hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超電子機能を目指した電荷移動高分子の創成

新しい電子材料への応用を目的として、電子供与性のジチアフルベンやチオケテン二量体ユニットを主鎖に持つπ共役ポリマーもしくはオリゴマーを合成し、それらの性質を比較、検討した。様々な鎖長を有するオリゴエチレンオキシド基を側鎖に持つ1,4-ジエチニルベンゼンを新しく合成した。これをモノマーとして、系中で調整されるチオケテンの環化付加反応を用いて主鎖にジチアフルベン構造を持つπ共役ポリマーの合成を試みた。鎖長の変化により、得られるポリジチアフルベンの溶解性に違いが見られ、UV測定による吸収極大の値にも大きな影響を与えた。これは側鎖のセグメント長によってポリジチアフルベンの物性に影響が与えられることを示している。また、チオケテンの環化二量化反応を用いて主鎖にチオケテン量体構造を有するπ共役ポリマー合成も行った。このポリマーはチオケテン二量体構造を含む最初の高分子である。その酸化電位の測定をCVを使って行った結果、予想よりも低い酸化電位(E_<pa>=0.39、0.90V)を示し、このポリマーが上述のポリジチアフルベンよりも強い電子供与体として働くことが明らかになった。そのためにこのポリマーは有機電子受容体とかなり強く相互作用し、得られた電荷移動錯体は比較的高い導電性を示した。テトラチアフルバレン(TTF)-オリゴエチレンオキシドユニット-長鎖アルキル基を持つオリゴマーを合成し、その性質について検討を行った。この化合物のクロロホルム溶液に電子受容性のDDQを加えるとTTF-DDQ電荷移動相互作用に由来する吸収があらわれ、色が黒色へと変化した。この溶液の近赤外における吸収スペクトルを測定すると、TTF-DDQが固体状態でスタッキングしていることを示すスペクトルが得られた。また、重クロロホルム中での1H NMR測定を行うと、DDQを加えた後のTTFのピークが完全にブロード化し、オリゴエチレンオキシド部位もややブロード化したピークが確認された。これらの結果はTTF-DDQの電荷移動相互作用によって、オリゴマーがミセルのような凝集体を形成していることを示唆している。
ミャンマー初の世界遺産における住民参加型の遺産保護と活用の可能性を探る

研究代表者は、研究対象地域であるスリ・クセトラの世界遺産範囲内の全ての村で約3週間にわたり研究調査を実施した。この調査によって、考古学的な遺産と地域住民の関係について明らかになった。地域住民は、ピュー時代の遺跡、寺院、村、湖などに纏わる伝承を多く継承しており、それは、地元から発見・発掘された文化財によって確かなものと捉えられている。また、重要な門、古い寺院のある場所、湖などの拠点地域は、ナッと言う精霊によって守られており、そこでは、霊媒を呼んで一年に度大きな儀礼が行われる。また、個別に車やオートバイなどを購入した後や男子の得度式の前にご加護を求めて祈りを捧げる。ミャンマーでは、一般的に仏教が精霊信仰より重要であると考えられているが、ここでは、他の地域よりもナッ信仰の重要度が高く、僧侶でさえもナッに敬意を払っていることが明らかになった。世界遺産登録後に地域社会に大きな変化はないが、緩やかではあるが、新築する建物の高さや色の指定は課されている。これに関してはあまり大きな不満は聞かれなかったが、期待したほど観光開発による利益が得られず、このことに関して当局が何もしてくれないという不満も聞かれた。研究代表者は、どのようにしたら観光開発を推進できるかを地域住民と意見交換し、アンコールの事例などを紹介した。フィールドスクールの考古学者や世界遺産事務所のスタッフたちは、本調査研究に大変協力的だったので、意見交換、情報や地図などの収集も予想以上の成果が得られた。地域住民と管理当局との関係には大きな問題はなく、多くの会合が既に持たれていた。一部当局に批判的な住民もいたので、住民側からの意見や要望は当局に口頭と文書(帰国後に報告書を文化省、考古学フィールドスクール、世界遺産事務所に送付)で伝え、その一部は既に改善されたことが、平成28年2月に私費で行った調査により明らかになった。
Redox理論に基づく肝臓外科・肝移植における周手術期の代謝的解析と治療法の確立

様々な動物実験及び海外の代表的肝移植施設との国際共同研究により肝臓外科だけでなく肝移植の場においてもRedox理論が極めて有効であることが示されてきた。まず、術前の段階では移植の前提条件となる生物活性の高いグラフトを入手するため血中ケトン体比の測定を行い、ケトン体比がより高い程、グラフトの生物活性は高く、移植後の成績も良いことが示された。さらに、ケトン体比を指標とした脳死ドナ-管理法を雑種犬を用いて行い、長時間のドナ-管理が可能となり、また、その際に用いられる様々な薬剤の適非についても判定が可能となった。次に術中管理においては、肝切除術を含む一般外科手術での知見を基に、術中肝ストレススコアを測定することにより、手術侵襲の程度を知り手術手技については、術後、ケトン体比が速やかに上昇し得ないものではグラフとは機能不全に陥り、再移植を行わない限り多臓器不全にて死亡することが判明した。これは術後管理においては、血中ケトン体比の低下を防ぐことが最も重要であるという従来よりの我々の主張が肝移植術においても適正であることを示したものといえる。以上のような知見を応用し、平成2年6月より平成3年12月までに29例の生体部分肝移植を行い、良好な成績を治めている。また逆に、こうして生体部分肝移植術で培われた技術は従来切除不能とされていた広範な肝硬変合併肝癌に対する拡大手術に応用され、一旦肝臓を摘出し癌を切除した後、自家再移植するというex situ手術を行い2例の切除困難な肝癌の治療に成功している。以上のようにRedox理論のより広範な応用が行われ肝臓外科、肝移植の両分野において成果を治めている。ハノ-ファ-医科大学、ピッツバ-グ大学、UCLAなど代表的な肝移植施設と国際共同研究を行い、肝移植時グラフト血行再開後血中ケトン体比が速やかに上昇しないと、グラフトの機能不全に陥り、homeostasisが破綻し、再移植が成功しないと多臓器不全(MOF)により死亡することが明らかとなった。これは、肝切除術後に血中ケトン体比が低下するとMOFとなり死亡するため、術後管理には血中ケトン体比の低下を防ぐことが最も重要であるという、従来よりのわれわれの主張と一致するものであり、肝移植術後にも血中ケトン体比の速やかな上昇と再低下を防ぐことが成績向上につながるものと考えられる。血中ケトン体比低下時のMOF発症の機序として、血中ケトン体比低下にひき続き多核白血球やリンパ球のエネルギ-代謝異常、機能不全が発生し、重症感染症が合併してくることが明らかとなった。さらに、経門脈インスリン投与法や積極的な人工呼吸器による呼吸管理がRedox理論に則った血中ケトン体比低下時の治療法として開発された。これらの研究業績に基づき、平成2年6月より生体部分肝移植を開始し、術中にも可及的に血中ケトン体比を低下させず、また速やかに上昇させるよう術式の改良を行い、術後管理にあたっても、Redox理論を駆使し、満足すべき成績をあげてきている。また、生体部分肝移植術の手術手技は、従来の肝切除手術手技では切除不能であった肝硬変合併肝癌の肝切除術にも応用した。癌を含んだ肝臓を部分的に摘出し、ex situにて太い静脈に接した癌を切除し、残肝を自家再移植することにより、2例の切除困難な肝癌の治療に成功している。以上のように、Redox理論の導入により、肝臓外科、肝移植術の治療成績が向上することが明らかになりつつある。

