hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周組織におけるCGRP受容体サブタイプとその特異的細胞内情報伝達系の解明

しかし、合成依頼に対して業者側のトラブルから入手に手間取り、予定通りに進行していない状況である。海外共同研究者(Dr.Burns)のunpublished dataによるとCGRP(1-12)が弱いながらアゴニスト活性をもっているとのことから、その見かけの立体構造が類似していると想像されるCGRP(1-12)のN末端とC末端を逆にしたfragmentをまず合成した。また、CGRP(1-8)とCGRP(1-14)の合成を依頼しているが、未入手である。上記のreversed-CGRP(1-12)はERKのリン酸化を一時的に亢進するが、cAMPあるいは細胞内free Ca^<2+>([Ca^<2+>]i)に対しては有意な影響を及ぼさなかった。ちなみに、使用した細胞約10種類のなかでヒト骨肉腫由来MG63細胞がすべてにおいて、CGRPに対する反応性が高いこと、すなわち実験モデルとして最適であることがあらためて確認された。3)non-RIのCGRP-受容体結合実験法の開発RI-CGRPを使用した結合実験は、種々の問題から実行困難な状況である。そこで、CGRPを細胞膜上の結合部位(受容体)に結合させた後、DSSにより化学的に架橋形成させてSDS-PAGEとWesternblottingにより検出する半定量する方法を確立した。また、96-well plateに培養した細胞を固定して、CGRPの結合量を比色定量する方法を開発中である。さらに、本実験用にビオチン化したCGRPの合成を発注し、現在入荷待ちの状況である。これにより、CGRPと比較した新規合成CGRPfragmentsの受容体への親和性が容易に評価できるようになると思われる。遅れていたCGRP fragments(4種類)の作製をひとまず完了し、それらの受容体結合能および細胞内情報伝達系に及ぼす影響について検討した。また、それらのペプチドが細胞増殖に及ぼす影響ならびに歯周組織・細胞でのCGRP受容体サブタイプの発現状況についても検討した。2)生理活性のあるCGRPfragmentsの細胞内情報伝達系に及ぼす影響-骨芽細胞(MG63)においてCGFP_<8-37>には強いantagonistic活性が認められ、CGRP_<1-37>によるcAMP産生などを完全にブロックした。CGRP_<22-37>にも弱いながら同様なantagonistic活性が認められた。また、[Cys(Acm)^<2,7>]-CGRPには中程度のantagonistic活性のみならず弱いagonistic活性があった。3)生理活性のあるCGRP fragmentsの受容体結合能-蛍光色素で標識したCGRP_<1-37>(FL-CGRP)を用いて結合能の測定した。FL-CGRPは濃度依存性に特異的結合を増加させ、それは非標識CGRP_<8-37
細胞脂質の代謝平衡とその病態

アポリポ蛋白質による細胞の反応によるHDL新生機構を中心に、3種類のモデル系が用いて研究が行われた。1)マウス白血病細胞RAW264に於けるアポリポ蛋白質結合部位の研究。Aキナーゼ活性化により結合部位が誘導され、アポリポ蛋白質と反応して細胞脂質からHDLが新生する。この誘導には数時間を要し、各種の蛋白質合成阻害剤による抑制が認められることから、細胞膜上の特定の蛋白質の関与が示唆された。しかし、家族性HDL欠損症における変異蛋白質ABC1の発現には大きな影響が認められなかった。2)ヒト白血病細胞THP-1に於けるHDL新生系に連動した細胞内コレステロール輸送機構の研究。未分化な細胞からはアポリポ蛋白質は燐脂質のみからなるHDLを新生するが、PMA刺激による分化誘導によりHDLはコレステロールに富んだものとなる。この時ABC1とcaveolin-1が誘導されるが、caveolin-1のantisense DNAによりHDLへのコレステロール積み込みは選択的に抑制される。従って、HDL新生系に連動した細胞内コレステロール輸送にはcaveolin-1が関与している。3)HDL新生系をin vitroで阻害するprobucolをマウスに投与し、この反応の生理的意義を検討した。マウスのHDLはprobucolにより迅速かつ著名に低下するが、ABC1を始めとするその代謝に関わる蛋白質の発現には殆ど影響がなくなるクリアランスにも差は認められなかった。腹腔マクロファージからのアポリポ蛋白質によるHDL新生反応はprobucloにより著名に低下し、この反応がマウス血漿HDLの主要な生成源であることが示された。本年度はアルバータ大学医学部と名古屋市立大学医学部の間の共同研究の初年度に当たる。まず5月に研究代表者(横山)がアルバータ大学を訪問、現地の研究チームの研究会に参加して、具体的共同研究の打ち合わせを行った。それに基づき研究体制が発足し、3人のカナダ側共同研究者が来日した。さらにその結果、名古屋市立大学から堂前がアルバータ大学に派遣され、共同実験を実施した。9月に来日したフランシス助教授とは主として細胞コレステロールの代謝平衡とコレステリルエステル転送蛋白質(CETP)の臨床的研究について検討し、アルバータ大学で進行している虚血性心疾患治療の臨床試験に名古屋市立大学が開発したCETP測定組み込むことが決まった。また10月にはバンス教授の来日により、細胞コレステロール搬出反応と燐脂質代謝の関連について新しい研究の方向が定まり、これに基づいて名古屋市大の堂前講師が23月アルバータ大学に滞在し、反応の細胞燐脂質の合成制御に関わる実験を行った。1月に来日したアジェロン助教授とはコレステロールの胆汁酸への転換と血漿リポ蛋白質代謝に関する研究課題について話し合い、横山との共同論文の執筆が決まった。本年度の成果はこのように具体的であり、2年目以後の研究の発展が見込まれる。

従って、HDL新生系に連動した細胞内コレステロール輸送にはcaveolin-1が関与している。3)HDL新生系をin vitroで阻害するprobucolをマウスに投与し、この反応の生理的意義を検討した。マウスのHDLはprobucolにより迅速かつ著明に低下するが、ABC1を始めとするその代謝に関わる蛋白質の発現には殆ど影響がなくクリアランスにも差は認められなかった。腹腔マクロファージからのアポリポ蛋白質によるHDL新生反応はprobucolにより著明に低下し、この反応がマウス血漿HDLの主要な生成源であることが示された。
バイオリアクターによる有用物質の生産とその制御

