hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネ胚乳アミロペクチンの分枝構造の遺伝的変換に関する基礎的研究

BEIタンパク質の減少に伴いBEIIbの増加が認められたことから、正常な澱粉蓄積量と糊化温度の低下は、BEIIbの相補的な作用によるものと推察される。3)未同定の変異体の遺伝学的解析BEIIa酵素活性減少変異体は、移動度の異なるBEIIaが認められること、BEIIaのcDNAをプローブとするサザン解析から、BEIIa構造遺伝子のミッセンス変異であると推察された。一方、胚乳特異的ホスホリラーゼ(SPH)活性を欠く変異体は、110kDSPHタンパク質を欠くこと及びSPH特異的プローブを用いたサザン解析から、SPH構造遺伝子の変異であると推察された。4)MNU受精卵処理後代における新たな変異体の探索水稲品種「金南風」のMNU受精卵処理後代(M2/M3)より、新に糊化特性やデンプン蓄積量、あるいは糊化特性を異にする変異体191系統を得た。本年度は、以下の点について研究を行い、当初に予定した成果を得た。1)澱粉枝作り酵素-I(BEI)欠損変異体の特性解析BEI欠損変異体澱粉はDP13-24及びDP37以上のアミロペクチン分枝鎖が減少することから、BEIはB1及びB3鎖の形成に関与すると考えられる。BEI欠損澱粉は糊化開始温度が野生型より5°C以上低く、BEIIbの結果同様、アミロペクチン構造が澱粉の理化学的特性に重要な役割を果たすことが示された。2)アミロペクチン変異体澱粉の糖質化学的評価澱粉ホスホリラーゼ(SPH)変異体澱粉では、DP12以下のアミロペクチン分枝鎖が増加し、DP13-24が減少したことから、SPHは澱粉生合成とともに、アミロペクチン分枝構造の形成にも関与することが明らかとなった。3)変異体澱粉粒の微細構造解析sug2変異体胚乳中心部では、イソアミラーゼ変異体(sug1)に見られる複粒澱粉を持たない平板状の構造が認められた。ADP-グルコースピロホスホリラーゼSS欠損変異体(shr2)澱粉では、少数の複粒澱粉とともにオオムギ型の単粒型の小型澱粉粒が多数認められた。変異体心白部分ではアミラーゼによる消化痕が認められ、心白の形成は澱粉の分解によることが示唆された。4)可溶性澱粉合成酵素(SSS)に関する変異体の探索登熟種子のNative-PAGE/CBB染色及び活性染色分析を行い、低SSSI変異等、イネ胚乳で認められる3種のSSSに関わる幾つかの変異体を得た。また、印度型品種IR36では、SSSI活性が著しく低下していた。5)2重劣性系統の作製及びflo2遺伝子のRFLPマッピングSPH/GBSSやBEI/BEIIa二重欠損変異体など、多くの2重変異体を作製できた。印度型品種Kasalathとflo2遺伝子標識系統とのF1植物を養成し、RFLPマッピングに充分量のF2種子を得た。1.枝作り酵素BE IIa変異遺伝子(sbe 2m)の構造解析EM19はBEIIa酵素はほぼ正常に発現するものの活性が1/16以下に低下し、sbe2遺伝子座のミッセンス変異(sbe2m)と考えられた。変異部位解析を行ったところ、cDNA内にG1946Aの塩基置換が見出され、アミノ酸配列では第13エクソン内でGly499Aspへと置換していた。変異部位は本酵素が有する3種のアミラーゼドメインの第2活性中心の近傍にあり、中性アミノ酸から酸性アミノ酸への変異がBEIIa活性の低下とNative-PAGEにおける移動度の変化をもたらしたものと考えられた。2.アミロペクチン変異体の生理・生化学的特性解析sbe2m変異玄米の粒型や粒重、澱粉蓄積量は野生型とほぼ同等で、外観にも差異は認められなかった。また、アミロース含有率もほぼ同等であった。アミロペクチン鎖長分布は野生型に比べ若干短鎖が増加したが、有意な差異は認められなかった。
マウスレトロウイルス誘導免疫不全症候群(MAIDS)に於ける免疫異常の解析:B細胞の異常とその役割

LPーBM 5 MuLV感染によりマウスは,リンパ節腫脹と脾腫,多クロ-ン性B細胞活性化を伴う免疫不全を発症し感染後約20週で死亡する。多クロ-ン性B細胞活性はB細胞が免疫調節機構から逸脱した結果と考えられるが,その病態や発症機構については不明な点が多い。今回,多クロ-ン性B細胞活性化の発生機構を解明するためにB細胞不全マウス(xid)を用いて解析し,興味ある知見を得たので報告したい。C57BL/6マウスならびにC57BL/6ーxidマウスにLPーBM5MuLVを感染させ,血中Ig値のELISAによる測定,リンパ球の細胞表面抗原のFACS解析と種々のサイトカインに対する応答性の解析を行いB細胞活性化の病態を解析した。LPーBM5.MuLV感染C57BL/6マウスは,感染7週目において著名なリンパ節腫脹と脾腫さらに高IgM血症と高IgG血症を認めた。感染10週目以降になるとSIgA陽性細胞の増加が腫大した脾臓やリンパ筋中に認められ,血中IgA値も著明に上昇していた。感染15週目には血中総蛋白質量の約50%を超えるM蛋白が検出された。一方,LPーBM5 MuLVを投与したS57BL/6 xidマウスは投与後7週目において脾腫リンパ節腫脹,高Ig血症を認めなかった。感染後期に認められるIgA産生の増強にはIgA産生細胞1のクラススイッチの亢進ならびにIgA産生細胞の腫瘍性増殖が考えられる。現在,IgAクラス変換因子であるTGFーβやIgA産生増強作用をもつILー5の関与について解析を進めている。LPーBMS MuLV感染による多クロ-ン性B細胞活性化にはxidマウスにおいて欠損しているB細胞亜集団もしくはB細胞に発現しているxid遺伝子が重要な役割を果たしていることが示唆された。
戦乱による子どもの心的外傷に関する調査研究-東ティモールにおける孤児の実態調査-

