hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時空間制御型複数遺伝子破壊システムの確立と生殖生物学への応用

現行のCRISPR/Cas9systemはgRNA発現にRNA polymerase III系プロモーターが広く利用されており、全身でgRNAの発現が誘導され、Cas9発現のみが部位特異的に制御可能な状況である。実際に、現行のCRISPR/Cas9systemを利用して部位特異的な変異導入が試みられているが、予期しない部位での変異導入が認められている。そこでこれまでに時空間制御が可能なRNA polymerase II系プロモーターで機能するgRNA発現系ベクターの確立を行い、培養細胞レベルでは機能することを証明してきた。次にこの開発したシステムを利用して部位特異的なゲノム改変マウスの作出を試みたが、ゲノム編集された個体は得られなかった。これは現行のsystemと比較して変異導入効率が低く、マウスに応用する際にボトルネックとなることが予想できた。そこで本年度はRNA polymerase II系プロモーターを利用して、より効率よくゲノム編集が可能な系の確立に取り組んだ。具体的には、以前開発した自己スプライシング能を有するリボザイムを利用した系から、tRNAのプロセッシングを利用してgRNAが切り出す系へと切り替えた。これらのゲノム編集効率を培養細胞レベルで評価し、tRNAのプロセッシングを利用した系で若干の改善が認められた。次に、tRNAプロセッシングの系を利用して部位特異的(卵巣)なゲノム改変マウスを作出するため、CYP19およびGDF9プロモーターでgRNAが発現するベクターを構築し、部位特異的なゲノム改変マウスの作出を試みたが、目的のマウス個体は得られなかった。現在は部位特異的ではないが一般的によく利用されているプロモーターを利用して、RNA polymerase II系のプロモーターを利用した系でゲノム改変マウスが作成可能かどうかを検討している。29年度が最終年度であるため、記入しない。個体レベルで遺伝子機能を調べる場合、ゲノム改変動物を作出し、機能評価する手段が有効であるが、現在用いられているES細胞を利用したゲノム改変動物の作製系は時間やコストの点で利用するのは困難である。近年、CRISPR/Cas9systemを利用したゲノム改変がその簡便性および効率性の高さから普及している。しかし、現行のCRISPR/Cas9systemはgRNA発現にユビキタスな発現を誘導するRNA pol IIIプロモーターが広く利用されており、全身でgRNAの発現が誘導されることから、厳密な部位・時期特異的コントロールが難しい。そこで最初に時空間制御が可能なRNA pol IIプロモーターで機能するgRNA発現系の確立を行った。RNA pol IIプロモーターを利用するとgRNAが機能しない理由として、キャップ構造やpoly Aの付加が考えられるため、自己切断能を有するリボザイムをgRNAの両端に配置し、転写後にgRNAが切り出されるかどうかをノザンブロットにより確認した。その結果、切断されたgRNA発現が認められ、本gRNA発現系を用いることで変異導入が可能であることを確認した。次に、単一のRNA pol IIプロモーター制御下でgRNA・Cas9両方が発現する系(mono-promoter型CRISPR/Cas9 system)を確立し、変異導入できることも確認した。また、mono-promoter型CRISPR/Cas9systemを応用することで、一度に複数の遺伝子を改変可能であることを確認した。最後にmono-promoter型CRISPR/Cas9systemの特異性を評価するためにTet-on systemを活用し、ドキシサイクリン存在下でのみgRNA・Cas9発現が誘導される系とCas9発現のみがドキシサイクリン制御下にある現行の系を比較した所、現行の系ではドキシサイクリン非存在下でも変異導入されたのに対し、gRNA・Cas9共にドキシサイクリン制御下にある系ではドキシサイクリン依存的に変異導入されることが示された。本年度は計画通りに時空間制御に適したCRISPR/Cas9systemの確立が達成できた。すなわち、現行ではユビキタスな発現が誘導されるRNA pol III promoterを利用したgRNA発現を時空間制御に適したRNA pol II promoterで制御可能にした。また、単一のRNA pol II promoterでgRMAおよびCas9を発現し、機能するmono-promoter型CRISPR/Cas9systemの確立も行い、これらの成果を論文として公表した。このことから、おおむね順調に進展していると評価することが出来る。CRISPR/Cas9システムは近年爆発的に普及し始めているゲノム編集技術であり、医学および農学分野への応用が期待されている。しかし医学あるいは農学分野への応用に際して、いかに部位特異的にゲノム編集を実施できるかが課題の一つである。現在までの研究で、我々はgRNAの発現誘導を部位特異的な発現に適した単一のRNA polymerase II系プロモーターを用いてヒト培養細胞系において機能するCRISPR/Cas9システムの開発を行ってきた。この手法では時期あるいは部位特異的な発現誘導をするプロモーターが確立されている組織・細胞種でのゲノム編集には有用であるが、特異的なプロモーターがない組織・細胞種でのゲノム編集は実行できないなどの問題点もある。そこで、CRISPR/Cas9システムの生体における時期・部位特異的な遺伝子改変の汎用性を高めるため、生体組織へ直接注入し部位特異的なゲノム編集への応用が進められているアデノ随伴ウイルスの生産法の習得を試みた。ウイルスベクターの生産は既報の論文を参考に行い、安定的に高力価のウイルスベクターを生産することが可能となった。次に神経細胞を標的とし、ウイルスベクターの部位を限局した注入法の習得を試みた。

部位を限局したウイルスベクターの導入を評価するために蛍光タンパク質発現ウイルスベクターを生産し、大脳の特定に部位へ注入し、それぞれの部位限局的に蛍光タンパク質が発現することを確認した。脊髄においても同様に、特定の脊髄レベルに限局したウイルスベクターの導入が達成できた。脳あるいは脊髄へのウイルスベクター注入による運動障害は認められず、組織へのダメージは最小限であることが確認された。現在はウイルスベクターを利用したCRISPR/Cas9システムの系の確立に取り組んでいる。時空間制御型のゲノム編集技術の開発に着手しているが、いまだに生体での評価が行えていない。現行のCRISPR/Cas9systemはgRNA発現にRNA polymerase III系プロモーターが広く利用されており、全身でgRNAの発現が誘導され、Cas9発現のみが部位特異的に制御可能な状況である。実際に、現行のCRISPR/Cas9systemを利用して部位特異的な変異導入が試みられているが、予期しない部位での変異導入が認められている。そこでこれまでに時空間制御が可能なRNA polymerase II系プロモーターで機能するgRNA発現系ベクターの確立を行い、培養細胞レベルでは機能することを証明してきた。次にこの開発したシステムを利用して部位特異的なゲノム改変マウスの作出を試みたが、ゲノム編集された個体は得られなかった。これは現行のsystemと比較して変異導入効率が低く、マウスに応用する際にボトルネックとなることが予想できた。そこで本年度はRNA polymerase II系プロモーターを利用して、より効率よくゲノム編集が可能な系の確立に取り組んだ。具体的には、以前開発した自己スプライシング能を有するリボザイムを利用した系から、tRNAのプロセッシングを利用してgRNAが切り出す系へと切り替えた。これらのゲノム編集効率を培養細胞レベルで評価し、tRNAのプロセッシングを利用した系で若干の改善が認められた。次に、tRNAプロセッシングの系を利用して部位特異的(卵巣)なゲノム改変マウスを作出するため、CYP19およびGDF9プロモーターでgRNAが発現するベクターを構築し、部位特異的なゲノム改変マウスの作出を試みたが、目的のマウス個体は得られなかった。現在は部位特異的ではないが一般的によく利用されているプロモーターを利用して、RNA polymerase II系のプロモーターを利用した系でゲノム改変マウスが作成可能かどうかを検討している。これまでの研究から、時空間制御に適したCRISPR/Cas9
コンピュータ支援による顎顔面手術の統合的三次元シミュレーション

