hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝動脈化学塞栓療法における抗癌剤担体ナノ粒子の磁力による集積方法に関する研究

我々は肝実質ならびに肝細胞癌の血行動態について種々の研究を行っており、肝動脈塞栓術についても技術的な側面から治療成績を向上させてきた。近年抗癌剤の担体、つまりドラッグデリバリーシステム(DDS)としてナノ粒子が使用されてきている。磁性を持つナノ粒子を磁力を用いて誘導することにより、より効率的に腫瘍への効率的な抗癌剤の集積を高めることで治療成績を向上させる実験を行い検証した。インビトロ実験では水流のあるポリエチレンチューブに磁石を近接させて分布の差異を検証した結果、セミウェッジ状態で注入することが有効であると示された。引き続き行ったインビボ実験においてはラット肝癌モデルは血管径が小さいことで実験が困難であったため、磁石による誘導で磁性ナノ粒子の分布を変化させることは困難であった。ウサギ腫瘍モデルにおいては組織学的な鉄の沈着に差異を生じさせることが可能であった。一方でMRIによる画像評価においてはアーチファクトのためその際を画像化することが困難であり、今後の課題であると考えられた。したがって磁石を用いた磁性ナノDDSを意図的に有効分布させることが可能であるという結論に至ったが、非侵襲的な画像評価に関しては工夫の余地があると考えられた。本研究においては磁場を用いたDDS環境での薬剤集積のコントロールにカテーテルを用いた選択的血管造影技術を組み合わせることでより選択的、効率的に薬剤を分布させることが可能となることが示唆された。本年度は家兎モデルへの動注実験ならびにラットについての肝癌モデル作成と血管造影手技確立を行った。さらに表面か大きく減衰してしまう原理を利用して、体外から誘導するために家兎ではなくさらに小型の動物であるラットにおける血管造影手技の確立を目指し、実験を行っている。ラットについてはdiethyl- nitrosamine(DEN)を用いた肝癌発生可能モデルが存在し、実際に肝癌作成を行った。腫瘍の発生についてはモニタリングが難しい状況で、一定の腫瘍サイズを得ることが困難ではあったが腫瘍作成自体は可能であり、持続的に実験可能な状態とすることが可能であった。体外からの磁性物質誘導のための超電導磁石装置の入手を、工学部等の当学部施設以外の期間と協力することが、未だ実現していないことが大きな理由と考えられる。また、体外からの誘導可能なラットモデルについては、そのサイズから動脈造影が困難ではあるが、実験系としては確立してきており、肝癌作成も可能となっている。この作業にやや時間を要したこともあり、当初の実験計画よりも遅延している。こちらに関しては十分なスキルが得られつつあるので、次年度以降に遅れを取り戻すことは十分可能であると考えている。本年度は、昨年度に引き続いてdiethyl- nitrosamine(DEN)を用いてラットに対して肝癌を発生させる実験を行った。腫瘍発生の個数や大きさのモニタリングが困難なことは昨年度報告してあるが、体外式の超音波により腫瘍の状態観察を試みている。家兎モデルに対しては、すでに複数回の腹部血管への動脈造影や注入実験は確立することができている。磁性体の動注については当初予定のフェルカルボトランの動注実験と平衡して、より磁性の強い鉄粉も用いている。鉄粉については200マイクロメートル以下にキャリブレーションを行ったものも使用した。磁石誘導については体外からの誘導も試みたが、磁力の分布が左右肝動脈のそれぞれの血管分岐点においてほとんど差異が生じないために十分な磁力側への導入が困難であったため、昨年度に行い始めたネオジム磁石による誘導に力点をおくこととした。用いた磁石は径1.5mmで3mm長のものであり、直列あるいは数本の束の並列でも用いることが可能であった。太さは17ゲージ針とほぼ同じ太さであり、体外からの刺入も可能であったが、臓器損傷もあり、開腹下での使用として行っている。家兎では肝動脈全体に注入した分布状態、磁力により片葉に誘導した場合、選択的に片葉に動注させた場合の差異を比較検討している。結果としては透視画像上やDSA画像上は分布の有意差はリアルタイムで観察することは困難であったが、組織学的には磁性体の分布の観察を行い、磁力の有無により軽度の分布差は見られているが、完全な定量化はできていない。鉄粉で行った実験については少量で完全塞栓となってしまい、有効な全体分布を得ることができない状態で、その理由としては各粒子同士が凝集しやすいためと考えている。従来のTACEのようにリピオドールとの混和することも含めて追加の実験を検討中である。体外式の磁石による誘導については、血管分岐レベルでの磁力の差異を十分に得ることが解剖学的に困難であると考えられた。本年度の実験結果からは体内に留置した磁石による誘導がより有効であり、現実的であると考えられた。フェルカルボトランの動注は確立できているが、鉄粉やその他の磁性粒子での実験は今後の課題ではあるが、実験系としては確立していると考えられるため、おおむね順調な進行状況であると判断している。

インビトロ実験では水流のあるポリエチレンチューブに磁石を近接させて分布の差異を検証した結果、セミウェッジ状態で注入することが有効であると示された。引き続き行ったインビボ実験においてはラット肝癌モデルは血管径が小さいことで実験が困難であったため、磁石による誘導で磁性ナノ粒子の分布を変化させることは困難であった。ウサギ腫瘍モデルにおいては組織学的な鉄の沈着に差異を生じさせることが可能であった。一方でMRIによる画像評価においてはアーチファクトのためその際を画像化することが困難であり、今後の課題であると考えられた。したがって磁石を用いた磁性ナノDDSを意図的に有効分布させることが可能であるという結論に至ったが、非侵襲的な画像評価に関しては工夫の余地があると考えられた。本研究においては磁場を用いたDDS環境での薬剤集積のコントロールにカテーテルを用いた選択的血管造影技術を組み合わせることでより選択的、効率的に薬剤を分布させることが可能となることが示唆された。他施設に協力を依頼して、超電導磁石による動物実験を行う。この際に磁性物質について購入可能なものを使用しつつ、新たな物質の作成を試みる。家兎も出るについては、超電導磁石使用を考えつつ、より簡便な永久磁石の体内誘導法の研究も同時に行う予定である。ラットモデルについては、腫瘍モデル、非腫瘍モデルでの比較や、磁性物質の解剖学的な局在における局所への集積上昇と腫瘍への特異的集積上昇についての研究も同時に行い、効率的な抗腫瘍効果を目指せるように、従来法の発展させるのみならず、動注物質やその誘導方法についても抜本的改革も視野に入れつつ、他機関の協力を仰ぐ予定である。ラットについては、動脈がかなり細いため、家兎のように片葉への選択的動注ができないため、磁石のon vs. offでの実験を行う。現在問題となっていることは、肝動脈自体が細く、通常の動注でもそれぞれの葉への分布が不均一となってしまうことであり、カテーテルのさらなる細径化を試みている。さらに、動注の状態を安定化させた状態で、肝癌モデルでの動注実験を行い、腫瘍、非腫瘍分も含めた分布の確認を行う予定にしている。また、今後は細径の磁石の位置取りや、その挿入方法についてもより安全な方法の確立についての実験的検討を行う。そして、各部位に流入した粒子の全体量のより正確な定量法についての検討を行う。本年度については、旅費、人件費・謝金については不使用。物品についても当初予算額にいたっていない状況です。実験器機、薬剤については既存の購入済のものを使用しつつ、不足分が生じた場合に購入の予定でありましたが、実験の進行遅滞もあり、購入額が少なくなっております。情報収集目的の学会出張についても、その活動がかなわなかったことにより残額が生じる事態となりました。謝金については、本実験に関する学会発表や論文作成を行っておらず、通常英文校正費を使用していない状況です。実験器機については、実験動物や試薬、関連物質の購入に次年度以降の支出が増加する見込みであり、さらに、実験協力施設の目処がたてば、実験協力に対する謝金がかなり増加するものと考えます。ラットの腫瘍作成モデルについては均一な腫瘍を得ることを目的とすると、実験に必要な数は当初の計画数を上回る可能性が高く、これらに対して、十分な費用が必要となってくると考えられる。
環境会計のフレームワーク構築に関する研究

