hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Pten変異マウスを用いた新しいてんかん病理・治療モデルの確立

本研究では、Pomc陽性ニューロン特異的にPtenを欠失させたコンディショナル・ノックアウトマウスを作製した。本マウスは生後8-9週目に全身けいれんを自然発症し、11週目までに全て死亡した。生化学、顕微鏡学的観察結果を通じて、本マウスの海馬歯状回は、年齢依存的に肥大・変形し、またけいれんに先立って海馬における興奮抑制およびCrh-Pomc (ACTH)バランスが破綻していることを明らかにした。ラパマイシンを使用するとけいれんの発症と早期死亡を抑制した。これらの結果から、PI3K-AKT-mTOR経路は、難治性てんかんに対する新しい治療標的となりうることが示唆された。PI3K-AKT-mTOR経路は、てんかんおよび自閉症に関与する共通の分子経路である。Phosphatase tensin homolog (Pten)は本経路を負に制御する重要な脂質脱リン酸化酵素であり、その突然変異により、多発腫瘍を特徴とするPten過誤腫症候群の他、自閉症、てんかんなどの神経学的徴候を来たすことが知られている。今回、我々はPomc陽性ニューロン特異的Pten欠損マウスを作成し、その神経学的フェノタイプを観察した。本マウスは生後9週目頃からけいれんを自然発症し、ほぼ全てのマウスが11週頃までに死亡した。生化学、顕微鏡学的観察結果を通じて、本マウスの海馬歯状回は、年齢依存的に肥大・変形し、またけいれんに先立って、海馬における興奮抑制バランスおよびCrh-Pomc (ACTH)バランスが変化していることを明らかにした。ビデオモニター下での脳波測定では、海馬起源と考えられるてんかん性放電を捕捉した。mTOR阻害薬・ラパマイシンの投与により、けいれん症状は軽減し、これらの分子フェノタイプも正常化することを確認した。本マウスは脳内限定的な領域でPtenを欠損しても、難治性・致死性てんかんを発症すること、AKT-mTOR経路とCrh-ACTH軸との機能的関連性をはじめて示した研究である。AKT-mTOR経路の過剰活性化は、大脳皮質異形成を来たすことが知られており、難治性てんかんの分子病理と新しい治療の確立に有用である。Matsushita et al., Sci Rep6, Article number: 22991 (2016)doi:10.1038/srep22991.原著論文を発表したPten遺伝子の海馬歯状回および視床下部Pomc発現ニューロン特異的欠損(Pten-cKO)マウスを作成したところ、9週目までに難治性・致死性けいれんを自然発症し、12週までに全ての個体が死亡した。蛍光免疫抗体法では、海馬歯状回特異的なPtenシグナル欠損と同領域のリン酸化AKTシグナルの亢進が確認された。海馬ではcFos mRNAの発現がけいれん発症に先立ち上昇し、大脳皮質ではけいれん発症後にこれが上昇していた。Pten-cKOマウスの海馬では、けいれん発症時までに顆粒細胞層ニューロン細胞体および樹状突起の肥大が経時的に進行し、Dcx陽性・ニューロン前駆細胞の減少が見られた。一方、生後神経新生の亢進は見られなかった。また大脳皮質ニューロンの異型性および6層構造の変化は見られなかった。大脳皮質のけいれんを引き起こすメカニズムとして、海馬歯状回で生後新生されたニューロンの分化障害と歯状回顆粒細胞から出力する苔状線維の分岐異常が考えられた。またラパマイシンでこれらの異常細胞フェノタイプは軽減した。以上の結果は、先天的Pten欠損にともなうAKT-mTORシグナル亢進が生後ニューロンの機能的成熟と神経回路の形成異常を来し、年齢依存的なてんかんを発症するメカニズムを示していた。原著論文として上記内容を国際誌に発表したPI3K-AKT-mTOR経路は、てんかんおよび自閉症フェノタイプいずれにも関与する共通の分子経路である。Phosphatase tensin homolog (Pten)は本経路を負に調節する重要な脂質脱リン酸酵素であり、その突然変異により、多発腫瘍を特徴とするPten過誤腫症候群の他、自閉症、てんかんといった神経学的徴候を引き起こすことが知られている。我々は、Pomc陽性ニューロン特異的にPtenを欠失させたコンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、その神経学的フェノタイプを観察した。mTOR阻害薬ラパマイシンの投与により、けいれん症状は軽減し、これらの分子フェノタイプも正常化することを確認した。本マウスは脳内限定的な領域でPtenを欠損しても、難治性てんかんを発症すること、AKT-mTOR経路とCrh-ACTH軸との機能的関連性を初めて示した研究である。AKT-mTO経路の過剰活性化は、大脳皮質異形成を来たすこと知られており、難治性てんかんの分子病理と新しい治療法の確立に有用である。

以上の結果を英文誌に報告した(Matsushita Y., Sci Rep 2016)本研究では、Pomc陽性ニューロン特異的にPtenを欠失させたコンディショナル・ノックアウトマウスを作製した。本マウスは生後8-9週目に全身けいれんを自然発症し、11週目までに全て死亡した。生化学、顕微鏡学的観察結果を通じて、本マウスの海馬歯状回は、年齢依存的に肥大・変形し、またけいれんに先立って海馬における興奮抑制およびCrh-Pomc (ACTH)バランスが破綻していることを明らかにした。ラパマイシンを使用するとけいれんの発症と早期死亡を抑制した。これらの結果から、PI3K-AKT-mTOR経路は、難治性てんかんに対する新しい治療標的となりうることが示唆された。新しい治療点を探索する上記けいれんマウスの分子フェノタイプをさらに詳細に解析し、てんかんの新たな治療標的を探索する。小児神経学報告した論文掲載料(オープンジャーナル)実験の進捗が順調であり、消耗品費などの消費量が予想より少なかったため。本年度同様の使用予定はない平成29年度の実験試薬や論文作成に関する投稿費等に使用する。
台湾経済のニックス化要因に関する実証研究

