hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化管吻合部狭窄に対する細胞シート治療の基礎的研究

以上より、順調に計画が進んでいると判断した。引き続き、本年度の成果を基に、RICの実験モデルで細胞シート移植を行う。また、食道胃吻合部狭窄モデルを再度行ってみる。本学では、他研究者との相談で決まったゲージで大形実験を行っている。したがって本研究は大形動物を使用しているため、頭数に制限があり、次年度に使用することとした。来年度は、他研究者と相談の上、実験可能なことを調整済みであり、研究を推進する予定である。
神経機能制御におけるユビキチン結合蛋白質依存的なエンドサイトーシスの機能的役割

本研究は、「神経細胞の形質膜上で形態形成や機能制御を担う膜型蛋白質が、ユビキチン(Ub)化修飾を受けた後にUb-結合蛋白質であるRabex-5によって、脂質ラフト/カベオラ依存的にエンドサイトーシスされる分子機構」の検証とその生理的な意義について解明することを目的としている。これまで私は(1)Rabex-5(Ub結合ドメインを含むN末端側領域)の融合蛋白質をカラムに結合させたアフィニティカラムを用いたスクリーニングを行った結果、形質膜上のコレステロールや受容体等が局在する脂質ラフトのエンドサイトーシスを制御するCaveolin-1が結合していた(未発表)、(2)実際にRabex-5のN末端側に位置するUb結合ドメイン近傍にはCaveolin-1と結合するためのコンセンサス配列が保存されている(未発表)、ことを見出している。そこで「Rabex-5とCaveolin-1タンパク質分子間相互作用」についてさらに検証するために、本年度(2013年4月2013年10月)はRabex-5を特異的に認識する3種類のペプチド抗体(それぞれRabex-5の14054番目のアミノ酸残基、28497番目のアミノ酸残基、3380394アミノ酸残基、のペプチド領域に対して)の作製を行い、ウエスタンブロッティング・免疫沈降法・細胞免疫染色法などによりそれら抗体の精度についての検討を行った。作製されたペプチド抗体は、Protein Gカラムおよび各ペプチドをカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて精製を行った後、検討を行った。しかしながら、今回作製したペプチド抗体は、ウエスタンブロッティングの結果から、Rabex-5以外のタンパク質を非特異的に認識する抗体であることが分かった。上記に示した以外のペプチド領域に対して抗体を作製すべきであることが考えられた。
ナノ表面構造制御による高感度バイオセンサの開発

本研究では高感度かつ高い選択性を持つミオグロビンバイオセンサの開発を目指している.特に昨年度,ブロッキング材としてポリエチレングリコール系分子の2-(2-Aminoethoxy)ethanolを用いることで,センシング表面での非特異吸着を大幅に抑制することに成功し,信頼性の大幅な向上につながった.一方で開発したセンサは再利用できないという問題点が残っていた.そこで本年度は再生可能なセンサの開発をすべく,抗体の一軸配向固定に用いているProtein G'の特性に着目し,再生可能なセンサの開発を試みた.Protein G'は,有る特定の方向でIgG抗体と特異結合するタンパク質である.中性溶液中でこの結合は維持されるが,酸性溶液中ではその結合を絶つ性質を持つ.この性質を利用し,使用後にミオグロビンと結合した抗ミオグロビン抗体を酸性溶液中で脱離させ,新しい抗体を再びProtein G'に捕獲させることでセンサの再生を試みた.Protein G'からの抗体脱離に使用可能な3種類(クエン酸,酢酸,グリシン)の酸性バッファーをとりあげ,濃度および浸漬時間を変化させて脱離と抗体再固定の条件を探った.結果,グリシンバッファー(0.2 mol/L, pH 2.5)に10分間浸漬することで抗体を脱離させることが可能であり,再び中性の抗体溶液中に浸漬することで新しい抗体を捕獲させ得ることが分かった.再生前後のインピーダンスセンサ特性の変化を,抗ミオグロビン抗体を固定化したミオグロビンセンサに関して調べた.その結果,計測可能な濃度範囲は両者でほぼ一致しており,本手法で新たな抗体が確かに固定化されていることが分かった.一方,再生後の試料におけるインピーダンスの増加率は元の7割程度に減少しており,グリシンによるブロッキング表面の変性の可能性があることが示唆された.本年度はProtein G (PrG)を用いて抗体分子を直立配向させた試料を作製し,この配向性試料のセンサ特性をランダム配向試料と比較することで抗体分子の配向効果を評価した.具体的には櫛型Au基板上に11-Mercaptoundecanoic acidと6-Mercapto-1-hexanolの混合比1 : 3となる自己組織化膜(SAM)を成膜し,そのSAM表面上にPrGを化学結合させた.PrGはY字型抗体の根本部分を選択的に補足・固定化する性質を有し,本試料を抗ミオグロビンIgG抗体溶液中に浸漬することで,直立配向した抗ミオグロビンIgG抗体表面が得られる.一方,ランダム配向試料は,上記と同様のSAM表面上に抗ミオグロビンIgG抗体を直接化学結合させることで得た.これら二つの試料のミオグロビンセンサ特性を電気化学インピーダンス(EIS)法で評価したところ,以下のことが明らかになった.1)配向試料およびランダム試料共にミオグロビン濃度の上昇と共にシグナルである電荷移動抵抗(Rct)値が増加することから,両試料はミオグロビンセンサ特性を示すことが分かった.2)配向性試料では0.001 - 10 ng/mLの広い濃度範囲でRctの増加が認められるが,ランダム試料では0.001 - 0.1 ng/mLの狭い濃度範囲の変化に留まる.従って,配向性試料では測定濃度範囲が高濃度側に2桁広いことが分かった.3)両試料のRct変化率を比較すると,配向性試料ではRctの増加割合がランダム配向性試料に比べて約3倍大きい.これらの結果より,抗体の直立配向によりセンサ特性が大きく向上することが分かった.IgG抗体を直立配向させた試料において,センサ特性の大幅な向上が達成できた.これは当初の計画通りの進捗状況である.次年度は,この成果を足掛かりにさらに高性能なセンサの開発を行う予定である.本年度では次の2点の研究を進めた:1)センサ再生技術の確立と2)新規ブロッキング手法の開発.それぞれの概要を以下に示す.1)センサ再生技術の確立:前年度では,あらかじめ基板上に抗体配向固定可能なProtein G (PrG)層を化学結合によって形成し,ここに抗ミオグロビン抗体を固定化することで高い感度を有するミオグロビンバイオセンサを作製した.ここで使用したPrG-抗ミオグロビン抗体の結合は低pH環境下で切断できることが知られている.そこでセンサ使用後にPrG-抗ミオグロビン抗体-ミオグロビンとなったセンサ表面を低pH溶液中に曝すことで試料表面を再びPrGに戻し,新たに抗ミオグロビン抗体を固定化してセンシング表面の再生を行うことができると考えられる.本年度ではこの実験を行った.使用後の試料をクエン酸バッファーpH3.0に浸漬し,再び抗ミオグロビン抗体を固定化したが,センサ特性は得られなかった.様々な実験結果を検討した結果,ブロッキング材であるウシ血清アルブミン(BSA)が変性していることが分かった.そこで次のブロッキング方法の検討を始めた.2)新規ブロッキング手法の開発:バイオセンサ開発で一般的に使用されているブロッキング材BSAに代わる新たな候補材料として,ポリエチレングリコール(PEG)系分子に注目した.インピーダンス測定に適用するには表面抵抗に大きく影響を与えない低分子系が望ましい,そこでPEG類似構造を持つ2-(2-Aminoethoxy)ethanol (略称AEE)を用いたブロッキング方法を探った.その結果,AEEをブロッキング材とするとBSAより表面抵抗に与える影響が少なく,非特異吸着も格段に抑制できることが判明した.上述のように当初の計画であった「センサ再生技術の確立」に関しては,予想外の難点に行き当たった.

