hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化管壁内神経細胞における容量性Ca流入機構の制御と機能的役割の解明

本研究の目的は壁内神経細胞における細胞外からのCa流入調節機構、容量性Ca流入の性質及び関与するチャネル分子機能を明らかにすることである。そのため、まず神経モデル細胞であるクロム親和細胞とPC12細胞を用いて、細胞外からのCa流入経路に関する研究を行った。次いで、新生ラット小腸より単離培養した壁内神経細胞の細胞内Ca動態解析並びにチャネル蛋白質候補であるTRP5遺伝子を神経細胞に発現させ機能解析を行った。その結果、1)クロム親和性細胞の電位依存性Caチャネルは内因性オピオイドペプチドによりG蛋白依存性の抑制性調節を受けていた。2)細胞内ストアからのCa放出は分泌反応に加えて細胞膜チャネル活性を制御していた。3)ラット小腸壁内神経細胞は神経特異的蛋白質PGP9.5免疫陽性を示し、この細胞はATPにより[Ca2+]l増加と内向き陽イオン電流を引き起こした4)外液Ca存在下ではATP及びタプシガルジンは持続的な[Ca2+]l増加を引き起こし、この反応は容量性Ca流入阻害薬La、Ni、SK&F96365により抑制された。5)TRP5発現PC12細胞では自発的チャネル活性の増加が見られた。更にブラジキニン、UTPによりmock細胞より大きな[Ca2+]l増加反応が生じ、TRP5がGTP結合型受容体と関連したイオンチャネルを形成する可能性が示された。9)RT-PCRによる遺伝子解析の結果、壁内神経細胞にTRP蛋白質が発現していることが明らかになった。本研究により細胞外からのCa流入経路は様々な調節を受けていることが示された。また壁内神経細胞には容量性Ca流入機構が存在し、この機構は神経伝達物質であるATPにより活性化されることが明らかになった。責任チャネル分子としてTRPの関与が示唆されたが、サブタイプの同定には至らなかった。今後は各TRPサブタイプ蛋白質の発現による機能解析やアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた変異導入細胞を用いる等の更なる研究が必要であると思われる。本研究の目的は、消化管壁内神経細胞におけるCa流入機構の性質とその細胞内制御機構並びにチャンネル分子を同定することである。本年度は神経細胞のモデルである副腎クロム親和性細胞並びにPC12細胞を用いて、細胞外Ca流入経路としての膜電位作動性Caチャネル及び受容体作動性チャネルの機能を調べた。更に、Ca流入チャネル分子の同定のため、候補蛋白質であるtransient receptor potential(TRP)遺伝子サブタイプの発現の有無を検討した。1)クロム親和性細胞の膜電位依存性Caチャネル活性は内因性オピオイドペプチドにより、可逆性に抑制された。2)オピオイドによるチャネル抑制作用は百日咳毒素処理、G蛋白質抑制薬の細胞内投与により減弱した。またN型遮断薬存在下では消失したことから、オピオイドはGTP結合蛋白質を介してN型Caチャネルを抑制することが明らかになった。3)PC12細胞をATP刺激するとP2x受容体を介して細胞外からのCa流入が生じた。4)ATPによるCa増加反応はATP除去後も持続し、この反応にはミトコンドリアのNa依存性Ca放出が関与することが明らかになった。5)TRPサブタイプに特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った結果、クロム親和性細胞にはTRP16、PC12細胞ではTRP1と2が発現していることが分かった。

現在、新生ラットの壁内神経を分離培養し、神経特異抗体を用いた形態学的な検索に加えて、細胞内Ca濃度変化の画像解析及びTRP遺伝子の発現実験を行っている。本研究の目的は消化管機能を制御している壁内神経細胞における容量性Ca流入の性質と関与するチャネル分子機能を明らかにすることである。そのため、新生ラット小腸より単離培養した壁内神経細胞の細胞内Ca動態解析と容量性Ca流入チャネル蛋白質候補であるTRP5遺伝子を神経細胞に発現させ機能解析を行い、以下の成績を得た。1)Ca蛍光指示薬を負荷した壁内神経細胞は高濃度K及びニコチンにより細胞内Ca濃度([Ca2+]I)上昇が生じた。2)ATPは濃度依存性に[Ca2+]Iを増加させ、同時に膜電位固定した細胞では内向き陽イオン電流が発生した。3)ATP及びP2Y作動薬UTPは細胞外Ca非存在下でも細胞内ストアの刺激による一過性[Ca2+]I増加を引き起こした。4)外液Ca非存在下でATP或いはストア枯渇薬タプシガルジン適用後、細胞外へCaを再導入すると持続的なCa増加が生じ、この反応は容量性Ca流入阻害薬のLa、Ni、SK&F96365により抑制された。5)ATPによる[Ca2+]I増加の大部分は薬理学的性質(作動薬、遮断薬、2価イオン感受性)、PCR解析及び免疫組織化学的検索からイオンチャネル型P2x2受容体を介することが明らかになった。6)TRP5発現細胞では自発的チャネル活性の増加により、非刺激時の[Ca2+]Iはmock細胞群に比べて有意に高かった。7)TRP5発現群ではブラジキニン、UTPによる[Ca2+]I増加は有意な高値を示し、TRP5がGTP結合型受容体と関連したイオンチャネルを形成する可能性が示された。8)RT-PCRによる遺伝子解析の結果、壁内神経細胞ではTRP蛋白質のうち1、3,4,6タイプが発現していることが分かった。本研究により壁内神経細胞において容量性Ca流入機構が存在すること、この機構は神経伝達物質であるATPにより活性化されることが明らかになったが、チャネル分子の同定には至らなかった。今後はTRP5以外の他のサブタイプ蛋白質チャネルの発現による機能解析やアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた変異導入細胞を用いる等の更なる研究が必要である。
MBE法によるビスマス系高温超伝導体の薄膜形成と新しい高温超伝導薄膜の人工設計

