hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単コロニーからのDNA塩基配列決定法を用いた海氷藻類群集の低温耐性酵素の解析

生物活動に不可欠な酵素などの反応は液体状態の水を必要とする.このため,生物が「生きて活動する」温度範囲は0100°Cを大きく外れることない.塩分を含み0°C以下でも液体で存在する海水中では,0°C以下でも微細藻類が増殖する.調査を行なったサロマ湖でも,結氷した氷中に残された僅かな海水中で海氷藻類群集(IceAlgae)が活発に増殖し,海氷が黄色に着色することを確認した.これら微細藻類が増殖には,低温での光合成の維持が不可欠である.本研究では光合成の鍵酵素の一つRuBisCOに着目し,IceAlgaeと常温棲の近縁微細藻類のRuBisCOを比較することで,RuBisCOの低温での活性維持機構を検討した.培養を行なうことなくIceAlgaeコロニーから直接塩基配列を決定することで,これまで難しかったRuBisCOの塩基配列と一次構造を決定した.小サブユニットにはIceAlgae酵素に特徴的な共通の配列は認められなかったが,小サブユニットに特徴的なアミノ酸残基が存在することを明らかにし,これが16と17番のα-ヘリックスを接続するループにあたることを示した.低温での酵素の柔軟性に強く影響するわずかな変異が酵素の低温での活性の維持にきわめて重要である可能性を示唆した生物活動に不可欠な酵素などの反応は液体状態の水を必要とする.このため,生物が「生きて活動する」温度範囲は0100°Cを大きく外れることない.塩分を含み0°C以下でも液体で存在する海水中では,0°C以下でも微細藻類が増殖する.調査を行なったサロマ湖でも,結氷した氷中に残された僅かな海水中で海氷藻類群集(IceAlgae)が活発に増殖し,海氷が黄色に着色することを確認した.これら微細藻類が増殖には,低温での光合成の維持が不可欠である.本研究では光合成の鍵酵素の一つRuBisCOに着目し,IceAlgaeと常温棲の近縁微細藻類のRuBisCOを比較することで,RuBisCOの低温での活性維持機構を検討した.培養を行なうことなくIceAlgaeコロニーから直接塩基配列を決定することで,これまで難しかったRuBisCOの塩基配列と一次構造を決定した.小サブユニットにはIceAlgae酵素に特徴的な共通の配列は認められなかったが,小サブユニットに特徴的なアミノ酸残基が存在することを明らかにし,これが16と17番のα-ヘリックスを接続するループにあたることを示した.低温での酵素の柔軟性に強く影響するわずかな変異が酵素の低温での活性の維持にきわめて重要である可能性を示唆した生物が「生きて活動する」温度範囲は,0100°Cを大きく外れない.生物活動に不可欠な酵素などの反応が,液体状態の水を必要とするためである.塩分を含む海水は0°C以下でも,液体で存在する.この低温環境には微細藻類から成る海氷藻類群集(IceAlgae)が増殖する.本申請で調査地としたサロマ湖では13月に結氷し,氷中でIceAlgaeが増殖する.このような厳しい低温で光合成速度が維持されるためには、鍵酵素の一つリブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ(RuBisCO)が低温へ対応していなければならない.IceAlgaeに含まれる様々な種類の藻類が全て海氷中で増殖していることを考えると,全ての種類のRuBisCOが低温耐性であり,種に依らない共通の低温耐性機構が存在すると考えられる.様々な種で低温耐性RuBisCOの一次構造を決定し比較できれば,共通の構造を発見しRuBisCOの低温耐性との関係を解析できる.RuBisCOの一次構造をコードするDNA塩基配列(rbcLとrbcS)を決定するためには,一個体から培養し,遺伝的に均一な細胞を増やしてDNAを調製しなければならない.しかし,安定した低温に生活するIceAlgaeの培養は難しく,必要な量の試料を調製できるのは一部の種に限られていた.申請者は,マイクロマニュピレーションと高効率のDNA抽出法,ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を組み合わせて,数細胞からなる微細藻類の各個体からゲノムの特定領域のDNA塩基配列を決定することに成功している.本研究ではこの方法をIceAlgaeに適用し,培養することなく,直接,低温耐性RuBisCOの一次構造を決定することを試みた.本年度は2006年2月下旬から3月上旬に結氷したサロマ湖において、海氷中より微細藻類群集を採集し、各個体からのDNAの抽出を行った。現在解析中である。また、より詳細な解析を行うために優占種数種の単離も行った。生物が「生きて活動する」温度範囲は,0100°Cを大きく外れない.生物活動に不可欠な酵素などの反応が,液体状態の水を必要とするためである.塩分を含む海水は0°C以下でも液体で存在する.この低温環境には微細藻類から成る海氷藻類群集(IceAlgae)が増殖する.本申請で調査地としたサロマ湖では13月に結氷し,氷中でIceAlgaeが増殖する.このような厳しい低温で光合成速度が維持されるためには,鍵酵素の一つリブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ(RuBisCO)が低温へ対応していなければならない.

申請者は,マイクロマニュピレーションと高効率のDNA抽出法とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を組み合わせて,数細胞からなる微細藻類から低温耐性RuBisCOのDNA塩基配列(rbcS/rbcL)を解析し,一次構造を決定した.海氷藻類18種類の塩基配列を比較した結果,低温耐性生RuBisCOに共通した一次構造は認められず,複数のアミノ酸変異による高次構造の変化が低温耐性に必要である可能性が示唆された.また,培養実験の結果から海氷藻類が過冷却状態の-5°Cの海水中でも増殖を維持することを明らかにしており,低温耐性RuBisCOがこの温度でも働くことを示した.2007年2月下旬から3月上旬に結氷したサロマ湖において,海氷中より微細藻類群集を採集し,各個体からのDNAの抽出を行った.この試料を用いて塩基配列情報を更に集積する予定である.近年の暖冬傾向により,サロマ湖海氷の状況も変化している.本研究で得られた結果は、温暖化による海洋環境の変化が,冬季海洋の一次生産に与える影響についても様々な示唆を与えるものとなった.生物活動に不可欠な酵素などの反応が,液体状態の水を必要とするため,生物が「生きて活動する」温度範囲は0100°Cを大きく外れることない.塩分を含む海水は0°C以下でも液体で存在するため,この温度でも微細藻類が増殖することが知られている.本申請で調査地としたサロマ湖でも,結氷した氷中に残された僅かな海水中で海氷藻類群集(IceAlgae)が活発に増殖し,海氷が黄色に着色することを確認した.これら微細藻類が増殖するためには,それを支える光合成が維持されていなければならない.本研究では光合成の鍵酵素の一つRuBisCOに着目し,IceAlgae酵素と常温棲微細藻類酵素を比較することで,IceAlgae酵素の特徴を明らかにした,困難な単離培養を行なうことなくIceAlgaeコロニーから直接塩基配列を決定することで,7種のrbcSと9種のrbcLを決定した.rbcSにはIceAlgae酵素に特徴的な共通の配列は認められなかったが,rbcLに特徴的なアミノ酸残基(438Aと443N)が存在することを明らかにした.酵素の立体構造をシミュレーションで,16と17番のα・ヘリックスを接続するループにあたるこれらのアミノ酸の変化が,低温での酵素の柔軟性に強く影響する可能性を示唆した
歯髄炎の病態形成におけるAlarminレセプターの機能解析

