hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大脳辺縁系および脳幹における急性ストレス反応

法医鑑定では,犯罪被害者の死因のみならず,生存時間や受傷時の苦痛・身体的行動能力などについての医学的立証が求められることがある.ヒトの死の直前における神経伝達物質の中,特にカテコラミンの測定を中心として,致死的外傷(侵害刺激)が中枢神経系に及ぼす急性ストレス反応を生化学的に評価し,ヒト(法医剖検例)における脳組織,脳脊髄液および血液内に残された痕跡を分子病理学,分子生物学および神経化学・生理学的指標を用いて多元多角的に分析した.法医鑑定では,犯罪被害者の死因のみならず,生存時間や受傷時の苦痛・身体的行動能力などについての医学的立証が求められることがある.ヒトの死の直前における神経伝達物質の中,特にカテコラミンの測定を中心として,致死的外傷(侵害刺激)が中枢神経系に及ぼす急性ストレス反応を生化学的に評価し,ヒト(法医剖検例)における脳組織,脳脊髄液および血液内に残された痕跡を分子病理学,分子生物学および神経化学・生理学的指標を用いて多元多角的に分析した.種々の外因性侵害刺激による苦痛、恐怖、怒り、不安、怯えなどの急性ストレス(痛み)反応が中枢神経系に及ぼす影響を解明するため、種々の死因における中枢神経系のストレス反応を免疫組織学的および生化学的指標を用いて多角的に分析した。これまでの研究の結果、中脳黒質神経細胞核内ユビキチン陽性封入体の出現率(変性指標)と中脳黒質神経細胞核のssDNA陽性率(アポトーシス指標)が死因と深く関係していることが明らかになった。今回種々の外因死386例(焼死、機械的窒息、溺死、頭部損傷、胸、腹部損傷、覚せい剤中毒、急性心臓死など)について、死後の血液、心膜液および脳脊髄液における神経伝達物質ドーパミン(DA)、セロトニン(5-HT)、アドレナリン(Adr)およびノルアドレナリン(Nad)を測定し、生体の急性ストレス反応を評価した。その結果、上記指標は年齢、死後経過時間(<48時間)と弱い相関がみられたが、死因や受傷後経過時間とより強い相関性を示した。体内AdrとNad値は右心血で最も高く、以下、左心血、心膜液、脳脊髄液の順であった。脳脊髄液中のAdr、Nad、DAおよび5-HT値は、頭部外傷、溺死、凍死と火災死では上昇が認められず、鈍器損傷の非頭部外傷、窒息および中毒で顕著な上昇が認められた。さらに、DAは絞頸で縊死より顕著な高値を示した。5-HTは睡眠薬中毒で高値となり、覚せい剤中毒ではそれよりも有意に低かった。また、鋭器損傷、熱中症、急性心臓死や肺感染症ではDAの上昇はみられず、5-HTの顕著な上昇が認められた。一方、脳脊髄液のAdr、Nad、DA値は、血液および心膜液内の値と有意な相関性を示した。しかしながら、血液・心膜液中の上記指標の値は、脳脊髄液とは異なっており、それらと神経組織形態学指標との関連について検討する必要があると考えられた。以上のように、上記神経伝達物質の血液、心膜液および脳脊髄液における分析は体内外因性ストレス(痛み)反応や薬物の影響を反映しているものと考えられた.本研究では,大脳辺縁系・脳幹における急性ストレス反応を解明することを目的としている.各種中毒死例の脳組織内・脳脊髄液・血液における神経伝達物質であるドーパミン,セロトニン,アドレナリンとノルアドレナリンを測定し,マクロ的な急性ストレス反応を評価した.急性中毒死の36剖検例と非中毒死136例について血液,心膜液および脳脊髄液のアドレナリン(AD),ノルアドレナリン(NA),ドパミン(DA)およびセロトニン(5-HT)の測定値を比較検討した.中毒死では心内・末梢血,心膜液および特に脳脊髄液のDAの上昇が特徴的で,血中ADとNA,心膜液および脳脊髄液のNAと5-HTの上昇傾向がみられた.薬毒物別にみると,覚せい剤中毒では各部位のカテコラミン類が上昇傾向を示し,特に心内血と心膜液のADが高値であったが,血中濃度は症例によって大きく異なり,心膜液の5-HTは低値であった.向精神薬中毒では各部位のDAおよび心膜液のADは低値で,それ以外は覚せい剤と同様の上昇傾向がみられた.一酸化炭素中毒においては各部位のNAおよびDA並びに心膜液および脳脊髄液の5-HTは高値を示した.これらの濃度分布は各薬毒物の中毒作用を反映している可能性がある.また,致死的外傷が生体に及ぼす病態を解明するため,剖検例336例におけるエリスローポエチン(EPO)およびC反応性蛋白(CRP)濃度を分析した.損傷死に関しては,急性死(生存時間1時間以内),亜急性死(同11日以内)と遷延死(同1日1週間以内)に分けて検討した.その結果,右心内血EPOは,鈍器損傷例で,急死,亜急死および遷延死群の順に有意差が認められた.

亜急死群では多発外傷死群が有意な高値を示した(p<0.01).鋭器損傷死群では,心臓・大動脈損傷群が腹部臓器・静脈損傷群よりも有意な高値を示した(p<0.001).一方,右心内血CRPは,鈍器損傷例の単独外傷群で,急死,亜急死および遷延死群の順に有意差が認められた(p<0.01),全例における右心内血EPOおよびCRPの測定値と受傷後経過時間との関係は,それぞれ有意な上昇が認められた.特に,鈍器損傷死の急死・亜急死例では,右心血EPOおよびCRPは多発外傷群で顕著な上昇を示した(r=0.8,p<0.001),以上から1日以内生存例の右心血EPO上昇の要因としては,外傷の重傷度と受傷後生存時間が最も影響したと考えられ,1日以上生存例では低酸素血症や感染症が影響したと考えられた.
高立体選択的な反応の開発に基づく生物活性天然物の全合成研究

