hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波によるエピジェネティック制御の分子基盤

低出力パルス超音波(LIPUS)は,骨折治癒に対する補助治療として広く利用されている.我々は,網羅的な遺伝子発現解析技術を用いて,1回,20分間のLIPUS (1.5 MHz, 30 mW/cm2)を作用させたマウス骨芽細胞において,骨の形態に関連する数多くの遺伝子の発現が上昇することを明らかにした.得られた結果は,骨芽細胞におけるLIPUSの作用メカニズムの分子基盤を解明する一助になる.超音波とエピジェネティックな遺伝子発現制御との関係を明らかにするために研究を実施し,今年度は,以下の実験成績を得た.未分化骨芽細胞のモデルとして骨芽細胞様株MC3T3-E1を用いた.低出力パルス超音波は超音波発生装置SAFHSを用いて,強度ISPTA (空間ピーク時間平均強度)が0.03 W/cm2の超音波を20分間照射した.この超音波の照射は,細胞増殖やアルカリフォスファターゼ活性(骨芽細胞の分化の指標)に影響を及ぼさなかった.一方で,超音波はERK (extracellular signal-related kinase)の活性化を誘導した.またGeneChipシステムを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行った結果,数多くの遺伝子の発現レベルが変動することが示された.さらに,ヒストンH3の幾つかのメチル化レベルがこの刺激によって変動することを明らかにした.超音波の影響を評価する細胞モデルとして,大型T抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットから口腔上皮細胞の樹立に成功した.この細胞は,長期間の培養により重層上皮を形成し,非角化マーカーであるサイトケラチン13を発現した.数種類の扁平上皮がん細胞株を用いて,マイルドハイパーサーミア(41°C)に応答する遺伝子群を明らかにした.超音波とエピジェネティックな遺伝子発現制御との関係を明らかにする研究を行い,今年度は以下の研究成果を得ることができた.骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1に対して,現在臨床で用いられている超音波発生装置SAFHSを用いて低出力パルス超音波(0.03 W/cm2,20分間)を照射した.本超音波の一回照射は,細胞増殖やアルカリフォスファターゼ活性(骨芽細胞の分化の指標)に影響を及ぼさなかったが,他の骨芽細胞の分化の指標であるオステオカルシンの遺伝子レベルを有意に上昇させた.GeneChipシステムとバイオインフォマティク技術を用いて網羅的な遺伝子発現解析を行った.その結果,骨の分化に関連する数多くの遺伝子の発現が上昇し,ERKやAp1を介して遺伝子間の相互作用があることが予測できた.エピジェネティックな遺伝子発現制御を調べるために,種々のヒストンに対する抗体を用いて評価した.トリメチルヒストンH3 (Lys4, Lys9, Lys36),および,モノメチルヒストンH3 (Lys27)においては超音波照射直後,トリメチルヒストンH3 (Lys9)においては超音波照射30分後にタンパク質発現の有意な上昇が認められた.これらのヒストン修飾が遺伝子発現制御に関連していると推察される.開発したラット口腔上皮細胞モデルは,長期間の培養により口腔で観察されるような重層上皮を形成する.網羅的な遺伝子発現解析により,上皮形成に重要であるサイトケラチン13の発現制御にFos, Prdm1やCdkn1a遺伝子が関与する可能性が示された.本上皮細胞モデルは,超音波の作用を検討する良いモデルになると考えられる.低出力パルス超音波(LIPUS)は,骨折治癒に対する補助治療として広く利用されている.我々は,網羅的な遺伝子発現解析技術を用いて,1回,20分間のLIPUS (1.5 MHz, 30 mW/cm2)を作用させたマウス骨芽細胞において,骨の形態に関連する数多くの遺伝子の発現が上昇することを明らかにした.得られた結果は,骨芽細胞におけるLIPUSの作用メカニズムの分子基盤を解明する一助になる.エピジェネティックな遺伝子発現制御と超音波の関係を明らかにするために実験を行い,今年度は,以下の実験成績を得た.未分化骨芽細胞のモデルとして骨芽細胞様株MC3T3-E1を用いて実験を行った.相対的に高強度の照射には,デジタルパワーメータ付超音波発生装置を用いて,強度ISPTA (空間ピーク時間平均強度)が0.1-0.3 W/cm2程度の超音波の影響を検討した.低強度照射では,実際に臨床で使用されているセーフスを用いた(30 mW/cm2).MC3T3-E1細胞への0.1 W/cm2の超音波の1日1回,4日間の連続照射により,骨分化の指標の一つであるalkaline phosphatase活性が有意に上昇することが示された.他方,多分化能(骨,平滑筋,脂肪や内皮細胞に分化)を有する間葉系幹細胞TBR31-2の培養条件を検討した.ヒストンの修飾状況の評価のために,アセチル化,リン酸化やメチル化ヒストン(H2A, H2B, H3やH4)の抗体を入手し,抗体の反応条件をウエスタンブロット法を用いて検討した.その結果,概ねこの方法に用いることが出来る抗体であることが示された.ヒトリンパ腫細胞株において,0.3および0.4 W/cm2 (各々0.132および0.144 MPa)の超音波によりDNAの二本鎖切断を伴うアポトーシスが誘導されることを初めて明らかにした.一方.0.1 W/cm2 (0.082 MPa)ではこれらの変化は認められなかった.

平成24年度は,低出力パルス超音波により数多くの遺伝子が発現変動することを明らかにした.これに並行して,超音波の効果にエピジェネティックな機構が存在する可能性を示唆するデータを得ることができた.概要に示したように,研究は概ね良好に進捗した.平成23年度は,細胞培養の条件検討,超音波照射条件の検討と細胞分化の評価であった.実績の概要に示したように,研究は概ね良好に進捗した.超音波によりヒストンの修飾が変化した条件において,種々のヒストン修飾抗体を用いたChIPアッセイを行う.GeneChipマイクロアレイシステムで変化が観察された遺伝子のプロモーター領域に対するプライマーを用いたPCR反応を行い,種々のヒストンとの関連性を調べる.また,幾つかのヒストン修飾抗体を用いたChip on Chip解析によりターゲットヒストン毎のターゲット遺伝子を網羅的に解析する.超音波により分化状態が変化した細胞のヒストンの修飾状況の評価をアセチル化,リン酸化やメチル化ヒストン(H2A, H2B, H3やH4)に対する特異的抗体を用いてウエスタンブロット法で行う.次に,種々のヒストン修飾抗体を用いたChIPアッセイを行う.得られたDNAを鋳型にして,分化のマーカー遺伝子のプロモーター領域に対するプライマーを用いたPCR反応を行い,種々のヒストンと分化マーカーの関連性を調べる.GeneChipマイクロアレイシステムの発現解析アレイを用いて,超音波によって発現変動する遺伝子を網羅的に解析する.並行して,幾つかのヒストン修飾抗体を用いたChip on Chip解析によりターゲットヒストン毎のターゲット遺伝子を網羅的に解析する.上記のように概ね順調に研究は進んでいるが,次世代シーケンサーを用いた検討を行えなかったので,次年度に繰り越す研究費が生じた.この研究を含めて,次年度の研究を実施するために以下の使用を計画している.試薬類:400千円.培養器具類:300千円.抗体類:180千円.次世代シーケンサー試薬類:1,000千円.国内旅費:100千円.謝金等:100千円.その他(論文投稿費など):200千円.次年度の研究を実施するために以下の使用を計画している.試薬類:300千円.培養器具類:200千円.抗体類:100千円.マイクロアレイ試薬類:400千円.国内旅費:100千円.謝金等:50千円.その他(論文投稿費など):50千円.
聴覚障害児童の算数学習における困難さの複層的要因の実践的検討

