hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性型ビタミン_3のコロニー刺激因子の分化誘導作用に及ぼす調節作用の解明

骨髄細胞の分化誘導機構の解明は、免疫系の理解のみならず血液ガンに対する分化療法開発のために必須である。しかしながら、これまでの研究では、分化誘導能を持つ物質についていくつか発見されたものの、未だ実際の複雑な分化は説明できなかった。しかし、最近、分化誘導能を持つ物質を複数組み合わせることにより、その分化誘導能が飛躍的に高まる場合があることが見い出された。我々は、過去ビタミンD3を用いた破骨細胞の分化誘導を研究していく中で、ビタミンD3がマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)あるいはマクロファージ/顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF)の分化誘導能を高めることを見い出した。しかも興味深いことには、ビタミンD3は骨髄未分化細胞からマクロファージ方向への分化を誘導する物質であると従来認識されているが、各種コロニー刺激因子の存在下では処理方法により顆粒球方向への分化をも誘導することが明らかとなり、あたかも分化方向をスイッチングしているような所見が得られた。そこで、本年度の研究は、ビタミンD3と残り1つのコロニー刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の相互作用を明らかにし、これまでの研究と併せて統括するとともに、分化誘導物質の相互作用という観点の可能性を検討した。マウス未分化骨髄細胞を材料としたG-CSFまたはビタミンD3処理は、それぞれクロロアセテートエステラーゼ及びノンスペシフィックエステラーゼの発現を引き起こしたが、その同時処理は両方のエステラーゼについて飛躍的な発現をもたらした。同様にこれら同時処理は、テトラゾリウム還元能を著変させなかったものの、Mac-1表面抗原の発現について、また貧食能を有する細胞の割合には著しい上昇をもたらした。形態的には、大型球形細胞ならびに不定形接着性細胞の同時多数出現が認められた。これらの所見は、G-CSF及びビタミンD3は単独ではそれぞれ顆粒球方向、マクロファージ方向に分化誘導するが、それら組み合わせ処理は、両方の方向にしかも強力に分化誘導することを示唆するものである。このことは、別の方向へ分化誘導するべき物質同士が相乗作用を現すことを見い出した点において画期的である。CSFとビタミンD3の相互作用を総じて、分化誘導方向について複雑に調節しあっていることが認められ、さらにどの場合でも作用力において相乗的であった。この結果は分化誘導機構研究の一助となるが、さらに、作用点の詳細な解明ならびに他多種の分化誘導物質との相互作用の研究が今後求められる。
ヌクレオホスミンにより転写後発現制御される遺伝子の軟骨における役割の解析

NPMに結合するmRNAをクローニングした。すなわち、マウス軟骨細胞株であるATDC5細胞においてこれを鋳型にcDNAマイクロアレイ法にて、特異的遺伝子を単離する。単離されたmRNAがNPMタンパクと実際に結合することをRNAゲルシフト法(REMSA)によって確認した後、発現調節がなされているかをレポーターアッセイ、RNA分解アッセイ、および細胞分画アッセイで精査した。一方、この遺伝子のmRMAおよび翻訳後のタンパクの発現をin vitroおよびin vivoで検索した。骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞などの骨代謝に関与する細胞の分化・増殖は多くの遺伝子によって厳格に制御されている。さらに、細胞における遺伝子の発現は、様々な段階(転写、転写後調整、翻訳、翻訳後調整など)で、様々なタンパクによって調節されていることが報告されている。細胞核内のゲノムDNAからmRNAへの転写制御機構は、軟骨細胞などを含む様々な細胞で、数多く報告されてきた。さらに、最終的な遺伝子発現は、転写以降の段階でも巧妙に制御されている。すなわち、核内あるいは細胞質におけるmRNAの輸送、安定性調節などの転写後制御および、リボゾーム(ポリゾーム)におけるタンパク-核酸複合体結合制御や翻訳制御などである。しかし、骨芽細胞や軟骨細胞などの硬組織系細胞では、この制御機構がほとんど明らかにされていない。そこで、本研究では、アフィニティクロマトグラフィー法によるNPM結合RNAの精製、およびcDNAマイクロアレイの実施準備を行った。すなわち、CMVプロモーター下流に、マウスNPMのcDNAの5'末端(アミノ酸配列のC末端)にHA抗原タグを付与したキメラタンパク質をコードする哺乳類発現ベクターを作成し、これをマウス軟骨細胞株ATDC5細胞にトランスフェクションをおこなった。48時間後に、タグ付き強制発現NPM-RNA複合体を化学的に架橋固定し、抗HA抗体で免疫沈降させる。これをプロテインGカラムに通し、塩濃度勾配法にて抗体特異的NPM-RNA複合体を溶出させる。過熱還元反応によりRNA-NPM間の架橋結合を破壊、ただちにRNAを精製し、この精製されたRNAを鋳型として、cDNAに逆転写し、次世代シークエンサーで目的のcDNAの発現を解析中である。過熱還元反応によりRNA-NPM間の架橋結合を破壊、ただちにRNAを精製し、この精製されたRNAを鋳型として、cDNAに逆転写し、DNAマイクロアレイ(GeneChip、アフィメトリクス社)にて遺伝子発現をした。

すなわち、CMVプロモーター下流に、マウスNPMのcDNAの5'末端(アミノ酸配列のC末端)にHA抗原タグを付与したキメラタンパク質をコードする哺乳類発現ベクターを作成し、これをマウス軟骨細胞株ATDC5細胞にトランスフェクションをおこなった。48時間後に、タグ付き強制発現NPM-RNA複合体を化学的に架橋固定し、抗HA抗体で免疫沈降させる。これをプロテインGカラムに通し、塩濃度勾配法にて抗体特異的NPM-RNA複合体を溶出させる。過熱還元反応によりRNA-NPM間の架橋結合を破壊、ただちにRNAを精製し、この精製されたRNAを鋳型として、cDNAに逆転写し、DNAマイクロアレイ(GeneChip、アフィメトリクス社)にて遺伝子発現を解析中である。平成24研究計画に基づいて、以下の研究を遂行した。「次世代シークエンサーにより単離されたされた遺伝子の内軟骨性骨化における軟骨細胞の増殖・分化に対するin vitroでの検討」ATDC5細胞をインスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウムで増殖肥大化終末分化軟骨細胞に分化誘導し、それぞれの分化ステージで、単離された遺伝子がどのように発現しているかをreal time RT-PCRおよび、細胞分画western blotting法で検討した。なお、骨・軟骨の増殖の検索には、MTTアッセイを用い、分化マーカーの検索には、アルカリホスファターゼ活性測定、硫酸化GAG定量などの生化学的アッセイを行った。さらに、TUNEL染色、アルカリホスファターゼ活性染色、アリザリンレッドS染色、トルイジンブルー染色などの細胞組織化学染色法も同時に行った。平成23年度研究計画に示したように、以下の研究を遂行した。1.アフィニティクロマトグラフィー法によるNPM結合RNAの精製、およびcDNAマイクロアレイサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下流に、マウスNPMのcDNAの5'末端(アミノ酸配列のC末端)にV5抗原および6xHisタグを付与したキメラタンパク質をコードする哺乳類発現ベクター(インビトロゲン社)を作成し、これをインスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウムで成熟軟骨細胞に分化させたマウス軟骨細胞株ATDC5細胞にトランスフェクションする。トランスフェクション48時間後に、細胞をRIPAバッファーで回収、4%ホルムアルデヒドで、タグ付き強制発現NPM-RNA複合体を架橋固定し、抗V5抗体で免疫沈降させる。この溶液をプロテインGカラムに通し、カラム洗浄後、塩濃度勾配法にて抗体特異的NPM-RNA複合体を溶出させる。SDS-DTT存在下の過熱還元反応により、RNA-NPM間の架橋結合を破壊、ただちに酸性フェノール法にてRNAを精製し、これをNPM結合RNAライブラリー原液として保存する。精製されたRNAを鋳型として、メーカーのプロトコールに従いcDNAに逆転写し、DNAマイクロアレイ(GeneChip、アフィメトリクス社)にて遺伝子発現を解析する。
スフィンゴ糖脂質による生体調節における分子クラスター形成と特異性の創出機構

