hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫におけるアルドラーゼ遺伝子の分子進化とアイソザイムの生成機構

この中で,昆虫はショウジョウバエのようなC型中心のアイソザイムも持つもの,カイコのC型とB型を持つもの,バッタのようにA型とB型を持つもの(バッタについては未発表データ)と多様に進化したものと推察した.ショウジョウバエとカイコを使って昆虫のアルドラーゼアイソザイムの生成機構について調べた。ショウジョウバエのcDNAライブラリーからアルドラーゼクローンを単離し、これをプローブとしてゲノム遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、ショウジョウバエアルドラーゼ遺伝子はゲノム上1個で最終エキソンの選択的スプライシングによって、3種のアイソザイム(alpha,beta,gamma)が生成されることが予想された。PCR法で3種のアイソザイムをつくるcDNAを合成し、これを発現ベクターに導入して、タンパクを生産させ、アルドラーゼ活性の比較を試みた。これらのcDNAはいずれも活性あるタンパクを作り出すが、Km値、FBP/F1P比、温度安定性や等電点に差が見られた。タンパク的にはC末側の30個のアミノ酸領域にわずかな違いが見られるに過ぎないが、酵素の特異性に関してはC末側の構造が重要であることが強く示唆された。また、cDNAを単離するにあたり、C末側のエキソンを2つもつ新しいタイプのmRNAが存在することが観察され、4-3と名付けたクローンはalphaとbetaの両者のアイソザイムが作られる可能性が示唆されので、これを発現ベクターでタンパクを作らせ、活性あるそのタンパクのアミノ酸配列を決定した。これより出来るアイソザイムはalpha型であった。alphaと作ると考えられるmRNAには明確なポリAシグナルがないのでbetaのシグナルを利用していると推察された。一方、カイコには2種のアルドラーゼアイソザイムが存在していたが、そのうちの1つのcDNAを単離した。これは卵や脂肪体に見られるタイプと思われ、ショウジョウバエのアルドラーゼと80%のホモロジーをもっており、ヒトとは70%であった。また別のアイソザイムは現在スクリーニング中で、これをコードすると思われるタンパクの性質からして遺伝子構造にかなりの変化が予想される。ゲノム構造も解析中である。本年度はアルドラーゼアイソザイムの遺伝子構造を明らかにしたが、次年度は分子進化の問題とアイソザイム生成のメカニズムにアプローチを行う。ショウジョウバエでは選択的スプラシングによって生成されると思われる3つのアイソザイムを大腸菌の系で発現させ,それらの酵素を精製し,性質を明らかにした.その結果,3つのアルドラーゼとも性質的には哺乳類のC型に類似していた.また,成虫より作成したcDNAライブラリーから新しい2種のアルドラーゼクローンを得,1つは2つのC末端のエキソン(4αと4β)をもつクローン4-3と活性中心のLys残基がGln残基に置換している6-2の全シークエンスを決定した.4-3クローンは4αのエキソンを翻訳し,α型のアイソザイムを生成した.6-2は疑似遺伝子と思われ,進化の課程で変異したものと推定された.カイコでは脂肪体cDNAライブラリーより1つのクローンを得,解析の結果,ショウジョウバエとは80%のホモロ-ジ-を持っていた.これはS型アルドラーゼをコードするものと推定される.また,F型アルドラーゼについては現在スクリーン中である.しかし,カイコではノーザン,サザンの結果,S型,F型の遺伝子は別々であることが示唆された。酵素にはS型は哺乳類のB型に,F型はC型に類似しており,ショウジョウバエではC型のみしか観察されなかったが,カイコではFructose-1-phosphate(FIP)の代謝系があることが確認された.ショウジョウバエについてもこの代謝系は存在するものと考えられ,6-2の更なる解析が必要とされる.
免疫増強配列を導入した組換えウマヘルペスウイルス1型の作出とその性状解析

ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)は妊娠馬に流産を起こす主原因の一つで、現在、流産防止の目的で不活化ワクチンが実用化されているが充分な効果は得られていない。申請者の教室では弱毒生ワクチンの併用を考えて強毒株をウシ腎(BK)細胞で343回連続継代してウマに病原性を示さない弱毒BK343株を作出したが、その感染防御能は不充分であった。そこで、有効な生ワクチン開発を効率良く行うために遺伝子組換え法の応用を検討しているが、潜伏感染の問題もあり実用化には至っていない。EHV-1による流産を防止するには、液性免疫だけでなく細胞性免疫を十分に誘導することが必須である。そこで、本研究では免疫調節・増強に関わるサイトカインと細胞性免疫を付与する特殊な塩基配列をもつDNA(DNAアジュバント)に着目し、これらの遺伝子を自然環境下では感染性ウイルスを産生しない組換えEHV-1ウイルスに導入し、その免疫効果をマウスモデルを用いて検証することを目的とした。EHV-1のウイルスゲノムから感染性ウイルスの構築に必須のgD遺伝子、ウイルスの生体での増殖性ならびに拡散に関わっているgE、gIと71番遺伝子を欠損させたウイルスを構築した。このウイルスは自立複製不能で、感染性ウイルスの作製は欠損させた4種類の蛋白が発現する細胞を用いて行った。次に、この自立複製不能型EHV-1へのサイトカイン遺伝子あるいはDNAアジュバント配列の導入を試みた。サイトカイン遺伝子としてはインターロイキン(IL)-2、IL-12とインターフェロン(IFN)-γ遺伝子を対象とした。現在、組み換えウイルスのスクリーニングを行っている。同様に、馬についても同種のサイトカイン遺伝子について組み換えウイルスの構築を進めている。今年度は、免疫増強配列をウマへルぺスウイルス1型(EHV-1)に導入するために必要なものを下記のように調整した。1.マウスサイトカイン遺伝子のクローニング:本研究ではマウスを用いて組換えウイルスの評価を行うので、マウス由来のサイトカイン遺伝子をEHV-1ゲノムに導入する。細胞性免疫を惹起するIL-2、IL-12、IFN-γ遺伝子をリポポリサッカライドで刺激したマウスの末梢血単核球から抽出したRNAを用いてRT-PCRで増幅し、発現用プラスミドベクターにクローニングした。各サイトカイン遺伝子の正確な蛋白発現を確認した後、これらのサイトカイン遺伝子をEHV-1ゲノムへの遺伝子導入用プラスミドに連結した。2.DNAアジュバントの調整:これまでに報告されているDNAアジュバントの塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、それをEHV-1ゲノムへの遺伝子導入用プラスミドに連結した。3.自立複製不能型EHV-1の作出:EHV-1のウイルスゲノムから感染性ウイルスの構築に必須のgD遺伝子、ウイルスの生体での増殖性ならびに拡散に関わっているgE、gI、と71番遺伝子を欠損させた組換えウイルスの構築を試みた。これらの遺伝子はEHV-1ゲノム上でクラスターを形成している。このウイルスの複製のために、これら4種類の遺伝子産物を相補的に発現する細胞株を樹立した。次いで、これら4遺伝子の代わりにβ-ガラクトシダーゼ(gal)遺伝子を挿入した遺伝子導入用プラスミドを調整し、相同組換え法にて自立複製不能型のEHV-1をβ-gal活性を指標に選択し、現在、その性状解析を行っている。

