hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋症ハムスター心筋膜異常のサルコグリカン機能解析からの解明

アンチセンスDNAを導入してSGを減少させた骨格筋由来の培養細胞を用いた実験系を作成した。サルコグリカン欠損細胞に伸展刺激をくわえるとこれらの欠損細胞は傷害をおこし細胞からクレアチンキナーゼの漏出をおこし心筋症や筋ジストロフィーの病態モデルとして利用できることが明らかとなった。アデノウィルスベクターを用いてBIO14.6ハムスター骨格筋にδ-SG遺伝子を導入したところ、4種すべてのSGが細胞表面膜に正常ハムスター骨格筋と同様に発現しδ-SG遺伝子導入により他のSG欠損が相補できることが明らかになった。さらにα1-syntrophin(Syn)と呼ばれる別のジストロフィン複合体タンパク質の機能についても検討した。synそれ自身がアクチン、カルモデュリンと結合することを明らかにし、それぞれの結合部位を同定した。アクチン結合部位は2ヵ所、PH2ドメインを含む領域(アミノ酸274-315)およびSUドメイン(アミノ酸449-505)でKdはそれそれ0.15PMと0.5ドMであった。カルモデュリン結合部位も2ヵ所あり、カルモデュリンとの親和性が低い(Kd 0.3μM)PHlaドメイン(aa.1-38)と親和性の高い(Kd15nM)PDZドメインの各々がsynのカルモデュリン結合に寄与していることが明らかになった。心筋症ハムスター(BIO14.6)心筋細胞においてサルコグリカンの異常がどのような機構で細胞機能異常を引き起こすかどうかを明らかにすることが大きな目標である。その一段階として、ラット骨格筋由来のL6細胞を用いた実験系を構築し、筋細胞機能におけるサルコグリカンの役割とアンチセンスDNAによるサルコグリカン欠損に伴う細胞傷害並びにこの実験系が心筋症の病態モデルとなりうるかどうか検討を行った。培養細胞においては、ジストロフィン複合体とインテグリン細胞接着系とがサルコグリカンを介して相互作用していることが明らかになった。従って、サルコグリカンを欠損する筋細胞ではジストロフィン複合体やインテグリン細胞接着系を含む細胞膜に異常が存在する可能性が示唆された。またサルコグリカン欠損細胞は伸展刺激を加えると細胞外へのCPK遊離の増大、細胞傷害が発症し、Caチャネル阻害剤、非特異的カチオンチャネル阻害剤で軽減された。このことから、細胞傷害発症の機序として細胞膜からのCa流入により細胞内Ca濃度が上昇しカルパイン等のプロテアーゼ活性を上昇させることが考えられた。筋ジストロフィー患者の骨格筋細胞では細胞内Ca濃度やカルパイン活性が高いなどの報告があり、今回の研究で構築した細胞実験系が心筋症や筋ジストロフィーの病態の有用なモデルとして使用できる可能性が示された。細胞膜からのCa流入の詳しい機序およびサルコグリカン欠損との関係は今後の課題である。
翻訳中に変化するタンパク質粘弾性のリアルタイム測定

ナノグラムレベルの質量変化を測定できる水晶発振子を用いてタンパク質生合成の速度を求める手法を確立した。これはストレプトアビジン結合性ペプチドの上流に興味あるタンパク質を融合し、翻訳反応を観察する事で可能にした。これより、翻訳速度はコード領域においてmRNA配列だけでなく翻訳されるタンパク質にも影響することが示唆された。翻訳途中のタンパク質の粘弾性と翻訳速度を同時測定することで、タンパク質の物性が翻訳反応に与える影響の理解が期待される。当初、水晶発振子(QCM)の振動現象を高精度に解析することのできる装置を開発する予定であったが、当研究室で既に進行していた装置開発が順調に進んでいたことから、遺伝子レベルの材料作製に従事した。まず、翻訳速度を変化させる因子の一つとしてtRNAに着目し、大腸菌の全48種類のtRNAをコードするDNA配列を、K-12株のゲノムDNAからそれぞれ全てPCR法により各遺伝子断片を増幅した。これを恒常的に転写量の多いlppプロモーターおよび汎用性の高いrrnCターミネータ配列間に挿入し、ベクターを構築することで、各tRNA過剰発現ベクターを作製した。これを用いて大腸菌XL1-Blueを形質転換し、形質転換体を培養することで、目的tRNAを菌体内に過剰発現させた。過剰発現させたtRNAはフェノール処理により菌体内から抽出し、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。続いて、大腸菌抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を調製した。RNaseの少ないBL21(DE3)Starを培養し、フレンチプレスによる破砕、超遠心により抽出液を得た。得られた抽出液からtRNAを除くため、まず20種のアミノ酸とATPを過剰に加えることで内在性のtRNAをアミノアシル化し、Hisタグ融合EF-Tuを系内に添加した。これによりアミノアシル化された内在tRNAがHistag-EF-Tuと結合する。これをNi-NTAカラムにより除去することで、抽出液系内からtRNAを除いた。得られた無細胞合成系に様々な濃度のtRNAを添加して、モデルであるGFPの発現を検討した。その結果加えたtRNAの濃度変化により蛍光強度が変化したことがみられ、翻訳速度によりフォールディングを制御できるシステムが構築されたことを確認した。mRNAの翻訳速度を定量化するために、ストレプトアビジン結合性ペプチド(Streptavidin Binding Peptide ; SBP)とその上流にT7tagを複数個連結したDNAを作成し、in vitro転写によりmRNAを調製した。このmRNAを用いて水晶発振子(Quartz-Crystal Microbalance ; QCM)の基板にストレプトアビジンを固定化したセル中で翻訳反応を起こすことで、合成されたSBPを介してリボソームを基板上に結合させた。その結果質量が増加したため、振動数減少が観察された。T7tagの個数を変化させることにより、翻訳されるmRNA長が変わり、SBPがリボソームから合成されるタイミングが変わるため、振動数変化が始まる時間は各mRNAによって異なった。そのタイムラグを合成されるポリペプチド鎖長に対してプロットすると、良い直線性を示し、翻訳速度を求めることができた。また前年度に調製した各tRNAを添加して翻訳を行うことで、レアコドンや内部Shine-Dalgarno配列による翻訳速度に与える影響を評価することができた。様々なタンパク質をコードする配列についても同様に、各翻訳速度を評価したところ、いずれもT7-tagとは異なる速度を示した。tRNA添加実験によりコドンの効果をキャンセルしても一致しなかったことから、各遺伝子はコドンの他にもmRNAの二次構造、リボソームと相互作用するある特定の配列の効果によって翻訳速度が決定されていることが示唆された。翻訳されたタンパク質の効果も一つの要因と考えられるため、翻訳されたタンパク質の物性と相関付ける必要がある。そのために、現在、特別な立体構造をとらないタンパク質やαヘリックス含量が異なるタンパク質をコードするmRNAの翻訳に関して粘弾性と翻訳速度に対する関連性について評価を行っている。
初代培養肝細胞を用いたFasによるアポトーシスの研究

