hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低線量放射線の発癌閾値の検証

1回当たりの照射線量は、50、150、300、800cGyとし、各照射線量につきそれぞれ1群300匹(50cGy群は50匹)とした。800cGy照射群では照射開始後245日、300cGy群では281日、150cGy群では488日に最初の発がんが見られた。その後、800cGy照射群では照射開始後444日、300cGy群では527日、150cGy群では701日に積算発がん率100%に達した。ところが50cGy群では照射開始後1284日に実験群中最後の1匹が死亡するまで、発がんは観察されなかった。ちなみにこの群の生存曲線と非照射対照照群のものには差がなく、この程度の線量ではたとえ週3回一生涯照射を続けられても、生存率に影響はないことがわかった。これらの結果は、ここで用いた反復照射という条件による放射線発がんには、従来放射線発がんには無いとされていた閾値が存在することを示している。またこれらの実験群から60個の腫瘍を得、そのうち29個についてRT-PCR、SSCP法を用いて発がん抑制遺伝子とされているp53遺伝子の変異を調べ、変異があると思われるものを選びDNAの配列を検索した。を行った。そのうち1例で点突然変異、3例でデリーション、1例でインサーションがみられており、放射線誘発腫瘍には今までに報告されていない特異的なタイプの変異が起こっていることがわかった。本年度でこの実験は終了となるが、目的としていた放射線発がんにおける閾値線量の有無の問題に関しては、反復照射による発がんで閾値が存在することを見いだした。また放射線誘発腫瘍の発がん関連遺伝子異常の検索に関しては、発がん抑制遺伝子であるp53遺伝子に放射線特異的な変異を見いだし当初の研究目的を達成できた。
ファインケミカルズを指向した化石ヘテロ芳香族資源の有効利用

昭和61年度の研究実績の概要は次のようである。1.ヘキサ-及びテトラヒドロインドリジン-7-オン類の立体選択的合成に成功した。すなわち、4-ピリドン体から誘導した4-(シリルオキシ)ピリジン体を四級化してピリジニウム塩として、ついで脱プロトン化によって生じた4-(シリルオキシ)ピリジニウムメチリドと電子不足オレフィン類との環状付加、それに続く脱シリル化によって初期の環状付加体の立体化学が保持されたヘキサヒドロインドリジン-7-オン類を合成することに成功した。また、環状付加反応の親双極子としてアセチレン類を用いることによってテトラヒドロインドリジン-7-オン類を合成した。2.ピリジニウムメチリド体とオレフィン類との環状付加反応で生成するテトラヒドロインドリジン体は一般に不安定で単離できない。このような不安定なテトラヒドロインドリジン体を安定化させる1つの手法としてニトリルオキシドとの付加体への誘導について研究した。その結果、ニトリルオキシドがテトラヒドロインドリジン体の6,7位ヘレギオ選択的かつ立体選択的に環状付加した安定なイソオキサゾリン体が高収率で得られることが明らかとなった。3.イリド炭素に電子求引性基をもつピリジニウムメチリドと電子不足オレフィンとの環状付加体は不安定で複雑な混合物を与えるが、シリカゲルで処理すると容易にピリジンの脱離が起り、ピリジニウムメチリドのイリド部がオレィンをヒドロアルキリデン化した化合物に対応する生成物が得られることを見出した。この反応はオレフィンの新しいヒドロアルキリデン化反応として興味ある知見と云える。今後さらにピリジニウムメチリドを用いた合成反応を展開する予定である。
好中球ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスの感染防御能と組織傷害

ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は、好中球と単球に存在する活性酸素の代謝酵素である。病原微生物感染によって好中球が活性化されると、まず好中球膜上に存在するNADPHオキシダーゼによりスーパーオキシド(・O_2^-)が産生され、・O_2^-は過酸化水素(H_2O_2)に変換される。MPOはH_2O_2と塩素イオンから次亜塩素酸(HOCl)が生成される反応を触媒する。このようにして好中球から産生された活性酸素は感染初期の迅速な殺菌を営んでいるが、どの活性酸素種がどんな病原微生物の殺菌に必要なのかは必ずしも明らかではなかった。報告者らは、自らが作製したMPOノックアウトマウス[MPO(-/-)マウス]が各種真菌および細菌に対して顕著な易感染性を示すことをすでに報告していた。一方、NADPHオキシダーゼの欠損患者は慢性肉芽腫症を発症して幼少期から重篤な感染を繰り返す。また、この酵素の欠損マウス(CGDマウス)がアスペルギルス等に易感染性を示すこともすでに報告されている。そこで、MPO欠損の感染症に対するリスクをより詳細に知るために、MPO(-/-)マウスとCGDマウスのカンジダ菌に対する易感染性を直接的に比較した。野生型マウス、MPO(-/-)マウス、およびCGDマウスに、3種の異なる菌量をマウスに投与した。すると、投与量が増加するにつれて、MPC(-/-)マウスの生存率はCGDマウスの生存率に近接し、両マウスは同程度に易感染になることが示された。すなわち、MPOは多量の菌が感染した際の初期生体防御機構として、NADPHオキシダーゼに匹敵する重要性を有している酵素であることが明らかとなった。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は好中球に存在する活性酸素の代謝酵素であり、過酸化水素から次亜塩素酸が生成される反応を触媒する.従来のIn vitroの実験によると、MPO欠損患者から採取した好中球は微生物の殺菌力に低下がみられる。しかし、MPO欠損患者は健康な生活を営んでおり、わずかにカンジダ菌に感染し易い傾向が認められているに過ぎない。したがって、MPOが個体の感染防御に不可欠な酵素なのかどうか明らかではない。そこで、個体レベルでのMPOの機能を知るために、我々がすでに作製しているMPOのノックアウトマウス(MPO-KOマウス)を用いて、種々の真菌および細菌に対する感染防御能を解析した。まずカンジダ菌を鼻腔内投与すると、野生型マウスの状態にはなんら変化は認められなっかたが、MPO-KOマウスは肺炎を誘発し、5日目までにおよそ2/3のマウスが死亡した。さらに、その他の病原微生物に対する易感染性を調べるために、真菌(アスペルギルス,クリプトコッカス,トリコスポロン)または細菌(黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、緑膿菌,クレブシエラ)を鼻腔内投与し、48時間後の肺における残存菌数を測定した。その結果、MPO-KOはトリコスポロンと緑膿菌の殺菌能も著しく低下し、さらにアスペルギルスとクレブシエラの殺菌能も野生型マウスとの比較において有意に低下していた。しかし、黄色ブドウ球菌と肺炎球菌に対する殺菌能の低下はほとんど認められなかった。すなわち、MPOはカンジダ菌のみならず、多くの真菌や細菌感染に対する生体防御に重要な酵素であることが個体レベルで明らかとなった。ミエロペルオキシダーゼ(MPO)は好中球に存在し、過酸化水素から次亜塩素酸が生成される反応を触媒する。

