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胎児期のアルコール被曝による脳特異物質発現障害の神経化学的、学習行動学的研究

妊娠中の母胎のアルコール摂取が、「胎児性アルコール症候群」と呼ばれる子供の精神運動発達遅延などの中枢神経系の異常を引き起こす。体内アルコール被曝によって惹き起こされる神経障害の生化学的な機構を明らかにすることが本研究の目的である。実施した内容は、胎児期アルコール被曝のモデル動物をラットで作製し、神経伝達物質関連酵素およびミエリンタンパク質のmRNAの発現を検討すること、学習行動学的実験である。実施した内容は、胎児期アルコール被曝のモデル動物をラットで作製し、神経伝達物質関連酵素およびミエリンタンパク質のmRNAの発現検討と、学習行動学的実験である。(1)アルコール被曝群の2',2'-cyclicnucleotide 3'-phosphohydrolase(CNP)とミエリン塩基性のタンパク質(MBP)は、発育全過程を通じてコントロールより低く、しかもミエリン形成終期に入ると発現量が低下した。ミエリン構成タンパク質の中で最も多いプロテオリピドタンパク質(PLP)についてノーザン解析をした結果、アルコール群のPLPは、ピーク時の発現量はコントロール群と殆ど変わらないが、発現のピークがコントロール群よりも遅れた。また脳ではミエリンの約1%しか存在しないが、ミエリン膜重層開始や突起形成阻害などの複雑な機能を持つミエリン関連糖タンパク質(MAG)のmRNAの発現を調べたところ、コントロールに比して、アルコール群の著しい発現遅延が観察され、PLPと同じ傾向を示した。胎仔期のアルコール被曝がミエリン膜に与える影響は、CNPとMBPおよびPLPとMAGでは異なるという知見が得られた。(2)体内アルコール被曝の量や投与間隔を変えたラット胎仔について、十分に発育してから動物の明度弁別学習法による学習行動実験を行った。その結果、アルコール被曝群ラットの方が活動度がやや高い傾向が見られたが、全対としてコントロール群とアルコール被曝群とに、学習行動実験で顕著な差はなかった。妊娠中の母体のアルコール摂取が子に精神運動発達遅延や中枢神経系の異常を引き起こす「胎児生アルコール症候群」の機作の解明を目的とする研究である。昨年度に引き続き、ラットで作製した胎児期アルコール被曝のモデル動物について、神経特異物質関連代謝酵素のmRNA発現と学習実験のまとめを行った。(1)学習実験は、コンピューター解析と組み合わせたスキナ-箱による明度弁別学習実験である。動物実験にありがちな変動要因を出来るだけ排除しているため、得られるデータの客観性が非常に高い。対照群と、母体のアルコール摂取量の異なる二つの実験群(いずれも生後90日)とで、学習実験を繰り返して統計処理を実施した。その結果、記憶判別度には有意差が認められないことが判明した。しかし、活動度は実験群が有為に高く、いわゆる“落ち着きの無さ"を示した。本実験結果については、平成10年度中に発表の予定である。なお、この実験は正の報酬を与える課題実験であるため、一定の実験期間は食餌量を減少させるので、十分に発育した90日齢のラットを使っているが、発達期にある若いラットで、実験を組めないか検討している。(2)胎児期アルコール被曝ラットについて、生後経時的に採取した脳からRNAを抽出した。昨年度のミエリン構成蛋白のmRNA発現の検索に引き続き、神経伝達物質合成と代謝酵素のmRNAの発現を調べた。調べた酵素は、アセチルコリンエステラーゼ、コリンアセチル転移酵素、チロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素である。いずれもすでに遺伝子クローニングされているので、文献に従ってオリゴヌクレオチドプローブを作製し、ノーザンブロットを行った。妊娠中の母体のアルコール摂取が、「胎児性アルコール症候群」と呼ばれる子供の精神運動発達遅延などの中枢神経系の異常を引き起こす。胎児期アルコール被曝のモデル動物をラットで作製し、神経伝達物質

関連酵素のmRNA発現検討と、学習行動学的実験を実施している。今年度は、(1)未検討だったプロテオリピドタンパク質(PLP)のmRNA発現をノーザンハイブリダイゼーションで解析、(2)学習行動実験の展開、の2項目を行った。(1)胎内でアルコール被曝したラット脳のミエリン形成については、以前に、ミエリン障害を反映する標識酵素である2',3',環状ヌクレオチド-3'-リン酸水解酵素(CNPase)と、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)のmRNA発現を発育過程を追って調べ、既に報告している(Life Sci.,1994)。アルコール被曝群のCNPaseとMBPは、発育全過程を通じてコントロールより低く、しかもミエリン形成終期に入ると発現量が低下した。コントロール群は一定値を維持した。今回、未検討だったミエリン構成タンパク質の中で最も量の多いPLPについてノーザン解析をした結果、アルコール群のPLPはコントロール群のmRNA発現ピークよりも遅れる事、しかし、ピーク時の発現量はコントロール群と殆ど変わらない事が確認された。つまり、ミエリン膜構成の主要タンパクであるPLPと、量的に少ないがミエリン膜重層化に関係があると思われるCNPaseでは、胎内アルコール被曝の影響が異なるという知見が得られた。(2)学習実験に入るまでの飼育をする北里の動物飼育施設の汚染が一時期発生し、検討が遅れていた項目、胎内アルコール被曝の量や投与間隔を変えた動物にの明度弁別学習法による学習行動実験を現在埼玉医大のグループによって実施中である。統計処理までの最終結果が11年6月に出る予定なので、本研究最終年度となる11年中には報告する。妊娠中の母体のアルコール摂取が、「胎児性アルコール症候群」と呼ばれる子供の精神運動発達遅延などの中枢神経系の異常を引き起こす。胎内アルコール被曝によって惹き起こされる神経障害の生化学的な機構を明らかにすることを目的として研究を行った。実施した内容は、胎児期アルコール被曝のモデル動物をラットで作製し、神経伝達物質関連酵素およびミエリンタンパク質のmRNA発現検討と、学習行動的実験である。(1)アルコール被曝群の2',3'-cyclicnucleotide 3'-phosphohydrolase(CNPase)とミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、発育全過程を通じてコントロールより低く、しかもミエリン形成終期に入ると発現量が低下した。ミエリン構成タンパク質の中で最も量の多いプロテオリピドタンパク質(PLP)についてノーザン解析をした結果、アルコール群のPLPはコントロール群のmRNA発現ピークよりも遅れる事、しかし、ピーク時の発現量はコントロール群と殆ど変わらない事が確認された。
着地動作時の足部荷重変形機能の3次元解析への挑戦