医療の世界においてCTなどの画像を元にして、三次元的画像処理をおこない、より立体的な詳しい情報を得る手法が導入されてから久しい。しかし未だ、頭頸部領域では、他領域と比較して解剖学的な複雑さや変異の大きさによって頭頸部・顔面骨手術に際して、緻密な術前計画が妨げられてきた。最近になり、主に骨情報による三次元実体モデルを用いることにより、virtual realityとも呼べる手術シミュレーションが可能となった。しかしながら、三次元実体モデルは、作製コストが非常に高価であり、また作製にも相当な時間を要し、また作製材料によっては実際の骨よりも硬く、取り扱いが困難であるといった問題点が多々あった。そこで、本研究においては、比較的安価な市販のパソコン上で最近開発された画像処理ソフトを用いて、術前の顎顔面骨のCTデータを三次元的に再構築し、術中あるいは術後の手術予測をすることで、術前シミュレーションとして有用であるか検討を行った。対象とした顎変形症症例あるいは下顎骨骨髄炎症例における術前術後の検討から、正確な手術予測とそれに見合った結果が得られ、術前シミュレーションとしての意義は十分にあると考えられた。今後さらに有用なソフトウェアの開発が、ハードウェアの進歩と合致して進行するものと予想される。その結果、時間的にも費用的にもさらに容易に手術シミュレーションが行え、より正確な術後予測が可能となれば、顎顔面領域の手術療法を受ける患者にとっては福音となると考える。医療の世界においてCTなどの画像をもとにして三次元的情報を得る手法が導入されて久しい。また頭頸部領域では解剖学的な複雑さや変異の大きさによって緻密な術前計画が妨げられてきたが、主に骨情報による三次元実体モデルを用いることによりVirtual Realityと呼べる手術シミュレーションが可能となった。しかしながら三次元実体モデルは高価であり、作製までに時間を要する、材質によっては骨よりも硬くて扱いにくいといった問題点があった。今年度の研究内容は患者のCT画像をもとにまずパソコン上での三次元画像の構築を行った。使用したハードウエアはデル社製Inspiron8200、ソフトウエアは計画当初はINTAGE3.0(ケイ・ジー・ティー)であったが、技術の進歩により手術シミュレーションの機能を兼ね備えたV-Works(CyberMed)に移行することとした。当科の顎顔面手術の基本となる顎顔面骨サーフェイスレンダリング・イメージの作成を通常のDICOMデータから行い、まず一般的な手術法である下顎枝矢状分割法を対象とした。V-Worksではサーフェイスレンダリングとボリュームレンダリング情報とをリンクさせることにより顎骨のセグメンテーションがリアルタイムで可能であった。5例の下顎枝矢状分割法の手術シミュレーションを行った後、従来使用してきたアナログ的シミュレーションであるPaper surgeryとModel Surgeryによって得られた移動量、移動方向の記録と比較を行うとともに術後に撮影された側貌頭部X線規格写真による移動量の実測値との関係の検討を行った。その結果、V-Worksによる骨片の移動量の計測値はModel Surgeryの計測値と近似的で、いずれも実際の移動量とほぽ一致したが、Paper Surgeryの値は不正確で他の計測値とは開きがあった。さらに非対称の傾向があり左右の移動量が異なる症例ではV-Worksの計測値がもっとも信頼度が高かった。顔面骨手術に際して、三次元実態モデルを用いた術前手術予測あるいは術式検討を行うことで、virtual realityと呼べる手術シミュレーションが可能となった。しかし、三次元実態モデルを用いた検討における問題点として、作製価格が高い、作製までに長時間を要する、作製材質によっては骨より硬く骨切りなどのシミュレーション操作が困難など、が上げられる。最近、市販パソコンおよび患者の顔面骨CTデータを用いて、顔面骨の三次元構築が可能となるソフトが開発された。これを用いると、任意の部位において骨の三次元的な切断・移動が可能で、手術シミュレーションが画面上で容易に操作できる。今回、実際の顎顔面手術における術前シミュレーションにこの方法を用いて、その有用性あるいは信頼性について検討した。重症の放射線性下顎骨骨髄炎症例のCTデータより検討した。

従来、下顎骨骨髄炎の罹患範囲を正確に診断することは困難で、臨床的には実際手術の際の手術所見から判断せざるを得なかった。今回用いた方法では、任意の部位、方向で下顎骨の断面を容易に再構築、再現できるので、術前に罹患範囲の推定に有用であった。実際の手術の際には、術前の推定切断予定部で下顎を離断したが、離断面の皮質骨および海面骨の状態は再現されたCT像と類似していた。以上より、術前シミュレーションにおけるCT解析ソフトの利用は有用であると考えられた。今後の問題点としては、補綴物による金属アーチファクトの克服と、顔面軟組織を含めた手術シミュレーションの開発である。顔面骨手術に際して、三次元実態モデルを用いた術前手術予測あるいは術式検討を行うことで、virtual realityと呼べる手術シミュレーションが可能となった。しかし、三次元実態モデルを用いた検討における問題点は、作製価格が高い、作製までに長時間を要する、作製材質によっては骨より硬く骨切りなどのシミュレーション操作が困難などの欠点が上げられる。最近、市販パソコンおよび患者の顔面骨CTデータを用いて、顔面骨の三次元構築が可能となるソフトが開発された。これを用いると、任意の部位において骨の三次元的な切断・移動が可能で、手術シミュレーションが画面上で容易に操作できる。今回、実際の顎顔面手術における術前シミュレーションにこの方法を用いて、その有用性あるいは信頼性について検討した。前年度に引き続き、病的骨折を生じた重症放射線性下顎骨骨髄炎症例で検討した。術前にCT撮影し、DICOMデータを用いてコンピュータ上で三次元的に再現し、適切な切除範囲について検討した。下顎骨骨髄炎の罹患範囲を正確に診断することは困難で、実際の手術所見から臨床的に判断せざるを得ないところであるが、今回のシミュレーションでは、任意の部位・方向で下顎骨の断面を容易に再構築、再現できるので、術前に罹患範囲の推定に有用であった。今回の症例では病的骨折周囲の硬化性骨髄炎様あるいは腐骨と思われる範囲は小さく、再建腸骨に見合う術前の推定切断予定部で下顎を離断したが、離断面の状態は再現されたCT像と酷似していた。術後機能および形態を考慮した手術術式決定に今回の検討は有用であった。
乳酸菌バクテリオシン探索のハイスループット化と発酵生産の総合システム化

