hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射性同位体を全く使用しない細菌生産速度測定法の開発と確立

本研究は、安定同位体である質量数15の窒素でラベルしたデオキシアデノシン(15N-dA)を、水圏環境中の自然細菌群集に取り込ませ、その取り込み量を液体クロマトグラフィ質量分析計により測定することで、放射性同位体を全く使用しない細菌生産速度測定方法を開発・確立することに、国内外で初めて成功した。15N-dA法による細菌生産速度は、放射性同位体を使う従来法であるチミジン法と顕著な正の相関を示した。本研究では、安定同位体である質量数15の窒素でラベルしたデオキシアデノシン(15N-dA)を用いて、湖沼及び海洋の自然細菌群集に取り込ませ、その取り込み量を測定することで細菌生産を見積もることを目的とした。2013年度は、既存の細菌生産測定法である、放射性同位体を用いたチミジン法(3H-TdR)との比較を、霞ヶ浦の湖水及び相模湾の海水を用いて実施した。3H-TdR法と15N-dA法は、霞ヶ浦及び相模湾のそれぞれ4地点から試水を採取し実験に用いた。培養条件は、培養温度を10°C、15°C、20°C、25°C、30°Cの5条件に設定し、3H-TdR及び15N-dAをそれぞれ最終濃度50 nMになるように添加して5時間培養した。その結果、3H-TdR及び15N-dAの取り込み速度(pmol/L/h)は、海洋のサンプルでも湖沼のサンプルでも有意な関係を示したことから、既存の細菌生産測定法との互換性が確認され、15N-dA法による細菌生産測定法の有効性が示された。海洋では15N-dAの取り込み速度は3H-TdRと比べて高い値を示し、湖沼ではその逆の傾向を示した。バクテリアの分類群によって、外部から取り込んだヌクレオシドをDNA合成へ使用できる能力の多寡が報告されている。また、TdRとdAは水中ではそれぞれ負、正に帯電すると考えられるため、試水へ添加した際に懸濁・溶存物質への吸着などによりこれら基質の可用性が異なり、細菌の取り込み速度の違いをもたらすかもしれない。今後は、バクテリアの分類群による取り込み能の違いなどの生物学的側面と、基質の水中での可用性の違いなどの物理化学的側面の両面から、15N-dAと3H-TdRの取り込み速度の違いをもたらしたメカニズムを明らかにする必要がある。本研究では、安定同位体である質量数15の窒素でラベルしたデオキシアデノシン(15N-dA)を用いて、水圏環境中の自然細菌群集に取り込ませ、その取り込み量を測定することで細菌生産を見積もることを目的とした。2014年度は、既存の細菌生産測定法である放射性同位体を用いた、DNA合成速度を見積もるチミジン法(3H-TdR)及び、タンパク質合成速度を見積もるロイシン法(3H-Leu)との比較を、相模湾沿岸域の海水を用いて実施した。実験は、採取した海水に、15N-dA、3H-TdR、3H-Leuをそれぞれ最終濃度50 nMになるように添加し、10°C、15°C、20°C、25°C、30°Cに設定したインキュベータ内において数時間培養を行った。その結果、15N-dAは0.62-1.8 ×102 pmol L-1 h-1、3H-TdRは0.31 3.2 ×102 pmol L-1 h-1、3H-Leuは4.2-8.4 ×102pmol L-1 h-1の取り込み速度を示した。また、15N-dAと3H-TdRまたは3H-Leuの取り込み速度は、それぞれ有意な正の相関を示し([15N-dA] = 0.55 ×[3H-TdR]-4.1; n = 20, r = 0.99, p < 0.001、[15N-dA] = 0.051 ×[3H-Leu]-0.35; n = 18, r = 0.99, p < 0.001)、15N-dA法において、既存の放射性同位体で測定されるDNA合成速度(3H-TdR)及びタンパク質合成速度(3H-Leu)を正確に見積もることが可能であることが示唆された。15N-dA法は、3H-TdR法と同じくDNA合成速度を見積もる方法であるが、それらの取り込み速度の線形回帰の傾きは1を下回った(0.55)。生物学的な原因として、細菌の細胞外ヌクレオシドを原料としてDNA合成を行う能力の有無などが考えられ、方法論的な原因として、3H-TdR法における放射性同位体の非特異的標識などによる取り込み速度の過大評価などが考えられる。

結果として、海水サンプルに対しては、放射性同位体を全く使用しない細菌生産速度測定法が開発されたと言える。現在、当該測定法に係る論文投稿・審査中である。水環境工学本研究では、安定同位体である質量数15の窒素でラベルしたデオキシアデノシン(15N-dA)を用いて、湖沼及び海洋の自然細菌群集に取り込ませ、その取り込み量を測定することで細菌生産を見積もることを目的とする。2013年度は、既存の細菌生産測定法である、放射性同位体を用いたチミジン法(3H-TdR)との比較を、霞ヶ浦の湖水及び相模湾の海水を用いて実施した。3H-TdR法と15N-dA法は、霞ヶ浦及び相模湾のそれぞれ4地点から試水を採取し実験に用いた。その結果、3H-TdR及び15N-dAの取り込み速度(pmol/L/h)は、海洋のサンプルでも湖沼のサンプルでも有意な関係を示した。従って、既存の細菌生産測定法との互換性が確認され、15N-dA法による細菌生産測定法の有効性が示された。したがって、本研究の目的の半分以上は達成されたと思われる。海洋では15N-dAの取り込み速度は3H-TdRと比べて高い値を示し、湖沼ではその逆の傾向を示した。バクテリアの分類群によって、外部から取り込んだヌクレオシドをDNA合成へ使用できる能力の多寡が報告されている。また、TdRとdAは水中ではそれぞれ負、正に帯電すると考えられるため、試水へ添加した際に懸濁・溶存物質への吸着などによりこれら基質の可用性が異なり、細菌の取り込み速度の違いをもたらすかもしれない。今後は、バクテリアの分類群による取り込み能の違いなどの生物学的側面と、基質の水中での可用性の違いなどの物理化学的側面の両面から、15N-dAと3H-TdRの取り込み速度の違いをもたらしたメカニズムを明らかにする必要がある。次年度使用額が発生した理由は二つある。(1)ブロモデオキシウリジン(BrdU)法に使用する化学発光装置の基盤ユニットが故障し修理不可能と診断され、修理に200万円強かかることは判明したため、当該装置の使用を諦めたため;(2)使用している実験施設においてアスベスト除去工事が実施され約半年近く、まともな実験ができなかったため。以上の理由により、次年度に研究費を繰り越すことが妥当と判断した。なお、BrdU法のための化学発光装置については、所外の研究協力者の保有する同一機器を、限定的ではあるが、使用できることになった。現状ではBrdU法関係の測定を頻度高く実施できないため、15Nデオキシアデノシン(15NdA)法に重点を置き、当該法に係る研究・測定を集中的に実施する計画である。当該計画の遂行のために次年度使用額を実験用消耗品と人件費に充てる。
日本国債の需給関数の推計

