hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
伝達性プラスミドの膜透過性促進遺伝子の機能とその発現調節機構

(1)遺伝子発現の調節について:FプラスミドのsrnB遺伝子は通常はほとんど発現していないsilent geneである.この遺伝子は, RNAポリメラーゼにリファンピシンが結合することによって発現が誘導され, stable RNAが分解される.この発現機構を明らかにするためにin vitroで合成させた_mRNAの分析を行なった.srnBを含む断片をDNA templateとして転写させると,リファンピシン存在下では,転写産物の大部分は330塩基の長いmRNAであったが,リファンピシン非存在下では,これはほとんど生成せず,大部分は65塩基の短い_mRNAであった.SIマッピングにより,これらの二種のmRNAの転写開始点が一致していることを明らかにした.srnBのプロモーターと構造遺伝子との間にあるstem-loop構造の一部を欠失したDNAを用いて転写させると,リファンピシン非存在下でも長い転写産物が生成した.以上より, srnBの転写は通常はstem-loopにおいて終結しているが,リファンピシンの結合したDNAポリメラーゼはこの部位を通過できることによって遺伝子発現が起きると考えた.(2)遺伝子産物の機能について:srnBや,これと同等のpnd遺伝子産物は,大腸菌の膜透過性を上昇させると推察されるので,次のことを明らかにした.遺伝子発現を誘導したとき,1)ONPGの菌体内への取りこみが増加した.2)高張液中で原形質分離が見られなくなった.3)スフェロプラストが溶菌した.4)菌体内マグネシウムが菌体外へ流出した.以上の結果から,遺伝子産物の機能は細胞質膜に一種の孔を生じさせることで菌体外Mgの流出をもたらし,そのためリボソームRNAはRNaseにより感受性になると考えられる.この孔の形成は同時にペリプラズムに存在するRNaseIの細胞質内への流入をもたらし,これによってstable RNAが分解されると考えた.(1)遺伝子発現の調節について:FプラスミドのsrnB遺伝子は通常はほとんど発現していないsilent geneである.この遺伝子は, RNAポリメラーゼにリファンピシンが結合することによって発現が誘導され, stable RNAが分解される.この発現機構を明らかにするためにin vitroで合成させた_mRNAの分析を行なった.srnBを含む断片をDNA templateとして転写させると,リファンピシン存在下では,転写産物の大部分は330塩基の長いmRNAであったが,リファンピシン非存在下では,これはほとんど生成せず,大部分は65塩基の短い_mRNAであった.SIマッピングにより,これらの二種のmRNAの転写開始点が一致していることを明らかにした.srnBのプロモーターと構造遺伝子との間にあるstem-loop構造の一部を欠失したDNAを用いて転写させると,リファンピシン非存在下でも長い転写産物が生成した.以上より, srnBの転写は通常はstem-loopにおいて終結しているが,リファンピシンの結合したDNAポリメラーゼはこの部位を通過できることによって遺伝子発現が起きると考えた.(2)遺伝子産物の機能について:srnBや,これと同等のpnd遺伝子産物は,大腸菌の膜透過性を上昇させると推察されるので,次のことを明らかにした.遺伝子発現を誘導したとき,1)ONPGの菌体内への取りこみが増加した.2)高張液中で原形質分離が見られなくなった.3)スフェロプラストが溶菌した.4)菌体内マグネシウムが菌体外へ流出した.以上の結果から,遺伝子産物の機能は細胞質膜に一種の孔を生じさせることで菌体外Mgの流出をもたらし,そのためリボソームRNAはRNaseにより感受性になると考えられる.この孔の形成は同時にペリプラズムに存在するRNaseIの細胞質内への流入をもたらし,これによってstable RNAが分解されると考えた.(1)遺伝子発現の調節についてFプラスミドのsrnB遺伝子やRプラスミドのpnd遺伝子は通常はほとんど発現していないsilent geneである。これらの遺伝子は、RNAポリメラーゼにリファンピシンが結合することによって発現が誘導される。この発現機構を明らかにするためにin vitroで合成したmRNAの分析を行なった。srnBを含む550塩基対のDNA断片をtemplateとして、リファンピシン存在下または非存在下で転写を行なわせ、生成した転写産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した(備品として購入した大型ゲル乾燥器を使用)。リファンピシン非存在下では転写産物の大部分は短い(65塩基)mRNA(RNA1)であった。一方、リファンピシン存在下ではRNA1はほとんど生成せず、srnB遺伝子産物をコードするのに充分な長さのmRNA(RNA2:330塩基)が生成した。S1マッピングによると、RNA1とRNA2の転写開始点は一致した。この結果より、srnBの転写は通常はプロモーターと構造遺伝子の間に存在するstem-and-loop構造において減衰しているが、リファンピシンの結合したRNAポリメラーゼはこの部位をread-throughすることによって遺伝子発現を誘導すると考えた。(2)遺伝子産物の機能についてsrnBやpnd遺伝子産物は、大腸菌の膜透過性を上昇させると推察されている。このことについて本年度は次のことを明らかにした。遺伝子発現を誘導したとき、1)ONPGの菌体内への取りこみ量が増加した。また2)菌体内Mgの菌体外への流出がみられた。この膜透過性の上昇は、二次的現象として大腸菌のstableRNAの分解をひきおこす。リボソームRNAは【Mg^(2+)】
多様な色素体分化の総括的理解のための網羅的形態解析(モルフォローム)

