hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高精細ステレオ三次元測定システムによるオンマシン３Ｄ砥石性状解析

本研究では,ステレオ法による砥石作業面トポグラフィの3次元計測が可能であり,かつ研削加工機から砥石を脱着させることなくオンマシンで計測できるシステムを開発した.本システムにより得られた試料の3次元形状をレーザ顕微鏡のものと比較して,水平方向に-3.7%,垂直方向に+0.8%の精度で計測できていることを確認した.また,研削加工における砥石作業面トポグラフィの追跡観察を行い,加工による砥粒切れ刃の挙動を3次元データによって確認した.さらに,砥粒切れ刃の形状や分布の定量的な解析を行った.ステレオ立体視法による研削砥石表面性情の3次元測定システムの開発を目指し,システムのハードウェア構築とプログラムの開発を行った.特に平成25年度では,前年度構築したシステムの改良および画像処理プログラムの開発を行った.システムのハードウェア構築では,前年度に構築した,現有の研削加工機上で研削砥石を取り外すことなく砥石表面の撮像を行える,機上撮像装置の改良を行った.CCDカメラ1台による撮像システムを再構築し,新たな撮像法に対応したCCDカメラやレンズの治具を製作した.また,ステレオ視法におけるマッチングの改良のため,アルゴリズムの改善を行い,実際にシステムを用いて撮像した画像により3次元計測を行った.前年度から継続して,スレテオ視法による3次元計測アルゴリズムの開発のため,まず特徴点抽出アルゴリズム改善に向けたウェーブレット変換の開発を行った.ステレオ視法では,2枚の画像間において同一箇所の対応を求める必要があり,その注目点として輪郭などのエッジ上の点を特徴点として利用する.その特徴点を抽出するアルゴリズムの一つとして,ウェーブレット変換を利用してきた.2次元画像に対するエッジ抽出のために,2次元のフィルタを用いた面領域ウェーブレット変換のアルゴリズム開発を行ってきた.さらに処理速度の向上のためのアルゴリズム開発を行い,前年度よりも早い処理のアルゴリズムを開発した.本研究では,ステレオ法による砥石作業面トポグラフィの3次元計測が可能であり,かつ研削加工機から砥石を脱着させることなくオンマシンで計測できるシステムを開発した.本システムにより得られた試料の3次元形状をレーザ顕微鏡のものと比較して,水平方向に-3.7%,垂直方向に+0.8%の精度で計測できていることを確認した.また,研削加工における砥石作業面トポグラフィの追跡観察を行い,加工による砥粒切れ刃の挙動を3次元データによって確認した.さらに,砥粒切れ刃の形状や分布の定量的な解析を行った.ステレオ立体視法による研削砥石表面性情の3次元測定システムの開発を目指し,システムのハードウェア構築とプログラムの開発を行った.特に平成24年度では,静止画像に対するシステム構築を行った.システムのハードウェア構築では,現有の研削加工機およびCCDカメラから簡易なステレオ撮像システムを構築し,3次元計測を行った.現有の研削加工機上で研削砥石を取り外すことなく砥石表面の撮像を行えるように,CCDカメラやレンズの治具を設計製作した.治具を利用したCCDカメラ1台による撮像システムを構築し,実際にシステムを用いて撮像した画像により,これまでのアルゴリズムを用いて3次元計測を行った.スレテオ視法による3次元計測アルゴリズムの開発のため,まず特徴点抽出アルゴリズム改善に向けたウェーブレット変換の開発を行った.ステレオ視法では,2枚の画像間において同一箇所の対応を求める必要があり,その注目点として輪郭などのエッジ上の点を特徴点として利用する.その特徴点を抽出するアルゴリズムの一つとして,これまでに研究してきたウェーブレット変換を利用した,エッジ抽出アルゴリズムの開発を行った.ウェーブレット変換では,エッジの強度および位置を抽出することが可能なため,特徴点として特に目立つエッジを抽出することを考えて,ウェーブレット変換を利用する.ウェーブレット変換を用いた2次元画像のエッジ抽出のためにウェーブレット変換の2次元画像への適用アルゴリズムの開発を行い,実際にエッジの検出を行った.ステレオ立体視法による研削砥石表面性情の3次元測定システムの開発を目指し,システムのハードウェア構築とプログラムの開発を行った.特に平成26年度では,前年度構築したシステムの改良および画像処理プログラムの開発を行い,実際に砥石表面のトポグラフィの3次元計測および砥粒パラメータの取得を行った.システムのハードウェア構築では,前年度までに構築した,現有の研削加工機上で研削砥石を取り外すことなく砥石表面の撮像を行える,CCDカメラ1台による撮像システムによる機上撮像装置の改良を行った.カメラ1台での撮像方式の改善を行い,より精度良く撮像できるように光学系の設計製作を行なった.さらに,実際の砥石表面を撮像するために必要なレンズの治具を製作し,機上での連続計測のために機上測定システムの固定用治具の設計製作を行なった.前年度から継続して,スレテオ視法による3次元計測アルゴリズムの開発を行なってきた.計測精度向上のため,撮像画像を全焦点画像を取得するようなアルゴリズムへの変更を行った.また,ウェーブレット変換をステレオマッチング後の異常値除去に利用することで,さらなる計測精度向上を実現した.上記の開発システムを用い,実際に現有のウエハ研削装置上で,研削を行い砥石表面の追跡観察を行った.追跡観察結果を用いて研削性能に及ぼす砥石作業面トポグラフィの影響を評価するため,砥粒パラメータを定義し,砥粒の挙動を解析した.画像処理応用ハードウェアでは,前年度の問題点を解決するための,新たな撮像方法を考案し,機上撮像システムの設計開発を行なった.しかし,研削加工機の工作軸との同調撮像はいまだ作成できておらず,また必要とする砥粒を十分に撮像するシステムが完成していない.ソフトウェアでは,特徴点抽出のためのウェーブレット変換を用いたアルゴリズムを開発してきた.

