hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属間架橋ヒドロキシル基を利用した新しい水素分子活性化

高周期14属元素であるゲルマニウムと種々の遷移金属がカルコゲンで架橋された錯体の構造や反応性を検討し、ゲルマニウムとルテニウムがスルフィドヒドロキシル基で架橋された錯体が常温常圧の水素と反応すること、またこの反応が可逆であり、水を水素に定量的に変換することができることを見いだした。本反応は典型元素と遷移金属を組み合わせることで初めて実現された、架橋カルコゲンを利用した新しい水素分子活性化反応である。架橋ヒドロキシル基を架橋ヒドロチオ基に変えた錯体についても水素との反応を検討したところ、ルテニウム上に電子供与性の高いトリエチルホスフィンを導入した錯体を用いると水素分子が活性化され、硫化水素の発生をともなってヒドリド架橋錯体へと変換されることがわかった。速度論的検討から、過剰の水素存在下で反応は擬一次であり、その速度定数はヒドロキシ架橋錯体に比べて非常に小さかったが、その逆反応である硫化水素の活性化による水素発生は、水との反応に比べて速かった。架橋ヒドロキシ錯体と架橋ヒドロチオ錯体は、それぞれ水、硫化水素を加えることによって相互変換が可能であったことから、架橋部を水と硫化水素の量によって自在に変化させることにより、水素の消費と合成が制御可能であることがわかった。本反応の応用として、水から水素を触媒的に合成する反応も見いだした。ベンゼン中でトリエチルシランと水の混合物に、スルフィドとヒドロキシル基で架橋された2核ゲルマニウム-ルテニウム錯体を触媒量加えたところ、トリエチルシラノールの生成にともなって、水素の発生が観察された。反応は室温で速やかに進行した。この反応では、トリエチルシランが水素と同様に活性化され、シラノールとして脱離することによって生成する架橋ヒドリド錯体が速やかに水と反応し、水素が生成する機構で進行したものと考えられる。我々は、高周期14族元素であるゲルマニウムと種々の遷移金属がカルコゲン原子で架橋された錯体の構造や反応性を検討し、ゲルマニウムとルテニウムが硫黄原子と酸素原子で架橋された錯体の架橋酸素原子上をプロトン化したカチオン性錯体が常温常圧の水素と速やかに反応することを見いだした。この架橋ヒドロキシル基を有するカチオン性錯体と水素を反応させると、水の脱離とともにゲルマニウム-ルテニウム間に架橋ヒドリドを有するカチオン性錯体が定量的に得られた。架橋ヒドロキシル基を鍵とするこのような水素分子活性化反応はこれまで例がない興味深い反応である。また本反応は可逆であり、得られた架橋ヒドリド錯体に水を加えて加熱すると水素の発生とともに再び架橋ヒドロキシ錯体が生成した。本反応の機構について知見を得る目的で水素、およびその同位体である重水素との反応を行い、速度論的解析を行ったところ、その同位体効果が小さかったことから、本反応の律速段階はゲルマニウム上から水分子が脱離する過程であると考えられる。一方、ルテニウム上に配位しているホスフィン配位子を、より電子供与性の高いトリエチルホスフィンに変えた場合に、反応は著しく加速されたこともこの機構を支持している。また反応溶媒をベンゼンからメタノールに変えた場合にも反応が大きく加速されることがわかった。また、この水素分子活性化反応は触媒量のプロトンを添加するだけでも進行することがわかった。先のゲルマニウムとルテニウムが硫黄原子と酸素原子で架橋された錯体に1モル%量のH(Et_2O)_2BAr^F_4を加えて水素との反応を行ったところ、水素分子が2つのプロトンに変換され、錯体が還元されることも見いだした。
ゴルフスイングにおける全身の力学的エネルギーフロー

本研究では,ゴルフスイング中の力学的エネルギーの流れを,動力学的観点も踏まえて明らかにするとともに,エネルギー発生能力とエネルギー伝達能力という2つの指標を用いてゴルフスイングを評価し,各々の能力に優れたゴルフ選手の力学的特徴を明らかにすることを目的とした.本年度は,エネルギー発生および伝達能力に着目し,各々の能力に秀でた選手の特徴を明らかにするとともに,動力学的な分析も用いて,効果的にクラブにエネルギーを伝達する仕組みについて分析した.ダウンスイング開始時点からインパクトまでの身体ークラブ系の力学的エネルギーの変化(仕事量)をエネルギー発生能力,身体ークラブ系のエネルギー変化に対するクラブのエネルギー変化の割合をエネルギー伝達能力と定義した.競技レベルの高いアマチュアおよびプロゴルフ選手16名のゴルフスイングを分析した結果,エネルギー発生能力とクラブヘッドスピードとの間に強い正の相関関係が認められた.一方,エネルギー伝達能力とクラブヘッドスピードとの間には相関関係は認められなかった.エネルギー発生能力が秀でた選手の特徴として,特に両股関節や肩関節で生成された関節トルクパワーが大きいことが示唆された.これらのことから,ゴルフ選手は股関節で大きなパワーを発揮し,獲得したエネルギーを上肢,クラブに伝えているものと考えられる.さらに,肩関節では,エネルギーを伝達するだけではなく,新たにパワーを発生させ,クラブに大きなエネルギーを伝えているものと考えらえる.また,クラブに作用するパワーの幾何学的成分(関節運動による貢献成分)を分析した結果,クラブにパワーを効果的に作用させるためには,骨盤,胸郭,上肢の角速度ベクトルがクラブのスイングプレーンに対して垂直に向いていること,これらの角速度が連鎖的とよりもむしろ同じタイミングで最大値に達することが有効である可能性が示唆された.本研究では,ゴルフスイング中の全身の力学的エネルギーの流れを,関節間に作用する力の発生要因も加味して明らかにするとともに,ゴルフスイングを,エネルギー発生能力とエネルギー伝達能力という2つの指標を用いて評価し,各々の能力に優れたゴルフ選手の力学的特徴を明らかにすることを目的とした.ゴルフスイングにおいては,体幹部の回旋運動によって大きなエネルギーを獲得し,これを上肢に伝えることが重要である.平成29年度は,体幹部の回旋運動を生成する力学的要因を明らかにするとともに,特に体幹部・上肢におけるエネルギー伝達の特徴について分析・検討を行った.具体的には以下の活動を実施した.(1)競技レベルの高いアマチュアゴルフ選手16名(handicap : 4.2±1.6)のスイング動作を,3次元自動動作分析装置を用いて計測した.また,2台のフォースプラットフォームを用いて,両足の地面反力を計測した.(2)得られたデータから,ゴルフスイング中の体幹部の回旋運動を生成する動力学的要因(下肢各関節トルクや運動依存力等の貢献度)を定量化し,体幹部回旋に寄与する下肢各関節トルクの機能について検討した.その結果,ゴルフスイングにおいて大きなエネルギーを有する体幹部の回旋動作の生成には,右股関節伸展トルクおよび左股関節屈曲・内転トルクが主要因となっていること,その関与の仕方や役割は両股関節で異なる可能性が示唆された.(3)グリップ部に作用するパワーの内訳を,近位部の関節運動の関数として記述することにより,クラブに流れたエネルギーに関与した関節運動について検討した.その結果,骨盤部の回旋運動や近位部の関節運動に起因するパワーの割合が大きく,これらの動作がクラブのエネルギーの生成に大きく関与することなどが示唆された.当初予定していた,競技レベルの高いゴルフ選手の動作計測,動力学的な解析の実施,エネルギーフローの算出について,実施できている.一方,エネルギーの発生能力と伝達能力を測る指標については,現在さまざまな方法を試している段階である.今後は指導の現場においても有用となる評価指標を構築し,選手の技能評価を行う予定である.本研究では,ゴルフスイング中の力学的エネルギーの流れを,動力学的観点も踏まえて明らかにするとともに,エネルギー発生能力とエネルギー伝達能力という2つの指標を用いてゴルフスイングを評価し,各々の能力に優れたゴルフ選手の力学的特徴を明らかにすることを目的とした.本年度は,エネルギー発生および伝達能力に着目し,各々の能力に秀でた選手の特徴を明らかにするとともに,動力学的な分析も用いて,効果的にクラブにエネルギーを伝達する仕組みについて分析した.ダウンスイング開始時点からインパクトまでの身体ークラブ系の力学的エネルギーの変化(仕事量)をエネルギー発生能力,身体ークラブ系のエネルギー変化に対するクラブのエネルギー変化の割合をエネルギー伝達能力と定義した.競技レベルの高いアマチュアおよびプロゴルフ選手16名のゴルフスイングを分析した結果,エネルギー発生能力とクラブヘッドスピードとの間に強い正の相関関係が認められた.一方,エネルギー伝達能力とクラブヘッドスピードとの間には相関関係は認められなかった.エネルギー発生能力が秀でた選手の特徴として,特に両股関節や肩関節で生成された関節トルクパワーが大きいことが示唆された.これらのことから,ゴルフ選手は股関節で大きなパワーを発揮し,獲得したエネルギーを上肢,クラブに伝えているものと考えられる.さらに,肩関節では,エネルギーを伝達するだけではなく,新たにパワーを発生させ,クラブに大きなエネルギーを伝えているものと考えらえる.また,クラブに作用するパワーの幾何学的成分(関節運動による貢献成分)を分析した結果,クラブにパワーを効果的に作用させるためには,骨盤,胸郭,上肢の角速度ベクトルがクラブのスイングプレーンに対して垂直に向いていること,これらの角速度が連鎖的とよりもむしろ同じタイミングで最大値に達することが有効である可能性が示唆された.平成30年度における研究課題は,エネルギー発生能力とエネルギー伝達能力という2つの指標を用いて,個々の選手のゴルフスイングを評価することである.また,各々の能力に秀でた選手の動作や力学的特徴を分析することにより,エネルギー発生能力および伝達能力を高めるための動作要因・力学的要因について検討する.