1.新奇バクテリオシンのハイスループットスクリーニングシステムの開発培養液上清を用いて、バクテリオシン感受性の十数菌株を検定菌として設定し、抗菌スペクトルを調べた。抗菌活性を数値化、データベース化し、多変量解析法の主成分分析によって解析した。その結果、バクテリオシンを3から4のグループに分類することができ、既知と未同定のバクテリオシンの位置を比較することで、新奇性を判定できた。分子量は、高速液体クロマトグラフィー質量分析計(LC/MS)を用いて培養液上清から直接測定したところ、数種のバクテリオシンの検出と同定が可能となった。さらに、検出されるイオンの範囲を限定することで未同定のバクテリオシンの分子量を決定することも可能となった。本ハイスループット化技術の導入によって、新奇バクテリオシンの検出に要する時間が大幅に短縮された。2.新奇バクテリオシンの発見(1)ラクトコッシンQ:ラクトコッシンQは、2つのペプチド、α(39アミノ酸)とβ(35アミノ酸)から成るクラスIIbバクテリオシンで、生産株と同菌種のL.lactisのみ抗菌活性を示した。また、αとβが共存した時にのみ相乗的に作用して抗菌活性を示した。(2)ラクティシンQ : L.lactis QU 5が生産するラクティシンQ(53アミノ酸)はクラスIIcに分類され、ナイシンに匹敵する強い抗菌活性と広い抗菌スペクトルを示した。また、ラクティシンQは、弱アルカリ領域でとくに高い安定性を示した。これは、乳酸菌バクテリオシンの常識を覆す特性であり、ラクティシンQはスーパーバクテリオシンとして大いに期待される。3.ナイシン配合手指用殺菌洗浄剤の開発既存殺菌成分である陽イオン界面活性剤を主剤、非イオン界面活性剤と両性界面活性剤を洗浄剤とした配合にナイシンを添加した。広範な抗菌スペクトル、および高い殺菌力を示し、市販品との比較では概ね優位性が認められた。様々な目的・対象・要求などに対応するには、多種多様なバクテリオシンを取り揃えておくことが重要である。そこで、スクリーニングの初期、すなわち試験管レベルの培養液上清の段階、での新奇性を判定し、新奇バクテリオシンの探索に要する時間の大幅な短縮、さらにはハイスループット化を目指した。乳酸菌バクテリオシンには様々な特性があるが、培養液上清を用いて新奇性を迅速・簡便に判定するにあたり、最も差別化を図りやすいと考えられる抗菌スペクトルと分子量を指標とすることとした。抗菌スペクトルの解析には、すでに確立していた迅速・特異的な抗菌活性試験法を利用した。また、これまでの研究成果から選抜されたバクテリオシン感受性株、十数菌株を検定菌として設定し、抗菌スペクトルを調べた。培養液上清が各検定菌に対して示す抗菌活性を数値化、データベース化し、多変量解析法の一つである主成分分析によって解析した。分子量は、高速液体クロマトグラフィー質量分析計(LC/MS)を用いて培養液上清から直接測定した。抗菌スペクトルの主成分分析では、バクテリオシンを3から4のグループに分類することができた。この方法では類似した抗菌スペクトルのものほど、グラフ上で近くに位置するため、既知バクテリオシンと未同定のバクテリオシンの位置を比較することで、新奇性を判定することが可能となった。

これまで抗菌スペクトルの解析は経験に頼ることが多かったが、この手法を用いることで誰にでも客観的な判断を下すことが可能となった。LC/MSによる分子量の解析では、3つのナイシン類縁体(A、Z、Q)をはじめとする数種のバクテリオシンの検出と同定が可能となった。さらに、検出されるイオンの範囲を限定することで未同定のバクテリオシンの分子量を決定することも可能となった。本ハイスループット化技術の導入によって、新奇バクテリオシンの検出に要する時間が大幅に短縮された。1.新奇バクテリオシンの発見昨年度開発した、新奇バクテリオシンのハイスループットスクリーニングシステムを用いて、以下の新奇バクテリオシンを見出した。(1)ラクトコッシンQラクトコッシンQは、2つのペプチド、α(39アミノ酸)とβ(35アミノ酸)から成るクラスIIbバクテリオシンで、生産株と同菌種のL.lactisのみにしか抗菌活性を示さず、抗菌スペクトルはきわめて限定的であった。化学合成したラクトコッシンQの2つのペプチド(Qα、Qβ)は単独では活性を示さず、αとβが共存した時にのみ相乗的に作用して抗菌活性を示した。また、各αとβの組み合わせによって活性に最大32倍の差が生じ、βペプチドの差異が活性に大きく影響することが明らかとなった。(2)ラクティシンQナイシンは非常に優れたバクテリオシンであるが、一方では中性からアルカリ性域での低い安定性や広いながらも特徴的な抗菌スペクトルなどの欠点があり、これらはバクテリオシンの応用範囲を拡大する上での克服すべき課題となっている。我々が発見したL.lactos QU5が生産するラクティシンQ(53アミノ酸)は、クラスIIcに分類され、ナイシンに匹敵する強い抗菌活性とナイシンとはややパターンの異なる広い抗菌スペクトルを示した。また、ラクティシンQは、ナイシンをはじめとする他の乳酸菌バクテリオシンとは異なり、弱アルカリ領域でとくに高い安定性を示した。これは、これまでの乳酸菌バクテリオシンの常識を覆す特性であり、ラクティシンQはスーパーバクテリオシンとして大いに期待される。2.ナイシン配合手指用殺菌洗浄剤の開発既存殺菌成分である陽イオン界面活性剤を主剤、非イオン界面活性剤と両性界面活性剤を洗浄剤とした配合にナイシンを添加した。広範な抗菌スペクトル、および高い殺菌力を示し、市販品との比較では概ね優位性が認められた。
血中タンパク質ＡＩＭによる慢性腎臓病の病態制御に関する研究

