hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
5-HT3受容体陽性細胞を標的とする過活動膀胱の新規治療法開発にむけた基礎的研究

今後は、膀胱機能における5-HT3受容体の役割を解明するため機能解析を行う予定である。また、ヒト膀胱組織における5-HT3受容体陽性細胞の存在を検討する予定である。排尿障害予定していた出張が延期になったため延期していた出張に参加した際の旅費として使用予定
Notch2 Hajdu-Cheney 症候群型変異の病態分子機構の解明

非常に稀な常染色体優性の結合織の先天性疾患であるHajdu-Cheney症候群は(HCS)、末節骨の骨吸収、進行性の骨粗鬆症、頭蓋骨変形がみられる。これまでの報告からNotch2がHCS症候群の原因分子であることが確立された。しかしながら、Notch2のHCS症候群の発症に関わる分子メカニズムには不明な点が多い。今回我々は、本発症メカニズムとしてNotch2 HCS型変異がNotch2の量的制御を逸脱し、Notch2の細胞内の蓄積が起こることにより破骨細胞の分化が亢進することにより、骨吸収が引き起こされることを細胞レベル、動物モデルおよび臨床サンプルにて明らかにした。多中心性骨融解症であるHajdu-Cheney症候群(HCS)は末節骨の異常骨吸収,進行性の骨粗鬆症,頭蓋骨変形と共に、口腔内では乳歯の早期喪失や重度の歯周病を引き起こす。近年、このHCSの原因遺伝子としてNotch2が同定され、Notch2のシグナル活性や安定性を制御するPESTドメインの欠失が生じることが明らかとなった。しかしながら、HCS変異による骨吸収亢進のメカニズムは未だ不明である。今回、このNotch2のHCS変異による多中心性骨融解症の発症メカニズムを明らかにするために以下の検討を行った。1)Notch2HCS変異のマッピング:これまで報告のあるHCS患者のNotch2遺伝子変異部分のマッピングを行った。Notch2 HCS変異のほとんどは欠失型変異であり、そのC末端欠失部はアミノ酸配列で最小部で約2470アミノ酸うち約50アミノ酸の欠失がみられた。2) Notch2 HCS変異の破骨細胞形成に対する効果: 1)で解析を行ったNotch2 HCS変異体のクローニングを行い、破骨細胞に過剰発現させ、破骨細胞形成効果を検討した。野生型Notch2にたいしてNotch2 HCS変異体は、有為な破骨細胞形成の上昇が見られた。3) Notch2 HCS変異体の分子生物学的変化: Notch2 HCS変異体によるNotch2分子の変化を明らかにするために、分子生物学的手法を用いて解析を行ったところ、野生型Notch2にたいしてNotch2 HCS変異体は、有為なNotch2タンパクの半減期の延長が見られた。以上の結果から、Notch2 HCS変異はタンパクの量的制御機構が関与していることが示唆された。今後はin Vivoモダルの作成などを含めた、より詳細な検討を重ねていきたいと考えている。これまで我々は、Notch2遺伝子が破骨細胞分化に重要な役割を報告してきた。今回我々は、Notch2のHajdu-Cheney変異がユビキチン・プロテアソームシステムのうちSCF型ユビキチンライゲースのFBW7によるタンパクの量的制御機構から逸脱し、破骨細胞内に蓄積する事により破骨細胞分化の異常亢進が引き起こされる事を見いだした。また、破骨細胞特異的FBXW7コンディショナルノックアウトマウスの解析を行っており、その結果破骨細胞分化の異常亢進が見られ、その細胞においてもNotch2の異常亢進が認められた。以上のことからも、FBW7はNotch2の量的制御を介して破骨細胞分化を制御していることが示唆された。また、CanalisらのグループはNotch2遺伝子に変異が挿入されたノックインマウスを作出し解析を行った結果、同様に骨粗鬆症の病態を示したことから、我々の分子モデルは患者の病態形成に関わっているものと考えている。現在、Hajdu-Cheney症候群の臨床サンプルの解析を行っており、実際の患者における破骨細胞分化活性に対して解析を行っている。今年度までに、研究計画書に沿った研究項目である、細胞を用いたin Vitro系の分子モデルは概ね明らかになり、動物モデルの作出・解析も順調に進んでおり、研究計画は概ね順調に推移している。非常に稀な常染色体優性の結合織の先天性疾患であるHajdu-Cheney症候群は、末節骨の骨吸収、進行性の骨粗鬆症、頭蓋骨変形がみられる。2011年に本症候群の原因遺伝子として2つのグループからNotch2の変異が報告された。最近、このNotch2変異を模倣したモデルマウスが作成され、Hajdu-Cheney症候群の病態の責任遺伝子がNotch2であることが証明された。しかしながら、このNotch2変異のHajdu-Cheney症候群の病態形成における役割はらかになっていない。本年度は、Hajdu-Cheney症候群の患者から得られた末梢血の臨床サンプルの解析を行った。

その結果、昨年度行ったin Vitro解析およびモデルマウスの解析を裏付けるNotch2のSkp1-Cul1-Rbx1-F-box(SCF)型FBW7ユビキチンプロテアソーム機構からの逸脱とそれに伴う安定化による破骨細胞分化の亢進を認めた。次に、これまで作成した破骨細胞特異的なFBW7コンディショナルノックアウトマウス(FBW7 cKO)において見られた破骨細胞の分化亢進による骨量低下の表現系が、Notch2の発現亢進が原因であるかどうかを確認するために、FBW7 cKOとNotch2-floxマウスとの交配を行なった。現在、本マウスの解析を行なっており、本マウスの解析からFBW7 cKOによる骨量の低下に関わる主たる分子が、Notch2の安定化によるものであることを証明できるものと考えている。今後の予定として、本研究助成を受け行なった治療モデルの効果に関する知財を特許申請するとともに、結果をまとめて論文として発表する予定である。平成26,27年度で予定していた、遺伝子解析と破骨細胞系に対する効果および分子生物学的変化を明らかに出来たことから、順調に推移していると考えられる。また、in Vivoモデル作成に必要なマウスの導入も終了しており、27年度に交配作出を進めていきたいと考えている。これらのことから、予定の研究が順調にすすんでいるものと考えている。現在、作出している破骨細胞特異的FBW7コンディショナルノックアウトマウスの臨床サンプルの解析も進み始めており、本解析を行いその結果を踏まえて論文での発表を行いたいと考えている。骨代謝現在、今回得られたNotch2 HCS変異の変化を制御している分子機構の解明が進んでいることから、本分子機構をin Vivoで再現できる動物モデルの作成を進めている。本年度は動物モデルの解析を行い、本年度のin Vitroモデルの検証を行う。さらに、臨床サンプルのを用いた解析に向かって準備を行っている。今年度は、予算を主に実験に関わる物品費として支出し、計画していた旅費・謝金等の支出を行わなかったため、次年度に使用するために予算を移行した。本年度に拠出予定であった、物品費に関して予定していたマウスモデルの作出に関わる費用に関して、マウスの納入が終えていないことから来年度の支出とした。また、いくつかの実験試薬等を次年度購入の予定である。次年度使用する予算に関しては、論文投稿に関わる英文校正費及び学会発表のための旅費等に使用したいと考えている。27年度に作出予定のマウスモデルの納入後に支出する予定である。また、今後のモデル動物を用いた解析に必要な実験試薬や、モデル動物の治療モデルに用いる試薬に関わる費用として支出する予定である。
災害リスク管理における人々の生活と健康に関連するアウトカム指標の開発