最後に,これらの能力とクラブヘッドスピードとの関係性について検討する.本年度は,主としてデータの取得と分析を行ったため,学会発表にかかる経費が削減された.また,被験者謝金等にかかる経費も予定より大幅に削減されたことから,次年度使用額が生じた.次年度に繰り越された経費は,海外学会発表や論文発表等の研究の成果発表にかかる経費として使用する予定である.
π計算の圏論的意味論と論理的解釈

並行計算とは、複数のプロセスが相互作用しながら同時に実行される計算である。例えば、ネットワークを介したサーバとクライアントの協働や、複数のコアやプロセッサを持つ計算機でのタスクの実行などが挙げられる。並行計算にはデッドロック・競合状態や命令実行順序の非決定性などの厄介な問題があり、逐次処理に比べて、正しい設計を行うことや正しさの検証が特別難しい。こうした課題へのアプローチとして、本研究では、並行計算の本質的な部分を抽象化した筋の良い計算モデルを与え、これを用いて設計や検証を行うことを狙いとする。本研究の特徴は、道具として圏論的意味論や論理学の研究の蓄積を知見を利用することにある。
超高密度磁気記録用信号処理方式の検討

磁気記録装置の記録密度を向上させるために必要である信号処理方式に関して検討を行った。始めに、コンピュータシミュレーションにより信号処理アルゴリズムについて検討した。磁気ディスクの再生信号を模擬した信号(ローレンツ波形)にノイズを重畳し、その信号をウェーブレソト変換によって解析した。記録密度はk=2以上を仮定し、入力データ系列はランダムなバイナリーデータ系列とし、これにガウス雑音を重畳した。ウェーブレット解析には、メキシカンハットとフレンチハットの2種類のマザーウェーブレットを用いた。マザーウェーブレットとしてフレンチハットを用いた場合、符号間干渉の除去とS/Nの大幅な改善がみられた。次に、このアルゴリズムを集積回路化(LSI化)するためには、離散ウェーブレット変換を用いることとすると入力信号のオーバーサンプリングと並列処理が必要である。そのために精度の高い多相クロックが必要となる。今回、このウェーブレットを利用した磁気ディスク用信号処理LSIの実現性を検討するにあたって、オーバーサンプリングのために重要であるクロック生成回路(PLL回路)を検討し、設計・試作を行った。試作したPLLは、1.2μmCMOSデザインルールで設計し、VDEC(東京大学大規模集積システム設計教育研究センター)を通じ試作した。測定、評価の結果、PLLは電源電圧5Vの時、約300MHzで動作し、消費電力は約30mWであった。今後、このPLLを用いてウェーブレット変換処理を行う信号処理回路の検討を行う予定である。本研究では、磁気ディスク装置の情報記録密度の向上のために、磁気ヘッド再生信号の信号処理技術について検討した。磁気記録では、高密度記録になると符号間干渉が顕著になり再生信号の劣化、すなわち信号振幅の減少やピークシフトが起こり、また、雑音の影響等によりS/Nが低下する。このため、BER(Bit Error Rate)が低下する。この問題を解決するために、現在、PRML等の信号処理技術が検討されている。本研究では、雑音の問題に着目し、そのフィルタリングについてウェーブレット変換で解析を行った。始めにビット列をM系列で発生させ、信号の形をローレンツ波形で近似した信号を生成した。その信号にホワイトノイズを重畳し模擬再生信号を得た。この模擬再生信号をウェーブレット変換で解析を行った。ここでは、記録密度Kをパラメータとした。その結果、メキシカン型アナライジングウェーブレットを用い、再生信号のサンプリング周期を信号に対して十分に短くすると重畳されたノイズをほとんど取り除くことができたこのことは、ウェーブレット変換のアルゴリズムを磁気ディスク装置の信号処理に適用すると、S/Nを改善できることを意味している。また、フィルタリングと同時に波形等価を行うことでPRML方式と同様な特性が得られるものと思われる。ウェーブレット変換は離散信号処理であり、ディジタル信号処理に適している。今後はこのアルゴリズムをLSI化し、実機状態で性能を検討する必要がある。
酪農食品ゲル中の水の挙動に関する研究

