hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
耐熱性酵素モジュールを用いた高効率物質生産プロセスの開発

また宿主由来の酵素が完全に失活しておらず、そのため補酵素のATPが分解することで反応が停止することが明らかとなり、ATP量を増やすことで反応の停止を回避することができた。次に8種の酵素遺伝子を単一細胞内で発現する組換え体の作成を行った。np-ED経路を構成する9種の酵素遺伝子を任意の3塩基突出末端を付加するためのベクターにクローニングした。DraIII制限酵素によって、各酵素遺伝子の断片化を行った後、枯草菌・大腸菌シャトルベクターとライゲーションし、枯草菌よりプラスミドを抽出し、大腸菌に再導入を行った。本大腸菌を超音波破砕し熱処理することで、耐熱性酵素カクテルを得た。8種の酵素について、それぞれ活性測定を行ったところ、個別発現株に比べて活性がおとるものの、全ての酵素活性が確認でき、np-ED経路の酵素遺伝子の集積に成功した。本耐熱性酵素カクテルを用いたところ10mMのグルコースから13mMの乳酸のバッチ生産に成功し、耐熱性酵素モジュールの調製の簡便化とこれを用いた物質生産に成功した。好熱菌に由来する耐熱性酵素を遺伝子組換え的に生産する大腸菌は、70°Cの熱処理に供するのみで、耐熱性酵素のみが活性を有した極めて選択性の高い生体触媒へと変貌する。こうして得られた耐熱性酵素モジュールを任意に組み合わせることで、所望の化学品生産に特化したin vitro代謝経路の構築が可能となる。本研究では本手法を用いて一部の超好熱菌が有するEntner-Doudoroff解糖経路のin vitro構築を行った。その結果、8種の耐熱性酵素を組み合わせることで、グルコースより100%の収率で乳酸を生産することに成功した。またこれら8種の耐熱性酵素を単一の大腸菌内で生産させる技術の開発にも成功した。本研究は耐熱性酵素モジュールを用いた物質生産の生産性と経済性を向上させるために、(1)複数の耐熱性酵素を最適な量比で含有する酵素モジュールの調整技術、(2)酵素モジュール高密度充填型リアクターを用いた物質生産プロセスを開発することを目的としている。昨年度までの研究で、モデル反応となる非リン酸化ED経路を用いたグルコースからの8段階キメラ型の乳酸生産経路を構成する遺伝子のクローニングを行い、これらの活性を確認した。更に、これらの酵素モジュールを混合することで、グルコースからの乳酸生産にも成功した。今年度の研究では、これらの酵素を全てを単一細胞内で生産する技術の開発を行った。キメラ型のEM経路をモデルに技術開発を行ったところ、9種の耐熱性酵素遺伝子を単一細胞内で発現させることに成功した。更に発現量が低い、あるいは比活性の低い酵素をオペロン上の蒸留に配置することで、発現量をラフに調節できることを示すことができ、本システムが(1)でかかげる複数の耐熱性酵素を最適な量比で含有する酵素モジュールの調製技術として利用可能であることを示した。本研究の主眼である非リン酸化型ED経路についても、遺伝子集積のための準備である、それぞれの遺伝子に任意の3塩基突出末端を付加するためのプラスミド、デスティネーションプラスミドの構築をすでに終えている。以上のように、本年度の目標を達成し、次年度に向けての研究の準備も着実に進行していることから、研究は順調に進んでいるといえる。生物化学工学次年度は非リン酸化型ED経路の8種の酵素遺伝子の遺伝子集積を行う。
ソフト無線技術を適用する時間・周波数同時拡散方式に関する研究

ソフト無線技術を適用する時間・周波数同時拡散方式について研究を行い,以下の研究成果を得た.(1)周波数拡散FSK波形の時間軸の位置に情報を乗せて時間拡散を行う時間・周波数同時拡散PPM方式を開発した.(2)同時拡散式の時間波形,周波数スペクトル,及び,誤り率をシミュレーションを用いて明らかにした.また,解析的にその通信路容量を導出し,時間拡散PPM,周波数拡散FSK,及び,同時拡散方式が等しい通信路容量を持つことを示した.(3)同時拡散方式は,ソフトウェアにより帯域幅と時間の積からなる次元の配分を,時間拡散PPMと周波数拡散FSKに対して通信路に適応して変化させることができ,通信路におけるCW干渉およびインパルス干渉の両方に対して耐性を有することを示した.(4)DSPボード上で,時間・周波数同時拡散PPM方式をソフトウェアで製作し,ソフトウェアによる送信機の実現可能性を明らかにした.(5)時間・周波数同時拡散方式の誤り率を改善する方法として,PPMのセパレート符号化と反復復号の提案を行った.これは,セパレート符号化における各部分符号器の相関をスロット確率情報の受け渡しにより利用するものである.提案した復号法は,符号器の全状態を利用する方法とほぼ同等の符号化利得が得られることを明らかにした.更にターボ符号の適用による誤り率の改善を明らかにした.(6)時間拡散PPM方式における周波数有効利用技術として,帯域幅を削減して伝送し,受信側で削減スペクトルを再生する新たな変調方式を開発し,その誤り率評価を行った.ソフト無線技術を適用する時間・周波数同時拡散方式について研究を行い,以下の研究成果を得た.(1)周波数拡散FSK波形の時間軸の位置に情報を乗せて時間拡散を行う時間・周波数同時拡散PPM方式を開発した.(2)同時拡散式の時間波形,周波数スペクトル,及び,誤り率をシミュレーションを用いて明らかにした.また,解析的にその通信路容量を導出し,時間拡散PPM,周波数拡散FSK,及び,同時拡散方式が等しい通信路容量を持つことを示した.(3)同時拡散方式は,ソフトウェアにより帯域幅と時間の積からなる次元の配分を,時間拡散PPMと周波数拡散FSKに対して通信路に適応して変化させることができ,通信路におけるCW干渉およびインパルス干渉の両方に対して耐性を有することを示した.(4)DSPボード上で,時間・周波数同時拡散PPM方式をソフトウェアで製作し,ソフトウェアによる送信機の実現可能性を明らかにした.(5)時間・周波数同時拡散方式の誤り率を改善する方法として,PPMのセパレート符号化と反復復号の提案を行った.これは,セパレート符号化における各部分符号器の相関をスロット確率情報の受け渡しにより利用するものである.提案した復号法は,符号器の全状態を利用する方法とほぼ同等の符号化利得が得られることを明らかにした.更にターボ符号の適用による誤り率の改善を明らかにした.(6)時間拡散PPM方式における周波数有効利用技術として,帯域幅を削減して伝送し,受信側で削減スペクトルを再生する新たな変調方式を開発し,その誤り率評価を行った.まず,時間拡散PPMと時間軸・周波数軸で対称な関係にある周波数拡散FSKを考え,この波形の時間軸の位置に情報を乗せて時間拡散を行う時間・周波数同時拡散PPM方式を提案し,その時間波形,周波数スペクトル,及び,誤り率をシミュレーションを用いて明らかにした.次に,解析的にその通信路容量を導出し,時間拡散PPM,周波数拡散FSK,及び,同時拡散PPMが等しい通信路容量を持つことを示した.提案方式は,ソフトウェアにより帯域幅と時間の積からなる次元の配分を,時間拡散PPMと周波数拡散FSKに対して通信路に適応して変化させることができ,通信路におけるCW干渉およびインパルス干渉の両方に対して耐性を有することを示した.更に,DSPボード上で,時間・周波数同時拡散PPM方式をソフトウェアで製作し,ソフトウェアによる送信機の実現可能性を明らかにした.また,時間・周波数同時拡散PPM方式の誤り率を改善する方法として,PPMのセパレート符号化と反復復号法の提案を行った.これは,セパレート符号化における各部分符号器の相関をスロット確率情報の受け渡しにより利用するものである.提案した復号法は,小さい装置規模であるが,符号器の全状態を利用する方法とほぼ同等の符号化利得が得られることを明らかにした.ソフト無線技術を適用する時間・周波数同時拡散方式に関する研究の研究実績の概要を以下に示す.(1)周波数拡散FSK波形の時間軸の位置に情報を乗せて時間拡散を行う時間・周波数同時拡散PPM方式を開発した.(2)同時拡散式の時間波形,周波数スペクトル,及び,誤り率をシミュレーションを用いて明らかにした.また,解析的にその通信路容量を導出し,時間拡散PPM,周波数拡散FSK,及び,同時拡散方式が等しい通信路容量を持つことを示した.(3)同時拡散方式は,ソフトウェアにより帯域幅と時間の積からなる次元の配分を,時間拡散PPMと周波数拡散FSKに対して通信路に適応して変化させることができ,通信路におけるCW干渉およびインパルス干渉の両方に対して耐性を有することを示した.(4)DSPボード上で,時間・周波数同時拡散PPM方式をソフトウェアで製作し,ソフトウェアによる送信機の実現可能性を明らかにした.(5)時間・周波数同時拡散方式の誤り率を改善する方法として,PPMのセパレート符号化と反復復号の提案を行った.