しかし,マッチングアルゴリズムに問題点があり,その問題点の解決に取り組んでいる状況である.以上の進捗状況より,達成度を判断した.ハードウェアの点では,研削加工機上でのステレオ視法による3次元計測システムの構築を行い,機上での3次元計測システムの問題点を明らかにした.また,ソフトウェアの点では,特徴点抽出アルゴリズムへの利用のためにウェーブレット変換を用いたエッジ抽出のアルゴリズムの開発を行った.しかし,ハードウェアではまだ研削加工機との協調および機上での最適な撮像システムが実現できておらず,またソフトウェアではまだ特徴点抽出アルゴリズムへのウェーブレット変換の組み込みができていないため,この達成度と判断した.ハードウェアの開発を続けていく.特に,現在使用している砥石用の砥粒を十分撮像できる,機上ステレオ撮像システムへの改善を行なっていく.前年度までの問題点である,カメラのワーキングディスタンスの問題点を解決するために,新たにレンズを購入する必要がある.また,ソフトウェアの開発では,同じくワーキングディスタンスの問題点を解決するために,面領域ウェーブレット変換を用いたエッジ検出,領域分割のアルゴリズムの開発,またマッチングアルゴリズムの再検討による計測結果の改善をはかる.ハードウェアの開発を続け,まず機上での撮像システムの改善を行う.前年度の問題点を解決するために,必要な解像度・倍率・サイズのCCDカメラやレンズを用いたシステムの構築を行う.ソフトウェアとしては,特徴点抽出のためのアルゴリズム改善を行う.ウェーブレット変換を用いた抽出手法の改善およびその他の手法による特徴点抽出手法の開発を行い,3次元計測および計測結果の評価を市販のレーザ顕微鏡との比較により行う.購入した物品が予定よりも値段が安いものが購入できたため.H26年度において,必要な砥粒を撮影するために改善した撮像システムを構築するため,レンズおよび治具の購入に充てる.機上撮像システム構築のために,前年度の問題点から必要となるスペックのCCDカメラとレンズの購入を行う.また,研削シミュレーションのためのソフトウェアの検討を行い,ソフトウェアを購入する.成果発表のために,国内・国際学会への発表旅費なども使用する.
高強度レーザーと構造性媒質の相互作用による極限輻射プラズマ生成・閉じ込めと応用

本研究は、構造性媒質への高強度レーザー照射によって、高エネルギーイオンの発生および生成した高エネルギー密度プラズマの高い閉じ込めを目的として、平成29年度は以下の研究を推進した。(1)構造性ターゲットの作製(課題4):電子線リソグラフィー技術と化学エッチング技術の併用によって、直径と間隔がミクロンメートルオーダで制御されたシリコン(Si)ロッド群作製の原理実証を行った。特に、ドライエッチング手法による実験において直径がアスペクト比10を超えるロッドターゲットの作製に成功した。(2)極限輻射プラズマの理論と数値モデル(課題2・3):(a)ロッド群からなるターゲットにkTオーダの外部磁場を印加した構造性媒質に高強度レーザーを照射する拡張型粒子コード(EPIC3D)によるシミュレーションを行い、磁場乱流の自己組織化過程と通して磁気渦が生じることを見出し、高エネルギー密度プラズマの閉じ込めは可能であることを示した。一方、高強度外部磁場の印加は困難であることから、年次計画では予定していなかった背景ガス(水素)を導入したシミュレーションを実施した。その結果、ロッド集合体と背景高圧気体の相互作用を通してkTオーダの高強度の自己磁場がロッド周辺およびロッド間に生成するとともに、ベータ値がオーダ1の高エネルギー密度プラズマ生成とその慣性時間を超えての閉じ込めが成立する現象を発見した。(b)高強度外部磁場を印加した単一ロッドに高強度レーザーを照射すると、ロッド中心の反磁性効果の結果、ミラー型の閉じ込め状態が実現することが分かった。周辺領域では、電子は磁化する一方、イオンは磁化しないため、強い径電場が生成され、磁場閉じ込めプラズマのHモードに対応する高い閉じ込め状態が実現することを見出した。慣性時間を越えての高エネルギー密度プラズマの閉じ込めの実現において構造性ターゲットの作製は不可欠の要素であるが、H29年度に、ナノ工学・電気化学分野の共同研究者の協力を得て、ミクロンメートルオーダで形状は位置が制御されたロッド状の構造体を作成することに成功し、予定のスケジュールでこれを実現した。特に、ドライエッチング手法が有効的であることを見出したことは、今後のターゲット実験につながる成果である。一方、レーザー照射によって生成された高エネルギー密度プラズマの慣性時間を越えての閉じ込めを実現する具体的な手法の開拓は本プロジェクトの実現において急務である。当初、これを実現する方法としてkTオーダの外部磁場の印加を考案し、シミュレーションを行い所定の成果を得た。しかし、kTオーダの外部磁場の印加は困難であることから、プラズマ自身が自律的に生成する磁場を利用することが必要であるとの着想に至り、ロッド集合体に背景ガスを導入した物理系を考案した。その結果、背景ガスの効果によってkTオーダの自己磁場の生成とそれによる閉じ込め状態を確認するに至った。H29年度に実施予定であった計画(磁場生成の理論の構築や実験環境化へのシミュレーション)の一部をH30年度に実施することになったが、これらについてもH30年度中に研究が進展し、一定の達成度は確保したと判断している。また、共同研究者が開発した特殊なノズルを使用することにより、ミクロンメートルサイズのクラスターの作製に成功するとともに、それを模擬するシミュレーションを実施するなど、当初計画を概ね達成している。H29年度および一部H30年度に繰り越された成果に基づき、H31年度は、構造性媒質の実験研究に向けた研究を推進する。具体的には、H29年度に原理実証を行ったロッドの集合体を、制御された環境下でサブミクロンメートルサイズに縮小したり、アスペクト比を向上させたりする技術に注力する。特に、H31年度以降に、作製したロッド状の構造性ターゲットと高強度レーザー(QSTのJ-KARENを想定)の相互作用実験を実施するためのターゲットを製作するとともに、実験を想定したシミュレーションを進展させる。また、背景ガスを導入したロッドと高強度レーザーの相互作用シミュレーションに基づく、その素過程を同定・記述する理論研究を進展させる。特に、水素クラスターと高強度レーザーとの相互作用実験において、背景ガスイオンの加速現象や爆風波などの衝撃波の形成が確認されていることから、これらを記述する理論モデルの構築に向けた研究を行う。これらの研究を円滑に進めるには、拡張型粒子コード(EPIC)による実空間が2次元および3次元の大規模シミュレーションが必要になることから、EPICの並列化効率の向上を含むコード開発を進展させる。その結果、ロッド集合体と背景高圧気体の相互作用を通してkT