2002年に独立した東ティモールにおける戦乱孤児の心的外傷の実態を把握するために、心理面・身体発達・健康面から調査を実施した。生活の安定と共に身体発達・健康面に若干の改善が見られてきているが、心的外傷が慢性化し、不安感、空虚感と共に、不安定な感情状態に陥っている子どもも多くみられた。また、他者に対する不信感、人間関係を形成することへのためらい等の問題が解消し得ないままに残っていることが見出された。2002年に独立した東ティモールは、長い戦乱の中にあり、その間多くの子どもは親を病死、殺害、虐殺によって失ってきた。ある子ども達はその現場に直面させられ、あるいは、自分自身も生存の危険にもさらされてきた。また、多くの女性はレイプされ、時には余儀なく出産せざるを得ない状況におかれた。その結果として産まれた子どもは、出生直後から捨てられ、あるいは、育児放棄されるという事態も生じていた。このような状況下にある多くの子どもは、孤児院での生活を送っている。本研究では、そういった子ども達の身体面や健康面、心理的状況を把握すると共に、戦乱が与える影響を検討すること、心的外傷を負った子供達への援助の可能性を探り、効果的な援助方法を検討すること、さらに、東ティモール内に自国民における相互支援体制を確立するための方策を見いだすことを目的としている。2005年度においては、現状把握を主たる目的として、身体・健康面を把握するための基本的計測指標を検討した。また、心理面の把握のために活用できるツールを検討した。その結果、文化や言語による影響の少ない統合型HTPを活用することとなった。9月10月に現地に赴き、6カ所の孤児院、1カ所の障害児のための学校、1カ所の幼稚園を探し出し、身体面の計測と統合型HTPを実施した。その結果、発育状況において栄養不良が見いだされた。また、心理面において、貧弱な体験、過去に受けた外傷の影響と思われる「傷っき」、悲哀感、統合されていない攻撃性の存在が示唆された。2002年5月に独立した東ティモールは、これまで長い戦乱の中にあったことにより、多くの子どもは親や家族の殺戮場面に遭遇させられることとなった。さらに、自分の生命が危険にさらされるような体験をした子どもも多くみられた。その中で、親を亡くし、あるいは親の育児放棄といったことにより、子どもたちは孤児院での生活を余儀なくさせられることとなった。本研究の目的は、そういった体験が子どもの心理面、身体発達にどのような影響を与えるのか、心的外傷を負った子どもへの援助の可能性を探り、効果的な援助方法を検討することである。首都のDili市内5箇所、東部地区2箇所、西部地区2箇所、南部地区2箇所、計9箇所の孤児院で、心理テストと身体計測を実施した。また、障害児学校1箇所では心理テスト、幼稚園1箇所では身体計測を行った。その結果、2006年3月から勃発した紛争状況によって、心理的不安定さを増幅させていることが見出された。また、身体発達状況においては、やせ気味、あるいはやせと判断される子どもが約80%であることが明らかとなった。継続的に実施している心理テストからは、悲哀感、攻撃性、過去の体験によると思われる「外傷」が見出された。同時に、描かれている内容が少しずつ豊かになってきていること、全体が統合されていると判断される絵が増加していることから、自己表現力の伸展や独立以来の平和な状況が続いていることからの影響とも考えられることが見出された。今回、東ティモール国内の政情不安のため、健康面の調査、及び孤児院スタッフへのワークショップを開催することができなかった。研究成果報告として、2007年2月16日18日、山梨県立大学において写真展とともに調査結果のパネル展示を行った。2002年5月に独立した東ティモールは、これまで長い争乱の中にあったことにより、親や家族の殺戮場面に遭遇させられたり、自分の生命が危険にさらされるような体験をした子どもも多くみられた。その結果、親を亡くし、あるいは親の育児放棄といったことにより、これまで過ごしてきたコミュニティを離れ、孤児院での生活を余儀なくさせられることとなった。本研究の目的は、そういった過酷な体験が子どもの心理面、身体発達にどのような影響を与えるのか、心的外傷を負った子どもへの援助の可能性を探り、効果的な援助方法を検討することである。首都のDili市内5箇所、西部地区2箇所、南部地区2箇所、計9箇所の孤児院で、心理テストと身体計測を実施した。比較対照のため、予備調査として6名の家庭で暮らしている高校生も対象とした。その結果、2006年3月から勃発した紛争状況によって、再発したと思われる心理的不安定さが軽減されず、PTSDの後遺症とみられる状態を呈していることが見出された。

また、身体発達状況においては、年齢が高くなるに従って、日本の子どもと比較しより低身長、低体重であること、BMIが低く痩せすぎと判断される子どもが34.8%であることが明らかとなった。今回、東ティモール国内の政情不安のため、東部地区の調査、及び孤児院スタッフへのワークショップを開催することができなかった。研究成果報告の一つとして、2008年1月25日27日、1月29日2月1日の2回一般の方を対象とした調査結果の報告とともに、写真展を行った。長い争乱を経て2002年5月に独立した東ティモールでは、多くの子どもは親や家族の殺戮場面に遭遇させられることとなった。さらに、自分の生命が危険にさらされるような体験をした子どもも多くみられた。その中で、親を亡くし、あるいは親の育児放棄といったことにより、これまで過ごしてきたコミュニティを離れ、孤児院での生活を余儀なくさせられることとなった孤児も多数見られる。本研究の目的は、そういった過酷な体験が子どもの心理面、身体発達にどのような影響を与えるのか、心的外傷を負った子どもへの援助の可能性を探り、効果的な援助方法を検討することである。首都のDili市内4箇所、東部地区2箇所、西部地区2箇所、南部地区2箇所、計10箇所の孤児院で、S-HTPテストと身体計測・健康調査を実施した。また、障害児学校1箇所ではBaumテストを実施した。継続的調査の結果から、S-HTPに描かれるアイテム数は増加しているが、心的外傷を伺わせる内容、悲哀感、孤独感、無力感を示す内容には変化が見られない。また、身体発達状況においては若干の体重増加がみられる。健康面においては、未治療の歯が多く、医療面の乏しさの影響をうけていることが見いだされた。今回は青少年期に非常に過酷な体験をし、成人となった男女5名に面接調査を実施した。現在もフラッシュバックに苦しめられていることが明らかとなった。心的外傷の治療の一つとして、過去の体験を語ることの重要性が示唆された。研究成果報告として、2008年5月3日に一般人対象に「東ティモール孤児の戦乱による心的外傷について」と題した講演会と写真展を行った。
画像誘導による軟性臓器変形に実時間対応可能な穿刺ロボットの開発

本研究では移動と変形を持つ代表的な軟性臓器である脳と心臓に対してその動きを補償し、患部への正確なアプローチが可能な手術支援システムを開発してきた。臓器別に分け詳細を述べると次のとおりである。(1)術中MRIを用いた脳腫瘍切除ナビゲーションシステム脳は腫瘍切除のため開頭手術を行なう際、開頭後のそして切除過程において大きく変形することがわかっている。したがって、術前診断画像のみを参考にした場合、腫瘍の正確な切除が困難な問題がある。近年術中MRI装置が導入され、開頭後脳変形が起こった後にMR撮像できるようになった。本研究では術中に撮像されたMR画像を用いて、現在の腫瘍と手術器具の位置をナビゲーションモニター上に表示し、正確な腫瘍切除を支援する技術を開発した。特に、手術器具の軌跡を記録したログデータを分析する独自の方法を用いて、腫瘍においてすでに切除された領域と今後切除すべき領域を三次元モデルとして表示し、腫瘍切除率を向上できるシステムを構築した。後ろ向き調査4例と臨床データ実験1例を通してその有効性を確認し、2編の学会論文を発表(予定)している。(2)超音波画像誘導による心臓手術支援システム超音波画像は一般的にMR画像より、コントラストは落ちるが、リアルタイム性が高く、心臓の手術には適合している。本研究では胆嚢の呼吸性運動を補償した既存研究をさらに発展させ、拍動による動きを補償できる画像処理技術を開発した。これは心臓を止めることなく穿刺を行なう手術システムの一部として用いることができる。ボランティアの心臓超音波画像を用いた実験でその可能性を確認しており、現在精度とロバスト性を高めるため、アルゴリズムの改善を行なっている。
浮遊バイオエアロゾル挙動の遠隔計測が可能な車載型蛍光分光ライダー装置