これは,セパレート符号化における各部分符号器の相関をスロット確率情報の受け渡しにより利用するものである.提案した復号法は,符号器の全状態を利用する方法とほぼ同等の符号化利得が得られることを明らかにした.更にターボ符号の適用による誤り率の改善を明らかにした.(6)時間拡散PPM方式における周波数有効利用技術として,帯域幅を削減して伝送し,受信側で削減スペクトルを再生する新たな変調方式を開発し,その誤り率評価を行った.
低出力超音波刺激による関節拘縮の治療と予防

関節拘縮の治療と予防に対する低出力超音波パルス治療(以下LIPUS)の効果を、実験動物を用いて組織学的側面から検討した。LIPUS照射により、不動化によって生じた後部関節包のコラーゲン線維束間の間隙の狭小化が改善を示し、関節拘縮に治療に有効である可能性を明らかにした。一方、関節拘縮予防を目的とした介入結果においては著明な差を認めず、LIPUSの有用性を明らかにすることは出来なかった。本研究は、実験動物を用いて関節拘縮の治療と予防に対する低出力超音波パルス治療(以下LIPUS)の効果を組織学的に検討することである。関節の強度や伸張性に大きく影響するであろう後部関節包のコラーゲン線維束間の間隙に着目し、不動化により生じた狭小化がどの程度改善するのか、あるいは予防的な介入ではどの程度間隙を維持できるのか観察することを目的とした。平成27年度にはラット膝関節拘縮モデルを用いてLIPUSの効果を検証した。8週間後肢膝関節を不動化させた拘縮モデルに対して1日20分間のLIPUSを4週間実施し、膝関節可動域と膝関節後部関節包の組織像を観察した。その結果、LIPUSを行わなかった場合と比較して、膝関節可動域は有意な改善を認め、後部関節包その厚み及び密度(膠原線維束間の間隙の割合)ともに有意差を認め、正常な組織像に近づいていることが確認された。これらの知見は、LIPUSが新たな拘縮治療方法に繋がる可能性を示している。関節包への効果が期待できることは、とりわけこれまで治療に難渋してきた関節構成体由来の拘縮への適応が期待できる。不動化による拘縮は不動期間の長期化に伴い、その制限の因子が筋性から関節性となることが明らかにされており、すなわち本成果は、より重度な拘縮治療の可能性を広げるものと言える。またLIPUSはその特徴から安全な治療装置であると言え、基本的には目的部位にセットしてからは治療者の手を煩わせることがない。マンパワーの追加を要しないという側面からも優れ、総じて価値ある一石を投じたものと考えられる。治療効果の検証において、想定よりも介入条件の設定に時間を要し、複数条件下での比較が出来ていないため。平成28年度にはLIPUSの関節拘縮予防効果について検証を行った。ラット膝関節をギプスにより不動化させ、実験群は期間中、毎日1回ギプスを除去し、膝関節に対してLIPUS照射を加えた後、再固定を行った。対照群はプラセボ照射を行う以外は全て同一条件とし、4週間の飼育期間の後、比較検討した。その結果、実験群と対照群で関節可動域制限の程度に有意差を認めず、また、膝関節後部関節包の組織所見(厚みおよび膠原組織間の間隙の割合)においても著明な差を認めなかった。本研究結果からは、LIPUSによる関節拘縮予防効果は明らかに出来なかった。これまでにLIPUSが不動期間中の関節に与える影響を検討した報告はなく、拘縮の予防について新たな知見を加えることができた。拘縮治療にLIPUSを用いた場合には一定の効果を認めており(平成27年度実績)これとあわせると、LIPUSによるメカニカルストレスは細胞の増殖とアポトーシスの両方を促し、それは細胞が置かれている環境に適応するように調整されるとする先攻研究の示唆を裏付けるものと考えられ、この点についても興味深い知見を得ることが出来た。当初予定していた通りの複数条件下での比較までは至っていないものの、LIPUS介入による拘縮予防効果を検証することができたため。本研究は、実験動物を用いて関節拘縮の治療と予防に対する低出力超音波パルス治療(以下LIPUS)の効果を組織学的に検討した。関節拘縮は、今なおリハビリテーション分野で最も多く遭遇する問題の1つであり、その治療法・予防法を明らかにすることが求められている。関節の不動化による拘縮は不動期間の長期化に伴い、その制限の因子が筋性から関節性にシフトすることが明らかにされていることから、関節構成体の変化がより重要となる。本研究では、後部関節包のコラーゲン線維束間の間隙に着目し、LIPUS介入により、不動化によって生じた狭小化がどの程度改善するのか、あるいは予防的な介入ではどの程度間隙を維持できるのか観察することを目的とした。ラット膝関節拘縮モデルを用いて、拘縮治療におけるLIPUSの効果を検証した結果、LIPUSを行わなかった場合と比較して、膝関節可動域は有意な改善を認め、後部関節包その厚み及び密度(膠原線維束間の間隙の割合)ともに有意差を認め、正常な組織像に近づいていることが確認された。これにより、とりわけこれまで治療に難渋してきた関節構成体由来の拘縮治療の可能性を広げる成果が得られたと言える。しかし、同モデルを用いて、LIPUSによる拘縮予防効果を検証した結果では、非照射群との間に関節可動域、後部関節包組織の両方で有意な差を認めず、LIPUSによる関節予防効果は明らかに出来なかった。