AIMは肝臓のクッパー細胞などの組織マクロファージが産生する分子量約40kDaの血中タンパク質であり、AKIをはじめとしたさまざまな疾患の治癒に寄与している。AIMは通常血中でIgM五量体と結合し、不活性化されているが、AKI発症時にはAIMはIgM五量体から解離した活性型となり、AKIからの回復に寄与する。そこで、より効率的にAIMをIgM五量体から解離させ活性型とすることで速やかなAKIからの回復が促され、CKD発症が抑制されるのではないかと考えた。まずAIMをIgMから解離させる“AIM活性化分子"を探索すべく、電子顕微鏡による構造解析によってAIMとIgMの結合様式を同定することを目標とした。IgM五量体は各単量体同士、およびJ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖がジスルフィド結合によって結合し血中で五量体を形成して存在している。これまでIgM五量体はシンメトリックな正五角形をしていると信じられてきており、教科書にもそのように記載されている。今回、負染色したIgM分子の電子顕微鏡による観察により、これまで正五角形をしていると信じられてきたIgM五量体が、実は正五角形ではなく六量体から一つの単量体が抜けたような大きな空間を一つ有する歪な五角形であることを発見した。これは、これまで50年間以上免疫学の教科書に記載されていたIgM五量体の構造を覆す成果である。さらに、負染色したAIM-IgM複合体の観察により、AIMがIgM五量体の1カ所のギャップにちょうどはまり込むように結合している姿を電子顕微鏡で捉えることに成功し、AIMとIgMの結合はジスルフィド結合と電荷相互作用によるものだと明らかとなった。この研究成果は、AIMをIgMから解離させることでAKIなど腎疾患をはじめとしたさまざまな疾患治癒を目指す新規創薬開発に大きく貢献することが期待される。AKI治癒において治癒においてAIMがIgMから解離することが非常に重要である一方で、AIMとIgMの結合様式は不明であった。しかし、AIMとIgMの結合様式が明らかになったことにより、AIMをIgMから解離させる分子の探索およびそれを用いた新規創薬開発が可能となった。また、CKD発症モデルについても野生型マウスとAIM欠損型マウスでの比較を行い、AIMの有無による解析を進めている。今後は、クライオ電子顕微鏡による三次元構造解析により、より詳細なAIMとIgMの結合様式を明らかにするとともに、AIMをIgMから解離させる“AIM活性化分子"の同定を進める。また引き続き、CKD発症モデルマウスを用いて野生型およびAIM欠損型マウスの比較を行うことで、CKDの発症、治癒に対するAIMの寄与について検討する。さらに組み換えAIMタンパク質を投与、あるいはAIM活性化分子を投与することで、活性型AIMのCKD予防、治療効果を検討する。組み換えAIMタンパク質の投与量や回数、時期は適宜調整し最適化する。

今後は、クライオ電子顕微鏡による三次元構造解析により、より詳細なAIMとIgMの結合様式を明らかにするとともに、AIMをIgMから解離させる“AIM活性化分子"の同定を進める。また引き続き、CKD発症モデルマウスを用いて野生型およびAIM欠損型マウスの比較を行うことで、CKDの発症、治癒に対するAIMの寄与について検討する。さらに組み換えAIMタンパク質を投与、あるいはAIM活性化分子を投与することで、活性型AIMのCKD予防、治療効果を検討する。組み換えAIMタンパク質の投与量や回数、時期は適宜調整し最適化する。
共焦点内視鏡によるヒルシュスプルング病の腸管神経可視化システムの確立と臨床応用

先天的な腸管神経の欠損による運動障害により、生下時から便秘腹満を呈するヒルシュスプルング病およびその類縁疾患を対象として、手術時に切除範囲を決定するためのより良い方法として腸管神経可視化に挑む研究を続けてきた。研究期間の前半では手術によって切除された正常腸管およびヒルシュスプルング病患者の腸管を用いて生体外での神経可視化を試みた。本研究の中心的医療機器である共焦点内視鏡(confocal ;aser endomicroscopy,以下CLE)を用いて切除検体に蛍光色素であるcresyl violetを局注し、CLEによる腸管壁内の構造を観察した。cresyl violetは神経に親和性が強いため周囲の平滑筋などよりも強調されて観察することができた。正常腸管では梯子状の形状をした腸管神経叢が描出されその内部には腸管神経およびグリア細胞の核と思われる部位が黒く抜けて見えるのが特徴であった。ヒルシュスプルング病の無神経節腸管においては先述の神経叢が観察されず、平滑筋の線維が観察された。また、外来性の太い神経線維束がCLEでは内部に蛇行する線維の束として明瞭に描出されるのを確認した。CLEでの所見を同一部位で作成した病理標本と照らし合わせてCLEによる神経可視化の精度を評価した。正常腸管においては86%において腸管神経の可視化に成功し、ヒルシュスプルング病腸管においてはCLE所見と病理所見の的中率が88%と高い精度で腸管神経を識別可能である事を示した。研究期間の後半は摘出検体で得られた高い精度をもって生体内観察に着手し、これまでに2例において切除前の生体内にある腸管で同様にCLEによる腸管神経可視化に挑戦した。2例共に腸管神経の観察は焦点深度の幅が狭く、視野も限られていることなどから容易ではなかったが、神経叢を観察することができた。世界初の生体内腸管神経可視化の瞬間である。ヒルシュスプルング病(H病)は遠位側腸管における神経節細胞の欠如を本態とする先天性の腸管神経異常疾患で、適切な診断、治療には腸管の生検による正確な病理診断が必要不可欠である。本研究では,共焦点内視鏡(confocal laser endomicroscope, CLE)を用いた低侵襲消化管壁内神経叢のin vivo imaging法を確立し,ヒルシュスプルング病の確定診断と、初期治療や根治手術の際の人工肛門造設部位や切除腸管の範囲を正確に決定するリアルタイム診断システムを構築することを目指している。1年目となる今年度はヒト腸管切除検体を用いての検討を行った。慶應義塾大学病院および関連病院である東京都立小児総合医療センター外科と共同研究体制をつくり、腸管切除が必要である患者さんに術前に同意を得て、切除検体の一部を研究に使用した。これまでに38症例(H病患者18症例、その他の腸管神経に異常のないコントロール患者20症例)よりサンプルを収集し、そのうち29症例においてCLEによる観察を行った。方法としては、蛍光色素(cresyl violet)を漿膜面より散布もしくは漿膜下に局注し、CLEで漿膜側より筋層間の神経叢を観察した。H病の無神経節部や移行部においては神経線維束についても観察、記録した。また、CLEによる観察後に組織を固定し、水平連続切片を作成して病理所見を検鏡した。CLEの検鏡と同様に筋層間の神経叢の有無を観察し、さらにH病の無神経節部や移行部では、太い神経線維束の出現についても観察、記録した。CLE所見と病理所見の対比を行い、統計的な解析をこれまでにH病8例、コントロール11例にておこなった。結果はH病において正診率、感度、特異度がそれぞれ92.6%, 90.5%, 93.9%であり、コントロールではそれぞれ92.9%, 92.3%, 100%と高い精度が確認された。当初の計画では、初年度はヒト腸管切除検体を用いての生体外でのCLE観察と病理所見の対比であった。研究実績の概要で記述したとおり、ヒト腸管切除検体としてH病、コントロールともに十分なサンプル数が集められ、腸管神経の可視化がよい精度で可能である事を示すことができた。コントロール検体におけるCLE所見をまとめて論文化(Kobayashi et al., Gastroenterol Hepatol. 2017)がなされ、現在、H病における所見をまとめている。また、2年目の計画である実験動物を用いての生体内観察についても、現在、ブタを用いた実験系を準備している。当初は慶應義塾大学病院にある動物実験センターにて実験を行う予定であったが、CLE本体が慈恵医大にあること、慈恵医大でも大動物の実験が可能である事から実験の場所は慈恵医大で行う計画に変更した。下島も慈恵医大の動物実験講習を受講し、慈恵医大での動物実験計画書の共同研究者に入る手続きを済ませている。近日中に実際にブタを用いての生体内観察を具体的に行う予定である。共焦点内視鏡を用いて、ヒト腸管神経の可視化の研究を進めている。初年度となる平成28年度は手術にて摘出された腸管検体を用いて、ヒルシュスプルング病およびコントロールそれぞれで観察を行い、どちらにおいても腸管神経や外来性の神経線維の様子をとらえることに成功した。