海外における代表的な肝移植施設との国際共同研究により、肝臓外科だけでなく肝移植の場においてもRedox理論が極めて有効であることが実証されてきた訳であるが、本年度はその成果をさらに分析し、より詳細な状態の把握と広範な応用を見い出すことに成功した。まず、移植の前提条件となる生物活性の高いグラフトを入手するため、血中ケトン体比を指標とした脳死ドナ-管理法を雑種犬を用いて行い長時間のドナ-管理が可能となった。また、ドナ-肝摘出直前にドナ-のケトン体比を測定することにより、そのドナ-肝の生物活性を知り移植後の生活率を予測することが可能となった。この成果を当科で行っている生体部分肝移植にも応用し、ドナ-肝摘出前にケトン体比を高値に保つべく手術手段を改善している。この様に移植前に肝臓の評価にもRedox理論が応用されるに到り、Redox理論は肝移植の術後の状態を分析する方法に留まらず、肝移植のあらゆる面を多角的に分析し統合しうる極めて応用性の高い理論体系であることが示された。また、肝移植術で培われた技術は肝臓外科の分野においてより拡大傾向に進む肝硬変合併肝癌の切除術に応用され、従来の切除不能肝癌も手術可能となってきている。また、ケトン体比がより高い方がドナ-肝の生物活性も良好であるという知見に基づき、出血性ショックや肝温阻血などの肝機能障害時にいかにケトン体比を上昇させるかという実験を行い、甲状腺ホルモンの有用性が指摘されている。こうした甲状腺ホルモンの投与は脳死ドナ-の管理においても極めて有効であり、甲状腺ホルモンの使用により脳死ドナ-の血行動態の安定化と肝生物活性の上昇が認められている。以上の様にRedox理論のより広範な応用が行われ、肝臓外科、肝移植の両分野において成果を治めている。
多元的な臓器工学的アプローチによる(超)小口径人工血管の開発

病変血管の置換手術として人工血管による再健術が行なわれているが、内径6mm以下の小口径人工血管の開存性は極めて悪く、口径34mmにおいては臨床応用可能な人工血管は現時点ではない。また、口径1mm以下の超小口径人工血管の開発は全く未踏分野である。閉塞に至る主要因子として、移植初期では血栓形成、慢性期では吻合部に好発する内膜肥厚による狭窄であることが指摘されている。従って、これらの問題を克服すれば、高度生体適合性を有する(超)小口径人工血管が開発でき、循環系医学へ大いに貢献できることになる。研究代表者らは、(1)人工材料と血液相互作用及び血栓形成過程、(2)人工基材と細胞挙動及び組織形成過程、(3)表面光化学に基づく人工基材の微細加工技術の研究を系統的に展開し、これらの基盤の上に、最近3、4年は新しい設計思想による(4)階層性ハイブリッド血管壁組織体形成によるハイブリッド小口径人工血管の開発、及び(5)ハイブリッド組織体の力学的ストレス負荷による分子・細胞レベルでの配向・形質変換(合成型平滑筋細胞の収縮型への変換)についてのバイオメカニクス的研究を行なってきた。本研究で開発した人工血管はこれらの研究の成果をもとにした、新しい概念、材料設計及び成型加工技術に基づくものである。本研究では次の各要素因子:1)移植初期においては非血栓性、2)多孔質化による外側と内腔間の細胞交通性による組織の侵入促進、3)血管壁組織の再建築と機能化、4)宿主血管との力学的適合性、5)任意の口径、膜厚、多孔度及び長さが制御でき、簡便で再現性のある成型加工技術を組み込み、研究代表者らによって新しく見い出されたバイオメカニクス、バイオマテリアル及びバイオロジーの基盤原理を複合化した臓器工学的手法によって、(超)小口径人工血管の開発を意図する。具体的には、口径0.5mm3mm迄の(超)小口径人工血管として次の3つのアプローチを並行して開発した。システムI:細胞による自己収縮・配向化を利用した高密度・高配向性ハイブリッド管状組織体システムII:低温ゲル化能と細胞接着性を有するハイブリッド細胞外マトリックスによる管状ゲル構造体システムIII:セグメント化ポリウレタン薄膜による管状体とエキシマレーザによる微孔化病変血管の置換手術として人工血管による再健術が行なわれているが、内径6mm以下の小口径人工血管の開存性は極めて悪く、口径34mmにおいては臨床応用可能な人工血管は現時点ではない。システムI:細胞による自己収縮・配向化を利用した高密度・高配向性ハイブリッド管状組織体システムII:低温ゲル化能と細胞接着性を有するハイブリッド細胞外マトリックスによる管状ゲル構造体システムIII:セグメント化ポリウレタン薄膜による管状体とエキシマレーザによる微孔化病変血管の置換手術として人工血管による再建術が行なわれているが、内径6mm以下の小口径人工血管の開存性は極めて悪く、口径34mmにおいては臨床応用可能な人工血管は現時点ではない。研究代表者らは、(1)人工材料と血液相互作用及び血栓形成過程、(2)人工基材と細胞挙動及び組織形成過程、(3)表面光化学に基づく人工基材の微細加工技術の研究を系統的に展開し、これらの基盤の上に、最近3、4年新しい設定思想による

