hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
岩石強度の時間変化メカニズムに対する水の影響の解明

岩石強度変化メカニズムに対する水の影響を解明するため,高温高圧下及び種々の水蒸気圧下や真空雰囲気環境下で,岩石の摩擦強度を測定した.長期的な岩石強度変化プロセスにおいて,水が関与する化学作用(応力腐食作用)がプロセスの本質を担っているという作業仮説を実験的に検証した.岩石強度の時間変化(岩石強度弱化やヒーリング過程)メカニズムに対する水の影響に関しては,摩擦面の真の接触部分(アスペリティー)における,微小破壊がその本質で,強度の時間変化メカニズムとしては,ゆっくり進行する応力腐食反応が重要であることが明らかになった.岩石の摩擦強度に対する水の影響を明らかにするために,封圧下での圧縮実験に関する既存のデータについて検討した.特に,あらかじめ破断面の形成位置が予想できる岩石試料を使うことで,形成された断層面の摩擦を測定する際,条件が異なった複数回の実験の結果を比較検討できるように工夫した実験のデータを使用した.その結果,有効圧が同じでも,水のある場合とない場合では,摩擦強度とその温度依存性が異なることを確認した.これは物理的効果とは別の,水が関与する化学反応による効果(化学的効果)が働いていることを示唆するものである.さらに水がある状態では温度が上昇するにしたがって,断層面の摩擦強度が低下することがわかった.断層面の接触部分での微小破壊が化学反応に関係しているとすると,その反応速度は温度に依存するので,今回の結果はプロセスの時間スケールを短縮した観察したことに相当し,断層面の強度変化において化学反応が関与するプロセスが重要であるということを示唆している.また破断面の強度回復に関する実験・データ解析・考察を行った.過去に活動したとされる既存断層面を含む岩石試料を使った,封圧下での圧縮変形破壊実験を行った.新たに形成される断層面は既存面の位置に依存するが,その開始点を詳しく観察すると,既存面とは異なった場所から破壊が発生していることを見出した.これは,既存の断層面の強度が,破壊前のIntactな状態とほぼ同じレベルまで回復していることを示唆しており,このような破壊-回復を繰り返すことが,地表でみられる,幅をもった断層帯が形成されるメカニズムであると考えられる.この成果は,査読誌(国際誌)に公表した.本課題は2015/10/21に追加採択された.年度終盤より開始したので,今年度は研究計画にあった実験は十分できなかったが,既存のデータの再検討も含めて検討をすすめ,化学的効果の重要性を確認した.また,破壊面の強度回復とその地質学的意義に関しては,地質学的な意義を考察し,査読論文(国際誌)にその考察結果を公表できた.岩石強度の時間変化メカニズムに対する水の影響について,前年度の成果と既存データを総合し,水が関与する応力腐食作用が岩石物性の時間変化の本質であるという作業仮説を検証するためのモデル構築を継続しつつ,その応用や課題遂行の過程で開発した実験技術についてとりまとめた.応用例としては,誘発地震(注水等の人為的行為によって発生する地震)のリスク低減は重要課題である.現在開発されている地熱貯留層は比較的低温・低圧領域であるため脆性的な力学挙動を示し,誘発地震を引き起こすが,超臨界地熱貯留層では高温・高圧環境下のために,岩盤が延性的な力学挙動を示し,誘発地震の問題はないと考えられてきた.しかし,地下10km程度の地殻深部においても,微小地震が発生していることが観測されている.実際の開発前に,超臨界状態にある岩体内で発生する地震現象を理解しておくためには,室内実験による検証が有用な手段となる.地殻深部環境において,間隙流体によって誘発された地震のメカニズムや観測可能性を検証することが重要課題のひとつである.この成果は,地球惑星科学連合大会での招待講演で発表した.実験技術に関しては,高圧ガスを使った高温高圧下での岩石変形実験技術を独自開発した.地下深部で起こっている現象を加速化して検証できる技術の開発についてまとめた.自然界で進行する現象の時間スケールは長く,人間の時間スケールでは観測事実が得られない.そこで,プロセスを再現する場合の壁となる環境条件(温度・圧力)の違いに着目し,熱力学的考察を基に,プロセスをスピードアップするための高温実験技術を開発した.水の状態を制御して実際の地下環境よりさらに高温状態を実現(温度と時間のtrade-off)した.この開発過程について,産業技術総合研究所が発行する論文誌「シンセシオロジー」(日本語および英語版)に公表した.本課題は初年度2015/10/21に追加採択された.初年度終盤より開始したので,当初は研究計画にあった実験は十分できなかったが,既存のデータの再検討も含めて検討をすすめた.岩石強度の時間変化メカニズムに対する水の影響について,水の存在が2種類の地殻岩石構成鉱物の摩擦過程に与える影響の評価を行った.さらに,前年度までの成果と既存データを総合することで,水が関与する応力腐食作用が岩石物性の時間変化の本質であるというモデルが有効であることが明らかになった.地震発生領域の深度やその範囲は,地殻構成物質の摩擦強度で説明されている.地震の発生しない安定領域と地震が発生する不安定領域の境界深度は,温度や水の存在によって影響される物質の摩擦強度に支配されている.例えば,構成鉱物として石英が含まれると摩擦特性が安定化する効果が実験によって観測されている.