我々は既に初代培養成熟マウス肝細胞において核酸及び蛋白合成阻害剤存在下、抗Fas抗体によりアポトーシスが生じることや、また肝細胞にはアポトーシス抑制蛋白の存在が示唆され、これにCキナーゼが関与していることを明らかにした。今回は肝細胞のアポトーシスを抑制する蛋白質の同定と肝臓にけるFasによるアポトーシスの生理的意義を明らかにするための手がかりとして、幼若、成熟、老令マウスの肝細胞のFasによるアポトーシスについて比較検討した。1.肝細胞のアポトーシスを抑制する蛋白質の同定Cキナーゼ阻害剤であるH7存在、非存在で抗Fas抗体と^<32>P正リン酸で処理した肝細胞の抽出液を等電点電気泳動とSDS-PAGEで二次元電気泳動後、オートラジオグラフィーを行い両者のスポットを比較した。しかし、Cキナーゼに特異的なリン酸化蛋白質のスッポトは見つけられなかった。現在、この蛋白質の検出について等電点電気泳動のpH勾配やSDS-PAGEのゲル濃度を変えて検討中である。2.成熟、老化に伴う肝細胞のアポトーシスFasによる肝細胞のアポトーシスは老化した肝細胞の除去と肝臓サイズの維持に役割を果たすと考えられている。In vivoで幼若な肝細胞は肝小葉の周りから中心静脈へ移行する。この過程で細胞はだんだんと成熟し、その後老化、除去される。そこで幼若、成熟、老令マウスの肝細胞のFasによるアポトーシスについて検討した。抗Fas抗体はこれらの肝細胞を全て死滅させ抗Fas抗体の濃度依存性や経時変化に差がみられなかった。これらの結果からin vivoで肝小葉の中心静脈周辺にFasのリガンドが多くて細胞が老化すると死ぬのではないかと考えられた。現在、Fasのリガンドの肝小葉での分布について検討中である。
細菌膜貫通センサーを介した情報伝達の構造基盤

大腸菌由来セリン受容体Tsr、クエン酸受容体TcpのX線結晶構造解析を行い、構造に基づく変異体解析とITC測定を行い、それぞれのリガンド認識機構を明らかにした。また、Pas-likeドメインを持つタイプの走化性受容体Mlp24とMlp37のリガンド認識機構とリガンド結合による構造変化を、リガンドが結合状態と非結合状態の結晶構造、および変異体解析から明らかにした。外部情報の取得は、細胞が生きていく上で欠かせない。細菌の走化性センサーは広いダイナミックレンジを持ち、刺激物質濃度の時間変化、信号を記憶する仕組みを有するインテリジェントセンサーであり、温度・pH等も感知する多機能センサーである。本研究では、膜貫通領域を含むセンサー分子の構造、異なるリガンドを認識するセンサー分子の構造を解明すると共に、様々な変異体センサーのリガンド結合を直接測定し、リガンド結合、信号発生、細胞内への信号伝達の機構を原子レベルで明らかにすることを目的としている。本年度の研究成果は以下の通りである。Tcpリガンド結合部の結晶構造解析Tcpリガンド結合部の解析が大きく進展した。結晶化に成功したTcpリガンド結合ドメイン-クエン酸複合体のX線結晶構造解析を行い、空間群P43212の結晶から1.5A分解能の回折強度データを収集した。Tarの構造を用いた分子置換により構造解析を行い、現在精密化を行っている。Tcpは、クエン酸を認識し適応した後、さらに亜鉛に対する認識応答を行うことが知られている。結晶化母液に亜鉛イオンを含んでいたため、亜鉛の吸収端の前後で回折測定を行うことで、Tcpに結合した亜鉛の位置を同定した。亜鉛はTcp1分子に4個結合しており、うち一つは基質クエン酸に配位していた。この構造から、Tcpの複雑な刺激応答の分子機構を解明する手がかりが得られた。・変異型受容体と刺激物質の結合解離の直接測定TsrとTarはNiやLeuに対して異なる忌避応答を示す。TsrとTarのキメラ受容体の等温滴定熱測定から、Ni結合領域を絞ることができた。・細菌走化性受容体の精製大腸菌由来Tarの精製法の改良を行っているが、最終生成物にTar切断物が混入するため、さらなる条件検討が必要である。細菌の走化性センサーは広いダイナミックレンジを持ち、刺激物質濃度の時間変化や信号を記憶する仕組みを有するインテリジェントセンサーである。また、温度・pH等も感知する多機能センサーでもある。本研究は、膜貫通領域を含む走化性センサー分子の構造、異なるリガンドを認識する走化性センサー分子の構造を解明すると共に、走化性センサーのリガンド結合能を直接測定し、リガンド結合、信号発生、細胞内への信号伝達の機構を原子レベルで明らかにすることを目的としている。平成25年度の成果を以下に記す。・大腸菌走化性受容体Tarの結晶化を行い、膜貫通領域およびHAMPドメインを含むTarフラグメントの結晶作成に成功した。ただし、まだ分解能が低いため、構造解析にはさらなる結晶化条件の検討が必要である。・コレラ菌走化性受容体Mlp24のArg複合体、Mlp37のSer複合体の構造をそれぞれ2.7 A、1.8 A分解能で明らかにし、昨年度までの構造解析結果との比較から、リガンド認識機構と結合に伴う構造変化を明らかにした。・サルモネラ菌のクエン酸走性受容体Tcpのリガンド結合部の等温滴定熱測定から、二価金属イオンがクエン酸のTcpへの結合に必須であること,二価金属イオンは単独でTcpに結合することが明らかになった。これは、昨年までに解析したTcp-クエン酸複合体の構造において、クエン酸が亜鉛を介してTcpに結合していた事実と一致し、細菌のクエン酸に対する走化性応答機構が明らかになった。細菌の走化性センサーは広いダイナミックレンジを持ち、刺激物質濃度の時間変化、信号を記憶する仕組みを有するインテリジェントセンサーで、温度・pH等も感知する多機能センサーである。・Mlp24リガンド結合部の構造解析:コレラ菌のアミノ酸走化性センサーMlp24のリガンド結合部の解析が大きく進んだ。結晶化に成功したMlp24リガンド結合ドメインのX線結晶構造解析を行い、空間群C2の結晶から2.4A分解能の回折強度データを収集した。Mlp37リガンド結合ドメイン構造を用いた分子置換により構造解析を行い、現在精密化を行っている。Mlp24は結晶中で2量体を形成していたが、その様子は近縁のMlp37のリガンド結合ドメイン2量体と大きく異なっていた。また、Mcp_NがAlaを結合した状態で解かれていたが、今回はリガンドを結合していない状態の構造が明らかになった。

