hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C/EBPαの新規Ｃ末端機能領域を介した顆粒球系細胞分化経路の分子機構の解明

本研究課題において,好中球誘導因子C/EBPαの新規C末端機能ドメインに会合する新たなインターラクターの探索から,ポリコーム抑制複合体1の主要構成因子であるRING1Bを同定し,C/EBPαとの会合様式を解析した.RING1Bはユビキチン転移酵素活性を有し,造血幹細胞の自己複製を制御しているBMI1とヘテロダイマーを形成してヒストンH2Aをモノユビキチン化することにより,標的遺伝子を抑制すると考えられている.これまでの解析から,C/EBPαのC末端機能ドメインは,RING1B分子内のN末端領域と会合することを明らかにした.この領域にはRINGフィンガードメインが存在し,2個の亜鉛原子を含む特徴的な構造を形成して, BMI1との会合やE2ユビキチン結合酵素との相互作用に寄与することが知られる.しかしながらアミノ酸置換変異体を用いた解析から,C/EBPαとの会合能はRINGフィンガードメイン構造を破壊しても5割以上が保持されること,会合領域がRINGフィンガードメイン構造よりさらにN末端側に位置することがわかった.これらの知見は,C/EBPαがRING1Bのポリコーム抑制複合体形成とは競合せずに,RING1Bと会合し得ることを示唆する.C/EBPαは血球系細胞においてはミエロイド系細胞に特異的な転写因子であることが知られる.また近年,ポリコーム抑制複合体1には,従来型とは異なる構成因子からなる異型型ポリコーム抑制複合体1の存在が数多く報告されている.これらのことを考え併せると,好中球分化においてC/EBPαが細胞特異的なポリコーム抑制複合体を構成して機能する顆粒球分化経路の可能性が示唆される..本年度は,C/EBPαのC末端に同定した新規機能領域に会合する細胞内因子を同定することを目的として,酵母ツーハイブリッド法によってクローニングしたC/EBPαの新規C末端機能領域のインターラクター候補の解析を進め,ポリコーム抑制複合体1(PRC1)の構成因子であるRING1Bを同定した.RING1Bはユビキチン転移酵素として,BMI1とヘテロダイマーを形成してヒストンH2Aを直接モノユビキチン化し,標的遺伝子の転写を抑制すると考えられている.プルダウン解析から,RING1BはC/EBPα変異体CEα-P346Aにも会合でき,C/EBPαのGABPとの相乗的転写活性化には関与しないことが示唆された.C/EBPαが会合する領域を検討したところ,C/EBPαのC末端領域との会合には,RING1B分子のN末端に存在するRINGドメインが必要なことがわかった.RING1BのRINGドメインには,上記BMI1に加え,E2ユビキチン結合酵素が会合する.そこで,RINGドメイン内のC/EBPα会合部位をさらにアミノ酸レベルで同定するため,RING1BのRINGドメイン内の1アミノ酸置換変異体を構築中である.一方,C/EBPαのC末端領域内のRING1B会合部位を検討したところ,GABPとの会合に必要な部位とオーバラップすることがわかった.このことから,C/EBPαとの機能的相互作用に関し,RING1BがGABPに対して競合的に働く可能性が示唆される.ポリコーム抑制複合体は,クロマチンレベルで転写を制御することにより細胞の分化および発生に必須の役割を担っており,その主要構成因子であるRING1BがC/EBPαの新規C末端機能領域に会合するという知見は,本領域の顆粒球系の特異的遺伝子発現や細胞分化における役割とその分子機構を解明するための大きな足がかりとなることが期待される.本年度は,C/EBPαの新規C末端機能領域に会合する新たな相互作用因子の同定を第一の目標として研究を進めた.その結果,ポリコーム抑制複合体の主要構成因子であるRING1Bが本領域に会合することが明らかとなった.ポリコーム抑制複合体は,クロマチンレベルで転写を制御することにより細胞の分化および発生に必須の役割を担っていることから,今回得られた知見は,C/EBPαの新規C末端機能領域の顆粒球系の特異的遺伝子発現や細胞分化における役割とその分子機構を解明する大きな足がかりとなると判断した.前年度,好中球誘導因子C/EBPαのC末端に同定した新規機能領域に会合する細胞内因子として,ポリコーム抑制複合体1(PRC1)の主要構成因子であるRING1Bを同定し,C/EBPαがRING1BのN末端と相互作用することを明らかにした.RING1BはPRC1の中でユビキチン転移酵素として働き,造血幹細胞の自己複製を制御しているBMI1とヘテロダイマーを形成してヒストンH2Aをモノユビキチン化することで,標的遺伝子の転写を抑制すると考えられている.C/EBPαが会合するRING1BのN末端には,2個の亜鉛原子を含む特徴的な構造のRINGフィンガードメインが存在し,その構造が上記BMI1との会合やE2ユビキチン結合酵素との相互作用に寄与する.これらの相互作用とC/EBPαとの相互作用の関連を明らかにする目的で,RING1Bの各種アミノ酸置換変異体を構築して会合能を検討したところ,亜鉛原子が結合するアミノ酸に変異を導入してRINGフィンガー構造を破壊しても, C/EBPαとの相互作用が保持されることが明らかになった.この知見から,C/EBPαとRINGlBの会合がPRC1の複合体形成に関し競合しないこと,したがって,ポリコーム抑制複合体の機能を損なうことなしにC/EBPαとの会合能のみが欠損するRING1Bアミノ酸置換