スフィンゴ糖脂質による生体調節、とくに分子クラスターの形成プロセスとシグナルの調節機構に関し多くの成果が得られた。糖脂質の欠損では、残存糖脂質構造の代償機能が働く。GM3-onlyマウスの解析から、細胞膜ミクロドメインの健常性の維持にとって、糖脂質糖鎖の正しい構成が必須であることが、種々の実験から明らかになった。とくに、ラフトの異常が補体系の活性化を惹起して、神経変性の重要な要因となることが示唆された。糖脂質糖鎖の合成酵素ノックアウト(KO)マウス群を用いて、糖脂質糖鎖の生体内機能、特に脂質ラフトの構造と機能維持メカニズムにつき検討した。1.GM2/GD2合成酵素KOマウスとGD3合成酵素KOマウスを交配して作成したダブルKOマウスの表現型と病理組織織学的異常につき明らかにした。早期より振戦、歩行異常、抗うつ反応などの異常を認めた。2.2種の単独KOマウスおよびダブルKOマウスの脳より膜画分を分離し、ショ糖密度勾配超遠心によりタンパク質の分画を行った。各分画におけるラフトマーカー及びGPIアンカーダブルノックアウトでは著明なフロチリン、CD55などのラフトからの放散が認められた。3.DNAアレイにより、ダブルKOマウスの小脳と脊髄での遺伝子発現profileを比較検討した。その結果、補体系遺伝子の全般的な発現亢進を認めた。しかし産物のタンパクレベルは正常又は減少する場合もみられた。また炎症性サイトカイン遺伝子の発現レベルも亢進し、そのタンパク質産物の上昇も確認された。組織的検討においても、DKOのラフトでは、マーカー分子の局在が曖昧となり、ラフトの構造の基本的骨格が崩壊していることが示唆された。4.ダブルKOマウスで発現が低下している遺伝子としてNinj2が同定されたので、その発現ベクターを作成し、オリゴデンドロサイト細胞株に導入して細胞のstress耐性などを検討中である。また、Ninj2が相互に結合して、陽性細胞同士が凝集することを確認した。スフィンゴ糖脂質による生体調節における分子クラスター形成の意義と機構の解明のため、以下の実験を行って、新しい知見を得た。1.種々のガングリオシド欠損マウスにおける膜ミグロドメインにつき、スクロース密度勾配超遠心による蛋白質の分画とGPI-アンカー蛋白質の免疫組織染色により検討した結果、欠損糖脂質の範囲に応じた異常が認められた。2.GD3合成酵素KOマウス、GM3合成酵素KOマウスでは、ラフトマーカーであるflotillinの局在に大きな変化は認められなかった。3.複合型ガングリオシドを欠損するGM2/GD2合成酵素KOマウスでは、9-O-アセチルGD3が著明に発現しており、KOにおける代償作用が示唆された。また、初代培養アストロサイトにより、野生型マウスでも9-O-アセチルGD3を合成しうることが確認された。4.ダブルKOマウスにおける遺伝子発現プロフィールから、炎症・免疫関連遺伝子の発現が亢進しており、とくに補体系遺伝子(補体成分、補体受容体)の発現亢進を認めた。5.スクロース密度勾配超遠心により分画後、GPI-アンカー蛋白質の細胞内局在を検討し、flotillinおよび補体制御因子CD55の、非ラフト画分への移行が認められた。6.免疫組織化学的解析によりflotillihやCD55の分布を検討した結果、ダブルKOマウスで膜染色パターンの異常が認められた。即ち、膜に局在するflotillinやCD55が細胞質にも染色され、膜のintegrityの消失が示唆された。
放射線誘発クロマチン損傷修復におけるMDC1/53BP1センターシャペロンの機能

DNA二重鎖切断で誘導されるヒストンH2AXのリン酸化が、クロマチン損傷部位を特定する分子タグとして機能し、それを目印にMDC1/53BP1センサーシャペロンがクロマチン損傷を検出している可能性を明らかにするために、分裂中期染色体上でリン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成を検出できる実験系の検討を行った。放射線照射によるDNA二重鎖切断に起因した染色体異常は、照射直後は染色分体型の異常が、照射20時間後には染色体型の異常が観察されることを確認した。リン酸化ヒストンH2AXのフォーカスは、染色分体型の異常部位に確認されたが、MDC1フォーカスを同じ部位に局在することがわかった。さらに、染色体型の異常でも、リン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1のフォーカスは局在し、その部位は染色体異常が確認されない個所であった。以上の結果から、照射直後にDNA二重鎖切断部位に局在するリン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1は、照射後時間が経つにつれて必ずしも損傷部位に残存しないことが示唆された。さらに、MDC1/53BP1センサーシャペロンが、放射線照射後初期の段階でどのような役割を果たしているかを明らかにするため、EGFP-53BP1蛋白質を発現する正常ヒト二倍体細胞を樹立し、X線照射後のEGFP-53BP1フォーカスをタイムラプス法により解析した。その結果、放射線照射後15分以内に形成される初期フォーカスは、その後30分の間に徐々にその領域が拡大することが判明した。さらに、この拡大したフォーカスには、ヒストンH2AXやその他のDNA損傷チェックポイント因子が共局在し、多重蛋白質複合体を形成していることもわかった。MDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成に重要なATMによりリン酸化をATMの特異的阻害剤であるKU55933で阻害したところ、リン酸化ATMフォーカスが完全に消失した条件で、53BP1フォーカスは消失することから、MDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成には、ATM機能依存的なリン酸化が必須であることが明らかになった。その結果、コルセミド処理(0.1μg/ml)を施し、集積した分裂中期細胞を回収し、0.075MKClで20分間低張処理をし、さらにカルノー液により固定した細胞をスライドグラス上に展開し、風乾後にPBS緩衝液中で再度潤化し、抗体処理をする方法を確立した。1次抗体には、BETHYL社の抗MDC1抗体および抗53BP1抗体を用いた。1次抗体の検出には、蛍光物質としてAlexa488もしくはAlexa594で標識した抗ウサギ抗体を用いた。染色体DNAはヨー化プロピジウムにより対比染色した。蛍光画像の検出は、本研究費で設備したライカ社製蛍光イメージングシステムを用いて行った。放射線照射により、細胞中のDNAにに重鎖切断が生じそれに起因して染色体に異常が起こる。

