hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
語学学習支援システムにおける能力測定のための自動作問技術に関する研究

ここで、テスト理論(項目反応理論)では、「他の設問で能力が高いと測定された学習者は正答しやすく、他の設問で能力が低いと測定された学習者は正当しにくい」問題であるかどうかを数値的に評価することで、設問の内容に依存せずに問題の質を評価することが可能となる。この性質を利用して、問題の質を自動的に評価することで、質の高い作問を可能とする生成器を構築することが本研究の主眼となる。生成器の作成には敵対的学習を用いることも考えられる。本年度は、本研究の遂行に必要となる研究機材・データの購入に主に用いた。自動作問によって作成した試験はクラウドソーシングサービス(主にランサーズ社)を通じて不特定多数に受けてもらえる環境を整えた。また、クラウドソーシングではなく実環境で被験者に解いてもらうことにより、より高精度に作問した問題の品質を評価するため、表示機器等を購入した。一方、平成30年度は自然言語処理分野全体として、穴埋め問題の作成などに用いられる言語モデルについて、ELMo(NAACL2018)やBERT(NAACL2019)等の深層学習を用いたブレイクスルーが報告され、分野全体の方向性が大きく変革した。自動作問技術も、これらの技術を用いた研究が今後数年で主流になることが容易に想定された。こうした先進技術を取り入れるため、これらの技術の調査を主眼に行った。本研究の遂行に必要となる研究機材・データの購入や作成を行ったため。また、拙速に従来技術の小規模改善を行うことよりも深層学習を用いた先端技術の調査にエフォートを割き、次年度以降に具体的にモデル提案を行う準備を整えた。自動作問については、穴埋め問題の作成などに用いられる言語モデル技術において、ELMo(NAACL2018)やBERT(NAACL2019)等の深層学習を用いたブレイクスルーが報告された。これにより、今後、自動作問技術も、こうした技術を用いた研究が今後数年で主流になることが容易に想定される状況に変化した。まずは、これらの先端技術の基礎的な性質を調べるための文献調査や、予備実験を行うことに努めた。調査によって、平成30年度に提案されたこれらの先進的な手法を、本研究の目的に合わせて改善することにより、次年度以降に、今後主流となりえる先端技術を用いた自動作問を行う準備がととのった。今後の研究の推進方策としては、平成30年度に調査を行った深層学習を用いたモデルを利用して、具体的なモデル提案を行うことが挙げられる。研究計画書では、作問の質を評価するために、不特定多数の被験者にわずかに異なる問題を繰り返し投稿することで試験を受けてもらうHuman-in-the-loopという半自動手法を主眼においていた。語学教師に評価してもらうよりは低コストではあるが、繰り返しの投稿にコストがかかる問題や、そもそも作成した問題が流出する可能性もあるため、なるべく繰り返しの投稿は少ない方が望ましい。本年度の調査によって、性能の高い言語モデルを用いれば、最初の段階でより高精度な作問を行うことが可能となると思われる。また、実際に人間に回答させるのではなく、これらの技術を用いて回答者を模倣させることで、精度向上を高める工夫もおそらく可能と思われる。
触媒移動型縮合重合によるπ共役系高分子共重合体の精密合成

π共役系高分子は、電界効果型有機トランジスタ、有機EL材料、太陽電池へ応用する研究が活発に行われている。本研究では数種の芳香族モノマーをリビング重合と同様に連鎖重合させて、分子量分布の狭いπ共役系高分子のブロック共重合体および交互共重合体を末端構造と分子量を制御して合成する手法を確立し、新しい有機エレクトロニクス材料を開発することを目的とした。その結果、ドナー性π共役系高分子から成るブロック共重合体の合成、およびアクセプター性π共役系高分子の分子量制御法が開発できた。申請者らは末端構造の明確なポリ(ヘキシルチオフェン)がリビング重合と同等な連鎖重合によって分子量を制御して合成できることを報告した。さらにこの重合は金属触媒が高分子末端へと分子内移動することによって連鎖重合が進行していることを明らかにし、ポリフェニレン、ポリフルオレン、ポリピロールのπ共役高分子もこの触媒移動型縮合重合で精密に合成できることを見出した。しかし、異なるπ共役系高分子のブロック共重合体や交互共重合体を触媒移動型縮合重合によって精密に合成することは申請者らの最近の2つの予備的な実験以外まったく行われていない。そこで本研究では、1つの芳香族モノマーを重合後、第2の芳香族モノマーを加えてブロック共重合体を合成する手法と、異なる2つまたは3つの芳香環を結合したモノマーの触媒移動型縮合重合によって交互共重合体や三元配列制御共重合体を合成する手法を確立する。本年度は(1)アクセプター性π共役系高分子の精密合成法の開発、(2)鈴木・宮浦カップリング重合におけるブロック共重合体の合成法を検討した。(1)についてはNi触媒を用いるピリジンモノマーの熊田・玉尾カップリング重合について検討した結果、3,5位で結合したポリピリジンが分子量を制御して分子量分布狭く合成できることを見出した。(2)についてはポリフェニレン合成が鈴木・宮浦カップリング重合でも進行する重合条件を明らかにした後、ポリフルオレンとポリフェニレンのブロック共重合体の合成を検討した。その結果、ポリフェニレン合成の最適条件下においてポリフルオレンも合成でき、その重合終了後にフェニレンモノマーを加えると目的としたドナー・アクセプターブロック共重合体が合成できた。本年度は鈴木・宮浦カップリング重合による(1)アクセプター性π共役系高分子の精密合成法の開発、(2)ブロック共重合体の合成法を検討した。(1)についてはピリジンモノマーの重合について検討した結果、Pd錯体開始剤のアリール基がポリピリジン末端に導入されることから触媒移動型重合が進行していることが示唆されたが、容易に不均化反応が起こることも明らかにした。(2)についてはポリチオフェンが鈴木・宮浦カップリング重合でも制御して得られることを明らかにした。さらにフルオレンモノマーを重合後、チオフェンモノマーを加えると両者のブロック共重合体が合成できることを明らかにした。本年度は(1)熊田・玉尾カップリング重合におけるアクセプター性π共役系高分子の精密合成法の開発、(2)鈴木・宮浦カップリング重合におけるポリチオフェンの触媒移動型重合の最適化を検討した。

(1)についてはチアゾールの2位をGrignard化した5-プロモチアゾールは副反応を伴うため効率よく重合しないが、Grignrad化部位と臭素部位を逆にしたチアゾールが高分子量体を与えることを見出した。しかし、反応溶媒への溶解性が低く、4位のアルキル置換基を今後検討する。(2)についてはチオフェンモノマーのボロン酸ピナコールエステルをトリオールボレートとしたモノマーの重合を検討した結果、連鎖重合性が低下することを見出した。今後、ホウ素部位の連鎖重合性に及ぼす影響についてモデル反応によって明らかにする。
高速列車走行による発生する超低周波音の流体モデルによる解析