本研究は,聴覚障害児童が抱える算数学習の困難さの複層的要因を解明し,指導・支援に関して実践的手がかりを得ることを目的とした。まず,K-ABC検査結果の再分析を行った。重回帰分析により「算数」の標準得点に「手の動作」「数唱」「語の配列」(以上,継次処理尺度)と「模様の構成」(同時処理尺度)の2つのグループが関連することが明らかになった。手話の活用を検討するため,聴覚障害幼児とろうの母親による数や量に関わるプレニューメラシー活動を分析した。母親は身振りや指さしに手話の数詞を抱合させて提示するなど行為が見られた。児は1歳後半に数詞を表出し,2歳半頃に計数行為が母親の支援のもとに出現した。本研究は,聴覚障害児童が抱える算数学習の困難さの複層的要因を解明し,査定と支援に関して実践的な手がかりを得ることを目的とする。本年度は,まずこれまでの研究,実践的な記録を広範囲にレビューした。具体的には,定型発達児の算数概念の発達過程,聴覚障害児の算数の学習成績の実態,聴覚特別支援学校等での算数学習のつまずきと指導の工夫に関する実践,算数障害に関する最新の研究や実践等である。聴覚障害児の算数の困難さについては,一部では発達障害に関連するものも含まれること,また日本語の学習に関わる要因,同時に複数の事項を操作することの困難さなど認知的特性に関わる要因,計数など算数に関わる経験が幼少期に乏しいことの要因などの可能性があることが明らかになった。これらの結果をもとに,1つには算数学習場面での参与観察によるいくつかの記録を予備的に再分析し,「算数ことば」の表現や理解の困難さを示すエピソードが得た。ここに手話の役割の可能性が示唆された。また,これまでに実施したK-ABCの検査結果を再分析した。算数の標準得点に及ぼしている認知処理過程尺度の下位検査の影響を,重回帰分析により検討した。その結果,「手の動作」「数唱」「語の配列」の継次処理に関連する下位検査と「模様の構成」の同時処理に関連する下位検査の2つのグループが関連することが明らかになった。前者はことばの学習に関連性が高いことがわかっており,以上の結果から,ことば,特に日本語の獲得(特に算数ことば)に関係する要因と情報の統合に関係する要因の2つの要因が,算数学習の困難さを構成している可能性があると指摘された。今後,下位尺度の個々の項目についてもさらに検討を広げる予定である。具体的には,次の2点から検討する。1つは,これまで実施してきたK-ABC検査結果の再分析である。特に,習得度尺度の一つである「算数」について詳細に検討する。2つには,手話の活用に着目する。聴覚障害児の算数に関わる活動を観察・分析することにより,算数学習の改善の手がかりを得ることをめざす。本年度は,昨年度に引き続き,聴覚障害児童およそ150名に実施したK-ABC検査結果の,特に「算数」の下位検査の分析を行った。「算数」の得点分布は,多くの同時処理の下位検査と異なり(1極分布),継時処理や言語関連検査と同様,2極分布することが明らかになった。このことから聴覚障害児集団には,言語学習と同様,算数学習が困難なサブグループが存在することが示唆された。さらに「算数」の各項目の正答率を算出すると,極端に正答率が低い項目(14,18,21,22,23,25,26)が見いだされた。これらの項目はいずれも複数の数値を関連付けながら操作することや特別な算数ことば(ダース)が含まれることが明らかになった。これらの困難さが聴覚障害児に特有なのか,他の発達障害(算数障害など)と共通なのか,今後検討が必要である。手話の活用に関しては,就学前に着目し,手話を第一言語とする1名の聴覚障害幼児とろうの母親による数や量に関わるプレ-ニューメラシー活動を分析した。以下概略を示すと,母親は,児の1歳前後から,身振り(指さし)で数えたり,指さしに手話の数詞を抱合させて提示する行為が見られた。また1歳半頃から「多い」や「少ない」,「同じ」など,量に関わる手話単語を示し,それらを表情や動作を使って比較する表現も見られた。児は1歳後半に数詞を表出,2歳半頃に計数行為が母親の支援のもと出現した。

聴覚障害児の算数学習の困難さを構成する複層的要因を2つにより分ける可能性を得て,今後の実践的な方途を考える手がかりを得ることができたため。社会科学,特に特別支援教育算数学習の困難さの査定に関しては,K-ABCの下位検査の詳細な分析を進める。また支援に関しては,査定の検証結果と関連付けながら,聴覚障害児の算数の学習場面の観察と分析を進める。研究補助の謝金業務が年度末になり,執行が来年度となったため。特に変更はない。
デキストラナーゼに見出された新規な現象の分子解析とその応用