染色体異常としては、照射直後は染色分体型の異常が、照射20時間後には染色体型の異常が観察されることを確認した。リン酸化ヒストンH2AXのフォーカスは、染色分体型の異常部位に確認されたが、MDC1フォーカスを同じ部位に局在することがわかった。さらに、染色体型の異常でも、リン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1のフォーカスは局在し、その部位は染色体異常が確認されない個所であった。以上の結果から、照射直後にDNA二重鎖切断部位に局在するリン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1は、照射後時間が経つにつれて必ずしも損傷部位に残存しないことが示唆された。DNA二重鎖切断で誘導されるヒストンH2AXのリン酸化が、クロマチン損傷部位を特定する分子タグとして機能し、それを目印にMDC1/53BP1センサーシャペロンがクロマチン損傷を検出している可能性を明らかにするために、分裂中期染色体上でリン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成を検出した。その結果、照射直後にDNA二重鎖切断部位に局在するリン酸化ヒストンH2AXおよびMDC1は、照射後時間が経つにつれて必ずしも損傷部位に残存しないことが明らかになった。MDC1/53BP1センサーシャペロンが、放射線照射後初期の段階でどのような役割を果たしているかを明らかにするため、EGFP-53BP1蛋白質を発現する正常ヒト二倍体細胞を樹立し、X線照射後のEGFP-53BP1フォーカスをタイムラプス法により解析した。その結果、放射線照射後15分以内に形成される初期フォーカスは、その後30分の間に徐々にその領域が拡大することが判明した。さらに、この拡大したフォーカスには、ヒストンH2AXやその他のDNA損傷チェックポイント因子が共局在し、多重蛋白質複合体を形成していることもわかった。さらに、MDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成に重要なATMによりリン酸化をATMの特異的阻害剤であるKU55933で阻害したところ、リン酸化ATMフォーカスが完全に消失した条件でも、53BP1フォーカスは検出されることから、MDC1/53BP1センサーシャペロンのフォーカス形成には、ATM機能依存的なリン酸化により修飾以外に、クロマチン構造の変化に伴うクロマチンアセチル化の露出が必要であることが明らかになった。
食用担子菌による効率的なラッカーゼ等の有用タンパク質発現系の確立

食用担子菌による効率的なラッカーゼ等の有用タンパク質発現系を確立することを目的に、シイタケの遺伝子導入法の改良とラッカーゼ遺伝子の発現を試みた。その結果、遺伝子導入法に関しては、プロトプラスト調製法を簡便化できた。また、シイタケラッカーゼ遺伝子lcc1発現ベクターを構築しシイタケに導入したところ、宿主よりも2倍以上ラッカーゼ活性の高い株を得た。また、異種ラッカーゼとして漆のラッカーゼ遺伝子を単離し、cDNAの全配列を決定した。本研究では、担子菌類の中でも安全性が高く有用性が高い食用担子菌類の効率的な遺伝子導入法を確立すること、及び、ラッカーゼなどの有用遺伝子発現ベクター系を確立することを目的とする。本年度は、シイタケに関する遺伝子導入法の検討、発現ベクター導入株の解析,及び漆ラッカーゼ遺伝子の単離について検討した。遺伝子導入法に関しては、昨年度検討したエレクロトロポレーターによる裁断菌糸への直接導入法の予備実験結果を踏まえ、電圧1000Vによる裁断菌糸へのシイタケ薬剤耐性遺伝子発現ベクターの導入を試みたが、これまでのところ組換え体は得られていない。そこで、現在、培養菌糸の細胞壁溶解酵素処理条件の検討を行っている。シイタケ用ベクターとして構成的発現遺伝子(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子)プロモータと光誘導性遺伝子(チロシナーゼ遺伝子)プロモータを利用したベクターに、シイタケlcc1遺伝子を挿入したpChG-lcc1とpChT-lcc1をそれぞれ構築し、PEG-CaCl2法によって得られた形質転換体に関して解析を行った。その結果、前者ベクター導入株に関して、宿主株よりもラッカーゼ活性の高い組換え株の存在を確認できた。また、漆からのラッカーゼ遺伝子の単離のために、漆の葉からcDNAとゲノムDNAを調製した。DDBJに登録されている漆ラッカーゼ遺伝子情報をもとに、PCRによる増幅を試みたが、cDNA遺伝子断片は得られなかった。そこで、他の木本植物のラッカーゼ遺伝子情報をもとに、縮重プライマーを新たにデザインして、PCRを行ったところ、遺伝子断片が得られた。得られた断片の配列を決定したところ、既知の漆ラッカーゼ遺伝子と異なることが明らかとなった。今回の結果から、漆には発現時期あるいは発現部位などの異なる複数のラッカーゼ遺伝子が存在することが示唆された。本年度は、シイタケに関する遺伝子導入法簡便化の検討、シイタケラッカーゼ遺伝子lcc1発現ベクター導入シイタケ株の解析、及び漆ラッカーゼ遺伝子の単離について検討した。遺伝子導入法に関しては、エレクロトロポレーターによるシイタケ裁断菌糸への直接導入法によるシイタケの形質転換を試みたが、組換え体は得られなかった。そこで、プロトプラスト調製法の簡便化に関して検討を行った。その結果、本培養時に残存する菌糸を再利用することで、前々培養が省略可能となった。シイタケ用ベクターとして構成的発現遺伝子(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子:gpd)プロモータを利用したベクターに、シイタケlcc1遺伝子を挿入したpChG-lcc1をPEG-CaCl2法によって得られた形質転換体に関して解析を行った。その結果、宿主株よりも2倍以上ラッカーゼ活性の高い組換え株が選抜され、gpd遺伝子プロモータからのlcc1遺伝子の発現が、RT-PCR法により確認できた。次に、漆のラッカーゼ遺伝子をシイタケで発現させるために、漆の葉から漆ラッカーゼ遺伝子cDNAの単離を試みた。DDBJに登録されている漆ラッカーゼ遺伝子情報をもとに、RACE法により漆ラッカーゼ遺伝子cDNA全長の配列Tvlccを単離し、その配列を決定した。その結果、既知情報と、DNA配列で15塩基の違いがあることが明らかとなった。また、新規に、漆ラッカーゼ遺伝子cDNAの、5`非翻訳領域、N末端のシグナルペプチド領域、及び3'非翻訳領域の配列を明らかにした。本研究では、担子菌類の中でも安全性が高く有用性が高い食用担子菌類の効率的な遺伝子導入法を確立することと、ラッカーゼなどの有用遺伝子発現ベクター系を確立することを目的とする。本年度は、シイタケに関する遺伝子導入法と発現ベクターの構築,及び漆ラッカーゼの単離について検討した。遺伝子導入法に関しては、エレクロトロポレーターによる裁断菌糸への直接導入法の予備実験として、電流量やパルス回数による裁断菌糸の死滅に及ぼす影響について検討した。現在、1×10の7乗程度の生細胞の懸濁液の調製が可能となり、細胞の生残率が10%程度になる条件を検討中である。

