hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヌクレオソーム1分子イメージングによるヘテロクロマチン動態の解明

本年度はヘテロクロマチンの動態解明のため、以下の2つの項目について研究をおこなった。ヘテロクロマチン領域のヌクレオソーム動態の解析ーヘテロクロマチンにおいて、ヌクレオソームのリンカーDNAをつなぎ止めるクリップの役割をしていると考えられているリンカーヒストンH1を蛍光ラベルし、H1に富んだヌクレオソームの1分子解析をおこなった。ヘテロクロマチン領域のヌクレオソーム動態制御に関与する因子の同定ー核内膜直下のヘテロクロマチンについては、核膜の裏打ちタンパク質LaminA/CやLBRなどのヘテロクロマチン形成に対する関与が示唆されている。これらの核内膜タンパク質を体系的にノックダウンし、ヌクレオソームの動きを解析した。計画通りのH1-ヌクレオソームの1分子イメージング実験、データ解析を遂行することができ、有意義な結果を得ることができた。また本年度までの結果を論文発表することが出来た(Nozaki et al. Mol. Cell, 2017)。さらに米国ウッズホール海洋生物学研究所Shribak博士らが開発したOI-DIC顕微鏡を用いて、生細胞内の密度イメージングに成功し、ヘテロクロマチンの密度定量をおこなった。その結果、ヘテロクロマチンの密度(208 mg/mL)はユークロマチン(136 mg/mL)のわずか1.53倍であることが明らかになった。この成果は、米国細胞生物学会MBoC誌に「ハイライト」として掲載された。ヘテロクロマチンにおいて、ヌクレオソームのリンカーDNAをつなぎ止めるクリップの役割をしていると考えられているリンカーヒストンH1を蛍光ラベルし、H1に富んだヌクレオソームの1分子解析をおこなう。H1-PA-mCherryを細胞内で少量発現させ、安定発現細胞を単離する。H1ヌクレオソーム1分子観察のため、細胞内の限られた範囲だけを照らし出すことができる斜光照明のシステム(を用い、動画50ms/frame撮影をおこなう。観察した蛍光輝点は点拡かり(ガウス)関数でフィッティングし、正確な中心を決定する。次に1個1個のヌクレオソームの動きを追跡し、データを昨年度と同様に解析し、ユークロマチンでの解析と比較する。計画は順調に進んでいる。来年度理研・高橋恒一らと共同でモンテカルロ計算機シミュレーションを組み合わせ、測定値に基づくクロマチン環境を再現する。高橋らと代表者はヌクレオソームの濃度・動きを再現するシステムを既に構築しているため、この方法をさらに改良し、どのくらいの大きさのタンパク質が、どのくらいのヌクレオソームの動きによって、クロマチンにアクセスできるようになるのか?を詳細に解析する。そして、ヘテロクロマチンにおいて、抑制されたヌクレオソームの動きがタンパク質のクロマチンへのアクセシビリティに与える影響を明らかにする。また、リンカーヒストン・HP1・ヒストンメチル化酵素を過剰発現させ、ヌクレオソーム動態と遺伝子発現が低下するかを確認する。技術的な困難はない。
低温希ガスマトリックス中での二酸化窒素とアルケンとの光反応ダイナミックス

1温度制御装置を新規購入し,マトリックス単離試料に対する温度制御能力を高めることができた.2これまでの二酸化窒素とアルケンとの光反応ダイナミックスについて,総合的に解釈することを試みた.(1)エチレンとそのメチル基置換誘導体について:エチレン,プロペン,2-メチルプロペン,トランス-2-ブテン,シス-2-ブテン,2,3-ジメチル-2-ブテンの結果を比較した.その結果,メチル基で置換されるほど,光反応に必要な光のエネルギー波長が長波長側にシフトすることがわかった.また,二酸化窒素から酸素原子が移動する反応速度定数は光の波長の1次に比例し,また,反応中間体であるニトリトラジカルから一酸化窒素が解離する反応速度定数は2次に比例することがわかった.(2)ブタジエンとそのメチル基誘導体について:二酸化窒素から酸素原子が移動するときには,ブタジエン分子の端の炭素原子と結合してビラジカルが生成することがわかった.また,気相中で起こると言われている1,4-付加はマトリックス中では起こらず,選択的に1,2-付加が起こることがわかった.(3)シクロヘキサジエンについて:1,3-シクロヘキサジエンも1,4-シクロヘキサジエンも,オキシランビラジカルを経由してニトリトラジカルを生成する経路の他に,水素原子が脱離してベンゼンが生成する経路があることがわかった.とくに,1,4-シクロヘキサジエンでは,水素脱離反応が主反応であった.1温度制御装置を新規購入し,マトリックス単離試料に対する温度制御能力を高めることができた.2これまでの二酸化窒素とアルケンとの光反応ダイナミックスについて,総合的に解釈することを試みた.(1)エチレンとそのメチル基置換誘導体について:エチレン,プロペン,2-メチルプロペン,トランス-2-ブテン,シス-2-ブテン,2,3-ジメチル-2-ブテンの結果を比較した.その結果,メチル基で置換されるほど,光反応に必要な光のエネルギー波長が長波長側にシフトすることがわかった.また,二酸化窒素から酸素原子が移動する反応速度定数は光の波長の1次に比例し,また,反応中間体であるニトリトラジカルから一酸化窒素が解離する反応速度定数は2次に比例することがわかった.(2)ブタジエンとそのメチル基誘導体について:二酸化窒素から酸素原子が移動するときには,ブタジエン分子の端の炭素原子と結合してビラジカルが生成することがわかった.また,気相中で起こると言われている1,4-付加はマトリックス中では起こらず,選択的に1,2-付加が起こることがわかった.(3)シクロヘキサジエンについて:1,3-シクロヘキサジエンも1,4-シクロヘキサジエンも,オキシランビラジカルを経由してニトリトラジカルを生成する経路の他に,水素原子が脱離してベンゼンが生成する経路があることがわかった.とくに,1,4-シクロヘキサジエンでは,水素脱離反応が主反応であった.
随意運動の制御における脊髄介在ニューロン系の役割

