hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リハビリ領域における系統的レビューの基盤整備とエビデンス診療ギャップの検証

1) 2008年から2017年の間に出版された理学療法関連領域コクランレビューを網羅的に検索、抽出し、対象疾患、介入、アウトカムを整理し、確固とした結論が出ているかどうか(conclusive evidenceの有無)を整理した。283件のコクランレビューが抽出された。結論の出ているコクランレビューは16件(5.7%)に過ぎなかった。結論の出ているコクランレビューは、そうでないレビューに比べ、選出された臨床研究数、参加症例数、共に多かった。結論の出ているコクランレビューは年々増加傾向にあることが分かった。理学療法に関するconclusive evidenceはまだまだ少なく、さらなる研究が必要であることが分かった。2)リハビリテーション関連システマティックレビューに挑戦してみたい研究者を広く募集し、研究テーマを相談した。レビューの実施は2人以上で行うこととし、研究計画立案をサポート、PROSPEROへ登録を行った。文献スクリーニングやデータ抽出、統計解析に必要なソフトウェアの操作法に関して指導を行った。スクリーニング作業は手間と時間のかかる作業であるため、人工知能(AI)を搭載した文献スクリーニングソフト(Rayyan等)を活用することで研究協力者の負担の軽減した。そして研究成果の出版までを包括的にサポートし、急性期入院患者に対する作業療法士による退院前訪問指導の効果に関するレビュー、急性期脳卒中リハビリテーション患者に対する栄養介入効果に関するレビューなどを出版した。3)今後、エビデンスと診療のギャップの検討に必要なDPCデータを入手することができた。初年次の目標であった理学療法に関するconclusive evidenceに関する研究を出版することができた。リハビリテーション関連システマティックレビューに関する研究支援も徐々に実施でき、システマティックレビューを複数出版することができた。次年度のエビデンスと診療のギャップの検討に必要なDPCデータを入手することができ、そちらの研究も始めることができるようになった。人工知能を用いたシステマティックレビューのサポート体制の整備を開始することができた。1)引き続きシステマティックビューのサポートを行っていく。義歯使用の嚥下機能改善効果、胃ろう患者に対する半固形栄養剤の有効性、脳卒中に対するボツリヌス療法の安全性、脳卒中に対する末梢磁気刺激に関するコクランレビュー(アップデート)、サルコペニア嚥下障害に対するリハビリテーション、肺がんに対する活動量増加、在宅がん患者に対するリハビリテーションと栄養介入、大体骨近位部骨折に対するリハビリテーションと栄養介入、急性入院患者に対するリハビリテーションと栄養介入に関するシステマティックビューを出版していく。2) DPCデータベースを用いて、心不全に対するリハビリテーション、大腸がんに対する術前リハビリテーション、間質性肺炎に対する早期リハビリテーションなどに関するエビデンス・プラクティス・ギャップについて検討を行う。
顔面神経麻痺後遺症としてみられる病的共同運動は改善するのか?

本研究によって顔面神経軸索障害後の運動神経核内における、神経細胞および周囲のグリア細胞の解剖学的変化についての知見が得られた。顔面神経の中枢神経内(脳内)および末梢部の軸索障害後、1週目から10週目にかけて顔面神経内の変化を観察した。抗GFAP抗体を用いて活性化アストロサイトをラベルし、障害神経核内のグリオーシスパターンを検討し、またsynaptic strippingとして知られている起始神経細胞からのシナプスの遊離現象を抗シナプスフィジン抗体を用いて観察した。顔面神経末梢軸索圧迫モデルでは手術後に顔面運動の完全麻痺がみられたが、運動神経細胞数の減少はみられなかった。synaptic strippingやアストロサイトの活性化は手術後3週目まで増強がみられ、顔面運動の改善が観察された後から、正常の状態に戻っていった。中枢神経内軸索切断モデルでは、障害後4週目には運動神経細胞の著明な減少がみられた。末梢軸索障害モデルと比較し中枢内軸索障害モデルでは、synaptic strippingやアストロサイトの活性化が強くかつ遷延して認められた。この顔面神経中枢内軸索障害モデルは、外傷性脳損傷後の神経細胞死や細胞死に至る経時的変化を検討するための、潜在的価値のある新しいモデルであると考えられる。顔面神経障害後に、一部の動物では糖質コルチコイド(プレドニゾロン)の腹腔内投与を行い、1週間後に効果を検討した。中枢軸索障害後には、クロマトリーシスに陥った神経細胞数は、非投与群に比較して少なかった。またsynaptic strippingやアストロサイトの活性化は、投与群において明らかに抑制されていた。これらの結果から、糖質コルチコイドには軸索障害部における抗炎症作用以外にも、神経の変性や再生の過程に直接の影響、効果があることが期待され、今後末梢性顔面神経麻痺の治療の際に末梢の軸索障害部への影響のみではなく、顔面神経核レベルへの影響も考慮が必要であると考えられた。顔面神経麻痺後の顔面痙攣や、病的共同運動の成因としての中枢の関与を検討するために、まず顔面神経軸索障害後の神経核内における、運動神経細胞および周囲のグリア細胞の解剖学的変化を検討した。抗GFAP抗体を用いて活性化アストロサイトをラベルし、障害神経核内のグリオーシスパターンを検討し、またsynaptic strippingとして知られている起始神経細胞からのシナプスの遊離現象を抗シナプトフィジン抗体を用いて観察した。顔面神経抹消軸索圧迫モデルでは手術後に顔面運動の完全麻痺がみられたが、運動神経細胞数の減少はみられなかった。今回作成した顔面神経中枢内軸索障害モデルは、外傷姓脳損傷後の神経細胞死や細胞死に至る経時的変化を検討するための、潜在的価値のある新しいモデルであると考えられる。中枢軸索障害後には、クロマトリ-シスに陥った神経細胞数は、非投与群に比較して少なかった。これらの結果から、糖質コルチコイドには軸索障害部における抗炎症作用以外にも、神経の変性や再生の過程に直接の影響、効果があることが期待される。

これらの結果から、糖質コルチコイドには軸索障害部における抗炎症作用以外にも、神経の変性や再生の過程に直接の影響、効果があることが期待され、今後末梢性顔面神経麻痺の治療の際に末梢の軸索障害部への影響のみではなく、顔面神経核レベルへの影響も考慮が必要であると考えられた。
圧負荷肥大心における冠循環に関する研究