発現ベクターの構築に関しては、シイタケ用ベクターとして構成的発現遺伝子(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子)プロモータと光誘導性遺伝子(チロシナーゼ遺伝子)プロモータを利用したベクターに、シイタケlcc1遺伝子を挿入したpChG-lcc1とpChT-lcc1をそれぞれ構築した。構築したベクターは、従来法であるプロトプラストを用いたポリエチレングリコール(PEG)-塩化カルシウム法によって、シイタケに導入した。また、次年度予定していた漆からのラッカーゼ遺伝子の単離のために、漆の葉からのcDNA調製とゲノムDNAの調製を行った。また、予備試験として、登録されている漆ラッカーゼ遺伝子情報をもとに、数種類のプライマーを合成し、PCRによる増幅を試みた。しかしながら、現在のところ増幅バンドは確認できていない。原因としては、登録情報のもとになった漆と、今回単離に用いた漆との種の違いによる配列の相違や、今回原料とした漆の葉では、時期的な問題から、ラッカーゼが発現していなかった可能性などが考えられる。本研究では、担子菌類の中でも安全性が高く有用性が高い食用担子菌類の効率的な遺伝子導入法を確立することと、ラッカーゼなどの有用遺伝子発現ベクター系を確立することを目的とする。本年度は、シイタケの遺伝子導入法簡便化の検討、漆ラッカーゼ遺伝子の解析、及びシイタケラッカーゼ遺伝子lcc1発現抑制ベクターpChGaS-cL1のシイタケへの導入とその解析について検討した。遺伝子導入法に関しては、エレクロトロポレーターによるシイタケ菌糸への直接導入はうまくいかなたったことから、プロトプラスト調製法の簡便化に関して検討を行った。その結果、本培養時に残存する菌糸を5回までは再利用可能であり、細胞壁溶解酵素のキチナーゼの使用量を約1/4に減少できることを明らかにした。漆のラッカーゼ遺伝子をシイタケで発現させるために、漆の葉からウルシラッカーゼ遺伝子cDNAの単離を試み、昨年までにRACE法によりウルシラッカーゼ遺伝子Tvlcc cDNA配列を決定した。今年度は、この配列情報を基に、全長cDNA約1.7kbpをPCRで増幅後、サブクニーングしてDNA配列を決定した。その結果、既知情報とDNA配列で4塩基の違いが確認され、推定アミノ酸配列には相違がなかった。また、新規にウルシラッカーゼ遺伝子cDNAの5'非翻訳領域、シグナルペプチド領域、及び3'非翻訳領域の配列を明らかにした。昨年までに、構成的発現遺伝子gpdプロモータによるシイタケlcc1遺伝子発現ベクターpChG-lcc1導入シイタケ株では、宿主株より2倍以上ラッカーゼ活性の高い組換え株が選抜され、導入ベクターによるlcc1遺伝子の発現が確認できた。今年度は、シイタケラッカーゼ遺伝子lcc1発現抑制ベクターpChGaS-cL1を構築して、シイタケへ導入し、得られた組換え体の解析を行った。その結果、lcc1遺伝子の発現抑制が確認できた。応用微生物学遺伝子導入法の簡便化については、若干遅れ気味であるが、シイタケの発現ベクターに関しては、ラッカーゼ発現の高い組換え体が確認できたことから、進展が認められた。ヒラタケ用のベクター構築に関しては、着手できなかったことから、ベクター構築全体としては若干の遅れが認められた。一方、漆ラッカーゼ遺伝子の単離に関しては、cDNAとgDNA断片を単離でき、一部配列を確認できたことから進展が認められた。
脳微小血管内皮細胞の培養と脳虚血の病態解析への応用

1.アラキドン酸による脳血管内皮細胞傷害:培養脳微小血管内皮細胞を用いた検討砂ネズミからとりだし、継代培養した脳微小血管内皮細胞に対するsodium arachidonate(SA)の細胞傷害を^<51>crのspecific releaseを用い検討した。SAは、3μg/mlの低濃度から濃度及び時間依存性に内皮細胞を傷害した。酵素阻害剤を使用した実験では、lipoxygenase inhibitorを使用した群においてはSA濃度が6及び10μg/mlの場合には、いずれの作用時間においても内皮細胞傷害が有意に抑制された。一方、cyclooxygenase使用群では内皮細胞傷害が増強される傾向を示した。SAによる内皮細胞傷害の機序として、SAの直接作用(detergent action)が従来より考えられてきたが、内皮細胞自らが産生するlipoxygenase系代謝産物が関与している可能性が高いことが示唆された。2.脳血管透過モデルの作製と内皮細胞の透過性を亢進させる物質の検索培養内皮細胞を、コラ-ゲンでcoatingしたmesh上に培養し、この三者から形成される膜の透過性を検討し、さらにcyclooxygenase系とlipoxygenase系代謝産物の透過性に与える影響を検索した。内皮細胞はalbuminの透過率をcontrolの1/50以下に抑制した。条件を0°Cとしたものでは、透過率は有意に抑制された。PGE_2、PGF_<2α>、そしてarachidonateは内皮細胞の透過性に変化を与えなかった。15-HPETEとLTC_4は透過性を亢進させた。以上の結果から、脳血管透過モデルはalbuminに対してbarrierとしての機能を有していることが判明し、透過は主としてenergy depedentなものと考えられた。脳の血管内皮細胞の透過性を亢進させる物質としては、lipoxygenase系の代謝産物が原因物質として最も疑われた。本モデルは、脳血管の透過性を亢進、あるいは抑制する物質の検索に有用と考えられた。脳虚血時に、脳実質内に多量のアラキドン酸が蓄積するが、本物質あるいはその代謝物が内皮細胞障害を起こし、いわゆるvosogenic edemaが生じるのではないかと推論されている。そこで、当科で継代維持されている砂ネズミ脳微小血管由来の培養内皮細胞を利用し、アラキドン酸による内皮細胞障害を定量的に検討してみた。アラキドン酸はsigma社のアラキドン酸ナトリウム(MaA)を使用し、細胞障害の指標としてはトリパンブルーによる色素排除法と^<51>Crの放出率を用い、同時にプロスタサイクリン産生態の変化についても検討した。NaAの濃度は0、1、3、5、7.5、10、50、100、500、1000.μg/mlの10段階とし、作用時間は1、3、6、12、24の5段階とした。結果:(1)MaAは3μg/mlの低濃度から濃度依存性、時間依存性に内皮細胞を障害した。(2)MaA1時間作用後では、10から1000μg/mlの範囲内では濃度依存性にプロスタサイクリン産生量の減少が認められた。考察:Maier-Hauffらによれば、vosogenic edemafluid中のアラキドン酸濃度は60μg/mlに達するとされる。

