hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
妊娠恒常性維持機構における羊膜マトリクス細胞蛋白の役割

本研究の目的は,妊娠恒常性維持機構における羊膜の役割の一端を解明することである.昨年度,それまでの羊膜細胞の単層初代培養方法に細胞・組織増殖の不安定性が認められたため,新たなflow cytometryを用いた上皮細胞分離法を確立した.本年度では,この方法により得られた羊膜上皮細胞および間葉系細胞の特性を検討するため,それぞれの遺伝子発現について網羅的に解析した.【方法】妊娠3739週での胎盤表面羊膜および辺縁羊膜を採取し,羊膜上皮特異的蛋白EpCAMを用いて,蛍光活性化細胞分離法で羊膜上皮細胞の分離を行った.分離細胞は,その形態やEpCAMおよび間葉系細胞特異的蛋白Vimentinを用いた免疫染色で確認した.得られた細胞において,羊膜採取部位ごとの相違や,初代培養細胞および継代後細胞における遺伝子発現の違いをmicroarrayにより比較解析した.【結果】初代羊膜上皮細胞において,増殖・分化に関与するmidkine,FGF2の発現が低く,間葉系細胞では細胞性免疫に関連するHLA-A,HLA-B,HLA-Cの発現は低く,妊娠中に関与するとされるHLA-Gの発現は高かった.継代後,midkineの発現は両細胞で急速に増加した.また,間葉系細胞にて増殖・細胞周期に関わるS100A8や免疫系に関わるCD163,VSIG4,SPP1の発現が増加した.total RNAを用いたmidkine,HLA-Gに対する定量的RT-PCRにおいても同様の結果を確認した.なお羊膜の採取部位別における遺伝子発現の差異は認めなかった.【結論】羊膜上皮および間葉系細胞において,増殖・分化に関与する遺伝子発現は低く,免疫抑制に関連する遺伝子発現は高いという結果が得られた.これらの遺伝子発現特性は,羊膜の免疫寛容におけるシグナル伝達機構としての役割を究明する一助となる可能性が考えられた.産婦人科本研究実験の基盤となる羊膜上皮細胞および間葉細胞の単層初代培養における細胞,組織増殖にいまだに偏りがあり不安定であるため,当初の予定の実験が終わらなかった.羊膜上皮細胞の単層培養や遺伝子導入過程,羊膜マトリクスscaffold作製において,安定した実験系の構築が困難であり,想定した結果が得られず,実験計画に大幅な修正と追加実験が必要となったため.本研究実験の基盤となる羊膜上皮細胞および間葉細胞の単層初代培養における細胞,組織増殖に偏りがあり不安定で,実験結果にばらつきが生じたため,当初の予定の実験が終えられなかった.羊膜上皮細胞の初代培養法の改良に加え,flow cytometryを用いた上皮細胞分離による実験を平行して行う予定である.遺伝子発現解析のためのマイクロアレイ解析を予定している.羊膜上皮細胞の初代培養法にさらなる改良を加え,平成23年度に行えなかった研究内容を含め当初の実験計画を遂行する予定である.
ジェンダー・女性学研究活動におけるIT-CMCの活用実態と利用者技能レベル開発

ジェンダー・女性学研究教育領域においてICT(情報通信技術)はいかに活用されているかについての基礎研究である。所見として高度情報技術格差が明らかに男女間にある。しかし近年女性が積極的にICT活用で社会活動においてネットワークを拡大し、研究・社会運動等を展開している。直接的地位向上、収入上昇の例は少ないが女性はICTの活用により迅速な情報収集・発信ができ、全国規模の情報、国境を越えた情報を入手している。また双方向型情報交流が活性化され、地方自治体の生涯学習情報、NGOなどの調査結果、集会情報が迅速に流通している。他方その活用によってデメリットもある。即ちプライバシーの侵害など情報被害、インターネットを利用した犯罪(出会い系サイト等)、ポルノ情報蔓延、人権侵害情報・ウィルスの流布などが指摘された。事例調査から中高年女性では活用は限定的であり、高齢男女への地域での無料研修機会が不足している。ICT専門領域の意思決定機関に女性が極めて少ない。高度情報技術領域の高等教育にも女性は10%程度に留まっている。国際比較としてタイではパソコン、通信費用、ソフトなどが高額のため活用は大都市高学歴層に限定されておりそこではジェンダー格差は少ない。無料ソフトへの志向が強い。スウェーデンではインフラが整備されており、政府としての積極的取り組みが効を奏している。社会的ジェンダー格差が比較的少ないためにICT活用においてもジェンダー格差は少ない。社会関係のジェンダー格差はICT活用においても反映している。さらに国連など国際的にICTの格差解消の努力が開始されている。ICT活用におけるジェンダー格差の調査についてまず初年度は第一に先行研究の調査を資料、文献検索によっておこなった。日・英文献によって調査し、資料リストを作成。白書類専門誌、一般文献、雑誌・定期刊行物、新聞などにわけて検索した。英文資料については主に、ICT活用におけるジェンダー分析をおこなっているものに限定した。第二には日本全国のジェンダー・女性関連研究所、地方自治体女性センター、大学図書館、さらにNGO, NPOについて「パソコン、インターネット利用と社会活動についての実態調査」として構成化された質問票によって各組織、機関においてどのようなICT活用がおこなわれているかについて質問票郵送し、回答を得た。地方自治体男女共同参画担当部局、大学図書館などからの回収は少なかった。現在集計結果分析中である。第三には国際比較としてスウェーデン、タイをフィールドとして選び、現地共同研究者によってストックホルム大学及びそのジェンダー関連研究所、大学、NGOについてICT活用状況を調査。調査票は日本国内調査のものと共通で現地語の調査票を作成した。タイ北部のチェンマイ大学、同大学ジェンダー研究センター及び、その周辺のNGOについても共同研究者によって共通調査票による調査を実施した。現在、第二段階として詳細聞き取りを実施中である。活用の問題点、障害となるインフラの限界、PCの経費、維持費用、通信費、技術レベルの限界などの問題、情報収集・発信における問題点などについて詳細調査を行う。2年度には資料調査は継続し、さらに事例的聞き取り調査をすすめ、国際比較における異同の分析、ジェンダー間のICT活用の異同の質的分析をおこない、報告書刊行、報告会開催を予定している。ICT活用の実態についての一年目の調査から女性がICTを積極的に活用している様子が高等教育機関、大学図書館、地方自治体生涯学習機関、民間組織のいずれにおいても見えてきた。男女間格差を比較するには男性回答者が少なすぎた。女性ICT活用者は1)情報収集力の国内外への拡大、2)情報発信・受信が容易にかつ安価になった。3)伝達速度が情報したこと等の指摘頻度が高かった。特にNGO/NPOでは女性たちが指導力、主体性を発揮して新たな社会運動を展開し、目標達成している例が報告された。しかしICT活用によって地位の向上や収入の向上があったという人はほとんどいなかった。また情報収集量の拡大とともにデメリットとして1)機器・維持管理の出費増大、2)活用能力向上訓練指導者不足が多く指摘された。他方、情報被害も出ている。例えばポルノ情報の蔓延、個人的中傷、情報漏洩などである。

