hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
同種指向性マウスレトロウイルスEnvとその受容体の機能構造

レトロウイルスEnvの機能は感染受容体結合依存的な膜融合の媒介である。これらの素過程が共役している。共役にかかわるEnvの構造とEnv内シグナル伝達過程の解明を目的とした。同種指向性マウスレトロウイルスEnvに新たな膜蛋白質結合モチーフを遺伝子工学的に導入して、これによる新たな膜蛋白質への結合が膜融合機能と共役するか、その程度はどの位かを調べるという方法をとった。結合モチーフとしてSDF-1α全長を用い、導入部位をEnvの本来の感染受容体結合領域内(Pro-79)にした揚合、共役が起こることを我々は既に報告した。今回、SDF-1α配列部分を種々に改変した場合、キメラEnvのCXCR4結合能と膜融合媒介能(ベクターの遺伝子導入能)とが良く相関することがわかった。これはPro-79部位が外来結合モチーフの導入部位として、共役に関して極めて優れた部位であることを示している。このことはSDF-1α配列の導入部位をPro-3にしたキメラEnvの結果からも支持された。このキメラEnvはCXCR4に結合したが膜融合媒介能はなく、共役能を欠いていることが示された。感染受容体については、ガンマレトロウイルス感染受容体が共通に示す構造的特徴である複数回膜貫通型構造が感染受容体としての機能発現に関連しているか否かに関して手がかりを得ることを目的とした。CXCR4は複数回膜貫通型であると同時にHIVの感染共受容体でもある。複数回膜貫通型の膜蛋白質であるがHIVの共受容体ではないケモカイン受容体CCR7が、そのリガンドであるCCL19(ELC)をPro-79に導入したキメラEnvを持つウイルスベクターの感染受容体となるかどうかを詳細に調べた。種々検討の結果、CCR7はELCキメラEnvベクターの細胞内侵入に何らかの関与はするものの、感染受容体として機能するとの確証は得られなかった。マウス同種指向性白血病ウイルス(E-MLV)の細胞侵入を担うエンベロープ蛋白質(Env)と細胞膜に存在する感染受容体の機能を分子レベルで解明する。このためにEnvの構造をペプチドリガンド配列の挿入により修飾して、感染受容体指向性を人為的に改変するという方法を取る。今年度においては、第1に、すでに受容体指向性の改変に成功したCXCR4指向性Envについて、挿入リガンドであるSDF-1αの修飾により細胞侵入効率がどのように変化するかを調べた。N末側にCXCR4結合部位があるSDF-1αの配列をC末側から種々に削り、またCysからGlyへの変異を導入して7種の短鎖SDF-1αキメラEnvを作製した。それぞれのEnvのウイルス粒子への取り込みを調べたところ、全長(68アミノ酸)のものと65まで短くしたものは変化ないが、56や51にすると粒子にほとんど入らなくなり、35や17にすると全長のものより、より多く入るようになった。鎖長によらずCysのGlyへの変異は粒子への取り込みを増やした。これらのキメラEnvを持つlacZベクターのCXCR4経由細胞侵入を測定した。65のものが全長のものの約1/10の効率で侵入したが、その他のキメラEnvベクターは全く侵入しなかった。第2にE-MLVの感染受容体となり得る膜蛋白質の構造的必要条件を知るために、CXCR4に続く第2の例を探索した。CCR5とCCR7とを候補とした。CCR7のリガンドであるCCL19(ELC)を挿入したキメラEnvベクターがCCR7依存的に遺伝子導入する事を見いだした。CCR5に関しては数種のリガンドキメラEnvベクターを試したがCCR5依存的遺伝子導入は観察されなかった。CCR7は7TMのケモカイン受容体であるが、HIVの共受容体ではない。従って、HIVの共受容体として機能することはE-MLVの感染受容体としての必要条件ではないと思われる。

複数回膜貫通型の膜蛋白質であるがHIVの共受容体ではないケモカイン受容体CCR7が、そのリガンドであるCCL19(ELC)をPro-79に導入したキメラEnvを持つウイルスベクターの感染受容体となるかどうかを詳細に調べた。種々検討の結果、CCR7はELCキメラEnvベクターの細胞内侵入に何らかの関与はするものの、感染受容体として機能するとの確証は得られなかった。
エンドサイトーシスによる膜受容体からのシグナル伝達の調節

Arf6は形質膜を中心とした小胞輸送を制御する低分子量Gタンパク質であり、接着分子であるE-カドヘリンや様々な膜受容体の局在を制御する事により、細胞の運動性や浸潤性を調節すると考えられている。昨年度までに上皮細胞で主に発現する接着分子であるE-カドヘリンだけでなく神経系の細胞で主に発現するN-カドヘリンの細胞内局在性もArf6により制御される事、N-カドヘリンの強制発現によりE-カドヘリンの細胞内への取り込みが促進される事、さらにはこのE-カドヘリンの細胞内への取り込みがArf6の不活性型変異体であるArf6T27Nにより阻害される事等を明らかにした。本年度はN-カドヘリンを発現するアデノウイルスベクターを作製し、一過性に全ての-MDCK細胞にN-カドヘリンを発現させた際のE-カドヘリンの動態を検討した。その結果N-カドヘリンの発現により、ほぼ全てのE-カドヘリンは細胞間接着部位から消失し、細胞内のエンドソーム様の小胞に局在した。しかしながらE-カドヘリンの総蛋白量はウイルス感染前後で大きな差は無く、エンドサイトーシスされたE-カドヘリンは分解経路に輸送されるのでは無く、主にリサイクリング経路に輸送されるものと考えられた。これは、E-カドヘリン小胞がリソソームのマーカーとほとんど共局在しない、という以前得られた結果と一致した。以上の知見を基にGFPなどを利用して生細胞中のE一およびN-カドヘリンの細胞内局在性を検討する事が今後の課題である。1.Clathrin非依存的エンドサイトーシスの解析本年度の研究により細胞間接着分子のひとつであるN-カドヘリンがArf6によりその細胞内局在が制御される分子である事を明らかにした。すなわちNIH3T3細胞にArf6の活性型変異体であるArf6Q67Lを強制発現させたところArf6により形成される小胞上にN-カドヘリンが局在する事を見いだした。またイヌ上皮細胞であるMDCK細胞を用いてN-カドヘリンの動態について解析したところ、N-カドヘリンの強制発現によりE-カドヘリンの細胞内への取り込みが促進される事、細胞の形態が上皮細胞様から繊維芽細胞様に変化する事、さらにE-カドヘリンとN-カドヘリンが事なる輸送経路、すなわちE-カドヘリンがリサイクリング経路、N-カドヘリンがリソソームへの分解経路で細胞内輸送される事を示す興味深い結果を得た。またこれらのN-カドヘリン発現による表現形はArf6の不活性型変異体であるArf6T27Nにより阻害される事から、N-カドヘリンがArf6の活性化を引き起こす分子である事が示唆された。2.Clathrin非依存的エンドサイトーシスを制御する分子の同定上記の研究成果により、我々はMDCK細胞がClathrin非依存的エンドサイトーシスを制御する分子の同定に有用であると判断し、この細胞を用いてArf6の野生型、活性型および不活性型の安定導入株を樹立した。またN-カドヘリンを発現させる新たな系としてアデノウイルスベクターを作成した。今後Arf6の安定導入株にN-カドヘリンを発現させ、pull-down法によりArf6と結合する分子を同定する予定である。
「見える電磁気」可視化教材の製作と新型授業開発プロジェクトでの実践に関する研究

