hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
主竜類の胃の進化と多様性の関係解明

一方で,化石ワニ類の胃石の特徴に大きな差異は見られず,白亜紀の鳥類では種によって胃石の特徴に差が出る事が判明した.このことから,主竜類の進化過程において胃石を用いた消化システムの獲得の柔軟性は恐竜類の登場以降に獲得されたと推察できる.今後は主竜類全体の傾向をより正確に検証するため,サンプル数の拡大に努める.加えて,各国の博物館を訪問し,化石主竜類の胃石のデータを採取する.平成30年度は中国,ドイツ,カナダ,アルゼンチンなどを訪問し,化石主竜類の胃石のデータを網羅的に取得する.取得したデータに現生主竜類の胃と胃石の関係性を適用し,化石主竜類の胃の進化過程を復元する事で,胃の進化が主竜類の多様性に与えた影響を評価することを目指す.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
超高繰返しフェムト秒レーザーによる高次高調波発生の実現と真空紫外光の偏光制御

本年度は以下の2点を目的に研究を行った.1.超高繰返し(THz)超短(fs)パルス列を用いた,気相原子・分子からの高次高調波発生(HHG)の実現.2.100%基底準位占有まで冷却した気相分子の断熱または非断熱配向による空間的に高度に配向した(配向度1)分子集団の実現.THzに達する超高繰返しフェムト秒パルス列を用いたHHG実験は申請者の知る限りまだ例が無く物理的基礎研究として非常に重要である.また,実用研究としても,将来のHHG光源のCW化につながる実証研究として重要であると考えられる.また,透明な固体材料が存在しない真空紫外域では,伝統的に表面反射などを利用することにより偏光制御や偏光解析が行われてきた.同手法が完成すれば,コヒーレント真空紫外光の偏光制御法が初めて出現し,同コヒーレント光源の有用性は飛躍的に増大する.上記の圏的に対し,本年度は以下の研究成果を出した.1.分子からのHHGの角度分布を詳細に測定し,結果から単一分子のHHG角度分布を再構成する手法を新たに開発し,その成果をPhysical ReviewLetters誌106巻(2011年1月)に投稿し,掲載された.2.HHGに必要なレーザー強度を得るため,超高繰返し(THz)超短(fs)ハルスレーザーのパルス幅を短縮しなければならない.この目的のため,レーザーの高感度スペクトル位相計測や光周波数標準に安定化された超短パルス列の搬送波位相制御を行い国外・国内学会で成果を報告した.本年度は以下の2点を目的に研究を行った.1.超高繰返し(THz)超短(fs)パルス列を用いた,気相原子・分子からの高次高調波発生(HHG)の実現.2.100%基底準位占有まで冷却した気相分子の断熱または非断熱配向による空間的に高度に配向した(配向度1)分子集団の実現.THzに達する超高繰返しフェムト秒パルス列を用いたHHG実験は申請者の知る限りまだ例が無く物理的基礎研究として非常に重要である.また,実用研究としても,将来のHHG光源のCW化につながる実証研究として重要であると考えられる.また,透明な固体材料が存在しない真空紫外域では,伝統的に表面反射などを利用することにより偏光制御や偏光解析が行われてきた.同手法が完成すれば,コヒーレント真空紫外光の偏光制御法が初めて出現し,同コヒーレント光源の有用性は飛躍的に増大する.上記の圏的に対し,本年度は以下の研究成果を出した.1.分子からのHHGの角度分布を詳細に測定し,結果から単一分子のHHG角度分布を再構成する手法を新たに開発し,その成果をPhysical ReviewLetters誌106巻(2011年1月)に投稿し,掲載された.2.HHGに必要なレーザー強度を得るため,超高繰返し(THz)超短(fs)ハルスレーザーのパルス幅を短縮しなければならない.この目的のため,レーザーの高感度スペクトル位相計測や光周波数標準に安定化された超短パルス列の搬送波位相制御を行い国外・国内学会で成果を報告した.
要因実験における検索可能計画の構成とその最適基準の開発

オーダkの検索可能計画に対してSrivastava (1976)の必要条件をより明確に特徴付けることをを出発点とした。検索の対象を2因子、3因子交互作用(4因子交互作用以上は無視可能)とし、k=2に対する検索可能計画の構成方法を与えた。さらに検索の対象を2因子交互作用(3因子交互作用は無視可能)だけに限定した時、k=3に対する検索可能計画の構成方法を与えた。この場合、選ばれた3因子交互作用のパターンに分類に、グラフ理論からあるグラフの同値類の分類に同等であることを用いた。Shirakura, Suetsugu and Tsuji(2002)によって導入された、ある特殊な組合せ的配列をもつST-array(n, m)を用いて、検索の対象を2因子交互作用(3因子交互作用以上は無視可能)とし場合に、k=1に対する検索可能計画の新たな構成方法を与えた。後半は、検索可能計画の比較のための最適性について検討した。検索可能計画において、実際の未知母数の検索手順を明確にた。その手順に対して、検索可能計画の比較のための最適基準を構築した。導入された検索力を、k=1、2に対する検索可能計画に対して、シュミュレーションにより求め、検索可能計画の比較検討を行った。現在得られた成果は以下の論文にまとめている。m個の因子で、各々2レベルで施される要因実験を考える。統計的モデルとして、一般平均と主効果の要因効果の存在を認めた上で、さらに2因子、3因子交互作用の中にどれかはわからないが高々k個の未知母数が存在し(残りの母数は存在しない)という線形検索モデル(statistical search linear model)を設定する。(kは正の整数で、応用上比較的に大きくない数とされ、今年度の研究ではk=2を対象にた。)得られたデータから、高々2個の未知母数を検索し、それらと一般平均、主効果と共に推定することが求められる。そのためには、(できるだけ少ないデータで)どのようなデータを採取すれば良いか(実験の計画)が問題になる。それを可能にする計画を検索可能計画という。Srivastava(1976)は、計画が検索可能計画となるための必要条件を与えた。この条件は計画としては最大限の条件で、十分条件を議論するには確率的な要素が加わる。今年度は、本研究で対象にしている検索モデルについて、Srivastavaの条件を組合せ数学的及び幾何学的な立場で再検証しながら、過去の成果を再検討した。まず、一般平均と主効果だけを推定可能にする計画を考え、それにどのような処理組合せ(計画)を加えれば全体で、高々2個の検索可能計画になるか、その条件を組合せ的に与えた。その条件に沿って、mに対する一般的な検索可能計画の構成方法を導き、具体的にはコンピュータの支援を得ながら、各mに応じた計画の構成を与えた。これらの成果は以下の表題で発表した。1.2因子交互作用と3因子交互作用に対する検索可能計画の構成(日本統計学会)2.2因子・3因子交互作用に対する検索可能計画の構成(科研(A)による研究集会)m個の因子で各々2レベルで施される要因実験に対して、一般平均と主効果のすべては完全に未知母数とし、2因子交互作用は以下の意味で部分的に未知母数とする:2因子交互作用の中で、どれかは分からないが高々k個の未知母数が存在する。(3因子交互作用以上の効果は無視可能とする。)このようなモデルを統計的線形検索モデルと呼ぶ。問題は、得られたデータから、高々k個の未知母数を検索し、主効果と共に推定することである。それを可能にする実験計画Tを,MEP.k plan(検索可能計画)という。Srivastava(1976)はTがMEP.k planであるための必要十分条件を与え、本研究はこの条件を基本にMEP.k planの具体的な構成を展開している。