チ-ズの製造において、凝乳酵素による牛乳のゲル化(カ-ドの形成)およびクッキングでの水分のコントロ-ルはチ-ズの収量や品質に直接関係することから極めて重要である。本研究はレンネットゲル形成時における水の動きを分子レベルで追究するため核磁気共鳴(NMR)測定法を利用した。結果:超遠心法により牛乳からカゼインミセルを分離し、さらに、人工乳清に再懸濁し、カゼインミセル液を調製した。まず、凝乳酵素レンネットを加えて、ゲルを形成し、低周波型ゲル強度測定装置でゲル形成の条件、ゲルの固さなどについて検討した。一方、^1HーNMRで水のスピンースピン緩和時間T_2を測定することにより、カゼインミセル液とカゼインサブミセル液での緩和速度について検討した。まず、水がカゼインミセル表面にあるサブミセルにだけ結合している、すなわち速い速度で自由な水と交換しうる水がミセル表面にのみ存在すると仮定すると、ミセルの水の結合部位の数はサブミセルの表面積比(10^2)に比例することになり、一方、水がミセルを構成している全てのサブミセルに結合していると仮定すると、ミセルの水の結合部位の数はミセルとサブミセルの質量比(10^2)に比例することになる。実測されたミセル液とサブミセル液の水の緩和時間の比は10の二乗のオ-ダ-であり、ミセルと結合し、しかも、速い速度で自由な水と交換しうる水はミセル全体でなくミセルの表面にあるサブミセルにあると推定される。勿論、カゼインミセルの内部には閉じ込められていて、非常に遅い速度で自由な水と交換している水の存在の可能性もある。さらに、カゼインミセル液のレンネットによるゾル-ゲル転移に伴う水の緩和速度についても検討した。実験の結果、ゲル化に伴う^1Hの緩和時間には変化がなく、カゼインミセル溶液中の水はレンネットによりゲルしても微視的な状態には変化がないと考えられる。
配偶子操作法の家畜繁殖技術への応用に関する基礎的研究

本年度の研究計画に従って研究し以下の成果を得た.1)核操作胚の組織学的検討:適切な核操作の時期と方法を知るために本研究室で確立した方法で成熟培養した牛卵胞内卵子を体外受精または精子頭部注入を行い,侵入精子,注入精子の経時的な変化をホールマウント法および電子顕微鏡(TEM)で検索した.その結果,体外受精卵子の精子頭部注入卵子における両前核形成過程は精子尾部の有無以外全く同じであった.すなわち,両卵子内では核膜の近辺に小胞体ガルジー装置,ミトコンドリアなどすべての細胞内小器官の配列なども全く同じで注入操作以外の差は全く認められず,本注入操作法は極めて再現性のあるものであることが示唆された.2)遠心処理豚初期胚の発生能:前年度マウス胚で行った研究成果をもとに豚胚について検討を行い以下の成果を得た.PMSG+hCG(400IU+200IU)で処理した未経産豚から未受精,受精卵子(前核期ー2細胞期)を採取し, 11000g 15000gで3分間遠心処理を行った.処理卵子の一部は遺伝子注入に技術開発の実験に,他は遠心処理後の発生能試験に用いた.豚卵核胞または前核への注入操作は牛卵子より比較的容易であった.一方,発生能試験では無処理区で1細胞期から96時間の培養で7ー8細胞期まで発生したのに対し,処理区ではgが強い区で発生能が低くかった. 11000gto15000gではそれぞは10細胞期, 6細胞期まで発生したが発生率は低かった.3)操作胚の培養法の検討:操作胚の発生能を改善するために最も培養系の進んでいるマウス胚を用い培養液,培養期間と発生能と割球数を調べた結果,発生の早い時期から培養を開始し,培養時間が長くなればなるほど,割球数が少なくて胚盤胞を形成することや移植後の発生能も同様に悪くなることが明らかになった.本年度は家畜の配偶子を体外で各種顕微操作をするためのモデルとしてマウス,ラット,ウサギ卵子,一部,屠場材料によるウシ、ブタの卵巣内卵子について基礎実験を行ない以下の成果を得た。1)受精卵子の顕微操作法を操作卵子の培養移植法モデルとしてマウス桑実胚および初期胚盤胞を生、または凍結保存したものについて、主として割断法をマイクロマニプレーターを用い検討した。その結果、割断用のナイフとしてガラスナイフより両刃カミソリの先端を毛管ガラスの先に接着したものが優れていること、初期胚が透明帯内で收縮している状態で割断する方が2等分胚や処理後の胚の発生が良いことが明かになった。また、家兎卵子の透明帯のようにある一定の固さがある方が保定さえしっかりすれば割断が容易であることも明かになった。2)胚の融合法と発生能の検討受精卵子の融合法としてレクチンおよび電気的な方法についてマウス、ラットを用いて検討した。その結果、48細胞期の胚ではレクチンによる融合法が良好であり、2細胞期胚ではエレクトロフュージョン法がよく、約7080%割合で融合させ得ることが明かになった。しかし、その後の発生能は約30%と低くエレクトロフュージョン法の最適条件と処理卵子の移植による個体への発生能の検討が必要である。3)屠場材料のウシ,ブタ卵子の体外成熟法ウシ卵胞内卵子をHams【F_(12)】+20%FCS+【E_2】+hCGの培養液で28時間の培養で約80%以上が成熟するが、ブタ卵胞卵子はどの培養液を用いても約2030%しか成熟卵に達しなかった。この事は屠殺後ブタ卵胞内卵子はすみやかに退行するためと考えられるのでこの面の検討が必要である。4)ウシ,ブタ卵子の遠心処理による卵核胞の可視化12000×G3分間の遠心で可視化が可能なことが明かになった。本年度は前年度における成果をふまえ、家畜の配偶子における発生工学的手法の応用の可能性について検討を加えることを目的にして屠場材料によるウシ,ブタの卵巣内卵子を主として用いた実験とマウス,ラット卵子について基礎実験の再検討も行い以下の成果を得た。1)卵子の顕微操作法a)凍結したマウス桑実胚と胚盤胞を用い、両刀カミソリの先端を毛管ガラスの先に接着したものを割断ナイフとして前年度で得られた方式で割断実験を行った。割断した二等分胚の培養後の発生率は前年度と比べ有意に高かったが、移植後の成績が極めて悪く、今後、検討を加える必要がある。b)核操作法:マウスとウシの体外成熟卵子を用い、前核の操作や精子の注入実験を行った。マウス卵子の前核の操作は牛と比べ操作後の損傷が大きく発生率は低かった。一方、ウシ未受精卵子へ精子を注入し、経時的にその変化を調べたところ、注入後、in vivo&vitroでの受精とほぼ同様の経過で雄性前核が形成されることが明らかになったが分割卵子は得られていない。2)遠心処理卵子の体外発生と培養マウス受精卵子(1-4細胞期)を遠心処理し、その後の発生能を調べたところ、胚盤胞への発生率は処理時の発生段階によって著しく異なる。