しかし,原因としてブロッキング材の変性によるセンサ特性の変化であることを明らかにし,代わりのブロッキング材であるAEEを見出すなど難点の克服には解決の目途が立っている.従って,全体としては進捗状況としてはやや遅れているが,AEE使用による非特異吸着の大幅な改善など当初の計画にない部分での進展も得られた.本研究では高感度かつ高い選択性を持つミオグロビンバイオセンサの開発を目指している.特に昨年度,ブロッキング材としてポリエチレングリコール系分子の2-(2-Aminoethoxy)ethanolを用いることで,センシング表面での非特異吸着を大幅に抑制することに成功し,信頼性の大幅な向上につながった.一方で開発したセンサは再利用できないという問題点が残っていた.そこで本年度は再生可能なセンサの開発をすべく,抗体の一軸配向固定に用いているProtein G'の特性に着目し,再生可能なセンサの開発を試みた.Protein G'は,有る特定の方向でIgG抗体と特異結合するタンパク質である.中性溶液中でこの結合は維持されるが,酸性溶液中ではその結合を絶つ性質を持つ.この性質を利用し,使用後にミオグロビンと結合した抗ミオグロビン抗体を酸性溶液中で脱離させ,新しい抗体を再びProtein G'に捕獲させることでセンサの再生を試みた.Protein G'からの抗体脱離に使用可能な3種類(クエン酸,酢酸,グリシン)の酸性バッファーをとりあげ,濃度および浸漬時間を変化させて脱離と抗体再固定の条件を探った.結果,グリシンバッファー(0.2 mol/L, pH 2.5)に10分間浸漬することで抗体を脱離させることが可能であり,再び中性の抗体溶液中に浸漬することで新しい抗体を捕獲させ得ることが分かった.再生前後のインピーダンスセンサ特性の変化を,抗ミオグロビン抗体を固定化したミオグロビンセンサに関して調べた.その結果,計測可能な濃度範囲は両者でほぼ一致しており,本手法で新たな抗体が確かに固定化されていることが分かった.一方,再生後の試料におけるインピーダンスの増加率は元の7割程度に減少しており,グリシンによるブロッキング表面の変性の可能性があることが示唆された.PrGはpH 3.0以下の環境で補足したIgGを開放する.この性質を利用してセンサの再生技術の開発を試みる.すなわち一度使用した試料をグリシン-塩酸バッファーpH 2.2に浸漬し,表面上のミオグロビン-抗ミオグロビン抗体複合体を外す.次に,新しい抗体溶液中に浸漬し,PrGに再び抗体を捕捉させる.このようにして再生した試料のセンシング特性を調べ,センサ再生技術の開発を試みる.前年度に試みたセンサ再生技術の確立に再度挑む.PrG-抗体の結合を切る方法は低pH溶液に曝すことであるが,前年度ではブロッキング材であるBSAの変性によりセンサ特性が失われてしまった.今年度は新たなブロッキング材であるAEEを用いた試料で再生手法の開発を新たに目指す.PrGの機能を損なうことなくPrG-抗体の結合の切断が安定に実行が問題であるが,クエン酸バッファーやグリシンバッファーなど様々な切断条件を試み,再生技術を確立する方針である.研究を実施していくうえで必要な基板の一部を発注していたが,3月末までの作製・納品に間に合わず,新年度に入ってからの納品となった.
都市域における建造物の緑化が果たす環境改善機能の評価と自然共生循環システムの構築

既存の都市住民の意識調査から、市街地における緑として、建築物の屋上緑化よりも公園や街路樹といった公共空間の緑に対するニーズの方が高いと言える。しかし、公共政策としては、大規模民間施設への緑化義務付けの優先度は高いものである。屋上緑化施策を持つ自治体では、助成に対する予算不足が問題であることや市民への緑化意識啓発や施策内容の見直しが課題であり、屋上緑化施設では、施設管理者の負担が大きいため、維持管理費などへの継続的助成、税的優遇措置などが必要とわかった。屋上で簡易養液栽培によりサツマイモを栽培した結果、その植被温度はコンクリート表面より最大で23°C低かった。サツマイモ植被の温度低減効果は、草地や樹林より大きく、また成長速度がより大きい品種で、より大きかった。屋上での塊根収量は一般の土耕・栽培と同等であった。屋上に設置した水域では、ハイイロゲンゴロウやウスバキトンボ幼虫などの水生昆虫が観察され、ウスバキトンボでは、水のみを入れた水槽でも密度が高かった。また、アゲハチョウ類の寄主植物を屋上と地面に設置したところ、両方でナミアゲハとキアゲハの幼虫が確認され、幼虫期の死亡率は屋上で有意に低かった。プロット実験を通じて,屋上緑化施設による屋上周辺及び屋内の熱環境保全効果を確認した。また,降雨流出を抑制する効果も認められた.大気から降下する汚染物質の浄化効果は基本的には期待できないが,芝植栽プロットではT-Nの削減効果がみられた。潜熱による微気象緩和機能評価を目的に屋上に池を設置し、水位変動と降水量から蒸発散量を推定した。夏季の76日間の蒸発散量は361mmで、積算日射量の78%のエネルギーに相当した。水生植物で覆うこと蒸発効率が増加することが明らかとなった。屋上緑化の助成制度を有する全国の自治体のリストアップを行った。既存のアンケート資料の解析から、都市住民の屋上緑化に対するニーズは高く、大規模民間施設の緑化義務付けに賛同意見も多いことから、屋上緑化に対する都市住民の環境評価額は低くないと推測された。大阪府大農学部本館屋上に、屋上緑化による微気象緩和効果の定量的評価を目的に3m×3mの水槽と芝生、その他各種の植栽と測定装置を設置した。雨量、日射量、風速、乾湿球温度、池の水温、池および芝生の底面部における熱流量を自記計測した。水環境負荷の緩和効果として、緑化施設によって降雨が一時的に貯留され洪水流出の遅延効果が認められた。流出水の物質濃度と負荷量のいずれでみても大気からの汚濁負荷の軽減効果は期待できないと判断された。ただし、酸性雨水の負荷には効果が期待できる。雨量と池の水位測定から、夏季76日間の水面からの蒸発散量は361。3mmと算出され、屋上の池は森林と同程度の蒸発散を行うことが明らかとなった。地上と屋上における水深約20cmの水槽での捕虫網による掬い取りと目視により、ウスバキトンボなど4種のトンボ類幼虫のほか、ハイイロゲンゴロウ、マツモムシなど4種の水生昆虫が確認されたが、地上と屋上では種構成は異なっていた。屋上のヨシ栽培槽について、自動撮影装置で鳥の飛来を調査し、ハシボソガラスとハクセキレイを撮影した。軽量で管理の容易な養液栽培システムを用いてサツマイモを栽培し、その成長および葉群による屋上表面温度低減効果について検討した結果、葉群被覆下のコンクリート表面温度は、被覆のない場合に比べて最大で14°C低下した。葉の蒸散速度が高く、1株での被覆面積が大きい品種は、温度低減に効果的であった。

