hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
九州地区での強風割増係数情報に関する広域高密度データベースの構築

データとの対応比較を目的にした福岡市今宿地区と、台風9918号による強風分布状況把握を目的にした熊本県松合地区(宇土半島)の実地形模型を用いて風洞実験を行った。いずれも地表面30100m程度の風速分布を計測した。今宿地区の模型実験では、通常の境界層流れを用いた風速計測値は実測結果に基づく風速特性との対応が悪いことがわかった。これは縮小模型や風洞風速との関係で制限されるために起こるいわゆる相似則の不一致に起因するものと思われるが、風洞実験では直接的にこの問題を解決できないことは広く知られている問題である。そこで本研究では上流側にドライアイスを置くことで接近流の下層安定性を強化して計測を行ったところ、平均風速や乱れの強さに対する風向特性について、風洞実験結果をNeWMeK実測結果にほぼ対応させることができた。この実験計測法を、台風9918号によって大きな被害が出た宇土半島の地形模型に適用して松合地区山地部の風速特性を検証した。実験結果は宇土半島の谷筋方向と台風9918号の主風向が一致することで風速値が増大する傾向があることを示した。これは現地での風倒木状況との対比から見ても妥当な結果であることが分かった。以上の結果は、NeWMeK観測地点がない、すなわち実測データがない地点での風速割り増し係数を予測する上で重要な知見である。(2)上記実験結果に基づいて,地形形状別の割増係数情報の追加補正を含めて,基礎情報データベースの整理を行った.追加情報として、1999年9月に九州中央部を襲った台風18号による宇土半島山地部の特性を整理した。また,国土地理院発行の50mメッシュ数値地図情報を利用して観測地点の地形状況をモデル化し,LSD法その他による観測地点の突風率の推定を行った。(1)熊本県宇土半島の地形模型を用いて,海岸から山地部に及ぶ幾つかの地点の増速特性に及ぼす地表面温度勾配の影響を風洞実験で検証した。ドライアイスによる地表面付近の成層流の安定化現象を確認したところ,地表面付近での平均風速の増加に温度分布が強く影響することを確認した。しかしながら,河川や谷筋が複雑に錯綜している地域では,実際の現地の風状況に対応する検証が難しく,NeWMeK観測点以外の地点の従来手法での予測精度の再検討が必要であることが分かった。(2)1999年台風18号のデータを含めて,19952000年のNeWMeK観測記録を用いて各観測地点の突風率データを周辺平均風速の増速情報として整理した。この情報は台風と非台風の分別と8方位に対する風向別に整理したものであるが,台風時では九州南部で南風,中部では東風の場合に,また非台風時では九州全域南風の場合に,突風率が高くなることが分かった。突風率そのものは台風時の方が非台風時より高く,また台風時は高風速でも突風率が下がらない,などが分かった。(3)今年度当初の申請に入っていないが,台風9918号による配電柱の被害情報を入手し,九州電力(株)の各営業所毎の被害率を風速との対応で検証した。その結果,最大風速との関連は薄く,最大瞬間風速が30m/s以上になると急激に被害が拡大していることが分かった。これは,これまでの住家被害と同じ傾向であり,実際の強風被害低減を最大瞬間風速と関連して対策すべき示唆を与え,本研究の最終報告への指針となった。(4)本研究の最終年度として,これまでの研究成果を総括した。
霊長類に特異的なニューロン新生と脳再生療法の研究開発

未曾有の高齢化社会を迎えた我が国ではアルツハイマー病に代表される認知症が増え、幹細胞移植による脳再生療法の開発が急務の課題となっている。骨髄には造血幹細胞と間葉系幹細胞(MSC)の両者が含まれるが、GPR40を微量発現した自家骨髄MSCを分離した上で、in vitroでDHAを用いてGPR40陽性の幼弱神経細胞に分化させる手法が本研究で確立された。この細胞をヒトの脳内に移植すれば、海馬において新生ニューロンに分化し、高次脳機能障害を改善できる可能性がある。同時に、DHAなどの多価不飽和脂肪酸がGPR40との結合によりCREBのリン酸化を介してBDNFを産生し神経回路を再編し得ることを証明した。サルに脳虚血負荷をかけると12週後に新生ニューロンが増えるが、これらは毛細血管の外膜に集積していること、および、骨髄と同様の細胞接着因子を発現していることから骨髄に由来するものと推定される。そこで本研究では、脳を育てるドコサヘキサエン酸(DHA)と結合することでシグナル伝達を行うGPR40が、脳と骨髄に発現していることに着目した。すなわち、骨髄からGPR40陽性の間葉系幹細胞(MSC)を分離した上で、DHAを用いて神経細胞に分化させることができれば、脳再生療法に役立つと考えた。採取後、LymphoPrepを加えたサル骨髄液を静置し、上清を捨てた後800xgで30分間遠心する。サンプルと溶液の境界部より単核細胞群を採取しDPBSを加えて250xgで洗浄する。これを1%PSFと15%FBSを含む培養液で再遠心し、ペレットを3日間培養し浮遊細胞を除去するとMSCが得られた。この中からGPR40を微量発現した自家骨髄MSCを分離し、clonalexpansionを行い実験に供した。その結果、元来GPR40を発現する骨髄MSCは、通常の培養液に微量のDHAを添加することで、GPR40の発現増加と同期して神経細胞に分化してゆくことがわかった。ネスチン陽性の幹細胞は、幼弱ニューロンマーカーであるSSIII-tubulinを発現した後、NF-MおよびMap2陽性の成熟ニューロンへと分化することが、RT-PCRとウエスタンブロットおよび免疫組織で証明された。未処置の骨髄MSCと比べ、bFGF添加群ではGPR40のmRNAと蛋白の発現増加がみられたが、DHAを微量投与するとGPR40の発現は低下し、細胞膜表面から細胞質へと局在が変化した。しかも、GPR40の発現低下と同期して、上記の神経細胞マーカーの発現増加がみられた。この現象は、GPCRの特徴であるReceptor internahzationと一致した。ドコサヘキサエン酸(DHA)やアラキドン酸などの多価不飽和脂肪酸(PUFA)は脳の発達や維持に関与するだけではなく、成体脳におけるニューロン新生を制御することで学習記憶や精神疾患とも密接に関係している。PUFAはG protein-coupled receptor 40(GPR40)のリガンドであることが知られているが、ニューロン産生ニッチにおけるその情報伝達機構については未知である。平成23年度は成体脳ニューロン新生の亢進を示す一過性完全脳虚血ザルを用いてGPR40と転写因子であるphosphorelated cAMP response element-binding protein(pCREB)の発現について検索した。同時に、pCREBの下流にあるbrain-derived neurotrophic factor(BDNF)とそのレセプターであるrtopomyosin receptor kinase B(TrkB)の発現に関しても検索した。すでに報告したように、ウエスタンプロットではGPR40は虚血付加後の第2週目に発現が亢進していたが、pCREBも虚血第2週目に発現が亢進しており、しかも海馬のニューロン新生の増加の時期と一致していた。免疫組織化学的にもGPR40とpCREBの局在発現パターンはほぼ一致しており、歯状回下層(SGZ)の成熟ニューロンや新生ニューロン、星状膠細胞などに発現していた。GPR40/pCREBの2重陽性細胞は虚血15日目のSGZにおいて有意に増加していた。一方、BDNFの成熟型(mBDNF)とTrkBの蛋白質は有意な発現増加を示さなかったが、mBDNFの前駆体であるproBDNFは虚血9日目にピークとなっていた。さらに、免疫組織学的には新生ニューロンはBDNFを発現するが、TrkBは発現していなかった。以上の結果から、成体脳海馬においてPUEAによってニューロン新生が惹起されるためには、同じシグナル伝達経路内においてGPR40とpCREBおよびBDNFが連動していることが示唆された。申請者は、DHA/GPR40シグナルが骨髄MSCにおける神経細胞マーカーの発現に影響を与えるか否かに注目した。

