hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発生と発がんのフロンティア研究

カチオニックトリプシノーゲン遺伝子の変異により膵炎が発症するが、この場合の膵癌の発生頻度は50倍以上になる。そこで、トリプシンインヒビターであるSpink3遺伝子に着目し研究を行っている。Spink3遺伝子の破壊マウスでは、autophagyにより膵臓が消失することを発見しているが、セルレイン誘発膵炎でも、autophagyが誘導されることも見出した。このautophagyの役割を解析するため、膵腺房細胞でのみAtg5を欠損させたマウスを樹立し、セルレイン膵炎を誘発したところ、膵炎はむしろ軽症化すること、その原因はトリプシンが活性化されないためであること明らかにした。別の遺伝トラップ系統の解析から、発見したSkt遺伝子が、ヒトにおいても椎間板髄核特異的に発現していることを明らかにした。α/βhydrolaseドメインを持つAbhd2遺伝子が、肺のII型肺胞上皮細胞でも発現していることを見出した。遺伝子トラップによりAbhd2遺伝子をノックアウトしたマウスを樹立し、生後1年まで経時的に肺の病理学的解析を行った結果、生後6ヶ月以降に肺気腫が生じること、ゆっくり発症するためヒトの肺気腫モデルとして有用なことが分かった。そのメカニズムは、フォスファチディルコリンの分泌低下により、マクロファージが浸潤し、炎症を引き起こし、protease/anti-proteaseのバランスが崩れるとともに、肺胞上皮細胞のアポプトーシスを引き起こすためであることを明らかにした。これらのことは、Abhd2遺伝子が肺の構造を保つ機能があることを示唆している。トリプシンインヒビターであるSpink3遺伝子に細胞増殖作用があるが、そのリセプターはまだ不明であるため、膵がんから樹立された培養細胞を用いて解析を行った。その結果、これらの膵がん細胞に対して明らかに細胞増殖作用があること、そのリセプターはepidermal growth factor recdptor(EGFR)であること、しかし、EGFと比較すると結合数は約1/2であること、下流の3つのシグナル、PI3kinase/AKT, JAC/STATand MAPK、を伝えるが、細胞増殖にはNAP kinase経路が関連することを明らかにした。可変型遺伝子トラップベクターpU-21を用いて遺伝子トラップESクローンを単離し、トラップした遺伝子を同定できた800クローンについて、EGTCデータベースに登録した。日本産野生マウス由来のMSM/Msマウスから樹立したMol/MSM ES細胞を用いて遺伝子トラップを行い、142クローンを単離した。そのうち99クローンで1コピーのトラップベクターが挿入されていた。トラップ遺伝子の同定を行ったが、理由は不明であるが、rRNAへの挿入が多いことが分かった。セルレイン投与による実験的膵炎の各種マウス系統間の感受性の違いについて解析した。その結果、JF1とC57BL/6は抵抗性、C3Hは感受性、MSM,BALB/c,CBAは中間型であることが分かった。
難治性EBウイルス関連疾患の病因と治療に関する研究

慢性活動性EBウイルス感染症(CAEBV)とEBV関連血球貧食症候群(EBV-HLH)におけるEBV感染T/NK細胞は、造血前駆細胞に感染して増殖する可能性のあること、腫瘍と異なりクローン増殖にはCD4陽性細胞が必須であることを明らかにした。EBV-HLHに対する早期の免疫調節療法は成人例と異なり初感染小児例には奏功し、造血細胞移植後の予後も良好であった。腫瘍とは異なる感染細胞特性に応じた治療戦略が必要である。難治性EBウイルス関連疾患であるEBウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症(EBV-HLH)と慢性活動性EBウイルス感染症(CAEBV)の治療法確立をめざして、(1)造血細胞移植の成績と(2)EBV持続感染細胞の特性について解析した。この2つの疾患は、日本に多い予後不良なEBV感染T/NK細胞リンパ増殖性疾患である。(1)過去20年に行われたEBV-HLH 14名と家族性HLH(FHL)43名に対する計61回の造血幹細胞移植(HSCT)の成績を解析した。診断はEBV DNA量、PRF1およびUNC13D変異を基本とした。半数に非血縁者間臍帯血移植(UCBT)が、1/4に骨髄非破壊的前処置が行われた。10年生存率はEBV-HLH(86%)がFHL(65%)より良好であった。FHLはEBV-HLHより100日以内の早期死亡(7名)と神経学的後遺症が多かった(p<0.02)。UCBT後の生存率は、いづれのHLHも65%をこえ、2回UCBTをうけた4名中3名も生着生存した。EBV-HLHでは移植のみが根治療法となるFHLとの正確な鑑別が必要であること、UCBTはいずれのHLHにも有用性であることを明らかにして報告した。今後、UCBTの至適前処置の検討が必要である。(2)CAEBV患者(T細胞型3例、NK細胞型3例)の高純度分離細胞を用いてその感染細胞源を検討した。主たる標的細胞がいずれであってもそれ以外の細胞亜群にEBVまたはT細胞レセプターレベルでのクローン増殖を確認した。さらにEBV-TRの同一性からT/NK前駆細胞での感染が示唆された。しかし、骨髄の造血前駆細胞の感染はまだ確認されていない。この解析を継続しながら、感染細胞亜群の移入実験を2例で開始した。難治性EBウイルス関連疾患のうち、慢性活動性EBウイルス感染症(CAEBV)についてはT細胞型とNK細胞型の患者における感染細胞源の解析を終了した。高純度分離細胞とSouthern blot解析を用いて、同一患者において主たる標的細胞ではない細胞亜群にもEBVが感染しクローン増殖していること、さらにEBV-terminal repeatsの同一性からT細胞とNK細胞の前駆細胞に感染していることを示した。一方、骨髄のCD34陽性造血前駆細胞は感染から免れていた。この結果はEBVのT/NK細胞への感染機構に関する知見としてJ Clin Virolに受理された。この感染細胞亜群の免疫不全マウスへの移入実験を進めている。EBウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症(EBV-HLH)と家族性HLHについては、造血細胞移植の成績を米国小児血液学会誌に報告し、2010年アジア太平洋骨髄移植学会などで招請講演を行った。海外に比較して、日本ではEBV-HLHとFHLHの何れにも臍帯血移植が多く行われていたが、10年生存率はEBV-HLH 86%、FHLH 65%と比較的良好であった。しかし、移植後早期の治療関連死亡と中枢神経後遺症が問題であり、骨髄非破壊的前処置の有用性を明らかにすることはできなかった。最近、EBV-HLHとFHLHの確定診断が早くなり、適切な移植時期と前処置の強度を検討することが課題となっている。2006年以降の移植例を調査し、この2点を中心に治療法の検討を開始した。また、EBV-HLHの病因に関しては感染細胞のマウスモデルでの解析を計画している。難治性EBウイルス関連疾患のうち、慢性活動性EBウイルス感染症(CAEBV)については、T細胞型とNK細胞型の感染細胞を高純度に分離後Southern blot法を用いて解析し、T細胞とNK細胞の前駆細胞に感染する可能性があること、そして骨髄のCD34陽性造血前駆細胞は感染から免れていることを示した(J Clin Virol 2011)。さらに、この感染細胞亜群を免疫不全マウス(NOD/Shiscid/IL-2γc^<nulL>)へ移入してCAEBVモデルを作成し、感染細胞の生着にはCD4陽性細胞が必須であることを明らかにした(PLOS Path 2011)。

