hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
霊長類モデルを用いたインフルエンザ感染重症化宿主因子の探索

高病原性鳥インフルエンザウイルス感染時にカニクイザルの重症化と相関する遺伝子多型を解析した。前年度の研究において、カニクイザルケモカインの1種のエクソン領域にアミノ酸置換を伴う多型があり、重症度と相関することが判明した。人工合成により、野生型ケモカインとアミノ酸置換変異ケモカインを作製した。これらのケモカインとカニクイザル脾臓細胞を混合培養し、活性化に伴い上昇するサイトカインを測定した。変異ケモカインを加えた時のインターロイキン-6(IL-6)の産生量は、野生型ケモカインを加えた時の2/3程度であった。変異ケモカインと野生型ケモカインを同量混合した時は、変異ケモカインを加えた時と同様のIL-6産生が見られた。従って、変異ケモカインにより野生型ケモカインの機能が阻害されると考えられ、一方の対立遺伝子に変異ケモカイン遺伝子があると炎症性サイトカイン反応が抑制されることが示唆された。免疫低下時にサイトカインを産生する細胞の種類を調べるために、高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させたカニクイザルの肺組織を用いて、in situ hybridizationを行い、IL-6産生細胞を検出した。免疫抑制状態の時、肺胞上皮細胞にIL-6 mRNAのシグナルが検出され、重症化の原因はウイルスに感染した肺胞上皮細胞の反応によることが示唆された。免疫抑制状態にないカニクイザルの高病原性鳥インフルエンザウイルス感染時に症状と相関する遺伝子多型を次世代シーケンサーを用いて、解析した。その結果、10種類の遺伝子に軽症と相関する多型が検出された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。高病原性鳥インフルエンザウイルスに感染時の重症化因子を探索するために、今年度は免疫抑制剤を投与した状況で重症化したサルと軽症で回復したサルの遺伝子の比較を行った。その結果、化学走性に関与するサイトカインの1種と免疫グロブリン受容体FcRの1種に重症度と相関する遺伝子多型が見つかった。続いてあらかじめカニクイザルの血液を採取し、これらの遺伝子の塩基配列を決定し、重症化と相関する多型をもつサルともたないサルを選別した。免疫抑制剤を投与後にH5N1亜型高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させたところ、いずれの遺伝子でも重症化遺伝子多型をもつサル3頭中2頭が感染後重症化した。インフルエンザウイルス感染時に重症化するサルと関連性の高いゲノム遺伝子の多型を発見できた。予定通りに進んでいる。高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させた免疫低下状態のカニクイザルの症状と相関する遺伝子多型を解析した。その結果、ケモカインの1種の遺伝子のエクソン領域に多型が見られた。この多型はアミノ酸置換を伴い、アミノ酸の置換に伴う機能の変化を解析するため、重症型ケモカインと軽症型ケモカインの遺伝子組換えによる合成を試みた。哺乳類細胞で発現するプラスミドベクターに重症型と軽症型ケモカイン遺伝子を組み換え、動物細胞にトランスフェクションした。この培養上清を回収し、組み換えタンパク質を精製した。精製タンパク質をカニクイザルBリンパ球と培養し、細胞内カルシウム流入を測定し、細胞活性化を解析した。しかし、ケモカイン特異的細胞内カルシウム流入は見られなかった。また、大腸菌内でタンパク質を発現するプラスミドベクターを用いて、重症型と軽症型ケモカインの発現を試みたが、ELISAで検出可能なタンパク質の発現は見られなかった。新たに免疫抑制のない条件で、高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させたカニクイザルのゲノムDNA遺伝子を用いて、症状と相関する遺伝子多型解析を試みた。これまでに発表した論文、免疫抑制状態下でのカニクイザルの免疫反応の結果に基づき、インフルエンザウイルス感染、免疫応答、血液型に関連する遺伝子から545個の候補遺伝子を選出した。これらの遺伝子の約5700個のエクソンを回収するためにsequence capture probeを設計した。次年度にこれらのprobeを用いて、カニクイザルのゲノムDNA遺伝子を増幅後、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定し、遺伝子多型を検索する予定である。タンパク質発現効率が低いことと発現タンパク質の立体構造が動物生体内と異なる可能性があるので、変異ケモカインタンパク質作製法を人工合成に切り替える。また、細胞機能測定では、細胞内カルシウム流入のような急性期の短期の活性化では差が見られず、他の細胞機能測定法を検討する必要があるため。

免疫低下時にサイトカインを産生する細胞の種類を調べるために、高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させたカニクイザルの肺組織を用いて、in situ hybridizationを行い、IL-6産生細胞を検出した。免疫抑制状態の時、肺胞上皮細胞にIL-6 mRNAのシグナルが検出され、重症化の原因はウイルスに感染した肺胞上皮細胞の反応によることが示唆された。免疫抑制状態にないカニクイザルの高病原性鳥インフルエンザウイルス感染時に症状と相関する遺伝子多型を次世代シーケンサーを用いて、解析した。その結果、10種類の遺伝子に軽症と相関する多型が検出された。平成27年度に発見した遺伝子多型のちがいによるタンパク質の機能の変化の解析を行う。免疫抑制剤の使用がない状態で高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させた場合に、重症化と関連する遺伝子多型の解析を行う。細胞機能測定では、遺伝子転写、タンパク質分泌等の新たな遺伝子発現の差異を解析する予定である。遺伝子多型解析では、重症化と相関する遺伝子多型の解析を進めつつ、カニクイザルの遺伝子診断をあらかじめ行い、症状を予測の上、感染実験を行う予定である。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
生体機能制御活性を有する微生物由来医薬品素材の開発

