hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超流動ヘリウム中におけるヨウ素分子の解離・再結合ダイナミクス

一方、サファイア固体の自己位相変調光を用いる実験も、光量が不足するなどの問題点があって、この系におけるポンプープローブ実験のデータはまだ得られていない。昨年購入したInGaAsマルチチャンネル分光器を用いて、測定システムのソフトウェアなどを整備もしたが、現在までデータは取れていない。実験の精度を上げるために、もう一台のInGaAsマルチチャンネル分光器を導入し、2チャンネル化を行う必要があると思われる。一方、昨年導入した1KHzのパルス光を間引くことによって、いかなる周波数でも実験を可能にするガルバノモーターシャッターシステムは一応の動作を確認した。この装置によって、1KHzを単発パルスにまで減少させることができた。ヘリウムの泡の発生を最小限にすることが出きるので極低温の測定に大きな力を発揮すると思われる。この装置を用いた過渡吸収測定については現在実験を進行中である。今後ヨウ素分子を発生させるためのナノ秒レーザーの同期システムの開発が必要であると思われる。
概日リズムによる基本生理機能調節の分子メカニズム

概日リズムはホルモン分泌等の基本的生理現象の周期を外環境に適応させ維持する機構である。この機構の異常は精神(時差症候群、不眠)、循環器(心筋梗塞)、呼吸器(喘息)疾患を含む多くの病態に関与している。最近では、近代化がもたらす飽食に伴うメタボリック症候群、老齢化と関連する骨粗鬆症や発癌といった現代生活を脅かす疾患が概日リズムと密接に関係していることが明らかになっている。脊椎動物の概日リズムは全身の個々の細胞に存在する分子時計により制御されている。この分子時計においてCLOCKとBMAL1は二量体を形成し、転写活性化因子として機能する。過去10年の間にこの分子時計自体の制御機構についての研究は急速に進展してきたが、分子時計がどのように疾患に関与する様々な基本的生理機能を制御しているかについては現時点ではほとんど解明されていない。申請者は(1)概日リズム制御蛋白質CLOCKが酵素活性を有すること及び(2)CLOCKがその酵素活性により二量体形成のパートナーであるBMAL1をアセチル化することを見出している。本研究は,これらの知見に基づいて、CLOCKがアセチル化により細胞周期制御因子や核内受容体の機能調節をするという仮説を立て研究を行った。本研究において、申請者は免疫共沈降法及び質量分析解析によりCLOCKに結合する新規蛋白質として糖鎖付加酵素を見出した。また、CLOCKがこの糖鎖付加酵素をアセチル化することを見出した。さらに、CLOCKがこの糖鎖付加酵素により糖鎖付加を受けることを見出している。現在申請者はCLOCKによる糖鎖付加酵素のアセチル化及び糖鎖付加酵素によるCLOCKの糖鎖付加修飾の生理学意義について解析を行っている。申請者は概日リズムの転写制御に関してERK/MAPKとp38 stressシグナル伝達系がクロストークすることを見出し、論文を投稿中である。
分子軌道計算を援用したゼオライト触媒による新規脱硫反応の開発

これまで、我々は金属共担持Y型ゼオライト触媒を用いた多環芳香族化合物の水素化分解反応について検討を行ってきた。その中で、ニッケルとパラジウムを共担持したゼオライトが最も高い活性を示すことを見出してきた。本研究では、この触媒を石油中の難脱硫性成分のモデル化合物であるジベンゾチオフェンの水素化脱硫反応に適用した。その結果、320°C、1時間、70kg/cm^2の水素加圧下でジベンゾチオフェンのほとんど(98%+)が硫化水素、ベンゼン類、シクロヘキサン類、C_2-C_4の軽質炭化水素へと転化することを見出した。また、ジベンゾチオフェンよりも脱硫されにくいことが知られている4,6-ジメチルジベンゾチオフェンの場合も、同じ温度で2時間反応を行うことにより、ほぼ完全に反応が進行することを見出した。これらの基質のY型ゼオライト細孔内での拡散挙動について、汎用計算化学パッケージ(CACheワークシステム)を用いたシミュレーションを行ったところ、ジベンゾチオフェンについて細孔内を自由に移動できるが、4,6-ジメチルジベンゾチオフェンは細孔に侵入できないことが明らかとなった。後者について反応機構の検討を行ったところ、反応初期に4,6-ジメチルジベンゾチオフェンは、メチル基の転移による他のジメチルジベンゾチオフェンへの異性化あるいは、トランスメチル化によるモノ-およびトリメチルジメンゾチオフェンへの不均化が進行していることがわかった。
後発酵茶に存在する微生物の産生物と新規機能性成分に関する研究

