hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域の教育・文化拠点としての近世寺院：宗教施設をめぐる人間形成文化史研究の試み

神職の教育史研究は近年成果が提出されており、これをふまえつつ、神職を含む宗教者の修学過程について、僧侶を媒介とした京都と地方(九州)を結ぶ学習ネットワークの形成と私塾の発達の観点から、調査を進めた。以上、近世僧侶の修学過程の分析は、私塾研究の進展に資する事例となると考えており、今回の科研をふまえ、以後も調査を継続したい。寺院は第一に宗教施設であり、信仰と祈念の場である。同時に仏書や漢籍を討究する学問寺であり、庶民に手習指南や読書指導を行ったり、蔵書を形成して書籍を貸し出したりする場でもあった。近代学校教育制度が現出する以前、近世社会において寺院は学問所であり、学校であり、図書館であった。いわば地域学習センター的役割を担っていた。近世社会に形成される知的環境の実態と特質を解明するため、地域の教育・文化拠点としての寺院への視角は欠かせない。本研究を教育史と仏教史を結ぶ位置に据え、とくに近世寺院による庶民の文字学習への関与、私塾の学習ネットワークのなかの僧侶という側面を考察した。近世村落寺院僧侶の在村知識人としての性格を析出するため、彼らにおける都市としての京都との関連性に着目して研究を進めている。その関心から、京都・西本願寺学林の学籍簿『大衆階次』の調査を、前年度に引き続き実施した。『大衆階次』に掲載される飛騨地域や三河地域などの出身僧の情報は、ほぼ把握した。また、東本願寺学寮の学籍簿『入寮着帳証印』は撮影を終えた。この作業をふまえ、地方の村から京都の学林や学寮に学んだ僧侶のなかで、帰坊後、寺子屋を開き、庶民教育に従事したり、あるいはさらに他の私塾(伊藤仁斎や広瀬淡窓の塾)にも学んだ者を見いだし、集中的に事例研究を行う準備を進めている。教育学(教育史)飛騨地域の郷土史会に入会している。学林・学寮史料の収集成果をまとめ、当該地方誌に論考を発表し、成果を問いたいと考えている。また、村落寺院僧侶における庶民の文字学習への関与のありかたについて、考察を進めたい。中世寺院からその性格を変えた近世寺院が庶民に対して果たす世俗教育の意味を検討する作業に発展させたい。くわえて、京都の学林や学寮を、仏教教育・研究を専門とする「私塾」としてとらえ、教育史研究で進展する私塾研究のなかに、学林や学寮を系譜づけることを試みたい。このことは、従来の教育史研究のなかで看過されてきた課題だと考えている。第1に、飛騨国農村における僧侶経営の手習塾について、一次史料を調査・撮影し、内容の判読を進めている。当該寺院の蔵に保管される関連史料のほとんどは撮影し、その写真画像は保存している。ただし、実地調査において関係者への聞き取りで判明したことであるが、昭和末年から平成初年頃に郷土誌の編さんにかかわって寺院所蔵史料の一部が外部に提供され、まだ返却されていない史料を含むようである。未返却分のなかに、研究上必要と考えられる史料があるので、追跡調査を行いたい。第2に、近世学林(京都・西本願寺派)の学籍簿にあたる『大衆階次』について、安政期まで調査を行い、地方から京都に学ぶ修学僧の把握を行った。京都という学問中心地に長年学ぶ僧侶における地元自坊での手習塾の開設状況とその都市文化の地元への持ち帰りの影響を、このいわば中央文書の『大衆階次』と地方文書の各寺院所蔵史料との突きあわせを通じて明らかにする作業を進めている。学林の『大衆階次』の調査を継続し、残る年次の把握も行いたい。なお、本研究の一環として、仏教の歴史や伝統の現代的意味を問う観点から、四国遍路に関する教育実践研究を試みることができた。
細胞外の物体を操作することによる形態形成の分子メカニズム解明

ユーグリファ目に属する有殻アメーバは細胞外において珪酸質の鱗片を操作し、細胞外に卵型の被殻を構築することが知られている。タイムラプスビデオや電子顕微鏡観察により、被殻構築過程は形態学的にはある程度明らかになってきた。しかし、そのメカニズムは全く分かっていない。Paulinella micropora(以下ポーリネラ)はユーグリファ目の中でも分子情報が蓄積しており、いわば有殻アメーバのモデル生物とも言え、分子メカニズム解明へ向けた材料として適している。平成30年度は、ポーリネラの被殻構築の分子メカニズム解明へ向け、被殻構築の各段階における発現量比較解析を実現するために、RNAseqのサンプル調製方法の検討を行った。同調培養系や少数細胞からのRNA抽出によって被殻構築中の細胞からRNAseqに耐えうるRNAを調整するのは難しいと判断し、年度後半には単細胞RNAseqに挑戦する方向へ舵をきった。2018年11月にスペインInstitut de Biologia EvolutivaのInaki Ruiz-Trillo博士の研究室を訪ね、単細胞RNAseqの第一人者であるSebastian R. Najle博士とともに、予備実験を行った。間期の細胞を1-5細胞PCRチューブに単離し、凍結融解を3回繰り返し、細胞を破砕した。その後RT-PCRと逆転写産物の増幅・精製を行い、バイオアナライザを用いてクオリティーをチェックした。5サンプル中4サンプルで様々な大きさの転写産物の増幅がみられたが、シグナル強度が低く、cDNA濃度も微量であった。そのため、2019年度はRNAseqに供するためのサンプル調整では、PCRによる増幅のサイクル数を増やして行う予定である。有殻アメーバにおける細胞外物体操作の分子メカニズムを明らかにする第一歩として、本研究ではポーリネラの被殻構築に関与する遺伝子を比較RNAseqにより網羅的に解析することを目指している。被殻構築中の細胞からのRNA抽出には細胞周期同調系の確立が有効であると考え、系の確立を目指した。しかし、ポーリネラの増殖速度が遅いことから長時間に渡る薬剤処理が必要となり、それによって他の細胞プロセスへ大きく影響が出てしまい、系の確立には至らなかった。被殻構築中の細胞からRNAを抽出する方法として、培養液中から目的の細胞を単離する手段も非常に有効である。今回、細胞周期同調系の確立には至らなかったが、被殻構築中の細胞が比較的多く見られる阻害条件を見つけることができたので、この条件で処理した培養液中から被殻構築中の細胞を単離することは比較的容易にできるようになった。さらに、単細胞RNAseqの予備実験も進んでおり、比較トランスクリプトームによる候補遺伝子の抽出は平成31年度中に完了できる目処はたっている。自身の経験不足からポーリネラにおける遺伝子機能解析ツールの開発は思うように進んでいないが、平成30年度にポーリネラと同じ珪酸質の被殻を持つ珪藻の遺伝子導入系技術を当該研究室において習得することができたため、平成31年度は同様の方法を用いてポーリネラにも遺伝子を導入したいと考えている。珪藻ではエレクトロポレーション法とパーティクルガン法の2つの系が確立しているが、環状プラスミドを用いたパーティクルガン法よりも線状化したDNA断片をエレクトロポレーションにより導入する方法の方が格段に効率が良い。ポーリネラと珪藻は同じ珪酸質の被殻に覆われていることから、珪藻で用いられているエレクトロポレーション法を基盤に系の確立が可能であると考えている。本年度前半に、比較トランスクリプトーム解析により細胞外物体操作時に発現する遺伝子もしくは発現量の上昇している遺伝子を網羅的に抽出し、それらを細胞外物体操作に関与する候補遺伝子群とする。平成30年度内に、比較トランスクリプトームに耐えうる単細胞からのcDNA調整に目処がたったので、本年度はRNAseq解析を行い、細胞外物体操作に関与する候補遺伝子をin silico解析によって抽出する。被殻構築には細胞が細胞外の鱗片を「認識・接着」、「運搬・配置」することにより実現しているという作業仮説が立てられる。「認識・接着」は膜貫通型分子や細胞接着関連分子、「運搬・配置」はアクチン結合関連分子がそれぞれ関与していると予想できるため、これらに標的を絞り、候補遺伝子を選出する。比較トランスクリプトーム解析と並行して、遺伝子解析ツールの開発を行う。ポーリネラの近縁種において遺伝子開発ツールが確立している種は存在しないので、ポーリネラのプロモーター配列を用いたコンストラクトを作成する。この遺伝子導入用のコンストラクト作成にはある程度時間がかかるので、どの様な条件でDNAが細胞内へ入るかをFITC-dextranもしくはFluoresceinを使ってエレクトロポレーションの電圧やパルス回数などの条件を前もって検討しておく予定である。比較トランスクリプトーム解析によって抽出された被殻構築関連遺伝子を遺伝子導入系が確立し次第、コンストラクトを作成し、候補遺伝子の機能解析を順次行う。