Alarminは細胞が壊死すると分泌される内因性の免疫賦活化物質であり,敗血症において症状の重篤化を生じさせる重要な因子であり,歯髄炎においても急速な歯髄壊死に重要な役割を担っているものと考えられる。そこで本研究ではalarminとそのレセプターに焦点を当て,歯髄炎におけるalarminの役割と機能について解析し,歯髄炎治療の可能性を検討した。その結果、ラット象牙芽細胞にはalarminレセプターであるMINCLEが発現し、その発現は細菌関連因子刺激により自然免疫を介して増加すること、さらにMINCLEリガンドであるTDMがKN-3のCCL4産生を増強することを明らかにした。【抜去歯資料の採取並びに歯髄細胞の培養】う蝕に罹患せず,健全な歯髄を有する抜去智歯を無菌的に切断し歯髄を摘出,細切しout grows法にて培養を行い,ヒト培養歯髄細胞を得,510代継代し実験に供した。また,5代以下の継代数の細胞を多数保存し,今後の研究に使用する予定としている。【ヒト培養歯髄細胞,ラット象牙芽細胞様細胞,樹状細胞様細胞のalarmin発現解析】上述した培養ヒト歯髄細胞は各種alarminを産生することがPT-PCR法、ELISA法の結果から明らかとなった。ラット象牙芽細胞、樹状細胞については現在調査中である。【歯髄構成細胞におけるalarminセレプターの発現ならびに機能解析】〈KN-3細胞におけるalarminレセプターの発現ならびに機能解析〉昨年度までに、ラット歯髄象牙芽細胞であるKN-3細胞において細菌関連因子(Pathogen-Associated Molecular Patterns; PAMPs)の一種であり、NOD1によって認識されるiE-DAP刺激にてalarminレセプターであるMINCLEのmRNA発現が増強することを明らかにした。一方、NOD2リガンドであるMDPや、TLR2リガンドであるPam3CSK4、TLR4リガンドであるLPSでKN3細胞を刺激したところ、MINCLEのmRNAレベルに変化は認めなかった。さらに、KN-3細胞でのMINCLEの機能を確認するため、KN-3細胞をMINCLEの特異的リガンドであるTrehalose-6,6-dibehenate (TDB)にて刺激を行い、total RNAを回収しmRNAを精製後、PCR arrayを行ったところ、CCL4 mRNAの発現増強が認められた。そこで、iE-DAP刺激にて発現が増強されたMINCLE蛋白の機能を確認するため、KN-3細胞をiE-DAPにて24時間刺激した後、PBSにて洗浄し、ついでTDBにて刺激を行い、total RNAを回収した。回収したtotal RNAを精製後real-time PCRを行ったところ、iE-DAPにて前処理を行った群において、CCL4 mRNAの増強が有意に認められた。現在、iE-DAP刺激によりKN-3細胞が産生するCCL4の定量を試みており、今後、歯髄炎の進行にalarminレセプターであるMINCLEがどのように関与するのか研究を進める予定である。歯科保存学当初の予定通り、ヒト培養歯髄細胞の初代培養を行い、実験に供することができた。また、歯髄構成細胞である、ラット象牙芽細胞株の培養も行っており、今後の研究に使用する予定である。これらの細胞を用いた解析の結果、alarminの産生ならびにalarminレセプターの発現を確認した。現在、alarminレセプターであるMINCLEに着目し解析を行っており、研究はおおむね順調に進展している。平成25年度の研究計画についてはおおむね順調に推移しており、今後これらの解析を更に進める予定である。今年度は当初の予定通り、臨床歯髄サンプルにおけるalarmin発現の解析を行うとともに、平成25年度の研究成果より、歯髄炎発症のキーファクターである可能性が示唆されるMINCLEに着目し、その発現と機能についても、臨床歯髄サンプルを用い解析する。さらに、MINCLEを阻害することで歯髄炎を抑制できるかについても検討する。なお、購入機器の変更のため、蛍光色素を用いた解析に代わり、従来の壊死細胞判定法を用いる。研究はおおむね順調に進展しているが、次年度使用額が生じている。これは、当初予定していた、イメージベースサイトメーターに変わり、バイオクリーンベンチの購入が必須になり、購入金額に差額が生じたものである。備品の購入計画に変更が生じたため、当初予定していた蛍光色素を用いた検出システムに変え、DNA断片の検出のためにTUNEL染色を行う予定としており、これら試薬の購入に次年度使用額を使用する予定である。
漢魏六朝文学における「異景」描写の展開――辞賦から志怪書へ――