デキストラナーゼ(DEXと略)の新規な立体構造を使い、(1)(3)の3現象の調査が目的である。(1)触媒残基: X線構造解析やケミカル・レスキュー反応を用いて触媒残基の候補であるD189・D340・E412の役割を調べる。(2)連続グライコシンターゼ反応(SGRと略) :触媒アミノ酸を他の残基に置換しSGRを調べ、反応機構を明らかにする。生成物の構造を調べ、物質素材としての応用を目指す。(3)環状化反応を行うDEX (C-DEXと略) : C-DEXは通常のDEXにない長い挿入アミノ酸配列(LISと略)を有するのでLISの機能を調べる。環状糖生産への関連を調べる。計画は順調に進行しており、本年度の成果を以下に述べる。(1)触媒残基:昨年度の結果に引き続き、イソマルトトリオースを用いたソーキング実験をし、X線構造解析を行った。本糖質は転移あるいは縮合反応で高分子化していた。今年度もDEXが「2触媒残基システム」で反応を行う結果を得た。(2)SGR : 1)反応条件の解析: Dl89変異体が示すSGRが効率良く進行する条件を調べた。特に、塩を加えることで反応が促進された。2)応用研究: SGRの生成物は、TLCの原点(スポット位置)に止まり移動しないことから、大きな分子量を有することが想像された。反応液にメタノールを加えると混濁物質を観察できた。本混濁物質にデキストラナーゼを作用させるとイソマルトオリゴ糖が生成されることから、デキストランであると結論できた。全糖量測定と還元力分析から、そのDPを算出すると約100となり、人工血液に適することが判明した。本サイズは小型デキストランに分類できる。このデキストラン様多糖の生産は、エンド型加水分解酵素(特にα-グルカンに作用するデキストラナーゼ)で初めて発見された現象である。(抄録なし)デキストラナーゼ(DEXと略)の新規な立体構造を使い、次の(1)(3)にある新規な3現象の調査が目的である。(1)触媒残基の決定・機能の調査::1-1)DEXの結晶調製とX線構造解析:i)大量調製/ii)結晶調製;(2)連続グライコシンターゼ反応(SGRと略)の解明;2-2)ケミカル・レスキュー反応:iii)基質合成;(3)環状化反応を行うDEX(C-DEXと略)の分子機構の解明:3-1)構造因子:iv)挿入配列の解析、である。(1)触媒残基:1-1)DEXの結晶調製とX線構造解析:i)大量調製:X線構造解析に必要なDEXの親酵素とD189・D340・E412の変異体を大量調製した。ii)結晶調製:親酵素の結認作製法に準じ、i)項の酵素の結晶化を開始した。解像解析には不十分であるが、微小結晶を得た。この条件を基にさらなる検討を行って炉る。2-2)ケミカル・レスキュー反応:iii)基質合成:本反応やSGRに使用する基質(α-isomahote-traosyl fluoride;G4-Fと略)を大量合成した。(3)環状化反応を行うDKX:3-1)構造因子:iv)挿入配列の解析:C-DEXだけが持つ長いLISの欠損実験から環状化の構造因子を調べた。LIS全てを削除したC-DEX作製し、環状化活性を測定した結果、環状化反応が低下したが、消失しなかった。活性が消失しない点は、環状化を行う構造因子が他に存在することを示唆している。現在は、新たな構造因子の探索のための変異実験を行っている。(1)触媒残基:X線構造解析やケミカル・レスキュー反応を用いて触媒残基の候補であるD189・D340・E412の役割を調べる。(2)連続グライコシンターゼ反応(SGRと略):触媒アミノ酸を他の残基に置換しSGRを調べ、反応機構を明らかにする。(3)環状化反応を行うDEX(C-DEXと略):C-DEXは通常のDEXにない長い挿入アミノ酸配列(LISと略)を有するのでLISの機能を調べる。(1)触媒残基:1-1)DEXの結晶調製とx線構造解析:i)x線構造解析:昨年度に調製したD189・D340・E412の変異体の結晶に基質や阻害剤をソーキングし構造解析を行った。基質にはイソマルトオリゴ糖を用い、阻害剤には自殺基質を用いた。その結果、D340・E412が触媒残基と推定された。2-1)ケミカル・レスキュー反応:iii)

基質合成:昨年度に有機合成した基質(α-isomaltotetraosyl fluoride)を触媒残基(D340とE412)の置換酵素に、アザイドイオンやギ酸イオン存在下で反応させた。酵素活性が認められ、生成物のアノマー構造から機能が判明した。(3)環状化反応を行うDEX:3-1)環状糖の生産:C-DEXだけが持つ長いLISが環状化反応に必要な構造因子であることが明らかになったので、変異実験を行い生産量が増した酵素が得られた。デキストラナーゼ(DEXと略)の新規な立体構造を使い、(1)(3)の3現象の調査が目的である。(1)触媒残基: X線構造解析やケミカル・レスキュー反応を用いて触媒残基の候補であるD189・D340・E412の役割を調べる。(2)連続グライコシンターゼ反応(SGRと略) :触媒アミノ酸を他の残基に置換しSGRを調べ、反応機構を明らかにする。生成物の構造を調べ、物質素材としての応用を目指す。(3)環状化反応を行うDEX (C-DEXと略) : C-DEXは通常のDEXにない長い挿入アミノ酸配列(LISと略)を有するのでLISの機能を調べる。環状糖生産への関連を調べる。計画は順調に進行しており、本年度の成果を以下に述べる。(1)触媒残基:昨年度の結果に引き続き、イソマルトトリオースを用いたソーキング実験をし、X線構造解析を行った。本糖質は転移あるいは縮合反応で高分子化していた。今年度もDEXが「2触媒残基システム」で反応を行う結果を得た。(2)SGR : 1)反応条件の解析: Dl89変異体が示すSGRが効率良く進行する条件を調べた。特に、塩を加えることで反応が促進された。2)応用研究: SGRの生成物は、TLCの原点(スポット位置)に止まり移動しないことから、大きな分子量を有することが想像された。反応液にメタノールを加えると混濁物質を観察できた。本混濁物質にデキストラナーゼを作用させるとイソマルトオリゴ糖が生成されることから、デキストランであると結論できた。全糖量測定と還元力分析から、そのDPを算出すると約100となり、人工血液に適することが判明した。本サイズは小型デキストランに分類できる。このデキストラン様多糖の生産は、エンド型加水分解酵素(特にα-グルカンに作用するデキストラナーゼ)で初めて発見された現象である。C-DEXのLIS欠損実験から「環状化反応の構造因子」が複数存在する知見を得ており、現在解析中である。今年度3月に新たな構造因子の発見を期待させるデータを得た。研究開始(11月末日)からの4ヶ月の短時間で優れた結果が取得された。X線構造解析とケミカル・レスキュー反応を駆使し、触媒残基の機能を決定できた。触媒残基をこれら2つの方法で決定する例は多くなく、優れていると判断できる。今後の推進方策:計画は順調に進行しており、次年度も計画に基づいた研究方針で推進させる。また、11項で述べた新たな構造因子については、機能解析を急ぎたい。研究計画の変更あるいは研究を遂行する上での問題点:ございません。(抄録なし)
規則性ナノ空間光触媒の創製とラジカル化学的ＣＯ２固定化反応への展開

