hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
制癌の標的分子としての糖脂質糖鎖遺伝子(ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子)

当該研究期間内に、以下の諸点を明らかにした:(1)酸性糖脂質ガングリオシド合成系のキーエンザイムであるヒトGM3合成シアル酸転移酵素の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングすることによって、ゲノム全長を含むゲノミックローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)本酵素はペプチド部が41.2-41.7kDaの糖蛋白質であると推定され、C末端をMyc-tag標識したConstructでWestern blot解析した。N結合型糖鎖結合可能部位に突然変異を入れ、野生型と糖鎖欠損型酵素の酵素活性・動態を比較し、シアリルモチーフL中の特異的なHis177残基の変異体を作製し、酵素活性・動態を比較したが、明確な結論には至っていない。ガングリオシドの包括的生物機能解析のためGM3合成酵素欠損マウス作出のためのターゲッチングベクターの構築を行い、ES細胞への導入を開始した。(4)ヒト遺伝子ノックアウト細胞作成のため、GM3合成酵素ゲノムDNAからpositive and negative selectionvector及びpromoter less vectorを作成、数種類の付着性及び浮遊性がん細胞株に導入しホモ相同組み換えを起こした細胞のクローニングを開始した。(5)またメラノーマ12日本人症例から4症例の細胞株化に成功した。コーカシアン系のメラノーマ細胞株を含め5株の培養細胞に、GD3合成酵素cDNAを組み込んだsense及びantisense vectorを導入し、変異株を複数分離した。antisense vector導入株の一部に、GD3産生能低下と増殖能低下を認めた。
壁乱流内粒子分散機構の解明と予測の高度化

物質輸送プラントや相変化を伴う熱交換器等において生じる流体乱流内に粒子/液滴/気泡が分散した流れ形態における物質輸送や流体相と分散相間の干渉のメカニズムについて高精度数値シミュレーションを用いて検討を加えた.本研究は,流体を用いた物質輸送や粒子/液滴/気泡の添加による物質輸送の高効率化に貢献する.本研究課題において,添加される粒子の慣性の減少による流体駆動性能の向上と抵抗の減少,粒子の慣性の増加による流体乱流の減衰と摩擦抵抗の減少,すなわち,流体乱流内における粒子分散の分子拡散に対する類似性が示された.本研究課題は,資源等の輸送機器や各種熱流体機器の省エネルギー化・革新的開発において必須となる流体乱流内の粒子・液滴・気泡等物質の輸送メカニズムの解明とモデル化,並びに単相・二相乱流の制御に対する指針の構築を目的として行われた.本研究課題においては,平成2224年度基盤研究(C) (一般)『二相分散流システムにおける物質輸送機構のモデル化』(課題番号22560154)において同研究代表者により構築された手法等成果が用いられた.本研究課題は,直接数値シミュレーションを用いた3つのテーマにより構成される:(1)不均一流体乱流内における粒子分散メカニズムの解明とモデル化,ポリマー・界面活性剤を用いた流体乱流抵抗低減手法の構築.(2)液体乱流内におけるマイクロバブルの分散メカニズムの解明,マイクロバブルを用いた流体乱流抵抗低減手法の構築.(3)波面・粗面上流体乱流内における物質・熱の輸送メカニズムの解明.平成25年度に行った予備研究において上記1,2のテーマ拡大によって注目すべき結果が得られる予想を得たため,平成26年度はテーマ3の予定を中止することとした.テーマ1においては,鉛直に設置した平行平板間チャネル内下降気体乱流中に粒子を均一添加した場合の非定常挙動を計算し,粒子の慣性・分散相の体積割合・移流の対重力効果を表すフルード数が気体乱流・粒子輸送に及ぼす効果に対して検討を加えた.テーマ2においては,鉛直に設置した平行平板間チャネル内上昇液体乱流中にマイクロスケールの気泡を均一添加した場合の非定常挙動を計算し,気泡の体積割合,フルード数が液体乱流・気泡輸送に及ぼす効果について検討を行った.国内外の学会において,これら2テーマにおける運動量輸送理論を示した.平成27年度以降もさらに発展させた内容を国内外の学会と雑誌において発表する予定である.本研究課題は,物質輸送プラントや相変化を伴う熱交換器内において生じる乱流状態の流体相と粒子・液滴・気泡等の分散相が混在した流れ(分散流)における分散相/流体の輸送メカニズム,マイクロスケールの粒子・液滴・気泡の添加による流体輸送あるいは流体中における物質/物体の輸送の高効率化・抵抗低減のメカニズムに対する理解を得ることを目的として実施された.本研究課題は次の3つのテーマにより構成される.(1)不均一流体乱流内における粒子輸送・粒子による流体乱流抵抗低減のメカニズムの解明.(2)不均一液体乱流内におけるマイクロバブル輸送・マイクロバブルによる液体乱流抵抗低減のメカニズムの解明.(3)流体乱流内の物質・熱の輸送に対する粗面の影響に対する考察.テーマ1については,研究課題初年度(平成26年度)に実施した鉛直に設置した平行平板間チャネル内下降気体乱流中に粒子を均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションの結果の解析を進めた.テーマ2については,鉛直に設置した平行平板間チャネル内上昇液体乱流中にマイクロスケールの気泡を均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションを初年度に引き続き実施し,これに並行して,得られた結果の解析を進めた.テーマ1に関する成果は国内外の会議において公表した.次年度(平成28年度)以降,テーマ1から得られた結果において示唆された乱流の基礎知識の改訂に関わる内容の検討を進める必要が生じた.テーマ2に関する成果は次年度の国内外の会議にて発表予定である.本研究課題初年度本年度の研究において,テーマ1と2について更なる推進が必要と判断されたため,最終年度(平成28年度)を含め,本研究課題におけるテーマ3の実施は中止とした.平成27年度は,(1)不均一流体乱流内における粒子輸送・粒子による流体乱流抵抗低減のメカニズムの解明,(2)不均一液体乱流内におけるマイクロバブル輸送・マイクロバブルによる液体乱流抵抗低減のメカニズムの解明の2つのテーマを並行して行った.本研究課題の当初計画の3つめのテーマ『流体乱流内の物質・熱の輸送に対する粗面の影響に対する考察』については,テーマ1,2において重要度並びに緊急度の高い検討事項が見出されたため,本研究課題における実施は中止とした.テーマ1においては,前年度(平成26年度)に実施した鉛直に設置した平行平板間チャネル内下降気体乱流中に粒子を均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションの結果を用いて,粒子の慣性・体積割合,移流の対重力効果を表すフルード数の流体乱流に及ぼす影響に対して検討を加えた.粒子慣性の増加に伴う粒子による流体加振スケールの増加,これに伴う粒子による流体駆動力並びに流体乱流の減少,すなわち流体乱流の加振スケールの増加に伴う乱流によるエネルギー・カスケードの消滅が示された.平成28年5月イタリア・フィレンツェにて開催される混相流国際会議において,結果の総括と流体乱流におけるエネルギー輸送に対する基礎概念の修正を視野に入れた議論の必要性を発表する予定である.テーマ2においては,初年度に開始した鉛直に設置した平行平板間チャネル内上昇