変異体をデザインできることが示唆され,C/EBPαの新規C末端機能領域の顆粒球系の特異的遺伝子発現や細胞分化における役割とその分子機構を解明する上で大きな足がかりとなることが期待される.RING1Bは,ポリコーム抑制複合体を形成して機能することから,C/EBPαのインターラクターとして同定した当初から研究計画を変更する必要が生じた.特にC/EBPαの新規C末端機能領域が会合するRING1BのN末端には,ポリコーム抑制複合体の構成因子であるBMI1やE2ユビキチン結合酵素も会合するため,C/EBPα特異的な会合部位の同定を本年度の第一の目標として研究を進めた.その結果,BMI1やE2ユビキチン結合酵素の会合に必須なRINGフィンガードメイン構造非依存的にC/EBPαがRING1Bに相互作用することが明らかになった.今回得られた知見は,ポリコーム抑制複合体の機能を損なうことなしにC/EBPαとの会合能のみが欠損するRING1B置換変異体のデザインするための大きな足がかりとなると判断した.本研究課題において,好中球誘導因子C/EBPαの新規C末端機能ドメインに会合する新たなインターラクターの探索から,ポリコーム抑制複合体1の主要構成因子であるRING1Bを同定し,C/EBPαとの会合様式を解析した.RING1Bはユビキチン転移酵素活性を有し,造血幹細胞の自己複製を制御しているBMI1とヘテロダイマーを形成してヒストンH2Aをモノユビキチン化することにより,標的遺伝子を抑制すると考えられている.これまでの解析から,C/EBPαのC末端機能ドメインは,RING1B分子内のN末端領域と会合することを明らかにした.この領域にはRINGフィンガードメインが存在し,2個の亜鉛原子を含む特徴的な構造を形成して, BMI1との会合やE2ユビキチン結合酵素との相互作用に寄与することが知られる.しかしながらアミノ酸置換変異体を用いた解析から,C/EBPαとの会合能はRINGフィンガードメイン構造を破壊しても5割以上が保持されること,会合領域がRINGフィンガードメイン構造よりさらにN末端側に位置することがわかった.これらの知見は,C/EBPαがRING1Bのポリコーム抑制複合体形成とは競合せずに,RING1Bと会合し得ることを示唆する.C/EBPαは血球系細胞においてはミエロイド系細胞に特異的な転写因子であることが知られる.また近年,ポリコーム抑制複合体1には,従来型とは異なる構成因子からなる異型型ポリコーム抑制複合体1の存在が数多く報告されている.これらのことを考え併せると,好中球分化においてC/EBPαが細胞特異的なポリコーム抑制複合体を構成して機能する顆粒球分化経路の可能性が示唆される..C/EBPαの新規C末端機能領域のインターラクターとして同定したRING1Bは,ポリコーム抑制複合体を形成して機能することから,研究計画をいくつか変更する必要が生じた.1.上記したように,C/EBPαの新規C末端機能領域が会合するRING1BのRINGドメインには,ポリコーム抑制複合体の構成因子であるBMI1やE2ユビキチン結合酵素も会合する.そこで,これらの相互作用を保持しかつC/EBPαとの会合能のみが欠損するRING1Bのアミノ酸置換変異体の同定を試みる.3.ポリコーム抑制複合体にはいくつかの異性体型が知られている.FcαRやG-CSFレセプター遺伝子などの顆粒球分化のマーカ遺伝子のプロモーターに関し,クロマチン沈降方を用いて,C/EBPαとともに沈降するポリコーム抑制複合体の構成因子を同定することにより,C/EBPαがどの異性体型と会合しているかを明らかにする.
IP_3,IP_4分解酵素の活性調節機構

情報受容と共役してホスファチジルイノシト-ル4,5-ニリン酸から生成するイノシト-ル1,4,5-三リン酸(IP_3)と、それがさらにリン酸化されて生成するイノシト-ル1,3,4,5-四リン酸(IP_4)は、細胞内Ca^<2+>濃度調節に関与する2ndメッセンジャ-として機能し、これらの生成、分解のバランスによってCa^<2+>を介する情報伝達系が調節されると考えられている。本研究では、この情報伝達系の制御機構を理解する目的で、主にIP_3,IP_4の分解に関わる酵素に注目し、その酵素分子の性質、活性調節機構に検討を加えた。IP_3,IP_4は、同一の脱リン酸化酵素(イノシト-ルポリリン酸5-ホスファタ-ゼ)によって分解されることが知られているが、まずラット脳から本酵素の分離精製を試みた。その結果、膜画分から一種、可溶性画分から二種の三種のイソ型の存在を見い出した。そのうち、可溶性画分からの一種はIP_3に特異性が高く、また脳に特異的に存在する可能性が示された。他の二種は互いによく似た性質を示し、IP_4により高い親和性を持ち、種々の組織に存在していた。このことから、脳には特有のイノシト-ル代謝を介する情報伝達系が存在することが示唆された。活性調節に関しては、リン酸化の効果、遊離Ca^<2+>の影響を詳細に検討したが、いずれのイソ型も有意な活性変動を示さなかった。次年度にはさらに検索の範囲を広げ、活性化あるいは不活性化を誘起する因子を追求する予定である。また本酵素は三種とも含有量が少なくかつ不安定であるため高度精製は困難なものとなっており、抗体作成にもまだ成功していない。現在、IP_3をセルロ-スに結合させたアフィニティ-カラムを用いての精製を試みており、今後この方法で精製した標品を用いて抗体作成を行なう予定である。
気候変動と人間活動を考慮した総合地下水シミュレーションシステムの開発

以下に、本研究の実施状況とその成果について詳細に記す。(1)広域平野部で観測された水文・気象データに基づいて地下水変動および水収支を検討し、水循環を解析した。広域平野内での地下水流動や水利用のみならず、同平野の気象特性、背後地河川の流出・流況特性を解析して、流域全体としての水循環および水収支特性を総合的に明らかにした。さらに、農業・工業・上水道用揚水ポンプの稼働実績、渇水時における取水制限実態、あるいは河川水利用の実態など、解析に必要な様々なデータを収集した。そして、収集・推計された河川からの流入量、平野内での地下水位、農業・工業・上水道用水の利用量および気象データを基に、平野内の地表水・地下水を含む水循環モデル、背後地流域の流出モデルを包含した総合的モデルを構築し、降雨・地表水・地下水の合理的な利用計画を提案した。(2)中国内蒙古自治区黄河流域の河套潅区における高度な水利用・管理を実現するための基礎として、河套潅区の潅漑畑地の蒸発散量を測定し、空気力学式に基づいて構築した蒸発散モデルをSPACモデルに組み込み、衛星データを利用して河套潅区における蒸発散量の分布を推定した。これらの研究成果は、これまで定性的に評価されてきた潅漑畑地の公益的機能を、現地での実測データに基づいて明らかにし、その定量的な評価の方向性を見出して、地球温暖化等に伴う異常気象、都市化や森林伐採等による土地利用の変化などによる洪水災害や渇水災害などが懸念される中で、地域規模さらには地球規模での環境管理施策を確立するためにも、極めて有用な情報を提供した。(3)東アジアを対象に、窒素負荷に関する水質プロセスとその影響を把握するために、農業・畜産・自然・生活排水・工業排水を負荷源として個別に負荷量を推定した。20世紀におけるグローバルな陸面エネルギー水循環データセットを陸面水文植生モデルであるMATSIROと全球河川流路網及び流下モデルであるTRIPの外力として利用し、大陸スケールの陸面窒素循環シミュレーションを行った。データ整備については、東アジアを対象に精度の高いデータベースを作成することを主用な目的とし、窒素モデル研究を行う上で、最も重要な作業であるインプットデータの整備を行った。特に、人口・土地・社会統計などは、フォーマットが統一されないことが多いため、インプットデータとして整備するのに多大な時間と労力を必要とした。本研究で整備した総合データベースは、今後、ほかの研究者が容易に使用することが可能である。モデル開発については、研究代表者沖大幹グループがこれまで使用しているTRIPのコンポーネントを、水質に関する可能な部分について移植した。これらにより、東アジアの窒素負荷分布と日単位の窒素変動のシミュレーションを示し、また、それぞれの負荷が、各地域でどの程度のインパクトを持っているのかを明らかにした。東アジアを対象に、広域窒素負荷に関する水質プロセスとその影響の全容を把握するために、質の高いインプットデータを整備し、農業・畜産・自然・生活排水・工業排水と負荷源を分離して別個に負荷を推定した。データ整備については、本研究で、東アジアを対象に精度の高いデータベースを作成することを目的の一つとし、窒素モデル研究を行う上で、最も重要な作業であるインプットデータの整備を行った。特に、人口・土地・社会統計などは、フォーマットが統一されないことが多いため、インプットデータとして整備するのに余計に時間と労力を必要とする。しかし、本研究で整備した総合データベースは、今後、ほかの研究者が容易に使用することが可能である。モデル開発については、研究代表者のグループが数年来使用しているTRIPのコンジポーネントを、水質に関する可能な部分についてほ移植した。これらにより、20世紀における東アジアの窒素負荷分布と日単位の窒素変動のシミユレーションが良くなることが示された。また、それぞれの負荷が、どのような地域でどの程度のインパクトを持っているのかを明らかにした。また、モデル検証のため、日本・中国黄河流域・アメリカ等での観測とデータ収集を昨年度に継続した。とれらの結果に関しては、投稿論文を現在準備中である。(2)中国内蒙古自治区黄河流域の河套