山梨リニア実験線において、高速列車走行時に発生する低周波音の測定を行い、発生低周波音の距離減衰、速度との関係、トンネル(緩衝工)入口による影響を調査した。研究室において、実車両1両の1/100模型列車により高速列車による低周波音発生実験を行った。模型実験により、明かり区間での列車周りの圧力場による低周波音の速度との関係、距離減衰等の特性について明らかにした。これらの結果は、山梨リニア実験線での低周波音速体による結果と概ね一致するものであった。ポテンシャル流れモデルにより高速列車周りの圧力場を解析することで、明かり区間を一定速度で走行する高速列車より発生する低周波音の数値シミュレーション可能であることを示した。シミュレーションにより得られた結果は、山梨リニア実験線の結果及び模型実験の結果と概ね一致した。このシミュレーションにより、低周波音波形と軌道距離、低周波音と列車速度の関係、距離減衰、列車長さの影響、軌道距離と低周波音スペクトルの関係等を明らかとした。列車模型により、トンネル入口における低周波音波形の変化と、レベルの増加について実験を行った。これにより、高速列車のトンネル突入時の圧力場の変化の様子、トンネルと波形変形の関係、これらへのトンネル直径の影響等について明らかとした。これらの結果から、高速列車による明かり区間での発生低周波音はシミュレーションにより、トンネル入り口付近における低周波音は模型実験結果から概ね予測できる。高速列車走行時に発生する低周波音の特性を調べ、模型実験・シミュレーションの結果と比較検討するために、山梨リニア実験線において明かり区間、緩衝工入り口付近、軌道下部分におけるリニア走行時の発生音の測定を行った。この測定により約200km/h500km/hで走行する高速列車による発生低周波音のサンプルを得た。また、研究室において実際の車両の1/100模型列車による走行実験を行い、明かり区間・緩衝工入り口付近における高速列車模型周辺の圧力変動を細かに測定し、列車周りでの圧力分布とその移動、緩衝工の圧力分布への影響、圧力分布の距離減衰、圧力波の伝播速度、測定位置と低周波音問題の発生要因等について解析を行った。これらの測定・解析により、実高速列車と模型実験での相似・差異について明らかにした。また、緩衝工またはトンネル入り口付近における低周波音の発生原因を、明かり区間から緩衝工入り口の間の位置関係により、列車周りの圧力場の移動に原因する低周波音と緩衝工入り口周辺で発生する圧力波が圧縮性弾性波として伝播することに原因する低周波音で分類し解析することで、緩衝工周辺における低周波音の減衰・伝播速度等の特性の変化を明らかにするとともに、今後の流体モデルによるシミュレーションのための各種パラメータを得た。また、都内私鉄・ゼネコンの協力により、営業線において列車がトンネル内を走行する際にトンネル軌道内に発生する騒音・圧力波及び列車横の騒音変動の測定を行い、今後の高速列車によりトンネルロ周辺で発生する低周波音を分析するうえでのサンプルを得た。昨年の高速列車模型実験装置による模型実験では,列車発射装置から発生する騒音のために,圧力場変化の小さな列車軌道から離れた位置ではデータのS/N比がわるくなっていた。そこで,本年度は列車発射装置の軸受け部の改良を行うと共に,発射装置全体を吸音材を内張したカバーで覆う等の低騒音のための改良を加え,模型実験の精度を高める工夫をした。高速列車が明かり区間の走行時に列車周りに発生する圧力場の状態を,速度ポテンシャル流れのモデルより数値計算し,圧力場の特徴を捉えた。ポテンシャル流れモデルによるシミュレーション結果を評価するために,シミュレーションのモデルと対応した実車両1/100模型による高速走行実験を行い,ポテンシャル流れモデルによるシミュレーションの信頼性を確認した。シミュレーション及び模型実験により,高速列車周りの空気流れの状態と圧力場をとらえると共に,軌道からの距離・列車速度による低周波音レベル・周波数等への影響を確認した。高速列車模型実験装置により,トンネル(緩衝工)入り口付近の圧力場の変化を,トンネル入り口付近に設けた格子状の測定点で測定し,圧力場の時間分布を得た。山梨リニア実験線において,緩衝工入り口から明かり区間側約100mまでの軌道横の地点で,リニア速度約450km/hにおける低周波音圧波形の測定を行った。

この軌道方向の実地調査により得られた低周波音分布により,緩衝工入り口付近の圧力場の変化をとらえた。この結果は模型実験による圧力場の変化とほぼ同様な傾向を得られたことから,模型実験の結果と実高速列車による現象の同一性の確認が得られた。明かり区間を高速で走行する列車周りの圧力場をポテンシャル流れモデルにより数値解析を行い、圧力場が変化することにより発生する低周波音について、シミュレーションを行いった。このシミュレーションにより発生する低周波音の距離減衰特性、列車速度と音圧の関係、周波数特性、列車形状の影響等について明らかとした。またこのシミュレーションにおいてポテンシャル流れモデルに現れる不静定項の取り扱いについて、風洞実験モデルと実走行モデルにおける矛盾がないことを確認した。研究室に於いて実車両1両の1/100模型列車による模型実験を行い、明かり区間で発生する低周波音の各特性がシミュレーションの結果と一致することを確認した。また新幹線・リニア実験線等で問題となっているトンネル入り口周辺での低周波音発生について、トンネル模型入り口周辺に格子状測定点を設け各点で発生低周波音を測定することにより、トンネル入り口周辺での圧力場の変化の様子と低周波音伝播の様子について空間的・時間的に観察すると共に、圧力場の変化過程・発生低周波音のレベルとトンネル直径との関係について実験的に明らかにした。この測定により、列車周りの圧力場からトンネル入り口により圧力弾性波として伝播する低周波音について解析を行った。さらにこれらのシミュレーション結果、模型実験結果を確認するために、山梨リニア実験線の緩衝工入り口付近で、リニア走行時に発生する低周波音の測定を行った。
ラジカル重合によるデンドリマ-状高分子の合成

