hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉄栄養関連タンパク質の細胞内微細局在解析

イネ科植物の鉄獲得機構の主要な構成要因はムギネ酸類の合成と分泌である.ムギネ酸類生合成経路上の酵素のうち,S-アデノシルメチオニン3分子からニコチアナミンを生成するニコチアナミン合成酵素(NAS)と,ニコチアナミンからケト中間体を生成するニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)は,鉄欠乏によって強く誘導される.この両酵素タンパク質を鉄欠乏オオムギ根より精製し,これらをコードする遺伝子を単離した.NASは7個,NAATは2個のクローンが得られた.NAS,NAAT遺伝子を大腸菌で大量に発現させ,得られたタンパク質から両酵素のポリクローナル抗体を作成した.この抗体を用いて,光学顕微鏡レベルと電子顕微鏡レベルで,両酵素の鉄欠乏オオムギ根における組織内局在と細胞内局在を調べた.その結果,NASとNAATの両酵素は鉄欠乏オオムギ根に特異的に現れる顆粒に存在することが明らかになった.さらに,35Sプロモーターの下流にこの遺伝子とクラゲ緑色タンパク質をつないで,コムギの培養細胞に発現させるとこのタンパク質は顆粒状の構造に局在することが示された.この顆粒の限界膜にはリボゾームが付いており,粗面小胞体由来と考えられる.NAATがこの顆粒に局在することは,NAATタンパク質のN末端側に小胞体移行のためのシグナルペプチドが存在する結果とも一致した.ムギネ酸の分泌は日周性を示すが,ムギネ酸が分泌される日の出前にはこの顆粒は大きく膨らんでおり,分泌後には小さくなることから,ムギネ酸類が分泌されるまでの間ここに貯蔵されると想定されていた.ムギネ酸類合成系の主要な2つの酵素が共にこの顆粒に存在することが明らかになったことにより,この顆粒がムギネ酸類合成の場であることが証明された.イネ科植物の鉄獲得機構の主要な構成要因はムギネ酸類の合成と分泌である.ムギネ酸類生合成経路上の酵素のうち,S-アデノシルメチオニン3分子からニコチアナミンを生成するニコチアナミン合成酵素(NAS)と,ニコチアナミンからケト中間体を生成するニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)は,鉄欠乏によって強く誘導される.この両酵素タンパク質を鉄欠乏オオムギ根より精製し,これらをコードする遺伝子を単離した.NASは7個,NAATは2個のクローンが得られた.NAS,NAAT遺伝子を大腸菌で大量に発現させ,得られたタンパク質から両酵素のポリクローナル抗体を作成した.この抗体を用いて,光学顕微鏡レベルと電子顕微鏡レベルで,両酵素の鉄欠乏オオムギ根における組織内局在と細胞内局在を調べた.その結果,NASとNAATの両酵素は鉄欠乏オオムギ根に特異的に現れる顆粒に存在することが明らかになった.さらに,35Sプロモーターの下流にこの遺伝子とクラゲ緑色タンパク質をつないで,コムギの培養細胞に発現させるとこのタンパク質は顆粒状の構造に局在することが示された.この顆粒の限界膜にはリボゾームが付いており,粗面小胞体由来と考えられる.NAATがこの顆粒に局在することは,NAATタンパク質のN末端側に小胞体移行のためのシグナルペプチドが存在する結果とも一致した.ムギネ酸の分泌は日周性を示すが,ムギネ酸が分泌される日の出前にはこの顆粒は大きく膨らんでおり,分泌後には小さくなることから,ムギネ酸類が分泌されるまでの間ここに貯蔵されると想定されていた.ムギネ酸類合成系の主要な2つの酵素が共にこの顆粒に存在することが明らかになったことにより,この顆粒がムギネ酸類合成の場であることが証明された.オオムギ根において鉄欠乏により誘導されるタンパク質、あるいは鉄栄養関連遺伝子群がコードするタンパク質の細胞内微細局在を検出し、その機能を明らかにすることを本研究の目的とする。まず、鉄欠乏時にオオムギ根に特異的に発現するIds3遺伝子について以下の結果を得た。デオキシムギネ酸のみを分泌し、デオキシムギネ酸からムギネ酸への変換酵素を欠くイネにパーティクルガンによりIds3遺伝子を導入した形質転換体イネを作成した。現在再生植物体を得て成育中であるので、鉄欠乏によりムギネ酸が分泌されるかどうかを確認する予定である。形質転換体イネがムギネ酸を分泌すれば、Ids3がムギネ酸からデオキシムギネ酸への変換酵素をコードしていることが証明される。次に酵母の銅吸収変異株の変異形質を回復させるオオムギのcDNAを単離し、その塩基配列を決定したところ、非常に親水性の高い新規のタンパク質をコードしていることが判明した。このタンパク質は酵母において銅の利用性を向上させるが、植物体内での機能は明らかでない。そこで、タンパク質とクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質GEPの融合タンパク質を35Sプロモーターの制御によりパーティクルガンを用いて、タバコ培養細胞とタマネギの表皮細胞で発現させたところ、この新規のタンパク質は細胞内小器官に局在することが明らかとなった。イネ科植物の鉄獲得機構の主要な構成要因はムギネ酸類の合成と分泌である.ムギネ酸類生合成経路上の酵素のうち,S-アデノシルメチオニン3分子からニコチアナミンを生成するニコチアナミン合成酵素(NAS)と,ニコチアナミンからケト中間体を生成するニコチアナミンアミノ基転移酵素(NAAT)は,鉄欠乏によって強く誘導される.

この両酵素タンパク質を鉄欠乏オオムギ根より精製し,これらをコードする遺伝子を単離した.NASは7個,NAATは2個のクローンが得られた.NAS,NAAT遺伝子を大腸菌で大量に発現させ,得られたタンパク質から両酵素のポリクローナル抗体を作成した.この抗体を用いて,光学顕微鏡レベルと電子顕微鏡レベルで,両酵素の鉄欠乏オオムギ根における組織内局在と細胞内局在を調べた.その結果,NASとNAATの両酵素は鉄欠乏オオムギ根に特異的に現れる顆粒に存在することが明らかになった.さらに,35Sプロモーターの下流にこの遺伝子とクラゲ緑色タンパク質をつないで,コムギの培養細胞に発現させるとこのタンパク質は顆粒状の構造に局在することが示された.この顆粒の限界膜にはリボゾームが付いており,粗面小胞体由来と考えられる.NAATがこの顆粒に局在することは,NAATタンパク質のN末端側に小胞体移行のためのシグナルペプチドが存在する結果とも一致した.ムギネ酸の分泌は日周性を示すが,ムギネ酸が分泌される日の出前にはこの顆粒は大きく膨らんでおり,分泌後には小さくなることから,ムギネ酸類が分泌されるまでの間ここに貯蔵されると想定されていた.ムギネ酸類合成系の主要な2つの酵素が共にこの顆粒に存在することが明らかになったことにより,この顆粒がムギネ酸類合成の場であることが証明された.
うつ病リワークプログラムによるToM課題障害改善の可能性と脳機能画像の変化の検討