崑崙山や蒼梧山など中国の周縁の聖山とされる山の描写は、先秦から漢初の詩歌や史書・諸子では、その名を挙げるだけで、その情景の描写はほとんどない。これに対して『山海経のような巫祝の知識がもとになっている文献では、崑崙そのものの情景を装飾豊かな美文で描く。漢代の辞賦作品では崑崙は単に天子の支配の及ぶ最遠の地を示すアイテムと化すが、『海内十洲記』など道教系の文献や、その流れをくむ志怪小説では、依然として崑崙の詳細な風景描写が行われた。以上から、「異景」の描写に熱心だったのは巫術や道教などの宗教知識を伝える文献のみで、正統的な詩賦ではその情景描写に冷淡であったことが明らかになった。本年度はこれまでの『楚辞』『山海経』研究や挑戦的萌芽研究「中国古典文学における異文化イメージの形成」(課題番号21652034)の成果を踏まえ、漢賦における「異景」描写の分析を行うための環境整備及び準備作業に着手した。利用すべき基本文献としての『全漢賦校注』(費振剛、廣東教育出版社、2005)及びキョウ[龍/共]克昌等『全漢賦評注』は既に購入済みであり、さらに「拇指数拠庫」データベースシリーズのうち「歴代賦総集」「漢魏六朝詩文総集」「漢魏六朝志怪」「楚辞注」を新規購入した。これらによって「異景」に関する語彙を抽出し、『山海経』『楚辞』『淮南子』等の先行文献の語彙と照合する準備を整えた。また予備的研究として「歌う隠士ー先秦期における「歌」の一側面ー」を発表し、史書や諸子に記録された先秦期の「歌」の分析を通じて、礼教秩序に支配された「士」の世界の周縁にいる「隠者」が歌う「歌」を、「士」が警世として受け取り政治的教訓を引き出そうとしていたことは、『詩経』の詩に民衆の美刺を見出そうとする解釈にも通じる態度であることを明らかにした。『山海経』などに描かれる周縁世界に対する士大夫の意識を解明する一助となるものである。また中国河南省西峡県にて開催された「2013年楚辞国際学術研討会曁中国屈原学会第15届年会」にて、上記論文とほぼ同じテーマを含む口頭発表「論先秦逸民之詩歌与《漁父》」を行い、中国の研究者との学術交流を行った。本年度は基本文献としての『全漢賦校注』(費振剛、廣東教育出版社、2005)、キョウ[龍/共]克昌等『全漢賦評注』及び「拇指数拠庫」データベースシリーズのうち「歴代賦総集」「漢魏六朝詩文総集」「漢魏六朝志怪」「楚辞注」等を用いて「異景」に関する語彙を抽出し、『山海経』『楚辞』『淮南子』等の先行文献の語彙と照合する作業に着手した。この過程において、現存する辞賦作品のうち、漢代初期のものは斉魯の賦家による作品が多く、その形式も『詩経』に倣った四言句が大半を占め、賈誼に代表される『楚辞』の影響が強い諸作品とは別系統のものが中国北方で流行していたことが明らかになった。この成果は27年度中に論文として発表予定である。また「第11届詩経国際学術研討会」(中国河北省石家荘市)において「試論《詩経》景物描写的演変」と題する口頭発表を行った。これは『詩経』大雅や周頌に見える、周の先王をうたった詩における景物描写の変化を分析し、純粋に先王を祝頌する詩には見えない風景描写が、開国神話をうたった詩に初めて現れ、古代中国における風景描写が物語に付随する形で始まったことを解明したものである。この成果は論文としても27年度中に刊行予定である。本年度は基本文献としての『全漢賦校注』(費振剛、廣東教育出版社、2005)、キョウ[龍/共]克昌等『全漢賦評注』及び「拇指数拠庫」データベースのうち「歴代賦総集」「漢魏六朝詩文総集」「漢魏六朝志怪」「楚辞注」等を用いて「異景」に関する語彙を抽出し、『山海経』『楚辞』『淮南子』等の先行文献の語彙と照合する作業を行った。この結果次の事実を解明した。崑崙山や蒼梧山など中国の周縁にあって神々が棲む聖山とされる山の描写は、先秦から漢初の詩歌や史書・諸子においては、その名を挙げるだけで、その情景についての描写はほとんどない。これに対して『山海経』『穆天子伝』のような巫祝の知識がもとになっていると考えられる文献では、崑崙そのものの情景を不死を連想させる風物を中心に装飾豊かな美文で描く。漢初の『楚辞』後期作品でも崑崙への遊行が細やかな描写で描かれるが、司馬相如以後の辞賦では崑崙は単に天子の支配の及ぶ最遠の地を示すアイテムと化す。その一方、『神異経』『海内十洲記』など民間信仰の要素が混じる道教系の文献や、その流れをくむとみられる『拾遺記』『捜神記』等の志怪に、崑崙の詳細な風景描写が現れる。

この変化の鍵として挙げられるのは、漢の武帝が黄河源や旧南越国の地にそれぞれ崑崙・蒼梧の名を当てたことに象徴される、想像上の地名の現実化である。この成果は28年度中に口頭及び論文で発表の予定である。また「第11届詩経国際学術研討会」(26年8月、中国河北省石家荘市)において行った口頭発表「試論《詩経》景物描写的演変」の内容に若干の修正を行い、論文「『詩経』における情景描写の変遷」(28年8月刊行予定)にまとめた。これは『詩経』大雅や周頌において、純粋に先王を祝頌する詩には見えない風景描写が、開国神話をうたった詩に初めて現れ、古代中国における風景描写が物語に付随する形で始まったことを解明したものである。崑崙山や蒼梧山など中国の周縁の聖山とされる山の描写は、先秦から漢初の詩歌や史書・諸子では、その名を挙げるだけで、その情景の描写はほとんどない。これに対して『山海経のような巫祝の知識がもとになっている文献では、崑崙そのものの情景を装飾豊かな美文で描く。漢代の辞賦作品では崑崙は単に天子の支配の及ぶ最遠の地を示すアイテムと化すが、『海内十洲記』など道教系の文献や、その流れをくむ志怪小説では、依然として崑崙の詳細な風景描写が行われた。以上から、「異景」の描写に熱心だったのは巫術や道教などの宗教知識を伝える文献のみで、正統的な詩賦ではその情景描写に冷淡であったことが明らかになった。「拇指数拠庫」データベースシリーズ等を用いての漢賦における「異景」描写の分析が予想以上に難航し、研究成果を発表するには至っていないため。中国文学平成27年度上半期は前年度に続いて、『全漢賦校注』(費振剛、廣東教育出版社、2005)や「拇指数拠庫」のデータベースシリーズを用いながら、「異景」に関する語彙を抽出し、『山海経』『楚辞』『淮南子』等の先行文献の語彙と照合することによって、漢賦における「異景」描写の分析に努める。この作業を通じて、これまで散発的にしか行われていなかった漢代における「異国」「辺遠」のイメージの本質とその展開について、最新の研究成果を広く収集しながら、より明確かつ総体的に理解することを目指す。平成27年度下半期には上記作業に並行して、伝漢代作の仙話的長編小説から六朝志怪小説に至るまでの「異景」描写がいかに展開してきたかを解明する作業を行う。東方朔の撰と伝えられる『神異経』『海内十洲記』は、一般には『山海経』の影響が強い空想的地理書と目されているが、前者は『山海経』の叙述形式を踏襲しているのに対し、後者は班固の作と伝えられる『漢武故事』や『漢武帝内伝』のような仙話的長編小説との関連が認められる。巫祝とのかかわりが指摘される『山海経』以後、漢賦に取り込まれて滅びたかに見えた空想的地理知識が、今度は道士の手によって伝えられるようになったのであり、その間には当然大きな質的変化があったと考えられる。こうした空想的地理知識の質的変化の過程を解明するために、上に挙げた仙話的長編小説における「異景」描写の分析を行う。これらの作業の後に、研究の最終的な取りまとめに入る。漢賦における「異国」「辺遠」描写の展開、及び伝漢代作長編小説から六朝志怪小説に至る「異景」描写の展開について、研究成果を綜合し、「漢魏六朝文学における「異景」描写の展開」として報告書を取りまとめる。研究環境の整備は順調に進んでいるが、予備的研究に予想外の時間がかかり、「拇指数拠庫」データベースシリーズ等を用いて漢賦における「異景」描写を分析して研究成果を発表するには至っていないため。先秦両漢文学及び六朝文学関係図書の所要額が当初見込みよりも安くついたため。平成26年度上半期は前年度に続いて、『全漢賦校注』(費振剛、廣東教育出版社、2005)や「拇指数拠庫」のデータベースシリーズを用いながら、「異景」に関する語彙を抽出し、『山海経』『楚辞』『淮南子』等の先行文献の語彙と照合することによって、漢賦における「異景」描写の分析に努める。
多種間の比較ゲノム解析による新規メチル化制御配列の同定