そこで,それぞれの構成鉱物の摩擦特性の影響や地震発生に及ぼすメカニズムを考察するために,地殻主要構成鉱物である石英と長石の摩擦特性を高温高圧下で測定した.細粒の石英ガウジおよび長石ガウジを試料として使用し,DryおよびWet環境下で,速度ステップ試験を行った。温度範囲は室温600°Cとした.その結果,水が存在する環境下では,石英・長石ともに地震すべりが発生する不安定領域に相当する温度範囲が存在するが,石英の方がその温度領域が狭いことがわかった.これらの結果は,個々の構成鉱物の摩擦特性および水の存在が,地震発生領域を決める重要な役割をはたしていることを示している.前年度までとこれらの結果や既存データを総合すると,岩石強度の時間変化(岩石強度弱化やヒーリング過程)メカニズムに対する水の影響に関しては,摩擦面の真の接触部分(アスペリティー)における,微小破壊がその本質で,強度の時間変化にメカニズムとしては,ゆっくり進行する応力腐食反応であることを示唆している.モデルとして応力腐食メカニズムが有効であることが明らかになった.岩石強度変化メカニズムに対する水の影響を解明するため,高温高圧下及び種々の水蒸気圧下や真空雰囲気環境下で,岩石の摩擦強度を測定した.長期的な岩石強度変化プロセスにおいて,水が関与する化学作用(応力腐食作用)がプロセスの本質を担っているという作業仮説を実験的に検証した.岩石強度の時間変化(岩石強度弱化やヒーリング過程)メカニズムに対する水の影響に関しては,摩擦面の真の接触部分(アスペリティー)における,微小破壊がその本質で,強度の時間変化メカニズムとしては,ゆっくり進行する応力腐食反応が重要であることが明らかになった.初年度の採択が年度後半であったことより,初年度は当初計画通りの実施ができなかった.そこで,平成28年度以降は,既存のデータの再検討も含めることによって,実験データの不足を補い,岩石物性の時間依存性に関するメカニズムの考察を行う予定である.初年度の採択が年度後半であったことより,初年度は当初計画通りの実施ができなかった.平成28年度以降は,既存のデータの再検討も含めることによって,実験データの不足を補い,岩石物性の時間依存性に関するメカニズムの考察や技術開発についてとりまとめることができた.今後は,当初目的のモデルの検証を実施する予定である.地盤工学本課題は追加採択(10/21)のため,当初予定していた装置製作の設計製作を初年度に完了することができなかった.その関連費用が次年度使用となっている.本課題は追加採択(2015/10/21)のため,当初予定していた装置製作の設計製作を初年度に実施することができなかった.その関連費用が次年度以降の未使用分(の一部)となっていた.発生した次年度使用額は,初年度に予定していた装置製作の設計製作・装置導入のために使用する予定である.次年度以降は,既存のデータの再検討も含めることによって,実験データの不足を補う予定であるので,それらの収集・再解析にも使用する.計画の3年目で成果をとりまとめるため,既存の設備を使用し,既存の未解析データも使用することで当初の目的を達成することを目指す.解析のためのソフトウエアとモデル検討・情報収集のための研究集会出席に対し当初予定より多く支出する.
ヒト食道癌の転移浸潤機構

ヒト食道癌における転移浸潤機構を細胞間接着因子であるE-カドヘリン(ECD)を中心に研究した。ヒト食道癌培養株(TE-2)からECD(+)株と(-)株を樹立し、両者を比較した。細胞間接着能はECD(+)細胞のほうが強く、遊走能はECD(-)株のほうが高かった。ヒトECDモノクロナール抗体(HECD-1)の添加はECD(-)株の遊走能には影響を与えなかったが、ECD(+)株の接着を抑制し、遊走能を亢進させた。以上のことからECDの減弱及び消失は癌細胞の遊走能、浸潤能を亢進させると考えられた。されにEGFのEGFRを介する作用がECD-αCATという細胞間接着系に与える影響を同様の実験系を用いて検討し、以下の結果を得た。2,ECDの発現性の変化:ECD(+)細胞はECDを細胞膜に限局し強く発現するが、EGF添加によりECDの発現は細胞膜に限局せず細胞内に広く分布する。3,Invasion assay:線維芽細胞を含んだコラーゲンゲル上でECD(+)細胞を培養するとゲル上で細胞は重層化する。EGFを添加すると細胞はゲル中に浸潤する。ECD(-)細胞は単層に増殖しゲル中に浸潤する。EGF添加によっても影響を受けない。4,Immunoblot analysis:EGFを添加したECD(+)細胞をECDの抗体(HECD-1)で免疫沈降しチロシンリン酸化を調べると、βカテニンにチロシンリン酸化を認めた。このように、EGF-EGFRの反応がカドヘリン-カテニン系へ影響を及ぼし、その細胞間接着機能に異常をきたしたものと考えられた。またヒト食道癌組織における免疫組織学的検討ではECDとその膜裏打ち蛋白であるαカテニンの発現が減弱すると、リンパ節転移を高頻度に生じ予後不良であった。[総括]ヒト食道癌の転移浸潤においてはECDやαカテニンの減弱さらにEGFによるβカテニンのチロシンリン酸化などの細胞間接着機能の障害が関与していることが示唆された。食道癌細胞株(TE-2)よりlimitting dilutionにて樹立したE-CD(+)株とE-CD(-)株を対象として、micropore membrane(Transwell)を用い遊走能を評価した。さらにin vivoに近いモデルとして、線維芽細胞を含んだコラーゲンゲル上で腫瘍細胞を重層化させた組織様培養を行ない、浸潤能を評価した。E-CD(+)株はE-CD(-)株より細胞間接着能が強く遊走能が低かった。ヒトE-CDモノクローナル抗体(HECD-1)はE-CD(-)株には遊走能に影響を与えなかったが、E-CD(+)株に対しては接着を抑制し遊走を亢進させた。また、EGFの添加でもEGFRの発現量はほぼ同量であるのに、E-CD(-)株には遊走能に影響を与えなかったがE-CD(+)株に対しては遊走を亢進させた。コラーゲンゲルでの組織様培養ではHECD-1の添加によりE-CD(+)株の浸潤が強く誘導された。

