hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安全で特異性の芫いサルヘルペスウイルスB用診断抗原の作出と普及

平成12年度平成14年度の本研究期間により、1.われわれが使用したHerpesvirus papio 2(HVP2)抗原が、マカクBV感染のスクリーニング用診断抗原として優れていることを他のウイルスと比較検証した結果、証明した。2.アカゲザル由来のヘルペスBウイルス(BV)E2490株のUS領域の塩基配列(14,447bp)を決定した。BVのゲノムDNAから、KpnI、PvuII、HincIIを用いて6クローンを得、2個所のギャップをPCRで埋めることで、US12の10数塩基を残したUS領域の塩基配列を決定し、DDBJ/EMBL/GeneBankに登録した(accession#:AB074432)。3.わが国固有のサルであるニホンザルから検出されたBウイルス遺伝子断片を調べた結果、ユニークなゲノタイプを保有することが証明された。4.アカゲザル由来のヘルペスBウイルス(BV)E2490株のUS領域の塩基配列を決定したのに続き(JV,2002;#AB074432)、UL領域の塩基配列(106,873bp)を決定した(#AB096160)。さらに、HVP2による代替抗原の有用性を海外におけるアカゲザル血清についても検証するため、米国のウイスコンシン霊長類センターにHVP2による代替抗原の検査キットを送付し、ウイスコンシン霊長類センターにおいて自家検査を依頼した。ヒヒヘルペス2型ウイルス(HVP2)が抗原として優れていることを、他のウイルスと比較して検証した。BV(E2490)、HVP2(OU1-76)、HSV1(KOS)の感染細胞を得たうえ、条件決めも種々行って抗原プレートを作製した。このプレートを使用して、日本および米国のアカゲ(78検体)、カニクイ(73)、ニホン(77)、ブタオ(92)、ボンネット(3)、スラウェシ(5)、タイワン(5)、不詳(16)の各マカク349検体の他、対照としてヒヒ(39)、ヒト(60)の血清を用いて検査した。その結果、BV抗原を用いた場合に陽性253、陰性94、不明2と診断された。一方、HVP2は陽は250、陰は97、不明2でBV^+の98.0%(248/253)を検出し、BV^-の94.7%(89/94)を支持した。片や、HSV1は陽性247、陰性100、不明2で、BV^+の95.7%(242/253)、BV^-の97.9%(92/94)と一致した。不明と判定された2血清は3抗原でともに不明であった。BV^+253血清の平均OD値は0.90(BV)/0.89(HVP2)/0.58(HSV1)で、BVとHVP2とで有意差は認められなかったが(p=0.042)、HSV1は他の2抗原に比べて低かった(p<0.001)。一方、BV^-94血清の平均値は、0.045/0.018/0.022と、BVが他の2抗原に比べて高く(p<0.001)、陽性判定にあたり障害のひとつとなった。BV^+/HVP2^-の5検体はともにブタオザル血清で、OD_<BV>で0.1010.139とlow^+、一方OD_<HVP2>では0.0260.086(OD_<HSV1>=0.0610.123)だった。今回我々が使用したHVP2抗原はマカクBV感染のスクリーニング用抗原として、HSV1抗原より優れていることが判明した。アカゲザル由来のヘルペスBウイルス(BV)E2490株のUS領域の塩基配列(14,447bp)を決定した。

BVのゲノムDNAより,KpnI, PvuII, HincIIを用いて6クローンを得,2個所のギャップをPCRで埋めることで,US12の十数塩基を残したUS領域の塩基配列を世界に先駆けて決定し,DDBJ/EMBL/GeneBankに登録した(accession#:AB074432)。BVのUS領域は,HSV(1型:12,980bp,2型:14,329bp)よりやや長く,GC%は73.2%だった。第3コドンのGCバイアスなどは,SA8に準じて強かった。各種シグナルから推測されるORFはUS1-12とUS8.5の13個を認め,SA8とはまったく同じと考えられた(ただし,SA8はUS1,2、[10],11,12の報告なし)。HSVとは,mRNA転写セットがHSVではUS3/4とUS5/6/7なのに対し,BVではUS3/4/5とUS6/7である点を除けば類以していた。HSV1でその存在の可能性が報告されたUS1.5については,その開始コドンが見つからなかった。また,この機会にSA8でもUS8.5の存在が確認され,HSV/SA8/BVに共通の特性と考えられる。さらに,アミノ酸レベルでも,SA8との相同性が最も高く(51%[US5]83%[US3]),ついでHSV2(18%[US5]57%[US9]), HSV1(9%[US4]57%[US9])となった。概ね,US4(gG), US5(gJ), US8.5(?), US12(ICP47)で低く、US2(?), US3(Serin/Threonin kinase), US6(gD), US9(エンベロープを構成するリン酸化タンパク)で高い結果となった。昨年、アカゲザル由来のヘルペスBウイルス(BV)E2490株のUS領域の塩基配列を決定したのに続き(JV,2002;#AB074432)、UL領域の塩基配列(106,873bp)を決定するに至った(Arch Virol, in press;#AB096160)。BVのUL領域は,HSV(1型:107,589bp,2型:108,356bp)よりやや短く,GC%は72.9%だった。第3コドンのGCバイアスは、SA8に準じて強かった。各種シグナルから推測されるORFはUL1-56とUL26.5、UL49.5の58個を認め,HSVとまったくパラレルと考えられた。mRNA転写セットもHSVと同一であり、その結果、USおよびULのユニーク領域については、BVとHSVとではUS3-7の転写セットが異なる(HSVではUS3/4とUS5/6/7なのに対し、BVではUS3/4/5とUS6/7である)点を除いて完全に一致していることが明らかになった。塩基配列から類推される各ORFの相同性をみると、80%以上の高い相同性を持つタンパクは6つ(UL5,15,18,19,28,29)、逆に45%以下の低いタンパクは7つ(UL11,42,43,44,49,49.5,56)であった。現在、相同性の低いタンパクを中心に、BV特有の病原性および抗ヘルペスウイルス薬に対する耐性に関する研究を国際共同研究として推し進めている。
近代のキリスト教霊性の源流-中世末期のドイツ神秘主義との関わりを中心として-