ヒトのMPO欠損好中球は微生物殺菌能に低下がみられる。しかし、MPO欠損患者は健康な生活を営んでおり、わずかにカンジダ菌に感染し易い傾向が認められているに過ぎない。したがって、MPOが個体の感染防御に不可欠な酵素なのかどうか明らかではない。本研究は、個体レベルでのMPOの機能を知るために、すでに我々が作製しているMPOのノックアウトマウス[MPO(-/-)マウス]を用いて、種々の真菌および細菌に対する感染防御能を解析した。このノックアウトマウスは、カンジダ、アスペルギルス、トリコスポロン、緑膿菌、クレブシエラなど多くの真菌細菌に易感染性を示した。すなわち、MPOは生体防御に重要な酵素であることが個体レベルで明らかとなった。また、このマウスのカンジダ菌に対する生体防御能を、重篤な感染を繰り返すことで知られる慢性肉芽腫症のモデルマウス(CGDマウス)の比較したことろ、カンジダ菌が高量感染するとCGDマウスと同程度の重篤な感染症を罹患することが判明した。一方、好中球からの活性酸素やプロテアーゼの放出が長時間持続すると正常組織にも障害を及ぼす。この組織障害を回避するため、活性化した好中球は速やかに死に至る。好中球の細胞死には活性酸素が関与している可能性があるがその詳細は明らかでない。そこで、MPO(-/-)マウスを用いて、好中球の細胞死における次亜塩素酸の関与を検討した。その結果、活性化されたMPO(-/-)好中球のアポトーシスは、野生型好中球よりも著しく遅延することが判明した。すなわち、MPOの触媒によって好中球から産生される次亜塩素酸が、好中球自身のアポトーシスの初期過程を促進することが示された。
堆積層-基盤系における実体波の減衰特性とコヒーレンス特性に関する基礎研究

堆積層-基盤系は,地震時において地震波を変調する主たる伝播系である.この系を支配する要因として,実体波の減衰特性とコヒーレンス特性は最も基本となるものであり,観測により与えられる独立な観測量である.本研究では,関東地域に展開されている中・深層井観測施設で得られた地中群列記録を用いて,これら2つの特性のモデル化を試みている.実体波の減衰特性に関する研究では,前年度のP波に引き続き,S波の減衰特性に関する評価を,トランスバース成分を用いて行った.推定法は,深層井記録上での直達S波とその地表からの反射S波を周波数領域で比較するものであるが,0.52Hzにおいて,Qsはほぼ周波数に比例し,その比例定数が50程度となることが明らかになった.また,Qsは,216Hzでほぼ平坦な特性となった.近地地震から発生した直達実体波の堆積層-基盤系におけるコヒーレンス特性は,S波もP波と同様に,ω自乗型のモデルで説明された.また,コヒーレンスな伝播をする周波数帯域におけるQs/Qp特性は,0.5Hz2Hzでほぼ平坦となり,その値は1.5となった.これは,地表近くの地層における2よりも小さく,地殻上部の値にほぼ等しい.堆積層-基盤系を伝播するS波のコヒーレンス特性は,中・深層井記録と地表記録及び,深層井記録上の直達S波と地表からの反射S波を比較する方法を用いて推定した.これは,コヒーレンス特性に及ぼす伝播長の影響を見積もる為である.得られた結果は,ω^<-2>型のコヒーレンス特性を示し,そのコーナ周波数は伝播時間に比例して減少するが,伝播時間がある程度小さくなるとコーナ周波数が一定となる.即ち,臨界コーナ周波数が出現する.関東地域においては,SH波の場合,伝播時間が0.52.5秒程度の範囲で,コーナ周波数の半値が2.53Hzというきわめて狭い範囲で一定となる.この事実は,近地地震から発生したS波は,先第三系基盤に到達した時点で,この帯域以上の周波数域で既にインコヒーレントな波となっていることを示唆するものである.これは,強震動予測手法を構築する上で,重要な情報となろう.堆積層-基盤系は,地震時において地震波を変調する主たる伝播系である.この系を支配する要因として,実体波の減衰特性とコヒーレンス特性は最も基本となるものであり,観測により与えられる独立な観測量である.本研究では,関東地域に展開されている中・深層井観測施設で得られた地中群列記録を用いて,これら2つの特性のモデル化を試みている.実体波の減衰特性に関する研究では,前年度のP波に引き続き,S波の減衰特性に関する評価を,トランスバース成分を用いて行った.推定法は,深層井記録上での直達S波とその地表からの反射S波を周波数領域で比較するものであるが,0.52Hzにおいて,Qsはほぼ周波数に比例し,その比例定数が50程度となることが明らかになった.また,Qsは,216Hzでほぼ平坦な特性となった.近地地震から発生した直達実体波の堆積層-基盤系におけるコヒーレンス特性は,S波もP波と同様に,ω自乗型のモデルで説明された.また,コヒーレンスな伝播をする周波数帯域におけるQs/Qp特性は,0.5Hz2Hzでほぼ平坦となり,その値は1.5となった.これは,地表近くの地層における2よりも小さく,地殻上部の値にほぼ等しい.堆積層-基盤系を伝播するS波のコヒーレンス特性は,中・深層井記録と地表記録及び,深層井記録上の直達S波と地表からの反射S波を比較する方法を用いて推定した.これは,コヒーレンス特性に及ぼす伝播長の影響を見積もる為である.得られた結果は,ω^<-2>型のコヒーレンス特性を示し,そのコーナ周波数は伝播時間に比例して減少するが,伝播時間がある程度小さくなるとコーナ周波数が一定となる.即ち,臨界コーナ周波数が出現する.関東地域においては,SH波の場合,伝播時間が0.52.5秒程度の範囲で,コーナ周波数の半値が2.53Hzというきわめて狭い範囲で一定となる.この事実は,近地地震から発生したS波は,先第三系基盤に到達した時点で,この帯域以上の周波数域で既にインコヒーレントな波となっていることを示唆するものである.これは,強震動予測手法を構築する上で,重要な情報となろう.堆積層-基盤系は,地震時において地震波を変調する主たる伝播系である.この系を支配する要因として,実体波の減衰特性とコヒーレンス特性は最も基本となるものであり,観測により与えられる独立な観測量である.本研究では,関東地域に展開されている深層井と地表での地震記録を用いて,これら2つの特性のモデル化を試みている.まず,研究の基礎資料となる地震記録として,防災科学技術研究所の岩槻,下総及び府中地殻活動観測施設における基盤内地中記録と地表記録をデータベース化し,小課題毎に検索可能とした.また,地震情報等必要なパラメータのデータベース化も同時に行った.実体波の減衰特性に関する研究では,主としてP波の減衰特性を上下動の成分を用いて推定した.推定法は,深層井記録上での直達P波とその地表からの反射P波を周波数領域で比較するものであるが,0.516Hzにおいて,Qpはほぼ周波数に比例し,その比例定数が25程度となることが明らかになった.