今年度の研究では、k=1の場合で、Shirakura, Suetsugu and Tsuji(2002)の結果を用いて、m=2^r-1,n=r(r+1)/2(rは正整数、nは処理組合せ数)タイプの今までと異なる新たなMEP.1 planを構成した。さらに、推定量の誤差平方和を基本にしてMEP.k planに対する最適基準を導いた。この基準を用い、シミュレーションにより、mとnに対して、今までの研究で得られているMEP.1planとの比較を与えた。これらの成果は以下の表題で発表した。MEP.1計画の構成と比較(科研(A)による研究集会、2005年11月)さらに、検索の対象母数を2因子と3因子交互作用とするMEP.2planの構成について、昨年度の成果をより発展させ、以下の題目で論文にまとめた。m個の因子で各々2レベルで施される要因実験に対して、一般平均と主効果のすべては完全に未知母数とし、2因子交互作用は以下の意味で部分的に未知母数とする:2因子交互作用の中で、どれかは分からないが高々k個の未知母数が存在する(3因子交互作用以上の効果は無視可能とする)。このようなモデルを統計的線形検索モデルと呼ぶ。問題は、得られたデータから、高々k個の未知母数を検索し、主効果と共に推定することである。それを可能にする実験計画を検索可能計画という。今年度、単純配列から得られる検索可能計画に対してその検索確率を明確に与え、検索可能計画の最適基準について一定の成果を得た。さらにシュミュレーションにより、得られた検索確率(検索力)に基づいて検索可能計画の比較を行った。それらは以下の学会及び研究集会で発表した。1.標題:検索可能計画と最適性国際数理科学協会年会「統計的デザイン、組合せ的デザインとその周辺」分科会2.標題:検索可能計画とその検索確率のシュミュレーションによる比較日本計算機統計学会2006年10月26日(東京大学)3.標題:検索可能計画の検索力について科学研究費(B)研究集会、2006年11月21日(上山市)現在それらの成果を論文としてまとめている。さらにグラフ理論からのアプローチにより、検索可能計画の構成・分類に関する成果を得た。それらは以下の論文にまとめ、掲載可能決定を待っている状態である。今後の課題として、応用的側面から実際のデータに対して検索可能計画の有効性を実証することである。
βシヌクレインによる幹細胞の神経分化誘導機構の解析

シヌクレイン(syn)は神経組織に多く発現する生理機能未知のタンパクで、α、β、yの3種が存在する。本研究では、βsynに着目し、生理機能および病態発症への関与を検討した。Βsyn過剰発現細胞は、cAMPの活性化を通し、神経分化誘導作用を持つ可能性が推察された。またβsynの変異型をマウスに過剰発現させると、神経軸索末端の異常および記憶や運動の障害を引き起こし、新しい神経変性疾患のモデルとなると考えられた。1:骨髄系細胞を用いたβsynによる神経細胞への分化誘導系の確立シヌクレイン(syn)には、α、β、γの3種が存在し、神経系に主に発現する生理機能未知の蛋白である。本研究において、βsynを過剰発現させた骨由来細胞株において、神経細胞様の形態を示し、神経細胞に発現するマーカー蛋白の発現が誘導されることが認められた。このことから、βsynは神経細胞分化促進的に機能すると考えられる。また、βsyn過剰発現細胞において、細胞内のcAMP濃度が高いことが見出され、分化促進の機構として、cAMP経路を介した機序が示唆される。一方で、家族性のレビー小体型認知症家系において発見された、変異型βsyn(P123H)を過剰発現させた神経芽細胞株においては、蛋白封入体が形成されることが認められ、野生型のβsynのような神経分化への促進的ではなく、病的に作用することが示唆された。2:変異型βsynP123Hトランスジェニック(Tg)マウスの神経分化に関する解析生体における変異型βsynP123Hの作用を解析するため、Tgマウスを作成し、19年度は、まず表現系の解析を行い、モデル動物としての確立を試みた。老齢のTgマウスでは、大脳基底核におけるsyn陽性の封入体形成に加え、運動能力の低下、自発運動の低下が認められた。また、封入体は、神経末端に存在し、小胞が蓄積された形態を示していた。これらの結果から、変異型βsynP123HTgマウスがシヌクレイノパチーと総称されるような神経変性疾患の新しいモデルとなりうることが示唆された。1 :培養細胞を用いてのβsynによる神経細胞への分化誘導の解析MG63細胞株を用いた検討に加え、昨年度より取り掛かっている骨髄幹細胞株UE7T-13に対するβsyn過剰発現による細胞分化について、継続し解析を行った。一過性過剰発現および恒常的過剰発現の系を用いて、野生型βsynの神経細胞への分化能を比較検討したところ、βsyn発現細胞において、神経軸索様突起の伸長が認められ、分化誘導作用が見出された。2 :変異型βsyn P123Hトランスジェニック(Tg)マウスを用いた解析昨年度より以前の検討から、変異型βsyn P123H Tgマウスが新しいシヌクレイノパチーモデルとして有用となりうることを示唆していることから、引き続き表現系解析を詳細に行い、モデル動物としての確立を試みた。老齢期において、大脳基底核に神経末端の肥大などの軸索病変が認められること、および、運動能力が低下することに加え、6ヶ月の若齢のころに自発運動量の低下、記憶力の低下が認められた。6ヶ月齢のTgマウスの海馬において、豊富な変異型βsynP123Hの発現が見られ、一部蓄積している所見が得られた。また、アストログリオーシスの所見もみられ、syn陽性封入体が形成されるよりも早く、海馬に病変があらわれることが見出された。記憶の障害は、レビー小体型認知症において運動障害より早く現れることから、変異型βsynP123H Tgマウスは、レビー小体型認知症の初期のモデルとして有用であると考えられた。
道路橋エクスパンション・ジョイントからの騒音の発生メカニズム,人間への影響と制御