1.ニックス化の原動力台湾の経済発展を支えているのは、豊かな人的資源である。それはたんに人口が多いとか、低賃金労働が豊富にあることを意味するものではなく、高いレベルの教育とその普及、そして一人ひとりの人間が営利的行為にきわめて積極的である行動様式に由来する。そのため庶民生活に活気があり、社会全体に活力がみなぎっている。家族的経営を中心とした中小企業の活力と発展、労働者の高い労働意欲はいずれもこのような人間の生活態度から生れた旺盛な生活力を背景にしている。これが台湾がNICs化した原動力である。2.中小企業の発展訪問した企業の範囲内でみるかぎり、聞きしに勝るパーフォマンスを示している。新進気鋭の企業主、それもほとんどが40才前後、出身、経歴はさまざまであるが、経営能力の資質はかなり高い。夫婦、家族中心の経営形態が多くみられ、製品は輸出指向で、家族経営の強みを発揮している。模倣技術が優れており、日本からかなりの技術を移転している。そのなかに企業主が企業に長年勤めたあと、身につけた技術をたよりに独立して企業を起したのがいた。いわゆる技術のスピンオフのケースである。一般的には、日本から設備、製品を輸入して製造技術を模倣することに成功したケースが多い。技術移転の面では、日本との関係は確かに深い。しかし、それなるが故に、自己開発技術に乏しく、R&D投資も乏弱である。そのなかでも少数例外的に尖端技術を追求している企業がある。大学のクラスメート数人で組織された化学会社である。このような企業が増えるか否かが、今後の発展動向を占う鍵である。3.大企業の実情大企業のトップにあるのは、主として官営企業であるが、見かけほどには活気がない。官僚主義経営を克服できるかどうかが、いぜんとして重要課題であるが、その見取しは必ずしもたっていない状況にある。民間に大企業は、ほとんどが外資と緊密に提携している。その理由の一つが自己開発技術をそれほどもたないからである。この点は中小企業と共通している。同時に企業の系列化や下請制度も発達していない。輸出の場合、大企業であっても自己ブランド製品は少なく、DEM生産に依存しているケースがみられた。4.日系企業の進出状況労働集的型の輸出加工業への進出が典型的パタンである。近年の賃金上昇プレッシャーに対して、設備投資による合理化と技術導入で対応している。経営管理が行き届いており、労務管理や雇用制度、賃金水準も労働事情の新しい情勢を先取りして改善している。したがって投資が増え続け、経営状態も概して良好である。5.労働事情労働力不足がきわめて厳しく、労働組合運動の激化の影響もあって、賃金は著るしく上昇している。低賃金の比較優位は急速に喪失しつつあり、台湾経済はまさに大きな転換期を迎えている。6.台湾経済に関するアンケート・聞き取り調査報告(添付資料5)1.ニックス化の原動力台湾の経済発展を支えているのは、豊かな人的資源である。

経営管理が行き届いており、労務管理や雇用制度、賃金水準も労働事情の新しい情勢を先取りして改善している。したがって投資が増え続け、経営状態も概して良好である。5.労働事情労働力不足がきわめて厳しく、労働組合運動の激化の影響もあって、賃金は著るしく上昇している。低賃金の比較優位は急速に喪失しつつあり、台湾経済はまさに大きな転換期を迎えている。6.台湾経済に関するアンケート・聞き取り調査報告(添付資料5)
脊髄損傷修復に向けた再生阻害機構制御‐コンドロイチン硫酸を制御する新素材開発‐

脊髄損傷治療に関しては根本治療法がない。そのためにiPS細胞移植等による臨床治療が示されている。しかし損傷された神経の周辺領域ではコンドロイチン硫酸が再生阻害因子として機能し、神経再生を阻害する。そのため損傷部周囲の環境を整え、コンドロイチン硫酸の発現を制御することが重要となる。我々は新しいバイオマテリアルを用い、かつ核酸医薬をデリバリーすることで、再生環境を維持しマウスモデルにおける生理的機能回復につなげることを可能とした。さらにこの方法はiPS細胞移植時にも移植細胞と移植細胞周辺環境の制御と併用した治療方向性につなげることが出来た。脊髄損傷修復・神経再生においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現上昇が神経軸索再生の大きな阻害要因とされる。このコンドロイチン硫酸の発現制御による神経再生治療の可能性と方向性を探るために、コンドロイチン硫酸転移酵素の遺伝子欠損(ノックアウト)マウスの樹立を行い研究推進している。このマウスを用いて、治療においても神経再生の反発性および物理的なバリアとなっているグリア性瘢痕・繊維性瘢痕の形成メカニズムの解析を進めるとともに、コンドロイチン硫酸の発現制御メカニズムの解析を進めた。とくに、細胞培養系(in vitro)でこれら瘢痕形成を再現する混合培養系を確立し、モデル動物系では不可能であったこれまでにない分子メカニズムの解明を進めている。また、実際の治療方向性を見据えて、新規バイオマテリアルを用いた神経損傷部(脊髄損傷箇所)における組織部位特異的ノックダウン法の確立を推進した。すでにタンパク質を基材としたスポンジ状バイオマテリアルを用いて、siRNAをデリバリーする方法をこれまでに推進してきた。この基材を用いその組織内での詳細な解析を、マウスモデルを用いて行った。蛍光標識siRNAによる組織内デリバリー(DDS)効果を組織化学的に解析したところ、siRNAは損傷箇所を含む広範な領域にデリバリーされて機能することを確認することが出来た。また発現抑制効果も高めることに成功した。現在、このシステムを用いて組織内での炎症性の有無とともに、関連分子群の遺伝子遺伝子変動を、RNAseqを駆使して解析している。これらからコンドロイチン硫酸発現メカニズムを解明するとともに、発現制御に関する知見を得るとともに、モデル動物を用いての治療可能性をさらに進めている。脊髄損傷治療には決定的な方法が存在しない。それは、とくに中枢神経が損傷を受けたのちには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSーPG)が神経再生の阻害因子として損傷後修復を抑えてしまうことが、脊髄損傷からの治療を困難にしているためでもある。CSーPGをはじめとするグリコサミノグリカンは、中枢神経系の発生・回路形成、および神経の成熟過程に多方面から機能する。我々はこのコンドロイチン硫酸(CS)の発現を低下させるノックアウトマウスを作成し、解析を進めてきた。とくにCS合成転移酵素CSgalnacT1/T2のKOマウスは、その脊髄損傷モデル実験からは損傷後の劇的な回復を見せることを明らかにするとともに、ほかのグリコサミノグリカン発現にも影響を与える相互作用システムがあることが明らかになった。この酵素をはじめとするCSの発現制御は脊髄損傷をはじめとする神経再生治療の切妙なターゲットになることを示すことができた。本研究では、さらに治療に踏み込んで神経再生医療に向けたCS発現制御を治療応用につなげるために、新しい脊髄組織部位特異的な遺伝子ノックダウン法を開発した。新しいバイオマテリアル素材を基質として、継続的な遺伝子抑制法を開発し、脊髄損傷動物モデル(マウス・ラット)では生理的機能回復などの成果を挙げることができた。実際のヒトでの応用を考えて、遺伝子ノックダウンをさらに現実的なものとするためにアンチセンス核酸誘導体を用いた制御法も進めることができた。実際に効果のあるアンチセンス核酸誘導体を利用して、マウスモデルで損傷箇所の組織解析や分子レベルでの再生過程を検討している。さらに、細胞外基質がいかに再生を制御しているかを遺伝子発現レベルで組織部位特異的な検討を加えることもできるようになった。当初予定した以上に遺伝子発現制御技術は進めることができた。動物モデルでの解析は計画以上に進んでいる。脊髄損傷の治療には、根本治療法がない。そのためiPS細胞や幹細胞による移植治療が謳われ、多くのマウス基礎研究とトライアルが進められている。しかし、脊損後には損傷後炎症に続いて生じるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の発現上昇が神経の再生を阻害し(グリア性瘢痕)、さらに損傷部を取り囲むように線維性瘢痕が形成され、神経再生を完全にブロックしてしまう。申請者は、CS基(糖鎖部位)の生合成経路にある最も重要な2つの糖転移酵素Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyl transferase-1&-2の遺伝子欠損(KO)マウスを世界に先駆けて作製し、画期的な生理的回復を見せることを明らかにした。我々は、再生神経軸索のみを同定できる新規リン酸化抗体を作成し(特許取得)、再生時の順行性の回路の再編をトレースできるようになった。我々の遺伝子改変マウスで再生神経を解析すると、神経再生の多くは神経発芽によることが解った。定量的な再生神経の解析を進めることを可能とした。CSノックアウトマウスでは劇的な回復を認めたが、ヒトなどの治療応用展開を鑑みるにノックアウト技術は用いることが出来ないため、遺伝子ノックダウンなどの手法を様々にマウスにおいて試した。その結果、非常に有効な遺伝子配列を見出し、酵素発現とともにCSの発現レベルも落とすことに成功した。

