hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モーラ遷移確率モデルによる韻律の表現と音声認識への利用に関する研究

基本周波数パターンを中心とする韻律的特徴をモーラ単位で表現し、その遷移確率モデルにより韻律に関する事項を表現して検出、識別を行い、その結果を音声認識に利用することを目的とし、以下の様に所期の目標を達成した。1.離散型HMMであるモーラ遷移確率モデルを連続分布モデルとすることの検討を行った。基本周波数パターンをスプライン補間した後、2次曲線で近似し、その係数をパラメータとすることで数%の境界検出率の向上を得た。2.休止が後続する場合、モーラ持続時間が閾値より大きい場合について個別にモデル化することにより、アクセント句境界検出率の数%程度の向上を得た。3.入力された連続音声を、まず音素HMMと文章単位のモーラbi-gramで認識し、得られたモーラ境界情報を利用して、モーラ遷移確率モデルによりアクセント句境界を検出する。次に、検出された境界情報を基に、アクセント句単位のモーラbi-gramを用いて再認識を行うことにより認識率の向上を達成する。この様な2段構成の認識アルゴリズムを構築して、ATR連続音声データベースを用いた認識実験で数%のモーラ認識率の向上を確認した。4.上記の前段認識とアクセント句境界検出において、2ベストを取って認識を進め、最終的なスコアによって確定することを行い、1ポイント程度のモーラ認識率の向上を達成した。さらに、後段の2ndベストを時間情報を考慮して利用することで認識率がさらに向上する可能性を示した。5.発話内容既知の場合について、開発した手法による韻律の自動ラベリングを行い、7割程度の精度でのラベリングが可能なことを示した。6.モーラ遷移確率モデルを結合することにより、アクセント型、フレーズ境界位置を入力としてアクセント句の基本周波数パターンを生成することを行った。モーラ境界での不連続を平滑化するこれにより、音声合成に利用可能なことを示した。基本周波数パターンを中心とする韻律的特徴をモーラ単位で表現し、その遷移確率モデルにより韻律に関する事項を表現して検出、識別を行い、その結果を音声認識に利用することを目的とし、以下の成果を達成した。1.既に、モーラ単位の基本周波数パターン(モーラ基本周波数パターン)をその形状と先行モーラからの基本周波数の平均値の変化によってコード化して表現した上で、その遷移確率モデルとしてアクセント句の基本周波数パターンをモデル化するモーラ遷移確率モデルを提案している。モデルとして採用したHMMの構造とコード化について改良を加えた。2.ATR連続音声データベースについて、その韻律ラベルをモデル化に適したものに変更した上で、特定話者、不特定話者のアクセント句境界検出実験を行った。Tri-phoneモデルを用いた音韻境界の強制切り出しによって得たモーラ境界を利用した場合、70%75%の検出率、11%15%の挿入誤り率を得た。アクセント型の識別率としては6割程度であった。3.モーラbi-gramとして、アクセント句境界を考慮しないものと考慮したものを用意し、前者で1段目、後者で2段目の認識を行う連続音声認識手法を開発した。上記ATR連続音声データベースを用いた認識実験で数%のモーラ認識率の向上を確認した。4.離散型HMMであるモーラ遷移確率モデルを連続分布モデルとすることの検討を行った。モーラ遷移確率モデルにより、アクセント型、フレーズ境界位置を入力として基本周波数パターンを合成する手法を開発した。ビタビアルゴリズムによるパターン生成の際にモーラbi-gramを導入することで、自然な韻律を生成した。
各種繊維の熱的挙動に関する研究

目的無機リン化合物を用いて処理した防炎加工布の燃焼性と発煙量について検討した。方法試料として一時性防炎加工剤であるNaHPO_4、Na_2HPO_4、Na_2PO_4、NH_4H_2PO_4、(NH_4)_2HPO_4、(NH_4)_3PO_4を用いて防炎加工した(濃度:520%)綿100%織物を用いた。限界酸素指数(LOI)値及びLOI値雰囲気中における発煙量は酸素指数・煙濃度同時測定装置を用いて測定した。JIS L 1091法に準じ、45度燃焼性試験機を用い、残炎時間、残じん時間、炭化面積などを測定した。熱分解挙動は熱重量示差熱同時測定装置(DTG-60)を用いて測定した。熱重量-質量分析(TG-MS)により、TG分析における熱分解ガスの分析を行なった。結果LOI値はリン酸ナトリウム処理綿の場合は2329、リン酸アンモニウム処理綿の場合では3060を示した。リン酸アンモニウム処理綿ではリン成分のみではなく、窒素成分が加わることにより、相乗効果が表れ、燃えにくくなった。JIS L 1091法による燃焼性試験ではリン酸ナトリウム処理綿では、難燃性の指標であるLOI値に関係なく、着火時間、残炎時間、炭化面積に相違は認められなかった。リン酸アンモニウム処理綿の場合は、リン及び窒素含有量、LOI値の増加に伴い、残炎時間は短くなり、炭化面積は減少する傾向にあった。発煙量はリン酸ナトリウム処理綿では、未加工布の1/201/2と著しく減少したが、リン酸アンモニウム処理綿では未加工布の416倍を示し、特に、リン・窒素付着率の高い試料では約100倍を示した場合もあった。これらの結果から発煙量には、窒素の影響が大きく表れるが、リンの影響も大きいことが明らかとなった。DTG-60分析により求めた主要熱分解温度は、リン酸ナトリウム処理綿では未加工布よりも30°C低温側にシフトするが、リン酸アンモニウム処理綿では60°C100°C低温側にシフトした。目的繊維素材は燃焼すると、煙と種々の熱分解ガスを発生することはよく知られているが、実際に煙の発生量、熱分解ガスなどについては十分明らかにされているわけではない。そこで、本研究では、種々の繊維製品の燃焼性と煙濃度との関係を検討した。方法試料として各種繊維20種とビニルホスホナートオリゴマー(FYR)とアクリルアミド(AA)を用いて防炎処理したポリエステル4種を用いた。限界酸素指数(LOI)値及びLOI値の酸素雰囲気中における煙濃度、発煙量は、酸素指数・煙濃度同時測定装置を用いて測定した。煙濃度、発煙量は燃焼発煙に伴う光透過率の変動を測定し、求めた。また、熱的変化は熱重量(TGA)示差熱(DTA)同時測定装置を用いて検討した。結果各種、純および混紡織物20種および防炎加工を施したポリエステル織物4種についてLOI値を求め、LOI値の酸素濃度雰囲気中で、試料(7.5×16cm)を燃焼させ、燃焼時間、(最大)煙濃度、発煙量を求めた。易燃性のセルロースの発煙性は低いが、絹や羊毛のような可燃性の繊維は発煙量がやや高い。

