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ケモカインＣＣＬ２１と腫瘍溶解アデノウイルスを用いた新しい癌ワクチン療法の開発

腫瘍溶解ウイルス感染細胞を癌抗原とするワクチン研究を行った。ウイルス感染10時間ではウイルス感染細胞(CT26:1万個)は全て腫瘍を形成したが、24時間では腫瘍を形成しなかった。CT26再接種で50%のマウスが腫瘍を拒絶、ウイルス未感染のCT26でも25%で腫瘍を拒絶した。次に細胞数10万個、ワクチン回数2回、CCL21併用で検討した。ウイルス未感染細胞では100%腫瘍が出来たが、MOI1000ウイルス感染細胞では23%に腫瘍を形成する一方、31%で腫瘍が拒絶された。これはCCL21での17%より高かった。これらの結果からMOI1000ウイルス感染細胞は癌抗原を発現していることが示唆された。本実験は制限増殖型アデノウイルスを用いるため、文部科学大臣確認実験に相当する。平成23年12月1日付けで文部科学大臣より確認通知を受領し(23受文科振2141号)、その後平成24年2月17日に兵庫医科大学で本実験を行うための動物実験計画書、遺伝子組み換え実験計画書を提出、平成24年6月21日に実験許可を得た。本実験で用いる制限増殖型アデノウイルスはマウス細胞への感染効率が低い可能性があるということで、動物実験に入る前に再度マウス大腸癌細胞株CMT93とCT26で感染効率を検討した。どちらの細胞にもウイルス濃度依存性に殺細胞効果が見られたが、CMT93細胞の方が低濃度で殺細胞効果があり、同じウイルス濃度でも殺細胞効果がCT26細胞よりも高いことが分かった。そのためCMT93細胞を用いて動物を用いたワクチン実験を行うことにした。CMT93細胞はC57/BL6由来であるため、C57/BL6にCMT93細胞を皮下接種したが腫瘍を全く形成しなかった。CMT93細胞は付着性が強い一方で、浮遊状態にした場合に細胞生存率が低下することが危惧された。実際、培養液のFBS濃度を通常の10%から1%に減らして継代した場合、ヒト大腸癌細胞株HCT116では細胞生存率は落ちるものの継代可能であったがCMT93細胞では細胞が死滅して継代出来なかった。無血清培地(OPTIMEM)では継代可能なことは確認したのでPBSの代わりに無血清培地を用いて皮下腫瘍が形成出来ると考えて今後の実験を行う予定である。マウス大腸癌細胞CT26、CMT93に対するOncolytic virusの抗腫瘍効果をin vitroで検討したがほぼ同等の効果であった。CMT93では10,000,000まで細胞数を増やしたが皮下腫瘍が出来ず、CMT93を用いての研究は断念しCT26を用いた。増殖型ウイルス感染10時間で、CT26を1万個皮下接種するとMOI10, MOI100, MOI1000全てでMOIゼロ(ウイルス感染なし)と同様に腫瘍が生着した。ウイルス感染時間を24時間にするとCT26を1万個皮下接種してもMOI1000では皮下腫瘍が出来なかった(0/8、MOIゼロでも2/8)。ワクチン効果を確認するために再度CT26を接種すると50%のマウスで腫瘍生着が拒絶されたが、MOIゼロ2匹も腫瘍生着が拒絶された。CT26を10万個、CCL21を0.5μgウイルス感染細胞接種の24時間前に皮下投与、ワクチン回数2回として、抗腫瘍免疫を検討した。前投与が全くない場合は全てのマウスで腫瘍が生着(12/12)した。CCL21のみでワクチンした場合、CCL21-MOIゼロでワクチンした場合はどちらもそれぞれ17%(1/6)に腫瘍が生着しなかった。MOI1000でワクチンした場合は単独で33%(2/6)、CCL21との併用(CCL21-MOI1000)では29%(2/7)に腫瘍が生着しなかった。ワクチン段階で腫瘍が出来なかったもので、その後の再チャレンジで腫瘍が出来なかったものはCCL21単独, CCL21-MOIゼロで100%(それぞれ1/1)、MOI1000, CCL21-MOI1000で40%(それぞれ2/5)でありMOI1000のウイルス感染CT26細胞は必ずしも十分な抗原として働いておらず、ワクチン療法の改良が必要と考えられた。この結果は2014年度日本癌治療学会(横浜)で発表予定である。

そのため平成23年秋に文部科学省に実験計画書、申請書を提出し平成23年度12月1日付で文部科学大臣より確認通知を受領している(23受文科振2141号)。その後平成24年2月17日に兵庫医科大学に本実験を行うための動物実験計画書、遺伝子組み換え実験計画書を提出しており、認可待ちである(平成24年4月18日現在)。従って研究代表者である山野は制限増殖型アデノウイルスを用いた研究を兵庫医科大学で行うことが出来ていない状態であり研究計画に遅れが生じている。本研究の目的はケモカインであるCCL21をアジュバントとして用いることで腫瘍溶解アデノウイルスに感染した癌細胞を癌ワクチンの抗原と考えて抗腫瘍免疫を増強し、腫瘍溶解アデノウイルスによる抗腫瘍効果を増強することである。同ウイルスはヒトMidkineプロモーターによりウイルスの増殖を制御しているため、マウス細胞での増殖効率が低いことが危惧された。そこでまず初めにマウス大腸癌細胞株(CT26及びCMT93)における同プロモーター活性を、ルシフェラーゼアッセイにより確認する実験を行った(プラスミドを遺伝子導入)。その結果CT26細胞において、ヒトMidkineプロモーター活性はCMVプロモーターの9分の1程度ではあるが、SV40プロモーターと同等、ヒトTERTプロモーターの2-3倍である事を確認した。また分担研究者(久保)による実験ではCT26及びCMT93細胞において、Midkineプロモーター制御型腫瘍溶解アデノウイルスがウイルス濃度依存性に感染増殖し殺細胞効果を示すことを確認している。一方でCT26及びCMT93細胞は、ヌードマウスの皮下接種によりほぼ全例腫瘍を形成することを確認している。本実験は制限増殖型アデノウイルスを用いるため、文部科学大臣確認実験に相当する。平成23年12月1日付けで文部科学大臣より確認通知を受領し(23受文科振2141号)、その後平成24年2月17日に兵庫医科大学で本実験を行うための動物実験計画書、遺伝子組み換え実験計画書を提出、平成24年6月21日に実験許可を得た。従って動物実験可能となるまでに科研費内定後1年以上掛っている。従って書類の作成、事務手続きに時間が掛ったのが研究が遅れた最大の原因である。またin vitroでマウス大腸癌細胞であるCMT93細胞とCT26細胞でのウイルス感染実験を行ったが、初年度の結果と異なりCMT93細胞の方がCT26よりも明らかに感染効率が高く、殺細胞効果が高かった。そのためCMT93細胞をワクチン実験に用いることにしたが、これまでの報告を元に300万個を皮下接種したが腫瘍形成が見られなかった。そこで500万個に増やして再度皮下接種したがやはり腫瘍形成が見られなかった。CMT93細胞はATCCで購入可能な細胞であるが、動物実験に用いた報告は極少数しかない。同様にATCCから購入可能なCT26を用いた動物実験がマウス由来大腸癌細胞を用いた報告のほとんどである。CMT93細胞の腫瘍形成能がCT26に比べて明らかに低いため研究に用いられていないためであると予想して準備を進めるべきであった。細胞培養実験で検討すると培養液のFBSを10%から1%に減らすと細胞の継代が不可能なことからPBSを細胞溶解に用いて皮下接種すると細胞生存率が著しく低下してしまうことが腫瘍形成能が悪い原因と考えられた。無血清培地であるOPTIMEMでは継代可能であるため、OPTIMEMで細胞を溶解することで腫瘍形成能の向上が可能と考えている。
ジルコニアおよびチタン表面への軟組織接着機構の解明