ポストゲノムとして種々の網羅的解析手法が提唱・実施されてきているが、さらに新しい視点が必要であると考える。そこで私は、「個々の生体分子の機能を、細胞内微細構造の変化として捉えて可視化し、網羅的に解析する」という視点で、モルフォローム解析を行うことを提案した。昨年度は、野生型シロイヌナズナ個体の様々な組織における色素体観察を行ったため、本年度は主に、以下に示す3つのステージにおいて異常を示す遺伝子破壊株及び形質転換体を材料に用いて、詳細な電子顕微鏡観察を行った。(1)生殖細胞形成過程生殖細胞形成過程で特に注目しているのは、タペータム層の色素体(エライオプラスト)であり、これはポーレンコート形成に必須の成分を供給していると考えられている。そこで、ポーレンコート形成異常を示す変異体、cerl,cer6,hmglなどを用いて観察を進めた結果、超長鎖脂肪酸やイソプレノイド化合物が、エライオプラストの形態形成や脂質成分を花粉壁へ輸送するプロセスにおいて重要な役割を担っていることが明らかとなった。(2)種子胚形成過程発芽後の色素体形成異常を示す変異体はこれまでに多数単離されているが、種子内の色素体観察事例は大変少なかった。そこで、アルビノ、ペールグリーン、斑入りなど、様々な葉緑体異常を示す変異体(主としてapg変異体シリーズ)を材料に、種子発芽前の種子胚形成過程を中心に詳細な電子顕微鏡観察を進めた。その結果、apg7変異体は、エチオプラストから葉緑体への分化過程に異常をきたす変異体であることが判明した。(3)茎頂分裂組織apg7変異体において種子胚及び幼植物体の茎頂を詳細に観察したところ、正常なプロプラスチド形態を示した。このことは、胚の中において既に色素体は多様に分化しており、葉緑体への分化経路も多数存在することを示している。そこで、私は、「個々の生体分子の機能を、細胞内微細構造の変化として捉えて可視化し、網羅的に解析する」という視点で、モルフォローム解析を行うことを提案した。野生型シロイヌナズナ個体において、(1)生殖細胞形成過程、(2)種子発芽過程、(3)茎頂分裂組織の3つのステージにおいて、時空間的に色素体の形態変化を観察した。固定法として、通常のオスミウム酸を使った化学固定と並行して、過マンガン酸カリ固定、及び加圧凍結固定をおこない、詳細な透過電子顕微鏡観察を行った。生殖細胞形成過程で、注目できるイベントとして、タペータム層にだけ存在する色素体(エライオプラスト)の存在と、雄性配偶体の花粉壁やポーレンコート成分(花粉認識・接着に働くといわれる)の形成があげられる。今年度の詳細な観察から、エライオプラスト内包成分の脂質の劇的な蓄積、エライオプラストから小胞子への物質輸送の特殊性などが明らかになった。種子内の色素体観察事例は、思いの外少ない。細胞内へのプロテインボディやリピッドボディの大量蓄積が、観察を困難にしているためである。今回、種々の固定法を検討した結果、過マンガン酸カリ固定を用いた方法が有用であることを見出した。乾燥種子から発芽後数日にわたって、劇的な内部変化と色素体分化をとらえることに成功した。茎頂分裂組織は常に未分化な状態であり、未分化な色素体であるプロプラスチドが生活環を越えて存在していると言われている。しかし、今年度の観察では、生殖細胞中および種子中の茎頂付近などを比較すると、プロプラスチドの大きさなど多種多様であり、幾通りものの色素体分化経路が存在することが明らかとなった。
点字知覚における大脳半球の機能差について

手の神経上向系はほゞ完全に交差している。したがって、右手によって入力された情報は左半球に投影される。視覚や聴覚による実験結果からは、右脳がパタン認知や同時的処理をつかさどり、左脳は言語処理や継時的処理を行なっていることがわかっている。そこで点字を触読する場合に、右手で読んだ方が能率的であるか左手で読んだ方が良いかという問題が論議されている。今回の研究では、優れた点字触読者が左右いずれの手による読みを得意としているかを確かめるとともに、その読み手の触読行動を分析して実際にはどのような点字情報の処理が行われているのかを検討することにした。点字習熟者の点字触読行動をVTRカメラで記録した。その際、、難易度のほゞ等しい3種の読材料を用意し、両手読み,右手読み,左手読みを被験者にさせた。13名の被験者のうち、読速度の優れた者は右手による読みが優位である者であった。したがって、点字読みの場合も視覚と同じく文字の処理が左半球でなされていることが示唆された。次に優れた右手優位の被験者の両手読みの行動を分析したところ4つ方略が行われていることがわかった。1つは左手人差し指による触読で右半球によるものと考えられた。第2の方略は両手人差し指をそろえるもので左右の半球が関係していると考えられた。第3のものは右手による読みでこれは左半球が関係しているもので、これらの被験では長い時間がこの方略についやされた。第4の方略は左右の手指が同時的に別の情報を入力している行動で、触読の場合は2チャンネルの入力の存在が示唆された。
偏極移行(d,p)反応による核反応の研究

本研究は、偏極移行係数という新しい情報量を得ることによって低エネルギ-領域における(d,p)過程について、より詳細な研究を目指すものである。タ-ゲット核は、^<12>C,^<28>Si,^<40>Ca,^<52>Cr,^<90>Zrを用い、典型的な単粒子移行遷移についての実験を行った。測定は通常実験の観測量であるσ,A_y,A_<yy>,A_<xx>-A_<zz>,A_<xz>に加えて2重散乱実験によるP_y,K^y_y,K^y_y_y,K^y_x_x-K^y_z_z,K^y_x_z等の角分布について行った。上記各タ-ゲット核については同じ18MeVの重陽子ビ-ムによる弾性散乱の微分断面積、ベクトル及びテンソル分析能の測定も行い、併せて核反応理論による系統的な解析をすすめた。弾性散乱デ-タの解析からは、重陽子光学ポテンシャルにT_R型テンソル項の寄与の重要性が認められたが、(d,p)過程においては、K^y_y,K^y_x_x-K^y_z_z,K^y_x_z等のテンソル相互作用に関する最も感度の高い観測量によってもT_R-テンソル項の効果は極めて小さく、重陽子D状態からの(d,p)反応振幅への寄与がこの反応におけるほとんどのテンソル的な効果を占めている事が明らかになった。不変振幅法(Invariant Amplotue Method)による偏極量の解析、分類を進め、分析能、偏極移行量の組合せによって特定の核反応情報と結びついた観測量を導出する試みによって、特にテンソル交互作用のみにセンシティブな量を得ることに成功し(d,p)反応への重陽子D状態の寄与について定量的な理解が得られた。るたK^y_yは、元来重陽子D状態の寄与を調べるため最有力な観測量とされてきたが、この研究からは却ってCC効果等の反応メカニズムに関する重要な情報源になっていることが判明した。本研究の1つの目的として、K^z_z,K^x_x,K^y_y,の完全測定があり、そのための装置の改造の準備が進められてきたが、現行のテ-マに集中した実験を優先したため、研究としては先送りとなった。本年度中に実施された主要な研究は,以下の通りである.1.重陽子ビーム偏極モニターの整備とその分析能のキャリブレーション^3He(d,p)反応を利用する重陽子ビーム偏極モニターの分析態値を,明確な偏極量が解っている^<16>O(d,d)^<14>N反応を利用して精密な較正を行い,また使用可能エネルギー領域をEd>14MeVをEd>8MeVに拡大できる様改造した.2.(d,p)反応生成陽子偏極分析器の改造とその分析