塊根収量は一般の土耕栽培と同等であった。芝生およびセダム群落からの近赤外域における分光反射率は土壌の乾燥化に伴い低下した。建造物緑化の今後の管理運営を探ることを目的に、屋上緑化関連の行政施策を持つ自治体へのアンケート調査を実施した結果、施策の適用件数は東京都の条例制定(H.13)を機に急増したものの、助成に対する予算不足が問題であることや市民へのPR・緑化意識啓発や施策内容の見直しを図るといった課題を有することが分かった。屋上緑化による水環境負荷の緩和効果に関するプロット試験を行った。その結果、緑化施設によって、(1)降雨が一時的に貯留され洪水流出の遅延効果が認められた。一方、(2)濃度・負荷量のいずれで見ても、大気からの汚濁負荷の軽減効果については期待できないと判断された。ただし、(3)酸性雨の緩和には効果が期待できる。2005年度に屋上に設置した簡易池で蒸発散量の測定、屋上の微気象観測を継続して行った。また、屋上緑化樹木の活性評価を行うためのポット苗を作成し、クロロフィル蛍光測定による予備調査を行った。屋上に設置した水域と開花植物では、トンボ類、チョウ類などをはじめ前年度との合計で43種の昆虫が確認された。また、キアゲハの寄主植物であるパセリを設置したところ、卵、幼虫、蛹が観察され、繁殖場所としても利用可能であることが明らかになった。軽量で管理の容易な養液栽培システムを用いてサツマイモを栽培し、その成長および葉群による屋上表面温度低減効果を検討した。その結果、葉群被覆下の出ンクリート表面温度は、被覆のない場合に比べて最大で14°C低下した。葉の蒸散速度が高く、1株での被覆面積が大きい品種は、温度低減に効果的であった。マット状植栽の蒸散と蒸発を分離測定した。ヒメコウライシバでは土壌の含水量に比例して蒸発・蒸散するがメキシコマンネングサの蒸散は、土壌が湿潤な場合はヒメコウラィシバと差が無いが、含水量がわずかに低下すると著しく減少した。屋上緑化施設による水環境負荷緩和効果を調査した。その結果、緑化施設の土壌部への降雨の貯留によりピーク流出量が抑制されること、雨水に比べ、施設からの流出水の水質濃度(T-N、T-P、COD)が高いが、負荷量で見るとT-Nでは施設が浄化側に作用する例もあることが確認された.屋上で簡易養液栽培システムを用いて育成したサツマイモ植被の温度低減効果およびサツマイモの成長について検討した。その結果、サツマイモ植被はコンクリート表面温度より23°C低く、また草地や樹林表面より温度が低かったことから、温度低減のための緑化植物として有効であった。成長速度と蒸散速度の間には正の相関があり、成長速度がより大きい品種を緑化に用いることでサツマイモ植被の表面温度をさらに低下できる。屋上に設置した水域では、ウスバキトンボやショウジョウトンボなどのトンボ類幼虫が観察され、特にウスバキトンボでは、水のみを入れた水槽でも密度が高かった。また、アゲハチョウ類の寄主植物を屋上と地面に設置したところ、両方でナミアゲヴハとキアゲハの幼虫が確認され、幼虫期の死亡率は屋上で有意に低かった。屋上の建築物周辺にハナミズキのポット苗を設置し、直達光の照射時間の異なる処理区を設け、蒸散速度やクロロフィル蛍光から樹木の活性状態を評価した。
類天疱瘡におけるIgG subclass の発症病理的関与

我々は類天疱瘡(BP)の発症機構におけるIgG subclassの役割を下記の点について検討した.(1)BPの抗原がIgG subclassごとに異なるかどうか.(2)BP IgG subclassが直接作用して表皮真皮解離をおこすかどうか.(3)BP IgG subclassが抗原と結合して何らかのsignalを細胞内に伝えているかどうか.(4)BP IgGが補体を活性化させたのちcell lysisがおこるかどうか.(5)BP IgG subclassが抗原と結合したのち表皮細胞が何らかの物質(例えばproteaseなど)を分泌することがおこるかどうか.このうち(1)についてはブロッキング蛍光抗体法(補体法),Immunoblot法,合成抗原を用いたELISA法で検討した.その結果,1つのエピトープに対してIgG1,IgG2およびIgG4のすべてが結合しうる可能性があるが,その産生量がかなり個人差があることが判明した(Autoimmunity1994.)(2)については細胞培養系にIgG subclassを添加し,その後luciffer yellowを負荷し,共焦点レーザー走査顕微鏡でX-Z軸方向の断面像を観察することにより検討した.その結果,BP IgG subclass添加することにより,底面より細胞がシート状に剥離する場合もあったが正常のcontrolと有意の差は認められなかった.(3)に対しては細胞内Ca^<2+>,細胞内pH,膜電位について各々fluo-3,snarf-1およびdioc-5の色素を用いてその蛍光強度を経時的に観察した.その結果,BPIgG1添加でfluo-3,snarf-1の蛍光強度が変化する場合があることがわかった.fluo-3については低Ca^<2+>培地系でも蛍光強度の変化ををおこした.dioc-5については有意な変化は認められなかった.(4)についてはBPIgG1が補体添加時にfluo-3の蛍光強度が変化した.この時点においてluciffer yellowを用いて細胞形態を観察したが,特にcell lysisをおこしている所見はなかった.(5)については病変部におけるUrokinaze receptor(UKR)の有無を抗UKR抗体を用いた蛍光抗体法で観察した.その結果は尋常性天疱瘡ではUKRが表皮細胞間に認められたが,BPでは正常皮膚と差がなかった.我々は類天疱瘡(BP)の発症機構におけるIgG subclassの役割を下記の点について検討した.(1)BPの抗原がIgG subclassごとに異なるかどうか.(2)BP IgG subclassが直接作用して表皮真皮解離をおこすかどうか.(3)BP IgG subclassが抗原と結合して何らかのsignalを細胞内に伝えているかどうか.(4)BP IgGが補体を活性化させたのちcell lysisがおこるかどうか.(5)BP IgG subclassが抗原と結合したのち表皮細胞が何らかの物質(例えばproteaseなど)を分泌することがおこるかどうか.このうち(1)についてはブロッキング蛍光抗体法(補体法),Immunoblot法,合成抗原を用いたELISA法で検討した.その結果,1つのエピトープに対してIgG1,IgG2およびIgG4のすべてが結合しうる可能性があるが,その産生量がかなり個人差があることが判明した(Autoimmunity1994.)(2)については細胞培養系にIgG subclassを添加し,その後luciffer yellowを負荷し,共焦点レーザー走査顕微鏡でX-Z軸方向の断面像を観察することにより検討した.その結果,BP IgG subclass添加することにより,底面より細胞がシート状に剥離する場合もあったが正常のcontrolと有意の差は認められなかった.(3)に対しては細胞内Ca^<2+>,細胞内pH,膜電位について各々fluo-3,snarf-1およびdioc-5の色素を用いてその蛍光強度を経時的に観察した.その結果,BPIgG1添加でfluo-3,snarf-1の蛍光強度が変化する場合があることがわかった.fluo-3については低Ca^<2+>培地系でも蛍光強度の変化ををおこした.dioc-5については有意な変化は認められなかった.(4)についてはBPIgG1が補体添加時にfluo-3の蛍光強度が変化した.この時点においてluciffer yellowを用いて細胞形態を観察したが,特にcell lysisをおこしている所見はなかった.(5)については病変部におけるUrokinaze receptor(UKR)の有無を抗UKR抗体を用いた蛍光抗体法で観察した.その結果は尋常性天疱瘡ではUKRが表皮細胞間に認められたが,BPでは正常皮膚と差がなかった.われわれはこれまでIgG subclassが類天疱瘡(BP)における発症機構上でどのような役割をしているのかを検討してきた。本年度は次の2点につき検討した。まず第1に血清、水疱液およびDJM-1cell培養液中のinterleukin(IL)-3、IL-4、GM-CSFの濃度につきELISA法にて検討した。その結果、血清中のIL-3量はBP3例中2例で正常コントロールより高値を示した。水疱液中のIL-3量は当測定法の検出限界以下であった。培養上清中のIL-3も検出限界以下であった。IL-4については血清中では正常コントロールと差はなかった。水疱液中では7例中2例で検出可能な濃度を示し、その値は0.60.7pg/mlであった。培養上清中では検出限界以下であった。次にGM-CSFについては血清において6例中5例で2055pg/mlであった。正常血清では検出限界以下であった。