即ち、未受精と1細胞期の受精卵子では8細胞期までしか発生しない。他方、2、4細胞期で処理した場合、約24-44%が胚盤胞まで発生した。1細胞期で処理した胚の発生率の低下は2-cellブロックを増強したことによるのか検討を要する。本年度はウシ凍結卵子の割断法について材料の入手ができず検討することができなかったが62年度には実現し、家畜胚による操作を行う予定である。本年度の研究計画に従って研究し以下の成果を得た.1)核操作胚の組織学的検討:適切な核操作の時期と方法を知るために本研究室で確立した方法で成熟培養した牛卵胞内卵子を体外受精または精子頭部注入を行い,侵入精子,注入精子の経時的な変化をホールマウント法および電子顕微鏡(TEM)で検索した.その結果,体外受精卵子の精子頭部注入卵子における両前核形成過程は精子尾部の有無以外全く同じであった.すなわち,両卵子内では核膜の近辺に小胞体ガルジー装置,ミトコンドリアなどすべての細胞内小器官の配列なども全く同じで注入操作以外の差は全く認められず,本注入操作法は極めて再現性のあるものであることが示唆された.2)遠心処理豚初期胚の発生能:前年度マウス胚で行った研究成果をもとに豚胚について検討を行い以下の成果を得た.PMSG+hCG(400IU+200IU)で処理した未経産豚から未受精,受精卵子(前核期ー2細胞期)を採取し, 11000g 15000gで3分間遠心処理を行った.処理卵子の一部は遺伝子注入に技術開発の実験に,他は遠心処理後の発生能試験に用いた.豚卵核胞または前核への注入操作は牛卵子より比較的容易であった.一方,発生能試験では無処理区で1細胞期から96時間の培養で7ー8細胞期まで発生したのに対し,処理区ではgが強い区で発生能が低くかった. 11000gto15000gではそれぞは10細胞期, 6細胞期まで発生したが発生率は低かった.3)操作胚の培養法の検討:操作胚の発生能を改善するために最も培養系の進んでいるマウス胚を用い培養液,培養期間と発生能と割球数を調べた結果,発生の早い時期から培養を開始し,培養時間が長くなればなるほど,割球数が少なくて胚盤胞を形成することや移植後の発生能も同様に悪くなることが明らかになった.
群ロボットの作業計画問題における行動学習

本研究では,多数の自律的な移動ロボットが存在する系において,与えられた作業仕様を満たす各ロボットの適切な行動戦略を階層型アーキテクチャにより学習する手法を提案する.本研究では作業目的を郡ロボットの動作に限定し,問題を大きく「移動経路の決定階層」と「経路上での戦略形成階層」の2つに階層化し,それぞれの階層において学習則を付与することで問題の解決を図る.本研究は,1.制御則の提案,2.シミュレーションによる検証,3.一般系への拡張と創発に関する考察,を予定していた.本年度の成果としては,スタート地点からゴール地点へ多数の物体を複数のロボットで繰り返し搬送する作業を題材とし,1-(1).既知環境下での最適(最速)搬送経路選択学習則の提案,1-(2).未知環境下におけるLearned Visibility Graphを用いた搬送経路の生成手法の提案,2-(1).最適搬送経路学習シミュレーションおよび二台の小型ロボットを用いた簡易検証実験,2-(2).搬送経路生成シミュレーションおよび一台の小型ロボットによる簡易実験,3-(1).最適搬送経路学習に基づく創発性の検証,を行なった.1-(1).,2-(1).,3-(1).では,個々のロボットが単位時間あたりに運んだ物体個数から,いくつかの戦略から各々の選択する確率を修正する強化学習を採り入れ,これにより個々のロボット毎に学習しているにも関わらず,全体として最適な搬送形態が創発されていくことを確認した.また,2-(1).ならびに2-(2).では,障害物に遭遇し,経路が左右に分岐してしまう際に,両者にサブゴールをマークしておくことで、常に最短経路を探索しながらほぼ全ての経路候補を生成することが可能となっている.本研究では,多数の自律的な移動ロボットが存在する系において,与えられた作業仕様を満たす各ロボットの適切な行動戦略を階層型アーキテクチャにより学習する手法を提案する.本研究では作業目的を郡ロボットの動作に限定し,問題を大きく「移動経路の決定階層」と「経路上での戦略形成階層」の2つに階層化し,それぞれの階層において学習則を付与することで問題の解決を図る.本研究は,1.制御則の提案,2.シミュレーションによる検証,3.一般系への拡張と創発に関する考察,を予定していた.本年度の成果としては,スタート地点からゴール地点へ多数の物体を複数のロボットで繰り返し搬送する作業を題材とし,1-(1).既知環境下での最適(最速)搬送経路選択学習則の提案,1-(2).未知環境下におけるLearned Visibility Graphを用いた搬送経路の生成手法の提案,2-(1).最適搬送経路学習シミュレーションおよび二台の小型ロボットを用いた簡易検証実験,2-(2).搬送経路生成シミュレーションおよび一台の小型ロボットによる簡易実験,3-(1).最適搬送経路学習に基づく創発性の検証,を行なった.1-(1).,2-(1).,3-(1).では,個々のロボットが単位時間あたりに運んだ物体個数から,いくつかの戦略から各々の選択する確率を修正する強化学習を採り入れ,これにより個々のロボット毎に学習しているにも関わらず,全体として最適な搬送形態が創発されていくことを確認した.また,2-(1).ならびに2-(2).では,障害物に遭遇し,経路が左右に分岐してしまう際に,両者にサブゴールをマークしておくことで、常に最短経路を探索しながらほぼ全ての経路候補を生成することが可能となっている.
甲状腺機能異常症の新たな分子病態の解明

甲状腺刺激ホルモン(TSH)は,甲状腺のTSH受容体に結合し,甲状腺細胞の増殖ならびにホルモンの合成を促進する。甲状腺から分泌されたT4は,生理作用を発揮するためには末梢の組織において生物活性を有するT3に変換される必要がある。T4をT3に変換する甲状腺ホルモン活性化酵素には,1型甲状腺ホルモン脱ヨード酵素(D1)と2型甲状腺ホルモン脱ヨード酵素(D2)が存在する。私達の検討により,D2はヒト骨格筋細胞,ヒト大動脈および冠動脈血管平滑筋細胞,ヒト甲状腺組織に強く発現していることが明らかとなった。本研究において,血小板由来増殖因子(PDGF)によって促進されるヒト冠動脈血管平滑筋細胞の増殖ならびに遊走を甲状腺ホルモンが抑制し,この抑制効果にD2による甲状腺ホルモンの活性化が関与していることを明らかにした。また,D2とTSH受容体がヒト培養骨芽細胞に発現し,TSHによりD2の活性が増加することを報告した。骨代謝における新たな甲状腺ホルモン作用を示唆するものと考えられる。先天性のサイログロブリン遺伝子異常症では甲状腺腫をきたし,甲状腺癌を高率に発症することが知られている。サイログロブリン遺伝子異常症では,血中のT3がT4に比較して高値を示すが,その機序は明らかではなかった。本研究により,サイログロブリン遺伝子異常症の甲状腺組織ではD2の活性が亢進し,血中T3の高値に関与していることが明らかとなった。また,D2の一塩基多型(SNP)はインスリン抵抗性や糖尿病との関連が報告されているが,本研究における理化学研究所との共同研究により,D2のSNPの迅速解析法を確立した。私達は,高TSH血症を認めた症例において,我が国で最初のTSH受容体の遺伝子異常(R450HとG498Sの複合型ヘテロ接合体)を見出し変異TSH受容体の機能の解析に成功したが,本研究におけるTSH不応症例の解析により,V473I,R519CならびにR519Gの新たなTSH受容体遺伝子異常が明らかになった。これらはすべてR450Hとの複合型ヘテロ接合体であり,本邦においてはR450Hの頻度が高いことが示された。変異TSH受容体の機能解析の結果,TSHとの結合能,cAMPならびにIP産生能や細胞膜上への受容体の発現などの障害が認められ,その障害の程度は臨床的なTSH不応症の程度と相関がみられ,TSH受容体の変異がTSH不応症の病態に関連していることが明らかとなった。甲状腺から分泌されたT4は,生理作用を発揮するためには抹消の組織において生物活性を有するT3に変換される必要がある。

