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マントル物質の高圧相転移・ダイナミックスの解明と新規ポストスピネル相の探索と物性

研究課題のAB2O4新規ポストスピネル相の探索に関して、合成に成功した未知相であるMgFe2O4高圧相について、バイロイト大学バイエルン地球科学研究所で透過型電子顕微鏡を用いて、格子定数、空間群の決定を行った。その結果、格子定数、空間群は粉末X線回折から得られた結果と一致していることが分かった。現在、粉末X線回折データから結晶構造の決定を試みている。その他に、新たにCaFe2O4型MnCr2O4、CaTi2O4型FeV2O4新規高圧相の合成に成功した。以上の結果は、ポストスピネル相の安定性を理解する上で重要な結果である。これらの結果について国際誌に論文投稿する予定である。また、MgCr2O4の高圧相として本研究により発見されたMg2Cr2O5の結晶構造解析を透過型電子顕微鏡(TEM)法と単結晶X線回折法から行った。高分解能TEM像から微細構造モデルを立て、そのモデル構造が特異な制限視野電子線回折パターンを良く説明することができることを明らかにした。単結晶X線回折からは、平均的な構造が粉末X線回折から得られる構造と同じであることを確かめ、粉末X線回折よりも精密に結晶構造に関するパラメーターを決定した。この結果は、結晶化学的に珍しい発見であり、この内容に関して国内の学会で発表するとともに、現在国際誌への投稿の為、論文を執筆中である。また、前年度に明らかにしたマントル岩石であるパイロライト、ハルツバージャイト、中央海嶺玄武岩の16002200°Cでのマントル660 km不連続面付近の高温高圧相関係について、新たに約1220 GPaでの高温高圧相関係を決定した。この結果は、沈み込むプレート、マントル上昇流中の鉱物組み合わせを下部マントル最上部まで明らかにした点で重要である。この内容に関して、国内の学会において発表を行い、現在論文を執筆中である。上記の内容とこの3年間で得られた結果を総括し、博士論文を執筆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究課題であるAB204新規ポストスピネル相の探索(FeCr204、MgCr2O4)とその相関係の決定、また、LaCrO_3ヒーターを用いた高圧下における超高温発生技術の開発を行った。新規高圧相の良質なX線回折パターンを得るため、同大学物質科学系研究室、物質材料研究機構の協力のもと、SPring-8で放射光粉末XRDパターンを測定した。また構造解析における必須技術の一つである透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた制限視野電子線回折(SAED)技術とその観察用薄膜試料作成法の習得を、共同研究者の下で行った。なお、修士課程までの結果を基に英文論文を執筆し、Earth Planet.Sci.Lett.に投稿して2012年内に掲載された。MgCr2O4系では、CaTi2O4型MgCr2O4とMg2Cr2O5相の合成に成功した。Mg2Cr205相はTEMによるSAED測定で、特異なSAEDパターンを観測し、結晶学的に特異な構造の可能性を示唆している。今後SAEDパターンの解析から、構造決定を行う。これらの結果から、隕石中で発見されたFeCr2O4に富む2つの高圧相は18GPa以上で生成したことが示唆される。また、本研究から(Mg,Fe)2Cr2O5+Cr2O3の安定領域の存在が考えられるため、超高圧クロミタイトのマントル深部循環説に否定的な結果となった。これらの結果について、国内学会と国際学会で発表し、現在それぞれ英文論文を執筆中である。LaCrO3ヒーターを用いた高圧下における超高温発生技術の開発では、2500°Cまでの安定した長時間温度保持を可能にした。これにより、マントルの局所的高温領域を実験室で再現することを可能にした。今後この技術を用いて、マントル岩石の高温高圧相関係決定を行う。研究課題について下記に詳細な成果を示す。また、昨年度行ったMgCr2O4の相関係と新規ポストスピネル相の構造解析について、American Mineralogistに投稿した。前年度に決定した変形CaFe2O4型FeCr2O4について、高温高圧下の結晶構造を調べるため、岡山大学地球物質科学研究センターの研究グループの協力のもと、SPring-8での高温高圧下その場観察実験を行うための技術習得とその実験で得られるエネルギー分散型XRDデータを取得した。その結果、一気圧では、変形CaFe2O4型構造だが、高温高圧下ではCaFe2O4型構造であることがわかった。その他得られた結果と組み合わせることで、鉱物学・阻石学・結晶学的に様々な応用が可能である。この結果について、国内学会で発表し、英文論文(雑誌名: American Mineralogist)も受理された。Mg2Cr205の結晶構造について透過型電子顕微鏡を用いて調べた。その結果、この物質の微細構造は、反位相境界を有する結晶学的に珍しい特徴を持っていることがわかった。現在、更に詳細な観察を進めている。また、この物質の単結晶X線回折測定を行った。MgFe2O4系については相関係を決定し、また2つの新規MgFe2O4高圧相とMg2Fe205高圧相の合成に成功した。今後透過型電子顕微鏡を用いて、空間群を制約する。マントル岩石(パイロライト、ハルツバージャイト、MORB)について、高圧相関係を決定した。

その結果、1600°Cにおける深さ660km付近のパイロライトの密度は、ハルツバージャイトとMORBより高密度であることが本研究による詳細な比較から明らかになった。この結果は、マントルにおける物質循環を制約するために重要な結果である。この結果について、国内学会で発表し、現在英文論文を執筆中である。研究課題のAB2O4新規ポストスピネル相の探索に関して、合成に成功した未知相であるMgFe2O4高圧相について、バイロイト大学バイエルン地球科学研究所で透過型電子顕微鏡を用いて、格子定数、空間群の決定を行った。その結果、格子定数、空間群は粉末X線回折から得られた結果と一致していることが分かった。現在、粉末X線回折データから結晶構造の決定を試みている。その他に、新たにCaFe2O4型MnCr2O4、CaTi2O4型FeV2O4新規高圧相の合成に成功した。以上の結果は、ポストスピネル相の安定性を理解する上で重要な結果である。これらの結果について国際誌に論文投稿する予定である。また、MgCr2O4の高圧相として本研究により発見されたMg2Cr2O5の結晶構造解析を透過型電子顕微鏡(TEM)法と単結晶X線回折法から行った。高分解能TEM像から微細構造モデルを立て、そのモデル構造が特異な制限視野電子線回折パターンを良く説明することができることを明らかにした。単結晶X線回折からは、平均的な構造が粉末X線回折から得られる構造と同じであることを確かめ、粉末X線回折よりも精密に結晶構造に関するパラメーターを決定した。この結果は、結晶化学的に珍しい発見であり、この内容に関して国内の学会で発表するとともに、現在国際誌への投稿の為、論文を執筆中である。また、前年度に明らかにしたマントル岩石であるパイロライト、ハルツバージャイト、中央海嶺玄武岩の16002200°Cでのマントル660 km不連続面付近の高温高圧相関係について、新たに約1220 GPaでの高温高圧相関係を決定した。この結果は、沈み込むプレート、マントル上昇流中の鉱物組み合わせを下部マントル最上部まで明らかにした点で重要である。この内容に関して、国内の学会において発表を行い、現在論文を執筆中である。上記の内容とこの3年間で得られた結果を総括し、博士論文を執筆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。粉末X線構造解析と透過型電子顕微鏡による制限視野電子線回折の技術習得により、新規ポストスピネル相の合成に関しては当初計画していた組成で、4つの新規高圧相の合成に成功した。この技術は、今後さらに新規相探索を円滑に進めていく上で必要なため、平成24年度にこの技術を習得できたことで今後の研究の進行を促進させることができると考えられる。また、LaCrO3ヒーターを用いた高圧下での超高温発生技術の開発に成功したため、研究課題の一つであるマントル岩石の高圧相転移に関する研究を今年度の初めから進めていくことができるため、計画通りに研究を進められると言える。昨年度習得した透過型電子顕微鏡の技術を新規ポストスピネル相の微細構造の観察に応用でき、一般的な酸化物では報告されないような特異な構造を有することを発見した。これは習得技術が本研究計画の円滑な進行に貢献したと言える。
抗炎症・抗酸化物質と超音波エネルギーの相乗効果に着目した筋萎縮予防法の創成