(4)階層性ハイブリッド血管壁組織体形成によるハイブリッド小口径人工血管の開発、及び(5)ハイブリッド組織体の力学的ストレス負荷による分子・細胞レベルでの配向・形質変換(合成型平滑筋細胞の収集型への変換)についてのバイオメカニクス的研究を行なってきた。本研究で開発する人工血管はこれらの研究の成果をもとにした、新しい概念、材料設計及び成型加工技術に基づくものであり、これらのプロトタイプは既に予備的研究において一部実現化している。本年度では次の各要素因子:1)移植初期において非血栓性、2)多孔質化による外側と内腔間の細胞交通性による組織の進入促進、3)血管壁組織の再構築と機能化、4)宿主血管との力学適合性、5)任意の口径、膜厚、多孔度及び長さが制御でき、簡便で再現性のある成型加工技術を組み込み、研究代表者らによって新しく見い出されたバイオメカニクス、バイオマテリアル及びバイオロジーの基盤原理を複合化した臓器工学的手法によって、(超)小口径人工血管の開発を意図した。これらの並列的研究は各々初期の目標を達成した。本研究では次の各要素因子:1)移植初期においては非血栓性、2)多孔質化による外側と内腔間の細胞交通性による組織の侵入促進、3)血管壁組織の再構築と機能化、4)宿主血管との力学的適合性、5)任意の口径、膜厚、多孔度及び長さが制御でき、簡便で再現性のある成型加工技術を組み込み、研究代表者らによって新しく見い出されたバイオメカニクス、ナイオマテリアル及びバイオロジーの基盤原理を複合化した臓器工学的手法によって、(超)小口径人工血管の開発を意図する。具体的には、口径0.5mm3m迄の(超)小口径人工血管として次の3つのアプローチを並行して開発した。システムI :細胞による自己収縮・配向化を利用した高密度・高配向性ハイブリッド管状組織体システムII :低温ゲル化能と細胞接着性を有するハイブリッド細胞外マトリックスによる管状ゲル構造体システムIII:セグメント化ポリウレタン薄膜による管状体とエキシマレーザによる微孔化1)移植実験、2)組織化過程の形態学的研究、3)吻合部肥厚評価を行なった。何れのシステムにおいても、生体内のリモデリングが移植期間と共に進行した。病変血管の置換手術として人工血管による再建術が行なわれているが、内径6mm以下の小口径人工血管の開存性は極めて悪く、口径34mmにおいては臨床応用可能な人工血管は現時点ではない。また、口径1mm以下の超小口径人工血管の開発は全く未踏分野である。閉塞に至る主要因子として、移植初期では血栓形成、慢性期では吻合部に好発する内膜肥厚による狭窄であることが指摘されている。従って、これらの問題を克服すれば、高度生体適合性を有する(超)小口径人工血管が開発でき、循環系医学へ大いに貢献できることになる。研究代表者らは、(1)人工材料と血液相互作用及び血栓形成過程、(2)人工基材と細胞挙動及び組織形成過程、(3)表面光化学に基づく人工基材の微細加工技術の研究を系統的に展開し、これらの基盤の上に、最近3、4年は新しい設計思想による(4)階層性ハイブリッド血管壁組織体形成によるハイブリッド小口径人工血管の開発、及び(5)ハイブイッド組織体の力学的ストレス負荷による分子・細胞レベルでの配向・形質変換(合成型平滑筋細胞の収縮型への変換)についてのバイオメカニクス的研究を行なってきた。
ホモロジーのないアミノ酸配列からのタンパク質構造・機能情報の抽出

この5年間に数10種類の生物ゲノムが解析され、各遺伝子のアノテーションが進められてきた。しかし、ゲノム解析から得られるアミノ酸配列は、既知配列とのホモロジーがなく、実験的な情報もない未知配列が少なくない。したがって、ゲノム時代のタンパク質構造・機能予測では、補足的な情報がほとんどないみなしご配列の解析が求められている。このような研究状況の変化に対応して、アミノ酸配列の情報処理に対する要求も当然変わってきている。それを簡単にまとめると、以下のとおりである。(1)すべてのタンパク質について均質の情報が得られることが望ましい。(2)分類を行う場合、得られた情報はできる限り高精度でなければならない。(3)ゲノム全体の生物的な特徴を知るには、各遺伝子の情報が得られる必要がある。私たちは上記の要求を満たす情報処理を目指して、タンパク質の構造形成のプロセスをほぼたどりながら予測を行うシステムを構築しつつある。モジュールの流れは次のようなものである。(1)膜タンパク質か水溶性タンパク質科の判別、(2)シグナルペプチドの予測、(3)膜タンパク質のトポロジー予測、(4)膜貫通ヘリックス配置予測。今までに1番目のモジュールはほぼ完成しており、99%の制度で膜タンパク質と水溶性タンパク質が判別でき、膜貫通ヘリックスも高精度のシステムができた。そして、多くの遺伝子の解析で標準的な解析ツールとなってきている。私達は、この解析ツールを用いて計算し、ゲノム比較を試みた。計算の結果、線虫ゲノムを除くと、膜タンパク質の割合が2025%とほぼ一定であるが、線虫のゲノムでは3035%であることが分かった。また、膜貫通ヘリックスの本数で分類してみると、生物種によって特徴的な分布が見出された。
白血病幹細胞特異的抗原ＴＩＭ―３に対する標的治療の開発

