hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
硬組織再生を目的とした神経堤由来幹細胞の生体内分布解析とその培養方法の確立

P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの頬髭の毛包から採取し,幹細胞用培地にて増殖させ,液体窒素にて凍結保存させていたGFP陽性細胞を2017年5月に解凍し,増殖させた。これらの細胞を軟骨細胞分化誘導培地にて14日間と21日間培養した。その後,TORIZOLにて回収,-80°Cにて凍結保存していた.軟骨細胞分化誘導培地にて14日間と21日間培養した群とコントロール用培地(SFMのみの培地)にて14日間,21日間培養した群のTORIZOLにて回収後のサンプルを2019年2月に解凍し,RNA抽出を行った.その後,RT-PCRを行い, Real time PCRにて軟骨細胞分化マーカー(Col 2, Col 10, Aggrecan)の遺伝子発現解析を行った.解析の結果,RNA量は非常に少ない中,GAPDHの発現は認められたが,軟骨細胞分化誘導した群において,軟骨細胞分化マーカーの遺伝子発現は認められなかった.軟骨細胞分化誘導時に細胞をペレット状にして分化誘導を行い,RNA抽出のための回収を行ったが,その際にTORIZOLにて細胞塊を溶解させていたが,アグリゲーションが強く,なかなか溶解せず,TORIZOLによる回収が難しく感じた.私が行った方法が正しくない可能性があるため.通常どのようにして回収しているのか他の研究者へ聴取が必要と考えられる.2018年5月から2019年1月まで産休,育休しており,培養,回収後に継続して解析を行えず,凍結保存期間が長引いたのも原因と考えられる.2018年6月に息子を出産したため,2018年5月から2019年1月まで産休,育休取得し,現在10ヶ月になる息子と4歳の娘を養育しながらの研究活動を行っており,当初の計画のように実験をうまく行うことができなかったため。昨年,産休,育休に伴う研究費の延長申請を行い,申請を承認していただいたため,延長できた2019年度で今まで遅れている分を積極的に行っていく予定である.P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの頬髭の毛包から採取し,増殖させたGFP陽性細胞(神経堤由来細胞)の軟骨細胞分化誘導の再検証と頭蓋骨欠損モデルマウスを用いた顎骨再建法の開発に取り組む予定である.神経堤由来細胞の生体内分布について解析するために、神経堤由来細胞がGFPで標識されるP0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスを用いて実体顕微鏡にて観察を行った。GFPにて標識された神経堤由来細胞は、頭頚部では鼻甲介、頬粘膜や涙腺などに存在し、体幹部では背皮、膵臓など様々な部分に存在することが確認された。次に、各組織内での局在を解析するため、まずはダブルトランスジェニックマウスから採取した頬髭の毛包について解析を行った。毛包の組織切片を製作し、蛍光免疫染色を行ったところ、毛包のバルジ領域と毛乳頭にGFP陽性細胞が存在することが示唆された。また、以前に申請者らが確立した高純度培養方法によって純化された毛包の神経堤由来幹細胞にとって最適な培養方法の検討を行った。これらの細胞はコラーゲンコート培養皿上においても増殖能を維持していた。一方、低付着性培養皿にて培養を行ったところ、スフェア状に増殖する様子が観察された。申請者らは毛包の神経堤由来幹細胞をBMP-2の刺激により骨芽細胞へ分化誘導することに成功したが、これらの細胞の多分化能について検討を行うため、脂肪細胞への分化誘導を行った。毛包の神経堤由来幹細胞を脂肪細胞分化誘導用培地にて培養すると、脂肪細胞分化マーカーであるリポプロテインリパーゼの発現レベルが上昇した。またオイルレッドO染色によって赤く染まった脂肪滴が検出された。時間的な制約があり、思うように進まなかった。P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの毛包内のバルジ領域と毛乳頭にGFP陽性細胞((神経堤由来細胞)が存在することが前年度までに行った免疫蛍光染色の結果により示唆されたが、その時は緑色の蛍光の抗体を用いて染色を行っていたため、切片になっている毛包に存在するGFP陽性細胞が染色によるものではなく、光っている可能性も考えられたため、今年度は赤色の蛍光の抗体を用いて、P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの毛包内に存在するGFP陽性細胞の蛍光免疫染色を行った。その結果、同じようにバルジ領域と毛乳頭に赤色に染まったGFP陽性細胞が確認された。よって、今回の実験から毛包内のバルジ領域と毛乳頭にGFP陽性細胞(神経堤由来細胞)が存在することが改めて示唆された。前年度にP0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの毛包から採取したGFP陽性細胞(神経堤由来細胞)が脂肪細胞へ分化したことが示唆されたため、これらの細胞の軟骨細胞分化能についても実験を行った。P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウス毛包から採取した細胞を高純度培養法によって培養し、増殖したGFP陽性細胞(神経堤由来細胞)を軟骨細胞分化誘導培地にて培養を行い、遺伝子発現を解析するためのPCR解析用と染色による解析用に回収、保存した。その後、解析を行う予定であったが、時間がなく年度内に解析を行うことができなかった。研究以外の業務で多忙となり、うまく研究の時間を作ることができなかった。また、娘の養育のため、診療後は娘の迎えに行かなければならず、研究の時間をほぼ作ることができなかった。P0-Cre/GFPダブル