ヒルシュスプルング病11例、コントロール11例についてCLE所見と病理所見の比較を行い、正診率、感度、特異度はそれぞれ、ヒルシュスプルング病で90%、83%、95%、コントロールで86%、92%、100%であった。2年目である平成29年度は摘出検体ではなく生体内での観察を行うこととし、ブタを用いて生体内での観察を行った。これまで2度に渡り、ブタを用いた生体内観察を行っているが、きれいに腸管神経系を可視化するに至っておらず、原因の考察と今後の工夫が必要な状況である。最終年度となる今年(平成30年度)は、当初の計画ではヒトの生体内での観察を掲げていた。大動物で生体内観察がまだ不確かな結果しか出ていないが、ヒト生体内観察についても実施計画書を作成し、院内の倫理委員会にかけている。使用する蛍光色素がヒトに対しては未承認であるため、観察部位を切除予定の部分に限局して行うなどの工夫をしている。現在、条件付き承認の状態であり、今後、倫理委員会の承認を得た時点でヒト生体内観察を開始する準備は整いつつある。今年度中にfirst in humanとしての腸管神経可視化にトライしたい。初年度はヒト腸管摘出検体を用いてCLEによる腸管神経の観察を計画し、コントロール、ヒルシュスプルング病のいずれにおいても精度の高い結果を得た。コントロールデータはすでに論文化し(Kobayashi et al., J Gatroenterol Hepatol, 2017)、現在ヒルシュスプルング病のデータをまとめて投稿予定であるが、時間がかかっている。また、2年目は大動物を用いて生体内観察をする計画であり、これまでに2回の観察を施行したが、再現性をもって腸管神経が観察されているわけではない。今後、生体内観察を可能にするための工夫が必要であり、実験を積み重ねていく必要がある。先天的な腸管神経の欠損による運動障害により、生下時から便秘腹満を呈するヒルシュスプルング病およびその類縁疾患を対象として、手術時に切除範囲を決定するためのより良い方法として腸管神経可視化に挑む研究を続けてきた。研究期間の前半では手術によって切除された正常腸管およびヒルシュスプルング病患者の腸管を用いて生体外での神経可視化を試みた。本研究の中心的医療機器である共焦点内視鏡(confocal ;aser endomicroscopy,以下CLE)を用いて切除検体に蛍光色素であるcresyl violetを局注し、CLEによる腸管壁内の構造を観察した。cresyl violetは神経に親和性が強いため周囲の平滑筋などよりも強調されて観察することができた。正常腸管では梯子状の形状をした腸管神経叢が描出されその内部には腸管神経およびグリア細胞の核と思われる部位が黒く抜けて見えるのが特徴であった。ヒルシュスプルング病の無神経節腸管においては先述の神経叢が観察されず、平滑筋の線維が観察された。また、外来性の太い神経線維束がCLEでは内部に蛇行する線維の束として明瞭に描出されるのを確認した。CLEでの所見を同一部位で作成した病理標本と照らし合わせてCLEによる神経可視化の精度を評価した。正常腸管においては86%において腸管神経の可視化に成功し、ヒルシュスプルング病腸管においてはCLE所見と病理所見の的中率が88%と高い精度で腸管神経を識別可能である事を示した。研究期間の後半は摘出検体で得られた高い精度をもって生体内観察に着手し、これまでに2例において切除前の生体内にある腸管で同様にCLEによる腸管神経可視化に挑戦した。
涙液中ガレクチン3を用いた新規ドライアイマーカーの探索

2019年3月末現在、ドライアイ患者およびコントロール対象者からの涙液サンプル回収および結膜上皮細胞インプレッションサイトロジーサンプル回収は順調に進捗し、既に回収が完了したサンプル数は解析可能目標実施数に到達した。BCA法による涙液中タンパク濃度測定は回収サンプル全てで終了した。human recombinantのガレクチン3(hr-Gal3)を用いて、低濃度のガレクチン3が、ウェスタンブロッティング(WB)法で判定可能であることが確認できたため、実際の涙液サンプルからガレクチン3濃度解析を進めている。また定量線範囲内のhr-Gal3タンパクと、各涙液サンプルを同じゲル内に電気泳動し、型通りのWB法にて全長径galectin-3(Gal-3)量を、分子量30kDを利用して測定する。さらに涙液中proteaseなどによってcleavedされたと考えられる切断型ガレクチン3 (Gal-3C)を分子量26kDから同定し、Gal-3Cは重症度の高いドライアイ群に有意に多く認められることが分かった。サンプル回収に並行して、ドライアイの臨床評価項目は、角結膜上皮欠損のフルオレセイン染色スコア、リサミングリーン染色スコア、涙液層破綻時間(Tear Break Up Time: BUT)、シルマー試験(涙液分泌量検査)に関するデータ収集もほぼ修了しており解析を進めている。また自覚症状の定量化のために自覚症状判定質問票(DEQS)も回収し、自覚症状と涙液中ガレクチン3濃度の相関関係の有無についても解析を進めている。患者および対象者からの研究参加への同意取得および涙液などの研究サンプル回収にあたり、学内倫理委員会の許可を得る必要があり、その許諾を得るまでに時間がかかったが、現在のところではドライアイ症例および対象症例からの涙液サンプル回収は順調にほぼ修了し、研究進捗は予定通りである。また国際学会参加にて我々の進捗状況が他の研究グループよりも順調であるかを確認した。ほぼ涙液サンプルは回収目標数に達しており、涙液中のガレクチン3濃度および切断型ガレクチン3の有無についてもウェスタンブロッティングで順調に解析が進んでいる。今後は得られた結果から、正常群・中等度ドライアイ群、重症ドライアイ群にわけて、涙液中ガレクチン3濃度に有意差が認められるか解析し、切断型ガレクチン3の存在率を探索する。また結膜上皮細胞からTotalRNAを抽出した後に、ガレクチン3を中心にmRNA発現レベルを、各群間で統計解析する予定である。研究成果:現在ドライアイ患者およびコントロール対象者からの涙液サンプル回収および結膜上皮細胞インプレッションサイトロジーサンプル回収が順調に進んでいる。サンプル数も実際の解析を始めるのにほぼ十分数確保できている。涙液中ガレクチン3濃度を解析する前段階として、現在は涙液中タンパク濃度についてBCA法による解析を進めている。また、human recombinantのガレクチン3(hr-Gal3)を用いて、低濃度のガレクチン3が、ウェスタンブロッティング法でどこまで判定できるかを、前段階の実験として進めている。現段階における中間結果としては、我々が使用しているガレクチン3一次抗体は鋭敏に低濃度ガレクチン3を認識することが確認され、順調に涙液中のガレクチン3濃度判定を進める準備が整いつつある。サンプル回収に並行して、ドライアイの臨床評価項目は、角結膜上皮欠損のフルオレセイン染色スコア、リサミングリーン染色スコア、涙液層破綻時間(Tear Break Up Time: BUT)、シルマー試験(涙液分泌量検査)を予定している。また自覚症状の定量化のためにDEQSなどの自覚症状判定質問票も回収し、自覚症状と涙液中ガレクチン3濃度の相関関係の有無について確認するべく、各個人の自覚症状スコアリングを進めている。定量線範囲内のhr-Gal3タンパクと、各涙液サンプルを同じゲル内に電気泳動し、型通りのWB法にて全長径galectin-3(Gal-3)量を、分子量30kDを利用して測定する。さらに涙液中proteaseなどによってcleavedされたと考えられる切断型ガレクチン3 (Gal-3C)を分子量26kDから同定し、Gal-3C/Gal3の比を求める予定である。患者および対象者からの研究参加への同意取得および涙液などの研究サンプル回収にあたり、学内倫理委員会の許可を得る必要があり、その許諾を得るまでに時間がかかった。そのために涙液採取開始が平成30年1月から開始したため、遅れが生じている。現在、ドライアイ症例および対象症例からの涙液サンプル回収は順調に進んでおり、研究進捗の遅れは軽微であると考えている。