イットリア安定化ジルコニア(Y-TZP)は人工股関節や歯科材料として臨床応用されている。Y-TZPは硬組織と化学的に直接結合しない一方で、軟組織とは直接結合するが、その結合メカニズムは解明されていない。本研究では、2種類の市販イットリア安定化ジルコニア(Y-TZP)(KATANA、ZR-SS)、チタン(2種)の各試料に対して、純水に室温で60日間浸漬した。また、各試料を調製したハンクス液に室温で7日間浸漬した。浸漬前後の試料に対して、XPSにより測定を行った。測定はMgKα線(1253.6 eV)を照射し、試料面に対して90度の方向へ放出された光電子を検出した。はじめに結合エネルギー範囲01200eVについて走査し、検出されたZr 3d、Y3 d、Ti 2p、O 1s、P 2p、Ca 2p、Ca 2s、N 1s、K 2p、S 2p、Cl 2p、Na 1s、C 1sおよび価電子帯について高分解能で分析した。測定された結合エネルギーは、表面汚染層の炭化水素に由来するC 1sの結合エネルギーを285.0 eVとして補正した。各電子のエネルギー領域のスペクトルを化学状態に従って分離し、その積分強度および実測値に基づく光イオン化断面積によって定量を行った。純水に浸漬後はZr 3d、Y3 d、O 1s、C 1sが検出され、各スペクトルを分離した結果、浸漬前と同様の化学的状態であった。組成については、浸漬1日後は浸漬前と同様であったが、浸漬60日後では水酸基が増加した。ハンクス液に浸漬後は、P 2pスペクトルも検出された。Pの組成は0.60.9at.%であった。一方、チタンにおいては、ハンクス液浸漬後にリン酸に加えてCa2+状態のCaを検出した。イットリア安定化ジルコニア(YSZ)は化学的に安定であり、生体内不活性セラミックスに分類されており、そのため、骨形成促進のための表面処理法の試みが続けられている。一方、最近では歯科インプラントとして使用した際に、軟組織とある程度接着するという報告が散見されるようになってきた。本研究では、その機構を明らかにする一助として、YSZの水中およびハンクス液中での変化をX線光電子分光(XPS)によって解析し、表面反応を明らかにした。3種類の結晶面(100)、(110)、(111)の13mol%Yを含有する市販YSZの板材を試料とした。結晶面はX線回折(XRD)によって確認した。試料は純水中に60 d浸漬あるいはグルコースを含まないハンクス液に7 d浸漬し、純水で濯ぎ窒素ガスで乾燥した後、XPSで解析した。鏡面に研磨し洗浄したCP Ti板に対して同様の実験を行い、YSZの結果と比較した。純水およびハンクス液浸漬と浸漬前の試料からZr、Y、Oと汚染層に由来するCが検出された。ZrとYは酸化状態であった。OはO2-、OH-、H2Oの状態で存在していた。Yの相体濃度は(100)と(111)において公称組成よりも小さく(110)で同じであった。水中に60 d浸漬した(110)試料には大量の水酸基が存在していた。一方、リン酸イオンとしてのPはハンクス液浸漬のすべての試料から検出され、特に(110)試料で多く検出された。これらの結果から、結晶面に依存して表面反応速が異なるが、実際に歯科および医療に使用されるYSZ表面はランダムな多結晶面であり、反応は上記の総合的結果として現れる。純水中における水酸基の増加とハンクス液中におけるリン酸基の増加が確認され、これらの現象がYSZへの組織接着を促進している可能性がある。水及びハンクス液に対するイットリア安定化ジルコニアの反応性を明らかにすることができた。また、各結晶面に対する反応性も明らかにできた。無機イオン、水分子との反応を結晶面ごとに明らかにできたことで目標は達成された。本研究は、ジルコニアおよびチタン表面の組成と化学的状態の厳密な解析を通じて、これらと生体組織との界面反応機構を探る点で独創的であり、材料表面に形成した生体組織の観察から機構解明を行ってきた従来の研究とは非連続な学術的視野となり得るものであり、歯科インプラント周囲炎防止のため、ジルコニア・チタン表面と軟組織との接着機構を表面科学的手法によって明らかにすることを目指す。本研究は現象論に留まらず、その機構を明らかにして汎用的技術の創製を目指すことから、生体機能材料の応用に留まっている従来の研究手法とは異なる学術発展の方向性を提案する点でチャレンジングである。本年度までに、その機構を明らかにする一助として、YSZの水中およびハンクス液中での変化をX線光電子分光(XPS)によって解析し、表面反応を明らかにした。

