに、FeSi2表面(101)方向だけでなく、他の方位へ適用し、その磁性発現の差異のメカニズムを修士論文としてまとめた。その内容は、Fe原子の割合が多いほど磁性発現は大きくなるが、4層以上積層すると純粋なFe結晶に近い値となり、βーFeSi2表面の効果がうちなわれることが分かった。β-FeSi2表面はFe結晶を比べると、一方向にひずみを持っており、その上に積層されたFeもこの影響を受けて歪む。このひずみによりFe結晶でいうところの[100]方向に伸びた構造をとることから、磁性に対する影響が大きいことが明らかになった。鉄シリサイドFeSi2に対しての、表面観察(STM像)と第一原理計算シミュレーションをあわせることで、鉄シリサイド系のひとつであるβ-FeSi2の表面、界面における磁性機能発現のしくみ(原子と磁性構造の関係)を第一原理計算において、可視化を実施した。その結果、粒界面における原子位置、その比を評価することが可能で分かり、その構造解析を、研究会におけるSTMデータと比較し検討した。それをもとに、FeSi2表面(101)方向だけでなく、他の方向へ適用し、その磁性発現の差異やメカニズムを修士論文としてまとめた。その内容は、Fe原子の割合が多いほど磁性発現は大きくなるが、4層以上積層すると純粋なFe結晶に近い値となり、βーFeSi2表面の効果が失われることが分かった。βーFeSi2表面はFe結晶と比べると、一方向にひずみを持っており、その上に積層されたFeもやはり影響を受けひずむ。このひずみの影響がFe結晶で言うところの[100]方向に延びた構造をとることから磁性に対する影響が大きいことが明らかとなった。併せて純粋なFe結晶の[100]方向ひずみが磁性に対して大きな影響を持つかのメカニズムも実験と合わせて検討を実施している。すでに、βーFeSi2表面がどのような構造が磁性発現を促すか、モデル計算では判明しており、その信頼性評価において粒界における計算、表面への積層時における計算など追加で評価している。表面構造から、Si原子、Fe原子などを積層させた時の磁性発現と表面欠陥構造の依存性などを計算し、TEM観察と合わせることでその評価を行う。また、Fe結晶におけるひずみと磁性に対する影響の評価も実験と合わせて行い、比較検討する。計算規模が比較的小さく、実験値と直接比較することが困難であるため、計算規模拡大を行うためにその計算高速化機器を検討する。また、成果発表のために金属学会に参加し、発表するための旅費に使用する。
マルチンゲール理論による保測変換群の研究

はじめに昨年開催された日ソ確率論シンポジウムに於て、'Helices and I somorphism Problem 5 in Ergodic Theory'(I.Kubo,H.Murata and H.Totoki)と題された報告が行われ、本研究でこれまで代表者等が得た結果を越えるものが、Helices問に新しい演算を導入するという手法によって得られたことを報告する。この方向にむけて研究の発展が期待される。さて一方、本研究では次に述べる立場で研究が行われた。マルチンゲール理論に於けるGirsanovの定理(即ちVan Schappen-Wong,Leng lart)を応用して、測度の変換による新しい保測変換を研究することである。即ち、今測度dPに対してのKolmogorov変換Tに対して、ZdP(ここにZはE[Z]=1,Z〉O as.)に対して新たにKolmogorov変換を得ようという試みである。重複度KのHelicesのbase Xに対してその各々を成分とする無限次元行列のベクトル空間にTを標準表現し、その表現を(【Ω^*】,【Τ^*】)とするとき、測度の変換によって、即ちGirsanovの定理を応用することによって新たに(【(Ω!^)^*】,【(Τ!^)^*】,【(Ρ!^)^*】)ここにd【(Ρ!^)^*】=【Ζ^*】d【Ρ^*】、を【Ρ^*】-Helicesによって構成する。この【(Τ!^)^*】をもとに(【Ω!^】,【Ρ!^】)ここにd【Ρ!^】=ΖdΡ、上に新しい保測変換【Τ!^】を得るものである。詳しい結果は、後に発表される。
ニパウイルスの病原性に関するウイルス蛋白の機能解析

ニパウイルスの激しい病原性発現機構の解明を目的として、ウイルス増殖時の自然免疫回避に関与するアクセサリー蛋白と、強毒化に関わるウイルス蛋白の同定を目指して研究を行った。ニパウイルスのリバースジェネティックス系を用いてアクセサリー蛋白欠損ウイルスを作製し、感染細胞内でのIFN応答系への影響を解析した。その結果、全てのアクセサリー蛋白欠損ウイルスが、親株と同様に細胞のIFN応答系を抑制することが明らかとなった。また、これら組換えウイルスの病原性をハムスター感染モデルで調べたところ、3種のアクセサリー蛋白のうち、V、W蛋白を欠損させたウイルスの病原性が著しく低下することが分かった。これらの結果から、ニパウイルスのV、C蛋白がウイルス病原性に大きく関与しているが、その機序はIFN応答系を介したものではないことが示された。1)アクセサリー蛋白の作用機序ニパウイルスのアクセサリー蛋白であるVおよびW蛋白については、それぞれを細胞に強制発現させる実験によって、STAT1のリン酸化を阻害することによりJAK/STATシグナリングを抑制することや、IFN-βやIRF3 responsive promoterの活性化を阻害するなどの抗IFN作用を持つことが報告されている。