hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療組織での携帯端末の活用による医療リスク防止のための研究

本研究では、まず医療サービス組織のリスク問題の分類とそれの軽減のためのコミュニケーションツールの支援機能を解明すべく、ヒアリング調査および分析を行った。その結果、特定リスクとして生活習慣病の予防に焦点を絞り、医療サービス組織として大学内健康管理部局を対象とし、携帯電話を携帯端末としたヘルスケア支援システムを開発し、その活用による生活改善の実証研究を行い、成果を確認した。平成19年度は、ます医療サービス支援システムと親和性のある分野を特定するため当該分野における支援ツールのサーべイと医療従事者等へのヒアリング調査を実施した。主な活動は以下の通りである。・愛媛大学:医療支援システムに関するヒアリング・岐阜大学付属病院:医療現場視察、医療安全管理の実態及び電子カルテに関するヒアリング・国立山陽病院:リスクマネジメントに関する講義の聴講及び現場視察・西会津保健センター:在宅健康管理システムの導入・運営に関するヒアリング及び現場視察・熊本県植木町健康福祉センター:産官学の連携による健康支援活動の取り組みに関するヒアリング・日本赤十字社熊本健康管理センター:日本赤十字社熊本健康管理センターと熊本県庁との連携による健康履歴管理システムの導入と運営に関するヒアリングその結果、携帯端末システムの運用パターンとして以下の候補が挙がってきた。(1)コミュニケーションシステムとしての運用・医師と患者のコミュニケーションサポートを中心とした運用・看護師や保健士などのケアスタッフと患者のコミュニケーションサポートを中心とした運用・栄養士などの指導スタッフと患者のコミュニケーションサポートを中心とした運用(2)院内システム等としての運用・インシデントレポートシステムとしての運用・処方箋システムとしての運用検討の結果、現時点では(2)院内システム等としての運用においては安全性の担保が困難であり、(1)コミュニケーションシステムとして運用した方が業務の効率化等システムの導入効果が見えやすく、かつサービス向上の観点からも意義が大きいと考えられる。とりわけ若年リスク層に対する生活改善指導の推進は将来の生活習慣病発症リスクを低減することにつながり、国家的課題となっている医療費削減の観点からも極めて意義が大きいとの結論を得た。平成19年度の検討の結果、現時点では院内システム等としての運用においては安全性の担保が困難であり、院外でのコミュニケーションシステムとして運用した方が業務の効率化等システムの導入効果が見えやすく、かつサービス向上の観点からも意義が大きいと考えられる。とりわけ若年リスク層に対する生活改善指導の推進は将来の生活習慣病発症リスクを低減することにつながり、国家的課題となっている医療費削減の観点からも極めて意義が大きいとの結論を得たことをうけ、平成20年度は院外コミュニケーションシステムの設計開発をおこなった。さらに、そのシステムのフィージビリティ・スタディとして、阪南大学医務室の協力のもと、学生への生活改善サポートシステムの予備実験をおこなった。対象となったのはいわゆる生活習慣病、特にメタボリックシンドロームの予備軍と思われるBMI25.0以上の学生であり、実験に賛同してもらった14名にたいし、平成20年12月から平成21年3月まで行なった。本予備実験は医務室の健康教育の一環としておこない、・肥満に伴う健康障害の予防・学生のヘルスリテラシーの向上を目標として実施した。何名かの学生については実際にBMI値の減少の成果があがったが、一方、一部の学生では学生自身が参加の有無について十分に考える時間がなく、「言われたから何となく参加する」学生もいた。これらの学生については、プログラムに関して十分な理解が得られず、「こんなハズじゃなかった」と感じる学生や、「やらされ感」が強まってしまったことも否めない。これらについては平成21年度の課題となろう。平成20年度の院外コミュニケーションシステムの開発と、そのシステムのフィージビリティ・スタディとしての予備実験を踏まえ、まず平成21年度前期(4月7月)は阪南大学の学生30名に対して阪南大学医務室の協力のもと、学生への生活改善サポートシステムの検証実験をおになった。本実験は平成20年度と同様に、・肥満に伴う健康障害の予防・学生のヘルスリテラシーの向上を目標として実施した。また、これまでの教育支援をベースとしたシステムの運用の平行して、コミュニケーション機能を重視したメーリングシステムをベースとする新システムのプロトタイプ開発も行い、平成21年後期(11月1月)においては新システムの検証としてのフィージビリティ・スタディもおになった。前期後期とおして、BMI値の改善が見られた学生もいる一方、機能的には改善されているものの、互換性を重視していたのである意味当然でにあるが、学生ニエンドユーザからは機能の変化はみられずシステムに対しての飽きが一部みられたので、今後はコンテンツの工夫による継続容易性についても検討する必要があると考える。
インターネット上でのライフログの組織化と協調的活用に関する研究