【研究項目1】大脳皮質一次運動野及び赤核脊髄路細胞の表現する筋シナジーを明らかにした。結果は、皮質領域や細胞の筋活動生成に対する貢献が一様でない事を発見した。【研究項目2】一次体性感覚領域のうち、3a野には有意なミラーニューロン様活動が認められた一方、3b野にはそのようなニューロン活動は記録されなかった。皮質で認められるミラー活動は自己と他者の筋骨格運動そのものを反映している可能性がある。【研究項目3】運動中のシナプス前抑制が、感覚種及び運動内容に依存して選択的に行われていることを示した。また、光遺伝学によって末梢神経活動に介入する新たな方法を開発した。本研究では、随意運動制御の際の感覚運動統合において、上位中枢と脊髄の連関が持つ役割について明らかにする事が目的であった。具体的には3項目に分けて研究を実施した。第一の課題は、脊髄介在ニューロンと運動ニューロンとの関係性において表現されている筋協調パタンを、異なる脊髄下降路がそれぞれどのように利用して随意筋活動を生成しているのかについて明らかにする事であった。この点について、本年度は赤核脊髄路の筋シナジー表現に集中して電気生理学的実験を行い、それら多関節協調に関連する可能性を見いだした。第二に、高次運動中枢からの脊髄投射の役割を知るため、脊髄における把握運動ニューロンやミラーニューロン様活動の意義を明らかにする事を目的にした。本年度は新規行動課題の開発とサルの行動訓練を行なった。その結果、平成27年度前半には神経活動の記録を行なうことができそうである。第三に、随意運動の制御における中枢神経系への末梢感覚フィードバックの役割の一部を、光遺伝学による一次求心神経活動の選択的遮断などによって明らかにし、フードバックの制御がシナプス前抑制によって行われている事を証明する事であった。今年度は光遺伝学の実験系を齧歯類の末しょう神経系をにおいて確立すると同時に、シナプス前抑制の機能評価のための行動訓練を2頭のサルを対象に行なった。この点について、本年度は前年度獲得した赤核脊髄路の筋シナジー表現に関連するデータについて多変量解析を行い、赤核ニューロンの投射パタンは筋シナジーを表現している一方、それらの活動の時間的変動は筋シナジーの時間表現と必ずしも相関していない事が明らかになった。これらの知見の再現性を確かめるため、現在2頭目の課題訓練を行なっている。本年度はサルの行動訓練を継続して行ない、筋電図記録は完了した。今年度は光遺伝学の実験系を霊長類に展開させた。また、シナプス前抑制の機能評価のための行動訓練を2頭のサルを対象に継続している。【研究項目1】本年度は赤核脊髄路細胞の表現する筋シナジーを明らかにする解析を行なった。具体的には1頭のサルにおいて手指筋から体幹筋まで広い範囲の筋が使われる行動課題を訓練し、その際の赤核ニューロン活動を記録し、その際、筋電図のspike-triggered averagingによって同定された運動ニューロンに投射のあるpremotorニューロンの活動と、それらと同時に記録された筋電図活動を用いて抽出した筋シナジーパタンを統計的に比較した。その結果、赤核ニューロンの投射パタンは筋シナジーを表現している一方、それらの活動の時間的変動は筋シナジーの時間表現と必ずしも相関していない事が明らかになった。この結果は、我々がこれまで脊髄のpremotorニューロンで報告した結果と大きく異なることから、中枢神経系の多領域に存在するpremotor neuronの筋シナジー形成戸の貢献は一様でない事が示唆された。【研究項目2】当年度はサル頚髄ニューロンにおけるミラー活動を記録するための実験装置を用いた行動訓練を開始した。2頭のサルに訓練を継続し、1頭のサルについては、筋電図記録を完了し、当該タスクに関する筋シナジー抽出を終了した。また2頭目のサルについてもほとんど記録可能な状態まで行動訓練が終了している。【研究項目3】前年度にスタートしたサルの訓練を継続しており、近日中に、記録に必要な外科的手術を行なう予定である。一方、ラットを対象に、光遺伝学の実験系を確立した。具体的には、座骨神経への光刺激によって、脊髄における誘発電位が記録する事ができた。またその誘発電位は光強度や照射時間によって制御する事が可能であった。また当該技術を霊長類に応用するため、新たなウィルスベクターの開発に着手した。さらにそれらのための電極開発にも着手した。

第一の課題は、脊髄介在ニューロンと運動ニューロンとの関係性において表現されている筋協調パタンを、異なる脊髄下降路がそれぞれどのように利用して随意筋活動を生成しているのかについて明らかにする事であった。本年度も引き続き赤核脊髄路細胞に注目して、特に神経活動の時間的変化と筋シナジーの時間要素の関連性について解析を進めるとともに、2頭目のサルの訓練を行なった。第二に、脊髄における把握運動ニューロンやミラーニューロン様活動の意義を明らかにする事を目的にした。本年度は特に感覚誘発電位に注目し、筋神経及び皮膚神経刺激にたいする皮質一次感覚領域の活動変化に注目して実験を行った。筋神経と皮膚神経入力は皮質レベルでは運動中に異なった修飾を受けることが明らかになった。これらと脊髄上行路との関連性が今後の課題となる。また当該領域にミラー活動が少ないことを明らかにした。第三に、随意運動の制御における中枢神経系への末梢感覚フィードバックの役割の一部を、光遺伝学による一次求心神経活動の選択的遮断などによって明らかにし、フィードバックの制御がシナプス前抑制によって行われている事を証明する事であった。今年度は、遺伝子導入方法及び光刺激方法に大きな進歩が見られ、より多くのDRG細胞を光刺激によって制御できるようになった。シナプス前抑制に関しては、筋紡錘から脊髄への感覚入力は運動時に主に脱抑制を受けることが明らかになった。さらに、生体内埋植を目指した光刺激プローブとして超小型光刺激デバイスの開発を進めた.具体的には,フレキシブル基板上に実装した超小型青色LEDによるデバイスとフレキシブルワイヤに直接超小型青色LEDを接続したデバイスの2種類を開発した.【研究項目1】1頭のサルにおいて手指筋から体幹筋まで広い範囲の筋が使われる行動課題を訓練し、その際の赤核ニューロン活動を記録し、筋電図のspike-triggered averagingによって運動ニューロンに投射のあるpremotorニューロンを同定する。その後、個々のニューロン活動の時間変動と筋シナジーの時間要素の関係性を解析し、赤核ニューロンは全体としては筋活動の時間要素構成に貢献しない可能性が示された。一方2頭目の訓練が遅れており、この項目はやや遅れが見られる。【研究項目2】サル神経活動慢性記録用のチェインバーが外れるなど動物サイドのトラブルがあったが、脊髄ニューロンを直接評価するのでなくその出力系の評価に切り替えることにより実験を継続できた。特に3a領域の感覚制御機構は新たな知見である。【研究項目3】サル手首運動中の筋神経入力へのシナプス前抑制の動態を定量化する目的である。筋神経へのシナプス前抑制の動態を明らかにできたこと、またDRGへの光刺激が慢性実験で用いることのできるレベルまで改良できたことなど、この項目は予想以上に進展した。デバイス開発ではこれまでレキシブル基板上に実装した超小型青色LEDによるデバイスとフレキシブルワイヤに直接超小型青色LEDを接続したデバイスの2種類の開発に成功し,実際にマウス,ラットへの埋植を行った.またKoshianを使ったBluetoothモジュールによるLEDのON/OFF制御に成功した.ボタン電池を用いることでラットへの搭載が可能である.
新規変性LDLとしての糖酸化LDLの粥状硬化巣における形成とその役割

