hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
左右心室発生、領域化におけるHand遺伝子の役割

転写因子Hand1、Hand2は各々胎生期の左心室、右心室に優位に発現し、その発達に関与する。また両者は原始咽頭弓に共通して発現し、心室流出路の発達にも寄与する。これらHand遺伝子の遺伝的相補性を検討する目的で、遺伝子組み換え技術を用いて、Hand2^<Hand1/+>マウス(Hand2をHand1遺伝子で置換したヘテロ接合マウス)を作成し、それらを交配したHand2^<Hand1/Hand1>マウス(ホモ接合マウス)の表現型解析を行った。Hand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔は、胎生13.5日以後成長が停止し、胎生15.5日頃に胎内死亡した。左右心室構造が明らかになる胎生9.5日以降、様々な程度の右心室の低形成及び右心室肉柱層の発達障害が認められ、胎生後期に心不全で死亡したものと考えられた。Hand遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)レベルの発現をin situ hybridizatio法(ISH)で検討し、Hand2の右心室発現欠如、Hand1の右心室への発現拡大が認められたことから、Hand遺伝子間の置換が行われていることが示された。また、Hand2^<Hand1/+>マウスとHand2^<+/->マウスの交配により作製されたHand2^<Hand1/->マウスは、すでに報告されているHand2^<-/->マウス(Hand2ノックアウトマウス)と同様、胎生10.5日に著明な右心室低形成で胎内死亡した。ホモ接合マウス胎仔の咽頭弓構造は、野生型胎仔と比較して肉眼的、組織学的に明らかな変化は認められなかった。ISHを行った結果、咽頭弓におけるHand2発現消失、Hand1の拡大した発現が認められ、咽頭弓組織においてもHand遺伝子の置換が確認された。以上の所見から、Hand遺伝子は組織特異的かつ量依存的な遺伝的相補性を有することが示唆された。補助金交付申請書に述べた研究計画に基づき、本年度は、Hand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔(Hand2をHand1で置換したホモ接合マウス胎仔)を解析して、以下の結果を得た。Hand2^<Hand1/+>マウス(Hand2をHand1で置換したヘテロ接合マウス)の表現型は正常で、野生型と同等に生存し、生殖能も有していた。Hand2^<Hand1/Hand1>マウス(ホモ接合マウス)は、胎生12.5日頃までは表現型正常で、野生型と判別できないが、以後成長が停止し、胎生15.5日頃に胎内死亡した。心臓発生を観察すると、心ループを形成し、左右心室形態が明瞭になる胎生9.5日以降、様々な程度の右心室の低形成が認められた。胎生10.5日、11.5日に組織切片の顕微鏡的観察では、ホモ接合マウス胎仔の右心室肉柱層の発達が悪く、胎生各期において経時的に観察する必要があると考えられた。Hand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔において、遺伝子の発現をメッセンジャーRNA (mRNA)レベルで解析し、野生型マウスと比較した。胎仔から抽出したRNA、胎仔の全胚および心臓組織切片において、in situ hybridization等の手技を用いて遺伝子発現を検討した。心室特異的に発現する遺伝子のうちHand1は、野生型では左心室だけに発現するが、Hand2^<Hand1/Hand1>

マウス胎仔では右心室全体に発現が拡大し、一方Hand2の発現は両心室に認められなかった。すなわち遺伝子置換が達成されていることが確認された。また、左右心室に特異的なAnf、Irx4、左心室特異的なTbx5の発現は正常であり、ホモ接合マウス胎仔でも、心室筋の分化、左心室の分化に異常はないと考えられた。今年度の研究計画に基づき、Hand^<Hand1/Hand1>マウス胎仔(Hand2をHandlで置換したホモ接合マウス胎仔)、Hand2^Hand1/-マウス(Hand2をHand1でヘテロ置換したマウス)を解析した。1.Hand2^<Hand1/->マウス胎仔の心表現型Hand2^<Hand1/+>マウス(Hand2をHand1で置換したヘテロ接合マウス)と、Hand^<2+/->-マウス(Hand2ヘテロ欠失マウス)を交配させて得られたHand2^<Hand1>マウスは、胎生9.5日頃から右心室の著明な低形成が認められ、胎生10.5日に成長障害をきたし死亡した。この表現型はHand2-/-マウス(Hand2ホモ欠失マウス)と同等であった。昨年度行ったHand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔の解析と比較検討した結果、右心室発達においてHand1は遺伝子量依存性にHand2の機能を代償することが考えられた。2.Hand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔の咽頭弓の表現型Hand2^<Hand1/Hand1>マウス胎仔の咽頭弓は、右心室の低形成が明らかになる胎生12.5日において、その構造は保たれていた。Hand1及びHand2の咽頭弓におけるメッセンジャーRNA(mRNA)レベルの発現を、in situ hybridizationで検討した結果、Hand2の発現はなく、本来咽頭弓中枢に限局するHand1発現が、Hand2発現領域まで拡大しており、咽頭弓においてもHand1によるHand2の置換が正しく行われていることが示された。他の咽頭弓特異的発現遺伝子Fgf8、Fgf10、Msx1、Msx2のmRNA発現も野生型と変化がないことが判明し、咽頭弓発達においては、Hand1はHand2機能を代償すると考えられた。構造の類似したHand1、Hand2は、組織特異的にその遺伝子相補性が異なることが考えられた。
電子タグによる内服薬個別管理手法の確立に向けた研究