1.近代のキリスト教霊性の歴史的、文化的背景について研究・調査した。その結果、西欧のキリスト教世界の統一が崩壊した時代であった13-14世紀に起こった神秘主義運動、すなわち神中心的で神の本質との一致を志向する霊性や、新しい信心を求めるデヴォティオ・モデルナ運動、フランシスコ会、ドミニコ会の活躍が、神との個人的で、実存的な関わりを重視する近代の霊性への橋渡しをしていることがわかった。とくに中世末期のドイツ神秘主義の潮流は、ライン地方を経てフランドル地方へと入り、さらには十字軍、吟遊詩人などを通して、スペインへと流れ込んだ。その結果、個人的な聖書の読み方と祈りの体験が重視され、キリストの人性を強調する神秘主義がスペインで開花したと理解できる。2.中世末期の神秘主義について資料的、文献的な研究を行った。14世紀後半にヨーロッパで広く読まれたルドルフ・フォン・ザクセンの『キリストの生涯』(Vita Christi)と、トマス・ア・ケンピスの『キリストにならいて』(Imitatio Christi)は、イグナティウス・デ・ロヨラの霊性に直接的な影響をもたらし、また、アビラのテレサ、そして十字架のヨハネの霊性も信仰の内面化、宗教体験の情緒化という点で、直接的、間接的に中世末期のドイツ神秘主義の影響を受けている。中世末期のドイツ神秘主義に共通して見られる、宗教体験の個人化、情感豊かな霊性、実存的な祈りの方法、キリストの人間性、公生活、苦しみに焦点を当てたキリスト中心主義は、近代の霊性のモティーフとなったことが判明した。3.スペインの神秘家、アビラのテレサ、十字架のヨハネの霊性は、近代・現代の歴史的、精神的な体験、暗夜、苦しみの経験と交わるところがある。とくに現代ドイツの思想家、エディット・シュタインの霊性の根幹には、このスペインの神秘家の影響が色濃く見られることがわかった。16世紀ヨーロッパで台頭した近代のキリスト教霊性の歴史的、文化的背景について資料を収集し、分析をした。その結果、西欧のキリスト教世界の統一が崩壊した時代であった13-14世紀に起こった神秘主義運動、すなわち神中心的で神の本質との一致を志向する霊性や、新しい信心を求めるデヴォティオ・モデルナ運動、フランシスコ会、ドミニコ会の活躍が、神との個人的で、実存的な関わりを重視する霊性への橋渡しをしていることがかわった。とくに、中世末期のドイツ神秘主義の潮流は、ライン地方を経て、フランドル、ネーデルランドへと入り、さらには十字軍、吟遊詩人などを通して、スペインへと流れ込んだ。その結果、聖書の読み方と祈りにおける個人的な体験が重視され、キリストの人性を強調する神秘主義がスペインで開花したと理解することができる。今年度は、中世末期のドイツの神秘家の著作、特にルドルフ・フォン・ザクセンとトマス・ア・ケンピスの著作を中心に研究を進めた。ルドルフ『キリストの生涯』(Vita Christi)とトマス・ア・ケンピスの『キリストにならいて』(Imitatio Christi)に共通して見られる、宗教体験の個人化、情感豊かな霊性、実存的な祈りの方法、キリストの人間性、公生活、苦しみに焦点を当てたキリスト中心主義は、まさに近代の霊性のモティーフとなった。ルドルフ・フォン・ザクセンとトマス・ア・ケンピスの霊性は、とくにイグナ.ティウス・デ・ロヨラの霊性に主題的、資料的に大きな影響を与えたことが明らかになった。来年度は、中世末期のドイツ神秘主義がスペイン(とくにイエズス会とカルメル会)の霊性に及ぼした影響について、文献資料に沿って、テーマ別に検討していきたい。

近代のキリスト教霊性の源流を探るにあたって、今年度は16世紀スペインの神秘主義、とくにイエズス会を創立したイグナティウス・デ・ロヨラとカルメル会を改革したアビラのテレサ、および十字架のヨハネとドイツ神秘主義との関わりについて研究を進めた。1)中世末期のドイツの神秘家、ルドルフ・フォン・ザクセンの『キリストの生涯』(Vita Christi)がイグナティウスに及ぼした決定的な影響は、イグナティウスの『霊操』のなかに色濃く見られる。福音書にもとづく黙想のプログラムである『霊操』は、その構成と内容において、また黙想の方法において『キリストの生涯』と多くの点で類似するものがある。『キリストの生涯』と類似して、『霊操』は内的浄化、罪からの解放を黙想の導入に据え、続いてキリストの生涯の出来事を受肉、イエスの公生活、キリストの受難と十字架上での死、復活の黙想が展開されている。祈りの方法と霊性の特徴において、両者に共通している点は、キリストの救済に秘義に参与していくというキリストの人性を強調した、実存的で、体験的なアプローチである。ルドルフは神秘体験を世俗世界を軽視する隠遁的なものではなく、すべての人々に開かれ、共有しうる宗教体験霊性を探求している点できわめて近代的である。2)カルメン会(アビラのテレサ、十字架のヨハネ)の霊性と近代キリスト教への影響について研究を進めた。近代キリスト教霊性の特徴である信仰体験の個人化、実在化の傾向は明らかに16世紀スペインの神秘家のなかに見られる。テレサのキリストとの個人的な出会いと一致、そして人間の実在的なあり方、ヨハネが暗夜と呼ぶ霊的、内的な状態は、近代、現代の歴史的、精神的暗夜、苦しみと交わるところがある。とくにドイツのカルメル会を代表する思想家、エディット・シュタインの霊性の根幹には、このスペインの神秘家の影響が色濃く見られることがわかった。1)16世紀ヨーロッパで台頭した近代のキリスト教霊性の歴史的、文化的背景について資料を収集し、分析をした。その結果、西欧のキリスト教世界の統一が崩壊した時代であった13-14世紀に起こった神秘主義運動、すなわち神中心的で神の本質との一致を志向する霊性や、新しい信心を求めるデヴォティオ・モデルナ運動、フランシスコ会、ドミニコ会の活躍が、神との個人的で、実存的な関わりを重視する霊性への橋渡しをしていることがかわった。とくに、中世末期のドイツ神秘主義の潮流は、ライン地方を経て、フランドル、ネーデルランドへと入り、さらには十字軍、吟遊詩人などを通して、スペインへと流れ込んだ。その結果、聖書の読み方と祈りにおける個人的な体験が重視され、キリストの人性を強調する神秘主義がスペインで開花したと理解することができる。(2)資料的、文献的な影響について解析し、検討した。14世紀後半にヨーロッパで広く読まれたルドルフ・フォン・ザクセンの『キリストの生涯』(Vita Christi)と、トマス・ア・ケンピスの『キリストにならいて』(Imitatio Christi)は、イグナティウス・デ・ロヨラの霊性に直接的な影響をもたらした。また16世紀のスペインのカルメル会(アビラのテレサ、十字架のヨハネ)の霊性も信仰の内面化、宗教体験の情緒化という点で、直接的、間接的に中世末期のドイツ神秘主義の影響を受けていることが明らかになった。ティウス・デ・ロヨラの霊性に主題的、資料的に大きな影響を与えたことが明らかになった。
GWASを用いた野生イネの生育、代謝形質と遺伝変異の相関解析