本年度は、徳島県勝浦郡上勝町で阿波晩茶の生産実態について現地調査を行った。その結果、製造段階でこれまで大変な作業とされている、揉捻工程の舟型のすり機を使用する"船すり"がある。この工程は、現在緑茶製造に用いる揉捻機に良く似た機械を用いて行っていた。この揉捻機を用いる生産者が最近増加の傾向であった。これまで舟型を用いて人力で往復100回の操作が、揉捻機を用いると3分間で終了し、桶漬けなどの作業が1人で同時に実行できていた。その結果、製造時間の短縮になっていることが明らかとなった。後発酵茶の抗酸化性の測定方法として、DPPH法が有効であり、阿波晩茶の浸出液に存在することが示唆された。今後、どの成分に抗酸化性があるかについて検討する予定である。本年度は、昨年度阿波晩茶から分離した微生物のゼラチン分解能について検討した。単離した微生物32種において、ゼラチン分解活性の存在が明らかとなった。中でもゼラチン分解活性の高い菌について、16sRNAにより遺伝子解析を行った結果、Lactobacillus属の一種であることが明らかとなった。一方、昨年度抗酸化性に有効な方法として、DPPH法であることが明らかとなった。それに加えて、リノール酸・β-カロチン分解による測定方法を加えて比較検討を行った。また試料として他の茶との比較検討するため、緑茶(煎茶)・紅茶(2010年度製三番茶)を使用した。緑茶・紅茶は、ポリフェノール含量やアミノ酸含量、アスコルビン酸含量が多く、これらの成分による抗酸化性が強く認められた。しかし、阿波晩茶は、ポリフェノールやアミノ酸、アスコルビン酸等含量は少なく、これらの要因による抗酸化性の可能性が少ないことが明らかとなった。また浸出液を溶媒分画する方法を実施した結果、MIBK層、BuOH層、水層の3画分を検討した結果、アミノ酸が多く存在している水層は抗酸化性が大きいことが明らかとなった。MIBK層は、これらの要素が少ないにもかかわらず抗酸化性の強い成分の存在していることが明らかとなった。その他の後発酵茶として碁石茶に存在する微生物としてGeotrichum bryndzaeの存在を明らかとなった。これはカビの一種であることが認められた。また磁砿Geotrichum bryndzaeの性質についてはC源としてグルコース、N源としてアスパラギン、グルタミン酸が良く資可されていることが明らかとなった。本年度は、阿波晩茶の抗酸化性について昨年に続き検討した。阿波晩茶は、他の茶に比べて抗酸化性が低いことが認められた。浸出液の溶媒分画液のDPPH法による抗酸化性は、MIBK層が一番高くなっていることが明らかとなった。ついでBuOH層で水層が一番少ない結果であった。阿波晩茶の各画分に含まれる成分含有量を測定した結果、水層にアミノ酸が1.67mg/100ml含まれていた。MIBK層には0.02mg/100ml、BuOH層には、0.08mg/100ml含まれていた。ポリフェノール含量は、MIBK層に7.05mg/100ml、BuOH層に3.25mg/100ml、水層に1.75mg/100ml含まれていた。他の茶に比較して阿波晩茶に含まれる各成分の含有量は少ないところから、抗酸化性を示す物質が存在することが示唆された。桶漬け中から分離した微生物について、ゼラチン液化試験を行い、ゼラチン分解活性を持つ菌株32種を得た。分離した菌株をコラゲナーゼ誘導液体培地にて培養(37°C48時間)後、遠心分離した上清を粗酵素液として用いた。基質コラーゲン(TypeI)0.01gに0.1Mリン酸緩衝液300μlを加えて均一に懸濁し、菌株の粗酵素液を200μl加え、30°Cで6時間反応後、1M塩酸1500μlで反応を停止した。10分遠心分離し、上清100μlと蒸留水900μl加え、標準溶液ロイシンを用いてニンヒドリン反応にて遊離アミノ酸含量を測定した。その結果、基質にコラーゲンを用い、分離菌株32種のプロテアーゼ活性を検討した結果、遊離アミノ酸含量が高いもので718.6μg/mlで低いもので311.4μg/mlであった。また多くのものが非常に高い活性を示していた。今後は、これら微生物の産生するたんぱく質分解酵素について詳細な検討が必要であると考える。本年度は、後発酵茶の抗酸化性について検討を行い、他の茶(緑茶・紅茶)との抗酸化能を比較した。緑茶に比べて抗酸化能は少なかったが、溶媒分画によりMIBK層に抗酸化性が認められ、この分画を精査した結果、一般に茶に多く含まれると言われているポリフェノールやアスコルビン酸、アミノ酸は認められなかった。また微生物としてゼラチン分解能を産生する微生物について検討した。その結果、カゼイン分解をする微生物が認められ現在その遺伝子解析を行って同定をしている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今回抗酸化性が認められたMIBK層について、どのような成分が抗酸化性を示しているのかについて明らかとしたい。その他の新規後発酵茶の成分についても検討を続けてゆきたい。

また分離微生物に関しては、ゼラチン分解活性を有している微生物の遺伝子解析による詳細な同定を試みたい。またAPI同定キット等を用いて分離微生物の解析も明らかとしたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。
Akt(protein kinase B)の活性化による脊髄保護に関する研究

胸腹部大動脈瘤手術の重大な合併症の一つである下半身麻痺は、手術中の大動脈遮断に伴う脊髄虚血が原因と考えられている。多くの薬物による脊髄保護効果が動物実験で報告されているが、脊髄虚血から脊髄を保護する臨床応用可能な方法は未だに確立されていない。本研究では、既に市販されているエリスロポエチン製剤とインスリン様成長因子1製剤を虚血再灌流直後に同時投与することで、家兎一過性脊髄虚血モデルで脊髄保護効果があることを見出した。平成1920年度の基盤研究(C)で、インスリン様成長因子1(IGF-1)とエリスロポエチン(EPO)の併用により、一過性脊髄虚血に対して強い保護効果が認められた。In vitroの研究では、IGF-1とEPOの併用は相乗的にAktの活性化を起こすことが報告されているので、平成21年度は、IGF-1とEPOの脊髄保護効果にAktの活性化(リン酸化)が関与しているか否かのin vivoの検討を行った。家兎を対照群(生理食塩水投与)、IGF-1群(虚血30分前にIGF-1 0.3mg/kgを静脈内投与)、EPO群(虚血30分前にEPO 800IU/kgを静脈内投与)、IGF-1+EPO群(虚血30分前にIGF-1 0.3mg/kgとEPO 800IU/kgを静脈内投与)の4群に分けた(各群n=9)。イソフルラン麻酔下に経後腹膜的アプローチにより左腎動脈直下の大動脈にテーピングを行った。脊髄虚血は大動脈の13分間遮断により作成した。各群で、大動脈遮断直前、再還流15分後、再還流30分後の3時点(各n=3)で、脊髄を取り出し、Aktの活性化を測定した。結果は、IGF-1投与により虚血前よりAktが活性化される傾向が観察され、虚血再還流15分後には対照群に比較し、強くAktが活性化される傾向にあった。EPO単独では、Aktの活性化は顕著ではなく、IGF-1+EPOにより、相乗的にAktが活性化させる傾向も顕著ではなかった。今後、数を増やして検討を続ける予定である。家兎を対照群(生理食塩水投与)、IGF-1群(虚血30分前にIGF-1 0.3mg/kgを静脈内投与)、EPO群(虚血30分前にEPO800IU/kgを静脈内投与)、IGF-1+EPO群(虚血30分前にIGF-1 0.3mg/kgとEPO800IU/kgを静脈内投与)の4群に分けた(各群n=12)。各群で、大動脈遮断直前、再還流15分後、再還流30分後の3時点(各n=4)で、脊髄を取り出し、Akt(Thr308)、ERK(Thr202/Tyr204)、GSK3βの活性化を測定した。結果は、IGF-1単独群、IGF-1+EPO群で虚血前よりAktが活性化される傾向が観察され、虚血再還流15分後には対照群に比較し有意に強くAktが活性化された。EPO単独では、対照群と比較しAktの活性化は顕著ではなかった。IGF-1+EPOではIGF-1単独群と比較し、Aktの活性化が増強される傾向はなかった。GSK3βの活性化はAktの活性化とほぼ同様の傾向を示したが、群間差は認められなかった。ERKに関しては、各群とも再灌流30分後で虚血前値と比較し有意な活性化が見られたが、各群間で有意な差は見られなかった。平成1920年度の基盤研究(C)で、インスリン様成長因子1(IGF-1)とエリスロポエチン(EPO)を虚血前に投与すると、一過性脊髄虚血に対して強い保護効果が認められた。その機序として、Akt,の活性化が予想されたが、前年度までの研究では明らかな活性化を証明することはできなかった。本年度は、硬膜外電気刺激によるAktの活性化を試みたが、家兎での硬膜外電気刺激は、刺激条件を決定することが困難であることが判明した。したがって、IGF-1とEPOの脊髄保護作用において未検討課題である虚血再灌流後のIGF-1とEPO投与による脊髄保護効果について検討した。