我々が開発した高立体選択的に進行するビニロガス向山アルドール反応を利用し、カフレフンジン、TMC-151Cの全合成を達成することができた。また、この合成研究の過程で、E-選択的8員環閉環メタセシス反応を見出した。不斉三級アルコールを含む1,2-ジオールの不斉合成法の応用展開としてナフレジンγのコア部分の合成を達成した。一方、不斉三級アルコールを含む1,3-ジオールの立体選択的合成法を利用しディバーシフォリンの全合成を達成することができた。既に報告しているビニルケテンアセタールとアルデヒドのビニロガス向山アルドール反応は、ポリケチド化合物の骨格によく見られる部分構造を一挙に構築でき、これら一連の化合物合成の有力な手法になるものと考えている。抗菌性物質カフレフンジンはこの部分構造を二箇所に含んでおり、本方法論の有用性を示す格好の標的分子といえる。そこで、カフレフンジンの全合成について検討した結果、本方法論を利用して合成した2つのフラグメントを結合する方法によって全合成を達成することができた。さらに本手法を適用し、この部分構造を3個有するTMC-151Cの全合成研究に着手した。さらに、本反応は通常のアルデヒドだけでなく、環状ケトアミドであるイサチンに対しても極めて高立体選択的に付加することを明らかにし、この方法を利用してコンボルタミジン類のエナンチオ選択的な合成を行い、さらに天然物の絶対立体配置の決定を行った。また本反応は、α位にヘテロ原子を有するアルデヒドの場合には、通常のアルデヒドと異なる立体選択性を発現するという興味ある結果を見出した。立体選択性発現機構については、次年度の課題としている。1,2-あるいは1,3-ジオールは生物活性物質でよく見られる部分構造であるが、不斉三級水酸基を有する場合の立体制御は困難とされている。我々は、ヒドロキシプロピオン酸由来のキラルなイミドとアルデヒドのアルドール反応による1,3-ジオールの立体制御法を確立しており、昨年度はナフレジンγの合成について検討した。本合成研究では、不飽和アルデヒドを基質として用いる必要があるが、不飽和アルデヒドの場合は通常のアルデヒドと異なり、収率、選択性が大幅に低下することが明らかとなった。これらの課題は次年度の検討課題となった。この部分構造を二箇所に含んでいる抗菌性物質カフレフンジンの全合成は昨年度達成し、今年度はこの部分構造を3個有するTMC-151Cの全合成研究に着手した。種々検討した結果、本ビニロガス向山アルドール反応を二回利用し、オレフィンメタセシスによるアプローチを試みた。最終的には二つのセグメントをシリレンテザーで結合してからオレフィンメタセシス(閉環メタセシス)によって両者を結合することができた。しかも、8員環にもかかわらず、所望のEオレフィンを与えることを見出し、アグリコン部分の合成を達成することが出来た。NFκBの活性を阻害する生物活性と炭素10員環骨格からなるディバーシフォリンに興味をもち、メタセシスを利用する戦略を立てて全合成研究を行ない、昨年度までに炭素10員環骨格の構築に成功していた。本年度は、全合成に向けてのその後の展開を試み、効率的ラクトントランスポジション、アルドール反応によるヒドロキシメチル基の導入とデオキシ化などのいくつかの反応を開発することによってディバーシフォリンの最初の全合成に成功した。合成の終盤は少量での変換であり、各工程の収率の向上とデータの収集が今後の課題である。本年度は本研究の最終年度にあたり、多くの成果を挙げることができた。昨年度、TMC-151Cの合成研究で見出した8員環閉環メタセシスでE型オレフィンを与えるという前例のない極めて興味深い手法をTMC-151Cの直截的な全合成に適用すべく、両フラグメントの合成を行った。一般にマンノースのβ-グリコシル化は困難とされているが、Crichの方法を利用することで高収率、高選択的に行うことができた。また、シリコンテザー化もジエチルアミノジフェニルクロロシランを用いることで、立体的に嵩高い系でもよい収率で進行した。8員環閉環メタセシスもモデル系と同様にE-選択的に進行し、最後にすべてのシリル保護基を一挙に外すことでTMC-151Cの全合成を達成することができた。一方、NF-κBの活性阻害物質ディバーシフォリンの合成研究については、これまであまり例が少ない閉環メタセシスによって炭素10員環形成を行うことができた。当初はメチル基のないモデル系での検討を行ったが、後の段階でメチル基を導入することができ、ディバーシフォリンの最初の全合成に成功した。

本合成はTHL誌のカバー図に採用されることとなった。本合成ではメチル基を導入するために数工程を要するのが課題の一つとなっている。さらに検討した結果、ある特定の立体化学を有する基質のみ閉環メタセシスが進行することを見出し、第二世代のディバーシフォリンの全合成にも成功した。ナフレジンγの合成に関しても、成果を挙げることができた。すなわち、我々の開発した不斉三級水酸基を含む1,3-ジオールの立体制御法を利用することによって、これまでは10数工程を要した重要合成中間体を数工程で合成することができた。今後、側鎖部分との連結についても検討する計画である。
新薬開発を飛躍的に効率化するハイスループットスクリーニングシステムの開発研究

