hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
荷重環境下インプラント周囲の骨細胞による骨質制御機構を解明する

本研究の目的は、「骨細胞」と「骨質」に焦点を当て、荷重がもたらすインプラント周囲骨組織の骨質制御機構を分子生物学的に解明することにある。本年度も、前年度に引き続き、開発済みのラット通常型インプラントと配向型インプラントを用いた。両側第一大臼歯を抜歯して3週間後にインプラントを埋入した。インプラント埋入3週間後に、片側のインプラントには規則的な繰り返し荷重を加え(実験群)、反対側には荷重を加えなかった(対照群)。荷重付与(埋入)後2週間と5週間でラットを屠殺して上顎と長管骨を採取し、3次元的構造解析、組織形態学的解析、免疫組織化学的解析、ならびに遺伝子抽出と蛋白質抽出による分子生物学的解析を行って、詳細に比較検討した。その結果、通常型インプラント周囲骨組織では、荷重付与2週間の時点で骨関連細胞の動態変化が起こり、特徴的な複数の遺伝子の変動も認められた。さらに荷重付与5週間では破骨細胞ではなく骨芽細胞と骨細胞の動態変化が起こり、骨質が大きく適応変化していることが分かった。一方配向型インプラント周囲骨組織では、荷重付与2週間の時点で、通常型インプラントと同様に骨関連細胞の動態変化が起こっており、その差は認められなかった。ところが荷重付与5週間後では骨芽細胞の動態変化が著明であり、通常型インプラント比較して、骨関連細胞数の変化と分布、複数の遺伝子相対発現、ならびにコラーゲン線維の走行と量に優位性を持つことが分かった。さらに両者の解析結果から骨質制御分子の同定を試みた結果、Semaphorin3Aとオートファジー関連分子Xを候補として挙げることができた。以上より、インプラントの形状が荷重環境下で骨質を変化させ、そこには骨関連細胞における分子動態の変動が起こることが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はまず、ラット専用インプラントの開発に着手した。申請時に使用していたラット用インプラントはヒト用インプラントとはかけ離れたデザインをしており、たとえ結果が得られても臨床的に関与するかどうかは疑問であった。そして申請者らは、ヒト用のインプラントデザインに極めて類似した形態をラット用インプラントに付与することに成功した。まず初めにヒト用インプラントのネック部長軸に対して反時計回りに60度の溝が付与されたー60度グルーブインプラントと、ネック部の長軸に対して時計回りに60度の溝が付与された+60度グルーブインプラントを開発し、家兎の脛骨にて実験を行った。その結果、家兎脛骨に埋入されたー60度グルーブインプラントも+60度グルーブインプラントも荷重によって骨反応が起こり、骨量は有意に増大していた。興味深いことに荷重環境下では、+60度グルーブインプラントはー60度グルーブインプラントと比較して、周囲骨組織の骨細胞ネットワークが有意に発達し、生体アパタイト結晶とコラーゲン線維の優先配向が起こっていた。以上のことから、荷重応答性に骨質を向上させるインプラントは+60度グルーブを付与されたインプラントであると結論付けた。この結果をもとにして我々はラットに対して使用可能で、家兎に使用したインプラントに類似したデザインのインプラントを開発した。現在このインプランを、ラット上顎第一大臼歯部抜歯後に埋入し、規則的繰返し荷重を加えて骨組織の応答性を検索する段階まで研究は進んでいる。当初計画をしていなかったインプラントの開発に時間を要したが、ラットにインプラントを埋入して荷重を加える実験を行っており、現在、荷重応答性の遺伝子を決定する全段階まで研究は進んでいる。以上のことを総合的に判断して、研究はおおむね順調に進展しているといえる。本研究の目的は「骨細胞」と「骨質」に焦点を当て、荷重がもたらすインプラント周囲骨組織の骨質制御機構を分子生物学的に解明することにある。前年度までに開発した通常型ラットインプラントと配向制御型ラットインプラントを用いた。両側第一大臼歯抜歯後3週間でインプラントを埋入し、埋入後3週間で片側のインプラントには規則的な繰り返し荷重を加え、反対側のインプラントには荷重を加えなかった。荷重を加えて5週間後にラットを屠殺し、組織形態学的解析と免疫組織化学的解析を行った。さらに荷重を加えて30分後にラットを屠殺し、骨組織から抽出した遺伝子と蛋白質を用いて定量qPCRとウエスタンブロッティングを行った。その結果、通常型インプラント周囲骨組織では骨量の増加は認められず、骨密度だけが増加していた。また、荷重群は非荷重群と比較すると、骨細胞数、骨芽細胞数ならびに破骨細胞数が有意に増大しており、骨組織から抽出した遺伝子検索においても骨細胞マーカー、骨芽細胞マーカーならびに破骨細胞マーカーのそれぞれが有意な上昇を認めた。さらに骨芽細胞と破骨細胞の複数のカップリング因子は荷重群で有意な増大を示していた。以上から、荷重が加えられたインプラント周囲骨組織では骨量を変化させず、骨密度と骨質を変化させて荷重に適応していることが考えられた。また、骨質の変化には、今まで考えてきた骨細胞だけではなく、骨芽細胞と破骨細胞のカップリングが深く関与している可能性が強く考えられた。