サンプル回収に並行して、ドライアイの臨床評価項目は、角結膜上皮欠損のフルオレセイン染色スコア、リサミングリーン染色スコア、涙液層破綻時間(Tear Break Up Time: BUT)、シルマー試験(涙液分泌量検査)に関するデータ収集もほぼ修了しており解析を進めている。また自覚症状の定量化のために自覚症状判定質問票(DEQS)も回収し、自覚症状と涙液中ガレクチン3濃度の相関関係の有無についても解析を進めている。患者および対象者からの研究参加への同意取得および涙液などの研究サンプル回収にあたり、学内倫理委員会の許可を得る必要があり、その許諾を得るまでに時間がかかったが、現在のところではドライアイ症例および対象症例からの涙液サンプル回収は順調にほぼ修了し、研究進捗は予定通りである。また国際学会参加にて我々の進捗状況が他の研究グループよりも順調であるかを確認した。目標症例数の涙液および結膜上皮細胞サンプルが回収した後に、各タンパク質の解析に移行する。タンパク量解析については主にウェスタンブロッティングで行う予定であるが、すでに微量のガレクチン3が解析できる一次抗体および実験系を確立できているため、解析自体は順調に進められる予定である。ほぼ涙液サンプルは回収目標数に達しており、涙液中のガレクチン3濃度および切断型ガレクチン3の有無についてもウェスタンブロッティングで順調に解析が進んでいる。今後は得られた結果から、正常群・中等度ドライアイ群、重症ドライアイ群にわけて、涙液中ガレクチン3濃度に有意差が認められるか解析し、切断型ガレクチン3の存在率を探索する。また結膜上皮細胞からTotalRNAを抽出した後に、ガレクチン3を中心にmRNA発現レベルを、各群間で統計解析する予定である。次年度使用額はごく少額であり、ほぼ実施予定計画に基づき、支出実行された。翌年度は繰り越された少額残金を足し合わせて、計画通りに支出実行される予定である。
ＴＬＲシグナルはＢｔｋを介してＮＬＲＰ３インフラマゾームの活性化を制御するのか？

ヒト単球白血病細胞株THP-1をPMAによりマクロファージに分化させ、alumによりNLRP3インフラマゾームの活性化を誘導した、その際様々な細胞内シグナル阻害剤をスクリーニングすることにより、Btk阻害剤(LFM-A13とPCI-32765)がNLRP3インフラマゾームの活性を抑制することを見出した。これらの効果はマウス腹腔マクロファージや骨髄由来樹状細胞、ヒト末梢血単球でも同様に観察された。LFM-A13は既知の様々なNLRP3インフラマゾーム活性剤(alum, ATP, Nigerisine, LeuLeu OMe)に対して抑制効果を示した。一方poly(dA:dT)により引き起こされるcaspase-1活性には効果を示さなかったことより、LFM-A13はAIM2インフラマゾームには効果を持たないことが明らかとなった。更にBtk変異マウスXid由来のマクロファージでもNLRP3インフラマゾームの活性化が減弱していることが示された。293T細胞を用いた強制発現の実験によりBtkはASC重合を促進する作用を有しており、LFM-A13はその重合を減少させることが明らかとなった。さらにBtkのTKドメインがASCのpyrinドメインとNLRP3のLRRと結合することを免疫沈降法で証明した。BtkがASCとNLRP3に共に結合することはBtk安定発現THP-1細胞を用いた免疫沈降法でも証明された。加えてLFM-A13はBtkとNLRP3の結合を阻害することも判明した。Alumをマウス腹腔内に投与する腹膜炎モデルでは、WTマウスに比較してXidマウスでは浸潤好中球数が有意に少ないことから、BtkのNLRP3インフラマゾームの効果をin vivoでも確認することが出来た。以上より私達はBtkはNLRP3インフラマゾームの活性化に重要な細胞内シグナル分子であることを証明した。これは痛風や動脈硬化等、NLRP3インフラマゾームが病態の中心となっている疾患に対する新たな治療戦略の開発につながると共に、ヒトBtk変異により引き起こされる先天性無ガンマグロブリン血症の病態解明につながると思われる。25年度が最終年度であるため、記入しない。マウス腹腔マクロファージ及びヒト単球性白血病細胞株THP-1をPMAにより分化させたマクロファージ(THP-1-Mac)何れにおいてもAlumで誘導されたIL-1b p17とcaspase-1 p20がBtk特異的阻害剤であるLFM-A13で抑制されることを確認している。更にpoly (dA:dT)で誘導されるAIM2 inflammasome活性に対してはこのような効果が認められないことより、BtkはNLRP3 inflammasome特異的に関与することが示唆された。Btkの関与をより明確にするためにBtk変異マウスXid由来のマクロファージをAlumで刺激すると、野生型由来マクロファージに比べて、IL-1bの産生及びCaspase-1の活性化の優位な低下を認めた。