現在、CAEBVとEBウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症(EBV-HLH)の感染細胞の特性の違いに関して、このモデルを用いて解析を継続中である。EBV-HLHと家族性HLH(FHL)については、日本では臍帯血移植が多く行われ治療成績が改善されてきたものの、移植後早期の治療関連死亡と中枢神経後遺症が問題であることを明らかにしてきた。2005年以降の新規治療例を加え、FHLの移植成績を再検討して、早期に診断される乳児例の増加、および骨髄非破壊的前処置による非血縁臍帯血移植の成功例の増加を示すことができた(Am J Hemaol 2012)。EBV-HLHの病態と予後因子を検討し、etoposideを使用しない早期の免疫調節療法が約60%の初感染小児例に寛解をもたらすこと、一方成人例の予後が不良であることを明らかにした(Pediatr Blood Cancer 2012)。EBV-HLHとCAEBVの病態の違いを明らかにして、予後不良例に対する包括的治療戦略を確立することが重要である。
耐熱性・耐酸素性ヒドロゲナーゼの安定化機構の解明

Hydrogenovibrio marinusの膜結合型ヒドロゲナーゼ(MBH)で特徴的に見られたIle残基をRalstonia eutropha由来MBHに導入し、サブユニット構造や活性中心の構造安定性に関与することが示された。興味深いことに、顕著に安定化されたMBHでは比活性の上昇が観察された。変異を組み合わせた多重変異型MBHを作成したが、単純な変異の組み合わせでは期待される相乗的効果は得られなかった。Desulfovibrio vulgarisの[NiFe]型ヒドロゲナーゼの結晶構造に基づいてホモロジー・モデルを作成し、変異部位の構造を推測した。変異導入部位に相当する残基はいずれも活性中心から14Å以上離れており、活性中心の構造に直接的な影響は与えないと思われた。H.marinusとR.eutrophaのMBHの構造は類似しているが、変異導入部位周辺のキャビティはH.marinus MBAの方が小さい傾向があった。また、H.marinusのHoxG内部には疎水的なIle残基が多く集まり、強固な疎水的コア構造を形成することが推測された。H.marinusのMBH遺伝子下流にはシトクロム-bおよびヘムc結合モチーフをもつ新規の電子伝達蛋白質と思われるORFが見出され、水素酸化系を構成すると推定された。MBHの熟成化蛋白質と思われる2つのORFが解明されたが、異種宿主でのMBH発現には不十分であった。周辺にはトランスポザーセなどの相同蛋白質がコードされており、本菌の水素酸化系が転移性である可能性が示唆された。エネルギー変換に重要な利用ポテンシャルをもつヒドロゲナーゼの安定性に関与する構造的特徴が世界で初めて実験的に示され、同酵素の安定化や安定なミミックのデザインに有用な情報が示された。耐熱・耐酸素性に優れるHydrogenovibrio marinusの膜結合型ヒドロゲナーゼ(MBH)では、活性サブユニット(大サブユニット)のIle残基の割合が高い。このような特徴と高い安定性との関連を解析するために、本酵素と高い相同性(72%Identity,83%Similarity)をもつが安定性は大きく異なるRalstonia eutrophaのMBH大サブユニット(HoxG)に部位特異的なIle残基の導入を検討した。R.eutrophaの野生型hoxG遺伝子を鋳型として、2step PCR法によって変異型hoxG遺伝子の部分断片を調製した。シークエンスを確認した後、スーサイドベクターpLO3に載せ、接合伝達によってR.eutrophaへ導入した。pLO3に存在するTc耐性遺伝子とsacB遺伝子をマーカーとして、ゲノム上の野生型hoxGと導入された変異型hoxG部分断片との間で相同組み換えが生じた変異株を選抜した。HoxG[V115I](M1変異)、HoxG[P181I](M2)、HoxG[L243I](M3)、HoxG[V253I](M4)、HoxG[N168I,L170I](M5)、HoxG[V115I,A119I](M6)の6つ変異型MBHの作成に成功し、今後安定性の詳細な解析を行う。また、構造遺伝子下流域の解析を進め、大サブユニット遺伝子下流にシトクロムb様の配列(228bp)をコードするORFが、さらにその下流にはデータベース上に有意な相同タンパク質が見られないORF(ORF1,252bp)が確認された。

このORF1は4つの膜貫通ドメインをもつ膜タンパク質であることが予測され、ヘムc結合モチーフが存在することからヒドロゲナーゼ反応を介したATP生産に関与する新規の電子伝達タンパク質である可能性がある。Hydrogenovibrio marinusの膜結合型ヒドロゲナーゼ(MBH)は耐熱・耐酸素性に優れ、活性(大)サブユニット(HoxG)のIle残基の割合が高いという特徴が見られた。このような特徴に基づいてRalstonia eutropha由来MBHのHoxGに部位特異的Ile残基の導入を行い、6つ変異型MBHを作成した。本年度はメチレンブルー(MB)還元活性と重水素置換活性を指標とした安定性の解析を行った。MB還元にはHoxGから数個のFeS-クラスターをもつ小サブユニットへの電子伝達が必要であるため、本活性によってサブユニット構造の安定性が評価できる。一方、重水素置換反応には電子伝達が関与しないため、活性中心の安定性を評価できる。MB還元活性を指標とした場合、サブユニット境界面に変異部位が位置すると推測されるM2,M3変異で有意な安定性の増加が確認され、サブユニット間の会合が増強されたと考えられた。重水素置換活性を指標とした場合、M6を除く全ての変異で安定化が確認された。M1, M4, M5の変異部位はHoxGの疎水的コアに位置すると推測され、このような部位やサブユニット境界面へのIleの導入によって活性中心が安定化されることが示された。なお、変異部位の帰属はDesulfovibrio gigasの[NiFe]-ヒドロゲナーゼの結晶構造より推測した。さらに安定化効果の認められた変異については、それらを組み合わせた多重変異型MBHの作成を進めている。また、構造遺伝子下流域の解析により、R. eutrophaのHoxLやHoxMと高い相同性のあるORFが新たに見い出された。HoxMはHoxGの成熟化過程で働く特異的プロテアーゼであり、HoxLは遺伝子削除によってR. eutropha MBHの90%程度の活性が失われることが報告されており、いずれも重要な成熟化蛋白質である。Hydrogenovibrio marinusの膜結合型ヒドロゲナーゼ(MBH)で特徴的に見られたIle残基をRalstonia eutropha由来MBHに導入し、膜画分での解析を行ったところ、サブユニット構造や活性中心の構造安定性に関与することが示された。平成15年度はM1M5変異型MBHの精製酵素での解析を試みた。菌体を超音波破砕後、細胞膜画分を調製し、1%TritonX-100存在下での可溶化を行った。超遠心分離後の上清をQ-Sepharose High PerformanceおよびHydroxyapatiteカラムに供し、精製が達成された。精製酵素においても膜画分と同様の安定化効果が確認され、さらに興味深いことに顕著な安定化効果の見られたMBHでは比活性の上昇が観察された。また、M1M5変異を組み合わせた多重変異型MBHを作成し、膜画分での解析を行ったが、単純な変異の組み合わせでは期待される相乗的効果は得られなかった。変異部位の構造を詳細に推測するため、Desulfovibrio vulgarisの[NiFe]型ヒドロゲナーゼの結晶構造に基づいてホモロジー・モデルを作成した。変異導入部位に相当する残基はいずれも活性中心から14Å35Å程度離れており、活性中心の構造に直接的な影響は与えないと思われた。
極限高地生息動物の肺循環特性-Rhoキナーゼを中心とした分子生物学的研究