本研究は,車両通過時に道路橋モジュラー型エクスパンション・ジョイント部から発生する騒音について,その発生メカニズム,人間への影響,騒音制御法を解明することを目的とする.その研究成果は以下のとおりである.1.試験用ジョイント上を実車走行させ,ミドルビーム等の加速度応答,止水ゴム空間からの空隙圧縮音,ジョイント近傍地上と地下ピット内の騒音を同時多点計測して,実車走行時の騒音特性を解明した.また,騒音発生源ごとに騒音制御策を施した実物試験体について実車走行実験を行い,その効果を確認している.これらにより,ジョイント単体での騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムが明らかとなった.2.モジュラー型ジョイントを有する鋼4主桁橋・PC桁橋を対象として,橋桁振動に起因した騒音や車両走行音を含んだ実橋レベルでの騒音を実測し,騒音・振動データを詳細に解析して.複数の周波成分の音源を同時に,しかも時間変化に着目して探査し,ジョイント騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムを,構造の固有振動特性および各種空間の音響特性との関連で,解明した.また,A特性補正を施した音圧スペクトルおよびその非定常性から,苦情の要因となり得る騒音周波数成分とその発生源についても考察を加えた.3.道路橋ジョイント部からの騒音の時間周波数特性を基に,実験室レベルでの音響心理試験を行って,ジョイント騒音の人間への影響を解明した.すなわち,現地実測された騒音を実験室で再現し,走行車両や受音点の違いに着目したアノイアンス実験をシステマティックに行って,人間が不快に感ずる騒音成分の特定を試みた.本研究を通じ,モジュラー型ジョイント騒音はミドルビーム・止水ゴム部の空間圧縮音によって特徴付けられること,その制御には止水ゴム空間のゴム系材料での充填が効果的であること等,工学的に極めて有用な知見を得た.本研究は,車両通過時に道路橋モジュラー型エクスパンション・ジョイント部から発生する騒音について,その発生メカニズム,人間への影響,騒音制御法を解明することを目的とする.その研究成果は以下のとおりである.1.試験用ジョイント上を実車走行させ,ミドルビーム等の加速度応答,止水ゴム空間からの空隙圧縮音,ジョイント近傍地上と地下ピット内の騒音を同時多点計測して,実車走行時の騒音特性を解明した.また,騒音発生源ごとに騒音制御策を施した実物試験体について実車走行実験を行い,その効果を確認している.これらにより,ジョイント単体での騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムが明らかとなった.2.モジュラー型ジョイントを有する鋼4主桁橋・PC桁橋を対象として,橋桁振動に起因した騒音や車両走行音を含んだ実橋レベルでの騒音を実測し,騒音・振動データを詳細に解析して.複数の周波成分の音源を同時に,しかも時間変化に着目して探査し,ジョイント騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムを,構造の固有振動特性および各種空間の音響特性との関連で,解明した.また,A特性補正を施した音圧スペクトルおよびその非定常性から,苦情の要因となり得る騒音周波数成分とその発生源についても考察を加えた.3.道路橋ジョイント部からの騒音の時間周波数特性を基に,実験室レベルでの音響心理試験を行って,ジョイント騒音の人間への影響を解明した.すなわち,現地実測された騒音を実験室で再現し,走行車両や受音点の違いに着目したアノイアンス実験をシステマティックに行って,人間が不快に感ずる騒音成分の特定を試みた.本研究を通じ,モジュラー型ジョイント騒音はミドルビーム・止水ゴム部の空間圧縮音によって特徴付けられること,その制御には止水ゴム空間のゴム系材料での充填が効果的であること等,工学的に極めて有用な知見を得た.本研究は,車両通過時に道路橋モジュラー型エクスパンション・ジョイント部から発生する騒音について,その発生メカニズム,人間への影響,および最適な騒音制御法を解明することを目的とする.平成17年度の研究実績は以下のとおりである.1)試験用モジュラー型ジョイント(実物試験体)に対する打撃試験と有限要素解析により,道路橋モジュラー型ジョイントが構造として有する固有振動数の分布および振動モードを,固体音騒音で対象となる500Hzまでの範囲で解明した.また,2本のミドルビームと止水ゴムが作る空間の固有音響周波数特性を,実物試験体に対する音響特性試験と簡易解析により,500Hz以上の空気破裂音騒音との関連で解明した.2)試験用モジュラー型ジョイント上を実車走行させ,ミドルビーム,サポートビームの加速度応答,止水ゴム空間からの空隙圧縮音,およびジョイント近傍地上と地下ピット内の騒音を同時多点計測して,実車走行時の騒音特性を解明した.また,実車走行時騒音の非定常性に着目した計測を行って,複数の周波成分の音源を同時に,しかも時間変化に着目して探査した.さらに,騒音発生源ごとに騒音制御策を施した実物試験体について実車走行実験を行い,その効果を確認している.これらにより,ジョイント単体での騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムが明らかとなった.3)モジュラー型ジョイントを有する4主桁合成桁橋を対象として,橋桁振動に起因した騒音や車両走行音を含んだ実橋レベルでの騒音を実測し,車両が道路橋ジョイント部を通過した際の橋梁近傍での騒音特性を解明した.実測では,フィンガージョイントからの騒音も計測して,モジュラー型ジョイント特有の騒音特性を明確にしている.