我々の実験では、3μg/mlの低濃度から濃度依存性、時間依存性に内皮細胞障害がひき起されることが示され、10μg/ml以上の濃度では、濃度依存生にプロスタサイクリン産生量が減少することが示された。これらの結果は、脳虚血時の一次的脳損傷により脳実質に著増したアラキドン酸が、脳微小血管内皮細胞障害を介して、脳浮腫や脳微小循環障害に基づく二次的脳損傷を惹起する可能性を示唆するものと考えられる。平成元年度に達成できた研究実績について以下に述べる。脳血管透過モデルの作製を試み、内皮細胞の透過性を亢進させる物質の検索を行った。砂ネズミの脳微小血管由来培養内皮細胞(第45-50代)を、コラ-ゲン(type 1)でcoatingしたmesh上に培養し、この三者から形成される膜の透過性を検討した。透過物質としてはMEMに溶解したFITC-albumin(bovine)を用いた。さらに、37°Cの代りに0°Cの状態としたもの、あるいはMEMの代りにPBS(+)としたものと比較した。次に、内皮細胞の透過性を亢進させる物質を検索した。cyclooxygenase系の代謝産物としてはプロスタグランジンE_2とF_<2α>,lipoxygenase系では、15-HPETEとロイコトリエンC_4そしてアラキドン酸を各々上室に加え、2時間後に下室に透過したalbuminを定量した。次に結果を述べる。内皮細胞はalbuminの透過率をcontrolの1/50以下に抑制した。条件を0°CとPBS(+)としたものでは、透過率は有意に抑制された。プロスタグランジンE_2、プロスタグランジンF_2αそしてアラキドン酸と内皮細胞の透過性に変化を与えなかった。15-HPETEは、1と0.1μg/mlの濃度で有意に透過性を亢進させた。また、LTC_4はlμg/mlの濃度で著明に透過性を亢進させた。以上の結果から、我々が作製した脳血管透過モデルは、albuminに対してbarrierとしての機能を有していることが判明した。透過は、0°Cの低温状態とMEMの代りにPBS(電解質のみを含む緩衡液)を使用した場合に、著明な迎制を受けることから、主としてenergy dependentなものと考えられた。脳の血管内皮細胞の透過性を亢進させる物質として、アラキドン酸代謝物が推定されているが、その中でもlipoxygenase系の代謝産物であるロイコトリエンC_4が原因物質として最も疑われた。本モデルは、脳血管の透過性を亢進、あるいは抑制する物質の検索に有用と考えられた
効率的かつ持続的な遺伝子発現を指向する新規遺伝子治療用DNAの開発とその応用

ヒストン等の核内蛋白質との相互作用を制御することにより、外来遺伝子の核内動態や転写が制御可能であると考えられる。本研究課題では、核内蛋白質との相互作用を制御可能なDNAを新たに開発することを目的として、以下の研究を行った。以前に、我々は、マウス肝臓へ送達させた外来DNAの核内動態を解析し、外来DNA1分子当たりの発現効率が減少すること(silencing)を見出した。本研究でマウス肝臓中の外来DNAと結合している蛋白質の解析を行った結果、予想通り外来DNAはヒストン蛋白質と結合していること、及び、ヒストンの修飾状況には経時的変化が観察されないことが明らかとなった。また、silencingは培養細胞でも生じていることが明らかとなった。次に、ヒストンと結合する位置を制御する配列をプロモーター近傍に導入したプラスミドDNAをマウス肝臓へ送達させ、発現に対する影響を観察した。ヒストン高親和性配列(CATGTTTTTの36回繰り返し配列)の導入により、外来遺伝子の発現は約20倍上昇した。一方、核内における外来DNA量には変化は観察されなかった。従って、この機能配列の付加により外来DNA1分子当たりの発現効率が大きく改善された。これは、転写因子と相互作用する配列(TATA box)がヌクレオソームに取り込まれず露出するように制御された結果と思われる。また、相同組換え蛋白質との相互作用を向上させた遺伝子修復用DNA断片(直鎖状-本鎖DNA断片)による遺伝子修復法に関する実験も合わせて行った。新規標的遺伝子としてrpsL遺伝子を選択し、様々な箇所における遺伝子修復を調べた。その結果、遺伝子修復効率は部位により異なり、約1%から約9%の範囲であった。従って、一本鎖DNA断片を用いる遺伝子修復は、様々な遺伝子/配列に適用可能な遺伝子治療法であることが明らかとなった。本研究課題は、非ウィルスベクターの問題点を解決可能なこの作業仮説に基づいている。遺伝子治療の実用化に不可欠な効率的かつ持続的な外来遺伝子発現を可能とするために、核内蛋白質との相互作用を制御する配列を導入したDNAを新たに開発することを目的としている。今年度はマウス肝臓中の外来DNAと結合している蛋白質の解析を行った。その結果、予想通り外来DNAはヒストン蛋白質と結合していること、及び、ヒストンの修飾状況には経時的変化が観察されないことが明らかとなった。ヒストンと結合する位置を制御する配列の導入により、核内における外来DNA量には変化は観察されなかった。一方、この機能配列の位置により外来DNA1分子当たりの発現効率は大きく影響を受けた。転写因子と相互作用する配列(TATA box)がヌクレオソームに取り込まれず露出するように、ヒストンとの結合位置を制御する配列を導入した場合、外来DNA1分子当たりの発現効率が大きく上昇することを見出した。

遺伝子治療の実用化に不可欠な効率的かつ持続的な外来遺伝子発現を可能とするために、核内蛋白質との相互作用を制御する配列を導入したDNAを新たに開発することを目的としている。今年度は前年度に引き続き、ヒストンと結合する位置を制御する配列をプロモーター近傍に導入したプラスミドDNAをマウス肝臓へ送達させ、発現に対する影響を観察した。ヒストン高親和性配列(CATGTTTTTの36回繰り返し配列)の導入により、外来遺伝子の発現は約20倍上昇した。一方、核内における外来DNA量には変化は観察されなかった。従って、この機能配列の付加により外来DNA1分子当たりの発現効率が大きく改善された。これは、転写因子と相互作用する配列(TATA box)がヌクレオソームに取り込まれず露出するように制御された結果と思われる。また、相同組換え蛋白質との相互作用を向上させた遺伝子修復用DNA断片(直鎖状一本鎖DNA断片)による遺伝子修復法に関する実験も合わせて行った。新規標的遺伝子としてrpsL遺伝子を選択し、様々な箇所における遺伝子修復を調べた。その結果、遺伝子修復効率は部位により異なり、約1%から約9%の範囲であった。従って、一本鎖DNA断片を用いる遺伝子修復は、様々な遺伝子/配列に適用可能な遺伝子治療法であることが明らかとなった。
レトロウイルスによる抗ウイルス宿主因子アポベック蛋白回避機構に関する研究

