hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リモートセンシング技術を用いた水道水源林の管理手法の提案

森林流出水の水質と植生の関係に着目したリモートセンシングの技術を用いた水道水源林の管理手法を提案することが本研究の目標である。水道水源林の状態は,流出水量の安定した供給や良好な水質の生産の程度を左右する。よって,目標の達成には水道水源林全域の流出水の特性と状態を把握することが不可欠である。そこで,昨年度は主に水質と土地被覆の関係を検討した。本年度は,現地調査を継続することによって水道水源林の広範囲にわたる渓流の水における同様の検討に加え,水質の季節変動および形成要因についても検討した。なお,リモートセンシングの技術を用いた水道水源林の管理手法の具体的な提案は今後の課題として残った。以下に,得られた結果である。1.対象地における渓流の水質は,季節変動がほとんど見られなかった。このことは,無降雨時の水試料とした渓流の水の水質組成は年間を通じてほぼ一定値を示すことから,水試料の採水月の異なった検体間においても水質の比較ができることを意味する。2.研究対象域の地質図より認められた地質は3種類である。水道水源林の広範囲にわたる渓流の水の水質組成を化学的に分析した結果,渓流の水は位置する各地質で集合するが,ばらつきが大きい。このことは,対象とする水道水源林の渓流の水は,岩石との接触が十分にされていないことを示す。つまり、水の起源は降水によるもので,水の貯留時間が比較的短く地下水の流出が少量であることを示し,また,水質は森林土壌を反映していることが示唆された。3.研究対象の水道水源林における渓流の水質は,森林土壌を反映していることが示唆されたことから,水質の化学的分類方法を用いて林地について検討することが可能と考えられた。つまり,地質を一定とした上で隣接する渓流の水質から測定された林地からの流出物質を定量化することにより,その上部に位置する林種の推定が可能と考えられた。
組織幹細胞の系統決定を支配する遺伝子プログラム

組織幹細胞の基本的性質は、胚発生初期のepiblastやES細胞と共通の遺伝子プログラムにより維持されていると考えられているが、組織幹細胞がなぜ自分の系統以外の細胞を分化させる能力を喪失するのかは解っていない。そこで、cDNAマイクロアレイやRDA法を用いて、全能性幹細胞から組織幹細胞への遺伝子プログラム変化の実体を明らかにすることを目的とした。昨年、TALEファミリーホメオボックス遺伝子Meis3がES細胞の分化に伴って発現が低下し、逆にMeis1,Meis2の発現は上昇することを示した。Meis1とMeis3は純化した骨髄造血幹細胞を含む分画に発現していたが、Meis3 cDNAを骨髄造血幹細胞に強制発現させた場合にのみ、骨髄再建活性が上昇した。これらの事実は、幹細胞におけるMeis1とMeis3の役割は異なることを示唆する。次に、始原生殖細胞とgonadの体細胞とのmRNA発現比較、そして精原細胞とES細胞との間のマイクロアレイ解析をおこなった。これらの試みから、生殖系幹細胞に高レベルに発現するDEAD box型RNAヘリカーゼDdx1を同定した。精原細胞由来細胞株においてDdx1発現をsiRNAによりノックダウンしたところ、lamininに対する細胞接着性が昂進し、cyclin D2 mRNA発現が抑制された。Ddx1を発現抑制したES細胞を用いて作製したキメラマウスでは、精巣内の階層的精子分化が撹乱されていた。また、精巣以外の組織ではドナー細胞が検出されなかった。以上の結果は、Ddx1が生殖系列と体細胞系列の幹細胞とで異なる役割を果たしていることを示唆する。本研究で同定した、幹細胞の系統特異的な作用を示す遺伝子群は、組織幹細胞の系統決定の理解に貢献するものと期待される。本年度は、ES細胞や造血幹細胞で発現する遺伝子群の中から、Hox遺伝子と共同して臓器の発生や幹細胞の増殖分化を制御するTALEファミリーホメオボックス遺伝子Meisに注目し、以下の結果を得た。LIF存在下で増殖させた未分化なES細胞と、LIFを除去し3日及び6日間分化誘導したES細胞を用いMeis遺伝子群のmRNA発現を比較したところ、分化に伴ってMeis1,Meis2の発現が上昇し、逆にMeis3の発現は低下した。Meis1は純化した骨髄造血幹細胞を含む分画に発現していたが、Meis2は検出限界以下、Meis3 mRNAは発現低下していた。Meis1およびMeis3 cDNAを強制発現させたES細胞クローンは、コントロールベクターを導入したES細胞クローンと比較して、フィーダー細胞非存在下での増殖率が高進していた。しかし、これらのFlk1陽性細胞を造血系サイトカイン存在下でストロマ綿胞と共培養したところ、血液細胞および血管内皮様細胞が分化した。これらの結果は、Meis1,3にはES細胞の増殖を促進させる効果があるが、造血系・血管系分化プログラム自体は阻害しないことを示唆する。一方、造血幹細胞に対しては、Meis1とMeis3遺伝子の強制発現効果は異なっていた。したがって、Meis1,Meis3ホメオプロテインの機能は、胚性幹細胞と組織幹細胞との性質の違いと深い関連があると推察され、責任領域の同定を進めている。
幹細胞を用いた障害精巣の賦活化の検討