LIPUSによるメカニカルストレスは細胞の増殖とアポトーシスの両方を促し、それは細胞が置かれている環境に適応するように調整されることが先攻研究にて示唆されており、そうした性質が影響したことが考えられた。今回取り組んだ条件では予防効果を明らかに出来なかったものの、LIPUS適応を検討する上での重要な知見を得ることができた。関節拘縮の治療と予防に対する低出力超音波パルス治療(以下LIPUS)の効果を、実験動物を用いて組織学的側面から検討した。LIPUS照射により、不動化によって生じた後部関節包のコラーゲン線維束間の間隙の狭小化が改善を示し、関節拘縮に治療に有効である可能性を明らかにした。一方、関節拘縮予防を目的とした介入結果においては著明な差を認めず、LIPUSの有用性を明らかにすることは出来なかった。複数条件下での比較検討は十分行えていないものの、治療効果については一定の結果を出すことができたため、当初の予定通り、本課題のもう1つの大きな柱である予防効果の検証を開始する。複数条件下での比較を実施するとともに、これまでに得られたデータをまとめ研究成果の報告を行う。リハビリテーション科学比較的大きなウエイトを占めていた備品(超音波刺激装置)の購入を予定していた2台から1台に変更したため。備品や旅費が当初の計画時よりも安価であったため。翌年度購入予定の備品・用品の執行状況により、可能であれば当初の予定通り2台目を購入する。消耗品等の物品費として使用する。
バーチャルヒューマンの動作生成のための筋力パターン計測装置(マッスルキャプチャ)

研究の概要本研究では、従来のモーションキャプチャによる姿勢計測に加え、実際に動作している人間の筋肉の動き(筋力パターン)を前進の筋電計測によって獲得し、その情報を利用している人間型キャラクタの自然な動作生成を可能にするマッスルキャプチャの実現を目的としている。はじめに、我々がこれまで開発してきた等身大仮想環境構築技術および筋電パターンからの部分的な運動の推定技術を用いて、様々な運動を行いながら、筋電パターン計測が可能な計測環境の構築について検討した。そして、計測した筋電パターンから全身の筋力パターンを直接推定する技術を解明した。さらに、これらの計測情報をデータベース化し、そこから筋力パターンレベルにおいて動作を自在に合成することで、人間型キャラクタの自然な動作生成を試み、その有効性を評価した。具体的な成果は以下の通りである。本年度(平成19年3月31日)の研究実施計画平成18年度は前年度得られた筋力パターンの分析を進めると共に、運動との対応付けを前提としたデータベースの作成とそのデータへの多様なアクセス方法の検討を行う。1)動作データベースは、筋力パターンを含めた多様なデータ構成になることが予想されるため、高速な検索及び呼び出しが可能になるような構成を目指した。また、動作データを増やすことが一般的には困難であるとされているため、より多様なデータを容易に獲得し、データベースを拡張していくことが可能になるフレームワークの開発をすすめた。2)動作データに対して、力覚提示装置などで外力を加えた際の動作への影響を調べた。実際になんらかの作業を想定した仮想VP環境を構築し、等身大力覚提示装置を用いてこれを評価した。本研究では、従来のモーションキャプチャによる姿勢計測に加え、実際に動作している人間の筋肉の動き(筋力パターン)を全身の筋電計測によって獲得し、その情報を利用して人間型キャラクタの自然な動作生成を可能にするマッスルキャプチャを実現する。まず、我々がこれまで開発してきた等身大仮想環境構築技術および筋電パターンからの部分的な運動の推定技術を用いて、様々な運動を行いながら筋電パターン計測が可能な計測環境を構築する。そして、計測した筋電パターンから全身の筋力パターンを直接推定する技術を開発する。さらに、これらの計測情報をデータベース化し、そこから筋力パターンレベルにおいて動作を自在に合成することで、人間型キャラクタの自然な動作生成を試みる平成17年度は、マッスルキャプチャに必要な筋電パターン計測環境と、そこから得られた筋電パターンから全身の筋力パターンを推定する手法を検討した。筋電パターン計測は、従来のモーションキャプチャで行っていた各関節の位置・角度情報を筋電信号と同時に計測する。さらには、計測対象となる人間が何かの物体と力を介したインタラクションを行っている場合、そこから受ける力の計測も行う。そのためには、我々がこれまでに行ってきた等身大仮想環境提示技術(現有設備・技術)を用いてインタラクション対象を仮想物体として等身大提示し、等身大力覚提示装置で相互に発生する力を表現することで、多様な状況を自在に作り出すことが出来る。また、できる限り多くの筋肉を同時に計測し、かつマッスルキャプチャに特化した筋電装置が必要となる。様々な動きを実現しながらの計測を考慮した筋電電極について基本設計を進めた。
自己反応性TCRトランスジェニックマウスにおける特異的自己寛容の成立機構