本研究は、環境省「環境会計ガイドライン」(1999年・2000年・2002年・2004年)の公表、環境マネジメント・システム・環境監査およびこれらに関連する国際規格の普及などによって、企業および政府・地方自治体の間で急速に発展している環境会計の国際的および日本の理論的・実践的実態を明らかにすると同時に、企業外部環境会計、企業内部環境会計、政府・自治体環境会計、マクロ環境会計といった個別領域ごとのフレームワーク構築と、これらのフレームワークの基礎となる環境会計共通フレームワークの構築を目的とする。ミクロ環境会計領域では、UN、EU、北米、韓国などにおける制度化に関する現状、UNEP、EMAN、PIUSなどの国際的研究プロジェクトの成果、産業環境管理協会(日本)、EPA(アメリカ)、ACCA(イギリス)、EEA(ドイツ)、ブッパタール研究所(ドイツ)、ICLEI(ドイツ)といった環境会計の先進的研究機関の研究動向などに関する調査、日本企業を対象とした4年間にわたる環境報告書上の環境会計情報の開示実態調査、日本企業および地方自治体に対するヒヤリング調査などによって、国内外の内部環境会計、外部環境会計、自治体環境会計の現状分析を行い、併せて、新たなミクロ環境会計モデルの提示を試みた。また、マクロ環境会計領域では、UN、EUといった国際機関におけるモデル開発状況および同モデルの各国における運用状況などを明らかにすると同時に、こうしたモデルのデータベースをミクロ環境会計にリンクさせようとするOECD、CSD、UROSTAT、ドイツ環境統計法などの動向を視野に入れながら、ミクロ環境会計との共通フレームワークすなわちストック・フロー続合型環境会計の提示を試みた。本研究は、ミクロ環境会計における外部環境会計、内部環境会計、政府環境会計などの領域ごとの個別フレームワーク構築と、これらとマクロ・メゾ環境会計とのリンクを行うための環境会計共通フレームワークの構築を目的とするが、今年度は、主に、各国および国際的機関の環境会計に関する動向調査を行い、個別フレームワーク構築に関する考察を行った。まず、日本の1部上場企業の環境報告書で開示されている環境会計情報について、さまざまなガイドラインの影響度、開示内容の特質と構造、時系列的推移と展開の方向性などを明らかにし、併せて、財務諸表で開示されている環境コスト情報について、量的・質的特質、制度的背景などを調査し、両者の比較検討を行った。また、環境会計情報開示企業および環境会計を導入している地方自治体については、アンケート調査、ヒヤリング調査などを行い、内部環境会計の実態およびその外部環境会計との関係について分析を行った。次に、海外の環境会計の動向を把握するために各担当者が文献調査を行うと同時に、今年度は、環境会計の代表的研究機関であるEU、FEE、DEFRA、ACCA、リンパーグ研究所、PWCについてヒヤリング調査を行い、これらの機関が展開する先進的環境会計モデルとその実践例に検討を加えた。最後に、ミクロ領域の環境会計では、UNなどを中心に共通フレームワークの構築もしくはライフサイクル統合型の環境会計を指向する動きがあることから、UN、EMANなどの環境会計プロジェクトに関連する、文献調査、国際会議への参加、ヒヤリング調査を行い、これらの結果と既述の環境会計の調査結果、さらにはUNのマクロ環境会計フレームワークに基づいて、環境会計の個別フレームワークに関する比較検討を行った。本研究は、ミクロ環境会計における外部環境会計、内部環境会計、政府環境会計などの領域ごとの個別フレームワーク構築と、これらとマクロ・メゾ環境会計とのリンクを行うための環境会計共通フレームワークの構築を目的とするが、今年度は、各国および国際機関の環境会計に関する動向の継続調査と、昨年度未調査の環境会計研究機関のヒヤリング調査を行い、個別フレームワーク構築のための検討を行った。まず、日本の外部環境会計については、2002年に環境会計ガイドラインが改定されたため、1部上場企業の環境報告書で開示されている環境会計情報について、同ガイドラインの影響度、開示内容の特質・構造を調査し、昨年度調査からの時系列的推移と展開の方向性などを明らかにした。また、日本の環境会計導入企業および地方自治体については、昨年度の調査に基づいてさらに詳細なアンケート調査とヒヤリング調査を行い、内部環境会計の進展状況とその運用実態の分析を行った。

次に、海外の環境会計の動向を把握するために各担当者が引き続き文献調査を行うと同時に、今年度は、ドイツ・スイスの環境会計の研究機関および実践企業であるEEA、ブッパタール研究所、ICLEI、スイスキャノンでヒヤリング調査を行い、これらの機関が展開する先進的環境会計モデルとその実践例を調査した。さらに、国際的な内部環境会計推進の動向を調査するために、UNEPおよびEMAN-APの国際会議、エコバランス国際会議、PIUS国際会議などに参加して調査を行った。マクロ環境会計については、UNの動向を中心に文献およびヒヤリング調査を行った。最後に、こうした個別環境会計領域の調査結果に基づいて、個別フレームワークの比較検討と共通フレームワークに関する検討を行った。本研究は、ミクロ環境会計における外部環境会計、内部環境会計、政府・自治体環境会計などの領域ごとの個別フレームワーク構築と、これらとマクロ・メゾ環境会計とのリンクを行うための環境会計共通フレームワークの構築を目的とするが、今年度は、各国および国際機関の環境会計に関する動向の継続調査と、個別フレームワーク構築および共通フレームワーク構築のための検討を行った。まず、日本の外部環境会計については、本研究で2001年度から行っている、1部上場企業の環境報告書上での開示環境会計情報に関して、環境会計ガイドラインの影響度、開示内容の特質・構造などの継続調査を実施し、3年間の調査結果の時系列分析を行うと同時に、今後の展開の方向性を明らかにした。また、日本の環境会計導入企業および地方自治体についても、継続してアンケート調査とヒヤリング調査を実施し、内部環境会計の導入・運用の実態分析を行った。企業内部環境会計については、これらの分析結果に基づいたモデルの開発とケーススタディを行い、その研究成果を環境会計の国際的ネットワークであるEMAN-EUで公表した。外部環境会計、内部環境会計、政府・自治体環境会計の海外の動向については、各担当者が3年間の調査結果のとりまとめを行った。マクロ環境会計については、引き続きUNの動向を中心に文献およびヒヤリング調査を行った。3年間の調査・研究は、まず、外部環境会計では、EU、北米、日本、韓国および国際機関、内部環境会計では、EU、北米、オーストラリア、日本および国際機関、自治体環境会計では、イギリス、ドイツおよび日本、マクロ環境会計では、サテライト勘定および自然資産勘定について、研究・実践動向を体系的に把握し、次に、これらに基づいて、領域ごとの個別環境会計フレームワークおよび共通環境会計フレームワークの構築を行うという形で取りまとめた。
脳における時間表現の研究