高血圧は、心肥大、冠血管自動調節能の障害及び冠血流予備能の低下を生ずる。本研究の目的は(1)圧負荷により生じた冠自動調節能障害は、負荷除去後正常化するのか?(2)圧負荷時間の長さの違いは、冠血流予備能低下の回復にどのような影響を与えるか?の2つである。[方法]実験1ラットを用い、麻酔開胸後、上行大動脈を狭窄し、閉胸(4週狭窄群)。一部のラットで4週間後、再開胸し、狭窄を解除した(4週狭窄後解除群)。狭窄解除4週後、心臓を摘出し、ランゲルドルフ標本を作製した。牛赤血球、アルブミンを加えたタイロ-ド液にて灌流し、冠灌流圧-血流関係を求めた。実験2以上と同様の実験群に、10週狭窄群及び10週狭窄後、狭窄を解除した群(10週狭窄群、10週狭窄後解除群)を加えた。心臓を摘出後、クレブス-ヘンゼライト液にて灌流し、1分間虚血後の冠血流増加より冠予備能を検討した。[結果]実験1 4週狭窄群では、心重量がコントロ-ルの50%増の心肥大を生じ、狭窄除去後、心肥大はコントロ-ル値の11%増になるまで退縮した。冠灌流圧が50-100mmHgで、コントロ-ル群にみられた冠自動調節能は、狭窄群では消失した。狭窄解除後4週では、障害された自動調節能は正常となり回復した。実験2負荷時間を10週と長くしても、心肥大と冠予備能の低下の程度(コントロ-ルの60%)は同じであった。また、負荷時間の長さは、狭窄解除後の心肥大の退縮の程度を変化させなかった。しかし、負荷時間の長さの違いは、負荷解除後の冠予備能の回復過程に対称的な効果を生じた。即ち、4週狭窄後解除群では、低下した冠予備能は正常に復したが、10週狭窄後解除群では、全くその回復を認めなかった。[結論]圧負荷肥大心における冠自動調節能障害は、負荷除去後、正常化しうる。また、負荷時間の長さの違いは、負荷除去後の冠予備能の低下の回復を決定する重要な因子である。心臓は高血圧等の負荷を与えられると肥大し、同時に冠血流異常を生ずる。この心筋肥大は、圧負荷をとり除かれると退縮し正常化する。しかし、冠血流異常が正常化するかどうかは全く報告がなく不明である。本研究における目的は「肥大心における冠血流異常は正常化し得るか?」の問いに答えることであった。[方法]3群のWister Ratを用いた。第1群-大動脈狭窄を4週間加えた群、第2群-4週間狭窄を加えた後、それをとり除いた後1週群、第3群-4週間狭窄を加えた後、それをとり除いた後4週群。以上の3群のRatで屠殺直前に開胸して心内圧、大動脈圧を測定した。

次に、3群のRatの屠殺後、心臓を摘出し、Krebs- Henseleit液にて潅流し、冠潅流量を測定した。冠流量測定時には、心内圧の冠流量に与える影響をとり除くために、心内圧を0とし、冠潅流圧は100、15 0mmHg両者において測定した。また、最大冠動脈拡張時の流量を得るため、1分間の虚血後の最大平均冠流量を測定した。[結果]1.心内圧194±13mmHg (コントロールでは114±9mmHg)の圧負荷はコントロール心重量の148±5%の心肥大を生じ、圧負荷除去後、心肥大は退縮した。2.冠流量は狭窄群で有意に減少した(冠潅流圧100及び150mmHgでコントロール群の53±4、61 ±4%)。狭窄除去群4週では冠流量は、その絶対値、冠流量/心筋重量ともに完全に正常化した。3.狭窄除去群1週では心筋の肥大は約50%退縮したが、冠流量/心筋重量値は改善していなかった。[まとめ]以上の結果から、著者は、「心筋肥大における冠流量異常は、決して固定されたものではなく、ある条件下では完全に可逆的である」との概念を提唱した。これらの結果は、高血圧症患者における冠循環異常研究に最初の示唆を与えるものである。前年度,本研究者は、圧負荷肥大心における冠循環障害は負荷除去後、ある条件下では可逆的であることを見出した。本年度の目的は次の如くである。圧負荷の長さの違いは、負荷除去後の冠予備能低下の回復過程にどのような影響を与えるかを検討することである。〔方法〕ウイスタ-ラットを用い、麻酔開胸後、上行大動脈を狭窄し閉胸した(4週狭窄郡)。その一部のラットで4週後再開胸し、狭窄を解除した(4週狭窄後解除群)。同様に10週狭窄後(10週狭窄群)、狭窄を解除した群(10週狭窄後解除群)の4群に分けた。狭窄解除後4週にラットを屠殺し、ランゲンドルフ標本を作製した。Krebs-Henseleit液にて潅流した。心内圧を常に0とし、血管外圧の影響をとり除いた。潅流圧を100,150mmHgとしたときの冠流量を測定し、また1分間の虚血後の反応性充血の最大値より、冠血管最大拡張能を求めた。〔結果〕4週狭窄郡,10週狭窄郡ともに、コントロ-ル値の50%増の心肥大を認めた。最大冠血管拡張時の潅流量は、潅流圧が100及び150mmHgで、コントロ-ル値の60%に減少した。狭窄解除後、心肥大はコントロ-ル値の11%増まで退縮し、両群ともに同程度であった。4週狭窄後解除郡では、最大冠潅流量はコントロ-ル値に復し、完全に正常可した。しかしながら、10週狭窄後解除郡では、最大冠潅流量は潅流圧が100,150mmHg両者において、コントロ-ル値よりも減少したままであった。〔結論〕(1)短期間の圧負荷による心肥大及び冠循環障害は正常に復し得る。(2)しかし、長期間に亘る圧負荷による冠循環障害は負荷除去後も回復しない。
血流解析を組み込んだ循環器診断システムの開発と次世代の予測医療の樹立