私達の検討により,D2はヒト骨格筋細胞やヒト大動脈および冠動脈血管平滑筋細胞,さらにヒト甲状腺組織に強く発現していることが明らかとなった。私達は自己免疫性甲状腺疾患患者におけるD2に対する自己抗体の存在の可能性に着目し,その自己抗体の検出を試みた。高感度のD2活性の測定およびD2の部分ペプチドを用いた検討において,バセドウ病と橋本病などの自己免疫性甲状腺疾患においてD2に対する自己抗体を有する症例の存在が明らかとなった。D2は下垂体にも強く発現しているが,D2に対する抗体は抗下垂体抗体との間に相関がみられたことから,抗下垂体抗体の認識する自己抗原の一部はD2である可能性が示唆された。私達は,本学の小児科学教室との共同研究により,マススクリーニングで高TSH血症を認めた症例において,わが国で最初のTSH受容体の遺伝子異常(R450HとG498Sの複合型ヘテロ接合体)によるTSH不応症の症例を見出しその変異TSH受容体の機能の解析に成功した。今回の研究における更なる本邦のTSH不応症例の解析により,V473I, R519CならびにR519Gなどの全く新たなTSH受容体遺伝子異常の存在が明らかになった。これらはすべてR450Hとの複合型ヘテロ接合体であり,本邦においてはR450Hの変異の頻度が高いことが判明した。これらの新たに発見された変異TSH受容体の機能解析の結果,TSHとの結合能,cAMP産生能,IP産生能や細胞膜上への受容体の発現などの障害が認められ,その障害の程度は臨床的に認められたTSH不応症の程度と相関がみられ,これらのTSH受容体の変異がTSH不応症の病態に関連している可能性が示唆された。甲状腺から分泌されたT4は,生理作用を発揮するためには末梢の組織において生物活性を有するT3に変換される必要がある。T4をT3に変換する甲状腺ホルモン活性化酵素には,1型甲状腺ホルモン脱ヨード酵素(D1)と2型甲状腺ホルモン脱ヨード酵素(D2)が存在する。私達の検討により,D2はヒト骨格筋細胞,ヒト大動脈および冠動脈血管平滑筋細胞,ヒト甲状腺組織に強く発現していることが明らかとなった。本研究において,血小板由来増殖因子(PDGF)によって促進されるヒト冠動脈血管平滑筋細胞の増殖ならびに遊走を甲状腺ホルモンが抑制し,この抑制効果にD2による甲状腺ホルモンの活性化が関与していることを明らかにし,報告した。また,先天性のサイログロブリン遺伝子異常症では甲状腺腫をきたし,甲状腺癌を高率に発症することが知られている。サイログロブリン遺伝子異常症では,血中のT3がT4に比較して高値を示すが,その機序は明らかではなかった。本研究により,サイログロブリン遺伝子異常症の甲状腺組織ではD2の活性が亢進し,血中T3の高値に関与していることが明らかとなった。また,D2の一塩基多型(SNP)はインスリン抵抗性や糖尿病との関連が報告されているが,理化学研究所との共同研究により,D2のSNPの迅速解析法を確立し,報告した。甲状腺刺激ホルモン(TSH)は,甲状腺のTSH受容体に結合し,甲状腺細胞の増殖ならびにホルモンの合成を促進する。私達は,高TSH血症を認めた症例において,我が国で最初のTSH受容体の遺伝子異常(R450HとG498Sの複合型ヘテロ接合体)を見出し変異TSH受容体の機能の解析に成功したが,本研究におけるTSH不応症例の解析により,V4731,R519CならびにR519Gの新たなTSH受容体遺伝子異常が明らかになった。これらはすべてR450Hとの複合型ヘテロ接合体であり,本邦においてはR450Hの頻度が高いことが示された。
森林流域における陰イオン物質に関する降雨流出モデルの確立

森林流域における水質浄化機能の定量評価する手段として,流域内における物質循環機構を的確に表現できる数理モデルの開発を行った.将来的に富栄養化の原因物質である窒素やリンの解析を目標に置いて,方法論の基礎を確立するために,特に土壌組織との相互作用が小さい陰イオン(塩化物イオンおよび硫酸イオン)に対象を絞って渓流濃度の時系列データの再現を試みた.モデルは研究代表者らのグループが開発した森林水循環モデルのうちの直列2段タンクモデルを基礎とし,これによって表現される雨水流動過程に物質流動を関連づける方法によって構築されている.溶質循環過程で考慮の対象としたのは,雨水によって移動態の溶質が搬送される移流過程の他に,土壌組織との間で発生する移動態溶質と不動態溶質との交換に関連する吸脱着過程である.本モデルの検証のために,徳島県白川谷森林試験流域ならびに筑波森林試験流域において洪水出水時に観測された雨量・流量・水質データへ本モデルを適用し,渓流水における溶質濃度の時系列データの再現を試みた.その結果,塩化物イオンおよび硫酸イオンのいずれについても合計4つの洪水イベントで良好に渓流水濃度の変化を再現できた.その際に,再現過程で推算される各タンク内濃度と現地で観測された土壌水質の鉛直分布データとを比較したところ定性的に土壌内濃度の変化の再現にも成功した.森林流域における水質浄化機能の定量評価する手段として,流域内における物質循環機構を的確に表現できる数理モデルの開発を行った.将来的に富栄養化の原因物質である窒素やリンの解析を目標に置いて,方法論の基礎を確立するために,特に土壌組織との相互作用が小さい陰イオン(塩化物イオンおよび硫酸イオン)に対象を絞って渓流濃度の時系列データの再現を試みた.モデルは研究代表者らのグループが開発した森林水循環モデルのうちの直列2段タンクモデルを基礎とし,これによって表現される雨水流動過程に物質流動を関連づける方法によって構築されている.溶質循環過程で考慮の対象としたのは,雨水によって移動態の溶質が搬送される移流過程の他に,土壌組織との間で発生する移動態溶質と不動態溶質との交換に関連する吸脱着過程である.本モデルの検証のために,徳島県白川谷森林試験流域ならびに筑波森林試験流域において洪水出水時に観測された雨量・流量・水質データへ本モデルを適用し,渓流水における溶質濃度の時系列データの再現を試みた.その結果,塩化物イオンおよび硫酸イオンのいずれについても合計4つの洪水イベントで良好に渓流水濃度の変化を再現できた.その際に,再現過程で推算される各タンク内濃度と現地で観測された土壌水質の鉛直分布データとを比較したところ定性的に土壌内濃度の変化の再現にも成功した.
光で駆動された高密度励起子系での多体効果と協力現象