2001-2016年の月次データに基づき日本の新発国債(2・5・10・20年債)の需給関数の同時方程式システムを推計,日銀の量的緩和政策のイールドカーブへの影響を分析した.需要関数はいずれも日銀の量的緩和の前後で自己・交差弾力性に変化が見られ,構造変化の発生が確認された.構造変化前はいずれの年限でも利回りに対する弾力性は有意に0と異なることはなく非弾力的であった.中でも,2・5年債の需要関数では自己弾力性は正に,交差弾力性は負となるなど変化が見られたが,10・20年債の弾力性は非弾力的なままで変化はなかった.これらの推計結果は,日銀の量的緩和政策実施により2・5年債投資家には当座預金という代替資産での運用の道が開けた結果,利回りが大きく低下すれば当座預金に資金が流れ国債需要が減退したことを示している.一方,10・20年債投資家にとっては代替資産での運用は殆ど存在しない状況が続いていることを示す.換言すれば,中短期債では顧客効果(clientele effect)は弱まり,結果的に利回りの低下幅は抑えられた.長期債や超長期債では根強い顧客効果の結果,利回りの低下幅は大きなものとなった.低金利に喘ぐ日本国債投資家が直面する課題は,それぞれの許容リスクの範囲で国債に代わる代替資産が極めて限られる(殆ど存在しない)というものである.日銀の量的緩和がイールドカーブに与えた影響は,中短期利回りが当座預金という代替資産の登場によって低下幅が比較的小さかった一方,長期利回りの低下幅が大きなものとなった.1)同時方程式推計においては,金融政策に係る操作変数の選択が非常に重要な役割を担っていることが分かった.2)構造変化のタイミングを検出する推計手法を取り入れることにより,日銀の量的質的緩和政策導入の前後で国債投資家の行動の変化が変化し,変化の内容も年限によって大きく異なることが分かった.3)国債の弾力性のみならず,当座預金や他の代替資産による交差弾力性を推計することによって,国債投資家の行動に大きな影響を与えるのは,代替資産の有無や代替可能量であることが分かった.量的緩和のイールドカーブに対する影響の本質は,当座預金という代替資産の投入といえる.2018年秋の日本経済学会にて報告した.主要な推計結果は概ね明らかになった.今後は推計結果の堅牢性のチェックにも注力し,英文論文を仕上げて投稿したい.日本国債の発行残高は890兆円に達しており,その需給によって決定される利回りは日本経済に大きな影響を与える.しかし,これまで長期金利の決定メカニズムに関する分析は殆ど行われていない.2017年度は2段階最小二乗法(2SLS)により2・5・10・20年債それぞれについて需給関数を推計した.その結果,次のような事実が明らかになった.(1)供給関数は非弾力的.(2) 2・5年債需要の利回りに対する自己弾力性は大きく,特に2年債のそれは2013年の日銀による量的質的緩和政策導入以降大きく上昇した.(3)10・20年債の自己弾力性は小さく,外生的ショックは大きな利回り変動を引き起こす.債券利回りの特徴は,隣接する年限間で金利裁定が働くことによって滑らかなイールドカーブが形成されることである.研究によって,自己・交差弾力性の果たす役割の解明が進展した.即ち,(4)自己弾力性が小さく交差弾力性の負値が大きければ強力な金利裁定が働くが,(5)中短期債では裁定はあまり働かず,(6)中短期債と長期債の間では殆ど働かないなど年限間の金利裁定機能は概して弱い.こうした弾力性の特徴は金融政策の有効性に大きな影響を与える.(7)政策金利引き上げは中短期債投資家の金利リスクに対する懸念を刺激し利回りを引き上げるが,その影響は長期債には波及しにくい.他方,(8)量的緩和は自己弾力性の低い長期債では大きな利回り低下を引き起こすが,中短期債では僅かな低下に止まる.(9)こうした弾力性を考慮することによって,最適な量的緩和政策を策定することが出来る.このように,需給関数を推計することによって得られた弾力性の特性を解明することによって,金融政策の有効性を評価出来るようになった.研究は概ね順調に進捗している.(1)2SLSによる推計では,日銀による国債買入額を外生変数として取り込むことで良好な推計結果を得た.(2)推計の過程で,弾力性が時期によって大きく変化することが分かり,弾力性の構造変化も考慮した.(3)自己・交差弾力性の組み合わせによる金利裁定の効き方の違いも明らかにした.(4)金融政策の効果を弾力性に関連付けることにより,その問題点を明らかにした.これまでの分析結果をまとめ,2018年9月の日本経済学会秋季大会報告に投稿した.2001-2016年の月次データに基づき日本の新発国債(2・5・10・20年債)の需給関数の同時方程式システムを推計,日銀の量的緩和政策のイールドカーブへの影響を分析した.需要関数はいずれも日銀の量的緩和の前後で自己・交差弾力性に変化が見られ,構造変化の発生が確認された.構造変化前はいずれの年限でも利回りに対する弾力性は有意に0と異なることはなく非弾力的であった.

中でも,2・5年債の需要関数では自己弾力性は正に,交差弾力性は負となるなど変化が見られたが,10・20年債の弾力性は非弾力的なままで変化はなかった.これらの推計結果は,日銀の量的緩和政策実施により2・5年債投資家には当座預金という代替資産での運用の道が開けた結果,利回りが大きく低下すれば当座預金に資金が流れ国債需要が減退したことを示している.一方,10・20年債投資家にとっては代替資産での運用は殆ど存在しない状況が続いていることを示す.換言すれば,中短期債では顧客効果(clientele effect)は弱まり,結果的に利回りの低下幅は抑えられた.長期債や超長期債では根強い顧客効果の結果,利回りの低下幅は大きなものとなった.低金利に喘ぐ日本国債投資家が直面する課題は,それぞれの許容リスクの範囲で国債に代わる代替資産が極めて限られる(殆ど存在しない)というものである.日銀の量的緩和がイールドカーブに与えた影響は,中短期利回りが当座預金という代替資産の登場によって低下幅が比較的小さかった一方,長期利回りの低下幅が大きなものとなった.1)同時方程式推計においては,金融政策に係る操作変数の選択が非常に重要な役割を担っていることが分かった.2)構造変化のタイミングを検出する推計手法を取り入れることにより,日銀の量的質的緩和政策導入の前後で国債投資家の行動の変化が変化し,変化の内容も年限によって大きく異なることが分かった.3)国債の弾力性のみならず,当座預金や他の代替資産による交差弾力性を推計することによって,国債投資家の行動に大きな影響を与えるのは,代替資産の有無や代替可能量であることが分かった.量的緩和のイールドカーブに対する影響の本質は,当座預金という代替資産の投入といえる.2018年秋の日本経済学会にて報告した.国債需給関数の推計の最大の成果は,イールドカーブ形成における弾力性の役割を明らかにしたことであった.弾力性については,(1)中短期債では自己弾力性が大きく,長期債では小さいという基本特性がある.これは年限毎に投資家の金利リスクに対するスタンスが異なることを反映したものと考えられる.(2)交差弾力性は全般に年限間の代替性が低いことを示している.これは分析対象期間(2001-16年)が低金利であることに起因すると考えられる.弾力性はその時々の金融・投資環境によって変化するが,弾力性の変化の背後にある要因を解明することは興味深い課題である.今後の研究の方向の第1は,各年限の弾力性と投資家行動の関連を明らかにすることであり,第2はより長期の需給関数を推計することにより,金利水準と弾力性の関係を明らかにすることである.併せて,1990年代の金融政策のイールドカーブへの影響も明らかにしたい.主要な推計結果は概ね明らかになった.今後は推計結果の堅牢性のチェックにも注力し,英文論文を仕上げて投稿したい.昨年度は論文作成までには至らず,学会発表や他大学等での発表する機会が少なかった.今年度は日本経済学会秋季大会での発表が決まっており,国内外で発表を進めると共に,有力ジャーナルへの投稿の準備を進める計画である.研究は進捗したものの,海外での研究発表をするまでには至らず,旅費の支出が少なかったため.今年度については,論文の中身が略確定したことから,質の高い英訳を行い,ジャーナルへの掲載を目指す.同時に,内外の大学,研究機関での報告を行い,論文の質を高める予定である.
フォトトロピンファミリーが制御する葉緑体定位運動のシグナル伝達の解析