申請者の教室では弱毒生ワクチンの併用を考えて強毒株をウシ腎(BK)細胞で343回連続継代してウマに病原性を示さない弱毒BK343株を作出したが、その感染防御能は不充分であった。そこで、有効な生ワクチン開発を効率良く行うために遺伝子組換え法の応用を検討しているが、潜伏感染の問題もあり実用化には至っていない。EHV-1による流産を防止するには、液性免疫だけでなく細胞性免疫を十分に誘導することが必須である。そこで、本研究では免疫調節・増強に関わるサイトカインと細胞性免疫を付与する特殊な塩基配列をもつDNA(DNAアジュバント)に着目し、これらの遺伝子を自然環境下では感染性ウイルスを産生しない組換えEHV-1ウイルスに導入し、その免疫効果をマウスモデルを用いて検証することを目的とした。EHV-1のウイルスゲノムから感染性ウイルスの構築に必須のgD遺伝子、ウイルスの生体での増殖性ならびに拡散に関わっているgE、gIと71番遺伝子を欠損させたウイルスを構築した。このウイルスは自立複製不能で、感染性ウイルスの作製は欠損させた4種類の蛋白が発現する細胞を用いて行った。次に、この自立複製不能型EHV-1へのサイトカイン遺伝子あるいはDNAアジュバント配列の導入を試みた。サイトカイン遺伝子としてはインターロイキン(IL)-2、IL-12とインターフェロン(IFN)一γ遺伝子を対象とした。現在、組み換えウイルスのスクリーニングを行っている。同様に、馬についても同種のサイトカイン遺伝子について組み換えウイルスの構築を進めている。
先史モンゴロイド集団の拡散と適応戦略

平成元年度からの実施が予定されている重点領域研究「先史モンゴロイド集団の拡散と適応戦略」について下記の準備研究をおこなった。1.研究組織の検討全体会議(9月3日)を開催し、予定される計画研究(A01A05)および総括班の研究分担項目、研究組織を審議・決定した。計画研究代表者会議(10月8日)を開催し、計画研究および総括班の昭和64年度重点領域研究計画調書の内容を調整・決定した。2.先史モンゴロイド人骨データベースアメリカ・アジア・オセアニア化石人類カタログ(英国自然史博物館1975年出版)に登録されている約200遺跡の全属性をコンピュータ・データベース化し、その多次元検索システムを構築した。3.ニュース「モンゴロイド」本重点領域研究の研究成果等の周知を目的とする広報誌「モンゴロイド」を定期的に発刊する準備作業をおこない、今年度のその創刊準備号を計画し、刊行した。
サーモグラフィ搭載の船舶曳行式バルーン空撮でみた沿岸海洋の新世界

本研究では、観測船から高度100ー200m程度で曳行するバルーンに熱赤外カメラを装着し、海面の海洋微細構造を計量するシステム開発に取り組んだ。2013年の8月に伊予灘(瀬戸内海)で、2014年9月に玄界灘において、サーモグラフィ搭載のバルーンを調査船で曳行し、可視化された海表面水温から、沿岸海洋前線(フロント)構造や、前線に発達する舌状構造を確認した。さらに水平規模が10 m以下の微細渦(水温のパッチネス構造)の可視化に成功した。また、微細渦の前線周辺での生成や、それ以降の移動に至る一連の時間発展が追跡できた。本研究では、観測船から高度100ー200m程度で曳行するバルーンにデジタルカメラや熱赤外カメラを装着し、海面の海洋微細構造を計量するシステム開発に取り組んでいる。まず、既存のバルーン観測データを利用して、撮影した画像データを直交デカルト座標系に補正する幾何補正の技術や、あるいは色空間における色差を利用することで、特定のターゲットを自動抽出する画像処理を確立した.研究成果を、日本リモートセンシング学会誌における査読付英文論文として公表した。つづいて、2013年の8月に瀬戸内海において、サーモグラフィ搭載のバルーンを調査船で曳行し、水平規模が10 m以下の微細渦(水温のパッチネス構造)が密に分布する沿岸域の実態を可視化した。また、微細渦の前線周辺での生成や、それ以降の移動や消滅に至る一連の時間発展を追跡した。これらは、バルーン搭載の熱赤外リモートセンシング技術を沿岸海洋の観測に初めて導入することで、沿岸海洋において、微細渦が、水塊混合過程や熱輸送過、あるいは栄養塩供給過程として機能しているか否かを精査する試みである。そして、確かに可視化された海表面水温から、暖水と冷水が接する沿岸海洋前線(フロント)の形成が確認された。さらに、フロントには、混合域から成層域へと伸びる冷水の舌状構造が存在していることを確認した。なお、本観測で使用したカメラは、可視画像と熱赤外画像を同時に撮影することができ、可視画像から抜き出した集積物の位置と海表面水温との比較がを行うことも可能であった。そして、海面の漂流物が、確かに水温の急変するフロント部に添って分布していることを確認した。一連の成果を、日本海洋学会2014年春季大会にて口頭発表した。船舶曳航式のバルーンに搭載した熱赤外カメラを用いて、瀬戸内海伊予灘と福岡県北部の玄界灘において沿岸前線を空撮する低高度リモートセンシング実験を実施した。瀬戸内海での観測は、2013年8月20日に、瀬戸内海の伊予灘に形成された潮汐フロント周辺で実施した。最初に愛媛大調査船「いさな」から目視で筋状に集積したゴミや泡を確認し、漂流物の筋を直交するように測点を約100m間隔で11点設けた。そして各測点においてCTD観測を実施した。得られたデータから作成した水温・塩分鉛直断面図から、観測時におけるフロント形成を確認した。次に、漂流物周辺にGPSを装着したブイ(以降、GPSブイ)を24個投入した。そして、ヘリウムガスを充填したバルーン底部にサーモグラフィカメラ(Thermo shot F30;日本アビオニクス株式会社)を装着し、これを観測船から揚げて、GPSブイと漂流物が共に写るように遠隔操作でカメラアングルを調整しつつ、高度約200mから複数枚の海面赤外画像を撮影した。ここでGPSブイは、空撮写真を直交デカルト座標系上に再配置する幾何補正(射影変換;Magome et al., 2007)のために利用した。また、調査船による海表面水温の観測を空撮と同時に実施し、サーモグラフィカメラによって観測された水温データを検証した。玄界灘の観測は、九州大学応用力学研究所の「だんりゅう」を用いて、2014年9月9日に玄界灘に形成される潮汐フロント周辺で実施した。実施手順や内容は前年の瀬戸内海における実験と同様である。特に2014年の実験では、カメラに傾斜センサーを取り付け幾何補正を効率化した。大気中の水蒸気での赤外線減衰による誤差補正も行うことで、解像度が数m程度の高解像度で前線構造を明瞭に捉えることに成功した。成果を取りまとめ、日本海洋学会春季大会沿岸海洋シンポジウムで公表した。海洋物理学本研究計画において初年度に予定された現地観測が滞り無く行われた。やはり当初予定の通りに、熱赤外画像のバルーン空撮が、沿岸海洋前線の微細海洋構造を観察・計量する有効な手法であることが確認された。初年度に実施した熱赤外画像のバルーン空撮において、その撮影範囲の狭さが課題として残された。

