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無機リン酸（リン）応答複合体機能の解明とリン過剰克服に向けた新戦略

慢性腎臓病(CKD)の進行や透析患者の生命予後においてリンコントロールは非常に重要な役割を演じている。リン代謝異常は早期CKDから生じており、リンバランスの維持は生命予後を規定する重要な調節系であると考えられる。近年、リン酸(以下リン)代謝調節系(リンシグナルネットワーク:P net)を支配する線維芽細胞様増殖因子FGF23 /klotho系など明らかにされ、骨と腎臓を結ぶリン調節系など、様々なリン代謝における臓器相関の重要性が明らかにされた。我々は、これまでの研究によりリンシグナルネットワーク(P net)調節に共通に関わるリン応答複合体(Psome)の存在とリン代謝異常発症への関与を見出した。平成30年は、平成29年度に得られた研究成果を踏まえ、腎臓におけるリン感受機構に関わる分子群(リン応答複合体, TMD2)および骨細胞FGF23誘導因子とその表現型に関して、さらなる実験を実施した。DMP1-hHB-EGF :トランスジェニックマウスを解析し、骨細胞から分泌されている因子の役割を明らかにした。また、腸管や腎臓における、リン吸収を中心にミネラル代謝を分析し、カルシウム吸収能および胆汁酸代謝における異常を明らかにした。平成30年度も、Psomeの中心であるTMD2(#213)遺伝子欠損マウスの表現型解析を実施した。本マウスの表現型において、血中FGF23濃度の異常を明らかにして、その原因に関して腎近位尿細管上皮細胞におけるシグナル伝達異常を同定した。平成30年度の計画に従い、主に、骨細胞欠損マウスの表現型解析、およびFGF23誘導因子に関して実験を実施した。骨細胞欠損マウスの表現型では、各種ミネラル代謝の解析から、腸管におけるカルシウム吸収の抑制、及びリン吸収の亢進が観察された。また、腸管における遺伝子発現の解析より、胆汁酸代謝の異常が確認された。さらに、血中FGF23濃度は、骨細胞欠損により、顕著に抑制されていたが、欠損後、緩やかな回復が観察された。本動物では、NamptなどのNAD代謝に関する異常も確認された。骨細胞の欠損は、血中PTH濃度の変化が観察されたが、血中活性型ビタミンD濃度には、影響が確認されなかった。また、腸管におけるFGF15や胆汁酸輸送に関与する各種分子の亢進が観察された。カルシウムやリンの同位元素を用いた、体内ミネラル代謝解析では、先の出納実験と同じように、カルシウム吸収の抑制と、リン吸収亢進が観察された。腸管におけるカルシウム吸収抑制の原因として、活性型ビタミンDの代謝を解析したが、その作用には変化は観察されなかった。よって、腸管カルシウム吸収を抑制する新たな因子の存在が予想された。一方、骨細胞欠損により、腎臓Klotho蛋白の顕著な抑制が観察された。また腎近位尿細管におけるリン再吸収に関与するNaPi-IIa, NaPi-IIcの低下も確認された。さらに、腎臓における線維化が見られ、それらの原因としてリン排泄の亢進が考えられた。これらの異常の原因として、FGF23分泌を制御する因子の関与が予想され、その候補としてNamptなどのNAD代謝調節因子の関与が示唆された。以上のように平成30年度の研究計画に基づき、各項目に関してほぼ進行しており、平成31年度の計画が実施できると考える。よって、平成30年度の計画は、おおむね達成できた。平成31年度の計画としては、平成30年度までに得られた成果を発展させ、Psomeを中心としてのTMD2の役割、および腎/骨細胞から分泌されるFGF23誘導因子(IFGF)のさらなる解明を目指す。1)TMD2欠損マウスにおけるリン代謝異常の解析,平成31年度は、Psomeの中心であるTMD2(#213)遺伝子欠損マウス作製の解析を行う。本マウスの外見上での、骨格異常は観察されていないが、様々な、リン代謝異常が予想される。平成30年度に得られた結果より、本マウスの異常はFGF23の異常な高値を呈しており、その原因を明らかにする。また各種骨解析技術を用いて、本マウスのミネラル代謝異常を明らかにする。また、TMD2と相互作用するタンパクを同定する。2)IFGF候補分子Nampt遺伝子の解析,平成30年には骨細胞欠損マウスの遺伝子解析から、骨細胞や腎臓で発現が顕著に上昇する分泌型Namptに関して、リン代謝の異常などが、明らかにされた。平成31年度も、同様に、FGF23やミネラル代謝異常に焦点を絞り、その原因を明らかにすることでIGFI候補分子の情報に利用する。3)骨細胞特異的欠損マウスからのアプローチ,平成31年度は、平成30年度の結果をさらに詳細に解析する。Tatsumiらが樹立した、ジフテリア毒素(DT)投与により任意の時期に骨細胞を特異的に死滅させることができるトランスジェニックマウス(DMP1-hHB-EGF Tg:以下Tgマウス)の系統を使用し骨細胞死滅マウスの解析を行う。本マウスの解析により、骨細胞から分泌されている因子の機能欠損が可能となる。平成31年度においても、本マウスの腎臓障害の原因を明らかにすると同時に、IFGFによるFGF23分泌が、骨細胞由来であるか否か、さらなる検討を行う。

リン代謝異常は早期CKDから生じており、リンバランスの維持は生命予後を規定する重要な調節系であると考えられる。近年、リン酸(以下リン)代謝調節系(リンシグナルネットワーク:P net)を支配する繊維芽細胞様増殖因子FGF23 /klotho系など明らかにされ、骨と腎臓を結ぶリン調節系など、様々なリン代謝における臓器相関の重要性が明らかにされた。我々は、これまでの研究によりリンシグナルネットワーク(P net)調節に共通に関わるリン応答複合体(Psome)の存在とリン代謝異常発症への関与を見出した。平成29年は、腎臓におけるリン感受機構に関わる分子群(リン応答複合体)およびFGF23誘導因子に関して実験を実施した。Tatsumiらが樹立した、ジフテリア毒素(DT)投与により任意の時期に骨細胞を特異的に死滅させることができるトランスジェニックマウス(DMP1-hHB-EGF Tg:以下Tgマウス)の系統を使用し骨細胞死滅マウスを作製した。この方法は、任意の時期に誘導的に骨細胞のみを死滅させることのできるトランスジェニックマウス(Tg)を確立した。本マウスを解析し、骨細胞から分泌されている因子としてFGF23以外にも、様々な分泌蛋白の発現を解析した。また、腎臓における、リン吸収を中心にミネラル代謝を分析し、腎線維化の発症、Klotho蛋白の減少など、リン感受機構における異常を明らかにした。平成29年度は、Psomeの中心であるTMD2(#213)遺伝子欠損マウス作製しており、その表現型を解析した。本マウスの外見上での、骨格異常は観察されていないが、食餌性リン応答に変化が見られた。また、腎臓におけるリン感受機構において、明らかな異常が観察された。平成29年度の計画に従い、主に、腎臓におけるリン感受機構に関わる分子群(リン応答複合体)及びFGF23誘導因子に関して実験を実施した。平成29年度の研究計画に基づき、各項目に関してほぼ進行しており、平成30年度の計画が実施できると考える。よって、平成29年度の計画は、おおむね達成できた。慢性腎臓病(CKD)の進行や透析患者の生命予後においてリンコントロールは非常に重要な役割を演じている。近年、リン酸(以下リン)代謝調節系(リンシグナルネットワーク:P net)を支配する線維芽細胞様増殖因子FGF23 /klotho系など明らかにされ、骨と腎臓を結ぶリン調節系など、様々なリン代謝における臓器相関の重要性が明らかにされた。平成30年は、平成29年度に得られた研究成果を踏まえ、腎臓におけるリン感受機構に関わる分子群(リン応答複合体, TMD2)および骨細胞FGF23誘導因子とその表現型に関して、さらなる実験を実施した。DMP1-hHB-EGF :トランスジェニックマウスを解析し、骨細胞から分泌されている因子の役割を明らかにした。また、腸管や腎臓における、リン吸収を中心にミネラル代謝を分析し、カルシウム吸収能および胆汁酸代謝における異常を明らかにした。平成30年度も、Psomeの中心であるTMD2(#213)
芥子油由来チオヒダントイン化合物の食品中生成レベルと抗変異原性発現機構の解析