綿/ポリエステル混(35/65)織物は、綿織物の約30倍、ポリエステル織物の7倍という高い発煙量を示す。この混紡織物は、いわゆるローソク効果により、各成分の純織物よりも燃えやすいことが知られているが、今回の高い発煙量についての解釈は今後の課題である。防炎処理した試料は、FYRの比率を増加させることにより難燃性を増加できるが、LOI値が高い試料ほど発煙性が急激に高くなり、かつ、燃焼に要する時間も長くなる。なお、熱分解挙動は素材で決まり、試料の粗織や密度の影響をほとんど受けないが、煙濃度や発煙量は当然、布の密度の影響を受ける。今後、防炎加工試料についての発煙挙動についてさらに検討を進めるとともに、発煙性に及ぼす酸素濃度の影響を明らかにしたい。目的昨年度に引き続き、種々の繊維製品の燃焼性と煙濃度との関係を検討した。今年度は特に、無機リン化合物を用いて処理した防炎加工布の燃焼性と発煙量について検討した。方法試料として一時性防炎加工剤であるリン酸ナトリウム、リン酸アンモニウムを用いて防炎加工した綿100%織物およびポリ乳酸繊維など未処理の各種繊維を用いた。限界酸素指数(LOI)値及びLOI値雰囲気中における発煙量は酸素指数・煙濃度同時測定装置を用いて測定した。また、JIS L 1091法に準じ45度燃焼試験機を用し、着火時間、残炎時間(及び残じん時間)を測定した。結果リン酸ナトリウムあるいはリン酸アンモニウムを用いて防炎加工を施した綿布においてLOI値及びLOI値の酸素濃度雰囲気中における発煙量を求めた。リン酸ナトリウム処理綿のLOI値は約22を示し、未処理綿のLOI値(18)よりもわずかに高いが、リン酸アンモニウム処理綿のLOI値は26以上と、難燃性を示した。発煙量は、リン酸ナトリウムの場合は未処理綿の1/201/2と著しく減少したが、リン酸アンモニウムの場合は、48倍に増加した。JIS L 1091法による燃焼性試験では、リン酸ナトリウム処理綿は、リンの含有量とともに着火しにくく、残炎時間は少ない傾向を示し、これは発煙量の結果に対応した。リン酸アンモニウム処理綿では加熱により着火することなく、試料は炭化するのみであった。しかし、発煙量は48倍と多い。リンと窒素との相乗作用により難燃性は向上するが、同時に発煙量も増加するという結果であった。窒素が発煙量や煙濃度にどのように関係するのかは今後の検討課題である。未加工の繊維の燃焼性についても検討した。ポリエステル100%繊維では着火しなければ発煙量は少ないという傾向が認められ、難燃性と発煙量は一致する傾向が認められた。生分解性繊維であるポリ乳酸繊維はLOI値29と難燃性を示し、発煙量はポリエステル100%織物(JIS L 0802染色堅ろう度用添付白布)の1/2と、著しく少ない結果を示した。目的昨年度に引続き、無機リン化合物を用いて処理した防炎加工布の燃焼性と発煙量について検討した。方法試料として一時性防炎加工剤であるNaHPO_4、Na_2HPO_4、Na_2PO_4、NH_4H_2PO_4、(NH_4)_2HPO_4、(NH_4)_3PO_4を用いて防炎加工した(濃度:520%)綿100%織物を用いた。JIS L 1091法に準じ、45度燃焼性試験機を用い、残炎時間、残じん時間、炭化面積などを測定した。熱分解挙動は熱重量示差熱同時測定装置(DTG-60)を用いて測定した。熱重量-質量分析(TG-MS)により、TG分析における熱分解ガスの分析を行なった。
インクレチン分泌機構の統合的理解：GIPならびにGLP-1分泌の共通点と相違点

1) GIP分泌におけるFABP5の役割:FABP5の細胞内局在に関する組織学的検討を行った。経口脂肪負荷前後でマウスの上部小腸を摘出、FABP5抗体による染色ののち、共焦点レーザー顕微鏡・免疫電子顕微鏡を用いて観察したところ、FABP5は脂肪負荷前にはK細胞の核内・細胞質に存在していたが、負荷後一過性に核内の局在が消失した。経口糖負荷後の観察では、FABP5の細胞内局在変化は認めなかった。GIP分泌における本現象の意義については今後詳細な検討を要する。2) GPR120シグナルとのGIP分泌との関連性の検討:野生型(WT)、GPR40およびGPR120ダブル欠損(DKO)マウスを用いて経口ブドウ糖・コーン油負荷試験(OGTT・OCTT)を行った。OGTTではGIP分泌にWTマウスとDKOマウスに有意差を認めなかった。一方、OCTT時にはDKOマウスにおいて有意なGIP分泌を得られなかった。GIPレポーターマウスと交配してK細胞を可視化し、小腸K細胞数やK細胞内の遺伝子発現量を比較した。DKOマウスのK細胞数やK細胞内GIP遺伝子の発現はWTマウスと同等であった。K細胞内のGPR120, GPR40の発現はいずれも消失していたが、GPR119、FATP1-5、CD36等他の脂質関連遺伝子の発現量に変化を認めなかった。3) L細胞に高発現する分子の単離同定:L細胞が蛍光タンパクで標識されたGcg-GFPマウス腸管からL細胞を単離しマイクロアレイ解析を行ったところ、非L細胞に比べL細胞で高い発現を示す遺伝子の一つとして炭酸脱水酵素8 (carbonic anhydrase 8; Car8)を同定した。さらに腸管内分泌細胞株STC-1を用いた予備的検討の結果、Car8をノックダウンすることで長鎖脂肪酸刺激によるGLP-1分泌が増強し、過剰発現により抑制されることを確認した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1) GIP分泌におけるFABP5の役割:免疫組織学的評価から、脂肪摂取後にFABP5が核内から細胞内へ移動することが確認された。2) GPR120シグナルとのGIP分泌との関連性の検討:GPR120欠損マウスを用いて脂質摂取時のGIP分泌亢進に対するGPR120の役割について検討した。経口コーン油負荷試験(OCTT)におけるGIP分泌量は、野生型マウス(WT)に比してGPR120欠損マウスは50%減少した。コーン油負荷後の血中CCK濃度は、WTに比してGPR120欠損マウスは50%減少しており、経腹壁エコーで算出した胆嚢収縮率は50%低下していた。油負荷後の胆嚢内の胆汁量を用手的に直接測定すると、GPR120欠損マウスはWTの2倍量が残留していた。すなわち、OCTTでのGIP分泌量はCCK濃度や胆汁分泌量と相関関係にあることが判明した。CCKアナログをコーン油と同時に投与した状況下では、GPR120欠損マウスはWTと同等のGIP分泌量へと回復を得た。以上からGPR120はCCKを介してGIP分泌に寄与することが示唆された。3) L細胞に高発現する分子の単離同定:L細胞の可視化モデルであるグルカゴン-GFPマウスを用いて、上部小腸・下部小腸・大腸におけるL細胞の量的・質的差異を検討した。疫組織学的評価でL細胞数は上部小腸で最も少なく、腸管肛門側に向かって増加し、大腸に有意に多かった。GLP-1はプログルカゴン遺伝子より組織特異的に転写されるためGcg mRNAにて評価したところ、上部小腸L細胞において下部小腸L細胞に比較して有意に高い発現であった。他の腸管ホルモン遺伝子について、下部小腸L細胞においてPYY mRNAの高い発現を、上部小腸L細胞においてCCK mRNA発現の高い発現を認めた。また、上部小腸L細胞にGIP mRNAの有意に高い発現を認めた。GPR120欠損マウスの解析は終了し、L細胞可視化マウスのL細胞解析や遺伝子発現を確認することができた。我々は長鎖脂肪酸受容体GPR40とGPR120がK細胞に発現し、それぞれ異なる機序で脂肪摂取後のGIP分泌に関与することを報告した。しかし両受容体を同時に欠失した状況下での、インクレチン分泌に関しては不明であり、今回両受容体のダブル欠損マウスにおけるインクレチン分泌の評価、K細胞の解析を行った。野生型(WT)、GPR40およびGPR120ダブル欠損(DKO)マウスを用いて経口ブドウ糖・コーン油負荷試験(OGTT・OCTT)を行い、GIPとGLP-1分泌を評価した。OGTTではGIP、GLP-1ともにWTマウスとDKOマウスに有意差を認めなかった。一方、OCTT時にはDKOマウスのGIP分泌が、WTの90%以上減少し有意なGIP分泌を得られなかった。またGLP-1も有意な分泌を認めなかった。DKOマウスとGIP-GFPノックインマウスと交配してK細胞を可視化し、上部小腸内のK細胞数やK細胞内の遺伝子発現量を比較した。DKOマウスのK細胞の数やK細胞内GIP遺伝子の発現は野生型マウスと同等であった。