同調培養系や少数細胞からのRNA抽出によって被殻構築中の細胞からRNAseqに耐えうるRNAを調整するのは難しいと判断し、年度後半には単細胞RNAseqに挑戦する方向へ舵をきった。2018年11月にスペインInstitut de Biologia EvolutivaのInaki Ruiz-Trillo博士の研究室を訪ね、単細胞RNAseqの第一人者であるSebastian R. Najle博士とともに、予備実験を行った。間期の細胞を1-5細胞PCRチューブに単離し、凍結融解を3回繰り返し、細胞を破砕した。その後RT-PCRと逆転写産物の増幅・精製を行い、バイオアナライザを用いてクオリティーをチェックした。5サンプル中4サンプルで様々な大きさの転写産物の増幅がみられたが、シグナル強度が低く、cDNA濃度も微量であった。そのため、2019年度はRNAseqに供するためのサンプル調整では、PCRによる増幅のサイクル数を増やして行う予定である。有殻アメーバにおける細胞外物体操作の分子メカニズムを明らかにする第一歩として、本研究ではポーリネラの被殻構築に関与する遺伝子を比較RNAseqにより網羅的に解析することを目指している。被殻構築中の細胞からのRNA抽出には細胞周期同調系の確立が有効であると考え、系の確立を目指した。しかし、ポーリネラの増殖速度が遅いことから長時間に渡る薬剤処理が必要となり、それによって他の細胞プロセスへ大きく影響が出てしまい、系の確立には至らなかった。被殻構築中の細胞からRNAを抽出する方法として、培養液中から目的の細胞を単離する手段も非常に有効である。今回、細胞周期同調系の確立には至らなかったが、被殻構築中の細胞が比較的多く見られる阻害条件を見つけることができたので、この条件で処理した培養液中から被殻構築中の細胞を単離することは比較的容易にできるようになった。さらに、単細胞RNAseqの予備実験も進んでおり、比較トランスクリプトームによる候補遺伝子の抽出は平成31年度中に完了できる目処はたっている。自身の経験不足からポーリネラにおける遺伝子機能解析ツールの開発は思うように進んでいないが、平成30年度にポーリネラと同じ珪酸質の被殻を持つ珪藻の遺伝子導入系技術を当該研究室において習得することができたため、平成31年度は同様の方法を用いてポーリネラにも遺伝子を導入したいと考えている。珪藻ではエレクトロポレーション法とパーティクルガン法の2つの系が確立しているが、環状プラスミドを用いたパーティクルガン法よりも線状化したDNA断片をエレクトロポレーションにより導入する方法の方が格段に効率が良い。ポーリネラと珪藻は同じ珪酸質の被殻に覆われていることから、珪藻で用いられているエレクトロポレーション法を基盤に系の確立が可能であると考えている。本年度前半に、比較トランスクリプトーム解析により細胞外物体操作時に発現する遺伝子もしくは発現量の上昇している遺伝子を網羅的に抽出し、それらを細胞外物体操作に関与する候補遺伝子群とする。
不均一超流動ヘリウム3における奇周波数状態の線型応答に関する理論的研究