少子化が国家的問題として注目されている現在、男子不妊症も解決されなければならない大きなテーマである。今回、我々は体細胞由来幹細胞の一つである間葉系幹細胞を不妊モデル雄ラットに移植し、精子産生能を復活または正常化させることに成功した。また、細胞融合や造腫瘍性がないこと、その精子産生は移植した細胞からの精子への分化誘導ではないことを示し、安全性も確認した。今後はヒトへの応用を視野にブタ等の大動物での検討を開始した。精巣組織の修復効果の検討:前年度に決定した温熱処理による不妊モデルラットの精巣に脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を5.0 x 10e5細胞個を3回投与し、3週間後に病理組織を作製した。HEおよびPCNAの染色結果は前年度の実験結果を再現した。次に、不妊モデルラット治療群(MSC投与群)と非治療群(生理食塩水投与群)に、8週齢メスの野生型LEWラットを交配させ、生殖機能の治療効果を検討した。治療群ではメス1匹あたり24匹の出産、一方、非治療群では01匹(メス5匹中1匹が出産)の出産であった。野生型を交配した場合にはメス1匹あたり48匹の出産が確認される事から、生殖機能の完全回復とは考えられないが、少なくとも有効である事が判明した。細胞融合に関する検討:EGFP遺伝子を組込んだ不妊モデルTgラットの精巣にLuciferase遺伝子を組込んだTgラット由来MSCを移植し、Living imaging systemを用いて細胞動態の追跡および細胞融合の可能性について検討した。移植治療3週間目に精巣を摘出し、抗EGFP抗体および抗Luciferase抗体による多重染色を行った。Luciferase抗体に反応した細胞はなかった。そこで、細胞移植3日目の組織を免疫染色した結果、EGFP陽性細胞とLuciferase陽性細胞がそれぞれ独立して存在していた。次にEGFP遺伝子を組込んだメスラットと交配し、出産した新生児にEGFP陽性個体は確認されたが、Luciferase陽性個体およびLuciferase-EGFP二重陽性個体の出産は確認されなかった。造腫瘍性に関する検討:不妊モデルオスラットおよび野生型オスラットに脂肪組織由来MSCを移植し、6か月間の生存実験を行った。腫瘍性を疑う所見は確認されなかった。また、精巣の病理学的検査を行った結果、腫瘍を示す像は確認されなかった。平成24年度に実施した項目は以下の4項目である。1)ラット不妊モデルの作製条件の検討:野生型LEW雄ラットの精巣(陰嚢)を42°Cの恒温槽で熱処理により不妊化する。麻酔下15分、30分、45分、60分の条件で精巣を熱処理し、24時間後に精巣を摘出して病理検討を行った。15分では非熱処理群と同様で、30分以上で精原細胞等の肥大化や空洞化が確認された。45分と60分熱処理群で精巣内部で出血が確認された為、本研究では30分の熱処理を採用する事にした。2)遺伝子組み換えラットの間葉系幹細胞の樹立:遺伝子組み換えラットから皮下脂肪を摘出し、脂肪組織由来間葉系幹細胞を樹立した。膜抗原の発現有無および骨・軟骨・脂肪細胞への分化誘導の確認を行い、既報の間葉系幹細胞と同様であることを確認した。3)細胞投与ルートの検討:陰茎静脈からの投与ルートは移植したLuciferase-Tgラット由来間葉系幹細胞の分散化がin vivo imagingsystemの解析実験より顕著であった。そこで精嚢を切開して精巣を露出させ、直接細胞移植を行った結果、効率良く移植細胞が集積した。しかし露出した精巣を再度、精嚢に戻す操作が煩雑である事から、切開をせずに直接、精巣に細胞を移植した結果、精巣を露出した場合と同様の集積が確認された。4)精巣組織の修復効果の検討:オス不妊モデルラットに細胞をHeat shock24時間後の精巣に移植し、移植3週間目に精巣を摘出し、病理評価を行った結果、3回投与群においては正常ラットと同レベルのHE像およびPCNA陽性率であった。また抗Luciferase抗体を用いて免疫染色を行った結果、全例でLuciferase陽性細胞(移植した間葉系幹細胞)は確認されなかった。以上の実験結果により、不妊ラットモデルの条件を確立・移植細胞の樹立・投与ルートの決定そして精巣賦活効果を確認した。高齢雄ラットを用いた生殖能賦活化に関する検討:生殖能力が皆無になった高齢LEW雄ラット(24週齢)に間葉系幹細胞を移植し、精子形成の再開の可能性について調査を行った。細胞移植前に数回LEW雌ラット(89週齢)と交配して妊娠に至らない事を確認した後、高齢LEW雄ラットに間葉系幹細胞を移植し、細胞移植1週間後にLEW雌ラットと交配して検討した。単回投与では雌ラットで妊娠は確認出来なかった。

しかし、精巣を摘出して病理標本(HE染色)を作製した結果、細胞移植治療群には精子の形成が確認され、少なくとも生殖細胞の賦活化に移植細胞が寄与している事が確認された。MSC分泌因子の投与による精巣賦活化効果に関する検討:温熱処理による不妊モデルラットの精巣内に、分子量カラムと培養液を用いて作製した濃縮MSC分泌因子液を3日間枚に3回の反復投与を行った。3回の投与が終了し、3週間後に8週齢雌ラットと交配した結果、投与群では雌ラット1匹から12匹の出産が確認された(5匹中4匹)。一方、非治療群においては1匹も新生児が得られなかった(3匹)。以上の結果より、MSCを直接投与する場合よりも効果は弱いが、少なくともMSC分泌因子に精巣賦活効果を有する物質が含まれている事が明らかとなった。大動物(ブタ)1頭を用いた不妊モデルの検討:前臨床試験を行う為に、先端医療技術開発センター内にて家畜ブタ(30kg)の不妊モデル作製条件の検討を行った(n=1)。全身麻酔下にて下腹部を切開し、精巣を引き出し、42°Cに保温した生理食塩水に30分間浸した。加温処理後に精巣を体内に戻し、60分後に精巣を摘出して、病理作製を行った。病理の結果、精巣周辺領域では精巣の細部構造の破綻が確認されたが、中心付近の領域は正常である事がHE染色で明らかとなった。大動物(ブタ)での雄性不妊化には加温時間を30分から延長する必要がある事が判明した。泌尿器癌、尿路結石症、腎移植、男子不妊症当初、Ds-Red遺伝子を組込んだTgラットを「細胞融合に関する検討」の項目で使用する予定でいたが、蛍光性が弱い事からEGFP遺伝子を組込んだTgラットに変更した以外は計画通りに進行した。間葉系幹細胞移植による精巣賦活化の検討の一部は平成25年度に実施する内容であった事から当該評価にした。平成26年度は以下の1項目について検討をする。高齢雄ラットを用いた生殖能賦活化に関する検討:生殖能力が皆無になった高齢LEW雄ラットに間葉系幹細胞を移植し、精子形成の再開の可能性について調査を行う。数回LEW雌ラットと交配して妊娠に至らない事を確認した高齢LEW雄ラットに間葉系幹細胞を移植し、治療期間後に再度、LEW雌ラットと交配し、妊娠に至る事を確認する。妊娠に至らない場合においては、精巣を摘出し、病理切片の作製を行いHE染色にて組織の状態(精原細胞・幼若精子・セリトリ細胞などの形態や細胞数)を確認し、少なくとも生殖細胞の賦活化に移植細胞が寄与しているかどうかを評価する。平成25年度は以下の3項目について検討をする。精巣組織の修復効果の検討:最適投与回数と細胞数を検討する。細胞融合に関する検討:Ds-Red遺伝子を組込んだ不妊化モデルLEW雄ラットにGFP遺伝子を組込んだ間葉系幹細胞を移植し、先の実験で決定した治療完了時期に精巣を摘出する。その後、精子および精巣組織をコラーゲナーゼ細胞分離法にて構成している各細胞を回収し、蛍光顕微鏡下にてDs-RedおよびGFP陽性細胞の分布性(『独立発光:非細胞融合』・『重合発光:細胞融合』)を明確にする。造腫瘍性に関する検討:不妊化モデル雄ラットにLacZ遺伝子およびLuciferase遺伝子を組込んだ間葉系幹細胞を移植し、長期間飼育(180日間以上)を行う。
チオレドキシンを介した光合成電子伝達依存的な転写制御機構の解明

