hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸内細菌に特徴的なATP消費抑制型N-グリカン代謝経路の解明

数種の腸内細菌で見出される加リン酸分解酵素(ホスホリラーゼ)が関与するATP消費抑制型N-グリカン代謝経路を解明するために,本代謝経路の鍵酵素であるβ-1,4-マンノシル-N-アセチルグルコサミンホスホリラーゼの反応速度論的および構造学的解析を進めた。結晶が得られたBacteroides thetaiotaomicron由来の当該酵素について現在構造解析中である。また当該酵素遺伝子の近傍に存在し,N-グリカンの代謝に寄与することが推測される機能未知遺伝子について調査するために,当該遺伝子がコードするタンパク質を各種構造のN-グリカンに作用させたが,酵素反応は確認されず性質決定に至らなかった。N-グリカンに共通する構造(β-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミン)を加リン酸分解する新規酵素β-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンホスホリラーゼの機能と構造の相関を明らかにするため,当該酵素のX線結晶構造解析を試みた。まずハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化条件のスクリーニングを行なった。酵素タンパク質の生産性および結晶化において困難な点が認められたため,当該酵素についての検討に加え他の細菌由来のβ-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンホスホリラーゼホモログ遺伝子のクローニング・発現プラスミドの構築および酵素タンパク質の発現についても併せて行なうことで,結晶構造解析を行なう上での対策を講じた。また,当該酵素の反応メカニズムの解析に必要なβ-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンをマンノース1リン酸およびN-アセチル-D-グルコサミンを用いて,新規酵素の逆反応を利用して大量調製した。また,スクロースホスホリラーゼ,α-ホスホグルコムターゼ,グルコース6-リン酸イソメラーゼ,マンノース6-リン酸イソメラーゼ,ホスホマンノムターゼおよび当該新規酵素の6種の酵素を組み合わせることにより安価なスクロースおよびN-アセチル-D-グルコサミンからβ-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンを大量調製した。反応生成糖は,各種カラムクロマトグラフィーおよび電気透析装置により精製し,当該新規ホスホリラーゼの解析に必要な基質を十分量得た。腸内細菌Bacteroides thetaiotaomicronがもつ糖質加リン酸分解酵素(ホスホリラーゼ)が関与するATP消費抑制型N-グリカン代謝機構の全貌を明らかにするため,鍵酵素β-1,4-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンホスホリラーゼ(BT1033)のX線結晶構造解析を試みた。初年度においては構造決定に至らなかったため27年度では腸内細菌由来の酵素に加え他微生物由来の酵素についても併せて機能解析,結晶化および構造解析を遂行した。また,ホスホリラーゼ遺伝子と同一遺伝子クラスター上に存在する機能未知タンパク質BT1037をコードする遺伝子をクローニングし,大腸菌を用いた組換えタンパク質の異種宿主大量発現系を構築後,タンパク質発現,精製および活性確認を行なった。精製タンパク質を様々な構造を有する各種N-グリカンに作用させHPLC分析を行なったが,加リン酸分解および加水分解反応は認められず,現在のところ機能同定には至っていない。β-1,4-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンホスホリラーゼの結晶構造解析においては,他微生物由来の酵素についても機能解析および構造解析を進めることで,結晶化が困難であった腸内細菌由来の酵素の機能・構造解析を補完するデータを蓄積できた。結果的に腸内細菌由来の酵素の結晶化および構造解析が順調に進行するに至っており,現在鋭意解析中である。機能未知タンパク質の機能同定については,当初からその難易度は想定されており,種々のN-グリカンに対する非反応性ではあるがデータの蓄積が進んでいる。腸内細菌は,過酷な生息環境に適応するために多種多様かつ特徴的な糖質代謝経路を有する。本研究では,嫌気性腸内細菌より我々が初めて見出したアスパラギン結合型糖鎖(N-グリカン)の新規代謝経路に関与する新規ホスホリラーゼ(加リン酸分解酵素),および本酵素遺伝子とクラスターを形成し,連携してN-グリカンの代謝に寄与することが推測される機能未知遺伝子がコードするタンパク質の反応メカニズムを,遺伝子工学的,構造学的および分子動力学的手法を用いて解析することにより,嫌気性腸内細菌に特徴的な,ホスホリラーゼが関与するATP消費抑制型N-グリカン代謝機構を明らかにする。当該酵素の構造および機能解析に必要なβ-1,4-マンノシル-N-アセチルグルコサミンをマンノース1-リン酸およびN-アセチルグルコサミンを用いて,新規酵素の逆反応を利用して調製した。各種カラムクロマトグラフィーおよび電気透析装置により精製し,当該新規酵素の解析に必要な基質を十分量得た。N-グリカンに共通する構造を加リン酸分解する鍵酵素β-1,4-マンノシル-N-アセチルグルコサミンホスホリラーゼの機能と構造の相関を明らかにするため,当該酵素のX線結晶構造解析を試みた。結晶構造解析成功の確率を上げるため,腸内細菌由来の酵素に加え他微生物由来の酵素についても併せて機能解析,結晶化および構造解析を遂行した。その内,腸内細菌由来の酵素について現在も構造解析を継続している。また,ホスホリラーゼ遺伝子と同一遺伝子クラスター上に存在する機能未知タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし,大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現系を構築後,タンパク質発現,精製および活性確認を行なった。

精製タンパク質を様々な構造を有する各種N-グリカンに作用させHPLC分析を行ったが,加リン酸分解および加水分解反応は認められず,機能同定に至らなかった。数種の腸内細菌で見出される加リン酸分解酵素(ホスホリラーゼ)が関与するATP消費抑制型N-グリカン代謝経路を解明するために,本代謝経路の鍵酵素であるβ-1,4-マンノシル-N-アセチルグルコサミンホスホリラーゼの反応速度論的および構造学的解析を進めた。結晶が得られたBacteroides thetaiotaomicron由来の当該酵素について現在構造解析中である。また当該酵素遺伝子の近傍に存在し,N-グリカンの代謝に寄与することが推測される機能未知遺伝子について調査するために,当該遺伝子がコードするタンパク質を各種構造のN-グリカンに作用させたが,酵素反応は確認されず性質決定に至らなかった。当該酵素の結晶構造解析については,大腸菌におけるリコンビナント酵素の生産性および結晶化において困難な点が認められ少々の遅れが生じているが,他生物由来の数種の酵素ホモログについて遺伝子クローニング,発現プラスミドの構築および酵素タンパク質の発現を行ない,より構造解析が進展しやすいよう速やかに対策を講じたことから,今後の研究進展が大いに期待できる。また,当該酵素の反応メカニズムの解析に必要なβ-1,4-D-マンノシル-N-アセチル-D-グルコサミンの調製については,当該酵素の逆反応の利用および数種の酵素を組合わせたOne-pot酵素合成法を行なうことにより,大量に基質を調製することに成功しており,今後の研究進展が大いに期待できる。平成27年度における種々検討によって順調に進行し始めた構造解析を鋭意進め,機能と構造の相関について考察を深める。また同一遺伝子クラスター上に存在する機能未知タンパク質遺伝子および糖結合タンパク質ホモログ遺伝子がコードするタンパク質の機能同定を引き続き行なう。酵素化学当該酵素およびホモログタンパク質の結晶構造解析を進めると共に,N-グリカン代謝関連加水分解酵素および糖結合タンパク質についてクローニング,タンパク質発現,性質決定に取り組む。平成28年3月に使用した額が大学の平成27年度の会計システムに反映されなかったため。既に平成28年3月に差額3262円を消化し,残額を0円とした。
オブジェクト指向データベースにおける問い合わせプログラムの型検査法の開発