α-置換メチルアクリル酸メチルは置換基の種類によっては、付加開裂連鎖移動剤となり付加開裂が優先し2分子停止の寄与を最小限にすることができる。したがって、多官能性付加開裂連鎖移動剤を添加したビニルモノマーの重合により、分岐構造および多重分岐構造の生成と制御が可能となった。α-(ベンジルチオメチル)アクリル酸メチル(1)を連鎖移動剤を少量添加してメタクリル酸メチル(MMA)の重合を行うと、生成ポリマーの末端と移動剤切片のカルボメトキシアリル基の間にC-C結合が生成する。この不飽和末端基にポリ(MMA)ラジカルは付加しないが、ポリ(St)ラジカルは末端基に付加し最終的には2本のポリ(St)鎖が結合する。したがって、生成ポリマーは分岐ブロック共重合体あるいは星型ブロック共重合体となる。Stの重合に少量の1を加えると、付加開裂により生成した不飽和末端基へのポリ(St)ラジカルの付加も起こり星型ポリ(St)が得られる。2官能性付加開裂連鎖移動剤であるα-(ベンジルチオメチル)アクリル酸エチレン(2)を用いてMMAの重合を行い、2本のポリ(MMA)鎖が連鎖移動剤切片で結合したポリマーを得た。この場合は、連鎖移動剤の切片を介して2本のポリ(MMA)鎖が結合するが、ゲル化は起こらない。このポリマーの共存下でStの重合を行うと、分岐が増し星型ブロック共重合体が得られた。多官能性連鎖移動剤を用いると、ポリマー鎖中に導入できる分岐点の数には限りがある。そこで、α-アシロキシメチルアクリロイル基と付加開裂を行うα-(ベンジルチオメチル)アクリロイル基を含む重合性の付加開裂連鎖移動剤(3)を合成した。3を使用してMMAの重合を行うと分岐点が導入されるが、分岐にも分岐点が含まれるため多重分岐ポリ(MMA)が得られた。^1H-NMRによる構造解析で3単位ならびに不飽和末端基の含量は決定できるから、多重分岐ポリマーの構造を明確にすることができる。さらに、Stの重合に共存させて分岐数の増した多重分岐ブロック共重合体が得られたが、現段階では単独重合体の生成は避けられない。本研究では、α-置換メチルアクリル酸エステル(CH_2=C (CH_2X)COOR)でX=Br、SR'等の付加開裂連鎖移動では、2分子停止の寄与を最小限としα-末端にはXがω-末端にはCH_2C (=CH_2) COORが定量的に導入されることを利用してラジカル重合ポリマーの分岐構造を制御し、架橋のないデンドリマ-状の高度分岐ポリマーの合成を検討している。本年度は、^1H-NMRのよる末端基定量の容易さを考慮しX=SCH_2C_6H_5の2官能性付加開裂連鎖移動剤であるCH_2=C (CH_2SCH_2C_6H_5)COOCH_2CH_2OOCC-(CH_2SCH_2C_6H_5)=CH_2を合成して使用した。

少量の連鎖移動剤を添加してメタクリル酸メチルの重合を行い、生成ポリマーの^1H-NMRスペクトルにおける付加開裂で生成したC=CH_2とOCH_2のプロトンによる共鳴の強度比とGPCで求めたM_nとを比較し2本のポリマー鎖が-CH_2C (=CH_2) COO-を介して-CH_2CH_2-に結合していることを確かめた。なお、この重合では高重合率に達しても架橋は起こらず所定の連鎖移動が効率よく起こっていることがわかる。さらに、重合性の二重結合と付加開裂連鎖移動を行う炭素-炭素二重結合とを含む化合物であるCH_2=C (CH_3) COOCH_2CH_2OOCC (CH_2SCH_2C_6H_5)=CH_2も合成した。この連鎖移動剤を少量添加してメタクリル酸メチルの重合を行い、分岐ポリマーラジカルが連鎖移動性二重結合に付加して結合するから、架橋を起こすことなく高度分岐ポリマーを合成することができた。この場合も、構造解析により分岐点含量および平均分岐長を決定し、構造設計の可能な分岐ポリマーの合成法としての有用性を確認した。なお、X=Brの多官能性連鎖移動剤の合成も試みたが、ブロモメチル基自身が高反応性であるため基本構造が損なわれ成功したなかった。α-置換メチルアクリル酸メチルは置換基の種類によっては、付加開裂連鎖移動剤となり付加開裂が優先し2分子停止の寄与を最小限にすることができる。したがって、多官能性付加開裂連鎖移動剤を添加したビニルモノマーの重合により、分岐構造および多重分岐構造の生成と制御が可能となった。α-(ベンジルチオメチル)アクリル酸メチル(1)を連鎖移動剤を少量添加してメタクリル酸メチル(MMA)の重合を行うと、生成ポリマーの末端と移動剤切片のカルボメトキシアリル基の間にC-C結合が生成する。この不飽和末端基にポリ(MMA)ラジカルは付加しないが、ポリ(St)ラジカルは末端基に付加し最終的には2本のポリ(St)鎖が結合する。したがって、生成ポリマーは分岐ブロック共重合体あるいは星型ブロック共重合体となる。Stの重合に少量の1を加えると、付加開裂により生成した不飽和末端基へのポリ(St)ラジカルの付加も起こり星型ポリ(St)が得られる。2官能性付加開裂連鎖移動剤であるα-(ベンジルチオメチル)アクリル酸エチレン(2)を用いてMMAの重合を行い、2本のポリ(MMA)鎖が連鎖移動剤切片で結合したポリマーを得た。この場合は、連鎖移動剤の切片を介して2本のポリ(MMA)鎖が結合するが、ゲル化は起こらない。このポリマーの共存下でStの重合を行うと、分岐が増し星型ブッロク共重合体が得られた。多官能性連鎖移動剤を用いると、ポリマー鎖中に導入できる分岐点の数には限りがある。そこで、α-アシロキシメチルアクリロイル基と付加開裂を行うα-(ベンジルチオメチル)アクリロイル基を含む重合性の付加開裂連鎖移動剤(3)を合成した。3を使用してMMAの重合を行うと分岐点が導入されるが、分岐も分岐点が含まれるため多重分岐ポリ(MMA)が得られた。^1H-NMRによる構造解析で3単位ならびに不飽和末端基の含量は決定できるから、多重分岐ポリマーの構造を明確にすることができる。さらに、Stの重合に共存させて分岐数の増した多重分岐ブロック共重合体が得られたが、現段階では単独重合体の生成は避けられない。
プレホスピタル輸液としての高張膠質液と、腸管微小循環と予後の関係についての検討