オーダの高強度の自己磁場がロッド周辺およびロッド間に生成するとともに、ベータ値がオーダ1の高エネルギー密度プラズマ生成とその慣性時間を超えての閉じ込めが成立する現象を発見した。(b)高強度外部磁場を印加した単一ロッドに高強度レーザーを照射すると、ロッド中心の反磁性効果の結果、ミラー型の閉じ込め状態が実現することが分かった。周辺領域では、電子は磁化する一方、イオンは磁化しないため、強い径電場が生成され、磁場閉じ込めプラズマのHモードに対応する高い閉じ込め状態が実現することを見出した。慣性時間を越えての高エネルギー密度プラズマの閉じ込めの実現において構造性ターゲットの作製は不可欠の要素であるが、H29年度に、ナノ工学・電気化学分野の共同研究者の協力を得て、ミクロンメートルオーダで形状は位置が制御されたロッド状の構造体を作成することに成功し、予定のスケジュールでこれを実現した。特に、ドライエッチング手法が有効的であることを見出したことは、今後のターゲット実験につながる成果である。一方、レーザー照射によって生成された高エネルギー密度プラズマの慣性時間を越えての閉じ込めを実現する具体的な手法の開拓は本プロジェクトの実現において急務である。当初、これを実現する方法としてkTオーダの外部磁場の印加を考案し、シミュレーションを行い所定の成果を得た。しかし、kTオーダの外部磁場の印加は困難であることから、プラズマ自身が自律的に生成する磁場を利用することが必要であるとの着想に至り、ロッド集合体に背景ガスを導入した物理系を考案した。その結果、背景ガスの効果によってkTオーダの自己磁場の生成とそれによる閉じ込め状態を確認するに至った。H29年度に実施予定であった計画(磁場生成の理論の構築や実験環境化へのシミュレーション)の一部をH30年度に実施することになったが、これらについてもH30年度中に研究が進展し、一定の達成度は確保したと判断している。また、共同研究者が開発した特殊なノズルを使用することにより、ミクロンメートルサイズのクラスターの作製に成功するとともに、それを模擬するシミュレーションを実施するなど、当初計画を概ね達成している。H29年度および一部H30年度に繰り越された成果に基づき、H31年度は、構造性媒質の実験研究に向けた研究を推進する。具体的には、H29年度に原理実証を行ったロッドの集合体を、制御された環境下でサブミクロンメートルサイズに縮小したり、アスペクト比を向上させたりする技術に注力する。特に、H31年度以降に、作製したロッド状の構造性ターゲットと高強度レーザー(QSTのJ-KARENを想定)の相互作用実験を実施するためのターゲットを製作するとともに、実験を想定したシミュレーションを進展させる。また、背景ガスを導入したロッドと高強度レーザーの相互作用シミュレーションに基づく、その素過程を同定・記述する理論研究を進展させる。
同時代の知的文脈から見たアンリ・フォシヨンの総合的研究

本研究では、フォシヨンの美術史学が、これまで言われてきたような単純な様式史ではなく、同時代の様々な学問的潮流に棹さすものであったことが具体的に検討された。とりわけ、アナール派を中心とする当時の新しい歴史学における時間論、社会学的視点、そして人類学的(民族学的視点)との共同歩調が明らかとなり、それが社会主義知識人としてのフォシヨンの立場とも調和するものであることが明確となった。当該年度は、とりわけアンリ・フォシヨンの美術史方法論と、同時代の新しい傾向を持つ歴史学の流れ、特にマルク・ブロックやリュシアン・フェーヴルに代表される「アナール派」の新しい歴史学方法論との平行関係に注目し、分析を行った。その結果、彼らの間には、特に歴史的時間の把握の仕方について注目すべき共通性力弐認められることが分かった。もともと比較史を母体のひとつとするアナール派の歴史学は、比較対象であるヨーロッパ各国の歴史がそれぞれ異なる独自の時間を持つことを重要な出発点としていた。一方フォシヨンもまた、ヨーロッパ各地の美術の進展、そして美術の内部における技法上の各ジャンルにおいて、異なる速度を持つ歴史的時間制の存在を、自らの美術史学の基礎としている。こうした歴史の複線性は、それまでの一方向的な発展史観的美術史や、中心と周辺の区別とそれに伴う文化的・政治的優越性の主張を含んだ美術史的言説と一線を画す上で重要な論点であり、フォシヨンの反民族主義的立場とも結びつくものであった。しかし一方で、ブロックらがあくまで国家を歴史の単位と考える傾向を持つのに対して、フォシヨンは国家よりも地域を歴史の主体と考える相違もある。このように、同時代歴史学との平行性は単なる偶然や流行ではなく、より本質的な特質をもたらすものであり、同時代の歴史学の革新に沿った歴史家としてのフォシヨンの特質が、具体的に明らかとなったと言える。本年度は、アンリ・フォシヨンの美術史学をささえ、また枠組みとなっている理論的背景をなすさまざまな考えのうち、特に「社会」をめぐるそれについて考察を行った。この時代の人文諸科学は、デュルケーム派の社会学はもちろん、タルドなど他の流派の社会学的思考の豊かな成果に大きく影響され、その思考法を取り込んでいた。その例の一つが歴史学であり、歴史の主人公を個人から社会へと転換し、かつその社会を「国家」と切り離した点に注目すべきである。フォシヨンもまたそうした動向に沿って研究を展開しているため、その美術史研究においても社会という考察対象が重要な意味を持っている。この時代、社会を考察の対象および基盤としたのは、人類学も同様であり、モースにおけるように社会学と人類学を横断して業績を残す例も珍しいとは言えない。こうした例と比較してフォシヨンの視点を再検討すると、その歴史学が一方で聖職者ジェルベールや皇帝オットー3世のように個人の事績に着目する面があると同時に、他方でそうした個人の業績に意味を与える大きな社会的変動に多大な関心をいだいていたことが分かる(『至福千年』)。ミクロ的視点とマクロ的視点のこうした共存は、個人と社会という社会学に影響された同時代の人文科学の多くを捉えていた問題のひとつでもあった。特に人類学は、文化の主体を社会へとシフトする中で、必然的に「作者」のあり方を再考することになるが、同様の問題意識はフォシヨンの中世美術研究にも鋭角的に現れている。このことが、『至福千年』のように歴史の一断面をミクロ的に見る視点と、旧石器文化からゴシック末期までを貫く形象文化の存在を見て取ろうとするマクロ的視点の共存(論文「先史時代と中世」)につながっている。美術史学史の中でフォシヨンをユニークな存在にしているこうした視点の取り方が成り立つにあたって、社会学的思考の貢献は決定的であったと思われる。この点は、さらに同時代の芸術運動との関わりの中でさらに追究していきたい。美学者や芸術理論家、美術批評家ではなく、本質的に歴史家であり人文学者であったアンリ・フォシヨンの美術史学が、同時代の変動しつつある歴史学の趨勢と抜き差しならない関連の下にあったことが今回の研究により具体的に明らかとなった。まずエコール・ノルマルにおいてフォシヨンの師でもあったアンリ・ルモニエは、彼自身歴史学を背景とする美術史家でもあり、フォシヨンの学風の先駆者として位置づけが可能である。このことは、従来ほとんど注目されてこなかった点である。その上で、フォシヨンの歴史学は大きくふたつの点で同時代の歴史方法論とのつながりを持っている。第1に、その歴史的時間論において、単線的に流れる時間の観念が廃棄され、複線的でしかも速度を変えつつゆったりと変動していく時間が採用される。これは、同時代の歴史学とともに、勃興しつつあった人類学や先史考古学の影響を感じさせる側面である。第2に、人物論、人物批評あるいは伝記との親和性が強かった19世紀の歴史学に対して、より大きな次元で歴史を構成する姿勢が取られている。

