hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
色素細胞の肝細胞増殖因子シグナル伝達系におけるプロテインキナーゼCβ分子種の役割

色素細胞における肝細胞増殖因子(HGF)によるシグナル伝達経路をホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3-K)の活性化に焦点を絞り解析した。PI3-Kは85kDの調節サブユニット(p85)と110kDの触媒サブユニット(p110)からなり、その活性化の結果下流のさまざまな重要因子を活性化させる多機能性酵素で、癌細胞の浸潤・転移にも関与するとされているため、PI3-K活性化は黒色腫細胞の動態に大きく影響すると思われる。実験の結果、正常色素細胞、悪性黒色腫細胞ともにHGF刺激によりHGF受容体であるc-Metは活性化されるにもかかわらず、PI3-Kの活性化は黒色腫細胞においてのみ起こることを見い出した。さらに、HGF刺激の際、黒色腫細胞ではp85がGab1(HGFのシグナル伝達に必要な多くの分子をc-Metに集合させる働きをするc-Metのアダプター蛋白)と結合するのに対し、正常色素細胞ではこの結合が起こらないことを確認した。Gab1にはアミノ酸配列上、プロテインキナーゼC(PKC)によって燐酸化されうる部位がいくつか存在することが明らかとなっていることから、PKCによるGab1の燐酸化がGab1の機能に影響を与える可能性を考え、各PKC分子種の遺伝子導入実験を行ったところ、悪性黒色腫細胞で発現欠損がよくみられるβ分子種の細胞内導入は、HGF刺激によるPI3-K活性化を顕著に抑制し、かつGab1の燐酸化状態が正常色素細胞の状態と近くなることを見い出した。以上より、PKCβ分子種は正常色素細胞においてはGab1を燐酸化することによりHGF刺激によるPI3-K活性化を抑制しているが、悪性黒色腫細胞では発現欠損が起こることにより、その抑制が解除され、HGF刺激によるPI3-K活性化が起こることが示唆された。プロテインキナーゼCのα,β,δ,ε分子種の触媒活性欠失体・恒常的活性化体およびホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3-K)のドミナントネガティブ体として働くΔp85(PI3-Kの触媒サブユニットp110とは結合できないがGab1とは結合しうるPI3Kの調節サブユニットp85)に対するアデノウイルスベクターを次の順序で作製した。まず、それぞれの蛋白に対するcDNAをシャトルベクターpAdCMVに組み込み、これをアデノウイルスゲノムのE1及びE3領域を欠くlarge fragment dl7001と共にリン酸カルシウム法で293細胞に同時にトランスフェクトした。293細胞はヒト胎児腎細胞がアデノウイルスのE1領域遺伝子によりトランスフォームして樹立された細胞株で、この細胞株においてはE1遺伝子が発現しているので、細胞内でシャトルベクターpAdCMVとlarge fragment dl7001が相同組み換え(homologous recombination)を起こすと、その組み換えウイルスはE1遺伝子を持たないにもかかわらず、293細胞では野性株と同様に増殖し、かつ目的遺伝子を保持している。目的遺伝子を保持する組み換えアデノウイルスをサザンブロットによりスクリーニング・確認後、精製操作を行い、最終的に高力価の組み換えアデノウイルスベクターを得た。各種色素細胞にそれぞれの蛋白に対するアデノウイルスベクターを感染させた後、ウエスタンブロットを行い目的蛋白の発現を確認した。さらにΔp85については発現した細胞をインスリン刺激した際にPI3-K活性化が抑制されることを確認した。PI3-Kは85kDの調節

サブユニット(p85)と110kDの触媒サブユニット(p110)からなり、その活性化の結果下流のさまざまな重要因子を活性化させる多機能性酵素で、癌細胞の浸潤・転移にも関与するとされているため、PI3-K活性化は黒色腫細胞の動態に大きく影響すると思われる。実験の結果、正常色素細胞、悪性黒色腫細胞ともにHGF刺激によりHGF受容体であるcMetは活性化されるにもかかわらず、PI3-Kの活性化は黒色腫細胞においてのみ起こることを見い出した。さらに、HGF刺激の際、黒色腫細胞ではp85がGab1(HGFのシグナル伝達に必要な多くの分子をc-Metに集合させる働きをするc-Metのアダプター蛋白)と結合するのに対し、正常色素細胞ではこの結合が起こらないことを確認した。Gab1にはアミノ酸配列上、プロテインキナーゼC(PKC)によって燐酸化されうる部位がいくつか存在することが明らかとなっていることから、PKCによるGab1の燐酸化がGab1の機能に影響を与える可能性を考え、各PKC分子種の遺伝子導入実験を行ったところ、悪性黒色腫細胞で発現欠損がよくみられるβ分子種の細胞内導入は、HGF刺激によるPI3-K活性化を顕著に抑制し、かつGab1の燐酸化状態が正常色素細胞の状態と近くなることを見い出した。以上より、PKCβ分子種は正常色素細胞においてはGab1を燐酸化することによりHGF刺激によるPI3-K活性化を抑制しているが、悪性黒色腫細胞では発現欠損が起こることにより、その抑制が解除され、HGF刺激によるPI3-K活性化が起こることが示唆された。
精神障害者のインターネット利用が役割認知および自尊感情に及ぼす影響

精神障害者NPO法人喫茶店、共同作業所、授産施設、地域生活支援センターの4施設にインターネット・パソコン(以下PCと略す)を設置し、これら施設の通所精神障害者26人を対象に、自記式質問紙を用いた留め置き調査を実施した。調査の内容は属性(年齢、性別)、当事者が大切・必要と認識するサポート提供者の続柄・人数、自尊感情尺度(Rosenberg (1982)以下自尊尺度と略す)や自己が認識する役割、設置PC利用前・利用後の状況(1週間の利用日数・時間、目的など)であった。精神障害者では低いとされる自尊感情が平均値よりも高く、また、自尊尺度と年齢との相関関係は認められなかった。自尊尺度の高い人はソーシャルサポートの人数も多く、ソーシャルサポートネットワークがある程度確立されているのではないかと推測されたが、自尊尺度とソーシャルサポートの人数において相関関係は認められなかった。ソーシャルサポートにおける続柄の内訳では、両親などの家族や友人といったナチュラルソーシャルサポートが多かった。対象者の年齢とPC開始時及びPC使用3ヶ月後の利用時間(1日当たり)との間に相関関係を認めた。PCの利用目的は情報検索、メール交換などで、PC使用3ヶ月後、6ヶ月後では有意な変化は認められなかった。対象が認識している役割は、家庭や仕事での役割を上げていることが多かった。対象者の男女比は65.4:34.6で、男性が2/3を占めた。年齢は34才、自尊尺度:31点、ソーシャルサポート(以下、ソーシャルサポートと略す)の人数:4.5人で、PC開始時の1週間の延べ利用時間:86.25分、1週間の利用日数:2日、1日の利用時間:30分、PC使用3ヶ月後の1週間の延べ利用時間:30分、1週間の利用日数:2日、1日の利用時間:25分であった。以上の結果から、インターネットに関心を示し研究に参加協力した精神障害者は、男性が全体の2/3を占め、自尊感情が高く一定の役割を認識し、ソーシャルサポート人数が多い人の割合が高い実態が明らかになった。さらに、精神障害者を対象としたパソコンボランティアのマンパワー不足が明らかになり、パソコンボランティアの育成支援が強く示唆された。精神障害者がインターネットを活用し、社会的交流を図り孤立化を防止し、自らのサポートネットワークを拡充していくことは社会参加すなわち精神障害者の役割と自信の獲得につながると推測される。よって本研究では、精神障害者が生活基盤を獲得する上で重要な「役割」や「自信」をソーシャルサポート・ネットワーク(以下SSと略す)の拡充の視点から調査することを目的とした。調査の内容は属性(年齢、性別)、当事者が大切・必要と認識するサポート提供者の続柄・人数、自尊感情尺度(Rosenberg(1982)以下自尊尺度と略す)や自己が認識する役割、設置PC利用前・利用3ヶ月後の状況(1週間の利用日数・時間、目的など)である(期間;2003年12月2004年12月)。