平成29年度は既存文献のレビューから、「災害時に人々の生活と健康を守るために行われてきた具体的活動をその結果・成果」を明らかにすることから取り組んだ。まずは、分担研究者および連携研究者による全体研究会議を開催し、対象となる文献の基準および分析枠組み、各分担研究者の担当領域を定めた。文献調査は、分担研究者それぞれの専門領域から災害看護の対象者・活動領域・フェーズ・健康課題の枠で分類し、6領域に分けた。分析対象となる文献は当該分野での研究論文が多くないことから活動報告も含めることとし、アどのような活動が、イどのような意図で行われ、ウその結果はどうであったかを分析の枠組みとし、共通のフォーマットを作成して、分担研究者毎の研究班体制で分析を行った。分析から、看護職により災害時の人々の生活と健康を守るために行われている多様な活動が抽出されたが、活動の意図とその結果については、記載が不明瞭であり、既存文献の分析と並行して、災害看護の実践・研究者からのヒアリング等を併せて実施したが、分析に限界があることが明らかとなった。また、海外の研究者との意見交換により分析を精錬させるために平成29年度中に実施する予定であったワークショップは、海外研究者との再調整が必要となり延期し、平成30年7月に開催された国際学会においてアジアの災害看護研究者との意見交換を行ない、直近(平成30年内)に発生した災害後の看護職による活動について実践的な情報を収集することで、既存文献に不足する活動の意図と結果の内容を補うこととした。現在、被災地での実践的活動を通して看護活動の現状、特に活動の意図とその成果に関するデータを収集し、分析を進めている。当初、平成29年度内に実施する予定であった海外研究者との意見交換、ワークショップが国際学会の中止により翌年度に延期せざるを得ない状況となった。併せて、既存資料文献では、看護活動によるアウトカムを定めるための、活動の意図とその結果に関する情報が予想以上に不足しており、新たに補足データを収集することが必要となった。次の課題は、これまでの研究結果を集約しアウトカム項目リストの作成を行うことである。海外研究者からは、文献検討の対象を看護学に限定せず、広くヘルスあるいは人道支援の領域に広げ評価指標を検討すべきとの助言があった。このことを踏まえて、災害に関連するヘルスおよび人道支援領域の定量的研究についてのレビューを追加で実施する。このレビューでは、災害後の健康あるいは生活にかかる実態調査等から、評価指標となるものを抽出する。これらを踏まえアウトカム項目リストを作成し、災害看護領域等のエキスパート・パネルによる検討を経て精錬する。その後、各アウトカム項目について、その測定・評価方法およびその実行性を検討し、指標を提案していく予定である。すでにやや進捗が遅れていること、また新たなデータ・分析が追加となることから、研究期間を延長する必要があると思われる。データ収集と分析を効率的に実施するために研究協力者や研究補助者を追加し研究組織の強化をはかりつつ、研究の推進に努める。

これらを踏まえアウトカム項目リストを作成し、災害看護領域等のエキスパート・パネルによる検討を経て精錬する。その後、各アウトカム項目について、その測定・評価方法およびその実行性を検討し、指標を提案していく予定である。すでにやや進捗が遅れていること、また新たなデータ・分析が追加となることから、研究期間を延長する必要があると思われる。データ収集と分析を効率的に実施するために研究協力者や研究補助者を追加し研究組織の強化をはかりつつ、研究の推進に努める。
ケイ素官能性変換にもとづいた生理活性天然物の合成

本研究はポリオール類の立体選択的合成法を開発するため有機ケイ素化合物の合成とケイ素官能性変換に関して行ったものである。得られた研究成果をまとめると次の通りである。1.アミノ(アリル)シランの選択的γー位アルキル化反応ジアルキルアミノ(アリル)シランをtーブトキシカリウムとnーブチルリチウムで処理することによりγー位選択的アルキル化に成功した。2.(±)ブレビコミン(昆虫フェロモン)の合成上記で得たアリルカリウム中間体を利用して炭素ー炭素結合を位置選択的に行わせ、官能基の導入により(±)ブレビコミンを全合成した。α,βーエポキシシランのケイ素上の置換基がイソプロポキシ基のときシアン化銅(I)の存在下に、かさ高いアルキルグリニヤール試薬で処理するとエポキシ酸素が効果的に除去され、ビニルシラン誘導体に変化することを見出した。4.メタル化アリルアミノシランによるアルデヒドのαーヒドロキシアリル化反応。アミノ(アリル)シランをリチオ化を経て亜鉛試薬にするとアルデヒドのαーヒドロキシアリルが選択的に起った。これに基づいたエリトロー3ーシリルー1ーアルケンー4ーオールの合成法を確立した。5.メタル化アリルアミノシランを用いるアルデヒドのγー位選択的アリル化反応アミノ(アリル)シランをリチオ化を経てシアン化銅(I)と反応させ、これをアルデヒドと反応させることによりγー位選択的アリル化に成功した。これを基にした2ーデオキシーCーニュクレオサイド骨格の合成を行った。糖誘導体を含むポリオールには重要な生理活性を有するものが多く、これら化合物の合成を高度に立体選択的に行う新しい手法の開発が求められている。本研究はケイ素官能基変換法を利用して立体選択的なポリオール類の合成法を検討してきた。下記の成果を得た。1.アミノアリルシランの選択的γ-位炭素-炭素結合の生成ケイ素上にアミノ基を有する(ジエチルアミノ)ジメチルアリルシランを当量のテトラメチルエチレンジアミンの存在下、n-ブチルリチウムを作用させて、アリルアニオンとした後、シアン銅(【I】)を添加してアルデヒドを反応させると非常に高い選択性でγ-付加物を与えることを見出した。生成するビニルシランをエポキシ化し、引き続いてケイ素官能基を酸化的にヒドロキシ基に変換すると一挙に2,3-ジヒドロキシフラン骨格が生成した。この反応に基づいて2-デオキシC-ヌクレオシド誘導体の合成に成功した。2.アミノアリルシランの選択的α-位炭素-炭素結合の生成(ジエチルアミノ)ジメチルアリルシランとn-ブチルリチウムの反応で生成するアリルアニオンに塩化亜鉛を添加すると反応は一変した。すなわち、アルデヒドとの反応では選択的にα-付加体が生成し、ケイ素官能基を酸化的にヒドロキシ基に変換すると立体選択的にエリスロ体1,2-ジオールが得られた。一方このアリルアニオンとヨウ化アルキルでカップリング反応させるとγ-位置選択的に進行し、トランス-ビニルシランを得た。これをエポキシ化と引続きグリニャール試薬と反応させることによりスレオ体1,2-ジオール合成ルートを拓いた。次年度は官能性ケイ素を有するγ-シリルアリルシランについてもメタレーション反応を検討し、これに基づいた生理活性ポリオール類の合成を行う。糖を含むポリオールには重要な生理および薬理活性を有するものが多く,近年,これらの化合物を高度に立体選択的に合成する手法の開発が求められている.