これは,従来S波に着いて得られていた結果と比較すると,0.53Hzで,Qs/Qpがほぼ2となるものである.堆積層-基盤系を伝播するP波のコヒーレンス特性は,深層井記録と地表記録,及び深層井記録上の直達P波と地表からの反射P波を比較する方法を用いて推定した.これは,コヒーレンス特性に及ぼす伝播長の影響を見積もる為である.いずれにしても,得られた結果は,ω^<-2>型のコヒーレンス特性を示し,特徴周波数の存在を示した.本研究では,低周波数域の平坦コヒーレンスが8割まで減少する時の周波数をコーナ周波数として扱うことにしたが,このとき,P波のコーナ周波数は5Hz程度となる.このコーナ周波数は,堆積層-基盤系を伝播するP波の片道伝播と往復伝播で顕著な差違が見いだせず,より地下深部での伝播の影響をうかがわせた.堆積層-基盤系は,地震時において地震波を変調する主たる伝播系である.この系を支配する要因として,実体波の減衰特性とコヒーレンス特性は最も基本となるものであり観測により与えられる独立な観測量である.本研究では,関東地域に展開されている中・深層井観測施設で得られた地中群列記録を用いて,これら2つの特性のモデル化を試みている.実体波の減衰特性に関する研究では,前年度のP波に引き続き,S波の減衰特性に関する評価を,トランスバース成分を用いて行った.推定法は,深層井記録上での直達S波とその地表からの反射S波を周波数領域で比較するものであるが,0.52Hzにおいて,Qsはほぼ周波数に比例し,その比例定数が50程度となることが明らかになった.また,Qsは,216Hzでほぼ平坦な特性となった.近地地震から発生した直達実体波の堆積層-基盤系におけるコヒーレンス特性は,S波もP波と同様に,ω自乗型のモデルで説明された.また,コヒーレンスな伝播をする周波数帯域におけるQs/Qp特性は,0.5Hz2Hzでほぼ平坦となり,その値は1.5となった.これは,地表近くの地層における2よりも小さく,地殻上部の値にほぼ等しい.堆積層-基盤系を伝播するS波のコヒーレンス特性は,中・深層井記録と地表記録及び,深層井記録上の直達S波と地表からの反射S波を比較する方法を用いて推定した.これは,コヒーレンス特性に及ぼす伝播長の影響を見積もる為である.得られた結果は,ω^<-2>型のコヒーレンス特性を示し,そのコーナ周波数は伝播時間に比例して減少するが,伝播時間がある程度小さくなるとコーナ周波数が一定となる.即ち,臨界コーナ周波数が出現する.関東地域においては,SH波の場合,伝播時間が0.52.5秒程度の範囲で,コーナ周波数の半値が2.53Hzというきわめて狭い範囲で一定となる.この事実は,近地地震から発生したS波は,先第三系基盤に到達した時点で,この帯域以上の周波数域で既にインコヒーレントな波となっていることを示唆するものである.これは,強震動予測手法を構築する上で,重要な情報となろう.
ヒトヘルペスウイルス6型の母子感染および免疫不全状態における病原性に関する研究

血清学的にHHV-6の感染が証明された突発性発疹47例の罹患時期は、6カ月をピークとしその前後3カ月に集中しており、母体由来のHHV-6抗体の消失時期(J Infect Dis 159;750-2)に一致していた(小児科31;105-111)。また、母子の追跡調査中に見い出した突発性発疹早期罹患例3例は、いずれもHHV-6抗体陽転が証明され、その母親は全てHHV-6抗体陽性であった。これらの成績は、突発性発疹の罹患時期が母親由来のHHV-6抗体の消失時期によって規定されていることを示唆するものと思われた。新生児集中治療室(NICU)に1年以上入院している児6例のHHV-6抗体を測定したところ、5例が抗体陽性であり、その母親は全て抗体陽性であった(First International HerpesvirusSymposium,June 1992,Osaka)。また、大分県のA孤児院に生後3カ月未満で入所した小児25名のHHV-6抗体を測定したところ、1歳以上の21名は全て抗体陽性、残る4名(35カ月の乳児)は抗体陰性であり、一般の乳幼児集団と同様の感染状況であった。これらの成績より、母親との密接な接触がなくても小児期のHHV-6感染が成立しうることが示唆された。免疫不全状態におけるHHV-6の病原性を検討するための基礎データとして、HHV-6においても他のヘルペスウイルス同様、再活性化や再感染がみられるかを検討した。その結果、突発性発疹再罹患例の23例中3例、および無熱性発疹症の既往のある突発性発疹患児5例中2例で、ペア血清でのHHV-6 IgG抗体価の有意上昇がみられ、このうち3例でHHV-6 IgM抗体が検出された。この結果より、本ウイルスでも再活性化または再感染がおこり得ることが示唆された(Pediatr Infect Dis J 10;468-470)。血清学的にヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)の感染が証明された突発性発疹47例の罹患時期は、6カ月をピ-クとしその前後3カ月に集中しており、すでに報告した母体由来のHHV-6抗体の消失時期(J Infect Dis,159;750-752)に一致していた(小児科、31;105-111)。また、母子の追跡調査中に見い出した突発性発疹早期罹患例3例は、いずれもHHV-6抗体陽転が証明されたが、その母親は全てHHV-6抗体陽性であった。これらの結果より、乳児は、母体由来の移行抗体の消失により突発性発疹を発症するものと考えられた。これがHHV-6の水平感染によるものか、移行抗体の消失に先行する垂直感染によるものかを明らかにするために、HHV-6抗体陰性の母親から出生した児の追跡調査を継続中である。栄養法との関連については、上記の47例において、栄養法による突発性発疹罹患時期の差異はみられなかった。免疫不全状態におけるHHV-6の病原性を検討するための基礎デ-タとして、HHV-6においても他のヘルペスウイルス同様、再活性化や再感染がみられるかを検討した。