本研究では、高密度励起子系における巨視的量子状態に関する理論的研究を行った。高密度状態での多体効果をなるべく正確に取り入れるためにフェルミ粒子描像に基づいて解析した。一般化された乱雑位相近似(GRPA)とBeth-Salpeter方程式を組み合わせて2体のグリーン関数を解く事により、量子揺らぎを十分に取り入れた発光スペクトル形状を計算することに初めて成功した。即ち、鋭い発光線を有する比較的低密度での励起子ボーズ凝縮状態(BEC)と、高エネルギー端で特異性を持つ広い発光帯を示すFermi面上でBCS状態との間の移り変わり(BEC-BCSクロスオーバー)の様相が広い粒子数密度領域で定量的に明らかにされた。BCS的秩序を取り入れたバンド繰り込み効果(粒子数密度の増大によるバンドギャップの減少)を計算し、実験結果と非常に良く一致する結果を得た。更に、Eliashberg方程式を数値的に厳密に解く事により、高密度電子正孔系でのBCSギャップの存在を検証する有力な手段である赤外/THzスペクトルの解析を行った。量子揺らぎを考慮した場合のBCSギャップの評価を行いBCS状態の安定性を示し、また、光により増強された電子正孔系における巨視的量子状態の存在を明らかにした。更に、本研究では光励起された強相関電子系の研究も行った。2次元ハバードモデルを基にして、同一サイトでのクーロンエネルギーが十分に大きい場合の多光子励起状態における有効ハミルトニアン(t-Jハミルトニアンの一般化)を導出した。それを数値的に厳密対角化することにより、種々の相関関数を計算して、超伝導相、強磁性相、スピンスパイラル相などが光誘起される事を示した。20サイト数の計算なので断定は出来ないが、本研究の結果は光誘起超伝導を始めとする強相関電子系における光誘起相転移が実験的にも検証される可能性を強く示唆するものである。十分低温における半導体中の励起子多体系は、励起子ボーア半径aが平均粒子間距離rより十分に小さい場合、即ち比較的粒子数密度が低い場合には励起子のボーズ凝縮状態をとり、逆にaがrより大きい高密度の場合には電子正孔BCS状態をとる。前者はヘリウムIIの超流動状態と類似の巨視的量子状態、また後者の場合はBCS超伝導状態と類似の巨視的量子状態をとる。両者の間のクロスオーバは、高温超伝導の機構とも関連して大変興味深い問題であり、本研究によって始めてその様相が明らかにされた。2体のグリーン関数が満たすBeth-Salpeter方程式を、一般化された乱雑位相近似により巨視的量子状態の存在を考慮に入れて数値的に解くことにより、ルミネッセンススペクトル形状の密度依存性を得た。即ち、比較的低密度で見られる励起子発光及び励起子間相互作用によるPおよびP_2発光線は、高密度になるに従い、BCSギャップ端での異常発光スペクトルに連続的に移行することが示された。また、ポンプ・プローブスペクトルの計算も行い、ポンプ光により電子正孔BCSギャップが大きく開き、その低エネルギー端で鋭い誘導放出が生ずる事が示された。通常電子正孔BCSギャップはエネルギーバンドの異方性などによりつぶれて観測されていないが、強いコヒーレント光による共鳴励起により、BCSギャップを実験的に観測し得る事を示唆する興味深い結果である。また、BCSギャップを直接観測する為には、赤外(あるいはテラヘルツ光)プローブ光に用いるのが有効であり、そのポンプ・プローブスペクトルの解析も行った。

本研究では、電子相関を十分に取り入れた発光スペクトル形状を計算することに初めて成功し、励起子のボーズ凝縮相と電子正孔BCS相との間のクロスオーバーの様相を定量的に明らかにした。高密度状態では、フェルミ縮退を反映して広い発光スペクトルとなるが、フェルミ面上にBCSギャップが開くこと及び量子揺らぎの効果によるピーク構造が生ずる事を理論的に示した。また、バンドの繰り込み効果により、発光の低エネルギー端は低エネルギー側に大きくシフトし、バンドの形状も放物型からずれる事が示された。他方、密度が低い場合は、励起子描像で記述でき、励起子間相互作用を反映したP、P_2線と呼ばれるスペクトルが現れる事がしめされ、その強度の粒子密度依存性が明らかにされた。この様に、高密度から低密度になるに従い、BCS的巨視的量子状態から、ボーズ凝縮的な巨視的量子状態へのクロスオーバーの様相が全密度領域で統一的に解析された。これは、高温超伝導の疑ギャップの問題とも関連して重要な結果である。また、電子正孔BCS状態は、エネルギーバンドの異方性や熱的揺らぎなどにより容易に壊される可能性があるので、観測困難と見られているが、強い光励起下ではBCS状態が安定化されることがポンプ・プローブの解析によって示された。電子正孔BCS状態に対する電子相関の効果を更に精密に調べるために、可視光ポンプ・赤外プローブのスペクトルをEliashberg方程式により解析し、BCS状態の安定性を定量的に示した。この結果は、光励起下での電子正孔ペアの巨視的量子状態が観測される可能性を強く示唆するもので、半導体中の高密度励起状態の研究に新たな道を開く重要な成果である。本研究では、高密度励起子系における巨視的量子状態に関する理論的研究を行った。高密度状態での多体効果をなるべく正確に取り入れるためにフェルミ粒子描像に基づいて解析した。一般化された乱雑位相近似(GRPA)とBeth-Salpeter方程式を組み合わせて2体のグリーン関数を解く事により、量子揺らぎを十分に取り入れた発光スペクトル形状を計算することに初めて成功した。即ち、鋭い発光線を有する比較的低密度での励起子ボーズ凝縮状態(BEC)と、高エネルギー端で特異性を持つ広い発光帯を示すFermi面上でBCS状態との間の移り変わり(BEC-BCSクロスオーバー)の様相が広い粒子数密度領域で定量的に明らかにされた。BCS的秩序を取り入れたバンド繰り込み効果(粒子数密度の増大によるバンドギャップの減少)を計算し、実験結果と非常に良く一致する結果を得た。更に、Eliashber g方程式を数値的に厳密に解く事により、高密度電子正孔系でのBCSギャップの存在を検証する有力な手段である赤外/THzスペクトルの解析を行った。量子揺らぎを考慮した場合のBCSギャップの評価を行いBCS状態の安定性を示し、また、光により増強された電子正孔系における巨視的量子状態の存在を明らかにした。更に、本研究では光励起された強相関電子系の研究も行った。2次元ハバードモデルを基にして、同一サイトでのクーロンエネルギーが十分に大きい場合の多光子励起状態における有効ハミルトニアン(t-Jハミルトニアンの一般化)を導出した。それを数値的に厳密対角化することにより、種々の相関関数を計算して、超伝導相、強磁性相、スピンスパイラル相などが光誘起される事を示した。
骨再生過程に及ぼす炎症の影響に関する検討