敗血症や癌性カヘキシーで生じる炎症性筋萎縮に対する抗炎症・抗酸化物質、超音波照射の抑制効果を検証し、消耗状態の患者に適用できる非侵襲的な治療手段の確立を目指した。炎症刺激物質であるリポポリサッカライドの添加によって筋管細胞の萎縮が惹起された。短鎖脂肪酸の酪酸、ω-3系多価不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、カルテノイドのアスタキサンチンが炎症性筋萎縮を有意に抑制した。脂肪酸においては、高濃度添加によって筋萎縮が増悪し、適切な用量管理の必要性が示唆された。低強度超音波による炎症性筋萎縮の抑制効果、および酪酸のヒストンアセチル化作用に対する超音波照射の促進効果が明らかになった。<細胞培養の実施>筋芽細胞株C2C12を10%FBS含有の増殖培地にて90%コンフルエントまで増殖させた状態で、24%HS含有の分化培地での培養を開始することで筋管細胞に分化することが確認され、実験に用いる培養系が確立した。<筋萎縮モデルの確立>リポポリサッカライド(LPS)を筋管細胞に添加して、p38 MAPKの活性化により萎縮が惹起されることが確認された。<脂肪酸濃度の検討>短鎖脂肪酸(酪酸、プロピオン酸)、ω-3系多価不飽和脂肪酸(ドコサヘキサエン酸;DHA、エイコサペタエン酸;EPA)ともに、高濃度の適用によって酸化ストレスが生じ、細胞障害性を示すことが報告されている。4 mM以上の酪酸、および100μMのDHA、EPA添加で筋管細胞の萎縮が確認された。低濃度の脂肪酸を用いて抗炎症作用、および筋萎縮予防効果の検討を行う必要性が示唆された。<in vivoモデルの確立>ラットに対するLPS腹腔内投与により,筋萎縮が惹起されることを確認した。筋管細胞の培養系およびLPSによる筋萎縮モデルを確立することができ、それに対する超音波療法の効果を検出できた。抗炎症作用による筋萎縮抑制を期待する短鎖脂肪酸、ω-3系多価不飽和脂肪酸については、脂肪酸による筋萎縮抑制作用の検出には至らなかったが、筋管細胞に対して適用可能な濃度が明らかになり、萎縮の定量方法も確立したため、次年度以降の実験を円滑に行うための基盤が構築された。また、in vitro実験の次に予定しているin vivo実験で採用するモデルの適切性がすでに確認された。これらの点から、おおむね順調に進展していると判断した。<細胞培養の実施>前年度確立したC2C12筋芽細胞を用いた培養系にて筋管細胞への分化が安定して行えており、継続的に実験を行えている。<筋萎縮モデルの確立>前年度確立したリポポリサッカライドを用いた実験系にて、再現性のある筋萎縮を惹起できている。<超音波照射による筋萎縮予防効果>前年度明らかになった超音波照射による炎症性筋萎縮の予防効果について、超音波の機械的刺激がintegrinの裏打ちタンパクであるfocal adhesion kinaseを活性化することが機序として明らかになった。<脂肪酸による筋萎縮予防効果>前年度明らかになった萎縮を惹起する濃度(短鎖脂肪酸:酪酸4mM、ω-3系多価不飽和脂肪酸:ドコサヘキサエン酸およびエイコサペタエン酸100uM)より低い濃度にて、炎症性筋萎縮に対する各種脂肪酸の予防効果を検討した。1mMの酪酸、2550uMのドコサヘキサエン酸およびエイコサペタエン酸が萎縮を予防することが確認された。萎縮の定量は、筋管細胞径および筋原線維タンパク量を指標にして解析した。なお、予防効果が認められた濃度域では、細胞傷害性は認められなかった。<in vivoモデルでの検討>酪酸のトリグリセライドであるトリブチリンの経口摂取が、LPS誘導性(腹腔内投与)筋萎縮を予防することが確認された。前年度安定した実験系が確立できたため、今年度各種脂肪酸の筋萎縮予防効果を明らかにすることができたが、超音波療法との併用効果がまだ明らかにされていない。そのため、やや遅れていると判断した。<細胞培養の実施>C2C12筋芽細胞を用いた培養系にて、筋管細胞への分化が安定して行えており、継続的に実験を実施することができた。<炎症性筋萎縮モデルの確立>グラム陰性桿菌由来の起炎物質であるリポポリサッカライドを使用して筋管細胞に炎症刺激を与え、細胞径の減少、筋原線維タンパクの減少が生じることを確認できている。<脂肪酸および超音波による筋萎縮予防効果>初年度の研究過程において、短鎖脂肪酸の高濃度(4mM)投与によって筋管細胞が萎縮することが確認されたため、1mMの酪酸を用いて筋萎縮抑制効果を検討した。筋萎縮を惹起するために、酪酸添加1時間後にリポポリサッカライドを添加した。そして、その24時間後に細胞径を測定した。その結果、1mMの酪酸投与によって細胞径の減少が有意に抑制され、酪酸による炎症性筋萎縮抑制効果が確認された。酪酸はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の作用を有するため、筋管細胞におけるヒストンアセチル化を測定したところ、酪酸添加によってヒストンのアセチル化が有意に促進されていることが確認され、ヒストンのアセチル化が酪酸による筋萎縮抑制作用の因子であることが示唆された。

