hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
行政保健師の多様なキャリアに対応したキャリア総合的な発達測定尺度の開発

行政機関に勤務する保健師の総合的なキャリア発達測定尺度の開発を目的に、2回の調査を行った。一次調査では62項目を探索的因子分析を行い、キャリア発達測定尺は32項目3因子構造となった。二次調査では、42項目を因子分析した結果、24項目4因子構造(「地域活動・施策・管理」、「保健師としての基盤」、「保健師アイデンティティ」、「職務満足」)の尺度となった。クロンバックα係数は全体で.943、各因子は.924.851であった。より簡便な行政保健師の総合的なキャリア発達尺度は信頼性を確保したものとして開発された。平成25年度は、行政機関に勤務する保健師の総合的なキャリア発達尺度の開発のため、第一次調査の実施および分析、本調査を実施した。第一次調査の対象は、北海道内の行政機関に勤務する保健師とした。勤務する地域性と所属機関を考慮して系統抽出法で保健所を抽出し、その管内の協力の得られた保健所および自治体単位で全数調査を実施した。調査票は無記名自記式質問紙で、郵送調査を行った。調査内容は個人属性、職務経験、職業意識、実践能力とした。調査は所属大学の倫理委員会の承認を得た。配布1,009名、回収685名、有効回答665名(有効回答率65.9%)であった。平均年齢は39.5歳、性別は女性97.0%、所属自治体は県16.2%、大学・大学院卒業は22.1%であった。新任期111名、前期中堅期96名、後期中堅期227名、ベテラン期194名であった。総合的なキャリア発達尺度の項目を検討するため、尺度項目間の関連を検討した。尺度試案60項目に天井効果とフロア効果はなかったが、項目間の相関分析で相関係数が高い9項目を削除した。因子分析は51項目を用いて実施し、その結果、43項目から成る専門職務遂行能力、アイデンティティ、職務満足の3因子を抽出した。第一次調査の結果をもとに本調査の調査票を作成した。調査は、地域性を考慮して日本国内4県の県勤務の全保健師と系統抽出法で選定した市町村の全保健師で、合計約2,000名を対象とした。現在、無記名自記式質問紙調査を実施中である。保健師の総合的なキャリア発達尺度は、現場で活動する保健師の現任教育や人事管理に活用されることを目的としており、現場の研究協力が得られているのは、結果への期待でもある。現場の実態に即したキャリア発達測定尺度の開発の意義は大きいといえる。<研究目的>家族規模の縮小と地域社会のケア力の低下は、従来、家族機能の一部とされてきた育児や介護を社会化し、社会保障の充実と相まって、行政の保健福祉サービス機能は拡大してきた。さらに、健康の危機管理など保健師の関わる業務は拡大している。効果的な現任教育と保健師のキャリア発達のために、職業人生のライフサイクルを通しての系統的継続的な現任教育に活用できるツールとして、中核要素と応用的要素を取り入れた総合的なキャリア発達を測定する尺度を開発することを目的とする。<研究経過>職業人としてのキャリア発達の考え方を文献で整理し、保健師の能力(コンピテンシー)と関連要因についての既存文献の検討を行った。また、尺度開発のために総合的キャリア発達の概念検討を行い、一元軸で測定可能な尺度の要因構成と項目の検討を行った。仮説として、対人支援能力、地域支援能力、施策化能力、管理能力、専門職アイデンティティ、職務満足の6因子が想定された。保健師としての誠実さ、コミュニケーション力、他者を信じる力、人を理解する力などの人間力ともいうべき能力の測定が課題となった。尺度の要件として、実務者が活用し易いことを重視し、項目数をできるだけ限定することを検討した。また、主要な関連要因として、属性に関する個人要因、職場に関する個人要因、認識や意思に関する個人要因、職場環境要因、社会的環境要因が文献から抽出された。尺度の外的基準としては「保健師の職務実践能力尺度」を活用することとした。現在、一次調査のための調査票を作成中である。平成26年度は、平成25年度の作成した「保健師の総合的なキャリア発達尺度の開発」に関する調査票の配布回収を行い、結果の分析と公表を行った。調査票の配布は最終的には1,701部で、回収は974部(回収率57.2%)、有効回答953部(有効回答率56.0%)であった。対象の概要は、性別では女性98.8%、年齢の平均は41.6歳、保健師従事年数の平均は17.7年で、1ー5年目18.9%、6ー10年目13.1%、11ー20年目27.2%、21年以上40.8%であった。所属自治体は、都道府県29.2%、指定都市・中核市等31.2%、市区町村39.7%であった。職位は、一般職52.3%、係長級43.9%、課長補佐以上3.7%であり、教育背景は、養成所53.0%、短期大学15.5%、大学31.5%であった。有配偶者は69.3%、育児経験は61.6%がありと回答していた。

仕事への満足(職務満足)と職場満足は、満足に対して「そう思う」から「そう思わない」までを、5件法で尋ねた。職務満足は、そう思うから順に、6.1%、30.5%、39.1%、16.4%、7.9%であり、職場満足は同様に、8.5%、32.4%、35.6%、14.2%、9.3%であった。2つの満足は保健師経験21年以上の群で有意に高かった。また、昨年度調査を行った北海道地域での結果を2001年の調査結果と比較するために、倫理委員会に比較に関する申請を行い、参加者の了承の手続きを行った。その結果、2001年データとの比較では、1ー5年目群、6ー10年目群、11ー20年目群では対人支援能力の自己評価の低下が認められた。また、21年以上群では地域支援及び管理能力において、自己評価は上昇が認められた。平成27年度は最終年であり、行政保健師の総合的なキャリア発達尺度を作成するための分析を行った。また、調査に協力をしてもらった北海道ならびに全国の自治体にそれぞれの研究結果の概要をまとめ報告書を送付した。総合的なキャリア発達尺度の開発については、最初に平成25年に調査を行った北海道データのうち、保健師の実践能力について客観的自己評価ができると考えられる保健師経験3年以上の対象者566人の分析を行った。62項目について、天井効果、フロアー効果を確認し、Pearson相関係数を確認し、Good-Poor分析を行った後、探索的因子分析(一般化された最小二乗法でプロマックス回転)を行った。尺度の構成概念妥当性は確認的因子分析を行った。既知グループ法を用いて、保健師の経験年数と下位尺度得点の関連をt検定または一元配置分散分析(ANOVA)を用いた。信頼性は尺度全体と下位尺度についてクロンバックα係数で内的整合性を検討した。その結果、最終的に32項目が尺度項目となり、第一因子は14項目「地域活動・施策・管理」、第二因子は9項目「保健師アイデンティティ」、第三因子は9項目「保健師としての基盤」となった。クロンバックα係数はすべての項目で.9以上の値を示し信頼性は確保された。既知グループ法においてもすべての因子において有意な差があった。総合的なキャリア発達尺度の開発については、さらに平成26年に調査を行った全国調査データでも同様の方法で分析を行った。全国調査データは42項目のデータであり、因子分析の結果、24項目4因子構造の尺度となった。第一因子は9項目「地域活動・施策・管理」、第二因子は6項目「保健師としての基盤」、第三因子は5項目「保健師アイデンティティ」、第四因子は4項目「職務満足」となった。この結果は、より簡便な行政保健師の総合的なキャリア発達尺度といえる。行政機関に勤務する保健師の総合的なキャリア発達測定尺度の開発を目的に、2回の調査を行った。一次調査では62項目を探索的因子分析を行い、キャリア発達測定尺は32項目3因子構造となった。二次調査では、42項目を因子分析した結果、24項目4因子構造(「地域活動・施策・管理」、「保健師としての基盤」、「保健師アイデンティティ」、「職務満足」)の尺度となった。クロンバックα係数は全体で.943、各因子は.924.851であった。より簡便な行政保健師の総合的なキャリア発達尺度は信頼性を確保したものとして開発された。一次調査に引き続き、本調査を行いデータのクリーニングを終了し、一部のデータ分析を行い、結果を公表している段階である。本調査の有効回答率は56%であり、全国調査としては信頼性を確保できる回答率であり、有効回答数も統計解析を行うには十分なデータ量である。
高濃度の蛍光ATPを用いた1分子ATP加水分解イメージング