山崎は、子のう菌Gelasinospora multiforis等から新物質12種を含む合計13種の免疫抑制活性成分を単離したほか、Gelasinospora pseudoreticulata由来Mycelia Sterilia等から3種のモノアミン酸化酵素阻害活性成分と3種の向神経性成分を単離した。太田は、担子菌ニセクロハツ、ハエトリシメジ、シロオニタケ、カブラテングタケ等から抗腫瘍活性成分、cAMPホスホジエステラーゼ阻害活性成分等を単離した。岩崎は菌類Ustilaginoidea virensからのustiloxin A、海綿Dysidea arenariaからのarenastatin A、らん藻Lyngbya maiusculaからのcuracin A、日本産イチイからのtaxoid類の微小管重合阻害活性発現における構造活性相関、活性発現機構を詳細に解明した。田中は、HIVのエンベロープ糖蛋白質gp120とHIVの受容体であるCD4の結合阻害物質として、Penicillium multicolor等からisochromophilone I、II等合計4種の成分を単離した。中川は、緑膿菌感染難治性化の原因とされる細菌バイオフィルムの主成分アルギン酸の分解を促進するアルギン酸リアーゼをBacillus sp.から精製単離したほか、アルギン酸産生抑制物質としてペニシリン酸を同定した。飯田は、不完全菌Trichoderma polysporumからのペプタイボールであるtrichosporin(TS)の医薬品素材としての利用を目指し、TSが示すカテコールアミン分泌活性はTSにより形成されるイオンチャンネルを経由し細胞の外から内へCa^<++>が流入されて誘導されることを解明した。長尾は、プロキラルなa対称アミノマロン酸ジエチルエステル体をキラルセリンカルバニオンとして利用する合成法を開発し、冬虫夏草菌からの免疫抑制物質ISP-Iの不斉全合成を達成した。中田はMicale属海綿からの抗腫瘍性物質micalamide A、赤潮原因微生物Gymnodiumbreveからの毒素hemibrevetoxin Bの全合成を達成した。研究代表者及び各研究分担者は各分担課題につき平成6年度は次の研究成果を挙げた。山崎は子のう菌Gelasinosporamultiforisから免疫抑制活性成分multiforisin類を、G.pseudoreticulata由来Mycelia Steriliaからモノアミン酸化酵素阻害活性成分GP-A、-Bを単離、本研究課題全般を統括。野副はドクササコからグルタミン酸受容体リガンド性を期待されるアミノ酸3種を、ニセクロハツから抗腫瘍活性フェニルエーテルrussuphelin類を単離。岩崎はイネ病菌から抗微小管活性環状ペプチドustiloxinを単離、強い抗微小管活性を有するcombretastatinをリ-ドする新化合物を合成、Fusarium菌から抗カビ活性成分fusarielinを単離。佐藤はウマのエストロゲンequilin、equilenin及び合成誘導体につき微小管解重合活性、細胞毒性を調べた。田中はPenicillium multicolorからgp120-CD4結合阻害活性アザフィロンisochromophilone I、IIを、Streptomyces sp.から抗HIV活性成分chloropeptin I、IIを単離(IIは抗補体活性物質complestatinと一致)。中川は緑膿菌感染症難治性化の原因とされる感染菌のバイオフィルム(主成分アルギン酸)形成を阻止するため、糸状菌、放線菌からアルギン酸生合成阻害活性株、アルギン酸分解酵素産生株を見出した。飯田は不完全菌Trichoderma polysporum

産生ペプチドtrichosporin類が細胞膜でイオン輸送を行うのは、このペプチドが膜上でイオンチャネルを形成するためと考え、trichosporinと残基数の異なるペプチドを合成し、イオンチャネル形成能を比較。長尾はキラルなα-置換セリンの不斉合成法を確立し冬虫夏草菌の免疫抑制活性成分ISP-Iの合成に応用して全合成を達成。中田は海綿の抗ウイルス、抗腫瘍活性成分mycalamide Aを全合成、赤潮原因種Gymnodiniumbreveの毒性成分hemibrevetoxin Bを部分合成。山崎は、免疫抑制活性成分として、Gelasinospora kobiから新成分GK-2-5を単離、G. multiforisからの新活性成分multiforsin類の構造活性相関を解明、モノアミン酸化酵素阻害活性成分として、Coniochaete tetrasporaからconiochaetone A、Bを単離同定した。太田は、ハエトリシメジの悪酔い成分として、ibotenic acid、tricholomic acidを単離同定、ニセクロハツからP388細胞毒性活性成分russuphelol、カレバキツネタケからphosphodiesterase阻害活性成分laccarinを単離した。岩崎は、微小管機能制御物質であるustiloxin A、curacin Aの構造活性相関、arenastatin A、taxol類縁化合物の作用機構を解明した。田中はHIV(envelope糖蛋白はgp120)と標的細胞(受容体蛋白はCD4)の結合を阻害する物質を探索し、土壌菌代謝産物chloropeptin I、complestatinにつき、gp120-CD4結合阻害活性の測定と活性発現機構の解明を行った。中川は、緑膿菌薬剤耐性化の原因であるbiofilm形成に対する阻害物質を放線菌、糸状菌につき探索し、biofilmの主成分アルギン酸の分解酵素をBuci11us sp.から、アルギン酸産生抑制物質(penicillic acidと同定)をATF-547株からそれぞれ単離した。飯田は、不完全菌由来の膜修飾ペプチドtrichosporinB類の人工脂質2分子膜での電圧依存性イオンチャネル形成機構につき、trichosporin B類4分子のテンプレート結合ペプチド集合体(バンドル)を合成し、バンドルもまた電圧依存的にチャネル形成することを示した。長尾は、α-対称アミノマロン酸ジエチルエステルからα-置換セリン誘導体への合成法を開発し、同法を利用して、冬虫夏草菌からの免疫抑制活性物質ISP-Iの不斉全合成を達成した。中田は、環状エーテルの転位-環拡大反応を開発し、同反応とエポキシアルコールのエンド環化反応を利用して、赤潮原因海洋微生物産生毒素hemibrevetoxin B中の部分構造を合成し、更に、分子全体の全合成を目指した。
研究開発・設備投資戦略の理論・実証分析と実態調査

わが国企業は現在、競争力とともに経済性を重視する投資行動への移行を迫られている。そのためには、経済的に合理的な投資プロジェクトの評価が必要である。その第一候補と考えられる伝統的なDCFアプローチは、将来の不確実性に対処する柔軟性とプロジェクト間の相互作用から生じる戦略的なオプション価値を捉えることができない。すなわち、投資機会の真の価値を過小評価することになる。こうした欠点が明確になるにつれ、ダイナミックなアプローチが操業されるようになった。本研究では、これらのうち現在最も注目されている実物オプション・アプローチに焦点を当て、実務への適用可能性という視点から分析・検討した。まず個別オプションの特徴・評価および企業行動へのインパクトを、次いで実物オプション間の実物作用を検討し、投資機会の現在価値が正味現在価値に結合オプション価値を加えたものとなることを示した。また、この過程で適用可能性に限界があること、金融オプションとの類似点・相違点を示した。そして、これらの分析・検討を通して、実物オプション・アプローチが、将来の不確実性をより慎重に分析するフレームワークを提供し、現存の方法では見過ごされていたダイナミックな戦略遂行の可能性がもつ潜在的価値を数値化し、その分析プロセスを通して将来の可能性に関する視野を広げ、さまざまな戦略代替案を検討する論理を明確にするだけでなく、プロジェクトが実行に移されてからも継続的かつ積極的な関与を必要とすることを明らかにした。
クロマチン構築を介したDNA複製制御機構の解明