以上より2つのことが明かとなった。(1)E-CDの減弱、喪失は癌細胞の遊走能、浸潤能を亢進する。(2)EGF刺激によってE-CDの発現量は変わらないが、細胞接着能を低下させる。さらに我々は、100kd近傍にEGF刺激によってチロシンリン酸化を受ける分子を発見しており、現在同定を進めている所である。当科で樹立した食道癌細胞株(MAG)と細胞バンクより供与を受けた胃癌細胞株(MKN-28)をヌードマウス皮下に接種した所、肺・肝に転移を認めた。今後、これをin vivo転移モデルとして細胞間接着障害と転移の関係、及び転移臓器特異性の機構を解明したい。我々は、分子量102kdのカドヘリン結合蛋白質(α-catenin)の精製、アミノ酸配列の決定、抗体の作成を行なった。この抗体を用いて食道癌切除標本の免疫染色を行なった所、リンパ節転移症例ではα-cateninの減弱または消失例が多数認められた。今後、各種癌組織でも検討したい。ヒト食道癌細胞株TE-2をlimitting dilutionによりcloningしたE-cad(+)株(TE-2R)とE-cad(-)株(TE-2S)を対象として、EGFの細胞接着制御機構を二次元、三次元培養にて解析した。TE-2SはEGFRの発現量はTE-2Rとほぼ同量であるのに、EGF刺激により遊走能と浸潤能に変化を認めなかったが、TE-2RはEGFにより細胞間接着が阻害され、癌細胞の遊走、浸潤が強く誘導された。我々はこのEGFによる細胞接着抑制能の機構として、EGFRの細胞内ドメインの受容型チロシンキナーゼのリン酸化に引き続いてE-cadあるいはE-cad関連蛋白のチロシンリン酸化がおこり、細胞接着能が低下すると言う仮説の基に以下の実験を行った。免疫沈降を併用したwestern blotting法によりEGF刺激下のE-cad,E-cad関連蛋白質のチロシンリン酸化を調べたところ94KDの蛋白にチロシンリン酸化がみられた。さらに抗E-cad、抗α-Cateninモノクロナール抗体及び抗β-Cateninポリクロナール抗体を用いこの蛋白の同定を行ないβ-Cateninであることが証明でき、現在投稿中である。昨年度当科で樹立した食道癌細胞株(MAG)と細胞バンクより供与を受けた胃癌細胞株(MKN-28)をヌードマウス皮下に接種し肺・肝に転移を認めたが、さらにin vivoに近い系として名古屋大学と阪大微研より供与を受けた胃癌細胞株(SC-1-NU,H111)を胃漿膜下に接種し高肝転移系を確立しつつある。今後、この高転移株をモデルとし細胞間接着障害と転移の関係を解明したい。ヒト食道癌細胞TE-2をcloningして得られたE-カドヘリン(E-cad)(+)株(TE-2R)とE-cad(-)株(TE-2S)におけるEGFの細胞接着制御機構の解析では、TE-2RとTE-2SのEGFRの発現量はほぼ同量であるが、TE-2RはEGFにより細胞間接着が阻害され、遊走能と浸潤能の亢進が認められるもののTE-2Sでは変化がなかった。またTE-2R細胞ではEGF刺激によりE-cad関連タンパクであるβカテニンのチロシン燐酸化が認められた。以上の事からTE-2R細胞においては、EGF-EGFR系のシグナル伝達によりβカテニンが燐酸化されることにより、タンパクレベルではE-cadを発現していてもE-cadの細胞間接着機能が障害されることがわかった。以前に行なったヒト食道癌組織におけるE-cadとαカテニンの免疫組織学的検討では、E-cadが減弱しαカテニンが消失するものは細胞接着機能が障害されリンパ節転移をきたしやすいという結果であったが、生体内においては前述のようにβカテニンの燐酸化による細胞接着障害が起きている可能性も考えられる。
光源用電子蓄積リングの高性能化へ向けたスピン偏極効果の探索