K細胞内のGPR120およびGPR40の発現はいずれも消失していたが、GPR119、FATP1-5、CD36等他の脂質関連遺伝子の発現量に変化を認めなかった。胆汁酸受容体TGR5発現もWTマウスと同等だったが、FXR発現はDKOマウスで有意に上昇した。DKOマウスで有意なGIPおよびGLP-1分泌を得られないことから、脂肪摂取後の脂肪酸感知はGPR120とGPR40の2つの受容体が担うことが示された。GIP-GFPおよびグルカゴン-GFPマウスを用いたK細胞およびL細胞解析は順調に進んでいる。特にK細胞およびL細胞における脂肪酸受容体の役割については、ほぼ終了しつつある。現在FXRとインクレチン分泌の解析を行っている。腸管内L細胞の解析も順調に進み2018年には、既に論文発表を行った。L細胞に高発現する分子の解析についてもSTC-1細胞を用いてGLP-1分泌に対する分子の役割について解析中である。1) GIP分泌におけるFABP5の役割:FABP5の細胞内局在に関する組織学的検討を行った。経口脂肪負荷前後でマウスの上部小腸を摘出、FABP5抗体による染色ののち、共焦点レーザー顕微鏡・免疫電子顕微鏡を用いて観察したところ、FABP5は脂肪負荷前にはK細胞の核内・細胞質に存在していたが、負荷後一過性に核内の局在が消失した。経口糖負荷後の観察では、FABP5の細胞内局在変化は認めなかった。GIP分泌における本現象の意義については今後詳細な検討を要する。2) GPR120シグナルとのGIP分泌との関連性の検討:野生型(WT)、GPR40およびGPR120ダブル欠損(DKO)マウスを用いて経口ブドウ糖・コーン油負荷試験(OGTT・OCTT)を行った。OGTTではGIP分泌にWTマウスとDKOマウスに有意差を認めなかった。一方、OCTT時にはDKOマウスにおいて有意なGIP分泌を得られなかった。GIPレポーターマウスと交配してK細胞を可視化し、小腸K細胞数やK細胞内の遺伝子発現量を比較した。DKOマウスのK細胞数やK細胞内GIP遺伝子の発現はWTマウスと同等であった。K細胞内のGPR120, GPR40の発現はいずれも消失していたが、GPR119、FATP1-5、CD36等他の脂質関連遺伝子の発現量に変化を認めなかった。3) L細胞に高発現する分子の単離同定:L細胞が蛍光タンパクで標識されたGcg-GFPマウス腸管からL細胞を単離しマイクロアレイ解析を行ったところ、非L細胞に比べL細胞で高い発現を示す遺伝子の一つとして炭酸脱水酵素8 (carbonic anhydrase 8; Car8)を同定した。さらに腸管内分泌細胞株STC-1を用いた予備的検討の結果、Car8をノックダウンすることで長鎖脂肪酸刺激によるGLP-1分泌が増強し、過剰発現により抑制されることを確認した。1) GIP分泌におけるFABP5の役割:FABP5マウスを用いたグルコースおよび脂肪摂取後のマウス小腸の標本を作成、FABP5抗体で染色後、電子顕微鏡で観察する。K細胞のマイクロアレイ解析により、発現プロファイルをFABP5欠損マウス、野生型マウスで比較する。2)脂質によるGIP分泌における胆汁の作用点の解明:GPR120欠損およびGPR40欠損マウスを用いてGIP分泌を検討する3)腸管内のK細胞とL細胞の分布の違いについての検討:フローサイトメーターを用いて腸管部位ごとに腸管上皮細胞に占めるK細胞およびL細胞数を比較する。
末期肝不全・先天異常等による肝実質細胞機能不全に対する細胞療法の開発

末期肝不全あるいは肝細胞の先天性代謝異常症の新規な治療法としての細胞移植による肝組織再構築を目的として、1)肝上皮幹細胞の探索、2)肝細胞分化誘導因子の探求、3)細胞への遺伝子導入による機能付与、4)移植細胞生着のための免疫抑制、の面から研究を遂行している。初年度には仔ブタ肝細胞の増殖性肝細胞を利用しUDP-glucuronosyltransferase欠損ラット(GUNNラット)に対する細胞移植治療を行い、同ラットの高ビリルビン血症を軽減することができた。本年度は、新たな肝幹細胞様の性質を示す細胞ソースとしてヒト羊膜細胞に着目しin vitro、in vivoで検討を重ねた(ヒト材料の取扱いに先立ち国立小児病院倫理委員会に申請し、許可条件に基づき実験を行った)。帝王切開で得られた胎盤から分離されたヒト羊膜組織はアルブミン陰性であるが、培養経過と共にアルブミン、α-フェトプロテイン陽性に変化する。アルブミンについてはRT-PCRでmRNAの検出、ELISAで培養上清中の分泌タンパクの検出を行った。この組織をScidマウス肝へ移植したところ生着し肝組織構築に取り込まれた。この性質を利用し、上記GUNNラットへUDP-glucuronosyltransferase遺伝子を導入した羊膜細胞の移植による治療実験を試みている。肝実質細胞はin vitro培養系で速やかに分化機能を喪失するが、本年度は、種々の細胞との共培養及びラット胎児ホモジネートを用いることで分化機能の長期維持を試みた。共培養した細胞は、ヒト羊膜細胞、温度感受性SV40遺伝子導入ラット肝細胞株(IGRH)を用いた。ラット胎児ホモジネートは胎齢16日±1日を用い、ラット血漿を加えることによりゲル化させ、ゲル内で肝細胞を培養した。これらの条件下で肝細胞は本来の形態をよく維持しながら最長30日程度培養できた。また、分化機能の指標としてアンモニア除去能を調べたところ、ラット胎児ホモジネートゲル内培養で20日程度に及ぶ機能維持を見た。現在この機能維持因子を分画している。移植細胞生着のための免疫抑制についてはアポトーシス関連遺伝子、特にFas-L遺伝子の導入による免疫抑制療法を検討した。Fas-L遺伝子の導入により移植肝の生着日数は対照の約3倍程度に延長することがわかった。1)肝上皮幹細胞の探索肝の構成細胞の過半を占める実質細胞は均一な細胞集団ではなく酵素分布等の観点から未分化細胞から成熟してゆく過程が想定されている。ラット及び仔ブタ(生後50日前後)の分離肝細胞に培養初期(培養開始3日目前後)に増殖性の強い細胞が再現性よく得られた。肝実質細胞は培養下で殆ど増殖しないが、仔ブタ肝細胞では播種数(5x10^6/10cmディッシュ)を上回る増殖を見た。分化機能は薬物代謝活性(7-Ethoxycoumarin deethylation)の経時変化を検討している。