本研究はケイ素の特性を利用して立体選択的なポリオール類の合成法を開発し,それに基づいて有用天然物の合成を行うもので,本年度は下記の成果を得た.1.アミノアリルシランの選択的rー位アルキル化反応(ジエチルアミノ)ジメチルアリルシランおよび(ジイソプロピルアミノ)ジメチルアリルシランをtーブトキシカリウムとnーブチルリチウムで処理して相当するアリルカリウム中間体とした後,アルキルヨーダイドでアルキル化すると位置選択性よく,高収率でrーアルキル化することが出来た.2.(±)ーexoーブレビコミンー昆虫フェロモンーの合成(ジイソプロピルアミノ)ジメチルアリルシランをカリウム化したのち3ーオキソブチルヨーダイドのエチレングリコールケタールで炭素鎖を位置選択的に伸長させ,生成するビニルシラン誘導体をmークロル過安息香酸でエポキシ化した.次に,エチルグリニャール試薬を触媒量のシアン化銅(I)の存在下に反応させたところ,位置選択的にシリル置換基側にエチル基が導入された.最後にシリル基を酸化的に切断してヒドロキシ官能基に変換するとスレオー3,4ージヒドロキシー8ーノナノンのエチレングリコールケタールが得られた.ここで,過塩素酸水溶液で処理してエチレングリコール保護基を除去すると分子内ケタール化が起って(±)ーexoーブレビコミンが合成された.3.α,βーエポキシシランの脱酸素反応上記2.の反応を検討中, α,βーエポキシシランのケイ素上の置換基がイソプロポキシ置換基でグリニヤール試薬がかさ高いアルキル基のとき,シアン銅(I)の存在下,脱酸素反応が効果的に起った.糖を含むポリオールには重要な生理および薬理活性を有するものが多く、近年、これらの化合物を高度に立体選択的に合成する手法の開発が求められている。本研究はケイ素の特性を利用して立体選択的なポリオール類の合成法を開発し、それに基づいて有用天然物の合成を行うもので本年度は下記の成果を得た。1.メタル化アリルアミノシランを用いるアルデビドのαーヒドロキシアリル化反応ーエリトロー1,2ージオール骨格の合成アリル(ジイソプロピルアミノ)ジメチルシランをリチオ化し、塩化亜鉛で処理することにより調製される亜鉛試薬はアルデヒドと立置および立体選択的に反応し、エリトロー3ーシリルー1ーアルケンー4ーオールが得られた。これを過酸化水素で酸化的に処理することにより炭素ーケイ素結合は立体化学を保持してヒドロキシに変換され、エリトロー1,2ージオール誘導体を得た。2.メタル化アリルアミノシランを用いるアルデヒドのγー立置選択的アリル化反応ー2ーデオキシーCーニュクレオサイド骨格の合成アリル(ジエチルアミノ)ジメチルシランをリチオ化した後、シアン化銅を反応させ銅(I)エート錯体とすることによりアルデヒドをγー立置選択的に反応させることに成功した。この生成物を過酸化水素処理することによりγーヒドロキシアルデヒドをヘミアセタール体として得た。一方、γーヒドロキシビニルシラン生物物を過酸化水素酸化するに先立ってMCPBAでエポキシ化すると2ーデオキシ糖骨格に変換することが出来た。
広告規制と不正競争防止法

I本年度の研究は、「ドイツ広告法」に重点を置くとともに、EC諸国およびその他隣接国の広告規制をも対象とした。比較法的研究である本研究作業の基本的な部分を押さえた。その概要を以下では述べる。II我が国においては、広告を一般的に規制する包括的な立法はない。また外国ではそのために重要な役割を果たしている不正競争防止法も、我が国では広告規制、消費者保護という点では十分な機能をしていない。この点で、不正競争防止法の役割を我が国でも再度見直し、消費者保護に役立つようにその機能を変化させねばならない。不正な広告の類型を明確にする必要がある。また、契約上の保護も重視される。ドイツでは不正競争防止法の改正において誤解を招く広告によって契約を締結した消費者個人に当該契約を解除することができる権限が認められる。さらに、ドイツ法では不正な広告の類型は、不正競争防止法に固有の制裁が発動する要件でもあり、また消費者権ともいうべき権利(内容的は、民法上の解除権)を発生させる。ドイツ法の状況を知ることで、今後の我が国の広告規制の方向性を模索する上での課題が理解できた。III最近、広告に関する自主規制がバブル崩壊後の不況という経済的な要因から崩れており、広告規制を行う包括的立法および不正競争防止法の改正提案は必要である。IV市場統一を控えるヨーロッパ諸国における広告規制に関する知識は、我が国の企業が現地でマーケッティングを展開するためにも不可欠の前提となる。Vドイツ不正競争防止法とそれに含まれる広告規制を、手続法的側面と実体法的側面に分けて分析した。わが国においても詳細な不正競争行為の類型の構築がなされるべきであろう。
成長ホルモンの成長作用発現の分子メカニズムの解析-ドミナントネガティブSTAT分子を用いた解析-