次に第2にはRicoらの報告した合成epitopeのP1-1、P1-2についてBP IgG subclassの結合力をELISA法で検討した。その結果、P1-2についてはIgG_1では8例中5例、1gG_2では8例中1例、IgG_4では8例中2例が正常コントロールより高い結合性を示した。P1-1についてはIgG_1では10例中2例、IgG_2では10例中3例、IgG_4では10例中1例が正常コントロールより高い値を示した。次に抑制試験をP1-2について施行した。あるIgG subclassを反応させる前に別のIgG Subclassを反応させ、前者のIgG subclassのP1-2に対する結合力が前処理をしない場合と変化するかどうかを検討した。その結果IgG_2とIgG_4を先に反応させておき、次にIgG_1を反応させた場合、先にIgG_2とIgG_4を反応させないときに比較してP1-2に対する結合力が低下した。反応順序を逆にした場合ではこのような抑制現象は認められなかった。今後はレーザー共焦点顕微鏡が納入されたのでレーザー色素を用い、BP IgGが直接表皮細胞と基質の接着を障害するか、BP IgG_1が補体を活性化し、coll lysisを実際におこすかどうかなどを検討したい。われわれはこれまではIgG subclassを分離精製して類天疱瘡(BP)における発症機構上に各IgG subclassがどのような役割をしているのかを検討してきた。本年度は次の2点につき検討した。まず第1にBP血清およびIgG、subclassが直接作用して水疱を形成する可能性があるかどうかにつき検討した。DJM-1 cellを培養し、confluentになり重層化した時点で培養液中にluciffer yellowを添加した。次にBPおよび正常人血清を添加した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて24,48時間後の培養細胞のX-Z軸断面を観察した。その結果、BP血清添加系でも48時間までにDJM-1 cellとガラス底面の間に解離がみられなかった。第2にはBP IgG subclassが補体を活性化させ、cell lysisをおこすことができるかどうかを検討した。DJM-1 cellを培養し、ある程度colonyを形成した時点で培養液中にFluo3-AMを添加して37°C、1時間incubateした。次に培養液中のBP IgG subclassを添加した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、20秒ごとに9分までCa^<++>イオンの分布を観察した。3分後に補体源として正常人血清を添加した。その結果BPIgG_1 IgG_2およびIgG_4において添加直後に細胞内Ca^<++>濃度の上昇をみたが、正常人血清より分離したIgG_1およびIgG_4でも同様の現象が認められた。
変調電子ビームによるタンデムミラーの電位計測

本研究では、変調電子ビームによる電位計測法をタンデムミラーに初めて適用することにより、プラグ部とこれまで測定することの出来なかった外側のミラースロート、さらにそのすぐ外側の電位を直接計測して、既に測定されているエンドプレート及びその前面のシース領域の電位分布と合わせて、タンデムミラーのエンド部全体にわたる電位構造を明らかにした上で、ミラースロートの外側において、最近の理論モデルの予想する磁場の広がりに伴う急峻な電位降下の検証を目的とした。実験装置は、筑波大学プラズマ研究センターに設置されているタンデムミラー型プラズマ閉じ込め装置「ガンマ10」である。高周波で変調された電子ビームの位相シフトに反映される電位の情報は、ロゴスキーコイルで検出するが、本年度は電子ビームの変調周波数に対して、最適な形状と巻数を持つロゴスキーコイル製作した。また、変調用の高周波発振器と整合系、及び位相検出の回路系を整備した。ただし、ガンマ10の実験スケジュールの都合で平成6年2月まで大気開放がなかったため、製作したロゴスキーコイルの設置が遅れたので、現時点では変調電子ビームを用いての実際の電位計測は未実施である。このことを補完するため、ミラースロートから離れた位置ではあるが、静電プローブを挿入して、エンド部の電位分布計測を行った。その結果、ミラースロートの外側での電位降下と、その後の電位の平坦部の存在を、間接的ではあるが検証した。今後は本来の計画通りにミラースロートの電位を測定して、エンド部の電位形成モデルを直接検証する。さらに、タンデムミラーの閉じ込めに本質的な意味を持つにも関わらず、これまではプラグ部に存在すると推定されていたプラズマ閉じ込め電位を直接測定して、タンデムミラー全体の実際の電位形成機構をさらに解明する予定である。
腫瘍退縮に至る担がん宿主T細胞の腫瘍局所浸潤の分子機構