一方、細胞療法のシミュレーションとしてCrigler-Najjar症候群のモデル動物でビリルビン抱合酵素欠損のGUNNラットにこれらの肝細胞を門脈内投与したところ血中ビリルビンを良好に1ヶ月以上低下させる1結果を得た。尚、ブタ肝細胞投与に際しては免疫抑制としてFK506投与(1mg/kg,i.m.)を行った。また、ヒト羊膜細胞内に肝上皮幹細胞様の細胞の存在を認め、新たな肝上皮肝細胞のソースとして検討を加えている。2)肝細胞分化誘導因子の探求ラット、マウスの場合、胎生12日頃に肝芽細胞から肝細胞への分化が起こり細胞内にアルブミン合成が認められる。この時期の胎児組織の抽出液を培地内に加え、初代培養肝細胞の分化機能の維持状態を検討している。本年はそのスクリーニング条件を整備し薬物代謝活性による探求を可能とした。末期肝不全あるいは肝細胞の先天性代謝異常症の新規な治療法としての細胞移植による肝組織再構築を目的として、1)肝上皮幹細胞の探索、2)肝細胞分化誘導因子の探求、3)細胞への遺伝子導入による機能付与、4)移植細胞生着のための免疫抑制、の面から研究を遂行している。初年度には仔ブタ肝細胞の増殖性肝細胞を利用しUDP-glucuronosyltransferase欠損ラット(GUNNラット)に対する細胞移植治療を行い、同ラットの高ビリルビン血症を軽減することができた。本年度は、新たな肝幹細胞様の性質を示す細胞ソースとしてヒト羊膜細胞に着目しin vitro、in vivoで検討を重ねた(ヒト材料の取扱いに先立ち国立小児病院倫理委員会に申請し、許可条件に基づき実験を行った)。帝王切開で得られた胎盤から分離されたヒト羊膜組織はアルブミン陰性であるが、培養経過と供にアルブミン、α-フェトプロテイン陽性に変化する。アルブミンについてはRT-PCRでmRNAの検出、ELISAで培養上清中の分泌タンパクの検出を行った。この細胞をScldマウス肝へ移植したところ生着し肝組織構築に取り込まれた。この性質を利用し、上記GUNNラットヘUDP-glucuronosyltransferase遺伝子を導入した羊膜細胞の移植による治療実験を試みている。肝実質細胞はin vitro培養系で速やかに分化機能を喪失するが、本年度は、種々の細胞との共培養及びラット胎児ホモジネートを用いることで分化機能の長期維持を試みた。共培養した細胞は、ヒト羊膜細胞、温度感受性SV40遺伝子導入ラット肝細胞株(IGRH)を用いた。ラット胎児ホモジネートは胎齢16日±1日を用い、ラット血漿を加えることによりゲル化させ、ゲル内で肝細胞を培養した。これらの条件下で肝細胞は本来の形態をよく維持しながら最長30日程度培養できた。また、分化機能の指標としてアンモニア除去能を調べたところ、ラット胎児ホモジネートゲル内培養で20日程度に及ぶ機能維持を見た。現在この機能維持因子を分画している。移植細胞生着のための免疫抑制については本年度はアポトーシス関連遺伝子、特にFas-L遺伝子の導入による免疫抑制療法を検討した。Fas-L遺伝子の導入により移植肝の生着日数は対照の約3倍程度に延長することがわかった(詳細は、Liet
液体金属ＭＨＤ発電機内乱流の再層流化現象と渦電流による壁面ジェット流の解明

流れ方向に有限長さの磁石が作り出す磁束密度の流れ方向変化により、発電領域の上流と下流では渦電流が発生する。その渦電流によるローレンツ力により磁場と垂直な平面内で速度分布はM字形に歪められ、側壁ジェット流を形成する。ラージエディシミュレーション(LES)により、低磁束密度では流れ方向に伸長した発電機内の乱流構造は抑制され、さらに磁場を増加させ発電領域でレイノルズせん断応力がゼロになるまで乱流が抑制される条件では、乱流構造は磁場の方向に揃い、カルマン渦のように繰り返し下流へ流される。さらに磁場を増加させると側壁ジェットの局所摩擦レイノルズ数が増加し、側壁ジェット流が乱流遷移することが分かった。液体金属矩形ダクト流れに対して壁に垂直に磁場を印可するとファラデー起電力が流れ方向と磁場印可方向に垂直な壁方向に得ることができる。その壁に1対の電極を設けて負荷抵抗を繋ぎ、外に電力として取り出す液体金属MHD発電機において、負荷抵抗値(負荷率)依存性を調べた。磁石は発電領域である電極間に設置しているので、電極間の上流下流においては磁束密度は減少する非一様な磁場分布になっている。磁束密度を増加させると磁束密度の流れ方向への勾配に起因して渦電流が増加し、ローレンツ力によって、流れを減速させる方向に加えて壁面方向への力も発生する。その結果、平均流速分布はM字形の側壁ジェット流れとなる。負荷率はオープン電界に対する得られた電界で定義され、負荷抵抗値を増加させると1に近づき、減少させると0に近づく無次元量である。負荷率を増加させた場合、磁束密度を増加させた場合と同様に、電流は外へ取り出すことが困難になり、流路内で渦電流の増加として寄与する。その結果、M字形分布が強調されることがわかった。なお、ローレンツ力に対する磁束密度(ハルトマン数)と負荷率の寄与は、前者が2乗であるのに対して、後者は1乗となるので、その寄与は磁束密度の変化の方がより影響を与えることが分かった。このことは、流れの中の乱流構造抑制現象の結果からも示唆された。また、高負荷率では電流が外へ取り出すことができずに損失となることから、最適な負荷率が存在し、本研究では約0.64の時に、最大電気変換効率が得られた。負荷をオープンにした場合と高負荷率での流れ場の結果を比較し、それらに大きな違いが無いことが分かった。よって、理学系でまず検討されるであろう、外へ電流を取り出さないオープン電圧条件における流れ場も、本研究における高負荷率での結果から、その流れ場が理解できると考えられる。導電性を有する液体金属を矩形ダクト内に流し、そのダクトの壁面へ垂直に磁場を印加することで、流れ方向と磁場方向に垂直な方向にファラデー起電力が発生する。その起電力方向の壁に一対の電極を配置し、負荷抵抗を繋いで外部に電力を取り出すMHD発電機において、液体金属の種類や電極の導電率が発電性能に与える影響、そして波力からの発電を想定して、様々な周波数の波力による発電性能の周波数特性を検討した。電磁流体の流れ場(平均流速分布)はレイノルズ数が同じ場合、液体金属の電気伝導度、磁束密度、粘性係数で構成されるインターラクションパラメータで決まることが分かった。水銀、低融点合金であるGalinstan、Ualloy、NaKの4種類を比較するとインターラクションパラメータが他に比べて約5倍大きなNaKの平均流速分布はM字形となる変形が大きくなることが分かった。一方、同じインターラクションパラメータになるように、各作動流体実験における磁束密度を調整した場合でも、発電効率に違いが出ることが分かった。これは、電極の電気伝導度と作動流体の電気伝導度の比によって電流の電極への流れ込みに違いがあり、外部に取り出す電力量に違いが出ることが原因と分かった。また、波力への応用を考えて、波力でピストンを押し、作動流体を動かすシステムを考えた。その際の波力の周波数応答を検討したところ、低波数では発電機部分とピストン部分で断面積が異なることに起因して発生するシステムの形状損失で決まる効率となるが、高波数ではピストンの動きが少なく流速が低下するので、形状損失が小さくなり、効率の低下が押さえられるが、低出力となることが分かった。本研究で対象とする液体金属MHD発電機は、矩形ダクト内に液体金属を流して磁場を印可し、発生した起電力を壁面に配した電極から外へ電力として取り出すシステムで、流体エネルギーを直接電気に変換する。正方断面を有する発電機において、磁束密度の強さが発電機内の乱流現象に与える影響を、ラージエディシミュレーション(LES)を用いて検討した。磁場は発電を行う電極間には一様に印可されるが、流れ方向に有限長さの磁石によって生成されるので、その発電領域の前後では磁場の流れ方向変化により渦電流が発生する。