家兎を対照群(虚血再灌流直後に生理食塩水投与)、IGF-1群(虚血再灌流直後にIGF-1 0.3mg/kgを静脈内投与)、EPO群(虚血再灌流直後にEPO 800 IU/kgを静脈内投与)、IGF-1+EPO群(虚血再灌流直後にIGF-1 0.3mg/kgとEPO 800 IU/kgを静脈内投与)の4群に分けた(各群n=6)。イソフルラン麻酔下に経後腹膜的アプローチにより左腎動脈直下の大動脈にテーピングを行った。脊髄虚血は大動脈の15分間遮断により作成した。虚血再灌流後7日間家兎の後肢機能を観察した。後肢運動機能は5段階評価とした(4:正常、3:跳躍できるが正常ではない、2:後肢はよく動くが跳躍できない、1:後肢がわずかに動く、0:完全麻痺)。最終的な神経学的所見を観察後、再度全身麻酔を行い、脊髄を灌流固定した。腰部脊髄の切片をhematoxylin & eosinし、第5腰椎レベルの腹側脊髄の正常神経細胞数を測定した。最終的な後肢運動機能は対照群で1:1羽、0:5羽、IGF-1群で4:2羽、3:1羽、2:1羽、1:2羽、EPO群で3:2羽、2:3羽、0:1羽、IGF-1+EPO群で4:3羽、2:3羽と、IGF-1+EPO群が対照群に比較して有意に神経学的所見がよかった。第5腰椎レベルの腹側脊髄の正常神経細胞数(平均値±標準偏差)は対照群で6±4、IGF-1群で44±34、EPO群で31±18、IGF-1+EPO群で47±24と、IGF-1+EPO群が対照群に比較して有意に正常神経細胞数が多かった。今後は脊髄虚血再灌流後のIGF-1とEPOの投与によるAktの活性化を検討する予定である。
強相関トポロジカル相における量子エンタングルメントと創発的自由度の研究

フランスのグループとのここ数年の冷却SU(N)フェルミオン系に関する共同研究の成果をまとめたレビュー論文を執筆し、最終年度には2重井戸光格子を用いる現実的なセッティングで空間反転対称性を自発的に破る新たなSPT相を実現する方法を提案した。また太田氏等と、一次元のマヨラナ端状態を持つトポロジカル相における秩序変数、エンタングルメントなどのダイナミクスを調べた。結合ワイヤ構成法については、初めて正しくバルクの非自明な状態を表すChern-Simonsゲージ理論が創発されることを示した。さらに、2次元の任意の可換群の構造を持つトポロジカル状態を実現するレシピを発見した。一次元光格子中のSU(N)フェルミ気体のMott絶縁相の広い部分で、いわゆる対称性に護られたトポロジカル相が実現することがわかってきているが、戸塚と谷本は、エンタングルメントスペクトラムや非局所秩序パラメータを用いて、このSU(N)トポロジカル相を特徴づけることに成功した(Tanimoto-Totsuka, Phys.Rev.B投稿中)。また、一連の一次元SU(N)冷却原子系に関する研究成果を総合報告の形でまとめ、出版した(Capponi-Lecheminant-Totsuka, Annals of Physics 2016)。以前、戸塚は田中、胡両氏と共同で、強磁場中の磁化プラトー現象(磁化過程に平坦部が出現する現象)が、波動関数の量子性に起因するBerry位相と密接に関係していることを示したが、一次元の場合にこのBerry位相の効果を子細に検討することにより、対称性に護られたトポロジカル状態が存在し得ることを明らかにした(Takayoshi-Totsuka-Tanaka, Phys.Rev.B 2015)。カゴメ格子上のスピン-1/2模型に現れる、飽和磁化に対して磁化ゼロ、1/3、2/3の3つの磁化プラトーのうち、強結合領域で「量子ループ模型」にマップされる磁化1/3のものについて、量子モンテカルロ計算によりスピン液体磁化プラトー相を含むこの系の相図を決定した(Plat-Alet-Capponi-Totsuka, Phys.Rev.B 2015)。一次元のスピン偏極したp波超伝導体の模型、いわゆるKitaev鎖に、より長距離の超伝導ペアリングを考慮したモデルについて、複数のペアリング項の競合により出現するトポロジカル相や秩序相の相図を決定し、量子相転移の性質を調べた。また、相互作用を有限時間で変化(スイープ)させた時のトポロジカルな性質についても詳しく調べた(Ohta-Tanaka-Danshita-Totsuka, J. Phys.Soc. Jpn. 2015, Phys.Rev.B 2016)。平成27年度は、一次元SU(N)冷却原子系の物性の解明と、強磁場中でもトポロジカルな磁化プラトー状態の研究を2つの柱に設定していた。一番目のテーマについては、本課題の研究費に加えて、フランス国立科学研究センター(CNRS)の国際科学共同研究プロジェクト(PICS)の予算を用いて、昨年度は夏と冬にそれぞれ2週間ずつフランスの共同研究者を訪問して、集中的に議論・研究を進めることができた。また、本課題の成果も含む最近の成果について、フランスの研究者と共著で総合報告の形にまとめることができた。二番目の課題についても、Toulouse大の共同研究者と共に数値的、解析的な研究を行い、その成果を論文(Physical Review B誌)にまとめることができた。また、関連したテーマについて、国内の研究者と共同研究を行い、その成果を出版した(Physical Review B誌)。一次元の対称性に護られた(Symmetry-Protected Topological phases--SPT phases)におけるダイナミクスを調べた。具体的には、異なるSPT相をまたぐように相互作用を変化(スイープ)させ、それに伴う端状態、非局所相関、エンタングルメント・スペクトラムなどの変化を調べ、これがスイープで励起される準粒子と密接に関係していることを突き止めた(Ohta-Tanaka-Danshita-Totsuka, Phys. Rev. B 93, 165423 (2016))。さらにこれに関連して、SPT相と周期的外場との競合についても調べた(Ohta-Totsuka, J. Phys. Soc. Jpn., 85, 074003 (2016))。前年度から継続中のテーマである、一次元の光格子中のSU(N)対称性を持つアルカリ土類フェルミ原子気体を用いたSPT相の実現について、フランスの研究者と共同で、二連井戸型の光格子を用いた新たなSPT相の実現方法を提案した(Fromholtz et al.準備中)。また、関連するSU(N)系のトポロジカル相をメインテーマとして、7月に京大基研にて二週間の国際ワークショップを開催した(http://www2.yukawa.kyoto-u.ac.jp/sun2016/)。局所的な秩序変数の定義できないトポロジカル相の非局所的なプローブとしてエンタングルメントエントロピーがあるが、たとえば二次元の非自明なエンタングルメントエントロピーがどのようにして一次元から創発されるか、などはよくわかっていない。今村と戸塚は、これを理解する第一歩として、結合させた一次元系にどのようにゲージ自由度が創発されるかを明らかにした(Imamura-Totsuka, arXiv: 1605.09235)。

