hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線発がん過程を可視化するラットモデルの開発

本研究は、低線量放射線の影響評価に生物学的知見を取り入れて改善するために有用な科学的知見を創出することを目指す。そのため、放射線が誘発した突然変異を標識して腫瘍ができるまで追跡できるデバイスを内蔵した動物システムを作製することを目標とし、これに必要な要素技術の開発を推進していく。従来、放射線被ばくに関連するがんリスクの増加の大きさを推定するためには、放射線が最初に作った遺伝子変異の数とがんリスク増加との間に直線的な関係があるとの仮定に基づいて、線量とがんリスクの間にも直線的関係があるというモデルが用いられてきた。本研究の目指すシステムは、このようなモデルの妥当性を生物学的観点から検討するために有用である。本年度は、作製済みの遺伝子改変ラットのがんにおけるがん抑制遺伝子の解析系として、一塩基置換を定量的に検出するプライマーとプローブを作製して、定量的にがん抑制遺伝子の状態を検出する系を作製した。また、このラットを用いた放射線発がん実験を継続し、腫瘍の発生が見られた個体の解剖と病変の採取、保存、病理標本作製、診断を進めた。新規遺伝子改変ラットの作製については、ノックインの方法を変更するため、新規手法の検討を実施し、成功を見たため、ノックインラットの作製(インジェクション、胚移植、遺伝子改変のチェック)を実施した。産まれたラットのうち1匹で、初めて、目的のノックイン遺伝子の発現が見られた。しかし、生殖可能に至る前に死亡したため、継続的に作製を再開した。既存モデルの放射線照射後に発生した腫瘍の解析については、予想されたよりも腫瘍の発生が遅かったため、解析に時間がかかっている。最終年度に向けて解析を加速する予定である。改変ラット作製については、得られたノックインラットが死亡しやすい表現型を持つという新たな課題に直面したため、対応を検討している。いずれも予期しない要因による遅れであるが、対応可能な範囲内であると考えている。既存遺伝子改変ラットモデルの発がん実験の結果をまとめるとともに、同モデルの腫瘍におけるがん抑制遺伝子の状態を解析して、本モデルが目的とするラットシステムの基本形として使用可能かどうか検討する。また、新規改変ラット作製のためのノックイン実験を継続する。ラットの作製に成功した場合、ラットの清浄化、研究代表者の施設への輸送、繁殖、コロニー拡大、発がん実験の準備を行い、今後の研究につなげる。本研究の目指すシステムは、このようなモデルの妥当性を検討するために有用である。まず、転写抑制因子とその標的エレメントに連結したレポーター遺伝子の2つの構成要素を用いて、転写抑制因子の近傍の大規模欠失をレポーター発現の出現により検出する動物システムを考案した。フィジビリティ調査の結果、培養細胞レベルでかようなレポーターシステムの構築を可能とする報告があるものの、動物個体内では抑制因子によるレポーター発現の抑制が十分でない可能性が浮上した。そこで、まずは本研究で提案するコンセプトを実証することを目的として、より実施可能性が高く元来の目的にアプローチできる、大規模欠失によりレポーター発現が消失するシステムを採用することとした。その検討のために必要となる、がん抑制遺伝子の変異を有する動物モデル候補の繁殖、系統保存を実施した。初めに考案した実験システムのフィジビリティが予想より低いことが判明し、検討に時間をかけ、異なるシステムを採用することにしたため。本年度は、がん抑制遺伝子の変異をヘテロ接合性に持つ発がんモデル動物を基本に、2種類のレポーターを野生型アリル及び変異アリルの近傍にノックインして、野生型アリルが欠失し変異アリルが保持された細胞をレポーター発現の変化に基づいて検出するシステムを考案し、変異アリル側の設計を行った。これに基づき、ノックインのために用いる、恒常的発現プロモーターとレポーター遺伝子を連結したコンストラクトを探索、作製し、CRISPR/Cas法によってノックインすることでがん抑制遺伝子を破壊した発がんモデルラットの作製(インジェクション、胚移植)を行った。本年度行った試行では遺伝子改変ラットは出生せず、引き続き試行を行うこととなった。予定していた内容である、実験系の設計、コンストラクト作製、インジェクションを実施した。改変動物の作製には至らなかったが、想定内の遅れであるため、おおむね順調に進んでいるとした。

そのため、放射線が誘発した突然変異を標識して腫瘍ができるまで追跡できるデバイスを内蔵した動物システムを作製することを目標とし、これに必要な要素技術の開発を推進していく。従来、放射線被ばくに関連するがんリスクの増加の大きさを推定するためには、放射線が最初に作った遺伝子変異の数とがんリスク増加との間に直線的な関係があるとの仮定に基づいて、線量とがんリスクの間にも直線的関係があるというモデルが用いられてきた。本研究の目指すシステムは、このようなモデルの妥当性を生物学的観点から検討するために有用である。本年度は、昨年度入手した蛍光タンパクのコンストラクトをCRISPR/Cas法によってノックインすることでがん抑制遺伝子を破壊した発がんモデルラットの作製を試みているが、まだ成功していない。今年度も引き続き、コンストラクトをがん抑制遺伝子のエクソンを破壊するようにノックインするためのガイドRNA及びオリゴDNAを設計し、インジェクション、胚移植、遺伝子改変のチェックを行った。その結果、標的遺伝子をノックアウトしたラットを得ることはできたが、当初目的のノックインラットを得ることができなかった。その原因としては、産仔数が予想外に少なかったことがあげられる。そこで、上記で作製されたラットを用いて発がん実験の準備を行う予定を少し変更し、すでに作製済みのもう一つの発がんモデルノックアウトラットの使用を検討することとして、その発がん実験を進めた。予定していた内容である、改変ラット作製のためのコンストラクトの受精卵へのインジェクションを実施したが、生まれるラットの数が予期せず少なかったため、目的のラットの作製に至らなかった。代わりに、もう一つの改変ラットの発がん実験を先行したが、やや遅れていると判断した。本研究は、低線量放射線の影響評価に生物学的知見を取り入れて改善するために有用な科学的知見を創出することを目指す。本年度は、作製済みの遺伝子改変ラットのがんにおけるがん抑制遺伝子の解析系として、一塩基置換を定量的に検出するプライマーとプローブを作製して、定量的にがん抑制遺伝子の状態を検出する系を作製した。また、このラットを用いた放射線発がん実験を継続し、腫瘍の発生が見られた個体の解剖と病変の採取、保存、病理標本作製、診断を進めた。
腸内細菌叢による小腸内分泌細胞の分泌機能制御