その渦電流によるローレンツ力は流れに垂直に働くので、流れは磁場に垂直な平面内でM字形の速度分布にゆがめられ、側壁ジェット流を形成する。その側壁ジェットの最大速度は、磁束密度に比例するハルトマン数の0.5乗に比例して増加し、壁面からジェットの最大速度までの距離である側壁ジェットの厚さはハルトマン層の0.5乗分の1で薄くなることが分かった。磁束密度を増加させると流れ方向に伸長した発電機内の乱流構造は抑制され、このときの断面内にできる渦状の2次流れは磁場に垂直な壁面側の構造が抑制・消失することが分かった。さらに磁場を増加させ発電領域でレイノルズせん断応力がゼロになるまで乱流が抑制される条件では、乱流構造は磁場の方向に揃い、カルマン渦のように繰り返し下流へ流され、渦状の2次流れは断面内で消失することが分かった。さらに磁場を増加させると側壁ジェットの局所摩擦レイノルズ数が増加し、側壁ジェット流が乱流遷移することが分かった。実験で未解明だった乱流強度の増加の原因が判明し、その平均速度分布は実験結果と良く一致した。このときの断面内の2次流れは側壁側の渦状構造が抑制されて磁場に垂直な壁面側に現れることが分かった。一方で、細かな乱流構造は側壁側に存在し、その乱流構造は再び流れ方向に伸長されることが分かった。今年度は、流れ場や発電効率への負荷抵抗値依存性を調べることを目標としたが、その目標は達成された。電極の有無による流れ場への影響も検討できた。また、これまでの成果をまとめて、流体力学分野で一番権威のある雑誌Journal of Fluid Mechanicsへ受理され、論文が出版された。今年度は、磁束密度の強さにより発電機内の乱流現象への影響を調べることを目標としたが、低レイノルズ数流れにおいて、その目標は達成された。さらに、接続する負荷抵抗の違いによる乱流現象や発電性能への影響の検討も始まっており、次年度の目標であった電極の有無による流れ場への影響の検討も実施中である。直接数値計算の実行や高レイノルズ数でのLESの実行を行い、再層流化や乱流遷移についての知見を深める。また、壁面摩擦速度が磁束密度の増加に伴い極大極小をとる過去の実験結果へのM字形分布の影響を検討する。さらに、誘導磁場の影響が強い状況下での計算を検討し、乱流モデルへの検討を考える。接続する負荷抵抗の違いによる乱流現象や発電性能への影響の検討を進め、電極の有無による流れ場への影響の検討を実施していく。また、より高いレイノルズ数でのLESや直接計算による検討のためには、計算の高速化が必須であり、そのためにグラフィックス用の演算器(GPU)を用いた計算プログラの実行をテスト中である。また、大規模計算のためにMPIを用いた並列化も同時に行っていく。そのために、新たなLinuxサーバーを購入し、より数値計算を推進する予定である。
細胞1個の遺伝情報とリンクしたプロテインアレイシステムの構築

本研究は、一個の細胞が有する特定のmRNAをRT-PCRにより増幅、続けて無細胞転写翻訳共役反応を行ない、細胞固有の遺伝や形質の情報とリンクした蛋白質分子ライブラリーを構築する新規なシステムを開発することを目的としている。以下に今年度の主たる成果を記す。免疫マウスよりのモノクローナル抗体の取得作年度構築したシステムは、操作が複雑であったため、より単純化した1段階の一細胞RT-PCRと、改良した無細胞蛋白質合成系による抗体分子の合成を試みた。細胞のモデルとして、粘菌由来トランスグルタミナーゼTG3を認識する抗体を産生するハイブリドーマを用いて、新規システムの有効性を検討した。顕微鏡下で平均1細胞/ウェルになるよう細胞をばらまき、各ウェルごとに逆転写反応を行い、その後両端にタグ配列を付加した縮重プライマーを用いたPCRにより、L鎖とH鎖のFdフラグメントの増幅を試みた。縮重プライマーの濃度を極端に下げ、タグ配列に相同なプライマーを含んだPCR混合液の調整と最適化されたPCRプログラムにより、極微量の鋳型mRNAより特異的な遺伝子増幅に成功した。その結果L鎖およびH鎖のともに増幅されたウェルは13.5%であった。オーバラップPCRにより無細胞タンパク質合成に必要なT7RNAポリメラーゼのプロモーターおよびターミネーター配列を付加し、無細胞蛋白質合成系での直接発現を試み、抗原結合活性を有するFab断片の合成に成功した。また得られた遺伝子はL鎖H鎖ともに、germline遺伝子とそれぞれ高い相同性を示した。これらの実験結果は、1細胞から逆転写反応、PCR、さらには無細胞蛋白質合成系を連結させ、生細胞を一切用いずに、モノクローナル抗体及びその遺伝子を取得する新規なシステムの構築に成功したことを意味している。特にこの申請では例としてヒト由来B細胞1個より、L鎖とH鎖の組み合わせを変えることなく抗体cDNAを増幅、蛋白質として発現させることを試みた。1)免疫マウスよりのモノクローナル抗体の取得CB40蛋白質をマウスに免疫し、脾臓よりB細胞を回収してその1個細胞より、RT-PCRによりL鎖とH鎖遺伝子を増幅し、T7プロモーター、ターミネーターを付加した後、無細胞タンパク質合成系により発現させた。スクリーニングの結果抗原に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体(Fab断片)を得ることができた。2)ヒト由来モノクローナル抗体の取得健常人の血液より末梢B細胞を回収し、その1個細胞より、RT-PCRによりL鎖とH鎖遺伝子を増幅し、T7プロモーター、ターミネーターを付加した後、無細胞タンパク質合成系により発現させた。血液型に対する抗原によるスクリーニングの結果、親和性を有する抗体断片を取得することができた。
小児腫瘍高精度診断マーカーの開発