内服薬の管理は医療安全上重要な課題だが,個品単位で管理できる仕組みは構築できていない.そこで,最近開発されてきた超小型電子タグを用いて,高いユーザビリティのもとに内服薬の個別管理を実現できる仕組みを目指した.偽薬を格納したPTPシートに2mm以下の複数サイズの超小型電子タグを装着し,開封によるシートの変形を検出して服薬状況をモニタリングした結果,アンテナや出力の調整こそ必要なものの,このサイズまで小型化された電子タグを利用すれば内服薬の服薬状況を個品単位で管理できるシステムが構築可能で,服薬指導やトレーサビリティ管理,治験等における客観性の確保にも有効と考えられた.本年度はまず,内服薬のPTPシートに容易に実装可能なサイズである,0.5mm角の超小型電子タグおよびリーダーの性能評価を行った.当該タグは外部にアンテナを必要としないため,PTPシートの凸面にも装着可能であり,様々な実装方法を試みることができる.シート上の内服薬の数管理を想定し,平面上に超小型電子タグを配置して連続的に読み取り,欠損した箇所を検出する実験を行ったが,現在国内で入手可能なリーダーとの組み合わせでは読み取りできるエリアが極めて限られているため,読み取りが不安定であり,PTPシートへの実装方法によっては読み取りが困難であることが推測された.この点は,リーダーの仕様を変更するなどして,さらにシミュレーションを重ねる予定である.また,円滑に読み取りが可能となった場合でも,PTPシートへの実装方法には相当な工夫が必要と思われるため,本年度は同一形状の実験用PTPシートを用意し,これへの超小型電子タグの装着方法を試行した.次年度は,読み取りのシミュレーションを前提としたタグの装着を行い,仕様変更済みのリーダーを用いて,PTPシートの個々の内服薬をトレースできる仕組みを試作し,その効果を検証する.内服薬の管理は医療安全上重要な課題であり,適切な管理や事後評価の仕組みがますます重要となってきたが,個品単位で管理できる仕組みは構築できていない.一方,最近,我が国の技術力を背景に超小型電子タグが開発されてきた.本研究では超小型電子タグの特性を十分に生かして高いユーザビリティのもとに内服薬の個別管理を実現に向けた検討を行った.内服薬はその物理的制約(大きさや形態等)から,個品単位ではなくシートや薬袋単位で管理せざるを得なかった.一方,超小型電子タグはサイズの制約が極めて少なく,様々な箇所に装着できる利点はあるが,認証可能な距離は極めて短い.本研究ではこの特性を逆手にとり,内服薬のPTPシートのタグを装着して個々の薬剤の開封状況を簡便に検知し,医療機関内はもとより,在宅においても,高齢者も容易に使用できる仕組みを考案した.具体的には偽薬を格納したPTPシートに超小型電子タグを装着し,開封によるシートの変形によってタグの情報が読み取りできなくなったことを検出し,服薬状況をモニタリングすることを想定して実験を行った.その結果,タグのサイズによって装着の容易さは当然生じるが,シートへの装着は可能であり,個々の薬剤の開封状態を検出しうるものと考えられた.タグのサイズや種類によって未開封状態での読み取りや開封状態の検出には差異があり,アンテナや出力の調整最適化が必要なほか,PTPシートの表側に装着した場合は内部の薬剤の目視確認に支障をきたす可能性もあるため,実際の装着方法には工夫が必要だが,このサイズまで小型化が図られた電子タグを利用すれば内服薬の服薬状況を個品単位で管理できるシステムの構築も十分可能と思われ,服薬指導や薬剤のトレーサビリティ管理,治験等における服薬状況の客観性の確保にも有効な手段と考えられた.内服薬の管理は医療安全上重要な課題だが,個品単位で管理できる仕組みは構築できていない.そこで,最近開発されてきた超小型電子タグを用いて,高いユーザビリティのもとに内服薬の個別管理を実現できる仕組みを目指した.偽薬を格納したPTPシートに2mm以下の複数サイズの超小型電子タグを装着し,開封によるシートの変形を検出して服薬状況をモニタリングした結果,アンテナや出力の調整こそ必要なものの,このサイズまで小型化された電子タグを利用すれば内服薬の服薬状況を個品単位で管理できるシステムが構築可能で,服薬指導やトレーサビリティ管理,治験等における客観性の確保にも有効と考えられた.主任研究者が急な疾病のために手術と複数回の入院等の加療を要したため,若干の遅れが生じた.ただし,基本的な性能評価や実装方法の検討は行っているため,次年度は若干,試作・試行のペースを上げることで予定通りに研究が完遂できる見込みである.医療情報学次年度は,今年度に性能評価したタグや,仕様変更後のリーダーを用いて研究を継続する.実験用のPTPシートを用いて,内服薬管理に適したタグの装着方法を試行し,研究計画時点で予定した通りに研究を完遂する.課題としては,仕様変更したリーダーの入手が挙げられるが,これについても現時点で,メーカー側で改良済みとの情報を得ており,概ねの目処がついていることから,研究計画を変更する必要はないと考えている.主任研究者の入院等の加療のために研究に若干の遅れが生じ,出張や材料の購入,開発等に必要な経費の一部が今年度執行されなかったため.本研究の全体の研究計画は変更せずに,次年度は本年度に遅れた分を遂行することとする.
国際システムの変動と対外認識-デタント期における日米中三国の相互イメージ-

本研究課題に関連したデタント期のアジア・太平洋地域の国際関係に関する研究は、私がアメリカ留学時に書いた博士論文以降56年にわたって暖めてきたテーマであったため、小さな論文は最低限に留め、著書を執筆することに重点を置いてきた。2001年2月現在、その著書は400字詰め原稿用紙500枚程度の原稿となっており、『危機の中の同盟-国際システムの変動と日米中トライアングル』というタイトルで近々出版社に持参する予定である。近い将来、著書の形で発表することによって本研究課題に一段落つけることを目指している。これらの過程の中で、ワシントンDCと台北において海外調査を行い(この費用は自己負担)、一層の資料収集に努めた。また、その資料の分析と著書執筆の際の資料整理のために研究補助者を必要としたため、一定期間にわたって伊藤の研究室、または持ち帰りで作業をお願いした。概ね、本科学研究期間内での著書の執筆は完了しているが、まだ多少の改善の余地が残っている。できるだけ早く本研究費への対価を発表したいと考えている。本奨励研究は追加採択であったため、1999年度の研究成果を時期的に二つに分ける。まず、本研究が正式に採択されるまでの期間、限られた予算の中で本課題と関連したテーマに関して研究を続けていた。その際、日本国際政治学会1999年度研究大会において「同盟の『新しい役割』に関する概念的考察-東アジア安全保障体制に焦点を当てて-」と題する発表を行った。また、夏にワシントンDCを訪れ、少ない期間で米国公文書館で資料収集を行った。次に採択以降に関してだが、本研究テーマである1970年代の日米中三国関係に関して、当時の当該国の対外政策のみならず、日米中三国の政策決定者の「認識」にも焦点を当て、政府資料を整理・分析していった。「認識」に関する研究の重要性は、自国の意図する通りに相手国がものを考えないという、国際政治の特質から生じている。70年代初頭は世界全体としては緊張緩和の時代であるが、日本の外交当局者はこの時期をむしろ戦後秩序構造の急速な瓦解の「危機」としてとらえた。米国での博士論文を修正して2000年2月にJapan's Normalization with Mainland China and NorthVietnamと題する英語論文を発表した。また、1970年代初頭の東アジアの国際関係を現在に援用した類いの研究成果として、99年11月に中国社会科学研究会(国際文化会館にて)、同年12月政策メッセ(中央大学駿河台記念館にて)において「冷戦後の日米同盟と日米中トライアングル」に関する研究発表を行った。
オーレオクロムは褐藻のどの光反応の受容体か