うつ病リワークプログラムを行った患者を対象として、リワークプログラムの有効性と、リワークプログラム介入による向精神薬処方量の変化について、リワーク修了群22名とリワーク中断群10名に分けて検討を行った。リワーク修了群はリワーク中断群に比して、復職率、就労継続率ともに有意に高かった。リワーク介入による抗うつ薬量の変化は認められなかった。ベンゾジアゼピン系薬剤については、介入時期に修了群で減少し、中断群ではリワーク後に増加傾向が認められた。リワークプログラムを修了すれば復職しやすく、再休職しにくくなり、ベンゾジアゼピン系薬剤を減らすことも可能となることが示唆された。本研究の目的は、うつ病患者の復職における心の理論(theory of mind:ToM)能力の影響とその生物学的基盤を明らかにすることである。平成26年度は、(1)気分障害患者の白質結合性と認知機能と関連の検討と、(2)うつ病リワークプログラムを利用する患者のエントリーに取り組んだ。(2)については、うつ病リワークプログラム利用者を募っているが、初年度に予定したいた利用者数はエントリーできておらず、利用者数の向上が必要である事が明確となった。また、ToM能力の有無がうつ病リワークプログラムにおける復職準備性に影響を与えうるか、ToM能力の有無がうつ病寛解状態に何らかの影響を与えうるか、ToM能力の有無がうつ病リワークプログラムを終了し復職した後の再発や再休職に影響を与えうるかを検討するものである。本研究にあたり、平成26年度は気分障害患者の白質結合性と認知機能の関連を明らかにし、うつ病リワークプログラムを利用する患者のエントリーを行った。平成27年度は、うつ病リワークプログラムを利用する患者のエントリーに引き続き取り組んでいた。現在もうつ病リワークプログラム利用者を募っているが、平成26年度、平成27年度に当初予定していた利用者数はエントリーできておらず、利用者数の向上、うつ病リワークプログラムの期間短縮が必要である事が明確となった。当院のうつ病リワークプログラム開設時から平成27年度半ばまでのうつ病リワークプログラム利用者の転帰や復職準備性への効果、再発予防性、うつ病リワークプログラム利用前後の症状や心理特性の変化などについては平成27年12月に第19回日本精神保健予防学会において発表した。当初の予定よりうつ病リワークプログラムの利用期間が依然長くなったままであり、研究対象者が確保できない課題が継続している。本研究の目的は、うつ病患者の復職における心の理論(theory of mind:ToM)能力の影響とその生物学的基板を明らかにすることである。またToM能力の有無がうつ病リワークブログラムにおける復職準備性に影響を与えうるか、ToM能力の有無がうつ病寛解状態に何らかの影響を与えうるか、ToM能力の有無がうつ病リワークプログラムを終了した後の再発や再休職に影響を与えうるかを検討するものである。本研究にあたり、平成26年度は気分障害患者の脳における白質結合性と認知機能の関連を明らかにし、うつ病リワークプログラムを利用する患者のエントリーを行った。平成27年度、平成28年度は、うつ病リワークプログラムを利用する患者のエントリーに引き続き取り組んでいた。現在もうつ病リワークプログラム利用者を募っているが、当初予定していた利用者数はエントリーできておらず、利用者数の向上、うつ病リワークプログラムの期間短縮が必要である事が明確となった。うつ病患者の復職に向けて行われるリワークプログラムによる復職継続率や、リワーク前後の向精神薬の使用量変化について検討した。和歌山県立医科大学附属病院でのうつ病リワークプログラムに参加した32名について、リワークプログラムの修了基準を満たした修了群22名と、中断した中断群10名に分けて、復職率、復職継続率、抗うつ薬やベンゾジアゼピン系薬剤の処方量変化について調査を行った。修了群22名中のうち20名が復職し、18名が6ヶ月後にも就労を継続し、中断群10名では5名が復職し、3名が6ヶ月後にも就労を継続していおり、リワークプログラム利用者は有意に復職継続率が高かった。また、向精神薬の使用量については、リワーク開始時、リワーク終了直後、リワーク終了から半年後の3時点において調査を行った。抗うつ薬使用量については修了群、中断群ともリワーク開始時、リワーク終了直後、リワーク終了から半年後のいずれの時点においても有意な変化は認められなかった。ベンゾジアゼピン系薬剤使用量については、リワーク開始時において修了群が有意に多かった。修了群はリワーク利用期間中にベンゾジアゼピン系薬剤使用量が有意に減少したことで、リワーク終了直後には両群のベンゾジアゼピン系薬剤使用量は同等となった。リワーク終了から半年後には、中断群で使用量が増える傾向が見られた。リワークプログラムはうつ病患者の復職継続に効果的であり、心理・社会的治療を重点的に行うことでベンゾジアゼピン系薬剤の使用量を減らす手段にもなりうることが示された。

ベンゾジアゼピン系薬剤については、介入時期に修了群で減少し、中断群ではリワーク後に増加傾向が認められた。リワークプログラムを修了すれば復職しやすく、再休職しにくくなり、ベンゾジアゼピン系薬剤を減らすことも可能となることが示唆された。拡散テンソル画像を用いて気分障害の生物学的基盤と認知機能の関連を検討することはできたが、心の理論に特化した認知機能評価はデータ収集中である。また、当初の予定よりうつ病リワークプログラムの利用期間が長くなっており、研究対象者が確保できていないことが課題である。うつ病リワークプログラムの利用期間の短縮を目指しつつ、他診療期間とも連携して、研究対象者を確保したい。うつ病リワークプログラムの利用期間の短縮を目指しつつ、他医療機関とも連携し、研究対象者を確保したい。臨床精神医学心の理論を定量化した上で、心の理論に特化した生物学的基盤を明らかにしたい。また、うつ病リワークプログラムの利用期間の短縮を目指し、研究対象者を確保したい。国際学会での発表などを行わなかったため、海外渡航経費の必要がなかった。研究対象者が確保できずに研究を延長するため。平成26年度はエントリー患者が少なかったため、データ解析用パーソナルコンピューターの購入を見送ったため。成果発表などの経費に使用する。平成27年度にデータ解析用パーソナルコンピューターや解析ソフトの購入、成果発表に使用する。
大麻主成分の臨床適性使用に向けた予防薬学的基礎研究