今年度,新たに斜方晶に歪んだペロフスカイト構造のNd:YAlO_3基板を使用することにより,Bi_2Sr_2Ca_<nー1>Cu_nO_y特有の変調構造に関し,双晶構造のない薄膜のその場成長に成功した.n=13相に関し,実際に実験を行い,その全てで成功した.特にバルク単結晶の得られないn=3相でT_c=82K(零抵抗温度),室温での抵抗率200μΩcmという良質の非双晶薄膜が得られたことは,準安定相,非平衡相の薄膜成長という観点から重要である.2.人工格子の形成n=1,2相の超薄膜(単位格子教層程度以下の薄い単結晶に近い薄膜)の作製を行い,X線回折強度のラウエ関数による振動,RHEED観測等から実際に超薄膜が形成されていることを確認した.またn=3相1単位格子とn=1相1,2,3,4単位格子との超格子を作製し,これもX線回折強度を計算値との一致から,超格子の形成を確認した.さらにCuO_2面が合計で6枚になるn=1とn=2相の超薄膜ヘテロ積層構造とも言うべき構造の作製を行った.3.薄膜の物性評価及び物性研究作製した薄膜については,超伝導と構造,膜厚との相関,面抵抗と超伝導性との相関等の基礎的研究を行った.またX線回折回折強度のラウエ関数による振動の観測により,構造の同定に非常に有効であることを示した.我々は高温超伝導体薄膜ではおそらく初めて500A^^゚を越える膜で振動を観測した.我々の薄膜はSOR光による高エネルギ-の分光測定にもたえる膜であり,測定を行った.また電子エネルギ-損失分光(EELS)による測定が薄膜,特に超薄膜,超格子,超薄膜ヘテロ積層構造の研究に有効であることを示した.今年度,新たに斜方晶に歪んだペロフスカイト構造のNd:YAlO_3基板を使用することにより,Bi_2Sr_2Ca_<nー1>Cu_nO_y特有の変調構造に関し,双晶構造のない薄膜のその場成長に成功した.n=13相に関し,実際に実験を行い,その全てで成功した.特にバルク単結晶の得られないn=3相でT_c=82K(零抵抗温度),室温での抵抗率200μΩcmという良質の非双晶薄膜が得られたことは,準安定相,非平衡相の薄膜成長という観点から重要である.2.人工格子の形成n=1,2相の超薄膜(単位格子教層程度以下の薄い単結晶に近い薄膜)の作製を行い,X線回折強度のラウエ関数による振動,RHEED観測等から実際に超薄膜が形成されていることを確認した.またn=3相1単位格子とn=1相1,2,3,4単位格子との超格子を作製し,これもX線回折強度を計算値との一致から,超格子の形成を確認した.さらにCuO_2面が合計で6枚になるn=1とn=2相の超薄膜ヘテロ積層構造とも言うべき構造の作製を行った.3.薄膜の物性評価及び物性研究作製した薄膜については,超伝導と構造,膜厚との相関,面抵抗と超伝導性との相関等の基礎的研究を行った.またX線回折回折強度のラウエ関数による振動の観測により,構造の同定に非常に有効であることを示した.我々は高温超伝導体薄膜ではおそらく初めて500A^^゚を越える膜で振動を観測した.我々の薄膜はSOR光による高エネルギ-の分光測定にもたえる膜であり,測定を行った.また電子エネルギ-損失分光(EELS)による測定が薄膜,特に超薄膜,超格子,超薄膜ヘテロ積層構造の研究に有効であることを示した.
トラフグにおけるフグ毒結合性タンパク質の分布と機能究明－性成熟の視点から

無毒養殖フグを用いた種々のテトロドトキシン(TTX)投与実験、ならびに数種天然フグとツムギハゼの体内毒分布の調査により、これらのTTX保有魚類では、成長に伴う皮/肝臓の発達、および性成熟に伴う卵巣の発達/成熟に依存してTTXの体内動態が変化することを明らかにした。一方、数種のフグを対象にTTX結合性タンパク質(PSTBP)の相同遺伝子を探索し、トラフグには3つの候補遺伝子があり、そのうち2つはタンパク質として血漿中に存在すること、他の有毒フグ3種も2ドメインタイプのものをもち、それらの糖鎖結合部位の相違が毒蓄積能に関与する可能性があることを示した。昨年度は、早熟な人工交雑フグを用いたテトロドトキシン(TTX)投与実験により、フグでは性成熟が毒の体内動態に関与することを明らかにしたが、その過程で成熟のみならず個体の成長も毒の動態に影響を及ぼすことが示唆された。そこで、6ヶ月齢と15ヶ月齢の無毒養殖トラフグを用いてTTXの経口投与実験を行い、24時間後のTTX体内分布を比較したところ、6ヶ月齢魚では皮と肝臓のTTX量はともに消化管と同程度であったのに対し、15ヶ月齢魚では肝臓のTTX量が他の部位より著しく高かった。また、6ヶ月齢魚では投与毒量の31%が蓄積しており、その71%が皮に、21%が肝臓に分布していたのに対し、15ヶ月齢魚では84%が蓄積しており、その83%が肝臓から、14%が皮から検出された。生殖腺体指数(GSI)と生殖腺組織の成熟段階は雌雄ともに両月齢魚間で大差なかったが、肝量指数(HSI)と肝細胞の直径は15ヶ月齢魚の方が6ヶ月齢魚より大きかったことから、トラフグでは肝臓の発達に伴い、それまで主に皮に移行ないし排泄されていたTTXの多くが肝臓に移行・蓄積するようになるものと推察された。一方、成熟段階毎に個体を入手することがきわめて困難なトラフグに代え、フグ以外で唯一のTTX保有魚類であり、周年的に個体を採取することが可能なツムギハゼを用いて、性成熟に伴うTTX体内分布の変化を調査したところ、卵黄形成期から産卵期盛期にかけて、性成熟(卵巣の成熟段階の進展)に伴い卵巣に移行・蓄積するTTXの割合が顕著に上昇することを見出した。フグにおけるフグ毒テトロドトキシン(TTX)の動態とそれに対する性成熟の影響解明に資するため、初年度は、人工交雑フグ(トラフグ×クサフグなど)を用いてTTX投与実験を行った。その結果、フグ体内に投与されたTTXは、血液を介してまず肝臓、次いで雄では皮、成熟が始まった雌では卵巣に移行・蓄積することがわかった。一方、TTX輸送の分子機構解明に資するため、トラフグを対象にTTX結合性タンパク質(PSTBP)の相同遺伝子を探索したところ、3つの候補遺伝子が見出され、そのうち2つはタンパク質として血漿中に存在することが明らかとなった。2年目は、成熟段階別個体の入手が困難なトラフグに代え、ツムギハゼを用いて性成熟に伴うTTX体内分布の変化を調査したところ、卵黄形成期から産卵期盛期にかけ、性成熟に伴い卵巣に移行・蓄積するTTXの割合が顕著に上昇することを見出した。一方、月齢の異なるトラフグを用いてTTX投与実験を行い、本種では肝臓の発達に伴い、それまで皮に移行・排泄されていたTTXの多くが肝臓に移行・蓄積するようになること、すなわち成熟のみならず個体の成長もTTXの体内動態に影響することを示した。最終年度は、3種のフグにつき、体格、部位別毒量、肝量指数、生殖腺体指数、および皮の組織構造を調べ、トラフグでは肝臓の発達、ヒガンフグ雌では生殖腺の発達ないし成熟、オキナワフグでは皮の発達、特に腺構造の分化が体内毒分布の差異をもたらす主要な要因であることを示唆するとともに、養殖トラフグに異なる用量でTTXを投与し、肝臓と皮ではTTXの取り込み・蓄積・排出様式が異なることを示した。一方、無毒フグ1種、有毒フグ3種につき、PSTBP相同遺伝子の存否を検討したところ、有毒3種から2ドメインタイプのものが得られ、それらの糖鎖結合部位の相違が毒蓄積能に関与するものと推察された。フグにおけるフグ毒テトロドトキシン(TTX)の動態、ならびにそれに対する性成熟の影響解明に資するため、まず、トラフグに高毒性かつ早熟なクサフグをかけ合わせて作出した人工交雑個体(トラクサ)にTTXを筋肉内投与し、生殖腺を含む各部位への毒移行プロファイルについて検討した。