極限高地生息動物であるヤクは低酸素環境にもかかわらず、肺高血圧症(High-altitude pulmonary hypertension, HAPH)を発症しない。その理由の一つは、血管トーヌスの基本的な維持機序であるRhoキナーゼ活性の極度の抑制にあると判明した。肺血管組織学的検討でも肺動脈血管壁肥厚というリモデリングも認められなかった。一方、ウシやキルギス人ではHAPHを発症し、その成立機序にはRhoキナーゼの活性化が関与していた。「極限高地生息動物の肺循環特性(低酸素暴露にもかかわらず肺高血圧症・肺性心を発症しないこと)にはRhoキナーゼのdownregulationが強く関与している」を検証するべくキルギスタンに赴き、(1)海抜3,800m以上の高地に生息している元気な野生の雄ヤク(3歳、体重約200kg)を捕獲し、対象動物として低地で出生しその後海抜3,000m以上の高地で飼育されている同年齢雄牛を確保し、右心カテーテル検査を挿入し、Rho-kinaseインヒビタ投与前後の肺循環パラメーターを測定。(2)測定後心・肺組織を摘出し右室/左室重量比を計測。(3)肺組織を抗Rho-kinase抗体を用いて組織化学的に検討。低酸素性肺高血圧症成立にRhoキナーゼの関与が重要との報告がなされている。このRhoキナーゼはNOによって誘導されるcGMPにより抑制されることも報告されているが、申請者らは極限高地生息動物のヤクでは肺血管NO合成酵素活性が維持されていることを既に報告した。そして、極限高地生息動物の肺循環特性(低酸素暴露にもかかわらず肺高血圧症・肺性心を発症しないこと)にはRhoキナーゼのdownregulationが強く関与しているという仮説を実証すべく、今年度は高地生息の2歳の雄ヤクと2歳の雄牛を海抜2900mの場所で肺循環測定実験に供した。ベースラインの肺動脈圧を測定後Rho-キナーゼ抑制剤(Fasudil)60mgを20mlの生理食塩水に溶かしたものを10mg/分の流速で末梢静脈から投与した。投与後経時的に肺動脈圧を測定した。結果はヤクでは、スタート時、Fasudi投与後5分、10分、15分、20分で平均肺動脈圧(mPAP)は17mmHg, 14, 15, 16, 17mmHgほとんど薬剤の影響を受けなかった。一方、雄牛では70mmHg,30, 33, 40, 48と5分後に急激なmPAPの減少を来たし、その効果は少なくとも投与後20分持続した。研究結果は(1)高地適応動物であるヤクは低酸素環境にもかかわらず、肺高血圧を生じず、かつ、Rhoキナーゼ系は肺循環では働いていないという仮説に矛盾のない成績であった。一方、高地に適応できない牛は海抜2900mの高度で著明な高血圧症を呈し、その理由のひとつにRhoキナーゼ系が役割を果たしているという推定を導く成績であった。ヤクの肺標本を作製しRhoキナーゼ系の発現を検索中である。昨年度に引き続き高地生息の2歳、雄ヤクと雄牛それぞれ1匹ずつを対象とし、海抜3200mの野外で肺循環測定実験を行った。ベースラインの肺動脈圧を測定後、Rhoキナーゼ抑制剤(F a sudil)60mgを20ml生理食塩水に溶かし10mg/分の流速で末梢静脈から投与した。5分、15分、30分時の平均肺動脈圧(mPAP)は36.9mmHg、36.1mmHg、30.4mmHg、26.7mmHgと軽度のmPAPの低下を認めた。一方、雄牛では106.5mmHg、36.2mmHg、42.9mmHg、47.0mmHgと急激なmPAPの減少をきたした。この結果は昨年度のそれと同様であった。実験終了後、肺組織および心組織を取り出しRhoキナーゼ系の発現検索用とした。中間結果として、高地適応動物であるヤクは低酸素環境にもかかわらず、肺高血圧症を生じず、そして、Rhoキナーゼ系は肺循環系では働いていないという仮説を実証するものである。一方、高地非適応動物の牛は著名な肺高血圧症を呈し、その機序にはRhoキナーゼ系の発現が関与している。海抜3000m以上の天山山系に居住しているキルギス人で肺高血圧症を示した20名を対象にF a sudil、30mgを投与し、前後での肺動脈圧を検討すると32±3.1mmHgから30分後には25.4±2.5mmHgへとmPAPは有意に低下した。体動脈圧には影響を与えなかった。呼気中のNO値は10.7±5.1ppbから13.9±6.6と増加傾向を示した。