方法:ヒト血清アルブミンをグルコース存在下または非存在下で37°C、8週間インキュベーションし、それぞれ糖酸化アルブミン(goHSA)、酸化アルブミン(oHSA)とした。コントロールには未処理アルブミン(nHSA)とキレーター存在下でインキュベーションしたアルブミン(chHSA)を用いた。修飾アルブミンの糖酸化はカルボキシメチルリジン(CML)の形成、酸化はチオール基の量で評価した。各修飾アルブミン存在下でLDLを銅と37°C、6日間インキュベーションし、LDLの酸化の程度をMDAの形成とアガロースゲル電気泳動の移動度で調べた。結果:goHSAにはCMLが形成され、チオール基はnHSAやchHSAにくらべ有意に減少していた。oHSAではチオール基は減少したが、CML形成は見られなかった。nHSAはLDLの銅酸化によるMDA形成を1mg/mlで完全に抑制した。一方、MDA形成に対するgoHSAの抑制作用は著しく低下し、4.0mg/mlでもMDA形成を完全に抑制できなかった。oHSAとchHSAのMDA形成に対する抑制作用は中等度低下していた。oHSAとchHSAは、銅酸化によるLDLのアガロースゲル電気泳動の移動度をnHSAと同程度に抑制した。一方、goHSAの抑制作用は著しく低下した。結論:糖酸化修飾はアルブミンの抗酸化能の低下を引き起こし、LDLの酸化に関与している可能性が示唆された。1.抗CML抗体と抗nonCML抗体の特性に関する免疫化学的検討:我々は、カルボキシメチルリジン(CML)とCML以外の後期反応生成物(nonCML)に対する二種類の抗体を作製し、そのエピトープと抗体の特性を免疫化学的に検討した。その結果、CMLは酸化と糖化反応が関与する後期反応生成物、すなわち糖酸化反応産物であるのに対し、nonCMLは糖化反応だけで形成される後期反応生成物であることを免疫化学的に証明し、さらに両エピトーブに対する抗体は互いに交差反応しないことを明らかにした。2. CML,nonCML-epitopeの動脈硬化巣における局在と酸化LDLとの関係:20例の非糖尿病剖検例を用い、大動脈粥状硬化巣におけるCML,nonCML-epitopesと酸化LDLの局在を免疫組織化学的に調べた。CML-とnonCML-epitopeは、ともに40才以上の症例のびまん性内膜肥厚部のコラーゲンにすって認められた。しかし、40才未満の症例のびまん性内膜肥厚部には見られなかった。脂肪線条や粥状硬化班になると、CML-epititopeと酸化LDLは主にマクロファージ/泡沫細胞内に集積するのに対し、nonCML-epitopeは細胞外マトリックスに局在した。このことより、(1)後期反応生成物は加齢に伴ない内膜に蓄積すること、(2)糖酸化反応とLDLの酸化が密接に関与し、粥状硬化巣における糖酸化LDLの形成とマクロファージの泡沫細胞化を介する粥状硬化促進機序の可能性が示された。方法:ヒトLDLをグルコース、銅イオンまたはその両者と37°C、2週間インキュベーションし、それぞれ糖化、酸化、糖酸化LDLとした。各修飾LDLの酸化の程度をアガロースゲル電気泳動とTBARS値で.一方糖化の程度はフルクトサミン量で評価した。カルボキシメチルリジン(CML)の形成は抗CML抗体(6D12)で、また酸化フォスファチジールコリン(oxPC)の形成を抗oxPC抗体(DLH3)を用いて、ELISAで測定した。さらに、CMLとoxPC形成に対するキレート剤とアミノグアニジンの抑制効果について検討した。結果:糖化、酸化および糖酸化LDLはいずれも陰性荷電、TBARS値、フルクトサミン量の増加を示した。しかし、陰性荷電とTBARS値は酸化LDLで、一方フルクトサミン量は糖化LDLでより強く変化した。

高濃度のグルコースで糖化LDLにはCMLがわずかに形成された。酸化LDLではoxPCは形成されたが、CMLは形成されなかった。糖酸化LDLではCMLとoxPCが共に形成されたが、CMLはグルコースと銅イオンの容量に依存して増加したのに対し、oxPCの形成は銅イオンの容量にのみ依存し、グルコースの濃度には関係していなかった。CMLの形成はキレート剤とアミノグアニジのいずれでも完全に抑制された。しかし、oxPCはキレート剤では完全に抑制されたが、アミノグアニジンによる抑制効果は約50%であった。結論:本研究により、CMLは糖酸化LDLの特異的エピトープであることが明らかになった。1)LDLの酸化、糖化、糖酸化産物の形成:ヒトLDLをグルコースと銅イオンを用いてin vitroで糖化、酸化、糖酸化修飾し、カルボキシメチルリジン(CML)、マロンジアルデヒド(MDA)、ヘキシトールリジン(HL)の形成を免疫化学的に検討した。これら反応産物の形成におよぼすアミノグアニジンとキレート剤の効果を調べた。CMLは、LDLを糖酸化修飾する事により時間依存性に増加した。MDAは、糖酸化LDLと酸化LDLで形成された。HLは、糖酸化LDLと糖化LDLで形成された。CMLの形成は、アミノグアニジンまたはキレート剤添加により完全に抑制された。これに対し、MDA形成におよぼすアミノグアニジンの抑制効果は約50%であった。HLの形成はアミノグアニジン、キレート剤いずれにも抑制されなかった。2)動脈硬化病変における酸化、糖化、糖酸化産物の局在:剖検例から得られた大動脈の粥状硬化巣におけるCML,MDAおよびピラリン(PRL)の局在を免疫組織化学的に検討した。脂肪線条では、CMLとMDAが主に内膜の泡沫細胞/マクロファージの胞体内に蓄積していたが、PRLは細胞外マトリックスに局在した。粥状硬化斑ではCMLは泡沫細胞/マクロファージに、一方MDAは泡沫細胞/マクロファージと内膜平滑筋細胞に蓄積した。しかし、PRLは内膜の細胞外マトリックスにみられた。粥腫にはCMLとMDAが蓄積していたが、PRLは認められなかった。結論:LDLの糖酸化は酸化修飾を促進し、粥状硬化の形成に関与している可能性が示唆された。方法:ヒト血清アルブミンをグルコース存在下または非存在下で37°C、8週間インキュベーションし、それぞれ糖酸化アルブミン(goHSA)、酸化アルブミン(oHSA)とした。コントロールには未処理アルブミン(nHSA)とキレーター存在下でインキュベーションしたアルブミン(chHSA)を用いた。修飾アルブミンの糖酸化はカルボキシメチルリジン(CML)の形成、酸化はチオール基の量で評価した。各修飾アルブミン存在下でLDLを銅と37°C、6日間インキュベーションし、LDLの酸化の程度をMDAの形成とアガロースゲル電気泳動の移動度で調べた。結果:goHSAにはCMLが形成され、チオール基はnHSAやchHSAにくらべ有意に減少していた。oHSAではチオール基は減少したが、CML形成は見られなかった。nHSAはLDLの銅酸化によるMDA形成を1mg/mlで完全に抑制した。一方、MDA形成に対するgoHSAの抑制作用は著しく低下し、4.0mg/mlでもMDA形成を完全に抑制できなかった。oHSAとchHSAのMDA形成に対する抑制作用は中等度低下していた。
刺激特異的応答を示す神経細胞の多様性決定機構の分子メカニズム解析