成長ホルモン(GH)作用の発現機構は小人症の病因解明ならびにその治療という点から重要な課題である。成長ホルモン受容体(GH受容体)以後の作用伝達系には未解明の点が多いが、GH受容体以後のシグナル伝達には、様々なサイトカインのシグナル伝達にかかわるJAK-STATシグナル伝達路が関与している可能性が示竣されている。本研究では、GH→IGF-I→成長作用発現という一連のシグナル伝達(GH-IGF-I axis)においてJAK-STATがいかに関与しているのかについて検討を加えることを目標とした。そのために,生理的濃度のGHに応答して,IGF-Iを分泌しつつ成熟脂肪細胞へと分化する、脂肪前駆細胞ob1771細胞株(Doglioet al.,EMBOJ.5:4011-4016,1987)において、ドミナントネガティブSTAT分子を過剰発現する安定発現細胞株の作製を試みた。申請者らは現在までにi)ob1771脂肪前駆細胞および3T3-L1脂肪前駆細胞をGHで刺激した場合にSTAT5が特異的に活性化(チロシンリン酸化)されることを明らかにした。ii)ob1771脂肪前駆細胞において活性化されるSTATSに対応する、ドミナントネガティブSTAT5分子の作製に成功した。これらのコンストラクトを使用し、iii)ドミナントネガティブSTAT分子をリポフェクション法を用いて、ob1771tlB胞に導入し、薬剤選択を施してドミナントネガティブSTAT過剰発現細胞株を複数樹立した。現在、これらのドミナントネガティブ分子発現細胞とその親株におけるGH刺激による作用発現を比較検討している。具体的には、これらの細胞株において、実際にGH刺激した場合の内因性のSTATの活性化が抑制されていることを確認したのち、これら細胞株のGH応答性の表現型の変化について検討を加えつつある。現在実験途上であるが、残念ながら、安定した結果は得られていない。この原因として、ob1771細胞が非常に不安定な細胞であることがあげられる。薬剤でselectionをかける過程で、脂肪細胞への分化能が失われてしまうクローンを多数認めた。この問題を解決するべく今後は、薬剤によるセレクションを使用せず、Adenovirusを用いてドミナントネガティブSTAT5分子をob1771細胞に発現させる実験を予定している。研究課題:成長ホルモンの成長作用発現の分子メカニズムの解析-ドミナントネガティブSTAT分子を用いた解析-(1)まず、成長ホルモン(GH)刺激に応答してIGF-Iを分泌しつつ成熟脂肪細胞へと分化する、マウス脂肪前駆細胞ob1771細胞株をもちいてIGF-I遺伝子プロモーターのGH応答性について検討を加えた。ヒトIGF-I遺伝子をクローニングしたのち、種々の長さの5'flanking regionを含むluciferase constructを作製し、ob1771細胞に安定導入してstable transformantを得た。これらの細胞をGHで刺激し、luciferase assayにてGH応答性のIGF-I遺伝子プロモーターの活性化を検討したが、応答性は検出できなかった。現在この原因について検討を行なっている。(2)ob1771細胞の類縁のマウス脂肪前駆細胞株である、3T3L1細胞は増殖メディウム(DMEM,10%CS)から分化メディウム(DMEM,10%FCS+IBMX+Dexamethazone+Insulin)に移すと、34日で成熟脂肪細胞へと分化することが知られている。この細胞株には検討により、STAT1,STAT3およびSTAT5が発現していること、また増殖メディウムから分化メディウムへと移すと、15minというきわめて短時間のうちにSTAT5のみが活性化され(tyrosinephosphorylation)、この活性化は24時間以上持続することを見い出した。このSTAT5の活性化は詳細な検討により、分化メディウム中のFCSに依存しておることも明らかにした。STAT5活性化に関与する、FCS中に存在し、CS(Calf Serum)中には存在しない活性としてGHがその候補として考えられたが、実際、3T3L1細胞をCH刺激すると、分化メディウムでみられたのと同じ時間経過でSTAT5の活性化が観察された。3T3L1細胞の脂肪細胞分化における、STAT5活性化の生理的意義を検討する目的で、現在ドミナントネガティブSTAT5分子を3T3L1細胞に安定導入し、脂肪細胞分化に与える影響を解析しようと試みている。ii)

ob1771脂肪前駆細胞において活性化されるSTATSに対応する、ドミナントネガティブSTAT5分子の作製に成功した。これらのコンストラクトを使用し、iii)ドミナントネガティブSTAT分子をリポフェクション法を用いて、ob1771tlB胞に導入し、薬剤選択を施してドミナントネガティブSTAT過剰発現細胞株を複数樹立した。現在、これらのドミナントネガティブ分子発現細胞とその親株におけるGH刺激による作用発現を比較検討している。具体的には、これらの細胞株において、実際にGH刺激した場合の内因性のSTATの活性化が抑制されていることを確認したのち、これら細胞株のGH応答性の表現型の変化について検討を加えつつある。現在実験途上であるが、残念ながら、安定した結果は得られていない。この原因として、ob1771細胞が非常に不安定な細胞であることがあげられる。薬剤でselectionをかける過程で、脂肪細胞への分化能が失われてしまうクローンを多数認めた。この問題を解決するべく今後は、薬剤によるセレクションを使用せず、Adenovirusを用いてドミナントネガティブSTAT5分子をob1771細胞に発現させる実験を予定している。
経皮免疫療法で誘導される腫瘍特異的細胞障害性T細胞のケモカイン受容体の走化の調節

経皮ペプチド免疫療法(PPI)は、角質層を剥離した皮膚にペプチドを貼付することによって強力な細胞障害性リンパ球(CTL)反応を誘導する簡便で非侵襲的な免疫アプローチである。我々は、角層バリア破壊の後のヒトの皮膚では、表皮のランゲルハンス細胞はHLAと活性化分子の発現を増強して機能的に成熟し樹状突起の数を減らして遊走することを示した。さらにHLAクラスI拘束性の抗原ペプチドをもちいたPPIによりMHC-ペプチドテトラマー/ペンタマー陽性でIFN-γ産生性のCD8+細胞が末梢血中に出現した。メラノーマ関連のペプチドを用いたPPIによる実際の臨床試験では、7人のメラノーマ患者のうちの4人で病変のサイズを減らしたり腫瘍の更なる出現を抑制した。これらの臨床的効果は、縮小しつつある病変にテトラマー/ペンタマー陽性でin vitroにおける細胞障害性活性を有するCD8陽性T細胞が浸潤することによりもたらされることがわかった。PPIの副作用としてはメラノーマ患者での、白斑の出現を除いて、局所的にも全身にも毒性または自己免疫性を誘導しなかった。これらの結果からPPIは癌治療の臨床における新しい治療戦略となり得ることが示された。今回のメラノーマ患者における臨床試験の治療の効率化のためにはCTLの病変部位への浸潤が重要な要素となる。近年の研究でリンパ球の病巣への浸潤にケモカインとその受容体の発現が重要な働きをすることがわかってきている。そこで、今回の臨床試験への応用として、まずリンパ球の単クローン性の増殖疾患である皮膚のリンパ腫においてケモカインの発現が、病巣へのリンパ球浸潤にどのように影響しているかを調べた。その結果、リンパ腫においては、その細胞起源となるリンパ球の性質を反映しつつ、おのおのの疾患での病期の進行状態にあわせてダイナミックに発現が変化していくことがわかった。今後はこの知見をいかして、メラノーマの臨床試験に応用していく予定である。これまでに我々はマウスを用いた実験で、表皮最外層である角層を剥離することにより表皮内DCであるランゲルハンス細胞が活性化し、免疫機能が亢進ことを見いだした。またこの角層剥離皮膚に悪性黒色腫特異的ペプチドを貼付することにより極めて簡便な方法により効率よくペプチド特異的細胞障害性T細胞(CTL)を誘導することを示した。この方法をヒトに応用するための第一段階として、我々は正常人において経皮免疫によるCTLの誘導が可能であるかどうかを調べた。HIV非感染健常人ボランティアの角層剥離皮膚にHIV由来合成ペプチドを貼付したところ、数回の貼付により末梢血中に同抗原を特異的に認識するT細胞受容体を持ち、抗原刺激に反応してHIV抗原特異的にインターフェロンガンマを産生するCTLが出現することを見出した。悪性黒色腫第IV期に対する臨床試験では、これまでに浜松医大皮膚科において10例の進行例に施行し4例で腫瘤の縮小、または拡大、再発の予防効果が見られている。副作用として4例に軽度の白斑が見られたが生活上問題となるものではなかった。これらの患者でも健常人ボランティアと同様にペプチド特異的CTLが誘導されることがわかった。患者末梢血を免疫ペプチドの刺激で培養することにより、末梢血の約30倍まで高濃度にCTLを含む細胞群を精製することができた。この細胞群をエフェクターとして用いた実験では、免疫ペプチドを標識した標的細胞を効率よく障害することがわかった。