自己クラスII MHC抗原と反応するマウスT細胞クローンから、TCRαおよびβ鎖遺伝子を単離し、トランスフェクションによってその自己反応性を確認した上で受精卵に移入してトランスジェニック(TG)マウスを得た。TGマウスの胸腺内では、自己反応性TCRを表現しているCD4、CD8の両者を持ったdouble positive(DP)T細胞から、CD4のみを発現するsingle positive(SP)T細胞がポジティブに選択されていることが証明された。すなわち自己反応性T細胞は、自己抗原によって除去されないばかりか積極的に末梢リンパ組織に送り出されていることがわかった。CD8T細胞は作られなかった。このような動物では、in vivoの自己免疫現象は起こっていなかったが、リンパ球をin vitroで培養すると強い自己反応性を示し、T細胞が無反応性(アネルギー)に陥っているわけではないことがわかった。さらに、このような動物にIL2、IL4、γIFNなどの刺激を加えてやっても、T細胞の増殖は認められなかった。IL4やγIFNを投与した動物では、通常は細胞表面に増加するはずのクラスII分子の上昇が全く認められなかった。すなわちTGマウスのT細胞は、抗原提示細胞に働いてクラスII分子のdown regulationを起こしていることが明らかとなった。このような特殊なT細胞機能が、胸腺内でのSP細胞分化の際に教育されるものであることは、CD44、CD5、CD2、CD69、HSAなどの接着分子の経時的表現が正常と異なることからも示唆された。これらの結果は、われわれのTGマウスが、新しいタイプのトレランスのモデルとして、T細胞の自己反応回避の機序を解く有力な入り口となっていることを示している。
放射光全散乱によるナノPdの水素吸蔵非平衡状態における構造可視化

本研究の目的は、水素吸蔵特性を左右する固溶体α相から水素化物β相への転移点近傍における局所構造を放射光全散乱による原子二体分布関数(PDF)解析で明らかにすることである。初年度とその次年度は、目的達成に必要な計測システムの開発に注力した。具体的には、広いQ(散乱ベクトルの大きさ)レンジと高いQ分解能を両立する全散乱用検出器と、回転しているガラスキャピラリー内の水素ガス平衡圧力をオンライン制御可能な装置を組み合わせたシステムを構築した。最終年度は、この計測システムを用いて、代表的な水素吸蔵金属であるPdナノ粒子の全散乱データを水素ガス圧力を変化させながら測定した。これらのデータを全散乱構造関数に規格化した後、フーリエ変換することによりPDFが得られた。これらのPDFについて、110方向のPd-Pd間距離の相当する第一ピークと100方向に相当する第二ピークの幅の変化に着目したところ、α相とβ相では局所構造に違いがあることがわかった。平均として見ればα相もβ相も同じ面心立方構造であるが、局所的に見ると、α相に比べてβ相ではPdが110方向よりも100方向に2割程度大きく揺らいでいることがわかった。これは、拡散している水素の多くがPdが作る四面体サイトよりも八面体サイトのほうにトラップされた結果と考えるのが自然であるが、Pdの揺らぎの違方性が転移点近傍におけるPdまわりの水素の分布を知る手がかりになることを示唆している。ナノPdの水素吸蔵非平衡状態における構造可視化に向けて、放射光施設SPring-8のBL44B2で、全散乱計測用検出器システムを構築した。厚さ1mmのシリコンをセンサーとする半導体検出器モジュール(DECTRIS社製MYTHEN)を12個、散乱ベクトル方向に隙間なく並べることで、Atomic Pair Distribution Function (PDF)解析に必要とされるQ(散乱ベクトルの大きさ)>20Å-1の全散乱データを同時に得ることができるようになった。そのシステムを使ってバルクPdに加えて、ナノPdの予備的な全散乱PDF解析を行ったところ、原子が存在しないはずの距離に周期的なリップルが観測された。PDF解析に用いるQの上限値を制限するとそのリップルが軽減されることから、高いQ領域における統計精度が十分ではないことがわかった。全散乱データを精査した結果、計数が数万カウントを超えると、検出器の系統誤差が統計誤差に対して有意になり、計数したカウントに見合った統計が得られていないことが明らかになった。そのため、系統誤差を抑制する強度補正法を確立することに注力した。様々な実験的検証を行った結果、各センサーにおける系統誤差はお互いにランダムであることを利用した新たな強度補正法を考案し、数百万カウントに至るまで計数カウントに相当する統計データが得られるようになった。このような問題は全ての放射線検出器が抱えている問題であり、本研究で確立した方法は今後、様々な検出器への適用が期待される。このような強度補正法を組み込んだ検出器システムをオンラインガス吸着システムとリンクさせることで、ガス吸蔵下全散乱オンライン計測システムが完成し、ナノ構造可視化のための計測環境が整った。予定通り、構築した全散乱計測システムを使ってバルクPdの水素吸蔵下実験を行った。さらに、ナノPdについても予備的な実験を行ったところ、当初予期していなかった検出器由来の系統誤差の問題を発見し、その解決法を確立した。ナノPdの水素吸蔵非平衡状態における構造可視化に向けて、昨年度に引き続き、全散乱用検出器の感度ばらつきに起因する系統誤差の補正法を検討した。本年度初めに、一度にカバーできる角度範囲を従来の120度から150度に拡張した検出器システムがSPring-8のBL44B2に導入された。その結果、Pdからの蛍光X線の影響が少ない0.51 Aの波長を使っても、必要な散乱ベクトルの範囲を一度にカバーできるようになった。一方、検出器システムのアップグレードに伴い、一部の検出器モジュールが入れ替わったため、非晶質試料を使って補正効果を再確認した。しかし、その補正効果が十分ではないことがわかったため、本年度は再現性を高めるべく補正法の再構築に注力した。その結果、100万カウントの統計精度に相当する全散乱データがコンスタントに得られるようになった。その補正パラメーターをナノPdと同等の粒径をもつ標準的なナノ粒子の全散乱データに適用し、フーリエ変換して二体分布関数(PDF)を導出した。そのPDFを構造モデルで各実空間距離ごとにフィッティングしたところ、補正前後で信頼度因子が最大27%も改善することがわかった。つまり、ナノ粒子を含む結晶性試料でPDF解析を行うには、ブラッグ反射と散漫散乱を精度良く同時計測できる高分解能、大面積、ワイドダイナミックレンジの検出器が必要であるが、それによって顕在化した系統誤差を補正しなければ十分ではないことが明らかになったと言える。検出器のアップグレードに伴う補正法の確立に、当初の予定より時間を要したが、本年度でその目処がついた。具体的には、広いQ(散乱ベクトルの大きさ)