小児固形腫瘍の高精度マーカーの同定を行い、迅速・正確な病理診断に実用化する目的で、腎腫瘍と肺腫瘍を対象に研究を行った。腎腫瘍では、腎明細胞肉腫のマーカーの候補としてalpha-internexinの検討を他の小児腎腫瘍および腎外腫瘍の多数例を用いて行い、感度・特異性ともに高いことを示した。また、近年同腫瘍で検出された遺伝子異常であるBCOR-ITDをホルマリン固定パラフィン包埋検体から安定的に検出することに成功した。さらに、近年報告された小児腎腫瘍の1つであるanaplastic sarcoma of the kidneyの検討で、同腫瘍がDICER1遺伝子の異常を背景に発症する家族性腫瘍の1つであることの根拠を示しえた。肺腫瘍では新生児・乳児の肺腫瘍性病変であるfetal lung interstitial tumorと診断されていた一部で特異的なALK関連融合遺伝子を検出して、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍の乳児期発症の1亜型を同定した。腎腫瘍は小児固形腫瘍のなかでは比較的頻度の高い疾患である。腎芽腫、腎明細胞肉腫、先天性間葉芽腎腫、ラブドイド腫瘍の4つで小児腎腫瘍の90%以上を占め、これらは悪性度や治療法の選択に大きな違いがあるのにも関わらず、しばしば組織学的に鑑別が容易でない。特に診断の手掛かりとなるマーカーが免疫組織学にも分子生物学的にも乏しい腎明細胞肉腫(clear cell sarcoma of the kidney, CCSK)を標的に研究を行った。我々は昨年度までに、プロテオーム解析の手法を用いて、CCSKに特異性の高いマーカーとして、神経細胞に特異性の高い中間径フィラメントの一つalpha-internexin (INA)を見出した。さらにCCSKと、しばしばCCSKと鑑別が必要となる先天性間葉芽腫、富細胞型(congenital mesoblastic nephroma, cellular, cCMN)の少数例を用いてパイロットスタディーを行い、INAの特異抗体を用いたWestern blottingと免疫組織化学的検討を行った結果、CCSKとcCMNとの間に明確な差が認められることを確認している。これらの結果よりINAは、CCSKに特異性の高い免疫染色のマーカーとして有用と思われた。そこで、平成27年度には、CCSK以外の小児腎腫瘍多数例(腎芽腫、腎明細胞肉腫、間葉芽腎腫、ラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、anaplastic sarcoma of the kidney、腎細胞癌)の切片を用いてINAの免疫組織化学検討を行い、その有用性の検討を行った。具体的には、小児腫瘍を取り扱う施設の協力も得て腫瘍組織切片を準備し、HE染色にて診断を確認したうえで、INA染色を行ったことろCCSKに感度・特異性共に高い陽性所見を確認した。プロテオーム解析で同定されたCCSKの診断マーカーの候補であるINAの有用性の検討を小児腎腫瘍多数例で行った。現在、結果のまとめを行っている。腎芽腫、腎明細胞肉腫(CCSK)、先天性間葉芽腎腫、ラブドイド腫瘍の4つで小児腎腫瘍の90%以上を占め、これらは疾患ごとに悪性度や治療法の選択に大きな違いがあるのにも関わらず、しばしば組織学的に鑑別が容易ではない。特に診断の手掛かりとなるマーカーが免疫組織学的にも分子生物学的にも乏しいCCSKを標的に研究を行った。我々はプロテオーム解析の手法を用いて、CCSKに特異性の高いマーカーとして、神経細胞に特異性の高い中間径フィラメントの一つ、alpha-internexin (INA)を見出し、腎腫瘍以外の小児腫瘍多数例の切片を用いてINAの免疫組織学的検討を行った結果、INAのCCSKでの感度・特異性共に高い陽性所見を確認した。現在得られた結果の論文発表の準備をしている。一方先天性肺気道奇形(CPAM)に代表される先天性嚢胞性肺疾患は小児科領域では少なからず経験される。従来CPAMを母地として胸膜肺芽腫(PPB)が発症することが知られてきた。特にCPAM type4とPPB type1とは肉眼的/組織学的所見ともに重複する部分があり、その異同が議論されている。細胞遺伝学的な研究としては、DICER1遺伝子変異が報告されているが、未だ十分な検討はなされていない。近年では長期経過を経たCPAM type1に発症した腺癌にKRAS遺伝子変異の報告がある。また、新生児・乳児に発生する肺腫瘍性病変であるfetal lung interstitial tumorは、CPAM type3と組織像の類似点が指摘されている。さらに同腫瘍とされた病変ALK融合遺伝子の検出が報告され、細胞遺伝学的アプローチによる同腫瘍の本態の解明が期待されており、我々も新生児・乳児肺病変を用いて、検討に着手している。CCSKの診断マーカーのINAの有用性については論文発表準備と、腎腫瘍以外の小児腫瘍多数例を用いてINAの免疫染色による検討の継続を行っている。現時点までに腎外発生CCSK様腫瘍でのINAの陽性所見が確認されている。1.腎腫瘍は小児固形腫瘍のなかでは比較的頻度の高い疾患であり、腎芽腫、腎明細胞肉腫(CCSK)、先天性間葉芽腎腫、ラブドイド腫瘍の4つで90%以上を占め、これらは疾患ごとに悪性度や治療法の選択に大きな違いがあるのにも関わらず、しばしば組織学的に鑑別が容易ではない。