アブラナ科植物に特有の辛味成分であるイソチオシアナートは,アミノ酸の共存下においてチオヒダントインに変換される。昨年度は,アリルイソチオシアナート(AITC)を含む加工食品(ワサビ風味の調味浅漬,ワサビのり,ワサビ漬け)中にチオヒダントインが生成することを初めて明らかにした。チオヒダントインは,ヘテロサイクリックアミン類やニトロ化合物の変異原性を強く抑制することがこれまでの実験で明らかになっている。本年度は,AITCに由来するチオヒダントインを用いて,変異原の代謝活性化酵素のひとつであるシトクロムP450(CYP)1Aに対する影響,直接変異原に対する影響の観点から抗変異原作用機構を検討した。IQなどのヘテロサイクリックアミン類は,肝臓のCYP 1Aによって代謝活性化され,究極変異原物質であるN-hydroxy-IQに変換される。そこでまず,CYP 1Aに特異的な基質であるEthoxyresorufin (ER)を用いて,CYP 1A活性への影響を検討した。その結果,ATH-Leu, ATH-Val, ATH-Trp, ATH-Phe (AITCとロイシン,バリン,トリプトファン,フェニルアラニンとの反応物)がこの酵素活性を阻害することが確認され,チオヒダントインはCYP 1Aの阻害により変異原の代謝活性化を抑制し,抗変異原性を示すことが明らかになった。また,酵素活性試験では阻害作用を示さなかったATH-Asp, ATH-Glu, ATH-Gly (AITCとアスパラギン酸,グルタミン酸,グリシンとの反応物)は,N-hydroxy-IQの変異原性を抑制することがAmes試験で確認されたことから,直接変異原物質を不活化させて抗変異原性を示す機構も明らかになった。さらに,チオヒダントインは,ニトロ化合物である4-NQOとの直接的な反応によりその変異原性を抑制することも示唆された。以上の結果から,チオヒダントインは5位の炭素に結合したアミノ酸に由来する構造の違いによって抗変異原作用機構が異なることが示された。チオヒダントインの構造と抗変異原性との関連については,さまざまなチオヒダントインを調製し構造活性相関を検討する必要がある。アブラナ科植物に特有の辛味成分であるイソチオシアナートは,アミノ酸の共存下においてチオヒダントイン化合物に変換される。これまでに行ったモデル実験の結果から,実際に食品中においてもチオヒダントイン化合物が生成することが推測された。アリルイソチオシナアート(AITC)は,ワサビやカラシのフレーバーを付与する香料として加工食品に広く利用されていることから,AITCを含む食品(ワサビ風味の調味浅漬,ワサビのり,ワサビ漬け)を材料としてチオヒダントイン化合物の分析を試みた。これらの加工食品のメタノール抽出物を調製し,シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて分画後,AITCと各種アミノ酸より調製したチオヒダントイン化合物を標品としてLC-MS分析を行った。その結果,調味浅漬中にAITCとグルタミン酸の反応物であるATH-Gluが,のり佃煮中にはATH-GluのほかにATH-Val,ATH-Phe,ATH-Leu(それぞれバリン,フェニルアラニン,ロイシンとの反応物)の生成が確認され,食品中にチオヒダントイン化合物が生成することを初めて明らかにした。合成標品との比較から,含量は調味浅漬で0.3 1nmol/ml調味液,のり佃煮で1.9 8.9nmol/gであった。また,ATH-Val,ATH-Phe,ATH-Leuが検出され,それらの含量は0.3 3.1nmol/gであった。

さらに,チオヒダントインは,ニトロ化合物である4-NQOとの直接的な反応によりその変異原性を抑制することも示唆された。以上の結果から,チオヒダントインは5位の炭素に結合したアミノ酸に由来する構造の違いによって抗変異原作用機構が異なることが示された。チオヒダントインの構造と抗変異原性との関連については,さまざまなチオヒダントインを調製し構造活性相関を検討する必要がある。
タンパク質キャビティーを反応場として駆使する新触媒の創製