レンジと高いQ分解能を両立する全散乱用検出器と、回転しているガラスキャピラリー内の水素ガス平衡圧力をオンライン制御可能な装置を組み合わせたシステムを構築した。最終年度は、この計測システムを用いて、代表的な水素吸蔵金属であるPdナノ粒子の全散乱データを水素ガス圧力を変化させながら測定した。これらのデータを全散乱構造関数に規格化した後、フーリエ変換することによりPDFが得られた。これらのPDFについて、110方向のPd-Pd間距離の相当する第一ピークと100方向に相当する第二ピークの幅の変化に着目したところ、α相とβ相では局所構造に違いがあることがわかった。平均として見ればα相もβ相も同じ面心立方構造であるが、局所的に見ると、α相に比べてβ相ではPdが110方向よりも100方向に2割程度大きく揺らいでいることがわかった。これは、拡散している水素の多くがPdが作る四面体サイトよりも八面体サイトのほうにトラップされた結果と考えるのが自然であるが、Pdの揺らぎの違方性が転移点近傍におけるPdまわりの水素の分布を知る手がかりになることを示唆している。検出器の系統誤差の問題を解決したことにより計測環境が整ったため、今後はナノPdの系統的な全散乱PDF解析を行う予定である。ナノPdの水素吸蔵下全散乱実験を行い、PDF解析から非平衡状態を可視化する。当初、全散乱データをPDF解析するためのワークステーションを購入する予定だったが、データ解析スキームの効率化によりワークステーションの必要性は低いと判断し、購入を控えた。当初は全散乱データの解析環境を整備する予定だったが、目的達成にはデータ補正に注力する必要があったため。発表論文のビジビリティ向上のために、オープンアクセス費用に使う予定。主に国際会議での成果発表のための旅費や、発表論文のビジビリティ向上のためのオープンアクセス費に使用することを計画している。
伸展刺激受容時の骨縫合部組織細胞の細胞骨格・細胞接着装置に関する形態学的解析

頭頂骨縫合部器官培養系に伸展刺激を加えて骨芽細胞の分化を促進させ、その過程における細胞骨格、細胞接着因子の変化を観察した。結果、アクチンフィラメントは刺激後36時間で線維芽細胞において太さを増し、伸展方向に配列した。骨芽細胞では主として細胞皮質にアクチンが局在したが、伸展刺激によりストレスファイバー様のアクチン線維も出現した。βカテニンは伸展刺激により、骨芽細胞の膜への局在が促進された。骨芽細胞が機械的刺激を受容し、骨形成が促進される現象のメカニズムについて、細胞培養系を用いた研究により細胞骨格、細胞接着装置がその受容伝達機構に重要であることが示されつつある。しかしながら、それらの結果は実験方法、培養条件、使用細胞により異なってくる。さらに細胞培養系では、細胞外基質や周囲の細胞が生体内とは異なっているため、機械的刺激の受容応答機構をさらに解明してゆくためには、実際の生体内ではどのような因子が重要なのかについて検討する必要がある。そこで、我々は単純な骨器官培養系である頭頂骨縫合部組織培養系を用い、伸展刺激を加えることによって骨形成を促進させ、その際にどのような因子が変化するのかを観察することとした。本年度は主に免疫組織化学的に、細胞骨格としてアクチンフィラメント、細胞接着関係因子としてβ1インテグリン、ビンキュリン、PANカドヘリン、βカテニンの局在を検討した。その結果、アクチンフィラメントは伸展刺激を加えて6時間後には太さを増し、その配列は伸展方向に多く認められた。インテグリン、ビンキュリンは組織切片上では検出が難しく、さらに工夫が必要と思われた。カドヘリン、カテニンは骨芽細胞の分化が進行するのに伴い、骨芽細胞の膜に強く検出されるようになった。しかしながら、光学顕微鏡レベルで観察する限りではβカテニンが伸展刺激によって核に移行するなどの現象は観察されなかった。さらに、ウェスタンブロットのための条件検討を開始し、ERK, FAKおよび、それらのリン酸化状態をウェスタンブロットにより試験的に検出してみた。現在のところ、試料採取の方法や、ロードする蛋白量を均等化するなどの点でまだ課題がのこっており、対照群と実験群の間での差については結論を得ていない。骨芽細胞が機械的刺激を受容し、骨形成が促進されるメカニズムにおける細胞骨格、細胞接着因子の役割について、頭頂骨縫合部器官培養系を用いることで、より生体内に近い条件下での変化を観察した。免疫組織化学的検索の結果、βカテニンについては共焦点レーザー顕微鏡で観察することによって、局在をより明確に観察することが可能となり、またアクチンとの二重染色により、両者の関係についても明らかにすることができた。対照群では、縫合部骨形成端の骨芽細胞はβカテニンもアクチン同様に細胞皮質に局在したが、細胞皮質にあまり明瞭なβカテニンの局在をみとめない骨芽細胞もしばしばみられた。縫合中央部、骨膜線維層では、βカテニンは点状に認められた。伸展刺激6時間群では、縫合部骨縁から縫合部中心に向かって互いに密接しながら配列する前骨芽細胞と考えられる細胞が増加し、それらの細胞では、βカテニンはやや不明瞭だが細胞皮質に局在し、骨芽細胞のβカテニンはより明瞭になった。以上より、骨芽細胞へと分化するのに従い、アクチンならびにβカテニンは細胞皮質に局在するようになること、さらに、伸展刺激によりその過程が促進されるが、アクチンの方が先に細胞皮質に局在することが明らかになった。また、カドヘリンは骨芽細胞の分化が進行するのに伴い、骨芽細胞の膜に強く検出されるようになったが、免疫局在があまり明瞭でなく、検出感度にまだ課題が残っている。さらに、シグナル伝達因子のリン酸化状態をウェスタンブロットにより検出する試みでは課題がのこっており、対照群と実験群の間での差については結論を得られなかった。これらの結果は培養細胞を用いた実験系では明らかにされておらず、これは細胞外基質が3次元的に存在し、またさまざまな骨芽細胞の分化段階の細胞が観察できるこの実験系ならではの成果と考えられる。
教員の危機管理力向上のためのプログラム構築に向けた学際的研究