4D Flow MRIに関しては昨年度までに開発した研究用ソフトウェアに対して、利用者からのフィードバックを反映し、ユーザーインターフェースの改良、処理の高速化と安定化、HelicityやKinetic Pressureなどの機能追加を行った。また、位相画像の速度データに含まれる誤差を修正するアルゴリズムを比較し、従来の一次式で補正する手法を改良して二次関数で補正するアルゴリズムとして改良を行った。これにより正常大動脈において流量保存の誤差が小さいより正確な流量計測が可能となった。Computational FLuid Dynaicsに基づく血流解析手法に関しては、CTから形状を作成するためのプロセスの改良を行い、計算メッシュの精度を向上させることで、より短い時間で計算を行えるようになった。これにより手術など臨床で利用する上でより扱いやすいシステムとなった。また小児先天性心疾患、成人大動脈、冠動脈、ステントグラフトや人工弁などさまざまな疾患に対して精度良く計算するための手法を確立した。超音波カラードプラ計測に基づく血流解析に関して、昨年度完成させた解析ソフトウェアに対して心筋ストレインの解析機能、渦流の解析機能の開発を行った。また心内の血流をパスラインを使って可視化することで、より直感的に血流動態を把握することが可能となった。本年度は医療画像から2D, 3Dの画像診断および血流解析を可能とする画像診断ワークステーションのプロトタイプソフトウェアの開発を行い、下記を達成した。1MRI血流解析ソフトの開発:各装置メーカー、ソフトウェアメーカーと協力することでMRIの撮影方法、画像処理方法のプロセスを最適化し、精度よく自動で解析できるシステムを開発した。Phase ContrastMRIから2D, 3Dでの血流解析を単一のツールで数分数十分で可能となり、大幅に解析の効率が向上した。2プレリミナリー解析と学会発表:MRIの撮影方法の検証や精度検証を目的とし6例のMRIで血流解析を行った。撮影方法の違いによる血流解析の精度を検証し、国際学会(10th World Congress of Microcirculation)で発表を行った。また、解析のプロセスから得られたノウハウを解析ソフトウェアの開発にフィードバックし、より高精度かつ簡便に解析が可能なソフトウェアインターフェース、解析アルゴリズムを開発し組み込んだ。3コンピュータシミュレーション血流解析(CFD)システムの確立:血流をコンピュータでシミュレーションするための環境を構築し、大型計算機による高速な血流解析が可能となった。従来1週間かかっていた解析を1日程度で解析できるようになった。4システムの運用方法の検討:数例の解析を通して上記のシステムを統合して運用する方法を固めた。またシステムのバグを修正した。MRIおよびCFDを用いた血流解析システムは、当初の計画で参画を予定していた協力者に加え、MRI装置メーカー、ソフトウェアメーカーから技術支援、情報提供を受けることができたため、当初の計画以上に進展することができた。当該年度はワークステーションソフトウェアを京都府立医科大学内で運用し、弁膜症の血流の評価、大動脈解離の評価などの臨床研究に利用した。ソフトウェア利用のフィードバックを元にソフトウェアの安定性の向上、様々な計測機能の追加を行った。特に4D Flow MRI計測ソフトウェアにおいてはパスライン解析、Vorticity, Helicityを始めとした流体力学的な評価アルゴリズムを多数追加することで、大動脈解離でのエントリー血流の可視化など様々な面で血流解析の機能が強化された。また、4D Flow MRIの精度検証およびCFDの乱流モデルを始めとした計算手法のvalidationを4D flow MRI, CFDを相互に比較することで行った。4D Flow MRIは実測でin-vivoの血流速度場を得られるが空間分解能が14mm程度、時間分解能が50100ms程度と荒く、wall shear stressやエネルギー損失などの血行力学的な指標を求める上で分解能が不足している。一方CFDは空間分解能を十分に細かく設定できるものの流量、圧、血管形状などを境界条件として行われるシミュレーションであり実測ではない。特に1拍動の中で流れの様相がダイナミックに変化する大動脈のような流れ場において乱流モデルの利用の是非はわかっていない。我々はCFDとMRIの血流速度場をポイントごとで比較することで至適な乱流計算方法を検証し、また4D Flow MRIの低い分解能に依存するエネルギー損失計算、wall shear strss計算の特性を明らかにし、臨床研究で用いる上での信頼性を向上した。試作ソフトウェアを研究協力者が精力的にテスト、運用しており、十分なフィードバックが得られているため、ソフトウェアの開発、改良が順調に進んだ。4D Flow MRIに関しては呼吸および心拍の画像アーチファクトによる解析精度の影響に関して検証を行った。肺動脈において呼吸の影響を加味することで直径5mm程度までの血管であれば十分な精度を持って血流量を解析できることを明らかにし、呼吸同期あり、呼吸動機無しの条件においてMRIの分解能と血流解析の精度の関係を明らかにした。また、数値流体解析と4D Flow MRIでcross validationを行いエネルギー損失や壁ずり応力の精度と正確度について検証を行った。大動脈の血流解析において4D Flow MRIでは分解能の不足により血管径の小さな部位で流量が過小評価さること、また壁ずり応力は過小評価されるが同一の症例内での相対的な値は十分に計測できることを明らかにした。この検証結果をもとに壁ずり応力の計算アルゴリズムを改良しより正確な壁ずり応力を計測できるようになった。また、超音波カラードプラ計測に基づき血流をベクトルで可視化、解析するソフトウェアを完成させた。

この手法により、従来のカラードプラでは超音波プローベから遠ざかる血流と近づく血流のみ計測可能であったが、ビームに直行する血流速度を計算から求めることで心内に発生する渦流を可視化することが可能となった。HDF5を始めとした汎用的な数値データフォーマットから解析できるインターフェースを整備することで、特定の装置やメーカーに限定されずに汎用的に利用できるツールとなった。解析用ソフトウェアに関して研究協力者から多くのフィードバックを得ることができ、十分な完成度をもって開発を行うことができた。超音波VFM解析や4D Flow MRI解析においてVorticity, Helicityなど渦流に関する計測方法について共同研究者からのフィードバックにより新しい知見を組み込んだ機能を開発することができ、当初想定していた基本的な機能に加えてより実践的な解析が可能となった。またCFDについての臨床応用についても先天性心疾患における利用を中心に、エネルギー損失、壁ずり応力など血流指標の基準値が制定され大幅に前進した。4D Flow MRIに関しては昨年度までに開発した研究用ソフトウェアに対して、利用者からのフィードバックを反映し、ユーザーインターフェースの改良、処理の高速化と安定化、HelicityやKinetic Pressureなどの機能追加を行った。また、位相画像の速度データに含まれる誤差を修正するアルゴリズムを比較し、従来の一次式で補正する手法を改良して二次関数で補正するアルゴリズムとして改良を行った。これにより正常大動脈において流量保存の誤差が小さいより正確な流量計測が可能となった。Computational FLuid Dynaicsに基づく血流解析手法に関しては、CTから形状を作成するためのプロセスの改良を行い、計算メッシュの精度を向上させることで、より短い時間で計算を行えるようになった。これにより手術など臨床で利用する上でより扱いやすいシステムとなった。また小児先天性心疾患、成人大動脈、冠動脈、ステントグラフトや人工弁などさまざまな疾患に対して精度良く計算するための手法を確立した。超音波カラードプラ計測に基づく血流解析に関して、昨年度完成させた解析ソフトウェアに対して心筋ストレインの解析機能、渦流の解析機能の開発を行った。また心内の血流をパスラインを使って可視化することで、より直感的に血流動態を把握することが可能となった。当初の計画通り、より多くの症例でMRI,CFDなどを用いた本ワークステーションを運用し、臨床データを蓄積するとともに、解析から得られたフィードバックをシステムに反映していく。また、仮想手術シミュレーションシステムなどCFDを応用した新たな治療戦略モデルを開発しその効果を検証していく。ソフトウェアは完成しており、今後はフィードバックを元に安定性の向上、必要な機能の追加を行っていく。
インスリン刺激伝達系増強因子としてのカベオリンと糖代謝異常治療への応用