もう1つのアクセサリー蛋白であるC蛋白については報告がないが、近縁のパラミクソウイルスでの報告では、ウイルスゲノムの転写、複製に関わることやIFN-β産生を抑制することなどが示唆されている。本年度は、IFN-stimulated response elementとレポーター遺伝子を組込んだプラスミドをトランスフェクションしたVero細胞にそれぞれのアクセサリー欠損ウイルスと親ウイルスを感染させ、IFNを添加した後レポーター解析を行ない、それぞれの欠損ウイルスが細胞のIFN応答能に与える影響を調べた。その結果、アクセサリー蛋白欠損ウイルスもIFN応答を抑制することが明らかになった。2)ウイルス粒子放出機序ニパウイルスはウイルス膜蛋白であるM蛋白の細胞内強制発現によってウイルス様粒子(VLP)産生が強く起こるが、他のウイルス多くのウイルスでの研究から、M蛋白に相当するウイルス膜蛋白上にlate domain motifsと呼ばれる配列が存在し、この部位に改変を加えるとVLPの産生が起こらなくなることが証明されている。このlate domain motifのニパウイルスでの粒子形成への必要性を検索するため、本motifsを様々に改変させたウイルスをreverse geneticsにより作出した。このウイルスをvero細胞へ感染させたところ、感染初期において培養上清中へのウイルス放出が強く抑えられていることを確認した。アクセサリー蛋白の作用機序前年度に作出し、in vitroでの性状解析を行なったアクセサリー蛋白欠損ウイルスの病原性に変化が生じるか否かについて、ハムスターへの感染実験によって解析を行なった。親株とアクセサリー蛋白欠損ウイルスをそれぞれ、ハムスターに10^3TCID_<50>ずつ腹腔内投与し病態を2週間観察した。その結果、3種のアクセサリー蛋白のうちW蛋白を欠損させたウイルスでは親株と同様の高い病原性を示したのに対し、VおよびC蛋白を欠損させたウイルスの病原性が著しく低下することが明らかとなった。さらに、それぞれのウイルスを感染させた細胞でのIFN応答を調べたところ、アクセサリー蛋白欠損ウイルスを感染させた場合も親株を感染させた場合と同様に、IFN signal応答の抑制が認められた。これらの結果から、ニパウイルスのV、C蛋白がウイルス病原性に大きく関与しているが、その機序はIFN系を介したものではないことが示された。N蛋白のP蛋白との相互作用部位の同定N、P蛋白に蛍光標識を付加して細胞内での挙動を直接観察し、生きたままの細胞内での共局在を確認することができた。この系を利用して、N蛋白のdeletion mutantを作製してP蛋白との共局在の有無を観察した結果、新規の相互作用領域を同定することができた。さらに、ニパウイルスのミニジェノム系を用いた解析により、同定したN蛋白内の相互作用領域がウイルス遺伝子の複製に関与することも明らかとなった。
蛍光電極法を用いた電気生理学研究の新たな展開

蛍光電極法は脳の深部組織において神経活動を電気信号と光信号の2つの信号として同時に記録する手法である。本研究はこの研究手法を開発すると共に、トリの聴覚神経核に応用し、電気活動と相関した細胞内Ca応答性が神経情報の処理のレベルに応じて変化することを明らかにした。世界的にも例のない極めて挑戦的な研究である。神経情報の処理には、情報伝達と共に様々な可塑的変化が必用とされる。Caイオンは神経可塑性に密接に関わる分子でもあり、動物個体における神経情報処理過程の解明には、本研究により有用性を明らかにした蛍光電極法が今後極めて大きな役割を果たすことが期待される。本研究は蛍光分子を充填した神経細胞から電気活動に同期した蛍光シグナルを脳の深部から記録解析する事を目指した研究である。蛍光シグナルを画像として解析する手法として2光子顕微鏡法があり脳の表面に位置する神経細胞のCa応答等の詳細な解析は既に行われている。しかし、2光子顕微鏡法の到達深度は高々1mm程度が限界であり、脳の深部で行われている様々な神経活動を解析するには不向きである。本研究はパッチ電極を改良し素材に石英ガラスを用いる事でガラス管の長軸方向の光透過性を増し、同時に分光計およびCCDカメラの組み合わせで脳の深部の神経活動を記録解析する事ができた。オレゴングリーンBAPTA-1というCa指示性の試薬を個体脳に注入する事で神経細胞を染色し、本年度は聴覚刺激に対応するCaシグナルを記録する事ができた。さらに、パッチ電極内に詰める溶液を工夫する事により、GABA受容体を抑制する事で、聴覚応答が極めて大きくなった。抑制性のシナプスが興奮性の上向性のシグナルと同期して入力する事で、興奮性シナプス機構が抑えられ、一方では感度の高い聴覚情報処理を実現するメカニズムとして機能する事が示唆された。なお、本研究はさらに時間分解能を高める為に平成24年度は光電子増倍管を購入し干渉フィルターとの組み合わせでアンサンブル計測による高い時間分解能のシステムを開発中であり、基本型を年度内に完成する事ができた。時間分解能の向上とともに蛍光シグナルの検出感度も向上しこれまでのおよそ2倍のS/Nでパッチ電極からの蛍光シグナルを捉える事ができた。今後、高速高感度蛍光電極法として確立する予定である。ニワトリの蝸牛神経核である大細胞核および上行性下行性聴覚情報が統合される下丘、そして大脳皮質であるField-Lを対象として、聴覚刺激に伴う電場電流および細胞内Caイオン応答を測光電極を用いて計測した。大細胞核神経細胞は個体脳では聴覚刺激に応じた細胞内Ca応答は示さなかったが、脳切片標本では小さなCa応答を生じた。