両者の比較から、リガンド結合に大きな構造変化が伴うことが明らかになった。また、Mlp24、Mlp37について、様々なアミノ酸との複合体結晶の作成に成功した。・膜貫通部を含む細菌走化性受容体の精製:大腸菌由来Tar全長、およびHAMPドメインまでを含む1-266フラグメントの大量発現と精製に成功した。結晶化スクリーニングを開始した。研究目的は4月研究開始を想定して作成していたが、交付内定が行われたのが秋であり、研究開始が遅れたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究目的は23年4月研究開始を想定して作成していたが、交付内定が行われたのが23年秋であり、研究開始が半年遅れているため。Tcp受容体結合部の構造が明らかになったので、構造情報に基づいて作成した変異体の等温滴定熱測定を進め、クエン酸の結合と2価イオンの結合による信号発生のしくみを明らかにする。また、TsrとTarで忌避応答が異なることが新たに分かり,変異体実験から応答に関わる領域が同定されてきた。そこで、これらの構造解析を進め、同じ分子が走化性応答と忌避応答の両方の情報を発信するメカニズムの解明を進める。膜貫通領域を含む試料については、新たなコンストラクトを作成する。膜貫通領域を含む試料の大量精製が可能になったので、結晶化を進める。Mlp24は、Ser, Arg, Asn, Proと性質の異なるアミノ酸を認識する。また、Mlp37も同様に性質の異なるアミノ酸の一群を認識する。そこで、これらを結合した状態の受容体部の構造解析を進め、性質の異なる分子を認識する機構の解明を進める。既に、いくつかの結晶の作製に成功しており、これらのデータ収集と構造解析を進める。また、Mlp24は溶液中で会合解離の平衡状態にある。リガンド結合による平衡状態の変化を調べる。
個性及び表現性ロバストな音声言語インタフェースに関する研究

ユーザの嗜好や気分に応じた表現豊かな音声出力と,ユーザの個性,気分や話し方の変化に頑健な音声入力ができる音声インタラクションを実現するためのロバスト音声認識・合成技術の確立を目指して研究を行った。ロバスト音声合成では,基本周波数量子化に基づく韻律コンテキストや自然発話・会話音声合成のための拡張コンテキストに基づく音声合成手法を,またロバスト音声認識では,感情表現・発話様式などのパラ言語情報の検出・表出度合の推定手法及び高速なモデル適応手法を確立し,その有効性を示した。本研究はロバスト音声合成とロバスト音声認識に関する5項目の基盤要素技術の研究・開発からなり,本年度は以下の成果が得られた。感情表現・発話様式・声質を制御可能な音声合成に関しては,隠れマルコフモデルに基づく音声合成(HMM音声合成)の枠組みに,基本周波数(FO)量子化に基づく韻律コンテキストを導入することを提案し,FOの正規化及び量子化方法の検討,平均声モデルに基づくテキスト音声合成を利用した韻律コンテキストの付与手法等の基本的な検討を行い,韻律モデルの教師なし学習が可能となることを示した。さらに,提案法を声質変換に適用した場合の有用性を示した。自然発話・会話音声の合成に関しては,HMM音声合成の枠組みに基づいて,日本語話し言葉音声コーパス(CSJ)を用いた対話音声の合成のための音響モデル構築手法の検討を行い,音響モデル構築に用いるコンテキストの重要性を明らかにした。パラ言語情報の検出・表出度合推定では,重回帰HMMに基づいたスタイル推定手法を提案し,感情表現や発話様式の種別のみならず,その表現度合を連続量として推定可能なことを示した。また,自然発話音声の発話様式の識別に応用し,その有用性を示した。話者・スタイル変動に頑健な音声認識に関しては,重回帰HMMに基づいた高速なスタイル適応方式を提案し,感情音声や自然発話音声の認識におけるモデル適応に利用した場合,1文章毎のオンライン適応という少量の適応データしか使用できない場合でも認識率が向上することを明らかにした。動作からのパラ言語情報の抽出に関しては,3次元フェイスモデルに基づいて話し手の顔の3次元姿勢を推定し,この時間的変位から動作の分類や非言語情報を獲得する手法の基礎的な検討を行った。本研究はロバスト音声合成とロバスト音声認識に関する5項目の基盤要素技術の研究・開発からなり,本年度(第二年度)は初年度に得られた検討結果と成果に基づいて研究を進展させ,以下の成果が得られた。感情表現・発話様式・声質を制御可能な音声合成に関しては,提案した基本周波数量子化コンテキストを用いた音声合成手法の検討を行い,新たな韻律のモデル化と生成手法の基本的な枠組みを確立すると共に,声質変換ならびに音声符号化への応用の検討を行い,従来法に比べて性能が改善されることを示した。また多言語音声合成の一例としてタイ語について有効性を確認した。さらに日本語と英語音声合成のためのコンテキストについても検討を行った。自然発話・会話音声の合成に関しては,HMM音声合成の枠組みに基づいた多様で自然な韻律を持った対話音声合成を実現するために,日本語話し言葉音声コーパス(CSJ)を利用した新たなコンテキストセットの提案と基礎的な評価を行い,その有用性を明らかにした。パラ言語情報の検出・表出度合推定では,初年度に確立した重回帰HMMに基づく音声のスタイル表出度合推定法を,音声からの話者年齢推定手法へ応用し予備的な評価実験を行った結果,有意な相関が得られることを示した。また,実音声に現れる強調表現の自動検出への応用についても基礎的な検討を行った。話者・スタイル変動に頑健な音声認識に関しては,初年度においてほぼ確立したスタイル推定に基づくオンライン適応手法のさらなる性能改善や他のタスクへの応用に向けた可能性の検討を行った。動作からのパラ言語情報の抽出に関しては,初年度に引き続きスタイル推定に適した身体特徴量の検討と動作に関するスタイル推定の基礎的な検討を行った。本研究はロバスト音声合成とロバスト音声認識に関する5項目の基盤要素技術の研究・開発からなり,本年度(最終年度)は第二年度までに得られた成果に基づいて,残された問題点の解決に向けた新たな手法の提案とその評価検討を行い,以下の成果が得られた。感情表現・発話様式・声質を制御可能な音声合成に関しては,基本周波数量子化コンテキストを用いた音声合成,声質変換及び音声符号化システムのそれぞれについて詳細な性能評価を行い,従来手法に対する提案手法の有効性を明らかにした。また,タイ語の音声合成に応用した場合についても詳細な評価を行い,声調を含む韻律生成において提案手法の有効性を示した。さらに,不特定話者を対象とした音声のスタイル制御法を新たに提案し,評価検討を行った。自然発話・会話音声の合成に関しては,隠れマルコフモデルに基づく音声合成(HMM音声合成)の枠組みに基づいて提案した新たなコンテキストセットについて詳細な評価を行い,多様性が高い

