hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌をNK細胞へ抗原提示する抗体型分子標的治療薬セツキシマブの新たな治療戦略

セツキシマブの抗腫瘍効果にNK細胞が関与するかどうか検討するため抗アシアロGM1抗体を用いて、マウスの体内のNK細胞を除去し検討した。セツキシマブはNK細胞を除いた群で効果が減弱する傾向はみられたものの、明らかな有意差を得ることはできなかった。ADCC測定キットを使用しセツキシマブとADCC活性の関連性を検討したがセツキシマブによるADCC活性は使用した細胞株では検出できなかった。おそらく使用した癌細胞はEGFRの発現量が少なかったため十分なADCC活性を検出できなかったと考えられた。以上のことから今後はADCC活性の研究にEGFRの発現量が多い癌細胞を使用し検討を行う必要があると考えられた。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤であるセツキシマブは、KRAS等に遺伝子変異を有する患者に対しては無効とのことだが、実際に遺伝子変異のみではセツキシマブの抗腫瘍効果は語れないのが現状である。セツキシマブの効果判定因子の検索が行われているさなか、近年、セツキシマブの抗腫瘍効果の判断基準に新たな展開が見出された。セツキシマブはEGFRを標的とするIgG1抗体であり、NK細胞による抗体依存的細胞障害性(ADCC)を惹起することが明らかとなった。EGFRを過剰発現する頭頸部扁平上皮癌ではセツキシマブのADCCは非常に有効であり、今後、研究しなければならない課題となる。本研究は、セツキシマブの新たな抗腫瘍効果に関与する因子として、セツキシマブを介したNK細胞への癌細胞提示とEGFRシグナル阻害によるCXCL14の発現上昇に着目するため、あえてKRAS、BRAF、及びPIK3CAなどセツキシマブの抗腫瘍効果に関与する遺伝子に変異が存在しない細胞を使用する。今回の研究に向けて遺伝子変異が存在しない細胞はダイレクトシークエンスで確認し獲得済みである。まず、NK細胞の活性にCXCL14が関与するかどうか検討するため、CXCL14トランスジェニックマウスを使用しアシアロGM1を投与下でのセツキシマブの効果を検討した。結果としては、セツキシマブの効果は減弱するものの、アシアロGM1を投与したマウスは腫瘍の定着がよく、判定困難であった。H28はin vitroで詳細な検討で遂行する予定である。アシアロGM1が腫瘍の定着著しく関与し、判定困難であったため。これまでにEGF受容体阻害剤であるセツキシマブは、KRAS、BRAF、PIK3CA等に遺伝子変異が存在する症例に対して無効であることが報告されてきた。しかしながら、近年、セツキシマブの抗腫瘍効果の判断基準に新たな展開が見出された。セツキシマブはEGF受容体を標的とするIgG1抗体であり、NK細胞による抗体依存的細胞障害性をことが報告された。平成28年度はセツキシマブの抗腫瘍効果へのNK細胞の関与を解明するため、抗アシアロGM1抗体を用いて検討を行うことを目標とした。抗アシアロGM1抗体はNK細胞の細胞膜上に発現している糖脂質のアシアロGM1を認識する抗体であり、マウスに投与することで、体内のNK細胞を除去することが可能となる。実際にヌードマウスに抗アシアロGM1抗体を投与し、NK細胞欠損マウスを作製後、腫瘍細胞を移植し、セツキシマブによる抗腫瘍効果が減弱するかどうかを検討した。実験群としては、NK細胞を除去せず、1セツキシマブの投与を行っていないもの、2行ったもの、NK細胞除去後、3セツキシマブの投与を行っていないもの、4行ったもの、の4群とした。実験結果として、抗アシアロGM1抗体によってNK細胞を除去するとセツキシマブの効果が減弱するような傾向はみられた。しかしながら、NK細胞を除去することによって移植直後の腫瘍細胞の定着率が大きく異なってしまい、抗アシアロGM1抗体を投与した群と投与していない群の腫瘍サイズの比較が困難なことであった。ヌードマウスへの定着した腫瘍サイズが明らかに異なるため、大きな腫瘍と小さな腫瘍へのセツキシマブの効果を検討してしまう可能性が懸念され、まずはin vitroのデータ収集が好ましいと考えられた。実験自体は予定通り進行していると考えられる。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤であるセツキシマブは、KRAS等に遺伝子変異を有する患者に対しては無効と報告されているが、実際には遺伝子変異がないにもかかわらずセツキシマブが抗腫瘍効果抗腫瘍効果を示さない症例が多く存在する。近年、セツキシマブがEGFRを標的とするIgG1抗体であることから、NK細胞による抗体依存的細胞障害性(ADCC)が存在することが報告されている。私はセツキシマブの抗腫瘍効果にNKT細胞活性を有するCXCL14が関与することを明らかにしたことから、セツキシマブの抗腫瘍効果にCXCL14を介したADCC活性こそがセツキシマブの効果判定になりうると考え研究を進めてきた。セツキシマブの抗腫瘍効果にNK細胞が関与するかどうか検討するため、抗アシアロGM1抗体(NK細胞の細胞膜上に発現している糖脂質のアシアロGM1を認識する抗体)を用いて、マウスの体内のNK細胞を除去し、NK細胞の関与について検討した。しかしながら、NK細胞を除いたことにより移植した腫瘍の定着が顕著に良くなることで、セツキシマブ投与時の腫瘍サイズが異なってしまい傾向はみられるものの明らかな有意差を得ることはできなかった。ADCC活性においてもキットを使用し検討したが、セツキシマブによるADCC活性の上昇は報告例とは異なり確認できなかった。