トランスジェニックマウスの頬髭の毛包から採取し,幹細胞用培地にて増殖させ,液体窒素にて凍結保存させていたGFP陽性細胞を2017年5月に解凍し,増殖させた。これらの細胞を軟骨細胞分化誘導培地にて14日間と21日間培養した。その後,TORIZOLにて回収,-80°Cにて凍結保存していた.軟骨細胞分化誘導培地にて14日間と21日間培養した群とコントロール用培地(SFMのみの培地)にて14日間,21日間培養した群のTORIZOLにて回収後のサンプルを2019年2月に解凍し,RNA抽出を行った.その後,RT-PCRを行い, Real time PCRにて軟骨細胞分化マーカー(Col 2, Col 10, Aggrecan)の遺伝子発現解析を行った.解析の結果,RNA量は非常に少ない中,GAPDHの発現は認められたが,軟骨細胞分化誘導した群において,軟骨細胞分化マーカーの遺伝子発現は認められなかった.軟骨細胞分化誘導時に細胞をペレット状にして分化誘導を行い,RNA抽出のための回収を行ったが,その際にTORIZOLにて細胞塊を溶解させていたが,アグリゲーションが強く,なかなか溶解せず,TORIZOLによる回収が難しく感じた.私が行った方法が正しくない可能性があるため.通常どのようにして回収しているのか他の研究者へ聴取が必要と考えられる.2018年5月から2019年1月まで産休,育休しており,培養,回収後に継続して解析を行えず,凍結保存期間が長引いたのも原因と考えられる.2018年6月に息子を出産したため,2018年5月から2019年1月まで産休,育休取得し,現在10ヶ月になる息子と4歳の娘を養育しながらの研究活動を行っており,当初の計画のように実験をうまく行うことができなかったため。ダブルトランスジェニックマウスの頬髭毛包を用いて、培養方法の確立、脂肪細胞への分化誘導に成功したため、平成29年度はこれらを用いて軟骨細胞分化誘導を行う。また実体顕微鏡にて観察した他の組織に存在する神経堤由来細胞を高純度培養方法にて純化し、幹細胞の性質解析、骨芽細胞の分化能の解析を行い、骨再生用細胞ソースの選定を平成29年度上半期に行えるようにする。6月に出産を控えているため、現在は研究を進めることができないが、復帰後は研究以外の業務を効率よくこなし、勤務時間内での研究の時間が増やすことができるように上司と相談し、対策を行いたい。研究の時間を確保した上で、軟骨細胞分化能について直ちに解析を行う。また骨芽細胞分化能について、頬髭の毛包以外の細胞ソースと比較を行い、細胞ソースの選定をする。選定された細胞を用いて、三次元的骨組織の製作についての解析を進める。昨年,産休,育休に伴う研究費の延長申請を行い,申請を承認していただいたため,延長できた2019年度で今まで遅れている分を積極的に行っていく予定である.P0-Cre/GFPダブルトランスジェニックマウスの頬髭の毛包から採取し,増殖させたGFP陽性細胞(神経堤由来細胞)の軟骨細胞分化誘導の再検証と頭蓋骨欠損モデルマウスを用いた顎骨再建法の開発に取り組む予定である.時間の制約があり、研究の進行が遅れたため、今年度使用する予定だった金額について次年度へ使用することとなった。研究以外の業務が多忙であり、研究の時間を作ることが難しく、研究がうまく進められなかった。
ピロロキノリンキノンの生合成過程の解明

ピロロキノリンキノン(PQQ)は、NAD(P)やフラビン類を利用しない脱水素酵素の補酵素である。チロシンとグルタミン酸が前駆体とされたが、それらがどのような反応過程を経てPQQへと変換されるのかは現在でも明らかにされていない。M.extorquens AM1において、生合成に関与する事が同定されている6つないし7つの構造遺伝子のうちの一つ(pqqC)の変異株が前駆体を蓄積するので、その構造解析を行った。MALDI-TOFMSによる解析では推定構造と矛盾しない結果が得られた。推定構造のトリメチルエステル体の化学合成を依頼し、入手した。常法に従ってアルカリ条件下ではメチルエステルをはずしたところ、推定構造の化合物は得られず、PQQが生じた。この生成量は嫌気条件下で減少した。pqqC変異株から精製した前駆体もアルカリ条件下でPQQに変換されるので、推定構造が正しい事が示唆された。PqqC/Dタンパク質の酵素活性について検討した。酵素反応にはPqqC部分のみで十分であり、また、前駆体を生産する変異株はPqqC部分に変異があることが示された。PqqC/D酵素反応を様々な還元剤存在下で行ったところ、PQQ生産量は減少した。分子状酸素の関与が示唆されたので同位体ラベル実験を行った。これらの結果は日本農芸化学会大会(平成12年4月)に発表する。また、生合成に関与する遺伝子群の下流に存在するジオキシゲナーゼ様の酵素について、その遺伝子配列を決定し、大腸菌内で融合タンパク質として大量に発現させた。また、M.extorquens AM1の遺伝子破壊株を作成し、生合成に関与していないことを示した。これらの成果は日本農芸化学会大会(平成11年4月)にて発表した。この研究過程で、PQQが鉄イオンにより化学的に分解を受けることが示された。テロシンとグルタミン酸が前駆体として同定されたが、それらがどのような反応過程を経てPQQへと変換されるのかは現在でも明らかにされていない。生合成に関与する6つないし7つの構造遺伝子が遺伝子配列から決定され、異なる微生物間での対応する遺伝子産物同士は相同性が高いが、それら以外の相同性の高い蛋白質はデータベース内にはほとんど見い出されず、どのような酵素または機能タンパク質であるのかはわかっていない。最近申請者らは、M.extorquens AM1を用いて、これらの遺伝子のうちの一つ(pqqC)の変異株が前駆体を蓄積し、この前駆体はPqqCタンパク質によってPQQに転換されることを示した。PqqCは生合成の最終段階を触媒する酵素であると考えられた。そこで、まず前駆体の構造決定を目的としてM.extorquens AM1のpqqC変異株より前駆体の精製をした。マススペクトルによる解析の結果、推定構造と矛盾しない結果が得られた。PqqC酵素反応はヒドロキシル化または酸素添加反応と推定された。現在推定された化合物の化学合成を依頼している。一方、PqqC酵素を大腸菌内で大量に発現させ、精製した。補酵素や金属イオンは検出されなかった。密閉容器中ではPQQ生成量が低下したので、酵素反応に分子状酸素の関与が示唆された。金属イオンの反応におよぼす影響について検討したところ、種々の2価の金属イオンでの阻害が観察されたが、2価のマンガンイオンでは活性化された。過酸化水素は反応を阻害した。これらの研究結果は日本農芸化学会大会(平成10年4月)、ゴードン国際会議(平成10年7月)で発表した。

また、M.extorquens AM1の遺伝子破壊株を作成し、生合成に関与していないことを示した。これらの成果は日本農芸化学会大会(平成11年4月)にて発表した。この研究過程で、PQQが鉄イオンにより化学的に分解を受けることが示された。
プロジェクト学習とポートフォリオを活用した能力獲得型助産教育方法の開発