本研究の目的はオーレオクロム(AUREOCHROME)が発見されたフシナシミドロ(Vaucheria)以外の黄色植物(光合成をするストラメノパイル)で、オーレオクロムが仲介する青色光反応を探索することにある。褐藻は学問的にも産業的にも最も重要な黄色植物なので、できるだけ容易に培養でき、単純な体制を持つHalopteris属を中心に、青色光で制御される生理過程を探したところ、その成長自体が強く青色光に依存しており、赤色光単独では生存できないことを明らかにした。申請者らは2007年に青色光受容体オーレオクロムを発見した。オーレオクロムは青色光によって活性化される転写因子で、褐藻やケイ藻を含む黄色植物のみに保存されている。黄色植物の一つ、フシナシミドロでのオーレオクロムの機能は解明できたが、褐藻類はじめ他の黄色植物での機能は未知である。そのため、本研究の目的は,室内実験に使いやすい褐藻Halopterisなどを用いて,オーレオクロムの標的反応を明らかにすることである。神戸大学海藻類系統株コレクション(KU-MACC)からカシラザキ(Halopteris filicina),及び,同属の2種を入手し、培養庫を購入し、赤、青、白のLEDランプを使って、14時間明/10時間暗の周期で培養を開始した。その結果、最も培養が容易で、成長の早いHalopteris congesta(Reinke)が今後の実験に適していることがわかった。青色光によって成長し、分岐して扇状に拡がったが、赤色光単独では、持続した成長は認められなかった。しかし、死ぬことは無く、休眠状態を保っていると推測された。次年度は実験環境はさらに光周期、光強度等の実験条件を拡充して、藻体の成長を短い間隔で定期的に顕微鏡観察する予定である。申請者らが2007年に発見報告した新奇青色光受容体オーレオクロム(AUREOCHROME)は青色光によって活性化される転写因子で、褐藻やケイ藻を含む黄色植物(Stramenopile)のみに保存されていることが分かった(Ishikawa et al. 2009)。黄色植物の一群であるフシナシミドロでは青色光によって誘導される分枝発生がオーレオクロムの標的反応であることが分かった(Takahashi et al. 2007)が、褐藻類やケイ藻でのオーレオクロムの機能は未知である。本年度は神戸大学海藻類系統株コレクション(KU-MACC)から得たHalopteris congesta(Reinke)の成長や光形態形成に対する青色光の特異的効果を検出することを目標とした。同藻を15°Cに設定した培養庫内を2段に区切り、アルミニウム板や黒布で他段に光が漏れないよう工夫した上で、赤(660nm)と青(450nm)の2種のLEDランプを光源に用い、14時間明/10時間暗の周期で培養した。その結果、Halopteris congestaの成長と扇形に広がる正常な形態は青色光によってのみ達成されるが、赤色光単独では成長はほとんど停止し、3ヶ月後には枯死することを観察した。青色光単独で培養した藻体の色彩と形態は別の低温ショウケース内の白色光下で維持した藻体と区別できなかった。このことから正常な成長と形態形成をもたらすためには青色光が必要不可欠であることが確認できた。しかし、東日本大地震による停電とその後の度重なる余震による培養庫の移動や震とうが、藻体の成長に傷害的作用を与えたため、培養の継続的観察や成長測定は断念せざるを得なかった。
エネルギー・電子移動顕微鏡による生物分子モーターの可視化と機能評価

近接場走査光学顕微鏡(NSOM)の限界を打破すべく、NSOMプローブの開口部を蛍光性分子で化学修飾し、pH、イオン濃度、誘電率などのミクロな環境変化や疎水性、水素結合などの分子間相互作用の測定を行うことを目的として、センサー用修飾分子の開発と特性評価を行った。1.センサー分子の設計・合成NSOMプローブ開口部は金などの金属でコーティングされているが、金属近傍では分子の蛍光はエネルギー移動のために著しく消光されてしまう。そこで、消光を受け難いセンサー分子を開発するために一連の候補化合物を設計・合成し、スクリーニングした結果、蛍光特性のきわめて優れたポルフィリンジスルフィド誘導体を見い出した。2.センサー分子励起法としての表面プラズモンモードの応用金属近傍のセンサー分子を効率よく励起する方法として、表面プラズモン場の応用を試みた。ガラスに蒸着された金属薄膜の裏面から光を照射すると金属表面に表面プラズモン場が誘起される。ポルフィリンジスルフィドで修飾した金薄膜表面に表面プラズモン場を誘起すると蛍光が観測され、しかもその励起スペクトルの長波長部は20-30倍も増強されており、表面プラズモン場を表面修飾分子の高効率励起光源として応用できることを明らかにした。3.表面プラズモンモードによる励起の応用ポルフィリンジスルフィドで修飾した金薄膜を電極として光電流発生実験を行った。従来行われていた表面の直接光励起では150nAしか得られなかったのに対し、表面プラズモン励起では約10倍も高い1.7μAが得られ、有機系太陽電池の励起法として極めて有効なことが判明した。
ラジオ波焼灼術等の低侵襲治療のための効果的なトレーニングシステムの開発