本研究によって以下の成果を得た.1.無閉路OODBスキーマに対する型検査問題の計算複雑さ型検査問題が決定可能となる実用的な部分クラスとして,無閉路OODBスキーマというクラスを提案した.無閉路OODBスキーマとは,そのデータベースインスタンスが必ず無閉路グラフで表現できるクラスであり,例えば機械の部品関係を表すデータベースなどがこのクラスに属する.本研究では,無閉路OODBスキーマに対する型検査問題がco非決定性指数時間完全であることを示した.現在発表準備中である.また,更新操作のない無閉路OODBスキーマに対する型検査問題がPSPACE完全であるという予想をたてており,現在その証明を行っている.2. OODBセキュリティへの型検査問題の応用データベースのユーザが,実行を許可された問い合わせプログラムのみを用いて,それらの実行結果から(極秘な)情報を推論することを,推論攻撃と呼ぶ.データベーススキーマの設計やアクセス権の設定を行う際に,極秘情報が推論攻撃により漏洩する可能性があるかどうかをあらかじめ設計者が知ることができるかどうかは,データベースのセキュリティの保全を計る上で極めて重要な問題である.本研究では,型検査問題の計算量に関する既知の結果を利用して,OODBに対する推論攻撃について以下の結果を得た.・与えられたデータベースインスタンスのもとで,与えられた極秘情報が推論攻撃によって漏洩し得るかどうかは,極めて非実用的な特殊な場合を除いて,多項式時間で解くことができる.・与えられた極秘情報が推論攻撃によって漏洩し得るようなデータベースインスタンスが存在するかどうかは,一般に決定不能である.本研究によって以下の理論的成果を得た.1.問い合わせプログラム中に更新操作のないデータベーススキーマに対する型検査問題が,クラス階層の高さを高々1に限定しても決定不能であることを,Postの対応問題からの還元により示した.具体的には,与えられたPostの対応問題の解が存在するときかつそのときのみ実行時型エラーが発生するような,上記の条件を満たすデータベーススキーマを構成できることを示した.2.問い合わせプログラムが停止性を満たすデータベーススキーマに対する型検査問題が,クラス階層の高さを高々1に限定しても決定不能であることを,Turing機械の受理問題からの還元により示した.具体的には,与えられたTuring機械Mとそれへの入力χに対し,Mがχを受理するときかつそのときのみ実行時型エラーが発生するような,上記の条件を満たすデータベーススキーマを構成できることを示した.これにより,文献[1]では未解決であったすべてのデータベーススキーマの部分クラスに対する型検査問題の計算量が得られた.そして,既知の結果と比較することにより,型検査問題を難しくする要因として(a)クラス階層があること,および(b)問い合わせプログラム中に再帰があることが挙げられるという結論が得られた.さらに,問い合わせプログラムが停止性を満たす場合は,(c)問い合わせプログラム中に更新操作があることも型検査問題を難しくするという結論が得られた.本研究によって以下の成果を得た.1.無閉路OODBスキーマに対する型検査問題の計算複雑さ型検査問題が決定可能となる実用的な部分クラスとして,無閉路OODBスキーマというクラスを提案した.無閉路OODBスキーマとは,そのデータベースインスタンスが必ず無閉路グラフで表現できるクラスであり,例えば機械の部品関係を表すデータベースなどがこのクラスに属する.本研究では,無閉路OODBスキーマに対する型検査問題がco非決定性指数時間完全であることを示した.現在発表準備中である.また,更新操作のない無閉路OODBスキーマに対する型検査問題がPSPACE完全であるという予想をたてており,現在その証明を行っている.2. OODBセキュリティへの型検査問題の応用データベースのユーザが,実行を許可された問い合わせプログラムのみを用いて,それらの実行結果から(極秘な)情報を推論することを,推論攻撃と呼ぶ.データベーススキーマの設計やアクセス権の設定を行う際に,極秘情報が推論攻撃により漏洩する可能性があるかどうかをあらかじめ設計者が知ることができるかどうかは,データベースのセキュリティの保全を計る上で極めて重要な問題である.本研究では,型検査問題の計算量に関する既知の結果を利用して,OODBに対する推論攻撃について以下の結果を得た.・与えられたデータベースインスタンスのもとで,与えられた極秘情報が推論攻撃によって漏洩し得るかどうかは,極めて非実用的な特殊な場合を除いて,多項式時間で解くことができる.・与えられた極秘情報が推論攻撃によって漏洩し得るようなデータベースインスタンスが存在するかどうかは,一般に決定不能である.
大型農林業機械の騒音と振動による健康影響に関する研究