その結果、元来GPR40を発現する骨髄MSCは、通常の培養液に微量のDHAを添加することで、GPR40の発現増加と同期して神経細胞に分化していった。すなわち、ネスチン陽性の幹細胞は、βIII-tubulinを発現した後、NF-MおよびMap2陽性のphenotypeへと成熟することが、証明された。未処置の骨髄MSCと比べ、bFGF添加群ではGPR40のmRNAと蛋白の発現増加がみられた。さらに、GPR40のリガンドであるDHAを微量投与すると、GPR40の発現は低下し免疫組織学的局在は細胞膜表面から細胞質へと変化した。しかも、GPR40の発現低下と同期して、神経細胞マーカーの発現増加がみられた。さらに、成体脳ニューロン新生の亢進を示す脳虚血ザルを用いてGPR40と転写因子であるpCREBの発現とその下流にあるBDNFの発現に関しても検索した。GPR40は虚血負荷後の第2週目に発現が亢進していたが、pCREBも同様で、いずれも海馬のニューロン新生の増加の時期と一致していた。免疫組織化学的にもGPR40とpCREBの局在発現パターンはほぼ一致しており、歯状回下層(SGZ)の成熟ニューロンや新生ニューロン、星状膠細胞などに発現していた。GPR40/pCREBの2重陽性細胞は虚血15日目のSGZにおいて有意に増加していた。一方、mBDNFの前駆体であるproBDNFは虚血9日目にピークとなっていた。以上の結果から、成体脳海馬においてPUFAによってニューロン新生が惹起されるためには、同じシグナル伝達経路内においてGPR40とpCREBおよびBDNFが連動していることが示唆された。GPR40陽性の骨髄幹細胞は脳再生療法の開発に役立つものと思われる。平成23年度までの研究では一過性完全脳虚血ザルを用いて、主として成体脳ニューロン新生が誕生する歯状回を対象として研究を行って来た。歯状回で誕生した新生ニューロンは虚血後23週目にかけて、CA2-3領域にmossy fiber(苔状線維)を伸ばし、新しいシナプスを形成する。そこで、平成24年度の研究ではCA2-3領域を対象として、GPR40と転写因子であるphosphorylated cAMP response element-binding protein (pCREB)の発現について検索した。同時に、pCREBの下流にあるbrain-derived neurotrophic factor (BDNF)とそのレセプターであるtropomyosin receptor kinase B (TrkB)の発現に関しても検索した。さらに、pCREBとBDNFとの間をつなぐメッセンジャーであるERK1/2やAkt、Phospholipase C、Calmodulin kinase IV、Mapkinaseなどの分子の虚血負荷後の動きも検索した。その結果、すでに、歯状回において報告したのと非常によく似た結果がウエスタンブロットや免疫組織化学的検索で得られた。すなわち、GPR40とpCREBいずれもは虚血負荷後の第2週目に発現が亢進していた。
湿地林を構成する希少木本種の繁殖と更新に及ぼす異型交配弱勢の影響の解明

湿地林を構成する希少樹種を対象に、集団間交配や集団内遠距離交配が生活史初期段階の適応度成分に及ぼす影響を調べた。ハナノキについては、集団間交配子孫の適応度成分(授粉花の結実率・結果率)に異型交配弱勢が現れることを示した。さらに、ハナノキ集団内の交配距離と子孫の成長量との間に負の相関関係があることも明らかにした。シデコブシについてみると、結実率・結果率ともに集団間交配による異型交配弱勢は認められなかった。また、シデコブシの孤立小集団では、集団間交配によるプラスの効果(ヘテロシス)がマイナスの効果(異系交配弱勢)を上回るケースがあることを明らかにした。街路樹などとして自生地付近に植栽されるために人為的な遺伝子移入の悪影響が懸念される希少樹木ハナノキを対象として、交配距離と胚段階の生存率など子孫の適応度に関わる形質との関係を分析し、人為的な遺伝子移入などの遺伝的かく乱が異系交配弱勢を介して繁殖に及ぼす影響を推定した。岐阜県中津川市の集団を母樹として、瑞浪市・多治見市の集団との間で交配実験を行った結果、結果率と結実率は集団間交配によって減少する傾向が認められた。特に多治見市の集団との交配の影響は大きく、この子孫の結実率は集団内交配子孫の値に比べて25%低くなることを明らかにした。さらに、集団内遠距離交配によってハナノキに異系交配弱勢が生じる可能性を検討するため、母樹集団内のハプロタイプの分布を葉緑体SSRによる多型解析によって調べた。その結果、同じ遺伝子タイプを持つ個体が集団内でクラスターを形成し、遺伝構造を持つ傾向が認められた。これらの結果より、植栽導入などによってハナノキの種苗の移入を長距離で行うことは、集団内の遺伝構造を崩し、長距離交配と集団間交配を人為的に引き起こすこととなり、結果として異系交配弱勢により、子孫の生存率と成長量を減少させる危険性があることを示した。希少種を対象とした保全管理のなかでは,遺伝的荷重を軽減するために行われる移植の効果が異系交配弱勢によって減少する可能性があり,その実態の解明が課題となっている。準絶滅危惧種シデコブシを対象として、集団間交配(移植)にともなう弊害となる可能性がある異系交配弱勢の有無を検討した。岐阜県中津川市と土岐市の二集団(大集団)を母樹集団および父樹集団として、集団間交配と集団内交配を行った結果、結実率・結果率ともに集団間交配花と集団内交配花に有意な差は認められず、本種の生活史初期段階においては明瞭な異型交配弱勢が現れないことが示唆された。一方、種子重に関しては、母樹集団と父樹集団の交互作用が有意となり、中津川市では集団内交配と集団間交配の間に明瞭な差は認められなかったが、土岐市では集団間交配の方が集団内交配よりも小さな値を示した。この結果から、土岐市の集団でのみ種子重に異型交配弱勢が生じたものと推定され、種子重に現れる異型交配弱勢に母樹の効果が関与しているものと考えられた。さらに、三重県四日市市の孤立小集団を母樹として同一集団(集団内交配)および岐阜県瑞浪市と中津川市の集団を父樹とする交配(集団間交配)を行った結果、結実率・結果率ともに集団間交配花の値の方が集団内交配花の値よりも高くなる傾向が認められた。この結果は、シデコブシの小集団に関しては、集団間交配によるプラスの効果(ヘテロシス)がマイナスの効果(異系交配弱勢)を上回り、小集団の保全管理に集団間移植が有効となるケースがあることを示している。集団間交配による異型交配弱勢が認められているハナノキについて、同一集団内での遠距離交配によっても異型交配弱勢が起こるかどうかを岐阜県中津川市の集団を対象とした交配実験により検討した。その結果、交配距離(父樹と母樹との間の距離;20140m)と交配子孫の成長量(実生の苗高と乾燥重量)との間に有意な負の相関があることを明らかにした。この集団には葉緑体DNAのハプロタイプに集団内変異があり、同じハプロタイプが50m程度の集中斑を形成していることから(21年度研究成果)、この交配実験の結果は、同一集団内での遠距離交配によっても異型交配弱勢が生じることを示すものと考えられる。さらに、集団間交配による異型交配弱勢が認められなかったシデコブシについて、姉妹種のコブシとの交雑による雑種崩壊(交雑子孫の適応度低下)が生じないかどうかを交配実験により検討した。雑種崩壊は主に共適応遺伝子複合体の崩壊により生じると考えられており、広義の異系交配弱勢とみなすことができる。