特に診断の手掛かりとなるマーカーが免疫組織学的にも分子生物学的にも乏しいCCSKを標的に研究を行った。我々はプロテオーム解析の手法を用いて、CCSKに特異性の高いマーカーとして、神経細胞に特異性の高い中間径フィラメントの一つ、alpha-internexin (INA)を見出し、他の小児腎腫瘍、および腎腫瘍以外の小児腫瘍多数例(肝腫瘍、骨軟部腫瘍など)の切片を用いてINAの免疫組織学的検討を行った結果、INAのCCSKでの感度・特異性共に高い陽性所見を確認した。さらに今年度はCCSKと類似の組織像を示す腎外発生(軟部)腫瘍にもINAが陽性となることを見出した。CCSKと同軟部腫瘍との細胞遺伝学的背景の検索を加えて、両者が異なる臓器に生じた類似性格の腫瘍であることが推察された。2.先天性嚢胞性腺腫様奇形(CCAM/ CPAM)に代表される先天性嚢胞性肺疾患は小児科領域では少なからず経験される。近年その疾患概念が提唱された新生児・乳児に発生する肺腫瘍性病変であるfetal lung interstitial tumor (FLIT)は、CCAM/CPAM type3と組織像の類似点が指摘され、さらに同腫瘍とされた病変にALK融合遺伝子の検出が報告された。今年度我々は、FLIT類似の組織像を示す新生児・乳児肺病変を用いて、ALK融合遺伝子の検討を行い、同病変が小児肺病変としては比較的頻度の高い炎症性筋線維芽細胞性腫瘍の乳児期にみられる特殊な1亜型であると結論づけて論文発表を行った。CCSKの診断マーカーのINAの有用性については論文発表準備を行っている。さらに腎外発生CCSK様腫瘍でのINAの陽性所見を確認し、細胞遺伝学的背景の検索を加えて論文作成中である。小児固形腫瘍の高精度マーカーの同定を行い、迅速・正確な病理診断に実用化する目的で、腎腫瘍と肺腫瘍を対象に研究を行った。腎腫瘍では、腎明細胞肉腫のマーカーの候補としてalpha-internexinの検討を他の小児腎腫瘍および腎外腫瘍の多数例を用いて行い、感度・特異性ともに高いことを示した。また、近年同腫瘍で検出された遺伝子異常であるBCOR-ITDをホルマリン固定パラフィン包埋検体から安定的に検出することに成功した。さらに、近年報告された小児腎腫瘍の1つであるanaplastic sarcoma of the kidneyの検討で、同腫瘍がDICER1遺伝子の異常を背景に発症する家族性腫瘍の1つであることの根拠を示しえた。肺腫瘍では新生児・乳児の肺腫瘍性病変であるfetal lung interstitial tumorと診断されていた一部で特異的なALK関連融合遺伝子を検出して、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍の乳児期発症の1亜型を同定した。また新生児・乳児肺病変の組織像とALK融合遺伝子の検出の検討を進める。腎腫瘍についてはINAの類縁分子であるneurofilament proteinや他の神経系マーカーのCCSKでの発現を検討する。本課題は採択決定が10月であり、研究の開始が同時期となり、申請時に初年度に予定していた研究の一部の着手にとどまったため。本課題は採択決定が10月であり、研究の着手が初年度後半となった。そのため申請時に予定していた研究予定の一部が先送りとなったため。
移民ムスリム社会におけるイスラーム政治思想・運動の発展動態をめぐる資料収集

本研究の主要な成果は、少数派イスラーム教徒の知識人が欧米社会において言論活動を行う雑誌・新聞・単行書といった書籍資料、電子媒体による映像資料を包括的に収集したことである。また、在米ムスリム団体とそれに関与する主要ムスリム知識人とのネットワーキングを進めたことが、口頭・非公式の資料収集のための重要な成果であった。それらの収集資料上に現れたイスラーム政治思想、特に自由主義を原則とする西欧諸社会に対する思想的な挑戦をめぐっては、分析の成果を『イスラーム世界の論じ方』(平成20年11月)、『中東危機の震源を読む』(平成21年9月)として刊行している。研究初年度である平成20年度は、西欧と米国におけるイスラーム教徒の思想動向を表す文献資料の収集に専念した。特に、英国、スペイン等のモスク、宗教文化センター、ムスリム・コミュニティ・センターを中心に流通するコミュニティ新聞や、頒布されるパンフレット、DVDの収集が進んだ。また、これまで移民ムスリム研究でそれほど注目されていなかったスイスにおけるイスラーム教徒移民の統合をめぐる問題を扱った有用度の高い会議報告書を入手したことは、現地調査の一つの成果であった。西欧イスラーム教徒の、西洋近代自由主義に対する思想的な挑戦をめぐる分析の成果を、『イスラーム世界の論じ方』に収録して刊行した(平成20年11月)。収集した資料の分析の一つの課題となったのが、米国オバマ大統領がイスラーム教徒の血を引き、イスラーム法学上はイスラーム教徒である点をめぐって議論が提起されていたことである。米国と中東の双方のメディア上で行われた議論を分析した結果、少数派イスラーム教徒がイスラーム法学上もたらす潜在的な政治的対立と、米・欧の社会規範上、イスラーム教徒が政治指導者になることに関する拒否感情とその論拠づけを明らかにすることができた。また、フィリピン、中国にも視野を広げ、少数派の立場にあるイスラーム教徒にまつわる各国・国際政治上の問題と紛争を分析し、本研究計画の初期段階の成果とした。平成21年度は、前年度に引き続き、イスラーム教徒が少数派として存在し、異なる規範・原則が支配的である地域を研究対象に、居住する国の多数派・支配的価値規範との関係において強いられる、イスラーム思想の問い直しと再編成の過程を示す資料の収集と分析を行った。また、これと中東諸国での思想展開との相互の影響関係を調査し、イスラーム政治思想のグローバルな公共圏における発展の動態を観察した。本研究では、イスラーム政治思想史の現代的発展の研究を、いわゆるイスラーム諸国に限定せず、欧米諸国への移民を含めて行い、諸国民国家を横断するイスラーム教徒のグローバルな言説空間における思想発展を調査の対象とした。それによって、第一に、移民社会とホスト社会の間の思想的相互関係を解明し、自由主義・民主主義といった欧米諸国での支配的な価値規範との相互作用を迫られる環境でなされるイスラーム政治思想の変化を特定した。第二に、移民社会に端を発する思想変化が、アラブ諸国や中東地域、そしてイスラーム諸国全体を含むグローバルな言説空間でのイスラーム政治思想の発展に与える影響の解明を進めた。欧州および米国のムスリム移民社会における宗教思想の変動を調査し、資料を収集した。米国ではウッドローウィルソン・センターから招聘を受け、3ヶ月間にわたる滞在調査を行い、ワシントンにおけるムスリム系米国人のロビー団体への聞き取り調査を進めた。エジプトとアラブ首長国連邦を主な調査対象とし、アフラーム政治戦略研究センターの宗教政策研究者への聞き取りや、メディアにおける宗教言説の収集、宗教書の収集を進めた。成果は著書『中東・危機の震源を読む』、論文「政治的イスラームのガバナンス」、論文「オバマ政権初年度の中東政策」(『国際問題』)で発表する共に、ウッドロー・ウィルソン・センターでのコロキアムおよび招待講演(平成21年12月7日)で発表した。また、平成22年度にずれ込んだが、ワシントンのムスリム系アメリカ人の研究者および対ムスリム少数派政策担当者が中心になった学会「イスラーム民主主義研究協会(CSID)」の年次大会(平成22年年4月28日)にて招待講演を行った。
イソニトリル代謝酵素群の分子機能解析