携帯電話については今回の調査には含めなかったが、資料調査から青年層では携帯によるインターネット情報活用が頻繁である。活用技能については国家試験の情報処理技術者資格獲得、大学・大学院の情報領域専攻学生数においては圧倒的に(98%)男性というのが統計結果である。国際比較の結果についてみるとタイ政府は'99年以降ICT活用を重点課題化し政策推進に着手し始めている。このため安価なパソコンが入手可能になったが、他方ソフトの海賊版が流布され、著作権についての知識、基準設定がないという問題が指摘された。NPO/NGOでは女性の方が積極的にネットワークにICTを活用している。スウェーデンの事例調査では回答者が限定的ではあるが男女間に日常的活用格差はないものの、ICT先端技術專門職は男性集中があるといわれる。各種資料による先行研究調査から、社会一般にあらゆる領域にジェンダー分離・格差がある以上、ICT活用にも格差がでてくることは必然であるという所見の研究が多い。また地域格差も明確にある。今後の格差是正のためにネットワークができ、ICTにおけるジェンダー格差解消のための積極的格差是正策が必須である。そのためには研修機会の拡充、指導サービスの充実、電話・インターネット・FAXなどによる訓練・指導チャネルの確保などが有用である。
発達段階にふさわしい音声言語教育のための小学校英語活動教材開発とカリキュラム作成

平成23年度必修化の小学校外国語活動は音声面に対する敏感な知覚能力をもつ児童期に外国語音声に体験的に触れさせることに意義があるとして導入されるにも関わらず、現場には音声言語の指導の具体が示されず教授・学習効果に関する研究結果も十分蓄積されていなかった。本研究では小学校外国語活動において喫緊の課題である、小学校発達段階にふさわしい音声言語教育のための教材開発と教授法の整備を行った。具体的には(1)申請者が定期的に実践支援に携わる複数の小学校にて児童の英語運用能力データを定量的に収集・分析し、(2)音声言語教育の内容・程度・方法を明らかにした上で教育効果を測定し、(3)授業実践・教材開発を行った。昨年度から引き続き、申請者が英語活動の計画・実践を支援・実施している小学校において、児童の英語運用能力について、定期的・定量的な観察・教育効果評価を蓄積したデータベースの構築を行った。データベースの構築は、最終年度である2013年度も継続的に実施する。CALL(Computer Assisted Language Learning)教材等のICT教材・教具を活用し英語を聞き話す活動を行っている間に、音声的特徴に注意させた活動に取り組む種類・頻度と習得度との関連を調査したデータにを解析し、教育方法と児童のパフォーマンスとの相関について分析を行った。学習効果を検討する上で、今年度、特に焦点を当てたのは、アルファベット文字の認識、文字の聴取認識、英語のリズムの認識といった音声知覚能力に加え、英単語の聴取・理解といった技能の習得・定着の程度にも注意を向けた。その際、実験協力校の小学校においては高学年のみでなく、中学年から英語活動が実施されているため、学年ごとに発達段階に応じての分析を行った。また、同じ学年であってもそれまでの学習年数や、学校外での外国語学習の状況によって教育効果に影響を与えることが予想されるので、児童の外国語学習歴の要因も考慮するようにした。これらの技能面における変化の調査に加えて、学年ごとに、児童らの英語活動に対する関心・意欲・態度面に関するアンケート調査も行い、当年度の実践の評価と、次年度以降の実践計画・教育カリキュラム作成のための資料とした。研究期間を通じて、申請者が英語活動の計画・実践を支援・実施している小学校において、児童の英語運用能力について、定期的・定量的な観察・教育効果評価を蓄積したデータベースの構築を行った。本研究課題の研究開始以前に蓄積してきたデータと合わせると、のべ2000件となっている。CALL(Computer Assisted Language Learning)教材等のICT教材・教具を活用し英語を聞き話す活動と、音声的特徴に注意させた活動に取り組む種類・頻度と習得度との関連を調査したデータについて継続的に収集し、データを増やしながら、教育方法と児童のパフォーマンスとの相関についての分析を継続した。アルファベット文字の認識、文字の聴取認識、英語のリズムの認識といった音声知覚能力、英単語の聴取・理解といった技能の習得・定着の程度に焦点を当てて、学習効果を検討した。これらの技能面における変化の調査に加えて、学年ごとに、児童らの英語活動に対する関心・意欲・態度面に関するアンケート調査も行い、実践計画・教育カリキュラム作成のための資料とした。申請者が英語活動の計画・実践を支援・実施している小学校において、児童の英語運用能力について、定期的・定量的な観察・教育効果評価を蓄積したデータベースの構築を行ってきた。データベースの構築は、研究期間を通じて継続する。CALL(Computer Assisted Language Learning)教材等のICT教材・教具を使った学習活動や、ALT(Assistant Language Teacher、外国人英語指導助手)らとの対話といった、英語を聞き話す活動の間に、音声的特徴に注意させた活動に取り組む種類・頻度と習得度との関連を調査した。これらのデータに基づき、教育方法と児童パフォーマンスとの相関について分析を行ってきた。学習効果を検討する上で、特に焦点を当てたのは、アルファベット文字の認識、文字の聴取認識、英語のリズムの認識といった、音声言語の知覚能力・運用能力である。その際、実験協力校の小学校においては高学年のみでなく、中学年から英語活動が実施されているため、低学年・中学年・高学年の発達段階に応じての分析を行った。これらの技能面における変化の調査に加えて、学年ごとに、児童らの英語活動に対する関心・意欲・態度面に関するアンケート調査も行い、当年度の実践の評価と、次年度以降の実践計画への資料とした。