また、これらの効果が超音波療法の併用によって促進される傾向が観察された。敗血症や癌性カヘキシーで生じる炎症性筋萎縮に対する抗炎症・抗酸化物質、超音波照射の抑制効果を検証し、消耗状態の患者に適用できる非侵襲的な治療手段の確立を目指した。炎症刺激物質であるリポポリサッカライドの添加によって筋管細胞の萎縮が惹起された。短鎖脂肪酸の酪酸、ω-3系多価不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、カルテノイドのアスタキサンチンが炎症性筋萎縮を有意に抑制した。脂肪酸においては、高濃度添加によって筋萎縮が増悪し、適切な用量管理の必要性が示唆された。低強度超音波による炎症性筋萎縮の抑制効果、および酪酸のヒストンアセチル化作用に対する超音波照射の促進効果が明らかになった。LPS添加による筋萎縮の抑制ついて有効な脂肪酸およびその至適濃度を明らかにし、効果が見出された脂肪酸と超音波療法の併用効果を分析する。in vivo実験についても実施し、超音波療法による筋萎縮抑制効果について検討を進める。炎症性筋萎縮に対する脂肪酸等の作用に対する超音波療法による促進効果を検討する。併用効果が明らかになった治療プログラムにてin vivo実験を行い効果を検証する。リハビリテーション科学脂肪酸添加による筋萎縮抑制作用の検討について、予定していた試薬・消耗品を用いる解析に進まなかったため、その分の経費を次年度使用額とした。超音波照射と脂肪酸添加の併用効果の解析が当該年度に実施できなかったため、その解析に要する費用が次年度使用額として発生した。脂肪酸添加による筋萎縮抑制作用の検討を中心に次年度使用額を使用する。超音波照射と脂肪酸添加の併用効果の解析に次年度使用額を用いる。具体的には、細胞購入費、試薬・消耗品費等に充てる。
fMRIを用いたリラクセーション技法の選択適応基準作成のための実験研究

大脳生理学的所見から、リラクセーション技法(漸進的筋弛緩法)で生じる反応の作用機序を明らかにするために、fMRIを実施した。併せて主観的評価尺度、血圧・脈拍数を測定した。その結果、漸進的筋弛緩法実施後の安静時の脳活動領域は前頭および辺縁連合野における変化が認められ、骨格筋緊張の単純な繰り返しのみ実施した場合と比べ大脳活動に差が生じる可能性が示唆された。また、主観的評価からもリラックス感が得られたとことが確認できた。本研究の目的は,f MRIを用い大脳生理学的所見から,リラクセーション技法で生じる反応の作用機序を明らかにすることである.今回は,リラクセーション技法の中でも漸進的筋弛緩法(以下,PMR法とする)に焦点を当て検討することとした.今年度は,研究実施にあたり,fMRIを用いた研究の文献検討を行い,評価項目および解析方法を検討した.また,脳活動イメージングに関する専門技術者より専門知識を教授いただいた.研究プロトコール作成は,fMRI測定の結果に影響を及ぶことのないような動作という点から8筋群に絞り,対照タスクとリテックスタスクを設定した.対照タスクは単純に骨格筋の緊張と弛緩を繰り返す,リラックスタスクはPMR法を実施するとした.なお,緊張時間は15秒間,弛緩時間は30秒間と設定し各筋群2回ずつ緊張弛緩を繰り返した.この時間設定は,PMR法の基本的方法とfMRIデータの解析という点を根拠としている.プロトコールに基づき,プレテストを実施した.[対象]20歳代男性2名[方法]fMRI装置内で安静1分間の後,音声指示に従ってタスクを実施.実施前後に血圧、脈拍数を測定した.主観的評価として,実施前後に身体感覚尺度(高得点の方がより身体感覚としてのリラックス感が得られていると評価)に対象者が自己記入した.[結果]対照タスク実施後に収縮期血圧は上昇し,身体感覚尺度得点は低下した.リラックスタスク実施後は,収縮期血圧は低下,身体感覚尺度得点はわずかに上昇した.fMRIデータについては解析中である.次年度は,プレテズトの結果をもとにプロトコールの再検討および修正を行い,本試験を実施する予定である.本研究の目的は、fMRIを用いて大脳生理学的所見から、リラクセーション技法で生じる反応の作用機序を明らかにすることである。その第一段階として、骨格筋の意図的な脱力により上行インパルスを解して大脳へ弛緩感覚を認知させていく漸進的筋弛緩法について、検討を行った。本年度は前年度のプレテスト結果をもとに本実験を実施した。被験者が対照課題(骨格筋緊張の単純な繰り返し)とrelax課題(漸進的筋弛緩法条件)を行うデザインとし、両課題とも骨格筋の緊張時間を15秒間、弛緩時間を30秒間と設定した。実施部位はfMRI撮影に影響をしないよう頭部が動かない動作に限定し、具体的には両手拳、手関節の屈曲、上肢、足指の屈曲、膝関節周囲、臀部筋、腹筋の緊張・弛緩を2セットずつ繰り返し行うこととした。対照課題では単純な筋緊張の繰り返しを指導し、relax課題では、漸進的筋弛緩法の特徴である弛緩時問に意識を向け、ゆっくりと行うよう指導した。fMRI撮影の他、主観的評価として実施前後に身体感覚尺度を用い、併せて血圧・脈拍数を測定した。その結果、実施中は両課題とも運動野の賦活化を認めた。課題実施前後の安静時の脳活動領域を比較すると、relax課題では、実施後に前頭および辺縁連合野に賦活化が認められ、対照課題では後頭葉に変化を認めた。このことから、骨格筋の運動を伴うため実施中は運動野の賦活化を認めるが、リラクセーションを意識する漸進的筋弛緩法は実施後の大脳活動に差が生じる可能性が示唆された。また、血圧値変化に一定の傾向は認められなかったが、身体感覚尺度得点は実施後に上昇し、主観的リラックス感も得られたと推測される。今後さらに詳細に分析を進めるとともに、他のリラクセーション技法実施時の測定を行い、技法の種類による大脳生理的活動の側面からの作用機序の違いを明らかにしていきたい。
ウイルスの神経病原性とレセプタ-結合ドメインの構造