DNA複製フォークの通過後、複製DNAは速やかにヌクレオソームに変換され、元と同等のエピジェネティク情報を持つクロマチンが構築されるが、このことは、正確なゲノム機能を維持するうえで必要不可欠な反応である。核内でのヌクレオソーム形成反応は様々な因子により制御されるが、この反応の生理機能に関しては不明な点が多い。2007年度の本研究では、ヌクレオソーム形成に関与すると考えられるヒストンシャペロンCAF-1,ASF1及びS期に新合成されるヒストン(de novoヒストン)を特異的にアセチル化する酵素HAT1の各欠損変異株を用いて、ヒストンシャペロンの機能及び役割を解析するとともに、永らく不明であったde novoヒストンのアセチル化の生物学的意義の解析することにより、DNA複製、DNA修復、及びヘテロクロマチン形成機構における、これら因子群の役割を分子レベルで明らかにすることにおいて一定の成果を修めた。1、CAF-1及び欠損はS期の遅延、DNA合成能の低下、新規DNA合成鎖上へのすばやいヌクレオソーム形成能の低下を伴い、致死であるがことを明らかにした。変異CAF-1p150発現株の解析から、新規DNA合成鎖上への素早いヌクレオソーム形成能の低下が複製鎖の伸長を阻害すると考えられ、これがCAF-1のPCNA結合能に依存性であることから、CAF-1がPCNAを介したDNA複製伸長装置と密接に関連していることが示唆された。2、HAT1-/-細胞株ではDNA複製能及び複製鎖上のヌクレオソーム形成反応には異常が認められないが、DNA複製ストレスに対する感受性を示すことを以前報告していた。本年度はde novoヒストンを含むと考えられる細胞質画分のH3-H4を含む複合体構成性成分の解析を行い、Hat1もしくはH4のLys-5,12のアセチル化が安定したH3-H4複合体形成に寄与し、細胞質H3-H4複合体の一部はH3-H4との結合を介したHat1とAsf1を含む複合体であることが示唆された。ゲノムDNAは、細胞内ではピストンなどの蛋白質と共に様々な高次クロマチン構造を形成することによって、染色体機能が維持され、クロマチン構造を必要に応じて変化させることで様々なDNA代謝反応(転写、複製、修復、組換え)に寄与している。新規ヌクレオソームの形成と脱構築には種々のヒストンシャペロンが関与している。新規ヌクレオソームの形成因子の知られるCAF-1やASF1は様々なDNA代謝経路に関わり、恒常的ゲノムの安定性に種々の要因で影響をあたえることが予想される。我々は遺伝子ノックアウトが容易なニワトリのDT40細胞を用いて、クロマチン構造構築・変換に関与する遺伝子群の系統的な変異株の作成を行っており、HIRA欠損により種々の遺伝子発現の変化が起こるが、生存には必要ではないこと、3種のCAF-1サブユニットのconditional変異株の解析から、CAF-1欠損はS期の遅延、DNA合成能の低下、新規DNA合成鎖上へのすばやいヌクレオソーム形成能の低下を伴い、致死であるがことを明らかにした(業績1)。したがって、本システムはヌクレオソーム形成粗過程及びこれに関連したクロマチン機能の研究に適した系であると考えられた。また、変異CAF-1p150発現株の解析から,新規DNA合成鎖上へのrapidヌクレオソーム形成能の低下が複製鎖の伸長を阻害すると考えられ、これがCAF-1のPCNA結合能に依存性であることから、CAF1がPCNAを介したDNA複製伸長装置と密接に関連していることが示唆された(業績1)。同様にASF1 conditional変異株を作成し解析したところ、CAF-1変異株と比較すると弱いものの同様の表現型を示し、致死であった(業績2)。したがって、動物細胞では確かに複製に共役したクロマチン形成はCAF-1とASF1に依存し、細胞増殖に必須であることがわかった。興味深いことに、ASF1 conditional変異株に種々の変異をもつASF1を導入したレスキュー法から、CAF-1とHIRAとの結合能を持たないASF1の変異はヌクレオソーム形成及び細胞増殖に影響せず、ヒストンH3と結合できない変異ASF1も生存可能であることが明らかになった。このことはCAF-1とHIRAを介さないASF1依存的クロマチン形成経路もしくはクロマチン形成とは異なるASF1の機能が生存に重要であることを示した(業績2)。

変異CAF-1p150発現株の解析から、新規DNA合成鎖上への素早いヌクレオソーム形成能の低下が複製鎖の伸長を阻害すると考えられ、これがCAF-1のPCNA結合能に依存性であることから、CAF-1がPCNAを介したDNA複製伸長装置と密接に関連していることが示唆された。2、HAT1-/-細胞株ではDNA複製能及び複製鎖上のヌクレオソーム形成反応には異常が認められないが、DNA複製ストレスに対する感受性を示すことを以前報告していた。本年度はde novoヒストンを含むと考えられる細胞質画分のH3-H4を含む複合体構成性成分の解析を行い、Hat1もしくはH4のLys-5,12のアセチル化が安定したH3-H4複合体形成に寄与し、細胞質H3-H4複合体の一部はH3-H4との結合を介したHat1とAsf1を含む複合体であることが示唆された。
超音波ドプラー法を用いた筋振動特性測定による筋硬度,粘弾性測定法の開発