一方、下丘およびField-Lでは聴覚刺激に応じたCa応答があった。特にField-Lではおそらく視床核に起因するとみられる高い自発神経活動を伴いCa応答があり、さらに抑制性神経回路機能を薬剤を用いて抑制することで、頻度は低いが極めて大きなCaシグナルを発生した。Field-Lは大脳皮質に相当するために神経情報の集積統合が行われ、それに伴う細胞内Caシグナルも活発に変化するものと考えられる。一方蝸牛神経核は高い頻度で入力する聴覚情報に対応するために、大細胞核神経細胞は活動電位発射に伴うCa濃度上昇を抑制するメカニズムがあるのであろう。今後、この可能性を明らかにしたい。大細胞核では細胞内Ca濃度が必要以上に高まることで神経細胞死が生ずる可能性もある。本萌芽研究を進める事で、神経情報の抽出と統合処理の過程で活動電位以外に細胞内Caシグナルも調節を受けダイナミックに神経回路機能を制御する手立てとして働いている事の手がかりをうることが出来た。本研究での所見を土台として今後は測光電極を単にCaイオン測光だけではなく、膜電位応答など他の光応答の記録にも応用したい。本研究では、ガラス電極を工夫することで動物個体脳深部から蛍光を指標として神経細胞を同定し、同時に電気活動を記録する蛍光電極法を開発することを目標としている。平成23年度は、本法を安定した実験手技として確立するための予備実験として脳切片標本を用い、実験条件を最適化した。電極の端面を研磨することで、蛍光スペクトルの背景ノイズは大きく減少した。また、FRET-Ca指示タンパクであるf2cの発現を、トリだけでなくラット、マウスの様々な部位で試すことでFRET応答を効率良く観測できた。しかし、発現効率は個体脳からの蛍光測光に応用するには未だ不十分であり、さらに工夫が必要である。こうした改善の結果、電極を通して検出される蛍光スペクトルは、蛍光蛋白を発現した神経細胞と電極先端が接近するにつれて増大した。高濃度KCl(30mM)刺激、より生理的状態に近い細胞応答として神経線維の電気刺激によるCa応答をFRET計測したところ、FRET応答の変化量、時間経過共に、従来のCCDカメラを用いたW-View測光システム(浜松ホトニクス)と同等の精度が得られた。

さらに、高濃度KCl刺激によるFRET応答と細胞外活動電位を同時記録し、細胞内Ca濃度の増加に先立つ活動電位発火頻度増大が観察できた。現在の本法では、電極で捉えた蛍光シグナルを分光器を用いて波長分解し、目的の蛍光スペクトル強度を計測している。これにより、様々な背景ノイズを同定して取り除き、蛍光シグナルの効率良い検出が可能となった。しかし、分光器を用いたシステムは、蛍光シグナルを画像化するため時間分解能が低いのが欠点である。そこで現在、ホトマルを用いたシステムを作成中である。時間分解能を高めアンサンブル平均を取ることで、蛍光シグナル検出はより安定し、電気記録と細胞内物質動態の関連を詳細に解析出来ると考えられる。本研究で開発した蛍光分光機能を持ったパッチクランプシステムは現在個体動物脳の神経回路機能に密接に関連した神経細胞Ca応答を解析するのに成功している。さらに、電極として神経活動を記録すると同時に、電極内液を介して様々な化合物を脳の深部に送る事ができ、シナプス作用の解析にも応用できている。これは、当初予定した神経細胞に発現した蛍光物質からの測光以上の実験展開が可能となり、当初計画以上に進展したと考えている。(2)現時点で、蛍光電極法を用いて細胞の蛍光を指標として細胞を同定し、さらにFRET計測、電気活動の計測を行うことが可能になった。これは、本法の個体脳応用への準備という平成23年度の目標にほぼ到達しており、研究はおおむね順調に進展していると判断する。今後は高速高感度の分光パッチ電極法として完成させるとともに、多くの研究者が使える研究システムとして広めたい。これまでの研究で脳切片標本を用いて実験条件を最適化し、蛍光測光と電気活動の同時記録が可能となった。今後は、蛍光測光の時間分解能を高めるシステムを完成させ、動物個体脳に蛍光電極法を応用することを目標とする。蛍光電極法を用いて個体脳からCa応答性のFRET計測と電気活動を同時記録することで、神経活動及び聴覚情報処理上での細胞内Caイオンの役割を1細胞レベルで解析したい。当初の目標であった、蛍光シグナルを計測するための分光器を用いたシステムの開発はほぼ完成した。しかし平成24年度中に予定していた学会発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。通常の電気生理学実験に用いる設備は整っているので、動物の飼育に要する経費および使用する試薬等以外には計上しない。蛍光分光装置に関しては、レーザー、計測装置などの基本的設備は整っている。本研究では、特殊な石英電極等の消耗品を購入する。
造血幹細胞・ｉＰＳ細胞由来ＴＲＡＩＬ陽性ＮＫ細胞による肝癌免疫細胞療法の基礎研究