理科離れが言われて久しい。しかも中学・高等学校では「ゆとり教育」の名のもと理科の基本である観察や実験が削減されてきた。この結果、電気系においては電磁気学の修得が必要不可欠であるにもかかわらず、電磁気現象の体験が不十分なため、理論をイメージ化できる学生が少なくなっており、教科書の中だけの世界と考える学生も増えている。このような状況を改善し、高校教育から大学の専門教育への導入的教科の果たす役割が重要となり、多くの大学で様々な工夫が試みられている。本学でも学生の自主性を伸ばすような授業がもとめられており、大学教育実践センターより「新授業開発プロジェクト」の提案が求められている。申請者は21年度の奨励研究で採択された「『見える電磁気』教育支援プログラム」を発展させたものを、新型授業として提案し、開講科目である「電気物理学A」で演示実験を中心とした授業を実践した。そして授業後のアンケートおよび学生の出席状況より高い有効性を確認することができた。感想で寄せられた意見で特徴的なものは「教科書の中だけの世界と思っていたものが現実に現れた」というものであった。具体的な演示実験は、銅板の上に音を立てずに着地する磁石を観察したり、簡単なモーターがローレンツ力だけで回転したり、LEDの付いたコイルでIHヒーターが発する磁場を視覚的に観察するものである。このような演示実験をとおして知的好奇心をかき立てるだけでなく、日常の中で応用されていることを実感し、学習に対する意欲を喚起させ理解度を本物にする試みであった。このような実験プログラムは高校生を対象としたオープンキャンパス(2010.8.10)や、本学湯川記念室主催のSaturday Afternoon Physics 2010 (2010.10.16)でも行い、さらに工学研究科と連携協力協定を結んでいる高知県佐川町の4つの小学校(2010.9.6-8)で,そして、理科を楽しく教えられるようにと「小中学校の先生を対象にした理科教室」(2010.7.24電気学会関西支部主催)でも行い、子ども達から大人まで電磁気を身近のものとして認識できることで、教育効果が非常に高いものであることを確認するとともに、このような実践が理科教育の現場で広く取り入れられることを期待するものとなった。
脳脊髄動態障害における脳幹小脳の微細形態・機能障害の基礎的臨床的研究

正常圧水頭症7例(平均66歳)を対象とし、CT、MRI、CTC、脳血流検査について検討した。全例でV-Pシャントを行い、5例で症状の改善を認めた。脳室拡大が高度で脳室周囲白質、前頭葉大脳皮質の血流が低下し、ICPモニタリングで異常圧波の出現が高率であったものに手術治療が有効な傾向があった。正常圧水頭症14例(平均74.8歳)を対象としてシャント前後での大脳高次機能の評価を行った。手術適応の判定基準を、1)NPHのtriasを2つ以上認める、2)CTにて脳室拡大を認める、3)CTCでIIIbVである、4)ICPモニタリングでB波が35%以上出現する、5)手術・全麻のリスクが高くない、これら5つとして全例でシャントを行った。シャントの効果は著効4例、やや有効4例、不変4例、悪化2例であった。水頭症124例(平均35.5歳)を対象とした研究を行った。初回のV-Pシャントを行ったものは45例、シャント再建術を行ったものは49例であった。術前のCTCやICPモニタリングで手術適応が明らかに示されなかった症例でも高率で術後症状の改善を認めた。水頭症の診断、シャントの適応においてはCTCやICPモニタリングなどの検査ととともに、臨床経過を注意深く観察することが重要である正常圧水頭症7例(平均66歳)を対象とし、CT、MRI、CTC、脳血流検査について検討した。水頭症の診断、シャントの適応においてはCTCやICPモニタリングなどの検査ととともに、臨床経過を注意深く観察することが重要である7例の正常圧水頭症を対象として神経心理学的、神経放射線学的、髄液循環、頭蓋内圧、脳循環動態の各面から本症の病態の検討を行った。その病因として原因不明の特発性が6例、くも膜下出血後の続発性が1例であった。性別は男性2例、女性6例で、発症時年齢は57歳から74歳で、平均年齢は66歳であった。臨床症状として本症の3徴である精神症状、歩行障害、尿失禁の内2徴を有するものが5例で、3徴を呈するものは2例であった。精神症状と歩行障害は各6例にみられ、尿失禁は4名に認めた。脳室拡大の指標としてCTスキャンにてhydrocephaic index(Evans'ratio)を用い軽度拡大(33%以下)、中等度拡大(3440%)、高度拡大(41%以上)に分類した。軽度拡大が3例、中等度及び高度拡大が各2例となった。CTでは明らかな脳梗塞巣は認めなかった。MRIにて全例に脳室周囲の高信号域がみられ、4例でその進展が広範囲であった。CT脳槽造影では全例が中等度以上の髄液循環障害を示した。脳血流検査では7例全例に脳血流の低下を認め、その血流低下部位は脳室周囲白質が6例、前頭葉が4例、頭頂葉と側頭葉が各3例であった。小脳の血流は比較的良く保たれていた。治療は7例全例に脳室腹腔短絡術を行なった。術後症状は5例で改善した。手術前に脳室拡大が高度で脳室周囲白質、前頭葉大脳皮質の血流が低下し、持続頭蓋内圧測定で異常圧波の出現が高率であったものに手術治療が有効な傾向がみられたが今後更に症例数の増加を図り、脳幹の循環を含めたより詳細な分析を行なう予定である。目的:本年度は高齢者の脳脊髄液動態障害すなわち正常圧水頭症の髄液短絡術後の高次神経機能や日常生活動作がどの程度改善するかについて検討した。方法:年齢は70-79才(平均74.8才)の男性6例、女性8例、計14例の正常圧水頭症患者を対象とした。その原因疾患は特発性7例、くも膜下出血後4例、外傷後2例、脳腫瘍術後1例であった。大脳高次機能の評価は以下の臨床心理テスト1.長谷川式簡易痴呆スケール、2.ミニメンタルスケール、3.ベントン視覚記銘力テスト、4.WAISによって行われた。