本研究は、ナノ細孔構造を有する光触媒を創製し、通常の熱反応では起こり得ない新規な化学反応を光で誘起することを目指した。まず、メソポーラス型タンタル酸光触媒(m-Ta2O5)を調製し、二酸化炭素とエタノールから乳酸への一段階合成を試みた。しかし、疎水性の二酸化炭素はm-Ta2O5の親水性ナノ細孔内へ吸着されにくく、反応効率は向上しないという問題点が判明した。そこで、既報に従ってメソポーラスシリカ表面の一部をフッ素化して疎水性を持たせたナノ細孔構造体に酸化チタンを担持した光触媒を作成した。これについてUV照射下でOHラジカル発生能を検討したところ、優れた光触媒能を有することが明らかとなった。本研究は、ナノ空間細孔を有する光触媒を創製し、その細孔内で熱反応では起こり得ない独特な化学反応を光で誘起することを目指している。具体的には、二酸化炭素とアミン、あるいはアルコールとの熱反応では、直接、アミノ酸あるいはヒドロキシ酸を与えることはないが、本研究で開発するナノ空間細孔の光触媒を用いれば、上記の反応を起こしうる可能性がある。本年度は、上記の研究目標の達成を目指して、規則性ナノ空間(メソポーラス構造)を有するタンタル酸光触媒(m-Ta2O5)を調製し、エタノールとCO2から乳酸、ギ酸、酢酸を合成する反応検討を行った。m-Ta2O5の調製においては、細孔構造の特性(ポーラス構造の面間隔、細孔サイズなど)を小角X線散乱データや透過型電子顕微鏡で評価した。また、その構造情報とCO2とエタノールのラジカル化学的な反応で生成する乳酸、ギ酸、酢酸の生成物収量との相関を調べた。その結果、乳酸の生成は確認できなかったが、酢酸とギ酸に関しては効率の良い生成が観測された。しかしながら、m-Ta2O5のメソポーラス構造の面間隔、または、規則的なメソポーラスの構造性と触媒活性との相関は認められなかった。一方、m-Ta2O5は調製時における焼成温度が650°C付近でアモルファスからβ相の結晶構造へと相転移することが分かり、焼成温度600-700°Cの範囲で触媒活性との関連を詳細に調べた。しかし、この結晶構造の相転移と触媒活性との関係性も認められなかった。さらに、メソポーラス構造を保持しながら結晶化したm-Ta2O5の調製も検討したが、触媒活性の向上と乳酸の生成は認められなかった。当初の研究計画では、ナノ空間を有するゼオライトの空孔内部をチタンあるいはタンタルに置換した光触媒を調製することを試み、二酸化炭素とエタノールから乳酸生成の可能性を検討したが、反応は全く進行せず、ゼオライトを用いる手法を断念することとした。その後、次年度に計画していた高次ナノ構造多孔性シリカ(メソポーラスシリカ)の内部にチタン原子を孤立高分散で組み込んだ光触媒の調製に着手した。その結果、チタン原子がシリカの中に分散して組み込まれていることを、本年度の科研費で購入した「積分球付属紫外可視分光光度計」にて確認することができた。しかしながら、メソポーラス構造の規則性に関して、X線回折法による依頼分析にかけたところ、規則正しい細孔空間は形成されていないことが明らかとなった。次に、規則性メソポーラス構造を形成するタンタル酸光触媒の調製と反応性評価の検討に着手した。今のところ、X線回折の高角データによるとアモルファス(非晶質)のタンタル酸が得られているようであるが、小角散乱によるデータより規則性な長周期構造をもつタンタル酸を合成することに成功したと考えられる。現在、この光触媒のCO2還元能に関する反応性の評価を行い、触媒調製時の条件と反応性との相関を調べている。本研究は、ナノ空間細孔を有する光触媒を創製し、その細孔内で熱反応では起こり得ない独特な化学反応を光で誘起することを目指した。

前年度(平成25年度)までは、メソポーラス型タンタル酸光触媒(m-Ta2O5)を調製して、m-Ta2O5のナノ空間細孔内の反応場を利用し、二酸化炭素(CO2)を有用な化学物質(例えばアミノ酸やヒドロキシ酸)へと変換する研究を行なってきた。しかしながら、m-Ta2O5の表面が親水性なので、疎水性であるCO2がm-Ta2O5のナノ細孔内へ吸着されにくく、反応効率が向上しないという問題点が明らかとなった。そこで、本年度(平成26年度)は、この問題を解決するために、メソポーラスシリカ(m-SiO2)の表面を一部分フッ素化して疎水性を持たせたナノ細孔構造体を作成し、その表面に光触媒である酸化チタン(TiO2)またはタンタル酸(Ta2O5)の微粒子を担持して、CO2の吸着を大幅に改善するという問題解決の方策を立案して研究を進めた。m-SiO2の表面を真空乾燥して吸着水を取り除いた場合、TiO2微粒子の担持が確認された。しかし、m-SiO2を真空乾燥しなかった場合はTiO2の担持は認められなかった。一方、いずれの場合もTa2O5微粒子の担持はうまくいかなかった。そこで、TiO2微粒子の担持に成功した真空乾燥m-SiO2(TiO2/m-SiO2)について、光触媒の機能を有するかを確認するために光照射下におけるラジカル発生光反応を検討した。その結果、TiO2/m-SiO2は優れた光触媒能を有することが明らかとなった。触媒化学目的とする乳酸が二酸化炭素とエタノールとの反応から得られなかった理由として、光触媒であるタンタル酸の表面が親水性なので、疎水性である二酸化炭素がタンタル酸のメソポーラス構造の細孔内に吸着されにくいためではないかと推測した。ナノ空間を有するゼオライトの空孔内部をチタンあるいはタンタルに置換した光触媒を調製する当初の試みは、二酸化炭素とエタノールから乳酸生成の可能性はなく、この研究計画の推進を断念せざるを得なかった。しかし、メソポーラスシリカの内部にチタン原子を孤立高分散で組み込んだ光触媒の調製では、チタン原子がシリカの中に分散して組み込まれていることを、本年度の科研費で購入した「積分球付属紫外可視分光光度計」にて確認することができたことは、研究の推進で一歩前進したことを示すものである。さらに、規則性メソポーラス構造を形成するタンタル酸光触媒の調製では、X線小角散乱によるデータより規則性長周期構造をもつタンタル酸を合成し、この材料での今後の展望が十分に期待されるものである。したがって、本研究課題の達成度は、やや遅れているものの、着実に進行しているといえる。今後は、メソポーラスシリカの表面を一部分フッ素化して疎水性を持たせた細孔構造の中に、光触媒であるタンタル酸あるいは酸化チタンの微粒子を担持させ、細孔内部での二酸化炭素とエタノールとのラジカル反応で生成する乳酸の合成を目指す。今後は、「チタン原子をメソポーラスシリカの内部に高分散置換した規則性ナノ空間光触媒」と「規則性メソポーラスタンタル酸光触媒」の二つの材料に焦点を当て、CO2とアルコールの反応からヒドロキシ酸の合成へと導く品質の良い規則性ナノ空間光触媒材料を開発していく予定である。具体的には、今年3月に本学独自の予算にて導入した「多目的X線回折装置」によるX線小角散乱を用いた長周期メソポーラス構造評価とエタノール中におけるCO2光還元による乳酸、ギ酸、および酢酸の生成能(反応性)との相関を詳細に調べ、触媒調製の条件検討を重ねていく予定である。さらに、優れた特性を示す光触媒については、連携研究者(工藤)の協力のもと、BET法による比表面積測定、透過型電子顕微鏡(TEM)による表面測定と観察により、比表面積および細孔径の大きさをそれぞれ評価する。
ランダムな神経細胞の個性化メカニズムとメゾスコピック神経回路