認知症や自閉症との関連が指摘されている腸内細菌代謝産物を100種類にまで絞り込んだ。この絞り込んだ腸内細菌代謝産物のうち、容易に入手可能なもの30種類について、まず生細胞イメージングスクリーニングとELISAスクリーニングによって消化管ホルモン、特にグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)の分泌を引き起こす腸内細菌代謝産物の同定を試みた。本年度は、絞り込んだ腸内細菌代謝産物をGLP-1を分泌する小腸内分泌L細胞株であるGLUTag細胞に投与し、細胞内カルシウム濃度変化への影響を生細胞イメージングスクリーニングによって解析した。スクリーニングの結果、エクオール、グルタチオン、キヌレン酸といった腸内細菌代謝産物の投与によって細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。一方、4-ヒドロキシフェニル酢酸の投与では、逆に細胞内カルシウム濃度の低下が観察された。また一部の腸内細菌代謝産物では、低濃度の投与では細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こすが、高濃度の投与では逆に細胞内カルシウム濃度の低下を引き起こす反応が観察された。次に、細胞内カルシウム濃度上昇が観察されたエクオールについて、GLUTag細胞に投与した際のGLP-1分泌量への影響をELISAを用いて解析した。解析の結果、エクオールの投与によりGLP-1分泌が抑制されることが分かった。細胞表面のアクチンネットワークを蛍光免疫染色により解析したところ、エクオールの投与によりアクチンネットワークが密になっていることが分かった。これらのことから、細胞内カルシウム濃度上昇が必ずしもGLP-1分泌を引き起こすわけではないことが判明した。細胞内カルシウム濃度上昇または低下を引き起こす腸内代謝産物の同定に成功した。GLP-1分泌能への影響について解析の済んでいない腸内細菌代謝産物は、引き続き生細胞イメージング、ELISAを用いたGLP-1分泌量の測定を行う。
パーキンソン病の早期診断にむけてー嗅球体積評価ー

頭部MRI冠状断1mmスライスで嗅球嗅索の面積を測定し、総和することで体積に近似する方法により、パーキンソン病(PD)の嗅球嗅索体積は、他のPD関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)と疾患対照群と比して有意差をもって小さくなることを明らかにした。また、嗅球嗅索体積測定に、匂い検査、MIBG心筋シンチグラフィーの心/縦隔比を加えることでPD関連疾患からのPD鑑別がより正確になることが判明した。嗅球嗅索体積、匂い検査、心/縦隔比のカットオフ値はそれぞれ、270mm3未満、8点未満、1.6未満であった。嗅球嗅索体積が小さく、匂い検査が8点未満であれば91%がPDであった。パーキンソン病とパーキンソン病関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)を嗅球体積をMRIで計測評価することで鑑別することができることを明らかにした。我々は、morphologyとしての嗅球体積値とphysiologyとしての匂い検査、またはMIBG心筋シンチグラフィを組み合わせることで、上記疾患の鑑別に更に有用であることを見いだした。両者を組み合わせるとパーキンソン病関連疾患の鑑別は精度があがることを明らかにした。また、REM睡眠行動異常症のみ(パーキンソン症状なし)を認めている患者に、MIBG心筋シンチグラフィを実施しH/M比の低下を認める群と認めない群とで分けて嗅球体積を測定した。その結果、嗅球体積低下がみられるとパーキンソン病に移行する傾向にあることが判明した。パーキンソン病とパーキンソン病関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)との鑑別に嗅球体積評価が有効であるかを検討した。パーキンソン病患者14例(平均年齢68.8±10.6歳,平均Hoehn-Yahr Stage (HY) 2.9±1.3,平均罹病期間5.0±3.7年)、多系統萎縮症11例(平均年齢69.2±7.1歳,平均HY3.5±1.4,平均罹病期間3.0±1.5年)、進行性核上性麻痺5例(平均年齢67.8±8.2歳,平均HY3.4±0.7,平均罹病期間3.2±1.6年)、大脳皮質基底核変性症5例(平均年齢75.4±4.3歳,平均HY2.8±1.3,平均罹病期間1.8±0.4年)全例にUnified Parkinson's Disease Rating Score (UPDRS)を採点し、頭部MRIによる嗅球体積測定と匂い検査(OSIT-J)、MIBG心筋シンチグラフィーを実施した。その際、頭部MRIで副鼻腔炎罹患患者は除外し、MMSEを実施し20点以下の患者も除外した。その結果、以下の3点を明確にした。1.嗅球体積と匂い検査とは相関傾向を示すことが判明した。2.パーキンソン病では他の疾患(多系統萎縮症、大脳皮質基底核変性症)に比し明らかに嗅球体積が小さかった(p < 0.05)。3.匂い検査(OSIT-J)は8点未満、嗅球体積は270mm3未満がカットオフになり、両条件を満たす場合はパーキンソン病である可能性が非常に高い。パーキンソン病の早期診断患者を抽出するために必要な検査として頭部MRIによる嗅球・嗅索体積の測定を考案した。パーキンソン病患者の嗅球・嗅索体積は、他の神経変性疾患(進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症)と比して明らかに低下することが判明した。匂い検査(Odor Stick Identification Test for Japanese; OSIT-J)匂と嗅球・嗅索体積測定は相関することがわかった。さらにOSIT-Jと嗅球・嗅索体積を測定しcut off値をそれぞれ8点以下、270mm3以下に設定すると4群に分けられる。OSIT-Jが8点以下(嗅覚障害あり)で嗅球・嗅索体積が270mm3以下(萎縮あり)の群に分類されるとパーキンソン病患者が占める割合が約90%を示すことが判明した。また、MIBG心筋シンチグラフィーと嗅球・嗅索体積も相関することがわかり、この二つの検査においてもそれぞれMIBG心筋シンチグラフィーのH/M比が1.6以下、嗅球・嗅索体積が270mm3以下でcut offが引け、同様にH/M比が1.6以下、体積が270mm3の群にパーキンソン病患者の占有率が高くなることが判明した。以上のことから、パーキンソン病類似疾患に対して嗅球・嗅索体積を測定することは、パーキンソン病の補助診断として有用であることが判明した。嗅球・嗅索体積を測定することで,寝たきりとなってしまった神経変性疾患患者の診断に一役を担うことができる.また、病理解剖の承諾を得られなかった患者に対しても生前の評価として重要な位置を占める可能性がある.パーキンソン病関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)からパーキンソン病を抽出するのに補助検査として有用なものは何か。我々は、パーキンソン病において肉眼的に嗅球が萎縮することに着眼し、対象症例患者の嗅球体積をMRIで計測評価する方法を開発した。さらに我々は、morphologyとしての嗅球体積値とphysiologyとしての匂い検査、またはMIBG心筋シンチグラフィを組み合わせることが、上記疾患の鑑別精度をあげることを見出した。