その結果、筋肉内投与したTTXは、血液を介して速やかに他の部位に移行するが、卵巣への移行が際立っており、一旦肝臓に取り込まれた毒は、雌では卵巣、雄では皮に移行・蓄積することがわかった。次いで、トラフグとマフグの人工交雑個体(トラマ)を用い、より自然に近い投与法(TTX添加飼料を消化管内に経管投与する方法)でTTXを投与したところ、筋肉内投与の場合同様、消化管から吸収されたTTXは、血液を介してまず肝臓に、次いで皮膚に移行した。一方、血液を介したTTX輸送の分子機構解明に資するため、トラフグを対象に、ヒガンフグから分離されたサキシトキシン(STX)/TTX結合性タンパク質(PSTBP)の相同遺伝子を探索し、それらの無毒養殖トラフグにおける発現について調べた。すなわち、トラフグ概要ゲノムデータベースに対してPSTBPをクエリー配列としたBLAST検索を行ったところ、3つの候補遺伝子(Tr1-3)が見出された。RT-PCRにより養殖トラフグ各部位におけるmRNAの発現を調べたところ、Tr1とTr3については肝臓での発現が確認できた。さらに、血漿から得たPSTBPと同サイズ(約120 kDa)のタンパク質を硫安分画とSDS-PAGEで分離後、MALDI-QIT-TOFMS分析に付した結果、Tr1とTr3の遺伝子産物であることが明らかとなった。今年度は、成熟段階の異なる天然トラフグ個体群を入手することができず、また、Trタンパク質〔サキシトキシン(STX)/TTX結合性タンパク質(PSTBP)相同タンパク質〕に対する抗体の供給が遅れたため、当初の計画を変更して養殖トラフグ低月齢/高月齢魚へのTTX投与実験とツムギハゼの毒性調査を行った。従って、成熟に伴うTrタンパク質アイソフォームの発現状況や組織内微細分布の変化を明らかにすることはできなかったが、前述のとおり、トラフグでは成熟のみならず個体の成長も毒の動態に影響を及ぼすことを初めて明確に示すことができた。現在、雌性ホルモン(Estradiol-17ß; E2)の投与による養殖トラフグ催熟実験の準備も着実に進んでおり、3年計画全体としてみれば、おおむね順調に進展しているものと判断した。理由TTXの体内動態については、肝臓や皮を対象とした研究はあるが、今回、早熟な人工交雑個体を用いることで、卵巣にTTXが顕著に移行すること、すなわち性成熟が毒の体内動態に関わることを初めて明確に示すことができた。さらに、トラフグのPSTBP相同遺伝子については、肝臓においてmRNAレベルで、血漿ではタンパク質レベルで発現していることを明らかにできた。試料入手の都合上、天然トラフグ成熟/未成熟個体の比較を行うには至らなかったが、現在、毒投与/非投与の養殖トラフグを用いてPSTBP相同遺伝子発現状況の比較を進めており、おおむね順調に進展しているものと判断した。平成25年度は、ほぼ当初の計画に沿って、無毒養殖トラフグ2年魚を対象に、E2投与後、さらにTTXを投与する`催熟ー毒投与実験'を行い、TTXの体内分布の経時的な推移とTrタンパク質アイソフォームの発現状況を調べて、E2非投与の場合と比較する。他方、抗Trタンパク質抗体を用いてE2投与/非投与個体もしくは天然の成熟/未成熟個体における組織内Trタンパク質微細分布の差異や毒の分布との対比を明らかにし、Trタンパク質の機能や毒化における役割について総合的に考察する。平成24年度は、ほぼ当初の計画に沿って、トラフグ成熟/未成熟魚、ないし低月齢/高月齢魚につき、各部位におけるTrタンパク質アイソフォームの発現状況を、主にMALDI-QIT-TOFMSにより分析・比較していく。一方、九州大学との共同研究により、Trタンパク質に対する抗体供給の目処が立っており、これを用いてTrタンパク質の組織内微細分布についても検討を進め、毒の分布と対比することにより毒蓄積における同タンパク質の役割について推察する。
単生窒素固定菌Agospirillum属の植物根への定着機構に関する研究

