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独墺の観光事業に見る「ロマンティック・イメージ」形成についての文化史的研究

ロマンティック街道に代表されるように、ドイツとオーストリアにおける「ロマンティック」は、観光事業の展開にあたって不可欠な要素となっている。だが、ロマンティックという広く流布しているイメージを、彼の地における観光事業の側面から歴史的に掘り下げた研究は未だ存在しない。本研究では、1)ロマンティックとツーリズムとが相互に関係するようになった19世紀以降の時代に焦点を当てつつ、2)ドイツならびにオーストリアが観光立国として歩む中でいかに「ロマンティック・イメージ」が育まれ、それが観光の現場へ用いられたのかを文化史的アプローチから検証し、3)我が国のツーリズムにおけるイメージ戦略への応用性の検討と提言をおこなう。平成30年度は特に上記の1)を踏まえつつドイツとオーストリアにおける「ロマンティック・イメージ」の歴史を俯瞰し、A)神聖ローマ帝国時代の文化遺産を用いた国家ならびに地域の観光政策の方法、B)政治と観光の相互関係について、文化史というアプローチからそれらをいかに分析できるかを多角的に検討する。時代的には、1)19世紀から20世紀初頭にかけての君主制期における「ロマンティック・イメージ」の位置づけと観光事業との結びつき、2)第一次世界大戦後の共和制下におけるマス・ツーリズムの萌芽期に見る「ロマンティック・イメージ」とドイツとオーストリアの観光政策の変化、3)ナチス・ドイツ占領下・四カ国統治下における「ロマンティック・イメージ」の利用の実態、4)1950年代に主権を復活して以降のドイツとオーストリアにおけるマス・ツーリズムの発展と「ロマンティック・イメージ」の世界的展開、5)EU加盟以降の時代における新たな観光政策としての「ロマンティック・ツーリズム」という5つの時代と5つのトピックに区分をおこなった上で、それぞれの時代とトピックに沿った現地取材と資料収集をおこなった。ロマンティック・イメージと観光との関わりを念頭に、ドイツやオーストリアにおけるハプスブルク関係ならびに観光関係の資料を有している様々な機関や団体において、多角的な調査を展開する。具体的には、これまでも科学研究補助金による研究を通じて密接なコンタクトをとってきたウィーン楽友協会資料館館長のオットー・ビーバ博士や副館長イングリード・フックス博士をはじめ、オーストリア国立図書館、ウィーン市立図書館で資料調査をおこなった。またウィーンをはじめとする各地の観光協会や商工会議所で、図版をも含めた資料の収集にあたった。また国内においても、広くドイツとオーストリア、ならびに「ロマンティック・イメージ」に関する社会史、政治史、文化史関係の文献を収集した。とりわけ「日本ロマンチック街道」の起点の1つである草津、およびロマンティック・イメージと草津をつなぐ催し物である草津国際アカデミー&フェスティヴァルや同地の観光案内所において調査を実施することにより、我が国におけるロマンティック・イメージのPR方法、さらにそこから育まれた日本独自の「ロマンティック・イメージ」とドイツとオースリア観光の実態の解明を進めていった。なお調査では、PCやスキャナーを連動させて現地で入手した資料を速やかに電子処理すると同時に、迅速かつシステマティックに電子テキスト化をはかった。こうした資料収集作業を経ることによって、5つの時代および5つのトピックからドイツとオーストリアにおける「ロマンティック・イメージ」の歴史を俯瞰することが可能になり、次年度以降の研究の発展に大いに資することとなった。平成31年度は、平成30年度の調査を継続しつつ、ドイツとオーストリアにおける神聖ローマ帝国時代の代表的都市であるフランクフルトとウィーン、代表的観光街道であるロマンティック街道とアルペン街道を具体的な事例の中心に据えながら、観光政策を通じて浮かび上がるロマンティック・イメージの変遷、並びにそのようなイメージに基づいて作られる各都市や観光街道のイメージが「観光立国」としてのドイツやオーストリアにいかなる形で反映されたのか、という問題についての詳細な分析を行う。分析にあたっては、平成30年度の成果を踏まえ、以下のトピックを研究の柱とする。具体的には、1)政治体制の変化の中で「ロマンティック・イメージ」が観光事業の重要な要素として継承された経緯、2)民間レベル(観光産業、観光業等)における「ロマンティック・イメージ」の受容と発展の歴史に関する検証を推進するとともに、3)イメージ戦略をめぐる日本とドイツ・オーストリアのツーリズムの比較分析を通じ、4)我が国で展開される、「ロマンティック・イメージ」を通じたドイツ及びオーストリアの観光戦略、並びに5)そこから演繹される我が国のツーリズムに対する方法論の検討をおこない、購入予定のデジタル機器を用いてデータ化する予定である。時代的には、1)19世紀から20世紀初頭にかけての君主制期における「ロマンティック・イメージ」の位置づけと観光事業との結びつき、2)第一次世界大戦後の共和制下におけるマス・ツーリズムの萌芽期に見る「ロマンティック・イメージ」とドイツとオーストリアの観光政策の変化、3)ナチス・ドイツ占領下・四カ国統治下における「ロマンティック・イメージ」の利用の実態、4)1950年代に主権を復活して以降のドイツとオーストリアにおけるマス・ツーリズムの発展と「ロマンティック・イメージ」の世界的展開、

5)EU加盟以降の時代における新たな観光政策としての「ロマンティック・ツーリズム」という5つの時代と5つのトピックに区分をおこなった上で、それぞれの時代とトピックに沿った現地取材と資料収集をおこなった。ロマンティック・イメージと観光との関わりを念頭に、ドイツやオーストリアにおけるハプスブルク関係ならびに観光関係の資料を有している様々な機関や団体において、多角的な調査を展開する。具体的には、これまでも科学研究補助金による研究を通じて密接なコンタクトをとってきたウィーン楽友協会資料館館長のオットー・ビーバ博士や副館長イングリード・フックス博士をはじめ、オーストリア国立図書館、ウィーン市立図書館で資料調査をおこなった。またウィーンをはじめとする各地の観光協会や商工会議所で、図版をも含めた資料の収集にあたった。また国内においても、広くドイツとオーストリア、ならびに「ロマンティック・イメージ」に関する社会史、政治史、文化史関係の文献を収集した。とりわけ「日本ロマンチック街道」の起点の1つである草津、およびロマンティック・イメージと草津をつなぐ催し物である草津国際アカデミー&フェスティヴァルや同地の観光案内所において調査を実施することにより、我が国におけるロマンティック・イメージのPR方法、さらにそこから育まれた日本独自の「ロマンティック・イメージ」とドイツとオースリア観光の実態の解明を進めていった。なお調査では、PCやスキャナーを連動させて現地で入手した資料を速やかに電子処理すると同時に、迅速かつシステマティックに電子テキスト化をはかった。こうした資料収集作業を経ることによって、5つの時代および5つのトピックからドイツとオーストリアにおける「ロマンティック・イメージ」の歴史を俯瞰することが可能になり、次年度以降の研究の発展に大いに資することとなった。平成31年度は、平成30年度の調査を継続しつつ、ドイツとオーストリアにおける神聖ローマ帝国時代の代表的都市であるフランクフルトとウィーン、代表的観光街道であるロマンティック街道とアルペン街道を具体的な事例の中心に据えながら、観光政策を通じて浮かび上がるロマンティック・イメージの変遷、並びにそのようなイメージに基づいて作られる各都市や観光街道のイメージが「観光立国」としてのドイツやオーストリアにいかなる形で反映されたのか、という問題についての詳細な分析を行う。分析にあたっては、平成30年度の成果を踏まえ、以下のトピックを研究の柱とする。
フリーラジカルに対する生体防御物質の開発研究