ウイルスの神経病原性にかかわるウイルス側の因子を解明するため、ウイルスのレセプタ-結合ドメインが果たす役割に着目した。典型麻疹患者咽頭分秘液から分離した1株の麻疹ウイルス(長畑株)から、Vero細胞でプラ-ク純化後、新生ハムスタ-脳で4回継代することによって成熟ハムスタ-脳に対して病原性を示すようになった株(NーHB株)を分離選択し、ウイルスの細胞吸着に関する赤血球凝集素(Hタンパク)をコ-ドする遺伝子の塩基配例を決定し、神経病原性のない親株(NーV株)のH遺伝子の塩基配列と比較検討した。NーHB株はわずか250PFUでも成熟ハムスタ-脳内に注射すると80%のハムスタ-が痙攣を起こして発病した。神経病原性のないNーV株と共にH遺伝子特異的cDNAを作成し、Taqポリメラ-ゼを用いたキロシ-ケンスを行って塩基配列を決定した。NーHB株もNーV株もH遺伝子は1851塩基で、両株間のホモロジ-は99.5%であった。塩基配列の異なる個所は10ヵ所あった。塩基配列から予測されるアミノ酸は617残基で、両株間のホモロジ-は98.9%であった。コ-ディング領域でのアミノ酸の異なる個所は7ヵ所あった。いづれも1塩基の違いによっていた。NーV株からNーHB株への変異はLeu(43)→Phe、Thr(107)→Ala、Ser(126)→Asn、Ile(308)→Phe、Leu(321)→Pro、Ser(370)→Thr、Phe(431)→Leuであった。これらの変異のうち、Thr(107)は比較のため文献上から検索したEdmonston株でも同じであったが、NーHBではAlaであった。同様にIle(308)がPhe、Leu(321)がProとなっていた。このうち321番目のLeu→Proの変異がHタンパク分子の立体構造、ひいてはレセプタ-結合ドメインの構造変化をもたらす可能性があり、神経病原性との関連において重要であろうと考えている。ウイルスの神経病原性を細胞のレセプターと反応するウイルスのレセプター結合ドメインの構造から解析することを目的とした。麻疹では患者10002000人に1人の脳炎が起こるので、モデルとするウイルスに麻疹ウイルスを選んだ。患者から分離以降継代歴が判明している株で、神経病原性をもつ株がないので、1種の非神経病原性株(長畑株:N-V)から幼若ハムスターの脳内感染によって神経病原性株(N-HB)を選択し、この両者についてH蛋白の構造、特にレセプターに結合する部位の構造を遺伝子RNAの塩基配列の解析から明らかにしようとした。1)SSPEウイルスH遺伝子cDNAプローブの作成麻疹ウイルスのH遺伝子cDNAライブラリーを作成するために必要となるプローブを先ず作成した。pcDVベクターに組み込まれたSSPEウイルス(山形1株)のH遺伝子cDNA(東大医科研より分与を受けた)をPst IおよびBam HIで切断し、電気泳動後、目的のプラグメントを切り出した。次いで、ランダムプライマー法により^<32>PーdCTPを用いて標識し、H遺伝子のプローブとした。

2)N-HB株とN-V株のH遺伝子cDNAライブラリーの作成各々のウイルス株を感染させたVero細胞からグアニジウムチオシアネートCsCl法にしたがって全RNAを分離・抽出した。次いで、オリゴd(T)セルロースカラムを用いてmRNAを分離後、各々のウイルス株についてGubler-Hoffmanの方法によってcDNAを合成し、λgt10のEco RI切断部位に組み込み、in vitro packaging後、E.coli C600hfl株を宿主としてλプラークからなるcDNAライブラリーを作成した。ハイブリダイゼーションの結果、約300個のプラークが陽性に反応したので、今後の解析に充分なcDNAが得られたものと考えている。ウイルスの神経病原性を、麻疹ウイルスをモデルとして、細胞のレセプタ-と反応するウイルスのレセプタ-結合ドメインの構造から解析することを目的とした。モデルウイルスとして麻疹ウイルスを選んだ理由は、麻疹がWHOの根絶対象疾患であることと麻疹患者1000人に1人の頻度で脳炎を合併するほど麻疹ウイルスの神経病原性が強いためである。継代歴が判明している麻疹ウイルス長畑株に由来する神経病原性株(NーHB)と非病原性株(NーV)の赤血球凝集素(H)について、ゲノムRNAの塩基配列の比較と単クロ-ン抗体によるエピト-プの解析によって目的を達成しようとした。1)HのcDNAの作成と塩基配列の決定昨年度の研究でcDNAライブラリ-を作成していたので、先ずそれの中からHのcDNAを選択し、制限酵素マッピングを行った。現在までのところ、PvuII・SacI・EcoRI・SmaI・XbaI・KnoI・HiadIII・BamHの8種類の制限酵素を用いたマッピングではNーHBとNーVの間での差異を見出すことは出来なかった。2)に記した単クロ-ン抗体による解析で差異を見出しているので、今後、制限酵素フラグメントを用いて塩基配列を決め、ゲノム上の差異を探索していく予定である。2)Hの対する単クロ-ン抗体の作成とエピト-プの解析NーHBをBalb/cマウスに免疫することによって、Hに対する単クロ-ン抗体を作成した。現在までのところ、11種の単クロ-ン抗体が得られているが、これらの内、8種がNーHBを特異的に認識し、3種はNーHBとNーVの両方を認識する抗体であることが判明した。予定より少々研究が遅れ気味であるが、最終年度には目的を達成したいと考えている。ウイルスの神経病原性にかかわるウイルス側の因子を解明するため、先ずウイルスのレセプタ-結合ドメインに着目して、1株の麻疹ウイルス(長畑株)から、成熟ハムスタ-脳に対して病原性を示す株(NーHB株)を分離選択し、ウイルスの細胞吸着に関与する赤血球凝集素(Hタンパク)をコ-ドする遺伝子の塩基配列を決定し、神経病原性のない親株(NーV株)のH遺伝子の塩基配列と比較検討した。感染Vero細胞から全RNAを抽出し、オリゴdTセルロ-スカラムでmRNAを分離した。GublerーHoffmarの方法に準じて、逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、λgT10ベクタ-に組み込んで、cDNAライブラリ-を作成後、SSPEウイルス山形1株のH遺伝子をプロ-ブとして、特異的cDNAをスクリ-ニングした。Taqポリメラ-ゼを用いたキロシ-ケンスを行って塩基配列を決定した。ダイレクトシ-ケンスによる補正を同時に行った。NーHB株もNーV株もH遺伝子は1851塩基で、両株間のホモロジ-は99.5%であった。塩基配列の異なる個所は10ヵ所であった。塩基配列から予測されるアミノ酸は617残基で、両株間のホモロジ-は98.9%であった。コ-ディング領域でのアミノ酸の異なる個所は7ヵ所あった。
亜鉛トランスポーターと亜鉛シグナルを標的とする対がん創薬研究