生体内での生合成や代謝反応の多くは、酵素が介在し、基質選択性と生成物の立体制御を伴いながら温和な条件下で速やかに進行している。酵素が優れた触媒である主な要因は、長い年月の進化を経て最適化された活性中心とその周辺近傍の精密な分子構造が形成する反応場を有することにある。したがって、我々が新しい触媒を構築する際には、酵素の精巧な反応場を学ぶことが、きわめて有意義である。本研究では、タンパク質の空孔に非天然金属錯体を挿入した新しい反応場を構築し、天然の金属錯体の活性を凌駕する人工生体触媒の構築や、天然では見られない有機反応を触媒する新しい金属酵素の開発が目的である。当該年度は、生体内で酸素貯蔵タンパク質として機能するミオグロビンに着目した。このタンパク質は、ヘム分子が補因子として結合し、酸素分子の結合と脱離をつかさどっている。今回は、ヘム分子を除去したアポタンパク質に、天然のヘム分子に類似した配位子を有する金属ポルフィセンを挿入した再構成ミオグロビンを調製し、その触媒能の評価を実施した。特に難易度の高い不活性アルカンの水酸化、及びカルベン中間体を経由したオレフィンのシクロプロパン化反応について、以下に記述する。(1)補因子としてマンガンポルフィセンを有する再構成ミオグロビンは、過酸化水素存在下、C(sp3)-H結合の活性化を伴うアルカンの水酸化の触媒として働くことが明らかとなった。また、活性中間体はマンガン5価オキソ錯体であることも、EPR測定から示された。(2)補因子として鉄ポルフィセンを有する再構成ミオグロビンは、ジアゾ酢酸エチルとスチレンのシクロプロパン化の触媒反応を顕著に加速することが明らかとなった。また、本反応の中間体として想定されている鉄カルベン錯体種をストップドフロー測定によって検出を試みた。ミオグロビンの補因子であるヘム分子の置換は、これまでにも多くの例があるが、非天然ヘムを挿入した再構成ミオグロビンを用いて、高難度物質変換の触媒反応を実施した例はそれほど多くない。我々はこの課題に着目し、C(sp3)-H結合の活性化を介したアルカンの水酸化やC-C結合形成を伴うシクロプロパン化反応をつかさどる再構成ミオグロビンの開発に挑戦した。具体的には、ポルフィリンの構造異性体であるポルフィセンを配位子としたマンガン及び鉄錯体を補因子として合成し、アポミオグロビンに挿入して、新規人工生体触媒として用いた。以下に、その触媒を用いた反応の展開と進捗状況を記す。(1)マンガンポルフィセンを含有するミオグロビンについては、以前から同定を行っているが、今回さらにX線結晶構造解析で、マンガンポルフィセンがヘムポケットの正常な位置に結合していることを示した。さらにストップドフロー手法とEPR測定から、再構成ミオグロビンと過酸の反応においてはマンガン5価オキソ種(鉄の場合には、4価オキソ・ポルフィセンπカチオンラジカル種)であることが証明された。さらに、基質としては、エチルベンゼン、トルエン、シクロヘキサン、ヘキサン、プロパンなどを位置選択的に水酸化することが明らかとなった。(2)天然のミオグロビンにおいて、ジアゾ酢酸エチルを加えると、スチレンのシクロプロパン化が進行することは、近年明らかとなっている。一方、今回は、ミオグロビン中の補因子ヘムを鉄ポルフィセンに置換することにより、鉄カルベン錯体の生成が615倍加速されることが明らかとなった。また触媒効率を示すkcat/Km値も26倍向上することが示された。このようにミオグロビン中の鉄ポルフィリンは、シクロプロパン化反応の触媒として優れていることが判明した。この事実は、理論計算によっても、支持された。本来は酵素としては働かないミオグロビンのタンパク質を利用して、難易度の高い反応をつかさどる酵素に変換することは、非常に挑戦的な課題である。これまでは比較的簡単なペルオキシダーゼ活性を有する再構成ミオグロビンの開発研究を行ってきたが、今回は、より難しい反応の触媒として利用することを検討した。その結果、ある程度の目標は達成したが、さらなる反応性の向上や反応選択性の吟味を実施する必要がある。特に、金属ポルフィセンを結合するヘムポケットを形成するアミノ酸残基の検討を行い、ヘムポケットの構造に対して、活性化や選択性がどのように影響するのか、詳細に検討したい。さらに個々のテーマについては、以下の課題がある。特に(1)については、より難易度の高いエタン、そしてメタンの水酸化をめざす。また、ヘムポケットの構造をアミノ酸残基の変異導入によって調製し、生成物のアルコールのエナンチオ選択性の評価や反応活性の向上を図る。さらには、本反応のメカニズムを理論計算により考察する試みも実施する。一方(2)については、やはりヘムポケットの構造による生成物の置換シクロプロパンの立体選択性について吟味する。また、基質もスチレンだけでなく、色々なオレフィンやカルベン供与体を試みる。さらにこの反応をミオグロビン以外のヘムタンパク質でも検討を重ねたい。さらに、上記の反応だけでなく、C-H結合の活性化やC-C結合形成、あるいは水素発生やCO2固定など、難易度の高い物質変換に焦点をあて、天然では見られない反応を選択的に行う人工金属酵素の開発を積極的に展開する。

酵素が優れた触媒である主な要因は、長い年月の進化を経て最適化された活性中心とその周辺近傍の精密な分子構造が形成する反応場を有することにある。したがって、我々が新しい触媒を構築する際には、酵素の精巧な反応場を学ぶことが、きわめて有意義である。本研究では、タンパク質の空孔に非天然金属錯体を挿入した新しい反応場を構築し、天然の金属錯体の活性を凌駕する人工生体触媒の構築や、天然では見られない有機反応を触媒する新しい金属酵素の開発が目的である。当該年度は、有用な空孔を有するタンパク質として、ヘムタンパク質のアポ体(ヘムを除去したタンパク質)に焦点をあてた。ヘムタンパク質は補欠分子であるヘム(ポルフィリン鉄錯体)とタンパク質が結合して機能を発揮する生体分子である。このヘムの多くはプロトヘムIX (heme b)であり、配位結合を含む非共有結合でタンパク質と安定な複合体を形成している。したがって、ヘムタンパク質を酸処理することにより、ヘムを除去したアポ体を入手することが可能である。得られたアポ体が安定であれば、ヘムポケットにはユニークな空孔が存在し、そこに適した金属錯体を導入することが可能である。具体的には、本来NOを結合するnitrobindin (NB)と呼ばれるヘムタンパク質に着目し、天然のヘムを除去したアポ体の空孔にRhCp錯体を導入し、フェニルアセチレンの重合反応を試みた。実際には、NBの空孔の内部構造・環境を遺伝子工学的に改変したタンパク質にRhCp錯体を導入し、人工的に得られた生体金属触媒を水中で使うことによって、本来はシス体が得られるアセチレンのポリマーについてトランス体が優先して得られることを見出した。通常、phenylacetyleneは、Rh触媒を用いることによりcis体のポリマーが得られる。我々は、マレイミド基を側鎖に導入したCp配位子を有するRh錯体を、NBの96番目をCysに置換したNB(Q96C)変異体と反応させることで、Rh錯体をβバレル空孔内に装着したハイブリッド生体触媒を作製した。本来Rh錯体を触媒として用いた際のポリマーのtrans/cisの比が7:93となる重合反応において、ハイブリッド触媒を用いると、trans/cisの比は54:46に変化した。これは、Rh触媒を含むタンパク質の反応場によって、アセチレンの活性種への接近方向が規制されたことが一因と考えられる。この知見をもとに、さらに反応場を形成するβバレル空孔周辺の幾つかのアミノ酸を順次別のアミノ酸に置換することを試み、合計10種類以上のNB変異体を調製し、それぞれRh錯体を導入して、ポリマーの立体選択性を評価した。その結果、NB(F44W/H76L/Q96C/H158L)及びNB(H76L/Q96C/H158L)において、trans/cisの比は、それぞれ77:23、82:18となり、transポリマーが優先して生成する触媒を獲得した。本結果は、Rh触媒周囲の第2配位圏として振る舞うタンパク質マトリクス(βバレル)の構造や環境を改変することにより、生成物の立体を制御することが可能であることを示している。次に、NBに対して、マレイミド基を側鎖に有するterpyridineを空孔に修飾し、銅2価イオンを添加することで、銅錯体を有するNBを調製した。
ライスネル膜の細胞体および細胞接合部の強度に関する研究