平成30年度からトレーニング内容にRFA(ラジオ波焼灼術)だけでなくMWA(マイクロ波焼灼術)も取り入れ、名称をRFAトレーニングプログラムからIVO(Interventional Oncology)トレーニングプログラムに変更した。対象は今年度も中級者から上級者(主たる術者としてRFAの実施経験がある医師)とした。国内版は、第11回、第12回の計2回実施し、全国各地から各々21名、10名の計31名の医師が受講した。また、国際版も2回実施し、8月21日から8月25日までの5日間は5th International IVO training programを、2019年3月12日から3月16日までの5日間は6th International IVO training programを実施した。5thは台湾から12名、インドネシアから2名、香港から2名、インドから2名、ベトナム、ミャンマー、韓国、中国から各1名の計22名、6thは台湾から6名、韓国から5名、香港から3名、インドネシアから3名、シンガポール、タイ、ベトナムから各1名の計20名の医師が参加した。すなわち国際版では今年度は計42名の医師が受講した。いずれのプログラムも、従来と同様に、レクチャー、ライブデモンストレーション、ケーススタディの3つで構成されていた。プログラム終了後、受講者を対象にアンケート調査を実施した。「プログラム全体をどう評価しますか?Please rate the overall program.」「このプログラムをお知り合いの方に推奨しますか?Will yourecommend thistraining program to your colleagues?」などの質問を行なったが、ほとんどの参加者が「大変満足Strongly satisfied」と回答しており、プログラムは大変好評と考えられた。また、各プログラムの開始時と終了時には20問からなるpretestとposttestを実施したが、プログラム終了後は正答率が高くなりプログラムの効果と思われた。これらの成果は国内外の学会等で発表した。また、トレーニングプログラムの受講者の所属する施設に報告し、ホームページでも公表した。平成28年度は中級者から上級者(主たる術者としてRFAの実施経験がある医師)を対象に7月29日、30日に第7回国内版RFAトレーニングプログラムを実施し、全国各地から18名の医師が受講した。また、10月11日から10月15日までの5日間の日程で3rd International RFA training programを実施し、台湾から7名、韓国から2名、中国から1名の計10名の医師が参加した。また、3rd International RFA training programでは20問からなるpretestとposttestを実施したが、プログラム終了後は正答率が高くなりプログラムの効果と思われた。また、研究成果をトレーニングプログラムの受講者のいる施設に知らせ、ホームページでも公表した。他施設の医師を対象としたラジオ波焼灼術トレーニングプログラムは7月に国内版を、10月に国際版を実施した。Pretest、posttestを実施するなど、これまでのプログラムを一部改変した。平成28年度は、過去8回のトレーニングプログラムに参加した130名の医師および推薦状を書いた所属上長を対象にfollow-up surveyを実施し、どのような技術が習得でき役立っているかを調べ、transferable skillsを明らかにし、また、現在、困難を感じていることは何かのneeds surveyも行なう予定であったが、まだ、実施できていない。Kirkpatrickの4段階評価法のレベル1の評価であるReaction(反応)に関しては、これまでと同様に受講直後にアンケート調査を行ない、受講者のトレーニングプログラムに対する満足度を評価している。レベル2の評価であるLearning(学習)に関しては、知識に加えて技術の評価も必要であるが、十分な評価方法が確立できていない。レベル3の評価であるBehavior(行動)に関しては、6ヶ月後、12ヶ月後に受講者や各施設に連絡を取り、治療症例数が増加したか、体位変換法をどの程度取り入れているか、人工腹水法、人工胸水法、multimodality fusion imaging、造影超音波ガイド下治療などの手法の利用割合はどうかなどを評価する予定であったが、まだ、実施できていない。レベル4の評価のResults(業績)に関しては、6ヶ月後、12ヶ月後、24ヶ月後に受講者や各施設に連絡を取り、所要時間、technical successrate(治療後の画像診断で病変の完全壊死が得られているかどうか)、合併症の頻度、局所再発率、生存率などの項目から治療成績が向上したかどうかを評価する予定である。平成29年度は中級者から上級者(主たる術者としてRFAの実施経験がある医師)を対象に第8回、第9回、第10回国内版RFAトレーニングプログラムを実施し、全国各地から18名、22名、18名の計58名の医師が受講した。また、7月11日から7月15日までの5日間の日程で4rd International RFA training programを実施し、台湾から14名、韓国、マレーシア、インドネシア、フィリピンから各1名の計18名の医師が参加した。

プログラム終了後、受講者を対象にアンケート調査を実施した。「プログラム全体をどう評価しますか?Please rate the overall program.」「このプログラムをお知り合いの方に推奨しますか?Will yourecommend thistraining program to your colleagues?」などの質問を行なったが、ほとんどの参加者が「大変満足Strongly satisfied」と回答しており、プログラムは大変好評と考えられた。また、4th International RFA training programでは20問からなるpretestとposttestを実施したが、プログラム終了後は正答率が高くなりプログラムの効果と思われた。これらの成果は国内外の学会等で発表した。また、研究成果をトレーニングプログラムの受講者のいる施設に知らせ、ホームページでも公表した。他施設の医師を対象としたラジオ波焼灼術トレーニングプログラムは国内版を3回、7月に国際版を実施した。レクチャー、ライブデモンストレーション、ケーススタディ、情報交換会に加えて、Pretest、posttestを実施した。平成29年度は、過去10回のトレーニングプログラムに参加した170名の医師および推薦状を書いた所属上長を対象にfollow-up surveyを実施し、どのような技術が習得でき役立っているかを調べ、transferable skillsを明らかにし、また、現在、困難を感じていることは何かのneeds surveyも行なう予定であったが、まだ、実施できていない。Kirkpatrickの4段階評価法のレベル1の評価であるReaction(反応)に関しては、これまでと同様に受講直後にアンケート調査を行ない、受講者のトレーニングプログラムに対する満足度を評価している。レベル2の評価であるLearning(学習)に関しては、知識に加えて技術の評価も必要であるが、十分な評価方法が確立できていない。レベル3の評価であるBehavior(行動)に関しては、6ヶ月後、12ヶ月後に受講者や各施設に連絡を取り、治療症例数が増加したか、体位変換法をどの程度取り入れているか、人工腹水法、人工胸水法、multimodality fusion imaging、造影超音波ガイド下治療などの手法の利用割合はどうかなどを評価する予定であったが、まだ、実施できていない。
ヒト由来膜タンパク質の磁性粒子上での機能発現に向けたIVD法の開発