シューズ装着下(shoesと略す)および裸足(bareと略す)で以下の二種類の実験を行った-(1)ランニング時の距腿関節および距骨下関節,足関節の3次元運動解析をBanksらに習い2D-3D registration法を用いて評価する.(2)10cmの高さからの片足着地動作を教示した際の踵骨裏面の脂肪組織の変位度合いをcineradiographyを用いて評価する.なお実験(1)のCT撮影は下腿から測定まで15cmの範囲を対象として0.4m間隔で撮影を行った.実験(1)(2)で使用した足部のcineradiographyを用いての解析はサンプリング周波数60Hzで行った.「結果」(1)の実験では底背屈の最大角度変位は,それぞれ,距腿関節-14.2°(bare)-5.2°(shoes),距骨下関節2.8°(bare)2.3°(shoes),足関節全体で-16.0°(bare)-4.6°(shoes)であった.外返し・内返しの最大角度変位はそれぞれ距腿関節2.0°(bare)2.7°(shoes),距骨下関節4.7°(bare)3.0°(shoes),足関節全体で-5.6°(bare)-1.8°(shoes)であった.外旋・内旋の最大角度変位は,それぞれ距腿関節5.5°(bare)1.3°(shoes),距骨下関節3.6°(bare)1.5(shoes),足関節全体で5.9°(bare)3.2°(shoes)であった.距腿関節ではシューズ着用時に比べ,裸足時にはより底屈・外返しする傾向があり,距骨下関節においては,距骨に対する踵骨の背屈・外返し・外旋の複合的な動きが生じた.(2)の実験ではシューズ着用時の踵部着地後の脂肪組織の変位量は-3.4mmであり,裸足時の変位量は-9.8mmであった。着地後の踵部脂肪組織の変位量はシューズ着用時よりも裸足時の方が有意に大きい値を示した.「実験1.足部内外足側縦アーチの変形様式」10名の健常男子を対象とした.試技は高さ10cmからの片脚着地とし,膝関節伸展位を保持した状態で着地させた.その際の足部の骨の変位挙を,fluoroscopyを用いて60Hz,シャッタースピード2/1000secで矢状面からX線透視連続撮影した.得られたX線画像から,内側・外側アーチの角度変化および踵骨に対する第一中足骨及び第五中足骨の並進運動を求めた.結果として片脚着地時のアーチの角度変位は,内側アーチ(3.5±3.3°)よりも外側アーチ(7.9±3.2°)が有意に大きく,並進運動は,内側アーチ(前方0.72±0.23,下方0.62±0.28cm)が外側アーチ(前方-0.04±0.09,下方-0.12±0.13cm)よりも有意に大きいこどが明らかになった.「実験2.2D-3D registration methodを用いた足関節の三次元解析」健常人6名を対象として足部のCT撮影を行った.得られたCTデータより脛骨・距骨および踵骨の三次元骨モデルを構築し,座標軸を設定した.これらのモデルを実験1で得たfluoroscopy画像上でshape matching(Banks et al. 2006)を行い,それぞれの骨の相対的位置関係を求め,距腿関節および距骨下関節の三次元的な運動学的データを取得した.結果として片脚着地時の距腿関節の主な動きは,脛骨に対する距骨の背屈であり,内・外返しおよび内外旋の動きは極めて小さいものであった.一方,距骨下関節においては,距骨に対して踵骨が背屈・外返・外旋していた.実験1,2の結果より,内側縦アーチと外側縦アーチはそれぞれ異なる変形様式を有すること,また足関節については,距腿関節で脛骨に対する踵骨の背屈が主に起こり,距骨下関節において距骨に対する踵骨の三次元的な動きが起こることが確認された.シューズ装着下(shoesと略す)および裸足(bareと略す)で以下の二種類の実験を行った-(1)ランニング時の距腿関節および距骨下関節,足関節の3次元運動解析をBanksらに習い2D-3D registration法を用いて評価する.(2)10cmの高さからの片足着地動作を教示した際の踵骨裏面の脂肪組織の変位度合いをcineradiographyを用いて評価する.なお実験(1)のCT撮影は下腿から測定まで15cmの範囲を対象として0.4m間隔で撮影を行った.実験(1)(2)で使用した足部のcineradiographyを用いての解析はサンプリング周波数60Hzで行った.「結果」(1)の実験では底背屈の最大角度変位は,それぞれ,距腿関節-14.2°(bare)-5.2°(shoes),距骨下関節2.8°(bare)2.3°(shoes),足関節全体で-16.0°(bare)-4.6°(shoes)であった.外返し・内返しの最大角度変位はそれぞれ距腿関節2.0°(bare)2.7°(shoes),距骨下関節4.7°(bare)3.0°(shoes),足関節全体で-5.6°(bare)-1.8°(shoes)であった.

外旋・内旋の最大角度変位は,それぞれ距腿関節5.5°(bare)1.3°(shoes),距骨下関節3.6°(bare)1.5(shoes),足関節全体で5.9°(bare)3.2°(shoes)であった.距腿関節ではシューズ着用時に比べ,裸足時にはより底屈・外返しする傾向があり,距骨下関節においては,距骨に対する踵骨の背屈・外返し・外旋の複合的な動きが生じた.(2)の実験ではシューズ着用時の踵部着地後の脂肪組織の変位量は-3.4mmであり,裸足時の変位量は-9.8mmであった。着地後の踵部脂肪組織の変位量はシューズ着用時よりも裸足時の方が有意に大きい値を示した.
末梢神経のミエリン形成を抑制する分子機構の解明