遺伝的解析の困難な野生イネOryza rufipogon約300系統を用いて、代謝産物や出穂期・種子重量などの形態形質と各系統のゲノム配列変異との相関関係をGWAS(ゲノム全長相関解析)で調べた。代謝産物の解析では、比較のため交雑組み合わせ後代で量的遺伝子座(QTL)解析も行った。QTLで検出された12の有意な候補代謝産物のうち、最も高い値を示したトリゴネリンについてGWASの結果を精査した結果、機能未知遺伝子でストレス応答性に関連した遺伝子が責任遺伝子として特定できた。他の形態形質については、責任遺伝子探索のための一塩基変異検索データベースを作成し、候補領域検索を続行中である。H25年度の研究計画に基づき、以下の研究実績を得た。(1)野生イネO. rufipogonの400系統X各5個体を用いて、中国海南島において1年度目の育成と、出穂期、種子稔性、種子重量、花粉稔性、再生能力(1年生/多年生)についての形質調査を実施し、形質データを取得した。発芽不全や天候不良などによる欠失系統や、形質によるデータ取得のバラツキはあるが、300-350程度の系統数のデータを収集できた。特に多年生・1年生特性の自然変異幅は激しく、1年間栽培を続けても出穂しない系統もあった。また再生能力も、出穂期に合わせた解析サンプル取得による季節的ズレ、栄養状態などの問題もあり、個体内、個体間でも相当なバラツキが見られた。(2)平行してこれらの系統の種子を収集し、理研においてLCーMS解析(液体クロマトグラフ質量分析)を行い、100種類以上の代謝産物を検出できた。(3)すでに取得済みの上記系統におけるゲノム全域のSNP情報と、上記(1)(2)で得た形質および代謝物情報の相関解析を行った。1年次目のみで、バラツキの多いデータではあったが、試行解析を行い、GWA解析の結果を得た。GWASに用いる統計処理の方法により、観察できるピーク数が一致しない場合もあったが、有為な値を示したピークを、出穂期で2-3領域、種子稔性で4、種子重量で6-8、花粉稔性で2-3領域検出できた(4)同様にメタボローム解析データをGWASしたところ、少なくとも24の代謝産物について、有為な主要ピークを得る事が出来た。(5)量的な形質に関わるアソシエーション解析は計算手法の改良により、高精度な検出が可能になる場合がある。よって平行して、改良型を含む複数のGWAS解析プログラムの検討、および量的形質座解析に最適化された計算手法の適用を進めており、データバラツキの問題も踏まえて、次年度以降のGWA解析を進める。H26年度は、研究計画に基づいて研究を実施し、以下の実績を得た。(1)H26年度に栽培可能となった約380系統のO.rufipogonを系統毎に5個体育成し、全系統についての5種類の形質調査(葯形質、稔性、再生能力(一年生/多年生)、出穂期など)を行い、系統毎の形質特性の2年度目の計測データを得た。(2)代謝産物解析においては、他の植物系統群で、年次変動がかなり激しいことが分かりつつあった。そこで、計画したO.rufipogon系統の反復実験と共に、より安定した系統での責任領域(遺伝子)の検定を試みた。すでに系統群のゲノム情報解析の終了していた161系統のBIL(O.rufipogon x O. sativaのback-crossed inbred lines)における代謝産物の解析とを平行して行なう事とし、理研においてLC-MS(液体クロマトグラフ質量分析)を行った。計画変更に伴う種子輸入の手続きが遅れたことにより、経費繰り越しが必要となった。(3)これまで収集した2年度分の形質情報を用いて、アソシエーション解析を試行した。いくつかの異なる手法も試みているが、年度間で共通するピークを見つける事は簡単ではない。O.rufipogonの集団構造として分かれる3つのグループ別にピークの検出と年次間の比較も行なっており、グループ内では責任領域(遺伝子)の共通ピークを検出できる例が多いようである。しかし、詳細は3年次目の結果を待っての検定が必要と思われる。事前の海南島における栽培から、多様な変異を持つ多くの野生イネ系統で出穂をなるべく揃えかつ栽培期間を短縮するためには、秋作が最適であることがわかっていた。それでも収穫が大きく遅れた系統があり、初年度に続いて種子収穫、調査、整理などが大きく3年度目にずれ込んだものもある。また、利用種子の追加や輸入手続きのステップに時間を要してメタボローム解析への種子供給が大幅に遅れたこと、解析装置の故障による遅延などが重なり、解析が年度をまたぐ結果となった。装置の保守、海外とのやり取り等の影響で都合半年以上の遅れとなったが、データ取得については、実績概要に述べた通り,計画した実績を得ている。ただし、解析の結果に関しては、予想以上に複雑かつ特定の遺伝子を検出するのは困難と思われ、変異幅の広い自然集団を扱う場合の実績の内容は、様々な工夫や計画段階での注意が必要であると思われる。結果は予想とは異なるが、当初計画の2年次目の計画内容は、作業としてはほぼすべて終えている。結果は予想よりも複雑で、予定外ではあったが、3年次目の結果との比較を待って、解析の結論を出したい。H27年度の研究計画に基づき、以下の研究実績を得た。

(1)H25、H26年度の栽培で、320-350系統のO. rufipogon系統について数種類の形質調査(葯形質、稔性、再生能力(一年生/多年生)、出穂期など)を行い、形質特性の2年間の計測データのGWAS解析を行なったが、データのバラツキが年次間で多く見られたため、H27年度の栽培と解析を追加した。3年間のデータについて(3)の方法でGWAS解析を行い、2ー3回共通のGWASピークを検出できたものに関してSNPの特定と関与候補遺伝子または領域についての洗い出しを行い、(3)の結果を得た。(2)第1回目の理研でのLC-MS(液体クロマトグラフ質量分析)によるメタボローム解析により、100種類以上の代謝産物を検出しており、H27年度は2回目の反復解析を行った。並行して、GWAS結果を補強説明するための、交配系統群の種子を用いてQTL解析を試みた。(3)これまでの解析により、GWASに用いる統計処理の方法により、観察できるピーク数が一致しない場合もあり、GWAS解析手法の改良および調整を試みて来たが、本年度はさらに、SNPコール法の改善、欠測した遺伝子型の補完やヘテロSNPの考慮によるゲノム全体の遺伝型の調整を行なった。3年間のデータでGWAS解析を行い、出穂期、葯長、芒長、柱頭色、再生能力、穂長などで責任遺伝子のと考えられるピークが検出できた。(4)同様にメタボローム解析データでGWASを行い、代謝の相関を説明可能な複数の産物について、有為なピークを得る事が出来た。(5)GWA結果を関与遺伝子やSNPに落とし込むため、また取得データを公開するため、全系統のゲノム全体にわたってSNPや遺伝子の配置を閲覧できるビューワーを構築し、責任SNPの同定を進めた。結果を取りまとめた論文の執筆を進めており、公表を目指している。遺伝的解析の困難な野生イネOryza rufipogon約300系統を用いて、代謝産物や出穂期・種子重量などの形態形質と各系統のゲノム配列変異との相関関係をGWAS(ゲノム全長相関解析)で調べた。代謝産物の解析では、比較のため交雑組み合わせ後代で量的遺伝子座(QTL)解析も行った。QTLで検出された12の有意な候補代謝産物のうち、最も高い値を示したトリゴネリンについてGWASの結果を精査した結果、機能未知遺伝子でストレス応答性に関連した遺伝子が責任遺伝子として特定できた。他の形態形質については、責任遺伝子探索のための一塩基変異検索データベースを作成し、候補領域検索を続行中である。前年度の海南島における栽培から、多様な変異を持つ多くの野生イネ系統で出穂をなるべく揃えかつ栽培期間を短縮するためには、秋作が最適であることがわかった。それでも収穫が大きく遅れた系統があり、初年度の種子収穫、調査、整理などが大きく2年度目にずれ込んだ。さらに種子輸入手続きに時間を要してメタボローム解析への種子供給が大幅に遅れたこと、解析装置の故障による遅延などが重なり、解析費用の繰り越しを余儀なくされた。スタートは都合半年程度の遅れとなったが、その後の解析を通じて、実績概要に述べた実績を得ており、実績の内容は、当初計画の1年次目の計画内容のほぼすべてを達成しており、概ね順調に進んでいる。スタートの遅れは予定外ではあったが、前年度の予備実験の結果を判断して半年の遅れで済んだものであり、その後は順調に推移している。H28年度においては、繰り越ししたH27年度の本課題の推進を基本とし、以下の予定で行なう。
ウシβラクトグロブリン変異体を用いたフォールディングにおけるα→β転移機構の解明