結果:髄液短絡術の手術適応は、以下の通りとした。1.NPHのtriasの2つ以上認める2.CTにて脳室拡大を認める4.ICPモニタリングで異常圧波(B波)の出現頻度が高い(>35%)5.手術・全麻のリスクが高くない髄液短絡手術結果は、著効4例、やや有効4例、不変4例、悪化2例であった。原因別に分析するとくも膜下出血後水頭症は4例中3例は著効、1例が不変・悪化であった。外傷後水頭症は2例中1例はやや有効、他の1例は不変・悪化であった。脳腫瘍術後水頭症の1例はやや有効であった。特発性水頭症は7例中1例は著効、3例はやや有効、残り3例は不変・悪化であった。合併症は、両側慢性硬膜下血腫1例、髄膜炎1例、その他の感染症(肺炎)1例、閉塞性血管障害1例、すなわち計29%に認めた。1993年1月1日から1996年12月31日までに神戸大学脳神経外科において経験した水頭症症例124例について検討した。水頭症症例124例のうち男性は65例(52.4%)、女性は59例(47.6%)であり、診断時の平均年齢は35.5歳であった。そのうち水頭症初発例が76例(61.3%)、シャント機能不全例が53例(42.7%)であった。初回のV-Pシャントを行ったものは45例、シャント再建術を行ったものは49例であった。術前のCTCで水頭症の重症度分類で□a似下の症例でも、あるいはICPモニタリングで%Bwaveが40%以下の症例でも高率で術後症状の改善を認めた。したがってCTCやICPモニタリングでは手術の成否は確実には予測できないと考えられた。術後の高次機能検査では高い改善率が得られ、長谷川式痴呆スケールでは9例(75.0%)で改善を認めた。またベッドサイドでの臨床症状や画像を総合的に判断するとシャントによってほとんどの症例で改善を認めた。水頭症の診断、シャントの手術適応の判断においてはCTCやICPモニタリングなどの検査を行い、ベッドサイドでの注意深い観察をしていくことが重要である。
成体脳に存在する神経幹細胞の分化制御メカニズムと神経新生の生理的意義の解明

Notchシグナルの主要なエフェクター因子であるHesのコンディショナルノックアウトマウスを解析することで、マウス成体脳に存在する神経幹細胞において、Hesの果たす役割を明らかにした。また、Nestin-CreERT2 Tgマウスを用いて、新生ニューロンのGFPやLacZによる標識や、DTA-Aを用いた選択的除去を行なうことで、成体脳での神経新生の生理的意義の一端を解明した。嗅球においては、新生ニューロンは古いニューロンに置き換わる形で組み込まれているのに対して、海馬・歯状回においては古いニューロンは脱落せず、新生ニューロンは顆粒細胞の総数を増加させるように追加される形で組み込まれていることが明らかになった。また、ニューロン新生を阻害したマウスでは、バーンズ迷路を用いた空間学習テストにおいて、空間記憶は正常に形成されるものの、記憶の長期保持能が野生型マウスよりも著しく低かった。また、恐怖条件付けテストでは、状況記憶の低下が観察された。これらの実験結果から、海馬でのニューロン新生は、記憶や学習などの高次脳機能に積極的に関与しているものと考えられる。マウス成体脳に存在する神経幹細胞特異的に、Cre recombinaseの活性を誘導する事が可能なTgマウス(Nestin-CreERT2マウス)を作成した。これにより成体脳神経幹細胞とその娘細胞であるニューロンを、geneticalに非常に効率よく標識する事が可能になった。このマウスを用いた解析から、嗅球の顆粒細胞層のほとんどのニューロンは、成体になってから誕生した新生ニューロンに置き換わっている事、また神経新生が嗅球の神経回路の維持に必須である事を示した。また、海馬・歯状回においては、持続的な神経新生は顆粒細胞の増加に必須である事を示した。また、bHLH型転写抑制因子Hes1のfloxedマウスを作成し、種々の組織でHesのconditional K.O.を行なった。マウス胎仔の終脳内側から発生してくる、カハール・レチウスニューロンと脈絡叢の分化制御にHes1/3/5が重要な役割を果たしている事を示した。
階段コストのシステムにおける情報通信の理論的解析とその実践に関する研究

当該研究の「階段コスト」とは、ネットワークシステムにおいて、転送される情報ファイル(データ)の大きさに応じて、階段状に離散的に増加するコストのことである。転送コストがこのような階段コストであるシステムを考察対象とし、その上で、情報ファイルを、最小の総コストで転送する方法を、理論的に確立して、実際にプログラミングを行って実践するのが当該研究の目的である。ただし、転送方法は、情報の発信局からのダイレクトな場合のみならず、途中の中継局においても、情報を複製できる場合を含め(その際、複製コストも考慮する)総コストが最小となるような方法を取るものとする。本年度の主たる目的は、基礎理論の確立であった。その結果、得られた結果は、次のようである。1.パス構造に限定して、各点の情報ファイルの需要部数を1と限定した場合、総コストが最小となるような転送方法を求める、全解探索的プログラムを開発した。2.1と同様の条件の下、別の高速なアルゴリズムを開発し、プログラムにした。3.2の高速アルゴリズムでの最適性の証明等、背景となる基礎理論を、学会で発表するのと同時に、研究室のホームページでも公開し、理論の普及を行った。一見すれば、パス構造に限定した場合、最小総コストの転送方法の研究がほぼ終了したかのように見える。しかしながら、情報ファイルの需要部数の一般化の問題が残されている。また、パス構造よりも一般的な構造のネットワークを対象として、このような、情報ファイルの転送方法を求める上で、当該研究での考察がどのような活用・拡張できるか、などが興味深い問題である。いずれにせよ、基礎的な課題は、まだまだ残されていて、今後も継続して研究すべき余地があるかと思われる。
胸腺におけるネオ・セルフ生成機構