近年農業の機械化は急速に進展し、水田、畑作ともに乗用化、多機能化、多条化がはかられている。本研究では主として水田9機種、畑作13機種の乗用型農業機械の騒音及び手腕系振動、座席振動についてISO等国際標準に基づく測定法によって測定した。その結果、乗用機械の実稼動時の騒音は少なからず日本産業衛生学会の許容基準を上回り、聴覚障害のリスクが高いことが判明した。手腕系振動は乗用型農業機械では振動レベルは低いが、携帯型茶摘機などは高値を示した。他方、座席振動は現行の操作時間ではISOの許容曝露限界を上回るケースは例外的であるが、長期的な健康影響を考慮するとき、疲労・能率減退限界2時間を下回る機種が少なくなく、1997年のISO許容基準に照らせば、トラクター・コンバイン等の数機種では作業時間規制が必要であり、機械の工学的改善が必要だと思われた。作業者の健康影響については、乗用型農業機械の長期間操作者では高周波帯域の聴力低下が明らかで、臨床的に騒音性難聴と診断し得る症例がみられた。今後農業経営規模の拡大、あるいは法人・会社組織化による農業機械のオペレータの専属化の進行は必至だと思われる。農業機械の騒音及び振動の測定及び評価を今後、全国的に組織的・体系的に行う必要があり、筆者らは健康障害予防の観点から今後の医学的、衛生工学的対策の提言を試みた。近年農業の機械化が急速に進展し、稲作を中心に乗用型農業機械が普及している。これら農業機械の騒音や振動の農業従事者に対する健康影響を検討するための第一段階として、稲・麦作に汎用されている乗用型農業機械9種について、稼動時の騒音及び振動(座席・ハンドル)の測定を行った。測定機種はコンバイン(3種)、トラクター(2種)、田植機(2種)、運搬車及び乗用型管理機である。騒音は機械操作者の周辺にて普通騒音計及びオクターブフィルターユニットとしてRION(NA-20)(NX-01)を用い、各周波数域で測定した。座席振動はB&K2635型振動計及びB&K4332型ピックアップを用いてISO2631(1987)により測定した。測定はアイドリング、一般道路走行、圃場移動(実稼動)の条件で行った。実稼動時の乗用機械の騒音レベルは、コンバイン2機種が1,000及び2,000Hzにおいて曝露60分、120分の許容基準(日本産業衛生学会)を上回ってした。座席振動は周波数荷重加速度実効値でみると、コンバイン、トラクター、運搬車は疲労、作業能力減退境界FDP Limitsがそれぞれ2時間、1.8時間、2時間など、1日の稼動時間に制限が必要なレベルであった。一般の稲・麦作農家では乗用型機械の実稼動時間は概して少ない(例えばトラクターでは41日間)が、一部の地域では大規模なアグリコントラクターが専業的に作業を請け負う形態が広がりつつあり、特にこれらの専属オペレーターなどでは騒音、振動の健康リスクを評価し、予防対策を講じる必要がある。
感冒後嗅覚障害の病態生理解明と治療への応用

ウイルス性嗅覚障害の病態生理については不明な点が多く詳細は不明である。本研究ではウイルスに対する宿主免疫応答に伴う2次的な組織傷害および傷害後の組織再生に焦点を当て解析した。ウイルス感染に関与するToll-like receptor 7の人工リガンドを経鼻投与したが炎症細胞浸潤や嗅上皮の傷害は認められなかった。メチマゾール腹腔内投与による嗅上皮傷害後の組織再生に関してマクロファージ枯渇モデルマウスを作成し解析した結果、マクロファージ枯渇群において組織再生が不良であり、マクロファージが嗅上皮再生に関与していることが示唆された。ウイルス感染時の嗅粘膜免疫応答を解析するためToll-like Receptor(TLR)7の人工リガンドであるLoxoribineを24時間毎に3日間マウスに経鼻投与し、初回投与後3日目にマウスをホルマリン固定しパラフィン切片を作成した。嗅粘膜の形態学的変化、炎症細胞浸潤について免疫組織学的検討を行ったところ形態学的に明らかな変化は認められず、好中球・マクロファージなどの炎症細胞浸潤も認められなかった。また別の人工リガンドであるR848(Resiquimod)を用いて同様の検討を行ったが変化は認められなかった。嗅上皮傷害後の組織再生におけるマクロファージの関与を解析するため、clodronate liposomeを用いてマクロファージ枯渇モデルマウスを作成した。血中マクロファージおよび嗅上皮内の常在マクロファージを除去するためclodronate liposomeを腹腔内と鼻腔内に投与し、枯渇状態を維持するため3日毎に投与を継続した。メチマゾール腹腔内投与による嗅上皮傷害後1日目、14日目のパラフィン切片を作成した。まずメチマゾール投与後1日目の嗅上皮傷害の程度をclodronate群とPBS群(コントロール)で比較したところ、明らかな差は認めなかった。すなわちclodronate投与によるメチマゾールの嗅上皮毒性に変化は認められなかった。次に嗅上皮の再生状態を比較するため14日目の切片においてOMP染色を行い、OMP陽性成熟嗅神経細胞数を比較したところ、clodronate群で有意に減少していた。ウイルス感染時の嗅粘膜免疫応答に伴う自己組織の障害を解析するため、昨年度Toll-like Receptor7の人工リガンドであるLoxoribineおよびResiquimod(R848)を24時間毎に3日間マウスに経鼻投与し、嗅粘膜への炎症細胞浸潤、嗅粘膜の形態学的変化を免疫組織学的に解析したが点鼻開始後3日目、9日目の時点で明らかな炎症細胞浸潤は認められず、嗅粘膜の構造変化も認められなかった。本年度はリガンドの投与量を増加したり、他社のリガンドを用いて同様の検討を行ったがいずれも変化は得られなかった。嗅上皮傷害後の組織再生におけるマクロファージの関与を解析するため昨年度clodronateliposomeの腹腔内投与および経鼻投与によりマクロファージ枯渇モデルを作成し、メチマゾールによる嗅上皮傷害後の組織再生がマクロファージ枯渇群で有意に不良であったことが示された。また基底細胞においてKi67陽性細胞も減少しており細胞増殖能も低下していることが示された。本年度は分子生物学的解析を行うため、マクロファージが放出するとされる各種細胞増殖因子や神経栄養因子(TGFα、NGF,BDNF)についてELISA法を用いてマクロファージ枯渇群とコントロール群で比較した。TGFα,BDNFに関しては有意差は認められなかった。NGFでは有意差は得られなかったがマクロファージ枯渇群で減少している傾向があった。TLR7の人工リガンドの経鼻投与実験において変化が認められず、再検討を繰り返し時間を要した。ウイルス感染時の嗅粘膜免疫応答に伴う自己組織の傷害を解析するため、Toll-like receptor 7の人工リガンド(Loxoribine、Resiquimod)を24時間毎に3日間経鼻投与し点鼻開始後3日目、9日目の時点で嗅粘膜への炎症細胞浸潤、嗅粘膜の形態学的変化を免疫組織学的に解析したが明らかな炎症細胞浸潤は認められず、嗅粘膜の傷害も認められなかった。投与量を増加するなどの調整を行ったがいずれも変化は得られなかった。また嗅上皮傷害後の組織再生におけるマクロファージの関与を解析するため、clodronate liposomeを用いてマクロファージ枯渇モデルマウス作成し、メチマゾール腹腔内投与による嗅上皮傷害後の再生について解析を行った。マクロファージ枯渇群では嗅上皮傷害後の組織再生が有意に不良でありOMP陽性成熟嗅神経細胞は少なく、基底細胞におけるKi67陽性細胞が減少しており細胞増殖能も低下していることが示された。メチマゾール傷害後7日目の嗅粘膜を採取後タンパクを抽出し、マクロファージが放出するとされる各種細胞増殖因子、神経栄養因子、抗炎症因子(TGFα、NGF、BDNF、IGF-1,IL10)に関してELISA法を用いて定量を行った。TGFα、BDNFに関してはマクロファージ枯渇群とコントロール群で有意差は認められなかった。NGF、IGF-1、IL10では有意差は認められなかったがマクロファージ枯渇群で減少している傾向が認められた。メチマゾール腹腔内投与による嗅