上記検討により1)嗅球体積と匂い検査とは相関傾向を示すことが判明し、2)パーキンソン病を含むパーキンソン病関連疾患と健常者の中では、唯一パーキンソン病が嗅球体積萎縮を有意に示すことが確認できた。嗅球体積のカットオフ値は270mm3未満であった。日本人向けの匂い検査(Odor Smell Identification Test for Japanese; OSIT-J)のカットオフ値は8点未満であった。この2項目の条件を満たすとパーキンソン病を含むパーキンソン病関連疾患の中で90%の症例がパーキンソン病であることが示された。また、嗅球体積とMIBG心筋シンチグラフィの関係は、嗅球体積のカットオフ値は前述同様の270mm3未満で、MIBG心筋シンチグラフィーのH/M比のカットオフ値は1.8であった。同様に両者を組み合わせるとパーキンソン病関連疾患の鑑別精度は上昇することを明らかにした。上記結果は2015年に英文誌上(Parkinsonism Relat Disord)にて報告済みである。上述のごとく、英文誌上にパーキンソン病では嗅球体積を頭部MRIを用いて測定することがパーキンソン病関連疾患の鑑別において有用であることを示した。さらに、現状において実施されている日本人向けの嗅覚検査(12種の臭素を使用)の簡易版を作成中である。また、頭部MRIを用いた嗅球体積測定を簡易化するソフトを開発中である。パーキンソン病関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)からパーキンソン病を抽出する補助検査に嗅球嗅索体積測定が有用であることを本研究課題で示した。さらに得られた結果から嗅球嗅索体積と匂い検査、嗅球嗅索体積とMIBG心筋シンチグラフィ、それぞれ両者を組み合わせることでパーキンソン病関連疾患においてパーキンソン病を診断する鑑別精度がさらに上昇することを明らかにした。上記結果は2015年に英文誌上(Parkinsonism Relat Disord)で報告した。さらに我々は、この成果を踏まえて、頭部MRIにおける嗅球嗅索体積測定ソフトウェア開発を行っている。頭部MRI冠状断1mmスライスで嗅球嗅索の面積を測定し、総和することで体積に近似する方法により、パーキンソン病(PD)の嗅球嗅索体積は、他のPD関連疾患(多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症)と疾患対照群と比して有意差をもって小さくなることを明らかにした。また、嗅球嗅索体積測定に、匂い検査、MIBG心筋シンチグラフィーの心/縦隔比を加えることでPD関連疾患からのPD鑑別がより正確になることが判明した。嗅球嗅索体積、匂い検査、心/縦隔比のカットオフ値はそれぞれ、270mm3未満、8点未満、1.6未満であった。嗅球嗅索体積が小さく、匂い検査が8点未満であれば91%がPDであった。今年度においては、今までに得られた知見を英語論文としてpublishすることができたことが大きな成果といえるため。日本人向けに開発された匂いテスト(OSIT-J)は、12個の匂いの元(臭素)を嗅がせる試験であるが、12個を嗅がせるのに要する時間は長く、臨床現場としては向いていない。そのため今回われわれは、数個の臭素で簡便に鑑別が出来ないかを検討している。現在4個の臭素でスクリーニングが出来る結果を得ている。また、上述の頭部MRIによる体積測定法は、1mmスライスの画像を1枚1枚フリーハンドで測定するため1症例に対し数10分の時間を要する。そのため、頭部MRI嗅球体積測定方法の簡略化を目指し、体積測定ソフトの開発を行っている。
ポジトロン断層撮影法による「発語」と「その意志」に関する脳内機能局在の検討

言語は音の組合せであるが、日本人は表音文字のカナと表意文字の漢字を併用して言語活動を行なっている。このことは日本人は他の外国人とは違った脳の使い方をしていることが想定される。純粋失語のリハビリでは漢字の方が回復しやすいことと、カナと漢字を失った場合、部位的にことなることが本邦文献で確認されている。本研究の目的はこのことを確かめるために行なわれたものである。被験者をポジトロン断層撮影(PET)装置のベッドに仰臥させ、眼前のTV画面に4文字熟語とカナ単語を1.5sec間隔で、100msec間提示する。被験者はそれを黙読、音読することを教示される。課題は(1)仰臥閉眼静止する。(2)TV画面を凝視する。(3)提示された単語を音読する。(4)提示された単語を音読する。それぞれのPET画像を「遺伝的アルゴリズム」と呼ぶ、研究協力者の橋本の考案した引算法によって「発生」、「文字認知」、「視知覚」に関する脳部位を特定する。12名の被験者について実験を繰り返した。[結果]1.仰臥閉眼静止状態のPET像は被験者内、被験者間にバラツキが認められた。2.(2)のTV画面を凝視すると視覚野の局所血流量が特異的に有意に増加した。3.(3)文字認知については角回、Wernicke野を中心に局所血流量が増加した。4.発声にともない運動野に活性化されることが認められた。以上の結果は先行の英語論文に一致するものであるが、漢字とカナの認知に特別な差認めなかったことについての解釈については後の他の研究者の結果を待たなければならない。言語は音の組合せであるが、日本人は「かな」と「漢字」という表音文字と表意文字を使っているので、特有な脳の使い方をしているという考えがある。脳出血などで言語を失った患者のリハビリの際、「かの」より「漢字」が復活しやすいという症例報告がある。これは失語症において、損なわれるのは左脳であって、右脳ではないことに関係していることが推測される。本研究は「かな」と「漢字」言語処理の脳内機構を探るため、(1)閉眼静止してください。テレビ画面に映し出される文字を(2)黙読しない、(3)音読しなさいという課題を与えて、ポジトロン断層撮影を行ない、課題に特異的に働く部位の検討を行なうものである。被験者は20-25歳の志願者。刺激材料はそれぞれ120個から成る(1)4文字熟語、(2)4文字ひらがな単語で、1.5sec間隔に100msec順次提示する。仰臥した被験者に(1)、(2)の単語、熟語系列を提示、(1)、(2)、(3)の課題を与え、6回の実験を繰り返す。結果は、核磁気共鳴画像に、(1)と(2)について、(3)マイナス(2)、(2)マイナス(1)をコンピュータ処理したポジトロン断層撮影結果を重ねて、「かな」と「漢字」処理に関わる脳部位を明らかにした。予備実験に手間どり、本実験は9月から始め、現在12名の志願者について実験を行なったが、結論を出すまでには至っていない。この研究経過は計画どおり進んでいると考えている。言語は音の組合せであるが、日本人は「かな」と「漢字」という表音文字と表意文字を併用している。脳梗塞、脳出血などで言語を失った日本人のリハビリの過程において、「かな」より「漢字」の方が復活しやすいということが症例報告にしばしば記載されている。