計画どおり、学級での英語活動を経験している児童について、個々の発達段階や英語学習歴、コミュニケーションの意欲・態度面を記述したデータベースの構築を継続的に進めている。英語活動が行われている全学年(第3学年から第6学年)において、定量的データ収集を行うことができた。加えて、児童の行動データに基づき、教授法と技能の発達を関連づけた考察を開始した。教材開発には実験開始初期から携わり、継続している。授業実践・支援にも継続的に携わった。年間を通じてコンピュータを利用して行う英語活動の授業(毎週1回)にはゲストティーチャーとして毎回立ち会い、小学校の英語専科教諭とのティームティーチングを行った。開発教材とテスト開発も授業実践中に試用しフィードバックを得つつ改良を重ねてきた。音声教育・評価に関する部分のカリキュラムのプロトタイプを試作・実践し、問題点を洗い出すとともに、改良を重ね、小学校段階で評価すべき音声言語能力の項目を精査した。当小学校の児童の実態に応じて、カリキュラムの構築・改善を行い、最終年度の教材・カリキュラムの完成へ向けた基礎資料とした。当年度は、学級での英語活動を経験した児童について、個々の発達段階や英語学習歴、コミュニケーションの意欲・態度面も記述したデータベースの構築を行ってきた。英語活動が行われている全学年(第3学年から第6学年)において、データ収集を行うことができた。教材開発には実験開始初期から継続的に携わった。開発教材とテストは授業実践中に試用しフィードバックを得つつ改良を重ねてきた。音声教育に関する部分のカリキュラムのプロトタイプを試作・実践し、問題点を洗い出すとともに、改良を重ねてきた。学習指導要領解説の「外国語の音声やリズム」「英語特有のリズムやイントネーション」の文言、Council of Europe(2001)や岡・金谷(2007)によるルーブリック(評価項目と到達度を示した指標)等の文献資料等を参照しつつ、小学校段階で評価すべき音声言語能力の項目を精査した。その上で、当小学校の児童の実態に応じて、カリキュラムの構築・改善を行ってきた。申請者が定期的に指導助言や実践支援に携わる複数の小学校において、実践と研究を往還させ、発達段階にふさわしい音声言語教育のための小学校英語活動教材開発とカリキュラム作成を完成させる。下記に設定した3つのサブテーマ;(1)児童の音声英語運用能力データ、コミュニケーションへの意欲・態度等の情意面の変容についてのデータを定量的に収集・分析し、教授法と技能発達の相関に関するデータベースを構築し、研究のための基礎資料とする。単年度のみでなく、経年変化も記録していく。(2)発達段階に適した音声言語教育の内容
多価ECRイオン源のX線分光による診断

本年度は、まずECRイオン源から放出されるX線の全体像の把握とその測定方法の確立に重点を置いた。そのため、原子核実験で使用されている大容積のGe(Li)検出器を用いて、(1)ECRイオン源動作中に、検出器前方のコリメーターを通らずに、部屋の壁、床その他の実験機器から反射して来て検出器に入るX線量を無くすシールドの配置を検討して、これらのX線量を実質上無視できるようなシールド方法を見い出した。(2)予備的測定として、1MeV程度までの広いエネルギー範囲のX線スペクトルの測定を行った。イオン源をAr^<8+>とAr^<10+>とに調整した時のX線量が、数10keVから数100keVの範囲で大巾に異なることがわかった。来年度は、この方向で更に詳細な測定を行う。
母乳哺育期待の変化と母親の授乳意識・行動に関する研究

本研究では、授乳に焦点を当て、戦後日本の母子保健施策、乳児栄養関連施策、人工栄養法の開発などの授乳に関する環境の変化を捉えるとともに、養育や授乳にかかわる親の就労環境・保育環境の変化を整理し、これらの変化を背景とした授乳に関する多様な媒体における言説を分析してきた。これまで母親向けになりがちであった育児情報媒体の分析を相対化するため、父親向けの情報における授乳の位置づけや乳児保育にかかわる保育者向けの授乳関連情報など、母親以外の授乳者を想定した授乳情報について対象化し分析を行ってきた。また、おとなと子どもが共有し得る絵本という、親になる前から触れる可能性のある媒体についても分析を行った。このようにこれまで分析対象とされてこなかった媒体を幅広く取り上げ、ジェンダーに敏感な視点からの言説の考察を行って、平成28年度、平成29年度と学会発表および論文投稿を行ってきた。最終年度は、これらの資料分析より得られた成果をふまえ、1950年代以降の日本の母子保健施策、人工栄養品の開発・販売、女性の就労状況、乳児保育の場における授乳動向、栄養法に関する実態の変遷を明らかにし、授乳関連の時代画期を捉えた。そして、養育者に対し影響を及ぼしてきたと考えられる授乳についての言説の変化との関係を明らかにし、当時のインタビュー内容などを分析して投稿中である。また、これら社会的要因の史的変化を背景とした個々人の意識・行動の実際を明らかにするための当事者調査については、予備調査に着手し調査協力者を絞り込むための作業を行っている。授乳は、養育行動の中で母乳分泌という女性の身体的特性にかかわり、母親への養育期待の史的変遷の研究でも重要な位置を占めるなど、ジェンダーに敏感な視点で子育ての環境を構築する上で鍵となる養育行動である。本研究者はこれまで授乳に関する養育者の意識・行動を捉えるため、乳幼児の親を対象として量的・質的研究を行ってきた。本研究は、過去の授乳経験者も含めた多様な年代を対象としたインタビュー調査を行って、授乳に関する意識・行動に社会的要因等が影響を及ぼすダイナミズムを歴史的な背景のもとで明らかにしようとするものである。本年度は、授乳経験者対象インタビューに先立ち、社会的要因のうち、母乳哺育に関する言説の史的変化に焦点をあてた資料分析を行った。特に就労との関係で困難を生じやすいとされる乳児保育の場に着目し、日本の戦後の乳児保育の史的展開や保育所保育指針をふまえ、保育者養成のスタンダードとも言える保育者養成テキストについて、乳児栄養関連の記述の変化を分析した。これにより、1960年代以降今日までの母親と保育者に対する授乳に関する役割期待の変化を具体的な情報内容の変化とともに捉えることができた。保育者養成テキストは、保育者という専門職への期待を反映し、また学習者である保育学生が将来の親となる際に影響を及ぼすという側面ももつ。今回の50年間のスパンでの記述の変化については、「保育者養成テキストにみる母乳哺育観」として投稿した(日本家政学会児童学部会発行「児童学研究」第41号2017年3月発行)。次年度以降は、授乳経験者へのインタビュー調査を実施し、人工栄養品の開発や母乳推進運動などの動向とともに、これらの言説分析の結果を活用し考察を行う。本年度は、母乳哺育に関する言説の史的変化に焦点をあてた資料分析を行った。特に就労女性と保育者に着目した。乳児保育の史的展開に関する基礎資料とともに、保育所保育指針、保育者養成のスタンダードとも言える保育士養成テキストにおける乳児栄養関連の記述を分析した。これにより、1960年代以降今日までの母親と保育者に対する授乳に関する役割期待の変化と具体的な情報内容の変化を捉えた。そして、「保育者養成テキストにみる母乳哺育観」として発表した(日本家政学会児童学部会発行「児童学研究」第41号2017年3月発行)。これらの考察により、今後予定している授乳経験者への調査結果の分析において、経験者の時代背景とともにその意識・行動を理解する視点が得られたと考えている。母乳分泌という女性の身体的特性にかかわる養育行動は、男女平等社会における養育のあり方を考察する鍵となる養育行動である。本研究は、戦後の母子保健施策、人工栄養法の開発、そして就労環境・保育環境の変化をふまえ、授乳(母乳栄養、人工栄養などの栄養法を含むものとしての)に関する多様な媒体における言説を分析して、授乳に関する当事者の意識・行動の変化にこれら社会的要因がどのように影響を及ぼしてきたのかを明らかにするものである。本研究者はこれまで、母乳哺育に関する言説の史的変化を明らかにするべく、家庭科教育における母乳哺育と母親観についての考察等を進めてきた。昨年度は、乳児保育の場における乳児栄養に関する動向と保育者に向けての言説に焦点をあてて成果をまとめた(「保育者養成テキストにみる母乳哺育観」)。今年度は、さらに広範な資料を対象とし、多様な媒体に見られる母乳哺育観を把握することとした。親と子ども双方に影響を及ぼすという点で特色をもち、家庭科保育学習においても活用される絵本に着目し、登場人物や主題、授乳の描写の視点より分析・考察した(「養育行動を描いた絵本についてー家庭科保育学習教材としての検討」)。その結果、父親やミルクによる授乳はほとんど描かれず、母親と男児という関係性での描写が主で、女児は将来の母親としての視点で描かれるという授乳におけるジェンダーバイアス、現実の多様な授乳状況については反映されていないことなどが明らかとなった。