児童・生徒が集う学校が安全な場所でならないことは言うまでもない。その一方で、未成熟な児童・生徒が集う学校は、一般社会と比して、多様な危険が数多く存在していると言っても過言ではない。重大な事件や事故が発生すれば児童・生徒らの生命を危険に晒しかねないため、学校は、事後の危機管理はもちろんのこと、予想できる事故や事件には未然に備える必要がある。また、学校事故は、教員の行為に起因するものより、児童・生徒の行為に起因するものが多く、その意味で事故や事件の予想を難しくする可能性がある。つまり、児童・生徒と直接向き合う教員には、潜在する児童・生徒を取り巻く危険を適切に予測する力やそれに対処する力が求められる。そこで、教員が、学校に数多く潜む安全でない状況に気付き、注意すべき点を認識する力を高めることを目的にイラストによる研修教材等の開発を行ってきた。平成29年度までは、小学校の教員を対象としたイラスト教材を中心に作成してきたため、平成30年度は、特に、中学校の教員を対象としたイラスト教材の作成を進めた。イラスト教材の作成にあたっては、裁判に発展した学校事故事案等を参考にしたり、現職教員にヒアリングを行うなど意見を求めることで、学校現場で実際におこりうる状況を一つでも多く盛り込むよう努めた。また、小学校及び中学校の教員を対象とした危機管理研修会や免許更新講習等においてこれまで作成した教材等を使用し、プログラムや教材の改善に取り組んだ。学校は、未成熟な子どもが集うため、その特性上、遊具による負傷や水泳中の事故、熱中症など多様なトラブルが発生する可能性を内包している。近年では、安全配慮義務をはじめとする教職員の法的責任が厳しく追及される傾向にあり、これまで以上に教職員の危機管理力の向上が求められている。一方、いわゆる大量退職時代が到来する中で、各学校におけるOJT(On-the-Job Training)の組織化が十分に行えていない状況にある。学校における危機管理に関するそれも例外ではない。この点、学校を取り巻く多様な危機への教職員の対処力を組織的に育成する仕組み作りは、喫緊の課題である。危機管理は、「事前の危機管理(リスク・マネージメント)」と「事後の危機管理(クライシス・マネージメント)」の2つの側面から捉えることが可能である(文部科学省『学校の安全管理に関する取組事例集』)。だが、学校現場における危機管理をみると、クライシス・マネージメントがその中心を占めている。そのため、事件や事故の発生による被害を最小限にするためにも、クライシス・マネージメントの視点を持った教職員研修の実施が有効となる。研究1年目にあたる今年度は、他分野の研修事例を収集・分析し、若手教職員からベテラン教職員まで積極的に研修に取り組めるよう、ロールプレイングやグループワーク等を取り入れた危機管理研修プログラムの在り方を検討した。また、学校事故に関する裁判例や小学校・中学校における事故や児童・生徒が負傷した事案等を収集し、それを基に、危機管理研修において使用する教材の作成を試みた。近年、多くの地方公共団体において、教員の年齢構成の「歪みへの対応」が求められている。これまでの研究でのヒアリング調査などからも、初任者研修等の一斉研修の充実に加え、各学校におけるOJT(on-the-job training)を組織的に実施することが新たな課題であることが明らかとなってきた。危機管理も例外ではなく、教職員の危機管理力を組織的に育成することが求められている。また、学校の危機管理は、大阪教育大学附属池田小学校事件等を受け、クライシスマネジメントに重きが置かれる傾向があった。しかし、未然防止の観点からはリスクマネジメントの視点を持った学校経営及び教職員研修が有効であると考えられる。そこで、研究2年目である平成27年度は、他分野における職員研修に関する資料等の収集・分析、学校事故に関する裁判例の収集・分析、小学校・中学校におけるヒヤリハット事例の収集・分析を引き続き行った。その上で、プログラムの構築に力点を置いた。具体的には、中央労働災害防止協会等が行っているKYT(危険予知トレーニング)を参考にした研修プログラムを構築した。学校事故に関する裁判例や学校のヒヤリハット事例を基に、例えば「掃除の時間」や「跳び箱の授業」といったテーマ別にイラストを作成し、これらを活用したグループワーク研修を学校における危機管理研修会等で試行した。現在、研修会で実施したヒアリング調査等を基に、プログラムの改善を進めているところである。現在、他分野における研修事例や学校事故に関する裁判例は順調に収集することができている。しかし、小学校・中学校の教職員へのヒアリング調査をふまえた教材作成、特にイラスト教材の作成に時間を取られ、他の教材の開発及び作成が遅れている。2008年に学校保健法が改正され「学校保健安全法」に改称された。それ以降、学校においては学校安全計画の策定・実施、危険等発生時対処要領の作成等が義務づけられ、学校安全の取組が推進されている。しかし依然として、学校管理下の事件・事故は発生しており、児童・生徒が重大な被害を受ける事案も毎年一定数存在する。これらの事件・事故の中には、突発的に発生し防ぐことが困難なものもあるが、リスクマネジメントの視点を持った教職員研修等により、被害を小さくしたり、防ぐことが可能になるものも少なくないと考えられている。研究3年目にあたる平成28年度は、昨年度に引き続き、学校事故に関する裁判例の収集及びその分析を行った。また、小学校の教員を中心にヒアリング調査等を行いヒヤリハット事例を収集し、それらを元に、多様な研修教材を作成した。

具体的には、教育活動に潜む危険をイラストを見て把握し対応を検討する教材や、裁判例などを元に作成した「設題」を分析することで事故を防ぐ手立てを検討する教材、教員がロールプレイングをスムーズに行うための資料等を作成した。これらは、教職大学院での授業(「学校の危機管理」)や免許更新講習(選択必修)等において活用した。受講者の意見やアンケートからは、これらの教材を利用してグループワークを行うことで、教育活動に内在する様々な危険について具体的に話合う機会となると感じていること等が明らかとなった。また、現在、受講者の意見を基に、プログラムのさらなる改善や新たな教材の作成を進めているところである。現在、他分野における研修事例や学校事故に関する裁判例の収集、教員の危機管理向上のための教材作成(小学校)も順調に進んでいる。児童・保護者からの要求のうち、児童・生徒の生命、身体や財産が脅かされる事案に関するものは、学校においても特にリスクとして、把握・対応する必要がある。一般的にリスクマネジメントの第一歩はリスクの把握だとされる。児童・生徒の生命、身体や財産が脅かされる事案の発生頻度や被害の程度などを考慮したとしても、学校は一般社会と比べ、極端にリスクが少ないとはいえないであろう。だが、学校におけるリスクマネジメントは、企業や病院など一般社会のそれと比べ積極的に対策を取っているとは言いがたい状況がある。そこで、本研究期間においては、企業や病院などで行われている危機管理研修を参考に、学校における危機管理について教職員を対象とした研修の開発を行ってきた。平成29年度は昨年度に引き続き、小学校及び中学校の教職員を対象とした危機管理研修会や免許更新講習等においてこれまで作成した教材等を使用し、研修を実施し、プログラムの改善と、新たな教材の作成に取り組んだ。イラストを提示し、危険箇所や対処方法についてグループで議論してもらったところ、「他の先生の考え方を聞く機会ができ、対処方法なども学べてとても勉強になった」など概ね肯定的な感想が寄せられ、一定の成果を見ることができた。収集した事案を反映し、学校独自のリスク・マネジメント研修教材を開発することで、教職員間の議論が積極的に行われ、より現実的な教材となると考えられる。イラスト教材以外の教材の作成が、昨年度から遅れていることに加え、昨年度はイラスト教材の作成の依頼先が見つからず、作業が遅れたため。児童・生徒が集う学校が安全な場所でならないことは言うまでもない。その一方で、未成熟な児童・生徒が集う学校は、一般社会と比して、多様な危険が数多く存在していると言っても過言ではない。重大な事件や事故が発生すれば児童・生徒らの生命を危険に晒しかねないため、学校は、事後の危機管理はもちろんのこと、予想できる事故や事件には未然に備える必要がある。また、学校事故は、教員の行為に起因するものより、児童・生徒の行為に起因するものが多く、その意味で事故や事件の予想を難しくする可能性がある。つまり、児童・生徒と直接向き合う教員には、潜在する児童・生徒を取り巻く危険を適切に予測する力やそれに対処する力が求められる。
光学計測による神経系の複雑適合系に関する研究