哺乳動物の髄鞘(ミエリン)形成は正と負の細胞内外のシグナル伝達分子により制御されていると考えられているが、その実体に不明な点が多い。当該研究においては、とくに解明が遅れている末梢神経系の抑制性シグナルに着目し研究を行った。その結果、サイトヘジンを中心とした新しいミエリン形成シグナル伝達経路を明らかにし、それが正と負の小経路により制御されていることを見つけた。今後、これらの分子経路を詳細に解析することで、ミエリン形成不全疾患の創薬標的候補分子を明らかにできると期待できる。本年度はインビトロ共培養システムを用いてミエリン形成を抑制するシグナル伝達分子を明らかにすることに重点をおく。その候補となる遺伝子群に関して議論はあるものの、シュワン細胞は神経軸索がないと完全なミエリン膜を形成できないと考えられている。しかし、その過程の一部はシュワン細胞内でcAMP濃度を上昇させることで模倣できると考えられている。応募者らは、高純度に精製したラットのシュワン細胞に1 mMのジブチルcAMPを添加してミエリン膜に類似した膜構造を形成させ、その添加前後でトランスクリプトーム解析を行った。その結果、複数の遺伝子の増減が観察された(論文投稿準備中)。上昇する遺伝子群の多くはミエリン塩基性蛋白質(MBP)に代表されるミエリン膜構成蛋白質をコードしていたが、今回は低下する遺伝子に着目した。その理由は、これらの遺伝子がミエリン形成に抑制的に機能していると予想できるからである。膜形成誘導後に大きく低下する遺伝子は18個種類であった(厳密な数値補正後に-5.0倍以上のものをあげた。-2.5倍以上にすると、さらに50種類程度増える)。そのほとんどは機能未知のものであったが、そのドメイン構造からこれらの遺伝子の70%以上がシグナル伝達に関与する遺伝子である可能性が考えられた。インビトロ共培養システムに、これらの遺伝子群を導入し、ミエリン膜の形成を調べた結果、既存の報告がない複数のシグナル伝達因子が得られた。からだのさまざまな組織形成過程と同じように、ミエリン形成過程にもアクセルとブレーキの両方のシグナルが必須であるはずである。しかし、後者のシグナルはほとんど解明されておらず、今後、ミエリン形成の分子メカニズムを理解する上で重要な課題となるはずで、これらが本研究の当初の研究目的であった。当該年度においては、概ねインビトロでの分子標的の探索が終了し、インビボレベルへの研究に移行する途中であるが、そのなかでも、Arf6とよばれる低分子量GTP結合蛋白質に関する正負の制御メカニズムがそのままミエリン形成の正負のメカニズムに相当することが分かった。一部は論文として研究発表することができた。これらは、本研究を行うのに重要な独自の実験技術として、長期培養可能な共培養システム(マウスやラットの齧歯類由来の初代シュワン細胞と初代感覚神経細胞を用いた共培養システムで、ミエリン形成を生体内のタイムコースとほぼ同じようにインビトロで再現できる)と末梢神経で特異的に遺伝子産物の発現を抑制できる遺伝子改変マウス(末梢神経特異的ノックダウンマウス)の作製技術の結果である。シュワン細胞がつくるミエリン膜の表面積は、ミエリン膜をつくる前のシュワン細胞のそれに比べて100倍以上になることもある。しかし、その表面積の拡大は永遠におきるものではなく、齧歯類では生後数か月で必ず止まる。神経組織という限られた空間内で、一定の発生期に、このようなダイナミックな形態変化を達成するためには促進系シグナルばかりではなく、抑制系シグナルによる協調的な制御のもと、はじめてミエリン鞘が完成されるのではないかと推定できる。したがって、本応募研究において、インビトロとインビボの両面からの研究から抑制シグナルの分子経路を明らかにし、その主要な経路とともに働く補助経路に関しても解明を進めたい。正と負の両面のシグナルが明らかにされれば、ミエリン形成を司るシグナルの全容解明が可能になると期待できる。この研究目標に沿い、本年度はその分子機構に関与する分子の遺伝子改変マウス作成に着手した。ひとつの具体例は、サイトヘジンという分子(促進系シグナルの中核分子のひとつ)と、それを抑制する分子に関してである。今後、これらの分子を中心としたミエリン形成機構の解明研究を進め、ミエリン形成の発生シグナルの研究ばりではなく、再生シグナルへの応用という観点からも研究を考える。本年度の当初の目的通りに「末梢神経特異的に目的の分子がノックダウンされるマウスの作製」に着手できているため。また、一部の候補分子に関しては既に研究発表も行っている。現在まで、末梢神経のミエリン形成メカニズムに関する研究は、増殖因子受容体や転写因子の解明に重点が置かれてきた。また、近年急速に進んだ低分子RNAの標的に関しても、ミエリン形成の研究の議論だけに限れば、これらの分子を対象としたものだった。しかし、これらの分子はシュワン細胞の運命決定や生存そのものに関与する場合が多く、今もなお、どのようなタイミングで、どのようにミエリン膜が神経軸索を巻き、どのくらいミエリン膜が作られるのかというミエリン形成に関する基本的な研究命題に関して、未解明なままであった。

本研究においては、この抑制系シグナルを明らかにすることができた。それは、サイトヘジン(1および2)とよばれる交換因子(低分子量GTP結合蛋白質の活性化因子)と相反するACAP2(GTPase活性化因子)とよばれる分子を中心とした経路であることが判明した。今後この分子がミエリン変性疾患に関しての創薬標的分子になり得るかどうか検討する。哺乳動物の髄鞘(ミエリン)形成は正と負の細胞内外のシグナル伝達分子により制御されていると考えられているが、その実体に不明な点が多い。当該研究においては、とくに解明が遅れている末梢神経系の抑制性シグナルに着目し研究を行った。その結果、サイトヘジンを中心とした新しいミエリン形成シグナル伝達経路を明らかにし、それが正と負の小経路により制御されていることを見つけた。今後、これらの分子経路を詳細に解析することで、ミエリン形成不全疾患の創薬標的候補分子を明らかにできると期待できる。インビトロにおける標的分子探索が進み、今後、インビボとの相関研究を進めることができるから。当初の目的通り、今後は遺伝改変マウスを中心とした研究を展開し、インビボレベルで分子候補のミエリン形成への関与を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経薬理学当該年度までの研究を継続するとともに、インビトロでミエリン形成に抑制的に働く分子の候補とその結合分子が、実際にインビボレベルで末梢神経のミエリン形成に関与しているかどうかを明らかにしなければならない。いくつかの手法で研究期間内に結果達成可能なように標的の遺伝子改変マウスを作成していく。1次スクリーニングから同定されたシグナル伝達因子のミエリン膜形成に関するインビトロにおける評価試験が成功したため。遺伝子改変マウス作成には時間を要するため、年度内ですべての行程が終了しなかったため、次年度使用額が生じた。論文のための投稿料と受託費用が途中であるため。遺伝子改変マウス作成の作業工程ごと支払いを継続し、予定期間内に作成を終了させる。具体的にはまず候補遺伝子にmycなどのタグをコードする塩基配列を付加する。それをシュワン細胞株RT4-D6P2Tで発現させタグ抗体で免疫沈降後、結合する蛋白質の質量分析(MS)解析を行う。RT4-D6P2T細胞は株化細胞であるが、ジブチルcAMPによるミエリン様の膜の形成能力をもち、そのトランスクリプトーム解析でもmRNAの種類は初代シュワン細胞と約80%同じであることが分かっている(未発表データ)。実際、この方法でシュワン細胞に多く発現しているキナーゼの既知および新規結合分子を同定しており、それがシュワン細胞内でも機能していることを示している(宮本,応募者らCell.Signal.(2012))。そして、昨年度と同様に、これらの結合分子をシュワン細胞で特異的にノックダウンし、そのときにミエリン形成が促進されるかどうかを検討する。全力で論文をいい方向にもっていくとともに受託におけるマウス作成等を継続する。
レーザー加速パルス電子源の周辺プラズマ・電磁場制御による超高強度化