本研究は人の筋肉の硬さ(筋硬度)を測定する方法として,筋肉は弾性体としての性質を有するため,振動を外部から与えると固有の硬度・粘性に従って固有の周波数で振動する。この原理を利用して筋肉の硬度を測定しようとする新しい方法を確立することである。平成11度はこの原理が人の筋肉で現実に測定可能であるか否かについて,超音波ドプラー法を用いて検討し,筋に固有の振動あることを確認した。平成12年度はこの事実を基に,さらに測定原理を改変し,振動子の共振特性の変化を用いる接触コンプライアンス法により筋の硬さめ変化を捉えることが可能であることを確認した。平成13年度はさらにこの方法を用いて筋硬度の連続的は変化を周波数の変化として捉えることができるか,また,筋硬度の標準化ができるかどうかを検討した。足関節背屈筋の筋出力を最大筋力の075%の間で4段階に設定し,それぞれの段階での筋硬度を測定した。その結果,各段階で深度6mm付近で共振周波数の偏位が急激に増大した。また,深度6mmら深い部分では,筋出力と各深度での弾性率(g/mm^3)との関係をみても,同一深度で非常に高い相関関係が認められた。被検者の筋硬度測定部の皮下脂肪厚は平均4.2mmあったが,今回の結果より皮膚から深度6mm度に皮下組織と筋との境があると考えられる。一方,共振周波数の偏位と筋出力の関係では,被検者間にばらつきが大きく,相関関係は認められなかった。このことから共振周波数の偏位により,筋硬度を標準化することは困難であった。本測定法は個人の筋硬度の変化を捉えるには従来の方法に比べ精度が高く有効であると考えられるが,個人間の筋硬度を比較することは現状では難しく,今後さらに共振周波数の偏位の意味するところについて研究を進める必要がある。ヒトの筋は運動や不動によりその硬さに変化が起こる。この筋の硬さを測定する方法として,筋硬度計を用いる方法が一般的であり,これは一定の圧力を筋肉に与えると一定の距離だけ凹むという原始的な方法を用いている。一方,物体に振動を加えると,その振動は物体の硬さ(粘・弾性)により伝達速度,減衰特性が異なってくることが知られている。本研究ではこのことをふまえて,筋に振動を与えて筋が振動する現象を皮膚表面から超音波ドプラー法により筋内部の振動として記録し,筋の振動特性(剪断波の伝達速度,減衰特性など)を明らかにして理論的に粘・弾性を表現することを試みる。なお,本研究では筋の硬さの変化を筋の粘・弾性の変化としてとらえる。平成11年度は,筋に対して振動を加えた場合に,超音波診断装置を用いてその振動をとらえることが可能であるかどうかを検討する基礎実験と,刺激として定量的な振動を加えるための振動刺激装置の開発を行った。複数の超音波診断装置を使用し,筋の振動の様子を観察したが,それぞれの機種の特性により得られる情報に差が認められた。今後さらに検討を加え,筋の振動の変化を的確にとらえることができる機種の選定を進める。今回開発した振動刺激装置は実際に振動刺激を発生するアクチュエーター部と周波数,強度などを制御するコントローラー部からなる。このアクチュエーター部を固定機に固定することにより,定量的に安定した振動刺激を加えることができるようになった。平成12年度は粘・弾性の異なる素材に振動刺激を加え,超音波診断装置にてこの振動を剪断波の伝達速度,減衰特性としてとらえることができるか検討する。昨年度はこの原理が人の筋肉で現実に測定可能であるか否かについて,超音波ドプラー法を用いて検討し,固有の振動が確認されることを確認した。平成12年度はこの事実を基に,さらに測定原理を改変し,外部から投入した振動波を容易に検出できる方法について検討した。新規に採用した測定機器はアクシム社によって新たに開発されたバイオセンサーであり,測定原理は,外部から投入する振動を作る振動子と筋肉が共振した振動を受信する接触子を一本のピックアップとしてまとめたものである。振動子から5KHzの振動を投入して,筋肉の振動周波数を測定するものである。すなわち投入振動数と受信振動数の周波数の差から筋の硬度をアルゴリズムによって算定する。周波数の差が大きいほど柔軟であることになる。この機器の基礎的性能を検証するために,筋肉の硬度に類似した硬度が異なる3種類のシリコン素材を用いて,生体モデルを作成して硬度の分解能を測定した。その結果用手的には判別が困難な,わずかな硬度差を区別することが出来ることが判明した。さらに臨床的応用として,筋肉の硬結が原因であると考えられているいわゆるトリガーポイント(Triger point)の筋硬度について,全身麻酔の前後での測定を行った。その結果,覚醒時の周波数の差は-200Hzであるのに対して全身麻酔時には-250Hzとなり,麻酔時に有意に軟らかくなっていることが測定値として得ることが出来た。これに対して対象筋肉部位では有意差が認められなかった。これらの研究から筋肉の固有振動を測定原理とする筋硬度測定の基本的性能と臨床応用への有用性の一端を検証することが出来た。

本研究は人の筋肉の硬さ(筋硬度)を測定する方法として,筋肉は弾性体としての性質を有するため,振動を外部から与えると固有の硬度・粘性に従って固有の周波数で振動する。この原理を利用して筋肉の硬度を測定しようとする新しい方法を確立することである。平成11度はこの原理が人の筋肉で現実に測定可能であるか否かについて,超音波ドプラー法を用いて検討し,筋に固有の振動あることを確認した。平成12年度はこの事実を基に,さらに測定原理を改変し,振動子の共振特性の変化を用いる接触コンプライアンス法により筋の硬さめ変化を捉えることが可能であることを確認した。平成13年度はさらにこの方法を用いて筋硬度の連続的は変化を周波数の変化として捉えることができるか,また,筋硬度の標準化ができるかどうかを検討した。足関節背屈筋の筋出力を最大筋力の075%の間で4段階に設定し,それぞれの段階での筋硬度を測定した。その結果,各段階で深度6mm付近で共振周波数の偏位が急激に増大した。また,深度6mmら深い部分では,筋出力と各深度での弾性率(g/mm^3)との関係をみても,同一深度で非常に高い相関関係が認められた。被検者の筋硬度測定部の皮下脂肪厚は平均4.2mmあったが,今回の結果より皮膚から深度6mm度に皮下組織と筋との境があると考えられる。一方,共振周波数の偏位と筋出力の関係では,被検者間にばらつきが大きく,相関関係は認められなかった。このことから共振周波数の偏位により,筋硬度を標準化することは困難であった。本測定法は個人の筋硬度の変化を捉えるには従来の方法に比べ精度が高く有効であると考えられるが,個人間の筋硬度を比較することは現状では難しく,今後さらに共振周波数の偏位の意味するところについて研究を進める必要がある。
反応集積化に適した高活性反応プロモーターを用いるマイクロフローシステムの開発

本申請では、有機電子移動反応により発生させた高活性な均一系触媒やプロモーターを用いた高速反応をマイクロフロー系へ展開することにより、「高速で効率的な触媒型反応」の実現とこの集積化を研究課題として提案している。マイクロフロー系と電極反応を組み合わせることで、系中で創製した触媒量の超高活性な反応プロモーターとして利用することにより、効率的・理想的な触媒的反応を具現化し、反応集積化へ展開することを本研究の最大の目標として研究を推進した。本年度は、前年度までに作成した電解用マイクロリアクターを用いて二つの反応に焦点をあて研究を行った。1少量の電気量で開始されるシアノメチル化反応:前年度までに、アセトニトリル中、様々な芳香族アルデヒド誘導体を触媒量の電気量で電解還元することで、対応するシアノメチル化体が得られるという非常にシンプルな反応系を見出した。バッチ反応系では、一部脱水反応もあわせておこり、収率も中程度あったが、電解用マイクロリアクターを用いて、これをフロー系への展開したところ、高い選択性かつ高収率で対応するシアノメチル化体が得られることがわかった。2ごく少量の電気量で開始されるシアノシリル化反応:塩化メチレンにベンズアルデヒドとトリメチルシリルシアニドを溶解させ、バッチ型の電解セルを用いてごく少量の電気量で電解還元すると、対応するシアノシリル化体が得られた。この反応は電解用マイクロリアクターを用いたフロー系でも効率よく進行した。上記二つの反応以外の新たな電解反応として、前年度までに、臭化アンモニウム塩の酸化により発生する“Br+"が活性な反応プロモーターとなる酸化的なチエノフラン骨格構築法も見出していたが、これまでは化学量論量の臭化アンモニウム塩が必要であった。電流量を含めた様々な検討を行った結果、臭化アンモニウム塩を触媒量に減らした高効率的な反応系を見出すことができた。平成30年度は低温電解酸化反応により発生させた有機ジカチオンをプロモーターとする反応に取り組む予定であったが、この反応系の検討は前年度までに概ね終了したため、アセトニトリル中、少量の電気量を通電することによって開始されるアルデヒドのシアノメチル化反応に焦点を当て研究を推進した。この反応は極めて単純で非常にクリーン、かつ、原子効率の高いシアノメチル化反応であり、反応の集積化の観点からも非常に有用であると考えられるが、電解用マイクロリアクターを用いることで、反応の効率が格段に向上することが明らかになった。この成果は反応集積化を指向する上で、極めて大きな発見であったと考えている。また、当初平成31年度に予定していた“Br+"を反応プロモーターとして用いる反応の触媒化にも成功した。これも計画以上の成果である。上記反応のマイクロフロー系への展開により、連続フロー系ないしはワンポット系による連続的な官能基変換反応可能な新しい反応集積化法の開発を計画している。