ネズミ目およびウサギ目特異的インプリンティングを受ける遺伝子Impactに着目し、卵形成で新規メチル化を受けるDNA配列を、ビーバー、リスなど約30種の動物で決定し、メチル化シグナル同定を目指してインプリンティングを受けない哺乳類ゲノムと比較解析を行った。その結果、これまで重要と考えられてきたリピート配列や、CpGおよびG+C含量ではなく、CpGサイト間の間隔がアレル別メチル化の確立に関わっていることが示唆された。哺乳類の一部の遺伝子はいずれの親に由来するかによって発現量が著しく異なるゲノムインプリンティングという独特の発現制御を受ける。これまで、インプリンティングに必要とされる比較的広い領域は見付けられていながら、特定のタンパク複合体と相互作用すると考えられるcjs-制御領域の同定には至っていない。本研究では種特異性を示すインプリント遺伝子Impactに注目し、研究代表者が現在関わっているバイオインフォマティクスを生かして、これまで行われてこなかった多種間によるゲノム比較解析により、新規DNAメチル化標的配列の特徴付けを行った。遺伝子Impactは、ネズミ目およびウサギ目の種でインプリンティングを受け、それ以外のサル目、ウシ目などの哺乳類では受けないことが知られている。今回、前者16種、後者11種について、制御領域があるとされる第1イントロンの配列を独自に決定し、両グループで比較解析を行ったところ、前者においてのみ、8 bp離れたCpGが統計学的に有意に多く存在することが示された。その一方、これまで重要と考えられてきたリピートの有無や、CpGの頻度に有意な差は見いだされなかった。8 bpの間隔は、新規DNAメチル化を担うDnmt3a-Dnmt3L複合体にあると考えられている2つの活性部位の距離に対応するため、インブリンティングに重要な新規メチル化標的配列の重要な特徴であると考えられる。メチル化の異常ががんと深く関わっていることは指摘されて久しく、またー卵性双生児の疾病に対する感受性がメチル化の違いで説明できるようになり、新規メチル化はエピジェネティクスの中心的なテーマの一つである。本研究の成果はインプリンティングに限らず、医学研究にも容易に応用されうる意義のあるものである。ゲノムDNAメチル化は哺乳類に限らず、原索動物や棘皮動物にも見られ、遺伝子発現制御およびゲノムの安定性に重要な役割を果たしている。しかし脊椎動物と無脊椎動物との間にはメチル化パターンに大きな違いがあることが指摘され、哺乳類ではCpGアイランドを除いてほとんどの領域がメチル化を受けるのに対し、無脊椎動物であるホヤではメチル化を受ける領域と免れる領域が広い範囲で半々ずつ見られることが知られている。また局所的なメチル化状態はCpGの出現頻度により推定が可能で、哺乳類のCpGアイランドに限らず、無脊椎動物であるホヤにおいてもCpGの出現頻度からメチル化、非メチル化領域を大まかに推定することができる。しかしながら従来、脊椎動物と無脊椎動物のメチル化は別のものと考えられてきたため、統一された評価基準が用いられてこなかった。そこで本研究ではゲノムワイドなメチル化パターンの程度を多種のゲノムで比較するイン・シリコ解析法を提案することで、エピジェネティクな変化の流れを追い、両グループを分ける明確な境界が見られるのかを調べた。その結果、新口動物であるウニ、ナメクジウオ、ホヤ、魚類、哺乳類において、進化系統に沿ったメチル化パターンの段階的な変化が見られ、進化におけるエピジェネティックな変化を反映した解析法であることが示された。さらにこの手法を、6種の魚ゲノムに当てはめたところ、無脊椎動物の性質に近い種も見られた。以上のことから、現在よく知られているマウスやヒトのメチル化パターンは初期脊椎動物において突然獲得されたというよりも、むしろ無脊椎動物の断片的なメチル化から徐々に拡大、維持されたことにより確立された可能性が示唆された。本研究は新しいバイオインフォマティクスの手法を導入することにより、今まであまり手が付けられていなかったエピジェネティックな分子進化に新たな知見を与えることができた。
顎骨の骨梁構造を考慮した高分解能・高精度・大規模有限要素解析

顎骨の骨梁構造にまで考慮した荷重伝達機構を明らかにするため、高分解能撮像分解能のままの要素寸法で高精度三次元有限要素解析を行った。その手段として、64ビットPCでの大規模解析を行う方法で、顎骨全体のマクロモデルに骨梁構造を反映した均質化材料モデルを適用するマルチスケール解析を行い、その結果をふまえて海綿骨の微細構造に注目して骨梁内のBAp配向を算出を行った。また撮像分解能が応カ解析精度に及ぼす影響を解明するために、対象骨を分解能を変えてマイクロCT撮像し、均質化法により解析するマクロ特性値から違いを考察した。その結果、ビーグル犬上顎骨インプラント埋入試料についてインプラント間の骨梁構造の観察を行い、頬舌方向と近遠心方向・インプラント軸方向の骨梁構造と剛性に定量的に異方性を認めた。顎関節部の前方滑走運動のシミュレーションも行い、応力状態と内部構造観察から荷重モードや骨梁への荷重伝達機構を解明している。さらに、ヒト下顎骨インプラント埋入体及び、無歯顎下顎骨を試料体として骨密度、骨梁構造、マクロ剛性の相関を定量的に解明した。今回の研究により、1000万メッシュ以上の三次元有限要素解析を行うことができるようになり、骨梁構造を考慮に入れたマイクロメートルオーダでの解析を行えるようになった。さらに次年度は生体アパタイト配向と撮像分解能が応力解析制度に及ぼす影響について追求し、骨梁の異方性を正確に予測できる顎骨のマルチシミュレーションを実用化するための基礎データを取得する予定である。
加齢による視界の黄変化に配慮した建築色彩計画の研究-種々の条件下の仕上げ材料色-