本研究は学士課程における助産学教育に電子ポートフォリオを導入し、助産学生の教授ー学習過程を学生・教員・実習指導者が可視化して共有できる学習支援方法を構築することであった。学生と教員は可視化された学生の課題および課題達成のための戦略とその振り返りに関する記述内容を共有することが可能になった。更に、ポートフォリオは、助産実習場面における、学生自身の成長過程での「気づき」に関する変化を可視化した。本研究の目的は学士課程における助産教育にプロジェクト学習およびクラウド型ポートフォリオを活用して、能力獲得型の助産教育方法を開発することである。具体的には、助産実践能力獲得のための学習過程にプロジェクト学習とポートフォリオを活用し、学生が自身の目標を見据えて現状を適切に捉え、リクレクションし、自律的かつ持続可能な自己教育力を支える教育方法の開発を目指している。当該年度においては、1学生、実習指導者、教員の3者が同時に教授ー学習過程を可視化するためのクラウド型ポートフォリオの使用環境の整備、2クラウド型ポートフォリオの利便性、簡便性、安全性の確認を行った。また、プロジェクト学習の展開方法に関して、「ゴールシート」及び「目標達成シート」作成過程におけるコーチング内容を共有し、コーチングのトレーニングを行うとともに、教授ー学習過程の可視化による問題点・課題および利点を検討している。さらに、プロジェクト学習の教授学習過程の評価のために、「ゴールシート」および「目標達成シート」作成過程における学生の現状認識、目標、課題、課題克服のための具体策を抽出する視点と方法およびコーチングの内容を抽出する視点と方法を検討している。また、学生の成長と課題を「目標達成シート」から抽出し、成長過程を可視化する方法を検討中である。学士課程において、能力獲得型の助産教育方法を開発することを目的として、平成26年度に引き続き、クラウド型ポートフォリオのシステムを用い、学生のゴールシート、目標達成シートの記述、評価、修正および教員によるコーチングを行った。電子ポートフォリオにより、学生ー教員間の学習過程、成長過程の可視化および共有は可能となっている。一方、実習指導者による活用においては、以下の課題がある。病院内のLANを経由せずに簡便に学生のポートフォリオを供覧し、コメントを入力する方法としてキーボード付きのタブレット端末を利用しているが、画面構成などに慣れておらず、実習指導者単独での使用は難しい現状にある。教員や学生とともに共有することは可能となっている。学生が実習指導者と積極的にポートフォリオを供覧していない場合は、実習指導者と学習過程や学習上の課題をポートフォリオ上でタイムリーに共有することは出来なかった。また、学生の状況を適時に把握できた場合でも、実習指導者がポートフォリオ上で、学生に対してタイムリーに助言やコーチング内容を入力することは困難であった。ポートフォリオへの教員からの書き込みやコメントは増加したが、当該年度においては、実習期間中に学生の基本的な学習上の課題が散発し、教授学習過程の評価を進めることが困難であった。また、2年続けて助産学コース選択者が定員を大幅に割り現状で母集団が少ないため、研究期間の延長について検討中である。本研究の対象は助産学コース選択学生のプロジェクト学習の記録物等であるが、選択学生が2年連続で定員を割り、サンプル数が不足している。また、実習指導者によるクラウド型ポートフォリオへのタイムリーなコーチング内容の入力は困難であった。学士課程における能力獲得型の助産教育方法を開発することを目的として、前年度に引続き、クラウド型ポートフォリオシステムを活用した。教育方法においては、目標達成に向けた学生個々の到達目標、目標達成に向けた戦略、目標達成状況および目標達成に向けた取り組み過程でのコーチングとフィードバック、リフレクションを支援した。学生個々が何を達成するかが見える表現と目標達成に向けて達成状況が評価可能な計画立案をコーチングした。また、目標達成状況を可視化するため、目標達成の結果ではなく、目標達成に向けた取り組み過程で、具体的に身についたこと、向上したこと、成長した点、達成していない課題および改善点に気づくことができるためのリフレクションの支援とフィードバックを学習段階ごとに繰り返し実施した。現状において、学生と教員間の目標および目標達成に向けた計画、目標達成状況の振り返りに関しては、共有できているが、臨地実習指導者を含めた共有は、分娩期ケア以外では十分にできないという課題がある。クラウド型ポートフォリオシステムの使用に関しては、臨地実習指導者にとっては、病院のパソコンから独立して使用できる利点がある。しかしながら、タブレットを使用しているため、操作性における課題をクリアできていない。現状においては、学生が所有しているタブレットまたはノートパソコン画面の共有により目標達成状況や教員からの指導内容を共有する方法とした。分析おいては、質的記述的分析とテキストマインニングを組み合わせた多面的な分析方法を検討した。研究期間における対象学生数の母集団を30名と想定していたが、対象学生である助産科目を選択した学生が当初の研究期間内では16名であった。研究目的を達するために補助事業研究期間を延長して母集団を20名以上を確保する。本研究の目的は学士課程における助産教育に、クラウド型電子ポートフォリオを活用することで、学生の成長と課題を学生・教員・実習指導者が同時に可視化して共有できる学習支援方法を構築し、能力獲得型助産教育方法を開発することであった。クラウド型電子ポートフォリオを活用することで、簡便かつ安全に、教員および学生が教授ー学習過程の共有および可視化が可能となった。特に遠隔地での実習においても、タイムリーに学生の学習状況を複数の教員が共有し時機を逃さず学習過程を支援することが可能となった。

更に、常に自ら課題および目標を設定し、目標達成のための計画、実施、評価を繰り返す学習過程におけるコーチングの内容を教員間で共有することが可能となった。学生の学習過程については、ポートフォリオを使用していない場合との比較はできない。しかしながら、クラウド型電子ポートフォリオを活用することで、可視化された学生の課題および目標、目標達成に向けた戦略および計画、実施、評価の記述内容から、学生自身が成長過程を認識し・実感していること、自らの成長を踏まえて、目標・計画の記述内容の変化を認めた。また、目標達成のみでなく、助産学実習の日々の助産実践場面における対象者との関わりや対象者の捉え方、学習過程における率直な「気づき」における変化を認めた。計画当初は学生、実習指導者、教員三者間で可視化した学習過程をクラウド型電子ポートフォリオで共有することを目指した。しかし、勤務時間内に指導者自らが電子ポートフォリオにアクセスして共有するには、操作や時間的な余裕において課題があった。本研究は学士課程における助産学教育に電子ポートフォリオを導入し、助産学生の教授ー学習過程を学生・教員・実習指導者が可視化して共有できる学習支援方法を構築することであった。学生と教員は可視化された学生の課題および課題達成のための戦略とその振り返りに関する記述内容を共有することが可能になった。更に、ポートフォリオは、助産実習場面における、学生自身の成長過程での「気づき」に関する変化を可視化した。実際の授業および実習における教授ー学習過程を用いるため、学生の学習への不利益や成績評価への影響等を配慮するため、教授ー学習過程の検討や分析は学生の成績評価終了後から開始する必要があり、やや遅れている。当初は、分析対象を母集団20名よりサンプリングする予定であったが、現時点で母集団が9名であるため、平成28年度の学生を加えてサンプルを追加する必要がある。また、当初予定していた学生、教員、実習指導者3者による教授ー学習過程の可視化については、学生と教員による記述を用いることとし、実習指導者については、学生、教員、実習指導者3者による同時的な教授ー学習過程共有における課題の明確化に絞って検討する。研究補助者等の協力により分析の迅速化を図る。看護学(生涯発達看護学)教授ー学習過程のデータ整理等は助産実習終了後の12月末から1月に行うため、研究補助者が効率的になデータ整理を行い、短期間に集中して分析・評価できる体制を整える。サンプル数が少なく、成果発表には至らなかったため、旅費の支出が少なくなった。データ分析の遅れから、人件費の支出が予定より少なくなった。また、クラウド型ポートフォリオの効率的なシステム運用における専門的作業依頼および助言指導を受ける頻度が予定より少なかった。助産教育課程選択者が予定より少なく、当初予定のサンプル数を下回った。助成期間の延長により、サンプル数を確保する必要がある。
地方公共団体のＩＴ化に関する経済分析