活性酸素のようなフリーラジカルは生体内で常に生成され、放射線や紫外線などの外的要因や、様々な内的要因によっても生成する。通常は、生体の制御システムによりそれらが消去されるが、消去が不充分だと種々の疾患が生じる。本研究では、種々のフリーラジカルの消去化合物を探索した。消去能はDMPOを用いるESR-スピントラッピング法などで評価した。また致死量の放射線に対する防護能を調べるためマウスに7-8Gyの放射線を照射して30日間の生存率を調べ防護能を調べた。今回用いた抗酸化剤は、カテキンのようなポリフェノール誘導体や、ビタミンEやTMGのようなフェノール性化合物、システアミンやセレノメチオニンのようなチオール其を有する化合物である。スーパーオキシド消去活性ではTMGやカテキン類に強い消去作用が見られ、ヒドロキシルラジカル消去活性に関しては、TMGは、トロロックスより10倍強い消去能が認められた。フェノール性水酸基を持つ天然抗酸化物質のラジカル消去機構を調べ、カテキンはフリーラジカルへの電子移動を経由し、ビタミンEモデルでは、1段階の水素原子移動機構で進行することがわかった。活性酸素やフリーラジカルを消去して放射線防護作用を示すニトロキシルラジカルのペルオキシルラジカル消去機構を検討し、消去機構はペルオキシルラジカルからニトロキシルラジカルへの電子移動を経由することがわかった。このようにして得られた反応機構情報に基づき、平面型カテキン誘導体を合成した。電子供与性のアルキル基の導入は、電子移動の結果生成するカテキンラジカルカチオンを安定化するため、ラジカル消去反応が顕著に加速されると考えられる。実際、得られた平面型カテキン誘導体のフリーラジカル消去活性は、天然型カテキンに比べ5-10倍高かった。放射線防護薬剤としてニトロキシド類(MC-, HM-PROXYL)、エダラボン、水溶性ビタミンEのTMG、ミネラル含有熱処理酵母、γ-トコフェロール-N,N-ジメチルグリシンエステル塩酸塩を用い、マウスのX線全身照射に対し、防護剤を腹腔内に投与し、30日間生存率を指標としてその防護能を評価した。その結果MC-PROXYL(450mg/kg、DRF=1.2)、エダラボン(450mg/kg、DRF=1.3)に照射前投与において顕著な防護効果があった。しかし、照射後投与においてはこれらの防護剤に有効性は見られなかった。TMG、および亜鉛、銅、セレン等の抗酸化ミネラル含有熱処理酵母、ならびに□-トコフェロール-N,N-ジメチルグリシンエステル塩酸塩は照射後投与においても効果があった。TMGは、650mg/Kg腹腔内照射直後投与の場合のDRFは1.2であった。亜鉛含有酵母を照射(7.5Gy)直後投与(腹腔内100mg/kg)すると、30日生存率は90%以上であり、スーパーオキシド消去活性は亜鉛含有酵母が最も高かった。スーパーオキシド消去活性が高い酵母が高い防御効果を示し、被ばくにより生じる酸化的ストレスの制御が重要と考えられる。γ-トコフェロール-N,N-ジメチルグリシンエステル塩酸塩を照射直後に投与100mg/Kgすると、30日生存率は98%であり、皮下注射においても効果があった。照射後投与で防護活性を示し、骨髄死の線量で有効なことから免疫活性の賦活化が考えられる。

その結果MC-PROXYL(450mg/kg、DRF=1.2)、エダラボン(450mg/kg、DRF=1.3)に照射前投与において顕著な防護効果があった。しかし、照射後投与においてはこれらの防護剤に有効性は見られなかった。TMG、および亜鉛、銅、セレン等の抗酸化ミネラル含有熱処理酵母、ならびに□-トコフェロール-N,N-ジメチルグリシンエステル塩酸塩は照射後投与においても効果があった。TMGは、650mg/Kg腹腔内照射直後投与の場合のDRFは1.2であった。亜鉛含有酵母を照射(7.5Gy)直後投与(腹腔内100mg/kg)すると、30日生存率は90%以上であり、スーパーオキシド消去活性は亜鉛含有酵母が最も高かった。スーパーオキシド消去活性が高い酵母が高い防御効果を示し、被ばくにより生じる酸化的ストレスの制御が重要と考えられる。γ-トコフェロール-N,N-ジメチルグリシンエステル塩酸塩を照射直後に投与100mg/Kgすると、30日生存率は98%であり、皮下注射においても効果があった。照射後投与で防護活性を示し、骨髄死の線量で有効なことから免疫活性の賦活化が考えられる。生体が放射線や紫外線、低酸素状態(虚血)などの内的要因によるストレスに曝されると活性酸素などのフリーラジカルが生成する。それらは、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル、一酸化窒素などのラジカル種である。通常は生体が本来有しているフリーラジカル消去システムにより除去されるため障害は起こらない。障害は生体内で発生する活性酸素や活性窒素などのフリーラジカルが消去されない時に生じる。これらフリーラジカルによる生体成分の損傷は、核酸塩基の酸化や鎖の切断、蛋白質の酸化による酵素機能の不活性化、脂質過酸化であり、これらが蓄積すると種々の障害・疾病が生じる。本研究では、種々のフリーラジカル種に対する消去化合物を探索した。本年度は主としてスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルやペルオキシルラジカルの消去能について、電子スピン共鳴法によるスピントラッピング法、DPPHを用いる分光法によって、またin vivo評価においては致死量の放射線(7-8Gy)に対するマウスの30日間生存率を調べ有効性を調べた。また分解してヒドロキシルラジカルとNO2ラジカルを生成するパーオキシナイトライト(PN)についてその消去物質を探索した。今回用いた消去剤は、水溶性ビタミンE誘導体であるトロロックスに、システイン、ビタミンC誘導体、セレン含有化合物を、エステルあるいはアミド結合で共有させた化合物、ならびに平面型カテキン誘導体を化学合成した。これらの化合物のフリーラジカル消去能を調べ、トロロックスと同等のスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、ペルオキシルラジカル消去能を有していた。平面型カテキンは側鎖が長くなる程、分光法によるペルオキシルラジカル消去能は高くなったが、スーパーオキシドやヒドロキシルラジカル消去能は弱くなった。放射線照射に対するマウスを用いた防護能は、ビタミンC誘導体やセレン含有化合物に防護能が認められた。
不確実性下の設備投資関数に関する理論的・実証的研究