潅区における高度な水利用・管理を実現するための基礎として、河套潅区の潅漑畑地の蒸発散量を測定し、空気力学式に基づいて構築した蒸発散モデルをSPACモデルに組み込み、衛星データを利用して河套潅区における蒸発散量の分布を推定した。これらの研究成果は、これまで定性的に評価されてきた潅漑畑地の公益的機能を、現地での実測データに基づいて明らかにし、その定量的な評価の方向性を見出して、地球温暖化等に伴う異常気象、都市化や森林伐採等による土地利用の変化などによる洪水災害や渇水災害などが懸念される中で、地域規模さらには地球規模での環境管理施策を確立するためにも、極めて有用な情報を提供した。(3)東アジアを対象に、窒素負荷に関する水質プロセスとその影響を把握するために、農業・畜産・自然・生活排水・工業排水を負荷源として個別に負荷量を推定した。20世紀におけるグローバルな陸面エネルギー水循環データセットを陸面水文植生モデルであるMATSIROと全球河川流路網及び流下モデルであるTRIPの外力として利用し、大陸スケールの陸面窒素循環シミュレーションを行った。データ整備については、東アジアを対象に精度の高いデータベースを作成することを主用な目的とし、窒素モデル研究を行う上で、最も重要な作業であるインプットデータの整備を行った。特に、人口・土地・社会統計などは、フォーマットが統一されないことが多いため、インプットデータとして整備するのに多大な時間と労力を必要とした。本研究で整備した総合データベースは、今後、ほかの研究者が容易に使用することが可能である。モデル開発については、研究代表者沖大幹グループがこれまで使用しているTRIPのコンポーネントを、水質に関する可能な部分について移植した。これらにより、東アジアの窒素負荷分布と日単位の窒素変動のシミュレーションを示し、また、それぞれの負荷が、各地域でどの程度のインパクトを持っているのかを明らかにした。
内視鏡的吸引粘膜切除法の開発

1.内視鏡的粘膜切除法は消化管疾患の診断・治療法として臨床的にきわめて有用であり、一定の条件を満たす早期胃癌の根治的治療法として広く普及している。しかし、現在までの標準法として確立された、2チャンネルの処置用内視鏡を用いる従来法では、病変の部位によっては熟練した術者によってもなお困難であった。今回開発中の内視鏡的吸引粘膜切除法(Endoscopic aspiration mucosectomy:以下EAM)では病変の存在部位によらず、通常観察用1チャンネル内視鏡を用いて、容易確実に病巣を摘除可能となった。2.病変部直下に局注して粘膜下層を剥離するまでは従来法と同様である。この後、先端にフードを、外側にスネアガイドチューブを装着した内視鏡を挿入し、病巣中央部を照準、フード内に病巣部を充分吸引後、病巣基部でスネアにより絞扼し、高周波通電切除し、切除標本をフード内に吸引収納して回収する。フードの材質、性状、形態などの試作を重ね、臨床応用を計ってきたが、現在ではスネアガイドチューブを一体化した形とした。3.現在までに早期胃癌31例、胃腺腫43例にEAMが施行され、容易に、類円形の、平均径23×20mm標本が切除された。表面に挫滅はなく、病理学的検索も容易であった。合併症は穿孔1例、出血4例を経験したが全例内視鏡的に処理可能であった。4.リンパ節転移のない早期胃癌に対する内視鏡的治療は患者の肉体的、経済的負担を軽減し、医療資源の節減に貢献する。技術的には容易なEAMによる恩恵は広く行き渡るであろう。医療機関にとっても特殊な内視鏡を要しないことは有益である。現在高度先進医療の適用を申請準備しており、今後さらに改良を加えて安全な方法として普及を計る予定である。
無尾両生類における下垂体神経葉ホルモン合成活動の変動の解析

両生類は、脊椎動物が陸上へ進化する中間に位置している。下垂体神経葉ホルモンが両生類の体液浸透圧調節機構においてどのような役割をはたしているかを明らかにするため、ウシガエルの個体発生(特に変態)の過程において、正常および浸透圧刺激にともなうバソトシン(VT)遺伝子の発現量の変動を調べた。平成4年度に作製した、ヒキガエルのVT mRNAに対する合成DNAプローブを用い、ノーザンブロット法により解析した。VT遺伝子の発現は、足指形成期のステージ(St)710ですでにみられた。発現量は個体発生とともに増加したが、特に前肢が伸びるSt20において顕著な(統計的にも有意な)増加を示した。このSt20は、幼生が陸上に進出する変態最盛期に相当する。雄の成体を高浸透圧刺激(絶水および30%海水中での飼育)にさらすと、VT mRNA量は増加した。絶水による上昇は統計的にも有意であった。一方、幼生を30%海水中で飼育したところ、St15以後で、有意な増加を示した。St10以前では、発現量の増加はほとんど見られなかった。St10以前では、VT投与にともなう体重の増加(水の吸収)もほとんどおこらないことが、他の研究者により示されている。この時期では、VT産生ニューロンに浸透圧刺激に対する反応性がないだけでなく、標的器官の反応性も存在しないと考えられる。今回、ウシガエルでは、陸上に進出する変態最盛期にVTの合成が顕著に増加すること、VT産生ニューロンは変態始動期から浸透圧刺激に対する反応性を獲得することが明らかとなった。すなわち、ウシガエルが変態にともなって陸上に進出していくために、VTが非常に重要な役割を果たしていることが示唆される。今後さらに、標的器官におけるVT受容体の動態を明らかにできれば、VTの役割をより明確なものにできると考えている。
逆行性シグナルとして働く内因性カンナビノイドの同定およびその放出メカニズムの解明