遺伝子操作菌を用いたペプチドホルモン,リンフォカイン等の生産が世界的に注目されている.これらの有用物質を連続的にかつ効率的に生産するためには,バイオリアクターによる遺伝子操作菌培養の連続モニタリングならびに目的生産物のオンライン計測が必要不可欠である.そこで本研究では研究代表者のもとで開発されたバイオセンサーをバイオリアクターによる遺伝操作菌を用いた有用物質生産のオンラインモニタリングに適用し,高度にコントロールされたバイオリアクターシステムを構築し効率的なバイオプロセスを設計することを目的とした.まずフィヒター教授のもとでコンピューターで制御された最新のバイオリアクターを用いて酵母の培養とそのモニタリングを試みた.酵母はタンパク質を細胞外に分泌できることから,遺伝子組換え技術を用いた外来性ペプチド生産を行う際の最も注目されている宿主である.本リアクターはコンピューターにより通気量,温度,撹拌連度が制御されており,また各種センサーにより溶存酸素,pH,溶存二酸化炭素,気相中の酸素,二酸化炭素濃度が連続モニタリングできる.特にエタノールは質量分析機を用いて連続的に測定できる.しかし酵母の培養過程で最も重要視されているグルコース濃度はバイオセンサーを用いない限り測定できないことがわかった.また質量分析機によりエタノール測定は大変複雑で高価であるため,簡易でしかも安価なバイオセンサーによる測定の方がすぐれていることがわかった.また,組み換え菌培養においてはリアクター内の菌体量は重要な因子であり,これを測定するセンサーも開発が急務であることが明らかとなった.一方,東工大において開発されたグルコース測定用のバイオセンサーをバイオリアクターのモニタリングに用いるためには,無菌サンプリングシステム,自動校正機能,自動希釈機能が本センサーに必要であることがわかった.特に,無菌サンプリングシステムではセラミックフィルターを用いることが有効であると考えられた.さらにリンフォカイン測定のためのバイオセンサーシステムの開発も行った.本年度は,インターロイキンII(ILII)測定用センサーに用いるILIIレセプターの定量をバイオイメージセンサーを用いて行えることを確認した.今後,定量化されたILIIレセプターを用いるILII測定用バイオイメージセンサーが開発できることがわかった.遺伝子操作菌を用いたペプチドホルモン,リンフォカイン等の生産が世界的に注目されている.これらの有用物質を連続的にかつ効率的に生産するためには,バイオリアクターによる遺伝子操作菌培養の連続モニタリングならびに目的生産物のオンライン計測が必要不可欠である.そこで本研究では研究代表者のもとで開発されたバイオセンサーをバイオリアクターによる遺伝操作菌を用いた有用物質生産のオンラインモニタリングに適用し,高度にコントロールされたバイオリアクターシステムを構築し効率的なバイオプロセスを設計することを目的とした.まずフィヒター教授のもとでコンピューターで制御された最新のバイオリアクターを用いて酵母の培養とそのモニタリングを試みた.酵母はタンパク質を細胞外に分泌できることから,遺伝子組換え技術を用いた外来性ペプチド生産を行う際の最も注目されている宿主である.本リアクターはコンピューターにより通気量,温度,撹拌連度が制御されており,また各種センサーにより溶存酸素,pH,溶存二酸化炭素,気相中の酸素,二酸化炭素濃度が連続モニタリングできる.特にエタノールは質量分析機を用いて連続的に測定できる.しかし酵母の培養過程で最も重要視されているグルコース濃度はバイオセンサーを用いない限り測定できないことがわかった.また質量分析機によりエタノール測定は大変複雑で高価であるため,簡易でしかも安価なバイオセンサーによる測定の方がすぐれていることがわかった.また,組み換え菌培養においてはリアクター内の菌体量は重要な因子であり,これを測定するセンサーも開発が急務であることが明らかとなった.一方,東工大において開発されたグルコース測定用のバイオセンサーをバイオリアクターのモニタリングに用いるためには,無菌サンプリングシステム,自動校正機能,自動希釈機能が本センサーに必要であることがわかった.特に,無菌サンプリングシステムではセラミックフィルターを用いることが有効であると考えられた.さらにリンフォカイン測定のためのバイオセンサーシステムの開発も行った.本年度は,インターロイキンII(ILII)測定用センサーに用いるILIIレセプターの定量をバイオイメージセンサーを用いて行えることを確認した.今後,定量化されたILIIレセプターを用いるILII測定用バイオイメージセンサーが開発できることがわかった.
バクテリアマイクロコンパートメントを用いた自己組織化タンパク質構造体の創製

大腸菌由来エタノールアミン代謝マイクロコンパートメント(Eut-BMC)を構成する5つのシェルタンパク質を大腸菌で発現し、BMC様の構造体の形成を確認した。好熱性シアノバクテリア由来カルボキシソームのシェルタンパク質の発現、結晶構造解析、相互作用解析を行った。Rhodococcous erythropolis N771由来のEncapsulinと呼ばれるナノコンパートメントの発現と精製に成功した。Encapsulinは単一のシェルタンパク質で構成される内部が空洞のナノ構造体である。新規Encapsulinを獲得するためにRhodococcus erythropolis N771株由来Encapsulinを大腸菌内で発現させ、透過型電子顕微鏡(TEM)観察での構造観察と分子量の測定を行った。既知のEncapsulinのアミノ酸配列からプライマーを設計し、R. erythropolis N771株のゲノムを鋳型にしてPCRを行った。得られた遺伝子をpET-23bベクターに導入し、大腸菌で大量発現させた。精製したタンパク質をTEMで観察した結果、直径約20 nmの内腔を有する球状粒子が観察され、既知のEncapsulinの構造に類似していた。さらに、精製したタンパク質の分子量を測定したところ、FFF-MALSでは約1.8 MDa、沈殿速度法による超遠心分析では約2.1 MDaと両者で同程度の分子量が算出された。モノマーの分子量が30 kDaであることからN771株由来EncapsulinはT. maritima由来と同様、ホモ60量体を形成することが分かった。以上の結果から、得られたタンパク質は目的のEncapsulinであり、大腸菌内でホモ60量体のナノ構造体の発現に成功した。大腸菌のエタノールアミン代謝マイクロコンパートメント(Eut-BMC)を構成するEut-S,-M,-N,-L,-Kの5つのシェルタンパク質を大腸菌で発現し、EutKに付加したHis-tagを用いてNiキレーティングアフィニティークロマトグラフィーで複合体を精製した。得られた複合体をTEMで観察したところ、1辺が100 nm程度のBMC様の構造体を確認できた。一部の原核生物に存在するバクテリアマイクロコンパートメント(BMC)は、タンパク質のみによって構築された高度に制御されたナノ構造をであり、安定でデザイン性が高く、機能性や自己修復能を有したタンパク質ナノ構造体への応用が期待されている。大腸菌のエタノールアミン代謝マイクロコンパートメント(Eut-BMC)を構成するEut-S,-M,-N,-L,-Kの5つのシェルタンパク質を大腸菌で発現し、EutKに付加したHis-tagを用いてNiキレーティングクロマトグラフィーで複合体を精製した。得られた複合体を透過型電子顕微鏡で観察したところ、1辺が100 nm程度のBMC様の構造体を確認できた。しかし、サブユニットの発現効率が不安定であり、複合体の収率に問題があるため、構造や機能の解析には至っていない。また、Rhodococcus erythropolis N771のゲノムにEncapsulinと呼ばれるナノコンパートメントを形成するタンパク質をコードする遺伝子が存在することを発見し、大腸菌で発現して、Niキレーティングクロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。得られたタンパク質を透過型電子顕微鏡で観察したところ、直径約20 nmの球状粒子を観察することができた。また、フィールドフローフラクショネーション多角度光散乱検出器と沈殿平衡法による超遠心分析による解析を行った結果、分子量1.8 MDa、RMS半径12 nmの粒子であることが確認された。塩基配列から計算した分子量が29 kDaであることから、発現したRhodococcus Encapsulinはホモ60量体でカプセル状の構造を形成していることが示された。BMCを大腸菌で発現、精製できる可能性を示唆する結果を得ることに成功した。また、Encapsulinと呼ばれる新規なナノ構造体の発現、精製に成功した。各サブユニットの発現効率及び精製方法を改良することで、Eut-BMCの発現、精製方法を確立し、機能と特性の解析を行う。また、Rhodococcus Encapsulinについては、表面に様々なペプチド配列をDisplayすることにより、何らかの機能性を有するナノ構造体を構築する。Eut-BMC及びRhodococcus Encapsulinの発現系構築及び変異体作成のための試薬や酵素の購入。40万円種々のナノ構造体の精製のための試薬やクロマトグラフィー用担体の購入。40万円機能解析用試薬の購入20万円成果の発表(学会、論文)30万円
コンクリート構造物の損傷評価解析システムの構築