本研究によってなされた不確実性下の投資関数についての理論面での貢献は以下の通りである。1.不確実性回避が不確実性下の設備投資において果たす役割を考察するために、ナイト流の不確実性を考慮した確率的投資モデルを構築し分析した結果、ナイト流の不確実性の増大は設備投資を必ず減少させること、従来の意味での不確実性の増大(平均保存的分散の拡大)が投資に与える影響は、ナイト流の不確実性の大きさに決定的に依存することを明らかにした。2.Saltari and Ticchi(2005)の私の論文(Nakamura,1999)に対するコメントへの回答を通して、不確実性下の投資関数を分析する際には、危険回避と異時点間の代替性を区別する必要があることを指摘した。3.危険回避と異時点間の代替性が設備投資に与える影響をそれぞれ独立に分析することができる連続時間の非期待効用モデルを構築し分析し、これまでの不確実性下の投資関数がもっていた説明するのが困難な性質のいくつかが経済学的に比較的容易に説明できることを明らかにした。4.解析的な分析とそれを補完するMathematicaを用いた数値計算によって、資本設備の耐用年数が有限である場合、限界調整費用が小さい場合には投資は不確実性とともに単調に減少するが、大きい場合には逆に投資は不確実性とともに単調に増加し、限界調整費用が中間的な場合には不確実性が増大すると投資は初めのうちは上昇するがやがて減少するようになることを明らかにした。実証面では、製品の普及度・生産技術の不確実性を考慮して日本の製造業、特に家電産業について分析を行い、しばらくの間高い投資水準が続くことを指摘した。また、需要及び価格の不確実性を考慮した多変量GARCH(M-GARCH)を用いて日本の製造業の投資関数を推定したが、まだ明確な結論は得られておらず、これは今後の課題である。資本設備の耐用年数の有限性を明示的に組み込んだ離散型の設備投資モデルを構築し分析を進めた。企業の計画視野よりも設備の耐用年数が短く、かつ生産関数が規模に関して収穫逓減的である場合、投資の調整費用関数の形状が、不確実性と設備投資の関係を決定する際に大きな役割を果たすことが明らかになってきた。この点については、Mathematicaを用いた数値計算で最適投資関数の性質をより詳しく調べているところである。不確実性下の投資行動において、企業の危険に対する態度(危険回避)と異時点間の代替性が果たす役割を明確に区別するために、成長理論において用いられている「非期待効用(Non-Expected Utility)」を導入した連続型モデルを構築し分析を行った。その結果、従来の期待効用最大化モデルでは説明できなかった、非常に危険回避的な企業は危険中立的な企業と同じように振舞うというやや逆説的な結論が、異時点間の代替の弾力性を用いてうまく説明できることが明らかになった。経済学的含意をより明確にするために検討を加えている段階である。不確実性を避けようとする行動(不確実性回避)が設備投資にどのような影響を及ぼすのかを分析するために、ナイト流の不確実性(Knightian Uncertainty)とそれを扱える確率過程についての研究を始めた。試みとして非常に簡単な連続型モデルを用いて投資関数を求めてみた。その結果、ナイト流の不確実性は従来の不確実性(平均保存的分散の拡大)とは違う影響を投資に与える可能性があることが分かってきた。実証研究ついては、日本の製造業のデータを使ってGARCH-in-Meanモデルあるいは多変量GARCH-in-Meanによる推定を行うために、従来の実証研究に関するサーベイを行なうと同時に、必要なデータの収集・整理を行っている段階である。

昨年度構築した資本設備の耐用年数の有限性を明示的に組み込んだ離散型の設備投資モデルを改良し詳しく分析した。解析的な分析から得られた予測を確かめるために、Mathematicaを用いて数値計算を行った結果、投資の限界調整費用が投資と不確実性の関係に大きな影響を与えることが明らかになった。限界調整費用が小さい場合には投資は不確実性とともに単調に減少するが、大きい場合には逆に投資は不確実性とともに単調に増加する。また、限界調整費用が中間的な場合には不確実性が増大すると投資は初めのうちは上昇するがやがて減少するようになる。理論面ではさらに、不確実性を避けようとする行動(不確実性回避)が設備投資及び設備投資と不確実性との関係にどのような影響を及ぼすのかを分析するために、ナイト流の不確実性(Knightian Uncertainty)を組み込んだ連続型の確率的投資モデルを構築し分析した。その結果、ナイト流の不確実性の増大は設備投資を必ず減少させること、従来の意味での不確実性の増大(平均保存的分散の拡大)が投資に与える影響は、ナイト流の不確実性の大きさ(不確実性回避)に決定的に依存することが明らかになった。実証研究については、従来の研究結果のサーベイを行うと同時に、研究補助者に協力してもらいながら日本の製造業に関するデータを収集し、その整理・加工を行った。理論分析において需要及び価格の不確実性を想定しているので、それに対応した実証モデルを構築するために最新の計量経済学研究書籍に依拠しながらGARCH-in-Mean、あるいは多変量GARCH(M-GARCH-in-Mean)モデルの特定化を進めている。一昨年度構築し分析した「非期待効用(Non-Expected Utility)」を導入した連続型の設備投資モデルから得られた結論の経済学的意味合いを明確にするために、設備投資と同時に金融的投資を考慮した不確実性下の家計の動学的最適化行動を導入したマクロ経済モデルを構築し分析を行った。その結果、不確実性下においては異時点間の代替の弾力性が危険回避度とは大きく異なる役割を果たすこと及びその直感的かつ経済学的な含意が明らかになった。理論面でのもう一つの課題であった不確実性回避と危険回避が不確実性下の設備投資に与える影響についても、昨年度構築したナイト流の不確実性(Knightian Uncertainty)を組み込んだ確率的投資モデルを用いてさらなる分析を行い、ナイト流の不確実性の大きさ(不確実性回避)が大きければ、不確実性の増大(平均保存的分散の拡大)が投資を減少させることが明らかになった。実証研究においては、まず、日本の製造業全体及びその中のいつかの代表的な産業について売上高・設備投資・資本ストック等のデータを収集し、その整理・加工を行った。理論分析においては需要及び価格の不確実性を想定しているので、実証研究では売上高の分散を不確実性の尺度とし分析を行った。具体的には、GARCH(1,1)モデルで売上高を推定しその条件付分散を不確実性の尺度として捉え、売上高の予測値及びその分散を説明変数として投資関数を推定した。その結果、売上高の成長が遅い時期には設備投資と不確実性の間に明確な負の相関関係が現れるが、成長が早い時期についての分析からは必ずしも明確な負の相関関係は得られなかった。
腋芽形成を決定するLAXの分子機能の解明

