hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病幹細胞におけるNF－κBシグナル経路活性についての研究

本研究は急性骨髄性白血病(AML)発症とNF-κB経路活性化との関連を明らかにし、特に白血病幹細胞(LSC)における同経路の活性を調べ、その活性化機序、NF-κB経路活性阻害がAML発症抑制・治療に与える効果を解析することである。昨年度までに3種類の白血病マウスモデル(MLL-EM,MOZ-TIF2、BCR-ABL+Nup98-HoxA9導入白血病)のLSCでNF-κBの核内移行の亢進を確認し、またNF-κBの抑制がin vivoにおいて白血病進行を著しく抑制すること、TNF-αのautocrine作用が恒常的活性維持に重要であることを示した。今年度は白血病細胞におけるTNF-αの発現をshRNAの導入により抑制し、in vivoにおいて白血病の進行が抑制されることを確認した。またLSC,non-LSCにおいてNF-κBの活性が異なる機序として、プロテアソームの活性に注目し、LSCにおけるプロテアソームの高い活性が、IκBαの分解亢進、それに伴うNF-κBの核内移行の亢進につながることを明らかにした。これに加え、proteasome inhibitorの白血病発症マウスへの投与がLSC分画を特異的に減らすことを示し、同機構の治療標的としての重要性を示した。また逆に、IκBαに対するshRNAを導入し、NF-κBの活性を強制的に亢進させた場合、白血病細胞中のLSC fractionの割合が増加することを確認し、LSCの増殖における同経路の重要性を多角的に証明した。最後にAML患者検体を用いて、LSCに富むCD34+CD38-分画におけるNF-κBの活性、TNF分泌能を調べ、コントロールと比較しほとんどの症例で両者とも亢進していることを確認した。患者検体での同様のデータを得られたことは、実際の臨床応用を目指す上で非常に意義が大きいと考えられる。NF-kBの活性化機序として、正常造血細胞との比較以外に、LSC,non-LSCの比較を通して、新たにLSCでのプロテアソーム活性の重要性を明らかにした。また患者検体でマウスモデルに近いデータを得られたことで、臨床応用への可能性が大いに高まった。本研究の目的は急性骨髄性白血病(AML)発症とNF-κB経路活性化との関連を明らかにし、特に白血病幹細胞(LSC)における同経路の活性を調べ、NF-κB経路活性阻害がAML発症抑制・治療に与える効果を検証することである。研究手法として、臨床的にもよく知られている様々な特異的な遺伝子異常をレトロウイルスによりマウス骨髄細胞に導入して同細胞を移植することで、AMLモデルマウスを作製し、これを用いてLSCにおけるNF-κBの活性を見ることとした。はじめにMLL-ENL融合遺伝子導入によるMLL関連白血病モデルでの実験で、正常骨髄細胞との比較においてNF-κBの核内移行の亢進、複数の標的遺伝子における有意な発現上昇を示した。特に白血病骨髄中、LSCに富むとされる分画においても同経路の活性を示した。次にNF-κB経路活性阻害によるAML治療効果をマウスモデルにおいて検証するため、上記のLSCを再度移植し、生着後にNF-κB阻害作用を持つことが知られているボルテゾミブを投与し、コントロール群と比較して有意に生存日数が改善すること、すなわち同経路抑制によるAML治療効果を具体的に証明した。さらに同経路の活性を他の白血病モデルでも検証するため、AML1変異、BCR-ABL融合遺伝子の持つレトロウイルスを導入することでMLLと同様に白血病モデルを作製した。やはり上記と同様の手法でNF-κB経路の活性を白血病骨髄全体、LSCに富む分画双方において証明し、同経路の活性が特定の遺伝子異常によらない、骨髄性白血病に普遍的な現象であることを示した。本研究の目的は急性骨髄性白血病(AML)発症とNF-κB経路活性化との関連を明らかにし、特に白血病幹細胞(LSC)における同経路の活性を調べ、NF-κB経路活性阻害が韻L発症抑制・治療に与える効果を検証することである。研究手法として、様々な特異的な遺伝子異常をレトロウイルスによりマウス骨髄細胞に導入して同細胞を移植することで、AMLモデルマウスを作製し、これを用いてLSCにおけるNF-κBの活性の解析を行っている。昨年度までにMLL-ENL導入マウスモデルにおけるNF-κBの核内移行の亢進を確認しているが、これに加えて、MOZ-TIF2、BCR-ABL+Nup98-HoxA9をそれぞれ導入した2つの白血病モデルにおいても同様のデータを得た。その後、NF-κBの活性を白血病細胞において特異的に抑制した際の効果を見るため、dominant-negativeに働くIκBα変異体をこれら白血病細胞に導入した。コロニー形成能の低下に加え、移植実験を行うことでin vivoにおいても白血病進行が著しく停滞することを上記3種類の白血病モデルにおいて示した。また正常造血幹細胞に同変異体を導入してもコロニー形成能に変化を認めなかった。NF-κB経路の遮断が白血病細胞特異的に、とりわけ白血病幹細胞に有効であることをin vivoで示し、新規治療法の確立に向けて意義のある知見を得た。

さらに、NF-κBシグナル亢進の機序として主要な刺激因子として知られているTNF-αに着目し、マウスモデルの白血病骨髄中のTNF-α濃度が正常骨髄と比べて亢進していること、白血病幹細胞自身がTNF-α分泌能を持っており、autocrine作用によりNF-κB経路の恒常的活性を維持していることを示した。従来腫瘍細胞のアポトーシスに働くとされるTNF-αがNF-κBシグナルとの関連から白血病細胞の増殖に関わっているという新たな知見を得られ、今後の新規治療の開発に有用であると考えられる。本研究は急性骨髄性白血病(AML)発症とNF-κB経路活性化との関連を明らかにし、特に白血病幹細胞(LSC)における同経路の活性を調べ、その活性化機序、NF-κB経路活性阻害がAML発症抑制・治療に与える効果を解析することである。昨年度までに3種類の白血病マウスモデル(MLL-EM,MOZ-TIF2、BCR-ABL+Nup98-HoxA9導入白血病)のLSCでNF-κBの核内移行の亢進を確認し、またNF-κBの抑制がin vivoにおいて白血病進行を著しく抑制すること、TNF-αのautocrine作用が恒常的活性維持に重要であることを示した。今年度は白血病細胞におけるTNF-αの発現をshRNAの導入により抑制し、in vivoにおいて白血病の進行が抑制されることを確認した。またLSC,non-LSCにおいてNF-κBの活性が異なる機序として、プロテアソームの活性に注目し、LSCにおけるプロテアソームの高い活性が、IκBαの分解亢進、それに伴うNF-κBの核内移行の亢進につながることを明らかにした。これに加え、proteasome inhibitorの白血病発症マウスへの投与がLSC分画を特異的に減らすことを示し、同機構の治療標的としての重要性を示した。また逆に、IκBαに対するshRNAを導入し、NF-κBの活性を強制的に亢進させた場合、白血病細胞中のLSC fractionの割合が増加することを確認し、LSCの増殖における同経路の重要性を多角的に証明した。最後にAML患者検体を用いて、LSCに富むCD34+CD38-分画におけるNF-κBの活性、TNF分泌能を調べ、コントロールと比較しほとんどの症例で両者とも亢進していることを確認した。患者検体での同様のデータを得られたことは、実際の臨床応用を目指す上で非常に意義が大きいと考えられる。正常幹細胞との比較における白血病幹細胞におけるNF-κBの活性亢進、その遮断による増殖抑制、また上流のシグナル機構の解明まで今年度中に進められたため。NF-kBの活性化機序として、正常造血細胞との比較以外に、LSC,non-LSCの比較を通して、新たにLSCでのプロテアソーム活性の重要性を明らかにした。また患者検体でマウスモデルに近いデータを得られたことで、臨床応用への可能性が大いに高まった。これまでのデータで、白血病幹細胞と分化した白血病幹細胞においてNF-κBシグナル活性に顕著な違いが見られており、白血病幹細胞の維持にNF-κB活性が本質的な役割を果たしている可能性が考えられるため、この差が生じる機構を解明する。これまでに示したTNF-α分泌による活性化機構では分画ごとの違いは説明できない。よってより下流のシグナル、特にプロテアソーム活性の違いによるTNF-α反応性の差が生じるという仮説を立て、研究を進める。またこれまでに示した知見より、TNF-αの抑制により白血病治療効果があるかどうかを、in vivoモデルにおいて示すことも目指す。
犬猫の食事性アレルギーに関与するIgGの研究