内因性カンナビノイドは、中枢神経系の活動依存的なシナプス伝達調節において逆行性シグナルとして重要な役割を担っている。しかし、その分子実体および生成経路に関しては不明の点が多い。本研究では主にラット培養海馬ニューロンを用い、種々誘導条件により放出される内因性カンナビノイドおよびその合成酵素の分子実体を明らかにすることを試みた。得られた結果は以下の通りである。1.内因性カンナビノイド3種の中で、2-AGが最もシナプス伝達抑制作用が強く、かつその作用は可逆的であった。したがって、逆行性シグナルとして働くカンナビノイドは2-AGである可能性が高い。2.I型代謝型グルタミン酸受容体やM1/M3ムスカリン性アセチルコリン受容体のようなGq共役型受容体の活性化はカンナビノイドの放出を誘導した。また、この現象はPLCβ欠損マウスで消失した。3.強い脱分極により細胞内Ca^<2+>濃度が大きく上昇するとカンナビノイドが放出されるが、この現象は、PLCβおよびPLCδ欠損マウスで消失しないが、PLC阻害剤ET-18で消失した。4.単独ではカンナビノイド放出を引き起こさない弱い脱分極との弱いGq共役型受容体活性化が同時に起こると、カンナビノイドが放出された。この現象もまたPLCβ依存性であった。また、TRPC6チャネルを用いて細胞1個のPLC活性をリアルタイムでモニターする実験より、脱分極と受容体活性化の相乗効果はPLCβのCa^<2+>濃度依存性で説明できることが判明した。以上より、カンナビノイド放出を誘導する種々刺激条件は、まずPLCを活性化しDAGを生成し、次にDAG lipaseの働きにより2-AGが生成される。生成された2-AGは膜を自由に通り抜け細胞外に遊離し逆行性シグナルとして働く、と考えられる。また、関与するPLCのタイプは誘導条件により異なると思われる。内因性カンナビノイド(マリファナ類似物質)がシナプス後ニューロンの活動状態(脱分極やある種の受容体活性化)をシナプス前終末に知らせる逆行性シグナルとして働いていることが最近明かとなった。本研究では、ラット培養海馬ニューロンを用い、逆行性シグナルとして働く内因性カンナビノイドの同定および生成・放出メカニズムの解明をめざした。(1)内因性カンナビノイドの候補であるアナンダミド、2-AG、noladin etherの3物質についてシナプス伝達を抑制する効果を比較した。その結果、2-AGが最も効果が強いことが判明した。(第80回日本生理学会大会で発表)(2)2-AGの前駆物質であるジアシルグリセロール(DAG)は膜のリン脂質よりホスホリパーゼGCの働きにより生成される。そこでDAGの生成量を種々条件下で測定し、逆行性シグナル発生量と相関するかどうか調べた。DAC量は、培養海馬ニューロンに強制発現させたDAG感受性TRPC6チャネルの電流を測定することによりリアルタイムで検出した。逆行性シグナルを発生させる刺激(グループI代謝型グルタミン酸受容体およびM1/M3ムスカリン受容体の活性化)によりDAG量は著しく上昇し、また、逆行性シグナル発生量とDAG生成量はほぼ同じ細胞内Ca濃度依存性を示した。以上の結果より、逆行性シグナルとして機能する内因性カンナビノイドは2-AGであり、その生成の律速酵素はホスホリパーゼCである可能性が高いと考えられた。

脳内マリファナとも呼ばれる内因性カンナビノイドは、シナプス後ニューロンからシナプス前終末への逆行性シグナルとして、シナプス伝達の調節に重要な役割を担っている。本研究では、ラット培養海馬ニューロンおよび小脳スライス標本を用いて、逆行性シグナルとして働く内因性カンナビノイドの分子実体および生成・放出メカニズムの解明をめざした。まず、培養海馬ニューロンを用いてカンナビノイドの生成・放出メカニズムを調べた。私たちはすでに、I型代謝型グルタミン酸受容体やM1/M3ムスカリン性アセチルコリン受容体などのGq共役型受容体の活性化と脱分極(細胞内Ca^<2+>濃度上昇)を同時に起こさせると、多量の内因性カンナビノイドが放出されることを報告した。本研究ではその相乗効果のメカニズムを詳しく検討したところ、海馬ニューロンではホスホリパーゼCβ1(PLCβ1)が内因性カンナビノイド生成の律速酵素となっており、それが細胞内Ca^<2+>濃度上昇と受容体活性化により強く活性化され、多量のカンナビノイドが生成・放出されることが判明した。次に、小脳スライス標本を用いてシナプス刺激による内因性カンナビノイド放出について調べた。その結果、(1)I型代謝型グルタミン酸受容体の活性化と脱分極が同時に起こると、多量の内因性カンナビノイドが放出され、それがPLCβ4依存性であること、(2)シナプス刺激によるカンナビノイド放出には、I型代謝型グルタミン酸受容体、細胞内Ca^<2+>濃度上昇、PLCβ4が必要であること、(3)I型代謝型グルタミン酸受容体の活性化と脱分極を同時に起こすと内因性カンナビノイドの1つである2-AGが生成されること、が明らかとなった。以上より、神経活動により放出される内因性カンナビノイドは2-AGであり、その生成・放出にはGq共役型受容体-PLCβカスケードと細胞内Ca^<2+>濃度上昇が重要であると考えられた。1.内因性カンナビノイドは、シナプス後ニューロンからシナプス前終末への逆行性シグナルとして、シナプス伝達の調節に重要な役割を担っている。しかし、内因性カンナビノイドの合成経路については不明の点が多い。そこで本研究では、ラット培養海馬ニューロンを用いて、脱分極により誘導されるカンナビノイド合成の経路について検討した。2.海馬ニューロンのカンナビノイド感受性抑制性シナプス後電流(IPSC)は、シナプス後ニューロンからカンナビノイドが放出されると、シナプス前終末のCB1カンナビノイド受容体を介して振幅が減少する。そこで、その振幅の変化を指標にして、カンナビノイドの放出量を推定した。3.カンナビノイドの生合成経路を調べる実験によく用いられている酵素阻害剤について、まず、その副作用の有無について調べた。phospholipase C(PLC)阻害剤のU73122、DAG lipase阻害剤のRHC-80267、DAG kinase阻害剤のDAGK inhibitor I、PA-hydrolase阻害剤のpropranorolには、それぞれIPSCの振幅を低下させる副作用、あるいは、シナプス前終末のカンナビノイド感受性を低下させる副作用があることが判明した。したがって、本研究のようにIPSCの振幅を指標とするような実験には使用できないことがわかった。一方、PLC阻害剤のET-18、DAG lipase阻害剤のTHLにはそのような副作用は見られなかった。
心臓２次元膜電位光学マッピングデータからの心壁内３次元興奮伝播波面の再構成