以上のような多様な媒体における言説の動向から、本研究でインタビューを行う女性たちの青年期から出産・育児期において、影響を及ぼしてきた社会的要因についての分析視点を検討することができた。昨年度は乳児保育の担い手となる保育者に影響を及ぼすと考えられる資料を用い、1960年代以降の授乳観と母乳哺育観の変遷を捉えた。これにより、乳児期の就労と子育ての両立にかかわる乳児保育の環境における授乳観・母乳哺育観と母親や保育者への期待の変化を捉えることができた。今年度は、さらに分析対象を拡大し、これまであまり分析対象とされてこなかった養育行動を描いた絵本という媒体に着目した。そして、おとなと子どもが共有する絵本に描かれた授乳に関して、母乳授乳以外の実態が反映されていないこと、母親への期待、さらには将来の母親としての女児への期待の位置づけについて考察することができた。これらの資料分析に基づく研究成果については、それぞれに投稿をし、公表をしている。次年度はこれら多方面における資料分析で得られた授乳についての言説の変化を1つの軸とし、授乳に関する分析視点を精緻化して、1960年代から1980年代に子育てを行った女性に対するインタビューの実施・考察を行うことができる。本研究では、授乳に焦点を当て、戦後日本の母子保健施策、乳児栄養関連施策、人工栄養法の開発などの授乳に関する環境の変化を捉えるとともに、養育や授乳にかかわる親の就労環境・保育環境の変化を整理し、これらの変化を背景とした授乳に関する多様な媒体における言説を分析してきた。これまで母親向けになりがちであった育児情報媒体の分析を相対化するため、父親向けの情報における授乳の位置づけや乳児保育にかかわる保育者向けの授乳関連情報など、母親以外の授乳者を想定した授乳情報について対象化し分析を行ってきた。また、おとなと子どもが共有し得る絵本という、親になる前から触れる可能性のある媒体についても分析を行った。このようにこれまで分析対象とされてこなかった媒体を幅広く取り上げ、ジェンダーに敏感な視点からの言説の考察を行って、平成28年度、平成29年度と学会発表および論文投稿を行ってきた。最終年度は、これらの資料分析より得られた成果をふまえ、1950年代以降の日本の母子保健施策、人工栄養品の開発・販売、女性の就労状況、乳児保育の場における授乳動向、栄養法に関する実態の変遷を明らかにし、授乳関連の時代画期を捉えた。そして、養育者に対し影響を及ぼしてきたと考えられる授乳についての言説の変化との関係を明らかにし、当時のインタビュー内容などを分析して投稿中である。また、これら社会的要因の史的変化を背景とした個々人の意識・行動の実際を明らかにするための当事者調査については、予備調査に着手し調査協力者を絞り込むための作業を行っている。1970年代の母乳推進運動始動期を含む1960年代1980年代の幅広い世代の授乳経験者へのインタビュー調査により、当事者の授乳についての意識・行動を明らかにしていく。母乳哺育期待が当事者にはどのように捉えられていたのか。また、当時の授乳についての自身の希望と栄養法の決定の過程、家族や保育者など母親以外の人々のかかわりなどの実態、自身の授乳行動に影響を及ぼした要因の認識についても、その語りから捉えたいと考える。母乳哺育や授乳に関する情報や環境の時代的な変化についての認知も合わせて捉えたい。
メチル水銀の神経毒性発現における標的としてのプロテオグリカン代謝異常