(1)Agospirillum属を始めとする拾数株の最近の植物根への吸着能をトウモロコシ、白菜、陸稲で検討した結果、細菌種および植物種により吸着能が異なることが明らかになり、定着への関わりが示唆された。(3)IとIII、IV、Vの各々との混合接種時の各細菌の増殖はIII、IV、Vの場合単独時に比べて促進されたのに対し、Iの増殖は何んら影響されなかった。IIの場合、混合接種によりIIの増殖は阻害され、III IV Vの増殖は促進した。このように細菌相互の作用が見い出され、この相互作用は定着の要因となる。(4)混合接種による窒素固定能の促進は認められず、窒素源は阻害した。(5)トウモロコシ根から分泌される光合成の産物の分析結果、Glucoseが全体の80%を占め、糖と有機酸の比は3:1であった。分泌液と同じ組成の接地での各細菌の増殖および混合培養時の増殖はトウモロコシ根での結果と類似しており光合成産物組成と細菌のそれらの資化能が定着にとって重要である。(6)IV菌株の糖、有機酸の資化性を検討した結果、II、IVは糖の資化能が低く、IIは全くGlucoseを資化出来ず、これらの特性は植物根上での増殖特性および細菌相互作用を解明する手がかりとなる。(7)I、IIの糖、有機酸に対する走化性を調べた結果、資化しない物質も誘因能を有すること、また、有機酸は低濃度で誘因することから、定着の過程において走化性が一定の役割を演ずることが示唆された。窒素源制限下、【I】,【II】に対してそれぞれ【III】,【IV】,【V】を組合せ接種した。【I】,【II】は共に良好な増殖をし、【IV】,【V】は抑制され単独接種時と同様の結果で窒素源制限下での窒素固定菌の優位性が示された。【III】は【I】と共に窒素固定菌でありながら、【I】と共存すると増殖は抑制された。同様の結果は【II】+【III】でも得られ、窒素固定菌間での相互作用が示唆された。一方、窒素源存在下(非制限)では、【I】の増殖は全ての組合せにおいて抑制され単独接種時とは異っていた。これに対し、単独接種時に見られる【IV】の増殖抑制、また、窒素源制限下で見られた【I】+【III】での【III】の抑制は全て解除された。【II】は【I】と対照的に全ての場合で増殖は良好で他菌株の作用を受けないが、【I】と同様に【IV】,【III】の増殖抑制を解除し、さらに、【I】ではみられなかった【V】の抑制も解除した。従って、増殖面での菌株間の相互作用が認められると同時にその作用は窒素源存在下でより顕著に現われ、かつ、【I】,【II】でその内容が異なることが明らかになった。2.定着における菌株相互作用などを解明するため、植物根から分泌される光合成産物(細菌に対する炭素源)の各細菌の増殖(栄養)への影響を検討する必要がある。その観点から、無菌栽培トウモロコシの分泌物(炭素化合物)の分析を糖,有機酸,アミノ酸について行った。Glucoseが全体の80%で、他にArabinose,Fructose,Xyloseであった。糖に対し、有機酸は1/31/4と含有量で、Glyoxylate,Succinate,Fumarate,Pyruvateであった。アミノ酸は分析中である。1.供試菌の炭素化合物の資化性:接種した各細菌のトウモロコシ根上での増殖特性と細菌相互作用の要因として,供試菌の炭素源資化能の差異が昨年の結果で示唆さた.

また,トウモロコシ根から分泌される炭素化合物の組成も明らかになったので,それを基に供試菌の糖,有機酸の資化能を検討した. A.brasilense(I), A.lipoferum(II), P.ovalis(III), B.megaterlurn(IV),およびK.oxytoca(V)は良好に有機酸を資化した.これに対して, (I), (III)は他の菌株に比べて糖12種の内約半数以上の糖を資化出来ず,特にトウモロコシ根より多量に分泌されるGlucoseを全く資化出来なかった.このような菌株による資化能の差異は糖においてより顕著に現われた.トウモロコシ根の分泌物より成る培地を用いて,単独または混合培養時の増殖を生菌数で求めた結果,単独時の増殖パターンの差異はないが混合培養時では一方の細菌の増殖が抑制されるなど細菌相互作用が認められた.以上の結果から,炭素源の資化能は植物根上での増殖に決定的に影響を与え,定着の要因になることが明らかになった.2.陸稲根上での細菌の増殖:(1)陸稲種子の殺菌条件を再検討し,更に圃場栽培で新たな種子を得ることで無菌化が安定した.一方,カルス培養による検討の結果,カルス形成,発根などは可能となったが,それ以上の再分化は認められず組織培養による無菌陸稲の確立には至らなかった.(2)C_3, C_4植物の比較のため,トウモロコシで行った実験と同様に無菌陸稲根上での各細菌の増殖を検討した.単独細菌接種時,窒素源存在下で(III), (V)は初期生育は認められその後定常状態になるのに対し, (I)(II)(IV)は初期から抑制された.窒素源制限下では,接種後1日目で生育するもののその後定常状態になった.これらの結果はトウモロコシでの結果と非常に異っており,単独接種時にしかも窒素源存在下で生育抑制が起る現象については今後詳細な検討が必要である.(1)トウモロコシ根から分泌される炭素化合物の分析結果に基づいて、培地を調製し、その培地における供試菌の生育を検討した結果、K.oxytoca(I)を除く4株、A.frasilense(II)、A.lipoterum(III)、P.ovalis(IV)、B.megaterium(V)の生育パターンは植物根へ単独接種時に得られた生育パターンとほぼ同一であった。また、2菌株の混合培養時におけるIIの生育はI、IV、V各各と共存すると阻害されるのに対し、IIVVの生育は促進した。この相互作用は植物根接種時と同じであったが、そのパターンは若干異っていた。IIIについても同様の検討をした結果、IIVV株各々共存時にIIIの生育は抑制され、植物根への接種時と異っていた。以上の結果から、分泌された炭素源に対する菌株の資化能の違い、あるいは菌株間での炭素原資化における競合は定着の重要な要因になることが一層明らかになった。しかしながら、培養系と植物根系では栄養源の濃度や抗菌物質の分泌など他の要因の関わり方も異なるので、さらに詳細な検討が必要となる。(2)植物根に細菌が吸着する前に、Azospirillum属のように運動性を有する細菌にとって、植物根から分泌される物質に対する走化性は定着に意義を持つと考えられるので検討した。その結果、IIではGlucose、Sucrose、Glyonylateなど資化不可能な物質も菌の走化性を誘因し定着に関与することが明らかになった。また、有機酸は低濃度で誘因しIIに対して資化性と共に重要な物質であることが一層明らかになった。他方、IIIでは、糖、有機酸共に全般的に資化され、しかも誘因性も強いことから、IIとはかなり異なることが示された。このように走化性は定着に関わることが示唆され、しかも菌株によりその程度も異なる。
高度技術社会における統合的生産自動化と労働・資源・環境

高度技術社会における統合生産自動化(CIM)と労働と資源と環境の関係を、それぞれに研究グル-プを構成して研究を進行させた。1.「CIM構築が業務内容と人の意識に及ぼす影響に関するアンケ-ト調査」の実施CIMの構築が「業務内容に及ぼす影響」と「人の意識に及ぼす影響」を調査研究した。調査対象としては既にCIMを導入済か導入中の企業を選定し、その企業内の部門を調査単位とした。調査対象部門は648部門となり、回答が213部門から得られた。その結果を集計・分析して報告書を作成し、各企業にフィ-ドバックした。調査内容は、CIM導入の仕事への効果、個人への心理的効果、仕事の環境変化、仕事の制度の変化、人間側からみて望ましいCIMシステムを構築するための課題、CIM導入が人間に及ぼす影響などである。2.意思決定システムとしてのニュ-ロコンピュ-タの適用に関する研究の推進総合生産自動化における経営意思定の基幹をなす経営方針分析へのニュ-ロコンピュ-タの摘要を推進させた。一部上場企業の本年度の経営方針を前年度に継続させて調査・分析し、全産業、素材依存型産業、加工組立依存型産業に関する経営方針設定のための援用システムを構築した。研究の過程でニュ-ロコンピュ-タ活用の適用技術向上のために「中間層ノ-ドの学習過程挙動から見た解釈」に関する研究を実施した。3.多様な業務遂行能力を有する作業者に対応する人間機械系の技術的な可能性に関する研究の推進ニュ-ロコンピュ-タを中心とした学習機能付きの自動動作識別装置のプロトタイプを試作し、技術的な可能性を研究した。
精子の受精能に係わる責任遺伝子の同定とその機能解明