上皮傷害後の組織再生に関してマクロファージ枯渇モデルマウスを作成し解析した結果、マクロファージ枯渇群において組織再生が不良であり、マクロファージが嗅上皮再生に関与していることが示唆された。Loxoribine、R848経鼻投与により嗅粘膜に形態学的変化が認められず、doseを増量し再検討を行った。マクロファージ枯渇モデルマウス作成にあたり、長期間枯渇状態を維持するため複数のプロトコールを試す必要があり時間を要した。マクロファージが放出する細胞増殖因子・神経栄養因子に関して個体数を増やして再度検討を行う。今回検討していない因子(IGF-1など)についても解析予定である。医歯薬学ウイルス認識に関与する受容体の別のリガンドを用いて再度検討を行う予定である。嗅上皮傷害後の再生におけるマクロファージの役割を分子生物学的に解析していく予定である。研究の進行が遅れたため、データが不十分であり学会発表や論文作成を年度内に行うことができなかった。また必要な試薬の購入を次年度に回すこととなった。研究の進行がやや遅れたため、必要な試薬の購入を次年度に回すこととなった。また研究の遅れからデータが不十分でなり学会発表を年度内に行うことができなかった。学会発表の旅費、論文作成にかかわる経費、試薬・機器の購入などに使用予定である。試薬の購入、学会の旅費などに使用予定である。
ヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究

我々は、紫外線誘発DNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体や(6-4)光産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、1J/m^2という正常ヒト細胞の生存率に影響を与えない紫外線線量域におけるDNA損傷修復能を測定できる超高感度定量系を開発した。その結果、従来の線量域(10-40J/m^2)では全く修復能が見られなかった色素性乾皮症A群(XP-A)患者由来細胞XP12BE、およびXP-G患者由来細胞XP2BIにおいて、(6-4)光産物が24時間で約40-50%修復されるという現象を見出した。本研究では、この現象がヌクレオチド除去修復が完全に破壊されたときのバックアップシステムによるものか否かさらに検証した。そこで、臨床症状と修復欠損がより重篤なXPEMB-1(XP-A)細胞、およびXPCS2LV(コケイン症候群併発型XP-G)細胞について1J/m^2照射後の(6-4)光産物の修復動態を解析したところ、これらの細胞ではウェスタンブロッティングで各欠損タンパク質が全く検出できなかったが、やはり24時問で20-40%程度の修復が観察された。また、検出限界以下の変異型タンパク質の存在とそれによる残存活性を否定するため、XPAあるいはXPGのノックアウトマウス由来細胞の供与を受けて同様の解析を行った結果、色素性乾皮症患者由来細胞で見られるよりも程度は低いものの(6-4)光産物の修復傾向が確認された。以上の結果より、1J/m^2照射時に見られるヌクレオチド除去修復欠損細胞における(6-4)光産物の修復能は、ヌクレオチド除去修復以外のバックアップシステムによる可能性が示唆された。
新規分子ツールの開発と応用によるCa放出チャンネルの機能部位構造の解析

筋収縮は細胞内Ca動員によって引き起こされるが、その中心的役割を担っているのがCa放出チャンネルである。このチャンネルは近年リアノジン受容体として同定され、その活性化および調節機構について研究が進められている。最近、申請者は中国サソリの産生する毒が骨格筋本受容体を強力に活性化することを見いだした。本研究において、このサソリ毒中の活性成分を明らかにし、サソリ毒によるチャンネルの活性化機構と活性調節部位の同定を目指した。中国産サソリ(Buthus martensi)の粗毒画分を逆相系HPLCにより分画を行った。各画分につき骨格筋筋小胞体膜標品を用い、チャンネルの開口状態に結合し、固定すると考えられている[^3H]リアノジンの結合活性測定を行い、活性化を引き起こすかを調べた。この結果、強い活性化を引き起こす画分を得、分子量7kDaの単一タンパク質成分から成ることがわかった。この分子をプロティンシークエンサーによりアミノ酸配列分析を行い、N末端より約25残基を決定した。既に報告のある他のイオンチャンネルの阻害するサソリ毒とホモロジーの比較を行った結果、興味深いことに電位依存性Naチャンネルを阻害するアフリカ産サソリの毒成分の一つと非常に高い相同性を示した。さらに、チャンネルの活性化機構について、[^3H]リアノジン結合活性を基に詳細に調べた結果、ATPやカフェインとは異なる機構で活性化していることが分かった。また、膜画分より可溶化精製した本受容体についても同様のことを行い、この毒の効果を調べた結果、精製受容体にはまったく効果は無かった。したがって、受容体に直接、結合して作用するものではなく、何か未知の分子を介して活性化することが明らかとなった。このことより、骨格筋細胞でのCa放出は単にCaまたは脱分極刺激だけでなく、活性調節因子によっても制御されている可能性が示された。
琵琶湖堆積物の高精度分析による最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動の解明