放射光施設SAGA Light Sourceの1.4GeV電子蓄積リングにおける電子ビームの寿命変動機構の解明と安定化を最終目標として,電子ビームの放射偏極の検証とスピン偏極度測定装置の開発を行った.放射偏極の検証実験ではスピン消極共鳴による電子損失率の増加を観測することに成功した.スピン偏極度の評価のために円偏光レーザーによる逆コンプトン散乱ガンマ線の空間分布測定システムを開発しスピン偏極度測定へ利用する準備を進めた.本研究によってスピン偏極の観点から電子ビームの寿命変動を探索する準備を整えることができた.レーザーコンプトン散乱(LCS)を利用したスピン偏極度測定システム(ポーラリメータ)の構築を目指し,円偏光レーザーを用いたLCSガンマ線の発生試験および空間分布測定を行った.まず既設のLCS実験装置の光学系へ波長板を組み込み,円偏光レーザー光の発生および左右円偏光の切り替えを可能とした.円偏光レーザーを用いたLCSガンマ線の発生試験では,BGOシンチレーション検出器を用いたスペクトル測定により,最大エネルギー3.5 MeVのLCSガンマ線の生成を確認した.ポーラリメータとして活用するためには,ガンマ線の空間分布を迅速に測定するシステムが必要である.そこで二種類の測定方法を試みた.一つはイメージングプレートによる空間分布測定である.イメージングプレートを用いた測定により,レーザーの偏光状態(水平・垂直直線偏光,円偏光)に応じたガンマ線空間分布の変化が観測された.これはコンプトン散乱の異方性を反映しており,イメージングプレートによるガンマ線検出の有効性が示された.しかしながらポーラリメータとして運用するためには,左右円偏光切り替え時の微小な強度差の評価が必要であり,測定の有効性については試験を継続する必要がある.もう一つの方法はコリメータスキャンである.コリメータを二次元スキャンしつつ透過ガンマ線強度をシンチレーション検出器で計測する.鉛コリメータを新たに製作し,XYステージと組み合わせてコリメータスキャンシステムを開発した.測定試験ではLCSガンマ線ビームの二次元強度分布を得るには至らなかったが,コリメータ透過によるLCSガンマ線の単色化はスペクトル測定で確認されており,コリメータの利用に技術的な困難は少ないことが分かった.今後,スキャンシステムの整備を進めれば空間分布測定の実現に大きな問題は無いと考えている.LCSガンマ線の空間分布測定に基づくスピン偏極度測定システム(ポーラリメータ)の立ち上げ調整に継続して取り組んだ.ポーラリメータとして利用するためには左右円偏光レーザーに対するLCSガンマ線の空間分布の微小な差異の評価が必要である.前年度に引き続き,二種類の手法(イメージングプレート,コリメータスキャン)によるガンマ線空間分布測定の試験を継続して行い,測定時間は不利であるものの,SNおよび定量性に優れるコリメータスキャンがポーラリメータには有効と結論付けた.コリメータスキャンシステムの整備を進め,左右円偏光レーザーを用いたLCSガンマ線の空間分布測定に成功した.ビーム電流およびレーザー出力を調整パラメータとして測定条件の最適化に取り組み,電子ビームの蓄積時間を変えつつガンマ線空間分布の測定試験を行ったが,左右円偏光切り替え時の空間分布の差異の検出には至らなかった.その要因としてコリメータの軸調整やバックグラウンドの寄与などが考えられた.そこでコリメータの調整自由度の向上を目的とした回転ステージの導入や散乱ガンマ線を除去するための鉛遮蔽の増強など,コリメータスキャンシステムの性能向上に取り組んだ.また鉛コリメータの再設計を行い,次年度には新たなコリメータスキャンシステムを早々に立ち上げる予定である.当初予定に比べ,スピン偏極度測定システムの構築が遅れている状況である.主な原因はコリメータスキャンシステムの調整に関する技術的な困難さであった.これまでにポーラリメータの試験を継続して実施したことで,コリメータスキャンシステムや測定上の問題点を洗い出すことが出来た.コリメータスキャンシステムについては既に部分的な改修も施しており,実験開始当初に比べれば大幅に性能は向上している.現状のシステムにおいてもガンマ線の空間分布測定に大きな支障は無い.今年度までの開発研究によって,LCSガンマ線の空間分布を測定する手法は確立することが出来たと考えている.LCSガンマ線の空間分布測定に基づく電子ビームのスピン偏極度測定システム(ポーラリメータ)の立ち上げ調整を継続しつつ,スピン偏極度の時間発展の探索を目的とした測定を試みた.ガンマ線の空間分布測定法はコリメータスキャンを採用した.新規に制作したコリメータを用いてスキャンシステムを再構成し,これまでの測定で問題となっていたコリメータの軸合わせやバックグラウンドとなる散乱ガンマ線の除去に目処をつけた.電子ビームのスピン偏極度の時間変化を観測するため左右円偏光レーザーを用いてガンマ線空間分布の差分測定を行った.1.4GeVまで加速した後の蓄積ビームに対して加速直後から1時間程度の時間範囲で差分測定を行ったが,ガンマ線の空間分布に左右円偏光切り替えによる有意な差異は検出できなかった.特に炭酸ガスレーザーの発振開始直後は出力変動が大きく,レーザーパワーで信号強度を規格化しても微小な差分を検証することは困難であった.そこでレーザーの連続運転による熱的安定化と測定時間の増加による統計精度の向上を試みた.スピン偏極度が大きく異なると予想される加速終了直後と数時間の蓄積後の電子ビームについて,最適な測定状件を探りながら差分測定を繰り返し行ったが,いずれの測定条件においても電子ビームのスピン偏極の兆候を見出すことができなかった.

研究期間中にSAGA-LSリングにおける電子ビームのスピン偏極をポーラリメータで観測することはできなかったが,高周波電場によるスピン消極共鳴を用いて電子ビームのスピン偏極を確認することはできた.今後はスピン偏極以外の要因まで含めてビーム寿命の変動に対する要因調査を継続し,SAGA-LSリングにおける蓄積ビームの長寿命化へ向けた方策を探る予定である.放射光施設SAGA Light Sourceの1.4GeV電子蓄積リングにおける電子ビームの寿命変動機構の解明と安定化を最終目標として,電子ビームの放射偏極の検証とスピン偏極度測定装置の開発を行った.放射偏極の検証実験ではスピン消極共鳴による電子損失率の増加を観測することに成功した.スピン偏極度の評価のために円偏光レーザーによる逆コンプトン散乱ガンマ線の空間分布測定システムを開発しスピン偏極度測定へ利用する準備を進めた.本研究によってスピン偏極の観点から電子ビームの寿命変動を探索する準備を整えることができた.当初予定に比べ,コリメータスキャンシステムの試験がやや遅れている状況である.主な原因はガンマ線シャッターの動作不具合による実験の中断ならびに制御用ソフトウェアの開発の遅れであった.ただし平成26年度中にコリメータスキャンシステムの開発は継続して行っており,ガンマ線ビームを使用しないオフライン試験では,スキャンシステムの動作に支障が無いことを確認している.次年度以降,速やかにLCSガンマ線を用いてコリメータスキャンシステムの試験を行う.LCSガンマ線の空間分布測定にはコリメータスキャンシステムを採用することとした.これまで実施した測定試験によってスキャンシステムの調整方法を確立するとともに改善点を洗い出すことが出来た.次年度は新規製作の鉛コリメータを組み込み,空間分布測定の精度向上に取り組む.さらに電子ビームを用いた試験を継続し,ポーラリメータとしての運用の早期実現ならびにスピン偏極度に関する情報を得ることを目指す.電子加速器,原子分子物理ポーラリメータとしての運用を実現するため,ガンマ線空間分布測定の方法論を確立することを優先する.特にコリメータスキャンシステムを用いた空間分布測定の性能評価を第一の目標とする.左右円偏光レーザーによるLCSガンマ線を用いて,イメージングプレートとコリメータスキャンの両手法による測定結果を比較しながら測定試験を繰り返し,ポーラリメータとしての最適な測定条件を早期に確立することを目指す.コリメータスキャンシステムやレーザー光学系の整備用に消耗品費を計上していたが,現有品の利用や光学素子の損傷が少ないことから消耗品費には若干の余裕が生じた.円偏光発生用の光学素子,イメージングプレート,鉛コリメータなど,本研究で必要な主要物品は平成26年度中に揃えることができた.光学機器やガンマ線計測機器類などに現有品を使うことで,当初計上していた消耗品費に若干の余裕が生じた.次年度以降もコリメータスキャンシステムの性能向上に継続して取り組む必要がある.次年度使用額は主に新規コリメータの開発費用に用いる予定である.
有機触媒を用いる超分子の不斉合成