大気中に浮遊している生物起源のエアロゾル(バイオエアロゾル)の検出が可能な蛍光ライダー装置の開発を行った。本装置の特徴は、UVレーザー照射時に発生する蛍光を日中においても検出できることである。そのため、検出時間を蛍光発光時間に同期する同期検出法を提案しその有効性を実験的に実証した。さらに、バイオエアロゾルの種類を判別するための蛍光データベースの作成を行った。屋外実証実験として、植物葉内に含まれる微量成分のクロロフィル分子および光合成二次代謝分子の蛍光スぺルクトルの遠隔検出を行った。結果は、前者では650nm-750nm付近、後者では400ー650nm付近の蛍光スペクトル検出に成功した。「バイオエアロゾルの遠隔実時間計測が可能な車載型蛍光分光ライダー装置の開発」を目的として、平成25年度は「車載型蛍光分光ライダー装置の要素技術開発」を課題設定し、1)バイオエアロゾル蛍光特性の把握、2)蛍光分光ライダー装置の設計、を重点研究項目とした。1)では、バイオエアロゾルの蛍光スペクトルEEM(Excitation-Emission-Matrix)特性の把握を試みた。その結果、試料とした殆ど全ての花粉が、紫外波長励起により400nm-600nmにかけての幅の広い蛍光スぺクトルを有する事がわかった。花粉のEEM特性と使用可能なライダー光源の検討より、励起波長は335nmで蛍光検出波長は450nm付近とするのが、ライダー装置に適していることが示された。次に蛍光スペクトル強度の絶対値測定を行った。実験装置は、現有機器(YAGレーザ、同期回路、オシロスコープ、PC)に自作の検出部(PMT、粒子カウンタ(レンタル)、多波長分光計測器(備品購入))からなる。本装置により求められたスギ花粉粒子1個の蛍光量子効率は0.000064%であった。2)では、1)の結果を受け、バイオエアロゾルの代表としてスギ花粉を選び、蛍光分光ライダーで観測するための条件設定を行った。スギ花粉濃度をパラメータとして、355nmで70mJのパルスエネルギーを照射した際の、蛍光強度(電圧換算)の距離依存性のシミュレーション設計を行った。オシロスコープの1bit電圧(78μV)を最小検出電圧とすると、20m程度の距離であれば1平方mあたり約100個のスギ花粉粒子の検出が可能である事が示された。さらに、疑似バイオエアロゾルとして屋外生育のケヤキ葉内のクロロフィルを対象にして、蛍光の同期検出法を試みた。微弱蛍光信号の日中観測が可能であった。3)その他、システム構造設計をほぼ終わらせた。研究目標「バイオエアロゾルの遠隔実時間計測が可能な車載型蛍光分光ライダー装置の開発」のもと、平成26年度は「車載型蛍光分光ライダー装置」の完成を目指した。1車両:装置搭載車両を、利便性・入手性を考慮して、バンタイプの小型軽自動車に設定した。市販車の荷室内に搭載可能な大きさ(容量約2.0m3)を考慮し装置製作を行う事とした。2装置製作:1の条件を満足することを目標とした結果、蛍光分光ライダー装置は1725 mm (L) x 1240 mm (W) x 1200 mm (H)のものが製作できた。小型UVパルスレーザー(波長355nm、パルスエネルギー30mJ、パルス幅6ns)を備品購入し、受信系と一体化したモノスタティック構造とした。蛍光検出器はゲート機能付きマルチチャネル検出器を、動作制御ソフトウェアは前年度にて開発された大型装置のものをカスタマイズした。装置全体は保持脚折り畳み構造の移動台に載せることで、屋内・車両間の移動・配置がスムーズに行えるようになった。フィールド観測時の電源確保のため、小型発電機を準備した。3動作確認試験:三次元掃引観測試験と疑似エアロゾルスペクトル観測試験を行った。前者では、植物成分であるクロロフィル分子の蛍光観測を試み、10m×5m(距離20m)の空間を水平方向10×高さ方向6分割のステップ掃引で、かつ奥行き方向空間分解能3m以下の三次元マルチ蛍光画像を得た。後者では、微粉末化されたバイオエアロゾル原因物質を封入したセルをレーザー伝搬光路上に設置し、蛍光スペクトル受信の可能性実験を試みた。アメリカシロヒトリの糞では480nm、685nm、740nm付近に、人工物の道路標識では405nm、515nm、560nm付近とそれぞれ蛍光スペクトルのピーク値の違いが検出された。平成27年度研究課題は「フィールド観測の実施による装置性能評価と情報提供手法の提案」に置いた。1.フィ-ルド観測1:ハードターゲットによる三次元蛍光スペクトル画像化実験を実施した。前年度までに開発製作が完成した車載型蛍光スペクトルライダーを用いて、フィールド観測を実施した。植生フィールド環境と河川フィールド環境を対象とした観測結果からは、波長445nm、685nm、740nmを中心とした、蛍光の二次元画像の距離方向への分布の蛍光三次元構造が得られた。またバイオエアロゾルの原因物質(アメリカシロヒトリの糞の微細粉末)と人工物(ロードコーンの微細粉末)の蛍光スペクトル計測では、両者の蛍光スペクトル形状に大きな差異を確認し、本ライダーで種類の判別が可能であることが明らかとなった。2.フィールド観測2:大気エアロゾル鉛直分布観測実験を行った。接地逆転層発生時の地上付近の高濃度エアロゾルに含まれる蛍光物質の検出を試みたが、明確な結果を得ることができなかった。