研究の目的:平成7-8年度の科研費による研究で、建築の日常生活安全上重要な、床・壁の色取り合わせを対象とし、一定条件の測定光を持つ接触型ハンディ色差計を用いて、黄変化シミュレーションした色標・仕上げ材の実物見本を測定、加齢黄変化視界で変色した色を明示した色事典を試作した。さらに、その測定値に基づいて段差の視認、視覚障害用床材の視認性などにつき、見分け易い色の組み合わせの例を試作している。しかし、現実の建築の中では場所により明暗があったり、照明による色彩の変化も起こり得る。本研究では、主に屋内の種々の照明条件下で、建築仕上げ材の色の測定・分析をして、色の組み合わせ例が有効であるかどうかの検討を行うことを目的とする。本年度の研究実績:現実の建築の中に各種仕上げ材の実物色見本を持っていき、現実の種々の条件下で非接触型ハンディ色差計を用いて、実物色見本を計測し、さらに、これら実物色見本に加齢黄変レベル別黄色薄膜をそれぞれにかけ、その黄変色度を引き続き計測した。さらに、平成9年度に購入した分光測色計(CM-508d、ミノルタ)は、太陽光や蛍光灯などの照明光の標準的な光源のデータを内蔵しているので、それらの光源による実物色見本の色の変化を黄変化シミュレーションしながら計測し、先の色差計での計測結果と比較検討を行った。標準色名小辞典についても加齢黄変レベル別黄色薄膜をかけ分光測色計で測定し分析を試みた。本年度の研究実績:現実の建築の中に各種仕上げ材の実物色見本を持っていき、現実の種々の条件下で平成7年度の科研費で購入した非接触型ハンディ色差計を用いて、実物色見本を計測し、さらに、これら実物色見本に、平成5年度に科研費の研究成果として得た加齢黄変レベル別黄色薄膜をそれぞれにかけ、その黄変色度を計測した。さらに、本年度購入した分光測色計(CM-508d、ミノルタ)は、太陽光や蛍光灯などの照明光の標準的な光源のデータを内蔵しているので、それらの光源による実物色見本の色の変化を黄変化シミュレーションしながら計測し、先の色差計での計測結果と比較検討を行った。
動脈硬化病態の解析と分子イメージング:プロスタグランジン合成酵素を標的として

本研究では、動脈硬化モデルにおいて放射性標識COX-2阻害薬の動態を解析し、分子生物学的評価結果と対比することにより、COX-2を標的とする動脈硬化病態診断の可能性を検証することを目的とし、本年度は以下の検討を行った。1.COX-2を標的とする放射性薬剤の開発に関する検討昨年度までに、選択的COX-2阻害薬であるCelecoxibのヨウ素置換体(IMTP)をデザイン・合成した。今年度は、IMTPの分子イメージング剤としての有用性をさらに検証するため、ラットを用いてインビボでの評価を行った。その結果、IMTPは速やかな血中クリアランスを示し、優れた標的/血液比を示した。これらの結果より、IMTPのCOX-2選択的イメージング剤としての可能性がインビボ実験において示された。2.動脈硬化モデルウサギにおけるCOX-2発現の検討動脈硬化病態、特に、プラーク破綻には、細胞外マトリックス分解酵素(MMP)が深く関与している。最近、MMPがプロスタグランジン(PG)E2依存性の経路により産生されることが示され、PGE2合成の律速酵素であるCOX、特に誘導型であるCOX-2の役割が注目されつつある。そこで、動脈硬化モデル家兎においてCOX-2発現を解析し、MMP-2の発現と対比することにより、COX-2を標的とする動脈硬化病態診断の有用性を検証した。その結果、MMP-2は、最も不安定性を示すアテローム性病変に強く発現していた。一方、COX-2は初期病変から進行性病変にわたって広く発現していた。これらの結果は、COX-2を標的とする分子イメージングにより動脈硬化病変の早期検出が可能であり、他方、MMP-2イメージングでは進行性病変の描出が可能であることを示唆している。1.COX-2を標的とする放射性薬剤の開発に関する検討構造-活性相関学的検討から、選択的COX-2阻害薬であるCelecoxibのヨウ素置換体(IMTP)をデザインし、標識前駆物質の合成に成功した。また、IMTPの分子イメージング剤としての有用性を検討した結果、IMTPがCOX-2に対して高い選択性と阻害活性を有することを見い出し、その放射性ヨウ素標識に成功した。動脈硬化プラークにおいてマクロファージや血管平滑筋細胞のアポトーシスは脂質コアの増大と線維性被膜の脆弱化とに寄与しており、その不安定化に深く関与すると報告されている。そこで今回、アポトーシスにより細胞膜外に現れるホスファチジルセリンに対して親和性を有する放射性化合物、^<99m>Tc標識Annexin Vによる動脈硬化のイメージングについて、ApoEノックアウトマウス・頚動脈狭窄モデル・を用いて基礎的に検討した。今回購入した手術用顕微鏡は頚動脈狭窄モデルの作成に用いた。その結果、WHHLMIウサギにおいて^<99m>Tc標識Annexin Vの病巣への集積はアポトーシス数と正の相関を示し、^<99m>Tc標識Annexin Vにより動脈硬化病変におけるアポトーシスを検出できることが示された。今後、COX-2イメージングとの対比を行う予定である。
絨毛細胞の血管内皮様分化における細胞系列並びに分化誘導刺激の特異性に関する研究