非対称な軸成分や輪成分から成るカテナンやロタキサンなどの超分子は、超分子特有の不斉構造(topological chirality)を持つ。これらの超分子では輪成分の回転や軸成分の移動により、不斉構造が逐次変化し、超分子キラリティー自体が可動性を持つため、キラル超分子の不斉構築や不斉識別は極めて困難で、有効な不斉合成法は未だ皆無に近い。例えば、高田らによってロタキサン不斉合成の先駆的な試みが報告されているが、最大で4% eeに留まっている(Chem. Lett. 2007, 36, 162-163.)。このような状況下、代表研究者は、分子認識型不斉アシル化触媒を用いるラセミ体ロタキサンの速度論的分割を行い、topological chiralityを持つロタキサンを99% ee、29%収率で得ることに成功した(選択性s値=16)。この成果に基づき、本研究では超分子の不斉合成法の確率を目指して研究を行なった。まず、topological chiralityを持つカテナンの合成に取り組んだ。これまでに軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基(Ns= SO2-2-NO2-C6H4)を持つラセミ体ロタキサンの不斉アシル化による速度論的分割を行い、上記の成果を得ている。本年度は、この成果に基づき、片方の輪成分に水酸基、もう片方の輪成分にNHNs基をもつラセミ体カテナンの水酸基の不斉アシルによる速度論的分割を目的に研究を実施した。ラセミ体カテナンはビピリジル構造を持つ輪成分のCuテンプレート法によるプレカテナンの形成ののちに、閉環メタセシス法を用いてその合成に成功した。キラルなカテナンの光学純度決定はキラルカラムを用いるHPLC分析により行うため、まず、ラセミ体カテナンの分析条件を検討し、精度は十分でないものの、分析条件を見つけることができた。精度の高い分析条件をさらに検討中である。topological chiralityを持つカテナンの不斉合成を目指して、研究に取り組んだ。片方の輪成分に水酸基、もう片方の輪成分にNHNs基をもつラセミ体カテナンの合成を検討し、ビピリジル構造を持つ輪成分のCuテンプレート法によるプレカテナンの形成、続く閉環メタセシスにより、目的を達成した。また、不斉合成により得られるtopological chiralityを持つカテナンの光学純度決定のため、合成できたラセミ体カテナンのキラルカラムを用いるHPLC分析条件を精査し、精度は十分でないものの、分析条件を見つけることができた。すでに合成に成功した軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基を持つラセミ体カテナンを大量合成し、キラルカラムを用いる精度の高いHPLC分析条件を見つける。次にこのラセミ体カテナンの軸成分上にある水酸基の触媒的不斉アシル化による速度論的分割を行い、topological chiralityを持つカテナンの不斉構築を行う。例えば、高田らによってロタキサン不斉合成の先駆的な試みが報告されているが、最大で4%eeに留まっている(Chem. Lett. 2007, 36, 162)。このようような状況下、受入研究者は分子認識型不斉アシル化触媒を用いるラセミ体ロタキサンの速度論的分割を行い、topological chiralityを持つロタキサンを99% ee、29%収率で得ることに成功した(選択性s値=16)。本年度は、この成果に基づき超分子のこの不斉合成法をカテナンに展開すべく、カテナンの構造設計と基質合成を行った。本研究の鍵を握るのは、カテナンの非対称性構造の設計と、その不斉化を行う不斉アシル化触媒の設計、合成である。本年度は、高度な非対称性を持つラセミ体カテナンの合成に成功した。また、その不斉化を行うための種々の不斉アシル化触媒を大量合成した。