理由として、集光光学系と分光器との光学的結合効率の低さと回折格子とCCD検出器の組み合わせによる感度の低さが問題となった。新たに干渉フィルタと光電子像倍管からなる検出系の開発を行っている最中である。3.蛍光データベースの開発:ライダー観測の蛍光スペクトルから物質の種類判定を行う事を目的として、エアロゾル候補物質の蛍光データベースの作成を進めた。19種類の物質を冷凍粉砕して微細化(エアロゾル化)し、ライダー光源と同じ335nm励起による蛍光スペクトルを取得した。蛍光スペクトル形状から、植物系、動物系、人工物系に分類されることが明らかとなった。4.情報提供手法の提案:スマートフォンを利用した環境情報の実時間配信を提案した。大気中に浮遊している生物起源のエアロゾル(バイオエアロゾル)の検出が可能な蛍光ライダー装置の開発を行った。本装置の特徴は、UVレーザー照射時に発生する蛍光を日中においても検出できることである。そのため、検出時間を蛍光発光時間に同期する同期検出法を提案しその有効性を実験的に実証した。さらに、バイオエアロゾルの種類を判別するための蛍光データベースの作成を行った。屋外実証実験として、植物葉内に含まれる微量成分のクロロフィル分子および光合成二次代謝分子の蛍光スぺルクトルの遠隔検出を行った。結果は、前者では650nm-750nm付近、後者では400ー650nm付近の蛍光スペクトル検出に成功した。平成26年度の研究実施計画では「車載型蛍光分光ライダー装置の完成を目指す」であって、「車載型蛍光分光ライダー装置が完成した」が平成26年度の実績である。バンタイプの軽自動車に搭載が可能な装置を完成したこと、動作性能についても20mあるいはそれ以上離れた距離からの蛍光信号が検出された事、三次元マルチ蛍光画像観測に成功したこと、何種類かの疑似バイオエアロゾルスペクトルの遠隔計測に成功した事、微弱蛍光信号を背景光の強い日中に取得可能にしたこと等が「完成した」の根拠である。「車載型蛍光分光ライダー装置」の完成により、バイオエアロゾル発生と挙動に合わせた観測場所を特定しないフィールド計測が可能となった。「バイオエアロゾルの遠隔実時間計測が可能な車載型蛍光分光ライダー装置の開発」という本研究の最終目標に着実に近づいている。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境情報センシング平成27年度は、1フィールド観測の実施、2蛍光スペクトルデータベースの作成、3総括を行う。1バイオエアロゾルとしての花粉、肥料、水中藻類などを観測対象にした、森林、畑、河川などをフィールドとした観測を実施する。具体的には長野市近辺と諏訪湖釜口水門を検討している。バンタイプの軽自動車をレンタルする。2フィールド観測と並行して、バイオエアロゾル原因物質の蛍光スペクトルデータベースを作成する。生活環境中に存在する原因物質を収集し冷凍粉砕により微粉末化し、本装置および蛍光分光光度計を用いてスペクトル計測を行いデータベース化を行う。1の結果と比較することで、バイオエアロゾルの種類の同定を試みる。研究期間終了後の展開として、長期的な最終目標である「生活空間内に浮遊する多種エアロゾル挙動
卵細胞内カルシウムイオンの一過性増大を誘起する精子由来の因子の同定

計画我々はウニ可溶性画分を、受精膜を除去した受精卵に投与すると受精時のそれと類似したCa-transient誘起する事を見出している。この因子に関し以下の研究を行う。1.この因子の精製を行い化学的性状を追求する。2.このCa-transientの発生にIP_3の関与するIICR(IP_3-induced-Ca release)およびcCMPが関与するCICR(Ca-induced Ca trlease)の両者が関与しているかどうかか調べる.研究成果ウニ精子の可溶性画分より受精卵に一過性の脱分極と細胞内カルシウムイオン濃度の増大(Ca-transient)が起こる事を確かめた。この成分を陽イオン交換樹脂-陰イオン交換樹脂-アミド80によるカラムクロマトグラフィーにより部分精製した。これは酸、アルカリ、熱、蛋白分解酵素にたいし安定であり分子量500以下である。これ以上の精製の試みにたいしては失活してしまい、複数の成分からなるのではないかと考えられる。それゆえこの成分の精製はこれ以上前進していない。受精時あるいは再受精時のCa-transientは、IICRとCICRの二つの機構が働いていると考えられている。しかるにこの画分によるCa-transientはヘパリンやGDP-βSにより阻害されなかった。またこのときの細胞のIP_3およびcGMP含有を測定すると前者のみが変化した。これらの事実はこの画分はIICRのみを誘起する事を示している。従来このような物質は発見されておらず今後この分野の研究の有力な手段となりうると考えられる。我々はウニ精子の可溶性画分に受精卵に細胞内カルシウムイオン濃度の一過性増大(Ca-transient)を誘起する因子が含まれている事を確かめている。本研究ではこの因子を精製する事を第一の目的としている。バフンウニとムラサキウニを敦賀湾と富山湾で大量に採集し、精子を集めた。精子を凍結融解し遠心して得た上清を熱処理後分子量5,000以下の分画を出発物質とした。ゲル濾過クロマトグラフィによるとこの因子の分子量はおよそ300となった。pH8.2において陽イオン交換樹脂に、pH5.0において陰イオン交換樹脂に吸着されずめだった解離基の無いこと、逆相クロマトグラフィの結果からこの因子は両親媒性であることが判明した。そこでゲル濾過-陰イオン交換-陽イオン交換-アミド80による順相クロマトグラフィを重ねる事によりかなり純度の高い標品を得ることが出来た。しかしマススペクトロスコピイやNMRにかけるには量的に不足であった。現在、大規模の精製を行っている。かなりの労力をウニ集め・精子集め・因子精製に使った。それでもなお不十分なようで、再度挑戦中である。そのためには、活性検定法の簡略化の必要にせまられ、現在種々の試みを行っている。更にこの因子によるCa-transientの誘起機構について追究した。従来この因子によるCa-transientはG-proteinを経てIP_3によるカルシウム遊離(IICR)によっておこるとする傍証を得ていた。そこでこの時のIP_3濃度の測定を行ったところやはり一過性の増大が起こった。ただしIP_3濃度のピークはCa-transientのそれより遅れた。これはこのCa-transientにIICRが関与している事は確かであるが他の遊離機構が関与している事を示しているのかもしれない。さらにこのCa-transientのsourceは細胞内にある事を確かめた。計画我々はウニ精子可溶性画分を、受精膜を取り除いた受精卵に細胞外から投与すると、受精時とよく似た一過性の[Ca^<2+>]_iの増大を誘起する活性を見いだしている。1.この因子の精製を引き続き行う。前年度の精製により、いくつかの性質が分かってきた。それを参考にさらに精製方法に改良を加え、精製を行う。

2.この因子による活性化には、IP_3が関与しているかどうか明らかにするため、因子投与前後の卵内IP_3量および卵細胞内のCaイオン濃度の経時的変化の測定をおこなう。3.受精時の活性化にはCaによるCa遊離(CICR)の機構も関与していると考えられている。この因子による活性化にもこの機構が関与しているかどうかを明らかにするため、細胞内cGMP濃度の経時的測定をおこなう。結果1.陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂およびアミド80によるクロマトグラフィイによる精製の結果かなり精製出来たと思われる。しかし残念ながらその後の脱塩操作などで一挙に失活してしまい、精製は進行していない。2.および3.IP_3およびcGMPはアマシャム社のisotope dilution methodを用い再現性良く測定できた。結果はcGMPの増大が先行し、ついでCaイオンの一過性増大が、ついでIPが増大した。この結果は受精後のCa-transientにはCICRが主導的役割を果たし、IICRはCa-transientの結果起こるという仮説と矛盾しなかった。
ヒスイ輝石岩に包有されたスラブ起源流体の塩濃度