交配実験の結果、シデコブシとコブシの交雑子孫は、非交雑子孫と同様の初期生存率(胚段階の生存率)を示すことが明ちかとなった。このことから、少なくとも生活史初期段階に関しては、これら2種間の交雑子孫に雑種崩壊は現れないものといえる。この結果は、シデコブシと自然分布域が重複しないコブシをシデコブシの自生地近隣に植栽すると、浸透交雑による遺伝子かく乱が生じる可能性があることを示している。
変性椎間板の組織再生における基礎的研究

本研究では、脊索性髄核細胞を有するラットおよびウサギ、軟骨性髄核細胞を有するウシの髄核細胞を使用し、これら動物種の髄核細胞の形態学的特徴、並びに細胞代謝の指標である乳酸産生量、^<35>S-sulphateを用いたプロテオグリカン(PG)合成能、及びdimethylmethylene blue assayを用いたグリコサミノグリカン(GAG)産生量の違いについてin vitroで検討した。その結果、三次元培養下で観察した髄核細胞の乳酸産生量、PG合成能及びGAG産生量は、ラットとウサギではウシに比べ明らかな高値を示し、脊索細胞の細胞代謝活性の高さを示す結果を認めた。現在、各動物種間の椎間板細胞の細胞代謝について測定比較検討しており、その概要については第23回日本整形外科学会基礎学術集会、第43回脊髄障害医学会にて発表を行っている。要点については、以下の通りである。ラット、ウサギ、ウシの髄核組織をHE染色で比較検討し、ラット、ウサギは複数の細胞によるクラスターの形成を認め、細胞内に胞体形成がみられ、細胞数もウシと比較して多く存在していたことが分かった。それに対してウシの椎間板組織では細胞は軟骨細胞様であり胞体形成は見られず細胞数も少ない。また透過型電顕像では、ラット、ウサギにおいては核周囲に大小様々な胞体の形成を認め、細胞間にtight junctionを認めた。ウシ髄核細胞では細胞の直径も小さく、clusterの形成も無かった。次にアルジネートを用いた髄核細胞の3次元培養では、細胞の生存率は培養3日後そして5日後で各群とも90%以上であった。乳酸産生量は、ラットで5日間の平均で37.6mM/cell/24hrs、ウサギにおいては36.2mM/cell/24hrs、ウシで18.5mM/cell/24hrsとラットとウサギにおいて細胞代謝活性が高い結果であった。ビーズ内のGAG産生量では、培養3日目、5日目ともにウシに比べ、ラットで産生量が多く、培養5日目において、ラットとウサギ、ウシでそれぞれ平均704.8、444.3、207.4μg/mlでラットはウシと比較して約3.5倍、ウサギにおいては約2倍のGAG産生がみられた。本研究では、脊索性髄核細胞を有するラットおよびウサギ、軟骨性髄核細胞を有するウシの髄核細胞を使用し、これら動物種の髄核細胞の形態学的特徴、細胞代謝の指標として乳酸産生量、^<35>S-sulphateを用いたプロテオグリカン(PG)合成能、及びdimethylmethylene blue assayを用いたグリコサミノグリカン(GAG)産生量の違いについてin vitroに検討した。採取した髄核組織は、細胞密度が4×10^6個/mlとなるようにalginate beadsを作成し21%酸素下に5日間の培養を行った。結果、形態学的にラットとウサギでは、ウシに比し細胞密度が高く、脊索の特徴である担空胞細胞(physaliphorous cells)が集合し互いに接着しているのに比し、ウシでは脊索細胞は全く見られず細胞周囲には小窩様構造(lacuna)を有する軟骨細胞が単独で基質内に散在していた。三次元培養下で観察した髄核細胞の乳酸産生量、PG合成能及びGAG産生量は、ラットとウサギではウシに比べ明らかな高値を示し、脊索細胞の細胞代謝活性の高さを示す結果を認めた。本研究結果から正常のヒト椎間板で見られる7% GAG (70mg/ml)濃度を有する髄核組織を作成するためには、脊索細胞を有するラットでは約1年、ウサギでは約2年を要し、ヒトと同様な形態を有するウシの軟骨様細胞では少なくとも約5年と非常に長い時間を要することが推測され、臨床応用が可能な椎間板組織の作成としては非現実的であることが分かった。またPG産生能の高い細胞の髄核内への移植が可能になったとしても、移植された細胞が周囲より十分な栄養供給を受け変性椎間板内で力学的強度を維持するのに十分なPG産生を生涯維持していけるか否かは不明である。分子生物学的手法や細胞培養技術を用いた椎間板再生治療では、まず病的な椎間板変性下にある髄核細胞周囲の生理学的環境を改善させることが重要課題であり、ヒトの椎間板再生治療には脊索細胞ではなく軟骨様髄核細胞を用いることが現時点では望ましいと考えられた。
小児骨折および骨粗鬆症に関する基礎的研究ー運動およびCa摂取量の違いが骨硬度・骨成分に及ぼす影響ー