液体乱流中にマイクロバブルを均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションを引き続き行い,気泡のサイズ・体積割合,フルード数が液体乱流に及ぼす影響に対して検討を加えた.粒子サイズの増加の影響が,終端速度の増加に伴う壁垂直方向リフトの増加とこれに伴う壁面上濃度の増加として現れることが示された.本研究課題においては,物質輸送プラントや相変化を伴う熱交換器等において生じる流体乱流内に粒子・液滴・気泡が分散した流れ形態(“分散乱流")における分散相/流体の輸送メカニズムに対する理解の促進,マイクロスケールの粒子・液滴・気泡の添加による分散相/流体の輸送効率化に対する指針の高精度化を目的として,テーマ1:壁乱流内に添加された粒子の輸送メカニズムの解明および添加粒子による流体乱流変化のメカニズムの解明,テーマ2:壁乱流内に添加されたマイクロバブルの輸送メカニズムの解明および添加気泡による流体乱流変化のメカニズムの解明に対して検討が加えられた.テーマ1については,平成26年度に実施した鉛直に設置した平行平板間チャネル内下降気体乱流中に粒子を均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションの結果を用いて,粒子の添加によって生じる流体乱流の変化における諸因子の影響に対して更なる検討を加え,粒子慣性による中心的役割を示した.テーマ2については,平成26年度から平成28年度に掛けて実施した鉛直に設置した平行平板間チャネル内上昇流体乱流中にマイクロバブルを均一添加した場合の非定常挙動の直接数値シミュレーションの結果を用いて,気泡の添加によって生じる流体乱流の変化における諸因子の影響に対して検討を加え,平成27年度に示した気泡添加による流体駆動の変化が反映されることを示した.テーマ1と2の結果より,粒子慣性の増加に伴う粒子分散の増加とこれに伴う流体乱流の減衰,粒子慣性の減少に伴う重力効果の増加と粒子によって付加される体積力による流体駆動性能の向上が示された.物質輸送プラントや相変化を伴う熱交換器等において生じる流体乱流内に粒子/液滴/気泡が分散した流れ形態における物質輸送や流体相と分散相間の干渉のメカニズムについて高精度数値シミュレーションを用いて検討を加えた.本研究は,流体を用いた物質輸送や粒子/液滴/気泡の添加による物質輸送の高効率化に貢献する.本研究課題において,添加される粒子の慣性の減少による流体駆動性能の向上と抵抗の減少,粒子の慣性の増加による流体乱流の減衰と摩擦抵抗の減少,すなわち,流体乱流内における粒子分散の分子拡散に対する類似性が示された.
皮膚バリア機能異常におけるIL-33の役割

インボルクリンプロモーター下にIL-33を発現させることで、IL-33を有棘層に発現したトランスジェニックマウスの作成を試みた。初回は、Balb/c系マウスでの作成を試みたが、妊娠を確認できなかったため、2回目はBL6系マウスでの作成としたところ、妊娠、出産に至り、3個体のTg陽性仔マウスを得た。しかしながら、これらの仔マウスは生育が極度に悪く、34週で死亡してしまったため、死亡個体を凍結保存したものから、皮膚を採取して、組織学的、免疫組織学的検討を行った。さらに次のBL6系マウスでのTgマウス作成時には、同じく3個体の仔マウスが得られた。死亡する前の3週で皮膚、肝臓、肺、リンパ節を採取し、組織学的検討用にホルマリン固定、RNA抽出用にRNALater保存した。これらのサンプルを組織学的に検討したところ、手足の関節部位に好中球、リンパ球を含む著明な炎症細胞浸潤を認めた。解剖前の肉眼的にも、手足の著明な腫脹を認めた。皮膚には、肉眼的にも組織学的にも明らかな炎症を認めなかった。さらに、これらのサンプルからRNA抽出を行い、外注にてDNAアレイを施行した。現在、IL-33KOマウスの結果とも合わせ、データ解析を行っている。今後、IL-33トランスジェニックマウスにおけるサイトカインネットワークについて情報を得、野生型との差異を検討する予定である。有棘層でのIL-33の発現は、手足という外的刺激を受けやすい部分に特に炎症を生じることが考えられ、乾癬やアトピー性皮膚炎などの炎症性疾患での有棘層におけるIL-33発現の役割について、今後考察を加え報告する予定である。インボルクリンプロモーター下にマウスILー33を発現するベクターを構築した。まず、正常ヒトケラチノサイト、HaCaT細胞およびHEK293細胞にベクターをトランスフェクトし、ILー33発現をウェスタンブロットにて確認した。トランスジェニックマウス作成は外注にて施行した。まず、Balb/cマウス受精卵200個に発現ベクターをインジェクションし、マウス卵管内に移植した。仔マウスが得られなかったため、さらにB6マウスの受精卵200個に発現ベクターをインジェクションし、B6マウス卵管内に移植したところ、B6マウスの仔マウスが29匹得られたため、尾の組織からDNAを抽出してタイピングを行った。29匹のファウンダーマウス(F0)うちILー33トランスジェニックマウスは6匹ですべて成長過程で死亡した。繁殖可能週齢まで成長したマウスは21匹ですべて野生型であった。死亡したILー33トランスジェニックマウス皮膚から切片を作成して、ILー33抗体にて免疫染色したところ、有棘層に発現を認めた。また、死亡したILー33トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの各臓器からRNAを抽出してILー33発現を検討したところ、トランスジェニックマウスの皮膚で高い発現を認めたことから、インボルクリンプロモーター下に予想通りILー33が強制発現されているものと考えられた。さらに、1週、2週、4週と、週齢が進むにしたがって皮膚におけるILー33発現が上昇することが確認された。保有しているILー33ノックアウトマウスがBalb/cであるため、トランスジェニックマウスもBalb/cで作成したかったが、Balb/cでは仔マウスが得られなかった。次にB6マウスで試したところ、仔マウスが得られたが、トランスジェニックマウスはすべて成長過程で死亡し、繁殖できず、交配ができなかった。1今後、もう少しB6マウスでトランスジェニックマウス作成を試みる。外注ではなく、自施設の実験動物センターにて作成をすることで、成長過程においても詳細に検討できるようにする予定である。