脳のニューロン間の信号の伝達には時間がかかり、しかも多数のループがあるので、信号の前後関係は逆転しやすい。しかし、信号の順序の誤りは生存を脅かす可能性があるから、脳の中には、時間を安定に表現するための何らかの原理が隠されているはずだ。我々は、特に右手と左手に加えた刺激で生じる信号を脳がどこでどのようにして順序付けるかを明らかにすることを目的として研究を行った。心理物理学的研究では、触覚刺激が視覚刺激と共通の空間座標系に位置付けられてから順序付けられるという我々の仮説を支持する成果が得られた。非侵襲脳活動計測では、時間順序判断課題で対象課題よりも有意に大きな活動を示した領域が、両側の中側頭回、運動前野、下前頭回、下部頭頂葉、左の2次体性感覚野に見出された。閉眼して計測したにもかかわらず、視覚的な動きに応じる中側頭回や、空間座標系が表現されている頭頂葉、運動前野、前頭回に時間順序判断特異的な活動が生じている点が注目された。さらに、マウスに関して時間順序判断の実験系を開発し、細胞レベルの時間順序判断機構の解明を目指した。その結果、時間順序判断を経験したマウスでは、一次体性感覚野の2-3層や2次体性感覚野、2次聴覚野にc-Fosの集積が多いことが明らかになった。これらの結果から我々は、左右の皮膚からの信号は、一次体性感覚野を経由した後、1)異種感覚が収束する「動き」の領域で「動き」として表現される一方、2)「空間」を表現する領域で「空間」内の2つの信号として位置づけられ、3)最後に両者を統合して時間順序が再構成される、と推定する。時間順序が脳のどこで決定されるか、という機能地図の概略を明らかにするための研究を行った。ヒトに対しては心理物理実験と非侵襲脳活動計測を、マウスに対しては免疫抗体染色の手法を適用した。さらに、ラットで電気生理実験を行なう準備としてラット用の課題訓練装置を開発した。1.ヒト被験者を用いた心理物理実験と非侵襲脳活動計測右手と左手に加えた刺激の時間順序を判断する際の脳の活動を機能的磁気共鳴画像(fMRI)により計測した。これまで時間順序判断課題と同じ刺激を用いて時間順序の判断は行わないような対照課題の開発が望まれていた。今年度は新規に非磁性の8点点字刺激装置を開発し、対照課題として左右の手の刺激点数の差を判断する課題を考案した。時間順序判断課題で刺激点数判断課題よりも有意に信号強度が強い領域は、主として左半球の中側頭回(動きを検出するMT/V5領域の近傍)と、運動前野(空間座標の表現がある)、ならびにブロードマンの44-47野に見出された。この結果は、2つの刺激が空間で定位されるとともに、動きの情報となり、これらが統合されて時間順序が再構成されるという「動き投影仮説」を支持する。2.マウスの免疫組織学的研究左右の髭刺激の時間順序判断課題マウスに訓練することに成功した(15匹中9匹)。時間順序判断課題を行った直後のマウスの脳標本に対し免疫抗体染色法を適用し、c-fos遺伝子の発現領域を検索した。今後、一側の髭のみを連発刺激するコントロール群と比較することにより、時間順序判断に特異的に貢献する脳部位を推定する予定である。3.ラットの実験系の開発ラット用の課題訓練装置を開発した。我々はこれまでに、両手に加えた刺激の時間順序判断は、腕を交差することにより逆転する傾向があることを示した。この現象は刺激が脳の中で空間内に定位された後にはじめて順序付けられることを示唆する。本年度は次の研究を行った。

1.非侵襲脳活動計測腕を交差した条件下で、両手の刺激の時間順序判断が逆転した場合と、正解した場合の脳活動を比較した。その結果、正解した際には、角回のシルビウス裂以上の領域に逆転した場合よりも有意に強い活動が生じていることが明らかになった。2.視覚(動き)刺激が両手刺激時間順序判断に与える効果(心理物理実験)視覚刺激が片手の3本の指に加えた刺激の時間順序判断に与える効果を調べたところ、視覚刺激の方向と片手3本指の刺激の方向が一致したときに比べ、両者の方向が一致しない場合には平均40%程度の正解率の低下が生じた。この結果は、動きの領野の活動が体性感覚の時間順序判断に影響を及ぼすという仮説が支持された。3.マウスのimmediate early gene発現領域の解析昨年度までの研究の成果により、左右の髭刺激の時間順序判断課題を訓練したマウスと、1側の髭だけに2発刺激を与えて刺激側を回答するコントロール課題を訓練したマウスの2群が準備された。これら2群の脳のそれぞれについてc-fosの脳活動と相関して発現する遺伝子の発現を免疫抗体染色法を用いて調べたところ、時間順序判断群では対象群に比較して一次体性感覚野のII-III層におけるc-Fos陽性細胞の割合が有意に高かった。時間順序判断に必要な半球間の情報伝達がbarrel cortexの段階ですでに行われている可能性が示唆された。4.ラットの実験系の開発と電気生理学的研究マウスの実験系にならって、ラットに対する時間順序判断課題の訓練を開始した。並行して、ラットに電極の慢性埋め込みを行いワイヤレスで神経活動を記録する技術の開発を行った。我々はこれまでに、両手に加えた刺激の時間順序判断は、腕を交差することにより逆転する傾向があることを示した。この現象は刺激が脳の中で空間内に定位された後にはじめて順序付けられることを示唆する。本年度は次の研究を行った。1.視覚(動き)刺激が両手刺激時間順序判断に与える効果(心理物理実験)昨年度までに、視覚刺激が片手の3本の指に加えた刺激の時間順序判断に大きな影響を与えることを明らかにした。本年度は、刺激時間差を変えて外乱の効果を調べた。刺激時間差が100ms程度のときには平均40%程度の正解率の低下が生じたが、300msでは正解率の低下は生じなかった。今後、動きの領域の活動が刺激時間差に依存して変化するかどうかを調べ、動きの領野の活動が体性感覚の時間順序判断に影響を及ぼすという仮説を検証する。2.マウスのimmediate early gene発現領域の解析昨年度までに得られたc-fosの免疫組織標本に対して、statistical parametric mappingの手法を新たに開発して適用した。組織標本をアトラスの標準脳に変形、標準化し、微小な区画内の陽性細胞を自動計測した上で、実験群と対照群の間の陽性細胞数を区画毎に検定し、標本全域で検定パラメータをカラー表示するという手法である。極めて有効な手法であることが確認された(特許出願中)。3.ラットの実験系の開発と電気生理学的研究引き続きラットに対して時間順序判断課題を訓練した。並行して、ラットに電極の慢性埋め込みを行いワイヤレスで神経活動を記録する技術の開発を進めた。
肝機能実時間評価法の開発:アミノ酸利用率測出と針定検採取肝