本研究は,小児の不可解な骨折および老齢期における骨粗鬆症の増加原因と予防法を明らかにする目的から,実験Iでは発育期について,実験IIでは老齢期について,それぞれ運動やCa摂取有の違いが骨硬度・骨成分などに,どのような影響を及ぼすのかをマウスを用いて経時的に検討したもので,結果は以下のとおりである。<実験I・発育期>(1)大腿骨重量は,雄は非運動群に比し運動群が,雌では低Ca食群に比し普通食群がそれぞれ高値を示した。(2)骨硬度は,雌雄とも運動・普通食群が最も硬く,雄では13週齢以降で,雌では7週齢以降で他の群との間に有意差が認められた。(3)骨成分のCaとP値はともに雌雄とも運動・普通食群が最も高値を示した。(4)骨中のヒドロキシプロリン量は,各群とも発育に伴い漸次減少し,雌雄とも非運動・低Ca食群が低値傾向を示した。(5)血清CaとP値は,各群とも正常範囲を示し群間の差は認められなかった。<実験II・老齢期>(1)大腿骨重量は,雌は運動・普通食群が高値を示したが,雄では4群間に差は認められなかった。(2)骨硬度は,各群とも加齢に伴い低下傾向がみられたが,雌雄とも低Ca食群に比し普通食群の低下は緩やかであった。(3)骨成分のCa,Pおよびヒドロキシプロリン値は,いずれも骨重量当りの濃度では4群間に差は認められなかったが,骨全体量では低Ca食群に比し普通食群は高値概向にあった。(4)血中カルシトニンおよびパラソルモン濃度は,雄では4群間に差は認められなかったが,雌のパラソルモン濃度は非運動群に比し運動群は低値を示した。以上の結果から,運動およびCa摂取は,発育期の骨重量や骨硬度および老齢期の骨脆弱化の予防などに好影響を及ぼすものと考えられていた。近年、増加傾向にある小児の不可解な骨折や老齢期における骨粗鬆症の増加原因を究明する目的から、運動およびCa摂取量の違いが骨硬度や骨成分に及ぼす影響について、マウスを使用し行った。なお、本年度は小児の骨折に焦点をあて、発育期における実験を行いその結果の概要は次の如くである。1.骨発育...(1)骨重量:雌雄で傾向を異にしており、雄はCa摂取量の多少に拘らず非運動群に比し運動群が優れるのに対し、雌では、どの剖検時とも運動の影響により、むしろCa摂取量の違いの方が大腿骨重量への影響が強い傾向が認められた。(2)骨長:4群間で一致した傾向が認められなかった。2.骨硬度...雌雄とも、ほぼどの剖検時においても運動負荷+普通食群が最も優れた結果を示し、この傾向は殊に雄において強く、実験開始後9週間目(13週齢)以降では、他の群に比し有意差が認められた。また、この差は週齢を追う毎により顕著であった。3.骨成分...大腿骨中のCa、P濃度は、いずれも発育に伴い増加の傾向がみられたが、低Ca食群は普通食群よりも低値を示した。また低Ca食群のうち運動群と非運動群を比較すると、前者の方が良好な結果を示した。

大腿骨中のコラ-ゲン濃度は、雌雄とも非運動群に比し運動群の方が高値を示し、殊に雄で顕著に認められた。4.血清Ca、P値...各群とも週齢による上下変動は認められたが、4群間では差は認められず、Ca(79mg/dl)、P(811mg/dl)とも、ほぼ正常範囲にあった。以上の結果、発育期における運動やCa摂取の影響について経時的変化を明らかにすると同時に、この時期における適度な運動やCaの充足が骨硬度や骨成分、しいては骨発育に、いかに重要であるかが示唆された。本研究は,小児の不可解な骨折および老齢期における骨粗鬆症の増加原因と予防法などを明らかにする目的から、運動やCa摂取量の違いが,骨硬度・骨成分などに,どのような影響を及ぼすのかをマウスを用いて経時的に検討したもので、特に本年度は老齢期について行い、結果は以下のとおりである。(1)大腿骨重量は,雌で運動・普通食群が高値を示し,48週齢以降で,他の群との間に有意差が認められたが、雄では差が認められなかった。(2)骨硬度は,各群とも加齢に伴い低下する傾向にあったが,雌雄とも,低Ca食群に比べ普通食群の低下は緩かであった。また各週齢とも最も高値を示したのは,運動・普通食群であった。(3)骨成分のカルシウム,リンおよびヒドロキシプロリン値は,いずれも骨重量当りの濃度では、各群間に差は認められなかったが,大腿骨全体に含まれる、カルシウム,リンおよびヒドロキシプロリン量は,低Ca食群に比し,普通食群が高値傾向にあった。(4)血中ホルモンのカルシトニンおよびパラソルモン濃度は,雄は各群とも差は認められなかったが,雌のパラソルモン濃度では,52週齢以降で非運動群に比し,運動群は低値を示した。以上,本研究から老齢期における骨脆弱化の予防には,運動およびカルシウム摂取の充足が果たす役割は,かなり大きいものと考えられた。本格的な高齢社会に向けて、高齢者の体力・症状に応じた運動処方の確立と実践が急務と考える。また骨粗鬆の発症予防として高齢者に対するカルシウム摂取の,より一層の啓蒙およびカルシウム摂取量や補給のための食品の組合せなどの検討も必要と考えられる。
新型インフルエンザA型ウイルスの出現と感染伝播に関与するNA遺伝子の機能解析

本研究は、1957年に出現したヒトH2N2型ウイルス株や1968年に出現したヒトH3N2型ウイルス株のNA遺伝子に見出された酸性条件下においてもシアリダーゼ活性を保持しているNA遺伝子が、ヒトやブタなどの哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの感染、増殖、伝播にどのような役割を果たしているのかを明らかにすることを目的とする。これまでに、シアリダーゼ活性のlow-pH安定性を規定するアミノ酸部位を置換したN2型変異NA遺伝子のcDNAから、遺伝子操作系(リバースジェネティクス)によりA/WSN/33(H1N1)株の遺伝子を基盤にシアリダーゼ活性のlow-pH安定性のみが異なる4種類のインフルエンザウイルスを作製し、これらウイルスのMDCK細胞とマウス感染モデルにおける増殖性を比較した結果、ウイルスシアリダーゼは、これまで報告されていたようにインフルエンザウイルスの感染増殖後に新たに形成された子孫ウイルス粒子の形成と出芽過程で機能するだけでなく、ウイルス粒子の細胞内侵入初期過程においても機能していることを見出した。そこで本年度は、これら4種類のインフルエンザウイルスを用いて、エンドゾーム内での酸性pHにおけるウイルス膜とエンドゾーム膜の融合に伴ったウイルス粒子の脱殻やウイルス粒子の形成と出芽の過程におけるシアリダーゼ活性の影響を比較解析した。抗NP単クローン抗体を用いた共焦点レーザー顕微鏡によるウイルス粒子の脱殻過程の解析や赤血球吸着法によるゴルジ装置内でのHAからのシアル酸除去能の比較から、これらウイルス間で脱殻や出芽過程に相違は認められなかった。一方、endosome/lysosome内のlow-pH条件下におけるシアリダーゼ活性がウイルスの増殖性に大きく影響していることが判明した。本研究成果はインフルエンザウイルス侵入過程におけるNAの新たな機能を示唆するものである。そこで本年度は、クローン化したそれぞれのN2型NA遺伝子とlow-pH安定性を規定するアミノ酸部位を置換したN2型変異NA遺伝子のcDNAから、遺伝子操作系(リバースジェネティクス)によりA/WSN/33(H1N1)株の遺伝子を基盤にシアリダーゼ活性のlow-pH安定性のみが異なる4種類のインフルエンザウイルスを作製した。さらに、これらウイルスのMDCK細胞とマウス感染モデルにおける増殖性を比較し、NAの機能を共焦点レーザー顕微鏡とFACSにより解析した。low-pH安定性を示すA/Hong Kong/1/68(H3N2)株とlow-pH安定性を示さないA/Texas/68(H2N2)株のNAと、これら親株由来のNAとはそれぞれ反対のlow-pH安定性を付与した変異NAをもつウイルスの感染増殖性は、MDCK細胞とマウス感染モデルにおいて顕著な相違を示した。すなわち、low-pH安定性を示すウイルスは、MDCK細胞とマウス感染モデル実験系において、low-pH安定性を示さないウイルスに比べ著しい感染増殖能をもつことが明らかとなった。さらに、共焦点レーザー顕微鏡とFACSによる解析から、NAはウイルス感染初期過程においても機能していることを見出した。この実験結果は、インフルエンザウイルス感染におけるNAのlow-pH安定性が新型インフルエンザウイルスの病原性に関与していることを示唆している。