研究代表者の松本は、免疫学的自己を表出する胸腺髄質上皮細胞(mTEC)に発現する転写調節因子AireがどのようなメカニズムによってT細胞にトレランスを誘導するかを検討した。その結果、Aireは他のmTECに対してtransに作用して、Ly6C/Gの発現誘導に寄与していることが明らかになった。一方、mTECおよび骨髄由来の抗原提示細胞(BM-APC)の両方の抗原提示細胞でAireを付加的に発現させたトランスジェニックマウスでは、逆説的に筋肉特異的な自己免疫病態が見られたが、I型糖尿病の発症に対しては抑制的に作用することが判明した。一方、分担研究者の吉開は胸腺で分化する過程で既にインターロイキン(IL)-17A産生能を有するVγ6+γδT細胞は、様々な細菌感染症や自己免疫病でT細胞レセプター(TCR)依存性に活性化されることから、胸腺内と末梢の炎症の場で発現する「ネオ・セルフ」抗原を認識していると考えている。しかしVγ6を認識する抗体がないためにその詳細は不明な点が多い。今回、Vγ6に対してトレラントになっているVγ4/6ノックアウト(KO)マウスにTCRVγ6の超可変領域(CDR2)のペプチドで免疫することによってVγ6特異的モノクローナル抗体(1C10-1F7 mAb)を樹立した。この抗体はフローサイトメーター、免疫組織染色、in vivoに使用可能であり、Vγ6+γδT細胞は1)胎生期の胸腺で産生され,新生児期にその数がピークとなる。2)胸腺の髄質領域で髄質上皮細胞に接して存在する。3)末梢では子宮頸部粘膜下層、大腸の粘膜固有層、腹腔、肺、皮膚真皮に多く存在する。4)肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)の感染早期の防御に働く。5)imiquimod投与乾癬モデルで、好中球の誘導し、皮膚炎症に誘導を担う。以上の新事実を明らかにした。当初、計画していた遺伝子改変マウスは作出に成功しており、AireがLy6C/Gの発現誘導に寄与していることを明らかにした点については既に論文発表を行っている。一方、Aireの過剰発現に伴うI型糖尿病の発症抑制機構については、現在、論文投稿に向けて最終実験を進めている。また、吉開はこれまで存在しなかったVγ6を認識する抗体の作製に成功しているので、この点についてもより詳細な解析を進めている。このように、おおむね順調に進展していると考えている。Aireの過剰発現によって全く膵臓ラ氏島病変病変を示さないhuAIRE-Tgが得られた。そのメカニズムを解析したところ、このマウスではAg transferにはたらくCD103+ DCが選択的に減少していることが判明した。DCにhuAIREを発現すると、なぜCD103+ DCの減少に至るかのメカニズムの解明が必要であるが、そのための実験系として、骨髄細胞をFlt3ligand、またはGM-CSFで刺激して、大量の骨髄由来のDCを発現する実験系を構築する。また、transに作用して、他のmTECからのLy6C/Gの発現を誘導する作用のメカニズムについては、Ly6C/Gのリガンドを同定する作業が有望ではないかと考えている。他方、innate gd-T細胞はBcl11b非依存的にDN2a期より発生するIFN-g+ gd-T細胞とBcl11b依存的にDN2b期より直接発生するIL-17A+ gd-T細胞、およびDN3期より発生するIFN-g+ gd-T細胞の合計3つのサブセットが存在することを明らかにしている。今後は胸腺細胞の発現するネオ・セルフがinnate T細胞の分化にどのように関与しているかを解析するとともに、末梢組織でinnate T細胞がネオ・セルフを認識して早期の感染防御や自己免疫疾患を引き起こすメカニズムを解析して、innate T細胞の産生と機能に関わるネオ・セルフの性状を明らかにする予定であるが、何よりも重要な点はinnate gd-T細胞の認識抗原を明らかにすることである。この問題は、innate gd-T細胞の発見当初から世界中の研究者が取り組んでいる難題であるが、innate gd-T細胞を活性化するネオ・セルフ抗原の同定には必須の課題であり、研究期間内の解決を目指す。胸腺髄質上皮細胞(mTEC)に発現する転写因子Aireは種々の自己抗原遺伝子の発現を正に制御し、自己寛容の成立機構に重要な役割をはたすと考えられている。しかしながら、mTECにAireを過剰に発現させたトランスジェニックマウス(NOD背景)が多発性筋炎様の自己免疫病態を呈することを見出した。今年度はAireの過剰発現によってどのような遺伝子群の発現変動がみられたかをRNA-seq法を用いて解析した。その結果、Aireによる自己抗原遺伝子の発現誘導には、mTECに対する分化誘導作用が関与していることが示唆された。他方、ナイーブ状態でもあらかじめ記憶細胞の特徴を有し、サイトカイン産生能やキラー活性能を既に獲得したT細胞が生体内に存在する。このようなT細胞を自然免疫T細胞と呼ぶ。我々は自然免疫T細胞の代表であるγδ型T細胞が、胎生早期の胸腺ですでにIFN-γ/IL-17産生能を獲得していること、さらにこのγδ型T細胞はCD44highCD25+CD117+(DN2)ステージから直接分化することを見いだした。

DN2ステージはCD117の発現によってCD117highのDN2aとCD117medのDN2bステージにわけられる。転写因子BcL11bはこのDN2aからDN2bへの胸腺細胞の分化に必須の転写因子である。我々はconditional Bcl11bKOマウス(Bcl11bflox/floxマウスx RAG-1-Creマウス)を用いて、IFN-γ産生γδ型T細胞はDN2a胸腺細胞から、IL-17A産生γδ型T細胞はDN2b胸腺細胞から直接分化できることを明らかにした。さらにIL-17A産生γδ型T細胞は新生児期の胸腺でその産生数が最大となり、末梢では新生児期から幼若期の肺における肺肺炎桿菌感染防御に必須であることを証明した。種々の遺伝子改変マウスを用いた研究は、ほぼ当初の予定通りに進行している。免疫学的自己を表出する胸腺髄質上皮細胞(mTEC)に発現し、自己寛容の成立に必須の役割を担う転写調節因子AireがどのようなメカニズムによってT細胞にトレランスを誘導するかを検討した。その結果、mTECが産生する自己抗原が骨髄由来の抗原提示細胞(BM-APC)に受け渡されるプロセスにAireが重要な役割を担うことが明らかになった。一方、mTECおよびBM-APCの両方の抗原提示細胞でAireを付加的に発現させたトランスジェニックマウスでは、逆説的に筋肉特異的な自己免疫病態が発生した。これらの結果はAireが単にmTECにおける自己抗原の発現レベルを転写レベルで調節しているのみならず、T細胞に対して自己反応性をコントロールするネオ・セルフの生成を制御していることを示している。一方、従来から知られているT細胞とは異なる分化経路をとって胎生早期の胸腺で産生され、早期の感染防御や自己免疫病態に関わるT細胞(innate T細胞)を見出した。胸腺においてCD4-CD8- double-negative(DN)細胞から直接発生するinnate T細胞の分化と活性化にはたらく抗原認識機構を検討した。Zinc finger転写因子B-cell leukemia/lymphoma 11B(Bcl11b)非依存的にDN2a期から分化するinnate gd-T細胞はCD5ーNK1.1+およびGranzyme B+であり、TCR刺激によってIFN-gを産生した。これに対してDN2b期から分化するinnate gd-T細胞はTCR刺激でIL-17Aを産生した。Bcl11b非依存性innategd-T細胞は肝臓などの非リンパ系組織に豊富に存在し、Listeria感染早期の生体防御に働くことがわかった。これは胸腺内での発生と同様、innate gd-T細胞が末梢でもネオ・セルフ共通抗原を認識して活性化することを示唆する。これら2つの研究課題の成果は胸腺におけるT細胞抗原認識機構の解明に寄与する当初、計画していた遺伝子改変マウスも作出出来ており、既に当該研究に関する論文発表も行っている。研究代表者の松本は、免疫学的自己を表出する胸腺髄質上皮細胞(mTEC)に発現する転写調節因子AireがどのようなメカニズムによってT細胞にトレランスを誘導するかを検討した。その結果、Aireは他のmTECに対してtransに作用して、Ly6C/Gの発現誘導に寄与していることが明らかになった。
干渉型過渡反射率測定による固体中の量子コヒーレンス検出