本研究において、申請者らはTIM-3を標的とした治療戦略を開発するうえで、その機能解明が重要であると考え、ヒト白血病幹細胞におけるTIM-3の機能解析を行った。TIM-3リガンドであるgalectin-9およびHMGB-1に注目し、TIM-3リガンドによる刺激後の白血病幹細胞の網羅的遺伝子発現変化を評価したところ、galectin-9が特徴的遺伝子発現変化をもたらすことを見いだした。さらに白血病細胞自身がgalectin-9を産生、分泌していることを明らかにした。また、その下流のシグナル経路の同定を行い、TIM-3の機能として自己複製能を含む幹細胞活性に関連していることを見いだした。我々は正常造血幹細胞には発現を認めず、急性骨髄性白血病(AML)の幹細胞に特異的に高発現する分子Tim-3を同定した。Tim-3は細胞表面に発現しているため、フローサイトメトリーにより解析可能で、AML-M3を除くすべてのAML幹細胞においてTim-3の高発現を認め、理想的なAML標的分子としての抗体治療候補と考えた。そこで、Tim-3抗体を作成するために、balb/cマウスにヒトTim-3タンパクを免疫し、抗ヒトTi鉢3マウスIgG2a抗体(ATIK2a)を純化・精製した。ATIK2aの殺細胞効果を検証するため、細胞株EoL-1とL929にTim-3を遺伝子導入し、in vitroにおいてウサギ血清存在下にATIK2aを添加した。Tim-3陽性細胞株はATIK2a用量依存性に死滅し、ATIK2aがCDC活性を有することが明らかとなった。また、ヒト単核球存在下においてもATIK2aはTim-3陽性細胞株を溶解させ、ATIK2aがADCC活性を有することが示された。すなわち、ATIK2aはTim-3陽性白血病細胞に対して、CDCおよびADCC活性を通して、殺白血病胞効果を有することが示された。次に、免疫不全マウスにヒト白血病サンプルを移植し、ヒト白血病マウスを作成し、ATIK2aの抗白血病効果を検証することを目的とする。そのために、事前にヒト正常造血に対するATIK2aの効果を検討した。ヒト臍帯血CD34陽性幹細胞を純化して免疫不全マウスに移植後、ATIK2aを腹腔内投与した。コントロールと比較してATIK2a投与群では、ヒト造血幹細胞、骨髄球系、Bリンパ球系分画に差を認めず、ATIK2aはマウス内で再構築されるヒト正常造血に影響を与えないことを確認した。AMLサンプルをマウスに移植して,ヒトAMLが再構築されたマウスにおいてATIK2aによる分子標的治療の開発を行う予定である。申請者らは、急性骨髄性白血病(AML)において、白血病幹細胞に特異的に高発現する分子TIM-3を同定しておりTIM-3 signalingのAMLにおける機能解析を主眼として本年度は解析を進めた。TIM-3のリガンドとして、これまでgalectin-9, HMGB-1,Phosphatidylserine等が知られている。平成25年度は、この中でTIM-3のリガンドとしてこれまでに最も解析が進んでいるgalectin-9に注目して研究を進めた。galectin-9の生理的濃度が、これまで報告に乏しく不明であったために、最初に健常者および白血病患者血清中のgalectin-9濃度をELISA法にて測定した。ヒトgalectin-9の血中濃度は、リンパ系腫瘍においては健常人と同程度であるのに対して、AMLにおいて血中濃度が特異的に上昇していることを我々は見出した。そこで、我々はAML細胞自身がgalectin-9を産生、分泌するのではないかという仮説をたて、検証を行った。FACSによる細胞内染色でAML細胞がgalectin-9タンパクを細胞内に高レベルで発現していることを見出した。次に、AML細胞がin vivoでgalectin-9を分泌するか否かを検討した。患者由来AML細胞を免疫不全マウスに移植し、AMLをin vivoで再構築し、マウス血清中のヒトgalectin-9濃度を測定した。AMLを再構築したマウス血清からはAML患者同様に高濃度のヒトgalectin-9が検出された。即ち、AML細胞がTIM-3のリガンドであるgalectin-9をautocrine様式で分泌するという新しい知見を得た。我々は、正常造血幹細胞には発現を認めず、AML幹細胞に特異的に高発現する分子TIM-3を同定した。TIM-3は細胞表面に発現しているため、フローサイトメトリーにより解析可能で、AML-M3を除く殆どすべてのAML幹細胞においてTIM-3の高発現を認め、理想的なAML標的分子としての抗体治療候補と考え実験を行った。我々の樹立した抗ヒトTIM-3抗体ATIK2aは、in vitro, in vivoでTIM-3陽性AML幹細胞を傷害することを以前報告した。

今回、我々が新規に開発した高度免疫不全マウス(BRGSマウス)および、同等の免疫不全マウスであるNSGマウスを用いて、異種移植実験を行った。これまでの免疫不全マウス(NRGマウス)同様にマウス内に再構築したヒトAMLに対して、ATIK2aがin vivoにおいてTIM-3陽性AML細胞に対して、細胞傷害活性を示す事を確認した。これらの治療モデルの検討に加えて、我々はAML以外の骨髄増殖性疾患において、CD34陽性CD38陰性造血幹細胞分画のTIM-3発現を解析した。その結果、骨髄異形成症候群(MDS)や慢性骨髄性白血病等においても、TIM-3が発現する異常幹細胞の存在が確認された。また、MDSにおいてはCD34陽性CD38陰性造血幹細胞分画内のTIM-3陽性細胞の割合が、AMLへの病期進行に伴い劇的に上昇していくことを見出した(論文投稿準備中)。これらの所見から、TIM-3がAMLのみならず、多くの骨髄性造血器腫瘍において腫瘍性幹細胞を標識している可能性が示唆され、今後解析症例をさらに増やして、TIM-3陽性異常造血幹細胞の生物学的意義を明らかにしていく予定である。申請者らは先行研究において、ヒト急性骨髄性白血病(AML)における癌幹細胞であるCD34+CD38-白血病幹細胞とCD34+CD38-ヒト正常造血幹細胞を純化し、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、T-cell immunoglobulin mucin-3 (TIM-3)が、正常造血幹細胞には発現せずに、白血病幹細胞に特異的に高発現していることを報告した(Kikushige et al., Cell Stem Cell, 2010)。本研究において、申請者らはTIM-3を標的とした治療戦略を開発するうえで、その機能解明が重要であると考え、ヒト白血病幹細胞におけるTIM-3の機能解析を行った。TIM-3リガンドであるgalectin-9およびHMGB-1に注目し、TIM-3リガンドによる刺激後の白血病幹細胞の網羅的遺伝子発現変化を評価したところ、galectin-9が特徴的遺伝子発現変化をもたらすことを見いだした。そこで、まずgalectin-9に着目して研究をすすめた。ヒトgalectin-9の生理的血中濃度を明らかにするために、健常人および造血器腫瘍患者血清中のgalectin-9濃度をELISA法により測定した。その結果、急性骨髄性白血病患者では、galectin-9の血中濃度が上昇していることを見いだし、その機序として白血病細胞自身がgalectin-9を産生、分泌していることを明らかにした。また、その下流のシグナル経路の同定を行い、TIM-3の機能として自己複製能を含む幹細胞活性に関連していることを見いだした。26年度が最終年度であるため、記入しない。血液内科学26年度が最終年度であるため、記入しない。Tim-3に対する抗ヒトTim-3マウス抗体の作成に成功し、まずはin vitroでのT-m3陽性細胞株に対する抗白血病効果を確認できた。
Siナノ構造を用いた消化器系診断in-vivo粒状チップの創製

