hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
進行肝細胞癌に対する新規肝動脈化学療法の開発と分子標的治療併用の意義

我々はこれまでに肝細胞癌に対する経血管的治療として、固形塞栓物質を用いず、リピオドールと微小デンプン球(DSM)の両者を併用する新たな肝動注化学療法を考案し、シスプラチンを用いた臨床研究を行っており、その有用性を認めたため、論文などに報告した。本研究の平成23年度の目的は、シスプラチンよりもリピオドールとの親和性がよいミリプラチンを用いてリピオドールとDSMの両者を併用する新たな肝動注化学療法の有用性を検討することである。従来の肝動注化学塞栓療法の適応症例を対象とし、無作為割り付けによる、2群(ミリプラチン+リピオドール群、ミリプラチン+リピオドール+DSM群)比較検討試験を、山口大学医学部附属病院医薬品等治験・臨床研究等審査委員会の承認を得たのちに開始した。ミリプラチンの最大使用量は120mgとし、腫瘍の個数、最大径でリピオドールの投与最大量を変更することとし、腫瘍5個以下で最大径5cm以下ではリピオドール6mlまで(A群:ミリプラチン+リピオドール(最大投与液量:6 mL/回、B群:ミリプラチン+リピオドール(最大投与液量:6 mL/回)+DSM)、10個以下で最大径10cm以下ではリピオドールは10mlまで(C群:ミリプラチン+リピオドール(投与液量:6 mL/回を超過し10 mL/回まで)、D群:ミリプラチン+リピオドール(投与液量:6 mL/回を超過し10 mL/回まで)+DSM)とした。これまでに13症例の登録を行い、治療を施行中である。13症例の内訳はDSM併用群7例(B群:3例、D群:4例)、DSM非併用群6例(A群:4例、2例)である。これまでのところ、特に重篤な合併症は認めておらず、安全に治療を施行できており、今後も継続していく予定である。無増悪期間や抗腫瘍効果、全生存期間などの有用性については今後検討予定である。本研究の目的はミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性の検討である。平成23年度より順調に臨床研究を開始できている。平成25年11月までに100症例の登録を目標としているが、平成24年度末までの登録症例数は22症例であり、やや少ないと考える。今後さらなる適応症例の登録が必要である。また、血管新生因子などのサイトカインを測定し、分子標的薬の意義についても検討予定であるが、使用するキットの特性(測定検体数、使用期限)のため、現時点では検討できておらず、25年度に検討予定である。本研究の目的は臨床研究によりミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性の検討と肝動注化学療法後のソラフェニブ投与による併用効果の検討である。平成23年度の実施計画は、ミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性の検討を開始することであったが、順調に臨床研究を開始できている。しかし、有用性の評価のために3年間で100症例の登録を目標としているが、平成23年度の登録症例数は13症例であり、やや少ないと考える。今後更なる適応症例の登録が必要である。引き続き、ミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性の検討に関する臨床研究への登録を継続し、治療を行う。また、無増悪期間や抗腫瘍効果、全生存期間などの有用性について検討する。登録症例におけるTGF-βなどの血管新生因子を測定し、治療効果との関連についても検討する。引き続き、ミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性の検討に関する臨床研究への症例の登録を継続し、治療を行う。さらに肝動注化学療法後のソラフェニブ投与による併用効果についても検討を開始する。平成23年度より検討を開始しているミリプラチンを用いた新たな肝動注化学療法の有用性に関する臨床研究を継続する。
麻酔薬が大脳皮質興奮性に及ぼす影響についての二連発感覚刺激を用いた解析

二連発の電気刺激により頭蓋骨上から記録される体性感覚誘発電位は、麻酔深度が深い場合には、300 msの短い刺激間隔では二発目の刺激に対する誘発反応の振幅が、麻酔が浅い時と比べて有意に低下するという現象が見られる。この現象の機序を調べるために電流源密度推定法を用いて検討した。本研究の結果から、麻酔薬による皮質興奮性の低下は、全ての神経細胞に一様に引き起こされているわけではない可能性が示唆された。また、皮質のγアミノ酪酸作働性介在神経の役割については、本研究からは明らかとはならなかった。今後同現象の詳細な機序についてのさらなる研究が必要であると考えられる。具体的内容:平成25年度までにおこなった基盤研究(C)「二連発刺激による誘発電位を用いた麻酔深度・睡眠深度の新しい評価方法の開発」の研究成果として、二連発の感覚刺激の刺激間隔が300 ms未満の場合、麻酔深度を深くするにつれて、二発目の刺激に応じた体性感覚誘発電位の振幅が一発目の刺激に応じた振幅より、より強く低下する現象を見いだした。これを二発目の刺激に応答する振幅と一発目の刺激に応答する振幅の比でみると、麻酔深度が深くなると誘発電位の振幅比が低下するという現象であると言い換えられる。この発見は、客観的な麻酔深度の評価方法の開発につながる可能性があると同時に、麻酔薬による大脳皮質神経細胞の興奮性変化の生理学的な理解を深めることにおいて重要であると考えられる。平成26年度は当初の計画に従い、上記の現象が感覚野の皮質層のどの部分で観察されるのかを、電流源密度推定法を用いて確認する実験のセットアップ、具体的にはミシガンプローブを用いた記録を安定して得るための工夫、記録、解析のためのソフトウェアの開発などをおこなった。また、日本生理学会等で関連する情報の収集をおこなった。意義及び重要性:上記の誘発電位の振幅比における現象は、皮質への連続入力が高頻度になると、麻酔などによって皮質の興奮性が低下した場合には、その入力に対して十分に応答できなくなることを示している。これは皮質の興奮性を左右するメカニズムそのものに深く関わっている可能性も考えられ、麻酔や睡眠などによって皮質の興奮性が低下し、意識レベルが低下する機構を理解するために重要な研究であると考えている。具体的内容:平成25年度までにおこなった基盤研究(C)「二連発刺激による誘発電位を用いた麻酔深度・睡眠深度の新しい評価方法の開発」の研究成果として、二連発の感覚刺激の刺激間隔が300 ms程度と短い場合、麻酔深度を深くするにつれて、二発目の刺激に反応する体性感覚誘発電位の振幅が一発目の刺激に反応する電位の振幅より、より大きく低下する現象を見いだした。平成26年度は当初の計画に従い、上記の現象が感覚野の皮質層のどの部分で観察されるのかを、電流源密度推定法を用いて確認する実験のセットアップをおこなったが、ノイズ除去が困難であった。平成27年度は記録方法の改善に脳深部電気活動記録の専門家の助言を得て、記録の安定化の試みの効果が現れているところである。また、電流源密度推定法の解析ソフトウェアとして国際的に用いられているCSD plotterを採用することとし、そのセットアップをおこなった。平成27年度は、平成26年度におこなったミシガンプローブを用い電流源密度測定実験のセットアップを継続しておこなった。実験方法としては、セボフルラン麻酔およびベンチレータによる呼吸管理下の正常ラットに、末梢感覚神経電気刺激のための電極を前肢末端に設置し、さらに脳定位固定装置に固定後、刺激と対側の、刺激部位と対応する体性感覚野上の頭蓋骨にドリルで穴を開け、硬膜を切開し、電流源密度推定法のための多チャンネル電極(ミシガンプローブ)を体性感覚野皮質に刺入して遠隔電場電位を記録するというものである。平成26年度はノイズが少ない記録を得ることがどうしても困難であり、記録方法の見直しが必要と考え、脳深部電気活動記録の専門家である福島大学の小山純正教授の研究室を訪問し、記録方法についての相談をおこなった。いくつかアドバイスをいただいた中で特に重要であったのは、誘発電位という局所フィールド電位を記録するには、我々が用いているミシガンプローブのインピーダンスが高すぎる可能性があるという指摘であった。そのアドバイスに従い、インピーダンスが低いプローブを購入して用いたところ、ノイズの低減が得られた。現在は記録系の安定化をさらに図りながら実験をおこなっているところである。また、記録ソフトウェアは平成26年に作成したが、解析用ソフトウェアは自作せず、国際的にも用いられているMATLABベースのツールボックスであるCSDplotterを採用することとし、そのセットアップをおこなった。