対象者の年齢とPC開始時及びPC使用3ヶ月後の利用時間(1日当たり)との間に、相関関係を認めた。PCの利用目的は情報検索、メール交換などで、PC使用3ヶ月後の変化は認められなかった。対象が認識している役割は、家族や仕事の中での役割を上げていることが多かった。SSにおける続柄の内訳では、両親などの家族や友人といったナチュラルSSが多かった。今後、このナチュラルSSがパソコン・インターネット利用をきっかけとしてどう変化し、役割や自尊感情にもよい影響を及ぼすかどうかは、今後因子をさらに細かく調査・検討する必要があると考える。我々は、パソコン・インターネットの利用が、地域在住の精神障害者の社会的交流を図り、サポートネットワークの拡充につながるのではないかと考え、NPO法人喫茶店、授産施設、共同作業所、地域支援センターにおいて、当事者の「自尊感情」、「役割」、ソーシャルサポート提供者およびパソコン・インターネット利用状況を把握する研究を行った。精神障害者では低いとされる自尊感情が平均値よりも高く、また、自尊尺度と年齢との相関関係は認められなかった。自尊尺度の高い人はソーシャルサポートの人数も多く、ソーシャルサポートネットワークがある程度確立されているのではないかと推測されたが、自尊尺度とソーシャルサポートの人数において相関関係は認められなかった。ソーシャルサポートにおける続柄の内訳では、両親などの家族や友人といったナチュラルソーシャルサポートが多かった。対象者の年齢とPC開始時及びPC使用3ヶ月後の利用時間(1日当たり)との間に相関関係を認めた。PCの利用目的は情報検索、メール交換などで、PC使用3ヶ月後、6ヶ月後では有意な変化は認められなかった。対象が認識している役割は、家庭や仕事での役割を上げていることが多かった。研究対象者のパソコン・インターネットへの要望は、パソコンの基本的操作、表計算ソフトやワープロソフトへの操作方法であった。また、インターネット・パソコンの利用状況から、パソコンの操作技術指導が必要であると考えられた。以上の結果から、インターネットに関心を示し研究に参加協力した精神障害者は、男性が全体の2/3を占め、自尊感情が高く一定の役割を認識し、ソーシャルサポート人数が多い人の割合が高い実態が明らかになった。さらに、精神障害者を対象としたパソコンボランティアのマンパワー不足が明らかになり、パソコンボランティアの育成支援が強く示唆された。
核医学検査・治療に伴う患者の吸収線量、介護者および医療従事者の被ばく線量の測定

FDG-PET検査における被ばく管理を目標に、基礎的検討と共に医療従事者、患者の介護者、そして患者の被ばく線量を測定した。1.基礎的検討の結果(1)低エネルギー核種であるTc-99mの鉛半価層は約0.3mmであるのに対し、511keV光子では約4.1mmである。またタングステンによる半価層はTc-99mで0.23mm、F-18で2.61mmである。(2)標準のシリンジシールド(1.6mmタングステン)の遮蔽効果はTc-99mでは99.2%、F-18では34.3%であり、ポジトロン核種を90%遮蔽するには8.6mm厚のタングステンシールドが必要である。(3)防護エプロン(0.5mmPb)の遮蔽効果を点線源と電離箱式サーベイメータにより測定すると、低エネルギー核種であるTl-201(70keV)は80%、Tc-99m(140keV)は70%遮蔽されるが、F-18(511keV)の遮蔽効果は約6%であった。511keVのγ線は5.5mmの鉛で50%、16.2mmの鉛で90%が遮蔽された。2.PET検査における医療従事者、介護者の外部被ばく線量の測定結果(1)医療従事者の被ばく線量;1日平均9名の被検者(FDG使用量185MBq)を放射線技師2名で検査。1回検査当り1従事者の被ばく線量は平均0.294-0.769μSvであった。車椅子の介助を要した症例、並びに心または脳検査の症例においては、各々平均1.278、1.339μSvtと被ばく線量が増加した。1ヶ月総計(1520日間勤務)線量は平均3.7818.91μSv(n=6)であった。(2)介護者の被ばく線量は、FDG130MBq投与23.5時間で0.5m距離の介助者が5.46μSv、1m距離の介助者が3.81μLSvであった。(3)被検者の被ばく線量はFDG176MBq投与後29時間で267μSvであった。また196MBq投与された被検者の210時間の累積線量は600μSvであった。以上から、PET検査においては遮蔽物(511keVのγ線用)と距離により防護された施設、そして時間・距離・遮蔽物・取り扱い技術などのソフト面を整えて安全管理を行う必要がある。医療従事者の被ばく線量は被検者数に比例して増加し、年間数mSvの累積放射線量に達する可能性が高い。一般公衆の被ばく管理にも配慮したガイドラインの作成が急務であると考えられた。