一方骨質制御型インプラントに関しては動物実験が一部終了したことから、引き続き研究を継続し、最終的には通常型インプラントと配向制御型インプラント周囲骨組織における分子生物学的な差異を見出すことで、骨質修飾因子を同定する。荷重がインプラント周囲骨組織の骨質に与える影響の一部を分子生物学的に解明できた。また、配向制御型インプラントを用いた動物実験も終了したことから、おおむね順調に進展しているといえる。本研究の目的は「骨細胞」と「骨質」に焦点を当て、荷重がもたらすインプラント周囲骨組織の骨質制御機構を分子生物学的に解明することにある。前年度までに開発した通常型ラットインプラントと配向制御型ラットインプラントを用いた。両側第一大臼歯抜歯後3週間でインプラントを埋入し、埋入後3週間で片側のインプラントには規則的な繰り返し荷重を加え、反対側のインプラントには荷重を加えなかった.埋入2週間と5週間後にラットを屠殺し、3次元的構造解析、組織形態学的解析、免疫組織化学的解析、ならびに遺伝子抽出と蛋白質抽出による分子生物学的解析も行った。通常型インプラント周囲骨組織の各種定量解析の結果、荷重応答性に通常型インプラントの骨質は有意に変化し、コラーゲン線維の優先配向がもたらされ、同時に荷重応答性に骨芽細胞と破骨細胞のカップリング因子であるsemaphorin3Aともう一つの蛋白質Aの変動が認められたことから、semaphorin3Aともう一つの蛋白質Aを荷重応答性骨質制御分子の候補と同定した。現在Sempahorin3Aは骨芽細胞だけでなく近年では骨細胞でも産生されることが報告されており、荷重環境下では、骨細胞と骨芽細胞が産生するSempahorin3Aや、蛋白質Aを基軸とした骨質制御機構が構築されている可能性が考えられたため、遺伝子改変マウスの作製を目指している。一方配向型インプラントの解析は現在行われており、定量解析が終了すれば、Sempahorin3Aと蛋白質A以外に、骨質向上関連分子の候補を同定できる可能性が高いと考えられる。既に配向型と通常型インプラントにおける全ての動物実験は終了し、Sempahorin3Aという骨質制御分子候補の同定まで終了した。配向型インプラントの解析も近々終了することから新たに荷重制御型骨質向上分子の候補も同定される可能性が高い。さらに遺伝子改変マウスの作製も目指して動いているため、総合的に鑑みて(2)おおむね順調に進展している、とした。本研究の目的は、「骨細胞」と「骨質」に焦点を当て、荷重がもたらすインプラント周囲骨組織の骨質制御機構を分子生物学的に解明することにある。本年度も、前年度に引き続き、開発済みのラット通常型インプラントと配向型インプラントを用いた。両側第一大臼歯を抜歯して3週間後にインプラントを埋入した。インプラント埋入3週間後に、片側のインプラントには規則的な繰り返し荷重を加え(実験群)、反対側には荷重を加えなかった(対照群)。荷重付与(埋入)後2週間と5週間でラットを屠殺して上顎と長管骨を採取し、3次元的構造解析、組織形態学的解析、免疫組織化学的解析、ならびに遺伝子抽出と蛋白質抽出による分子生物学的解析を行って、詳細に比較検討した。その結果、通常型インプラント周囲骨組織では、荷重付与2週間の時点で骨関連細胞の動態変化が起こり、特徴的な複数の遺伝子の変動も認められた。さらに荷重付与
緑茶カテキンセンシングの分子的基盤の解明とそれに基づく機能性発現イメージング

緑茶カテキンの主成分である(ー)-epigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)は、多彩な生体調節作用を示す。EGCGの細胞膜上におけるセンサー分子として67-kDa Laminin Receptor(67LR)が発見されて以来、抗がん作用を始めとするEGCGの様々な機能性発現(EGCGセンシング)に67LRが関与することが示されてきた。そこで本研究では、EGCGセンシングの分子的基盤を明らかにすることを目的とした。「EGCGの慢性骨髄性白血病細胞致死作用の分子機構」EGCGは慢性骨髄性白血病細胞に対してアポトーシスを誘導する。その作用機構の解明にあたり、アポトーシス誘導に関わるシグナル伝達の場としての脂質ラフトに着目した。EGCGが脂質ラフトに与える影響を検討した結果、EGCGは脂質ラフトの会合を誘導することを見出した。また、EGCGによるアポトーシス誘導において、cGMP産生を介したProtein kinase Cδならびに酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)の活性化が重要であることを明らかにした。「EGCGのがん特異的な抗がん作用の増強」多発性骨髄腫(MM)において67LRが高発現しており、EGCGはMM細胞に対して特異的にアポトーシスを誘導することが知られている。EGCGのアポトーシス誘導にはASM誘導性のセラミド産生が重要であるが、セラミドは様々な代謝調節を受けている。そこで、セラミド代謝関連酵素の発現について検討したところ、セラミド分解酵素の一種であるスフィンゴシンキナーゼ1(SphK1)がMM細胞で高発現していることを明らかにした。また、SphK1の阻害剤はEGCGのMM特異的なアポトーシス誘導作用を保持したまま、その活性を顕著に強め、骨髄腫細胞を移植したマウス腫瘍モデルにおいても肝毒性を示すことなく腫瘍成長を抑制することを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。「テーマ1: EGCGセンシングの分子基盤の確立」緑茶カテキンの主成分であるEpigallocatechin-3-O-gallate (EGCG)センシングの分子基盤を確立するために、これまで不明であったEGCGの67LRを介した抗メラノーマ作用機構を明らかにした。この新しい作用機構は、メラノーマの既存抗がん剤が「増殖シグナルをONにする酵素を抑制する」ものであることに対し、EGCGは「増殖シグナルをOFFにする酵素を活性化する」ことで抗腫瘍効果を発揮していることから、メラノーマ治療における全く新しい観点からの標的になりうると考えられる。その詳細をまとめた論文は近日中に報告する予定である。「テーマ2: EGCGセンシングの生体内イメージング」これまでの機能性食品に関する研究の多くは、生理的な濃度を無視した条件下で行われるが、近年ではより生体に近い条件で検討し、生体内で真に起こりうる現象を把握することが強く求められている。そこで本研究では、緑茶カテキンEGCGにより誘導される分子メカニズム情報を基盤とし、そうした変化を生体内でリアルタイムに観察するという新たな評価系の確立を同的とした。プルダウン法を用い、EGCGの細胞増殖抑制作用を仲介する二つの分子が直接相互作用を示すことを明らかにした。リアルタイムに細胞内のタンパク質相互作用を評価できる生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)システムを利用し、この二分子がそれぞれ「ルシフェラーゼ」、あるいは、「GFP」が付くタンパク質を同時に定常的に発現する細胞の構築に成功した。「テーマ1:EGCGセンシングの分子基盤の確立」現在、メラノーマの代表的な治療薬(BRAF阻害剤)に対する薬剤抵抗性が問題となっている。一方で、緑茶カテキンエピガロカテキン-3-O-ガレート(EGCG)はがん細胞で高発現する細胞膜上受容体67 kDaラミニンレセプター(67LR)を介してがん特異的な抗がん作用を発揮することから注目されている。特に、EGCGは、BRAF阻害剤感受性およびBRAF阻害剤抵抗性のどちらのメラノーマ細胞に対しても同程度の増殖抑制作用を発揮することから、BRAF阻害剤とは異なる作用機構を有していると考えられた。網羅的遺伝子スクリーニング法を用い、EGCGのメラノーマ細胞増殖抑制作用を仲介する遺伝子を探索した結果、Protein phosphatase 2a alpha (PP2A)という酵素が、EGCGのメラノーマ細胞増殖抑制作用の中心的役割を担っていることを明らかにした。また、EGCGは67LRを介してAdenylate Cyclase/cAMP経路でPP2Aを活性化し、CPI-17/Merlin経路を活性化することでメラノーマ細胞特異的な増殖抑制作用を発現することを明らかにした。さらに、EGCGをBRAF阻害剤と併用することで、BRAF阻害剤の抗メラノーマ作用が顕著に改善することを確認した。以上より、67LR/PP2A経路の活性化は、既存メラノーマ治療薬の抵抗性を改善する新たな治療戦略として期待できると考えられる。「テーマ2:EGCGセンシングの生体内イメージング」EGCGが細胞膜タンパクである67LRを介して強い生理活性を示すが、EGCGと67LRが結合する際に何が起きているかに関して全く不明である。そこで、本研究はEGCGの機能発現につながるイメージング手法を成功に樹立した。