ワイヤレス通信チップとして、ディジタル回路のみを用いたオールディジタルワイヤレスモデムの提案、設計、試作を行なった。提案するオールディジタルモデムは、LSIで用いるクロックを無線通信のキャリアとして用いることにより送受信回路をディジタル論理回路素子のみで構成し、超小型・超低消費電力動作を実現した。また、in-vivoチップに求められる。全二重通信機能を実装し、その動作を確認した。0.18μmCMOSプロセスを用いて試作したLSIはコアサイズが160×164μmと超小型を実現しその消費電力は108.48μMHzクロック動作で0.6mWと低消費電力動作であることを確認した。カプセルと錠剤の2種類のアンテナ構造にフェライトコアの有無を加えた、4種類の服用型デバイスについて結合係数を比較し、錠剤型でフェライトコアを用いた場合が最も効率よく更新できることを見出した。Ansoft社の電磁界解析シミュレータ(Q3D Extracter)を用いてアンテナ特性の解析を行い、実利用時におけるアンテナコイルの特性と結合係数の挙動について調べた。Siチップ上に送信側と受信側のアンテナコイルを試作し、実測による電磁誘導伝送を示した。振幅変調・周波数変調・位相変調・パルス間隔変調の各変調方式についてノイズ耐性・消費電力の観点から比較したところ、パルス間隔変調がin-vivoチップシステムに適していることを示した。0.35μm Si CMOSプロセスで送受信回路を試作し、実測とシミュレーションによる解析を行った。各回路プロックの実測結果から、半波整流昇圧回路は設計値通り動作することが確認できた。電圧制限回路中の寄生バイポーラトランジスタの影響により設計された動作に至らなかったため、重圧制限回路には例えば寄生バイポーラトランジスタを持たない整流動作が可能なMOSダイオード回路を検討する必要があることを明らかにした。またpH敏感DDS研究については、許認可の医薬品添加物を用いて放出時間制御型および胃内浮遊型DDSの開発を行ない、プラズマ照射条件(照射出力や時間など)により薬物放出までのラグタイムや放出速度の制御が可能であることを見出し、個々人の生体内環境に即した薬物放出性を持つDDS構築がプラズマにより達成できることを明らかにした。本消化器診断「in vivo」粒状チップ創製研究では、(1)送受信微小チップ、アンテナ開発、(2)電源系、(3)pHセンサー、校正液・体液入排出系とポンプ、(4)これらの内部配線、(5)動物による体内pH測定とDDSによる治療が主な研究項目になっている。このうちpHセンサについては、一対のゲート電極上のうち一方に超撥水性テフロン膜を形成し、両電極を差動アンプ式に動作させるイオン感応性電界効果トランジスタ(ISFET)を作製した。特にテフロン膜を形成したISFETは中性(pH=7)強酸性(pH=2)の範囲でほとんど出力電圧が変化しないことが分かり、胃液中pH測定がこれにより可能となることを示した。また校正液、体液入排出系についてはISFET上にポリエチレンテレフタレート(PET)を用いて断面100μm x 100μm、長さ3mmの流路を形成した。流路はモールド法によりパターン転写して作製した。またISFETと流路の張り合わせ工程にドライフィルムレジストを用いることにより、溶液漏れのない堅牢なマイクロチャネルの形成に成功した。さらに差動アンプ式に動作させるために必要なアナログ回路を作製した。

さらにセンサと体外送受機との信号をやり取りする送受信微小チップ、アンテナを試作するとともに、試作したチップの送受信特性を評価した。送受信感度を向上させるための増幅回路、通信周波数の最適化を行った。また人体を透過する際に電波の減衰が生じるが、鶏肉等の食肉を実際に用いて電波減衰率を測定した。in vivoワイヤレス通信について、通信周波数帯を決定し、つぎに簡便な送受信回路構成について検討した。まず、周波数帯についてチップアンテナを利用した2.4GHz帯を検討したが、模擬人体厚さ1020cm程度で90dBほどの非常に大きな減衰があるので、現実的には利用が難しいことを測定を通じて明らかにした。通信距離が1020cm程度であることから電磁結合での伝搬について検討し、周波数帯数MHz数十MHzで2030dBであることを明らかにし、第一ステップとして13MHz帯での電磁結合を利用した通信手段を選択した。人体内での測定データがpHなどのデータであることとに着目し、単純な数値データを送信する方法としてPIM(Pulse Interval方式を想定し、チップ設計を行った。次年度以降、試作チップの通信特性について評価する。体外とのワイヤレス通信を受け持つ超小型長消費電力動作RFID用ワイヤレス通信LSIとして、ディジタル回路のみを用いたオールディジタルワイヤレスモデムの提案、設計、試作を行なった。提案するオールディジタルモデムはLSIで用いるクロックを、無線通信のキャリアとして用いることにより、送受信回路をディジタル論理回路素子のみで構成し、超小型・超低消費電力動作を実現した。また、in-vivoチップに求められる全二重通信機能を実装し、その動作を確認した。0.18μmのCMOSプロセスを用いて試作したLSIは、コアサイズが160μm x 164μmと超小型を実現し、その低消費電力は108.48MHzクロック動作で0.6mWと低消費電力動作であることを確認した。これにより提案したオールディジタルモデムはin-vivoチップへの適用が可能であることを示した。pHセンシング測定はISFET(イオン感応電界効果トランジスタ)を用いて行なった。センシング領域は30μm x 360μmで、同サイズのゲート電極が並んで配置されている。一方のゲート電極にはプロトン感応膜としてTa_2O_5を用い、もう一方の電極にはイオン不感応膜として超撥水性を示すテフロンナノ微粒子を固定化した。消費電力を低減するためにソース・ドレイン電流を極力少なく抑え20nAで測定可能であることを示した。またさらに低消費電力化を測るため、ソース・ドレイン電流をパルス状に流して測定したところパルス時間が0.5秒まで短縮できることが分かった。これらの結果からソース・ドレイン電流20nAを0.5秒間流して測定したところ、ISFETにおいて消費される電力量は50nJと見積もられin-vivoチップへの適用の可能性を示すことができた。
生体内タンパク質分解能と非定型BSE発生の関連性