このことは日本人は他の言語を使う人たちと異なった脳の使い方をしていること、つまり、「かな」と「漢字」を処理する神経機構が異なっていることを推定させるものである。本研究はこの推定を確かめるためにポジトロン断層撮影法(PET)を用い、「かな」と「漢字」を提示したときの違いを明らかにすることを目的とするものである。被験者は実験の意味をよく理解し被験者になることに同意した20-25才の学生志願者。テレビ画面に映し出される四文字熟語、かな単語(1.5秒間隔で100ミリ秒を順次4分間提示)に対して、(1)黙読しなさい、(2)音読しなさい、(3)連想する単語を言いなさいという課題を与え、その結果から(3)-(2)、'(2)-(1)、(1)-閉眼静止した状態を引算することにより、(1)連想に関わる部位、(2)発声に関わる部位、(3)文字処理に関わる部位、(4)視覚情報の処理に関わる部位を検討した。本年度は「自発運動をする課題」から「閉眼静止した状態」を引算することにより運動野を選択的に光らせることができ、われわれが行なった画像処理の妥当性を確認した。課題実験に関しては現在までに16名の被験者を用い実験を繰り返している。個体別の結果を得ているが、平均値を出す点に問題があり、未だ結論を出すまでには至っていない。この研究経過は計画どおり進んでいると考えている。言語は音の組合せであるが、日本人は表音文字のカナと表意文字の漢字を併用して言語活動を行なっている。このことは日本人は他の外国人とは違った脳の使い方をしていることが想定される。純粋失語のリハビリでは漢字の方が回復しやすいことと、カナと漢字を失った場合、部位的にことなることが本邦文献で確認されている。本研究の目的はこのことを確かめるために行なわれたものである。被験者をポジトロン断層撮影(PET)装置のベッドに仰臥させ、眼前のTV画面に4文字熟語とカナ単語を1.5sec間隔で、100msec間提示する。被験者はそれを黙読、音読することを教示される。課題は(1)仰臥閉眼静止する。(2) TV画面を凝視する。(3)提示された単語を音読する。(4)提示された単語を音読する。それぞれのPET画像を「遺伝的アルゴリズム」と呼ぶ、研究協力者の橋本の考案した引算法によって「発声」、「文字認知」、「視知覚」に関する脳部位を特定する。12名の被験者について実験を繰り返した。[結果]1.仰臥閉眼静止状態のPET像は被験者内、被験者間にバラツキが認められた。2. (2)のTV画面を凝視すると視覚野の局所血流量が特異的に有意に増加した。3. (3)文字認知については角回、Wernicke野を中心に局所血流量が増加した。4.発声にともない運動野に活性化されることが認められた。以上の結果は先行の英語論文に一致するものであるが、漢字とカナの認知に特別な差認めなかったことについての解釈については後の他の研究者の結果を待たなければならない。
映像を用いた東南アジアのゴング文化の音楽人類学的研究

東南アジアにおいて、ゴングは、霊的な力を備えた音具、権力を示す財産、交易品などとして重要な位置を占めてきた。この研究は、(1)これまで研究の少なかったベトナム中部とラオス南部、カンボジア北東部、およびフィリピン北部における少数民族のゴング文化についての調査、(2)ベトナムとインドネシアにおけるゴング製作技術の比較調査、(3)インドネシアにおけるゴング流通の変化と製作拠点の再編および鉄製ゴング製作の発展について明らかにした。平成24年度には、(1)ベトナム中部、ラオス南部、タイ、(2)フィリピン、(3)ジャワ島、バリ島、ロンボク島にて調査撮影等をおこなった。(1)ベトナム中部及びラオス南部は、カンボジア北部やフィリピン・ルソン島とともに、平ゴングを用いるアンサンブルを特徴としている。これらの地域のゴング演奏等を調査撮影するとともに、ホイアン近郊の村にて、現在も平ゴングが製造されていることを確認し、調査撮影をおこなった。ラオスやカンボジアにおいては、これまで平ゴングの製造を確認できていないが、今後、これらの地域が平ゴング流通においてどのようにつながっているのかを明らかにする端緒となるだろう。また、タイにおける小型こぶつきゴング製造過程の調査撮影の成果と合わせて、他地域におけるゴングの製造や調律の技術との比較研究の素材としても重要である。(2)フィリピンは、治安上の問題により、ゴング・アンサンブルをもつ地域の調査撮影は困難な状況にあるため、過去に国立民族学博物館が撮影した映像の上映会をマニラ等においておこなった。上記地域を出身地とする人々の参加を得て、彼らのコミュニティにおけるゴング・アンサンブルの重要性を明らかにするための手がかりとすることができた。(3)ジャワ島、バリ島、ロンボク島では、ゴングの製造と流通の過程について、調査撮影をおこなった。特に大型こぶつきゴングの製造については、ジャワ島中部が東南アジア島嶼部のセンターとして機能していることが明らかになってきた。一方、小型ゴングの製造や調律作業等は、ゴングが使用される地域でおこなわれる傾向が強く、ゴング関連楽器の製造と流通における分業が見られることも明らかになっている。また、マレー半島からジャワ島へのゴング製造の注文も多いことが明らかになり、今後、マレーシアにおける調査により、島嶼部のゴング流通やゴング文化の動態を明らかにすることができるだろう。平成25年度は、ラオス、インドネシア等にて調査撮影を進めたほか、東洋音楽学会大会にて、中間的な成果報告をおこなった。また、ロンドン大学等で関連する映像の上映をおこない、関連分野の研究者等との意見交換をおこなった。1ラオスにおいては、南部山間部において調査撮影等をおこなうとともに、平成24年度の調査映像を政府関係機関および調査対象村の関係者に渡し、意見交換をおこなった。開発が進み、急速に社会が変化しつつあるが、伝統的なゴング文化は比較的変わらず伝えられており、ゴングに関する信仰やタブーについて調査を進めることができた。2インドネシアでは、ジャワ島、バリ島、ロンボク島などにおいて調査撮影を進めた。これまでの調査により、これらの地域における青銅製のゴングの製造および流通の概要を把握することができたが、それに加え、鉄製のゴングの製造および流通についても調査を進めた。鉄製ゴングは、青銅製のものとは異なる製造過程と流通経路をもつことが明らかになりつつある。3東洋音楽学会大会において、パネルディスカッション「ゴング文化研究への視角」を組織し、これまでの研究成果の中間報告をおこなった。A.これまで比較的調査が進んでいなかったベトナムとラオスの少数民族のゴング文化について報告し、B.広い範囲でのゴングの製造拠点と流通の再編を背景として、地域のゴング文化を維持するために調律師の存在が重要であることを指摘、また、C.鉄製ゴングが青銅製ゴングとは異なる製造と流通のパターンをもつことを示し、鉄製ゴングに注目することでゴング文化の多様性への理解を深めることにつながると論じた。4ロンドン大学、エストニアのワールド・フィルム・フェスティバル等で、東南アジアのゴングに関連する映像の上映をおこない、映像を通じてゴング文化を研究する可能性について、多くの研究者らと議論をおこなった。1東南アジア大陸部では、ベトナム中部高原にて、これまで撮影した映像を関係者と視聴して意見交換をおこない、さらにゴング演奏や関連する民謡等について調査撮影を進めた。また、ラオス東北部において楽器使用等について調査をおこなった。当初調査予定だったカンボジアについては、長期にわたり調査を続けている井上航氏と情報交換を密におこない、国立民族学博物館が所蔵するゴング文化の記録映像と併せて、比較検討の材料とした。この地域の特徴である平ゴングの使用とこぶ付ゴングとの合奏の広がり、儀礼との結びつき、特に精霊との交流におけるゴング演奏の重要性、ゴングの流通を支えるゴング製作工房や調律師の役割について明らかにした。2主にインドネシアのジャワ島、バリ島、ロンボク島での調査撮影を進めた。青銅製ゴングおよびその代用品と捉えられることの多い鉄および真鍮製のゴングの製造と流通、使用の歴史的動態が明らかになってきた。特に1980年代以降、学校教育で地域の文化を教えるために大量のゴングの需要が生まれ、大量の注文をさばくゴング商が誕生し、比較的安価で製作も容易な鉄製ゴングの製作と流通のネットワークが生まれた。また、鉄製ゴングの突起部に真鍮製のこぶを取り付けるなど、新しい製作手法が広がっている。3フィリピンにおいて、11回にわたり映像の上映および意見交換をおこない、映像が音楽文化の継承や活性化に果たしうる役割を検証した。映像は音楽伝統の伝承において大きな役割を果たしうる。