本研究は、先立っておこなった研究で得られた、麻酔深度を深くすると二連発の感覚刺激の刺激間隔が300 ms程度と短い場合、二発目の刺激に反応する体性感覚誘発電位の振幅が、一発目の刺激に反応する電位の振幅より有意に大きく低下するという現象が、大脳皮質のどの部位で起こっているかを調べることを目的としたものであった。ラット大脳皮質の1次体性感覚野に、ミシガンプローブという多チャンネルの遠隔電場電位記録電極を刺入し、麻酔深度が浅い条件と深い条件との2つの条件下で、末梢の電気刺激を300 ms程度の間隔で行い、麻酔深度が深い場合に二発目の刺激に対する反応が小さくなることが、皮質の層構造のどの部分で観察されるかについて電流源密度推定法を用いた検討と、末梢の電気刺激間隔が1秒と比較的長い場合と、300msと短い場合とで、大脳皮質におけるγアミノ酪酸の分泌量に差が見られるかどうかの検討を行なった。研究機関全体を通じた研究の遅れがあったが、最終年度にプレアンプを購入・導入することで記録自体は順調に行うことができた。しかし、麻酔深度を深くすると誘発電位自体が消失する場合が多く、本研究の仮説を再検討する必要性が生じた。つまり先に述べた現象は、大脳皮質の個々のニューロンで一様に起こっている現象ではなく、誘発電位を構成する数多くのニューロンのうち、麻酔を深くすると二発目の刺激には反応しなくなるニューロンの数が増加することで、全体として誘発電位が低下したという可能性が考えられた。また、γアミノ酪酸の分泌量に差があるかどうかについては、検出感度を十分に高めるまでには至らず結論は出なかった。電気生理学的検討については、今後は新たな仮説に基づいて研究計画を練り直し、またγアミノ酪酸の関与の検討については、検出感度の向上を測りながら、本現象の生理学的な解明の研究を継続して行なっていきたいと考えている。二連発の電気刺激により頭蓋骨上から記録される体性感覚誘発電位は、麻酔深度が深い場合には、300 msの短い刺激間隔では二発目の刺激に対する誘発反応の振幅が、麻酔が浅い時と比べて有意に低下するという現象が見られる。この現象の機序を調べるために電流源密度推定法を用いて検討した。本研究の結果から、麻酔薬による皮質興奮性の低下は、全ての神経細胞に一様に引き起こされているわけではない可能性が示唆された。また、皮質のγアミノ酪酸作働性介在神経の役割については、本研究からは明らかとはならなかった。今後同現象の詳細な機序についてのさらなる研究が必要であると考えられる。平成26年度はミシガンプローブを用い電流源密度測定実験のセットアップをおこなった。実験方法としては、セボフルラン麻酔およびベンチレータによる呼吸管理下の正常ラットに、正中神経刺激のための電極を前肢末端に設置し、さらに脳定位固定装置に固定後、刺激と体側の刺激部位と対応する体性感覚野上の頭蓋骨にドリルで穴を開け硬膜を切開し、電流源密度推定法のための多チャンネル電極(ミシガンプローブ)を体性感覚野皮質に刺入して遠隔電場電位を記録した。実験を重ねてはいるものの、安定した記録を行うための実験系を整えること、また記録・解析用ソフトウェアの開発に時間がかかっており、当初の計画よりは遅れている状況である。平成28年度は引き続き実験系を安定させたうえで、計画の遅れを取り戻すよう研究を推進していく予定である。
Ki-1リンパ腫の発生に関わる遺伝子のクローニングと解析

悪性リンパ腫の一型でHodgkinリンパ腫(HD)と関連の深いKi-1リンパ腫(Anaplastic Large Cell Lymphoma,ALCL)の発症に関わるt(2;5)染色体転座の切断点領域をクローニングし、その発症に関わる分子機構を明らかにすることを目的として解析を進めてきた。まず第一にt(2;5)染色体転座切断点を含むDNA領域をクローニングするために、第二染色体短腕上の転座切断点近傍に位置すると考えられるPOMC,APOB,MYCN遺伝子をマーカーとしてYACライブラリーのPCRスクリーニングを行った。その結果、APOB遺伝子を含む320kbと355kbの、POMC遺伝子を含む235kb,345kb,350kb,475kbの、MYCN遺伝子を含む220kbのシングルYACクローンを単離した。これらのYACクローンが転座点を含んでいるかどうか確かめるためにAlu-PCRにより作製したプローブを用いてFISHを行ったところ、いずれも転座に由来する染色体のうちの一方der(5)のみにシグナルが観察されたので転座点を含んでいないことがわかった。さらに、転座点に最も近いと推定されたPOMC遺伝子プローブを用いた高精度分染法によるマッピングでこの遺伝子は2p23.3上に存在することが明らかになった。従って、転座点はこの部位よりセントロメア側(2p23.1-p23.2)であることが予測された。2p22-p24にマップされた16個の、5q35.1-q35.2にマップされた4個のコスミドクローンについても転座点を含むかどうか調べたところ、このうちの一つcCl2-496が転座点を含んでいる可能性が示唆された。現在、このコスミドクローンをプローブとしてt(2;5)細胞のDNAを各種の制限酵素で断片化し転座に伴う再構成バンドが検出できるかどうか検索しているが、原因遺伝子の追究には至っていない。今後、クロモソームウォーキング、フィジカルマッピングなどにより転座点を含むDNA断片を単離することを目指している。悪性リンパ腫の一型でHodgkinリンパ腫(HD)と関連の深いKi-1リンパ腫(Anaplastic Large Cell Lymphoma,ALCL)の発症の関わる遺伝子のクローニングを行い、その発症に関わる分子機構を明かにすることを目的として、t(2;5)染色体転座を持ったKi-1リンパ腫症例を重症免疫不全SCIDマウスに移植し、この腫瘍株細胞を材料として解析を行っている。転座切断点を含むDNA領域をクローニングするために、まず第二染色体短腕上の転座切断点近傍に位置すると考えられるPOMC,APOB遺伝子をマーカーとしてヒト全ゲノムYACライブラリーのPCRスクリーニングを行った。APOB遺伝子のノンコーディング領域にプライマーをセットしPCRを行った結果、第二染色体特異的なPCR産物の増幅を認めた。三次元YACライブラリーDNAプールのスクリーニングにより、APOB遺伝子領域を含むと予想されるYACライブラリークローンは65/67、680クローンに限定され、さらにコロニーPCR法で二つのポジティブクローンに絞られ、パルスフィールド電気泳動の結果、およそ320kbと355kbのシングルYACクローンを得た。一方、POMC遺伝子の第一エクソン内にプライマーをセットしPCRを行った結果、POMC遺伝子近傍に少なくとも三個のシングルYACクローンを得た。このクローンのサイズについては現在分析中である。