本研究は、現実に救急の場で起こりうる出血性ショックを想定し、プレホスピタルで最も有効な輸液を模索する目的で行った。従来の出血性ショックに対する輸液の効果は、血圧・心拍数などのマクロな循環を指標としてきた。しかし救急の場で一命を取り留めても、病院搬送後にの治療に効果的に受け渡すことが出来なければ予後は悪くなる。本研究では長期的な予後を左右するといわれている腸管微小循環の回復を指標(血流、酸素分圧)として比較した。群は、出血非処置群、出血量の3倍量の酢酸リンゲル液投与群(AR group)、出血量と等量の膠質液(ヒドロキシエチルスターチ:HES)を投与した群(HES group)、高張膠質液を4mL/kg投与した群(HHS group)とした。その結果、輸液を行わない群はすべて死亡した。一方、輸液を施行した群間で腸管の微小循環に関する指標で、有意な差は観察されなかった。しかし最終的な結果ではHES groupが比較的良好な回復を示した。HHSはHES groupほど効果に持続は見られなかったものの、少量でプレホスピタルでの輸液を賄うことが出来た。HHS groupに効果の持続が見られなかった理由として、本研究における出血性ショックが重篤すぎて、4mL/kgという投与量では充分な循環血液量を回復するに至らなかったことが考えられる。高張食塩液は血管外から浸透圧較差で水分を引くことで循環血液量を回復させるが、重篤な出血では間質の水分が既に消費されている可能性がある。このところは検討の余地が残る。しかし、プレホスピタルという人手の足りない状況で、しかも短時間で効果を得たい場合、高張膠質液が少量で大きな効果が得られることは有益と考えられる。本年度は、主に出血に伴う微小循環系の観察に主眼を置いた。脱血により、微小循環の広範囲に存在する毛細血管網の血流は減少し、ある程度の太さを持つ細動脈の流れだけになることが、生体顕微鏡下で観察された。これは本来大量の血液が存在すると思われる毛細血管網の容量が減少したことを示す。この現象は、脱血に伴う循環血液量の減少により引き起こされる臓器潅流圧の減少を防御するためにも必要な反応である。先に行われた、循環血液量の10%程度の出血に対する同量の6%FITC-HES投与時の微小循環系観察では、大・中・小の分子量の違いにかかわらず、投与開始3分後には多くのFITC-HESが血管外に漏出した。時間の経過と共に小分子量のHESは血管内から消失していくのが観察された。一方、中・大分子量のHESは投与後2時間において80%以上が血管内に留まっていることが観察された。これにより、ある程度の出血に対する膠質液として、HESの分子量は必ずしも大きい必要はなく、今回の研究での中分子量のHESでも十分であることが示された。また、循環血液量の約1/3を脱血し、同量のHESを投与すると、投与後約1時間はどの群(大・中・小分子量)においても血管外に漏出することはなかった。この現象は大量出血後に毛細血管網の大部分が閉鎖して、物質移動の場となる部分が少ない細動脈系だけが開通していたことを示すものと思われる。この場合、小分子量のHESでもある程度の時間は血管外に漏出することはないことが示されたことでもあり、大量出血のさいの膠質液として小分子量のHESも有効であると考えられる。

なお、大量出血後であってもHESを投与して循環が安定した場合、毛細血管網でのFITC-HESの漏出が観察された。これは膠質液投与により循環血液量が正常に近づいたこと、そして循環の安定により毛細血管における静水圧の増加したことにより、小分子量のHESは血管外に漏出したものと考えられる。前年度の研究結果から、人工膠質液としては平均分子量175-225kDaのHESが幅広い出血性ショックにおいて良好な循環血液量改善効果を発揮することが認められた。本年度は、この人工膠質液と現在一般に用いられている酢酸リンゲル液、高張食塩液に人工膠質を加えた高張膠質液を用いて、救急の現場を想定した出血性ショックモデルでの輸液(Prehospital fluid therapy)を行った。特に、救命処置後の予後に関わるとされる腸管微小循環に着目した。出血後に輸液を施さなかった群は受傷後90分までにすべて死亡した。本研究で用いた出血性ショックは重篤であり、輸液無しでは致命的であることが分かった。出血量の3倍量を投与した酢酸リンゲル液群、出血量と等量を輸液したHES群、出血量の約18%の7.5%NaClに人工膠質液を添加した高張膠質液群、いずれの群も輸液してから病院搬送時まではすべて生存した。しかし、大量の輸液を施した酢酸リンゲル液群では腸管粘膜血流が著しく低下し、HES群ではコントロール値の約2/3程度を維持した。最も少ない量を投与した高張膠質液群ではコントロール値のほぼ半分程度を維持した。これらすべての群で、病院到着後直ちに輸血を開始した。その結果、病院到着時から5時間後には高張膠質液群において、腸管粘膜血流は最も高値を示した。出血源のコントロールの不可により輸液療法は左右される。本研究では受傷から病院での高度医療施行までのプレホスピタルにおける輸液療法に着目した。特に純粋な循環血液量減少を回復させる輸液療法に焦点を絞った。救急の場では、時間や人手が足りないこともあるため、少量で有効かっ安全な輸液が望まれる。従来、乳酸・酢酸リンゲル液のような細胞外液の大量輸液が救急における輸液療法の基本であった。確かに本研究でも晶質液の大量投与により病院到着までは生存可能であった。しかしその後の循環改善と維持という点からは疑問が生じる。中長期的な予後を鑑みると、腸管粘膜機能の維持、つまり腸管微小循環維持が重要な役割を示すことが知られている。本研究では、輸液を多く使用した群よりも少:量投与であった高張膠質液群が、受傷後5時間での腸管微小血流は最も多かった。晶質液は投与量の約2/3は血管外に漏出するとされ、大量に投与される水分の大半は間質に移動する。これは組織への酸素供給に不利な要因となる。特に大量出血のように末梢循環不全を伴う場合、末梢組織は虚血に陥りやすくなる。また膠質液では膠質性分すべてが血管内に留まるわけではなく、一部は間質に留まり浮腫を形成すると考えられる。本研究結果からも、高張膠質液は十分な潅流圧を保つことはできなかったが、腸管微小循環の血流維持に有利に働いていることが示された。これは高張膠質液が血管周囲の浮腫を発生させにくいことを示唆するもので、病院到着後の輸液療法に有利に働くものと思われる。
科学技術革新と武力紛争形態の変容：新しい戦争に対する国際法整備のための学際研究