琵琶湖底堆積物を用いて最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動を解明するため,平成25年度は, BIW08Bコアの高精度な編年の構築と琵琶湖底堆積物が保持する情報の明確化に取り組んだ.以下にその研究実績の概要を述べる.過去5万年間の堆積物コアの編年は,堆積物中に含まれる陸起源植物片(木片や葉)の放射性炭素年代と火山灰の降下年代によって構築される.しかし, BIW08Bコアには,放射性炭素年代測定が適用できる炭素量が数mgC以上の陸起源植物片が限られ,高分解能な編年を構築することができない.そのため,堆積物コアから得られた気候変動指標を十分に解釈できない.そこで,堆積物中の全有機炭素(TOC)の放射性炭素年代を使った年代測定法を考案し,その有用性に関する検討を行った.その結果, TOC含有量と放射性炭素年代のズレに負の相関があり,この関係を使いTOCの放射性炭素年代を補正することで、高時間分解能な深度ー年代モデルの構築に有用な堆積年代が得られることが明らかになった.一方, BIW08Bコアの炭酸塩の起源・生成過程等について地球化学的な考察をして,炭酸塩の含有量と気候変動との関連性について検討した.現状では,気候変動の指標として炭酸塩の含有量が有効である確固たる説明は得られていなく,炭酸塩の安定同位体比等のデータや他の気候変動指標の比較研究を行うことで, BIW08Bコアの炭酸塩含有量の変化を解釈する研究を継続して進めている.本研究で新たに高時間分解能の深度ー年代モデルが構築されれば, BIW08Bコアの生物起源シリカ含有量,鉱物粒子の中央粒径値,炭素含有量の高分解能なデータに炭酸塩の含有量および酸素・炭素同位体比のデータを加え,気候変動の観点から総合的に検討することで,東アジア地域の最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動の特徴の詳細が解明することが可能となった.(抄録なし)本研究の目的は,琵琶湖湖底堆積物に記録された過去30万年間の気候変動の特徴を詳細に明らかにすることである.この目的を達成するために,本年度は以下のような研究を実施した.1.琵琶湖堆積物コア(BIW08Bコア)の全層から,7ccのプラスチックキューブを用い,連続的に3,591個の分析試料を採取した.BIW08Bコアに含まれていた陸起源植物片の放射性炭素年代と火山灰の降下年代から構築された深度-年代モデルによると,本研究で採取した分析試料の時間分解能は,21155年(平均71年)となる.分析試料すべての分析を行うと,極域氷床コアなどの高時間分解能の分析データ以上の時間分解能で気候変動を詳細に復元することが可能である.2.BIW08Bコアには,放射性炭素年代測定が適用できる数mgサイズの陸起源植物片が含まれるのは稀である.放射性炭素年代測定で必要な試料サイズが1mg以下になれば,微量試料の測定が可能となり,より高精度の編年の構築が可能となると考えられる.そこで,微量試料を効率的に処理できる準自動試料調整装置の研究開発に取り組んだ.3.東アジアの気候変動を考えるうえで重要な広域大気循環の変動を明らかにするため,堆積物に含まれる石英粒子のケイ素と酸素の同位体比を用いたデュアル同位体トレーサー法の導入を検討している.本年度は,堆積物中から石英粒子を物理的に分離する重液(SPT)分離法について検討した.その結果,堆積物を粒子のサイズ画分ごとに処理すること,重液の比重を厳密にコントロールすることが,純度よく石英粒子を分離するうえで重要であることが明確になった.4.過去24万年間の長期的な気候変動を明らかにするため,生物起源シリカの含有量および鉱物粒子の粒度分布の分析を11cm間隔(約350年間隔)で実施した,今後,さらなる考察が必要であるが,過去24万年間の降水量変動は,全球的な氷床量の変動や日射量の変動と同期していた可能性が高いことが明らかになった.本研究は,琵琶湖底堆積物に記録された過去30万年間の気候変動を詳細に明らかにし,最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動の特徴を解明することを目的としている.平成23年度には,過去24万年間の気候変動を明らかにすることを目的として, BIW08Bコア(掘削長: 100m)から11cm間隔(約350年間隔)で採取した試料の生物起源シリカの含有量と鉱物粒子の粒度分布の分析を実施した.琵琶湖底堆積物中の生物起源シリカの含有量と鉱物粒子の中央粒径値は,降水量の変動を反映している可能性が先行研究によって指摘されている.しかし, BIW08Bコアの生物起源シリカの含有量と鉱物粒子の中央粒径値の変動は同期しない.そこで本年度は,生物起源シリカの含有量と同様に湖内の生物生産を反映すると考えられている炭素含有量の分析を実施した.生物起源シリカの含有量と炭素含有量には正相関が認められ,大まかに変動のパターンが同期している.湖内の生物生産は,降水量だけでなく他の気候や生物地球化学的な要因にも影響をうけるので,生物起源シリカの含有量が降水量の変化を反映しているとはいえない.鉱物粒子の中央粒径値には,スパイク状に増大する期間が認められる.また,湖内の生物生産の指標である生物起源シリカの含有量や炭素含有量の変動と一致しない.

鉱物粒子の中央粒径値は洪水などの特殊なイベントを反映している可能性がある.さらに,これらの解釈をより厳密にするために, BIW08Bコアの上部80mに関して5m間隔で炭酸塩の分析を実施し,炭酸塩の供給源として想定される風成塵の発生地域の試料を採取した. BIW08Bコア堆積物中には,従来から言われていた炭酸塩の含有量より多くの炭酸塩が含まれており,新たな気候変動の指標となる可能性がある.今後,炭酸塩についてより詳しく検討し,生物起源シリカの含有量,鉱物粒子の中央粒径値,炭素含有量,炭酸塩含有量の変動をもとに過去30万年間の気候変動の詳細を解明する.琵琶湖底堆積物を用いて最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動を解明するため,平成25年度は, BIW08Bコアの高精度な編年の構築と琵琶湖底堆積物が保持する情報の明確化に取り組んだ.以下にその研究実績の概要を述べる.過去5万年間の堆積物コアの編年は,堆積物中に含まれる陸起源植物片(木片や葉)の放射性炭素年代と火山灰の降下年代によって構築される.しかし, BIW08Bコアには,放射性炭素年代測定が適用できる炭素量が数mgC以上の陸起源植物片が限られ,高分解能な編年を構築することができない.そのため,堆積物コアから得られた気候変動指標を十分に解釈できない.そこで,堆積物中の全有機炭素(TOC)の放射性炭素年代を使った年代測定法を考案し,その有用性に関する検討を行った.その結果, TOC含有量と放射性炭素年代のズレに負の相関があり,この関係を使いTOCの放射性炭素年代を補正することで、高時間分解能な深度ー年代モデルの構築に有用な堆積年代が得られることが明らかになった.一方, BIW08Bコアの炭酸塩の起源・生成過程等について地球化学的な考察をして,炭酸塩の含有量と気候変動との関連性について検討した.現状では,気候変動の指標として炭酸塩の含有量が有効である確固たる説明は得られていなく,炭酸塩の安定同位体比等のデータや他の気候変動指標の比較研究を行うことで, BIW08Bコアの炭酸塩含有量の変化を解釈する研究を継続して進めている.本研究で新たに高時間分解能の深度ー年代モデルが構築されれば, BIW08Bコアの生物起源シリカ含有量,鉱物粒子の中央粒径値,炭素含有量の高分解能なデータに炭酸塩の含有量および酸素・炭素同位体比のデータを加え,気候変動の観点から総合的に検討することで,東アジア地域の最終間氷期から最終氷期への移行期の気候変動の特徴の詳細が解明することが可能となった.本研究では3つの課題((1)琵琶湖湖底堆積物コアの信頼のできる編年の構築,(2)琵琶湖湖底堆積物が保持する情報の明確化,(3)過去30万年間の気候変動の高精度な解明)を設定している.課題(1)については本年度の研究計画をほぼ遂行することができた.課題(2)については本年度に予定していた石英粒子のケイ素と酸素の同位体比を用いたデュアル同位体トレーサー法の方法論の確立が計画通り完遂することができなかった,その代わり,次年次以降に予定していた課題(3)の一部を進展させることができたことから,おおむね順調に進展していると判断した.琵琶湖底堆積物に記録された過去30万年間の気候変動を解明する上で,湖底堆積物が保持する情報を明確にすることが重要になる.生物起源シリカの含有量と鉱物粒子の中央粒径値に加え,炭素含有量という新たな指標を導入することにより琵琶湖底堆積物が持つ情報がより明確になった.また,炭酸塩の含有量と酸素・炭素同位体比の分析を行なうことにより炭素含有量の変動パターンをさらに詳細に検討することが可能であることが明らかになった.以上のことから,おおむね順調に進展していると判断した.
有機化学反応における電子状態および溶媒の制御に関する理論的研究