当初、Synechocystis sp. PCC 6803の転写因子のレドックス変化を網羅的に検出するレドックスプロテオミクス解析を計画していたが、予備実験段階で、予算上実施困難であると判明したため、研究計画を変更し、チオレドキシンとの相互作用スクリーニングにより単離された5種の転写因子のうち、Sll1961に関して、野生株とsll1961破壊株の弱光下・強光下でのRNA-seq解析を実施し、遺伝子発現プロファイル比較による標的遺伝子の同定を試みた。さらに、野生株に比べて破壊株で高発現していた複数の遺伝子について、DNAゲルシフトアッセイを行うことにより、標的遺伝子候補を絞り込んだ。Sll1961はこれらの遺伝子について、リプレッサーとして働いている可能性が高い。今後、様々な環境条件下で野生株とsll1961破壊株のノーザン解析を行い、これらの遺伝子の発現変動を比較することにより、in vivoでのSll1961の働きを解明することができると考える。RpaBに関しては、すでに確立しているクロマチン免疫沈降法を用いて、試薬添加により光合成電子伝達鎖のレドックス状態を変動させた場合に、RpaBの標的遺伝子上流域への結合活性がどのように変化するかを検討した。その結果、in vivoにおいて、光強度によらず、光合成電子伝達活性からの還元力供給が少ない・多い状況下でRpaBのDNA結合活性が上昇・低下することを示すことができた。これまでに、チオレドキシンと転写因子との相互作用を検出するために開発した、大腸菌共発現株を用いたスクリーニングの系において、Synechocystis sp. PCC 6803のSll1961転写因子が、チオレドキシンと相互作用する結果を得ていた。今年度は、野生型、およびSll1961に存在する3つのシステイン残基C124、C229、C307をアラニンに置換した変異型タンパク質をそれぞれ大腸菌より精製し、精製チオレドキシンとの相互作用を検証した。チオール基修飾試薬PEG-maleimideを用いた解析により、システイン残基のレドックス状態を調べたところ、酸化条件下ではC229とC307が分子内ジスルフィド結合を形成すること、チオレドキシンとの相互作用により可逆的に還元されることを見出した。また、酸化還元処理を行ったSll1961タンパク質をトリプシン消化し、TOF-MS解析に供したところ、C229とC307の分子内ジスルフィド形成に由来すると考えられるペプチド鎖が、酸化サンプルで検出された。さらに、酸化還元処理を行ったSll1961タンパク質をHPLC解析に供したところ、酸化還元状態によらず、Sll1961タンパク質は二量体として検出された。以上の結果より、Sll1961はシステインを介さず二量体を形成しており、酸化条件下ではC229とC307の分子内ジスルフィド結合形成により構造変化・活性変化が起きる、というスキームが考えられる。今後、in vivoでのSll1961の存在状態を検出することにより、このような構造変化・活性変化、およびチオレドキシンとの相互作用が実際に起きているかどうか、検証を行う予定である。Sll1961タンパク質がチオレドキシンと相互作用するというスクリーニング結果を、精製タンパク質を用いた解析で実証することができた。さらに、システイン置換型タンパク質を用いて、チオレドキシンとの相互作用および分子間ジスルフィド結合形成に、C229とC307が関与することを示唆する結果を得ることができた。これらのタンパク質を用いたDNAゲルシフトアッセイにより、推定標的遺伝子上流域への結合能が、システインの酸化還元状態によりどのような影響を受けるか調べようとしたが、今のところSll1961タンパク質のDNA結合活性を検出できていない。この点については今後、反応液組成の検討を行っていく必要がある。当該年度は、チオレドキシンとの相互作用スクリーニングにより単離されたSynechocystis sp. PCC 6803の5種の転写因子のうち、Sll1961とRpaBについての個別解析を行った。Sll1961に関しては、これまでにin vitroにおいてC229とC307がレドックスアクティブであること、チオレドキシンとの相互作用によりこれらの間の分子内ジスルフィド結合が還元されることを見出していた。そこで、Synechocystis sp. PCC 6803を強光照射や阻害剤添加により、光合成電子伝達活性を変化させた条件下で培養し、TCA添加によりレドックス固定して集菌し、チオール修飾試薬PEG-maleimideで処理した後に、イムノブロット解析によりin vivoでのSll1961のシステイン残基のレドックス状態を検出した。その結果、培養条件によらず3つのシステイン残基のうち2個または3個が常に還元条件にあることが明らかになったが、この結果はin vitroでの結果と合致しない。今後、現在行っているレドックス固定方法が妥当であるか検討したい。RpaBに関してはゲノムワイドな標的遺伝子の探索を行った。バイオインフォマティクス解析によりSynechocystis sp. PCC 6803ゲノム中より、RpaB認識配列であるHLR1を適切な位置に持つ遺伝子を検出することで、RpaBにより正の調節を受ける標的、および負の調節を受ける標的候補約300個をリストアップした。この中には、これまでにRpaBの制御下にあると報告されてきた光化学系関連遺伝子に加え、広義の光合成関連遺伝子が多く含まれていた。

現在、いくつかの新規標的候補遺伝子についてノーザン解析、クロマチン免疫沈降解析、ゲルシフト解析等により、HLR1配列へのRpaBの結合と遺伝子発現レベルの変化の関係性を調べている。in vitroにおける転写因子のシステインレドックス変化、およびチオレドキシンとの相互作用に関する解析は終了しており、今後はそれらのレドックス変化や相互作用が実際に起きるin vivoでの条件を探すことが最優先課題となる。当該年度までにチオール修飾試薬PEG-maleimideによるシステインのレドックス状態検出系、およびChAPによる転写因子の動態検出系を立ち上げ、in vivoでの転写因子の状態変化をモニターすることが可能となった。しかし、この系を用いて解析を行ったところ、in vitroで検出されたレドックス変化がin vivoで検出できないという問題に直面している。強い酸化剤を培養液に添加する等の酸化還元ストレス条件下で、Sll1961やRpaBのレドックス変化を検出できるかどうか評価することにより、実験系を再検討することが急務である。ChAPの系はRpaBに関しては十分に機能しており、環境条件を変化させた際の動態をモニタリングする準備が整った。しかし、Sll1961に関しては、当初標的候補と予想していた遺伝子上流域へのSll1961の結合活性が見られず、今後genomic SELEX法等により、実際にSll1961が結合して働くゲノム領域を同定する必要がある。当該年度は、チオレドキシンとの相互作用スクリーニングにより単離されたSynechocystis sp. PCC 6803の5種の転写因子のうち、GntR型転写因子Sll1961についての生化学解析を進めた。Sll1961に関しては、これまでにin vitroにおいてC229とC307がレドックスアクティブであること、チオレドキシンとの相互作用によりこれらの間の分子内ジスルフィド結合が還元されることを見出している。Sll1961は非還元SDS-PAGEを行うと常に単量体として検出されるが、GntR型転写因子は二量体構造を取ることが一般的であるため、これまでの実験系では、チオレドキシンとの相互作用に伴う単量体二量体変換等を見落としている可能性があると考え、HPLC解析により多量体状態の検討を行った。その結果、Sll1961はレドックス状態によらず、またシステイン残基の置換の有無によらず、二量体として存在していることが明らかになった。一方、CDスペクトル測定とその結果に基づくモデル構築により、C末側に存在する分子内ジスルフィド結合にチオレドキシンが作用することにより、N末側のDNA結合領域に構造変化がもたらされる可能性が示唆された。今後、Sll1961が標的とする遺伝子を同定した上で、レドックス状態がDNA結合活性に影響を与えるかどうか検証する必要がある。また、Sll1961とチオレドキシンの相互作用の生理的意義を明らかにするためには、in vivoにおけるレドックス変化の検出が必須であるが、チオール基修飾後にイムノブロット検出する方法では、Sll1961システイン残基のレドックス変化は依然として検出できていない。今後、レドックスプロテオミクスの手法を用いる等、別の手法を試みる必要がある。
運動ニューロン病への分子生物学的アプローチ