全反射蛍光顕微鏡法により1分子観測することが可能となったが,観察蛍光分子の濃度は50nM程に限られる。申請者が提案する「量子ドット(以下QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げることが可能である。本手法はミオシンに標識したQD(ドナー)とCy3-ATP(アクセプター)間のFRETにより実証する. QDとヌクレオチドポケットの距離を可能な限り短縮するため, QDの粒子径とミオシンへの標識方法を検討した.まず12アミノ酸からなる短鎖ペプチドで表面処理したペプチドコートQDを作成した。短鎖ペプチドは, QDに配位結合するポリシステインと親水性アミノ酸からなり、結果として粒子径の小さな親水性QDが得られる.次に、ミオシンVの270番目のリジンをシステインに置換した変異体(K270C)を作成した。K270Cのシステイン残基のチオール基とコートペプチドのアミノ末端を架橋することで、ペプチドコートQDとミオシンVの特異的近接結合を実現した。作成したQDミオシンVをカバーガラスに固定し、Cy3-ATPの加水分解を高濃度1分子イメージングしたところ, Cy3とQDの蛍光強度は逆相関を示し、ヌクレオチドの結合解離をFRETのクライテリアで検出できた。ヌクレオチドの解離速度は,ミオシンVのMg ATPase rate(0.020.03 S-1)に一致した.また,試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ,期待通りの速い解離速度が検出できた.申請者が提案する「量子ドット(QD)と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を組み合わせた1分子イメージング手法」は、観察蛍光分子の濃度を従来の200倍まで引き上げる可能性がある。研究の最終目標は、高濃度Cy3-ATPによるミオシンVのATP加水分解反応の可視化である。研究開始当初、ミオシンVの運動活性を維持しつつCy3-ATPへの高効率のFRETを実現するQDの標識方法がなかったため、19年度はQDの標識方法の探索に専念した。まずビオチン・アビジン反応を利用した最も汎用性の高い結合方法を試験した。Halo-tagシステムによりN末端をビオチン標識したミオシンVとアビジン標識された市販のQDを結合したところ、運動法性は維持されていたがCy3-ATPとのFRETは観察できなかった。そこでドナーアクセプター間距離を可能な限り短縮できる結合方法に方針転換した。まずQD結合部位をATP結合部位に近づけるためのシステイン変異体を作成した。さらに市販のQD表面の親水性ポリマーコートがFRET効率を低下させていることがわかったので、QD結合部位と親水性部位を持っ短鎖ペプチドコートに置換した。最後に、ペプチドコートQDのアミノ基とシステイン変異体のチオール基をクロスリンカー(Maleimide-PEO2-NHS)により結合し、高いFRET効率を実現することが可能になった。しかし、不安定な蛍光強度とブリンキングという不本意な性質を呈したため、現在はこれら問題点の解決にむけてQDの合成技術を有する産業技術総合研究所と共同で新しいQDとそのコーティング手法の開発に取り組んでいる。ヌクレオチドの解離速度は,ミオシンVのMg ATPase rate(0.020.03 S-1)に一致した.また,試行錯誤の過程でCaATPase(0.07s^<-1>)がMg ATPaseの約3倍速いことが明らかになったため, Ca存在下での高濃度1分子イメージングを行ったところ,期待通りの速い解離速度が検出できた.
珪酸塩系におよぼすクロムの影響

Crを含む珪酸塩系は広いスピネルの液相面を持つ。このことは微量のCrの存在が珪酸塩系の相平衡に大きな影響をおよぼすことを示すものである。この研究においては岩石学の重要なモデルであるForsterite-Anorthite-Diopside-Si【O_2】に0.3%のMg【Cr_2】【O_4】を加えた場合の相平衡図を検討しつつあるが、今年度においては以下の相平衡図を決定した。Fo-An-Di-Si【O_2】-0.3%Mg【Cr_2】【O_4】系においては、2つの不変点が確認された。A:Fo+Sp(Spinel)+En(protoenstatite)+Di+液,B:An+Sp+Pen+Di+Si(珪酸鉱物)+液である。このうち不変点Aの固相組合せはスピネルレールゾライトに相当する。その組成点はほぼEn(30)Di(39.7)An(30)Mg【Cr_2】【O_4】(0.3),温度は約1300°Cである。Aに相当する不変点はクロムを含まない系では高圧下でないと出現せず、1atmでは斜長石レールゾライトの固相組合せを持つ不変点が存在する。一般にスピネル、レールゾライトは1000°C、8kb以下では斜長石レールゾライトヘ転移するとされている。しかしながら今回の実験結果は少量のクロムが存在すれば、この転移圧力はかなり低下することを示している。
疼痛制御機構における中枢神経細胞Ca^<2+>チャネルサブタイプの役割解明とその意義

