hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母を用いたヒトch-TOG相同遺伝子による染色体分配制御の解析

昨年までの研究結果より、生細胞におけるタイムラプス顕微鏡解析、ならびにクロマチン免疫沈降法などの技術により、Dis1, Mtc1が微小管結合タンパク質であると同時に、分裂期特異的に動原体DNAの中央領域に結合するタンパク質であることを明らかにしてきた。本年度の研究ではこれらの遺伝子産物と相互作用する因子の探索を主として行なった。まずDis1を用いて酵母ツー・ハイブリッド法により、物理的に結合する因子の探索を行なった。その結果、複数候補が得られ、相互作用が強いと思われる2群のクローンについて解析を進めた。一群は驚いたことにDis1自身であり、この結果はDis1は細胞内でも多量体を形成して機能している可能性を示唆している。興味深いことにMtc1とはツー・ハイブリッド法による相互作用は検出できなかった。これらの相同タンパク質はアミノ酸は極めて類似しているが、物理的相互作用はないらしい。もう一群のクローンは分裂酵母Mal3であった。Mal3は真核生物全般に高度に保存されたタンパク質であり、ヒトではがん抑制遺伝子APCに結合する因子EB1として知られている。EB1, Mal3共に微小管結合活性を持ち、細胞内で微小管と共局在することが知られている。Dis1は自分自身、ならびにMal3と結合することで微小管機能を制御する因子かもしれない。また、Dis1, Mal3共にヒト相同遺伝子とアミノ酸の高度な保存性を保持していることから、この物理的相互作用ならびにそれら複合体の機能も種間を通じて保存された機構によるものかも知れない。本研究の一連の解析の結果により、進化的に高度に保存された分裂酵母の2つの微小管結合タンパク質Dis1, Mtc1は、微小管を介した細胞周期制御、とりわけ分裂期における微小管機能、並びに動原体機能に必須機能を持つことが明らかとなった。酵母におけるヒトch-TOG相同タンパク質Dis1ならびにMtc1について以下の解析を行なった。昨年までの研究結果より、Dis1,Mtc1が微小管結合タンパク質であると同時に、分裂期特異的に動原体DNAの中央領域に結合するタンパク質であることを明らかにし、その結合因子の探索を行なってきた。本年度の研究ではこれまでに同定したこれらの遺伝子産物と相互作用する因子の解析ならびに相互作用する因子の新たなスクリーニングを主として行なった。まずDis1を用いた酵母ツー・ハイブリッド法により分離したMal3についての解析を行なった。Mal3にクラゲ緑色蛍光タンパク質を融合し、細胞内でMal3遺伝子産物を可視化する系を構築した。その結果、免疫蛍光染色法により報告されていた結果と同じく、細胞内で微小管と共局在することが観察された。またこの系をさらに進め、生細胞内で経時観察を行なった結果、微小管、ならびに微小管に沿って点状のシグナルが観察され、さらにこれらの点状のシグナルは微小管に沿って移動しているのが観察された。
自律神経障害によるドライアイに関する基礎的、臨床的研究と新規治療の研究

ドライアイマウスを作成し、涙液分泌量、角膜上皮障害を野生型と比較する予定であった。また摘出涙腺から炎症性サイトカイン、免疫染色などの検討を腎不全マウスも用いて比較し、マウスでの涙液動態を調べる予定であったが、発表には至らなかった。また透析患者を糖尿病患者と非糖尿病患者に分け、比較検討を行う予定であったが発表には至らなかった。他にTRPV1欠失マウスにおける角膜新生血管の動態を研究した。マウス角膜を熱凝固し、角膜輪部から伸展する角膜新生血管はTRPV1欠失マウスでは野生型マウスに比べ伸展を抑制していた。この研究をJournal of Ophthalmologyに投稿し医学博士を授与した。マウス涙腺にボツリヌス毒素B型を投与し、ドライアイ動物実験マウスを作成した。その涙腺を摘出し、経時的にドライアイの評価を涙液分泌量、瞬目回数、角膜上皮の障害を検討した。またその涙腺を摘出し炎症性サイトカインである、TNFα、MCP-1、IL-6、TGF-βや好中球、マクロファージ、そのシグナル伝達系の蛋白発現を免疫染色やWesterm blot法を用い検討した。また自然発症肥満2型糖尿病モデルであるdb/dbマウスの涙液分泌量、瞬目回数、角膜上皮の障害の程度を検討した。また涙腺を摘出し同様に炎症性サイトカインやシグナル伝達系の蛋白発現を免疫染色など同様に検討し、mRNA発現はin situ hybridaization法、real-time Rt-PCR法を用いて検討した。また腎不全モデルも作成し同様にドライアイの涙液動態を検討した。これらの研究を踏まえて、糖尿病患者における涙液分泌量が低下している報告があることを説明し、同意を得た上で結膜炎、結膜結石、マイボーム腺の状態、涙液量、角膜びらんの有無などを検討し、ドライアイに関する診察を行う予定である。また血液透析患者においては、同様の診察を行うが透析前後での変化が生じていないのか、涙液のpH測定、涙液の成分分析、impression cytologyなどの検討も行う予定である。さらには透析患者を糖尿病患者と非糖尿病患者に分けて、副交感神経障害の透析によるドライアイの改善を推測し、新しいドライアイの治療法の手掛かりを検討していく。マウス涙腺にボツリヌス毒素B型を投与し、ドライアイマウス動物実験マウスを作成した。その涙腺を摘出し、経時的にドライアイの評価を涙液分泌量、角膜上皮の障害を検討した。またその涙腺を摘出し炎症性サイトカインである、TNFα、MCPー1、IL-6、TGFβや好中球、マクロファージ、そのシグナル伝達系の蛋白発現を免疫染色やWestern blot法を用いて検討した。また自然発症肥満2型糖尿病モデルであるdb/dbマウスの涙液分泌量、瞬目回数、角膜上皮障害の程度を検討した。また涙腺を摘出し同様に炎症性サイトカインやシグナル伝達系の蛋白発現を免疫染色など同様に検討し、mRNA発現はin situ hybridaization法、real time RTーPCR法を用いて検討した。これらの研究を踏まえt下、糖尿病患者における涙液分泌量が低下している報告があることを説明し、同意を得た上で結膜炎、結膜結石マイボーム腺の状態、涙液量、角膜びらんの有無などを検討し、ドライアイに関する診察を行う予定である。また血液透析患者にあおけては、同様の診察を行うが透析前後での変化が生じていないか、涙液のpH、涙液の成分分析、impression cytologyなどの検討も行う予定である。さらに透析患者を糖尿病患者と非糖尿病患者に分けて、副交感神経障害の透析によるドライアイの改善を推測し、新しいドライアイの治療法の手がかりを検討する。当教室にて作成したドライアイ動物実験マウスの涙腺を摘出し、経時的に涙液分泌量、瞬目回数、角膜上皮障害の有無を検討する予定であった。また摘出涙腺の炎症性サイトカイン、免疫染色などの検討を行う予定であった。この実験系は野生型、腎不全型マウスモデルでも検討する予定であった。この基礎研究結果をふまえて、臨床研究を行う予定であった。これまで糖尿病患者では涙液分泌量が低下しているという報告があり、ドライアイが重症化することが問題となるため、新たな治療法の検討を行う予定であった。患者から同意を得た上でマイボーム腺の状態、涙液量、角膜びらんの有無などを検討し、透析患者を非糖尿病と糖尿病患者に分けて検討する予定であった。基礎研究では発表を行えず、臨床研究においても、糖尿病患者への説明及び同意が遅れたため、マイボーム腺の状態、涙液量、角膜びらんの有無など、診察による臨床研究が遅れた。このため研究発表が行えなかった。また、この研究期間にマウス角膜における新生血管の研究を行った。重症化した角膜炎症性疾患では炎症により角膜混濁が残存することがある。これは炎症による瘢痕、線維化により起こる。我々は温度感受性イオンチャンネルであるTRPV1(transient receptor potential protein vanilloid 1)に着目した。TRPV1欠失マウスは角膜中央部を熱凝固した際に起こる輪部からの新生血管の伸展を抑制した。