自然発話対話音声の自然な韻律の実現に有用であることを明らかにすると共に,モデルパラメータ共有のための決定木停止基準や,より効率的な基本周波数モデリングのための新たな韻律モデル単位を提案し,それらの有用性を示した。パラ言語情報の検出・表出度合推定,話者・スタイル変動に頑健な音声認識,動作からのパラ言語情報の抽出の3項目に関しては,問題解決に向けた提案手法における共通基盤技術となる重回帰隠れマルコフモデル(重回帰HMM)のための学習法について検討を行い,主観的な表出度合を考慮する適応学習を組込んだ新たな学習法を提案し,主観評価と重回帰説明変数の相関性を高める効果があることを示した。
理科実験観察にともなう確証の判断能力と科学的思考力の育成に関する研究

本研究は、理科実験観察活動で学習者が概念的理解の論理一貫性を築くために必要不可欠な科学的思考力、特に「確証判断能力」を中心に学習者の実態を明らかにするとともに、これらの資質育成に有効な教授支援方略を検討することを目的としている。本年度は、昨年度に引き続いて教員養成系学部学生および小・中学生に見られる、探究過程での思考特性の分析を行うとともに、科学的思考力の育成に向けた教授支援方略などについて検討を加えた。以下に結果を示す。1.教員養成系学部学生に見る、探究過程での思考特性の分析昨年度講義の電気回路学習をモチーフに、学生による回路作用の確証判断の有無やその対象、結論の論理性などの特性についての分析を継続して行った。予想場面において学生は小・中学生同様の誤り判断を示したが、疑問をわかせる知的な意識高揚や、考えを検証する実験・討論活動等の提供により改善が見られ、確証判断能力を育成する機会を提供できうることが示唆された。2.小・中学校の児童生徒に見る、探究過程での思考特性の分析水溶液学習をモチーフに、実験課題模索期の観察における(1)観察メモ作成上の特色、(2)提示事象と関連する変数への気づきとその過程での特色、(3)溶質存在モデルと観察結果との接点の有無、(4)作業中での社会的意味構成の有無と観察への影響等について事例面接法で分析し、小・中学校児童生徒の学習履歴や認知的・社会的発達との対応について検討した。3.科学的思考力の育成に向けた教授支援方略(1)仮説立ての大切さに気づく、(2)実験で納得するまで試行したり、データを偏見なく見取る、(3)事実と概念的理解を結びつける論理的思考が必要であると意識する、(4)他者との話し合いで、他の見方・考え方に気づき相対的に理解する、という4要素を導入した電気回路学習を開発して本年度講義で教員養成系学部学生を対象に実践した結果、一定の教育効果を得ることができた。本研究は、理科実験観察活動で学習者が概念的理解の論理一貫性を築くために必要不可欠な科字的思考力、特に「確証判断能力」を中心に学習者の実態を明らかにするとともに、これらの資質育成に有効な教授支援方略を検討することを目的としている。このうち本年度は、課題に適する実験観察を数テーマ設定したうえで、学習者の探究過程での思考様式について、確証判断の有無やその対象、さらには結論の論理性などの特性、さらには科学性の度合いなどについて明らかにした。以下に結果を示す。1.教員養成系学部学生に見る、探究過程での思考特性の分析先行研究より、「電気回路」に係わる単元での小学生児童の思考特性は既に分析済みである。これをふまえ、中等教育修了者かつ理科教員候補者である教員養成系学部学生を対象に、中学校の「電気回路」に係わる実験活動を導入した大学講義における彼らの思考特性を分析し、義務教育で育成すべき理解や科学的思考の定着度と講義による変容を捉えた。大学生であっても教育的介入がなければ中学生と同様な定着度を示すこと、仮説設定前に事象への疑間をわかせる知的な意欲高揚策が行われ、彼らに自由度を持たせた実験活動が提供できれば、彼らの意欲面や理解面に効果的に働くこと、などが得られた。2.小学生に見る、確証判断に関する思考特性の分析調査協力校との協議の結果、小学校第4学年の単完「水のすがたとゆくえ」・第6学年「自然界のつながりを探ろう」を題材として、学習者の探究過程をVTR記録、筆記記録等をもとに浮き彫りにし、確証判断の有無やその対象、さらには結論の論理性を吟味し、学習者の思考の特性を明らかにした。概して、設定テーマによらず、児童は実験観察での取り扱い事象が明確なほど、仮設設定や確証判断で科学的に処理することが意識化できたが、仮設の自由度を狭めるために、彼らの思考過程も理科授業も単調になること、などが得られた。以下に結果を示す。

3.科学的思考力の育成に向けた教授支援方略(1)仮説立ての大切さに気づく、(2)実験で納得するまで試行したり、データを偏見なく見取る、(3)事実と概念的理解を結びつける論理的思考が必要であると意識する、(4)他者との話し合いで、他の見方・考え方に気づき相対的に理解する、という4要素を導入した電気回路学習を開発して本年度講義で教員養成系学部学生を対象に実践した結果、一定の教育効果を得ることができた。
漢方薬の肝毒性における代謝酵素チトクロームP450とトランスポーターの関与