APOB,POMC遺伝子を含むこれらにYACクローンを手がかりにしてクロモソームウォーキングにより転座切断点を含むDNA断片を単離することを目指している。t(2;5)染色体転座切断点を含むDNA領域をクローニングするために、第二染色体短腕上の切断点近傍に位置すると考えられるPOMC,APOB,MYCN遺伝子をマーカーとしてヒトゲノムYACライブラリーのPCRスクリーニングを行った。その結果、APOB遺伝子を含む320kbと355kbの、POMC遺伝子を含む235kb,345kb,350kb,475kbの、MYCN遺伝子を含む220kbのシングルYACクローンを単離した。次いで、これらのYACクローンが転座点を含んでいるかどうか確かめるためにAlu-PCRにより作製したプローブを用いてFISHを行ったところ、いずれも転座に由来する染色体のうちの一方der(5)のみにシグナルが観察されたので転座点を含んでいないことがわかった。さらに、転座点に最も近いと推定されたPOMC遺伝子プローブを用いた高精度分染法によるマッピングでこの遺伝子は2p23.3上に存在することが明らかになった。従って、転座点はこの部位よりセントロメア側(2p23.1-p23.2)であることが予測される。2p22-p24にマップされた16個の、5q35.1-q35.2にマップされた4個のコスミドクローンについても転座点を含むかどうか調べたところ、このうちの一つcCI2-496が転座点を含んでいる可能性が示唆された。現在は、このコスミドクローンをプローブとしてt(2;5)細胞のDNAを各種の制限酵素で断片化し転座に伴う再構成バンドが検出できるかどうか検索している。
中国の権威主義体制下における法の役割と限界についての比較研究

「競争的国家資本主義経済+非競争的超権威主義政治」というカップリングのもと、「抑圧的法」が支配する中国にあって、制度的複合体としての法が、現実にいかなる役割を果たしているか、そしてそれにはいかなる現実的意義があり、また限界があるのかを明らかにする。「自律的法」ないし「応答的法」へ移行、変容するための条件ないし可能性について以下二つの視角から検討する。一つは文化的伝統が類似する東アジア3国の権威主義法との比較であり、もう一つは中国法内部に萌芽的に生じつつある「自律的法」生成の胎動に対する分析である。
極微ナノ構造形成過程の動的観察とその解析に関する研究

本研究では、シリコン表面上に形成される極微構造の形成を制御し、かつその過程の動的な観察をすることにより形成メカニズムの解明を試みるのが目的である。いずれも実験は動的観察が可能な低エネルギー電子顕微鏡(LEEM)を世界で初めて開発した共同研究者のBauer教授の研究室に設置されているLEEMを用いて実験を行った。実験は主に若手研究者である安江が担当し、その結果を越川とBauer教授が検討を行った。Si(111)の温度を比較的低温である300-400度に保ち銅を蒸着していくと、銅の2次元的な"5x5"不整合構造の小さなドメインがステップエッジ、ドメイン境界ならびにテラス上に形成される。テラス上のドメインの数密度は温度と被覆度に依存する。しかし高温(約600度)になるとこの2次元ドメインはステップエッジのみから成長する。シリコン表面上の拡散距離が温度により異なるためである。Si(111)上のダングリングボンドを水素で終端して銅原子の拡散距離を増加させることにより3次元の極微構造を作製した。試料の温度を360-380度に保ち銅を蒸着するとステップエッジ、ドメイン境界、テラス上に3次元の極微構造(20-60nm)が形成された。テラス上の数密度とサイズはは温度と被覆率に依存する。温度が450度程度になるとシリコン上の水素の脱離が生じるため、清浄なSi(111)と同様な2次元層が形成される。このように超高真空内でかつその場で動的観察を行うことにより、単原子ステップやドメイン境界を観察しながら、それらへの極微構造の形成過程を観察した。その結果その形成過程の一端を解明することが可能になった。このように水素を用いて表面での拡散長を制御することにより極微構造のサイズを制御できることを示すことができた。この方法は他の物質にも応用することが可能であると考えられる。アリゾナ州立大学のBauer研究室に設置されている低エネルギー電子顕微鏡(LEEM)を用いて、水素終端されたシリコン上の銅の極微構造生成過程のin-situ動的観察を行った。その結果、銅の極微構造は清浄なシリコン表面上より拡散距離が大きくなることが観察された。又、生成した極微構造のサイズは概ね数十nmのオーダーであった。用いたシリコン表面がミスオリエンテーションが小さな表面であったので、テラス幅が大きい(約1μm)。そのため、銅原子がテラス上を表面拡散してステップ端に極微構造が集まるという傾向は必ずしも観察されなかった。極微構造のサイズはex-situで走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて観察された結果とは大きく異なることがわかった。この違いについて種々の面から議論を行ったが、現在明確な結論を出すに至っていない。しかし、in-situとex-situの観察結果の違いについても、引き続き詳細な実験を行っていくことになった。来年度の課題に中にいれて実験を行うことになる。本研究では、シリコン安面上に形成される極微構造の形成を制御し、かつその過程の動的な観察をすることにより形成メカニズムの解明を試みるのが目的である。

