hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人間の感覚、特に臭気を考慮した新しい室内環境評価法の開発

本研究の目的は,シックハウス症候群(SBS)を来す室内空気の評価をする上で,揮発性有機化合物(VOCs)の総和であるケミレスTVOC(ΣVOCs)に加えて,主観的な「臭い」を客観的な指標として捉える試みである総臭気閾値比(TOTR)の有用性を検討することである。その結果1「臭い」という本来、主観的な感覚を客観的に評価できる可能性を明らかにし、2SBS症状に対するΣVOCs,TOTRの閾値として各400μg/m3および40という暫定的な値を提唱できた。また3TVOCのわが国の厚生労働省の暫定目標値である400μg/m3の妥当性に対して根拠となるデータを提唱、などの成果を得ることができた.平成25年度は7月と1月に千葉大学内ケミレスタウンの実験棟8か所で室内空気中の化学物質濃度測定を2回行いデータの解析をした。また、7月にはボランティア12人による室内体感評価試験を行い、室内空気中濃度・臭気強度と症状の関係の調査をした。化学物質濃度については、実験棟が竣工後6年を経過した時点での経年変化の考察を行ったところ、平成23年夏には実験棟内の室内空気中TVOC(総揮発性有機化合物)はそれぞれの実験棟で39μg/m3から610μg/m3とある程度まで減衰していたが、2年経過した平成25年の夏には243μg/m3から816μg/m3に上昇していた。なかでも特に(臭気閾値の低い)アルデヒド類は、平成23年7月では15μg/m3から39μg/m3であったのに対して平成25年7月には60μg/m3から269μg/m3と大きく上昇していた。体感評価試験では、なんらかの症状を訴える人は12人中3人であったが、においについては12人中9人が楽に感知できるあるいは強いにおいと回答した。これまで室内空気中の化学物質濃度は時間とともに減衰するものと考えられていたが、そうではない場合もあることが確認された。特にアルデヒド類は濃度が上昇していることが確認され、そのため室内の臭気が強くなっていると考えられる。発生源やなんらかの化学変化によるものなのかの追及が必要だが、エイジングだけでは室内空気中化学物質濃度を減衰できないことを認識する必要がある。また3TVOCのわが国の厚生労働省の暫定目標値である400μg/m3の妥当性に対して根拠となるデータを提唱、などの成果を得ることができた.平成24年度は、ケミレスタウン内の実験棟室内の空気質測定および述べ218名の健康なボランティアによる体感評価実験を3度行った。室内空気質測定については、これまで千葉大学予防医学センターで開発してきた宅配型簡易ポンプによる1時間のアクティブサンプリングを行い、併せてポンプの性能の検証も行った。体感評価試験については、空気質測定前後に、述べ218名のボランティアに依頼して、15分間の室内滞在後、アンケートを取る方法で行った。方法としては、まず全被験者からインフォームドコンセントを取得後、化学物質に対する敏感度を調べる問診、QEESI(Quick Environmental Exposure Inventory)試験を実施、その後、室内に15分間滞在し20分休憩後、別の部屋で15分滞在を行いそれぞれの部屋について臭気や症状を5段階から10段階に分けて記入していただいた。臭気については、ヒトの感覚によるもので、これまで数値であらわされることが進められてこなかったが、本実験では、室内の化学物質濃度をその化学物質の臭気閾値で除した数値を臭気閾値比として数値化する試みをおこなった。この臭気閾値比はこれまでのプレ実験からVOCと比例することがわかっており、臭気の数値化の検証はおこなっている。上記実験の結果、実証実験棟室内の総VOC(TVOC)は28μg/m3から18000μg/m3、TOTRは1から293でそれらの値は居室の構造材や内装材により違った。また、今回の体感評価試験の結果から、化学物質に対して感受性の高い人は、TVOC(総揮発性有機化合物)値が400μg/m3以上、またTOTR(総臭気閾値比)が40以上になると何らかの症状を訴えることがわかり、室内空気質の指標となりうることが明らかとなった。室内空気中には多くの化学物質が存在し、シックハウス症候群の主な原因はそれらの化学物質(揮発性有機化合物:VOC)と考えられている。そしてシックハウス症候群問題は原因物質がますます多様化しているにもかかわらず、実態把握が追いついていないのが現状である。そのため化学物質を総量で規制することや人の感覚である臭気を客観的に評価することなどの対策が必要となってきている。VOCの総量についてはISO16000-6で定義しているTVOC(総揮発性有機化合物)が

あるが、本研究においてはアルデヒド類と測定できるVOCすべてを加算したものをケミレスTVOC(ΣVOCs)とし、ケミレスTVOCとボランティアによる体感評価試験結果との関係を解析してきた。その結果、ケミレスTVOCがおよそ400μg/m3以上になれば、症状を訴える人は有意に増える、ということがわかった。さらにこの集団をQEESIによる問診によって、化学物質に対して感受性の高い集団とそうでない集団とに分けると、ケミレスTVOCが高いほど感受性の高い集団では顕著に症状があらわれることがわかった。臭気とシックハウス症候群については、これまでも密接な関係があると考えられてきた。そこで室内空気中の化学物質濃度をそれぞれの化学物質の嗅覚閾値濃度で除したOTR(Odor Threshold Ratio:臭気閾値比)およびTOTR(Total Odor Threshold Ratio:総臭気閾値比)を開発し、人の官能試験によらず臭気を数値化する試みをおこなった。その後、実証実験で得たデータを基に臭気とシックハウス症候群症状との関係の解析をしたところ、TOTRが40以上の場合、有意に症状と関係があることがわかった。また化学物質に対して感受性の高い人は、臭気についてもTOTRが高いほど症状が出ることが明らかになった。このことからVOC濃度が低い室内においても臭気閾値の低い物質の存在がシックハウス症候群を引き起こす可能性があることが示唆された。室内空気環境昨年度に引き続き、室内化学物質濃度の測定と体感評価を行い、データ解析を行った結果から化学物質の経年動向についての新しい知見やヒトの感覚である臭気強度と症状との関係が少しずつ明らかになってきた。今後さらなる解析を行うことで臭気から室内環境を評価し、シックハウス症候群を予防するための対策を構築することができると思われる。宅配型簡易ポンプが順調に作動し、1時間の空気サンプリングでも24時間サンプリングと変わらず結果がだせることが検証できたこと、室内空気中の化学物質濃度測定と体感評価試験が順調に進んだため、シックハウス症候群をひきおこす室内空気中の化学物質濃度または臭気濃度がわかってきたことなどから、研究の目標である「人間の感覚、特に臭気を考慮した新しい室内環境評価法の開発」の目途がみえてきた。1)一般住宅の室内空気測定および分析をさらに50件程度行う2)居住者に質問票による臭気および症状の調査を行い、室内空気環境(化学物質濃度及び臭気濃度、臭気強度)と自覚症状との関係を明らかにする。3)上記からシックハウス症候群を予防できる室内環境の指標を設定、予防対策の構築を試みる4)上記の結果を学会発表、論文発表として公表する1ケミレスタウンの実験棟内で内装材を変えた場合の室内空気中VOCがどうなるかを明らかにするため、継続して室内空気中VOCを81物質程度、測定する。2宅配型簡易ポンプでのポンプおよびサンプラー送付がスムースに行くことを確認した上で、関係者以外の、専門家ではない一般市民であっても空気捕集が可能かどうかを検証する。3ボランティアによる室内空気質の体感評価試験を継続し、千葉大学環境医学診療科にて診察を行い、VOCの濃度と症状との関係、臭気と症状との関係を明らかにする。4上記の研究結果より室内空気がどのような環境であればシックハウス症候群を予防できるかを明らかに新しい指標を設定し、予防対策システムを構築する当該年度において測定した物質の中の新規物質の同定および経時変動を観察するために時間がかかり、臭気閾値の測定依頼にいたらなかったため。
気候変動に伴う種の損失を補償する機能的冗長性の存在可能性の検証