本課題では絨毛細胞(EVT)の血管内皮様分化のメカニズムについて検討し、EVTと血管内皮はマトリゲルの刺激により同じ形態変化を示すがその機構は異なり、EVTでは正常酸素濃度においてもHIF1Aの発現および転写活性と分化能が相関していること、逆に活性酸素種のうちH2O2がEVTの細胞死や細胞分化に関わること、早発型妊娠高血圧症候群症例胎盤で活性酸素種が細胞障害をおこしていること、すなわち妊娠高血圧症候群の病態形成に単に酸素濃度のみならず虚血再潅流等により生じる活性酸素種も胎盤において関与していると考えられた。本課題では1)絨毛細胞の血管内皮様分化であるtube formationにおける、分化刺激(細胞外基質、低酸素)特異性、細胞特異性を有する遺伝子の動的変化、2)血管内皮様分化に重要なシグナル伝達径路、遺伝子機能、3)臨床検体(疾患胎盤)での動態を明らかにすることで、絨毛細胞の分化なかでも血管内皮様分化のメカニズムとその調節およびその臨床的意義、血管内皮細胞との共通点や相違点を明確化することを目的とした。本年度は、絨毛細胞の血管内皮分化に重要な分子機構を明らかにするために、ヒト不死化絨毛細胞TCL1ならびにヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞HUV-EC-Cがともにマトリゲル上で示すtube-like formationにおける遺伝子変動を比較した。その結果、TCL1のtube formationで有意な発現増幅・減少を示す遺伝子のうち血管内皮細胞において同様の変化を示す遺伝子は約10%とごく一部であることがわかった。すなわちEVTと血管内皮はマトリゲルの刺激により同じ形態変化を示すが細胞の種類によってその機構が異なっていることがわかった。さらに、TCL1に特異的に変動する遺伝子の中から、低酸素環境への反応に関わることが知られている転写因子Hypoxia inducible factor 1alpha(HIF1A)遺伝子に着目し検討を行ったところ、HIF1AはTCLの血管内皮様分化の過程でRNA、蛋白発現が上昇しており、その発現および転写活性とtube formation能が相関していることがわかった。このことから、絨毛の浸潤過程において寡能性EVTは細胞外基質や液性因子のみならず酸素濃度など周囲の環境を調節因子としてこれに適応するように分化していると考えられた。これまでの検討により、絨毛の浸潤過程において寡能性EVTは細胞外基質や液性因子のみならず酸素濃度など周囲の環境を調節因子としてこれに適応するように分化することが示唆されている。さらに、妊娠高血圧症候群(PIH)患者胎盤では低酸素再潅流障害に関わる、Xanthine Oxidase(XO)の発現上昇が報告されていること、我々の検討でも患者血漿中H202濃度が対照妊婦に比し有意に高値を示し、血清尿酸値と相関することがわかった。そこで、本年度はTCL1細胞において、諸種の酸化ストレスがどのようにその表現形に影響を与えるか、細胞増殖、細胞浸潤、既知の絨毛細胞の分化に関わるタンパクの発現を指標として検討を行った。細胞培養液中に基質としてxanthine(X)、XO、細胞数、細胞浸潤能、細胞分化に関連する遺伝子、遺伝子産物発現について検討した結果、X+XO添加時には容量依存的に培養上清中の尿酸値が上昇し、これに伴い接着細胞数が減少し、細胞浸潤能も低下した。タネル法ではこの細胞減少はアポトーシスによるものであった。阻害剤であるcatalase、アロプリノールを添加したところ、この細胞数減少ならびに細胞死はアロプリノールならびにcatalase添加で抑制されたがSOD添加では抑制されなかった。H202を培養上清中に加えたところ、X, XO添加時と同様にTCL1細胞にアポトーシスが誘導された。以上のことから、XOが産生するROSはヒトEVT細胞株にアポトーシスを誘導し,細胞浸潤能や細胞分化を抑制すること,これらの影響は主としてH202により惹起されることが示された。このことは、妊娠高血圧症候群の病態形成においては胎盤局所でも単に酸素濃度のみならず虚血再潅流等によるROSが関与することを示唆すると考えられ、今後はその分子機構をさらに検討していく。本課題における初年度、第二年度の検討から、(EVT)の血管内皮様分化のメカニズムについて検討し、EVTと血管内皮はマトリゲルの刺激により同じ形態変化を示すがその機構は異なること、EVTにおいてはHIFIAの発現および転写活性と分化能が相関していること、Xanthine Oxidase(XO)が産生するROSはヒトEVT細胞株にアポトーシスを誘導し,細胞浸潤能や細胞分化を抑制すること,これらの影響は主としてH2O2により惹起されることを示した。つまり、絨毛の浸潤過程において寡能性EVTは細胞外基質や液性因子のみならず酸素濃度など周囲の環境を調節因子としてこれに適応するように分化し、妊娠高血圧症候群の病態形成においては胎盤局所でも単に酸素濃度のみならず虚血再潅流等によるROSが関与していると考えられる。

そこで本年度は、妊娠高血圧症候群胎盤におけるROSの関与を明らかにするために、活性酸素種による細胞障害で生じる8 OHDCについて、正常対照41例ならびにPIH患者27例において胎盤を染色し、その染色と臨床像を比較した。80HdGは、胎盤の合胞体絨毛細胞がPIH症例では年齢や妊娠背景の一致する対照例に比し有意に陽性に染色されていた。PIH症例のなかで、80HdG陽性例は陰性例に対し、妊娠中の血中尿酸値が高値で分娩週数が早く早発型の割合が多かった。これらの結果は、前年までのin vitroで得られた解析の通り、臨床検体においても、胎盤において虚血再潅流障害は活性酸素種を介して直接絨毛細胞を障害する場合があることこの障害は、早発型の妊娠高血圧症候群の病態に関連する可能性があることを示すと考えられた。
イタリアのインクルーシブ教育における教師の資質と専門性に関する調査研究

イタリア北部の都市を中心に障害のある児童生徒を統合した学校現場の授業揚面の観察や教師へのインタビュー、文献収集等を通して、学校の在り方、特別な教育的ニーズのある児童生徒を支援する教師の養成、その具体的な役割、医療福祉等の地域の資源との連携について情報を収集・整理した。1992年ハンディキャップに関する基本法第104号のもとで、各県単位で教育・医療・福祉・労働が<プログラム協定>を結び連携して障害や文化などの多様性を内包する統合教育を進めていることがわかった。今年度は、まず、昨年度実地調査で入手された幼稚園において統合教育を受けていた聴覚障害のある幼児の診断表、3歳時、4歳時及び6歳時の3年間にわたる動的機能プロフィールPDF、個別教育計画を翻訳した。支援教師が中心となり「言葉だけじゃない」プロジェクトを企画し、障害のある幼児と障害のない幼児がお互いに理解し合いそして理解する機会をつくる授業の全体像がわかった。また、11月23日モデナ市で開催された「統合のための資源」というテーマのセミナーに参加し、学識経験者による講演や事例の紹介があった。学校管理者と支援教師から学校現場での様々な経験や課題についての協議を聞くことができた。3年間5回の実地調査を通して、イタリアの現代の社会状況の中で教師に求められる資質と専門性があきらかになった。すなわち障害はもちろん民族や文化などの違いを含めた一人一人の子どもの多様性を受容し、積極的に歓待していく姿勢と、全体性を見る姿勢である。イタリアの子どもたちは、彼ら自身がインテグレーションを体験し、お互いの多様性を理解することを学んできている。自分の学んできた学校で既に教師にとって極めて重要な資質が養われてきている。30年前の教育は、知識の量であったが、今の教育は人間関係を学ぶことであり、自分と異なる多様な状況・価値観をもつ人と人間関係を維持し、発展させ、新たな価値観を創造する力量を育てることであるとイタリアの教育は主張している。イタリア北部の都市を中心に2回の実地調査を行った。この調査で明らかになったことは、次のとおりである。(1)1992年法律104号に基づいて、各県ごとに毎年度ハンディキャップ状況にある児童生徒の統合教育のためのプログラム協定を結び、ASL(地域保健機構)、学校・教育委員会、コムネ等の関係機関がそれぞれの特別なニーズに対応したサービスを提供する役割分担が明確に確認される。(2)モデナ県の統計資料からハンディキャップの状態にある児童生徒の対象となる障害は、ICD-10に基づいてASLにおいて診断され、その範囲は、精神統合障害等F20-29、学習障害等の心理的発達障害F80-89、多動性障害等の行動及び情緒の障害F90-99が含まれている。(3)学校での実地調査において、重度の肢体不自由児や自閉症、精神統合障害のある児童が通常の小学校の学級に統合されて指導を受けている状況が確認された。それらの学校ごとに、支援教師がコーディネーターとなり、小児精神科医、心理療法士、PT、OT、ケースワーカー等の専門スタッフからなる支援チームが編成され、学校における統合教育を支えていた。