理由として考えられることは、使用した癌細胞の細胞膜上のEGFRの量が少なく十分なADCC活性を検出できなかったことによると思われる。H29年度の研究としてはCXCL14ノックアウト細胞のRNAをサンプルに、CXCL14の機能を見出すためマイクロアレイを用いて網羅的解析を行ったところ、糖代謝、細胞の分化、神経疾患、腎機能などに関わる遺伝子が多く発現変動を示しており、その遺伝子発現について詳細に検討した。セツキシマブの抗腫瘍効果にNK細胞が関与するかどうか検討するため抗アシアロGM1抗体を用いて、マウスの体内のNK細胞を除去し検討した。セツキシマブはNK細胞を除いた群で効果が減弱する傾向はみられたものの、明らかな有意差を得ることはできなかった。ADCC測定キットを使用しセツキシマブとADCC活性の関連性を検討したがセツキシマブによるADCC活性は使用した細胞株では検出できなかった。おそらく使用した癌細胞はEGFRの発現量が少なかったため十分なADCC活性を検出できなかったと考えられた。以上のことから今後はADCC活性の研究にEGFRの発現量が多い癌細胞を使用し検討を行う必要があると考えられた。平成28年度はin vitroの実験を中心に遂行する。販売されているリコンビナントCXCL14は、大腸菌にとって作製されたものであり、活性も極めて低く、CXCL14の機能解析に用いることは困難である。そのため、3次元培養法を用いて、下層にCXCL14強制発現ベクターを導入した頭頸部扁平上皮癌細胞を、上層にNK細胞を播種し、NK細胞よりRNAを抽出後、マイクロアレイ解析を行う。本研究方法を用いることで、CXCL14がNK細胞に及ぼす影響を網羅的に解析することができる。また、同様の手法で、上層から下層に移動中のNK細胞を計測することでCXCL14によるNK細胞の遊走活性を併せて調査できる。実際にNK細胞除去後の腫瘍細胞移植によるセツキシマブの効果判定は困難と考えられる。そこで現在遂行している研究として、癌細胞からCXCL14をノックアウト及びノックアウトした細胞へのCXCL14強制発現細胞を作製し、NK細胞との供培養による反応を検討することも視野においている。実際に細胞は作製済みであり、NK細胞活性に関与する遺伝子が、ノックアウト細胞と強制発現細胞で異なることは確認済みである。口腔外科H28年度は論文執筆におもに時間がかかり、実際の研究の進行が遅れたと考えられる。in vivoの実験でNK細胞に対するCXCL14の作用を検討することから、マイクロアレイ(受託)等に研究費を使用する予定。H29年度は、頭頚部扁平上皮癌細胞がCXCL14刺激によって分泌するNK細胞活性に関わる遺伝子群を網羅的に解析することに重点を置く。さらには、セツキシマブのNK細胞活性に関与するかどうかについて併せて検討を行う予定である。
水銀のメチル化の場としてのマイクロプラスチックの新たな生態リスク

近年、マイクロプラスチック(以下MPと表記)による海洋汚染とその生態影響が懸念されているが、その詳細は殆ど不明確である。これまで、海洋中のメチル水銀は微生物の作用により無機水銀から生成されるとして知られてきたが、最近、海洋を漂流するMPの表面にバイオフィルムが形成され、さらにバイオフィルムに無機水銀が吸着されることが報告されたことから、バイオフィルム付着MPが新たな「メチル水銀生成の場」として機能する可能性が想定された。そこで本研究では、無機水銀のメチル化および水生生物のメチル水銀取込に与えるMPの影響を評価する。
海洋上に発達する縦渦による大気中への湿度取り込み機構

これまで長年にわたり行ってきた工学上重要な3次元境界層の乱流遷移に関する知識を気象学に応用する試みを行った。すなわち、冬の日本海上に達するすじ雲と日本海側に降大雪との関連を探る目的で風洞実験を行った。すじ雲は、日本海を暖流が北上し、その海面上に北西シベリア上空より寒気が流入するために浮力不安定が発生し、それが主原因で発生する縦渦の存在を示していると考えられる。この渦運動により大量の水蒸気が大気中に取り込まれる結果日本海側に大雪をもたらす、という仮設のもと温水平面モデルを風洞に設置、流れの可視化、水蒸気密度分布および温度分布などの測定を行った。その結果、一定の条件のもとで温水平面上に組織的縦渦が発生し、その縦渦が存在する範囲で水蒸気密度は完全乱流状態に比べておよそ3倍に増加し、表面気流温度も50%程増加することが判明した。このことは、縦渦の旋回運動が空気主流中の低蒸気密度、低温度の空気を温水面上の絶えず運び、と同時に温水面上の高蒸気密度、高温度の空気を主流中に運び去る役目をしていることを意味する。つまり、表面上に発達する縦渦が湿度の取り込み機構に明らかに貢献していることを示したことになる。更に、縦渦の成長過程で2次不安定波の発生がみられることも明らかにしたが、この2次不安定波が湿度取り込みにどのような役割を果たしているのかは解っていない。以上の結果をふまえて、今後より定量的なデ-タを得られる実験を計画し、気象学上の大雪のメカニズムとどのように関連づけられるかなどを検討していゆきたいと思っている。
末梢炎症時の髄膜傷害因子としてのIL-1βとその産生におけるカテプシンBの役割

本研究において、慢性の末梢炎症に対して髄膜-グリア連関は若齢ではニューロン保護的に、中年では逆にニューロン傷害的に作用し、髄膜バリア機能も破綻することが明らかとなった。中年ラットにおいて末梢炎症に伴って主にミクログリアに発現するIL-1βは密着結合タンパク質occludinの発現を有意に低下させることから、髄膜バリア機能も破綻においてIL-1βが中心的な役割を果すことが強く示唆された。さらに、中高年においては髄膜バリア機能の破綻ならびに脳炎症反応において中心的な役割を担っているミクログリアからのIL-1βの産生分泌においてカテプシンBが必須酵素として関与することが明らかとなった。本研究の目的であるIL-1βの脳バリア機構、特に髄液・脳関門に対する影響を解明することを目的とし、平成20年度はIL-1βによる髄液・脳関門の障害や白血球の脳内浸潤を誘導するメカニズムを解析した。具体的には、慢性炎症モデルであるラットアジュバント関節炎(AA)ならびにラットの初代培養髄膜細胞を用いて、加齢に伴う密着結合タンパク質発現や白血球の脳内浸潤動態変化にIL-1βの関与について解析を行った。その結果、AAを誘発した若年ラットの大脳皮質において、髄膜にIL-1βならびに誘導型プロスタグランジンE2合成酵素(mPGES-1)の発現が認められた。脳実質内のグリア細胞には抗炎症性サイトカイインのIL-10ならびにTGF-β1の発現が認められた。一方、AAを誘発した中年ラットの大脳皮質では、IL-1βならびにmPGES-1の発現が髄膜に加えて脳実質内のグリア細胞にも認められた。また、IL-10ならびにTGF-β1の発現の発現は低下していた。AAを誘発した中年ラットの大脳皮質では髄膜における密着結合タンパク質であるoccludinならびにZO-1の発現が低下しており、髄膜透過性の増大ならびに血球細胞の脳実質内への浸潤が認められた。次に初代培養髄膜細胞を用いてIL-1βならびにPGE2の密着結合蛋白質に対する影響を解析した。その結果、IL-1βならびにPGE2は各々occludinならびにZO-1の発現を有意に低下させた。一方、IL-10ならびにTGF-β1はIL-1βならびにPGE2の作用を抑制した。さらにリソソーム酵素であるカテプシンBのミクログリアによるIL-1βの産生分泌に対する役割を解析した。クロモグラニンAによる刺激を行ったところ野生型マウスより調整した初代ミクログリアではIL-1βの培養液への分泌が認められたが、カテプシンB欠損マウスより調整したミクログリアでは検出できなかった。以上の結果より、慢性の末梢炎症に対して髄膜-グリア連関は若齢ではニューロン保護的に、中年では逆にニューロン傷害的に作用し、髄膜バリア機能も破綻することが明らかとなった。このことから特に中高年者では慢性の末梢炎症が深刻な脳炎症を引き起こすことが示唆された。また、カテプシンBがIL-1Bの産生分泌に必須であることが強く示唆された。平成20年度の研究によりカテプシンB(CB)がミクログリアにおけるIL-1βの産生・分泌に重要な役割をもつことが明らかになったため平成21年度は野生型ならびにCB欠損マウスより調整した初代培養ミクログリアを用い、IL-1βのプロセシングならびに分泌におけるCBの役割について解明を行った。ミクログリアは野生型ならびにCB欠損マウスの大脳皮質より調整した混合培養より振とう法を用いて単離を行い、細菌培養用プラスチックシャーレに播種して静置した後、非付着細胞を除去する。セルスクレーパーを用いて接着細胞をシャーレから剥離することによりミクログリを回収した。回収したミクログリアをディシュに播種し、クロモグラニンAを培養液に添加後、経時的に細胞を回収し可溶分画を調整するとともに各々の時間での培養上清も回収した。これらの可溶分画ならびに培養上清について抗IL-1β抗体、抗体カスパーゼー1抗体、あるいは抗CB抗体を用いたイムノブロット解析を行った。その結果、野生型マウスより調整したミクログリアではクロモグラニンA適用24時間後にプロ型IL-1βは細胞内でプロセシングを受けて成熟型に変換し、細胞外に分泌されことが明らかとなった。一方、CB欠損マウスより調整したミクログリアではクロモグラニンA添加によりプロ型IL-1βは増大したが、成熟型のIL-1βの形成は48時間後においてもほとんど認められなかった。また、細胞外への成熟型IL-1βの分泌も認められなかった。さらにCB阻害剤のCA074Meによりプロ型カスパーゼー1の成熟型へのプロセシングが抑制された。以上の結果より、CBはプロ型カスパーゼー1の成熟型へのプロセシングを行うことで、プロ