超流動ヘリウム3の界面に形成されるアンドレーエフ束縛状態が磁場の方向に強く依存した異方的磁気応答を示すことを明らかにした。さらに、奇周波数クーパー対とアンドレーエフ束縛状態のゼロモードとの間に極めて密接な関係があることを指摘し、奇周波数状態とゼロモードという新たな視点からアンドレーエフ束縛状態に関する従来の実験結果を再検討することで、超流動ヘリウム3の界面に実際に奇周波数クーパー対が形成されていることを明らかにした。平成21年度は、超流動ヘリウム3薄膜のスビン帯磁率に関する研究において、以下のような成果を得た。超流動ヘリウム3の液面や容器壁近傍には、アンドレーエフ束縛状態と呼ばれる表面準粒子束縛状態が形成されることが知られている。また、並進対称性の破れに起因して、奇周波数対称性券右する秩序変数が表面付折に誘起されることが理論的に予想されている。この奇周波数秩序変数は現在のところ観測されていないが、アンドレーエ束縛状態についてはその存在が横波音響インピーダンス測定によっで確認されている。我々は、超流動ヘリウム3-B相のアシドレーエラ束縛状態の波動関数とその磁気応答を詳細に調べた。アンドレーエフ束縛状態に関して、スピン演算子の行列要素を計算すると、スピン演算子の表面に平行な成分の行列要素はゼロになり、垂直成分のみが有限な行列要素をもつという結果が得られた。アンドレーエフ束縛状態は、磁場を表面に垂直にかけた場合にのみ磁化に寄与するのである。その結果、超流動ヘリウム3-B相薄膜のスピン帯磁率は磁場の方向に関して顕著な異方性をもつ。さらに、アンドレーエフ束縛状態はマヨラナ型準粒子励起と見なせることも指摘した。これらの結果は日本物理学会の欧文誌(Journal of Physical Society of Japan, JPSJ)の2009年12月号に掲載され、注目論文(Papers of editors' choice)に選ばれた。本年度は、超流動ヘリウム3の表面近傍に現れる奇周波数クーパー対の理論的研究において以下のような成果を得た。超流動ヘリウム3のB相では、表面付近の局所状態密度が、アンドレーエフ束縛状態の形成に起因した特徴的な低エネルギー構造をもつ。東工大の低温実験グループは、その低エネルギー表面状態密度を横波音響インピーダンス測定によって観測し、超流動ヘリウム3B相の表面に実際にアンドレーエフ束縛状態が存在することを実証した。一方、最近の理論的研究の進展から、超流動ヘリウム3B相の表面付近には、並進対称性の破れに伴って、奇周波数対称性を有する特殊なクーパー対が形成されると予想されるが、その存在は現在のところ観測されていない。本研究では、奇周波数クーパー対と超流動物性との関連を解明することを目的として、超流動ヘリウム3B相の表面奇周波数クーパー対振幅に関する詳細な解析を行い、表面奇周波数クーパー対振幅のエネルギー依存性とアンドレーエフ束縛状態を反映した局所状態密度の低エネルギー構造に極めて密接な相関があることを明らかにした。特に、ゼロエネルギー極限では、両者の値が完全に一致することを解析的に証明した。横波音響インピーダンスの周波数依存性には、有限のゼロエネルギー状態密度を反映した構造が見られる。この実験データは、超流動ヘリウム3B相の表面近傍に奇周波数クーパー対が実際に存在していることを強く示唆していると言える。平成23年度(最終年度)の主な研究成果を以下にまとめる。○超流動ヘリウム3B相における表面奇周波数状態の研究超流動ヘリウム3B相の表面近傍に形成される、奇周波数クーパー対とアンドレーエフ束縛状態に関する理論解析を行った。アンドレーエフ束縛状態のゼロモードと奇周波数クーパー対振幅の間に厳密に成り立つ関係があることを指摘し、この関係を準古典的グリーン関数理論に基づく数値計算によって確認するとともに、ゼロモードと奇周波数状態の関係という新たな視点から従来の実験データを再検討し、超流動ヘリウム3B相の表面に奇周波数クーパー対が実際に形成されていることを明らかにした[Phys.Rev.B85,024524(2012)]。○超流動ヘリウム3A相、及び、カイラルp波状態における自発質量流の解析円筒容器中に閉じ込められた超流動ヘリウム3A相では、Mermin-Hoテクスチャーと呼ばれる特殊な渦構造が実現する。この状態は、従来、GL理論の範囲内で議論されてきた。本研究では、準古典的グリーン関数法を駆使し、自己無同着なテクスチャー構造とそれに付随する自発質量流を絶対零度まで数値計算することに成功した。また、Sr_2RuO_4を舞台に議論されているカイラルp波状態の表面に誘起される自発質量流についても詳細な数値計算を行い、表面の散漫的な準粒子散乱が質量流を減少させること、表面付近でのギャップ関数の空間構造や表面状態密度に超流動ヘリウム3の(A相ではなく)B相と類似性があることなどを明らかにした[J.Phys.Soc.Jpn.80 113706(2011)]。
極短パルスレーザーを用いた細胞内局在性タンパク質作用因子の取得とその網羅的解析

近年、細胞間あるいは、細胞内情報伝達やこれに関わる各種生理作用物質の研究が、モレキュラーレベルで論じられるようになってきた。これらの研究は主に、組織や個体を用いたミュータントのフェノタイプの観察あるいは、関連分子のバルク調製による生化学的相互作用の解析に基づいたものがほとんどであるが、より正確で、直接的な知見を得るためには、バルクでの観測ではなく、個々の細胞で実際に起こっている情報伝達をオンサイトで観測し、そこで作用している物質を直接同定することが望ましいことは、言うまでもない。本研究では、細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質の細胞内での作用機作の解明、および、常染色体劣性遺伝の疾患の一種、ロバーツ症候群の原因核局在性遺伝子産物の細胞内での作用機作の解明を題材に取り上げ、細胞微細加工技術および、超微量生体物質分析技術を用いて、これらの分子のカウンターパートとなる、ホスト細胞由来相互作用因子の直接同定を試み、当該分野に新知見をもたらすと共に、1細胞を基盤としたライフサーベイヤ研究の重要性を指し示すことを目的としている。H18年度は、(1)極短パルスレーザーを用いたサブセルラーサンプリング装置のセットアップ、(2)GFP融合アミロイド蛋白質毒素TDH(腸炎ビブリオ由来)発現細胞の調製、(3)GFP融合ESCO2蛋白質発現細胞の調製、(4)サブセルラーマイクロサンプリングによる相互作用する蛋白質の取得を検討し、フェムト秒レーザーを用いたサブセラーミクロディセクションによって、GFP標識した細胞毒性を有する細菌由来アミロイド様凝集性タンパク質を切り出すことに成功した。また、微量分析技術として、PCRとLC-MSを組み合わせた新しい転写産物の分析法を確立した。
ジャトロファに含まれる抗酸化物質の高度利用に関する化学的研究