THP-1マクロファージに対してBtk shRNAによるBtkのノックダウンを行ったところ、同様な結果が得られた。更にXidの腹腔内にAlumを注射し腹膜炎を誘発させたところ、腹腔内の侵潤好中球数は野生型に比べてBtk変異マウスXidで優位に低下していた。これらの結果はBtkがNLRP3 inflammasomeの活性化を制御していることを示す。過去にTLRのシグナルがBtkの活性化を誘導することが報告されており、本研究の成果と併せ考えると、Btkはシグナル1をシグナル2の橋渡しをするシグナル分子である可能性が深まった。BtkのNLRP3 inflammasome活性化への影響を分子レベルで解析する点ではベクター作成等の準備段階に留まっているが、Btk shRNAを用いたBtkノックダウンの実験及びマウスを用いた個体レベルでのBtkの重要性を確認できた点では、一つの目的を達成したと考える。本年度は主として、BtkのNLRP3 inflammasomeの制御機構を分子レベルで解析する。特にNLRP3のリン酸化に着眼する。Btkの野生型、ドメイン欠損体そしてE41K-BtkをNLRP3と共にHEK293Tに強制発現させNLRP3の免疫沈降を行い、リン酸化チロシン特異的抗体4G10を用いたウェスタンブロット解析によりNLRP3のチロシンリン酸化を証明する。Btkは223と551番目のチロシンのリン酸化により活性化すると考えられておりこれらのアラニン置換の発現ベクターも合わせて作成し、NLRP3と共にHEK293Tに強制発現させた際のNLRP3のチロシンリン酸化の有無を調べる。尚Btk shRNAを安定発現したTHP-1-M#61542;をNLRP3あるいはASC抗体により免疫沈降を行い、4G10にて内在性のNLRP3のチロシンリン酸化も明らかにする。更に、NLRP3のリン酸化が証明された場合、GST融合NLRP3をBtkと共にHEK293Tに発現させグルタチオンカラムによりGST融合NLRP3を精製する。精製NLRP3をトリプシン処理しMS/MS解析によりリン酸化部位を同定する。尚、BtkがNLRP3をリン酸化するにはinflammasomeを形成する細胞内環境が必要である可能性がある。その場合はAlum刺激THP-1-M#61542;の細胞溶解液をSDSゲル電気泳動にかけ、NLRP3のバンドを切り出しゲル内消化によりペプチドサンプルを得る。25年度が最終年度であるため、記入しない。
理科教育における実際的能力(観察能力等)育成のためのカリキュラムと指導法の開発

1.岩手、東京、岐阜、岡山、広島の各都県教育センター所員および小・中・高の教師に協力委員を依頼し、小・中・高それぞれ実験調査用の小単元の設定とその授業展開案を作成した。2.対象と指導案は、小学校6年「てこ」、中学校2年「電流による発熱」、高等学校1年「仕事」とし、それぞれについて対比的な2つの指導案を作成した。そして、岩手、岐阜、岡山、広島の各県教育センターにおいて選定した小学校、高等学校3校、中学校4校について、それぞれ2学級をとり、これらの指導案に基づいた授業を実施した。3.実験授業の評価のための関連領域に関する学力調査問題、科学に対する態度質問紙、実験テスト問題等を作成し、実験授業終了後に実施した。4.実験授業の評価結果の統計的な分析に基づいて、2つの実験授業案(A案:帰納中心的、B案:演繹中心的)の相対評価を行い、両者の特長を比較検討した。主な結果は次のとおりである。(1)実験テスト及び理科問題では、A,B案で差のはっきりした問題でA案の方がB案より正答率が高いものが多い。(2)態度質問紙では、科学及び理科学習に対する評価とも小学校ではA案、中学校ではB案の方が積極的態度を示し、高校では科学に対してB案の方が積極的な評価を行っている。科学観調査では、A案の方が得点の高い項目がほとんどである。(3)各項目の相互相関より、特に中学校において、考え方中心のB案の方が成績上位の生徒に良い環境を与え(実験テストや理科問題の得点、標準偏差より)、実験中心のA案の方は、逆に成績下位の生徒に良い影響を与えたのではいかと考えられる。1.岩手,東京,岐阜,岡山,広島の各都県教育センター所員,および小・中・高の教師に協力委員を依頼,小・中・高それぞれについて,物理領域の単元を一つづつ選び,実験調査用の小単元の設定とその授業展開案を作成した.2.対象と指導案は,小学校6年「てこ」,中学校2年「電流による発熱」,高等学校1年「仕事」とし,対比的な2つの指導案(実験中心,帰納的と概念中心,演繹的)を作成,各教育センターで選定した.小・中・高各2校について,それぞれ2学級をとり,この指導案に基づいて授業を実施した.3.実験授業の評価のための,関連領域に関する学部調査問題,科学観テスト,態度質問紙,実験テスト問題等を作製し,実験授業終了後実施した.4.実験授業の経過,評価結果のデータの蒐集を完了し,現在集計・分析中である.
埋没材用ベルリナイト耐火材の研究

ベルリナイトは石英と類似した結晶構造と転移現象を示めすため、将来有望な埋没材用耐火材である。ベルリナイトは市販されているものは結晶性、膨張性が低く、不純物を多い。そこで、結晶性の高いベルリナイトの合成方法について検討した。加熱法では、各種合成アルミナ水和物と第一リン酸アルミニウムとの混合物に水を加えてスラリー状態で反応させた。硬化反応後は非晶質相であるが、加熱脱水させるとベルリナイトが結晶化した。Al(H_2PO_4)_3-Al_2O_3・5H_2Oの反応系が最も結晶の高いベルリナイトが生成した。生成物は、大部分ベルリナイトであるがトリジマイト型やクリストバライト型がわずかに含有した。練和水量が多くなるとベルリナイト相は生成せず、トリジマイト型が生成した。水熱法では、加熱合成ベルリナイト種結晶をオートクレーブ中で200250°Cで水熱処理を行った。合成生成物はベルリナイト単一相であった。結晶粒子は大きく成長して、結晶性も非常に高くなっていた。合成ベルリナイトの結晶性解析を行った結果、生成したベルリナイトは比較的結晶性の高いものであった。加熱処理によって結晶はさらに高くなった。水熱処理を行ったベルリナイトはさらに結晶性が良くなった。水熱処理条件(リン酸溶液濃度、処理時間)によって結晶性が影響した。合成ベルリナイトの熱的特性を検討した結果、加熱合成ベルリナイトを含有した埋没材は45%の線膨張率(加熱時)を示し、再組織型転移による膨張は9001,000°Cで起こっていた。一方、水熱処理ベルリナイトを含有した埋没材は78%の線膨張率(加熱時)を示したが、再組織型転移による温度は1,1001,200°Cで起こっていた。この転移温度はかなり高いため、今度転移温度の低下方法について検討する必要がある。1)ベルリナイトの合成1.加熱法について室温で、各種の合成アルミナ水和物(Al_2O_3・nH_2O)とオルソ第1リン酸アルミニウム(Al_2(H_2PO_4)_3)との混合物を蒸留水を加えたスラリー状態で反応させた。粉末X線回析法では硬化生成したものは非晶質であった。この非晶質相を100°C以上で脱水乾燥するとオルソ第3リン酸アルミニウム(AlPO_4)に結晶化した。通常の溶液反応では結晶学的に安定なクリストバライト相やトリジマイト相が結晶化するが、上記の出発材料で反応させ、反応条件を選択することによってベルリナイト単一相も生成することがわかった。2.水熱法について市販されているAlPO_4を種結晶として各種濃度のリン酸2水素アンモニウム溶液に入れ、オートクレーブ中で加熱反応させ、再結晶化させた。窒素雰囲気では、リン酸アルミニウム水和物が生成した。また、脱気せず酸化雰囲気で行うと水和物は生成せず、リン酸アルミニウムの結晶性が高くなった。しかしながら、上記の方法より結晶性の高いベルリナイトは生成せず、合成条件の再検討が必要である。これら研究結果を考慮し、次年度の課題とする。