本研究はプレート収束域の、沈み込み帯における物質移動の解明を目指し、蛇紋岩メランジ中の構造岩塊の一種、ヒスイ輝石岩を対象として、その生成時において関わった、地下深部の流体の実体を知ることを目的とする。平成30年度迄の研究結果として、日本各地の石英ヒスイ輝石岩およびその曹長岩反応縁、曹長石ヒスイ輝石岩中の流体包有物の内容物、流体包有物の塩濃度の測定結果が得られた。これらの結果の違いが、ヒスイ輝石岩の主な2つの成因(1)流体からの沈殿、(2)元岩の変成・交代作用の違いに結びつくことが明らかになり、ヒスイ輝石岩の2つの成因論を共に説明し得る、新たなモデルを考案した。具体的には、神居古潭地域(旭川市)のヒスイ輝石岩、大屋産曹長岩の試料について、新たに分析用試料を作成し、一部は塩濃度測定を試みた。平成29年度迄までに現地住民の調査・試料採取への理解が得られにくいことから研究対象から除外した、高知産ヒスイ輝石岩(オンファス輝石岩)について、岩石試料を購入することができた。しかし、これらの岩石は細粒のため分析に適さないことがわかった。これまでに調査した岩石試料のSEM/EDSによる岩石組織観察・鉱物化学分析を追加で行った。本研究はプレート収束域の沈み込み帯における物質移動の解明を目指し、蛇紋岩メランジ中の構造岩塊の一種、ヒスイ輝石岩を対象として、その生成時において関わった、地下深部の流体の実体を知ることを目的とする。今年度は、既存岩石試料を使用した流体包有物の同定、および流体の塩濃度測定の続きを京都大学において継続した。その時点までの結果をまとめて、鉱物科学会においてポスター発表をおこなった。ポスター発表時の議論の中で、年末の京都大学の研究集会での発表の機会を得て、深部流体関係の最新の知識、情報に触れることができた。また、ポスター発表の際の議論において、関東山地(寄居)の調査の必要性が明らかになった。そのため、今年度は新たに、関東山地2地点(寄居および下仁田)における野外調査と試料採取を実施した。新たに寄居で採取した岩石試料について、熊本大学で電子顕微鏡観察および構成鉱物の化学組成の測定を実施した。得られた結果については、大まかには、昨年度までの予察的研究結果を補足するデータが得られた。さらに新しい試料の追加により、岩石組織と生成過程の理解が深まったため、今後の展開が期待できる。予定どおりの内容ではないが、研究テーマに沿って順調に進展している。関東山地で野外調査が必要となったため、大屋(中国山地)における曹長岩の試料採取を実施しなかった。新たに、関東山地2地点(寄居および下仁田)における野外調査と試料採取を実施した。寄居試料について、熊本大学で電子顕微鏡観察および構成鉱物の化学組成の測定を実施した。下仁田で採取した岩石試料については、まだ同様の内容を実施できていない。大学の機器の使用状況に空きが出やすい年度末に、熊本大学における分析を予定していたが、熊本地震の被害で大学や交通の状況が変化し、実現が難しくなったため延期している。今年度の成果は、全体として昨年度までの予察的研究結果を補足するデータが得られた。また、新しい試料の追加によって、岩石組織と生成過程への理解が深まり、今後の展開が期待できる。今年度迄の研究結果として、日本各地の石英ヒスイ輝石岩およびその曹長岩反応縁、曹長石ヒスイ輝石岩中の流体包有物の内容物、流体包有物の塩濃度の測定結果が得られた。これらの結果の違いが、ヒスイ輝石岩の主な2つの成因(1)流体からの沈殿、(2)原岩の変成・交代作用の違いに結びつくことが明らかになり、ヒスイ輝石岩の2つの成因論を共に説明し得る新たなモデルを考案した。具体的には、今年度までに高知産ヒスイ輝石岩の入手ができなかったため、計画を変更し、曹長石ヒスイ輝石岩についての試料の選定とデータの拡充を中心に研究を進めた。その結果として、既存試料のうちの糸魚川産曹長石ヒスイ輝石岩2試料を追加した。糸魚川産曹長石ヒスイ輝石岩2試料と、昨年度から継続して分析を進めている関東産地寄居産石英ヒスイ輝石岩、関東産地下仁田産曹長岩(脈)について、鉱物分析(EDS)、流体包有物の種類の同定(ラマン分析)と塩濃度測定を実施した。予定どおりの内容ではないが、室内研究で一定の成果が得られた。また、本研究の結果と、従来のヒスイ輝石岩の主な2つの成因とを結びつける、新たなモデルを考案した。曹長石ヒスイ輝石岩、石英ヒスイ輝石岩、曹長岩(脈)について、地震被害の影響で遅れていた、熊本大学での室内分析を実施した。今年度までに高知産ヒスイ輝石岩を入手できなかったため、計画を変更し、新たに曹長石ヒスイ輝石岩についての試料を追加するため、既存試料から、糸魚川産2試料を選定した。

111月に中国山地大屋での曹長岩の調査を予定していたが、天候にも恵まれず、実施できなかった。本研究はプレート収束域の、沈み込み帯における物質移動の解明を目指し、蛇紋岩メランジ中の構造岩塊の一種、ヒスイ輝石岩を対象として、その生成時において関わった、地下深部の流体の実体を知ることを目的とする。平成29年度迄の研究結果として、日本各地の石英ヒスイ輝石岩およびその曹長岩反応縁、曹長石ヒスイ輝石岩中の流体包有物の内容物、流体包有物の塩濃度の測定結果が得られた。これらの結果の違いが、ヒスイ輝石岩の主な2つの成因(1)流体からの沈殿、(2)元岩の変成・交代作用の違いに結びつくことが明らかになり、ヒスイ輝石岩の2つの成因論を共に説明し得る、新たなモデルを考案した。内容の一部は、Nishiyama et al.(2017)に載せた。具体的には、ヒスイ輝石中の流体包有物が観察しにくいため、塩濃度データが得られていなかった、寄居産及び神居古潭産の石英ヒスイ輝石岩、大屋産曹長石ヒスイ輝石岩の試料について、新たな試料を追加して測定を実施した。実施が遅れていた神居古潭地域(旭川市)及び大屋(養父市)の曹長岩の現地調査と試料収集を実施し、試料処理などを進めてきた。野外調査と試料採取をおこない、室内基礎研究(試料の薄片作製、顕微鏡観察)を進めている。大屋産曹長岩について氷点測定により塩濃度測定を試みた。予定どおりの内容ではないが、野外調査・試料採取及び室内研究で一定の成果が得られた。また、本研究の結果と、従来のヒスイ輝石岩の主な2つの成因とを結びつけた、独自のモデルに関するデータを補充した。これらの結果について、論文化を進めている。天候に恵まれず、実施できなかった中国山地大屋(養父市)や、神居古潭地域(旭川市)での野外調査を実施した。大屋産曹長岩については、流体包有物の大きさが小さく個数が少ないため、分析が困難であった。測定した神居古潭地域(旭川市)の石英ヒスイ輝石岩のヒスイ輝石中には流体包有物が観察されなかった。その後、研究代表者本人の怪我により、長期間、分析用の試料作成作業が不可能となったため、作業を中断している。また、平成29年度迄までに、住民の理解が得られないため調査が困難であり、試料の入手もできなかったため、高知産ヒスイ輝石岩の調査研究を見送った。これについては現在も情報収集中である。平成30年度迄の研究結果として、日本各地の石英ヒスイ輝石岩およびその曹長岩反応縁、曹長石ヒスイ輝石岩中の流体包有物の内容物、流体包有物の塩濃度の測定結果が得られた。具体的には、神居古潭地域(旭川市)のヒスイ輝石岩、大屋産曹長岩の試料について、新たに分析用試料を作成し、一部は塩濃度測定を試みた。平成29年度迄までに現地住民の調査・試料採取への理解が得られにくいことから研究対象から除外した、高知産ヒスイ輝石岩(オンファス輝石岩)について、岩石試料を購入することができた。しかし、これらの岩石は細粒のため分析に適さないことがわかった。これまでに調査した岩石試料のSEM/EDSによる岩石組織観察・鉱物化学分析を追加で行った。
抑制性神経回路をターゲットとした神経障害性疼痛発症機構の解明