これまでに、シアリダーゼ活性のlow-pH安定性を規定するアミノ酸部位を置換したN2型変異NA遺伝子のcDNAから、遺伝子操作系(リバースジェネティクス)によりA/WSN/33(H1N1)株の遺伝子を基盤にシアリダーゼ活性のlow-pH安定性のみが異なる4種類のインフルエンザウイルスを作製し、これらウイルスのMDCK細胞とマウス感染モデルにおける増殖性を比較した結果、ウイルスシアリダーゼは、これまで報告されていたようにインフルエンザウイルスの感染増殖後に新たに形成された子孫ウイルス粒子の形成と出芽過程で機能するだけでなく、ウイルス粒子の細胞内侵入初期過程においても機能していることを見出した。そこで本年度は、これら4種類のインフルエンザウイルスを用いて、エンドゾーム内での酸性pHにおけるウイルス膜とエンドゾーム膜の融合に伴ったウイルス粒子の脱殻やウイルス粒子の形成と出芽の過程におけるシアリダーゼ活性の影響を比較解析した。抗NP単クローン抗体を用いた共焦点レーザー顕微鏡によるウイルス粒子の脱殻過程の解析や赤血球吸着法によるゴルジ装置内でのHAからのシアル酸除去能の比較から、これらウイルス間で脱殻や出芽過程に相違は認められなかった。一方、endosome/lysosome内のlow-pH条件下におけるシアリダーゼ活性がウイルスの増殖性に大きく影響していることが判明した。本研究成果はインフルエンザウイルス侵入過程におけるNAの新たな機能を示唆するものである。
聴覚障害者の他者感情理解:難聴者・児を対象とした表情認知の神経生理学解明

本研究は、言語獲得前に朱聴した聴覚障害児塾よび統制群として健聴定型発達児を対象として、社会性の発達のひとつの指標となりえる、他者の感情や意図の認知に関する実験を行ったものである。健聴児と難聴児に対して、既存の他者意図理解課題を提示し、遂行を観察した。その結果こ難聴児ほ健聴児と比較して他者意図理解における認知発達に発達遅延がみちれた。1.他者感情理解課題を用いた感情認知の発達聴覚障害者・児の他者感情理解について調査する際の統制群として、健聴成人・児を対象とし、既存の他者感情理解課題(The Reading Mind on the Eyes Test)の日本語版を作成し、実験を行なった。正常範囲内の言語発達を示す3歳から15歳の児童および18から21歳の健聴成人を対象とし、他者感情の認識が、発達年齢に伴って上昇することを示した。2.健聴児の発達段階の測定他者意図理解課題遂行には、児童の言語発達段階が大きく影響することが示唆されている。また、健聴児と、難聴児や発達障害児を比較するとき、発達段階を考慮にいれる必要がある。そこで、既存の発達段階テスト(PVT語彙獲得検査・ITPA言語学習検査など)を用いて、実験に参加した児童が、生活年齢に応じた言語学習年齢を獲得しているか、確認している。3.障害児の記録広汎性発達障害児(診断あり)・軽度発達障害児(診断なし)各1名を対象とし、健聴児と同様の検査を行なった。広汎性発達障害児は他者意図理解課題の遂行が困難であることが知られているため、聴覚障害児との対照群として、また軽度発達障害児は言語発達遅延が各課題に及ぼす影響を検討するために、各障害児に対しても同様の発達検査を実施している。4.感情刺激の作成感情を伴う顔画像および音声・発話の記録・加工技術について、情報収集中である。1.健聴児の他者感情・意図認知研究既存の複数の他者意図理解課題遂行および表情認識課題を用い、健聴定型発達児童の他者の意図・感情発達を測定した。2.障害児の記録聴覚障害児38名を対象とし、健聴児と同様の検査を行なった。その結果、難聴児は健聴児と比較して他者意図理解課題における認知発達に遅延がみられた。3.感情刺激の作成感情を伴う顔画像および音声・発話を、演技経験者をモデルとして収集した。基本6感情の表清および感情音声を記録し、輝度・音圧・時間などを統制中である。本研究は、言語獲得前に失聴した聴覚障害児および統制群として健聴定型発達児を対象として、社会性の発達のひとつの指標となりえる、表情認知および他者の感情認知に関する実験を行ったものである。1.感情刺激の作成:演技経験者をモデルとして、感情を伴う顔画像および音声・発話を収集した。同画像および音声の、輝度・音圧・時間などを統制して実験刺激とした。基本6感情(喜び・怒り・悲しみ・驚き・恐れ・嫌悪)および中立(真顔および平常の音声)の、計7種類の表情および感情音声の刺激データベースを作成した。さらに各顔刺激と音声刺激を合成し、視聴覚刺激の情動が一致する一致条件刺激と、情動が一致しない不一致条件刺激を作成した。2.健聴児の他者感情・意図認知実験:既存の複数の他者意図理解課題遂行および表情認識課題を用い、統制群として健聴定型発達児童の他者の意図・感情発達を測定した。先行研究と同様の結果を得、これらのデータを、難聴児の結果と比較するための統制条件として使用した。3.難聴児の他者感情・意図認知実験:聴覚障害児50名を対象とし、健聴児と同様の検査を行なった。その結果、難聴児は健聴児と比較して他者意図理解における認知発達に遅延がみられた。これらの遅延は、難聴児の知能発達(言語性IQおよび運動性IQ、WIscを使用)および聴力(裸耳および補聴耳(人工内耳を含む))とは独立であることが示された。ただし、人工内耳や補聴器装用時期と、これらの社会性発達との関係はまだ明らかになっておらず、今後のさらなる調査及び実験が必要である。
ナトリウム駆動型べん毛モーターのエネルギー変換機構の解析