米国において、大麻主成分のテトラヒドロカンナビノール(THC)はがん患者などでモルヒネが効かない重篤な痛み緩和の目的で投与される。本研究は、がん患者、特に乳がんに注目し、THCの臨床適正使用に向けた基礎研究である。THCは分子中に、女性ホルモンと類似した部分を有していた。女性ホルモンは乳がん増殖を促進したが、THCの共存下でその効果が消失した。低女性ホルモン条件下(閉経後乳がんモデル)でTHCを添加した場合、逆に増殖の促進が見られた。本研究により、THCは女性ホルモンと相互作用し、乳がん増殖に影響を与える可能性が示唆された。大麻主成分であるテトラヒドロカンナビノール(THC)は我が国では厳しい法規制下にあるが、海外ではがん患者の悪心・嘔吐予防などの目的で臨床使用されている。このようにTHCはがん患者の悪心・嘔吐予防としての薬効を示すが、THCががん細胞増殖自体に与える影響の有無は不明であった。THCはカンナビノイド受容体(CB受容体)に作用しその薬理作用を発揮することやCB受容体の発現レベルが腫瘍の進行程度に応じて変動することが報告されている。先に我々は、大麻草抽出物(THCを豊富に含む)がMCF-7ヒト乳がん細胞増殖を促進することを見出している。本研究は医薬品としてのTHCに注目し、THCがヒト乳がん細胞増殖に影響を及ぼす可能性について検証することを目的とした。その結果、THCはCB受容体欠損下においてMCF-7細胞増殖を促進することが明らかになった。THCによる細胞増殖促進は乳がん特異的に発現する因子のレベル増加を伴うものであった。この因子は乳がんの予後を規定する標的として注目されている。最近、がん細胞増殖がCB受容体の発現レベルの低下により亢進することが報告された。この知見と本研究で得られた成果を併せ考察すると、CB受容体は腫瘍細胞の増殖を制御している可能性があり、CB受容体の発現低下によりその制御が解消されたがん細胞、特に乳がん細胞はTHC処理依存的に増殖するというメカニズムが推察された。本研究では、CB受容体の発現レベルの多寡に注目しTHCが乳がん細胞増殖に与える影響を検討した。今後は、THCによる乳がん細胞増殖の促進メカニズムをより詳細に解析することや生理的な乳がん細胞増殖の促進成分であるホルモンとTHCとの相互作用に関する研究を実施する予定である。本研究はTHCの臨床適正使用の確立を目的として、がん患者にTHCが投薬された際、その優れた薬効と共に起こりうる副作用を未然に防ぐことを目的とした予防薬学的基礎研究である。大麻主成分であるテトラヒドロカンナビノール(THC)は我が国において厳しい法規制下にあるが、特に海外では、がん患者の悪心・嘔吐予防などの目的で臨床使用されている。このようにTHCはがん患者の吐き気予防を期待して投与されるが、これらの薬理作用はカンナビノイド受容体を介した作用である。先に我々は、THCがカンナビノイド受容体欠損下において、ヒト乳がん細胞増殖の促進作用を示すことを報告した(Toxicology, 259:25-32,2008)。しかしながら、そのメカニズムの詳細は不明であった。本研究により、THCによる乳がん細胞増殖の促進にはシクロオキシゲナーゼ-2由来の代謝物が関与していることが明らかになった。また、乳がん細胞増殖は女性ホルモンにより正の調節を受けるが、興味深いことに、細胞内女性ホルモン濃度が高い環境下においては、THCによる増殖促進作用は見られず、逆に、低濃度下にいては作用が増強された。このことは、THCが乳がん細胞内のホルモン産生系に作用して、その作用を誘導していることを示唆する。本研究は、THCが臨床でがん患者に投与された際、その優れた薬効と共に起こりうる副作用を未然に防ぐことを目的とした予防薬学的基礎研究である。今後は、乳がんモデル動物などを用いた検討が必要である。
低温生物処理における微視的保温領域の形成とそれに及ぼす微生物膜の効果

本研究は、低水温期の付着微生膜処理における新しい処理法の開発を目指している。この処理法では、加温担体表面に付着した微生物膜によって、低水温原水中から汚濁物質除去を行わせると言うものであるが、加温担体表面を低温水が層流で流れる場合、担体表面近傍には微生物の増殖が可能と考えられる微視的保温領域が形成され、そこでは実際に微生物膜の形成が起こることがわかっている。しかしながら、担体表面に微生物膜が形成されていく過程で、微生物膜内の温度分布がどうなっており、これが微生物膜の形成にどのような影響を及ぼすのかという点についてはまだわかっていないのが現状である。そこで、今回の研究では、加温担体表面上に形成された微生物膜内の温度分布とこれが微生物膜の形成に及ぼす影響の検討を行った。加温ケーブルを巻き付けた円管内に低温汚濁水を連続的に通水して、円管内壁に微生物膜を形成させる実験を行い、微生物膜形成の過程を調べるとともに、円管内層流熱伝達理論を用いた解析を行うことにより微生物膜内の温度分布を求め、微生物膜形成との関係を検討した。その結果、円管内に微生物膜が付着した状態でも円管内層流熱伝達理論が適用できることが示され、これを用いて微生物膜表面温度が計算で求めることができた。また、微生物膜表面と円管内壁面とでは、ほとんど温度差が無く、微生物膜内はほぼ一定温度で保たれていること、微生物膜の形成によって、円管内壁面温度が若干高めに保たれることが示された。従って、これらが効果的に働き、微生物膜の形成が促進される可能性が示唆された。
糖鎖シグナルを介した発癌防御機構の解明

前年度の解析結果から、主任研究者らは、ポリコーム複合体の一つで、がん抑制遺伝子のサイレンシングに関わっているBMI-1が標的とする糖転移酵素遺伝子について調べたところ、C2GNT2の発現がBMI-1により制御されていることが示唆された。そこで本年度は、がんの促進におけるBMI-1の糖鎖構造制御を介した役割について検討した。その結果、BMI-1ノックダウンにより、C2GNT2の発現が上昇し、糖鎖構造がcore1型からcore2型へと変化することが分かった。また、ヌードマウスへの皮下移植実験において、BMI-1を移植されたグループではコントロールに対し、腫瘍の成長が抑制されたが、C2GNT2とBMI-1の両方をノックダウンした細胞を移植されたグループは腫瘍形成能が著しく亢進し、BMI-1ノックダウンによる腫瘍形成能力の低下が消失した。このことから、C2GNT2は腫瘍の増殖を抑制する機能を持つと考えられる。更に、細胞運動能と浸潤能を調べたin vitro実験において、BMI-1をノックダウンすると運動能・浸潤能ともに著しく低下するが、C2GNT2をノックダウンしておくとBMI-1ノックダウンによる運動能と浸潤能の低下が消失することから、C2GNT2発現の減少は細胞の運動能と浸潤能を高めることが示唆された。以上の結果から、BMI-1はC2GNT2の発現抑制を介して糖鎖構造を制御し、異常細胞の遊走能や浸潤能を高めることでがんの促進に関与している可能性が示唆された。本年度の研究推進の結果、BMI-1はC2GNT2の発現抑制を介して糖鎖構造を制御し、異常細胞の遊走能や浸潤能を高めることでがんの促進に関与している可能性が示唆された。本年度の研究推進により、糖転移酵素遺伝子C2GNT2はがん細胞の運動能と浸潤能を抑制し、がん抑制機能をもつことが示された。このため、今後、生体内での転移能におけるC2GNT2の役割について検討していく。また、がん化の過程においてC2GNT2遺伝子がサイレンシングされる機構についても解析を行う。上皮細胞の膜表面に発現している糖蛋白質のムチンは、がん化により、その糖鎖構造が大きく変化することが知られている。しかし、高密度に大量の糖鎖が結合し巨大分子を形成しているムチンの取り扱いの難しさから、ムチン糖鎖プロファイルの癌性変化についての研究は殆ど進んでいない。近年、発癌や老化といった高次生命現象にエピジェネティックな遺伝子発現の制御が重要な役割を果たしていることが明らかになってきたことから、私達は、ポリコーム複合体の一つとして知られ、がん細胞において発現が著しく高く、がん抑制遺伝子のサイレンシングにも深く関わっているBMI-1に着目し、高分子糖蛋白質を分離できる新しい分離分析技術を利用して、BMI-1が標的とする糖転移酵素遺伝子を調べた。その結果、BMI-1はCore2β1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(C2GNT2)遺伝子の発現を制御している可能性が示唆された。そこで、BMI-1がC2GNT2の発現を抑制しているかどうかを明らかにするため、様々な癌細胞を用いてBMI-1をノックダウンしたところ、BMI-1のノックダウンによりC2GNT2遺伝子の発現が上昇することが分かった。以上の結果から、腺組織においては通常、BMI-1はC2GNT2が過剰に発現しないように発現を抑制しており、がん化の過程ではBMI-1によるC2GNT2の発現抑制が解除されてC2GNT2の発現が上昇することでC2GNT2は癌抑制に働いている可能性が示唆された。研究計画通り、研究が順調に進展しており、成果が得られている。