高等哺乳動物の視覚系神経回路では、M細胞系(空間・動作情報を伝達)、P細胞系(色彩・形態情報を伝達)など多彩な視覚入力に刺激特異的応答を示す神経細胞群が存在しており、カラム構造や層構造などの立体構築を形成している。これらの機能分業と立体構造とは、効率の良い視覚情報処理に重要であると考えられているが、これらの神経細胞の多様性と立体構造の形成に関する分子メカニズムはまだまだ不明である。我々はこれまでに、視覚情報の中継核である外側膝状体(LGN)に焦点を絞り、M細胞への分化メカニズムに注目をして解析を進めてきた。これまでに、M細胞に発現する遺伝子の同定を行い、この遺伝子の発現を分子マーカーとして、M細胞への分化過程を調べてきた。まず、網膜自発発火の重要性を検討するために、網膜自発発火を抑制する薬剤epibatidineを生直後より投与し、その後にLGNにおけるM細胞マーカーの発現をin situ hybridization法により検討した。その結果、LGNにおいてM細胞マーカーは正常に出現してきたことから、M細胞分化には網膜自発発火は不要であることが示唆された。また眼球を除去してもM細胞分化は正常であったことから、網膜自発発火のみならず、眼球からの入力も不要であることが示唆された。さらに、LGNのスライス培養を作成し、M細胞への分化を検討したところ、スライス培養でもM細胞マーカーは出現してきた。スライス培養には、大脳皮質や脳幹部などLGNに入力を送る部位は含まれておらず、この結果は、M細胞への分化は、LGN自律的に規定されている可能性を示唆している。しかしながら、これまでの研究では1種類のM細胞マーカーしか使っておらず、今後複数種類のマーカーで、この結論が正しいか検証する必要がある。高等哺乳動物における視覚系神経回路には、空間情報を伝達するM細胞系、色彩情報を伝達するP細胞系、光照射に反応するon細胞や光除去に反応するoff細胞など、多彩な反応特性を持つ神経細胞が存在しており、これらの細胞はカラム構造や層構造などの立体構造を形成している。この細胞多様性と立体構造は、効率のよい情報処理に重要であると考えられている。我々は、この神経細胞多様性と立体構造の形成過程の分子メカニズムに興味を持ち研究を進めている。これまでに視覚情報の中継核である外側膝状体(LGN)を用いて、M細胞への分化過程に注目して解析を進めてきた。その結果、LGNにおけるM細胞への分化には、外界からの視覚入力や網膜での自発神経活動は必要ではないことを見出した。この結果は、M細胞への運命決定は遺伝子プログラムにより制御されていることを示唆している。さらに、M細胞の分化とともにLGNに発現が見られる遺伝子群の単離も行ってきた。そこで、これらの遺伝子群の細胞生物学的な機能解析を進めた結果、主要な細胞内シグナル伝達分子であるカルモジュリンの細胞内分布を制御する可能性を見出してきた。実際に、カルモジュリンと共発現させると、カルモジュリンの細胞内局在が変化した。この結果は、神経細胞の多様性の形成機構の一つとして、カルモジュリンの細胞内局在を変化させることにより、そのシグナル出力を変化させているというメカニズムの可能性を示唆している。脳神経系には多彩な個性を持つ神経細胞が存在し、高次脳機能の基盤となっているが、多様性構築の分子基盤は未だに不明な点が多い。我々はこの問題点に対して、中枢神経系が発達した高等哺乳動物フェレットを用いて解析を進めている。我々が特に注目しているのが、網膜から外側膝状体(LGN)へと至る視覚神経回路である。視覚神経回路には様々な反応特性を持つ多様な神経細胞群が存在している。

これまでに、フェレットより遺伝子を効率よく単離するために、独自のフェレットマイクロアレイを作成し、発生過程のLGNに発現する遺伝子の単離を進めてきた結果、LGNのA層(視覚情報の動作・色彩情報を伝達)やC層(視覚情報の青色情報を伝達)などに発現する遺伝子を見出してきた。つぎの問題点は、これらの遺伝子の機能解析である。フェレットでは遺伝子改変動物の作成は困難であるために、我々は遺伝子機能解析の実験系として、スライス培養を用いることとした。即ち、発生過程をin vitroで再現するようなスライス培養系を作成し、その中で遺伝子機能解析を行うこととした。生直後のフェレットよりLGNのスライス培養系を作成し10日間培養した後に、分子マーカーを用いてin situ hybridization法により、分化進行を検討した。培養液条件などを検討した結果、分化過程が正常に進行する培養条件を見出すことに成功した。面白いことに、この培養条件を用いると、時間的に分化が進行するのみならず、空間的にもA層やC層に対応する構造ができていることを見出した。これらの培養系はフェレットにおける遺伝子機能解析を可能とする新しい実験系であり、神経細胞の多様性決定機構の解析に有用であると考えている
ナチュラルコンピューティングの分子実現とその設計論