平成30年度助成による研究結果を以下に記す。1.がん細胞に発現する亜鉛トランスポーターの意義ZIP7とZIP10のがん細胞における意義について、それぞれの遺伝子をヒト肺がん細胞株A549において遺伝子ノックダウンすることによって解析した。その結果、両者ともにA549細胞の増殖とスフェロイド形成に必要であることを見出した。2.がん悪液質における亜鉛トランスポーターの役割転移性がんを罹患した患者の多くは、骨格筋萎縮を伴うがん悪液質を発症する。申請者は、がん悪液質における骨格筋萎縮の発症において、ZIP14が重要に関与することを見出した。この知見は、ZIP14を介する亜鉛シグナルが骨格筋の形成と維持に対して抑制的に作用することを示しており、がん悪液質治療の創薬標的としてZIP14が有用であることを示唆するものである。3.亜鉛トランスポーターの発現細胞をモニターできる遺伝子改変マウスの作製申請者は、ZIP10が皮膚の毛包外根鞘に発現すること、上皮性組織特異的Zip10遺伝子欠損(cKO)マウスでは表皮の菲薄化と毛包の減少が生じ、皮膚バリア機能が損失すること、ZIP10がp63の転写能の活性化に重要な役割を果たしていることを示した(Bin et al, PNAS 2017)。一方、様々ながん細胞でZIP10の発現亢進が認められることから(Miyai et al, PNAS 2014)、ZIP10陽性細胞が個体恒常性に深く関わり、ZIP10の発現制御が正常な細胞機能に必要であることが示唆された。そこで申請者は、Zip10遺伝子プロモーターの下流にEGFP-IRES-ERT2Creを挿入したノックインマウス(Zip10-EGFP-KIマウス)を新たに作製した。当該マウスを用いた初歩的な解析では、既に報告したZIP10抗体を用いたFACSや免疫染色の結果と同様に(Miyai et al, PNAS 2014)、pro-B細胞や皮膚毛包外根鞘におけるGFP陽性細胞が確認された。すなわち、ZIP10陽性細胞の役割とZIP10の意義の解明に関する研究において、本マウスの有用性が示された。本研究は、がん細胞に焦点を当てて亜鉛シグナルおよび亜鉛トランスポーターの役割解明と創薬を目的として研究を開始したが、今年度の研究においては、がん悪液質と骨格筋萎縮における亜鉛シグナルの意義に関する新たな知見を見出し、がん関連領域における当初の予想以上の成果を得ている。達成度の指標となる項目を以下に示す。1:ZIP7とZIP10は、両者ともにがん細胞の増殖とスフェロイド形成に必要であることを見出した。2:ZIP14が、がん悪液質における骨格筋萎縮の発症に関与することを見出した。3:がん細胞に高い発現を示し、上皮性組織の形成に重要であるZIP10の発現をGFPでモニターできる遺伝子改変マウス(Zip10-EGFP-KIマウス)を作成した。平成30年度に得られた知見と進捗状況を踏まえて、今年度の研究方針を以下に示す。1:ZIP7とZIP10が、肺がん細胞の増殖にどのような役割を担っているのか明らかにする。その役割が他のがん細胞においても同様に保存されているのか、複数のがん細胞種を用いて検討する。2:ZIP7とZIP10の亜鉛輸送活性または発現を制御する化合物をスクリーニングして、候補化合物のがん細胞に対する効果を解析する。3:ZIP14の亜鉛輸送活性または発現を制御する化合物をスクリーニングして、骨格筋分化過程に対する候補化合物の効果を解析する。平成29年度助成による研究結果を以下に記す。1.がん組織に発現する亜鉛トランスポーター:大腸がんにおけるZIP7の発現に加えて、皮膚がんにおけるZIP10の亢進を見出した。2.創薬研究の評価系開発: ZIP14をモデルとして、亜鉛トランスポーターを制御する化合物同定のアッセイ系を構築している。既に、誘導的にヒトZIP14を発現する細胞株を樹立しており、この細胞株を用いてスクリーニングを始めている。3.亜鉛トランスポーター結合分子の同定: Yeast two hybrid system (Y2H)によって複数の亜鉛トランスポーター結合分子を単離し、これらが亜鉛トランスポーターの機能にどのような影響を与えるのか検討している。4.皮膚における亜鉛トランスポーターの役割: ZIP7欠損マウスは、皮膚薄弱化とコラーゲン線維の減少を呈した。間葉系幹細胞のZIP7遺伝子を不活化させたところ、線維芽細胞の分化が阻害された。さらに、ZIP7欠損によって小胞体ストレスの上昇による細胞死が亢進した。これらから、ZIP7は小胞体内の亜鉛量を調節し、小胞体ストレス応答の上昇を制限していることが示された。また、ZIP10が皮膚の毛包に発現することを見出し、上皮系細胞でZIP10が欠損するマウスを作製して解析した。その結果、ZIP10欠損マウスでは表皮の菲薄化と毛包の減少が生じ、皮膚バリア機能の損失が認められた。さらに、ZIP10がp63の転写能の活性化に重要な役割を果たしていることが示された。加えて、ZIP13が脂肪細胞の褐色化にブレーキをかけている調節因子であり、生活習慣病治療の標的分子となる可能性が示された。5.アトピー性皮膚炎:アトピー性皮膚炎患者の表皮では、ZIP10の発現が顕著に減少していることを見出した。表皮疾患において、ZIP10が創薬標的分子となる可能性が示唆された。

がんに焦点を当てて、亜鉛シグナルおよび亜鉛トランスポーターの役割解明と創薬研究を開始したが、がん以外の疾患や組織における意義も含めて、当初の予想以上の発見を得ている。達成度の指標となる項目を以下に示す。1:亜鉛トランスポーターは、様々ながん組織に過剰発現している。2:亜鉛シグナルはがん細胞の生存や増殖の制御に関与しており、個々の亜鉛トランスポーターが特異的に標的分子を制御している。3:皮膚組織において、表皮と真皮では異なる亜鉛トランスポーターによる亜鉛シグナルが、それぞれの組織構築に関与している。4:アトピー性皮膚炎、肥満、骨格筋分化に関わる亜鉛トランスポーターが存在する。5:亜鉛トランスポーターの中には、亜鉛以外の金属を基質として輸送しているものがある。6:亜鉛トランスポーターの亜鉛輸送活性をモニターできるアッセイ系を構築した。7:当該年度までに得た知見をもとに、亜鉛シグナルに関する書籍を編集した。当該書籍は、平成30年度中に発刊される予定である。平成30年度助成による研究結果を以下に記す。1.がん細胞に発現する亜鉛トランスポーターの意義ZIP7とZIP10のがん細胞における意義について、それぞれの遺伝子をヒト肺がん細胞株A549において遺伝子ノックダウンすることによって解析した。その結果、両者ともにA549細胞の増殖とスフェロイド形成に必要であることを見出した。2.がん悪液質における亜鉛トランスポーターの役割転移性がんを罹患した患者の多くは、骨格筋萎縮を伴うがん悪液質を発症する。申請者は、がん悪液質における骨格筋萎縮の発症において、ZIP14が重要に関与することを見出した。この知見は、ZIP14を介する亜鉛シグナルが骨格筋の形成と維持に対して抑制的に作用することを示しており、がん悪液質治療の創薬標的としてZIP14が有用であることを示唆するものである。3.亜鉛トランスポーターの発現細胞をモニターできる遺伝子改変マウスの作製申請者は、ZIP10が皮膚の毛包外根鞘に発現すること、上皮性組織特異的Zip10遺伝子欠損(cKO)マウスでは表皮の菲薄化と毛包の減少が生じ、皮膚バリア機能が損失すること、ZIP10がp63の転写能の活性化に重要な役割を果たしていることを示した(Bin et al, PNAS 2017)。一方、様々ながん細胞でZIP10の発現亢進が認められることから(Miyai et al, PNAS 2014)、ZIP10陽性細胞が個体恒常性に深く関わり、ZIP10の発現制御が正常な細胞機能に必要であることが示唆された。そこで申請者は、Zip10遺伝子プロモーターの下流にEGFP-IRES-ERT2Creを挿入したノックインマウス(Zip10-EGFP-KIマウス)を新たに作製した。当該マウスを用いた初歩的な解析では、既に報告したZIP10抗体を用いたFACSや免疫染色の結果と同様に(Miyai et al, PNAS 2014)、pro-B細胞や皮膚毛包外根鞘におけるGFP陽性細胞が確認された。すなわち、ZIP10陽性細胞の役割とZIP10の意義の解明に関する研究において、本マウスの有用性が示された。
超老化耐性ハダカデバネズミ特異的に心臓で高発現する抗酸化酵素ＤｅＢＡＴ１の解析