今年度の成果LAXの細胞非自律的な働きlax変異体では腋生分裂組織が作られないことから、LAXの機能は腋生分裂組織が形成される部位で発揮されると予想されたが、予想に反してLAX mRNAは腋芽の向軸側の境界で層状に発現した。LAXタンパク質の局在を調べたところ、LAXタンパク質の局在はmRNAが観察される領域から腋生分裂組織方向にずれていることがわかった。したがって、LAXタンパク質は方向性を持って細胞間を異動していることが示唆された。log変異体では花芽分裂組織が正常に維持されず、花器官数が減少する。また、形成される花芽の数も少なく、小さな穂を形成する。理研植物科学センターの榊原均博士との共同研究により、LOG遺伝子はサイトカイニン合成の最終ステップである、ヌクレオチド型サイトカイニンからのヌクレオチドの離脱を触媒する酵素をコードすることが明らかになった。LOGは茎頂分裂組織の先端部分の非常に限られた領域で発現する。したがって、植物体中では茎頂分裂組織を維持するために局所的にサイトカイニンを活性化する機構が働いていることが示された。将来の展望イネでは、穂に形成される花芽の数は、穂の枝の先端の花序分裂組織が花芽に転換するタイミングによって決まる。今後は、LAXや、LOG遺伝子の機能に関してさらなる解析を行うことにより、サイトカイニンと分裂組織の相転換のかかわりについて新たな知見が得られるものと期待される。LAXは、腋生分裂組織の形成過程を進行させるために必須である。LAXはbHLHドメインを持つ転写因子をコードし、新たに分化する腋芽の向軸側の境界で層状に発現する。このLAXの発現部位(腋芽の境界)と機能が発揮される部位(腋芽の中心部)のずれは、LAXの非細胞自律的な働きを意味する。植物の成長においては、茎頂分裂組織から葉原基が分化し、その腋に腋芽が分化するという過程が繰り返される。したがって、葉原基や腋芽と茎頂との境界領域も繰り返し出現する。これらの境界領域(およびそこで発現する遺伝子)は分化にとって積極的な機能を持つと考えられるが、その具体的な機能は示されていない。そこで、LAXがどのようにその機能を伝達して腋生分裂組織形成に貢献するかというLAXの分子機能の解析を通して、境界領域の機能を明らかにすることを大きな目的とする。今年度はLAXの下流因子を決定し、LAXの転写因子としての機能を明らかにすることをめざした。LAXの下流で働く因子の同定網羅的解析と誘導系を用いた解析により、DOFドメイン遺伝子(OsDOF)をLAXの下流で働く遺伝子として同定した。OsDOFはLAXにより発現が誘導され、lax変異体では発現が消失する。また、OsDOFとLAX mRNAの発現パターンはほぼ一致する。OsDOFの発現誘導が迅速に起こることから、OsDOFはLAXに非常に近い因子であると考えているが、イースト・ワン・ハイブリッド解析やゲルシフト解析では、LAXのOsDOFプロモーターへの結合は確認されなかった。LAXダイマーパートナーの同定と機能解析LAXがヘテロダイマーとして働く可能性を検証するために、ダイマーパートナーを探索した。その結果、bHLHドメインを持つ転写因子と2つの機能未知タンパク質が同定された。bHLH遺伝子(LAXP)は茎頂と根端で特異的に発現する。また、トランジエントアッセイによりLAXPがOsDOFの発現を誘導することを確認した。茎頂分裂組織の維持に必要なLONELYGUY (LOG)の解析log変異体では花芽分裂組織が正常に維持されず、花器官数が減少する。
母音知覚の系統および個体発達に関する研究

この研究ではヒトの幼児とヒト以外の霊長類の母音の知覚、とくに声道長の正規化とプロトタイプ効果を検討した。母音は一般に第1,2ホルマントによって特徴づけられる。ホルマントは声道のフィルタ-特性によって生じるエネルギ-の通過しやすい周波数帯域であり、それは舌の位置、口唇の形などによって変化する。さらにホルマントは、たとえ同一の構音動作による発話でも、声道長によって変わってくる。ヒトの声道は、男性、女性で、また成人、幼児でその長さが異なる。それゆえ同じ母音であっても発話者によってホルマントは異なる。一般に成人男性、女性、幼児の順序で、ホルマント周波数は高くなる。ホルマント周波数の絶対値で母音を判断しているならば、われわれはしばしば母音の混同を経験するはずであるが、そのようなことは少ない。それは母音の基本周波数などを手がかりにして(一般に幼児、女性では基本周波数が高い)、声道長を補正していることを示唆する。これを母音の正規化と云い、音声言語成立の前提条件をなすと考えられる。この研究では、ヒトの声道長の正規化の能力の発達的変化と、チンパンジ-,ニホンザルにおける正規化の検討を行なった。一方それぞれの母音は典型例を持つと考えられる。母音の種類は言語によって異なるので、典型(原型、プロトタイプ)が幼児期のどの時点で成立するかは、国際化が叫ばれる現在、興味深い。ヒトとチンパンジ-では発話する母音(的音声)が異なるので、母音のプロトタイプも異なることが考えられる。本研究ではその点も検討した。声道長の正規化については、[O]ー[a]の母音系列を、基本周波数などを変えて2種類合成した。一方は成人男性、一方は女性の声と判断される。被験体は成人、3ー5歳児、5ー7カ月児、チンパンジ-、ニホンザルであった。成人、3ー5歳児では母音系列をランダムに提示し、筆記、口頭、絵カ-ドで解答させた。一方5ー7カ月児では、分担者のKuhlのところで修得した頭部回転法で検討した。この方法では、母音が変化すると幼児は顔を人形の方に向け、その反応は人形が動いたり、音や光を出すことにより強化される。一種のオペラント条件づけである。チンパンジ-、ニホンザルでは母音が変化するとキイから手を離す課題(反応時間課題とよばれ、手を離す反応時間が測定される)により検討された。その結果、成人と3ー5歳児では声道長の正規化の能力がみられ、基本周波数が高くなると(女性の声)、[O]ー[a]の境界がホルマント周波数が高い方に移動した。3ー5歳児の方が移動量が多く、基本周波数の影響を受け易かった。また5名の5ー7カ月児では、正規化の能力を示すものと示さぬものがいた。実験手続きの問題もあり、被験者を増やしてさらに検討する必要がある。チンパンジ-、ニホンザルでは、検討は間接的になるが、正規化を示唆する結果を得た。一方、プロトタイプ効果については、[u]ー[i]の母音系列を合成してチンパンジ-で検討した。チンパンジ-は[u]と聴取される音声を持つが、筆者は[i]を聴取したことはない。このような母音のレパ-トリ-の相違は、当然ヒトとチンパンジ-で異なる母音のプロトタイプを予想させる。分担者のKuhlは母音空間上で、プロトタイプの母音はそれと同一の母音と判断される範囲が、非プロトタイプの母音よりも広いことを示した(マグネット効果)。チンパンジ-においては、レパ-トリ-にある[u]に比べ[i]では、同一の母音と判断される範囲が狭いと考えられる。1頭のチンパンジ-で前述の反応時間法で、[u]ー[i]の母音系列の弁別を検討した。その結果、[u]と判断される範囲は、[i]と判断される範囲よりも広かった。これは上記の予測を裏づける結果である。この問題をKuhlはアメリカ人とスウェ-デン人の幼児で追求した。スウェ-デン語には英語にない母音([y])が[u]ー[i]の間にある。この母音のプロトタイプが、スウェ-デンの幼児にいつ成立するかを、アメリカ人の幼児との比較から検討した。方法ま前述の頭部回転法である。その結果6カ月齢のスウェ-デンの幼児が母音[y]のプロトパイプを持つことが示された。すなわち6カ月齢で母国語の影響が見られた。