クラスター型プロトカドヘリン(cPcdh)分子群による神経細胞の個性化メカニズムと標的認識による神経回路形成メカニズムを明らかにすることを目標に、本年度は、神経細胞において個性的に発現しているcPcdh分子群の遺伝子制御機構の解析を行った。これまでにcPcdh-α、cPcdh-γについて個々の神経細胞でのランダムな個性的発現が認められている。しかし、cPcdh-βについては不明であったので、cPcdh-βメンバーについての発現解析を行った。その結果、β1以外の全てのメンバーがランダムな発現をしていることを明らかにした。また、このランダムな制御がCTCFにより制御されていることを、興奮性神経細胞のみでCTCFを欠損させたマウスを作製することにより明らかにした。CTCFはランダムに発現するcPcdh-α、-β、-γメンバーの全てのプロモーター領域に結合し、また、以前に我々が明らかにしたエンハンサー領域にも結合している。また、このCTCF欠損マウスでは感覚入力依存的に形成される皮質体性感覚野バレル構造が形成されていなかった。このマウスでの層構造や脳領域での異常が認められないことから、CTCFは感覚入力依存的な神経回路形成機構に関わることが示唆された。以前、我々はcPcdh-βメンバーのランダムな発現制御に関わるエンハンサー領域を欠損させたマウスにおいて皮質体性感覚野バレル構造の異常を観察していることから、cPcdhのランダムな発現制御と神経活動依存的な神経回路形成との関連性において興味深い結果であると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。脳では、個々の神経細胞ごとに特異的な局所回路があり、脳回路の機能単位であるメゾスコピック神経回路(メゾ回路)を構成している可能性が考えられる。本研究では、このメゾ回路をもたらす分子的基盤を明らかにすることを目標として、個々の神経細胞においてランダムな組み合わせ発現をしているcPcdh分子群に注目して、個々の神経細胞のもつ特異的なシナプス形成メカニズムと複雑ネットワーク(集団性と短距離性を有する)の形成メカニズムを明らかにする。本年度、私たちはcPcdhαとcPcdhβのランダムな遺伝子発現を制御するエンハンサーをDNase hyppr sehsitive assayにより同定し、これらエンハンサー領域欠損マウスの作製と解析を行った。その結果、cPcdhβのランダムな遺伝子発現を制御するシス制御領域(cluster control region: CCR)を特定することに成功した。また、このCCR欠損マウスでは、機能的構造である大脳皮質体性感覚野におけるバレル構造が認められなくなっていた。これらの結果により、cPcdhβのランダムな遺伝子発現が、大脳皮質の機能的局所回路形成に関わる可能性が示唆された(Yokota et al.,2011)。更に、cPcdh遺伝子クラスター領域に結合するインシュレータのCTCFを興奮神経細胞特異的に欠損させたマウスの作製ができ、この遺伝子変換マウスにおいてcPcdh分子群のランダムな発現に異常があることを確かめることに成功した。この大脳皮質興奮性神経細胞におけるCTCF欠損マウスにおいても大脳皮質体性感覚野におけるバレル構造が認められなくなっていたことより、cPcdh分子群のランダムな発現が大膨皮質の機能的局所回路形成に関わる可能性が示唆されてきている。また、このマウスでは興奮性神経細胞の樹状突起形成やスパイン形成での異常が認められ、mEPSCの頻度の減少が認められており、シナプス形成や神経回路形成での異常が明らかとなってきている。cPcdhβのランダムな発現を制御するシス制御領域の同定に成功しただけでなく、この領域欠損マウスにおいて大脳皮質体性感覚野における機能的バレル構造の異常が認められ、メゾ回路へのアプローチの進展が当初の計画以上に進展している。

今後は、Pcdhのランダムな発現を制御する因子を更に明らかにして行くとともに、このランダムな発現調節とメゾ回路形成との関連性を明らかにする。また、cPcdhを直接欠損したマウスの作製をすることにより、cPcdhの多様性と神経回路形成との関係を生理学的に解析して行く。
簡便な高齢者用運転能力評価法の研究