高強度短パルスレーザーを固体物質に照射した際に加速される電子パルスは、高輝度、極短パルスといった特徴を有しており、超高速に変化する現象を観察可能な電子源としての可能性を秘めている。高強度レーザーにより加速される電子のうち、そのほとんどはシース電場と呼ばれる極めて強い準静的な電場に捉えられてしまうため、利用可能な電子は極めて少なかった。本研究では、高強度レーザーを照射する周辺のプラズマ密度分布を、もう一つの高強度レーザーを用いて制御することで電場の発生を抑制し、利用可能な電子の数を向上させることに成功した。また、これらの結果を数値シミュレーションや簡易モデル評価によりよく説明することに成功した。物質が超高速に変化する様子を直接捉えることが可能となれば、基礎物理や物質科学をはじめとする広範な分野の基礎研究に発展をもたらす。高強度短パルス電子源はこれを可能にする魅力的な放射線源の一つであり、よりパルス幅が短く、1パルスあたりの電子数のより多い、“高強度・短パルス電子源"の開発が精力的に行われている。しかし、現行の短パルス電子発生手法では飛躍的な高強度化が本質的に困難であるため、新たな超高強度短パルス電子源の開発が望まれている。本研究の目的は、1パルスあたりの電子数が1pC(600万個)の、世界最高の超強度短パルス電子源を実証することである。我々はこれまでに、高強度フェムト秒レーザーと固体薄膜の相互作用による電子加速の際、強度の低いフェムト秒レーザーを薄膜裏面に300ピコ秒早く照射すると、レーザー加速電子パルスの強度が単一照射の場合に比べ10倍以上向上することを発見している。このような電子パルスの高強度化現象についての報告はこれまでになく、そのメカニズムは明確でない。しかし二つのレーザーパルス間の遅延時間や強度などの諸条件を最適化することで、更なる高強度化達成の可能性を示唆するデータが得られていた。そこでこれまでの成果を発展させ、世界最高の超高強度短パルス電子源の実証を目指した。電子パルス高強度化現象を制御するためには、非常に多くの照射条件を最適化しなければならないことが分かっている。すべての条件を最適化することは容易ではないため、まず電子パルス高強度化のメカニズム解明を目指し、下記14の研究を実施した。1時間分解光干渉計によるプラズマ密度分布測定2電子エネルギースペクトル測定器による電子エネルギー分布の測定3電子放射角度分布測定器による放射角度分布の測定4PICコードによる数値シミュレーション物質が超高速に変化する様子を直接捉えることが可能となれば、基礎物理や物質科学をはじめとする広範な分野の基礎研究に発展をもたらすことができる。高強度短パルス電子源はこれを可能にする放射線源の一つであり、よりパルス幅が短く、1パルスあたりの電子数のより多い、“高強度・短パルス電子源"の開発が精力的に行われている。本研究では、高強度短パルスレーザーと固体薄膜との相互作用により加速される電子パルスを用いて、1パルスあたりの電子数が1pCの、世界最高の超強度短パルス電子源を実証することを目指した。我々はこれまでに、高強度フェムト秒レーザーと固体薄膜の相互作用による電子加速の際、強度の低いフェムト秒レーザーを薄膜裏面に前もって照射すると、レーザー加速電子パルスの強度が単一照射の場合に比べ10倍以上向上することを見出していた。この現象を制御することで、超強度短パルス電子を発生させることが本研究での狙いである。本現象のメカニズムが明確ではなかったため、前年度までに、時間分解干渉計の構築によるプラズマ密度分布の測定や電子エネルギースペクトル測定器及び電子放射角度分布測定器による電子パルス特性の測定、およびプラズマ密度分布の計算や電磁粒子コードを用いた電子パルス特性の数値計算を実施し、そのメカニズムの一端が明らかとなりつつあった。本年度はさらにプラズマの特性を反映した電磁粒子コードによる数値計算や、実験結果から提唱した新たなモデルによる理論計算を行い、高強度化メカニズムを明らかとした。本結果をもとに種々のレーザー照射条件や電子光学系の最適化等を行い、2pCを超える電子パルスが実証可能であることを示した。交付申請書に記載した「研究の目的」を達成するための、平成26年度の研究実施計画を要約すると次の四点であった。1時間分解干渉計の構築によるプラズマ密度分布の測定2放射流体コードを用いたプラズマ密度分布の数値計算3電子エネルギースペクトル測定器及び電子放射角度分布測定器による電子パルス特性の測定4電磁粒子コードを用いた電子パルス特性の数値計算。現在までに1、3、4を実施し、13の実験により得られた電子スペクトルの変化や、電子ビームの高強度化を4のシミュレーションによりよく再現することに成功した。これによりレーザー加速電子が高強度化するメカニズムの一端が明らかとなった。また、研究の目的を達成するために重要となる電子パルスによる電場測定法を論文としてまとめ、結果はPhysical Review Eに掲載された。

本結果は平成27年度に実施予定の電子偏向法によるレーザープラズマ近傍電磁場の時間分解測定のために重要である。以上より、全体として、研究はおおむね順調に進展していると考えている。プラズマ科学本研究課題における平成27年度の研究計画は、電子偏向法によるレーザープラズマ近傍電磁場の時間分解測定、3次元荷電粒子軌道解析コードを用いた電子パルス特性の計算、および超高強度短パルス電子源の実証であった。これらの研究を実施し、平成26年度までに得られた研究結果と統合し、電子パルス高強度化メカニズムの全貌を解明する。得られた知見を基に、高強度フェムト秒レーザー及び低強度レーザーの照射条件やレーザー照射ターゲット、電子光学系の最適化を行うことで、超強度短パルス電子源を実証する。平成26年度に特殊な光学部品の購入を計画していた。本光学部品は平成25年度以前に購入実績があり、特殊な仕様を満たすことを確認していた。平成26年度に本光学部品を注文したところ、業者の装置が不調なため、特殊な仕様を満たした光学部品を年度内に納品することができなかった。このため、次年度使用額が生じた。平成26年度に購入を計画していた特殊な光学部品の購入と、申請書に記載した物品の購入を計画している。
「何の平等か？」に関する研究－運の平等主義の修正と複合的平等の導入から－