平成18年度は、様々な種類のライフログデータを統一的に扱う枠組みとして経験ウェブの概念を提案し、経験ウェブの一つの実装例としてX・Webを開発した。X・Webはライフログを構成する様々な形式のデータを統一的な形式で管理できる枠組みである。X・Webのモデル化要素はユニットであり、コンテンツ、経験、主体の3種類に分類される。ユニット間の関連のつながりはランキング関数によって表現される。ランキング関数の重みは、コンテンツの種類によって様々なやり方がある。例えば、テキスト形式のコンテンツであれば単語の出現頻度などの特徴量を利用することが考えられる。利用者の問い合わせはクエリパスによって表現される。利用者が指定したクエリパスによって重み伝播ネットワークが構成される。重み伝播ネットワークはユニット間の関連に基づいて重みを伝播させる。本手法では、コンテンツは検索対象であると同時に2種類の異なる概念やコンテンツを介在する役割を果たす。このことにより、パーソナルコンテンツを手動でインデキシングすることなしに、様々なタイブのコンテンツ間の関連を利用して検索や推薦を実現可能である。また、X・Webでは利用者の経験に基づいて、同じ活動に参加した利用者間で、コンテンツをインデックスや検索対象として利用するために自動的に共有できる。経験Webの応用例として、利用者が過去に閲覧したウェブページとデジタル写真を対応付けて写真を共有する手法を開発した。さらに、TVMLを利用して蓄積された個人コンテンツを自動的に番組化するシステムのプロトタイプを開発した。また、ライフログの一種である運転中の振る舞いに基づいて楽曲を検索する手法を開発した。このシステムでは、楽曲にあわせてハンドルを叩く、足踏みすると行った「ノリ」の振る舞いを蓄積する。利用者は、蓄積された「ノリ」の振る舞いの類似性に基づいて、楽曲を検索したり、利用者の嗜好を反映した再生リストを構成できる。本研究は,個人の生活や業務に関する記録であるライフログを有効的な活用の支援を目的に,インターネット上で個人が管理するライフログを安全に相互参照可能とし,統合的なデータ操作と流通を実現するシステムに関する基礎的な技術を開発することを目指す.3年間の研究の初年度である本年度は,ライフログ管理システムに期待される機能の中でも特に重要なライフログ検索に対象を絞り,単一個人のライフログを検索するための枠組みを明確化することを目標に研究を実施した.まず,従来のマルチメディアデータ検索とライフログ検索との比較・考察を行い,ライフログは同一の活動が複数のメディアで表現される特徴を有し,コンテクストに基づく検索及び不確実性を有する根拠の統合的な基づく検索が重要であることを明らかにした.そこで得られた知見に基づいて,単一個人のライフログを管理するための検索モデルを開発した.本検索モデルはベイジアンネットワークを利用して上記の2種類のライフログの特徴的な検索をサポートする.検索に必要なデータと概念はライフログネットワークとして構造化される.ライフログネットワークには,メディアネットワークとクエリネットワークが部分ネットワークとして含まれている.メディアネットワークはライフログを構成するメディア間の相互関係や意味内容を表現し,システムによって恒常的に保持される.クエリネットワークは利用者が与えた検索要求の表現であり,利用者が与えた検索要求に基づいて動的に生成される.検索時にはメディアネットワーク中のメディアノードとクエリネットワーク中のクエリノードの依存関係を計算することによって,検索結果をランク付けする.本年度開発モデルは単一個人のライフログを対象としたものである.次年度から,複数人のライフログに適用可能とする拡張を行う.平成17年度は16年度に考察したベイジアンネットに基づくライフログ検索の枠組みを発展させて以下の研究成果を得られた。まず、多種多様なライフログデータを利用したマルチメディアデータ検索手法の代表例として電子メールと写真に対象を限定し、電子メールに含まれる時間概念表現を利用して写真コンテンツに対して自動的なインデキシング(アノテーション)を行いキーワード検索実現する手法を提案した。この手法では、時間概念の粒度の違いに基づいて重み付けがなされる点に新規性がある。次に、実世界の協調的な活動に基づいて個人コンテンツのアクセス管理を行う枠組みを提案した。提案手法では、活動した時間区間に対してアクセス権を設定可能であるという特徴を有する。さらに、本研究を進めていく中で、ライフログ検索においては個人コンテンツの管理が非常に重要であることがわかった。そこで、それまでのアプローチをより一般化してインターネット上で個人コンテンツ管理を行うためのX-Webデータモデルの枠組みを開発した。X-Webの基本的なモデル化要素はユニットと呼ばれ「コンテンツ」「経験」「主体」の3種類に分類される。この構造により、個人コンテンツの検索や推薦のために重要なコンテンツのコンテクストを蓄積・管理可能となる。ユニット間の関係はランキング関数によって重み付けされ、クエリはランキング関数を巡航することによって指定されるクエリパスによって表現できる。クエリパス上で重みを伝搬させることにより検索・推薦対象となるコンテンツのランク付けする。X-Webでは検索と推薦を統一的な枠組みで利用者の多様な検索・推薦要求に対応可能であるという特徴を有する。また、ライフログに基づくコンテンツ管理の具体的な応用例の一つとして、運転中の振る舞いに基づいて車載オーディオ機器で楽曲を検索する手法を開発し、プロトタイプシステムによる評価実験を行った。

ランキング関数の重みは、コンテンツの種類によって様々なやり方がある。例えば、テキスト形式のコンテンツであれば単語の出現頻度などの特徴量を利用することが考えられる。利用者の問い合わせはクエリパスによって表現される。利用者が指定したクエリパスによって重み伝播ネットワークが構成される。重み伝播ネットワークはユニット間の関連に基づいて重みを伝播させる。本手法では、コンテンツは検索対象であると同時に2種類の異なる概念やコンテンツを介在する役割を果たす。このことにより、パーソナルコンテンツを手動でインデキシングすることなしに、様々なタイブのコンテンツ間の関連を利用して検索や推薦を実現可能である。また、X・Webでは利用者の経験に基づいて、同じ活動に参加した利用者間で、コンテンツをインデックスや検索対象として利用するために自動的に共有できる。経験Webの応用例として、利用者が過去に閲覧したウェブページとデジタル写真を対応付けて写真を共有する手法を開発した。さらに、TVMLを利用して蓄積された個人コンテンツを自動的に番組化するシステムのプロトタイプを開発した。また、ライフログの一種である運転中の振る舞いに基づいて楽曲を検索する手法を開発した。このシステムでは、楽曲にあわせてハンドルを叩く、足踏みすると行った「ノリ」の振る舞いを蓄積する。利用者は、蓄積された「ノリ」の振る舞いの類似性に基づいて、楽曲を検索したり、利用者の嗜好を反映した再生リストを構成できる。
九州方言の歴史的研究

(1)(i)国立国語研究所蔵の九州及びその隣接地方言関係資料(各県地方調査員の報告書等)や、九州各県の地方教育委員会所蔵資料その他を、可能な限り調査し、従来における九州方言研究の実態を究明した。(ii)九州諸方言の中、肥前・肥後・筑前筑後・豊前豊後・薩摩・大陽・日向それぞれに関し、各地5地点ずつ、計35地点の方言を臨地調査した。アクセント・言語・文法諸現象中心。(iii)国会図書館所蔵の本草書など、近世期の九州方言文献を調査した。(iv)上記(i)(iii)の調査結果をカードに整理した。(v)上記の結果から九州諸方言相互の系譜関係や、新古関係を考察した。(2)その研究成果については、『九州方言の史的研究』(1989年3月刊)で記述するが、重要な発見としては、次の如きが挙げられる。(i)九州諸方言のうち、薩隅方言は、比較的古い語彙が多く存するが、アクセント・言語・文法等の面では、むしろ豊前豊後方言の古形が注目される。(ii)アクセントについては、豊前豊後方言が最も古く、日向大部分や大隅東部・肥後東部・肥前北部・筑後諸方言が最も新しいと考えられる。その他の諸現象も、アクセントに準ずる場合が多い。(iii)従来の「豊日方言」は、日向方言と両豊方言に分けるべきであり、両豊方言のうち日向方言に入れるべきである。(iv)従来の「肥筑方言」は、両肥方言及び筑後方言と筑前方言及び壱岐・対馬方言に分けるべきである。(v)『庶物類纂はじめ数種の本草書・農書類が、動植物名等の九州方言史料として貴重なものである事を明らかにした。
DNA二重鎖切断の「トリアージ」とその分子機構