また、当初平成31年度に予定していた“Br+"を反応プロモーターとして用いる反応の触媒化にも成功した。これも計画以上の成果である。上記反応のマイクロフロー系への展開により、連続フロー系ないしはワンポット系による連続的な官能基変換反応可能な新しい反応集積化法の開発を計画している。
若年発症１型糖尿病に対する再生膵島移植―膵島細胞シートの同種移植

ティシュエンジニアリングの手法を用いた膵島細胞シートを開発した。in vitroにおいてインスリン分泌機能を持つ事、in vivoにおいて同系移植モデルで血糖値の正常化を確認している。今回は、同種移植モデルの系で、BALB/cマウスの膵島を単離し、温度応答性培養皿にて接着培養を行い、培養2日後に回収した細胞シートをB6マウスの皮下に移植後、血糖値の測定と組織学的検討を行った。血糖値の正常化は移植後3日目より認め、移植部位には炎症性細胞浸潤が確認された。マイトマイシン処理により約1週間の生着延長と細胞浸潤の抑制効果を認め、インスリンおよびグルカゴン陽性細胞から構成される細胞集塊が確認された。我々は、膵島移植研究において、既に、ティッシュエンジニアリングの手法を取り入れた膵島細胞シートを発明している(Biomaterials. 30:5943-9,2009)。膵島をsingle cellとし、温度応答性培養皿と細胞間マトリックスであるラミニンを用いることにより、シート状に再構築を可能とした。さらにin vitroにおいてはインスリン分泌機能を持つ事を明らかにしており、in vivoにおいても同系ラット及び同系マウスに移植を行い、血糖値を正常化させている。前年度は、膵島細胞シートの臨床応用へ向けて、同種移植の系で、移植片の拒絶反応について組織学的分析を行った。実際、実験1として、BALB/cマウスの膵島細胞シートを作成し条件を設定した。実験2として、膵島細胞シートを同種マウスに移植し、移植部位での膵島細胞シートの形態と機能に関して観察した。本年度は、免疫寛容の誘導を目的として、マイトマイシン処置による生着延長効果について検討した。実験3として、MMCで免疫寛容を誘導した膵島細胞シートを同種マウスに移植し、移植部位での膵島細胞シートの形態と機能に関して観察した。同種移植および同種移植片の拒絶反応は、ヒト膵島移植の際に避けては通れないものであるから、本研究は、同種移植での免疫寛容を獲得するべく再構築膵島移植モデルの完成を目指し、小児膵島移植の臨床応用への展開を図るといった意義を持つものである。【はじめに】我々は、膵島移植研究において、ティッシュエンジニアリングの手法を取り入れた膵島細胞シートを発明している(Biomaterials. 30:5943-9,2009)。今回は、同種移植条件を設定し、膵島移植の臨床応用への道を探った。【方法】BALB/cマウスの分離膵島をトリプシン処理にて単離し、Laminin-5薄層コートした温度応答性培養皿にて接着培養を行い、培養2日目に培養温度を20°Cに変化させることにより、膵島細胞をシートとして回収した。作成した細胞シートを同種(B6)マウスの皮下に移植し、移植部位での膵島細胞シートの形態と機能に関して観察した。ストレプトゾトシンで糖尿病を誘発B6マウスへの皮下に移植し、血糖上昇が見られた時点の移植片を摘出し、免疫染色にて観察した。【結果】移植した皮下組織においてInsulinおよびGlucagon陽性細胞から構成される膵島組織を確認した。糖尿病マウスへの移植後に、血糖値の正常化と血糖の再上昇を認め、移植部位には炎症性細胞浸潤を確認した。また、マイトマイシン処置による生着延長効果を認めた。【考察】同種移植において積層化された膵島細胞シートの生着に成功した。今後、膵島細胞シート作製の効率化と免疫寛容の誘導が課題となる。本年度は、膵島細胞シートの臨床応用へ向けて、同種移植の系で、移植片の拒絶反応について組織学的分析を行った。

BALB/cマウスからB6マウスへの同種移植の際、MMC処置後膵島で作成した細胞シートを使用し、血糖を正常化および生着期間の延長に成功した。BALB/cマウスの膵島細胞シートを日本で初めて完成させた。さらにBALB/cマウスからB6マウスへの同種移植を成功させ、血糖を正常化させた。免疫応答の評価を行う。BALB/cマウスからの膵島細胞シートを、ストレプトゾトシンで糖尿病を誘発B6マウスへの皮下、腹膜前腔、腎被膜に移植し、移植後定期的に血糖測定を行う。血糖上昇が見られた時点の移植片を摘出し、免疫染色にて観察する。炎症反応、機械的刺激の有無、インスリン分泌能等を比較し、引き続き大動物膵島移植実験を行う際の参考にする。膵島細胞シートの同種移植片の拒絶反応について分析を行い、膵島移植シートの修飾としてMMC注入による生着延長の獲得を目指す。膵島細胞シート作成、同種移植、免疫染色を行う。また、研究報告を行う。次年度は、実験3としてMMCで免疫寛容を誘導した膵島細胞シートを同種マウスに移植し、移植部位での膵島細胞シートの形態と機能に関して免疫組織学染色にて観察する。
抗赤血球寄生性原虫活性を示すペプタイド治療薬の探索