本研究では、肝毒性を考える上で重要なことの1つである肝臓における薬物の集積を定量的に評価するin vitro実験系を構築するために、サンドイッチ培養肝細胞を用いた薬物の胆汁排泄の検討を進めている。本年度は、ラット肝細胞を用いて、ラットにおける血漿中濃度基準の胆汁排泄クリアランスをサンドイッチ培養されたラット肝細胞におけるbile pocketへの薬物のクリアランスの値を用いて予測できるかについて検討を行ったところ、胆汁排泄クリアランスの大小関係は、in vitro実験系において得られた関係と一致することが明らかとなった。一方、絶対値については、in vitro実験の結果から予測される胆汁排泄クリアランスは、in vivoにおいて観察された値と比較して、約1/10程度であることが分かった。その原因として、取り込みトランスポーターの培養時間依存的な発現量低下を考え、培養時間ごとの肝細胞への薬物の取り込みを観察したところ、どの薬物においても、培養時間依存的に取り込みが低下した。また、取り込みクリアランスとin vivo胆汁排泄クリアランスの間の関係を観察したところ、良好な相関が見られたことから、一連のトランスポーターの基質薬物の胆汁排泄は、取り込み過程が律速となっており、この機能低下が絶対値の低下につながっていることを示唆することが出来た。また、加えて、ヒト肝細胞を用いたサンドイッチ培養による胆汁排泄の評価に着手し、種々の薬物のbile pocketへの排出を観察することに成功した。薬物の肝臓における血管側から胆管側にいたる経細胞輸送を観察するための実験系として利用するために、本年度は、sandwich culture培養肝細胞の実験系の確立・最適化を目的として、ラット肝細胞を用いて実験を行った。方法論としては複数の文献報告があるが、ゲル成分への薬物の吸着や肝細胞の機能維持などの観点から、最も薬物の経細胞輸送アッセイを行うのに適した系としては、下層にcollagen type Iがコートされたdishを用いて、上層には、matrigelをオーバーレイしたものが最適であることを見出した。また、その状態で、taurocholateやDPDPE, rosuvastatinなどの経細胞輸送をCa^<2+>イオンの有無の条件下で確認したところ、bile pocketへの時間依存的な蓄積が確認され、本実験系が、in vivoにおける胆汁排泄を模倣したin vitro実験系として利用可能であることが示唆された。さらに、carboxydichlorofluorescein(CDF)のdiacetate体をあらかじめ肝細胞に取り込ませた後に、carboxyesteraseにより切断されて蛍光を発するCDFの出現の時間推移を観察したところ、Ca^<2+>がある条件下でのみ、CDFの蛍光が時間依存的にbile pocketに蓄積する様が、蛍光顕微鏡により確認され、Ca^<2+>がない条件では、その蛍光が見受けられないことが示されたことから、Ca^<2+>があると、bile pocketが閉鎖しておりCDFの蓄積が見られる一方、Ca^<2+>がない条件では、bile pocketが開放されており、蓄積が見られないことが確認された。これらの検討により、in vitroにおいて薬物の肝臓における経細胞輸送を反映する実験系を作製することができ、次年度以降の解析系として利用していく予定である。薬物の肝胆系輸送は、薬物の肝毒性を決める要因のひとつとして非常に重要な役割を果たすことから、薬物の肝取り込み、排泄を同時に評価できるsandwich培養肝細胞のシステム構築にこれまで着手してきた、今年度は、この実験系を用いてラット肝細胞において、in vivoにおける胆汁排泄クリアランスの予測、ならびに胆汁排泄に関わるトランスポーターの寄与率を、各トランスポーターの選択的な阻害剤を用いて推定する方法論の確立を目指して研究を進めた。その結果、medium中基準の胆汁排泄クリアランスをもとに計算で予測したin vivoの肝固有クリアランスは、実測の値のほぼ1/10程度の値で良好な相関が認められた。このことは、取り込みトランスポーターの発現量の低下と合致すると推定され、今後実測の発現量の低下と一致するかについて検討をさらに進める。また、寄与率の推定においては、MDR1,MRP2,BCRPそれぞれの選択的な阻害剤として、verapamil,glycyrrhizin,Kol43を適切な濃度で用いることで利用しうることを見出し、それらを用いて、3種類のHMG-CoA還元酵素阻害薬をモデル化合物として用いた結果、個々の薬物に応じて、阻害剤による影響が異なることを見出し、その結果は、in vivoにおいて遺伝子欠損動物を用いて得られた結果とも合致することから、in vitro実験の結果から、胆汁排泄トランスポーターの寄与率を算出可能であることが示唆された。

また、取り込みクリアランスとin vivo胆汁排泄クリアランスの間の関係を観察したところ、良好な相関が見られたことから、一連のトランスポーターの基質薬物の胆汁排泄は、取り込み過程が律速となっており、この機能低下が絶対値の低下につながっていることを示唆することが出来た。また、加えて、ヒト肝細胞を用いたサンドイッチ培養による胆汁排泄の評価に着手し、種々の薬物のbile pocketへの排出を観察することに成功した。
マイクロデバイスで実現するホモプラズミックなミトコンドリアゲノム改変技術