これまでの研究成果に基づき、BMI-1とGCNT3の制御経路による癌抑制機構について詳細な解析を行う。様々な発癌ストレスを加え細胞老化を誘導したり、BMI-1の発現を抑制した際に、ムチン糖鎖構造が変化するかどうかを高分子糖蛋白質を分離分析できる技術と質量分析を用いて調べる。また、BMI-1をノックダウンしたり、C2GNT2を強制発現させることにより、癌細胞の増殖能、浸潤能や転移能などが阻害されるかどうかを検討する。更に、がん化の過程におけるC2GNT2遺伝子サイレンシング機構についても解析を行う。本年度の研究推進により、糖転移酵素遺伝子C2GNT2はがん細胞の運動能と浸潤能を抑制し、がん抑制機能をもつことが示された。このため、今後、生体内での転移能におけるC2GNT2の役割について検討していく。また、がん化の過程においてC2GNT2遺伝子がサイレンシングされる機構についても解析を行う。遺伝子改変マウスの搬入が遅延しており、それに掛かる経費が未使用分として生じた。また、綿密な研究計画による研究費の効率的な使用により、費用を節約することが出来た。綿密な研究計画による研究費の効率的な使用により、費用を節約することが出来た。本年度の未使用額は遺伝子改変マウスを用いた実験に掛かる費用として使用し、次年度分と合わせ、研究費を適切に使用する。本年度の未使用額は遺伝子改変マウスの搬入に掛かる費用として使用し、次年度分と合わせ、研究費を適切に使用する。
逆問題の手法を用いたファイナンス市場における諸問題への総合的研究

本研究課題においては,オプション価格決定の金融モデルであるArbitrage Modelを中心に,ファイナンスの逆問題において得られている数学的な理論構築の結果を高度な技術として実務へ還元する方法を確立することを目的とした.本年度の研究成果として,提案モデルの対する数学的な理論構築,特に提案モデルの解の一意性,及び再構成に関する成果が得られ,それらの結果が国際雑誌Inverse Problemsに掲載された.また,ベイズ推定の手法を用いた,トレンド,ボラティリティの同時推定に成功し,得られた結果をまとめて国際雑誌International Journal of Computer Mathematicsに投稿した.さらに,市場における株価やオプション価格の高頻度データを利用し,トレンドやボラティリティを再構成するために,共同研究者間で打ち合わせを行い,次年度以降の計画案をまとめた.次年度は,得られた数学的な解析の結果を実用的な技術に高めるために,統計数理研究所の研究施設や人的資源を最大限利用し,応用家・実務家との相互交流を深め,現場での実証分析を通して技術の限界を見極め,それに応じた理論モデルの修正を繰り返し行うことを計画している.なお、本研究課題に関連して以下の国際会議において招待講演を行った。昨年度中に当該研究の論文が採択され,さらに2つの研究論文を投稿できたことは当初の予定より進んでいると評価される.また,予定より早めにベイズ推定の手法を用いた逆問題のパラメータ推定を行うことができ,それらの結果が得られたことも研究の進捗状況が順調である要因である.また,本年度においては,昨年度までに得られた結果を2つの国際学会で発表する予定であり,さらにそれらの結果を論文としてまとめ,投稿する予定であるため,現在までの進捗状況は当初の予定通り順調に進展していると考えられる.1.昨年度までに得られているボラティリティに関する安定性の評価を当該研究のモデルに拡張することを一つ目の研究課題とする.また,前年度に引き続きIsakovが導出したFinal-overdetermination問題に対するLipschitz安定性評価式の導出を検討する.また,制約条件下での最小二乗汎関数の最小化の評価と,同種の評価を導き出すための解析手法を解明することも昨年度の継続課題として計画している.2.昨年度は,ベイズ推定の手法(MCMC-MH法等)などの統計的な手法を金融の逆問題のモデルに適用し,ボラティリティやトレンドの推定を行い,いくつかの研究成果が得られた.しかしながら,いずれの成果も人工データを用いたものであり,今年度はこれらの結果を実データまで拡張することを前半の目標とする.3.当該研究の成果を用いて実証分析を行うメリットは,市場のオプション価格や企業価値などの実務的なデータから,乖離を最小限に抑えながら株式や企業の変動率(ボラティリティ)や期待収益率(トレンド)などを逆推定できることにある.本年度においては,昨年度に引き続きこれらの逆推定を高頻度データ使用して行うことを計画している.また,応用家・実務家との相互交流を深め,現場での実証分析を通して技術の限界を見極め,それに応じた理論モデルの修正を繰り返し行うことを計画している.本研究課題においては,オプション価格決定の金融モデルであるArbitrage Modelを中心に,ファイナンスの逆問題において得られている数学的な理論構築の結果を高度な技術として実務へ還元する方法を確立することを目的とした.本年度の研究成果として,提案モデルの対する数学的な理論構築,特に提案モデルの解の一意性,及び再構成に関する成果が得られ,それらの結果が国際雑誌Inverse Problemsに掲載された.また,ベイズ推定の手法を用いた,トレンド,ボラティリティの同時推定に成功し,得られた結果をまとめて国際雑誌International Journal of Computer Mathematicsに投稿した.さらに,市場における株価やオプション価格の高頻度データを利用し,トレンドやボラティリティを再構成するために,共同研究者間で打ち合わせを行い,次年度以降の計画案をまとめた.次年度は,得られた数学的な解析の結果を実用的な技術に高めるために,統計数理研究所の研究施設や人的資源を最大限利用し,応用家・実務家との相互交流を深め,現場での実証分析を通して技術の限界を見極め,それに応じた理論モデルの修正を繰り返し行うことを計画している.なお、本研究課題に関連して以下の国際会議において招待講演を行った。昨年度中に当該研究の論文が採択され,さらに2つの研究論文を投稿できたことは当初の予定より進んでいると評価される.また,予定より早めにベイズ推定の手法を用いた逆問題のパラメータ推定を行うことができ,それらの結果が得られたことも研究の進捗状況が順調である要因である.また,本年度においては,昨年度までに得られた結果を2つの国際学会で発表する予定であり,さらにそれらの結果を論文としてまとめ,投稿する予定であるため,現在までの進捗状況は当初の予定通り順調に進展していると考えられる.1.昨年度までに得られているボラティリティに関する安定性の評価を当該研究のモデルに拡張することを一つ目の研究課題とする.また,前年度に引き続きIsakovが導出したFinal-overdetermination問題に対するLipschitz安定性評価式の導出を検討する.また,制約条件下での最小二乗汎関数の最小化の評価と,同種の評価を導き出すための解析手法を解明することも昨年度の継続課題として計画している.2.昨年度は,ベイズ推定の手法(MCMC-MH法等)などの統計的な手法を金融の逆問題のモデルに適用し,ボラティリティやトレンドの推定を行い,いくつかの研究成果が得られた.しかしながら,いずれの成果も人工データを用いたものであり,今年度はこれらの結果を実データまで拡張することを前半の目標とする.