本研究の最終的な目的は、貧困や格差が問題視される現状を背景に、市場経済や社会保障に関する規範的な制度の構想を提示することである。本年度は、前年度の成果を受け継ぎ、以下の二つの成果を達成した。第一に、不運によって生じる不利益から人々を保護する仮想保険アプローチを、さらに精緻化および発展させた。これに関しては、特定不可能な形で人々に影響を与える不運のリスクに対しては、R.ドゥオーキンの提示した仮想保健アプローチの発展が有効であると、昨年度の報告書で提示した。今年度はこの成果を2017年5月の政治思想学会で報告した後に、『政治思想研究』第18号に掲載された論文へと発展させた。その際には、仮想保険に対する諸々の批判に応答する中で、仮想保険アプローチの精緻化を行った。その中でも特に重要なものとして、仮想保険を合理的なリスク選好に基づくコスト・ベネフィット計算に依拠するものと捉えることで、不運に基づく不利益に対して適切な水準の補償を提供できると明らかにした。第二に、平等を論じる際に着目する指標を問う「何の平等か?」問題に関して、厚生への機会の平等という立場の限界点を指摘した。この議論の一部は、『相関社会科学』第27号に掲載されている。厚生への機会の平等は、人々が有する選好の達成として厚生を定義した上で、選好を達成するための機会を人々に平等に提供する立場である。しかしこの立場はそのままでは、莫大な資源を用いることで初めて達成することが可能な高価な選好に関しても、それを充足するための機会を提供してしまう。したがってこの立場に依拠する場合、選好を形成することへの選択責任を重視するならば、人々が選好を形成する際に前提とすべき使用可能な資源の量を先に規定することが必要となる。しかしそのとき、厚生への機会の平等は、それと対立すると見られてきた資源の平等の立場を一部取り入れる必要に迫られる。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は特に、選択責任と平等主義との関係に関して研究を進めた。第一に、運の平等主義の立場を検討して、運の平等主義の立場に立つとしても、運の中立化とは異なる分配の原理を提示すべきことを明らかにした。運の平等主義とは、選択と運との区別が自律的な行為者にとって重要な規範的意味を持つという前提から、選択の影響を反映しつつ人々を不運の影響から保護しようとする立場である。この立場に基づく典型的な分配の原理は、ある人の苦難に対する選択の影響と不運の影響とを特定し、不運の影響を除去する、運の中立化である。しかし、運の平等主義は選択の帰結として不遇な状態に陥った人々を支援できないという過酷性批判に応答するならば、人々の苦難には選択と不運とが両方介在しており、かつ、それらが個々の苦難にどの程度の影響を与えているのかは特定不可能であると考えるべきである。それ故に、選択と運との区別を規範的に重要視しても、運の中立化という分配の原理からは離れる必要がある。第二に、この選択と不運との特定不可能な併存を前提とするならば、R.ドゥオーキンが提示した仮想保険アプローチに依拠すべきことを明らかにした。仮想保険とは、不運への補償のスキームを構想する際に必要となる考慮事項をまとめた、規範的判断を導く手続き的な装置である。本研究ではまず、従来は選択と区別された不運の影響のみに補償を与えると解されてきたこの仮想保険を、具体的なケースにおける選択と不運との特定不可能性に応答して、不運が関わっている蓋然性の高い苦難の類型に対して補償を行うものとして再解釈した。その上で、運の中立化とは異なる不運への対処の独自の基準として、仮想保険が依拠するコストと有効性の比較考量が適切であることを示した。本研究課題にとって最も重要な論点は、人々が陥る苦難に対しては選択と不運とが併存しているという前提に立った上で、どのように人々を不運から保護すべきかを論じるものである。この論点に関して本年度の研究は、大きく進展したと言える。まず第一に、人々が陥る苦難に選択と不運とが両方介在していると考える場合、選択と不運とがそれぞれどの程度介在しているのかを特定することはできないという、選択と不運との特定不可能な併存という観点をとるべきことを明らかにした。この議論は、不運の影響を特定してそれを消去しようとする運の中立化という分配のあり方が不可能であることを示すものである。したがって、運の平等主義の分配原理をめぐる論争において大きな意義を持つとともに、本研究の課題を大きく進展させたと言える。第二に、従来は選択とは異なる運の影響のみに補償を与えると解されてきた仮想保険アプローチを、ある人が陥った苦難が選択の影響であったのか運の影響であったのかを事後的に特定することなしに、不運が介在する蓋然性の高い苦難の類型に対して補償を提供するアプローチとして再解釈した。これは、選択と不運との特定不可能な併存に応答することを念頭に置けば、不運への補償を構想する本研究にとって大きな意義がある。第三に、仮想保険アプローチが、運の中立化とは異なる独自の補償基準を提示しうることを示した。

その上で、選択と不運の特定不可能な併存という戦略的課題に対して、誰がリスクを有しているかは分からないという反実仮想的な条件下におけるコストと有効性の比較考量という基準が、適切な応答であることを示した。本研究の最終的な目的は、政策的示唆を念頭に置いた規範的構想の提示にあるため、具体的な補償基準を適切に提示しうるアプローチを特定したことは、研究の大きな進展といえる。本研究の最終的な目的は、貧困や格差が問題視される現状を背景に、市場経済や社会保障に関する規範的な制度の構想を提示することである。本年度は、前年度の成果を受け継ぎ、以下の二つの成果を達成した。第一に、不運によって生じる不利益から人々を保護する仮想保険アプローチを、さらに精緻化および発展させた。これに関しては、特定不可能な形で人々に影響を与える不運のリスクに対しては、R.ドゥオーキンの提示した仮想保健アプローチの発展が有効であると、昨年度の報告書で提示した。今年度はこの成果を2017年5月の政治思想学会で報告した後に、『政治思想研究』第18号に掲載された論文へと発展させた。その際には、仮想保険に対する諸々の批判に応答する中で、仮想保険アプローチの精緻化を行った。その中でも特に重要なものとして、仮想保険を合理的なリスク選好に基づくコスト・ベネフィット計算に依拠するものと捉えることで、不運に基づく不利益に対して適切な水準の補償を提供できると明らかにした。第二に、平等を論じる際に着目する指標を問う「何の平等か?」問題に関して、厚生への機会の平等という立場の限界点を指摘した。この議論の一部は、『相関社会科学』第27号に掲載されている。厚生への機会の平等は、人々が有する選好の達成として厚生を定義した上で、選好を達成するための機会を人々に平等に提供する立場である。しかしこの立場はそのままでは、莫大な資源を用いることで初めて達成することが可能な高価な選好に関しても、それを充足するための機会を提供してしまう。したがってこの立場に依拠する場合、選好を形成することへの選択責任を重視するならば、人々が選好を形成する際に前提とすべき使用可能な資源の量を先に規定することが必要となる。しかしそのとき、厚生への機会の平等は、それと対立すると見られてきた資源の平等の立場を一部取り入れる必要に迫られる。今後は、以下の三つの具体的な課題に応答することを中心に研究を進める。第一に、仮想保険アプローチの更なる洗練である。本年度の研究成果において明らかになったように、選択と不運との特定不可能な併存に対応するのであれば、運の中立化とは異なる不運への補償の基準を提示する仮想保険に依拠することが適切である。しかしながら、仮想保険という手続き的な判断装置には、いくつか改善すべき点がある。そこで、仮想保険の手続きをさらに洗練させるために、個々の条件設定をさらに検討していくことが必要となる。第二に、仮想保険アプローチを、制度主義的な運の平等主義の議論へと拡張することを試みる。運の平等主義は従来、不運から人々を保護する中心的な手段に、不運の影響に対する補償を据えてきた。しかしながら近年では、不運が発生してもそれが人々に不利益をもたらさないような制度を構築することを、中心的な手段にすべきという主張がなされている。そこで本研究は、このような制度主義のアプローチを採用しつつ、不運を不利益に転換しないような制度を構築する際にも、仮想保険が提示するコストと有効性の比較考量という視点が重要であることを論じる。
家系分析法の活用による高コレステロール血症と喘息の責任遺伝子の同定