2年目の段階としてこの細胞のT細胞受容体ベータ鎖を標識抗体で解析することにより、ペプチド特異的CTLの同定が容易となり、細胞走化性の実験に進めると考えている。これまでに我々はマウスを用いた実験で、表皮最外層である角層を剥離することにより表皮内DCであるランゲルハンス細胞が活性化し、免疫機能が亢進ことを見いだした。またこの角層剥離皮膚に悪性黒色腫特異的ペプチドを貼付することにより極めて簡便な方法により効率よくペプチド特異的細胞障害性T細胞(CTL)を誘導することを示した。この方法をヒトに応用するための第一段階として、我々は正常人において経皮免疫によるCTLの誘導が可能であるかどうかを調べた。HIV非感染健常人ボランティアの角層剥離皮膚にHIV由来合成ペプチドを貼付したところ、数回の貼付により末梢血中に同抗原を特異的に認識するT細胞受容体を持ち、抗原刺激に反応してHIV抗原特異的にインターフェロンガンマを産生するCTLが出現することを見出した。悪性黒色腫第IV期に対する臨床試験では、これまでに浜松医大皮膚科において10例の進行例に施行し4例で腫瘤の縮小、または拡大、再発の予防効果が見られている。副作用として4例に軽度の白斑が見られたが生活上問題となるものではなかった。これらの患者でも健常人ボランティアと同様にペプチド特異的CTLが誘導されることがわかった。患者末梢血を免疫ペプチドの刺激で培養することにより、末梢血の約30倍まで高濃度にCTLを含む細胞群を精製することができた。この細胞群をエフェクターとして用いた実験では、免疫ペプチドを標識した標的細胞を効率よく障害することがわかった。これらの患者のなかで、治療中止後に、末梢血中の腫瘍特異的CTLの濃度の低下とともに悪性黒色腫が皮下腫瘍として再発した症例が2例存在した。治療再開後に腫瘍を摘出して病理学的に調べたところ、腫瘍細胞に分け入る様にリンパ球が浸潤して腫瘍細胞が壊死やアポトーシスを起こしている所見が得られた。病巣内に浸潤しているリンパ球を解析したところ、末梢血の10倍以上の濃度で腫瘍特異的なCTLが確認された。この腫瘍内に浸潤するCTLからクローンを確立して解析を継続する予定である。
スギのオゾン耐性機構は極端現象にも有効に作用するか？

スギのオゾン耐性機構の解明を目的として、スギ3品種(河津4、ドンデン562、屋久島4)の針葉の活性酸素消去系酵素の活性と抗酸化物質の濃度に対するオゾンの影響を調べた(実験1)。スギの比較的高いオゾン耐性に、アスコルビン酸による活性酸素種の消去能力の高さが関与していることが示唆された。針葉の活性酸素消去系酵素としてスーパーオキシドデジスムターゼ(SOD)等、抗酸化物質としてアスコルビン酸を測定した。その結果スギ針葉の活性酸素消去系酵素活性と抗酸化物質濃度に対するオゾンの影響に品種間差異があり、その応答が葉齢により異なることが明らかになった。8月と11月の当年葉と一年葉に対してSOD活性とアスコルビン酸濃度の測定を行った。針葉細胞における活性酸素種の消去に関わるSOD活性は、8月の当年葉のみでオゾン処理の効果を示し、ドンデン562と屋久島4でオゾンにより増加し、河津8で低下する傾向を示した。アスコルビン酸濃度は、11月にオゾン処理の効果が見られ、当年葉では3品種ともオゾンにより低下し、一年葉では屋久島4と河津8でオゾンにより低下する傾向を示した。還元型アスコルビン酸濃度の低下は、気孔から葉内に取り込まれたオゾンにより生成された活性酸素種の消去に利用されたことを意味する。特にドンデン562では、オゾン処理の比較的初期の段階の当年葉ではSOD活性を高め、その後、アスコルビン酸濃度を保持し、オゾンに対する高い抵抗性を保っている可能性が考えられた。新たに開始した実験2では、前年度用いた天然スギと同じ3産地(河津,ドンデン,屋久島)の別クローンの挿し木苗を材料に用いた。1年間育苗した挿し木苗を7月に植栽しオゾン処理を開始した。個体サイズが小さいことから、翌年に乾燥処理を実施する。スギのオゾン耐性機構の解明を目的として、スギ3品種(河津4、ドンデン562、屋久島4)の針葉の活性酸素消去系酵素の活性と抗酸化物質の濃度に対するオゾンの影響を調べた。概ね当初の予定通り、研究を遂行することができた。また本成果の一部が論文として掲載された。当初の計画通り、前年度に引き続き、高オゾン環境でスギ挿し木苗木を生育させ、極端現象の一つである無降水期間の長期化による乾燥ストレスをシミュレートするために、降雨遮断処理を実施する。処理区は、コントロール区、乾燥区、オゾン区、オゾン+乾燥区の4つとし、各処理3基設定する。処理期間の前後を通じて、実験1と同様の測定を実施する(実験2の2年目)。生育期間終了時に、苗木の全木刈り取り調査を行い、バイオマス配分の変化を調べる。2つの実験で得られたデータを総合し、オゾン耐性に関与する発現遺伝子を探索し、オゾンに対するスギの耐性機構を解明する。さらに、この耐性機構が、極端現象の一つである無降水期間の長期化による乾燥に対して有効に機能するのか解明する。スギのオゾンに対する耐性機構を解明するために、開放型オゾン暴露施設内に植栽したスギ挿し木苗3クローンに、オゾン付加処理を行い、光合成機能、揮発性有機化合物(モノテルペン)生成量等の測定を行った。光合成機能(電子伝達速度)は、屋久島産スギのみ、苗の下部の1年生針葉と当年生針葉で、オゾン付加により低下する傾向を示した。揮発性有機化合物生成に対するオゾン付加の影響は産地間差が見られ、屋久島産スギではモノテルペン放出量が大幅に増加し、河津産スギではモノテルペンの組成が変化した。光合成機能の指標である光飽和時の電子伝達速度は、屋久島産スギの苗の下部の1年生針葉と当年生針葉でのみ、オゾン処理により低下する傾向を示したが、苗の上部の当年生針葉や他のクローンでは明瞭な差が見られなかった。揮発性有機化合物の生成は、オゾンに対する耐性機構として作用する可能性が考えられている。スギはモノテルペンの生成量が多い樹種である。安定的な室内実験手法の開発により、モノテルペン放出特性の針葉樹クローン間の比較が可能になった。8月に通気法によりスギ針葉のモノテルペン放出量を測定した結果、オゾン暴露後に屋久島産スギはモノテルペン放出量が大きく上昇し、河津産スギではモノテルペンの組成が大きく変化した。活性酸素消去系酵素活性の分析と発現遺伝子解析のために、各処理個体の1年生針葉と当年生針葉のサンプリングを年3回行い、冷凍保存した。年度内に両項目の分析を実施すると伴に、苗の地上部の刈り取りと地下部の掘り取りを実施する。以上のデータセットがそろった段階で、トランスクリプトーム解析によりオゾン耐性に関与すると考えられる発現遺伝子候補の探索を開始する。当初予定通り、開放型オゾン暴露施設内に植栽したスギ挿し木苗3クローンに、2年目のオゾン付加処理を行った。光合成活性(電子伝達速度)の評価を行い、屋久島産スギの一年生針葉と苗の下部の当年生針葉で、オゾン処理により低下する傾向を示したが、苗の上部の当年生針葉では明瞭な差が見られないことを明らかにした。安定的な室内実験手法の開発に成功したことで、モノテルペン放出特性の針葉樹地域品種間の比較が可能になった。オゾン暴露後に屋久島産スギはモノテルペン放出量が大きく上昇し、河津産スギではモノテルペンの組成が大きく変化するなど、大きな地域品種間差が存在することが明らかになった。