本研究は,任意の荷重条件・環境条件下において各種作用を受けるコンクリート構造物の性能を定量的に予測可能な解析システムを開発することを目的として行ったものであり、研究期間中に以下の成果を得た.1)塩分による鋼材腐食環境下に置かれた,鉄筋コンクリート構造物の力学性能(曲げ耐力)の経時変化を数値シミュレーションにより予測する手法を構築した.脱塩工法,連続繊維シート接着による曲げ補強による補修補強効果も考慮できる特徴を備えている.2)1)のシステム中の個々のモデルの開発と改良に取り組んだ.主な開発モデルは,曲げひび割れを有するかぶりコンクリートに適用可能な水分移動モデル,鉄筋軸に沿った腐食分布解析法,鉄筋が腐食した鉄筋コンクリート部材の引張剛性モデルである.3)RC構造物の損傷評価解析を多様な条件下で可能とするための解析手法の開発を行った.多様な構造形式への適用を考慮し,RC構造の非線形挙動を終局域まで精度良くできる3次元非線形有限要素解析プログラムの開発を行った.4)ひび割れを生じたコンクリート中の物質移動性を調べるために,割裂引張強度試験とガス透過性試験を組み合わせた「ガス透過による損傷度評価試験装置」を考案した。本装置を用いて,損傷を受けたコンクリートが,どの程度腐食軍子の移動に抵抗できるかを実験的に調べた.コンクリート構造物の損傷評価解析システムにおけるひび割れ発生と物質移動の関係やひび割れの空間的形状の定式化に資する成果を得た.5)多種多様な荷重条件・環境条件下でのRC構造物の損傷評価解析を実現するため,引張もしくは圧縮の繰返し荷重を受けるプレーンクリートの構成則,凍結融解作用を受けたプレーンコンクリートの圧縮構成則および引張軟化構成則,静的および繰返し荷重を受ける連続繊維シートの付着構成則の開発を行った.本研究は,任意の荷重条件・環境条件下において各種作用を受けるコンクリート構造物の性能を定量的に予測可能な解析システムを開発することを目的として行ったものであり、研究期間中に以下の成果を得た.1)塩分による鋼材腐食環境下に置かれた,鉄筋コンクリート構造物の力学性能(曲げ耐力)の経時変化を数値シミュレーションにより予測する手法を構築した.脱塩工法,連続繊維シート接着による曲げ補強による補修補強効果も考慮できる特徴を備えている.2)1)のシステム中の個々のモデルの開発と改良に取り組んだ.主な開発モデルは,曲げひび割れを有するかぶりコンクリートに適用可能な水分移動モデル,鉄筋軸に沿った腐食分布解析法,鉄筋が腐食した鉄筋コンクリート部材の引張剛性モデルである.3)RC構造物の損傷評価解析を多様な条件下で可能とするための解析手法の開発を行った.多様な構造形式への適用を考慮し,RC構造の非線形挙動を終局域まで精度良くできる3次元非線形有限要素解析プログラムの開発を行った.4)ひび割れを生じたコンクリート中の物質移動性を調べるために,割裂引張強度試験とガス透過性試験を組み合わせた「ガス透過による損傷度評価試験装置」を考案した。本装置を用いて,損傷を受けたコンクリートが,どの程度腐食軍子の移動に抵抗できるかを実験的に調べた.コンクリート構造物の損傷評価解析システムにおけるひび割れ発生と物質移動の関係やひび割れの空間的形状の定式化に資する成果を得た.5)多種多様な荷重条件・環境条件下でのRC構造物の損傷評価解析を実現するため,引張もしくは圧縮の繰返し荷重を受けるプレーンクリートの構成則,凍結融解作用を受けたプレーンコンクリートの圧縮構成則および引張軟化構成則,静的および繰返し荷重を受ける連続繊維シートの付着構成則の開発を行った.平成11年度は,研究代表者・分担者ごとに以下の課題に取り組み,成果を挙げた.・塩害による鉄筋コンクリート構造物の力学性能の劣化過程のシミュレーションプログラムの構築とプログラム中の各モデルの改良を行った.連続繊維シートによる補修補強効果(物質遮蔽効果と力学的な補強効果)を考慮できるようにした.・鉄筋コンクリート構造の2次元有限要素法動的解析プログラムの基本フレームの整理および再構築を行った.・地震作用時の終局域まで解析可能な構成モデルの開発を行った.補強材に対しては,座屈挙動を含む鉄筋の構成モデルの開発,コンクリートに対しては,引張・圧縮破壊エネルギーを考慮している構成則の開発に取り組んだ.・コンクリート中の塩化物イオンの拡散係数と固定化量と固定化速度について,電気化学的な手法と従来の浸漬法を併用して,実験的に考察した.・ひび割れを有するコンクリート中の有害物質の移動について研究を開始し,引張ひずみを受けるコンクリートのガス透過性を調べるための透過セルの開発を行なった.・疲労荷重下におけるコンクリートの変形挙動および疲労寿命を予測できる数値解析モデルの構築を行った.蓄積されるエネルギー量と剛性低下および塑性ひずみの変化との関係を実験結果に基づき定量化した.・疲労荷重下における炭素繊維シートの付着応力-すべり関係の定式化を行った.疲労寿命は積層数が多いほど長くなることを明らかにした.次年度は,付着応力-すべり関係に及ぼす凍結融解作用の影響について検討する.平成12年度は,これらの課題に関する研究をさらに推進するとともに,成果の統合化に着手する.塩害,凍害,静的・疲労・繰返し荷重作用を総合的に考慮し,鉄筋コンクリート構造物の力学性能を評価しうる解析システムの開発を目指す.平成12年度は平成11年度に引き続き,研究代表者・分担者ごとに以下の課題に取り組み,成果を挙げた.・鉄筋腐食による鉄筋コンクリート構造物の力学性能の劣化過程のシミュレーションプログラムの構築とプログラム中の各モデルの改良を行った.連続繊維シートによる補修補強効果(物質遮蔽効果と力学的な補強効果)を考慮できるようにした.室内実験により,鉄筋の腐食した鉄筋コンクリート部材の引張剛性を検討し,モデル化を開始した.