我々は、ヒト肝臓内に局在する未成熟NK細胞に、強い抗癌分子(TNF-related apoptosis-inducing ligand: TRAIL)誘導する方法を確立し、肝臓移植後のドナー肝由来NK細胞補助療法の臨床実施により癌無再発生存率の有意な改善を得た。しかし、末梢血由来の成熟NK細胞からTRAIL分子を誘導することは、現段階では不可能である。本研究では、CD34+細胞およびiPS細胞から未成熟NK細胞への分化誘導を実施し、抗腫瘍分子であるTRAIL,NKG2D,CD226およびIFN-γ産生の高表出を確認した。また、肝癌細胞株(HepG2,Huh7)を用いて抗腫瘍活性を確認した。昨年度は、ヒトCD34+造血幹細胞およびiPS細胞からの未成熟NK細胞の誘導効率の工夫とフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の解析を行った。培養条件は、iPS細胞からは、H3000メディウムにFlt3、SCF、IL-3、IL-6、IL-15、IL-7を加えた培養液で、10日間培養後X-VIVOメディウムにFlt3、IL-7、IL-15添加培養液に交換し、IL-12、IL-18による短期刺激でTRAIl発現NK細胞を誘導することを確認した。今年度は、抗腫瘍分子であるTRAILに加え、HLA-classIを認識するNKG2DやDNAM-1(CD226)およびFas ligandの表出の検討とともに肝癌細胞株(HepG2, Huh-7)の上記分子に対するLigandの検索を実施した。また、上記細胞に対する細胞傷害性試験を実施した。さらに、ヒトCD34+造血幹細胞の解剖学的存在によるNK細胞分化誘導の差を確認するため、末梢血、骨髄、肝臓内のCD34+細胞を用いて誘導実験を実施した。本年度は、ヒトCD34+造血幹細胞およびiPS細胞からの未成熟NK細胞の誘導効率の工夫とフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の解析を行った。その結果、未成熟NK細胞の分化にはH3000メディウムにFLt3, SCF, IL-3, IL-6,IL-15,IL-7を添加し1週間培養後X-VIVOメディウムにFLt3, SCF,IL-15,IL-7を加え、さらに21日間培養で効率的に誘導し得ることを確認した。さらに、培養最終段階の4週間後にIL-12とIL-18を同時に添加することで、NKG2DやKNp46やTRAILの表出が高まることを確認した。この誘導細胞を用いて、肝細胞癌株であるHUh7に対しての細胞傷害性を51Crリリース法で評価し、肝臓内NK細胞と同等の細胞傷害性があることを確認した。次に、Tic株を用いたヒトiPS細胞からの分化誘導では、CD34+CD45+細胞への分化を経てCD56+細胞への分化誘導を確認した。今後は誘導NK細胞の機能評価を実施する。我々は、ヒト肝臓内に局在する未成熟natural killer (NK)細胞に、強い抗腫瘍分子(TNF-related apopyosis-inducing ligand:TRAIL)を誘導する方法を確立し、肝臓移植後のドナー肝由来NK細胞補助療法の臨床実施により癌無再発生存率の有意な改善を得た。本研究は、ヒトCD34+造血幹細胞およびiPS細胞から未成熟NK細胞を効率的に分化誘導する技術を開発し、抗腫瘍活性を評価することを目的とする。昨年度までに、CD34+造血幹細胞からの未成熟NK細胞の分化誘導法を確立し、TRAILおよびNKG2D、DNAM-1などの抗腫瘍分子の表出とともに、肝癌細胞株(Huh-7,HepG2)に対する抗腫瘍活性を確認した。本年度は、iPS細胞からのNK細胞の分化誘導を実施した。ヒト線維芽細胞由来のiPS細胞株を用いて、M210-B4 (マウス骨髄線維芽細胞)とともに24日間培養し、造血幹細胞(CD34+CD45+)に分化させ、その後、磁気ソーティング法でCD34+細胞を分離後、AFT-024 (マウス胎児肝線維芽細胞)、サイトカイン(IL-15, IL-7,SCF, Flt3-L, IL-3)とともに30日間培養するとNK細胞に分化した。誘導したNK細胞は、肝臓内NK細胞やCD34+造血幹細胞由来NK細胞と同様に高いIFN-γ産生能を示したが、抗腫瘍分子であるTRAILやDNAM-1の表出はやや弱く、CD16の表出が高い末梢血NK細胞フェノタイプに近い成熟型NK細胞が誘導されているものと考えられた。

肝癌腫瘍株(HepG2)に対する細胞試験では、細胞障害性はCD34+由来NK細胞に比べ抗腫瘍効果は弱い傾向を認めた。今後、機能分子の表出を促進する工夫を要するものと考えられる。臨床試験における解析では、肝癌症例に対する肝臓移植後では、NK細胞移入により抗ドナー応答性が促進され得るかをリンパ球混合試験によって評価した。その結果、NK細胞はアロ応答性T細胞には影響を示さないことがわかった。移植免疫学Induced immmatureNK細胞の誘導法の確立とTRAIL発現はすでに確認した。CD34+細胞からの誘導NK細胞の肝癌細胞株に対する細胞傷害性も確認し得た。臨床応用を目指すにあたり、今後は末梢血中に存在するCD34+細胞を回収し、詳細な培養系の確立を目指す。研究計画は順調に進んでいる。しかしながら、iPS細胞細胞由来の誘導NK細胞の増殖効率が乏しく、機能解析を実施し得ていない。誘導後のNK細胞のmRNAのテロメア活性を検索すると、iPS由来のものはテロメア活性が低下していることが示唆された。テロメア活性を維持するための、培養系あるいは誘導高率の改善を図る必要がある。充分な誘導効率が得られれば、抗腫瘍活性の確認とin vitroによる抗腫瘍メカニズム解析およびin vivoモデルを用いた機能解析を必要とする。この部分において、計画がやや遅れている。本研究の目的は、CD34+造血幹細胞およびiPS細胞から抗腫瘍活性の高いTRAIL発現induced immatureNK細胞への分化・誘導効率を改善し、肝細胞癌に対する抗腫瘍活性の解析と機能解析を行うことである。