本研究の目的は、各種動物赤血球に吸着活性を示すペプタイド配列の一覧パネルを作製し、赤血球内寄生性原虫の爆発的増殖を阻止できるペプタイド治療薬を探索することであった。成果達成のために、1)各種動物赤血球に高い親和性を示すPeptide display phage(PDF)の精製とそのペプタイド配列の同定、2)吸着が確認された各種PDPによるバベシア原虫の増殖抑制効果の評価、3)抗標的ペプタイド免疫血清と各種原虫由来cDNA expression phage libraryを用いた原虫由来赤血球吸着リガンドのイムノクローニング、4)遺伝子発現産物の赤血球吸着能の検証、5)遺伝子導入組換えバベシア原虫を用いた遺伝子発現産物の機能解析、6)赤血球側受容体の同定を計画した。現在までに、バベシア原虫の感染には赤血球側のシアル酸分子が受容体として重要な働きをしていることを見いだし、PDF libraryよりウシの生赤血球膜上のシアル酸に吸着活性を示すPDP群の精製に成功した。このPDP群はIn vitro培養におけるウシバベシア原虫の増殖を有意に抑制した。さらに、このPDP群を免疫したマウス血清は、バベシア感染血液塗末標本を用いた間接蛍光抗体法により原虫のみを認識することを発見し、かつ本マウス血清を添加した培養液中ではバべシア原虫の増殖が有意に抑えられることを見いだした。現在、このマウス血清とウシバベシア原虫のcDNA expression phage libraryを活用して原虫側のシアル酸認識リガンドを探索しており、この分子相互作用を解き明かすことで有効なペプタイド治療薬の構築が可能となると考えている。
エッジ保存スプライン平滑化による不連続箇所を含む関数の推定とその応用に関する研究

本研究の究極の目標は,複雑なエッジを含む高次元観測データからでも任意の点の高精度標本値を瞬時に計算する「究極の超解像アルゴリズム」の実現である.この究極の目標を目指して,まず,不連続性を許容するスプライン関数を新たに定義し,有限個のエッジを含む関数を最適化問題の解として推定する.次に,2次元以上の高次元データに対しても,エッジ保存スプライン平滑化を高速に実行可能にするため,最適化問題の解の高速計算手法を確立する.その後,「離散パラメータの回帰分析」や「合成開口レーダによる地形観測」を例として,エッジ保存スプライン平滑化の応用可能性を示す.本研究の究極の目標は,複雑なエッジを含む高次元観測データからでも任意の点の高精度標本値を瞬時に計算する「究極の超解像アルゴリズム」の実現である.この究極の目標を目指して,まず,不連続性を許容するスプライン関数を新たに定義し,有限個のエッジを含む関数を最適化問題の解として推定する.次に,2次元以上の高次元データに対しても,エッジ保存スプライン平滑化を高速に実行可能にするため,最適化問題の解の高速計算手法を確立する.その後,「離散パラメータの回帰分析」や「合成開口レーダによる地形観測」を例として,エッジ保存スプライン平滑化の応用可能性を示す.
特別養護老人ホームの終末期ケアにおける多職種チームケアプロセスモデルの開発

本研究は、特別養護老人ホームにおける多職種チーム(ケア)プロセスモデル及びモデルを用いた活用ガイドラインの開発を目的に取り組んでいる。2018年度は、デルファイ法を用いた調査をもとにプロセスモデルを作成するとともに、モデルを活用するための活用ガイドライン(使用説明書)、プロセスモデル確認シートを作成した。作成したプロセスモデルは、「状態変化期」4項目、「看取り期」22項目、「臨終・死亡時期」9項目、「退所後」5項目の計40項目で構成され、調査対象者より各期におけるプロセスは概ね適切との回答を得た。なお、調査対象者は、特養の終末期ケアの内容や方針、評価などを検討する際に中心となって関わった経験のある職員であった。プロセスモデルの使用を検討している職員に、気軽に活用ガイドラインを手に取ってもらうことを考慮し、活用ガイドラインの名称を「特養の終末期ケア(看取り介護)における多職種チームプロセスモデル使用説明書」とした。使用説明書の内容は、プロセスモデルの内容や活用方法、確認事項などである。プロセスモデル確認シートは、対象者や担当者、実施状況などを検討・確認する際に多職種チームで活用することを想定したシートである。プロセスモデルを図解化したもので、視覚的にとらえることが可能である。活用することで関わる職員のコミュニケーションや共通理解が深まると期待される。現在は、作成したプロセスモデルの有効性を確認すること、および作成した使用説明書、確認シートをよりよいものに改良することを目的とした研究に取り組んでいる。2018年度は、デルファイ法を用いて特養入所者の終末期に関わる多職種チームプロセスモデルと使用説明書を作成することができた。それだけでなく、確認シートも作成することができ、一定の成果をあげることができた。しかし、当初の計画では、2018年度中に研究参加施設(作成したモデルおよび使用説明書等を用いて多職種による終末期ケアを実践してもらう特養)を公募する予定であったが、2019年度を迎えた現在、参加施設を募集しているところである。そのため、「やや遅れている」と判断した。現在、作成したプロセスモデルおよび使用説明書などの有効性を検討する目的で介入研究を計画し、研究参加施設を募集中である。研究参加にかかる施設の負担などから、予定していた参加施設数を確保することが困難になる恐れがある。そのため、当初は介入群と比較対照群を設定して研究を進める予定であったが、今回は介入群のみとした。そして、介入前後の変化を調査することで、モデルなどの有効性を検討することとした。また、研究参加施設で不測の事態などがあった場合に速やかに対応できるよう、研究責任者らが居住する地域にある特養を対象に研究参加施設を募集しているが、応募の状況によっては対象地域を広げ、参加施設数を確保したいと考えている。本研究は、特別養護老人ホーム(特養)の終末期ケアにおいて、よりよい成果に繋がる「多職種チームケアプロセスモデル」及びモデルを用いた活用ガイドラインの開発を目的としている。平成29年度は、特養の終末期ケアに関わる多職種職員のコンセンサスが得られる多職種の連携・協働の行動とそのプロセスを明らかにし、「多職種チームケアプロセスモデル」を作成することを目標に取り組んだ。まず、これまでに取り組んだ研究成果をもとに、よりよい終末期ケアを目指す多職種の連携・協働の行動に関する調査項目を作成し、特養での終末期ケアの経験が豊富な看護職員、介護職員、介護支援専門員、生活相談員、機能訓練指導員、管理栄養士・栄養士、計6人に項目の妥当性の検討を依頼した。職員の意見を参考に、多職種の連携・協働の行動として36項目を設定し、36項目の必要性とプロセス(過程)の適切性について5件法で回答を求める第1回目調査票を作成した。次に、看取り介護を実施する全国特養から無作為抽出した特養のうち、施設長から研究参加の同意を得た104施設に勤務する上記の6職種、計624人を対象に、第1回目調査票を用いて郵送による質問紙調査を行った。その結果、432人から調査票の返送があった(回収率69.2%)。多職種の連携・協働の行動36項目のうち、「必要」または「どちらかといえば必要」と回答した人の割合が80%以上の項目が34あった。一方で80%未満の項目が2つあった。多職種の連携・協働のプロセスについては、「適切」または「どちらかといえば適切」と回答した人の割合が80%以上となった。その後、第1回目調査結果および自由記述による職員の意見を参考に、多職種の連携・協働の行動の項目を追加・修正・削除し、第2回目調査票を作成した。平成29年度は、特養の終末期ケアに関わる多職種のコンセンサスが得られる「多職種の連携・協働の行動」およびプロセスを明らかにするために、同じ対象者に2回の質問紙調査を計画していた。しかし、年度内に第2回目調査を実施することができず、研究の進行は当初の予定よりやや遅れていると判断する。遅れた原因は、多職種の連携・協働の行動に関する調査項目の検討などに時間を費やしたためと考える。検討した内容は「多職種チームケアプロセスモデル」の基盤となるため、十分な吟味を必要とする。そのため、研究の進行はやや遅れたが、本研究を推進するにあたり必要な時間であったと考えている。