APOBEC3Gは新規に同定された抗HIV-1宿主因子であり、一方HIV-1Vif蛋白は本分子をユビキチン-プロテアソーム系を用いて分解、中和することによりHIV-1複製を助けている。このAPOBEC3G/VifシステムによるHIV-1複製制御に関して、我々はこれまでに両分子の翻訳後修飾による機能調節に焦点をあてて研究を進めてきた。本年度は、さらにそれらの知見を進展させ、1)APOBEC3GのVifとの結合部位、およびその様式に関して:R24およびR122のアミノ酸がVifとの結合に重要な役割を果たしていることをコンピューターによる構造予測、及び変異体を用いた研究で明らかにした。本結果は、新たなVif/APOBEC3G結合様式を詳細に明らかにし、その分子間相互作用を制御する基礎情報となり得る。2)VifによるG2期停止機構の解析に関して、Vifがp53依存性に感染細胞の細胞周期をG2期に停止させること、さらにそれによりHIV-1の複製を正に制御していることを見出した。本結果は、Vifの新規機能の分子メカニズムとそのウイルス学的な意義を初めて明らかにしたものであり、その学術的な意義は大きい。これらの研究成果は、Vif/APOBEC3Gシステムの制御を介する新規ウイルス複製制御法の開発に役立つと考えられ、学術的な意義のみならず、臨床的な意義も大きいと考えられる。APOBEC3Gは新規に同定された抗HIV-1宿主因子であり、一方HIV-1 Vifは本分子をユビキチン-プロテアソーム系を用いて分解、中和することによりHIV-1複製を助けている。本年度は、さらにそれらの知見を進展させ、1)APOBEC3GのVifとの結合部位、およびその様式に関して:R24およびR122のアミノ酸がVifとの結合に重要な役割を果たしていることを見出した。本結果は、これまで報告されていない新たなVif/APOBEC3G結合領域を明らかにし、その分子問相互作用を制御する基礎情報となり得る。本結果は、これまで報告されていないVifの新規機能であり、その学術的な意義は大きい。
関節炎モデルマウスにおけるＢｖ８の役割の検討

1関節リウマチ患者において末梢血白血球のBv8mRNAの発現を検討した。本研究で、関節リウマチ患者では末梢血白血球のBv8mRNAの発現が亢進し、関節炎の活動性が高い患者では発現が高い傾向があることが明らかになった。Bv8が関節炎の活動性のマーカーとなる可能性が示唆された。2関節炎モデルマウスにおいてBv8レセプターの発現を検討した。そして、Bv8に対する好中球、単球の遊走能を検討した。本研究で関節炎部でBv8レセプターが発現しており,Bv8が関節局所に作用している可能性があることが明らかとなった。また,Bv8が好中球を遊走させることにより関節炎を悪化させている可能性が示唆された。1関節炎モデルマウスに対するBv8投与の影響の検討正常マウスの膝関節におけるBv8のケモカイン作用の検討を行った.様々な濃度のBv8溶液をマウスの膝関節に関節注射した.膝関節の周囲径と組織学的検討を行った.その結果,Bv8投与群では膝関節周囲径が増加していた.一方関節組織では好中球の浸潤を認めたが,単球の浸潤は認めなかった.以上より,実際,Bv8が好中球を関節局所に動員しており関節炎を悪化させる可能性があることがわかった.現在関節炎モデルにおいて検討している.2関節リウマチ患者における末梢血Bv8の発現の検討関節リウマチ患者,正常人コントロールにおける末梢血Bv8の発現をELISA法,realtimePCR法で検討した.ELISA法ではコントロール群と比較し,関節リウマチ患者にて有意に末梢血のBv8の発現が低下していた.PCRは現在検討中である.関節リウマチ患者末梢血におけるBv8の発現の低下は想定外の結果であった.関節局所と末梢血におけるBv8の動向は異なる可能性があるため今後,関節リウマチ患者の関節液中のBv8の発現を検討予定である.3正常人末梢血の白血球,単球におけるBv8に対する走化性の検討正常人末梢血から好中球と単球を分離し,ケモタキシスチャンバーを用いて,Bv8に対す走化性を検討した.結果,好中球はBv8による走化性が亢進している傾向を認めたが,単球では認めなかった.関節炎患者においても検討予定である.1関節リウマチ患者において末梢血白血球のBv8mRNAの発現を検討した。昨年度の研究計画:1骨髄キメラマウスの作成、2免疫染色、FISH法による骨髄由来Bv8陽性細胞の同定3real-timePCR法によるPROKR1,R2の発現の検討4In situ hybridisation法によるPROKR1、PROKR2発現細胞の同定5PROKR1、PROKR2knock-out mouseにおける関節炎重症度の検討6関節炎モデルにリコンビナントBv8を投与することによるBv8の関節炎に対する影響の検討、以上6項目を予定していた。昨年度の実施状況:研究計画に沿った研究は進んでいるが、昨年度の科研費を使用した研究はまだ実施されていない。研究計画123に関しては以前からの研究の継続を行っった。既に当科にて作成された骨髄キメラマウスの切片を免疫染色、FISH法を行い関節滑膜のBv8陽性細胞が骨髄由来であることを同定した。また、関節炎モデルマウスにおいて関節炎部より抽出したRNAをreal-timePCR法にて解析することによりPROKR1よりPROKR2が関節部にコントロール群と比較し有意に発現が上昇していることを見出した。今後、科研費を用いて456の研究を行う予定である。1Bv8のケモカイン作用の検討正常人末梢血好中球,単球のBv8に対する走化性をin vitroにて検討した.その結果,好中球に対する走化性亢進を認めたが,単球における走化性亢進は認めなかった.次に正常マウス膝関節にrecombinant Bv8を注射しin vivoにおける炎症細胞の集積を検討した.その結果,recombinantBv8投与群は対照群に比べ膝関節に好中球の集積を認めたが単球の集積は同等であった.2関節炎モデルマウスにおけるprokineticin receptorの検討関節炎モデルマウスにおいてBv8のreceptorであるPKR1とPKR2の発現を検討した.その結果,PKR1,2共に滑膜炎部での発現が亢進していた.PKR1の免疫染色を行ったところ好中球にPKR1が発現していることが判明した.1,2の結果より関節滑膜で産生しているBv8が関節局所に好中球を誘導し関節炎を増悪させている可能性が明らかとなった.3関節リウマチ患者における末梢血Bv8の発現の検討