induced immature NK細胞の誘導法の確立とTRAIL発現はすでに確認済みである。また、CD34+細胞からの誘導NK細胞の肝癌細胞株に対する細胞傷害性も確認し得た。今後はiPS細胞由来の誘導NK細胞の抗腫瘍活性の確認とin vitroによる抗腫瘍メカニズム解析およびin vivoモデルを用いた機能解析を必要とする。iPS細胞の増殖効率には、誘導NK細胞のテロメア活性の低下やBmi1の発現低下があることから、増殖初期にhTERTやBmi1の遺伝子導入による細胞増殖の効率改善を試みる。また、induced immature NK細胞の機能解析にあたり、担癌マウスを用いて細胞移入実験およびブロッキング抗体投与による抗腫瘍効果の確認を行う。今後は、induced immature NK細胞が肝細胞癌に対して、抗腫瘍活性を十分に発揮することへの評価とメカニズム解析を実施する。in vitroにおいて、肝細胞癌株を標的とした細胞傷害性試験を引き続き実施するとともに、抗腫瘍活性におけるTRAIL介在機構、CD226-CD155/CD112認識機構、IgFcレセプターを介した抗体依存性傷害機構、ケモカインレセプターによるケモタキシスをそれぞれブロッキング抗体により解析する。さらに、外科手術後の補助細胞療法として有用であるかを担癌マウスモデルを用いてin vivo imaging assayにより評価する。研究を進めていくうえで、必要に応じて研究費を遂行したため、当初の見込み額と執行額において異なった結果となった。また、iPSからの分化誘導において改善の必要があったため、次年度に改善点に対する実験を行うことになった。
未利用資源カツオ「髄」の食品科学的価値の解明

カツオは魚体の40%が未利用部分であり、有効利用法の提案が求められている。本研究では、未利用資源の中骨と髄の食品的価値を調べた。髄の遊離アミノ酸分析とアミノ酸組成分析の結果、タウリン含量が高いことが判明した。また髄にはコラーゲンが豊富に含まれていた。中骨・髄からのアミノ基含有化合物の溶出挙動を調べた結果、煮沸時間15分で最大となった。しかし、その抽出液中のうま味関連物質含量は低かった。中骨・髄抽出液の抗酸化活性、抗肥満活性、高血圧予防効果のin vitro試験を実施したが、顕著に高い活性は認められなかった。以上の結果、カツオ中骨・髄抽出液を食品素材として取扱うことは現時点では難しいと判断した。日本で高い漁獲量を誇るカツオ(Katsuwonus pelamis)は生食用の他、鰹節等へ加工され保存食として活用されているが、未だ魚体の40%は未利用部分が占めており、その廃棄コストは取扱い業者の負担となっている。従って、未利用部分の有効な利用法の提案や高付加価値化が強く望まれている。本研究では、未利用部分の一部である中骨と髄を対象とし、その食品科学的価値の追究を行った。カツオ髄の遊離アミノ酸分析、ならびに加水分解後のアミノ酸組成分析の結果、両分析において、アミノ酸関連物質であるタウリンの含量が高いことが判明した。また、髄中にはコラーゲンが豊富に含まれていることも判明した。カツオ中骨・髄からのアミノ基含有化合物の溶出挙動を調べたところ、煮沸時間15分で頭打ちの状態になることが判明した。しかし、その煮沸溶液中でのうま味に関連する核酸関連物質の濃度は低いものであった。カツオ中骨・髄抽出溶液の機能性の解明を目的として、in vitroでの抗酸化活性(DPPHラジカル消去活性、スーパーオキシドアニオン消去活性)、抗肥満活性(リパーゼ阻害活性)、高血圧予防効果(アンジオテンシンI変換酵素(ACE)阻害活性)を調べた。しかしながら、いずれにおいても顕著に高い活性は認められなかった。以上のことから、カツオ中骨・髄抽出液そのものを食品素材として取り扱うことは現時点では難しいと判断した。今後は、髄中のコラーゲン分解物やタウリンの機能性に着目した研究を行うことで、新たな用途を見出すことができる可能性があるものと考えている。日本で高い漁獲量を誇るカツオ(Katsuwonus pelamis)は,生食用の他,鰹節等へ加工され保存食として活用されているが,未だ魚体の約40%は未利用部分が占めており,その廃棄コストは取扱い業者の負担となっている。従って,未利用部分の有効な利用法の提案や高付加価値化が強く望まれている。本研究では,未利用部分の一部である中骨と髄に着目した研究を行った。カツオの中骨と髄の食品科学的価値の追求の一環として,遊離アミノ酸分析,ならびに加水分解後のアミノ酸組成分析を行った。その結果,遊離アミノ酸分析,アミノ酸組成分析の両方において,アミノ酸関連物質であるタウリンの含量が高いことが判明した。様々な生理的機能を有するタウリンが豊富に含まれていることは,カツオの中骨・髄の栄養学的特徴になり得る可能性があると考えられた。また,カツオの中骨・髄からのアミノ基含有化合物の溶出挙動を調べたところ,煮沸時間15分で頭打ちの状態になることが判明した。今後,溶出液中のアミノ酸,ならびにタウリン等のアミノ酸関連物質濃度を調べ,調理科学的データの蓄積も行う予定である。また,カツオの髄にはコラーゲンが含まれると共に,分子量6020 kDaのタンパク質が含まれている可能性が示された。過去にカツオの中骨・髄に着目した研究はほとんどなく,その科学的特徴は不明な部分が多い。今年度収集した食品科学的基礎データに,次年度に実施予定である機能性に関する情報が加わることにより,未利用資源であるカツオの中骨・髄の食品素材としての特徴付けができるものと考えられる。当初の予定通り,カツオ中骨・髄の遊離アミノ酸分析,加水分解後のアミノ酸組成分析,核酸関連物質の定量等を実施した。加えて,次年度実施予定の機能性に関するデータも予備実験を終了している。特に遅れはないことから,上記の評価に値すると判断した。次年度は,当初の予定通り,中骨・髄溶出液の機能性のスクリーニングを実施する。また,溶出液の味関連物質,ならびに核酸関連物質を実施し,食品素材としての可能性の追求も行う。本年度の学会参加が当初の予定の2回から1回になったこと,ならびに謝金の支出額が予定より少なかったことから繰り越し金が生じた。従って,研究計画そのものには,変更はない。