3.当該研究の成果を用いて実証分析を行うメリットは,市場のオプション価格や企業価値などの実務的なデータから,乖離を最小限に抑えながら株式や企業の変動率(ボラティリティ)や期待収益率(トレンド)などを逆推定できることにある.本年度においては,昨年度に引き続きこれらの逆推定を高頻度データ使用して行うことを計画している.また,応用家・実務家との相互交流を深め,現場での実証分析を通して技術の限界を見極め,それに応じた理論モデルの修正を繰り返し行うことを計画している.物品費に関して、当初予定していたデスクトップPCの購入を次年度に変更したため次年度使用額が生じました。次年度の早い段階でデスクトップPCの購入を計画している。また、昨年度に購入したMatlabのToolBoxの追加購入等を計画している。
サーカディアンリズムの中枢を担う時計因子複合体の分子解剖

概日時計の分子発振システムにおいて、時計タンパク質CLOCKとBMAL1の複合体はE-boxを含む時計シスエレメントに結合して転写を活性化する。転写・翻訳された負の因子群は、CLOCK-BMAL1複合体を不活性化することにより自らの転写を抑制する。この負の因子群によるCLOCK-BMAL1複合体の不活性化機構の分子実態は謎に包まれているが、時計タンパク質の翻訳後修飾が極めて重要な役割を担うと考えられる。そこで私は、この時計因子複合体を形成する構成因子の時刻依存的な変動をタンパク質レベルで把握することが、時計発振の真の理解に重要かつ不可欠であると考えた。この目的に向け私は、時計因子複合体の中枢因子であるCLOCKを認識するモノクローナル抗体を作製し、CLOCKが転写抑制期にリン酸化されていることを見出した。このCLOCKリン酸化の生理的意義に迫るため、マウス肝臓から単離したCLOCKを質量分析に供してリン酸化部位を決定した。このリン酸化部位変異体の解析より、CLOCKのリン酸化はCLOCKの核移行を阻害すると共に、CLOCK-BMAL1複合体のDNA結合力を低下させることにより、転写活性促進を抑制することが判明した。興味深いことに、CLOCKのリン酸化状態は負の因子CIPCの共発現により促進し、CIPC結合ドメインを欠いたCLOCK変異体は低リン酸化状態であることを見出した。さらにこの変異CLOCKは細胞内蓄積量が大幅に増大しており、薬剤処理によりCLOCKのリン酸化を強制的に亢進させたところ、過リン酸化されたCLOCKはプロテアソームを介した分解に導かれることが分かった。以上の結果は、時計タンパク質へのリン酸化シグナルがタンパク質機能を巧みに調節してE-boxの転写抑制に寄与している可能性を示唆している。この目的に向け私は、時計因子複合体の中枢因子であるCLOCKおよびBMAL1を認識するモノクローナル抗体を作製し、抗CLOCK抗体を用いた時計因子複合体の単離手法を確立した。この過程で、マウス肝臓の核内においてCLOCKとBMAL1が時刻依存的にリン酸化されていることを見出した。興味深いことに、BMAL1のリン酸化はE-boxの転写が活性化している時刻にピークを迎えるのに対して、CLOCKのリン酸化は転写が抑制されている時刻に亢進した。つまり、CLOCKとBMAL1は、互いに異なる位相で、低リン酸化状態と過リン酸化状態をサイクルしている。さらなる解析により、マウスの肝臓において、エクソン19を欠損しているCLOCK変異体が野生型CLOCKに比べて低リン酸化状態であり、細胞内蓄積量が大幅に増大していることが判明した。さらに、培養細胞においては、薬剤処理により内在性のCLOCKのリン酸化を強制的に元進させたところ、過リン酸化されたCLOCKはプロテアソームを介した分解に導かれた。以上の結果は、時計タンパク質へのリン酸化シグナルがタンパク質分解を介してE-boxの転写抑制に寄与している可能性を示唆している。
市民参加型環境行動支援システムの開発

当該研究は、Webページやメーリングリストを用いて、京都市のローカルアジェンダ21フォーラムや草津市コミュニティ支援センターを事例に、市民、企業、行政と意見交換、共働作業ができる条件を整えながら、簡易な環境行動支援システムを開発して、その有効性を検証する研究を進めてきた。企業やNPOへのアンケートを通じて、感性評価法に基づく調査法を開発し、パートナーシップを推進する誘因としてISO14001や地球温暖化防止京都会議の影響等が明らかにできたが、具体的なメリットが見いだしにくいので企業とNGOとの連携が進んでいないミスマッチの実態が明らかになった。マルチメディアGISとしては、京都市や草津市を事例に、GISを用いて、樹木による二酸化炭素の吸収量の増大の可能性の検討や、太陽光発電を用いたエネルギー消費の抑制効果を試算した。この成果を基に、デジタル地図上で多くの人が書き込め、読み出せる簡易システムを試作し、グループウェア上で公開できる準備を進めている。環境行動支援システムの検証としては、ローカルアジェンダ21策定や草津川の跡地利用の参加体験型のワークショップの主催を通じて、オンラインとオフラインのコミュニケーションとの効果を調べて、両者の複合的な利用方法の社会実験を行った。オンラインのコミュニケーションを進める上でも、関心を持つ人々のオフラインでの中核グループの形成と、双方向性を支援する丁寧なシステム管理が必要なことがわかった。京都市のローカルアジェンダ21の策定への参加を通じて、市民、企業、行政のパートナーシップ型の環境行動計画の枠組みを策定した。また、地球温暖化防止京都会議のために結成された環境NGOのアンブレラ組織である気候フォーラムの活動への参加型アクションリサーチを通じて、市民環境行動の新しい展開の枠組みを示した。そして、京都のローカルアジェンダ21や気候フォーラムを支援するホームページの作成や、参加体験型のワークショップの主催を通じて、オンラインのコミュニケーションとオフラインのコミュニケーションとの効果を調べて、両者の複合的な利用方法の社会実験を行った。ホームページは、マスコミなどへの広報戦略上有効であり、電子署名にも効果を発揮した。ワークショップの参加体験型のプログラムは、参加者に好評で、環境行動参画への支援手段として有効あった。しかし、情報ボランティアの不足や、ワークショップのグループ・ファシリテ-タの不足など、コミュニケーション手段以前の人材不足が、オンラインでも、オフラインでも環境行動の普及のネックとなったのが実状である。一方、京都市の地球温暖化防止を支援するために、GISを用いて、樹木による二酸化炭素の吸収量の増大の可能性の検討や、太陽光発電を用いたエネルギー消費の抑制効果を試算した。これらのGISデータを基に、簡易な属性検索データベース管理システムを構築しており、ブラウザ-を通じてインターネットでアクセスできる状況になりつつある。また、現地で撮影したデジタル写真を、GISのデジタル地図上にリンクさせた。これらの手法も次年度、環境行動支援に使う予定である。
高体温時の救命救急法の検討