ジャトロファ搾油カスから1種類のカテコール型リグナン、5種類のネオリグナン類、2種類のセスキネオリグナン類を単離・同定した。2つのカテコール構造を持つ3,3'-ビスデメチルピノレジノール、イソプリンセピン、プリンセピンはトロロックスよりも高い抗酸化活性を示した。メタノール抽出物有機層画分とイソアメリカノールAは植物油やバイオディーゼルの酸化を抑制した。このことからジャトロファ搾油残渣に含まれる天然抗酸化物質は、ジャトロファバイオディーゼルの酸化防止剤として利用が期待される。1.抗酸化物質の単離・同定:ジャトロファ搾油カスは、ソックスレー抽出器を用いて、ヘキサン、酢酸エチル、メタノールにより逐次抽出を行った。酢酸エチル抽出物とメタノール抽出物は,それぞれ酢酸エチルと水で二層分配し,有機層と水層の画分を得た。これら4画分についてDPPH法とFolin-Ciocalteu法を用いた抗酸化活性試験を行った結果、メタノール抽出物有機層画分に強い抗酸化活性を有することが認められた。このメタノール抽出物有機層画分を各種クロマトグラフィーにより分離・精製し、NMR等により構造解析を行い、3,3'-bisdemethylpinoresinol、5種類のカテコール型ネオリグナン、2種類のセスキネオリグナンを単離・同定した。2.化学合成:カフェ酸エチルを無水THF中でDIBAL-Hにより還元し、カフェイルアルコールを得た。これをアセトン-トルエン中で脱水素重合させ、(±)-isoamericanol Aを選択的に好収率で得られた。3.粗酵素実験:カフェ酸と西洋ワサビペルオキシダーゼを反応させ、カテコール型リグナンの生成を確認した。この生成物から(±)-isoamericanol Aと(±)-americanol Aを得られた。4.油脂安定性試験:合成したisoamericanol Aを酸化防止剤として用いた油脂安定性試験を行った結果、isoamericanol Aは、α-Tocopherolよりも高い抗酸化作用を有することが示された。このことからジャトロファ搾油カスに含まれるisoamericanol Aは、バイオディーゼル燃料を生産する際の酸化防止剤としての利用が期待でき、バイオマス資源として更なる利用価値が見出せた。1.化学合成:カフェ酸エチルを無水THF中でDIBAL-Hにより還元し、カフェイルアルコールを得た。これをアセトンートルエン中で脱水素重合させ、(±)-isoamericanol Aを選択的に高収率で得られた。2.粗酵素実験:カフェイルアルコールを西洋ワサビペルオキシダーゼにより脱水素重合させたとこと、カテコール型リグナン・ネオリグナン類の生成を確認した。この生成物から(±)- 3,3'-bisdemethylpinoresinol、(±)- isoamericanol Aが得られた。3.油脂安定性試験:合成したisoamericanol Aを酸化防止剤として用いた油脂安定性試験を行った結果、isoamericanolAはα-トコフェロールよりも高い抗酸化作用を有することが示された。このことからジャトロファ搾油カスに含まれるisoamericanol Aは、バイオディーゼル燃料を生産する際の抗酸化防止剤としの利用が期待され、バイオマス資源としての利用価値が見出された。4.イソアメリカノールAの抗ガン活性について調べた結果、4種類のヒトガン細胞(MCF-7、MDA-MB231、HuH-7、Hela細胞)の細胞増殖を濃度依存的に抑制した。MCF-7細胞を用いた遺伝子解析により、イソアメリカノールAはG2/M期で細胞周期停止させ、BTG2、p21、GADD45A遺伝子の発現が増加していたが、CDK1、cyclins B1とB2の遺伝子の発現が減少していた。このことから、イソアメリカノールAは、抗ガン剤としての利用が期待される。1.抗酸化物質の化学合成、2.粗酵素実験は、当初の研究計画通りに進行した。3.油脂安定性試験については、ジャトロファ搾油カスに含まれる抗酸化活性成分をバイオディーゼル燃料の酸化防止剤として有効利用できることを示した。また、4.抗ガン活性については、イソアメリカノールAは抗ガン剤としての利用が期待される結果が得られ、当初の計画以上に研究が進展した。これをアセトンートルエン中で脱水素重合させ、(±)-イソアメリカノールAを選択的に高収率で得られた。2.粗酵素実験:カフェイルアルコールを西洋ワサビペルオキシダーゼにより脱水素重合させたところ、カテコール型リグナン・ネオリグナン類の生成を確認した。この生成物から(±)-bisdemethylpinoresinol、(±)-3,3'-イソアメリカノールAが得られた。3.油脂安定性試験:合成したイソアメリカノールAを酸化防止剤として用いた油脂安定性試験を行った結果、イソアメリカノールAはα-トコフェロールよりも高い抗酸化性を有することが示された。このことからジャトロファ搾油カスに含まれるイソアメリカノールAは、バイオディーゼル燃料を生産する際の抗酸化防止剤としての利用が期待され、バイオマス資源としての利用価値が見出された。4.生理活性試験:イソアメリカノールAの抗ガン活性について調べた結果、4種類のヒトガン細胞(MCF-7, MDA-MB231, HuH-7, Hela細胞)の細胞増殖を濃度依存的に制御した。

MUF-7細胞を用いた遺伝子解析により、イソアメリカノールAはG2/M期で細胞周期を停止させ、BTG2, p21, GADD45A遺伝子の発現が増加していたが、CDK1, cyclins B1とB2の遺伝子の発現が減少していた。このことから、イソアメリカノールAは抗ガン剤としての利用が期待される。ジャトロファ搾油カスから1種類のカテコール型リグナン、5種類のネオリグナン類、2種類のセスキネオリグナン類を単離・同定した。2つのカテコール構造を持つ3,3'-ビスデメチルピノレジノール、イソプリンセピン、プリンセピンはトロロックスよりも高い抗酸化活性を示した。メタノール抽出物有機層画分とイソアメリカノールAは植物油やバイオディーゼルの酸化を抑制した。このことからジャトロファ搾油残渣に含まれる天然抗酸化物質は、ジャトロファバイオディーゼルの酸化防止剤として利用が期待される。1.抗酸化物質の単離・同定、2.化学合成、3.粗酵素反応は、当初の研究計画通りに進行した。また、4.油脂安定性試験についてはも研究が進行し、ジャトロファ搾油カスに含まれる抗酸化活性物質をバイオディーゼル燃料の酸化防止剤として有効利用できる可能性を示せた。1.代謝解析:粗酵素実験の結果を踏まえ、二重標識したケイヒ酸、カフェ酸を用いた生合成経路の解析を行う。2.化学合成:カフェ酸を西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素、あるいは炭酸銀を用いて脱水素重合を行い、カルボキシル型リグナン・ネオリグナン類を得る。さらに、これらを還元させることによりカテコール型リグナン・ネオリグナン類のアルデヒド体の化学合成を行う。3.抗酸化物質の構造活性相関:化学合成した抗酸化リグナン・ネオリグナン類は、同様に抗酸化活性試験を行い、官能基と抗酸化活性について構造活性相関を評価する。さらに、抗酸化物質とDPPHを反応させた後にNMRを測定し、ラジカルを消去する際の化学構造の変化を明らかにする。4.抗酸化物質の定量実験:単離・同定した抗酸化物質についてHPLCによる定量方法を確立し、種子、植物体、殻などに含まれる含有量を測定する。また、地域や栽培条件によって含有量に変化があるのかについて検討を行う。バイオマス化学1.代謝解析:前年度の未熟種子を用いた結果を踏まえ、二重標識したケイヒ酸、カフェ酸を用いて生合成経路の解析を行う。前年度の代謝解析が上手く行かなかった場合には、放射性同位元素(14C)でラベルした前駆体を用いた方法で行い、研究水準は維持する。2.化学合成:カフェ酸を西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素、あるいは炭酸銀(アセトンートルエン中)で脱水素重合させ、カルボキシル型リグナンを得る。さらに、これを還元させることによりカテコール型リグナンのアルデヒド体の化学合成も行う。3.抗酸化物質の構造活性相関:単離・同定した抗酸化物質は、メチル化、アセチル化等を行って水酸基を保護し、同様に抗酸化活性試験を行う。抗酸化物質の官能基と抗酸化能について構造活性相関を評価する。さらに、抗酸化物質と安定ラジカルであるDPPHを反応させた後にNMRを測定し、抗酸化物質がラジカルを消去する際の化学構造の変化を明らかにする。
固結力が小さな地山内のトンネルの地震時破壊挙動とその対策法に関する研究