本研究は,有機化学反応機構における電子状態および溶媒効果を理論的に検討することを目的とする.本年度の成果と進捗状況は以下の通りである.(1)昨年度に引き続き,置換オキセテンの開環反応の立体選択性における電子状態の影響についてB3LYP密度汎関数法計算および実験的に検討し,アルコキシメチル置換オキセテンの開環反応ではキレート効果が見られないことを明らかにした.またそのアルコキシ基によって選択性が大きくなるという置換基効果についてnatural bond orbital解析を行った.その結果切断するC..O結合とメトキシ基のO-Meの超共役の効果が大きいことを示した.(2)有機銅-リチウム会合体のエノン,エナールとの共役付加反応の機構を検討した結果,ともにC-Cu結合へのオレフィン部分の挿入反応であることを明らかにした.また溶媒和の効果を検討した結果,炭素-炭素結合生成以降のエネルギー変化が変わること,生成物のIRスペクトルに影響することを明らかにした.(3)Hg^<2+>をはじめとした金属イオンとシステインの相互作用についてnatural bond orbital解析によって検討した.結合エネルギーの金属イオンによる相違は金属-硫黄反結合軌道と酸素の非共有電子対との二次軌道相互作用に由来することを明らかにし,現在投稿準備中である.水銀(II)塩の解離について水溶媒の極性だけでなく配位の影響が大きいことを,PCM法及び水和モデルを用い示した.(4)安価な塩化鉄(III)触媒を用い,アルデヒドからベンジルエーテルの合成に一段階で成功した.本研究は,有機化学反応機構における電子状態および溶媒効果を理論的に検討することを目的とする.本年度我々は,酸素を含む4員環を有するオキセテン類の立体選択的環開裂反応の実験的及び理論的検討を行った.とくにシリル置換体の開環で高選択性が発現する原因を解明した.シアノ置換有機銅(I)会合体のアセチレンとの反応機構についての検討を行い,銅配位子の違いによって会合体の電子状態が変わり,反応性が変化する新しい可能性を提唱し報告した.選択性の溶媒効果も,self-consistent reactionfield法を用い,理論的に検討した.また,配位性官能基と結合したオキセテン類の開環反応の選択性について検討中である。(2)環境科学で重要な,水銀,カドミウム化学種およびシステインとの相互作用に関する検討を行い,興味深い成果を得た.システイン金属錯体の配座解析については,まずPM3半経験的分子軌道法で予備検討できることがわかった.来年度は,半経験的分子軌道法を併用し密度汎関数法で重金属イオンとアミノ酸2分子あるいはそのモデルとの相互作用について,NMR実験とともに溶媒効果を調べる.なお,RISM-SCF法の密度汎関数法での使用については現在検討中である.本研究は,有機化学反応機構における電子状態および溶媒効果を理論的に検討することを目的とする.本年度の成果と進捗状況は以下の通りである.(1)昨年度に引き続き,置換オキセテンの開環反応の立体選択性における電子状態の影響についてB3LYP密度汎関数法計算および実験的に検討し,アルコキシメチル置換オキセテンの開環反応ではキレート効果が見られないことを明らかにした.またそのアルコキシ基によって選択性が大きくなるという置換基効果についてnatural bond orbital解析を行った.その結果切断するC..O結合とメトキシ基のO-Meの超共役の効果が大きいことを示した.(2)有機銅-リチウム会合体のエノン,エナールとの共役付加反応の機構を検討した結果,ともにC-Cu結合へのオレフィン部分の挿入反応であることを明らかにした.また溶媒和の効果を検討した結果,炭素-炭素結合生成以降のエネルギー変化が変わること,生成物のIRスペクトルに影響することを明らかにした.(3)Hg^<2+>をはじめとした金属イオンとシステインの相互作用についてnatural bond orbital解析によって検討した.結合エネルギーの金属イオンによる相違は金属-硫黄反結合軌道と酸素の非共有電子対との二次軌道相互作用に由来することを明らかにし,現在投稿準備中である.水銀(II)塩の解離について水溶媒の極性だけでなく配位の影響が大きいことを,PCM法及び水和モデルを用い示した.(4)安価な塩化鉄(III)触媒を用い,アルデヒドからベンジルエーテルの合成に一段階で成功した.
腫瘍細胞特異的に外来遺伝子を発現させる新しい遺伝子導入システムの開発