real-time RT PCRでトランスフォーミング増殖因子1(TGFb1)のmRNAが低下しており、免疫組織学的検討ではTRPV1と血管内皮増殖因子の染色性が低下していた。このことからマウス角膜ではTRPV1欠失は新生血管の成長が抑制されると考られた。この研究はJournal of Opthalmologyに投稿し医学博士を授与した。ドライアイマウスを作成し、涙液分泌量、角膜上皮障害を野生型と比較する予定であった。また摘出涙腺から炎症性サイトカイン、免疫染色などの検討を腎不全マウスも用いて比較し、マウスでの涙液動態を調べる予定であったが、発表には至らなかった。また透析患者を糖尿病患者と非糖尿病患者に分け、比較検討を行う予定であったが発表には至らなかった。他にTRPV1欠失マウスにおける角膜新生血管の動態を研究した。マウス角膜を熱凝固し、角膜輪部から伸展する角膜新生血管はTRPV1欠失マウスでは野生型マウスに比べ伸展を抑制していた。この研究をJournal of Ophthalmologyに投稿し医学博士を授与した。糖尿病患者への説明及び同意が遅れているため、マイボーム腺の状態、涙液量、角膜びらんの有無など、診察による臨床研究が遅れている。同様に透析患者への説明及び同意が遅れているため、涙液のpH測定、涙液の成分分析、impression cytologyなどの臨床研究が遅れている。眼科糖尿病患者、及び透析患者への同意を得るための説明を増やす機会をもうける。さらにはこれらの結果を検討し新たなドライアイの治療の手がかりを検討する。学会などで発表にはいたっていないため、糖尿病患者および透析患者にドライアイと関連があることを説明し同意をいたうえで、涙液動態の検討を行う積極的に学会に出席し、新たな情報を入手し、今後の研究に役立てる学会費用や消耗品として実験消耗品を購入した今後の実験消耗品の追加購入が必要である
象牙質・歯髄複合体再生療法に新生面を開く基盤研究

申請者らは,間葉系幹細胞から分化する過程で細胞表面マーカーの発現が変動することに着目し,変動量の違いにより幹細胞特異的マーカーを特定できると考えた。しかしながら,骨芽細胞が分化中に産生する石灰化物はフローサイトメーターによる解析を困難にしていたため,この石灰化物を除去して,分化した細胞を回収する方法の開発に着手し,成功した。これにより,間葉系幹細胞マーカーの解析が可能となる。一方で, LIFの骨芽細胞分化における機能解析をおこなったところ, LIF-JAK-STAT3シグナル伝達経路により発現が誘導されるSOCS3により,骨芽細胞の分化を抑制性に制御することも明らかにした。歯科における2大疾患の一つであるう蝕は,う蝕病原細菌により象牙質・歯髄複合体が損なわれる疾病である。う蝕により失われた象牙質・歯髄複合体の回復を目指した薬剤を用いての治療法の開発は,多くの研究グループのもとで行われてきた。本申請課題は,薬剤ではなく,未分化間葉系幹細胞を用いて象牙質・歯髄複合体の回復を目指すという新たな治療法の確立を目標にしている。具体的には,未だ単離に成功していない未分化間葉系幹細胞の単離法の開発と遺伝子工学的な手法による未分化間葉系幹細胞の作成を目指し,象牙質・歯髄複合体再生治療につながる基盤的な研究を行う。平成24年度は,新規幹細胞集団(lin-BMSC)のプロファイリングとして,in vivoにおける硬組織再生能についての評価として移植実験を行った。C57BL6/Jから調整した様々な細胞数(1.0x10^5個,2.5x10^5個,7.5x10^5個,1.0x10^6個,1.5x10^6個,2.0x10^6個)の新規細胞集団をICR nudeマウスに移入する。約8週後に移植片を摘出しmicro-CTにて硬組織量を計測した。移植細胞数と硬組織産生量は,正の強い相関関係が認められた(r=0.97)。新規幹細胞集団(lin-BMSC)により再生する硬組織は、移植する細胞数と相関することが明らかとなった。また一方で,未分化間葉系幹細胞を維持もしくは分化を誘導するシグナル伝達経路についても検索を行った。我々は,マウスES細胞(Embryonic Stem Cell)を未分化な状態に維持するのに必要な因子として知られているLeukemia Inhibitory Factor(LIF)に着目し,解析を行った。骨芽細胞分化誘導培地中で3週間培養したのちALP染色およびvon Kossa染色を行い,CFU-0数を計測し,石灰化能を評価したところ,LIFを含む骨芽細胞分化誘導培地にて培養した骨髄ストローマ細胞のCFU-0数は,LIFを含まない骨芽細胞分化誘導培地にて培養した骨髄ストローマ細胞のCFU-0数に対して有意に減少していた。以上の結果からLIFは骨芽細胞への分化および石灰化を抑制することが明らかとなった。平成25年度は、LIFは骨芽細胞への分化および石灰化を抑制するメカニズムについて, LIF-JAK-STAT3シグナル伝達経路の活性化により誘導されるタンパクが骨芽細胞分化特にWnt/β-catenin経路に対し何らかの影響を及ぼしているという仮説のもとに解析をおこなった。まず, LIFの刺激により, STAT3がリン酸化されるかどうか調べたところリン酸化することがわかった。つまり,骨髄ストローマ細胞においてLIFにより, LIF-JAK-STAT3シグナル伝達経路が活性化することがわかった。次に, STAT3により誘導されるタンパクとしてSOCS3がある。そのSOCS3の発現について調べたところ, LIF刺激2時間後に, SOCS3のタンパクが検出された。さらに,このSOCS3はβ-cateninと会合していることが明らかとなった。以上の結果から, LIF-JAK-STAT3シグナル伝達経路により誘導されるSOCS3はβ-cateninと会合し, β-cateninをユビキチン化し,分解することでWntシグナルを抑制性に制御していることを明らかにした。