当研究の目標は、インスリンシグナル増強因子であることを我々が初めて発見した3型(筋型)カベオリンを、耐糖能異常の治療に応用することである。蛋白、細胞レベルで3型カベオリンがインスリンシグナル増大作用を持つこと、当遺伝子のノックアウトマウスが、骨格筋におけるインスリンシグナル伝達系の異常から、耐糖能異常と脂質代謝異常を示すことはすでに報告済みである(J Biol Chem 273:1998)(Proc Natl Acad Sci 101:2004)。さらに、3型カベオリンが元来発現していない肝細胞へのadenovirusを用いた遺伝子導入により,インスリン感受性が飛躍的に増幅すること、高脂肪食による高血糖マウスの肝臓へadenovirusを用いて当遺伝子を導入すると、耐糖能異常と脂質異常が改善することを見いだしており,3型カベオリンがインスリンシグナルを増幅させるメカニズムを検討した.肝細胞への3型カベオリン強制発現は受容体を活性化し,IRS-1チロシンリン酸化に対するインスリン感受性を10倍に増幅,グリコーゲン合成能も増加した.2型糖尿病モデル動物(高脂肪食による高血糖マウス,遺伝的肥満マウス)では,肝臓へのカベオリンの強制発現により,インスリン受容体の自己リン酸化,インスリン受容体基質のチロシンリン酸化および,伝達系下流のシグナルが増加し,グリコーゲン合成は5倍に増大した.肝臓における糖取り込みは増加し,インスリン負荷試験や糖負荷試験では,インスリン抵抗性改善によって糖代謝異常の回復がみられた.しかし,ストレプトゾトシン投与によるインスリン分泌不全型のマウスや正常マウスには,上記のような遺伝子導入の効果はみられなかった.2型糖尿病モデル動物の肝臓ではインスリン刺激伝達系に抑制的に働くチロシンフォスファターゼPTP1Bの活性が上昇しており,カベオリンはPTP1Bの活性を直接抑制することも蛋白レベルの実験では示された.3型(筋型)カベオリンはインスリン受容体基質のチロシンリン酸化増幅および,チロシンフォスファターゼPTP1B活性抑制によりインスリン感受性を増加させ,耐糖能を改善させることが証明された.当遺伝子導入による,2型糖尿病治療への応用が期待される.当研究の目標は、インスリンシグナル増強因子であることを我々が初めて発見した3型(筋型)カベオリンを、耐糖能異常の治療に応用することである。さらに、3型カベオリンが元来発現していない肝細胞へのadenovirusを用いた遺伝子導入により,インスリン感受性が飛躍的に増幅すること、高脂肪食による高血糖マウスの肝臓へadenovirusを用いて当遺伝子を導入すると、耐糖能異常と脂質異常が改善することを見いだしており,3型カベオリンがインスリンシグナルを増幅させるメカニズムを検討した.インスリン感受性が低下している糖尿病モデル動物(高脂肪食による高血糖マウスや3型カベオリンノックアウトマウス)では,肝臓へのカベオリンの強制発現により,インスリン受容体の自己リン酸化,インスリン受容体基質のチロシンリン酸化および,伝達系下流のシグナルが増加し,グリコーゲン合成が増大した.

肝臓における糖取り込みは増加し,インスリン負荷試験や糖負荷試験では,インスリン感受性増加による高血糖の著明な改善がみられた.しかし,ストレプトゾトシン投与によるインスリン分泌不全型のマウスや正常マウスには,上記のような遺伝子導入の効果がなく,3型カベオリン自体がインスリン作用を示すのではなく,低下したインスリン感受性を改善させる作用があることが証明された.耐糖能異常の発症自体にもカベオリンの機能異常や発現量低下が関与している可能性もあり,さらに詳細なメカニズムについて研究中である.当研究の目標は、インスリンシグナル増強因子であることを我々が初めて発見した3型(筋型)カベオリンを、耐糖能異常の治療に応用することである。蛋白、細胞レベルで3型力ベオリンがインスリンシグナル増大作用を持つこと、当遺伝子のノックアウトマウスが、骨格筋におけるインスリンシグナル伝達系の異常から、耐糖能異常と脂質代謝異常を示すことはすでに報告済みである(J Biol Chem 273:1998)(Proc Natl Acad Sci 101:2004)。さらに、3型カベオリンが元来発現していない肝細胞へのadenovirusを用いた遺伝子導入により,インスリン感受性が飛躍的に増幅すること、高脂肪食による高血糖マウスの肝臓へadenovirusを用いて当遺伝子を導入すると、耐糖能異常と脂質異常が改善することを見いだしており,3型カベオリンがインスリンシグナルを増幅させるメカニズムを検討した.肝細胞への3型力ベオリン強制発現は受容体を活性化し,IRS-1チロシンリン酸化に対するインスリン感受性を10倍に増幅,グリコーゲン合成能も増加した.2型糖尿病モデル動物(高脂肪食による高血糖マウス,遺伝的肥満マウス)では,肝臓へのカベオリンの強制発現により,インスリン受容体の自己リン酸化,インスリン受容体基質のチロシンリン酸化および,伝達系下流のシグナルが増加し,グリコーゲン合成は5倍に増大した.肝臓における糖取り込みは増加し,インスリン負荷試験や糖負荷試験では,インスリン抵抗性改善によって糖代謝異常の回復がみられた.しかし,ストレプトゾトシン投与によるインスリン分泌不全型のマウスや正常マウスには,上記のような遺伝子導入の効果はみられなかった.2型糖尿病モデル動物の肝臓ではインスリン刺激伝達系に抑制的に働くチロシンフォスファターゼPTP1Bの活性が上昇しており,カベオリンはPTP1Bの活性を直接抑制することも蛋白レベルの実験では示された.3型(筋型)カベオリンはインスリン作用を示すのではなく,インスリン感受性を増加させることによって耐糖能を改善させることが証明された.
生体の情報処理機構を模倣したスケーラブルな高分子デバイスの創製

近年、生物模倣型の信号伝達/情報処理デバイスは、高エネルギー効率の処理が可能であるため、超低消費電力のプロセッサとして注目されつつある。本研究では、ニューロン模倣型の確率的閾値デバイス素子の作製を目指して研究を行った。生物の柔軟な信号伝達/情報処理に重要な素子の「確率性」は、構造様式制御型ポリ(3-デシルチオフェン)[RR-P3DT]のキャリアトラップ充填転移付近の確率的な電気伝導特性を利用した。示差走査型熱量(DSC)計測と温度可変固体高分解能C-13核磁気共鳴(NMR)計測より、このキャリアトラップ充填転移はRR-P3DTのチオフェン環のツイスト運動と相関をもっていることが明らかとなり、分子運動のゆらぎが巨視的な物性ゆらぎを生じさせていることがわかった。さらにノイズ計測の結果より、キャリアトラップ充填転移を境界として、ノイズのパワースペクトル密度の関数型が、低電圧側ではDebye型、高電圧側では1/f型であることがわかり、印加電圧によってノイズのパワースペクトル密度の関数型の制御が可能であることが明らかとなった。このことは、ノイズ駆動型信号伝達デバイスやスイッチデバイスの実現にとって重要な技術要素となる。以上のことから、RR-P3ATを中心としたノイズ駆動型信号伝達デバイス素子の作製を通して、生物模倣型エレクトロニクスデバイスの開発と学理を追求した。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、パイ共役系高分子を中心に、ノイズ発生源に適した物質を探索し、確率的値素子の開発に着手した。物質探索の際には、形状の大きな変化を伴わない構造相転移やガラス転移に着目し、その相転移と、巨視的な電気物性との相関が大きな物質を探索した。その結果、構造様式制御型ポリ(3-デシルチオフェン)[RR-P3DT]が室温付近において、ポリ(3-ヘキシルチオフェン)[RR-P3HT]に比べて電気伝導度の大きな時間ゆらぎを有していることがわかった。このゆらぎは、複数伝導状態間の準確率的な遷移によるノイズ発生であり、マルチプルトラッピングとその熱的解放(MTRモデル)の枠組でのトラップ充填転移近傍のゆらぎが原因であることが示唆された。さらに、ノイズ測定により、このゆらぎのノイズパワースペクトル密度は、印加電圧の上昇に伴い、f-2型からf-1型へ変化することが分かった。このことは、印加電圧によって、ノイズパワースペクトル密度を制御することができることを意味しているため、ノイズ駆動型の信号伝達の際に重要な役割を担うと考えられる。確率的値素子の研究開発に並行して、電界効果がゆらいだ電界効果トランジスタ(FET)の開発も行った。この不安定動作のFETには、パイ共役系高分子の相転移現象と結合した、確率的な負性抵抗現象を伴う非線形電流電圧特性といった準確率過程を用いることとした。現時点では、ゆらいだFETを作製する前段階として、安定動作するボトムゲート型およびトップゲート型高分子FETを作製し、共に、飽和領域を有する双安定特性を有することが分かった。また、確率共鳴現象の計測セットアップを構築し、既存の金属酸化物電界効果トランジスタ(MOSFET)を用いた確率共鳴分光測定を確立した。現在、RR-P3HTおよびRR-P3DTを用いた確率共鳴現象の発現を行っている。平成25年度は、ノイズ発生源に適した物質を探索し、確率的閾値素子の開発を行う計画で研究を行った。物質探索の際には、形状の大きな変化を伴わない構造相転移やガラス転移に着目し、その転移と、巨視的な電気物性との相関が大きな物質を探索することとした。実際に、室温付近での秩序-無秩序相転移を有するパイ共役系高分子であるポリ(3-デシルチオフェン)[P3DT]を用いた縦型デバイス素子において、電気伝導度の大きな時間ゆらぎを観測することができたことから、確率的素子の開発に一定の目途がたったと考えている。