型IL-1βの成熟型へのプロセッシングに間接的に関与することが明らかとなった。これまでの解析により、ミクログリアにおけるカテプシンBのアポトーシスにおける役割を解析する過程で、クロモグラニンA刺激によって誘導されるIL -1β産生分泌がカテプシンB欠損マウスから調整したミクログリアではほとんど生じないことが明らかとなった。ウエスタン解析の結果、カテプシンB欠損あるいはCAO74MeによりクロモグラニンAで誘導されるプロIL-1βの産生は影響されることなく成熟型へのプロセシングならびに細胞外への分泌が抑制されることが明らかとなった。また、細胞内局在を調べた結果、クロモグラニンAで処理したミクログリアにおいてもカテプシンBはリソソーム内局在を示唆する顆粒状の免疫反応を示していた。さらに、リソソーム指向性色素であるアクリジンオレンジならびにカテプシンB蛍光基質を用いた解析によってもカテプシンBの細胞質への漏出を示す証拠は得られなかった。通常の一次リソソームは直径1ミクロン程度であるが、カテプシンB、カスパーゼ-1ならびに成熟型IL-1βは直径4ミクロン程度に膨化したリソソーム内に共存していた。興味深いことにクロモグラニンAはAβと同様にクラスAスカベンジャー受容体を介して取り込まれることでミクログリアに作用し、リソソーム系の再編を引き起こすと考えられる。これらの結果より、クロモグラニンA刺激に伴って膨化したリソソーム内でカテプシンBによるプロカスパーゼ-1の活性化、引き続いてカスパーゼ-1によるプロIL-βの成熟型への変換が生じることが示唆される。膨化したリソソームの内容物はエクソサイトーシスにより細胞外に放出され、脳炎症反応を惹起するものと考えられる。
脂肪組織幹細胞から誘導した骨による3次元形状骨の形成に関する研究

ヒトの手術などでの残余脂肪を得て(倫理委員会許可済み)、脂肪組織幹細胞の培養を進めた。表面抗原CDマーカー検索しCD34(+)により脂肪組織幹細胞であることを確認し、骨、軟骨、脂肪への多分化能を確認した。脂肪組織幹細胞の骨分化誘導を行い、得られた骨芽細胞をシャーレ内で連通性ポアーを有するハニカムコラーゲンスポンジに播種し、ヌードマウス背部皮下に埋入し、8週後コラーゲンスポンジ部分を摘出し、軟X線写真、ならびに光学顕微鏡、電子顕微鏡により組織学的評価を進めた。特にハニカムポアー内への骨量と骨の進入状況を検討した。ヒトの正常脂肪組織を下腹部より採取し,コラゲナーゼ処理によりASCsを調整し、サブコンフルエントに達するまで培養した。ASCsを骨分化誘導培地で7,14日間培養したのち,アルカリフォスファターゼ活性を,Alkaline Phophatase Detection Kitを用いて測定した。ASCsは96wellプレートに10^4/穴ずつ播種し,Ex:340 nmEm:450 nmで蛍光を測定した。培養期間が長くなるにしたがって,アルカリフォスファターゼ活性が上昇するのを確認した。骨分化誘導培地で培養した3次元培養骨を、走査電子顕微鏡で観察した。培養14日目で、atelocollagen honeycomb shaped scaffoldの穴にASCsが入り込み、横断面においてもscaffoldの内部まで増殖している様子が観察された。以上より、コラーゲンスポンジでの3次元培養においてASCsは骨細胞に分化することを確認できた。次いで2週間培養したコラーゲンスポンジをヌードマウス皮下へ移植し,8週間後に取り出し,その組織切片をHE染色Von Kossa染色して観察すると,新生骨形成を認めた。コラーゲンスポンジは,ASCsの骨分化におけるscaffoldとして有用であり、この様式で、ヒト正常脂肪組織から得られたASCsを応用し、3次元立体の骨組織再生への基本的3次元骨の誘導経路が確認できた。昨年19年度と同様の基盤として、ヒトの手術などでの残余脂肪を得て(倫理委員会許可済み)、脂肪組織幹細胞の培養に進めた。まず、新たなる系で脂肪組織幹細胞が多分化能を持つことを再度確認した。FACSにより表面抗原CDマーカー検索しCD34(+)により脂肪組織幹細胞であることを確認し、さらに、骨分化、軟骨分化、脂肪分化培地に適用後それぞれ骨・軟骨・脂肪への多分化を確認した。骨分化誘導とハニカムコラーゲンスポンジへの播種、埋入後の3次元形状骨の評価の系として、得られた脂肪組織幹細胞を、24wellマルチプレートに8×10^4個播種し、コントロール培地、骨分化培地で培養し比較検討した。2週後、von Kossa染色と培養液のAlkaline Phosphatase(ALP)活性、RT-PCRによりosteocalcin mRNAを検査した。得られた骨芽細胞をシャーレ内で連通性ポアーを有するハニカムコラーゲンスポンジに播種し、ヌードマウス背部皮下に埋入し、8週後コラーゲンスポンジ部分を摘出し、軟X線写真、ならびに光学顕微鏡、電子顕微鏡により組織学的評価を進めた。一部は生化学的にALP活性、osteocalcin mRNAで骨量を検討した。脂肪組織から幹細胞を単離培養し、骨の3次元形状骨を得る系で、幹細胞から骨芽細胞を導く段階に、サイトカイン(bFGF, TGF-β1, BMP-2)を各培養液中に付加し、骨芽細胞の増生ならびに誘導された骨量と骨の性状の比較検討を行った。検討項目として、軟X線写真、ならびに光学顕微鏡、電子顕微鏡により組織学的評価を行った。一部個体は生化学的にALP活性などで骨量を検討した。過去2年の実験を基盤として、ヒトの手術などでの残余脂肪を得て(倫理委員会許可)、脂肪組織幹細胞の培養に発展させた。まず、新たなる系で脂肪組織幹細胞が多分化能を持つことを検証した。1)FACSにより表面抗原CDマーカーCD34(+)で脂肪組織幹細胞であることを確認し、骨分化、軟骨分化、脂肪分化培地に適用後それぞれ骨・軟骨・脂肪への多分化を確認した。2)骨分化誘導とハニカムコラーゲンスポンジへの播種、埋入後の3次元形状骨の評価の系として、得られた脂肪組織幹細胞を、24wellマルチプレートに8×10^4個播種し、コントロール培地、骨分化培地で培養し比較検討した。