さまざまな環境変動が、自然に存在する生物種の組み合わせ(群集)を改変することが予測されている。その結果、個々の群集の多様性により発揮される生態系機能が変質する可能性も考えられる。本研究では、知床国立公園の森林生態系を対象としたフィールド調査に基づき、生物多様性を評価することで、気候変動に伴う群集再構成のメカニズムと再構成に伴う生態系機能の変化の双方を解き明かした。しかしながら、群集の再構成後の生態系の機能性を推察することは容易ではない。本研究では、フィールド調査に基づき、「種多様性」と「機能的多様性」を評価することで、気候変動に伴う群集再構成のメカニズムと再構成に伴う生態系機能の変化の双方を解き明かす。対象とする知床世界自然遺産では、気候変動対応を迫られている。それゆえ、環境変動下で自然環境を恒久的かつ包括的に保全するための「生物多様性の多面性の意義」を問う。本研究では、分類群の枠を超えた機能群の組み合わせが、気候変動に伴い再構成されることによって、生態系の機能性にどのような変化が生じるのかをフィールド観測に基づき評価する。そのために、現地(知床国立公園)において、標高勾配に沿って調査区を設定する。各調査区において、多くの分類群にまたがる動植物の多様性のデータを取得し、さらには、全種の機能的特性のデータを取得する。これらを基にして、標高経度に伴う種多様性と機能的多様性の変化速度(β多様性)にミスマッチが生じるのかどうかを検証する。以上の研究計画に対して、対象地である知床国立公園の標高傾度に沿った森林性の多分類群の野外調査データの取得、各種の機能特性データの取得、群集の再構成の解析、英語論文の作成、学会発表、論文投稿までを行った。それゆえ、環境変動下で自然環境を恒久的かつ包括的に保全するための「生物多様性の多面性の意義」を問う.本研究では、分類群の枠を超えた機能群の組み合わせが、気候変動に伴い再構成されることによって、生態系の機能性にどのような変化が生じるのかをフィールド観測に基づき評価する。以上の研究計画に対して、対象地である知床国立公園の標高傾度に沿った森林性の多分類群の野外調査データの取得、各種の機能特性データの取得、群集の再構成の解析、英語論文の作成、学会発表、論文発表(印刷中)までを行った。本研究では、分類群の枠を超えた機能群の組み合わせが、気候変動に伴い再構成されることによって、生態系の機能性にどのような変化が生じるのかをフィールド観測にした。各調査区において、多くの分した。これらを基にして、標高経度に伴う種多様性と機能的多様性の変化速度(β多様性)にミスマッチが生じるのかどうかを検証した。以上の研究計画に対して、袋瀬要地である知床国立公園の標高傾度に沿った森林性の多分類群の野外調査データの取得、各種の機能特性データの取得、群集の再構成の解析、英語論文の作成、学会発表、論文発表までを行った。また、得られた成果のメディアリリースや新聞報道を通して、環境変動下での生物多様性と生態系機能の保全戦略についての意見を提示した。すでに学会発表と論文投稿を行った。

27年度が最終年度であるため、記入しない。生態系管理学今後は、さらなるデータ取得を重ねて、さらなる学術論文出版を目指す。すでに学会発表と論文投稿を行った。当該成果論文の出版に要するカラー印刷代を残しておいたが、出版の都合上4月にずれ込んだため27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、さらなるデータ取得を重ねて、さらなる学術論文出版を目指す。上記のカラー印刷の費用として使用する27年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周病原性細菌P.gingivalisの自然免疫逃避機構の解析

歯周病原細菌P.gingivalisの自然免疫からの逃避機構を検討するために、gingipain欠損株P.gingivalisからgingipainにより切断・不活化されるToll-like receptor(TLR)2、TLR4非依存性自然免疫活性化因子の精製、同定を試みた。まず、P.gingivalisのrgpA rgpB kgp遺伝子変異株KDP136を嫌気条件下で培養し、集菌後に低濃度の界面活性剤で菌体表層成分を遊離し、可溶化成分を抽出した。抽出物をイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画し、分画後の試料で、LPSやリポ蛋白等に非応答性のNF-κBレポーター細胞(7.19細胞)を刺激し、TLR2およびTLR4非依存性自然免疫細胞刺激活性を測定して活性画分をスクリーニングし、精製試料を得た。試料をSDS-PAGEにより解析したところ、123kDaのバンドが検出された。精製後の蛋白をマススペクトロメトリーにより解析したところ、P.gingivalis33277株ゲノムのORF PGNO748にコードされる蛋白であった。更に、P.gingivalisKDP136のORF PGNO748を、アンピシリン耐性遺伝子cepAに置換した変異株を作製し、7.19細胞を刺激したところ、NF-κBは活性化されなかった。これらの結果から、P.gingivalis gingipain欠損株の保有するgingipain感受性自然免疫活性化因子は、ORF PGNO748によってコードされていることが示された。gingipainによる、自然免疫活性化因子の切断・不活性化は、P.gingivalisの自然免疫からの逃避に、有利に作用しているものと考えられる。歯周病原性細菌P.gingivalisの自然免疫からの逃避機構を検討するために、gingipain欠損株P.gingIivalisからgingipainにより切断・不活化されるTLR2、TLR4非依存性の自然免疫活性化因子の精製、同定を試みた。まず、P.gingivalisのrgpA rgpB kgp遺伝子変異株KDP136を嫌気条件下で培養し、対数増殖期後期に集菌した。洗浄後に低濃度の界面活性剤で菌体表層成分を遊離させ、可溶化成分を抽出した。可溶化菌体表層成分をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、各画分で、LPSやリポ蛋白等に非応答性のNF-κBレポーター細胞(7.19細胞)を刺激し、TLR2およびTLR4非依存性自然免疫細胞刺激活性を測定して活性画分をスクリーニングし、粗精製試料を得た。上述の粗精製試料をトリプシンで処理すると活性は消失し、また熱処理によっても活性は消失した。このことから、この画分に含まれる自然免疫刺激活性は主に蛋白成分に由来するものと考えられた。また、この粗精製試料でヒト末梢血単核球を刺激するとIL-1βが産生され、IL1-βの産生は抗TLR2抗体および抗TLR4抗体の添加によって抑制されなかったが、抗CD14抗体の添加により部分的に抑制された。このことから、この粗精製試料はTLR2およびTLR4非依存性にNF-κBを活性化するが、CD14には部分的に依存性であることが明らかとなった。現在、この試料の精製をさらに進め、活性を保有する分子の同定を進めている。歯周病原性細菌P. gingivalisの自然免疫からの逃避機構を検討するために、gingipain欠損株P.gingivalisからgingipainにより切断・不活化されるTLR2、TLR4非依存性の自然免疫活性化因子の精製、同定を試みた。