本研究課題は,間葉系幹細胞の分化過程における細胞表面マーカーの発現量の変化に着目することで,間葉系幹細胞の特定や分化の詳細なメカニズムの解明につながると考えた。しかしながら,骨芽細胞が分化中に産生する石灰化物がフローサイトメーターによる細胞表面マーカーの解析を困難にしていた。そこで,この石灰化物を除去して,分化した骨芽細胞を回収する方法を開発し,間葉系幹細胞に特異的な細胞表面マーカーを検討することを本研究の目的とした。また一方で,間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を制御している機構についても明らかにすることも目的とした。解析の結果,骨芽細胞が分化中に産生する石灰化物はフローサイトメーターによる細胞表面マーカーの解析を困難にしていた。そこで,この石灰化物を除去して,分化した骨芽細胞や象牙芽細胞を回収する方法の開発に成功した。これにより,間葉系幹細胞の特定や分化の詳細なメカニズムの解明が可能となる。一方で,幹細胞を未分化な状態に維持する働きがあるLIFの骨芽細胞分化における機能解析をおこなったところ, LIF-JAK-STAT3シグナル伝達経路により発現が誘導されるSOCS3により,骨芽細胞の分化を抑制性に制御することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。新規幹細胞集団(lin-BMSC)のin vivoにおけるプロファイリングについての研究成果は,国際的な学術雑誌に掲載された。また,未分化間葉系幹細胞を維持もしくは分化を誘導するシグナル伝達経路の研究についても国際学会および国内学会にてその研究経過を報告しており,おおむね順調に進展している。未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を誘導するシグナル伝達経路の研究成果は,国際的な学術雑誌に掲載された(in press)。また,未分化間葉系幹細胞のさらなる精製法についても国際学会にてその研究経過を報告しており,おおむね順調に進展している。本研究課題は順調に進展しており,現在のところ研究計画に変更はない。研究計画書に記載していたフローサイトメトリーを購入した結果,遺伝子導入実験のための予算が不足したため前倒し請求を行った。遺伝子導入実験は、現在も遂行中であり当該助成金は平成25年度において使用する予定である。研究の進捗状況が当初の予定よりも円滑に進行したため,実験試薬等の購入量が想定額よりも低く抑えることができたため。平成25年度は,より精製した幹細胞集団の細胞表面マーカー(CD44, CD73, CD90, CD105, Sca-1など)の発現パターンについて,フローサイトメトリーをもちいて包括的に解析することを予定している。したがって,各種細胞表面マーカー抗体を購入する必要性があるため,抗体の購入に充てる予定である。
二重免疫法によるテーラーメイド人工酵素(抗体酵素)の新機能創出

本研究では,「二重免疫法」と名付けた新たな免疫手法を用いて抗体酵素の新しい機能を創出するとともに,高活性化を検討した.特に触媒反応のための抗原結合部位における分子認識を最適化するための方法を開発した.トリフルオロアセチル基を有するリン酸遷移状態アナログとアセチル基を有するリン酸遷移状態アナログを順次免疫する二重免疫法によりそれぞれのハプテンを単独免疫する方法により得られた抗体酵素より触媒活性の高い抗体酵素を獲得することに成功した.抗体酵素の各種反応速度パラメーター,アミノ酸配列を決定し,抗体酵素の触媒機構について考察した.本研究では,「二重免疫法」と名付けた新たな免疫手法を用いて抗体酵素の新しい機能を創出するとともに,高活性化を検討した.特に触媒反応のための抗原結合部位における分子認識を最適化するための方法を開発した.トリフルオロアセチル基を有するリン酸遷移状態アナログとアセチル基を有するリン酸遷移状態アナログを順次免疫する二重免疫法によりそれぞれのハプテンを単独免疫する方法により得られた抗体酵素より触媒活性の高い抗体酵素を獲得することに成功した.抗体酵素の各種反応速度パラメーター,アミノ酸配列を決定し,抗体酵素の触媒機構について考察した.天然酵素は,「遷移状態の安定化」に加え,「一般酸・塩基触媒」,「求核触媒」,「金属触媒」などの複数の触媒因子を使って,高い反応効率を獲得している.しかしながら,我々のこれまでの研究結果が示しているように,これまでの抗体酵素は,単一の触媒因子(遷移状態の安定化)で反応を触媒しているため,その活性は低いものにとどまっている.この原因の一つに,従来の方法では単独の遷移状態アナログを使用して抗体を作製するために,複数の触媒因子を導入することが困難なことが挙げられる.そこで,本提案では,2種類のリン酸型遷移状態アナログを組み合わせた二重免疫法により,抗原結合部位における分子認識の最適化を検討した.1.ハプテンの合成:リン酸ジエステル(1および2)を合成しKLHやBSAと結合させ,ハプテンコンジュゲートを作製する.2.二重免疫:ハプテンコンジュゲートをマウスに免疫する.1,1,1,2の順にマウスに免疫を行った.3.細胞融合,モノクローン化,および抗体の精製:電気細胞融合装置を用いて,ミエローマ細胞と脾臓細胞との細胞融合を行った.ハイブリドーマをクローニングによりモノクローンとして,それぞれのハイブリドーマを大量培養した.抗体は,プロテインGカラムを用いてFPLCにより精製した.天然酵素は,「遷移状態の安定化」に加え,「一般酸・塩基触媒」,「求核触媒」,「金属触媒」などの複数の触媒因子を使って,高い反応効率を獲得している.しかしながら,我々のこれまでの研究結果が示しているように,これまでの抗体酵素は,単一の触媒因子(遷移状態の安定化)で反応を触媒しているため,その活性は低いものにとどまっているこの原因の一つに,従来の方法では単独の遷移状態アナログを使用して抗体を作製するために,複数の触媒因子を導入することが困難なことが挙げられる.本年度は,2種類のリン酸型遷移状態アナログを組み合わせた二重免疫法により得られた抗体酵素の機能解析を行った.1.抗体酵素の動力学的パラメータの決定:抗体酵素について,エステル基質を用いて,加水分解反応速度を高速液体クロマト・グラフィーにより測定し,Michaelis-Menten式より動力学的パラメータを決定した.2.抗体酵素のpH依存性の解析:抗体酵素のエステル加水分解反応について,pH依存性を検討した.3.抗体酵素の遺伝子クローニング:抗体酵素の抗体遺伝子をマウス抗体遺伝子クローニング用プライマーを用いて増幅させ,抗体発現ベクターへ組み込みクローニングを行った.得られたベクターを大腸菌へ導入し,ELISA法により抗体の産生を確認した後,DNAシークエンスを行い,抗体のアミノ酸配列を推定した。本研究では,2種類のリン酸型遷移状態アナログを組み合わせた二重免疫法により,抗原結合部位における分子認識の最適化を検討した.昨年度までに,2種類のリン酸型遷移状態アナログを組み合わせた二重免疫法により,単独の免疫により得られる抗体酵素よりも活性の向上した抗体酵素を獲得することに成功し,その詳細な速度論的パラメータを明らかにした.本年度は,本抗体酵素の触媒機構についてさらに詳細を検討するとともに,新たにリン酸型ハプテンとエポキシドとの組み合わせにより二重免疫を行った.(1)抗体酵素の構造解析:2種類のリン酸ハプテンの免疫により得られた抗体酵素について,昨年度得られたアミノ酸配列の結果をもとに,分子モデリングを行い,その触媒機構について考察した.(2)リン酸型ハプテンとエポキシドとの二重免疫:リン酸型ハプテンとエポキシドを順次マウスに免疫し,通常の手法により細胞融合を行い,マウスハイブリドーマを作製した.それぞれのハイブリドーマを大量培養し,プロテインGカラムを用いて精製した.(3)触媒活性のスクリーニング:精製したモノクローナル抗体にいついて,エステル基質を用いて,加水分解反応速度を高速液体クロマトグラフィーにより測定し,触媒活性のある抗体を特定した.触媒活性の観測された抗体が得られたので,反応速度と基質濃度との関係を調べ,Michaelis-Menten式より反応速度パラメータを決定した.その結果,通常のエステラーゼ抗体酵素より顕著に活性の高い抗体は得られなかった.
斑点米カメムシ類のイネ加害メカニズムに関わる植物香気物質の解明