この結果は高地に適応できないヒトでもRhoキナーゼ系の関与する肺高血圧症を呈することを示した。昨年度に引き続き直接現地に赴き海抜3600mの高地でヤクを確保し高地生息の2歳、雄ヤクと雄牛それぞれ1匹ずつを対象とし、海抜3200mの野外で肺循環測定実験を行い、実験数を増やそうと試みたが、測定機器につなげる変圧器の不具合のため正確なデータ収集はできなかった。そこで、ヤクと牛(低地で出生し、家畜として高地に運ばれ生育しているもの)との肺組織を入手し、組織学的検討を行った。前者では細気管支に並走する肺小動脈は内膜・中膜・外膜すべてにわたり肥厚は全く認められなかった。一方、後者では同じサイズの肺小動脈中膜・外膜の均等な全周性肥厚と内膜のいびつな肥厚とを認めた。なお、肺小動脈内腔には血栓形成もなく、肺胞壁自体の肥厚等の変化を認めなかった。また、同時に検索した高地生息適応動物のナキウサギ肺でも肺小動脈壁はまったく肥厚を認めなかった。参考に肺組織を検索した高地生息キルギス人(2名)では、慢性高山病での死亡例では牛と同様、肺小動脈中膜・外膜の均等な全周性肥厚と内膜のいびつな肥厚とを認め、慢性高山病ではなく交通事故での死亡例1ではヤクと同様に肺小動脈壁肥厚を認めなかった。以上、総合すると、海抜3000m以上の高地に長期間生息している動物も人も適応例は肺動脈肥厚を認めず、適応しがたい動物も人も著しい肺動脈肥厚を呈しているという結果である。高地適応非肺高血圧動物・人では、前年度までの結果の肺動脈系ではRho-kinaze系が不活発であるという結果を裏づけるものである。
血管における糖鎖シグナルの制御を介した動脈硬化症治療の解明

糖鎖は複数の単糖が結合して構成されている。単糖は複数の結合部位を持つため、様々な構造をとる。また、単糖は糖以外の物質とも結合し得、他の物質と結合して糖鎖を構成する際、様々な結合様式をとり、相互作用をもつ。また、細胞により、同じ糖鎖であっても異なる構造をとったり、細胞の代謝や栄養状態や微小環境によっても様々に修飾される。このように複雑で変化に富む糖鎖を対象とした研究は非常に難しいとされる。特に、生体内での糖鎖の修飾の組み合わせを解読する方法は未だ開発されていない。申請者は、血管の糖鎖合成酵素を制御することで動脈硬化の治療応用を目指しており、他の研究とは一線を画す。
錐体細胞におけるカルシウム依存性脱分極スパイク後電位の長期増強の誘導

脳波のγ-band成分は、機能円柱ニューロン群の活動を周期的(20-70Hz)に同期化する時に発現し、統合概念の形成や短期記憶情報の再現に関与するとされている。視覚野でのγ-band波は、単一細胞レベルでの高頻度バースト発火の周期的発現と同期して現れ、個々のバーストは300Hz以上で発火する2-5発のスパイクより成り、バースト間間隔は15-50ms(20-70Hz)であると報告されたが、細胞外記録のため、バースト発火を担う内因的膜特性は不明であった。一方、研究代表者は、単一発火パターンしか示さない錐体細胞が、強い脱分極通電の反復刺激により、脱分極スパイク後電位が増強され、それに伴い、周期的な高頻度バースト発火を示すようになることを初めて報告した。引き続き、バースト発火の基盤となる脱分極性スパイク後電位のイオン機序についての研究を行い、脱分極性スパイク後電位が、Ca^+依存性のカチオン電流により担われていることを初めて明らかにした。さらに、その増強機構についての研究をおこない、以下のことを明らかにした。脱分極性スパイク後電位を担うCa2+依存性カチオン電流は、膜電位固定下では数秒間持続するslow tail電流として観察される。このslow tail電流は、カフェインによるCICRの増強或いはIP3の分解阻害剤のリチウムとムスカリンの共同作用によるIICRの増強により著しく増強される。こうした現象において、電流記録とカルシウム測光を同時に行った結果、カチオン・チャネルのCa^<2+>感受性が上昇していることが明らかとなった。こうしたカチオン電流の増強は、CaM KIIの阻害剤であるKN-62やAIP(autocamtide inhibitory peptide)の投与により阻害された。従って、CICRやIICRにより細胞内カルシウム・ストアーからのカルシウム放出が生じ、その結果CaM KIIが活性化され、それによりカチオン・チャネルのCa^<2+>感受性が増大し、バースト発火が引き起こされると結論することができる。こうしたガンマ帯脳波発現に関与する発火機構の解明は、シナプス伝達におけるLTPやLTDとは異なる新しい次元から、認知や記憶のメカニズムの解明に寄与するものである。単一発火型の錐体細胞にバースト後発射を誘引し得る基盤となる脱分極性スパイク後電位(DAP)はCa@@S12+@@E1依存性のカチオン・チャンネルの脱活性化の過程で発生するslow tail電流(I)により担われている。このslow tail-Iは、カフェイン或いはNK3受容体のアゴニストのSenktide存在下で脱分極パルスを反復して与えると、著明に増強されたが、CaM-KIIのinhibitorであるKN-62存在下ではそうした増強は観察されなかった。従って、こうしたslow tail-Iの顕著な増大は、CaM-KIIの活性化の結果、CICRの増強により細胞内Ca@@S12+@@E1濃度が増加したためか、或いは、カチオン・チャネル自体のCa@@S12+@@E1感受性が増大したためかの、いずれかである可能性が考えられる。この二つの作業仮説を直接的に検証するため、slow tail-Iの測定と同時に細胞内Ca@@S12+@@E1の濃度変化の測定を行った。その結果、以下のことが解明された。1,反復脱分極パルス通電により細胞内Ca@@S12+@@E1濃度の上昇が誘発されるが、その下降相にCICRに起因する成分が存在する。2.下降相はカフェインにより増強されたが、リアノジンにより抑圧された。3. CaM-KIIのinhibitorであるKN-62は、下降相に影響を与えなかった。4. CaM-KIIのinhibitorであるKN-62存在下でも、カフェインによる下降相の増強は、KN-62非存在下と同程度に認められた。以上の所見より、CaM-KIIの活性化によりカチオン・チャネル自身のCa@@S12+@@E1感受性が増大する可能性が示唆された。