3)得られた骨芽細胞をシャーレ内で連通性ポアーを有するハニカムコラーゲンスポンジに播種し、ヌードマウス背部皮下に埋入し、8週後コラーゲンスポンジ部分を摘出し、軟X線写真、ならびに光学顕微鏡、電子顕微鏡により組織学的評価を進めた。特にハニカムポアー内への骨量と骨の進入状況を検討した。一部は生化学的にALP活性、osteocalcin mRNAで骨量を検討した。脂肪組織から幹細胞を単離培養し、骨の3次元形状骨を得る系で、幹細胞から骨芽細胞を導く段階に、サイトカイン(bFGF, TGF-β1, BMP-2)を各培養液中に付加し、骨芽細胞の増生ならびに誘導された骨量と骨の性状の比較検討を行った。4)軟X線写真、ならびに光学顕微鏡、電子顕微鏡により組織学的評価を行った。一部個体は生化学的にALP活性などで骨量を検討した。
チアミン反応性貧血症候群におけるチアミンピロホスホキナーゼの動態解析

先天性代謝異常症であるチアミン反応性貧血症候群(TRMA、OMIM249270)は巨赤芽球性貧血と糖尿病、難聴を三主徴とし、チアミンの大量投与によりそれらの症状が軽減するチアミン依存症である.本症の原因異常酵素としてチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)とチアミン輸送タンパク質のいずれかが考えられていたが、申請者はイスラエルのCohenらとの共同研究で本症の原因遺伝子(THTR-1)を決定し、THTR-1が高親和性チアミン輸送タンパク質をコードすることを明らかにした.一方、マウスのESTデータベースのホモロジー検索、2-step PCR法、および酵母のTPK欠損変異株の機能相補スクリーニングを組み合わせて、初めて哺乳類のTPK cDNAをマウスより単離し、続いてコロニーハイブリダイゼーション法によりヒトのTPK cDNA(hTPK1)を単離した.hTPK1翻訳産物は243残基のアミノ酸からなる分子量約27000のタンパク質でマウスのTPKと89%のアミノ酸が一致していた.hTPK1mRNAの発現量は非常に少ないが、検討した12種類の組織のほとんどで認められた.また、TRMA患者の線維芽細胞をチアミンの低濃度(3nM)の条件下で培養させると細胞内総チアミン濃度は低下したが、hTPK1mRNA量は変化しなかった.以上より、hTPK1遺伝子は細胞内チアミンあるいはチアミンピロリン酸に調節を受けず各組織で構成的に発現していることが示唆された.さらに、FISH法による染色体マッピングによりhTPK1遺伝子は7q34に存在することを決定したが、ヒトゲノム情報によりhTPK1遺伝子は少なくとも8個のエキソンからなり、365-kb以上の大きさを持つことも明らかとなった.先天性代謝異常症であるチアミン反応性貧血症候群(TRMA、OMIM249270)は巨赤芽球性貧血と糖尿病、難聴を三主徴とし、チアミンの大量投与によりそれらの症状が軽減するチアミン依存症である.本症の原因異常酵素としてチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)とチアミン輸送タンパク質のいずれかが考えられていたが、申請者はイスラエルのCohenらとの共同研究で本症の原因遺伝子(THTR-1)を決定し、THTR-1が高親和性チアミン輸送タンパク質をコードすることを明らかにした.一方、マウスのESTデータベースのホモロジー検索、2-step PCR法、および酵母のTPK欠損変異株の機能相補スクリーニングを組み合わせて、初めて哺乳類のTPK cDNAをマウスより単離し、続いてコロニーハイブリダイゼーション法によりヒトのTPK cDNA(hTPK1)を単離した.hTPK1翻訳産物は243残基のアミノ酸からなる分子量約27000のタンパク質でマウスのTPKと89%のアミノ酸が一致していた.hTPK1mRNAの発現量は非常に少ないが、検討した12種類の組織のほとんどで認められた.また、TRMA患者の線維芽細胞をチアミンの低濃度(3nM)の条件下で培養させると細胞内総チアミン濃度は低下したが、hTPK1mRNA量は変化しなかった.以上より、hTPK1遺伝子は細胞内チアミンあるいはチアミンピロリン酸に調節を受けず各組織で構成的に発現していることが示唆された.さらに、FISH法による染色体マッピングによりhTPK1遺伝子は7q34に存在することを決定したが、ヒトゲノム情報によりhTPK1遺伝子は少なくとも8個のエキソンからなり、365-kb以上の大きさを持つことも明らかとなった.先天性代謝異常症であるチアミン反応性貧血症候群(TRMA、OMIM 249270)は巨赤芽球性貧血と糖尿病、難聴を三主徴とし、チアミンの大量投与によりそれらの症状が軽減するチアミン依存症である。本症はチアミン反応性楓糖尿病や高乳酸血症のような補酵素チアミンピロリン酸依存性酵素の遺伝的障害によるものではない。動物では摂取したチアミンをチアミンピロリン酸として利用するためにはチアミン輸送タンパク質とチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)が必要であり、研究代表者は本症の異常酵素として最も可能性が高いと考えられたTPK遺伝子の単離を試みた。そして、マウスのESTデータベースのホモロジー検索、2-step PCR法、および酵母のTPK欠損変異株の機能相補スクリーニングを組み合わせて、初めて哺乳類のTPK cDNAをマウスより単離した。一方、イスラエルTechnion-Israel Institute of TechnologyのCohenらとの共同研究でTRMA遺伝子の染色体マッピングを進めていたが、ついに原因遺伝子(THTR-1)を決定し、THTR-1が高親和性チアミン輸送タンパク質をコードすること、日本人を含む数家系での変異部位等を明らかにした。現在、ヒトのTPK cDNAの単離に成功したので、TRMA患者細胞におけるTPKの発現等について検討している。先天性代謝異常症であるチアミン反応性貧血症候群(TRMA、OMIM249270)は巨赤芽球性貧血と糖尿病、難聴を三主徴とし、チアミンの大量投与によりそれらの症状が軽減するチアミン依存症である.本症の原因異常酵素としてチアミンピロホスホキナーゼ(TPK)とチアミン輸送タンパク質のいずれかが考えられていたが、申請者はイスラエルのCohenらとの共同研究で本症の原因遺伝子(THTR-1)を決定し、THTR-1が高親和性チアミン輸送タンパク質をコードすることを明らかにした.