まず、P.gingivalisのrgpA rgpB kgp遺伝子変異株KDP136を嫌気条件下で培養し、対数増殖期後期に集菌した。洗浄後に低濃度の界面活性剤で菌体表層成分を遊離させ、可溶化成分を抽出した。可溶化菌体表層成分をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、分画後のそれぞれの試料で、LPSやリポ蛋白等に非応答性のNF-κBレポーター細胞(7.19細胞)を刺激し、TLR2およびTLR4非依存性自然免疫細胞刺激活性を測定して活性画分をスクリーニングし、部分精製試料を得た。上述の粗精製試料をトリプシンで処理すると活性は消失し、また熱処理によっても活性は消失した。このことから、この分画に含まれる自然免疫刺激活性は蛋白性成分に由来するものと考えられた。また、この部分精製試料でヒト末梢血単核球を刺激するとIL-1βが産生され、IL-1βの産生は抗TLR2抗体および抗TLR4抗体の添加によって抑制されなかったが、抗CD14抗体の添加により部分的に抑制された。このことから、この部分精製試料はTLR2およびTLR4非依存性にNF-κBを活性化するが、CD14には部分的に依存性であることが明らかとなった。更に、部分精製された試料は、2次元電気泳動によって展開され、活性を示さない分画には認められず、活性を示す分画にのみに認められるスポットを検索した。このスポットのマススペクトロメトリー解析を行い、目的の分子候補とした。現在、部分精製試料に対する抗体を作成し、2次元電気泳動によって展開された試料のうち活性を保有するスポットの絞り込みを進めている。歯周病原性細菌P.gingivalisの自然免疫からの逃避機構を検討するために、gingipain欠損株P.gingivalisからgingipainにより切断・不活化されるToll-like receptor (TLR) 2、TLR4非依存性の自然免疫活性化因子の精製、同定を試みた。洗浄後に低濃度の界面活性剤で菌体表層成分を遊離し、可溶化成分を抽出した。可溶化菌体表層成分をイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画し、分画後のそれぞれの試料で、LPSやリポ蛋白等に非応答性のNF-κBレポーター細胞(7.19細胞)を刺激し、TLR2およびTLR4非依存性自然免疫細胞刺激活性を測定して活性画分をスクリーニングし、精製試料を得た。試料をSDS-PAGEにより解析したところ、123kDaのバンドが検出された。精製後の蛋白をマススペクトロメトリーにより解析したところ、P.gingivalis 33277株ゲノムにコードされるORF PGNO748であることが確認された。更に、P.gingivalis KDP136のORF PGNO748を、アンピシリン耐性遺伝子cepAに置き換えた変異株を作製し、7.19細胞を刺激したところ、KDP136凍結乾燥菌体は7.19細胞を活性化したのに対し、KDP136由来PGNO748欠損株凍結乾燥菌体は7.19細胞を活性化しなかった。これらの結果から、P.gingivalis gingipain欠損株の保有するgingipain感受性TLR2、TLR4非依存性自然免疫活性化因子は、ORF PGNO748によってコードされていることが示された。
サリン等の神経ガスの新規ターゲット酵素の探索に関する研究

本年度は、新規神経ガスターゲット酵素の探索のための神経ガス付加物の特異的検出法の開発を目的とし、神経ガス付加セリン残基を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体作製のための神経ガス付加(結合)セリン誘導体の合成を試みた。三塩化リンを出発物質として、モノホスホロアミダイトアルキルエステルをアルキルメチルホスホン酸骨格形成の原料として利用し、これをFmoc-セリンを出発原料として合成した保護セリン(Fmoc-Ser-OPac)と結合させることにより神経ガス付加セリンを合成するとともに、これを原料としてペプチド合成機によるペプチド鎖の伸長を行って目的物を得る合成ルートを計画した。Fmoc-セリン-OPacはFmoc-Ser-OHを原料とし、DCHA塩を経由する合成法により合成を行った。また、リン酸骨格の合成については、当初、ジクロロメチルホスフィンが市販品として入手可能と考えて実験計画を作成したが、輸入不可とのことで三塩化リンからの合成経路を検討した。その結果、十分なジクロロメチルホスフィンを得ることができず、合成方法を再検討する必要があると考えられた。そこで、入手可能な精製セリン酵素類に神経ガスを加えてセリン-神経ガス付加物を形成し、適切な酵素により消化し、HPLCによって精製することにより神経ガス結合セリン残基を含むペプチド断片を作成することを検討した。トリプシンに有機リン系化合物であるDFPを加えてすべての活性セリン残基にDFPを付加した後、還元アルキル化の後、トリプシン消化を行なった。消化物について、4.6mm径のC18逆相カラムを用いてHPLC分析を行ない、分画を取った上で、各画分にっいてLC-MS/MS分析を行ってDFP付加ペプチドの検出を行ない、目的ペプチドの精製を試みた。その結果、目的ペプチドの含有はLC-MS分析で確認されたものの、それ以外のペプチドと分離できず、純粋なDFP付加ペプチドを精製するのは困難であると考えられた。
敗血症多臓器不全のRNA干渉を用いた遺伝子治療と薬理学的病態解明