こうした現象において、電流記録とカルシウム測光を同時に行った結果、カチオン・チャネルのCa^<2+>感受性が上昇していることが明らかとなった。こうしたカチオン電流の増強は、CaM KIIの阻害剤であるKN-62やAIP(autocamtide inhibitory peptide)の投与により阻害された。従って、CICRやIICRにより細胞内カルシウム・ストアーからのカルシウム放出が生じ、その結果CaM KIIが活性化され、それによりカチオン・チャネルのCa^<2+>感受性が増大し、バースト発火が引き起こされると結論することができる。こうしたガンマ帯脳波発現に関与する発火機構の解明は、シナプス伝達におけるLTPやLTDとは異なる新しい次元から、認知や記憶のメカニズムの解明に寄与するものである。脳波のγ-band成分は、機能円柱ニューロン群の活動を周期的(20-70Hz)に同期化する時に発現し、統合概念の形成や短期記憶情報の再現に関与するとされている。視覚野でのγ-band波は、単一細胞レベルでの高頻度バースト発火の周期的発現と同期して現れ、個々のバーストは300Hz以上で発火する2-5発のスパイクより成り、バースト間間隔は15-50ms(20-70Hz)であると報告されたが、細胞外記録のため、バースト発火を担う内因的膜特性は不明であった。一方、研究代表者は、単一発火パターンしか示さない錐体細胞が、強い脱分極通電の反復刺激により、脱分極性スパイク後電位が増強され、それに伴い、周期的な高頻度バースト発火を示すようになることを初めて報告した。引き続き、バースト発火の基盤となる脱分極性スパイク後電位のイオン機序についての研究を行い、脱分極性スパイク後電位が、Ca^<2+>依存性のカチオン電流により担われていることを初めて明らかにした。さらに、その増強機構についての研究をおこない、以下のことを明らかにした。リチウムとムスカリンの共同作用、或いはカフェインにより細胞内カルシウム・ストアーからのカルシウム放出が生じ、その結果CaM KIIが活性化され、それによりカチオン・チャネルのCa^<2+>感受性が増大し、バースト発火が引き起こされるという結論を得た。
分子間力制御によるナノカーボン材料の光機能性可溶化剤

ヘテロコアジアンスロン(HCD)やベンゾキサンテン(BDX)のアルキル置換体が有機溶媒中において単層カーボンナノチューブ(SWNT)を分散させ,かつ光反応性によって分子間力の変化を伴い可溶化能力が変化する光機能性可溶化剤となることを見出した。アルキル基の長さがSWNTの分散に影響を与え,SWNTとの分子間および可溶化剤/SWNT複合体間の相互作用バランスが重要であることが分かった。SWNT分散液中の光析出だけでなく,可溶化剤/SWNT複合体膜中からも,SWNTの光析出が起こることを見出した平成23年度に得られた大きな進展,すなわち,アルキル鎖の比較的短いジプロピルヘテロコアジアンスロンによってカーボンナノチューブが可溶化できること,さらにジプロピルヘテロコアジアンスロンでは可溶化した単層カーボンナノチューブの分散溶液から可視光照射によりカーボンナノチューブが析出することを基にして,さらに分子設計を拡げた。アルキル基を導入したベンゾキサンテンにおいてもカーボンナノチューブの光析出をさせることができた。これにより,光機能性可溶化剤候補化合物を増やすことができた。しかし,ジプロピルヘテロコアジアンスロンを用いてのカーボンナノチューブの薄膜形成については,露光波長を変えての実験など鋭意取り組んだが,本年度においてはカーボンナノチューブ薄膜の光パターニングプロセスの確立には至っていない。ところが,意外なことにジプロピルヘテロコアジアンスロンとカーボンナノチューブ錯体薄膜中から光によって直接カーボンナノチューブが析出する非常に興味深い現象を観察することができた。また,グラフェンシートの溶解と光析出プロセスを試みたが,カーボンナノチューブを溶解ー光析出する反応条件では同様な現象は観測されず,グラフェンシートの種類を変えての実験を進めている。これまでに得られた進展,すなわちアルキル鎖の比較的短いジプロピルヘテロコアジアンスロンによってカーボンナノチューブが可溶化でき,さらに可溶化した単層カーボンナノチューブの分散溶液から可視光照射によりカーボンナノチューブが析出することが観察されたことに基づき,アルキル基の異なるベンゾキサンテンやヘテロコアジアンスロンなどの光可溶化剤候補を合成した。これらの化合物によるカーボンナノチューブの可溶化や光析出を調べたところヘテロコアジアンスロンよりも可溶化量が少なかったが,この結果を踏まえて,よりカーボンナノチューブと相互作用の大きいと考えられるジフェニル置換体などの分子設計へ進展させた。本年度,カーボンナノチューブの薄膜形成について鋭意取り組んだ結果,基板表面に微小な膜形成が観測され,基板の表面処理方法を検討し,その成長過程の検討に入った。また,カーボンナノチューブ以外の有機半導体の可溶化と光析出にチャレンジし,有機半導体のひとつであるピセンが可溶化できることを見出した。また,カーボンナノチューブとジプロピルヘテロコアジアンスロンの錯体がカチオン重合を引き起こすことが示唆される興味深い実験結果がイスタンブール工科大学との共同研究により得られた。研究成果の発信では,カーボンナノチューブの光機能性可溶化剤としての成果を国際学会であるThe 4th Asian Symposium on Printing Technologyにおける招待講演において発表した。国内では代表的な光化学の学会である光化学討論会で口頭発表した。また,薄膜形成に関して特許出願した。以上のような最終年度の成果も含めて,目的として挙げたうちの選択的可溶化・光析出には届かなかったが,主目的としたナノカーボン材料の光パターニング技術の原理的な検証は確実にできたものと思われ,今後のこの分野の展開が期待される。SWNT分散液中の光析出だけでなく,可溶化剤/SWNT複合体膜中からも,SWNTの光析出が起こることを見出したジオクチルヘテロコアジアンスロンやジプロピルヘテロコアジアンスロンなどの光機能性可溶化剤候補のジアルキルヘテロコアジアンスロン誘導体を合成し,カーボンナノチューブの可溶化について調べた。その結果,興味深いことに,有機溶媒であるクロロホルム中でジオクチルヘテロコアジアンスロンは混ぜただけで単層カーボンナノチューブと錯体を形成して沈殿してしまうのに対して,アルキル鎖の短いジプロピルヘテロコアジアンスロンによってカーボンナノチューブが可溶化できることを見出した。さらにジプロピルヘテロコアジアンスロンでは可溶化した単層カーボンナノチューブの分散溶液から可視光照射によりカーボンナノチューブが析出することが観察された。これは,まだ一例にすぎないがジアルキルヘテロコアジアンスロン誘導体が光機能性可溶化剤として作用することが明確に観測された初めての例であり,大きな進展を得ることができた。また,このようにアルキル鎖長のような単純な分子構造の差により可溶化や光析出の現象が大きく異なることから機能性分子設計上も興味ある結果が得られたと言える。したがって,分子間力の変化にもとづく可溶化ー不溶化メカニズムによるナノカーボン材料の光精製と光パターニングの原理検証の道筋ができた。

