hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白質工学的手法による脳神経シグナル伝達系の解明とその人工制御

1.トリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)の酸化ストレス下での新規機能の解明TrpRSは、tRNAにトリプトファンを結合させる反応(アミノアシル化)を触媒する酵素である。今回、ヒトのTrpRSの新規機能を探索したところ、酸化ストレス下で、ある有機化合物と複合体を形成することを発見した。現在、部位特異的アミノ酸置換体を作製し、分子レベルでの制御メカニズム、及び、生理機能の解明を目指している。2.ニューログロビン(Ngb)の新規機能の探索最近、ヒトNgbが、従来の酸素貯蔵するグロビン蛋白質とは異なり、三量体G蛋白質のαサブユニットと結合し、GDP/GTP交換反応抑制蛋白質(GDI)として機能する酸化ストレス応答性のシグナル伝達センサー蛋白質であることを発見した。さらに、魚類NgbのcDNAをクローニングし、大腸菌での蛋白質発現、蛋白質精製し、解析した結果、魚類NgbにはGDI活性がないことが判明した。今回、魚類、ヒトNgb間で、部位特異的なアミノ酸置換体、さらにモジュール置換した種々の蛋白質を作製し、細胞に対する生理機能を研究した。今回、システインプロテアーゼ阻害因子である"Cystatin C"、及び、脂質ラフト構成蛋白質である"Flotillin-1"とNgbとの相互作用に関して、部位特異的アミノ酸置換体を作製し解析を行った。また、複合体のモデリングを試みた。最近、脳神経細胞に特異的に発現し、可逆的な酸素結合が可能な蛋白質「ニューログロビン(Ngb)」が報告された。このNgbには、脳虚血、再潅流などの酸化ストレスに伴う神経細胞死を抑制する働きがあると指摘されている。今回、我々はこのNgbが脳神経系においてシグナル伝達系を制御する分子として機能しているという仮説を立て、Ngbが関与する脳神経シグナル伝達系を明らかにすることを目指した。Ngbは、二つの大きく異なる構造をとりうる。一つは、通常の酸素正常状態の構造であり、この状態では、ヘム鉄は2価であり、酸素などの配位子が結合できる。もう一つの構造は、虚血・再潅流時などの酸化ストレス下で生成する構造であり、ヘム鉄は3価に酸化され、蛋白質由来のヒスチジンが直接ヘム鉄に配位することにより、酸素正常状態の構造と比べ大きな構造変化を生じる。本研究では、この酸化ストレス下での大きな構造変化に着目し、Ngbに結合する蛋白質の解析を行った結果、酸化ストレス下で生成する鉄3価Ngbが細胞内シグナル伝達蛋白質であるGαと特異的に結合すること、他方、通常の酸素正常状態の鉄2価NgbはGαとは相互作用しないことを発見した。さらに、Ngbは酸化ストレス応答性のセンサー蛋白質として働き、酸化ストレスを受けた時のみGαと結合し、GαのGDP/GTP交換反応抑制蛋白質GDIとして機能することにより、神経細胞死を抑制し、さらに、神経再生を促進していることを明らかにした。さらに、脳神経シグナル伝達系におけるNgbの役割を検討するために、ヒトNgbをbaitとし、Yeast two hybrid systemを用いて、Ngbと相互作用する相手分子をhuman brain cDNA libraryから探索した結果、Gα以外の他のNgb結合蛋白質を特定することにも成功した。現在、Ngbと脳内蛋白質との複合体形成、制御メカニズムを分子レベルで明らかにするために、Ngbに関しモジュール置換した種々のキメラ蛋白質を作製し、それらの構造及び機能解析を行っている。最近、脳内に、可逆的な酸素結合力河能な蛋白質Ngbが存在することが報告され、酸化ストレスに伴う神経細胞死の抑制へのNgbのかかわりが指摘されている。しかしながら、その神経細胞死の抑制メカニズムはまだ明らかになっていない。我々は、最近、ヒトNgbが、従来の酸素貯蔵するグロビン蛋白質とは異なり、三量体G蛋白質のαサブユニットと結合しGDP/GTP交換反応抑制蛋白質(GDI)として機能する酸化ストレス応答性のシグナル伝達センサー蛋白質であることを発見した。さらに、我々は、魚類NgbのcDNAをクローニングし、大腸菌での蛋白質発現、蛋白質精製し、解析した結果、魚類NgbにはGDI活性がないことが判明した。そこで、魚類、ヒトNgb間で、部位特異的なアミノ酸置換、さらにモジュール置換した種々の蛋白質を作製し、構造及び機能解析を行い、GDI活性に重要なNgbのアミノ酸残基の特定に成功した。脳神経シグナル伝達系におけるNgbの役割をさらに検討するために、ヒトNgbをbaitとし、Yeast two hybrid systemを用いて、Ngbと相互作用する相手分子をhuman brain cDNA libraryから探索した。その結果、システインプロテアーゼ阻害因子である"Cystatin C"、及び、脂質ラフト構成蛋白質である"Flotillin-1"が、Ngbと特異的に結合することを明らかにした。3.アミノアシルtRNA合成酵素の酸化ストレス下での新規機能の解明トリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)は、tRNAにトリプトファンを結合させる反応(アミノアシル化)を触媒する酵素である。ヒトのTrpRSと相互作用する蛋白質を探索したところ、解糖系の酵素であるグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GapDH)がTrpRSと結合し、さらに、酸化ストレスに応答してTrpRSのアミノアシル活性を上昇できることが明らかになった。

今回、ヒトのTrpRSの新規機能を探索したところ、酸化ストレス下で、ある有機化合物と複合体を形成することを発見した。現在、部位特異的アミノ酸置換体を作製し、分子レベルでの制御メカニズム、及び、生理機能の解明を目指している。2.ニューログロビン(Ngb)の新規機能の探索最近、ヒトNgbが、従来の酸素貯蔵するグロビン蛋白質とは異なり、三量体G蛋白質のαサブユニットと結合し、GDP/GTP交換反応抑制蛋白質(GDI)として機能する酸化ストレス応答性のシグナル伝達センサー蛋白質であることを発見した。さらに、魚類NgbのcDNAをクローニングし、大腸菌での蛋白質発現、蛋白質精製し、解析した結果、魚類NgbにはGDI活性がないことが判明した。今回、魚類、ヒトNgb間で、部位特異的なアミノ酸置換体、さらにモジュール置換した種々の蛋白質を作製し、細胞に対する生理機能を研究した。今回、システインプロテアーゼ阻害因子である"Cystatin C"、及び、脂質ラフト構成蛋白質である"Flotillin-1"とNgbとの相互作用に関して、部位特異的アミノ酸置換体を作製し解析を行った。また、複合体のモデリングを試みた。
高次視覚物体認識の統合的脳機能に関する認知心理学的研究