また,ジョイントや橋桁の加速度応答をも測定し,計測データの時間周波数特性等の相関を見て,苦情の要因となる騒音周波数成分とその発生源を考察した.本研究は,車両通過時に道路橋モジュラー型エクスパンション・ジョイント部から発生する騒音について,その発生メカニズム,人間への影響,および最適な騒音制御法を解明することを目的とする.平成18年度は主として実橋計測に基づき研究を進めたが,その研究実績は以下のとおりである.1)17年度に騒音・振動を実測した4主桁非合成桁橋について,有限要素解析により,道路橋モジュラー型ジョイントおよび橋桁が構造として有する固有振動数の分布,振動モードを,固体音騒音で対象となる500Hzまでの範囲で解明した.また,2本のミドルビームと止水ゴムが作る空間,ジョイント下部空間,桁下空間の固有音響周波数特性を,500Hz以上の空気破裂音騒音との関連で考察を加えた.2)モジュラー型ジョイントを有する連続PC箱桁橋を対象として,橋桁振動に起因した騒音,ジョイント直下の隣接箱桁間空間からの騒音,車両走行音等を含んだ実橋レベルでの騒音・振動を実測し,車両が道路橋ジョイント部を通過した際の橋梁近傍での騒音伝播特性を解明した.その結果を,4主桁非合成桁橋ジョイントからの騒音と比較し,構造形式や桁剛性の及ぼすモジュラー型ジョイント騒音特性への影響を明確にしている.また,通過車種及び通過速度による騒音特性の違いについても考察した.3)実測した鋼桁橋・PC桁橋での騒音・振動データを詳細に解析して,複数の周波成分の音源を同時に,しかも時間変化に着目して探査し,ジョイント騒音の各周波数成分の発生源,および発生メカニズムを,構造の固有振動特性および各種空間の音響特性との関連で,解明した.また,A特性補正を施した音圧スペクトルおよびその非定常性から,苦情の要因となり得る騒音周波数成分とその発生源についても考察を加えた本研究は,車両通過時に道路橋モジュラー型エクスパンション・ジョイント部から発生する騒音について,その発生メカニズム,人間への影響,および騒音制御法を解明することを目的とする。最終年度は実橋計測データの分析,振動音響連成解析,音響心理実験により研究を進めたが,その研究実績は以下のとおりである。1.平成18年度までに実測した4主桁プレートガーダー橋およびPC箱桁橋での騒音、振動データを詳細に解析して。複数の周波数成分の音源を同時に,しかも時間変化に着目して探査し,ジョイント騒音の各周波数成分の発生源,発生メカニズム,および伝播特性を考察した。2.モジュラー型ジョイントおよびその周辺橋梁部の振動音響連成解析を行って,現象の解明を解析的に行うとともに,統計エネルギー解析法を適用し,実測データとの併用で騒音パワーや放射音パワーを算出して比較することで,各周波数成分に対する音源の寄与度をより定量的に考察した。3.道路橋ジョイント部からの騒音の時間周波数特性を基に,実験室レベルでの音響心理試験を行って,モジュラー型ジョイント部からの騒音の人間への影響を解明した。具体的には,現地実測された騒音を実験室で再現し,走行車両や受音点の違いに着目したアノイアンス実験をシステマティックに行って,人間が不快に感ずる騒音成分の特定を試みている。4.3年間の研究成果を総合的に考察し,道路橋モジュラー型エクスパンション、ジョイント部での騒音の発生メカニズム,人間への影響,最適な騒音制御法に関して結論を得た。
氷晶成長を利用した規則性マクロポーラスカーボンの創製と階層構造制御法の開発

レゾルシノールとホルムアルデヒドからゾルーゲル重合で合成した有機ゲルの一方向凍結,凍結乾燥,炭素化,賦活によって,特殊なテンプレートを使用せずに「共連続構造」の規則性マクロポーラスカーボンモノリス(ハニカム上カーボン成形体,CMH)を作製した。ハニカム状有機ゲルのHClを用いたエージングあるいはCMHのCO_2賦活によってハニカム構造を維持しながらミクロ/メソ細孔容積を増加させることに成功した。さらに,ハニカム状あるいは繊維状のシリカゲルをCMHのチャンネル内に形成させ,高強度化できることがわかった。本研究は,レゾルシノールとホルムアルデヒドからゾル-ゲル重合で合成した有機ゲルの一方向凍結,凍結乾燥,炭素化,賦活によって,特殊なテンプレートを使用せずに「共連続構造」の規則性マクロポーラスカーボンモノリス(連続したマクロ流路を持つカーボン成形体)を製造する新しい方法を確立し,マクロ構造とナノ構造の階層制御(独立制御)法を開発することを目的とする。有機湿潤ゲルに氷晶テンプレート法を適用して作製したマイクロハニカム状カーボンクライオゲル(CMH)は通常のカーボンクライオゲルと比べてメソ細孔容積が減少する傾向が見られ,凍結操作が主な原因であることが判明した。しかし,凍結操作はCMHの作製に不可欠であるので,マクロ構造形成後にエージング操作あるいは賦活操作を加えることによって,CMHのミクロ/メソ細孔特性の向上を試みた。その結果,HClを用いたエージングによってハニカム構造を維持しながらミクロ/メソ細孔容積を向上できることが明らかとなった。CMHのCO_2賦活においては,バーンオフが65%に達してもCMHはハニカム構造を維持していることが分かった。さらに,CMH前駆体の有機ゲルの合成条件とCO_2を用いたCMHの賦活を組み合わせれば,ミクロ細孔を選択的に発達,あるいはミクロ細孔とメソ細孔の両者を発達できることが分かった。HClエージングではユニークな細孔の発達が見られたが,ミクロ/メソ細孔の増加率では賦活操作のほうがより効果的である。本研究で作製した賦活CMHのBET表面積は1000m^2/g以上,メソ細孔容積は0.5cm^3/g以上であることから,規則性マクロポーラスカーボンは吸着材,触媒担体などへの応用が期待される。本研究は,レゾルシノールとホルムアルデヒドからゾルーゲル重合で合成した有機ゲルの一方向凍結,凍結乾燥,炭素化,賦活によって,特殊なテンプレートを使用せずに「共連続構造」の規則性マクロポーラスカーボンモノリス(連続したマクロ流路を持つカーボン成形体)を製造する新しい方法を確立し,マクロ構造とナノ構造の階層制御(独立制御)法を開発することを目的とする。マクロポーラスカーボン(ハニカム状カーボン)のハニカム開口径に及ぼす一方向凍結速度(冷媒温度と試料浸濱速度)の影響に検討を加えたところ,開口径は凍結速度が大きくなるにつれて小さくなることが分かった。次に,ゲル合成条件と賦活を組み合わせることによってメソ細孔特性とミクロ細孔特性を向上させた。その結果,ミクロ細孔のみが発達したハニカム状カーボン(BET表面積:2106m^2/g,ミクロ細孔容積:0.87cm^3/g,メソ細孔容積:0.06cm3/g)あるいはミクロ細孔とメソ細孔がともに発達したハニカム状カーボン(BET表面積:1948m^2/g,ミクロ細孔容積:0.57cm^3/g,メソ細孔容積:1.13cm^3/g)を作製でき,本研究の開発目標を達成していることが分かった。また,賦活操作を用いないで,カーボンゲルのメソ細孔を発達させるために,ハニカム状カーボン内での有機ゲルの重合,炭素化によって繊維状のカーボンをマクロ細孔内に形成する手法を提案した。その結果,メソ細孔容積の非常に発達した階層構造のカーボン材料を作製できることが分かった。以上の研究成果から,規則性マクロポーラスカーボンは吸着材,触媒担体などへの応用が期待される。凍結速度を変化させてハニカム開口径が異なるマクロポーラスカーボン(ハニカム状カーボン)(CMH)を作製し,CO_2賦活を行ったところ,ハニカム構造を保持し,細孔を発達させることができた。次に,CMHのメソ細孔特性とミクロ細孔特性に及ぼすゲル合成条件の影響に検討を加えた。レゾルシノールと触媒のモル比R/C=100,50,25で作製したCMHのCO_2賦活を行ったところ,全ての試料において賦活により細孔特性が向上することが分かった。特にR/C=50で作製したCMHをburn-off 75%まで賦活させたところ,著しくメソ細孔が発達した。