2また、ILー33の有棘層での発現が致死的である可能性を考慮し、成長後に発現誘導できるシステムを構築することを計画している。トランスジェニックマウスが計画した通りに作出できなかったため、研究計画に遅れが生じたため。来年度に、トランスジェニックマウスの作成方法について変更を加えて再度トランスジェニックマウスの作出を試みるために、次年度分を使用する。
ケモカイン及びそのレセプターを標的とする抗体療法及び遺伝子療法の開発

ケモカインのアンタゴニストであるTAK776とFK506の効果をラットの小腸移植モデルにて研究した。レシピエントはFK506とTAK779の投与を行った。グラフト生存率と免疫学的反応はMLRとINFγの生成にて評価を行った。グラフト生存期間は同種移植群、FK506投与群、TAK779投与群、2剤投与群にてそれぞれ7.0,12.0,9.8,18.0日であった。MLRとINFγの生成はFK506群にて、顕著にTAK779群に対して抑制されていた。CD4+とCD8+陽性の細胞はFK506群、TAK779群ともに顕著に抑制されていた。今後、TAK779の効果を研究することによって、小腸移植に対する新しい抗拒絶療法の開発が期待される。8週目のラットを用いて、DAとLEWの間で異所性小腸移植モデルを作成することに成功した。腸管吻合モデルも作成し、同所性小腸移植モデルを作ることも成功した。少量のタクロリムスを追加することにより、拒絶抑制モデルを作成することにも成功した。また、同種間の小腸移植モデルを用いて虚血再還流モデルを作成することに成功した。これらのマウスは移植後、グラフトの生存を経時的にモニタリングを行う(人工肛門の排液、色調等)ことに成功して移植後個体の観察を行うことが可能になった。これらのモデル作成により、小腸移植の実験をラット動物モデルにて行うことが可能になった。ラットに対する小腸に特異的に発現されているケモカインLARK,TECK,Fractalkineに対するペプチド抗体を作成することに成功した。これらの抗体作製により、移植小腸において発現されているケモカインを測定すること、並びにその活性を操作することが可能になった。移植後一定期間後に犠牲死させることによって、移植後腸管、並びに正常腸管を摘出し、冷凍に保存して組織バンクを作成した。前述したケモカインの抗体を使用して、摘出腸管内に存在するリンパ球のケモカインの発現をフローサイトメトリーで測定した。また、腸管を腸管全体、腸管粘膜、腸間膜リンパ節に分離し、そこに存在しているケモカインタンパク質量をELISA法により測定を行った。これらの実験により、前述したケモカインの発現があるかどうか、またその強度を確認することが可能になる。これらのラットに移植前処置として、また移植後の追加投与として小腸に特異的に発現されているケモカインに対する抗体の内TECK、並びにfractalkineの投与を行い、抗体によって拒絶反応、並びに虚血再還流による傷害の抑制が得られるかどうかを比較した。小腸移植の成績改善のためラット小腸移植のモデルを使用して、拒絶の改善を研究している。今年度は現在一般的に使用されているタクロリムス(FK506)や、シクロスポリンと組み合わせて、臨床に近いレシピを利用してその効果を判定した。ケモカインレセプター阻害剤であるTAK-779単独投与とFK506単独投与をラット小腸移植モデルに投与を行い同程度にgraft survival延長認めた。FACS解析において,FK506の単独投与によって、allogeneic群に対してケモカインレセプターCCR5およびCXCR3の発現に変化を与えなかった。一方、TAK-779群ではCCR5およびCXCR3の発現低下を認めた。レシピエントリンパ球のalloantigenに対する活性をMLR(リンパ球混合培養反応)を用いて解析を行った。MLRのによるリンパ球の活性はAllogenic群がもっとも高くて、TAK-779が低く、FK506が最も低い結果であった。また、MLR上清中のINF-γの産生量をELISA法にて測定したところ、TAK779の方がFK506より高いことが判明した。今後、FK506と同時投与により臨床に近い状態でグラフト内で一般的に移植免疫にたずさわっている、CD4, CD8, integrinβ7、CD103、CD45RA等をフローサイトメトリーにより測定する予定である。小腸移植の臨床成績はいまだに満足のいくものではない、特に他臓器と比べると急性拒絶反応の制御が困難なため、その改善のためラット小腸移植のモデルを使用して、拒絶の改善を研究している。今年度は現在一般的に使用されているタクロリムス(FK506)と組み合わせて、臨床に近い免疫抑制剤投与を行い効果を判定した。

ケモカインレセプターCCR5及びCXCR3の阻害剤であるTAK779とFK506をラット小腸移植モデルに投与を行いグラフト生存期間,EACSによりリンパ球のCCR5, CXCR3発現,real-time RT-PCRによりCCR5, CCL5, CXCR3, CXCL10mRNA発現,リンパ球混合試験(MLR)の変化,IFN-γ分泌能の変化を検討した。また,TAK779とFK506併用によるグラフト生存期間を検討したTAK-779とFK506の併用ではグラフト生存期間は18±1.5日で有意に延長した。FACS解析においてFK506投与群のCD4^+, CD8^+T細胞数がグラフトパイエル板,脾臓,腸間膜リンパ節で有意に減少した.T細胞におけるCCR5発現またはCXCR3発現は,非投与群に比しTAK779投与群で有意に抑制されたが,FK506群と非投与群とでは変化を認めなかった。MLRおよびIFN-γ分泌は非投与群とTAK506群に比しFK506群で有意に抑制を認め,非投与群に対してTAK779群は抑制傾向であった。TAK779はCCR5及びCXCR3を抑制する効果を示した。一方,FK506は非投与群に対してCCR5及びCXCR3の発現に変化を与えなかった。TAK779とFK506の併用によりリンパ球の浸潤抑制および増殖・エフェクター能抑制による相乗効果により、小腸移植の拒絶抑制の改善が明らかになった。
エストロゲン合成に係わる遺伝子多型と身体活動による動脈硬化抑制効果の関係