この結果を受けて,薄膜形成のためのLED光源の購入など光パターニングの準備を始めた。一方,これらの化合物が有機溶媒系の光機能性可溶化剤であるのに対し,水系での光機能性可溶化剤も並行して検討した。アントラセン-2ースルホン酸ナトリウム,9,10ージフェニルアントラセンジスルホン酸ナトリウムなどのアントラセン誘導体が単層カーボンナノチューブを水に可溶化することについて学会発表をおこなった。さらに水溶性のヘテロコアジアンスロンの目標化合物を設計し,途中段階まで合成した。目的のひとつである「分子間力の変化にもとづく可溶化ー不溶化メカニズムによるナノカーボン材料の光精製と光パターニングの原理的な検証」では実際にこの現象を起こす光機能性可溶化剤例を増やすことができ,普遍性のある現象であることが示された。さらに,グラフェンシートなど難溶解性の多環芳香族化合物などのさまざまなカーボン材料に適用するための光機能性可溶化剤の検討にも着手することができた。課題であったジアルキルヘテロコアジアンスロン誘導体の十分な量の合成のためにパックドカラムの利用が効率的で,本年度,他の予算も利用し,本研究費ではパックドカラム検出器部分を整備した。これによりジアルキルヘテロコアジアンスロン誘導体の精製が用意になり,条件を変えての実験や,ジプロピルヘテロコアジアンスロンとカーボンナノチューブ錯体薄膜中から光によって直接カーボンナノチューブが析出する意外な現象の発見につながった。さらにこれによって今後基礎的な溶液濃度と単層カーボンナノチューブの溶解量との関係や溶媒との関係,会合状態の対応と相互作用の推定の検討も進めることが容易になった。また,代表的な国際学会での発信も行い,この研究についての興味を持たれている。目的のひとつである「分子間力の変化にもとづく可溶化ー不溶化メカニズムによるナノカーボン材料の光精製と光パターニングの原理的な検証」では実際に現象を起こす光機能性可溶化剤例を見出すことができ,研究は大きく進展した。しかしながら光機能性可溶化剤候補物質の有機合成では苦労しており,現在ジアルキルヘテロコアジアンスロン誘導体を大量には合成することができない。そのため,溶液濃度と単層カーボンナノチューブの溶解量との関係や溶媒との関係を明らかにすることや,紫外可視分光スペクトルや核磁気共鳴スペクトル(NMR)における化学シフトなどの実験結果と分子モデリングによる会合状態の対応と相互作用の推定の検討はやや遅れている。会合した物質や分離できたナノカーボン材料についての分析も十分な量が得られていないためやや遅れている。ジプロピルヘテロコアジアンスロンやジプロピルベンゾキサンテンなどアルキル置換アントラセン誘導体で成果がでている。したがって,これらの化合物を中心に基礎的な会合現象の測定,比較分析を行い,分子設計における知見を得ていく。さらにはグラフェンや単層カーボンナノチューブなどのカーボンナノ材料以外にも展開できると考えられるので,平成24年度には手がつけられなかった難溶性縮合芳香族化合物の光分離・光パターニングの検討を行う。特にナノカーボン材料の光パターニングによる薄膜形成は材料的立場から重要であると考えており,引き続き注力する。
シリカ高圧相から読み解く月への小惑星衝突史

月表層の岩石試料(月起源隕石,アポロ・ルナ回収試料)に記録された天体衝突の記録を高圧科学,鉱物学及び同位体年代学に基づいて解明した。月起源隕石,アポロ・ルナ回収試料には衝撃溶融組織に加えて様々な種類の高圧鉱物が発見された。高圧鉱物の安定圧力領域から,月表層岩石に記録された衝撃圧力がおおよそ323万気圧,衝突速度が数km/秒と見積もられた。同位体放射年代を用いて衝突が起きた時代の推定も試みた。平成26年度の研究計画は,月表層試料の入手と衝撃溶融組織に含まれる高圧相の記載・分類を行い,衝撃圧力とその天体が衝突した時の速度を決定することである。月表層試料としては玄武岩質の月起源隕石であるNWA 032, NWA2977,NWA 2727を入手した。また,玄武岩質なものとシリカの産状を対比するために少量の斜長岩質角礫岩の月起源隕石,NWA 4881及びNWA 5000も入手した。全ての試料は岩石薄片或は表面研磨を施し,偏光顕微鏡による母岩組織及び衝撃溶融組織(衝撃溶融脈,メルトポケット,斜長石のガラス化など)を観察・撮影した。その後,高分解能の走査型電子顕微鏡で衝撃溶融脈とメルトポケットを中心に観察し,構成鉱物や高圧相の組織観察を行った。これらの鉱物の化学組成を電子線プローブ微小分析装置で測定した。高圧相の相同定はラマン分光装置を利用した。その結果,NWA 032, NWA 2977及びNWA 2727ではいずれも強い衝撃変成により斜長石がガラス化しており,衝撃変成に伴い岩石の一部が高温で溶融した組織である衝撃溶融脈及びメルトポケットが確認された。この内,NWA 032とNWA 2727には多くのシリカが含まれており,その高圧相,コーザイトが見出された。一方,NWA 2977ではカンラン石の高圧相,リングウッダイトが同定された。リングウッダイトの存在から,NWA 2977に記録された衝撃圧力は15ギガパスカル程度と見積もった。なお,別途入手していたアポロ15号の試料からはシリカ高圧相のスティショバイトが見出された。衝撃圧力は8ギガパスカル以上,月の表側で起きたインパクトに関連すると結論付けた。この結果は早急に公開する必要があり,米国の鉱物科学雑誌にレターとして投稿し受理された。平成27年度の主な研究計画は,隕石中に見出された高圧相のカイネティクスを利用し,インパクト・イベントを引き起こした天体のサイズとその際に形成されたクレーターサイズを見積もることである.平成26年度にNWA 2977の衝撃溶融脈近辺からオリビンの高圧相であるリングウッダイトを見出している。そのリングウッダイトを集束イオンビーム(FIB)加工装置で透過型電子顕微鏡(TEM)用薄膜に加工した。その薄膜をTEMで観察し,その粒径を測定した。その結果,粒径は200-300 nm程度であった。衝撃溶融脈の簡単な1次元モデルを構築し,非定常熱伝導に基づく温度履歴の計算と,その計算された熱履歴を用いて,リングウッダイトが300 nm成長するのに必要な圧力と温度の条件を制約した。平成26年度にNWA 2727で見出していたシリカの一部にシリカの高圧相であるコーザイトの存在を確認し,その衝撃圧力を2 GPa以上と推定した。新たに月表層の回収試料(ルナ試料)を僅かに借用し,粒子の電子顕微鏡観察及びレーザーラマン分光法分析を行い,少量のシリカを確認した。シリカは微量であるため,その相同定には放射光X線回折を行う予定である。シリカ高圧相の記載にやや手間取っているものの,オリビンの高圧相であるリングウッダイトの発見とその記載,衝撃変成規模の推定は順調に推移しており,本課題で掲げている目標"月表層物質に含まれる高圧相とリン酸塩鉱物のU-Pb放射年代を用いて月で起きた小惑星衝突の履歴(衝突速度,衝突天体サイズ,クレーターサイズ,衝突年代)を明らかにする"は十分達成可能である。28年度には新たに入手した月起源隕石NWA 479の記載を行った。NWA 479の岩石組織及び構成鉱物種は既に記載を終えたNWA 032(玄武岩)とよく似ていた。NWA 479の衝撃溶融脈に接するカンラン石にはリングウッダイトへの相転移組織或はブリッジマナイト+マグネシオブスタイトへの高圧分解組織らしきものが観察されたが,組織が微細であったため分析が難しく確証を得ることができなかった。本年度は遅れていた高圧相のカイネティクスを用いた衝撃イベント持続時間の見積もりを試みた。今回記載した月表層岩石試料ではシリカが角礫岩内に含まれていた。角礫岩は不均質でありインパクト・イベント定量化に用いるモデルの構築が困難であった。そこで,代わりに衝撃溶融脈に生成したリングウッダイトのカイネティクスに基づくモデル計算を試みた。隕石中のリングウッダイトをTEMで観察すると,リングウッダイトは数百ナノメートルの粒子の集合体となっていた。これは衝撃を経験した普通コンドライトに含まれるリングウッダイトの特徴と同じである。リングウッダイトのカイネティクスに基づき得られた衝撃誘起高圧力持続時間はシリカのカイネティクスに基づく結果より1桁程度長くなった。