この研究では、ヒトの声道長の正規化の能力の発達的変化と、チンパンジ-,ニホンザルにおける正規化の検討を行なった。一方それぞれの母音は典型例を持つと考えられる。母音の種類は言語によって異なるので、典型(原型、プロトタイプ)が幼児期のどの時点で成立するかは、国際化が叫ばれる現在、興味深い。ヒトとチンパンジ-では発話する母音(的音声)が異なるので、母音のプロトタイプも異なることが考えられる。本研究ではその点も検討した。声道長の正規化については、[O]ー[a]の母音系列を、基本周波数などを変えて2種類合成した。一方は成人男性、一方は女性の声と判断される。被験体は成人、3ー5歳児、5ー7カ月児、チンパンジ-、ニホンザルであった。成人、3ー5歳児では母音系列をランダムに提示し、筆記、口頭、絵カ-ドで解答させた。一方5ー7カ月児では、分担者のKuhlのところで修得した頭部回転法で検討した。この方法では、母音が変化すると幼児は顔を人形の方に向け、その反応は人形が動いたり、音や光を出すことにより強化される。一種のオペラント条件づけである。チンパンジ-、ニホンザルでは母音が変化するとキイから手を離す課題(反応時間課題とよばれ、手を離す反応時間が測定される)により検討された。その結果、成人と3ー5歳児では声道長の正規化の能力がみられ、基本周波数が高くなると(女性の声)、[O]ー[a]の境界がホルマント周波数が高い方に移動した。3ー5歳児の方が移動量が多く、基本周波数の影響を受け易かった。また5名の5ー7カ月児では、正規化の能力を示すものと示さぬものがいた。実験手続きの問題もあり、被験者を増やしてさらに検討する必要がある。チンパンジ-、ニホンザルでは、検討は間接的になるが、正規化を示唆する結果を得た。一方、プロトタイプ効果については、[u]ー[i]の母音系列を合成してチンパンジ-で検討した。チンパンジ-は[u]と聴取される音声を持つが、筆者は[i]を聴取したことはない。このような母音のレパ-トリ-の相違は、当然ヒトとチンパンジ-で異なる母音のプロトタイプを予想させる。分担者のKuhlは母音空間上で、プロトタイプの母音はそれと同一の母音と判断される範囲が、非プロトタイプの母音よりも広いことを示した(マグネット効果)。チンパンジ-においては、レパ-トリ-にある[u]に比べ[i]では、同一の母音と判断される範囲が狭いと考えられる。1頭のチンパンジ-で前述の反応時間法で、[u]ー[i]の母音系列の弁別を検討した。その結果、[u]と判断される範囲は、[i]と判断される範囲よりも広かった。これは上記の予測を裏づける結果である。この問題をKuhlはアメリカ人とスウェ-デン人の幼児で追求した。スウェ-デン語には英語にない母音([y])が[u]ー[i]の間にある。この母音のプロトタイプが、スウェ-デンの幼児にいつ成立するかを、アメリカ人の幼児との比較から検討した。方法ま前述の頭部回転法である。その結果6カ月齢のスウェ-デンの幼児が母音[y]のプロトパイプを持つことが示された。すなわち6カ月齢で母国語の影響が見られた。
流体潤滑膜中の高せん断速度場を利用した流体の成分分離に関する研究