本研究では、高い活性を保持した膜タンパク質を担持した磁性粒子の創製に向け、磁性細菌内で発現させたヒト由来タンパク質を、細胞外(in vitro)で磁性細菌粒子上に再構築するin vitro docking (IVD)法の確立を目的とした。IVD法のためのドッキングタンパク質を検討した後、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)をモデルとしてIVDに供し、リガンドとの結合能を評価した。更に、磁性粒子上への膜タンパク質発現の最適化に向けて、必要最低限の量のタンパク質を発現させて、適切なフォールディングを促す発現調節機構(Minimum expression system)の構築についても検討した。本研究では、ターゲット膜タンパク質と磁性細菌粒子の双方に、ドッキングタンパク質を融合し、細胞の異なる区画で発現させる。これにより細胞破砕後に細胞外でin vitroドッキングが進むように設計する。平成26年度では、このin vitroドッキングに利用可能なドッキングタンパク質の評価に注力した。まず、IgGのFc領域と抗体結合タンパク質Protein AのZZドメインの相互作用が、in vitroドッキングにおいて有効であるか検証した。磁性細菌粒子上のMms13にZZドメインを融合し粒子上にディスプレイした。一方で、Fc部位にはペリプラズム輸送シグナル配列、および粒子上へ固定化するタンパク質のモデルとして単鎖抗体を融合した。破砕時に、粒子画分とペリプラズム画分が混合するよう設計したところ、in vitroドッキングのメカニズムに従い、粒子上へ単鎖抗体が固定化されることを確認した。さらに発現誘導システムにより単鎖抗体融合タンパク質の発現量を調整することにも成功している。来年度は、本システムによる粒子上への単鎖抗体固定化量の制御を確認する。また、ZZドメイン・Fc部位のペア以外にも利用可能なドッキングタンパク質として、種々のセルロース分解菌で見られる安定なタンパク質複合体であるドックリン・コヘシンの利用を試みた。Mms13にコヘシンを、蛍光タンパク質にドックリンを融合し、まずは磁性細菌細胞内におけるドッキング(in vivoドッキングによる粒子上への蛍光タンパク質の固定化を行った。その結果、期待通り細胞内において蛍光タンパク質の固定化が観察された。ドックリン・コヘシンは種々のセルロース分解菌ごとに特異的な相互作用を示すことから、異なる菌由来のドックリン・コヘシンのペアを用いることで、複数種類の蛍光タンパク質を固定化することにも成功した。今後、ドックリン・コヘシンの相互作用をin vitroドッキングにおいても利用可能であるか、更なる検証を進める予定である。本研究では、標的膜タンパク質と磁性粒子の双方に、ドッキングタンパク質を融合し細胞の異なる区画で発現、さらに細胞破砕によりin vitroでドッキングが進むように設計する。平成27年度では、種々のセルロース分解菌から得られたドックリン・コヘシン相互作用を利用した標的タンパク質の磁性粒子上へのドッキングを行った。ドックリン・コヘシン相互作用の特徴として高い親和性(Kd値10.01 nM)と結合の特異性が挙げられる。粒子上のアンカータンパク質であるMms13にコヘシンを、また標的タンパク質にドックリンを融合し、磁性細菌をホストとして外来タンパク質発現を行った。このとき、標的タンパク質とドックリンの融合タンパク質発現には、テトラサイクリン誘導システムを組み込み、細胞内での標的タンパク質の発現量を調節した。その結果、誘導剤であるアンヒドロテトラサイクリン(ATc)の濃度に応じて、細胞内及び粒子上の標的タンパク質の発現量は増加した。また、低いATc濃度において、磁性粒子上の標的タンパク質量が定常となり、それ以上のATc濃度においては細胞内に標的タンパク質が蓄積していくことが観察された。以上の結果より、細胞内で必要最低限の標的タンパク質を発現させ、磁性粒子上にドッキングするMinimum expressionsystemの構築が可能となった。本手法は、細胞内発現により細胞毒性を示す膜タンパク質発現において、有効であると考えられる。さらに、2種類のセルロース分解菌由来ドックリン・コヘシンのペアを用いて、2種類の標的タンパク質を近接配置する技術も確立し、磁性粒子上に自在に標的タンパク質を固定化する技術の確立が行えた。平成27年度までに、当初想定していたZZドメイン・Fc部位の相互作用、およびドックリン・コヘシンの相互作用を利用した、磁性細菌における組み換えタンパク質のドッキングに成功した。また、複数のドックリン・コヘシンのペアを用いることで、複数のタンパク質を近接させて固定化できることも実証している。さらに、発現誘導システムの導入により、細胞内への発現毒性を低減させた膜タンパク質発現系(Minimum expression system)が確立できている。これらの成果により、来年度に予定されている、膜タンパク質や膜タンパク質の構造維持を補助するタンパク質の同時発現を滞りなく開始することが可能となった。以上の事より、本研究はおおむね順調に進んでいると判断している。平成28年度では、前年度までに構築したドックリン・コヘシン相互作用による標的タンパク質の磁性粒子上へのドッキングを利用し、膜貫通タンパク質の発現及び機能評価を行った。ヒト由来膜タンパク質として、細胞外領域にSS結合を多数有する甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR、膜7回貫通タンパク質)を用いた。TSHRを始めとするGタンパク質共役受容体(GPCR)の機能発現には受容体中のSS結合の適切な形成が重要である。そこでTSHRのN末端を酸化的環境であるペリプラズム空間に局在させ、SS結合の促進を行うことで機能向上を行った。

前年度までに構築した発現毒性を低減させた膜タンパク質発現系(Minimum expression system)を用いてTSHRを発現させたところ、粒子上への全長TSHRの固定化が確認された。その発現量は従来法のTSHRを粒子上のアンカータンパク質Mms13に直接融合した場合と同程度であった。よって、in vitroドッキング法によりペリプラズム空間で発現させた膜タンパク質を粒子上に固定化可能であることが示された。また、甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する結合が確認され、従来法と比較してTSHに対して高い親和性を保持していることが示された。更に、立体構造を認識するTSHRに対する自己抗体を用いた結合試験では従来法と比較して結合量の向上が確認された。これらの結果はペリプラズム空間の酸化的環境下でTSHR中のSS結合の形成が促され、TSHRの機能の向上及び高次構造の保持につながったことが示唆された。以上より、ヒト由来膜タンパク質の機能発現にin vitroドッキング法の有効性が示された。本研究では、高い活性を保持した膜タンパク質を担持した磁性粒子の創製に向け、磁性細菌内で発現させたヒト由来タンパク質を、細胞外(in vitro)で磁性細菌粒子上に再構築するin vitro docking (IVD)法の確立を目的とした。IVD法のためのドッキングタンパク質を検討した後、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)をモデルとしてIVDに供し、リガンドとの結合能を評価した。更に、磁性粒子上への膜タンパク質発現の最適化に向けて、必要最低限の量のタンパク質を発現させて、適切なフォールディングを促す発現調節機構(Minimum expression system)の構築についても検討した。平成26年度までに、当初想定していたZZドメイン・Fc部位の相互作用、およびドックリン・コヘシンの相互作用を利用した、磁性細菌粒子上における組み換えタンパク質のドッキングに成功した。これらの成果により、本研究の基盤技術である磁性細菌粒子上でのタンパク質ドッキング法が確立できたと考える。そのため来年度に予定されている、膜タンパク質への応用を滞りなく開始することが可能となった。以上の事より、本研究はおおむね順調に進んでいると判断している。前年度までに構築したドッキングタンパク質のうち、Clostridium thermocellus由来のドックリン-コヘシンタンパク質の組み合わせを選択し、膜貫通タンパク質の発現を試みる。膜貫通タンパク質としては、細胞外領域にSS結合を多数有する甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR、膜7回貫通タンパク質)を利用する。ペリプラズム移行シグナル配列の下流にTSHR及びドッケリンタンパク質の遺伝子を融合する。
加齢に伴うコンドロイチン硫酸鎖の減少が妊孕性に及ぼす影響