中枢神経系、あるいはそれに類する神経系の動作機構は、単純な集約的制御システムとして作動としているだけでなく、ダイナミックな複雑系であり、自己組織化されたシステムであることを意味している。そこで、本協同研究は、そのような神経系の作動機構を"複雑適合性"という視点からアプローチすることを目的として実施され、次のような成果が得られた。1)延髄における迷走神経、舌咽神経応答のパターン形成に関する研究:鶏胚、ラット胎仔から摘出した脳幹を用いて、迷走神経や舌咽神経を電気的に刺激すると孤束核や運動神経核に対応する領域にニューロン応答が誘発される。そのニューロン応答の空間的・時間的パターンは刺激条件によって変化し、分散性があることが認められた。例えば、孤束核は、迷走神経や舌咽神経刺激の強さや頻度に応じて異なった空間的・時間的パターンを示した。これは、孤束核内の情報処理が集約的機構というよりも、むしろ分散的機構によって遂行されていることを示唆している。このことから、呼吸や循環系から入る入力に応じて、孤束核内では分散処理が行われ、それが、さらに呼吸中枢や循環中枢で分散処理されると考えられた。2)脊髄ニューロン回路の機能的形成:鶏胚脊髄から摘出したスライス標本で、脊髄神経を電気刺激することによってニューロン活動を光学的シグナルとして記録して、脊髄反射に関与する神経回路の機能的形成過程を明らかにすることに成功した。そこでも、ニューロン応答に分散性があることが示される。3)ラット体性感覚野におけるbarrel応答に関する研究:ラットのヒゲを機械的に刺激し、体性感覚野に誘発される内因性の光学的変化の計測によって、barrelのニューロン応答パターンの解析を行った。barrel応答のパターンは固定的なものでなく、同じ刺激条件に対してもtrialミtoミtrial variationsがみられ、ある範囲内で、非再現性現象とも云えるような結果が得られた。これは、barrcl応答には自由度があり、入力情報を分散処理している可能性を示すものである。本年度は、以下の手順に沿って研究をすすめた。1.神経系における「複雑適合系」についての研究は、ニューロンの機能的集合体におけるニューロン間に形成される統合的機能を解析することであり、特に、trial-to-trial variebilityのなかに潜むregularity(規則性)、consistensy(整合性)を実験指標とし、その中に、複雑適合系についての解析を行った。したがって、この研究では、個々のニューロンの特性というよりも、ニューロン集合体としてのダイナミックな特性を調べあげることが、ストラテジーであり、それに対しては、われわれ3グループが即戦力として持っている「ニューロン活動の光学的多チャネル計測法」を駆使した。2.この「ニューロン活動の光学的計測法」では、膜電位感受性色素を用いて、ニューロンの電位活動を光学的シグナルに変換し、それを多素子フォトダイオードアレイで多数ヶ所あるいは多数個のニューロンから電位活動を同時記録し、さらに、医歯大グループは内因性光学シグナルの計測も行った。3.現在、われわれ3グループは、1001020素子フォトダイオードアレイによる計測システムおよび画像化システムを保有しているが、この方法を駆使して、脳幹、視覚野、体性感覚野、下垂体、脳管神経系を対象とした実験を行った。4.本年度は、まず、各々の対象について、「複雑性適合系」を実験的に具体的描像として検証することからはじめ、その創発パターンを分類し、各々の基本的性状を整理した。

特に、夏期にWoods Holeの海洋生物学実験所(MBL)、冬季に東京に集結して、各々のデータの比較検討および国際シンポジウムを行い、その中で基本的な問題を抽出したうえで、さらなる共同実験についての計画案について検討した。中枢神経系、あるいはそれに類する神経系の動作機構は、単純な集約的制御システムとして作動としているだけでなく、ダイナミックな複雑系であり、自己組織化されたシステムであることを意味している。そこで、本協同研究は、そのような神経系の作動機構を"複雑適合性"という視点からアプローチすることを目的として実施され、次のような成果が得られた。1)延髄における迷走神経、舌咽神経応答のパターン形成に関する研究:鶏胚、ラット胎仔から摘出した脳幹を用いて、迷走神経や舌咽神経を電気的に刺激すると孤束核や運動神経核に対応する領域にニューロン応答が誘発される。そのニューロン応答の空間的・時間的パターンは刺激条件によって変化し、分散性があることが認められた。例えば、孤束核は、迷走神経や舌咽神経刺激の強さや頻度に応じて異なった空間的・時間的パターンを示した。これは、孤束核内の情報処理が集約的機構というよりも、むしろ分散的機構によって遂行されていることを示唆している。このことから、呼吸や循環系から入る入力に応じて、孤束核内では分散処理が行われ、それが、さらに呼吸中枢や循環中枢で分散処理されると考えられた。2)脊髄ニューロン回路の機能的形成:鶏胚脊髄から摘出したスライス標本で、脊髄神経を電気刺激することによってニューロン活動を光学的シグナルとして記録して、脊髄反射に関与する神経回路の機能的形成過程を明らかにすることに成功した。そこでも、ニューロン応答に分散性があることが示される。3)ラット体性感覚野におけるbarrel応答に関する研究:ラットのヒゲを機械的に刺激し、体性感覚野に誘発される内因性の光学的変化の計測によって、barrelのニューロン応答パターンの解析を行った。barrel応答のパターンは固定的なものでなく、同じ刺激条件に対してもtrialミtoミtrial variationsがみられ、ある範囲内で、非再現性現象とも云えるような結果が得られた。これは、barrel応答には自由度があり、入力情報を分散処理している可能性を示すものである。
癌間質線維芽細胞を標的とした新たな子宮内膜癌治療戦略の開発