本研究の目的は,潤滑油を含む多成分系液体,炭化水素および水を溶媒とした各種の溶液を用いて,すべり接触において,接触域中での成分分離発生の有無を確認するとともに,その発生機構,発生条件を明確にすることと,基礎的なせん断速度試験を実施し,せん断速度と溶解度の関係を検討することにより,せん断場が溶媒の溶解能力や溶質の溶解状態に与える影響を明らかにすることである.成果は次の通りである.多成分系の炭化水素系の合成潤滑油における成分分離現象に関する成果1.潤滑油の構成成分の同定が,炭化水素系潤滑油の赤外分光IRスペクトル中のC-H変角振動に伴う2つの吸収ピーク強度の比,またエステル等の極性基を有する潤滑油に対しては極性基の起因する吸収強度により可能なことを明らかにした.2.顕微FT-IR装置内に点接触および線接触滑り接触試験機を組込み,接触部入り口域での潤滑油成分構成の変化を測定した.その結果,線接触,点接触両試験において,境域分子量分布油では入り口域での成分構成の変化は観測されなかった.一方,広域分子量分布油では,線接触滑り試験では成分の分離は生じなかったが,点接触滑り試験においては,入り口域で低粘度成分の比率が増加し,低粘度成分が接触域に優先的に導入されることを見いだした.3.入り口部での成分分離が生じるかどうかは,潤滑油を構成する炭化水素,極性基の種類,分子量分布の広狭の程度により異なり,点接触条件下での必ずしも成分分離が発生する訳ではない.また,ステアリン酸(固体)添加潤滑油,砂糖水溶液によるせん断試験において,せん断試験前後のステアリン酸,上白糖の溶解度に差が認められる例が生じたが,この点は再現性のチェックが必要である.本研究の目的は,潤滑油を含む多成分系液体,炭化水素および水を溶媒とした各種の溶液を用いて,すべり接触において,接触域中での成分分離の発生の有無の確認するとともに,その発生機構,発生条件を明確にすることと,基礎的なせん断速度試験を実施し,せん断速度と溶解度の関係を検討することにより,せん断場が溶媒の溶解能力や溶質の溶解状態に与える影響を明らかにすることである.本年度は,多成分系の炭化水素系の合成潤滑油における成分分離現象の観察を中心に研究を実施した.研究の概要を以下に示す.1.潤滑油の構成成分の同定が,炭化水素系潤滑油の赤外分光IRスペクトル中のC-H変角振動に伴う2つの吸収ピーク強度の比,またエステル等の極性基を有する潤滑油に対しては極性基の起因する吸収強度をにより可能なことを明らかにした.2.顕微FT-IR装置内に点接触および線接触滑り接触試験機を組込み,接触部入り口域での潤滑油成分構成の変化を測定した.その結果,線接触,点接触両試験において,境域分子量分布油では入り口域での成分構成の変化は観測されなかった.一方,広域分子量分布油では,線接触滑り試験では成分の分離は生じなかったが,点接触滑り試験においては,入り口域で低粘度成分の比率が増加し,低粘度成分が接触域に優先的に導入されることを見いだした.3.入り口部での成分分離が生じるかどうかは,潤滑油を構成する炭化水素,極性基の種類,分子量分布の広狭の程度により異なり,点接触条件下での必ずしも成分分離が発生する訳ではない.本研究の目的は,潤滑油を含む多成分系液体,炭化水素および水を溶媒とした各種の溶液を用いて,すべり接触において,接触域中での成分分離発生の有無を確認するとともに,その発生機構,発生条件を明確にすることと,基礎的なせん断速度試験を実施し,せん断速度と溶解度の関係を検討することにより,せん断場が溶媒の溶解能力や溶質の溶解状態に与える影響を明らかにすることである.成果は次の通りである.多成分系の炭化水素系の合成潤滑油における成分分離現象に関する成果1.潤滑油の構成成分の同定が,炭化水素系潤滑油の赤外分光IRスペクトル中のC-H変角振動に伴う2つの吸収ピーク強度の比,またエステル等の極性基を有する潤滑油に対しては極性基の起因する吸収強度により可能なことを明らかにした.2.顕微FT-IR装置内に点接触および線接触滑り接触試験機を組込み,接触部入り口域での潤滑油成分構成の変化を測定した.その結果,線接触,点接触両試験において,境域分子量分布油では入り口域での成分構成の変化は観測されなかった.一方,広域分子量分布油では,線接触滑り試験では成分の分離は生じなかったが,点接触滑り試験においては,入り口域で低粘度成分の比率が増加し,低粘度成分が接触域に優先的に導入されることを見いだした.3.入り口部での成分分離が生じるかどうかは,潤滑油を構成する炭化水素,極性基の種類,分子量分布の広狭の程度により異なり,点接触条件下での必ずしも成分分離が発生する訳ではない.また,ステアリン酸(固体)添加潤滑油,砂糖水溶液によるせん断試験において,せん断試験前後のステアリン酸,上白糖の溶解度に差が認められる例が生じたが,この点は再現性のチェックが必要である.
乾燥ストレス耐性ペプチドを利用したタンパク質発現系の構築とその作用機構の解明

ネムリユスリカのLEAタンパク質を参考に設計した13アミノ酸のLEAペプチドを大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると、細胞当たりの目的タンパク質の発現量が倍増する事をこれまでに明らかにしてきた。本研究では、ペプチド配列のルールに則ったライブラリーを作成し、その中からタンパク質発現効率の増大を示すLEAペプチド配列を探索した。その結果、配列中のグリシンをリシンやアスパラギンに置換するとLEAペプチドの効果が増大することを明らかにした。また、LEAペプチドの発現量および発現誘導を制御することで、LEAペプチドを共発現させない時と比べて目的タンパク質の発現量を最大で10倍増大させることに成功した。本研究の目的は、組換えタンパク質の効率的な生産方法について、独自に開発したタンパク質の高効率発現系を開発・発展させることである。目的タンパク質を大腸菌に発現させる時に、乾燥ストレス耐性タンパク質をベースに設計したペプチド(LEAペプチド)を共発現させると、目的タンパク質の発現量が倍増することを研究代表者はこれまでに見出した。本手法は、目的タンパク質を高効率に発現させる手法として他にはない独特な技術である。本発現システムの実用化を念頭に、本年度は発現量が増大する新規ペプチドの探索をおこなった。これまでの研究で、タンパク質発現量増大の効果が得られたLEAペプチド(AKDGTKEKAGE配列)は、その発現効率の増大が最大で2倍であった。実用化を図るうえで、発現効率の増大をこれまで以上にもたらす新規ペプチドを探索する必要性がある。LEAタンパク質は、規則性をもつ11アミノ酸が繰り返し存在する特徴的な親水性タンパク質である。その配列の特徴として一般的に、1,5,9番目に疎水基、3,7,11番目に負電荷基、6,8番目に正電荷基をもつアミノ酸を有する。これまでに設計・使用してきたLEAペプチドは5番目の配列が親水性であったため、疎水性を有するアミノ酸(ロイシン)に置換した新規LEAペプチドを設計し、目的のタンパク質と共発現させた。その結果、これまで得られていた発現量よりもさらにその発現量が増強された。また、とくに規則性が求められていない4番目と10番目のアミノ酸配列に着目し、そこに変異を入れたペプチドライブラリーの設計を行い、それらを発現する共発現ライブラリーの構築を行った。本発現システムの実用化を念頭に、本年度は前年度までに作成したペプチドライブラリーを用いて、目的タンパク質の発現量をこれまで以上に亢進させる新規LEAペプチドを見出すことを目的としている。また、本技術の汎用性を確認するため、他の宿主用いた評価も行った。これまでの研究成果として、タンパク質発現量増大の効果が得られたLEAペプチドは、その発現効率の増大が最大で2倍であった。LEAペプチドの配列で規則性が求められていない4番目と10番目のG配列に着目し、そこに変異を入れたペプチドライブラリーを前年度までに行い、本年度は、まず発現量の増大効果を与えるペプチドのスクリーニングを行った。設計したペプチドにおいて、GをSに変異させたペプチドを除いて、他の新規LEAペプチドを共発現させたときに目的タンパク質の発現量が増大した。とくにGをKやNに置換したLEAペプチドは今までに最も目的タンパク質の発現量を増大させていたペプチドを上回る効果が得られた。一方、他の宿主を用いた評価も実施した。コドンバイアスによる発現抑制を解消するために作成されたRosetta種を用いて評価した際も、同様にLEAペプチドによる発現量増大効果を確認した。他の宿主を用いた発現に関しても、現在検討中である。遺伝子組換え技術の発展と共に、高等生物の酵素や抗体といった機能性タンパク質を大腸菌や酵母などの細胞を利用して大量生産することが汎用的な手法となってきた。その一方、シンプルなプロセスによる、新しい有用タンパク質の高効率生産技術の開発が望まれている。本年度はこれまでに作成したペプチドライブラリーを用いて、目的タンパク質の発現量をこれまで以上に亢進させる新規LEAペプチドを見出す研究を前年度から継続して推進した。一方、LEAペプチドの細胞内での発現量が制御できる共発現系を構築した。これにより、LEAペプチド発現の量的な変化が共発現するタンパク質の発現量にどのような影響を与えるのかを明らかにした。このLEAペプチド発現量の量的制御により、これまで得られた増大効果を飛躍的に向上させることに成功した。また大腸菌の発現システムを利用した無細胞タンパク質発現系を用いて、共発現タンパク質の発現量が増大するメカニズムの解明を実施した。