導入が高くかつ安全性においても優れるEBVエピゾーマル・ベクターを、腫瘍細胞特異的に外来遺伝子を発現させる新しいシステムの樹立を試みた。本年度では新たに、EBVベクターを用いて腫瘍細胞に高率に遺伝子導入を行う系を樹立した。EBVベクターをカチオニック・リポソーム,あるいはポリカチオンと組み合わせた独自のシステムを作成し、まずin vivoで、肝癌細胞、あるいはユーイング肉腫細胞株に非常に高率にマーカー遺伝子を導入できることを確認した。さらに自殺遺伝子(HSV1-Tk)を発現させることにより、ganciclovir存在下に腫瘍細胞を殺傷する系を確立した(原田et al.,Cancer Gene Therapy誌、印刷中)。次にこの導入システムを用いてSCIDマウスに移植した腫瘍にin vivo導入し、著明な治療効果(腫瘍の増殖抑制とマウスの延命効果)を得ることにも成功た。これらの結果は、EBVベクター・システムのがんの遺伝子治療への有効性を証明している。さらに、腫瘍細胞への特異性を考慮して、p53依存性サイレンサーを含んだ種々のベクターによる発現について検討している。すなわち、ヒトのがんの約50%において,がん抑制遺伝子p53の欠損,あるいは変異がみとめられ、細胞の悪性化に密接に関わっていることが知られている。p53はDNA結合たんぱくであり、種々の遺伝子の制御領域に結合することにより、その標的遺伝子の転写の促進(エンハンサー)または抑制(サイレンサー)を行う。そこで,p53依存性の転写のサイレンサー・エレメントを組み込んだEBVベクターを導入することにより,p53陰性の細胞(すなわち、腫瘍細胞)にのみ目的の遺伝子を特異的に発現させる系の樹立を検討中である。さらに、CEA(carcinoembryonic antigen)がある種の消化器系悪性腫瘍に特異的に発現していることを利用して、CEAプロモーターをEBVベクターに組み込み、胆嚢癌、胆管癌に特異的に遺伝子発現を行う系の樹立に成功しており、現在in vivoの治療実験によりさらに詳細に検討している段階である(田中et al.,投稿準備中)。我々はこれまで,EBVエピゾ-マル・ベクターにより,種々の細胞に非常に効率良く遺伝子導入/発現が可能であることを示し,この系を遺伝子治療に応用する試みを行ってきた。本研究では,腫瘍細胞特異的に自殺遺伝子を発現させる2つの新しいシステムの樹立を試みた。1 p53陰性がん細胞特異的な自殺遺伝子発現システム多くのがん細胞において,がん抑制遺伝子p53の欠損,あるいは異常が認められる。そこで,p53依存性の転写のサイレンサー・エレメントを組み込んだEBVベクターを導入することにより,p53陰性がん細胞にのみ自殺遺伝子を特異的に発現させる系が可能であると考えられる。本年度はまず,サイレンサーを含んだ種々のベクターを構築することに成功した。さらにin vivoで導入するための基盤技術として,EBVベクターをカチオニック・リポソーム,あるいはHVJ-リポソームと組み合わせた系を確立した(Satoh et al.,BBRC誌,1997年)。現在この系を用い,p53依存性サイレンサーを含んだ種々のベクターによる発現について検討している.2 EBV関連腫瘍特異的な自殺遺伝子発現システムEBVはBurkttリンパ腫,上咽頭癌などさまざまなヒト悪性腫瘍の発症に関与している。これらのEBV関連腫瘍はEBNA1分子を発現しており,EBV oriPを有するベクターを導入すれば高効率に外来遺伝子を発現させることが可能である(Mazda eta1.,JIM誌,1997年)。ヒトのほとんどの正常細胞はEBNA1陰性であるため,この方法により腫瘍細胞特異的な発現が期待できる。実際HSV1-チミジン・キナーゼを導入しガンシクロビルを添加することにより,in vitroでEBNA1陽性腫瘍細胞を特異的に殺傷することに成功した(Hirai et al.,BBRC誌,1997年)。現在,マウスを用いたin vivo治療実験を進行中である。

そこで,p53依存性の転写のサイレンサー・エレメントを組み込んだEBVベクターを導入することにより,p53陰性の細胞(すなわち、腫瘍細胞)にのみ目的の遺伝子を特異的に発現させる系の樹立を検討中である。さらに、CEA(carcinoembryonic antigen)がある種の消化器系悪性腫瘍に特異的に発現していることを利用して、CEAプロモーターをEBVベクターに組み込み、胆嚢癌、胆管癌に特異的に遺伝子発現を行う系の樹立に成功しており、現在in vivoの治療実験によりさらに詳細に検討している段階である(田中et al.,投稿準備中)。
分子生物学的アプローチによる哺乳類卵透明帯の構造解析

哺乳動物の卵透明帯(ZP)は、種特異的な精子・卵相互作用に関与する重要な構造物であり、その分子構造の解明は、受精の分子機構解明のために必須である。本研究では今まで実験動物として最もポピュラーなラットとマウスのZPの構造を比較検討する事でその種特異的精子・卵相互作用の分子機構の解明を試みてきたが、現在まで以下の結果を得た。1)マウスZP2とZP3上にはN結合型poly-N-acetyllactosaminyl glycanとO結合型trisaccharideが存在し特に従来その精子・卵結合に於ての重要性が提唱されていたZP3上のO結合型糖鎖はWassarmanらの報告よりも、その含有量は遙に少なく、しかもその構造はGlcNacβ→Galβ1,3GalNAcolであった。この結果は従来定説化していたマウスZP3のO結合型糖鎖上のαGal残基が精子へのリガンドとする説を真正面から疑問視する結果となり、国際的にも注目されている研究結果である。2)マウスZP2及びZP3cDNA(米国NIH Dr.J.Deanより供与)をprobeとしてラット卵巣cDNAライブラリーをスクリーニグした。これらのprobeを用いたラット卵巣RNAに対するNorthern blottingではそれぞれ2.2kb,1.3kbのメッセージを認めたが、スクリーニングの結果、陽性クローンの最長のものはZP2は2.2kbp,ZP3は1.05kbpであった。現在、これらのシークエンスの全貌を明らかにする為に、欠損部のRapid Amplification of cDNAendを含めその最終段階に入っている。哺乳動物の卵透明帯(ZP)は、種によって異なるが34種類の糖蛋白質より成っており、高分子のものから順にZP1,ZP2..と名付けられている。このZPの構造解析は、主として、マウスを用いて国際的にも研究されている。ZPは種特異的な精子・卵相互作用に関与する重要な構造物であるので、種特異性を研究する為には、他種動物のZPの構造を明らかにし、マウスと比較検討する方法は、多くの有益な情報を与える可能性が期待される。本研究では、マウスZP2及びZP3 cDNAを用いて、実験動物としてポピュラーなラットのZP2及びZP3のホモローグ分子のクローニングを行う事を目的として居り、現在まで以下の結果を得た。(1)単離したラット卵ZPを^<125>Iでラベルし、SDS-電気泳動、各種Exo-or Endoglycosidase処理により、ratZP2、ZP3.は、各々119KDa、115KDaの分子量を持つ事が明らかになった。(2)このうちペプチドは各々59KDa、44KDaであり、分子量及び抗マウスZPペプチド抗体が、ラットZPと反応する事より、ラットZP2、ZP3は、マウスZP2、ZP3のホモログである可能性が推定された。(3)ラット卵巣より、オリゴdT-クロマトグラフィーによりmRNAを精製し、cDNA合成後λZAPIIベクターに挿入し、ラット卵巣cDNAライブラリーを製作した。現在、マウスZP2及びZP3cDNA(米国NIH Dr.J.Deanより供与)をProbeとして、このcDNAライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンのDNAシークエンスを解析中である。
フルクトース摂取によるNASH発症のリスク評価および病態発症メカニズムの解明