薬物相互作用の主な原因のひとつに,ヒトにおける主要な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の阻害が含まれる.そのため近年ではCYPを阻害する物質は医薬品の開発段階で除外される流れにある.この阻害作用の有無の予測を開発の初期に行うことができれば大幅な効率化につながると期待される.このことから,膨大な数の候補化合物をヒトCYPに対する影響を基準に絞りこむための系として,ハイスループットスクリーニング(HTS)システムによるヒトCYPの触媒活性測定法の開発が待たれている.ヒトCYPの触媒活性の測定を大規模に行うためにはヒトCYPが大量に必要とされる.そこで本研究では,大腸菌を宿主としたヒトCYPの大量発現系の樹立,およびそれを用いた薬物相互作用の大規模試験系の確立を目的とした.13種類のヒトCYP(CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4,CYP3A5およびCYP3A7)をそれぞれ大腸菌に発現させることに成功した.大腸菌に発現したヒトCYPを用い,カルシウム拮抗薬であるニカルジピンが抗癌薬であるタキソールのCYP2C8による代謝を強力に阻害することを見出し,大腸菌に発現したCYPを用いて薬物相互作用を検討できることを示した.大腸菌に発現したヒトCYPをHTSに応用するため,これらの大腸菌を全容10Lの大量培養装置にて培養し,一度に大量のCYPを得ることを可能にした.我々はさらに,マイクロプレートを用いてクマリン7-水酸化酵素活性(CYP2A6)および7-エトキシレゾルフィン0-脱エチル化酵素活性(CYP1A1)を測定する系を確立した.これらの系を応用することによりヒトにおける薬物相互作用を短時間に,しかも大量に検討できるようになり,医薬品開発の効率化に貢献できると期待される.薬物相互作用の主な原因のひとつに,ヒトにおける主要な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の阻害が含まれる.そのため近年ではCYPを阻害する物質は医薬品の開発段階で除外される流れにある.この阻害作用の有無の予測を開発の初期に行うことができれば大幅な効率化につながると期待される.このことから,膨大な数の候補化合物をヒトCYPに対する影響を基準に絞りこむための系として,ハイスループットスクリーニング(HTS)システムによるヒトCYPの触媒活性測定法の開発が待たれている.ヒトCYPの触媒活性の測定を大規模に行うためにはヒトCYPが大量に必要とされる.そこで本研究では,大腸菌を宿主としたヒトCYPの大量発現系の樹立,およびそれを用いた薬物相互作用の大規模試験系の確立を目的とした.13種類のヒトCYP(CYP1A1,CYP1A2,CYP1B1,CYP2A6,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4,CYP3A5およびCYP3A7)をそれぞれ大腸菌に発現させることに成功した.大腸菌に発現したヒトCYPを用い,カルシウム拮抗薬であるニカルジピンが抗癌薬であるタキソールのCYP2C8による代謝を強力に阻害することを見出し,大腸菌に発現したCYPを用いて薬物相互作用を検討できることを示した.大腸菌に発現したヒトCYPをHTSに応用するため,これらの大腸菌を全容10Lの大量培養装置にて培養し,一度に大量のCYPを得ることを可能にした.我々はさらに,マイクロプレートを用いてクマリン7-水酸化酵素活性(CYP2A6)および7-エトキシレゾルフィン0-脱エチル化酵素活性(CYP1A1)を測定する系を確立した.これらの系を応用することによりヒトにおける薬物相互作用を短時間に,しかも大量に検討できるようになり,医薬品開発の効率化に貢献できると期待される.CYP3A4は、成人肝に発現する最も主要なP450分子種であり、現在臨床応用されている医薬品の50%強の代謝に関与するため、ハイスループットシステム(HTS)構築の最初の標的酵素としては最適である。HTS構築のためには、酵素源は大量かつ迅速に調整する必要があるため、ヒトCYP3A4を短時間に大量発現できる大腸菌発現系が最適と考えられるが、大腸菌にはCYPが酵素活性を発現するために必須なNADPH-cytochrome P450還元酵素(OR)がない。そこで本年度はCYP3A4とORを同時に大腸菌内に発現できる発現系を樹立した。発現した酵素は酵素活性を有しており、CYP3A4の基質薬物を用いて速度論的解析を行って、ヒト肝ミクロゾームでの結果と比較した結果、HTSに応用するために充分な酵素活性を示した。またCYP3A4はその活性発現にチトクロームb_5(b_5)を要求する場合があり、肝臓での活性をより正確に反映するためには、b_5の添加を考慮する必要がある。したがってb_5の高効率な精製法を確立した。この場合、b_5は、動物種間でアミノ酸配列がきわめて良く保存されており、機能的にもほとんど差がないことを当研究室ですでに明らかにしているため、ヒト肝ミクロゾームから精製する必要はなく、他の動物種の肝臓で代用した。非イオン性の界面活性剤と水溶性ポリマーの相分配を利用して、従来行われていた数本のカラム操作を省くことによって、精製にかかる時間短縮と回収率の向上に成功した。

精製したb_5は-80°Cで長時間安定に保存できるため、HTSのツールに有用であると考えられる。本研究では現在臨床応用されているCYPで代謝される医薬品の50%強の代謝反応に関与するチトクロームP450(CYP)分子種であるCYP3A4による薬物間相互作用をインビトロで効率的に予測するハイスループットシステム(HTS)構築を目指している.CYP3A4の代謝反応では,小胞体電子伝達成分のチトクロームb_5(b_5)が関与する例がしばしば観察されているが,現在までどのような医薬品の代謝反応にb_5が関わるのか明らかにされていない.しかしながら,CYP3A4による医薬品代謝を生体内により近い条件でインビトロで再現するためには,b_5の共存下で反応を行うべきことは避けられないと予想される.そこで本年度はまず,ヒトのb_5を大量に発現可能な大腸菌発現系の開発を目指し,大腸菌用の発現ベクターpCWに,当研究室で単離したヒトb_5cDNAを挿入し,b_5発現プラスミドを構築した.Westernブロッティングおよび,酸化-還元差スペクトルより,b_5の発現を確認した.ついでb_5が局在する膜画分を調製し,現在臨床応用されている約15種類の医薬品の,CYP3A4での代謝を,b_5非存在下とb_5存在下で比較検討した.検討した医薬品のうち,汎用されているCa拮抗薬であるジルチアゼム,抗うつ薬のイミプラミン,デシプラミン,アミトリプチリン,クロミプラミンなどの薬物は,b_5の共存によりその代謝活性が顕著に上昇したが,同じ抗うつ薬でもノルトリプチリンでは,b_5共存下でその代謝が40%まで抑制された.その他の医薬品については,b_5共存下非共存下でも代謝活性にほとんど差が認められなかった.以上のことから,CYP3A4のHTSを構築する場合,b_5共存下で反応を行うことは,CYP3A4が代謝を触媒する医薬品によってはその活性に顕著に影響することを明らかにした.今後はさらに多くの医薬品の代謝におけるb_5の影響を検討し,医薬品の構造-b_5要求性相関を明らかにすることで,生体内をより正確に予測できるHTS構築の基礎的情報を得る必要があると考えられる。薬物相互作用の主な原因のひとつに,ヒトにおける主要な薬物代謝酵素であるチトクロームP450(CYP)の阻害が含まれる.そのため近年ではCYPを阻害する物質は医薬品の開発段階で除外される流れにある.この阻害作用の有無の予測を開発の初期に行うことができれば大幅な効率化につながると期待される.このことから,膨大な数の候補化合物をヒトCYPに対する影響を基準に絞りこむための系として,ハイスループットスクリーニング(HTS)システムによるヒトCYPの触媒活性測定法の開発が待たれている.ヒトCYPの触媒活性の測定を大規模に行うためにはヒトCYPが大量に必要とされる.そこで本研究では,大腸菌を宿主としたヒトCYPの大量発現系の樹立,およびそれを用いた薬物相互作用の大規模試験系の確立を目的とした. 13種類のヒトCYP(CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5およびCYP3A7)をそれぞれ大腸菌に発現させることに成功した.大腸菌に発現したヒトCYPを用い,カルシウム拮抗薬であるニカルジピンが抗癌薬であるタキソールのCYP2C8による代謝を強力に阻害することを見出し,大腸菌に発現したCYPを用いて薬物相互作用を検討できることを示した.大腸菌に発現したヒトCYPをHTSに応用するため,これらの大腸菌を全容10Lの大量培養装置にて培養し,一度に大量のCYPを得ることを可能にした.
統計的決定理論によるのり面危険度判定の支援システムに関する基礎的研究