この揮発性物質の放出に関して、すでに論文投稿(査読あり、英文)がされており、予定より早い成果の公表が期待できる。活性酸素消去系酵素活性等の分析、RNA-Seqの実施、伐倒・掘り取りサンプリングについても、予定通り、年度内に実施することができた。スギのオゾン耐性機構の解明を目的として、スギ3品種(河津4、ドンデン562、屋久島4)の針葉の活性酸素消去系酵素の活性と抗酸化物質の濃度に対するオゾンの影響を調べた(実験1)。スギの比較的高いオゾン耐性に、アスコルビン酸による活性酸素種の消去能力の高さが関与していることが示唆された。針葉の活性酸素消去系酵素としてスーパーオキシドデジスムターゼ(SOD)等、抗酸化物質としてアスコルビン酸を測定した。その結果スギ針葉の活性酸素消去系酵素活性と抗酸化物質濃度に対するオゾンの影響に品種間差異があり、その応答が葉齢により異なることが明らかになった。8月と11月の当年葉と一年葉に対してSOD活性とアスコルビン酸濃度の測定を行った。針葉細胞における活性酸素種の消去に関わるSOD活性は、8月の当年葉のみでオゾン処理の効果を示し、ドンデン562と屋久島4でオゾンにより増加し、河津8で低下する傾向を示した。アスコルビン酸濃度は、11月にオゾン処理の効果が見られ、当年葉では3品種ともオゾンにより低下し、一年葉では屋久島4と河津8でオゾンにより低下する傾向を示した。還元型アスコルビン酸濃度の低下は、気孔から葉内に取り込まれたオゾンにより生成された活性酸素種の消去に利用されたことを意味する。特にドンデン562では、オゾン処理の比較的初期の段階の当年葉ではSOD活性を高め、その後、アスコルビン酸濃度を保持し、オゾンに対する高い抵抗性を保っている可能性が考えられた。新たに開始した実験2では、前年度用いた天然スギと同じ3産地(河津,ドンデン,屋久島)の別クローンの挿し木苗を材料に用いた。1年間育苗した挿し木苗を7月に植栽しオゾン処理を開始した。個体サイズが小さいことから、翌年に乾燥処理を実施する。スギのオゾン耐性機構の解明を目的として、スギ3品種(河津4、ドンデン562、屋久島4)の針葉の活性酸素消去系酵素の活性と抗酸化物質の濃度に対するオゾンの影響を調べた。概ね当初の予定通り、研究を遂行することができた。また本成果の一部が論文として掲載された。スギのオゾンに対する耐性機構を解明するために、初年度の実験で得られたデータからトランスクリプトーム解析によりオゾン耐性に関与すると考えられる発現遺伝子候補の探索を継続して行う。オゾンに対する耐性機構が、乾燥ストレスに対してプラスに作用するのか、マイナスの効果を持つのか明らかにするために、オゾン付加に加えて、極端現象の中の無降水期間の長期化を想定した降雨遮断による乾燥処理を行う。天然スギの各分類系統中の典型的なクローンを新たに選択し、挿し木苗を作成し、1年間育苗したものを材料に用いる。4月に開放型オゾン暴露施設内に植栽し、初年度と同様のオゾン付加処理を実施する。乾燥処理は処理2年目に実施する。
納豆菌γ-ポリグルタミン酸合成機構の解明