Na^+駆動型モーターのエネルギー変換ユニットあるいはイオンチャネルに対応すると考えられる遺伝子(motX、motY、pomA、pomB)を我々は同定している。H^+駆動型モータータンパク質MotAとMotBとの相同性から、PomAとPomBは複合体を形成してNa^+チャネルとして機能していると考えられている。イオンチャネルとして機能していると推定されているpomA遺伝子産物の機能を調べるため、プラスミド上のpomAをヒドロキシルアミン処理してランダムに変異を導入した。機能欠損を起こすアミノ酸変異部位は、PomAと相同な大腸菌のH^+駆動型モータータンパク質MotAで得られている運動能欠損変異部位と類似した位置にあり、どの部位も大腸菌や好アルカリ性保存されてることが分かった。MotX、MotYは共に1回膜貫通で、特にMotXはNa^+チャネルを構成する可能性が示唆されている。そこで、V.alginolyticusでは完全な遺伝子としてクローニングされていなかったmotXのクローニングを行った。この遺伝子を使い、それまでに得られていたpomA、pomB、motYのいずれにも相補されないV.alginolyticusの変異株が、motX欠損株であることが分かった。H^+型べん毛モーターを形成するタンパク質にはMotA、MotBが固定子として、FliG、FliM、FliNが回転子として同定されている。特に回転力産生に重要なものはMotAの細胞質内ループ領域とFliGのC末端領域の静電気的相互作用であると考えられている。回転子のタンパク質の中で特に重要なFliGに注目し、V.alginolyticusのfliGをクローニングした。さらに、FliGのC末端にヘキサヒスチジンを導入し、大腸菌でHis_6-FliGを大量発現させ、細胞質からHis_6FliGをNi-NTA agarose、Superose6で精製する事に成功した。PomAとPomBの菌体内での安定性を調べるために、PomA、PomBを単独もしくは共発現させた菌体を培養し時間を追って菌体を回収し、それぞれのタンパク質を免疫ブロットで検出した。その結果、PomBの安定性には、PomAが必要であることがわかった。また、多くのこれまでの実験結果から相互作用をしていると考えられているMotA、MotBにおいても、今回の実験結果と同じような結果が得られている。以上のことよりPomAとPomBも複合体を形成していると言う仮説を支持する証拠がNa^+駆動型モーターでも示された。イオンチャネルとして機能していると推定されているpomA

遺伝子産物の機能を調べるため、プラスミド上のpomAをヒドロキシルアミン処理してランダムに変異を導入し、正常なべん毛を持が運動できないpomA欠損株に導入して、軟寒天培地中のスワ-ム能を指標にして選択した。遊泳スピードの遅い変異体も期待したが、単離された37個すべて、完全に運動能を回復できないものだった。pomA遺伝子上の変異を同定するために、挿入されているpomAのコード領域の塩基配列決定を行ったところ、変異が見つからなかったものが6個、フレームシフトを起こしたものが1個、ナンセンス変異体が9個、1アミノ酸置換が16個、2アミノ酸置換が5個見つかった。そのうち1アミノ酸置換が起こった11残基中の7残基が、PomAの3番目と4番目の推定膜貫通領域に存在することが分かった。これらのアミノ酸変異部位は、PoAと相同な大腸菌のH^+駆動型モータータンパク質MotAで得られている運動能欠損変異部位と類似した位置にあり、どの部位も大腸菌や好アルカリ性BasillusのMotAでよく保存されていた。そのため、PomAにおいても、3番目と4番目の推定膜貫通領域がモーター回転機能に重要であると推測された。今後、さらに多くのミュータントを単離して変異部位を同定することや、他のモーター構成タンパク(PomB、FliGなど)との相互作用を調べていくことが、モータータンパクの機能解析において今後の課題である。Na^+駆動型モーターのエネルギー変換ユニットあるいはイオンチャネルに対応すると考えられる遺伝子(motX、motY、pomA、pomB)を我々は同定している。H^+駆動型モータータンパク質MotAとMotBとの相同性から、PomAとPomBは複合体を形成してNa^+チャネルとして機能していると考えられている。PomA、PomBのペプチド断片を、そのDNA配列から予想されたアミノ酸配列から合成し、それらをキャリアタンパク質につけたものをウサギで免疫して抗ペプチド抗体をそれぞれ作成した。これを用いて、免疫ブロット法によりタンパク質の検出を行った。その結果、抗PomAペプチド抗体では、PomAを発現している菌体で25kDaに、抗PomBペプチド抗体では、PomBを発現している菌体で37kDaの付近にそれぞれ特異的なバンドが検出できた。これらのバンドはそれぞれ、PomA、PomBの推定分子量とほぼ一致することから、PomAまたはPomBであると考えられる。PomAとPomBの菌体内での安定性を調べるために、PomA、PomBを単独もしくは共発現させた菌体を培養し時間を追って菌体を回収し、それぞれのタンパク質を免疫ブロットで検出した。PomAは単独またはPomBとの共発現でも、培養時間に依存せず一定レベルのバンドが確認できた。PomBはPomAとの共発現では、培養時間に依存せず一定レベルのバンドが確認できたが、PomB単独の発現ではサンプリング時間に依存して、バンドのレベルが弱くなっていった。このことによりPomBの安定性には、PomAが必要であることがわかった。また、多くのこれまでの実験結果から相互作用をしていると考えられているMotA、MotBにおいても、今回の実験結果と同じような結果が得られている。
胎性造血退縮後の新生子肝臓における組織再構築とアポトーシス