DNA二重鎖切断(DSB)は最も重篤なDNA損傷であり、主として、非相同末端結合(NHEJ)と相同組換えで修復される。本研究は、DNA末端形状の違いによるNHEJの反応過程や難度の違い、この違いへの細胞の対応を「トリアージ機構」と呼び、これを再現する新しい試験管内(in vitro)実験系を構築し、分子機構の一端を明らかにすることを目的として行った。細胞抽出液に制限酵素で処理したプラスミドDNAを添加して反応させた後、PCRでの定量を試みた。細胞抽出液調製、DSB修復(結合)反応、反応産物解析法をいくつか試み、DNA末端形状によるDSB修復(結合)反応の違いを再現することができた。本研究は、放射線によって生じるDNA損傷の中で最も重篤と考えられるDNA二重鎖切断(DSB)の非相同末端結合(NHEJ)による修復において、プロセシングの必要がある損傷とない損傷の選別機構(これを「トリアージ」機構と呼ぶこととする)を明らかにすることを目的としている。本年度は、さまざまな末端形状を有するDSB基質を用いたin vitro実験系の構築を中心に行った。具体的には、細胞抽出液に制限酵素処理したプラスミドを加えて反応させた後、PCR法で結合産物の量を解析することを試みた。まず、既報を参考に細胞抽出液の調製法、修復(結合)反応の条件を確立した。次に、制限酵素処理時における未消化DNAの増幅が問題となることが分かった。この問題は、プライマーを1種類のみ加え、いわゆるhead-to-head型の増幅産物を検出することで解決することができた。さらに、リアルタイムPCR法によってより定量的に修復(結合)活性を評価する実験法を確立した。25年度には、細胞抽出液に制限酵素処理したプラスミドを加えて反応させた後、リアルタイム(定量的)PCR法で結合産物の量を解析するin vitroDSB修復実験系を構築した。26年度は反応産物の構造、配列解析を予定していたが、副産物生成の可能性が考えられたため、反応条件の再検討を行った。また、NHEJによるDSB修復の最終段階に働くXRCC4の欠損細胞や変異細胞を用いて、正常細胞との比較検討を行った。その結果、制限酵素の種類や組合せによっては放射線感受性と整合する結果が得られたが、一方で、予想に反して欠損細胞で増幅が最も多く見られたものもあった。これについては、プライマー設計などの再検討の余地があるが、酵母等を用いた研究でも類似の現象が報告されており、結合に誤りを伴いやすい形状の損傷ではNHEJ系が逆に結合をブロックする機構も考えられた。本研究は、DNA末端形状の違いによるDNA二重鎖切断(DSB)修復の反応過程や難度の違い、この違いへの細胞の対応を「DSBのトリアージ」と呼び、これを再現する試験管内実験系を構築し、分子機構を明らかにすることを目的として行った。最終年度を1年延長した本年度は、追加実験、新たな技術・知見への対応、これまでの研究成果のとりまとめ、発表などを行った。追加実験に関しては、まず、試験管内でのDSB修復(結合)反応との対比のため、細胞内での反応を制限酵素I-SceIを用いた系で解析することを試みた。やはり、平成27年度までに行った試験管内での反応の場合と同様、XRCC4等に依存しない非相同末端結合(A-NHEJ)反応が見られた。試験管内、細胞内の両方において、A-NHEJ反応をいかに抑えるかが重要と考えられた。そこで、再度試験管内の反応系について細胞抽出液調製、DSB修復(結合)反応、反応産物解析の手法の見直しを行った。これによって、DNA末端形状によるDSB修復(結合)反応の違いを再現することができた。この系がXRCC4等に依存したNHEJ(C-NHEJ)反応を特異的に捉えていることを確認するには、さらにいくつかの実験が必要であるが、確立すればNHEJの分子機構の詳細の解明に有用な系となることが期待される。新たな技術・知見に関しては、2013年に報告されたゲノム編集技術CRISPER/Cas9系の導入、2015年に発見されたPAXX遺伝子のクローニング、大腸菌での発現精製を行った。研究成果のとりまとめ、発表に関しては、5月に京都にて国際放射線研究会議が開催されたため、本研究のこれまでの成果に関係する発表を2件行った。その他、国内学会での発表を1件行った。

本研究では、リアルタイム(定量的)PCR法を用いてDSB修復をin vitroで再現することを目指しているが、そのためには、制限酵素処理時の未消化DNAやPCRの副産物が問題となることが分かり、これらの解決に時間を要した。一方で、当研究室の関連研究で解析が進んだXRCC4欠損細胞や変異細胞の利用で、放射線感受性とDSB形状ごとの修復能の相関解析を可能とするオリジナルの実験系ができつつある。分子放射線生物学平成27年度は反応物解析を行う。また、並行する研究において新たな変異体が見出されたため、それを用いた反応を行う。さらに、学会、論文などでの成果発表を行う。本研究に関連して、平成26年度には新たな重要知見がいくつかあった。(1)新たなNHEJ因子PAXX (Paralog of XRCC4 and XLF)が発見された。PAXXは名前が示す通り、XRCC4およびXLFと構造上類似する。XRCC4およびXLFがDNA ligase IVとともにDSBの結合段階に働くのに対し、PAXXはKuと相互作用し、NHEJ複合体全体の安定化に関わる可能性が考えられている。(2)XRCC4に変異を有する患者が同定された。これまで同定されている他のNHEJ因子変異患者と類似した小頭症、発育不全などを呈するが、一方で、免疫不全がほとんど見られないのは予想外であった。変異の部位はいくつかあるが、それぞれがXRCC4の機能にどのように影響するか不明の部分もある。平成27年度はこれらの新たな知見も踏まえ、DSBの形状による修復プロセスの違いに迫りたい。In vitroでのDSB修復実験系の構築においては、当初予想していた以上に制限酵素処理時の未消化DNAが問題となることが分かった。この解決に時間を要したが、プライマーの工夫により一つの解決法を見出した。さらに、リアルタイムPCR法を組み合せることにより、オリジナルの実験系ができつつある。全体的に見れば、おおむね当初計画通りの進捗度であると自己評価している。本研究では、リアルタイムPCR法を用いた新たな試験管内DNA二重鎖切断修復法の開発と、DNA末端形状による修復機構の違いの検出を目指している。平成26年度には反応産物の構造、配列解析を予定していたが、副産物生成の可能性が考えられたため、反応条件の再検討を行った。また、並行する研究において新たな変異体が見出されたため、それを用いた反応を行い、反応産物の構造、配列解析を平成27年度に行うこととした。In vitroでのDSB修復実験系の構築については、本年度は反応産物解析を中心に行う予定としていたが、ビオチン化基質とTaqmanプローブを用いた新たな手法も考案したので試したい。また、一昨年から昨年にかけて、新たなゲノム編集技術として、RNAをガイドとして部位特異的にDNA切断を生じるCRISPR/Cas9システムが登場した。Cas9は異なる触媒ドメインによって両鎖の切断を独立に行うと考えられ、一方の触媒ドメインに変異を導入することにより、片鎖のみを切断することも可能である。これによって、さまざまな長さの5'-あるいは3'-突出を持つ切断を細胞内で作ることが可能である。本研究申請時においては、この技術はこれほどの注目を集めておらず、本計画もこれを視野に入れたものとはなっていなかった。
湖沼の炭素・窒素循環を駆動するメタン栄養食物網のグローバルパターン解明