一方、リン酸イオンとしてのPはハンクス液浸漬のすべての試料から検出され(Fig. 1)、特に(110)試料で多く検出された。これらの結果から、結晶面に依存して表面反応速が異なるが、実際に歯科および医療に使用されるYSZ表面はランダムな多結晶面であり、反応は上記の総合的結果として現れる。純水中における水酸基の増加とハンクス液中におけるリン酸基の増加が確認され、これらの現象がYSZへの組織接着を促進している可能性がある。これまでに、3種類の結晶面(100)、(110)、(111)の13mol%Yを含有する市販YSZの板材(10mm x 10mm x 0.5mm)を試料とし、純水中に60 d浸漬あるいはグルコースを含まないハンクス液に7 d浸漬し、XPSで解析した。その結果、水との反応でわずかに水和し、ハンクス液中では、カルシウムは検出されず、リン酸イオンのみ取り込むことがわかった。これらの反応が、軟組織接着に関与している可能性を明らかにした。本年度までの成果を論文として公表することができた。イットリア安定化ジルコニア(Y-TZP)は人工股関節や歯科材料として臨床応用されている。Y-TZPは硬組織と化学的に直接結合しない一方で、軟組織とは直接結合するが、その結合メカニズムは解明されていない。本研究では、2種類の市販イットリア安定化ジルコニア(Y-TZP)(KATANA、ZR-SS)、チタン(2種)の各試料に対して、純水に室温で60日間浸漬した。また、各試料を調製したハンクス液に室温で7日間浸漬した。浸漬前後の試料に対して、XPSにより測定を行った。測定はMgKα線(1253.6 eV)を照射し、試料面に対して90度の方向へ放出された光電子を検出した。はじめに結合エネルギー範囲01200eVについて走査し、検出されたZr 3d、Y3 d、Ti 2p、O 1s、P 2p、Ca 2p、Ca 2s、N 1s、K 2p、S 2p、Cl 2p、Na 1s、C 1sおよび価電子帯について高分解能で分析した。測定された結合エネルギーは、表面汚染層の炭化水素に由来するC 1sの結合エネルギーを285.0 eVとして補正した。各電子のエネルギー領域のスペクトルを化学状態に従って分離し、その積分強度および実測値に基づく光イオン化断面積によって定量を行った。純水に浸漬後はZr 3d、Y3 d、O 1s、C 1sが検出され、各スペクトルを分離した結果、浸漬前と同様の化学的状態であった。組成については、浸漬1日後は浸漬前と同様であったが、浸漬60日後では水酸基が増加した。ハンクス液に浸漬後は、P 2pスペクトルも検出された。Pの組成は0.60.9at.%であった。一方、チタンにおいては、ハンクス液浸漬後にリン酸に加えてCa2+状態のCaを検出した。鏡面研磨し、洗浄、乾燥したYSZおよびCP Ti表面での、アルブミン、γ-グロブリン、フィブリノーゲンの吸着特性を明らかにする。結合上皮細胞を培養し、増殖を調べる。また、インテグリンの蛍光観察から細胞接着性を明らかにする。線維芽細胞を同様に培養し、細胞増殖、細胞接着性を評価する。上述の培養細胞中の細胞接着に係る遺伝子発現を評価し、細胞接着に係る因子を考察する。上述の細胞培養後に、細胞を機械的に剥離し、剥離後のYSZおよびCP Ti表面をXPSで解析する。これにより、細胞培養中の表面組成、化学的状態の変化を明らかにする。以上から、YSZおよびCP Tiの結果の相違を検討し、細胞培養中におけるジルコニア表面の組成変化、化学的状態の変化を明らかにする。また、細胞接着に係る遺伝子発現を明らかにする。市販の無作為の結晶面のYSZと純Tiで同様の試験を実施し、その結果を比較する。
肝細胞癌におけるネスチン（幹細胞マーカー）の機能解析とバイオマーカーとしての評価

【研究目的】申請者は、神経幹細胞および各組織のstem/progenitor cellsのマーカーである中間係フィラメント;ネスチンタンパクを肝細胞癌症例のホルマリン固定パラフィンブロックとtissue microarrayを、抗ネスチン抗体を用いて免疫組織化学的に解析した結果、予後の非常に悪い症例と肝癌転移巣に高頻度に発現していることを見出した。この観察から、ネスチンは、ヒト肝癌細胞の遊走・転移・細胞増殖能に関連していると考え、肝細胞癌の予後を推察する新たなバイオマーカーになるのではないかと推測した。本研究では、ヒト肝癌細胞の遊走・転移・細胞増殖能に与えるネスチンタンパクの機能解析とそのメカニズムを追究するとともに、肝細胞癌の針生検と手術材料(パラフィン切片)を用いてネスチン遺伝子・タンパク発現とその予後について病理学的に考察し、予後推察の新たなバイオマーカー開発を最終目的とした。【研究結果】ヒト肝細胞癌細胞株のネスチン過剰発現株(HLF)、ノックダウン株(Huh-7)を樹立し、コントロール群と形態的に比較すると、過剰発現株では、変化は認められなかったが、ノックダウン株では紡錘形を呈した。また、細胞遊走能・浸潤能は過剰発現群では亢進し、ノックダウン群では低下することからネスチンは、細胞遊走能・浸潤能に関与していることが示唆された。一方、in vivo研究として、Huh-7(ネスチンノックダウン肝細胞癌細胞)をヌードマウスに皮下移植し、コントロール群と腫瘍形成能、転移動態を比較したが、統計学的解析では有意な差は認められなかった。病理標本の組織化学的にネスチン発現についての検討では、肝癌細胞の肝生検症例は非常に稀であり、パラフィン切片からmRNAの抽出を試みたが困難であったが、手術摘出肝細胞癌症例を用いたネスチン発現と予後に加え、遊走・浸潤に関与し予後予測バイオマーカーであると以前報告したファシン発現とは強い相関が認められた。【考察】神経幹細胞のマーカーであるネスチンは、肝癌予後を推察する新たなバイオマーカーとなることが示唆された。
ソフトDSPに関する基礎研究とその生体情報処理への応用-ソフトコンピューティングとディジタル信号処理の融合-