この方法をもって、実際に生体投与応用を進めることで、ChABC投与と同等レベルの脊髄損傷後の生理的回復を認めることが出来た(特許出願中)。この解析をさらに、上記トレーシング定量技術と結びつけて推進することを計画している。また、バイオマテリアルを用いてのDDS(ドラックデリバリー)解析を推進した。信州大で作成されたフィブロインスポンジは生体安定性も高く、核酸医薬のDDSに非常に有効であることも示した。治療応用への糸口をつけることが出来た。脊髄損傷治療に関しては根本治療法がない。そのためにiPS細胞移植等による臨床治療が示されている。しかし損傷された神経の周辺領域ではコンドロイチン硫酸が再生阻害因子として機能し、神経再生を阻害する。そのため損傷部周囲の環境を整え、コンドロイチン硫酸の発現を制御することが重要となる。我々は新しいバイオマテリアルを用い、かつ核酸医薬をデリバリーすることで、再生環境を維持しマウスモデルにおける生理的機能回復につなげることを可能とした。さらにこの方法はiPS細胞移植時にも移植細胞と移植細胞周辺環境の制御と併用した治療方向性につなげることが出来た。当初計画通りに推進している。とくにバイオマテリアルによるDDSシステム解析は当初計画以上に進んだ。遺伝子発現解析も新しいシステムを導入して加速的に解析を推進した。損傷治療におけるもうひとつの重要な課題として提案した骨解析においては、バイオマテリアルによる材料解析に問題があり難航しているが、ノックアウトマウスを用いた解析で別の解析方法を模索して解決を図りつつある(本件に関しては下記に後述)。すべてにおいては順調に進展している。バイオマテリアルの安定性や核酸誘導体の徐放効果などの検討をさらに進める。実際の応用を考え、本内容を当初計画以上に推進することとした。さらに組織内でのCSの存在形態や再生に与える組織的な要素も計画以上に見る必要性が課題として浮かび上がった。組織化学的解析をさらに進めて、治療応用に生かすための基盤技術とすることを目標とする。分子細胞生物学・神経科学神経損傷治療における、損傷領域におけるバイオマテリアルと骨形成解析においては、遺伝子発現制御を捉えることが技術的に難しかったため、方向性を転換して我々のノックアウトマウスを駆使して骨形成を見るという原点に戻って解析を進めている。中心としている神経再生だけではなく、こちらの解析も推進を容易にしたので今後は問題なく進められる。神経系での解析は順調に推移したが、分担研究者の下での骨解析においてはマウス供給およびバイオマテリアルを組み合わせた解析系の困難さから計画の組みなおしを進めざるを得なかった。現在までに、マウス供給は順調に推移し、骨の解析系も問題点は完全にクリアできたので次年度に全て進めることが出来ると考える。我々のマウスでの骨解析は順調に進み、また移植再生実験なども開始した。
室内気質の免疫影響に関する実験システムの構築