現状の撮影技術では、解像度を犠牲にすることなしに観測できる範囲は20m四方で、これは沿岸海洋過程といえども、いかにも狭すぎるものであった。数百m四方程度の観測範囲が実現できるように、次年度は、バルーンに傾斜計を取り付け、このデータを利用することで画像の幾何補正を速やかに行う現地調査を計画している。これによって、調査船を移動させて撮影を繰り返すことで、広範な観測領域を確保できる見込みである。
射出成形による多孔質炭素材料軸受けの商品化

本研究で取り組んでいる多孔質炭素材料は,米糠や籾殻が持つ天然の多孔質構造と,そこに含まれるミネラル成分を,できるだけ手をかけずにそのまま利用し,工業原料として利用していくことを目指して開発しているものである.さらに,射出成形できる炭素材料として低製造コストという利点も活かした商品化を目指している.米糠あるいは籾殻は,900°Cで焼成された後,合成高分子と混合・焼成して多孔質炭素材料となる.この素材には,炭素が持つ良好な摩擦摺動性,導電性,水素透過性,軽量,環境無負荷などの性質が保持され,さらに,天然のミネラル成分の炭化物が硬度や強度を高める働きをしている.本研究では,耐水性・膨潤性などの環境劣化に関する耐久性を克服するのが先決であるとの判断から,実用上重要な水環境下での劣化を防ぐ課題に取り組んだ.得られた結果の要約を以下に示す.(1)化学的な分析の結果,耐水性を低下させているのは,米糠中に含まれるK,Ca,Pが結合したリン酸塩の持つ吸水性によることがわかった.すなわち,そのような化合物が生成しない工夫が必要となる.(2)具体的には,米糠焼成粉体に含まれるリン酸塩を成形前に洗い出す前処理が有効である.(3)P等の耐水性を低下させる化合物が生成しない籾殻の焼成材料を作製する手法を確立した.(4)籾殻焼成材料には,良好な耐水性・膨潤性が備わっていることを確認した.以上の結果から,籾殻焼成粉体を用いたペレットを射出成形することによって,製造コストが低く,さらに籾殻焼成材の特長である無潤滑・高耐水性・安定した摩擦特性を持つ軸受けの製品化が可能であることが明らかになった.これによって,今後は具体的な製品に対して,製造企業と共同で製品開発への取組みを加速できる環境が整った.本研究で取り組んでいる多孔質炭素材料は,米糠や籾殻が持つ天然の多孔質構造と,そこに含まれるミネラル成分を,できるだけ手をかけずにそのまま利用し,工業原料として利用していくことを目指して開発しているものである.さらに,射出成形できる炭素材料として低製造コストという利点も活かした商品化を目指している.米糠あるいは籾殻は,900°Cで焼成された後,合成高分子と混合・焼成して多孔質炭素材料となる.この素材には,炭素が持つ良好な摩擦摺動性,導電性,水素透過性,軽量,環境無負荷などの性質が保持され,さらに,天然のミネラル成分の炭化物が硬度や強度を高める働きをしている.本研究では,耐水性・膨潤性などの環境劣化に関する耐久性を克服するのが先決であるとの判断から,実用上重要な水環境下での劣化を防ぐ課題に取り組んだ.得られた結果の要約を以下に示す.(1)化学的な分析の結果,耐水性を低下させているのは,米糠中に含まれるK,Ca,Pが結合したリン酸塩の持つ吸水性によることがわかった.すなわち,そのような化合物が生成しない工夫が必要となる.(2)具体的には,米糠焼成粉体に含まれるリン酸塩を成形前に洗い出す前処理が有効である.(3)P等の耐水性を低下させる化合物が生成しない籾殻の焼成材料を作製する手法を確立した.(4)籾殻焼成材料には,良好な耐水性・膨潤性が備わっていることを確認した.以上の結果から,籾殻焼成粉体を用いたペレットを射出成形することによって,製造コストが低く,さらに籾殻焼成材の特長である無潤滑・高耐水性・安定した摩擦特性を持つ軸受けの製品化が可能であることが明らかになった.これによって,今後は具体的な製品に対して,製造企業と共同で製品開発への取組みを加速できる環境が整った.米糠から米糠油を抽出した後に残る脱脂糠は,現在,飼料や肥料として使用されている.本研究はこの脱脂糠の有効利用を目的として,脱脂糠の合成高分子を含浸して焼成することによって得られる「多孔質炭素材料」を工業材料として使用することを目指している.この米糠焼成材には炭素が持つ低摩擦・軽量などの特性が保持されており,良好な摩擦摺動特性を示す.したがって,これまでに直動軸受けとしての応用が進んでおり,一部では商品化までされている.本研究では,この多孔質炭素材料からなる軸受けを射出成形によって製作し,大量に安価に商品化するための基礎となる仕様書の作成を目指している.本年度は,実際に射出成形した直動軸受けにおける破壊限界モーメントの測定,およびFEM解析によって直動軸受け各部に生じる応力集中を評価するシステムの確立を行った.得られた結果の要約を以下に示す.(1)射出成形した直動軸受けの破壊限界モーメントを測定した.限界モーメントの値はM_f=2.2N^*m程度であった.この値は市販の直動軸受けの低荷重用LMガイドに匹敵する強度である.(2)強度のばらつきは平均でワイブル係数m=6程度であった.この値は1015程度以上が製品化の目安であり,この値はばらつきのやや大きな範疇に入る.(3)3次元FFM解析を実施し,直動軸受けの破壊強度を評価するシステムを確立した.多孔質炭素材料の破壊試験で得られた材料強度に基づいて,直動軸受けの強度を制度よく予測することが可能になった.(4)直動軸受けに生じる応力集中の程度への直