本研究は道路公団中央自動車道の多治見諏訪間のような山岳切り取りのり面の安全性の評価を,単に土質力学的な視点から究明するものではなく,既往のり面の崩壊・未崩壊事例に基づいて素因の分析とそのデータベースに基づき,対象のり面の危険度判定を行うための統計的決定理論による意思決定支援システムを構成したものである.本研究の成果を要約すると以下のようである.(1)中央自動車道のり面・斜面の崩壊・未崩壊事例の収集・整理を行った.その結果,斜面崩壊の形態はすべり面が高々12mの浅いものが多く,のり面保護は植生である場合に崩壊が多いこと,連続雨量では100200mm,最大時間雨量は2040mm程度であることを明らかにした.(2)飽和・不飽和浸透解析を基礎とした降雨時の斜面安定解析法による事例解析を実施するために,崩壊履歴のある斜面において現位置土質調査と不攪乱土質試験の室内試験を実施した.不飽和土の強度係数を求めるために三軸圧縮試験を排気・排水条件別に実施し,それらの強度差を明らかにした.(3)(2)で得られた各種入力データに基づいた事例解析を実施した.その結果降雨時の斜面安定解析法に用いるべき強度試験法としては,排気・非排水試験で十分であること,ひずみレベルによる不飽和土の強度差は解析結果にあまり影響しないことが明らかとなった.また,各種入力パラメータの安全率の絶対値に与える影響が大きいので,安全率の低下速度に着目した方法も検討した.この方法によれば,一般に知ることが困難である地盤内の初期飽和度などの影響にあまり依存されず,崩壊発生時で指摘することができる.なお,これらの解析と多数収集・整理された崩壊・非崩壊データに基づきのり面危険度判定の支援システムを開発中である.本研究は道路公団中央自動車道の多治見諏訪間のような山岳切り取りのり面の安全性の評価を,単に土質力学的な視点から究明するものではなく,既往のり面の崩壊・未崩壊事例に基づいて素因の分析とそのデータベースに基づき,対象のり面の危険度判定を行うための統計的決定理論による意思決定支援システムを構成したものである.本研究の成果を要約すると以下のようである.(1)中央自動車道のり面・斜面の崩壊・未崩壊事例の収集・整理を行った.その結果,斜面崩壊の形態はすべり面が高々12mの浅いものが多く,のり面保護は植生である場合に崩壊が多いこと,連続雨量では100200mm,最大時間雨量は2040mm程度であることを明らかにした.(2)飽和・不飽和浸透解析を基礎とした降雨時の斜面安定解析法による事例解析を実施するために,崩壊履歴のある斜面において現位置土質調査と不攪乱土質試験の室内試験を実施した.不飽和土の強度係数を求めるために三軸圧縮試験を排気・排水条件別に実施し,それらの強度差を明らかにした.(3)(2)で得られた各種入力データに基づいた事例解析を実施した.その結果降雨時の斜面安定解析法に用いるべき強度試験法としては,排気・非排水試験で十分であること,ひずみレベルによる不飽和土の強度差は解析結果にあまり影響しないことが明らかとなった.また,各種入力パラメータの安全率の絶対値に与える影響が大きいので,安全率の低下速度に着目した方法も検討した.この方法によれば,一般に知ることが困難である地盤内の初期飽和度などの影響にあまり依存されず,崩壊発生時で指摘することができる.なお,これらの解析と多数収集・整理された崩壊・非崩壊データに基づきのり面危険度判定の支援システムを開発中である.
マイクロプラズマによるシリコン量子ドット合成と量子ドット増感太陽電池への応用

シリコンは結晶のサイズを10nm以下にすることで量子サイズ効果が発現し,その大きさによってバンドギャップの大きさを制御できる。すなわち,結晶のサイズによって吸収する太陽光スペクトルを紫外から近紫外までチューニングすることができる。このような,量子サイズ効果を利用した次世代太陽電池の開発が世界中で行われているが,発電効率20%を上回る太陽電池の開発は未だ報告されていない。その原因として,量子ドットのサイズ分布や位置制御を原子スケールで制御するには至っていないことがあげられる。本研究では,予め気相合成したシリコンナノ粒子を溶媒に分散させたシリコンインクを作製し,これをスピンキャスティング(塗布プロセス)によって均一な薄膜に加工する方法を開発した。これを用いて光吸収特性を調べた結果,シリコンの直接遷移に相当するエネルギーギャップ(紫外領域)に顕著なサイズ効果が出現することを明らかにした。一方,間接遷移に対応するエネルギーギャップ(可視近赤外)には明確なサイズ依存性が発現しないことも同時に明らかにした。そこで,量子サイズ効果だけでなく,大きな比表面積を有する点に着目し,p型半導体有機材料(P3HT)とシリコン量子ドットをブレンドし,バルクヘテロジャンクション(BHJ)構造を有する量子ドット増感太陽電池を開発した。その結果,シリコン量子ドットの重量割合が約60%に相当する場合,発電効率約1%を達成した。これは,我々が既に開発したショットキーバリア太陽電池の発電効率0.01%をはるかに上回っており,適切な半導体材料との組み合わせにより,シリコン量子ドットによる光キャリアの生成,分離,輸送を改善できることを明確に示している。今後,より分散性の高いシリコンインクの作製と最適なBHJ構造の探索,さらにシリコン量子ドットのドーピングが,飛躍的な効率向上に不可欠である。次世代高効率を実現するためのキーマテリアルとして,シリコン量子ドット(Si-QD, Silicon Quantum Dots)が大きな注目を集めている。一般的なSi-QDの合成法として,シリコン亜酸化物やアモルファスシリコンの薄膜をプラズマCVD,イオンドープ等で予め制作し,その後高温で熱処理してナノ結晶へ相変化させる方法がある。しかし,ナノ結晶への相変化には1000°Cを超える高温で熱処理が必要になるため,太陽電池を構成するSi-QD以外の材料に熱的なダメージを与えたり,不純物の拡散を促すなどの問題が指摘されている。他方,レーザーアブレーションなどの気相合成法では予め微粒子を合成するためデバイス設計の自由度は高まるが,ナノ粒径のサイズ制御,位置制御が難しいことに加え大量生産に向かない。このような現状を鑑み,本研究ではマイクロプラズマCVDによるシリコン量子ドットの気相連続合成法を開発した。さらに,Si-QDを有機溶媒に分散させたコロイド溶液を作成し,これをスピンコーティングによって薄膜化し,Si-QDを含有した増感太陽電池の開発を試みた。本年度の研究では,Si-QDのサイズ制御及び結晶サイズに依存したフォトルミネッセンスの制御に成功した。一方,シリコン原料として四塩化ケイ素を用いているため,残留塩素によってSi-QDが著しく酸化されるほか,アルミなどの電極材料を腐食させる問題が顕在化した。四塩化ケイ素は太陽電池の低コスト化において重要な要素であることから,来年度以降は,残留塩素を最小限にとどめるためのプラズマCVD法の改良と太陽電池の開発を実施する予定である。シリコンは結晶のサイズが10nmより小さくなると量子サイズ効果が出現し,結晶のサイズによってバンドギャップの大きさを制御できる。すなわち,結晶のサイズによって吸収する太陽光スペクトルを紫外から近赤外までチューニングできる可能性があり,実用に供されている結晶系シリコン太陽電池の効率20%を大幅に上回る40%を実現できる可能性がある。さらに,シリコンは安全性が高く豊富に存在する資源であることから,シリコン量子ドットは次世代太陽電池の実現に不可欠なキー・マテリアルとして期待が寄せられている。これまでの研究では,新たに開発したインフライト・プラズマCVD法を用い,サイズが揃ったシリコンナノ結晶(3nm10nm±1nm)を連続的に合成することに成功している。さらに,シリコン量子ドットを有機溶媒に分散させたシリコンインクを用いることでシリコン量子ドットを薄膜化し,ショットキーバリア太陽電池を制作した。透明電極(ITO)に50nmから3nmの厚さでシリコン量子ドットをスピンコーティングによって製膜し,その上部にアルミ電極を真空蒸着によって製膜した。模擬太陽光の照射によってVoc=0.19V,JSC=9μA/cm^2の発電特性を示すことを確認した。残留した塩素によってシリコン量子ドット(ノンドープ)はp型半導体と類似の特性を示した。一方,課題として,塩素による電極の腐食が新たな問題として明らかになったほか,使用する溶媒の種類によって太陽電池発電特性の時間遅れが発生することが明らかとなった。