本研究課題で用いたウシβラクトグロブリン(BLG)は、フォールディング研究におけるモデルタンパク質として用いられてきたタンパク質である。研究代表者は、昨年度までに、BLG二分子がジスルフィド結合により二量体化することが報告されているA34C変異を、研究代表者が作製した、変性の可逆性が高く、フォールディング研究に適したC121A変異体に導人したA34C/C121A変異体が、非常に遅くフォールディングすることを見いだした。今年度は、二量体化の影響をうけたA34C/C121A変異体の非常に遅いフォールディング反応を、ストッブトフローや重水素交換バルスラベル法を含むさまざまな手法を用いて測定、解析し、α→β転移反応を含むBLGのフォールディング機構のより詳細な研究を行った。その結果、A34C/C121A変異体では、変性状態からの再生効率がフォールディング反応を行う尿素濃度に依存し、低い尿素濃度よりも中程度の尿素濃度において高くなることが明らかになった。さらに、フォールディング反応初期に形成されている中間体において、A34C/C121A変異体とC121A変異体では、同程度の疎水性コアおよび非天然のαヘリックスを含む構造が形成されていることが示された。これらの結果から、フォールディング反応初期には、主に二量体化に影響されない近距離の疎水相互作用により非天然のαヘリックスを含む大まかな構造が形成され、その後、非天然のαヘリックスがβシートへと変化し、より詳細なコンフォメーションが形成される際に、二量体化により新たに生じた非天然の相互作用の影響によって、フォールディング速度や再生効率の低下が起きているという、A34C/C121A変異体のフォールディング機構が明らかになった。このことは、BLGのα→β転移反応には、広範囲の残基との適切な相互作用による構造変化が必要であることを示唆している。本研究で使用しているウシβラクトグロブリン(BLG)は、フォールディング過程において、一度、天然構造には存在しないαヘリックスを形成した後、天然構造のβシートへと変化するα→β転移をすることが知られているが、その詳細は明らかにされていない。本研究ではBLGのフォールディング機構、特にα→β機構について明らかにすることを目的としている。野生型BLGは変性状態からのフォールディング効率が悪く、ここでは研究代表者がこれまでに作製したフォールディング効率の良い変異体(C121A)を野生型の代わりに用いている。主に用いる手法はpHパルスラベル重水素交換で、この手法でラベルしたサンプルを核磁気共鳴法(NMR)で測定することで中間体の二次構造情報をアミノ酸残基レベルで得ることができる。本年度は、NMRで測定するために必要なシグナルの帰属を行い、pHパルスラベル重水素交換実験を酸性および野生型では困難であった中性条件で行った。その結果、数ミリ秒までに形成されている領域はどちらの条件でも同じG、Hストランドであり、その領域の形成がBLGのフォールディングに重要であることが示唆された。また最近、BLGのABループ領域に変異を入れたA34Cが、天然構造を崩さずに分子間でS-S結合を形成し安定な二量体として存在することが報告された(Sakurai et al.J.Mol.Biol.(2006))。この変異をC121Aに導入し、二量体としたところ、単量体では数分でフォールディングを完了するのに対し、数時間かけてゆっくりとフォールディングさせることに成功した。この遅くフォールディングする性質を用いれば、より初期のフォールディング中間体の情報を得ることができると考えられ、今後、α→β転移反応が起きている領域など、詳細なフォールディング機構を明らかにできると期待できる。
P糖蛋白の血液ー脳関門及び脳腫瘍の細胞膜透過性に対する効果