高齢運転者による事故に注目が集まっているが、高齢者の運転適性を評価する方法は確立されていない。本研究では、高齢者の運転適性を正しく評価するために、高齢者版抑制課題付有効視野測定法(Visual Field with Inhibitory Tasks - Elder Version; VFIT-EV)の開発を試みた。健常高齢者を対象に認知機能検査と実車評価を行った結果、有効視野検査成績と実車評価との間に関連が認められた。タクシー運転手において、事故歴と有効視野検査成績等との関連を検討したが、有意な関連は認められなかった。有効視野検査は運転適性を予測する指標の1つとして有力ではあるが、今後さらなる検討が必要である。VFITは、17インチディスプレイのノートパソコンと12ボタンUSBゲームパッドを用いて実施し、検査プログラムは、単純反応検査、中央反応検査、周辺視野検査および二重課題検査からなり、二重課題検査によって有効視野が測定できるようになっている。この二重課題検査の中央にある刺激を4個の弁別から2個の弁別に簡略化して課題難易度を下げた。また老眼の影響を軽減するため、ディスプレイと頭部との距離を400mmから500mmに変更した。その変更に合わせて中心刺激と周辺刺激との距離を従来版と同様の視野角(4°、7°、10°、14°)に呈示されるよう修正した。ただし、最も難易度の高いStage4(14°)は上下方向がディスプレイから呈示位置がはみ出してしまうため、左右方向のみ14°で呈示し、上下方向は10°で呈示することとした。呈示刺激サイズは見かけ上VFITと同じサイズになるよう約20%大きくした。このVFIT-EVと従来版のVFITを、自動車運転免許を持ち日常的に運転している60歳から90歳までの4名を対象として実施した。対象者は脳血管障害などの神経疾患や眼科的疾患など視覚情報の処理に障害がでるような既往歴がないことを確認した。その結果、全ての対象者で、正解率はいずれのステージでもVFITに比べVFIT-EVの方が高成績となった。VFITでは二重課題検査でステージが進み課題難易度が上がっても(ステージが進む毎に周辺視野課題が中心視野から離れる)、成績がかえって向上することがあり、課題難易度と成績が必ずしも相関しない場合があったが、VFIT-EVは全ての対象者において課題難易度が上がるほど、緩やかに成績が低下するという結果が得られた。今回の対象者はすべて日常的に運転しており、相応に運転頻度が高くかつ交通事故の経験もなかった。成績の平均値はステージ1(視野角4°)では90%を超えており、有効視野が狭くなった高齢者を測定するのに適した課題難易度であると考えられた。今年度は、日常的に運転している健常高齢者の認知機能や運転能力を明らかにすること、ならびに既存の認知機能検査の結果および有効視野は独自に開発した有効視野測定ソフトウェア高齢者版(Visual Field with Inhibitory tasks Elderly Version : VFIT-EV)によって測定した有効視野と、実車による運転適性評価との関連を明らかにすることを目的として研究を行った。対象は、月に1回以上運転している65歳以上の高齢者20名(男性16名、女性4名、平均年齢72.3土4。9歳)とした。既往に明らかな脳疾患、認知症、運転に支障となる眼科疾患を持つ者は除外した。予備検査として参加者全員に近見視力の確認および視野検査を実施し、基本的視機能に問題がないことを確認した。インタビューガイドを用いて運転状況や事故経験、運転に対する自己認識などを確認した。有効視野測定にはVFIT-EVを用いた。認知機能検査はTrail Msking TestAおよびB(以下TMT-A、TMT-B)、ウェクスラー成人知能検査改訂版(以下WAIS-R)の下位検査の符号課題(以下WAIS符号)、認知機能のスクリーニング検査としてMini Mental State Examination(以下MMSE)を用いた。実車評価は、高齢者講習を実施している東京都A区および埼玉県B市の指定自動車教習所2カ所の修了検定コースで実施し、検定員による採点を行った。それぞれの指標の基本統計量を求め、各指標間の相関関係をスピアマンの順位相関係数によって求めた。その結果、実車評価とTMT-AおよびB、WAIS符号、MMSEとの間には相関関係は認められなかった。実車評価と有意な相関関係が認められたのはVFIT-EVの正解率のみであった(rho=.47,p<0.05)。教習所での実車評価が普段の運転を反映するかどうかには検討の余地があるものの、VFIT-EVを用いた有効視野検査によるスクリーニングは、高齢者の運転適性評価のひとつとして期待できるものと考えられた。今後はもの忘れ外来受診者などにおける有効性の検証を行う必要がある。

本研究の最終的な目的は、高齢者の運転技能を活用し高齢者の自立と社会参加を促進するとともに安全な交通環境を構築するために、高齢者にも適用しうる自動車運転能力評価法を開発することである。本年度は、1これまでに作成したパソコンを用いた有効視野測定システムの高齢者版検査課題プログラム(VFIT-EV)を用いた運転能力評価を、高齢の職業運転手(タクシードライバー)を対象にして実施し、運転能力評価の結果と実際の事故歴との関係を明らかにすること、2高齢者版有効視野測定システムをもの忘れ外来受診者および一般高齢ドライバーを対象者にして実施し、運転相談への活用とその有効性を検証することを目的とした。1高齢のタクシー運転手を対象として、高齢者版有効視野測定システムと机上検査(MMSE、TMTなど)を実施し、本人の承諾を得て会社から提供を受けた事故歴との関連を検討した。2もの忘れ外来においては、危険な運転をしているが本人の自覚が乏しく運転を止めさせられないという家族からの相談事例が多いが、これに対して高齢者版有効視野測定システムの成績を示すことによって運転能力についての本人の自覚を促し免許返納へ繋がるかを検討した。その結果、1高齢者版有効視野測定システムと机上検査との間には一定の相関関係が認められたが、事故歴との間には有意な相関は認められなかった。2もの忘れ外来において運転相談を実施したが、認知症患者では高齢者版有効視野測定システムのデータが十分に得られず、その有用性を明らかにすることはできなかった。高齢ドライバーが事故を起こす要因は複雑であり、職業として運転する場合と日常の足代わりに運転する場合との違いなど、認知機能以外の背景要因を含めて、今後さらに検討する必要がある。有効視野測定装置VFIT-EVを独自に開発し、その有効性の検証を部分的に実施するところまで至った。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの検討の対象者を、もの忘れ外来受診者や職業ドライバーに拡大し、実際の事故歴との関連を検討する必要がある。今後の課題としては、実際の事故件数は必ずしも多くないため対象者を多数集める必要があること、また正確な事故歴の把握が困難であること、などが挙げられる。その対策としては、タクシー会社や警察組織に協力を求めることが考えられる。
細胞の生存・分化・増殖シグナルにおけるレドックス制御機構の解析

生体は活性酸素などの酸化ストレスにさらされているが、細胞はグルタチオン等の細胞内還元物質や抗酸化酵素により酸化還元(レドックス)状態を還元状態に保持している。本研究では細胞の「生と死、分化、増殖」に連関した細胞内シグナル伝達系のレドックス制御システムの解明を目指して、とくに神経成長因子(NGF)及び上皮成長因子(EGF)のシグナル伝達系に関する解析を遂行した。H_2O_2で細胞を処理するとEGFレセプターのチロシンリン酸化が誘導された。一方、H_2O_2の単独の処理ではNGFレセプター(TrkA)のリン酸化が誘導されることはなかったが、NGFによるTrKAの活性化をH_2O_2は顕著に促進した。H_2O_2によりこれらのレセプターの脱リン酸化反応が阻害されることがら、酸化ストレスは細胞内においてチロシンホスファターゼの活性を阻害することによりこれらのレセプターチロシンキナーゼの活性化を誘導すると考えられた。一方、還元剤N-アセチルシスティン(NAC)やDTTで細胞を処理したところ、NGFによるTrKAの活性化及びEGFによるEGFレセプターの活性化が抑制され、ShcやGrb2との会合によるレセプター複合体の形成が阻害された。さらにDTTはEGFとEGFレセプターの結合を阻害することによりレセプターの活性化を抑制していたが、NACはEGFがEGFレセプターと結合した後のレセプターキナーゼの活性化を抑制することが見いだされた。NACは細胞から抽出したEGFレセプターの活性化を阻害することはないことがら、細胞内レドックス感受性機構を介してNACはEGFレセプターの活性化を抑制すると考えられた。すなわちレセプターチロシンキナーゼはリガンド結合、および細胞内における脱リン酸化反応と、細胞内のレドックス感受性機構を介した多重のレドックスによる制御を受けていることが明らかにされた。近年、細胞内の酸化還元(レドックス)状態が細胞の生存にとって必須であるのみならず細胞の分化や増殖に対しても重要な役割を担うことが明らかにされてきた。本研究に於いて我々は、細胞の生存・分化・増殖に関与する細胞内情報伝達機構と細胞内レドックスに関する解析を行った。神経成長因子(NGF)はPC12細胞に神経分化を誘導するが、この誘導を還元剤N-アセチルシステイン(NAC)は顕著に抑制する。この抑制機構に関する解析を行ったところ、NGFレセプターチロシンキナーゼの活性化、およびRasからMAPキナーゼカスケードに至る情報伝達がNACにより阻害されていることが見いだされた。さらに上皮成長因子(EGF)の情報伝達系に対してもNACは抑制効果を示し、EGFレセプターチロシンキナーゼの活性化を阻害することが示された。これらのレセプターチロシンキナーゼの活性化に対するNACの抑制効果は、キナーゼ活性の抑制によるものではなくむしろレセプターが活性化される際の二量体化の抑制に起因するものと考えられた。すなわちNGFやEGFなどのレセプターチロシンキナーゼの活性化にはそのレドックス状態の適正な保持が必須の要件であると考えられる。またNACはPC12細胞に於いて三量体Gタンパクを介したアセチルコリンからのMAPキナーゼの活性化に至る情報伝達系に対しても抑制効果を示すことが見いだされた。今後、さらにこれらの細胞増殖因子や三量体Gタンパクを介する情報伝達系におけるレドックス制御の分子機構に関して解明することが重要な課題であると考えられる。また細胞増殖に対するレドックスの効果を解析したところ、Wl38などの正常ヒト細胞株においてNACは細胞内へのチミジンの取り込みを抑制し、細胞増殖に対する阻害効果を示したのに対して、HeLaなどの細胞株に対してはほとんど抑制効果を示さず、細胞増殖のレドックス感受性は細胞腫により異なることが判明した。今後、細胞内情報伝達系のレドックス制御の機構と併せて、細胞腫特異的な細胞増殖のレドックス制御機構の分子メカニズムの解明を行う予定である。