その結果、突発性発疹再罹患例の23例中3例、および無熱性発疹症の既往のある突発性発疹患児5例中2例で、ペア血清でのHHV-6抗体価の有意上昇がみられた。この結果より、本ウイルスでも再活性化または再感染がおこり得ることが示唆された(Amer J Dis Child、投稿中)。免疫不全状態におけるHHVー6の病原性を検討するための基礎デ-タとして,HHVー6においても他のヘルペスウイルス同様,再活性化や再感染がみられるかを検討した。その結果,突発性発疹再罹患例の23例中の3例,および無熱性発疹症の既往のある突発性発疹患児5例中2例で,ペア血清でのHHVー6IgG抗体価の有意上昇がみられ,このうち3例でHHVー6IgM抗体が検出された。この結果より,本ウイルスでも再活性化または再感染がおこり得ることが示唆された(Pediatr Infect Dis J,印刷中)。未熟児室に1年以上入院している児4例のHHVー6抗体を測定したところ3例が抗体陽性であった。また,その母親は全て抗体陽性であった。未熟児室の環境では他の児や成人との濃厚な接触はなく水平感染の機会は極めて少ないとより,この3例は出生時ないしそれ以前にHHVー6の垂直感染を受けていた可能性が示唆された。HHVー6の正確な顕性感染率を知るために,小児科医の1歳以上の子弟113名の突発性発疹罹患調査を行った。その結果,70名(62%)が本症に罹患しており,欧米で報告されている約30%と比較して高い罹患率を示すことが明らかになった。一歳以上では突発性発疹の既住がかくてもほぼ100%の児がHHVー6抗体陽性であることから(J Infect Dis,159,750ー752),この数字はわが国におけるHHVー6の顕性感染率を示すものと考えられた。HHVー6の小児への感染様式を解明する手がかりを得るために、大分県のA孤児院の乳幼児および学童81名のHHVー6抗体を測定した。このうち生後3カ月未満で入所した者は25名(年齢3カ月18歳)であったが、1歳以上の21名は全て抗体陽性であり、残る4名(35カ月の乳児)は抗体陰性であった。既に報告したように、生後35カ月は母親由来のHHVー6抗体の消失時期と突発性発疹の好発時期に挟まれたHHVー6抗体陽性率の最も低い時期にあたるので(J Infect Dis,159;750ー752)、この4名の乳児の抗体陰性は生理的なものであると言える。一方、抗体陽性の21名は母親との密接な接触がないまま35カ月以降にHHVー6に感染したものと考えられる。この成績は、母親との密接な接触がなくても小児がHHVー6に感染しうること、したがって出生後の母子感染はHHVー6の主要感染経路ではないことを示唆している。小児のHHVー6抗体の長期的な推移を検討するために、318歳の15年間にわたって断続的に採取された血清が保存されていた7名の子どもとその母親のHHVー6抗体を測定した。HHVー6抗体は全員陽性であった。子どものHHVー6抗体価は、同一個人では採血の年齢にかかわらず一定で、時間の経過による抗体価の変動はなかった。成人では加齢とともにHHVー6抗体価が低下することが報告されているが、小児ではこのように一定の抗体価が維持されていた。
婦人科がんにおけるメトロノミック化学療法の有用性に関する検討

最近提唱されたMetronomic chemotherapyは血管内皮細胞が少量の抗癌剤でも再現性良く障害されることを利用して、薬剤耐性腫瘍に抗癌剤を少量頻回投与することで軽い副作用のままtumor dormancyに導こうという治療法である。今回我々はこのMetronomic chemotherapyの婦人科がんに対する有効性を検証するため、動物実験と臨床試験を行った。パクリタキセル耐性ヒト卵巣がん細胞株を担癌させたマウスをパクリタキセル少量分割投与群と高量単回投与群で治療したところ、少量分割投与の方が腫瘍の増殖速度を抑制した。毒性も少量分割投与の方が明らかに軽度であった。すなわち薬剤耐性腫瘍に対して、Metronomic chemotherapyは軽度の副作用にも関わらず腫瘍の増殖をより抑制しうると考えられた。この理由として、パクリタキセル高量単回投与より少量分割投与の方がより血管新生を抑制していることがマトリゲルに侵入する新生血管数の評価実験からわかった。これはドセタキセルやイリノテカンなど、他の抗癌剤でも同様であった。Metronomicchemotherapy理論に基づき、個別化最大継続可能量(iMRD : individualized maximum repeatable dose)で抗癌剤を少量頻回投与するがん休眠療法の臨床試験をおこなった。IRB承認のもと現在まで、難治性の再発卵巣がん42例と子宮頸がん29例に対して試み、良好なQOLと共に比較的良好な進行抑制期間(TTP:time to progression)が得られた。まだ症例が少なく経過観察期間も短いがMetronomic chemotherapyによるがん休眠療法の有効性が示唆された。種々の集学的治療を受けたにも関わらず、進行・再発するがん患者に対して完全治癒を得ることは難しく、次善の治療目標は病巣の進行を食い止めながらの延命となる。これはいわゆるがん休眠療法(Tumor dormancy therapy)そのものであるが、この治療概念に合致し着目すべきものとして、近年FolkmanとKerbelが報告したメトロノミック化学療法がある。これは適当な抗癌剤を低用量で頻回投与すれば、新生血管阻害作用を介した腫瘍の増殖抑制が得られ、かつその低毒性のため治療を長期継続でき、長期の腫瘍との共存による延命が期待できるというものである。本年度は、卵巣がん細胞株による動物実験系を用いてどのような抗がん剤がメトロノミック化学療法に適しているかを明らかとした。(a)抗腫瘍効果の検証:卵巣癌のタキサン系薬剤耐性細胞株を移植したヌードマウスを同じdose intensityとなるように各種抗がん剤の高用量単回投与と低用量頻回投与の2つのスケジュールで治療した。抗腫瘍効果の指標として腫瘍サイズを、副作用の指標として体重減少をモニターし比較検討したところ、薬剤抵抗性細胞株では特にタキサン系薬剤の再投与において低用量頻回投与群の方が、腫瘍増殖抑制効果が強かった。血管新生阻害剤であるBevacizumabを低用量頻回投与スケジュールに併用すると、更なる腫瘍増殖抑制効果が得られた。(b)メトロノミックスケジュールで投与した各薬剤が高用量単回投与時よりも血管新生を強く抑制しているかに関して、ヌードマウス皮下に注入したマトリゲルへの新生血管の侵入量で比較検討したが、低用量頻回投与群の方が血管新生が抑制されやすい傾向が得られた。初年度(平成21年度)の基礎研究の結果に基づき、メトロノミック化学療法の有効性を発揮できる抗がん剤を組み入れた婦人科がん腫別の臨床試験プロトコールを作成した。現時点で有効な治療法のない集学的治療後の進行再発卵巣がん、子宮頸がん(通常、積極的治療を行わず対症療法に移行するような症例)を対象に、患者個々および施行コースごとに適正薬剤量を設定したがん休眠療法の臨床試験計画書をIRBに申請し承認を得た。本治療はメトロノミック化学療法の理論に基づいたがん休眠療法であり、前コースでgrade3以上の血液毒性あるいはgrade2以上の非血液毒性を一項目でも認めた場合は次コースの薬剤の投与量を1レベル減量する。