以上から、PET検査においては遮蔽物(511keVのγ線用)と距離により防護された施設、そして時間・距離・遮蔽物・取り扱い技術などのソフト面を整えて安全管理を行う必要がある。医療従事者の被ばく線量は被検者数に比例して増加し、年間数mSvの累積放射線量に達する可能性が高い。一般公衆の被ばく管理にも配慮したガイドラインの作成が急務であると考えられた。基礎的検討として、ウエル型シンチレーションカウンタにて測定したTc-99m、Tl-201、Ga-67、I-131の実測値を基に、シンチカメラ(G7200)および小型線量計の検出感度を決定した。ポケット線量計の測定感度に於ける方向依存性は比較的少なく、360度方向の放射線を均一に検出していることが確認された。臨床的検討として、各種アイソトープ検査・治療に携わる医療従事者の外部被ばく線量をポケット線量計にて測定した。核医学診療に携わる事務員3名、看護士3名、診療放射線技師6名、検査技師1名、医師7名の計20名の医療従事者が診療に従事する1日について、線量測定を行った。被ばく線量の測定に関与する従事者は、1日の検査内容と共にポケット線量計の累積放射能を経時的に白己記録し集計した。放射性同位元素使用施設内で診療に携わっている従事者は、装着している鉛エプロンの前面胸部(女子では腹部)にポケット線量計を設置した。1日の検査件数は40件前後であるが、全体の過半数を占める心筋シンチグラフィ、骨シンチグラフィなどの検査では、放射性医薬品投与後の患者が1日2回に亘り管理区域に出入りした。ポケット線量計による1日の累積放射能は、放射性同位元素使用施設内でバックグランド0.3-1.1μSvとなった。医療従事者の表面線量は、受け付け業務の事務員で0.7-4μSvとなり、I-131カプセルを服用した患者との接触時間が長引くほど増加する傾向がみられた。看護士の被ばく線量は7-40μSvとなり、患者と直接接触して介護する時間の増加に伴って増加した。放射線診療技師および医師の被ばく線量は1-58μSvとなり、被ばくを念頭に置いた線源取扱い法や患者介助法の習熟と共に減少する傾向が見られた。検査内容別に見ると、脳血流シンチグラフィに携わる放射線診療技師の被ばく線量が20-30μSvと平均的に高かった。重症患者の占める割りあいが高い脳血流検査では、頭部固定等の介助に要する時間が長く、遮蔽用具の利用が不可欠と考えられた。FDG-PET検査における被ばく管理を目標に、基礎的検討と共に医療従事者、患者の介護者、そして患者の被ばく線量を測定した。1.基礎的検討の結果(1)低エネルギー核種であるTc-99mの鉛半価層は約0.3mmであるのに対し、511keV光子では約4.1mmである。またタングステンによる半価層はTc-99mで0.23mm、F-18で2.61mmである。(2)標準のシリンジシールド(1.6mmタングステン)の遮蔽効果はTc-99mでは99.2%、F-18では34.3であり、ポジトロン核種を90%遮蔽するには8.6mm厚のタングステンシールドが必要である。(3)防護エプロン(0.5mmPb)の遮蔽効果を点線源と電離箱式サーベイメータにより測定すると、低エネルギー核種であるT1-201(70keV)は80%、Tc-99m(140keV)は70%遮蔽されるが、F-18(511keV)の遮蔽効果は約6%であった。511keVのγ線は5.5mmの鉛で50%、16.2mmの鉛で90%が遮蔽された。2.PET検査における医療従事者、介護者の外部被ばく線量の測定結果(1)医療従事者の被ばく線量;1日平均9名の被検者(FDG使用量185MBq)を放射線技師2名で検査。1回検査当り1従事者の被ばく線量は平均0.2940.769μSvであった。車椅子の介助を要した症例、並びに心または脳検査の症例においては、各々平均1.278、1.339μSvtと被ばく線量が増加した。1ヶ月総計(1520日間勤務)線量は平均3.7818.91μSv(n=6)であった。(2)介護者の被ばく線量は、FDG130MBq投与23.5時問で0.5m距離の介助者が5.46μSv、1m距離の介助者が3.81μSvであった。
血液細胞産生の調節に関する基礎的解析ー幹細胞の濃縮・純化とその機能の解析

(1)幹細胞の濃縮・純化・増幅:マウスでは前年度の研究で完成した方法で幹細胞を単離し、その幹細胞に発現している10種の受容体型チロシンキナーゼを明らかにした。また、マウス幹細胞はstem cell factor(SCF)とIL-6あるいはIL-11を一緒に加えると数千倍に増幅されるが、γインターフェロンにも同様の作用があることを明らかにした。なお、SCFの活性にAsp^<134>からSer^<142>までの構造が必要であることも明らかにした。ヒト幹細胞では分化系列抗原陰性でCD34^+の細胞を集めると幹細胞が2050%に濃縮された。SCFとIL-11を共に加えると、約10倍に増幅されることを明らかにした。(2)多能性幹細胞の細胞周期の調節:映画撮影によってマウス幹細胞の分裂様式を検討し、サイトカイン刺激ではランダムであり、ストロマ細胞存在下では規則正しく起こることを明らかにした。(3)増殖関連遺伝子を挿入したトランスジェニックマウスにおける造血幹細胞の挙動:p53遺伝子欠損マウスを相同組換えにより作成し、各組織の線維芽細胞が培養すると高い増殖能を維持し続け、造血系では幹細胞およびBリンパ系細胞が同様であり、生後36ヶ月のマウスで多クローン性のT細胞の腫癌を形成し、p53遺伝子の造血における機能を明らかにした。4.顆粒球マクロファージ系細胞の分化:顆粒球マクロファージの分化に関わる造血因子およびレセプターは既に明らかにされており、本年度はその方面の研究はなされなかった。(5)リンパ球の初期分化と幹細胞:骨髄中の幹細胞に発現しているトランスフェリンレセプターがT細胞への分化に必須であることを明らかにした。その他、LFA-1およびPgp-1は幹細胞からT細胞への分化には必須であるが、胸腺中の前駆細胞からT細胞への分化には必要ないことも明らかにした。(6)巨核球・血小板産生:IL-11のオートクリン機構が巨核芽球性白血病細胞株にあることを明らかにし、その結果は巨核球の増殖分化機序に示唆を与えるものである。
活断層の運動による発熱現象の実証研究-淡路島野島断層を例として-