動軸受け各部における形状因子の影響について検討し,破壊強度を向上させる幾何学的考察の検討手法を確立した.(5)レールと直動軸受けの隙間の大きさと破壊強度の関係をFEM解析に基づく数値解析によって解明した.本研究で取り組んでいる多孔質炭素材料は,米糠が持つ天然の多孔質構造と,そこに含まれるミネラル成分を,できるだけ手をかけずにそのまま利用し,工業原料として利用していくことを目指して開発しているものである.さらに,射出成形できる炭素材料としての利点も活かした商品化を目指している.米糠は,900°Cで焼成された後,合成高分子と混合・焼成して多孔質炭素材料となる.この素材には,炭素が持つ良好な摩擦摺動性,導電性,水素透過性,軽量,環境無負荷などの性質が保持され,さらに,天然のミネラル成分の炭化物が硬度や強度を高める働きをしている.本年度は,耐久性の評価,その中でも特に動的な疲労強度を測定するシステムの確立と評価を計画していた.しかし,試作品を評価している段階で,動的な耐久性以前に,耐水性・膨潤性などの環境劣化に関する耐久性を克服するのが先決であることがわかり,実用上重要な水環境下での劣化を防ぐ課題に取り組んだ.得られた結果の要約を以下に示す.(1)化学的な分析の結果,耐水性を低下させているのは,米糠中に含まれるK, Ca, Pが結合したリン酸塩の持つ吸水性によることがわかった.すなわち,そのような化合物が生成しない工夫が必要となる.(2)具体的には,米糠焼成粉体に含まれるリン酸塩を成形前に洗い出す前処理を実施することにした.(3)その結果,従来の強度よりも高く,より耐水性も向上した多孔質炭素を得ることができた.(4)さらに,米糠に混ぜる合成高分子の種類を変えることによって,生成する炭化物を制御できることがわかり,それらを実施することによって,さらに耐水性を改善した材料を作成することができた.また,動的な耐久性試験については,試験装置の作成等の準備を終え,いつでも実施できる態勢を整えることができた.今年度が最終年度であり,天然素材から作製した多孔質炭素材料を用いた直動軸受の製品化を目指した.この素材を軸受等の摺動部材として工業製品に利用する際の最も大きな課題は,製作した多孔質炭素材料の寸法安定性であった.すなわち,湿気や水環境下で膨潤性を示す点が精密部品への応用を妨げていた.本研究ではこれまでに,その膨潤性を引き起こす成分を特定し,それを改質する処理法に成功している.本年度は,はじめに,改質材の良好な耐水性・膨潤性を確認した後に,摩擦摺動特性を測定して,製品化に向けた取組みに入る計画を立てた.(1)安定した多孔質炭素材料を作製できるシステムを確立した.はじめに,加圧成形によって作製した素材について,寸法安定性に関する試験を実施した.その結果,純水中に浸漬すると従来材では0.2%膨潤したのに対して,改質材では0.03%にまで低下させることができた.さらに,米糠ではなく,もみがらを用いて作製した多孔質炭素材料で同試験を実施したところ,0.015%の低膨潤性を得ることに成功した.両素材ともに十分な寸法安定性を示すことが確認できた.(2)直動軸受設計の取組み直動軸受の開発は三木プーリと共同で展開を図った.はじめに,膨潤性を改善した改質材料の摩擦試験を実施した.その結果,米糠焼成材では0.20.3程度の動摩擦係数を得た.これに対して,もみがら焼成材では動摩擦係数0.08という極めて良好な値を得た.そこで,三木プーリと検討の末,もみがら焼成材を用いた直動軸受を作製し,無潤滑・耐水・低摩擦・静寂性を売りにした丸型直動軸受を製品化することを決定した.本研究は,当初米糠を焼成した炭素材料の製造とその利用を目的に展開してきた.
肝臓でのインスリン応答性転写制御におけるHNF4の基幹的役割の解析

解糖系酵素・Glucokinase遺伝子の転写はインスリン存在下で活性化され、糖新生酵素・G6pase遺伝子の転写はインスリン非存在下で活性化される。これまでにHNF4がこれら2つの遺伝子の転写を活性化することが報告されていた。本研究においては、これら遺伝子のインスリン応答性転写制御におけるHNF4の役割を明らかにすることを目的に解析を行った。その結果、FOXO1とHNF4とのコンビネーションが、遺伝子依存的に相反する機能を発揮し、インスリン応答性転写制御に重要であることを明らかにした。肝臓で活性化されている遺伝子の40%以上(約1300遺伝子)に転写因子HNF4が結合していることが報告されていることなどから、HNF4の転写制御機構の解明は、肝臓の代謝制御解明に大きな意味を持つと注目されている。しかしながら、HNF4が複数の代謝に関連する遺伝子群をそれぞれのシグナルに応じていかに制御しているのかは全く不明である。本研究では糖代謝に着目し、HNF4を中心とした糖代謝遺伝子の転写制御機構を解明することを目的として実験を行った。昨年度はマウス個体のイメージング法である「in vivo LUC法」を中心に解析を行った。Glucose-6-phosphatase遺伝子・Glucokinase遺伝子のプロモーター上に存在するHNF4結合配列に変異を導入したレポーターを作製し、invivoLUC法にて野生型レポーターとの比較を行った。その結果、両遺伝子共に野生型レポーターにおいては絶食・摂食処置に対して発現に変化が見られたものの、HNF4結合配列変異導入型レポーターにおいては、発現の変化が消失もしくは減弱した。これらのことから、HNF4結合配列が両遺伝子における絶食・摂食に応答した発現制御に必要であることを明らかとなった。この結果は、HNF4が絶食・摂食に応答してその転写活性を制御している可能性を示唆していることから、大変意義深い。今後はその分子メカニズムの解明を行っていきたいと考えている。肝臓で活性化されている半数近い遺伝子にHNF4の結合が報告されていることなどから、HNF4の転写制御機構の解明は、肝臓の代謝制御解明に大きな意味を持つと考えられる。本研究では糖代謝に着目し、HNF4を中心とした糖代謝遺伝子の転写制御機構を解明することを目的としている。本年度は、HNF4-Foxo1の活性化・抑制化決定機構の解析を中心に解析を行った。Foxo1はG6Pase、GK遺伝子のHNF4転写活性をそれぞれPositive・Negativeに制御している事をこれまでの解析から明らかにしてきた。このFoxo1のHNF4に対するDual FunctionはPromoter依存的である。そこでPromoterのどの配列がFoxo1のHNF4への機能を決定しているのかを明らかにする事を目的に以下の実験を行った。【結果】: 1、G6Pase mutFoxo1 LUCではHNF4依存的な転写活性をFoxo1が抑制し、2、GK plus Foxo1 LUCでは相乗的に転写を活性化した。これらのことから、FOXO1がプロモーター配列上のHNF4結合配列、FOXO1結合配列の組み合わせによって遺伝子依存的な効果を発揮していることが明らかとなった。そして、この結果を基に、論文を発表した。
骨芽細胞による石灰化を制御する新規血清タンパク質の同定