・鉄筋コンクリート構造の2次元有限要素法動的解析プログラムの基本フレームの整理および再構築を行った.・疲労荷重下ならびに地震作用時の終局域まで解析可能なコンクリート・補強材(連続繊維シート,鉄筋)の構成モデルの開発を行った.補強材に対しては,座屈挙動を含む鉄筋の構成モデルの開発,コンクリートに対しては,引張・圧縮破壊エネルギーを考慮した構成則の開発に取り組んだ.・コンクリート中の塩化物イオンの拡散係数と固定化量と固定化速度について,電気化学的な手法と従来の浸漬法を併用して,実験的に考察した.・ひび割れを有するコンクリート中の有害物質の移動について研究を開始し,引張ひずみを受けるコンクリートのガス透過性を調べるための透過セルの開発を行なった.また平成12年度には,研究代表者・分担者による打ち合わせを行い,上記の研究成果の統合化の方向を検討した.鉄筋腐食,凍害,疲労など個別の劣化現象を扱うモジュールについては,構造物各部位の材料の損傷の程度を出力し,構造物全体の力学応答を解析するプログラムでそれらを考慮できるように構成則に反映すること,最初は複数の劣化現象の相互作用のない問題を対象とし,徐々に相互作用のある複雑な問題に取り掛かることを決定した.最終年度である平成13年度は,これらを行い,研究の取りまとめ作業に入る.本研究は,任意の荷重条件・環境条件下において各種作用を受けるコンクリート構造物の性能を定量的に予測可能な解析システムを開発することを目的として行ったものであり,研究期間中に以下の成果を得た.1)塩分による鋼材腐食環境下に置かれた,鉄筋コンクリート構造物の力学性能(曲げ耐力)の経時変化を数値シミュレーションにより予測する手法を構築した.脱塩工法,連続繊維シート接着による曲げ補強による補修補強効果も考慮できる特徴を備えている.2)1)のシステム中の個々のモデルの開発と改良に取り組んだ.主な開発モデルは,曲げひび割れを有するかぶりコンクリートに適用可能な水分移動モデル,鉄筋軸に沿った腐食分布解析法,鉄筋が腐食した鉄筋コンクリート部材の引張剛性モデルである.3)RC構造物の損傷評価解析を多様な条件下で可能とするための解析手法の開発を行った.多様な構造形式への適用を考慮し,RC構造の非線形挙動を終局域まで精度良くできる3次元非線形有限要素解析プログラムの開発を行った.4)ひび割れを生じたコンクリート中の物質移動性を調べるために,割裂引張強度試験とガス透過性試験を組み合わせた「ガス透過による損傷度評価試験装置」を考案した.本装置を用いて,損傷を受けたコンクリートが,どの程度腐食因子の移動に抵抗できるかを実験的に調べた.コンクリート構造物の損傷評価解析システムにおける,ひび割れ発生と物質移動の関係やひび割れの空間的形状の定式化に資する成果を得た.
グラム陰性細菌のリポ蛋白質を標的とする化学療法剤の開発

細菌の細胞表層に存在するリポ蛋白質は病原性毒素の菌体外分泌生産、線毛・鞭毛の形成など病原性の発現に関与している。さらに、リポ蛋白質がマクロファージによるインターロイキン産生の誘導物質であることが判明し、免疫学の分野においてもリポ蛋白質に対する関心が高まっている。グラム陰性細菌である大腸菌のリポ蛋白質のなかで機能解析が行われているリポ蛋白質は20にも満たず、大部分は未だに解析されていない。本研究は、大腸菌を用いて、重要な細胞機能や病原性に関与するリポ蛋白質の機能を分子レベルで明らかにし、リポ蛋白質を標的とした新しい化学療法剤の探索、創製をめざすものであり、得られる基礎研究の成果をもとに実戦的スクリーニング系を確立することを目的として行われた。新たに64のリポ蛋白質遺伝子を同定し、再確認した既知のものと合わせて大腸菌には少なくとも90のリポ蛋白質遺伝子が存在することを明らかにした。全リポ蛋白質遺伝子の欠失変異株を構築し、生育、運動性、形態、薬剤感受性などについて解析した。形態異常を示す変異株のほかに、定常期に溶菌する変異株(Δb2512)、低浸透圧下で高温感受性の生育を示す変異株(ΔrlpA,ΔycfM)、運動性を喪失した変異株(ΔnlpC)、薬剤に高感受性になる変異株(Δb2512,ΔycfM)などを新たに得た。また、必須リポ蛋白質遺伝子としてlolB,のほかにb2595を同定した。リポ蛋白質局在化に必須であるLolAとLolBのX線結晶構造解析から、3次構造を決定し、ドラッグデザインの道を開いた。
中枢神経系の神経回路形成におけるセマフォリンの機能解析

嗅覚系において、嗅上皮に存在する嗅細胞は約1000種類存在すると言われている嗅覚受容体の内1種類だけを発現しており、同種の嗅覚受容体を発現する嗅細胞の嗅神経は嗅球に存在する約1800個の糸球体の内わずか2数個の糸球体に正確に投射・収束する。糸球体の空間配置は嗅球における嗅覚系感覚地図(いわゆる「匂い地図」を形成する。しかし、正確な匂い地図形成の分子メカニズムは現在ほとんど分かっていない。セマフォリンは神経軸索ガイダンスにおいて重要で、以前にセマフォリン分子のセマフォリン3A(Sema3A)のノックアウトマウスの解析により、初期発生中の末梢神経系の神経回路形成過程において重要な役割をしていることを明らかにした。しかし、Sema3Aは嗅覚系にも特異的な発現が認められる。現在は、嗅球にSema3Aの発現が認められる、嗅神経にSema3Aレセプターであるニューロピリン-1(NP-1)が発現している、嗅神経はSema3Aにより反発される、という理由等から嗅覚系、特に匂い地図形成におけるSema3Aの機能に注目をして研究を進めている。本研究では、抗OCAM(Zone II-IVに発現)抗体と抗NP-1抗体を匂い地図(糸球体地図)作製における分子マーカーとして使用し、成体Sema3Aノックアウトマウスの匂い地図形成を解析した。ワイルドマウスでは、NP-1を発現している嗅神経は嗅球の内側と外側の2つのバンドとして認められた。しかし、Sema3Aノックアウトマウスにおいてはワイルドマウスで見られたパターンが全く見られず、NP-1陽性の糸球体は嗅球全体に広がっていた。また抗OCAM抗体による匂い地図においても興味深い結果が得られた。ざらにノックアウトマウスの機能解析において、匂いに対する嗅球の反応を見るためにopticalimaging法を用いて神経活動を解析した結果、匂いに対するパターン形成の変化を明らかにした。以上のことより、Sema3Aは嗅球において正確な匂い地図を形成するために必須であることを解明した。
界面活性剤分子の寸法効果と帯電性を利用した過冷度と氷の付着力抑制の制御