疼痛機構における神経細胞内Ca^<2+>変動を中心とした細胞内情報系およびGABA神経系の役割について検討を行った成績を下記に要約する。(1)Ca^<2+>チャネルのサブタイプに関しては、細胞体に主に存在すると考えられるLおよびT型チャネルを中心に行った。T型チャネルに親和性を有するとするフルナリジン、および、L型チャネルに親和性を有するニモジピンのいずれもがフォルマリン誘発疼痛の基準となるフリンチング反応誘発に対して著名な抑制効果が認められた。しかし、フォルマリンによって誘発されるc-fosの発現に対してはT型チャネル阻害薬のみが著明抑制を認めた。(2)腰髄内アラキドン酸カスケードの疼痛機構に関する役割に関しては、実際に腰髄内アラキドン酸カスケードが疼痛機構に関与するか否かを検索するため、フォスフォリパーA2の阻害薬であるトリフルオペラジンを腰髄内に投与するとフォリマリン誘発疼痛に関して著明な抑制作用が確認された。さらに、リポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼの関与を検索するとリポキシゲナーゼ阻害薬は著明な影響を及ぼさなかったが、シクロオキシゲナーゼ阻害薬は著明な抑制が認められ、さらに、シクロオキゲナーゼIIの阻害薬が明らかな抑制作用を有していた。しかしながら、シクロオキシゲナーゼIIが抑制されていてもIが部分的にしか抑制されていない状態ではむしろ疼痛効果が発現することが明確となった。(3)中枢神経系での抑制神経系であるGABA神経系のフォルマリン誘発疼痛に関する役割に関しては、腰髄に存在するGABAaならびにGABAb受容体で著明な抑制効果が認められるが、これらの効果は直接的な疼痛抑制効果とは異なっていることが示唆された。さらに、GABAb受容体の役割は、腰髄内においてはフォルマリン誘発疼痛に関して抑制性に作用するが上位中枢においてはむしろ興奮性に作用し疼痛亢進を惹起させる可能性のあることが示唆された。細胞内情報系は主に細胞膜に存在する各種電位依存性Ca^<2+>チャネル(VOCC)のサブタイプを介して流入するCa^<2+>によって調節されている。一方、疼痛制御機構における細胞内Ca^<2+>変動の重要性は電気生理学的手法から指摘されている。しかしながら、疼痛とVOCCのサブタイプの役割を考慮した成績は少ない。本研究は脊髄の疼痛経路におけるVOCCサブタイプの局在と機能性について持続的疼痛モデルから神経薬理/神経免疫学的検索から明らかとすることを目的とした。麻酔した雄性Wistar系Rat(体重230g280g)に薬物注入用のPE-10をクモ膜下腔に腰膨大部まで挿入した(i.t.投与)。各薬物投与10分後に5%formalin 100μlを右後肢足背に注入した。疼痛の判定は注入部位のlicking及びflinchingを計測した。二次性疼痛を明確にするためformalin注入後010分を第1相とし、1060分を第2相とした。c-fosの発現は第1腰椎から第4腰椎の第1層から第4層までのABC染色法、Bcl-2は腰膨大部のホモジネート上清部をSDS-page法で計測を行った。多重解析法を用い危険率5%以内を有意とした。薬物はL型VOCCの作働薬BAYK8644、拮抗薬nimodipine、nifedipine、TおよびL型VOCC拮抗薬のflunarizineを用いた。結果として、BAYKのi.t.投与で二相性のformalin誘発二次性疼痛反応が観察された。LならびにT/L型拮抗薬はいずれも用量依存性の二次性疼痛反応およびBcl-2発現抑制効果が認められた。殊に、T型VOCCに拮抗する用量のflunarizineは一次および二次性疼痛反応を抑制した。しかしながら、T型拮抗薬はL型と異なってc-fos発現を著明に抑制した。即ち、腰髄においてT型VOCCは上位中枢系への疼痛反応に関与することが初年度の研究から明かとなった。以上の成果は「ペインクリニック」に発表予定である。

さらに、リポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼの関与を検索するとリポキシゲナーゼ阻害薬は著明な影響を及ぼさなかったが、シクロオキシゲナーゼ阻害薬は著明な抑制が認められ、さらに、シクロオキゲナーゼIIの阻害薬が明らかな抑制作用を有していた。しかしながら、シクロオキシゲナーゼIIが抑制されていてもIが部分的にしか抑制されていない状態ではむしろ疼痛効果が発現することが明確となった。(3)中枢神経系での抑制神経系であるGABA神経系のフォルマリン誘発疼痛に関する役割に関しては、腰髄に存在するGABAaならびにGABAb受容体で著明な抑制効果が認められるが、これらの効果は直接的な疼痛抑制効果とは異なっていることが示唆された。さらに、GABAb受容体の役割は、腰髄内においてはフォルマリン誘発疼痛に関して抑制性に作用するが上位中枢においてはむしろ興奮性に作用し疼痛亢進を惹起させる可能性のあることが示唆された。本研究は細胞内へのCa^<2+>流入に多大な影響を及ぼしている電位依存性Ca^<2+>チャネルのサブタイプの中でも、特にシナプス後神経細胞に存在するTおよびL型Ca^<2+>チャネルの関連薬物を投与してフォルマリン誘発二次性疼痛におけるTおよびL型Ca^<2+>チャネルの局在ならびに役割について明確にした。結果として,二種類のL型Ca拮抗薬の脊髄内投与はフォルマリン誘発二次性疼痛を用量依存的に抑制した。一方、L型Ca^<2+>チャネル活性薬はflinchingを基盤とした疼痛反応に対して用量による反応の相違が認められた。この結果は、Ca^<2+>チャネル活性薬の細胞内へのCa^<2+>過剰流入によって誘発されるフィードバック機構によるものと考えられる。すなわち、Ca^<2+>チャネルを介して細胞内へCa^<2+>の一次的な過剰流入が生じるとイオンチャネルに隣接した燐酸化酵素によってチャネル活性が抑制され、さらに、細胞膜に存在するポンプによって細胞内Ca^<2+>は細胞外や細胞内貯蔵部位へ搬出される結果、Ca^<2+>カスケードは抑制的に働き疼痛反応は低下する。LおよびT型Ca拮抗薬であるフルナリジンにおいてはT型Ca^<2+>チャネルを選択的に阻害する用量で著明な疼痛反応の抑制が認められた。c-fosの結果とflinchingを基盤とした疼痛反応の成績をまとめると、特異的L型Ca拮抗薬はflinching反応に抑制的であったがc-fosの発現に対しては何ら影響を及ぼさない、しかし、T型Ca拮抗薬はflinching反応のみならずc-fosの発現に対しても抑制的に作用することが明らかとなった。本研究で得られた成績を要約すると、腰髄神経系のT型やL型Ca^<2+>チャネルに関連する薬物は疼痛制御系において異なる作用点で神経細胞内Ca^<2+>変動に影響を及ぼし鎮痛効果を惹起する。さらに、持続性疼痛発現機序を考慮すると神経細胞内Ca^<2+>の変動は細胞内情報系に重要な影響を及ぼすことから、これら調節機構に作用点を有する薬物は術後痛を緩和すると考えられている局所麻酔薬やクロニジン等と併用することで薬用量の減量、および、副作用の軽減が可能となるものと思われる。
野外調査支援モバイルGISに関する研究