高齢の不妊患者の生殖補助医療後の胚では、多核割球が高頻度に形成され妊孕性低下の原因となっている。多核割球の形成機序を解明するために以下の二つの研究に着目した。1コンドロイチン硫酸(CS)鎖の欠損胚では多核割球が形成される。2加齢に伴うCS鎖の減少が、加齢疾患の原因となっている。本研究では、以上の二つを基盤とし融合することで、加齢によるCS鎖の減少が多核割球形成の原因となっているという仮説を提唱し、検証した。これまでに、加齢に伴って卵巣内のCS鎖総量が減少すること、CS鎖の減少が割球間の脱離に影響を及ぼしている可能性を見いだした。しかし、その形成機序には不明な点が多く、また回避策として有効な手段も確立されていない。1コンドロイチン硫酸(CS)鎖の欠損胚では多核割球が形成され、さらに生体内においても骨格筋の分化過程でCS鎖の減少が多核化・融合の過程に重要である。本研究では、以上の二つの研究を基盤とし融合することで、加齢によるCS鎖の減少が多核割球形成の原因となり妊孕性低下の一因となっているという仮説を提唱し、検証している。今年度は、ライブイメージングの系の構築を行った。マイクロインジェクション法によってmRNAを導入し、紡錘体及び核を可視化することで卵割過程を観察した。その結果、コンドロイチン硫酸の減少した胚ではanaphaseでの核の分配に異常が観察されるだけでなく、分裂後に消失するはずの紡錘糸が分裂後にも架橋構造を維持していた。以上のことから、コンドロイチン硫酸の減少が契機となって、細胞質分裂の最終段階である細胞質の脱離に異常を呈している可能性が示唆された。さらに、加齢マウス卵巣における硫酸化グリコサミノグリカン鎖生合成関連遺伝子群の遺伝子発現解析を行ったところ、加齢によって大きく変化する遺伝子としてグリコサミノグリカン鎖の結合領域の生合成に関与する遺伝子で発現量が顕著に減少していることを明らかにしている。今後、加齢卵においても発現量が減少しているか検討する。1マイクロインジェクション法によってmRNAをCS欠損胚に導入し、前年度に構築したタイムラプス観察の系に適用した。実際に、mRNAの導入によって紡錘体及び核を可視化することで、卵割過程を観察したところ、CS欠損胚は細胞分裂の最終段階である割球間の脱離に失敗し、その結果、融合することで多核割球を形成していることが明らかとなった。2さらに、複数のプロテオグリカンが細胞分裂終期に形成される中央体に限局して存在することを免疫蛍光染色によって明らかにした。現在、候補となったコアタンパク質を発現するmRNAをCS鎖欠損胚に導入し、解析を進めている。3マウスの着床前胚からCS鎖の組成及び総量を検出する系を構築した。予想に反し、硫酸化されていないコンドロイチンの組成が最も多くを占めていることを明らかにした。現在、加齢胚に適用することで、加齢に伴ったCS鎖の減少を明らかにする。生殖糖鎖生物学初年度に計画していた加齢卵巣内卵細胞のコンドロイチン硫酸の発現量解析は、蛍光強度によって定量を試みていたが、蛍光強度での定量は困難であった。そこで、卵巣の凍結切片から卵細胞のみをレーザーマイクロダイセクションによって切り出し、定量解析を行うべく現在検討を行っている。着床前胚のタイムラプスイメージングについては、候補となるプロテオグリカンについて解析を行っている。着床前胚の遺伝子発現をRNA Seqによって網羅的に調べた論文を参考に、遺伝子発現量の高いプロテオグリカンを絞り込んだ。

着床前期に発現量が高いプロテオグリカンは、当初の予想よりも遙かに少なかった。絞り込みを行ったプロテオグリカンについては、順次発現ベクターへの構築を行う。また、卵細胞の遺伝子発現については、加齢マウス卵巣より直接卵を採取するレーザーマイクロダイセクションによって解決を図る。
大阪における近代絵画の展開

1.榮樂は大阪近代日本画の、塩田は大阪近代洋画の調査と研究を分担し、当該作家作品や文献等の基礎的な資料の収集等に努めた。2.最終年度の研究報告書作成にあたり、榮樂は「大阪で開催の美術展覧会」、塩田は「大阪関係主要洋画家の比較」をテ-マとした。二人とも、同テ-マを年表にまとめることとし、概論的に述べることを避けた。何故なら、当研究課題に関する研究つまり大阪画壇の大系的な研究は、これまで行われたことがなく、まともな年表すら無いのが現状で、その是正の一助を意図するのが実績であると考えたからである。3.榮樂の年表は、1868(明治元)年から1945(昭和20)年までに大阪府下で開催された美術展覧会の抄録である。展覧会は、日本画だけでなく、洋画、彫塑、工芸、建築などの展覧会まで言及した。併せて、同時期に大阪府下で組織されたり創設された美術団体、美術学校、美術研究所の事項も書き加えている。各展覧会の事項の内容は、展覧会名は言うに及ばず、会期、会場、一部については概要を記した。加えて各事項には必ず典拠文献の明示を欠かしていない。4.塩田の年表は、主題を多く大阪に求めた洋画家の代表として、鍋井克之、国枝金三,小出楢重、黒田重太郎を取り上げた。同年表では、同四人の同年の事項が一目で比較できるよう配慮している。四人に関する事項は、単に画歴だけに限定せず、家族、住居、エピソ-ド等にも触れた。四人の<大阪らしさ>と対比させるために、大阪を代表する小説家の織田作之助の事項も四人と同年に参考として掲載している。1、榮樂は大阪の近代日本画の、塩田は大阪の近代洋画の調査・研究を分担してきた。平成元年度は、三年度にわたる初年度で、二人とも、当該作家の基礎となる作品デ-タ、文献等の調査や収集を重点的に行った。2.榮樂は所属研究機関が現代美術を重視しているため、当研究課題を第二次世界大戦後の大阪における絵画の展開にまで敷衍し、先鋭的な絵画運動を繰り広げたグル-プ(デモクラ-ト美術家協会、現代美術懇談会、制作者集団・極、リアリズム美術家集団、テムポなど)についても調査している。平成元年度は、(1)出入りの激しかったデモクラ-ト美術家協会員名、(2)現代美術懇談会とテムポの会員名、展覧会数、展覧会期、展覧会場、展覧会評などについて新たな知見を得た。3.塩田は所属研究機関が美術の国際交流に力点を置いているため、大阪を代表する洋画家、とくに佐伯祐三と小出楢重の滞欧経験が二人の作風にどのような影響を与えているかについて調査している。平成元年度は、佐伯祐三の作品「郵便配達夫」(1928年)の背景に部分的に描かれたポスタ-がワグナ-の曲の演奏会のものであることに着目し、最晩年の佐伯が西洋音楽に親しんでいたのではないかという新しい見方を得た。4.今後、榮樂は第二次世界大戦後の大阪における先鋭的な絵画運動に関する基本事項の調査を聞書なども含めて重点的に行い、日本や外国における同時期の美術運動と対比しながら年表にまとめ、塩田は佐伯祐三と小出楢重における滞欧経験と作風との影響関係について二人を対比しながら深く堀り下げてゆく。1.榮樂は大阪の近代日本画の、塩田は大阪の近代洋画の調査・研究を分担しており、平成二年度は、三ケ年にわたる二年目で、二人とも、一年目に引き続き、当該作家の基礎となる履歴、作品デ-タ、文献等の調査や収集を行った。