能のキャリブレーション超流動状態の液体ヘリウムを利用する陽子偏極ポラリメーターにおいて,散乱陽子検出器を上下左右の4台から軸対線12台に増設し,その測定効率,精度を飛躍に高めることができた.また^<12>CCp,P^^→)^<12>C反応を用いてポラリメーターの分析能値を較正した.3.カマックとパーソナルコンピューターによる新しいデータ取得及び処理システムの製作.カマックを利用した多チャンネルPHA及びこれと結合したパソコンによるデータ集録,処理装置によって,重陽子ビーム偏極状態の高速自動切りかえによる測定が可能になり,かつ核反応からの情報とビーム偏極量情報の即時処理により,較正された偏極観測量が直ちに得られる様になった.4.上記の整備された測定システムにより, ^<28>Si,^<52>Cr,^<12>Cをターゲットにした重陽子弾性散乱, (d,p)反応の断面積,ベクトル,テンソル分析能の測定が行われ,現在その解析が進められている.また,(d,p)反応の偏極移行量については,やはり上記2.の新ポラリメーターを用いて, D^y_,K^y_<xz>,K^y_<xz>などについての精密なデータが得られた.来年度は, C,Zr,Ca等の新ターゲットについて測定を進める予定である.本年度中に実施された主要な研究は、以下の通りである。1.データ処理システムの整備昨年度ほぼ基本的なシステムを開発したカマック、パソコンによる偏極データ取得、処理系は、今年度ソフトの整備が進められ、偏極ビーム検出量系のモニタリング、確認など即時に行われるようになった。4.(d,p)反応からの陽子偏極のx成分を測定可能にするための装置の改造については、ビーム光学的計算を進め基本的な設計を終わり、偏向電磁石中で用いる真空槽を購入した。本年度の主要な研究計画としては、K^X_X、K^Y_Y、K^Z_Zの測定によって(d,p)反応断面積のスピン反転成分と非反転成分の分離測定を実施する予定であったが、タンデム加速器が不調となり18MeVでの実験が全くできなかったため計画は先送りとして、昨年度までに得られた実験デ-タの解析を進め、テンソル相互作用のみに依存性をもつ新しい観測量を導入しその性質を調べた。また、偏極測定デ-タ収集回路系をさらに完備したものに改造した。新システムは、イオン源、スピンフィルタ-、陽子分析電磁石などの制御をCAMA系に取入れ、コンピュ-タ-制御下での自動測定、モニタ-システムを備えたものになった。(d,p)偏極移行の研究は、今後もこの整備した実験施設を活用して、^<24>Mg等の新しいタ-ゲットについての研究や上記のP_X成分測定の実現など、より幅広い研究へと発展させる予定である。
フォノン援用近接場光エッチングを用いたダイヤモンドの発光制御

ダイヤモンド中の窒素欠陥(Nitrogen vacancy: NV)中心を用いることで、微弱な磁気センサーとしての応用が期待されている。しかしながらダイヤモンドは高硬度のため表面処理が困難であり、高屈折率であることから光の取出しが難しい。そのため、発光体であるNV中心がダイヤモンド表面に存在すると発光特性が劣化するという欠点があった。申請者が開発した近接場光エッチングによりNVの発光性能を劣化させず、ダイヤモンド表面を原子レベルで平滑化する技術を開発した。本課題では、近接場光エッチングをNV含有ナノダイヤモンドに対してエッチングすることでNVの発光効率を13.5ば向上させることに成功した。フォノン援用近接場光エッチングの技術は、平面基板のみならず、凹凸レンズやグレーティング構造の側面の平坦化を実証済である。そこで、本技術を粒径が50nm以下のナノダイヤモンドに対して適用し、発光特性改善の評価を行った。ナノダイヤモンドには窒素欠陥中心(NV中心)を有するものを用いた。NV中心を有するダイヤモンドは可視域での蛍光を示すが、破砕により作製されるため表面に非発光中心となる欠陥が多く存在し、本来の発光特性が得られない。近接場エッチングには波長213nm、325nmおよび405nmのCWレーザを用いた。発光特性の評価にはカソードルミネッセンス評価装置(CL装置)を利用した。エッチングの前および後のCLスペクトルをそれぞれ評価したところ、近接場光エッチングによって、発光強度が大幅に増大している結果が得られた。この結果は近接場光エッチングにより表面の非発光中心が選択的に削除されたことを示す有用な結果であるといえる。ダイヤモンド中の窒素欠陥(Nitrogen vacancy: NV)中心を用いることで、微弱な磁気センサーが実現するなど広い応用が期待される。しかしながら、ダイヤモンドは高い硬度のため、表面加工が難しく、高い屈折率であることから、光の取り出しが難しい。そのため、発光中心であるNV中心がダイヤモンド表面に存在すると発光特性が劣化するという欠点があった。そこで、申請者が開発した近接場光エッチングという手法によってNVの発光性能を劣化させずに、ダイヤモンド表面を平滑化する技術を開発した。本プロジェクトでは、近接場光エッチングをNVを有するナノダイヤモンドに対してエッチングすることで、NVの発光効率を13.5倍向上させることに成功した。エッチング用の波長として複数の光源(213nm、325nm、405nm)を利用することで、それぞれの光源における最適エッチング時間を明らかにすることに成功した。ナノテクノロジー近接場光エッチング中にリアルタイムで発光特性評価可能なシステムを構築することでさらなる発光特性改善を目指す。また単一のナノダイヤモンドのみならず複数個のナノダイヤモンドは配列させることで、さらなる発光強度の増大を実現させる。購入を予定した備品の仕様を見直すことで、より適当な製品を購入し金額が変わったため。繰越金額を利用して、購入するナノダイヤの表面状態の異なるものを購入する予定である。
東日本におけるクルーズ観光活性化のための新たな寄港地選定と誘致方策の検討