一方,間接遷移に対応するエネルギーギャップ(可視近赤外)には明確なサイズ依存性が発現しないことも同時に明らかにした。そこで,量子サイズ効果だけでなく,大きな比表面積を有する点に着目し,p型半導体有機材料(P3HT)とシリコン量子ドットをブレンドし,バルクヘテロジャンクション(BHJ)構造を有する量子ドット増感太陽電池を開発した。その結果,シリコン量子ドットの重量割合が約60%に相当する場合,発電効率約1%を達成した。これは,我々が既に開発したショットキーバリア太陽電池の発電効率0.01%をはるかに上回っており,適切な半導体材料との組み合わせにより,シリコン量子ドットによる光キャリアの生成,分離,輸送を改善できることを明確に示している。今後,より分散性の高いシリコンインクの作製と最適なBHJ構造の探索,さらにシリコン量子ドットのドーピングが,飛躍的な効率向上に不可欠である。当初の予定どおりショットキーバリア太陽電池を制作することに制作し,さらにその発電特性を評価するためのシステムを立ち上げた。一連の研究により現状の課題を明確にすることができた。本研究では,安価で豊富な四塩化ケイ素(SiCl_4)を原料にしていることが特徴の一つである。一方,シリコン量子ドットに残留した塩素が電極材料を腐食したり,量子ドット薄膜のキャリア導電率が変化するなどの課題が明らかになった。平成24年度の研究では,量子ドット薄膜の熱処理による脱塩素処理の検討,及び量子ドット薄膜の膜厚と光吸収波長依存性及びキャリア易動度の関係を明確にする。
メチル化異常の網羅的解析による食道胃接合部腺癌の新たな分類と治療標的分子の探索

昨年度の検討で予後不良と相関したLINE-1低メチル化の悪性度に及ぼす原因を検討するために、LINE-1メチル化レベルを四分位点で4群(LINE-1メチル化レベルが低いものから順にQ1, Q2, Q3, Q4と定義)に分類し詳細に検討した。Q1群は有意に男性が多く(Q1, Q2, Q3, Q4順に92%, 86%, 78%, 81%, P=0.047)、病理組織型分類であるLauren分類でintestinal型が多かったが(84%, 80%, 76%, 62%, P=0.0041)、TNM Stageなどには有意な差を見いだせなかった。4群間の再発部位に有意な特徴を見いだせなかった。また腫瘍免疫の観点から、4群間で腫瘍細胞のPD-L1の発現状態には差を見いだせないものの、最も低メチル化を示したQ1群では腫瘍内部に浸潤したCD8陽性細胞数が最も低く、腫瘍辺縁に浸潤したFOXP3陽性細胞数が最も高値を示した。さらに興味深いことにTP53 IHCでまったく染色されないnull型の変異や、シーケンス上truncationタイプのTPP53変異がQ1群で有意に高頻度に検出され(いずれもP<0.0001)、Ki-67 indexも有意に高いことから、低メチル化群のがん細胞はChromosomal instabilityが高く、細胞周期関連の異常が高悪性度の原因ではないかと推測される。CHFR, MGMT, CDKN2Aのメチル化レベルの測定をMethylight-PCR技術を用いて測定したところ、LINE-1との相関はCDKN2AとCHFRで良好に相関し(P<0.0001)、これらがん抑制遺伝子の関与が強く示唆された。低メチル化群への治療としてはHER2 IHC強陽性のものが比較的頻度がたかく(17%,18%,12%,6%, P=0.12)、トラスツズマブの可能性が考察された。本研究では、食道胃接合部腺癌には(1)バレット食道由来のもの、(2)胃噴門上皮を由来のもの、に大別されるとの仮説を、網羅的に解析することである。ゲノム全体のメチル化の指標とされるLINE-1メチル化レベルの検討を、申請時N=160であったが、さらに症例数を増やし、N=353で解析した。Siewert type別に検討したところ、やはり、食道側に存在するSiewert type I,食道と胃の間に存在するtype IIが、胃側に主に占居するtype IIIよりも有意にLINE-1低メチル化の影響を受けていることが判明した(P<0.05)。またバレット食道の併存の有無での検討では、やはりバレット食道ありの腫瘍において有意にLINE-1低メチル化を認めた。Molecular subtype別の検討をおこなったところ、MSI-highやEBV関連の食道胃接合部癌ではやはりLINE-1は高メチル化状態を認め、LINE-1自体が本疾患でのゲノムワイドなメチル化の指標となることが再確認された。さらに、LINE-1メチル化状況を4分割し予後解析を行ったところ、LINE-1メチル化が高いものは予後良好、低いものになるにつれて良好曲線は下になる、メチル化レベル順に4つの予後曲線はそのメチル化レベルとパラレルに相関することが判明した。以上より、本疾患のメチル化レベルは、予後と相関することが多数例を用いた検討で明らかとなった。また、CHFR, MGMT, CDKN2Aのメチル化レベルの測定をMethylight-PCR技術を用いて測定可能かどうかの予備実験を継続中であり、どれも問題なく測定できることこれまでかくにんしている。これらは食道胃接合部腺癌のCpG Methlylator phenotypeとしての有用性が期待される。順調に進んでおり、特に理由はなし。