敗血症性ショックおよび多臓器不全は,敗血症患者の致死的な原因とされている.細胞アポトーシスは敗血症の病態機構に重要な役割を演じているかもしれない.デス受容体が刺激されるとアダプター蛋白であるFADDがれクルーとされ,caspase-8が活性化され,アポトーシス・カスケードの"effector"プロテアーゼであるcasapase-3が活性化されアポトーシスが進行する.合成した短鎖干渉RNA(siRNA)は,RNA干渉により特異的に遺伝子発現を抑制する.そこで,多菌性敗血症のマウスモデルを用いて,caspase-8/caspase-3siRNAsおよびFADD siRNAの治療効果を検討した.多菌性敗血症はBALB/cマウスを回盲部結紮・穿孔により腹膜炎を起こさせ誘発した(CLP),生体内へのsiRNAデリバーは,CLP後10時間にtransfection reagent(Lipofectamine 2000)を用いて行った.ネガティヴ・コントロールとしてノンセンスsiRNAを投与したマウスを用いた.Caspase-8/caspase-3あるいはFADDのsiRNAs処置により,敗血症大動脈,心臓および肺組織にみられるDNAラダー形成やTUNEL陽性細胞の出現は妨げられた,さらに,著明な炎症所見は,これらのsiRNAs投与により改善した.CLPにより通常は2日以内で死亡したが,caspase-8/caspase-3あるいはFADD siRNAsで処置しておくとCLP施行後の生存率は著名に改善した.以上より,siRNAsでのFADDあるいはcaspase-8とcaspase-3の遺伝子を封じることが多菌性敗血症に対して顕著な防御作用を示すことが明らかとなった.本siRNAsでの敗血症に対する遺伝子治療は非常に有用である可能性が示唆された.敗血症性ショックおよび多臓器不全は,敗血症患者の致死的な原因とされている.細胞アポトーシスは敗血症の病態機構に重要な役割を演じているかもしれない.デス受容体が刺激されるとアダプター蛋白であるFADDがれクルーとされ,caspase-8が活性化され,アポトーシス・カスケードの"effector"プロテアーゼであるcasapase-3が活性化されアポトーシスが進行する.合成した短鎖干渉RNA(siRNA)は,RNA干渉により特異的に遺伝子発現を抑制する.そこで,多菌性敗血症のマウスモデルを用いて,caspase-8/caspase-3siRNAsおよびFADD siRNAの治療効果を検討した.多菌性敗血症はBALB/cマウスを回盲部結紮・穿孔により腹膜炎を起こさせ誘発した(CLP),生体内へのsiRNAデリバーは,CLP後10時間にtransfection reagent(Lipofectamine 2000)を用いて行った.ネガティヴ・コントロールとしてノンセンスsiRNAを投与したマウスを用いた.Caspase-8/caspase-3あるいはFADDのsiRNAs処置により,敗血症大動脈,心臓および肺組織にみられるDNAラダー形成やTUNEL陽性細胞の出現は妨げられた,さらに,著明な炎症所見は,これらのsiRNAs投与により改善した.CLPにより通常は2日以内で死亡したが,caspase-8/caspase-3あるいはFADD siRNAsで処置しておくとCLP施行後の生存率は著名に改善した.以上より,siRNAsでのFADDあるいはcaspase-8とcaspase-3の遺伝子を封じることが多菌性敗血症に対して顕著な防御作用を示すことが明らかとなった.本siRNAsでの敗血症に対する遺伝子治療は非常に有用である可能性が示唆された.敗血症性ショックおよび多臓器不全は,敗血症患者の致死的な原因とされている.血管内皮細胞のアポトーシスは敗血症の病態機構に重要な役割を演じているかもしれない.Caspase-8はデス受容体を介したアポトーシス回路の先端にあると考えられており,一方casapase-3はアポトーシス・カスケードの"eifector"プロテアーゼであるとされている.合成した短鎖干渉RNA(siRNA)は,RNA干渉により特異的に遺伝子発現を抑制する.そこで,平成18年度では,多菌性敗血症のマウズモデルを用いて,caspase-8/caspase-3siRNAsの治療効果を検討した.多菌性敗血症はBALB/cマウスを回盲部結紫・穿孔により腹膜炎を起こさせ誘発した(CLP).生体内へのsiRNAデリバリーは,CLP後10時間にtransfectionreagent (Lipofectamine2000)を用いて行った.ネガティヴ・コントロールとしてノンセンスsiRNAを投与したマウスを用いた. Caspase-8/caspase-3siRNAs投与により,大動脈において敗血症誘発により著明に増加したcaspase-8とcaspase-3の発現は強く抑えられた.このsiRNAs処置により,敗血症大動脈にみられるDNAラダー形成やプロアポトーシス蛋白Badのリン酸化の低下は妨げられた.電顕像において,敗血症大動脈での内皮細胞の形態学的異常は,caspase-8/caspase-3siRNAs投与により改善した.CLPにより通常は2日以内で死亡したが,caspase-8/caspase-3siRNAsで処置しておくと全例CLP施行後も7日以上生存した.本年度の研究により,siRNAsでのcaspase-8とcaspase-3の遺伝子を封じることが多菌性敗血症に対して顕著な防御作用を示すことが明らかとなった.

さらに,血管内皮細胞アポトーシスを防ぐことが,少なくとも部分的には,敗血症に対する本siRNAsの効果を脱明するかもしれないことが示唆された.敗血症性ショックおよび多臓器不全は,敗血症患者の致死的な原因とされている.細胞アポトーシスほ敗血症の病態機構に重要な役割を演じているかもしれない.デス受容体が刺激されるとアダプター蛋白であるFADDがれクルーとされ, caspase-8が活性化され,アポトーシス・カスケードの"effector"プロテアーゼであるcasapase-3が活性化されアポトーシスが進行する.合成した短鎖干渉RNA(siRNA)は, RNA干渉によ.り特異的に遺伝子発現を抑制する.そこで,多菌性敗血症のマウスモデルを用いて,caspase-8/caspase-3siRNAsおよびFADD siRNAの治療効果を検討した.多菌性敗血症はBALB/cマウスを回盲部結紮・穿孔により腹膜炎を起こさせ誘発した(CLP).生体内へのsiRNAデリバリーは, CLP後10時間にtransfection reagent(Lipofectamine 2000)を用いて行った.ネガティヴ・コントロールとしてノンセンスsiRNAを投与したマウスを用いた.Caspase-8/caspase-3あるいはFADDのsiRNAs処置により,敗血症大動脈,心臓および肺組織にみられるDNAラダー形成TUNEL陽性細胞の出現は妨げられた.さらに,著明な炎症所見は,これらのsiRNAs投与により改善した. CLPにより通常は2日以内で死亡したが,caspase-8/caspase-3あるいはFADDsiRNAsで処置しておくとCLP施行後の生存率は著名に改善した.以上より, siRNAsでのFADDあるいはcaspase-8とcaspase-3の遺伝子を封じることが多菌性敗血症に対して顕著な防御作用を示すことが明らかとなった.本siRNAsでの敗血症に対する凄伝子治療は非常に有用である可能性が示唆された.
過酷な培養環境に応答した細胞由来因子群による骨再生法