地震時においてトンネル被害が想定される比較的固結力が小さな地山を対象として、(1)地震動に伴うせん断変形を受ける土被りが小さなトンネル、(2)地震により大きな地圧を受けるトンネル、(3)下部基盤層の断層変位に伴う変形を受ける堆積地盤中のトンネル、の地震時挙動を調べるための各種模型実験手法を開発し、それを用いた実験と数値解析を行うことにより、地震時のトンネル構造部と地盤の相互作用を含めた地震時安定性を明らかにするとともに、その耐震補強法の提案を行った。この実験では,一心円馬蹄形断面の都市トンネルを対象に覆工土圧,覆工曲げモーメントの初期分布,及び,地震を模擬した地盤のせん断変形履歴によるその分布の変化,また,そのせん断変形に伴うトンネル覆工の変形について地盤の緩みの有無が与える影響を遠心場静的せん断模型実験を行い検証した。模型地盤は乾燥砂地盤と,弱い固結力を持つ洪積砂礫層または堆積軟岩を模擬したセメント改良土地盤を対象とした。その結果,以下の結論を得た。・本研究の実験装置では,地表中央部まで入力変位は完全には伝達されない。土被り3D地盤において土槽枠水平変位の57割程度,1D地盤においては,13割程度しか変位が伝達されず,土被りが低くなるほど変位が伝達されにくくなる傾向がある。・トンネル覆工側壁部とインバートの接合条件をピン構造にすることで,せん断時発生曲げモーメントは多少大きくなるが,端部のモーメントを大幅に低減できる可能性がある。・乾燥砂地盤とセメント改良土地盤の相違点は,比較しうる因子が多く,また,それらが相互に関係しているので一概には理由付けできないが,以下の傾向がえられた。モーメントの初期分布は,セメント改良土のほうが大きい値を示し,モーメントのせん断増分は乾燥砂地盤のほうが大きい。せん断時のモーメントの絶対量は,分布形状が違うもののセメント改良土地盤のほうが小さい。・本実験において,都市NATMの設計において想定している緩み土圧相当の初期条件を再現することができた。また,この緩み土圧はせん断履歴を受け,地盤のアーチ効果が解消されることで解消される。つまり,地震等のせん断履歴により,設計で仮定している初期外力分布が変化する可能性があることを示した。一方で,次年度以降に基盤層の断層変位による固結力が弱い上部地山の変形挙動とトンネル構造物に与える影響の解明するため,遠心模型実験用断層シミュレーターの開発を行った。内陸型大地震において生じる断層変位によって上部の堆積地盤でも大きな変位が生じ,これを横切る地中埋設物等,地中構造物が大きな被害を受ける.このような被害を防ぐために,断層変位を受ける地盤の動きを予測し,その地盤変位と地中構造物の相互作用の理解が必要である.本研究では,遠心模型実験により断層変位にともなう地盤の相対変位を再現し,埋設管の挙動を調べた.本年度は昨年度作成した遠心模型実験用断層シミュレータを用いて,豊浦砂地盤中のステンレス製埋設管模型に対して,遠心加速度50gで断層変位を毎m分2mの速度で与えた。埋設管模型はガス導管程度の剛性を想定しており,管には曲げモーメント計測用のひずみゲージを貼付した。実験中の地盤の変形状況を観測するために,観測用ガラス面近傍のみ色砂を用い層状のパターンを作った。変形は容器全面に地盤変位解析用のデジタルビデオカメラで計測した。実験ケースは逆断層2ケース,正断層1ケースである。逆断層のケースでは,土被り厚40mm(原型寸法2m)で一般的なガス導管径に近い場合と,土被り130mmにさらに上載圧490kPaを与え,大きな土被り圧(およそ30m)を想定した2ケースを行った。正断層ケースでは,土被り厚40mmとしている。以上の実験から,以下の結論を得た。・逆断層の場合,不同沈下幅は上部に行くに従い直線的に増加する,一方,正断層の不同沈下幅は,地盤上部でもそれほど大きくならず,逆断層に比べると幅は著しく小さくなる.・地盤剛性に対する管の相対剛性が小さい場合,変形の及ぶ範囲は狭いが,管には大きなモーメント、曲げ変形が生じる.・相対沈下の幅が狭い場合,同じ土被り圧であっても管には局所的なモーメントが生じ,破壊を生じる可能性が高くなる.内陸型大地震において生じる断層変位によって上部の堆積地盤でも大きな変位が生じ,これを横切る道路,鉄道トンネル,ガス水道管などの地中埋設物等,地中構造物が大きな被害を受ける.このような被害を防ぐために,断層変位を受ける堆積地盤の挙動を予測し,その地盤変位と地中構造物の相互作用の理解が必要である.しかしながら,地盤中の破壊面の伝播,それに伴う変位は多くの要因の影響を受け,極めて複雑である.

そこで本研究では,遠心模型実験により縦ずれ逆断層変位を受ける地盤変形を再現し,断層タイプ,拘束圧,岩盤と堆積層の境界面の摩擦条件が縦ずれ断層の変位進展に与える影響について検討すると共に,その変位を受ける埋設管の挙動を調べた.その結果,以下のような点が明らかになった.即ち,・下部岩盤の断層近くらか最初に生じた断層面は,地盤途中で進展が止まり,新たな断層面が複数が生じ,その発生位置,発生個数によって地盤変形が決まる.・上記逆断層変位における破壊面の伝播は,上載圧力と,岩盤と堆積層の境界の条件の影響を強く受け,上載圧力が大きくなり,岩盤と上部堆積層の境界の粗度が小さな場合は,岩盤の変位に対する地盤の変位が小さくなり,鉛直変位量も小さくなる.・地盤中に生じる不等変位領域の幅は,逆断層変位に比べて正断層変位では狭くなる.また破壊面の傾斜は,正断層変位では急になる.・土被り厚が浅い場合,上記岩盤と堆積層の境界条件の違いが地盤や埋設管に与える影響は少ない.・縦ずれ断層変位の場合,鉛直変位と水平変位が局所的な変化が生じ,埋設管は軸力と曲げ荷重を受け,結果として土被りが浅い場合は座屈に近い破壊形態となる.
hTERTによるがん性幹細胞維持機構の解析