ヒトの視覚による物体認識について、これまで知られていなかった様々な特性を発見した。1、前年度に続く物体方向知覚(車やイスといった物体が自分に対してどちらを向いているかを視覚によって認識すること)についての研究では、物体が置かれている周囲の環境が持つ方向情報(例えば、道路や部屋の方向)が物体方向知覚に影響を与えることがわかった。物体方向知覚において、本来は物体そのものと関係のない周囲の環境の方向を無視できない傾向があるということになる。物体認識のみならず、情景認識など視覚認知研究の他分野にも影響を与える成果だと言える。2、また、物体の見た目の好ましさがどのように形成されるのかを調べる実験研究が進行し、すでにいくつかのまとまった知見を得ることができた。例えば、家具や乗物などの製品の画像を見て、その製品の好ましさを答えてもらう実験では、たった0.1秒間見るだけ好ましさがほぼ決定されることがわかった。好ましさのような非常に複雑で高次の視覚的認知がこのように高速かつ効率的に行われていることは、驚くべき発見である。こういった発見はいずれも、視覚物体認識が単一の物体認識神経機構によって独立に担われているという従来の考え方に変更を迫るものである。高次視覚物体認識は、他の様々な視覚認知メカニズムとの相互作用と統合的情報処理によって成立していることが裏付けられたと言える。いずれの成果も国内外で学会発表をしている。また、1の成果は英語論文として投稿、査読中である。2の成果も英語論文執筆中である。身の回りの物体の方向(前,横など)を視覚によってどのように認識しているかを,二つの方向で研究した。第一に,機能的MRIを用いて物体を見ている時のヒトの脳活動を計測し,物体方向の認識の脳内機構を調べた。主に視覚的物体認識を担うと従来考えられてきた後頭・側頭葉の領域は,何の物体かを判断するだけの時も,物体方向を判断しなければならない時も同程度に活動した。しかし,これとは異なる頭頂葉の領域で,物体方向の判断時により強い活動が見られた。視覚的物体認識の脳内機構は従来考えられていたよりも複雑で,新しいモデルを考える必要があることが示唆された。第二に,心理学的実験によって,物体の方向を判断する際に周囲の空間(道路や部屋など)の方向が影響するかどうかを検討した。何もない背景の中の物体の方向を判断する場合と,視線に対して平行な空間(部屋の中で壁に正対しているような場合)の中の物体の方向を判断する場合とで,認識された物体方向は同じだった。しかし,物体の方向と近いが少しずれている方向の空間の中の物体を見ると,何もない背景の中で物体を見るときに比べて,知覚された物体方向がずれることがわかった。例えば,道路と少しだけ違う方向を向いている車の方向は,道路の方向に少し引きずられて知覚される。物体方向の認識は,物体そのものの視覚的情報だけによるのではなく,本来は関係のない周囲の空間の情報も影響することが初めてわかった。身の回りの空間の中で物体をどのように認識しているのかについて新しい示唆をもたらす結果だと考えられる。
LBLナノカプセルによる人工膵臓システムの開発

フェニルボロン酸(PBA)が過酸化水素によって分解する反応とグルコースオキシダーゼの酵素反応を組み合わせることで、糖尿病患者の血糖値に応答して速やかにインスリンを放出するナノカプセルのおよびナノ粒子を調製することを目的に研究を行った。血糖値の上昇に応じて自発的にインスリンを放出する人工膵臓用材料へと発展させる。つまり、薄膜材料やカプセルの構造、インスリンと酵素の固定化方法などの最適化を行い、医療用デバイスと組み合わせることでインスリン療法に有用なドラックデリバリーシステムを実現する。1)インスリン放出薄膜のナノピペットへの導入先行研究で得られた結果をもとに、過酸化水素に応答して分解する薄膜を先端口が数百ナノメートルから数マイクロメートルサイズのピペットの内壁に被覆することを試みた。薄膜の被覆には交互累積膜(LBL)法を用い、ピペット壁面への薄膜の被覆状態はイオン電流変化を指標として評価した。また、カプセルおよびナノ粒子の場合と同様にこの薄膜にグルコースオキシダーゼおよびインスリンを組み込むことでグルコース刺激によりインスリンを放出するナノピペットを作製した。現在はグルコース応答性およびインスリン放出特性を同様にイオン電流変化からの評価を行っている。2)PBA/H2O2と異なる機構でのグルコース応答材料開発ヘミン分子は過酸化水素から生成する活性酸素種(ROS)を生成する。このROSがDNA鎖を切断する反応を利用した過酸化水素およびグルコース応答薄膜の開発を行った。ヘミン分子を修飾したポリエチレンイミンとDNAを静電的相互作用により積層して作製した薄膜は過酸化水素刺激により分解応答を示した。同様にグルコースオキシダーゼを組み合わせることでグルコース応答性を獲得した。フェニルボロン酸(PBA)が過酸化水素によって分解する反応と酵素反応を組み合わせることで、糖尿病患者の血糖値に応答して速やかにインスリンを放出するナノ薄膜を調製することを目的に研究を行った。また、この薄膜で微粒子を被覆もしくはナノカプセルを作製し、血糖値の上昇に応じて自発的にインスリンを放出する人工膵臓用材料へと発展させる。1)PBA誘導体と過酸化水素の反応の解析:先行研究においてPBAと1,3-ジオールのエステル結合を製膜の駆動力としたノ薄膜を作製したが、応答速度や安定性が不十分であった。そこで、種々のPBA誘導体およびジオール化合物を用いて検討を行った結果、置換基効果および用いるジオール構造の差異により安定性や過酸化水素応答速度に差異が生じることを明らかにした。2)ナノ薄膜材料、酵素およびインスリン固定化法の検討:先行研究で用いたPBA-PAHとPVAでは微粒子上にナノ薄膜を被覆することができなかったが、材料を工夫することで改善することができた。また、交互累積膜(LBL)法によりインスリンを効果的にナノ薄膜固定化する方法を検討した。インスリンはタンパク質であるため静電気相互作用を利用することでナノ薄膜へ固定した。水晶振動子ミクロバランス法、原子間力顕微鏡、紫外可視分光法、蛍光分析によりインスリンの放出特性の評価を行った。フェニルボロン酸およびシキミ酸を20%程度修飾したポリアリルアミンを用いることで微粒子上へのナノ薄膜の被覆に成功した。これらの材料で調製したナノ薄膜も過酸化水素に対して速やかに応答した。また、この薄膜にインスリンが静電的相互作用により吸着すること、インスリンが過酸化水素によって放出することを確認した。1)インスリン放出ナノカプセルのおよびナノ粒子の作製前年度に得られた結果をもとに、グルコースに応答してインスリンを放出する微粒子およびナノカプセルの作製を試みた。薄膜およびカプセルの調製には交互累積膜(LBL)法を用いた。この方法は、基板上に相互に結合するポリマーを交互に被覆することで調製し、膜厚や膜透過性および機能性分子の量などを任意に操作することができるためグルコース応答やインスリン放出の最適化を行うことができる。種々の材料や条件においてLBL法により微粒子にインスリン放出膜を被覆する、薄膜被覆後に微粒子を溶解除去する、ことで様々な構造を試みた。微粒子や膜材料、調製条件を検討したところ、グルコースに応答してインスリンを放出する微粒子の作製に成功した。2)乳酸応答累積膜の開発上記のシステムを応用し、グルコースオキシダーゼのかわりに乳酸オキシダーゼを利用することで乳酸刺激によって分解する累積膜を開発した。がん細胞周辺は正常細胞に比べ乳酸濃度が高いことが知られており、この累積膜はがんドラックデリバリーシステムへの応用が期待できる。また、球状高分子であるデンドリマーを用いることで応答性の改善ができた。これらの材料で調製したナノ薄膜にグルコースオキシダーゼを固定することでグルコースに対する速やかな応答性を獲得した。