担癌宿主リンパ組識内で腫瘍特異的T細胞応答が検出されても、必ずしも腫瘍が免疫退縮を遂げるとは限らない。腫瘍拒絶に至るには抗腫瘍T細胞の腫瘍局所への浸潤が不可欠である。IL-12投与により治療効果が認められる腫瘍系では、腫瘍局所に於いてT細胞上の接着分子LFA-1/VLA-4と腫瘍周辺血管内皮細胞のICAM-1/VCAM-1との相互作用を介して著明なTh1型T細胞の浸潤が誘導される。本研究では、IL-12によるT細胞浸潤の増強機構を解析した。T細胞抗原受容体での刺激により活性化されIL-12受容体を発現したT細胞は、IL-12刺激に応答してケモカイン受容体CCR5の発現を誘導した。このT細胞が腫瘍塊内に存在するMIP-1α/βで更に活性化されるとLFA-1分子のICAM-1分子への接着能が著明に増強した。また、腫瘍内T細胞浸潤はケモカイン受容体CXCR3よっても支配されていた。即ち、CXCR3はIL-12刺激の結果産生されるIFN-γによりT細胞自身に誘導され、これにIP-10が作用することでLFA-1分子のICAM-1分子への接着能が増強された。なお、CCR5発現は転写因子STAT4依存性に、一方CXCR3はSTAT4非依存性に誘導された。一方、CCR5特異的阻害剤として開発されたTAK-779は、Th1細胞に発現されるCCR5とCXCR3両受容体に対して選択的な阻害効果を示すことを明らかにした。興味深いことに、TAK-779をin vivo投与するとIL-12治療によるT細胞浸潤が抑制されるとともに、腫瘍退縮効果もほぼ完全に阻害された。以上、抗腫瘍性T細胞の腫瘍局所浸潤機構の分子機構の解明により、担癌宿主抗腫瘍T細胞の腫瘍塊内での拒絶反応に至る詳細な過程が明らかとなった。これらの知見は腫瘍免疫療法の効果判定に関する分子レベルでの予知指標を提供する。我々はこれまで、担がん宿主にIL-12を投与すると、ある種の腫瘍系では腫瘍の完全退縮が誘導出来ること、そしてIL-12による腫瘍の完全退縮にはT細胞が所属リンパ組織から腫瘍局所へ浸潤することが重要であり、このIL-12誘導性の腫瘍塊内へのT細胞の浸潤に、LFA-1/VLA-4(T細胞上)とICAM-1/VCAM-1(腫瘍周辺血管内皮細胞上)の相互作用が必須である事を証明している。また最近、腫瘍局所の浸潤T細胞はCCR5を発現していることを見出している。そこで本研究では、腫瘍免疫で重要な役割を演ずる担癌宿主T細胞のIL-12誘導性の腫瘍局所浸潤過程にケモカイン/ケモカインレセプター系が如何なる役割を果たしているのかを検討した。その結果、IL-12奏効性腫瘍系では、担癌リンパ組織にはCD4/CD8の両T細胞サブセット共にIL-12R発現細胞が出現し、これにIL-12刺激が加わるとCCR5が発現され、さらに腫瘍局所に誘発されたCCR5のリガンドであるMIP-1α/βの刺激が加わり、inside-outのシグナル伝達により細胞接着分子の親和性が高くなり、接着能が亢進することを示唆する知見が得られた。この抗腫瘍性T細胞の動員機構の解明によって、担癌宿主T細胞の腫瘍抗原感作から始まって腫瘍塊内での腫瘍の拒絶反応に至る腫瘍免疫機構の全過程が明らかとなり、腫瘍免疫療法の効果判定や治療効果の予知指標確立に向けてのアプローチも可能となると考えられる。担癌宿主で腫瘍特異的T細胞応答が検出されても、腫瘍が退縮するとは限らない。我々はIL-12の担癌宿主への投与による腫瘍の拒絶には、IL-12で刺激された抗腫瘍T細胞の腫瘍局所への動員が不可欠である事、またIFN-γ欠損マウスではIL-12の治療効果は認められない事、一方正常T細胞をT細胞抗原受容体の刺激で活性化するとIL-12レセプターが誘導され、引き続くIL-12刺激でケモカインレセプターCCR5が高レベルに誘導される事を報告している。本年度は、CCR5誘導の分子機構及びIL-12の抗腫瘍効果発現に於けるCCR5の役割を解析し以下の知見を得た。(1)IL-12のCCR5発現誘導の分子機構:IFN-γ欠損或いはSTAT4欠損マウスの活性化T細胞を用いたin vitroの実験で、T細胞のCCR5発現誘導にSTAT4は必要不可欠であり、その役割はIFN-γを供給しても代償できない事、またIFN-γはSTAT4存在下においてのみCCR5の誘導を増強する事が示された。更に、正常活性化T細胞でCCR5からのシグナルはLFA-1/ICAM-1を介した細胞接着を促進する事も確かめられた。(2)IL-12によるT細胞の腫瘍内浸潤に果たすCCR5の役割:1)IL-12奏効腫瘍系に於て、IL-12治療により担癌マウス脾臓T細胞にCCR5 mRNAの発現が誘導され、又腫瘍塊ではCCR5のリガンドであるMIP-1α/MIP-1βのmRNA発現が増強した。2)IL-12治療マウスの腫瘍塊から単離したT細胞はCCR5を発現していた。3)IL-12刺激を受けた担癌マウスT細胞の腫瘍塊への浸潤は、抗CCR5抗体により抑制された。

4)IL-12治療に併行してCCR5阻害剤を投与した所、腫瘍拒絶が阻止された。即ち、IL-12によるT細胞の局所浸潤に、CCR5は重要な機能を発揮している事が示された。担癌宿主リンパ組識内で腫瘍特異的T細胞応答が検出されても、必ずしも腫瘍が免疫退縮を遂げるとは限らない。腫瘍拒絶に至るには抗腫瘍T細胞の腫瘍局所への浸潤が不可欠である。IL-12投与により治療効果が認められる腫瘍系では、腫瘍局所に於いてT細胞上の接着分子LFA-1/VLA-4と腫瘍周辺血管内皮細胞のICAM-1/VCAM-1との相互作用を介して著明なTh1型T細胞の浸潤が誘導される。本研究では、IL-12によるT細胞浸潤の増強機構を解析した。T細胞抗原受容体での刺激により活性化されIL-12受容体を発現したT細胞は、IL-12刺激に応答してケモカイン受容体CCR5の発現を誘導した。このT細胞が腫瘍塊内に存在するMIP-1α/βで更に活性化されるとLFA-1分子のICAM-1分子への接着能が著明に増強した。また、腫瘍内T細胞浸潤はケモカイン受容体CXCR3よっても支配されていた。即ち、CXCR3はIL-12刺激の結果産生されるIFN-γによりT細胞自身に誘導され、これにIP-10が作用することでLFA-1分子のICAM-1分子への接着能が増強された。なお、CCR5発現は転写因子STAT4依存性に、一方CXCR3はSTAT4非依存性に誘導された。一方、CCR5特異的阻害剤として開発されたTAK-779は、Th1細胞に発現されるCCR5とCXCR3両受容体に対して選択的な阻害効果を示すことを明らかにした。興味深いことに、TAK-779をin vivo投与するとIL-12治療によるT細胞浸潤が抑制されるとともに、腫瘍退縮効果もほぼ完全に阻害された。以上、抗腫瘍性T細胞の腫瘍局所浸潤機構の分子機構の解明により、担癌宿主抗腫瘍T細胞の腫瘍塊内での拒絶反応に至る詳細な過程が明らかとなった。これらの知見は腫瘍免疫療法の効果判定に関する分子レベルでの予知指標を提供する。
東南アジアにおける中古生界の海洋無酸素事変と大量絶滅およびその後の回復と適応放散