(1)データに基づく寄港魅力度の算定統計データや地理情報等を基に,当該港湾・漁港への陸路でのアクセス不便性を示す「アクセス指数」に,当該港湾・漁港の付近に存在する観光資源の多寡を示す「観光地指数」を乗じ,北海道および東日本の港湾・漁港ごとに「寄港魅力度」を算定した。(2)寄港実績に優れた港湾等の実態調査クルーズ船の受け入れに実績のある港や,大型クルーズ船の誘致を目指して専用ふ頭の整備等を実施・計画している港などを訪れ,港湾管理者,自治体担当者,地元の観光業者等を対象としたヒアリング調査を実施した。なお,本年度に訪問した地方自治体等は次の通りである。釧路市役所水産港湾空港部港湾空港振興課,釧路港利用促進協議会釧路クルーズ振興部会,根室市役所水産経済部港湾課,羅臼町役場産業創生課,網走市役所建設港湾部港湾課(以上2018年7月に実施),舞鶴市役所みなと振興・国際交流課,日南市役所観光・スポーツ課クルーズ振興室,日向市役所商工観光部観光交流課,宇和島市役所建設部建設課および産業経済部商工観光課,宇和島市観光物産協会(以上2018年11月に実施),別府市役所観光戦略部観光課,佐世保市役所港湾部みなと振興・管理課および観光商工部観光課,長崎市役所文化観光部観光推進課、長崎港クルーズ客船受入委員会(以上2018年12月に実施)(3)中国・香港から大量に日本を訪れている大型クルーズ船の実態を把握するため,深せんで開催された第13回中国クルーズ産業発展大会(CCS13)に参加するとともに,香港を母港とするゲンティン社の大型クルーズ客船World Dream号に乗船し,多様な船内アクティビティなどを体験した。また,ゲンティン本社を訪問して日本を寄港地とするクルーズ観光の現状と将来,日本の受入港湾の改善すべき点等に関して意見を収集し,拠点としている啓徳クルーズターミナルを視察した。研究計画調書に記載した平成30年度の研究計画では,1データに基づく寄港魅力度の算定,2寄港実績に優れた港湾等の実態調査の2点を行う計画であった。1については,クルーズ船の寄港実績の少ない東日本(北海道,東北地方,北陸地方)の沿岸に整備された港湾および漁港を対象として,統計データや地理情報等に基づきを基に,港湾・漁港ごとに「寄港魅力度」を算定することができた。また,2については,既に多くのクルーズ船を受け入れてきた実績のある港など計10港程度を訪れ,港湾管理者,自治体担当者,地元の観光業者等を対象としたヒアリング調査を行う計画であったが,これについても,釧路港,根室港,羅臼漁港,網走港,舞鶴港,油津港,細島港,宇和島港,別府港,佐世保港,長崎港の計11港での調査を実施できた。さらに,日本を訪れている大型クルーズ船の実態を把握するため,深せんで開催された第13回中国クルーズ産業発展大会を視察するとともに,香港を母港とする大型客船にも体験乗船し,その実態を把握できた。また,香港の船社,ゲンティン本社を訪問し,日本を寄港地とするクルーズ観光の現状と将来,日本の受入港湾の改善すべき点等に関して意見を交換することができた。以上,当初の計画を上回る調査活動を行い,また,それに応じた成果を得ることができたので上記の自己評価とした。本研究の初年度にあたる平成30年度は,当初の予定通りに研究計画を遂行できたので,平成31年度も研究計画調書に従って次の通り調査研究を推進していく予定である。1.クルーズ船を受け入れてきた実績のある港のうち,本土にある主要港湾については,平成30年度に計11港を訪れ,港湾管理者,自治体担当者,地元の観光業者等を対象としたインタビュー調査を実施したが,平成31年度は,離島にある港湾を対象として,同様なヒアリング調査を行う予定である。調査内容は,平成30年度調査とほぼ同様であるが,特に大きな埠頭を持たず,また,下船後の観光が島内に限定されるという制約が,クルーズ観光に及ぼす影響を把握する。2.平成30年度に実施した寄港魅力度の算定結果に基づき得られた東日本(北海道,東北地方,北陸地方)の「寄港候補地」10か所程度を対象として,それぞれの地元自治体,港湾管理者,漁協などを訪問してヒアリング調査を実施する。調査内容は,クルーズ船の受入可能性,誘致に対する地元支援の有無,寄港地となった場合の船社や国・県等への要望,泊地に適する海域の有無,沿岸の漁業実態,定置網や航路の現状,上陸後に使用する道路交通網の現状などを聞く。3.現在,クルーズ客船を運航している日本船社3社,長距離の大型カーフェリーを運航している日本船社計10社程度を対象としてインタビュー調査を実施する。調査内容は日本を周遊するクルーズ事業への参入意向,東日本における新たな寄港地開発を要望したい場所,寄港地や停泊地に相応しい海域等の条件,上陸地点となる港湾や漁港に求めたい条件,寄港地となる自治体・港湾管理者・漁協等への要望等である。

釧路市役所水産港湾空港部港湾空港振興課,釧路港利用促進協議会釧路クルーズ振興部会,根室市役所水産経済部港湾課,羅臼町役場産業創生課,網走市役所建設港湾部港湾課(以上2018年7月に実施),舞鶴市役所みなと振興・国際交流課,日南市役所観光・スポーツ課クルーズ振興室,日向市役所商工観光部観光交流課,宇和島市役所建設部建設課および産業経済部商工観光課,宇和島市観光物産協会(以上2018年11月に実施),別府市役所観光戦略部観光課,佐世保市役所港湾部みなと振興・管理課および観光商工部観光課,長崎市役所文化観光部観光推進課、長崎港クルーズ客船受入委員会(以上2018年12月に実施)(3)中国・香港から大量に日本を訪れている大型クルーズ船の実態を把握するため,深せんで開催された第13回中国クルーズ産業発展大会(CCS13)に参加するとともに,香港を母港とするゲンティン社の大型クルーズ客船World Dream号に乗船し,多様な船内アクティビティなどを体験した。また,ゲンティン本社を訪問して日本を寄港地とするクルーズ観光の現状と将来,日本の受入港湾の改善すべき点等に関して意見を収集し,拠点としている啓徳クルーズターミナルを視察した。研究計画調書に記載した平成30年度の研究計画では,1データに基づく寄港魅力度の算定,2寄港実績に優れた港湾等の実態調査の2点を行う計画であった。1については,クルーズ船の寄港実績の少ない東日本(北海道,東北地方,北陸地方)の沿岸に整備された港湾および漁港を対象として,統計データや地理情報等に基づきを基に,港湾・漁港ごとに「寄港魅力度」を算定することができた。また,2については,既に多くのクルーズ船を受け入れてきた実績のある港など計10港程度を訪れ,港湾管理者,自治体担当者,地元の観光業者等を対象としたヒアリング調査を行う計画であったが,これについても,釧路港,根室港,羅臼漁港,網走港,舞鶴港,油津港,細島港,宇和島港,別府港,佐世保港,長崎港の計11港での調査を実施できた。さらに,日本を訪れている大型クルーズ船の実態を把握するため,深せんで開催された第13回中国クルーズ産業発展大会を視察するとともに,香港を母港とする大型客船にも体験乗船し,その実態を把握できた。また,香港の船社,ゲンティン本社を訪問し,日本を寄港地とするクルーズ観光の現状と将来,日本の受入港湾の改善すべき点等に関して意見を交換することができた。以上,当初の計画を上回る調査活動を行い,また,それに応じた成果を得ることができたので上記の自己評価とした。本研究の初年度にあたる平成30年度は,当初の予定通りに研究計画を遂行できたので,平成31年度も研究計画調書に従って次の通り調査研究を推進していく予定である。1.クルーズ船を受け入れてきた実績のある港のうち,本土にある主要港湾については,平成30年度に計11港を訪れ,港湾管理者,自治体担当者,地元の観光業者等を対象としたインタビュー調査を実施したが,平成31年度は,離島にある港湾を対象として,同様なヒアリング調査を行う予定である。調査内容は,平成30年度調査とほぼ同様であるが,特に大きな埠頭を持たず,また,下船後の観光が島内に限定されるという制約が,クルーズ観光に及ぼす影響を把握する。
35型アデノウイルスベクターシステムの開発