日常的なフルクトースの摂取がNASH発症に及ぼす影響について検討をおこなった。マウスに10%フルクトース水を最長24週間自由摂取させ、血液生化学検査および肝臓組織学的検査、遺伝子発現解析を行なった。その結果、血液生化学検査及び遺伝子発現解析では、対象群と差は認められなかった。肝臓組織学的検査では、NASHだけでなく脂肪肝の誘導も確認されなかったが炎症細胞の浸潤が確認された。今回の試験条件ではフルクトース摂取によるNASHの発症は確認されなかったが、一般的なヒトでの検査で実施されない組織の結果で変化が認められたことから、日常的なフルクトースの摂取が及ぼす影響について、今後も検討する必要がある。フルクトースの摂取はNAFLDさらにはNASH発症の危険因子であると考えられているが、フルクトース誘発モデルはNASH病態モデルとして一致した見解が得られていない。本研究ではフルクトース誘発性NAFLDモデルを作製し、フルクトースの慢性的な摂取に伴うNASHの発症リスクならびに単純性脂肪肝からNASH発症のメカニズム解明を目指している。本年度は雄性C57BL6Jマウスを用い、10%フルクトース水摂取による経週的な病態変化の検討。4週目より肝臓重量の増加、8週目より血清TGの上昇、血清AST、ALTの軽微上昇が認められた。肝臓中TGに関しては経週的に増加傾向を示した。現在、NASHの確定診断には肝臓組織学的検査が必須であることから、組織学的検査を行った結果、4週目より脂肪滴が確認され、12週目においてわずかな炎症細胞の浸潤が見られた。しかし、既存のNASHモデルであるSTAMマウスと比較すると血清AST、ALTおよび肝臓組織学的検査の異常は軽度であり、血糖値に関しては12週間のフルクトース水摂取においても異常は認められなかった。すなわち、10%フルクトース水12週間摂取では軽度の肝機能異常、脂肪肝様の病変は認められたが、NASHには至らないことが示唆された。そこで、フルクトースモデルとSTMAマウスの相違を明らかにし、NASH発症に特異的なバイオマーカーを検討するため、現在遺伝子発現解析を行っている。本研究ではフルクトース誘発NAFLDモデルを作成し、フルクトースの慢性的な摂取に伴うNASH発症のリスク評価ならびに単純性脂肪肝からNASH発症のメカニズム解明を目的とする。従来の報告では実際の食生活では考え難い濃度で検証がされていたため、本研究では清涼飲料水の濃度を考慮した濃度設定で検討を行った。26年度までに12週間の投与で検討を行った結果、NASHに至らなかったことから、27年度はさらに16、24週の長期飼育を行った。しかし、24週投与でもNASHには至らなかった。さらに単純性脂肪肝にも至らなかった。一方で、肝臓組織学的検査の結果、フルクトースの長期投与によって肝臓への炎症細胞の浸潤が認められた。清涼飲料水程度の濃度のフルクトース単独摂取ではNASHには至らないが、炎症を惹起する可能性を示唆する結果が得られたことから、今後、炎症の観点からフルクトース摂取とNASHのリスクに関して検討を行う。26年度の時点で飼育設備の問題から動物実験が遅れていたため、27年度も26年度の遅れが影響した。昨年までに10%フルクトース水の24週間摂取によってNASHには至らないが肝臓への炎症細胞の浸潤を確認した。本年度は、昨年度の再現性確認の実験ならびに肝臓中の遺伝子発現解析を行った。その結果、今年度の結果でも前年度と同様に10%フルクトース水摂取により血液生化学検査値の変化やNASHの発症は確認されなかったが、肝臓中での炎症が確認された。有意差は認められないものの、生殖器周囲の脂肪重量、肝臓中の総脂質量等は増加する傾向が確認された。遺伝子発現解析では、84遺伝子が搭載されたRT2 Profiler PCR array (Mouse Fatty Liver)を用いて解析を行なったが、顕著な発現変動は認められなかった。本研究では清涼飲料水程度の濃度でフルクトースの日常的摂取がNASHの発症に及ぼす影響について検討したが、今回の実験条件ではNASH発症には至らないことを確認した。今回の飲水量、摂食量から1日の摂取エネルギー量に対する単純糖質の摂取割合を算出すると約15%であり、WHOの推奨する1日の摂取エネルギー量に対する単純糖質の摂取割合よりも多い条件であった。この程度の摂取量では体重増加やヒトの診断で一般的に測定される血液検査の値には影響を与えないものの、肝臓中での炎症細胞の浸潤が確認されたことから、清涼飲料水程度のフルクトースの日常的な摂取が及ぼす影響については、今後も検討する必要があることが示唆された。

今回の試験条件ではフルクトース摂取によるNASHの発症は確認されなかったが、一般的なヒトでの検査で実施されない組織の結果で変化が認められたことから、日常的なフルクトースの摂取が及ぼす影響について、今後も検討する必要がある。施設のトラブルにより、予定より短い期間でしか投与実験が行えなかった。これまでの結果から、フルクトース単独摂取ではNASHに至らないことが明らかとなったが、炎症を惹起する可能性を示唆するデータがえられた。そこで、今後はフルクトース摂取と炎症の観点から既存のNASHモデルとの遺伝子発現等の差異について解析を行い、NASH発症のメカニズム解明を目指す。食生活学現時点においてはフルクトース摂取ではNASHには至っていないが、今後さらに長期間飼育した際の影響について検討を行う。また、初年度に得られたサンプルをもとに、遺伝子発現および代謝物の解析をおこない、既存NASHモデルとの相違を明らかとし、NASH発症に特異的な因子の探索を行う。研究が遅れていたため、予定していた試薬を年度内に購入しなかった。動物飼育期間が予定より短期間でしか行えなかったため、動物購入費に差額が生じた。試薬購入費に使用する。再試験を行うため、動物購入費にあてる。