平成28年度は、昨年度の実績報告でも触れたとおり、一次元の対称性に護られたトポロジカル相の物性(基底状態、エンタングルメント、ダイナミクスなど)の研究と、二次元、三次元の長距離エンタングルメントを持つトポロジカル状態の結合ワイヤ構成法の研究を柱として研究を行った。本課題の研究費とフランス国立科学研究センター(CNRS)の国際科学共同研究プロジェクトの予算を用いて2016年秋にフランスの共同研究者のもとに2週間滞在して共同研究を進めたほか、夏には関連するテーマについて、2週間の国際ワークショップを開催することができた。その成果については、2篇の論文を投稿準備中である。引き続き、光格子中のSU(N)対称性を持つアルカリ土類フェルミ原子気体を用いたSPT相の実現について、フランスの研究者と共同で研究を進めた。昨年、一次元の二連井戸型の光格子を用いた新たなSPT相の実現方法を提案したが、この方法で、いままで現実的な実現方法が知られていなかった空間反転対称性の破れを伴うカイラルなSPT相も実現できることを明らかにし、これらの成果について論文にまとめた(Fromholtz et al. arXiv:1709.10409、査読中)。また、この問題に密接に関連したSU(N)対称性のあるスピン模型についてその相図を詳細に検討した(Fromholz et al.投稿準備中)。2次元、3次元のトポロジカル相を一次元系を結合させることで実現する「結合ワイヤ構成法」がKane等により提案されているが、この構成法において、いかにしてChern-Simonsゲージ理論などのバルクの非自明な有効作用が形成されるかを初めて明らかにし、その考察を分数量子ホール状態の階層構造を含む一般の可換なトポロジカル相についても拡張した(Imamura-Totsuka,投稿準備中)。これにより、2次元トポロジカル相の非自明なエンタングルメントがいかにして一次元から創発されるか、高次元トポロジカル相の実現方法など、未解決の問題の理解が進むことが期待される。フランスのグループとのここ数年の冷却SU(N)フェルミオン系に関する共同研究の成果をまとめたレビュー論文を執筆し、最終年度には2重井戸光格子を用いる現実的なセッティングで空間反転対称性を自発的に破る新たなSPT相を実現する方法を提案した。また太田氏等と、一次元のマヨラナ端状態を持つトポロジカル相における秩序変数、エンタングルメントなどのダイナミクスを調べた。結合ワイヤ構成法については、初めて正しくバルクの非自明な状態を表すChern-Simonsゲージ理論が創発されることを示した。さらに、2次元の任意の可換群の構造を持つトポロジカル状態を実現するレシピを発見した。研究計画は概ね順調に進捗している。今年度からは、分数量子ホール系を一次元系を結合させることで構成するcoupled-wire constructionと、テンソルネットワークなどの手法との関連について重点的に明らかにしたい。このテーマについては、5-6月に基礎物理学研究所で開催される国際研究会の際にいろいろ議論を重ねる予定である。また、SU(N)冷却原子気体のトポロジカル相の研究については、今年度7月に、この分野の指導的研究者を集めた2週間のワークショップを開催する予定であるので、その際にまた大きな進展があると期待している。平成28年度も研究計画はおおむね良好に達成できたと言える。
社会行動確立にオキシトシン/オキシトシン受容体システムが果たす役割の解析

オキシトシン(OXT)は脳下垂体後葉性ペプチドホルモンであり、その受容体であるオキシトシン受容体(OXTR)は、脳を中心に発現するGタンパク質共役型受容体である。最近の研究によってOXT/OXTRは社会行動、情動行動などの脳高次機能に関わることが報告され、従来考えられていた以上に興味深い機能を持つことが明らかとなってきた。我々はOXTおよびOXTR遺伝子欠損マウス(Oxt-/-,Oxtr-/-)の作製を世界に先駆けて成功した。研究代表者らの解析からOxtr-/-は攻撃行動異常、母性行動異常、社会記憶の低下、仔マウスにおける活動量の増大、超音波発声の発声頻度の低下が観察された。この研究成果(Takayanagi, Y. Yoshida, M., et. al., PNAS. 102)はPNAS officeからPress発表され、国内外に報道された。研究代表者はOXT/OXTRと社会行動、情動行動との関連についてより詳細な解析を行うため、Oxtr遺伝子に蛍光タンパク質であるVenusのcDNAをknock-inすることにより、OXTR発現細胞でVenusを発現するOxtr-Venus knock-inマウスを作製した。このマウスを用いた解析から縫線核のセロトニンニューロンの約50%がOXTR発現細胞である事を見出した。また縫線核にOXTを局所投与するとセロトニンの放出が促進され、室傍核、分界条床核のOXTニューロンが縫線核に投射している事も明らかとなった。OXTを脳室内に投与すると不安行動が抑制され、この効果はセロトニン2A/2C受容体のアンタゴニストによってブロックされた事から、OXT-セロトニン経路の生理的な機能を明らかとした。オキシトシン(OXT)は脳下垂体後葉性ペプチドホルモンで、その受容体であるオキシトシン受容体(OXTR)は、脳を中心に発現するGタンパク質共役型受容体である。最近の研究によってOXT/OXTRは社会行動などの脳高次機能に関わることが報告され、従来考えられていた以上に興味深い機能を持つことが明らかになってきた。研究代表者はOxt-/-ならびにOxtr-/-を用いて攻撃行動に着目して解析を行った。Oxt-/-,Oxtr-/-の攻撃性を評価した結果、Oxtr-/-は野生型(Wt)に対して、攻撃性の上昇が確認された。一方で、Oxt-/-の攻撃行動にWtとの差異はなく、リガンドと受容体の遺伝子欠損マウスの表現型が異なるという興味深い結果が得られた。この現象がOXT/OXTRsystemの新たな機能の発見に繋がるものであると考え、詳細な解析を行った。上記の攻撃行動解析で用いたOxt-/-はOxtヘテロ接合体(Oxt+/-)同士の交配から得たマウスであった。そこで、現在までにOXTは母体から胎児へ胎盤を通過するとの報告がなされているなどから、このOxt-/-では胎仔期に母体及び同腹子からのOXTの流入によってOXTRを介したシグナルが伝達され、これがOxtr-/-と異なる表現型を示す原因である事を推測した。そこでOxt-/-同士の交配によりOXTが存在しない母胎環境下に育ったOxt-/-を得て、攻撃行動解析を行った。その結果Oxt-/-ではwtに比して攻撃性の上昇が認められた。これらのことから、胎仔自身のOXTRがリガンド刺激を受けて活性化する事が胎仔期の脳の発達に重要である事が示唆された。またOxtr-/-は攻撃行動異常の他に母性行動異常、社会記憶の低下、仔マウスにおける活動量の増大、超音波発声の発声頻度の低下が観察された。近年、OXT/OXTRsystemと自閉症症状との関連が相次いで報告されている。Oxtr-/-で観察された行動異常は、自閉症で観察される社会行動異常、多動、言語障害と類似した現象ではないかと考えられた(Takayanagi, Y. Yoshida, M. et al., PNAS. 102,16096-101,2005)。この報告はPNAS officeからpress発表され、国内外に報道された。この研究成果(Takayanagi, Y. Yoshida, M. et al., PNAS. 102, 16096)はPNAS officeからpress発表され、国内外に報道された。