2018年度は、デルファイ法を用いた調査をもとにプロセスモデルを作成するとともに、モデルを活用するための活用ガイドライン(使用説明書)、プロセスモデル確認シートを作成した。作成したプロセスモデルは、「状態変化期」4項目、「看取り期」22項目、「臨終・死亡時期」9項目、「退所後」5項目の計40項目で構成され、調査対象者より各期におけるプロセスは概ね適切との回答を得た。なお、調査対象者は、特養の終末期ケアの内容や方針、評価などを検討する際に中心となって関わった経験のある職員であった。プロセスモデルの使用を検討している職員に、気軽に活用ガイドラインを手に取ってもらうことを考慮し、活用ガイドラインの名称を「特養の終末期ケア(看取り介護)における多職種チームプロセスモデル使用説明書」とした。使用説明書の内容は、プロセスモデルの内容や活用方法、確認事項などである。プロセスモデル確認シートは、対象者や担当者、実施状況などを検討・確認する際に多職種チームで活用することを想定したシートである。プロセスモデルを図解化したもので、視覚的にとらえることが可能である。活用することで関わる職員のコミュニケーションや共通理解が深まると期待される。現在は、作成したプロセスモデルの有効性を確認すること、および作成した使用説明書、確認シートをよりよいものに改良することを目的とした研究に取り組んでいる。2018年度は、デルファイ法を用いて特養入所者の終末期に関わる多職種チームプロセスモデルと使用説明書を作成することができた。それだけでなく、確認シートも作成することができ、一定の成果をあげることができた。しかし、当初の計画では、2018年度中に研究参加施設(作成したモデルおよび使用説明書等を用いて多職種による終末期ケアを実践してもらう特養)を公募する予定であったが、2019年度を迎えた現在、参加施設を募集しているところである。そのため、「やや遅れている」と判断した。今後は第2回目調査を実施し、その分析結果をもとに「多職種チームケアプロセスモデル」とガイドラインを作成する。その後、開発したモデルとガイドラインの有効性を検討するために、介入研究を予定している。当初の計画では、研究者が第2回目調査票などを印刷する予定であったが、印刷業者に委託することで作業の効率化を図りたい。また、介入研究を行うにあたり、北陸三県にある特養のうち、介護サービス情報公表システムにおいて「看取り介護の実施」として公表されていない施設に研究への協力を依頼する予定であった。迅速に協力施設を確保するために、対象地域を拡大して取り組みたい。現在、作成したプロセスモデルおよび使用説明書などの有効性を検討する目的で介入研究を計画し、研究参加施設を募集中である。研究参加にかかる施設の負担などから、予定していた参加施設数を確保することが困難になる恐れがある。そのため、当初は介入群と比較対照群を設定して研究を進める予定であったが、今回は介入群のみとした。そして、介入前後の変化を調査することで、モデルなどの有効性を検討することとした。また、研究参加施設で不測の事態などがあった場合に速やかに対応できるよう、研究責任者らが居住する地域にある特養を対象に研究参加施設を募集しているが、応募の状況によっては対象地域を広げ、参加施設数を確保したいと考えている。
癌化関連遺伝子の特異的発現機構

本研究グループは癌細胞の遺伝子発現の異常の本質を明らかにする目的で編成された。本年の研究成果は次の通りである。酒井は肝癌におけるGSTpの異常発現は遺伝子上流の転写制御エレメントTREに働くcjunの発現によることを示した。また遠藤は癌化に伴い特異的に発現が誘導されることの多いレトロウィルス様遺伝子の発現誘導にはプロモーター領域の脱メチル化が関係している可能性を指摘した。一方堤は発癌に伴うアルドラーゼB遺伝子の発現停止は肝特異的な転写に協調的に働く二つのDNA要素(A,B)の中のB要素のメチル化によることを明らかにした。メチル化によってこの要素に働く転写因子の結合が阻害される。藤井はPー450遺伝子の制御領域に結合する因子のcDNAクローンを分離して、その構造解析より新しいDNA結合因子であることを示した。鈴木はフィブロイン遺伝子の転写制御にはホメオドメインを持つ複数の制御因子が関与していることを明らかにした。渡辺はIgGH鎖遺伝子にB細胞特異的発現に働く新しいDNA要素を見出し、長田はGーCSF遺伝子に三つの細胞特異的に働いてLPS刺激に応答する要素の存在を証明し、各々の要素に働く因子の分離精製を行なっている。西郷はDrosophilaの複眼形成異常の原因であるBarHI遺伝子の過剰発現はtranspossonの挿入によることを示唆した。岡田(典)は一次構造の比較から高等動物のretrotranspossonはtRNAを起源としていることを示唆した。岡田(信)はアザチロシンによる癌細胞の正常復帰誘導の機構を研究するために差ハイブリダイゼーションを行い正常復帰に特異的に出現するcDNAクローンを得て構造を行っている。若い研究者の榎森はPLaseCのcDNAの解析を行いSrc関連配列をもった新しい構造を明らかにし、岡田(雅)は新生ラットの脳にp60CーSrcに特異的なチロシンキナーゼの精製に成功した。島田はPー450 6βの異なった分子種が肝において成長ホルモンによって正あるいは負の制御されていることを示した。
遺伝子欠損マウスの心理学的行動解析