緑色植物の葉緑体は、光環境に合わせてその位置を変えている。この現象は、フォトトロピンファミリーが関与していることが知られている。種子植物ではフォトトロピンを介して青色光により制御されており、ホウライシダやヒザオリではフォトトロピンとともにフィトクロムとフォトトロピンのキメラタンパク質であるネオクロームがその光受容体として機能していると考えられている。本研究では、これらフォトトロピンファミリーの機能解析を行った。大腸菌はネオクロムの発色団ファイトクロモビリンは合成できない。そこで、ホウライシダ、シロイヌナズナ、藍藻のHO1とHY2,PCYAの遺伝子を組み合わせ、ファイトクロモビリンまたはファイコシアノビリンを合成する組み換え大腸菌を作出した。この大腸菌において、ホウライシダまたはヒザオリのネオクロム光受容領域を合成し、分光測光をおこなった。その結果、ホウライシダのネオクロムはフィトクロムおよびフォトトロピンの両者の光受容領域で光を吸収することができるが、ヒザオリのネオクロム光受容領域はフォトクロム領域でしか光受容できなことがわかった。また種子植物のシロイヌナズナでは、遺伝子型の解析からフォトトロピンはその発現量に依存して生理反応が応答することがわかった。数百個体の形質転換植物を使って、葉緑体逃避運動・花茎の光屈性・葉の伸展度合いを調べた。前者2形質に関しては、phot2の発現が増えるとその反応は大きくなることがわかり、同程度の光強度の時はphot2の蓄積量が増えると、葉緑体の逃避速度が増し、より花茎が屈曲した。しかし、イムノブロッティング解析の検出限界濃度以下でも葉はほぼ完全に伸展したので、発現量と明確な相関関係は認められなかった。つまり、phot2が必要とする発現量は、生理現象に依存して異なることがわかった。ホウライシダは、胞子発芽、原糸体の伸長・光屈性、細胞分裂のタイミング制御、葉緑体光定位運動等の生理現象、フィトクロムで制御されていることが知られており、3つのフィトクロム遺伝子が同定されている。そのうちphy3が光屈性と葉緑体光定位運動を制御するフィトクロムであることは同定されているが、他のフィトクロムがどの生理反応を制御するは不明である。一方、ホウライシダからフィトクロムを部分精製し分光学的特性を調べられたが、測定された分子種は判っていない。そこで、シダ植物におけるフィトクロムの機能や生化学的性質の全体像を明らかにすることを最終目標とし、本年は大腸菌によりシダフィトクロムを再構築系の開発を行った。これまでシダ植物からはフィトクロム発色団合成関連酵素は得られていないので、ホウライシダからシロイヌナズナのAtHO1,AtHY2に相同な遺伝子AcHO1,AcHY2をクローニングした。ホウライシダ、シロイヌナズナ、藍藻のHO1とHY2,PCYAの遺伝子を組み合わせ、ファイトクロモビリンまたはファイコシアノビリンを合成する組み換え大腸菌を作出した。この大腸菌内でphy3発色団領域を発現させると、ホウライシダかシロイヌナズナのHY2の場合669nmにピークを持つ部分フィトクロムが作れたが、PCYAでは656nmだった。これらの結果は、ホウライシダでもシロイヌナズナ同様、発色団としてファイトクロモビリンを利用していることを示唆している。さらにLOVドメインを含む領域を発現回収し、吸収スペクトルを測定したところ、FMN特有の吸収を確認できた。フォトトロピンファミリーの光受容部位を大腸菌内で発現させ分光学的測光を行った。その中でも、緑藻植物ヒザオリの受容体であるネオクロームとフォトトロピン、およびフィトクロムで行った。

2つのフォトトロピンのLOVドメインは、典型的な光吸収反応を示した。また光励起の状態の暗反転の速度は、photAで1/10になるのに約3分であり、photBで15秒程度であった。一方、ネオクロームのフィトクロムドメインはファイトクロモビリンとも結合しその吸収スペクトルは葉緑体定位運動の作用スペクトルと酷似していた。しかしながらLOVドメイン様領域はフラビンの結合は観察されなかった。そこでこのLOVドメインの機能を調べるためにゲル濾過による多量体形成を調べると、フィトクロム領域までは単量体として確認できるが、LOVドメイン様領域を含む融合タンパク質は多量体(4量体)として存在している可能性を認めた。つまりフラビンの結合がなくてもネオクロムのLOVドメイン様領域は多量体形成に機能していることを示唆している。一方ホウライシダのフィトクロム3もネオクロムと同等のドメイン構造を持っている。しかし、LOVドメインはフラビンが結合しており、光吸収能が確認できる。しかし、フィトクロム領域とLOVドメインとの間には光学的相互作用は確認できない。つまりエネルギー転移などはなく独立した光吸収領域と思われる。一方、フィトクロム領域は典型的な青色・遠赤色光可逆性を示す。この光強度反応曲線は、これまで知られていた原糸体の光屈性と一致する。このことから青色光で誘導される原糸体の光屈性はフィトクロム領域を介した反応であることを示唆する。これまでの研究成果により、遺伝子型の解析からフォトトロピンはその発現量に依存して生理反応が応答することがわかった。そこで数百個体にもおよぶphot2形質転換植物を作成し、それぞれの発現量をイムノブロッティング解析を行い、発現量の異なる植物体群のプールを作成した。この形質転換植物を使って、葉緑体逃避運動・花茎の光屈性・葉の伸展度合いを調べた。前者2形質に関しては、phot2の発現が増えるとその反応は大きくなることがわかり、同程度の光強度の時はphot2の蓄積量が増えると、葉緑体の逃避速度が増し、より花茎が屈曲した。しかし、イムノブロッティング解析の検出限界濃度以下でも葉はほぼ完全に伸展したので、発現量と明確な相関関係は認められなかった。つまり、phot2が必要とする発現量は、生理現象に依存して異なることがわかった。また世界中の野生株のphot2遺伝子型と葉緑体光逃避運動の運動速度を測定した。その結果、phot2の遺伝子多型は、2つのタイプに分類され、氷河期前に地理的に分離し、独立して遺伝子の変異が蓄積されたことがわかった。しかしながら、これらの多型に依存した形質は認められなかった。一方で、葉緑体光集合運動の情報伝達因子と考えられるJAC1遺伝子付近のゲノム解析により、JAC1遺伝子は2つの遺伝子群に分けられた。このうち、N端側にのみpolymorphismsが認められたが、C端側にはほとんどなかった。さらにN端側上流のpolymorphismの頻度はJAC1遺伝子と一致し、C端側下流ではほとんど認められなかたが、さらなる下流では多くの変異が認められ、その多型はaccession numberと一致している。
平均場理論に基づく3次元太陽全球ダイナモモデルの開発