テロメレースの触媒サブユニットであるhTERTがテロメレース活性以外の新規機能を持つ可能性が示唆されていることから、hTERTの新規結合因子の同定とその複合体の生物学的意義の解析を本研究の目的とした。申請時までにhTERTの新規結合タンパク質として核小体GTP結合タンパク質であるNSとそのファミリータンパク質であるGNL3L、クロマチンリモデリング複合体構成タンパク質であるBRG1を同定し、このhTERT新規複合体により、がん幹細胞形質ががん細胞に付加されることを見出していた。そこで本年度の研究では、(1)hTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構のメカニズムの解明、(2)臨床検体を用いたhTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構の解析を研究課題とし実験を行った。(1)の研究課題では具体的に、新規に作製した抗hTERT抗体を使用しIFを行ったところ、11TERTが分裂期の細胞において紡錘糸に局在することを見出したため、紡錘糸が結合する染色体領域であるセントロメアのDNA配列であるAlphoidとヒトのDNAの多くを占めるhHNE1に注目し研究を行った。2009年には転写したRNAと精製したhTERTを使用してRdRp活性を確認するRdRp assayを確立していたが、新しく細胞抽出液を使用したIP-RdRp assayを確立し、上記AlphoidとhLINE1から転写されたRNAがhTERTのRdRp活性の基質となることを見出した。またAlphoid及びhLINE1から転写されるRNAの発現量と同領域のヒストンのメチル化状態が比例することから、hTERTのRdRp活性はヘテロクロマチン状態の形成または維持に関与する可能性が示唆された。(2)の研究課題では、現在までに見出したhTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構を臨床に応用するため、手術検体を用いた解析を行った。独立行政法人国立がん研究センター中央病院婦人腫瘍科との共同研究を行い、卵巣がん、卵管がん、腹膜がんの手術検体を収集し、hTERT複合体構成因子及びがん性幹細胞マーカーの発現解析を行った。その結果、hTER新規複合体の構成因子であるNSとBRG1が共発現しており、ヒトの卵巣腫瘍においてBRG1とNSが複合体を形成し、機能している可能性が示唆された。本年度独立行政法人国立がん研究センター中央病院婦人腫瘍科と共同で臨床検体を使用した研究を中心に行い、研究の成果を日本癌学会学術総会及び日本分子生物学会年会で発表することで、臨床研究特有のプレゼン方法を身に付け、医師とのディスカッションを経験することが出来たため。本研究の課題として(1)hTERTのRdRp活性とヘテロクロマチン形成を介したがん幹細胞維持機構の解析、(2)臨床検体を用いたhTERT新規複合体の機能解析への取り組みが必須であると考えられる。(1)では現在までhTERTのRdRp活性がAlphoid、hLINE1領域のヘテロクロマチン形成に関与することが示唆されているため、両領域のヘテロクロマチン形成のがん幹細胞維持機構への関与を証明する必要があると考えられる。また、(2)では、卵巣腫瘍においてhTERT新規複合体が機能している可能性が示唆されたため、この複合体の発現と生存率、化学療法後の再発の有無について統計学的な解析を行い、臨床的な意味を見出していく必要があると考えられる。そこで本年度では以下の研究課題についての検証を行った。(1)hTERT新規複合体ががん浸潤転移に及ぼす影響の検討:NS/GNL3Lを過剰発現した細胞におけるEMT関連因子の発現及び免疫不全マウスにおける転移能についての検討を行い、NS/GNL3L過剰発現細胞ではEMT関連因子の発現上昇を伴った転移能の亢進が見られることを見出した。また、hTERT及びBRG1の発現抑制によってEMT関連因子の発現が抑制されることを確認した。(2)hTERT新規複合体が放射線療法抵抗性に及ぼす影響の検討:課題(1)と同様にNS/GNL3L過剰発現細胞を用いてclonogenicassayを行い、NS/GNL3Lの過剰発現細胞では放射線療法抵抗性が亢進していることを確認した。(3)hTERT新規複合体がES細胞様遺伝子の発現に及ぼす影響の検討についての検討:課題(1)及び(2)と同様、NS/GNL3L過剰発現細胞を用いて、iPS因子の発現についての検討を行い、NS/GNL3Lの過剰発現によってiPS因子の発現が上昇していることを確認した。これらの結果より、hTERT新規複合体ががん幹細胞形質として報告されている複数の性質に関与することを見出し、hTERT新規複合体のメカニズムの解明ががん幹細胞標的治療の開発に繋がる可能性を持つことが示唆された。

申請時までにhTERTの新規結合タンパク質として核小体GTP結合タンパク質であるNSとそのファミリータンパク質であるGNL3L、クロマチンリモデリング複合体構成タンパク質であるBRG1を同定し、このhTERT新規複合体により、がん幹細胞形質ががん細胞に付加されることを見出していた。そこで本年度の研究では、(1)hTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構のメカニズムの解明、(2)臨床検体を用いたhTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構の解析を研究課題とし実験を行った。(1)の研究課題では具体的に、新規に作製した抗hTERT抗体を使用しIFを行ったところ、11TERTが分裂期の細胞において紡錘糸に局在することを見出したため、紡錘糸が結合する染色体領域であるセントロメアのDNA配列であるAlphoidとヒトのDNAの多くを占めるhHNE1に注目し研究を行った。2009年には転写したRNAと精製したhTERTを使用してRdRp活性を確認するRdRp assayを確立していたが、新しく細胞抽出液を使用したIP-RdRp assayを確立し、上記AlphoidとhLINE1から転写されたRNAがhTERTのRdRp活性の基質となることを見出した。またAlphoid及びhLINE1から転写されるRNAの発現量と同領域のヒストンのメチル化状態が比例することから、hTERTのRdRp活性はヘテロクロマチン状態の形成または維持に関与する可能性が示唆された。(2)の研究課題では、現在までに見出したhTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構を臨床に応用するため、手術検体を用いた解析を行った。独立行政法人国立がん研究センター中央病院婦人腫瘍科との共同研究を行い、卵巣がん、卵管がん、腹膜がんの手術検体を収集し、hTERT複合体構成因子及びがん性幹細胞マーカーの発現解析を行った。その結果、hTER新規複合体の構成因子であるNSとBRG1が共発現しており、ヒトの卵巣腫瘍においてBRG1とNSが複合体を形成し、機能している可能性が示唆された。平成23年度に本研究課題についての研究をまとめ、PNASに筆頭著者として初めて論文を発表し、reviewerからの指摘に答えるための時間管理能力や実験技術の向上に努めたため。また、研究内容においても申請時と比較して臨床への応用を視野に入れるようになり、独立行政法人国立がん研究センター中央病院と共同研究を行い、臨床検体の収集を行う等の新しい方向性を打ち出しているため。本年度独立行政法人国立がん研究センター中央病院婦人腫瘍科と共同で臨床検体を使用した研究を中心に行い、研究の成果を日本癌学会学術総会及び日本分子生物学会年会で発表することで、臨床研究特有のプレゼン方法を身に付け、医師とのディスカッションを経験することが出来たため。今後は以下の2つの研究課題についての検証を行う。(1)hTERT新規複合体によるがん幹細胞維持機構のメカニズムの解明:平成23年度までの研究により、hTERT、BRG1、NS/GNL3LがhTERTのテロメレース活性とは独立した機能を介してがん細胞にがん幹細胞の形質を付加することを見出したため、hTERT及びNS/GNL3Lのメカニズムに注目し検討を行う。
痴呆性疾患における音韻及び意味失語の分離評価法の開発と画像所見との関連の研究