本研究は分子計算によって培われた情報科学・生命科学の協力体制によって、分子進化という同一の課題に取組むことを目的とした。ウエット進化計算の分子実現について、染谷と山村は、タンパク質工学のために「探索が任意のある一点から開始される」確率的最適化の手法を検討した。SAなどの既存手法の分子実現について理論的に考察し、遺伝的アルゴリズムに基づく主要を提案して、計算機実験により有効性を確かめた。春木はランダム変異およびDNAシャッフリングによる大腸菌リボヌクレアーゼHの耐熱化実験、および大腸菌リポヌクレアーゼHIの耐熱化機構の熱力学的解析を行った。木賀は構成生物学の立場から、工学一般における部品や作業の標準化という観点から遺伝子工学を改めて見直すことを試みた。部品の標準化に役立つフォーマットを提案し、実際に条件判定を行うためのパーツを構築してAND論理演算が可能であることを示した。さらに、Tokyo Allianceと称するチームを率いて、第3回国際人工遺伝子回路コンテストに参加し、最優秀部品賞、最優秀共同作業賞のふたつを受賞した。進化リアクタの作成では、伏見は、mRNAの5'末端と、蛋白質のN末端付近を結合したin vitroウイルスを作製した。また、等温核酸増幅進化リアクタープロセスによるプロモーターの進化を実現した。理論解析では、樺島は、多数のユニットが複雑に結合した系を数理的に解析する方法論について研究した.特に平均場近似のための効率的な数値最適化アルゴリズムを開発し、3体スピングラス模型で最近提唱された理論予想を支持する結果を得た。遺伝的アルゴリズム(GA)、焼きなまし法(SA)など生命・自然現象に啓発された計算技法をナチュラルコンピューティングと総称する。本研究の目的はナチュラルコンピューティングの分子実現にある。最適化問題として見たときの適応度地形の特長によって2種類の具体例を用意した。平成14年度の研究成果をそれぞれについてまとめる。1、特定の酵素(アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS))の基質特異性の進化的改変を対象とした、熱力学的遺伝アルゴリズム(TDGA)の分子実現をテストベッドとして生物系・情報系双方向からの検討を加えた。aaRSはすべての生物が持っている古いタンパクで、多種多様の立体構造を持ち、広域多峰性の適応度地形を持っていると考えられる。TDGAに適した進化実験系を新たに構築し、実験で得られたデータをもとに、進化計算、最適化、統計物理などナチュラルコンピューティングの側面からの理論解析・シミュレーションを行うことで、実験条件の改良と同時に理論解析の補強を試みた。2、伏見らが開発した既存の試験管ウイルスを改良し、ワンポットの試験管中でライフサイクルを回すことのできる人工ウイルスの分子系を構築し、この等温(核酸+タンパク質)増幅系を用いて、進化リアクターを構築し改良した。この進化リアクター中の試験管ウイルスは、そのリアクター中に設定された環境に適応するように進化するという意味において、分子人工生命と呼び得る。この進化リアクターを用いて、タンパク質の大域的適応度地形、並びに、適応度地形中腹の性質を探査する。蛋白の多くは富士山型の地形をもつことが知られており上記と好対照をなす。これら地形の性質を蛋白質物性データを基に理論的に調査し、また、その上の適応歩行を考察した。遺伝的アルゴリズム(GA)、焼きなまし法(SA)など生命・自然現象に啓発された計算技法をナチュラルコンピューティングといい、様々な分野で一定の成功を収めているが、生命科学との関わりは一方的なアイデアの借用に留まる。一方、生命科学ではこれとは独立に生命・自然現象に起源を持つ概念を日常的に用いており、変異と選択によって望みの分子を設計する分子進化工学は、確立した分野として成果をあげている。本課題の目的は、分子計算によって培われた情報科学・生命科学の協力体制によって、分子進化という同一の課題に取り組むことにある。前年度に引き続き、2つの具体的対象のそれぞれについて、実験・理論両面から接近した。(1)aaRSの基質特異性の進化的改変について(a)進化実験系を構築する。遺伝的アルゴリズム(GA)との整合性を高めるため、繰返しスクリーニング(選択)を行うことで、弱いながら活性を持つ酵素を進化させた。(b)進化計算としての困難さを反映するように適応度地形の形状特性のみを一致させたモデルに対して、進化実験系の試験データをもとにモデルのパラメータチューニングを行った。(2)ワンポット分子進化系の構築についてa)分子人工生命としての試験管ウイルスを構築した。3SR法により核酸部分を増幅して作ったDNAウイルス粒子を用いて、自然淘汰式進化リアクターを継代植継ぎ法でエミュレートする。植継ぎ時に人為淘汰式を加味しつつタンパク質部分の評価を行う。前年度に提案した方法の改良を行った。(b)生体高分子の大域的適応度地形と地形中腹の性質の理論的調査を行った。適応度地形上のランダムウォークについて統計力学的解析を行った。生命科学ではこれとは独立に生命・自然現象に起源を持つ概念を日常的に用いており、特に分子進化工学は確立した分野として成果をあげている。次の2つの具体的対象で成果を上げた。(1)アミノアシルtRNA

合成酵素(aaRS)の基質特異性の進化的改変を対象とした、熱力学的遺伝アルゴリズム(TDGA)の分子実現をテストベッドとして生物系・情報系双方向からの検討を加えた。進化過程のシミュレーションについて国際会議(DNA10)で発表した。(2)試験管ウイルスを改良した。ワンポットの試験管中でライフサイクルを回すことのできる人工ウイルスの分子系により、具体的な分子進化を行った。また、統計物理的手法に基づいて、適応度地形の歩行の理論解析を行った。本研究の目的は、分子計算によって培われた情報科学・生命科学の協力体制によって、分子進化という同一の課題に取り組むことにある。3年目の中間報告を過ぎて、研究課題の絞込みと新たな展開の両面を試みた。昨年より分担者として春木満氏の参加を得て実験面を強化した。本年は坂本健作氏の理研への移転に伴い、研究協力者として若林健一氏にウェット進化計算の実現実験を依頼した。主要な成果は次の通りである。理論面においては、山村は組換えタンパク質の発現量およびフォールディングの有無について生物学実験データからのデータマイニングを行って、組換えタンパク質の生産性向上に役立つ知見を得た。また染谷は理論解析とシミュレーションを分担し、シミュレーテッドアニーリングなどのマルコフ連鎖モンテカルロ法に基づく最適化手法の分子による実現可能性について検討した。その結果、これらの実現は困難であるとの結論を得た。これにより、間接的にではあるが、提案しているウェットGAによるタンパク質の進化手法の意義を確認した。伏見は、単純化された進化分子工学実験における分子進化過程と熱力学過程とのアナロジーをとることで、分子進化過程が外部環境からの情報獲得過程であるという概念を明確にした。実験面においては、伏見は進化リアクターにおけるミスハイブリを減少させる目的で50°CのThermoT7RNAポリメラーゼに対するプロモータの最適配列を決定するためのin vitroselection実験を行った。春木は熱安定性の低下した大腸菌RNase HIのC末端欠失変異体と、大腸菌RNaseH依存性温度感受性株を利用し、淘汰圧の有無により、熱安定性の向上の頻度がどのように変化するか検討を行った。また、タンパク質変異体安定性プロフィールの予測に基づく部位特異的およびランダム変異導入による大腸菌リボヌクレアーゼHIの熱安定化の向上を試みた。本研究は分子計算によって培われた情報科学・生命科学の協力体制によって、分子進化という同一の課題に取組むことを目的とした。ウエット進化計算の分子実現について、染谷と山村は、タンパク質工学のために「探索が任意のある一点から開始される」確率的最適化の手法を検討した。SAなどの既存手法の分子実現について理論的に考察し、遺伝的アルゴリズムに基づく主要を提案して、計算機実験により有効性を確かめた。
前頭皮質局所回路の皮質下構造に対応した機能分化