マイナス荷電粒子優位の室内空気室を構築して,健常人ボランティアにより2.5時間滞在,ならびに夜間のみ2週間滞在型試験を行ってきた結果,短期間のインターロイキン2の軽微な,しかし有意な上昇と,中期間(2週間)でのナチュラルキラー細胞の活性増強を観察していたので,今回,実験的にそのシステムの構築と,検証を行った結果,マイナス荷電粒子の優位の程度は,オーダーは異なっていたが,実験的にこの環境がヘルパーT細胞の活性化とナチュラルキラー細胞の活性化を誘導することが判明した。室内空気室環境については,健康に対して障害をもたらす場合が,多く取り上げられている。シックハウス症候群(元来はシックビルディング症候群であるがここでは本邦の実態に沿った呼び名としてシックハウス症候群を使用し,Sick-House Syndrome : SHSとする)はその代表的な疾患であり,多くの微量の化学物質が,精神-神経-内分泌-免疫系(Psycho-Neuro-Endocrino-Immune Network : PNEI-NW)を介して,多彩なかつ病態生理としてまだまだ不明な症状を惹起することが知られている。今回の課題では,シックハウス症候群など室内空気室の健康障害や,反対に森林浴などでマイナス荷電粒子が優位な状況ではNK細胞活性などの免疫機能の賦活化が生じるなどので,書家の報告を受けて,室内気質の改善あるいは工夫が,健康状態を高める可能性と,特に免疫系に特化して,その観察検討システムを構築することを目的とした。初年度は,マイナス荷電粒子優位空気質システムのインキュベーターシステムへの導入を目的として,仮想室内環境の免疫影響検査として,当然,実際の住居環境とは異なるものの細胞培養インキュベーター内にマイナス荷電粒子を過剰に投入かつ循環するシステムを構築し,その中で種々の免疫担当細胞の機能検査を行い,通常インキュベーターとの比較を実施した。その結果,NK活性や,T細胞の刺激に対する増殖能などでは,マイナス荷電優位な環境でそれぞれ亢進する結果が得られている。まだ十分な検証には至っていないが,これらの結果と,実際にボランティアで行う実験等で,今後検証をすすめていきたい。今回の課題では,シックハウス症候群など室内空気室の健康障害や,反対に森林浴などでマイナス荷電粒子が優位な状況ではNK細胞活性などの免疫機能の賦活化が生じるなどのの報告を受けて,室内気質の改善あるいは工夫が,健康状態を高める可能性と,特に免疫系に特化してその観察検討システムを構築することを目的とした。第2年度は,初年度に実施したマイナス荷電粒子優位空気質システムのインキュベーターシステムへの導入を目的として,仮想室内環境の免疫影響検査として,当然,実際の住居環境とは異なるものの細胞培養インキュベーター内にマイナス荷電粒子を過剰に投入かつ循環するシステムを構築し,その中で種々の免疫担当細胞の機能検査を行い,通常インキュベーターとの比較の結果を受け,NK活性や,T細胞の刺激に対する増殖能などでは,マイナス荷電優位な環境でそれぞれ亢進するということをまとめた。更に実際に長期居住者の免疫変動の観察の予定を構築しつつある。シックハウス症候群などにより室内環境による健康障害が重要視され,また健康増進法の制定に伴い「よりよい健康」を求める機運が高まっている。こういった状況の中で,住宅メーカーの商品開発などの方向性の一つに健康増進がキーワードになってきている。研究代表者らは「陰性荷電粒子優位空気質の生体影響」について,2.5時間滞在型試験,2週間滞在型試験によって,この室内空気室環境がナチュラルキラー(NK)細胞活性を高めることを見出し,in vitro実験系においてもT細胞の活性化やNK細胞の活性増強の所見を得た。仕様としては壁面に70V程度で電圧を施すことによって壁面を陰性に帯電させ陽性荷電粒子(20nmサイズ)を吸着させることによる室内の陰性荷電粒子を相対的優位に保つことと,木炭微粉塗料の塗布を施すことによっている。平成23年度では3名の長期モニター(川崎医科大学倫理委員会承認854)による生体反応を検討した。1名(63歳,男性)は本プロジェクト開発に携わった元社員で,研究開始時点ですでに自宅集合住宅(マンション)に仕様を実施しており,約半年NK活性が60%以上を維持していた。本例では2012年1月20日に仕様をオフとしその後約3か月後のNK活性は50%と個人としては低値を示した。また明らかな副作用は認められなかった。他2例については偶発した疾病あるいは施工状況の不安定さにより明らかな結果を得るに至っていない。
犬の先天性難聴に関する研究

被毛や虹彩の退色を伴う症候性難聴がいくつかの犬種で報告されている。当施設で維持されている症候性難聴症例について、人での類似疾患であるワーデンブルグ症候群2型の原因遺伝子であるメラニン合成経路に働く遺伝群(MITF,PAX3,SOX10)に着目し、それらの遺伝子の発現ならびにタンパクコード領域の塩基配列について検討した。犬のMITF遺伝子では2つのアイソフォームが報告されているが、今回健常犬で従来報告されているMITF-MおよびMITF-Hの2つのアイソフォームに加え、新たに人のMITF-Aに相当するアイソフォームが検出された。MITF-HおよびMITF-A沼は多くの臓器に広く発現が認められたが、MITF-M腎臓、大脳、小脳、心臓、上部消化管などで顕著な発現が認められ、臓器特異性が観察された。症例犬のMITFの3つのアイソフォームの発現と塩基配列を解析したが健常犬との間に差異は検出されなかった。次いでPAX3遺伝子の構造解析を試みた。健常犬のPAX3遺伝子構造を確認後、各エクソン領域を増幅するためのプライマーを作成し、PCR増幅後、塩基配列を決定した。しかし、症例犬のPAX3遺伝子にも疾患に関連する変異を見出すことはできなかった。さらに健常犬のSOX10 cDNAをクロニングして塩基配列を決定した後、ゲノム構造を解析してタンパクコード領域のPCR増幅を可能とした。症例犬のSOX10遺伝子のタンパクコード領域の塩基配列は健常犬と一致し、変異は検出されなかった。本研究で対象とした先天性難聴の症例では解析した3つの遺伝子に変異は検出されなかったが、本研究で人のワーデンブルグ症候群に関連する遺伝子の犬における構造解析と解析方法が確立されたことより、今後他の犬種の先天性難聴症例についても解析を進め、関連遺伝子の同定を試みたい。犬の先天性難聴は多くの犬種で認められ、特に被毛の白色化を伴った症候性難聴が報告されている。この病態は人のワーデンブルグ症候群との相同性が推測されているが、その本態は明らかではない。本研究では人のワーデンブルグ症候群で遺伝子異常が報告されている遺伝子群を犬の症例で解析し、その病態と人との相同性を明らかにしようとするものである。今年度は標的遺伝子としてMITF、SOX10、PAX3の3遺伝子に焦点を当て、犬における各遺伝子の構造解析を進めて、遺伝子検査のための基礎的研究を実施した。まず、各遺伝子は健常犬の組織より抽出したRNAを試料としてRT-PCR法によりcDNAを増幅し、その塩基配列を明らかにした。そして、人やマウスの遺伝子構造を参考にして犬の遺伝子構造を推測し、PCR法によりゲノムDNAの断片を増幅、クローニングして遺伝子のエクソンーイントロン構造の解明を進めた。その結果、犬のMITF cDNAではヒトの同様にアイソフォームが存在し、現在までに3つの存在が明らかになった。また、犬のSOX10遺伝子の構造は人と同様に、コーディング領域は3つのエクソンにまたがることが明らかとなった。犬のPAX3遺伝子の構造解析は進行中である。本年度に解析された犬の各遺伝子のゲノム構造をもとに、次年度は犬の各遺伝子のエクソン領域をそれぞれ増幅して、犬の標的遺伝子の検査法を開発し、犬の先天性難聴の症例犬の遺伝子異常の本態を明らかにしたい。その結果は集団遺伝学的検査を可能にすると共に、疾患予防につながるものと期待される。