その特長を生かすために、学術的映像における文字情報の効果的かつ適切な位置づけなどを再検討する必要が指摘された。さらに、1人の創作者の作品として映像を考察するばかりでなく、伝統継承者、研究者、教育者、一般の聴衆など、多様なアクターを結び付けて音楽文化を活性化するプロセスとして映像を再想像する必要が確認された。平成27年度は補助期間の1年間延長が認められ、インドネシアにおける補充調査と東洋音楽学会大会における成果発表等をおこなった。1.インドネシアのジャワ島中部スラカルタにおいて、鉄製ゴングの製作について補充調査と撮影をおこなった。近年、鉄製ゴングの製作において、浅いこぶの上に真鍮製のこぶをとりつける技法がよく用いられている。この技法はスラカルタに発祥したという情報を得たため、現地にて調査をおこなった。少なくとも1980年代初頭にはスラカルタでこの技法が用いられていたことがわかったが、この技法の考案者については明らかにすることができなかった。なお、ジョグジャカルタのゴング製作者が考案したという情報もあったが、製作者本人が他界されたため、詳しく情報を確認することができなかった。2.東洋音楽学会大会において、パネルディスカッション「東南アジア諸地域のゴング文化の相互関連」を組織し、研究成果の報告をおこなった。東南アジア大陸部については、これまで詳細な報告があまりなかった東南アジア大陸部少数民族の平らゴングを中心とするアンサンブルについて、ラオス南部のゴング・アンサンブルの映像記録を紹介したほか、ベトナム中部高原のゴング・アンサンブルの現代における変化について報告した。また、島嶼部に関しては、鉄製のゴングの製作状況等について報告した。ジャワの王宮文化で知られるジョグジャカルタでは、青銅ゴングはほとんど製作されておらず鉄製ゴングが作られていること、バリ島とロンボック島では価格が安く重量が軽い鉄製のゴングの需要が高まっていることが指摘された。島嶼部では、地域間のゴングの流通が比較的盛んであり、近年の鉄製ゴングの需要の高まりに応じてゴング製造拠点と流通が変化していることが明らかになった。東南アジアにおいて、ゴングは、霊的な力を備えた音具、権力を示す財産、交易品などとして重要な位置を占めてきた。この研究は、(1)これまで研究の少なかったベトナム中部とラオス南部、カンボジア北東部、およびフィリピン北部における少数民族のゴング文化についての調査、(2)ベトナムとインドネシアにおけるゴング製作技術の比較調査、(3)インドネシアにおけるゴング流通の変化と製作拠点の再編および鉄製ゴング製作の発展について明らかにした。カンボジア、マレーシアのゴング文化については、本格的な調査撮影を実施できなかったが、以前、国立民族学博物館の音楽展示新構築に合わせて調査撮影をおこなったため、それらの資料を基にそれぞれの地域の研究者との意見交換をおこない、資料と情報を補った。
サブウイルスＲＮＡ病原体の失われた環を繋ぐ新型リボザイムの基本構造と新機能解析

サブウイルスRNAとは宿主に依存して自律複製するウイロイドとウイルスに依存して複製するサテライトRNAを包含したRNAの総称である。特にウイロイドと小環状サテライトRNAの一部には共通の保存配列を有するリボザイム活性が認められることからサブウイルスRNAの単系統説が提唱されている。中国の桑樹から分離された新規ウイロイド様小環状RNAが有するハンマーヘッド型リボザイムと新規リボザイムの分子構造、自己切断活性及び遺伝的多様性を分析し、リボザイム活性に影響を与えうる複数の塩基変異を検出した。自己複製能の欠如とリボザイム特性から桑小環状RNAは環状サテライトRNAに所属させるのが妥当と考えられた。ウイロイドは環状1本鎖RNAからなる最小の病原体で、宿主植物に感染して自律的に複製する。一方、サテライトRNAは線状或は環状1本鎖RNAで、“ヘルパーウイルス"粒子中に取り込まれウイルスに依存して複製増殖する。両方を併せて“サブウイルスRNA"と呼称する。環状サテライトRNAはウイロイド様サテライトRNAとも呼ばれ、リボザイム機能を有する。中国のMosaic dwarf病罹病桑樹から検出されたウイロイド様小環状RNA(以下mscRNA)について、今年度(2年目)は、その遺伝的多様性、特にリボザイム保存領域とそれ以外の領域の遺伝的多様性の違いを分析し、リボザイム機能発現に必須な配列情報を明確にし、新規な人工リボザイム設計に必要な情報を収集した。昨年度までに発生を確認した中国江蘇省と陝西省産の桑樹から収集した44株のmscRNA分離株のうち、江蘇省の10分離株を無作為に抽出し、RT-PCR法で全長cDNAを増幅した後クローン化し、各分離株につき10個ずつのcDNAクローンの全塩基配列を解析し、各分離株集団内の遺伝的多様性を分析した。その結果、江蘇省10分離株と浙江省分離株は共に355ヌクレオチドで構成され、江蘇省集団には3種の主要変異体が存在し、既報の浙江省分離株と4箇所、4箇所、2箇所でそれぞれ塩基置換変異が認められた。その内の一箇所の変異は江蘇省10分離株で共通に見られ、興味深いことにマイナス鎖のヘアピンリボザイムの自己切断部位の3'末端塩基に生じていた。また、江蘇省2分離株に見られたもう一つ変異はやはりマイナス鎖のヘアピンリボザイム保存領域のすぐ5'上流塩基に生じていたことから、これらの変異はマイナス鎖の自己切断活性に影響を及ぼす可能性が高く、結果として病原性の違いに関与する可能性も示唆された。以上、当初の目的に掲げたmscRNAのリボザイム機能に関与する可能性のある遺伝的多系を検出することができ、論文投稿(Sagawaら)の準備を進めている。ウイロイドは環状1本鎖RNA病原体で、宿主植物で自律的複製する。サテライトRNAは“ヘルパーウイルス"に依存して複製増殖する。両方を“サブウイルスRNA"と呼称する。中国の桑樹からウイロイド類似の小環状RNA(以下Mulberry small circular RNA; mscRNA)が検出され、Mosaic dwarf病の病原と疑われている。mscRNAの発生分布、分子性状、及び生物的性状を分析した。まず発生分布に関し、海外共同研究者(中国農科院・李世訪博士)及び日本国内の研究者と共同で中国江蘇省、江西省、陝西省、及び日本の群馬県の各桑栽培圃場で採集した200点以上の試料を検査し、浙江省、江蘇省、陝西省に分布していることを明らかにした。江西省と群馬県からは検出されなかった。また、リボザイム機能に関し、in vitro自己切断実験と自己切断部位特定実験を行った結果、mscRNAはプラス鎖もマイナス鎖も効率よく自己切断され、プラス鎖はハンマーヘッド型、マイナス鎖はヘアピン型のリボザイム機能で自己切断することを明らかにした。以上の結果に基づき、mscRNAはウイロイドではなく「環状1本鎖RNA型サテライトRNA」であり、未同定のウイルスに付随して複製増殖している分子と結論付けた。当初の予定通り、mscRNAの発生分布、分子性状、生物的性状に関する新たな知見を得ることができた。まず期待通りmscRNAの複数の栽培地域における分離株を収集できたのでその遺伝子多様性分析の目途が立った。また、mscRNA分子が有する2種類の異なるリボザイム配列を明確にできたので、予定通りハンマーヘッド型とヘアピン型リボザイム配列の置換が自己複製能に果たす役割を分析する実験が可能になった。当初の予定に沿って、mscRNAの遺伝的多様性、特に2種類のリボザイム保存領域とそれ以外の領域の遺伝的多様性の違いを分析し、リボザイムの機能発現に必須な配列情報を明確にし、新規な人工リボザイム設計に必要な情報を収集する。また、類似の環状RNA分子構造を有しながら自己複製するウイロイドとウイルスに依存して複製するサテライトRNAの違いについて、サブウイルスRNA病原体の分子進化の観点から考察する。