私たちは前年度までの研究成果により、骨髄間葉系幹細胞による骨芽細胞分化誘導に伴って誘導される石灰化には、少なくとも一部は死細胞が石灰化のコアとして関与していること、血清タンパク質が関与していることを明らかにしてきた。そして、質量分析により死細胞に結合する分子の同定とクローニングを行い、発現ベクターの構築を行った。今年度は、このベクターを用いて、候補分子の石灰化能について評価を試みた。石灰化誘導候補分子Serpin H1、Serpin A5を、リポフェクションにて強制発現した間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導し、14日目に石灰化を解析した結果、Empty vectorをトランスフェクトした間葉系幹細胞に比べ、Serpin A5をトランスフェクトした間葉系幹細胞では、石灰化が促進された。以上の成果により、死細胞結合タンパク質Serpin A5には石灰化促進能があることが示唆された。間葉系幹細胞の骨芽細胞分化に伴い石灰化が誘導される。この分化誘導には高密度培養が要求され、細胞死が誘導されることが明らかである。私たちは、この死細胞の石灰化機構を明らかにする中で、血清タンパク質の中に石灰化因子含まれることを見出した。血清中に含まれる新規石灰化因子探索のため、ヒト間葉系幹細胞を凍結融解して死細胞を作製後、血清存在下非存在下で反応を行った。これらをSDS-PAGEにより分離した結果、血清存在下で死細胞に結合したタンパク質と推測されるバンドが複数検出された。このバンドを切りだし、in gel digestion後、質量分析により同定し、石灰化関連因子の候補分子とした。また、SDS-PAGEは巨大分子や10kDa以下の分子の分離には適さない。これらの分子の中からも候補分子を得るには、SDS-PAGEによる分離ではなく、トリプシン消化後分離すれば解決することを見出した。そこで、石灰化反応後の死細胞を回収し、そのままアクリルアミドゲルに封入した。その後分離をせずにin gel digestionし、LC-MSシステムにより分離・同定をおこなった。以上より複数の石灰化候補分子を同定した。さらに、候補分子が石灰化に関わるかどうかをin vivoで調べるため、CRISPR/Cas systemの実験系を構築した。マウス受精卵を体外受精により取得し、Cas9およびgRNA存在下エレクトロポレーションすることにより、ノックアウトマウスが作製できることが確認された。死細胞に関連した石灰化候補分子の同定を質量分析で行うところまで遂行できた。また、同定分子の機能の同定に有用なゲノム編集法の構築を推進することができ、概ね順調であるとと判断した。In vitroにおける骨芽細胞分化培養の際に死細胞が出現し、その細胞が石灰化のコアとなっていることが明らかとなっている。そしてこの石灰化には血清タンパク質の関与が示唆されている。本研究課題では、骨芽細胞による石灰化を制御する血清タンパク質を同定することを目的としている。前年度までの研究では、質量分析により死細胞に結合する分子の同定を行い、石灰化制御候補分子とした。今年度の研究では、複数の候補分子の遺伝子クローニングを行った。骨芽細胞の前駆細胞である骨髄間葉系幹細胞株に候補分子の遺伝子を発現させるため、それぞれの遺伝子をMammalian FLAG Expression vector pFLAG-CMV5.1にクローニングした。また、骨髄間葉系幹細胞株へのトランスフェクションは導入効率が低いため、エレクトロポレーションによる導入の検討を行なった。加えて、in vivoでの石灰化にこれら分子が関与することを可視化するため、GFPノックインマウスを作製する実験系の構築を試みた。死細胞に関連した石灰化候補分子の発現ベクターを複数構築するところまで遂行できた。また、同定分子の局在解明に有用なノックイン技術を推進することができ、おおむね順調であると判断した。候補分子をさらに充実させるため、2次元電気泳動とTOF-MS質量分析による分離同定を行う。同定された候補タンパク質が本当に石灰化に関与するかどうかを機能解析するために、候補分子の発現ベクターを構築する。発現ベクターを細胞に導入してタンパク質を精製する。精製したタンパク質を、骨芽細胞による石灰化実験系に添加することで、候補タンパク質の機能を解析する。構築した発現ベクターを用いて、骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞分化の際の石灰化に、候補分子がどのような影響を与えるか明らかにする。そのために、まず強制発現の確認をFLAG抗体を用いたウエスタンブロットにより、発現していることを確認する。

その後、石灰化への影響を明らかにするため、候補分子強制発現細胞を骨芽細胞に分化誘導し、その際に生じる石灰化量を定量化する。また、石灰化領域と候補分子の共局在をImmunocytochemistryと共焦点顕微鏡により解析する。得られた研究成果は論文として専門誌に投稿し、学会発表にて公表する予定である。予定していた2次元電気泳動の実験系よりも先にゲノム編集の実験系の確立を優先させたためである。当初予定していた候補分子のリコンビナントタンパク質の合成の前に、過剰発現による石灰化の解析を行なっているため、次年度への持ち越しが生じた。過剰発現による石灰化の解析結果から、有力な候補分子を同定後、リコンビナントタンパク質の合成を行うことを計画しており、この経費として使用する予定である。次年度の計画に入れており、次年度に使用する予定である。
ヒト肝細胞癌の動物実験モデルの作成