それがもっとも露わなのは、個々の作品の作者を問題とすることがほとんどない中世美術史研究であり、もともと近代美術史家であったフォシヨンの転回そのものが、この歴史方法論と軌を一にしている可能性が感じられる。ただし、個人を超えた次元で歴史の主体化されるのは、例えば当時の大歴史家ラヴィスの場合と異なり、フォシヨンにおいては国家ではなく社会である。このことは、フォシヨンの広い意味での政治的立場、すなわち反国家主義、反民族主義の反映でもあると考えられる。彼の学問は、その意味で彼の政治的立場と切り離すことができないものでもある。この点もまた、これまでほとんど顧慮されてこなかった側面と言えるだろう。もともと分野別にフォシヨンの思索の理論的背景を探ることとしており、当初の計画に沿って各分野を取り上げているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、理論的考察を学問と芸術の各分野にわたって順次進めていく。
骨髄細胞移植による肝線維化溶解・発癌抑制療法の開発

マウスに四塩素化炭素を週2回4週間投与し肝硬変モデルを作成した。同種同系のGFPマウスの骨髄細胞を尾静脈より投与し、四塩素化炭素をその後も4週間投与し続けた。投与した骨髄細胞は、線維に沿って浸潤し、定着後に増殖を示した。浸潤した骨髄細胞は、がん細胞が転移浸潤するときに産生する、細胞外マトリックスを溶解するMatrix metalloproteinases(MMPs)を産生することが判明した。特にMMP-9の産生は著明ですでに完成した肝線維化を溶解することを、in situ hybridization,免疫染色(蛋白産生を確認)そしてin situ zymographyでproteinaseとしての活性があることを証明することができた。しかも、骨髄細胞投与後も四塩素化炭素を投与し続けており、肝細胞壊死が引き続き起こっているにおもかかわらず、肝線維化を改善させることが明らかになった。また、浸潤してきた骨髄細胞は、肝芽細胞を経てアルブミンを産生する肝細胞へと分化することも同時に明らかになった。すなわち、現在の医療では不可能である、肝再生と繊維溶解を同時にかつ持続炎症下で発生させることが可能になった。また、肝線維化を抑制すると肝発癌が抑制され、線維化を促進すると肝発癌も促進することが明らかになり、骨髄細胞投与による肝線維溶解は、発癌抑制に繋がる事が判明した。この線維溶解作用を持つ骨髄細胞群が、造血系の幹細胞か、間葉系の幹細胞であるかを、造血系の幹細胞を認識するLiv8抗体を用いて、骨髄細胞をそれぞれの分画に分けて、上記の四塩素化炭素実験系をおこなったところ、葉間系幹細胞群に肝線維溶解と肝細胞への分化能力があることが判明した。我々は、自己骨髄細胞を用いた肝臓再生療法の臨床応用を進める基盤モデルとして骨髄細胞から肝細胞への分化評価モデル(GFP/CC14モデル)を開発し、骨髄細胞が持続的肝障害の肝硬変時に肝臓に遊走され肝細胞へ分化・増殖することを明らかにした(JB2003、特公2003-70377)。さらにこのモデルの解析を通じ、骨髄細胞移植により生存率の回復、また肝線維化の改善を発見した(Hepatology 2004,この発見はWiley社よりHepatology News Alert記事として世界に発信された)。さらに骨髄細胞の肝臓への定着、分化を促進する血清因子の解析のため、マウスの血清を用いてプロテオミクス解析を行った。その結果、Apolipoprotein等の発現が血清中に有意に上昇していることが明らかになった。また増殖因子の解析の結果、FGFが増殖因子の中でも特に骨髄細胞の肝臓への定着に関与することが明らかになった。この骨髄細胞の肝臓内浸潤には、MMP-9のほかにMMP-14が重要な役割を演じていることが、今年の研究で明らかになった。浸潤した骨髄細胞は、がん細胞が転移浸潤するときに産生する、細胞外マトリックスを溶解するMatrix metalloproteinases (MMPs)を産生することが判明した。

また、浸潤してきた骨髄細胞は、肝芽細胞を経てアルブミンを産生する肝細胞へと分化することも同時に明らかになった。すなわち、現在の医療では不可能である、肝再生と繊維溶解を同時にかつ持続炎症下で発生させることが可能になった。また、肝線維化を抑制すると肝発癌が抑制され、線維化を促進すると肝発癌も促進することが明らかになり、骨髄細胞投与による肝線維溶解は、発癌抑制に繋がる事が判明した。この線維溶解作用を持つ骨髄細胞群が、造血系の幹細胞か、間葉系の幹細胞であるかを、造血系の幹細胞を認識するLiv8抗体を用いて、骨髄細胞をそれぞれの分画に分けて、上記の四塩素化炭素実験系をおこなったところ、葉間系幹細胞群に肝線維溶解と肝細胞への分化能力があることが判明した。
協奏的な分子認識に伴う自己組織系のミクロ・マクロ特性評価