減圧下でシリカゾルをCMHに含浸させ,一定時間のエージングの後,一方向凍結,溶媒置換,凍結乾燥を行った。軟らかいゲルを一方向凍結することでハニカム状の,硬いゲルを一方向凍結することで繊維状のシリカゲルをCMHのチャンネル内に作製することができた。シリカ含有量は,ハニカムの場合には31wt%,繊維の場合には20wt%となり,直線状のマクロ孔空間を残したまま複合化することができた。また,開口径の大きいCMHに開口径の小さなハニカム状シリカゲルを複合させることで,シリカ含有量は45wt%に増加した。さらにコロイダルシリカをCMH内で重合することで,73wt%のシリカを含有する高強度な複合材料を作製できることが分かった。
次世代シーケンス技術を用いた農耕地土壌の微生物群集の構造と変遷の網羅的解明

農耕地土壌ではしばしば硝酸溶脱や温室効果ガス(一酸化二窒素(N_2O)やメタン)発生などといった地域・地球規模の環境問題を抱えており、環境負荷を低減するような改善が求められている。本研究では、近年登場した、迅速性・コスト性に優れた次世代シーケンス技術を用いて、これらの問題の根本的な背景となっている微生物群集も含め、水田土壌の微生物群集の全体像およびその変遷と環境要因との関わりを明らかにすることを試みた。メタゲノム解析およびメタトランスクリプトーム解析の結果から、水田土壌において優占する微生物や機能遺伝子の群集構造が詳細に明らかとなった。また、メタゲノム解析から水田土壌の還元反応に関与する鍵酵素の遺伝子の塩基配列を抽出し、各機能に関わる微生物の群集構造を明らかにした。その中で、水田土壌においてAnaeromyxobacter属細菌が優占していることが明らかとなり、Anaeromyxobacter属細菌由来のnosZが環境中からはじめて見出された。さらに、水田土壌からAnaeromyxohaoter属細菌を単離し、N_2O還元活性を有していること、畑土壌よりも細菌群集におけるAnaeromyxobacter属細菌の割合が高いことを明らかにした。これらのことから、優占するAnaeromyxobacter属細菌が水田土壌におけるN_2O還元反応に関与している可能性が示唆された。本研究は最先端の環境微生物群集解析法を導入し、水田土壌微生物に関する既往研究に新たな知見を数多く加えた点で重要である。さらに、本研究は脱窒反応において脱窒菌だけでなく、脱窒反応を部分的に行う細菌も関与している可能性をはじめて見出した。この発見は、今後、地球規模の窒素循環に関与する微生物群集の考察にとっても大きな意義をもつものである。本年度は、現場の水田圃場を対象として、PCR増幅を行わずに土壌DNAおよびRNAを大規模・網羅的にシーケンスする、メタゲノム、メタトランスクリプトーム解析を行った。PCRのバイアスを回避し、大量の塩基配列情報を取得・解析し、水田土壌における微生物コミュニティー全体の構造をこれまでよりも詳細に明らかにした。その結果、森林土壌や海水といった他の環境とは異なり、水田土壌には大量にAnaeomyxobacterが存在すること、また、Anaeromyxobacter由来のN_2O還元酵素遺伝子nosZが既知の脱窒菌由来のnosZよりも多く存在していることが分かった。近年の研究で、Anaeromyxobacterが脱窒能はない(硝酸や亜硝酸からN_2Oを生成しない)けれども、N_2Oを還元することが示された。また、畑地では温室効果ガスであるN_2Oガスの発生が問題となっているが、水田はN_2Oガスの発生が少ないことが知られている。大量に存在する非脱窒菌のAnaeromyxobacterが水田土壌中におけるN_2O除去に関与している可能性が示唆された。本研究により、水田土壌の微生物相をこれまでよりもはるかに詳細に明らかにしたこと、非脱窒型N_2O還元菌の関与という、水田土壌における新たな窒素循環経路を提唱したことは、学術的に新規性が高い。これまでの脱窒に関する研究は脱窒菌のみを対象にしてきており、Anaeromyxobacterのような脱窒過程を部分的に担う菌に着目した研究はほとんどない。Anaeromyxobacterを水田土壌から単離し、そのN_2O還元活性について解析することにより新たな知見が得られることが期待される。
モバイル望遠鏡を活用した学校教育における新しい天体観察授業の展開