Si(111)の温度を比較的低温である300-400度に保ち銅を蒸着していくと、銅の2次元的な"5x5"不整合構造の小さなドメインがステップエッジ、ドメイン境界ならびにテラス上に形成される。テラス上のドメインの数密度は温度と被覆度に依存する。しかし高温(約600度)になるとこの2次元ドメインはステップエッジのみから成長する。シリコン表面上の拡散距離が温度により異なるためである。Si(111)上のダングリングボンドを水素で終端して銅原子の拡散距離を増加させることにより3次元の極微構造を作製した。試料の温度を360-380度に保ち銅を蒸着するとスナップエッジ、ドメイン境界、テラス上に3次元の極微構造(20-60nm)が形成された。テラス上の数密度とサイズはは温度と被覆率に依存する。温度が450度程度になるとシリコン上の水素の脱離が生じるため、清浄なSi(111)と同様な2次元層が形成される。このように超高真空内でかつその場で動的観察を行うことにより、単原子スナップやドメイン境界を観察しながら、それらへの極微構造の形成過程を観察した。その結果その形成過程の一端を解明することが可能になった。このように、水素を用いて表面での拡散長を制御することにより極微構造のサイズを制御できることを示すことができた。この方法は他の物質にも応用することが可能であると考えられる。
酸窒化膜形成における表面反応精密制御の研究

本年度は、シリコン酸化・酸窒化制御のための表面反応の解明を目的として、高分解能電子エネルギー損失分光法(HREELS)による水素終端シリコン表面の初期酸化過程と、走査トンネル顕微鏡(STM)によるシリコン窒化・酸窒化に伴う表面モホロジーの変化について実験・解析を行った。まず、室温における水素終端Si(100)表面の初期酸化過程を、水素・酸素の吸着状態に関するHREELS測定結果に一次元連鎖モデルを適応することにより解析した。その結果、モノハイドライド表面、ダイハイドライド表面とも、表面シリコン原子のバックボンドの一方に、優先的に酸素が吸着することを明らかにした。これは、シリコン清浄表面では現れない現象であり、水素原子による酸化過程制御の一端を示すものである。また、表面一層までは、酸化が層状に進行することも見出し、酸化膜/シリコン界面の急峻性にも有効であることを示した。Si(100)清浄基板を350°Cで窒化した場合、表面が一様に窒化されることを見出した。さらに、窒化初期には表面ラフネスの周期およびRMSが膜厚の増加に伴い大きくなるが、膜厚0.38nm(3ML)を境としてほぼ一定となることを見出した。この結果は、3MLまでの窒化では、窒素原子がシリコン表面構造を大きく変化させながら吸着することを示している。また走査トンネル分光(STS)測定により、3.7ML以上の窒化膜におけるバンド構造の形成を見出し、Si_3N_4膜が表面を一層覆うことによりバンドの形成が起こることを明らかにした。ULSIデバイスの更なる微細化の要求に対して、フラッシュメモリに代表されるMOSデバイスのデバイス特性の安定性及び高信頼性を確保するためには、原子オーダーで制御された絶縁膜/シリコン界面を実現する必要がある。現在絶縁膜として注目されているシリコン酸窒化膜の形成反応を精度良く制御するためには、シリコン酸窒化過程を原子オーダーで理解しなければならない。本研究では、高分解能電子エネルギー損失分光法(HREELS)及び操作トンネル顕微鏡・分光法(STM/STS)を用いることによりシリコン表面の原子オーダーでの酸化・窒化過程及び酸窒化膜の局所構造を解明することを目的としている。平成9年度は、STM/STSを主な分析手段として、窒化及び酸窒化に伴うシリコン表面モホロジー及び表面電子状態の変化について調べた。得られた結果を以下に示す。Si(100)表面を窒素ラジカルを用いて窒化すると、350°Cの低温においても窒化速度0.03nm/sが得られた。この値は通常の熱窒化やプラズマ窒化の成長速度と比較して一桁近く大きく、低温窒化を行う上でラジカル窒化が有効であることを示した。また、窒化温度350°Cでは、窒化膜厚の増加に伴い表面ラフネスは増加するが、およそ4MLになると表面ラフネスが膜厚にほとんど依存せず一定になることを明らかにした。それに対応して、4ML以上になると表面電子状態に窒化膜のバンド構造及び界面準位と思われる電子状態が形成されることも見出した。これらの結果は、Si_3N_4が一層覆う程度形成されると窒化膜が絶縁膜として機能し始めることを示唆している。さらに、350°Cの窒化ではシリコン表面に一様に窒化が進行するのに対して、800°Cの窒化では窒化膜が島状に形成された。以上の結果から、シリコンの原子層窒化には窒素ラジカルを用いた低温窒化を行う必要があると考えられる。平成10年度は、これらの結果を基に、HREELSを用いてシリコンの初期窒化過程を解明する予定である。
骨・軟骨の分子時計系の解明とその標的遺伝子の同定