EGCGの細胞膜上におけるセンサー分子として67-kDa Laminin Receptor(67LR)が発見されて以来、抗がん作用を始めとするEGCGの様々な機能性発現(EGCGセンシング)に67LRが関与することが示されてきた。そこで本研究では、EGCGセンシングの分子的基盤を明らかにすることを目的とした。「EGCGの慢性骨髄性白血病細胞致死作用の分子機構」EGCGは慢性骨髄性白血病細胞に対してアポトーシスを誘導する。その作用機構の解明にあたり、アポトーシス誘導に関わるシグナル伝達の場としての脂質ラフトに着目した。EGCGが脂質ラフトに与える影響を検討した結果、EGCGは脂質ラフトの会合を誘導することを見出した。また、EGCGによるアポトーシス誘導において、cGMP産生を介したProtein kinase Cδならびに酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)の活性化が重要であることを明らかにした。「EGCGのがん特異的な抗がん作用の増強」多発性骨髄腫(MM)において67LRが高発現しており、EGCGはMM細胞に対して特異的にアポトーシスを誘導することが知られている。EGCGのアポトーシス誘導にはASM誘導性のセラミド産生が重要であるが、セラミドは様々な代謝調節を受けている。そこで、セラミド代謝関連酵素の発現について検討したところ、セラミド分解酵素の一種であるスフィンゴシンキナーゼ1(SphK1)がMM細胞で高発現していることを明らかにした。また、SphK1の阻害剤はEGCGのMM特異的なアポトーシス誘導作用を保持したまま、その活性を顕著に強め、骨髄腫細胞を移植したマウス腫瘍モデルにおいても肝毒性を示すことなく腫瘍成長を抑制することを明らかにした。まず、「テーマ1:EGCGセンシングの分子基盤の確立」に関しまして、EGCGががん細胞で高発現する細胞膜上受容体67LR)を介しAdenylate Cyclase/ cAMP経路でメラノーマ特異的にPP2Aを活性化し細胞増殖抑制作用を発揮するメカニズムを解明した。この新しい作用機構は、メラノーマ治療の既存抗がん剤が効かない細胞においても効果を示すことから、全く新しい観点からメラノーマ治療の新規ターゲットを提示した。本研究成果はJ Biol Chem. 2014, 289(47):32671-81.にて掲載している。また、「テーマ2:EGCGセンシングの生体内イメージング」では、EGCGの機能発現につながるイメージング手法を成功に樹立した。その詳細をまとめた論文は近日中に報告する予定である。よって、期待以上の研究の進展があったといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。テーマ1:EGCGセンシングの分子基盤の確立に関しまして、上記の研究成果を検討していく途中で新たながん幹細胞の維持に重要な因子を同定した。近年、がん幹細胞と呼ばれる少数の細胞集団が抗がん剤治療や放射療法など従来のがん治療に抵抗性を示し、また、がんの再発および転移の原因となっている。そのため、がん幹細胞を標的とする新規がん治療法の開発が急務となっている。
胎児完全房室ブロックの胎内DDDペーシングの利点の検討およびその際の脳血流の評価

羊胎仔に対し、高周波アブレーションカテーテルにて完全房室ブロックの作製を試みたが、胎仔心機能を悪化し胎内死亡してしまい完全房室ブロックを作製する事が困難であった。そこで、羊胎仔10頭に対して頻脈性不整脈の際の脳血流の変化について検討した。母体を硬膜外麻酔およびケタラールによる鎮静を行い、腹壁、子宮を切開した。胎仔を露出し、総頚動脈をカットダウンにて確保して、超音波血流計を装着した。次に、右側開胸を行い、上行大動脈基部にやはり超音波血流計を逢着、また、右房に針電極を逢着した。体外式ペースメーカーを用いて、OFF,200,300,350,400/minにて右房をペーシングして、その際の上行大動脈、腕頭動脈の血流量、血流パターンを観察した。上行大動脈の血流量が、338、300、275、260、250ml/mmin/kgと変化したのに対し、脳血流は53.7±20.9、55.8±16.3、50.8±18.1、48.5±21.3、60.0±18.3ml/min/kgと一定の値を保つことがわかった。これは、胎児心房粗動の際心拍出量が減少しても重要臓器血流である脳血量は合目的に維持されることを示す。ペーシングレートが上がるにつれて腕頭動脈の最高流速は減少し、最低流速が増加する傾向が見られ(心室拡張不全の為)、Pulsatility Indexの低下を認めた。血流量としては維持されても、この血流パターンの変化がどの様に脳機能に影響していくかは今後の課題である。この検討を行うためには、頻拍のまま維持する慢性実験が必要である。今回の検討では、予定していた完全房室ブロックを作製する事が困難であった。房室結節を焼灼し周りの組織に影響を与えない方法として、高周波アプレーションが最も適していると考えたが、さらに先端の電極が小さく周囲の心筋組織への接触が少ないカテーテルを用いる必要を感じた。
有機強誘電体の外場による物性制御と構造変調