研究代表者はOXT/OXTRと社会行動の関連についてより詳細な解析を行うためOxtr遺伝子に蛍光タンパク質であるVenusのcDNAを導入することにより、OXTR発現細胞でVenusを発現するOxtr-Venus knock inマウスを作製した。このマウスを用いた解析から社会行動に重要と考えられる脳内領域を中心に非常に多くの領域でOXTRが発現していることが明らかとなった。この中には現在までに発現が報告されていない領域も含まれていた。現在、OXTR発現神経細胞の特性を調べるために、抑制性神経細胞のマーカーであるGABA、興奮性神経細胞のマーカーであるシナプス小胞型グルタミン酸トランスポーター、カテコラミン神経細胞のマーカーであるTyrosine hydroxylase、Tryptophan hydroxylaseとの免疫組織化学二重染色を行っている。これにより。OXT/OXTRが起こす神経活動について理解できるものと考えている。オキシトシン(OXT)は脳下垂体後葉性ペプチドホルモンであり、その受容体であるオキシトシン受容体(OXTR)は、脳を中心に発現するGタンパク質共役型受容体である。最近の研究によってOXT/OXTRは社会行動、情動行動などの脳高次機能に関わることが報告され、従来考えられていた以上に興味深い機能を持つことが明らかとなってきた。我々はOXTおよびOXTR遺伝子欠損マウス(Oxt-/-,Oxtr-/-)の作製を世界に先駆けて成功した。研究代表者らの解析からOxtr-/-は攻撃行動異常、母性行動異常、社会記憶の低下、仔マウスにおける活動量の増大、超音波発声の発声頻度の低下が観察された。この研究成果(Takayanagi, Y. Yoshida, M., et. al., PNAS. 102)はPNAS officeからPress発表され、国内外に報道された。研究代表者はOXT/OXTRと社会行動、情動行動との関連についてより詳細な解析を行うため、Oxtr遺伝子に蛍光タンパク質であるVenusのcDNAをknock-inすることにより、OXTR発現細胞でVenusを発現するOxtr-Venus knock-inマウスを作製した。このマウスを用いた解析から縫線核のセロトニンニューロンの約50%がOXTR発現細胞である事を見出した。また縫線核にOXTを局所投与するとセロトニンの放出が促進され、室傍核、分界条床核のOXTニューロンが縫線核に投射している事も明らかとなった。OXTを脳室内に投与すると不安行動が抑制され、この効果はセロトニン2A/2C受容体のアンタゴニストによってブロックされた事から、OXT-セロトニン経路の生理的な機能を明らかとした。
複数機能モジュールによる物体の視覚表現メカニズムの解明

微小針電極や光ファイバーを間に貫通させることが可能なメッシュ状の皮質脳波計測法(ECoG)用電極を東京大学工学部と共同で開発した。ECoG用電極の間に微小電極を複数貫通させてサルの下側頭葉に埋め込み、注視課題中の視覚応答の同時計測を行った。それぞれの記録を用いてデコーディング解析を試み、顔情報(視覚刺激が顔画像であるか否か)から、顔の視角度(正面顔であるか左右側面であるか)や動物種(サルであるかヒトであるか)などの比較的細かな情報まで、ほぼ同程度成績で読み出すことができた。ECoG電極で微小電極アレイと同等の視覚情報が読み出せること、また大脳皮質の機能を損なわずECoG電極の隙間よりを複数の微小プローブが刺入可能なことが確認された。大脳皮質において光遺伝学的手法を用いた多点刺激系と多点電気生理学的記録系の組み合わせへの応用に有意義な成果を得た。マカクザル下側頭葉に多電極アレイを埋めこみ、顔以外の物体にはほとんど応答せず、顔には強く応答するいわゆる"顔エリア"の一つより記録を行った。この領野は、顔のある部分により選択的に応答したが、顔の部分のみで視覚提示した場合よりも、顔の全体画像として提示した時により強く応答した。また、個体や見る角度によってカラム活動パターンは微妙に異なり、これらの応答パターンは個体情報や角度情報で優位にカテゴリー化することが可能であった(2009年日本神経科学会にて発表)。このような領域で当課題の計画を実施することで、動物が画像を視覚的に同一カテゴリーと見なすメカニズムに迫れると期待できる。マカクザルにてウイルスベクターの導入実験を行い、ある種のアデノ随伴ウイルスをマカクザルの神経細胞に特異的に発現することに成功した(未発表)。このウイルスベクターを用いて、光を感受して細胞膜電位を選択的に変化させるチャネルロドプシンを導入することで、光刺激によって狙った部分の神経興奮あるいは抑制を起こすことが可能となる。電気的な刺激では、神経興奮と神経抑制がある程度混在しだ汚い"刺激になることが知られているが、当課題においてカラム選択的な刺激を行う部分をチャネルロドプシンを使う光刺激の系に置き換えることで、よりクリーンな実験結果を得られると期待できる。申請者は今年度より新しい研究室に移動したが、マカクザルが視覚行動課題を行う実験系と多電極記録を行う実験系を組み立て、2頭の動物に注視課題を行わせている。うち1頭の動物では下側頭葉より多電極記録を行い、視覚刺激に対する視覚皮質の応答パターンを記録した。高次視覚野である下側頭葉に多電極アレイを埋め込んだマカクザルから、埋め込み後最大3ヶ月間に渡って神経細胞の視覚応答を記録し、記録の長期安定性を確認した。また弁別課題の前段階として、画像および画像の一部をマスクした視覚刺激を提示した際の神経活動の記録も行った。代表者が課題採択後に移った研究室では、微小電気刺激よりも高時間・空間分解能で神経細胞の膜電位を操作できる、チャネルロドプシンによる光刺激の実験系の導入を進めている。本研究もこの光刺激系による実施を目指し、刺激/記録系を大幅に変更した。この系では刺激インターフェースを微小針電極から光ファイバーに変更する必要があるが、皮質活動の電気生理学的記録手段が無くなってしまうので、代替手段として光ファイバーを間に貫通させることが可能なメッシュ状の皮質脳波計測法(ECoG)用電極を東京大学工学部と共同で開発した。このECoG用電極と微小電極アレイと同等の視覚情報が読み出せることを確認するため、両タイプの電極をサルの下側頭葉に埋め込み、注視課題中の視覚応答の同時計測を行った。それぞれの記録を用いてデコーディング解析を試み、顔情報(視覚刺激が顔画像であるか否か)から、顔の視角度(正面顔であるか左右側面であるか)や動物種(サルであるかヒトであるか)などの比較的細かな情報まで、両方の記録法からほぼ同程度に読み出すことができた。これによって新しい刺激/記録系の有効性を確かめることが出来た。この成果は日本生理学会(誌上開催)にて発表済みで、現在雑誌投稿の準備を進めているところである。
DNase I及びDNase IIのアポトーシスへの関与機構の解析