1)セブンレイクス:7つの火山湖沼群で月例湖沼物理観測を実施した結果、水深30m以上の湖が部分循環湖となることが判った。いずれの湖でも雨季から乾季の変わり目に表層で鉛直混合が観察され、季節風に伴う気温低下が主要な混合メカニズムであると示唆された。さらに、水深30m以上の3湖沼において、メタンの季節・鉛直プロファイルを調べたところ、底層の貧・無酸素層で高濃度の溶存メタンが検出された。また、pmoA遺伝子のDNA配列に基づいてメタン酸化細菌(MOB)を同定したところ、いずれの湖沼でもType I、Type II、NC10が出現した。しかし、脂肪酸分析を用いて動物プランクトンに含まれるMOB特異的脂肪酸を定量したところ、二次生産への寄与は極めて小さいことが判った。2)翡翠水庫:冬季の不完全循環が翌夏の成層期のメタン貯蔵に及ぼす影響を評価するため、2012年から2018年までメタンプロファイル調査を継続した。この長期観測データにより、暖冬年に不完全循環が起こると、続く成層期にメタン貯蔵が増大することが判った。さらに、嫌気的メタン酸化細菌NC10の季節・鉛直プロファイルを調べたところ、メタン貯蔵が発達するにつれてNC10が表層方向に分布を拡大する様子が捕捉できた。脂肪酸分析により、二次生産への寄与は低いものの、メタン貯蔵の発達期に動物プランクトンによるNC10特異的脂肪酸の取り込みが増加することを確認した。3)琵琶湖:2016年の冬季に北湖盆最深部地点にて採集したメタンとMOBの鉛直プロファイル試料を解析したところ、水深90m層において低濃度のメタン亜極大が検出された。MOB計数の結果、水深90mにおいて低密度ではあるものMOBの3型が検出された。次世代シークエンスを用いた解析でも90m層にMOB群の分布極大が検出され、琵琶湖において初めて水柱からMOBの存在が確認された。1)湖沼のメタン栄養食物網の緯度間比較:日本・台湾・フィリピンの3つの気候帯に属する湖沼を比較することにより、低緯度湖沼ほど部分循環傾向が強くメタン貯蔵が発達しやすいという予測通りの観察結果を得ることができた。特に、翡翠水庫の長期観測データに基づいて、厳冬・暖冬の年変動が湖沼の鉛直循環とメタン動態を左右する重要な気象要因となりうることを実証できた。本研究成果はEcological Researchに公表され、温帯湖沼の温暖化影響に関する示唆に富む内容が評価され、論文賞を受賞した。また、メタン栄養食物網の定量解析ツールである脂肪酸分析のNC10市販マーカーが入手できたことにより、3湖沼の比較研究を確立できた。当初の予測に反して、メタン栄養食物網の発達はメタン貯蔵と無関係であることが明らかとなった。無酸素層における動物プランクトンの行動生理的な制約による移動制限がMOBの二次生産への低い寄与率をもたらすかもしれない。2)熱帯湖沼の循環パタン:これまで熱帯湖沼ではスナップショット的な観測しか行われてこなかったが、本研究で月例湖沼物理観測を実施したことにより、熱帯湖沼における季節的鉛直循環を観察することができた。さらに、7つの湖沼群を比較することにより、一回循環湖と部分循環湖の深度境界が30m付近にあることを明らかにできた。3)NC10純粋培養実験:脂肪酸分析用マーカーの開発を目的としてNC10の純粋培養実験を試みてきたが、NC10は安定的に増殖せず、代わりにメチル栄養細菌が優占した。培養がうまくいかない理由は、本分類群の低い増殖率と狭い環境選好性によると思われる。様々な培養条件下でNC10およびメチル栄養細菌の増殖条件を比較検討中である。1)熱帯湖沼の集中観測調査:熱帯湖沼の季節的鉛直循環の物理メカニズムを明らかにするために昨年度に計画した高時間解像度観測調査が台風の影響で延期となったため、今年度の繰り越し期間に実施する。予算残額が限られていることから、長期滞在調査ではなく、水温・溶存酸素・気温・風速・風向ロガーを付属した係留系を台風と季節風が通過する2つのシーズンにセブンレイクスのヤンボ湖(一回循環湖)に設置して観測調査を実施する。2)MOBの群集構造および分子系統地理:セブンレイクスと琵琶湖におけるMOB群集の季節・鉛直プロファイルの解析が遅れていることから、CARD-FISHによるMOBの計数作業に注力する。また、各湖沼から得られたMOBのpmoA遺伝子配列のDNA配列情報に基づいて、分子系統地理解析を実施する。3)MOBによる窒素補給と栄養カスケード:翡翠水庫では、動物プランクトンにおけるMOB生産寄与率とそのC/N比に負の相関が認められ、MOBによる窒素補給(Nitrogen subsidy)が示唆されている。窒素欠乏の本湖沼において、MOBによる窒素補給が二次生産や表層の一次生産に及ぼす栄養カスケード効果を検証するために、共同研究者によって取得された各種環境資料・生物試料の長期データセットを収集・整理し、解析に供試する。1)翡翠水庫のメタン栄養食物網の長期観測台湾の翡翠水庫で2009年より開始されたメタン栄養食物網の長期観測調査を継続して実施した。2015年12月に観察された深底層のメタン極大が冬季全循環によって2016年3月までに完全に消失した。