肺繊維症患者の呼吸音に含まれる異常音であるcrackleを自動的に分離抽出することを目的としてソフトコンピューティングを導入した新しいたディジタル信号処理手法の開発を行なった。まず呼吸音の信号振幅分布や周波数特性などを調べ、異常音が突発的に発生する非定常信号であることに着目し、予測フィルタにソフトコンピューティングの一つであるファジィ推論を伴う判定を組み合わせるフィルタ構成を提案した。このファジイ推論判定部は単純な非線形関数で実現される。このフィルタは予測誤差の大きさに対しファジィ判定を行い突発性非定常信号を抽出することができる。しかしこれのみでは、crackle抽出精度が不十分であるので、さらに、大きさによる識別と突発的非定常信号存在個所の前後でのみの条件付き平滑を行う機能を付加した。得られた信号処理システムを実際の呼吸音データ10件程に対して適用して波形の上で十分高い精度でcrackleを分離抽出できることを確認し、また、音としても効果的に分離できることを聴覚において確認した。さらに、このcrackle分離抽出システムを実装するための新しいDSP形態を提案した。本研究で得られたcrackle分離抽出システムは線形荷重和処理と簡単な非線形関数の組み合わせにより構成される。従来のDSPは線形荷重和処理のみを行なう構造になっているので、本システムには適さない。そこで、crackle分離抽出システムを実現するDSPとして、従来のDSPに簡単な非線形関数を組み込む構造を有する非線形DSPの提案を行ない、それにより本システムが効果的に実現できることを示した。呼吸音に含まれるcrackleなる異常音を自動的に分離抽出するシステムの開発を行なった。まず、国立療養所東京病院より入手した呼吸音データ波形を観察し、crackleの波形上の特徴を明らかにすると共に、cracleを他の波形成分と分離するためのルールの検討を行なった。次に、予測誤差解析、スペクトル解析などの定量的解析を行ない、定量的解析を用いた場合のcrackle分離のためのルールの検討を行なった。これらの解析・検討結果に基づき、予測誤差に着目したルールベース信号処理システムの構築を行なった。このシステムは、まず、crackleがインパルス波とその余波からなる非定常波であることに着目し、予測誤差の大きな成分のみ抽出する(ST-NSTフィルタ)。次に、ここで抽出された成分に対し、crackele波形の特徴を考慮した処理を行い、抽出精度の向上を図る。具体的には、持続幅がある一定値以下のものとそれに後続する成分のみの抽出、さらに、この抽出波のうち、積分値が一定値以上の成分の抽出を行なう。特に、持続幅に基づく信号抽出では、rank orderフィルタなる非線形フィルタに基づく処理により容易に実装できるアルゴリズムの開発を行なった。最後に、抽出部の前後における波形補正を行ない、最終的抽出成分をcrackelとして出力する。以上のようなシステムにより、crackleが十分精度良く抽出されることが示された。ST-NSTフィルタはファジィルールに基づくフィルタに相当するものであり、後続の波形の特徴を考慮した処理もルールベースシステムになっている。本研究により、呼吸音などの生体信号から異常成分を自動的に抽出するには、通常の線形信号処理手法では能力の限界があり、信号の種々の特徴梁を考慮したルールベース信号処理システムが必要であることが明らかとなった。肺繊維症患者の呼吸音に含まれる異常音であるcrackleを自動的に分離抽出するシステムの開発を行なった。昨年度、開発したcrackle抽出アルゴリズムを実際の呼吸音に適用しその有効性を示すと共に、このアルゴリズムをDSP(digital signal processor)で実装するために処理手法を見直し、また、このアルゴリズムに適したDSPの構成を提案した。まず、実際に得られた呼吸音データ10件程に対して、本提案手法を適用し、波形の上で十分高い精度でにcrackleを分離抽出できることを確認し、また、音としても効果的に分離できることを聴覚において確認した。本手法のファジィルール部におけるパラメータは、入力信号の振幅に依存するので、それを入力

信号振幅の標準偏差に応じて適応的に設定できるよう改良を行なった。次に、このcrackle分離抽出システムを実装するための新しいDSP形態を提案した。本研究で得られた、crackle分離抽出手法は信号の予測誤差の大小に対するファジィルールに基づき非定常成分を分離するST-NSTフィルタとその後処理の条件付き平滑フィルタからなるが、ファジィルールの部分は非線形関数で表されるので、ST-NSTフィルタと条件付き平滑フィルタを統合すると線形荷重和処理と簡単な非線形関数の組み合わせによる構成が得られることを明らかにした。従来のDSPは線形荷重和処理のみを行なう構造になっているので、本システムには適さない。そこで、crackle分離抽出システムを実現するDSPとして、従来のDSPに簡単な非線形関数を組み込む構造を有する非線形DSPの提案を行ない、それにより本システムが効果的に実現できることを明らかにした。
高効率有機薄膜太陽電池を指向した近赤外光吸収材料の開発

本研究では,次世代の太陽電池として注目されている有機太陽電池の高効率化に資する材料開発を行った.高効率化の鍵は,太陽光エネルギーの約40%を占める近赤外光を効率的に吸収する新規活性層材料を開発することである.本研究では,890 nmの近赤外領域まで吸収出来るキノイド型材料を開発した.これらの材料を活性層とした有機太陽電池が,近赤外領域において光電変換可能であることを明らかにした.新たな長波長吸収材料の分子デザインとして,従来までの設計指針を拡張したホウ素含有錯体を設計し,その合成に成功した.この錯体の吸収波長は1050 nmに及び,太陽光の効率的な吸収に有効な分子の創製に成功した.本研究は,高効率有機薄膜太陽電池を指向した,近赤外光のみを選択的に吸収するドナー材料の開発を目的としている.キノイド型π共役化合物は,HOMO-LUMO遷移に由来する光吸収が極めて強く,長波長吸収を示すため,近赤外光のみを選択的に吸収する手段として有望である.しかしこれまでのキノイド型分子は,ドナー材料としての利用上,主として以下の2点が課題であった.1)開殻構造の寄与により化合物の安定性が低下し,マテリアル応用に適さない.2)安定なキノイド型分子の多くは電子吸引性置換基を有し,ドナー材料としての応用に適さない.初年度は,これらの課題を克服すべく,新規キノイド型分子を設計・合成し,ドナー材料としての評価を行った.新規に設計・合成したキノイド型分子は,熱的に安定であり,かつ近赤外領域に選択的に強い光吸収を示すことを明らかにした.合成した化合物群の示唆熱-熱重量分析を行ったところ,熱分解温度は220 °C以上であり,ドナー材料への応用に展開可能な十分な熱安定性を有していた.また,合成した化合物の薄膜を作成し,イオン化ポテンシャルの評価を行ったところ,ドナー材料として適切な値(4.70-4.90 eV)を有することを明らかにした.さらに,新たに開発したキノイド型分子を有機薄膜太陽電池のドナー材料として利用し,890 nmまでの近赤外領域におよぶ光電変換を達成した.本研究は,高効率有機薄膜太陽電池を指向した,近赤外光のみを選択的に吸収するドナー材料の開発を目的としている.キノイド型π共役分子は,HOMO-LUMO遷移に由来する光吸収が極めて強く,長波長吸収を示すため,近赤外光のみを選択的に吸収する手段として有望である.これまでのキノイド型分子の問題点として,1)分子の開殻性に起因した不安定性と,2)太陽電池用ドナー材料として適さないエネルギー準位が挙げられる.今回,安定な新規キノイド型材料を設計・合成し,有機薄膜太陽電池の光吸収ドナー材料として評価を行った.新規キノイド型分子をドナーとして,またフラーレンC60をアクセプターとして使用したヘテロジャンクション型太陽電池素子において,近赤外領域(890 nmまで)の光電変換を達成した.光電変換効率(PCE)は0.37%であり,この効率のボトルネックとして,材料自身の電荷輸送特性が一因であることを明らかにした.また,新たな近赤外光吸収材料の設計指針として,ベンゾジピロール骨格をドナー骨格として有するドナー・アクセプター(D-A)連結型分子を考案し,合成することに成功した.本分子は,太陽電池材料へ利用するうえで欠かせないエネルギー準位制御を,簡便な化学修飾を経ることで達成できるユニークな分子である.このD-A型分子にトリアリールボランを作用させて合成したホウ素錯体は,1050 nmまでに及ぶ長波長吸収を示し,新たな近赤外光吸収材料の設計指針を与える有用な知見となった.本研究では,次世代の太陽電池として注目されている有機太陽電池の高効率化に資する材料開発を行った.高効率化の鍵は,太陽光エネルギーの約40%を占める近赤外光を効率的に吸収する新規活性層材料を開発することである.本研究では,890 nmの近赤外領域まで吸収出来るキノイド型材料を開発した.これらの材料を活性層とした有機太陽電池が,近赤外領域において光電変換可能であることを明らかにした.新たな長波長吸収材料の分子デザインとして,従来までの設計指針を拡張したホウ素含有錯体を設計し,その合成に成功した.この錯体の吸収波長は1050 nmに及び,太陽光の効率的な吸収に有効な分子の創製に成功した.初年度の当初の達成目標は,近赤外光領域に光吸収をもつドナー分子の合成・評価であったが,現在の進捗状況はこの段階を大きく超えている.合成した化合物群は実際に近赤外光領域に選択的に強い光吸収を示し,さらにこれを有機薄膜太陽電池のドナー層へと活用することで,近赤外光領域での光電変換を達成することに成功している.このように,分子設計における新規コンセプトの確立は既に達成され,使用する分子の最適化や素子の高効率化といった次のステージに突入している.有機エレクトロニクス本研究の当初の第一段階目標である,近赤外光のみを選択的に吸収する分子の設計・合成およびドナー性の評価は既に達成している.今後は合成した新規化合物群を有機薄膜太陽電池の活性層材料と活用し,更に高効率な素子の開発に向けた新学理の構築を目指す.