P糖蛋白が脳内毛細血管内皮細胞及び脳腫瘍の細胞膜透過性に及ぼす影響について、薬物動態学的、生化学的及び免疫組織化学的な検索を行った、ラットの脳に15万個の9Lグリオーマ細胞を定位脳的に移植した後2週間目に,1)ラジオアイソトープでラベルした薬剤を頚動脈内に注入し,5秒間での脳内及び腫瘍内への移行を液体シンチレーションカウンターにより測定し,Oldendorfらの方法により解析した.さらに,2)薬剤を細胞外に排出することで癌細胞の多剤薬剤耐性に関与するP-糖蛋白の有無を,C-219モノクローナル抗体を用いて脳内毛細血管,腫瘍内血管及び腫瘍細胞膜において免疫組織化学的に検索し,3)これらの超微構造との関連を検索した.その結果,1)血液-脳関門を移行しないはずのシュクロースは9Lグリオーマ内に脳内への取り込みの5倍移行した.MCNUと5-FU,アドリアマイシンはシュクロースと同様に正常脳内へはほとんど移行しなかったが,ACNUはシュクロースよりは有意に多く移行した.MCNUとアドリアマイシンはコントロールであるシュクロースと同様,腫瘍内には十分に取り込まれたが,腫瘍細胞内へは取り込まれなかった。一方,ACNUと5-FUは腫瘍細胞内にも著明に取り込まれた.5-FUの培養9Lグリオーマ細胞内への移行は,ATP阻害剤や4°Cの培養液中で著しく減少した.2)脳内毛細血管の内皮細胞と9Lグリオーマの腫瘍細胞膜では免疫組織化学的にP-糖蛋白の発現がみられたが,腫瘍内血管の内皮細胞にはみられなかった.3)腫瘍内血管の内皮細胞には電顕的に多数の窓形成や内皮細胞の腫大,及び内皮細胞間隙の開大等が観察された.以上より,MCNUや5-FU,アドリアマイシンの脳内への移行のみならず,MCNUやアドリアマイシンの9Lグリオーマ細胞内への移行は,それぞれ脳内毛細血管内皮細胞膜と腫瘍細胞膜に発現したP-糖蛋白による細胞外排出の為制限されているものと推定された.P糖蛋白が脳内毛細血管内皮細胞及び脳腫瘍の細胞膜透過性に及ぼす影響について、薬物動態学的、生化学的及び免疫組織化学的な検索を行った、ラットの脳に15万個の9Lグリオーマ細胞を定位脳的に移植した後2週間目に,1)ラジオアイソトープでラベルした薬剤を頚動脈内に注入し,5秒間での脳内及び腫瘍内への移行を液体シンチレーションカウンターにより測定し,Oldendorfらの方法により解析した.さらに,2)薬剤を細胞外に排出することで癌細胞の多剤薬剤耐性に関与するP-糖蛋白の有無を,C-219モノクローナル抗体を用いて脳内毛細血管,腫瘍内血管及び腫瘍細胞膜において免疫組織化学的に検索し,3)これらの超微構造との関連を検索した.その結果,1)血液-脳関門を移行しないはずのシュクロースは9Lグリオーマ内に脳内への取り込みの5倍移行した.MCNUと5-FU,アドリアマイシンはシュクロースと同様に正常脳内へはほとんど移行しなかったが,ACNUはシュクロースよりは有意に多く移行した.MCNUとアドリアマイシンはコントロールであるシュクロースと同様,腫瘍内には十分に取り込まれたが,腫瘍細胞内へは取り込まれなかった。一方,ACNUと5-FUは腫瘍細胞内にも著明に取り込まれた.5-FUの培養9Lグリオーマ細胞内への移行は,ATP阻害剤や4°Cの培養液中で著しく減少した.2)脳内毛細血管の内皮細胞と9Lグリオーマの腫瘍細胞膜では免疫組織化学的にP-糖蛋白の発現がみられたが,腫瘍内血管の内皮細胞にはみられなかった.3)腫瘍内血管の内皮細胞には電顕的に多数の窓形成や内皮細胞の腫大,及び内皮細胞間隙の開大等が観察された.以上より,MCNUや5-FU,アドリアマイシンの脳内への移行のみならず,MCNUやアドリアマイシンの9Lグリオーマ細胞内への移行は,それぞれ脳内毛細血管内皮細胞膜と腫瘍細胞膜に発現したP-糖蛋白による細胞外排出の為制限されているものと推定された.P糖蛋白は癌化学療法の後に発現し得る分子量約17万の膜糖蛋白で、癌細胞においてATP依存性にビンクリスチンやアドリアマイシン等の抗癌剤を細胞外へ排出し多剤耐性に関与する。近年、P糖蛋白は副腎や腎、肝などの正常組織のみならず、脳や睾丸の毛細血管にも特異的にみられることから、関門機能との関連が示唆されているがその詳細については不明な点が多い。そこで、本研究においては牛脳より精製した毛細血管内皮細胞を対象として、P糖蛋白の発現と薬剤の取り込みを検討した。牛脳および精製した毛細血管内皮細胞の初代単層培養系を用いて、ABC法によりウエスタンブロッティングを行い、同時に光顕と電顕を用いた免疫組織化学によりP糖蛋白の発現を検索した。P糖蛋白に特異的に反応するモノクロ-ナル抗体としてC219およびMRK16を用いた。さらに、P糖蛋白の作用を阻害する種々の薬剤を用いて、培養脳毛細管内皮細胞へのビンクリスチンの取り込みを薬物動態学的に検討した。ウエスタンブロッティングでは、牛脳より精製した毛細血管内皮細胞において、分子量約13万のP糖蛋白が検出された。免疫組織化学的には、牛脳毛細血管内皮細胞では内腔側の細胞膜に局在してP糖蛋白の発現が認められた。

初代培養脳毛細血管内皮細胞においては、MRK16では胞体全体にび慢性に、C219では顆粒状にP糖蛋白の発現が認められた。免疫電顕的には、内腔側の細胞膜に局在してP糖蛋白の発現が認められた。初代単層培養系を用いた薬物動態実験では、MRK16やカルシウム拮抗剤、ステロイドホルモン等を加えると、脳毛細血管内皮細胞内の薬剤取り込みは有意に増加した。以上より、P糖蛋白は脳毛細血管内皮細胞において薬剤を細胞内から血管内腔側へ能動的に汲み出す作用により、血液脳関門の機能の一端を担っていることが示唆された。P糖蛋白が脳内毛細血管内皮細胞及び脳腫瘍の細胞膜透過性に及ぼす影響について、薬物動態学的、生化学的及び免疫組織化学的に検索を行った。ラットの脳に15万個の9Lグリオーマ細胞を定位脳的に移植した後2週間目に、1)ラジオアイソトープでラベルした薬剤を頸動脈内に注入し、5秒間での脳内及び腫瘍内への移行を液体シンチレーションカウンターにより測定し、Oldendorfらの方法により解析した。さらに、2)薬剤を細胞外に排出することで癌細胞の多剤薬剤耐性に関与するP-糖蛋白の有無を、C-219モノクローナル抗体を用いて脳内毛細血管、腫瘍内血管及び腫瘍細胞膜において免疫組織化学的に検索し、3)これらの超微構造との関連を検索した。その結果、1)血液-脳関門を移行しないはずのシュクロースは9Lグリオーマ内に脳内へり取り込みの5倍移行した。MCΝUと5-FU、アドリアマイシンは、シュクロースと同様に正常脳内へはほとんど移行しなかったが、ACΝUはシュクロースよりは有意に多く移行した。MCΝUとアドリアマイシンはコントロールであるシュクロースと同様、腫瘍内には十分に取り込まれたが、腫瘍細胞内へは取り込まれなかった。一方、ACΝUと5-FUは腫瘍細胞内にも著明に取り込まれた。5-FUの培養9Lグリオーマ細胞内への移行は、ATP阻害剤や4°Cの培養液中で著しく減少した。2)脳内毛細血管の内皮細胞と9Lグリオーマの腫瘍細胞膜では免疫組織化学的にP-糖蛋白の発現がみられたが、腫瘍内血管の内皮細胞にはみられなかった。3)腫瘍血管の内皮細胞には電顕的に多数の窓形成や内皮細胞の腫大、及び内皮細胞間隙の開大等が観察された。以上より、MCΝUや5-FU、アドリアマイシンの脳内への移行のみならず、MCΝUやアドリアマイシンの9Lグリオーマ細胞内への移行は、それぞれ脳内毛細血管内皮細胞膜と腫瘍細胞膜に発現したP-糖蛋白による細胞外排出の為制限されているものと推定された。
遺伝子発現の転写後制御を撹乱する天然および合成由来の環境化学物質