本研究の目的は、磁場生成から黒点形成・消失までの一貫した計算を可能にする『3次元太陽全球平均場ダイナモモデル』を開発することである。今回開発するモデルは、その3次元性と現実的乱流起電力(太陽内部熱対流の直接数値計算の結果に基づく)をダイナモ効果として実装する点に独自性を持つ。次期極小期の極域磁場の強度分布を初期条件に、次期サイクルの太陽活動予測を行うことが本研究の目標である。平成30年度は熱対流に起因した乱流輸送のモデル化(具体的には乱流アルファ効果と乱流磁気拡散、そして乱流パンピング効果のモデル化)を行うための、太陽熱対流に関する基礎研究を実施した。本研究の結果、以下の3点を明らかにした:1.局所駆動型と表層冷却駆動型の熱対流を比較すると,後者の方が現実の太陽表面で観測される速度スペクトルと整合的2.冷却駆動型の熱対流による輸送は,表層で間欠的に発生する冷却プルームによって支配されており,勾配拡散型のモデルでは適切に記述できない3.冷却プルームの伝搬とその周囲の物質との混合エントレインメント過程は,微視的拡散係数の大きさや計算解像度に依存以上の成果は,天文学会2019春季年会で口頭発表された。本研究成果については,現在論文を執筆中である。当初の計画では,輸送係数のモデリングは,混合距離理論や勾配拡散型の輸送理論にもとづき行う予定であったが,平成30年度に実施した研究で,太陽の熱対流が表層冷却型である場合,その輸送は勾配拡散型のモデルでは適切に記述できない可能性があることがわかった。そのため,新たに「冷却プルームの物理的性質,特にその微視的拡散係数に対する依存性」を調べる当初計画にはなかった研究を実施したため,研究の進捗が当初の計画からやや遅れている。平成30年度に追加して行った「冷却プルームの伝搬」に関する研究の結果,太陽のようなプラントル数の非常に小さい天体では,プルームによる物質のエントレインメントは,表層部のみに影響を及ぼす可能性が高いことがわかった。この結果は,太陽対流層の深部では,従来の勾配拡散型の理論で乱流輸送が記述できる可能性を示唆する。よって今年度は,これらの研究結果に基づき,まず太陽対流層深部に注目し乱流起電力のモデル化を試みる。さらに,観測から得られている太陽内部の差動回転分布と子午面流分布を全球モデルに組み込むことで3次元の平均場モデルを完成させる予定である。
オペラント行動の発現に側坐核コアの神経伝達が果たす役割

動物の選択行動にはマッチングの法則と名付けられた規則性が見出されている。本研究では、この法則に従った行動(マッチング行動)の発達に、前脳深部の側坐核コア領域がどのように関与しているのかを調べるため、コアを破壊されたラットにおけるマッチング行動の発達を調べた。その結果、コア破壊群のラットではマッチング行動の発達が亢進すると共に、片方のレバーから他方にレバー押しを交代する頻度が低下していることを見出した。この結果から、コア破壊はレバー押しの交代反応の頻度を低下させるために、マッチング行動の発達を早めている可能性が示唆された。動物の選択行動は目的を果たすための重要な手段で、その場の状況判断に学習経験がつけ加わることで、より洗練された適切な行動を取れるようになる。しかし、学習の繰り返しが選択行動の発達に果たす役割については具体的な解明は進んでいない。そこで本研究では、学習の繰り返しが選択行動の発達に及ぼす影響の程度を明らかにすると共に、それに関わる脳部位を見いだすことによって、選択行動の発達をうながすしくみの解明をめざした。動物の選択行動には、過去の研究からマッチングの法則と名付けられた規則性が見いだされていて、二つの選択肢間の反応頻度の割合は、各選択肢から実際に得た報酬の割合に一致する事が知られている。本年度は、イムノトキシン細胞標的法を用いて側坐核コアでドパミンD2受容体を発現する神経細胞を選択的に除去したラットに、餌を報酬にしたレバー押し反応を学習させて、マッチングの法則に従った行動(マッチング行動)に対照群とどのような違いがあるかを調べた。その結果から、側坐核コアの神経細胞はマッチングの法則の発達に重要な役割を果たすことが示唆されたため、イボテン酸を用いて側坐核コアの神経細胞を除去したラットを新たに作成した。さらにこの動物を用いて、マッチング法則の発達過程を調べるための行動実験系の開発を新たに行い、発達を測定できることを確認した。コアの神経細胞が除去された確認は、神経細胞特異的マーカーのNeuNに対する免疫染色を用いて行った。ある目的を持った動物の行動は常に、その行動と他の目的を持った行動との選択過程を経て遂行されている(例えば闘争-退避の選択など)。また、同一の目的を達するための手段が複数存在する場合もある(例えば採餌場所の選択など)。従って、適切な選択行動は動物がある目的を達するための重要な手段となり、周囲の環境に対する知覚に加えてさらに学習経験を参照することで、より環境に適応した行動を取れるようになる。しかし、学習のくり返しが選択行動の発達に果たす具体的な役割の解析や、それに関わる神経回路メカニズムの解明はあまり進んでいない。そこで本研究では、学習のくり返しが選択行動の発達に及ぼす影響の程度を明らかにすると共に、選択行動の発達に関わる脳部位を見出すことによって、適応的な選択行動がどのように発達するのか、そのメカニズムの解明を目指した。過去の研究から動物の選択行動にはマッチングの法則と名付けられた規則性が見出されていて、二つの選択肢の中からどちらか片方を選ぶ頻度の割合は、それぞれの選択肢をそれまでに選んだ結果得られた報酬の割合にほぼ一致することが知られている。平成24年度の本研究では、マッチングの行動に従った行動(マッチング行動)が発達する過程に、脳内の側坐核コアと呼ばれる領域がどのように関与しているのかを調べる目的で、興奮性神経毒の脳内局所注入によりコアの神経細胞が破壊されたラットを作成した。