アポトーシス過程におけるクロマチンDNA断片化の機構解明は現代生物学の大きな研究課題となっている。これに関与すると想定されるエンドヌクレアーゼとしてDNase IおよびDNase IIがあるが、これらがアポトーシスに果たす役割に関する実験的根拠はほとんど皆無である。本研究ではDNase IおよびDNase IIのアポトーシスへの関与機構を解明することを主な目的とした。1.両生類DNase Iは他の脊椎動物酵素と大きく異なる性状を有する。両生類や爬虫類などの冷血動物から鳥類や哺乳類などの温血動物がどのように進化してきたかを明らかにするため、系統学上両生類と鳥類・哺乳類の中間に位置する爬虫類酵素は興味ある研究対象である。爬虫類DNase Iに関する解析結果から、哺乳類酵素の熱安定性は下記の2段階の変異を経て獲得されたと考えられた:(1)両生類から爬虫類への進化に伴う両生類酵素におけるSer205の欠失、(2)爬虫類から鳥類への進化に伴う爬虫類酵素におけるIle130のLeuへの置換。2.胸痛発作直後に来院した急性心筋梗塞患者群と狭心症や不安定狭心症などの非心筋梗塞患者群について、その血中DNase I活性の経時的変動を精査した。狭心症および不安定狭心症患者群の血中DNase I活性は正常値内であり、経時的変動も認められなかった。心筋梗塞患者群においては、約9割の症例で胸痛発作直後に血中DNase I活性が上昇し、2ないし3時間後に最大値となり、その後活性は減少し、およそ12時間以内に正常値に復帰した。従って、血中DNase I活性は心筋発作直後に一過性の上昇を示すことが明らかとなった。他方、これまで心筋梗塞の診断に使用されてきたtroponin Tは発症直後には顕著な濃度の上昇を示さないことから、血中DNase I活性値上昇は急性心筋梗塞の超早期診断マーカーになりうると考えられた。アポトーシスにおいて観察されるクロマチンDNA断片化の分子機構解明は現代生物学の大きな研究課題となっている。この断片化に関与すると想定されるエンドヌクレアーゼの一つとしてDNase IおよびDNase IIが注目されてきた。本研究では、DNase IおよびDNase IIのアポトーシスへの関与機構を分子レベルで解明することを主な目的とした。本年度は、発生過程におけるアポトーシスへのDNase Iの関与機構について精査するため、ツメガエルDNase Iに関する解析を行った。ツメガエル膵臓から精製したDNase Iは分子量36kD、等電点4.0を示し、これまでに精製された脊椎動物酵素に比べ若干大きな分子量を有した。また、酵素活性は2価金属イオン要求性であったが、最適pHは7-8であり、他に比して若干アルカリ側にシフトしていた。そこで、このような生化学的性状の相違を分子レベルで解明するため、ツメガエルDNase I cDNAのクローニングを行った。cDNAの全長は1200bpであり、1053bpのopenreading frameには19アミノ酸残基のsignal peptideおよび331アミノ酸残基のmature enzyme部分がコードされていた。これまでに報告されているすべての脊椎動物DNase Iは258-262アミノ酸残基から構成されているが、ツメガエルDNase IのC末端にはCys-richな70アミノ酸残基の延長領域が見られた。さらにツメガエルDNase Iには他の脊椎動物DNase Iにおける204と205残基の間に新たにSer残基が挿入され、これによって構造の不安定性が惹起されていた。

上記のようにツメガエルDNase Iは他の脊椎動物DNase Iとは構造上にも大きな相違が認められ、分子進化においてツメガエルは脊椎動物DNase Iに対して特異な位置にあるものと考えられた。現在、他の無尾ならびに有尾両生類由来のDNase Iについて解析を継続している。アポトーシスにおいて観察されるクロマチンDNA断片化の分子機構解明は現代生物学の大きな研究課題となっている。この断片化に関与すると想定されるエンドヌクレアーゼの一つとしてDNase IおよびDNase IIが注目されてきた。本研究ではDNase IおよびDNase IIのアポトーシスへの関与機構を分子レベルで解明することを主な目的とする。本年度は、DNase Iについて以下に記載する新たな2つの知見を得た。1.アポトーシスとDNase Iの関係を解明するために、簡便な抗DNase I特異抗体の樹立に着手した。DNase I cDNAを組込んだ哺乳類細胞発現ベクターを遺伝子導入したCOS-7細胞から発現・分泌されたDNase Iを含有する培養上清について、3段階のカラムクロマトグラフィーを用いてDNase Iを単離・精製する方法を確立した。得られた酵素標品を免疫して調製した抗DNase I特異抗体は、生体試料から調製した酵素を免疫したそれと比較して免疫学的に遜色ないものであった。従って、哺乳類細胞を用いたDNase I発現系および培養上清からの酵素の精製法は抗DNase I特異抗体作製のための有用な免疫源調製法であることが判明した。2.今回、血液や体液などの生体試料中のDNase I含量の生理的変動を精査した。ソマトスタチンは多くの内分泌・外分泌器官における分泌を抑制する生理的因子である。ソマトスタチンを投与したラットでは消化管におけるDNase I遺伝子発現レベルが抑制され、それに伴い血中のDNase I活性レベルの減少が惹起された。従って、ソマトスタチンは血中DNase I活性の変動を起こす生理的因子として初めて見出されたものである。アポトーシス過程の一つであるクロマチンDNA断片化の分子機構解明は現代生物学の大きな研究課題となっている。この断片化に関与すると想定されるエンドヌクレアーゼの一つとしてDNase IおよびDNase IIが注目されてきたが、これらDNaseがアポトーシスに果たす役割に関する実験的根拠はほとんど皆無である。そこで本研究ではDNase IおよびDNase IIのアポトーシスへの関与機構を分子レベルで解明することを主な目的とした。1.DNase IIは精液をはじめヒト体液に広く分布する遺伝的多型形質であるが、その多型解析に利用される特異性の高い抗体がこれまで作られていない。今回、新規な抗体スクリーニング法を利用してDNase IIに対するマウスモノクローナル抗体の作製に成功した。得られた抗体は電気泳動後の免疫ブロット法によってDNase IIを高感度に検出できた。さらに、本モノクローナル抗体を使用したイムノアフィニティー法による簡便なDNase II精製法を確立した。従って、今回得られた抗DNas IIモノクローナル抗体がDNase II蛋白質多型検出に応用できることが明らかとなった。
新定量法で明らかにする生後発達に伴うラット顔面神経細胞死