このため、2016年は12月になっても深底層にメタン極大が観察されず、脂肪酸分析の結果からもメタン栄養食物網が未発達であることが確認された。一連の観測結果は、冬季湖沼循環の強弱が次年度のメタン栄養食物網の発達に影響するという本研究グループの提唱する仮説を支持した。2)NC10の培養実験翡翠水庫の深底層に特異的に出現する還元的メタン酸化細菌NC10の増殖特性を理解するために還元環境を再現した連続培養実験を実施した。翡翠水庫の湖底泥から採取した細菌の培養開始後、メタン濃度の顕著な減少が観察され、還元的メタン酸化の進行が示唆された。定量PCRによって、NC10の密度変化を調べたところ、培養開始後に増殖するものの、その後、減少に転じることが確認された。3)メタン栄養食物網の緯度間比較の同時観測体制の整備湖沼のメタン栄養食物網の緯度間比較を行うために、日本・台湾・フィリピンの同時観測体制を整備した。6月にフィリピンの調査地視察を実施し、セブンレイクス(7つの火口湖沼群)を調査候補に選定した。メタン栄養食物網調査の手法を共有するために、9月に台湾にて3か国合同ワークショップを開催した。琵琶湖(亜熱帯域)、翡翠水庫(亜熱帯ー熱帯境界域)、セブンレイクス(熱帯域)で同時観測の予備調査を実施した。冬季の琵琶湖では、深底層に小さなメタン極大が観察されるものの、メタン栄養食物網は未発達であった。セブンレイクスでは、2016年10月より月例湖沼物理観測を開始、底層が周年混合しない部分循環湖であることを確認した。1)翡翠水庫のメタン栄養食物網の長期観測翡翠水庫におけるメタン栄養食物網の長期観測では、温暖化に伴うメタン栄養食物網の応答メカニズムを理解するためのデータが順調に蓄積している。2)NC10の培養実験当初、バッチ培養によるメタン・硝酸添加実験を用いてNC10の増殖要因を検討する計画を立てていたが、還元環境中の化学合成細菌の研究を専門とする林立虹教授(臺灣大学地質科学系研究所)が本研究プロジェクトに参画したことにより、ケモスタットを用いた連続培養系での実験を新たに研究計画に組み込むことができた。NC10の純粋培養系はまだ確立していないが、連続培養実験の導入により、培養条件を柔軟に変更しながらNC10の増殖制御因子を探索することが可能となった。3)メタン栄養食物網の緯度間比較の同時観測体制の整備研究計画段階では、熱帯湖沼のモデルとしてフィリピンのタール湖を想定していたが、現地視察によりセブンレイクスが観測調査に適すると判断し、基礎調査を開始した。多項目水質系を導入して、7湖沼群における湖沼物理の鉛直プロファイル観測調査を2016年10月から開始した。サント・トーマス大を中心としたフィリピンの研究チームには、メタン栄養食物網の調査に必要な設備が整っていなかったことから、メタン観測用のGC、および、メタン酸化細菌観察用の蛍光顕微鏡やFISHを導入して、研究環境を整備した。琵琶湖においても冬季鉛直循環前のメタン栄養食物網の予備調査を実施し、3湖沼間で一斉観測調査を開始する準備が整った。1)セブンレイクス:7つの火山湖沼群で月例湖沼物理観測を実施した結果、水深30m以上の湖が部分循環湖となることが判った。いずれの湖でも雨季から乾季の変わり目に表層で鉛直混合が観察され、季節風に伴う気温低下が主要な混合メカニズムであると示唆された。
インテグリンを介するシグナル伝達の制御機構とその多様性に関する研究

1)成体基底膜の主要な接着分子であるα4鎖を含むラミニン-8とα5鎖を含むラミニン-10/11を精製し、そのインテグリン結合特異性を明らかにした。具体的には、ヒトグリオーマ細胞T98Gがα4鎖を含むラミニンを選択的に分泌することを明らかにし、このT98G細胞の培養上清からゲルろ過とイムノアフィニティークロマトグラフィーによりラミニン-8を均一に精製した。また、ヒト胎盤より精製したラモニンを抗原としてα5鎖に特異的な単クローン抗体5D6を作成し、この抗体を不溶化したカラムを用いて肺癌細胞株A549の培養上清より、ラミニン-10/11を精製する方法を確立した。これらの精製ラミニン標品のインテグリン結合特異性を検討し、インテグリンα3β1とα6β1の両方がラミニン-8およびラミニン-10/11のレセプターとして機能することを明らかにした。2)CD151遺伝子を欠失したマウスを作成するため、CD151遺伝子のターゲティングベクターを構築し、これをマウスES細胞に導入して、相同組換えのおこった細胞をスクリーニングした。これまでに600個以上のコロニーについてスクリーニングを行ったが、これまでに相同組換えをおこした細胞を得ることはできなかった。3)ラミニン-10/11に接着した細胞では、アクチンストレスファイバーと接着斑が形成されない(昨年度報告)。この理由を明らかにするため、低分子量G蛋白質であるRhoおよびRacの活性化の有無をラミニン-10/11に接着した細胞とフィブロネクチンに接着した細胞で比較検討した。その結果、ラミニン-10/11の上では、Racが速やかに活性化されることを見いだした。Rhoではなく、Racが優先的に活性化されることが、ラミニン-10/11上でストレスファイバーと接着斑が形成されない原因であると考えられる。細胞外マトリックスからインテグリンを介して細胞内に伝達されるシグナルの多様性とその制御機構を明らかにするため、間質と基底膜の代表的なマトリックス分子であるフィブロネクチン(FN)とラミニン(LN)に注目して解析を行い、以下の成果を得た。1)選択的スプライシングにより生じるEDA+とEDA-の2つのタイプのフィブロネクチンアイソフォームを遺伝子工学的に調製し、インテグリンα5β1結合活性とインテグリンを介する細胞内シグナル伝達因子の活性化能を比較検討した。その結果、EDA+FNはEDA-FNに比べて、インテグリンα5β1への結合親和性が増加していること、インテグリン依存的なp130Casのリン酸化とMAPキナーゼの活性化が23倍亢進していることを見いだした。また、EDA+FNはEDA-FNよりも基質依存的なDNA合成をより強く誘導し、これはインテグリンα5β1からのシグナルに依存したcyclin D1の発現誘導の亢進とそれに伴うpRB蛋白質のリン酸化の亢進によることを明らかにした。2)ヒト肺癌細胞A549の培養上清より、成体組織の主要なLNであるLN10/11をはじめて精製することに成功した。LN10/11はLN5と同様、インテグリンα3β1により認識されること、LN5とLN10/11はほぼ同等の非常に強い細胞接着活性と細胞遊走促進活性を持つことを明らかにした。3)インテグリンα3β1と一緒にヒト

胎盤から精製される分子量30kDの蛋白質を同定し、これが膜4回貫通型蛋白質ファミリーTM4SFに属するCD151であることを明らかにした。CD151を特異的に認識する単クローン抗体を作成し、ヒト組織での局在を検索した結果、腎臓では糸球体に強く発現しており、その局在部位はインテグリンα3β1と非常によく一致していた。1)成体基底膜の主要な接着分子であるα4鎖を含むラミニン-8とα5鎖を雄含むラミニン-10/11を精製し、そのインテグリン結合特異性を明らかにした。具体的には、ヒトグリオーマ細胞T98Gがα4鎖を含むラミニンを選択的に分泌することを明らかにし、このT98G細胞の培養上清からゲルろ過とイムノアフィニティークロマトグラフィーによりラミニン-8を均一に精製した。また、ヒト胎盤より精製したラミニンを抗原としてα5鎖に特異的な単クローン抗体5D6を作成し、この抗体を不溶化したカラムを用いて肺癌細胞株A549培養上清より、ラミニン-10/11を精製する方法を確立した。これらの精製ラミニン標品のインテグリン結合特異性を検討し、インテグリンα3β1とα6β1の両方がラミニン-8およびラミニン-10/11のレセプターとして機能することを明らかにした。2)CD151遺伝子を欠失したマウスを作成するため、CD151遺伝子のターゲティングベクターを構築し、これをマウスES細胞に導入して、相同組換えのおこった細胞をスクリーニングした。これまでに600個以上のコロニーについてスクリーニングを行ったが、これまでに相同組換えをおこした細胞を得ることはできなかった。3)ラミニン-10/11に接着した細胞では、アクチンストレスファイバーと接着斑が形成されない(昨年度報告)。この理由を明らかにするため、低分子量G蛋白質であるRhoおよびRacの活性化の有無をラミニン-10/11に接着した細胞とフィブロネクチンに接着した細胞で比較検討した。その結果、ラミニン-10/11では、Racが速やかに活性化されることを見いだした。Rhoではなく、Racが優先的に活性化されることが、ラミニン-10/11上でストレスファイバーと接着斑が形成されない原因であると考えられる。
失なわれた知覚軸に対する補償軸付加による色覚障害者のＱＯＬ向上のための画像処理