このラットに餌を報酬にした二つのレバー押しの選択行動を学習させて、マッチング行動の発達の違いを対照群と比較し、前年度の予備実験で得られた結果の再現性を確認した。その結果、コア破壊群のラットでマッチング行動の発達が亢進し、かつ、二つのレバー間のスイッチング反応の割合も低下していることが明らかになった。この結果を査読のある英文学術誌であるBMC Neuroscience誌に投稿して受理された。側坐核コアのドパミンD2受容体陽性細胞の除去により、マッチング行動の獲得過程に遅れがあることを示唆する結果が得られたが、いったん獲得されたマッチング行動のパラメータは対照群との有意な違いは認められなかった。そのため、新たにコアの神経細胞を非特異的に破壊した動物を作成し、行動の獲得を調べるための新たな行動実験系を確立して解析を行い、興味深い結果が得られつつある。25年度が最終年度であるため、記入しない。側坐核コアの吻側と尾側で破壊の効果が異なる傾向が認められるかも知れないので、そのような場合はさらに吻側のみ、または尾側のみを破壊した動物で効果を比較検討し、機能分化があるかどうかを確かめる。また、側坐核コアに入力するドパミン入力がマッチング行動の発達に及ぼす役割についても検討を加えたい。
粉末焼結積層造形法による高代謝臓器再生用担体の造形および培養に関する研究

代謝速度の速い組織の再構築には,担体内に細かく分岐した流路ネットワークを配置する必要があり,このような構造を持った担体の製作に粉末焼結積層造形法を利用した.本加工法には,材料選択の自由度が高い一方で微細性が低いという問題点があったが,焼結用のレーザのスポット径を市販造形装置の1/2程度に絞ることができる造形装置を開発し,さらに高い空孔率を得るために導入する水溶性フィラの特性が造形物の微細性に与える影響を評価し,その結果を造形状に反映させることによって,従来の造形装置で作製した場合の1/2程度の微細構造を有する担体を製作することに成功した.この担体の内部には最小で500μmの直径を有する微細流路ネットワークが配置されており.このことにより,培養密度の4倍程度の向上が期待できる.レーザスキャナのビーム径を小さくすると,ビームのスキャン可能な範囲が縮小し,結果として造形可能な造形物の大きさが小さくなる.そこで,レーザスキャナ全体をシフトし,造形範囲を拡大する機構とシステムを試作した.この結果,露光範囲を50mm×50mmから,150mm×150mmまで拡大し,大型スカフォールドの造形にも対応可能とした.この装置を用い,実際に流路を有する多孔質体の造形にも成功した.また,担体のスケールアップに伴う酸素供給不足の解消を目指し,ナノカプセル化ヘモグロビン(人口赤血球)を利用する可能性を検討した.肝前駆細胞の培養において試験をしたところ,酸素供給は一定の向上が得られたものの,遊離ヘモグロビンによって引き起こされる毒性の問題を完全に排除することは困難であるという結論を得た.また,流路が配備された担体を用いてヒト肝ガン細胞の灌流培養を行ったところ,細胞の増殖と肝機能の発現において顕著な向上が得られた.さらに,細胞の増殖が流路からおおむね200μmの距離で発生していることから,流路からの最大の距離が200μmとなるような設計が必要であるという知見が得られた.代謝速度の速い組織の再構築には,担体内に細かく分岐した流路ネットワークを配置する必要があり,このような構造を持った担体の製作に粉末焼結積層造形法を利用した.本加工法には,材料選択の自由度が高い一方で微細性が低いという問題点があったが,焼結用のレーザのスポット径を市販造形装置の1/2程度に絞ることができる造形装置を開発し,さらに高い空孔率を得るために導入する水溶性フィラの特性が造形物の微細性に与える影響を評価し,その結果を造形状に反映させることによって,従来の造形装置で作製した場合の1/2程度の微細構造を有する担体を製作することに成功した.この担体の内部には最小で500μmの直径を有する微細流路ネットワークが配置されており.このことにより,培養密度の4倍程度の向上が期待できる.レーザスキャナのビーム径を小さくすると,ビームのスキャン可能な範囲が縮小し,結果として造形可能な造形物の大きさが小さくなる.そこで,レーザスキャナ全体をシフトし,造形範囲を拡大する機構とシステムを試作した.この結果,露光範囲を50mm×50mmから,150mm×150mmまで拡大し,大型スカフォールドの造形にも対応可能とした.この装置を用い,実際に流路を有する多孔質体の造形にも成功した.また,担体のスケールアップに伴う酸素供給不足の解消を目指し,ナノカプセル化ヘモグロビン(人口赤血球)を利用する可能性を検討した.肝前駆細胞の培養において試験をしたところ,酸素供給は一定の向上が得られたものの,遊離ヘモグロビンによって引き起こされる毒性の問題を完全に排除することは困難であるという結論を得た.また,流路が配備された担体を用いてヒト肝ガン細胞の灌流培養を行ったところ,細胞の増殖と肝機能の発現において顕著な向上が得られた.さらに,細胞の増殖が流路からおおむね200μmの距離で発生していることから,流路からの最大の距離が200μmとなるような設計が必要であるという知見が得られた.本研究では,これまでに組織再生技術が実用化されている皮膚などに比べて代謝速度の速い組織を再生のための担体の造形技術と細胞の培養技術の確立を目指す.高代謝速度の組織を再生には担体内に細かく分岐した流路ネットワークを配置する必要があり,このような担体の製作に粉末焼結積層造形法を利用した.本方法は材料選択の自由度が高い一方,微細性が低いという問題点があった.本年度は焼結用のレーザのスポット径を市販造形装置の1/5に絞ることができる造形装置を開発した.また,本研究では担体の材料となるポリカプロラクトンに水溶性のフィラを混合して造形することによって担体の空孔率を高めているが,フィラの特性,例えば材質,粒径,混合率と,空孔率,空孔の大きさ,造形分解能などの関係が明らかになっていなかったが,これらの関係について実験的な検証をおこない,要求される担体の性能を実現できるようになった.また,樹脂およびフィラの熱伝導特性と,光の透過特性が微細性に与える影響を評価した.上記のように作成された10cm^3の担体を用いて,肝ガン細胞株Hep G2を用いて10日間の灌流培養による臓器育成を行った.まず流路有無の影響を調べたところ,流路無しではほぼ全増殖が起こらなかったが、流路を配備することで3倍の増殖を達成した。