ミトコンドリア(mt)ゲノムの機能解析を実施するためにはホモプラズミックなmtゲノム改変が必要であるが、これを実現する実用的な改変技術は開発されていない。本研究ではマイクロデバイスによる独自の細胞質移植技術を用いたホモプラズミックなmtゲノム改変技術の創出を目指した。この技術では変異mtゲノムをクローニングすることによりホモプラズミックなmtゲノム変異を構築することを想定している。これを実現するためには生きた細胞間における単一ミトコンドリアの移植が不可欠であるが、マイクロデバイスを用いた独自の細胞質移植技術に改良を加えることで、これを実現した。mtゲノムは多岐にわたる生命現象に関与するためその機能解析には大きな関心が寄せられている。しかしそのコピー数は一細胞あたり数千にもおよび、いくつかの変異タイプが混合した(すなわちヘテロプラズミックな)状態で存在するため、変異導入に基づいた機能解析を行うためにはホモプラズミックなmtゲノム変異の導入という困難な課題を克服しなくてはならない。本研究では、マイクロデバイスを用いた独自の細胞質移植技術を用いたホモプラズミックなmtゲノムの改変技術を創出することを目的とした。本研究において提案するホモプラズミックなmtゲノム改変技術の概略は以下の通りでる。まず、mtゲノム全領域を対象にランダムに変異を蓄積させた細胞をドナー細胞とし、mtゲノムを欠失させた細胞(ρ0細胞)をレシピエント細胞として準備する。このような細胞材料を用いて極めて微量の(理想的には一つの)ミトコンドリアをドナーからレシピエントに移植することで変異mtゲノムを純化して、ホモプラズミックなmtゲノム変異を有する細胞を樹立する。H26年度は、上記のmtゲノム改変技術の実現に向けて、独自技術であるマイクロデバイスを用いた細胞質移植技術による量的制御を伴ったミトコンドリア移植の実現に取り組んだ。これまで用いてきたマイクロデバイスは微細なスリット構造(マイクロスリット)を介して細胞を融合させることで細胞質の移植を実現していたが、ミトコンドリア移植量の制御は行えなかった。そこでマイクロスリットをトンネル構造に置換することを試みた。その結果、トンネル長を変えることでミトコンドリアの移植量の制御に成功した。特に、トンネル長を約10 μmに延長することでミトコンドリアの移植量が著しく減ずること示され、この条件下において目標としていた単一ミトコンドリアの移植に成功した。本研究では、マイクロデバイスを用いた細胞融合による独自の細胞質移植技術を利用したホモプラズミックなmtゲノム改変技術の開発を目的とした。その概略は以下の通りである。mtゲノムに変異を蓄積させた細胞をドナー細胞とし、ρ0細胞(mtゲノムを欠失させた細胞)をレシピエント細胞として、微量のミトコンドリア(理想的には一つ)を移植することでmtゲノムのクローニングを実現し、ホモプラズミックなmtゲノム変異を有した細胞を樹立する。このmtゲノム改変技術を実現するためには、1)単一ミトコンドリアの移植、2)ドナー細胞の樹立、3)レシピエント細胞の樹立、4)ミトコンドリアが移植されたレシピエント細胞の選別、を実現しなければならないが、平成26-27年度における研究期間において、これらの課題1、3、4を実現した。具体的には、マイクロデバイス形状の改良と細胞骨格阻害剤を併用した細胞融合法の開発によって直接的な単一ミトコンドリア移植が実現した(課題1)。また、長期間の臭化エチジウム処理によってρ0細胞を樹立した(課題2)。さらに、virus thymidine kinase発現とGCV暴露によってドナー細胞由来の核を含む細胞を除去できる細胞選別システムを構築した(課題4)。本研究では、残念ながら最終的な目標であったホモプラズミックなmtゲノム改変には至らなかったが、ホモプラズミックなmtゲノム改変技術の開発において最も重要かつ困難な課題であった“直接的な単一ミトコンドリア移植"に成功したことは特筆すべきことである。残された課題、すなわちドナー細胞(mtゲノム変異の蓄積した細胞)の作製そのものは既存の技術で十分に実現が想定できるものであり、したがって、本研究による成果は、ホモプラズミックなmtゲノム改変の実現に向けて大きな進展があったと評価できる。本研究計画において提案したホモプラズミックなmtゲノム改変技術を実現するためには、少なくとも以下の4項目の課題を克服しなくてならない。1)ドナー細胞(mtゲノム変異蓄積細胞)とレシピエント細胞(ρ0細胞)を樹立する。2)単一ミトコンドリアの移植を実現する。3)ミトコンドリア移植後に融合した細胞対を解離させる。4)ミトコンドリアが移植された細胞をマイクロデバイス内から選別、回収する。これらの課題の中で最も技術的な困難を伴うと予想されるものは「単一ミトコンドリアの移植の実現」であった。本年度の研究実施において、ミトコンドリア可視化細胞を用いた模擬的試行であったが、マイクロデバイスの改良を通じてこれを実現することに成功した。また、レシピエント細胞として不可欠であるρ

0細胞も143B細胞から樹立が終了した。これらの研究成果より、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価した。細胞/分子生物学当初の研究計画では、ミトコンドリア量の制御を細胞の解離時間を任意に制御することで実現することを想定していたが、この試みは成功に至っていない。これにかわり、マイクロデバイス形状を改良することでミトコンドリアの移植量を制御し、目標だった単一ミトコンドリアの移植を実現した。次に必要なことは、ミトコンドリアが移植された細胞を融合パートナーから解離させた後に、選別、回収する手段を開発することである。したがって、H26年度に成功に至らなかった細胞解離の制御は、今後実現しなければいけない項目においても重要な検討課題である。これを踏まえて、H27年度は特に細胞解離の制御を実現する方法の開発に重点を置いて研究を進める予定である。本年度末に研究に大きな進展があったため、実験を一時中断し論文作成に取り組んだ。この期間に使用を予定していたものを次年度への使用額とした。本年度に研究に伸展に伴い新しい研究課題が萌芽した。当初の研究計画に加えてこの研究課題の実施のために次年度使用額を使用する計画である。
加齢による聴力損失が明瞭度及び「聴きとりやすさ」に及ぼす影響の評価に関する研究

社会の高齢化が進んでいる現在、建築空間を利用する人々の年齢層は多様化しており、今後、聴空間計画において、あらゆる年齢層を想定しなければならない。しかし、音声伝達の評価は、聴力健常な者を基準として行われているのが現状である。そこで,被験者として加齢による聴力損失を伴った高齢者を用いて,文章了解度試験を残響,騒音及び双方が同時に存在する音場において行い,健聴者による結果と比較して,加齢による聴力損失が音声の聴き取りの度合いを示す文章了解度に及ぼす影響を明らかにした。その結果として,以下の知見が得られた。1.騒音付加音場において健聴者と同じ文章了解度を得ようとした場合,実験条件の範囲では約5[dBA]の騒音の低減が必要である。2.高齢者は健聴者と比較して残響の影響を大きく受け,その差は3040%であり,両者は比較的直線的な関係にある。3.高齢者にとって,残響の影響が大きく現れるのは騒音レベルが63[dBA]以上になるときである。4.残響及び騒音を付加した音場における健聴者と高齢者の文章了解度の比較全した場合,高齢者の60%を割るあたりから健聴者の了解度が100%近くから低下し初め,健聴者の了解度が40%を割ると,高齢者の了解度が20%以下となりほぼ定常的になる。5.健聴者と高齢者の音節明瞭度の差は直線的であり,ほぼ25%の差を示していたのに対し,文章了解度は2次曲線的な相関を示しており,音節受聴における聴力損失の影響は傾向が異なることが示唆された。6.残響と騒音が同時に存在する音場においては,残響付加音場と同様な傾向が見受けられるが,健聴者と高齢者の了解度の差が小さくなる.社会の高齢化が進んでいる現在、建築空間を利用する人々の年齢層は多様化しており、今後、聴空間計画において、あらゆる年齢層を想定しなければならない。6.残響と騒音が同時に存在する音場においては,残響付加音場と同様な傾向が見受けられるが,健聴者と高齢者の了解度の差が小さくなる.
泥炭地湖沼の水文化学的環境の解明とその生態系保全・再生手法に関する基礎的研究