本研究の目的は,胎生期の造血機能から消化腺へと急激に機能転換する生後早期肝臓を対象として,組織構成の変化,細胞組成の変化を細胞死の観点から明らかにすることである.初年度は肝細胞を対象として観察した.肝細胞の細胞死は出生後増え,生後4ないし5日をピークとして減少する.肝細胞は小型化して細胞死に陥り,超微形態レベルで細胞質に形態変化が初発するタイプIと核に初発するタイプIIに区別できる.タイプIは小胞体の変化を初発とする細胞質型のプログラム細胞死であり,タイプIIは核形態の変化を初発とする古典的なアポトーシスであり,タイプIIにくらべタイプIの頻度が高い.二年度はマクロファージを中心に観察した.ラット抗マウスマクロファージモノクローナル抗体F4/80免疫染色と鉄染色による光顕観察ならびに電子顕微鏡観察を行った.肝臓単位面積あたりのF4/80陽性細胞数は肝臓形成初期から生後早期まで急速に増加するが,生後4日と生後13日との間で有意に減少した.F4/80陽性細胞は胎生11日からすでに肝臓内に少数存在し,原始類洞腔でスカベンジャーマクロファージとして大小様々な細胞断片を取り込み,細胞質には鉄陽性封入体が認められた.肝臓造血最盛期にF4/80陽性細胞は造血巣内の赤芽球島中心マクロファージとなり,造血退縮期の胎生19日で,F4/80陽性細胞は造血巣内に存在するほか,造血細胞と離れ肝細胞間に孤立性に分布する.孤立性のF4/80陽性細胞の多くは鉄反応陽性を示したが,ほかに鉄陰性で小型球形の単核細胞が認められた.これは高い核・細胞質比を持つ.新生子期は肝造血の退縮に伴って肝細胞以外でマクロファージにも著しい変化がみられ,赤芽球島中心マクロファージも一部は新生子期の肝臓内で細胞死に陥り,鉄反応陰性の小型単核細胞は肝常在性マクロファージの前駆細胞とみなされる.本研究の目的は,胎生期の造血機能から消化腺へと急激に機能転換する生後早期肝臓を対象として,組織構成の変化,細胞組成の変化を細胞死の観点から明らかにすることである.初年度は肝細胞を対象として観察した.肝細胞の細胞死は出生後増え,生後4ないし5日をピークとして減少する.肝細胞は小型化して細胞死に陥り,超微形態レベルで細胞質に形態変化が初発するタイプIと核に初発するタイプIIに区別できる.タイプIは小胞体の変化を初発とする細胞質型のプログラム細胞死であり,タイプIIは核形態の変化を初発とする古典的なアポトーシスであり,タイプIIにくらべタイプIの頻度が高い.二年度はマクロファージを中心に観察した.ラット抗マウスマクロファージモノクローナル抗体F4/80免疫染色と鉄染色による光顕観察ならびに電子顕微鏡観察を行った.肝臓単位面積あたりのF4/80陽性細胞数は肝臓形成初期から生後早期まで急速に増加するが,生後4日と生後13日との間で有意に減少した.F4/80陽性細胞は胎生11日からすでに肝臓内に少数存在し,原始類洞腔でスカベンジャーマクロファージとして大小様々な細胞断片を取り込み,細胞質には鉄陽性封入体が認められた.肝臓造血最盛期にF4/80陽性細胞は造血巣内の赤芽球島中心マクロファージとなり,造血退縮期の胎生19日で,F4/80陽性細胞は造血巣内に存在するほか,造血細胞と離れ肝細胞間に孤立性に分布する.孤立性のF4/80陽性細胞の多くは鉄反応陽性を示したが,ほかに鉄陰性で小型球形の単核細胞が認められた.これは高い核・細胞質比を持つ.新生子期は肝造血の退縮に伴って肝細胞以外でマクロファージにも著しい変化がみられ,赤芽球島中心マクロファージも一部は新生子期の肝臓内で細胞死に陥り,鉄反応陰性の小型単核細胞は肝常在性マクロファージの前駆細胞とみなされる.妊娠13日から生後10日のICRマウスを用いた.光顕のTUNEL染色のためには,パラフォルムアルデヒド固定後,パラフィンに包埋し,3μmの連続切片を作成した.'Apoptosis in situ Detection Kit'(和光純薬社製)により,核DNAの断片化をDABで可視化し光顕で観察した.カルノフスキー液で固定後,エポン包埋した肝臓からは,はじめ準超薄切片を作成し,トルイジンブルー染色切片で光顕観察後,超薄切片を作成し,電顕観察をおこなった.;マウス胚子肝臓における造血は,胎生14日ピークとし,それ以後は次第に減衰する造血退縮期となり,ほぼ生後1週間で造血細胞は肝臓から消失する.胎生後期から生後早期の肝臓で肝細胞間または拡張した類洞周囲腔内に,孤立性の造血巣を形成し,造血巣は赤芽球,果粒球,リンパ球の造血系細胞のほかに少数のマクロファージや線維細胞を含む.造血退縮期の肝臓には,TUNEL陽性細胞が含まれる.陽性反応は,造血巣内の造血系細胞やマクロファージのほかに,肝細胞にも観察され,新生子期肝臓にはプログラム細胞死に陥る肝細胞の存在することが明らかになった.パラフィン切片の光顕観察では確認できないが,エポン切片による光顕ならびに電顕観察で,細胞死にいたる肝細胞は,異なった二つのプロセス<タイプIとタイプII>を観察することが出来た.タイプIは細胞死の最初の兆候が細胞質に現れる.

細胞質に含まれる細胞小器官の中で,粗面小胞体が拡張するのが特徴である.角膜周囲腔も拡張する.高度に球状に拡張した小胞体はサイズが数μmに達し,細胞質全体を占め,それによって肝細胞は泡状を呈する.核は変形して消失し,小型化した細胞断片は隣接細胞との結合を失って,類洞周囲腔内へと移動する.一方,タイプII型は核に細胞死の最初の兆候が現れる.核染色質が核膜に沿って強度に凝集し,細胞質も退縮する.タイプIは細胞質の変化を主体とするプログラム細胞死で,タイプIIは核の変化を初発とする古典的なアポトーシスによるプログラム細胞死で,新生子期の肝臓では,タイプIが極めて多いのが,特徴である.胎生期の造血性肝臓から生後の消化腺への機能転換にともなう肝臓組織構成の変化を,本年度はマクロファージを中心として観察した.マウス胎子および新生子肝臓を用い,ラット抗マウスマクロファージモノクローナル抗体F4/80免疫染色と鉄染色による光顕観察ならびに電子顕微鏡観察を行った.肝臓単位面積あたりのF4/80陽性細胞数は肝臓形成初期から生後早期まで急速に増加するが,生後4日と生後13日との間で有意に減少した.F4/80陽性細胞は胎生11日からすでに肝臓内に少数存在し,原始類洞腔でスカベンジャーマクロファージとして大小様々な細胞断片を取り込み,細胞質には鉄陽性封入体が認められた.肝臓造血最盛期にF4/80陽性細胞は造血巣内の赤芽球島中心マクロファージとなり,赤芽球からの放出核をはじめとして大小の封入体を含み,多数の鉄陽性封入体を含有した.造血退縮期の胎生19日で,F4/80陽性細胞は造血巣内に存在するほか,造血細胞と離れ肝細胞間に孤立性に分布した.孤立性のF4/80陽性細胞の多くは鉄反応陽性を示したが,ほかに鉄陰性で小型球形の単核細胞が認められた.生後早期に肝細胞間に孤立性に分布する小型のF4/80陽性細胞は鉄反応陰性であり,高い核・細胞質比を持つ.生後13日の肝臓で,F4/80陽性細胞は造血系細胞とは離れ,生後のクッパー細胞と同様に類洞壁に限局し,鉄陽性封入体を含まない.新生子期の肝臓には,アポトーシスならびにdark cell formationの過程を経て細胞死にいたる大型マクロファージが認められた.新生子期は肝造血の退縮に伴って肝細胞以外でマクロファージにも著しい変化がみられ,赤芽球島中心マクロファージも一部は造血の終焉とともに新生子期の肝臓内で細胞死に陥り,鉄反応陰性の小型単核細胞が肝常在性マクロファージの前駆細胞として出現する.
宇宙における野菜栽培のための養水分供給システムと成長制御法の研究