具体的には,ドナー分子の電荷移動度の向上,イオン化ポテンシャル/電子親和力の調節,太陽電池素子構成の変更などの項目を掲げる.これを通じて有機エレクトロニクス分野に波及効果をもたらす新学理の探求を行う.
カルボカチオンの超安定化に基づく多段階酸化還元系の構築と動的配座異性機構の解明

カルボカチオンによる多段階酸化還元系の構築ならびに動的配座異性機構の解明を踏まえ、目的のカルボカチオン類に関する超安定化を試みた。安定化ユニットには炭化水素化合物であるにも関わらず分極効果が相当程度に大きいアズレン環を基本ユニットとした。単に安定化に寄与するアズレン環数を増すのみでは、カルボカチオンが効率よく安定化されない傾向を既に見い出しており、本研究では、アズレン環を用いたカルボカチオン類の安定化効果について、アズレン環上の置換基の検討およびアズレン環に代替する安定化基の検討を合わせ、系統立てたカルボカチオン類の超安定化に関する検討を行った。アズレン環上の置換基は、立体的かつ電子的な安定化が期待できるt-ブチル基、電子的に高い安定化が期待できるジメチルアミニ基、ならびにメトキシ基を検討した。その結果、熱力学的安定性の尺度となるpK_R^+値が14を遥に越える超安定化というべきカルボカチオンの高い安定化に成功した。またアズレン環に代わり得るシステムとして、ジメチルアミノフェニル基、メトキシフェニル基、ならびに酸化還元的挙動に期待が持たれるフェロセニル基について検討し、カルボカチオンの高い安定化と共に両性的多段階酸化還元系の構築に成功した。さらに、電子供与体として安定カルバニオン類を用い導電性電荷移動錯体の生成に成功した。また、高い安定性を有するカルボカチオン類は、その高い安定性に由来した特異な配座異性現象を示す期待から、生成したカルボカチオン類の動的配座異性現象を温度可変NMRスペクトルを用いて詳細に検討を加えた。その結果、安定化カルボカチオン類におけるジメチルアミノフェニル基が、期待される平面構造を取らず、ピラミダル構造を有していることを明らかにすることが出来た。
骨髄幹細胞由来高悪性度口腔扁平上皮癌発生機序の解明と臨床的意義