大脳皮質錐体細胞の機能的分化を生理学・薬理学的に検索した。錐体細胞は皮質外投射先によって発火特性やアセチルコリン作用が異なることを見つけた。新皮質の2/3層から5層錐体細胞への興奮性結合は5層錐体細胞サブタイプによって、シナプス結合の確率・結合細胞の空間分布・発散結合の選択性が異なることが分かった。アセチルコリンは覚醒・認知機能に深く関する伝達物質であり、前頭皮質と海馬でも重要な働きをすると考えられている。新皮質は多様なニューロンタイプからできているが、アセチルコリンは皮質ニューロンのタイプごとに、投与時間・作用領域(細胞体・樹状突起など)に依存した固有の応答を引き起こすことがわかってきた。前頭皮質の錐体細胞についていうと、一過性のアセチルコリン投与に対して、5層のものは著明に過分極するのに対して、2・3層のものではそれはみられない。海馬にも領域ごとに興奮性の錐体細胞がある。今回、アセチルコリンを海馬錐体細胞の細胞体付近に一過性に与えたところ、CA3領域では過分極が見られなかったが、CA1領域では、M1型ムスカリン受容体、細胞内カルシウム上昇を介したSKチャネルによる過分極が起きた。また、この過分極反応の維持には、電位依存性カルシウムチャネルを介した細胞外からのカルシウム流入が必要なことがわかった。前頭皮質では2・3層から5層錐体細胞への結合が主要な興奮性経路の一つなのに対して、海馬ではCA3からCA1錐体細胞へのシナプスが主な興奮経路である。皮質外への投射については、それぞれ5層とCA1錐体細胞が担っている。従って、アセチルコリンは、層構造下位の興奮性細胞の発火を一過性に抑制し、皮質外への出力を遮断することが示唆された。また、錐体細胞の電気的性質を調べると、CA1錐体細胞は5層錐体細胞と同じくh電流を発現しているのに対して、CA3では2・3層と同じくそれが見られなかった。アセチルコリン作用・皮質内経路・皮質外投射様式・電気的性質を合わせて考えると、前頭皮質2・3層錐体細胞はCA3錐体細胞に、5層錐体細胞はCA1錐体細胞に対応すると考えられる。大脳新皮質は複数の層(レイヤー)からできており、各層の間は興奮性の錐体細胞で結合している。同じ層の錐体細胞でも投射先や生理的性質が多様であることが知られている。今回、スパイク発火のバーストや順応パターンを細胞内脱分極通電で調べたところ、前頭皮質5層の錐体細胞には3種類の発火サブタイプがあることがわかった。橋核や線条体に投射する5層錐体細胞はそれぞれ特有の発火パターンであることから、投射先に依存して生理的にも機能分化すると考えられる。次に、発火特性を同定した2個の5層錐体細胞から同時記録し、2/3層錐体細胞をグルタミン酸の短時間投与で発火させ、2/3層から5層錐体細胞への興奮性結合を解析した。同一2/3層細胞から共通入力を受ける確率が5層錐体細胞発火サブタイプの組み合わせやサブタイプ間のシナプス結合に影響されるのかを検討した。その結果、5層細胞が同一2/3層細胞から共通入力を受ける確率は、同じサブタイプペアーの方が異なるサブタイプペアーより高くなった。さらに、同じ5層サブタイプペアーでは、シナプス結合があるものが無いものより共通入力確率が高くなり、一方、異なるサブタイプペアーが共通入力を受ける確率は5層間結合の有無に影響されなかった。以上のことから、2/3層から5層への興奮結合が5層錐体細胞サブタイプやその結合に依存したサブネットワークを作ることがわかった。皮質下出力に依存して、皮質内局所回路が分化していると考えられる。
１２年間（小学１年生から高校３年生まで）の疾走能力の縦断的分析

小学1年時から高校3年時まで12年間継続して50m走を計測し、分析できた18名(男子9名、女子9名)を対象に、疾走能力の検討を縦断的に行った。男子は、中学3年時まで経年的に速くなり、高校1年時で停滞するが、高校2年、3年と速くなった。一方、女子は、中学2年時までは経年的に速くなり、中学3年時で停滞、高校1年時から遅くなり、高校3年時ではさらに遅くなった。ピッチは、男女とも小学時から高校時まで、あまり経年的に変わらないが、小学6年時と中学1年時あたりが低い値を示すことが明らかとなった。ストライドは、男女とも小学1年時から中学2年時まで経年的に増加し、その後あまり変化が見られなかった。研究の目的は、平成22年度まで行ってきた小学生から中学生までの発達に伴う疾走能力の縦断的検討を、高校3年生まで継続することによって、発育発達の個人差を考慮した疾走速度の詳細な発達研究を行うためであった。そこで、平成23年度に高校1年生で小学2年生から毎年継続して分析できた対象者(79名)に対して、さらに3年間の継続実験への参加協力依頼を行い、了承を得られた対象者は11名(男子7名、女子4名)であった。したがって、11名の対象者について、50m走を走ってもらい、側方からビデオ撮影し、10mごと5区間の疾走速度、ストライドやピッチなど動画ソフトで分析し、平成15年度から蓄積している縦断的データに加えた。また、発育発達の個人差を考慮できる身長発育速度ピーク(PHV)年齢を算出するため、身長や体重の測定も行い、蓄積しているデータに加えた。また、対象者に関して縦断的分析の欠点であるデータ数の減少が起こりえるため、平成15年度に小学1年生から分析を続けている平成23年度中学3年生(男子31名、女子25名)についても、中学校に実験協力を得て、身長や体重の測定、新体力テスト時に50m疾走のビデオ撮影を行い、疾走速度、ストライド、ピッチなどデータ分析を行い蓄積した。次年度に継続実験の協力依頼を行う必要があるが、2学年を対象として研究を行うことでデータ数の減少が起こっても計画を遂行できると考えている。これらの結果は、単年度の結果分析のため、論文等にしていないが、継続することによって結果は報告していきたい。これまで、発達に伴う疾走能力の変化を検討する縦断的研究は少なく、そして、小学校(6年間)、中学校(3年間)、高校(3年間)の各学校種別ごとには報告はあるが、同一の対象者を小学1年生から高校3年生まで追跡した疾走能力の研究は皆無である。そこで、平成23年度まで行ってきた小学生から中学生までの発達に伴う疾走能力の縦断的検討を、高校3年生まで継続することによって、発育発達の個人差を考慮した疾走速度の詳細な発達研究が可能となる。多くの被験者は、個人差はあるものの中学生の時期に、身長発育速度ピーク(PHV)年齢を過ぎ、発育速度の減速が見られる。しかしながら、発育停止までに至っていないため、最終身長に限りなく近づく18歳ごろまで、これまでの研究を継続させることで、成長段階を完全に把握し、個人の発育発達に伴う疾走能力を研究することができると考えている。今年度は、平成15年に小学1年生を被験者として、平成24年まで縦断的な分析を続けられた対象者24名(高校2年生)と、1年前倒しで継続している高校3年生6名、合わせて30名に対して、身長や体重の測定、そして、疾走能力の計測・分析を行った。疾走能力については、ビデオ映像を再生することにより、10m毎の通過時間、疾走速度、ピッチやストライドなどを分析・算出し、縦断的データとして蓄積した。身長・体重などのデータから、年間発育量を算出し、これまでのデータと比較・分析し、蓄積した。この研究に関する間接的な論文は報告したが、今年度の結果は、単年度の分析結果としてデータを蓄積するため、論文として報告していないが、これまでのデータと合わせて、来年度にまとめていきたい。これまで、発育発達に伴う疾走能力の変化を検討する縦断的研究は少なく、そして、小学校(6年間)、中学校(3年間)、高校(3年間)の各学校種別毎には報告があるが、同一の対象者を小学1年生から高校3年生まで追跡した疾走能力の研究は皆無である。