また、ポリ(ヘキシルチオフェン)[P3HT]を用いたボトムゲート型およびトップゲート型の高分子電界効果トランジスタ(PFET)を作製し、共に、FET挙動に飽和領域を観測することができた。このFETの挙動は、excitable mediaとしてのニューロンに特徴的な電気特性である双安定性を模倣した挙動を示している。また、複数の伝導状態間の確率的な遷移を示す二端子素子は分子ノイズ発生器としても有用であり、ノイズ駆動型信号伝達や情報処理デバイスにとって重要な要素技術となると考えられる。以上のことから、平成25年度の研究成果は、研究計画と照らし合わせて、おおむね順調に進展していると考えられる。平成25年度に引き続き、ノイズ発生源の物質探索と確率的閾値素子の開発を行い、確率的閾値素子の作製とその周辺技術を確立する。さらに、確率的閾値素子を用いたノイズ駆動センサおよびノイズ駆動スイッチの開発を行う。具体的には、複数の素子から成る回路に必要な電極を、金属マスクを用いた真空蒸着法により作製し、センサおよびスイッチの電気的特性を調べる。以上の研究課題と並行して、確率的閾値素子に一方向信号伝達性能を付与するために、(i)確率的電界効果トランジスタ(FET)と(ii)確率的光電変換性能を有する確率的フォトカプラの開発にも着手する。FETの開発では絶縁膜の開発がキーとなることが多いが、本研究では、確率的動作の発現にも注力する。確率的フォトカプラは、高分子エレクトロルミネセンス(EL)素子と光起電力(PV)素子から構成され、FETの場合と同様に、確率的挙動の発現に注力する。以上のように本研究では、そのような不安定なスイッチング現象を示す高分子材料を探索し、確率的なEL素子またはPV素子の作製を行う。具体的には、EL素子としては、ポリフルオレン(PFO)系のものを予定しており、高分子薄膜の固体構造の違いによるEL挙動の不安定性の違いを調べ、確率的なEL特性の発現に注力する。一方、PV素子にはポリアルキルチオフェン(P3AT)系とフラーレン誘導体を用いた典型的なバルクヘテロジャンクション型のものを予定している。平成26年度は、このようなP3ATを用いた確率的な光電変換効率を有するPV素子の研究開発も併せて行う。上述のEL素子とPV素子のいずれかまたは一方の素子が確率的挙動を示すことができれば、確率的なフォトカプラの実現が可能となり、一方向信号伝達性能を有するシナプス模倣素子の実現が可能となる。以上の研究を実施し、平成26年度は最終年度として研究全体の総括を行う。
頸部リンパ節転移に対する既存抗癌剤の磁性化薬を用いた新規治療法の開発