内耳膜迷路においてライスネル膜の強度を調べることはメニエル病における内リンパ水腫の病態生理を知る上で必要である。測定機器の組立に当たっては微小な生体膜の周囲をいかに押え、それをセンサーで突く際に生じる微弱な荷重をいかに記録するかが問題であった。ライスネル膜はヒト剖検体内耳から採取したものを用ちいた。ヒト内耳が実験動物に比べてもっとも大きく対象可能であったからである。200mumの小孔に切り出したライスネル膜を張り、130mum径のセンサー針で4.8mum/secの速度で押込むと荷重押込み量曲線を描いて4.2mNの荷重で破断する。ライスネル膜の強度は細胞体と細胞接合部で維持されているが、破断は接合部で生じることが多い。この曲線からライスネル膜の物理的特性である弾性係数(ヤング率)は3.78×10^4mN/mm^^2と計算された。これに対して基底膜は破断荷重は31mN、弾性係数は1,356×10^4mN/mm^^2でありライスネル膜よりかなり強靱である。基底膜上にはコルチ器が載っており、基底膜が静的、恒常的に偏位すると聴覚に影響を来す。ライスネル膜は2層の細胞から成り、内リンパ腔に面した神経上皮とリンパ腔に面した中胚葉系の膜である。強度はほとんどが神経上皮性の細胞層に依存している。内リンパ液の量が増加してそれに蝸牛管の膜が抵抗する時、一番弱いライスネル膜の物性が内リンパ圧を産生するのに寄与している。ライスネル膜の破断値と同じ荷重をヒト基底膜にかけるとこれに20mum以上押下げられることが判明した。ライスネル膜の弾性や復元力がメニエール病内リンパ水腫における病的状態を作り出していることが示唆された。
サッカーにおける高強度走中のポゼッション攻撃に関する研究

当該年度は、大学サッカー公式戦において、小型GPS計測デバイスの着用による試合中の競技パフォーマンスに関するデータ収集するとともに、異なる地域リーグにおいて測定を実施し、大学サッカー公式戦における試合中の活動量および生理的応答に関する比較から競技レベルについて定量的な評価を行った。移動距離、移動速度などの測定に際しては、小型GPS計測デバイスSports Performance Indicatorを用い、データ解析にはTeam AMSの専用分析ソフトを用いた。試合中の心拍数の測定に際しては、心拍モニター胸部ベルトを用いた。心拍モニター胸部ベルトT34トランスミッターを選手の胸部に装着し、心拍信号は小型GPS計測デバイスと同期化され、試合開始から終了まで連続的に記録された。測定対象は、平成27年度に全日本大学サッカー選手権大会に出場した2チームを対象とした。各チームの所属先リーグとして、関東大学サッカーリーグ1部に所属するKチーム、北海道学生サッカーリーグ1部に所属するHチームであった。結果、総移動距離ではKがHよりも長く、Walking以外のスピードカテゴリーにおいても長い傾向が示された。平均心拍数および平均%HRmaxともにKがHよりも高く、高強度帯域においても高い傾向が示された。平均移動速度および平均心拍数ともにDFおよびFWにおいてはKがHよりも高い傾向にあるものの、MFにおいてはHがKよりも高い傾向が示された。本研究の結果、KはHよりも高強度帯域での試合中の活動量および生理学的応答が高い傾向が示されたものの、ポジション別におけるMFでは、HがKよりも高い傾向がみられた。研究計画調書において記載のとおり、「GPS基盤内蔵ボール」をもとに次年度はさらに研究を遂行する予定であった。そのため「GPS基盤内蔵ボール」の開発に際して28年度から30年度にかけて\1,500,000を費用として計上した。しかし、28年度において、先方企業の都合によって開発が年度途中に棄却され、研究計画そのものを大きく修正せざるを得ない状況となった。そこで、新たに、「SPI HPU」の機器の導入によって研究を円滑に遂行していけるものと判断し、本法人の費用立替のもと、機器の導入が実施された。次年度においては、研究計画調書に記載どおりの実験が可能となったことから、新奇性の高い研究成果を発信する。国内サッカーにおいては、ポゼッションプレイを基盤とした戦い方をするチームがあらゆるカテゴリーを超えて増えてきている。一方、ポゼッショントレーニングの熟達に従い、試合で発現される動作とそれに伴う運動強度について定量化した報告は数少ない。ポッゼッショントレーニングの熟達による影響を調査することは、選手のポゼッションスキルを促進させるコーチングポイントを検討する上で意義があると思われる。そこで本研究は、ポゼッショントレーニングの熟達差が試合での加速および減速とそれに伴う運動強度にどのような影響を及ぼすか明らかにすることを目的とした。本研究の対象は、日本の大学サッカー選手60名であり、同チームのうち競技レベル別にファーストチームとセカンドチームに分けた。試合中のランニングパフォーマンスおよび心拍数として測定されたデータは、GPSおよび短距離無線テレメトリーを用いて収集した。ボールポゼッションとして測定された技術的パフォーマンスのデータはnotational analysisを用いて収集した。結果、ランニングパフォーマンスとボールポゼッションに関する関係は競技レベルで異なる特徴が示された。自己点検の結果、研究計画書どおり、競技レベル別にランニングパフォーマンスとボールポゼッションに関する関係を提示することができたことから、(2)「おおむね順調に進展している」と評価した。(今後の方針)当該年度においては、公式戦で発現される高強度走中のポゼッション攻撃に関する具体的なデータについて生理的応答をベースに知見を得ることが出来た。次年度においては、これらのデータがさらに試合で発現されるために、どのようなトレーニング方法が適しているのかについて、ポゼッション攻撃を高めるトレーニングをあらゆる条件のもと複数実施し、トレーニング効果を見極める介入試験を実施する。なお次年度で得る知見をもとに高強度走中のポゼッション攻撃に関するトレーニング方法について確立をめざす。当該年度までの研究成果を整理し、本年度の研究計画に基づいた研究成果を報告するとともに、国際学術誌に論文投稿を予定している。なお今現在すでに論文投稿中である。機器の開発依頼をかけていた企業の開発棄却により、研究経費の使用も含め大幅な変更が生じた。本年度の研究計画に基づいて計画通り遂行できているが、より多くのデータを得るための人件費等に充てる。現在、本法人の助力により次年度使用額の充当が認められ、新たな研究機材の購入をすることができた。今後は研究計画調書とおり研究計画の実施が可能である。
放物型ハーディ空間のポテンシャル解析