われわれは培養骨髄間質細胞多血小板血漿複合体による骨再生法に取り組み,基礎から臨床まで研究成果を収めてきた.そのなかで培養細胞は低酸素,低栄養といった環境で飢餓状態になると血管新生などに有効なサイトカイン類を放出することがわかった.つまり細胞は環境に反応して自己生存に有利な因子群を放出するのである.そこで培養環境を任意に設定することで合目的性のあるサイトカインや細胞外基質類を含む上清を得ることができると考えられる.研究の全体構想は,過酷な環境下で幹細胞を培養し,その上清中因子群を適用することにより,大量の骨再生を可能にし,顎骨区域欠損の再建を,さらにその製剤化も目指すことである.研究の目的は,組織欠損部の環境を調整し,組織を再生させるのに最適な細胞由来因子群を得るための培養条件と,生体内で実際に組織再生を誘導するのに最適な投与方法を求めることであった.本年度は上清中因子群の局所投与法,徐放性担体による投与法について検討した.細胞種は骨髄間葉系幹細胞,歯髄幹細胞とし,培養条件は酸素分圧,栄養,pH,機械的ストレスについて,生体にとって過酷な環境,組織破壊が起きる環境を想定して設定した.培養終了後,無血清培地でさらに48時間培養し,それを遠心分離することによりその上清を得た.培養上清の組成を明らかにするために,その中に含まれるタンパク質をマススペクトロメトリーにより網羅的に解析して同定し,その機能面からさらに種類を絞ってELISAで発現を確認し定量した.またその遺伝子発現について,培養終了後の細胞からRNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにて解析した.培養上清の担体としてコラーゲン,リン酸カルシウムなどの許認可材料のほか,プラズマにより表面加工処理を施したチタンを用いた.この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで,骨形成を期待し検討した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の全体構想は過酷な環境下で幹細胞を培養し,その上清中因子群を適用することにより,大量の骨再生を可能にし,顎骨区域欠損の再建を,さらにその製剤化も目指すことであった.そしてその目的は細胞が環境に反応して自己生存に有利な因子群を放出することを利用して,組織欠損部の環境を調整し,組織を再生させるのに最適な細胞由来因子群を得るための培養条件と,生体内で実際に組織再生を誘導するのに最適な投与方法を求めることであった.本年度は幹細胞培養上清の調製条件の探索を中心に進めた.幹細胞培養上清は,所定の手続きを経て得たヒト細胞を培養して調製した.細胞種は骨髄間葉系幹細胞,歯髄幹細胞とした.培養条件は酸素分圧,栄養,pH,機械的ストレスについて,生体にとって過酷な環境,組織破壊が起きる環境を想定して設定した.培養終了後,無血清培地でさらに48時間培養し,それを遠心分離することによりその上清を得た.培養上清の組成を明らかにするために,その中に含まれるタンパク質をマススペクトロメトリーにより網羅的に解析して同定し,その機能面からさらに種類を絞ってELISAで発現を確認し定量した.またその遺伝子発現について,培養終了後の細胞からRNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにて解析した.培養細胞の種類,分化度と前述の培養条件を変数とし,求めるものをM1とM2の各マクロファージ,骨と血管を中心に組織再生に関連するタンパク質発現,遺伝子発現,細胞増殖能,細胞遊走能,動員される細胞の種類と動態,再生組織の範囲と密度としてin vivoで解析を進め,in vitroでは細胞増殖および遊走アッセイ,RT-PCR,ウェスタンブロッティング,管腔形成アッセイにより,組織再生に最適な因子群を含む培養上清を得るための条件を明らかにした.本年度は幹細胞培養上清の調製条件についてあらためて検討した.幹細胞培養上清の調製とその機能解析の手法はそれを扱ったわれわれの既報に準じた.機能解析もその既報で示したデータを活かし,それを補完できるように項目を設定したため効率的に研究を進めることができた.本研究の全体構想は,過酷な環境下で幹細胞を培養し,その上清中因子群を適用することにより,大量の骨再生を可能にし,顎骨区域欠損の再建を,さらにその製剤化も目指すことであった.そのために本研究の目的は,細胞は環境に反応して自己生存に有利な因子群を放出することを利用して,組織欠損部の環境を調整し,組織を再生させるのに最適な細胞由来因子群を得るための培養条件と,生体内で実際に組織再生を誘導するのに最適な投与方法を求めることであった.本年度は上清中因子群の局所投与法,徐放性担体による静的投与法について検討した.幹細胞培養上清の調製とその機能解析の手法はそれを扱ったわれわれの既報に準じた.所定の手続きを経て得た間葉系幹細胞を培養して上清を調製した.培養条件は酸素分圧,栄養,pH,機械的ストレスについて,生体にとって過酷な環境,組織破壊が起きる環境を想定して設定した.培養終了後,無血清培地でさらに48時間培養し,それを遠心分離することによりその上清を得た.培養上清の組成を明らかにするために,その中に含まれるタンパク質をマススペクトロメトリーにより網羅的に解析して同定し,その機能面からさらに種類を絞ってELISAで発現を確認し定量した.またその遺伝子発現について,RNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにて解析した.培養上清の組成を模した成長因子の混合物が骨再生に有効であることを示し,製剤化への手がかりをつかんだ.