また、この薄膜にインスリンが静電的相互作用により吸着すること、インスリンがグルコースによる膜分解に伴って放出することを確認した。フェニルボロン酸(PBA)が過酸化水素によって分解する反応とグルコースオキシダーゼの酵素反応を組み合わせることで、糖尿病患者の血糖値に応答して速やかにインスリンを放出するナノカプセルのおよびナノ粒子を調製することを目的に研究を行った。血糖値の上昇に応じて自発的にインスリンを放出する人工膵臓用材料へと発展させる。つまり、薄膜材料やカプセルの構造、インスリンと酵素の固定化方法などの最適化を行い、医療用デバイスと組み合わせることでインスリン療法に有用なドラックデリバリーシステムを実現する。1)インスリン放出薄膜のナノピペットへの導入先行研究で得られた結果をもとに、過酸化水素に応答して分解する薄膜を先端口が数百ナノメートルから数マイクロメートルサイズのピペットの内壁に被覆することを試みた。薄膜の被覆には交互累積膜(LBL)法を用い、ピペット壁面への薄膜の被覆状態はイオン電流変化を指標として評価した。また、カプセルおよびナノ粒子の場合と同様にこの薄膜にグルコースオキシダーゼおよびインスリンを組み込むことでグルコース刺激によりインスリンを放出するナノピペットを作製した。現在はグルコース応答性およびインスリン放出特性を同様にイオン電流変化からの評価を行っている。2)PBA/H2O2と異なる機構でのグルコース応答材料開発ヘミン分子は過酸化水素から生成する活性酸素種(ROS)を生成する。このROSがDNA鎖を切断する反応を利用した過酸化水素およびグルコース応答薄膜の開発を行った。ヘミン分子を修飾したポリエチレンイミンとDNAを静電的相互作用により積層して作製した薄膜は過酸化水素刺激により分解応答を示した。同様にグルコースオキシダーゼを組み合わせることでグルコース応答性を獲得した。微粒子上へのナノ薄膜の調製およびインスリンの吸着が達成できたので、酵素反応を組み合わせることを検討する。酵素固定化の最適な方法を明らかにしインスリンの放出、さらにカプセル化を目指す。糖尿病患者の血糖値に応答して速やかにインスリンを放出するナノ薄膜を調製する。作製したナノカプセルおよび粒子を組み込んだインスリンドラックデリバリーシステムのためのナノピペットの試作および評価を行う。ナノピペットはガラスおよび石英キャピラリーから作製する。インスリン応答ナノ薄膜を被覆、およびナノカプセル、ナノ微粒子を充填したナノピペットの調製はイオン電流観察、走査電子顕微鏡および蛍光顕微鏡観察により行い、市販の皮膚を模したゲルを購入しグルコース応答性評価を行う。交付決定後の予算の減額により予定した機器の購入ができなかったため、共同研究者の施設で測定を行ったため。(理由)交付決定後の予算の減額により予定していた機器の購入をあきらめ、共同研究者の施設に赴き機器を借り一部の測定を行ったため。(使用計画)引き続き共同研究先で測定を行うため物品費の一部を旅費にあてる。
口腔扁平上皮癌に対するインテグリン機能を標的とした浸潤・転移抑制療法の確立