当初はウッドチャックの飼育条件(ケ-ジの材質,構造,飼料等)及び繁殖条件を探ることが重要課題であったがこの2つに関しては基本的に解決することができた。即ち個体飼育用のケ-ジとしてはステンレス製の側面開放できる様式の強固なケ-ジを作成し,現在もこれを使用している。飼料はモルモット用固型飼料と基本的にほぼ同じ成分であるが繊維成分を少くしたものを開発した。繁殖条件に関しては狭い固体用ケ-ジ内では不可であるが1匹あたり2m^2以上の面積を有する室内ケ-ジでは可能で更に屋外施設で土の中での営巣が可能ならかなり効率的に(原産地北米と出産数はほぼ変らない)繁殖することが明らかとなった。ノンキャリヤ-よりウィルスキャリヤ-を作成するには生後期間をおかずにウィルスを接種すればよいことも判明した。生後6週間のキャリヤ-率はかなり高いので接種時期としては生後24週間が一番適していると考えられる。何故ならば生後4週間でウッドチャックは毛もはえそろい目が開き動きも活発となり死亡することも殆んどなくなるからである。ウィルス陽性の判定は従来RIAによるウィルス表面抗原測定で行ってきたがそれをコ-ドしているDNAをプライマ-としてPCR法を導入した。しかし両者の一致率は未だ完全とは言えないので別なプライマ-を作成して検討する予定である。キャリヤ-から発生する肝細胞癌に関してはエコ-によりこれを追跡したが大きさが10cm^3以上をこすと急速に発育することを見出した。肝癌の発育,進転様式に関しては多中心性発生と,転移の両方が存在することをウィルスDNAの組み込み様式あるいは癌遺伝子のrearrangementから明らかにし得た。動物繁殖のための場所として屋外で土の中に巣をつくれる環境が最善であるが、施設内でも3.2m^2の広さを有するコンクリ-ト製の小屋、また2m^2の面積のケ-ジ内でも繁殖可能であった。日照時間、温度に関しては通常の日本の気候条件であれば充分で特殊な条件は不要と考えられる。飼料に関してもモルモットの飼料の粗線維の成分を若干低くした飼料で特に問題はなかった。人工的ウイルスキャリヤ-作成に関して合計36匹に試みた。芝山羊センタ-22匹、予防衛生研究所で8匹、長野県施育場で6匹で接種後1匹死亡したが残り35匹を半年後に血液を採種して検査した。結果は全例陰性であった。即ちキャリヤ-はできず全例一過性の感染に終ってしまった。生後最も早期に接種した個体も3ケ月は経過していたので時期が遅すぎたと反省し来年度は生後2週間以内に行う予定である。そのために施設内繁殖を重点的に行う。垂直感染による自然発生キャリヤ-から生じた肝臓癌に対して分子生物学的検討を加えた。肝臓に発生した複数の肝癌より標本をとり、ウイルスDNAの肝癌DNAへの組み込みパタ-ンとC-mycのrearrangementを検討した。組み込みパタ-ンは各々の腫瘍で異っている場合が多いが、同一のものも存在した。即ちウッドチャックの肝癌の多くは多中心性に発生しているが、転移性のものも混在していることが判明した。C-mycのrearrangementは認められなかった。しかしその発現が増幅しているものがみられた。ウッドチャックの屋内及び屋外飼育,管理方法は基本的に確立した。繁殖に関しては屋外であるならば可能であるが室内においてはケ-ジを使用するかぎり不可能と結論してよいと考えられる。ギャリヤ-を作成する場合屋外方式で特に大きな支障はないので今後この方針で行くべきと考えられた。

ウィルスキャリヤ-作成に関してはウィルスキャリヤ-の親からキャリヤ-の子をとる垂直感染方式は親の死亡率が高く,従って安定性が低いので中止し,ノンキャリヤ-の子にウィルス接種をしてウィルスキャリヤ-を作成する方式を取ることにした。本年度は長野県で生まれた11匹に生後6週で6匹,生後8週で5匹にウィルスを接種した。群馬県で生まれた3匹には生後60日で接種した。ウィルスマ-カ-判定には今年度Polymerase chain reaction(PCR)法によるウィルスDNA測定を導入した。増幅領域としては表面抗原をコ-ドする遺伝子を選び、これをはさむ一対のプライマ-を合成した。各プライマ-は20塩基からなり,GC量は3045%,プライマ-間距離は666塩基である。上記接種実験をこのPCR法により判定した。長野県の結果は生後6週で6匹中6匹,8週では5匹中1匹陽性であった。群馬県は3匹全て陰性であった。表面抗原をRIAで測定すると2匹を除き全てカットオフ比1.0以下で陰性と判定された。2匹のカットオフ比は3.2と2.0であった。しかしこの2匹のPCRの結果は陰性であり,なぜこのような測定方法による差が生じたか今後検討されるべき課題である。平成2年度にウッドチャック肝炎ウィルスを接種したノンキャリヤ-幼獣でPCR法,もしくはRIAによる表面抗原測定で陽性と判断されたものは合計9匹に達した。本来ウッドチャックのキャリヤ-は100%肝細胞癌を発生するのでこの9匹をエコ-グラムで追跡中である。しかし今のところ肝癌を発生した個体はない。キャリヤ-は通常3年令で肝癌を発生するので未だその年令に達していないので結論を下すことはできない。継続して経過を追う予定である。今年度長野飼育場で得られた幼獣は3匹のみで極端に出生率が低下した。親の老令化のためと考えられる。この3匹に関しては2ヶ月後ウィルス接種を行ったがRIA法,PCR法でもキャリ-化しなかった。方法論に関してPCRで陽性と判定したもののうちRIA法で陰性となったものがあるがこれはPCRの原理より理解し得るがRIA法で陽性となった個体でPCR法で陰性となったものが存在した。測定をくり返しても同じ結果なので測定誤差ではない。プライマ-作成に際して増幅領域として表面抗原をコ-ドする遺伝子をはさむ部分を選択したが,このプライマ-とはやや異るプライマ-を作成する必要があると判断し検討中である。なお野生キャリヤ-から発生した肝細胞癌につき癌遺伝子を検討中であるが,C-mycのrearrangementについては今のところ認められていない。しかしn-mycに関しては4匹,15結節の腫瘍にrearrangementが見出された。このrearrangementの有無はウィルスDNAの組み込みpatternと一致していることが多く癌結節の間のclonarityの同一性を示す指標となると考えられる。
食道癌特異的キラーT細胞の作製と癌退縮抗原遺伝子のクローニング