また培養上清の担体としてコラーゲン,リン酸カルシウムなどの承認済み材料のほか,プラズマにより表面加工処理を施したチタンを用いた.この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで,また上記の材料と組み合わせることで,これらが顎骨区域欠損部でも骨形成を期待し得る再建材料となることを検討している.前年度までに検討した幹細胞培養上清の調製条件や生体内適用条件を補完できるように項目を設定し,既報で示したデータを活かすことができたため,効率的に研究を進めることができた.われわれは培養骨髄間質細胞多血小板血漿複合体による骨再生法に取り組み,基礎から臨床まで研究成果を収めてきた.そのなかで培養細胞は低酸素,低栄養といった環境で飢餓状態になると血管新生などに有効なサイトカイン類を放出することがわかった.つまり細胞は環境に反応して自己生存に有利な因子群を放出するのである.そこで培養環境を任意に設定することで合目的性のあるサイトカインや細胞外基質類を含む上清を得ることができると考えられる.研究の全体構想は,過酷な環境下で幹細胞を培養し,その上清中因子群を適用することにより,大量の骨再生を可能にし,顎骨区域欠損の再建を,さらにその製剤化も目指すことである.研究の目的は,組織欠損部の環境を調整し,組織を再生させるのに最適な細胞由来因子群を得るための培養条件と,生体内で実際に組織再生を誘導するのに最適な投与方法を求めることであった.本年度は上清中因子群の局所投与法,徐放性担体による投与法について検討した.細胞種は骨髄間葉系幹細胞,歯髄幹細胞とし,培養条件は酸素分圧,栄養,pH,機械的ストレスについて,生体にとって過酷な環境,組織破壊が起きる環境を想定して設定した.培養終了後,無血清培地でさらに48時間培養し,それを遠心分離することによりその上清を得た.培養上清の組成を明らかにするために,その中に含まれるタンパク質をマススペクトロメトリーにより網羅的に解析して同定し,その機能面からさらに種類を絞ってELISAで発現を確認し定量した.またその遺伝子発現について,培養終了後の細胞からRNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにて解析した.培養上清の担体としてコラーゲン,リン酸カルシウムなどの許認可材料のほか,プラズマにより表面加工処理を施したチタンを用いた.この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで,骨形成を期待し検討した.マウスあるいはラットの頭蓋骨欠損モデルに培養上清を含む担体を適用して,形成された組織を組織学的,X線学的に,また多重免疫組織化学法にて評価する.細胞動態は,体外で蛍光標識した細胞を体内に導入し,組織再生の場に遊走する様相をインビボイメージングシステムにより評価する.さらに再生組織における血管網構築について血流画像解析装置で評価する.上清中因子群の局所投与法について検討する.徐放性担体による静的投与法では培養上清の担体としてコラーゲン,リン酸カルシウムなどの許認可材料のほか,プラズマにより表面加工処理を施したチタンを用いる.培養上清中の因子や基質のチタン表面への親和性を高めることを目的とした共同研究を学内の工学博士らと進めてきており,これによりインプラント周囲に著しい骨化促進効果を示す結果が得られている.この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで,また上記の材料と組み合わせることで,これらが顎骨区域欠損部でも骨形成を期待し得る再建材料となる可能性がある.
培養システムを用いた着床機序の研究-不妊症への応用

初期胚着床の詳細な検討を細胞培養系を用いて行った。初期胚はヒト、家兎を用い、着床の場としてそれぞれの子宮内膜を培養し静置しその後の胚発育を経時的に検討した。1.生体外で月経直後の内膜再生を再現できた。2.不妊症患者から得た内膜を体外で患者本人の血清存在下で培養できた。3.家兎子宮内膜培養系で着床現象を正確に再現できた。4.初期胚着床にはカルシウムとラミニンが必要であった。5.着床の場を規定する脱落膜空間を考えると着床現象の理解の手助けになるものと考えられた。6.初期胚の絨毛細胞には特異的なコラゲナーゼ活性が存在し、この活性の変化によって子宮内膜内での絨毛細胞の振舞いが制御される可能性が示唆された。7.初期胚の着床のプロセス、その後の胚発育も培養系で正確に再現された。以上のことから、培養システムは着床機序のさらなる解明につながるものと思われる。また、本システムを利用した研究は不妊症治療時にカルシウムや細胞外成分(とくにラミニン)の臨床応用を示唆するものと思われた。平行培養(不妊症患者から得た内膜培養システム)は治療周期の治療の正否を予測できるものとして今後不妊症治療に利用できるシステムと思われた。今後、着床部位の検討、ICMの着床との関連、ヒト着床過程の経時的観察などが本システムで再現、研究可能であると考えられた。本年度は手術により摘出された子宮組織を細胞外成分(コラ-ゲン、ヒイブロネクチン、ラミニン等)の抗体を持ちいて染色し、正常子宮内膜の月経周期に依存した細胞外成分の発現の変化を明かにした。この結果より培養条件下で完全な子宮内膜再構成が可能になり、以下の新しい知見が得られた。1)子宮内膜に存在するコラ-ゲンは月経周期とともに周期的な変化を示し、着床準備状態を築き上げることが明かになった。着床期は内膜上皮下層の基底膜成分にIV型、V型コラ-ゲンが染色されラミニンとともに着床初期の初期胚接着の重要な因子になるものと思われた。2)不妊症患者の治療前周期の内膜を患者の了解を得てバイオプシ-し採取し体外で培養した。その後治療周期まで培養を継続し、治療周期に実際の患者血清を用いて培養した。その結果着床にとって効果的な内膜像とは、腺管開口部が均等に配列すること、腺管の占める割合が一定程度以下であること、腺管開口部の面績もまた着床現象に関与していることが判明した。3)着床期に働くステロイドホルモンの検討では、黄体期のプロゲステロンは内膜上皮の形態、機能発現に重要であること以外にも、内膜間質とも相互作用し、腺管の間質内に占める割合を制抑していることが判明した。以上の結果より我々が開発した子宮内膜培養システムは着床初期の初期胚一内膜相互作用解明のための基礎的な実験システムとして、また妊娠初期の着床の維持機構の優れた研究手段になるものと思われる。2.不胚症患者から得た内膜を体外で患者本人の血清存在下で培養できた。

7.初期胚の着床のプロセス、その後の胚発育も培養系で正確に再現された。以上のことから、培養システムは着床機序のさらなる解明につながるものと思われる。また、本システムを利用した研究は不妊症治療時にカルシウムや細胞外成分(とくにラミニン)の臨床応用を示唆するものと思われた。平行培養(不妊症患者から得た内膜培養システム)は治療周期の治療の正否を予測できるものとして今後不妊症治療に利用できるシステムと思われた。今後、着床部位の検討、ICMの着床との関連、ヒト着床過程の経時的観察などが本システムで再現、研究可能であると考えられた。
多剤耐性細菌のVI型分泌機構を標的とした抗菌薬の開発