皮質骨由来細胞(compact bone derived cells, CBDCs)により免疫正常マウスを用いた骨再生モデルを作製したところ、培養骨による骨形成が認められ、炎症サイトカインIL-4、IL-17およびOsterixが2週から4週にかけて増加した。IL-6とTNF-αの発現は免疫不全動物に比べ高値であったことが明らかにした。ステロイドの投与によって移植部位の初期の炎症性細胞の浸潤とIL-4、TNF-αが減少した一方、短期間のステロイドの投与であってもIL-6など一部の炎症サイトカインの上昇を認め、アポトーシスおよびTRAP陽性細胞の増加も明らかにした。BALB/cAJclマウス(6週齢、雌)の大腿骨、脛骨を細切後コラゲナーゼ処理し、シャーレ上で培養することで、接着性の細胞を採取した。得られた細胞は2週間の分化誘導を行った後、同系マウス(8週齢,雄)の背部皮下へ移植した。また、比較のために、一部の細胞を免疫不全であるヌードマウス(BALB/c AJc l-nu/nu、8週齢、雄)の背部下へ移植を行なった。細胞移植1、2、4週後経時的にサンプルを摘出し、解析を行った。摘出組織を2分割し、一方は直ちに液体窒素中で凍結し、RNAを抽出した。定量的PCRにて、炎症および抗炎症関連サイトカインの発現を解析した。もう一方は中性ホルマリンにて固定し、パラフィン包埋、薄切の後、炎症関連サイトカイン抗体による免疫組織化学的染色を行った。移植1週目より、BALB/c AJc1マウスおよびヌードマウスの両群において、移植部位への炎症細胞浸潤が認められた。移植2週目ではマクロファージの遊走とTRAP陽性細胞が見られるようになったが、ヌードマウスではBALB/c CAJc1マウスと比較してTRAP陽性細胞が有意に多く、さらにその傾向は細胞移植4週目まで持続した。TNF-α、IL-6、IL-17陽性細胞は、細胞移植1週後から担体周囲に認められ、4週から8週後にはさらに強い発現を認め、その分布には両群で差を認めなかった。IL-4のmRNAはBALB/cAJcl群のみで発現しており、2週から4週にかけて増加した。TNF-αは1週目より両群で発現を認めたが、どの時点においてもBALB/cAJcl群ではBALB/cAJc1-nu/nu群より高値であった。BALB/cAJclマウス皮質由来細胞(CBDCs)を用いた骨再生モデルを作成し、骨再生の程度に観察するとともに、炎症サイトカインなどの発現も免疫組織化学的に解析を進んている。また、局部における炎症サイトカイン(IL-1、IL-23)の変動をReal-time PCRで定量中である。細胞移植による局所の炎症や免疫系細胞が骨再生に与える影響について、詳細を解析するため、平成27年度得られた細胞移植1、2、4、8週後のサンプルを、TRAP染色により破骨細胞の誘導と分布を解析した。移植1週目より、BALB/cAJc1群およびBALB/cAJc1-nu/nu群において、移植部位への炎症細胞浸潤が認められた。TNF-α、IL-6、IL-17陽性細胞は、細胞移植1週後から担体周囲に認められ、4週から8週後にはさらに強い発現を認めたが、その分布には両群で差を認めなかった。特に、細胞移植4週後において、BALB/cAJc1-nu/nu群ではBALB/cAJc1群と比較してTRAP陽性細胞数が多く、再生骨の面積も有意に広かった。この解析より変化の見られたポイントを絞り込みした結果、TNF-αとIL-6陽性細胞は、新生骨周囲には存在しなかった。また、炎症サイトカイン経時的な定量において、TNF-aはBALB/cAJc1群に多く発現していた。IL-4およびIL-17のmRNAはBALB/cAJcl群のみで発現しており、2週から4週にかけて増加した。さらにRANKLにおいて、1週目にBALB/cAJc1-nu/nu群で多く、その後はBALB/cAJc1群と比較して有意差は認めなかった。また、骨分化誘導因子Osterixにおいて、2週目にBALB/cAJc1-nu/nu群で高く、その後両群とも急激に増加し、有意差はなかった。BALB/cAJclマウス皮質由来細胞(CBDCs)を用いた骨再生モデルを作成し、骨再生の程度に観察するとともに、炎症サイトカインなどの発現も免疫組織化学的に解析を進めている。また、骨形成の程度により炎症サイトカインの違いをReal-time PCRで定量中である。これまでの研究から,免疫正常マウスでは,骨再生過程の初期に起こる炎症性サイトカインの上昇によって骨再生が抑制されることが示唆されている。骨再生治療の効果を最大化するため、本年度には免疫正常マウスを用いた骨再生モデルに対して抗炎症作用を持つステロイドを投与し、その影響について検討を行った。BALB/cAJc1マウスの大腿骨および脛骨の皮質骨より細胞を採取し、担体として用いたβ-TCP上に播種し、骨分化誘導を行った。得られた細胞-担体複合体(培養骨)を同系マウスの背部皮下へ移植した。実験群へは培養骨移植後に1回と翌日に2回、あるいはその後7日間ベタメタゾンリン酸エステルナトリウムの腹腔内投与を行った。対照群へは、同量の生理食塩水を同じ回数腹腔内に投与した。