我々は生体侵襲時に最も重要な生体代謝能は肝蛋白合成力であること、臓器機能評価には実時間代謝率を示す、クリアランスの概念の導入が有力であることに着目し、肝機能の指標として、肝アミノ酸利用率を考案その有用性を実験的、臨床的に検討した。初年度においては1)イヌを用いた虚血障害に於いて、肝アミノ酸利用率測定により、その障害度に応じた肝機能評価をなし得ること。2)アミノ酸利用率は、針生検採取肝を用いる肝蛋白合成率と良く相関すること。3)アミノ酸利用率の評価は生体侵襲の程度により左右され、侵襲度の程度を加味して評価することが重要であり、侵襲の程度は筋肉よりのアミノ酸放出が指標となることを明かとした。2年度においては臨床例で検討し、手術侵襲の程度の指標として筋放出アミノ酸量(mーRR)を測定し、全身アミノ酸利用率(CPCRーAA)との比から、アミノ酸利用指数(AAUI)を提案し検討した。AAUIは、肝切除量に比例し低下し全身反応によるアミノ酸代謝の変動を加味した結果、全身反応から、肝機能の反応部分を浮彫りにし得ると考えられた。殊に、肝不全を来した例においては、AAUIは低下し、生命維持に直結した肝機能をリアルタイムにあらわすことが出来る指標として、有用であると示唆された。更に我々の開発した針生検採取肝による短時間測定法を用いて、肝蛋白合成率の測定をおこなった。肝切除例におにて、開腹直後に採取し、蛋白合成率を測定すると、正常例では低く、肝硬変例では亢進していた。肝切除後の蛋白合成能増大には、限界があることから、正常肝では、十分な予備力をもって回転しているが、硬変肝では持てる能力のかなりの程度をすでに亢進させていることをあらわしており、術前に於ける肝予備力評価の一指標と考えられた。肝移植、肝切除等肝手術に於いて肝機能を実時間に適格に評価することは患者管理上重要である。我々は生体侵襲時に最も重要な生体代謝能は肝蛋白合成力であること、臓器機能評価には実時間代謝率を示す、クリアランスの概念の導入が有力であることに着目し、肝機能の指標として、肝アミノ酸利用率を考案その有用性を検討した。1)イヌを用いた虚血障害肝に於いて、肝アミノ酸利用率測定により、その障害度に応じた肝機能評価をなし得た。2)アミノ酸利用率は、針生検採取肝を用いる肝蛋白合成率と良く相関し、アミノ酸利用率の測定は肝での蛋白合成能の近似である事が判明した。3)アミノ酸利用率の評価は生体侵襲の程度により左右され、侵襲度の程度を加味して評価することが重要であることを明かとした。4)侵襲の程度は筋肉よりのアミノ酸放出が指標となることを明かとしてきた。5)以上の動物実験での成果に加え、臨床肝切除例に於ける、アミノ酸クリアランスのデ-タを集積し、解析している。以上、肝アミノ酸クリアランス測定により、リアルタイムの肝機能評価を可能と出来ることが示唆された。また肝蛋合成率の侵襲に対する増大の程度は肝の機能予備力をあらわしており、侵襲前(術前)においての単位当たりの肝組織の蛋白合成率の上昇は、その増大に限界のあることより、機能的予備力の低下をあらわしていると考えられ、術前における、針生検肝組織の蛋白合成率測定と、肝アミノ酸利用率測定により、肝予備力評価を成し得る可能性が示唆された。手術侵襲に対する肝代謝の特徴は、増大する筋蛋白より放出されるアミノ酸の蛋白再合成への利用増大である。

前年度の結果を基として臨床例において筋放出アミノ酸量(mーRR)、全身アミノ酸利用率(CPCRーAA)を算出し、また、放出アミノ酸量の利用度を示す、指標として、アミノ酸利用指数(AAUIml/μmol=CPCRーAA/mーRR)を提案し検討した。mーRRは手術侵襲の程度に伴い増大し、尿中窒素排出量より算出するcatabolic indexと良く相関した。CPCRーAAは食道切除、肝切除例で何れも、手術後増大し、放出アミノ酸を蛋白合成に利用すべく上昇していた。これらは、手術侵襲により、生体が積極的に筋放出アミノ酸を利用し、創傷治癒力を亢進させていることをうかがわせるが、肝での利用の指標とはなり得ていなかった。しかしAAUIは、肝切除量に比例し低下し全身反応によるアミノ酸代謝の変動を加味した結果、全身反応から、肝機能の反応部分を浮彫りにしたと考えられた。殊に、肝不全を来した例においては、他の肝機能検査に先立って、AAUIは低下し、生命維持に直結した肝機能をリアルタイムにあらわすことが出来る指標として、有用であると示唆された。更に我々の開発した針生検採取肝による短時間測定法を用いて、肝蛋白合成率の測定をおこなった。これは、肝の単位組織当たりの蛋白合成能をあらわしており、短時間(10分)のincubationで測定可能である。肝切除例において、開腹直後に採取し、蛋白合成率を測定すると、正常例では低く、肝硬変例では亢進していた。肝切除後の蛋白合成能増大には、限界があることから、正常肝では、十分な予備力をもって回転しているが、硬変肝では持てる能力のかなりの程度をすでに亢進させていることをあらわしており、術前に於ける肝予備力評価の一指標と考えられた。
エクソーム解析とiPS細胞を用いた受容体後障害によるインスリン抵抗症遺伝子の同定