口腔扁平上皮癌発生母細胞の同定の一つのプロジェクトである粘膜由来か小唾液腺由来かを識別する方法を確立し,international Journal of Cancerにパブリッシュした.現在,ハイスループットな検査方法としてティッシューアレイの方法を確立すべく検索を進めている.一方,口腔扁平上皮癌でも骨髄由来と考えられる高悪性度の腫瘍の識別として白血病の治療で異性から骨髄移植を受けた患者に発生した扁平上皮癌,口腔扁平苔癬様病変を組織FISHを行うことにより,X染色体,Y染色体を指標に,扁平上皮癌がドナー細胞由来(骨髄細胞由来か),患者自身の細胞由来かの検索を行い,数例ではドナー由来であることを証明し,EACMFS(欧州頭蓋顔面外科学会)で発表した.現在,同様の患者における慢性GVHDにより発症する扁平苔癬様病変を初代培養することにより,上皮細胞のGバンド染色でドナー由来か患者由来かを確実に識別する方法の開発に着手している.また,パブリックデーターベース,我々の口腔癌患者のマイクロアレイによる全遺伝子発現解析の結果を,ES細胞の形質維持に必要な20数種の遺伝子を用いたクラスタリング解析が可能か否かの検討を開始した.これらの検索と並行して患者情報を詳細にデーターベース化し遺伝子情報と臨床情報をリンクできる独自の癌患者データーベースを構築している.さらに,多施設共同研究を展開するための準備として,愛媛大学口腔外科と連携しながら,解析の準備を始めている.概ね順調に研究は進行している.仮説を証明する時期から,臨床応用へのハイスループットな検査方法の開発にシフトしていかなければならないので,当初の計画とやや異なった検索も進めている.口腔扁平上皮癌の見かけに左右されない生物学的悪性度の診断を前向き臨床研究として進めていく.そのためには扁平上皮癌患者の生検組織から病理標本のみならず,DNA,RNA,ティッシューアレイ用のパラフィン包埋サンプルをルーティンワークとして調整し,2週間以内に結果が出るようなシステムを構築する必要がある.さらに,今回証明された仮説を,多施設共同研究として実証し,通常の検査に加えられるようにしていく.遺伝子発現の網羅的解析により,口底扁平上皮癌6症例を用い,生検材料からRNAを抽出し,32,878種類の遺伝子が搭載のHuman Genome Survey Array (Applied Biosystems社製)にて遺伝子発現の検索を行い,AB1700 Chemiluminescent Microarray Analyzerにて読み取り後,GeneSping GX 7.3で解析を行った.このアレイを用いて正常重層扁平上皮と小唾液腺の遺伝子発現の差が5倍以上ある遺伝子845個を同定しており,これらの遺伝子を用いてクラスタリング解析を行うと,口腔扁平上皮癌は2つのグループ(唾液腺グループと粘膜重層扁平上皮グループ)に分けることができた.クラスタリングできる最小の組み合わせを行うと12個の遺伝子により正確にグループ分けできることが明らかとなった.さらに,WEB上に公開されている口腔癌の遺伝子発現プロファイルを約167症例の口腔扁平上皮癌を同様の方法でクラスタリングを行うと,やはり2つグループに分けることができることを証明した.さらに,臨床検体を用いた後ろ向き試験により,これら2つのグループには予後,生物学的悪性度に明らかな差があることを明らかにした(Int J Cancer誌でrevision中).さらに,凍結切片,あるいはホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて,XY染色体プローブを用いてFISHをおこなう.Y染色体はCy3で,X染色体はDigoxigeninで標識して検出を行う.既に予備実験で,ホルマリン固定パラフィン包埋切片でもFISHが可能な条件は設定しており,データ解析はLeica CW-4000を用いて行う.予備実験として骨髄移植後の口腔扁平上皮癌と,通常に発生した口腔扁平上皮癌6症例で検索を行い,2症例が骨髄由来である可能性を示した(投稿準備中).われわれの臨床サンプルで検証したマイクロアレイ,クラスタリングの結果が,パブリックデーターベースに登録されている口腔扁平上皮癌でも同様の観察が可能か否かを行うために多大な労力を要した.その結果,少数のサンプルで観察した現象は,多数のサンプルでも同様であることが明らかとなった.また,臨床データもその精度を見直し,コホート表を作成し,単変量解析,多変量解析をやり直すことにより,より信頼度の高い結果が得られた.骨髄移植患者で口腔癌が発症したサンプルの追加があり,性別の違うドナーから移植された口腔癌患者でFISHを行いX染色体,Y染色体の検索が進められた.予想通り,ドナー骨髄細胞由来の口腔扁平上皮癌は多くはないが,何例かは存在することが明らかとなった.口腔扁平上皮癌発生母細胞の同定の一つのプロジェクトである粘膜由来か小唾液腺由来かを識別する方法を確立し,international Journal of Cancerにパブリッシュした.現在,ハイスループットな検査方法としてティッシューアレイの方法を確立すべく検索を進めている.一方,口腔扁平上皮癌でも骨髄由来と考えられる高悪性度の腫瘍の識別として白血病の治療で異性から骨髄移植を受けた患者に発生した扁平上皮癌,口腔扁平苔癬様病変を組織FISHを行うことにより,X染色体,Y染色体を指標に,扁平上皮癌がドナー細胞由来(骨髄細胞由来か),患者自身の細胞由来かの検索を行い,数例ではドナー由来であることを証明し,EACMFS(欧州頭蓋顔面外科学会)で発表した.現在,同様の患者における慢性GVHDにより発症する扁平苔癬様病変を初代培養することにより,上皮細胞のGバンド染色でドナー由来か患者由来かを確実に識別する方法の開発に着手している.

また,パブリックデーターベース,我々の口腔癌患者のマイクロアレイによる全遺伝子発現解析の結果を,ES細胞の形質維持に必要な20数種の遺伝子を用いたクラスタリング解析が可能か否かの検討を開始した.これらの検索と並行して患者情報を詳細にデーターベース化し遺伝子情報と臨床情報をリンクできる独自の癌患者データーベースを構築している.さらに,多施設共同研究を展開するための準備として,愛媛大学口腔外科と連携しながら,解析の準備を始めている.概ね順調に研究は進行している.仮説を証明する時期から,臨床応用へのハイスループットな検査方法の開発にシフトしていかなければならないので,当初の計画とやや異なった検索も進めている.口腔扁平上皮癌が粘膜幹細胞由来,唾液腺幹細胞由来が存在し,その生物学的悪性度,予後に差があることは明らかであり,今後は如何にハイスループットな鑑別診断を行うかが重要であり,我々が同定した9因子を組織アレイで免疫染色を行う条件を早急に確立しなければならない.骨髄由来細胞による口腔癌の発癌に関しては,どのようなタイプの幹細胞由来であるのかを同定すると同時に,骨髄移植患者以外の口腔扁平上皮癌での骨髄幹細胞由来症例を同定するための方法を確立しないといけない.口腔扁平上皮癌の見かけに左右されない生物学的悪性度の診断を前向き臨床研究として進めていく.そのためには扁平上皮癌患者の生検組織から病理標本のみならず,DNA,RNA,ティッシューアレイ用のパラフィン包埋サンプルをルーティンワークとして調整し,2週間以内に結果が出るようなシステムを構築する必要がある.さらに,今回証明された仮説を,多施設共同研究として実証し,通常の検査に加えられるようにしていく.免疫染色に試用できる抗体の選択に苦慮している.その分を遺伝子解析費用に充てているが,次年度は免疫染色にてハイスループットなシステムを構築することができると予想され,その費用を使用予定である.研究の大部分は終了し,学会発表の準備,論文掲載の準備を始めているところであり当初計画した予算を使用しきれなかった.最終年度に向けて,国際学会での発表,論文投稿料等の支出が見込まれるため,その支出に充てる予定である.
横隔膜超音波検査に基づいた小児人工呼吸器管理指針構築に関する研究

人工呼吸器は重篤な患者さんの生命維持に必要なものですが、長期に人工呼吸器管理を行うと本人の呼吸筋、特に横隔膜の機能が低下していくことが分かってきました。小児では特に横隔膜の呼吸への寄与は大きく、横隔膜機能を温存するような人工呼吸器管理が望まれますが、まだその効果的な実践方法は明らかになっておらず、さらに言えば横隔膜の機能を調べるのに小児に負荷が少なく簡便な評価法はまだありません。超音波検査は体に負担をかけず反復して行うことができ、横隔膜に応用できれば有用と考えます。本研究では横隔膜超音波検査の妥当性を検証し、また効果的なリハビリテーションや人工呼吸器管理法を探索していきます。
神経系の胚誘導及びその頭尾軸部域化の細胞・分子レベルにおける調節機構