1.食道癌における特異免疫の存在食道癌に対する特異免疫の存在の有無を明らかにする目的で食道癌浸潤リンパ球内にHLA-クラスI拘束性キラーT細胞が存在するか否かを検討した。その結果、食道癌の癌局所にHLA-クラスI拘束性キラーT細胞は存在した(Toh et al.,Cell.Immunol.1997)。以上より食道癌においてもメラノーマと同様に癌局所に特異免疫(キラーT細胞)とが存在することが示唆される。これらの事実は腫瘍特異免疫療法の科学的根拠を与えるものと考えられる。2.扁平上皮癌及び腺癌拒絶抗原遺伝子の同定上記にて樹立したキラーT細胞株により認識される抗原をコードする遺伝子をT.Boonらの方法(gene-expression cloning法)を用いて解析した。これまでのところ食道癌cDNAライブラリーより4種類の新規と考えられる遺伝子(SART-1,SART-2SART-4)をクローニングし、現在その全DNA配列、蛋白構造、ペプチド等々について解析中である。以下最も解析の進んでいるSART-1についてその概略を記す。3.HLA-A2601拘束性扁平上皮癌拒絶抗原遺伝子SART-1の解析:これまでにKE-4CTL株によって認識される抗原が2506bpからなる新規の遺伝子(GenBank Accession number AB006198)であり、その遺伝子(SART-1と仮称)は2つの蛋白(125kd及び43kd)をコードするbicistronic geneであることを見い出した(Shichijo et al.,J.Exp.Mcd.,1998)。125kdのSART-1蛋白はLeucine-zipper構造及びDNA結合能を有する核内蛋白であった。-方、43kdのSART-1蛋白は頭頸部癌や食道癌の殆どすべて(80-100%)及び非小細胞性肺癌の50%、子宮癌の30%に発現する細胞質内蛋白であり、正常組織や正常細胞また、白血病細胞、メラノーマ、乳癌などには全く発現していない。これらより43kdSART-1蛋白質にコードされるペプチド部分が扁平上皮癌や-部の腺癌に対するキラーT細胞において認識されているものと推定される。MHC拘束性食道癌特異的キラーT細胞株(CTL)の樹立を通して食道癌に対する宿主応答を明らかにするとともに、樹立したCTL株の認識する癌退縮抗原の遺伝子をクローニングし、新しい癌ワクチンの標的分子としての可能性を追求する目的で以下の研究を行った。1.術前化学療法や術前放射線治療のおこなわない食道癌患者の転移性リンパ節内浸潤T細胞をIL-2にて長期培養することによりHLA-class I拘束性癌特異的キラーT細胞株を樹立した。一方、術前に化学療法もしくは放射線治療を実施した症例では転移性リンパ節内に浸潤するT細胞はIL-2反応性に乏しく長期培養が不可能でありかつHLA-class I拘束性キラーT細胞活性は認められなかった。

これらより食道癌における転移性リンパ節内には癌特異的キラーT細胞が存在すること、かつそれらは術前の化学療法もしくは放射線治療により抑制されることが明らかになった(Toh et al.,Cell.Immunol.,in press 1997)。2。食道癌組織より樹立した細胞障害性T細胞(KE4-CTL)が認識する抗原ペプチドを同定する目的で、癌細胞株(KE4)よりcDNAライブラリーを作製し、HLA-A2601遺伝子と共にヒト線維芽細胞株(VA13)にtransfectした。その結果KE4-CTLに認識される抗原をコードする777bpのORFを含む1034bpの遺伝子を、扁平上皮癌細胞株のcDNAライブラリーよりクローニングした。さらに少なくとも3種類のペプタイドが抗原となり得る事を見出した。このことから、宿主の免疫細胞によって特異的に認識される癌退縮抗原がヒト扁平上皮癌の細胞に存在するが示唆された。1.食道癌における特異免疫の存在食道癌に対する特異免疫の存在の有無を明らかにする目的で食道癌浸潤リンパ球内にHLA-クラスI拘束性キラーT細胞が存在するか否かを検討した。その結果、食道癌の癌局所にHLA-クラスI拘束性キラーT細胞は存在した(Toh et al.,Cell.Immunol.1997)。以上より食道癌においてもメラノーマと同様に癌局所に特異免疫(キラーT細胞)とが存在することが示唆される。これらの事実は腫瘍特異免疫療法の科学的根拠を与えるものと考えられる。2.偏平上皮癌及び腺癌拒絶抗原遺伝子の同定上記にて樹立したキラーT細胞株により認識される抗原をコードする遺伝子をT.Boonらの方法(gene-expression cloning法)を用いて解析した。これまでのところ食道癌cDNAライブラリーより4種類の新規と考えられる遺伝子(SART-1,SART-2SART-4)をクローニングし、現在その全DNA配列、蛋白構造、ペプチド等々について解析中である。以下最も解析の進んでいるSART-1についてその概略を記す。3.HLA-A2601拘束性偏平上皮癌拒絶抗原遺伝子SART-1の解析:これまでにKE-4CTL株によって認識される抗原が2506bpからなる新規の遺伝子(GenBank Accession number AB006198)であり、その遺伝子(SART-1と仮称)は2つの蛋白(125kd及び43kd)をコードするbicistronic geneであることを見い出した(Shichijo et al.,J.Exp.Med.,1998)。125kdのSART-1蛋白はLeucine-zipper構造及びDNA結合能を有する核内蛋白であった。一方、43kdのSART-1蛋白は頭頸部癌や食道癌の殆どすべて(80-100%)及び非小細胞性肺癌の50%、子宮癌の30%に発現する細胞質内蛋白であり、正常組織や正常細胞また、白血病細胞、メラノーマ、乳癌などには全く発現していない。これらより43kdSART-1蛋白質にコードされるペプチド部分が偏平上皮癌や一部の腺癌に対するキラーT細胞において認識されているものと推定される。
脂肪幹細胞を用いた血管付人工脂肪弁の開発