斑点米カメムシはイネが出穂すると周辺のイネ科雑草・牧草地から水田に侵入し、子実を吸汁することにより斑点米を生じさせる。斑点米カメムシの主要種アカヒゲホソミドリカスミカメを用いて水田への侵入メカニズムを解析したところ、彼らは開花しているイネ穂の香気に誘引されることにより、水田へ侵入することが明らかになった。さらに、開花したイネ穂から多く放出されるβ-caryophyllene等いくつかの物質が誘引の原因物質であることを突き止めた。斑点米カメムシの最重要種、アカヒゲホソミドリカスミカメの寄主植物香気に対する嗅覚応答を調査した。春夏にかけての好適寄主であるスズメノカタビラ香気に対する反応を、幼虫、雌雄成虫で調査した。幼虫および雄成虫はスズメノカタビラ香気に有意に誘引された。雌成虫も有意ではないが誘引される傾向が認められた。以上より、本種は寄主探索の際、寄主植物香気を利用していることが示された。そこで、本種の好適寄主とされている他の3種のイネ科雑草(オヒシバ、メヒシバ、スズメノテッポウ)香気に対する本種成虫の嗅覚応答を調査した。雌成虫はスズメノテッポウ、オヒシバの穂およびメヒシバの穂と茎葉の香気に、雄成虫はスズメノテッポウ、メヒシバの穂およびオヒシバの茎葉の香気に誘引されることが明らかになった。次にイネ香気の本種に対する誘引性を、イネの生育段階、部位別に調査した。4葉期、功穂形成期、開花期の茎葉および開花期、乳熟期、成熟期の穂について調査したところ、雌雄成虫ともに功穂形成期の茎葉に有意に誘引された。雌成虫は開花期の穂にも有意に誘引され、雄成虫は開花期の穂に有意ではないが誘引される傾向が見られた。各生育段階のイネとその時期に優占種となっているイネ科雑草の香気とを選択させたところ、雌雄成虫ともに、開花前のイネ香気よりもその時期のイネ科雑草の香気を有意に選好することが明らかになった。しかし、開花期のイネではその時期のイネ科雑草よりも同等以上に好むことが明らかになった。乳熟期、成熟期のイネでは、その時期のイネ科雑草との間に選好性の違いは認められなかった。以上のことより、雌雄成虫とも、イネ開花前はイネ科雑草の香気の方を好むが、イネが開花するとイネの香気の方を好むことが明らかになった。イネが開花すると本種が水田内に侵入するのは、イネおよびイネ科雑草香気に対する本種の嗅覚応答が大きく関与していることが示された。アカヒゲホソミドリカスミカメは米に甚大な被害を及ぼす斑点米カメムシの最重要種である。本種はイネの出穂に伴い水田内に侵入するが、そのメカニズムは明らかでなかった。この解明は防除技術の確立に大きく貢献する他、新たな発生予察技術の開発に繋がると考えられる。昨年度の研究で、本種はイネ科雑草の香気に誘引されること、イネの誘引性はイネの生育段階により変化し、幼穂形成期の地上部全草および開花期の穂が誘引することを明らかにした。また、イネとイネ科雑草香気に対する選好性もイネの生育段階により変化し、イネ開花前はイネ科雑草を好むのに対し、開花期はイネをやや好み、それ以降は同程度に好むことも明らかにした。これを受け、本年度はイネ開花期における本種の水田内侵入メカニズムを物質面で解明するために、イネ香気成分の生育に伴う変化を部位別に分析した。SPMEによるヘッドスペース分析により、幼穂形成期の地上部全草および開花期穂の香気には共通してβ-caryophylleneが特異的に多く含まれていることを明らかにした。その他の物質としては開花期穂でmethyl benzoateが、幼穂形成期地上部全草および開花期穂でβ-elemeneの放出量が特異的に多かった。そこで、β-caryophylleneの本種に対する誘引性を、標品を用いて調査したところ、ゴムキャップに0.001%濃度で含浸させた本物質が雌に対して誘引性を示すことが明らかになった。本濃度で処理したゴムキャップから放出されるβ-caryophyllene量は、開花期イネ穂から放出される量とほぼ同量であることも、分析結果から明らかになり、β-caryophylleneが本種の水田内侵入に関与する物質の一つであることが明らかになった。物質面から本種の水田内侵入メカニズムの一部が解明されたことは、本種の防除技術の確立に向け大きく貢献するものと思われる。斑点米カメムシの最重要種、アカヒゲホソミドリカスミカメはイネの出穂に伴い水田に侵入するが、その侵入メカニズムは不明であった。