近年、ドローン・サイバー攻撃・ロボットといった新しいテクノロジーが、日常生活のみならず、戦争にまで用いられるようになってきている。しかし、これら技術の発展は従来になく急速であるため、国内社会や国際社会におけるルールづくりは、技術革新の速さに追い付いていない。この研究では、これら先端技術の利用を推進するとともに、不適切な使用を規制するためのルールを国際法および国内法でどのように整備すべきかを検討した。平成27年度は、本研究が対象とする新技術・新兵器のなかでも特に、無人航空機(いわゆるドローン)と標的型サイバー攻撃に焦点を絞り、研究を推進した。我が国の官邸へのドローン落下事件や官公庁・企業の重要技術・個人情報漏えい事件をきっかけとして、これら2つの対象は、急速に社会的関心事となった。本研究でも、その関心の高まりを踏まえ、研究対象とする意義が急速に高まったと判断し、これらを特に重視した。本研究を開始した時点では、ドローンの規制議論は国内ではほとんど論じられることがない状況であり、「研究実施計画」に示したように、ドローンを含み新型兵器の規制議論は、特定通常兵器禁止制限条約(CCW)締約国会議といった国際会議に委ねられていた。しかしながら、上述のような国内情勢の変化は、これら技術の国内法規制を急速に活性化させることとなり、国際条約は一般的に各国国内法を如実に反映したものとなることから、日本国内での規制論と、その参照事例となっている他国の国内法の動向を検討することにした。また、標的型サイバー攻撃に関しては、人工知能を使用した、より高度化・自動化された攻撃が増えつつある。本研究では、そうした自動化されつつあるサイバー攻撃の技術的動向を検討した。さらに、この新たな技術的動向が、一方で有益な技術でもある人工知能の平和的活用を妨げず、適切な規制を行う方法について、電子計算機上に実験室としてのサイバー空間を構築し、攻撃と監視のシミュレーションを実施するなどによって、研究メンバーで検討を行った。公共政策モデル作成に関しては、データ収集のためのシステム設計を行った。実際の運用は、次年度から行い、収集されたデータによるモデル構築を進める。研究代表者およびすべての研究分担者は、「研究実績の概要」で記した通り、当該研究テーマの世界的関心にともなう情勢の変化に対応しつつ、おおむね交付申請書に記載した「研究実施計画」に沿った研究を実施した。また、本研究テーマおよび研究内容の先駆性が注目され、代表者所属機関である京都産業大学の理解と支援を受けて、同大学の総合学術研究所内に特定研究センターとして「グローバル公共財研究センター」という拠点を設けることが出来た。その結果、研究の進捗過程において、適切に会合を持ち、代表者の主導のもと、本研究テーマをめぐる世界的情勢の変化に関する情報の集約、これをふまえた互いの研究進捗状況の確認と意見交換ならびに知見の共有を効果的に実施することが可能となった。平成28年度の世界の武力紛争情勢では、引き続きシリア内戦が最も深刻な事態であり続けた。シリア内戦では、無人航空機(ドローン)が一般的に使用される兵器となったことに加えて、先進国社会でも人員不足・費用削減・災害支援という点で、ドローンに対する関心は一段と高まっていった。こうした状況を踏まえて、平成28年度には、本研究が対象とする新技術・新兵器のうち、無人航空機(ドローン)に焦点を絞り、研究を推進した。その成果は、次の2点を通じて公開・具体化した。第一に、本研究の持続的推進を目指して、平成27年度に代表者所属機関内に設立したグローバル公共財研究センターのもと、公開シンポジウム「グローバル公共財としての法規制と技術開発-ドローンによる産業革命:課題と展望-」を開催した。シンポジウムでは、1ドローンに関する法規制と2情報セキュリティ技術からみたドローンの問題点の解明という本研究の成果に加えて、3ドローン産業のベンチャー企業経営者を招き、研究に対する要望を議論することで、その後の研究の精緻化を行った。第二に、ドローン関連の国際国内法、行政文書、民間文書、さらにソーシャルネットワーク上のデータ(いわゆるビッグデータ)を集積し、そのデータベースを上記センターに構築するプロジェクトに着手した。具体的には、インターネット上の上述データを自動的に収集し、汎用データベースとして利用可能な書式に変換するシステムのひな形を作成し、次年度以降での本格実装が可能であることを確認した。研究代表者およびすべての研究分担者は、「研究実績の概要」で記した通り、当該研究テーマの世界的および国内的関心に伴う情勢変化に対応しつつ、おおむね交付申請書に記載した「研究実施計画」に沿った研究を実施した。また、本研究テーマおよび研究成果の先駆性が、代表者所属機関である京都産業大学に理解され、平成27年度にはグローバル公共財研究センターが設置されたが、平成28年度にはさらに、学内の「特定課題研究」としての支援も受けることができるようになった。このように、研究成果の創出および支援体制の拡充の両面において、着実に進歩がみられることから、おおむね順調に進展していると判断できる。本年度は、本研究が対象とした、武力紛争に使用される新技術ドローン、インターネット、ロボットのうち、インターネットを利用したサイバー攻撃に関して重点的に研究を行った。具体的には、(1)インターネット脆弱性に関する公開データベースに掲載された10万件以上の脆弱性データを取得し、(2)サイバー攻撃のタイプを独自の基準で5つに区分したうえで、(3)各脆弱性を、その脆弱性が被りやすい攻撃のタイプ別に分類する、というコンピュータ・システムを構築した。

本システムの特徴は、日々発見されるインターネット上の膨大な脆弱性を、それらが被りやすいサイバー攻撃別に自動分類するという機械化を実現し、攻撃動向の特徴を最新の脆弱性までも含めて瞬時に明らかにするという点にある。上記システムは、以下の2つの意義を持っている。第一に、各インターネット脆弱性がそれぞれ潜在的に内包している、攻撃に対する危険性のタイプを個別に明らかにする点で、日常的なサイバーセキュリティ対策に、本システムを役立てることができる。第二に、膨大なデータをまとめて整理・分類することで、サイバー攻撃の時系列的変化や地域的特徴などを可視化することができ、それによって本システムは、グローバルな観点からサイバー攻撃を体系的に把握することを可能とする。特に第二の意義は、本研究の申請時に述べた目的に照らして重要といえる。すなわち、本研究の目的は、新技術の武力紛争への使用に対する国際法整備を検討することにあったが、この点で、本システムが解明するサイバー攻撃のマクロな特徴・動向は、個々のサイバーセキュリティ対策をこえた、中長期的な法整備や政策に役立てることができ、本研究の目的に即した成果を実現している。なお、最終的に約13万円を未執行としたが、これはデータベース用コンピュータの計算能力が当初の想定よりも高く、マシンの追加購入を中止したことによる。近年、ドローン・サイバー攻撃・ロボットといった新しいテクノロジーが、日常生活のみならず、戦争にまで用いられるようになってきている。しかし、これら技術の発展は従来になく急速であるため、国内社会や国際社会におけるルールづくりは、技術革新の速さに追い付いていない。この研究では、これら先端技術の利用を推進するとともに、不適切な使用を規制するためのルールを国際法および国内法でどのように整備すべきかを検討した。全体としては、平成27年度中の社会変化とそれに対応した研究実績に基づき、ドローンと、標的型および自律型サイバー攻撃を分析対象の中心に置き、以下の3点を軸に研究を遂行する。まず法的規制論に関しては、平成27年度と同様に進める。ただし、「研究実績の概要」でも述べたように、本研究の分析対象に対する規制論の日本国内での高まりを踏まえて、国際条約交渉のみならず、国内の規制論、および他国における国内法規制論も分析に含める。次に技術論に関しては、ドローンやロボット兵器については当初から、自動(自律)は視野に入れられていたが、「研究実績の概要」でも触れたように、サイバー攻撃においても「自動化」の波が急速に進展している。このことを踏まえて、「自律化」によってもたらされる諸課題・被害に対する検討の比重を高める予定である。3番目に公共政策モデルに関しては、本年度から実装を開始するビッグデータ収集システムを利用し、モデルを構築する。こうしたデータ収集自体が、きわめて斬新な取り組みであることから、その過程では多くの試行錯誤が予想される。そのため、平成28年度は、モデル構築を最終目標としながらも、データベース自体の完成度を高めることも、ひとつの課題となる。なお、研究の分担体制については、従来通りである。
ウエストナイルウイルス感染ノックアウトマウスにおける脳内浸潤特異的Ｔ細胞の検討