最終年度であるH30年度は,膜界面におけるミクロ-メソスケールの挙動をマクロで可視化するための方法論の開発について検討した.具体的には,刺激応答性ポリマーであるポリジアセチレン(PDA)膜場の基礎的な知見の収集を行い,コレステロールを修飾したPDAベシクルにおいて高次キラリティが誘導される事を明らかにした.PDAを含有する膜場材料の設計として,TCDA/MOから成るCubosomalゲルについて検討し,高温条件においても安定にゲル構造を維持可能な自己組織化膜材料を開発した(H30年度化学工学会研究奨励賞受賞).並行して脂質膜表層における水和水の挙動解析のための方法論について検討した.ここでは環境応答性蛍光プローブであるLaurdanを用いて,Steady-State蛍光スペクトルより溶媒モデルを構築する新たな解析手法を確立した.さらに,時間分解蛍光スペクトルに基づくLaurdan蛍光解析を発展させ,膜表層の水分子を定量的に解析する方法論を開発した.上述の方法論に基づき,膜界面への核酸分子吸着における協同的な水和挙動について検討し,特に一本鎖RNA分子の相互作用においてはエントロピー駆動が支配的であることを確認した.脂質膜-アミロイドタンパク質の相互作用について,金ナノ粒子を活用する表面増強ラマン解析を行った.負電荷脂質PSを含む脂質修飾金ナノ粒子を調製し,アミロイドβタンパク質の線維化挙動について観察した.粒子自体は負電荷により分散するが,タンパク質を系に共存させる事でラマンスペクトルが増強される事を明らかにした.このとき脂質ータンパク質間における水素結合相互作用を確認し,タンパク質の線維化(βシート構造)に伴い脂質膜への親和性が増大する可能性を明らかにした.H28年度は、主に単分子膜ならびにリポソーム膜を用いて脂質膜ドメインのナノ構造解析を行った.DPPC脂質に脂肪酸(オレイン酸)を添加した際のπ-A等温線ならびに表面力測定解析より、オレイン酸分子が膜の秩序構造を乱し膜内部の疎水場を暴露させる事を明らかにした(BBA-Biomembranes, 1859, 211-217 (2017)).リポソーム膜状におけるナノドメイン形成挙動についても検討を行った.コレステロール(Chol)誘導体(Chol、Erg、Lan)の場合、Cholでは秩序相の形成が見られたが、ErgやLanでは秩序相形成がほとんどみられなかった(Langmuir, 32 (24), 6176-6184 (2016)).さらに、Chol誘導体であるDC-Cholにおいても同様にナノドメインが形成される事を明らかにした.DC-Chol分子は正電荷脂質であるため,膜上のDC-Cholドメインは非ドメイン領域と比較して約6倍の電化密度を有する事を明らかにした(Langmuir, 32, 3630-3636 (2016)).分子認識については,主にリポソームによる核酸(tRNA),アミノ酸の選択的な吸着挙動について検討を行った.核酸(例:tRNA)を認識する膜場設計として,グアニジニウム修飾リポソームを調製し,従来の正電荷リポソームと比べ,約10倍程度の結合乗数を示す事を明らかにした.さらに,リポソームによって認識されたtRNAは,加熱によって工事構造変化を誘導した際に,C-G塩基が選択的に開裂する挙動を示した(J. Phys. Chem. B, 120 (25), 5662-5669 (2016)).アミノ酸認識において,不均一膜の相境界においてL-アミノ酸認識が促進される事を明らかにした(Langmuir, 32 (24), 6011-6019 (2016)).H28年度の目標である,自己組織化膜のミクロ環境に関する特性解析手法は概ね確立できたと考えられる.単分子膜に関して,πーA等温線より分子占有面積,圧縮率を解析する事で脂質分子間相互作用を見積る事ができる.リポソーム膜の場合,蛍光プローブ(TMA-DPH,Prodan,ANS,Laurdan,DPH)を利用して膜深度の異なる領域の特性を多焦点的(Multi-level)に比較する手法を開発した(Langmuir, 32 (24), 6176-6184 (2016)).また,従来のゼータ電位測定では膜のミクロ相分離を反映した電荷密度解析は困難であったが,蛍光プローブHHCにより膜表層の局所的な静電ポテンシャルを解析する手法を開発した(Langmuir, 32, 3630-3636 (2016)).分子認識については,主にリポソームを基盤とする分子認識機構の解明に成功した.アミノ酸や核酸の吸着選択性を向上させる鍵となる要素は,ナノドメインならびに相境界である.従来では,経験的に不均一リポソームが分子認識に応用されてきたが,本研究では界面長という概念を導入し,不均一膜ドメインの周囲界面長を定量的に評価した.結果,L-His認識において,界面長と吸着速度に比例関係がある事を初めて明らかにした.グアニジニウム基による核酸認識において,グアニジニウムリガンドが膜上で秩序相を形成する事を明らかにした.

このとき,室温ではtRNA分子の構造に影響はないものの,高温(60°C)ではドメイン構造が崩壊し,それに伴って認識したtRNA分子の特異的な構造変化を誘導する事がわかった.以上より,膜設計ならびに分子認識への応用という課題は概ね達成できていると考えられる.H29年度は、脂質膜界面における分子の振舞いに着目し、リポソーム膜、金ナノ粒子に担持したリン脂質膜、脂肪酸ベシクル膜を用いて研究を行った。RNA分子認識を目的としてグアニジニウム基を有するリガンド分子(SG、MA)を設計し、膜界面におけるモデルRNA分子の吸着挙動について解析した結果、SGはRNA分子と強く相互作用し高次構造変性を誘導する一方、MAはRNA分子との相互作用が弱く、その理由として膜表層が親水化されていることが原因であることを明らかにした(J. Phys. Chem. B., 2017)。分子間相互作用の解明を目的として、膜表面増強ラマン分光法(Membrane Surface-Enhanced Raman Spectroscopy)による核酸分子ならびにペプチド分子の相互作用を評価した.核酸分子の場合、グアニンあるいはアデニンのN7部位が膜と相互作用し水素結合している可能性が高い(第67回コロイドおよび界面化学討論会、若手講演賞受賞)。またアミロイドβ分子の場合、ホスホセリン(PS)脂質分子のカルボニル基と強く相互作用している事を明らかにした。脂質膜界面での分子認識において、対象分子と膜の双方が水和水を失い、エントロピー駆動により分子が膜表層へと分配されると考えられる。以前より取り組んでいるアミノ酸分子認識について、リン脂質を包埋させたCryo-Gelを作成することで、リン脂質自己集合体を材料に組み込んだ担体を設計した(SERDJ, 2018)。本材料は、従来と同様にL-トリプトファンの吸着を示し、さらにくり返し吸着実験に使用できる。以上より、ミクローメソスケールでデザインされた自己組織化膜を材料に組み込むことで、分子認識可能な担体を設計できると考えられる。H29年度の研究成果により、膜表層の水和挙動が自己組織化や分子認識(広義では自発的な分子の自己組織化)のカギであることを明らかにした。既存の手法では膜界面の水和水を評価するのは困難であるが、本研究では、多角的(Multi-Focal)に膜表層特性を解析しその知見を体系的にまとめることで、膜表層の水和水を実験的アプローチで評価することを重点的に取り組んだ。具体的には、高周波誘電緩和スペクトル解析によるbulk水/水和水の定量的な解析、DPH蛍光消光法による脂質膜厚みの評価、Laurdan/Proda蛍光スペクトルのデコンボリューション解析によるミクロ極性環境の評価である。実験データは概ねそろっているため現在論文執筆中である(3報執筆中)。また、脂肪酸分子の自己組織化を利用した材料設計にも取り組み、オレイン酸/モノオレイン集合体が3次元的なネットワークを形成したCubosome構造についてRaman分光ならびにLaurdan蛍光プローブを用いて膜特性を評価した。マクロ的には集合体はゲルであり、膜界面において分子はゲル相状に密にパッキングされた状態であることを明らかにした(Langmuir 2018)。本手法は、分子認識能を備えた各種の脂質膜を分離担体へとスケールアップさせるために必要不可欠な知見である。最終年度であるH30年度は,膜界面におけるミクロ-メソスケールの挙動をマクロで可視化するための方法論の開発について検討した.
X線ステレオ撮影によるマイクロチャンネル内の混相流の3次元流動計測