関節リウマチ患者において末梢血白血球中のBv8の発現をrealtime PCR法で検討した.そして,Bv8の発現と関節リウマチでみられる臨床症状との関連を検討した.結果,対照群と比較しリウマチ患者では白血球中Bv8mRNAの発現が亢進していた.更に関節炎の活動性が高いほど,末梢血白血球中のBv8の発現が高い傾向を認めた.この結果は関節炎モデルマウスと同様の傾向であった.しかし,Bv8の発現と疼痛やサーカディアンリズムの異常,抑うつ,ストレスとの関連は認めなかった.関節リウマチ関節リウマチ患者における末梢血中のBv8の発現が低下しており想定外の結果であったため,さらなる検討が必要になったこと.Bv8のレセプターであるPROKR1,PROKR2のノックアウトマウスを用いた研究を予定していたが,実験に用いる個体数を確保するための繁殖が難しいこと,研究を行うためのマンパワーがやや不足しており研究が遅れている.平成23年度より研究を継続して行っており研究は進行している。しかし、PROKR1 PROKR2knock-out mouseの作成やリコンビナントBv8の作成は技術的な点で進行が遅れている。現在諸企業、院内の動物実験施設と協力し研究を進めていく予定である。昨年度は既に当科にある消耗品で実験が進行し新たな消耗品が発生していないが、今後相当の消耗品が発生すると思われる。1関節リウマチ患者における関節液中のBv8の発現を検討する.もし発現が増加しているようであれば臨床症状との関連を検討する.2関節炎モデルマウスにおいてBv8が関節炎の増悪因子になっているか.また,Bv8の関節炎以外の作用(疼痛,サーカディアンリズムに対する影響)も検討する.炎症性サイトカイン,血管新生因子に対する影響を検討する.3正常人白血球と比較し関節リウマチ患者白血球においてBv8による走化性が変化しているか検討する.関節炎モデルマウスにおけるBv8、PROKR1、PROKR2の発現の亢進、発現細胞の同定はされたが、病態への関与が十分に分かっていない。また、ヒトの関節リウマチにおける役割も十分解明されていない。本年度はBv8が関節リウマチの症状にどの程度関与しているかの解析を進める予定である。昨年度からの継続でPROKR1 R2knock-out mouseの作成し関節炎を発症させること、リコンビナントBv8の関節炎モデルマウスへの投与の検討を進めていく。また、同時に本年度より関節リウマチ患者における各症状と末梢血中Bv8の発現の検討を行う予定である。関節リウマチ患者における各症状と末梢血中Bv8の発現の検討は当施設の倫理委員会で既に承認されている。方法として、関節リウマチ患者、コントロールの末梢血の採取、関節リウマチの関節症状、不眠やサーカディアンリズム、ストレスやうつの有無を質問票を用いてデータ採集を行う。ヒトBv8ELISAの構築し測定、末梢血単核球のBv8の発現をreal-timePCR法にて測定し症状との関連を検討する予定である。前年度正常マウス,ヒト白血球においてBv8が好中球の遊走を促進させることを確認した.実際関節炎に対する影響を調べるため研究を継続する必要がある.また,関節リウマチ患者において関節液中のBv8の発現を調べ解析する必要がある.
連星中性子星の合体

ガンマ線バーストとは、宇宙の最強爆発である。一つのバーストのエネルギーは、百億年で太陽から放出される量ほどで、輝いている数秒の間全体の銀河より光度が高い。ただ、ガンマ線バーストという神秘的な現象は、動力源がまだ把握されていない。本研究の目的は、ガンマ線バーストの一種いわゆるショート・ガンマ線バーストの動力源の解明である。動力源は連星中性子星の合体から生成されたシステム(ブラックホールと降着円盤)だと考えられてある。どうやって上記の現象の探求を行うというと、一般相対論的(アインシュタイン理論)な磁気流体力学の範囲で連星中性子星の合体の数値シミュレーションを行うために、メッシュ・リファインメントで磁場の進化を扱う手法を調べた。且つ、現実的な状態方程式を用いる合体の様々なシミュレーションを実行して、磁場なしで、状態方程式の影響の探求を始めた。それと同時に、簡易な状態方程式を用いて磁場を含む計算を行って、合体や合体で発生した降着円盤のダイナミックスを研究している。色々なシミュレーションを実行し、順調な結果が出てきた(発行済み)。連星中性子星の合体の意義は、ショート・ガンマ線バーストの動力源の解明にとどまらず、重力波の研究にも至る。アインシュタイン理論の予言である重力波は時空の波紋である。ただ、振幅は非常に小さいので、今まで観測できていない。測れるようになるために正確な重力波刑を把握しなければならない。本研究の数値シミュレーションは連星中性子星の合体の重力波も計算して、「かぐら」という日本の大規模なレーザー干渉計をはじめ、観測器のデータの解析を行う研究団と協力している。色々なテスト・シミュレーションを実行し、予備段階ほどの順調な結果が出てきた(発行中)。本研究の数値シミュレーションは連星中性子星の合体の重力波も計算して、観測器のデータの解析を行う研究団と協力している。

どうやって上記の現象の探求を行うというと、一般相対論的(アインシュタイン理論)な磁気流体力学の範囲で連星中性子星の合体の数値シミュレーションを行うために、メッシュ・リファインメントで磁場の進化を扱う手法を調べた。且つ、現実的な状態方程式を用いる合体の様々なシミュレーションを実行して、磁場なしで、状態方程式の影響の探求を始めた。それと同時に、簡易な状態方程式を用いて磁場を含む計算を行って、合体や合体で発生した降着円盤のダイナミックスを研究している。色々なシミュレーションを実行し、順調な結果が出てきた(発行済み)。連星中性子星の合体の意義は、ショート・ガンマ線バーストの動力源の解明にとどまらず、重力波の研究にも至る。アインシュタイン理論の予言である重力波は時空の波紋である。ただ、振幅は非常に小さいので、今まで観測できていない。測れるようになるために正確な重力波刑を把握しなければならない。本研究の数値シミュレーションは連星中性子星の合体の重力波も計算して、「かぐら」という日本の大規模なレーザー干渉計をはじめ、観測器のデータの解析を行う研究団と協力している。
仕事をもつ2型糖尿病患者および境界型におけるセルフモニタリングの有効性