CHFR, MGMT, CDKN2Aのメチル化レベルの測定をMethylight-PCR技術を用いて測定したところ、LINE-1との相関はCDKN2AとCHFRで良好に相関し(P<0.0001)、これらがん抑制遺伝子の関与が強く示唆された。低メチル化群への治療としてはHER2 IHC強陽性のものが比較的頻度がたかく(17%,18%,12%,6%, P=0.12)、トラスツズマブの可能性が考察された。凍結組織がある術前化学療法を施行していない症例において、LINE-1メチル化レベルの検討と行い、高メチル化群3例、低メチル化群3例を選出し、網羅的メチル化解析を6例で検討する。それによって得られたデータから統計解析上指標となるような有意なマーカーを検索する。同時に、Nature 2017に発表されたTCGAの7312のCpGアイランドのメチルレベルの検討から、CHFR, MGMT, CDKN2A,APC, ITHAV, RUNX1, SMARCA4, SMAD4, FHIT, WWOX, CD44, ERBB2, MYC, VEGFAのメチル化レベルをMethylight-PCR技術を用いて追加解析し、上記により我々が選んだCpGマーカーとTCGAのマーカーの優越に関して比較検討を行う。TCGAのデータに関しては、BipPortalから得る。また不明なものに関しては、共同研究者であり、TCGA消化器癌のトップであるDana-Farber Cancer InstituteのDr. Adam J Bassから情報提供してもらう予定である。
ニューロブラストーマ・グリオーマ雑種細胞によるシナプス形成・伝達機構

伝達物質遊離能に関して、シナプス伝達の短期的変調を行うホスホイノシトールリン脂質代謝物に注目し、それらの作用から遊離に必須の要素を組織培養下の形成されたシナプスを用いて抽出した。以下具体的な結果について述べる。1.ニューロブラストーマ雑種NG108-15やその他の細胞の培養を行った。2.新生ラット後肢より筋細胞を分離培養し横紋筋を形成させる。前処理しない100200万個のNG108-15細胞を重層培養した。3.プロスタグランジンを加え分化させた。4.3日後に筋細胞線維に刺入したガラス微小管電極によりシナプス電位(MEPP)を記録し、シナプス結合を同定した。イノシトール代謝を上昇させるブラジキニン投与によりアセチールコリン遊離が促進した。この促進は(1)細胞外のCaを除いても生じた。さらに、(2)Buによりニューロブラストーマ細胞の膜電位変化を抑制した状態でも生じた。以上の結果から、イノシトール三リン酸依存的Ca^2の上昇のみでアセチールコリンの遊離が促進される事が証明された。プレシナプス性興奮のメカニズムの一つがこれと考えられた。
咀嚼筋の終日筋電図分析による顎口腔機能の行動科学的解析

平成2年度は,まず被験者1名の筋電図記録を用いて校正を行い記録条件の適正化を行った。ついで,決定された記録条件下で数回の予備実験を行い,条件を確認するとともに,デ-タレコ-ダをパ-ソナルコンピュ-タに接続し,AーD変換プログラムおよび分析プログラムを自作し,動作の確認を行った。以上の結果,記録分析システムが完成し,顎口腔系に機能異常を認めない個性正常咬合者22名(正常者群)および欠損を有しない顎口腔機能異常者11名(異常者群)について24時間の行動下における咀嚼筋筋電図を記録した。同時に被験者に1日の行動記録とその時刻を記録させた。平成3年度は,記録したテ-プを再生して積分することにより筋活動量を算出し,1日を(1)睡眼時(2)食事時(3)その他の3相に分類し,以下の項目について分析を行った。(1)各相の筋活動量,(2)各相の単位時間あたりの平均筋活動量,(3)各相の筋活動量が全体の筋活動量に占める割合,(4)各相の単位相時間あたりの平均筋活動量の全体の単位時間あたりの平均筋活動量と比較した場合の相対値,(5)食事時の平均活動量の50%および100%をスライスレベルとした場合の,睡眠時およびその他の相におけるスライスレベル以上の筋活動量が生じる時間の割合。その結果,正常者群と異常者群との間にほぼ類似した筋活動パタ-ンが認められた。しかし,相違点として異常者群では正常者群と比較して食事時の筋活動量が小さく,相対的に睡眠時の筋活動量が高いという極めて興味深い傾向が認められた。今後さらに,デ-タを集積することにより,行動科学的な新しい顎口腔機能評価法が開発可能であることが強く示唆され,この評価法の確立によって,潜在的な顎口腔機能異常者の早期発見の可能性が高まった。本年度はまず,1名の被験者を用いて,左右咬筋および側頭筋前腹を被検筋とし,ポ-タブルカセットレコ-ダ-にDRアンプを接続し,6時間の行動下における咀嚼筋活動を記録した。その際,キャリブレ-タを用いた記録と比較することにより,校正を行い、記録条件の適正化を行なった(大川が担当)。決定された記録条件下で数回の予備実験を行い、条件を確認するとともに、デ-タレコダ-をパ-ソナルコンピュ-タに接続し,AーD変換プログラムおよび分析プログラムを自作し,動作の確認を行なった(佐藤が担当)。以下の結果、記録分析システムが完成し、顎口腔系に機能異常を認めない,個性正常咬合者22名(正常者群)および欠損を有しない顎口腔機能異常者11名(異常者群)について24時間の行動下に置ける咀嚼筋筋電図を記録した。同時に被検者に1日の行動内容とその時刻および摂取した食事の内容を記録させた(長澤,大川が担当)。