本研究は色覚異常者が識別できない色を、画像処理によって識別可能にする手法の研究である。この目的の画像処理として、識別できない色を識別できる色にする手法もあるが、本研究では色以外の画像属性を変化させて認知可能とするアプローチを採った。一つには画像のテクスチャを変更する方法であり、図やグラフに有効なパターンとしてドット・格子パターンを考案した。またコンピュータやスマートフォン向けの手法として、ブリンクによって差異を表示する手法も開発した。本研究の目的は、色覚異常者に欠けている色識別能力を補償した上で、色覚異常者に対してもそうでない人に対しても、同様に好ましい見え方をする画像を生成することである。この目的のため色自体を変更するという方策をとらず、色覚異常者が色空間上で失った一次元の軸を、色以外の画像特徴にマップするという新しい考えに基づいた処理を開発する。平成26年度の予定は正確な色再現が可能なディスプレーや色覚異常者の色知覚の正しいシミュレーションなど、研究を進める上での環境整備に加え、色覚異常者が混同する色をマップする画像特徴として画像ノイズを使った場合に生じる、平均色が移動してしまうという問題に対処することであった。研究環境の整備については色校正のされたディスプレーや色覚異常シミュレーション眼鏡の購入、ソフトウエアの開発を終了している。また画像ノイズ付加に関する平均色移動の問題に関しては、付加するノイズの分布を色覚異常者の混同曲線の方向によって変えることにより、この問題を解決した。この結果は学会発表により報告した。以上の成果に加えて、当初の計画に織り込まれていなかった画像特徴としてハッチングの使用した場合の問題にも取り組んだ。ハッチングはビジネスドキュメントに使われる図やグラフを対象とした場合に有効な画像特徴であるが、画像の適切な部分のみに適用することが重要である。そこで画像の適切な部分のみにハッチングを適用する手法を開発した。まず色によってセグメンテーションを行い、色覚異常者が混同する部分のみを抽出する。そしてその部分のみにハッチングを適用することにより、視認性の高い画像を生成することに成功した。この結果も学会発表により報告した。この目的のためには色自体を色覚異常者が識別可能な色に変更するのが直接的であるが、本研究ではこの方針を取らず、色覚異常者が色空間上で失った一次元の軸を、色以外の画像特徴に写像するという考えに基づいた手法を開発している。これによって色覚異常者に欠けている色識別能力を補償した上で、色覚異常者に対してもそうでない人に対しても、同様に好ましい見え方をする画像を生成することを目指している。研究を進めている一つの手法は、画像ノイズによるテクスチャの変化で識別できない色の区別を可能にする手法である。この手法は主に自然画などへの適用を想定している。この手法は今年度以前から提案・実験・評価を行ってきているが、今年度も引き続き、より効果的なノイズの付加手法を実験・検討した。一方同様の処理を、画像ノイズではなくハッチングを用いて行う手法も前年度から引き続き研究している。こちらは自然画ではなく、グラフや図などの人工的な画像への適用を想定している。ハッチングを用いる手法は本研究を始める以前に提案されているが、昨年度はその効果的な使用を自動的に決定する方法について取り組んだ。本年度はその手法を進化させるとともに、破線や縁取りなどハッチング以外の装飾も想定し、その装飾の効果的な利用のルールを検討している。さらに本年度の初めての進展として、色覚異常者が色空間上で失った一次元の軸を、時間軸に写像するという考えに基づき、ブリンクによって色の差異を表現する手法を考案した。色覚異常者は日常、焼肉の焼け具合やトマトの熟れ具合が分からないことに不便を感じると言われているが、それを画像のブリンクの程度に対応させることによって区別できるようにする処理を実験し、学会で発表した。画像ノイズを付加する手法およびテクスチャを用いる手法とも研究が進んでいる上に、当初計画していなかった画像ブリンクによって色の差異を表現する方法を考案し、その手法を焼肉やトマトの色変化を知るために適用した。そのために当初の計画以上に進展していると評価した。研究を進めている一つの手法は、画像テクスチャの変化で識別できない色の区別を可能にする手法である。テクスチャとして画像ノイズおよびハッチングの使用を検討・実験してきたが、今年度はハッチングより優れるテクスチャとしてドット・格子を用いたテクスチャを考案して効果を検証した。現在得られた結果をまとめており、学術論文として投稿を準備中である。一方色覚異常者が色空間上で失った一次元の軸を、時間軸に写像するという考えに基づき、ブリンクによって色の差異を表現する手法を昨年度より研究中である。この手法は主に焼肉の焼け具合とトマトの熟れ具合を色覚異常者に知らせる目的で研究しているが、本年度は実際に焼肉とトマトの反射スペクトル変化を実際に調べ、より良いブリンクを検討し効果を検証した。その結果は学会発表を予定している。また本手法を利用したスマートフォン用のアプリケーションの開発も計画している。以上の手法に加え、本年度は色覚異常者が検知できない色のエッジを抽出して輝度エッジに重畳する手法を検討中である。これは色の変化に対して色覚異常者が検知できない成分を抽出し、色覚異常者が知覚できる輝度情報として提示しようとする手法である。

この手法は画像ノイズ、あるいはドット・格子のテクスチャとまた異なる種類の画像に適している可能性があり、現在検証中である。本科学研究費は本年度が最終年度であるが、以上述べたように複数の手法について研究は継続する。本年度はそれぞれの研究フェーズが成果をまとめる段階にならなかったため学会での発表が無かったが、近々学会での発表および学術論文としての投稿を行う予定である。本研究は色覚異常者が識別できない色を、画像処理によって識別可能にする手法の研究である。この目的の画像処理として、識別できない色を識別できる色にする手法もあるが、本研究では色以外の画像属性を変化させて認知可能とするアプローチを採った。一つには画像のテクスチャを変更する方法であり、図やグラフに有効なパターンとしてドット・格子パターンを考案した。またコンピュータやスマートフォン向けの手法として、ブリンクによって差異を表示する手法も開発した。当初計画していた環境の整備と、ノイズ付加による画像処理手法の改善を達成した上、平成27年度の計画としていたハッチング付加による手法に関しても進捗があった。したがって計画以上の進展と自己評価した。画像ノイズおよびハッチングを用いる手法は引き続き研究を進め、その成果を結果を報告する。画像をブリンクさせる手法については基礎を定式化すると同時に、特に焼き肉の焼け具合やトマトの熟れ方の検知など、色覚異常者が日常で困難を感じている問題に特化した手法を確立することも目指す。さらにその手法をスマートフォンのアプリケーションとして実現することも検討する。コンピュータビジョン・画像処理今年度はノイズ付加およびハッチング付加による手法を引き続き研究し、よりその有効性を高めるとお同時に、当初28年度の計画としていた、これらの画像特徴以外の特徴の可能性を検討する。これと同時に処理画像の内容に応じた処理の変更という問題に対しても、さらに進めて研究を行う。
小胞体ストレスを起源とする神経細胞死の機序解明