何故このような差が生じたのか原因を検討している。記載の終わった月起源隕石試料(NWA 2977)のリン酸鉱物のU-Pb放射年代の測定も行った。予想に反して衝撃溶融内部と母岩で放射年代に差異が認められなかった(共に約31億年)。一方,母岩中の一部のリン酸鉱物は相対的に若い放射年代を示したが(約3000万年;誤差の範囲で現在),その理由については現在も検討中で明確な答えは得られていない。今回の研究計画では月起源隕石5個と月回収試料2個を調査した。予想外の結果が多かったものの,先行研究成果に格段の知見を付け加えることが出来た。月表層の岩石試料(月起源隕石,アポロ・ルナ回収試料)に記録された天体衝突の記録を高圧科学,鉱物学及び同位体年代学に基づいて解明した。月起源隕石,アポロ・ルナ回収試料には衝撃溶融組織に加えて様々な種類の高圧鉱物が発見された。高圧鉱物の安定圧力領域から,月表層岩石に記録された衝撃圧力がおおよそ323万気圧,衝突速度が数km/秒と見積もられた。同位体放射年代を用いて衝突が起きた時代の推定も試みた。他にも玄武岩質月起源試料を借用申請しており,認可が遅れているものの,借用申請が承認され次第27年度に衝撃溶融組織と高圧相の記載・分類をする予定である。平成28年度の主な研究計画は,月表層物質に記録されたインパクト・イベントの年代をリン酸塩鉱物(アパタイト,ウイットロカイト,トゥーアイト)のU-Pb系放射年代を測定することで決定することである.月試料の衝撃溶融脈やメルトポケット内部や付近と母岩に存在するリン酸鉱物を電子顕微鏡とレーザーラマン分光装置で記載し,高感度二次イオン質量分析装置で年代を測定する予定である。隕石学NWA 032とNWA 2727については,微小の未知のシリカ高圧相が存在する可能性があり,引き続き強力なX線を用いて相同定を行う予定である。本課題ではシリカ高圧相を衝撃変成のスケールとして扱う計画であるが,NWA 2977ではカンラン石の高圧相が見出されている。カンラン石の高圧相も衝撃変成のスケールとして扱えるため,NWA 2977ではカンラン石の高圧相に基づく衝撃変成のスケールの制約を行う。上記の2点以外は当初の研究計画通りに進める。シリカ高圧相の相同定にやや戸惑ったため文献調査に多くの時間を割いたこと,新たな試料を借用することで入手できたため差額が生じた。物品費で購入した隕石試料の一つが予想以上の成果を上げており,他の試料の購入を控え,現在のこの隕石試料の研究に専念したため予想使用額を下回った。28年度では放射光X線回折や国際学会での成果発表を予定しており,その旅費に充当する。27年度は全ての隕石試料において学外施設での電子顕微鏡実験が主体となる為,その消耗品や共同利用施設への交通費として物品費と旅費を使用する予定である。
肥満外科手術マウスを用いた減量効果における視床下部NPYシステムの解析