有機分子からなる強誘電体を用い、新規強誘電体の設計指針や、強誘電体の特性向上のための設計指針を得るために、その分極の起源を構造物性的見地から明らかにした。酸-塩基超分子強誘電体において、分極の起源であるプロトン移動が低温圧力下で起こっていること、また、置換基の導入による水素結合長の増大が誘電特性向上のための一つの方策であることを示したほか、電荷移動型強誘電体において、「電子型強誘電体」という新たな分極起源を放射光X線回折から明らかにした。強誘電体は多くの電子材料をはじめ、圧電素子、光学素子など応用範囲の広い重要な物質である。軽量、低コスト、有害・希少元素を含まないなど多くの利点を有する有機強誘電体の開発は喫緊の課題といえよう。強誘電体における分極発現機構は、実空間の構造と密接に関連し、物性と構造の対応は強誘電体設計・開発における最も重要な知見の一つである。本研究課題では、これまでに得られた水素結合系強誘電体、電荷移動型強誘電体結晶を用いて、温度・電場・圧力などの外場下における物性変化と構造変化を明らかにし、その知見を元に新規強誘電体の設計指針を得ることが目的である。当該年度は、酸-塩基からなる水素結合系超分子強誘電体Phz-H2xaの温度-圧力による構造変調を明らかにするための実験を行った。この結晶は、置換ハロゲンの違いにより異なる基底状態(Cl;二倍周期構造強誘電、Br:三倍周期構造強誘電、F:常誘電)を有し、常圧で強誘電転移を示す塩素・臭素置換体では温度変化により逐次相転移を示すことが知られていた。これらの結晶に圧力を印加し、誘電測定及び放射光回折実験を行ったところ、フッ素置換体、臭素置換体ともに常圧とは異なる長周期構造をもつ強誘電相が誘起され、高圧低温では塩素置換体で見られた二倍周期構造が安定になることが明らかになった。赤外分光の結果と合わせて考察した結果、これらの長周期構造は、プロトンが酸から塩基へ移動して生じたイオン性種と中性種が共存することに由来すると示唆される。長周期構造を有する低温での分極の起源は、中間温度領域に見られたプロトンのわずかな変位がさらに進んだプロトン移動型の構造にあることが明らかになった。また、温度-圧力相図から、置換ハロゲンと温度の違いにより出現した多くの誘電相がすべて統一的に理解できることを明らかにした。これまでに、有機の酸と塩基からなる強誘電体、反強誘電体が多く見つけられてきたが、これらの物質について、誘電転移の温度(TC)と強誘電体の分極値(P)を、構造的観点から整理してみたところ、水素結合長が大きいほど誘電体としての特性が高い(転移温度が高く、分極値が大きい)ことが明らかになった。この特徴から、用いる酸あるいは塩基分子に立体障害となる置換基を導入することで、誘電体の特性をあげることが可能であると考え、かさ高い置換基であるピリジン環を導入した[H-dppz][Hca]を作成したところ、水素結合長が約2.7オングストローム、それまでに得られていた水素結合系強誘電体の中では最も大きく、P = 5.2 μCcm-2、TCも約400 Kとなり、高い強誘電特性を示しすことが明らかになった。一方、メチル基を導入した系である[H-66dmbp][Hia]では、さらに長い約2.9オングストロームという水素結合長をもつ構造をとることがわかった。この物質では、高分子系の強誘電体であるPVDFに匹敵するP = 8.0 μCcm-2を示した。転移温度に関しては、水素結合長から期待される転移温度(約600K)よりも低い約400 Kで構造相転移が生じ、反強誘電的構造へと変化することが明らかになった。これは、大きな水素結合距離や立体障害の影響により、分子配列や分子内の置換基の回転などに自由度が生じたために高温で構造相転移がおこったためと考えられる。これらの結果から、誘電体の特性を向上させるための方策として、水素結合長の制御は有効であり、一つの設計指針であることが明らかになった。今年度得られた成果のうち、一つはイミダゾール骨格を有する新規の水素結合系有機強誘電体・反強誘電体の構造を明らかにし、これらの分極整列、分極発現機構を構造的に明らかにしたことが挙げられる。

この系では従来の酸素-窒素型、あるいは酸素-酸素型の水素結合系誘電体に比べ、キュリー温度が高く、また熱的に安定なことが予想され、応用面からの期待もあるが、従来の水素結合系誘電体では見られなかった90度ドメインの構造や、反強誘電体特有の二重履歴型の分極反転ループが観測されるなど、水素結合系強誘電体の新たな展開が期待される系である。また、二つめの成果として、電荷移動型有機強誘電体TTF-CAの電場下における回折実験により、分極発現機構を明らかにしたことが挙げられる。この物質は発見から30年以上たつ物質であり、低温におけるイオン性相が強誘電体であることは知られていたものの、分極の大きさなどの誘電体としての特性は知られていなかった。近年になって、従来のイオン分極に基づく機構に比べてはるかに大きな分極の値が期待されることが予測されており、実際に分極の測定を行ったところ、理論予測通りに大きな(7μC/cm2)分極が観測された。この分極発現機構が電子型強誘電に基づくものであることを明らかにするために、放射光を用いた電場下回折実験を行い、理論予測通りにイオン分極の向きとは逆向きに分極は発生していることを証明した。また、同時に、電場下ではほぼ100%の分極ドメインが整列出来ていることも明らかにできた。電場下低温における分極ドメインの整列と、放射光回折を組み合わせた成果といえよう。さらに、外場として圧力を用いた実験を行うために、従来のBeを用いた高圧セルよりもバックグラウンドが小さく、より精密な実験を可能とするためのエンジニアリングプラスチックを材質として用いた高圧セルの開発を続けている。交付申請書における当初計画に記述した通り、超分子型水素結合系強誘電体Phz-H2xaの逐次相転移に関して、高圧下における誘電挙動と構造変調の測定を行い、この系の基底状態及び高圧低温下における分極発現機構を明らかにした。さらに電場下におけるドメイン制御、圧力下における精密構造解析システムの構築など、次年度以降の研究のための予備実験も行いつつある。25年度が最終年度であるため、記入しない。当所の予定通り、放射光X線を用いて、電場あるいは圧力、温度など外場下での結晶構造、構造変調についての実験を進めている。今年度は、新規強誘電体の構造解析をいくつか行った他、特に電場における強誘電ドメインの整列に関する実験を行い、これにより電荷移動型強誘電体TTF-CAにおける分極発現機構が、電子型強誘電であることを明らかにするとともに、従来型のイオン分極の機構よりも一桁以上大きくしかも分極の方向が逆向きであることを報告できた。これは放射光を用いた実験ならではの成果であり、本課題における研究の目標としてよく合致しているといえる。一方、圧力を用いた実験では、バックグラウンド低減型圧力セルの基本データ(温度、圧力のキャリブレーション)の整備を進めている。セルの材質の問題により、熱伝導が悪いなどの問題などがあり、当所は試料の温度が外部の温度と一致しない問題があったが、一部の材質の見直しを行い解決できる目処がたった。今後はこの高圧セルを用いた基礎データの補完を行うとともに、圧力下における精密構造解析や、圧力による構造の変調の観測を行うことを予定している。種々の有機強誘電体の分極発現機構を明らかにするために、H23年度に行った超分子水素結合系強誘電体Phz-H2xaに加え、他の水素結合系誘電体、あるいは電子ドナー・アクセプターからなる電荷移動錯体系など、多くの系についての測定を行い、分極整列機構に関する知見を集積し、新たな誘電体構築のための設計指針を構築する。また、電場によるドメイン制御を施した構造解析、高圧下における精密構造解析など、強誘電体の構造解析及び外場下構造変調の観測のための新たな手法の確立を目指す。昨年度までの実験成果を元に、引き続き、放射光を用いた外場下での回折実験を通じて有機強誘電体の分極発現機構を明らかにする研究を進める。
新規光感受性物質を用いた悪性神経膠腫に対する光線力学療法の基礎実験