これまでに軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基(Ns= SO2-2-NO2-C6H4)を持つラセミ体ロタキサンの不斉アシル化による速度論的分割を行い、上記の成果を得ている。本年度は、この成果に基づき、片方の輪成分に水酸基、もう片方の輪成分にNHNs基をもつラセミ体カテナンの水酸基の不斉アシルによる速度論的分割を目的に研究を実施した。ラセミ体カテナンはビピリジル構造を持つ輪成分のCuテンプレート法によるプレカテナンの形成ののちに、閉環メタセシス法を用いてその合成に成功した。キラルなカテナンの光学純度決定はキラルカラムを用いるHPLC分析により行うため、まず、ラセミ体カテナンの分析条件を検討し、精度は十分でないものの、分析条件を見つけることができた。精度の高い分析条件をさらに検討中である。topological chiralityを持つカテナンの不斉合成を目指して、研究に取り組んだ。片方の輪成分に水酸基、もう片方の輪成分にNHNs基をもつラセミ体カテナンの合成を検討し、ビピリジル構造を持つ輪成分のCuテンプレート法によるプレカテナンの形成、続く閉環メタセシスにより、目的を達成した。また、不斉合成により得られるtopological chiralityを持つカテナンの光学純度決定のため、合成できたラセミ体カテナンのキラルカラムを用いるHPLC分析条件を精査し、精度は十分でないものの、分析条件を見つけることができた。Topologicalchiralityを持つカテナンの合成を行う。予備実験として、軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基(Ns= SO2-2-NO2-C6H4)を持つラセミ体ロタキサンの不斉アシル化による速度論的分割を行い、優れた成果を得ている。この成功は分子認識型不斉触媒がNHNs基からある一定の距離にある水酸基の不斉環境を高度に識別できることに基づいている。そこで、片方の輪成分に水酸基、もう片方の輪成分にNHNs基をもつラセミ体カテナンの合成し、片方の輪成分上にある水酸基の不斉アシルによる速度論的分割を検討する。さらに、Topological chiralityを持つロタキサンの不斉非対称化による不斉合成を行う。これまでに軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基を持つラセミ体ロタキサンの不斉アシル化による速度論的分割で好結果を得ている。この成功例を、不斉非対称化によるロタキサンの不斉合成へと展開する。両側に2つの水酸基を持つ対称な軸成分と、NHNs基をもつ非対称な輪成分から成るプロキラルなロタキサンの水酸基の不斉アシル化による不斉非対称化を行う。前述した速度論的分割では収率が最大50%であるが、本法では理論的には収率100%、不斉収率100%が可能となる。なお、プロキラルロタキサンの合成は、アンモニウム塩とクラウンエーテルの錯形成を利用したプレロタキサンを経由して行う。すでに合成に成功した軸成分に水酸基、輪成分にNHNs基を持つラセミ体カテナンを大量合成し、キラルカラムを用いる精度の高いHPLC分析条件を見つける。次にこのラセミ体カテナンの軸成分上にある水酸基の触媒的不斉アシル化による速度論的分割を行い、topological chiralityを持つカテナンの不斉構築を行う。
カルプロテクチン誘導性炎症関連因子の産生に及ぼす高グルコースの影響

糖尿病患者の歯周病は、悪化しやすく治癒しにくいことが知られているが、その明らかな原因はわかっていない。糖尿病患者の歯周病の歯周ポケット(歯と歯茎の間の溝)にカルプロテクチンというたんぱく質が明らかに多く検出されることが知られている。このカルプロテクチンをターゲット分子として糖尿病患者の歯周病の悪化のしくみを解明することで新たな治療薬の開発の一助となる研究であると考える。糖尿病患者の歯周病(糖尿病関連歯周炎)は,重症化しやすく治癒しにくいことが知られているが,その病態形成は不明である。我々は,歯周病及び糖尿病患者の歯周病の歯肉溝滲出液(歯と歯茎の間に分泌される液)中にS100蛋白の1つであるカルプロテクチンが多く検出されることを見出した。また、このカルプロテクチンは、歯肉線維芽細胞における炎症関連因子であるIL-6産生を誘導し,歯周病の重症化が促進されることを報告した。本研究は,このカルプロテクチンをターゲット分子とし、糖尿病関連歯周炎の増悪化の機序を調べることを目的とした。すなわち、歯肉線維芽細胞を高グルコース状態にて培養し、カルプロテクチンを刺激することでどの様な細胞反応を示すのかを明らかにすることとした。結果として、高グルコース状態で培養した歯肉線維芽細胞において,カルプロテクチンの標的レセプターであるRAGEの発現誘導がノーマルグルコースに比べて蛋白レベルで認められた。しかし、TLR4は、認められなかった。高グルコース状態で培養した歯肉線維芽細胞をカルプロテクチンで刺激した際のMMP-1, MMP-3, MCP-1の産生性は、ノーマルグルコースに比べて有意に高かった。さらに、高グルコース状態で培養した歯肉線維芽細胞をカルプロテクチンで刺激した後の細胞内シグナル分子(NF-kB)の活性化を蛋白レベルで確認した。ヒト歯肉線維芽細胞を高グルコースで培養すると、ノーマルグルコースで培養した場合と比較し、カルプロテクチンの標的受容体であるRAGEの発現性とカルプロテクチン誘導性炎症関連因子(MMP-1, MMP-3, MCP-1)及びNF-kB経路のリン酸化の亢進を確認することができた。このことから、高グルコース状態は、カルプロテクチンにおける炎症カスケードの亢進が生じ、歯周病病態の増悪に影響することが示唆された。このことから、本研究は、おおむね順調に進展していると考える。カルプロテクチンの標的受容体であるRAGEがカルプロテクチン誘導性炎症関連因子の産生性に及ぼす影響を調べる必要がある。今後、ヒト歯肉線維芽細胞におけるRAGE遺伝ノックダウン細胞を樹立し、炎症関連因子の産生性と細胞内シグナル経路の探索を行う予定である。

今後、ヒト歯肉線維芽細胞におけるRAGE遺伝ノックダウン細胞を樹立し、炎症関連因子の産生性と細胞内シグナル経路の探索を行う予定である。
原子間力顕微鏡による単原子観察条件の引力領域での研究