アニオン系界面活性剤-純水混合液(以下,混合液)の濃度を臨界ミセル濃度(CMC)に固定して,その混合液を任意の極性の電圧印可することで帯電した銅表面上で完全に凍結させた後,銅表面と生成された氷の界面に水平方向にせん断力を与え,試験板から氷を破壊することなく完全に剥離させた.この時与えたせん断力を測定し,得られた結果を氷の付着力と定義した.なお,銅表面温度は-3°Cとした.同様の実験を銅板への印可電圧を変えながら行った.また,他の研究者の結果との比較を容易にするため,せん断力を氷の付着面積で除したせん断応力で結果を評価した.また,測定結果の妥当性を検討するために,アニオン系界面活性剤が吸着した氷の表面エネルギーを印可電圧を変えながら測定し,せん断応力の測定結果と比較し,以下の結果が得られた.(1)プラスの印可電圧の上昇に従い,せん断応力が次第に増加した.(2)電圧印可をした場合の氷表面の表面エネルギーも,界面活性剤無添加の条件下での氷に比べ増加することが分かった.(3)混合液pHと混合液と接している金属表面の等電点が異なるために界面電位が生じ,印可電圧が0Vでもプラスのせん断応力となった.(4)マイナス電圧を印可した場合,アニオン系界面活性剤を使用したため界面いは界面活性剤分子の疎水基は吸着したため,純水のせん断応力より小さく印可電圧の大きさに係らず,一定のせん断応力であった.また,濃度がCMCの混合液をステンレス容器に入れ,一定冷却速度で混合液を冷却しながら,任意の極性の電圧印可により帯電したステンレス容器内の混合液の過冷度を測定した.印可電圧を変へながら同様の測定を行った結果,プラスの電圧を印可した場合,印可電圧に係らず平均過冷度は純水のそれより大きくなることを明らかにした.本研究室では,これまで様々な金属,ガラスや樹脂におけるせん断応力(氷の付着力)の測定を行い,得られた結果を様々な学術論文に投稿してきた.その経験から,せん断応力の測定や,本研究で得られた結果の評価方法にも精通している.同様に様々な種類の非イオン性の界面活性剤を使用して様々な金属やガラスに対する氷のせん断応力を測定し,得られた結果を,様々な学術論文に投稿してきたので,同様に,得られた結果の評価方法にも精通している.また,これまで純水に非イオン性界面活性剤を添加した場合の過冷度を様々な条件下で測定してきたので,過冷度の測定実験にも精通している.また,せん断応力の結果と同様に様々な学術論文に投稿してきたので,本研究で得られた結果の評価方法にも精通している.今後は,カチオン系性界面-純水混合液を使用した場合の銅板に対するせん断応力(氷の付着力)の測定を銅板への印可電圧や極性を変えながら明らかにしていく.なお,本年度実験を行ったアニオン系界面活性剤-純水混合液から生成された氷の銅表面に対するせん断応力の結果を,2019年度のできるだけ早期に学術論文投稿する.また,アニオン性界面活性剤-純水の混合液の過冷却現象に関しても,印可電圧をマイナスにした場合と0Vの場合についても並行して検討し,今後,学術論文への投稿を目指す.当該年度では,分子径の大きい界面活性剤を母材としてその濃度をCMC(臨界ミセル濃度)とし,分子径の小さい方の濃度をCMCより極めて低い濃度に設定した2種類の非イオン性界面活性剤と水を予め同時混合して過冷度測定実験を行う.同様の実験を一方の界面活性剤濃度を上げながら行う(パターン1).次に,母材界面活性剤(濃度:CMC)-水混合液に母材以外の界面活性剤を低濃度から徐々に濃度を変えながら滴定して過冷度測定実験を行った(パターン2).そして,過冷却は確率現象なので,同一条件で30回の測定を行い,その平均値を平均過冷度として評価した.また,固体面への界面活性剤分子の疎水基の吸着量が過冷度に影響すると考えられるので,QCM(Quartz crystal microbalance)装置を使用して固体面への吸着量を定量的に測定し,平均過冷度との相関を検討した.以上の実験により,以下の結果が得られた.(1)疎水基の寸法が異なる2種類の界面活性剤混合液の平均過冷度の特性は,単一の界面活性剤を使用した場合とまったく異なることを明らかにした.(2)分子サイズの異なる2種類の界面活性剤の使用は,母材界面活性剤のCMCによる制限されることいなく純水より大きい平均過冷度の領域をより高濃度の領域まで広げることができた・(3)母材界面活性剤の分子サイズの大きさの平均過冷度に及ぼす影響は,混合方法の違いより大きいことが分かった.(4)平均過冷度と界面活性剤分子の吸着量の間には強い相関があることが分かった.当初の計画より順調に研究が進展し,分子径の異なる2種類の界面活性剤-水混合液の混合を,当初の計画では,当該年度では研究実績の概要で示したパターン1のみの実験を行う予定であったが,実際にはパターン2の条件でも実験を行い,それぞれの混合方法での平均過冷度の特性を明らかにし,その特性が,固体面への界面活性剤分子の吸着量特性と強い相関を持つことを明らかにすることができた.

アニオン系界面活性剤-純水混合液(以下,混合液)の濃度を臨界ミセル濃度(CMC)に固定して,その混合液を任意の極性の電圧印可することで帯電した銅表面上で完全に凍結させた後,銅表面と生成された氷の界面に水平方向にせん断力を与え,試験板から氷を破壊することなく完全に剥離させた.この時与えたせん断力を測定し,得られた結果を氷の付着力と定義した.なお,銅表面温度は-3°Cとした.同様の実験を銅板への印可電圧を変えながら行った.また,他の研究者の結果との比較を容易にするため,せん断力を氷の付着面積で除したせん断応力で結果を評価した.また,測定結果の妥当性を検討するために,アニオン系界面活性剤が吸着した氷の表面エネルギーを印可電圧を変えながら測定し,せん断応力の測定結果と比較し,以下の結果が得られた.(1)プラスの印可電圧の上昇に従い,せん断応力が次第に増加した.(2)電圧印可をした場合の氷表面の表面エネルギーも,界面活性剤無添加の条件下での氷に比べ増加することが分かった.(3)混合液pHと混合液と接している金属表面の等電点が異なるために界面電位が生じ,印可電圧が0Vでもプラスのせん断応力となった.(4)マイナス電圧を印可した場合,アニオン系界面活性剤を使用したため界面いは界面活性剤分子の疎水基は吸着したため,純水のせん断応力より小さく印可電圧の大きさに係らず,一定のせん断応力であった.また,濃度がCMCの混合液をステンレス容器に入れ,一定冷却速度で混合液を冷却しながら,任意の極性の電圧印可により帯電したステンレス容器内の混合液の過冷度を測定した.印可電圧を変へながら同様の測定を行った結果,プラスの電圧を印可した場合,印可電圧に係らず平均過冷度は純水のそれより大きくなることを明らかにした.本研究室では,これまで様々な金属,ガラスや樹脂におけるせん断応力(氷の付着力)の測定を行い,得られた結果を様々な学術論文に投稿してきた.その経験から,せん断応力の測定や,本研究で得られた結果の評価方法にも精通している.同様に様々な種類の非イオン性の界面活性剤を使用して様々な金属やガラスに対する氷のせん断応力を測定し,得られた結果を,様々な学術論文に投稿してきたので,同様に,得られた結果の評価方法にも精通している.また,これまで純水に非イオン性界面活性剤を添加した場合の過冷度を様々な条件下で測定してきたので,過冷度の測定実験にも精通している.また,せん断応力の結果と同様に様々な学術論文に投稿してきたので,本研究で得られた結果の評価方法にも精通している.H30年度は,パターン1及び2の条件下で,様々な金属表面での氷の付着力に対する界面活性剤の影響を明らかにする.今後は,カチオン系性界面-純水混合液を使用した場合の銅板に対するせん断応力(氷の付着力)の測定を銅板への印可電圧や極性を変えながら明らかにしていく.なお,本年度実験を行ったアニオン系界面活性剤-純水混合液から生成された氷の銅表面に対するせん断応力の結果を,2019年度のできるだけ早期に学術論文投稿する.また,アニオン性界面活性剤-純水の混合液の過冷却現象に関しても,印可電圧をマイナスにした場合と0Vの場合についても並行して検討し,今後,学術論文への投稿を目指す.納期の関係で注文すべき消耗品が注文できなったので,次年度に当該消耗品を注文する.納期の関係で注文すべき消耗品が注文できなったので,次年度に当該消耗品を注文する.
国定読本の用語の研究