アト秒の時間精度で位相制御した光パルス列を用いて時間差をつけて固体内部に生成する量子状態間の干渉(量子コヒーレンス)を過渡反射率計測により検出する新しい方法(干渉型過渡反射率計測法)を開発した。半導体(GaAs)結晶を用いて電子フォノン結合系における量子コヒーレンス計測を行い、90Kの試料温度において50fs程度のあいだ電子コヒーレンスが保持されていることを明らかにした。電子2準位系と調和振動子ポテンシャルを用いたモデル系を用いて、コヒーレントフォノン生成過程の量子力学的理論を開発した。系の時間発展は時間依存シュレディンガー方程式を2次の摂動論により計算し、密度演算子形式を用いて求めた。量子状態の持つコヒーレンスを活用することが、次世代量子デバイス開発には必要不可欠である。本研究では、アト秒の時間精度で位相制御した光パルス列を用いて時間差をつけて固体内部に生成する量子状態間の干渉を、過渡反射率計測により量子コヒーレンスを計測する新しい方法(干渉型過渡反射率計測法)を開発することを目的としている。この目的の達成のために2015年度は、フェムト秒励起光パルスを評価するための、光学干渉計および周波数分解自己相関測定を、過渡反射率計測と同時に計測できるシステムを構築した。また小型クライオスタットを用いて低温(85Kまで冷却可能)での干渉型過渡反射率計測ができる装置を作成し、半導体GaAs単結晶を試料とした計測を行った。その結果、85Kでは電子・フォノン結合状態の量子コヒーレンスが室温に比べて1.5倍程度長くなることが分かるとともに、量子干渉のパターンが低温と室温では大きく異なることを見出した。理論解析では、二凖位電子状態とフォノンの調和振動子ポテンシャルで構成される電子・フォノン結合系モデルを用いて超短光パルス励起によるコヒーレントなフォノン励起に関する量子力学計算を行った。光パルスエネルギーの共鳴条件では、瞬間的光吸収過程と瞬間的誘導ラマン散乱過程が共存し、それらの寄与はパルス幅に依存することを見出した。瞬間的光吸収過程によるフォノン励起強度は、パルス幅の短い極限で最大であり、パルス幅の増加に伴い減少する。一方、瞬間的誘導ラマン散乱過程では、パルス幅がゼロ近傍ではフォノン励起に寄与しない。フォノン励起強度はパルス幅の増加にともない増加し、フォノン振動周期の半分程度のパルス幅のときに最大となり、そのあと減少していくことを見出した。この結果は高く評価されPhysical Review B誌(92 (2015144304)に掲載された。本研究の目的に沿ってフェムト秒パルス列を300アト秒の精度で制御し、光パルス列の干渉と物質内部に記憶される量子状態の干渉を同時に計測できる、干渉型過渡反射率計測装置を立ち上げた。この装置と、準備研究用の小型クライオスタットを用いて、室温および低温(85K)においてGaAs単結晶内部における電子・フォノン結合量子系における量子コヒーレンス時間計測することに成功した。その結果、低温での量子干渉の振る舞いが室温のものと大きくことなっていることを初めて見いだした。また、さらなる低温での過渡反射率計測を可能とするために、現有の冷却器型のクライオスタットを低振動化するとともに試料移動機構の改造を行った。当初計画では、クライオスタットの4軸位置調整を行う予定であったが、反射率測定を行うと振動が大きいことが判明したため、低振動化に変更して対応した。実験研究に加えて、フェムト秒光パルス照射による電子・フォノン結合系におけるフォノンのコヒーレント励起に関する量子力学計算を行った。この結果は、コヒーレントフォノン生成メカニズムの系統的な理論解析として高く評価されPhysical Review B誌(92 (2015144304)に掲載された。このような成果達成状況から区分(1)を選択した。本研究では、アト秒の時間精度で相対位相制御した光パルス列を用いて時間差をつけて固体内部に生成する量子状態間の干渉を過渡反射率計測により調べることで、量子コヒーレンスを計測する新しい方法(干渉型過渡反射率計測法)を開発することを目的としている。平成28年度は、振動を抑制するように改造した冷凍機クライオスタットを導入することで、室温から10 Kまでの試料温度においてポンプ・プローブ型過渡反射光強度測定ができる装置を開発した。これを用いて半導体GaAsのコヒーレントフォノン(LO)とフォノンプラズモン結合振動(LOPC)の振動数と位相緩和時間の温度依存性を測定し、低温になるに従ってLOが高振動数側にシフトし、寿命が延びる結果を得た。またLOとLOPCの比率も温度依存した。相対位相ロックしたパルス対を用いて90 Kの温度(温度安定度1 K以内)でGaAsの干渉型過渡反射率計測法を行い、電子・フォノン結合系での量子コヒーレンスを計測した。

LOフォノン強度にのった電子コヒーレンスは50 fs付近で消失したあと復活し、光の干渉が無くなった120 fs程度までGaAsに保持されることを見いだした。理論研究では、電子2バンドと変位した調和振動子で構成されるモデルを用いて、超短パルス光励起による電子・フォノン結合量子状態の時間発展を計算した。動的ヤーンテラー相互作用を考慮することによって、非対称モードの光学フォノンも取り扱えるようになった。この成果はPhys. Rev. B誌(95 (2017) 104302)に掲載された。このモデルを、パルス対励起によるコヒーレント制御計算に拡張し、実験結果の基本的振る舞いを再現できるようになった。本研究では、アト秒の時間精度で位相制御した光パルス列を用いて時間差をつけて固体内部に生成する量子状態間の干渉を過渡反射率計測により調べることで、量子コヒーレンスを計測する新しい方法(干渉型過渡反射率計測法)を開発することを目的としている。本研究の目的に沿って300アト秒の精度で制御したフェムト秒パルス列を発生し、光パルス列の光学干渉と物質中に光励起された量子状態の干渉を同時に計測できる、干渉型過渡反射率計測装置を作成した。この装置により、物質中に励起されたフォノン状態に電子コヒーレンスを焼き付けることで、電子コヒーレンスとフォノンコヒーレンスを同時に計測することが可能になった。冷凍機クライオスタットを低振動型に改良することで、10 Kまでの低温で過渡反射率計測ができるようになった。半導体GaAs単結晶を試料として、干渉型過渡反射率計測法を用いた計測を試料温度室温と90 Kで行い、室温に比べて90 Kで電子コヒーレンスとフォノンコヒーレンスが長く保たれることを実測した。とくに90Kでは、LOフォノン強度にのった電子コヒーレンスは50 fs付近で消失したあと復活し、光の干渉が無くなった120 fs程度まで固体中に保持されるという、当初予期していなかった新しい現象を発見した。この成果はPhys. Rev. B誌に2報(95, 10430 (2017)と92, 144304 (2015))掲載された。このような成果達成状況から区分(1)を選択した。近赤外光パルス(中心波長800nm、パルス半値全幅40fs)を、独自に開発したマイケルソン型干渉計によりアト秒制度で位相ロックしたフェムト秒パルス列を作成した。その遅延時間を相対位相関係まで含めて光学干渉およびフリンジ分解自己相関計測により確定した。このアト秒精度の位相ロックパルス列を用いて、量子コヒーレンスを計測するためのポンプ・プローブ過渡反射率計測測定システムを開発した。GaAsに対して干渉型過渡反射率計測実験を行い、電子・フォノン結合量子系における量子コヒーレンスの計測を行った。使用した光パルスのエネルギーは1.55eVであり、GaAsのバンドギャップよりも大きくため電子状態間の遷移が可能であり、電子フォノン結合量子系の励起ができる。
日本住血吸虫宿主RNA取り込み関連遺伝子に関する研究