変性性神経疾患の中でも運動ニューロン病は原因が全く不明であり,治療法も現在のところ皆無の状態にある.近年,運動ニューロン病での核酸代謝異常や,遺伝子異常が報告されているが多くの弧発性運動ニューロン病での分子生物学的アプローチはその端緒についたにすぎない.本研究では運動ニューロン病の脊髄前角細胞における核酸代謝レベルの変動の有無を明らかとすることを目的とした.まず,運動ニューロン病発症と連鎖している染色体を決定するためにリンパ球からDNAを抽出しVNTR34種を用いて連鎖解析を行った.ついで,Rosenらの報告に準じてSOD(superoxide dismutase)遺伝子のうちexonl,3,5遺伝子,さらに神経成長因子,神経成長阻害因子,軸索流に関係する細胞骨格蛋白,タウ等の遺伝子レベルでの発現状態および異常の有無を変性性神経疾患以外で死亡したコントロール脊髄と対比して検討した.本年度は主としてVNTRおよびSODについて検討したが,自検運動ニューロン病症例においては有為な連鎖を得ることができなかった.これにはSOD遺伝子が家族性運動ニューロン病のうち10%内外にしか連鎖していないこと,さらにはVNTRでは編み目が大きく検出し得ない可能性が原因として考えられる.今後はマイクロサテライトを用いた,さらにきめの細かい連鎖解析を行っていく予定である.変性性神経疾患の中でも運動ニューロン病は原因が全く不明であり,治療法も現在のところ皆無の状態にある.近年,運動ニューロン病での核酸代謝異常や,遺伝子異常が報告されているが多くの弧発性運動ニューロン病での分子生物学的アプローチはその端緒についたにすぎない.本研究では運動ニューロン病の脊髄前角細胞における核酸代謝レベルの変動の有無を明らかとすることを目的とした.まず,運動ニューロン病発症と連鎖している染色体を決定するためにリンパ球からDNAを抽出しVNTR34種を用いて連鎖解析を行った.ついで,Rosenらの報告に準じてSOD(superoxide dismutase)遺伝子のうちexonl,3,5遺伝子,さらに神経成長因子,神経成長阻害因子,軸索流に関係する細胞骨格蛋白,タウ等の遺伝子レベルでの発現状態および異常の有無を変性性神経疾患以外で死亡したコントロール脊髄と対比して検討した.本年度は主としてVNTRおよびSODについて検討したが,自検運動ニューロン病症例においては有為な連鎖を得ることができなかった.これにはSOD遺伝子が家族性運動ニューロン病のうち10%内外にしか連鎖していないこと,さらにはVNTRでは編み目が大きく検出し得ない可能性が原因として考えられる.今後はマイクロサテライトを用いた,さらにきめの細かい連鎖解析を行っていく予定である.変性性神経疾患の中でも運動ニューロン病は原因が全く不明であり,治療法も現在のところ皆無の状態にある。近年,運動ニューロン病での核酸代謝異常や,一部の家族性筋萎縮性側索硬化症における遺伝子異常が報告されているが,多くの弧発生運動ニューロン病での分子生物学的アプローチはその端諸についたにすぎない。本研究では50例におよぶ運動ニューロン病の剖検脊髄,および凍結下にある剖検脊髄について神経成長因子、神経成長阻害因子、軸索流に関係する細胞骨格蛋白,Tau,Rosenらの家族性運動ニューロン病の報告に準じてSOD等の遺伝子レベルでの発現状態,および異常の有無を変性性神経疾患以外で死亡したコントロール脊髄と対比して検討している。平成5年度に本研究を開始し,現在,自験家族性運動ニューロン病症例(構成員10数人,発症者4人)についてSODの遺伝子変異についてExon1について検討を行なっているところである。現在のところ,Exon1では有意な結果を得られていないため,他のExon1について検討を開始したところである。我々の研究の主たる対象である細胞骨格については,キネシン,MAP1c,Tauについて合成プライマーを作成済みであり、ホルマリン固定下の脊髄について検討を開始した。また,一部の脊髄凍結切片からは凍結乾燥切片を作成し、RNAを抽出するための準備が整ったところである。また,一部の凍結切片についてはスライドガラスに塗布し,ハイブリダイズの準備を完了した。現在,まだ有意な結果は得られていないが,近日中に何等かの結果を得ることができると考えている。運動ニューロン病は原因が全く不明である.近年,運動ニューロン病での核酸代謝異常や,遺伝子異常が報告されているが多くの弧発性運動ニューロン病での分子生物学的アプローチはまだ少ない.本研究では運動ニューロン病の脊髄前角細胞における核酸代謝レベルの変動の有無を明らかとすることを目的とし,まず,運動ニューロン病発症と連鎖している染色体を検討するために患者のリンパ球からDNAを抽出しほぼ全染色体をカバーするようにVNTR34種を選び,定法に乗っ取り,連鎖解析を行った.またこれと平行して,Rosenらの報告に準じて,SOD(superoxide dismutase)遺伝子のうちexon1,3,5について検討した.自検運動ニューロン病症例においては有為な連鎖を得ることができなかった.これにはSOD遺伝子が家族性運動ニューロン病のうち10%内外にしか連鎖していないこと,さらにはVNTRでは編み目が大きく検出し得ない可能性が原因として考えられる.今後はマイクロサテライトを用いた,さらにきめの細かい連鎖解析を行っていく予定である.
環境に応じて運動するスライム構築の実現に向けたシステムデザイン