健康な日本人女性を対象として,エストロゲン合成に関連する遺伝子多型が動脈硬化指数および身体活動による動脈硬化改善効果の個人差への関与について検討した。エストロゲン合成に係るaromataseに関連する遺伝子(CYP19A1)の多型のうち,rs4646多型およびrs1062033多型に関しては,HDLコレステロール濃度と明らかに関連していた。rs10046多型に関しては,ヘモグロビンA1cと明らかな関連性が認められた。さらに,rs4646多型は頸動脈β-stiffnessや上腕足首間脈波伝播速度(brachial-ankle pulse wave velocity; baPWV)といった動脈硬化指数と明らかに関連していた。これらの関連性に有酸素性作業能力の高低は影響しなかった。以上より,日本人女性において,エストロゲン合成に関連する遺伝子多型(aromataseに関連する遺伝子多型)は,有酸素性作業能力の高低とは無関係に,動脈硬化指数およびHDLコレステロールやヘモグロビンA1cレベルといった冠危険因子に影響することが示唆された。本研究課題では,エストロゲン合成に関与するステロイド変換酵素群の遺伝子多型の違いが,エストロゲン合成効率に影響し,動脈硬化指数やその身体活動増加に伴う改善度に違いを生じさせるとの仮説を検証することを目的とした。サンプル数は800名程度であった。平成24年度にはこのDNAサンプルから多型分析を行った。数種類の遺伝子多型と特に血圧や動脈硬化指数,糖代謝,血中脂質といったphenotypeとの関連性を確認した。さらに,各年代における最大酸素摂取量の中央値を基準にフィットネスレベルを2群に分け,有酸素性作業能力の高低による動脈硬化改善効果の差異についても検討した。今回はエストロゲン合成に関わるaromataseに関連する遺伝子(CYC19A1)の単一遺伝子多型についての結果を報告する。rs4646多型およびrs1062033多型に関しては,HDLコレステロール濃度と明らかに関連していた。さらに,rs4646多型は,頸動脈ベータスティフネスと明らかな関連が認められ,aromataseに関連する遺伝子多型はHDLコレステロールといった冠危険因子やヘモグロビンA1cといった糖代謝指標の個人差に関与し,さらにそれらの危険因子が影響する頸動脈の動脈硬化指数にも多型の影響があることが確認された。有酸素性作業能力の高低による運動効果の違いに関しては,いずれの指標においても,有酸素性作業能力の違いと遺伝子多型の違いの間に明らかな交互作用は認められなかった。この点は仮説と異なる点であった。本研究課題では,エストロゲン合成に係わるステロイド変換酵素群の遺伝子多型が動脈硬化指数および身体活動による動脈硬化抑制作用の個人差に及ぼす影響について検討することを目的としている。幅広い年代の女性を対象として,エストラジオール合成に係わるステロイド変換酵素群の遺伝子多型の分析を行い,身体活動量・体力(最大酸素摂取量)の増大による動脈硬化指数の抑制効果の個人差と候補遺伝子多型との関係を横断的に検討する。本研究課題は,すでに展開されているコホート研究の一部として実施され, 600名程度(閉経前および閉経後女性それぞれ300名程度)の動脈硬化指数を含む生理学指標や身体活動量・体力の測定および遺伝子多型解析に必要なDNAの抽出は終了していた。加えて,約200名分の生理学指標等のデータ取得と採血が終了していた。平成23年度には,この約200名分のDNA抽出や性ホルモン濃度の測定を行い,サンプル数を800名程度とした。これらのサンプルをすでに得られているものと合わせて全800名程度のDNAサンプルから,エストラジオール合成に係わるステロイド変換酵素群の遺伝子多型を解析する準備をおこなった。すなわち,種々のデータベースあるいは文献的情報より,候補となる遺伝子多型の選定とその解析方法の確認作業を行った。これらの作業により,1)CYP17A1 ,2)HSD3B,3)HSD17B1 ,4)CYP19A1に関してそれぞれ数種類の候補遺伝子多型を決定することができた。本研究課題の進行状況は,申請当初の計画よりも幾分遅れている。この理由は,遺伝子多型の解析に必要なプライマーの設定・作成に予想以上に時間が必要であったことによる(プライマーの設定は専門業者との共同で行っており,その進行に予想以上に時間が必要であった)。

また,本研究課題実施に関して,施設面での支援を得ている共同研究先との時間的設定の問題が挙げられる。ただし,これらの問題点はおおむね解決されているため,平成24年度以内に研究目的を達成することは十分に可能であると考えている。平成24年においては,上記の今後の推進方策に示すように,遺伝子多型の判定・分析のためのプライマーや試薬の購入が研究費使用の中心となる。その他として,学会参加費用や人件費(分析のためのアルバイト費用)として研究費を使用する。
上水汚泥とバチルス菌優先し尿処理汚泥を混合醗酵した連作障害解決型土壌改良剤の開発

バチルス菌(枯草菌)優占で運転されているし尿処理施設の乾燥汚泥と、急速ろ過の浄水汚泥及びキノコ工場廃菌床を、実験室レベルで生ゴミ処理機を使用して中温で混合醗酵すると、当初は廃菌床に由来するカビや各種のバクテリアコロニーが発生するが、2週間以上の培養では、必ずバチルス菌が優占化することを確認(32°C、平板寒天培地)した。この理由としては、バチルス菌が休眠時の芽胞形成に必要なシリカ分を浄水汚泥のシルトから供給できること、バチルス菌(枯草菌)のエサとなるセルロースが廃菌床から供給できることが考えられる。バチルス菌が、土壌中に1.0E+07個/g程度いると、微生物生態系が安定し、連作障害が解消できるといわれているが、1.0E+08個/g以上のレベルまでバチルス菌が増殖することを繰り返し確認した。次に実設備を用いた試作試験では、温度管理を確実に行えば生ゴミ処理機と同等のバチルス菌濃度が得られたので、平成18年春に数トンの土壌改良剤を試作し、実農家の協力を得てヤマト芋畑に施用して、実際の畑で連作障害抑止試験を実施したところ、消毒区(マルチングでソイリーン薬剤を注入、殺菌)と比較してほぼ遜色ない(ネコブ線虫罹患率消毒区1%に対して23%)結果を得たが、土壌改良剤が投入されていない隣地境界部の罹患率は5070%であった。この結果は予想した値よりも良好であり、試験区の土壌中バチルス菌濃度は1.0E+07個/g程度存在することも確認できた。なお乾燥汚泥中のバチルス菌はB.subtillusが優占であるにもかかわらず、製造された土壌改良剤の優占種はB.thuringiensisを中心とする複合的な種で構成されており、複数種のバチルス菌の相互作用がより効果を高めていることが示唆された。バチルス菌優占で運転しているし尿処理施設の乾燥汚泥と、急速ろ過の浄水汚泥及びキノコ工場廃菌床を、実験室レベルで生ゴミ処理機を使用して中温で混合醗酵すると、当初は廃菌床に由来するカビや各種のバクテリアコロニーが発生するが、2週間以上の培養(32°C、平板寒天培地)では、必ずバチルス菌が優占化することを確認した。バチルス菌が、土壌中に10E-8程度いると、土壌細菌の優占種となるので微生物生態系が安定し、連作障害が解消できる可能性があるといわれているが、10E-8/gのレベルまでバチルス菌が成育することが確認できた。次に土壌中に投入した場合、浄水汚泥のアルミニウムが土壌中のリンと結合し、リン飢餓が発生する危険性については、醗酵物の溶出試験を実施したところ、水溶性リンまたはク溶性リンが高い濃度で検出されるので、し尿汚泥と廃菌床に含まれるリンがアルミと結合しても、余剰のリンが残存することが確認され、リン飢餓の問題は回避できることが確認できた。実規模の設備を用いた発酵試験では、温度管理をしっかりやれば(冷えすぎない)生ゴミ処理機と同等の成果が得られることが確認された。