メチル水銀は魚介類に多く蓄積している有機金属である。プロテオグリカンはコアタンパク質にグリコサミノグリカン糖鎖を結合した複合糖質であり,細胞機能を多様に調節する分子である。本研究はメチル水銀の血管毒性に,プロテオグリカンが関与する生体システムであるFGF-2及びVEGFシステムが重要であることを明らかにした。さらに,メチル水銀中毒ラットの小脳の組織学的観察から,メチル水銀による小脳障害の病因論として,炎症性の細胞が関与するという"炎症仮説"を提案した。水俣病の公式発見から50年以上が経過した今になってもメチル水銀の毒性発現機構はほとんど不明のままである。特に,大脳において脳溝周囲に障害が限局する機構と,小脳において顆粒細胞が特異的に傷害される機構がよく分かっていない。プロテオグリカンは細胞外マトリックスの構成成分として細胞増殖因子等による細胞の機能調節に重要に関与している複合糖質である。本研究では,脳微小血管構成細胞のプロテオグリカン代謝とそれが関与する生体システムがメチル水銀の毒性発現機構に寄与することを明らかにする。本研究はメチル水銀の神経細胞特異的な毒性発現がその微小環境の変化に起因するという作業仮説に立脚し,微小環境の構築と細胞の機能調節因子に活性調節に重要な役割を果たしている分子であるプロテオグリカンの代謝異常を解明しようとするものである。実際,病理学的知見として,メチル水銀が脳組織において浮腫を形成させ,そのことによって生じた循環障害が神経細胞を変性させ得ることが報告されている。本年度は,メチル水銀の標的組織としての脳微小血管の機能について検討し,以下の結果を得た。(1)脳浮腫に係る因子として重要とされるVEGFの発現について検討し,メチル水銀が少なくとも遺伝子発現レベルにおいてPIGFおよびそのレセプターであるVEGFR-1の発現を上昇させることを見出した。(2)一方,脳微小血管内皮細胞層の維持に重要な役割を果たすとされるVEGF-Aは,抗血栓特性(ヘパリン様活性)を示しFGF-2のレセプターへの結合を加速するヘパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種パールカンの合成を,ヘパラン硫酸糖鎖の長さや二糖組成を変えることなく誘導することが明らかにした。(3)また,内皮細胞層維持に対するメチル水銀の作用を検討し,メチル水銀が細胞層を傷害しないが増殖の阻害によって傷害後の修復を遅延させることを明らかにした。現在,メチル水銀投与ラットを用いて,組織病理学的な手法を用いて,神経細胞の変性とそれに関わる周囲の細胞種の変化,およびそれらが発現しているプロテオグリカン分子種の変化,さらには神経細胞の機能調節に重要なニューログリカンCの代謝に対するメチル水銀の作用を検討中である。メチル水銀の毒性発現について最も重要な未解決の問題は2つある。ひとつはメチル水銀の神経細胞に対する毒性発現を担う分子標的であり,もうひとつは成人水俣病患者の脳神経細胞障害が深い脳溝付近に局在するメカニズムである。我々は,脳微小血管を構成する内皮及び周皮細胞にメチル水銀の分子標的があり,血管の機能障害による二次的な神経細胞障害がメチル水銀の神経細胞特異的な毒性発現をもたらすと考えている。過去の研究から,その分子標的はプロテオグリカンが関与する生体システムであると推察されたので,脳微小血管内皮及び周皮細胞の培養系を用いて平成18年度に引き続き検討した。また,脳特異的プロテオグリカンであるニューログリカンCの代謝に対するメチル水銀の作用をラット脳神経細胞で検討し,さらにメチル水銀中毒ラットの脳に関する組織学的検討も開始した。(1)周皮細胞がメチル水銀に対して高い感受性を示すだけでなく,傷害を受けるときにVEGFの発現が顕著に上昇することを見いだした。内皮細胞ではP1GFとその受容体であるVEGFR1の発現が上昇していた。メチル水銀が脳微小血管において,VEGFシステムのオートクリン及びパラクリン作用を介して脳浮腫を発生させ,それによって神経細胞障害が生じるという仮説が支持された。(2)メチル水銀が周皮細胞においてヘパラン硫酸プロテオグリカンの小型分子種シンデカン-4の発現を誘導することを明らかにした。(3)メチル水銀は神経細胞のニューログリカンCの代謝には影響を及ぼさないことが分かった。(4)後肢交差が認められるメチル水銀中毒ラットの脳では,顆粒細胞に特に著明なアポトーシスが観察された。プロテオグリカン分子種の免疫組織学的検討を実施中である。結果を総合的に見たとき,我々が提案している仮説「メチル水銀の毒性は血管障害から神経細胞傷害ヘプロテオグリカン代謝異常を通じて発展する」がメカニズムのひとつとして存在することが示唆されている。平成20年度は,(1)メチル水銀曝露による内皮細胞の機能異常,(2)メチル水銀に対する周皮細胞の感受性,および(3)メチル水銀中毒ラット脳組織におけるプロテオグリカンの発現,に関する研究を遂行し,以下の結果を得た。【メチル水銀曝露による内皮細胞の機能異常】

細胞培養系を用いた昨年度までの検討によって, FGF-2システムがメチル水銀による脳微小血管の機能障害とそれに続く浮腫の形成に関わることが示唆された。そこで,培養ヒト脳微小血管内皮細胞についてこれを検討し, FGF-2システムを構成するFGF-2タンパク質, FGF2レセプター,及びパールカン(ヘパラン硫酸プロテオグリカンの大型分子種)コアタンパク質についてその発現を調べたところ,メチル水銀がFGF-2タンパク質の発現を選択的に抑制し,その結果,内皮細胞の増殖が抑制され,傷害後の修復過程が遅延することが示された。【メチル水銀に対する周皮細胞の感受性】周皮細胞は細胞密度が低いときにメチル水銀に対して高い感受性を示した。そのメカニズムについて検討し,毒性防御系には細胞密度による違いは認められないが,アミノ酸トランスポーターのひとつLAT-1の発現が細胞密度の低い周皮細胞で上昇しており,それによってメチル水銀が細胞内に多量に輸送されることが分かった。【メチル水銀中毒ラット脳組織におけるプロテオグリカンの発現】以上の培養細胞を用いた実験と併行して, in vivoにおけるメチル水銀曝露とプロテオグリカンの発現を検討した。その結果,メチル水銀中毒ラットの大脳及び小脳ではプロテオグリカンの発現低下は認められず,むしろ増加しているように観察された。しかしながら,そのような変化が分子種に非選択的に観察されたので,細胞外マトリックスの形成阻害の結果である可能性を引き続き検討する必要がある。メチル水銀による部位特異的な中枢神経系傷害のpathogenesisとして脳浮腫の形成による循環不全により脳の特定組織の神経細胞が傷害されるとする「浮腫仮説」が有力である。しかしながら,その分子機構は分かっていない。そこで,プロテオグリカンが関与し得る浮腫発生にかかわる生体システムとして脳微小血管内皮および周皮細胞における(1)VEGFシステムおよび(2)グリコサミノグリカンのひとつであるヒアルロナンの合成系に着目して検討した。その結果,(1)メチル水銀に曝露した内皮細胞ではVEGF-Aの機能受容体VEGFR2,デコイ受容体VEGFR1およびVEGFR1に選択的に結合するPlGFの発現が高まり,一方,周皮細胞ではVEGF-Aの発現が上昇する結果,脳微小血管におけるVEGFシステムの活性上昇とそれに伴う血管透過性の亢進が起こることが示唆された。(2)メチル水銀に曝露した内皮細胞および周皮細胞ではともにヒアルロナンの合成・分泌が増加するが,内皮細胞ではUGDHの発現上昇がそのメカニズムであるのに対し,周皮細胞ではHAS-2の著明な発現上昇が重要であることが示された。本研究の結果は,メチル水銀の神経毒性にプロテオグリカン/グリコサミノグリカンが関与する生体システムが重要であることを示唆している。
脂肪族ニトロ化合物の求核置換反応

ニトロ基の活性化力を活用して炭素骨格を構築し、続いてニトロ基を求核剤で置換する反応は合成の手法として重要である。これまでの研究により、三級,アリル,ベンジル位のニトロ基はルイス酸の触媒により、各種の求核剤で置換されることがわかってきたので、6162年にかけて、この研究をさらに発展させ、一級位や二級位のニトロ基を求核置換する手法の開発をおこなった。その結果(1)α-ニトロスルフィドの求核置換反応、(2)β-ニトロスルフィドの求核置換反応の開発に成功した。α-ニトロスルフィドと【Me_3】SiY(Y=H,CN,【CH_2】=CH【CH_2】,【CH_2】C(=0)C【H_3】)とをルイス酸(Sn【Cl_4】)存在下室温で反応させると、ニトロ基は高収率でYで置換された。β-ニトロスルフィドもα-ニトロスルフィドと同様にルイス酸触媒によって【Me_3】SiYと反応し、収率よくニトロ基がYで置換できた。このようにニトロ基のα-位又はβ-位にチオ基を導入することにより、一級位や二級位のニトロ基の求核置換反応が始めて可能となった。求核剤は【Me_3】SiYに限定されず、各種の求核剤の使用が可能であった。例えば、芳香強化合物を求核剤で用いると、ニトロ化合物を求電子剤として用いたFridel-Crafts反応がおこった。置換生成物中のチオ基は、還元的或いは酸加的に徐去できるため、α-ニトロ或いはβ-ニトロスルフィドの求核置換反応は有機合成上有用な新手法を提供するものである。
大脳基底核のトポグラフィック神経回路におけるプロトカドヘリンの多面的解析