地域研究などの分野で広く野外調査が行われている.近年,GPSなどの普及によって計算機を利用した地理情報の収集も容易になりつつある.そこで本研究では,GPSやレーザ距離計などを組み合わせたシステムや,デジタルペンを使い地図への書き込みを記録するシステムのプロトタイプを作成し,野外調査支援の有効性と問題点を明らかにした.さらに本研究では,地理教育のためのシステムを提案し有効性を示した.地域研究などの分野で広く野外調査が行われている.近年,GPSなどの普及によって計算機を利用した地理情報の収集も容易になりつつある.そこで本研究では,GPSやレーザ距離計などを組み合わせたシステムや,デジタルペンを使い地図への書き込みを記録するシステムのプロトタイプを作成し,野外調査支援の有効性と問題点を明らかにした.さらに本研究では,地理教育のためのシステムを提案し有効性を示した.地域研究,マーケティングなどにおいて野外調査は,一次情報を収集する方法として広く実施されている.近年の計算機の小型・高性能化や無線通信網の充実, GPSなどの普及によって,利用者による屋外での計算機利用や位置情報取得などが容易になってきている.そこで本研究では,野外調査に関するデータの収集,分析,共有を情報技術で支援することによって効率化することを目的とする.本年度は,野外で効率的にデータ収集を行うための2種類のクライアントシステムを構築した.一つは,ペンタブレットPCとGPS,デジタルカメラ,マイク,傾きセンサ,距離センサを統合したシステムである. GPSだけを用いたデータ収集では利用者の立ち位置に関する情報しか記録できない.しかし,提案システムによって利用者は,危険な場所や建物中のような直接位置を計測できない対象に関する位置情報を取得できる.さらに本研究では,予備調査によって提案システムの有効性を確認した.二つ目はデジタルペンを用いた地図への注釈システムである.長時間の現地調査において計算機に比べて紙の方が扱いやすく信頼性がある.しかし紙に記述されたデータは,収集後に電子化されることが多く手間がかかる.そこで,提案システムは,デジタルペンを用いることによって手書きデータを効率的に電子化し,データの分析や共有への応用を支援する.今後は,これらクライアントシステムのユーザビリティを比較し評価するとともに,収集されたデータの分析や共有するためのサーバシステムの実現を目指す.近年,小型GPS受信機や高機能携帯電話のようなモバイル機器の普及にともなって,地域研究,マーケティングなどの野外調査でモバイル機器の利用が増えている.一方,これらの機器に比べて紙は安価で信頼性があるため,現在でも広く課外調査で利用されている.特に長時間におよぶ野外調査では,モバイル機器の電源問題により紙を用いることの方が多い.野外調査で紙に手書きしたデータを分析するために,利用者は手作業で電子化しなければならない.このような手作業は,入力ミスなどが考えられるため効率的ではない.そこで本研究では,紙とペンを使った野外調査と,収集した手書きデータの効率的な電子化を実現するためにデジタルペンを用いた地図注釈システムのプロトタイプを開発した,本研究では,提案システムの応用として地理教育での野外調査について考察し,教師の負担軽減や生徒が収集した地理情報の共有が容易になることによる授業の効率化が可能であることを示した.さらに提案システムのユーザビリティに関する予備実験として,情報系大学院生を対象に大学や公園での模擬野外調査を実施し,野外でのデジタルペンの使用感や,調査結果の電子化処理についてアンケートを行った.被験者から得たアンケートからデジタルペンの有用性を示せたが,電子化処理では処理結果の確認方法に関する問題点が明らかになった.
細胞外小胞の不均質性を可視化するデジタルMSイメージング

がん領域でエクソソームをはじめとした細胞外小胞が重要視されているが、細胞外小胞の不均質性については未知の部分が多い。本研究では、細胞外小胞の不均質性を明らかにすることを最終目的とした、単一がん細胞由来の細胞外小胞に含まれる分子群の可視化に向けたプラットフォームの構築を目指す。はじめに、単一細胞から分泌される小胞を確実に捕捉できるデバイスの開発と、質量分析計を用いて捕捉された小胞内の分子群を可視化する系の構築を行う。開発したプラットフォームの既存技術によるバリデーションと、分子生物学的観点から不均質性がもたらす意味を考察する。最後に、同定された分子群のバイオマーカーとしての利用可能性を探る。
微小振動系に対するレーザを用いた光減衰機構の開発

本研究では,線径20ミクロン,直径が300ミクロンのコイルばねと球による1自由度振動系を構築し,この微小振動系の動的特性について実験的検討を行った.まず微小要素に対する新たな計測系を提案し,固有振動数と減衰特性を実験的に把握した.次いでレーザ光によって減衰を与える可能性について検討した.この実験系で微小振動系の振動特性を得ることができたが,製造工程の問題で実験系大きくなり,放射圧による減衰作用を確認することはできなかった.本研究では,線径20ミクロン,直径が300ミクロンのコイルばねと球による1自由度振動系を構築し,この微小振動系の動的特性について実験的検討を行った.まず微小要素に対する新たな計測系を提案し,固有振動数と減衰特性を実験的に把握した.次いでレーザ光によって減衰を与える可能性について検討した.この実験系で微小振動系の振動特性を得ることができたが,製造工程の問題で実験系大きくなり,放射圧による減衰作用を確認することはできなかった.本研究では,線径20ミクロン,直径が300ミクロンのコイルばねと球による1自由度振動系を構築し,この微小振動系にレーザ光の放射圧を利用した減衰を作用させることを試みた.マイクロマシンの開発は研究レベルで積極的に進められているが,単に通常の機械の寸法を小さくしたものが多く,動力学特性を考慮した研究はほとんどない.そこで,マイクロマシンを極力単純化した微小ばねー質量系に対して振動特性を把握し減衰を与えることを試みた.まず減衰特性を実験的に把握し,次いでレーザ光によって減衰を与える可能性について実験的に検討した.このような微小振動系の振動実験を行った研究例はほとんどなく,ばね質量,ばね部材の構造減衰,空気抵抗,静電気力等の影響で,理論値とは異なることが予想された.質量の変位測定にはハイスピードマイクロスコープを利用した.この実験系で振動特性が得られたが,特筆するべきは減衰作用が極めて小さいことであった.また静電気の作用は比較的大きいので実験で初期変位を与える際に注意を要した.さらに,光放射圧を用いたダイヤモンド球の運動制御のための光学系を構築して,レーザ光の放射圧による減衰作用の定量的同定を行ったが,振動系が大きく光放射圧による減衰作用は得ることができなかった.この減衰効果を活用するためには,さらに小型・軽量の振動系が必要とされるが,現時点でコイルばねを使用する限りは限界であり,光放射圧以外の減衰作用を利用を検討する必要がある.
神経細胞の生存維持におけるDNA修復蛋白質の役割-神経変性疾患の発症機序として-