2.榮樂は所属研究機関が現代美術を重要視しているため、当研究課題を第二次世界大戦後の大阪における絵画の展開にまで敷衍し、先鋭的な絵画運動を繰り広げたグル-プについても、一年目と同様、研究をつづけ、平成二年度も、各グル-プの会員名、展覧会数、展覧会期、展覧会場、展覧会出品リスト及び図版類、展覧会評などを重点的に調査した。3、塩田は所属研究機関が美術の国際交流に力点を置いているため、大阪を代表する洋画家、とくに佐伯祐三と小出楢重の滞欧経験が二人の作風にどのような影響を与えているかについて、一年目と同様、研究を続行し、平成二年度は、パリで佐伯祐三と親交のあった里見勝蔵、里見の師であるモ-リス・ド・ヴラマンク、この三人の影響関係、小出楢重の滞欧体験を彼の自筆文献に探ることなどを行った。4.今後、榮樂は大阪の近代日本画、塩田は大阪の近代洋画の展開について、日本や外国における同時期の美術運動などと対比しながら年表にまとめてゆく。また、榮樂は第二次世界大戦後の大阪における絵画運動に関する基本事項の調査を続行し、塩田は佐伯祐三と小出楢重における滞欧経験と作風との影響関係につての研究をさらに深める。大阪における近代絵画の展開について、平成元年度同二年度と同じように、榮樂は日本画を、塩田は洋画をそれぞれ引き続き分担し、下記のとおり調査・研究を行い、最終的に研究報告書を作成・発行した。1、当該作家作品や文献等の基礎的資料の継続的な収集と整理。2、二人の所属機関の性格を考慮に入れ、榮樂は現代美術という観点から大阪における戦後の絵画運動、塩田は美術の国際交流という観点から当該作家の渡欧体験と作風との影響関係の調査。3、当研究課題に共通する問題点を検討し、同課題の研究つまり大阪画壇の大系的な研究が従来行われたことがなく、まともな年表すらないことを確認。4、研究報告書用の各自のテ-マについての打合せを数回行い、同上問題点の是正の一助を意図して、榮樂は「大阪で開催の美術展覧会」、塩田は「大阪関係主要洋画家の比較」と決定(いずれも論文ではなく年表にまとめる)。5、同上テ-マに関する資料等の再整理と原稿執筆。6、同上原稿の検討会。7、研究報告書の作成。
神経線維腫症(NF1)におけるNF1遺伝子の発現について

はじめに皮膚神経線維腫(NF1)は,皮膚神経線維腫,カフェオレ斑,虹彩小結筋,脳脊髄腫瘍,骨変化など多彩な症候を特徴とする優性遺伝性疾患で,1990年にその遺伝子はクローニングされNF1遺伝子は17q11.2に座位し,その蛋白はneurofibrominと命名されている.しかし,その症状発生機構に関しては未だ不明な点が多く,これまで神経線維腫の正常対立遺伝子に異常を起こしているという報告やneurofibrominが低下したという報告もない.また,NF1遺伝子の変異のポットスポットも認められていない.そこで今回,抗NF1-GRD(GAP-related domain)抗体を用いて免疫組織化学的に神経線維腫におけるneurofibrominの局在について検討し,さらにNF1cDNAを用いたin situ hybridization法によりNF1mRNAの局在についても検討した.材料および方法NF-1に生じた神経線維腫20例,正常皮膚5例,皮膚線維腫5例,尖圭コンジローム2例およびミルメシア2例について10%ホルマリン固定パラフィン包埋切片,および凍結切片を用いて検討した.使用した抗体は,neurofibrominに対する抗NF1-GRD抗体でベクタステインABCキットを用いて免疫組織学的検索を行った.また,NF1mRNAの局在に関してはユタ大学Viskochilから分与されたNF1cDNA(10kbp)をプローブとしてDNAおよびRNA color kit(Amersham LIFE SCIENCE)を用いてin situ hybridization法を行った.なお,対照としてHPV-1DNA(8kbp)をプローブとしてミルメシアのHPV-1mRNAの局在を調べた.結果100倍希釈から1200倍希釈までの各種濃度で検討したが,神経,表皮細胞を含めた正常皮膚,神経線維腫,皮膚線維腫,ミルメシア,尖圭コンジローム全例においてNF1-GRDの発現は認められなかった.HPV-1DNAをプローブとしたHPV-1mRNAの局在はミルメシア病変部の有棘層の細胞質ならびに核に認められた.しかし,NF1cDNAをプローブとしたNF1mRNAの局在は神経線維腫,神経および表皮細胞を含めた正常皮膚のいずれにおいても発現は認められなかった.はじめに皮膚神経線維腫(NF1)は,皮膚神経線維腫,カフェオレ斑,虹彩小結筋,脳脊髄腫瘍,骨変化など多彩な症候を特徴とする優性遺伝性疾患で,1990年にその遺伝子はクローニングされNF1遺伝子は17q11.2に座位し,その蛋白はneurofibrominと命名されている.しかし,その症状発生機構に関しては未だ不明な点が多く,これまで神経線維腫の正常対立遺伝子に異常を起こしているという報告やneurofibrominが低下したという報告もない.また,NF1遺伝子の変異のポットスポットも認められていない.そこで今回,抗NF1-GRD(GAP-related domain)抗体を用いて免疫組織化学的に神経線維腫におけるneurofibrominの局在について検討し,さらにNF1cDNAを用いたin situ hybridization法によりNF1mRNAの局在についても検討した.材料および方法NF-1に生じた神経線維腫20例,正常皮膚5例,皮膚線維腫5例,尖圭コンジローム2例およびミルメシア2例について10%ホルマリン固定パラフィン包埋切片,および凍結切片を用いて検討した.使用した抗体は,neurofibrominに対する抗NF1-GRD抗体でベクタステインABCキットを用いて免疫組織学的検索を行った.また,NF1mRNAの局在に関してはユタ大学Viskochilから分与されたNF1cDNA(10kbp)をプローブとしてDNAおよびRNA color kit(Amersham LIFE SCIENCE)を用いてin situ hybridization法を行った.なお,対照としてHPV-1DNA(8kbp)をプローブとしてミルメシアのHPV-1mRNAの局在を調べた.結果100倍希釈から1200倍希釈までの各種濃度で検討したが,神経,表皮細胞を含めた正常皮膚,神経線維腫,皮膚線維腫,ミルメシア,尖圭コンジローム全例においてNF1-GRDの発現は認められなかった.HPV-1DNAをプローブとしたHPV-1mRNAの局在はミルメシア病変部の有棘層の細胞質ならびに核に認められた.しかし,NF1cDNAをプローブとしたNF1mRNAの局在は神経線維腫,神経および表皮細胞を含めた正常皮膚のいずれにおいても発現は認められなかった.
光照射による溶液中のシリコン表面の原子レベルでの構造変化