マウス脳の神経回路形成におけるリソゾームカテプシン群の役割について

カテプシンBとL、カテプシンDとL、およびBとDのダブルノックアウトマウスにおける中枢神経系の組織構築を検討した結果、生後10日過ぎにおいて、カテプシンDとLのダブルノックアウトマウスにおいてのみ海馬の欠損あるいは低形成となる傾向がしばしば認められた。これは、クロライドチャネルCLC-3欠損マウスの海馬で認められた所見と類似していた。これらのダブルノックアウトマウスにおける所見の差異は、カテプシンD、B、Lの基質特異性の差によることが考えられ、現在最も所見が多く認められるカテプシンDとLのダブルノックアウトマウスと対照群のマウスの生後10日過ぎの全脳組織を用いて二次元電気泳動を行なったところ、カテプシンDとLのダブルノックアウトマウスにおいてのみ明らかに増加しているスポットが数カ所確認された。なお、以前より検討を行ってきたカテプシンD単独欠損マウスに関して、C57BL/6Jマウスを用いて10代以上バッククロスを行ったものが得られたので、生後20日以降の終末期の海馬組織を形態学的に再検討した。その結果、海馬組織の欠損は認められなかったが、海馬のCA1錐体細胞層には細胞死に陥った錐体細胞が多数観察された。カテプシンB、L単独欠損マウスも同様にバッククロスを行なったもので再検討したが、このような変化は全く認めなかった。このことより、海馬組織の維持形成には、カテプシンDが最も重要で、それに加えてカテプシンLが何らかの役割を担っていることが示唆された。カテプシンBとL、カテプシンDとL、およびBとDのダブルノックアウトマウスは平均的に生後14日前後まで生存するが、中には20日近くまで生存するものもあった。カテプシンBとL、カテプシンDとL、およびBとDのダブルノックアウトマウスは中枢神経系においてカテプシンD単独欠損マウスと同様リソゾーム蓄積症様の神経病理学的所見を呈した。これら3系統はD単独欠損マウスの所見に加え、軸索の変性がより顕著で、脳梁におけるspheroid様構造の著名な集積が認められた。このようなspheroid内に蓄積する構造物はオートファゴソームに由来することを電子顕微鏡観察および新規マーカーLC3を用いた免疫組織化学で明らかにした。また、細胞内の封入体の種類を比較したところ、D単独欠損マウスで認められたミエリン様に層状化した膜をもつ小体がカテプシンBとLでは認められない一方、両者とも神経性セロイドリポフスチン蓄積症の特徴であるミトコンドリア内膜のサブユニットc蛋白の蓄積が認められることが明らかとなった。カテプシンDとL、およびBとDのダブルノックアウトマウスはD単独欠損マウスと同様網膜変性像が観察されたが、少なくとも生後14日の時点のカテプシンBとL欠損マウスでは網膜変性像を認めなかった。神経組織以外の所見としてカテプシンBとLおよびカテプシンDとL欠損マウスにおいては、生後10日前後で対照群に比べ毛が短いこと、脂肪肝を呈することが明らかであったが、カテプシンBとD欠損マウスにおいてはそのような現象は認められなかった。
強心薬の酸素浪費効果の新しい評価法の開発:機械的エネルギー産生および陽性変力作用のエネルギーコストの定量

本研究代表者は一連の基礎生理学的研究において心臓の収縮性の指標としてEmax(最大エラスタンス)と心臓の収縮に伴って発生する機械的エネルギーを定量する指標としてPVAを提案、確立し、さらに、PVAが、一拍毎の動静脈酸素濃度較差と冠灌流量との積である酸素消費量(Vo_2)と良好な直線関係を持つことを示してきた。初年度は、それらを利用し、カルシウム感受性の増強作用を有する強心薬ピモベンダンのEmax,PVA,Vo_2に対する効果を正常心で検討した。次年度は、不全心に対する強心薬の作用を検討するために不全心モデル形成の研究を行った。実験は、二頭のイヌを用い血液交差灌流摘出心臓標本を作製し、まず心室容積をかえながら等容積収縮を行わせて、左心室容積と左心室圧を測定し、コントロールのEmax,PVA,Vo_2を測定した。そして、Vo_2-PVA関係をしらべると、良好な直線関係を示した。この勾配の逆数は、PVA-依存性のVo_2を全機械エネルギーに変換する収縮効率を表す。またPVA=0の時のVo_2はPVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)を表す。これら、すべてのパラメータは従来の結果と同様な値が得られた。ついで、ピモベンダンペン又はバルビタールの濃度を次第にあげながら冠注すると、Emaxは有意に増加、減少し、Vo_2-PVA関係の勾配は変わらずに上方、下方にシフトした。すなわち、収縮効率は変わらず、PVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)のみ増加、減少を示した。