現在は記録されたテ-プを再生し,パ-ソナルコンピュ-タで,(1)1分あたりの平均筋活動量,(2)各行動パタ-ンごとの平均筋活動量(睡眠,休息,食事,作業時など),(3)左右筋活動量比,(4)咬筋/側頭筋活動量比を分析中であり(佐藤が担当),来年度はさらに被験者を増やし,各群30名づつとし,正常者群の行動内容と筋電図パラメ-タパタ-ンの関連性を検討し、さらに異常者群との比較を行い,顎口腔機能異常による筋電図パラメ-タパタ-ンの変化の詳細について検討を行なう予定である。前年度の研究により終日筋電図の記録分析システムが完成し,顎口腔系に機能異常を認めない個性正常咬合者22名(正常者群)および欠損を有しない顎口腔機能異常者11名(異常者群)について24時間の行動下における咀嚼筋筋電図を記録した。平成3年度は,記録したテ-プを再生し,積分,AーD変換後,パ-ソナルコンピュ-タを用いて,自作のソフトにより分析を行った。すなわち,1日を(1)睡眠時(2)食事時(3)その他の3相に分類し,以下の項目について分析を行った。(1)各相の筋活動量,(2)各相の単位時間あたりの平均筋活動量,(3)各相の筋活動量が全体の筋活動量に占める割合,(4)各相の単位時間あたりの平均筋活動量の全体の単位時間あたりの平均筋活動量と比較した場合の相対値,(5)食事時の平均筋活動量の50%および100%をスライスレベルとした場合の,睡眠時およびその他の相におけるスライスレベル以上の筋活動量が生じる時間の割合。なお,24時間のデ-タが膨大であることから今回は咬筋に絞って分析を行った。その結果,正常者群と異常者群との間にほぼ類似した筋活動パタ-ンが認められた。しかし,(1)および(3)において,異常者群では睡眠時と食事時の値に差が認められなかったのに対し,正常者群では食事時の値に比較して睡眠時の値が有意に小さくなる傾向が認められた。すなわち,異常者群では正常者群と比較して食事時の筋活動量が小さく,相対的に睡眠時の筋活動量が高いという極めて興味深い傾向が認められた。今後さらに,デ-タを集積することにより,行動科学的な新しい顎口腔機能評価法が開発可能であることが強く示唆され,この評価法の確立によって,潜在的な顎口腔機能異常者の早期発見の可能性が高まった。
フグおよびイモリにおけるテトロドトキシンの起源と代謝

フグおよびイモリにおけるフグ毒(テトロドトキシン,以下TTX)の起源を外因性と仮定し,TTXの起源と代謝に関する以下の研究を行った。1.フグが捕食するかも知れない三陸沿岸産各種無脊椎動物27種について毒性スクリ-ニングを行ったが,いずれからも毒は検出されなかった。2.フグの体内におけるTTXの挙動を調べる手段としてカニュレ-ションにより無毒の養殖フグ血管内にTTXを投与し,血中におけるTTXの消長を調べたところ,血中TTXは投与後1時間までに濃度を急激に減じ,12時間以降は痕跡的になることから,TTXは速やかに減少し,各臓器に蓄積されるものと推察された。3.TTXの蓄積・排出状況を調べるため,無毒の養殖フグの腹腔内にTTXを投与後,経時的に臓器組織のTTX濃度を調べた。TTX量は12時間後まで,投与量の約半分にまで減少したが,それ以後はほぼ一定となった。TTXは筋肉には蓄積しにくく,大部分は肝臓に蓄積された。4.イモリの生息する沼の周辺においてイモリが捕食すると考えられる餌生物の毒性スクリ-ニングを行った。カワニナ,ミズカマキリなど数種の毒性を調べたが,いずれからも毒は検出されなかった。5.イモリの毒性には著しい個体差があるが,地域による差異もあることが分かり,何が地域差を生じさせているのかについて検討した結果,標高も影響するとの示唆を得た。6.天然イモリの成長に伴う毒性の変化を追跡したところ,幼生の毒性は低く,成体の毒性は高かった。亜成体の毒性は不明である。人工飼育イモリの毒性がどうなるかを知るため受精卵からイモリを飼育し,成長に伴う毒性の変化を追跡した。7.動物のTTXに対する抵抗性を調べる過程で,イソガニの体液中にTTXと反応し,抗TTX作用を持つ高分子成分のあることを発見した。従来のTTXの研究の中で起源と解毒法の二つが未解決の問題であるが,この発見は後者の解決につながる研究である。1.フグが捕食するかもしれない三陸沿岸産各種無脊椎動物27種について毒性をTTX分析器で調ベたが毒は検出されなかった。しかしクリゲヒモムシ,ミノヒラムシの抽出液の毒性をイワガニによる生物検定法で調べたところ,微量の毒の存在が示唆された。2.無毒の養殖フグの腹腔内にTTXを投与後,経時的に体内のTTX量を調ベたところ,TTX量は12時間後まで,投与量の約半分にまで減少したが,それ以後はほぼ一定となった。3.イモリ生息池周辺生物として,ミズカマキリ,ハサミムシ,カワニナなどの毒性を調べたが,毒は検出できなかった。一方TTXの起源として生息池の水中の細菌が考えられるため,生息池の水を濾過して固形物を得,その抽出液の毒性をイワガニを用いた生物検定で調べたところ,微量の毒の存在が示唆された。

4.天然イモリの成長に伴う毒性の変化を追跡した結果,幼生(0.5g以下)の毒性は低く(10MU/g以下),成体(体重3g以上)の毒性は高かった。亜成体の毒性は亜成体の採集が因難であるため不明である。5.天然イモリの毒性の個体差は著しい。天然イモリの飼育中の毒性変動の有無を知るため,イモリの同一個体の尾を10日おき,または切り取り,その毒性を調べたが毒性に経時的変化はみられなかった。なお,岩手県産イモリと三重県産イモリの毒性を比較したところ,三重県産の方が有意に低く,毒性に地域差があることが示唆された。6.養殖フグは無毒であるが,人工飼育イモリの毒性がどうなるかを知るため受精卵からイモリを飼育し,成長の伴う毒性の変化を追跡している。飼育が難しく飼育途中での死亡率が高いのが問題であるが,飼育を続けている。フグおよびイモリにおけるフグ毒(テトロドトキシン,以下TTX)の起源を外因性と仮定し,TTXの起源と代謝に関する以下の研究を行った。1.フグ体内におけるTTXの挙動を調べる手段として,カニュレ-ションにより無毒の養殖トラフグ血管内にTTXを投与し,抵抗性および血中におけるTTXの消長を調べた。トラフグにおける血管内投与時の半数致死量は140ー150MU/20gであり,腹腔内投与時の半数致死量,400ー500MU/20gよりも少なかった。血中TTXは投与後1時間までに濃度を急激に減じ,12時間以降は痕跡的になった。TTXは血中から速やかに減少し,各臓器に蓄積されるものと推察されたが,このことは,致死量末満の投与ならばある程度時間をおけば何度投与しても死に至らずに毒を蓄積できることを示唆している。2.イモリの毒性には著しい個体差があるが、地域による差異もみられ,山間部のイモリは毒性が強く,平地のイモリは毒性が低い傾向のあることに注目し,何が地域差を生じさせているのかについて検討した。そこで岩手県三陸町内の標高3mから標高350mに位置する水田4箇採から採集したイモリの毒性を比較したところ,標高と毒性の間に正の相関関係がみられ,水田という同じ環境下では標高が毒性に影響するとの示唆を得た。3.動物のTTXに対する抵抗性を調べる過程で,カニ類の抵抗性には著しい種差のあることがわかり,イソガニのTTXに対する高い抵抗性の原因を追求したところ,イソガニの体液中には,TTXと結合し,抗TTX作用を持つ高分子成分の存在することを発現した。またこの物質の前投与はマウスに対するTTXの毒作用を軽減した。従来のTTXの研究の中で起源と解毒法の二つが未解決の問題であるが,この発見は後者の解決につながる研究である。
Cキナーゼの基質蛋白質MARCKSとGAP-43の神経伝達物質放出における役割