高体温症の病態は、臨床症例以外には全く解明されていない。一般的に体温が42°Cを越えると致命的であると言われる一方で43°Cを越えて生存しているものもある。今回は各器官の中、消化管の血流の総和と考えられる門脈血流を測定し、エンドトキシンの発現の有無、サイトカインへの影響を検討した。[方法]雑種成犬(体重10-20Kg)10頭をペントバルビタール30mg/kgを静注、後気管内挿管し、1%キシロカイン局所麻酔下に大腿静脈を血管切開する。ペントバルビタール5mg/kg及びモルヒネ1-2mg/kgで麻酔した後、ベクロニウム0.1mg/kgで不動化し、動物用人工呼吸器アイカRM50に接続する。動物をビニールシートで覆い浴槽に侵し、大洋社製サーマルユニット201恒温槽で温水加温法により体温を上昇させる。心電図、観血的動脈圧測定、中心静脈圧をモニターしつつ加温前、39、40、41、42、43°C及び復温時の7点で採血および測定を行う。上行大動脈に電磁血流計を装置し、心拍出量を測定する。門脈血流はトランジットタイム血流計にて測定する。同時に動脈血中エンドトキシン、肝静脈血中インターロイキン6の測定を行う。[結果]心拍出量はコントロール1.74±0.1から42°Cで2.39±0.24と上昇したが43°Cで低下した。これに対して門脈血流はコントロールの37.0±7.5から有意な変化は示さず一定であった。エンドトキシンは4頭で確認された。インターロイキン6については1頭のみが有意な上昇を来した。[結論]今回の人為的高体温時は腸管全体の血流は良く保たれていると考えられるが、腸管由来と考えられるエンドトキシンの増加とこの刺激由来と考えられるサイトカインの上昇が認められた。この結果高体温時は腸管由来のエンドトキシン、肝臓からのサイトカインの遊離というネットワークの形成が示唆された。
ピロリ菌ウレアーゼによるB-1細胞活性化と自己免疫疾患の誘発に関する研究

報告者らは、ピロリ菌より採取・精製した菌体制分ウレアーゼが、ヘルパーT細胞の非存在下でマウス由来のB-1細胞を選択的に活性化すること、そしてこうしたB-1細胞をピロリ菌ウレアーゼで刺激したところ、培養上清中に自己抗体としてのリウマチ因子(RF)や抗DNA抗体が放出されることを発見した。また、ピロリ菌の培養上清中には全く菌体由来ウレアーゼ蛋白は検出されないこと、ならびに菌体表面に多量のウレアーゼ蛋白が発現していることを確認した。そこで、ウレアーゼを欠損したピロリ菌を入手し、このウレアーゼ欠損株と非欠損株ピロリ菌をプレート上に固着させ、B-1細胞を添加培養し、上清中のリウマチ因子や抗DNA抗体の放出量を測定したところ、ウレアーゼ非欠損株とともに培養した場合においてのみ、これらの自己抗体が検出された。こうした事実は、ピロリ菌表面のLPSなどではなく、菌体表面に発現したウレアーゼが直接にB-1細胞を刺激し、自己抗体の産生・放出を促したことを示している(論文投稿中)。(1)BALB/cマウスに感染性を有するピロリ菌シドニー株(SS-1株)より抽出精製した菌体成分ウレアーゼのpurityをWestern blot法で確認した。また、精製ウレアーゼの含有量をタンパク量を指標として測定し、同時にその酵素活性が失活していないことを確認した。(2)次に、無免疫BALB/cマウスより胸腺細胞を採取しピ.ロリ菌ウレアーゼによる増殖反応を追跡したところ全く応答が観察されなかったことを確認後、様々なリンパ臓器を採取しピロリ菌ウレアーゼの添加実験を行ったところ、B220陽性のBリンパ球の増殖反応が認められた。そこで、B220陽性細胞を分離採取し精製ピロリ菌ウレアーゼを添加したところ、T細胞を完全に除去した場合にも増殖反応が認められたため、増殖反応の標的が従来のB-2細胞ではなく、自然免疫系に属するT-independentなB-1細胞であることを見出した。この際、LPSの特異的lnhibitorであるPolymyxin Bを培養系に加えることで増殖反応は抑制されなかったため、この増殖反応はLPSの混入によるものではないことを確認した。以上より、SS-1株より抽出精製した菌体成分ウレアーゼには、BALB/cマウスのB-1細胞に対する選択的な刺激活性化能があることが判明した。(3)そこで、B-1細胞の表面マーカーであるCD5指標としてマウス脾臓由来B細胞をB-1細胞とB-2細胞とに分け比較検討したところ、CD5陽性のB-1細胞に対する選択的な活性化能が菌体成分ウレアーゼに存在することを確認した。以上の成果をInfect.Immunol.74,248-256,2006に発表した。これらの事実を下に、次年度は実際にヒトCD5陽性B-1細胞のピロリ菌ウレアーゼに対する応答性、ならびに自己抗体産生能をマウスのみならずヒトの細胞を用いても追跡する予定である。1.これまでの研究により、ピロリ菌シドニー株(SS-1株)に感受性を有するBALB/cマウスの胸腺細胞を採取し、ピロリ菌より抽出精製した菌体成分ウレアーゼを添加培養しても全く応答が認められなかったが、脾臓細胞に添加した場合には有意な増殖反応を示すことを見出した。このことから、この菌体ウレアーゼにはT細胞以外の脾臓細胞、即ちB細胞の活性化能が存在すると考え、B細胞をpannning法で選択的に採取し、それに菌体ウレアーゼを添加培養した。2.その結果、T細胞を完全に除去した場合にも増殖反応が認められたため、増殖反応の標的が従来のB-2細胞ではなく、自然免疫系に属するT-independentなB-1細胞であると推測した。このことを、B-1細胞の表面マーカーであるCD5指標としてマウス脾臓由来B細胞をB-1細胞とB-2細胞とに分け、それぞれに菌体成分ウレアーゼを添加培養することによって、CD5陽性のB-1細胞に対する選択的な活性化能が存在することを確認した。以上の成果をInfect.Immun.74,248-256,2006に発表した。