磁性パクリタキセルはヒト由来扁平上皮癌細胞株に対して、アポトーシスを誘導させた。また、温熱することでよりアポトーシスが誘導させた。浸潤能抑制試験においても、磁性パクリタキセルによって、細胞の動きが抑制された。温熱することでより抑制することが確認された。細胞実験において、磁性パクリタキセルはヒト由来扁平上皮癌細胞株において抗癌活性が認められ、温熱効果も有用であった。動物実験では、マウスの舌に移植したヒト由来扁平上皮癌細胞株の腫瘍の縮小を認めており、病理組織学的初見において頚部リンパ節の転移の抗癌活性を認めていた。CTによる評価では、アーチファクトが大きく評価困難であった。局所の超進行癌、再発症例、頸部の多発性リンパ節転移などは超選択的動注化学放射線療法だけでは制御困難な症例もあることから、このような症例に対しては温熱療法の併用を行っている。今回の研究では、われわれはマウス舌癌頸部リンパ節転移モデルを作成し、申請者らのグループが開発した磁性パクリタキセルを用いて、頸部のリンパ節転移に対する抗腫瘍効果の検討を目的とする。本研究では、磁性パクリタキセルを利用することにより、頸部転移リンパ節を対象として、パクリタキセルが持つ抗癌活性と温熱療法の両者の効果による相乗的作用とCT造影効果を細胞実験、動物実験において検討し、その効果を実証する。頸部リンパ節への転移モデルとして、ヒト由来扁平上皮癌細胞を用いて従来の抗癌活性と温熱療法によるアポトーシス誘導を解明し、磁性パクリタキセルの細胞傷害性を証明した。われわれが開発した磁性パクリタキセルが、乳がん細胞に対して抗腫瘍効果があることは証明されている。アポトーシスによる細胞死が、パクリタキセルの従来持つ抗癌活性と温熱療法の相乗効果による抗腫瘍効果がどの程度増強されるかは不明である。平成27年度は、細胞実験において抗腫瘍効果のメカニズムを確認するとともに、動物実験をはじめる上で必要な条件検討を行った。また、実際のリンパ節への磁性パクリタキセルの集積量をCTの造影効果から検討するため、ファントムモデルを用いてプレ実験を行った。平成27年度は、頸部リンパ節への転移モデルとして、ヒト由来扁平上皮癌細胞を用いて従来の抗癌活性と温熱療法によるアポトーシス誘導を解明し、磁性パクリタキセルの細胞傷害性を証明した。腫瘍細胞はヒト由来扁平上皮癌細胞(OSC-19、HSC-3)を用いた。OSC-19、HSC-3(5×105cells)に本抗癌剤7.5、15、30、60μMを投与した。温熱は交流磁場にて行った。アポトーシスは、FACSCantoIIフローサイトメトリーで測定した。ヒト由来扁平上皮癌細胞に対して濃度依存的にアポトーシスの誘導を認めていた。次に、本抗癌剤が浸潤能の高いOSC-19、HSC-3癌細胞に対して細胞の動きを抑制することを解明し、リンパ節転移の細胞に対しても有効であることを証明するため、ヒト由来扁平上皮癌細胞株に対して磁性パクリタキセルが及ぼす浸潤能抑制を評価した。OSC-19、HSC-3癌細胞をチャンバースライドに撒き24時間後に7.5μMの本抗癌剤を投与した。顕微鏡で細胞の動きを30分おきに24時間撮影し、細胞が動きをプロットし距離を求めた。本抗癌剤を投与した群では、細胞の活動性が抑制されていた。最後に、アポトーシスによる細胞死が、パクリタキセルの従来持つ抗癌活性と温熱療法の相乗効果による抗腫瘍効果がどの程度増強されるかは不明であったため、動物実験を用いて最適な投与方法などプロトコールの確立を目指した。このことから、最適な投与濃度と投与量を決定した。また、実際のリンパ節への磁性パクリタキセルの集積量をCTの造影効果から検討するため、ファントムモデルを用いて評価を行った。平成28年度は、頸部リンパ節への転移モデルにおける磁性パクリタキセルの抗癌活性・温熱療法による抗腫瘍効果とCT造影効果を、マウスを利用した動物実験において証明した。マウスの舌にHSC-19癌細胞(細胞数:5.0×108個)を移植した。マウスのHSC-19癌細胞については移植後約20日後に頸部リンパ節への転移を確認した。イソフルランを用いた吸入麻酔下に、腫瘍部位に局所に本抗癌剤(5mg/kg)を投与した。コントロール群は投与なし。投与後、頸部をコイル径100mmの内部へ挿入し、磁場印加を行った。週2回、3週間行い定期的にCT撮影を行った。舌・リンパ節の組織標本を作成し、HE染色、TUNEL法、免疫組織染色で評価を行った。温熱を行うためのマウスの頸部が入る交流磁場機器については申請者らのグループが開発した装置を使用した。CTによる評価はアーチファアクトにより困難であったが、病理の評価において温熱をおこなった群では、原発と頚部リンパ節転移部分の抗腫瘍効果を認めていた。申請者らのグループが開発した磁性パクリタキセルを用いて口腔癌の原発巣に投与することによって、リンパ流を介して頸部の転移リンパ節へ本抗癌剤が流入し、原発巣および頸部への選択的温熱療法を行い、転移リンパ節に対する抗腫瘍効果を示した。

口腔癌に対する従来の治療法のデメリットを極力回避し、低侵襲かつより安全で、患者のQOL向上が期待される新たな治療法になりうる可能性が示唆された。今後は、実験群とN数を増やして優位性を示していく予定である。また、口腔癌のみならず他の癌種においても有用性を示したいと考えている。磁性パクリタキセルはヒト由来扁平上皮癌細胞株に対して、アポトーシスを誘導させた。また、温熱することでよりアポトーシスが誘導させた。浸潤能抑制試験においても、磁性パクリタキセルによって、細胞の動きが抑制された。温熱することでより抑制することが確認された。細胞実験において、磁性パクリタキセルはヒト由来扁平上皮癌細胞株において抗癌活性が認められ、温熱効果も有用であった。動物実験では、マウスの舌に移植したヒト由来扁平上皮癌細胞株の腫瘍の縮小を認めており、病理組織学的初見において頚部リンパ節の転移の抗癌活性を認めていた。CTによる評価では、アーチファクトが大きく評価困難であった。平成28年度は、マウスリンパ節転移モデルを用いた新規磁性抗癌剤の抗腫瘍効果の検討を行う予定である。頸部リンパ節への転移における本薬剤の抗癌活性・温熱療法による抗腫瘍効果とCT造影効果を、マウスを利用した動物実験において証明する。実験方法としては、マウスの頸部リンパ節転移モデルの確立を行う。マウスの舌にHSC-19癌細胞(細胞数:5.0×108個)を移植する。マウスのHSC-19癌細胞については移植後約20日後に頸部リンパ節への転移が起こることが報告されている(Sano D. et al. Head Neck Oncol. 2009)ため、HSC-19癌細胞を舌に移植し、移植後16日、18日後、20日後、22日後にリンパ節を摘出し、転移の有無、原発と転移リンパ節の大きさ、個数について病理組織学的に評価する。次に、交流磁場発生装置を用いたマウスリンパ節転移モデルによる温熱療法の検討を行う。マウスの舌にHSC-19癌細胞を移植し、腫瘍径5mmを超えリンパ節転移が確認されたら実験開始とする。イソフルランを用いた吸入麻酔下に、腫瘍部位に局所に本抗癌剤(5mg/kg)を投与する。コントロール群は投与なし。投与後、頸部をコイル径100mmの内部へ挿入し、磁場印加を行う。週2回、3週間行い定期的にCT撮影を行う。舌・リンパ節の組織標本を作成し、HE染色、TUNEL法、免疫組織染色で評価を行う。温熱を行うためのマウスの頸部が入る交流磁場機器については申請者らのグループが開発した装置を使用する予定である。口腔癌
血管新生をターゲットとした吻合部内膜肥厚の病態解明と治療法の確立

小口径人工血管の吻合部内膜肥厚を検討するためには、臨床において用いられている端側吻合部の血流異常、特にheel側におけるto-and-froの血流によるずり応力の血管内皮細胞や血管平滑筋細胞等の血管構築細胞に対する影響を検討する必要がある。そこで、高脂血症兎頚動脈人工血管置換モデルを用い血管新生抑制物質であるAGM-1470の吻合部内膜肥厚に与える影響について以下の要領で実験的検討を行った。1.<目的>血管平滑筋細胞・血管内皮細胞をずり応力下で培養し、ずり応力の血管平滑筋細胞に対する影響を検討する<結果>両方向性のずり応力を負荷されることにより、血管平滑筋細胞の遊走能は抑制され、増殖能は亢進された。血管内皮細胞は、平滑筋細胞の遊走能を亢進する液性因子を培養液中に産生したが、増殖能を亢進させなかった。血管内皮細胞産生増殖因子を介した平滑筋の遊走能は、ずり応力により直接的に抑制された。2.<目的>in-vitroにおいて、血管新生抑制物質であるAGM-1470が血管平滑筋細胞自身の遊走・増殖能にどのように作用するか検討する<結果>血管内皮細胞がずり応力下で産生する増殖因子は、主としてPDGFであることが示され、AGM-1470はその産生を抑制した。AGM-1470は、ずり応力下の血管内皮細胞が産生する増殖因子のない状態では、血管平滑筋細胞の増殖能には影響を与えず、遊走能には抑制的な影響を与え、増殖因子存在下においても血管平滑筋細胞遊走能を抑制した。3.<目的>最終的にin-vivoにおいて血管新生抑制物質AMG-1470が、局所投与により内膜肥厚に与える影響を検討する。<結果>AGM-1470局所投与は高脂血症ウサギ頚動脈ePTEEグラフト置換モデルにおいて、重大な全身性副作用を認めずに吻合部内膜肥厚を抑制した。今後、新しいdrug deliverysystemの開発が進めば、さらに薬剤の投与プログラムを調整することが可能となり、AGM-1470局所投与は吻合部内膜肥厚抑制の良い治療戦略になりうると考えられた。1.〈目的〉血管平滑筋細胞・血管内皮細胞をずり応力下で培養し、ずり応力の血管平滑筋細胞に対する影響を検討する〈結果〉両方向性のずり応力を負荷されることにより、血管平滑筋細胞の遊走能は抑制され、増殖能は亢進された。