不整脈発生時の心筋内活動電位伝播様式は複雑な三次元的構造を持つ。膜電位感受性色素を用いた光学マッピングによって得られる膜電位情報は、組織標本表層から深さ300μmの浅い情報であり、心内膜側を計測するためには心室壁を切開するなどの処置が必要であった。本研究では心外膜と心内膜を同時かつその位置関係を正確に同定して光学マッピングするシステムを開発した。線状レーザ光を心外膜側から照射し、心内膜側の像を観察することで位置の対応関係を同定する方法を考案し、1mm以下の精度で画像統合可能であることを確認した。またウサギLangendorff灌流心標本右心室の心外膜側と心外膜側の同時光学マッピングを実施した。本研究は不整脈の主な成因であるスパイラルリエントリーのダイナミクスの実験的解析手法として幅広く使用されている電位感受性色素を用いる膜電位光学計測法に関連して、新たに心内膜側からも膜電位光学マッピングを可能とする内視鏡型光学系を新たに試作開発し,摘出灌流心標本の心外膜側・心内膜側の2方向から励起光照明条件,撮影条件を複数変えて同時にマッピングを行い,三次元興奮伝播シミュレーションから得られた知見を活用し,不整脈における心壁内のスパイラルリエントリーの解析を可能とする実験技術の開発とその応用を目的としている。平成24年度は心内膜側・心外膜側両方からの同時光マッピング技術の基盤技術の確立、ならびに適切な実験条件を定める目的で予備的な実験装置を構築し、実験検討を行った。予備システムでは心外膜側からLED光源からの励起光を照射し、心腔内に挿入した硬性内視鏡に接続した高速度カメラと、心外膜表面を計測する高速度カメラを2台用いて、心房の外膜側ならびに心房内膜組織での心臓活動電位光学マッピングを行う計測システムを試作した。膜電位感受性色素で染色したウサギLangendorff灌流心標本を心外膜側から青色のLED光源(主波長525nm)により蛍光励起し、細胞膜活動電位に対応する光シグナルを心外膜側・心内膜側から得た。試作した実験装置にて心内膜側の同時活動電位マッピングが可能であることを確認した。しかし心外膜側から励起であることから、心内膜側の光シグナルは心房組織の厚みは薄いものの心壁内の組織の細胞活動電位の重ね合わせになっているという問題がある。また今回計測として撮影可能な撮影速度は10ofps(毎秒100枚)程度であり、不十分な性能であった。以上より計測装置の改良を、(1}心腔内への挿入での設置自由度が高い軟性内視鏡を用いたものとする、(2)励起光源をより強度の高いものとする、ことを中心に行うこととした。心外膜・心内膜電位同時光学計測を可能とする実験技術の開発に取り組みH25年度には以下2つの項目について研究を実施した。1解剖学的構造を保った非切開心臓を対象とする心内膜光学計測システムの開発、切開を行わず自然な興奮様態を示す心臓において心臓内側の興奮を光学計測することが可能な従来には無い新しいシステムの構築。2心外膜・心内膜電位同時光学計測システムの開発、である。心内膜光学計測システムの開発では心腔内に細径の内視鏡を挿入することから、光学系的には集光効率の悪いシステムとなり、興奮伝播光マッピングの時間分解能の制約となるが、構築した高速度カメラ、半導体レーザー、直径4.1mm直視軟性鏡から構成されるシステムでは、従来の心外膜光学計測システムと同等の良好なシグナル計測に成功した。また3000fpsという高速度撮像で得られたノイズの大きな信号に対しデジタル的なフィルタリングの適用を試み、特徴的な電位信号の抽出を実現した。次に、新たに構築した心内膜光学計測システムと心外膜光学計測システムを統合し、同時計測システムを構築した。各システムで得られた計測結果画像の位置、姿勢のレジストレーションを行う必要があるが、計測システムの変更が不必要かつ簡便で迅速に行えるラインレーザーの透過光を用いた手法を提案した。これは心臓外側からラインレーザーを走査し、反射光と透過光を各システムで同時に計測することでレジストレーションを行うもので切片標本を用いた精度評価実験によってサブミリ精度を有することを実証し、アプリケーションとして右心壁での同時光学計測にも成功した。本年度構築したシステムにより心臓内側の興奮情報と心臓外側の興奮情報と統合することで三次元での興奮伝播把握に将来的に取り組むことができ、薬効解析や効果的不整脈治療の基盤となりうる心臓電気生理学的に詳細な現象解明が可能となると予想される。

前年度は心外側、心内側から同時計測を可能とするシステム開発を行い心筋組織表面上の電位活動が観測可能となったが正確な3次元興奮伝播波面再構成のためには組織深部における電位活動の計測が必要となる。本年度は前年度に開発したシステムに組み込める、新たな組織深部計測システムの検討を行った。シミュレーション上での組織内部の膜電位活動の3次元再構成の評価と高速現象である興奮伝播を捉えるための高速サンプリング手法の検討である。深さ方向の情報を得るために新たに拡散光トモグラフィの原理を応用した手法の有用性検討を行った。縦25 mm x横20 mm x高さ3 mmの3次元膜電位分布モデルを用いたシミュレーション結果よりノイズの無い理想状態では興奮伝播波面が3 mmの深さにおいて平均二乗誤差0.2 mmという良好な結果を得られた。組織深部の上述の計測プロセスではレーザー光を一点照射し、組織表面上に現れる放射蛍光の分布を計測するため計測領域全体の計測に時間がかかり非周期的な興奮伝播現象を捉えることが困難であった。そのため圧縮センシングの考えを取り入れ、少ないサンプリング数から元の膜電位情報を再構成可能であるかの検討を行った。シミュレーション結果から64 x 64 pixelの画像においてランダムに800点(全画素数の約20%)での計測を行えばノイズの無い理想状態においては- 90 mVから30 mVまで変化する膜電位二次元画像で9 mV程度の平均二乗誤差で膜電位情報を再構成可能であることを示した。本年度実施したシミュレーション結果から新たな組織深部計測システムが心壁内3次元興奮伝播の再構成に有用であることが示された。この結果を元に高速3次元サンプリング手法、ハードウェア構築に取り組み、前年度開発した同時計測システムと統合することでより正確な3次元興奮伝播再構成ができると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。医用工学26年度が最終年度であるため、記入しない。性能は不十分であるものの、心内膜側、心外膜側からの同時膜電位光マッピングが達成できたが、撮影速度は不十分なものであった。この点を改良するためにはレーザ光源を導入することを検討したが、実験を行う共同研究機関でのレーザ使用のための安全管理上の申請手続きがやや遅れこの点の改良が遅れた研究の目的は光学計測では把握のできない組織深部の興奮伝播を把握可能とする3次元興奮伝播推定であり、そこに至るプロセスとして大きく3つのステップを想定していた。1心内膜光学計測システムの新規構築、2心外膜・心内膜同時光学計測システムの構築、3光学計測結果を元にした3次元興奮伝播推定である。現在は1、2についておおよそ完成しており3に移行できる基盤作りができていることから達成度としておおむね順調に進展していると考えている。心内膜光学計測システムはハードウェア的要求仕様を満たした計測システムを構築できており、心内膜の活動電位を良好なシグナルで計測可能であることを実証している。さらなる課題として高速度撮像にも取り組みデジタル的な信号処理手法によりノイズの多い計測波形から所望の活動電位波形の抽出可能性を示すこともできた。最終目標である3次元興奮伝播推定のためには照明のスイッチング機構が必要であると想定しているが既存のシステムに光学チョッパを組み込むのみで可能である。
科学実験器具と18世紀イギリス文化