血清中に炭酸脱水酵素(CA)に対する抗体を産生した犬猫を発見した。CAはペットフード中に抗原性が保持されていた。CAはほ乳類間で共通抗原性があるため、食事性アレルギーと推察した。CA-3gG抗体をラットに筋肉注射すると筋力の低下は認めなかったが、筋重量の増加を抑制した。CA-1,2IgG抗体をラットに筋注した。投与後21日目に全採血をして、腎臓の病理標本を作製した。血液検査で高値を示したのは、BUN, IP, Na, Cl, ALT, LDH, AMY, TG,T-CHO,HDL-C、クラスタリン、αGST, kIM-1が有意に上昇した。腎臓の病理検査では、近位尿細管に変性壊死が認められた。犬血清を用いて、牛血清アルブミン(BSA)、犬血清アルブミン(CSA)、炭酸脱水酵素アイソザイムのCA-IとCA-IIに対するIgG抗体をELISA法で測定した。直線性試験の結果、犬血清は100倍希釈して測定した。健康犬として1ヶ月齢,3ヶ月齢,6ヶ月齢,12ヶ月齢,24ヶ月齢のビーグル(25頭)の血清を用いた。さらに、無症状の犬(17頭),アトピー性皮膚疾患(15頭),下痢・嘔吐(8頭),糖尿病・膵炎(7頭),腎疾患(6頭),肝疾患(9頭),甲状腺疾患(10頭)を用いた。3ヶ月齢のビーグルでは、BSAに対する抗体価が高値を示した。これは、接種したワクチンに含まれる牛胎児血清のBSAによる影響であった。ビーグルの測定値からカットオフ値を算出し、疾患犬の値と比較した。その結果、CA-I、CA-II、BSA、CSAに対する抗体価のそれぞれのカットオフ値以上を示した陽性率は、肝疾患の犬ではそれぞれ、67%,78%,44%,22%であった。甲状腺疾患ではそれぞれ、40,10%,10%,20%であった。下痢・嘔吐の犬では、それぞれ、38%,25%,13%,13%であった。無症状の犬では、35%, 41%, 29%,18%であった。糖尿病・膵炎では、それぞれ29%,43%,29%,14%であった。腎疾患では、それぞれ17%,17%,0%,33%であった。アトピー性皮膚疾患では、それぞれ0%,27%,7%,13%であった。CA-IとCA-IIには正の相関があり、CA-IIとBSAにも正の相関があった。BSAに対するIgG抗体価の上昇は食事性アレルギーを発症する可能性は高いが、どのような症状かは犬では不明である。CAは動物種が異なっても共通抗原性が高く、CAに対する抗体は自己免疫疾患を引き起こす可能性が高いことが考えられる。遅延型食事性アレルギーの診断は犬の健康管理に重要な検査と考えられる。犬の血清中に炭酸脱水酵素(CA-I, CA-II)アイソザイムに対するIgG抗体が上昇した症例を初めて見いだした。一般的に、アトピー性皮膚炎はIgEの上昇が報告されているが、今回の測定ではCA-IとCA-IIに対するIgGはほとんど上昇していなかった。一方、無症状の犬においてはIgGの上昇傾向があった。すなわち、免疫寛容になっていると考えられる。しかし、肝疾患の犬ではCA-IとCA-IIに対するIgGの上昇する傾向があった。したがって、上昇したIgGは肝細胞に障害をもたらす可能性を示唆した。高い抗体価を示した犬は、自己免疫疾患ではないため、IgG遅延型フードアレルギーと考えられた。猫血清中には高値を示す症例は発見できていない。CA-1, CA-II, CA-IIIに対するネコIgGをELISA法で測定した。健康52頭と43頭の疾病のネコを用いた。IgGの値は吸光度で表した。CA-1, CA-II, CA-IIIに対するIgG抗体価のカットオフ値は0.53, 0.54, 0.33であった。カットオフ値を超えたネコは、CA-Iでは妊娠40日齢の1頭であった。CA-IIではいなかった。CA-IIIでは腎不全と高血糖の1頭、転移性肺腫瘍の1頭、多飲多尿の1頭。脱水症の1頭の計4頭であった。抗CA-III IgGが運動機能に与える影響を調べた。抗CA-III IgG投与群と、正常ウサギIgG投与群(偽処置群)、無処置群の3群に分け、各5mgの抗体をマウスに筋肉注射した後、Tugging Force Testで筋力を測定した。7日目の測定後、腓腹筋と大腿四頭筋を採材し計量した。筋力の低下傾向は抗CA-III群では1日目に見られ、偽処置群では1日目から3日目にかけて見られた。無処置群と抗CA-III群では3日目以降と偽処置群の5日目以降では筋力の上昇傾向が見られたが、実験期間を通じて抗CA-III群と偽処置群の間に有意差は認なかった。体重は各群増加傾向が見られた。投与後7日目での筋肉の採材の結果、右後肢の大腿四頭筋を除いたほかの3か所の採材部位で抗CA-III群の筋肉が最も軽く、次いで偽処置群の筋肉が軽く、無処置群の筋肉が最も重いという結果が得られた。