1.大脳基底核トポグラフィック神経回路の神経発生学的解析:回路の神経発生学的な解析を推進するための遺伝子改変マウスの作製に着手した。2.プロトカドヘリンの結合選択性のメカニズムを明らかにする構造生物学的解析:Pcdhの結晶構造解析を行うための、タンパク質大量発現系を構築し、最適な結晶化条件を見出した。X線結晶構造解析によりデータ収集を行っており、一部の結晶構造を明らかにしている。3.霊長類脳の大脳皮質ー大脳基底核神経回路における神経解剖学的解析:霊長類アカゲザルにおけるPcdhファミリーの発現パターンについて、大脳基底核を中心とし解析を行った。また、マウスにおける発現パターンとの比較を行い、トポグラフィック神経回路における意義付けを行った。1.大脳基底核トポグラフィック神経回路の神経発生学的解析大脳基底核トポグラフィック神経回路の神経発生学的解析を推進するための遺伝子改変マウスの作製を検討した。2.プロトカドヘリンの結合選択性のメカニズムを明らかにする構造生物学的解析PCDH17を中心として結晶構造解析を推進している。これまでに、PCDH17とPCDH10の細胞外カドヘリンドメインの大腸菌による大量発現系を確立した。続いて、PCDH17に焦点を当てて、結晶化の条件検討を行った。これまでに、多数の結晶化条件を見出しており、X-線結晶構造解析を行いデータ取集を行っている。3.霊長類脳の大脳皮質ー大脳基底核神経回路における神経解剖学的解析霊長類のアカゲザルを用いた神経解剖学的解析を行うために、PCDH17とPCDH10の免疫染色を行った。大脳基底核におけるトポグラフィック神経回路の発現パターンを中心に解析を進めた。また、同ファミリーのPCDH19についても特異的抗体を作製し、その発現パターンをマウスおよびアカゲザルにおいて検討した。PCDH17,10,19の3分子において大脳基底核の発現パターンを検討してる。1の大脳基底核トポグラフィック神経回路の解析に必要な遺伝子改変マウスの作製が思うように進んでいない。2及び3に関しておおむね順調に進んでいる。1の大脳基底核トポグラフィック神経回路の解析に必要な遺伝子改変マウスに関して焦点を当て進めていく。2に関しては、結晶構造解析のために必要なデータを集める。3に関しては得られたデータを元に論文作成に取り掛かる。1の研究計画の遺伝子改変マウスの作製にまで至らず、次年度使用額が生じた。今年度以降に必要な遺伝子改変マウスの作製の費用に用いる予定である。
縄文土器の彩色技法に関する復元的研究

縄文文化の彩色土器は、土器製作に加えて、漆などに代表される膠着材や赤色顔料などの素材や工程に関わる技術を体系的に具現化したものである。本研究では、彩色土器から得られた微小片をもとにして、その構造や材質などに関わる製作技法を明らかにすることを目的に調査を進めた。具体的には、(a)素地=胎としての土器製作技法、(b)彩色前処理としての下地作り及び下地調整方法、(c)塗膜中における漆などの膠着材や赤色顔料などの素材、(d)塗膜層の構成などに注目して、彩色土器製作に関わる技術的な特質などを実証的に検討することを試みた。本研究によって、以下のような知見を得たので、今後さらに復元的研究を進めるための基礎としたい。1.彩色材料として、朱、ベンガラ(パイプ状、その他)などが便い分けられて用いられていた。2.彩色の各部位とその方法との対応関係については、(1)沈線部などの凹部において重ね塗りされることが多用される一方で、(2)平滑部の彩色については全ての試料において、"ベンガラ漆塗り"あるいは"朱漆"による1回塗りが行われていることを確認した。3.赤彩土器の一部には、赤彩を施す前の事前調整として、"磨き"による表面の平滑化と、還元炎条件下における土器焼成による"黒色化処理"が行われる事例を確認した。4.土器彩色材料の必要量について、顕微鏡観察結果による膜厚の知見に基づいて試算した。その結果から、漆、顔料(朱)、朱漆ともにごく僅かな量によって、全面塗彩も可能であることを確認した。縄文文化に登場する彩色土器は、土器製作に加えて、漆などに代表される膠着材や赤色顔料などの素材や工程に関わる技術体系を高度に具現化したものであり、その技術体系に関する知見は、縄文の人々の生活や文化を復元するためには極めて有効である。本研究では、主に北海道の彩色土器について、従来の集成的研究を基礎にするとともに、同時に自然科学的な立場から、微小片試料をもとにして、その構造や材質など製作技法上の調査をおこなうものである。平成15年度には、関係資料のデータベース化を進めるために、北海道内資料とあわせで新潟県と石川県の関係資料の実見とその記録化に努めた。あわせて、八雲町野田生1遺跡、千歳市キウス4遺跡出土の彩色土器については、微小片試料を採取して、自然科学的手法による検討を加えることでそれぞれの材質・技法的特質を明らかにした。本年度の成果については、下記の内容で公表した。(1)学会、研究会発表/(1)北海道考古学会研究発表大会(4月26日、札幌市):「北海道における縄文時代の出土漆器技術的に検討する立場から」小林幸雄、(2)文化財修復学会(6月7日、京都市):「北海道八雲町野田生1遺跡出土赤色漆塗り竪櫛の製作技法」小林幸雄、種市幸生、田口尚、(3)2003日本文化財科学会公開講演会「考古学の最前線科学が語る北海道の古代」(11月15日、札幌市)、:「漆膜にさぐる縄文人の工芸技術」小林幸雄(2)普及/(1)北海道開拓記念館2003移動博物館「北海道のうるし文化」:8月26日8月31日上ノ国町開催、9月5日9月10日南茅部町開催縄文文化に登場する彩色土器は、土器の製作に加えて、漆などに代表される膠着材や赤色顔料などの素材や工程に関わる技術的体系を高度に具体化したものである。その技術体系に関する知見は、縄文の人々の生活や文化を復元するためには極めて有効と言える。