環境化学物質の中には、生体の恒常性制御システムに影響を及ぼすものが存在する。これら内分泌撹乱物質の作用機序として最も多いのは、擬似ホルモンとしての転写制御受容体への結合である。本研究は、こうした一般的な機序にとらわれない新たな撹乱作用様式を明らかにすることを目的として行われ、以下の成果を得た。(1)強い抗エストロゲン作用を示す植物由来化合物(イソフラボン誘導体)を見出した。この物質は、内在性エストロゲンに対する受容体結合結抗が弱いにもかかわらずエストロゲンによる転写活性化を強く阻害したことから、その結合部位が内在性ホルモンとは異なることが示唆される。さらに、受容体と転写共役因子との相互作用には影響しなかったことから、受容体の二量体化やDNA結合の段階で作用すると予想される。(2)抗男性ホルモン様作用が懸念されているプラスチック可塑剤の毒性発現機序についていくつかの新知見を得た。一つは環境中での光暴露や体内代謝過程での水酸化による女性ホルモン活性の獲得、もう一つは疾患時の解毒代謝能低下による毒性増強機構、である。前者は、古典的な機序に見えるが、これまで見過ごされてきた「構造変化による活性化」に注意を促す重要な結果である。同様の機序は、他のいくつかの物質の活性発現にも適用することができた。後者は、疾病や個体差から来る毒性許容量の違いに関する発見であり、この物質のin vivo活性の不確定さを説明し得る。肝臓の全タンパク質発現変動解析から、脂質酸化(βあるいはω)関連酵素の発現誘導が毒性発現の内因性因子として決定的な役割を果たすことを明らかにした。以上の結果は内分泌撹乱の新しい作用様式を含む毒性発現機序を示唆するものであり、その詳細な作用点の解明は新たなホルモン治療薬の開発へ展開することが期待される。私たちは環境中に蔓延する化学物質に曝されている。個体の機能は様々な内因性ホルモンによって複雑かつ巧妙に制御されているが、環境化学物質の中にはこの制御システムに作用し得るものが存在する。これらの内分泌撹乱物質の作用機序として一般に考えられているのは、擬似ホルモンすなわち転写因子としてのはたらきである。近年、遺伝子発現は転写以外の段階においても様々な制御を受けることが明らかになってきている。したがって、内分泌撹乱についても転写以外の制御段階での撹乱の可能性を検証する必要がある。mRNA安定性、翻訳、タンパク質分解などの転写後制御段階において作用する環境化学物質の探索が本研究の目的である。一年次末現在、従来のホルモン受容体へのリガンド結合という考え方では解釈できない内分脳撹乱作用をいくつか見出している。主なものを以下に示す。1.比較的強い抗エストロゲン作用を示す植物由来化合物(イソフラボン誘導体)を見出した。この物質は、天然のエストロゲンのエストロゲン受容体(ER)への競合的結合阻害が弱いにもかかわらず、レポーター遺伝子のER依存的な転写活性化を強く阻害する。ERのダイマー形成への影響や受容体を介さない発現抑制などの新しい内分泌撹乱の作用点が示唆される。2.弱い女性ホルモン作用が懸念されているプラスチック可塑剤の毒性発現機構は未だ解明されていない。我々を含むグループの研究で、病態時にその毒性が増強することが明らかになっている。この原因として、外因性物質の解毒反応による内因性ホルモン代謝回転への影響を想定している。個体レベルでのホルモンバランスの変調という新しい内分泌撹乱メカニズムにつながる興味深い結果である。
海洋性微細藻類を用いる環境ホルモン等の環境汚染物質の機能改変や回収除去法の開発

本研究は,海洋性微細藻類の物質変換能力を巧みに利用することにより,環境汚染関連物質の効率的な分解や回収を可能にし,海洋環境汚染防止に貢献しえる「環境浄化への新たな道」を切り開くことを主目的とするものである.本年(平成14年)度は,「海洋性微細藻類を利用する海洋汚染物質(環境ホルモン等)の機能改変と無毒化」を目標に,海洋性微細藻類のスクリーニングと環境汚染関連物質分解,およびエコシステムを用いた汚染物質の回収に関する研究を行った.研究に用いた植物プランクトンは,瀬戸内海沿岸海域から単離された海洋性クロレラ(Nannochloropsis sp.,Pavlova lutheri),動物プランクトンとしてはアルテミアとシオミズツボワムシを使用した.環境汚染物質(内分泌攪乱関連物質)は,フタル酸ジエチルヘキシル(DOP),ビスフェノールA(BPA)の2種類を使用した.海洋性微細藻類の培養は人工海水中,蛍光灯による照射下(1000lx),2週間,20°Cで通気(2L/分)培養を行った.培養液(微細藻類懸濁液)50mlに,環境ホルモン物質1.2μmol(アセトン溶液)を加え,蛍光灯光照射下(1000lx),20°C,好気的条件にて6日間インキュベートし,ガスクロマトグラフにて分析し基質の回収率を求めた.DOPについては時間経過とともに,微細藻類による分解が観測された.BPAについては,Nannochloropsisを用いた場合,時間経過とともに細胞内へ取り込まれることがわかった.そこで,アルテミア及びワムシとNannochloropsisを組み合わせて利用し,海水中のBPAが植物プランクトンを介して動物プランクトンに移行・蓄積するかどうかを調べた.プランクトンネットを利用して,動物プランクトンを取り出し,その細胞内にBPAの存在を調査した結果,アルテミアやワムシを用いた両者の場合において,BPAが動物プランクトンの細胞内に蓄積されていることがわかった.以上の結果から,植物プランクトンと動物プランクトンを組み合わせれば,海洋といった広範囲に希釈された汚染物質も効率的に回収可能であることがわかった.本研究は,海洋性微細藻類の物質変換能力を巧みに利用することにより,環境汚染関連物質の効率的な分解や回収を可能にし,海洋環境汚染防止に貢献しえる「環境浄化への新たな道」を切り開くことを主目的とするものである.本年(平成13年)度は、「海洋性微細藻類を利用する海洋汚染物質(環境ホルモン等)の機能改変と無毒化」を目標に、海洋性微細藻類のスクリーニングと環境汚染関連物質分解への応用に関する研究を行った.研究に用いた微細藻類は,瀬戸内海沿岸海域から単離された株(Chaetoceros gracilis, Chaetoceros sp., Nannochloropsis sp., Pavlova lutheri)を使用し,環境汚染物質(内分泌撹乱関連物質)としては,フタル酸ジエチルヘキシル(DOP),p-ter-オクチルフェノール(t-OP),p-n-オクチルオキシフェノール(4-OoP)の3種類を使用した.海洋性微細藻類の培養は人工海水中,蛍光灯による照射下(1000 lx),2週間,20°Cで通気(2L/分)培養を行った.培養液(微細藻類懸濁液)50mlに,環境ホルモン物質1.2μmol(アセトン溶液)を加え,蛍光灯光照射下(1000 lx),20°C,好気的条件にて6日間インキュベートし,ガスクロマトグラフにて分析し基質の回収率を求めた.DOPについては時間経過とともに,微細藻類による分解が観測されたが,分解よりも細胞内への蓄積が主として起こっていた.t-OPと4-OoPについては,時間経過とともに培養液中の基質残量は減少していったが,微細藻類細胞内では,ほとんど検出されなかったことから考えて,微細藻類内へ取り込まれ分解されていると考えられた.以上の結果から、海洋性微細藻類に環境ホルモン関連物質分解能力、細胞内への蓄積力が存在することがわかった。本研究は,海洋性微細藻類の物質変換能力を巧みに利用することにより,環境汚染関連物質の効率的な分解や回収を可能にし,海洋環境汚染防止に貢献しえる「環境浄化への新たな道」を切り開くことを主目的とするものである.本年(平成14年)度は,「海洋性微細藻類を利用する海洋汚染物質(環境ホルモン等)の機能改変と無毒化」を目標に,海洋性微細藻類のスクリーニングと環境汚染関連物質分解,およびエコシステムを用いた汚染物質の回収に関する研究を行った.研究に用いた植物プランクトンは,瀬戸内海沿岸海域から単離された海洋性クロレラ(Nannochloropsis sp.,Pavlova lutheri),動物プランクトンとしてはアルテミアとシオミズツボワムシを使用した.環境汚染物質(内分泌攪乱関連物質)は,フタル酸ジエチルヘキシル(DOP),ビスフェノールA(BPA)の2種類を使用した.海洋性微細藻類の培養は人工海水中,蛍光灯による照射下(1000lx),2週間,20°Cで通気(2L/分)培養を行った.培養液(微細藻類懸濁液)50mlに,環境ホルモン物質1.2μmol(アセトン溶液)を加え,蛍光灯光照射下(1000lx),20°C,好気的条件にて6日間インキュベートし,ガスクロマトグラフにて分析し基質の回収率を求めた.