本年度は実施計画に従って、以下の2つの研究テーマについて研究を進めた。1、カスペース12の活性化による細胞質へのデスシグナル伝達メカニズム;小胞体局在性の細胞死実行分子であるカスペース12のデスシグナル伝達機構を理解するため、カスペース12と結合し細胞質への移行に関与するかあるいはカスペース3の活性化に関与する分子を酵母Two-hybrid法により検索した。その結果、2つの候補遺伝子の取得に成功した。すなわち、RanBPMと新規ESTクローンである。両者はカスペース12の活性中心が存在する領域近傍に結合すること、および動物細胞内でもカスペース12との結合能力を有することが明らかになった。現在、それぞれの抗体を作成中であるが、小胞体ストレス刺激時におけるカスペース12との結合をエンドレベルで検出する実験を行う予定にしている。2、小胞体ストレス依存的に発現誘導する遺伝子の細胞死誘導メカニズム;目的遺伝子を網羅的に検索するため、PCR-Selected subtraction法により遺伝子スクリーニングを行った。その結果、発現上昇する遺伝子として14種類を同定した。そのうちから新規遺伝子MDG1/ERdj4の解析を行った。この遺伝子がコードする蛋白質はN末端側にJドメインを有しており、ヒートショック蛋白質群の活性制御に関与すること、細胞にMDG1/ERdj4を発現させておくと小胞体ストレスに対して抵抗性を示すようになることがわかった。以上の結果から、MDG1/ERdj4は小胞体ストレスに応答して発現誘導し、小胞体内腔に蓄積した折り畳みの異常な蛋白質を分解系に導くか、あるいはGRP78/BiPと協調して異常蛋白質の折り畳みを促進し、細胞傷害から保護する役割を果たしている可能性が示唆された。小胞体ストレスによって引き起こされる神経細胞死に中心的な役目を果たすカスペース12の活性化機構を明らかにできれば、小胞体を起源とする神経細胞死から救済する戦略が構築できる。そして、この研究成果は小胞体ストレスによって起こる神経難病の新たな治療法開発への道を切り開くことも可能にする。本研究ではカスペース12と結合しその活性化を制御する分子の同定を試みることと、小胞体ストレスによる神経細胞死の制御機構の解明を目指した。本研究によって得られた新知見を以下に示す。1.カスペース12と結合する分子の同定:カスペース12がCARDドメインを有することからTRAF2と結合することが予想された。実際に細胞内に両者を強制発現させて免疫共沈を行うことにより細胞内で結合することが証明された。つまり小胞体ストレスによって活性化した小胞体膜キナーゼIRE1がTRAF2をリクルートし、それがトリガーとなってカスペース12、IRE1、TRAF2による複合体形成が生じる。その結果TRAF2にリクルートしてきたカスペース12は自己切断を起こし、細胞死シグナルの活性化を引き起こすものと考えられた。2.カスペース12活性化に先行するストレスセンサーの活性化障害:家族性アルツハイマー病原因遺伝子プレセニリン1(PS1)は小胞体ストレスに対する細胞の抵抗性を減弱させ、カスペース12活性化を伴う神経細胞死を誘発する。変異PS1はカスペース12の活性化が生じる前に、ストレスセンサーのIRE1およびPERKの活性化を抑制することを見出した。この結果は、PS1による神経細胞死はストレスセンサーの機能障害を起源とすることを意味する。2.の結果については論文にまとめた。今後は小胞体ストレスによる神経細胞死のメカニズムをさらに詳細に検討するために、カスペース12の結合パートナーをさらに見出すことと、小胞体ストレスによる細胞死シグナルに関わる新規分子の同定を試みる。
光受容膜内視物質の量的変動と代謝

感桿型視細胞光受容膜内の光受容分子の変動を調べ、光受容機能の調節機構を明らかにする事を目的とし、本年度はラブドーム構造が大きく変動する動物で光受容膜内粒子数・視物質量・光感度を調べた。一方、これと並行して、視物質クロモホアを直接抽出し定量分析する方法を開発した。実験動物にはイソガニを用い、採集後25°C、DL12:12条件に2週間保った後、25°C、DD条件に移し12時間毎に眼を摘出した。ラブドーム直径は明暗条件で約2.5倍の変化があり、これは暗期には全光受容膜面積が明期の約6倍に増加している事になる。恒暗条件に移すと振幅は次第に減少するが24時間周期でのラブドーム構造変化は持続した。眼全体の視物質量は暗期は明期の1.7倍で、恒暗条件下でも24時間周期で変動した。光受容膜内粒子密度と全膜面積の値から膜内粒子総数を求めると暗期は明期の4.5倍であった。膜内粒子当りの視物質数を計算すると明期で35、暗期で13という極めて大きな値となった。この結果は、ラブドーム構造外に視物質のプールがあり、光受容膜合成時にすみやかにラブドーム構造に組み込まれてゆくという機構を示唆するものである。今回の研究は、イソガニでは光受容膜・視物質の合成と分解が内因性日周リズムの支配下にあり、これによって視細胞の光感度が調節されている事を明らかにした。視物質クロモホアはこれまでレチナールのアルデヒド基をヒドロキシルアミンでブロックし、オキシム誘導体として抽出・分析してきた。今回、これと逆に蛋白のアミノ基を大過剰のホルムアルデヒドでブロックし、レチナールそのものを抽出する事に成功した。本法による抽出とHPLCによる定量結果はオキシム法に匹適する精度であった。この方法は多くの利点があり、今後有用な手法となろう。
格子量子色力学を用いたキャビボ・小林・益川行列要素の決定