ある条件下で[112]方向にわずかに傾斜したSi(111)に溶液処理を施すと、完全ではないが直線的なステップが見られるようになり、ダイハイドライドステップの形成が起こりやすくなることがわかった。その条件について結論のみを記すと、1)シリコン基板がp型であること、2)フッ化アンモニウム濃度が高いこと(40%程度)、3)溶液のpHは7から8程度の範囲であること、4)溶液が溶存酸素を含んでいること。上記の結果から、最もダイハイドライドステップの現れやすい条件を選び、その条件での処理中に白色光の照射を行った。すると、暗所での処理では直線的なダイハイドライドステップ上にモノハイドライドステップで構成された三角形の突起が見られるが、0.2mW/cm^2程度の白色光を照射するとモノハイドライドステップが減少して直線的なダイハイドライドステップがさらに成長することがわかった。また、それより強い光を照射するとかえって表面構造が乱れてくる。なお、n型シリコンについては、光照射を行なってもダイハイドライドステップが観測されない。p型シリコンにおいては光照射により、溶解速度が促進されることが見出された。また、光照射によりその開回路電位が正にシフトすることも見出された。これらの結果より、光照射下では表面の正孔濃度が増大することによりダイハイドライドステップの形成が促進されると結論された。なお、光強度がさらに強くなると、正孔によりテラス部分も攻撃されて、結果的に表面が荒れるものと考えられる。
新たな分子標的薬の開発 : SELEX法を用いたEGFに対するRNAアプタマーの創製

ビオチンタグ化epidermalgrowthfactor (EGF)蛋白質を作製。このEGF蛋白質を用い、systematic evolution of ligands by exponential enrichment法(SELEX法)にて、ランダム配列をもつ合成オリゴヌクレオチドをもとにEGFに特異的結合するRNAを選別し、抗EGFアプタマー(RNAアプタマー)を取得した。このアプタマーによるEGFの受容体への結合阻害を検証した。本年度はEGFに対するRNAアプタマーの取得、アプタマーのEGFへの親和性、特異性、EGFRリン酸化阻害の検討を研究目標とし、以下のとおり実施した。1,ビオチンタグ化EGF蛋白質の作製。EGFタンパク質をコードするcDNAをPinPointTM Xa-1 T-Vectorのクローニングサイトに挿入。大腸菌でビオチンタグ化EGF蛋白質を発現させた。これを精製しビオチンタグ化EGF蛋白質を取得した。2,SELEX法N50のランダム配列をもつ合成オリゴヌクレオチドをPCRにて増幅。T7 RNA増幅法を行い、この増幅RNAをEGF蛋白と結合させる。EGFに結合したRNAのみを回収。Reverse transcriptionにて1st strand DNAを合成し、次に2nd strand DNAを合成する。これを次の選別に使用する。この一連の淘汰、選別、増幅の操作を15 round繰り返すことによって、EGFに特異的に結合するRNA(抗EGFアプタマー)を取得する。現在、この手法を行っておりRNAの回収を行っている。今後、以下の方法によって、アプタマーの選別、EGFRリン酸化阻害の検討を行う。3.アプタマーの選別(1)SELEX法にて得られたRNAのシークエンスを行い、共通配列の検索を行う。(2)ゲルシフトアッセイにて、抗EGFアプタマーとEGFとの結合を確認する。(3)リン酸化チロシンEGFR抗体を用いたウエスタンブロット法にて、アプタマーを加えたときのEGFRのリン酸化を定量。抗EGFアプタマーとEGFの結合によるEGFRのリン酸化阻害(シグナル伝達の阻害)を確認する。(4)ゲルシフトアッセイにてEGFと親和性が高く、EGFRリン酸化を最も阻害する抗EGFアプタマーを選別する。EGFに結合することによって、そのシグナル伝達を阻害するRNAアプタマーを取得する。新たな分子標的薬創製につなげていきたい。本年度は抗EGFアプタマーのEGFへ結合によるEGFRリン酸化阻害の検討、抗EGFアプタマーによる癌細胞株の増殖抑制効果の検討を研究目標とし、以下のとおり実施した。大腸菌でピオチンタグ化EGF蛋白質を発現させた。これを精製しピオチンタグ化EGF蛋白質を取得した。2,SELEX法N50のランダム配列をもつ台成オリゴヌクレオチドをPCRにて増幅。この増幅RNAをEGF蛋白と結合させる。Reverse transcriptionにて1st strand DNAを合成し、2nd strand DNAを合成する。この淘汰、選別、増幅の操作を15round繰り返すことによって、EGFに特異的に結合するRNA(抗EGFアプタマー)を取得した。今後、以下の方法によって、アプタマーの選別、EGFRリン酸化阻害の検討を行い、癌細胞株を用いた抗EGFアプタマーによる増殖抑制効果の検討を予定している。3,アプタマーの選別(1)SELEX法にて得られたRNAのシークエンスを行い、共通配列の検索を行う。(4)ゲルシフトアッセイにてEGFと親和性が高く、EGFR-リン酸化を最も阻害する抗EGFアプタマーを選別する。4,抗EGFアプタマーによる癌細胞株増殖抑制効果の検討。食道癌、胃癌、肺癌、乳癌細胞株に、抗EGFアプタマーを加え48時間接触させる。MTTアッセイにて増殖抑制効果を評価する。EGFに結合することにより、そのシグナル伝達を阻害するRNAアプタマーを取得する。