天文分野は、主に夜間観察する事象を昼間の授業内に学習するため、授業中の実験・観察が、困難で「本物」の星空や天体を授業中に見せる機会はほとんどない。しかし、ICT機器やインターネットを活用すれば、「今現在の星空・天体」を観察することが可能になる。そこで、本研究では学校に導入されつつあるモバイル型タブレット端末から遠隔にある天体望遠鏡を生徒自ら操作して天体観測を授業中に行うモバイル望遠鏡、および、モバイル天文台を構築し、教育現場における授業実践を通して、新しい天体観測授業を開発することを目的としている。タブレット端末を1人1台所有した教室の環境において教師が各児童のタブレット端末からのモバイル望遠鏡操作のアクセス権限を制御して、天体観測授業を実施する方式を昨年に引き続き検証した。本年度は、本モバイル望遠鏡システムを用いて、小学校5・6年生、約20名を対象として天体観測授業を実施した。これらは、未来の教室における天体観測につながる可能性があり、IoTと天体観測の融合が学校の授業で可能となった。特に、学校現場における1人1台のタブレット端末所有が現実的となった今、そのタブレットで何ができるかが重要であり、天体観測がアプリケーションとして加わることは、1台のタブレット端末が未来の学習の扉を開く可能性がある。さらに、国立天文台石垣島観測所に、太陽の日周運動を観測しインターネット配信するための全天カメラを設置した。これにより、宮城県仙台市(緯度38度)、赤道地域のタイ(緯度7度)、日本最南端最西端の八重山諸島(緯度24度)と設置することができ、太陽の日周運動の教材作成のほか、ホームページにより公開された。天文分野は主に夜間観察する事象を昼間の授業内に学習するため、授業中の実験・観察が困難で、「本物」の星空や天体を授業中に見せる機会はほとんど無い。しかし、ICT機器やインターネットを活用すれば、「今の天体」を観察することが可能である。そこで、本研究では学校に導入されつつあるモバイル型タブレット端末から遠隔にある天体望遠鏡を生徒自ら操作して天体観測を授業中に行うモバイル望遠鏡、及び、モバイル天文台を構築し、教育現場における授業実践を通して、新しい天体観測授業を開発する。また、タブレット端末を用いた学習に望遠鏡操作と天体観察という新しい機能を提供し、1台の端末が無限に広がる学びの世界の扉になる可能性を提案し学校教育のICT化に寄与することを目的とする。本年度は、モバイル望遠鏡ならびにモバイル天文台システムの要件を検討し、モバイル型端末対応型のインターネット望遠鏡、いわゆるモバイル望遠鏡の構築を実施した。望遠鏡制御システムにおいては、望遠鏡制御用PCサーバーのOSを最新OSに更新し、本OS上で稼働する望遠鏡制御ソフトウエアを導入し、望遠鏡の制御、格納、望遠鏡追尾機能等、望遠鏡の遠隔操作を可能とするための機能を試験運用した。さらに、高感度カラーカメラで撮像する天体映像を遠隔地からウェッブブラウザで確認できるようにし、既存の天文台ルーフ自動開閉システムが新OS上で問題なく稼働することを確認した。望遠鏡の操作画面を遠隔側で共有するために、本年度はChromeのリモートデスクトップ機能をiOSとWindows10搭載のタブレット端末を用いて試験運用し評価した。さらに、2015年11月に、本モバイル望遠鏡システムを用いた月の表面の観察授業を小学生約20名を対象に実施し、授業に活用できることを実践した。モバイル望遠鏡システムの構築に関しては、新OS対応のシステム環境がおおむね整備できた。今後は、遠隔での操作用タブレット端末のハード面や遠隔からの操作方法等のソフト面について、さらに具体的な検討が必要である。また、学校現場におけるネットワーク環境を考慮すること等の課題があげられる。天文分野は主に夜間観察する事象を昼間の授業内に学習するため、授業中の実験や観察が困難で、「本物」の星空や天体を授業中に見せる機会はほとんどない。しかし、ICT機器やインターネットを活用すれば、「今」の天体を観察することが可能である。そこで、本研究では、学校に導入されつつあるモバイル型タブレット端末から遠隔にある天体望遠鏡を生徒自ら操作して天体観測を行うモバイル望遠鏡、および、モバイル天文台を構築し、教育現場で授業実践を通して、新しい天体観測授業を開発する。また、タブレット端末を用いた学習に望遠鏡操作と天体観察という新たな機能を提供し、一台の端末が無限に広がる学びの世界の扉になる可能性を提案し、学校教育のICT化に寄与することを目的としている。本年度は、学校によって採用されているモバイル端末やPC端末の機種やOSが異なるため、遠隔側の端末がいずれの場合にも対応できるように、さらに、ありうる問題点を精査するために、一般的に用いられている、iOS、Windows10、Androidの3つのOSを搭載したモバイル端末を導入して、モバイル望遠鏡並びに学校現場で活用するためのシステムの検討を実施した。特に、プロジェクタ投影等、モバイル端末の画面を生徒らで共有する方法や、遠隔操作の土台となるリモートデスクトップ機能については、OS単位で異なる方法を検討する必要があることが判明した。また、2016年12月には、本モバイル望遠鏡のシステムを用いた星空観察授業を小学生対象に実施し、生徒らから評価を得た。その結果、特に、小学生はモバイル端末の操作性等ユーザビリティが重要であることがわかった。モバイル端末について各種検討ができたほか、また、モバイル望遠鏡についても、システムを新しく安定的に動かせるようになっている。また、これまでに、モバイル望遠鏡を活用した授業を2回実践し、授業での使われ方について検討を重ねることができている。ただし、ルーフ開閉の遠隔操作機器の不調など機器の故障の問題もありシステム全体としての安定性を保持するための施策が必要がある。

天文分野は、主に夜間観察する事象を昼間の授業内に学習するため、授業中の実験・観察が困難で、「本物」の星空や天体を授業中に見せる機会はほとんどない。しかし、ICT機器やインターネットを活用すれば、「今現在の星空・天体」を観察することが可能である。そこで、本研究では学校に導入されつつあるモバイル型タブレット端末から遠隔にある天体望遠鏡を生徒自ら操作して天体観測を授業中に行うモバイル望遠鏡、および、モバイル天文台を構築し、教育現場における授業実践を通して、新しい天体観測授業を開発することを目的としている。モバイル望遠鏡のシステム検討ならびに構築に加え、本年度は、教室での授業を想定し、授業者にとって活用しやすいモバイル望遠鏡利用のための教室側のシステムを検討・構築した。特に、生徒・児童が1人1台のタブレット端末を持つ将来型の授業形態を想定し、教室の中で教師の1台のタブレット端末から生徒・児童のタブレット端末の望遠鏡操作権限の制御を可能とし、クラス全体で天体の観察授業ができる観察システムの構築と運用を実現した。このモバイル望遠鏡システムと教室側の観察システムを利用し、小学生20名を対象としたモバイル望遠鏡を用いた天体観察の実践授業を行い、1人1台与えられたタブレット端末から望遠鏡を操作して、全員で天体の映像を観察した。この結果、教師側は、全児童・生徒の端末管理が可能となり、より円滑な授業運営が可能となった。また、太陽の日周運動の観察のための全天カメラを赤道直下のタイ国に設置し、リアルタイムで赤道域の太陽の位置がわかるほか、合成することで太陽の日周運動の映像も保存できた。この結果、中緯度地域に位置する仙台と赤道域のタイでの太陽の位置や日周運動と比較して観察する教材が開発された。モバイル望遠鏡の開発については、順調であり構築されているが、機器の故障等の対応も必要となり、長期自動運転とまでの安全性が満たされていない現状である。理科実験教室等を利用して、モバイル望遠鏡を用いた授業実践も数回実施し、その都度、検討課題が挙げられ対応をしている状況である。次年度は、実際の学校における授業の中での活用を、実践を通して評価する必要がある。また、太陽の位置リアル観測用の全天カメラを海外に設置できたことから、世界へのネットワーク拡大も検討したい。天文分野は、主に夜間観察する事象を昼間の授業内に学習するため、授業中の実験・観察が、困難で「本物」の星空や天体を授業中に見せる機会はほとんどない。しかし、ICT機器やインターネットを活用すれば、「今現在の星空・天体」を観察することが可能になる。
アラキドン酸カスケードを介した癌幹細胞制御機構の解明