一方、マウスのESTデータベースのホモロジー検索、2-step PCR法、および酵母のTPK欠損変異株の機能相補スクリーニングを組み合わせて、初めて哺乳類のTPK cDNAをマウスより単離し、続いてコロニーハイブリダイゼーション法によりヒトのTPK cDNA(hTPK1)を単離した.hTPK1翻訳産物は243残基のアミノ酸からなる分子量約27000のタンパク質でマウスのTPKと89%のアミノ酸が一致していた.hTPK1 mRNAの発現量は非常に少ないが、検討した12種類の組織のほとんどで認められた.また、TRMA患者の線維芽細胞をチアミンの低濃度(3nM)の条件下で培養させると細胞内総チアミン濃度は低下したが、hTPK1 mRNA量は変化しなかった.以上より、hTPK1遺伝子は細胞内チアミンあるいはチアミンピロリン酸に調節を受けず各組織で構成的に発現していることが示唆された.さらに、FISH法による染色体マッピングによりhTPK1遺伝子は7q34に存在することを決定したが、ヒトゲノム情報によりhTPK1遺伝子は少なくとも8個のエキソンからなり、365-kb以上の大きさを持つことも明らかとなった.
イオントラップ中冷却イオンの相転移近傍における統計力学的諸量の測定

イオントラップに閉じ込めた一成分プラズマをドップラーレーザー冷却することで、イオン温度を絶対零度近くまで下げることができる。本研究課題は、極低温プラズマの物性に対するクーロン相互作用の影響を、実験的に明らかにすることを目的としている。本研究課題で、冷却プラズマのレーザー誘起蛍光(LIF)スペクトルを非破壊観測する方法を確立した。この方法を用いて、イオン温度を室温程度から極低温に冷却する過程で、イオンのLIFスペクトルが異常な形状変化を示すことを明らかにした。イオントラップとは、電磁場を用いてイオンを閉じ込める装置のことである。この装置による閉じ込めは、イオンと外界との相互作用が小さく、閉じ込め時間が非常に長いといった特徴がある。この特徴を活かし、イオンのみからなる一成分プラズマを、外部から入射されるレーザーと長時間相互作用させてレーザー冷却し、強結合プラズマを生成することが可能である。強結合プラズマ状態とは、イオン間のクーロンエネルギーが熱エネルギーを上回った状態で、このような粒子間の相関が強い系の統計力学的な物性には未解明な部分も多い。本研究は、強結合プラズマの統計力学的な物性を明らかにすることを目的としている。今年度は、レーザー冷却されたイオンの温度を安定化し、系統的な実験を可能とするため、冷却用レーザーの周波数安定化を行った。その結果、外部共振器からの光フィードバックを利用して、短期の周波数揺らぎの幅を6MHzに抑制するとともに、ファブリーペロー干渉計の干渉縞を電気的フィードバックで安定化することで長期の周波数ドリフトを、10kHz/minへと抑えることに成功した。また、従来のドップラーLIF法を用いて、レーザー冷却されたプラズマを観測した場合、観測による擾乱を無視することが出来ないため、低擾乱な観測法として強度変調したプローブレーザーによる観測法を考案し、その基本システムとなるSHGレーザーシステム、強度変調に対応した光子計数LIFシステムを構築した。来年度は、プローブレーザーによる観測系を現システムに組み込み、冷却プラズマの低擾乱観測実験を開始する予定である。我々は,RFトラップ中に閉じ込めた一成分プラズマが弱結合状態から強結合状態に至る過程でクーロン相互作用がプラズマの統計力学的な特徴にどのような影響を与えるかを,精密に調べることを目的として研究を行っている.プラズマの結合状態は,レーザー冷却技術を用いて,イオン温度を数千ケルビンから数十ミリケルビンの範囲で制御することによって変化させる.これにより,非常に高精度にプラズマの状態を制御することが可能であるが,極低温に冷却されたプラズマは非常に脆弱なため,その状態を非破壊で観測する方法は確立されていない.本研究は,RFトラップ中で生成された強結合プラズマの非破壊観測法の確立,およびそれを用いて中規模程度(粒子数数十から数万個程度)の古典的強結合プラズマの臨界点近傍におけるダイナミクスの詳細を解明することを目的としている.平成20年度は,冷却イオンを非破壊観測するプローブレーザー法を確立し,レーザー冷却プラズマのレーザー誘起蛍光スペクトルの観測を行った.これによって,レーザー冷却過程におけるイオン温度の変化を初めて非破壊観測した.また,レーザー冷却プラズマのスペクトルを正確に観測することによって,冷却過程における結合状態の変化に伴い,レーザー誘起蛍光スペクトルの非ボルツマン成分に顕著な変化が生じることが確認された.この変化が,イオン-イオン相互作用による衝突広がりであるか,プラズマのダイナミクスの変化を表すのかについて検討を行っている.本研究は、強結合プラズマの物性に対する長距離相互作用の影響を明らかにすることを目的としている。イオントラップに閉じ込められた一成分プラズマは、レーザー冷却技術を用いてイオン温度を制御することで弱結合状態から強結合状態までプラズマを変化させることが出来るため、長距離相互作用の効果を系統的に研究するのに適した系である。しかし、レーザー冷却されたプラズマは非常に脆弱なため、その測定手段は限られており、従来用いられてきたレーザー誘起蛍光(LIF)法では観測による擾乱によって歪められたスペクトルしか得られない。我々は、微弱なプローブレーザーを用いた観測法を確立し、初めて冷却プラズマのLIFスペクトルを非破壊で観測することに成功した。これにより、スペクトル形状に関する詳細な議論を可能にした。このプローブレーザー法を用いて、弱結合状態から強結合状態へと遷移する過程でLIFスペクトルを観測し、フォークト分布を仮定してスペクトル形状の変化を詳細に調べた。その結果、弱結合-強結合の境界領域では、LIFスペクトルのローレンツ成分が異常に大きな値(約100MHz)になることが明らかとなった。この値は2体の衝突周波数(数百kHz)と比較して3桁程度大きな値である。このようなローレンツ幅の特異な変化は,強結合状態でのクーロン多体相互作用の影響が観測された初めての例と考えられ、さらに詳細な観測を進めている。
CD4+CD8+マクロファージの抗腫瘍メカニズムと免疫学的役割に関する研究