ヒト悪性神経膠腫に対する光線力学療法において様々な光感受性物質が臨床応用されつつあるがその殺細胞効果の低さから満足のいく結果が得られていないのが現状である。従来の光感受性物質に比べ殺細胞効果を持つ一重項酸素の発生効率を増加させたケイ素置換基導入ポルフィリン誘導体を用いて基礎実験を行った。この新規光感受性物質は有用と考えられ、ヒト悪性神経膠腫の光線力学療法への応用の可能性が示唆された。神経膠腫は中枢神経系に原発する悪性腫瘍で、現在なお治療の困難な疾患である。腫瘍は正常脳組織に浸潤、増殖するために腫瘍摘出時に正常脳組織と腫瘍組織を肉眼的に識別することは非常に困難である。そのため腫瘍組織だけを選択的に可視化し治療する方法の開発が進められ、近年、ヘム前駆体ポルフィリンが利用されるようになった。ヘム前駆物質5-アミノレブリン酸(ALA)が癌細胞に特異的に取り込まれ、ミトコンドリアでALAからPpIXに生合成され、PpIXが赤色蛍光を出す。この赤色蛍光は肉眼で観察できるため、術中に正常脳組織と腫瘍組織をreal timeに識別する術中蛍光診断法(PDD)として悪性脳腫瘍の分野でも広く応用されるに至った。さらに現在、ALA induced Pp IXは光化学反応によって生じるフリーラジカルにて殺細胞効果を狙った光線力学的治療(PDT)へ臨床応用されている。ALA induced Pp IX、フォトフリン、レザフィリンなどの光感受性物質によるPDTが臨床応用されつつあるがその殺細胞効果の低さから満足のいく結果が得られていないのが現状であり、新規の光感受性物質の開発が待たれている。本研究では共同研究者である群馬大学工学部応用化学科助手堀内宏明先生らが開発したケイ素導入ポルフィリン誘導体を用いた。ポルフィリン誘導体にケイ素置換基を導入することにより殺細胞効果を持つ一重項酸素の発生効率が増加する。ヒト神経膠腫初代培養細胞を用いたin vitroの検討では培養液中に加えたケイ素導入ポルフィリン誘導体が細胞内に取り込まれ、レーザー光を照射することにより殺細胞効果を示すことが確認された。新規感受性物質であるケイ素置換基導入ポルフィリンを使用した光線力学療法のヒトの悪性神経膠腫治療への応用の可能性が示唆された。ヘム前駆物質5-アミノレブリン酸(ALA)が癌細胞に特異的に取り込まれ、ミトコンドリアでALAからPpIX(に生合成され、PpIXが赤色蛍光を出す。ALA induced PpIX、フォトプリン、レザフィリンなどの光感受性物質によるPDTが臨床応用されつつあるがその殺細胞効果の低さから満足のいく結果が得られていないのが現状であり、新規の光感受性物質の開発が待たれている。またヌードマウス移植モデルを用いたin vivoの検討も行い、新規感受性物質であるケイ素置換基導入ポルフィリンを使用した光線力学療法のヒトの悪性神経膠腫治療への応用の可能性が示唆された。
高度好熱菌DNA結合蛋白質のX線結晶構造解析

高度好熱菌DNAの結合蛋白質を精製する為に、Thermus Thermophilusの20l培養を繰り返し行ない、菌体1.5Kgを集め、これを以下の実験に用いた。実験では、DNA結合蛋白質の存在の確認と精製方法の検討を第一に行なった。その為に、DNAを結合させた親和クロマトグラフィー用のカラムを作製し、これに結合する蛋白質の分離を試みた。その結果、少なくとも3種のDNA結合蛋白質が確認された。その内の一種は、既に我々がBacillus stearothermophilusから結晶化、構造解析を行なったものと分子量が類似し、同種の蛋白質と考えられる。しかしながら、3種ともに収量が少なく、解析に足る量を確保するには、やや困難が予想される。そこで、DNA結合蛋白質の耐熱性を利用した精製方法を検討した。摂氏90度、30分の熱処理で、多くの不純蛋白質は沈殿するのにし、DNA結合蛋白質は、ほとんどが、インタクトのまま回収されることがわかった。現在、大量精製の準備、および、これまでに得られている蛋白質を使った結晶化のテストを行なっている。並行して行なった、X線結晶構造解析ソフトウェアーの開発では、パーソナルコンピュータ上で、電子密度図をもとに、蛋白質の分子構造を構築するプログラムシステムを開発した。従来、高価な3次元コンピュータグラフィクス装置でしか行ない得なかったこの種の作業が、非常に安価に、また手軽に行ない得るようになったといえる。同システムは、2種の蛋白質の構造解析に利用された。
生体活動に認められる概日リズム、縮日リズム、長日リズムの発達生理学的研究