3.そこで、一般にB-1細胞はリウマチ因子などの自己抗体を産生することに着目し、精製B-1細胞に菌体成分ウレアーゼを添加しその培養上清中の自己抗体を測定したところ、抗核抗体、リウマチ因子、抗phosphatidyl Choline抗体などの自己抗体が検出された。そこで、ピロリ菌陽性リウマチ患者の活動性とB-1細胞数を追跡したところ、実際にリウマチ因子の量が多いほど末梢血中のB-1細胞数が多いことを確認した(論文作成中)。本年度は、菌体成分ウレアーゼがB-1細胞上のどのような分子を介して活性化されるかを明らかにし、その分子をブロックするような抗体を用いて自己抗体の産生を抑制し、ピロリ菌感染に伴う病状の進行を止めるような新たな手だてを模索する。抗体産生細胞は、CD4陽性ヘルパーT細胞の補助の下様々な異物特異的な抗体を産生するB細胞(B-2細胞)、すなわちT細胞依存性B-2細胞と、ヘルパーT細胞非依存性に抗体を産生するB細胞(B-1細胞)とに大別される。これまでの研究で報告者らは、ピロリ菌より採取・精製した菌体制分ウレアーセが、ヘルパーT細胞の非存在下でマウス由来のB-1細胞を選択的に活性化することを見いだした(Infect. Immun.74:248-2565,2006)。そして、こうしたB-1細胞をピロリ菌ウレアーゼで刺激したところ、培養上清中に自己抗体としてのリウマチ因子(RF)や抗DNA抗体が放出されることを発見した。そこで本年度は、こうしたピロリ菌ウレアーゼがB-1細胞を活性化するメカニズムを探るため、まずピロリ菌の培養上清中に実際にウレアーゼ蛋白がどの程度放出されるかを調べてみた。その結果驚くべきことに、報告者等が開発した各種のピロリ菌ウレアーゼ特異的抗体群(Infect. Immun.69:6597-6603,2001)を駆使しても、培養上清中には全く菌体由来ウレアーゼ蛋白は検出されなかった。次に、ウレアーゼ蛋白が胃粘膜への生着に不可欠な因子である事実に基づき、菌体表面へのウレアーゼの発現状況を検討した結果、予想通り菌体表面に多量のウレアーゼの発現が観察された。そこで、ウレアーゼを欠損したピロリ菌を入手し、このウレアーゼ欠損株と非欠損株ピロリ菌をプレート上に固着させ、B-1細胞を添加培養し、上清中のリウマチ因子や抗DNA抗体の放出量を測定したところ、ウレアーゼ非欠損株とともに培養した場合においてのみ、これらの自己抗体が検出された(論文投稿中)。こうした事実は、ピロリ菌表面のLPSなどではなく、菌体表面〓発現したウレアーゼが直接にB-1細胞を刺激し、自己抗体の産生・放出を促したしたことを示している(794字)。
脳梗塞克服へ向けた虚血応答性核酸医薬の開発

脳梗塞は本邦での主要な死因となる国民病で、神経細胞の虚血分子病態は明らかになっているにもかかわらず神経保護薬は開発されていない。本研究では、医学、工学の連携により世界最高水準の遺伝子抑制効果をもつ独自のヘテロ核酸と、脳梗塞病態特異的に作用する人工核酸技術を軸に、急性期脳梗塞の病態に最適化した核酸医薬を開発することを目的としている。急性期脳梗塞でpHが低下したときのみに遺伝子抑制効果を発揮する虚血応答型人工核酸を開発/最適化し、ヘテロ核酸技術と組み合わせることにより、マウス脳梗塞モデルに対して経静脈投与であっても梗塞病巣選択的に遺伝子抑制効果を示し、さらに強い治療効果を示すことに成功した。本研究において、脳梗塞に特異的な病態にのみ効果を発現する虚血応答性核酸医薬を開発し、現在まで有効な治療法が開発できていなかった脳梗塞に対する神経保護療法を実現化させる。具体的には、医工の連合により現段階で世界最高水準のin vivo遺伝子抑制効果を持つ独自のヘテロ核酸分子構造に、pH応答性人工核酸技術を導入した「細胞内環境応答型核酸医薬」を開発して、虚血脳組織に部位/時間特異的に治療効果を発揮する、全く新しい発想の脳梗塞治療薬を創薬する。平成26年度は、pH応答性人工核酸の作成及びチューニングを行った。具体的には、分子内導入フェニルボロン酸部位への置換基導入など分子設計・合成によりpH5.8-7.4程度まで、目的とするpHが変化した場合であっても対応出来るようになった。すなわち、当初はpH6.5程度が虚血脳での目標とするpHであったが、梗塞周辺のペナンブラ領域、あるいは脳梗塞病変が小さい場合などpH低下が乏しい場合もあり、その目標とする病変部位のpHに対して、最適なpH応答性人工核酸を選択出来るようになった。さらに、当初は平成27年度に行う予定であったが、マウス脳梗塞モデルも作成し、実際に経静脈的に投与した核酸が脳内に侵入出来るかどうかを確認した。脳内への分布が達成されなければ、我々の検討の実現が難しくなるからである。実際にin vivo脳梗塞モデルであっても急性期に脳血管関門が破綻し、投与した蛍光色素付き核酸が虚血脳内に分布し、主には神経細胞に分布していた。遺伝子抑制効果も虚血脳で認められ、今後のプランは実現可能と考えられた。本研究において、脳梗塞に特異的な病態のみに効果を発現する虚血応答性核酸医薬を開発し、現在まで有効な治療法が開発できていなかった脳梗塞に対する神経保護療法を実現化させる。具体的には、医工連合により現段階で世界最高水準のin vivo遺伝子抑制効果を持つ独自のヘテロ核酸構造に、pH応答性人工核酸技術を導入した「細胞内環境応答型核酸医薬」を開発して、虚血脳組織に部位/時間特異的に治療効果を発揮する全く新しい発想の脳梗塞治療薬を創薬する。実際に、共同研究者の和田健彦教授との共同研究によりpH低下時にのみ遺伝子抑制効果を発現する虚血応答性核酸の開発に成功した。脳梗塞病巣では細胞内pHが6.0-6.5程度に低下するが、目的とするpH低下状態で強く遺伝子抑制効果を発現することをin vitro脳梗塞モデル(OGDモデル)で確認することができた。我々の研究室で開発したヘテロ核酸は従来の核酸と比較して数十倍以上の強い遺伝子抑制効果をもつことが特徴であり、直接脳室内に投与するのではなく経静脈的に投与した場合でも実際の脳梗塞モデルにおいて標的遺伝子を抑制させることに成功した。また、虚血直後には主には血管内皮細胞に6時間後には虚血領域の神経細胞に選択的に分布することが確認できた。これらの結果から、血管内皮細胞や神経細胞に脳梗塞後発現が増加するMalat-1遺伝子を標的として人工核酸による制御を行った。Malat-1遺伝子は、非投与群と比較して約25%程度に低下することに成功しただけではなく、脳梗塞体積の拡大、血管内皮細胞分裂能の減少、神経学的後遺症の悪化など、脳梗塞の病態をも変化させた。さらに、虚血側大脳半球Malat-1遺伝子は抑制するものの、非虚血側大脳半球の遺伝子抑制効果は優位ではなく、虚血部位選択性を有していた。これらの結果により、神経細胞死及び脳血管関門制御遺伝子を標的とした人工核酸を開発し、新たな脳梗塞治療が開発できると考えられた。脳梗塞病巣は通常状態より酸性に傾き、pHが低下することが知られている。現在までに、in vitro脳梗塞モデルであるOGD(oxygen glucose deprivation)負荷による細胞内pHを測定し、虚血応答性核酸はpH低下に反応した選択的な遺伝子抑制効果を確認することが出来た。また、核酸の構造を改変(分子内導入フェニルボロン酸部位への置換基導入など)することにより目的とするpH(pH 6.0-6.5程度)に合わせ最適化された虚血応答性核酸を開発することに成功した。また、in vivo脳梗塞マウスモデルを使用することによる同核酸医薬の虚血選択的遺伝子抑制効果を確認することができた。即ち、経静脈的に投与した人工核酸は、虚血部位選択的な遺伝子抑制効果を示すだけでなく、蛍光色素で標識した人工核酸を投与することにより解析した脳内での分布は、虚血中心部及び周辺部のみに認められた。