微細管内を気体と液体が混じって流れる場合気泡が栓状になって移動するパターンが多いが、化学反応や熱移動が伴う場合には管内を微小な気泡が分散して流れることがある。その流れの状態を詳しく調べるには管内の速度や気泡の流動を3次元的に把握する必要がある。本研究ではそのような流れを計測するために放射光X線を利用して細管内の微小気泡の3次元的な流動を計測する技術を開発して、実際に計測できることを示している。平成22年度に予定していた放射光X線の実験は放射光施設の研究課題として採択されなかったため実施できなかった.平成23年度にはダブルラウエクリスタルを製作して予備実験を実施したが,ラウエクリスタルが正常に作動しなかったため,問題点を修正して再実験を行うことにした.しかし,実験予定日の数日前に放射光施設にトラブルが発生して,実験を行うことができなかった.上述のように放射光X線を利用した実験は実施できなかったので,レーザを用いたステレオインラインホログラフィ法でマイクロチューブ内の流れを計測した.マイクロチャンネルに気液二相流を導入することが簡単ではないことが判ったため,マイクロバブル発生法や気液二相流のマイクロチャンネルへの導入法を検討した.平成23年度の研究は順調には進まなかった。本研究で使用する重要な実験装置であるダブルラウエクリスタル(以下DLC)の製作会社が八戸にあり、地震の影響で製作が遅れた。DLCは初年度(平成22年)に発注する予定だったが、それを使用して行う放射光研究施設での実験課題が採択されなかったため、発注できなかった。そのため平成23年度予算を繰越さざるをえなくなった。平成23年度の前半の課題申請(11A)も採択されなかったため、7月にビームライン担当者のビームタイム(実験時間)を一部利用させていただく形で単相流の予備実験を行い、ステレオ撮影ができることを確認した。ただ、DLCに問題があって、像が二重になる現象が現れて、それ解決することが課題となった。年度後半に実験を行うために11Bに課題申請して、12月初頭に3シフト(24時間)の実験時間が許可された。しかしながら、実験日程の直前に(12月末)ビームラインにトラブルが発生したため、11Bの実験を実施できなかった。やむをえず、23年度の研究予算の翌年度繰越しを申請して認められた。さらに実験の課題申請が採択されても、本研究の最終年度の平成24年度に行うことになった。細管内をマイクロバブルが分散した流れを生成法について検討した。管内に直接微小気泡が発生させる方法は気泡が管璧に付着するため使えなかった。マイクロバブルを外部で発生させ、それを管内に導入する方法を利用した。マイクロバブルを発生させるには気泡発生ノズルが用いられることが多いが、この方法では気泡の寸法のばらつきが大きいので、より均一なマイクロバブルが発生する加圧溶解法を利用した。加圧溶解法で気泡を高濃度に発生させることと、発生した気泡混り液を細管に導入する方法は翌年度に開発する。放射光研究施設への課題申請は12A(年度前半)と12B(年度後半)の2回採択され、4月と11月に実施できた。DLCの問題点は上流側でビームを一度全反射させることで解決できた。4月の実験では、a)撮影に使用するビデオカメラの問題とb)実験台上での機器配置の問題で十分に実験できなかった。最新鋭高性能のビデオカメラをフォトロンから借用して持ち込んだが、実験に使えないことが判って、急きょ放射光施設のビデオカメラを借用して問題は回避できた。もう一件はマイクロバブル発生装置を実験台に乗せたために発生した。精密な防振装置である実験台にマイクロバブル発生装置を置いたために光学的調整がずれてしまって、ステレオ撮影不能になった。深夜に発生したこのトラブルで、やむなく実験を中止した。12Bは優先課題(施設使用を払う)として採択され、11月上旬に3シフトの実験を実施した。マイクロバブル発生装置は防振台から切り離して丈夫な台を設けてその上に設置した。細管中への高濃度のマイクロバブルを導入できたが、気泡分布を均一にするのは困難であった。高濃度に導入したマイクロバブルの運動をステレオ撮影できたが、カメラの感度不足(または、ビーム強度の不足)のため低速流の場合しか撮影できなかった。気泡以外の固体分散相(たとえば、短い炭素繊維、中空ガラス球、球状シラス粉末)を混入した場合も撮影した。炭素繊維はX線がよく透過するため画像は不明瞭だった。シラス粉末は砕けて多数の破片が混入した、中空ガラス球は液との微妙な比重差で管内分布が偏ってしまった。最終年度の11月に実験を実施できた。数パターンの流れを撮影できた。速度分布計測のためにはもっとデータがほしいところだが、本研究の方法で細管内を微粒子やマイクロバブルが分散して流れる混相流を計測できることは示せた。

遅れの理由は単純ではないが、いくつか挙げることができる。a)放射光施設の利用申請が採択されなかったため、実験開始の年度が後ろにずれたこと、b)実験計画が遅れたため、主要な学生が卒業して抜けたこと、c)製作に特殊な技術を要するDLCを作る会社が地震被害に会ったこと、d)年度の後半に採択された実験時期にビームライントラブルで、実験できなくなったことなど。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の実験実施のための課題申請は新しく設けられた優先課題枠で申請して、実験費用を支払ってでも実施する。DLCの問題の解決、気泡分散流の細管への導入問題の解決、混相流の試写実験を早急に実施する。
ウラン濃集タンパク質の効率的な新規探索法の開発