NACは細胞から抽出したEGFレセプターの活性化を阻害することはないことがら、細胞内レドックス感受性機構を介してNACはEGFレセプターの活性化を抑制すると考えられた。すなわちレセプターチロシンキナーゼはリガンド結合、および細胞内における脱リン酸化反応と、細胞内のレドックス感受性機構を介した多重のレドックスによる制御を受けていることが明らかにされた。
オブジェクティブ・パネルデータを用いた消費者購買行動の動的モデリング

オンライン市場における顧客レビューの重要性については多数の研究に議論されていたが、それが店舗の販売結果との定量的関係はまだ明確されていない。本研究は、顧客レビューと店舗販売成果との関係は店舗の形態によって異なると仮定し、ベイズ統計モデルを用いて顧客レビューが店舗の販売結果に与える影響、およびその影響の店舗形態間の差について調べた。本研究のデータはすべてウェブクローリング技術を用いて収集した。分析結果によって、販売結果に対するレビューの量の影響は、過去の販売結果によって小さくなる。また、知覚リスクの低い直営店に比べ、知覚リスクの高いマーケットプレスでは、レビューの数量と内容による影響が大きい。本年度主に以下の3つの分析を行っていた。まずは、過去のデータに加え、TaobaoとeBayという2つC2C型eコマースサイトから、約10万件の月間売上データを利用し、C2C型eコマースの販売者の成長パスとその成長の分布の散らばりについてクラスター分析と分位点回帰分析と通して試みた。その結果、オンライン市場における販売者の成長は「等速型」、「加速型」と「減速型」といった3つのクラスターがあり、その中で、「加速型」かつ売上の時系列的ばらつき(分散)の少ない成長パターンが販売者の業績に最もよい効果を与えるという結論を示した。その結果からも、消費者側の購買行動傾向をある程度把握できると考えられる。次に、B2C市場における顧客レビューと店舗販売成果との関係を解明するために、Tmall.comとJD.comという2つのサイトから、約1年分のショルダーバッグの販売データをWeb Crawling技術で収集して解析を行い、さらに異なる市場における顧客レビューが店舗の販売成果に与える影響の差も調べた。結果として、顧客レビューと販売成果の間に同時影響が存在することが証明できたことと共に、更に、知覚リスクの高い市場において、レビューの質による影響が有意であることに対して、知覚リスクの低い市場では、レビューの量による影響が有意であることを明らかにした。その結果から、他人の口コミやレビューに対する消費者の行動反応をある意味で把握でき、店舗の販売戦略の効率化となる知見を得ることができる。また、Web Crawlingデータを用いた分析だけでなく、Web Log技術によって取得されるオンラインストアの「訪問率」および「滞在時間」などのデータと、Web Crawlingによって取得される売上データの融合による分析を試みた。こうした分析を通して、消費者購買行動モデルの精度を向上することが期待できる。予定通り、平成27年度は、今までの既存データを用いて、オンライン市場における消費者購買行動のモデル分析を進めている。それと同時に、Web Crawlingのプログラムも従来のTaobaoとeBayから、Tmall.com, JD.com, Amazonなどのプラットフォームに拡張し、各オンライン市場のトランザクションデータを時系列的に(週間ごとに)収集している。また、分析の精度を上げるために、分析対象となる商品データも異なる製品カテゴリーから収集している。現時点では、5つのオンライン市場の約半年のトランザクションデータが収集でき、ある程度水平的比較を行うことができると考えられる。本年度主に以下の2つの分析を行っていた。まずは、昨年度に収集したデータに加え、複数のオンライン市場から、各店舗の販売実績を時系列に収集した。そのデータを用いて、Becker (1991)の消費の外部性理論をオンライン環境で実証した。消費者は他の消費者の行動結果に影響を受けて意思決定を行うといった外部性理論がある。その理論を基に、商品販売量の時系列影響(自己影響)、および販売量の時系列変化が当該商品の次期価格に与える影響について分析を進めた。具体的には、消費の外部性を考慮した動的経済モデルを構築し、Crawling技術を用いて複数のショッピングサイトから販売成果を収集し、消費者の需要の動的変化を一般化モーメント法で推定した。推定結果から、オンライン市場では、季節性等の要因を制御した後、ある商品の当期販売量は当該商品の次期販売量に強い正の影響を与えることが実証された。つまり、情報の非対称性がある市場において、消費者の購買意思決定は、他の消費者の過去の購買行動に影響を受けやすいことを証明し、店舗の競争戦略の効率化となる知見を得ることが期待できる。次に、昨年度の研究の引き続き、顧客レビューと販売成果との関係を解明するために、オンライン市場から顧客のレビュー情報を収集し、更にそれを関連する店舗の販売成果に統合することによって、オンライン市場における顧客レビューの影響及び重要性について調べた。他の消費者の購買状況がネット上で公開されることによって、レビューが販売結果に与える影響が弱くなることが実際のデータで確認できた。また、情報非対称性の市場において、ポジティブな情報よりも、ネガティブな情報が、消費者の購買意思決定に与える影響が強いとの結論も実証された。さらに、ネガティブなレビューは、商品性質や評価ポイントにより、店舗の販売業績にポジティブな影響も与える可能性もあることも確かめた。