東東南アジアでの地質調査を通じて,中古生代の大量絶滅とその後の回復から適応放散に関する現象の解明とテチス海東域における海生動物相の比較および陸生動物相の復元を行うことが研究のテーマである.調査の対象は,オルドビス系三畳系で,大量絶滅が生じたと考えられる層準を挟む複数のセクションで,アンモナイトやコノドントなどの化石と岩相の特徴,安定炭素同位体比の変動パターンなどを用いて地質年代や堆積環境,海洋無酸素事変などの地質イベントを明らかにする事が本研究の最終目的である.今年度の研究で最も大きな成果を得たのは,上部デボン系のフラニアン・ファメニアン境界(F-F境界)で生じた2回の大量絶滅(下部・上部ケルワッサー事変:UKE・LKE)とその後の回復に伴う研究である.調査は北部ベトナム複数のセクション(シーファイセクションやマーピーレンセクションなど)と中部ベトナムのソムニャーセクションで実施した.これらの3地域では,コノドントと安定炭素同位体比の変動パターンからLKEとUKEを確認する事ができた.さらにマーピーレンセクションでは,海洋無酸素事変に伴う2枚の黒色泥岩がこれらのイベント層準で確認され,LKE層では還元的な堆積環境や森林火災の痕跡を示すバイオマーカーなどを確認する事ができた.一方でソムニャーセクションでは,顕微鏡下で多くの化石を確認する事ができ,下部ケルワッサー事変後に複数の軟体動物や棘皮動物,コケムシなどで大量絶滅後の生物相の回復が起こっていた可能性があることが分かったが,サンゴや層孔虫などの造礁生物では生物相が回復していなかった可能性が高いことが明かになった.なお,北部ベトナムでの調査結果については,3編の論文や報告として国際誌を含む当該分野の学術誌に掲載されている.北部ベトナムのハーザン省やカオバン省に分布する上部デボン系とランソン省の下部三畳系,ニンビン省の上部三畳系などで複数回にわたる地質調査を実施し,微化石を含む古生物および堆積学分野の様々なデータを採取することができた.学会発表は,少なかったものの,日本古生物学会年会の学術講演では,本研究課題で得た北部ベトナム産の前期三畳紀二枚貝類を用いて発表を行い,同学会例会では,上部三畳系ソイバン層の軟体動物化石や堆積相に関する予察的な研究成果について報告した.また,共同発表ではあるものの,地質学会の西日本支部会などで後期デボン紀のコノドント化石生層序や安定炭素同位体比の変動パターンについて報告した.この研究も北部ベトナムで実施した研究成果で,これによって海洋生物の大量絶滅で知られている下部・上部ケルワッサー事変を特定できたセクションがある.論文については,平成25-27年度基盤研究(C)〔25400500〕からの継続研究の成果をPalaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecologyに公表することができた.これは,北部ベトナムに分布するバックテゥイ層の三畳紀前期スミシアン・スパシアン境界で生じた海洋無酸素事変とそれに伴うTOCや安定炭素同位体比の変動パターン,コノドントやアンモナイトなどの種の消長を報告した分解能の高い研究である(Komatsu et al., 2016).また,この他にも同層から産出した放散虫化石を国際誌に報告し,これらが古生代末期の大量絶滅を生き延びた古生代型の群集であることを明らかにした(Takahashi et al. in press).当初予定していた以上に研究は順調に進んでおり,特に北部ベトナムでの野外調査では,大量絶滅などを記録してる可能性が高い露頭やセクションと多くの化石産地を発見した.また,採取した岩石試料を処理した結果,コノドントやテンタキュロイド,オストラコーダ,放散虫などの微化石を多数得ることができ,地質年代や大量絶滅などを検討する上で重要な古生物学分野のデータを得ることができた.さらに露頭状態の良いセクションでは,堆積環境を復元する上で重要な堆積学的なデータを多数得ることが出来た.熊本地震の影響で電子顕微鏡やいくつかの研究機器が使えない状況であったため,微化石の電子顕微鏡画像などは撮影できなかったが,これらの作業や分析の遅れを差し引いても期待以上の研究成果が出始めている.今年度は北部ベトナムに分布するオルドビス系シルル系,デボン系と三畳系で地質調査を実施した.コートー諸島(Co To Islands)でのシルル系の調査では,コートー層(Co To Fm)のタービダイトから多くの筆石化石を採取し,下部シルル系のS. turriculatus帯とO. spiralis帯を確認することができた.ハーザン省(Ha Giang Prov)に分布する上部デボン系のトクタット層(Toc Tat Fm)の研究では,主に2つのセクションで調査を進めた結果,フラスニアン/ファメニアン境界を確認する事ができ,この境界付近で生じた大量絶滅としてよく知られている下部・上部ケルワッサー事変をコノドント生層序と安定炭素同位体比層序から特定することができた.また,シーファイセクション(Si Phai Sec)で,テンタキュリトイドの絶滅パターンについて検討した結果,下部ケルワッサー事変に先駆けてテンタキュリトイドの産出量は,著しく減少するものの,種数の顕著な減少はなく,上部ケルワッサー事変以降もHomoctenusなどの複数の種が産出することが確認できた.また,メオバックセクション(Meo Vac Sec)では,ケルワッサー事変層付近に有機物に富む黒色頁岩が挟まれていたため,化学分析などを進めた結果,これらの頁岩は嫌気的な環境下で堆積したことが明らかになり,世界各地のケルワッサー事変層から報告されている汎