高コレステロール血症:高コレステロール血症の児童を発端者とする核家族85家系を対象に量的形質遺伝子座マッピング法(QTL法)を用いて、脂質代謝に関与する主な候補遺伝子と血清コレステロール値の個体差との連鎖を解析し、11番染色体11q23-q24のApoA-I/CIII/AIV遺伝子クラスター領域と血清コレステロール値の個体差との間に強い連鎖を観察した。連鎖の原因となっている遺伝子変異を検出するため変異検索を行ったところ、49種類の多型をApoAI/CIII/AIV遺伝子クラスター領域内に同定した。このなかで、7種類の多型において子供における遺伝子型と血清コレステロール値との間に関連がみられた。これら7種類の多型のうち6種類はApoCIII遺伝子内に存在していた。ApoAI遺伝子とApoAIV遺伝子内には、血清コレステロール値と関連がみられる多型はなかった。主としてApoCIII遺伝子の多型が血清コレステロールと関連していることが示唆された。喘息・アトピー:気管支喘息児を発端者とする68家系306人のDNA検体を用いて、気管支喘息およびアトピーとT細胞受容体α鎖(TCRA)、およびβ鎖遺伝子座(TCRB)との連鎖を罹患同胞対法を用いて解析した。その結果TCRAとTCRB領域に関する連鎖解析ではTCRBおよびその近傍のマーカーと気管支喘息およびダニ抗原に対するIgE免疫応答性に関して連鎖が認められた。さらにTDTを用いた連鎖不平衡の検定ではTCRBの近傍のマーカーであるD7S684の対立遺伝子が有意に高頻度に喘息、高IgE及びダニ抗原に対するIgE特異免疫応答陽性者に伝達されていた。TCRA領域とは連鎖が認められなかった。この他に、IL4遺伝子クラスター領域との連鎖についても新たな家系においても連鎖が示唆された(ロッド値2.28)。この連鎖はアトピー性皮膚炎を発端者とする88家系377人を新たに対象として確認した。さらに日本人におけるアトピーとIL4遺伝子クラスター領域の連鎖の一部はIL4転写活性の多様性にその原因であることを示した。
コレステロール生合成後段階の酵素調節機構

1.SE酵素の構造と機能ドメイン小野とPrestwichはネズミのΔ^<99>リコンビナントSEのE.coliでの発現系を確立し、精製SE酵素標品に対しフォトアフィニティ標識化合物としてベンゾフェノン誘導体を用い基質、阻害剤、FADアナログの酵素蛋白修飾からこれらのアナログの結合ドメインの決定を試みた。その結果FAD誘導体で対照の120-30%の酵素活性を検出、本酵素がフラビン酵素である可能性を確認した。また基質アナログの結合したシアンブロミド処理後のペプチド断片(14kDa)のアミン酸配列(N末端を含む)から、酵母と哺乳類間のホモロジー検索で2番目に保存率の高い推定FAD結合領野の直後が基質結合部位であると推定した。また阻害剤アナログの結合したリジルエンドペプチダーゼ処理ペプチド断片からアナログの結合したトリペプチドを質量分析計で同定、阻害剤結合部位が酵母と哺乳類の酵素で最もホモロジーが高かったウンデカペプチドの極く近傍に位置することを明らかにした。2.SE酵素の調節小野と榊原は培養細胞を用いてSE酵素の遺伝子発現調節をHMG-CoA還元酵素、LDL-Rと比較した。対照に比べリポ蛋白欠乏血清(LPDS)下のL929細胞培養では明らかにSEmRNAも酵素蛋白量も増加した。同様の結果はヒトの細胞株(HepG2,HeLa,Chang Liver cells)でも認められ、これらのSEmRNAの増加は細胞に25-hydroxycholesterolあるいはコレステロールを与えることで投与量依存的に阻止された。LPDSのSE酵素阻害剤の存在下ではSE、HMG-CoA還元酵素、LDL-R共にmRNAが増加したが、リポ蛋白含有血清のSE酵素阻害剤の存在下では何れの酵素蛋白でも遺伝子のメッセージに影響はなかった。これらの結果はShechterらが解析したスクアレン合成酵素での調節と一致して内因性に生成されたステロールが転写レベルでSE発現を調節していることが示された。また熊谷はHMG-CoA還元酵素の分解過程がコレステロールにより調節されているのと比較し、SEのターンオーバーはステロール感受性が極めて低いことを見出した。3.ヒトSEゲノムDNAの単離と構造決定榊原はヒトのゲノムライブラリーをスクリーニングし、全長11エクソンを含む17kbのヒトSE遺伝子を単離した。10個のイントロンは87から3.2kbの範囲にあった。エクソンI,IIはそれぞれ推定膜結合ドメイン、FAD結合モチーフを含む他、エクソンVIIIには酵母と哺乳類の酵素のホモロジー検索で最も保存されているウンデカペプチドを含んでいた。これらの特徴をShechterらの単離したスクアレン合成酵素遺伝子と比較検討した。4.ヒトSE遺伝子の染色体局在榊原はヒトSE遺伝子をクローニングし、これをプローブにヒト/ケッ菌類体細胞ハイブリッドパネルをテンプレートにPCRでマッピングした。最終的に染色体8に局在し、ミクロサテライトマーカーの解析から8q24.13に存在することを突き止め、FISH法でも確認した。この情報を基に遺伝子異常疾患の候補としてLanger-Giedion Syndromeが推定され、これら疾患の不ケン化脂質の分析をSchreopferと共に行なっているが、未だ疾患の確認までには至っていない。5.SE遺伝子のプロモーター領域の解析榊原と小野はヒトとネズミのSE遺伝子の5'配列を決定しそれらの転写開始点からの5'フランキング配列を並べた。ヒトとネズミで極めて良く保存された配列が転写開始点から上流700-800bp部分にあり、これら保存領野を中心にコレステロールによる調節領野を決定するため、5つのキメラルシフェラーゼプラスミドとプロモーター欠失フュージョン構築物を作りHeLacellに導入発現を調べた。その結果、限られた2つの保存領域がステロールによるSE遺伝子の調節に決定的であることを明かに出来た。スクアレン合成酵素遺伝子でのShechterらによるSRE解析及びトランスアミナーゼ遺伝子でのSteinらによるレチノイン酸解析との情報交換から、SE遺伝子は主にクラシカルなSRE-like配列及びNF-Y配列がステロールによる調節の主要なcis-elementになっていると推定された。