抗体・酵素等のほ乳類由来の機能性タンパク質は、糖鎖修飾などの翻訳後修飾が必要であり、それらの工業的大量生産には大腸菌等の原核細胞を用いた発現系ではなく、一般的に真核細胞の発現系が多く用いられる。本研究では、共発現システムを酵母細胞発現系への応用を目指し、その発現系の構築を行った。ネムリユスリカのLEAタンパク質を参考に設計した13アミノ酸のLEAペプチドを大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると、細胞当たりの目的タンパク質の発現量が倍増する事をこれまでに明らかにしてきた。本研究では、ペプチド配列のルールに則ったライブラリーを作成し、その中からタンパク質発現効率の増大を示すLEAペプチド配列を探索した。その結果、配列中のグリシンをリシンやアスパラギンに置換するとLEAペプチドの効果が増大することを明らかにした。また、LEAペプチドの発現量および発現誘導を制御することで、LEAペプチドを共発現させない時と比べて目的タンパク質の発現量を最大で10倍増大させることに成功した。本研究では、以下の3つの項目を解決すべき問題として取り上げ、それを研究目的として、推進している。1.実用化を推進するためのペプチド配列の至適化2.他の宿主を用いた発現系への応用展開3. LEAペプチドの細胞内での作用機序の解明2年目は、LEAペプチドの配列ルールに則った機能性ペプチドライブラリーからタンパク質発現効率増大を示す機能性ペプチド配列を探索し、配列の至適化を行うことが最大の目標である。その結果、研究実績の概要に示したように、これまでに得られたペプチドよりも発現量増大効果を有するペプチドのスクリーニングに成功した。他の宿主を用いた実験においては、評価対象が少ないものの、その汎用性を明らかにしつつある。LEAペプチドの細胞内での作用機序の解明に向けて、その取りかかりとしてペプチド発現量の制御による目的タンパク質の発現量増大への影響について検討を始め、足がかりとなるデータを収集している。以上のことから、最終年度の細胞内での作用機序の解明に向け、順調に研究が進んでいると考えている。生物工学得られたペプチド配列を分子シミュレーションソフトウェア:MOE(Molecular Operating Environment)を用いて、その構造およびタンパク質への結合予測を行う。得られたペプチドの構造パターンから、タンパク質への吸着部位および分散を促進する部位を見出し、本ペプチドによる発現量増大効果のメカニズム解明への足がかりとする。酵母によるタンパク質発現システムは、工業用酵素の生産で利用例が多く、適切な折りたたみ構造および糖修飾を要するタンパク質の生産に広く利用されている。当共発現システムを酵母細胞発現系へ応用し、その汎用性を確証する。
同位元素分布を変調した化合物半導体超格子構造の創製とその物性

ワイドギャップ化合物半導体である酸化亜鉛(ZnO)、窒化ガリウム(GaN)、窒化アルミニウム(AlN)を対象として、電子状態は同じであるが質量数が異なる同位元素を任意に分布させた人工超格子構造を作製した。作製した超格子構造について、同位元素の変調ドーピングに伴う格子振動、および、結晶学的、光学的な変化について調査した。さらに、同位元素の質量差を利用した精密な質量分析を実施し、正確な拡散係数の算出、および、薄膜の欠陥構造、微粒子の成長機構の解明に成功した。フォノンや核スピンが寄与する物性を制御するために、同位元素を利用した質量数変調人工超格子について、作製プロセスの確立を主とした研究を実施した。1.酸化物質量数変調人工超格子パルスレーザー堆積法を用いてZnO薄膜について検討した。質量数16の酸素から構成されるZnO焼結体をターゲットとし、質量数18の酸素ガスを活性化して供給することで、ZnO薄膜の酸素同位体比を制御できることを明らかにした。また、ターゲットとして利用するZnO焼結体を亜鉛の質量数64のZnOと亜鉛の質量数68のZnOから作製することで、ZnO薄膜の亜鉛同位体比を制御することにも成功した。これらのプロセスにより、ZnOの陽イオン、陰イオンの同位体比を任意に制御したZnO薄膜の作製を可能にした。2.窒化物質量数変調人工超格子分子線エピタキシー法により、AlN,GaN,InN薄膜を検討した。質量数14の窒素と質量数15の窒素を独立に活性化して供給できるように、既設のMBE装置を改良し、質量数14から構成されるIIIb族窒化物と質量数15から構成されるIIIb族窒化物の作製に成功した。3.分析・評価質量数の異なる同位元素を導入することによる物性の変化をXRD測定、PL測定、ラマン分光法等を用いて調査した。格子定数、バンドギャップ、格子振動に変化が確認され、作製した薄膜のフォノンに変化が生じていることを明らかにした。また、2次イオン質量分析を用いた同位元素の分析により、人工超格子や、デバイス作製の際に有益な情報となる自己拡散係数や、界面における拡散現象を調査した。このように、同位元素を利用する新しい概念の人工超格子作製プロセスの確立に成功し、さらに、同位元素の利用によるフォノンが寄与する物性の制御が可能であることを明らかにした。ZnO、AlNについて、質量数変調人工超格子の作製、および、それらの二次イオン質量分析法(SIMS)による評価を中心とした研究を実施した。1.ZnO質量数変調人工超格子の作製PLD法を用いて、亜鉛、酸素の質量数を変調させた[(^<64>ZnO)_x/(^<68>ZnO)_y]_z、[(Zn^<16>O)_x/(Zn^<18>O)_y]_zを合成した。同位体亜鉛、同位体酸素を制御した焼結体を合成し、これらを交互にターゲットとして利用し、積層構造を作製した。同位体酸素を制御した焼結体は、H_2^<18>Oを用いた水溶液プロセスにより合成したZn^<18>O粉末を原料とした。2.AlN質量数変調人工超格子の作製MBE法を用いて、窒素の質量数を変調させた[(Al^<14>N)_x/(Al^<15>N)_y]_zを合成した。アルミニウムはK-cellから供給し、^<14>Nと^<15>Nはそれぞれ独立したラジカルガンから供給した。同位体窒素比は、ラジカルガンのシャッター開閉により制御した。3.分析・評価質量数変調人工超格子の構造を評価するには、SIMSが有用であることから、作製した質量数変調人工超格子の一次イオンのイオンミキシングに関わる効果を評価した。その結果、ミキシングの効果は23nm程度、ラフネスの効果は膜厚の0.3%程度であることが判明した。以上のことを考慮した結果、窒素イオンを同位体変調した試料では、2nm周期程度の試料で急峻な同位体界面が形成されていることが判明した。前年度までに確立した同位体薄膜の合成プロセスを用いて、ZnO、GaN、AlNの同位体人工超格子を合成し、拡散係数の算出など、物性評価を中心とした研究を実施した。PLD法を用いて、Zn、Oの質量数を変調させた[(^<64>ZnO)_x/(^<68>ZnO)_y]_z、[(Zn^<16>O)_x/(Zn^<18>)_y]_zを合成し、拡散焼鈍、SIMS分析を行い、ZnOの拡散現象を調査した。ZnO薄膜中の陽イオン、陰イオンそれぞれの拡散係数、拡散係数の深さ方向依存性とその原因、ZnO薄膜中の拡散機構について明らかにした。