対象患者:DSM-4によるアルツハイマー型痴呆と脳血管性痴呆患者のうち、Ravenの色彩マトリックステストによる重症度評価によって軽度もしくは中度とされた者を各群ともに20-30名選択した。選択方法は、申請者の属する国立精神神経センターおよびその協力機関に、上記病名で入院となった患者を順に無作為登録し、登録に当たっては書面によるinformed consentの手続きをとり、拒絶例については登録しなかった。測定:対象患者に対して音韻意味認知テストバッテリーによって音韻と意味認知の機能的乖離を探索し、mini-maetal scale.Dementia Rating Scaleによる痴呆症状の評価、脳波測定、三宅式記銘力検査を行った。音韻・意味テストバッテリーおよび各種心理テストについては心理士2名に委嘱し、申請者との間で対象患者10名について信頼性検定をあらかじめ行い、ICCで各項目につき0.8以上を得た。心理テストの施行にあたっては施行者には診断を知らせなかった(blind base)。結果:解析:音韻意味認知テストバッテリーの結果の因子分析(Varimax回転)により、漢字の音韻認知と文脈上の意味認知の両機能が分離され、これらの機能の独立性が確認された。ただしクラスター分析の結果からは、両機能のそれぞれの障害の程度による患者群の分離は不良であり、実際の患者類型には他の要因が大きく関与することが示唆された。上記の両機能の障害と、他の痴呆症状、脳波(徐波、α派の出現頻度等)、テスト所見結果との相関については、それぞれが全般的知能との相関、病前知能(教育歴より推計)との相関を有したが、各知能検査の下位尺度との間には有意な相関を見いだし得なかった。音韻意味認知テストバッテリ-の開発のために、予備テストの作成と健常高齢者への施行による信頼性検定を行い、痴呆患者への施行による妥当性検定を行った。(1)漢字サンプルの抽出:漢字の難易度(漢字検定試験の分類に従う)に応じて、漢字のみよりなる2字熟語サンプルを抽出し、それらを同音異義語を持つグループとそれ以外とに分類した。漢字選択については漢字検定試験、文部省の教育指導要領、NHK国語研究所資料等を参考とした。(2)音韻・意味テストバッテリ-(予備の版)の作成:上記漢字サンプルを用いて、a.音韻的認知b.文脈中の意味の認知の検査のために、文例提示による同音異義語との用法区別(例:「教会に行く」と「境界に行く」)および同音語によらない文脈の適切さの区別(例:「布団を干す」と「布団を走る」)に基づき、用例を集積して予備テストバッテリ-を作成した。(3)第1相予備研究:上記予備テストを健常高齢者(60歳以上)143名に試行し、回答の偏りのある項目の補正、削除を行うとともに、Crohnbachのa係数を用いて内的信頼性の検定を行いテストバッテリ-の標準化を行った。(4)第2相予備研究:音韻・意味テストバッテリ-(標準版)の妥当性検定を行った。対象はRavenの色彩マトリックステストによる軽度もしくは中等度の痴呆高齢者28名とした。この段階では診断名は問わず、痴呆の重症度のみによって対象を選択した。同時にmini-mental scale、三宅式記銘力検査を施行し、音韻・意味テストバッテリ-とのあいだの基準連関妥当性を検定した。現在、さらに項目の選択を行い、テストバッテリ-の最終版を作成中である。
継続と文脈の概念にもとづく新しい関係的プログラム意味論

本研究の目的は、「残りの計算」を表す概念である継続(continuation)と、「現在実行中のプログラムのまわりのプログラム」を表す評価文脈(evaluation context)の概念に基づく、新たなプログラミング言語理論の確立である。当年度は前年度までに得られた、call-with-current-continuation(call/cc,継続を操作する演算子の一つ)を持つλ計算(関数型プログラミング言語の理論的体系)のための新たな双模倣(bisimulation,異なるプログラムの等価性を証明する手法の一つ)の理論に続き、評価文脈の概念と密接に関連する、名前呼び(call-by-name)評価と必要呼び(call-by-need)評価の対応に関する研究に取り組んだ。特に、名前呼び評価と必要呼び評価の対応を定理証明支援器で定式化するにあたり、従来よりも扱いが容易な対応関係を考察・着想し、より初等的(操作的)でありながら厳密な証明を得た。また、データの機密度を型として表すセキュリティ型付きλ計算という理論体系において本質的に問題となる条件分岐(if文)の扱いに評価文脈の考え方を適用し、問題を解決する新たな糸口を得た。これらの研究は研究協力者ら(事務上、分担金の配分を必要とせず研究分担者とならない同一研究室の研究者や、研究者番号を持たず研究分担者になれない同一研究室の博士後期課程学生・博士前期課程学生・学部4年生(いずれも研究実施当時)を含む)との共同研究である。Call/cc(call-with-current-continuationの略)とは、「残りの計算」を表す「継続」を取り出して変数に束縛(代入)し、後で呼び出せるようにする言語機能である。具体的構文は言語によって異なるが、例えば42 + (callcc k. k(777) + 13)というプログラムを考えると、callcc kによって取り出される「残りの計算」すなわち「継続」はk(x) = abort(42 + x)なる関数kによってあらわされる。ただしabortはその時点での残りの計算(継続)を捨てて、中の式の計算のみを続ける演算子である。したがって、前述のプログラムはk(777) + 13(ただしkは上述の関数)すなわちabort(42 + 777) + 13すなわち42 + 777と計算される。このように、call/ccは大域脱出(global exit)や命令型言語のgotoないしC言語でいうsetjmp/longjmpのような制御構文を表すことができる強力な演算子であるが、その強力さのため、call/ccを用いたプログラムに関する理論、特にプログラム等価性は困難な問題であった。本研究では研究代表者らによる環境双模倣の理論を発展させ、call/ccを持つλ計算の、文脈等価性(contextual equivalence)に対して健全(sound)かつ完全(complete)なプログラム等価性理論を初めて定義し、複数の自明でないプログラム等価性の例を証明した。本研究は博士前期課程学生との共同研究である。研究計画のとおり、call/ccに関する理論を定義した上、自明でない複数の例を証明することができた。本研究の「具体的内容」を「600字800字で」「できるだけ分かりやすく」「専門用語を多用することは避けて」述べることは不可能なため、一部について述べる。当年度は「継続」を表現する「評価文脈」を用い、名前呼び(call-by-name)と必要呼び(call-by-need)の計算の対応関係(ある種の等価性)を形式化した。継続(continuation)とは計算の途中の時点での「残りの計算」を指す概念であり、評価文脈(evaluation context)によって表すことができる。例えば(1+2)×3という式において、[]×3という評価文脈は、1+2を計算し終わった後の継続を表す。ただし[]は1+2のような部分式が代入される穴(hole)であり、E[1+2]のような記法により、評価文脈の穴に部分式を代入した結果である(1+2)×3等の式を表す。一般に式Mから式Nに1ステップの計算が進む(簡約される)とき、式E[M]も式E[N]に簡約される。評価文脈の定義の仕方により、様々な評価戦略(evaluation strategy)すなわち計算の順序を表すことができる。例えば関数呼び出しの前に引数の値を計算する値呼び(call-by-value)の評価文脈は引数の位置に穴が来ることを許すが、名前呼びでは許されない。評価文脈は、「必要」になったときに式の値を計算する必要呼びの計算の定式化においても重要な役割を果たす。本研究では評価文脈の定義を必要呼びの簡約の定義に埋め込む等の工夫により、名前呼びと必要呼びの対応関係の証明を既存研究より簡潔にし、定理証明器上の形式化を容易にした。本研究は博士前期課程学生(当時)との共同研究である。前年度の成果に加え、当年度も前述の成果等が得られているため。当年度は前年度までに得られた、call-with-current-continuation(call/cc,継続を操作する演算子の一つ)を持つλ