本研究の目的は、自治体のシステム評価体系の構築を行うことである。経済学の視点からシステム評価を行う場合は、費用対便益の観点が重視され、安全性(セキュリティ)の視点が軽視されやすい。また、システムの効率性を重視するあまり、本来のシステム導入の目的である経営面での有効性の評価が疎かになる場合がある。複数の視点からの評価を高めることは、最終的なアウトカムである自治体住民の満足度という便益を高めることに繋がる。住民の満足度を高めるにはそのサービスを提供する自治体職員のシステム満足度の影響を考慮したシステム評価体系を構築する必要がある。本研究では、統計分析に基づいた評価体系の構築を行った。日本の電子政府が十分に活用されていない原因を既存の研究をもとに整理し、電子政府を評価する包絡分析を用いる手法を提示した.また、公務員に対して聞取り調査を行い、アンケート調査を当該年度内に実行する予定であったが、アンケート内容の再吟味によるアンケートの再設計を余儀なくされ、研究を次年度に繰り越すことになった.そして、次年度に公務員に対して電子政府に関するアンケート調査を行った。公務員に対するアンケートは、組織コミットメント、情報満足度、システム評価の観点から実施している.このアンケートには信頼性を測る心理的な項目が導入されている。また、共通番号制導入に対する意見やシステム監査基準の6項目に対する重要度評価も実施しており、電子政府内部で情報システムを使う-公務員の情報システムへの認知的要因を測っている。これらは、情報システム成功モデルに応用する事ができる。日本の電子政府が十分に活用されていない原因を既存の研究をもとに整理し、電子政府の評価にDEA(包絡分析)を用いた分析を行った。この研究成果は、国内国外の学会で報告中である。また、公務員と地域住民に対して電子政府に関するアンケート調査を行った。公務員に対するアンケートは、組織コミットメント、情報満足度、システム評価の観点から実施している。また、地域住民には、システム評価の観点から実施している。これらのアンケートには信頼性を測る心理的な項目が導入されている。また、共通番号制導入に対する意見やシステム監査基準の6項目(効率性、信頼性、安全性、有効性、準拠性、戦略性)に対する重要度評価も2つのアンケートで実施しており、電子政府内部で情報システムを使う公務員と外部からその情報システムを使う地域住民との認知的要因さを測っている。これらを情報システム成功モデルに応用した研究を行なっている。地方自治体の情報システムの評価方法を確立するため、前年度から引き続き聞き取り調査をもとにしたWEBアンケート調査を実施した。2013年3月に実施したWEBアンケート調査(サンプル数1000)を用いて、地域住民の情報システム利用意向に関する分析を行った。分析には、技術受容モデル(TAM)にその他の関連モデルの要因を加えた拡張モデルを用いた。分析対象は、市区町村のホームページである。また、アンケート回答者の評価基準が属性によって影響を受けていることを検証した。分析の結果、属性の違いによってモデルのパス係数の大きさに差が生じることが判明した。また、2012年3月に実施したWEBアンケート調査(標本数2200)を用いて、自治体職員のシステム利用の満足度やシステム利用意向に与える要因を分析した。具体的には、自治体職員の組織への忠誠を表す組織コミットメントと情報化、教育などが満足度・利用意向に与える影響を分析した。板倉(2002)は、情動的コミットメント(組織への一体感による感情的愛着)が低い場合は、情報化がかえって組織貢献度を下げてしまうという結果を示している。本研究でも、ほとんど転職がない公務員組織でこのような現象が発生しているのかどうか検証した。分析の結果、これらの仮説がある程度支持されることが判明した。また、2013年度に実施した地方公務員へのアンケート調査を用いて公務員組織の情報化と組織構造の関係を分析した。Apple社などが用いている従業員に対するNPS(Net Promoter Score)と情報化の関係を分析している。NPSは、ユーザー(従業員、消費者)経験を計測、改善を可能とする組織ツールである。NPSの決定理由をテキストマイニングの手法を用いて分析する。分析の結果、NPSを通した情報化の効果に影響を与える要因の整理を行うことができた。これらの分析の結果、地方自治体の情報システム評価の基本体系を完成することができた。本研究は、地方自治体の情報システムの評価方法を構築し、その有用性を検証することを目的としている。具体的には、本年までの調査結果から以下の4点の研究を行った。(1)DEAを用いた自治体情報システム効率性評価モデル、(2)自治体住民、自治体職員のシステム評価基準モデル、(3)自治体住民に対する拡張版技術受容モデル、(4)地方自治体職員のシステム満足度モデルの分析である。(1)DEAを用いた自治体情報システム効率性評価モデルでは、公開されているデータを用いて自治体の情報システムの効率性をはかるモデルの構築を行った。

その結果、自治体の情報システムを評価するために必要な項目の選定と体型を示唆することができた。(2)自治体住民、自治体職員のシステム評価基準モデルでは、独自に行ったアンケート調査を用いて、自治体職員と自治体住民のシステム評価基準の違いに影響する要因を判明することができた。(3)自治体住民に対する拡張版技術受容モデルでは、前年の調査を改良したアンケート調査によって、地域住民の技術受容モデルを構築した。(4)地方自治体職員のシステム満足度モデルでは、公共サービスの提供にインターナルマーケティングの考えを適用して、自治体職員の情報システム満足度に影響を与える要因について分析を行った。これらの分析はお互いに関連性の高い研究である。これらの分析結果を組み合わせることによって、体系的な自治体情報システム評価モデルの構築が可能となる。自治体情報化モデルを作成するアンケート調査が順調に行えたため。前年度はアンケート調査設計の変更を行ったため、研究が進展しなかったが、かえって今年度のアンケート調査との整合性を取ることができた。2つの調査の比較分析によって更に多くの論文を作成することができる。25年度が最終年度であるため、記入しない。分析に必要なデータの収集が一通り完了し、統計分析も順調に進んでいる。自治体公務員調査、地域住民調査の結果、住民満足度に関する更なる調査を行う必要が出てきた。今回は、TAMなどの基本モデルを拡張した質問項目を増やす必要がある。また、前回のアンケートで質問したシステム評価項目の質問方法をAHPを対象としたものに変える必要がある。また、システム評価を行う方法として、DEAだけではなく、住民満足度を決定する認知的意思決定に関する研究も取り入れる必要がある。そのための基礎研究は終了している。今までの分析結果を用いて関係各所へのヒアリングを行いモデルの精緻化を行う。これらのモデルを組み合わせることによって、統一的な視点からみた自治体情報化評価モデルを完成させる。
G1期における細胞成長・細胞周期を制御する分子に着目した新たながん治療法の研究