従来より開発を進めていたキャピラリー高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレー質量分析計に直結したLC/MS法を確立し、それを用いてMARCKS、GAP-43、シナプシンI、MAPIB等の脳特異的リン酸化タンパク質のin vivo(生体内)における翻訳後修飾の詳細な検討を行った.その結果、従来、Cキナーゼや、CaMキナーゼII、カゼインキナーゼIIなどの基質として知られてきたこれらのタンパク質が、いずれも、プロリン残基の直前のセリン/スレオニンをリン酸化するいわゆるプロリン指向性キナーゼいよりリン酸化されていることを見い出した。脳に大量に発現しているプロリン指向性キナーゼであるMAPキナーゼ及びCdk5キナーゼによる、in vitroでのリン酸化の解析により、これらキナーゼが、部位特異的にこれらタンパク質をリン酸化すること、また、キナーゼのみでは説明できないリン酸化部位があることから脳には未知のプロリン指向性キナーゼが発現しているらしいことなどが明らかになった。またMAPキナーゼによるシナプシンIのリン酸化により、シナプシンIによるアクチン繊維のバンドリング活性が減少することから、神経伝達物質の放出、及びその調節において、これらのリン酸化がCキナーゼ、CaMキナーゼIIと同様或いはそれ以上に重要な役割を果たしていることが示唆された.また、MAPIBのリン酸化が培養大脳皮質ニューロン間のシナプス形成に必須であることを見出した.これらの結果は、伝達物質放出の制御、神経突起の伸長、シナプス形成などにおいて、MAPキナーゼ、Cdk5キナーゼをはじめとするプロリン指向性キナーゼの究明が必須であることを示している.従来より開発を進めていたキャピラリー高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレー質量分析計に直結したLC/MS法を確立し、それを用いてMARCKS、GAP-43、シナプシンI、MAPIB等の脳特異的リン酸化タンパク質のin vivo(生体内)における翻訳後修飾の詳細な検討を行った.その結果、従来、Cキナーゼや、CaMキナーゼII、カゼインキナーゼIIなどの基質として知られてきたこれらのタンパク質が、いずれも、プロリン残基の直前のセリン/スレオニンをリン酸化するいわゆるプロリン指向性キナーゼいよりリン酸化されていることを見い出した。またMAPキナーゼによるシナプシンIのリン酸化により、シナプシンIによるアクチン繊維のバンドリング活性が減少することから、神経伝達物質の放出、及びその調節において、これらのリン酸化がCキナーゼ、CaMキナーゼIIと同様或いはそれ以上に重要な役割を果たしていることが示唆された.また、MAPIBのリン酸化が培養大脳皮質ニューロン間のシナプス形成に必須であることを見出した.これらの結果は、伝達物質放出の制御、神経突起の伸長、シナプス形成などにおいて、MAPキナーゼ、Cdk5キナーゼをはじめとするプロリン指向性キナーゼの究明が必須であることを示している.本年度は従来より開発を進めていたキャピラリー高速液体クロマトグラフィーをエレクトロスプレー質量分析計に直結したLC/MS法を確立し、それを用いてMARCKS、GAP-43、シナプシンI、MAPIB等の脳特異的リン酸化タンパク質のin vino(生体内)における翻訳後修飾の詳細な検討を行った.その結果、従来Cキナーゼや、CaMキナーゼII、カゼインキナーゼIIなどの基質として知られてきたこれらのタンパク質が、いずれも、プロリン残基の直前のセリン/スレオニンをリン酸化するいわゆるプロリン指向性キナーゼによりリン酸化されていることを見い出した。脳に大量に発現しているプロリン指向性キナーゼであるMAPキナーゼ及びCdk5キナーゼによる、in vitroでのリン酸化の解析により、これらキナーゼが、部位特異的にこれらタンパク質をリン酸化すること、また、これらキナーゼのみでは説明できないリン酸化部位があることから脳には未知のプロリン指向性キナーゼが発現しているらしいことなどが明らかになった。またMAPキナーゼによるシナプシンIのリン酸化により、シナプシンIによるアクチン繊維のバンドリング活性が減少することから、神経伝達物質の放出、及びその調節において、これらのリン酸化がCキナーゼ、CaMキナーゼIIと同様或いはそれ以上に重要な役割を果たしていることが示唆された.また、MAPIBのリン酸化が培養大脳皮質ニューロン間のシナプス形成に必須であることを見出した.これらの結果は、伝達物質放出の制御、神経突起の伸長、シナプス形成などにおいて、MAPキナーゼ、Cdk5キナーゼをはじめとするプロリン指向性キナーゼの究明が必須であることを示している.申請者らは数年来、キャピラリーHPLCにエレクトロスプレー質量分析計を直結したLC/MS法を開発し、これを用いて、脳特異的リン酸化蛋白質の生体内での(in vivo)のリン酸化の解析を行っている.その過程で明らかとなったことは、従来Cキナーゼの生体内における主要基質と知られてきたMARCKSやGAP-43が、これらのキナーゼ以外の、MAPキナーゼ、Cdk5キナーゼなどのプロリン指向性キナーゼいわゆるSPキナーゼの基質となっていることである.

本年度はキャピラリー高速液体クロマトグラフィーにエレクトロスプレー質量分析計をオンラインで結合したLC/MS法を用い、神経伝達物質放出の制御に重要な役割を果たしていると考えられているシナプシンIの生体内におけるリン酸化部位を詳細に解析した.試料はウシ脳膜画分から酸性抽出、或いは界面活性剤により抽出後、定法により精製したものを用いた.その結果、従来その寄与が示唆されていたCaMキナーゼI/IIによるリン酸化部位以外の部位でシナプシンIがリン酸化されていること、この新しく見出されたリン酸化部位の直後にプロリンが存在することが明らかとなった.このことから、MAPキナーゼやCdk5キナーゼなどのプロリン指向性キナーゼが、シナプシンIをリン酸化し、そのリン酸化が伝達物質制御に重要であると考えられる.実際、in vitroでMAPキナーゼやCdk5はシナプシンIをリン酸化し、そのリン酸化はシナプシンIとアクチン繊維との相互作用に影響することを見出した.