住血吸虫はC. elegansと同様にlong-dsRNAのsoaking法によるRNAiが誘導できる。これまでの実験で住血吸虫は外界からdsRNAや、宿主のRNAを取込んでいることがわかってきた。このRNA取込みの意義を確認するために、RNAi関連遺伝子の一つであるsid-1遺伝子についての解析を行った。sid-1遺伝子は宿主に侵入してすぐの幼虫期で発現が上昇し、dsRNA刺激で発現が調節された。しかし、sid-1遺伝子ノックダウンにおいて、RNAi、dsRNA取込みや、寄生適応には影響を与えず、住血吸虫には独自のRNAi機構が備わっていると推測された。ヒトを含めた哺乳類の血管内に寄生する日本住血吸虫は、その寄生過程で多くの宿主由来の分子を取込んでいると考えられている。特に、住血吸虫は近年様々な分野で使用されているRNA干渉を容易に、かつ強力に引き起こすことができる。実際には、溶液中に標的となる遺伝子のdsRNAを添加するだけで誘導が可能である。このことから、住血吸虫は容易に宿主由来のRNA成分を取込めると考えられ、実際に標識した宿主RNAを取込むことも確認された。今回、この宿主RNA取込みのメカニズムとその意義を確認するために、その担当分子の同定を試みた。線虫類であるC.elegansのdsRNAのトランスポーターであるSID-1は外環境からのRNAの取込みと、その後に引き起こされるRNA干渉に関わっている。そこで本年度の研究内容としては、このSID-1の日本住血吸虫のホモログを同定し、解析を行った。日本住血吸虫のsid-1遺伝子のホモログを同定したが結果、sid-1遺伝子は一種類ではなく、様々なmRNAヴァリアントが存在していることがわかった。しかし、ゲノム中にこの遺伝子は1コピーであり、最も多く発現しているものは3`側の580bpの領域がプロセッシングを受けて存在していることがわかった(SID-aヴァリアント)。住血吸虫の発育段階ごとでのsid-1遺伝子の発現を調べたところ、全てのステージでのSID-aの発現が見られたが、他のmRNAヴァリアントの発現は発育段階ごとに異なっていた。このsid-1遺伝子を標的にしたsiRNAによるRNA干渉を行った結果、全体のsid-1遺伝子やSID-aヴァリアントの有意な発現抑制が確認された。しかし、この遺伝子の抑制は住血吸虫の持つRNA干渉の機能を阻害することはできなかった。このことから、日本住血吸虫のSID-1はRNA干渉に機能しないと考えられた。昨年度までに、C.elegansでRNAiやdsRNAの取込みに関わる遺伝子であるsid-1遺伝子の住血吸虫ホモログの解析を行った。しかし、この遺伝子をノックダウンした住血吸虫では、直接、RNAiの機能を阻害することができなかった。今年度は、その他のRNAi関連遺伝子を主に標的として実験を行った。特にdsRNAの切断に関与するRNAseIIIファミリーに属する遺伝子群として、Dicer、Argonaut、Droshaと、機能未知のRNAseIIIのそれぞれをノックダウンしたが、すべてにおいて、soaking法によるRNAiを阻害することができなかった。このことから、住血吸虫のRNAiにおいて、他の生物とは異なるdsRNAの取込み、及びRNAiのプロセスが行われていると考えられた。一方で、sid-1遺伝子のmRNAの発現を発育段階ごとに調べてみると、ヒトに感染直後の幼虫であるシストソミュラでの発現量が最も強くなっており、また、長鎖のdsRNAでシストソミュラを処理すると、sid-1の発現量が一過性に減少することが確認された。このことから、やはりsid-1はdsRNAに応答する分子であり、住血吸虫が宿主に感染してすぐに利用するRNAセンサーとなると推測された。他の報告により、sid-1の中に含まれている共通モチーフから、この分子が推定のセラミダーゼ活性を有することが示唆された。そこで、住血吸虫のタンパク質中のセラミダーゼ活性を測定した。その結果、成虫とシストソミュラの両方でセラミダーゼ活性が確認された。データベース上では日本住血吸虫のセラミダーゼは1つしか見つからず、その発現は成虫期に高いと報告されている。このことからも、宿主侵入時でのセラミダーゼの機能にsid-1が関与しているのではと推測された。今後、sid-1ノックダウンとセラミダーゼ活性への影響について実験を行う予定である。
遺伝子多型解析によるステロイド性大腿骨頭壊死症の予防法の開発