逆に前コースの毒性がすべてgrade1以下であった場合は次コースの薬剤の投与量を1レベル増量し、個別化最大継続可能量(iMRD)に準じたテーラード型の抗がん剤投与を行った。以上の治療を病巣が進行(PD)するまで可能な限り繰り返し、1)治療効果をTime to progression(TTP:本治療開始から症例がPDとなるまでの期間)の長さで評価したが、比較的良好な結果が得られ、数例は難治再発例であるにも関わらず、12か月以上のTTPであった。2)安全性をNCI-CTC ver3.0に基づいて評価し、同一患者が以前に受けた高用量化学療法施行時と本治療試行時のQOLの違いをEORTCのQOL質問表を応用して比較したが、本治療の方が明らかに良好なQOLを示した。以上より、がん休眠療法にメトロノミック化学療法を臨床応用することの有用性が示された。この結果は多くの学会で発表したり、招請を受けて講演した。初年度(平成21年度)の基礎研究結果に基づき平成22年度よりメトロノミック化学療法の有効性を発揮できる抗がん剤を組み入れた婦人科がん腫別の臨床試験を開始した。現時点で有効な治療法のない集学的治療後の進行再発卵巣がん、子宮頸がん(通常、積極的治療を行わず対症療法に移行するような症例)を対象に、患者個々および施行コースごとに適正薬剤量を設定したがん休眠療法の臨床試験計画書をIRBに申請し承認を得た。本治療はメトロノミック化学療法の理論に基づいたがん休眠療法であり、前コースでgrade3以上の血液毒性あるいはgrade2以上の非血液毒性を一項目でも認めた場合は次コースの薬剤の投与量を1レベル減量する。この結果は学会での自主発表や招請講演などで報告した。
新しく見いだされヌクレオチド結合モチーフの構造

本年度の研究では、最近同定された「フェレドキシンNADP^+還元酵素(FNR)ファミリー」に含まれるNADH-シトクロムb5還元酵素(b5R)、硝酸還元酵素(NR)およびNADPH-シトクロムP450還元酵素(P450R)に見い出された新しいヌクレオチド結合モチーフ(GxGxxP,RxYT/S)の構造について研究を行なった。1。ヒトb5Rと、植物の硝酸還元酵素のFAD結合ドメインは、一昨年(1994年)中に2.5A-2.0A分解能での結晶構造が、b5Rについては我々の共同研究者、高野(摂南大学)のグループにより、また、NRにつては研究分担者キャンベル博士の共同研究者らによりそれぞれ結定された。それらの結果から、FNR(フェレドキシン-NADP還元酵素)の活性中心(ヌクレオチドFAD,NADHの結合部位)の構造との違いが明らかになった。なお、P450Rについては、すでに結晶構造の予備的なデータについての報告が発表されたが、全構造の決定は近々発表されると聞いている(ポーター私信)。2。これらの酵素は同じFNRファミリーに属しているが、b5RとNRは、特に以下の諸点でFNRと異なることがそれぞれの結晶構造の解析から明らかとなった。即ち、(1)前2者の方がFNRよりタンパク質全体がコンパクトに詰まっている、(2)前2者のカルボキシル-末端と補酵素FADは離れているが、FNRではカルボキシル-末端のチロシン残基がFADと近接し、相互作用している、(3)b5RのFb5からFa1へ向うループはFADをカバーしているが、FNRではカバーしていない(FNRでは、FADがより溶液に露出している)、(4)前2者ではアミノ-末端ドメインとカルボキシル-末端ドメインをつなぐループが長く、bシートを含んでいる、こと等が明らかとなった。3。ヌクレオチド結合モチーフの解析に関して、b5Rでは特にカルボキシル-末端部分の疎水性アミノ酸残基(フェニールアラニン、バリン)がヌクレオチドFADの結合を安定化していることが、結晶構造の解析から判明していたが、この点をさらに、部位特異的変異法によりアミノ酸置換した種々の変異酵素を作りそれらの性質を解析した結果から明らかにした。即ち、カルボキシル-末端のフェニルアラニン300,バリン299や、フェニルアラニン298などの疎水的なアミノ酸を側鎖の小さなアラニンに置換しても殆ど失活は起こらないが、それらを欠失させると劇的な活性の失活が起きることが明らかとなった。4。硝酸還元酵素のFAD結合ドメインでは、酵素に含まれる5分子のシステインのうち242番目のシステインがNADHとの結合に関与していることをアミノ酸置換を行なった変異酵素の解析により示した。硝酸還元酵素については、現在、キャンベルらがFAD結合ドメインとシトクロムb部分との融合タンパク質をつくり、酵母細胞で大量発現させて結晶構造を解明し、シトクロムbから補酵素FADへの電子伝達機構を解明すべく研究を進めている。5。一方、P450RはFNRフアミリ-のなかでは、1分子中に2種類の補酵素(FMN,FAD)をもち、しかも同酵素にはアミノ-末端側に約120残基の長さの挿入配列がある特徴のある酵素である。この長い挿入配列がヌクレオチドFMN,FADの結合とどのように関わっているかを明らかにするために、ポーターらはこの挿入配列(120残基)を削除した変異酵素を作った。大腸菌での発現系では、変異酵素の発現が確認されたがタンパク質が沈澱してしまい、活性が測定できなかった。そこで現在、P450Rのアミノ-末端側ドメインとb5Rのアミノ-末端側ドメインを入れ替えたキメラ酵素を作製中である。もし、このキ-メラ酵素が活性のある酵素として発現出来れば、P450Rにおける挿入配列の役割解明についての重要な情報がえられると思われる。1。2。即ち、(1)前2者の方がFNRよりタンパク質全体がコンパクトに詰まっている、