バチルス菌(枯草菌)優占で運転されているし尿処理施設の乾燥汚泥と、急速ろ過の浄水汚泥及びキノコ工場廃菌床を、実験室レベルで生ゴミ処理機を使用して中温で混合醗酵すると、当初は廃菌床に由来するカビや各種のバクテリアコロニーが発生するが、2週間以上の培養では、必ずバチルス菌が優占化することを確認(32°C、平板寒天培地)した。この理由としては、バチルス菌が休眠時の芽胞形成に必要なシリカ分を浄水汚泥のシルトから供給できること、バチルス菌(枯草菌)のエサとなるセルロースが廃菌床から供給できることが考えられる。バチルス菌が、土壌中に1.0E+07個/g程度いると、微生物生態系が安定し、連作障害が解消できるといわれているが、1.0E+08個/g以上のレベルまでバチルス菌が増殖することを繰り返し確認した。次に実設備を用いた試作試験では、温度管理を確実に行えば生ゴミ処理機と同等のバチルス菌濃度が得られたので、平成18年春に数トンの土壌改良剤を試作し、実農家の協力を得てヤマト芋畑に施用して、実際の畑で連作障害抑止試験を実施したところ、消毒区(マルチングでソイリーン薬剤を注入、殺菌)と比較してほぼ遜色ない(ネコブ線虫罹患率消毒区1%に対して23%)結果を得たが、土壌改良剤が投入されていない隣地境界部の罹患率は5070%であった。この結果は予想した値よりも良好であり、試験区の土壌中バチルス菌濃度は1.0E+07個/g程度存在することも確認できた。なお乾燥汚泥中のバチルス菌はB.subtillusが優占であるにもかかわらず、製造された土壌改良剤の優占種はB.thuringiensisを中心とする複合的な種で構成されており、複数種のバチルス菌の相互作用がより効果を高めていることが示唆された。
細胞のエンドサイト-シスを利用した膜融合を用いるドラッグデリバリ-

インフルエンザウイルスの膜融合活性タンパク質(HAタンパク質)の活性部位を模した酸性pHー依存的膜融合活性ペプチド(HAペプチド)及び、そのアナログペプチド数種を合成し、タンパク質・核酸・薬剤等を封入したリポソ-ム表面に吸着・共有結合させた擬似インフルエンザウイルス(以下人工ウイルス)を調製すれば、細胞のエンドサイト-シスを利用したエンドソ-ム経由の全く新しい細胞内物質導入法の開発ができる。本年度は、人工ウイルスのkey pointとなる弱酸性pH(<6.0)での膜融合活性及び、赤血球溶活性などのbiomembraneに対する活性を有する酸性ペプチド(E5,E5L)を合成し、蛍光法・電顕観察を中心とした物理化学的手法により、融合活性に必要不可欠なペプチドの機能モチ-フを研究した。その結果、HAペプチドのN末端10残基程が活性発現に必要な両親媒性ヘリカル構造をつくる為の「核」となっていることを明らかにした。また、培養細胞に取り込まれた人工ウイルスの挙動をリアルタイムに近い時間スケ-ルでモニタ-することは、今後の人工ウイルス改良に必要不可欠である。本年度は、リポソ-ムを蛍光共鳴エネルギ-移動(RET)を起こす2種の蛍光性脂質(エネルギ-供与体;NBDーPE,エネルギ-受容体;R_<18>)でラベルし、COSー1細胞に非特異的にエンドサイト-シスさせ、高感度ビデオ付き蛍光顕微鏡などで追跡することができた。また、リポソ-ムがエンドソ-ムやリソソ-ムで破壊されたり、それらの膜と融合すると、蛍光性脂質がそれらエンドソ-ムの膜上で拡散、RETが解消し、エネルギ-供与体(NBDーPE)の蛍光強度が増加し蛍光寿命が長くなることを、時間分解顕微蛍光法やセルソ-タを駆使し、単一細胞内での挙動を定量的に測光、追跡できた。
中小企業のパフォーマンスと支援政策の効果に関する計量分析