昨年度までの研究で、イネの本種への誘引性はイネ生育段階により変化し、開花期穂の香気が雌成虫を強く誘引することを明らかにした。さらに、開花期穂からの放出量が特に多いβ-カリオフィレンを誘引因子の一つと特定したが、本物質は雌にのみ誘引性を示し、雄には誘引性を全く示さなかった。本年度は同じく主要香気成分の一つ、β-エレメンの誘引効果を調査したが、本物質は誘引効果を示さず、β-カリオフィレンに添加すると逆に誘引性を抑制した。そこで開花期穂主要香気成分5種(上記2種+安息香酸メチル+n-デカナール+ゲラニルアセトン)、6種(5種+サリチル酸メチル)、7種(6種+n-トリデセン)、8種(7種+(Z)-ツヨプセン)、9種(8種+2-ヘプタノン)、10種(9種+d-リモネン)混合物の効果を調査した。7種混合物のみが雌成虫を有意に誘引し、雄成虫にも誘引傾向を示した。このことからn-トリデセンも誘引に関与していることが明らかになった。また、8種混合物には誘引性がなかったことから、(Z)-ツヨプセンは誘引に抑制的に働くことが示された。上記7種混合物から安息香酸メチルを除くと誘引性が消失することも示され、安息香酸メチルも誘引に関与していることが明らかになった。以上の結果から、開花期穂の本種誘引性にはβ-カリオフィレン、n-トリデセン、安息香酸メチルの少なくとも3物質が関与していることが明らかになった。これら3物質は開花期のイネ穂で放出量が特に多くなることから、イネが開花すると穂からこれらの物質が放出され、それにより本種は水田内に侵入することが明らかになった。この知見は、本種の水田内侵入メカニズムを利用した新たなモニタリングトラップの開発に、また、効率的な防除対策の立案に繋がることが期待できる。
動脈硬化を予防する食事因子-女性ホルモン合成酵素・アポE欠損マウスによる検討

エストロゲン合成酵素であるアロマターゼ遺伝子をノックアウトしたマウス(ArKOマウス)では血清のエストロゲンが検出されない。メスでは卵巣の発達に異常があり、オス、メスともに脂肪肝が観察される。このため、エストロゲンに依存する動脈硬化研究のモデル動物として期待が持たれている。これまでの検討から、ArKOマウスを高コレステロール食で飼育しても正常マウスと同様に動脈硬化になりにくいことがわかった。マウスは血清にHDLを多く含むラット型の動物であり、ヒトやウサギのようにHDLを多く持たない動物のようには動脈硬化にならない。このために女性ホルモンがないArKOマウスにおいても、非常に動脈硬化を起こしにくいものと思われた。以前からHDLに含まれるアポE遺伝子をノックアウトしたマウス(ApoEKOマウス)は普通食で飼育してもアテローム性動脈硬化症を起こすために動脈硬化のモデル動物として知られている。そこで、ArKOマウスとApoEKOマウスをかけあわせて、ダブルノックアウト(DKO)マウスを作出し、エストロゲンの有無が動脈硬化にどのように働くかを検討した。DKOマウスの血清総コレステロール値は、♂、♀につき、♂1368±638mg/dl (n=8)、♀704±245mg/dl. (n=7)であった。血清トリグリセリド値は。♂、♀につき、969±869mg/dl (n=8)、♀251±121mg/dl (n=7)であった。ArKOマウスやApoEKOマウスに比べて、明らかに高脂血症になっていた。DKOマウスの大動脈を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後、切片を作成し、染色後光学顕微鏡で動脈硬化部位を観察した。解析には、病変の面積率でその病変を判定した。その結果、DKOマウスはApoEKOマウスに起きる動脈硬化病変がむしろ縮小していることがわかった。♀では、DKOマウスの病変面積率は16±8%に有意に縮小していた(p<0.0001、n=11)。♂においても、病変面積率は28±6%で、有意に縮小していた(p=0.0022、n=12)。以上のことから、本マウスでは、高コレステロール血症と動脈硬化の発症とは、必ずしも相関しないことが判明した。エストロゲンは男性ホルモンのテストステロンを基質として、卵巣などの生殖器官に存在する女性ホルモン合成酵素であるアロマターゼと呼ばれるチトクロームP-450酵素の触媒によりつくられる。アロマターゼ遺伝子をノックアウトしたマウス(ArKOマウス)では血清のエストロゲンが検出されない。しかし、血清脂質などの結果から、正常マウスと比較すると動脈硬化の方向に向かっていることが示唆された。

マウスは血清にHDLを多く含むラット型の動物であり、ヒトやウサギのようにHDLを多く持たない動物のようには動脈硬化にならない。このために女性ホルモンがないArKOマウスにおいても、非常に動脈硬化を起こしにくいものと思われた。以前からHDLに含まれるアポE遺伝子をノックアウトしたマウス(ApoEKOマウス)は普通食で飼育してもアテローム性動脈硬化症を起こすために動脈硬化のモデル動物として知られている。そこで、ArKOマウスとApoEKOマウスをかけあわせて、ダブルノックアウト(DKO)マウスを作出し、エストロゲンの有無が動脈硬化にどのように働くかを検討した。DKOマウスでは、ApoEKOマウスよりも顕著な動脈硬化の増悪が期待された。DKOマウスの大動脈を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後、切片を作成し、染色後光学顕微鏡で動脈硬化部位を観察した。その結果、DKOマウスはApoEKOマウスよりも動脈硬化の増悪がみられなかった。したがって、閉経後の女性の動脈硬化の発症にはエストロゲンだけでなく、他の影響を強く受けていると思われた。エストロゲンは男性ホルモンのテストステロンを基質として、卵巣などの生殖器官に存在する女性ホルモン合成酵素であるアロマターゼと呼ばれるチトクロームP-450酵素の触媒によりつくられる。アロマターゼ遺伝子をノックアウトしたマウス(ArKOマウス)では血清のエストロゲンが検出されない。メスでは卵巣の発達に異常があり、オス、メスともに脂肪肝が観察される。このため、エストロゲンに依存する動脈硬化研究のモデル動物として期待が持たれている。これまでの検討から、ArKOマウスを高コレステロール食で飼育しても正常マウスと同様に動脈硬化になりにくいことがわかった。しかし、血清脂質などの結果から、正常マウスと比較すると動脈硬化の方向に向かっていることが示唆された。そこで、ArKOマウスとApoEKOマウスをかけあわせて、ダブルノックアウトの(DKO)マウスを作出し、エストロゲンの有無が動脈硬化にどのように働くかを検討した。解析には、病変の面積率でその病変を判定した。その結果、DKOマウスはApoEKOマウスに起きる動脈硬化病変がむしろ縮小していることがわかった。♀では、DKOマウスの病変面積率は16±8%に有意に縮小していた(P<0.0001、n=11)。♂においても、病変面積率は28±6%で、有意に縮小していた(P=0.0022、n=12)。以上のことから、エストロゲンを介する動脈硬化予防効果は、未知の遺伝子を介する複雑な機構が働いているものと思われる。エストロゲン合成酵素であるアロマターゼ遣伝子をノックアウトしたマウス(ArKOマウス)では血清のエストロゲンが検出されない。
「移動」の文学表象におけるジェンダーと言語