抗CA-III IgGは筋肉の発達に影響を及ぼした可能性がある。抗CA-III群・偽処置群において投与後筋力の低下傾向が認められた原因は、無処置群では筋力上昇傾向が認められたことから、筋肉内注射による疼痛が原因と考えられる。7日目で各群ともに筋力が上昇したのは、実験期間中に各群の平均体重が増加していることから、成長に伴った筋力の上昇であると考えられる。ネコの血漿を用いて、CAアイソザイム(CA-I,CA-II,CA-III)に対するIgG抗体を測定した結果、CA-IIIに対するIgG抗体の上昇を初めて発見した。しかしながらネコの疾患の特異性と抗体価の上昇には関連性は明らかとならなかった。CA-IとCA-IIに対する抗体価が上昇したネコはいなかった。マウスへの抗CA-III IgG投与実験から、筋肉の発育に影響を及ぼす可能性が示唆された。しかし、筋肉注射をしたことで、筋力への影響は確認できなかった。犬と猫の血清中にCAアイソザイムに対する抗体が上昇している個体を発見した。これらの個体は、ペットフード中にCAアイソザイムの抗原性が存在することから、抗体上昇は食事性アレルギーと考えた。ほ乳類のCAアイソザイムは共通抗原性が強いことから、CAアイソザイムに対するIgG抗体は自己免疫疾患様の危険性を示唆した。CA-IIIに対するIgG抗体2mgをラットに筋注して、ラットの筋力に与える影響を観察した結果、筋力には影響を及ぼさなかった。しかし、IgGを投与したラットの筋肉の重量の発育に影響を及ぼした。CAは亜鉛酵素であるため、筋肉の成長にはCAが重要であることが示唆された。したがって、CAに対する抗体の上昇は、筋肉の発育に影響を及ぼすことが示唆された。炭酸脱水酵素アイソザイム(CA-I,CA-II)に対するIgG抗体の上昇が生体に及ぼす影響を明らかにするために次の実験を行った。CAに対するウサギIgG抗体5mgをラットに筋注した。対照実験として正常ウサギIgG5mgを筋注した。投与後21日目に全採血をして、腎臓の病理標本を作製した。血液の検査の結果、CAIgG抗体の投与により高値を示したのは、BUN, IP, Na, Cl, ALT, LDH, AMY, TG,T-CHO,HDL-Cであった。唾液腺にはCAアイソザイムが存在するため、血清中のAMYの上昇は唾液腺の障害と考える。腎疾患マーカーの、対称性ジメチルアルギニン(SDMA),シスタチンC,クラスタリン,αGST, Kidney injury molecule-1(KIM-1), β2マイクログロブリン, L-FABPを測定した結果、クラスタリン、αGST, kIM-1が血漿中に有意に上昇した。病理検査の結果、CA-I,CA-IIに対するIgG抗体を投与したラットの近位尿細管には軽度から中度の変性壊死が認められた。血清中に炭酸脱水酵素(CA)に対する抗体を産生した犬猫を発見した。CAはペットフード中に抗原性が保持されていた。CAはほ乳類間で共通抗原性があるため、食事性アレルギーと推察した。CA-3gG抗体をラットに筋肉注射すると筋力の低下は認めなかったが、筋重量の増加を抑制した。CA-1,2IgG抗体をラットに筋注した。血液検査で高値を示したのは、BUN, IP, Na, Cl, ALT, LDH, AMY, TG,T-CHO,HDL-C、クラスタリン、αGST, kIM-1が有意に上昇した。腎臓の病理検査では、近位尿細管に変性壊死が認められた。各種疾患のある犬と猫の血清をさらに収集する。
眠気の発生と睡眠中の注意機構(見張番機構)の解析

健常若年成人を対象に,非侵襲的な生理指標を用いて,睡眠中の注意機構(見張番機構)を検討した.まず,高覚醒状態から寝息がはっきり聞き取れる睡眠紡錘波期までの入眠期を,脳波パタンから5段階に分け,各段階における音刺激に対する応答性を,事象関連電位(event-related potentials : ERPs)を用いて調べた.その結果,覚醒時に特徴的な脳波であるアルファ波が消え,睡眠時に特徴的な脳波であるシータ波が出現する時期(脳波段階III)を境に,覚醒時に特有のERP成分(ミスマッチ陰性電位,P300)が消失し,睡眠時に特有のERP成分(P200,P400)が出現することが明らかになった.睡眠中のERP成分は,覚醒中のERP成分とは異なり,刺激に対する意図的な注意とは無関係に誘発される外因性の成分であった.同様のERP成分は,睡眠段階2やレム睡眠中にも認められた.次に,このような中枢神経系の変化が,自律神経系の変化とどのように関連しているかを検討した.日中の短時間仮眠において心拍数と血圧を連続測定したところ,目覚める数分前から心拍数が予期的に上昇し,睡眠中に内的な覚醒準備が行われることが示唆された.この心拍数の変化は浅いレベルの脳波段階の持続とと関連していたが,血圧には対応する変化が認められなかった.以上の知見を総合して,次のような睡眠中の注意モデルを提案した.(1)覚醒から睡眠に移行することにより,環境事象に対して意図的に注意を向けることが困難になり,低頻度で出現する刺激に対して自動的に応答する睡眠時に特有の神経機構が活動しはじめる.(2)この神経機構は,ノンレム睡眠中にもレム睡眠中にも機能し,見張番として環境のモニタリングを行っているが,覚醒中と比べて感度が低い.(3)中枢神経系における覚醒から睡眠への神経機構の交代は,自律神経系の変化と一部連動している.健常若年成人を対象に,非侵襲的な生理指標を用いて,睡眠中の注意機構(見張番機構)を検討した.まず,高覚醒状態から寝息がはっきり聞き取れる睡眠紡錘波期までの入眠期を,脳波パタンから5段階に分け,各段階における音刺激に対する応答性を,事象関連電位(event-related potentials : ERPs)を用いて調べた.その結果,覚醒時に特徴的な脳波であるアルファ波が消え,睡眠時に特徴的な脳波であるシータ波が出現する時期(脳波段階III)を境に,覚醒時に特有のERP成分(ミスマッチ陰性電位,P300)が消失し,睡眠時に特有のERP成分(P200,P400)が出現することが明らかになった.睡眠中のERP成分は,覚醒中のERP成分とは異なり,刺激に対する意図的な注意とは無関係に誘発される外因性の成分であった.同様のERP成分は,睡眠段階2やレム睡眠中にも認められた.次に,このような中枢神経系の変化が,自律神経系の変化とどのように関連しているかを検討した.日中の短時間仮眠において心拍数と血圧を連続測定したところ,目覚める数分前から心拍数が予期的に上昇し,睡眠中に内的な覚醒準備が行われることが示唆された.この心拍数の変化は浅いレベルの脳波段階の持続とと関連していたが,血圧には対応する変化が認められなかった.以上の知見を総合して,次のような睡眠中の注意モデルを提案した.(1)覚醒から睡眠に移行することにより,環境事象に対して意図的に注意を向けることが困難になり,低頻度で出現する刺激に対して自動的に応答する睡眠時に特有の神経機構が活動しはじめる.(2)この神経機構は,ノンレム睡眠中にもレム睡眠中にも機能し,見張番として環境のモニタリングを行っているが,覚醒中と比べて感度が低い.(3)中枢神経系における覚醒から睡眠への神経機構の交代は,自律神経系の変化と一部連動している.10人の大学生・大学院生(男子5人,女子5人)を対象に,自然終夜睡眠の入眠期におけるミスマッチ陰性電位(MMN)の消長を検討した。標準刺激(1000Hz,出現頻度90%)と逸脱刺激(低逸脱1050Hz,5%;高逸脱1200Hz,5%)を音圧60dB(A),持続50ms,刺激間隔450msで呈示し,各刺激の前100ms,後500msの脳波記録から事象関連電位(ERP)を求め,標準刺激と逸脱刺激に対するERPの差分波形からMMNを求めた。入眠期の階段判定はHori et al.(1994)に従って,覚醒から睡眠紡錘波出現までを5段階に分類した。MMNはα波期(段階1:覚醒期)及び脳波平坦期(段階2:入眠前期)までは出現するが,漣波期(段階3:入眠中期)以降,頭頂部鋭波期(段階4:入眠後期)や睡眠紡錘波期(段階5:中等度睡眠)で著しく減衰した。MMNの消失と拮抗するように段階4以降で,陽性電位成分(P240)が出現した。この成分は入眠期の進行に伴って振幅が増大したが,それは高逸脱刺激に対してのみ出現し,低逸脱刺激には出現しなかった。P240成分は睡眠中の弁別過程に関与しており,MMNが関与する覚醒中の注意機構とは別に,睡眠時に特有の注意機構が機能していることを示唆している。