本年度は,前年度の研究に対するモデルおよび論文の修正,加えて,あらたに創業時の資金調達に焦点をあてた分析を中心に取り組んだ.まず,前年度の研究では,雇用,資産および売上高の増加を中小企業のパフォーマンスとしてとらえ,中小企業向けの代表的な支援政策である「中小企業創造法」を含めて,その決定要因を分析した.この分析について,モデルの変数の選択,および推定方法に対していくつか問題があったため,修正を加えたモデルによりあらたな推定を試みた.結果として,修正後の推定においてもこれまでと同様の分析結果を提示することができ,中小企業創造法が資産増加に影響を与えていることが示された.また,高度経済成長期以前に創業した古い中小企業とそれ以降に創業した若い中小企業に分割し,分割の妥当性の検定を行った上でそれぞれのパフォーマンスの決定要因を分析した.その結果,中小創造法やキャッシュフローの大きさが若い中小企業に影響を与えることが示された.加えて,モデルおよび推定方法の修正にともなって論文を大幅に加筆修正した.次に,前年度の先行研究のサーベイより,中小企業のパフォーマンスに対しては,資本市場における情報の非対称性の存在もあって,創業時の資本市場からの資金調達の違いによる影響が考えられる.また,資金調達に対しては,企業よりもむしろ起業家の個人属性の影響が考えられるため,資金調達と起業家の個人属性の関係が重要となってくる.このような視点から,既存のデータベースを用いて,創業時における「家族・友人」「事業に賛同してくれた個人・法人」「銀行」の3つのグループからの資金調達額と起業家の個人属性との関係を分析した.これまでの推定結果から,学歴の高い起業家は,銀行から資金調達する傾向が示された.また,年齢の若い起業家は,家族や友人から資金調達する傾向がみられる一方,年齢の高い起業家は,事業に賛同してくれた個人・法人から資金調達する傾向がみられた.さらに,自ら出資した個人資産が大きい起業家ほど,銀行から資金調達しやすいことも示された.これらのことから,情報の非対称性の存在するなかで,銀行からの資金調達には一定の限界があり,このことを踏まえながら支援政策の検討が必要であることが示唆された.最後に,今後のさらなる研究のため,現在,いくつかのデータベースをもとにわが国中小企業のデータを整理しており,これらのデータベースを用いたあらたな推定を検討している.本年度は,中小企業のパフォーマンスに関する先行研究のサーベイをもとに,モデルの設定および計量分析の準備を行ってきた.これに加えて,これまでに得られたデータを用いて,本研究に結びつけるための分析も試みてきた.まず,これまでに得られたデータを用いた分析では,雇用,資産および売上高の増加を中小企業のパフォーマンスとしてとらえ,その決定要因を推定した.特に,中小企業のパフォーマンスと資本構成との関係,および創業や研究開発・事業化を通じて新たな事業分野の開拓を促進するために金融支援を行う「中小企業創造法」との関係を示した.これまでの推定結果から,資本構成について,負債比率の小さい中小企業ほど雇用と資産を増加している傾向がみられた.ただし,売上高については,逆に,負債比率の大きい中小企業ほど増加する傾向がみられている.加えて,これらの傾向は,中小企業の中でも創業後の経過年数の長い企業ほどみられており,逆に,若い中小企業では,雇用や資産の増加に対して負債比率の与える影響はほとんどみられなかった.また,「中小創造法」によって,中小企業の資産増加につながることが示されたが,雇用や売上高への影響はみられなかった.特に,若い中小企業については,資産のみならず雇用や売上高への影響がみられており,いわゆる「ベンチャー企業」の支援につながることを示唆した結果が得られた.このように,資本構成および支援政策が,中小企業のパフォーマンスに影響を与える傾向がみられたことから,今後,中小企業の資金調達に焦点をあてた研究を展開していくことを検討している.一方,中小企業のパフォーマンスに関する先行研究のサーベイより,中小企業のパフォーマンスに対しては,資本市場における情報の非対称性の存在もあって,創業時の資本市場からの資金調達の影響が十分に考えられよう.また,資金調達に対しては,企業のみならず起業家の個人属性の影響も考えられるため,資金調達と起業家の個人属性の関係も含めたモデルを検討している.これらの検討をもとに,次年度では,あらたなデータとモデルによる実証分析を予定している.現在,試験的に利用したデータベースについて,必要なデータが収集可能かを検討し,加えて,モデルおよび推定方法の検討を行っている.本年度は,前年度の研究に対するモデルおよび論文の修正,加えて,あらたに創業時の資金調達に焦点をあてた分析を中心に取り組んだ.まず,前年度の研究では,雇用,資産および売上高の増加を中小企業のパフォーマンスとしてとらえ,中小企業向けの代表的な支援政策である「中小企業創造法」を含めて,その決定要因を分析した.この分析について,モデルの変数の選択,および推定方法に対していくつか問題があったため,修正を加えたモデルによりあらたな推定を試みた.結果として,修正後の推定においてもこれまでと同様の分析結果を提示することができ,中小企業創造法が資産増加に影響を与えていることが示された.また,高度経済成長期以前に創業した古い中小企業とそれ以降に創業した若い中小企業に分割し,分割の妥当性の検定を行った上でそれぞれのパフォーマンスの決定要因を分析した.その結果,中小創造法やキャッシュフローの大きさが若い中小企業に影響を与えることが示された.加えて,モデルおよび推定方法の修正にともなって論文を大幅に加筆修正した.

次に,前年度の先行研究のサーベイより,中小企業のパフォーマンスに対しては,資本市場における情報の非対称性の存在もあって,創業時の資本市場からの資金調達の違いによる影響が考えられる.また,資金調達に対しては,企業よりもむしろ起業家の個人属性の影響が考えられるため,資金調達と起業家の個人属性の関係が重要となってくる.このような視点から,既存のデータベースを用いて,創業時における「家族・友人」「事業に賛同してくれた個人・法人」「銀行」の3つのグループからの資金調達額と起業家の個人属性との関係を分析した.これまでの推定結果から,学歴の高い起業家は,銀行から資金調達する傾向が示された.また,年齢の若い起業家は,家族や友人から資金調達する傾向がみられる一方,年齢の高い起業家は,事業に賛同してくれた個人・法人から資金調達する傾向がみられた.さらに,自ら出資した個人資産が大きい起業家ほど,銀行から資金調達しやすいことも示された.これらのことから,情報の非対称性の存在するなかで,銀行からの資金調達には一定の限界があり,このことを踏まえながら支援政策の検討が必要であることが示唆された.最後に,今後のさらなる研究のため,現在,いくつかのデータベースをもとにわが国中小企業のデータを整理しており,これらのデータベースを用いたあらたな推定を検討している.
高圧実験によるポストペロフスカイトとマントル最下部のレオロジー