口腔扁平上皮癌に対する浸潤・転移抑制療法の確立を目的として、口腔扁平上皮癌におけるintegrin-linked kainase (ILK)、ラミニン5、hypoxia-induced factor 1α(HIF 1α)、Her3/ErbB3の発現を検索した。ILKは67%の症例で過剰発現を示し、癌細胞の細胞膜上または細胞質内に局在していた。ILKはラミニン5と局在が一致せず、α3β1インテグリンからのシグナル伝達への関与は小さいと考えられた。またILK過剰発現は浸潤態度、治療転帰と明らかな関連を示さなかった。現時点で、ILKをターゲットとした新規治療の可能性は見い出していない。口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株(SCC9、SCC25)についてILK、Akt、GSKー3b、FAK、Src、PI3Kの発現を単層培養と浮遊培養で比較した。いずれの蛋白も発現を認めるたものの、細胞株の違い、培養条件の違いによる発現量に明らかな差を認めていない。これらのOSCC細胞はいずれも高分化型扁平上皮癌であり、発現量の差を捉えにくいと考えられる。さらに明らかに組織学的分化度に違いがある舌腫瘍から樹立したOSCC細胞株MOK101、MOK205、MOK215についても同様に検討を追加しているところである。これらの細胞株は形態学的に大きさ違いがあり、EカドヘリンとNカドヘリンの発現パターンが異なっている。MOK系のOSCC細胞株は一時、細胞保存状態が悪かったために増殖が不良であったが、現在、調整が済んで実験に使用できるようになっている。前年度行った口腔扁平上皮癌細胞株SCC9、SCC25の培養条件の違い(単層細胞と浮遊培養)によるILK、Akt、GSK-3b、FAK、Src、PI3Kの発現について追試をおこなったが、あきらかな違いは見出せなかった。さらに他の口腔扁平上皮癌細胞株MOK系を用いて同様の検討を行うため、MOK系細胞株を調整している。MOK系は当科で樹立した細胞株でカドヘリン発現に顕著な差がみられ、細胞接着能に大きな差があるため、インテグリンやカドヘリンなどの細胞接着分子からの細胞内シグナル伝達の差をみるのに適している。MOK系は本研究の遂行に必須の細胞株であるが、前年度の凍結保存トラブルのため再調整をおこなっている。MOK系の調整と並行して、ヒト口腔扁平上皮癌組織の浸潤先端におけるHIF1aとErbB3の発現を検索し、癌細胞分散とこれらのタンパクの関連を調べた。癌細胞の浮遊培養により形成される細胞集塊内部では低酸素状態のためにHIF1a(hypoxia-induced factor 1a、低酸素誘導因子1a)の発現が亢進し、さらにこれを介してErbB3発現が亢進することで低酸素環境での細胞生存を助けている。口腔扁平上皮癌の浸潤先端では癌細胞が分散するため酸素供給が容易となりHIF1a発現の減弱が予想されたがこのような発現変化をみられず、しかも細胞増殖に関わるErbB3の発現が弱まる傾向を認めた。口腔扁平癌細胞の生存・増殖には細胞集塊と細胞分散状態で異なる因子が関わっていることが示唆される。口腔癌組織での浸潤先端の状態を模倣するin vitro細胞分散モデルを用いて、上記タンパクの発現を継続検討中である。当科で樹立した口腔扁平上皮癌細胞の凍結保存状態の悪化のため、予定の実験が遂行困難となっている。残った細胞株から再度のクローニングを行ってEカドヘリン発現株、非発現株の単離をすすめている。前項で記したように、細胞調整と並行して口腔癌組織での検索を行うことによる研究目的の達成を目指している。HIF1αは浸潤先端部の癌胞巣が小型化する部位で高頻度に発現していた。HIF1α発現は低酸素環境で誘導されることを考えると、癌細胞が血管と近接する浸潤先端部での高発現は予想に反する所見であった。一方、ErbB3は浸潤先端部の小型胞巣ではやや発現減弱の傾向であった。ILKは癌組織内の分化傾向を示す部分では細胞膜上(細胞間接着部)に弱い発現を認めたのに対して、浸潤先端部では細胞質内に強く発現していた。ILKはintegrin β1の細胞内ドメインと結合し、様々な細胞内シグナルを仲介するタンパクであるが、癌細胞が分散・浸潤する過程で、細胞膜から細胞質内へ移行するものと考える。さらにintegrin β1がintegrin α3とカップルをつくることで認識する細胞外マトリックスlaminin 332の発現をみたところ、浸潤先端部で強く発現していた。癌細胞がintegrin α3β1によりlaminin 332と結合することで、ILKを介した浸潤性亢進を起こしているものと考える。これらの所見は、われわれが以前に行ったOSCC細胞株を用いたin vitroの研究結果(integrin α3β1によるシグナルが細胞間接着を解除し、浸潤性運動を亢進する)と一致するものである。以上から、ILKをターゲットとした治療によりOSCCの浸潤・転移を制御できる可能性が示唆された。

口腔扁平上皮癌に対する浸潤・転移抑制療法の確立を目的として、口腔扁平上皮癌におけるintegrin-linked kainase (ILK)、ラミニン5、hypoxia-induced factor 1α(HIF 1α)、Her3/ErbB3の発現を検索した。ILKは67%の症例で過剰発現を示し、癌細胞の細胞膜上または細胞質内に局在していた。ILKはラミニン5と局在が一致せず、α3β1インテグリンからのシグナル伝達への関与は小さいと考えられた。またILK過剰発現は浸潤態度、治療転帰と明らかな関連を示さなかった。現時点で、ILKをターゲットとした新規治療の可能性は見い出していない。使用を予定したOSCC細胞の一部の保存状況が不良であったため、実験に要する細胞の準備に時間を要したため。口腔扁平上皮癌細胞株の再調整を進め、計画した実験を再開し、研究スケジュールの遅れを取り戻す。口腔外科学OSCC細胞の再調整がほぼ済んだので、計画した実験を進めている。約4ヵ月の研究スケジュールの遅れであるが、今後、早急に実験を進める。
DNA担持ナノ粒子の非架橋凝集と増幅反応の組合せによる超高感度分子診断

金ナノ粒子は分散状態では赤色を示すが、凝集すると表面プラズモン共鳴シフトにより青色になる。表面に短鎖DNAを密生させた金ナノ粒子は、DNAの鎖長や立体構造に応じて分散安定性が鋭敏に変化する。したがって、DNA修飾金ナノ粒子を切断、連結、重合などの酵素反応と組み合わせれば、さまざまな比色分析法に応用できる。本研究では、DNA修飾金ナノ粒子の酵素反応操作に基づくキニーネ比色分析法を構築した。キニーネはトニックウォーターなどの清涼飲料水に添加される苦味剤であるが、過剰摂取が神経毒症状を引き起こすことが報告されている。したがって、その量を簡便に検知する分析法の開発は重要である。本法は、ヘアピン型DNAアプタマープローブ、ニッキング酵素、およびニッキング酵素に認識・切断される配列をもつDNA修飾金ナノ粒子の3つで構築した。キニーネが試料溶液に含まれていると、ヘアピン型DNAアプタマープローブがキニーネに結合すると同時に直鎖状に開いて、粒子表面のDNAと二重鎖を形成する。この二重鎖のうち粒子表面に固定されたDNA鎖のみがニッキング酵素に切断され、ヘアピン型DNAアプタマープローブが粒子表面から遊離し、ほかの粒子の表面に結合して再利用される(信号増幅)。表面DNAが短縮されると粒子間の静電反発と立体反発が弱まるので、粒子は凝集して赤色から青色に変化する。これが本法の検出原理である。本年度はこの分析システムの概念実証実験に成功し、さらにキニーネ以外の物質(たとえばテトラサイクリンやクロラムフェニコール)には応答しないこと、米国食品医薬品局で認可されている上限量の10分の1の量が目視検出できること、ヒト尿中に添加したキニーネも同様に目視検出できることを明らかにした。アプタマーの種類を変えることで、さまざまな標的物質の目視検出法に応用展開できると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
慢性腎不全患者のビタミンD受容体mRNAとビタミンD受容体遺伝子多型の解析

保存期慢性腎不全患者、慢性透析患者および健常者各10名の末梢血白血球よりRNAを抽出し、competitive RT-PCR法にてVitamin D受容体(VDR)遺伝子発現を検討した。保存期患者8/10例、透析患者7/10例、健常者4/5例でVDR遺伝子の発現が同定されたが、全体にその発現量は少なく群間の差は認められなっかた。また、保存期腎不全患者5例では、calcitoriol 0.25μgの投与を行い、1ヶ月後のVDR遺伝子発現の変化を検討したが有意な変化は認めなかった。末梢血白血球のVDR遺伝子発現の同定には、30サイクル以上のPCRを必要とし、その定量性には問題があった。
障害者雇用における企業の「合理的配慮」の方法と費用に関する研究