環境に応じて運動する微小物体について、駆動力の発生方法など、基本的な知見を得るために実験と理論の両面から研究を行った。今年度も幾つかの共同研究を進展させ、その中で研究成果を得たので、以下簡単に説明する。1.気液界面上での微小物体の移動と物質輸送:気液界面上の微小物体(疎水性高分子の粉体で気液界面を安定化させた体積15マイクロリットルの水滴:リキッドマーブル)の周囲に表面張力の勾配をつくりだすことで、物質輸送させたのち、内部の物質を放出する手法を確立した。具体的には、遠赤外線レーザーをリキッドマーブルの表面に照射し、局所過熱を誘起し、それによって数マイクロニュートンの力を発生させた。研究成果はAdvanced Functional Materialsに掲載され、論文の引用回数は順調に伸びており(被引用回数19回)、微小物体による物質輸送に関する重要な論文として注目されている。2.微小管の力学的特性:これまでの実験的研究から、微小管の応力-ひずみ線図が得られてきている。これまでの微小管の力学的特性の考察では、応力-ひずみ線図に従って、微小管のYoung率の考察を行ってきたが、次の段階である、変形の大きな領域の力学的性質の扱いが単純な弾性体では理解が困難であった。今回、この問題点は微小管を超弾性体として扱うことで、理解できることが見いだされた。具体的には、1軸伸長の条件でひずみエネルギー関数を用いると、実験で得られているこれまで得られている微小管の応力-ひずみ線図を再現できるとともに、Young率やせん断率を評価でき、得られた値はこれまで報告されている値ともよく一致する。微小管を超弾性体として考察した結果である。現在、論文執筆中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に沿って北大・角五彰准教授との共同研究が進展し、研究成果が得られている。1.微小物体の運動性を高めるための表面構造について:水中のバクテリアなどの微生物の運動では駆動力の大きさを考えることも重量であるが、運動の際に流体から受ける抵抗にも注目しなければならない。この問題を理解するために、異なる表面構造(ラテックスビーズ、高分子ブラシで表面修飾したシリカビーズ、ゲルビーズ、窪みのあるシリカビーズなど)を有したシリカビーズを作成し、光ピンセットにより低レイノルズ数の領域での流体から受ける力の大きさを測定した。その結果、Stokesの抵抗則で流体力学的半径を評価したときに高分子ブラシで表面修飾したシリカ粒子が実効的なサイズ一番大きく、その反対に表面に窪みがある微粒子とゲルビーズは小さかった。この結果から、力を発生させる際は流体力学的半径を大きくすること(大きく流体をかく)で大きな駆動力が得ることができること、表面にわざと凹凸をつくることで駆動力を発生させた後に抵抗を小さくすることができることが分かった。実際の微生物の運動と比較することが今後必要となる。2.微小管(細胞骨格)の力学的特性:これまでの共同研究から、微小管の破壊現象から力学的性質の1つであるYoung率を定量的に評価する理論を確立した。今年度の共同研究ではこの理論を基本にして微小管の屈曲による破壊現象を理解することに成功した。当初の研究計画に沿って共同研究を遂行している。次年度では、これまでの共同研究を展開させるとともに、これまで進めてきた埼玉大学・根本直人教授との共同研究を本格的に遂行する。
音楽と文学における虚構理論の美学的関連性の検証

研究成果は以下の2つである。1音楽と文学における虚構性の共通構造と差異、2文化的コンテクストにおける虚構性受容構造分析。音楽は作為的時間の作出/表出を基盤に置き、言語芸術におけるプロットと類似した構造を有している。この構造的類似性から、音楽作品を《虚構》とする共通的構造側面に到達した。対して音楽と文学の受容過程で《語り手》と《代理話者》で構造的差異が観測できた。続いてフィクションとしての芸術の受容には、その作品が成立する文化的コンテクストが大きく作用する点を、明治期の小説におけるヴァーグナーの架空の受容、戦後の前衛音楽の衰退とポストモダン終焉にともなう現象を実例をもとに分析した。本研究は虚構性に関する音楽研究と文学研究の協同理論を開発し、その観点から文学理論を援用した音楽表象の分析・検証をおこなう。特に、“虚構性"と“作品の受容構造"に焦点を絞り、諸芸術作品における時間性と文学作品内で音楽体験が言語化される諸相等を取り上げ、芸術性の生成・受容場面で、言葉と音の相補性が果たす役割を明らかにすることを目的としている。平成27年度は1音楽美学におけるアヴァンギャルド/エクスペリメンタル理論、2ポリリズムの語用研究、3演奏における楽譜の問題を中心に文学理論を敷衍しつつ音楽芸術における諸問題の基盤的視点を確立した。まず1では音楽美学における“前衛"(avant-garde)と“実験"(experimental)の語用的混同を検証しつつ、現代のあらゆる表現様式が混在する音楽文化においては、既存の制度を打破する攻撃性を有する“前衛"が理論的に存在しにくい状況を分析した。2では一般にモノリズムとポリリズムに2分割される諸リズム形態をマルティリズム、ポリメトリック、ポリクロノミー、クロスリズム、カウンターリズムに細分化し、ルネサンスから現代に至るジャンルを超えた膨大な作品に見られる各リズム構造を分析することに成功した。3ではブルックナーの第8交響曲の3つの版を自筆譜をもとに分析し、改訂及びクリティカル・エディション(ノヴァーク第1稿、ハース稿、ノヴァーク第2稿)の楽理的必然性及び楽譜テクストを対象とした美的折衷の意義を考証した。研究初年度に音楽理論を専門とする研究代表者と文学理論を専門とする研究分担者間で綿密な学術的論理整合性を常に協議しつつ、美学的に語用が混同されている諸問題を整理することができた。従って文学理論を音楽芸術に敷衍しつつ両芸術領域の虚構理論の統合および美学思想の横断的展開を今後発展させることが可能となった。本研究は音楽が美学上《虚構(フィクション)》に位置するのか《現実(ノンフィクション)》に在るのか、という命題を文学領域と協同しつつ研究している。音楽・文学ともに作者は「現実の時間」軸上で“可能世界"を作出する。文学作品内では作者は架空の《語り手》を設定し、読者は《語り手》の語りを現実時間に聞く、という行為こそが読書であり受容するか否かの決め手となる。少なくとも可能世界における虚構の時間上で展開される語りは、それが一人称であっても作者本人とは乖離した可能世界における存在となる。この文学作品の成立構造を音楽の聴取構造に援用すると、音楽作品は楽譜を再現する《演奏者》という代入因子が介在することによって、虚構の時間が再び現実の時間へと引き戻される現象が起こる(文学作品は朗読者が不在でも作品そのものは成立する)。これが音楽=虚構という構造を棄却する概念の中心的働きとなっているという議論の中心点に到達することができた。28年度は上記の音楽/文学における虚構の在り方の乖離点について、マリー=ロール・ライアン『可能世界・人工知能・物語理論』をもとに音楽における《語り手》及び《代理話者》の関係性を詳細に分析した。さらに、《代理話者》が実際の音楽作品でどのように機能するのか、という構造に着目し、実際の音楽作品を制作発表し、現実世界の《語り》と可能世界における《代理話者》=《演奏者》が音楽的時間で併存する実験的試みを行った。音楽学と文学理論との協同により、音楽作品と文学作品における《虚構》=フィクションの成立要件の根本的相違点が受容サイドから見た《語り手》のポジションにある、と言う点に到達した。とりわけ音楽における《語り手》と《代理話者》はジャンルやリアライズされる形態によって可変的であり、極めて複雑な様相を呈している構造に着目することができた。研究最終年度であるH29年度はテクノロジー文化と音楽の消費構造の変遷データを詳細に分析し、ゼロ年代と比較して、音楽消費サイドがネットでヴァーチャルに音楽を享受するよりも、リアルに音楽が演奏される《場》を求めるようになったことを論じた。とりわけポストモダン文化を読み解き、それが脆弱な論理的基盤の上に成り立っていたことを指摘した。ポストモダンの概念は芸術世界に適用された場合,芸術の自律性さらに創作サイドのメタ物語性が全て棄却される。この論理的脆弱性が後にゼロ年代における,個々の作品としては単純でありながらも混然とした音楽文化状況を招いてしまう結果につながったという結論に達した。しかし、ポストモダンの終着点たるゼロ年代が終わると、無重力/無個性化されたポストモダン的消費音楽は廃れ,前時代的な,ある種の自己主張の《強烈さ》を表出するフィクション世界(=芸術)が再び求められる時代に突入した。何重にも仕掛けられたフィクションの愉楽から、リアリティを持つ“声"と“身体性"を再び希求するようになっているという結論に至った。