血管内皮細胞産生増殖因子を介した平滑筋の遊走能は、ずり応力により直接的に抑制された。2.〈目的〉in-vitroにおいて、血管新生抑制物質であるAGM-1470が血管平滑筋細胞自身の遊走・増殖能にどのように作用するか検討する〈結果〉血管内皮細胞がずり応力下で産生する増殖因子は、主としてPDGFであることが示され、AGM-1470はその産生を抑制した。AGM-1470は、ずり応力下の血管内皮細胞が産生する増殖因子のない状態では、血管平滑筋細胞の増殖能には影響を与えず、遊走能には抑制的な影響を与え、増殖因子存在下においても血管平滑筋細胞遊走能を抑制した。本年度は、最終的にin-vivoにおいて血管新生抑制物質AMG-1470が、局所投与により内膜肥厚抑制に有用であることを確認する予定である。小口径人工血管の吻合部内膜肥厚を検討するためには、臨床において用いられている端側吻合部の血流異常、特にheel側におけるto-and-froの血流によるずり応力の血管内皮細胞や血管平滑筋細胞等の血管構築細胞に対する影響を検討する必要がある。そこで、高脂血症兎頚動脈人工血管置換モデルを用い血管新生抑制物質であるAGM-1470の吻合部内膜肥厚に与える影響について以下の要領で実験的検討を行った。1.<目的>血管平滑筋細胞・血管内皮細胞をずり応力下で培養し、ずり応力の血管平滑筋細胞に対する影響を検討する<結果>両方向性のずり応力を負荷されることにより、血管平滑筋細胞の遊走能は抑制され、増殖能は亢進された。血管内皮細胞は、平滑筋細胞の遊走能を亢進する液性因子を培養液中に産生したが、増殖能を亢進させなかった。2.<目的>in-vitroにおいて、血管新生抑制物質であるAGM-1470が血管平滑筋細胞自身の遊走・増殖能にどのように作用するか検討する<結果>血管内皮細胞がずり応力下で産生する増殖因子は、主としてPDGFであることが示され、AGM-1470はその産生を抑制した。3.<目的>最終的にin-vivoにおいて血管新生抑制物質AMG-1470が、局所投与により内膜肥厚に与える影響を検討する。<結果>AGM-1470局所投与は、高脂血症ウサギ頚動脈ePTEEグラフト置換モデルにおいて、重大な全身性副作用を認めずに吻合部内膜肥厚を抑制した。今後、新しいdrug deliverysystemの開発が進めば、さらに薬剤の投与プログラムを調整することが可能となり、AGM-1470局所投与は吻合部内膜肥厚抑制の良い治療戦略になりうると考えられた。
Dkk4による大腸癌Wntシグナルの分子制御機構の解明

本研究の目的はDkk4のWntシグナル伝達経路への関与を解析し、大腸癌発癌過程におけるDkk4の役割を明らかにすることにある。DkkにはDkk1からDkk4まで4種類のホモログが存在するが、各々の機能の違いは明確になっていない。われわれは大腸癌で高発現している遺伝子の1つとしてDkk4を見い出し、これに着目して研究を開始した。進行大腸癌、早期大腸癌、腺腫の腫瘍部・非腫瘍部の臨床生検検体についてReal Time-PCRを行ないDkk familyそれぞれの発現量を調べたところ、腫瘍部ではDkk2とDkk4が著明に高発現しており、悪性化に伴い発現が増加していた。Dkk1はWntの阻害蛋白であり、大腸癌でDkk1の発現低下しているとの報告があるが、Dkk1以外のDkk familyについては大腸癌での発現の報告はこれまでにない。いままでDkk4もDkk1と同様にWntシグナル伝達を制御すると考えられていたが、我々が大腸癌でDkk4が高発現することを確認したことは、Dkk1とは逆にDkk4がWntシグナル伝達経路および大腸癌の発生進展に対して促進的に作用する可能性を示している。Dkk4のWntシグナル伝達での役割を解析し、大腸癌発癌におけるDkk4の役割を明らかにすることは大腸癌発生過程の理解とその診断治療法の開発において重要であると考え、これまでDkk4を含めたDkk familyの機能を解析してきた。現在、つぎの検討を行なっている。(1)Dkk familyの発現ベクターによる、Dkkの細胞増殖能、細胞周期への関与について。(2)βカテニンの標的であるTCFプロモータを用いたレポーターアッセイにより、DkkのWntシグナル伝達系への影響。(3)マイクロアレイ法を用いてDkkの過剰発現、抑制により発現の変化している遺伝子の網羅的な検索。Dkk1と同様にDkk4もWntシグナル伝達を制御すると考えられているが、我々が大腸癌でDkk4が高発現することを発見したことは、Dkk4がWntシグナル伝達経路および大腸癌の発生進展に対して促進的に作用する可能性を示している。したがってDkk4のWntシグナル伝達での役割を解析し、大腸癌発癌におけるDkk4の役割を明らかにすることは大腸癌発生過程の理解とその診断治療法の開発において重要であると考えられる。H17年度は大腸癌細胞株を用いてDkkの発現量を調べる一方、実際の大腸癌の生検検体を用いて、RT-PCRを行いDkk4の発現を調べた。今後、正常粘膜、早期癌、進行癌、転移巣におけるDkk4の発現の変化について検討し発癌・癌の進行にDkk4がどのように関与しているか調べDkkを標的とした診断、治療方針、予後の判断に応用できるか検討する。また、Dkk1からDkk4について、これらを正常細胞株、大腸癌細胞株に導入し、細胞増殖アッセイ、フローサイトメトリーを用い、Dkkの細胞増殖能、細胞周期へ関与を調べるための、発現ベクターの構築を行った。また、Dkk1からDkk4についてそれぞれの発現を効率的に抑制するsiRNAを作成、大腸癌細胞株に導入し、細胞増殖アッセイ、フローサイトメトリーを用い、Dkkの細胞増殖能、細胞周期へ関与を検討中である。レポーターアッセイ、βカテニンの標的であるTCFプロモータを用いたレポーターアッセイにより、DkkのWntシグナル伝達系への影響を検討している。今後、Dkkの遺伝子過剰発現系、抑制系でのWntシグナル伝達系での遺伝子・蛋白発現量の変化を調べることによりDkk4がWntシグナル伝達系に対して抑制性に働くのか、促進性に働くのか検討する予定である。