本研究は、障害者雇用促進法2013(平成25)年改正法により規定された、“合理的配慮"提供の「方法」と“過重な負担"でない限りとされている「負担の程度」の実態について、企業への調査により明らかにすることを目的とする。本研究の(1)障害者が必要な合理的配慮を申し出ることで、提供されることになっている採用前の合理的配慮提供は、職場や職務の実際の情報が乏しい状況では、障害者から網羅的に申し出が行われる傾向にあること、(2)インターンシップを行い職場と職務の実際の情報がある場合は、実際の職務遂行を念頭に効果的な合理的配慮提供の調整がなされること、(3)インターンシップを行い、障害者、支援者、企業の3者で合理的配慮提供の調整がなされた場合は、就職後の定着がよいこと、である。昨年度に企業9社、就労支援機関3事業所、精神科クリニック1施設に行った調査により、障害のある従業員に対する職場での合理的配慮は、第一に個別的な雇用管理(労働時間や休憩時間、通院のための休暇の扱い、仕事の配置等)第二に、相談体制の構築(障害者雇用の実務と実際に障害のある従業員が従事している仕事に精通した人材を配置すること、障害のある従業員からの信頼を得るために国家資格を所持した専門職の配置など)がなされている。この結果をもとに、特に相談体制をきめ細やかに個別的に対応できるように、障害のある労働者が日々の業務と自身の状態を振り返り、不安や疑問を蓄積して状況を悪化させる前に相談ができるようなツールである「reflection paper」(以下RP)を開発した。最終年度は、このRPを調査先企業で実際に使用し、その効果的な使用法と課題、コストについて質問紙調査を行う。研究計画では、29年度から30年度の前半に雇用事例調査を行い、障害種別ごとの合理的配慮提供の具体的な方法を明らかにすることとしており、相談体制をきめ細やかに個別的に対応できるよう「reflection paper」(以下RP)を開発した。おおむね順調に進展していると考えている。開発した「reflection paper」(以下RP)を用いて、今後実際に企業で試行し、合理的配慮方法と課題、コストについて企業に質問紙調査を行う。仮説に基づき障害種別ごとの“合理的配慮"提供の「方法」について検討するために、鉄道事業、製造業、情報通信業、印刷業、人材派遣業、金融業、小売業の企業9社、就労支援機関3事業所、精神科クリニック1施設に調査を行った。調査により、上記仮説(2)、(3)のような過程を経て採用された障害のある従業員が職場でどのような合理的配慮を提供されているのかその一端が明らかになった。第一に個別的な雇用管理がなされていた。具体的には、労働時間や休憩時間、通院のための休暇の扱い、仕事の配置等についての障害のある労働者ごとに個別のきめ細やかな管理がなされていた。第二に、相談体制の構築である。平成25(2013)年改正法第36条の4の2で定められている雇用管理上必要な措置を講じられる相談体制であるが、障害者雇用の実務と実際に障害のある従業員が従事している仕事に精通した人材を配置すること、障害のある従業員からの信頼を得るために国家資格を所持した専門職の配置もなされていた。事例調査で得られた知見をもとに今後アンケート調査の質問紙の検討に入る。2014年(平成26)年から、法の施行までに必要な地域での障害者雇用の方法を議論する中で、企業の人事担当者、支援機関の就業支援員、弁護士と研究者をメンバーとする「地域における差別禁止・合理的配慮提供プロセスに関する研究会」を立ち上げ、実際の雇用の場で、改正法の趣旨に合致した合理的配慮提供を検討しながら個別企業の障害者雇用の事例を蓄積し、分析した結果をもとに合理的配慮提供プロセスの構築と企業が合理的配慮提供を適切に円滑に行うためのツールの開発を行ってきた。研究計画では、29年度から30年度の前半にこのツールを用いて企業での雇用事例調査を行い、障害種別ごとの合理的配慮提供の具体的な方法を明らかにすることとしており、おおむね順調に進展していると考えている。本研究の(1)障害者が必要な合理的配慮を申し出ることで、提供されることになっている

採用前の合理的配慮提供は、職場や職務の実際の情報が乏しい状況では、障害者から網羅的に申し出が行われる傾向にあること、(2)インターンシップを行い職場と職務の実際の情報がある場合は、実際の職務遂行を念頭に効果的な合理的配慮提供の調整がなされること、(3)インターンシップを行い、障害者、支援者、企業の3者で合理的配慮提供の調整がなされた場合は、就職後の定着がよいこと、である。昨年度に企業9社、就労支援機関3事業所、精神科クリニック1施設に行った調査により、障害のある従業員に対する職場での合理的配慮は、第一に個別的な雇用管理(労働時間や休憩時間、通院のための休暇の扱い、仕事の配置等)第二に、相談体制の構築(障害者雇用の実務と実際に障害のある従業員が従事している仕事に精通した人材を配置すること、障害のある従業員からの信頼を得るために国家資格を所持した専門職の配置など)がなされている。この結果をもとに、特に相談体制をきめ細やかに個別的に対応できるように、障害のある労働者が日々の業務と自身の状態を振り返り、不安や疑問を蓄積して状況を悪化させる前に相談ができるようなツールである「reflection paper」(以下RP)を開発した。最終年度は、このRPを調査先企業で実際に使用し、その効果的な使用法と課題、コストについて質問紙調査を行う。研究計画では、29年度から30年度の前半に雇用事例調査を行い、障害種別ごとの合理的配慮提供の具体的な方法を明らかにすることとしており、相談体制をきめ細やかに個別的に対応できるよう「reflection paper」(以下RP)を開発した。おおむね順調に進展していると考えている。平成31年度初頭に特例子会社(422社)と大企業だけでなく中小企業も会員となっている社団法人全国重度障害者雇用事業所協会(以下全重協324社)を対象にアンケート調査の実施を予定している。これに備え、平成30年度は、雇用事例調査の結果を踏まえ、質問票の検討を行う。開発した「reflection paper」(以下RP)を用いて、今後実際に企業で試行し、合理的配慮方法と課題、コストについて企業に質問紙調査を行う。平成31年度に予定しているアンケート調査に備えて統計ソフトの更新を考えていたが、専用パソコンで処理を行うことが適切であることから、両方を平成29年度に準備するのは、最新版を使用したい趣旨からすると適切な時期ではないと考え、次年度以降に整備することとした。予定していた邦訳費用を支出せずに済んだため差額が生じた。次年度ツールをシステム化し、修正する費用に充当したいと考えている。
インプラント体周囲組織再生部のin situ bacteriologyの融合