また、ジョナサン・スターン『聞こえてくる過去音響再生産の文化的起源』(中川ほか訳、インスクリプト、2015)を中心に、音響再生産技術と音響メディアの関係、その組織化をめぐる考察も行った。研究成果は以下の2つである。1音楽と文学における虚構性の共通構造と差異、2文化的コンテクストにおける虚構性受容構造分析。音楽は作為的時間の作出/表出を基盤に置き、言語芸術におけるプロットと類似した構造を有している。この構造的類似性から、音楽作品を《虚構》とする共通的構造側面に到達した。対して音楽と文学の受容過程で《語り手》と《代理話者》で構造的差異が観測できた。続いてフィクションとしての芸術の受容には、その作品が成立する文化的コンテクストが大きく作用する点を、明治期の小説におけるヴァーグナーの架空の受容、戦後の前衛音楽の衰退とポストモダン終焉にともなう現象を実例をもとに分析した。今後はマリー=ロール・ライアンの可能世界理論及びジェラルド・レヴィンソンが提唱した演奏における真正性を研究し、音楽作品における演奏者の位置づけを詳細に分析して行くこととなった。あらゆるフィクションにはライアンが代理話者(substitute speaker)の類型として挙げた「純理論的根拠によって存在が措定される無人格の語り手」が潜在している。しかしながら近代のパラダイムにおいては、それを「現実の作者の思想」等々で顛倒的に充填することで、フィクション生成の場が成立していると考えられる。音楽の場合に興味深いのは、演奏者の演奏行為によるテクスト(楽譜)の現実化が、録音も含めてマテリアルなものとなることである。これはもしかすると、現実の作曲家の“意図"にも、現実の演奏者の“理想"にも落としこめない、テクスト(楽譜)に潜在する「無人格の語り手」の音楽-行為と考えられるかもしれない、と仮定し、音楽作品における代理話者の存在論を音楽・文学双方から横断的に論じて行く予定である。音楽及び文学の側面からフィクションとしての芸術の存在論を美学的に研究した結果、最終的課題として《代理話者》の位相が浮かび上がってきた。とりわけ音楽芸術における《代理話者》の位置づけは、作曲者が楽譜に“記譜"したものを「再現」する演奏者というスタンスと、作曲者自ら自作を演奏する(作曲者が代理話者として成立する)スタンスでどのように取り扱うのか、判定基準の策定が目標として挙げられた。さらにジャンルを超えて音楽という事象そのものを観察すると、ボーカロイド・ムーヴメント等《代理話者》までもがヴァーチャルで架空の存在である場合等、文学と比較して極めて複雑な様相を呈している。従って今後は音楽と文学における《代理話者》に焦点を絞り、ジャンルをまたいでライアンが提唱した代理話者の形態における「純理論的根拠によって存在が措定される無人格の語り手」の存在論を総合的に分析する。また、音楽作品に付随するマテリアルな要素も分析研究の課題として挙げられる。作曲、音楽理論、音楽美学本年度は当初計画で見込んだより地方での学会及び研究会の開催が少なく、出張費がほとんどかからなかった。また、研究分析対象をパフォーミング・アーツ分野に拡大する必要性が生じ、文献・音源資料等のリストアップに時間がかかり、本年度の購入に間に合わなかった。
複雑な血管網を有するマイクロ三次元組織の開発