DOPについては時間経過とともに,微細藻類による分解が観測された.BPAについては,Nannochloropsisを用いた場合,時間経過とともに細胞内へ取り込まれることがわかった.そこで,アルテミア及びワムシとNannochloropsisを組み合わせて利用し,海水中のBPAが植物プランクトンを介して動物プランクトンに移行・蓄積するかどうかを調べた.プランクトンネットを利用して,動物プランクトンを取り出し,その細胞内にBPAの存在を調査した結果,アルテミアやワムシを用いた両者の場合において,BPAが動物プランクトンの細胞内に蓄積されていることがわかった.以上の結果から,植物プランクトンと動物プランクトンを組み合わせれば,海洋といった広範囲に希釈された汚染物質も効率的に回収可能であることがわかった.
大脳皮質形成におけるエンドサイトーシス経路の「使い分け」の生理的意義と制御機構

発生期の大脳皮質において、脳室近辺で誕生した神経細胞は、多段階の移動を行い、脳表層の特定の場所に配置される。この多段階の移動の破綻は、様々な脳神経疾患と関連することが知られている。これまでに我々は、エンドサイトーシス経路の初期段階に重要な役割を果たす低分子量Gタンパク質の1つであるRab5が、神経細胞ではクラスリン依存性エンドサイトーシスに関与すること、神経細胞移動の特定の段階(移動の初期段階における多極性形態の形成と、ロコモーション移動と呼ばれる長距離移動)に必須であることを明らかにした(Histol Histopathol 2018; Brain Sci 2017; Development 2014; Neuron 2010)。これに対して、Caveolin-1がクラスリン非依存性エンドサイトーシスを介して細胞接着分子N-カドヘリンを負に制御することにより、上記とは異なる移動段階(多極性細胞からロコモーション細胞への変換)に関わることを明らかにした。本成果は、Cell pressの新しい雑誌iScienceに受理された。また、以前に我々は、多極性細胞の突起形成には、細胞周期関連分子p27によるアクチン細胞骨格の再編成が必要であることを報告しているが(Nature Cell Biol 2006)、本研究により、p27がゴルジ体を介した細胞内輸送経路の制御に関わる可能性が示唆された(Front Cell Dev Biol 2019)。以上の研究成果より、これまで細胞骨格制御ばかりが注目されてきた大脳皮質形成における多段階の神経細胞移動が、クラスリン依存性・クラスリン非依存性など様々なエンドサイトーシス経路の使い分けによって制御されていることを明らかにすることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに我々は、エンドサイトーシス経路の初期段階に重要な役割を果たす低分子量Gタンパク質の1つであるRab5が、神経細胞移動の特定の段階(移動の初期段階における多極性形態の形成と、ロコモーション移動と呼ばれる長距離移動)に必須であることを報告した(Neuron, 2010)。Rab5はいくつかのタイプのエンドサイトーシスに関与することから、平成26年度の研究では、神経細胞においてRab5がどのタイプのエンドサイトーシスに関わるかを検討した。その結果、神経細胞においてRab5はクラスリン依存性エンドサイトーシスに関わることが分かった。そこで、簡便に個体への遺伝子導入を行える子宮内エレクトロポレーション法を用いて、クラスリン依存性のエンドサイトーシス経路を阻害したところ、Rab5を機能抑制した場合とよく似た表現型が得られた。これまでに我々は、Rab5はロコモーション移動に関わることを明らかにしているが、ロコモーション移動は他の神経細胞にはみられない特徴的な移動様式を示す。そこで、ロコモーション移動を行う神経細胞においてRab5の機能抑制を行い、その動態をタイムラプス顕微鏡で経時的に観察したところ、ロコモーション移動に必須と言われている先導突起の動態と核の形態変化が異常になることが分かった。これらのデータより、Rab5依存性のエンドサイトーシスは、神経細胞に特徴的な移動様式に必須であることが明らかとなった(Development, 2014)。これまでに我々は、エンドサイトーシス経路の初期段階に重要な役割を果たす低分子量Gタンパク質の1つであるRab5が、神経細胞移動の特定の段階(移動の初期段階における多極性形態の形成と、ロコモーション移動と呼ばれる長距離移動)に必須であることを報告した(Neuron 2010)。さらに前年度までの研究により、神経細胞においてRab5はクラスリン依存性のエンドサイトーシス経路に関与すること、また、Rab5は、ロコモーション移動における神経細胞特異的な形態変化を制御することを同定し、論文として報告した(Development 2014)。今年度の研究では、非クラスリン依存性エンドサイトーシス経路の役割を中心に解析を行った。ごく最近、多くの細胞において、非クラスリン依存性のエンドサイトーシスはほとんど起こらないという報告があり、非クラスリン依存性エンドサイトーシスの意義について議論が起きている。我々は、非クラスリン依存性エンドサイトーシスの関連因子が、多段階の神経細胞移動のうち特定の段階のみに発現していることを見いだした。さらに、非クラスリン依存性エンドサイトーシス経路とクラスリン依存性エンドサイトーシス経路は、それぞれ異なる移動段階を制御することも明らかにした。現在は、非クラスリン依存性エンドサイトーシス経路によって輸送される分子を探索中であり、最終的な候補が得られ次第、それらの機能解析を行う予定である。H26年度には、クラスリン依存性のエンドサイトーシス経路に関与するRab5の役割について、論文発表を行った。また、研究計画に掲げた系統的なノックダウン解析についてもおおむね順調に進んでいるが、H27年度は研究代表者の異動に伴う引越しがあったため、H27年度の課題であった積み荷分子については、探索の途中である。現段階で、すでにいくつかの候補分子が得られていることから、H28年度の研究によって、積み荷分子の候補を絞り、その機能解析を行うことは可能だと考える。