イソニトリル代謝群の中で、(他の酵素に関しては継続して研究を進めているが)現在、特にArthrobacter pascens F164株のイソニトリルヒドラターゼに関して得られている成果について以下に記載する。N-置換ホルムアミドをアミンとギ酸に分解する新規酵素N-置換ホルムアミドデポルミラーゼを有するF164株からイソニトリルヒドラターゼを精製し、物理化学的・酵素科学的諸性質を検討するとともに、これまで唯一の報告例であるPseudomonas putida N19-2株のイソニトリルヒドラターゼと比較した。精製したF164株イソニトリルヒドラターゼは、SDS-PAGE上でのサブユニット分子量がN19-2株イソニトリルヒドラターゼとは異なり、約13kDa大きい値を示した。F164株イソニトリルヒドラターゼは活性や基質特異性などにおいて、N19-2株イソニトリルヒドラターゼと異なることを確認した。さらに、F164株イソニトリルヒドラターゼのCDスペクトルを測定した結果、N19-2株イソニトリルヒドラターゼとは異なるスペクトルを示した。そこで両株由来の抗イソニトリルヒドラターゼポリクローナル抗体をそれぞれ作成し、Western解析により、同じイソニトリルヒドラターゼ由来の抗体とは交差性を示すが、異なるイソニトリルヒドラターゼ由来の抗体との交差性が全くなく、両酵素の構造が異なることが示唆された。本酵素遺伝子のクローニングの結果、本酵素遺伝子はアミノ酸レベルで全く相同性を示さなかった。これらの結果より、F164株N19-2株イソニトリルヒドラターゼとはN19-2株イソニトリルヒドラターゼとは同じ反応を触媒するものの、全く異なる構造を有した新規な酵素と同定した。
β切断へのシフトとアミロイドβ蛋白産生機構に関する生化学的分子生物学的研究

アルツハイマー病(AD)脳には、アミロイドβ蛋白(Aβ)産生経路においてアミロイド前駆体蛋白(APP)からβ、γ切断酵素によって切り出されるAβが凝集・沈着して主要な病変が形成される。一方、Aβ非産生経路においては、Aβの中間でα切断酵素によって分解処理をうけるためAβは産生されない。従って、α切断からβ切断へのシフトがADの病理過程ならびに治療戦略を考えるうえで重要である。本研究では、近年、同定されたβ切断酵素とAβの産生について以下の検討を行った。1.クロロキン添加筋細胞培養系においては、Aβが産生されAβは凝集・沈着する実験系を我々は既に確立した。この実験系においてAβ産生が増加する際に、β切断酵素の発現と蛋白量をそれぞれ定量して検討した。クロロキン添加によって、Aβの産生は増加することがウエスタンブロティングによって観察された。β切断酵素の発現はmRNAでみると、発現はup-regulationされていることが示唆された。樹立した抗体を用いてウエスタンブロティングによって蛋白量を観察すると、同様に増加することが観察された。クロロキン添加培養筋細胞系ではβ切断酵素がAβの産生に実際に関与していると考えられる。γ切断酵素の候補であるPS-1の動態については現在検討中である。2.この実験系においてantisense法によってβ切断酵素の発現を抑制した際に、Aβ産生がどのような動態を示すかを検討した。クロロキン添加と同時にβ切断酵素のantisense DNAを培養液に添加すると、非添加時に比較してAβ産生は抑制されることが示唆された。クロロキン培養筋細胞系で見いだされたβ切断酵素に関する知見は、極めて重要な知見である。クロロキン培養筋細胞系で示唆されたこの知見が、変異型APP遺伝子を強制発現させるAβ産生実験系においても見いだされるか、どうかについて検討を加えている。アルツハイマー病(AD)脳には、アミロイド前駆体蛋白(APP)から分解処理を受けてアミロイドβ蛋白(Aβ)が産生され、凝集・沈着する過程が最も重要である。Aβ産生には、α切断からβ切断へのシフトが生じているが、ごく最近になってβ切断酵素が同定されたことから本研究では、以下の検討を行った。1.β切断酵素に関する研究:1)β切断酵素に対する抗体の確立:β切断酵素のクローニングが成功して、予想されるアミノ酸配列(502aa)が明らかになった。そのアミノ酸配列からN末端、中間部分、C末端部分の合成ペプチドを作成して、ウサギに免疫して特異抗体を確立した。この抗体はウエスタンブロットでは50kDa前後のバンドを認識することを確認した。2)β切断酵素のmRNAの測定の試み:β切断酵素遺伝子の塩基配列(2526bp)から、primerを合成してRT-PCRを行いmRNAの測定を試みている。これまで試行錯誤を繰り返して、ようやく定量できるようになった。2.家族性ADの原因遺伝子である変異型APP遺伝子(Sweden型、British型)を培養細胞に導入:強制発現させた場合、ならびに散発性ADのモデルとなりうる新しいin vitroの実験系での、β切断へのシフトが引き起こされる機構について、免疫病理学的、生化学的、分子生物学的検討を加えて検討中である。Aβ産生には、α切断からβ切断へのシフトが想定される。最近、β切断酵素が同定されたことから本研究では、以下の検討を行った。

I.遺伝子導入筋細胞におけるβ切断酵素とAβ産生に関する検討:1)β切断酵素、APP遺伝子のmRNAをRT-PCR法によって定量した。遺伝子導入前の培養細胞と比較すると、APP遺伝子の発現量は増加を示していた。β切断酵素についてもmRNAの発現量には増加傾向が認められたが、測定手技を安定させるべく方法を検討している。2)Aβ量ならびにAβ分子種(Aβ42、Aβ40)をELISA、Western blotによって定量を試みている。感度の点で十分ではないが、Aβの量が増加傾向を示し、また分子種ではAβ42が増加している傾向が認められた。重要な知見と考えられるので確認中である。3)β切断酵素、APP蛋白、Aβ、ならびにPS1蛋白の細胞内局在を免疫病理学的に検討を加えた。抗β切断酵素抗体は予想されるアミノ酸配列(502aa)からN末端、中間部分、C末端部分に特異的な抗体を樹立した。それぞれ特有の局在が認められた。4)β切断酵素、APPからAβ生成に至る細胞内処理過程の生化学的検討:a)β切断酵素の定量c)ウエスタン・ブロット法による細胞画分におけるAPP断片については検討中である。II.β切断酵素遺伝子ノックアウト培養筋細胞の樹立:ジーンターゲティングにより培養細胞のβ切断酵素遺伝子ノックアウトすることを試みている。細胞の選択が極めて困難であり、mRNA量を測定して確認すると、発現がみられるため方法論的検討を行っている。アルツハイマー病(AD)脳には、アミロイドβ蛋白(Aβ)産生経路においてアミロイド前駆体蛋白(APP)からβ、γ切断酵素によって切り出されるAβが凝集・沈着して主要な病変が形成される。一方、Aβ非産生経路においては、Aβの中間でα切断酵素によって分解処理をうけるためAβは産生されない。従って、α切断からβ切断へのシフトがADの病理過程ならびに治療戦略を考えるうえで重要である。本研究では、近年、同定されたβ切断酵素とAβの産生について以下の検討を行った。1.クロロキン添加筋細胞培養系においては、Aβが産生されAβは凝集・沈着する実験系を我々は既に確立した。この実験系においてAβ産生が増加する際に、β切断酵素の発現と蛋白量をそれぞれ定量して検討した。クロロキン添加によって、Aβの産生は増加することがウエスタンブロティングによって観察された。β切断酵素の発現はmRNAでみると、発現はup-regulationされていることが示唆された。樹立した抗体を用いてウエスタンブロティングによって蛋白量を観察すると、同様に増加することが観察された。クロロキン添加培養筋細胞系ではβ切断酵素がAβの産生に実際に関与していると考えられる。γ切断酵素の候補であるPS-1の動態については現在検討中である。2.この実験系においてantisense法によってβ切断酵素の発現を抑制した際に、Aβ産生がどのような動態を示すかを検討した。