また、PVAに依存しないVo_2とEmaxの関係も直線になり、その勾配は、収縮性の酸素コストをあらわすが、カルシウムと同様であった。従って、ピモベンダンペンとペントバルビタールは収縮効率および収縮性の酸素コストを変えることなく収縮性の指標Emaxを増加、減少させた。今後は、不全心モデルを使って他の強心薬の効果を検討する。本研究代表者は一連の基礎生理学的研究において心臓の収縮性の指標としてEmax(最大エラスタンス)と心臓の収縮に伴って発生する機械的エネルギーを定量する指標としてPVAを提案、確立し、さらにPVAが、一拍毎の動静脈酸素濃度較差と冠灌流量との積である酸素消費量(Vo_2)と良好な直線関係を持つことを示してきた。本研究では、それらを利用し、カルシウム感受性の増強作用を有する強心薬ピモベンダンのEmax,PVA,Vo_2に対する効果を強心作用を有するカテコールアミンであるドーブタミンと比較検討した。実験は、二頭のイヌを用い血液交差灌流摘出心臓標本を作製し、まず心室容積をかえながら等容積収縮を行なわせて、左心室容積と左心室圧を測定し、コントロールのEmax,PVA,Vo_2を測定した。また、PVA=0の時のVo_2はPVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)を表す。ついで、ピモベンダンの濃度を次第にあげながらな冠注すると、ドーブタミンと同様に、Emaxは約2倍に増加し、Vo_2-PVA関係の勾配は変わらずに上方にシフトした。

すなわち、収縮効率は変わらず、PVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)のみ増加を示した。また、PVAに依存しないVo_2とEmaxの関係も直線になり、その勾配は、収縮性の酸素コストをあらわすが、ドーブタミンと同様であった。従って、カルシウム感受性の増強作用を有するピモベンダンも収縮性の酸素コストを節約する効果は示さず、ドーブタミンの作用と質的には同じ強心作用をしめした。本研究代表者は一連の基礎生理学的研究において心臓の収縮性の指標としてEmax(最大エラスタンス)と心臓の収縮に伴って発生する機械的エネルギーを定量する指標としてPVAを提案、確立し、さらにPVAが、一拍毎の動静脈酸素濃度較差と冠灌流量との積である酸素消費量(Vo_2)と良好な直線関係を持つことを示してきた。昨年度は、それらを利用し、カルシウム感受性の増強作用を有する強心薬ピモベンダンのEmax,PVA,Vo_2に対する効果を正常心で検討した。今年度は、不全心に対する強心薬の作用を検討するために不全心モデル形成の研究を行なった。実験は、二頭のイヌを用い血液交差灌流摘出心臓標本を作製し、まず心室容積をかえながら等容積収縮を行なわせて、左心室容積と左心室圧を測定し、コントロールのEmax,PVA,Vo_2を測定した。そして、Vo_2-PVA関係をしらべると、良好な直線関係を示した。この勾配の逆数は、PVA-依存性のVo_2を全機械エネルギーに変換する収縮効率を表す。またPVA=0の時のVo_2はPVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)を表す。これら、すべてのパラメータは従来の結果と同様な値が得られた。ついで、ペントバルビタールの濃度を次第にあげながら冠注すると、Emaxは有意に減少し、Vo_2-PVA関係の勾配は変わらずに下方にシフトした。すなわち、収縮効率は変わらず、PVAに依存しないVo_2(=興奮収縮連関に要するエネルギー)のみ減少を示した。また、PVAに依存しないVo_2とEmaxの関係も直線になり、その勾配は、収縮性の酸素コストをあらわすが、カルシウムと同様であった。従って、ペントバルビタールは収縮効率および収縮性の酸素コストを変えることなく収縮性の指標Emaxを減少させた。今後は、このような不全心モデルを使って正常心に対する強心薬の効果と比較検討する。
グルタミン酸輸送蛋白によるGABA機能修飾過程とてんかん原性獲得の分子機構の解明

てんかんの病態解釈仮説として興奮系と抑制系の不均衡が現在も強く支持されている。興奮系賦活化を担うグルタミン酸(Glu)の細胞興奮毒性は、グルタミン酸トランスポーター(EAATs;グリア型GLAST,GLT-1とニューロン型EAAC-1)によってある程度制御されている。このなかでGABAニューロン上のEAAC-1は、細胞外GluをGABA合成に繋げる経路に関与するEAATsとして注目されている。さらにEAAC-1は、EAATs発現調整因子であるGlutamate Transporter Associated Protein(GTRAP3-18)によって抑制的に制御されている。このような背景からGTRAP3-18は興奮系と抑制系両機能を調整する興味深い膜蛋白であると考えられる。EAAC-1の発現は増加していたが、GTRAP3-18はてんかんモデルにおいて発現が低下していることが明らかになった。同結果は、細胞外グルタミン酸の取り込みの促進を意味するものであり、興奮系シナプス伝達の亢進とともに、抑制系も同時に増強していることを視させる貴重な結果である。その帰結として、興奮系の過同期が生じててんかんの発作発現へと呈するものと推測される。興奮系賦活化を担うグルタミン酸(Glu)の細胞興奮毒性は、グルタミン酸トランスポーター(EAATs;クリア型GLAST,GLT-1とニューロン型EAAC-1)によってある程度制御されている。