以上の結果より,覚醒中の注意機構はα波消失期までは機能しているが,θ波が出現する時期からは睡眠時に特有の注意機構に切り替わることが指摘できる。トポグラフィ分析からMNNなどの陰性成分は頭皮上の中心・前頭領域に分布し,P240などの陽性成分は頭頂・後頭領域に分布することが分かった。次年度ではこのトポグラフィ特徴が,ボタン押し反応を求めるなど,能動的な刺激弁別課題を導入した時に,どのような対応を示すかを詳細に検討する。入眠期における注意機構の変化を事象関連電位(ERP)により検討した.16名の被験者が実験に参加した.被験者の両耳に装着したイヤホンから標準刺激(1000Hz,出現頻度90%)と逸脱刺激(2000Hz,出現頻度10%)をランダムな順序で,音圧60dB,持続時間50ms,刺激間間隔1450msで呈示した.2種類の刺激を弁別して逸脱刺激に対して行動反応(ボタン押し)を要求する注意条件と,単に聞き流す無視条件を設定した.入眠期脳波段階判定基準(Hori et al.,1994)にもとづいて脳波パタンから5秒ごとに入眠期を5段階に分類し,各段階におけるERPを求めた.覚醒中は,注意条件でのみ逸脱刺激に対して後期陽性成分(P300)が出現した.他方,寝息がはっきり聞き取れる睡眠紡錘波期(脳波段階V)にも後期陽性成分(P400)が出現したが,この成分は注意条件と無視条件のどちらに対しても出現し,P300に比べて後頭部優位の分布を示した.P300とP400は,アルファ波が消えてシータ波が出現する脳波段階IIIで交代した.これらの知見から,(1)脳波段階IIIは覚醒と睡眠の注意機構が入れ替わる端境期であり,(2)睡眠中の注意機構は逸脱した刺激に対して自動的に応答する性質をもつことが示唆された.また,連続指血圧測定装置を用いた予備実験を行い,2つの指に装着した血圧カフの交代間隔や測定姿勢についての最適値を求めた.これらの基礎知見をもとに,次年度は入眠期における自律神経系活動の時系列変化を検討する.本研究の成果は,第15回ヨーロッパ睡眠学会(2000.9.14,Istanbul,Turkey),第64回日本心理学会大会(2000.11.6,京都),第3回アジア睡眠学会(2000.12.6,Bankok,Thailand),第30回日本臨床神経生理学会大会(2000.12.14,京都)で発表した.本研究の目的は,睡眠中と覚醒中の注意機構の違いを,事象関連電位と自律神経系活動(血圧・心拍数)を指標として検討し,睡眠中の注意機構モデルを提案することであった.本年度は以下の2実験を実施した.[1]覚醒と睡眠の過渡期における自律神経系の活動を,日中の短時間仮眠中に測定した.実験参加者に15分後に自分で覚醒するように教示すると,目覚める数分前から心拍数が予期的に上昇し,覚醒の準備が行われることが示唆された.この心拍数の上昇は,浅いレベルの脳波段階の持続と関連していた.しかし,血圧には対応する変化が認められなかった.[2]昨年度までに得られた入眠期の知見が,さらにすすんだ睡眠期(睡眠段階2,レム睡眠期)にも適用できるかを検討した.睡眠段階2では,睡眠時に特有の脳電位反応(K複合)が,刺激の呈示頻度が低いときに誘発されやすく高振幅になることが示された.また,レム睡眠期でもP200/P400といった成分の振幅が刺激の呈示頻度に依存して変化することが明らかになった.以上の知見とこれまでの研究成果を統合し,以下のモデルを提案した.(1)覚醒から睡眠に移行することにより,刺激に対して意図的に注意を向けることが困難になり,低頻度で出現する刺激に対して自動的に応答する神経システムが活動しはじめる.(2)この神経システムは,ノンレム睡眠中にもレム睡眠中にも機能し,見張番として環境のモニタリングを行っている.
第一原理計算に基づくナノ構造キャパシタンスの理論解析