移植3日、7日および28日後に培養骨を摘出し、HE染色、TRAP染色、免疫染色と定量的PCRにより比較検討を行った。培養骨移植3日後に炎症性細胞浸潤が著明であり、特に3日目では対照群において炎症性細胞の浸潤が顕著であった。F4/80陽性細胞数を面積比で検討したところ、培養骨移植7日目において、実験群では少ない傾向であったが、それ以降ではステロイド投与の有無による差は認められなかった。培養骨中では7日間ステロイド投与群ではIL-4発現の減少が認められ、TNF-αの発現もステロイド投与により減少した。一方IL-6の発現は7日間投与にて増加した。また、3回投与、7日間投与のいずれの群においてもコントロール群と比較してアポトーシスが増加した。ステロイドの投与によって、初期の炎症性細胞の浸潤や一部の炎症性サイトカインが減少する可能性が示された。しかしながら、短期間のステロイドの投与であってもアポトーシスを増加させ、IL-6など一部の炎症性サイトカインの上昇を認めたことから、骨再生症例に対する有用性については慎重になるべきと考えられた。皮質骨由来細胞(compact bone derived cells, CBDCs)により免疫正常マウスを用いた骨再生モデルを作製したところ、培養骨による骨形成が認められ、炎症サイトカインIL-4、IL-17およびOsterixが2週から4週にかけて増加した。IL-6とTNF-αの発現は免疫不全動物に比べ高値であったことが明らかにした。ステロイドの投与によって移植部位の初期の炎症性細胞の浸潤とIL-4、TNF-αが減少した一方、短期間のステロイドの投与であってもIL-6など一部の炎症サイトカインの上昇を認め、アポトーシスおよびTRAP陽性細胞の増加も明らかにした。細胞移植1、2、4、8週後に摘出されたサンプルについて、TRAP染色により破骨細胞の誘導と分布を明らかにする。さらに、免疫組織化学的に解析より変化の見られたポイントを絞り込み、炎症サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6等)とTRAP陽性細胞の関係について、TRAPと免疫組織化学の2重染色によって検討を行う。また、再生骨中に存在する骨芽細胞の分布と、炎症および免疫細胞との関係について解析を行う。正常免疫モデルマウスに対して抗炎症剤を投与し、抗炎症剤が骨再生に与える影響について検討を行う。また、細胞移植後炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17など)及び骨分化誘導因子Osterix及び破骨細胞活化因子RANKLの発現を解析する。再生医学・口腔顎顔面外科学試薬の納期が遅くなったため、次年度に使用する研究費が生じた。注文した消耗品は定価より低くなったため、次年度に使用する研究費が生じた。次年度の消耗品の購入に合わせて使用する予定である。次年度の消耗品の購入に合わせて使用する予定です。
トランスジェネシスによるRAN干渉:機能ゲノミクスにおける新規のアプローチ

我々は、マウスでの遺伝子導入(tg)によるRNA干渉(RNAi)法の開発を試みた。まず、この導入実験として、短い二重鎖RNAによるRNAi(siRNA)実験を未成熟卵(GV)において行い、そのターゲットに対するRNAi効果(遺伝子発現抑制効果)を示した。我々が選んだターゲットは、その遺伝子欠損に由来する表現系が既知であるものから、今回のRNAi実験により新たな表現系が発見されたものまでを含む。RNAiによるターゲットの転写産物の減少度はGV卵1個レベルでの準定量的RT-PCRを実施し確認した。次に、我々はRNAポリメラーゼIII(Pol III)によりショートヘアピン型RNA(shRNA)を転写しsiRNAを産生するベクターを構築した。このshRNAのターゲットは、我々が初期に提案したeGFP、チロシナーゼおよびレプチンとした。これらのshRNA発現ベクターの有効性は、哺乳類培養細胞の遺伝子導入実験によるスクリーニングシステムによって検討した。我々のシステムでは、ターゲット発現ベクターとしてヽターゲットのオープンリーディングフレームの下流にires(mRNA内部のリボゾーム結合サイト)によってレポーター遺伝子である蛍光タンパク質venusを発現させるフレームを挿入したバイシストロン性発現ベクターを用いた。このベクダーでは、1種類のmRNAから2つのオープンリーディングフレームが翻訳される。したがって、これをshRNA発現ベクターと共に培養細胞に導入した場合、その蛍光タンパク消失の有無を観察することでターゲットに対するRNAi効果を検出することができる。我々は、このスクリーニング法により候補shRNAから効果の高いshRNAを選択し、各トランスジェニックマウス系統の作出に用いた。本スクリーニングシステムはRNAポリメラーゼII (pol II)による次世代RNAiベクターの開発にも使用している。研究の背景本研究では、転写産物がRNAi活性をもつ遺伝子をマウスゲノムに導入し、特定の遺伝子発現を動物個体全体で抑制する新たな実験手法を開発している。RNAiでは2本鎖RNAが標的mRNAの分解を誘導し無発現変異と類似の効果が得られる上、大部分もしくは全ての遺伝子に適用できるなど、相同組換えに依存した既存の遺伝子ターゲティングと比較して多くの利点がある。RNAiでは、2本鎖RNA発現遺伝子の導入位置はほぼランダムであり、さらに半接合性アレルで機能するため非常に効果的である。以下に本研究の進捗状況を報告する。研究成果本研究を申請して以来、当研究チームは成功裏に研究を進め、新たな段階に入つている。現在ではピエゾ作動性マイクロマニピュレーションが日常的に行われ、遺伝子導入マウスの作成に用いられている。国立遺伝学研究所で分子生物学の経験を積んだ庄司志咲子Ph.D.が2003年10月から研究室に加わり、JSPSのポスドクとして非常に高い能力を発揮している。同氏は以前に経験のなかったピエゾ作動性マイクロインジェクションを既に会得し、マウス配偶子の操作やin vitro胚発生を日常的に行うに至っている。庄司氏は、卵母細胞の分離培養にも成功しており、当研究室で作成したGFP発現マウスから卵母細胞を得てRNAi実験のコントロールに用いる予定である。まだ同氏は試験的に用いているeGFPの次のステップとして、実際の標的遺伝子を対象としたtg RNAiを可能にするベクターの設計及び構築を行っている。これらのことから初年度の目標は順調に達成される見込みである。今後の展望初年度に引き続き、コントロールを用いたtg RNAiコンストラクトの確認作業を進めた上で、目的の新たな遺伝子について解析を開始する予定である。これらの研究結果を基礎として、少なくとも論文の1つをインパクトの高い雑誌へ掲載したいと考えている。[背景]本プロジェクトは、当研究チームが有する高効率のトランスジェニック技術(mII-transgenesis)とRNA干渉法(RNAi)との組み合わせによる新規の遺伝子ノックダウンマウス作成法(tg-directed RNAi)確立を模索するものである。RNAiは、ほとんどの遺伝子に対して適応可能であり、2本鎖RNAがそれに相当するメッセンジャーRNAを目標として破壊することが良く知られている。

もし、我々がtg-directed RNAiを確立すれば、ヘミ接合体の作成が可能となり、これは従来よりも有用性の高い遺伝子ターゲティング法になるものと期待される。[本年度研究実績]当研究チームでは、ピエゾを用いたマイクロマニピュレーション法による変異マウスの作成を日常的に行ってきた。2003年の10月より当研究チームに所属し、本プロジェクトに携わっている庄司志咲子研究員は、既にこの技術を習得し、現在では、未成熟卵(GV)への短鎖RNA(siRNA)のインジェクションも行えるようになった。ここで使用するsiRNAは、まず、標的に相当するeGFP融合タンパク質と共にマウスNIH3T3細胞株にて発現させ、そのeGFPタンパク消失の有無を観察することで、その有効性の検証を行ってきた。GVインジェクションおよび細胞株発現系の両実験において、ターゲットに対するRNAiの効果を通常のRT-PCRに加え、さらに定量性のあるリアルタイムRT-PCRによっても確認した。上述の確認実験により、有効と認められたsiRNAの遺伝子配列は、ショートヘアピン型RNA(shRNA)を発現するようにデザインしたDNAコンストラクトの作成に用いた。このようにして作成したコンストラクトにより、5種類のtgRNAiマウスを作製している。本研究成果の詳細については、成果報告書にて行うものとする。