LPDSのSE酵素阻害剤の存在下ではSE、HMG-CoA還元酵素、LDL-R共にmRNAが増加したが、リポ蛋白含有血清のSE酵素阻害剤の存在下では何れの酵素蛋白でも遺伝子のメッセージに影響はなかった。これらの結果はShechterらが解析したスクアレン合成酵素での調節と一致して内因性に生成されたステロールが転写レベルでSE発現を調節していることが示された。また熊谷はHMG-CoA還元酵素の分解過程がコレステロールにより調節されているのと比較し、SEのターンオーバーはステロール感受性が極めて低いことを見出した。3.ヒトSEゲノムDNAの単離と構造決定榊原はヒトのゲノムライブラリーをスクリーニングし、全長11エクソンを含む17kbのヒトSE遺伝子を単離した。10個のイントロンは87から3.2kbの範囲にあった。エクソンI,IIはそれぞれ推定膜結合ドメイン、FAD結合モチーフを含む他、エクソンVIIIには酵母と哺乳類の酵素のホモロジー検索で最も保存されているウンデカペプチドを含んでいた。これらの特徴をShechterらの単離したスクアレン合成酵素遺伝子と比較検討した。4.ヒトSE遺伝子の染色体局在榊原はヒトSE遺伝子をクローニングし、これをプローブにヒト/ケッ菌類体細胞ハイブリッドパネルをテンプレートにPCRでマッピングした。最終的に染色体8に局在し、ミクロサテライトマーカーの解析から8q24.13に存在することを突き止め、FISH法でも確認した。この情報を基に遺伝子異常疾患の候補としてLanger-Giedion Syndromeが推定され、これら疾患の不ケン化脂質の分析をSchreopferと共に行なっているが、未だ疾患の確認までには至っていない。5.SE遺伝子のプロモーター領域の解析榊原と小野はヒトとネズミのSE遺伝子の5'配列を決定しそれらの転写開始点からの5'フランキング配列を並べた。ヒトとネズミで極めて良く保存された配列が転写開始点から上流700-800bp部分にあり、これら保存領野を中心にコレステロールによる調節領野を決定するため、5つのキメラルシフェラーゼプラスミドとプロモーター欠失フュージョン構築物を作りHeLacellに導入発現を調べた。その結果、限られた2つの保存領域がステロールによるSE遺伝子の調節に決定的であることを明かに出来た。スクアレン合成酵素遺伝子でのShechterらによるSRE解析及びトランスアミナーゼ遺伝子でのSteinらによるレチノイン酸解析との情報交換から、SE遺伝子は主にクラシカルなSRE-like配列及びNF-Y配列がステロールによる調節の主要なcis-elementになっていると推定された。コレステロール生合成後段階酵素の1つスクアレン・エポキシダーゼ酵素(SE)のcDNAをラット、マウス、ヒトのライブラリーより単離し、そのORFを決定した。更にその大腸菌及び分裂酵母に発現系を構築した。
悪性神経膠腫に対する、蛍光・PET dual tracerの開発

本研究は5-ALAを用いた術中蛍光診断と、MRIや従来のPET(FDG, 11C-Methionine等)による術前画像診断との相関関係を明らかにし、これらを同期させる新たなPETトレーサーの開発を目的とした。その候補として、新たに開発されたPET用トレーサーであるMALA(5-ALAの誘導体)の動態を解析した。その結果、MALAは悪性腫瘍細胞株に蓄積することが確認され、5-ALAを用いた術中蛍光診断のトレーサーとなるPPIXの蓄積量と有意に相関することがin vitro、及び、in vivoで確認された。MALAは目的に合致したPETトレーサーとなり得ることが示唆された。本研究は5-ALAを用いた術中蛍光診断と、MRIや従来のPET(FDT, 11C-Methionine等)による術前画像診断との相関関係を明らかにし、これらを同期させる新たなPETトレーサーの開発を目的としている。その候補として、新たに開発されたPET用トレーサーであるMALA(5-ALAの誘導体)の腫瘍細胞内での動態を解析する。本年度の研究では、神経膠腫細胞株を始めとする種々の悪性腫瘍細胞株を用い、in vitroにおいて腫瘍細胞のMALAの取り込みと5-ALA投与によるPPIX(蛍光物質)の蓄積の強い相関を認めた。さらにこれらが5-ALAの最初の代謝酵素であるALADの発現量と相関していることが明らかになった。また、皮下腫瘍モデルを用いて、in vivoでも同様の相関関係があることが明らかになった。現時点では腫瘍細胞におけるPPIX蓄積のメカニズムは完全には解明されていないが、本年度の研究により、MALAを用いたPETにてPPIXの蓄積量を推定可能である可能性が示唆された。さらに、MALAのマウスにおける体内動態、腫瘍内における蓄積量の経時的変化についても解析を行った。一方、上記の各種細胞株を用いて、脳腫瘍モデルマウスの作成を現在試みている。本研究では5-ALA誘導体であるPET用トレーサーMALAのin vitro及びin vivoでの脳腫瘍イメージングの妥当性を検証し、MALAによるmolecular imagingと5-ALAによるchemical imagingの動態解析を行い、それら二つのモダリティ間の相関性を検証し、molecular imagingと術中chemical imaging双方に使用できるdual tracerの開発を目的としている。昨年度までに、各種腫瘍細胞株を用いてin vitroでのMALAと5-ALAの取り込みが相関することを確認した。さらに、それらの腫瘍細胞株を用いて脳腫瘍モデルマウスを作成した。また、マウスでのMALAの生態分布動態解析も行った。本年度はそれらの脳腫瘍モデルマウスを使い、実際にMALA PETを施行した。その結果、皮下腫瘍モデルだけでなく、脳腫瘍モデルでもMALA PETで十分評価し得ることが確認できた。さらに、腫瘍細胞によってtime activity curveが異なることが明らかになった。一部の細胞株では初期の取り込みが高いにも関わらず素早くwash outされており、別の細胞株ではMALAが長時間腫瘍内に蓄積した。しかしながらin vitroのデータとin vivoのデータを比較したところ、明らかな相関が得られなかった。この原因としては、腫瘍の細胞密度や壊死の影響が関与しているものと推測された。今後はin vivoで5-ALAによるPPIXの蓄積を評価し、in vivoの結果同士で評価する方針としている。前述の通り、一部の実験結果が当初予想していたものと異なったため、追加の実験を進める方針である。本研究は5-ALAを用いた術中蛍光診断と、MRIや従来のPET(FDG, 11C-Methionine等)による術前画像診断との相関関係を明らかにし、これらを同期させる新たなPETトレーサーの開発を目的としている。その候補として新たに開発されたPET用トレーサーであるMALA(5-ALAの誘導体)のin vitro及びin vivoでの動態を解析し、5-ALAによる術中蛍光診断でトレーサーとなるPPIXの細胞内蓄積量との相関性を検討する。昨年度までに、1各種細胞株におけるin vitroでのMALAとPPIX蓄積量の相関性の確認、2各種細胞株を用いた脳腫瘍モデルマウスの作成、3マウスでのMALAの生態分布動態解析、4脳腫瘍モデルマウスでのMALA-PET imaging、を行った。さらに各種腫瘍細胞株を用いて作成した担腫瘍モデルマウスでMALA-PET imagingを行い、in vivoでの11C-MALAの集積値を測定し、各種細胞株のin vitroでのPPIX蓄積量と比較したが有意な相関が得られなかった。そこで本年度は各種細胞株で担腫瘍モデルマウスを作成し、MALA-PETを用いてin vivoでの11C-MALAの集積値を測定すると同時に、5-ALAを投与してその代謝産物であるPPIXのin vivoでの腫瘍内蓄積量を測定した。その結果、MALAの集積値とPPIX腫瘍内蓄積量の相関性を確認することができた。in vivoでの5-ALAやMALAの取り込みは、腫瘍の細胞密度や血流量、壊死などの影響を受けるために昨年度はin vitroとin vivoの結果が相関しなかったものと推測された。今後は本研究結果の妥当性を臨床で検証することを検討している。