1.第3期第6期の国定読本の用例つき用語索引データの整備第3期分については、国定読本の原文データとOCRシートを読みとって作成した単位切りデータとをマッチさせて、原文データに単位切りを加えた。単位切りの問題個所を修正したのち、JISコード順排列の用例つき用語索引(KWIC)を作成した。第4期第6期分については、磁気テープにおさめた原文データと単位切り作業の修正を行った。2.第1期・第2期国定読本の用語の分析第1期国定読本の用語については、注目すべき用語の分析を行い、以下の各種語彙表を作成した。【◯!1】使用度数順語彙表【◯!2】品詞別語彙表【◯!3】意味分類語彙表【◯!4】漢字用法一覧表これらの成果は、報告書「国定読本第1期『尋常小学読本』の用語」に収めた。第2期国定読本の用語については、意味による分類作業、意味の分析を行った。
銅精鉱粒子のガス流中における酸化・溶融反応の速度論的研究

銅自溶炉シヤフト部における反応の解析のための基礎データを得るため、まず銅精鉱粒子の着火現象が起る以前の低温度域における酸化反応速度について検討した。平均粒子径72μmの粒子約10mgをアルミナウール内に散布し、O_2ーN_2混合ガス流中で、粒子表面のガス境膜物質移動抵抗が無視しうる条件で非等温酸化反応実験を行った。得られた反応率一時間曲線から、反応率0.2以下の場合には黄銅鉱の熱分解反応律速の速度式が適用され、その反応速度定数k=koexp(ーE_R/RT)において、E_R=13kcal/mol,Ko=0.03mol/cm^2・sの値で反応率の計算値と実測値との一致が得られた。また、反応率0.2以上では、Fesの酸化反応に対応して、反応生成物内のガス拡散律速の速度式が適用された。ガスの有効拡散係数De=Doexp(ーE_D/RT)においてE_D=3kcal/molD_o=0.001cm^2/s程度の値で反応率の計算値と実測値との一致が得られた。さらに、内径2cm、高さ2mの垂直反応管内に上と同じ粒子径の銅精鉱粒子をO_2ーN_2混合ガスとともに落下させ、酸化・溶融過程について検討を加えた。反応管上端から60,120,180cmの位置で粒子をサンプリングし、S分析によって反応率を求めるとともに、粒子の顕微鏡観察ならびにX線回折によって生成物の同定を行った。一方、粒子の反応速度式の他に熱および物質移動を考慮して反応モデルを作成し、実験結果と対比させながら反応の進行について検討した。このモデルでは、上述の研究結果に基づいて、反応率0.2以下では化学反応律速、0.2以上では粒子内が2拡散律速の速度式を用いた。検討の結果、粒子が800K程度の着火温度に達した時点で十分な酸素量があれば、粒子温度はその反応熱によって急激に上昇し、反応管内の滞留時間0.4秒程度の短時間で粒子が溶融することが明らかになった。組成がほとんどCuFe【S_2】に近い天然の黄銅鉱を粒子径105250μmに粉砕範別したものを試料に用いた。これを内径2cm、高さ2mの鋼管製縦型反応管の上端から【O_2】-【N_2】混合ガスとともに1g/minの速度で供給した。反応管は3段の電気炉によって加熱し、管壁温度は791,903,990および1080Kの4水準とした。また、【O_2】-【N_2】混合ガスの酸素分圧は5,10,20,30kPaとした。反応管下端で採取した粒子について化学分析・X線回折・顕微鏡観察などによって検討した。粒子の反応率は、管壁温度によっても若干変化するが、ガス流の酸素分圧とともに著しく上昇する。酸素分圧30kPaでは管壁温度によらず反応率は0.9を越えた。なお、粒子が反応管内を落下するのに要する時間は約0.8秒であり、このような短時間で反応率が0.9を越えることは、自溶炉シヤフト部における反応を検討する上で興味深い実験事実である。