神経変性疾患の発症機序の一つとしてDNAの欠失や変異が蓄積して変異タンパク質により細胞機能が傷害されて神経細胞死が起こることが考えられている。神経細胞が長期にわたり生存し、正しく機能するためには、細胞の機能を司るタンパク質をつくる遺伝子に傷害がないことがきわめて重要である。本研究計画では、この点に着目して、私たちが発見し、Tradと命名したDNA修復タンパク質がDNA損傷による神経細胞死にどのように関与しているかを明らかにするための検討を行った。私たちはすでにこの修復タンパク質mRNAが脳で高い発現が認められることを見出しており、中枢神経細胞で重要な役割を果たしていることが示唆されている。すでに作成していたTradのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質に対する抗体をウエスタンブロッティング法で特異性の確認をしたところ、複数のバンドが確認された。新たに作成した4カ所の抗ペプチド抗体を用いて、特異性を検討するため、遺伝子のクローンニングがなされているマウスRAD51/recAfamilyすべてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を作成し、発現誘導を行い、ウエスタンブロット法により各々の抗体で検出を行ったところ、組換えGST融合Trad蛋白質に対する特異性は低く、組換えGST融合Trad蛋白質に対する抗体価も低いことが示された。そこでTrad蛋白質に対する新たな抗ペプチド抗体を作成し、同様にRAD51/recA familyに対する特異性を検討したところ、組換えGST融合ヒトTrad蛋白質や他のマウスRAD51/recA family蛋白質とはクロスせず、組換えGST融合マウスTrad蛋白質に特異的な高力価の抗体であることが示された。この抗体を用いてマウス培養細胞や各組織のウエスタンブロット法による検討を行ったところ、Trad蛋白質の発現レベルは極めて低く、複数のバンドが検出された。このことは私たちが既に報告しているノザンブロットの結果およびヒトに於ける複数のスプライスバリアントの存在を裏付けるものと考えられた。ヒトにおいては複数のスプライスバリアントがあることを報告しているので、マウスにおいても同様のバリアントがあるか検討を行い、複数のバリアントを確認した。これらバリアントをマウスで発現させ表現型を検討するため、テトラサイクリンで発現を制御できるウイルスベクターに各バリアントを組込み、高力価のウイルス上清を作成した。私たちはすでにこの修復タンパク質が脳で高い発現が認められることを見出しており、中枢神経細胞で重要な役割を果たしていることが示唆されている。本年度は以下の研究を実施した。1)マウス個体でのDNA修復蛋白質(Tradを含む)の組織分布を調べるため、マウス各発達段階8,9,10,12,13,14,15,16dayの組織標本を作製した。

2)すでに作成していたTradのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質に対する抗体をウエスタンブロッティング法で特異性の確認をしたところ、複数のバンドが確認された。3)新たに3カ所の抗ペプチド抗体を作成し、ウエスタンブロッティング法を行ったところ、すべての抗ペプチド抗体で複数のバンドが確認された。私たちはヒトとマウスではmRNAレベルにおいて複数のスプライスバリアントが存在することを確認しており、ウエスタンブロッティングの結果はそれを裏付けるものである可能性がある。4)すでに遺伝子のクローンニングがなされているマウスRAD51/recAfamilyすべてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を作成し、発現誘導を行ったところ、Rad51,Rad51B, Rad51C, Xrcc2,Xrcc3の5種類では、誘導によって発現したと思われるはっきりとしたバンドが確認されたが、DMC1は発現誘導したサンプルと誘導しなかったサンプルの間で明らかな差が認められなかった。神経変性疾患の発症機序の一つとしてDNAの欠失や変異が蓄積して変異タンパク質により細胞機能が傷害されて神経細胞死が起こることが考えられている。神経細胞が長期にわたり生存し、正しく機能するためには、細胞の機能を司るタンパク質をつくる遺伝子に傷害がないことがきわめて重要である。本研究計画では、この点に着目して、私たちが発見し、Tradと命名したDNA修復タンパク質がDNA損傷による神経細胞死にどのように関与しているかを明らかにするための検討を行った。私たちはすでにこの修復タンパク質mRNAが脳で高い発現が認められることを見出しており、中枢神経細胞で重要な役割を果たしていることが示唆されている。本年度は以下の研究を実施した。すでに作成していたTradの3カ所の抗ペプチド抗体の特異性を検討するため、遺伝子のクローンニングがなされているマウスRAD51/recAfamilyすべてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を作成し、発現誘導を行い、ウエスタンブロット法により各々の抗体で検出を行ったところ、組換えGST融合Trad蛋白質に対する特異性は低く、組換えGST融合Trad蛋白質に対する抗体価も低いことが示された。そこでTrad蛋白質に対する新たな抗ペプチド抗体を作成し、同様にRAD51/recA familyに対する特異性を検討したところ、組換えGST融合ヒトTrad蛋白質や他のマウスRAD51/recA family蛋白質とはクロスせず、組換えGST融合マウスTrad蛋白質に特異的な高力価の抗体であることが示された。この抗体を用いてマウス培養細胞や各組織のウェスタンブロット法による検討を行ったところ、Trad蛋白質の発現レベルは極めて低く、複数のバンドが検出された。このことは私たちが既に報告しているノザンブロットの結果およびヒトに於ける複数のスプライスバリアントの存在を裏付けるものと考えられた。
次世代核酸医薬の開発を志向した三重鎖形成核酸創製基盤の構築