多くの中学生は身長発育速度ピーク(PHV)年齢を過ぎ、発育速度の減速が見られるが、発育停止までに至っていないため、最終身長に限りなく近づく18歳ごろまで、これまでの研究を継続させることで、成長段階を完全に把握し、個人の発育発達に伴う疾走能力を研究することができると考えている。今年度は、平成15年に小学1年生を被験者として平成23年まで縦断的な分析を続けられた対象者56名に対して、継続して実験参加の同意が得られた27名(高校1年生)と昨年度から継続している高校2年生6名、合わせて33名に対して、身長や体重の測定、そして疾走能力の計測・分析を行なった。疾走能力については、ビデオ映像を再生することにより、10m毎の通過時間、疾走速度、ピッチやストライドなど分析・算出し、縦断的なデータとして蓄積した。身長、体重などのデータも測定・蓄積し、年間発育量を算出し、これまでのデータと比較・分析した。今年度の結果は、単年度の分析結果のため、論文などにしていないが、これまでのデータと合わせて継続することによって、結果をまとめていきたい。これまで発育発達に伴う疾走能力の変化を検討した縦断的研究は少なく、さらに小学校6年間、中学校3年間、高校3年間の各学校種別ごとには縦断的研究報告はあったが、小学1年生から高校3年生まで、同一の対象者を追跡した疾走能力の研究は皆無であった。そこで、以前行ってきた小学生から中学生までの発育発達に伴う疾走能力の縦断的検討を、対象者数が年々減少したが、今年度、高校3年生として、身長や体重の測定、50m走を行ってもらい、その疾走をビデオ撮影し、ビデオ映像を分析することによって、疾走能力の計測・分析を行った。疾走能力については、単純にスタートからゴールまで要したタイムだけでなく、脚の回転の速さであるピッチ(step frequency)や片足の接地から逆足の接地までの歩幅で表わされるストライド(step length)を分析した。また、10m区間ごとに、疾走速度、ピッチやストライドを分析・算出し、今年度のデータとして、蓄積した。さらに、今年度は、小学1年生から高校3年生までの12年間にわたる縦断的分析の最終学年であるため、年間の身長(体重)増加量、つまり身長(体重)発育速度の分析をもとに、発育発達の個人差を考慮して、疾走能力を分析した。今年度中に、論文の投稿には至らなかったが、発育発達による疾走能力の変化について、個人の疾走能力発達、早熟あるいは晩熟による疾走能力の違いなど、いろいろな角度から論文としてまとめ、投稿準備を進めた。26年度が最終年度であるため、記入しない。スポーツトレーニング・コーチィング26年度が最終年度であるため、記入しない。縦断的分析の欠点である実験対象者の欠落があったが、継続的に分析してきたデータと同様に、実験データを積み重ねることができたため、おおむね順調であった。縦断的分析の欠点である被験者の欠落が見られたが、男女別の被験者数も十分であり、これまで継続的に分析してきたデータに、今年度の実験データを追加できたため、おおむね順調であった。縦断的分析の欠点である実験対象者の欠落が進学等により大きくみられたが、縦断的分析として、男女別の被験者数も十分であり、これまで継続的に分析してきたデータに、今年度の実験データを積み重ねることができたため、おおむね順調であった。実験計画や測定方法に問題はないが、実験対象者の欠落がないよう、連絡を密にとり協力いただけるよう趣旨を説明していきたい。実験計画や測定方法に全く問題はないが、24名(男子14名、女子10名)の被験者が、これ以上、欠落がないよう連絡を密にとり、実験日を増やすなどの対策をとり、協力いただけるよう趣旨をさらに説明し、来年度も縦断的データとして蓄積できるようにしていきたい。
希少種アマミノクロウサギの遺伝学的手法を用いた個体数推定と遺伝的構造の把握