本研究は、牛の加齢と脳内不溶性タンパク質量を比較し、その関連性を明らかにすることである。また生体内のタンパク質分解酵素による異常プリオンタンパク質への影響を明らかにする。健康と畜牛3グループ(4860か月齢、96119か月齢および120か月齢以上)の牛について、延髄のタンパク質量を調査した。延髄の不溶性プリオンタンパク質(PrP)量に有意な差はなかった。しかし不溶性PrP量の上位25%のサンプルは、120か月齢以上の牛がもっとも多かった。非定型BSEの異常型プリオンタンパク質は、定型BSEよりもペプシンやトリプシンに消化されたが不完全であった。本研究では、若齢牛と高齢牛の脳内不溶性タンパク質の出現量の比較から、加齢と不溶性タンパク質、特にプリオンタンパク質(PrP)との関連性を明らかにするため、健康と畜牛4860ヶ月齢の牛と96ヶ月齢以上の高齢牛の延髄を収集し、脳組織中のタンパク質をSDS-PAGE(タンパク質の電気泳動)およびウエスタンブロット法により解析した。健康と畜牛133頭の延髄を月齢により3群に分け収集した。各群は、4860ヶ月齢(n=47、平均53.7ヶ月齢)と96119ヶ月齢(n=45、平均107.7ヶ月齢)、121183ヶ月齢(n=41、平均135.8ヶ月齢)であった。遠心分離および超遠心分離により得られる上清および沈渣画分中のタンパク質は紫外線照射によりタンパク質を可視化させたSDS-PAGEで、PrPはウエスタンブロット法で検出可能であった。現在、上記材料の不溶性タンパク質量の解析を進めている。次に、生体中のタンパク質分解酵素が、非定型BSEの異常プリオンタンパク質(PrPSc)に与える影響を明らかにするため、消化酵素ペプシンによる影響をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により解析した。非定型BSE実験感染牛の脳幹部で作製した20%脳乳剤を、第4胃消化液である塩酸存在下で、消化酵素ペプシンの濃度を変え(15mg/mlより10倍階段希釈)、37°C、1時間消化したところ、1.5mg/ml以上の濃度でPrPScのバンドが減弱する像が得られた。定型BSEではペプシン濃度に依存した変化は見られなかった。健康と畜牛4860ヶ月齢の牛(n=33、平均53.7月齢)と96ヶ月齢以上の高齢牛(n=47、平均111.5月齢)の延髄20mgから遠心分離および超遠心分離により得られる沈渣画分中をELISA法によりのPrP量を測定した。4860ヶ月齢の牛でOD値2.46±0.57、96ヶ月齢以上の牛でOD値2.30±0.44であり、両群の組織量あたりのPrP量に差は見られなかった。定型および非定型L型BSE感染脳乳剤に対し、トリプシン(最終濃度2.5mg/ml)および膵臓の乳剤(最終濃度10mg/ml)で37°C、2時間消化したところ、非定型L型BSE感染脳で処理なしのバンドに比較し、トリプシン処理のPrPScのバンドが0.74±0.05倍(p<0.05)に減弱する像が得られた。定型BSEではトリプシンによる有意な変化は見られなかった。当初の計画通り、収集した被検試料の解析をおこなった。また非定型BSE(L型)のPrPScは、定型BSEのPrPScと異なり、膵臓由来消化酵素トリプシンにより減弱することを示した。本研究は、4860ヶ月の牛と96ヶ月以上の高齢牛の脳内不溶性タンパク質の出現量の比較から、加齢と不溶性タンパク質(特にPrP)との関連性を明らかにする。またBSE感染脳乳剤をタンパク質分解酵素で処理し、生体中の酵素によるPrPScへの影響を明らかにする。BSE検査陰性が確認された健康と畜牛、4860か月(A群:n=44)、96119か月(B群:n=42)および120か月以上(C群:n=40)の3群について、延髄を破砕し作成した乳剤を遠心分離して上清(S1)を得た。そのS1をさらに超遠心分離し、沈渣(P2)を分取する。SDS-PAGEおよび抗PrP抗体等を用いたウエスタンブロット(WB)法により、P2から得られる不溶性タンパク質の量および性状を解析した。3群間に遠心上清総タンパク質量および不溶性PrP量に有意な差は見られなかった。しかし延髄の不溶性PrP量の比較では、上位25%の個体数は、C群が最も多く、加齢に伴い不溶性PrP量の多い個体数が増える傾向がみられた。脳内の不溶性PrP増加に加齢およびそれ以外の要因が関与していることが示唆された。電気泳動像や分子量に加齢による影響はみられなかった。健康牛、定型BSE実験感染牛および非定型(L型)BSE実験感染牛の脳を用い乳剤を作製し、それぞれ酵素(ペプシン、トリプシン等)溶液および消化管液に添加した。反応後、SDS-PAGEおよびWB法により含まれるタンパク質の分子量および量を解析した。

非定型BSE感染脳乳剤を塩酸処理下においてペプシンで消化したところ、1.5mg/ml以上の濃度でPrPScのバンドが減弱した。非定型BSE感染脳をトリプシン(最終濃度2.5mg/ml)で37°C、2時間処理したところ、PrPSc量は、処理なしに比較し0.74±0.05倍(p<0.05)に減少した。本研究は、牛の加齢と脳内不溶性タンパク質量を比較し、その関連性を明らかにすることである。また生体内のタンパク質分解酵素による異常プリオンタンパク質への影響を明らかにする。健康と畜牛3グループ(4860か月齢、96119か月齢および120か月齢以上)の牛について、延髄のタンパク質量を調査した。延髄の不溶性プリオンタンパク質(PrP)量に有意な差はなかった。しかし不溶性PrP量の上位25%のサンプルは、120か月齢以上の牛がもっとも多かった。非定型BSEの異常型プリオンタンパク質は、定型BSEよりもペプシンやトリプシンに消化されたが不完全であった。当初の計画通り、被験材料を収集し解析を行っており、また非定型BSE(L型)のPrPScがペプシンへの抵抗性が定型BSEと異なることを示した。引き続き収集した健康牛の延髄を遠心分離および超遠心分離して得られる上清および沈渣画分のPrP量を解析する。H28年度は、SDS-PAGEおよびWB法により総タンパク質量との比較し、牛の加齢とPrPの関連を検討する。また生体中のタンパク質分解酵素が非定型BSEのPrPScに与える影響について、これまでに胃および膵臓由来の酵素に影響を受けることを示したので、H28年度は、健康牛、定型BSEおよび非定型BSE実験感染牛の脳から作製した乳剤を用いて、牛の消化管液を反応させた後、タンパク質の量および分子量、糖鎖パターンを解析することで、本研究課題を総括する。獣医学H27年度は、引き続きH26年度に収集した4860ヶ月の牛と96ヶ月以上の高齢牛の脳幹部組織の不溶性タンパク質をSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法で解析し、加齢と脳内不溶性タンパク質の関連性を検討する。またH26年度の結果を踏まえ、生体中のタンパク質分解酵素が非定型BSEのPrPScに与える影響を明らかにするため、健康牛、定型BSEおよび非定型BSE実験感染牛の脳乳剤のペプシンおよびトリプシンに対する消化率、分子量および糖鎖パターンを解析する。物品費は、より安価な物品の選択し、節約に努めた。解析サンプル数が予定より多くなったため(120頭分→133頭分)、試薬等の購入に充当する。
高アンモニウムイオン選択性イオノフォア,ピラゾール クラウンエーテルの開発と応用