本研究では、兵庫県南部地震を引き起こした淡路島の野島断層を対象として、陸上と掘削した地殻深部のいろいろな深さにおける熱年代学的解析から活断層の運動による発熱現象の実証を目指している。昨年度までに得られたデータから、大学500mボーリングコア(Tagami et al.,1999)及び地質調査所(GSJ)ボーリングコアの両コアで、断層沿いにトラックの短縮、つまり何らかの熱影響が過去にあったことが分かった。そこで、平成11年度は、熱影響のあった時期を調べるために、ジルコン割粒法を用いたGSJコアの再測定を主として行った。その結果、従来の測定法による結果と同様、トラック短縮が認められたほとんどの試料について、そのトラック長分布は長いトラック(1011μm)と短いトラック(67μm)にピークをもつバイモーダル分布を示した。断層中軸帯の試料については従来法による結果からあまり変化は見られなかったが、比較的低深度(200300m前後)については今回の測定で短いトラックが若干強調されていることが分かった。また、今回の測定でも前回と同様にFT長分布が断層中軸帯に対し非対称であった。やはり、トラックが温度上昇によって最も影響を受けた地点は断層中軸帯よりも深い地点であると考えられる。平成9年度は、陸上部分と500m掘削試料についての予察的な分析を行うことができた。500m掘削試料ではすべて花崗岩・花崗閃緑岩より試料採取した。また比較のために、500m掘削地点付近の地表に露出する野島断層破砕帯(分岐断層)、及び分岐断層から東南側に20m離れた地点の花崗岩からも試料を採取した。これらを鉱物分離することにより、適量のジルコンとアパタイトを得た。トラック長測定のルーチンに従い研磨とエッチングを行い、画像処理装置を用いてHorizontal Cofined Track(表面トラックやクラックなどを通じて二次的にエッチングされる結晶内部のトラックで、観察面に平行な全長をもつもの;HCT)の長さを測定した。アパタイトは自発トラック密度が低いため(<10^5/cm2),タンデム型加速器による重イオン照射により表面トラックを増やした後でも、十分な数のHCTを観察することができなかった。これに対して、ジルコンでは自発トラック密度が十分高いので(>10^6/cm2)、HCTの長さ分布を求めることができた。その結果、破砕帯近傍の試料だけから、約20-40%有意に短縮し、かつ、幅広い分布を持つトラック長分布が得られた。これは、断層沿いの何らかの温度異常、たとえば断層運動による摩擦熱の発生、ないしは熱水等による地殻深部からの熱輸送を示す。他のデータも加味すると、その場での断層運動による摩擦熱の発生よりは、熱水等による地殻深部からの熱輸送を示唆する。平成10年度は、陸上部分と地質調査所平林コア試料についての予察的な分析を行うことができた。コア試料ではすべて花崗岩・花崗閃緑岩より試料採取した。また比較のために、平林掘削地点付近の地表に露出する野島断層破砕帯に接した花崗岩、及び断層から東側に20m離れた地点の花崗岩からも試料を採取した。トラック長測定のルーチンに従い研磨とエッチングを行い、画像処理装置を用いてHorizontaI Cofined Track(表面トラックやクラックなどを通じて二次的にエッチングされる結晶内部のトラックで、観察面に平行な全長をもつもの;HCT)の長さを測定した。アパタイトは自発トラック密度が低いため(<10^5/cm^2)、十分な数のHCTを観察することができなかった。これに対して、ジルコンでは自発トラック密度が十分高いので(>10^6/cm^2)、HCTの長さ分布を求めることができた。

その結果、平林コア中の破砕帯近傍の試料から、有意に短縮し、かつ、バイモーダルなピークを持つトラック長分布が得られた。一方、陸上部分の断層では短縮が見られなかった。これらは、大学500mコアのデータにも共通に見られる特徴であり、地下深部での断層沿いの何らかの温度異常、たとえば断層運動による摩擦熱の発生、ないしは熱水等による地殻深部からの熱輸送を示す。また、今回の測定では平林コアのトラック長分布が断層中軸帯に対し非対称であったことも分かった。本研究では、兵庫県南部地震を引き起こした淡路島の野島断層を対象として、陸上の掘削した地殻深部のいろいろな深さにおける熱年代学的解析から活断層の運動による発熱現象の実証を目指している。昨年度までに得られたデータから、大学500mボーリングコア(Tagami et al.1999)及び地質調査所(GSJ)ボーリングコアの両コアで、断層沿いにトラックの短縮、つまり何らかの熱影響が過去にあったことが分かった。そこで、平成11年度には、熱影響のあった時期を調べるために、ジルコン割粒法を用いたGSJコアの再測定を主として行った。その結果、従来の測定法による結果と同様、トラック短縮が認められたほとんどの試料について、そのトラック長分布は長いトラック(1011μm)と短いトラック(67m)にピークを持つバイモーダル分布を示した。断層中軸帯の試料については従来法による結果からあまり変化は見られなかったが、比較的低深度(200300m前後)については今回の測定で短いトラックが若干強調されていることが分かった。また、今回の測定でも前回と同様にFT長分布が断層中軸帯に対し非対称であった。やはり、トラックが温度上昇によって最も影響を受けた地点は断層中軸帯よりも深い地点であると考えられる。
環境有害物質の気道上皮細胞に及ぼすサイトカイン分泌刺激の細胞内情報伝達機構の研究

培養皿に気道上皮細胞株A549をsubconfluentな状態に培養し、50μg/mlの濃度のディーゼル排気粒子懸濁液で刺激する。気道上皮細胞からIL-8、GM-CSFなどの炎症性サイトカインの産生が増強し、そのメカニズムの一つとしてNF-κBの活性化がおこっていることは以前より示されているが、ディーゼル排気粒子による刺激では、IL-8の産生は刺激されるにもかかわらず細胞質内でNF-κBと結合しているIκBのリン酸化および分解がおこらない。一方で細胞骨格系に関与するSmall G proteinのRhoAは活性化することによりNF-κBを活性化することが知られており、実際Rhoの活性化、すなわちGDP結合型からGTP結合型への変換、をRhotekinのRho結合ドメイン(主にRhoA、RhoCに結合)による免疫沈降で調べると刺激後2分程度で活性がすみやかに上昇し徐々に減退する。RhoBは同じRhoの中でも逆にNF-κBの活性抑制に働くとされているが今回のアッセイ系では検出されない。同じファミリーに属するsmall G proteinのRac1、Cdc42の活性はPak1のRac1およびCdc42結合ドメインを用いたアッセイ系では活性は上昇しない。おなじ粒子状物質である活性炭ではRhoの活性化は見られない。Rhoは細胞骨格系の維持に必須の蛋白質であり、dominant negativeなRhoの強制発現系は細胞の分裂に影響を及ぼす可能性が高いため、現在A549気道上皮細胞株にTet-off gene expression systemを用いた誘導性の発現を試み、気道上皮細胞におけるRhoAの機能解析が進行中である。ディーゼル排気粒子の気道上皮細胞に及ぼす影響を検討するため、気道上皮細胞の細胞株であるBET-1Aを用い、さまざまな細胞内刺激伝達系の活性化の有無を検討中である。現在のところ、DEPのJNK活性に及ぼす影響を抗リン酸化JNK抗体で調べたが、はっきりとした活性化は確認できなかった。またDEPがアレルギー性炎症を増悪させるという報告もあり、気道上皮細胞においても何らかの働きをしている可能性を検討するため、IL-4との同時刺激がSTAT-6の活性化に及ぼす影響を検討したがはっきりとした増強効果はみられなかった。さらにDEP単独の刺激でIL-8の産生がみられることが知られており、IL-8の産生には核内転写因子のNF-кBの活性化が重要であることより、NF-кBの細胞質内阻害因子であるIκBの蛋白レベルでの分解をみたが、はっきりとした変化が認められなかった。以上のことより、DEPは気道上皮細胞に対して、受容体を介する刺激伝達系と比べゆっくりと刺激を伝達する可能性、また今まで調べたような経路を介さない伝達系を通して刺激を伝達している可能性が示唆された。最近の報告で気道上皮細胞はディーゼル粒子を食作用で取りこんでいることが判明しており、細胞内に長くとどまることにより粒子に含まれる物質が可溶化し刺激を細胞に与えている可能性が示唆されている。細胞の食作用には細胞骨格系の関与が必須であり、それに関与するsmall G proteinの役割が重要と考えられる。また活性酸素を介した刺激の伝達にもsmall G proteinが関与しているとも言われており、現在dominant negativeのsmall G proteinを細胞に発現させることによりその影響を検討する前段階の予備実験中である。
コンホメーション変化を駆動力とする分子アクチュエーターの開発