造精障害モデルとして片側停留精巣ラットおよび手術により片側精巣を挙上したラットを作成した。それぞれの精巣および精巣上体精子からのmRNA抽出。ラットでのプライマーであるClusterin, Protamine2, WNT5Aの3種のmRNA測定を行った。停留精巣モデル患側精巣からは造精機能が均一に傷害されJohnsen's score7であったため精子採取できず。健側での精子採取を行った。また精巣組織でのmRNAの発現変化も同時に検討を行った。Clusterinの発現については特に患側、健側と変化は認めなかった。Protamine2, WNT5Aについては停留精巣において発現の低下を認めた。精巣でのProtamine2、WNT5A、Clusterinの発現を免疫染色にて確認した。Protamine2の発現は陰嚢内に下降した精巣では精子細胞において陽性に反応した。しかし停留精巣においては全く発現していなかった。WNT5AはLeydig cellにおいて健側、患側精巣ともに陽性を示した。ClusterinはSertoli cellにおいて発現を認めたが、患側である停留精巣側の精細管内に強く発現を認めた。以上の結果から精子に認められるmRNAは精子が運ぶべきDNAや遺伝子保護をしたり、精子自身が正常に作られるためのものと考えられた。造精障害モデルとして妊娠ラットにフルタミドを投与しての片側停留精巣ラットおよび手術により片側精巣を挙上したラットを作成した。ラットでのプライマーであるclusterin,protamine2,WNT5Aの3種のmRNA測定を行った。停留精巣モデル患側精巣からは造精機能が均一に傷害されJohnsen'score7であったため精子採取できず。精巣挙上モデル患側精巣からは造精機能が不均一に傷害されJohnsen'scoreは平均7であったため精子採取できず。精子からのmRNA抽出を現在取り組んでいる。Clusterinの発現については特に患側,健側と変化は認めなかった。protamine2,WNT5Aについては停留精巣において発現の低下を認めた。更なる造精機能障害モデルとして現在精索静脈瘤モデルラットを作成中である。このモデルからも精子および精巣のmRNAを抽出していく予定である。今後,精子からmRNAを抽出することへの取り組み,工夫を行っていく。また造精機能障害モデルは障害が強くなりすぎると精子が採取できなくなる。障害の程度も精巣障害モデルの期間で検討を行っていく。また,germ cellのみではなく間質細胞であるsertoli cellあるいはleydig cellの分離を行い遺伝子発現の変化を検索する必要を検討している。ラットでのプライマーであるclusterin, protamine2, WNT5Aの3種のmRNA測定を行った。停留精巣モデル患側精巣からは造精機能が均一に傷害されJohnsen's score 7であったため精子採取できず。精巣挙上モデル患側精巣からは造精機能が不均一に傷害されJohnsen's scoreは平均7であったため精子採取できず。/また精巣組織でのmRNAの発現変化も同時に検討を行った。精巣でのprotamine2、WNT5A、clusterinの発現を免疫染色にて確認した。protamine2の発現は陰嚢内に下降した精巣では精子細胞において陽性に反応した。WNT5Aはleydig cellにおいて健側、患側精巣ともに陽性を示した。clusterinはsertoli cellにおいて発現を認めたが、患側である停留精巣側の精細管内に強く発現を認めた。
原子間力顕微鏡の地質学における有効利用

原子間力顕微鏡を使用して、岩石・鉱物の表面形状を精密に調べる方法について検討した。特に石英の表面形状について詳しく検討した。1.超微小硬度計による圧痕の状況を調べるのに、表面形状のコンターを描く方法が便利であると考え、マットラブ(コンピュータ計算ソフト)を用いてコンターをカラーで表現する方法を検討した。その結果、35ナノメートルの間隔で等高線を描くことができた。その結果は、超微小硬度計によるビッカース圧痕の周りで起こった遅れ破壊の状況を描き出すのに役立った。この結果は目下投稿中の論文に掲載した。2.上記の研究の際に、結晶表面をナノスケールで平滑にするべく研磨するのが意外に困難であることに気がつき、いろいろな方法を試した。3種類のアルミナ懸濁液を利用し、徐々に細かな懸濁液を使う方法が良さそうであることがわかった。3.点接触変形で形成された圧痕に0.1規定のフッ化水素を作用させ、化学腐食の表面形状について検討した。これについては、原子間力顕微鏡像の読み込み制度の問題と、操作上の問題が解決されず、いまだコンター図を作れていない。今後の課題としたい。4.貝殻の裏側を原子間力顕微鏡で予察的に観察を行った。あまりにスケールが違うので、電子顕微鏡で見ているものと、原子間力顕微鏡で見ている者の対応がつかず、難航中である。レーザー顕微鏡のような、電子顕微鏡と原子間力顕微鏡の中間的な顕微鏡があれば解決するかも知れない。5.液体観察モードようの設備を購入した。今後、観察中に乾燥するような、安定して観察ができない物体についての観察の道が開けると考える。本研究では、原子間力顕微鏡がどのくらい地質学・地球科学の観察に有効であるのかを検証中である。結晶(石英、電気石、ざくろ石、藍閃石)の表面を原子間力顕微鏡で観察すると、やはり一見平らに見えても若干の凹凸があることがわかる。凹凸が結晶内の転位とどのように関係しているのかについてはまだ不明である。石英を研磨し、そこに超微小硬度計でビッガース圧痕をあけた試料の観察では、圧痕がきちんとしたピラミッド状になっていることを確認した。また、この試料をHF溶液1Nで溶解させる実験を行った。その結果、圧痕内部が外部の平面に比べて著しく溶解されやすいことがわかった。溶解された面は、フランボイダル状になっており、溶解が不規則に進行していることを想像させる。このような研究にも原子間力顕微鏡は強烈な能力を発揮できることがわかった。有孔虫の殻表面の観察を原子間力顕微鏡で行った。倍率が大きすぎたためか、どのような位置を観察しているのかわからないので、現状では十分有効利用できていないが、今後引き続き同様の検討を行う予定である。また二枚貝の貝殻の裏側の光沢面を観察した。これまで見たことがないような異様な球状の顆粒がたくさんあることがわかった。この貝殻でも有孔虫と同様で、どこを見ているのかわからなくなってしまった。わからなくなった最大の理由は、想像していたものと全く違ったイメージ像が原子間力顕微鏡の観察で得られたからである。通常の走査型電子顕微鏡と原子間力顕微鏡の中間くらいの倍率の顕微鏡(例えばレーザー顕微鏡)で観察し、橋渡しをする必要を感じた。これは来年度への課題である。今後の課題としたい。
タスクに基づくライティングテストにおける自動評価採点システムの開発