抗腫瘍物質を産生する共生型渦鞭毛藻の環境応答解明およびその高速大量培養法の開発

培養環境条件が渦鞭毛藻の細胞増殖速度に及ぼす影響について、目的に応じて水滴(容量0.003 mL)、中型培養器(容量70-300 mL)、および大型培養器(容量1-2 L)を用いた培養実験系で調査した。細胞増殖速度を最大にする環境条件の組み合わせは、温度:26°C、PPFD: 0.05-0.07mmol m-2 s-1、O2濃度:3-5%、CO2濃度:0.1%、NaHCO3 2.5 mmolであった。既存の標準培地への栄養塩の添加は、増殖促進に効果的であった。また中型あるいは培大型培養器での培養における最適な水深は10 mm以下であった。抗腫瘍性物質であるアンフィジノリド類を産生する海産共生型渦鞭毛藻の細胞増殖を促進する培養条件を求め、藻類の効率的大量高密度培養技術を確立することを目的として研究を行った.細胞数の計測による評価方法を用いて,培養時の光強度,光質、温度、CO_2・O_2濃度、培地成分濃度が藻類の増殖速度におよぼす影響について検討した.その結果,(1)蛍光灯照明下で増殖速度を最大とするPPFDは、3070μmol m^<-2> s^<-1>となり、その時の比増殖速度は0.025h^<-1>となった。(2)PPFD60μmol m^<-2> s^<-1>の場合,赤色光、青色光、緑色光の比4:1:1の光質の組み合わせが最適であり、その時の比増殖速度は0.033h^<-1>となった。(3)海水塩濃度14%において、3.3%での比増殖速度が最大となる傾向があった。海水塩濃度1%では比増殖速度は大きく低下した。(4)無機塩について、N・P・Kを含む農業用液体胆料(園試処方)の添加したところ、濃度1531.5mg/Lでの比増殖上速度が農大となった。(5)培地温度26°Cにおいて、比増殖速度が最大となった。(6)O_2濃度5%およびCO_2濃度0.05-0.1%において、比増殖速度が最大となった。特にO_2濃度については、比増殖速度は5%O_2>0.3%O_2>21%O_2の順に大きかった。以上のことから、次年度以降に計画している人工光を用いた海産共生型渦鞭毛藻の大量高密度培養システムを構築する上で、培養条件に関する有用な知見が得られた。抗腫瘍性物質であるアンフィジノリド類を産生する海産共生型渦鞭毛藻の細胞増殖を促進する培養条件を求め、藻類の効率的大量高密度培養技術を確立することを目的として研究を継続した。24年度に行った、容積1 L、最大培地深65 mmの培養槽を用いて、光を培養槽内に均一に拡散させて藻類を大量培養する方法の検討結果に基づいて、環境因子が渦鞭毛藻の増殖および有用成分の生産に与える影響を精査し、有用成分の大量生産に最適な高密度培養システムを構築するための知見を得た。各段の培養器の液深を10 mmに維持した薄層多段培養システムの基礎的構成を提案した。またこの方法による微細藻生産を、太陽光利用型に応用し、低コストで細胞増殖速度を高めると同時に有用成分の産生速度を高めるための環境維持が可能な大量培養システムについて提案した。抗腫瘍性物質であるアンフィジノリド類を産生する海産共生型渦鞭毛藻の細胞増殖を促進する培養条件を求め、藻類の効率的大量高密度培養技術を確立することを目的として研究を行った.平成24年度は、環境因子が渦鞭毛藻の増殖および有用成分の生産に与える影響を精査し、有用成分の大量生産に最適な高密度培養システムを構築するための知見を得た。1.渦鞭毛藻の増殖速度が最大となる培養条件の解明23年度に培地量0.03 mLの水滴培養による実験系で得られた最適培養条件を、大量生産可能な培養系に展開する。実用的な高密度培養システム開発のための基礎実験として、0.5 Lの培地容量を持つ培養器を用いて、飛躍的に効率の高い細胞増殖条件を確立した。2.渦鞭毛藻の大量生産に最適な高効率光利用型培養システムの構築細胞増殖に大きく影響する光照射システムについて検討する。付着性渦鞭毛藻の培養用として、容積1 L、最大培地深65 mmの培養槽を用いて、光を培養槽内に均一に拡散させて藻類を大量培養する方法について検討した。その結果、細胞増殖を促進できる環境条件を維持できる培養システムを試作し、有用成分の分析に供試できるに足る量の細胞を生産する手法の目処が付いた。

藻の増殖を最大にするO_2濃度が5%であることなど、興味深い結果が得られているが、当初に計画した圧力の影響解明については、耐圧培養器の制作が遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度には、有用成分の生産速度が最大となる環境条件の解明を計画していたが、藻細胞の大量培養システムの構築が遅れたため、藻細胞内で産生する有用成分含有量を求めるための十分な量の藻細胞が生産できていない。耐圧培養器の制作を早急に進め、今年度6月までには、渦鞭毛藻の増殖に及ぼす圧力の影響を解明する。その他は、当初計画通りに進めていく。また、今年度は国際会議、国際雑誌への投稿を含めて、研究発表を積極的に行う。平成25年度には、大量培養システムを完成し、十分量の藻細胞を生産することにより、細胞の増殖速度のみならず、有用成分生産速度を高める環境条件を求める予定である。また現在、人工光で行っている高効率光利用型培養装置を用いた藻細胞の生産を、太陽光利用型に応用し、低コストで細胞増殖速度を高めると同時に有用成分の産生速度を高めることができる環境を維持できる実用規模の大量培養システムを構築する。