近年、プローブ顕微鏡の開発・進歩に基づき、各部品を分子レベルで作製し組み立て、分子集合体のスケールで作動するインテリジェントマシン、分子機械を創成する研究が始まっている。本申請研究では、分子機械の部品となる新規のアクチュエーター(分子ピストン)を開発することを目的とし、外部電場によりポリオキシメチレン分子中の双極子モーメントを1方向に配向させ、ヘリックス・トランスコンホメーション転移を生じさせることで分子鎖長を変化させ、力を伝える分子アクチュエーターを創成することを試みた。ポリオキシメチレンのベンゼン溶液を水面上に展開・圧縮して調製した単分子膜を雲母基板上に1層移し取り、原子間力顕微鏡により単分子膜表面の形態を観察した。単分子膜を調製する際、展開溶液濃度、表面圧、圧縮速度、水相温度を変数とした。展開溶液濃度10^<-3>M、表面圧20mN/m、圧縮速度0.8mm/s、水相温度293Kにて形態学的に均一なポリオキシメチレン単分子膜が調製できることが明らかとなった。また、ポリオキシメチレン分子は単分子膜中で凝集し、配向していた。原子間力顕微鏡のカンチレバ-を用いて強い力で走査することにより、単分子膜中の多数のポリオキシメチレン分子をはぎ取り、走査領域内でポリオキシメチレンを孤立鎖とした。原子間力顕微鏡カンチレバ-と基板間に電場を印加し、ヘリックス・トランス転移によるポリオキシメチレン分子の伸縮挙動を評価する予定である。平成7年度は、ポリオキシメチレン(POM)のベンゼン溶液を水面上に展開・圧縮して調製した単分子膜を雲母基板上に1層移し取り,現有の原子間力顕微鏡(AFM)により単分子膜表面の形態を観察した。単分子膜を調製する際,展開溶液濃度,表面圧,圧縮速度,水相温度を変数とした。展開溶液濃度10^<-3>M,表面圧20mN・m^<-1>,圧縮速度0.8mm・S^<-1>,水相温度293Kにて形態学的に均一なPOM単分子膜が調製できることが明らかとなった。平成8年度は,前年度に調製したPOM単分子膜を用い、その分子像観察を試みる。さらに,AFMカンチレバ-とHOPG基板間に電場を印加し,ヘリックス-トランス転移によるPOM分子の伸縮挙動を評価する予定である。原子間力顕微鏡カンチレバ-と基板間に電場を印加し、ヘリックス・トランス転移によりポリオキシメチレン分子の伸縮挙動を評価する予定である。
希土類錯体を前駆体とする材料の高圧合成と物性

1.高圧高温下での希土類-シクロペンタジエニル錯体からのダイヤモンド合成シクロペンタジエニルのネオジム錯体について、コバルトを共存させてダイヤモンド合成を試みた。未焼成のものと800°Cで焼成したものを圧力4.6、5.4、6.0GPa、温度1300または1600°Cにおいてそれぞれ10分間処理した結果5.4GPa以上、1600°Cではダイヤモンドが生成することが明らかとなった。コバルトを共存させないときにはダイヤモンドが生成しないことを確かめた。本法は超微粒子ダイヤモンド合成に適している。2.NdCo_2Si_2の磁気相転移の圧力効果この化合物は常圧・低温下で磁気スピンの長周期変調構造から単純な反磁性構造に逐次相転移を示し、それらの温度は32K、26K、19K、18Kである。高圧下の中性子回折測定から磁気転移点は圧力によって大きく上昇し、その係数はすべてについておよそ5K/GPaであることを明らかにし、1GPa付近に新しい相を見いだした。この化合物は常温常圧下では斜方晶型の結晶構造をとっている。常温で圧力を加え、回収した試料についてX線回折測定を行ない、3GPaからガラス化が始まり9GPaで完全にガラス状態になっていることを見いだした。直接高圧下でのX線回折でも同様の挙動をとらえた。回収試料の蛍光スペクトル測定を準備中である。
神経形態形成と再生における細胞接着蛋白群の機能

神経形態形成と再生における細胞接着蛋白群の機能の解明を目的として、研究を行い、次の成果を得た。1)免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞接着蛋白L1には神経細胞に特異的な完全型と非神経細胞の短型があり、セリンのリン酸化が細胞移動能に関与することを示した。2)神経形態形成の過程で、スブチリジン様プロテアーゼによってL1が分解され、機能変化する可能性を示した。3)Pax6ノックアウト動物の解析から、Pax6陽性細胞がL1免疫陽性の視床皮質路の線維の誘導に関与することを示した。4)中脳ドーパミン神経細胞は幼若期に一次的にフォスファカンを発現し、L1陽性線維との作用により細胞移動が制御されることを示唆した。5)L1cDNAを組込んだ変異ヘルペスウイルスベクターを導入、発現した初代培養アストロサイトは、同種性細胞接着活性を示し、神経細胞の突起伸展の促進、移動促進作用を示した。6)遺伝性水頭症患者にL1の新しい遺伝子変異を見出し、大脳の発達異常におけるL1の異常変化を検討した。7)シュワン細胞の分化の解析から、CD44がシュワン細胞のマーカーとなる可能性を示した。シュワン細胞はミエリン形成前期に軸索との接着を失うと細胞死を起こすが、この細胞死はニューレグリンにより抑制された。この時期の神経細胞に分泌型および膜結合型の多種のニューレグリンアイソフォームが発現し、作用することを示した。8)末梢神経ミエリン膜蛋白のPOとPASII/PMP22の精製法を開発し、それらの構造解析を試みた。Charcot-Marie-Tooth病1B型患者のPO遺伝子に新しい変異が見出され、ミエリンのコンパクションの異常が推測された。9)ヒルシュプルング巨大結腸症における神経節の欠損部では外来性神経線維のL1の発現が消失する結果、神経冠細胞の移動、神経突起伸展が障害されると推定された。神経形態形成と再生における細胞接着蛋白群の機能の解析を行い、次のような結果を得た。1)神経形態形成の過程に細胞接着蛋白群は重要な役割を果たすが、それらの発現を調節する転写因子群が注目される。ゼブラフィッシュを用いて、LIMホメオドメイン型転写制御因子のLH2ファミリーの解析を行い、3種のサブタイプLH2A,B,Cを同定した。これらは早期には領域特異的の、後記には神経細胞特異的な発現パターンが見られた。LH2BのmRNAは後期には、菱脳節境界部に存在し、細胞接着蛋白のSC1を発現する介在神経細胞に発現することが明らかとなり、LH2Bが細胞接着蛋白の発現を制御している可能性が示された。この現象を手がかりに神経形態形成過程の分子機構の解析を進める。2)変異ヘルペスウイルスベクターを利用して、外来の細胞接着蛋白遺伝子を初代培養グリア細胞に導入、発現系を検討した。アストロサイトおよびシュワン細胞に変異ヘルペスウイルスベクターに組み込んだL1cDNAを効果的に導入、発現させる条件を検討し、in vitroでの機能を解析中である。今後、in vivoにおける再生促進作用の解析を試みる。3)発育過程のシュワン細胞のアポトーシスの検討を行い、増殖期から前ミエリン形成期において、シュワン細胞のアポトーシスが観察さること、このアポトーシスは神経軸索との接着およびグリア成長因子(GGF)の存在によって抑制されることを明らかにした。脊髄後根神経節の発現するGGFの検索を行い、既知のGGFと異なる新しいサブタイプのGGFの存在を確認した。シュワン細胞と神経軸索との接着に関与し、活性をもつ細胞接着蛋白の解析を行う予定である。