ポストペロフカイトはマントル最下部層(いわゆる、D"層)の主要構成物質である。そこで、地球内部の対流を理解するために、ペロフスカイトからポストペロフスカイトへの相転移に伴う、レオロジー的性質の変化を高圧実験的手法により調べた。結晶粒径は、物質の粘性率や変形機構を制約する重要な要因で有り、実験結果から、相転移に伴い細粒化が起こることが明らかになった。このことは、ポストペロフスカイトに相転移することによって粘性率の低下が起きることを示している。地球マントル最深部に存在しているポストペロフスカイト相のレオロジーを理解することは、地球内部で最大の境界である核・マントル境界の流動現象の理解に必要不可欠であり、全地球ダイナミクスの解明に非常に重要である。しかしながら、珪酸塩ポストペロフスカイトは120GPa以上の高圧下のみで安定であり、レオロジー特性を実験的に決定することは非常に困難である。そこで、本研究では、ゲルマニウム酸塩をアナログ物質として用いることにより、実験的にポストペロフスカイト相のレオロジーに迫ることを目的としている。今年度は、まず、アナログ物質MnGeO3の安定領域を精密に調べる実験を行い、圧力60GPa、温度1600Kで低圧相のペロフスカイトからポストペロフスカイト相に相転移し、その勾配は13MPa/Kであるということを明らかにした。これは、最下部マントルの温度構造、ひいては、.マントル流動に関しての新たな情報を提供することになる。ポストペロフスカイト相の安定領域が明らかになったことにより、その安定領域での粘性率を見積もるために必要な拡散係数決定の実験に取り組みつつあるところである。また、ペロフスカイトからポストペロフスカイト相転移における結晶粒の細粒化の有無を調べる実験を行った。相転移その場)X線回折実験から得られた予備的な実験結果は、細粒化が起きることを示唆している。固体物質の場合、物質構成粒子の結晶粒が細粒のとき、粗粒な場合と比較して、その粘性率は低い。すなわち、相転移に伴う粘性率の低下が予想される。このことは、最下部マントルに沈み込んだスラブのレオロジーを考察する上で重要である。2004年に下部マントルの主要構成物質である珪酸塩ペロフスカイトのさらなる高圧相が発見された。この高圧相はポストペロフスカイトと言われており、相転移の温度圧力条件から地球マントルの最下部D"層を主要に構成すると考えられている。本研究では、このポストペロフスカイト相のレオロジーを明らかにし、マントル流動の観点から全地球ダイナミクスを議論することにある。昨年度に引き続き、D"層における結晶粒径にかんする研究を行った。構成物質の結晶粒径は、その物質の変形様式を支配する。結晶粒が小さい場合には拡散クリープが卓越し、結晶粒が大きい場合には転位クリープが卓越する。地球物理学的観測、および、アナログ物質を含めたポストペロフスカイトにおける変形実験より、D"層においては、ポストペロフスカイトは転位クリープで変形していると考えられてきている。しかしながら、昨年度および今年度行った相転移その場X線回折実験により、相転移後の結晶粒径は非常に小さいことが明らかになり、ポストペロフスカイトでは拡散クリープが卓越しているだろうということが分かってきた。この知見は非常に重要であり、地球物理学的観測データとの対比を行うことにより、マントルダイナミクスの解釈に新たな制約を与えうる。一方、上述したような実験をより広い温度圧力領域で安定して行うための実験実の開発も併せて行ってきている。この開発した技術を用いて、今後は、拡散クリープの場合でのポストペロフスカイトの粘性率の見積もりを試行する。地球の下部マントルは、主要に、珪酸塩ペロフスカイトで構成されている。このペロフスカイトは、約120GPaの圧力で、ポストペロフスカイトへと圧力誘起相転移を起こし、この相転移が、マントル最下部に存在するD"層との境界を形成していると考えられている。従って、ペロフスカイトからポストペロフスカイトへの相転移機構とレオロジー変化、さらには、ポストペロフスカイト自体のレオロジーを調査することは、マントル最下部から表層に至る全地球的岩石圏のダイナミクスを理解する上で欠かすことができない。ペロフスカイトからポストペロフスカイトへの相転移を実験的に調査したところ、1.相転移に伴い、結晶粒の細粒化が起きることと、2.この相転移においては、ペロフスカイトとポストペロフスカイト間にトポタクティックな関係があり、ペロフスカイトのα軸(a_<pv>)が、ポストペロフスカイトのα軸(a_<ppv>)に、b_<pv>がc_<ppv>に、c_<pv>がb_<ppv>に置き換わることが示された。

これらの結果から、マントル最深部に沈み込んでいくスラブでは、支配的な変形機構が、ペロフスカイトの転位クリープから、ポストペロフスカイトの拡散クリープを経て、ポストペロフスカイトの転位クリープへと発展していく可能性が高い。さらに、マントル最深部での流動パターンを水平方向が卓越しているとした場合には、ペロフスカイトのスベリ系を考慮すると、相転移直後に(から)、強い弾性的異方性を形成することが示唆される。このことは、D"層深さで環太平洋地域での強いV_<SH>V_<SV>という地震波速度異方性を上手く説明できる。今後は、追試を重ね、この実験結果の確度を挙げていきたい。
クオラムセンシングを調節するプロバイオティクスの開発

クオラムセンシング(QS)は細菌密度に応じて産生されたオートインデューサー(AI)を介して遺伝子大腸菌によるマイクロプレート内バイオフィルムアッセイを確立した。QSを介在する分子であるautoinducer2を本バイオフィルムアッセイ系に添加した際にバイオフィルム形成が充進することを確認した。腸内フローラ構成菌16菌属25菌株の培養上清のうちバイオフィルム形成を抑制したものはBifidobacterium longum, Clostridium difficile, Enterococcus faecalis Lactobacilus casei, Peptoniphilus asaccharolyticus, Veillonella parvulaであった。一方、バイオフィルム形成の亢進を示したものはBacteroides属およびFusobacterium necrophorumであった。AI-2が産生されないHelicobacter pyloriluxS変異株と親株のバイオフィルム形成能を比較した結果、両者に差は認められず、本菌はQSとは異なるバイオフィルム形成が行われている可能性が示された。健常成人糞便由来腸内菌576株を使用して大腸菌のバイオフィルム形成に変化を及ぼす菌株のスクリーニングを行った結果、対照に比べ80%以下のバイオフィルム形成を示した菌株は12株であった。しかし、本実験では対照の大腸菌のバイオフィルム形成が十分でなかったため、2回目の実験を行った。健常成人糞便由来腸内菌534株中、大腸菌のバイオフィルム形成を20%以上および50%以上抑制したものはそれぞれ43株および22株認められた。腸内菌株534株中、S. aureusのバイオフィルム形成を20%以上および50%以上抑制したものはそれぞれ42株および5株認められた。今後、これらの菌種同定を行うとともに、バイオフィルム形成以外のQS関連遺伝子(付着性、毒素産生等)の発現に及ぼす効果を解析していく。クオラムセンシングを調節するプロバイオティクスの開発を目的として、各種腸内フローラ構成細菌のバイオフィルム形成に及ぼす研究を行った。バイオフィルムは各種細菌が産生する多糖体により構成され、抗菌薬の浸透阻害や貪食阻害などの効果を有する。バイオフィルム形成はクオラムセンシングにより調節されることが知られており、本研究ではPrattらの方法(1998)の方法に基づき、大腸菌によるマイクロプレート内バイオフィルムアッセイを確立した。被験大腸菌6菌株のバイオフィルム形成能を比較した結果、K12株が最も高度なバイオフィルムを形成することが明らかとなった。また、クオラムセンシングを介在する分子であるautoinducer 2(luxS陽性Vibrio harveyiおよびluxS相補株の大腸菌DH5αPTKY株の培養上清を使用)を本バイオフィルムアッセイ系に添加した際にバイオフィルム形成が亢進することを確認した。腸内フローラ構成菌としてAnaerococcus, Bacteroides, Candida, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Finegolderia, Fusobacterium, Klebsiella, Propionibacterium, Peptoniphilus, Streptococcus, Veillonellaの14菌属17菌種23菌株を使用した。添加した培養上清のうちコントロール培地に比較してバイオフィルムの形成が低下したものはClostridium difficile, Peptoniphilus asaccharolyticus, Veillonella parvula, Enterococcus faecalisの培養上清であった。現在までに健常ヒト成人糞便から腸内菌を1000株以上分離している。