[1]STM探針一試料間静電容量を理論的に評価すると、探針一試料間距離の減少とともに静電容量が減少する非古典的な振る舞いをWangらが報告しているが、彼らは電子状態を自己無撞着に解いていない。そこで彼らの結果の妥当性を検証したところ、自己無撞着計算では距離が非常に短い領域でも、静電容量は増加し続ける振る舞いを示した。一方非自己無撞着計算を行うと、彼らと一致する静電容量が減少する振る舞いを得、この振る舞いは誘起電荷が正しく評価できないために現れることを明らかにした。また、探針先端原子に働く力を解析し、バイアス電圧印可・非印加時の各探針距離での探針の構造最適化を行ったが、探針の構造変化は静電容量の振る舞いに影響を及ぼさないことがわかった。探針と試料の原子種をAlからNaに変化させても、静電容量は距離の減少に対し増加をし続けた。[2]金属原子点接触構造を引っ張りながらそのコンダクタンスを測定すると、量子化コンダクタンス値の整数倍を示しながら階段状に減少する。特にA1原子点接触構造が破断する直前は、階段状コンダクタンスが一時的に増加する振る舞いが観測される。本研究では、両電極からとび出た一原子同士が接触した完全なAl原子点接触構造と一電極からとび出た一原子と他方電極の平坦表面が接触したSTM探針一試料を模した系に対し破断コンダクタンスを解析した。その結果前者の構造では実験結果を再現するコンダクタンスの増加が見られるのに対し、後者では見られないという、コンダクタンスの電極表面原子構造依存性を見出した。また、静電容量を同時に評価したところ、前者の構造でははじめ静電容量が増加をした後に急激に減少するという非古典的振る舞いを示すのに対し、後者は距離の増加に伴い一様に減少した。以上から、原子点接触構造の電気特性は、電極表面原子構造に非常に敏感に変化することが明らかになった。[1]NC-AFMの探針と試料が近づくと、通常探針-試料間相互作用によりエネルギー散逸量は増加する。しかし最近の実験で距離が短い領域で散逸量が急激に減少する振舞いが報告された。そこで本研究ではこの振舞いを解明するため、散逸の起源の一つである探針振動に伴うジュール熱に注目し、探針-試料間静電容量からジュール熱を評価した。探針と試料には平行平板ジェリウム模型を用いた。すると、探針-試料間距離が非常に短い領域ではトンネル電流の発生により距離の減少に伴い静電容量が減少した。そのため、探針の振動振幅が小さい場合、探針-試料間距離が短い領域でジュール熱は減少し、実験結果と定性的に一致する振舞いを得た。これは静電容量に現れる量子効果をそのまま反映しており、実験で得られた散逸が減少する振舞いの一因にジュール熱の減少があることを明らかにした。[2]STM探針-試料間静電容量を理論的に評価すると、探針-試料間距離の減少とともに静電容量が減少する振舞いをWangらが報告したが、彼らは電圧印加時の電子状態を自己無撞着に解いていない。そこで彼らの結果の妥当性を検証したところ、自己無撞着計算では静電容量は距離が非常に短い領域でも増加した。非自己無撞着計算では彼らと一致する振舞いを得、この振舞いは誘起電荷が正しく評価できないために現れることがわかった。一方、静電容量の増加理由にはバイアス電圧が関係することを見出した。すなわち、本手法では左右電極のフェルミ準位差をバイアス電圧としているが、トンネル電流が流れている場合、電極内部の電荷中性条件によりフェルミ準位を調整する。調整による変化はトンネル電流が強い系で大きな値となり、調整したバイアス電圧を用いると静電容量は定量的に減少する。ナノ構造でのバイアス電圧は従来十分考慮されておらず、散乱状態を扱う電子状態計算手法全般で注意が必要であることを示した。

その結果前者の構造では実験結果を再現するコンダクタンスの増加が見られるのに対し、後者では見られないという、コンダクタンスの電極表面原子構造依存性を見出した。また、静電容量を同時に評価したところ、前者の構造でははじめ静電容量が増加をした後に急激に減少するという非古典的振る舞いを示すのに対し、後者は距離の増加に伴い一様に減少した。以上から、原子点接触構造の電気特性は、電極表面原子構造に非常に敏感に変化することが明らかになった。
各種時間分解振動分光を駆使した人工光合成過程のその場観測とメカニズムの解明

本研究では、研究代表者が独自開発した時間分解赤外振動分光(TR-IR)装置を活用し、人工光合成や生物の光合成における過渡的な状態の解明、およびそれに基づくメカニズムの詳細な解明をめざしている。さらに、既存の装置では測定が困難な系の測定を可能にする装置開発も同時に行うことも目的としている。本年度は、既存のTR-IR装置および過渡発光スペクトル測定装置を用いて、CO2還元光触媒であるReホスフィンカルボニル単核錯体の励起状態構造と光物性、さらにそれに光増感剤を結合させたRu-Re二核における電子移動過程のTR-IR測定とデータの解析を進めた。その結果、前者の単核錯体では、ホスフィンに結合したフェニル基の光構造変化が、その光物理的性質、すなわち発光波長や励起状態寿命に大きな影響を及ぼし、その触媒活性も支配していることを示した。一方、後者の二核錯体では、光増感剤であるRu錯体から触媒部であるRe錯体への電子移動過程を実時間で観測することに成功し、さらにそのメカニズムがアルキル鎖を通したスルーボンド型であることも明らかにした。また光物質変換に関連する物質系として、光相転移物質および光応答性液晶のTR-IR測定およびその光物性変化と構造変化との関係についても明らかにした。これらはより複雑な人工光合成系を構築する上での基礎的な知見となる。新たな領域内共同研究としては、安価な光増感剤として期待されているCu錯体の励起状態構造変化、光合成植物における光毒性制御に関与するクロロフィル分子の失活過程、空間制御により長寿命化されたRuターピリジン錯体の励起状態構造の解明にも取り組み、予備的なTR-IRの観測に成功した。従来から取り組んできたRe錯体を用いた各種CO2還元光触媒のメカニズム解明に関しては、データが十分揃い、その解析も順調に進んだ。さらに新たに人工光合成、生物の光合成を研究するグループと共同研究をスタートさせ、測定試料の決定、測定条件の決定などを経て、予備的なデータを得るところまで来ている。しかし一方で、新たな装置開発の方は、既存の装置の老朽化による故障が続き、その修理に多くの時間とお金を費やしたためあまり進んでいない。本年度は、新たに取り組み始めた人工合成、光合成関連物質の光機能と構造変化の関係のさらなる解明を進め、論文としてまとめる。さらに、TR-IR装置の大元の光源において問題となりそうな箇所の修理がほぼ済んだため、当初の計画に従い、高強度狭帯域ピコ秒パルス光源を用いた3つの時間分解振動分光装置、すなわち1ピコ秒波数掃引型TR-IR、2ピコ秒時間分解ラマン、3時間分解2次元赤外振動分光(TR-2DIR)の製作を行う。これらの手法によりこれまで測定出来なかった系の励起状態の性質、反応中間体の検出、電子移動、エネルギー移動過程などの実時間その場観測およびそのメカニズムの解明を行う。さらに生物の光合成研究のグループとも共同で、これらの測定手段、得られた成果が、より複雑ながら共通の過程をもつ光合成過程の理解に役立てることもめざす。

さらに、TR-IR装置の大元の光源において問題となりそうな箇所の修理がほぼ済んだため、当初の計画に従い、高強度狭帯域ピコ秒パルス光源を用いた3つの時間分解振動分光装置、すなわち1ピコ秒波数掃引型TR-IR、2ピコ秒時間分解ラマン、3時間分解2次元赤外振動分光(TR-2DIR)の製作を行う。これらの手法によりこれまで測定出来なかった系の励起状態の性質、反応中間体の検出、電子移動、エネルギー移動過程などの実時間その場観測およびそのメカニズムの解明を行う。さらに生物の光合成研究のグループとも共同で、これらの測定手段、得られた成果が、より複雑ながら共通の過程をもつ光合成過程の理解に役立てることもめざす。
放物型ポテンシャル論の研究