ウランを特異的に集めるタンパク質を効率的に特定する新規の手法を開発した。この方法は、サイズ排除カラムを利用した液体クロマトグラフィーと質量分析器を組み合わせた検出系を利用している。実際に、この方法を利用して、酵母タンパク質からウランを集めるタンパク質特定を試みたところ、46キロダルトン程度の大きさのタンパク質がウランを集めることを明らかにした。そして、そのタンパク質は硫黄を含むアミノ酸(メチオニンとシステイン)を構成要素としないことが示唆された。本研究は、ウランを濃集するタンパク質を特定・同定する効率的な新規手法を開発し、タンパク質探索に費やす時間と労力を大幅に短縮するものである。そして、タンパク質を用いた使用済核燃料や放射性廃棄物、さらに環境中からのウラン回収方法の確立を目指すとともに、核燃料サイクル実現に貢献することを目標としている。平成21年度は、(1)微生物の培養条件確認、(2)微生物からのタンパク質の抽出条件確立、(3)ゲル二次元電気泳動の条件確立、(4)ウェスタンブロッティングの条件確立、(5)タンパク質とウランの接触ならびに放射能測定の条件確立に取り組む予定であった。(1)については、使用する微生物を出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeのBY4743株と決めて、この酵母を利用して培養条件を検討した。培養条件としては、成分を変えた数種類の培地を調製し、酵母の最適培養温度30度で培養した。その結果、このBY4743酵母培養にはYPD培地が最適あることを確認した。しかし、YPD培地はウランを沈殿させる成分が含まれており、その対策としてYNB培地での培養を試みた。YNB培地ではBY4743酵母の生育があまり良くないので、カザミノ酸を加えることで生育度を上げることに成功した。(2)については、ガラスビーズの粒径、ガラスビーズとの混合割合、破砕機での破砕回数などを試験して抽出条件を最適化した。(3)については、使用する電気泳動用ゲルの種類、泳動時間、マーカータンパク質の条件を検討して最適化を図った。平成22年度も引き続き試験を行う。(4)と(5)の課題については、文献や必要試薬の調査を行い、平成22年度以降の本格試験に備えた。以上の成果を出し、平成21年度は研究実施計画通りに研究を遂行した。平成22年度は、(1)微生物からのタンパク質の抽出条件確立、(2)ゲル二次元電気泳動の条件確立、(3)ウェスタンブロッティングの条件確立、(4)タンパク質とウランの接触ならびに放射能測定の条件確立、(5)タンパク質の同定に取り組む予定であった。(1)については、平成21年度からの試験を継続した結果、バイオラッド社製「ReadyPrep Sequential Extraction Kit」(カタログNo.163-2100)を使用した場合に最大のタンパク質を抽出出来ることを確認した。また、クマシーブリリアントブルー染色の場合、銀染色に比べて4倍量の微生物菌を利用することでタンパク質の検出が可能であることを確認し最終的な最適化を完了した。(2)についても平成21年度からの試験を継続した結果、一次元目と二次元目の電気泳動の条件最適化をほぼ終え、平成23年度前半に最終的な最適化を完了する。(3)については、バンド状態のタンパク質転写を試験し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写させることに成功した。平成23年度前半に、ゲルに点状に存在するタンパク質をニトロセルロース膜に転写する試験を実施し、最終的な最適条件の確立を行う。(4)と(5)の課題については、文献や必要試薬の調査を行い、放射能測定の条件確立などの一部予備試験を開始した。当初計画通り、平成23年度に最終目標を達成出来る見込みである。以上の成果を出し、平成22年度は研究実施計画通りに研究を遂行した。そして、タンパク質を用いた使用済核燃料や放射性廃棄物、さらに環境中からのウラン回収方法の確立を目標としている。平成23年度は、(1)ゲル二次元電気泳動の条件確立、(2)ウエスタンブロッティングの条件確立、(3)タンパク質とウランの接触ならびに放射能測定の条件確立、(4)タンパク質の同定に取り組む予定であった。(1)については、SDS-PAGE法とNative-PAGE法という二種類の電気泳動法について条件設定を行い、タンパク質を分離する条件を確立した。(2)のウェスタンブロッティングはタンパク質をゲルからPVDF膜に転写する操作のことである。

転写されずにゲルに残ったタンパク質の銀染色法による観察、PVDF膜に転写したタンパク質の金コロイド染色法による観察からタンパク質の転写を確認し、ウェスタンブロッティシグの条件を確立した。(3)と(4)について、まず酵母がウランを濃集すること、酵母のタンパク質がウランを濃集することを確認した。タンパク質とウランの接触条件、放射能の測定条件も設定した。しかし、ゲルで分離出来るタンパク質の絶対量が少なすぎたため、タンパク質が濃集するウランの放射能は検出限界以下であった。そこで、サイズ排除カラムを利用した液体クロマトグラフィーと質量分析器を組み合わせた検出系を利用することでタンパク質に濃集するウランの測定を試みた。その結果、46キロダルトン程度の大きさのタンパク質がウランを濃集することを明らかにした。また、硫黄が検出されなかったことから、当該タンパク質は含硫アミノ酸(メチオニンとシステイン)を構成要素としないことが示唆された。以上の成果を出し、平成23年度はほぼ研究実施計画通りの成果が得られた。
各種の病的音声の音響的特徴と声帯振動異常パタンとの対応ち関する研究

本年度は各種の病的音声を呈する症例のうち、とくに従来のストロボスコピー下の観察が困難であるような例を対象として研究を進めた。研究実施にあたっては従来のモニタ画面上の観察に加えて適切な画面をビデオプリンタを用いて静止画像化し計測することも可能となった。またイメージメモリのサイズを増大させることに成功し、コマ数を毎秒2,500コマとすれば連続6秒間の記録が可能で、過渡的発音の解析もできるようになった。これによって、まず従来解析困難であった痙攣性発声障害症例について検討を進めた。これらの症例では音声の断続的な変化と、その際の音質の変動が特徴的であるが、今回、次のような点が観察された。すなわち発声中、正常音声で一定の音高を保っている部分では、十分な声門閉鎖が規則正しく繰り返されているのに、次の瞬間、声帯振動の1周期おきに声門閉鎖が不完全となり、このため聴覚的に声の高さが急に低くなることが確かめられた。また別の症例では、間欠的な声の停止が観察され、この時声門の閉鎖期の異常な延長が同期して起こっていることが明瞭に示された。このような散発的ないし間欠的な声帯振動の異常と声の同時解析は、従来の観察様式では同定が困難なもので、本研究の成果として有意義なものであると考えられた。また、その他の神経疾患症例で、左右の声帯振動が異なる場合に二重声を呈する例について検討を進めた結果、左右声帯の振動の位相差が振動周期ごとに次第に大きくなり、声門閉鎖が不完全となって音声波の振動が減弱していくことが観察された。これらの例では位相差がある程度大きくなるとそれがリセットされて初期状態に戻ることが特徴的で、この際の様式に3種のパタンがあることが初めて確認された。また声帯振動の位相差に、左右差のほか前後軸上の差もあることが指摘された。
側底模型ペプチドトランスポータの遺伝子クローニングと薬物動態制御における役割解明