本年度は35型アデノウイルスベクターシステムの開発研究として以下の結果を得た。1.研究代表者らはin vitroライゲーションに基づいたプラスミド構築を利用した簡便なアデノウイルスベクター作製法を開発済みである。そこで、本原理を35型アデノウイルスベクターの作製にも応用し、誰でも簡便に35型アデノウイルスベクターの作製が可能となるシステムの開発に成功した。2. 35型アデノウイルスベクターの臨床応用に向けて、35型アデノウイルスベクターのin vivo遺伝子導入特性を明らかにすることは必要不可欠と思われるが、CD46がマウスで発現していないためマウスをモデル動物として使用することは不可能である。そこで本研究では、CD46安定発現細胞およびCD46TGマウスを用いて35型アデノウイルスベクターのin vitroおよびin vivo遺伝子導入特性について検討した。その結果、35型アデノウイルスベクターがin vitroおよびin vivo遺伝子導入において、CD46を認識し細胞に感染することが確認された。しかしながら、ヒトCD46TGマウスへの全身投与によるin vivo遺伝子導入効率は5型アデノウイルスベクターと比べると依然低く、今後、第2受容体の同定などさらなる検討が必要であると思われた。3. 35型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入活性を5型アデノウイルスに対する抗体存在下で検討したところ、遺伝子導入活性の減弱は認めらなかった。成人のほとんどは5型アデノウイルスに対する抗体を有しているが、35型アデノウイルスに対する抗体保持率は低いこと等も考え合わせると、35型アデノウイルスベクターはアデノウイルス抗体を保持しているヒトにおいても効果が期待できること、5型アデノウイルスベクター投与後の2度目のベクター投与に利用できることが明らかとなった。現在汎用されているアデノウイルスベクターはSubgroup Cに属する5型アデノウイルスを基本骨格としているが、Coxsakievirus-adenovirus receptor (CAR)を認識して感染するため、CAR陽性細胞では高い遺伝子発現を示すものの、CAR陰性細胞での遺伝子発現効率は低い。この問題点を克服するため、CAR以外の分子を認識して感染する、Subgroup Bに属する35型アデノウイルスを基本骨格とするアデノウイルスベクターを開発した。35型アデノウイルスベクターの遺伝子導入活性を5型アデノウイルスベクターと比較したところ、35型アデノウイルスベクターはCAR陰性細胞を含む多くのヒト由来細胞において高い遺伝子導入活性を示した。特に、5型アデノウイルスベクターで遺伝子導入が困難なヒトCD34陽性細胞に対しても高い遺伝子導入効率を示すことが明らかになった。次に、35型アデノウイルスベクターのin vivo(マウス)における遺伝子導入特性を検討するため、ルシフェラーゼ発現35型アデノウイルスベクターをマウスに尾静脈内投与し、各臓器でのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、各臓器(肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓)で低いルシフェラーゼ活性しか示さなかった。この原因について検討するため、尾静脈内投与後のアデノウイルスベクターの血中滞留性および臓器分布をSlot-blotおよびsemi-quantitative PCRを用いて検討した。その結果、35型アデノウイルスベクターの血中半減期は数分であること、ベクターは肝臓の非実質細胞に主に取り込まれ分解されていることが判明した。なお、本研究進行中に、35型アデノウイルスの受容体がCD46であることが報告されたが、上記結果は各細胞、組織におけるCD46の発現の有無で解釈できるものであった。
実験的アルコール性肝障害におけるアポトーシスの発現について

総カロリーの36%をエタノールに置換した液体飼料に、アルコール脱水素酵素阻害剤であるピラゾールを添加して、12週間ラットを飼育すると、血清トランスアミナーゼ活性が上昇し、中心静脈周囲の肝細胞に著明な風船化が認められ、ヒトのアルコール性肝炎に類似の組織所見が認められた。上述のアルコール・ピラゾール肝炎では、1)Nick end labeling法による陽性細胞は対象群より明らかに多く認められた。しかし、すべての風船化肝細胞が染色されたわけではなく、一方、膨化を認めない肝細胞にも陽性所見が認められた。2)肝組織より抽出したDNAのfragmentationが確認された。3)抗Fas-lgM抗体を用いたFas抗原についての検索では、肝細胞全体が染色され、この実験モデルにおける特異的染色所見が得られなかった。また、Le^Y抗原については、今回用いた抗体では陽性所見は認められなかった。以上のごとく、ラットのアルコール・ピラゾール肝炎では、明瞭にアポトーシスの発現していることが確認された。次いで、同モデルの肝組織について、cytokeratinの変化について検討すると、1)抗cytokeratin抗体を用いた免疫組織化学とnick end labeling法の二重染色では、膨化した肝細胞の多くについて、両者の陽性所見が認められた。しかし、一部の肝細胞では、抗cytokeratin抗体に対してのみ陽性所見が認められた。2)0.5% Triton X-100の処理によって不溶性のcytokeratin蛋白を抽出し、SDS-PAGEによって泳動されないcytokeratin、すなわちtransglutaminaseによって架橋されたcytokeratinの出現状況について、抗cytokeratin抗体を用いたimmunoblotting法によって検索すると、アルコール・ピラゾール肝炎では、対照群に比較して、明らかに強い陽性所見が認められた。したがって、apoptosisの発現過程で誘導・活性化されるtransglutaminaseによってcytokeratinが架橋され、detergentに対して水溶性のcytokeratinになるものと考えられ、アルコール性肝炎の組織学的特徴であるマロリ-体の形成機序との関連が示唆された。Wistar系雄性ラットを総カロリーの36%のエタノール含有液体試料にアルコール脱水素酵素阻害剤であるピラゾールを添加して12週間飼育すると、血清トランスアミナーゼ活性が上昇し、中心静脈周囲の肝細胞に著明な風船化が認められ、ヒトのアルコール性肝炎に類似の組織所見であった。Nick end labeling法による陽性細胞は対照群より明らかに多く認められたが、風船化肝細胞のすべてが染色されたわけではなく、ほとど膨化を認めない肝細胞にも陽性所見が認められた。また、肝組織より抽出したDNAのfragmentationについても対照群より多い傾向が認められた。抗Fas-IgM抗体を用いたFas抗原の検索では、肝細胞全体が染色され、特異的染色所見が得られなかった。なお、Le^v抗原については、今回用いた抗体では陽性所見は認められなかった。以上のごとく、ラットのアルコール・ピラゾール肝炎では、アポトーシスが明瞭に発現しており、病態との関連性が推測された。
光および弾性波励起による磁化の超高速制御とその応用