宇宙の微小重力下で植物を育成するためには、根の成長制御法及び養水分供給装置の開発が必要である。われわれはこれまで、微小重力下での養水分供給システムとして多孔性セラミック管を導入し、その効率化のために根の水分屈性を利用することを提唱してきた。本研究では、そのためのシステムの開発及び宇宙環境に適した植物種の選抜と作出に資することを目的に、根の水分屈性の発現機構を解析し、以下の点が明らかにされた。1.水分屈性と重量屈性:正常に重力に反応する根では重力屈性が水分屈性をマスクしており、その干渉の程度も植物の種類によって異なる。つまり、重力に反応する正常な根も微小重力下では水分屈性を発現しやすくなり、宇宙環境に適した植物種が存在する。2.水分勾配と根の屈曲:水分勾配をより的確にコントロールする方法として、閉鎖型の容器内に水供与体とともに各種の飽和塩溶液をおく方法が確立された。この方法では、根は約1%RHmm^<-1>の水分勾配を感受して正の水分屈性を発現する。またソルビトール寒天片を用いた実験では、根は根冠における約0.5MPaの水ポテンシャル勾配を感受して水分屈性を発現することがわかった。3.水分屈性発現の仕組:根の水分屈性は、伸長帯における偏差成長の結果として生ずるが、その偏差成長は伸長部の組織の水分状態の相違によってではなく、細胞壁の伸展性が相違することによって起こる。根の水分屈性にはカルシウムを必要とし、また、アブシジン酸の前処理が水分屈性を促進する。根冠が水分勾配センサーであること、カルシウムとアブシジン酸の作用部位が根冠であることから、伸長帯での細胞壁の伸展性を変化させるような情報が根冠から伸長帯に伝達されるメカニズムにカルシウム及びアブシジン酸が関与すると考えられた。重力に反応しないエンドウの突然変異種(ageotropum)と正常種のアラスカエンドウを用いて根の水分屈性と重力屈性の関係を解析し、正常種では重力屈性が干渉して水分屈性をマスクしていることを示した。この場合、正常種もクリノスタット上で重力屈性反応を抑えると突然変異種の根と同程度の水分屈性を示すようになることから、正常種が水分屈性を発現しにくいのはやはり重力反応との競合のためであることが明らかになった。さらに,宇宙環境での野菜栽培を模擬して,養水分供給システムとして多孔性セラミック管を用いて根の水分屈性を解析し,重力非感受性突然変異種の根は水分屈性によってセラミック管に沿って成長するが,正常種の根は重力屈性のため,セラミック管との接触を維持できないことがわかった.したがって微小重力の宇宙環境では,植物の根は水分勾配に強く反応すると考えられ,その成長制御に水分屈性を利用できる可能性が示された.また,異なる水環境に適応したと考えられるコムギ12品種を用いて根の水分勾配に対する感受性を比較した結果,水分屈性に顕著な品種間差異を見出した.この場合の品種間差異は,先の重力感受性とは独立したものであることが明らかになり,水分屈性による水環境への植物の適応が示唆された.現在,多くの野菜作物について水分屈性発現能力を比較し,水分屈性の発現機構とともに,その生態的意義について解析中である.コムギでの品種間差異の発見は,宇宙環境での水分屈性による根の成長制御に適した野菜作物あるいは遺伝子資源を選抜できる可能性を与えた.ジャガイモの塊茎形成に及ぼす重力およびエアロポニック(セラミック管養水分供給システム)等の影響を解析するための実験系を開発した.これについての詳細な実験は次年度行う.

宇宙の微小重力環境下で植物を育成する場合の根の成長制御法に根の水分屈性を利用するため、根の水分屈性の発現機構についての詳細な解析を行った。根の水分屈性が根冠部における浸透圧勾配(水ストレス勾配)によるものかどうかを検討するために、1mm^3の大きさの1%寒天片に各種の濃度のソルビトールを含ませて重力不感受性のエンドウ突然変異体の根の根冠部に投与し、屈曲を調べた。その結果、根冠の片側に与えられた0.5-1.5MPaのソルビトール寒天片によって、根はソルビトール寒天片とは反対側に屈曲し、根の水分屈性が、根冠における水ストレス勾配の感受を介して発現するものであることが証明された。また、同じソルビトール寒天片の伸長帯片側への処理は正の水分屈性を誘発しなかった。一方、根冠の片側にCa^<2+>を濃度別に処理した場合、根はCa^<2+>ム寒天片と反対側に屈曲し、このCa^<2+>による根の屈曲は、一定の水ストレスによって促進されること、さらにソルビトールによって誘発される水分屈性はCa^<2+>キレート剤の処理によって阻害されることも見出された。根の水分屈性はアブシジン酸(ABA)の前処理によっても促進された。これらの水分勾配の感受、Ca^<2+>及びABAの作用部位はともに根冠であることがわかった。根の水分屈性における偏差成長の仕組みを明らかにするために、根の伸長(屈曲)部位における高湿度側及び低湿度側の組織の水ポテンシャル、浸透ポテンシャル、膨圧、降伏圧、細胞壁の伸展性を測定した。その結果、根の低湿度側と高湿度側の間には、水ポテンシャル、浸透ポテンシャル、膨圧、降伏圧の差は認められなかった。しかし、細胞壁の可塑的伸展係数は、高湿度側よりも低湿度側で有意に大きいことがわかった。これらの結果から、水分勾配は根冠によって感受され、新頂部の細胞壁伸展性を変かさせるような情報が伸長帯に伝達されて水分屈性が起こり、この情報伝達系にCa^<2+>及びABAが関与するものと考えられる。
扁平上皮癌細胞に対する分化誘導制御と頭頚部癌における分化誘導の試み

扁平上皮癌の治療の目的の下、p53に変異のある2株およびp53野生型である2株、計4つの株化扁平上皮癌細胞における分化誘導について検討し、以下の結果を得た。1.扁平上皮癌細胞は、分化誘導剤であるベスナリノンによって、さらには5-FU、γ線、TGF-βによって分化が誘導された。一方、アポトーシスは、ベスナリノンによっては誘導されず、ペプロマイシンおよびTGF-βによっては弱く、5-FUおよびγ線によっては強く誘導された。ベスナリノンによる分化誘導はp21-anti-senseによって阻害された。2.ベスナリノンおよびTGF-βでは、G1期に、5-FUではS期に、γ線ではG2/M期に細胞は集積したが、サイクリンD、サイクリンE.Cdk2およびCdk4の発現は、各処理によってもほとんど影響を受けなかった。3. p21プロモーター活性は、TGF-βで増強し、他では抑制され、p21蛋白発現はTGF-βおよびベスナリノン(p21-mRNAを安定化する作用有り)で増強され、他では抑制された。4. Baxはいずれの処理によっても、ほとんどその発現量は増強せず、一方、Bcl-2は無処理細胞では、ほとんど発現されておらず、各処理によっても発現は増強されなかった。5.アポトーシスは、p53の変異に関係なく誘導され、かつ、p21の発現レベルとは相関していなかった。6.細胞傷害性リンパ球と、γ線あるいは5-FU、シスプラチンとを組み合わせると、アポトーシスはより強く誘導された。しかしながら、リンパ球の関わるアポトーシスにFasは強くは関与していなかった。7.アポトーシスの程度とCu-Zn-SOD活性との間には、関連性がなく、Mn-SOD活性と関係し、Mn-SOD活性が低いと抗癌剤およびγ線によりミトコンドリアの膜電位はより強く低下した。さらに、Mn-SOD活性が低いとcaspase-3の活性化、さらにはPARPの不活化はより強く、Mn-SOD活性の高い細胞よりもアポトーシスはより強く誘導された。これらの結果より、扁平上皮癌の分化・アポトーシスはp53-p21に非依存性に誘導されること、細胞傷害性リンパ球と抗癌剤あるいはγ線との併用はアポトーシス誘導にとって有利であること、さらには、アポトーシス誘導とMn-SOD活性は逆相関すること、が明らかとなった。現在、p21の役割をより明らかにするために、p21遺伝子の導入実験を行っているところである。株化扁平上皮癌細胞をヌードマウスに移植し、peplomycin、5-FU、TGF-β、TNF-α、放射線で処理すると、TNF-αを除き、他では、生残癌細胞の角化は亢進し、分化が誘導されていた。