小腸上皮細胞の刷子縁膜に発現するペプチドトランスポータ1(PEPT1)は、H^+勾配を駆動力として小分子ペプチドやペプチド類似薬物の輸送を媒介し、生理学的、薬物動態学的に重要な役割を担っている。本研究では、分子機能のコンピュータシミュレーションを活用し、PEPT1の種々輸送特性を規定する詳細な輸送メカニズムの解明を試みた。PEPT1を介した[^3H]glycylsarcosine(Gly-Sar)取り込みはpH5.5に最大値をとるベル型のpHプロファイルを示すのに対し、ceftibuten取り込みはpHの低下と共に増加した。取り込み実験に用いた範囲のpHにおいて、Gly-Sarは91%以上が電気的に中性であるのに対し、ceftibutenはアニオンとして存在することが分かった。さらに、Gly-SarのKm値はpH5.5で最小値を示し、pH5.0で上昇したが、ceftibutenのKm値はpHと共に低下した。これらの結果と文献情報に基づき、H^+はH^+結合部位だけでなく基質認識部位にも結合し、基質結合に影響を及ぼすこと、またその影響は基質のチャージによって異なることが推察された。推測したメカニズムをもとに14状態モデルを導き、PEPT1機能のシミュレータを構築した。その結果、Gly-Sar輸送の濃度依存性やpH依存性、膜電位依存性が再現できることが明らかとなった。さらに、ceftibutenやチャージを有するジペプチドの輸送特性もシミュレート出来たことから、推測した輸送メカニズムの妥当性が示唆された。本研究成果は、PEPT1の機能特性を包括的に表す輸送メカニズムを初めて提唱したものであり、前年度までに構築したGly-Sar経細胞輸送モデルに本PEPT1モデルを組み込むことによって、細胞外pHの変化などの細胞環境の変動にも対応し得る経上皮輸送予測システムへと発展できると考えられる。小腸上皮細胞の側底膜には、刷子縁膜に局在するペプチドトランスポータ(PEPT1)とは機能的に異なるペプチドトランスポータが発現し、PEPT1とともにジ・トリペプチドや様々な薬物の消化管吸収を媒介している。本研究では、側底膜型ペプチドトランスポータの遺伝子クローニングと、薬物動態制御における役割を解明することを目的として、ヒト培養腸上皮細胞Caco-2よりcDNAライブラリーの作製を試みた。さらに、両ペプチドトランスポータを介した基質の経細胞輸送について精査した。Caco-2細胞よりmRNAを精製し、サイズ分画を行った後、卵母細胞発現系用いてグリシルザルコシン(Gly-Sar)の取り込み活性を評価したところ、3つのmRNA画分において顕著な活性が認められた。また、Gly-Sar取り込みのpH依存性、並びに阻害剤感受性の検討から、観察された取り込み活性は、PEPT1及び側底膜型ペプチドトランスポータによる活性の総和であることが判明した。そこで、側底膜型ペプチドトランスポータを最も多く含むと考えられるmRNA画分を選択し、cDNAライブラリーを作製した。現在、ライブラリーのスクリーニングを進めている。Caco-2細胞を介したGly-Sarの経細胞輸送について速度論的解析を行ったところ、頂側膜を介した取り込みクリアランスは排出クリアランスよりも顕著に大きかったが、側底膜を介した両クリアランスは同程度であることが判明した。従って、側底膜型ペプチドトランスポータはPEPT1とは異なり、濃度勾配に従った輸送を示す促進拡散型のトランスポータであると考えられた。さらに、管腔側から細胞内への取り込みクリアランスよりも細胞内から血管側への排出クリアランスの方が小さかったことから、β-ラクタム抗生物質などの消化管吸収においては、側底膜を介した輸送が律速段階になることが示唆された。小腸上皮細胞の側底膜には、刷子縁膜に局在するH^+駆動型ペプチドトランスポータ(PEPT1)とは異なるペプチドトランスポータが発現し、PEPT1とともにジ・トリペプチドやペプチド類似薬物の消化管吸収を媒介している。本研究では、側底膜型ペプチドトランスポータの遺伝子クローニングのための基礎的情報の収集、並びに薬物動態学的役割を解明することを目的として、側底膜型ペプチドトランスポータの排出方向における機能特性を精査した。さらに、Caco-2細胞におけるグリシルザルコシン(Gly-Sar)経細胞輸送のシミュレータ構築を試みた。側底膜型ペプチドトランスポータを介したGly-Sar排出は、取り込み方向と同様に顕著なpH依存性を示さなかった。基質認識特性及び親和性を調べるため、種々条件下でのGly-Sarの経細胞輸送を速度論的に解析し、得られたパラメータを比較解析した。その結果、側底膜型ペプチドトランスポータは取り込み、排出方向ともにPEPT1の基質であるセフチブテンをほとんど認識しなかった。一方、排出方向におけるKm値は取り込み方向よりも大きかった。従って、側底膜型ペプチドトランスポータのpH依存性及び基質認識特性は輸送方向によらず類似しているものの、基質親和性は排出方向の方が低いことが判明した。上記の検討で得られた両ペプチドトランスポータの速度論パラメータを用いて、Caco-2細胞を介したGly-Sar輸送のシミュレータを構築した。任意のGly-Sar濃度に対し、細胞内蓄積量並びに経細胞輸送量の時間変化をシミュレートしたところ、実験値とよく対応していた。従って、本シミュレータはペプチドトランスポータを介したGly-Sar輸送を定量的に再現できるものであり、小腸上皮細胞を介したペプチド類似薬物輸送の予測をin silicoで行うことが可能になると考えられる。

小腸上皮細胞の刷子縁膜に発現するペプチドトランスポータ1(PEPT1)は、H^+勾配を駆動力として小分子ペプチドやペプチド類似薬物の輸送を媒介し、生理学的、薬物動態学的に重要な役割を担っている。本研究では、分子機能のコンピュータシミュレーションを活用し、PEPT1の種々輸送特性を規定する詳細な輸送メカニズムの解明を試みた。PEPT1を介した[^3H]glycylsarcosine(Gly-Sar)取り込みはpH5.5に最大値をとるベル型のpHプロファイルを示すのに対し、ceftibuten取り込みはpHの低下と共に増加した。取り込み実験に用いた範囲のpHにおいて、Gly-Sarは91%以上が電気的に中性であるのに対し、ceftibutenはアニオンとして存在することが分かった。さらに、Gly-SarのKm値はpH5.5で最小値を示し、pH5.0で上昇したが、ceftibutenのKm値はpHと共に低下した。これらの結果と文献情報に基づき、H^+はH^+結合部位だけでなく基質認識部位にも結合し、基質結合に影響を及ぼすこと、またその影響は基質のチャージによって異なることが推察された。推測したメカニズムをもとに14状態モデルを導き、PEPT1機能のシミュレータを構築した。その結果、Gly-Sar輸送の濃度依存性やpH依存性、膜電位依存性が再現できることが明らかとなった。さらに、ceftibutenやチャージを有するジペプチドの輸送特性もシミュレート出来たことから、推測した輸送メカニズムの妥当性が示唆された。本研究成果は、PEPT1の機能特性を包括的に表す輸送メカニズムを初めて提唱したものであり、前年度までに構築したGly-Sar経細胞輸送モデルに本PEPT1モデルを組み込むことによって、細胞外pHの変化などの細胞環境の変動にも対応し得る経上皮輸送予測システムへと発展できると考えられる。