(1)免疫抑制剤ラパマイシンの細胞内標的蛋白mTORがアミノ酸バランスを感知し、蛋白合成系・細胞成長・細胞周期を制御する中心分子である事を示すため、高率にhomologous recombinationを起こすチキンB細胞DT40を用い、まず外来性のラットmTORをテトラサイクリンで発現を制御する系を作製。その細胞を使って、mTORのknockout細胞を作成しつつある。(2)アミノ酸のなかでもロイシンが、最も強くmTORの情報伝達系を活性化し、ロイシンのL体、アミノ基、側鎖が重要。ベータアラニンとリジンからなるmulti-antigen peptide(MAP)中のリジンのアルファ・イプシロンアミノ基に、8つのロイシン(L体)をカルボキシル基を介して結合させ、Leu8-MAPを合成。これは、分子量約2000で、細胞膜を通過できない。ラット肝癌細胞H4IIEをLeu8-MAPで刺激すると、mTOR下流のp70S6キナーゼが活性化される。この時Leu8-MAPの分解はほとんど観察されず、Leu8-MAPが細胞表面から作用したと思われた。(3)ロイシン誘導体中にロイシンによるp70S6キナーゼの活性化を阻害する化合物を発見。このロイシン誘導体の細胞増殖に対する効果は、ラパマイシン感受性ヒトT細胞であるJurkat細胞において、血清存在下で、細胞数増加を抑制、G1期で停止、サイクリンキナーゼ阻害因子p27Kip1の発現量の増加とretinoblastoma蛋白のリン酸化の低下を誘導。(4)mTORを介するシグナル系に関与する新規シグナル伝達分子の探索を行なうため、yeast two hybrid法と生化学的手法を用いた。mTORに対するモノクロナール抗体を作製し、この抗体のアフィニティカラムで、mTORを精製、共に精製されてくる蛋白を発見。現在、解析を行なっている。
mRNAサーベイランス機構が仲介する新規ストレス応答メカニズムの解明

ATF5 mRNAは通常状態ではuORFからの翻訳によるATF5翻訳領域内でのストップコドンの発生によりNMDによる分解を受けている。一方、ストレス環境下では本来の翻訳開始点からの翻訳が起る事によるNMDシステムからの回避が起り、mRNAの安定性が増加する。その結果、ATF5の発現量が上昇し、標的遺伝子の発現が引き起こされ、ATF5を介したストレス応答が形成されることがわかった。「ATF5mRNAは通常状態ではuORFからの翻訳によるATF5翻訳領域内でのストップコドンの発生によりNMDによる分解を受けている。その結果、ATF5の発現量が上昇し、標的遺伝子の発現が引き起こされ、ATF5を介したストレス応答が形成される。」という仮説を証明する事を目的とする。NMD経路において中心的な役割を果たす制御因子であるUpf1のSiRNAを細胞へ導入したところATF5 mRNAの発現量が増加した。また、Luciferase(LUC)レポータープラスミドのLUC cDNAの開始コドンより上流部分をATF5の5'UTRと交換したプラスミドのLUC構造遺伝子内の5'UTR内のuORFからの翻訳由来の終止コドンよりも55塩基以上下流に外来遺伝子のスプライシングのドナー、アクセプター配列を含むイントロン配列を挿入したプラスミドを作製し、動物細胞へ導入したところ、イントロンの挿入によりmRNAの分解が促進された。これらの結果からATF5 mRNAの発現にNMD経路が関与している可能性が示唆された。」という仮説を証明する事を目的とした。NMD経路において中心的な役割を果たす制御因子であるUpf1,Upf2のSiRNAを細胞へ導入したところATF5mRNAの発現量が増加した。また、Luciferase(LUC)レポータープラスミドのLUC cDNAの開始コドンより上流部分をATF5の5'UTRと交換したプラスミドのLUC構造遺伝子内の5'UTR内のuORFからの翻訳由来の終止コドンよりも55塩基以上下流に外来遺伝子のスプライシングのドナー、アクセプター配列を含むイントロン配列を挿入したプラスミドを動物細胞へ導入したところ、イントロンの挿入によりmRNAの分解が促進されるが、この分解促進は、Upf1,2のノックダウンやATF5の翻訳開始を5UTR上のuATGからそれより下流の本来のATGヘシフトさせる事がわかっているヒ素暴露により阻害された。この様な阻害は、コントロールであるPTCを持つbeta-globin遺伝子では見られなかった。これらの結果からATF5mRNAの発現にNMD経路が関与している可能性が示唆された。
ミニバイオ人工肝臓と^<13>C安定同位体化合物代謝を利用した肝毒性試験の開発

ヒト培養細胞を用いた毒性評価法は、動物とヒトという種の違いを埋める手法である。しかし、従来の単層培養法では、細胞が生体で持っていた機能を再現することはできない。3次元高密度培養法で作製したバイオ人工臓器は、ヒト組織・臓器の代替臓器として利用できる。今回の研究では、代替臓器での代謝評価を簡易に感度良く行う方法として、^<13>C安定同位体化合物代謝を利用した代謝・毒性試験の開発を行った。3次元培養は、単層培養に比較すると大掛かりな培養で、1回の実験で多くの条件を設定し、多数のリアクターを稼動させることは困難である。このため、ひとつのリアクターの稼動状況を丹念に、簡易に評価するためのシステムが必要である。まず、3次元培養系を簡易にするため、混合ガス供給装置を作製し、CO_2インキュベーターや大掛かりなコントローラーがなくても、培養系の酸素を供給し、pHを調節できるシステムに改良した。薬剤の毒性評価や、ある特定の代謝評価を培養経過とともに行うため、^<13>C安定同位体標識化合物の代謝排出^<13>CO_2測定法を開発した。その主な利点は、(1)種々の標識化合物を用いることで特定の代謝が評価でき、(2)排出ガスをリザーバーから回収すれば測定でき、リアクターを開けて細胞をサンプリングする必要がない、(3)サンプリング後、迅速(2分30秒)に^<13>CO_2を測定することができる。本研究の結果、3次元高密度培養による代替バイオ人工臓器に、^<13>C安定同位体標識化合物を添加し、その最終代謝物質である排出^<13>CO_2の測定することによって、生体での代謝シミュレーションを簡便に行うことができる系が開発できた。客観的評価は、代謝モデリングとコンピューター・シミュレーションを応用できる。今後、動物やヒトでの検討の前に、薬物や食品添加物質の毒性・代謝の評価に、代替バイオ人工臓器と安定同位体標識化合物を用いた代謝研究が有用となる。本研究では、ヒト肝臓由来細胞を3次元培養したミニバイオ人工肝臓(ミニ肝臓)を用いた肝毒性試験を開発する。平成17年度は、ミニ肝臓での^<13>CO_2測定系を開発し、ブドウ糖代謝を主体に検討した。多孔質担体ハイドロキシアパタイトビーズを充填した小型ラジアルフロー型バイオリアクター(RFB)に、高機能ヒト由来肝癌細胞FLC-7を高密度3次元培養し、リザーバーの培養液をポンプで循環し、閉鎖系で培養した。CO_2/エアーの混合ガスは新規に開発した混合ガス供給装置(特許申請中)より2-5%CO_2濃度で、20ml/minで供給した。培養は37°Cのインキュベーター内で行った。培養液交換毎に100mlの培養液あたり、25mgの^<13>Cラベルグルコース(クロレラ工業株式会社)を添加し、リザーバーより排出されるガスを呼気バッグに採取した。採取されたガス中の^<13>CO_2を呼気中^<13>CO_2分析装置(POC ONE赤外分光分析装置、大塚製薬株式会社)で測定した。ミニ肝臓から排出されるガス中のグルコース代謝物としての^<13>CO_2は、検出可能で最高40‰に達した。バイオリアクターでの細胞数が少ない状態ではグルコース消費は少ないが、細胞が増殖し組織として再構築されるとグルコース消費は急速に増加した。