本研究では、タスクに基づくライティングテストに特化した「コンピューターによる自動評価採点システム」の開発を進めた。ライティング評価を予測する言語的特徴として抽出された客観的評価指標(特徴量)により、総合評価を6169%予測できる回帰式を作成することができた。しかし、予測精度をより向上させるために、1) Accuracyタスクの「言語的正確さ」の評価において、語彙や文法、スペル句読法などにおける誤りを特定し、統計指標化する方法を考案すること、2) Communicabilityタスクの「情報伝達効果」の評価において、課題との関連性を判定し統計指標化する方法を考案する必要性が示唆された。ライティングテストの自動評価採点システム構築に向けての初年度であり、まずサーバー専用コンピューターの研究室設置を終え、プログラム開発に向けてハード面の準備を完了した。次に、自動採点の対象となる評価タスクの開発に取り組み、これまでの研究において、信頼性・妥当性の検証を終えている評価タスクと同等の困難度を持つタスクの開発に成功した。具体的な研究内容については、学会で発表を行い、その後投稿し、学会誌に掲載された。引き続き、英文における自動評価採点システムに関する研究動向を把握するために必要な文献等の収集を行った。特に、システム構築の基盤となる言語的特徴数値化の指標に関して先行研究からの絞り出しを行い、その結果として「語数」「1文あたりの従属節数」「使用語彙の難易度」が有効な指標となり得る可能性が高いことを確認した。しかし、これらの指標の有効性に関しては実データに基づいて検証する作業が不可欠であり、そのためのウェブ・サイト構築に取り組んだ。具体的には、評定者トレーニングをかねて、オンラインでライティング・サンプルの評定を依頼し、それぞれの指標に基づいて段階化されたサンプルに対して、日本人英語教師が行った評定結果を分析する作業となる。現在、公開前準備の最終段階にあり、近日中に実証実験開始の手続きに入る予定である。さらに、自動評価採点システムにおけるテキスト処理に使用するプログラムについて、情報収集を行った。平成26年度研究においては、日本人英語学習者のライティングによる言語運用能力の測定・評価を目的とする「タスクに基づくライティング・テスト(Task-Based Writing Performance Test: TBWT)」の評定者を対象として、トレーニング・プログラムの開発を試みた。また、多忙な教育現場の教師たちが一堂に会して評定者トレーニングに参加することは現実的に困難であることを考慮して、オン・ラインでの実施形態を模索した。開設したウェブ・サイトで、このTBWT評定者トレーニングを実際に行った英語教師からのフィードバックに基づき、オン・ライン評定者トレーニングに対する英語教師の評価について報告を行った。さらに、TBWTに特化した「コンピューターによる自動評価採点システム」を構想するためには、構成概念であるAccuracy, Communicabilityそれぞれの評価規準に適合する言語的特徴数値化のための客観的評価指標を設定することが最重要課題となる。そこで、自由英作文評価における統計指標(特徴量)として妥当性が実証された言語的特徴の中から、TBWTの評価規準(評価の観点)に適合する複数の言語的特徴を抽出し、それらの特徴量とタスクの総合的評価との相関分析によって客観的評価指標としての妥当性を検証し、重回帰分析によって総合的評価を予測する回帰式を作成しその回帰式の有用性検討を行った。本研究は、客観性および有用性の高いライティングテストの評価採点システムを構築することを目的として行った。評定者要因による影響を除外したより客観的で実用的なライティング・パフォーマンス評価の実現を目ざし、これまで5年間をかけて開発を行ってきた「タスクに基づくライティングテスト(TBWT)」に特化した「コンピューターによる自動評価採点システム」の応用開発に取り組んだ。今次研究により構築されたTBWT自動評価採点システムのウェブサイト(http://www.meijigakuin.ac.jp/ysugita)へのアップロードを完了し、実用化に向けて最終的な検証実験を行う段階までに至った。今年度は、過去に実施されたTBWTにおける評定者(中学校教員)の評価と自動評価採点システムによる評価との相関の度合いを指標として信頼性の検証を行った。Accuracyタスクでは「総語数」と「使用単語のレベル」が、Communicabilityタスクでは「使用単語のレベル」と「アイディア数」が信頼性の高い客観的指標であることが確認された。妥当性の検証に関しては、「オンライン自動採点システム(Criterion)」による6段階の全体的評価法のスコアとTBWT自動評価採点システムの評価結果との相関から併存妥当性について検討を行った。その結果、それぞれのタスクの評価を予測する回帰式による予測得点とCriterionスコアには中程度以上の相関があり、有用性があると判定された。3年間の年次計画に沿って研究を推進し、構想していた自動評価採点システムを実際に構築し、小規模ながら検証実験を行うまでに至ることができたため。本研究は、客観性および有用性の高いタスクに基づくライティングテスト(Task-based writing test: TBWT)に特化した「コンピューターによる自動評価採点システム」を構築することを目的として行った。開発した自動評価採点システムのウェブサイトへのアップロードを完了し、過去に実施したテスト結果に基づく検証実験を行ったではところ、ライティング評価を予測する言語的特徴として抽出された客観的評価指標(特徴量)により、総合評価を6169%予測できる回帰式を作成することができた。