時計遺伝子DEC1とDEC2の生理的役割を追究するため、それぞれのノックアウトマウスを、恒常的暗条件下で飼育して赤外線センサーにて行動をモニターしたところ、両ノックアウトマウスとも行動周期の期間の延長が観察された(MSC,2008)。我々の報告の後、他グループも同様な結果を報告した(ProsONE,2008)。また実験的時差条件で飼育すると、DEC1ノックアウトマウスにおいて、リセット機能の変化が観察された。この結果は、DEC1とDEC2が概日リズム周期の維持に関与することおよびDEC1が時計の位相変化への適応に関与することを示した。さらに東京大学(理学部深田研究室)との共同研究で、transforming growth factor-betaによる組織の概日リズムの位相変化にDEC1が必須であることも明らかにした(Nature Cell Biol,2008)。これまでの結果を総合すると、光、食事時刻、ホルモン/成長因子による細胞時計のリセットにDEC1が関与することが明らかになった。さらに我々は16種類の新規時計応答エレメントを同定して、そこに結合する多くの転写因子も同定した。またこれらのエレメントは下流遺伝子の概日リズムを誘導しうることを証明した。さらにDEC1とDEC2のノックアウトマウスの肝臓からRNAを抽出して、Affimetrix GeneChipを用いて遺伝子発現パターンの変化を現在解析している。最近、概日リズム中枢である視交差上核だけでなく、肝臓など末梢組織においても時計遺伝子(Bmal, Per, Cry, Decなど)および様々な遺伝子が概日リズム発現することが明らかになってきた。一方、軟骨では細胞分裂、アグリカン合成、コラーゲン合成に概日リズムがあり、概日リズムが骨格成長に重要であることが報告されている。しかし、遺伝子レベルでの軟骨の概日リズムについての報告はこれまでない。そこで、6週齢雄SDラットを明暗条件下(LD)で2週間飼育後、LDあるいは恒暗(DD)条件下で連続48時間、4時間おきに屠殺して肋軟骨成長板を採取し、これらのRNAサンプルをGene Chip(Affymetrix)にかけ31,042のcDNAについて解析した。概日リズムの有無はLD, DD条件における各遺伝子のmRNAレベルでのコサインカーブとの一致率、LD、DDでのリズムの一致率に基づいて判定した。その結果概日リズムをもつ遺伝子が275遺伝子同定された。時計遺伝子であるBmal1、Per2、Dec2などのほか、転写因子、成長因子、細胞周期、細胞外基質、細胞内伝達などに関連した遺伝子が概日リズムを示した。また、成長板と肝臓に共通して発現しているリズム遺伝子を検討したところ、時計遺伝子を含めても概日リズム遺伝子全体の10%以下だった。よって、成長板では成長板独自の遺伝子が概日リズム発現していることが判明した。次に、軟骨特異遺伝子について検討したところ、軟骨マトリックスのアグリカンとII型コラーゲンの概日リズムは、コアタンパクの合成レベルのみならず、post-translationレベルでも制御されていることが示唆された。以上軟骨の発生、分化、成長に関わる多くの遺伝子に概日リズムが存在し、骨格成長に遺伝子の概日リズム発現が重要な役割を果たすことが示された。分子時計系のポジテイブ因子はClock/Bmalでネガテイプ因子は、DEC, Per, Cryの三種類が存在する。DEC1の分子時計系での役割を明らかにするために、DEC1ノックアウトマウスを作成した。動物体内では多くの時計遺伝子が相補的に作用するため解析が困難であるので、今回はノックアウトマウスより分離した繊維芽細胞および骨、軟骨分化能をもつ間葉系幹細胞を用いた。DEC1欠乏により、各種時計遺伝子の発現の位相が前進した。しかしDEC1を強制発現することにより、前進した位相が元に戻った。さらにDEC2に対するsiRNAを併用することで、多くの時計遺伝子の概日リズムの振幅と位相が著明に変化した。この結果は、DECが概日リズムの正確な位相の維持に必須であることを明らかにした。前年度の研究で我々は軟骨で概日リズムを示す275個の遺伝子を同定した。これらが軟骨分化に重要であることを示した。本年度は、これらの軟骨リズム遺伝子のプロモータ配列を詳細に検討することにより、それぞれの遺伝子の発現リズムのピーク時刻に依存して特異的に存在する新規の転写調節エレメントを16種類同定した。これらのエレメントは時計遺伝子による上方および下方制御をうけた。また数種の新規転写因子がこれらのエレメントの転写活性を制御することが判明した。これらのエレメントと転写因子は軟骨分化の概日リズムおよびその病的な変化に関与することが示唆された。1おもに軟骨で発現している約400種類の転写因子の完全長cDNAを含む発現ベクターを構築した。そしてこれらをNIH3T3細胞に導入した。そしてわれわれが成長板軟骨のリズム遺伝子のプロモータから同定した新規時計応答配列に結合して転写に影響する転写因子として、NPAS2,Bmal2,HESなどを同定した。2軟骨細胞や線維芽細胞を用いて、リズム遺伝子のプロモーターからわれわれが同定した新規時計応答配列が、リアルタンムモニタリングにて、実際に約24時間のリズム発現を誘導することを明らかにした。この実験にはクロノスを用いた。また対照としてE-box,E'-boxも約24時間のリズム発現を誘導することを明らかにした。3多数のマウスをクロックラボ飼育箱で飼育して、野生型マウスおよびDEC1ノックアウトマウスの行動解析を行い、DEC1ノックアウトマウスでは概日リズムの周期が野生型より長くなる事、時差への時計の抵抗性が低下することが明らかになった(投稿中)。

また別のグループはDECノックアウトがハエの概日リズムをほとんど失わせることを報告した(Genes Dev,2007, Current biol.2007)。なおハエにはDEC1とDEC2の区別がなく一種類しかなかった。以上の結果から、DEC1とDEC2が生物時計系のマスター遺伝子として動物界で広く役割を果たしている事が明らかになった。時計遺伝子DEC1とDEC2の生理的役割を追究するため、それぞれのノックアウトマウスを、恒常的暗条件下で飼育して赤外線センサーにて行動をモニターしたところ、両ノックアウトマウスとも行動周期の期間の延長が観察された(MSC,2008)。我々の報告の後、他グループも同様な結果を報告した(ProsONE,2008)。また実験的時差条件で飼育すると、DEC1ノックアウトマウスにおいて、リセット機能の変化が観察された。この結果は、DEC1とDEC2が概日リズム周期の維持に関与することおよびDEC1が時計の位相変化への適応に関与することを示した。さらに東京大学(理学部深田研究室)との共同研究で、transforming growth factor-betaによる組織の概日リズムの位相変化にDEC1が必須であることも明らかにした(Nature Cell Biol,2008)。これまでの結果を総合すると、光、食事時刻、ホルモン/成長因子による細胞時計のリセットにDEC1が関与することが明らかになった。さらに我々は16種類の新規時計応答エレメントを同定して、そこに結合する多くの転写因子も同定した。またこれらのエレメントは下流遺伝子の概日リズムを誘導しうることを証明した。さらにDEC1とDEC2のノックアウトマウスの肝臓からRNAを抽出して、Affimetrix GeneChipを用いて遺伝子発現パターンの変化を現在解析している。
難治性白血病・リンパ腫に対する新しい免疫遺伝子治療法の開発

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)遺伝子導入腫瘍細胞を用いた遺伝子治療臨床研究において、GM-CSF遺伝子導入腫瘍細胞が抗腫瘍免疫を誘導する際の実際のエフェクター遺伝子を同定し、より高い効率での遺伝子治療を可能にする目的で、マウス白血病モデル系を用いた検討を行った。白血病細胞株・WEHI/3B細胞はBalb/cマウス皮下に接種すると腫瘍は不可逆的に増生しマウスは死ぬが、GM-CSF遺伝子導入WEHI/3B細胞を接種した場合、10日目を境に腫瘍は宿主免疫により再現性をもって拒絶された。一方、ヌードマウスでは同様な現象は認められない。そこで、GM-CSF遺伝子導入WEHI/3B細胞を接種後10日目の腫瘍切除組織内に抗腫瘍活性が最も強く現れていると想定し、SAGE(serial analysis of gene expresion)法にて腫瘍内発現遺伝子を解析し、上記3種類の系からそれぞれ11baseから成るTag配列を30,000個づつクローン化した。腫瘍拒絶の系1群と腫瘍を拒絶しない系2群を比較した結果、得られた遺伝子情報の大部分は3者間でほとんど差異が認められず、内部標準のGAPDHの発現量は0.951.36倍と一定であったものの、腫瘍拒絶のけいにおいて20倍以上発現が増強される遺伝子を9種類同定できた。その中には、GenBankのデータベースに該当する既知の遺伝子が1種類と、これまでに報告されていない未知の遺伝子が8種類存在し、マウス骨髄系で50倍以上発現が増幅される遺伝子が2種類含まれていた。現在、各々のTag配列と5'端にM13配列を有するOligo dTプライマーを用いたRT-PCR法からプローブを合成し、同定された遺伝子群の経時的な発現量変化をNorthern Blot法にて解析し、変化を来した遺伝子cDNAを用いた新たな免疫遺伝子治療法を展開中である。当該研究により現在までに以下の点が明らかになっている。白血病細胞株・WEHI/3B細胞はBalb/cマウス皮下に接触すると腫瘍は不可逆的に増生しマウスは死ぬが、GM-CSF遺伝子導入WEHI/3B細胞を接種した場合、10日目を境に腫瘍は宿主免疫により再現性をもって拒絶された。そこでGM-CSF遺伝子導入WEHI/3B細胞を接種後10日目の腫瘍切除組織内に抗腫瘍活性が最も強く現れていると想定し、SAGE(serial analysis of gene expression)法にて腫瘍内発現遺伝子を解析し、上記3種類の系からそれぞれ11baseから成るTag配列を30,000個づつクローン化した。腫瘍拒絶の系1群と腫瘍を拒絶しない系2群を比較した結果、得られた遺伝子情報の大部分は3者間でほとんど差異が認められず、内部標準のGAPDHの発現量は0.951.36倍と一定であったものの、腫瘍拒絶の系において20倍以上発現が増強される遺伝子を9種類同定できた。