磁気パルスによる磁化反転時間限界2ピコ秒打破を目指し、フェムト秒光パルスによる磁化操作の研究を行った。強磁性半導体の磁化の光励起才差運動がMnの光イオン化による磁気異方性変化によること見出し、サブピコ秒間隔光パルス対による才差運動の非線形振幅制御を達成した。弱い光パルスで磁化才差運動が生ずるCo-Pd積層薄膜を発見し、スピン光デバイスの候補材料を得た。磁性薄膜と光ファイバを複合化した導波路デバイスを試作し、導波光偏波変調が薄膜の磁化変調位置と導波モードによって選択可能であることを見出し、スピン光デバイスの基礎を拓いた。スピン発光ダイオードを試作し、室温で円偏光切替え100 kHzを達成した。10-20μm×100μm程度の寸法に加工した(Ga,Mn)Asマイクロバーにおいて、光誘起才差運動の周波数が大幅に低下することが明らかとなった。新規な合成磁石との位置づけでM/(Ga,Mn)As(M=Fe,Pt,Ni,MnAs)ヘテロ構造試料を真空一貫の手法で作製し、界面を横切るスピン流の効果や特殊な光励起効果の有無の研究を進めた。強磁性半導体を光励起するとスピン流が発生するとの仮説を提唱し、光誘起スピン流の実証と制御をめざし、隣接金属層が磁化の光誘起才差運動に与える動的影響を調べる目的でPt/(Ga,Mn)AsならびにFe/(Ga,Mn)As構造を取り上げた。前者において才差運動減衰の増大がスピンポンピング効果できれいに説明できることから、両層間で角運動量の流れ(スピン流)があることを確立した。後者においては、才差運動の減衰が外部磁場に依存して大きく変化する現象を世界に先駆けて見出した。具体的には、両層の磁化が平行だと減衰は最小で、直交だと最大になるという現象である。すなわち、直交状態で生ずる界面磁壁でスピン流の消費が最大になる。これを巨大磁気ダンピングと名づけた。弾性波誘起磁性のための実験装置、すなわち、ひずみ印加可能な試料台を作製した。熱収縮率の大きな銅製微小試料ホルダーでGaMnAs試料を固定した後で全体を冷却し、(Ga,Mn)As薄膜に一軸性圧縮ひずみを導入することのできる試料台である。副次的に見出した事実として、磁化の光誘起才差運動は金属的伝導特性を有する(Ga,Mn)Asにおいてのみ発生することを見出した。磁性体金属に関する研究では、低強度の光パルス励起によるGdFe試料での光誘起才差運動のコヒーレント制御をNHK放送技術研究所と共同で達成することができた。あわせて、石英溶融ガラス光ファイバーと試料が一体となった構造の作製の第一段階として、電通大レーザー研究センターと共同で光ファイバーのクラッド部分の選択的除去法の研究に着手した。(Ga,Mn)As薄膜の光誘起才差運動の研究では2つの新知見が得られた。第一に、磁化ベクトルが面内に配向した薄膜の示す磁気光学効果が、ベクトルの方位に依存して変化する屈折率すなわち磁気複屈折による起因することを世界に先駆けて明らかにすることができた。この結論は、磁気特性がほぼ同じ一連の試料について、反射光偏光面の回転角の(Ga,Mn)As層厚依存性を注意深く調べた実験により得られた。第二に、(Ga,Mn)Asにおける磁化ダイナミクスとひずみの関係を明らかにすることができた。具体的には、試料をピエゾアクチュエータ(PA)により伸長・収縮させると、才差運動の振動周波数が増加・減少することを見出した。ひずみ1%に対する有効磁場の変化量は0.26Teslaであり、この結果は、弾性波励起による磁化ベクトル変調実験の土台となる。一方、室温における磁化の光制御とスピン光メモリーへの展開については、室温光制御に適した素材に関する新知見が1点、光導波路と磁性体金属薄膜の光結合に関する新知見が1点得られた。まず、前者に関して、昨年度導入したDCマグネトロンスパッタによりシリコン基板上に作製したCo/Pd多層膜において、磁化の光誘起才差運動が、室温で、しかも、従来の実験例より二桁低い光強度でおこることを見出した。界面磁性が関連した現象と推測している。後者の光結合に関する背景として、磁気光学効果を介して光導波路内の偏光を制御できれば光回路にメモリー機能を付加できると期待され、光入射角度と磁気光学効果との関連を精密に知る必要がある。本年度は、溶融石英ガラスプリズム上にGdFe薄膜を直接堆積した試料についてこのことを調べた結果、入射角度78°、すなわちプリュースター条件近傍で磁気光学効果が増強されること、さらに、水平に近い入射角(84°)でも比較的大きな磁気光学信号が得られることが明らかとなった。(1)Co/Pd多層膜構造の作製と評価スピンー軌道相互作用な顕著なCo/Pd多層膜構造に着目し、試料作製から光励起実験までを一貫して進めた結果、弱励起領域(1μJ/cm2以下)で光誘起強磁性共鳴が起こることを世界に先駆けて見出した。磁性金属で非熱的過程が存在することを強く示唆する結果である。成果発表し第60回応物講演会(神奈工大13年3月27日)でポスター賞を受賞した。

(2)強磁性半導体(Ga,Mn)Asにおける非熱的過程の検証とテラヘルツ領域へのアクセス強磁性共鳴が超高速消磁と直接関係ないことを示す実験データを世界に先駆けて得た。金属多層膜とは対照的である。具体的には、光励起から磁化才差運動開始までおよそ29 psの遅れが生じていることを新たに発見した。光励起された電子系はただちにスピン系に影響を及ぼさないこと、および、光で励起される電子系と磁化を担う電子系が同一でないことをも示唆している。(3)光学顕微鏡の感度向上と空間情報一括取得に関する取り組み非常に良く平行化された光束(コリメート光)を試料面に対して常に一定角度で入射することで極めて信頼性の高い観測系を構築することに成功した。このような観測系を用いて、(Ga,Mn)As面内磁化膜の磁気光学効果の起源が磁気線二色性でなく磁気複屈折であることを実証した。(4)室温における磁化のコヒーレント制御とスピン光メモリーの試作励起光強度18 microJ/cm2の中励起強度の第一光パルスによりGdFe試料中で強磁性共鳴を誘起し、第二光パルスにより才差運動の位相に応じた振幅の増大と抑制を行えること、すなわち光誘起磁化才差運動のコヒーレント制御を実証した。光ファイバーのコア部分に隣接して磁性体薄膜を堆積させた構造体を設定し、作製と評価を進めた結果、光ファイバーコア部にGdFe薄膜を堆積する基本的な作製工程を確立した。(1) Co/Pd多層膜構造層厚の異なる様々な試料の磁化を系統的かつ精密に調べ、界面磁性の存在を明確化することができた。光励起磁化才差運動の発現機構として、励起電子系からスピン系への超高速エネルギー流入効率がPd層の層厚低下とともに増大する実験データを示し論文化した。(2)光励起磁化才差運動発現の非熱的過程の検証磁化才差運動開始までの遅れ(いわゆる孵化時間)と励起光条件(波長と強度)との因果関係を系統的に明らかにし短報として出版した。熱的過程と非熱的過程に関して行ったオランダグループとの共同研究を論文化した。(3) (Ga,Mn)Asにおけるテラヘルツ領域光制御1ピコ秒程度の時間領域で第2励起光パルスを試料に照射した場合に起こりうる効果をポンプ・プローブ法を駆使して実験的に調べた。その結果、孵化時間内に第2励起パルスを試料に照射すると、才差運動開始が遅延することを明らかにした。(4)スピン光メモリーの試作高屈折率ガラス基板上にSiO2とGdFe一層ずつ堆積させた構造を作製し、SiO2から染出す光による磁気光学効果測定用装置を自作した。加えて、斜め入射配置におけるCo/Pd多層膜の光励起磁化才差運動を研究し入射角度80度以上においても才差運動励起できることを世界に先駆けて明らかにした。(5)弾性励起第二世代のCCD顕微鏡構築を完了し、(Ga,Mn)As薄膜の磁気ドメイン観察および光励起磁化反転実験を遂行した。加えて、新規に雇用した研究員と協働して第三世代のCCD顕微鏡の構築を遂行し、極微小光励起による磁化才差運動の発現に成功した(第62回応用物理学会春季学術講演会にて2015年3月11日発表)。(6)光スピントロニクスデバイス円偏光切替型スピンLEDの作製と実証実験、ならびに、結晶性アルミナトンネル層の作製に関する実験結果を論文化した。光パルス励起によって引き起こされる磁化の非平衡状態に関する研究では,第一に、新規光磁石素材Co/Pd極薄多層膜構造の弱励起強磁性共鳴の実験データを詳しく解析した結果,Coの磁気異方性だけでなくCo/Pd界面磁気異方性が光励起によってクエンチングする可能性が濃厚であるとの結論を得た.
潰瘍性大腸炎におけるＩｇＧ形質細胞の病態関与の解明と新規治療法の開発