この検証結果を4月開催の国際学会において発表するために研究期間の延長手続きを行った。本研究では、タスクに基づくライティングテストに特化した「コンピューターによる自動評価採点システム」の開発を進めた。ライティング評価を予測する言語的特徴として抽出された客観的評価指標(特徴量)により、総合評価を6169%予測できる回帰式を作成することができた。しかし、予測精度をより向上させるために、1) Accuracyタスクの「言語的正確さ」の評価において、語彙や文法、スペル句読法などにおける誤りを特定し、統計指標化する方法を考案すること、2) Communicabilityタスクの「情報伝達効果」の評価において、課題との関連性を判定し統計指標化する方法を考案する必要性が示唆された。コンピューター利用による自動採点システム構築に向けて、客観的評価指標(特徴量)の抽出が完了した。また、平成26年度の研究計画としていた過去に実施された中・高教員によるTBWT評価との相関による自動評価採点システムの信頼性およびオンライン自動採点システム(Criterion)による評価結果との相関による併存的妥当性の検証までを終えることができたため。予測精度をより向上させる客観的統計指標(特徴量)についての検討として、1) Accuracyタスクの「言語的正確さ」の評価において、語彙や文法、スペル句読法などにおける誤りを特定し、統計指標化する方法を考案すること、2) Communicabilityタスクの「情報伝達効果」の評価において、課題との関連性を判定し統計指標化する方法を考案すること。および自動評価採点システムによる総合評価の信頼性・妥当性や予測式の有用性に関する実証実験の実施。英語教育学平成26年度までの信頼性・実用性の検証結果に基づいて、必要なプログラムの修正を試みる。また、実用性の検証に関しては、一定規模の受験者を対象としてTBWTのオンライン受験を依頼して、自動採点システムの稼働状況および処理結果等の分析を行う。さらに、3年間の研究内容を報告書としてまとめ、実用化に向けての課題明確化を行う。言語的特徴数値化のための統計的指標の絞り出しに、想定以上の時間がかかっている。また、絞り込まれた指標の適切性については、検証実験が必要であり、そのためのウェブ・サイト構築に時間を要した。今後、サイトを通じてデータ収集を行い、検証作業を進める。なお、プログラミングに関する資料収集等が不十分であるため、並行してその収集にあたる。3年間の研究成果発表の機会となる第50回国際英語教育学会(イギリス)が2016年4月1215日開催となるため。
ジオデモグラフィクスの国際比較研究

本研究では、欧米の最新のジオデモグラフィクス研究や社会地図に関する研究の動向を展望すると共に、日本および海外諸国のジオデモグラフィクスを構築し、ジオデモグラフィクスの国際比較を行うことを目的とする。国際比較には、ジオデモグラフィクスの先進国である英国と米国を、さらにジオデモグラフィクスの構築に必要な国勢調査データやGIS地図データを整備した。3年間の研究期間においては、初期の段階で、1)英米における地理情報科学としてのジオデモグラフィクス研究のレビューと、2)社会地図としてのジオデモグラフィクスの地図表現方法に関するレビュー行い、3)対象候補国のジオデモグラフィクス整備状況の調査、そして4)各国のジオデモグラフィクスの国際比較を行う。最終的には、日本、英国、米国の3国を対象に、共通の居住者特性に関わる変数を選択して(英国のOutput Area Classificationをベースに)、同一の地区類型に基づいた国際ジオデモグラフィクスの構築を目指した。本年度は、日本のジオデモグラフィクスの構築・表示のための準備と、国際比較のためのデータ収集を主に行った。その研究実績は以下のようである。1.日本のジオデモグラフィクス(1)1995年・2000年国勢調査小地域統計の町丁・字等集計のデータベースの整理(2)日本の代表的なジオデモグラフィクスの入手:MosaicJapan(Experian社)、Cameo(GMAP社)を入手し、GIS化を行った。(3)ジオデモグラフィクスの地図化システムの構築:Google MapsやGoogle Earthを用いた、ジオデモグラフィクスの表示システムを構築した。2.海外のジオデモグラフィクス(1)英国のセンサスデータのダウンロード(Output Areas)、MosaicUK(Experian社)の購入、英国における(3)アイルランドのセンサスデータの調査(アイルランド国立大学Maynooth校NCG)、MosaicRepublicOfIreland(Experian社)の購入3.ジオデモグラフィクス研究の動向調査(1)8月中旬に、米国センサスおよびジオデモグラフィクスの状況を調査するために、ESRI User Conferenceに参加し、米国センサス局と、Tapestryの開発者***と意見交換を行った。(2)英国センサスおよびジオデモグラフィクスの状況を調査するために、ロンドン大学UCLのCASAにおいて、Paul LongleyやRichard Webberらとの意見交換を行った。(3)アイルランド・センサスおよびジオデモグラフィクスの状況を調査するために、アイルランド国立大学Maynooth校NCGにおいて、A.Stewart FotheringhamやMartin Charltonらとの意見交換を行った。4.ジオデモグラフィクス・セミナーの開催UCLのRichard Webber教授とMaurizio Gibin博士を招聘し、京都と東京でセミナーを開催した。今年度は、昨年度から継続して、国内外の小地域レベルでの国勢調査データやジオデモグラフィクスの収集を行った。現時点で収集されている関連データは、以下のようである。【日本】データ:2000年国勢調査小地域統計(全国)、モザイク・ジャパン、カメオ・ジャパンGIS:境域データ(全国)、国際航業・アルプス社・昭文社の町丁目境界データ【他】アイルランド:Mosaic Republic of Ireland英国のOutput Area Classification(OAC)を作成するために用いられた入力41変数(人口、家族構成、住宅、社会経済、雇用)をベースとして、英国、日本、米国に共通の変数を設定し、英国のOutput Area、日本の町丁・字等、米国のBlock Groupの空間単位で、全国レベルでのジオデモグラフィクスを構築するためのデータ整備を行った。また、日本ではジオデモグラフィクスの実戦的利用例が乏しいため、日本ではジオデモグラフィクスの実戦的利用例が乏しいためジオデモグラフィクスの地区類型との関係を試験的に検討する次の統計資料を収集した;(1)企業保有の情報(矢野担当)、(2)犯罪や保健医療(中谷担当)、(3)地価や賃貸料データ(磯田担当)。この他、ジオデモグラフィクス研究の応用としての名前分析の構築と国際比較のためのデータベース構築し、日本語の苗字のローマ字化を行った。また、日本における名字分布の空間的特徴を明らかにした。さらに、ジオデモグラフィクスの地図表現とWeb配信のために、Google MapsやGoogle Earthなどを用いたWeb配信システムの構築を行い、試験的な配信を試みた。〔研究協力者〕立命館大学文学部講師瀬戸寿一ジオデモグラフィクスのWeb配信システムの構築立命館大学大学院桐村喬日本のジオデモグラフィクスの構築今年度は、これまでに構築してきた、日本、英国、アメリカ合衆国における国勢調査小地域統計をベースに、ジオデモグラフィクスの国際比較を行った。地区類型を作成する変数としては、英国Output Area Classification(OAC)で用いられた41変数を参考に、日本とアメリカ合衆国の国勢調査の変数を選択した。