本研究では、日本帝国の崩壊後に生じた、植民地からの引揚げや戦地からの復員といった大規模な「祖国」への帰還の物語を読み解くと同時に、「残留」の物語や残留者としての在日朝鮮人による北朝鮮への帰国運動、また、60年代の炭坑地帯における移動労働者や21世紀の非正規雇用の若者と不法移民の物語など、さまざまな小説テクストやドキュメンタリーを取りあげて、植民地主義とポスト植民地主義の時代における移動経験の分析を行った。研究成果の一部は本年(2014年)1月に平凡社から『「帰郷」の物語/「移動」の語りー戦後日本におけるポストコロニアルの想像力ー』として刊行された。研究初年度である本年度に実施した研究の内容と成果については以下の通りである。1. 2010年6月:海外研究協力者(B・ド・バリー、朴裕河)および国内研究協力者(西川祐子、伊豫谷登士翁、坪井秀人、美馬達哉)とともに、戦時中の強制連行と戦後の引揚げ・復員に関する現地調査を行い(舞鶴引揚記念館、大江山ニッケル鉱山跡地ほか)、第1回目の研究会を行った。研究の前提である"移動"研究のパラダイムへの時空軸の挿入についての議論を行い、文学・歴史研究および社会科学研究としての方法論的な接点と位置づけについて、共同研究としての方向性を設定した。2. 2010年12月:韓国曝園アジア文化研究所と建国大学アジア・ディアスポラ研究所の共催によるシンポジウム<<植民地とディアスポラ>>で招待講演を行った。ロシア沿海州における「高麗人」、占領下上海における朝鮮人移住者、戦時下の朝鮮人強制戦争動員と戦後の送還などパネル報告者との討議を通して、本研究における"移動"研究の脱中心化の重要性が評価された。3. 2011年1月:台湾国立交通大学社会與文化研究所主催のシンポジウム越境移動與漂流的記憶>>に参加し、国内研究協力者とともに研究発表を行い、併せて日式住宅など植民地遺跡や移民労働者の集住地区における支援団体事務所を対象とした現地調査を行った。日本の植民地支配下の朝鮮半島と台湾との比較、および台湾の過去と現代との比較を通して、研究パラダイムにおける空間的差異と時間的差異の分節と綜合の重要性と困難さを確認することができた。4. 2011年2月1本年度の最後の研究会を開いて、研究の総括と取りまとめおよび来年度の研究計画について打ち合せを行った。研究第二年度である本年度に実施した研究の内容と成果については以下の通りである。1.2011年49月:英国オックスフォード大学付属図書館所蔵の大英帝国時代の植民地支配における文化政策関係資料、移民歴史資料、日本関係資料(アストン文庫)のうち言語関係図書等を中心とした調査を行った。また、ケンブリッジ大学を中心とする日本研究者(日本文学・日本近現代史)、移民研究・地域文化研究、ジェンダー研究に従事する研究者・大学院生とワークショップと情報交換会を行った。2.2011年5月:ロンドン大学東洋アフリカ学院(SOAS)主催シンポジウム"GENDER AND TRANSCULTURAL PRODUCTION"に参加し、グローバリゼーションとジェンダー研究に関する情報収集および情報交換を行った。3.タリン大学主催ヨーロッパ日本研究集会に参加し、ヨーロッパにおける日本文学研究およびポストコロニアル文学研究に関する情報交換を行った。5.2011年12月:国外の研究協力者(朴裕河)および国内連携研究者(西川祐子、伊豫谷登士翁、美馬達哉)とともに研究会を持ち、本年度における各研究状況の報告および総括を行い、研究成果の取りまとめに関する方針および最終年度の研究計画について打ち合せた。研究期間の最終年度にあたる2012年度(一部を2013年度に繰越)は、一橋大学の科研費プロジェクト(伊豫谷登士翁代表)とのコラボレーションを引きつづき進め、成果発表に向けた原稿の集約および編集作業と併行して以下の作業を行った。1.2012年5月18日:上海大学当代文化研究中心主催ワークショップ" Thinking in The Vision of Moving "に参加して、堀田善衛『上海にて』に関する報告を行い、「移動」におけるジェンダー研究に関する情報交換を行った。2.2012年7月:オーストラリア国立大学アジア太平洋学院と大阪大学科研プロジェクト(北原恵代表)共催のワークショップに参加し、日本への密航者であり北朝鮮帰国者である朝鮮人画家・曹良奎についての報告を行った。3.2012年8月:海外研究協力者および国内研究協力者ら論文執筆メンバーに、出版社から担当の編集者を加えた研究会を開き、各論の最終原稿について検討を行った。論文相互の連携と論文集としての一体性を確保するための編集方針を決定し、論文間の調整作業を行った(13年8月。2014年1月に『「帰郷」の物語/「移動」の語り:戦後日本におけるポストコロニアルの想像力』を研究成果として平凡社から刊行)。

半年間の研究休暇を得て研究に専念することができたため、国内外での資料の調査収集ならびに情報交換が進み、本研究へのフィードバック可能な知見も数多く得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画以上に進展しているため、今後の研究方針を研究成果の取りまとめに力点を置いたものに変更し、共同作業を進めていく。
顎顔面補綴装置を用いる頭頸部癌患者に対する栄養アセスメント

頭頸部腫瘍患者の栄養状態をMini Nutritional Assessment-Short Form(MNA-SF)を用いて明らかにし、その影響因子を検討することを目的とした。被験者は東京医科歯科大学歯学部附属病院顎義歯外来を訪れた患者のうち、46名(平均年齢74.7歳)を対象とした。被検者の約半数(45.6%)は、低栄養(4.3%)または低栄養の危険性(41.3%)があった。ステップワイズ法による重回帰分析を用い、MNA-SFスコアに影響を及ぼす予測因子を同定した。顎義歯を長く使用することは、栄養状態の改善に関与し、頸部郭清術の既往は栄養状態を低下させる可能性があることが示唆された。今回の研究では本学歯学部顎義歯外来を受診した頭頸部がん患者を対象に手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時、最終顎義歯装着時の各時点における栄養アセスメント(主観的手法と客観的手法)と補綴的観点よる咀嚼機能評価を行うことを目的としている。本年度は初年度であるため、大学に設置された倫理委員会への申請を行い、その承認を得た。すべての被験者に研究目的、研究方法、承諾しない場合であっても一切の不利益を受けないこと、承諾後であってもこれを撤回できること、この研究参加においてプライバシーが厳守されること、研究結果を学会等に報告することを説明し、承諾を得た場合に同意書に署名捺印を受け、確認後研究を開始した。初年度においては最終顎義歯を装着する段階に進んだ患者はいない為、手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時の各時点において、研究計画に沿った方法(主観的手法として簡易的栄養状態評価表、摂取可能食品アンケート法、University of Washington Quality of Life Questionnaire及び客観的手法として静的栄養指標、動的栄養指標)にてデータ収集を行った。本年度に得られたデータをさらに経時的に追跡し、また今後さらに研究に参加する患者総数を増やす必要があると考えられる。また、関連学会に多く出席し、情報収集および当該分野における研鑽を積み、研究の最前線についての知識を得ることができ、本年度得られた成果の一部は既に発表予定となっている。大学に設置された倫理委員会への申請を行い、その承認を得たのですべての被験者に倫理員会の承認を受けた同意書に署名捺印を受け、確認後研究を開始した。本年度においては最終顎義歯を装着する段階に進んだ患者が数名程度であったが、手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時、最終顎義歯装着時の各時点において、研究計画に沿った方法(主観的手法として簡易的栄養状態評価表、摂取可能食品アンケート法、University of Washington Quality of Life Questionnaire及び客観的手法として静的栄養指標、動的栄養指標)にてデータ収集を行った。また、手術後も追加治療を行う場合もあったため、患者の現状を把握するようにフォローを続けることが研究遂行のために必要である。追加治療による影響によって補綴装置の選択および補綴装置の装着期間は変化することも踏まえた追跡が必要となった。研究開始に必要な倫理申請を提出し、本学の倫理審査委員会より承認を受けた上での研究を行うことが可能となり、本年度は手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時、最終顎義歯の各時点において、研究計画に沿った方法にてデータを収集することが出来たが収集できたデータは目標数より少なくなったため。大学に設置された倫理委員会への申請を行い、その承認を得たのですべての被験者に倫理員会の承認を受けた同意書に署名捺印を受け、確認後研究を開始している。本年度は得られた研究結果を関連雑誌へ投稿し、受理された。また、関連学会に多く出席し、情報収集および当該分野における研鑽を積み、研究の最前線についての知識を得ることができ、またさらに成果の一部は既に発表予定となっている。