管壁温度によらず、酸素分圧20kPa以上の場合には、反応率は0.6以上になり、顕微鏡観察によると、酸化熱によって粒子は溶融し、球状になっていた。これらのことから、黄銅鉱粒子を落下中に溶融するためには、粒子がある程度(着火温度)加熱されたとき、十分な酸素があれば溶融するものと考えられる。以上の実験結果に基づいて、粒子の落下途上における反応の進行について解析を試みた。まず、粒子の反応は、黄銅鉱の熱分解と過剰のSの燃焼、分解生成物であるピロタイトの酸化による粒子温度の上昇と溶融、硫化物融体の酸化などの各段階を経て進行するものとする。一方、反応速度については従来報告されている黄銅鉱粒子の酸化による脱硫速度の実験式を採用した。この他に、粒子およびガスに関する熱および物質収支式をたてて解析を行なった。現在のところ、実験結果をほゞ満足する解析結果が得られているが、速度定数についてさらに検討を要する。61年度において,粒子径105250μmの黄銅鉱粒子を高さ2mの縦型反応管内にO_2-N_2混合ガス流とともに落下させ,反応の進行について検討した結果,反応管温度が800K以上では, O_2-N_2混合ガスの酸素分圧が20kPa以上であれば粒子の酸化反応は著しく速く,反応時間0.8秒以内でその反応熱によって粒子の溶融がすでに起ることが明らかになった.固体の銅精鉱粒子の酸化反応過程については従来比較的情報が得られている.しかし,粒子は融解後も酸化反応が進行するので, 62年度においては,内径3mm,高さ25mmアルミナ管に80mgの銅マットを入れ, 1503および1533Kで溶融し,その酸化反応の速度がガス拡散律速となる程度に速い反応の進行について検討を加えた. Cu-Fe-S3元系融体の酸化では,まずFeS成分が酸化されFeOを生成し,その後金属Cuが生成する.この段階までは通常のマット吹錬の反応と同様であるが,その後Fe_3O_4, CuFeO_2およびCu_2Oの生成が認められ,これらの生成速度もアルミナ管上端から試料表面までのガス拡散によって律速された.CuOおよびFe_2O_3の生成はガス拡散律速より遅いことが明らかになった.これらのことから,自溶炉の反応解析を目的とする本研究では,反応管内を落下する粒子の溶融後の反応として, Fe_3O_4, CuFeO_2, Cu_2Oの生成までを考慮に入れればよいことが明らかになった.この結果はMetall.TransactionsBに発表した.一方,縦型反応管を用いる落下粒子の反応の進行に関する実験では, 61年度は反応管下端で粒子をサンプリングした.ところが,高さ2mの反応管内で粒子の反応は十分に進行し溶融に至るので,粒子が反応管内を落下する途上における反応の進行をさらに詳細に検討するため,反応管の高さ方向3箇所に側管を設け,水冷式サンプラーを用いて粒子をサンプリングして検討しており,成果をあげつつある.61年度において、粒子径105250μmの銅精鉱粒子が高さ2mの垂直反応管内を落下する途上での酸化・溶融過程について検討を加えた。また62年度においては、粒子の溶融後の酸化反応に関して、比較的速やかに進行する反応について検討した。その結果、Fesの優先酸化、Cu_2Sの酸化によるCuの生成の他に、Fe_3O_4、CuFeO_2、Cu_2Oの生成も比較的速く、CuO、Fe_2O_3の生成速度はかなり遅いことが明らかになった。63年度では、61年に用いた銅精鉱の粒子径が比較的大きかったので、これを平均径72μmまで小さくし、約800Kと思われる着火温度以下の低温度における酸化反応速度について検討を加えた。この実験方法は、アルミナウール中に約10mgの銅精鉱粒子を散布し、粒子表面のガス境膜物質移動抵抗が無視しうる程度の速度でガスを流し、その反応速度を測定する方法をとった。
外界との相互作用に関わる感覚運動系の脳調節メカニズム

運動時の外部環境の変化に巧く対応するうえで,感覚入力から無意識に短時間で実行されるリアクション運動(いわゆる反射)を適切に制御することが極めて有効である.本研究では,体性感覚反射の制御が運動中にどのように行われるのかを検討した.その結果,体性感覚反射の大きさは力学的変化に応じて非常に素早く(0.1秒程度で)調節されること,また体性感覚反射の調節は視覚的な変化に対しても生じることなどが観察され,運動中の反射は環境に応じて柔軟に制御されることが示唆された.運動時の外部環境の変化に巧く対応するうえで,感覚入力から無意識に短時間で実行されるリアクション運動(いわゆる反射)を適切に制御することが極めて有効である.本研究では,体性感覚反射の制御が運動中にどのように行われるのかを検討した.その結果,体性感覚反射の大きさは力学的変化に応じて非常に素早く(0.1秒程度で)調節されること,また体性感覚反射の調節は視覚的な変化に対しても生じることなどが観察され,運動中の反射は環境に応じて柔軟に制御されることが示唆された.日ごろの様々な身体運動に伴って(例えば,ボールを捕る時に)外界や物体との間に生じる力学的な変化に巧みに対応するためには,知覚や判断に基づく運動だけでなく,体性(固有)感覚入力から無意識的に短時間で実行されるリアクション運動,いわゆる伸張反射(以下,反射)を適切に調節することが不可欠である.本研究では,反射がどのような規範で調節されるのか,反射調節の脳情報処理の仕組みを解明してゆくことを目的としている.これまでの筆者らや他の研究から,反射はそれまでの経験(学習)を通して運動中の力学的状況を事前に予測することによって調節されることが知られている.このような反射調節の「予測性」に対して,本年度は,反射調節の「実時間性」に着目した研究を実施した.運動後半に力学的変化(右方向または左方向の仮想力場)を伴うリーチング連動を行う際,力場方向を視覚合図(矢印)によって運動開始前に提示すると,反射出力は予測に基づき力場方向に応じて調節された(例えば、肩屈筋反射は右力場の条件で増大した).次に,反射調節の実時間性を評価するために,連動開始前にわぎと力場と逆方向の矢印を提示し,運動開始後に正しい方向の矢印に切り替える条件を課したところ,非常に短い切り替え時間でも(切り替えから反射出現まで0.1秒程度.ごれは意識的な反応時間よりも短い),適切な方向へ反射の修正が起こり始めているごとが観察された.こめ結果は,反射出力が,事前の外界予測に基づくだけでなく,運動実行中の外界変化に対してオンラインで調節されることを示しており,運動中の不意の力学的変化に素早く柔軟に対応するうえで反射が重要な役割を演じていることを示唆している.今後は,本実験を元に,視覚フイードバック情報を操作して反射調節の空間特性を解明するとともに,脳磁気刺激法を用いて調節を司る脳領域を明らかにすることをめざす.様々な運動(例えば,ボールを捕るとき)に伴って外界や物体と身体の間に生じる力学的な変化に素早く対応するためには,知覚や判断に基づく運動(随意運動)だけでなく,感覚入力から無意識的に短時間で実行されるリアクション(反射)運動を適切に調節することが不可欠である.本研究では,脚気の検査でよく知られている体性感覚反射(いわゆる伸張反射)を題材に,この反射が運動中にどのような規範で調節されているかという情報処理の仕組みを解明してゆくことを目的としている.昨年度は,運動遂行中の不意の力学的変化に対して反射の大きさが非常に素早く(0.1秒程度)修正される,という反射調節の「時間的特性」に関する知見を得た.本年度は,この実験の定量的評価を進めるとともに,反射調節の「空間的特性」に関する実験を試みた.実験ではマニピュランダム装置を用い,上肢の直線運動を行っている際の手先軌道が仮想力場によってズラされた場合に,ズレの大きさの見え方(視覚フィードバック)の操作が伸張反射の応答に影響を与えるかを調べた.その結果,物理的な手先位置のズレは同程度であっても,ズレの見え方の大小に伴って,伸張反射の応答も(視覚フィードバックを操作しない条件に比べて)増減することが観察された.この課題で被験者は,なるべくズレを小さくするよう運動を行うことを教示されているため,見た目のズレが大きくが生じた際に,それを補償するように反射が増大することは利に叶っている.一般的に,伸張反射は体性感覚に基づく姿勢補償反応と考えられてきた.しかしながら,体性感覚と視覚情報とにギャップを作り出した本実験の結果から,必ずしも体性感覚情報だけで反射調節のゴールが決まるわけではなく,求められる課題の状況に応じて,他の感覚情報も統合しつつ応答の大きさを調節していることが示唆された.
直流通電によるエントリ-誘発時の不応期計測・シミュレーション解析システム開発