毒性物質として、殺細胞効果を示す濃度の1/100にあたる抗癌剤を加えたところ、抗癌剤を投与したミニ肝臓における^<13>CO_2排出量はコントロールに比較して10-20%低下した。しかし、乳酸産生量、グルコース消費量では差がでなかった。本研究で開発したミニ肝臓の^<13>CO_2産生からみた肝臓毒性試験法はきわめて感度が高いことが証明された。平成18年度は、グルコース以外の代謝に関しても、他の^<13>Cラベル化化合物を用いて検討する予定である。ヒト培養細胞を用いた毒性評価法は、動物とヒトという種の違いを埋める手法である。しかし、従来の単層培養法では、細胞が生体で持っていた機能を再現することはできない。3次元高密度培養法で作製したバイオ人工臓器は、ヒト組織・臓器の代替臓器として利用できる。今回の研究では、代替臓器での代謝評価を簡易に感度良く行う方法として、^<13>C安定同位体化合物代謝を利用した代謝・毒性試験の開発を行った。3次元培養は、単層培養に比較すると大掛かりな培養で、1回の実験で多くの条件を設定し、多数のリアクターを稼動させることは困難である。このため、ひとつのリアクターの稼動状況を丹念に、簡易に評価するためのシステムが必要である。まず、3次元培養系を簡易にするため、混合ガス供給装置を作製し、CO_2インキュベーターや大掛かりなコントローラーがなくても、培養系の酸素を供給し、pHを調節できるシステムに改良した。薬剤の毒性評価や、ある特定の代謝評価を培養経過とともに行うため、^<13>C安定同位体標識化合物の代謝排出^<13>CO_2測定法を開発した。その主な利点は、(1)種々の標識化合物を用いることで特定の代謝が評価でき、(2)排出ガスをリザーバーから回収すれば測定でき、リアクターを開けて細胞をサンプリングする必要がない、(3)サンプリング後、迅速(2分30秒)に^<13>CO_2を測定することができる。本研究の結果、3次元高密度培養による代替バイオ人工臓器に、^<13>C安定同位体標識化合物を添加し、その最終代謝物質である排出^<13>CO_2の測定することによって、生体での代謝シミュレーションを簡便に行うことができる系が開発できた。客観的評価は、代謝モデリングとコンピューター・シミュレーションを応用できる。今後、動物やヒトでの検討の前に、薬物や食品添加物質の毒性・代謝の評価に、代替バイオ人工臓器と安定同位体標識化合物を用いた代謝研究が有用となる。
新生仔低酸素性虚血性脳障害における神経栄養因子の動態と治療に関する実験的研究

これまでにわれわれは、低酸素性虚血性障害(HI)を受けた脳における神経栄養因子の発現を検討してきた。最終的な目標は神経栄養因子による障害の治療、予防である。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、in vitroにおいて神経細胞の突起伸長などの神経栄養作用を有することが報告されている。今回われわれは、BDNFの受容体であるTrkB蛋白の発現を、正常発達脳と障害脳について免疫組織化学を用いて検討した。その結果、ラットの大脳皮質におけるTrkB蛋白陽性細胞は古皮質から見られ始め、発達に伴い大脳全体に出現した。従って、TrkB蛋白は遊走を終えある程度の発達段階に達した神経細胞に発現すると考えられた。また、生後早期では突起が強く染色されたことが特徴であった。これは、BDNFやNT3/4が突起上に発現したTrkB受容体に結合することにより、神経細胞発達に何らかの関わりを持つ可能性を示唆する。また、障害側の梗塞部位の近傍には、多数の突起を有したTrkB陽性細胞が出現していた。このことより、HIの障害を受けた後生き残ろうとする神経細胞は、細胞体だけでなく神経突起のTrkB受容体を強く発現し、BDNFなどと結合しその神経保護作用を受けようとしていると推察された。さらに、梗塞巣周囲のみならず非結紮側大脳皮質のTrkB陽性細胞が増加していたことは、低酸素のみ(非結紮側)のストレスを受けた細胞においてもTrkB蛋白が新たに発現誘導されることを示す結果であると考えられた。これらのことから、BNDFあるいはNT4/5は未熟な脳においても広範囲の神経細胞に作用しその神経細胞保護作用を発揮することを示唆するものと考えられた。今後は、生体内においてこれらの神経栄養因子が、実際に作用するのかまた作用するならばどの様な機序で働くのかを検討し、臨床への応用を検討する必要がある。近年、低酸素性虚血性障害(hypoxic-ischemic injury,HII)を蒙った神経細胞の防御過程あるいは再生過程に、各種の神経栄養因子が関与しているとされてきた。それらの神経栄養因子のうち、脳由来神経成長因子(BDNF)は中枢神経系に広範囲に分布しており、各種の神経細胞に発現が見とめられ、神経細胞の防御機転あるいは再生機転に重要な役割をになっていると考えられる。今年度は、BDNFの特異的な受容体であるTrkBの発現の正常ラット脳における発達を観察するとともに、HIIを負荷したラット脳について免疫組織学的に検索した。SD系ラットの胎生18日目および生後0、1、2、4、7、10、14、30日目の脳を4%パラホルムアルデヒド液で固定し、凍結切片を作製した。各切片は1次抗体として、抗TrkB polyclonal抗体(Transduction Lab.,)を用い、ABC法にて免疫染色を行った。また、生後7日目に左頸動脈を絹糸で結紮し、8%酸素、92%窒素の混合ガスを満たしたチャンバー内に仔ラットを2時間留置することにより、HII負荷を行った。これらの仔ラットの脳に関しても、同様の方法で負荷後0、3、24、48時間後、および負荷後5日目に免疫染色を行った。その結果、TrkB受容体は胎生18日目の脳の広範囲に、弱いながらもすでに発現が認められた。生後のラット脳にも瀰漫性にTrkBを発現している細胞が認められ、形態学的に神経細胞と考えられた。免疫染色の強度は生後2日目頃にピークを示し以後漸減していった。