計算(関数型プログラミング言語の理論的体系)のための新たな双模倣(bisimulation,異なるプログラムの等価性を証明する手法の一つ)の理論に続き、評価文脈の概念と密接に関連する、名前呼び(call-by-name)評価と必要呼び(call-by-need)評価の対応に関する研究に取り組んだ。特に、名前呼び評価と必要呼び評価の対応を定理証明支援器で定式化するにあたり、従来よりも扱いが容易な対応関係を考察・着想し、より初等的(操作的)でありながら厳密な証明を得た。また、データの機密度を型として表すセキュリティ型付きλ計算という理論体系において本質的に問題となる条件分岐(if文)の扱いに評価文脈の考え方を適用し、問題を解決する新たな糸口を得た。これらの研究は研究協力者ら(事務上、分担金の配分を必要とせず研究分担者とならない同一研究室の研究者や、研究者番号を持たず研究分担者になれない同一研究室の博士後期課程学生・博士前期課程学生・学部4年生(いずれも研究実施当時)を含む)との共同研究である。引き続き計画にもとづき研究を行う。理由:いわゆる「基金化」の趣旨のとおり、科研費の対象は予測の不可能な基礎研究であり、完全な予算計画は本質的にありえないため。使用計画:国民の血税を年度末に「消化」する等の不適切な行為は決して行わず、引き続き本研究に必要な物品の購入等に用いる。
毒素原性大腸菌の産生する耐熱性エンテロトキシン(ST)の検出用キットの開発

毒素原性大腸菌は、60°C10分の加熱によって失活する易熱性エンテロトキシン(LT)と、100°C10分の加熱によっても失活しない耐熱性エンテロトキシン(ST)の2種類の下痢原因毒素(エンテロトキシン)を産生して、ヒトに下痢を起こす。このうちLTについては、簡易検出法が開発されているが、STの検出法は乳のみマウスを用いる方法しか利用できず、簡易検査法の開発が待望されていた。本研究は、ヒトに下痢を起こす2種類のSThおよびSTpについて、その構造、物理化学的性状、免疫学的性状を明らかにするとともに、それらの基礎データを基にして、簡易検出法を開発することを目的として行ない、以下の成績を得た。1.STh、STpはそれぞれ19個、18個のアミノ酸から成るペプチドであることを明らかにし、それぞれのアミノ酸1次構造を決定した。2.決定したアミノ酸1次構造に従い、STh、STpを化学合成した結果、合成STh、合成STpが天然の標品と同じ生物活性、免疫活性を持つことを示した。3.STh、STpの短鎖アナログを化学合成し、STの生物活性に必須の13個のアミノ酸から成るペプチドを決定した。4.SThに対するモノクローン抗体を調製し、このモノクローン抗体がSThおよびSTpの生物活性を中和するとともにELISA法で同程度に反応することを確かめた。5.合成STを固相に用い、上述のモノクローン抗体を利用したcompetitive ELISA法を開発し、この方法が1ng/ml以上のSTh,STpを検出できることを示した。6.合成STとモノクローン抗体を組合わせたST検出用キットを試作し、これがST産生性大腸菌の検出に有用であることを示した。
張力刺激に対する反応特性からみた血管内皮細胞の異質性

1.各部血管内皮細胞の張力刺激に対する応答性の違いについて切り出した各部の血管片に0-50%の張力刺激を与え、ストレスファイバー(SF)形成能を形態計測学的に調べた。その結果、内皮細胞群は動脈系では3型、静脈系では2型に分類された。一般に動脈系内皮細胞の方が静脈系のそれよりも本刺激に対する応答性は顕著であるが、静脈系においても常に機械刺激を負荷されている可能性の高い部位(肝門脈、子宮静脈、前顔面静脈など)では高いSF形成能が認められた。また、SF形成には動・静脈内皮細胞いずれも約40%の張力が必要であるが、SF発現までに要する時間は静脈系の方が長かった(動脈系:刺激後10分、静脈系:同約40分)。このように本刺激に対する各部血管の内皮細胞の応答性の違いの中身とSF形成に関する難・易血管部位を同定することができた('94.9・第47回日本細胞生物学会シンポジウム発表)。2.血管内皮細胞の張力刺激によるストレスファイバー形成の機構解析本刺激に対するSF易形成系である子宮静脈と大腿動脈の内皮細胞を対象にSF形成における関連要因を探った。まず、Ca^<2+>を除くEGTA処理やストレッチ依存性イオンチャネルの阻害剤であるガドリニウム処理によりSF形成は著しく抑えられた。SF形成に外液からのCa^<2+>流入が必要であることを示唆するが、単に細胞内にCa^<2+>が入るのみでは不十分であることがイオノフォアA23187を用いた実験で明らかにされている。Ca^<2+>流入以外でSF形成に必要な因子を求めたところ、チロシンキナーゼの関与がその阻害剤を用いた解析より強く示唆された。この際、やはり阻害剤を組み合わせた実験よりセリン、スレオニン系キナーゼがSF形成に深く関与している可能性は低いと思われた。これらのことから、内皮細胞のSF形成には張力刺激によって細胞内にストレッチ依存性イオンチャネルを介してCa^<2+>が入ること、およびこの刺激によってチロシンキナーゼが活性化されることの両方が必要であると考えられる。