泥炭地湖沼は湿地を利用する様々な生物にとって重要な生息場であり,保全の必要性が社会的にも認識されている.しかし,泥炭地湖沼の保全に必要な,水文化学環境に関する研究は少ない,本研究では,以下の二課題を通して,とくに北海道の低平地湿原に典型的な泥炭地湖沼の水文化学環境の保全・修復手法を提言した.課題1.泥炭地湖沼に固有の水文化学環境の把握人為的攪乱の少ない釧路湿原赤沼を対象に,湖沼の水文化学環境を水・物質収支を用いて定量的に評価した.その結果,赤沼では余剰降水量が多いため,多量の地表流入水が生じ,これまで報告のあった泥炭地湖沼や泥炭地に比べて流入・流出水量が多かった.この地表流入・流出水は湖水のミネラルイオン蓄積を抑制する役割を果たしていた.課題2.人為的攪乱による泥炭地湖沼の水文化学環境変化機構の解明人為的攪乱を受けている泥炭地湖沼として,集水域の大部分が農地化された石狩泥炭地宮島沼を対象に,赤沼と同様の方法で湖沼の水・物質収支を調査した.その結果,宮島沼は農地排水の流入や樋門操作といった営農に伴う水管理によって,泥炭地湖沼本来の水文化学環境を失っていることがわかった.宮島沼の水文化学環境を修復するためには,農地排水の流入を阻止するだけでなく,降水のようなミネラルイオン濃度の低い地表水の流入が必要であると考えられた.以上の結果は,宮島沼を含む石狩泥炭地湖沼群の水文化学環境の保全を検討するうえで重要な知見となる.1.泥炭地湖沼の水文化学環境の解明釧路湿原の赤沼を対象として,湖沼の流入出水量および水質の観測を行い,水・物質収支の把握を試みた.その結果,泥炭地湖沼の水収支は,その大部分を降水と蒸発に依存していることが考えられた.特に降水量の多い赤沼の場合,他の地域の泥炭地湖沼に比べて,湖沼を出入りする水・物質量が多いことが分かった.以上の結果は,降水量の多い東アジア地域の泥炭地湖沼の水・物質収支に関して,世界で初めて整理したものといえる.泥炭地湖沼は貴重な生態系を有している一方で,湿原開発とともに人為的な攪乱を受けてきたため,世界的にもその保全が望まれている.今回得られた結果は,そのような泥炭地湖沼の保全・再生手法の検討に活かすことができる.2.人為的攪乱が泥炭地湖沼の水文化学環境に及ぼす影響の把握人為的攪乱を受けている泥炭地湖沼として,集水域のほとんどが農地利用されている,石狩泥炭地の宮島沼を対象に,赤沼と同様の方法で湖沼の水・物質収支を調査した.その結果,宮島沼は営農に伴う水門操作によって,非灌漑期に水位が大きく低下していた.また,灌漑期においては,灌漑用水の流入量増加によって,湖沼を出入りする水量が多く,水収支の大部分を水路流入水と水路流出水が占めていた.一方,宮島沼の全窒素,全リン濃度は,多くの期間で湖沼の環境基準値を上回っており,富栄養化状態にあることが分かった.以上の結果から,宮島沼の水文化学環境は,営農に伴う水管理の影響により,健全な泥炭地湖沼とは大きく異なっていることが示唆された.今後,水・物質収支を整理し,赤沼と比較することによって,宮島沼の水文化学環境の再生手法を検討する必要がある.泥炭地湖沼は湿地を利用する様々な生物にとって重要な生息場であり,保全の必要性が社会的にも認識されている.しかし,泥炭地湖沼の保全に必要な,水文化学環境に関する研究は少ない,本研究では,以下の二課題を通して,とくに北海道の低平地湿原に典型的な泥炭地湖沼の水文化学環境の保全・修復手法を提言した.課題1.泥炭地湖沼に固有の水文化学環境の把握人為的攪乱の少ない釧路湿原赤沼を対象に,湖沼の水文化学環境を水・物質収支を用いて定量的に評価した.その結果,赤沼では余剰降水量が多いため,多量の地表流入水が生じ,これまで報告のあった泥炭地湖沼や泥炭地に比べて流入・流出水量が多かった.この地表流入・流出水は湖水のミネラルイオン蓄積を抑制する役割を果たしていた.課題2.人為的攪乱による泥炭地湖沼の水文化学環境変化機構の解明人為的攪乱を受けている泥炭地湖沼として,集水域の大部分が農地化された石狩泥炭地宮島沼を対象に,赤沼と同様の方法で湖沼の水・物質収支を調査した.その結果,宮島沼は農地排水の流入や樋門操作といった営農に伴う水管理によって,泥炭地湖沼本来の水文化学環境を失っていることがわかった.宮島沼の水文化学環境を修復するためには,農地排水の流入を阻止するだけでなく,降水のようなミネラルイオン濃度の低い地表水の流入が必要であると考えられた.以上の結果は,宮島沼を含む石狩泥炭地湖沼群の水文化学環境の保全を検討するうえで重要な知見となる.
動物モデルを用いたハンタウイルス感染症の病態解明