KOマウスのバックグラウンドであるC57BL/6マウスを用いて、ウエストナイルウイルスよりも取扱いが簡便な日本脳炎ウイルスをまず感染させ、免疫学的病態解明を行った。JaOArS982株の感染実験は感染後10日の体重変化から予後判定(死亡群と生存群)が可能である。両群間の免疫学的性状を比較したところ、死亡群では生存群よりもTh1タイプサイトカイン、細胞障害性因子の有意な増加が認められた。一方、Treg関連遺伝子の発現は生存群において増加した。T細胞受容体レベルでの解析では、脳内で死亡群と生存群で異なるT細胞クローンが存在した。質的に異なるT細胞が脳内に浸潤・増殖していることが示唆された。本研究ではウエストナイルウイルス(WNV)感染における病態解明のためにマウスを用いた感染実験を実施している。WNVと同じ血清型に含まれる日本脳炎ウイルス(JEV)はWNVと比べて取扱いがしやすく、P2施設での実験が実施可能であるため、予備実験としてJEVでの反応性を精査している。昨年はJEVのOArS982株をC57BL/6マウスに感染させた際の病態について解析した。このウイルスをマウスに感染させると濃度非依存的に約半数のマウスを致死に至らしめる毒性を持つが、残りの半数は生存するという病態を示す。この理由について細胞性免疫の違いが影響しているのではないかという発想の基に、qPCRを用いたT細胞関連分子の発現解析、TCRレパトア解析、CDR3シークエンス解析を実施した。その結果、生存群と死亡群の脳内ではTh1サイトカイン、T-betやGATA3などの上位転写因子の発現量が異なることがわかった。さらにFoxp3やTGF-beta1などのTreg関連因子が生存群で死亡群よりも増加していたことから、過度の炎症を軽減することが生存に有利であることが示唆された。異なる性状に導く理由がT細胞の種類に影響されるかを評価するためにTCRレパトア解析を実施したところ、生存群と死亡群ではMock群に対して共通するTCRV遺伝子の増加を認めた。しかしCDR3シークエンス解析では同じ増加したV遺伝子を所有するT細胞でありながら、CDR3配列は生存群と死亡群で厳格に異なった。したがってJEV感染において生存群と死亡群では異なるT細胞の浸潤とその誘導する細胞性免疫によって生死が分かれる可能性が示唆された。本研究の目的は、フラビウイルス属に含まれるウエストナイルウイルス(WNV)において、C3H/Heマウスにおける感染実験で確立した実験手法及び解析法を用いて、KOマウスの実験系が整備されているC57BL/6マウスにおける感染実験を実施し、病態解明を行うことにある。そのため、まずWTのC57BL/6マウスにおけるフラビウイルス感受性を正確に評価するため、P3のWNV感染実験を実施する前に、扱いやすいP2のWNVと同じ血清型に含まれる日本脳炎ウイルス(JEV)感染実験を実施した。具体的にはJEVのJaOArS982株をC57BL/6マウスに感染させた。発症した個体の脾臓と脳を経時的に採取し、Total RNAを抽出した。T細胞の抗原特異的性を評価するため、TCRレパトア解析法(Adaptor-ligation PCR、Microplate hybridization assay)を実施した。TCR抗原認識部位のアミノ酸配列の特異性を評価するため、CDR3サイズスペクトラタイピング、CDR3シークエンス解析を行った。リアルタイムPCR解析により、細胞性免疫にかかわる各種マーカーの発現量を定量した。Mock群脾臓との比較において、各感染群13 dpiの脳では共通したTCRレパトアファミリーのskewが確認された。シークエンス解析において個体間に共通するクローンが高頻度に認められた。リアルタイムPCR解析の結果から、JEV感染マウス脳内はMock群のそれと比較してTh1タイプのサイトカインバランスを呈し、その偏りは13 dpiまで徐々に増加した。本研究では、ウエストナイルウイルス(WNV)感染にお寝る病態解明のために、マウスを用いた感染実験を実施した。WNVと同じ血清型である日本脳炎ウイルス(JEV)はWNVと比べて危険度のカテゴリが低く取扱いが容易であるため、予備実験としてJEVにおける反応性をまず検討した。さらにKOマウスのバックグラウンドはC57BL/6マウスであるが、これまで実施してきた実験ではウイルス反応性が良いC3Hマウスを採用していたため、WTのC57BL/6における反応性の評価から進める流れとなった。感染実験に使用したウイルスはJEVのOArS982株で、濃度非依存的に約半数のマウスを死亡させ、半数は生存する病態を示すことが知られている。

病態の差異が細胞性免疫の違いによって引き起こされる可能性を考慮するため、生存群と死亡群についてqPCRを用いたサイトカインプロファイル、T細胞関連遺伝子、細胞障害性因子の検討を実施した。さらにT細胞の特異性を評価するため、TCRレパトア解析を実施した。結果、死亡群では生存群に対して有意にTh1サイトカイン、細胞障害性因子の増加が認められ、TCRレパトア解析では、脳内に浸潤するT細胞は生存群と死亡群で異なることを証明した。したがって、JEV感染において、両群間では異なるT細胞の浸潤とその誘導する異なる細胞性免疫によって生死が分かれる可能性が示唆された。本研究は3年で満期となるため、書類上では一旦終了となるが、感染実験における基礎的知見を収集することができたため、今後も引き続き機会を見て研究を進めることとする。ウイルス学昨年に引き続きC57BL/6マウスを用いたフラビウイルス感染実験を実施している。細胞性免疫において特異性がその後の免疫性状を大きく変化させる可能性を本実験では見出すことができた。これは今後実施するKOマウス実験においても感染の病態を適切に判断するための重要な指標となり、今後も継続してウイルス、動物、免疫がどのようなメカニズムで生存や致死、炎症の程度などをコントロールするかについて検討を進めていく。C3H/HeマウスとC57BL/6マウスはMHCハプロタイプが異なるために抗原特異的T細胞のクローンは当然異なるものの、C57BL/6マウスにおける感染実験においても細胞性免疫において特異性が認められた点、またTh1タイプのサイトカインバランスを呈した点はモデルマウスとしての意義は大きい。これはKOマウスの実験系が整備されているC57BL/6マウスにおけるフラビウイルス感染実験が、従来の実験手法及び解析法を用いて評価を行うことができることを示唆する。したがって研究を続行するうえで、今後のKOマウス感染実験が順調に進展することを予測できる。今後の研究の推進方策として、WNV感染におけるT細胞の免疫学的役割について解析を進める。具体的にはWNV脳内浸潤T細胞クローンの樹立として、WNV感染に伴い脳炎を発症した各KOマウスを作成し、脳内よりWNV特異的T細胞クローンを樹立する。抗原刺激により活性化したT細胞のクローナリティーは相当高いものと推測されるが、TCRの各V領域に対する抗体を吸着させたMACS法を利用して、TCRレパトア解析によって特定されたV遺伝子を有するT細胞を抽出する方法も代案として用意している。このようにして得られたT細胞クローンを他動物に移入することで、感染初期にウイルス排除に対して活性化可能なT細胞が存在する状況を作製し、その挙動を評価することができる。今後の研究の推進方策として、WNVの病態におけるT細胞の機能的役割解析を進める。WNV脳内浸潤T細胞クローンの樹立として脳炎を発症した各KOマウスから、脳内浸潤T細胞クローンを樹立する。抗原刺激により活性化したT細胞のクローナリティーは高いものと推測されるが、TCRの各Vセグメントに対する抗体を吸着させたmagnetic beadsを利用して、TCRレパートリー解析によって特定されたV遺伝子を有するT細胞を抽出することも考慮する。さらにT細胞クローン移入に伴う病態変化を検討する。
可変長-固定長符号としてのLempel-Ziv増分分解法の研究