1)外来の細胞接着蛋白遺伝子を、ウイルスベクターを用いて、in vitroの神経系細胞に発現する系の確立を試みた。神経親和性をもつ単純ヘルペスウイルスを使用し、細胞毒性の原因となるウイルス複製が感染した宿主細胞内で出来ないように工夫した欠損型HSVベクターを構築した。細胞接着蛋白L1を選択し、ベクターの構築に必要なヘルパーウイルスには、31.5°Cでのみ複製する温度感受性変異株HSV-tsKおよび神経系ではリボヌクレオチド還元酵素を発現する腫瘍細胞でのみ複製可能な変異株HSV-G207を用いた。その結果、細胞毒性が低く目的に適した、L1およびアンチセンスL1発現型欠陥型HSVベクターが得られた。このベクターをin vitroで感染させ、L1を過剰発現した初代培養ラットシュワン細胞上では、脊髄後根神経節ニューロンの突起伸展が促進され、アンチセンスL1によりシュワン細胞のL1発現を抑制した系では突起伸展が抑制された。これらの結果はL1が神経細胞の再生に促進効果をもつこと、この欠陥型HSVベクターは神経系の初代培養細胞、組織へ外来蛋白を感染、発現させるベクターとして有用であることを示した。2)L1のin vivoで神経再生促進効果を確認するため、動物モデルの確立を試みた。成体ラットの胸髄を半切断する脊髄損傷モデルにおいて、損傷部位にa)直接ウイルスベクターを注入する実験、b)胎仔脊髄のホモジェネートにウイルスを感染させ、それを移植する実験、c)末梢神経グラフトを作りそこにウイルスを感染させる実験を計画し、予備実験を行った。3)シュワン細胞がミエリン形成の前期に起こすアポトーシスは軸索由来のグリア成長因子(GGF)または細胞接着シグナルによって、抑制される。その過程に有効なGGFを同定するため、脊髄後根神経節、大脳、脊髄よりmRNAを抽出し、RT-PCR法によって、GGFのアイソフォームのタイプを解析し、新しいアイソフォームが存在することを示した。神経形態形成と再生における細胞接着蛋白群の機能の研究を行い、次のような成果を得た。a) L1蛋白は神経組織に特異的に発現し、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する高分子細胞接着蛋白である。脳では発生初期にスブチリジン様プロテアーゼの発現がみられ、それによって分子量20万のL1が14万と8万のフラグメントに分解され、接着能が低下し機能変化する可能性が示された。b) Pax6を欠損したマウスでL1免疫陽性の視床皮質路の線維走行には著しい異常がみられ、Pax6陽性細胞がこの線維の誘導に関与すると推定された。c)中脳ドーパミン神経細胞は細胞移動の時期にフォスファカンを発現するが、L1陽性線維との異種性の相互作用によって細胞移動が制御されることが示唆された。d)日本の遺伝性水頭症の患者にL1の新しい遺伝子変異を見出し、大脳の発達異常においてL1蛋白の発現が種々に変化することを明らかにした。e)カイニン酸投与ラットの海馬の反応性アストロサイトにポリシアル酸化NCAMの発現がみられ、苔状線維の発芽に関与する可能性が示された。f)末梢神経ミエリン膜蛋白のPOとPASII/PMP22の精製法を開発し、それらの構造解析を試みた。Charcot-Maric-Tooth病
英仏海峡にまたがる政治文化のネットワークと中世後期イングランドの王権理念