一方、HII負荷後3時間目より両側大脳において免疫反応の増強がみられ、2448時間目頃が発現が最も亢進している。結紮側では梗塞巣と思われる部分の免疫反応が負荷後早期より低下ないし消失しており、その周囲の神経細胞における発現が特に著しく亢進していた。これらのことより、TrkBを発現している神経細胞は、BDNFあるいはその他の神経栄養因子の作用を受け、HIIに対する防御能を発揮している可能性が示唆された。これまでにわれわれは、低酸素性虚血性障害(III)を受けた脳における神経栄養因子の発現を検討してきた。最終的な目標は神経栄養因子による障害の治療、予防である。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、in vitroにおいて神経細胞の突起伸長などの神経栄養作用を有することが報告されている。今回われわれは、BDNFの受容体であるTrkB蛋白の発現を、正常発達脳と障害脳について免疫組織化学を用いて検討した。その結果、ラットの大脳皮質におけるTrkB蛋白陽性細胞は古皮質から見られ始め、発達に伴い大脳全体に出現した。従って、TrkB蛋白は遊走を終えある程度の発達段階に達した神経細胞に発現すると考えられた。また、生後早期では突起が強く染色されたことが特徴であった。これは、BDNFやNT3/4が突起上に発現したTrkB受容体に結合することにより、神経細胞発達に何らかの関わりを持つ可能性を示唆する。また、障害側の梗塞部位の近傍には、多数の突起を有したTrkB陽性細胞が出現していた。このことより、IIIの障害を受けた後生き残ろうとする神経細胞は、細胞体だけでなく神経突起のTrkB受容体を強く発現し、BDNFなどと結合しその神経保護作用を受けようとしていると推察された。さらに、梗塞単周囲のみならず非血紮側大脳皮質のTrkB陽性細胞が増加していたことは、低酸素のみ(非血紮側)のストレスを受けた細胞においてもTrkB蛋白が新たに発現誘導されることを示す結果であると考えられた。これらのことから、BDNFあるいはNT4/5は未熟な脳においても広範囲の神経細胞に作用しその神経細胞保護作用を発揮することを示唆するものと考えられた。今後は、生体内においてこれらの神経栄養因子が、実際に作用するのかまた作用するならばどの様な機序で働くのかを検討し、臨床への応用を検討する必要がある。
内分泌撹乱物質による子宮癌の発生促進機序解明に関する研究

エストロゲン様作用を示す内分泌撹乱化学物質(EDCs)と子宮癌への関連性とその発生機序を解明するために以下の実験を行った。EDCsとしてp-tert-octylphenol(OP)を選択した。1.p-tert-octylphenol(OP)の成熟および新生仔期大量曝露によるラット子宮癌への修飾作用[平成12年度]正常な性周期を示す成熟Donryuラットの子宮腔内に発癌剤を経膣的に投与し、その後大量のOP(100mg/kg)を65週齢まで皮下投与した結果、本系統に自然発生する高分化型の腺癌の発生頻度が有意に増加した。また、成熟動物と同量のOPを生後115日齢の同系統ラットに隔日皮下投与し、その後10週齢で発癌剤を同様に投与して65週齢まで観察した結果、子宮内膜腺癌の頻度は対照群と同様で、むしろ過形成病変が減少したが、中低分化型子宮癌および腹腔内あるいは肺への遠隔転移が有意に増加するなど明らかな悪性度の亢進が認められた。2.新生仔期OP大量曝露による子宮の変化とER発現の経時的変化について[平成13年度]0P新生仔期大量曝露による子宮内膜の変化を6日齢から性成熟前まで観察した。その結果、OP新生仔期大量曝露は視床下部・下垂体へ影響を及ぼし、成熟前のゴナドトロピン分泌を明らかに抑制し雄型の分泌パターンを示した。これらの動物では、排卵は行われず黄体のない多嚢胞性卵胞から成る萎縮性の卵巣となり、相対的エストロゲン値が増加した結果、持続発情および8週齢で既に子宮内膜の過形成が観察された。一方、性成熟前より子宮腺の形成が顕著に抑制され、子宮被覆上皮および間質細胞のエストロゲンレセプターα(ER)および細胞増殖活性の異常が認められたことから、OPの新生仔期大量曝露与は、直接的に子宮内膜上皮の発育分化異常をもたらすことが示唆された。3.子宮の増殖性病変部におけるER発現の経時的変化について[平成13年度]加齢に伴うラットの子宮増殖性病変部におけるERαの発現および細胞増殖活性について免疫組織化学染色法を用いて検索した結果上皮の過形成から高分化型腺癌へと進展するにつれ、ERの発現および細胞増殖活性は亢進したが腺癌の分化度が低いものではホルモン非依存性癌であることが明らかとなった。これらの結果より、成熟動物での子宮癌の増加は持続的なOP投与がエストロゲン様作用として子宮の増殖活性を亢進させた結果であると考えられた。一方、新生仔期曝露による子宮癌の増加は、視床下部・下垂体・性腺系障害による相対的エストロゲン値の増加と子宮の発育分化異常が関連していると考えられ、曝露時期により子宮癌の発生機序が異なる可能性が示唆された。しかし、いずれも極めで大量を皮下投与した結果あることから、環境中に存在する量では子宮癌を修飾させる可能性は極めて低いと考えられた。

これらの結果より、成熟動物での子宮癌の増加は持続的なOP投与がエストロゲン様作用として子宮の増殖活性を亢進させた結果であると考えられた。一方、新生仔期曝露による子宮癌の増加は、視床下部・下垂体・性腺系障害による相対的エストロゲン値の増加と子宮の発育分化異常が関連していると考えられ、曝露時期により子宮癌の発生機序が異なる可能性が示唆された。しかし、いずれも極めで大量を皮下投与した結果あることから、環境中に存在する量では子宮癌を修飾させる可能性は極めて低いと考えられた。平成12年度において、内分泌撹乱化学物質であるp-tert octylphenol(OP)投与がラットの子宮癌の発生を促進させるか否かを我々が確立した二段階子宮発癌モデルを用いて検索した。長期投与群として、正常な性周期を示す10週齢のDonryuラットの子宮腔内に発癌剤を経膣的に投与し、その後OPを背部皮下に65週齢まで投与した。また、新生仔期曝露群として生後24時間内にOPを雌ラットに皮下投与し、15日齢まで1日おきに計8回投与し、10週齢にて上記の同様発癌剤を投与した。OPの投与量として、成熟動物および新生仔期曝露により動物に明らかにエストロゲン様作用を示す量である100mg/kgを設定した。その結果、OPの成熟動物の長期投与により、子宮内膜腺癌の発生頻度が有意に増加した。OP投与動物に観察された子宮腺癌は、本系統に自然発生する分化型の腺癌であった。新生仔期に100mg/kgという大量のOPに曝露した動物の65週齢の子宮では、増殖性病変の発生頻度の増加は観察されなかったものの、認められた子宮癌は低分化型で、且つ遠隔転移が多くの動物に観察された。これらの結果より、OPの成熟動物への長期投与および新生仔期曝露はラットの子宮内膜腺癌の発生を促進することが明らかとなった。また、興味深い事実として成熟動物と新生仔期曝露に観察された子宮癌のタイプが異なることから、この二者では発癌に至るメカニズムが異なる可能性が示唆された。さらに、次年度はこのエストロゲン様作用を有するOPで促進した子宮発癌の発生メカニズムについて検索するために、下垂体・性腺系ホルモンを測定することにより内分泌学的な変化が明らかにし、形態学的な変化とくにエストロゲンと結合することにより子宮の増殖に影響を及ぼすエストロゲンレセプターの変化について考察を加える予定である。1.成熟動物へのp-tert-octylpheno1(OP)大量曝露によるエストロゲンレセプターα(ER)の発現についてOP大量曝露によるラットの子宮内膜の変化を検討するために卵巣摘出した成熟Crj : Donryu雌ラットにOP100mg/kgを皮下投与(2週間)すると、子宮上皮および間質細胞のER発現および細胞増殖活性はともに増加した。2.新生仔期OP大量曝露によるER発現の経時的変化について新生仔期OP曝露によるラット子宮内膜の変化を観察するために生後24時間以内から生後15日齢までのDonryu雌ラットに100mg/kgのOPを1日おきに皮下投与し、性成熟前の子宮内膜の変化を観察した。その結果、t-OP群で子宮被覆上皮のER発現および細胞増殖活性は対照群より早く10日齢から観察されて21日齢まで増加した。一方、OP群では子宮腺が14日齢以降減少し、子宮腺のER発現および細胞増殖活性も減少した。OP群では間質細胞のERが10日齢まで対照群より減少したが、間質細胞の細胞増殖活性は対照群と同様であった。これらの結果より、新生仔期のOP大量曝露与は性成熟前の子宮内膜上皮および間質細胞のER発現と細胞増殖活性に影響を与え、子宮の発育を変化させていると考えられた。3.子宮の増殖性病変部における(ER)発現の経時的変化について加齢に伴うラットの子宮増殖性病変部におけるERαの発現および細胞増殖活性について免疫組織
ヒト細胞の新規凍結保存方法