当施設で維持されている症候性難聴症例について、人での類似疾患であるワーデンブルグ症候群2型の原因遺伝子であるメラニン合成経路に働く遺伝群(MITF,PAX3,SOX10)に着目し、それらの遺伝子の発現ならびにタンパクコード領域の塩基配列について検討した。犬のMITF遺伝子では2つのアイソフォームが報告されているが、今回健常犬で従来報告されているMITF-MおよびMITF-Hの2つのアイソフォームに加え、新たに人のMITF-Aに相当するアイソフォームが検出された。MITF-HおよびMITF-Aは多くの臓器に広く発現が認められたが、MITF-Mは腎臓、大脳、小脳、心臓、上部消化管などで顕著な発現が認められ、臓器特異性が観察された。症例犬のMITFの3つのアイソフォームの発現と塩基配列を解析したが健常犬との間に差異は検出されなかった。次いでPAX3遺伝子の構造解析を試みた。健常犬のPAX3遺伝子構造を確認後、各エクソン領域を増幅するためのプライマーを作成し、PCR増幅後、塩基配列を決定した。しかし、症例犬のPAX3遺伝子にも疾患に関連する変異を見出すことはできなかった。さらに健常犬のSOX10 cDNAをクロニングして塩基配列を決定した後、ゲノム構造を解析してタンパクコード領域のPCR増幅を可能とした。症例犬のSOX10遺伝子のタンパクコード領域の塩基配列は健常犬と一致し、変異は検出されなかった。本研究で対象とした先天性難聴の症例では解析した3つの遺伝子に変異は検出されなかったが、本研究で人のワーデンブルグ症候群に関連する遺伝子の犬における構造解析と解析方法が確立されたことより、今後他の犬種の先天性難聴症例についても解析を進め、関連遺伝子の同定を試みたい。
ミオシン軽鎖キナーゼにより調節される血管内皮機能および細胞内情報伝達機構の検討

本研究ではMLCKが血管内皮細胞においてミオシン軽鎖(MLC)リン酸化非依存的に細胞内Ca^<2+>濃度を調節し、内皮依存性血管拡張反応を制御することを以下の点で明らかにした。1.アゴニスト刺激時に生じる細胞外からのCa^<2+>流入現象およびMLC二リン酸化体生成は、MLCKアンチセンス導入細胞において有意に抑制されたが、センス細胞では抑制されなかった。2.細胞外Ca^<2+>存在下でbradykininを投与すると、MLC二リン酸化体生成が亢進したが、無Ca^<2+>溶掖中では二リン酸化体生成は完全に抑制された。3.MLCの脱リン酸化を阻害する蛋白ホスファターゼ阻害薬であるcalyculinAを投与すると、内皮細胞の全MLCが二リン酸化体に変化したが、血管内皮細胞内Ca^<2+>濃度に有意な変化を及ぼさなかった。4.MLCK阻害薬(ML-9,wortmannin)投与群およびMLCKアンチセンス導入内皮細胞では、アゴニスト刺激時の一酸化窒素(NO)産生が著明に抑制された。5.Acetylcholine刺激時の内皮依存性過分極反応は、MLCK阻害薬(ML-9,wortmannin)により著明に抑制された。【総括】容量性Ca^<2+>流入はMLCリン酸化の上流に位置するシグナルであることが明らかとなった。この結果は、MLCKがMLC以外にターゲットを持ち、直接Ca^<2+>流入を調節する可能性を強く示唆している。さらに、MLCK阻害によりアゴニスト刺激時の内皮依存性NO産生と過分極反応は抑制された。平滑筋細胞でのMLCK活性化は血管収縮を惹起するのに対し、血管内皮細胞におけるMLCK活性化は血管拡張性に作用することが認められ、MLCKを中心とした血管トーヌス調節系が存在することが示唆された。【目的】血管内皮細胞においてミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)がアゴニスト刺激時およびシェアストレス時に生じる容量依存性Ca^<2+>流入の調節に重要な役割を果たしていることを我々は報告したが、この事実はミオシン軽鎮キナーゼの活性化が平滑筋細胞では血管収縮性に作用するのに対し、内皮細胞では血管拡張性に作用する可能性を示唆している。本研究ではアゴニスト刺激時の内皮依存性NO産生および内皮依存性過分極反応に及ぼすミオシン軽鎖キナーゼの役割について検討した。【方法】内皮依存性NO_2^-/NO_3^-(NOx)産生は培養ブタ大動脈血管内皮細胞をアゴニスト刺激後、培養液中のNOx量をHPLC法により定量した。内皮依存性過分極反応はアセチルコリン(ACh)刺激時のラット腸管膜動脈平滑筋細胞(SMC)の膜電位を微小電極法により測定した。【結果】1)ブラジキニン(10nM)およびサプシガーゲン(1μM)刺激時、内皮細胞によるNOx産生は非刺激時の約1.6倍、約3.2倍にそれぞれ増加したが、MLCK阻害剤であるML-9(100μM)、wortmannin(100μM)の前投与によりNOxの増加はほぼ完全に抑制された。

2)SMCの静止膜電位は約-51mVであり、ACh(1μM)投与により約-13mVの過分極を生じたがML-9の前投与により過分極反応は約60%抑制され、wortmanninの前投与では完全に抑制された。【総括】MLCK阻害によりアゴニスト刺激時の内皮依存性NOx産生と過分極反応は抑制された。MLCK活性化は内皮細胞においては血管拡張性に作用し新たな血管調節系となることが示唆された。血管内皮細胞においてNOやEDHFの産生は、細胞内Ca^<2+>濃度の変化により調節される。我々はミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)が内皮細胞内Ca^<2+>濃度調節に深く関与することを報告した。この結果はMLCK活性化がCa^<2+>濃度を上昇させ内皮依存性血管拡張因子産生を刺激する可能性を示唆している。本研究ではMLCKにより調節される内皮依存性血管拡張反応について、MLCKに対するアンチセンス法およびMLCK阻害剤を用い以下の知見を得た。2)BKおよびTG刺激時、内皮細胞によるNOx産生は非刺激時の約1.6倍、約3.2倍にそれぞれ増加したが、アンチセンス細胞およびML-9、WTの前投与によりNOxの増加はほぼ完全に抑制された。3)SMCの静止膜電位は約-51mVであり、ACh(1μM)投与により約-13mVの過分極を生じたが、ML-9前投与により過分極反応は約60%抑制され、WTの前投与ではほぼ完全に抑制された。以上の結果から、MLCK活性化は平滑筋収縮を生じる一方、内皮細胞では血管拡張因子の産生を刺激し血管拡張性に作用することが示唆された。血管内皮細胞は血管透過性や血管トーヌスを調節し、抗血栓、血管新生、種々の炎症反応にも関与する多機能細胞として循環系のホメオスタシスを維持するうえできわめて重要な役割を果たしてしている。これら内皮機能の発現・調節に細胞内カルシウムイオン(Ca^<2+>)濃度の変化が関与し、とくに細胞外からのCa^<2+>流入が重要であることが注目されている。我々はミオシン軽鎖キナーゼが、アゴニスト刺激時および機械的刺激であるシェアストレス時に生じる内皮細胞内へのCa^<2+>流入を調節することを認め報告した。ミオシン軽鎖キナーゼはこれまで平滑筋細胞において収縮調節に関与することが報告されているが、上記の知見はミオシン軽鎖キナーゼの新たな役割として、内皮細胞において細胞内Ca^<2+>濃度を調節し内皮機能調節に関与する可能性を示唆している。そこで我々は、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤とともにアンチセンス法を用い、内皮依存性NO産生および内皮依存性化分極反応におけるミオシン軽鎖キナーゼの役割を検討したところ、アゴニスト刺激時の内皮依存性NO産生は、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害によりほぼ完全に抑制され、アセチルコリンによる内皮依存性化分極反応もミオシン軽鎖キナーゼ阻害により抑制されることを認めた。ミオシン軽鎖キナーゼの活性化は、平滑筋細胞では収縮に関与するが、内皮細胞では内皮依存性血管拡張因子の産生を促し、血管拡張性に作用する。この結果は、生体循環系のホメオスタシス維持に関与するミオシン軽鎖キナーゼを中心としたあらたな心血管系調節機構の存在を示唆している。
細菌情報伝達機構による環境適応システムネットワークの研究