本研究は、インスリン受容体以降の情報伝達障害によるインスリン抵抗症と考えられる症例の遺伝子解析及びiPS細胞を用いた機能解析である。発端者とその家族から得たDNAを用いてエクソーム解析を行った結果、PIK3R1遺伝子c.1945C>Tが原因遺伝子であることが明らかとなった。さらに、発端者からiPS細胞の樹立を行い、健常iPS細胞とともに、肝細胞に分化させて、インスリン作用の検討を行った。インスリン受容体の下流にあるAktについてインスリン添加によるリン酸化を解析したところ、健常iPS細胞由来肝細胞と比較して、疾患iPS細胞由来肝細胞ではインスリンによるAktリン酸化が抑制されていた。またインスリン添加によるG6PC(Glucose-6-phosphatase catalytic subunit)発現の減弱作用を比較したところ、疾患iPS細胞由来肝細胞の方がG6PC発現の減弱作用がより弱いという結果であった。以上よりこのPIK3R1変異ではインスリン作用が抑制されていることが示唆された。さらに、変異を修復することでこのインスリン作用の抑制作用がレスキューされることを検討するため、また、これまでの誘導において肝細胞の分化マーカーであるalbuminの発現量が患者iPS細胞由来肝細胞よりも健常者iPS細胞由来肝細胞の方で低くなるという傾向が認められており、細胞株によって分化誘導効率に違いがみられるという問題の解決のため、CRISPR/Cas9システムを用いてPIK3R1変異を修復する試みを行った。また、同じくインスリン感受性組織である骨格筋への分化誘導も行い、健常iPS細胞から誘導した骨格筋細胞において、インスリンによるAktのリン酸化が増強されることを明らかとした。インスリン抵抗症は、強いインスリン抵抗性と治療の困難な糖尿病を特徴とする疾患である。インスリン抵抗症のうち、インスリン受容体遺伝子異常により発症するのがA型であるが、A型様の表現型を示すものの、インスリン受容体遺伝子に異常を認めない例もごく稀に存在する。このような例はインスリン受容体以降の情報伝達障害が原因と考えられている。申請者は「優性遺伝形式を持つ新生突然変異の獲得」という極めて稀な遺伝学的病態を持つ「受容体以降の情報伝達障害によるインスリン抵抗症」と考えられる症例を継続診療してきた。本例ではインスリン受容体遺伝子に加え、インスリン情報伝達に関わる主要分子であるIRS1、IRS2、PDK1、Akt1、Akt2の遺伝子、さらにインスリン抵抗症に類似した表現型を示すとされるPPARγ2の遺伝子異常(Nat Genet. 31:379, 2002)の検索のため、これらの遺伝子の全コード領域のシークエンスを行ったが、原因となり得る異常は認めていない。本研究では、この症例におけるインスリン抵抗性の原因遺伝子の同定と、原因遺伝子の機能解析を目指す。原因遺伝子の同定のために、発端者とその家族(両親、配偶者)から得たDNAを用いてエクソーム解析を行ったところ、優性遺伝形式を持つ新生突然変異を示す遺伝子を約550個認め、現在、候補遺伝子の絞り込みを進めている。また、発端者とその児の末梢血単核球にセンダイウイルスベクターを用いて初期化因子(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc)を導入し、iPS細胞の樹立を進めている。並行して、既報を参考にして対照iPS細胞から肝細胞(ALB、AFP陽性)への分化誘導を試みた。また対照iPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導を行い、RT-PCRや免疫染色でmyosin heavy chainやmyogeninの発現を確認した。遺伝的解析とiPS細胞を用いた機能解析の2つの解析を行っている。遺伝的解析については、発端者、その児(罹患者)、発端者の両親、配偶者のエクソーム解析を施行し、候補遺伝子の絞り込みの段階まで進められている。また、iPS細胞については、発端者とその児由来のiPS細胞を作成中であり、まだ樹立できてはいない。ただし、対照細胞として用いる健常者由来のiPS細胞は樹立した。その対照iPS細胞を用いて、インスリン標的細胞である肝細胞や骨格筋細胞へ分化誘導する系を確立できているため、疾患iPS細胞が作成出来次第、解析へと進められる状態となっている。原因遺伝子の同定のために、発端者とその家族から得たDNAを用いてエクソーム解析を行った結果、発端者でdenovoに生じ、児へ遺伝した遺伝子変異を38個認めた。そのうち、アミノ酸変化を伴い機能の変化が予測された遺伝子変異を1個同定した。その遺伝子変異は、PIK3R1遺伝子c.1945C>Tであり、SHORT症候群の原因遺伝子として2013年に報告されていた(Am J Hum Genet. 93:141, 2013)。また、発端者とその児の末梢血単核球にセンダイウイルスベクターを用いて初期化因子(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-Myc)を導入し、iPS細胞の樹立を行った。また、健常者由来iPS細胞および患者由来iPS細胞を用いて、既報(PNAS.109.12358-12543)に従い肝細胞への分化誘導を行った。AFPやALBなど肝細胞のマーカーの発現をmRNA、蛋白質レベルで確認し、肝細胞に分化していることを確認した。また、インスリン作用の検討として、インスリン受容体の下流にあるAktについて、インスリン添加によるリン酸化を解析した。

健常者由来iPS細胞から誘導した肝細胞と比較して、患者iPS細胞細胞から誘導した肝細胞ではインスリンによるAktリン酸化が顕著に抑制されており、PIK3R1異常ではインスリン作用が抑制されていることが示唆された。また、糖新生系酵素の発現を検討することが必要であったが、通常の誘導方法では、糖新生系酵素であるG6PC(Glucose-6-phosphatase catalytic subunit)の発現が認められなかった。培地の変更や、分子化合物の添加など、誘導方法を改良することでG6PCが発現する条件を見出した。エクソーム解析から疾患遺伝子を同定したところ、既知の遺伝子変異(PIK3R1遺伝子c.1945C>T)であった。しかし、本邦では未報告の遺伝子変異であったため、治療経過とあわせて、学会報告および論文報告(Hamaguchi et al. J Diabetes Investig. 2018 doi: 10.1111/jdi.12825.)を行った。PIK3R1遺伝子は、PI3キナーゼの調節サブユニットをコードする遺伝子であり、本症例ではPIK3R1遺伝子異常がインスリン抵抗性に繋がっているものと考えられる。しかし、PI3キナーゼの調節サブユニットには、3つの遺伝子から産生される5つのアイソフォームが存在し、個々の調節サブユニットのアイソフォームはPI3キナーゼ経路の活性化に促進的だけではなく、抑制的に作用するものもあると考えられている。実際、本症例で変異を認めたPIK3R1遺伝子をマウスで欠損させると、インスリン抵抗性ではなく、インスリン感受性の増強と低血糖が生じると報告されている(Nat Genet,21:230, 1999)。したがって、PI3キナーゼ経路の活性化に対して、本症例のもつ遺伝子変異が、どのようなメカニズムで影響を及ぼすかが明らかとなれば、PI3キナーゼの活性化機構に関する新知見が得られる可能性が高く、iPS細胞の樹立、機能解析を進める。上記のように当初の計画と異なった点はあるものの、遺伝子解析は完了した上で、疾患iPS細胞も樹立でき、機能解析も進みつつある点から順調に進展していると評価した。本研究は、インスリン受容体以降の情報伝達障害によるインスリン抵抗症と考えられる症例の遺伝子解析及びiPS細胞を用いた機能解析である。発端者とその家族から得たDNAを用いてエクソーム解析を行った結果、PIK3R1遺伝子c.1945C>Tが原因遺伝子であることが明らかとなった。さらに、発端者からiPS細胞の樹立を行い、健常iPS細胞とともに、肝細胞に分化させて、インスリン作用の検討を行った。インスリン受容体の下流にあるAktについてインスリン添加によるリン酸化を解析したところ、健常iPS細胞由来肝細胞と比較して、疾患iPS細胞由来肝細胞ではインスリンによるAktリン酸化が抑制されていた。またインスリン添加によるG6PC(Glucose-6-phosphatase catalytic subunit)発現の減弱作用を比較したところ、疾患iPS細胞由来肝細胞の方がG6PC発現の減弱作用がより弱いという結果であった。
非均質磁化構造を考慮した地震地磁気効果とその検出限界