ハダカデバネズミ(naked mole-rat, NMR)は、マウスと同等の大きさながら、異例の長寿動物(平均生存期間31年)であり、未だ腫瘍形成が確認されていない癌化耐性齧歯類である。申請者は、NMR、ヒト、マウスおよびラットの4動物種での組織別遺伝子発現比較で同定した、心臓においてNMRで特異的に高発現するgene Xの解析を行った。報告のある動物種のなかで、gene Xが心臓で高発現しているのはNMRのみであった。gene Xは通常肝臓で発現して血中に分泌され、アリルエステラーゼおよびパラオキソゲナーゼとしての酵素活性を有する抗酸化酵素である。しかしながら、NMRの血清におけるgene Xの酵素活性を測定した結果、酵素活性は測定限界値以下であった。gene Xはカルシウム依存性の酵素活性を有するが、NMRの血中カルシウム濃度は検出限界値以下であったことから、NMRでは、他種とは異なるカルシウム非依存的な様式を有する可能性が考えられた。申請者は次に、細胞の癌化や個体の老化との関係が報告されている癌抑制遺伝子INK4aとARFのクローニングと機能解析を行った。NMRにおいては、INK4aとARFに種特異的な配列変化が存在することが知られている。この遺伝子の種特異的な機能・個体の癌化・老化耐性との関係を解析するために、抗体作製等の解析基盤を確立し、発現様式と遺伝子機能に関して解析を行った。結果として、マウスやヒトと同様に、細胞老化ストレス時の発現上昇、細胞周期を停止させる機能は保存されていることが明らかとなった。さらに、NMRからiPS細胞を作成して造腫瘍性の検証を行ったところ、NMR-iPS細胞はARF遺伝子の種特異的な発現制御により腫瘍化耐性であることを見いだしている。今後、これらの遺伝子の詳細な機能差、個体の癌化・老化耐性への寄与についての解明をさらに進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。ハダカデバネズミ(naked mole-rat、DEBA)は、マウスと同等の大きさながら(体重約35g)、年齢が39歳を超える生存個体が確認されている異例の長寿動物である(平均生存期間28年)。申請者は次世代シークエンサーを用いてハダカデバネズミの心臓および肝臓の全mRNAのシークエンシングを行い、ヒト、マウスおよびラットの同組織データと比較することでハダカデバネズミに特異的に高発現する遺伝子群DeBATs (DEBA-associated transcripts)の同定を試みた。結果として、心臓においてハダカデバネズミで特異的に高発現する抗酸化酵素DeBAT1を同定した。これまでに報告のある動物種のなかでDeBAT1が心臓で高発現しているのは、ハダカデバネズミのみであった。DeBAT1は肝臓で発現し、血液中に分泌されることで酵素活性を有することが知られている抗酸化酵素である。そこで申請者は、各動物種の血中におけるDeBAT1の酵素活性について比較解析を行った。ハダカデバネズミ、マウス、ヒトおよびウサギ(報告されている動物のなかで最も酵素活性が高いとされている)の血清を用いてDeBAT1の酵素活性を測定した結果、ハダカデバネズミのDeBAT1の酵素活性は、測定限界値以下であった。DeBAT1はカルシウム依存性の酵素活性を有することが知られているため、ハダカデバネズミの血中カルシウム濃度を測定したところ、驚くべきことに血中カルシウム濃度は検出限界値以下の超低濃度であった。野生下のハダカデバネズミはアフリカ東部の地中に生息し、コレカルシフェロール(ビタミンD)合成系が存在しない独自のカルシウム代謝機構を有するという報告が存在することから(Br J Nutr. 1993)、ハダカデバネズミの血中カルシウム濃度が低いことで、DeBAT1の血中酵素活性が極めて低くなっている可能性が考えられた。今後、マウスやヒトとは異なるカルシウム非依存的なハダカデバネズミ特有のDeBAT1の機能を有する可能性を踏まえて、ハダカデバネズミの生体組織におけるDeBAT1の生理機構について解析を進める予定である。

この遺伝子の種特異的な機能・個体の癌化・老化耐性との関係を解析するために、抗体作製等の解析基盤を確立し、発現様式と遺伝子機能に関して解析を行った。結果として、マウスやヒトと同様に、細胞老化ストレス時の発現上昇、細胞周期を停止させる機能は保存されていることが明らかとなった。さらに、NMRからiPS細胞を作成して造腫瘍性の検証を行ったところ、NMR-iPS細胞はARF遺伝子の種特異的な発現制御により腫瘍化耐性であることを見いだしている。今後、これらの遺伝子の詳細な機能差、個体の癌化・老化耐性への寄与についての解明をさらに進めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、ハダカデバネズミの老化/がん化抑制機構を規定する候補遺伝子群の一次スクリーニングとして、ハダカデバネズミ・ヒト・マウスおよびラットの組織別発現遺伝子の情報を組み合わせた、ハダカデバネズミ種特異的発現遺伝子群DeBATs (DEBA-associated transcripts)の抽出パイプラインを構築した。今後DeBAT1に次ぐ新たな関与遺伝子候補について解析を進める。今後、現在改善中のハダカデバネズミ遺伝子情報を利用することにより、より高精度の発現解析を行うことが可能となる。今回確立したパイプラインをもちいて、さらなるDeBATを同定し、ハダカデバネズミの癌化および老化耐性を起因するメカニズムの解明に挑みたい。
F1-ATPaseの回転機構