ピラゾール環を環構成成分とするクラウン誘導体(A)(H)(図1参照)を合成し、各誘導体の1つを含むNH_4^+イオン選択性高分子膜電極を開発した。電極膜の調製は、PVC、クラウン誘導体、膜溶媒(DOS,NPOE,あるいはDBE)および親油性添加塩を用いてキャスト法により行った。各電極のNH_4^+イオン選択性は単独溶液法によって求め、妨害イオン(アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、水素イオン等)に対するNH_4^+の選択係数で評価し、従来のノナクチンを用いた電極の性能と比較検討した。クラウン誘導体(A)(H)とNH_4^+イオンとの錯形成は、6位、12位の酸素および20位の窒素との水素結合に由来する。このためNH_4^+イオン選択性は膜溶媒の極性に大きく影響され、極性が低い膜溶媒、特にDBEを用いた場合に選択性が向上することを見い出した。表1に開発した電極の代表的な結果として、DBEを膜溶媒に用いたPVC膜電極の場合のK^+イオンおよびNa^+イオンに対するNH_4^+イオンの選択係数を示す。当初、置換基Rに電子供与性のメチル基を導入した誘導体(B),(F),(H)あるいは嵩高いベンジル基ならびにオクチル基を導入した誘導体(C),(D)が、NH_4^+イオン選択性に優れると期待されたが、むしろ未置換の誘導体(A),(E)が相当する類縁体に比べNH_4^+イオン選択性に優れることを認めた。なお誘導体(A)および(B)を用いたPVC膜電極のK^+イオンに対するNH_4^+イオンの選択係数(log〓)は各々-1.20,-1.14であり従来のノナクチンをニュートラルキャリアとする電極のそれ(log〓=-0.92)より優れており、これら誘導体は実用面でも十分に耐える性能を有すると判断される。
機械学習を用いた脳腫瘍低酸素領域の予測

悪性腫瘍における低酸素状態はその悪性度との関係性が強く示唆されている。腫瘍の低酸素状態をin vivoに評価する方法として、18F-fluoromisonidazole(FMISO)などのポジトロン断層撮影法(PET)製剤を用いる方法があるが、その合成には特別な設備や、高度な技術を持つ専門家が不可欠であり、臨床使用が可能な施設は世界的に見ても少ないのが欠点である。そこで今回申請者は、日常臨床で用いられている既存の設備、既存の装置で撮像可能な画像検査から、低酸素状態を予測する研究を計画した。平成30年度では、最終的な目標である低酸素領域のセグメンテーションを目指し、ボクセル単位での低酸素予測を試みた。具体的には、低酸素イメージングであるFMISO-PETが陽性を示した15症例の脳腫瘍患者の画像を対象とし、FMISO集積をより一般的なモダリティで予測する検討を行った。予測するための画像モダリティとして、FDG-PET画像に加え、FLAIR画像、ダイナミック造影MRIの解析から算出される体積移動係数(Ktrans)画像、血液量(Vp)画像、および、動脈スピンラベル標識法を用いたMRIから得られる脳血流画像を用いた。すべての画像はMRIのT1強調画像にリスライスし、ボクセルごとに各モダリティが示す値をロジスティック回帰分析してFMISOの集積の有無を予測した。FDGを含む上記すべてのモダリティを用いた場合、AUC 0.892で予測可能であった。FDGを除いたMRIの各モダリティのみでの予測精度はAUC 0.844だった。ロジスティック回帰分析以外にも、3層の全結合ニューラルネットワークやK means、ランダムフォレストを試したが、いずれもロジスティック回帰より精度が劣る結果となった。現段階ではサンプル数が少なく、精度の高い予測が可能かどうかについては、今後の検討が必要である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度では、低酸素予測の方法として、悪性神経膠腫32症例の病変領域を30×30ピクセルのRegion of Interest(ROI)に分割し、それぞれの区域が低酸素状態か否かを予測する検討を行った。合計3453個の正方形領域に対してConvolutional neural network(CNN)を用いて解析を行うと、ガドリニウム造影T1強調画像(Gd-T1WI)、FDG-PET画像、拡散強調画像(DWI)の3種類の画像から、精度88.4%で低酸素領域を同定することができた。それぞれの画像単独での精度はGd-T1WIで86.4%, FDGで81.6%, DWIで76.2%と、Gd-T1WIが低酸素予測への寄与分が最も大きいことが示唆された。また、MRIの血流画像や、磁化率マッピングのシークエンスを用いてピクセル単位での検討を行った。低酸素イメージングであるFMISO-PETが陽性を示した15症例の脳腫瘍患者の画像を、ロジスティック回帰で解析したところ、精度75%程度でピクセル単位での低酸素の予測が可能であることが明らかになった。セグメンテーションを行うためにはピクセル単位での解析が重要であり、次年度の目標である低酸素領域のセグメンテーションの足掛かりとなった。平成30年度はこれまでの知見をふまえ、低酸素領域のセグメンテーションを行うことを目標とする。セグメンテーションを行う実際のNeural Networkとしては医療画像のセグメンテーションで用いられることの多いU-netの導入を検討している。セグメンテーションは画像認識のタスクの中では難易度の高い解析になるため、データ量の不足が問題になる可能性が考えられる。

そこで、入手可能な臨床画像を可能な限り収集することに加え、データ量の不足を補うための基本的な技術として知られている、元画像に対して回転や拡大縮小を行い新たな画像とする方法などをを積極的に活用し、解析を進める予定である。昨年度行った、ピクセル毎の予測では、脳血流画像や定量的磁化率マッピングなどといった比較的特殊なMRIシークエンスを用いたが、広く普及できることを目標に、より平易な画像シークエンスからの予測を試みる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
線虫C.elegansの始原生殖細胞分化に必要な遺伝子mrg-1の機能解明