(1)大腸菌TCS遺伝子の欠失株と機能測定システムの構築大腸菌ゲノム上のTCSセンサーキナーゼ(HK)遺伝子30種類、レスポンスレギュレーター(RR)遺伝子34種類を標的としてCRISPR-Casシステムにより単一欠失株を単離した。また29種類のDNA結合型RRの標的プロモーターのレポーターセット、およびTCS遺伝子群の発現を担う全31プロモーターのレポーターセットを構築した。さらに、20種のHKを欠失した多重欠失株、21種のRRを欠失した多重欠失株を単離した。(2)細菌ゲノムの全情報伝達機構による環境応答システムネットワークの解明628種類の原核生物ゲノム情報から、ゲノムサイズとRRカテゴリー数との間にゴンペルツ曲線で近似する相関関係を見出した。ゲノム当たりのRRカテゴリー数は、5 Mbまでは2個/1 Mb、5 Mb以上では8個であった。ゲノムサイズ4.6 Mbの大腸菌は8個のRRカテゴリーを持ち、これは5つのRRファミリーに分類される。RR遺伝子は14種がOmpRファミリー、10種がNarLファミリー、3種がNtrCファミリー、2種がCriRファミリー、2種がLytTファミリーに分類される。LytTファミリーRRのPyrRについて新規標的遺伝子を同定した。またPyrSRの応答がピルビン酸特異的であること、2つのピルビン酸応答システムBtsSRとPyrSRのピルビン酸濃度による応答性の違い、クロストークの存在を報告した。さらにOmpRファミリーRRの内、大腸菌細胞内で増殖相を通して安定的に存在し、かつポジティブフィードバック調節を行うPhoP、PhoB、OmpRの3つのRRに着目した。顕微鏡観察で得た一細胞分析データの統計解析により増殖への寄与を調べた結果、細菌が環境シグナルに対して感知、応答、適応の3段階を経て発揮する「適応増殖」に重要であることを明らかとした。大腸菌ゲノム上に同定されているHK遺伝子30種類、RR遺伝子34種類を標的としたCRISPR-Casシステムによる遺伝子破壊において、Cas9との共発現により宿主大腸菌株のゲノムを標的遺伝子領域内部で高効率に切断するようなガイドRNA発現プラスミドライブラリを得た。切断箇所への終止コドン挿入に際し、いくつかの遺伝子においては終止コドンが挿入されない、挿入後のゲノム配列の確認ができないといった問題が生じた。この問題はガイドRNAの再設計、ガイドRNA発現プラスミドの再構築によるゲノム切断位置の変更によっておおむね解決されたが、30種類のHK遺伝子全てを機能欠失した全HK欠失株、および34種類のRR遺伝子全てを機能欠失した全RR欠失株の単離には至っていない。一方、大腸菌の包括的なTCSプロモーター測定結果やバイオインフォマティックスによる細菌高保存TCSの理解が進み、大腸菌での新しいクロストークの発見や新しい増殖への影響を発見した。1.大腸菌の環境応答システムの全体像の解明CRISPR-Casシステムを用いたゲノム編集法を利用して、大腸菌ゲノム上のHK遺伝子30種類、RR遺伝子34種類を標的とした遺伝子破壊を行い、全HK遺伝子欠失株および全RR遺伝子欠失株を単離する。単離した欠失株について、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析といったオーム解析、およびレポーターシステムによる各TCS制御下流遺伝子の転写活性測定を行う。さらに、顕微鏡を用いた多重欠失株の増殖能(増殖速度)の単一細胞レベルでの解析により、TCSの増殖機能への影響を調べる。2.異種細菌のゲノム情報から推定される主要情報伝達ネットワーク(1)異種細菌ゲノム情報に基づく環境適応システムの推定:サルモネラ属の2つの菌種(S. enteriaとS. bongori)のうち、チフス菌とネズミチフス菌のゲノム情報、また難培養性化学独立栄養細菌のゲノム(またはメタゲノム)情報から全TCSを抽出し、それらの大腸菌TCSとの構造類似性から機能を大別する。(2)異種細菌の主要な環境適応のTCS遺伝子発現システムの構築と情報伝達ネットワークの再構成:得られた情報から、各異種細菌由来HKとRRをそれぞれ異なる誘導物質で発現誘導できるプラスミドにクローニングする。さらに、各TCS制御下流にある遺伝子群を文献中心に調査し、それらのプロモーターをルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングする。構築した各プラスミドを大腸菌TCS多重欠失株に導入した形質転換体を獲得する。種々の環境下でのPhosタグSDS-PAGEを用いた免疫検出による異種細菌TCS因子の細胞内リン酸化の測定およびルシフェラーゼレポーターシステムによる各TCS制御下流遺伝子の転写活性を測定する。導入するHKとRRの組み合わせから、各異種細菌の環境適応システムの全体像を明らかとする。