(4)支援教師insegnante di sostengoは、統合教育を促進するため全在籍児童生徒数に対して138:1の基準にもとづいて配当され、学級担任とチームを組んで、障害児への直接指導することに加え、クラスメイトと障害児の円滑な関係を保つように学級全体の指導に対して責任をもつ。今年度、支援教師の大学での養成課程及び現職研修を中心に調査を実施した。・5月下旬にイタリア北部ボローニャ・モデナを調査した。ボローニャ大学の支援教師を養成するコースについてN.クォーモ教授及びA.カーナヴァーロ教授にインタビューができた。教育学部卒業後の2年間の追加コースは、180時間の講義、120時間のグループ作業と100時間の教育実習の400時間から成る。支援教師の形態は、学校のインテグレーションにおいて、システム的かつ相互作用的次元で活動させる精神と能力を形成し、異なる機関と科学的環境に参入する専門家としての力量が要請される。講義は、心理学、障害とリハビリテーション心理学、特殊教育学、認識論、方法論を含めた医療-精神-教育学プロジェクトでの教育学が中心になる。グループ作業では、支援教師としての専門的役割を鍛えるため視聴覚機材を使用した記録方法、理論と実践を結びつける演習がある。教育実習では、教育的日常性の中で、認知・認識方法論・実務・戦略・作業場など講義や演習で形成した教育学的過程を実現化させ、専門的日誌の作成を通してデータの観察と測定を深め、教育方法と指導方法との相互関係を検討する。・これらの調査で得られた資料を独立行政法人国立特殊教育総合研究所のホームページで公開するため、モデナ県プログラム協定添付文書、ボローニャ大学支援教師養成の追加コース及びA.カーナヴァーロ教授著「特殊教育学」の一部を翻訳した。イタリア北部の都市を中心に障害のある児童生徒を統合した学校現場の授業場面の観察や教師へのインタビュー、文献収集等を通して、学校の在り方、特別な教育的ニーズのある児童生徒を支援する教師の養成、その具体的な役割、医療福祉等の地域の資源との連携について情報を収集・整理した。1992年ハンディキャップに関する基本法第104号のもとで、各県単位で教育・医療・福祉・労働が<プログラム協定>を結び連携して障害や文化などの多様性を内包する統合教育を進めていることがわかった。今年度は、まず、昨年度実地調査で入手された幼稚園において統合教育を受けていた聴覚障害のある幼児の診断表、3歳時、4歳時及び6歳時の3年間にわたる動的機能プロフィールPDF、個別教育計画を翻訳した。支援教師が中心となり「言葉だけじゃない」プロジェクトを企画し、障害のある幼児と障害のない幼児がお互いに理解し合いそして理解する機会をつくる授業の全体像がわかった。また、11月23日モデナ市で開催された「統合のための資源」というテーマのセミナーに参加し、学識経験者による講演や事例の紹介があった。学校管理者と支援教師から学校現場での様々な経験や課題についての協議を聞くことができた。3年間5回の実地調査を通して、イタリアの現代の社会状況の中で教師に求められる資質と専門性があきらかになった。すなわち障害はもちろん民族や文化などの違いを含めた一人一人の子どもの多様性を受容し、積極的に歓待していく姿勢と、全体性を見る姿勢である。イタリアの子どもたちは、彼ら自身がインテグレーションを体験し、お互いの多様性を理解することを学んできている。自分の学んできた学校で既に教師にとって極めて重要な資質が養われてきている。
滋賀の水環境との共存を考える単元「びわ湖と私(仮)」のカリキュラム作成と教材開発

「環境の学習」といえば,科学的な内容がわかりにくいうえに,「情勢はだんだん悪くなっていく」という話が多い。そのため、たいていの場合重苦しい雰囲気になる。これまでのような学習の流れには,生徒が生態系を学ぶことと環境保全について考えることにつながりがないために,環境保全の学習が説教になって,「ああやっぱり環境問題を解決できそうにない」と感じてしまう。それは,生態系を学習するための観察実験と環境調査とでは全く別の対象を扱い,それぞれ違う方法でおこなっていたからである。2つの学習の間には直接の接点がなく,それが障害となって,自然と人間とのかかわり方について相互に見たり考えたりできるような学習になっていないからである。そこで、本研究では,子どもたちにとって本来一番身近な存在であるはずの琵琶湖に愛着を感じ、琵琶湖と共存するために必要なことを考えられるような学習について研究を進めた。研究として,既存の単元「生物どうしのつながり」の中で扱う食物連鎖や物質の循環を琵琶湖を中心とした視点から取り上げた。実際の単元構成については大きく以下の流れで進めた。(1)琵琶湖に住む生物の多様性を理解する。(2)生物相互のつながりがあることを理解する。(3)人と琵琶湖、人と生物のつながりを理解する。(4)琵琶湖の抱える環境問題について理解する。(5)琵琶湖と私たちの暮らしについて考える。本実践を終えた後のアンケートでは、7割の生徒が「琵琶湖の環境問題について関心が高まった。」と答えた。ミニ琵琶湖や低酸素化の実験を行ったことで、自分たちの生活が琵琶湖の環境に与える影響をより身近に感じ取ったようで、「たった1滴の排水が、あんなにも水質を変化させるとは思わなかった。」「琵琶湖の環境悪化させる一人になる可能性があることが分かった。」などの意見を持つ生徒が見られた。また、生物相互のつながりやその多様性について、琵琶湖を題材として扱ったことについて、「琵琶湖の中にあんなにたくさんの魚やプランクトンがいるとは思わなかった。」「琵琶湖の中の生物がお互いにつながりあって生きていることが分かった。」「外来魚などが問題になっているが、私たちの生活の影響によってもたくさんの生物に影響が出ることが分かった。」「自分たち以外にもたくさんの生物が生きていることを改めて感じた。」などといった意見が多く見られ、『琵琶湖』とい環境が生徒にとって「守りたい」と感じる自然の1つになったのではないかと感じる。この実践を通して身につけさせたい力は、評価が難しく、子どもたちの中にどのように根付いているかが十分に把握できない。子どもたちが将来、滋賀を担う存在になったときに、この実践の持つ意味が問われるのだろう。滋賀の環境教育を考えるにあたり、水環境だけでじゅうぶん満足できるとは思わない。今後、さらに深まりのある環境教育を目指して、森林、里山、土壌、田園...いろいろな要素を取り込んだ環境教育のプログラムを開発していきたい。」と答えた。

子どもたちが将来、滋賀を担う存在になったときに、この実践の持つ意味が問われるのだろう。滋賀の環境教育を考えるにあたり、水環境だけでじゅうぶん満足できるとは思わない。今後、さらに深まりのある環境教育を目指して、森林、里山、土壌、田園...いろいろな要素を取り込んだ環境教育のプログラムを開発していきたい。
グラム陰性菌初のABC型薬剤排出輸送体MacABの構造機能解析