近年,データ圧縮技術への期待が高まっている.通信需要以外にも,大量に蓄積しつつあるデータを記録媒体に長期にわたって効率的に記憶するにはデータ圧縮が不可欠であり,特に後者の目的には,算法が究極的な圧縮性能を持つよう設計しなければならず,長い視野に立った基礎研究が重要である.著者は,こうした視点に立って,実際と理論両面から,データ圧縮法に関する諸問題に取り組んできた.今回の研究の対象としたのは,誤りなしデータ圧縮法に分類されるLempel-Ziv増分分解法(以下LZ法と略)である.この分解法は,既に標準的なファイル圧縮法として普及しているとはいえ,圧縮限界からのずれを示す冗長度などの重要な性質には十分理解されていないところがあるうえ,アルゴリズム的にも改善すべき点がある.冗長度を知るには,ファイルに情報源確率モデルを仮定し,圧縮率を理論的に評価することが必要である.筆者は以前,無記憶情報源に対する圧縮率の厳密式を発見し,それを評価する方法を提案した.しかし,無記憶の仮定は情報源モデルとしては現実的でなく,これをマルコフ過程に拡張することが望まれる.ところが,LZ符号は非定常かつ自己組織的な符号であり,無記憶の場合すらその厳密解析は困難であった.著者はまずLZ増分分解列の期待長がなす奇妙な再帰関係に着目し,この解法を行なうという方法をとった.半無限列上に4つの基本的な作用素を定義し,その性質を利用してこの再帰関係を解くという別道を発見し,極めて形式的にLZ自己組織木の深さの統計量を,求める方法を見い出した.それによって,ユニフィラマルコフ過程に適合した状態依存型LZ増分分解法の厳密な圧縮率を求める閉式を見い出した.この結果は,その漸近解析とあわせて,IEEE情報理論国際シンポジウムで発表を予定しているが,同時に論文としても公表するつもりである.近年,データ圧縮技術への期待が高まっている.通信需要以外にも,大量に蓄積しつつあるデータを記録媒体に長期にわたって効率的に記憶するにはデータ圧縮が不可欠であり,特に後者の目的には,算法が究極的な圧縮性能を持つよう設計しなければならず,長い視野に立った基礎研究が重要である.著者は,こうした視点に立って,実際と理論両面から,データ圧縮法に関する諸問題に取り組んできた.今回の研究の対象としたのは,誤りなしデータ圧縮法に分類されるLempel-Ziv増分分解法(以下LZ法と略)である.この分解法は,既に標準的なファイル圧縮法として普及しているとはいえ,圧縮限界からのずれを示す冗長度などの重要な性質には十分理解されていないところがあるうえ,アルゴリズム的にも改善すべき点がある.冗長度を知るには,ファイルに情報源確率モデルを仮定し,圧縮率を理論的に評価することが必要である.筆者は以前,無記憶情報源に対する圧縮率の厳密式を発見し,それを評価する方法を提案した.しかし,無記憶の仮定は情報源モデルとしては現実的でなく,これをマルコフ過程に拡張することが望まれる.ところが,LZ符号は非定常かつ自己組織的な符号であり,無記憶の場合すらその厳密解析は困難であった.著者はまずLZ増分分解列の期待長がなす奇妙な再帰関係に着目し,この解法を行なうという方法をとった.半無限列上に4つの基本的な作用素を定義し,その性質を利用してこの再帰関係を解くという別道を発見し,極めて形式的にLZ自己組織木の深さの統計量を,求める方法を見い出した.それによって,ユニフィラマルコフ過程に適合した状態依存型LZ増分分解法の厳密な圧縮率を求める閉式を見い出した.この結果は,その漸近解析とあわせて,IEEE情報理論国際シンポジウムで発表を予定しているが,同時に論文としても公表するつもりである.
免疫学的認識の分子機構