ラット脾臓内CD4+CD8+マクロファージを用いて、数種類の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を検討し、またそのメカニズムを解析したところ、NK細胞と同様に、活性型NKレセプター(NKRP2)を介して腫瘍細胞表面上のRAET1分子を認識し、granzymeやperforinなどの細胞傷害因子を分泌することで、抗腫瘍細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。本年度の中心となる研究計画として,CD4^+CD8^+マクロファージによる細胞傷害メカニズムの解明を目的とした解析を開始した。初めに4種類の腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を検討したところ,細胞傷害感受性に顕著な差が認められた。そこで,それらの腫瘍細胞株からmRNAを抽出し,細胞傷害関連分子のプロファイリングを行なったところ,ラットRAET1分子の細胞傷害感受性株での高発現が認められたのに対して,最も抵抗性を示した細胞株ではRAET1分子の発現はほとんど観られなかった。RAET1は活性化型NKレセプターの一つであるNKG2Dのリガンドであることが知られており,NK細胞による標的細胞認識に重要な役割を担っていることがすでに報告されている。そこで,NK細胞と同様に,RAET1分子がCD4^+CD8^+マクロファージによる細胞傷害過程にも関与しているかを検討するため,RAET1の発現ベクターを遺伝子導入した過剰発現細胞株に対する細胞傷害活性を測定した。その結果,非遺伝子導入細胞株と比較して,RAET1分子の遺伝子導入により細胞傷害活性が増強することを確認した。また,以前から本細胞での高発現が認められているgranzymeやperforinなどの細胞傷害因子のinhibitorを用いると,細胞傷害活性がほぼ完全に抑制されることも確認した。これらの結果から,本細胞は活性型NKレセプターを介した標的細胞の認識により,granzyme/perforin依存性の細胞傷害活性を示すことを証明した。これらの結果は,Journal of Immunologyに報告し,腫瘍免疫療法における新しいエフェクター細胞としての有用性が期待されている。昨年度の研究結果から、ラット脾臓CD4^+CD8^+マクロファージは、NK細胞と同様に、活性型NKレセプターを介して腫瘍細胞表面上のRAET1分子を認識し、granzymeやperforinなどの細胞傷害因子を介した抗腫瘍細胞傷害活性を示すことが明らかとなっており、腫瘍免疫療法における新しいエフェクター細胞としての有用性が期待されている。そこで、本年度は、腫瘍細胞を皮下接種した、担がんラットモデルに対するin vivoでの抗腫瘍活性の検討、ラット脾臓CD4^+CD8^+マクロファージのcDNAマイクロアレイ解析による新たな細胞特異マーカーの抽出、さらには、その結果得られた分子を標的とした、ヒトやマウスにおけるカウンターパートの同定に着手した。その結果、結核死菌をfootpadに免疫することで本細胞群を高頻度に分化させたラットに対して腫瘍細胞を摂取することで、未処置の対照群と比較して顕著に腫瘍増殖が抑制されることを見出した。さらに病理組織学的解析から、腫瘍組織内へのgranzymeを発現した本細胞群の有意な浸潤が観察された。また、cDNAマイクロアレイ解析の結果から、leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily B(Lilrb)を始めとするいくつかの細胞表面分子の高発現が観察された。しかしながら、定量的PCR法による詳細な解析の結果、結核死菌を免疫したラットから採取したCD4^+CD8^+マクロファージと生理的条件下で採取したものでは、発現パターンが異なっており、ヒトやマウスでのカウンターパートの指標としては、本細胞の分化過程における経過的解析など、さらに詳細な検討を必要とする。一方で各種疾患との関連性も踏まえ、腫瘍性疾患、自己免疫疾患などの様々なマウスモデルを用いて、現在、ヒト・マウスでの本細胞群の同定を目標として解析を進めている。
抗B型肝炎ウイルス機構に誘導される発がん

慢性B型肝炎ではHBVを完全に除去できれば肝硬変、肝がんへの進行が止まるが、既存の治療法では血中HBV量を減少させることはできても、ウイルスの核内フォームであるcccDNAが細胞に維持されたままである。抗ウイルス因子として知られるAPOBEC3GをはじめとするAID/APOBECファミリーがHBVにおいても発現誘導されウイルスゲノムへ変異を導入することが報告されている。本研究では核内の塩基除去修復因子であるUNGがこの変異をcccDNAの段階で修復している可能性を示した。我が国の肝がん患者は20%がB型肝炎ウイルス(HBV)を保有しているが、ウイルスによる発がんがなぜ起こるのかは依然として明らかではない。宿主因子であるAPOBEC3Gは、ウイルスゲノムにC-to-Uの高頻度突然変異(hypermutation)を導入しウイルス複製を抑制するため、自然免疫因子として働くと考えられているが、本研究課題ではこのAPOBEC3Gを含むAPOBECsファミリーの直接的な作用及び関連因子の作用が、肝がん発症の引き金となる可能性を検討している。本年度はC-to-Uによって生じるHBVDNA上のUに対する宿主因子UNGの作用を詳細に調べた。UNG阻害蛋白質であるUGIあるいはsiRNAを用いたUNGノックダウン実験により、インターフェロンα及びγで誘導されるAPOBECsによるHBV hvpermutationをUNGがキャンセルしていることを配列解析から明らかにした。APOBEC3Gによるウイルス抑制機構として、単なる変異導入のみならずウイルスDNA上のUをUNGが除去することによってDNA断片化を引き起こすというモデルが考えられているが、本実験ではウイルス粒子内のDNAにおいてUNGによる断片化は確認されなかった。ウイルス粒子を形成するHBc蛋白質の免疫沈降では、APOBEC3Gは共沈されたがUNGは検出されず、hypermutationがウイルス粒子内で起こるのに対して、UNGの作用は、核局在型のUNG2が核内において少ないコピー数で存在するHBV cccDNAをターゲットにしていると考えられた。cccDNAはB型肝炎治療で用いられる抗ウイルス薬ラミブジンによっては除去されず、薬剤耐性やがん関連変異をはじめとする様々な変異株出現のソースと成り得るので、UNGがこのDNA formに対する変異率に影響を及ぼすことは重要な知見である。また、UNGによるウイルス粒子内HBV DNAの断片化は検出されなかったが、核内cccDNA断片化やこれに付随する細胞ゲノムへの挿入についてはがん化誘導とも関連して検討が必要と考えられるため、核内ウイルスDNAに対するAPOBECsとUNG作用についてさらなる解析を進めている。本年度は、核内に存在するHBV cccDNAに対するUNGタンパク質の作用について、より詳細な解析に取り組んだ。HBVを安定発現する肝細胞培養株に対するインターフェロンαの刺激によりAPOBECs発現を誘導した後、抗ウイルス薬ラミブジンを添加した。ラミブジンは新たなHBV DNAの合成を止めるが、cccDNAは除去されない。この条件でUNG阻害によるcccDNAにおける変異頻度の検討をした。また、cccDNAの産生量が多く解析が容易であるduck HBV (DHBV)を用いて、APOBECs、UNGの作用を検討した。HBV cccDNAをターゲットとした配列解析の結果、インターフェロンαにより引き起こされるウイルスゲノム上のC-to-U変異をUNGが核内で除去していることが示された。DHBVを用いた配列解析でも同様の結果が得られた。APOBEC3Gによるウイルス抑制機構の説明として、単なる変異導入のみならずその後のUNGによるU塩基除去がDNA断片化を引き起こすというモデルが想定されているが、DHBV cccDNA量はUNG活性の阻害によっては変化が見られなかった。これらのことから核内で起こるU塩基除去はウイルスDNAの断片化ではなく、細胞ゲノムにおける作用と同様に変異修復に働いている可能性が示唆された。慢性B型肝炎ではHBVを完全に除去できれば肝硬変、肝がんへの進行が止まるが、既存の治療法では血中HBV量を減少させることはできても、細胞内cccDNAが維持されたままである。UNGはこのウイルスのリザーバーであるcccDNAの変異をキャンセルすることが本研究で示唆され、ウイルスに利する方向に働いていると考えられる。また、高頻度の突然変異はウイルスの遺伝情報を破壊するが、この変異率を低くするUNGの作用は、バランスによっては逆に薬剤耐性やがん化関連変異株出現の要因となりうる。以上より、本研究からHBVに対する抗ウイルス機構に付随して起こるUNG作用の病理学的意義を示す結果が得られた。
水中放電による超臨界状態を利用した環境汚染物質の分解