生殖細胞は次世代を生じる唯一の細胞であり、それゆえ種の永続性に重要である。多くの動物において、始原生殖細胞の確立はいくつかの母性因子に依存している。しかしながら、どのようにして母性因子が生殖細胞の特殊な性質を始原生殖細胞に与えるのかについての分子機構は不明である。我々は、クロモドメイン蛋白質MRG-1が、始原生殖細胞が生殖細胞特異的遺伝子であるpgl-1の発現開始に母性的に必要であることを明らかにした。MRG-1は核内において染色体に結合していることから、クロマチンの再編成を通じて生殖細胞特異的な遺伝子の転写を調節していることが示唆された。これまでの研究から、ヒストン脱アセチル化酵素複合体の構成因子であるMEP-1を欠いた線虫において、体細胞における生殖細胞特異的な遺伝子発現抑制が解除されることが分かっている。我々は、MRG-1の欠損が上記のMep-1表現型を抑制することを見いだした。この結果は、MRG-1はすべての割球に生殖細胞としての潜在能力を与えており、その能力の発現はMEP-1とMRG-1の拮抗によって始原生殖細胞に限定されることを示唆している。また、Mep-1表現型はmes遺伝子群の変異によっても抑制される。MES蛋白質群はピストンのメチル化に関与することが知られており、Mes表現型とMrg-1表現型がきわめて類似している。さらに、mrg-1変異がMES蛋白質群の局在や活性に影響を与えないことから、MRG-1はMES蛋白質群と協調して、または下流で働いていることが示唆された。本研究で得られた知見は、始原生殖細胞の核内に蓄えられた母性因子がクロマチンの再編成を通じて、生殖細胞特異的な遺伝子の転写活性を保証しているというモデルを支持している。クロモドメイン蛋白質は、メチル化ヒストンを認識し染色体との結合ドメインとして機能するという報告から、染色体の活性化領域の選択に機能していると推定される蛋白質である。本研究では、線虫C.elegansをモデル生物とし、クロモドメイン蛋白質MRG-1の発現解析、機能解析を行った。MRG-1は、酵母からヒトまで真核生物に高度に保存されており、種を問わず重要な機能を有していると考えられる。RNA干渉法を用いてMRG-1の発現を阻害した結果、始原生殖細胞は形成されるが増殖せず不稔となった。こうした表現型は必ずF1世代で現れることから、MRG-1は生殖細胞形成に必須な母性蛋白質であることが強く示唆された。MRG-1蛋白質が機能する組織を特定するため、特異的抗体を用いた発現解析を行ったところ、MRG-1の発現は発生の初期と成虫の卵母細胞で強く、胚形成期の初期にはMRG-1は全ての細胞の核に局在することが明らかとなった。さらに、MRG-1の局在は線虫の胚発生が進むにつれて始原生殖細胞の核に収束することが明らかになった。また、線虫欠失変異体ライブラリーをPCR法によってスクリーニングし、mrg-1遺伝子の欠失変異体を分離することに成功した。このmrg-1欠失変異体の表現型の解析を行った結果、これまでRNA干渉法によって示唆されていたこと、すなわち、MRG-1蛋白質は生殖細胞形成に必須な母性蛋白質であることが明らかになった。生殖細胞は種の連続性を担う特別な細胞種であり、多くの動物において生殖細胞の運命決定・初期発生過程に母性因子群が重要な役割を果たすことが知られている。

しかしながら、生殖細胞形成において母性因子群がどのように寄与するのかについての詳細については明らかにされていない。昨年度までに、線虫C.elegansをモデル生物とした解析によって、クロモドメイン蛋白質MRG-1が生殖細胞の初期発生過程に必須な母性因子のひとつであることを明らかにしてきた。本年度の研究では、mrg-1遺伝子破壊株を用いた解析によって、生殖細胞形成においてMRG-1の母性機能がきわめて重要であるが、接合体におけるMRG-1の新規発現もある程度貢献していることを明らかにした。また、RNAポリメラーゼに対する特異抗体を用いた解析によって、mrg-1遺伝子機能がない状態においても始原生殖細胞の全般的な転写活性には大きな影響がないことを明らかにした。しかしながら一方で、mep-1変異体を用いてMRG-1の機能を解析した結果、MRG-1が生殖系列特異的な遺伝子pgl-1やnos-1の発現に必要であることを示した。これらの結果は、MRG-1がヒストン脱アセチル化酵素構成因子MEP-1に拮抗する機能をもち、クロマチンリモデリングを介してpgl-1をはじめとする生殖細胞遺伝子の発現活性化に働いていることを強く示唆している。また、MRG-1ときわめてよく似た発現パターンや表現型を示す母性因子であるMES蛋白質群との関係についても解析を進め、MRG-1の発現と独立であることを明らかにし、MES蛋白質群によるヒストンのメチル化をMRG-1が認識してヒストンのアセチル化を促進し、生殖細胞特異的な遺伝子の発現を活性化するというモデルを立てることができた。
プロポフォールが誘導・抑制する新規分子のDNAマイクロアレイによる検索―麻酔薬の作用機序解明を目指して―

本研究は、麻酔薬によって中枢神経系で誘導、あるいは抑制される分子を、DNAマイクロアレイを用いて効率よくスクリーニングしようとするものである。平成13年度は、比較的培養が容易なアストロサイトを静脈麻酔薬であるプロポフォールで刺激した際に誘導あるいは抑制される分子の検索を行った。培養アストロサイト単独とプロポフォールで刺激したアストロサイトからmRNAを単離し、DNAマイクロアレイを施行した。その結果、プロポフォールによりmRNA発現が増加する分子が41種類、減少する分子が44種類検出された。平成14年は、増加する分子群のうちHeat shock protein(HSP)に注目して詳細な検討を行った。HSPは、ストレス反応性タンパク質や抗アポトーシス作用を持つ分子群の転写を上昇する細胞内電子伝達系関連分子であり、プロポフォールの細胞保護作用の機序を説明できる可能性がある。主なHSPについてPCRによるアストロサイト内のmRNA発現定量法を確立し、プロポフォールによるHSP mRNA発現の増加、タンパク質発現の増加を調査中した。HSP84はプロポフォールにより、発現が増加する可能性があり、今後も検討を続けていきたい。また、発現が減少する分子は多彩であるが、興味深いのは細胞骨格に関わる分子群が他種類検出されており、プロポフォールがアストロサイトの分化あるいは形態変化をモジュレイトしている可能性がある。なかでも、シンデカンは反応性アストロサイトにおいて高発現しており、脳損傷後の修復過程におけるグリオーシスに関与している。プロポフォールはシンデカンの発現を低下させることが分かり、今後脳損傷後のグリオーシス予防に使用できる可能性がある。以上のように、プロポフォールの細胞保護作用の機序解明やプロポフォールの新しい作用の発見につながる研究の発端となった。本研究は新たな研究への萌芽的な機能を十分に果たしたと考える。増加する分子群のうち興味深いのは、Heat shock protein(HSP)などのストレス反応性タンパク質や抗アポトーシス作用を持つ分子群の転写を上昇する細胞内電子伝達系関連分子であり、プロポフォールの細胞保護作用の機序を説明できる可能性がある。また、細胞周期に関与する一連の分子群が増加しており、プロポフォールの細胞周期への関与を示唆するものと考える。現在、これらの分子群について、PCRによるアストロサイト内のmRNA発現確認プロポフォールによるmRNA発現の増加、タンパク質発現の増加を調査中である。また、発現が減少する分子は多彩であるが、興味深いのは細胞骨格に関わる分子群が多種類検出されており、プロポフォールがアストロサイトの分化あるいは形態変化をモジュレイトしている可能性があり、今後さらに検討を進める予定である。来年度、検出された分子群についてさらに研究を進めることにより、プロポフオールの多彩な機能を解明できる可能性があり、麻酔薬の麻酔作用以外の新たな使用法が見いだせるかもしれない。