納豆菌(Bacillus subtilis IFO16449)のγ-ポリグルタミン酸(PGA)の生合成に関与する遺伝子をクローニングした。クローン化したDNA断片(4.2Kb)に、B.subtilis 168で報告されているywsC、ywtABCとほぼ同一の塩基配列を示す4つの遺伝子を同定し、これらの遺伝子がPGA合成に関与する遺伝子であることは、このDNA断片を形質転換した大腸菌(E.coli JM109)がPGAを生産したことによって確かめられた。納豆菌NR-1のこれら4つの遺伝子(ywsC-ywtABC)の機能を明らかにするために、ywsC、ywtA、ywtBの3つの遺伝子破壊株を作製した。ywsCとywtAの2つの遺伝子破壊株はPGAをまったく合成しなかったが、ywtB遺伝子破壊株は少量のPGAを合成した。これらの結果から、納豆菌NR-1のPGA合成には少なくともywsCとywtAの2つの遺伝子が必要であり、ywtC遺伝子はPGAの大量生産に関わる遺伝子であることが示された。ywsC遺伝子(1182bp)とその上流約1Kbを含むDNA断片の下流に、ywsC遺伝子のC末端にヒスタグコドンを付与した断片(300bp)とPGAオペロンの転写終結配列を含む断片(150bp)のPCR増幅物を連結させ、これをpHY300PLKベクターに挿入し、この組換えプラスミドを納豆菌のywsC遺伝子破壊株に形質転換した。形質転換株にヒスタグ抗体でYwsCタンパク質(分子量44K)の生産とPGA合成を確認したのち、菌体破壊液からニッケルアフィニテイークロマトによってYwsCタンパク質を精製した。精製タンパク質を^<14>C-L-グルタミン酸、ATP、マンガンイオンを含む反応液に加えて反応させ、^<14>C-PGAを反応生成物として検出した。この結果は、YwsCタンパク質がL-あるいはD-グルタミン酸をγ-グルタミル結合させてPGAを合成するPGAシンテターゼであることを強く示唆している。【目的】納豆菌の窒素同化代謝を支配するグルタミン酸合成酵素(GOGAT)遺伝子破壊株を作製して、本破壊株のγ-ポリグルタミン酸(PGA)生産性を調べた。【方法と結果】枯草菌168のゲノム情報の基づいて、納豆菌NR-1のGOGAT遺伝子の約5.5KbをPCR増幅し、これをpUC18に連結してgltA領域にCm耐性遺伝子を挿入した。この欠陥GOGAT遺伝子を含むpUC18を納豆菌NR-1に取り込ませてGOGAT遺伝子破壊株を作製した。破壊株は生育にグルタミン酸を要求し、グルタミン酸の添加量に伴ってPGAは増大した。8%グルタミン酸添加培地の48時間培養でPGAの生産は最大(35gm/ml)に達し、この生産量は野性株NR-1の約2倍に相当した。【目的】枯草菌のゲノム配列に、Bacillus anthracisの莢膜成分であるγ-D-ポリグルタミン酸の合成酵素遺伝子(CapBCA)とホモロジーの高い遺伝子(ywsC、ywtA、ywtB)を見い出した。この領域からプローブを合成して納豆菌のこれら3つの遺伝子をクロ一ニングし、それぞれの遺伝子を破壊した納豆菌を作製して、納豆菌のこれら3つの遺伝子とPGA合成との関係を調べた。【方法と結果】

納豆菌NR-1からクローン化した3つの遺伝子(ywsC、ywtA、ywtB)のそれぞれにcat遺伝子を挿入し、その下流にSpacプロモーターを連結したそれぞれの破壊遺伝子をもつプラスミドを調製した.これら3つのプラスミドを納豆菌NR-1にコンピーテント法で形質転換し、相同組換えによってywtA,ywtBの導伝子破壊株を作製した。ywtB遺伝子破壊株からはPGAが合成されたが、ywsCとywtAの破壊株からはPGAは合成されなかった。これらの結果は、納豆菌NR-1のPGAの合成には少なくともywsCとywtAの2つの遺伝子が必要であることが示唆された。納豆菌(Bacillus subtilis IFO16449)のγ-ポリグルタミン酸(PGA)の生合成に関与する遺伝子をクローニングした。クローン化したDNA断片(4.2Kb)に、B.subtilis168で報告されているywsC、ywtABCとほぼ同一の塩基配列を示す4つの遺伝子を同定し、これらの遺伝子がPGA合成に関与する遺伝子であることは、このDNA断片を形質転換した大腸菌(E.coli JM109)がPGAを生産したことによって確かめられた。納豆菌NR-1のこれら4つの遺伝子(ywsC-ywtABC)の機能を明らかにするために、ywsC、ywtA、ywtBの3つの遺伝子破壊株を作製した。ywsCとywtAの2つの遺伝子破壊株はPGAをまったく合成しなかったが、ywtB遺伝子破壊株は少量のPGAを合成した。これらの結果から、納豆菌NR-1のPGA合成には少なくともywsCとywtAの2つの遺伝子が必要であり、ywtC遺伝子はPGAの大量生産に関わる遺伝子であることが示された。ywsC遺伝子(1182bp)とその上流約1Kbを含むDNA断片の下流に、ywsC遺伝子のC末端にヒスタグコドンを付与した断片(300bp)とPGAオペロンの転写終結配列を含む断片(150bp)のPCR増幅物を連結させ、これをpHY300PLKベクターに挿入し、この組換えプラスミドを納豆菌のywsC遺伝子破壊株に形質転換した。形質転換株にヒスタグ抗体でYwsCタンパク質(分子量44K)の生産とPGA合成を確認したのち、菌体破壊液からニッケルアフィニテイークロマトによってYwsCタンパク質を精製した。精製タンパク質を^<14>C-L-グルタミン酸、ATP、マンガンイオンを含む反応液に加えて反応させ、^<14>C-PGAを反応生成物として検出した。この結果は、YwsCタンパク質がL-あるいはD-グルタミン酸をγ-グルタミル結合させてPGAを合成するPGAシンテターゼであることを強く示唆している。
体育・スポーツシステムにおけるコミュニケーションの社会学的調査研究