生体活動のリズムのうち、周期の早いものとして心拍動、縮日および概日リズムを示すものとして下垂体・性腺系のホルモン分泌、さらに経過の長いものとして成長および性成熟過程を取り上げ成長発達医学の立場から検討した。1.下垂体・性腺系の活動リズムを幼児期から思春期中期までの小児を対象に検討した。ゴナドトロピン(LH,FSH)およびテストステロンの血中濃度を高感度で測定し、従来の報告とは異なり幼児においても明かな縮日リズムと概日リズムが存在することを明らかにした。その概要は次の通りである。(1)血清LHは年齢・二次性徴の如何にかかわらず昼夜共に脈動的分泌で特徴づけられる縮日リズムと夜間に高振幅となる概日リズムを持っている。(2)幼児期には安定した平均血中濃度を示すLHおよびFSHは、睾丸容量が3mlに達すると急上昇する。その要因は脈動的分泌の数(縮日リズムの周期)の変化によるものではなく、基礎分泌と脈動的分泌の振幅増大にある。(3)血清LHおよびFSH濃度の上昇がおこると、それまで漸減していた身長増加速度が増加に転ずる。(4)血清テストステロンは、幼児期には緩慢に上昇を続けているが、LHおよびFSHの急上昇に23年遅れて思春期レベルに到達する。2.体重の変化について低出生体重児を対象に検討したところ、体重増加速度には22例中21例で平均周期が9.28±1.05日の長日リズムがあった。このリズムは性、在胎週数、出生体重、水分およびエネルギー摂取量とは独立のものであることが明かとなった。3.インスリン依存型糖尿病の心拍動を、超音波ドップラー法によって左右の心室流入血流および流出血流波形として計測した。糖尿病罹病期間が平均4年8カ月の早期から心室拡張早期の弛緩障害が認められた。平成元3年度の3年間で我々は概日および縮日(超日)リズムから見た視床下部下垂体機能の発達生理学的研究(一般研究C:課題番号01570511)を行った。これをさらに発展させて、平成4年度から対象を内分泌を含めた生体活動全般に拡大して研究を進めることにした。1.二次性徴発現に関して40例の非内分泌性低身長者を対象にゴナドトロピン、テストステロンと分泌リズムと二次性徴の関係を検討した。全例でゴナドトロピンおよびテストステロンに脈動的分泌と夜間に高値となる概日リズムが認められた。二次性徴の発達との関係を検討したところ、従来の知見とは異なり、ゴナドトロピンおよびテストステロンは睾丸容量が3mlに達する2年前から着実に上昇を続けていることが明らかになった。この成績は平成5年の日本小児科学会およびLWPES/ESPE合同会議に報告の予定である。2.先天性副腎過形成患者を対象にした研究は上記の問題を病的状態で確認する手段になると期待される。すでにホルモン測定が進行中である。疾患の性質上、症例が限定されるので、長期間にわたるデータの集積が必要である。3.成長速度の長日リズムについて、未熟児の成績では約9日周期のリズムが存在することを報告した(日児誌96:2048-53,1992)。その後成熟健康新生児についても同様の検討を加え、未熟児と同等のリズムが存在することが確認できた。ボランティアを募って研究を重ねている。てんかん患者の睡眠覚醒リズムについても症例の検討を続けている。4.予定外であったが、Interleukin6の加齢による変動について検討することが出来た。

免疫機能の発達を今後の研究課題に加えることにしたい。生体活動のリズムのうち、周期の早いものとして心拍動、縮日および概日リズムを示すものとして下垂体・性腺系のホルモン分泌、さらに経過の長いものとして成長および性成熟過程を取り上げ成長発達医学の立場から検討した。1.下垂体・性腺系の活動リズムを幼児期から思春期中期までの小児を対象に検討した。ゴナドトロピン(LH,FSH)およびテストステロンの血中濃度を高感度で測定し、従来の報告とは異なり幼児においても明かな縮日リズムと概日リズムが存在することを明らかにした。その概要は次の通りである。(1)血清LHは年齢・二次性徴の如何にかかわらず昼夜共に脈動的分泌で特徴づけられる縮日リズムと夜間に高振幅となる概日リズムを持っている。(2)幼児期には安定した平均血中濃度を示すLHおよびFSHは、睾丸容量が3mlに達すると急上昇する。その要因は脈動的分泌の数(縮日リズムの周期)の変化によるものではなく、基礎分泌と脈動的分泌の振幅増大にある。(3)血清LHおよびFSH濃度の上昇がおこると、それまで漸減していた身長増加速度が増加に転ずる。(4)血清テストステロンは、幼児期には緩慢に上昇を続けているが、LHおよびFSHの急上昇に23年遅れて思春期レベルに到達する。2.体重の変化について低出生体重児を対象に検討したところ、体重増加速度には22例中21例で平均周期が9.28±1.05日の長日リズムがあった。このリズムは性、在胎週数、出生体重、水分およびエネルギー摂取量とは独立のものであることが明らかとなった。3.インスリン依存型糖尿病の心拍動を、超音波ドップラー法によって左右の心室流入血流および流出血流波形として計測した。糖尿病罹病期間が平均4年8カ月の早期から心室拡張早期の弛緩障害が認められた。
妊婦の自動車運転の安全性に関する基礎的研究

妊婦ドライバーに保健・医療サイドから的確なアドバイスを行えるよう母子の安全に関する基礎的情報の集積を目的として、平成12年度に以下の研究を実施した。研究対象:医療法人定生会谷口病院(大阪府泉佐野市)で出産した790名質問紙の自由記載回答欄に述べられた妊娠中の自動車運転に対する意見について分類・整理を行った結果、懸念事項として妊娠のアウトカムに関する項目が多く含まれていることが判明した。そこで、回答者の妊娠のアウトカム(切迫早産・在胎期間・分娩時胎位・臍帯巻絡・出生体重・アプガールスコア・分娩時の母体BMI)に関する情報を出産記録より収集し、運転との関連について検討を行った。臍帯巻絡以外は自動車運転によるリスクの増大は認められなかった。妊娠中の自動車運転と臍帯巻絡の頻度の関係は現在調査中のprospective studyにより検討する予定である。これまでの研究結果を総合して、妊婦ドライバーに保健指導を行う保健医療職者へ次の10項目を提言した。(1)妊婦の日常生活行動に関する情報収集事項の中に自動車運転の有無を入れ、地域をふまえた実態を把握しておくこと。(2)特別な理由がない限りほとんどの妊婦は自動車運転を中断しないという前提にたって、個別指導を考えること。(3)子宮筋活動が高まっている妊婦は運転を控えた方が安全である。切迫早産傾向のある妊婦は要注意。(4)疲労・子宮筋活動亢進予防のため、長時間運転を避けるように指導する。(5)帰宅後の十分な安静をすすめる。(6)運転に自信がない妊婦、運転歴の浅い者は注意する。(7)妊娠中に運転スピードをおとしている者は、後続車にあおられないようにステッカーを貼っておくことをすすめる。(8)CTG上では胎児に対する影響はないことを伝え、胎児に対する不安を取り除く。(9)妊婦が自動車運転中に感じやすい不快症状や運転操作に関する情報を予め伝えておく。(10)シートベルト着用の重要性を伝え、安全な装着方法を指導する。産後のチャイルドシート使用の意識向上へつなげる。妊娠中の自動車運転が妊娠経過に及ぼす影響を明らかにするために、平成11年度に以下の研究A・Bを行い、妊婦指導に有用な基礎的情報を集積することができた。【研究A】携帯用分娩監視装置使用による運転中の子宮収縮・胎児心拍動・胎動の連続モニタリング並びに自動血圧計使用による運転前後の母体血圧・脈拍測定を実施した。研究対象:町立内海病院(香川県小豆郡)において妊娠管理中の妊婦29名(通算49名)【研究B】独自に作成した質問紙を使用して、(1)地域(都市部・都市部郊外・島部)による妊婦の自動車運転の実態の比較、(2)運転席・助手席乗車時の比較、(3)ドライバーとノンドライバー(妊娠中に運転しなかった者)の比較、(4)妊婦の自動車運転に対する意見・要望の把握、を実施した。研究対象:都市部NTT西日本大阪病院(大阪市天王寺区)288名大阪厚生年金病院(大阪市福島区)現在調査中都市部郊外医療法人定生谷口病院(大阪府泉佐野市)790名島部町立内海病院(香川県小豆郡)180名研究A・B双方の中間結果によると、子宮収縮に及ぼす影響については、「子宮筋活動が亢進した状態では自動車運転によって子宮筋活動がアクチベートされるが、運転後の休息によって速やかに回復する。また、子宮筋活動が静穏な状態では運転による子宮筋活動への影響は全くない。」ことが強く示唆された。次年度はデータ集計・分析を行い、妊婦指導を行う助産婦をはじめとする医療従事者が活用できる報告書を作成する計画である。