当該年度は、放物型ポテンシャル論の中でも、特に、ユークリッド空間上の熱方程式に関するマルチン境界に重点をおいて研究した。境界が比較的きれいな有界領域では、熱方程式に関してKemperは、マルチン境界が、位相的境界と一致していることを示した。そこで我々は、非有界領域の無限遠点におけるマルチン境界に興味をもった。大阪数学雑誌に発表した論文では、空間1次元の場合、{(x,t);t>psi(x)}の形の領域において、psiが、下に有界であれば、無限遠点に対応する熱方程式のミニマルな正値解が存在しないことを示した。次に、領域が時間座標に関して下に有界でない場合を考察した。Dをn次元ユークリッド空間上の有界リプシッツ領域とし、領域{(x,t);x∈psi(x)D}を考え、psiの-∞でのオーダーと、マルチン境界との関係を調べた。psi(t)のオーダーが、(-t)^<1/2>より小さい時には、発散型の放物型方程式に対し、無限遠点にはマルチン境界の一点が対応することがわかり、名古屋数学雑誌に発表した。一方psi(t)のオーダーが、-tより大きい時は、無限遠点でのマルチン境界は連続体の濃度になるので、1/2から1までの間が問題であった。これに関し、空間1次元の場合は、熱方程式に関しての調和測度の境界の線素に関する密度が連続であることを示して、やはり一点であることを示し、この結果は、ポテンシャルアナリシスに発表予定である。空間次元が一般の場合は、名古屋大学の鈴木紀明氏との共同研究の結果解決し、大阪数学雑誌に発表予定である。また、最近alpha次放物型方程式に対して、正則境界の、リ-ス容量による特徴付けが得られ、名古屋数学雑誌に投稿中である。
一次繊毛由来細胞外小胞（pc-ECV）の生理機能解析

前年度に作成したマウス腎臓髄質内集合管上皮由来細胞の遺伝子破壊株に加えて,マウス線維芽細胞由来の細胞を用いて,CRISPR/Cas9によるゲノム編集を介して一次線毛形成に必須なタンパク質群をコードする遺伝子破壊株を作成した。作成した遺伝子破壊株および正常(野生型)細胞株の培養上清から超遠心法により細胞外小胞を沈殿し,培地に再懸濁した細胞外小胞濃縮液を作成した。一次線毛の生えていない遺伝子破壊株,すなわち一次線毛由来細胞外小胞を放出できない細胞株を細胞外小胞濃縮液(一次線毛由来細胞外小胞;含・不含)各々で処理し,細胞の応答を解析した。解析の結果,非常に微弱ながらも正常野生型細胞由来の細胞外小胞濃縮液で処理した細胞において,一次線毛由来細胞外小胞に含まれる生理活性タンパク質の発現増加が検出された。この発見は,新しい細胞間コミュニケーションツールとしての一次線毛由来細胞外小胞の生理学的機能を解明することを目的とする本研究にとって,その生理機能の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。上記の研究にくわえて,一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に寄与する遺伝子の破壊株について細胞外小胞の細胞内局在を解析した。解析の結果,一次線毛は形成されるものの一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出が阻害される遺伝子破壊株では,エクソソームの細胞内貯留が検出された。これは一次線毛機能,一次線毛由来細胞外小胞放出,エクソソーム放出におけるそれら3者の相互作用の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。以上の2つの成果は,本研究に限らず線毛研究,細胞外小胞研究,これら二つの研究領域,さらには細胞生物学の研究界に大きな基礎的知見を与える点で大きな意義を持つ。当初計画どおり,一次線毛由来細胞外小胞の生理機能の一端に踏み込むことができた。くわえて,一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に関して新しい知見を得ることができた。研究代表者の独立,異動,研究室の立ち上げなど,研究が一時的にストップした点を考慮すれば,おおむね順調に進展しているものと考えられる。平成30年度に発見した一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液の生理作用について更に解析を進める。とりわけ,一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液に暴露された一次線毛欠損あるいは一次線毛由来細胞外小胞放出能欠損細胞株について,細胞の形態,分裂速度,接触阻害効果,移動能など,各種細胞挙動を解析する。くわえて,平成30年度に発見した一次線毛,一次線毛由来細胞外小胞,エクソソーム,これら3者の相互連関について更に解析を進め,本研究課題終了後の研究展開および発展につながる異なる細胞外小胞放出系のクロストーク,その生理学的意義について新たな知見を得る。マウス腎臓髄質内集合管上皮由来の細胞株を用い,CRISPR/Cas9によるゲノム編集を介した複数の遺伝子破壊株を作成した。作成した遺伝子破壊株の培養上清から超遠心法により細胞外小胞を沈殿濃縮し,一次繊毛に局在するArl13b,Ift88を指標に培地中に放出されて一次繊毛由来細胞外小胞の量を解析した。解析の結果,遺伝子破壊によって一次繊毛由来細胞外小胞の放出が顕著に阻害されるものが一つ見つかった。また,遺伝子破壊によって一次繊毛由来細胞外小胞の放出が促進されるもの一つを発見した。以上の結果より,一次繊毛由来細胞外小胞の放出に強く寄与しているタンパク質と,逆に放出を抑制する分子をそれぞれ一つずつ同定することに成功した。これらの発見は,新しい細胞間コミュニケーションツールとしての一次繊毛由来細胞外小胞の生理学的機能を解明することを目的とする本研究にとって,大きな基礎となる重要な成果である。また,本研究に限らず,一次繊毛由来細胞外小胞の放出を正と負に制御する分子が同時に発見されたことは,繊毛研究,細胞外小胞研究,これら二つの研究領域,さらには細胞生物学の研究界に大きな基礎的知見を与える点で大きな意義を持つ。当初計画どおり,一次繊毛由来細胞外小胞の放出に寄与する分子を特定できた。くわえて,一次繊毛由来細胞外小胞の放出を抑制する分子を同定できた点は当初計画以上の成果である。この発見は,新しい細胞間コミュニケーションツールとしての一次線毛