哺乳動物の中枢神経系では発生初期で過剰に生産された神経細胞がプログラム細胞死を来すため、生後発達過程において神経細胞数は減少することが一般に知られているが、その経時的な変化の詳細や神経系の機能発達との関連は未だ明快に解明されていない。そこで、本研究では脳組織薄切切片内における神経細胞核の形状に着目した新定量法を確立し、それを用いて支配筋の運動機能発現時期が異なるラットの顔面運動神経細胞数を経時的に定量し、生後発達に伴うプログラム神経細胞死に起因する経時的な細胞数減少を明らかにした。その定量結果とそれぞれの顔面筋の運動機能発現時期から、顔面筋の運動機能発現以前に比べてそれ以降では明らかに顔面神経細胞数の減少率が低下していることが判明した。このことから、プログラム神経細胞死に起因する顔面神経細胞数の減少は、顔面筋の運動機能の発現と密接に関連していることが明らかになった。また、今回利用した新定量法は高い正確性を有することが確認されたため、今後の細胞数定量におけるStandardとなることが期待される。
UーTーSn_3(T:Ru,Rh,Ir)系化合物の探索と輸送測定による評価

我々はこれまでRERuSN_3(RE:軽希土類)について結晶育成と物性測定を行ってきており、CeRuSn_3で高濃度近藤的振舞い、SmRuSn_3で価数揺動的振舞いを見いだした。この物質系はRE間距離が4.8オングストロ-ムと大きく、REサイトをUで置換した系も興味深い。U_3Rh_4Sn_<13>とU_3Ru_4Sn_<13>の育成に成功した。U_3Rh_4Sn_<13>の電気抵抗は降温と共に対数的に増加し飽和傾向を見せた後、17Kで再び急な増加を示す。1.5K迄抵抗減少は観測されない。帯磁率は高温でキュリ-ワイス則に従うが、17Kに急激な増加が観測される。何等かの磁気オ-ダ-が起きていることを示している。低温での電子比熱係数は260mJ/mol.K^2であり、かなりの質量増加がある。U_3Ru_4Sn_<13>の帯磁率も、高温でキュリ-ワイス則にのり、1.8Kまで磁気オ-ダ-を示さないが、低温でかなり大きな値を持つ。電気抵抗の温度依存は、U_3Rh_4Sn_<13>と異なり、低温から100Kにかけて急激な増加を示し、スピンフラクチュエ-ション散乱を示唆する。Snを含む3元系を調べるにあたり、UーSn系の金属間化合物の物性を知ることは基本的な問題であるが、USn_3以外の化合物については全く知られていない。そこで、U_3Sn_5及びU_3Sn_2の育成と物性測定を行った。U_3Sn_5については残留抵抗μΩcmの良質の試料がつくられた。低温で強磁性であるが、50K100Kに複雑な磁性を示す。抵抗は温度低下と共に増加して、70Kで急激な曲がりを示した後、低温でマグノン散乱によると思われる。T^2依存を示す。U_3Sn_2は50Kで強磁性転移を示し、SQUID磁束計による磁化の垂直成分が5.5Tでもかなり大きいことは、異方的な強磁性体と考えられる。更に、Ce系との比較を行うため、多種のU化合物で熱電能の測定が行われ、いくつかの特徴ある振舞いが捉えられた。T^2依存を示す。
看護実践における指圧マッサージ技法の適用基準に関する研究

本研究は、看護職者が指圧マッサージ技法を看護臨床場面で実践する際に、より的確に適用するための判断基準を作成し、事例によって検証することを目的としている。平成12年度は、指圧マッサージ技法の研修を修了した看護師を対象に、臨床で実践した体験と効果を調査した。回答者の9割以上が、「リラクゼーションの促進」や「コミュニケーションの円滑化」などに効果があると答えた。しかし、今後の課題は、「看護スタッフの技法の修得」や「技法の習熟度」であった。また、4割が「効果が現れるまで期間」や「治療方針」は支障にならないと答えた。平成13年度は、指圧マッサージ技法の適用基準マニュアルと、視聴覚媒体としてのVTRを作成した。適用基準マニュアルは、臨床場面で技法を活用している看護師ならびに研究協力者の意見を参考にして、研究分担者が検討を重ねた。指圧マッサージ技法の適用基準は、7つの看護場面別に目的、摘用条件、患者への説明事項、技法、効果など11項目で構成した。VTRは研修修了生を対象に、基本的な手技を解説した。適用基準の明確化により、評価が容易になった。そのため、今後は看護師が臨床場面で指圧マッサージ技法を応用した臨床事例を増やし、指圧マッサージ技法の適用基準マニュアルの妥当性を継続して検討する。本研究は、看護職者が生活援助技術を実施する際に指圧やマッサージの技法を的確に適用するための判断基準を作成し、臨床事例によって検証することを目的としている。今年度は基本的な指圧マッサージ技法について研修を受けた2165歳の看護職者30人を対象に、臨床場面での実践の基準や実践事例について調査した。臨床場面の実践に関する質問紙調査では、指圧マッサージ技法による効果は、「リラクセーションの促進」、「コミュニケーションの円滑化」、「安楽」、「生活の質を低下させる症状の緩和」、「家族による援助の参加」、「生活援助技術の効果の増大」に対して9割以上があると回答した。その他に、「的確なタッチング」、「精神的な援助」、「時間が調整可能」、「対象者に即した実施方法の選択」、「症状の予防」に関して68割が肯定的に評価した。また、指圧マッサージ技法の実践により、慢性疾患患者のリラクセーション、ターミナル期にあるがん患者の排泄援助、意識障害と半身麻痺のある患者への他動運動実施、下肢浮腫が著名な妊婦の排尿援助、切迫早産を治療する妊婦の排便援助などの事例で効果があらわれる傾向にあった。さらに、実践に伴う課題として「看護スタッフの技法の修得」、「技法の習熟度」、「効果の不確実性」などが指摘された。なお、「効果発現までの期間」、「治療方針との相違」、「患者の拒否」については実施の妨げにならないとする回答者は約4割であった。なお、この結果および先行研究に基づき指圧マッサージ技法の適用基準マニュアル案、その視聴覚媒体となるVTRを作成途中にある。今後はこれらの成果をもとに、臨床調査をかさねて事例を分析し、指圧マッサージ技法の看護援助場面での効果的な実践について検討したい。本研究は、看護職者が生活援助技術を実施する際に指圧やマッサージの技法を的確に適用するための判断基準を作成し、臨床事例によって検証していくことを目的としている。今年度は前年度の研究実績に基づき指圧マッサージ技法の適用基準マニュアル案、その視聴覚媒体となるVTRを作成した。作成に当たっては、研究分担者間での意見交換の他に、第三者ならびに研究協力者の意見を取り入れて検討し、改正を重ねた。第三者とは指圧やマッサージ技法の看護臨床場面での活用に関する研修を受けた後に、指圧やマッサージの技法を臨床場面で活用している看護職者である。研究協力者は鍼灸指圧マッサージ師および看護師でもあり、専門的知識を有している。指圧マッサージ技法の適用基準マニュアル案は、先行調査の実績に基づいて7つ?の看護場面別に基に実践方法について詳述した。