本研究の目的は、格子量子色力学によるキャビボ・小林・益川行列要素の決定である。キャビボ・小林・益川行列要素は、素粒子標準理論の基本パラメータであり、行列要素の定量的決定は素粒子論的に意義深い。研究目的達成のため、DおよびDs中間子の純レプトン崩壊を用いた行列要素Vcd、Vcsの高精度決定を試みた。最終的にVcd=0.205(6)(10)、Vcs=1.00(1)(4)を得た。本研究の目的は、格子量子色力学に基づく数値シミュレーションによるキャビボ・小林・益川行列要素の決定である。キャビボ・小林・益川行列要素は、素粒子標準理論の基本パラメータであり、行列要素値の決定は素粒子論的に意義深い。特に、行列要素の一成分である|Vcd|及び|Vcs|は実験的直接測定が難しく、理論的な決定が重要である。本研究では、格子量子色力学シミュレーションを使用した|Vcd|及び|Vcs|の高精度決定を目指す。研究目的達成のため、本年度は、D及びDs中間子の純レプトン崩壊を用いた|Vcd|及び|Vcs|の決定を行った。具体的には、格子計算によりD及びDs中間子崩壊定数を非摂動論的に求め、実験的に測定されているD及びDs中間子の純レプトン崩壊幅のデータと組み合わせ、|Vcd|及び|Vcs|を引き出した。この計算の際、チャームクォークに対して相対論作用を適用する、作用中のパラメータ及び改良係数を部分的にではあるが非摂動論的に決定する等の工夫を施した。その結果、|Vcd|及び|Vcs|を誤差5%の精度で求める事ができ、ある程度研究目的を達成できた。この成果を踏まえ、平成23年度に、D及びDs中間子のセミレプトン崩壊を用いた|Vcd|及び|Vcs|の決定を行う。この計算は、平成22年度に行った純レプトン崩壊を用いた|Vcd|及び|Vcs|計算と相補的である。両者を組み合わせ、さらなる精度向上を図る。特に、行列要素の一成分である|Vcd|および|Vcs|は実験的直接測定が難しく、理論的な決定が重要である。本研究では、格子量子色力学シミュレーションを使用した|Vcd|、|Vcs|の高精度決定を目指した。研究目的達成のため、DおよびDs中間子の純レプトン崩壊を用いた|Vcd|、|Vcs|の精度向上を試みた。キャビボ・小林・益川行列要素の決定には、DおよびDs中間子の純レプトン崩壊幅の実験値に中間子崩壊定数を組み合わせる必要がある。この中間子崩壊定数の理論的誤差削減に努めた。具体的には、チャームクォークに対して相対論的重クォーク作用を用いる事で、重クォークに起因する離散化誤差を削減した。同様に、DおよびDs中間子崩壊定数の繰り込み因子を非摂動的に決定し、繰り込み因子から生じる離散化誤差を抑えた。また、物理点直上でシミュレーションを実行し、クォーク質量の外挿による誤差を消滅させた。本研究により、最終的に|Vcd|=0.205(6)(10)、|Vcs|=1.00(1)(4)を得た。最初の括弧内数値が統計誤差、二番目の数値が系統誤差である。本研究で用いた大規模シミュレーションにより統計誤差は系統誤差を下回るに至った。より高精度のキャビボ・小林・益川行列要素を得るためには、系統誤差削減が必須である。系統誤差は、大部分が純レプトン崩壊幅の実験誤差に占められている。純レプトン崩壊幅実験値の精度向上が待たれる。これまで、特にlVcslにおいて、理論的不定性が最大誤差であったが、本研究にて大幅に改善できた。
歯根形成初期臼歯歯胚のヘルトビッヒ上皮鞘に及ぼす成長因子の影響

昨年度我々はマウス臼歯歯胚歯根形成初期においてIGF-Iが外エナメル上皮の細胞増殖を促進することでヘルトビッヒ上皮鞘(HERS)の分化調節に関わることを示唆する結果を得た。今年度はさらにHERS細胞の動態と他の因子の作用について検討した。1,成侵に伴うHERS細胞の増殖とその変化を確認するために生後5、10、15、20日のマウスにおいて腹腔内にBrdUを投与し、経時的にマウスから下顎第一臼歯歯胚を摘出・固定し、HERS細胞へのBrdU取込み数の変化を調べた。歯根形成開始期(生後5日)でBrdU陽性細胞が多く見られ、また外エナメル上皮の陽性細胞数が、時局経過ともにしだいに減少する傾向がみられた。このことはHERSの外エナメル上皮細胞が盛んに分裂を繰り返すことを意味すると考えている。2,局所的に外因性因子をデリバリーするヘパリンbeadsを用いた特殊な器官培養法を習得する機会に恵まれ、IGF-Iをしみ込ませたbeadsを生後5日齢の臼歯ヘルトビッヒ上皮鞘付近に置き、4日間培養を行った。Beadsを置いた実験群は対照群に比べヘルトビッヒ上皮鞘の伸長が顕著であることが確認できた。このことは培養液にIGF-Iを添加して行った昨年度の実験結果をより明確にした。3,IGF-I以外の外因性因子のHERSの発達に及ぼす影響を検討した。PDGFはヘルトビッヒ上皮鞘の伸長を促進する効果を、EGFは歯頚彎曲部のエナメル上皮からヘルトビッヒ上皮鞘への分化を抑制する効果が見られた。この時期の臼歯歯胚歯頚部に発現するEGFをRT-PCRで確認すると、成長と共に減弱する傾向がみられたことから、EGFもヘルトビッヒ上皮鞘の発達に何らかの影響を持つことが示唆された。先に我々が考案したin vivoと同様の立体構築を維持可能な無血清盟官培養系を用いて、生後5日齢のマウス下顎第一臼歯においてIGF-Iの影響を調べた。培養開始前に、あらかじめIGF-I receptorがヘルトビッヒ上皮鞘(HERS)に存在するかどうかを免疫組織化学的に確認した。臼歯歯胚は培養4日目で対照群に較べIGF-I添加群で歯根成長を促進していた。次にIGF-Iと共に中和抗体を添加して6日間培養を行った。実験は対照(A)群、IGF-I添加(B)群、中和抗体添加(C)群、中和抗体添加群で2日間培養後IGF-I添加群で4日間培養したIGF-Iリカバリー(D)群の4群とした。すべての群で4日間の培養に比較し歯根が伸長していた。形態観察に加え、形態計測をして比較した結果、B群はA群に較べ2倍近いHERS成長の促進が見られ、C群はA群とほぼ同様の成長に留まった。D群は培養途中で中和抗体を除くことにより、残り4日間の培養でかなりHERS成長が回復した。このことからIGF-Iが歯根,の成長、特にHERSの伸長に促進的に働くことが明らかとなった。さらに、培養1日目にBrdUを取り込ませ、HERSの細胞増殖について調べた。陽性細胞は歯髄、歯根膜、歯槽骨とHERSに見られた。HERSの陽性細胞数をカウントしてみた結果、外エナメル上皮においてA、C群とB群の間に有意の差が見られ、IGF-IがHERSの外エナメル上皮の細胞増殖に影響を及ぼしている事が示された。これらの実験からIGF-IはHERSの増殖を調節する因子として重要な役割を持っていることが判明した。

この時期の臼歯歯胚歯頚部に発現するEGFをRT-PCRで確認すると、成長と共に減弱する傾向がみられたことから、EGFもヘルトビッヒ上皮鞘の発達に何らかの影響を持つことが示唆された。