超臨界状態の水はその高い反応性からそれを反応場とする各種の分解・合成反応への応用が期待されており、特に難分解性物質の分解反応場としての利用が検討されている。従来の超臨界水処理の問題の一つとして大がかりな装置とエネルギー効率の問題が挙げられる。本研究では超臨界状態を簡易に低コストで実現するために水中放電ならびに気液界面でのパスルストリーマ放電あるいはコロナ放電の利用の検討を行った。特に気相を介した液体表面への放電では気相中での反応と液相中での反応が同時に起こり、エネルギー効率が向上することが期待される。本研究では排ガス中の硫黄分除去のキーテクノロジーとなる液相の亜硫酸イオンの硫酸イオンへの酸化を対象とし、同軸型プラズマ反応装置の壁面に水膜を形成した湿式プラズマ反応装置を用いた。400ppm程度のSO2ガスを流した反応装置に放電プラズマを発生させるこで、SO2ガスの気相からの除去が促進されることがわかった。また、イオンクロマトグラフにより液体中の亜硫酸イオンと硫酸イオンの存在比を調べた結果、放電プラズマなしの場合はほとんどが亜硫酸イオンであったのに対して放電プラズマの存在下ではその多くが硫酸イオンとして観測された。また、水のかわりにOHラジカルとの反応性が高いメタノール水溶液を用いた場合には酸化が抑制されることが分かった。これらのことは気液および液相での放電により亜硫酸イオンの酸化が起こったことおよびその過程には何らかの形でOHラジカルが関与している可能性が高いことを示唆している。超臨界状態の水は非常に高い密度を持つ気体の状態であると考えることができる。このような見地から本年度は水中放電のための基礎的なデータを収集するため、高温水蒸気中での放電の実験系を構築し、電流電圧特性およびアセトアルデヒドに対する分解特性、オゾン生成特性の検討を行った。放電空間の温度は100°C、水蒸気発生量は液体状態で1ml/minとし、反応器内を完全に水蒸気で置換した後実験を行った。正および負コロナ放電の電圧電流特性を測定した結果、正極性、負極性ともに水蒸気存在下ではドライ条件よりもコロナ開始電圧が高くなるという結果を得た。また、同じ印加電圧では水蒸気存在下では電流値が小さくなることがわかった。アセトアルデヒドを空気で希釈したもの(濃度3ppm)を模擬ガスとして4l/minの割合で上記の水蒸気と混合し、放電を行った。その結果、ドライ条件下での正極性コロナ放電では数ppmのオゾンが生成したが、水蒸気存在下では発生量は約1/10であった。アセトアルデヒド分解率に関しては、正コロナの比較的電流値が大きな領域(約10μA以上)を除いては水蒸気が存在する場合の方がドライ条件よりも高い分解率を示した。このことは非常に低いオゾン発生にも関わらず、アセトアルデヒドの除去が可能であることを示唆している。
記号としての「身体」-青年運動と文学における「身体」の馴致・政治化の研究-

研究発表の欄に記載した論文3編を執筆した。「ナチス・イデオロギーの多元性-ナショナリズムとジェンダー配置の考察-」ではナチスの二大イデオローグであるアルフレート・ローゼンベルクとアルフレート・ボイムラーにおける男性同盟賛美と女性蔑視の傾向を論じた。「『女性的なるもの』の位相-母権制と反ユダヤ主義に関する試論-」ではバッハオーフェンの母権論に対するボイムラーとルートヴィヒ・クラーゲスの解釈の対比し、両者の反ユダヤ主義が「女性的なもの」とどのように切り結んでいるかを考察した。加えてボイムラーのバッハオーフェン解釈に対するトーマス・マンの批判の妥当性に関しても言及した。「男性同盟とホモソーシャリティ-同性愛と政治のディスクルス-」ではセジウィックの「ホモソーシャリティの理論」を援用して、オットー・ヴィニンガー、ローゼンベルク、ボイムラー、ハンス・ブリューアーの男性同盟イデオロギーを分析した。なおこの原稿は、2002年度秋季日本独文学会で研究代表者が企画・司会を担当したシンポジウム「青年運動と文学」における口頭発表に加筆・修正を加えたもので2003年5月発行予定の「日本独文学会研究叢書」の第20巻に所収される。
情報量基準に基づく細胞集団の多重分類・比較方式の開発と細胞アトラスへの応用

1細胞RNAシーケンス技術の発展により、様々な臓器・組織の細胞集団の持つ遺伝子発現プロファイルが細胞アトラスとしてまとめられつつある。本研究では、細胞集団中で遺伝子発現に関連が認められる細胞どうしを辺でつないだネットワークを構築し、ベイズ情報量基準に基づくスコアを導入して、スコアの高い部分ネットワークを抽出することで細胞間相互作用のネットワークを推定する。次元削減を使わずに、ネットワーク中での辺の接続関係をもとに細胞集団を比較・分類することが独創的な点である。
経強膜マルチドラッグデリバリーによる神経網膜保護研究