ゲノムサイズ4.6 Mbの大腸菌は8個のRRカテゴリーを持ち、これは5つのRRファミリーに分類される。RR遺伝子は14種がOmpRファミリー、10種がNarLファミリー、3種がNtrCファミリー、2種がCriRファミリー、2種がLytTファミリーに分類される。LytTファミリーRRのPyrRについて新規標的遺伝子を同定した。またPyrSRの応答がピルビン酸特異的であること、2つのピルビン酸応答システムBtsSRとPyrSRのピルビン酸濃度による応答性の違い、クロストークの存在を報告した。さらにOmpRファミリーRRの内、大腸菌細胞内で増殖相を通して安定的に存在し、かつポジティブフィードバック調節を行うPhoP、PhoB、OmpRの3つのRRに着目した。顕微鏡観察で得た一細胞分析データの統計解析により増殖への寄与を調べた結果、細菌が環境シグナルに対して感知、応答、適応の3段階を経て発揮する「適応増殖」に重要であることを明らかとした。大腸菌ゲノム上に同定されているHK遺伝子30種類、RR遺伝子34種類を標的としたCRISPR-Casシステムによる遺伝子破壊において、Cas9との共発現により宿主大腸菌株のゲノムを標的遺伝子領域内部で高効率に切断するようなガイドRNA発現プラスミドライブラリを得た。切断箇所への終止コドン挿入に際し、いくつかの遺伝子においては終止コドンが挿入されない、挿入後のゲノム配列の確認ができないといった問題が生じた。この問題はガイドRNAの再設計、ガイドRNA発現プラスミドの再構築によるゲノム切断位置の変更によっておおむね解決されたが、30種類のHK遺伝子全てを機能欠失した全HK欠失株、および34種類のRR遺伝子全てを機能欠失した全RR欠失株の単離には至っていない。一方、大腸菌の包括的なTCSプロモーター測定結果やバイオインフォマティックスによる細菌高保存TCSの理解が進み、大腸菌での新しいクロストークの発見や新しい増殖への影響を発見した。1.大腸菌の環境応答システムの全体像の解明CRISPR-Casシステムを用いたゲノム編集法を利用して、大腸菌ゲノム上のHK遺伝子30種類、RR遺伝子34種類を標的とした遺伝子破壊を行い、全HK遺伝子欠失株および全RR遺伝子欠失株を単離する。単離した欠失株について、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析といったオーム解析、およびレポーターシステムによる各TCS制御下流遺伝子の転写活性測定を行う。さらに、顕微鏡を用いた多重欠失株の増殖能(増殖速度)の単一細胞レベルでの解析により、TCSの増殖機能への影響を調べる。2.異種細菌のゲノム情報から推定される主要情報伝達ネットワーク(1)異種細菌ゲノム情報に基づく環境適応システムの推定:サルモネラ属の2つの菌種(S. enteriaとS. bongori)のうち、チフス菌とネズミチフス菌のゲノム情報、また難培養性化学独立栄養細菌のゲノム(またはメタゲノム)情報から全TCSを抽出し、それらの大腸菌TCSとの構造類似性から機能を大別する。
低・未利用水産資源の機能性に及ぼす調理加工操作の影響

低・未利用水産資源に生活習慣病予防効果などの機能性を見出し、適切な抽出法および濃縮法を検討することにより、それらの機能性食品原料や医薬品原料としての利用を促進するとともに、調理加工における機能性の変化を検討し、機能性成分を効果的に摂取するための嗜好性を加味した調理加工法を開発することを目的に研究を行っている。前年度の試験結果から海藻は水分含量が多いため、生の状態よりも凍結乾燥後に粉末化後にオートクレーブ抽出を行う方が目的とする機能性成分の抽出効率が高まることが明らかとなったことから、有効濃度の機能性成分を含む加工食品を製造する為に市販の海藻乾燥加工品を必要量確保し、その機能性成分に関して前年度と同様の検討を行った。その結果、市販の海藻乾燥加工品は産地や前処理方法の違い等により、ポリフェノール含量や抗酸化活性が著しく低下しているものがあったことから、更に試料を追加して検討を進めているところである。一方、スピルリナが有する機能性について、大量抽出および濃縮が可能な方法で抽出した試験液は、α-アミラーゼ阻害活性やα-グルコシダーゼ阻害活性が低く、高いリパーゼ阻害活性を有していたことから、動物実験の必要性および有用性に関して再検討を行っている。他方、前年度に引き続き、農産物の廃棄部位を代替試料として製造したパンなどの加工食品の物性試験や官能評価を行うとともに、スピルリナやわかめ胞子葉等をパンに添加する際の条件検討を行っている。藻類の様々な加工製品を試料として機能性に関する検討を行ってきたが、一次加工の方法によっては機能性が大きく低下するものがあったため、機能性を損なっていない必要量の試料の入手に時間を要している状況である。当初の研究計画では、人体に有効な濃度の機能性成分を含む加工食品を製造し、その健康効果を見極めることを目標としていたが、有効成分と同時に濃縮される食品成分が加工特性に与える影響が大きいため、有効成分の簡易精製等が必要な状況となっている。一方で、煩雑な精製作業は本研究の趣旨にそぐわないものであることから、濃度を高めることよりも、加工による機能性の変化を見極めることを優先して、研究を進めていく予定である。本年度は、機能性成分を簡便かつ効率よく抽出する方法を検討するために、まず、海藻原料の加工工程における機能性成分の変化について検討した。わかめ等の海藻は水分含量が多く、生の状態では大量の原料からの抽出が困難であったことから、わかめ、茎わかめ、めかぶ等のの乾燥粉末を調整し、乾燥方法や抽出方法の違いによる抽出成分の相違について検討した。一方で、有効濃度での加工食品への添加に充分な試料量を確保できなかったことから、農産物の廃棄部位を代替試料として食パンを製造し、物性試験や官能評価に関する手法を確立させることを優先的に研究を行った。他方、スピルリナが有する機能性について、大量抽出および濃縮が可能な方法で抽出した試験液の機能性評価を検討するべくアンジオテンシンI変換酵素阻害活性、α-アミラーゼ阻害活性、α-グルコシダーゼ阻害活性等の様々な指標を用いて試験を行った結果、熱水抽出液におけるリパーゼ阻害活性が比較的高く、透析により除外されない成分が含まれることが明らかとなったことから、本成分の加工食品への利用が期待できるものと思われた。当初予定していた濃縮法の検討に時間を要しているが、代替試料を用いた物性測定および官能評価試験を先に進めることが出来たため、次年度以降、順調に研究を進められる見込みである。本年度に充分に検討できていない濃縮法の検討を急ぎ、濃縮成分を添加した加工食品による物性試験および官能評価を行う。

動物実験は極力避けるため、最終年度において、有望なサンプルのみの試験に留める予定である。当初の研究計画では、人体に有効な濃度の機能性成分を含む加工食品を製造し、その健康効果を見極めることを目標としていたが、有効成分と同時に濃縮される食品成分が加工特性に与える影響が大きいため、有効成分の簡易精製等が必要な状況となっている。一方で、煩雑な精製作業は本研究の趣旨にそぐわないものであることから、濃度を高めることよりも、加工による機能性の変化を見極めることを優先して、研究を進めていく予定である。成果報告のために予定していた学会出張を行うことが出来なかったため、次年度に開催される学会で成果報告を行う予定である。年度末の学会出張により残額の支出が出来なかったが、繰越額は僅かであるため、速やかに使用する予定である。
グリーンランドにおけるグラファイト層の総合研究:38億年前の生物活動と生息環境