イギリス16-18世紀に発明された科学(自然哲学)実験器具--顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプ、磁気羅針盤、ライデン瓶など--を中心に据え、それらが科学/医学、視覚芸術、美学、文学、哲学、政治、宗教などの学問諸領域において果たした役割や与えた影響を検証することによって、新しい18世紀(啓蒙期)イギリス文化像を探った.科学史上、特別な器具を用いて実験的に研究をするという形態は、17世紀に誕生した近代科学が生み出した主要な変化のひとつである.科学実験器具の発明は、多くの場合、科学史上のひとつのエピソードとして扱われ、隣接学問領域や一般大衆文化との相関関係に対する目配りは極めて不十分なものであった。顕微鏡に関して言えば、誰によってどこでこの器具が発明されたかという紹介ではなく、光学器具を用いて不可視の世界を観察することの形而上学的意義、哲学や文学、解剖学や細菌学にあたえた影響、実験観察結果を示す図版等が視覚文化の中で占める位置等々、顕微鏡が18世紀イギリス文化全体に及ぼした意義を総合的に捉えることを試みた.Henry Power, Experimental philoso-phy, Robert Hooke, Micrographia, George Adams, Essays on the Microscope ; Micrographia Illustrata, Henry Baker, Microscope Made Easyなどの綿密な解読を通して、それらを取り囲む諸領域に及ぼした影響また諸領域間の相関関係を詳細に分析・検討した,そうすることにより、今日的視点からは断片的で細分化されたものとしてしか映らない当時の文化の諸相が、その根底では相互に依存し合い・協力し合いながら18世紀イギリス文化を形成していた様子を明らかにした.その過程で、とくに18世紀啓蒙期における巡回科学者による公開科学実験と科学的知識の伝播および教育の問題、文字化された実験結果・成果(解説)とそれを伝える視覚芸術(絵画・図像など)つまり「言葉とイメジ(絵)」の親密な関係について明らかにした。(2)顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプに関して個別的に論じた研究書や論文を多数入手し精読した。(3)入手したデータや分析した結果をカードにとり、また、必要に応じてコンピュータに入力した。平成13年度は平成12年度の作業の継続を行った。(1)顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプに関する文献を読んだ。(a)同顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプに関する実験や観察報告が豊富な図版と共に掲載されているイギリス王立協会発行の学術研究誌Philosophical Transactionsを読んだ。(c)17-19世紀に出版された顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプに関連する絵画(Joseph wright of Derby、James Barry)、図像・図版(銅版画ほか)を可能な限り入手し解読した。(3)顕微鏡、望遠鏡、真空ポンプに関して個別的に論じた研究書や論文を多数入手し精読した。(4)入手したデータや分析した結果をカードにとり、また、必要に応じてコンピュータに入力した。
着衣内装着式人間動作補助機向け超小型駆動機構の最適諸元調査

人間動作補助機に使用可能な駆動部を実現するため,小型軽量安価を念頭に置き,波動歯車に限らず,ウォームギヤをはじめとする駆動部の構造および諸元について,人間に装着することを前提とした検討をした.まず,多条ウォーム+ヘリカルギヤの使用を提案し,負荷繰り返し試験よりヘリカルギヤにLT625を使用すると摩耗が低減することを確認した.また,ホビー用超小形サーボモータが小形軽量安価に適しているが,過負荷が入力されても連続使用するために歯車内に組み込むトルクリミッタを開発した.挟む樹脂板ごとの最大伝達トルクを確認し,NBRとPVCの負荷トルクごとの最大負荷繰り返し数を確認した.着衣内に装着可能な超小型の人間動作補助機を開発するため,その駆動部を開発する.着衣内に装着するには,身体に密着した構造の駆動部を設計する必要があり,円筒形のモータの回転軸方向を90度変更し,最も小型かつ大減速可能なウォームギヤの活用が望ましい.しかし一般的なウォームギヤは伝達効率が50%以下,逆入力ができない(セルフロック)という特徴がある.できるだけ小型軽量にするには効率を上げて可能な限り小さいモータを使用できること,装着者の突発的動作時の対策として装着者の動作を妨げないことなどが重要であることから,ウォームとヘリカルギヤ(はすば歯車)をかみ合わせること,逆入力可能にするために進み角を摩擦角よりも大きくする3条ウォームとすることを提案する.ウォームとヘリカルギヤのかみ合いは従来から行われる手段の一つであるが,かみ合いが理論上点接触となり,高効率化を図れる半面,面圧が著しく増加することから軽負荷時のみ使用することが一般的である.そこで,高面圧に耐えられるヘリカルギヤの材質を検討する.また,グリース潤滑が一般的だがグリースの選定も高効率化には重要なファクターであることからグリースの違いによる影響も検討する.今年度は,これらの実験による確認を実施するための実験装置整備を行い,ウォーム+ヘリカルギヤ用の負荷繰り返し実験時に入出力トルクおよび入出力回転軸角度を計測できること,人間に装着したときの動作を模擬した角度変化をプログラム化可能とした.また,高寿命な材料を選定するため,各種試験材料を準備した.さらに,ウォーム+ヘリカルギヤをかみ合わせたギヤボックスを製作し,歩行補助機に取り付け,実際に歩行して使用できることを確認した.現在歯車を評価する試験装置のシステムを製作しているが,歯車試験の経験豊富な各研究機関の方々からご指導を頂きアドバイスを頂いたところ,歯車自体の寿命を試験するためには軸受や歯車箱は,十分な剛性を有したものでなければならないこと,入力の原動機がある程度の出力を持たないと大負荷時のブレーキに負けてしまい,本来確認したい動作が十分行えない可能性があることなどのご指摘を頂いた.以上の面を踏まえて実験装置の見直しを図り,かつ実験ができる条件を早急に整える必要があるため.人間動作補助を目的とした衣服内装着型ロボットの小型軽量化を検討し,その駆動部の最適方法を検討した.まず,多条ウォーム+ヘリカルギヤによる高効率かつセルフロックレスの駆動部について検討した.アルミ青銅ALBCと,日本軽金属のLT625にてヘリカルギヤを製造し,これらの違いによる摩耗量の変化を確認した.人間の歩行中の足関節に使用することを想定し,可動範囲は65deg,歩行周期1secと仮定し,負荷を30Wモータ定格の4.7Nmと設定し,繰り返し試験を実施した.グリスは一般的な鉱油+リチウム石鹸とし,角度バックラッシの変化を確認した.足関節から屈の爪先までを25cmとしたときに足先に1cmのガタが出る概算より,正逆の平均値が2.3degを超える回数を確認したところ,ALBCは30万回に対し,LT625は60万回であり,ALBCの倍以上の耐摩耗性を確認できた.しかし,約160時間程度の連続使用で交換必要があり,モータ込みで約400gの重量があることから,同程度のトルクと角速度を確保し低ながら重量は約100gと超軽量小形であり,かつ安価なホビー用サーボモータに着目した.しかし当モータはセルフロックレスだが定格トルク以上の過負荷が衝撃的に逆入力されると減速歯車が小さく内部破損を起こすため,意図的に最終段の従動歯車の歯が折損するよう設計されている.そこで,歯車に内臓可能な超小形トルクリミッタを開発した.2枚の円板で樹脂材を挟み,半割れのギヤボックスで両側から固定するため,外観,重量共に従来と変わらない.各種樹脂材にて最大伝達トルクおよび衝撃負荷トルクと繰り返し数のSN曲線を得たところNBRは負荷トルクは定格を満たすが寿命が短く,PVCは負荷トルクが低いが寿命はNBRより長かった.今後長寿命の樹脂材を検討する.人間動作補助機に使用可能な駆動部を実現するため,小型軽量安価を念頭に置き,波動歯車に限らず,ウォームギヤをはじめとする駆動部の構造および諸元について,人間に装着することを前提とした検討をした.まず,多条ウォーム+ヘリカルギヤの使用を提案し,負荷繰り返し試験よりヘリカルギヤにLT625を使用すると摩耗が低減することを確認した.また,ホビー用超小形サーボモータが小形軽量安価に適しているが,過負荷が入力されても連続使用するために歯車内に組み込むトルクリミッタを開発した.挟む樹脂板ごとの最大伝達トルクを確認し,NBRとPVCの負荷トルクごとの最大負荷繰り返し数を確認した.