(8)CTG上では胎児に対する影響はないことを伝え、胎児に対する不安を取り除く。(9)妊婦が自動車運転中に感じやすい不快症状や運転操作に関する情報を予め伝えておく。(10)シートベルト着用の重要性を伝え、安全な装着方法を指導する。産後のチャイルドシート使用の意識向上へつなげる。
海外留学プログラムの効果検証：大規模パネルデータによる学生の心理特性の変化の分析

グローバル化推進のため、近年、海外留学プログラムを充実し、海外派遣学生数は大幅に増加している。多様な形態の留学(語学・異文化学習・交換/長期・短期)における派遣学生の学修成果の可視化また留学プログラム自体の効果を客観的分析ツールBEVI(the Beliefs, Events, and Values Inventory)を利用し明らかにする。留学体験の測定により、学修成果の可視化にとどまらず、個々の留学プログラムの質保証、さらにはプログラムの新規構築また実施の見直し等に重要なエヴィデンスを提供する。
Negotiated Spectrum Access for Cognitive Radio Networks

近年、無線技術の発達によりモバイルトラフィックの量が激増している。一方、現在の周波数割り当ては、周波数を排他的に利用する仕組みとなっている。このような静的な周波数利用システムにおいて、使用されずに残っている帯域が数多く存在し、構造的に周波数利用効率の低下が生じてしまう課題を持つと考えられる。これらの問題を改善するため、本研究では、ダイナミックかつ密な周波数二次利用の実現を向け、プライマリシステムとセカンダリシステムを相談しながら、周波数資源を効率的に共用できるフレームワークを提案した。提案手法より、周波数利用効率の向上と各ユーザーに対するサービス品質の向上を同時に実現した。無線通信、無線ネットワーク
インドネシア海洋大陸における降水特性の時空間的変動機構

地球大気の熱源域であるインドネシア海洋大陸域における降水活動の時空間特性を明らかにすることを目的として研究を行った。特に、この地域に卓越する二つの顕著な変動成分である日周変化と季節内変動がどのように相互作用して、地域全体の対流・降水活動を作り上げているかに着目して調査を行った。解析に際しては、熱帯降雨観測衛星(TRMM)により得られた高解像度な降水量データを用いた。世界一の暖水海域に無数の島々が広がるこの特異な地域では、降水日変化が非常に卓越しており、日中夕刻にかけては島上で、深夜早朝にかけては近海域で降雨がもたらされる。顕著な海陸コンラストによって特徴づけられるこの平均的な日周変化は、大規模な大気循環場の変動に伴い変調する。特に、マッデン-ジュリアン振動(Madden-Julian Oscillation ; MJO)と呼ばれる30日60日の周期で熱帯赤道域を東進する季節内擾乱の通過に伴う対流圏下層の東風期・西風期の出現に関連し、島々の降水日変化は島の風下側へ伝播するという系統的な変化を示すことがわかった。このような島々の日周変化が、実際にMJOに関連した大規模な季節内擾乱が海洋大陸上を通過するときに、どのような変動を示すのかをさらに調べた所、これらの伝播性日変化がMJO擾乱の内部構造として内在していることがわかった。特に、MJO擾乱の中心が島々を覆い、下層から中層で西風が顕著になると、東進する伝搬性日周擾乱が卓越する。この日周期性の擾乱群は、実質的に海洋大陸域におけるMJO擾乱そのものの移動および発達を担っており、島々の顕著な日周変化が能動的に働くことにより大規模なMJO擾乱は複雑に分布した島々の間を通り抜けていくことがわかった。
新規ラジカル消去系による抗疾病食品素材の開発とその生体系での機能検証・応用

本研究組織分担者が明らかにした、抗酸化性物質(Y)の、活性酸素種(X)および受容種(Z=抗酸化助長成分など)の共存下における微弱発光と、Yの抗酸化能との関連性、また、Zとして作用する食品・生体成分の検索を行った。また、XYZ系においてYが示す微弱発光量と生体酸化防御機能との関連について検討し、XYZ系を用いる生体酸化防御食品素材の開発システムの有用性について検討した。一方、腫瘍抑制成分としても作用するY,Z成分単独あるいは乳癌特効薬との併用が示す細胞増殖抑制活性について検討を行い、XYZ系の腫瘍抑制食品素材成分探索システムとしての利用の可能性などについて検討し、次のような結果を得た。1.強い抗酸化能(脂質過酸化抑制など)を示すY成分ほどXYZ系において強い微弱発光を示すことがカテキン類、フラボノイドなどを使用した実験によって明らかし、XYZ系が抗酸化食品素材成分の検索システムとして有用なことを明らかにした。2.パラコート酸化ストレス負荷ラットにY成分としてのカテキン類を給与したところ、強い微弱発光を示すエピカテキンガレートが微弱発光能の弱いエピカテキンに比べて強い生体酸化防御能を示すこと、また、防御能は用量依存的に増大することが明らかとなった。3.ヘモグロビン、シトクロームc、ペルオキシダーゼ、SOD、カタラーゼなどは典型的なZ成分として作用してリノール酸の自動酸化を促進するが、典型的なY成分との存在下ではむしろアンチオキシダントとしての作用することが明らかになった。また、血漿、味噌、醤油、アミノカルボニル反応物には未確認のY、Z成分の存在することが明らかになった。4.ヌードマウスにヒト乳癌細胞の移植を行い、味噌、あるいは味噌成分のビオカニンAの単独投与、あるいはそれらの乳癌特効薬タモキシフェンとの併用投与が細胞増殖に及ぼす影響について検討し、味噌、ビオカニンAにはがん予防効果のある可能性を示した。Y(触媒種=抗酸化性物質)が、X(活性酸素種)とZ(受容種)の共存下で微弱光を示すという発見に基づいて、YあるいはZとして作用する食品素材成分・生体成分の検索、さらにはそれらが生体内で示す酸化防御機能について検討した。また、XYZ系の病態診断への利用の可能性について合わせて検討を行い、次ぎのようなことが明かになった。1.Zそのものはプロオキシダントであるが、Yとの共存で協奏的に強い抗酸化能を示すようになること、また、フォトンはY,Zの特徴に依存して400800nmに特徴的な発光を示すことが明かになった。生体成分としてのリポキシゲナーゼ、シトクロム、SODなどはZとしての性質を示すが、Yの存在下では抗酸化作用を示すことが明かになった。2.YあるいはZ成分としてのビオカニンA、あるいはビオカニンAを含む大豆、味噌はいずれもラット乳癌の発生数と、一匹当たりの平均腫瘍数を低下させた。また、その効果はビオカニンAで最も強く、次いで味噌、大豆の順であった。3.動脈硬化性疾患者の低密度リポタンパク質をYとしてXYZ系の微弱発光を測定したところ、動脈硬化性疾患者では発光量の減少がみられ、ラジカル消去活性が低下していることが明かになった。喫煙者においても低密度リポタンパク質の過酸化と発光量の減少が観察された。4.Y成分としてのカテキン類をパラコート酸化ストレス負荷ラットに給与し、それらの酸化防御機能について比較検討を行ったところ、XYZ系でYとして強い微弱光を示すカテキン類ほど高い生体酸化防御機能を示すことが明かになった。