昨年度に引き続き、回転分子モーターF1-ATPaseの回転子を縦に半身に削ぐ実験を行った。このモーターは、3組のαおよびβサブユニットが筒状に並んで固定子を構成し、中央にγサブユニットが片側から突き刺さって回転子となる。3つのβで順にATPが加水分解されるに伴い、γが回転する。γの固定子内に突き刺さる部分は、カルボキシル(C-)末端およびアミノ(N-)末端のαヘリクスが反平行のコイルドコイル構造をとったものである。このうちN-末ヘリクスを端から遺伝子的に削った。削除によりモーター分子全体が不安定になるのを防ぐため、γのC-末端のほうは、ペプチドリンカーによりβにつないでおいた(昨年度報告したようにリンカーは回転にほとんど影響を与えない)。N-末ヘリクスは49残基よりなるが、これをN-末から順に8, 14, 28, 40, 50残基の所まで削除した。結晶構造によると、28残基削除したところで固定子との相互作用はなくなる。これらにつきまず無負荷回転速度を40nm金粒子をプローブに用いて計測したところ、野性型の毎秒200回転からだんだん速度が落ち、28残基ないしそれ以上を削除すると約50回転で一定となった。一方、0.29μmのビーズをプローブとしてトルク(回転力)を見積もったところ、野性型の約40pN・nmに対し28残基以上を削除しても半分にしかならなかった。半身に削いだ回転子でも、半分のトルクは生み出せることになる。従来の結果と合わせると、回転子が固定子に入り込む部分ないし回転子の先端(この2箇所で固定子と相互作用)のどちらかさえ残っていれば、半分のトルクが出る。F1の同転子には、これがなければ、という重要部品はないようである。これらの結果は、現在投稿中である。回転分子モーターF_1-ATPaseのATP加水分解活性が、0.003%(w/v)SDS(sodium dodecyl sulfate)の存在下で3-4割上昇することを見いだした。これ以上SDS濃度を上げると、活性が下がりはじめる。活性上昇には、SDSがその場に存在する必要があり、SDS preincubationでは効果がない。また、F_1はATP存在下でだんだん阻害状態に陥り、定常状態(活性型と阻害型が平衡)での平均活性は初期の数分の一に下がるが、SDSがあると定常状態活性が大きく上昇した。一方、回転特性に関するSDSの影響を調べたところ、無負荷での回転速度(40nm金粒子を付けて測定)もトルク(0.29μmのポジスチレンビーズを2個付け九時の回転速度からの見積もり)もほとんど変わらなかった。かわりに、顕微鏡下で回転する分子の数が数倍に増えた。これらの結果は、SDSが活性型のF_1-ATPaseの割合を増やすということで説明できる。その機作は、まだ不明である。F_1の定常活性を上げることでよく知られた界面活性剤lauryldimethylamine oxideが0.1%を要するのに比べ、SDSは遥かに効率がよく、しかも初期活性も数割とはいえ上昇させる。すでに回転子であるγサブユニットの回転軸部分を大きく削っても回転能が損なわれないことを報告したが、固定子βサブユニットの中でこの削られたγが接触すると思われる部分を大きく削り取った変異体を作成し、活性があるかどうかを調べる研究を開始した。昨年度報告したように、界面活性剤SDS(sodium dodecyl sulfate)は、一般にたんぱく質変性剤であるにもかかわらず、0.003%(w/v)という極低濃度で回転分子モーターF_1-ATPaseの活性を向上させる。この効果は主として、MgADP阻害状態に陥ったF_1分子を活性型に引き戻すことによると考えられたため、顕微鏡観察により回転する(活性のある)分子数を定量した。0.29μmのbead duplexを結合させて回転観察したところ、飽和ATP濃度(2mM)では0.003% SDS存在下で回転分子の割合が2.2倍に、低濃度ATP(200nM)では3.5倍に増加した。40nmの金粒子を結合させた回転観察(無負荷回転)では、2mM ATPで1.4倍、20nMで4.7倍であった。ATP加水分解活性に対するSDSの効果も同じ傾向で、低濃度ATP下でのMgADP阻害からの復帰に著しい効果を発揮する。そもそも低ATP濃度では回転観察が困難であるが、SDS添加により容易となる。一方、回転子γサブユニットのカルボキシル(C-)末端を固定子βサブユニットに遺伝子的につないでしまった変異体を用いて、回転子のアミノ(N-)末端の削除が回転に及ぼす効果を調べた。N-末はC-末とともにαヘリクスのコイルドコイルを形成して回転軸となるが、その半身を端から削いでいく実験である。回転子を削ると固定子から抜けやすくなる可能性があるので、固定子との間をポリペプチドリンカーでつないだのである。リンカーの存在は回転特性にほとんど影響を与えないことが分かった(ペプチドは一重結合を含むため自由回転可能)。また、N-末のαヘリクスを完全に削除してしまっても(完全に半身に削いでも)、モーターはかなりの高速で回転し、しかも有限のトルクを発生できる(粘性抵抗に抗してビーズを回せる)ことが分かった。

このモーターは、3組のαおよびβサブユニットが筒状に並んで固定子を構成し、中央にγサブユニットが片側から突き刺さって回転子となる。3つのβで順にATPが加水分解されるに伴い、γが回転する。γの固定子内に突き刺さる部分は、カルボキシル(C-)末端およびアミノ(N-)末端のαヘリクスが反平行のコイルドコイル構造をとったものである。このうちN-末ヘリクスを端から遺伝子的に削った。削除によりモーター分子全体が不安定になるのを防ぐため、γのC-末端のほうは、ペプチドリンカーによりβにつないでおいた(昨年度報告したようにリンカーは回転にほとんど影響を与えない)。N-末ヘリクスは49残基よりなるが、これをN-末から順に8, 14, 28, 40, 50残基の所まで削除した。結晶構造によると、28残基削除したところで固定子との相互作用はなくなる。これらにつきまず無負荷回転速度を40nm金粒子をプローブに用いて計測したところ、野性型の毎秒200回転からだんだん速度が落ち、28残基ないしそれ以上を削除すると約50回転で一定となった。一方、0.29μmのビーズをプローブとしてトルク(回転力)を見積もったところ、野性型の約40pN・nmに対し28残基以上を削除しても半分にしかならなかった。半身に削いだ回転子でも、半分のトルクは生み出せることになる。従来の結果と合わせると、回転子が固定子に入り込む部分ないし回転子の先端(この2箇所で固定子と相互作用)のどちらかさえ残っていれば、半分のトルクが出る。F1の同転子には、これがなければ、という重要部品はないようである。これらの結果は、現在投稿中である。
天疱瘡標的抗原に対する胸腺における免疫寛容獲得機序の解明