初年度に試料収集・研究打ち合わせ等のための旅費を計上していたが、海外共同研究者の事情により2年目に変更した。初年度の分析から中国国内の複数の栽培地域にmscRNAが発生していることを明らかにしたので、次年度には中国以外の桑産地のmscRNAの発生分布も調査したい。
無尾両生類アンドロゲン受容体cDNAの単離と構造解析

1.本邦産のツチガエル(Rana rugosa)の東広島(広島県)、大子(茨城県)及び浜北(静岡県)の3地方集団を用いて、幼生期のステージI、V及びXに1匹当り100μgのテストステロンプロピオネートを投与し変態完了期に性腺を調べたところ、東広島及び大子集団では全ての処理群で79.2-100%と高率に雄が観察され、浜北集団では42.9-60.9%となり対照群と差はなかった。従って、雄性ホルモン投与により、東広島及び大子集団では雌から雄への性転換が起こり易く、浜北集団では起こり難いことが考えられた。2.東広島集団の幼生期のステージVに0.01,0.1,1,10,100μgのテストステロンプロピオネートを投与したところ,1μg以上の投与で100%雄が観察された。さらに、東広島及び浜北集団のステージVに10μgのテストステロンプロピオネートまたはエストラジオールベンゾエイトを投与したところ、東広島集団へのテストステロンプロピオネート処理でのみ100%雄が観察される。従って、雄から雌への性転換は雄性ホルモンによって誘導されることが考えられた。3.東広島集団と浜北集団間の性逆雑種を作り、その幼生期のステージIに100μgのテストステロンプロピオネートを投与したところ、91.4-100%と高率に雄が観察された。従って、ツチガエルでは性転換を抑制するのではなく誘導する機構が存在することが考えられた。4.成体のアフリカツメガエルよりmRNAを抽出し、すでにクローニングされているヒト、ラット及びマウスの雄性ホルモン受容体cDNAの塩基配列を基に設定したプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ約700塩基対のフラグメントが増幅された。現在、そのクローニングを行っている。
軸索膜電位とイオンチャネル機能異常をターゲットとしたALSの新規治療法の開発

神経変性疾患モデルマウスに対して神経イオンチャネル機能異常が果たす役割、あるいは神経イオンチャネル機能調整薬を用いて治療ターゲットにすることで神経保護作用を持つ、という仮説を立てて評価を行った。通常用いられているSODモデルマウスは発症時期が早期であり、かつ一旦発症すると急激に機能低下が起こるため、イオンチャネル機能調整薬では臨床効果を認めなかった。より緩徐発症の新規モデルマウスを当施設で作成しており、本研究が終了した後も引き続き今回の仮説を用いた研究を行っていく。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は進行性の運動ニューロン死による難治性神経疾患である。精力的な研究が世界中で行われて来てはいるが、根本的な治療法はいまだ存在しない。そのため、新規治療法を開発することが強く求められている。さて、ALSやALS関連疾患と関連すると考えられている原因遺伝子はいくつか報告されている。それらは細胞内輸送に関連するために、その機能に異常をきたした場合にはミトコンドリア機能障害を引き起こすことが知られている。ミトコンドリアは細胞のエネルギー産生に関わっており、神経細胞において重要な機能として膜電位の維持と神経興奮性の適切な管理である。神経軸索の興奮性を適切に維持することにより、ミトコンドリア障害に続発する神経軸索障害を最小化し、神経保護作用をもつことが報告されている。この研究ではALSモデル動物を用い、神経軸索の興奮性調整に重要な機能をもつイオンチャネル機能調節薬が神経保護作用をもつか調べる。イオンチャネルと軸索膜電位がALS治療の治療ターゲットとして有用であるか検討することが本研究の主目的である。本年度は実験動物において神経興奮性検査の記録を再現性良く記録する方法と月齢に対する神経興奮性検査の変化につき検討してきた。これまでの研究でも行われてきた方法であり、良い再現性にて検査を行っていくことについては、ほぼ満足する結果を得ることができた。コンピュータモデリングを用いたイオンチャネル機能の推定に関しても精度よく行われている。引き続き、神経変性疾患に対して神経イオンチャネル機能異常が果たす役割、さらにそれを治療ターゲットにすることで神経保護作用を持つかにつき、実験動物を用いて評価を行っている。現在のところ、遅いK電流の機能低下と持続性Na電流の機能亢進がALSの病態生理に密接に関連しているというデータが動物・患者において複数の報告がある。これらのチャネル作動薬を用いてALSモデルマウスの予後が改善するか現在評価中である。薬物投与による危険性は認められず、順調に実験が行われている。引き続き、神経変性疾患モデルマウスに対して神経イオンチャネル機能異常が果たす役割、あるいは神経イオンチャネル機能調整薬を用いて治療ターゲットにすることで神経保護作用を持つ、という仮説を立て、評価を行っている。現在のところ、遅いカリウム電流の機能低下を持続性ナトリウム電流の機能亢進がALSの病態生理に密接に関連しているというデータが人およびモデル動物において散見される。薬物投与により危険性は無く、神経保護作用に対して実験を行っている。予想よりもモデルマウスの発症が遅いため、薬物投与による治療効果の判定が遅れ気味である。臨床神経生理学引き続き動物に対して薬物投与を行い、生命予後に影響あるか評価を行う。神経病理学的評価も行い、発症早期においても評価をしていき治療が有用か評価していく。検査法の信頼度及び再現性について検討中であり、疾患モデル動物への応用を行っているところである。使用薬物が当初の予定より安価に入手できるようになった疾患モデル動物に対する治療及び検査所見につき引き続き検討している。動物の購入・管理費、薬剤の購入費用、試薬代などに使用する予定動物実験につき、動物の供給が若干遅れているため翌年度に実験を継続していく。具体的には実験動物の購入、電気生理検査の備品購入などである。
南米先住民族の人類遺伝学的研究