生体側が細菌感作時に産生する抗菌ペプチドの特性として,広範囲の殺菌作用,機能ホルモンのような多面的な作用である,好中球・単球・Tリンパ球の遊走などケモカイン様の働き,また一部の抗菌ペプチド(cathelicidin)については血管新生作用を持つことが知られている.また抗菌ペプチドの大切な特性の一つとして,生体側より産生されるため副作用がないことが挙げられる.以上の性質を有する抗菌ペプチドであるが,これまでに抗菌ペプチドの組織再生への効果は明らかになっていない.そこで抗菌ペプチドを用いたインプラント体周囲組織再生療法の確立を目指し,抗菌ペプチドの局所投与による創傷治癒効果について検証を行った.今検証では,抗菌ペプチドの一つであるLL37に着目し,これまでに創傷治癒部位における組織再生に必要不可欠な脈管新生能について,また創傷治癒不全を引き起こす細菌感染の抑制能について検証を行った.その結果,口腔細菌中ではレンサ球菌が最も多いとされるが,LL37作用時にレンサ球菌の一種である,Streptococcus mutansの生存率の抑制作用が認められた.また,脈管新生能についてはLL37作用時のリンパ管内皮細胞に対する細胞増殖,遊走能,管腔形成能について調べた結果,増殖に関して効果は認められず,遊走能と管腔形成能については促進効果が認められた.今後は,vitroでのメカニズム解析とマウス創傷治癒モデル作成とマウス創傷治癒モデルにおけるLL37投与における創傷治癒効果について検証を進める予定である.抗菌ペプチドの一種であるLL37作用時の創傷治癒部位における組織再生に必要不可欠な脈管新生能について,また細菌感染抑制能について,申請時の計画通りに概ね順調に進んでいる.今後は,これまでに明らかにしたLL37の脈管新生能や細菌感染抑制能を基に,vitroでのメカニズム解析とマウス創傷治癒モデル作成およびマウス創傷治癒モデルにおけるLL37投与時における創傷治癒効果について検証を進める予定である.インプラント体埋入後の埋入周囲組織の良好な治癒は,インプラント体の長期生存において必要不可欠である.インプラント体埋入後の良好な周囲組織の治癒には,創傷治癒部位への血流供給,および細菌感染の抑制が必要である。近年,細菌感作時に生体側より産生される抗菌性ペプチドが抗菌作用以外に,ケモカイン様の作用や血管新生作用を示すことが報告されている.しかし抗菌性ペプチドの組織再生への効果については不明である.そこで本研究は抗菌性ペプチドの創傷治癒部位における有効性についての基礎データを蓄積し,最終的には抗菌性ペプチドを用いたインプラント体周囲組織再生療法の確立を目指すものである.抗菌性ペプチドを用いたインプラント体周囲組織再生療法の確立を目指し,当該年度において,創傷治癒部位を想定したin vitroにおける抗菌性ペプチドの有効性検証を行った.具体的には,購入可能な抗菌性ペプチドを用い,口腔内細菌細菌および真菌に対する抗菌,抗真菌作用について,また組織の創傷治癒部位に不可欠な細胞遊走能についての評価を行った.その結果,用いた抗菌性ペプチドにおいて,う蝕原生菌の一つであるStreptococcus mutansに対して抗菌作用を示し,また誤嚥性肺炎の起因菌の一つであり,常在菌のCandida albicansに対しても抗真菌作用を示した.また,transwell chamberを用いた細胞遊走能評価においては,ヒト臍帯静脈内皮細胞の抗菌性ペプチド作用時の遊走を確認した.今後は,ヒト臍帯静脈内皮細胞の抗菌性ペプチド作用時の管腔形成能,抗菌性ペプチドの歯肉線維芽細胞への影響能について検証を進める予定である.研究申請書よりも若干の研究進度の遅れをとった大きな要因として,抗菌性ペプチドの各検証における作用濃度の特定に時間を要したことが挙げられる.しかし,現段階において各抗菌性ペプチドの各検証時の試適濃度が明らかになったため,以後の検証はさらに効率よく進めることができると考えている.生体側が細菌感作時に産生する抗菌ペプチドの特性として,広範囲の殺菌作用,機能ホルモンのような多面的な作用である,好中球・単球・Tリンパ球の遊走などケモカイン様の働き,また一部の抗菌ペプチド(cathelicidin)については血管新生作用を持つことが知られている.また抗菌ペプチドの大切な特性の一つとして,生体側より産生されるため副作用がないことが挙げられる.以上の性質を有する抗菌ペプチドであるが,これまでに抗菌ペプチドの組織再生への効果は明らかになっていない.そこで抗菌ペプチドを用いたインプラント体周囲組織再生療法の確立を目指し,抗菌ペプチドの局所投与による創傷治癒効果について検証を行った.今検証では,抗菌ペプチドの一つであるLL37に着目し,これまでに創傷治癒部位における組織再生に必要不可欠な脈管新生能について,また創傷治癒不全を引き起こす細菌感染の抑制能について検証を行った.その結果,口腔細菌中ではレンサ球菌が最も多いとされるが,LL37作用時にレンサ球菌の一種である,Streptococcus mutansの生存率の抑制作用が認められた.また,脈管新生能についてはLL37作用時のリンパ管内皮細胞に対する細胞増殖,遊走能,管腔形成能について調べた結果,増殖に関して効果は認められず,遊走能と管腔形成能については促進効果が認められた.今後は,vitroでのメカニズム解析とマウス創傷治癒モデル作成とマウス創傷治癒モデルにおけるLL37投与における創傷治癒効果について検証を進める予定である.抗菌ペプチドの一種であるLL37作用時の創傷治癒部位における組織再生に必要不可欠な脈管新生能について,また細菌感染抑制能について,申請時の計画通りに概ね順調に進んでいる.当該年度の検証により,各抗菌性ペプチドの各検証における作用試適濃度が明らかとなった.

今後は申請書に記載した,in vitroにおける全ての検証において有効性を示す抗菌性ペプチドの試適濃度を特定する予定である.さらに,in vitroにおける試適濃度を参考にして,in vivoにおける抗菌性ペプチドの有効性についても合わせて検証を推進する予定である.今後は,これまでに明らかにしたLL37の脈管新生能や細菌感染抑制能を基に,vitroでのメカニズム解析とマウス創傷治癒モデル作成およびマウス創傷治癒モデルにおけるLL37投与時における創傷治癒効果について検証を進める予定である.当該年度は,抗菌性ペプチドの試適濃度の探索に主な検証労力を割いたため,予定したよりも予算を消費しきれなかったことが次年度使用額の生じた理由と考えられる.次年度より効率的な検証を遂行し,かつ得られた検証結果をもとに学会発表や論文投稿費用などに積極的に予算を充てたいと考えている.申請時よりもさらにより効率的に消耗品を使用し,また業者のキャンペーンなどをうまく使用し,申請時に想定したよりも物品を安く購入できたため。最終年度ではさらに研究のペースを上げin vivoでの検証も進め、またこれまでに検証してきた知見を論文にする際の経費に充てたりすることで効率的に予算を消化していく予定である。
自閉症発症におけるPGD2を鍵とした慢性神経炎症とシナプス形成異常連関の解明