さらに,ポリカプロラクトンの低細胞付着性を改善するため,細胞側をビオチンで、担体内部表面をアビジンで修飾し、両者の高親和力を利用して、初期細胞付着性の改善を試みた.アビジン・ビオチン反応と流路有り担体とを用いることで,10日間の灌流灌流培養にて,コントロールに比べて,6倍の増殖を得ることができた。更なる改善を目指し,ナノカプセル化ヘモグロビン添加の可能性検討のため、ラット肝細胞での毒性と効果とを小スケール培養にて調べたところ毒性はなく,酸素供給不足部分への酸素供給を大幅に改善しえる可能性を示すことができた.最小管径生250μm程度の3次元擬血管ネットワーク構造を内部にもち,全体で90%程度の空孔率を有し,さらに生分解性樹脂からなる培養担体を粉末焼結積層造形法により造形することを目的の第1とする.さらにその有効性を実証するため,そこに増殖性の高いブタ胎児肝細胞を播種,大幅な酸素供給量向上が期待できるヘモグロビンベースの酸素供給体を用いた特殊な灌流培養法で臓器をin vitro育成することを第2の目的とする.本年度は,市販の造形装置のビームスポット径が500550μmであるのに対し,350μmのスポット径を有する造形装置を試作した.ビーム系が小さくなることにより,面積あたりのパワーが高くなることから,微細な造形を実現するにはレーザパワーを低減し,重ね合わせ露光を多くすることによって,微細性を大幅に向上できることを見出した.この結果,市販の装置での縦壁の厚さの最小値が900μm程度であるところ,250μm程度の薄い壁まで造形できることが確認できた.また,KClとPCLを混合した粉末をもちいて,1cm^3の容積を持つスカフォールドを造形した.このスカフォールドの内部には最小で500μmの直径を有する微細流路ネットワークが配置されており,造形結果をマイクロCT観察したところ内部に流路が造形されていることを確認した.このことにより,担体あたりの培養密度を4倍程度の向上が期待できる.一般にレーザスキャナのビーム径を小さくすると,ビームのスキャン可能な範囲が縮小し,結果として造形可能な造形物の大きさが小さくなる.そこで,レーザスキャナ全体を,シフトし造形範囲を拡大する機構とシステムを試作した.この結果,露光範囲を50mmx50mmから,150mmx150mmまで拡大し,大型スカフォールドの造形にも対応できるようにした.この装置を用い,実際に流路を有する多孔質体の造形にも成功した.
好中球の情報伝達におけるホスホリパーゼDの役割とその活性化機構

当初計画したホスホリパーゼD(PLD)の活性調節機構について、論文発表には至っていないが、以下のような非常に興味ある新しい知見が得られている。細胞膜透過性細胞と細胞質との再構成系におけるPLDの活性化:ウサギ好中球を[^3H]lyso platelet-activating factorと保温して内因性のPLD基質phosphatidylcholineを標識した後、ストレプトリジン0で処理して細胞質を除去した細胞膜透過性好中球を調製した。この膜透過性細胞をGTPγS/Ca^<2+>/Mg-ATPで刺激してもPLDの活性化が認められなかったが、ラット大脳より調製した細胞質共存下では顕著なPLDの活性化が認められた。この膜透過性細胞と細胞質との再構成系でのPLDの活性化は、GTPγS//Mg-ATPあるいはGTPγS/Ca^<2+>でも認められたが、最大の活性化は三者を必要とした。以上の結果より、ウサギ好中球のPLD活性化は、GTP結合蛋白質、タンパク質キナーゼおよびCa^<2+>依存性因子の三者を必要とすることが示唆された。PLD活性化因子:カルモジュリン(CaM)阻害剤のフルフェナジンを固定化したアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用い、CaMを除去したラット大脳細胞質を調製した。カラムに結合したCaMは、EGTA溶液で溶出した。上述の方法で調製した膜透過性好中球とCaM不含細胞質を再構成すると、GTPγS/Ca^<2+>/Mg-ATPによるPLDの活性化は、CaMを含む細胞質と再構成した場合と比較して顕著に減少したが、カラムから溶出したCaM画分を添加することにより回復した。精製CaMを用いても、CaM画分と同様な効果が認められた。以上の結果から、CaMは少なくとも部分的にはウサギ好中球のPLD活性化機構に関与していることが結論づけられた。当初計画したホスホリパーゼD(PLD)の活性調節機構については、必ずしも思うような成果は得られていないが、以下に示すように、PLDの情報変換酵素としての重要性を示唆する知見が現在までに得られている。(1)スタウロスポリンによるPLDの活性化:ウサギ好中球をプロテインキナーゼCの選択的阻害剤であるスタウロスポリン(ST)とエタノール存在下で保温すると、ホスファチジルコリン(PC)の分解に伴うホスファチジルエタノールの産生が起こり、STがPLDを活性化することが明らかになった。STによるPLD活性化は、百日咳毒素(IAP)により抑制された。さらに、STは、ウシ脳より精製したGo、Gi1およびGi2のGTPase活性を顕著に促進し、この効果もIAP依存的であった。以上の結果は、STがウサギ好中球のPLDと共役しているGTP結合蛋白質を活性化することによりPLDを活性化することを示唆する。(2)2,3ージホスホグリセリン酸によるPLD活性阻害:ウサギ好中球を2,3ージホスホグリセリン酸(DPG)で前処理すると、N-formyl-Met-Leu-Phe(fMLP)刺激によるPLD活性化は、DPGの濃度依存的および処理時間依存的に抑制された。さらに、DPGは、S.chromofuscus由来のPLD活性を拮抗的に阻害した。

これらの結果より、DPGは内因性基質のPCと拮抗することによりfMLPによるPLD活性化を阻害することが示唆される。(3)PLDの好中球機能への関与:STは、PLDを活性化する条件下で、ウサギ好中球の酵素放出反応を誘起したが、活性酸素の産生には影響を与えなかった。一方、DPGは、fMLPによるPLD活性化を阻害する条件下で、fMLPによる酵素放出反応および活性酸素の産生を抑制した。これらの結果から、PLDは酵素放出反応に積極的に関与するが、活性酸素産生の促進にはPLDの活性化のみでは不十分であり、他の情報伝達経路も必要である可能性が考えられる。当初計画したホスホリパーゼD(PLD)の活性調節機構について、論文発表には至っていないが、以下のような非常に興味ある新しい知見が得られている。細胞膜透過性細胞と細胞質との再構成系におけるPLDの活性化:ウサギ好中球を[^3H]lysoplatelet-activating factorと保温して内因性のPLD基質phosphatidylcholineを標識した後、ストレプトリジンOで処理して細胞質を除去した細胞膜透過性好中球を調製した。この膜透過性細胞をGTPγS/Ca^<2+>/Mg-ATPで刺激してもPLDの活性化は認められなかったが、ラット大脳より調製した細胞質共存下では顕著なPLDの活性化が認められた。この膜透過性細胞と細胞質との再構成系でのPLDの活性化は、GTPγS〓Mg-ATPあるいはGTPγS/Ca^<2+>でも認められたが、最大の活性化は三者を必要とした。以上の結果より、ウサギ好中球のPLD活性化は、GTP結合蛋白質、タンパク質キナーゼおよびCa^<2+>依存性因子の三者を必要とすることが示唆された。PLD活性化因子:カルモジュリン(CaM)阻害剤のフルフェナジンを固定化したアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用い、CaMを除去したラット大脳細胞質を調製した。カラムに結合したCaMは、EGTA溶液で溶出した。上述の方法で調製した膜透過性好中球とCaM不含細胞質を再構成すると、GTPγS/Ca^<2+>/Mg-ATPによるPLDの活性化は、CaMを含む細胞質と再構成した場合と比較して顕著に減少したが、カラムから溶出したCaM画分を添加することにより回復した。精製CaMを用いても、CaM画分と同様な効果が認められた。以上の結果から、CaMは少なくとも部分的にはウサギ好中球のPLD活性化機構に関与していることが結論づけられた。
電場応答エラストマーによる波浪発電技術の確立と発電装置の開発