核酸糖部の立体配座と核酸塩基の回転角を精密に制御した人工ヌクレオシドの合成とそのオリゴ核酸中での性質を評価することにより、アンチジーン法をはじめとした新たな核酸創薬の基盤構築を目指した。本研究では、O4'エンド構造またはC3'エンド構造の糖部立体配座をもつ新しいヌクレオシドを合成し、その三重鎖核酸安定性を評価したところ、これまで高次構造を不安定化すると考えられていた2'-5'連結型のC3'エンド型人工核酸が安定に三重鎖を形成できることを明らかにした。さらに、これら人工核酸やLNA類との構造比較により、核酸塩基の回転角が高次構造の安定性を決める大きな要因になっていることを明らかにした。本研究では、核酸糖部の立体配座と塩基の回転角を精密に制限した人工ヌクレオシドの合成とそのオリゴ核酸中での性質を評価することにより、アンチジーン法をはじめとした新たな核酸創薬の基盤構築を目指す。本年度は、O4'エンド構造とC3'エンド構造に糖部を固定した新しい二種類の人工ヌクレオシドを合成した。O4'エンド構造をもつヌクレオシドは、5-メチルウリジン出発原料とし、糖部2'位と塩基部6位との間をラジカル反応によって架橋する事で合成した。一方、C3'エンド構造をもつヌクレオシドは、ジアセトングルコースを出発原料とし、トランス縮環したテトラヒドロフラン構造の構築を鍵として合成し、その構造の揺らぎを強固に抑制した。それぞれ200ミリグラムまたは10ミリグラム程度合成する事に成功した。さらに、O4'エンド構造をもつヌクレオシドはオリゴDNA中に導入し、その基本的性質を評価した。まず、15塩基長のピリミジンDNA中を、1ヶ所、2ヶ所、3ヶ所または11ヶ所の人工ヌクレオシドで修飾したオリゴ核酸の三重鎖形成能を三重鎖核酸の50%融解温度で評価した結果、一修飾あたり9度程度の融解温度の低下が観察され、この糖部構造をもつ人工核酸は三重鎖形成核酸としては不向きである事が分かった。一方で、3'-5'エキソヌクレアーゼによるオリゴDNAからの切り出しに対して強い耐性を有している事を明らかにした。これは3'エンド構造に固定した核酸類とは異なる耐性様式であり興味深い。本研究は、核酸糖部の立体配座と核酸塩基の回転角を精密に制御した人工ヌクレオシドの合成とそのオリゴ核酸中での性質を評価することにより、アンチジーン法をはじめとした新たな核酸創薬の基盤構築を目指すものであり、本年度は、昨年度合成を開始したC3'エンド構造の糖部立体配座をもつヌクレオシドの合成を引き続き行なうとともに、そのオリゴ核酸経の導入の検討、さらにその性質の一部を評価した。まず、昨年度合成に成功したトランス縮環したテトラヒドロフラン構造をもつヌクレオシドをオリゴ核酸へ導入するためホスホロアミダイト体へと誘導を試みた。その過程で本ヌクレオシドが酸性条件下で極めて不安定であることが明らかとなり、それに伴い合成経路の見直しを行なった。続いて、新たに確立した合成経路に従って合成したホスホロアミダイト体(600mg)を用いてオリゴ核酸への導入を検討した。定法の核酸合成法を用いるとトランス縮環したテトラヒドロフラン構造の分解が原因で目的のオリゴ核酸を合成する事は出来なかったが、種々検討を行った結果、酸性水溶液を使う操作を経ない方法を選択すれば、合成が可能である事を見いだした。続いて、このトランス縮環したテトラヒドロフラン構造によってC3'エンドに固定した人工ヌクレオシドをもつオリゴ核酸のアンチジーン法を志向した性質解析を行なった。まず、興味深い事に、この人工ヌクレオシド構造はオリゴ核酸中では酸性条件下でも安定であり、エンドソーム内よりも酸性と考えられる水溶液(pH = 4)中で少なくとも1時間は分解が認めらなかった。一方、15塩基長のピリミジンDNA中の一ヶ所に人工ヌクレオシド修飾したオリゴ核酸が形成する三重鎖の熱的安定性を評価した結果、天然DNAの三重鎖と全く同じ安定性を示した。これらの性質は、核酸創薬への応用を十分に期待できることから、より詳細な性質解明を実施する必要がある。昨年度の研究で新しく合成を開始したC3'エンド糖部立体配座をもつ人工ヌクレオシドの合成を引き続き行なった。当初は、昨年度合成した経路を利用して合成が完了すると想定していたが、予想以上に化合物の化学安定性が低かった事から合成経路の見直しが必要となったが、計画を遅らせること無く新たな合成経路の確立に成功し、オリゴ核酸の合成に着手できた。新たな合成経路では600ミリグラムという通常のオリゴ核酸基礎研究には十分な量のアミダイトユニットの合成にも成功している。さらに、合成した化合物のアンチジーン法に向けた基礎的な性質の解析も実施し、核酸創薬に展開する上での基本的な性質を獲得していることを明らかにしている。一方、昨年度合成を計画していたピラノシド核酸の合成は難航しており、ほとんど進んでいない。本化合物は、テトラヒドロピランのアキシアル位に核酸塩基とヒドロキシメチル基を配置するように立体配座を固定する必要があるが、それには各置換基が1,3-ジアキシアル位に配置することになるためエネルギー的に非常に不利であり、構造構築のための結合形成反応が進行せずに脱離反応や還元反応といった望まない反応か進行することが原因である。

以上の結果と、昨年度の研究は当初計画以上に進展していたことを総合して考えると、概ね当初計画通りに進行していると考えている。核酸糖部の立体配座と核酸塩基の回転角を精密に制御した人工ヌクレオシドの合成とそのオリゴ核酸中での性質を評価することにより、アンチジーン法をはじめとした新たな核酸創薬の基盤構築を目指した。本研究では、DNA中で広く見られる立体配座であるO4'エンド構造またはC3'エンド構造の糖部立体配座をもつ新しいヌクレオシド(Ns)を合成し、その基本的な化学安定性を精査するとともに、LNA類との比較を通じてそのアンチジーン法に繋がる基本的性質を評価した。O4'エンド型Nsは、5メチルウリジンを出発原料とし、糖部2'位と塩基部6位との間をラジカル反応によって架橋することで合成した。C3'エンド型Nsは、グルコース誘導体を出発原料とし、5メチルウリジン類縁体とアデノシン類縁体とをそれぞれ10010ミリグラムスケールでの合成に成功した。また、C3'エンド型Nsは、これまで報告のない独特なトランス縮環構造により極めて強固に立体配座が固定されていることが、NMRやX線結晶造を解析することで明らかとなった。さらに、トランス縮環テトラヒドロフラン構造が酸性下で分解することを示した。興味深い事にNsレベルでは酸性条件下で分解性を示した人工Ns骨格がオリゴ核酸中では安定であり、酸性水溶液(pH 4)中で少なくとも1時間は分解が認められなかった。人工Ns導入したオリゴDNAが形成する三重鎖の熱的安定性は、O4'エンド型Nsをもつオリゴ核酸が大きくその高次構造を不安定化する一方で、C3'エンド型Nsをもつオリゴ核酸は天然DNAの三重鎖と全く同じ安定性を示した。これら人工核酸が天然DNAとは異なる分解酵素耐性を示すことも明らかとした。本研究で合成したC3'エンド構造をもつオリゴ核酸の性質はアンチジーン法への適用に期待でき、引き続きこの類縁化合物の開発がこの研究領域の理解に役立つことを示すことができた。本研究では、O4'エンド構造またはC3'エンド構造の糖部立体配座をもつ新しいヌクレオシドを合成し、その三重鎖核酸安定性を評価したところ、これまで高次構造を不安定化すると考えられていた2'-5'連結型のC3'エンド型人工核酸が安定に三重鎖を形成できることを明らかにした。さらに、これら人工核酸やLNA類との構造比較により、核酸塩基の回転角が高次構造の安定性を決める大きな要因になっていることを明らかにした。構造制御したヌクレオシドの合成経路は煩雑になる事が多いことから、昨年度の当初計画では、一種類の人工ヌクレオシド、1'エキソ型ヌクレオシドの合成とその構造特性を精査することを計画していた。残念ながら1'エキソ型ヌクレオシドの合成は未達成ではあるものの、その研究過程で見いだした結果の一部からO4'エンド構造をもつヌクレオシドの合成を達成できる事を明らかにした。また、その合成が比較的短経路となった事からヌクレオシドの合成と構造特性評価にくわえ、当初は次年度に計画していたオリゴDNAへの導入を達成した。さらに、当初の計画では想定していなかったが、量子化学計算等による分子モデリングの結果、新しく設計したC3'エンド構造をもつヌクレオシドの合成を達成できれば、これまでに達成されていないカタチへの核酸糖部構造固定を実施できる可能性が明らかとなったことから、その合成に着手した。
腸内細菌・発酵産物による制御性T細胞表面結合TGF-β発現誘導の研究