我々はこれまでに、ツメガエル嚢胚外胚葉細胞のミクロ培養系において、bFGFがオ-ガナイザー細胞の神経誘導作用を代行し、生理的低濃度で神経細胞の分化を誘導することを明らかにした。オ-ガナイザー細胞は未分化外胚葉細胞を神経化した後、更に神経系の頭尾軸部域化を誘導することが知られているので、本研究ではbFGFがオ-ガナイザー細胞この作用をも代行し得るのか解析した。初期嚢胚(st.10)の外胚葉細胞を様々な濃度のbFGF存在下で培養した後、RNAを抽出し、ツメガエル幼生の中枢神経系頭尾軸に沿って局所差次的に発現する4種のhomeobox遺伝子(XeNK-2,En-2,XlHbox1,X1Hbox6)の転写発現をRT-PCR法で定量的に解析した。その結果、bFGFは濃度に応じてあらゆる部域の神経系細胞を誘導し得ることが明らかになった。0.1ng/ml以下の低濃度のbFGFでは、頭部マーカーのXeNK-2,En-2の発現が誘導されたが、bFGF濃度を上昇させるとこれらの発現は抑制され、代わって尾部マーカーのXlHbox1,XlHbox6の発現が漸次誘導された。誘導されるマーカーの生体内での発現部域と、各マーカーを最大に誘導するbFGF濃度はよく相関し、低濃度ほど頭部、高濃度ほど尾部のマーカーが誘導された。これらのマーカー遺伝子の発現には神経細胞の普遍的マーカーNCAMの発現が伴うが、オ-ガナイザーを含めて様々な部域の中胚葉マーカー(noggin、goosecoid,brachyury,Xwnt-8)の発現は見られなかったことから、bFGFは直接神経系細胞の分化を誘導し、濃度勾配により単独で神経系頭尾軸部域化を誘導し得ることが明らかとなった。
神経内分泌小胞膜に特異的に存在する電子伝達系の構造と機能

(1)パルスラジオリシス法によるMDAと還元型チトクロムb561との電子伝達反応の解析を行った。ミリ秒領域においてMDAは還元型ヘムを酸化し、秒領域ではAsAによる酸化型ヘムの再還元が見られた。MDAによる酸化はpH5.5で最大の値を示し、pHが上昇するとその速度は減少した。一方、AsAによる還元過程は中性付近で速度が最大となった。このことは、2つの電子伝達反応が全く違う部位において行われていることを示している。過剰量のMDA存在下でも全ヘムの半分しか酸化されず、半分のヘムのみがMDAとの反応性を持つことがわかった。(2)酸化型チトクロムらb561をDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理すると、AsAからの電子伝達が阻害され、ヘムの還元速度が顕著に低下し、約半分のヘムしか還元されないことがわかった。パルスラジオリシス法によりMDAとの反応を調べると、還元型ヘムの酸化過程は未処理の場合と同程度であったが、続くAsAによるヘムの再還元過程は全く観察されなかった。DEPCによる修飾部位をtrypsin, V8protease消化断片のMALDI-TOF-MSスペクトルにより解析した。His88,His161,Lye85の3つの残基が修飾されていていることがわかった。細胞質側へムの配位子His88,His161の修飾が起こりAsAからの電子受容ができなくなったと考えられる。以上の結果は、チトクロムb561中の2つのへムは、AsAとMDAとの電子伝達反応において別個の役割を持ち、MDAは小胞内側に位置するヘムを酸化し、その後、細胞質側に位置するヘムからの分子内電子伝達反応が起こると、酸化された細胞質側へムが再びAsAにより還元されると思われる。(3)下等な中枢神経系を持つプラナリア(扇形動物門)におけるチトクロムb561の全長。cNAクローンを得ることに成功した。アミノ酸配列解析より、高等動物で完全に保存されて機能的に重要な役割を持っていると思われる2つの保存性領域が、プラナリアb561においても完全に保存されていることがわかった。高等動物において完全保存されていた6つのHis残基の内の1つが、Asn残基に置換していることもわかった。(4)植物(Arabidopsis thaliana)にもチトクロムb561類似のタンパク質が発現している。この類似タンパク質一次構造を明らかにするため、A. Thaliana cDNAライブラリーからcDNAクローニングを行った。2種類のクローンを得、その全長配列を調べた。動物で見られた2つの保存性領域の内、細胞質側に位置しAsAとの相互作用に関与すると思われる領域の保存性は良くなかった。小胞内側に位置しMDAとの相互作用に関与すると思われる領域は良く保存されていた。6つの保存在His残基の内、プラナリアb561でAsn残基に置換していたHis残基が2つのクローンの内の1つではGln残基に置換していた。この結果はプラナリアb561 cNAの解析結果を裏付けるとともに、植物のチトクロムb561は生理的役割が動物チトクロムb561とは異なる方向に分子進化したものであることを示している。

高等動物において完全保存されていた6つのHis残基の内の1つが、Asn残基に置換していることもわかった。(4)植物(Arabidopsis thaliana)にもチトクロムb561類似のタンパク質が発現している。この類似タンパク質一次構造を明らかにするため、A. Thaliana cDNAライブラリーからcDNAクローニングを行った。2種類のクローンを得、その全長配列を調べた。動物で見られた2つの保存性領域の内、細胞質側に位置しAsAとの相互作用に関与すると思われる領域の保存性は良くなかった。小胞内側に位置しMDAとの相互作用に関与すると思われる領域は良く保存されていた。6つの保存在His残基の内、プラナリアb561でAsn残基に置換していたHis残基が2つのクローンの内の1つではGln残基に置換していた。この結果はプラナリアb561 cNAの解析結果を裏付けるとともに、植物のチトクロムb561は生理的役割が動物チトクロムb561とは異なる方向に分子進化したものであることを示している。
浮遊性有孔虫殻の安定同位体と微量化学成分のグローバルマッビングと古海洋への応用