大きく分けて、以下の4点について研究を行なった。1.数値体積分法による高分解能数値解の検討これまで得られている数値解と比較して非常に高解像度な解を得ることができるようになった。その結果、解析解との詳細な比較が可能になった。代表的な断層タイプを用い、過去に得られている解析解との比較から、体積分の領域に含まれる特異点が、結果に大きく影響し、特異点を単に体積分から除外するだけでは、正しい解が得られないことが判明した。2.表面積分法を用いた地震地磁気効果のモデリング非均質磁化構造の場合の地震地磁気効果のモデリングには、数値的アプローチがどうしても必要であるが、上に述べた特異点の問題を避けるため、特異点を、その内部に含まない磁化物体のブロック境界面上での表面積分による、地震地磁気効果を計算する手法を検討した。2次元問題への適用では、方法が上手く行き、良好な結果が得られたが、3次元の場合、表面積分の収束性の問題のため、計算コードの完成には至らなかった。全磁力の高精度同期観測を利用したノイズリダクションの手法の開発リファレンス点を用いたノイズ除去方法を考案し、実際に伊豆で観測されたデータに適用して、良好な結果を得ることができた。この方法は、高精度同期差分観測の際のノイズ処理に充分に効果を発揮するものと考えられる。差分観測のための高精度同期システムの開発ラジオの時報信号を用いた、時刻自動校正方式によるプロトンコントロール・データ収録システムを開発した。1分計測で、1年間分のデータ記録容量を持つこのシステムは、長期間にわたる時刻の正確な自動運転を可能にし、高精度同期観測を可能にする。平成5年度の研究予定は、大きく分けると次の2点であった。1)3次元モデルによる非均質磁化構造の効果の解明。2)差分観測のための高精度同期システムの開発。[3次元モデルによる非均質磁化構造の効果の解明]地震地磁気効果を見積もるために、3次元モデルによる断層運動に伴なう磁場変化を計算するためのプログラムの開発を終了した。これは、変化磁場を計算するのに体積分を用いる方法である。過去に解析的な研究のなされている数例の断層のタイプについて、このプログラムを用い、その断層運動に伴なう地磁気変化を調べたところ、ほぼ、解析解により示されているものと同程度の分解能を持って、地磁気変化の空間分布を調べることができるようになっていることが確認された。しかし、上記の方法では、メモリと計算時間を非常に費やすため、研究者が、周辺のコンピュータ環境で手軽に計算をさせるには問題がある。そこで、磁化物体の表面上で面積分を実行して磁場変化を求める新しい計算方法の開発も合わせて行なった。これについては、まだ、2次元モデルによるテスト段階であり、まだ開発が終了していない。特にこの研究については次年度へ継続する。[差分観測のための高精度同期システムの開発]全磁力値の差分観測のため、2台のOMEGAクロックを用いたプロトン磁力計の高精度同期観測用コントロラーを開発し、そのテストを、宇治キャンパス内で行なった。また、購入したプロトン磁力計自体のテストは、短期間ではあるが、すでに保有していたプロトン磁力計とともに、ノイズの少ない能登半島周辺で行ない、0.25nT以上の精度を確認した。平成6年度においては、大きく分けて、次の3点について研究を行なった。1)数値体積分法による高分解能数値解の検討、2)表面積分法を用いた地震地磁気効果の3次元拡張、3)全磁力の高精度同期観測を利用したノイズリダクションの手法の開発、4)差分観測のための高精度同期システムの開発。[数値体積分法による高分解能数値解の検討]解析解と詳細な比較を可能にするような分解能の数値解を得ることができた。

代表的な断層タイプを用い、過去に得られている解析解との比較から、体積分の領域に含まれる、特異点が、結果に大きく影響し、特異点を端に体積分から除外するだけでは、正しい解が得られないことが判明した。[表面積分法を用いた地震地磁気効果の3次元拡張]上に述べた問題を避けるため、特異点を除いたブロックで、そのブロック境界面上の表面積分により、地震地磁気効果を計算する手法を検討した。2次元問題への適用では、方法が上手く行き、良好な結果が得られたが、3次元の場合、表面積分の収束性の問題のため、計算コードの完成には至らなかった。[全磁力の高精度同期観測を利用したノイズリダクションの手法の開発]リファレンス点を用いたノイズ除去方法を考案し、実際に伊豆で観測されたデータに適用して、良好な結果を得ることができた。この方法は、高精度同期差分観測の際に充分に効果を発揮するものと考えられる。[差分観測のための高精度同期システムの開発]今年度新たに、ラジオの時報信号を用いた、時刻自動校正方式によるプロトンコントロール・データ収録システムを開発した。1分計測で、1年間分のデータ記録容量を持つこのシステムは、長時間に渡る時刻の正確な自動運転を可能にする。
アストロサイトによるシナプス機能調節機構解明とその脳内局所異常が行動に及ぼす影響

アストロサイトに凝集体が形成されるAlexander病モデルマウスの脳の機能を調べれば、アストロサイトのどのような異常が、どのような脳機能に関与するか明らかにすることができる。このコンセプトの元、我々はAlexander病モデルマウスの網羅的行動解析を行ったところモデルマウスでは作業記憶が優れているという興味深い結果を得た。Alexander病モデルマウスでは特に海馬領域で凝集体形成が多いこと、作業記憶は海馬依存的な行動であることから、海馬に焦点をあててその電気生理学的な性質を調べた。モデルマウス海馬スライスにおいて野生型ではLTPに至らない100 Hz10発の刺激でもLTPが起こることを見いだした。興奮性シナプス伝達に変化は無いがGABAの放出能力が低下していたことから、LTPの起こりやすさは抑制系の抑制によって生じていると結論した。抑制系の抑制は低濃度のアデノシンを潅流液に追加した場合でも観察される。アストロサイトからATPが放出されること、そのATPは速やかにアデノシンに変換されることから、モデルマウスのアストロサイトからATPが多く放出されているのではないかと仮説を立て、実験を行った。ATPの自発放出をルシフェリン:ルシフェラーゼ反応による発光としてとらえ、その放出頻度を比較したところ、モデルマウスでは野生型よりも1.5倍多くATPを放出することがわかった。以上のことから、Alexander病モデルマウスでは凝集体形成によってATPの放出が増加し、それがすみやかにアデノシンへ変換され、抑制性神経をtonicに抑制することによって海馬神経回路の興奮を高め、海馬依存的な学習を促進することが明らかになった。本研究によってグリオトランスミッターATPの放出増加が作業記憶を元進にいたる過程、すなわち分子から行動までを統合的に理解することが出来た。我々が作成したAlexander病モデルマウス(変異GFAPのトランスジェニックマウス、hemizygote)は、アストロサイト細胞内に凝集体が形成され、凝集体形成に依存してカイニン酸全身投与によるけいれん誘発閾値が低下する。モデルマウスではGFAPの発現の強い領域、例えば、海馬、淡蒼球、嗅球、glialimitansにおいてのみ凝集体が発現すること運海馬を含む背側終脳の凝集体のみを消去したマウスではカイニン酸によるけいれん誘発閾値が正常と同じであることから、海馬神経回路になんらかの機能異常が生じている可能性が示唆された。アストロサイトの異常が、神経回路機能発現にどのような影響を及ぼすか、海馬スライス標本を用いた電気生理学的解析を行った。海馬スライス標本を用いて、CA3-CA3-CA1synapse伝達について検討した。野生型マウスではLTPが起こりえない10Hz10発の低頻度刺激によって、モデルマウスはLTPを起こすことが明らかになった。またCA1錐体細胞から記録してDaired pulse inhibitionを検討したところ、モデルマウスではpaired pulse inmbitionが有意に抑制されていることが明らかになった。このことから、モデルマウスでは、抑制系が障害を受けているために興奮性が亢進していることが示唆された。次いで、網羅的行動解析を行った。モデルマウスは、運動、知覚で異常が観察されなかった。より高次な機能を評価したところ、不安、抑うつ、恐怖、sensorimoter gatingでは異常が観察されなかったが、社交性のわずかな異常が観察された。海馬依存的な学習については現在解析中である。
新型引張り筋違装置の開発