現在、各々のTag配列と5'端にM13配列を有するOligo dTプライマーを用いたRT-PCR法からプローブを合成し、同定された遺伝子群の経時的な発現量変化をNorthen Blot法にて解析し、変化を来した遺伝子cDNAを用いた新たな免疫遺伝子治療法を展開中である。
β-カルボリンの脳内での活性化による神経毒の生成機序と肝における解毒化活性

um ion(2,9-Me_2HA)は13例中2例からしか検出しなかった。黒質からも、2-MeNHと2,9-Me_2NHは検出され、皮質のレベルより有意に高い値(平均値でそれぞれ20及び7倍)を示したが、2-MeHAと2,9-Me_2HAは検出限界以下であった。これらの前駆体であるnorharman(NH)とharman(HA)も、両方の部位においてそれらのイオンより高い値で検出された。黒質のNHは皮質のそれよりも平均値で30倍高かった。HAの両部位での差は認められなかった。9-Methyl-NHと2-MeNHを基質として、皮質および黒質において2[β]および9[indole]位のN-methyation活性を測定した。2[β]-N-Methylation活性は、9[indole]-N-methy-lation活性よりも両部位で高かったが、部位による活性値の差はなかった。近年の研究によりβ-carbolinium ionは、構造的にも作用的にもMPP^+に類似していることが明らかにされている。このように生体内で活性化されたβ-carbolinium ionは、自然発症パーキンソン氏病の発症要因の一つと考えられる。
ブラジル日本人入植地の歴史民俗学的研究

民俗学の研究視角と調査手法をブラジル日系社会へと適用し、「日本」との関係のあり方を明らかにするという「研究の目的」にしたがい、交付申請書に記載したとおり、とくに具体的な文化表現の記録化に留意しつつ共同研究を遂行した。研究実施計画にある第1回研究会は4月27日に神奈川大学にて開催し、吉村竜「『日系コロニア』を創造するーブラジル南東部における日本人移民の営農戦略とエスニシティー」の発表があった。第2回研究会は12月25日に同所にてシンポジウム形式で開催した。この「ブラジル日本人入植地の歴史と民俗」では、以下の発表があった。角南聡一郎「墓からみた日系移民のエスニシティーレジストロ市サウダーデ墓地の場合」、泉水英計「日系移民の出自としての日本語学校『同窓会』、永井美穂「ブラジル日系社会の歴史を伝える手段ーイグアッペとレジストロにおける博物館の可能性」、森武麿「ブラジル移民から満洲移民へー信濃海外協会を対象として」、須崎文代「レジストロにおける戦前期竣工の日系移民住宅について」、田中和幸「現地調査にみる日系移民住宅の架構形状について」。本共同研究全体の最後の研究会という位置付けを考慮し、実施計画のとおりブラジル在住者を招聘した。本共同研究の主要な調査地であるサンパウロ州レジストロ入植地について郷土史研究の視点からおこなわれたこの講演は、福澤一興「ようこそレジストロ日伯文化協会へー過去・現在・FUTURO」とルーベンス清水「日本人植民地のレジストロへの影響」であった。さらに、米田誠士による「空からレジストロを見てみよう」と題したドローン動画の上映もおもなわれた。このシンポジウムの発表者は、発表原稿を整理して『比較民俗研究』誌に寄稿し、ブラジル特集として出版された。その他に、建築班は6月23日に日本建築学会にて調査報告をおこない、8月中に1名がレジストロにて補足調査をおこなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究事業開始年度にあたり共同研究者間での役割分担および調査活動の展望について周知をはかった。そのうえで実質的な調査活動の第一段階を開始した。具体的には、年度内に2回の研究会(6月6日、7月25日)を開催し、それぞれブラジル日系社会の特定分野の専門家の研究発表によりメンバーの知見を深めた。国内での調査活動は、(1)国会図書館憲政資料室所蔵の南米移民資料から調査予定地レジストロ市の基礎資料を複写にて収集、(2)八丈島からレジストロ市への移民家族の調査のために同島の縁者にインタビュー調査、(3)レジストロ市での移民家屋調査へむけた準備の参考にするために、愛知県明治村に移築されているレジストロ移民家屋を見学、また、(4)関東圏以外に在住のメンバーは研究会の前後に国会図書館および海外移住資料館(横浜)にて文献資料探索をおこなった。海外での調査活動は、協力者を含めて8名による調査チームが2月下旬から1週間にわたりブラジル国サンパウロ州に赴いた。そのうち建築班は残存移民家屋を巡検し、適切なサンプルを選択し内部構造を含めた計測作業をすすめた。一方の民俗班は高齢者かららの聞き取りをすすめ、そこに言及される事項(地名や影響力のあった故人)の確認をすすめた。レジストロ市に加え、隣接するドイツ人入植地にも赴いて、比較参考のための情報を収集した。一人のメンバーは引き続きサンパウロ市街およびロサンジェルス移民地区にて比較研究のための資料収集をおこなった。ブラジルでの本格的な現地調査を開始できたから。とくに現地での積極的な協力が得られ、現地の自治体からも本研究に強い関心が示されたことは今後の進捗に大きな助けとなると考える。本年度は本格的な調査活動の初年となるため、ブラジル未渡航者を中心に現地調査を重点的におこない、あわせて研究会による情報交換と補足的な国内調査をおこなった。第1回研究会(4月14日)では米田誠士が「レジストロ研究資料の紹介」をし、内田青蔵が、前年度建築班による計測データをCADに落としてサンプル化しその分析結果を報告した。ブラジル調査は10月下旬から11月末の期間に4つの旅程でおこなった。具体的には、小熊誠が沖縄人集住地区ビラカロンにて「ブラジル沖縄移民の系譜意識と祖先観」について面談調査をおこなった。黒瀬郁二と永井美穂はサンパウロ州公文書館にて「ブラジル側資料からイグアペ植民地像を検証する」ための資料探索をすすめた。角南聡一郎はサウダーデ共同墓地にて「レジストロにおける日系人墓地とその周辺」を描くためのデータ収集を開始した。森武麿は、レジストロを中心とするサンパウロ州南西地区ばかりでなく、アリアンサ農場やコチア農場にも観察を拡大した。第2回研究会(2月1日)ではこれらの現地調査について詳細な報告があり、『比較民俗研究』(第31号)誌上の研究報告として出版された。日本国内の主な出張は次の3つがおこなわれた。鳥居龍蔵の南米調査特別展の機会に同氏記念館(徳島)を訪問し、関連資料の問い合わせをすすめた。明治村(愛知)に移築されたレジストロ移民家屋の修復作業を見学し、建築材や工法について確認した。レジストロの姉妹都市である中津川市を訪問し、同市が所有するレジストロ関連資料の収集をおこなった。前年度に現地調査を予定していた共同研究メンバーのうち1名が、予期せぬ校務の増加によってブラジル出張の日程が調整できなかったため。