現代の環境問題に対処するには,自然そのものの働きと人類活動によるものの二つによって影響されているので,自然の変動幅と仕組みを明らかにすることが不可欠である.過去の水温などは直接測定できないので,古海洋の解析では間接指標(Proxy)が用いられる.有孔虫炭酸塩殻の安定同位体や化学組成は,この中で最も有力な道具である.これは,炭酸塩殻が,生産された周囲の環境を定量的に記録しているとの考えに基づいている.石灰化がどのように環境を記録するのかを,有孔虫とサンゴ骨格の安定同位体比および微量成分を分析することによって間接指標をより高精度化した.サンゴ骨格については,飼育実験において,石灰化に伴う速度論的効果について,特に炭素同位体について検討し,生理的機能と深く関わっていることを明らかにした.但し,未だ解明されていない古環境指標としての化学組成変化が含まれている可能性はまだあると考えられる.それらの化学組成変化を古環境指標として利用するためには,特定の元素挙動のモデル構築および環境データとの相関確認という両方の作業が必要である.また,有孔虫の場合にもこのようなケースを検討するために,精密飼育実験を行なうべく,事前予備実験を開始した.以上の結果を応用し,日本周辺海域での堆積物コアを用いて有孔虫を用いて過去の変動を解析した.北西太平洋下北半島沖の北緯41度34分,東経141度52分,水深975mから採取された柱状堆積物試料MDO1-2409に含まれる,浮遊性有孔虫二種類(N.pachyderma(left), G.bulloides)と底生有孔虫二種類(U.akitaensis, B.seminuda)を用いて,同位体を測定し,水温を復元した.氷床の影響1.0‰と仮定し,Shackleton(1974)の式を用いて水温を換算し,氷期(15.621.0ka)から完新世(3.43.9ka)における水温の変動幅を算出した.その結果,2.5°C上昇という値を得た.現代の環境問題に対処するには,自然そのものの働きと人類活動によるものの二つによって影響されているので,自然の変動幅と仕組みを明らかにすることが不可欠である.過去の水温などは直接測定できないので,古海洋の解析では間接指標(Proxy)が用いられる.有孔虫炭酸塩殻の安定同位体や化学組成は,この中で最も有力な道具である.これは,炭酸塩殻が,生産された周囲の環境を定量的に記録しているとの考えに基づいている.石灰化がどのように環境を記録するのかを,有孔虫とサンゴ骨格の安定同位体比および微量成分を分析することによって間接指標をより高精度化した.サンゴ骨格については,飼育実験において,石灰化に伴う速度論的効果について,特に炭素同位体について検討し,生理的機能と深く関わっていることを明らかにした.但し,未だ解明されていない古環境指標としての化学組成変化が含まれている可能性はまだあると考えられる.それらの化学組成変化を古環境指標として利用するためには,特定の元素挙動のモデル構築および環境データとの相関確認という両方の作業が必要である.また,有孔虫の場合にもこのようなケースを検討するために,精密飼育実験を行なうべく,事前予備実験を開始した.以上の結果を応用し,日本周辺海域での堆積物コアを用いて有孔虫を用いて過去の変動を解析した.北西太平洋下北半島沖の北緯41度34分,東経141度52分,水深975mから採取された柱状堆積物試料MDO1-2409に含まれる,浮遊性有孔虫二種類(N.pachyderma(left), G.bulloides)と底生有孔虫二種類(U.akitaensis, B.seminuda)を用いて,同位体を測定し,水温を復元した.氷床の影響1.0‰と仮定し,Shackleton(1974)の式を用いて水温を換算し,氷期(15.621.0ka)から完新世(3.43.9ka)における水温の変動幅を算出した.その結果,2.5°C上昇という値を得た.現在の地球環境問題は,自然のみの働きによる環境変動に人間活動の地球環境へのインパクトが加わったものである.そこで,現代の環境問題に対処するには,両方の変動幅と仕組みを明らかにすることが不可欠である.古海洋の研究では,現在のところ物理場を支配する水温,塩分,生物および化学場に影響を与える栄養塩,一次生産の解析が最も基本である.最近では,古環境分野でも精密なモデリングが可能となってきたので,計算機に入力可能なデジタルデータの取得が強く求められている.過去の水温などは直接測定できないので,古海洋の解析では間接指標(Proxy)が用いられる.有孔虫炭酸塩殻の安定同位体や化学組成は,この中で最も有力な道具である.これは,炭酸塩殻が,生産された周囲の環境を定量的に記録しているとの考えに基づいている.しかし,殻の酸素同位体比は,しばしば平衡値からずれることが報告されている.そこで,炭酸塩殻に残された安定同位体比から真の環境情報を引きだすには,有孔虫の生態,生活史,石灰化の機構などを詳細に知る必要がある.生物起源炭酸塩殻の同位体および化学組成は定量的な古環境解析に非常に貢献してきた.特に、浮遊性有孔虫はほぼ汎世界的に生息しているので、重要である.

特に、低緯度域での古環境復元ではGlobigerinoudes ruberを中心に研究がなされてきたが、これまで1種と考えられてきたG.ruberには2形態のあることが提案され、本研究ではセジメントトラップで採取された試料について安定同位体比を測定した.その結果、海洋表層が成層化した時期、すなわち生産が比較的小さくなった時期には両者の酸素同位体比は0.25パーミル差が認められ、G.ruber s.s.とG.rubers.lについて前者は極表層に、後者は50mの深度に生息することが明らかとなった.また,この結果は炭素同位体比とも整合的で、G.ruber s.lの炭素同位体比の値はG.ruber s.s.よりも低い値となった.現在、低緯度域での古環境の復元に、この2形態を区別して分析および解析を行なうと、より精密な古環境復元ができると考えられる.今後は予定どおり、他の表層から採取した有孔虫について安定同位体の分析を行ない、現世の値が意味するものをより詳細に明らかにしていく予定である.現在の地球温暖化は,「自然本来の温暖化」+「人為起源の二酸化炭素による温暖化」が合わさったものである.現在の温暖化レベルは産業革命以前よりは高いものの,実は数千年前に地球が自然のみの働きで経験した温暖化より低いレベルにある.しかし,その程度がどの位であったのか,高精度の定量的(デジタル)な復元は行われてきていない.その復元のために,生物起源炭酸塩が使用されてきた.特に,外洋域で主に方解石殻を作る有孔虫(foraminifera),石灰質ナンンプランクトン(calcareous nannoplankton)は,ほとんどの外用域に生息という点で,古環境の定量的解析の際には非常に重要となっている.西赤道太平洋においてセジメントトラップ観測を実施した.このサイトは,赤道域であるにもかかわらず,主要成分およびプランクトンの種類について解析した結果,1年の中でも生物生産が著しく変化したことを示していた.トラップから得られたPulleniatina obliquiloculata, Neogloboquadrina dutertreiについて酸素・炭素同位体比を測定した結果は,表層水温および栄養塩の供給などについて,炭酸塩殻が環境を正確に記録していることが明らかとなった.また,西赤道太平洋の東経135度から西経170度までの極表層に生息している有孔虫Globigerinoides sacculiferの炭酸塩殻の酸素・炭素同位体比には,東経170度以東の湧昇域では冷たく、豊富な栄養塩を有した海水が上昇していることが酸素同位体比に記録されていた.また,西赤道太平洋、暖水塊は高温水で特徴づけられるが,酸素同位体比も低く,温度を反映していることがわかった。また,この海域は硝酸,リン酸,ケイ酸などの濃度が低い貧栄養塩で特徴づけられるが,Globigerinoides sacculiferの炭素は栄養塩の状態とともに大きく変動していた.これは,この種が共生藻を有しており,この活動状態が炭素同位体比の変化となって記録されていると解釈された.これは,過去の栄養塩の新たな間接指標となることを意味している.