(2)前2者のカルボキシル-末端と補酵素FADは離れているが、FNRではカルボキシル-末端のチロシン残基がFADと近接し、相互作用している、(3)b5RのFb5からFa1へ向うループはFADをカバーしているが、FNRではカバーしていない(FNRでは、FADがより溶液に露出している)、(4)前2者ではアミノ-末端ドメインとカルボキシル-末端ドメインをつなぐループが長く、bシートを含んでいる、こと等が明らかとなった。3。ヌクレオチド結合モチーフの解析に関して、b5Rでは特にカルボキシル-末端部分の疎水性アミノ酸残基(フェニールアラニン、バリン)がヌクレオチドFADの結合を安定化していることが、結晶構造の解析から判明していたが、この点をさらに、部位特異的変異法によりアミノ酸置換した種々の変異酵素を作りそれらの性質を解析した結果から明らかにした。即ち、カルボキシル-末端のフェニルアラニン300,バリン299や、フェニルアラニン298などの疎水的なアミノ酸を側鎖の小さなアラニンに置換しても殆ど失活は起こらないが、それらを欠失させると劇的な活性の失活が起きることが明らかとなった。4。硝酸還元酵素のFAD結合ドメインでは、酵素に含まれる5分子のシステインのうち242番目のシステインがNADHとの結合に関与していることをアミノ酸置換を行なった変異酵素の解析により示した。硝酸還元酵素については、現在、キャンベルらがFAD結合ドメインとシトクロムb部分との融合タンパク質をつくり、酵母細胞で大量発現させて結晶構造を解明し、シトクロムbから補酵素FADへの電子伝達機構を解明すべく研究を進めている。5。一方、P450RはFNRフアミリ-のなかでは、1分子中に2種類の補酵素(FMN,FAD)をもち、しかも同酵素にはアミノ-末端側に約120残基の長さの挿入配列がある特徴のある酵素である。この長い挿入配列がヌクレオチドFMN,FADの結合とどのように関わっているかを明らかにするために、ポーターらはこの挿入配列(120残基)を削除した変異酵素を作った。大腸菌での発現系では、変異酵素の発現が確認されたがタンパク質が沈澱してしまい、活性が測定できなかった。そこで現在、P450Rのアミノ-末端側ドメインとb5Rのアミノ-末端側ドメインを入れ替えたキメラ酵素を作製中である。もし、このキ-メラ酵素が活性のある酵素として発現出来れば、P450Rにおける挿入配列の役割解明についての重要な情報がえられると思われる。本研究では、最近同定された「FNRファミリー」に含まれるNADH-シトクロムb5還元酵素(b5R)、硝酸還元酵素(NR)に見い出された新しいヌクレオチド結合モチーフの構造について研究を行なった。ヒトb5Rと、植物の硝酸還元酵素のFAD結合ドメインは、昨年中に2.5A-2.0A分解能で結晶構造が結定され、FNR(フェレドキシン-NADP還元酵素)の活性中心(ヌクレオチドFAD,NADHの結合部位)の構造との違いが明らかになった。これらの酵素は同じファミリーに属しているが、b5RとNRは、特に以下の諸点でFNRと異なることがそれぞれの結晶構造の解析から明らかとなった。即ち、1)前2者の方がFNRよりコンパクトに詰まっている、2)前2者のC-末端と補酵素FADは離れているが、FNRではC-末端のチロシンがFADと近接し、相互作用している、3)b5RのFb5からFa1へ向うループはFSADをカバーしているが、FNRではカバーしていない、4)前2者ではN末端ドメインとC末端ドメインをつなぐループが長くbシートを含んでいる、こと等が明らかとなった。
免疫チェックポイント阻害薬併用凍結療法の腫瘍免疫変調効果の検討

ヒト血液サンプルにおいて、Ficoll処理後のPBMCからCD11b+ HLA-DRlow/- CD14-CD15+細胞をPMN-MDSC、CD11b+ HLA-DRlow/-CD14+CD15-細胞をM-MDSCとしてゲーティングする形で、MDSCの解析を行う方法を確立できた。NO産生能およびROS産生能を検出することによりMDSCの活性を評価できるようになった。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を抽出した後、CD45RA+ CD62L+細胞をナイーブT細胞、CD45RA- CD62L+細胞をエフェクターT細胞、CD45RA+ CD62L-細胞をエフェクターメモリーT細胞、CD45RA- CD62L-細胞をセントラルメモリーT細胞、としてそれぞれゲーティングする形でT細胞機能解析を行う方法を確立できた。TNF-αおよびIFN-γについてそれぞれ細胞内染色を行うことによりMDSCの活性を評価できるようになった。まだ十分な数の評価は行えていないが、免疫チェックポイント阻害薬の影響によりMDSCとT細胞免疫の間での相互作用が遮断されている可能性が示唆されている。さらにMDSCのPD-L1発現を安定的に確認できるようになってきており、PD-L1発現の有無が免疫チェックポイント阻害薬の効果判定に使用できるのかどうか臨床判断との間での相関性を評価できるようになる見込みである。マウス血液での安定的な免疫機能解析のためのフローサイトメトリー条件の確立に時間がかかり、少し遅れている早急に実験動物レベルでの安定的な免疫機能解析のためのフローサイトメトリー条件を確立し、腫瘍モデルマウスでの解析を進めていきたい。そのために研究協力者との密な検討を続けていきたいヒト血液サンプルにおいて、Ficoll処理後のPBMCからCD11b+ HLA-DRlow/- CD14-CD15+細胞をPMN-MDSC、CD11b+ HLA-DRlow/-CD14+CD15-細胞をM-MDSCとしてゲーティングする形で、MDSCの解析を行う方法を確立できた。そのために研究協力者との密な検討を続けていきたい他研究で使用していた研究用抗体を使用するなどしたため、実際に購入する金額が見た目上少なくなっているが、今後必要な物品を購入することで、研究費を使用する予定である。
古代インドにおける宗教的造形の諸相-寺院建築と美術の成立と展開-