薬剤の体内分布に関わる筋肉や脂肪組織,ドラッグデリバリーに関わる末梢組織のモデル化を実現するために,毛細血管網を有した筋肉や脂肪などの三次元組織,およびハイドロゲルを用いた血管の構築を目指した.市販のヒト初代細胞を利用し,内部に毛細血管網を有したマイクロ三次元組織を構築することを実現した.本研究の成果は将来的に,創薬や有毒化学物質等のリスク評価など,様々な分野に応用可能であると期待される.細胞培養のためのマイクロデバイスの設計と試作を行った。チップ内の微小な培養槽で細胞を三次元培養する場合、栄養欠乏に陥りやすいため、細胞の接着面側からの培地供給も必須であり、多孔質膜上に細胞を培養することを着想した。そこで、上下に接する2本の流路の間を多孔質膜で仕切るようなチップを作製し、多孔質膜の上側を培養槽とした。チップはソフトリソグラフィー法によってPDMSを用いて作製し、流路の形状及びサイズ、膜の表面修飾について最適化を試みた。作製したデバイスを用いて細胞の集積培養法について検討した。その結果、複数種類の株化細胞を用いた実験において、集積培養に成功した。さらに、ヒト由来の初代線維芽細胞での三次元培養を試みており、細胞懸濁液の細胞数密度、導入方法、培養時間、培地の供給方法などについて検討を行った。また、この三次元培養している細胞層の間に血管内皮細胞を1層共培養することにより、自発的に管腔構造を形成させて血管として機能させることを試みたが、現時点では成功に至っていない。一方、ハイドロゲルを用いて作製したマイクロ流体デバイスを用いて模擬血管を構築することも試みた。アガロースゲルを用いてマイクロ流路を作製し、その中に管腔構造を有したアルギン酸ゲルを造形した。具体的な作製手順としては、細胞を懸濁したアルギン酸溶液にマイクロ流路内で外側からCa2+を作用させる事により、外側のみゲル化させることで環状構造を作製した。アルギン酸ゲル内に2種類の細胞を共培養することにより模擬血管を作製することをめざし、内側に血管内皮細胞、外側に平滑筋細胞を用い、細胞接着を促すためにアルギン酸にはコラーゲンの添加を試みた。その結果、細胞培養には成功したものの、充分な細胞の進展と分化を観察することはできなかった。マイクロデバイスの作製とモデルである株化細胞の培養には成功しており、おおむね順調に推移している。ただし、初代細胞の増殖や充分な分化には至っていないために、今後重点的に検討する必要がある。細胞培養のためのマイクロデバイスの設計と試作を行った。チップ内の微小な培養槽で細胞を三次元培養する場合、細胞量に対して培地量が少なく、栄養欠乏に陥りやすい。その問題を解決するため、細胞の接着面側からも培地供給を実現可能な方法として、マイクロ流体デバイス内に設置した多孔質膜上に細胞を培養することを着想した。上下に接する2本の流路の間を多孔質膜で仕切るような構造のチップをソフトリソグラフィー法によってPDMSを用いて作製し、形状やサイズの最適化を行った。フィブロネクチンとゼラチンのナノ薄膜多層コーティングした細胞を一度に大量に播種するという集積培養法を作製したマイクロチップ内で実現するための培養手順の最適化について検討した。また、この三次元培養している線維芽細胞層の間に血管内皮細胞を1層共培養する方法で内部に血管構造を有した三次元組織の開発を試み、自発的血管構造の形成を確認した。ハイドロゲル内部に細胞培養することにより模擬血管を作製することを試みた。管腔構造内に培養する細胞としては動脈由来の血管平滑筋細胞を用いた。用いるハイドロゲル素材についてはアルギン酸を中心に検討し、細胞外マトリックスや接着因子添加の効果についても検討したが、充分な平滑筋細胞の伸展は見られなかったため、ハイドロゲル材料としてコラーゲンを用い、pH変化によってゲル化させることにより、より優れた平滑筋細胞の管腔状培養構造体を構築することに成功した。薬剤の体内分布に関わる筋肉や脂肪組織,ドラッグデリバリーに関わる末梢組織のモデル化を実現するために,毛細血管網を有した筋肉や脂肪などの三次元組織,およびハイドロゲルを用いた血管の構築を目指した.市販のヒト初代細胞を利用し,内部に毛細血管網を有したマイクロ三次元組織を構築することを実現した.本研究の成果は将来的に,創薬や有毒化学物質等のリスク評価など,様々な分野に応用可能であると期待される.管腔状ハイドロゲルの内側に血管内皮細胞、外側に平滑筋細胞、場合によってはさらにその外側に線維芽細胞などを共培養することをめざして、培養条件の検討を試みる。さらに、作製したこの太い血管に、毛細血管網を有した三次元組織を自発的に構築させることを試みる。これにより、外部流路からつながる太い血管、そこから分岐する毛細血管網、全体を取り囲む線維芽細胞といった複雑な構造を有した三次元組織培養の実現を試みる。作製した三次元組織について、外部からモデル薬剤などを導入し、これが毛細血管網などを通じて組織に移行する速度、および移行量を測定し、薬がどれだけ体内組織に分布するかのモデルとしてふさわしいかどうか評価する。マイクロ分析化学株化モデル細胞を用いた条件検討が多く、高価な初代細胞とその専用培地の購入が少なかったことや、学会出張経費を計上しなかったために未使用額が生じた。本年度は初代細胞を用いた培養条件の検討を数多く行うために、繰越額を合わせた予算の大半を細胞培養実験の消耗品費として使用する。
緑内障の新治療法の基礎的研究ー視神経乳頭循環と温度変化測定法の開発

緑内障,殊に低眼圧緑内障の場合に正常人と比べて角膜温度回復状況が低温負荷の条件下で有意に低下していることが証明された。手指末端の低温負荷後の温度回復率も顕者に低下していることと併せて、自律神経殊に交感神経系の異常が推定された。そこで、正常者、低眼圧緑内障、高眼圧緑内障を対象に眼脈流量を、バイオラッド社製BFAシステムにより測定したところ、低眼圧緑内障では有意に眼脈流量が低値を示すことを認めた。しかも病期の進行とともにより低値を示す傾向がみられた。治療として交感神経α遮断剤点眼によって眼脈流量が有意に増加することを証明した。すなわた、塩酸ブナゾシン点眼によって、眼圧の下降も得られるが、眼循環量が点眼1週後より増加し、3ケ月後には最大の増加率(投与前の50%増)が得られた。全身の血圧や脈拍には有意な変化を認めなかった。さらに、視野変化も改善や不変を示す症例が多く、視野改善例では眼脈流量の増加率が非改善群より有意に高いことを認めた。低眼圧緑内障の治療法として、眼圧を下降させると同時に眼内血流量の増加を図ることが重要と考えられるが、α遮断薬として塩酸ブナゾシンの点眼によってその効果が実証できたことは新しい治療の可能性を見出しにものと考えている。今後さらに長期間にわたって効果の持続性や遠隔成績を検討してゆく予定である。緑内障が眼内圧の抗進によって眼内の循環、特に視神経乳頭における血液供給の障害をうけ、視神経障害に導かれると考えられる。血液の変化を知る方法として、温度変化で把握する手段を選び、医用サーモグラフイーによる測定を試みた。予備実験として、緑内障患者(原発開放隅角緑内障と低眠圧緑内障)を選択し、対照として非緑内障患者と高眠圧症患者を選んだ。そして、手指を0°Cの氷水の中に1分間浸たし、温度計にて刻々と変化する手指の皮膚温を測定した。その結果、低眠圧緑内障患者は有意に低温からの皮膚温の回復が遅延し、原発開放隅角緑内障もそれに次いで皮膚温回復が遅延することが分った。このことは末梢血管収縮を惹起し、その回復がおくれることで交威神経系の調整能が障害されている可能性を示唆する。(第148回大阪眼科集談会、平成元年1月21日報告)更に、眼部の温度を医用サーモグラフイー(インフラアイ160)を用いて測定し、4°C低温の生理食塩水を点眼させた後の眼部温度変化を継時的に測定した。対象は、低眼圧緑内障、原発開放隅角緑内障および高眼圧症で、正常者を対照とした。現在、測定結果を得ている段階で手指の皮膚温回復率との相関性も検討している(第56回日本中部眼科学会、平成元年9月8日10日発表予定)である。なお、動物眼について眼圧を眼圧センサーでモニターしながら温度変化を測定する実験を行っている段階である。緑内障、ことに低眼圧緑内障において手指の皮膚温度が低温負荷後に回復がおくれることから、自律神経系の異常で四肢末端の末梢循環系が異常な調整を示すことが明らかになった。そこで、医用サ-モグラフィ-によって眼の温度を正常人、緑内障(高眼圧症、原発開放隅角緑内障、低眼圧緑内障)について測定し、氷水(4°C)低温の生理食塩水を点眼した後の温度の回復状況を観察した。その結果、低眼圧緑内障次いで原発開放隅角緑内障、高眼圧症、正常人の順で異常な回復遅延がみられることを証明できた(平成元年9月9日、第55回日本中部眼科学会において発表)