都内国立大学学部3,4年生を対象に郵送自記式による質問紙調査を実施した。サンプル数は665本(有効回答率45.2%;男子520、女子125本)であり、運動部所属(元所属を含む)が127名(19.1%)、スポーツサークル所属者が178名(26.8%)、文化系サークル所属者が101名(15.2%)、無所属が259名(38.9%)であった。これら運動・スポーツ活動の準拠集団への所属(あるいは非所属)カテゴリーにより学生の運動・スポーツ活動へのコミットメントを把握し、学生の意識生活やライフスタイルとの関係を分析した。それによると、所属カテゴリー間で有意差がみられた意識・ライフスタイル調査項目はわずかであり(119項目中31項目)、またそのほとんどが運動・スポーツに関連する項目であった。この点、運動・スポーツへのコミットメントは確かに運動・スポーツ観や自己の健康・体力観にポジティブな影響を与えるものの、それ以外の意識生活に対してはほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。また一方で、消費性向によって分類された人格システム類型(宮台、1987)とも有意な関係は見られなかった。すなわち、運動・スポーツ活動へのコミットメントは、各人格類型にとって機能的に等価な社会適応戦略のうちの一つであり、各準拠集団内にほぼ均等に様々な人格類型が分布しているものと推測される。いずれの準拠手段への所属を選択するかは各人の置かれた環境と偶然に依存する。一方で、スポーツ系サークルにおいて観察される旺盛な先駆的消費実態(携帯保有率、メール利用率等)は、先の人格類型と準拠集団への所属による交互作用の結果とみられる。以上の点から、運動・スポーツへのコミットメントおよびそのスタイルは学生の意識生活を決定的に左右するものではなく、「運動・スポーツ」のコミュニケーションの社会適応戦略としての優位性はさしあたり認められない。人間は必ずといっていいほど、行為の帰結についての「表象(イメージ)」を抱きながら行為を操縦している。社会が機能的に分化し複雑化するとは、「価値コンセンサス」や「規範的指向」といった社会的に共有され、自明視されてきたイメージが次々に相対化され、効用が限定されていくことを意味する。特に、高度消費化、情報化、成熟化した社会では、それまで共有されてきたあらゆるイメージが相対化され、非自明化されていく。こうした状況では、個々の体験を通じたイメージの獲得が相対的に重要になってくると同時に、そのようにして個々が依拠するイメージは、社会からはますます不透明のものになる。運動したり、スポーツしたり、部活動に参加したりといった行為も(意識的であれ無意識的であれ)すべて何らかの社会的なイメージに基づき、何らかのイメージの獲得を目指すという、人間が行為するうえで不可避の前提に依拠している。しかし、変化の激しい現代社会ではそうしたあらゆるイメージが安定的な地位を与えられず、従来のステロタイプなスポーツ観、運動観による試作や事業がほどんど意味をなしえなくなる。こうした状況において、人々の抱くイメージの、真に科学的、理論的な検討が重要になってくる。平成11年度の調査では、大学の学生、大学院生を対象に、運動・スポーツ実施、大学の運動施設の利用、スポーツ行事への参加と、意識生活(イメージ)との関係を明らかにする質問紙調査を実施した。無作為に抽出された学生、大学院生3014名に質問紙を送付し、現在回収作業中である。また、某中高一貫校の全校生徒を対象に、運動部活への参加、実施状況、生理的、物理的に測定された体力、運動能力と、意識生活との関係を明らかにする質問紙調査を実施し、中学生359名、高校生236名から解答を得て、現在入力作業中である。

以上の点から、運動・スポーツへのコミットメントおよびそのスタイルは学生の意識生活を決定的に左右するものではなく、「運動・スポーツ」のコミュニケーションの社会適応戦略としての優位性はさしあたり認められない。
遺伝子治療の基礎的研究:小児神経疾患のモデル動物を用いた神経細胞移植

発育期神経遺伝病の治療は現在の所できない.脳へ遺伝子を導入する遺伝子治療の基礎実験が行われているが,それぞれの神経疾患の神経細胞の障害のおこる時期,神経細胞障害のおこり方には特異性があり,漠然と遺伝性神経疾患全体を対象にした基礎的研究はありえない.本研究は,人の遺伝病と全く同じ遺伝子に欠陥がある自然発生した変異マウスでKrabbe病のモデルであるTwicherマウス,Niemann-Pik病C型のモデルであるSphingo-myelinosisマウスへの細胞移植による治療法を開発することによって,遺伝子治療の基礎的な研究を行うことを目標にしている.今年度は,正常マウス由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞を移植しそれらが生着するかどうか検討した.トランスフェリン,インスリン,プロゲステロン,セレン,bFGFを含む完全合成培地で生後0日の正常マウス中脳の細胞を培養し,90%以上がA2B5抗原陽性であることを確認し,ファーストブルーで標識した.このA2B5陽性O-2A細胞を生後5日のTwicherマウス大脳皮質下白質に2×10^4個移植し,2週間後移植した細胞が生着しているかどうかを確かめた.移植した細胞は大脳皮質下側脳室周辺に広く分布していた.さらに,オリゴデンドロサイトのマーカーである抗ガラクトセレブロシッド抗体で染色すると,Twicherマウス白質ではほとんどガラクトセレブロシッドが発現していないのに対し,移植部位の周囲はガラクトセレブロシッドが陽性になっていた.さらにKluber-Barrera染色によってミエリン形成を確認したところ,移植部位にミエリンの形成を認めた.これらのことから,TwicherマウスへのO-2Aの移植は大脳白質の髄鞘形成不全には有効であることが確認された.今後,移植の細胞の量,移植場所,移植する時期を検討し,臨床症状にも有効かどうか確かめていく.また,Sphigomyelinosisマウスへは,小脳からの前駆細胞移植を試みていく.発育期神経遺伝病の治療は現在の所できない.脳へ遺伝子を導入する遺伝子治療の基礎実験が行われているが,それぞれの神経疾患の神経細胞の障害のおこる時期,神経細胞障害のおこり方には特異性があり,漠然と遺伝性神経疾患全体を対象にした基礎的研究はありえない.本研究は,人の遺伝病と全く同じ遺伝子に欠陥がある自然発生した変異マウスでKrabbe病のモデルであるTwicherマウス,Niemann-Pik病C型のモデルであるSphingo-myelinosisマウスへの細胞移植による治療法を開発することによって,遺伝子治療の基礎的な研究を行うことを目標にしている.今年度は,正常マウス由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞を移植しそれらが生着するかどうか検討した.トランスフェリン,インスリン,プロゲステロン,セレン,bFGFを含む完全合成培地で生後0日の正常マウス中脳の細胞を培養し,90%以上がA2B5抗原陽性であることを確認し,ファーストブルーで標識した.このA2B5陽性O-2A細胞を生後5日のTwicherマウス大脳皮質下白質に2×10^4個移植し,2週間後移植した細胞が生着しているかどうかを確かめた.移植した細胞は大脳皮質下側脳室周辺に広く分布していた.さらに,オリゴデンドロサイトのマーカーである抗ガラクトセレブロシッド抗体で染色すると,Twicherマウス白質ではほとんどガラクトセレブロシッドが発現していないのに対し,移植部位の周囲はガラクトセレブロシッドが陽性になっていた.さらにKluber-Barrera染色によってミエリン形成を確認したところ,移植部位にミエリンの形成を認めた.これらのことから,TwicherマウスへのO-2Aの移植は大脳白質の髄鞘形成不全には有効であることが確認された.今後,移植の細胞の量,移植場所,移植する時期を検討し,臨床症状にも有効かどうか確かめていく.また,Sphigomyelinosisマウスへは,小脳からの前駆細胞移植を試みていく.
社会の要請に応える高等教育改革成果のエビデンスの生成

本研究は、大学等における教育改革は何を行い社会に何を与えたのか、一方で社会からは大学等に何を求めているのか、これらを明らかにすることで、教育改革成果のエビデンスを明らかにし、大学の教育改革が社会に受け入れられるようにすることを目的としている。政府から補助金を受けた教育改革事例の公開資料から取組の内容、成果、派生した組織等への影響を把握する。これらの情報をもとに訪問調査を行い、成功例に見られる共通要素を探索する。また大学関係者と大学と関係のない社会人に調査を行い、教育改革として高い評価を受ける要素を選択する。最終的に、教育改革の成功のエビデンスと社会の要請に即した教育改革の示し方を明らかにする。