ハンタウイルスはヒトに腎症候性出血熱を起こす。患者と類似の腎出血を発現するマウスモデルを開発し、ウイルス側・宿主側双方の病態関連因子の同定を試みた。その結果、ハンタウイルスの外殻を構成する糖蛋白質Gnの417番目のアミノ酸と、宿主の免疫に関わるT細胞が病態発現に関与することが明らかとなった。また、細胞傷害性T細胞などを引きつける複数のケモカインが発症時に顕著に増加することも明らかとなり、これらケモカインによって誘導される過剰な細胞性免疫が病態発現機序の一端を担っている可能性が示された。適当な動物モデルがなく、病態発現メカニズムには不明な点が多い。研究代表者はこれまでに、腎症候性出血熱患者に認められる腎髄質の出血と類似の病変を成熟BALB/cマウスに発現させることに成功した。本研究では、この動物モデルの病態をさらに解析した。尿を検査した結果、接種後6日目に尿蛋白質濃度の上昇、接種後9日目をピークとして、612日目に潜血が認められた。一方、腎機能のマーカーの1つである血清中尿素窒素濃度については、コントロールとの差は認められなかった。主要な血中サイトカイン等を比較した結果、インターロイキン(IL-7、IL-13)、ケモカイン(IP-10、MIG、MCP-1、MIP-1α、CXCL1)、TIMP-1濃度の上昇が認められた。特に、IP-10、MIG、MCP-1、TIMP-1濃度の上昇が顕著であった。一方、代表的な炎症性サイトカインであるIFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6や、補体成分であるC5aの濃度に大きな変動は認められなかった。IP-10、MIG、MCP-1は単球やT細胞の遊走活性などを持つ。また、TIMP-1はマトリックスメタロプロテアーゼの作用を阻害する。マトリックスメタロプロテアーゼは細胞外基質の分解の他、サイトカインなどの生理活性物質の活性化など、様々な生理現象に関与している。今後はこれら分子の濃度変化が病態発現の原因なのか結果なのかを明らかにするため、抗体投与の影響を調査する予定である。腎症候性出血熱はハンタウイルスの感染によって起こる重篤な疾患である。これまでに私は、腎症候性出血熱患者で認められる腎髄質の出血と類似の病変を発現する動物モデルを初めて開発した。また、同じ患者の血液から分離されたウイルスのなかから、病気を起こすクローン(強毒株)と病気を起こさないクローン(弱毒株)を発見した。さらに、機能的なTおよびB細胞を欠く免疫不全マウスにおいては、腎臓の出血性病変が起こらないことを発見した。これらのことは、ウイルスのゲノム配列の違いに起因するウイルス側の要因と、免疫系の関係する宿主側の要因が病態発現に関与することを示している。そこで、まずウイルス側の要因の同定を試みた。定法により、強毒株および弱毒株のゲノム配列を決定し、比較した。その結果、糖蛋白質コード領域に1塩基、RNA依存性RNAポリメラーゼコード領域に1塩基の違いが認められた。推定アミノ酸配列を比較した結果、糖蛋白質Gnの417位のアミノ酸が強毒株ではグルタミン酸、弱毒株ではリジンであることが明らかとなった。RNA依存性RNAポリメラーゼのアミノ酸配列は同一であった。これらのことから、糖蛋白質Gnの417位のアミノ酸の違いが病態発現に関与することが明らかとなった。強毒株で認められたグルタミン酸は、ハンタウイルス属の間で高度に保存されていた。したがって、このアミノ酸が病態に関与するメカニズムはハンタウイルス属に共通するものである可能性がある。次に、宿主側の要因の同定を試みた。T細胞を欠く免疫不全マウスに強毒株を接種したところ、マウスは無症状で経過した。このことから、病態発現にはT細胞が関与することが示唆された。ハンタウイルスは、病原性の高い出血熱ウイルスのひとつで、ヒトに腎症候性出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome: HFRS)を起こす。その病態発現メカニズムを解明するため、研究代表者はHFRSマウスモデルを確立した。このモデルでは、ウイルス接種後612日にHFRS患者に特徴的な腎髄質の出血が認められる。これまでに、ウイルス糖蛋白質Gnの417番目のアミノ酸およびT細胞が病態発現に関与することを明らかにした。また、発症し始める時期にあたる接種後6日をピークとして、多くのサイトカインの血中濃度が増加することを明らかにした。今年度は、病変発現部位である腎臓において、発症時に発現量が大きく変動するサイトカインの同定を試みた。その結果、CXCL9 (C-X-C motif Chemokine ligand 9)が非感染マウスの50倍以上に増加することが明らかとなった。CXCL

9はケモカインの一種で、細胞性免疫に関与するCD8陽性T細胞などを遊走させる活性を有する。このことから、感染後、腎臓中で産生されたCXCL9が過剰な細胞性免疫を誘導し、腎出血を起こしている可能性が考えられた。そこで、CXCL9の活性を中和する抗体をマウスに投与し、感染実験を行った。しかし、抗体投与による病態発現の抑制効果は認められなかった。CXCL9は、CXCL10およびCXCL11とともに、受容体であるCXCR3を持つ細胞に作用する。CXCL10およびCXCL11の血中および腎臓中の濃度も比較的高いことから、これらが協調的に作用して過剰な細胞性免疫を誘導している可能性はある。今後、CXCR3を欠損するマウスでこれらケモカインの病態発現への関与の有無を検証する必要があると考えられる。ウイルス学初年度に申請時に予定されていなかった研究室の引っ越しが行われ、ハンタウイルスを用いた実験を実施するために必要なバイオセーフティーレベル3の実験室の移設、申請に時間を要した。また、感染性材料の保存に使用していたディープフリーザーが故障し、材料を再調製しなければならなくなった。今年度はハンタウイルス感染時に発現量の増加する蛋白質を同定し、その機能阻害の影響を調べる予定であった。しかし、発現量の増加した蛋白質が多数見つかったため、その後の解析の対象とする候補の選抜とその機能を阻害する方法の調査検討に時間を要した。申請時には予定されていなかった研究室の引っ越しが行われ、ハンタウイルスを用いた実験を実施するために必要な、バイオセーフティーレベル3の実験室の移設、申請に時間を要した。血中濃度の増加が顕著であった分子を対象として、抗体投与等による機能阻害が病態発現に及ぼす影響を調査する。多くの実験は並行して実施することができる。遅れを取り戻すため、可能な限り並行して実施する。ハンタウイルス感染時に発現量の増加する蛋白質を同定し、その機能阻害の影響を調べる予定であった。しかし、発現量の増加した蛋白質が多数見つかったため、その後の解析の対象とする候補の選抜とその機能を阻害する方法の調査検討に時間を要し、未使用額が生じた。このため、発現量の増加した蛋白質の機能阻害の影響を調べる実験を平成26年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。平成24年度に実施予定であった、DNAマイクロアレイやリアルタイムPCRによる遺伝子発現応答の解析や、抗体アレイを用いた血清中のサイトカイン量の解析は、上述した理由で実施できず、平成25年度に延期となった。繰り越した研究費は主にそれらに使用する。平成25年度分の研究費については、当初の予定通りに使用する。
わが国における信託収益課税制度の立法論的検討

1.日米の信託収益課税制度の差は、両国の信託に関する実体法およびそれに関する行政的規制の違いにも、その多くを拠っている。本研究の前提として既に明らかにした、わが国の信託収益課税における「受託者非課税の原則」は、わが国において信託を業として営むことができるのが原則として信託銀行に限られ、それらが金融行政当局の法律上または事実上の厳しい規制下に置かれていることと密接に関連している。2.(1)これに対して、米国の信託課税は、原則として受託者に日本のような意味での直接的な行政的規制が及ばないこと、および「事業」を受託財産となしうることを前提として、原則として「信託」を一個の納税主体として捉え、例外的にこれを課税上「導管」として扱うこととしている。ここにわが国の信託収益課税制度との構造的な違いが存することが判明した。(2)「例外的」に信託が納税主体とされないのが、投資信託の場合である。これは、その本質上「導管」であるとされる場合(判例はそのメルクマ-ルを受託者に「投資内容の変更権限がない場合」としている)と、RIC(Regulated Investment Company),REIT(Real Estate Investment Trust),REMIC(Real Estate Mortgage Investment Conduit)等、特に立法によって認められる場合とがあることが判明した。3.信託が一個の納税主体として扱われる制度の下では、委託者から信託への財産の移転が重要なtaxable eventとなる。この点が米国的な制度のわが国への導入の可否を考える際に大きな問題点となることが、本研究の結果得られた、次のステップというべき問題の展望である。なお、以上の研究を進めるにあたり、多くの資料を保存し、かつ、それを迅速に処理する必要から、大容量の記憶装置と高い処理能力を備えた機械の購入が必要となった。