昨年度より引き続き英国ウェールズ大学スウォンジー校において、グリフィス教授より研究上の助言をうけつつ、史料収集および中世後期イングランドの王権理念についての研究を深めた。とくに、中世イングランド史研究に不可欠であるマニュスクリプトの読解について有益な助言と指導を得ることができた。さらに、英国15世紀史学会およびロンドン歴史研究所の研究セミナーに参加し、最新の研究動向について得るところがあった。史料収集としては、とくに14世紀後半の『トマス・ウォルシンガムの年代記』、15世紀のビーチャム伯家にまつわる画集『ビーチャム・パジェンツ』(系図のほか同時代の貴族の生活風景を描いたもの)といった、中世後期の政治文化に関する重要な刊行史料を購入したほか、ロンドンの国立公文書館において、マニュスクリプト史料群の分析につとめた。一時帰国中の平成16年6月21日には、東京のお茶ノ水女子大学において、リーズ国際中世学会における報告の準備のため、準備報告と研究打ち合わせをおこなった。その結果をもとに、同年7月のリーズ国際中世史学会では、The Duchy of Lancaster manor of Caldicot in South Wales(南部ウェールズにおけるランカスター公領荘園カルディコット)と題する報告をした。英国でのマニュスクリプト史料類の読解と分析から得た成果の一部をもとに、15世紀のウェールズ辺境における地域社会の政治・経済状況とそれに関連する様々な史料類の成立と性格について、まとめたものである。このリーズ報告をもとにした研究報告書は、『日本ハスキンズ歴史協会ジャーナル』第1号(鶴島博和編)に所収、平成17年春に刊行される予定である。なお、平成16年6月14日6月27日まで日本に一時帰国したため、在外研究は平成15年7月9日から平成16年12月28日まで、のべ537日間に亘った。まず、中世イングランドの国王戴冠儀礼に関する研究文献を集め、これまでの研究論点の整理と問題点の抽出に努めたうえで、戴冠儀礼の諸史料のうち最も重要な戴冠式次第集である『liber regalis』を分析し、アングロ=サクソン期から14世紀までの式次第書の種類および、それぞれの式次第書の現存状況とマニュスクリプトの分類について知見を得た。そしてアングロ=サクソン期の式次第以来、国王戴冠式は司教叙任式に倣って行われてきたことを史料的に確認した。これにより、次のような発履過程を明らかにできるとの見通しを立てた。すなわち、国王は、戴冠儀礼全体を通じて、その聖職者的役割、すなわち神と臣民との仲介者としての性格を強調するようになったこと、さらに世襲権利や、神により選ばれたことを明示するようになったこと、一方で、ゲルマン民族の伝統としてあった選挙王政の性格は、次第に単なる列席者からの「承認」にまで薄められていった、ということである。また、諸種のロンドン年代記を分析し、15世紀以降、国王のロンドン入市式が、ほぽ必ず戴冠式前日に挙行されていたことを明らかにした。そして、入市式の中で用いられたモチーフやテーマの変遷をたどることによって、市民と国王双方にとっての入市式の重要性や意味合いがどのように変化したかを考察した。この結果を、西欧中世史研究会のリーズ報告打ち合わせ会において口頭発表した。さらに、日本西洋史学会における中世ヨーロッパの王権と政治文化についてのシンポジウムや、英国リーズで開催された国際中世史学会に出席し、広く中世ヨーロッパ諸地域の政治文化、国王儀礼について多くの口頭発表を聞き、大いに知見を得た。そしてロンドンの大英図書館において、史料収集と調査を行い、18世紀から19世紀に刊行された垂要な戴冠式関迎の図書類を閲覧することができた。昨年度より準備していたとおり、今年度7月に英国のリーズ国際中世史学会においてRoyal Entry in the Later MedievalEngland(中世後期イングランドにおける国主入市式)と題する報告をおこなった。この報告では、とくに15世紀半ばのイングランド国王ヘンリ6世とその王妃マーガレット・オブ・アンジューによるロンドン入市式をとりあげた。まず、同時代史料にもとづいて各入市式において上演されたページェントの内容を再構成し、各場面の意味するところを分析した。さらに、それぞれの入市式の政治的背景を検討し、都市当局と王権との政治的関係と入市式の挙行との関連を分析した。リーズでの報告後から現在まで引き続き英国に滞在し、ウェールズ大学スウォンジー校のラルフ・グリフィス名誉教授から研究上の助言を受けつつ、中世後期イングランドの王権理念についての研究を深めた。とくに、中世イングランド史研究に不可欠である手稿本の読解について有益な助言と指導を得ることができた。さらに、所属する西欧中世史研究会より出版された論文集『史料が語る中世ヨーロッパ』に執筆者の一人として参加し、「『イングランド政策の書』にみる中世後期イングランドの政治意識」と題する論文を寄稿した。この論文ではまず、15世紀半ばに書かれたとされる『イングランド政策の書』という韻律詩の写本の伝来状況を検討し、この詩が同時代においてのみならず16-17世紀にいたるまで読み継がれた作品であったことを明らかにした。さらに、この詩の成立時の政治状況と内容の分析を通じて、当時のイングランド商人および市民層のあいだにナショナリズムの高揚がみられたことを解明するとともに、こうした文学作品がもつ歴史史料としての有用性を指摘した。

さらに、英国15世紀史学会およびロンドン歴史研究所の研究セミナーに参加し、最新の研究動向について得るところがあった。史料収集としては、とくに14世紀後半の『トマス・ウォルシンガムの年代記』、15世紀のビーチャム伯家にまつわる画集『ビーチャム・パジェンツ』(系図のほか同時代の貴族の生活風景を描いたもの)といった、中世後期の政治文化に関する重要な刊行史料を購入したほか、ロンドンの国立公文書館において、マニュスクリプト史料群の分析につとめた。一時帰国中の平成16年6月21日には、東京のお茶ノ水女子大学において、リーズ国際中世学会における報告の準備のため、準備報告と研究打ち合わせをおこなった。その結果をもとに、同年7月のリーズ国際中世史学会では、The Duchy of Lancaster manor of Caldicot in South Wales(南部ウェールズにおけるランカスター公領荘園カルディコット)と題する報告をした。英国でのマニュスクリプト史料類の読解と分析から得た成果の一部をもとに、15世紀のウェールズ辺境における地域社会の政治・経済状況とそれに関連する様々な史料類の成立と性格について、まとめたものである。このリーズ報告をもとにした研究報告書は、『日本ハスキンズ歴史協会ジャーナル』第1号(鶴島博和編)に所収、平成17年春に刊行される予定である。なお、平成16年6月14日6月27日まで日本に一時帰国したため、在外研究は平成15年7月9日から平成16年12月28日まで、のべ537日間に亘った。
分子量4MDaの巨大酸素運搬蛋白質ヘモシアニンの構造生物学研究（国際共同研究強化）