近年、我が国でも導入された肥満外科手術における中枢神経系、特に視床下部の関与を明かにし、肥満症手術後の中枢神経系-消化器連関のメカニズムを解明することを目的として、摂食衝動に関わる視床下部NPY系ノックアウトマウスを用いて解析を行っている。現状として、NPYノックアウトマウスを交配させ、約180匹のホモマウス、ヘテロマウス、野生型マウスを作製し、検討に必要なホモマウス、野生型マウスを確保しつつある。しかしNPY遺伝子に対するprimerを用いたgenotypingがあまりうまくいかずに、得られたマウスのphonotypeの同定に時間がかかってしまった。また、当マウスの特性としてホモマウスが生まれる確率が低く、検討に必要なホモマウスと野生型マウスそれぞれの群を得るのに時間がかかっている。平行して、マウスにおける肥満手術(スリーブ状胃切除術)のモデルの作成にとりかかっている。既報にならい通常マウスを用いて、スリーブ状胃切除術を10頭ほどに対して施行したが、ほぼ全例で術後1日目に死亡しており、原因が究明できていない。そのため新しい文献などを参考にしつつ、スリーブ状胃作製方法(クリップを用いる方法、結紮を用いる方法)を模索している状況である。上記に述べた如く、NPYノックアウトマウスの交配には成功したが、NPY検討に用いる十分な頭数を現状ではまだ得られておらず、さらに交配を繰り返している状況である。手術に関しては、マウススリーブ状胃切除術の手技が安定していないため、さまざまな方法を用いることで手技の確立を行っている。NPYノックアウトマウスのホモ、野生型親マウスを十分頭数確保できたため、今年度上半期には検討に必要なホモ、野生型マウスが得られると考えられる。スリーブ状胃切除術に関しては、方法を変更し術後1週間生存する術式を開発している。まずは術後1週間で犠牲死させ、グレリンやアディポネクチンなどの肥満に関わるホルモン動態を検討することが可能となる予定である。今回の検討では、肥満外科手術における視床下部の働き、特にNPYと呼ばれる神経システムの果たす役割を検討することにある。当大学第一病理学教室では、これまで視床下部のNPYノックアウトマウスを用いて、食事制限における加齢現象の抑制に対するNPYの役割や、脂質代謝における役割を検討、発表されている。そこで、視床下部のNPYノックアウトマウスを管理している第一病理学教室と、これまでのNPYノックアウトマウスを用いた実験の結果、今後マウスを用いて行う実験系についてディスカッションを行い、今後同マウスの使用について了解をいただいた。実際の手技に関しては、これまでの報告によれば比較的体躯の大きな肥満ラットによる肥満手術の施術は導入および確立が容易であることが予想されるが、より体躯の小さなマウスによるモデルは困難であることが予想される。今回の実験系では手術手技の安定が結果の安定に非常に重要である。国内においては、大分大学消化器小児外科教室と、東北大学外科学教室において、ラットを用いた肥満症手術の効果発現機序について多く報告されているため、当該大学においては、ラットに対する肥満症手術の方法や、各種ホルモンの測定法、視床下部NPYの解析方法についてノウハウがあるものと考えられる。そのため、先進的施設である大分大学消化器小児外科学教室に技術指導を受け、まずはラットにおいて、肥満手術の手技の確立を早急に行うための準備をしている。マウスを用いた実験であるため入念な下準備を行っている状態です。糖尿病などを随伴した病的肥満症が日本でも増加傾向である。現在、世界的に減量効果の認められた治療法である肥満外科手術は、2014年から日本でも保険収載され、今後症例数が増加することが予想される。摂食制限、吸収制限などが減量の機序として報告されているが、肥満外科手術による生存期間延長や癌発生率の低下の機序や、中枢神経系の働きに関する検討は少ない。今回の研究の目的は、肥満外科手術における中枢神経系、特に視床下部の関与を明かにし、肥満症手術後の中枢神経系-消化器連関のメカニズムを解明し、中枢神経系を標的とした病的肥満症治療法開発の端緒とすることにある。そのために摂食の調節や情動行動に関して重要な役割を演じるとされている視床下部において、摂食抑制の機能を持つNPYニューロンに着目した。NPYノックアウトマウスに関してはすでにcaloric restrictionにおける生存期間延長などに関与することが報告されておりavailableであるため、同マウスを用いた肥満手術マウスモデルの作製に着手している。最終的に日本にて多く行われているスリーブ状胃切除術モデルを作製し、野性型マウスとNPYノックアウトマウスにて同手術を行った場合の体重減少や摂食行動の比較を行う予定であるが、現時点ではまだモデルの作製に至っておらず、準備を行っている状況である。手術モデルの作製に関しては、これまではラットにおける肥満外科手術モデルの報告が多く、より体躯の小さなマウスのモデルに関する報告は少ない。先行施設である大分大学にてラットモデルを作成していることより、見学に伺い、手技や道具に関してご教授いただき、準備に時間を費やしているが、現在はまだモデルの作製に取りかかれていない状態である。使用するノックアウトマウスはNPYヘテロのものが入手可能であったため、現在NPYホモマウスを得るべく繁殖を繰り返している状況である。

現状として、NPYノックアウトマウスを交配させ、約180匹のホモマウス、ヘテロマウス、野生型マウスを作製し、検討に必要なホモマウス、野生型マウスを確保しつつある。しかしNPY遺伝子に対するprimerを用いたgenotypingがあまりうまくいかずに、得られたマウスのphonotypeの同定に時間がかかってしまった。また、当マウスの特性としてホモマウスが生まれる確率が低く、検討に必要なホモマウスと野生型マウスそれぞれの群を得るのに時間がかかっている。平行して、マウスにおける肥満手術(スリーブ状胃切除術)のモデルの作成にとりかかっている。既報にならい通常マウスを用いて、スリーブ状胃切除術を10頭ほどに対して施行したが、ほぼ全例で術後1日目に死亡しており、原因が究明できていない。そのため新しい文献などを参考にしつつ、スリーブ状胃作製方法(クリップを用いる方法、結紮を用いる方法)を模索している状況である。上記に述べた如く、NPYノックアウトマウスの交配には成功したが、NPY検討に用いる十分な頭数を現状ではまだ得られておらず、さらに交配を繰り返している状況である。手術に関しては、マウススリーブ状胃切除術の手技が安定していないため、さまざまな方法を用いることで手技の確立を行っている。本年度中に、まずはラットによる肥満手術手技の確立およびNPYノックアウトマウスによる施術を行う予定である。手術モデルの作製に関しては、まずは通常マウスによる手技の修練を行う準備をしており、手術器具や麻酔方法の準備などこちらはすぐに取りかかれる状態に達している。おそらく10匹ほど行うことで手技は安定することが見込まれる。NPYホモマウスに関しては、繁殖が徐々に進んでおり、仔マウスが生まれている状態である。今後genotypingを行い、NPYホモノックアウトの雌雄マウスを入手することが出来るようになり、手術手技の安定と相まって実験の進捗が期待出来ると考えている。NPYノックアウトマウスのホモ、野生型親マウスを十分頭数確保できたため、今年度上半期には検討に必要なホモ、野生型マウスが得られると考えられる。スリーブ状胃切除術に関しては、方法を変更し術後1週間生存する術式を開発している。まずは術後1週間で犠牲死させ、グレリンやアディポネクチンなどの肥満に関わるホルモン動態を検討することが可能となる予定である。実際にrodentを使用した実験がまだ始まっていないため、その購入費や飼育に関する費用などが生じていないため。当初の予定に比較し、マウスの繁殖や肥満手術マウスモデルの確立等の進捗が遅れている。そのため、採血による種々の血清ホルモンの測定やさまざまな解析に係る経費の削減に努めた結果、次年度使用額が生じてしまった。次年度も引き続き、マウスの繁殖や肥満手術マウスモデルの確立を行っていく予定である。NPY遺伝子に対するprimerを用いたgenotypingがあまりうまくいかずに、得られたマウスのphonotypeの同定に時間がかかってしまった。
メソスケール数値モデルによる冬期日本海の降雪現象の研究

先ず、ドップラーレーダーのデータを用い、冬期日本海の降雪現象を解析した。特に、発生には風向、風速、そのシアー、原因となる地形の山頂高度付近の大気の安定度が重要な因子あるいことを見いだした。また、地形の下流に弱風域が生じ、そこに吹き込む風の収束が降雪雲の成因であることが示唆された。さらに、紐状降雪雲にそって波動が伝搬することなど興味ある現象が見いだされた。一方、モデルの開発の為には雲物理過程や熱力学過程のモデル化の調整が必要となる。この基礎として、リトリ-バル法を開発した。これはレーダーで得られた降水粒子分布や風速場から気温、雲水量等を再現するもので、降雪雲の力学的構造等の解析に有効であるとともに、雲物理過程、熱力学過程の妥当性のチェックにもなる。今回は、よりリトリーバルがやりやすい熱帯の対流雲についてこの解析を試みた。その結果、妥当な場の再現が可能であり、また力学的な構造に関しても多くの情報が得られることが示された。この結果をもとにこの解析手法を冬期日本海の降雪現象にも適用し、それ基づいて数値モデルの開発に着手したが、時間が不足し、完成には至らず、今後の課題として残された。