造血幹細胞の凍結保存には凍害を防ぐためにDMSOが添加されているが、副作用が生じる場合もあるため、新規凍結保存剤を開発した。新規凍結保存剤で凍結保存した造血幹細胞を培養して赤血球と白血球へ分化するコロニーの数はDMSOで凍結保存した場合と同等であり、凍結保存液に入れた細胞の生存率は高く、ラットの体内で有害な分子を生じなかったため、新規凍結保存剤はDMSOに劣らない凍結保存剤となることが判明した。細胞を凍結すると氷の結晶が細胞を潰す凍害が生じるため、細胞は凍害保護剤を添加して長期の凍結保存がされている。ジメチル酸化硫黄(DMSO)は、広範な細胞の凍害を防止できるが、毒性は無視されてきた。凍結保存剤は60年前に偶然に発見されたため、DMSOの機能を再検討した。DMSOは硫黄の持つ電子親和性がラジカル除去剤になるとともに副作用も生じ、酸素を切り離しやすいことが毒性の原因になると推定した。ふたつのメチル基がペプチド結合を挟む構造を持つN-メチルアセトアミド(NMA)は、DMSOに類似した分子構造である。NMAは水中ではペプチド結合で会合し、DMSOも水中で会合するため、DMSOに似た分子構造と性質を持つNMAを、DMSOに替わる凍害保護剤として、本研究では提案している。DMSOまたはNMAを添加した生理食塩水に、白血球を入れて3時間観察すると、NMAはDMSOより高い生存率が得られる。NMAは造血幹細胞の良好な凍害保護剤となることが判明してきた。NMAがメチル化したジメチルアセトアミド(DMA)に、弱い発癌性を指摘する研究があり、凍結保存剤は治療と同時に体内に入るため、NMAが体内で有害な代謝物を作らないことを立証する必要がある。ラットにNMAを注射して尾から蒸散するガスと、尾の表面に分泌する体液を、質量分析ガスクロマトグラフィーと微量分析赤外分光装置で分析して、ラット体内ではNMAはDMAを作らず、またDMAもNMAを作らないことが判明した。細胞保護剤として凍結保存剤に添加されているアルブミンの危険性も指摘されているため、安全な細胞保護剤としてトレハロース、ヘキサエチルスターチ(HES)、デキストランをNMAに添加して凍結保存を行い、家畜精子にはトレハロースが有効で、ヒト造血幹細胞にはHESが有効な凍結保存剤となることが判明した。アルブミンを使用しなくてもNMAが有効な凍害保護剤となるための細胞保護剤の選択が重要な課題となった。ニメチル酸化硫黄(DMSO)に替わる凍結保存剤の候補があげられており、造血幹細胞を凍結保存する場合に、細胞分化に与える影響はないことを確認した。人体に適用するためには、凍結保存剤が体内にはいって、異常物質を発生しないことを証明する必要がある。新規凍結保存剤は、メチル基の受容体や供与体になって、異常物質を作る可能性がある。新規凍結保存剤を注射したラットの体液を質量分析しても異常物質は検出できなかったが、新規凍結保存剤と50種類存在するメチル化酵素との作用を検討した。メチル化酵素の作用の量子化学的な解明は最近開始されている。メチル化酵素はメチル基受容体の窒素に結合した水素をはずして、メチル基供与体のメチル基を移動させる。基質特異性は一般に高いため、新規凍結保存剤がメチル化酵素の認識を受けてメチル化される可能性は少ないが、新規凍結保存剤がメチル化酵素の認識を受ける可能性も推測される。メチル化酵素としてguanidinoacetatemethyltransferase(GAMT)、メチル基受容体としてGuanidinoacetate(GAA)、メチル基供与体としてS-adenosyl-L-methionine(AdoMet)のタンパク結晶の空間構造を検討した結果、メチル化酵素とメチル基受容体とメチル基供与体の三分子が、正確な立体配置をとらないと、メチル基の移動は行われないことがわかった。X線散乱による結晶解析では、酸素の位置しかわからないが、5個の水の酸素が、この三分子の中間に水和している。水の酸素とメチル化酵素とメチル基受容体とメチル基供与体の三分子の酸素や窒素原子の距離を測ると、2,78A、2,92Aといった水素結合の距離にあり、メチル化酵素は水を介した水素結合によつて正確な立体配置をすることによつて、高い基質特異性を持つことがわかった。メチル基受容体とメチル基供与体が大きいため、基質特異性が高いことが推測された。新規凍結保存剤の分子形状を検討して、メチル基の受容体または供与体になって、メチル化酵素と反応する可能性は少ないと判断された。現在まで白血球の凍結保存剤として使用されてきたジメチル酸化硫黄(DMSO)は、凍害保護作用とともに、副作用も生じることは見逃されてきた。凍結保存された造血幹細胞を解凍して、静脈注射を行う骨髄移植において、必ずDMSOは体内にはいり、肝機能傷害やアレルギーを生じる。1970年代には欧米でDMSOによる副作用の報告が出版されてきた。