動物実験では角膜輪部より12mmの強膜上に熱拡散センサ-を設置し、熱勾配式組織血流量測定アンプを用いて脉絡膜血流量を継時的に測定し、同時に大腿動脉にカニュ-レを挿入して血圧をモニタ-した。先ず、種々の眼圧水準を設定して血流量を測定し、次いで昇圧剤を用いて、血圧変動時の脉絡膜血流量、血圧、眼圧を測定した。緑内障,殊に低眼圧緑内障の場合に正常人と比べて角膜温度回復状況が低温負荷の條件下で有意に低下していることが証明された。手指末端の低温負荷後の温度回復率も顕著に低下していることと併せて,自律神経殊に交成神経の異常が推定された。そこで,正常者,低眼圧緑内障,高眼圧緑内障を対象に眼脈流量をバイオラッド社製BFAシステムにより測定したところ,低眼圧緑内障では有意に眼脈流量が低値を示すことを認めた。しかも病期の進行とともにより低値を示す傾向がみられた。治療として交感神経α遮断剤点眼によって眼脈流量が有意に増加することを証明した。すなわち,塩酸ブナゾシン点眼によって,眼圧の下降も得られるが,眼循環量が点眼1週後より増加し,3ケ月後には最大の増加率(投与前の50%増)が得られた。全酸の血圧や脈拍には有意な変化を認めなかった。さらに,視野変化も改善や不変を示す症例が多く,視野改善例では眼脈流量の増加率が非改善群より有意に高いことを認めた。低眼圧緑内障の治療法として,眼圧を下降させると同時に眼内血流量の増加を図ることが重要と考えられるが,α遮断薬として塩酸ブナゾシンの点眼によってその効果が実証できたことは新しい治療の可能性を見出したものと考えている。今後さらに長期間にわたって効果の特結性や遠隔成績を検討してゆく予定である。
カンキツ類カルスの形態形成能に関する研究

細胞融合や組換えDNAなどの新しいバイオテクニックを駆使してカンキツ類の品種改良を行う場合、単細胞またはひとつのプロトプラスト由来のカルスから植物体を再生しなければならない。本研究ではカンキツ類の多数の品種につき種々の器官、組織から誘導したカルスの形態形成能を調査し、組織培養による品種改良のための基礎的知見を得ようとした。1.カルスはやく、胚珠,珠心,胚軸,子葉,砂じょう,アルベド,生長点などから誘導することができたが、カルスの形状や分化能に差異がみられた。また、オレンジ類の血を引く品種の珠心カルスは分化能が高かった。2.形態形成能が高いカルスは外観的特徴によって選抜でき、白色小粒状で生長が早いことが重要な指標となった。3.バレンシアオレンジ,ワシントンネーブルオレンジ,マーコットタンゴールおよびマイヤーレモンの珠心由来のカルスと、シキキツのやく培養によって得られた幼植物体の胚軸部分から発生したカルスが高い形態形成能を有し、プロトプラスト単離も可能であった。これらのカルスは10ppmベンジルアデニンを含む培地で継代培養するとカルスの状態を維持し、ホルモンを含まない培地に移植すると胚を発生した。発達した胚をジベレリン1ppmを含む培地で育てると発根し、完全な植物体になった。形態形成能はプロトプラストを経由しても維持されたので、植物体-カルス-プロトプラスト-カルス-植物体という系がカンキツ類で完成された。4.林温州,ハッサク,ユーレカレモン,マーシュシードレスグレープフルーツの胚軸から誘導したカルスは白色大粒で柔らかな外観的特性を有していたが、形態形成能はなかった。胚軸由来のカルスから単離したプロトプラストは、珠心由来のカルスからのプロトプラストに比べ細胞膜が破れにくく、操作が容易であった。
C型肝炎ウイルスの粒子産生機構の解析

本研究ではC型肝炎ウイルス(HCV)粒子がリポタンパク質の一種であるアポリポタンパク質E ApoE)と相互作用し、HCVの感染性に重要な役割を果たしている事を明らかにした。さらにそれらの相互作用は細胞内においておこりHCVはApoEを含むリポタンパク質との複合体として細胞外に放出されることが示された。また、細胞外に放出されたHCVはApoEをリガンドとし、Low density lipoprotein receptor (LDLR)とScavenger receptor B,type I(SR-BI)を介して宿主細胞に感染している可能性が示唆された。申請者は、内在性のアポリポタンパク質E(ApoE)の発現量をsiRNA法により抑制すると、C型肝炎ウイルス(HCV)粒子の感染性が顕著に減少する事を見いだしているが、ApoEがどのような機構でウイルス粒子の産生に関与しているのかについては全く明らかとなっていない。そこで、ウイルス粒子産生におけるApoEの機能を明らかにすることを目的とし、下記の事項に焦点を絞り研究を遂行した。共免疫沈降実験の結果、HCVのE1,E2,NS5AとApoEがそれぞれ相互作用することが明らかとなった。また、結合領域の同定までには至っていない。(b)ウイルス粒子とApoEは相互作用するのか?HCV粒子を抗ApoE抗体で免疫沈降した後に定量RT-PCR解析を行なった結果、免疫複合体にHCVRNAが検出された。さらに、非沈降画分のHCVの感染性が顕著に減少した事から、感染性HCV粒子とApoEが相互作用していることが明らかとなった。(c)ウイルス粒子の感染性にApoEのアイソフォームが関与するか?ApoE抑制細胞にApoEのアイソフォームをそれぞれ発現させ、さらにそれらの細胞から産生されるウイルス粒子の感染性を解析した結果、低比重リポタンパク質受容体(LDLR)との結合力が弱い事が知られているApoE2が発現している細胞からのウイルス粒子の感染性がApoE3やApoE4と比較し、顕著に低い事が示された。この事から、ApoEとLDLRとの結合力がHCVの感染性に関与している可能性が示唆された。これまでにHCVのウイルス粒子がVLDL(very low density lipoprotein)と結合していることが報告されている。VLDLとは中性脂肪とコレステロールが主成分で、タンパク質としては主にアポリポタンパク質-B(ApoB)、-C(ApoC)、-E(ApoE)が結合している。このVLDLを構成する種々のアポリポタンパク質がウイルス粒子と結合し、ウイルス粒子の感染性に関与していることが報告されているが、その詳細な分子機構は未だ明らかになっていない。本研究ではウイルス粒子産生における詳細な分子機序を明らかにする為にアポリポタンパク質に焦点を絞り解析を行なった。その結果、内在性の各種アポリポタンパク質の発現量をsiRNA法により抑制すると、ApoEを抑制した場合にのみ顕著にウイルス粒子の感染性が減少した。その際、細胞内におけるHCVの複製効率には変化がなかった。またウイルス培養液と抗ApoE抗体を混合した結果、ウイルス粒子の感染性が減少した。また、細胞外に分泌できないApoE変異体をHCV複製細胞に発現させると感染性ウイルス粒子が細胞外に放出されずに細胞内に蓄積した。また、非感染性ウイルス粒子にApoEを添加しても感染性は回復しなかった。さらに、LDLR(low density lipoprotein receptor)との親和性が低いApoE変異体を含むウイルス粒子を解析した結果、正常型のApoEを含むウイルス粒子と比較し、浮遊密度およびApoEと相互作用しているウイルス粒子の量に差がないもののウイルス粒子の感染性が減少した。本研究の結果から、HCVが細胞内においてApoEと相互作用しApoEを含むアポリポタンパク質との複合体として細胞外に放出されることが示された。また、細胞外に放出されたHCVはApoEを介して宿主細胞に感染している可能性が示唆された。