プロスタグランジンD2(PGD2)が幼若期脳の神経形成に及ぼす影響の検討我々は周産期の神経炎症を引き起こすようなイベントが自閉症発症のリスクであることを報告している。また、米国ATPから供与を受けた自閉症脳を用いた解析で、自閉症脳では造血器型プロスタグランジンD合成酵素が増加していることを見出した。これらのデータより、幼若脳において、PGD2が神経細胞形態にどのような作用を及ぼすのかを検討してきた。マウスの一次培養神経細胞にDP1受容体agonisを加えると、濃度依存性にneuriteの有意な伸長が認められた。また、primary dendriteも有意に増加をみとめ、PGD2が神経細胞形態を変化させることを見出した。次に、生後5日齢から11日齢までの幼若マウスにDP1受容体agonistもしくはsalineを1日1回腹腔内投与し日齢14と15週齢の時点での神経形態をゴルジ染色で観察したところ、大脳皮質において、樹状突起の分枝数がDP1受容体agonist群ではsaline群より有意に低下していた。反対に、スパイン密度は増加していることが確認された。15週齢のマウスにおいて、DP1受容体agonist群では大脳皮質のアストロサイトの活性化が認められた。本年度はP2P6マウスにpolyI:Cの5日間の連続投与を行い、神経炎症を起こさせることで行動が変化するかを検討したところ、4週齢の時点で自閉症様行動を示すことが明らかとなった。引き続き、造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスを用いて、polyI:C投与の行動変容への作用がPGD2を介したものかを検討中である。造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスは受精卵で保存していたものから作成しようとしたが、1度仔がすべて食殺されてしまったため、大幅に研究計画が遅れてしまったため。現在造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスが得られ、実験を行っているところである。プロスタグランジンD2(PGD2)が幼若期脳の神経形成に及ぼす影響の検討本年度は、マウス初代培養神経細胞を用いて、プロスタグランジンD2(PGD2)のスパイン形成への作用を調べた。マウス胎児海馬からの初代培養神経細胞DP1受容体agonistを作用させ、スパインの数をカウントした。結果、培養後14日の時点ではスパイン数には明らかな変化はみられなかった。これは予想と異なる結果であったが、原因として、スパインの観察およびカウントをしやすくするため、レンチウイルスを用いて蛍光タンパク質venusを発現させる系を用いたところ、神経細胞へのダメージが強く、条件設定に時間がかかった。今後、細胞濃度を多くする、また、ウイルスを用いず、免疫染色でスパインを観察する、などで、DP1受容体agonistの神経発達への影響を確認する。また、生後5日から11日までの幼若マウスにDP1受容体agonistを腹腔内投与したのち、日齢14日でサンプリングを行い、前頭葉のゴルジ染色を行い錐体細胞のスパインをカウントしたところ、DP1受容体agonist投与群で有意な増加をみた。脳でのTNF-a, IL-6, COX Iba-1などの炎症性分子のmRNAの増加は認めなかった。今後個体数を増やすことと、成体になったときの行動観察を行う予定である。また、DP1KOマウスを用いてスパイン数を観察する。DP1アゴニストを作用させる頻度が多いと培養神経細胞にダメージを与えることや、観察を容易にするためにレンチウイルスを用いて蛍光蛋白Venusを導入したが、それにより培養神経細胞にダメージが生じ、条件設定に時間がかかったため。プロスタグランジンD2(PGD2)が幼若期脳の神経形成に及ぼす影響の検討本年度は、昨年度に引き続き、生後5日齢から11日齢までの幼若マウスにDP1受容体agonistもしくはsalineを1日1回腹腔内投与したのち、4週齢、89週齢で行動試験を行った。また、DP1受容体agonistもしくはsalineを投与したマウスを日齢14と15週齢でサンプリングを行いゴルジ染色で樹状突起の形態を観察するとともに、グリアのマーカーで組織学的検討を行った。行動試験はオープンフィールド試験、社会性相互作用試験、新奇物体認識試験、self grooming testを行った。結果はいずれのテストにおいても、DP1受容体agonist群ではバラツキが大きく、saline群とは有意差は認めなかった。組織学的検討では、大脳皮質において、樹状突起の分枝数を調べたところDP1受容体agonist群ではsaline群より分枝性が有意に低下していた。また、スパイン密度は増加していることが確認された。これは、一次培養神経細胞を用いた昨年の結果と一致するものであった。また、15週齢のマウスにおいて、DP1受容体agonist群では大脳皮質のアストロサイトの活性化が認められた。今後、行動試験については条件設定を検討し直すことと、個体数を増やすことで検討して行く予定である。さらに、造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスが入手できたため、今後これらのマウスを用い、行動観察および組織学的にスパイン数の検討などを行って行く予定である。造血器型プロスタグランジン

合成酵素欠損マウスを凍結卵で入手し、個体を得ようとしたところ、初回は出産仔が少なく、さらにすべて食殺してしまい、仔を得るのが遅くなってしまっている。プロスタグランジンD2(PGD2)が幼若期脳の神経形成に及ぼす影響の検討我々は周産期の神経炎症を引き起こすようなイベントが自閉症発症のリスクであることを報告している。また、米国ATPから供与を受けた自閉症脳を用いた解析で、自閉症脳では造血器型プロスタグランジンD合成酵素が増加していることを見出した。これらのデータより、幼若脳において、PGD2が神経細胞形態にどのような作用を及ぼすのかを検討してきた。マウスの一次培養神経細胞にDP1受容体agonisを加えると、濃度依存性にneuriteの有意な伸長が認められた。また、primary dendriteも有意に増加をみとめ、PGD2が神経細胞形態を変化させることを見出した。次に、生後5日齢から11日齢までの幼若マウスにDP1受容体agonistもしくはsalineを1日1回腹腔内投与し日齢14と15週齢の時点での神経形態をゴルジ染色で観察したところ、大脳皮質において、樹状突起の分枝数がDP1受容体agonist群ではsaline群より有意に低下していた。反対に、スパイン密度は増加していることが確認された。15週齢のマウスにおいて、DP1受容体agonist群では大脳皮質のアストロサイトの活性化が認められた。本年度はP2P6マウスにpolyI:Cの5日間の連続投与を行い、神経炎症を起こさせることで行動が変化するかを検討したところ、4週齢の時点で自閉症様行動を示すことが明らかとなった。引き続き、造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスを用いて、polyI:C投与の行動変容への作用がPGD2を介したものかを検討中である。造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスは受精卵で保存していたものから作成しようとしたが、1度仔がすべて食殺されてしまったため、大幅に研究計画が遅れてしまったため。培養細胞の濃度を増やす、また、ウイルスを用いず、従来の免疫染色で行う、などで、実験を継続していく予定である。また、新生仔を用いた投与実験を引き続き行う。造血器型プロスタグランジン合成酵素欠損マウスおよびDP1欠損マウスにDP1受容体agonistを投与し、行動観察および組織学的検討を行う。さらに、妊娠マウスに全身性の炎症を引き起こすことで、仔の神経炎症を引き起こし、仔の脳に置ける樹状突起およびスパインの形態を観察する。現在造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスおおびDP1受容体欠損マウスが得られ、実験を行っているところである。実験の条件設定が決まらなかったために、実験が滞り、次年度に持ち越した分がある。マウスを凍結卵から起こすのがうまく行かず、実験がやや遅延しており、マウス飼育費等が来年度になってしまった。造血器型プロスタグランジンD合成酵素欠損マウスとDP1欠損マウスを凍結卵から増やすことがスムーズにいかず、研究が滞り、試薬等を使わなかったため。29年度に実験をする予定である。
肥大した骨格筋組織に出現するサテライト細胞以外の筋原細胞の由来と役割について