南西諸島の希少種アマミノクロウサギの生息状況把握と適切な保全計画を樹立するために,モニタリング手法の確立,遺伝学的手法を用いた集団の構造把握,及び個体数推定方法の確立を図り,また生息環境要因との関係を検討した.本種が夜行性で,夜間に巣穴から100-200mの範囲で活動し,林縁部や森林のギャップ部に出現して,主に採食と排糞活動を行なうことが明らかになった.糞粒カウント法を用いた主要流域単位9エリア(合計24河川)を対象とするモニタリングシステムを構築し,最近に増加傾向を示す地域として8エリアが認められた.採集した糞サンプルで12型のハプロタイプを検出したが,地域間で顕著な遺伝的差異は認められず,近年までの全島的な遺伝的交流の可能性が示唆された.遺伝的手法を用いた個体数推定では,クロウサギのマイクロサテライトプライマー9ペアを開発し,この9プライマーとヨーロッパアナウサギの4プライマーを加えて,個体識別の有効性が明らかになった.さらに,糞中からマイクロサテライトDNAをより精度高く得る方法を確立した。糞粒発見地点と生息環境要因との関係との検討として,特定の林道(距離15km)での糞粒発見地点と植生図などの既存のGISデータを用いて周辺環境の特徴を予備的に分析した例では,糞粒発見地点の周辺に照葉樹林が多いことが捉えられたが,植生図での特徴的な差を検出するまでには至らなかった.これらの成果から,アマミノクロウサギの生態や生息実態が明らかになり,今後の生息動向を把握するためのモニタリング手法の一部を確立したと考える.南西諸島の希少種アマミノクロウサギの生息状況把握と適切な保全計画を樹立するために,モニタリング手法の確立,遺伝学的手法を用いた集団の構造把握,及び個体数推定方法の確立を図り,また生息環境要因との関係を検討した.本種が夜行性で,夜間に巣穴から100-200mの範囲で活動し,林縁部や森林のギャップ部に出現して,主に採食と排糞活動を行なうことが明らかになった.糞粒カウント法を用いた主要流域単位9エリア(合計24河川)を対象とするモニタリングシステムを構築し,最近に増加傾向を示す地域として8エリアが認められた.採集した糞サンプルで12型のハプロタイプを検出したが,地域間で顕著な遺伝的差異は認められず,近年までの全島的な遺伝的交流の可能性が示唆された.遺伝的手法を用いた個体数推定では,クロウサギのマイクロサテライトプライマー9ペアを開発し,この9プライマーとヨーロッパアナウサギの4プライマーを加えて,個体識別の有効性が明らかになった.さらに,糞中からマイクロサテライトDNAをより精度高く得る方法を確立した。糞粒発見地点と生息環境要因との関係との検討として,特定の林道(距離15km)での糞粒発見地点と植生図などの既存のGISデータを用いて周辺環境の特徴を予備的に分析した例では,糞粒発見地点の周辺に照葉樹林が多いことが捉えられたが,植生図での特徴的な差を検出するまでには至らなかった.これらの成果から,アマミノクロウサギの生態や生息実態が明らかになり,今後の生息動向を把握するためのモニタリング手法の一部を確立したと考える.遺伝的手法を用いたアマミノクロウサギの個体数法を確立するために,捕獲個体及び採集死体の計19個体(1996-2005年)を用いてノウサギのマイクロサテライト10座位の適用,PCR反応条件の確立,有効座位の確定と個体識別に必要な座位数をプログラムNoLocSimにて個体識別に必要な座位数の推定を検討した.19個体中古いサンプル以外の12個体でPCRに成功し,ノウサギの10マイクロサテライト座位中6座位が使用可能となり,最適PCR条件を確立できた.また,12個体の上記6座位で個体識別が可能だった.さらにシミュレーションの結果,個体識別には12座位以上のマイクロサテライト部位が必要と判明した,遺伝的構造の把握のために,2005年3月に採集した糞粒106サンプルを対象にミトコンドリアDNAコントロール領域の約400bpをダイレクトシーケンス法により塩基配列決定し,解析ソフトTCSで最節約法による樹形図作成及びNested Clade Analysisにより遺伝的構造の有無を分析した.44サンプルの解析ができ,14ハプロタイプを検出した.現在のところ地域間で顕著な遺伝的差異は認められず,近年までの全島的な遺伝的交流の可能性が示唆された.2006年2月に実施したサンプル収集では,調査した沢と林道の総数24ルート,発見した糞塊数401,採集サンプルの地点数89で,上記同様の分析を進めている.特定の林道(距離15km)での糞粒発見地点をGPSにより記録し,植生図などの既存のGISデータを用いて周辺環境の特徴を捉えた.自動カメラの設置地点のGPS地点も記録した.糞粒発見地点の周辺は照葉樹林が多いことが捉えられたが,本林道沿い自体照葉樹林が卓越しており,顕著な違いは捉えられなかったが,地形との関係を今後検討する.遺伝的手法を用いたアマミノクロウサギの個体数法を確立するために、捕獲i個体及び採集死体の計19個体(1996-2005年)を用いてノウサギのマイクロサテライト10座位の適用、PCR反応条件の確立、有効座位の確定と個体識別に必要な座位数をプログラムNoLocSimにて個体識別に必要な座位数の推定を検討した。19個体中古いサンプル以外の12個体でPCRに成功し、ノウサギの10マイクロサテライト座位中6座位が使用可能となり、最適PCR条件を確立できた。また、12個体の上記6座位で個体識別が可能だった。

さらにシミュレーションの結果、個体識別には12座位以上のマイクロサテライト部位が必要と判明した。遺伝的構造の把握のために、2005年3月に採集した糞粒106サンプルを対象にミトコンドリアDNAコントロール領域の約400bpをダイレクトシーケンス法により塩基配列決定し、解析ソフトTCSで最節約法による樹形図作成及びNested Clade Analysisにより遺伝的構造の有無を分析した。44サンプルの解析ができ、13ハプロタイプを検出した。現在のところ地域間で顕著な遺伝的差異は認められず、近年までの全島的な遺伝的交流の可能性が示唆された。2006年2月に実施した糞サンプル収集結果をGIS化した(調査した沢と林道の総数24ルート、発見した糞塊数401、採集サンプルの地点数89)。特に、特定の林道(距離15km)での糞粒発見地点をGPSにより記録し、植生図などの既存のGISデータを用いて周辺環境の特徴を捉えた。自動カメラの設置地点のGPS地点も記録した。糞粒発見地点の周辺は照葉樹林が多いことが捉えられたが、本林道沿い自体照葉樹林が卓越しており、顕著な違いは捉えられなかったが、地形との関係を今後検討する。遺伝的手法を用いたアマミノクロウサギの個体数法を確立するために,捕獲個体及び採集死体の計19個体(1996-2005年)を用いてノウサギのマイクロサテライト10座位の適用,PCR反応条件の確立,有効座位の確定と個体識別に必要な座位数をプログラムNoLocSimにて個体識別に必要な座位数の推定を検討した.19個体中古いサンプル以外の12個体でPCRに成功し,ノウサギの10マイクロサテライト座位中6座位が使用可能となり,最適PCR条件を確立できた.また,12個体の上記6座位で個体識別が可能だった.さらにシミュレーションの結果,個体識別には12座位以上のマイクロサテライト部位が必要と判明した.遺伝的構造の把握のために,2005年3月に採集した糞粒106サンプルを対象にミトコンドリアDNAコントロール領域の約400bpをダイレクトシーケンス法により塩基配列決定し,解析ソフトTCSで最節約法による樹形図作成及びNested Clade Analysisにより遺伝的構造の有無を分析した.44サンプルの解析ができ,13ハプロタイプを検出した.現在のところ地域間で顕著な遺伝的差異は認められず,近年までの全島的な遺伝的交流の可能性が示唆された.2006年2月に実施した糞サンプル収集結果をGIS化した(調査した沢と林道の総数24ルート,発見した糞塊数401,採集サンプルの地点数89).特に,特定の林道(距離15km)での糞粒発見地点をGPSにより記録し,植生図などの既存のGISデータを用いて周辺環境の特徴を捉えた.自動カメラの設置地点のGPS地点も記録した.糞粒発見地点の周辺は照葉樹林が多いことが捉えられたが,本林道沿い自体照葉樹林が卓越しており,顕著な違いは捉えられなかったが,地形との関係を今後検討する.