本研究課題にて収集したヘモシアニンのクライオ電子顕微鏡データを用いて構造精密化を行った.プログラムSPHIREを用いて,外壁領域と内部領域を別々に精密化することで,D5対象の外壁領域と,対称性のない内部領域の構造を明らかにすることができた.X線結晶構造解析では,C5対象な分子として解釈された分子が,実は,外部はD5,内部は非対称な構造を有していることを明らかにできたのは,クライオ電子顕微鏡の単粒子解析とX線結晶構造解析の両方の長所を組み合わせたためであり,複雑な対称性を有する分子の構造解析において,これらの手法を組み合わせることの重要性が示された.外部領域にはX線結晶構造解析で明らかにしたヘモシアニンの外部領域の構造をプロトマーごとにリジッドボディーフィッティングでフィッティングし,内部領域にはX線結晶構造解析で決定したFUを元に作成したFU-gとFU-d*のポリアラニン構造をリジッドボティーフィッティングして全体構造のモデルを構築した.明らかになった10この各プロトマーを比較したところ,内部ドメインの配置の違いにより,4種類に分類された.内部に存在するFU-gとFU-d*が2つのコンフォメーションを取ることができ,それらの組み合わせにより4種類のプロトマーの構造が存在した(プロトマー1,2.3,4).プロトマー1,2はそれぞれ4つのプロトマーが分類され,プロトマー3,4にはそれぞれ1つのプロトマーが分類された.これらの4種類の異なる構造のプロトマーが複雑に相互作用することで,外部はD5,内部は非対称な複雑な構造が形成されていた.また,明らかになった構造を,他のヘモシアニと比較することで,軟体動物のヘモシアニンが進化する過程を明らかにすることができた.内定年度:2015軟体動物のヘモシアニンは4MDaにもおよぶ超巨大な円筒状の蛋白質会合体である.基課題において申請者はスルメイカ由来ヘモシアニンの結晶構造解析を行い,その構造が外壁領域と5つの内部ドメインから構成されている事を明らかにした.スルメイカヘモシアニンはFU-a,-b,-c, -d, -d*,-e, -f, -gの8つの機能ドメインから形成され,外壁領域にはFU-a,-b,-c, -d,-e,-fが,内部ドメインにはFU-d*, -gが含まれていた.しかし,結晶中でヘモシアニンは外壁領域のみで相互作用していたため,内部の2つのFUは結晶のパッキングによる構造安定化の寄与を得る事が出来ず,その結果,これらのFUの電子密度は非常にプアーで,そのモデルを十分な精度で決定する事ができなかった.そこで本研究では,クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により,スルメイカヘモシアニンの内部領域の構造を決定することを目指す.今年度は,平成28年度以降の連携研究の内容等について,渡航先のドイツマックスプランク研究所Stefan Raunser教授と詳細に議論し,2016年8月から2017年3月までマックスプランク研究所にて研究を実施することを決定した.研究の方針についても,先行研究にて培った手法を用いて北海道大学にて調製したスルメイカヘモシアニンを凍結状態で送付し,それをドイツで解析することを決定した.さらに,測定や解析の際の協力者を決定した他,具体的な測定方法,解析方法についても議論した.研究代表者が渡航している間の基課題の研究方針も決定した.次年度以降の渡航計画,研究計画について十分に議論し,大まかな研究スケジュールをたてる事が出来た.2月からの2ヶ月間で,十分な連携体制を整える事ができたことは十分な成果と言える.以上の成果を考慮し,おおむね順調に進展していると評価した.イカなどの軟体動物は,ヘモシアニンという分子量約4MDaの巨大蛋白質会合体を用いて酸素を運搬している.興味深い事に,ヘモシアニンはその大きさを生かしてハプテンのキャリアー蛋白質や免疫賦活剤として医工学的に応用されている.

研究代表者は,スルメイカ由来ヘモシアニンの会合体の結晶構造を3.0オングストロームの分解能で決定し,ヘモシアニンが外壁領域と5つの内部領域から構成されていることを明らかにした.外壁領域では非常に明瞭な電子密度が観測されたが,内部領域の立体構造を正確に決定する事は困難であった.本課題では,近年,著しい発展を遂げ,X線結晶構造解析に劣らない解像度で構造解析が可能となったクライオ電子顕微鏡による単粒子解析の技術を用い,X線結晶構造解析では達成できなかったスルメイカ由来ヘモシアニンの内部領域の構造を決定し,ヘモシアニンの内部空間のデザイン学への足がかりとする.研究代表者は,2016年7月から2017年3月まで,ドイツのマックスプランク研究所に滞在し,スルメイカヘモシアニンのクライオ電子顕微鏡解析を行った.はじめに,試料の調製方法を検討し,超遠心分離を用いた会合体の調製方を構築した.得られた試料を用いてクライオグリッドの作製条件を検討し,良質なグリッド作製の条件を決定した.最新のクライオ電子顕微鏡(FEI社製TITAN KRIOS)を用いて,約5000枚のイメージを取得し,プログラムSPHIREを用いてその構造を決定した.得られた構造は,X線結晶構造解析により得られたものとは異なる,対称性のない内部構造をしており,結晶中ではこれが10個の異なるオリエンテーションで積層したために,D5対称性の電子密度が見られたということがわかった.当初の予定通り,8ヶ月間,派遣先研究室に滞在してクライオ電子顕微鏡を用いた解析を行い,その構造決定に成功した.予定通りにすべてが行われているため,概ね順調に進行していると結論した.本研究課題にて収集したヘモシアニンのクライオ電子顕微鏡データを用いて構造精密化を行った.プログラムSPHIREを用いて,外壁領域と内部領域を別々に精密化することで,D5対象の外壁領域と,対称性のない内部領域の構造を明らかにすることができた.X線結晶構造解析では,C5対象な分子として解釈された分子が,実は,外部はD5,内部は非対称な構造を有していることを明らかにできたのは,クライオ電子顕微鏡の単粒子解析とX線結晶構造解析の両方の長所を組み合わせたためであり,複雑な対称性を有する分子の構造解析において,これらの手法を組み合わせることの重要性が示された.外部領域にはX線結晶構造解析で明らかにしたヘモシアニンの外部領域の構造をプロトマーごとにリジッドボディーフィッティングでフィッティングし,内部領域にはX線結晶構造解析で決定したFUを元に作成したFU-gとFU-d*のポリアラニン構造をリジッドボティーフィッティングして全体構造のモデルを構築した.明らかになった10この各プロトマーを比較したところ,内部ドメインの配置の違いにより,4種類に分類された.内部に存在するFU-gとFU-d*が2つのコンフォメーションを取ることができ,それらの組み合わせにより4種類のプロトマーの構造が存在した(プロトマー1,2.3,4).プロトマー1,2はそれぞれ4つのプロトマーが分類され,プロトマー3,4にはそれぞれ1つのプロトマーが分類された.これらの4種類の異なる構造のプロトマーが複雑に相互作用することで,外部はD5,内部は非対称な複雑な構造が形成されていた.また,明らかになった構造を,他のヘモシアニと比較することで,軟体動物のヘモシアニンが進化する過程を明らかにすることができた.前年度に収集したクライオ電子顕微鏡のデータを用いて精密構造解析を行った.得られた電子密度に,結晶構造解析で得られたFunctional Unitの原子構造をリジッドボティーフィッティングによりあてはめ,10量体の全体構造の原子モデルを構築した.また,各Functional UnitのN末端,C末端の位置と,それらを連結するリンカーの長さを考慮して,それぞれのプロトマーにおけるFunctional Unitのトレースを明らかにした.10個のプロトマーのFunctional Unitの相対配置は,4つのグループに分類されることがわかった.内部に存在するFunctional Unit-d*と-gは主に2つの位置に存在することができ,それらの組み合わせによって4種類のコンフォメーションが存在する.過去に報告されたX線結晶構造解析による構造モデルと比較し,内部領域の正確な構造を明らかにした.外壁領域はこれまでに報告のあるヘモシアニンと類似したD5対称の同様の構造であったが,内部構造は,これまでの構造とは大きく異なる配置をしていた.過去のX線結晶構造解析により得られた構造の問題点と,そのような構造が得られた原因についても考察した.明らかになったクライオ電子顕微鏡の構造からは,分子進化の様式が明らかになった.腹側類からタコなどの頭足類を経由して,イカなどの頭足類へと進化する過程で,Functional Unit-d*の遺伝子重複が起こり,それにより,ドメインスワップによる多量体が解離し,再会合する過程で内部ドメインの再配置が起こり,複雑な形状の内部ドメインへと変化したことが示唆された.