多剤を独立徐放性制御可能な経強膜マルチドラッグデリバリーシステム(DDS)を開発した。デバイスは微細成型したリザーバー、徐放膜、薬剤の3つから構成される。これらの基材として、光硬化性のポリエチレングリコールジメタクリレート(PEGDM)とトリエチレングリコールジメタクリレート(TEGDM)を使用した。薬剤の放出性はPEGDM/TEGDMの組成非で制御可能である。3種類の蛍光色素徐放デバイスをラット眼へ移植した結果、4週にわたって眼内に色素が確認できた。エダラボンとウノプロストンのマルチ徐放デバイスをラット眼に移植し、網膜光障害を行った結果、網膜電図等の解析からデバイスの網膜保護効果を確認した。本研究は、網膜疾患治療における低侵襲で効率的な眼内薬物投与デバイスとして「経強膜ドラッグデリバリーシステム(DDS)」を開発し、実際の臨床薬物を複数徐放化するデバイス条件を確立し、網膜変性動物モデルを用いて網膜保護効果を評価することが目的である。3年計画の1年目にあたるH23年度は、3種類の薬物を1か月以上に渡って多剤動態制御できるマルチDDSの開発を目的とした。3種類の蛍光色素(フルオレセイン、ローダミン、DAPI)をモデルドラッグとして用いて、各色素の独立徐放制御条件と、ラット眼への移植による色素の眼内移行性を評価した。各色素は分子量の異なる2種類のポリエチレングリコールジメタクリレート(以下、長鎖モノマーをPEG、短鎖モノマーをTEGと呼ぶ)の混合物と混ぜてUV光重合しペレット化した。ペレットをTEGリザーバーに充填し、PEG/TEGカバーで蓋をしてデバイスを作成した。デバイスをリン酸緩衝液PBSに浸漬し、定期的にPBSを回収して蛍光強度を測定した。その結果、各色素のPEG/TEG組成比をそれぞれ変えて充填することによって、各色素の徐放速度を個別にコントロールすることができた。さらに、カバーのPEG/TEG組成比も変えることによって、各色素の徐放速度をコントロールできた。以上より、ペレットとカバーの2段階徐放制御によって、拡張性の高い3種薬物マルチDDSを開発した。次に、徐放性の異なるデバイスをラット眼の強膜上に移植し、1週間後と4週間後に眼球の切片を観察した。デバイスは、DAPIの放出が早く、ローダミンが遅いデバイスと、逆にDAPIが遅く、ローダミンが早いデバイス(いずれもフルオレセインは一定)の2種類を作成した。その結果、DAPIの放出が早いデバイスではDAPIの網膜への移行が良く、逆にローダミンの放出が早いデバイスではローダミンの網膜移行性が良かった。すなわち、デバイスの徐放条件と色素の網膜移行性がほぼ一致していた。眼球組織のホモジネートの蛍光強度測定からも同様の結果を得た。現在、臨床薬物としてGeranylgeranylaceton、Edaravone、UnoprostoneをDDS化し、高速液体クロマトグラフィーで徐放量を定量中である。また、網膜光障害モデルラットに移植し、網膜保講効果存確認中である.本研究は、網膜疾患治療における低侵襲で効率的な眼内薬物投与デバイスとして「経強膜ドラッグデリバリーシステム(DDS)」を開発し、実際の臨床薬物を複数徐放化するデバイス条件を確立し、網膜変性動物モデルを用いて網膜保護効果を評価することを目的とした。3年計画の3年目にあたるH25年度は、薬物のEdaravone(EDV)とUnoprostone(UNO)のマルチDDSを作成し、ラット網膜光障害モデルに対する網膜保護効果を検討した。光障害の1週間前にデバイスを強膜上に移植し、光障害後4日目に網膜電図(ERG)による網膜機能を評価した。またERG後11日目に眼球を摘出し組織学的評価を行った。比較としてEDVとUNOの各シングルDDS、および薬剤なしのプラセボDDSを移植した。まず予備試験としてマルチDDSにおけるEDVとUNOの最適徐放条件を検討した結果、EDVは3.24μg/day、UNOは0.79μg/dayの組合せでERG振幅値の低下が最も抑制されていた。次に、シングルDDS移植群とマルチDDS移植群を比較した結果、マルチDDSはシングルDDSよりもERG振幅値の低下を抑制していた。さらに網膜視細胞外顆粒層の厚みやTUNELによるアポトーシス細胞数の減少もマルチDDS移植群で著名に抑制されていた。以上から、経強膜的な持続徐放によって網膜光障害から網膜保護をできる可能性が示唆され、またマルチ徐放化によって相乗的に網膜保護できる可能性が示唆された。

3年計画の2年目にあたるH24年度は、実際の臨床薬物Geranylgeranylaceton(GGA)、Edaravone(EDV)、Unoprostone(UNO)をDDS化し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で徐放量を測定し、徐放制御条件の確立を目指した。また、各薬剤の薬効濃度をIn vitro細胞培養で検討した。各薬剤を分子量の異なる2種類のポリエチレングリコールジメタクリレート(以下、長鎖モノマーをPEG、短鎖モノマーをTEGと呼ぶ)の混合物と混ぜてUV光重合しペレット化した。ペレットをTEGリザーバーに充填し、PEG/TEGカバーで蓋をしてデバイスを作成した。デバイスをリン酸緩衝液(PBS)に浸漬し、定期的にPBSを回収して徐放された薬剤濃度をHPLCでを測定した。その結果、カバーのPEG/TEG組成比を変えることで、各薬剤の徐放速度をコントロールできた。次に、網膜色素上皮細胞を低酸素・低栄養培養中に各薬剤を添加し、負荷培養から細胞を保護する薬剤濃度を検討した。その結果、GGAは30μM、EDVは600μM、UNOは300μM付近で有意に細胞保護効果を認めた。今後は、上記濃度で徐放するGGA, EDV, UNOのデバイスを作成し、網膜変性モデル動物で網膜保護効果を検討する。さらに、保護効果を認めたデバイス条件を組み合わせたマルチDDSで相乗的な網膜保護効果を検討する。本研究の要となる3種の薬物独立徐放条件の確立に成功し、さらに眼内への薬物移行性も確認しているため、順調に進展している。実際の臨床薬物でも、徐放データがそろってきており、さらに動物モデルでも良好な結果が得られてきている。25年度が最終年度であるため、記入しない。申請書では、H23年度にマルチ徐放デバイス条件を確立し、H24年度は細胞培養による薬効評価と動物実験による薬剤の網膜到達性を評価することを計画した。当初の予定通り、H23年度には、モデル薬物として3種類の蛍光色素を使用し、各色素の独立徐放制御条件を確立した。さらに、前倒しで動物実験を実施し、各色素が網膜へ到達していることを確認した。H24年度は、実際の薬剤として、Geranylgeranylaceton(GGA)、Edaravone(EDV)、および申請書に記載したNilvadipineの代わりに我々が検討中に見出したUnoprostone(UNO)に変更し、これら3種の薬剤の徐放制御性を検討した。その結果、H23年度の蛍光色素の徐放条件を応用し、各薬剤の徐放制御条件を確立した。また、各薬剤の薬効をIn vitro細胞培養で評価した。網膜色素上皮細胞の低酸素・低栄養培養下に各薬剤を添加し、細胞保護効果を検討した結果、各薬剤の有効濃度を評価することができた。以上より、計画通りに研究は進行中であり、最終年度の網膜変性モデル動物の実施の準備中である。計画通り研究を進める。H24年度は3種類の薬物のマルチDDS化による相乗効果を確認することが目的となるが、薬物の種類が多く、実験条件が複雑になるため、動物モデル実験で再現性を得ることに時間を要する可能性があるが、無駄な実験を省き、結果を精査しながら効率よく実験を進める。