まず,早急に実験装置を完成させ,すでに準備したヘリカルギヤの違い,グリースの違いによるバックラッシ拡大進行状況,歯車歯面の寿命への影響を,人体に装着し使用したときの運動を想定した繰り返し試験にて調査する.次に,実験装置だけでなく,実際に装着して歯車特性の寿命を確認する.さらに,本駆動部を目的に応じて適切に使用するため,モータに対し様々な制御手法を用いて効果を確認する.機構学人件費を計上していたが,使用しなかったこと,旅費の誤差などによるもの歯車評価試験装置用のねじ,金属板などの機械部品購入時に使用.
半導体微細加工プロセスとクラドニ図形の融合による細胞の輸送と単一分離技術の開発

近年要求が増加している単一細胞操作の技術開発は,その実現により個々の細胞の振舞いに着目した研究が可能になり創薬や細胞工学の研究に新しい展開が期待できる.本研究では,垂直振動による液体定在波を利用してマイクロ流路を用いず細胞懸濁液中に細胞の収集パターンを形成させ,振動波形や周波数の制御により細胞の位置決めと操作および単一分離を併せて可能にする技術を開発した.また,半導体プロセスとスンプ法を用いてセルロイド基板上にマイクロレンズアレイを製作し,裏面よりコリメートされたレーザ光の照射により集光位置に粒子を停止させる細胞の輸送の制御方法について実験的に検討し,細胞輸送の制御に関する要素技術を実証した.近年,細胞の機能の解析や医療分野の応用を目指して単一細胞操作の技術開発の要求が増加している。従来の生化学的技術では集団の分析であるため,多くの細胞から得られた平均値のみを情報として得ており,細胞の個性を無視した分析であるが,細胞を単一分離することができれば,個々の細胞の振舞いに着目した研究が可能になり,創薬や細胞工学の研究に新しい展開が期待できる。本研究は,酵母や大腸菌のような110μm程度の大きさの微生物細胞における単一細胞の操作技術を開発するものである。本研究では,クラドニ図形で実現されるような粒子の自動的なパターン形成技術の確立を目指し,細胞の濃度が低い状態でも,局所的に細胞を凝集させて濃度の高い状態を作り出し,流路レス凝集と凝集位置(パターン)の変更を瞬時に行う技術の構築を提案する。平成26年度は,単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集の瞬時位置決め技術について基礎的な実験を行った。空気中ではクラドニパターンは容易に形成されたが,酵母懸濁液を用いたクラドニパターン形成では,表面が平滑なシリコンウエハを用いて,(2,0)ー(0,2)モードのパターンが得られることがわかった。また,さらに,効率的に粒子パターンの形成を行うため,垂直加振による液体定在波を利用した凝集の実験を行い,透明材料の容器内において酵母懸濁液の酵母を流路レスで凝集できることがわかった。本手法は微生物細胞の輸送および単一細胞分離の要素技術として応用可能と考えられる。従来の生化学的技術な細胞分析技術は集団の分析でるために多くの細胞から得られた平均値のみを対象としていた。この方法は細胞の個性を無視した分析であるため,細胞を単一分離して個々の細胞の振る舞いに着目した研究を行うことにより,創薬や細胞工学の研究に新しい展開を期待することができる。本研究は,酵母や大腸菌などのμmオーダーの微生物細胞における単一細胞操作技術を開発するものである。本研究では,微生物細胞を微粒子にみたて,クラドニ図形のような自動的なパターン形成技術の確立を目指すものである。この技術が実現できれば,微生物細胞の濃度が低い細胞懸濁液でも局所的に細胞を凝集させて濃度の高い箇所を作ることができる。また,振動を利用して凝集させることから,従来技術のようなマイクロ流路を必要としない,流路レスで凝集位置の変更も可能な技術となる。これまでに,単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集位置決め技術について基礎的な実験を行った。空気中ではクラドニパターンは容易に形成されたが,酵母懸濁液を用いたクラドニパターンの形成は容易ではなく,表面が平滑なシリコンウエハを用いて,(2, 0)-(0, 2)モードのパターンを得ることができた。さらに効率的な流路レスパターン形成を行うため,垂直加振による液体定在波を利用した凝集実験を行い,透明材料の容器内において酵母懸濁液の酵母の流路レス凝集を実現した。平成27年度は,流路レス凝集法の秀周波数依存性,加振波形依存性について明らかにした。また,垂直加振による流路レス凝集法によるマイクロ囲いへの単一細胞分離とサイズ分離を実現した。さらに,傾向観察により本方法で細胞ごとの個性を判別できることを確認した。これまでに,単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集位置決め技術について基礎的な実験を行っている。空気中ではクラドニパターンは容易に形成されたが,酵母懸濁液を用いたクラドニパターンの形成は容易ではなく,表面が平滑なシリコンウエハを用いて,(2, 0)-(0, 2)モードのパターンを得られている。さらに効率的な流路レスパターン形成を行うため,垂直加振による液体定在波を利用した凝集実験を行い,透明材料の容器内において酵母懸濁液の酵母の流路レス凝集を実現している。さらに,流路レス凝集法の秀周波数依存性,加振波形依存性について明らかにし,垂直加振による流路レス凝集法によるマイクロ囲いへの単一細胞分離とサイズ分離を実現している。また,蛍光顕微鏡観察により,本方法で分離した細胞ごとに個性を判別できることを確認している。近年,単一細胞操作の技術開発の要求が増加している。従来の生化学的技術では集団の分析であるため,多くの細胞から得られた平均値のみを情報として得ており,細胞の個性を無視した分析であった。細胞を単一分離することができれば,個々の細胞の振舞いに着目した研究が可能になり,創薬や細胞工学の研究に新しい展開が期待できる。28年度の本研究では,酵母細胞について,細胞懸濁液中にパターンを形成させる基板表面上に半導体プロセスを用いてマイクロレンズアレイを製作し,裏面よりコリメートされたレーザ光を照射し集光位置に粒子をトラップし細胞の輸送の制御方法の可能性について実験的に検討した.