本研究は、十年前に南米における国際学術研究として開始したHTLVの調査から、研究目的や調査対象が著しく拡大し、この数年間ではアンデス先住民族と日本民族の遺伝学的類似性に焦点をあてた学際的な人類遺伝学的研究にまで展開した。第一に、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)の流行分布から中南米の先住民族は二群に大別される。つまり、北部のカリブ海地域、オリノコ川流域、アマゾン流域、南部のパタゴニア地域などの低地に幅広く定着している先住民族は2型を保有しているが、高地のアンデス先住民族は日本人と同じ1型を保有していた。第二に、動物の免疫監視機構に重要な役割を果たしているリンパ球抗原(HLA)DR-DQ遺伝子の塩基配列によるハプロタイプの類似性解析から、アンデス先住民族の中には九州西南部に分布する日本人と全く同型のものが多く分布するが、他全域の先住民族(上記のHTLVの2型を保有)では類似型はほとんど検出されない。むしろ、両者は全く異なった遺伝的背景を呈していた。このような知見から、アンデス先住民族が日本列島に定着したアジアの先住民族と人類遺伝学的に近縁関係にあるという仮説が立証できた。一方、われわれは、昨年度からアンデス地域に眠り続けてきた自然ミイラを対象とした遺伝疫学的研究を過去4年間続けていくことにより、ウイルス学的、人類遺伝学的、考古学的に重要な新知見を得ることができた。ミイラの骨や骨髄のDNAを解析することにより、チリ北部アタカマ高原のミイラ(約千五百年前のティワナク)からヒトβグロビン遺伝子、およびHTLVの1型プロウイルス遺伝子(pX領域の158bp)の抽出に成功した。両遺伝子についてはクローニングすることにより塩基配列を決定し、ヒトβグロビン遺伝子には全く変位がみられず、pX領域158bpの遺伝子では現存する先住民族で二つの型(日本人型と1塩基の変異型)に大別され、ミイラのそれは日本人のウイルスと同型であった。さらに、ミトコンドリア遺伝子の塩基配列から現存する先住民族とミイラが類似した分布様式を示すことも明らかになった。これらの研究成果は、日本人とアンデス先住民族の人類学的つながりや、南米アンデスに現存する先住民族と新大陸発見以前に居住していた先住民族を科学的に結びつける新知見として、医学的のみならず人類遺伝学的、考古学的に極めて重要な発見といえる。われわれはアジア人の同胞と考えられている南米先住民族、およびアンデス地域に眠り続けてきた自然ミイラを対象とした民族疫学的研究を過去3年間続けていくことにより、ウイルス学的、人類遺伝学的、考古学的に重要な新知見を得ることができた。第一に、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)流行分布から中南米の先住民族は二群に大別される。つまり、北部のカリブ海地域、オリノコ川流域、アマゾン流域、南部パタゴニア地域などに幅広く定着している先住民族は2型を保有しているが、アンデス先住民族は日本人と同じ1型を保有していた。

このような知見から、アンデス先住民族が日本列島に定着したアジアの先住民族と人類遺伝学的に近縁関係にあるという仮説が立証できた。さらに、今年度はアンデス地域に眠り続けてきた自然ミイラ(130体)の人類遺伝学的解析により、チリ北部アタカマ高原のミイラ(約千年前のティワナク)からHLA-DG遺伝子、およびHTLVの1型プロウイルス遺伝子(pX領域158bp)の抽出に成功した。また、ミトコンドリア遺伝子の塩基配列からは現存する先住民族とミイラが類似した分布様式を示すことも明らかになった。これらの知見は、日本とアンデス先住民族、また現存する先住民族と新大陸発見以前に居住していた先住民族を科学的に結びつける知見として、医学的のみならず人類遺伝学的、考古学的の極めて重要な発見といえる。われわれはアジア人の同胞と考えられている南米先住民族、およびアンデス地域に眠り続けてきた自然ミイラを対象とした民族疫学的研究を過去4年間続けていくことにより、ウイルス学的、人類遺伝学的、考古学的に重要な新知見を得ることができた。第一に、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)の流行分布から中南米の先住民族は二群に大別される。つまり、北部のカリブ海地域、オリノコ川流域、アマゾン流域、南部のパタゴニア地域などに幅広く定着している低地の先住民族は2型を保有しているが、高地のアンデス先住民族は日本人と同じ1型を保有していた。第二に、動物の免疫監視機構に重要な役割を果たしているリンパ球抗原(HLA)DR-DQ遺伝子の塩基配列によるハプロタイプの類似性解析から、アンデス先住民族の中には九州西南部に分布する日本人と全く同型のものが多く分布するが、他全域の先住民族(上記のHTLVの2型を保有)では類似型はほとんど検出されない。むしろ、両者は全く異なった遺伝的背景を呈していた。さらに、昨年度からアンデス地域に眠り続けてきた自然ミイラ(130体)のDNA解析により、チリ北部アタカマ高原のミイラ(約千五百年前のティワナク)からヒトβグロビン遺伝子、およびHTLVの1型プロウイルス遺伝子(pX領域の158bp)の抽出に成功した。両遺伝子についてはクローニングすることにより塩基配列を決定し、ヒトβグロビン遺伝子には全く変位がみられず、pX領域158bpの遺伝子では現存する先住民族で二つの型(日本人型と1塩基の変異型)に大別され、ミイラのそれは日本人のウイルスと同型であった。一方では、ミトコンドリア遺伝子の塩基配列から現存する先住民族とミイラが類似した分布様式を示すことも明らかになった。これらの知見は、日本人とアンデス先住民族、また現存する先住民族と新大陸発見以前に居住していた先住民族を科学的に結びつける知見として、医学的のみならず人類遺伝学的、考古学的に極めて重要な発見といえる。
衝動性と将来報酬予測機能における脳内セロトニンの役割