当年度におこなわれた研究活動は、昨年度から引き続き現地調査を主軸にした情報収集と研究会での情報交換であった。まず、共同研究参加者のブラジル現地調査として、サンパウロ州レジストロ植民地内での旧日本人小学校「同窓会」の参与観察、レジストロ市内での日系人墓地の空撮による平面図作成と墓標の調査、レジストロ本願寺の主導する葬送慣行および他宗派(生長の家、天理教、聖公会)の宗教慣行についての聞き書き調査、ブラジル力行会百周年記念行事の参与観察とサンパウロ州アリアンサ植民地での聞き書き調査がおこなわれた。つぎに、国内の調査として、愛知県犬山市の明治村内ブラジル移民住宅の補修作業にともなう建築学上の調査と、神戸市の竹中大工道具館での工具調査がおこなわれた。収集した資料の分析は各調査者が適時すすめたが、ある程度まとまった資料として、昨年度にサンパウロ公文書館で収集したポルトガル語文献の日本語への翻訳作業をすすめた。研究会ではレジストロからの講演者を立て一般に公開形式で2回おこなった。一つ目は、レジストロ日伯文化協会会長・福沢一興氏の来日の機会に合わせ「サンパウロ州イグアッペ植民地の成立ー日本移民はどのようにブラジルでの暮らしを築いたのか」という発表であった。二つ目は、Instituto Campos Registroの建築学者・肱岡明美氏を招聘した「MINKAーリベイラ沿岸の日本人移民の家屋」を基調講演とし、共同研究参加者による調査報告2本(「レジストロ移民住宅調査の概要と移民住宅の特徴」、「現地調査にみ日本人移民住宅の架構形状」)をあわせて情報交換をおこなった。昨年度に実施できなかった分もあわせてブラジル現地調査を実施できたが、昨年度からの継続調査予定については一部で日程調整ができなかった。一方で、ブラジルからの招聘による成果発表は最終年度に集中する予定であったが、一部前倒しで実施できた。民俗学の研究視角と調査手法をブラジル日系社会へと適用し、「日本」との関係のあり方を明らかにするという「研究の目的」にしたがい、交付申請書に記載したとおり、とくに具体的な文化表現の記録化に留意しつつ共同研究を遂行した。研究実施計画にある第1回研究会は4月27日に神奈川大学にて開催し、吉村竜「『日系コロニア』を創造するーブラジル南東部における日本人移民の営農戦略とエスニシティー」の発表があった。第2回研究会は12月25日に同所にてシンポジウム形式で開催した。この「ブラジル日本人入植地の歴史と民俗」では、以下の発表があった。角南聡一郎「墓からみた日系移民のエスニシティーレジストロ市サウダーデ墓地の場合」、泉水英計「日系移民の出自としての日本語学校『同窓会』、永井美穂「ブラジル日系社会の歴史を伝える手段ーイグアッペとレジストロにおける博物館の可能性」、森武麿「ブラジル移民から満洲移民へー信濃海外協会を対象として」、須崎文代「レジストロにおける戦前期竣工の日系移民住宅について」、田中和幸「現地調査にみる日系移民住宅の架構形状について」。本共同研究全体の最後の研究会という位置付けを考慮し、実施計画のとおりブラジル在住者を招聘した。本共同研究の主要な調査地であるサンパウロ州レジストロ入植地について郷土史研究の視点からおこなわれたこの講演は、福澤
歯根の発達、形成及び第三象牙質産生に関する因子の解明に関する研究

ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は種々の細胞増殖因子や基底膜細胞外マトリックス成分などの広範な蛋白質と結合してこれらの蛋白質の活性や機能を制御したり、細胞内に特異的なシグナル応答を導く。Glypican-1は細胞膜表面に存在する細胞膜型HSPGである。我々が作成した象牙芽細胞様細胞が多く含まれるcDNA libraryから無作為に200個のクローンを採取し塩基配列を調べたところ、Glypican-1が含まれていた。本研究の目的はGlypican-1の発現と象牙芽細胞様細胞の分化や第三象牙質産生との関係を酵素抗体法等の手法を用いて検討することである。(材料及び方法)350gの雄性Wisterラット42匹を用いた。下顎切歯を歯肉縁にて切断しk-file,40号にて歯肉縁より根管内へ14mmの深さまで断髄した。パルス型Nd:YAGレーザーのファイバーを14mmの深さまで挿入し2.0W,20pps,5sec歯髄内へ照射した。燐酸セメントにて根管を仮封した。照射後、0,3,6,10,13,18,21日に下顎骨の摘出を行い10%中性ホルマリン固定後、EDTA溶液にて脱灰しパラフィン包埋を行い連続切片を作成した。免疫組織染色には、抗ヒトGlypican-1抗体(sc-14645,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)を用いた。(結果)照射後3日において象牙芽細胞様細胞が認められGlypican-1の発現がfibrodentin matrixや象牙芽細胞様細胞に認められた。照射後6日では、fibrodentin内に埋入した歯髄細胞や象牙芽細胞様細胞に発現していた。照射後10日では6日後と同様に認められた。以後21日まで象牙芽細胞様細胞でのGlypican-1の発現が認められた。エナメル芽細胞においてもGlypican-1の発現が認められた。特に照射後3日で強く発現していた。(考察及び結論)Glypican-1は象牙芽細胞様細胞で発現しており第三象牙質の産生に関与している可能性が示唆された。齲蝕や窩洞形成によって産生される象牙質様構造物を積極的に産生させる事によって早期治療や外来刺激によって引き起こされる歯髄の炎症を防ぐことが可能となると考えられる。象牙質様構造物の形成や歯根形成に関与する因子を分子生物学的手法を用いて解明することによって従来の手法に加えて応用し、今まで困難であった症例においても歯根再形成を効果的に促す事や象牙質様構造物を積極的に産生させる事を可能にすることが出来ると考えられる。歯根や象牙質様構造物形成に関与している未知、既知の遺伝子を解明し、その塩基配列より蛋白構造まで明らかにしそれらの因子が部位、時期的にどのように関与しているのかを解明し、また同時に歯髄の硬組織誘導に関与する因子を解明し歯髄疾患治療への応用の手がかりとすることを本研究の目的とした。歯髄の硬組織誘導を調べるために、ラット切歯にNd : YAGレーザーを照射し早期に大量に硬組織を誘導させ、硬組織誘導が活発に行われている切歯よりmRNAを調整しライブラリーを作製した。ライブラリーから任意に200個のクローンを拾い、一部の塩基配列を調べ、Gene Bankで検索した。既に報告されているラット切歯ライブラリーの遺伝子と比較して、ネスチンなどの遺伝子が多く認められており硬組織誘導に関与する遺伝子を多く含んだライブラリーであることが示唆された。さらに調べた結果、Heparan sulfate proteoglycanのFamilyであるGlypican-1が多く発現していることがわかった。GlypicanはDrosophilaにおいて発達形成中に多く発現しており、形態形成に重要な役割があることが示唆されている。Immunohistochemistryの手法を用いてGlypican-1を始めとするHeparan sulfate proteoglycanの歯髄における発現を調べた結果、象牙芽細胞様細胞に発現しており象牙質様構造物の産生に関与していることが示唆された。