実践方法は目的・効果、摘要条件、患者への説明事項、技法(所要時間、頻度、手技、体位や患者-看護師のポジショニング)、使用する物品、手順、禁止事項、患者に及ぼす効果、セルフケア指導のポイント、看護者の負担や効果の11項目で構成した。指圧マッサージ技法の適用基準マニュアルの視聴覚媒体としてのVTRでは、マニュアルにおける技法について視覚的に解説し、既に研修を受講し、基本的知識と技術を習得している看護師を対象とした内容に設定している。このように、適用方法の基準を明確にしたことによって、臨床場面での調査の分析が簡素化され的確になっている。調査対象者数は少ない状況ではあるが、指圧マッサージ技法が看護援助場面で効果的に実践できる示唆が得られている。
犬の気質に関する行動遺伝学的研究

本研究で得られた成果の概要は以下の通りである。2.多型部位の同定;上記12遺伝子に加えて既知の興奮性アミノ酸transporters(GLAST,EAAT,GLT1)遺伝子において多型を探索したところ,9遺伝子27ヵ所の多型部位を同定した。3.犬の遺伝子バンク作出;多型出現頻度の犬種差および気質との関連を検索する目的で,行動特性の異なる5犬種(ゴールデンリトリバー,ラブラドールレトリバー,マルチーズ,ミニチュアシュナウザー,シバ)について,11カ所の動物病院の協力を得て血液サンプル(計253サンプル)の収集と行動特性調査アンケートを実施した。4.各種多型出現頻度の犬種差解析;現在までに解析が終了している5遺伝子の15多型のうち14多型については全て犬種差が存在することが明らかとなった。5.各種多型と気質の関連解析;我々が同定した多型に既報の3遺伝子5多型について解析したところ,DBH遺伝子のC789A多型と"遊び好き"や5HTR1B遺伝子のG246A多型と"犬に対する攻撃性"などいくつかの遺伝子多型については気質との関連が示唆された。本年度はまず,カリフォルニア盲導犬協会にて育成,訓練された盲導犬候補個体からの血液採材と気質評価のための行動観察シートの収集を行った。対象動物は,ラブラドールレトリバーが128頭,ゴールデンレトリバーが19頭,両交雑種が20頭,ジャーマンシェパードが22頭であり,そのうち82頭が盲導犬最終審査に合格し,74頭が不合格,33頭が医学的疾患により不適格とされた。これらの動物の訓練時行動観察より,攻撃性と不安傾向を抽出・数値化して評価したところ,盲導犬最終審査の過程では攻撃性が重要視されていることが明らかとなった。続いて東京大学ベテリナリーメディカルセンターより供与されたイヌの扁桃体よりTotal RNAを抽出してcDNAを作製し,それを鋳型として候補遺伝子のクローニングを行った。現時点にてヒトで気質や精神疾患と遺伝子多型が報告されている候補遺伝子のうち,モノアミンオキシダーゼA, B,セロトニントランスポーター,セロトニン1B受容体,2C受容体,ドパミントランスポーター,ドパミンD2受容体,D3受容体,トリプトファンヒドロキシラーゼ,カテコール-0-メチルトランスフェラーゼ,チロシンヒドロキシラーゼなどの遺伝子断片のクローニングに成功した。また,各候補遺伝子の多型を検索する目的で,行動学的に気質が評価されている7犬種(ゴールデンレトリバー,ラブラドールレトリバー,ウエストハイランドホワイトテリア,ミニチュアシュナウザー,マルチーズ,柴犬,秋田犬)について開業獣医師の協力を得て血液を入手し,白血球よりゲノムDNAを抽出することで各犬種50頭を目標としてイヌ遺伝子バンクの作製を試みた。候補遺伝子のクローニングおよびイヌ遺伝子バンクの作製は現在も継続中である。本年度は昨年度に引き続き、イヌ遺伝子バンクの作製およびヒトで気質や精神疾患と遺伝子多型の関連が報告されている侯補遺伝子における多型の検出を試みた。遺伝子バンクは、7犬種(ゴールデンレトリバー94頭、ラブラドールレトリバー70頭、ウェストハイランドホワイトテリア16頭、ミニチュアシュナウザー32頭、マルチーズ59頭、柴犬63頭、秋田犬9頭)から成り、その大部分の飼い主には各自のイヌにおける行動特性に関するアンケートについて回答してもらった。アンケート結果について解析を進めたところ、ほぼ全ての項目について犬種差が認められ、このアンケート結果が各犬種の行動特性を示している可能性が示された。多型の検出については、東京大学ベテリナリーメディカルセンターより供与された10個体のビーグル犬の扁桃体より作製されたcDNAよりスクリーニングを行い、すでにクローニングが完了しているモノアミンオキシダーゼAおよびB(MAOA、MAOB)、セロトニントランスポーター(5HTT)、セロトニン1B受容体および2C受容体(5HT1B、5HTR2C)、ドパミンD2受容体およびD3受容体(DRD2、DRD3)、トリプトファンヒドロキシラーゼ(TPH)、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ(CPMT)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)のうち、数種の遺伝子についてExon部位におけるアミノ酸変異を伴う一塩基多型が検出された。現在はさらなる候補遺伝子のクローニングおよび多型検出、遺伝子バンクにおける多型確認とともに行動特性との関係検索を継続している。

本年度は昨年度までに作出した犬の遺伝子バンクを利用し,これまで同定してきた犬の神経伝達物質関連遺伝子多型と行動特性との関係について解析を試みた。その結果,ドパミンD4受容体遺伝子多型と"飼い主に対する愛着"や"飼い主に対する依存傾向"と,セロトニン1B受容体遺伝子多型と"攻撃性",モノアミン酸化酵素B遺伝子多型と"活動性"など,本研究で同定した多型と一部の行動特性が関連する可能性が見い出された。また,研究代表者が当該研究の成果を2003年8月にオーストラリアで開かれた4^<th> International Veterinary Behavioural Meeting(第4回国際獣医動物行動学会)で報告したところ,3^<rd> International Working Dog Breeding Conference(第3回国際使役犬繁殖会議)の代表者であるDr.Burghardtより正式な招聘を受け2003年10月5-8日に開かれた同会議で講演を行った。同会議では,アメリカ国内を筆頭にオーストラリア,ノルウェー,イギリスなどから100名程度の専門家を迎え,盲導犬や探知犬を含めた使役犬の繁殖プログラム,育成プログラム,行動選抜に関わる情報交換が行われた。その中で申請代表者は本研究の重要性を再認識するとともに,1)使役犬先進国のアメリカであっても統一規格の行動テストがまだ開発されていないこと,2)盲導犬としても探知犬としても使用されるラブラドール種において使役犬として要求される行動表現型が両者で大きく異なること、3)アメリカにおける探知犬のうちラブラドールレトリバー種はオーストラリア税関が保有するコロニーが起源となっており,このコロニーでは行動評価が定期的に行われるとともに欧米において高く評価されていること,など今後の研究進展に役立つ情報を得た。