八木がジーンターゲッティング法によりFyn欠失マウスを作製し、二木がヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスを交配して繁殖させ、実験に使用するマウスを確保し、Fyn欠失マウスの行動異常の性質を解析した。すでに、Fyn欠失マウスでは恐怖反応が亢進していることが、種々なテストで明らかになっており(Miyakawa et al,1994)、恐怖反応の強いマウスは聴覚性痙攣発作の感受性も大であると言う知見があるので、Fyn欠失マウスは聴覚性痙攣発作の感受性も高いか調べたところ、予想通りの結果が得られた(Miyakawa et al,1995)。また、聴覚性痙攣発作以外の痙攣として、電撃痙攣と種々な痙攣剤によって誘発される痙攣の感受性についても調べた。電撃痙攣に関しては、ヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスで有意な差は認められなかったが、薬物性痙攣に関しては、GABA受容体がらみの痙攣剤のメエトラゾール、ピクロトキシン、ビキュキュリンによる痙攣の感受性がホモ欠失マウスで亢進していること、グルタミン受容体がらみの薬物ではカイニン酸とNMDAで誘発した痙攣の亢進が見出された。一方、グリシンと関連するストリキニンによる痙攣の感受性については、ヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスで有意な差は認められなかった。以上のように、Fyn欠失による痙攣感受性の亢進は痙攣剤に依存するという知見が得られた(Miyakawa et al,1996)。八木がジーンターゲッティング法によりFyn欠失マウスを作製し、二木がヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスを交配して繁殖させ、実験に用いるマウスを確保し、Fyn欠失マウスの行動異常の性質を解析した。本年度は8方向放射迷路の空間学習のテスト、側壁のないopen armと側壁のあるclosed armを十字型に配置した高架橋十字迷路での恐怖反応テスト、一般活動性のテストとして、open fieldテストなどを行った。これらの実験の結果、以下のような知見を得た。1)Fyn欠失マウスは、迷路に十分馴らしてやると、放射迷路が学習できた。しかし、順応期間中の各アームの選択傾向をみると、実験者のいる位置に近いアームを避ける傾向が対照群よりも顕著であった。これは、ヒトのいるそばのアームを恐がっているためと解釈できよう。2)Fyn欠失マウスの恐怖反応の亢進は、高架式十字迷路テストでも明らかになった。すなわち、Fyn欠失マウスは対照群よりも、側壁のないopen armに滞在する時間が短く、また、open armに入る回数も少なかった。3)open fieldのテストでは、恐怖反応の指標である脱糞についてみてみると、明るい照明下ではFyn欠失マウス対照群よりも有意に脱糞が多かったが、暗い照明下では両群間に差がなかった。以上のごとく、Fyn欠失マウスでは恐怖反応が亢進していることが明らかになった。なお、本年度の成果は、Molecular Brain Researchに投稿し11月8日付で受理されている。前年度までに、Fyn欠失マウスでは恐怖反応が亢進していることが、種々なテストで明らかになっており(Miyakawa et al,1994)、また聴覚性痙攣発作の感受性もFyn欠失マウスのほうが高いという知見が得られた(Miyakawa et al,1995)。そこで本年度は、聴覚性痙攣発作以外の痙攣として、電撃痙攣と種々な痙攣剤によって誘発される痙攣の感受性について調べた。

電撃痙攣に関しては、ヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスで有意な差は認められなかったが、薬物性痙攣に関しては、GABA受容体がらみの痙攣剤のメエトラゾール、ピクロトキシン、ビキュキュリンによる痙攣の感受性がホモ欠失マウスで亢進していること、グルタミン受容体がらみの薬物ではカイニン酸とNMDAで誘発した痙攣の亢進が見出された。一方、グリシンと関連するストリキニンによる痙攣の感受性については、ヘテロ欠失マウスとホモ欠失マウスで有意な差は認められなかった。以上のように、Fyn欠失マウスによる痙攣感受性の亢進は痙攣剤に依存するという知見が得られた。
糖尿病性神経障害の発症メカニズムに関する研究-プロテインキナーゼC活性異常とポリオール代謝活性-

【目的】糖尿病性神経障害の発症メカニズムを追究する目的で、培養ラットシュワノーマ細胞(JS-1細胞)を用い、神経細胞におけるPKC活性、MAPK活性および細胞増殖能に対する高濃度グルコースおよびポリオール代謝の影響を検討した。【成績】1)HGによりThy取り込み能は有意に低下し、この低下はEpにより有意に抑制された。2)HGにより有意に低下したPKC活性は、Epにより正常化された。3)各種PKCisoformのなかで膜分画におけるPKC-α蛋白発現量のみがHGにより有意に低下し、この低下がEpにより改善された。4)p38MAPK活性はHG条件下で著明に低下し、Epによりその低下が抑制された。5)PKC-αアンチセンス処理によりPKC-αのみならずp38MAPK活性および細胞増殖能は濃度依存性に低下した。6)SB処理により細胞増殖能は濃度依存性に低下した。【結論】以上の成績より、高グルコース条件下の神経系細胞ではポリオール代謝活性の亢進を介してPKC-αおよびp38 MAPK活性が低下することにより細胞増殖能が低下することが明らかとなり、糖尿病性神経障害の発症・進展に高グルコースによるポリオール代謝活性の亢進を介したPKC-α、p38MAPK活性の低下が関与することが示唆された。培養ラットシュワノーマ細胞(JS-1細胞)を用い、神経細胞におけるPKC活性と増殖能に対する高濃度グルコースおよびポリオール代謝の影響を検討した。【結論】JS-1細胞では、高グルコースによりPKC、とりわけPKC-α活性の低下および細胞増殖能の抑制が惹起され、Epによりこれらの異常が改善することが明らかとなり、神経系細胞におけるポリオール代謝活性の亢進に伴うPKC活性の低下および細胞増殖能の低下が糖尿病性神経障害の発症・進展に深く関与している可能性が示唆された。【目的】昨年度の研究により、高グルコース条件下ではラットシュワノーマ細胞(JS-1細胞)の細胞増殖能およびPKC-α活性が低下すること、またこれらの異常がポリオール代謝活性の亢進を介していることが明らかとなった。PKC-MAPKカスケードは、細胞の増殖・分化・アポトーシスに重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、神経系細胞における高グルコースがPKC-α-MAPKカスケードと細胞増殖能に及ぼす効果について検討した。【方法】1)JS-1細胞を5.5mMあるいは20mMグルコース(G)条件下でアルドース還元酵素阻害薬(エパルレスタット:Ep;1μM)の存在下・非存在下で14日間培養、またはPKC-αアンチセンス処理あるいはp38MAPK特異的阻害剤であるSB203580(SB)処理を行った。2)細胞増殖能は[^3H]-thymidine取り込み能で、MAPK活性はリン酸化/総MAPK蛋白発現量で評価した。【結論】これらの結果より、高グルコース条件下の神経系細胞ではポリオール代謝活性の亢進を介してPKC-αおよびp38MARK活性が低下することにより細胞増殖能が低下することが明らかとなり、糖尿病性神経障害の発症・進展に高グルコースによるポリオール代謝活性の亢進を介したPKC-α、p38活性の低下が関与することが示唆された。