今回、確立したバイオフィルムアッセイを用いて、上記の腸内菌のバイオフィルム形成能に及ぼす効果を検討する。緑膿菌、病原性大腸菌、肺炎球菌などのバイオフィルム感染症は治療に抵抗するため、バイオフィルム形成を抑制する腸内菌を分離して新規のプロバイオティクス開発を目指す予定である。クオラムセンシング(QS)は細菌密度に応じて変生されたオートインデューサー(AI)を介して遺伝子発現が調節されるシステムである。細菌のバイオフィルム形成は免疫回避、抗菌薬への抵抗性などと関連し、その形成はQSにより調節されることが知られている。本研究では細菌のバイオフィルム形成を調節する腸内フローラ由来細菌を分離し、細菌生剤として注目されているプロバイオティクスとして開発することを目的とした。Escherichia coliを用いたマイクロプレート内アッセイによるバイオフィルム形成判定法を確立した。QS介在分子であるAI-2(luxS陽性Vibrio harveyiおよびluxS相補株のE.coliαPTKY株の培養上清を使用)の添加により、E.coliのバイオフィルム形成が亢進することが明らかとなった。腸内フローラ構成菌16菌属25菌株の培養上清のうちバイオフィルム形成を抑制したものはClostridium difficile、Bifidobacterium、Enterococcus faecalis Lactobacilus casei、Peptoniphilus asaccharolyticus、Veillonella parvulaであった。AI-2が産生されないHelicobacter pyloriluxS変異株と親株のバイオフィルム形成能を比較した結果、両者に差は認められず、本菌はQSとは異なるバイオフィルム形成が行われている可能性が示された。健常成人糞便由来腸内菌576株を使用してE..coliのバイオフィルム形成に変化を及ぼす菌株のスクリーニングを行った結果、対照に比べ80%以下のバイオフィルム形成を示した菌株は12株であった。これらの菌種同定を行うとともに、バイオフィルム形成以外のQS関連遺伝子(付着性、毒素産生等)の発現に及ぼす効果を解析していく。
ウイルス感染伝播リスク解析を基盤とする牛白血病清浄化モデルの構築

増加する牛白血病ウイルス(BLV)による地方病牛白血病は、現在、日本の畜産生産上深刻な問題となっている。本研究ではBLVに新規感染した牛の感染源と媒介昆虫対策による感染阻止効果について検討した。新規感染した牛のBLV遺伝子(env遺伝子)を解析した結果、BLV陽性牛群内でリンパ球増多症を呈するウイルス量が多い牛の遺伝子と一致し、BLVの感染伝播においてハイリスク要因であることが示唆された。一方、吸血昆虫対策を実施した結果、新規感染は認められなかった。このことから、高ウイルス保有牛は感染源になりやすいこと、および昆虫対策は感染伝播阻止に有効であることが示された。平成23年、北海道大学大学院獣医学研究科は79件、4121頭の牛白血病ウイルス感染診断を行なった。依頼主の一つであるA農場で牛白血病が発生したため、担当獣医師より依頼を受け、従業員および農場関係者を対象とした牛白血病に関する対策講習会を行なった。その後、畜主および担当獣医師との対策協議を行ない、ウイルス感染全頭検査(約300頭)を行なうこととした。その結果、成牛で30頭(陽性率10.9%)と育成牛で15頭の感染牛が見つかった。感染牛の履歴を調べた結果、感染牛の11頭の母牛が感染牛であったことから、垂直感染によるウイルス伝播が推察された。そこで以下のことを実施した。1)牛白血病ウイルス感染全頭検査を行った。また、陰性牛は継続して検査を行った。2)ウイルス感染牛を隔離した。3)牛の動線をもうけ、搾乳は(1)ウイルス陰性牛、(2)乳房炎牛、(3)ウイルス陽性牛の順で行った。4)初乳ならびに全乳に対する加温殺菌(56□-30分)を行い、出生子牛の哺乳管理を徹底した。5)出血を伴う処置の使用器具やロープの洗浄・消毒を徹底した。6)感染牛の分娩時の出血に対する消毒に注意を払った。7)生産性を考慮した感染牛の淘汰を行った。対策実施後、10頭の陽転牛が発生したが、その陽転率は2.8%と非常に低く、畜主らが行なったこれらの対策が非常に有効であったことが示唆された。現在この農場では、ウイルス感染を含めた総合要因(生産性や受胎率の低さなどを優先的に考慮)を考えた淘汰を実行し、感染牛の清浄化に進んでいる。牛白血病対策に尽力し清浄化に着実に進んでいる同農場は、本病に対する非常に有用なモデルであると考えられた。現在、さらに淘汰順位を考慮するための感染ウシにおけるウイルス保有量の調査をReal-time PCR法およびシンシチウムアッセイ法により行なっている。今後、その他の農場でも対策実施を行なう予定である。平成25年、北海道大学大学院獣医学研究科は87件、2524頭の牛白血病ウイルス感染診断をnested-PCR法によって行い陽性率は8.4%であった。検査結果はモデル農場などにおいて新規導入牛の決定、感染牛の分離飼育、優先淘汰および感染牛産出(帝王切開を含む)の子牛の早期感染検査などに活用された。牛白血病対策の概要は次のとおりである。<モデルA農場(肉牛)>農場の背景:ウイルス感染牛8頭の導入によって5頭が新規感染(陽転)した。リスクの同定:新規感染牛のウイルスenv遺伝子を解析した結果、すべてリンパ球増多症を呈する導入牛のウイルスと一致し、同牛が感染源になったことを明らかにした。また、同農場で多数の吸血昆虫が発生していることを確認しサシバエおよびミナミサシバエと同定した。対策内容:医原性感染防止に努めた上、ピレスロイド配合イアータグ装着、アイボメック、バイチコールの3種併用による駆虫対策を3年間実施した。効果の実際:感染牛と陰性牛は同居状態であったが3年間陽転牛の発生がなかった。<モデルB農場(肉牛)>農場の背景:販売先で売却牛が白血病を発症した農場で全頭BLV検査を行った結果、陽性率および陽転率が高いことが判明した。リスクの同定:主にサシバエによる水平感染が発生していることが明らかとなった。対策内容:感染牛を分離飼育し、新規導入牛は感染検査を実施した。サシバエの発生源が堆肥場と同定されたので消石灰による駆虫対策を実施し、陰性牛に対して駆虫薬を噴霧した。効果の実際: 1年後の検査まで陽転を抑えることに成功した。平成24年、北海道大学大学院獣医学研究科は67件、2329頭の牛白血病ウイルス感染診断をnested-PCR法によって行い陽性率は7.5%であった。