平成28年度には、集めたデータを用い、オンライン市場における消費者購買行動の実証的推定を中心に行う。既存研究理論をベースに、データの前処理と説明変数間の理論的関係を想定し、異なるプラットフォーム間の相互作用を含む社会的相互作用と、消費者購買行動の動的変化を考慮するモデルを組むことによって、オンライン市場における消費者の需要関数の実証的推定を行う。具体的に、Becker (1991)のネットワーク外部性理論を実証する予定であり、彼の経済理論をベースに、オンライン市場における同じ商品の販売量の時系列影響、およびその販売量の時系列変化が当該商品の次期価格に与える影響について、経済モデルを構築しながら、Web Crawlingデータを用いて分析している。また、異なるオンライン市場や商品におけるネットワーク外部性の差もデータで議論してみたいと考えている。ただし、データの複雑さにより、推定したパラメータの有効性と一致性が落ちる可能性がある。その場合、研究協力者とモデリングや分析手法の妥当性についてディスカッションし、様々な推定方法を試行錯誤しながら、当てはまりの最もよい推定結果を導き出す。28年度が最終年度であるため、記入しない。マーケティング・サイエンス28年度が最終年度であるため、記入しない。
溶液高分解能核磁気共鳴法と固体法の融合による膜内アンテナタンパク質の構造機能解明

本研究の目的は溶液高分解能核磁気共鳴法と固体法の融合により、膜タンパク質ならびに色素会合体の構造解析手法を確立し、生体膜内にある膜タンパク質ならびに色素会合体の活性発現の構造・機能を解明することにある。このための研究対象として光合成膜内アンテナタンパク質LH1系とクロロゾームアンテナ系を取り上げた。膜内アンテナタンパク質LH1は活性中心としてバクテリオクロロフィル補因子(BCh1a)を有する。我々は機能解明に重要な補因子まわりの構造を選択的同位体置換した試料を用いて溶液NMRにより解析できることを示した。すなわち、LH1のサブユニット(B820と呼ぶ)を再構成により組み上げ、溶液高分解能核磁気共鳴法を用いて構造解明を行った。その際、色素バクテリオクロロフィルaを^<13>Cでエンリッチし、さらに、周囲のペプチドの^1Hを^2Hで置換したものを用いることにより、バクテリオクロロフィルaおよびその周辺の原子核をクローズアップし、さらに、多次元NMRにより、相互作用情報を得て、詳細な構造解析を行った。その結果、色素の相互作用配置、ペプチド残基との相互作用に興味深い知見が得られた。今年度は固体高分解NMRを用いて、B820状態、LH1状態でのNMRの観測に成功し帰属を試みた。それらの結果から、溶液NMRを用いて得た構造と同様な構造を形成していることを示した。膜タンパク質自身の構造については溶液NMRを用いて、クロロホルム・メタノール系で各モノマーについて検討した。その結果α、βそれぞれのモノマーの構造解析に成功し、業績リストの最後にあげた論文として成果を発表した。バクテリオクロロフィルc会合体の構造解析については、これまでの溶液ならびに固体NMRを用いた結果に加え、今回ダイマーの溶液NMRスペクトルの解析から緩和過程とシグナル強度に関して重要な知見を得た。本研究の目的は溶液高分解能核磁気共鳴法と固体法の融合により、膜タンパク質の構造解析手法を確立し、生体膜内にある膜タンパク質の活性発現の構造機構を解明することにある。このための研究対象として光合成膜内アンテナタンパク質LH1を取り上げた。この膜内アンテナタンパク質LH1は活性中心としてバクテリオクロロフィル補因子を有する。機能解明に重要な補因子まわりの構造に注目して、特に補因子自身の相互作用、ならびに補因子とタンパク質の相互作用解明に焦点を当てた研究を行った。ここで問題にするのは、この色素の配位構造とタンパク質との相互作用構造である。バクテリオクロロフィルa自身は、メタノール、アセトンのような極性有機溶媒中では中心のMgの上下から溶媒が配位した6配位状態をとりモノマーで存在すると780nm近傍に吸収極大を示すことが知られている。溶媒の極性が下がり5配位状態になると分子が会合し、ダイマーあるいはそれ以上の会合体を形成すると、極大吸収は800nm以上へと長波長シフトする。しかし、この相互作用だけでは、せいぜい830nm前後までで、870nmという長波長シフトの構造的、電子的な基礎は確立されていない。そこで、まず、このサブユニット(B820と呼ぶ)を再構成により組み上げ、溶液高分解能核磁気共鳴法を用いて構造解明を行った。

本研究の目的は溶液高分解能核磁気共鳴法と固体法の融合により、膜タンパク質ならびに色素会合体の構造解析手法を確立し、生体膜内にある膜タンパク質ならびに色素会合体の活性発現の構造・機能を解明することにある。このための研究対象として光合成膜内アンテナタンパク質LH1系とクロロゾームアンテナ系を取り上げた。膜内アンテナタンパク質LH1は活性中心としてバクテリオクロロフィル補因子(BCh1a)を有する。すでに昨年までに機能解明に重要な補因子まわりの構造を選択的同位体置換した試料を用いて溶液NMRにより解析できることを示した。すなわち、LH1のサブユニット(B820と呼ぶ)を再構成により組み上げ、溶液高分解能核磁気共鳴法を用いて構造解明を行った。その際、色素バクテリオクロロフィルaを^<13>Cでエンリッチし、さらに、周囲のペプチドの^1Hを^2Hで置換したものを用いることにより、バクテリオクロロフィルaおよびその周辺の原子核をクローズアップし、さらに、多次元NMRにより、相互作用情報を得て、詳細な構造解析を行った。その結果、色素の相互作用配置、ペプチド残基との相互作用に興味深い知見が得られた。今年度は固体高分解NMRを用いて、B820状態、LH1状態でのNMRの観測に成功し帰属を試みた。それらの結果から、溶液NMRを用いて得た構造と同様な構造を形成していることを示した。膜タンパク質自身の構造については溶液NMRを用いて、クロロホルム・メタノール系で各モノマーについて検討した。その結果α、βそれぞれのモノマーの構造解析に成功し、業績リストの最後にあげた論文として成果を発表した。バクテリオクロロフィルc会合体の構造解析については、これまでの溶液ならびに固体NMRを用いた結果に加え、今回ダイマーの溶液NMRスペクトルの解析から緩和過程とシグナル強度に関して重要な知見を得た。