Tissue engineering chamber(以下、TEC)内に導入した、人工真皮、動静脈血管束と遊離脂肪、または血管柄付き脂肪弁に対して、脂肪由来幹細胞(以下ASCs)を播種することで得られる効果を検討した。遊離脂肪と動静脈血管束を用いた実験1ではControl群、ASCs群の2群、血管柄付き脂肪を用いた実験2ではControl群、ASCs群で実験を行った。再生組織量を比較し、ASCsは1, 1'-Dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate(以下DiI)を用いて追跡を行った。結果:実験1での血管付軟組織の再生組織量はControl群2. 12±0. 48cm^3、ASCs群2. 20±0. 094cm^3。実験2ではControl群1. 30±0. 19cm^3、ASCs群1. 36±0. 22cm^3で、どちらの実験でも有意差が認められなかった(p> 0. 05)。また、DiIを用いたASCsの追跡ではTEC内の再生軟組織内にDiI標識細胞は認められなかった。このことよりTEC内ではASCsは早期に壊死していることが示唆された。われわれが開発してきたティシューエンジニアリングチャンバーを用いて、人工脂肪弁を開発することを目的としている。過去の実験と比較検討するために、まず純粋に脂肪由来幹細胞(ASCs)がチャンバー内の組織構築に対する影響を判断するために予備実験を行った。実験1.浅大腿動静脈、コラーゲンスポンジをチャンバー内に導入し、control、ASCs(+)、FGF-2(+)の3群で4週後に構築された組織量の比較を行ったところ、ASCs群<control群<FGF-2との結果となった。ASCs群では明らかに、組織構築が乏しく、ASCsがコラーゲンスポンジ内への血管新生を阻害していた。これはコラーゲンスポンジに播種したASCsが、スポンジ内の血管新生スペースを占拠し、チャンバー内の環境では有効な細胞材料として機能しないと考えられた。ASCsには遊離脂肪移植時の生着促進効果が知られている。実験1の結果を踏まえ、チャンバー内でのASCsに細胞材料としてではなく増殖因子として、遊離脂肪への血管新生や生着の作用を実験2で検討を行った。実験2.浅大腿動静脈、コラーゲンスポンジ、2gの遊離脂肪をチャンバー内に導入し、control、ASCs(+)で4週後に脂肪組織の比較を行っている。まだnが少ないが、脂肪組織への血管新生、遊離脂肪の生着にASCs群での脂肪生着に良い効果が見られる。今後FGF-2(+)群を加えn=7まで実験を行いその作用を検討し、よりよい人工脂肪弁の作成方法を構築する予定である。これまでの研究から、tissue engineering chamberは細胞の増殖・分化を促進し、3次元の組織を再構築する有効な再生の場であることが明らかとなった。また、脂肪由来幹細胞(ASCs)の局所注入により、局所皮弁における皮弁生着域を拡大することが知られている。両者を併用し、より効率的な人工皮弁の作製のための研究を行った。Japan White系の雄ウサギのソケイ部に移植したtissue engineering chamber内に、遊離脂肪+浅大腿動静脈および血管柄付き脂肪弁とともに10^8個の脂肪由来幹細胞を播種した。4週間後に採取して組織の検討を行った。ASCsによる皮弁体積の増大、脂肪壊死の減少、脂肪由来幹細胞の脂肪への分化などの効果が期待された。しかし、遊離脂肪+大腿動静脈、血管柄付き脂肪弁で得られた皮弁は容積、脂肪壊死の程度、病理組織像においてControl群、ASCs付加群で有意差がなく、期待された効果が得られなかった。このことより現状のtissue engineering chamber内の細胞環境では、有効なASCsの生着および生理活性を得ることが困難であることが分かった。分化誘導されたASCsは筋肉内などの血流の豊富な組織内でのみ生着、組織構築が報告されている。
口腔癌の浸潤・転移機構の解明とその悪性度診断ならびに遺伝子治療への応用

口腔癌の浸潤・転移機構に重要な働きを果たす分子の探索と、それらの悪性度診断や遺伝子治療への応用を目的として検討した結果、癌細胞の浸潤能を促進する分子として、これまでに我々が報告してきたPeriostin, IFITM1に加えてWnt5B及びMMP-10を、抑制する分子としてmicroRNA-203を、リンパ管新生を促進する分子としてPeriostionを、血管新生を促進する分子としてMMP-13を新たに同定した。特にPeriostinに関しては、口腔癌患者より採取した血清を用いた解析により、Periostinの発現量の増加とリンパ節転移の有無が相関することを見出し、悪性度診断への応用の可能性示した。我々は親株とその細胞から分離した高浸潤能を有する細胞との遺伝子発現プロファイルを比較検討することによって、最も差のみられたPeriostin、IFITM1が口腔癌の浸潤に深く関わることを証明したことから、本解析で差のみられた他の因子も口腔癌の浸潤に深く関わる可能性が十分に考えられた。差のみられた遺伝子には、PeriostinやIFITM1以外に、Wnt5Bがあり、口腔癌細胞を用いて、Wnt5Bが口腔癌の浸潤に深く関わることや高頻度に口腔癌症例で過剰発現していることを明らかにした。次に、Periostin、IFITM1、Wnt5Bの過剰発現した口腔癌細胞とコントロール細胞の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイにより検討し、共通して発現の高い因子を調べ、細胞外マトリックスメタロプロテアーゼであるMMP10およびMMP13が、Periostin、IFITM1、Wnt5Bの過剰発現によって誘導される因子であることを見出した。実際に、MMP10およびMMPI3は、口腔癌症例で高頻度に過剰発現しており、その発現は、悪性度とよく相関していた。実験的には、MMP10のみが、口腔癌細胞の浸潤を促進した。MMP13は、血管新生を促進することを血管内皮細胞を用いた解析により明らかにした。Periostinは、in vitroで血管新生を促進することをすでに明らかにしているが、リンパ管新生も促進することをリンパ管内皮細胞を用いて明らかにした。現在、MMP10による口腔癌の浸潤機構、MMP13による血管新生、Periostinによる血管およびリンパ管新生の分子メカニズムの詳細について検討中である。また、最近、microRNAが様々な生命現象に関わることが明らかになりつつあり、癌化や癌の進展にもmicroRNAの異常が関わることが報告されたことから、口腔癌の浸潤に関わるmicmRNAの異常を調べるため、親株とその細胞から分離した高浸潤能を有する細胞におけるmicroRNAの発現をアレイを用いて、網羅的に検討中である。我々が樹立した口腔癌細胞とその細胞から分離した高浸潤能を有する細胞との遺伝子発現プロファイルを比較検討することによって、最も大きな差のみられた3つの分子すなわちPeriostin、IFITM1、Wnt5Bに注目し、これらを過剰発現させた口腔癌細胞とコントロール細胞の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイにより検討することによって、共通して発現の変化する分子を同定することとした.その結果、3つの分子を高発現させた時に共通して発現が高くなる因子として、細胞外マトリックスメタロプロテアーゼであるMMP10およびMMP13を同定した。MMP10は、口腔癌の浸潤に関わることが明らかとなり、MAPキナーゼであるp38の活性を抑制が関与していた。また、MMP13は、血管新生を促進することを血管内皮細胞を用いた解析により明らかにし、fibroblastからの血管増殖因子であるVEGF-Aの分泌促進や血管内皮細胞のERKやSrcの活性を介して血管新生を促進することが明らかとなった。Periostinは、in vitroで血管新生を促進することをすでに明らかにしているが、リンパ管新生も促進することをリンパ管内皮細胞を用いて明らかにし、その促進にAktの活性が関与することを明らかにした。さらに、様々な生命現象に関わることが明らかになりつつあるmicroRNAについて、口腔癌の浸潤に関わるmicroRNAを同定するため、親株とその細胞から分離した高浸潤能を有する細胞におけるmicroRNAの発現をアレイを用いて、網羅的に検討し、すでに上皮間葉移行(EMT)に関わることが報告されているmiR-200familyやその機能が未だ明らかにされていないmiR-203の発現低下が口腔癌の浸潤に関わることが明らかとなった。本年度は、我々が以前に口腔癌の浸潤に関わる因子として同定したPeriostinのリンパ管新生の促進という新たな機能を明らかにした。Periostinは、SrcやAktの活性化を介して、直接リンパ管内皮細胞の管腔形成や遊走能を促進するとともに、リンパ管新生に重要なVEGF-Cの分泌も促進することを明らかにした。