前年度までに我々は野生型マウス胸腺において少数の髄質上皮細胞にDsg3の発現があることを蛋白およびRNAレベルで示し、遺伝性自己免疫疾患モデルであるAire-/-マウスにおいて胸腺Dsg3発現の著しい低下を認めるも、同マウスはDsg3によって強制免疫され得ないことを示した。本年度は胸腺Dsg3の細胞上の微細局在、thymocyteとの関連の見地から、胸腺におけるDsg3に対する免疫寛容形成機序の追究を試みた。まず、野生型マウス胸腺Dsg3の微細局在を包埋前免疫電顕法で観察した。一次抗体として我々が既に作製した抗Dsg3モノクローナル抗体を用いることで非特異的反応を抑制し真のシグナルを検出し得た。Dsg3に対するシグナルは胸腺上皮細胞のデスモソーム部のみならず、デスモソーム外の細胞膜上にも認めた。またDsg3陽性上皮細胞は数個のthymocyteと思われる小型細胞に囲まれ、それらと接していた。次に、各種リンパ球マーカーの免疫組織化学染色の結果、Dsg3陽性胸腺上皮細胞周囲のthymocyteの形質は一様にCD4^+8^-だが、免疫寛容の一つの重要な因子であるregulatoryT細胞のマーカー; Foxp3は髄質深部の細胞に陽性でありDsg3の存在する皮質髄質境界部には認めず、Aire-/-マウス胸腺についても組織学的に差異を認めなかった。Dsg3が限られた髄質胸腺上皮細胞上にデスモソーム外にも存在し、その発現がAire支配下にあるという知見は、胸腺Dsg3がDsg3に対する免疫寛容に寄与する可能性を示唆した。一方で胸腺Dsg3発現減少下の個体、Aire-/-マウスにおけるDsg3に対する免疫寛容状態の変化は、今年度の組織学的検査では捕らえることができなかった。胸腺内末梢抗原発現から免疫寛容形成までを介するさらなる必須因子の解明が今後の課題である。デスモグレイン3(Dsg3)は皮膚粘膜のデスモゾーム構成蛋白の1つで、自己免疫性水疱症である天疱瘡の標的抗原である。近年、様々な末梢抗原の胸腺内発現が明らかとなり、末梢抗原に対する免疫寛容獲得における胸腺の関与が示唆された。既に我々は野生型マウス胸腺でのDsg3発現を蛋白レベルで示している。本研究の目的は胸腺内Dsg3発現の意義および天疱瘡における免疫寛容破綻機序との関連を解明することにある。今年度以下のことを解明した。(1)Dsg3は少数の胸腺上皮細胞に発現している。野生型マウス胸腺を用いin situ hybridization法によりRNAレベルでのDsg3発現様式を検討した。Dsg3は一部の胸腺上皮細胞に個細胞性に発現しており、胸腺のDsg3が細胞接着以外の役割を持つ可能性が示唆された。(2)Aire-/-マウスでは胸腺内Dsg3発現が低下している。Aire遺伝子は多臓器に自己免疫性炎症をきたす遺伝疾患APECEDの責任遺伝子で、Aire-/-マウスでは様々な末梢抗原の胸腺内発現が抑制されることがわかっている。Aire-/-マウスにおける胸線内Dsg3発現を蛍光抗体法で観察した。Aire-/-マウスではAire+/+マウスに比しDsg3陽性細胞が著明に減少しており、胸腺内Dsg3発現はAire支配下にあることが示唆された。(3)Dsg3に対する免疫寛容獲得にはAire以外の因子が存在する。Dsg3-/-マウスはDsg3蛋白をくりかえし皮下注することにより抗Dsg3抗体産生する。同様の方法でAire-/-マウスのDsg3蛋白による強制免疫を試みたが天疱瘡症状や抗Dsg3抗体産生を認めなかった。Aire-/-マウスではDsg3に対する免疫寛容が成立していることが示された。次年度はDsg3またはAireの有無による胸腺におけるT細胞成熟過程の差異を検討する。次に、各種リンパ球マーカーの免疫組織化学染色の結果、Dsg3陽性胸腺上皮細胞周囲のthymocyteの形質は一様にCD4^+8^-だが、免疫寛容の一つの重要な因子であるregulatoryT細胞のマーカー; Foxp3は髄質深部の細胞に陽性でありDsg3の存在する皮質髄質境界部には認めず、Aire-/-

マウス胸腺についても組織学的に差異を認めなかった。Dsg3が限られた髄質胸腺上皮細胞上にデスモソーム外にも存在し、その発現がAire支配下にあるという知見は、胸腺Dsg3がDsg3に対する免疫寛容に寄与する可能性を示唆した。一方で胸腺Dsg3発現減少下の個体、Aire-/-マウスにおけるDsg3に対する免疫寛容状態の変化は、今年度の組織学的検査では捕らえることができなかった。胸腺内末梢抗原発現から免疫寛容形成までを介するさらなる必須因子の解明が今後の課題である。
溶血性連鎖球菌(S.faecalis)のβ溶血毒素の研究

フェカリス菌(S.faecalis)は心内膜炎、尿路感染症、各種化膿性疾患の起因菌として知られている。S.faecalisの生産するβ溶血毒素はこの菌の病原因子の一つと考えられている。S.faecalis菌には、グラム陽性菌では唯一の高頻度に接合伝達するプラスミドが存在する。プラスミドをもつS.faecalis(供与菌)は、受容菌が生産する低分子(アミノ酸8個)のペプチドに反応し、その菌体表面を均一に被う凝集物質を生産する。供与菌は凝集物質により受容菌と接合凝集を行い、プラスミドが受容菌に高頻度に接合伝達される。本研究は臨床分離フェカリス菌のβ溶血毒素生産株の中で、伝達性プラスミド上にβ溶血毒素生産遺伝子が存在するものにつき、そのプラスミドの比較構造解析をすることを目的とする。97株の臨床分離フェカリス菌の中で、58株(60%)がβ溶血性を示した。58株中31株においてβ溶血遺伝子が伝達性プラスミド上に存在した。β溶血性と薬剤耐性は連関性がみられなかった。これらのプラスミドは高頻度(供与菌当り【10^(-2)】【10^(-1)】)で接合伝達する。31株のβ溶血プラスミドの中で、28株は同一のフェロモン(cAD1)に反応し接合伝達することが解った。28株のプラスミドから10株を選び、制限酵素による構造解析を行った結果、すべてのプラスミドが同一構造をしていた。この10株のプラスミドと、アメリカ合衆国で分離された、フェロモン(cAD1)に反応するプラスミドpAD1(56.7Kb)とのDNA-DNAhybri-dizationを行った結果、10株すべてのプラスミドはこのpAD1プラスミドと構造が同一であった。以上の結果、フェカリス菌においてはβ溶血毒素生産能をもつ伝達性プラスミドは同一構造をしており、このようなプラスミドが臨床分離フェカリス菌に広く分布していることが解った。