小地域の空間単位に関しては、日本(2000年)は20.2万町丁・字等を、英国(2001年)は22.7万Output Areaを、アメリカ合衆国(2000年)は21.1万Block Groupを、それぞれ用いた。この3つの巨大なGISデータから、当該の41変数のデジタル社会地図を作成した(未公開)。さらに、これらの地理行列を個別にまたは統合してクラスタリングを実行し、OACのような地区類型のジオデモグラフィクスを構築している。この作業は現時点では終了していないが、現在進行中で、1年以内に結果をまとめて、公表する計画である。なお、英国UCLのCASAのPaul Longley教授らと共同で行っている国際的な名前研究では、日本の名前GISデータ(4千5百万件)を提供することで、さらなる国際的な比較研究の可能性が明らかになった。また、最終年度としてジオデモグラフィクスを用いた応用研究として、国内では、医療分野での応用、草津市の商業環境への応用、住宅市場への応用などを行った。こうした応用研究の成果が、今後のジオデモグラフィクス研究の発展に不可欠であることがわかった。さらに、国内のジオデモグラフィクスの地図表現とWeb配信のために、Google MapsやGoogle Earthなどを用いたWeb配信システムの構築も行い、その有効性を確認した。
Rabファミリー低分子量G蛋白質による細胞極性・接着の制御機構

多細胞生物の組織・器官形成において必須の細胞間接着装置であるタイトジャンクション(TJ)が形成・維持されるためには、TJを構成する膜蛋白質が細胞膜まで小胞輸送されてTJへ定着することが必須である。細胞内小胞輸送の制御系であるRabファミリー低分子量G蛋白質(Rab)には60以上のメンバーが同定されており、個々のメンバーが特定の細胞内部位に局在して特定の小胞輸送経路を制御している。そこで、本研究では、TJの形成・維持という観点から、TJに局在するRab3BとRab13の作用機構を明らかにすることを試み、以下の結果を得た。1)Rab3Bは側基底側膜蛋白質(LDL受容体)の、Rab13はTJ膜蛋白質(クローディン)のゴルジ体から細胞膜への輸送を、それぞれ特異的に制御することを明らかにした。2)極性化した上皮細胞において、TJ膜蛋白質クローディン、オクルーディンおよびJAMのうち、オクルーディンが常に細胞膜とエンドソームの間をリサイクリングしていた。3)Rab13はオクルーディンのリサイクリングを制御するが、Rab3Bは関与しなかった。4)Rab13のオクルーディンの小胞輸送に対する作用は、そのエンドサイトーシスではなくリサイクリングであることを明らかにした。5)Rab13は、側基底側細胞膜へリサイクリングしているトランスフェリン受容体には作用せず、オクルーディンを含む輸送小胞のリサイクリングを特異的に制御していると考えられた。6)オクルーディンのリサイクリングに対するRab13の作用を担っていると考えられる標的蛋白質の同定に成功した。これらの結果から、TJに局在するRab3BとRab13はそれぞれ異なる小胞輸送経路を制御すること、さらにTJ膜蛋白質は頂端側および側基底側膜蛋白質とは異なる経路で細胞膜へ輸送されていることが示唆された。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。多細胞生物の組織・器官形成において必須の細胞間接着装置であるタイトジャンクション(TJ)が形成・維持されるためには、TJを構成する膜蛋白質がTJまで細胞内小胞輸送されて定着する必要がある。そこで、本年度の本研究では、TJの形成・維持という観点から、TJに局在するRab3BとRab13の作用機構を明らかにする目的で、それらが制御する輸送小胞およびその積み荷蛋白質を明らかにすることを試み、以下の結果を得た。1)アピカル側(p75NTR)、バソラテラル側(LDLR)およびTJ膜蛋白質(Claudin1)の小胞体ゴルジ体細胞膜間小胞輸送を定量的に解析する実験系を確立した。2)この実験系を用いて、Rab3Bは、LDLRのゴルジ体細胞膜間輸送を、Rab13は、Claudin1のゴルジ体細胞膜間輸送をそれぞれ特異的に制御することを明らかにした。3)エンドサイトーシスを定量的に解析する実験系を確立し、TJ膜蛋白質(Occludin)がエンドサイトーシスされることを明らかにした。4)リサイクリングを定量的に解析する実験系を確立し、Occludinがリサイクリングされることを明らかにした。

これらの結果から、Rab3BとRab13はそれぞれ異なる小胞輸送経路を制御し、また、TJ膜蛋白質はアピカル側およびバソラテラル側膜蛋白質とは異なる経路で細胞膜へ輸送されていることが示唆された。このように、本年度の研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。哺乳動物の発生・分化においては、上皮細胞の極性や細胞間接着がダイナミックに再編成されており、上皮細胞膜を頂端側と側基底側に分離する細胞間接着装置タイトジャンクション(TJ)も、ダイナミックに分解・再形成されている。このためには、TJを構成する膜蛋白質が細胞膜まで小胞輸送されてTJへ定着する必要がある。細胞内小胞輸送の制御系であるRabファミリー低分子量G蛋白質(Rab)には60以上のメンバーが同定されており、個々のメンバーが特定の細胞内部位に局在して特定の小胞輸送経路を制御している。そこで、本年度の本研究では、TJの分解・再形成という観点から、TJに局在するRab3BとRab13の作用機構を明らかにすることを試み、以下の結果を得た。1)極性化した上皮細胞において、TJを構成する接着分子クローディン、オクルーディンおよびJAMのうち、オクルーディンが常に細胞膜からエンドソームヘエンドサイトーシスされ、再びエンドソームから細胞膜へリサイクリングされていることを明らかにした。2)Rab13はオクルーディンのリサイクリングを制御するが、Rab3Bは関与しないことを明らかにした。3)Rab13のオクルーディンの小胞輸送に対する作用は、そのエンドサイトーシスではなくリサイクリングであることを明らかにした。4)Rab13は、側基底側細胞膜へリサイクリングしているトランスフェリン受容体には作用せず、オクルーディンを含む輸送小胞のリサイクリングを特異的に制御することを明らかにした。5)オクルーディンのリサイクリングに対するRab13の作用を担っていると考えられる標的蛋白質の同定に成功した。これらの結果から、TJに局在するRab3BとRab13はそれぞれ異なる小胞輸送経路を制御すること、さらにTJを構成する接着分子は頂端側および側基底側膜蛋白質とは異なる経路で細胞膜へ輸送されていることが示唆された。