ポテンシャル論の主な対象は楕円型方程式の解であるが,放物型方程式の解析も興味深い対象であり,この方面の研究は放物型ポテンシャル論と呼ばれる.本研究は,この観点から,放物型作用素の可積分な解の作るハーディー空間およびベルグマン空間上の作用素解析を放物型ポテンシャル論の手法で行うものである.特に,カルレソン埋め込みが有界となる正測度の特徴付けに成功し,ベルグマン空間においてはテープリッツ作用素がそれぞれ,有界,コンパクト,シャッテン族,有限階数,になるための条件,さらに,テープリッツ作用素とカルレソン埋め込みの関係などついて整理した.ポテンシャル論の主な対象は楕円型方程式の解であるが,放物型方程式の解析も興味深い対象であり,この方面の研究は放物型ポテンシャル論と呼ばれる.本研究は,この観点から,放物型作用素の可積分な解の作るハーディー空間およびベルグマン空間上の作用素解析を放物型ポテンシャル論の手法で行うものである.特に,カルレソン埋め込みが有界となる正測度の特徴付けに成功し,ベルグマン空間においてはテープリッツ作用素がそれぞれ,有界,コンパクト,シャッテン族,有限階数,になるための条件,さらに,テープリッツ作用素とカルレソン埋め込みの関係などついて整理した.前年度に得られていた放物型Bergman空間のCarleson不等式に関する結果が出版できたが(Tohoku Math.J),それを継続発展させて整理する作業を続けた.3名の連携研究者との勉強会に旅費を使ったが有意義な時間が持てた.この勉強会において放物型Bergman空間上のToeplitz作用素のSchatten族への分類について,指数が1以下の場合の結果を得た.1以上の場合はすでにKodai Math.J.(Vol.32(2009),501-520)に発表していたが,今回はそれとは別の視点からの考察で,Schatten族の分類についての知見が深まった.この結果は現在投稿中である.関連して,9月にローマ大学ボルテラセンターを訪問し講演するとともに,確率解析との関連を模索した.本研究の本来の目的はHardy型空間の解析である.これまでの研究対象であるBergman型との比較検討により研究を進めている.対応する結果を整理して学会発表をしたがHardy型に独自の結果はまだ得られていない.Carleson埋め込みとToeplitz作用素との関係をより明確にすることを始めているが,今後の課題である.偏微分方程式研究者や確率論研究者を代表者が主催するポテンシャル論セミナーに招いての講演の機会も設けた.これらを通して,新しい視点からの解析を深めたい.放物型作用素の可積分な解の作るハーディー型およびベルグマン型の空間の解析をすすめている.特に,テープリッツ作用素のシャッテンクラスの分類を発展する形で,作用素が有限階数(finite rank)になるための条件を整理した.これまではテープッリッツ作用素を定義するラドン測度には増大条件を付加して考察してきたが,今回の研究は対称形式を利用して,増大条件を仮定しないで議論している.「Positive Toeplitz operators of finite rank on the parabolic Bergman spaces」のタイトルで論文を準備している.ポテンシャル解析との関連で,指数型の負荷を付けての多項式近似におけるいくつかの結果を得ている.1つはFavard型とJackson型の定理の関係であり,もう1つはFavard型不等式についてで,いずれも論文として発表した.また,マルチン境界に関して,放物型作用素からのアプローチによる成果を得て,「A parabolic approach to Martin boundaries forelliptic equations in skew product form」と題した論文として現在整理中である.毎週に研究代表者が主催しているポテンシャル論セミナーでは年間で25を越える講演があり,偏微分方程式や確率論の研究等の広い観点からポテンシャル論を見直す機会が得られた.分数ベキの放物型作用素のp乗可積分な解の作るベルグマン型空間とp乗可積分は境界値を持つ解の作るハーディー型空間の解析を進めた.特に,ベルグマン型空間に作用するテープリッツ作用素の有界性,コンパクト性,シャッテンクラスの分類についての知見はかなり深まり,さらに,作用素が有限階数になる場合についての結果を論文として発表した.また,ハーディ型空間におけるカルレッソン型不等式について整理をしたが,それ以外のベルグマン型空間で得られた事実についてのハーディー型空間における検証も進んでいる.複素平面における対数ポテンシャル論の応用として,指数型の重みをつけての多項式近似の理論がある.今年度はバーガの結果に関連して,近似関数が整関数に拡張できるための必要十分条件につての定理を示すことができた.また,重み関数を滑らかなものに置き換えることに成功した.この事実の応用を現在整理中である.26年度が最終年度であるため、記入しない。ポテンシャル論26年度が最終年度であるため、記入しない。放物型ベルグマン型空間の考察とポテンシャル解析に関連しての多項式近似やマルチン境界に関しては計画以上に進展しているが,ベルグマン型空間との比較によるハーディー型空間に対する解析は思うようにできていない部分がある.本研究の主要な目的は放物型Bergman空間で得られている結果の放物型Hardy空間における状況を整理することであるが,Carleson不等式に関して一定の成果が得られた.また,Martin境界と多項式近似においての成果を論文にまとめることができた.本研究は放物型作用素に関するハーディ型空間の解析であるが,これまでにベルグマン型空間の解析が十分に進み,その対応物としてのいくつかの結果が明確になってきている.

放物型ハーディー空間の解析に重点を置くとともに,ポテンシャル解析として関連する多項式近似やマルチン境界に関する研究をよりすすめたい.課題の1つはCarleson不等式における指数の条件が取り除けるかという問題である.実軸上の多項式近似に関しては,近似する多項式としてde la Vallee Poussin平均を考えて,その微分を含めた近似の度合いについての考察を進めたい.また,情報発信と情報収集の両面においても大変有効であった毎週のポテンシャル論セミナーの開催を,今までと同様に続けたい.上半空間の放物型作用素に関するベルグマン空間およびハーディー空間の研究に関連して,本研究の1つの柱であるポテンシャル論セミナー(毎週金曜日開催)において,ユークッリド空間の領域や対称等質空間におけるベルグマン核の境界挙動に関する発表がなされるようになった.今後はこれらの研究成果を踏まえて,より一般な領域について,幾何学的条件を加味したベルグマン空間およびハーディー空間の解析を進めたい.
スピンドルチェックポイントのシグナル伝達系