ATP bindingcassette(ABC)輸送体は、生物界に普遍的に存在し様々な物質を輸送する膜蛋白である。我々が発見した薬剤排出タンパクMacBは、グラム陰性菌で初めて同定されたABC型薬剤排出蛋白であり、MFPのMacA、To1Cと共に機能することでMacは菌体外へ直接的にマクロライド系の抗生物質を排出する。これまでに、私はMacBが4回膜貫通構造をとることを実験的に証明した。ABC輸送体で4回膜貫通構造のものは知られておらず、MacBはその唯一の例である。本年度は、MacBの輸送機構解明のため、さらに詳細な構造情報を得ることを目的として実験を行った。原子レベルでの構造情報を得る手段として3次元結晶を用いたX線結晶構造解析を行うため、大量発現系を構築した。His-tagを用い、大量の精製標品を得ることに成功したが、結晶は得られなかった。いかにして良質な結晶を得るかは今後の課題である。また、上記の研究と並行して血小板からのSphingosine 1-phosphate(S1P)の放出機構にABC輸送体の関与を調べた。S1Pは生体内で血管新生や免疫反応に重要な役割を果たす生理活性脂質である。これまで、生理活性脂質は単純拡散により放出されると考えられていた。そのため、S1Pの放出過程もほとんど明らかとなっていなかった。私は、S1Pの分泌が単純拡散や開口分泌によるものではないことを証明し、さらに阻害剤を用いることでS1Pの放出にABC輸送体が関与していることを明らかとした。これらの結果はJournal of lipid research誌に報告した。ABC輸送体は生物界に普遍的に存在し、ATPのエネルギーにより、異物をはじめとする様々な基質を輸送する。RND型輸送体は、プロトン駆動力により、ペリプラズムに存在するmembrane fusion protein(以下MFPと略す)と外膜蛋白(特に大腸菌ではTolC)を介した菌体外への直接の輸送を行う。MacBは、グラム陰性菌において初めて実験的に薬剤を排出することが確認されたABC輸送体であり、その機能にMFPであるMacAおよび、外膜蛋白であるTolCをその機能に必要とする。MacBは、そのアミノ酸配列より4回膜貫通構造をとると推定された。これは他のABC輸送体が少なくとも5回膜貫通構造をとると考えられていることを考えると珍しい特徴であると言える。そこで私は、本研究室で確立された化学修飾法により、MacBのトポロジーの決定を試みた。この方法は、部位特異的に変異導入したシステイン残基に対する膜透過性SH修飾試薬NEMの反応性が膜不透過性SH修飾試薬であるAMSにより阻害されるかどうかを検討する方法である。二つの膜貫通領域を間にとりえない30-40アミノ酸ごとにCysを導入し、そのシステインに対するSH修飾試薬の反応性を調べた結果、MacBは、4つの膜貫通領域しかとり得ないことが明らかとなった。このことはABC輸送体の輸送過程においてそれ程多くの膜貫通領域が必要でないこと示唆していると考えられる。この結果はFEBS Letterで発表された。ATP bindingcassette(ABC)輸送体は、生物界に普遍的に存在し、様々な物質を輸送する膜蛋白である。我々が発見した薬剤排出タンパクMacBは、グラム陰性菌で初めて同定されたABC型薬剤排出蛋白であり、MFPのMacA、TolCと共に機能することで、MacBは菌体外へ直接的にエリスロマイシンを排出する。また、私は現在までに、MacBがABC輸送体で初めて4回膜貫通構造をとることを実験的に証明した。本年度はMacBの輸送機構解明のため、さらに詳細な構造情報を得る事を目的として実験を行なった。原子レベルでの構造情報を得る方法として、3次元結晶を用いたX線結晶構造解析を行なう事とした。この方法における一番の障壁は良質の結晶を得る事である。一般的に膜蛋白の結晶化は特に困難なことで知られている。その大きな理由として大量の精製標品が得にくい事が挙げられる。私は、本年度、大量発現と精製のための系を構築することを試みた。そこで種々の発現ベクターと大腸菌の組み合わせを検討した結果、pBAD24にMacBのみを単独でクローニングし、W3104において発現させた時、最大の蛋白量が得られることを明らかとした。なお、この条件下で得た蛋白質を2%TritonX-100により可溶化し、His-tagによって精製する事により、CBB染色で単一のバンドを確認した。このことから、大量発現、大量精製の系を確立する事に成功した。このことから、結晶化のための一つの大きな壁を突破する事が出来たと考えている。また、大量の精製標品は、結晶化のみならず、再構成系やその他生化学的な実験に用いることが出来るため、MacBの機能解明に向けて大きく前進する事が出来たと考えている。

本年度は、MacBの輸送機構解明のため、さらに詳細な構造情報を得ることを目的として実験を行った。原子レベルでの構造情報を得る手段として3次元結晶を用いたX線結晶構造解析を行うため、大量発現系を構築した。His-tagを用い、大量の精製標品を得ることに成功したが、結晶は得られなかった。いかにして良質な結晶を得るかは今後の課題である。また、上記の研究と並行して血小板からのSphingosine 1-phosphate(S1P)の放出機構にABC輸送体の関与を調べた。S1Pは生体内で血管新生や免疫反応に重要な役割を果たす生理活性脂質である。これまで、生理活性脂質は単純拡散により放出されると考えられていた。そのため、S1Pの放出過程もほとんど明らかとなっていなかった。私は、S1Pの分泌が単純拡散や開口分泌によるものではないことを証明し、さらに阻害剤を用いることでS1Pの放出にABC輸送体が関与していることを明らかとした。これらの結果はJournal of lipid research誌に報告した。
海洋調査用曳航式観測ロボットの高精度運動制御に関する研究

今年度に行った、海洋調査用曳航式観測ロボットの高精度運動制御に関する研究で、新たに得られた知見等について以下に示す。まず始めに、現在当研究室で開発中の曳航式観測ロボットを研究の対象として、運動制御を行うためのアクチュエータ機構を含めた制御システムの設計を行った。ロボットの姿勢と運動を制御するための制御力は可動翼によって得るものとして設計を行い、システムの制御性能を数値シミュレーションにより検討した。その結果以下の知見を得た。1.最適制御理論に基づいて設計された制御系により、ロボットの姿勢を高精度に保った状態での深度変更が可能である。2.深度変更のための翼角変化の直後には、翼軸に非常に大きな揚力とモーメントが作用するため、高精度に姿勢を保持するためには、翼に十分な動力原が必要である。次に、開発された制御系の有効性を確認するために、日本海における海洋実験でロボットの運動試験を実施し、得られたデータを解析した。その結果、以下の考察を得た。1.PID制御による制御系でロボットの姿勢保持および運動制御が可能であり、設計した制御系は海洋観測に必要な精度を有する。2.実験結果と数値シミュレーションの比較の結果、設計に用いたシミュレーションプログラムは高い精度を有することが確認された。3.PID制御による運動制御では、深度変更時に縦揺運動などのロボットの姿勢を同時に制御することが困難なため、より高精度な姿勢の保持が必要とされる観測には、最適制御等の多入力多出力系のシステムを容易に取り扱える制御理論が必要である。