X(活性酸素種)、Y(触媒種)およびZ(受容種)はin vitroにおける共存下で微弱発光を示し、その発光強度は系全体の抗酸化能と密接に関連することを昨年度明らかにされた。したがって、食品素材に含まれるY、Z成分は生体においても強い酸化防御機能を示すことが期待できる。一方、生体成分そのものがY、あるいはZとして作用し、生体を酸化から防御している場合も想定できる。10年度は食品素材Y成分の微弱発光能と生体酸化防御機能との関連、生体成分からのY、Z成分の探索、さらには腫瘍抑制成分としても作用するY、Z成分単独あるいは乳癌特効薬との併用が示す細胞増殖抑制活性について検討を行い、次のような結果を得た。1.パラコート酸化ストレス負荷ラットにY成分としてのカテキン類を給与したところ、強い微弱発光を示すエピカテキンガレートが微弱発光能の弱いエピカテキンに比べて強い生体酸化防御能を示すこと、また、防御能は用量依存的に増大することが明らかとなった。2.ヘモグロビン、シトクロームc、ペルオキシダーゼ、SOD、カタラーゼなどは典型的なZ成分として作用してリノール酸の自動酸化を促進するが、典型的なY成分との存在下ではむしろアンチオキシダントとしての作用することが明らかになった。また、血漿、味噌、醤油、アミノカルボニル反応物には未確認のY、Z成分の存在することが明らかになった。3.ヌードマウスにヒト乳癌細胞の移植を行い、味噌、あるいは味噌成分のビオカニンAの単独投与、あるいはそれらの乳癌特効薬タモキシフェンとの併用投与が細胞増殖に及ぼす影響について検討し、味噌、ビオカニンAには予防効果のある可能性を示した。
配置空間上の超幾何方程式およびq-アナログの研究

本研究の目的は高野と共同してP^n上のk点の配置の定める空間上の超幾何方程式系E(k,n)について,その幾何構造,代数構造を調べることであった。幾何構造を明らかにするという意味は方程式の定める射影空間への写像の幾何構造を問題にすることである。不変量を曲率としてとらえ,その計算手続きを具体的に明らかにすることである。純幾何的には射影微分幾何学に属する問題といってよい。特に,今年度取り上げたことは,E(k,n)に関連して,未知関数が2である2変数の方程式系の局所幾何-線織面および線叢についての過去の議論を整理し,その不変式論を展開したことである。これは,Laplace変換を曲面上に実現する方法でもあり,sinh-Gordon方程式の対称性の1つの幾何的表現を与えることができる。さらに,大学院生の協力を得て,上記配置空間上の方程式系のq-類似についてそのq-対称性を野海によるformulationに従い明らかにしているところである。一般の方程式系E(k,n)の合流操作については,高野が共同研究者の協力を得て,方程式系,パラメーター空間および解空間それぞれのレベルの合流操作として明らかにした。
CreリコンビナーゼとAAVベクターを用いた脳回路の局所標識法確立

本研究では、in vivo脳において、軸索および樹状突起の伸展を、特定の局所神経回路に着目して克明に可視化する技術を開発することを目的とする。これまで、特定脳領域を部位選択的にウィルス感染させ、全投射束をまとめて染色させることが可能であったが、本研究ではCreリコンビナーゼとCre依存的に発現する蛍光蛋白質をアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターに適用し、単一細胞を可視化し一本一本の突起を可視化する系を構築する。まず、構成的、あるいは特異的に発現するCreリコンビナーゼ、薬剤投与により時期特異的に機能するCreリコンビナーゼのプラスミドを作成した。さらに、Cre作用後に、1種類のLoxPに挟まれた領域が切り出され、蛍光蛋白質の発現が誘導されるflox型ベクター、および、2種類のLoxPが特異的に反応し、蛍光蛋白質の発現が誘導されるdflox (double flox)型ベクターを作成した。次に、構成的発現をするCreリコンビナーゼとflox型、dflox型ベクターをそれぞれAAVに適用し、脳へ導入した。その結果、Creリコンビナーゼ発現ウィルスとdflox型蛍光蛋白質発現ウィルスを1x10^9:1x10^<13>のウィルスゲノムコピー数で導入することにより、単一細胞の可視化に成功した。一方、flox型はリークがあり、Cre非発現細胞においても蛍光蛋白質の発現が生じるため、バックグラウンドが高く、個々の細胞の微細な突起構造の描出には適さないことが分かった。また、Creリコンビナーゼが部位特異的発現するトランスジェニックマウスに、dflox型AAVベクターを導入することにより、Cre発現細胞種選択的な細胞標識が可能になることを確認した。今後、これらのAAVウィルスの導入量を用途に応じて、調節し適用することにより、多くの部位、細胞群において単一細胞の突起の可視化が可能になると考えられる。