癌幹細胞は各種癌において治療抵抗性や転移再発に関与することが報告されているが、膵癌における最も臨床的意義を持つ癌幹細胞マーカーは明らかにされていなかった。本研究では慢性炎症における臨床的に有用な膵癌幹細胞マーカーを明らかにするとともに、マウス膵腫瘍モデルを用いて膵癌幹細胞分画拡大を介した膵癌進展メカニズムの検討をおこなった。今後、ヒト膵管癌に組織学的に類似したマウス膵腫瘍を用いた解析により、膵癌バイオマーカー研究への応用が期待できる。膵臓の慢性炎症は膵癌発癌・進展と深く関わっていることが知られている。好中球リンパ球比(NLR)は炎症マーカーの一つであるが、私たちは膵管内乳頭粘液腺癌(IPMC)症例においてNLRが有意に高値であることを報告している。また膵腫瘍においてNLR高値症例では膵癌が多く、NLR高値が膵癌診断のsupportive markerとなること、膵内分泌腫瘍においてNLRが悪性度と相関し、NLR高値症例では低悪性度でも術後肝転移症例が多いことを明らかにした。一方で、癌幹細胞は腫瘍階層性の頂点にあり治療抵抗性や再発に深く関わるため、私たちも癌幹細胞マーカーの機能解析をおこなってきた。これらの研究成果を背景として、本研究では慢性炎症を制御するアラキドン酸カスケードと癌幹細胞に注目した解析を開始した。本年度の解析結果からアラキドン酸代謝物分解酵素である15-PGDHの発現は、癌部では発現が低下しており膵癌幹細胞マーカーのALDH1(Aldehyde dehydrogenase 1)は15-PGDH発現と逆相関関係にあることを見出した。さらにALDH1高発現症例は全生存期間、無再発生存期間が有意に短縮することを認めた。さらに癌細胞内へのアラキドン酸代謝物の蓄積が癌患者の予後を悪化させる分子メカニズムの詳細をin vitro解析により示し、生体レベルでの解析として膵上皮内腫瘍性病変(PanIN)を形成するLox-STOP-Lox(LSL)-KrasG12D;Ptf1aCre/+(KrasG12D)マウスをベースとして15-PGDH-/- KrasG12Dマウスを作製した。熊本大学の臨床および基礎研究室、それぞれの研究組織が得意とする研究手法を活かした共同研究を展開する事が出来ている。既にin vitroでの解析、臨床検体を用いた予後解析、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子改変マウスの作製まで終了している。本年度、連携研究者である大村谷准教授が兵庫医科大学遺伝学教室の教授として転出されたが、当初の計画に変更は無く、現在も連携して共同研究を進めている。また、癌進展に付随する慢性炎症に注目した関連研究テーマの研究成果を消化器病学のトップジャーナルに報告した(Ishimoto et.al. Gastroenterology 2017 in press)。本研究の成果は日本国内の複数の全国学会、シンガポールで開催されたヨーロッパ腫瘍学国際学会、アメリカ癌学会総会にて報告をおこなった。現在、これまでの本研究成果をまとめて腫瘍学トップジャーナルへの投稿準備を進めている。癌幹細胞は各種癌において治療抵抗性や転移再発に関与することが報告されているが、膵癌における最も臨床的意義を有した癌幹細胞マーカーは明らかにされていなかった。近年、炎症性サイトカインであるプロスタグランジンE2(PGE2)が正常組織における幹細胞の拡大や癌進展に関与することが知られているが、癌幹細胞におけるPGE2の役割は明らかでは無かった。本研究の目的は、慢性炎症における臨床的に有用な膵癌幹細胞マーカーを検討するとともに、膵癌幹細胞分画拡大を介した膵癌進展メカニズムを明らかにすることであった。PGE2の分解酵素である15-PGDHについて臨床検体における発現解析、膵癌細胞株を用いて15-PGDH遺伝子の機能解析を行った。さらに膵癌微小環境における15-PGDH発現制御メカニズムを見出し、研究成果を報告した(Arima et al. Cancer Sci. 2018)。この研究結果に基づいてinhibitorや中和抗体を用いた解析によって膵癌細胞株の増殖能・sphere形成能に与える影響を評価した。さらに膵腫瘍自然発症モデルマウスと15-PGDHノックアウトマウスの交配をおこない、生体内における腫瘍形成・膵癌幹細胞マーカー発現への影響について評価をおこなった。15-PGDHノックアウト膵腫瘍モデルマウスはPGE2蓄積を伴ないヒト膵管癌に組織学的に類似した腫瘍を形成するため、今後膵癌バイオマーカー研究への応用が期待できる。膵上皮内腫瘍性病変(PanIN)を形成するKrasG12Dマウスと本研究において作製した15-PGDHノックアウトマウスの交配を行なった結果、プロスタグランディンE2の蓄積に伴い腫瘍腺管ならびに腫瘍の著明な増大を示した。現時点では、まだ腫瘍の表現型以外に腫瘍増大につながる分子論を説明できるデータを得ていないが、in vitroの解析においてはプロスタグランディンE2の蓄積に伴いALDH1陽性な未分化な腫瘍細胞の増殖、ALDH

1発現に依存的な自己複製能関連遺伝子の発現上昇を確認している。今後、これらの分子メカニズムが遺伝子改変マウスの腫瘍においても存在するか否か更なる検討をおこなっていく。外科学、腫瘍生物学医局保管の消耗品を使用することが出来たため。平成28年度の実験計画を推進し、今後は分子メカニズムが遺伝子改変マウスの腫瘍においても存在するか否か更なる検討をおこなっていくため、各種実験消耗品及び、実験動物の購入・飼育費に充てたいと考える。また、最終年度でもあるため、研究成果発表にかかる出張旅費にも充てたい。
低分子二重特異性抗体の機能的な構造の解明に向けた既存抗ペプチド抗体の結晶化抗体化