外来通院中の非インスリン使用の2型糖尿病患者を対象に、セルフモニタリング教育を実施し、有用性を評価した。介入群は、2か月に1回、連続して3日間、1日7回の血糖自己測定と記録を行った。血糖コントロールの指標であるHbA1cは、介入群において6か月後に有意に低下し、対照群では有意な低下を認めなかった。6か月後の2群間のHbA1cに有意差を認めなかった。就労者を対象に、このセルフモニタリングの経験を明らかにした。参加者は、血糖変動のパターンを知り、食事や運動と血糖値が関係していることを体験し、SMBGによる行動変容を意識していた。医療者からのフィードバックが自己管理継続の要因であった。平成25年度は、非インスリン使用の2型糖尿病患者の血糖自己測定(以下SMBG)に関する文献検討を行い、国内外ともに新規性のあるテーマであることを確認した。その後、職域と臨床におけるパイロットスタディの研究計画の立案およびフィールド開拓と倫理審査申請に取り組んだ。パイロットスタディの目的は、無作為比較試験を行う準備として、臨床指標および心理・社会的指標がどのように変化するかを評価し、評価指標の適切性を検討することである。また実際に非インスリン使用の外来通院患者が、体系的SMBGに取り組むことができるのか、難しいのであれば頻度や回数等の実現可能性を見極めることを含め、どのような対象者に適しているのかに関する示唆を得たいと考える。また、介入手順や調査手順、医師・看護師のフィードバックの実現可能性を評価する。職域版計画概要:仕事をもつ2型糖尿病患者10名を対象に、2か月に1回、連続して3日間、1日に7回の血糖自己測定(self-monitoring of blood glucose:SMBG)を行う介入研究の計画を立案した。介入期間は6ヶ月である。主要な評価指標はHbA1cであるが、他に慢性疾患患者の健康行動に対するセルフエフィカシー尺度と健康度・生活習慣診断検査、ヘルスリテラシー尺度を用いることとした。1ヶ所の事業所から承諾が得られ、2014年4月に研究開始予定である。臨床版計画概要:2型糖尿病患者20名を対象に、2か月毎の体系的SMBGを行う介入研究の計画を立案した。介入方法、期間、評価指標は職域版と同様である。臨床版の特徴は、糖尿病療養指導士/糖尿病看護認定看護師の専門資格をもつ看護師が、主治医との連携のもとにフィードバックを行うことにある。2ヶ所の総合病院から承諾が得られ、2014年4月に研究開始予定である。平成26年度は、職域および外来通院中の非インスリン使用の2型糖尿病患者を対象に、体系的な血糖自己測定(以下SMBG)と記録を中心とするセルフモニタリング教育を実施し、有用性を評価するパイロットスタディを実施した。体系的SMBGは「2か月に1回、連続して3日間、1日に7回の血糖自己測定を行うこと」と定義した。主治医および看護師が体系的なSMBGと血糖値の転記とグラフ化、食事量・運動実施の有無・元気度の記録を含むセルフモニタリング教育を行った。患者は、練習期間を経て、6か月間に3回の体系的SMBGと記録を行った。受診時に血糖測定器と記録を持参し、医療者よりコメントを受けた。臨床では15名の患者が参加し、うち4名が途中で辞退した。研究開始時のHbA1cの中央値[範囲]は7.4 %であり、6か月後は6.8%であった。職域では、13名の患者が参加し、うち1名が1回目の体系的SMBG前に辞退した。参加者の研究開始時のHbA1cの平均は7.7%であり、6か月後には7.3%に低下していた。初年度の取り組みとしては、1日7回、3日連続という体系的な自己血糖測定が勤労者および外来通院患者において可能かということが主要なテーマであった。結果として、2か月ごと、3回の取り組みにおいて、職域で平均76%、臨床で94%の実施率が得られ、HbA1c値は半年で0.4%-0.6%の低下を示したことは、好ましい傾向であると言える。血糖測定に関心のある者にとって、2ヶ月に1回の集中測定は実現可能であると思われる。血糖の日内変動をグラフ化し、食後過血糖の程度を知ることは、患者のみならず医療者にも有用な情報となり、血糖コントロールに改善がみられたものと考える。次年度は本調査の推進とともに、コスト面を検討し、尿糖測定を活用したセルフモニタリング教育を検討したいと考えている。平成27年度は、外来通院中の非インスリン使用の2型糖尿病患者を対象に、体系的な血糖自己測定(以下SMBG)と記録を中心とするセルフモニタリング教育を実施し、有用性を評価する介入研究を実施した。主要評価指標はHbA1cであり、他に生活習慣、自己効力感、ヘルスリテラシーの質問紙を用いた。体系的SMBG群は、2か月に1回、連続して3日間、1日7回の血糖自己測定を行った。糖尿病の専門資格を有する看護師が体系的なSMBG、血糖値の転記とグラフ化、食事量・運動実施の有無・元気度の記録についてのセルフモニタリング教育を行った。体系的SMBG群は、練習期間を経て6か月間に3回の体系的SMBGと記録を行い、受診時に血糖測定器と記録を持参し、医療者よりコメントを受けた。一方、対照群は6か月後に血糖測定を開始することとし、従来の治療を継続した。

66名の患者が参加し、うち10名が途中で辞退した。また、選定基準からの逸脱、受診病院の変更、病状悪化による入院等の理由により6名が中止となり、現在は50名の参加者で研究が進行している。体系的SMBG群28名の研究開始時のHbA1cの中央値は7.5%、6か月後は7.2%であり、有意に低下していた。一方、対照群22名は研究開始時7.5%で、6か月後は7.6%であり、有意な低下は認められなかった。同様に、体系的SMBG群の自己効力感や生活習慣の運動、食事の得点が6か月後に有意に上昇し、血糖測定と記録によるセルフモニタリングセルフが、血糖コントロールや生活習慣、健康行動の自己効力感に好ましい影響を与えていた。また、パイロットスタディの1年後の追跡調査において、HbA1cの中央値が職域で7.05%、臨床で6.9%であり、いずれもベースラインと比較し有意に低下している。平成27年度は、4つの医療機関の協力を得て、臨床の場で体系的SMBG群の有用性を検討するランダム化比較試験に取り組んだ。職域においては、個人情報保護や健康管理・医療体制の観点から体系的SMBGを指導し、研究を進行管理できる人材やフィールドが確保できず、本調査を断念した。しかし、パイロットスタディ参加者を対象に体系的SMBGの経験を聞き取る面接調査を実施することができた。外来通院中の非インスリン使用の2型糖尿病患者を対象に、セルフモニタリング教育を実施し、有用性を評価した。介入群は、2か月に1回、連続して3日間、1日7回の血糖自己測定と記録を行った。血糖コントロールの指標であるHbA1cは、介入群において6か月後に有意に低下し、対照群では有意な低下を認めなかった。6か月後の2群間のHbA1cに有意差を認めなかった。就労者を対象に、このセルフモニタリングの経験を明らかにした。参加者は、血糖変動のパターンを知り、食事や運動と血糖値が関係していることを体験し、SMBGによる行動変容を意識していた。医療者からのフィードバックが自己管理継続の要因であった。外来通院中の非インスリン使用の2型糖尿病患者を対象に、体系的な血糖自己測定(以下SMBG)と記録を中心とするセルフモニタリング教育を実施し、有用性を評価する介入研究を実施した。主要評価指標はHbA1cとした。体系的SMBG群は、2か月に1回、連続して3日間、1日7回の血糖自己測定を行った。糖尿病の専門資格を有する看護師がSMBGの指導やセルフモニタリング教育を行った。体系的SMBG群は、練習期間を経て6か月間に3回の体系的SMBGと記録を行い、受診時に血糖測定器と記録を持参し、医療者よりコメントを受けた。一方、対照群は6か月後に血糖測定を開始し、従来の治療を継続した。体系的SMBG群25名の研究開始時のHbA1cの中央値は7.7%、6か月後は7.4%であり、有意に低下していた。一方対照群20名においては、有意な低下は認められなかった。6か月後の2群間のHbA1cの中央値に有意差を認めなかった。1年後の追跡調査において、HbA1cの中央値は6か月後と比較し、いずれの群も低下していた。就労男性10名を対象に、体系的SMBGとセルフモニタリングの経験を半構成的面接により明らかにした。【血糖値やSMBGへの関心】を持ち、血糖変動のパターンを知り、食事や運動と血糖値が関係していることを体験しながら【SMBGでわかった血糖値の変化】を認識していた。