本研究の成果から誘電エラストマー(人工筋肉)波力発電装置の特性は,発電出力が殆ど波浪の周波数に依存せず,どの周波数でも人工筋肉が変形すればそれに応じた発電出力が得られることが明らかになり,これは,従来の波力発電装置と異なり波の静かな海域でも発電が可能であることが明らかになった。即ち,漁港,マリーナ等の補助電力の発電装置として本装置を使用する場合の実用化及び商用化の見通しが明らかになった。研究目的:本研究は誘電エラストマーを適用した人工筋肉を波浪の仕事によって伸縮させることでそのエネルギーを電力に変換するシステムの構築を目指すものである。そして,このような人工筋肉による波浪発電システムの技術を確立することが本研究の目的である。研究内容と成果誘電エラストマーは高分子材でありそのひずみ-反力曲線は非線形である。この特性を材料実験より確認し,その特性を理論計算で考慮する方法をモデル化した。これを基に,周波数領域での簡易的発電ブイ応答計算プログラムと時間領域シミュレータの基本プログラムを開発した。周波数領域での理論計算により,小型ブイの形状や係留索本数および係留索の取り付け位置によって動揺特性を変化させることで,対象海域に適した応答性状に合わせることができた。合わせて,時間領域での運動応答解析を可能とするプログラムを開発した。ただし,上下揺の1自由度にのみ対応しており,今後は6自由度での運動応答解析を可能とすると共に,係留系の非線形影響ならびに,エラストマーの非線形影響と発電効果に伴う運動応答へのダンピング影響を具体的に考慮できるように導入していく。ただし,時間領域解析への誘電エラストマー発電の影響の考慮については既にモデル化を行うことができた。また,実海域実験の予備的実験を実施した。実施海域は下田市の須崎漁港内であり,波浪計測と発電の実証試験を実施した。その結果十数センチの波高,8秒程度の平均波周期の条件下での波浪発電に成功した。これらの成果を基に,次年度に実施するシミュレータの完成と実証試験用(本実験)モデルの設計用データとする。本研究の目的は,電場応答エラストマーによる発電特性を用い,浮体式波力発電装置の開発を行うものである。そのために,電場応答エラストマーの発電特性を把握すると共に,浮体動揺による発電システムを確立させる。平成23年度は上記の目的を達成するために,次の項目の研究を実施した。1)MPS法による浮体動揺シミュレータの開発,2)実海域実験による浮体式発電システムの係留方法の提案と発電特性の把握。発電シミュレータの完成には至らなかったが,強非線形浮体応答モデルでの計算を可能とするツールの開発は行われた。不規則波中での発電特性を把握するためのシミュレータおよび評価ツールの開発には至らなかった。本研究では,波浪中応答に関する基本的な動揺を再現するツールと周波数領域での検討を可能とすることができた。これらを踏まえて静岡県下田市須崎漁港内にて浮体式ブイの波力発電実証試験を実施した。潮位変動に対応させるために,本年度の実験では完全な係留状態を再現した。その方法として,没水平板を海底に触れないように深部に沈め,そこから係留ワイヤーをブイ本体の電場応答エラストマーに接続した。この方法により潮位変動にも追随する浮体システムとすることができた。また,発電出力も得られ,完全なる浮体システムとしての比較的長時間の計測が行われた。平成22年度までの水槽実験の成果から誘電エラストマー(人工筋肉)波力発電装置の特性は、発電出力が殆ど波浪の周波数に依存せず、どの周波数でも人工筋肉が変形すればそれに応じた発電出力があることが明らかになり、これはこれ従来の波力発電装置と異なり波の静かな海域でも発電が可能であることが明らかになった。このことは、平成23年度の静岡県下田市須崎漁港の港内静穏海域での実海域実験で確認されている。実海域実験では、発電出力をコンピュータによる定量的な計測のみ成らず現実的にLEDライトを夜間点灯させ現実に漁港岸壁の補助灯またはマリーナ浮き桟橋の補助灯などに必要な小規模発電等の実用に供し得る発電出力があることを確認した。平成24年度までの研究で小規模発電に供し得る場合、直ぐにでも実用化が可能であることが明らかになった為、マリーナ、漁港等の浮き桟橋の補助灯としての実用化及び商用化を目指してドルフィン係留された浮き桟橋をイメージした実験模型を作成し、誘電エラストマー波浪発電装置を浮き桟橋に取り付け実験を行った。補助灯の電源として必要な出力を発電することは、十分可能であることが明らかとなった。本発電装置を実用化及び商用化するためには、ェラストマー製造技術を上げることが重であり、とくに所定の発電量を得るためには、ェラストマーの性能を落とすことなく大型する技術及び大量生産技術が重要であると判明した。主たる目的は実海域にて潮位差変動に対応させるための係留方式での実証であった。これをある程度達成できたことが大きい。

24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は数値計算,理論計算ツールを統合していくことが大きな目標である。また,装置の開発としては,より簡便な波力発電装置設置方法を提案し,その具体を示し,実証することである。特に,1基での発電量が把握できているので,複数基にした時の同時発電システムの検証が必要である。これらの予定を実行するために,当初予定していなかった研究員を科研費にて雇用することを考える。実証試験には労力だけでなく,経験が重要となるため,これまでアルバイトで参加した学生を専門の研究員とする。
長崎における戦後と慰霊-原爆、忠魂碑、護国神社