単一細胞分離構造への細胞導入のための位置決め技術におけるマイクロレンズの製作ついては,より簡単に製作可能なようにスンプ法によるセルロイド基板上にマイクロレンズを製作することとした.スンプ法に用いるモールドは,シリコン基板に電子線レジストをスピンコートで塗布し,マイクロメートル以下の円形開口を電子線露光により形成した.その開口部を通してフッ化キセノンを用いた気相エッチングによりシリコン基板を部分的に半球状にエッチングしてモールドとした.セルロイド基板表面を酢酸アミルで軟化させたのちにこのモールドに圧着させ,固化したのち離型してセルロイド製のマイクロレンズを製作した.これを細胞の収集パターン形成用の透明容器の底面に接着し,垂直振動による酵母細胞の収集パターン形成が可能なことを確認した後,酵母懸濁液を注いで底面よりコリメートされた赤色の半導体レーザ光を照射したところ,懸濁液中で移動する酵母細胞が,レーザ光の集光部で停止する事象を確認した.前年度までの成果と合わせて,単一細胞分離構造と垂直振動による細胞収集パターンの形成およびマイクロレンズアレイを融合することにより,細胞輸送の制御方法を実現するための要素技術を実証した.近年要求が増加している単一細胞操作の技術開発は,その実現により個々の細胞の振舞いに着目した研究が可能になり創薬や細胞工学の研究に新しい展開が期待できる.本研究では,垂直振動による液体定在波を利用してマイクロ流路を用いず細胞懸濁液中に細胞の収集パターンを形成させ,振動波形や周波数の制御により細胞の位置決めと操作および単一分離を併せて可能にする技術を開発した.また,半導体プロセスとスンプ法を用いてセルロイド基板上にマイクロレンズアレイを製作し,裏面よりコリメートされたレーザ光の照射により集光位置に粒子を停止させる細胞の輸送の制御方法について実験的に検討し,細胞輸送の制御に関する要素技術を実証した.平成26年度は,単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集の瞬時位置決め技術について基礎的な実験を行った。単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集の位置決め技術については,石英基板上に微粒子の懸濁液で形成したクラドニ図形を用いてその挙動を明らかにすることを目標とした。実験は,金属製上にスチロール製の容器を載せ,この容器内に矩形の板を中心で支える構造を製作し,正弦波で鉛直方向に振動させた。空気中ではクラドニパターンは容易に形成されたが,酵母懸濁液を用いたクラドニパターン形成では,石英ガラス板,アクリル板,アルミニウム板を用いた実験ではその形成が困難であった。しかし,表面が平滑なシリコンウエハを用いて,(2,0)ー(0,2)モードのパターンが得られることがわかった。また,さらに,効率的に粒子パターンの形成を行うため,垂直加振による液体定在波を利用した凝集の実験を行い,酵母懸濁液の酵母を流路レスで凝集できることがわかった。振動後の密部分の濃度は疎部の約70倍に凝集されることがわかった。凝集形成する時の微小粒子としての酵母の動きを動画で撮影し,2次元運動解析システムで観察した。また,実験装置への照明方法を工夫することにより,液体定在波の存在を観察することができた。したがって,今年度の単一細胞分離構造への細胞導入のための凝集の瞬時位置決め技術についての基礎的実験の達成度としては,概ね順調に進展している。本手法は微生物細胞の輸送および単一細胞分離の要素技術として応用可能と考えられることから,次年度以降の研究への基礎が確立されたものと考えられる。
赤血球分化に関与するシグナル伝達分子の探索と機能解析

我々は赤芽球様細胞ELM-1を用いてエリスロポエチン(EPO)による赤血球分化の研究を行っている。我々はEGF受容体とEPO受容体のキメラ分子を作成し、さら受容体のチロシン残基に変異を導入することで受容体細胞内ドメインの2つのチロシン残基(Y343、Y401)のいずれかが赤血球分化に必須であることを証明した。これら2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に必要であり、STAT5と分化は密接に関連していることが考えられた。しかしながら一方IL3受容体やプロラクチン受容体とのキメラを作成して本細胞に導入したところこれらのキメラ分子はSTAT5を活性化するもののこの細胞の赤血球分化は誘導しないことを明らかにした。したがってIL3受容体になくEPO受容体に特異的な分化シグナルが存在し、STAT5とともに分化の促進に働くと考えられる。そしてそのシグナルの発生にはEPO受容体のY343、Y401のいずれかのりん酸化が必要であることが示唆される。この2つのりん酸化チロシン残基と会合する分子をクローニングするためりん酸化ペプチドによる精製を行った。アミノ酸配列決定の結果これらのペプチドにSTAT5とポスフォリパーゼCγ-2(PLC-γ-2)が会合することを明らかにした。PLC-γ-2の赤血球分化における役割を明らかにするために現在阻害剤やドミナントネガティブフォームを導入する実験を行っている。さらに酵母two-hybrid法による組織的スクリーニングを行うために、JAK2チロシンキナーゼを共発現させたスクリーニング系を開発した。これにエリスロポエチン受容体細胞ドメインをbaitとして様々なライブラリーをスクリーニングしたころフォスファチジル酸キナーゼのp55サブユニットなどが同定できた。新規分子も多数あり現在解析中である。