1.超高真空で劈開することにより、簡単に清浄な表面を得ることのできるインジウム燐やガリウムヒ素(III-V族半導体)の(110)劈開表面を取り上げ、引力領域での原子分解能測定に必要な引力勾配の大きさを実験的に検討した。この結果、原子レベルの欠陥や吸着物を安定に測定できるようになった。これは、原子間力顕微鏡が探針先端の1個の原子によって姫を観察できることを初めて実証した画期的な成果である。2.探針を機械的に振動させる2つの動作方式(一方は、探針の振動振幅を一定にする方式であり、他方は、探針の加振振幅を一定にする方式である)を比較した。その結果、加振振幅を一定にする方式の方が、試料表面へのダメ-ジが少ないことを見いだした。3.加熱清浄化処理により得られるシリコンの再構成表面を、探針と試料表面間に働く引力勾配を変化させながら観察し、表面に弱く結合した原子(アダトム)を原子分解能で安定に観察するための引力勾配の大きさを実験的に検討した。4.シリコン再構成表面の活性な原子(アダトム)を原子分解能で観察した場合、その画像化機構には、2種類あることが判明した。一方は、探針先端の原子と試料表面の原子との間に働くファンデル・ワールス力や静電気力などの物理的相互作用による力である。他方は、探針先端の原子と試料表面の原子との共有結合力、すなわち、化学的相互作用による力である。また、画像化機構によって単原子観察条件が大きく異なることを見いだした。1.力の距離依存性が弱い引力領域で原子分解能を実現するため、超高感度な変移検出を実現する必要がある。そこで、ノイズ成分の極めて少ない光源と安定な駆動回路を購入し、高感度な光干渉計を実現した。また現有の周波数変調回路を改良し、高感度に探針の共振周波数シフトを検出できるようにした。2.引力は一般に長距離力であり、探針先端の形状が空間分解能を大きく左右する。引力領域で単原子観察を実現するには、原子レベルで先鋭で清浄な探針を使用することが必要不可欠である。そこで、現有の超高真空装置に探針の先鋭度や清浄度を評価できるように電界イオン顕微鏡を付加した。3.引力領域で原子分解能を実現するためには、原子間距離に相当する間隔(5Å以下)まで探針先端を試料表面に近づける必要があると予想される。しかし、このような距離では、試料表面の引力勾配が急激に大きくなり、この引力勾配が板バネのバネ定数より大きくなると、探針が試料側に突然ジャンプし接触してしまう。そこで、引力領域での原子分解能測定に必要な引力勾配の大きさと探針先端の曲率半径との関係を理論的に検討した。4.III-V族化合物半導体であるインジウム燐の(100)劈開表面において、引力領域で原子分解能測定することに世界で初めて成功した。また、原子レベルの欠陥や吸着物の測定にも成功した。これは、原子間力顕微鏡が探針先端の1個の原子によって表面を観察できることを初めて実証した画期的な成果である。1.超高真空で劈開することにより、簡単に清浄な表面を得ることのできるガリウムヒ素(III-V族半導体)の(110)劈開表面を取り上げ、引力領域での原子分解能測定に必要な引力勾配の大きさを実験的に検討した。2.探針を機械的に振動させる2つの動作方式(一方は、探針の振動振幅を一定にする方式であり、他方は、探針の加振振幅を一定にする方式である)を比較検討した。

その結果、加振振幅を一定にする方式の方が、試料表面へのダメ-ジが少ないことを見いだした。3.加熱清浄化処理により得られるシリコンの再構成表面を、探針と試料表面間の働く引力勾配を変化させながら観察し、表面に弱く結合した原子(アダトム)を原子分解能で安定に観察するための引力勾配の大きさを実験的に検討した。4.シリコン再構成表面は活性な原子(アダトム)を原子分解能で観察した場合、その画像化機構には、2種類あることが判明した。一方は、探針先端の原子と試料表面の原子との間に働くファンデル・ワールス力や静電気力などの物理的相互作用による力である。他方は、探針先端の原子と試料表面の原子との共有結合力、すなわち、化学的相互作用による力である。また、画像化機構によって単原子観察条件が大きく異なることを見いだした。
アジアモンスーンの急激な変動伴う日本海海洋環境変動の高時間解像度復元