研究開始に必要な倫理申請を提出し、本学の倫理審査委員会より承認を受けた上での研究を行っており、本年度は手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時、最終顎義歯の各時点において、研究計画に沿った方法にてデータを収集することが出来たから。本研究は頭頸部癌患者における栄養アセスメントを手術前から手術後の顎顔面補綴装置装着時へ経過を追って、客観的機能評価と主観的評価を併用し総合的に評価することを試みるものである。本学歯学部顎義歯外来を受診した頭頸部がん患者を対象に手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時、最終顎義歯装着時の各時点における栄養アセスメントを行った。本研究により周術期における患者の栄養状態の程度や各段階における顎義歯装着による栄養評価を知ることができた。その中で頭頸部腫瘍への治療を受けている患者の栄養状態をMini Nutritional Assessment-Short Form(MNA-SF)を用いて明らかにし、頭頸部腫瘍患者の栄養状態に影響を及ぼす因子を検討行うことが可能であった。被験者は東京医科歯科大学歯学部附属病院顎義歯外来を訪れた患者のうち、46名(平均年齢74.7歳)を対象とした。顎義歯治療のために診察を受けた頭頸部腫瘍患者の約半数(45.6%)は、低栄養(4.3%)または低栄養の危険性(41.3%)があった。さらにステップワイズ法による重回帰分析を用いて、MNA-SFスコアに影響を及ぼす予測因子を同定した。独立変数として、年齢、性別、顎義歯の使用経験、残存歯数、上下顎別切除部位、頸部郭清術の有無、治療方法を用いた。結果、対象となった患者の約半数に低栄養の危険性があることがわかった。MNA-SFスコアの回帰式は、顎義歯の使用経験と頸部郭清術の有無の2つの独立変数を用いることで説明された。顎義歯をより長く使用することは、栄養状態の改善に関与し、頸部郭清術の既往は栄養状態を低下させる可能性があることが示唆された。頭頸部腫瘍患者の栄養状態をMini Nutritional Assessment-Short Form(MNA-SF)を用いて明らかにし、その影響因子を検討することを目的とした。被検者の約半数(45.6%)は、低栄養(4.3%)または低栄養の危険性(41.3%)があった。ステップワイズ法による重回帰分析を用い、MNA-SFスコアに影響を及ぼす予測因子を同定した。顎義歯を長く使用することは、栄養状態の改善に関与し、頸部郭清術の既往は栄養状態を低下させる可能性があることが示唆された。研究開始に必要な倫理申請を提出し、本学の倫理審査委員会より承認を受けた上での研究を行うことが可能となり、初年度として必要な手術前、入院中の暫間補綴装置装着時、退院後の暫間補綴装置装着時の各時点において、研究計画に沿った方法にてデータを収集することが出来たから。本年度に得られたデータをさらに経時的に追跡し、また今後さらに研究に参加する患者総数を増やす必要があると考えられる。本研究を遂行する上で、本学歯学部口腔外科、本学医学部頭頚部外科および他施設からの顎顔面欠損が生じる可能性のある患者について、手術前からの診査診断、手術直後に装着する暫間補綴装置の作製のために本学歯学部顎義歯外来に受診していただくよう、各科の更なる連携を強め、協力を求め患者の現状を把握するようにフォローを続けることが研究遂行のために必要である。
重複障害幼児の視覚活用を促す指導プログラムの開発

重複障害幼児における視覚活用の困難さについて、(1)眼球の光学系の異常、(2)眼球の疾患、(3)視覚伝達路の疾患・損傷、(4)大脳視覚野の損傷、(5)大脳頭頂葉の損傷の5つに機能的分類を行った。(1)については知的障害幼児への光学的屈折状態のアセスメントの方法と視覚補償による学習・行動への効果について検証した。また、(2)(5)について、効果的な視覚活用学習をするため刺激提示補助具を開発し、その効果について検討した。補助具は、視対象を傾けて提示することのできる書見台であり、背景輝度および、背景と視対象とのコントラストを見やすくすることのできるものである。試作した書見台を、知的障害幼児施設、盲学校、および弱視学級において評価し、製品化された。上記の刺激提示補助具を用いて、下記の指導ステップすなわち、(1)視対象への気づきと定位、(2)視対象持続的把握とスキャンニング、(3)視覚-運動協応と形態の方向づけ、(4)立体での方向の認識、(5)形の分解・構成と構成模倣、(6)描画と模写、(7)視覚刺激のコントロールによる類腹・系列概念の学習、による視覚活用学習を行い、指導プログラムおよび刺激提示補助具の効果について事例的に検証した。その結果、どのタイプの子どもにも指導ステップおよび補助具の活用が有効であり、特に(3)(5)に機能的に分類されるタイプの子どもでは、指導ステップの構造化と補助具の活用が学習効果に大きく寄与することが明らかになった。(3)の視覚伝達路の疾患・損傷のタイプでは、視覚活用学習において実用的な視野評価の必要性が指摘された。この点について、日常の学習活動で行うことのできる対面法による視野評価および、書見台を活用したスキャンニング課題における視対象の発見過程を視標とした評価を試みた。その結果、上記の方法で得られた視野評価の結果は、視覚活用学習における配慮において有用な情報となることを検証した。重複障害幼児の視覚活用を促す指導プログラムの開発のために、幼児期における視覚活用の困難さの機能的分類を試みた。具体的には、視覚の活用に何らかの困難のある重複障害幼児をその原因から、眼球の疾患、視覚伝達路の疾患・損傷、大脳視覚野の損傷、および大脳頭頂葉の損傷の4タイプに分類し、それぞれのタイプにおける視機能の特性について事例的に評価し検討した。結果の概要は以下ようであった。(1)視力障害は、原因疾患のタイプにかかわらず、眼疾患・脳損傷の程度によって様々であった。(2)立体視は、疾患・損傷の種類・程度にかかわらず、検出が困難であった。(3)視野障害は、視覚伝達路の疾患・損傷および、それ以降の脳損傷において必ず出現した。(4)眼疾患による視野障害と、視覚伝達路以降の疾患・損傷による視野障害とではタイプが異なり、機能的には後者の方が視覚活用の困難さが大きい傾向がみられた。(5)大脳頭頂葉の損傷のタイプでは、視力・視野などの機能レベルに比して、実際の視覚活用のスキル、すなわち注目・追視・スキャンニングに困難さが大きい傾向がみられた。これらの結果から、重複障害幼児の視覚活用を促すためには、個々の疾患・損傷および機能レベルに応じた指導プログラムの開発が必要であると考えられた。また、そのためには視覚活用への影響の大きいと考えられる視野について、重複障害幼児に実用的に適用できる評価法の検討が必要と考えられた。
メカニカルストレスによる歯根膜細胞のアポトーシス誘導に関する研究