ラット下歯槽神経を切断し、神経障害性疼痛を生じさせたIANXラットモデルを作製し、三叉神経脊髄路核(Vc)におけるGABA介在神経細胞の関与を調べた。その結果、下歯槽神経切断早期では、Vc表層神経細胞におけるGABAトランスポーターであるVGATの発現が抑制されてGABAの放出が減少し、後期では、Vc表層神経細胞のK+-Cl-外輸送KCC2が抑制されることにより、GABA様神経細胞の機能が興奮性に変化する可能性が示唆された。以上の結果より、GABA様神経細胞の変化が下歯槽神経切断後の神経障害性疼痛に関与している可能性が示唆された。ラット下歯槽神経を切断し、アロデニアや痛覚過敏を生じさせたIANXラットモデルを作製し、神経障害性疼痛へのGABA介在神経細胞の関与を調べ、延髄におけるK+-Cl-外輸送KCC2の変化による抑制機構の変化を詳細に調べることを目的とした。雄性WistarラットのVenus(蛍光タンパク)とGABAトランスポーター(VGAT)を共発現させた遺伝子変換ラット(VGAT-Venusラット)の下歯槽神経切断1週間から3週間目まで、顔面三叉神経第2枝領域の機械刺激に対する逃避反応行動閾値は低下したが、Shamラットでは変化しなかった。さらに、KCC2インヒビターであるRーDIOAをShamラットのくも膜下腔に持続投与したところ、IANXラットと同じように機械刺激に対する逃避反応行動閾値の低下が認められた。また、下歯槽神経切断1週間後から、三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)表層におけるVGAT-Venus陽性細胞の発現が減少した。切断3週間目においては、KCC2陽性発現の減少がみられ、侵害刺激によるVGAT-Venus陽性細胞の活性化が認められた。さらに、GABAAアゴニストのムシモルをIANXラットのVcに局所投与することにより、Vc神経細胞活性の抑制が見られなくなった。よって、切断3週間目では、VcのKCC2発現が減少することにより、VcにおけるGABA様神経細胞の興奮が抑制性から興奮性の作用を引き起こしたことが示唆された。これらの結果より、下歯槽神経切断早期では、Vc表層神経細胞におけるVGATの発現が抑制されてGABAの放出が減少し、後期では、Vc表層神経細胞のKCC2が抑制されることにより、GABA様神経細胞の機能が興奮性に変化する可能性が示唆された。Venus(蛍光タンパク)とGABAトランスポーター(VGAT)を共発現させた遺伝子変換ラット(VGAT-Venusラット)を用いて、下歯槽神経を切断させたIANXラットを作製した。行動学的観察により、IANXラットは神経切断1週間から3週間目まで、顔面三叉神経第2枝領域の機械的アロデニアや痛覚過敏が生じていることがわかった。前年度までの実験結果により、下歯槽神経切断1週間後から、三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)表層神経細胞におけるVGATの発現が抑制されてGABAの放出が減少し、3週間後からはVc表層神経細胞において、K+-Cl-外輸送であるKCC2が抑制されることにより、GABA介在神経細胞の機能が興奮性に変化する可能性を示した。本年度はさらに、Vc表層におけるKCC2発現の詳細を調べた。Western blot法を用いて、下歯槽神経切断1週間目と3週間目におけるVc表層のKCC2のタンパク発現量を調べたところ、1週間目では神経切断前と比較して変化がなかったのに対し、3週間目では有意に減少していることがわかった。以上の結果より、下歯槽神経切断早期と後期では同じように神経障害性疼痛が生じていたが、中枢Vc表層で生じているGABA介在神経細胞は異なる変化が生じており、神経障害性疼痛の発生には複雑なメカニズムが関与していることが分かった。これらの結果より、これまであまり着目されなかった抑制性神経細胞の機能的変化が解明される一端となり、神経障害性疼痛に対する鎮痛薬の開発につながる可能性が見いだされた。ラットの下歯槽神経を切断し、三叉神経第2枝支配領域(V2)に神経障害性疼痛を生じさせたIANXラットモデルを作製し、神経障害性疼痛とGABA介在神経細胞の関与を調べた。さらに、延髄におけるK+-Cl-外輸送KCC2の変化による抑制機構の変化を詳細に調べることを目的とした。実験には雄性WisterラットのVenus(蛍光タンパク)とGABAトランスポーター(VGAT)を共発現させた遺伝子変換ラット( VGAT- Venusラット)を用いた。IANXラットのV2領域の機械刺激に対する逃避反応行動閾値は、神経の剖出のみで神経の切断を行わないShamラットと比較し、下歯槽神経切断1週間から3週間目まで有意に低下した。そこで、KCC2のインヒビターであるR-DIOAをShamラットのくも膜下腔に持続投与したところ、IANXラットと同じように機械刺激に対する逃避反応行動閾値が低下した。また、切断1週間後に三叉神経脊髄路核(Vc)表層におけるVGAT- Venus陽性細胞の発現量が低下した。切断3週間目では、VGAT- Venus陽性細胞上の細胞活性マーカーであるpERK陽性発現が増加し、KCC2の発現量が減少した。