スピンドルチェックポイントは有糸分裂期において染色体の均等分配を保障する監視機構である。有糸分裂初期から中期にかけてこのチェックポイントはすべての染色体動原体に紡錘糸が接続されるまで姉妹染色分体の解離を遅延させる。本研究プロジェクトでは、スピンドルチェックポイントのシグナル伝達系で中枢的な役割を演じるMad2タンパク質に注目し、その生化学的性状とMad2タンパク質を負に制御する分子メカニズムの解明を目指した。まずMad2タンパク質がN1-Mad2とn2-Mad2の二種の立体構造をとり得ること、またN2-Mad2がよりAPC/Cに対する阻害活性が高いことを突きとめた。試験管系でN1-Mad2とN2-Mad2の変換は非常に遅いが、スピンドルチェックポイントの上流因子であるMad1がこの変換を促進することを示した。さらにMad2の負の制御因子であるp31cometはN2-Mad2に選択的に相互作用することも示した。p31cometを生化学的に解析することにより、DNCI(ダイニンモーターのサブユニットの一つである中間鎖)がp31cometと結合するすることを発見した。両タンパク質の相互作用は主に有糸分裂期の後半でおこる。DNCIを欠損する細胞は赤道面上に染色体が整列したまま細胞周期の進行が停止する。この表現型はDNCIとp31cometが協調してスピンドルチェックポイントの解除過程に機能することを示唆するものである。スピンドルチェックポイントは総ての染色体動原体と紡錘糸とが正常に接続するまで細胞周期の進行を停止する監視機構である。このチェックポイントの中枢タンパク質であるMad2はシグナル伝播因子として重要な機能を担っている。本研究により、Mad2タンパク質は2種(N1とN2)の立体構造を取り得ること、さらにN1型はMad2のリン酸化を保持しやすく、N2型は他の制御因子と相互作用しやすいこと、N1型からN2型の変換にはMad1タンパク質が必要であることを示した。チェックポイントのシグナル伝達過程においてMad2タンパク質の高次構造の変化が深く関与することが判明した。Mad2が関わるシグナル伝達系におけるMad1の機能をさらに詳細に解析する準備として、抗Mad1抗体を作成し、さらにMad1タンパク質の種々の変異体を作成中である。またこのチェックポイントの解除過程に関わるタンパク質Cmt2は有糸分裂中期までは紡錘糸の先端に局在し、後期への移行に先立ち紡錘糸から離脱、Mad2タンパク質と結合することを見いだした。興味深いことに、紡錘糸と相互作用できない変異型のCmt2は、より高いMad2結合能とスピンドルチェックポイントの解除活性を示した。動原体と紡錘糸との接続によりチェックポイントが制御される分子メカニズムの解明の重要な手がかりである。目下、生細胞でのCmt2タンパク質の挙動を追跡するための実験系を確立している。紡錘糸の動原体への接続と、Cmt2の紡錘糸からの離脱が共役することを碓認することを優先目標に鋭意努力している。スピンドルチェックポイントは、すべての動原体に紡錘糸が適切に接続するまで姉妹染色分体の解離を遅延させる。細胞周期が円滑に進行するためには、動原体への紡錘糸の接続完了にともないこのチェックポイントが解除されることが必要である。本研究ではスピンドルチェックポイントの解除因子、p31comet(旧名Cmt2)の機能解析を第一目的とした。本年度は、スピンドルチェックポイントの中枢因子であるMad2は生体内で2種の立体構造(N1とN2)をとりうること、またN2型は試験管系でAPCによる蛋白質のユビキチン化を阻害するが、この試験管系にp31cometを添加するとMad2のAPCに対する阻害作用が相殺されることを示した。また、p31cometは有糸分裂期には紡錘糸、とりわけその先端に好んで局在することを見つけた。すでに紡錘糸先端に局在する蛋白質、EB1と物理的相互作用することも示した。次年度はこの物理的相互作用がスピンドルチェックポイントの解除過程で果たす役割について解明したい。

本研究の第二の目的は、スピンドルチェックポイントに必須なMad1蛋白質の機能ドメインの解析である。本年度はスピンドルチェックポイントの活性化に伴いMad1蛋白質がリン酸化されることを確認した。また、リン酸化部位の候補も同定したので、この部位のアミノ酸を非リン酸化アミノ酸に置換し、その生物学的意義を追求する。スピンドルチェックポイントは、すべての動原体に紡錘糸が適切に接続するまで姉妹染色分体の解離を遅延させる。細胞周期が円滑に進行するためには、動原体への紡錘糸の接続完了にともないこのチェックポイントが解除されることが必要である。本研究ではスピンドルチェックポイントの解除因子、p31comet(旧名Cmt2)の機能解析を目的とした。前年度までの研究は、1)Mad2タンパク質は試験管系でAPCによる蛋白質のユビキチン化を阻害するが、この試験管系にp31cometを添加するとMad2のAPCに対する阻害作用が相殺されること、また、2)p31cometは有糸分裂期には紡錘糸、とりわけその先端に好んで局在することを見つけた。17年度(最終年度)は、p31cometがダイニン中間鎖と物理的相互作用をすること、さらにこの相互作用がp31cometの紡錘糸先端での局在に必要であることを示した。またp31cometは紡錘糸先端に存在するタンパク質、EB1とも相互作用し、その相互作用に必要なEB1の機能ドメインも同定した。有糸分裂期におけるp31comet、ダイニン中間鎖、そしてEB1の細胞局在の観察より、これら3種のタンパク質はおそらく動原体に接続される時期の紡錘糸先端で一過的に複合体を形成し、有糸分裂後期には解離するものと推測される。この複合体が有糸分裂中期から後期への遷移過程においてスピンドルチェックポントの解除に重要な機能を果たしているものと考えられる。
糖蛋白質極性分泌のための選別機構

赤血球造血因子であるエリスロポエチン(EPO)を腎尿細管由来の上皮細胞であるMDCK細胞に生産させたところ,EPOはもっぱら端頂面に分泌された。EPOに存在する3箇所のN結合型糖鎖付加部位を全て欠損させた変異EPOは,端頂面及び底側面に均等に分泌された極性分泌が完全に消失することを発見した。この事実は極性分泌に糖鎖が重要な機能を持つことを示す。そこで3箇所の糖鎖付加部位に関して全ての組合わせで(1箇所及び2箇所糖鎖付加部位に変異を持つ合計6種)変異EPOを作成し,MDCK細胞での極性分泌を調べ,極性分泌を支配する糖鎖付加部位を決定した。EPOは24,38,83番目のAsnにN-結合型糖鎖を持つが,38番目のAsnをGlnに変換しN-結合型糖鎖を欠失した変異体は端頂面及び底側面にほぼ均等に分泌され,EPOの極性分泌には38番目の糖鎖が重要であることを証明した。野性型および各種変異型EPOについて,端頂面と底側面に分泌されたEPOのin vitro活性及びSDS-電気泳動による分子サイズを比較したが,ほとんど差はなかった。野性型EPOを発現させたMDCK細胞に細胞内微小管の重合化の阻害剤であるノコダゾールを作用させた所,極性分泌に必要なタイトシャンクションは完全であるにもかかわらず,EPOの分泌は底側面に分泌されるようになった。この場合,底側面と端頂面とに分泌された総EPO量はノコダゾール非依存下の場合と変わりなかった。すなわち,糖蛋白質の極性分泌に細胞内微小管が重要な役割をはたしていることを示した。肝細胞増殖因子(HGF)は,上皮細胞の運動性を上昇させたり,MDCK細胞に管状構造を形成させる効果を持ち,これらの効果は上皮細胞の細胞骨格構造の変化に起因すると考えられている。野性型EPOを生産するMDCK細胞にHGFを与えると,極性分泌が見られなくなり更に総分泌量は2倍に増加した。
超幾何関数の有理点における値の数論的性質の研究