本研究は古代インドの仏教建築・美術の発生と展開に焦点を当て、その独自性をインド文化全体の中で捉え直し、インドにおける宗教美術の造形的特質を探ることを目指した。そのため出来るだけ多くの仏教・ヒンドゥー教・ジャイナ教の遺跡・寺院建築、および関連する宗教彫刻の調査、資料収集に努めた。平成14年度は中部インド(マディヤ・プラデーシュ州、チャティースガル州)、平成15年度は西部インド(主にグジャラート州とラージャスターン州)、平成16年度は南インドのタミル・ナードゥ州にそれぞれ残る、仏教・ヒンドゥー教・ジャイナ教の遺跡・寺院・彫刻、並びに博物館収蔵品の調査を行った。平成17年度は西インド(マハーラーシュトラ州)の石窟寺院の調査を行った。これらの調査を通して、一般に知られていない遺跡や彫刻類が多数、埋もれたままとなっていることが明らかとなった。これらの実地調査と、研究代表者・分担者の研究によって明らかになったことは以下の点である。第一に、従来石窟寺院の編年は、前2後3世紀の前期窟と、後5世紀中頃8世紀の後期窟とに分けられて論じられてきたが、両者を繋ぐ位置にある中期窟とも呼ぶべき石窟がみられ、石窟の形態と編年を見直す必要があること。第二にこれらの石窟の立地が現在は不便な場所にあるものが多いが、かつては港町と都市部を繋ぐ交易路に位置していたところが多く、今後、石窟寺院の造営と商業交易との関係の視点から、そのルートを追跡することが重要であること。第三に、ヴィハーラ窟の形態、ストゥーパ信仰、仏像信仰が様々に関係していることが明らかとなり、単純にヴィハーラ窟=僧院窟とは言えないこと。第四にクダー石窟の仏三尊像、パンハーレ・カジ石窟の不動明王像など、インドの大乗仏教美術、密教美術を考える上で、重要な作品が明らかとなったこと。以上である。以上である。インドのグプタ時代ポスト・グプタ時代(48世紀)を中心に、マディヤ・プラデーシュ州、チャティシュガル州,マハーラーシュトラ州などの仏教およびヒンドゥー教の寺院、および関連する博物館所蔵作品の調査を行った。主な遺跡・博物館として、マトゥラー博物館、ライプール州立博物館、シルプル仏教僧院、ターラのデーヴァーラーニ寺院、マラールのマハーデーヴィー寺院、ラームテクのヒンドゥー教寺院、ナグプール大学博物館、マンサールの仏教・ヒンドゥー教寺院、同現地収蔵庫、テゴワーのヒンドゥー教寺院、ナーチュナーのマハーデーヴァ寺院、同パールヴァティー寺院、エーラン、デオーガル、サーガル大学博物館、アラハーバード博物館などである。未調査、未紹介の遺跡、彫刻類も多く、多くの写真資料が収集できた。とりわけ従来不明であったナグプール周辺の東ヴァーカータカ朝の美術、建築の様相が明らかとなったことは大きな成果である。実地調査と収集された資料に基づいて、グプタ朝の建築形態の様相と、その後の発展のあり様、また彫刻の様式およびヒンドゥーと仏教の図像の展開の様相を明らかにする検討を行っている。また、建築と彫刻がどのように組合されて、図像・装飾のプログラムが構成されているかについても考察を加えている。とくに入口装飾について、地域・時代による展開の様相が観察された。なお、儀礼・図像に関する調査として、バリ島およびカトマンドゥ盆地に残るヒンドゥー教のものを中心に予備的な現地調査を行った。インドのグジャラート州およびラージャスターン州に存在する、仏教、ヒンドゥー教、ジャイナ教の遺跡、および関連する博物館所蔵作品の調査を行った。

主な遺跡・博物館として、バーグ仏教石窟、グムリ、ゴープのヒンドゥー教寺院、ビレシュワルのヒンドゥー教寺院、ジュナーガドの仏教石窟、バローダ博物館、バローダ大学付属博物館、アダラジ階段井戸、モデラー階段井戸、ローダのヒンドゥー教寺院、シャーマラージのヒンドゥー教寺院、同博物館、アーブー山のジャイナ教寺院群、ジャガト、ナークダーのヒンドゥー教寺院などである。未調査、未紹介の遺跡、彫刻類も多く、多くの写真資料が収集できた。とりわけジュナーガドの仏教石窟、シャーマラージのヒンドゥー教寺院、シャーマラージ博物館やバローダ博物館の所蔵品などは、従来見落されてきたが、重要な遺跡・作品群であることがわかった。また階段井戸も部分的には紹介されているが、多くの遺跡があることも判明し、この地域の仏教石窟との関連も含め、地域的な特質を考える上で重要なものであることも明らかとなった。実地調査と収集された資料に基づいて、グジャラート州の仏教石窟の様相、グジャラート州・ラージャスターン州の中世ヒンドゥー教寺院の建築形態の様相と彫刻装飾との関連、アーブー山のジャイナ教寺院群の歴史と建築・彫刻の様相などについて研究を行っている。なお、儀礼・図像に関する研究として、ネパール・カトマンズのスヴァヤンブー寺院、およびベトナム・ダナンのミーソン遺跡の調査を行った。インドのタミル・ナードゥ州に存在する、ヒンドゥー教、仏教、ジャイナ教の遺跡、ならびに関連する博物館所蔵作品の調査を行った。主な調査遺跡として、パッラヴァ朝やチョーラ朝に属するヒンドゥー教遺跡がまず挙げられる。カーンチープラムのカイラーサナータ寺、ヴァイクンタペルマール寺、ムクテーシュヴァル寺、マーマンドゥル石窟、ダナヴァヌル石窟、マンダガパットゥ石窟、チダムバラムのナタラージャ寺、クンバコーナムのナゲーシュヴァラ寺、プッラマンガイのブラフマプリシュヴァラ寺、カライユルのアガスティエーシュヴァラ寺、スリニヴァサルールのコーランガナータ寺などで、大規模なものも多く、概観的な調査を行った。仏教遺跡としては、寺院としてはほとんど残っていないが、ヒンドゥー教寺院内、学校校庭、警察署庭、遺跡や道跡の脇などに、その尊像の意義がわからずに、打ち捨てられたように安置されている例が数多くあることが確認された。ボンディシェリ州立博物館、チェンナイ州立博物館などにも仏像が少なからずあることを確認した。また、チョーラ朝のブロンズ像はほとんどがヒンドゥー教像であるが、中には仏陀像、観音菩薩像、弥勒菩薩像があることも分かり、尊像表現の上で仏教との混淆現象もうかがえる。壁画としてはヒンドゥー教、ジャイナ教の寺院に断片的に見られたが、とりわけシッタンナヴァーシャルのジャイナ教石窟の天井画は、仏教美術のテーマとの類似も見られ重要である。実地調査と収集された資料に基づいて、タミル・ナードゥ州のヒンドゥー教野外寺院、および石窟寺院の様相、南インドにおけるヒンドゥー教と仏教との関わり、この地の後期の仏教の様相などについて研究を行っている。本年度は西インド(マハーラーシュトラ州)の石窟寺院の調査、および4ヵ年の調査研究の総括を行った。石窟寺院の調査としては、クダー、マハッド、コール、ケード、パンハーレ・カジ、カラード、イェルパル、ポハレ、ワイ、シルワル、バージャー、カールラー、ベードゥサー、コンダーネー、ピタルコーラー、アジャンター、エローラ、ナーシク、カンヘーリーの諸石窟である。これらの石窟の半分近くはあまり知られていないが、ムンバイのソーマイヤ研究所のジャンケードカル氏の案内を得て、調査することが出来た。
GnRHサージ発生中枢による排卵制御機構の全容解明