酪酸の制御性T細胞(regulatory T cell; Treg)誘導能とTreg細胞表面TGF-β誘導能を検討するために、正常マウスに難消化性食物繊維・酪酸含有餌(酪酸投与群)、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌(コントロール群)を4週間給餌し、脾臓・腸管粘膜CD4+ T細胞中のTreg割合をフローサイトメトリーで解析した。脾臓CD4+ T細胞中Treg(CD25+Foxp3+分画)の割合は、コントロール群8.11%、酪酸投与群8.99%と酪酸投与で軽度の増加を認めたが、Treg細胞表面TGF-β発現は両群間で差を認めなかった。腸管粘膜CD4+ T細胞ではTregの割合はコントロール群10.5%、酪酸投与群で10.6%と差を認めず、Treg細胞表面TGF-β発現も両群間で差を認めなかった。次に、酪酸投与群で認められた脾臓CD4+ T細胞中Treg割合の増加に関して更に検討するため、通常の餌、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌、難消化性食物繊維・酪酸含有餌を4週間給餌し、脾臓CD4+ T細胞中Treg割合を解析したところ、それぞれ6.54%、9%、11.5%であり、酪酸のみでなく難消化性食物繊維にもTreg誘導能がある事が示された。更に酪酸投与による大腸炎抑制作用の有無を検討した。正常マウスに難消化性食物繊維・酪酸含有餌(酪酸投与群)、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌(コントロール群)を4週間給餌し、その後1週間1.8% dextran sulfatesodium salt(DSS)含有水を自由飲水させ、DSS大腸炎を誘導した。酪酸投与群ではコントロール群と比較して、より高度の体重減少を来し、大腸炎により大腸の長さが短縮していた。両群間で腸管粘膜Treg上の細胞表面TGF-β発現に明らかな差は認められなかった。酪酸投与による明らかな大腸炎抑制作用は認めなかった。本研究は大腸での発酵産物である酪酸もしくは腸内細菌による制御性T細胞(regulatory T cell; Treg)表面の免疫抑制性サイトカインTGF-β発現誘導のメカニズムの解明を目的とする研究である。現在の実験では、マウスへ酪酸産生菌とされるClostridium.butyricumの懸濁液の投与群と水投与群(コントロール群)とを作成し15日間経口投与を行い、最後の7日間にDSS腸炎を誘導し解析を行った.両群間で体重の変化・腸管長・大腸重量において差は認めず、C. butyricum投与群でおいて臨床的に明らかな大腸炎抑制はみられなかった。15日間投与後に両群マウスの大腸粘膜単核球(lamina propria mononuclear; LPMC)を採取し、CD4・CD25・Foxp3・Il-10・TGF-β・Nrp-1の各抗体にて染色し、フローサイトメトリーにて解析を行った。その結果,CD4+ T細胞中におけるCD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞の占める割合がC. butyricum投与群において1.36%と水投与群(0.88%)と比較して増加を認め、Tregの中でもNrp-1陰性で炎症抑制と関係が大きいと言われる末梢性Treg (inducible Treg; iTreg)が増加していることを確認した。しかし、C. butyricum投与群においてiTreg細胞表面TGF-βの発現は水投与群と比べて明らかな増加は認めなかった。また、TGF-βと共にTregで産生される免疫抑制性サイトカインIL-10の発現もC. butyricum投与で明らかな増加は認めなかった。酪酸のマウスの大腸への投与は現時点ではまだ行えていない。その理由は、経口投与では酪酸は小腸で吸収されてしまい、大腸までの到達には特殊飼料が必要であるためである。直接投与である注腸投与も試みたが、マウスへの連日の注腸はストレスが大きく困難であった。C. butyricum投与においてTregの誘導は確認できたが、細胞表面TGF-β・IL-10の発現増加は認めなかった。

次に、酪酸投与群で認められた脾臓CD4+ T細胞中Treg割合の増加に関して更に検討するため、通常の餌、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌、難消化性食物繊維・酪酸含有餌を4週間給餌し、脾臓CD4+ T細胞中Treg割合を解析したところ、それぞれ6.54%、9%、11.5%であり、酪酸のみでなく難消化性食物繊維にもTreg誘導能がある事が示された。更に酪酸投与による大腸炎抑制作用の有無を検討した。正常マウスに難消化性食物繊維・酪酸含有餌(酪酸投与群)、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌(コントロール群)を4週間給餌し、その後1週間1.8% dextran sulfatesodium salt(DSS)含有水を自由飲水させ、DSS大腸炎を誘導した。酪酸投与群ではコントロール群と比較して、より高度の体重減少を来し、大腸炎により大腸の長さが短縮していた。両群間で腸管粘膜Treg上の細胞表面TGF-β発現に明らかな差は認められなかった。酪酸投与による明らかな大腸炎抑制作用は認めなかった。酪酸投与により腸管粘膜CD4+ T細胞中の制御性T細胞(Treg)割合が増加し、腸管炎症を抑制する作用が期待されていたが、脾臓CD4+ T細胞中Treg割合が増加するものの、大腸粘膜CD4+ T細胞では認めず、明らかな大腸炎抑制作用も見られなかった。酪酸の制御性T細胞(regulatory T cell; Treg)誘導能とTreg細胞表面TGF-β誘導能を検討するために、正常マウスに難消化性食物繊維・酪酸含有餌(酪酸投与群)、難消化性食物繊維含有・酪酸非含有餌(コントロール群)を4週間給餌し、脾臓・腸管粘膜CD4+ T細胞中のTreg割合をフローサイトメトリーで解析した。脾臓CD4+ T細胞中Treg(CD25+Foxp3+分画)の割合は、コントロール群8.11%、酪酸投与群8.99%と酪酸投与で軽度の増加を認めたが、Treg細胞表面TGF-β発現は両群間で差を認めなかった。腸管粘膜CD4+ T細胞ではTregの割合はコントロール群10.5%、酪酸投与群で10.6%と差を認めず、Treg細胞表面TGF-β発現も両群間で差を認めなかった。C. butyricum投与ではTregの増加は確認できたが、細胞表面TGF-βやIL-10発現増加は認めなかった。今後、C. butyricum投与の条件設定を行い、細胞表面TGF-β発現誘導を試みる。また、TGF-βの活性化に関係するintegrinαvβ8やTGF-βが細胞表面に発現する際の結合蛋白であるGARPのTregでの発現解析を行っていく。上記に加えてマウス大腸へ酪酸を到達させうる方法を考案し、大腸における酪酸とTreg細胞表面のTGF-βの発現、またそれに関係するintegrinαvβ8、GARPの発現を解析し、酪酸とTGF-β発現のメカニズム解明の研究をすすめる。
PKC-ε選択的活性化による新規抗認知症治療剤創製と新規ターゲット探索