心室細動の治療には心臓への直流通電が有効だが,通電と細動の関係には不明な点が多く,通電が心臓に障害を発生させる等の問題点がある.また細動発生は,心室興奮伝播の異常なre-entryによることが分かってきた.re-entry発生機序として,通電による不応期変化が考えられる.本研究は,不応期変化の計測・シミュレーション解析が可能なシステムの開発を目的とし,文部省科学研究費の補助により既に試作した電位計測装置,及び二次元心臓興奮伝播シミュレーションモデルを基に,心表面上から不応期の計測が可能な装置,並びに不応期変化を考慮した三次元心臓興奮伝播シミュレーションモデルの開発を行った.モデルは心筋細胞に対応した1mm角の立方体形状のボックスセルモデルを17492個用い,単軸直径50mm,長軸半径50mmの楕円形状による心室モデルとした.本モデルは心外膜,心筋内部,心内膜の3層構造とし,左心室と右心室間の心室中隔も構成した.開発した不応期計測装置を用い,Langendroff灌流下のモルモット心臓にペーシング,連結期及び電圧を変化させた直流通電を与える動物実験を行った.この結果,re-entryが発生した条件下の不応期分布は通電前に比し,空間不均一性が増加した.同様の条件のペーシング及び直流通電を開発した三次元心室モデルに与えた結果,シミュレーションにおいてもre-entry発生が認められた.この場合,モデルの初期状態では不応期には不均一性を持たせなかったにも関わらず,通電により心筋各部の不応期に空間不均一性が発生していた.この結果から,通電が不応期の空間不均一性を作り出し,その結果としてre-entryが発生するという機序が確認された.心室細動の治療には心臓への直流通電が有効だが,通電と細動の関係には不明な点が多く,通電が心臓に障害を発生させる等の問題点がある.また細動発生は,心室興奮伝播の異常なre-entryによることが分かってきた.re-entry発生機序として,通電による不応期変化が考えられる.本研究は,不応期変化の計測・シミュレーション解析が可能なシステムの開発を目的とし,文部省科学研究費の補助により既に試作した電位計測装置,及び二次元心臓興奮伝播シミュレーションモデルを基に,心表面上から不応期の計測が可能な装置,並びに不応期変化を考慮した三次元心臓興奮伝播シミュレーションモデルの開発を行った.モデルは心筋細胞に対応した1mm角の立方体形状のボックスセルモデルを17492個用い,単軸直径50mm,長軸半径50mmの楕円形状による心室モデルとした.本モデルは心外膜,心筋内部,心内膜の3層構造とし,左心室と右心室間の心室中隔も構成した.開発した不応期計測装置を用い,Langendroff灌流下のモルモット心臓にペーシング,連結期及び電圧を変化させた直流通電を与える動物実験を行った.この結果,re-entryが発生した条件下の不応期分布は通電前に比し,空間不均一性が増加した.同様の条件のペーシング及び直流通電を開発した三次元心室モデルに与えた結果,シミュレーションにおいてもre-entry発生が認められた.この場合,モデルの初期状態では不応期には不均一性を持たせなかったにも関わらず,通電により心筋各部の不応期に空間不均一性が発生していた.この結果から,通電が不応期の空間不均一性を作り出し,その結果としてre-entryが発生するという機序が確認された.
血管恒常性制御機構 “AM-RAMP2システム”の、病的血管治療への応用

アドレノメデュリン(AM)は、血管をはじめ全身で広く産生され、多彩な生理活性を有する生理活性ペプチドである。我々はAMノックアウトマウス(AM-/-)と、AM受容体活性調節タンパクであるRAMP2(receptor activity-modifying protein 2)のノックアウトマウス(RAMP2-/-)が、共に血管の発生異常により胎生致死となることから、AM-RAMP2系が、血管新生にも必須であることを報告してきた。一方、AMは、様々な癌においても産生される。本研究では、腫瘍の増殖と転移におけるAM-RAMP2系の意義の検討を行った。誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)において腫瘍転移が亢進するメカニズムを解明するため、RAMP2欠損誘導後に転移予定先臓器である肺に生じる変化を時系列的に観察した。その結果、腫瘍の転移前の早期の段階で、血管壁におけるマクロファージの接着や浸潤、TNF-α、IL-6などの炎症性サイトカインの発現亢進が認められた。炎症はRAMP2欠損誘導後も持続し、腫瘍の転移がはじまる直前の段階では、腫瘍細胞を転移巣へ誘導するとされるS100A8/A9とその下流因子であるSAA3の発現亢進が確認された。以上の結果から、血管内皮細胞のRAMP2欠損により、転移予定先臓器の血管における慢性炎症が、癌細胞の「転移前土壌」となり、癌の遠隔臓器への転移を促進させる可能性が考えられた。誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)ラインを樹立することで、成体になってから血管のRAMP2遺伝子欠損を誘導し、解析に用いることが可能となった。DI-E-RAMP2-/-では肺への転移率が亢進する結果が得られており、今後そのメカニズムについて詳細な検討を進める計画である。癌細胞の転移に促進的に働く因子が明らかとなれば、新たな治療標的になり得る。我々はこれまで、DI-E-RAMP2-/-に対し、メラノーマ細胞(B16BL6)の皮下移植を行い、肺への自然転移モデルを検討してきた。このモデルを用いて、RAMP2遺伝子欠損誘導後より、原発巣と転移巣に起こる変化について、病理解析、および網羅的遺伝子発現解析を行う。さらに膵癌細胞(Pan02)を脾臓に移植し、肝臓への自然転移モデルを作成して、臓器間の転移についても同様に検討を行う。特に我々が注目しているのは、腫瘍内血管の内皮間葉系移行(EndMT)である。EndMTを生じた血管は安定した血管内膜シート構造を取ることが出来ず、血管透過性が亢進すると共に、様々な増殖因子を産生し、癌細胞の増殖と転移に促進的に働くとされている。今後の検討では、EndMT関連因子など、癌転移促進に働く因子群を同定する計画である。RAMP2floxマウスをVEカドヘリンMerCreMerマウスと交配することにより、誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)ラインを樹立し、成体になってから血管のRAMP2遺伝子欠損を誘導した。DI-E-RAMP2-/-では、タモキシフェン5日間の投与後、2週間後に、血管におけるRAMP2発現が20%以下に低下することが確認された。DI-E-RAMP2-/-を用いて、B16F10メラノーマ細胞の皮下移植実験を行なうと、コントロールマウスに比較して、腫瘍内血管新生は減弱し、腫瘍増殖は抑制された。その一方で、B16BL6メラノーマ細胞を用いて、原発巣から遠隔臓器への転移モデルの検討を行ったところ、DI-E-RAMP2-/-では肺への転移率が亢進するという結果となった。血管内皮細胞のRAMP2欠損により、転移予定先臓器の血管における慢性炎症が、癌細胞の「転移前土壌」となり、癌の遠隔臓器への転移を促進させる可能性を考えて検討を進めている。DI-E-RAMP2-/-では肺への転移率が亢進する結果が得られており、今後そのメカニズムについて検討を進める計画である。