UC患者の腸管粘膜局所にIgG産生形質細胞が増加していることは臨床病理学的特徴の一つとして知られている。我々は潰瘍性大腸炎患者腸管粘膜に浸潤しているIgG産生形質細胞は通常腸管粘膜に存在するIgA産生形質細胞とは異なりCXCL12-CXCR4 axisによって腸管に浸潤していること、IgG産生形質細胞は免疫複合体の産生により腸管マクロファージを刺激し潰瘍性大腸炎の病態形成に関与していることを世界で初めて明らかにした。Fcg受容体を介した免疫複合体からの刺激は細菌刺激による経路とは独立した因子として炎症惹起に関与していることも明らかとなり、新たな創薬の標的となりうると考えられた。患者数は増加し13万人を超えた。しかし原因はいまだ解明されておらず病態解明とそれに基づいた治療法の開発が急務である。UC患者の腸管粘膜局所にIgG産生形質細胞が増加していることは臨床病理学的特徴の一つとして知られているが、その病態への関与は未解明のままであった。我々はこの形質細胞浸潤が病態に関与していることを明らかにするために研究を開始した。我々は潰瘍性大腸炎患者腸管粘膜に浸潤しているIgG産生形質細胞は通常腸管粘膜に存在するIgA産生形質細胞とは異なりCXCL12-CXCR4 axisによって腸管に浸潤していること、IgG産生形質細胞は免疫複合体の産生により腸管マクロファージを刺激し潰瘍性大腸炎の病態形成に関与していることを世界で初めて明らかにした(Uo M, Hisamatsu T, et al. Gut. 2012 Sep 26.)。現在、Fcg受容体経路を阻害する低分子化合物のスクリーニングを開始した。またより詳細な病態を解析し、治療薬候補分子のin vivoでの評価を可能とするために慢性DSS腸炎モデル、腸管特異的CXCL12強制発現マウスを用いてIgG産生形質細胞による潰瘍性大腸炎類似腸炎モデルの確立を試みている。Fc&#61543;受容体を介した免疫複合体からの刺激は細菌刺激による経路とは独立した因子として炎症惹起に関与していることも明らかとなり、新たな創薬の標的となりうると考えられた。現在、Fc&#61543;受容体経路を阻害する低分子化合物のスクリーニングを開始した。

Fcg受容体を介した免疫複合体からの刺激は細菌刺激による経路とは独立した因子として炎症惹起に関与していることも明らかとなり、新たな創薬の標的となりうると考えられた。現在、Fcg受容体経路を阻害する低分子化合物のスクリーニングを開始した。またより詳細な病態を解析し、治療薬候補分子のin vivoでの評価を可能とするために慢性DSS腸炎モデル、腸管特異的CXCL12強制発現マウスを用いてIgG産生形質細胞による潰瘍性大腸炎類似腸炎モデルの確立を試みている。このなかで慢性DSS腸炎モデルにおいては急性腸炎モデルでは認められないIgG産生形質細胞が腸管粘膜に増加することを見出した。消化器内科学。特に炎症性腸疾患の病態解明と治療。粘膜免疫学現在までに潰瘍性大腸炎患者の腸管IgG産生形質細胞がユニークなケモカインシステムを用いて腸管に浸潤していること、さらにIgG免疫複合体が腸管マクロファージのFcg受容体を刺激しサイトカイン産生を増強させていることを明らかにした。潰瘍性大腸炎のIgG産生形質細胞浸潤は古くから教科書に記載されるほどの特徴的な病理学的所見であったが、今回我々の研究によってその浸潤メカニズムと病態への関与が証明された。特にヒトサンプルを用いて証明されたことが重要であり潰瘍性大腸炎の病態解明における大きな進歩である。この成果はGut誌に掲載され、全米消化器病学会や国際粘膜免疫学会を含む国内外の学会や研究会などで発表された。また、IgG形質細胞を標的とした治療薬の開発にも着手しており、すでにFcg受容体シグナルを阻害する候補分子としてSyk阻害剤がFcg受容体を介した炎症性サイトカイン産生を抑制することを確認した。IgG産生形質細胞浸潤を特徴としたマウス腸炎モデルの確立については腸管上皮細胞特異的CXCL12強制発現マウスを作成した。同マウスに慢性DSS腸炎を誘発するとその一部にIgG産生形質細胞が浸潤した慢性大腸炎を起こすことを見出している。現在までに潰瘍性大腸炎患者の腸管IgG産生形質細胞がユニークなケモカインシステムを用いて腸管に浸潤していること、さらにIgG免疫複合体が腸管マクロファージのFc&#61543;受容体を刺激しサイトカイン産生を増強させていることを明らかにした。また、IgG形質細胞を標的とした治療薬の開発にも着手しており、すでにFc&#61543;受容体シグナルを阻害する候補分子をいくつか見出している。最終的に治療薬の候補となる分子の有効性確認にはマウス腸炎モデルを用いたin vivo実験が必須であるが、IgG産生形質細胞浸潤を特徴としたマウス腸炎モデルは確立されていない。そこで我々は新たなマウスモデルの作成を開始した。すでに野生型マウスにおいて慢性DSS腸炎を誘発すると経過とともにIgG産生形質細胞浸潤がおこることを見出した。そこで潰瘍性大腸炎に類似したマウスモデルとして腸管上皮細胞特異的CXCL12強制発現マウスを作成し慢性DSS腸炎を誘発し解析を開始している。また慢性腸炎におけるCXCL12の発現変化を可視化するため、京都大学長澤研究室よりCXCL12-GFPマウスを入手し研究を開始した。
神経冠誘導分化の単クローン抗体による研究