[1]超幾何函数の値の数論的性質について今後は上の研究で得られた知見をもとにH(z;q)より一般のGauss,Heineの両超幾何級数を融合した形の級数の値の数論的性質を究明したいと考えている。[2]Hurwitz zeta-函数の二乗平均の漸近的振る舞いについて
ヘテロ元素を利用する新規分子構築手法の確立と合成反応への応用

本研究は、ヘテロ元素の反応特性を活用する高効率・高選択的分子変換法の創出と合成反応への応用を目的としている。初年度は、テルルを用いる炭素-炭素結合生成法の確立を目的として、テルリドの炭素-炭素不飽和結合へのラジカル付加反応、およびテルル-リチウム交換反応について検討し、ジビニルテルリドの立体選択的合成法及び有機リチウム化合物の効率的生成法を確立した。さらに、セレン触媒を用いるカルボニル化反応について、その合成化学的応用と理論化学計算による反応経路の解明を行った。次年度は、一酸化炭素を用いるカルボニル化反応の開発と合成化学的応用に重点を置いて研究を行った。その結果、セレンを共存させることにより、有機リチウム化合物が常圧の一酸化炭素と温和な条件下で反応し、セレノカルボン酸塩を生成することを見いだすとともに、本反応を利用するセレノエステル類の新規合成法を開発した。また、一酸化炭素の代わりに、それと等電子構造を有するイソシアニドを用いることにより、対応するセレノイミダ-ト類が収率良く得られることを明らかにした。さらに、この反応原理を応用することにより、イソセレノ尿素類の簡便な合成法を開発した。さらに、一酸化炭素を用いるラジカルカルボニル化反応の合成化学的応用面の開拓を行った。その中で、光照射下、有機セレン化合物を基質として用いる新しいカルボニル化反応を開拓した。また、適当な位置に炭素-炭素二重結合を有する有機ヨウ素化合物を用いることにより、環化を伴って二分子の一酸化炭素が導入されるダブルカルボニル化の新手法を開発した。本研究は、高効率・高選択的分子変換法の創出を目的として、テルル、セレン、スズ、ケイ素などのヘテロ元素の反応特性を積極的に活用することにより、新しい方法論に基づく炭素-炭素結合生成反応を開発し、有機分子の基本炭素骨格の新構築手法を確立するとともに、合成化学的応用面の開拓を行う事を目的としている。本年度の研究成果は、以下の通りである。1.テルリドの炭素-炭素不飽和結合へのラジカル付加反応を、種々のアセチレン類およびオレフィン類を用いて検討し、炭素-炭素結合生成を伴う有機テルル化合物の新しい生成法として、有機合成反応への応用研究を行った。その中で、ジビニルテルリドの立体選択的合成法を開発した。2.カルボニル基の極性反転型導入法の確立を目的として、リチウム-テルル交換反応を利用し、アシル、アロイル、カルバモイルリチウム類の効率的発生とその捕捉反応を検討した。3.有機リチウム化合物と種々のヘテロ原子化合物との交換反応における相対反応速度を明らかにした。4.セレン存在下、カルボニル化合物など、比較的酸性度の高い水素を有する化合物の一酸化炭素によるカルボニル化反応を検討し、セレノカルボン酸エステル類の新しい合成反応を開発した。5.一酸化炭素によるアミン類のセレン触媒カルボニル化反応について、その遷移状態および中間体の構造とエネルギーを理論化学的に明らかにした。また、セレン触媒を用いることにより、環状テトラアミン類から、新規な環状尿素類を合成し、その構造をX線結晶構造解析により明らかにした。6.一酸化炭素と炭素ラジカルとの反応の動力学的研究、およびラジカルカルボニル化反応の活性中間体であるアシルラジカルの、構造と安定性に関する理論化学的研究に着手し、ラジルカルボニル化反応の制御と高効率化、ならびに合成化学的応用に向けての基礎的研究を行った。本年度は、一酸化炭素を用いる新しいカルボニル化反応の開発とその合成化学的利用について検討した。その結果、セレンを共存させることにより、有機リチウム化合物が常圧の一酸化炭素と温和な条件下で反応し、セレノカルボン酸塩を生成することを見いだした。これを親電子剤で捕捉することにより、セレノエステル類の新規合成法を開発した。

このカルボニル化反応の反応経路についても検討し、反応系中に鍵活性種としてセレン化カルボニルが生成している可能性の高いことを明らかにした。また、一酸化炭素の代わりに、それと等電子構造を有するイソシアニドを用いることにより、対応するセレノイミダ-ト類が収率良く得られることを明らかにした。さらに、この反応原理を応用することにより、セレン、アミン、イソニトリル、ハロゲン化アルキルから、イソセレノ尿素類の簡便な合成法を開発した。また、セレノイミダ-トとトリブチルスズラジカルとの反応によりイミドイルラジカルを発生させ、それを効率良く捕捉することに成功し、イミドイルラジカルが対応するアシルラジカルの合成化学的等価体として利用できることを明らかにした。さらに、一酸化炭素を用いるラジカルカルボニル化反応の合成化学的応用面の開拓を行った。その中で、光照射下、有機セレン化合物を基質として用いる新しいカルボニル化反応を開拓した。また、適当な位置に炭素-炭素二重結合を有する有機ヨウ素化合物を用いることにより、環化を伴って二分子の一酸化炭素が導入されるダブルカルボニル化の新手法を開発した。
転写因子の制御機構解析による植物の環境刺激応答能の解明