ステロイド性大腿骨頭壊死症発生に関与する遺伝子的多型性を解析するために、マイクロアレイを用いて一次スクリーニングを行って候補遺伝子を絞り込み、候補遺伝子の塩基配列を解析して大腿骨頭壊死症発生に関連する遺伝子を発見することを目的とした。絞り込んだ候補遺伝子からSNP解析を行った。ステロイド性大腿骨頭壊死症と関連するSNPsを同定し、関連性の調査を試みたが、新規のSNPsを同定するには至らなかった。特発性大腿骨頭壊死症(idiopathic osteonecrosis of the femoral head, ION)は大腿骨頭が阻血性壊死に陥り、股関節機能が失われて患者のQOLが障害される難治性疾患である。ステロイド性が過半数を占め、膠原病、喘息、腎炎あるいは臓器移植に対するステロイド投与後に生じることが多く、医原性の側面があるため、病態の解明および実際的な予防法の開発が必要である。われわれはすでに遺伝子多型がION発生リスクに関与していることを明らかにしている。今後さらに、ION発生に関与する遺伝子的多型性を解析するために、まずマイクロアレイを用いて一次スクリーニングを行って候補遺伝子を絞り込む。さらに候補遺伝子の塩基配列を解析してION発生と関連する遺伝子を発見することを目的とする。本研究は現在までに積み重ねられた研究データおよび豊富なDNAサンプルを基盤に、日本人を対象としてステロイド性ION発生と、脂質代謝、凝固線溶系関連遺伝子などの疾患関連遺伝子群や、その産物であるタンパク質の解析からハイリスク患者をスクリーニングし、個人レベルでのステロイド投与法(tailor-made medicine)の開発を確立しようとする試みである。新たな関連遺伝子とION発生リスクとの関連が発見されれば、予防のみならず病態解析にも寄与するものと想定される。昨年までの研究で、われわれの施設で腎移植を施行された患者でステロイド投与直後から単純X線像とMRIで定期的にIONスクリーニングを施行している症例のうち経過観察が2年以上である患者を対象として採取した末梢血をもとに得られたゲノムDNAサンプルを採取した。特発性大腿骨頭壊死症(idiopathic osteonecrosis of the femoral head:ION)は阻血性壊死によって大腿骨頭が圧潰し、股関節機能が失われる難治性疾患である。ステロイド性が過半数を占め、医原性の側面も持つため予防法の確立が必要である。ステロイド性IONの発生には疾患関連遺伝子などの多型が関与しているとされている。われわれはすでに一部の遺伝子多型がION発生リスクに密接に関与していることを明らかにしている。新たな疾患関連遺伝子とION発生リスクとの関与が発見されれば、予防のみならず病態解析にも寄与するものと想定される。昨年度までの研究で、われわれの施設で腎移植を施行された患者で、ステロイド投与直後から単純X線像とMRIで、定期的にIONスクリーニングを施行している症例のうち経過観察が2年以上である患者を対象とした。そのうち、採取した末梢血をもとに得られたゲノムDNAサンプルを採取した。われわれは遺伝子多型がION発生リスクに関与していることを明らかにしている。今後さらに、ION発生に関与する遺伝子的多型性を解析するために、まずマイクロアレイを用いて一次スクリーニングを行って候補遺伝子を絞り込むみ、さらに候補遺伝子の塩基配列を解析してION発生と関連する遺伝子を発見することを目的とした。当施設で腎移植を施行された患者を対象に施行されているIONスクリーニングをもとに、すでに収集したDNAサンプルおよび新規ION発生患者のDNAサンプルを用いて一次スクリーニングを行い、ION発生群と非発生群での遺伝子発現を解析し、候補遺伝子の絞り込みを行った。その後、シークエンサーを用いて直接塩基配列決定法から、多型部位の配列確認を行った。リアルタイムPCRを用いてsingle nucleotide polymorphism;SNP解析を行い、また、制限酵素認識配列がある部位については、PCR-restriction fragment length polymorphism;PCR-RFLPを施行した。多変量解析を用いてステロイド性IONと関連するSNPsを同定し、IONとの関連性の調査を試みたが、新規のSNPsを同定するには至らなかった。

臨床研究においては、性別、年齢、ステロイド投与量、使用した免疫抑制剤などの臨床情報に基づいたION発生に関与する因子を調査し、日本股関節学会で発表した。医歯薬学対象は京都府立医科大学で腎移植を施行され、ステロイド投与直後から単純X線像とMRIで定期的にIONスクリーニングを施行している症例のうち経過観察期間が2年以上である患者としている。方法は、IONスクリーニングを継続し、インフォームドコンセントが得られた患者から末梢血10mlを採取しゲノムを抽出した。すでに収集したDNAサンプルおよび新規ION発生患者のDNAサンプルを用いて、1次スクリーニングとしてマイクロアレイを行いION発生群と非発生群での遺伝子発現を解析し、疾患発生に関与すると思われる候補遺伝子の絞り込みを行った。候補遺伝子の絞り込みを行った後、シークエンサーを用いた直接塩基配列決定法から、多型部位の配列確認を行った。われわれのグループが所有しているリアルタイムPCRを用いて、効single nucleotide polymorphism;SNP解析を行った。また、制限酵素認識配列がある部位については、PCR-restriction fragment length polymorphism;PCR-RFLPを施行した。性別、年齢、原疾患、ステロイド投与量など臨床情報に基づいた多変量解析を用いて、ステロイド性IONと関連するSNPsを同定し、IONとの関連性を調査した。平成25年度はインフォームドコンセントで同意を得られた患者数に限りがあり、サンプル収集にやや難渋している。対象は京都府立医科大学で腎移植を施行された患者で、ステロイド投与直後から単純X線像とMRIで定期的にIONスクリーニングを施行している症例のうち経過観察が2年以上である600例とした。方法は、すでに収集したDNAサンプルおよび新規ION発生患者のDNAサンプルを用いてIONスクリーニングを継続し、インフォームドコンセントを得た患者から末梢血10mlを採取しゲノムDNAを抽出した。1次スクリーニングとしてマイクロアレイを行いION発生群と非発生群での遺伝子発現を解析し、疾患発生に関与すると思われる候補遺伝子の絞り込みを行った。候補遺伝子の絞り込みを行った後、シークエンサーを用いた直接塩基配列決定法から多型部位の配列確認を行った。われわれのグループが所有しているリアルタイムPCRを用いて、効率よく大量のsingle nucleotide polymorphism;SNP解析を行った。制限酵素認識配列がある部位については、PCR-restriction fragment lengthpolymorphism;PCR-RFLPを施行した。
メラノサイトの分化過程でのc-Kitの発現(SCF、細胞外基質の役割について)

色素異常を示す突然変異マウスの解析によりc-KIT/stem cell factor(以下SCFと略す)情報伝達系がメラノサイトの発生に重要な役割をはたす事が明かとなったが、メラノサイトの分化・増殖に与える影響は不明の点が多い。メラノサイトの分化におけるSCFの役割をしらべるため、妊娠9.5日C57BL/6胎仔マウス由来の神経冠培養系を用い、メラノサイトの前駆細胞であるc-KIT陽性細胞の出現に可溶性SCFが与える影響を検討した。SCF無添加ではc-KIT陽性細胞は殆ど認められれなかったが、SCF添加によりc-KIT陽性細胞が培養3日に出現、次第に増数し9日にはプラトーに達した。c-KIT陽性細胞は培養5日以降にSCFを添加した場合には全く認められず、SCFは培養5日未満におけるc-KIT陽性細胞の生存に必須である事が明らかとなった。次にメラノサイトの分化の指標として、チロジナーゼ、チロジナーゼ関連蛋白1(TRP1)、チロジナーゼ関連蛋白2(TRP2)陽性細胞の出現にSCFが与える影響を検討した。SCF無添加では陽性細胞は出現しなかったが、SCF添加培養ではTRP2は培養4日から、TRP1は培養5日から、チロジナーゼは培養9日から認められ、SCFは神経冠細胞をこれらの酵素群を保有する段階まで分化させるのに必要である事が判明した。さらに分化の最終段階にSCFが影響を与えるか否かを検討するために、経時的にDOPA陽性メラノサイト数を計数した。SCFを単独添加培養するとDOPA陽性細胞は僅かながら出現したが、培養9日以降は増加せず、メラニン顆粒を有する成熟メラノサイトへの分化は認められなかった。これに対してSCFとコレラトキシンを併用添加すると、DOPA陽性細胞数は培養9日以降に著しく増加し、成熟メラノサイトが多数出現し、SCFとコレラトキシンの相乗効果を認めた。マウス神経管培養系を用いて、メラノサイトの分化におけるSCFの役割を検討した。1 SCFとコレラトキシン(以下CT)併用添加群、SCF単独添加群、CT単独添加群、無添加群に分けてマウス神経管を培養し、抗c-Kit抗体にて免疫染色した。その結果、3日目では無添加群、CT単独添加群は共に若干のc-Kit陽性細胞が認められたが、6日目以降c-Kit陽性細胞が殆ど認められなかった。何らかの原因でc-Kit陽性細胞が死滅したと考えられる。これに対してSCF単独添加群およびSCFとCT併用添加群では日を増すごとに、c-Kit陽性細胞数は増加した。以上の結果から、SCFはc-Kit陽性細胞の生存の維持あるいは増加に関与していることが明らかとなった。2 c-Kit陽性細胞の出現に効果的なSCFの作用時期を検討するため、SCFの添加日をずらしてマウス神経管を培養し、c-Kit染色を行った。その結果5日目以降では、SCFを添加してもc-Kit陽性細胞は認められなかった。メラノサイトの前駆細胞はc-Kit陽性細胞となり培養0日から5日目未満に神経管から次々に出ていくが、SCFが存在しない場合死滅(アポトーシス?)してしまうため、培養5日目を過ぎてからSCFを加えてももはやc-Kit陽性細胞が存在しないので、SCFは役に立たないと考えられる。つまりメラノサイトの前駆細胞の生存(および増殖?)にSCFが関与することが判った。