免疫組織染色には、抗ヒトGlypican-1抗体(sc-14645,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)を用いた。(結果)照射後3日において象牙芽細胞様細胞が認められGlypican-1の発現がfibrodentin matrixや象牙芽細胞様細胞に認められた。照射後6日では、fibrodentin内に埋入した歯髄細胞や象牙芽細胞様細胞に発現していた。照射後10日では6日後と同様に認められた。以後21日まで象牙芽細胞様細胞でのGlypican-1の発現が認められた。エナメル芽細胞においてもGlypican-1の発現が認められた。特に照射後3日で強く発現していた。(考察及び結論)Glypican-1は象牙芽細胞様細胞で発現しており第三象牙質の産生に関与している可能性が示唆された。
嫌気性菌Bifidobacterium属細菌のO2感受性メカニズムの解明

申請者は嫌気性菌のO2感受性機構の解明を目的として、偏性嫌気性菌のクロストリジウム菌やビフィズス菌を用いて研究を行っている。これまでに高いプロバイオティクス活性を持つ乳児由来のビフィズス菌:Bifidobacterium infantisが低濃度のO2下で生育が著しく阻害されることを報告した。本菌株からO2感受性の原因となる活性酸素H2O2を生成する酵素の同定に成功し、1つの酵素反応がビフィズス菌のO2感受性を左右する可能性が推定された。本研究ではビフィズス菌のO2感受性の原因酵素を同定し、O2に高い感受性を示すが故に産業上未利用の有用菌種の育種開発に貢献することを目的とする。
絨毛癌卵巣癌における癌遺伝子異常発現の研究

今回の研究においては、婦人科癌の中でも、いまだに予後の悪い卵巣癌と正常絨毛ー胞状奇胎ー浸入奇胎ー絨毛癌という一連の悪性化の過程をへる絨毛性疾患において、癌遺伝子がどの様な動きをしているかについて特に遺伝子増幅現象を中心に解析を行った。卵巣腫瘍に関しては、中間群を含む悪性腫瘍19例、良性腫瘍4例、絨毛性疾患に関しては、絨毛癌細胞株5例、正常絨毛2例、胞状奇胎2例、浸入奇胎2例、絨毛癌1例より各々DNAを抽出、12種の癌遺伝子を用い、サザンブロッティングにてDNAの構造異常を解析した。いずれの腫瘍においても癌遺伝子増幅は認められず、諸家の報告と併せ、これらの腫瘍の癌化、あるいは悪性度に、癌遺伝子増幅というメカニズムは深く関与していないであろう事が示唆された。又、卵巣癌症例12例につきDNAを抽出し、NIH3T3細胞を用い、トランスフォーミング遺伝子の検出を試みたが、いずれの腫瘍においても、活性化された癌遺伝子は検出されなかった。癌遺伝子の発現に関しては、これまでの種々の絨毛癌細胞株について多くの癌遺伝子の発現が報告されているが、今回の我々の検討にても同様の結果が得られた。ただ多数例の「正常絨毛ー胞状奇胎ー浸入奇胎ー絨毛癌」の摘出材料よりの癌遺伝子発現が未解明である為、これら一連の過程における癌遺伝子発現の癌化への関与は解明できていない。我々の研究の目標もここにあったが、残念ながら十分の臨床材料を得ることが出来ず、今後の課題としたい。1.悪性卵巣腫瘍17例,及び5例の良性卵巣腫瘍組織よりDNAを抽出し, Surthern blot hybridizationを施行した.用いたProbeはK-ras,myb,abl,fos,myc,src,erb-A,sis,fms,N-myc,であるが,いずれにおいてもDNAの増幅等の所見は得られなかった.今後,数種のprobeを用い, screeningを続行する予定である.これまでのところ,卵巣癌発生のメカニズムとしてのOncogeneの増幅という現象は,比較的まれであろうことが予想されるため,悪性卵巣腫瘍10例よりDNAを抽出し, NIH3T3 cellによるTransfection assayを施行中である.これにより, Transforming活性の検出,あるいは新たなoncogeneの検出が期待できるかもしれない.2.繊毛性疾患においては,繊毛癌細胞株5種,正常繊毛2例,胞状奇胎2例,侵入奇胎2例,繊毛癌組織1例よりDNAを抽出し,上に述べたoncogeneをprobeとしてSuuthern blot hybridizationを施行した.これらにおいてもDNAレベルにおける異常は,これまでのところみられていない.今後も, screeningを続行する予定である.又,繊毛癌細胞株のNorthern blot hybridizationは来年度施行予定である.卵巣癌に関して、悪性腫瘍(中間群を含む)19例、良性腫瘍4例に、5種類の癌遺伝子をプローベとしてDNAの遺伝子増幅等を検索したが、特に異常は認められず、卵巣癌の癌化のメカニズムには、癌遺伝子増幅という現象は、それ程深く関与していない事が示唆された。又、活性化された癌遺伝子を探る目的でNIH3T3細胞を使用したトランスフォーミングアッセイを12例の卵巣癌よりDNAを抽出し施行したが、いずれもトランスフォームさせる事なく、トランスフォーミング遺伝子をこの系において検出する事は出来なかった。絨毛性疾患に関しては、絨毛癌株5例、正常絨毛2例、胞状奇胎2例、侵入奇胎2例、絨毛癌1例につき、10種の癌遺伝子プローベにてDNAでの構造異常を検索したが、卵巣癌と同じく、癌遺伝増幅はみられず、絨毛性疾患の一連の悪性化への過程に、癌遺伝子という現象は、関与していない事が示唆された。又、ノーザンブロッティングにより、3種類の絨毛癌細胞株について、癌遺伝子の発現を検索したが、これまでの報告と同様に、種々の程度の発現が観察された。

しかしながら、多数例における「正常絨毛ー胞状奇胎ー侵入奇胎ー絨毛癌」よりの発現が未解明である為、これら一連の過程において、癌遺子の発現がいかに関与しているかについてはいまだ不明である。