本研究では、主に北海道の彩色土器について、従来の集成的研究を基礎にしながら、同時に自然科学的な立場から、微小片試料をもとにして、その構造や材質など製作技法上の調査をおこなうものである。平成16年度には、平成15年度に蓄積した関係資料のデータベース化をさらに進めた。とくに、北海道内資料にあわせて、南関東地区の関係資料の実見と、その記録化に努めた。北海道内資料については微小片試料を採取して、自然科学的手法による検討を加えることで、それぞれの材質・技法的特質を解明することに努めた。本年度の成果については、下記のとおり公表した。※日本文化財科学会第21回大会研究発表:小林幸雄・上屋真一「北海道カリンバ3遺跡の赤色漆塗堅櫛の材質と技法」あわせて、日本文化財科学会第22回(2005年度)大会における、研究発表「北海道の縄文時代後・晩期における彩色土器」の準備を進めている。縄文文化の彩色土器は、土器製作に加えて、漆などに代表される膠着材や赤色顔料などの素材や工程に関わる技術を体系的に具現化したものである。本研究では、彩色土器から得られた微小片をもとにして、その構造や材質などに関わる製作技法を明らかにすることを目的に調査を進めた。具体的には、(a)素地=胎としての土器製作技法、(b)彩色前処理としての下地作り及び下地調整方法、(c)塗膜中における漆などの膠着材や赤色顔料などの素材、(d)塗膜層の構成などに注目して、彩色土器製作に関わる技術的な特質などを実証的に検討することを試みた。本研究によって、以下のような知見を得たので、今後さらに復元的研究を進めるための基礎としたい。(1)彩色材料として、朱、ベンガラ(パイプ状、その他)などが使い分けられて用いられていた。(2)彩色の各部位とその方法との対応関係については、(1)沈線部などの凹部において重ね塗りされることが多用される一方で、(2)平滑部の彩色については全ての試料において、"ベンガラ漆塗り"あるいは"朱漆"による1回塗りが行われていることを確認した。(3)赤彩土器の一部には、赤彩を施す前の事前調整として、"磨き"による表面の平滑化と、還元炎条件下における土器焼成による"黒色化処理"が行われる事例を確認した。(4)土器彩色材料の必要量について、顕微鏡観察結果による膜厚の知見に基づいて試算した。その結果から、漆、顔料(朱)、朱漆ともにごく僅かな量によって、全面塗彩も可能であることを確認した。
ゼニゴケ被覆面におけるメタン吸収の通年観測とメカニズム解明

大気中に存在するメタンガスは二酸化炭素に次ぐ温室効果気体であり、その濃度変化は地球の気候変動に大きな影響を与える。通常、湿地のような湿潤な土壌はメタンガスの放出源となっているが、研究代表者が過去に西シベリアの湿地で観測を行った際に、ゼニゴケで覆われている土壌においてだけは大気中のメタンが土壌に吸収されるという特質を発見した。本研究は日本にも広く分布するゼニゴケにも同様の性質があるのかどうか明らかにすることを、またそのメカニズムを解明することを目的とする。通年の野外観測を実施した結果、ゼニゴケ被覆面によるメタン吸収は場所によって大きく異なり、土壌が非常に湿潤な場合にのみメタン吸収が起こっていることが明らかになった。日本におけるゼニゴケの生育場所は、畑の縁辺部や民家の軒先など比較的湿潤ではあっても常時湛水していることは少なく、メタン吸収が起こるのは梅雨期など降水量の多い時期に限られることも分かった。このため、通年で見たときの自然状態でのメタン吸収能は比較的低いと結論付けることができる。メタン吸収のメカニズムを明らかにするため、野外観測と並行して室内実験も行った。実験では、ゼニゴケによるメタン吸収はメタン酸化菌による酸化反応ではなく、ヒドロキシルラジカルの化学反応によるものと示唆される結果が得られた。今年度は、本研究のきっかけとなった西シベリアでの観測結果をまとめた論文が、Soil Science and Plant Nutritionに掲載され、また現地観測の結果を中心とした学会発表を行った。今年度は、ガスクロマトグラフ一式を購入し、ガスサンプルの分析環境を整えた後に野外観測を開始した。2003年8月から10月にかけて、東京都立大学構内をはじめとした数地点のゼニゴケ生育地で密閉チャンバー法を用いたメタンフラックスおよび地温・土壌水分などの環境要素の測定を行った。しかし、当初期待したようなメタンガスの吸収はいずれの地点においても得られず、西シベリアで観測されたような高いメタン吸収がおこるためには、土壌中の化学成分など何らかの条件が必要であると推察された。このため、現在は野外観測は1地点のみにしぼりこみ、室内実験の準備を行っているところである。次年度は、室内実験を中心に、ゼニゴケによるメタンガス吸収の発生条件に関して研究を行っていく予定である。上記の野外観測のほかに、今年度はゼニゴケの生態学的な特性を知るために、生態学の分野で蘇苔類を専門としている研究者を訪ね、ゼニゴケの分類、生長サイクルなどについてお話を伺った。また、メタンフラックスの測定方法である密閉チャンバー法に関する論文、ならびに本研究のきっかけとなった西シベリアのメタン吸収に関する論文を執筆し、いずれも国際学術雑誌に受理・印刷された。通常、湿地のような湿潤な土壌はメタンガスの放出源となっているが、研究代表者が過去に西シベリアの湿地で観測を行った際に、ゼニゴケで覆われている土壌においてだけは、大気中のメタンが土壌に吸収されるという特質を発見した。ゼニゴケは日本にも広く分布しており、そのメタン消去能が確認されれば、今後の大気中メタンの増加に対する対策手段の一つとして期待することができる。今年度は、昨年度に引き続き、野外の数地点におけるメタンフラックスの測定を実施した。その結果、ゼニゴケ被覆面におけるメタンの吸収フラックスは土壌水分の影響を強く受け、非常に湿潤な場合にのみ、メタンを吸収し、乾燥するとメタンを吸収も放出もしなくなるという結果が得られた。メタンの吸収フラックスは非常に微小であるため、今年度は測定方法の改良にも取り組んだ。今年度は、本研究のきっかけとなった西シベリアでの観測結果をまとめた論文が国際学術雑誌Tellus, Ser.Bに掲載され、またチャンバー法の方法論に関する学会発表を行った。
精神疾患をもつ当事者のリカバリーに影響する自己開示の要因