(2)βカテニンの標的であるTCFプロモータを用いたレポーターアッセイにより、DkkのWntシグナル伝達系への影響。(3)マイクロアレイ法を用いてDkkの過剰発現、抑制により発現の変化している遺伝子の網羅的な検索。
原発性骨・軟部腫瘍および転移性腫瘍における血管新生に関する分子生物学的研究

原発性骨・軟部腫瘍および転移性腫瘍における血管内皮増殖因子Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)とそのisoformsの発現についてRT-PCR法を用いてその発現を見た。VEGF isoformsの発現においてVEGF121、VEGF121+165、VEGF121+165+189をそれぞれVEGF type1、2、3とした。良性骨腫瘍が5種16検体、原発性悪性骨腫瘍が3種9検体、転移性骨腫瘍が3種3検体、良性軟部腫瘍が7種24検体、悪性軟部肉腫は11種36検体(うち肺転移6検体)、異種(マウス)移植検体は悪性骨腫瘍で1種1検体、悪性軟部肉腫で7種17検体を用いた。各々のVEGFのおよびそのisoformsの発現は良性骨腫瘍で12.5%(2/16)、VEGF type1-0%,type2-50%(1/2),type3-50%(1/2)、原発性悪性骨腫瘍で55.5%(5/9)、type1-20%(1/5),2-60%(3/5),3-20%(1/5)、転移性骨腫瘍で66.6%(2/3)、type1-0%,2-50%(1/2),3-50%(1/2)、良性軟部腫瘍で25%(6/24)、type1-50%(3/6),2-33.3%(2/6),3-16.6%(1/6)、悪性軟部肉腫で63.8%(23/36)うち肺転移は83.3%(5/6)、type1-17.3%(4/23),2-69.5%(16/23),3-13%(3/23)、移植検体は悪性骨腫瘍で0%(0/1)、悪性軟部肉腫で100%、type1-5%(1/17),2-76.4%(13/17),3-17.6%(3/17)であった。良・悪性を比較すると発現率は明らかに悪性で高く、とくに肺転移例、移植検体では83.3%、100%と高率であった。Isoformの発現様式は骨肉腫同様type2が高かった。
リン脂質代謝と脂質メディエーターの総合的研究

グリセロリン脂質は細胞膜の主要成分であり、その種類は1500に達すると言われている。リン脂質多様性がいかに作られ、単なる隔壁を越えた、多様性の生物的意義は何か、を明らかにすることが本研究の目的である。膜生成に関与すると思われる10種類のアシル転位酵素を同定し、多様性生成機構を明らかにした。また、膜の脂質組成や生理活性脂質を網羅的に解析するリピドミクス技術も開発した。脂質膜の異常が細胞機能の変化や疾病にどの様に関連するかの基礎知見が集積した。半世紀以上の謎が解けはじめている。(1)膜リン脂質代謝の解析(ホスホリパーゼA2およびアシル転移酵素ファミリー遺伝子の同定と機能解析)(2)脂質メディエーターの生理的意義、病態における役割とその分子機構の解明(3)脂質メディエーターの網羅的、且つ定量的な解析システムとデータベースの作成グリセロリン脂質は細胞膜の主要成分であり、その種類は1500に達すると言われている。PAF(血小板活性化因子)産生の責任酵素として2つのリゾホスファチジルコリンアシル転位酵素(LPCAT1,LPCAT2)を同定し、前者が恒常的に働くのに対し、後者は炎症誘導的に発現増強して活性化されることを明らかにした。また、この2つの酵素と配列的に近縁な遺伝子を網羅的に解析することでアシルCoAからリゾリン脂質に脂肪酸を転移させる酵素群を他にも見出し、こうした酵素群の働きで細胞内での膜脂質の生合成と代謝回転が進み、生体膜の多様性が生み出されることを発見した。ホスホリパーゼA2α欠損マウスで観察されている種々の表現型の分子機構を明らかにするため、下流分子の受容体欠損マウス(BLT1,BLT2,CysLT2,LPA4)を樹立し、その表現型解析を進めている。これら受容体の諸性質解析も並行して進め、これまでLTB4(ロイコトリエンB4)の低親和性受容体とされてきたLTB4第二受容体(BLT2)が、実はシクロオキシゲナーゼ産物のHHT(hydroxyheptadeca-5Z,8E,10E-trienoicacid)に対する高親和性受容体であることを発見した。また、脂質認識受容体ファミリーに分類されるオーファン受容体GPR20はリガンド非依存的に活性化状態にあり、Gi型G蛋白質を恒常的に活性化することで細胞内cAMPレベルの調節を担っている可能性を示唆した。さらに、病態時における各種脂質メディエーター産生の経時的変化を解明するため、液体クロマトグラフィー・質量分析計(LC-MS)を用いた脂質メディエーターの一斉定量系を構築し、30種類の脂質メディエーターを10数分で同時微量定量することを可能とした。現在、さらなる感度の向上を進めている。またこのシステムを駆使することで、各種遺伝子欠損マウスでアレルギー性脳脊髄膜炎などを発症させた際の病態進展各期における脂質メディエータープロファイリング(脂質メタボロミックス解析)を進めている。生体膜リン脂質はアシル転移酵素によって多様な構造を維持している。我々はこれまでにアシル転移酵素の新規ファミリーを数多く発見した。今回これらの内、MBOATファミリーに属する酵素群(LPCAT3, LPCAT4, LPEAT1, LPIATI)に着目し、配列比較と点変異体解析からこれら酵素群のリゾリン脂質アシル基転移活性に必須な4つのモチーフを見出した。我々は、これまでに6種の脂質シグナル分子認識GPCRやプロトン感受GPCR (PAF receptor, BLT1, BLT2, LPA4, G2A, TDAG8)を発見したが、オーファンGPCRであったp2y5が第六番目の新規LPA受容体(LPA6)であることを今年度に明らかにした。ところで、細胞内におけるGPCRの輸送機構、特に、小胞体(ER)で産生されたGPCRがどのような機構で形質膜まで運ばれるかについては未だ不明な点が多い。我々は、BLT2を材料とし、GPCRのC末端領域に共通して存在するHelix8ドメインがERからの搬出に必要であることを明らかにするとともに、こうした重要ドメインの変異に起因した構造異常体は特異的リガンドの添加でERから搬出させることが可能であることを明らかにした。また、昨年度構築した液体クロマトグラフィー・質量分析計(LC-MS)を用いた脂質メディエーターの一斉定量系を活用し、各種遺伝子欠損マウスでアレルギー性脳脊髄膜炎などを発症させた際の病態進展各期における脂質メディエータープロファイリング(脂質メタボロミックス解析)を進めている。H21年度は以下の成果を得た。1.血小板活性化因子(PAF)産生酵素であるリゾPAFアセチル転移酵素を2種類(LPCAT1とLPCAT2)同定することに成功した。この内、LPCAT2がリン酸化されることによって活性調節されていることを明らかにし、そのリン酸化部位を同定した。2.多発性硬化症モデルマウスの脊髄病変部におけるリピドミクス解析により、プロスタグランジン合成酵素mPGES-1依存的なプロスタグランジンE2