さらに、GABAAアゴニストのムシモルをShamラットのVcに局所投与すると侵害受容神経細胞の活動放電の抑制がみられたが、IANXラットへの投与では抑制が認められなかった。よって、切断3週間目では、VcのKCC2発現が減少することにより、VcにおけるGABA様神経細胞の興奮が抑制性から興奮性の作用に変化した可能性が示唆された。これらの結果より、下歯槽神経切断1週間では、Vc表層神経細胞におけるVGATの発現が抑制されてGABAの放出が減少し、切断3週間では、Vc表層神経細胞のKCC2が抑制されることにより、GABA様神経細胞の機能が興奮性に変化すると考えられた。以上より、GABA様神経細胞の変化が下歯槽神経切断後の神経障害性疼痛に関与している可能性が示唆された。ラット下歯槽神経を切断し、神経障害性疼痛を生じさせたIANXラットモデルを作製し、三叉神経脊髄路核(Vc)におけるGABA介在神経細胞の関与を調べた。その結果、下歯槽神経切断早期では、Vc表層神経細胞におけるGABAトランスポーターであるVGATの発現が抑制されてGABAの放出が減少し、後期では、Vc表層神経細胞のK+-Cl-外輸送KCC2が抑制されることにより、GABA様神経細胞の機能が興奮性に変化する可能性が示唆された。以上の結果より、GABA様神経細胞の変化が下歯槽神経切断後の神経障害性疼痛に関与している可能性が示唆された。申請時の計画通りに研究は進展している。VGAT-Venusラットの下歯槽神経を切断しIANXラットモデルを作製するのに成功した。さらに、IANXモデルラットと、皮膚と筋肉の切開のみを施したShamラットを用いて、行動学的観察、電気生理学的解析、2重蛍光免疫染色法を用いた解析、Western blot法による解析まで終了した。これまでの研究成果の一部をまとめたものが、Experimental of Neurologyに掲載された。麻酔学今年度まで計画していた実験内容はおおむね順調に進展した。よって、計画通りに来年度は、抑制性介在神経細胞に対するミクログリアの関与を新たに解明したいと考えている。ミクログリアから放出されるBDNFが三叉神経脊髄路核に存在するKCC2の合成を阻害させる可能性を調べるために、ミクログリアの培養をおこない、ELISAキットを用いてBDNFの抽出を行う。これら全ての実験結果をまとめ、英文雑誌に投稿したいと考えている。VGAT-Venusラットの下歯槽神経を切断してIANXラットモデルを作製するのに成功した。さらに、IANXラットモデルとshamラットの下歯槽神経切断3週間目までの顔面三叉神経第2枝領域の機械刺激に対する逃避反応行動閾値行動学的観察を終了した。下歯槽神経切断3週間目のIANXラットモデルとshamラットを用いた電気生理学的解析も行った。また蛍光免疫染色法を用いた解析は、平成26年度の計画の一部まで進んでおり、抗pERK、抗c-Fos、抗KCC2抗体を用いた2重蛍光免疫染色法を終了した。現在までに一通りの実験は終えたが、さらに追加実験やn数の増加などが必要である。申請時に計画していた海外での学会発表を平成27年度に発表することになった。よって、本年度に予定していた海外での学会発表に関する旅費が必要なくなった。
移植医療への応用を目指した免疫制御細胞療法の確立に関する研究

これまでの研究成果として、1)抗CD28superagonist抗体を用い、in vitroで増殖させたTreg細胞の動物モデルにおける有用性が示された;2)ラット骨髄からMSCを用いて、T細胞増殖反応およびGvHDへの抑制効果を明らかにした。また、クローン化MSCとの遺伝子発現プロファイルの活用により、MSC細胞における標的分子のスクリーニングや、免疫生物学の抑制機能について解析した;3)同種心臓、肝臓移植拒絶・寛容モデルの解析及び移植後拒絶・寛容予測するバイオマーカーの探索を行い、移植後拒絶・寛容を予測できるバイオマーカーの発見、免疫抑制療法の軽減や休止の指標として期待したい。現在用いられている免疫抑制剤による移植医療は、移植を医療としての段階へ導きはしたが、半永久的な投与による副作用、精神的および経済的な負担が大きい為、新たな拒絶反応抑制方法の確立が切望されている。我々は移植医療への応用を目指して、免疫制御リンパ球(Treg細胞)、間葉系幹細胞を移植片拒絶反応抑制に利用する免疫(抑制)細胞療法の確立を本研究の目標とする。これらの細胞を用いる事により、免疫抑制剤の使用を極力減らし、安全かつ患者の生活の質(QOL)を向上させる。本年度の研究では、制御性T(Treg)細胞の移植医療の臨床応用を目指して、今までの研究で明らかになった生体内数少ない細胞増殖抑制作用を持つTreg細胞を優位的に増やせる抗CD28 superagonist抗体(SupCD28抗体)を用い、腎移植、Graft versus Host Disease(GvHD)モデルにて、抗体投与後の活性化Foxp3陽性Treg細胞の動態をターゲットとし、その動態、抗原特異性および免疫抑制効果の機序について検討した。腎移植モデルを用いた移植片の生着延長効果の検討では、移植前或は直後に抗体を投与する事により顕著な生着延長効果が得られた。また、腎移植後の特異的な免疫寛容が誘導され、心臓テストグラフトの生着も確認できた。さらに、抗体の投与によるグラフト生着延長効果は、末梢血中のみならず、グラフト中浸潤細胞のFoxP3陽性Treg細胞による免疫抑制が関与していることが示唆された。GvHDモデルにおいては、生後24hr以内のDAラット新生児に、(LEW×DA)F1骨髄を投与し、Neonatal toleranceラットの作成し、GvHDの実験に用いた。SupCD28抗体をLewisラット由来のナイーブリンパ球移入前(-3日)に(LEW×DA)F1ラット、或はDA tolerant of(LEWxDA)F1ラットに投与し、GvH反応の抑制効果を検討した。(LEW×DA)F1ラットにおいては、SupCD28投与で増殖したTregの抑制効果はGvH反応発症の早期に有効であることを確認された。一方、DA tolerant of(LEWxDA)F1においては、SupCD28抗体投与有無関係なく、GvHDが発症した。Tolerant of(LEWxDA)F1ラットのSupCD28抗体投与によって増殖されたFoxp3陽性TregがDAラット由来であり、Lewisラット由来ナイーブリンパ球によるGvHDの発症を抑制できなかったため、Tregの免疫抑制作用は抗原特異的であることを示唆された。今後、移植領域においてこの抗体の新しい免疫抑制剤として期待されたい。本年度の研究は、主に間葉系幹細胞の移植片拒絶反応抑制に利用するための機序の解明であった。ラット骨髄1ヶ月間を培養後、付着細胞を回収し、磁気細胞分離(MACS)にて、抗CD11b抗体、抗CD45抗体を用いて、マクロファージ(Mφ、CD45+CD11b+CD90-)細胞、間葉系幹細胞(MSC、CD11b-CD45-CD90+)を精製分離した。また、MSCからクローニングし、クローン化MSC(cMSC)が得られた。これら三種類の細胞も用いて、抗体、ConA、アロ抗原刺激によるT細胞反応系に添加したところ、MSCはMφと同様各刺激に対するT細胞増殖反応の抑制機能を示した。しかし、cMSCはT細胞の増殖反応を増強した。一方、F1(LEW x DA,46週齢/120g)を放射線(6Gy)処理後、三種類の細胞(1.0×10^7cells)をそれぞれ投与し、翌日Naive Lewisリンパ球(1.0×10^7cells)を移植したGvHDモデルにおいては、MSCsおよびMφ細胞投与群では60日以上の生存が得られ、cMSC投与群では、無処置群と同様に23日前後であった。さらに、上記三種類の細胞の遺伝子発現プロファイリングによる包括的遺伝子発現パターンを比較した結果、MSC細胞においては特異的発現している遺伝子を明らかにした。