高度に進化を遂げた多剤耐性菌のモデルとしてAcinetobacter baumannii(Ab)に注目し、国内医療機関から収集した株のゲノム解析を行った。大規模な比較解析の結果、Ab流行株ST2株に特異的に存在するDNA領域にVI型分泌機構(T6SS)依存的に分泌する抗菌エフェクターTseXとその抗菌活性を阻害する免疫タンパク質TsiXをコードする遺伝子対を発見した。SNPを用いた系統樹解析から、ST2株は複数のcladeに細分類可能で、tseXとtsiX遺伝子のオペロンがコードされたDNA領域はclade毎で多様性があり、個々のエフェクターは異なる抗菌活性を有していることが明らかとなった。高度に進化を遂げた多剤耐性菌のモデルとしてアシネトバクター・バウマニ(Ab: Acinetobacter baumannii)に注目し、国内医療機関から臨床分離されたAb流行株と非流行株を含む133株のゲノム配列をIllumina社およびRoche社のパイロシークエンサーを用いて解読した。さらに国外医療機関のAb臨床分離株の配列データを加えた213株の大規模な比較ゲノム解析を行った。Ab流行株のゲノム配列をリファレンスに用いたBLASTatlas解析から、Ab流行株に特異的に存在するDNA領域にVI型分泌機構(T6SS)依存的に分泌する抗菌エフェクターTseXとその抗菌活性を阻害する免疫タンパク質TsiXをコードする遺伝子対を発見した。これらの遺伝子産物に類似のアミノ配列を有するホモログタンパク質はGenBankデータベース上には存在せず、TseXは新規の抗菌エフェクターであると推測された。TseXを大腸菌の細胞質に発現させても増殖阻害は観察されないが、TseXのN末端側にOXA-51型β-ラクタマーゼ由来のSec系分泌シグナルペプチドを融合させたPeri-TseXを発現させると大腸菌は2時間以内に死滅した。また、TsiXの共発現によってPeri-TseXの抗菌効果は顕著に阻害された。TseXの立体構造予測から、細胞壁溶解酵素であるムラミダーゼに類似したドメイン構造を発見した。同酵素の活性部位に存在するヒスチジン残基をアラニンに置換したPeri-TseX-HA変異体は大腸菌に対する抗菌活性を顕著に失った。Ab流行株を大腸菌などのグラム陰性菌と共培養すると競合菌は速やかに死滅したが、Ab流行株は黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌とは競合しなかった。以上の結果から、TseXはT6SSを介して競合するグラム陰性菌のペリプラズムに注入され、細胞壁を標的とすることが示唆された。高度に進化を遂げた多剤耐性菌のモデルとしてアシネトバクター・バウマニ(Ab: Acinetobacter baumannii)に注目し、国内医療機関から臨床分離されたAb流行株ST2株とそれ以外の株を合わせて133株のゲノム配列を次世代シークエンサーを用いて解読した。さらに海外医療機関の臨床分離株を加えた213株の大規模な比較ゲノム解析を行った。Ab ST2株のゲノム配列をリファレンスに用いたBLASTatlas解析から、Ab ST2株に特異的に存在するDNA領域にVI型分泌機構(T6SS)依存的に分泌する抗菌エフェクターTseXとその抗菌活性を阻害する免疫タンパク質TsiXをコードする遺伝子対を発見した。SNPを用いた系統樹解析から、Ab ST2株は5つのcladeに細分類可能で、tseXとtsiX遺伝子のオペロンがコードされたDNA領域はclade毎で多様性があり、個々のエフェクターは異なる抗菌活性を有していることが明らかとなった。また、国内医療機関から臨床分離された緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の多剤耐性株20株とGenBankに登録された緑膿菌の海外臨床分離株についてゲノム解析を行い、T6SS抗菌エフェクターTse1とその免疫タンパク質Tsi1はほとんど全ての菌株に保存されていることを確認した。そのため、Tse1-Tsi1複合体は緑膿菌に対する抗菌薬開発のよい標的と考えられ、in silicoスクリーニングにて阻害化合物候補を同定した。また、緑膿菌流行株ST235株に特異的に存在するDNA領域に新規T6SSエフェクターの候補と思われる遺伝子を発見した。BLASTによるホモロジー解析では、同遺伝子は緑膿菌流行株でのみ存在することから、流行株の迅速な診断法にも応用可能であり、ST235株を標的とした抗菌薬開発ではよい標的となることが予想された。高度に進化を遂げた多剤耐性菌のモデルとしてアシネトバクター・バウマニ(Ab: Acinetobacter baumannii)に注目し、国内医療機関から収集した152株のゲノム解析を行った。さらに公共データベース(PATRIC)から海外医療機関由来の150株のゲノム配列を加え、計302株を用いた大規模な比較ゲノム解析を行った。Ab流行株ST2株の完全ゲノム配列をリファレンスに用いたBLASTatlas解析から、Ab流行株ST2株に特異的に存在するDNA領域にVI型分泌機構(T6SS)依存的に分泌する抗菌エフェクターTseXとその抗菌活性を阻害する免疫タンパク質TsiXをコードする遺伝子対を発見した。SNPを用いた系統樹解析から、Ab ST2株は複数のcladeに細分類可能で、tseXとtsiX遺伝子のオペロンがコードされたDNA領域はclade毎で多様性があり、個々のエフェクターは異なる抗菌活性を有していることが明らかとなった。

また、国内医療機関または農場から分離された緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)40株とGenBankに登録された緑膿菌の海外臨床分離株について比較ゲノム解析を行い、T6SS抗菌エフェクターTse1とその免疫タンパク質Tsi1はほとんど全ての菌株に保存されていることを確認した。そのため、Tse1-Tsi1複合体は緑膿菌に対する抗菌薬開発のよい標的と考えられ、in silicoスクリーニングを経て、阻害化合物候補を同定した。さらに緑膿菌流行株ST235株に特異的に存在するDNA領域に新規のT6SSエフェクター候補遺伝子を発見した。BLASTによるホモロジー解析では、同遺伝子は緑膿菌流行株でのみ存在することから、流行株の迅速な診断法にも応用可能であり、ST235株を標的とした抗菌薬開発ではよい標的となることが予想された。高度に進化を遂げた多剤耐性菌のモデルとしてAcinetobacter baumannii(Ab)に注目し、国内医療機関から収集した株のゲノム解析を行った。大規模な比較解析の結果、Ab流行株ST2株に特異的に存在するDNA領域にVI型分泌機構(T6SS)依存的に分泌する抗菌エフェクターTseXとその抗菌活性を阻害する免疫タンパク質TsiXをコードする遺伝子対を発見した。SNPを用いた系統樹解析から、ST2株は複数のcladeに細分類可能で、tseXとtsiX遺伝子のオペロンがコードされたDNA領域はclade毎で多様性があり、個々のエフェクターは異なる抗菌活性を有していることが明らかとなった。初年度2013年度の目標はAb臨床分離株が有するT6SS抗菌エフェクターと免疫タンパク質の同定で、2014年度からは緑膿菌臨床分離株が有するT6SS抗菌エフェクターと免疫タンパク質も抗菌薬開発の標的に加えた。現在までにAbでは同菌種に広く保存されたT6SS抗菌エフェクターは研究代表者の解析も含めて同定されていないが、緑膿菌では同菌種で広く保存された抗菌エフェクターと免疫タンパク質が複数対存在することが報告されていた。そのため、緑膿菌に対する抗菌薬開発の標的として、同菌種に広く保存されている遺伝子を標的として選ぶことが可能であった。研究代表者による検討から、T6SS抗菌エフェクターTse1とその免疫タンパク質Tsi1は日本を含む世界の医療機関で臨床分離されたほとんど全ての緑膿菌株に保存されていたことから、緑膿菌に対する抗菌薬開発のよい標的と考えられた。Tse1-Tsi1複合体は既に高分解能のタンパク質複合体の立体構造が報告済みであったことから、Tsi1のTse1活性部位に対する結合ポケットを標的としてin silicoの化合物スクリーニングを行うことが可能であった。一般的に緑膿菌は外膜の排出ポンプの活性が強いため、最終年度2015年度は、まず分子量500以下の低分子量の阻害化合物候補を中心に緑膿菌の生菌を直接用いてin vitroのスクリーニングを進める予定である。緑膿菌流行株ST235株においては、同株に特異的に存在するT6SS抗菌エフェクター候補遺伝子も同定しており、2015年度中に可能な限り検討を進める。そのため、本研究はおおむね順調に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。細菌学2014年度に確認した緑膿菌のT6
喫煙による急性好酸球性肺炎の病態解明と血清診断マーカーの確立