1)NMRによる方法論の確立と展開:ハイブリドーマのinvitro培養により,選択的に重水素化した抗体を単離,精製するプロトコールを確立した.抗原抗体反応のプロトンNMRによる解析において,全重水素化した抗体は,言わば黒衣として,抗原の情報のみを浮かび上がらせる役割を果たす.また,抗原認識部位の一部を選択的に重水素化すれば,抗原受け口の構造と相互作用について, NMRの特長をフルに生かした研究成果が期待できる.これまでに,ダンシル,アセチルコリン,ステロイドなどハプテンのほか,ニワトリリゾチームに対するマウスモノグローナル抗体を選択的に重水素ラベルしNMRによって解析を行なった.2)抗原認識の分子機構について:ニワトリリゾチーム分子上のエピトープに対応するペプチドの単離,精製を行ない,高次構造を保持するタンパク質から分離されたペプチドがどのように相互作用するか, intactリゾチーム分子の場合と比較した.上に述べた意味でデザインされた抗体を,荒田が近年確立したspin diffusionを利用する方法と組み合わせて用いることにより,抗原抗体反応の特異性発現の本質が,抗原側から浮かび上がってくる.すなわち,抗原の広い部分が,抗体によってパターンとして認識されていることが明らかになりつつある.3)免疫学的認識分子の構造についての考察:研究協力者黒沢は, T細胞レセプターのC領域,免疫グロブリンのV領域をもつキメラタンパク質の発現に成功した.すでに, NMRを用いてこのタンパク質の高次構造について解析を始めている.4)本研究によって得られた成果:ここに要約した研究結果をもとにして,研究代表者が現在までに到達した結論は,最近まとめて総説の形で公表した.1)NMRによる方法論の確立と展開:ハイブリドーマのinvitro培養により,選択的に重水素化した抗体を単離,精製するプロトコールを確立した.抗原抗体反応のプロトンNMRによる解析において,全重水素化した抗体は,言わば黒衣として,抗原の情報のみを浮かび上がらせる役割を果たす.また,抗原認識部位の一部を選択的に重水素化すれば,抗原受け口の構造と相互作用について, NMRの特長をフルに生かした研究成果が期待できる.これまでに,ダンシル,アセチルコリン,ステロイドなどハプテンのほか,ニワトリリゾチームに対するマウスモノグローナル抗体を選択的に重水素ラベルしNMRによって解析を行なった.2)抗原認識の分子機構について:ニワトリリゾチーム分子上のエピトープに対応するペプチドの単離,精製を行ない,高次構造を保持するタンパク質から分離されたペプチドがどのように相互作用するか, intactリゾチーム分子の場合と比較した.上に述べた意味でデザインされた抗体を,荒田が近年確立したspin diffusionを利用する方法と組み合わせて用いることにより,抗原抗体反応の特異性発現の本質が,抗原側から浮かび上がってくる.すなわち,抗原の広い部分が,抗体によってパターンとして認識されていることが明らかになりつつある.3)免疫学的認識分子の構造についての考察:研究協力者黒沢は, T細胞レセプターのC領域,免疫グロブリンのV領域をもつキメラタンパク質の発現に成功した.すでに, NMRを用いてこのタンパク質の高次構造について解析を始めている.4)本研究によって得られた成果:ここに要約した研究結果をもとにして,研究代表者が現在までに到達した結論は,最近まとめて総説の形で公表した.免疫における認識の基本原理をタンパク質の高次構造の視点から解明することを目的として研究を行いつつあるが、昭和61年度の研究実績の概要はつぎのとおりである。1)選択的に重水素化したモノクローナル抗体の調製:抗ダンシルマウスモノクローナル抗体(Ig【G_1】、Ig【G_(2a)】、Ig【G_(2b)】、IgG)を産生するスイッチバリアント・ハイブリドーマを用いて、無血清化、重水素ラベルを行った。ハイブリドーマを無血清培地(日水製薬、NYSF-404)を順応させたあと、チロシン-2【d_(3,5)】を添加した培地を用いて重水素化ラベルモノクローナル抗体を調製した。【^1H】NMRの測定により、チロシンが選択的にラベルされていることを確認した。分子量16万の巨大タンパク質であるにもかかわらず、スピンエコー法、スピン拡散法などの貢法を組み合せることにより、予想をはるかに上まわる分解能の向上が達成された。2)タンパク質抗原上のエピトープの構造とモノクローナル抗体による認識:リゾチーム分子上のエピトープに対応するペプチドの単離、精製を行い、高次構造を保持するタンパク質から分離されたペプチドがどのように相互作用するか、intactなリゾチーム分子の場合と比較した。ペプチドと抗体の相互作用を解析する手段として、スピン拡散と分子間核オーバーハウザー効果を組み合せた一般的な方法を開発した。この結果、ペプチドが従来考えられていたよりもはるかに広い範囲にわたって、抗体によって認識されていることが明らかになった。3)プロテインA遺伝子のクローニングと改変:staph.aureusよりプロテインA遺伝子をクローニングし、さらに異なる数のドメインをもつ遺伝子断片を得た。次年度はこれらに対応するタンパク質の発現、さらに重水素ラベルした抗体との組合せによるタンパク質・タンパク質相互作用の高次構造解析へと進む予定である。
自己分泌型細胞運動刺激因子の骨分化における役割の検討

平成19年度も前年度に引き続き、温熱刺激を骨肉腫細胞に与える実験を継続した。自己分泌型細胞運動刺激因子(autocrine motility factor以下AMF)は細胞に対してストレスが加わると発現が増強することが多い。このため温熱刺激によりAMFの発現が上昇することが予想されたのだが、その発現は減弱した。これらの実験結果から骨肉腫細胞をコントロール群、メソトレキセート添加群、温熱刺激群に分けDNAマイクロアレイにて遺伝子の発現変化を比較し、温熱刺激に特異的と考えられる遺伝子をいくつか検出した。骨形成関連遺伝子の発現が認められ、これらの転写因子とAMFの関連が示唆された。次にRNA干渉を用いてAMFの発現が恒常的に減弱している細胞株を作製し、その形態・形質変化の観察、さらには発現遺伝子の解析を行い、AMFの発現減弱により間葉上皮転換が生じることが確認された。これらのことから温熱刺激により腫瘍細胞の間葉上皮転換が生じることが示唆された。さらにAMFの分解を阻害する因子としてPoly(ADP-Ribose)Polymerase Family-14(PARP14)を同定した。PARPl4はAMFに結合する因子として同定され、ユビキチンーライソゾーム経路を用いたAMFの分解を阻害することが示唆された。またPARPl4は正常細胞にも発現しているが腫瘍細胞ではその発現がより強く、腫瘍細胞のAMFの高発現に関わっていることが示唆された。本研究により同定されたAMFの結合パートナーのPARPl4をターゲットにすることにより腫瘍の転移に関わるAMFの発現・分泌を制御できることが期待される。本研究では骨肉腫細胞にさまざまな刺激を加えて自己分泌型細胞運動刺激因子(autocrine motility factor以下AMF)の発現量の変化を調べた。悪性腫瘍に対する治療に対して様々のものがあるが近年、温熱療法の有用性が報告されている。そこで骨肉腫細胞に温熱刺激を加えその時のAMFの発現量の変化をまず調べた。AMFは細胞に対してストレスになる刺激が加わるとその発現が培すことが知られている。一例として低酸素刺激によりAMFの発現が増すことが報告されている。温熱刺激によりAMFの発現が上昇することが予想されたのだがこの仮説に反してAMFの発現は減弱した。同じ細胞株に対し骨肉腫治症に用いられるメソトレキセートを添加したがAMF発現の減弱は認められなかった。これらの実験結果を元に細胞をコントロール群、メソトレキセート添加群、温熱刺激群に分けDNAマイクロアレイにて遺伝子の発現変化を比較し、温熱刺激に特異的と考えられる遺伝子をいくつか検出した。現在これらの遺伝子の発現量の変化をリアルタイムPCRで解析中である。当教室では1990年代からpositron emission tomography(以下PET)を用いて骨軟部腫瘍のエネルギー代謝、特に糖代謝につき解析を行ってきた。AMFは細胞内では解糖に必須の酵素phosphoglucose isomerase(PGI)と相同であることが知られているため、今までのPETのデータとAMFを含めた糖代謝、糖輸送に関連する分子群の発現を比較した。これは免疫染色とパラフィン切片から得られたmRNAを用いて解析を行った。このうち糖代謝、輸送に関連するいくつかの分子群はPETで高値となった症例で高発現を認めた。またある種の腫瘍細胞に特異的に発現が認められる糖代謝関連分子も確認された。