植物は様々な環境刺激を受けており、それぞれにどう反応するか、どのような機構になっているかを目的として本研究を行った。研究成果としては、研究のためのツール作りとして、転写因子を過剰発現する植物の整備、制御因子の機能解析等に役立つ植物細胞への生体高分子導入技術の開発、を行った。さらに、環境刺激における機能解析に関しては、光刺激、オゾン刺激、等との関わりから研究を行った。本研究では、植物の環境刺激応答機構制御において、どのようにタンパク質分解がかかわっているかを明らかにするために研究を進めている。まずは、本研究を進める上での材料となるシロイヌナズナの転写因子を高発現する転写因子ラインの整備が完了していなかったので、この転写因子ラインの作出を引き続き行った。当初は、これまで作出した転写因子ラインのみに注目して研究を行う予定であったが、注目した数の転写因子だけでは顕著な環境応答能を示す表現型が得られなかったため、より広範囲に解析するために追加で転写因子ラインの整備に着手した。作出した転写因子を高発現するラインを用いて、光応答性、かつタンパク質分解に関わる因子を見つけるべく、研究を行った。結果としては、タンパク質分解に関わると予測される転写因子を高発現する一種類のシロイヌナズナにおいて、青色光で生育させると顕著な表現型を示すことが明らかにした。さらに、当初の予定にはなかったが、タンパク質分解を解析する上でユビキチン化制御機構だけでなく、ユビキチン化されたタンパク質を分解する分解酵素であるプロテアソームの研究も同時並行で行うことが、本研究目的において役立つと考えた。プロテアソーム自体も環境刺激応答に関わっていることが知られているが、まだ未知の部分が多く、この研究はユビキチン化制御機構とプロテアソームによる分解制御機構の相乗効果を見込んでの研究である。具体的な研究としては、シロイヌナズナを材料として、プロテアソームと直接相互作用する因子を精製し、タンパク質を同定した。現在相互作用因子について解析中である。本研究では、植物がどのように環境刺激に対して応答し、生きるために自らの機構を制御しているか、を明らかにするために研究を行っている。転写因子と環境応答能との結びつきという点では現在進行形であり、論文報告前であるために詳細は述べられない。この研究については引き続き研究を進める予定である。本年度大きな成果を得たのは、本研究課題と密接に関係する発展研究であり、これについて簡単に説明する。まず、ユビキチン化タンパク質の分解に直接寄与するプロテアソームに新規に相互作用する因子を明らかにした。そして、その中に葉緑体局在のタンパク質が多数含まれていることを明らかにした。葉緑体は光をエネルギーへと変換する器官であり、光という環境刺激に対する植物の制御機構の一つといえる。そこで、同定された葉緑体局在タンパク質についてin vitro及びin vivo系を用いて、それらタンパク質がプロテアソームと直接相互作用すること、それらタンパク質の分解がプロテアソーム阻害剤で阻害されることも明らかにした。このような結果は、葉緑体局在タンパク質が細胞質内でプロテアソームと相互作用して、量的・質的なコントロールがされているのだということを示唆した。本研究は、植物が外部の環境刺激に対してどのように応答するのか、さらにその環境刺激応答が植物の生命維持、生育とどう関連があるのかを明らかにする研究である。転写因子と環境応答能との結びつきについては予想外に解析が難しい面がでてきて、まだまとめられてはいない。とはいえ、現在進行形として研究を着実に進めている。本年度は、特にナス科植物であるタバコを材料として、環境刺激応答能について研究を進めた。この研究では、Ub/プロテアソーム依存的なタンパク質分解と密接に関係のあるMAPキナーゼの一種に着目して、環境刺激に対する応答能との関わりについて研究を進めた。この研究についてはすでに論文投稿しており、現在レバイス状態で対応しているところである。さらに、本年度から植物における環境刺激応答研究に役立つツール開発も少し始めた。まだ成果といえるものはないが、引き続き進めていく予定である。今年度はシロイヌナズナ以外の植物を使った研究へと進むことができ、またすでに論文投稿した。3/31時点ではアクセプトはされてはいないが、投稿するところまで進めたのでおおむね順調といえる。昨年度にツール作りの一環として、植物ゲノムに変異を入れて機能変異体を作出する系の開発を行い、大気圧プラズマを用いて植物細胞に直接生体高分子(タンパク質やDNAなど)を導入することに成功したと報告した(Yanagawa et al, PLoS One, 2017)。本年度はこの開発した技術を実際の植物研究に利用できる形にするための研究を行った。植物は細胞表面のクチクラ層や細胞壁があるために、動物等で利用されているタンパク質導入法をそのまま使うことができず、また実際の応用研究に利用できるレベルの技術に確立された植物用のタンパク質導入技術はまだない。また、DNA導入法に関してはある程度確立されてはいるが、とはいえ既存の方法では限られた植物種や組織にしか利用できない。そのため、植物細胞に直接タンパク質やDNAなどを導入する新しい技術の開発が求められていた。開発した大気圧プラズマを用いた植物細胞への生体高分子導入法を実用化レベルの技術にすることは、将来の植物研究にとって新しいツールを提供できるという点で環境応答能の研究はもちろんのこと、広く植物分野に貢献すると期待できる。本年度は、上記の研究成果を外部へアピールすることにも力を入れた。

研究成果について高評価を受けたようで、招待講演や一般演題からのシンポジウム採択により複数の学会で発表する機会を得た。さらに、国際学会ではポスター発表の中からshort talkに選ばれ、賞をいただいた。また、化学と生物誌、バイオサイエンスとインダストリー誌から執筆依頼も受け、執筆した。植物は様々な環境刺激を受けており、それぞれにどう反応するか、どのような機構になっているかを目的として本研究を行った。研究成果としては、研究のためのツール作りとして、転写因子を過剰発現する植物の整備、制御因子の機能解析等に役立つ植物細胞への生体高分子導入技術の開発、を行った。さらに、環境刺激における機能解析に関しては、光刺激、オゾン刺激、等との関わりから研究を行った。本年度は、まず昨年度末に投稿した論文のレバイス実験を行い、アクセプトされた。この論文はUb/プロテアソーム依存的なタンパク質分解と密接な関係のあるMAPキナーゼの一種であるMAPキナーゼ4Lについての研究である。私たちはこのMAPキナーゼ4Lが環境刺激の一つであるオゾン耐性と関わりがあることを明らかにした。次に、昨年度から始めた植物における環境刺激応答研究に役立つツール開発に力を注ぎ、植物ゲノムに変異を入れて機能変異体を作出する系の開発を行った。具体的には、植物細胞へ直接タンパク質を導入する系の開発に成功し、論文もアクセプトされた。さらに、窒素欠乏状態における根の伸長を制御しているE3リガーゼに関する研究についての共著論文がアクセプトされた。植物栽培施設の排水設備故障により、本研究遂行に必須となる植物の栽培を一時的に縮小せざるを得ない状況になってしまった。さらに、別の栽培施設内に細菌等が大量発生したため、栽培室内の植物を処分して、洗浄・殺菌を行う必要が出てしまい、実験に必要な植物を実験途中で処分した。これらの理由で、本来予定していた実験を予定通り進めることができなくなったため、進歩状況を「やや遅れている」とした。特に本課題の発展研究で進展があり、論文を出すことができた。よって、おおむね順調に進展している。植物の環境刺激応答機構を明らかにするためにより発展的な研究へと進める計画である。これまでは植物のメカニズムに注目した研究が主であったが、環境刺激応答機構を明らかにするために新たに役立つツール開発も必要である。そこで、今後はこれまでどおり植物のメカニズム研究に加えて、ツール開発という点でも力を入れたいと考えている。植物生理学、生化学、分子生物学、生物工学今後は植物栽培に後れを生じたためにできなかった実験を進める予定である。さらに、開発したツールを現実的に利用可能なレベルにすることを目指して研究を行うことも計画している。環境刺激応答のキーワードを特に重要視して、植物の環境刺激応答機構を明らかにするために広範囲な視点から研究を進める計画である。これまではモデル植物であるシロイヌナズナを利用してきたが、環境応答能の研究を発展させるためにはシロイヌナズナのみではなく、必要に応じて他の植物種も利用していく計画である。