本研究では、リパーゼの光学分割を鍵としてinvivo実験に供し得る量の合成に対応可能な光学活性DCP-LAの合成に成功し、invivoにおいても、α,β-DCP-LAが高い活性を持つことを明らかとした。さらに、市販の化合物から容易に合成できる新規誘導体HUHS2002および抗炎症薬インドメタシンがDCP-LAと同様の薬理活性を有することを明らかとした。さらに、光学活性DCP-LAを用いたターゲット探索研究により、有望なターゲット蛋白質候補の同定に成功した。本研究目的はH20-21科研費(若手研究スタートアップ)研究成果として合成した光学活性DCP-LAに関する発展研究として、1)高純度かつ大量合成可能な合成ルートを構築し、in vivoを中心とした薬理評価および簡易安全性試験を行い、DCP-LAの各光学活性体間の構造活性相関を明確にし、抗認知症治療を目指す薬物創出を目指すこと、2)効率的な関連誘導体合成ルートを構築し、構造活性相関をより明確にすること、3)すでに合成済の光学活性体を用いアフィニティ樹脂を合成し、今後得られる活性情報および各誘導体の特異的結合蛋白質との比較から、作用メカニズムを解明し、抗認知症治療に貢献できる新規創薬ターゲットを創出すること、の3点にある。22年度は研究計画1および3の検討を中心に行った。まずで研究計画1に記した大量合成法の開拓研究においてはlipaseを用いた選択的acyl化法を用いることで、目的の絶対立体化学を有するジシクロプロパン鍵中間体を高純度で取得する方法を開発した。現在、鍵中間体に対し、側鎖導入の検討を行っており、合成ルートが確立次第、23年度の目標となる大量合成および研究計画2の誘導体合成へと着手する計画である。一方、研究計画3のターゲット探索研究に関して、本年度は準備段階として、アフィニティ樹脂を用いたターゲット捕獲手法および質量分析測定による結合蛋白質の同定手法を確立することを目的とした。種々の検討の結果、微量の蛋白質でも同定が可能である手法を確立した。現在、本研究の目的達成に向けて、光学活性DCP-LAのアフィニティ樹脂を合成しており、23年度中に合成を完了し、DCP-LAのターゲット探索研究に着手する予定である。【申請時の研究目的および計画】1)光学活性DCP-LA大量合成法の開拓および薬理評価(H22年度)2)誘導体合成および構造活性相関研究(H22年度H23年度)3)ターゲット探索(アフィニティ樹脂)(H23年度24年度)【H23年度研究進捗状況】研究計画1では22年度に引き続き、大量合成法の開拓研究を進めた。当初計画していた合成ルートが大量合成に適さない問題が生じたものの、元の合成ルートで大量合成に不向きな部分を改良することにより、in vivoでの活性試験が可能な量の光学活性DCP-LAを取得可能なルートの構築に成功した。さらに、ラット脳海馬スライスを用いたグルタミン酸、ドーパミン、セロトニンの放出活性を調べたところ、全ての異性体が活性を有し、in vivoにおいてもα,β-DCP-LAが最も高い活性を持つことを明らかとした。研究計画2の誘導体合成および構造活性相関研究では、DCP-LAと同様の活性を有し、DCP-LAよりも合成が容易な誘導体を見出すことができた。H24年度では、新規誘導体のin vivo実験およびDCP-LAを大きく凌ぐ誘導体の発見を目指し構造活性相関研究を続けていく予定である。研究計画3のターゲット探索研究はH22年度に同定した数種類の候補タンパク質について、ターゲットバリデーションを進め、現段階で物理化学的アプローチおよび分子生物学的アプローチ両面でターゲットと考えられる蛋白質を絞り込むことに成功した。【申請時の研究目的および計画】1)光学活性DCP-LA大量合成法の開拓および薬理評価(H22年度);2)誘導体合成および構造活性相関研究(H22年度H23年度);3)ターゲット探索(アフィニティ樹脂)(H23年度24年度)【H24年度研究進捗状況】研究計画1に関しては、H23年度に引き続き大量合成をした光学活性DCP-LAのさらなるin vivo実験データ取得を行い、認知症モデルマウスにおいて有効な抗認知症作用を示すことを見出し、学術論文誌に公表した。(遂行達成率95%)研究計画2に関しては、平成23年度に見出したDCP-LAに替わるラットの海馬における長期記憶増強作用活性を持つ新規誘導体HUHS2002の広範な薬理活性評価を行い、in vivoにおいてもDCP-LAと同等な抗認知症活性を見出すことに成功し学術論文誌に公表した2)。さらに、分子生物学的手法に基づくHUHS2002の作用メカニズムの初期検討についても検討し、PKCを直接活性化するDCP-LAとは異なりPP1を直接阻害してCaMKIIを活性化する結果を得たため学術論文誌に公表した。(遂行達成率95%)研究計画3に関しては、既にH23年度において、アフィニティ樹脂により同定したいくつかの特異的結合タンパク質について

蛍光標識体作成し、DCP-LA光学活性体の投与により、細胞内局在などからのターゲットバリデーション研究により、特異的結合蛋白質のうちの1つの蛋白質が極めて有力なターゲット候補タンパク質であるとのデータを得た。本研究期間内中に本結果を学術論文へ投稿することは間に合わなかったものの、本年中には投稿の見通しは立てることが出来た。(遂行達成率85%)研究目的1の合成法確立は当初計画した合成ルートでの達成はできなかったものの、元のルートを改良することにより予定していたH23年度内にin vivoでの実験を達成できた(in vivoデータはH24年4月論文発表、合成法はH24年度中論文発表予定)。さらに、研究目的2の誘導体合成もH23年度内に新規誘導体を発見することに成功した(論文投稿中)。研究目的3のターゲット探索もH24年度中には一定の成果を達成できる見込みである。以上の進展状況から研究はおおむね順調に推移していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度は本研究計画の最終年度となるため、本研究の完了およびこれまでの成果の公開を行っていく予定である。研究の推進に関しては、研究計画3のターゲット探索研究に重点を置いて展開する予定である。H23年度から進めている物理化学的アプローチおよび分子生物学的アプローチ両面でのターゲット蛋白質のvalidationデータを固め、DCP-LAのターゲット蛋白質を同定する予定である。さらに、本成果をベースとした新規テーマへと展開していく計画である。一方、成果の公開に関しては、年度内に研究計画1および2の報文化を行い、社会への公開をする計画である。