イスア地域の黒色頁岩及び縞状鉄鉱層に関する研究成果を以下に示す。(1)黒色頁岩において、グラファイト含有量<8.8wt%、炭素安定同位体値が-20‰前後の露頭では主要鉱物が緑泥石なのに対し、グラファイト含有量<0.5wt%、炭素安定同位体値が-14‰の露頭では角閃石・石英である。これは、Fe(III)を含む緑泥石がグラファイトを酸化して、二酸化炭素と角閃石(Fe(II))に置き換わる反応が起こったと考えられる。このように、同一層であっても、局所的にグラファイトの酸化が起こっている証拠が見つかった。(2)希土類元素含有量測定から、グラファイトの含有量が少ない露頭はLight-REEに欠乏したパターンを示すことが解った。これは、変成作用中に、REEを多量に含む鉱物が変成流体に溶して、岩石中から取り去られたものと考えられる。この結果はグラファイト含有量や炭素同位体値の結果とも調和的である。以上より、地質学的・地球化学的・岩石鉱物学的データをすべて対比させることが出来た。このように詳細なデータはこれまでの研究にないものであり、本研究結果から最古のグラファイトの起源のみならず、変成中のグラファイト-流体の同位体交換や移動プロセスについても言及することが可能となった。(3)縞状鉄鉱層中の角閃石の化学組成を測定した。北部の低変成地域ではマグネシウムに富むカミングトナイト、アンソフィライトのみが観察されるのに対し、南部の高変成地域は鉄に富むグリューネライトに卓越している。このことから、南部の縞状鉄鉱層堆積時にはシデライトが沈殿しており、変成作用の際の二次反応でグリューネライトが出来たと考えられる。これにより、詳細な岩石鉱物学的記載から、これまで行われていなかった初生鉱物の推定が可能になった。本研究で発見された、最古の「生物」由来グラファイトと、「非生物」由来グラファイトに結晶構造の差異が無いかを検討した。岩石粉末から薬品処理によって抽出したグラファイトに対して、フーリエ変換赤外分光計(FT-IR)によるスペクトル分析及び顕微ラマン分光分析を行った。その結果、両者のスペクトルに明瞭な違いは無いことが判った。固体NMR分析についても検討したが、十分なサンプル量が得られないこと、不純物を完全除去するのが非常に困難なことから分析を断念した。その後、処理後のグラファイトに対して(50mg)粉末X線解析(XRD)を行ったところ、グラファイト結晶の特定面のピークがブロードになることが解った。これはグラファイト結晶の特定面の原子配列がランダムになっていることを示す。そこで、よりミクロな視点から解析を行う為に、透過型電子顕微鏡(TEM)による観察を試みた。すると、「生物」由来グラファイトと、「非生物」由来グラファイトの形状に明瞭な差異があることがわかった。「生物」由来グラファイトの結晶は、直径400nm程度の角のとれた六角板状の結晶の凝集物として存在しており、結晶のひずみ由来の等厚干渉縞がしばしば見られた。それに対して、「非生物」グラファイトは直径600nm1μm程度で、明瞭な六角板状の結晶が折り重なっていた。両者の回折像をとったところ、どちらも同じ乱層構造を示す回折像を示した。今後はさらにミクロな観察、具体的にはTEMによる暗視野像の観察や、電気抵抗率の測定によって結晶欠陥の密度を見積もる予定である。2007年7月12日-7月22日にかけてグリーンランド・イスア地域西部東側で地質調査を行った。今回の調査では、東側の縞状鉄鉱層周辺の地質調査及びサンプリングを行いこれまで調査した比較的浅海部の環境と比較することによって、約38億年前の海洋環境を推定することを目的とした。また、西部東側はこれまで調査した西部西側に比べて変成度の高い地域である。両地域を比較することで変成/交代作用の評価を行うことも今回の調査の目的の一つである。調査の結果、西部東側の縞状鉄鉱層はmagnetiteとquartzの互層からなり、周辺には超塩基性岩、角閃岩及びドレライト質貫入岩が観察された。分析の結果、magnetiteに富む層にはamphibole(grunerite, anthophyllite)が観察された。これに対して、西部西側の縞状鉄鉱層はamphibole(cummingtonite, anthophyllite)、magnetite及びchloriteからなる層と石英の互層で構成されている。両地域の縞状鉄鉱層を比較すると、西側の縞状鉄鉱層がamphibole-richなのに対して東側ではmagnetite-richであることが判った。また、西部西側はMgに富むamphibole(cummingtonite, anthophyllite)が見られるのに対して東側はFeに富むamphibole(grunerite)が卓越している。また、西側の縞状鉄鉱層にはchloriteなどA1に富む鉱物が観察されたのに対して、東側にはほとんど観察されなかった。以上の結果から、イスア地域西部西側の縞状鉄鉱層及びグラファイト層は東側に比べA1及びMgに富むといえる。この原因としては、(2)縞状鉄鉱層堆積時には粘土や炭酸塩も同時に堆積しており、初生的にA1やMgに富んでいたの2点が挙げられる。

(1)のような変成フルイドは超塩基性岩の交代作用によって発生することが知られているが、イスア地域西部西側には超塩基性岩は分布していない。従って(2)の可能性が高い。イスア地域の黒色頁岩及び縞状鉄鉱層に関する研究成果を以下に示す。(1)黒色頁岩において、グラファイト含有量<8.8wt%、炭素安定同位体値が-20‰前後の露頭では主要鉱物が緑泥石なのに対し、グラファイト含有量<0.5wt%、炭素安定同位体値が-14‰の露頭では角閃石・石英である。これは、Fe(III)を含む緑泥石がグラファイトを酸化して、二酸化炭素と角閃石(Fe(II))に置き換わる反応が起こったと考えられる。このように、同一層であっても、局所的にグラファイトの酸化が起こっている証拠が見つかった。(2)希土類元素含有量測定から、グラファイトの含有量が少ない露頭はLight-REEに欠乏したパターンを示すことが解った。これは、変成作用中に、REEを多量に含む鉱物が変成流体に溶して、岩石中から取り去られたものと考えられる。この結果はグラファイト含有量や炭素同位体値の結果とも調和的である。以上より、地質学的・地球化学的・岩石鉱物学的データをすべて対比させることが出来た。このように詳細なデータはこれまでの研究にないものであり、本研究結果から最古のグラファイトの起源のみならず、変成中のグラファイト-流体の同位体交換や移動プロセスについても言及することが可能となった。(3)縞状鉄鉱層中の角閃石の化学組成を測定した。北部の低変成地域ではマグネシウムに富むカミングトナイト、アンソフィライトのみが観察されるのに対し、南部の高変成地域は鉄に富むグリューネライトに卓越している。このことから、南部の縞状鉄鉱層堆積時にはシデライトが沈殿しており、変成作用の際の二次反応でグリューネライトが出来たと考えられる。これにより、詳細な岩石鉱物学的記載から、これまで行われていなかった初生鉱物の推定が可能になった。