運動によって骨格筋が肥大することは良く知られているが、その肥大機構については今だ明らかではない。骨格筋肥大は基本的に筋組織を形成する筋細胞の肥大と増殖によって起る。筋細胞の増殖は各種成長因子によって誘導されることが知られている。これまで増殖よって筋細胞の新たな形成が起り、その元となる筋原細胞はサテライト細胞であることが明らかにされている。しかしながらサテライト細胞は加齢に伴い減少するにも関わらず、高齢者のレジスタンストレーニングでも肥大効果が認められることから、サテライト細胞以外の筋原細胞の存在が示唆されていた。そこで著者はサテライト細胞以外の筋原細胞の由来と役割について、その可能性について検討した。第一章ではこれまでほとんど観察されなかった、筋繊維の肥大に着目して研究を行った。実験の結果、明らかに筋繊維の肥大、長さの増大、細胞核の増加が観察された。しかしながら、細胞核当たりの細胞質の容積は対照群も肥大群もほぼ一定の割り合であった。骨格筋繊維は形成された後、分裂し増殖することがないことから、サテライト細胞あるいは他の筋原細胞が融合した結果、核が増えたものと考えられる。第2章では筋組織の新たな形成と筋原細胞由来について検討した。運動に伴い明らかに筋繊維の崩壊が進行し、筋組織の新たな形成が始まることが生体染色法によって明らかにした。筋原細胞由来については筋細胞特有の転写因子であるmyogeninの陽性細胞を観察することによってその由来を観察した。観察の結果、myogeninの陽性細胞は血管内と血管外周辺に観察され、血液を介して筋組織に運ばれる可能性を示唆した。また、肝細胞で特異的に発現し、分泌するアルブミン陽性細胞が同じく筋組織で観察された。これらに実験から肝細胞あるいは肝幹細胞が筋原細胞と機能することが示唆された。第3章では遊泳実験を現実的な運動形態をモデルとして用い、肝細胞あるいは肝幹細胞が肝臓から剥離し、肝臓重量にどのような影響をおよぼすのかそれを確認するために実験を行った。その結果、明らかに長期間の遊泳運動に伴い、肝臓の重量は低下し、抗重力筋であるヒラメ筋は重量は増加した。以上のような結果から運動に伴い、肝臓は筋肥大や再生時に細胞を筋組織に供給し、運動に適応した筋組織つくりに重要な役割をになっているものと思われる。これまでの実験研究実験1.一般的に臓器組織の成長は臓器をつくる細胞の肥大と細胞の増殖によってもたらされる。骨格筋の場合も同様である。運動による骨格筋の成長は細胞の肥大によるものと考えられてきたが、著者らの実験はこれまでの説を否定するものである。腱切除法により代償性肥大を誘導し肥大筋と対照筋から筋繊維を単離し、それぞれの細胞の核と容積を測定した結果、骨格筋の細胞核当たりの容積は肥大筋も対照筋もほぼ同じであった。すなわち、細胞核になるべき核の増加が細胞肥大には必然的であることが判明した。従ってこれまで筋細胞の肥大は筋細胞を構成するタンパク質の合成が分解を上回ることによっておこるとされていたがこの説には核が予め存在して起こることが必須条件である。

即ち、細胞の肥大は細胞増殖と同様に既存の筋細胞以外からの細胞の融合あるいは核の融合によって起こることが判明した。実験2.上記実験をふまえ骨格筋肥大時に増加する核の由来について検討した。これまで研究室で行って来た筋肥大の研究で分子量64kDaのタンパク質が特異的に増加することを発見した。このタンパク質はアルブミンとほぼ同じであることが化学的・免疫学的実験から明らかにした。これまでアルブミンは肝臓でつくられるものと考えられてきたが、筋細胞でもつくられ、肥大筋でその量が多いことから、肝臓細胞が血液を介して筋組織に浸潤する可能性が示唆された。この仮説は筋への機械的伸展刺激がストレスとなり肝臓から細胞が剥がれ、血液に入り、筋組織に浸潤するというものである。そこで、最初の実験として肝細胞が筋細胞に融合することを確認するために、同腹のマウスを6匹用い、1匹のマウスから肝細胞を分離し、ダピ染色を施した後に、その細胞を5匹のマウスの筋組織に移植した。その結果、筋細胞の中にダピで染色された核が多数観察することが、肝臓からの細胞が筋肥大に関与する可能性が示唆された。一般的に臓器組織の成長は臓器をつくる細胞の肥大と細胞の増殖によってもたらされる。骨格筋の場合も同様である。運動による骨格筋の成長は細胞の肥大によるものと考えられてきたが著者らの実験はこれまでの説を否定するものであった。腱切除法により代償性肥大を誘導し肥大筋と対照筋から筋繊維を単離し、それぞれの細胞の核と容積を測定した。測定の結果、骨格筋の細胞核当たりの容積は肥大筋も対照筋もほぼ同じであることから、細胞核になるべき核の増加が細胞肥大には必然的であることが判明した。従ってこれまで筋細胞の肥大は筋細胞を構成するタンパク質の合成が分解を上回ることによっておこるとされていたがこの説は核が予め存在して起こることが確認された。次に、骨格筋肥大時に増加する核の由来について検討した。これまでアルブミンは肝臓でつくられるものと考えられてきたが、筋細胞でもつくられ、肥大筋でその量が多いことから、肝臓細胞が血液を介して筋組織に浸潤するものと考えられる。この結果、筋細胞の中にダピで染色された核が多数観察することができた。この結果、肝臓からの細胞が筋肥大に関与する可能性が示唆された。また骨髄細胞についても同様の移植実験を行った。その結果、骨髄細胞核も肥大筋繊維の中に観察され、明らかに筋肥大に深く関与する可能性が示唆された。