低分子二重特異性抗体の機能的な構造の解明に向けた結晶化抗体の新たな調製法の開発を目指した。既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドをデータベースより選抜後、低分子二重特異性抗体に導入し、特異的抗体を結晶化抗体として用いることを試みた。結果、可溶性のタンパク質として十分な量を確保することが出来なかったため、発現宿主の検討も含めてさらなる検討が必要であるが、低分子二重特異性抗体のリンカー部位に選別した抗原ペプチドを導入し得ることが示された。低分子二重特異性抗体は、次世代抗体医薬として期待されているが、実用化された例は海外で1件のみであり、機能的なシーズをデザインするための技術基盤が未整備、特に立体構造情報が欠落していることに一因がある。構造解析に向けては結晶化抗体の利用が考えられるが、新たな抗体の取得は容易ではなく、また汎用性もない。本研究は、既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドを低分子二重特異性抗体に含まれるリンカーに組み込むことで、当該特異的抗体を結晶化抗体として利用し、その機能的な構造を解明することを目的としている。Ex3はがん関連抗原であるヒト上皮増殖因子受容体(EGFR)とリンパ球表面抗原であるCD3を標的としたディアボディ型二重特異性抗体である。本年度は、まず蛋白質構造データバンク(PDB)から抗体ー抗原ペプチドの共結晶構造情報を抽出し、抗体中に深く埋没しておらずアクセスビリティが高いことや、対応する特異的抗体の親和性が高いこと、など様々な観点からリンカーに組み込む抗原ペプチドの選定を進め、最終的に、精製・検出に用いられる抗ペプチドタグ抗体を2種類含む5種類のペプチド-抗体複合体を選別した。一方で、短いペプチドは5アミノ酸程度であったため、リンカーに組み込んだ際に、立体障害により特異的抗体が結合できないことが懸念された。そこで、リンカーへの挿入に先駆けてEx3のリンカー長の延長の許容性に関して検討を行った。従来のリンカーの3倍の長さを有するEx3を調製し、機能評価を行ったところ、報告されている自己集合体の形成の促進は見られず、興味深いことに活性の向上が認められた。このことから、抗原ペプチドの挿入の際には両末端方向に対してある程度のスペーサー配列の挿入が可能であることが分かったため、今後はペプチドの長さに応じた適切なリンカー配列をデザインする予定である。本年度は、まずデータベースから抗体ー抗原ペプチドの共結晶構造情報を抽出し、抗体中に深く埋没しておらずアクセスビリティが高いことなどを指標にリンカーに組み込む抗原ペプチドの選定を進め、精製・検出に用いられるペプチドタグ抗体を2種類含む5種類のペプチド-抗体複合体を選別した。この際、抗体の中心部に向かって埋没しているペプチド、即ちどちらか一方の末端が露出していないペプチド-抗体複合体は候補から除外したが、両末端が露出しているもののペプチド長が短いものは、リンカーに組み込んだ際に、立体障害により特異的抗体が結合できないことが懸念された。そこで、リンカーへの挿入に先駆けてEx3のリンカー長の延長の許容性に関する予備検討を進めた。低分子二重特異性抗体のリンカー長の延長は、フレキシビリティの向上に伴う、自己組織化の促進がしばしば観察されることが報告されている。しかしながら、従来のリンカーの3倍の長さを有するEx3の発現ベクターを作製し、大腸菌発現系を用いて調製したところ、ゲル濾過で顕著な高分子量の分子種の増加は認められなかったため、抗原ペプチドの挿入の際には両方向に対してある程度のスペーサー配列の挿入が可能であることが分かった。当初は、選定したペプチドを挿入したEx3の作製、および特異的抗体の全合成を進める予定であったが、前述の通り、予備実験としてリンカー長の許容性の確認を行う必要性が生じたため、全体としては、やや遅れているとした。今年度は、前年度選別した抗体ー抗原ペプチドの共結晶構造情報をもとに、実際に当該ペプチドをリンカーに挿入した低分子二重特異性抗体Ex3と当該ペプチド特異的抗体の全合成、および調製へと進めた。まず、ペプチド特異的抗体の遺伝子配列を発現宿主である大腸菌に至適なコドンに置換した配列を設計し全合成後、大腸菌分泌発現ベクターに挿入した。大腸菌を形質転換後、Western blottingにより発現確認を行った結果、菌体内不溶性画分、菌体内可溶性画分、および培地上清画分のいずれにも発現している様子が確認された。続いて、菌体内可溶性画分から金属キレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行った結果、目的分子量に一致した精製度の比較的高いタンパク質バンドが観察されたため、ペプチド特異的抗体の調製に成功したといえる。一方、大きく形態の異なる2種類のEx3のリンカーにペプチド配列を挿入した分子を設計し、PCRにより、それぞれ発現ベクターを作製した。

今後、ペプチド特異的抗体と同様に、発現確認、精製へと進め、機能評価を行う予定であり、それぞれ結果が良好であれば、ペプチド特異的抗体との複合体を作製し、結晶化へと進める。前年度までに、アクセスビリティが高いことや、対応する特異的抗体の親和性が高いこと、など様々な観点からリンカーに組み込む抗原ペプチドの選定を進め、最終的に、精製・検出に用いられる抗ペプチドタグ抗体を2種類含む5種類のペプチド-抗体複合体を選別した。本年度は、まず選別したペプチド特異的抗体の遺伝子配列を発現宿主である大腸菌に至適なコドンに置換した配列を設計し全合成後、大腸菌を用いた組換え発現を行った結果、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製に成功した。一方で、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した分子に関しては、形態が異なる2種類の分子を作製したが、発現確認を行った結果、従来の培養法では、菌体内不溶性画分での発現はみられたものの、菌体内可溶性画分や培地上清画分などの可溶性画分にはほとんど発現がみられなかった。このため、培地組成など培養条件の検討を行う必要性が生じ、前述の新たに調製したペプチド特異的抗体との複合体の作製に基づく、結晶構造解析に進むことが出来ず、未使用額が生じ期間延長を行ったため、やや遅れているとした。低分子二重特異性抗体は、次世代抗体医薬として期待されているが、実用化された例は海外で1件のみであり、機能的なシーズをデザインするための技術基盤が未整備、特に立体構造情報が欠落していることに一因がある。構造解析に向けては結晶化抗体の利用が考えられるが、新たな抗体の取得は容易ではなく、また汎用性もない。本研究は、既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドを低分子二重特異性抗体に含まれるリンカーに組み込むことで、当該特異的抗体を結晶化抗体として利用し、その機能的な構造を解明することを目的としている。前年度に引き続き、Ex3のリンカーにペプチド配列を挿入した2種類の分子形態に関して、可溶性画分からの調製を目指した培養条件検討を進めた。結果、内1種類に関しては培養上清への分泌が確認されたため、金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製を行ったが、目的蛋白質を高純度で得ることが出来なかった。そこで、菌体内不溶性画分を塩酸グアニジンで可溶化後、巻き戻し操作による調製を試みた行った結果、リンカーにペプチド配列を挿入した可溶性のEx3分子の調製に成功した。そこで、前年度までに可溶性画分からの調製に成功しているラクダ科由来の抗ペプチドシングルドメイン抗体と混合させ、複合体形成の有無をゲル濾過により確認した。結果、明確な複合体の形成はみられず、また電気泳動によりリンカーにペプチド配列を挿入したEx3分子の明瞭なバンドが確認できなかったため、リンカーの改変により凝集体が形成されたと考えられた。分子としての安定性を維持するようなペプチド配列の選択や挿入場所の検討が必要であることが示された。低分子二重特異性抗体の機能的な構造の解明に向けた結晶化抗体の新たな調製法の開発を目指した。既に特異的抗体との共結晶構造が報告されている抗原ペプチドをデータベースより選抜後、低分子二重特異性抗体に導入し、特異的抗体を結晶化抗体として用いることを試みた。