世界的な海洋無酸素事変を記録していることが分かった.三畳系の調査は,北部ベトナム南部に分布するソイバン層(Suoi Bang Fm)で実施した.その結果,上部三畳系のノーリアン階を主体とするソイバン層の最下部からカーニアン期を示すアンモノイドや二枚貝を採取することができ,カーニアン/ノーリアン境界を挟む可能性があることが明らかになった.予定していた地質調査を概ね実施することができ,化石および岩石試料の採取やそれらの分析を無事に進めることができた.しかし,下部三畳系の調査では,化石産地までの道路が崩れていたため,十分な調査を行うことができなかった.その一方で,ソンラ省での上部三畳系の調査では,工事に伴って,多くのアンモノイドや二枚貝などが産出していたため,再調査を行い,この地域での化石試料の採取を最優先した.その結果,露頭が構造物で被覆される前に,数百点以上の二枚貝やアンモノイド,巻貝に加えて,植物化石や脊椎動物の骨片などを得ることができた.デボン系の研究については,極めて順調に進んでおり,古生物学会などで上部デボン系のコノドント生層序や堆積環境,安定炭素同位体比層序,デボン紀後期の大量絶滅や海洋無酸素事変などに関する講演を行い,研究成果の一部についてはすでに国内外の雑誌に投稿済である.また,北部ベトナム南部に分布する上部三畳系の二枚貝やアンモノイドから推定される地質年代と愛媛県の田穂石灰岩から産出した下部三畳系のコノドント化石の記載と国際対比に関連する論文が英文学術誌に受理された.東東南アジアでの地質調査を通じて,中古生代の大量絶滅とその後の回復から適応放散に関する現象の解明とテチス海東域における海生動物相の比較および陸生動物相の復元を行うことが研究のテーマである.調査の対象は,オルドビス系三畳系で,大量絶滅が生じたと考えられる層準を挟む複数のセクションで,アンモナイトやコノドントなどの化石と岩相の特徴,安定炭素同位体比の変動パターンなどを用いて地質年代や堆積環境,海洋無酸素事変などの地質イベントを明らかにする事が本研究の最終目的である.今年度の研究で最も大きな成果を得たのは,上部デボン系のフラニアン・ファメニアン境界(F-F境界)で生じた2回の大量絶滅(下部・上部ケルワッサー事変:UKE・LKE)とその後の回復に伴う研究である.調査は北部ベトナム複数のセクション(シーファイセクションやマーピーレンセクションなど)と中部ベトナムのソムニャーセクションで実施した.これらの3地域では,コノドントと安定炭素同位体比の変動パターンからLKEとUKEを確認する事ができた.さらにマーピーレンセクションでは,海洋無酸素事変に伴う2枚の黒色泥岩がこれらのイベント層準で確認され,LKE層では還元的な堆積環境や森林火災の痕跡を示すバイオマーカーなどを確認する事ができた.一方でソムニャーセクションでは,顕微鏡下で多くの化石を確認する事ができ,下部ケルワッサー事変後に複数の軟体動物や棘皮動物,コケムシなどで大量絶滅後の生物相の回復が起こっていた可能性があることが分かったが,サンゴや層孔虫などの造礁生物では生物相が回復していなかった可能性が高いことが明かになった.なお,北部ベトナムでの調査結果については,3編の論文や報告として国際誌を含む当該分野の学術誌に掲載されている.昨年度は,野外調査で予想以上の成果が上がり,現地での調査や試料採集に要する時間が増えたため,今年度の研究費を前倒しで使用している.
気体カー効果による電界計測システムの試作

本研究では気体自身の電気光学効果(カー効果)を利用し、従来の測定手法では不可能であった、空間電荷が存在する場における気体の電界分布を、被測定対象に一切の擾乱を与えることなく定量的に正確に測定できる非接触電界分布計測システムの完成を目的としている。気体カー効果による電界計測システムは、投光部(レーザ、偏光子、位相変調器)、多重反射ミラーユニット、受光部(O/E変換器、信号増幅器)、高電圧印加部(電極、被測定気体、高圧電源)、測定部収納容器、から構成される。光学システムの設計においては、光の偏光状態の設計及び最適位相角、動作点の算出を行い、それに合致する位相変調器、信号増幅器の選択を行った。光学・機械系では、多重反射ミラーユニットの設計、適切な光源、光学部品の配置、選択、および、レーザ光束位置調節機構の設計、試作を行った。次に、被測定気体種類、圧力の選択を文献情報に基づき実施し、SF6ガス、炭酸ガス、窒素ガス、空気の14気圧をその候補とした。予備実験として電気光学結晶に微小電界を印加し、位相変調器つき光源より光を透過した状態で受光部における光学系応答を実測し、S/N比、検出可能最小信号の評価を行った。平行平板ギャップによる平等電界を試作したシステムを用いて測定し、特性評価を行い、10kV/cm程度の気体の電界測定が可能であることが明らかになった。従来、例がなかった大気圧空気のカー効果の測定について、本システムを導入し交流平等電界の測定を行った。その結果、大気圧空気のカー効果の測定に成功し、そのカー定数が1.3×10^<-1S>[m/V^2]であることを、初めて見出した。本年度は、音響素子内蔵型位相変調器および信号増幅器を用いて、直流、交流電界が計測可能な測定システムの設計と試作を行った。具体的にまず、光学システムの設計においては、光の偏光状態の設計及び最適位相角、動作点の算出を行い、それに合致する位相変調器、信号増幅器の選択を行った。平行平板ギャップによる平等電界を試作したシステムを用いて計測し、特性評価を行い、10kV/cm程度の気体の電界測定が可能であることが明らかになった。

気体カー効果による電界計測システムは、投光部(レーザ、偏光子、位相変調器)、多重反射ミラーユニット、受光部(O/E変換器、信号増幅器)、高電圧印加部(電極、被測定気体、高圧電源)、測定部収納容器、から構成される。本年度は、昨年度作成した電界計測可能な測定システムを使用して、実際に大気圧空気中の交流電界の測定を行った。具体的には、まず平行平板ギャップを用いての交流平等電界測定を行い、大気圧空気のカー定数を確定し、また10kV/cm程度の気体の電界測定が可能であることを明らかにした。次に棒平板ギャップによる交流不平等電界の測定を行った。棒の直径を1cm,2cm,3cmとして状態の違う不平等電界を測定し、その電界変化の様子を調べることに成功した。さらに位相ごとの電界の変化を見ることによって、不平等電界の時間的変化を見ることに成功した。そのとき、コロナ放電が電界の様子が変化することを発見した。またカー効果を用いた応用例の一つとしてがいし表面の電界測定を行った。コロナ放電で電界の様子が変化することを利用して、表面が汚損された状態などで電界に異常が起こったとき、それをカー効果で判別することに成功した。
抗うつ薬を用いた疼痛制御に関する行動薬理学的研究