これまでに我々は、エンドサイトーシス経路の初期段階に重要な役割を果たす低分子量Gタンパク質の1つであるRab5が、神経細胞移動の特定の段階(移動の初期段階における多極性形態の形成と、ロコモーション移動と呼ばれる長距離移動)に必須であることを報告し(Neuron 2010)、さらに本研究により、神経細胞においてRab5はクラスリン依存性のエンドサイトーシス経路に関与すること、Rab5は、ロコモーション移動における神経細胞特異的な形態変化を制御することを同定した(Development 2014および未発表データ)。そこで昨年度より、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路の役割を中心に解析を行っており、今年度の研究では、多数に分類されるクラスリン非依存性エンドサイトーシスのうち、細胞膜のGM1豊富領域を介するエンドサイトーシスが、神経細胞移動の特定の段階のみに関わることを明らかにした。また、GM1豊富領域からのエンドサイトーシスおよびその下流に輸送経路を解析し、基本的にはクラスリン依存性エンドサイトーシスとは異なる輸送経路を通るが、一部で輸送経路が重なる可能性を示唆するデータが得られ、何らかのクロストークがある可能性が示唆された。今後は、超解像顕微鏡を使用するなどして、神経細胞におけるGM1豊富領域からのエンドサイトーシス経路の全容を明らかにするとともに、このエンドサイトーシス経路に特異的な(クラスリン依存性エンドサイトーシスには関わらない)制御分子を探索する予定である。また、GM1豊富領域からのエンドサイトーシス経路によって運ばれる積み荷分子の候補が得られているため、神経細胞移動に重要な役割を果たす積み荷分子についても解析を続ける。H26年度には、クラスリン依存性のエンドサイトーシス経路に関与するRab5の役割について論文発表を行い、現在までに、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路の役割について、細胞レベルおよび個体レベルでの知見が得られてきた。H27年度に研究代表者の異動に伴う引越しがあったため、実験計画が後倒しになってはいるが、次年度(H29年度)には、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に関する論文を投稿できる見込みである。発生期の大脳皮質において、脳室近辺で誕生した神経細胞は、多段階の移動を行い、脳表層の特定の場所に配置される。この多段階の移動の破綻は、様々な脳神経疾患と関連することが知られている。これまでに我々は、エンドサイトーシス経路の初期段階に重要な役割を果たす低分子量Gタンパク質の1つであるRab5が、神経細胞ではクラスリン依存性エンドサイトーシスに関与すること、神経細胞移動の特定の段階(移動の初期段階における多極性形態の形成と、ロコモーション移動と呼ばれる長距離移動)に必須であることを明らかにした(Histol Histopathol 2018; Brain Sci 2017; Development 2014; Neuron 2010)。これに対して、Caveolin-1がクラスリン非依存性エンドサイトーシスを介して細胞接着分子N-カドヘリンを負に制御することにより、上記とは異なる移動段階(多極性細胞からロコモーション細胞への変換)に関わることを明らかにした。
子宮内感染症に起因する脳室周囲白質軟化症・肺損傷に対する間葉系幹細胞治療法の開発

新生仔SDラットにLPS15mg/kgを腹腔内投与し白質損傷モデルを作製した。対照群には同量の生理食塩水を投与した(saline群)。白質損傷ラットにMSC(LPS-MSC群)、MSC-CM(LPS-MSCCM群)をそれぞれ腹腔内投与し日齢12の脳室周囲白質量(脳切片のMyelin Basic Protein(MBP)染色量)と日齢6の脳組織の炎症性サイトカインレベルをコントロールと比較した。MBP陽性領域はLPS-MSC群で改善が認められた。炎症性サイトカインはLPS-MSCCM群、LPS-MSC群で低下した。炎症に起因する脳室周囲白質損傷に対してMSCは治療効果を有することが示唆された。1.LPS羊水腔内投与に惹起される子宮内感染の評価として、妊娠20日における胎盤組織における好中球数、CD68陽性細胞数、MPO陽性細胞数を測定したところ、いずれも上昇していた。2.LPSを日齢4の新生仔に投与し惹起される脳障害の評価として日齢12の新生仔脳組織の脳室周囲白質量をMyelin basic proteinの陽性面積で調べたところ、LPS投与群ではコントロール群と比較して有意に低下した。以上よりLPS投与により白質損傷が惹起されたと考えられた。脳障害新生仔におけるMSC、またはMSC培養上清の治療効果として、日齢12におけるMBP陽性領域、つまり白質量は増加する傾向にあった。培養上清よりもMSC投与の方が効果があったが有意差は認めなかった。3.日齢6の新生仔脳における炎症性サイトカイン・ケモカインの発現は、LPS投与により有意に上昇していた。脳障害新生仔におけるMSC培養上清投与により、日齢6の炎症性サイトカイン・ケモカインの発現は有意に低下しており、MSC培養上清には抗炎症効果があることがわかった。間葉系幹細胞は、胎盤、臍帯、骨髄由来のものを使用したが、骨髄、臍帯由来の方がより効果的だった。1.妊娠16日SDラットの羊水腔内にLPS 0.2μgを投与し、子宮内感染症を誘発した。2. LPS羊水腔内投与に惹起される子宮内感染の評価として、妊娠20日において、胎盤組織学的評価を行った。3.子宮内感染症に起因する脳室周囲白質軟化症、慢性肺疾患の程度を評価した。胎齢20胎児、日齢1、7、14新生児を対象として、脳病理学的検査として、HE染色、Myelin basic protein組織免疫染色を行い、脳器質的変化および脳白質量を評価した。またWestern blotting法でも評価した。4.治療用UCMSC採取のため、妊娠20日ラット臍帯からout growth法によりMSCを培養した。5.出生後の児に対する治療として、1×105個のUCMSCおよび24時間無血清培地で培養したMSC培養上清を採取し、日齢1および7の新生児に静脈内投与した。治療効果の判定のため、日齢14新生児を対象として、肺および脳の組織学的評価を行った。治療による炎症抑制を評価するため、組織における炎症性細胞浸潤の変化、Western-blot法、組織免疫染色、RT-PCR法にて炎症性サイトカイン、ケモカインの発現変化を調べている。早産の合併症である脳室周囲白質軟化症は、小児期に運動障害を主体とした脳性麻痺に陥る重大な合併症であるが、現在有効な治療がなく、またその成因も明らかにはなっていない。私たちは実験的子宮内感染症モデルを用いて、子宮内感染症に起因する脳室周囲白質軟化症における内在性幹細胞の障害と疾患成立への関与を検討し、間葉系幹細胞を用いた新たな治療法を開発した。まず、日齢4の新生仔ラットはヒトの妊娠28週前後に相当することを利用し、日齢4のラットにLPS15mg/kgを腹腔内投与し新生児白質損傷モデルを作成した。さらに日齢4に臍帯由来MSC、4、5、6、7に臍帯由来MSCの培養上清を腹腔内投与し、日齢6、12の脳を採取し評価した。動物は研究に最小限の匹数を用い、飼育保管基準をふまえて管理を行い、麻酔により最小の苦痛となるように配慮して行った。LPS投与により日齢6の新生仔脳における炎症性サイトカインの上昇、日齢12における脳室周囲白質量の低下を確認した。MSC投与により日齢12の脳白質量の改善を認め、またMSCやMSC培養上清投与により、炎症性サイトカインは減少した。今回の実験でのMSCが抗炎症作用を有し、白質損傷を防ぐことが示され、感染に起因する脳室周囲白質損傷に対して、出生後のMSCの投与が有効である可能性が示された。