矯正治療においては、メカニカルストレスにより歯の移動が行われるが、メカニカルストレスが生物学的反応に置換されるメカニズムについては、不明なままである。そこで、これを解明する手がかりを得るために、メカニカルストレスにより歯根膜細胞に誘導される遺伝子の同定を試みた。平成15年度には、矯正治療上、抜歯が必要と診断された患者に実験の趣旨を説現して同意を得た後、同歯の歯根膜を用いて、Flex bottom plateのシリコン膜上で細胞をアウトグロースさせた。これにより得られた歯根膜初代培養細胞に対し、持続的伸展力を、1時間、6時間、24時間負荷した後、総RNA約3μgを各々回収・精製した。これらを逆転写してcDNAを合成し、これを^<32>Pでラベルして、マクロアレイ法にて遺伝子発現の差を網羅的に検討した。その結果、遺伝子発現が最も大きく変化するのは、伸展力負荷後1時間で、その後、次第にコントロールと発現差がなくなることがわかった。メカニカルストレスに反応して発現の変動を認めた遺伝子として、サイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックス、細胞膜上蛋白の他、アポトーシス誘導遺伝子、あるいは細胞周期調節遺伝子等が挙げられた。これらの遺伝子のうち数種類について、quantitative RT-PCRにより定量的に遺伝子発現の差を調べた結果、マクロアレイ法で得られた結果が信頼できるものであることを確認した。平成16年度には、平成15年度の実験の再現性を確認するため、異なる5人の患者から歯根膜を採取し同様に実験を行った。その結果、細胞膜上蛋白遺伝子の変動に関しては、いずれも同様の傾向を示したが、それ以外の遺伝子発現に明らかな再現性はないことがわかった。これは、ドナー間の差異あるいは、多様な細胞集団を有する歯根膜の特性によるものと考えられた。また、メカニカルストレスを付与した歯根膜の初代培養細胞に、実際にアポトーシスの実行が行われているかどうかを確認するため、DNA ladder detection法、TUNEL assayを行ったところ、アポトーシスの所見は認められなかった。更に、メカニカルストレスにより最も発現が誘導された遺伝子発現の経路をウエスタンブロット法及び阻害実験にて検討した結果、少なくともp38MAPKを介する事がわかった。これらのことより、メカニカルストレスにより歯根膜細胞に誘導される遺伝子について、重要な手がかりが得られた。矯正治療上、抜歯が必要と診断された患者に実験の趣旨を説明して同意を得た後、同歯の歯根膜を用いて、Flex bottom plateのシリコン膜上で細胞をアウトグロースさせた。これにより得られた歯根膜初代培養細胞に対し、持続的伸展力を、1時間、6時間、24時間負荷した後、酸性グアニジンフェノールクロロホルム法にて対照群、ストレス負荷群の総RNA約3μgを各々回収・精製した。これらを逆転写してcDNAを合成し、cDNAを^<32>pでラベルして、マクロアレイ法にて遺伝子発現の差を網羅的に検討した。遺伝子発現が最も大きく変化するのは、伸展力負荷後1時間であることがわかった。マクロアレイ法により、ストレスに反応して発現の変動を認めた遺伝子として、細胞膜上蛋白や、アポトーシス誘導遺伝子、あるいは細胞周期調節遺伝子等が挙げられた。

これらの遺伝子のうち数種類を選択しprimerを各々作製して、quantitative RT-PCRで定量的に遺伝子発現の差を調べ、マクロアレイ法で得られた結果が信頼できるものであることを確認した。以上の実験は、再現性を確認するため、歯根膜提供者を変えて5種類行った。その結果、メカニカルストレスによる細胞膜上蛋白遺伝子の変動は、いずれも同様の傾向にあったが、それ以外の遺伝子発現に再現性を認めなかった。これは、ドナー間の差異、あるいは、多様な細胞集団という歯根膜の特性によるものと考えられた。また、メカニカルストレスをかけた歯根膜の初代培養細胞にアポトーシスの実行が行われているかどうかを確認するため、DNA ladder detection法、TUNEL assayを行ったところ、アポトーシスの所見は認められなかった。現在、以上の結果について、論文作成中であると同時に、メカニカルストレスによる細胞周期調節について検討中である。矯正治療上、抜歯が必要と診断された患者に実験の趣旨を説明して同意を得た後、同歯の歯根膜からアウトグロースした歯根膜初代培養細胞に対し、持続的伸展力を負荷した後、総RNAを回収・精製した。これらを用いて、マクロアレイ法にて遺伝子発現の差を網羅的に検討し、ストレスに反応して発現の変動を認めた遺伝子として、細胞膜上蛋白や、アポトーシス誘導遺伝子、あるいは細胞周期調節遺伝子等が挙げられた。これらの遺伝子のうち数種類を選択しquantitativeRT-PCRにより定量的に遺伝子発現の差を調べた結果、マクロアレイ法で得られた結果が信頼できるものであることを確認した。この実験の再現性を確認するため、異なる5人の患者から歯根膜を採取し同様に実験を行った。その結果、細胞膜上蛋白遺伝子の変動に関しては、いずれも同様の傾向を示したが、それ以外の遺伝子発現に明らかな再現性はないことがわかった。これは、ドナー間の差異、あるいは、多様な細胞集団を有する歯根膜の特性によるものと考えられた。また、メカニカルストレスを付与した歯根膜の初代培養細胞に、実際にアポトーシスの実行が行われているかどうかを確認するため、DNA ladder detection法、TUNEL assayを行ったが、アポトーシスの所見は認められなかった。更に、メカニカルストレスにより最も発現が誘導された遺伝子の発現経路を検討するため、ウエスタンブロット、及び阻害実験を行った。その結果、その遺伝子発現は、少なくともp38MAPKを介することがわかった。現在、以上の内容について論文を作成中である。