MBE法を用いてGa^<14>N、Ga^<15>N、これらの多層薄膜を作製し、^<15>N置換の効果を調査した。置換により、格子振動、バンドギャップ、格子定数が変化することを明らかにした。さらに、拡散焼純、SIMS分析から、GaN中の陽イオン、窒素イオンの拡散係数を精密に求めることに成功した。MBE法を用いて、窒素の質量数を変調させた[(Al^<14>N)_x/(Al^<15>N)_y]_zを合成した。これらの拡散焼鈍、SIMS分析により、初めてAlN中の窒素イオンの拡散係数を算出することに成功した。AlN中の窒素の拡散係数は、アルミナ単結晶中の酸素の拡散係数より二桁、Si_3N_4薄膜中の窒素拡散より一桁以上低い値であることが判明した。また、^<15>N置換試料、積層化試料の格子定数、格子振動の評価、DACを用いた高圧化での構造解析、フォノンモードの理論計算も実施した。
スギ花粉アレルゲンIgEエピトープのファージディスプレー法による検策

スギ花粉症は、戦後の植林に加えて住居環境の変化、食生活の変化、環境汚染、の増加等の要因から急増傾向にあり、深刻な社会問題の一つとなっている。しかし、即効性の一時的な対症療法剤に依存せざるを得ないのが現状である。そこで、スギアレルゲンを網羅的に解明するためにスギ花粉遺伝子工学的アレルゲン分子種の解明を行った。この方法により、CJP-3とCJP-6の重要なアレルゲンを発見した。次にスギ花粉タンパク質のプロテオーム解析を行った。スギ花粉アレルゲンタンパク質を2次元電気泳動を行い、蛋白染色の強いものからMALDI-トフマスを用いてアミノ酸シークエンスを決定し、患者血清IgEとの反応性から患者IgEとの反応頻度マップを作成した。その結果、少なくとも40人の花粉症患者の一人以上と反応するスギ花粉アレルゲンは131個存ストレス在した。スギ花粉症に関係する候補蛋白をリストアップし、この方法により、スギ花粉症を引き起こす総アレルゲンが明らかとなり、重要度のランク付けが行われた。さらに、IgEエピトープを構成するコンフォーメーショナルな構造を解明するために花粉アレルゲンのファージディスプレイ法によるエピトープの決定を行った。主要抗原を用いて行い代表的なペプチドの配列が見出されたが、まだ、主要タンパク質との立体的な照らし合わせが行われていない状態にある。スギ花粉症は日本人の13%以上の人が罹患する非常に重篤なアレルギーである。これに対するアレルゲンは現在Cryj1とCryJ2が良く研究されているが、そのIgEエピトープは未だ解明されていない。また、その他のアレルゲンについては我々の所で発見したCJP6のみであり、全く情報がない状態にある。いろいろな治療が施されているにも関わらず、花粉症の患者の60%を越えるひとが、治療に不満を抱いていることがアンケート結果から明らかである。その原因としては花粉抗原の洗い出しが不十分であるために適切な抗原による治療が受けれないことも1原因である。その点をふまえて、今回は研究のスタートが秋期からであったので、まず、スギ花粉アレルゲン分子種構成の解明から研究をスタートした。スギ花粉タンパク質をHoeferDALTシステムを用いて2次元電気泳動し、さらにウェスターンプロットを行い、スギ花粉全タンパク質スポットの中からスギアレルゲンタンパク質スポットを選別した。スギ患者IgEとの反応頻度を45人の患者血清を用いて測定した結果、10%以上の患者がIgEを持っているスギアレルゲンタンパク質が108個存在した。40%以上の患者血清IgEが反応するタンパク質が41個存在した。これまでスギ花粉アレルゲンは3個しか同定されておらず圧倒的多数のアレルゲンが未同定のままであることが明らかとなった。MALDI-トフマスを用いてアミノ酸シークエンスを決定したところ、Cryj1は9個の同位体が存在し、それぞれの同位体において患者IgEとの反応頻度に差があった。Cryj2には3個存在したが、患者IgEとの反応頻度には差がみられなかった。又患者間でもっているスギ特異的IgE抗体にかなり違いがあることから、この2次限のイムノブロットは花粉症の診断に威力を発揮するものと考えられた。前回までにスギ花粉アレルゲンに対する多数のアレルゲンが存在することが明らかとなった。これらアレルゲンのスギ花粉症患者血清IgEと結合するエピトープ構造を明らかにするために、今年度はファージディスプレー法を用いてIgEエピトープの解明を行うこととした。患者血清IgEは微量で沢山の種類が含まれるため、まずは市販のスギ花粉の主要抗原Cry j 1のモノクローナル抗体とランダムにペプチドを発現するM13ファージとの反応を解析した。1、スギ花粉の主要抗原Cry j 1モノクロナル抗体と反応するファージの取得Cry j 1モノクロナル抗体を結合したウェルにM13ファージライブラリーを加え、室温で1時間振盪した。ウェルをTBSTで10回洗浄し、モノクローナル抗体に結合したファージを0.2MGlycine-HCl(pH2.2)で溶出した。

溶出したファージを1M Tris-HCl(pH9.1)15μlで中和し、大腸菌ER2738株に感染させた。精製し、溶菌させ、再度ウェルに固定化されたCry j 1モノクロナル抗体に結合させた。これらの行程を6回繰り返し、2種類のモノクローナル抗体を用いて10個のファージを取得した。さらにこのようにして得たファージをウェルに固定化して、それにCry j 1モノクロナル抗体を結合させることによって、さらに精製し最終的には3種類のファージを取得しファージDNAのシークエンス解析は行った。2、pectate lyase Aを利用したCry j 1のホモロジーモデリングCryj 1はpectate lyaseという酵素の1つであるので、Cryj 1の一次構造情報を利用してこれとホモロジーが高く既に立体構造の決定されているErwinia Chrysanthemi strain EC16を用いて、Cry j 1の三次構造を推定した。