昨年度までの検討で、reward delay impulsivityにおけるセロトニンの役割が明らかになった一方で、うつ病患者を対象にこれまでの課題を行ったところ、理解力不足や注意の持続が困難であることより解析モデルにフィットせず、広く臨床に用いることができる簡易版報酬予測課題を作成しさらに検討を進める必要があった。本年度は、簡易報酬予測課題の基礎検討((1)fMRI計測では個人ごとに計算されたγの値が大きいほど報酬予測値に関連した脳活動のピークが背側に位置している、(2)計算されたγの値が低いほど抑うつ尺度の得点が高い、などの結果が得られた)を経て、簡易版報酬予測課題、質問形式の遅延割引課題、rapid response impulsivityに関連した報酬・罰GO/NOGO課題と脳内セロトニン濃度変化との関連を検討した。その際、脳内セロトニン濃度と合わせて、衝動性に関与する重要な要因と考えられるセロトニン受容体の遺伝子多型やパーソナリティーの特徴(TCIおよびNEO-FFIで評価)も個人差として考慮した。その結果、(1)簡易報酬予課題において、セロトニン欠乏時におけるdiscount factor;γの低下(reward delay impulsivityの上昇)が個人の性格特性と関連していること、(2)報酬・罰GO/NOGO課題において、セロトニン2A受容体のAA型ではG carrierと比較してrapid response impulsivityが高く、その傾向はセロトニン欠乏時により顕著となること、(3)質問紙形式の遅延報酬選択課題においては、セロトニン欠乏時に将来予測される損失が割り引いて評価されること、などが明らかとなった。今回衝動性におけるセロトニンの役割を多面的かっ個人差にも注目して検討できたことは、様々な衝動性を有する精神疾患の病態解明を進める上でも非常に有意義であった。本年度は、衝動性の神経基盤を明らかにするために、健常者およびセロトニンの機能低下がみられるうつ病患者を対象として、以下の通り実施した。1.申請者らは、セロトニンは報酬予測における時間スケールを制御し、セロトニン低下は長期報酬予測機能を低下させることを明らかにしてきた。しかし、これまでの報酬予測課題はうつ病患者では難易度が高く、課題を工夫する必要があった。そこで、本年度は、うつ病群においても実施可能な課題とするために、使用する刺激と課題のパラメータを単純化した、簡易版の報酬予測課題を作成した。2.簡易版報酬予測課題を用いて、健常者を対象に、行動実験を行った。行動データを強化学習モデルに当てはめて、割引率γを推定した。その割引率γと抑うつとの単相関分析を行ったところ、割引率γと抑うつとは正の相関関係を示した。また、長期報酬選択率と抑うつとは負の相関関係を示した。抑うつ症状は、セロトニンに関わる割引率に影響を与え、その結果として、長期的な報酬予測機能が低下すると推測できる。3.簡易版報酬予測課題を用いて、健常者を対象にfMRI実験を行った。行動データを強化学習モデルに当てはめて、割引率γと実験協力者の報酬に対する予期を推定した。その推定された報酬予期と相関する脳部位を検討したところ、線条体に賦活がみられた。そして、各実験協力者における割引率γの値と賦活した線条体の部位との相関をとると、割引率γが高くなるほど背側領域での賦活が増加した。これは、申請者らのこれまでの研究と一貫する結果であり、実験協力者ごとに推定した値でも同様の結果が再現できた点が新しい点である。今後、本課題をうつ病患者や摂食障害患者などの衝動性を示す患者群において実施し、脳内セロトニン機能との関係を検討する。
糸状菌(ヘミ)セルラーゼ遺伝子発現制御因子の同定と機能解析

糸状菌Aspergillus aculeatusの任意の遺伝子破壊株を網羅的に作出するために、効率のよいアグロバクテリウムを用いた本菌の形質転換法を確立した。作出した約1万5千株の形質転換体の中から、セルラーゼ遺伝子発現制御因子欠損株の候補として40株を選択した。転写因子様タンパク質の遺伝子破壊株において、セロビオヒドロラーゼ遺伝子発現誘導能が約1/5に低下している事を見出した。今後、同定された因子の機能解析を行うと共に、他の制御因子の同定・機能解析を行う計画である。本課題では、糸状菌の(ヘミ)セルラーゼ遺伝子発現制御因子を同定し、その機能を解析することを目的としている。まず平成20年度は、アグロバクテリウムによる趣Aspergilus aculeatus形質転換系を構築し、T-DNAの挿入により網羅的に遺伝子破壊株を作出する系を確立するとともに、TAIL-PCR法を用いて破壊遺伝子を効率よく同定するための系を構築した。アグロバクテリウムによりA.aculeatusを形質転換する条件を検討した結果、OD_660=0.4のアグロバクテリウム培養液と107個のA.aculeatus分生子を混合し、アセトシリンゴンを添加した液体培地で48時間共培養した場合に最も形質転換効率が高く、A.aculeatusの95%のゲノム遺伝子の破壊株を取得するに必要な45,000株の形質転換体を単離することが可能になった。また、この条件で得られた約60%の形質転換体でT-DNAがシングルコピーで挿入されていることがサザンブロッティング解析により明らかになり、その周辺配列がTAIL-PCRにより効率よく獲得できることを証明した。T-DNAの染色体への組み込みによりその周辺配列で大規模な欠失が起きていない事、T-DNAが安定して染色体上に保持されることから、本課題において確立したアグロバクテリウム形質転換法とTAIL-PCR法を用いて、新規遺伝子発現制御因子をスクリーニングすることが可能になった。現在、形質転換体から目的の(ヘミ)セルラーゼ遺伝子発現制御因子の遺伝子破壊株のみをスクリーニングできる系を構築しており、確立でき次第、因子の同定と機能解析を行う予定である。我々は、糸状菌Aspergillus aculeatusが分泌する糖化力に優れたセルラーゼ・ヘミセルラーゼをセルロース性バイオマスの酵素糖化に利活用するために、本菌を宿主として(ヘミ)セルラーゼを大量に生産する系を構築する事を目指している。本課題ではその一段階として、本菌における(ヘミ)セルラーゼ遺伝子群の発現制御機構を解明する事を計画した。これまでに、アグロバクテリウム形質転換(AMT)法を用いて網羅的にA.aculeatusの遺伝子破壊株を作出する条件を決定している。そこで平成21年度は、決定した条件のもと、AMT法を用いて本菌を形質転換後、(ヘミ)セルラーゼ遺伝子発現制御に関わる因子が欠損した場合にのみ形質転換体が生育可能となるような選択条件を決定し、目的の制御因子欠損株の単離を目指した。これまでに、約1万5千株のA.aculeatus形質転換体をスクリーニングし、セルラーゼ遺伝子発現制御因子破壊株の候補として40株を単離した。現在は、順次破壊遺伝子を遺伝子タギング法を用いて同定している段階ではある。これまでの解析で、同一の遺伝子が破壊された株が2株単離されたことから、この遺伝子がセルラーゼ遺伝子発現制御に関与していることが示唆された。そこで、宿主と遺伝子破壊株におけるセロビオヒドロラーゼI遺伝子(cbhI)の発現量をリアルタイムPCR法を用いて解析した結果、cbhI発現は候補株において宿主の約1/5に低下しており、同定した遺伝子がセルラーゼ遺伝子発現制御に関与していることが強く示唆された。今後、この遺伝子の機能解析を詳細に行うとともに、他の候補株の変異点を同定して解析を行うことにより、より多くの(ヘミ)セルラーゼ遺伝子発現制御因子を同定する計画である。糸状菌は、産業上有用な種々の酵素を生産する能力を有しているが、その生産メカニズムは未だ未解明な部分が多い。本研究は、それらのメカニズムを分子レベルで解明する事にも応用可能な成果である。