2)合成ベルリナイトの結晶性、膨張性の解析加熱法で合成したベルリナイトの生成量や結晶性は、使用した合成アルミナ水和物の水和量や粒子性状によって影響を受け、さらに出発材料である第1リン酸アルミニウムの結晶性によってもベルリナイトの結晶性に影響を与えることがわかった。脱水乾燥後、ベルリナイト-クリスタルファイト転移(再組織型転移)が起こらない700800°Cで一定時間加熱処理によりベルリナイトの結晶化を促進させ、結晶性を高めた。得られたベルリナイトは、我々が従来利用していた有機溶媒合成のベルリナイトの結晶性と膨張性に近いことがわかった。シリカに代わる新しい歯科鋳造用埋没材の耐火材として、優れて熱膨張特性を有するリン酸アルミニウム、特にベルリナイト(石英タイプ)の利用可能性について検討してきた。この研究では、良質なベルリナイト結晶を合成育成するために水熱法について検討した。また、得られたベルリナイト結晶粉末の熱的特性についても検討した。加熱合成したベルリナイト種結晶を各種濃度(540%)のリン酸水溶液に各温度(200°以上)、時間(17日)で水熱処理した。ただし、リン酸アルミでは溶解度の温度勾配が負であるためこれを考慮に入れて水熱処理した。得られたベルリナイトの形態観察、X線解析を行った。粉末X線回折の結果より使用したリン酸アルミはベルリナイト型で、わずかなクリストバライト型、トリジマイト型が含まれていたが、得られた水熱合成物はベルリナイト単一相であった。また、走査電顕観察より水熱処理して得られたベルリナイト粒子は出発粒子に比べて、粒状に大きく成長し、結晶性も向上していた。すなわち、合成時間とともに結晶粒子は大きくなり、特に加熱温度、溶媒濃度によって結晶性は影響を受けた。熱分析の結果、α-β転移温度は変化はなかったが、再組織型転移温度は結晶性の向上によって50100°C高くなっていた。また、埋没材とした場合の加熱膨張はα-β転移による膨張とリン酸アルミ特有の再組織型転移による膨張がみられ、種結晶よりも高い線膨張率(58%)を示した。今回、水熱処理によってベルリナイト単一相が得られたこと、ならびに膨張性や結晶性の向上が見られたことで、水熱法による耐熱性と膨張性の優れた耐火材用ベルリナイトの改良と調整が可能であることがわかった。
DNAメチル化による遺伝子発現不活化を回避するレトロウイルスベクターの開発

レトロウイルスベクターの生体内でのプロモーター不活性化機構の解析と、その回避の道を探る目的で、GFPを発現するMoMLV由来のレトロベクターを組み込んだマウスリンパ腫細胞株EL4を同系マウス腹腔内に移植し、GFPの発現を指標に遺伝子発現を解析する系を確立した。GFP発現細胞をあらかじめ皮下に投与したマウスでは、より速やかに腹腔内投与EL4におけるGFPの発現低下が見られたことから、発現抑制に宿主免疫が関与することが示唆された。また、同EL4細胞をin vitroに取り出して培養しても発現は変化せず、ゲノムレベルでの不可逆的な抑制であると考えられた。一方、ベクターのLTR U3領域をHTLV-1 U3に置き換え、GFP融合Tax遺伝子(Gax)をコードするレトロウイルスベクターを作成し同実験を行ったところ、腹腔内ではGaxの発現が強く抑制されたが短時間のin vitroでの培養で抑制が解除された。そこで、in vivo、in vitroにおける転写量をリアルタイムRT-PCR法で定量したところ、24時間の培養での転写の活性化が確認された。次に、この可逆的転写抑制におけるプロモーターCpGメチル化の関与を検討するため、プロウイルスゲノムU3領域DNAをbi-sufite sequencing法で解析したところ、抑制状態では11箇所のCpG塩基配列のうち9箇所が約60%メチル化を受けていたが、24時間培養後には、8箇所のCpG塩基配列について約30%程度までメチル化頻度が減少していることが示され、HTLV-1 U3の転写抑制にはCpGメチル化が関与しているが、生体外で培養することで短時間に脱メチル化されることが明らかとなった。レトロウイルスベクターのin vivoにおけるサイレンス機構の解析とその回避の道を探る目的で、マウスリンパ腫細胞株EL4にEGFPを発現するMoMLV由来のレトロベクターを組み込み、同系マウス腹腔内に移植した。その結果、非免疫のマウスでは約2週間で、あらかじめEGFP発現EL4細胞で免疫した個体では48時間以内にGFPの発現低下が認められた。この事実は、GFPの発現低下は宿主免疫系によるGFP低発現細胞選択の結果であることを強く示唆しているが、同細胞をin vitro培養に移してもGFPの発現は回復しなかったことから、発現抑制がMoMLV-LTRのゲノムレベルでの不可逆的なものであると考えられた。次に、ベクターの転写調節領域(U3)をHTLV-1 LTRのU3と入れ替え、EGFPをHTLV-1 Taxとの融合蛋白(Gax)と交換したところ、EGFP発現EL4細胞の場合と同様に、Gaxの発現はマウス個体内において低下した。ところが、同細胞をin vitro培養に移すと数時間でGaxの発現が回復し始め、マウス腹腔内におけるHTLV-1 LTRによるGax発現の抑制は可逆的であることが示された。これらの結果は、レトロベクターのLTRあるいは発現する遺伝子産物により、サイレンスの様式が異なることを強く示唆している。また、HTLV-1感染T細胞におけるウイルスの発現も個体内では抑制され培養系に移行後に発現が観察されることから、同実験系はヒトにおけるHTLV-1発現制御機構を解析する上で有用な系を与えると考えられる。今後、可逆的なサイレンス機構におけるLTR U3領域および発現遺伝子の関与を、細胞性免疫、液性因子あるいはゲノムのCGメチレーションやヒストンアセチル化との関連において解析するとともに、U3領域の改変によるサイレンスの調節・回避を検討する。