子宮内膜癌細胞の周囲に存在し、癌の生存、増殖を支持しているとされる癌線維芽細胞をターゲットとした治療戦略を確立すべく基礎的研究を行った。臨床検体の検討で癌線維芽細胞において発現低下のみられる分泌型タンパクIGFBP6に着目した。細胞株を用いた実験にて子宮内膜癌細胞は増殖因子IGF-2依存性増殖が確認された。IGFBP6はIGF-2の抑制因子であり、その添加によってIGF-2依存性増殖がキャンセルされることを証明した。これは癌線維芽細胞におけるIGFBP6発現低下が癌生存に有利な微小環境を作っており、その発現誘導が新たながん治療ターゲットとして有効である可能性を示す結果であると考えられた。本研究の目的は癌間質線維芽細胞(CAF:Cancer Associated Fibroblast)をターゲットとした子宮内膜癌治療を開発するものである。CAFは癌間質に存在し、細胞外マトリックス・成長因子・分化因子の分泌による癌細胞との相互作用を有し、様々な固形癌の発癌・癌形質維持・浸潤転移への関与が報告されている。子宮内膜癌はその体積の多くを癌間質に裏打ちされており、癌細胞とCAFの相互作用が推定されているが、ほとんど解明されていない。本研究は、子宮内膜癌におけるCAFの役割を解明し、その責任因子を標的とした新しい治療戦略の構築を目指すものである。我々はこれまでに子宮内膜癌幹細胞マーカーとしてCD133を報告し、その高発現が子宮内膜癌の予後不良因子であることを見出してきた(Nakamura M etal.Human Pathol.2010;41:1516-29)。またSide-Population cells(Kato K et al.Am J Pathol2010;176:381-92)も子宮内膜癌幹細胞マーカーとして有用である。我々はこれまでに、6種類の子宮内膜癌細胞株におけるCD133陽性率をフローサイトメトリーにて算出してきた。これらの癌細胞株とNF,CAFとそれぞれ共培養することにより、癌幹細胞の比率の変化、幹細胞ポテンシャルとしての造腫瘍能の変化を評価する。現時点で癌幹細胞とNFあるいはCAFを共培養することによる表現型の変化や構成比率の変化を確認するには至っていない。今後は至適培養条件を見つけるべく、条件設定の幅を広げていく予定である。これまでの研究によって以下の成果を獲得した。1.手術検体からの正常線維芽細胞(NF)および癌間質線維芽細胞(CAF)の単離と培養系の確立我々はこれまでに、様々な理由で摘出された子宮からNF、CAFをそれぞれ10,20サンプルずつ培養に成功しており、培養条件は確立した。培養した線維芽細胞は形態および免疫細胞染色により、上皮や血管内皮細胞ではないことを確認している。2.癌線維芽細胞による内膜癌細胞株の増殖能・浸潤能・転移能の変化を評価子宮内膜癌細胞株とNF,CAFをそれぞれin vitro共培養することで、増殖能・浸潤能の変化を観察している。現時点では中間評価であるがIn vivo実験系にて免疫抑制マウスに子宮内膜癌細胞株Ishikawa細胞とそれぞれNF,CAFを皮下注射し、腫瘍サイズの経時的変化においてCAFによる増殖能亢進が確認されている。CAFにおいて再現性をもって低下を認めた分泌型蛋白IGFBP6をCAFによる子宮内膜癌制御の候補遺伝子として解析を行った。子宮内膜癌においては組織内に高濃度のIGF-2を認め、これが子宮内膜癌の増殖に促進的に働いていると考えられている。我々がこれまでにin vitro遺伝子導入で樹立してきた子宮内膜癌細胞株(EM4-KRAS-PR)を用いたin vitro実験系にてIGF-2の添加により増殖促進が確認された。IGFBP6はIGF-2と結合することで競合的にIGF-2の作用を抑制するメカニズムが想定され、この増殖促進はIGFBP6の添加にてキャンセルされた。

CAFにおけるIGFBP6分泌低下がIGF-2依存性子宮内膜癌細胞の増殖に関与している可能性が示めされた。癌の生存に有利な微小環境の維持にCAFが関わっており、CAFをターゲットとした子宮内膜癌治療戦略の有効である可能性が示唆された。婦人科腫瘍CAFによる子宮内膜癌制御を証明する実験系を立ち上げようとしているが、研究環境の変化、時間的な制限があるため至適条件設定が難渋しているため。労働環境の変化に伴い研究に費やすことのできる時間が大幅に減少したため。CAFにより子宮内膜癌細胞株の増殖・浸潤・転移能をin vitroおよびin vivoの系にて評価する。さらにCAFにより子宮内膜癌幹細胞の分画がどの様に影響を受けるかを評価する。NF、原発巣CAFおよび転移巣CAFよりRNAを抽出し、遺伝子発現profileの相違より候補となり得る標的分子を選定する。候補分子を抑制するためのsiRNAをデザインし、至適条件を設定した後にCAFと子宮内膜癌細胞株の共培養実験によって癌細胞の表現形を観察する。そのために、研究環境の再編成を行い、時間的制約をカバーする。1.正常線維芽細胞(NF)と癌間質線維芽細胞(CAF)の遺伝子発現の相違から候補遺伝子の同定とその評価を行うNFとCAFの遺伝子発現の相違はcDNA Micro arrayにて検討する予定である。摘出子宮の凍結標本を用いた解析を予定している。予備実験において、凍結標本からLaser Capture Microdissection (LCM)法を用いてRNA抽出、cDNA合成の条件設定は終了している。また、剖検例よりサンプリングを行い、同一症例における原発巣と転移巣からも凍結標本を作製し、Microarray解析にて転移巣における遺伝子発現プロファイルの相違も検討する。分泌型タンパクを中心に候補遺伝子を選定し、それらをターゲットとしたsiRNAをデザインする。デザインしたsiRNAをCAFに作用させ、タンパク発現の低下をウェスタンブロット法にて確認する。CAFにおける候補遺伝子のノックダウンが癌幹細胞株の増殖能・浸潤能、あるいは細胞死に与える影響を共培養にて評価する。平成25年度にMicroarray解析を行う予定であったが、予定よりも検体数が少なかったため次年度も継続して行うこととしたため、それに伴う経費は繰り越しとした。次年度にNF,CAFの臨床検体から培養系に移した検体を追加しMicroarray解析を行う予定である。次年度の研究費の大半はMicroarray解析に使用する予定である。他に、細胞培養、Laser Capture Microdissection、免疫抑制マウスの購入など消耗品の購入に使用する予定である。平成24年度に購入予定としていたPCR増幅装置は次年度に繰り越しとしたこと、動物実験用のマウス購入費用が低額に収まったことにより未使用額が発生した。