本年度は、資料収集の取りまとめと、原爆の慰霊祭の関係者を中心としたインタビュー、慰霊祭のフィールドワークを行なった。その成果は、「戦後慰霊の公共性-長崎原爆殉難者慰霊祭を中心に」(「宗教と杜会」学会第10回学術大会於関西学院大学)、「死してなお動員される学徒たち-長崎医科大生靖国合祀」(西日本宗教学会第32回学術大会於九州大学)、「慰霊・記念・モニュメント-長崎医科大学の原爆碑群をめぐって」(日本宗教学会第61回学術大会於大正大学平成14年9月15日)という標題でそれぞれ学会発表を行ない、また学術論文として「死してなお動員中の学徒たち-被爆長崎医科大生の慰霊と靖国合祀-」(詳細裏面)をまとめた。また他方で、資料収集やフィールドワークによって得た知見を理論的に整理するための研究も同時に行なったが、その研究成果の一部は、「安丸良夫『近代天皇像の形成』を読む」(民衆・宗教・歴史研究会第11回集会於日本女子大学平成14年7月29日)、パネルディスカッション「国家神道研究と近代仏教研究のあいだ」羽賀祥二氏発題に対するコメンテーター(近代仏教史研究会2002年夏期セミナー於真宗大谷派名古屋別院教化センター、平成14年9月5日)、書評「本康宏史『軍都の慰霊空間-国民統合と戦死者たち』」(詳細裏面)、書評「田中丸勝彦『さまよえる英霊たち-国のみたま、家のほとけ』」(詳細裏面)という形で報告した。
2層クラッド素材による長波長電磁波用高精度金属ミラー製作技術の確立

長波長電磁波用の高精度金属ミラーを、従来からある一般的なNC加工機により低コストで製作するための技術を検討した。通常、切削加工時における製作物の形状誤差は、製作物の固定時に生じる変形、残留歪の解放、切削時の発熱による熱歪など、特に材料の剛性不足の時に顕著になると考えられる。そのため基板材料にセラミクスを用いて素材強度を高め、変形を抑制することを狙った。本課題ではミラー面にアルミニウム合金A5052を、セラミクス基板材料には、アルミニウム合金の熱膨張係数に近いセラミクス素材を選定し、ジルコニアセラミクスを用いた2層クラッド材ミラーの製作を試みた。2層クラッド素材の製作には真空環境下でのミラーの使用を考慮し、真空用接着剤(トールシール)を用いて接着することで製作を行った。製作サイズは、ジルコニア基板50mm×50mm厚み3mm、アルミニウム合金45mm×45mm厚み5mmとした。2層クラッド材の加工抑制効果を確認するために、製作した2層クラッド材およびアルミニウム合金単体を、アルミ合金部分の厚みが2mmとなるまでφ6mmスクエアエンドミルにて平面加工を行った。その結果アルミニウム合金単体の場合の平面度は、X方向30.7μm (RMS)、Y方向11.0μm (RMS)であった。また2層クラッド材の平面度はX方向1.3μm (RMS)、Y方向1.9μm (RMS)であり、2層クラッド材を使用した場合の加工精度改善に大きな有効性が確認された。またR3.0mmボールエンドミルを使用して2層クラッド材に対してミラー形状を模したR90凹面の加工を行い、非接触3次元形状測定装置(NH-3)で形状測定を行った。その結果、曲率演算結果90.12mm、R2乗誤差0.999998となり、良好な曲面形状加工が可能であることが確認された。これまでに2層クラッド材による高精度ミラー製作の前例は無く、この方法の有効性が確認されたことから、加工歪を考慮した加工効率の悪い低負荷な切削条件ではなく、一般の町工場や試作工場において、一般的な加工方法による効率的な製作を可能とすることができるものと思われる。
破骨細胞性骨吸収における小胞輸送関連シグナル伝達分子の発現の解析

本年度の研究テーマは、ホスファチジルイノシトール3リン酸(PI-3 kinase)のインヒビターであるwortomaninn(WT)を培養破骨細胞のメディウム中に添加した場合の小胞輸送関連蛋白であるRab3AおよびRab5A、Srcの局在を免疫光顕法、さらに免役電顕法にてそれらの局在を検索しWT無添加群での破骨細胞における局在と比較の検討であった。本研究を遂行していく上でのパイロットスタディーとして、WT投与における破骨細胞の機能的形態学的変化を同定するために、マウスに濃度1mg/kgのWTを静脈内投与し、骨吸収関連蛋白分解酵素で破骨細胞に特異的に発現するカテプシンKの局在変化を免疫電顕法にて検索した。結果は、WT投与後刷子縁の消失による骨吸収面へのカテプシンKの分泌が抑制され、自身の細胞内への蓄積が観察された。したがって破骨細胞の骨吸収能にPI-3kinaseが一役を演じていることが判明し、平成12年度日本保存学会秋季大会にてこの内容を報告した。本科研の主要テーマである培養破骨細胞における標的小胞輸送関連蛋白の局在について、まずは正常破骨細胞における検索をおこない、Rab3AおよびRab5Aについては免疫光顕法さらに免役電顕法にてそれらの局在が破骨細胞の特徴の1つである刷子縁の膜上さらに細胞内小胞および空胞の膜状に特異的な局在が認められた。一方Srcについては、使用した抗体の性質(モノクローナル抗体)から過去の報告(刷子縁および小胞の膜上)と同じデータの獲得が不可能であった。したがって、今後は使用抗体の性質等の再検討が必要である。またWT添加時のこれら蛋白の局在変化については、Rab3Aに関しては破骨細胞内への集積というデータが得られているが、ほかの分子については現在検討中である。また破骨細胞性骨吸収という観点から国際雑誌に関連研究を論文発表した。(1)ラット長管骨からの破骨細胞の単離とノーザンおよびウエスタン解析によるRab3A,5AのmRNAおよび蛋白の発現の解析について。生後1日のラット長管骨より採取した骨髄を培養プレートに播種し、破骨細胞の単離をおこなった。単離破骨細胞より全RNAおよび全蛋白を抽出し、電気泳動後、メンブレンに転写した。DIG標識オリゴDNAプローブとハイブリダイゼーションまたは抗Rab 3A,5A抗体による免疫反応をおこない、Rab 3A,5A mRNAおよび蛋白のシグナルの検知をおこなった。しかしながら破骨細胞のみの単離は困難であり、またRab3A,5AmRNAおよび蛋白のシグナルの強度が弱かった。破骨細胞を純粋でかつ大量に単離し、さらに抽出するtotal RNAおよび蛋白の量および質の効率化が現在の検討課題である。(2)in situ hybridization法による破骨細胞におけるRab 3A,5A mRNA発現の検索について。4週齢ラットを灌流固定後、脛骨を採取し、4μm凍結切片を作製し、DIG標識オリゴDNAプローブをもちいたin situ hybridization法を施行した。残念ながらRab3A,5AmRNAのシグナルは、弱いか検知することができなかった。したがって現在、プローブの設計の再検討中である。(3)免疫組織化学法による破骨細胞におけるRab 3A,5Aの局在の検索について。蛋白質レベルでのRab3A,5Aの局在を検討するために、灌流固定した脛骨より1μm凍結切片を作製し、抗Rab3A,5A抗体をもちいて、ABC法により検索した。骨組織において、Rab 3A,5Aは破骨細胞において特に細胞内の構造物および刷子縁相当部に局在していた。現在、免疫電顕法を用い、微細構造学的にRab3A,5Aの局在を検索中である。

またWT添加時のこれら蛋白の局在変化については、Rab3Aに関しては破骨細胞内への集積というデータが得られているが、ほかの分子については現在検討中である。また破骨細胞性骨吸収という観点から国際雑誌に関連研究を論文発表した。