本研究の目的は、地域で生活する精神疾患をもつ当事者の自己開示量を対象別および内容別に調査し、リカバリーの促進に影響する自己開示の要因を明らかにすることである。2018年度の具体的な計画は、1精神疾患をもつ人における自己開示尺度における開示対象を検討すること、2自己開示・リカバリー・情緒的支援ネットワーク知覚に関わるアンケート調査およびその追跡調査を実施することの2点であり、所属機関の倫理委員会の承認を得た後に研究を進めた。1については、リカバリーや障害開示に関わる文献レビュー、および精神疾患をもつ当事者や支援者数名との打ち合わせを通して検討を重ねた。その結果、“当事者の身近にいる重要な他者"として、「家族・支援者・職場の人・ピアサポーター・同様の障がいや病気を経験している人」が挙げられた。2については、就労支援および生活訓練施設に研究協力を要請し、対象者の募集を開始した。調査内容は、対象者の基本属性・主観的リカバリー・自己開示量・情緒的支援ネットワーク知覚とした。自己開示量は、精神疾患をもつ人を対象とした自己開示尺度を用いて測定し、開示対象は1で挙げられた他者のうち3名とした。追跡調査として、アンケート調査実施2か月後に同様のアンケート調査を依頼し、縦断的なデータを収集した。これまでに37名のデータが得られており、分析を進めている段階である。現時点までの成果については、学会発表と論文投稿を予定している。以上より、2018年度の計画はおおむね順調に実施できたと考える。次年度以降は、更なるデータ収集と分析、また成果の発信に向けて、精力的に取り組んでいく予定である。2018年度は当初の予定通り、就労支援および生活訓練施設を利用する精神疾患をもつ人を対象に、自己開示とリカバリーのアンケート調査を実施することができた。現在は、就労支援および生活訓練の施設を対象としているため、今後は精神科デイケアを利用する当事者・地域活動支援センターを利用する当事者・病気を持ちながらも就労している当事者等も対象とし、データ収集を継続する予定である。合わせて、データ分析も進め、精神疾患をもつ当事者のリカバリーに影響する自己開示の要因について,対象および開示内容の視点から明らかにできるように検討を重ねる。それらの成果は、学会発表や論文投稿を通して国内外に発信する予定である。これまでの分析を通して得られた知見について、学会発表や論文投稿をすることを計画立てていたが、成果をまとめるのに時間を要し、2019年度以降に実施することになった。2019年度もアンケート調査を継続するため,印刷費・交通費・謝金等の経費の計上が必要となる。また、データ分析を進めるために、必要な機材やソフトウエア等の購入、および研究成果の発表のための学会旅費・論文投稿費としての支出を予定している。
抗生物質ストレプトスリシン生合成酵素を利用した生理活性物質の膜透過性向上への試み

放線菌によって生産される抗生物質ストレプトスリシン(ST)は、その側鎖にβリジンオリゴペプチドを有する。本研究で我々は、STの生合成に関与する3つの非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)を同定し、ORF 5は単独型アデニル化ドメイン、ORF 18はチオレーションドメインと縮合ドメイン、ORF 19は単独型アデニル化ドメインであった。本研究課題では(1)ST生合成遺伝子群の機能解析、(2)β-リジンポリマーを合成する新奇ペプチド合成酵素(Bls)の同定、(3)β-リジンポリマー転移酵素(Blt)の同定とその応用利用、これら3点を本研究の主目的としており、H22年度の研究では、次ぎの3つの実験計画を行った。1-(1)ST生合成遺伝子群の機能解析ST生産放線菌Streptomyces rochei NBRC12908のST生合成遺伝群から見出した非リボゾームペプチド合成酵素(NRPS)遺伝子について、各遺伝子の破壊株を構築し、本遺伝子群に含まれる各ORFの機能解析を行った。また、得られた破壊株の生成物を解析し、生合成中間体の同定に成功した。1-(2) Blsの同定と機能解析ORF5(NRPS4)、ORF18(NRPS2)、ORF19(NRPS1)がBlsであることを明らかし、ORF5(NRPS4)はβ-リジンを活性化する酵素をコードし、ORF18(NRPS2)はペプチド結合形成に直接関与していることを見出した。しかし、ORF19(NRPS1)の機能については不明のままである。1-(3)Bltの同定と機能解析ORF18(NRPS2)がBltであることを明らかにし、その基質特異性が広いことを見出した。また、この基質特異性を利用し、新規ST化合物の創製に成功した。本研究課題では(1)ST生合成遺伝子群の機能解析、(2)β-リジンポリマーを合成する新奇ペプチド合成酵素(Bls)の同定、(3)β-リジンポリマー転移酵素(Blt)の同定とその応用利用、これら3点を本研究の主目的としており、H23年度の研究では、次ぎの3つの実験計画を行った。1-(2)Blsの同定と機能解析さらに、ORFI9(NRPS1)がβ-リジンのオリゴマー化(ペプチド合成)を直接触媒することを明らかにした。2-(1)長鎖β-リジンポリマー合成を可能にする高機能型Blsの構築野生型のORF18を用いた酵素反応では14残基のβ-リジンが付加したSTしか生産されないが、ORF18(Q288A)では26残基のβ-リジンが付加したSTが生産されることを見出した。2-(2)Bltの基質特性改変と種々化合物のβ-リジンポリマー化本研究課題では1ストレプトスリシン(ST)生合成遺伝子群の機能解析、2β-リジンポリマー(BP)を合成する新奇ペプチド合成酵素(Bls)の同定、3BP転移酵素(Blt)の同定とその応用利用、これら3点を本研究の主目的としており、1と2の主目的は計画通り達成できた。そこで、H24年度の研究では、3の主目的達成のために次ぎの2つの実験計画を行った。実験計画2-(1)長鎖BP合成を可能にする高機能型Blsの構築Blsとして3つの酵素(ORF5、ORF19、ORF18)を同定しており、野生型ORF18を用いた酵素反応では14残基のβ-リジンが付加したSTしか生産されない。しかし、変異型ORF 18 (Q288A)では26残基のβ-リジンが付加したSTが生産されることを見出した(H23年度の研究成果)。そこでH24年度では、さらに5つの変異型酵素(Q288H、Q288R、Q288V、M293G、Q288A/M293G)を構築しその機能を解析したところ、Q288A/M293GはSTの生産性を完全に消失したが、それ以外の変異型酵素はいずれもQ288Aと同様に26残基のβ-リジンが付加したSTを生産した。実験計画2-(2) Bltの基質特性改変と種々化合物のBP化Blsの酵素反応では、ST以外にもBPだけの構造をもったポリマー化合物が生産される。これは、ORF18にチオエステル結合したBPが非酵素的に加水分解されて生産せれることがQ288A/M293Gを用いた実験結果で証明できた。そこで、酵素反応液にグリセロールを加えたところ、グリセロールにBPが結合した新規化合物の創製に成功し、またBP化されたトリス誘導体の合成にも成功した。

さらに、ORF19の基質特異性を利用し、2'-amino guanosine、カナマイシン、アミカシンなど抗生物質のβ-リジン化にも成功した。研究事項1-(1)、1-(2)、1-(3)については研究計画通り終了し、研究事項2-(1)および2-(2)についても、計画通りの研究実績が得られている。また、これら終了した研究成果については現在論文投稿中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究事項2-(1)長鎖B-リジンポリマー合成を可能にする高機能型Blsの構築および2-(2)Bltの基質特性改変と種々化合物のβ-リジンポリマー化について、現時点で研究計画の変更、問題点は生じていない。今後も計画通り研究を進めたいと考えている。