新しく開発した新型の引張り筋違装置(チャックバックルと命名)の試作品について高い耐震性能を有することを繰り返し加力実験によって確認し、また、その実験で得られた復元力特性を簡単なモデルで表し、これを組み込んだ建築物を計算モデルとした地震応答計算を行い、チャックバックルを組み込むことで地震時挙動を改善することができ、大きな余震に効果を発揮することが期待できる筋違材であるといことを確認した。新型引張り筋違材を想定した細径鋼棒に関わる繰返し加力実験(1)(2)(3)と地震応答解析を行なった。実験(1)は、新型筋違装置を組み込んだ縮尺約1/3の架構が示す強震時の力学挙動を把握する実験である。この実験によって鋼棒筋違材は圧縮過程での座屈が無く、また引張り過程では即時に引張り応力が生じて紡錘型復元力特性を示すことが確認された。但し、載荷剛性は除荷剛性の約75%であったこと、小振幅の繰返しが続く際は、載荷の初期剛性が低く、スリップに近い性状を示すことが観測された。これは、偏芯輪から加わる側圧で鋼棒に生ずる「くびれ」が強く関係するものである。この「くびれ」に着目して行なった実験(2)により、鋼棒に引張り力が作用し始めると、引張り力の増大に伴って新型引張り筋違装置の主要部材である偏芯輪は回転し始めるが、鋼棒が降伏棚を進む段階に達すると回転は止まり、偏芯輪がしっかりと鋼棒を掴むことを確認した。実験(3)は、新型引張り筋違材を想定した細径鋼棒に材軸方向引張り荷重と材軸直交圧縮荷重を同時に加える2軸加力実験である。このような2軸加力を受けると、鋼棒は「くびれ」が進行し、単に材軸直交圧縮荷重だけの場合に比べ鋼棒径が一層細くなることは予想通りであったが、一連の実験により鋼棒径が細くなる状況をより詳しく捉えることができた。地震応答解析は、3階建て鉄骨造建築物を例としてとりあげ、これに新型筋違装置と従来から多用されている筋違(従来型筋違)の両タイプの引張り筋違を同時に配置し、実験で得られた復元力特性を反映した計算モデルを採用した。筋違用鋼材の総量一定の下、新型筋違装置と従来型筋違の鋼材量を様々に変えて行なった応答計算の結果、新型筋違を増やすと地震応答量は低減するが残留歪みが増大する傾向のあることがわかった。また、全筋違用鋼材量の50%75%を新型筋違装置とし、残りを従来型筋違とすれば耐震性能が向上し、余震に対しても有効となるとの結論が得られた。
代理親魚技法を用いた遺伝的不妊魚の大量生産法の開発

遺伝的不妊魚の大量生産を目指し、FSH受容体の変異メダカの生殖細胞を、野生型メダカ三倍体の孵化仔魚へと移植した雌宿主とFSH受容体ホモ欠損の突然変異個体の雄を交配した。得られた次世代のゲノムを解析した結果、これら次世代個体はFSH受容体ホモ欠損であった。以上、体細胞で発現する再生産に不可欠な遺伝子をホモ欠損した突然変異個体の生殖細胞を代理親魚へと移植することで、不妊個体を大量生産可能となった。遺伝的不妊魚の大量生産を目指し、研究分担者の北野が作成したFSH受容体の突然変異メダカの生殖細胞を突然変異を保持していないメダカ三倍体の孵化仔魚腹腔内へと移植した。なおこれらの移植細胞には、赤色蛍光遺伝子で標識したものを用いた。移植1月後に宿主を開腹し、移植細胞の挙動を観察した結果、観察個体の半数で赤色蛍光を発する移植生殖細胞が宿主の生殖腺へと取り込まれていることを確認した。また、これらの宿主個体を継続飼育した結果、一部の個体が成熟し、配偶子を生産することを確認した。現在これらの配偶子が間違いなく、移植したドナー個体に由来するもの、すなわちFSH受容体に変異を保持している配偶子であるかを確認中である。また、本技法の大型産業種への応用を見据え、CRISPR/CAS9システムでニジマス、ヒメマス、ヤマメのdnd遺伝子の変異導入が可能であるかを検討した。本年度はこれらのRNAを各種受精卵へと導入し、親世代での変異導入効率を解析した。その結果、導入個体の約7割程度の個体で少なくとも一部の細胞において変異が生じていることが確認された。現在これらの変異をホモ化を目指し、個体を飼育中である。一方、ドナーの新たな候補として、ゲノム編集(TALEN)を利用してLHRノックアウトメダカ系統の作製に成功した。この系統の表現型を解析したところ、XXメスは不妊であったが、XYオスは妊性があることが確認された。今後は、FSHRとLHRのダブルノックアウトメダカ系統を作製し、雌雄両方の妊性を調査する予定である。さらに、遺伝的不妊トラフグを作出するため、不妊化候補遺伝子を絞り込みを行った。そのうちメダカでの不妊化が確認できているFSH受容体、CYP17a1について、遺伝子欠損体作出に必要なCRISPR/Cas9の標的RNAを設計、合成した。これにより、次の産卵期に向けて準備が整った。特段問題はなく、研究は順調に進んでいる。メダカを用いた実験では既に順調に結果が出始めている。遺伝的不妊魚の大量生産を目指し、研究分担者の北野が作成したFSH受容体の突然変異メダカの生殖細胞を、突然変異を保持していない野生型メダカ三倍体の孵化仔魚腹腔内へと移植した宿主個体を継続飼育した結果、一部の個体が成熟し、配偶子を生産することを確認した。そこで、これらのうち雌宿主個体とFSH受容体ホモ欠損の突然変異個体の雄を交配することによって得られた次世代からゲノムDNAを抽出し、まずCEL1による変異挿入スクリーニングを行った。続いてこれらのスクリーニングで陽性だった個体に関しては、ダイレクトシークエンシングを行った結果、得られた次世代個体は間違いなくFSH受容体ホモ欠損であることが明らかとなった。以上の結果から、生殖細胞以外の細胞で発現する再生産に不可欠な遺伝子をホモ欠損した突然変異個体の生殖細胞を代理親魚へと移植することで、これらの変異を保持する配偶子を大量生産できることが明らかとなった。また、よりドナーとして適した突然変異体を作出するために、ゲノム編集(TALEN)を利用してLHRとFSHRのダブルノックアウトメダカ系統を作製し、この表現型を解析した。その結果、XXメスは不妊であったが、XYオスは妊性があることが確認された。今後は、別のノックアウトシステム(CRISPR/CAS9)を利用して、再びLHR/FSHRダブルノックアウトメダカ系統を作製し、雌雄両方の妊性を再度調査する予定であるさらに、遺伝的に不妊化された養殖魚を作出することを目指して、CRISPR/Cas9システムを用いてステロイド代謝酵素をコードするcyp17a1遺伝子変異トラフグの作出を試みた。その結果、cyp17a1遺伝子に変異が導入された不妊化(機能欠損)が期待できるトラフグの作出に成功した。計画当初に予定していたFSH受容体のホモ欠損メダカの大量生産に成功しており、本課題の中心となる研究課題についての大きな進展を得ることができている。昨年度までの研究で、メダカをモデルに用いてFSHの受容体に変異を保持した個体の生殖細胞を健常な野生型宿主へと移植すれば、これら宿主がFSH受容体に変異をもつ次世代のみを生産することを明らかにした。またこれらの個体をFSH受容体の変異XX雄と交配すると、すべての次世代はFSH受容体ホモ変異のXX個体になることが確認された。本年度はこれら得られた次世代のメス個体の妊性を調査した結果、すべての個体が卵黄蓄積の開始期で卵形成が停止しており、妊性を持たないことが明らかとなった。またこれらの技術を水産場重要種へと応用するために、サケ科およびサバ科魚類でCRISPR/Cas9システムが稼働するかを確認したところ、両魚種においても効率的にゲノム編集が可能であることが明らかとなり、メダカで開発した方法論を各種養殖対象魚種へと応用可能であることが強く示唆された。