由来細胞外小胞の生理学的機能を解明することを目的とする本研究にとって,その生理機能の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。上記の研究にくわえて,一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に寄与する遺伝子の破壊株について細胞外小胞の細胞内局在を解析した。解析の結果,一次線毛は形成されるものの一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出が阻害される遺伝子破壊株では,エクソソームの細胞内貯留が検出された。これは一次線毛機能,一次線毛由来細胞外小胞放出,エクソソーム放出におけるそれら3者の相互作用の一端に切り込んだ点で重要な成果となる。以上の2つの成果は,本研究に限らず線毛研究,細胞外小胞研究,これら二つの研究領域,さらには細胞生物学の研究界に大きな基礎的知見を与える点で大きな意義を持つ。当初計画どおり,一次線毛由来細胞外小胞の生理機能の一端に踏み込むことができた。くわえて,一次線毛由来細胞外小胞とエクソソームの放出に関して新しい知見を得ることができた。研究代表者の独立,異動,研究室の立ち上げなど,研究が一時的にストップした点を考慮すれば,おおむね順調に進展しているものと考えられる。平成29年度に作出した一次繊毛由来細胞外小胞の放出が阻害される遺伝子破壊株を用いて,細胞外小胞の比較プロテオミクスを行い,一次繊毛由来細胞外小胞に含まれる,とりわけ小胞の表面に局在し抗体により認識可能なタンパク質を同定する。一次繊毛由来細胞外小胞の放出が阻害された細胞の形態,分裂速度,接触阻害効果,移動能など,各種細胞挙動を解析し,ここに精製濃縮した一次繊毛由来細胞外小胞を投与し,それら各種細胞挙動に対する一次繊毛由来細胞外小胞の効果,すなわち生理学的機能を明らかにする。平成30年度に発見した一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液の生理作用について更に解析を進める。とりわけ,一次線毛由来細胞外小胞を含む細胞外小胞濃縮液に暴露された一次線毛欠損あるいは一次線毛由来細胞外小胞放出能欠損細胞株について,細胞の形態,分裂速度,接触阻害効果,移動能など,各種細胞挙動を解析する。くわえて,平成30年度に発見した一次線毛,一次線毛由来細胞外小胞,エクソソーム,これら3者の相互連関について更に解析を進め,本研究課題終了後の研究展開および発展につながる異なる細胞外小胞放出系のクロストーク,その生理学的意義について新たな知見を得る。今年度はほぼ計画通りに研究費を使用した。ただし,予想外に研究が順調に進んで消耗品費などの支出が抑えられたことと,平成30年度からの新所属先(広島大学)への移動準備などで年度末に研究活動を停止したことにより,若干の次年度使用額が生じた。翌年度分(平成30年度分)の助成金と合わせた直接経費1,452,901円の使用計画はおおよそ下記のとおりである。物品費:1,102,901円,旅費:150,000円,人件費・謝金:100,000円,その他:100,000円。研究実施場所の変更に伴い,物品費を多く計上している。所属機関変更に伴う移動により年度前半の研究活動がやや停滞したことにより若干の次年度使用額が生じた。翌年度分(令和元年度分)の配分額と合わせた直接経費1,357,788円の使用計画はおおよそ下記のとおりである。物品費:657,788円,旅費:100,000円,人件費・謝金:500,000円,その他:100,000円。研究実施の効率化のために人件費を多めに計上している。
イネ遺伝子ターゲティング法を発展させた次世代育種技術の確立

本課題では、強力ポジティブ・ネガティブ選抜法によるイネ・遺伝子ターゲティング法を基に、遺伝子組換えの痕跡が残らない次世代植物育種技術(NBT)の開発を進める。トウモロコシ由来のDNA型トランスポゾンAc/Dsを改変利用して、人為配列を一切残さないポジティブマーカー遺伝子削除機構の構築に成功したため、一回の実験プロセスで遺伝子ターゲティングとポジティブマーカー遺伝子削除が順次進行するシステムを構築した。次いで、それを用いてイネゲノム上の耐病性遺伝子OsRacGEF1の機能向上を試みた。得られた改変体は恒常活性化型OsRacGEF1を発現し、耐病性形質が向上すると期待される。本課題では、重要穀物であるイネについて、遺伝子ターゲティング法を利用して目的遺伝子の塩基配列を改変し、さらに外来配列を全て削除するシステムを開発することで、次世代植物育種技術としての展開を目指す。平成25年度は、外来遺伝子削除機構として、トウモロコシ由来のDNA型トランスポゾンAc/Ds系の最適化を進めた。Lazarowら(2012)の発表に基づき、機能強化型Ac転移酵素遺伝子(AcTPase4x)を合成し、ヒートショック誘導型プロモーターに連結した。次いで、ヒートショック誘導型AcTPase4xの制御条件を確立するため、両端に転移酵素の標的配列を両端に備えた"Removal unit"を作製し、これを35SプロモーターとGUSPlus遺伝子の間に挿入した評価用ベクターを構築した。このベクターをイネカルスへ導入した場合、"Removal unit"によりGUSPlus遺伝子の発現が抑制されるが、AcTPase4xの発現が誘導され"Removal unit"が脱離した場合、35SプロモーターとGUSPlus遺伝子が直結し、X-Gluc染色により青いシグナルが検出される。その頻度を元にAc/Ds系を用いた外来遺伝子削除機構の最適誘導条件の検討を進め、予備的成果を得た。一方、イネのいもち病耐性に関わる重要遺伝子OsRacGEF1を恒常活性化型に改変するため、遺伝子ターゲティングベクターを構築した。このベクターは、内部にAcTPase4x遺伝子を組み込めるため、一度の形質転換操作で標的遺伝子の改変と外来配列の削除が可能な"One component system"として展開可能である。上記の評価試験にてヒートショック誘導型AcTPase4xの制御条件が確定し次第、"One component system"によりイネのOsRacGEF1遺伝子改変を試みる予定である。遺伝子ターゲティング法と組み合わせるポジティブマーカー遺伝子削除機構として、トウモロコシのDNA型トランスポゾンAc/Dsを利用することとし、合成生物学的手法にて、イネに最適化した改変型Ac転移酵素遺伝子(AcTPase4x)とその標的配列Dsを作製した。次いで、イネゲノムにおける機能評価を目的として、改変型Ac/DsをGUSレポーターアッセイ用ベクターに組み込み、アグロバクテリウム法にてイネカルスへ導入した。イネカルスにおけるGUSレポーターの発現を解析した結果、AcTPase4xによるDsの削除を確認し、さらに時系列に沿ったAcTPase4xの発現変化を明らかにした。また、PCRおよびDNA塩基配列解析により、改変型Ac/Dsが人為配列を一切残さないポジティブマーカー遺伝子削除機構として利用可能であると実証できた。続いて、遺伝子ターゲティングベクターに改変型Ac/Dsを組み込んだ。このシステムでは2つの組み換え行程が順次進行し、相同組み換えによりゲノム上の標的遺伝子のDNA配列が任意改変された後、自律的に改変型Ac/Dsによるポジティブマーカー遺伝子削除が進行するため、一度の形質転換操作で標的遺伝子の改変が終了すると考えられる。そのため、上記システムを利用し、日本型イネ品種「金南風」のゲノム上に存在する耐病性遺伝子OsRacGEF1の機能向上を試みた。得られた改変体は、恒常活性化型OsRacGEF1タンパク質を発現して耐病性形質が向上すると予測されるため、病原菌接種試験等の評価を進める。植物育種本課題では、外来遺伝子削除機構としてトウモロコシ由来のDNA型トランスポゾンAc/Ds系を利用するが、その転移酵素遺伝子の発現制御が最も重要な点であった。しかし、ヒートショック誘導型プロモーターの利用と制御条件の最適化により、その機能を遺伝子ターゲティングベクター内へ組み込んだ"One component system"が確立できる見通しが立った。また、外来遺伝子削除機構が最適化でき次第、迅速にOsRacGEF1遺伝子の改変を開始できるよう、ターゲティングベクターの構築も進めることが出来た。当初の計画通り、外来遺伝子削除機構を搭載した"One componentsystem"ターゲティングベクターを構築し、イネ品種“金南風"のOsRacGEF1遺伝子改変体作製を試みる。

得られた改変体では、標的遺伝子の配列が改変され、さらに人為配列を一切残さず外来配列が削除されることが期待されるため、ゲノム配列を精査した結果、目的通りの改変体が得られた場合は、後代系統を展開していもち病等への抵抗性を評価する。本課題遂行にあたり、使用を予定していた機器類の複数について経年劣化や不調が認められ、それらの修理対応や新規購入を慎重に判断するため、直接経費の執行を一部見合わせたため。当初予定していた機器の購入を進めるとともに、必要に応じて解析機器の修理対応を行う。また、消耗品購入や研究解析の外部依頼などを適切に判断し、本課題を遂行する。
動的構成可能な分散計算システム