近年、治療困難な慢性疼痛に対して、抗うつ薬による疼痛制御の可能性が試みられている。なかでも新世代抗うつ薬セロトニンーノルアドレナリン再取り込み阻害薬(serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor: SNRI)が注目されている。研究代表者は、抗うつ薬の疼痛抑制機序の解明を目標に以下の研究を遂行した。1)ラットの慢性痛モデルとして、坐骨神経を絞扼した末梢神経損傷モデル(chronic constriction injury: CCI)ラットを用い、SNRIであるミルナシプランを持続的皮下投与したところ、数日後から発現する疼痛回避行動閾値の上昇を認めた。ミルナシプランが慢性疼痛に対する遅発性の鎮痛効果を持つ可能性を示唆した。2)1)に関連した形態学的研究として、1)と同じCCIラットを用い、侵害性機械的刺激に対する脳内調節因子であるc-Fos発現の脳内分布について調べたところ、ミルナシプラン慢性投与群では前部帯状回でのc-Fos発現が減少した。このことは、ミルナシプラン慢性投与による鎮痛効果に前部帯状回が機能的に関与している可能性を示唆した。3)ラット慢性痛モデルとして、抗腫瘍薬ビンクリスチン投与で誘発される抗癌剤誘発神経障害モデルラットを用いて、腹腔内にミルナシプランや三環系抗うつ薬アミトリプチリンを7日間反復投与したところ、疼痛回避行動閾値の上昇を認めず、鎮痛効果は確認されなかった。1)神経因性疹痛を有する神経圧迫モデルラットに対する抗うつ薬投与実験体重約300gのSprague-Dawley系雄性ラットを用いた。慢性疼痛モデルとして、主にKrugerらの方法を参考に、樹脂製チューブにより坐骨神経を絞扼することで、神経圧迫モデルラットを作成した。疼痛閾値は、フォンフレイフィラメントによる足底への機械的刺激により測定した。疼痛閾値の測定によりアロディニア(本来は疼痛刺激にならない程度の機械的刺激で疼痛回避行動を示す神経因性疼痛にみられる徴候)を示した神経圧迫モデルラットに対して、抗うつ薬ミルナシプランを髄腔に単回投与あるいは浸透圧ポンプによる持続的皮下投与を行った。その結果、髄腔内投与では濃度0.10.0001モル濃度において、投与1時間後に最大となる疼痛閾値の上昇、すなわち鎮痛効果が確認され、6時間後には消失した。また持続的皮下投与実験においては、ミルナシプラン10mg/kg/day投与群で、生理食塩水投与群と比較して、投与7日目以降、実験のエンドポイントである14日目まで持続する鎮痛効果を認めた。2)同モデルラットの脳及び脊髄後角におけるFos蛋白発現に、抗うつ薬が与える影響を調べた形態学的実験ミルナシプランを持続的皮下投与された神経圧迫モデルラットの脳及び脊髄後角における早期発現蛋白であるFos蛋白の発現について、形態学的実験を行った。その結果、ミルナシプラン持続的皮下投与群では、生理食塩水群と比較して、侵害性圧刺激(足底に対する荷重600gの機械的圧刺激)を加えられた条件での前部帯状回におけるFos蛋白陽性細胞数が、有意に少ないことが示された。このことは、ミルナシプランの有する鎮痛効果に、前部帯状回が関与している可能性を示唆している。
腸管オルガノイドを用いた新しい安全性評価系の構築

本研究の目的は、腸管オルガノイド(三次元的に生体外で作られた腸管:外側は基底膜側、内側は管腔側の構造)を用いて、(1)腸管に影響を引き起こすカビ毒のデオキシニバレノール(DON)とニバレノール(NIV)が、腸管の幹細胞や、タイトジャンクションやトランスポーターに対する影響を調べ、これまでのin vitro系の結果と比較し、当該オルガノイド評価系の妥当性を検討する、(2)オルガノイド評価系の結果と当該カビ毒を投与したマウスの腸管における変化の結果を比較検討することである。これにより、DONやNIVの腸管の幹細胞に与える影響といった新規の情報を提示するだけでなく、腸管オルガノイド評価系の有用性を示し、動物に替わる新たな安全性評価系の構築につなげたい。本年度は、主に基底膜側からの暴露の影響を調べた。その結果、DON、NIVともに1 uM以上の濃度で、腸管オルガノイドの細胞生存率を有意に低下した。また、DONは1 uM以上、NIVは0.05 uM以上の濃度で、腸管オルガノイドの増殖活性を低下した。さらに、Lgr5-EGFPマウスから調製した腸管オルガノイド(幹細胞に由来するLgr5を有する細胞が蛍光を発する)を用いて当該カビ毒を添加後、Lgr5に由来する蛍光をタイムラプスで追跡した結果、DON(0.1 uM)で18 h後、NIV(0.05 uM)で15 h後に蛍光強度の低下が認められ、幹細胞に負の影響を及ぼすことが示唆された。さらに、DON(1 uM)においてはタイトジャンクションに関わるZO-1や細胞骨格に関わるアクチンの低下、それらに起因するであろう物質透過性の増加が認められた。以上より、DONおよびNIVは細胞毒性を示した濃度よりも低い濃度において幹細胞に負の影響を及ぼすこと、DONがタイトジャンクションや細胞骨格に影響を及ぼし、物質透過性を増加させることが示唆された。本年度の予定は、デオキシニバレノール(DON)およびニバレノール(NIV)を腸管オルガノイドに添加し、基底膜側からの暴露の影響を調べることであった。具体的には、C57BL/6マウスから回収した腸管のクリプトをマトリゲルに包埋し、オルガノイド培養を行い、培養から3日目にDONあるいはNIVを培地に添加し、24時間後にオルガノイド自身の増殖活性(BrdU assay)、幹細胞への影響(Lgr5-EGFPマウス(幹細胞マーカーのLgr5が発現する細胞がEGFPという蛍光タンパク質で標識されるマウス)から調製したオルガノイドを用いて蛍光強度の変化を調べる)、分化細胞(内分泌細胞、杯細胞、上皮細胞、パネート細胞など)への影響(各マーカー分子の遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRで測定、あるいは各分化細胞のマーカー分子を蛍光免疫染色する)を調べることであった。また、DONあるいはNIVに暴露させた腸管オルガノイドのタイトジャンクションやトランスポーターに関わる因子の遺伝子やタンパク質の発現変化を、リアルタイムRT-PCR、ウエスタンブロッティング、切片の免疫染色により解析することも予定していた。DONにおいては増殖活性、幹細胞や分化細胞への影響、タイトジャンクションやアクチンへの影響を調べることができたが、NIVでは増殖活性と幹細胞への影響を調べた段階にとどまっている。しかし、手法はおおむね確立できており、DONとNIVともに幹細胞に負の影響があること、DONがタイトジャンクションやアクチンに影響して物質の透過性を亢進することが示唆されており、一定の成果が示せていると考え、進捗状況は「おおむね順調に進展している」と判断した。次年度は、管腔側からのDONおよびNIVを暴露させた場合、幹細胞にどのような影響があるのかを調べる。腸管オルガノイドは、外側が基底膜側、内側が管腔側という特徴を有しているため、管腔側からの暴露を模倣するためには、マイクロインジェクションが必要となる。マイクロインジェクション技術は確立しているが、定量的に腸管オルガノイドにインジェクションする手法がまだ確立できていない。すなわち、腸管オルガノイドの内側の体積がオルガノイドにより異なることから、インジェクション後に希釈程度が異なり、暴露濃度に違いが生じるためである。しかし、このポイントに関しては、Yokoiらの手法(Scientific Reports (2019)9:2710)を導入することでクリアできると考えている。この手法を確立できれば、次年度の計画である管腔側から当該カビ毒を暴露させた場合の腸管オルガノイドの増殖活性、幹細胞ならびに分化細胞(内分泌細胞、杯細胞、上皮細胞、パネート細胞など)への影響を明らかにできると考えている。また、初年度で予定していたDONあるいはNIVに暴露させた腸管オルガノイドのタイトジャンクションやトランスポーターに関わる因子の遺伝子やタンパク質の発現変化や、当該カビ毒を暴露させた後の物質の透過性の評価については十分ではないため、次年度にあわせて評価していく予定である。