喫煙により急性好酸球性肺炎(acute eosinophilic pneumonia : AEP)が発症することから、煙草煙懸濁液による肺胞マクロファージからのTARC/CCL17産生を解析した。気管支肺胞洗浄法により採取した肺胞マクロファージを煙草煙懸濁液で刺激し、培養上清中のTARC/CCL17値を測定した。その結果、培養上清中のTARC/CCL17値は刺激群、非刺激群で差を認めなかった。煙草煙懸濁液の濃度を上昇させると肺胞マクロファージの死細胞比率が増加した。以上の結果より煙草煙懸濁液が肺胞マクロファージからのTARC産生を亢進させることはないと結論した。II.急性好酸球性肺炎の血清診断マーカーの確立喫煙により急性好酸球性肺炎(acute eosinophilic pneumonia : AEP)が発症することから、煙草煙懸濁液による肺胞マクロファージからのTARC/CCL17産生を解析した。II.急性好酸球性肺炎の血清診断マーカーの確立また、喫煙によるTARC産生メカニズムを検討するため、煙草煙懸濁液により肺胞マクロファージあるいは樹状細胞からのTARC産生を解析中である。肺胞マクロファージは気管支肺胞洗浄法により、また樹状細胞は末梢血単球をIL-4,GM-CSFの存在下で培養し、採取し、煙草煙懸濁液で刺激した培養上清中のTARC値を解析中である。II.急性好酸球性肺炎の血清診断マーカーの確立
蛋白質分子の立体構造形成と機能発現のメカニズム

球状タンパク質(α-ラクトアルブミン,リゾチーム,リボヌクレアーゼA,トリプトファン合成酵素α-サブユニットなど),膜結合性タンパク質(哺乳類臓器チトクロムP-450,光合成細菌の反応中心など)のアミノ酸配列に対応する遺伝子の組換えをさらに進め,多種の変異タンパク質を調製することに成功した.変異型と野生型との相当する蛋白質の反応活性の比較を行うとともに,物性,立体構造を詳細に調べ,当該タンパク質の構造・機能相関について多くの知見を得た.このようなタンパク質における立体構造形成と機能発現のメカニズムの研究において,類縁タンパク質のX線結晶解析の結果に基づく当該タンパク質の全原子座標を駆使したコンピュータ・グラフィクスの手法が極めて有効であることを確認した.示差走査微小熱量計,種々の超高感度分光システム,超高速分光システム,立体構造解析ソフトウェア,コンピュータ・グラフィクスソフトウェアなどを開発し,上記の球状タンパク質や膜結合性タンパク質の立体構造形成と機能発現メカニズムの解析を高度に精密化することに成功した.これらの構造・物性・機能のデータを蓄積し,種々の遺伝子上に書きこまれたタンパク質のドメイン構造やモジュール構造を解析した.この手法は次第に単純な構造のタンパク質から複雑な構造のタンパク質へと適用対象を着実に展開していくことにも成功した.理論的な研究対象は比較的小さな分子量のタンパク質に限られていたが,計算機シミュレーションによるタンパク質の立体構造形成予知は確実さを増すと共に, NMRによるデータの補完によりよい実験的補正も試みられ,充分に実用に供せられるようになってきた.一般的に拡張できるいくつかのタンパク質高次構造予知の理論も提案された.実験的にも理論的にも飛躍的進歩がみられたことに感謝している.球状タンパク質(α-ラクトアルブミン,リゾチーム,リボヌクレアーゼA,トリプトファン合成酵素α-サブユニットなど),膜結合性タンパク質(哺乳類臓器チトクロムP-450,光合成細菌の反応中心など)のアミノ酸配列に対応する遺伝子の組換えをさらに進め,多種の変異タンパク質を調製することに成功した.変異型と野生型との相当する蛋白質の反応活性の比較を行うとともに,物性,立体構造を詳細に調べ,当該タンパク質の構造・機能相関について多くの知見を得た.このようなタンパク質における立体構造形成と機能発現のメカニズムの研究において,類縁タンパク質のX線結晶解析の結果に基づく当該タンパク質の全原子座標を駆使したコンピュータ・グラフィクスの手法が極めて有効であることを確認した.示差走査微小熱量計,種々の超高感度分光システム,超高速分光システム,立体構造解析ソフトウェア,コンピュータ・グラフィクスソフトウェアなどを開発し,上記の球状タンパク質や膜結合性タンパク質の立体構造形成と機能発現メカニズムの解析を高度に精密化することに成功した.これらの構造・物性・機能のデータを蓄積し,種々の遺伝子上に書きこまれたタンパク質のドメイン構造やモジュール構造を解析した.この手法は次第に単純な構造のタンパク質から複雑な構造のタンパク質へと適用対象を着実に展開していくことにも成功した.理論的な研究対象は比較的小さな分子量のタンパク質に限られていたが,計算機シミュレーションによるタンパク質の立体構造形成予知は確実さを増すと共に, NMRによるデータの補完によりよい実験的補正も試みられ,充分に実用に供せられるようになってきた.一般的に拡張できるいくつかのタンパク質高次構造予知の理論も提案された.実験的にも理論的にも飛躍的進歩がみられたことに感謝している.