その結果、MALAは悪性腫瘍細胞株に蓄積することが確認され、5-ALAを用いた術中蛍光診断のトレーサーとなるPPIXの蓄積量と有意に相関することがin vitro、及び、in vivoで確認された。MALAは目的に合致したPETトレーサーとなり得ることが示唆された。当初の予定通りin vitroでの解析と、皮下腫瘍モデルを用いたin vivoでの解析を行うことができた。脳腫瘍モデルマウスについてもいくつかの細胞株にて確立することができた。in vivoでのMALAPETの結果とin vitroでの結果に明らかな相関が得られなかった原因として、組織学的な検討の結果、腫瘍の細胞密度や壊死の影響が疑われた。そこで、PPIXの蓄積を腫瘍においてin vivoで測定し、in vivoのデータ同士を比較することでそれらの影響を回避する方針とした。さらに、他の腫瘍細胞株でも同様の実験を追加する方針である。脳腫瘍当初の研究計画通りに進める方針である。脳腫瘍モデルマウスでMALA-PET imagingを行い、脳腫瘍モデルにおいても5-ALAによるPPIXの蓄積とMALAの蓄積が、量・分布ともに相関することを検証する。さらに、近年脳腫瘍において有用性が多数報告されている11C-methionine PETとMALA-PETの相関も解析する予定である。予備的に行ったin vivoでのMALA-PETの解析結果が予測に反するものであったため、予定していたPETの本実験を行わず原因の解析を行っていたため。PET使用料を現時点で支払っていないため当初の見込額と執行額が異なる。原因解明後、MALA-PETの本実験や免疫組織学的解析、学会発表、論文作成などに用いる予定。研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含めて当初予定通りの計画を進めて行く。
1分子法を用いた接着斑形成におけるシグナル伝達機構の解明

本研究は、細胞が移動する際に、必ず必要とする接着斑のシグナル伝達形成に関わる、低分子量Gタンパク質Rac1と、そのRac1の細胞膜への局在化を制御するRhoGDIとの挙動について徹底的に明らかにしようとしている。これまでの研究成果は、『活性化型Rac1は、成長過程の接着斑の成長端側に特異的に集まり、そこでは、滞在時間が他の場所に比べて長く、さらにその場所では、その動きを静止する。さらに、RhoGDIは、細胞膜上をRac1の10倍以上の速さで、特に接着斑を中心的に動いている』というもので、これは、今まで接着斑という巨大な構造物がどのように成長していくのか、はっきりしていなかった点に、さらに、常識的に考えられていた以上の速さの拡散運動をしたタンパク質が、細胞膜上に存在しているという、新たな知見を与えることになったと考えている。実際に、接着斑の形成に関係している研究者は、山のようにいるが、このように、実際に形成している接着斑の内側に焦点を当て、そこに関係するタンパク質の挙動を1分子レベルかつ実時間で試みているものは、非常に稀である。また、医学の面から見ても、癌の浸潤と転移の直接の原因である接着斑の消長をより正確に直接目で見て理解することは、非常に意味のあることでもある。本申請書の基盤にもなっている、接着斑の形成に関わるシグナル分子である低分子量Gタンパク質Rac1の常時活性化型変異体にGFPタグを付けたGFP-Rac1(常時活性化型)が、形成途中の接着斑の成長端側に集まってくる過程を、1分子レベルでの観察を用いることで、初めて捉えることに成功した。この結果を踏まえて、次に細胞内のRac1に影響を与えない極低発現状態で観察を行うことに試みた。それには、Tet-on vectorという任意に発現量を調節可能な、遺伝子導入vectorを使用して、そのvectorにGFP-Rac1(常時活性化型)をサブクローニングしたものと、接着斑マーカーであるpaxillinに赤色蛍光タンパク質タグを付けたmRFP-paxillinをHeLa細胞に共発現させた。その際に、接着斑の形成開始地点を任意に決めるために、マイクロコンタクトプリンティング法を用いて細胞外基質であるfibronectinを直径2ミクロン、間隔3ミクロンのドット状に観察用ディッシュにプリントし、2種同時1分子観察を行った。その時、接着斑の形成を1分子レベルで観察するために、1分子タイムラプスを行えるシステムを組み上げた。それにより、1分子レベルでの接着斑の形成過程と、その時の活性化型Rac1の局在位置の特定に成功した。やはり、成長過程の接着斑では、その成長端側に活性化型Rac1は多くやってきていて、接着斑内での滞在時間も接着斑意外と比べると3倍以上長いことが分かった。しかし、1分子レベルにおける、GFPタグの観察時間は、0.1秒未満と短いため、接着斑への局在を観察できても、接着斑の中で、GFP-Rac1(常時活性化型)の挙動を観察することは、難しい。そこで、新たに、Halo-tagという細胞外から任意な有機蛍光色素を加えることで、蛍光観察を可能にする、Halo-tag vectorを用いた。さらに上記でも使用している任意に発現を制御することが可能なTet vectorを用いてTet-Halo-tag-Rac1(常時活性化型)をコンストラクションした。それらを用いて現在、実験を進めているところである。最近の結果では、GFPからHalo-tagの染色用有機蛍光色素であるRhodamine110への変更に伴い、新たな知見を得ることに成功した。それは、活性化型Rac1は、一つの接着斑内にとどまり続けているのではなく、接着斑外から接着斑内へ移動し、特定の場所で一時停留を行う。その後、近くの接着斑に移動しこれを繰り返すことが、明らかになってきた。現在、この発見をさらに詳しく追及するために、実験を行っているところである。