当初の実験計画通り、Proof of conceptとして脳内にユビキタスに発現するSR-B1(scavenger receptor)やMalat-1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)遺伝子を標的とし、遺伝子抑制効果の有無を確認した。我々の開発したヘテロ核酸は、遺伝子抑制効果の乏しい中枢神経であっても強い遺伝子抑制効果を発揮した。さらに、非虚血側での遺伝子抑制効果はほとんどなく、pHの低下した虚血病巣での遺伝子抑制効果が中心であり虚血応答性核酸の強い選択性が確認された。Malat-1遺伝子は、血管新生に関連する遺伝子であることからMalat-1遺伝子を抑制することにより血管新生が抑制され、脳梗塞の悪化が見られる可能性がある。実際に我々の検討でも、脳梗塞体積の増加、血管新生の抑制が認められた。経静脈的に投与した核酸医薬により、脳梗塞のphenotypeを変化させうることは、平成28年度の課題であったがすでに達成され、平成28年度は実際に最も治療効果の高い標的遺伝子への介入を行いたいと考えている。本研究では、脳梗塞に特異的な病態のみに効果を発現する虚血応答性核酸医薬を開発し、現在まで有効な治療法が開発出来ていない脳梗塞に対する神経保護両方を実現させることを目的としている。脳梗塞部位ではpHが6.0-6.5程度に低下するが、周辺に存在する神経保護療法の治療標的部位であるペナンブラ領域はpH6.5-6.8程度であることが判明した。当初開発した虚血応答性核酸は、pH 6.2程度に低下した細胞環境下において標的RNAに対する高い親和性を示すものであったが、フェニルボロン酸部位へのメトキシ基やニトロ基など各種置換基導入により、ボロン酸部位の酸性度(pKa)が制御可能であり、このpKaの制御により分子内ボロン酸エステル形成のon-off制御pHのコントロールも可能である事を明らかとした(JACSに投稿中)。これらの人工核酸への化学修飾技術により、ペナンブラ領域のpHに合わせた虚血応答性核酸の開発に成功したin vivoでのマウス脳梗塞モデルに対する治療効果における標的mRNAとして中枢神経系の中でも神経細胞や血管内皮細胞に強く発現しているMALAT-1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)遺伝子を選択した。経静脈的に投与したヘテロ核酸はペナンブラ領域の血管内皮細胞や神経細胞に良好に取り込まれ、mRNA抑制効果は脳梗塞部位において80%以上の低下を実現した。一方で、正常動物や脳梗塞と反対側の非虚血部位ではほとんど遺伝子抑制が見られず、明らかな虚血部位選択性を示した。MALAT-1遺伝子抑制の結果として、梗塞体積が変化したが、その原因としてMALAT-1遺伝子の持つangionegesisや神経保護作用を修飾したことであると考えられた。これらの結果により、虚血病態に選択的に作用する人工核酸により新たな脳梗塞治療が開発出来ると考えられた。脳梗塞は本邦での主要な死因となる国民病で、神経細胞の虚血分子病態は明らかになっているにもかかわらず神経保護薬は開発されていない。本研究では、医学、工学の連携により世界最高水準の遺伝子抑制効果をもつ独自のヘテロ核酸と、脳梗塞病態特異的に作用する人工核酸技術を軸に、急性期脳梗塞の病態に最適化した核酸医薬を開発することを目的としている。
イネ胚乳アミロペクチンの分枝構造の遺伝的変換に関する基礎的研究

(1)アミロペクチン分岐構造に関する変異の作製MNU受精卵処理により新たに胚乳澱粉に関する変異1,243系統を選抜し、アミロペクチン生合成に関与する5種の澱粉合成酵素(SSSISSSIV、GBSS)、3種の澱粉枝作り酵素(BEI、BEIIa及びBEIIb)並びに2種の澱粉枝切り酵素(ISA及びPUL)の全てに変異体を得た。さらに、澱粉ホスホリラーゼや基質であるADP-グルコースの合成に関与するAGPaseに関する変異体を単離できた。また、flo1変異は細胞質型PPDKの構造遺伝子変異であること、インド型品種IR36のSSSI活性の低下は、SSSI構造遺伝子変異に起因することが示唆された。(2)変異の遺伝学的解析上記変異がアミロペクチン生合成に関与する9種の酵素のそれぞれに関わる構造遺伝子変異であることが明らかとなった。一方、対立性検定により新たに20を超える遺伝子座を同定したが、これらは調節遺伝子系の変異であることが強く示唆された。(3)変異澱粉の糖質化学的評価BEIIb欠損変異(ae)はDP18以下のアミロペクチン短鎖(A鎖)を減少させ、DP19以上の長鎖を顕著に増加させる。本澱粉は糊化開始温度が10°C以上高く、8M尿素溶液中でも難糊化性を示した。一方、BEI欠損変異(sbe1)は、DP1324及びDP37以上の長鎖を特異的に減少させると共にDP12以下の短鎖を増加させ、糊化開始温度を5°C以上低下させる。これらの結果は、アミロペクチン分子構造の変化、特にDP12以下の短鎖(A鎖)の増加は澱粉の糊化開始温度の低下や膨潤度の増大、粘弾性の低下をもたらし、鎖長構造が澱粉の理化学特性を変更する主要な要因で有ることを示している。DBE変異及びSSS変異澱粉でも同様な傾向が認められた。これらの結果は、アミロペクチン変異が新奇澱粉特性の付与に必須であることを強く示唆している。1)ae変異体遺伝子の微細構造解析EM72、EM129及びEM189は、BEIIb酵素はほぼ正常に発現するものの活性が1/10以下に低下したae遺伝子座のミッセンス変異体であり、活性の低下に比例してアミロペクチンDP18以下の短鎖が減少し、それに伴いデンプンの糊化特性が低下した。EM72ではG462D、EM129ではW396R及びEM189ではF593Iのアミノ酸変異が生じていた。従って、3変異体BEIIb酵素タンパク質の活性の低下は、これらのアミノ酸置換に起因すると推察される。2)胚乳変異体デンプンのアミロペクチン分枝構造の解析BEI変異体は全て野生型と同等の澱粉蓄積を示すが、糊化開始温度及び終了温度は有意に低下した。変異体アミロペクチンは、DP13-24とDP37以上の単位鎖の減少とDP25-36及びDP12以下の短鎖の増加を示した。このことから、BEIはB1及びB3鎖の形成に関与すると推察される。