ラット骨髄短期(1ヶ月間)培養後で分離精製したMSCが同時期のマクロファージと同様各刺激によるT細胞増殖活性およびGvH反応に対し抑制効果を有しており、今後、GvHD治療だけでなく臓器移植においても、この細胞を新たな免疫抑制細胞としての可能性を期待したい。また、クローン化MSCとの機能違いの検討結果および遺伝子発現プロファイルの活用により、MSC細胞における標的分子のスクリーニングや、MSC細胞の免疫生物学の抑制機能における分子機序について理解・解明されたい。本年度の研究は、主にマウス同種異系心臓、肝臓移植拒絶・寛容モデルの解析及び移植後拒絶・寛容予測するバイオマーカーの探索であった。移植寛容モデルとして、B10.BR(H-2K^k)マウスの肝臓をB10.D2(H-2K^d)マウスへ同所性に肝移植を行った自然免疫寛容モデルにて、移植後5、8、14、30、100日目に移植肝、脾臓、リンパ節、血清等サンプルを採取した。一方、移植拒絶モデルとして、同様にB10.BR(H-2K^k)マウスの心臓をB10.D2(H-2K^d)マウスへ異所性に心移植を行った拒絶モデルにて、移植心、脾臓、血清等を採取した。組織はmRNAを精製し、蛍光物質で標識しプローブを作製し、作製したプローブをマイクロアレイにハイブリダイズし、移植心、肝組織、脾臓mRNA発現プロファイルを解析した。肝移植寛容モデルにおいては、30、100日目と移植後早期である5、8、14日目と比べ、数百個の有意に変化した遺伝子を見いだした。その中から統計学的な処理(t-test)を行い、109個(p<0.01)の候補遺伝子を見つけた。心移植拒絶モデルでは、遺伝子発現のパターンは主に移植後5、8日での急性拒絶期では500数個の統計学的に有意に変化した候補遺伝子を見つけ、既存の免疫活性に関わる遺伝子の高発現が認められた。また、肝臓移植モデルの移植後早期(5、8、14日)との相関・相同性についても確認できた。アレイ結果の検証方法として多機能ジーンエクスプレッサーGeXPを試みたGeXPはマルチプレックスRT-PCRアプローチを使い、25遺伝子の発現定量解析を1反応で同時に測定することができ、その発現をさらに定量RT-PCRにて確認を行い、アレイでの結果の相関性の確認が出来た。今後GeXP法による移植後拒絶・寛容を予測できるバイオマーカーの発見、患者に対する免疫抑制療法の軽減や休止の指標として期待したい。さらに、今年度では、Naive B6マウスの脾臓からT細胞を精製分離し、BDF1(B6xDBA)マウスへのリンパ球輸入による急性GvHDモデルも確立でき、今後、免疫細胞療法の実施へと繋げていきたいと考えている。
学術用モニター・システムの開発

最終年度である平成4年度は、まず平成3年度に実施した第2回調査の分析を行った。分析の中心は、生活意識・社会意識に関する質問項目であり、既存の調査の結果などとの比較により、くり返し調査の2回目の時点におけるサンプルの有効性を検討した。さらに、今年度は第3回目の調査も実施して1回目から3回目までの回答をすべて含むデータセットを作成し、これと回答状況(有効回答、返送なし、転居など)のデータを結合することによって、詳細な分析を行った。分析の結果から、同一サンプルにくり返し調査を行うモニター・システムでは、比較的安定したサンプルが得られることがわかった。しかし、質問内容の影響や調査間隔の問題、転出サンプルの扱い方など、3回の調査では十分解明できなかった問題もあり、今後もさらにデータを集める必要があると思われる。本研究の目的は、全国的な学術用のモニタ-・システムを開発することである。この開発が必要とされるのは、社会調査の環境が悪化し、調査が著しく困難になる一方で、社会調査技法の研究やコ-ホ-ト分析、ライフコ-スの細かな検討といった学術的な課題を果たすためには、より細かく、具体的内容に関しての繰り返し調査が不可欠であるためである。民間の世論調査、市場調査においては、すでにモニタ-・システムは導入されているが、標本抽出法ならびに標本の特性が偏っており、学術目的にはとうてい使用することができない。したがって、本研究が目的とする学術用モニタ-・システムを発表することによって、多くの成果がえられると考えられる。今回のモニタ-・システムにおいては、まず、日本全国300地点から、8,000標本を抽出し、この標本に対して、世帯構成、就業状況学歴、ライフステ-ジなどに関する基本的な調査と学術用調査のためのモニタ-になるかどうかを調査する調査票を作成し、郵送法によって調査を実施した。これらのデ-タは回収後すべて、パソコンに入力され、基本的な個人、世帯の社会的属性から、モニタ-・システムにふさわしい、代表性があるかどうかを分析し、その結果を検討することによっておよそ4000世帯をモニタ-として確定する計画である。このモニタ-に対して、さまざまな問題を調査することによって、回答の信頼性をテストし、社会調査への信頼度を高める一方で、パネル・デ-タの収集と解析、コ-ホ-ト分析、時系列デ-タの収集と解析、ライフコ-ス・デ-タの収集と解析といった、従来の調査では実施が困難なために取り組むことが少なかった重要な問題に答えることが可能となる。平成3年度は、まず平成2年度に収集したデ-タを、設備備品費によって購入したパ-ソナルコンピュ-タに入力し、パソコン用統計解析ソフトを用いて本格的な分析に入った。具体的には、世帯構成、職業、ライフステ-ジなどの分布状況をチェックするとともに、各調査地点に関する人口学的、社会的デ-タを収集し、サンプルの代表性の検討を行った。また、これと並行して、パネル調査のために設けた質問項目についてのアフタ-コ-ディングを行い、解答分布や調査属性との関連を調べることによって、2回目の調査の調査票を作成し、発送した。本調査の目的である学術用モニタ-・システムの有効性の検討は、最後の調査が終了した時点でないと評価できないが、現段階で言えることは、学術目的に耐えうるモニタ-サンプルを構成するためには、地域移動によるサンプルの変動への対応が、非常に大きな課題であるということであり、特に全国規模の調査では、地域移動の地域格差にも配慮する必要があることが明らかになった。今後は2回目(実施中)、3回目(4年度実施)の調査結果を、既に行った1回目の調査結果と比較検討することによって、モニタ-方式による被調査者の継続的な確保の可能性と、モニタ-方式によるパネル調査の有効性を検討する。