3免疫染色により、SCF単独添加培養した神経冠細胞中にTRP1、TRP2、チロジナーゼ陽性細胞が認められた。無添加では陽性細胞は無かったので、SCFはメラノサイトの前駆細胞の生存の維持だけでなく、メラニン産生に関与する酵素を保有するまで分化を進行させることが示唆された。マウス神経冠培養系を用いた6年度の研究によりstem cell factor(以下SCF)がメラノサイトの発生においてc-KIT陽性メラノサイト前駆細胞の生存の維持と、ある段階迄の分化に関与する事がわかった。7年度はSCFを添加培養したマウス神経冠細胞におけるチロジナーゼ(メラニン生成の鍵酵素)、チロジナーゼ関連蛋白TRP1、およびTRP2の発現時期を検索する事によりメラノサイトへの分化のどの段階にSCFが関与するかを明らかにする事を目的とした。方法)SCF添加あるいは無添加でマウス神経冠細胞を培養し、培養3、4、5、6、9日に抗チロジナーゼ抗体、抗TRP1抗体、抗TRP2抗体にて酵素抗体法により染色し、陽性細胞を計数した。結果)SCF無添加では全て陽性細胞の出現は認められなかったが、SCFを添加培養すると、c-KIT陽性細胞は6年度の結果から培養3日にはすでに認められ、培養9日をプラトーとする増加を示した。今回の結果ではTRP2陽性細胞は培養4日より出現以後増加し培養9日にはc-KIT陽性細胞より増加した。TRP1陽性細胞は培養5日から出現し、c-KIT陽性細胞と同様の増加傾向を示した。チロジナーゼ陽性細胞は培養9日に出現したが以後増加傾向は認められなかった。考察)マウス神経冠細胞をSCF添加培養すると、c-KIT、TRP2、TRP1、チロジナーゼ陽性細胞の順に出現したが、これはin vivoでのメラノサイトの発生過程を反映していると考えられる。また、SCFはc-KITの発現を増強しTRP2、TRP1の発現を誘導するが安定したチロジナーゼの発現には機能しないと思われる。
ポジトロンイメージング技術の光合成機能測定・分子イメージングへの応用

植物の光合成機能の環境応答を生体組織・器官レベルで理解することが重要であると考え、生体内のマクロな栄養動態を可視化する研究を展開してきた。所属研究グループ(ポジトロンイメージング動態解析研究グループ)では植物中の炭素動態の可視化にこれまでに成功しており、可視化された画像データをもとにした光合成および光合成産物の輸送・分配の定量的な解析が急務であった。本研究では葉における炭素動態を画像解析することで、光合成における「二酸化炭素固定」および「光合成産物送り出し」の定量を試み、さらに解析領域の限定しないPixel-bv-Pixel画像解析法により、植物葉の光合成能を示す機能画像を構築することを目的とした。これにより、測定環境下における植物葉の"機能の可視化"が可能となり、定量的な機能画像は植物分子イメージング研究を実現するものである。実験は原子力機構高崎量子応用研究所のPositron Emitting Tracer Imaing System (PETIS)を用いて植物体内の11Cの動態を撮像し、新たに構築した光合成コンパートメントモデルを用いて解析を行った。供試植物葉に11CO_2を供給して光合成プロセスを撮像して実データを取得し、既存の装置を用いた計測結果や解析誤差などにより、生理モデルの正当性を評価した。また、同一個体で光条件や温度といった環境条件を変化させて実験を行い、光・温度環境に対する光合成機能の応答を本手法により解析した。その結果、葉における「二酸化炭素固定」および「光合成産物送り出し」の機能分布の環境応答様式が明らかになった。植物の光合成機能の環境応答を生体組蘇・器官レベルで理解することが重要であると考えた。これまでにポジトロンイメージング動態解析研究グループでは植物中の炭素動態の可視化に成功しており、光合成産物の輸送・分配の解析が可能であった。本研究ではさらに輸送源である葉に注目し、葉における炭素動態を解析することで光合成における主要プロセスである「二酸化炭素固定」および「光合成産物送り出し」の定量を試みた。さらに葉上の限定領域の動態解析により、植物葉の局所レベルの生理機能を示す機能画像、即ち植物機能イメージングを実現を目的とした解析法の整備を行った。これにより、測定環境下における葉の"機能の可視化"が可能とする。実験はPositron Emitting Tracer Imaging System(PETIS)を用いて植物体内の^<11>Cの動態を撮像し、構築した生理モデルを用いて解析を行った。供試植物葉に^<11>CO_2を供給して光合成プロセスを撮像、データの動態解析には2-コンパートメントモデルを適用した。同一個体で光条件を変化させ、光環境に対する光合成機能の応答を解析した。PETISにより二酸化炭素が葉に固定され光合成産物であるショ糖が葉から送り出される動画像が得られた。PETISによって得られた^<11>C積算画像上の関心領域を設置し、動画像に投射して発生させた関心領域内の^<11>C濃度経時変化(TAC)が得られる。解析の結果、測定データと線で示したモデルが推定するTACとに非常に良い一致が見られ、本測定におけるモデルの妥当性が示された。モデル解析の結果、「二酸化炭素固定速度」が光環境に正の相関を持ち、「光合成産物の送り出し」は光環境からの影響が少ないことが示唆された。二酸化炭素固定速度からは葉内組織の二酸化炭素拡散抵抗、光合成産物の送り出し率からは葉のソースとしての生理機能などの定量的な議論が今後期待できる。