ウシの最も重要な繁殖障害のひとつである卵胞嚢腫の主な原因は、排卵を誘起するGnRHサージ発生中枢の機能不全であるとされるが、特に家畜におけるサージ発生中枢メカニズムはほとんど解明されていない。本研究は、1キスペプチンニューロンの活動を任意に操作可能な遺伝子組換えヤギを作出し、反芻家畜のGnRHサージ発生中枢を決定することを目的とする。さらに、2キスペプチンニューロン細胞株を樹立して、新たなGnRHサージ発生制御メカニズムを探索し、中枢による哺乳類の排卵制御機構の全容解明を目指す。以上の研究で得られた成果は卵胞嚢腫の発症機序を明らかにし、ウシの受胎率向上に資する新たな治療法の開発につながることが期待される。1ゲノム編集技術TALENによりキスペプチン遺伝子座にCreリコンビナーゼをノックインしたヤギ胎子線維芽細胞のヤギ未受精卵への体細胞核移植を行った。遺伝子相同組換えを行った培養ヤギ胎子線維芽細胞の細胞核のヤギ未受精卵への移植を試みたが、正常に発生する胚の作出には至らなかった。2ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株を樹立するため、細胞クローンの遺伝子発現解析を進めた。各細胞クローンにおけるキスペプチン遺伝子(KISS1)とエストロゲン受容体遺伝子(ESR1)のmRNA発現量をreal time RT-PCRにて測定し、両遺伝子を発現するものを排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株とした。その結果、5個の排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株候補を決定した。これらの候補株にエストロゲンを添加し、KISS1発現量の変化をreal time RT-PCRにて解析した結果、エストロゲンに反応してKISS1量が増加する細胞株を見出した。新たなGnRHサージ発生制御メカニズムの探索に利用できる、ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補を特定できた。1得られた遺伝子改変ヤギ胎子線維芽細胞の核をヤギ卵子に移植して(体細胞核移植)、正常に発生した胚を代理母ヤギの子宮に移植し、目的の遺伝子組換えヤギを得る。2ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補へのエストロジェン添加実験を追加で行い、エストロジェンの刺激によりキスペプチン遺伝子の発現量を有意に増加させる細胞株を特定する。ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株を用い、排卵中枢キスペプチンニューロンの活動を制御する因子やキスペプチン遺伝子の転写を活性化する因子のin vitro解析を実施する。3ラット排卵中枢キスペプチンニューロンのトランスクリプトーム解析結果から、排卵中枢に作用する可能性のある生理活性ペプチドの候補を見出した。このペプチドをラットおよびヤギの脳室内に投与し、LHサージやLHパルスに変化が見られるかを解析する。また、この生理活性ペプチドの受容体の視床下部における局在をin situ hybridizationにて確認する。1平成29年度には、ゲノム編集技術TALENによりキスペプチン遺伝子座にCreリコンビナーゼをノックインしたヤギ胎子線維芽細胞のヤギ未受精卵への体細胞核移植を開始した。ヤギにおける過排卵処置、卵巣採取、卵巣からの卵母細胞の吸引、卵子の成熟培養の一連の技術を確立した。遺伝子相同組換えを行った培養ヤギ胎子線維芽細胞の細胞核のヤギ未受精卵への移植を試みたが、正常に発生する胚の作出には至っていない。2遺伝子発現パターンの解析結果から、ラット排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補を複数特定したが、エストロジェンの刺激によりキスペプチン遺伝子の発現量を有意に増加させる株の特定には至らなかった。ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株を樹立するため、すでに得ている細胞クローンの遺伝子発現解析を進めた。ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株と合わせて家畜の排卵制御メカニズムの解析に使用できるヤギ排卵中枢(KNDy)ニューロン細胞株およびヤギGnRHニューロン細胞株についての報告を国際雑誌に投稿した。1遺伝子改変ヤギの作出に向けた実験は、着実に進んでいるものの、体細胞核移植により正常に発生する胚の作出には至らなかった。2ラット排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補を複数特定したが、エストロジェンの刺激によりキスペプチン遺伝子の発現量を有意に増加させる株は見つからなかった。そのため、研究開始当初に予定していた「ラット排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株と化合物ライブラリーを用いた排卵中枢制御因子のスクリーニング」を開始できない状況となっている。

本研究は、1キスペプチンニューロンの活動を任意に操作可能な遺伝子組換えヤギを作出し、反芻家畜のGnRHサージ発生中枢を決定することを目的とする。さらに、2キスペプチンニューロン細胞株を樹立して、新たなGnRHサージ発生制御メカニズムを探索し、中枢による哺乳類の排卵制御機構の全容解明を目指す。以上の研究で得られた成果は卵胞嚢腫の発症機序を明らかにし、ウシの受胎率向上に資する新たな治療法の開発につながることが期待される。1ゲノム編集技術TALENによりキスペプチン遺伝子座にCreリコンビナーゼをノックインしたヤギ胎子線維芽細胞のヤギ未受精卵への体細胞核移植を行った。遺伝子相同組換えを行った培養ヤギ胎子線維芽細胞の細胞核のヤギ未受精卵への移植を試みたが、正常に発生する胚の作出には至らなかった。2ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株を樹立するため、細胞クローンの遺伝子発現解析を進めた。各細胞クローンにおけるキスペプチン遺伝子(KISS1)とエストロゲン受容体遺伝子(ESR1)のmRNA発現量をreal time RT-PCRにて測定し、両遺伝子を発現するものを排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株とした。その結果、5個の排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株候補を決定した。これらの候補株にエストロゲンを添加し、KISS1発現量の変化をreal time RT-PCRにて解析した結果、エストロゲンに反応してKISS1量が増加する細胞株を見出した。新たなGnRHサージ発生制御メカニズムの探索に利用できる、ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補を特定できた。1得られた遺伝子改変ヤギ胎子線維芽細胞の核をヤギ卵子に移植して(体細胞核移植)、正常に発生した胚を代理母ヤギの子宮に移植し、目的の遺伝子組換えヤギを得る。2ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補へのエストロジェン添加実験を行い、エストロジェンの刺激によりキスペプチン遺伝子の発現量を有意に増加させる細胞株を特定する。ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株を特定したら、排卵中枢キスペプチンニューロンの活動を制御する因子やキスペプチン遺伝子の転写を活性化する因子のin vitro解析を開始する。3共同研究者のトランスクリプトーム解析結果を検索し、ラットにおいて排卵中枢キスペプチンニューロンで発現するが卵胞発育中枢キスペプチンニューロンで発現しない受容体を、排卵中枢制御因子の候補として選び出す。この候補について、ラット視床下部における局在の確認と、生体ラットのLHサージに与える影響を検討し、実際に排卵中枢制御機能を持つ因子を特定する。生体ラットで排卵中枢を制御することが確認できた因子を、生体ヤギを用いた確認実験に使用する。2ヤギ排卵中枢キスペプチンニューロン細胞株の候補へのエストロジェン添加実験を追加で行い、エストロジェンの刺激によりキスペプチン遺伝子の発現量を有意に増加させる細胞株を特定する。