神経冠の起源は形態的には神経板の両縁部に朔る事ができる。ところで神経板は嚢胚期外胚葉のうち中軸中胚葉に裏打ちされた部分から誘導される事(中軸中胚葉の作用を逃れた部分は表皮組織に分化する)、又神経冠については移殖した中軸中胚葉による二次神経誘導の実験から神経板の誘導に伴い誘導される事が知られている。アフリカツメガエルを用いた従来の研究で神経冠由来色素細胞に対する単クローン抗体(NC1)を得たが、さらに分化神経細胞に高い特異性を有す単クローン抗体(N1)が得られたので、本研究ではこれら単クローン抗体を利用して上記神経誘導過程をin vitro胚細胞培養系で解析した。方法(1)ツメガエル初期嚢胚から各部域を1030片切り出す。(2)Ca,Mg-frec溶液中で細胞を解離させ部域別細胞プールを調製する。(3)各プールから細胞を一定数ずつとってマイクロウエルに分注し単独或は部域間混合培養を行う。(4)一定時間培養後固定し特異的単クローン抗体(抗表皮抗体E3,抗神経抗体N1,抗色素胞抗体NC1)を用いた間接蛍光抗体法によリマイクロウエル中で分化した細胞を同定する。結果(1)予定外胚葉細胞の培養では表皮細胞が分化し、しかもその発生の時間経過はin situでのそれとよく一致した。(2)予定外胚葉細胞と予定背側中胚葉細胞(中軸中胚葉の前駆胚細胞)とを混合培養すると、表皮細胞の分化は著明に抑制されると共に、神経細胞が分化してきた。又いくつかの実験例では色素細胞の分化も見出された。対照として予定腹側中胚葉細胞と混合培養した場合には表皮細胞が分化し、神経細胞の分化は見られなかった。ただ若干例で色素細胞の分化がみとめられた。(3)予定外胚葉,背側中胚葉細胞の混合培養系にみられた表皮細胞分化の抑制、神経細胞,色素細胞分化促進の程度はいずれの場合も、ウエルに加えた予定背側中胚葉の数に強く依存した。
シアノバクテリアの宿主非特異的共生能の機構と進化

窒素固定性シアノバクテリアー植物共生系における宿主の特異性/非特異性を調査するため、自由性・共生性由来のNostoc属単離株を材料とした共生系を室内実験で再現し、細胞分化能および共生能を網羅的に調査した。一方で、Nostoc属シアノバクテリアの分子系統解析を行い、共生実験の結果と統合することで、シアノバクテリアー植物宿主間の宿主多様性・特異性の機構と進化過程について考察した。シアノバクテリアの共生能の実験的検証と系統進化の解明にむけ、以下の研究を行った:1)共生シアノバクテリアの単離と宿主植物の培養・共生実験系の確立野外における共生種を実験材料とするため、シアノバクテリアを共生者とするコケ植物・被子植物からシアノバクテリアの単離を行い、無菌化した。また、多様な宿主植物との共生関係を検証する実験系を確立するため、コケ植物、被子植物を培養し、共生性・自由生活性Nostoc属シアノバクテリアとの共培養を行い共生能を確認した。なお、被子植物Gunneraでは培養が安定せず、十分な数の植物体を実験に供することができなかったため、条件の最適化が必要である。2)シアノバクテリアの系統進化の解明と共生の分子機構の解析シアノバクテリアの系統進化を明らかにするため、共生性・自由生活性の10株と1)で単離された株を材料に、ゲノムDNAを抽出し、16SrRNAおよび細胞分化制御遺伝子をPCRで増幅、クローニングし、塩基配列を決定した。得られた配列を遺伝子データベースから収集した既知配列と合わせ、近隣接合法、最節約法、最尤法で分子系統樹を作成した。一方で、共生に必須な分化細胞形成能を分子レベルで解析するため、上記のシアノバクテリア株を材料に、研究代表者らが同定した形態形成制御遺伝子の相同遺伝子のPCRによる増幅を試みた。相同遺伝子の存在が明らかになった株については塩基配列を決定し、既知配列との比較、保存部位の特定等を進めた。シアノバクテリア-植物共生系における宿主の多様性・非特異性の機構と進化の解明をめざし、以下の研究を行った:1)Nostoc属の宿主植物の多様性・特異性の実験的検証シアノバクテリアと宿主植物との共生関係を検証するため、Nostoc属の単離培養株を材料に実験環境下での共生実験を行った。共生菌としては系統解析に用いた12株のうち10株を用い、宿主コケ植物Blasiaと共培養(n=2-4)し、細胞分化の状態と頻度および共生コロニーの生成率を顕微鏡を用いて経時的に観察し、定量的データを収集した。その結果、土壌や湖沼から単離された自由生活性株、またコケ植物以外の植物を宿主由来の共生性株でも、細胞分化が誘導されること、またその分化頻度は必ずしも共生性や株の由来する宿主には対応していないことが示唆される一方、培養期間中に細胞分化が観察されないものが存在した。さらに、共培養後の感染性については、異なる宿主および土壌・湖沼からの単離株にも、コケ植物との共生コロニーを生成する株が多く見られる一方で、共培養後にも共生コロニーを生成しない株があり、これらには上記にある細胞分化が誘導されなかった株が含まれた。2)Nostoc属シアノバクテリア-植物共生特異性の進化1)から得られたNostoc属の細胞分化・共生能に関する情報を、前年度に作成された分子系統関係と比較・検討した。その結果、細胞分化と共生能の間には明らかな相関がなく、また自由性/共生性や(元来の)宿主の系統等との関連は認められなかった。一方で、実験的に細胞分化を示さない株は独立のクラスターをなし、さらに、その中に細胞分化・感染性を持たないが含まれていた。このことは、宿主特異性は植物によるシグナルへの認識・応答機構の獲得から、安定した共生関係の構築へという段階を踏んで進化した可能性を示唆する。
G蛋白によるムスカリン性カリウムチャネルの活性化の機能的解析

1.モルモット単一心房筋細胞でinside-out PatchClampを行い、細胞外膜側のアセチルコリンの濃度を一定(5μM)にして細胞内膜側のGTP濃度を変化させ、活性化G蛋白質量を変えた時のムスカリン性カリウム(K_<ACh>)チャネルのPatch電流を記録した。GTP濃度と活性化G蛋白質量は比例すると仮定した。2.各GTP濃度のデータに対し高速フーリエ変換を行いパワースペクトラムを加算平均しLorentzian Curveでfittingを行った。Power Spectrumは2つのLorentzian Curveの和でfittingできた。GTPの濃度を変化させても2つのCorner Frequencyに有意な変化はなかった。3.K_<ACh>チャネルのKineticsはClose(2) Close(1) Openの速いGatingとUnavailable Availableの遅いTransitionの2つの独立したTransitionからなると考えられた。5.Monodらのアロステリック理論モデルを用いて濃度活性曲線のfittingを行ない、チャネルサブユニットの数が4個以上の時に良好にfittingできた。6.以上よりClose(2) Close(1) Openの間の反応は細胞内GTP濃度とは独立しており、GTPはUnavailable Availableの間の反応の平衡を変化させることにより開口確率を上昇させると考えられた。G蛋白質によるK_<ACh>チャネルの活性化過程は、アロステリック理論モデルでうまく説明できた。