また、よりドナーとして適した突然変異体を作出するために、今年度は、CRISPR/CAS9システムを利用して、細胞外ドメインに変異を導入したFSHR/LHRダブルノックアウトメダカ系統を作製し、このメダカが通常発生することを確認した。今後は、雌雄両方の妊性に関して、以前作製したノックアウトメダカ系統と比較する予定である。さらに、遺伝子に不妊化された養殖魚を作出することを目指して、さらに、遺伝的に不妊化された養殖魚を作出することを目指して、トラフグの遺伝的不妊化実験を行った。ゲノム編集によってFSH受容体の機能喪失が期待できる欠失変異(flame-shift)を効率よく導入できた。さらに、不妊化系統の始祖となる親魚候補を80尾確保した。今後、これらの個体の不妊化状態を解析するとともに、クサフグを用いた代理親魚技術を導入し、卵を産まないトラフグの大量生産を目指す。遺伝的不妊魚の大量生産を目指し、FSH受容体の変異メダカの生殖細胞を、野生型メダカ三倍体の孵化仔魚へと移植した雌宿主とFSH受容体ホモ欠損の突然変異個体の雄を交配した。得られた次世代のゲノムを解析した結果、これら次世代個体はFSH受容体ホモ欠損であった。以上、体細胞で発現する再生産に不可欠な遺伝子をホモ欠損した突然変異個体の生殖細胞を代理親魚へと移植することで、不妊個体を大量生産可能となった。今後の実験は交配実験が中心になるが、そのための親魚類の調整準備はほぼ完了している。今後は、集約的にこれらの実験魚を飼育していくことで、限られた期間内に成熟誘導を施し、次世代の解析が可能となるように配慮していく予定である。今後は、大型養殖魚を用いた研究、およびメダカの次世代個体の妊性を詳細に解析していくことを目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。水族発生工学28年度が最終年度であるため、記入しない。
肥満細胞の情報伝達系における環状GMPの役割

1.肥満細胞の単離法の検当。高濃度BSA溶液法、フィコール法、パーコール法などの密度こう配遠心分離法を試みた。高濃度BSA法では、肥満細胞の純度は10-30%と低かったが、レクチン〔ConA〕によるヒスタミン分泌反応は良好であった。フィコール法、パーコール法ではやや純度の高い〔40-50%〕肥満細胞が得られたが、ConAに対する反応はあまり良くなかった。従って以下の実験では高濃度BSA法を用いた。2.肥満細胞内環状GMP濃度の測定相当量の肥満細胞〔【10^5】Cells〕を用いて、環状GMPのラジオイムノアッセイ法を行ったが、いずれの検体でも測定感度以下であった。3.ジブチル環状GMPのヒスタミン分泌に及ぼす効果ジブチル環状GMPは、0.25mMでConAによるヒスタミン分泌を抑制する傾向を示した。
セリンピルビン酸トランスアミナ-ゼのペルオキシソ-ムへの移行機構

セリン:ピルビン酸トランスアミナ-ゼ(SPT)のオルガネラ局在は動物種属により異なり,独得である。すなわち,ヒト,ウサギ等の肝臓ではペルオキシソ-ムに局在し,ラットでは同一遺伝子由来の5'末端の長さが異なる2種類のSPTーmRNAから,それぞれミトコンドリアへ移行すべき運命を持つミトコンドリアSPT(SPTm)前駆体とペルオキシソ-ムへ移行するSPT(SPTp)が合成される。本研究では,ラットSPTpおよびヒトSPTのペルオキシソ-ム局在に焦点を合わせて実験を行い,次の結果を得た。1.cDNA移入培養COS細胞に発現させたラットSPTp,ヒトSPTはいずれも選択的にペルオキシソ-ムへ移行した。各種欠失cDNAを発現させた実験から,SPTのC末端30以内のアミノ酸残基の部分にペルオキシソ-ム標的シグナル配列があるか,あるいはこの部分が同シグナル形成に関わっていることが示唆された。一方,COS細胞に発現させたラットSPTm前駆体は大部分ミトコンドリアへ移行した。極く一部(約1/100)ペルオキシソ-ムへの移行も認められたが,これはmRNAの内部ATGコドンからの翻訳に由来するものらしい。2.ラットSPT遺伝子が第9染色体長腕(g)34ー36に存在することを明らかにし,且つ近交系ラットでのRFLPの解析により同遺伝子が一種類であることを確認した。3.SPT遺伝子のコ-ド領域にT→C点変異があり,このためSPT蛋白にSer→Pro変換が予想される原発性高蓚酸尿症1型の症例におけるSPT欠損を解析した。その結果,この症例の肝臓では変異SPTが合成されていると推定されるにもかかわらず検出されないのは,速やかな分解を受けているためであることがほぼ明らかになった。COS細胞での発現実験からこの変異SPTがペルオキシソ-ムへ移行し得ることは明らかであるが,その効率が低くサイトゾルに長く留まるため早い分解を受けるのか,あるいはペルオキシソ-ムへの到達過程で分解されるのかが次の課題となった。