この研究ではユビキタスコンピューティング環境を想定して、複数計算デバイスの機能を統合して、ネットワーク上で仮想的なコンピュータを形成するためのミドルウェアを設計・実装した。これにより大画面テレビの画面装置やPDAの入力装置やバックエンドサーバのプロセッサなどを組み合わせて、個々の計算デバイスでは実現できない処理を可能になった。具体的には、(1)アプリケーションソフトウェアを複数のコンポーネントから構成するためにコンポーネント構造とコンポーネント間構成・通信機能を新たに開発した。従来のコンポーネントとの相違はコンポーネント間の関係を通信だけでなく含有などの多様な関係を定義できることにある。(2)コンポーネントを計算デバイス間で移動可能にして、アプリケーションの分割とネットワーク上での再構成方法が動的に行えるようにした。(3)仮想的分散計算システムのアプリケーションとして、相違な計算デバイス連携させる機構を提供した。(4)コンポーネント移動性に投機的特性を加えることにより、他のコンピュータに実際に移動しながら最適な稼働先コンピュータを発見できるようにした。これらの研究成果を内外で周知するために学術誌及び国際会議への論文投稿・発表を行い、また研究過程の作成したソフトウェアはオープンソースソフトウェアとして公開され、すでに利用実績がある。ユビキタスコンピューティングを構成するコンピュータは計算資源、例えばプロセッサ、メモリ、入出力に制限が多いが、この研究では一台のコンピュータでは実現不可能なアプリケーションでも複数のコンピュータを協調動作させることにより実現可能にするためのミドルウェアを実現することが目標となる。本年度は研究実施計画にもとづいて(1)ソフトウェアを移動可能コンポーネントへの分割方法、(2)移動透過な分散イベントシステムの開発、(3)仮想コンピュータのアプリケーションについて研究を行った。まず(1)ではソフトウェアの構成部品となるコンポーネントをモバイルエージェントとして実現するとともに、それらがコンピュータ間を移動可能な自律的コンポーネントとなることと、オブジェクト指向設計におけるデザインパターンであるMVCパターンを例に取りながら、相違なコンピュータ上のコンポーネントからアプリケーションが構築できることを確かめた。次の(2)ではコンポーネントを組織化するとともに、コンポーネント移動における通信への影響を隠蔽する機構を設計した。(3)ではこの研究の有効性を示すために、既存の分散システム形態であるクライアントサーバシステムを実現した。なお、この研究の方式を用いることにより、クライアントとサーバを動的に結合するだけでなく、クライアントに相当するコンポーネントを遠隔コンピュータに動的に配置・実行が可能になるが、ここではユーザとともに移動するサーバを実現して、実際のユビキタスコンピューティング環境において実現可能となるかを確かめた。本年度は前年度までの成果をうけながら、次世代のユビキタスコンピューティング環境向けの分散処理技術を研究・開発した。ユビキタスコンピューティング環境を構成するコンピュータの特徴かつ問題は計算リソースに制限が多いことである。例えば大画面テレビにコンピュータが埋め込まれていても、キーボードを持つとは限らない。逆に携帯電話やPDAなどはボタンやポイティング装置を持っていてもその画面は小さい。本研究ではこれらの相違なコンピュータを組み合わせることで、個々のコンピュータの計算リソース制限を超えた情報サービスを実現する方法を実現する。今年度はその中でも、アプリケーションソフトウェアを移動可能コンポーネントへの分割・再構成方法を実現した。これはアプリケーションが複数コンポーネントから構成するとともに、各コンポーネントはその要求する計算資源に応じて分散システム上の複数コンピュータ上に動的配置するものである。また、その再配置手法としてコンポーネントの移動性、通信回数による結合強度、通信遅延、ユーザの入出力の有無などを基準に組織化するアルゴリズムを提案した。また、コンポーネントを投機的に移動させる方法も導入し、これらは前年度及び本年度に整備されたクラスターコンピュータ上で動作・実験を行った。また、最適配置の基礎となる空間モデルを提案した。これはユーザやコンピュータの位置や計算リソースなどを統一的に扱えるものであり、その空間モデルを通じて位置やユーザ依存サービスが提供できることを確かめた。
注釈・論議資料の用字法と文章構造に着目した仏教漢文書記史の研究

本研究の目的は、平安時代後期から鎌倉時代における日本撰述の仏教漢文の文体特徴の解明である。当該期の仏家の学問活動における漢文書記の実態、すなわち仏家における書記言語と書記様式の相関の整理を行い、仏教漢文内部にみられる文体の位相を明らかにする。平成30年度は、本研究課題開始以前より継続的に調査研究を行っている高山寺蔵『打聞集』の原本調査研究を中心に進めた。全三帖中、第一帖のデータ入力は一応の完成をみた。今後翻字本文の整備および第二帖以降の本文データ整備を進める。また、データ整備と平行して、談義の記録(聞書)としての本資料の性格を明らかにする論考をまとめた(現在編集中)。和化漢文体と漢字片仮名交じり文体とが混淆的様相を見せる『打聞集』中、とくに第三帖に多く認められる片仮名表記自立語の全例を示した上で、以下の点を指摘した。1本資料は特定の人物が関わる談義の記録としての一貫性を持つ一方で、各段義の内容によって教釈的文脈と説話的文脈とが混在するテキストであり、仮名表記自立語の多くは説話的文脈に現れている。2仮名表記自立語には、口語的な要素としての音便・係り結び、和文語的な呼応、口語・和文語的な語の使用が認められる。用例数が僅少ではあるものの、こうした諸要素は談義の場における言語の実態の表出である可能性がある。3以上のことと関わって、教釈的文脈は和化漢文的要素を持つ漢字文の表記様式、説話的文脈は漢字片仮名交じり文の表記様式というように、文章内容と表記様式・文体とが関連づく文体的位相性を内包するテキストを形成している。この他、和化漢文表記史研究の課題を考察し、語と漢字表記との密接な結びつきを前提としない方法論を提案する研究発表を行った。本研究課題の分析単位の一つである助字と日本語との対応の検討が主要なテーマとなっている。今年度は、原本調査研究、および学会発表等の成果発表について、家族の健康に関する不測の事態が生じたため、当初の予定通り研究を進捗させることができなかった。原本調査研究については、2019年度の調査予定を増やすこととする。また成果発表については、口頭発表・論文発表に至らなかった成果をまとめることとする。以上の内容を2019年度の当初予定に加えることによって、研究の進捗に努める。家族の健康に関わる不測の事態により、当初計画した原本調査、および口頭発表を実施することができなかった。次年度使用額分は主としてこの研究計画に関わる旅費である。今年度未使用額に関わる研究内容は、次年度の研究計画に加えて、より優先的に実施することとする。