本研究では、日本海から採取された複数のコアを用いて、特に最終氷期から後氷期にかけての日本海海洋環境の高時間解像度復元を行ない、同じコアからモンスーン強度変動の指標(風成塵粒度)を取り出して海洋環境指標と比較する事により、アジアモンスーンの変動に応答して日本海の表層および深層環境がどのように変化したかを立体的に明らかにする事を目的として研究を行なった。海洋表層水環境の指標としては、浮遊性有孔虫の酸素同位体比、アルケノン水温、浮遊性有孔虫の^<14>C年代、珪藻群集組成、有機物含有量などを用い、表層水温、塩分、起源、生物生産性などを推定した。深層水の指標としては、平行葉理保存度、有機炭素/硫黄比、炭酸塩鉱物含有量、底生有孔虫の酸素同位体比などを利用し、深層水の溶存酸素濃度、循環速度、CCDなどを復元した。更に、モンスーン強度の指標としては、風成塵の粒度、フラックス、石英のESR信号強度、鉱物組成などを用い、偏西風の強さ、黄砂の供給源、後背地の乾燥度などを推定した。こうした結果を基に、表層水環境、深層水環境、アジアモンスーン変動の位相関係を調べ、夏季モンスーンフロントが黄河、揚子江集水域に達した時期に栄養塩に富み、塩分が低い黄海・東シナ海沿岸水域が拡大して日本海に流入し、日本海の生物生産性を上げると共に弱い密度成層を引き起こして深層水循環を低下させ、深層水の還元化を招いたとするTada et al.(1999)の仮説を検証し、それが基本的に正しい事を示した。また、夏季モンスーン変動に伴い、黄海、東シナ海沿岸水の日本海への流入量が増加した時に、日本海の水温分布、表層における生物生産性、深層水循環はどう変化したか、そうした変化はどのくらいの時間で起こったのか、をより具体的に明らかにした。更に、規模は小さいが、同様の周期や変動様式を持った変動が、後氷期にも存在した可能性も示した。本研究は、日本海から採取された4本のコアを用いて、最終氷期極相期から後氷期にかけての日本海海洋環境を高時間解像度で復元するとともに、モンスーン強度変動指標を取り出して比較する事により、アジアモンスーンの変動に応答して日本海の表層水、深層水環境がどのように変化したかを立体的に明らかにする事を目的とする。初年度は、隠岐堆より採取されたDGC-6コア(2.5m)について、先ず14層準でAMS法による14C年代の測定、2層準でテフラの同定を行なった。その結果、本コアは過去約3万年間を連続的にカバーしている事がわかった。次に、本コアについて1.25cm間隔で明るさと色調、主要元素濃度、含水率、砕屑物粒度の測定を、525cm間隔でアルケノン水温の推定を行なった。その結果、11.57千年前にかけては堆積物の色は濃く、有機物含有量が高い事が判った。また、この時期は2024度と高いアルケノン水温を示した。これらは、夏季モンスーンの強化とそれに伴う揚子江流出量の増大、東シナ海沿岸水の日本海への流入強化を反映している可能性が高い。また、107千年前にかけては、砕屑物粒度も増大していた。

次に、後氷期の記録を詳しく見ると、1.32.4千年の間隔で6回(0.4,1.9,4.7,7.1,9.1,11.5ka)堆積物の色が濃くなる時期があり、それは有機物含有量が高まった事を反映すると考えられる。これらの層準はまた、FeやKなど砕屑性元素濃度が高く、含水率が低く、砕屑物粒度が粗くなる層準に対応する傾向があり、風成あるいは河川起源の砕屑物流入量が増加して、珪藻や有孔虫などの生物源粒子の含有量が減少した事を示唆する。これは、数千年スケールでのモンスーン変動を反映している可能性がある。そして、そのタイミングは、北大西洋の氷山起源礫の堆積量が減少した時期に良く対応している。この対応が正しければ、後氷期にも、東アジアにおける数千年スケールでのモンスーン変動が、北大西洋域の気候変動とリンクしていた事になる。本研究では、日本海から採取された複数のコアを用いて、最終氷期から後氷期について日本海海洋環境を高時間解像度で復元するとともに、モンスーン強度変動の指標を取り出して日本海海洋環境指標と比較する事により、アジアモンスーンの変動に対応して日本海の表層水、深層水環境がどのように変化したのかを明らかにする事を目的とした。海洋表層水環境の指標としては、浮遊性有孔虫の酸素同位体、炭素同位体、アルケノン古水温、浮遊性有孔虫の^<14>C年代、珪藻群集組成、生物源シリカ、生物源炭酸塩含有量などを用い、表層水温、塩分、表層水の起源、生物生産性を推定した。深層水の指標としては、放散虫群衆組成、平行葉理の保存度、有機炭素/硫黄比、炭酸塩鉱物含有量などを利用して、深層水の溶存酸素濃度、循環速度、CCDなどの復元を試みた。更に、モンスーン強度指標として、風成塵の粒度、フラックス、風成塵中の石英の結晶度、ESR信号強度などを用い、偏西風の強さ、黄砂の供給源、後背地の乾燥度などの推定も試みた。こうした結果を基に、表層水環境、深層水環境、アジアモンスーン変動の位相関係を調べた結果、最終氷期には、夏季モンスーンフロントが北上して黄河、揚子江集水域に達した時期に、栄養塩に富み、塩分が低い東シナ海沿岸水域が拡大して日本海に流入し、日本海の生物生産性を上げると共に深層水循環を低下させ、深層水の還元化を招いた事が明らかになった。一方、後氷期には、偏西風軸やモンスーンフロントの明確な動きは、読み取れなかった。しかし、約千年周期で、僅かながら東シナ海沿岸水寄与率が変動し、その増加に伴って、日本海表層の生物生産性の増加が認められた。また、その倍の約2千年周期での黒潮起源水の増減が識別された。^<14>Cの初期値の変動曲線と比較した所、東シナ海沿岸水流入期や黒潮起源水流入期は、太陽活動が活発化した時期に対応する可能性が示唆された。
非線形ネットワークによるナノ自動合成

非線形電気化学振動子の集団挙動を、非線形力学系の観点から進めてきたが、知見が蓄えられるにつれて、生物的な運動、たとえば、クラゲの傘の開閉運動や、腎盂や大腸の蠕動運動を、連成振動子系で再構成できる可能性が見えてきた。これらの経験を踏まえて、(1)大脳からの指令を必要としない不随意運動の再構成、(2)部分的な破壊を克服できる堅牢なパルス・ジェネレータの機能(生物的には、腎盂中の信号伝播)を非線形振動子のネットワークからエミュレートした。目的とする機能が、ネットワークの中に意図的に作った「欠陥」によって、どのように傷害されるかを調べ、生物回路が有する堅牢性の発現機構を解明した。我々の手法は、非線形振動子を決められた規則に従って空間的に配置し、その信号を記録することで、目で見て振る舞いを追跡することができた。標的とする腎盂は、「平滑筋細胞」と「カハール細胞」からなる臓器で、電気生理的に信号伝搬機能が制御され、内分泌等の分子制御の影響が少ない。平滑筋とカハール細胞の巨視的な応答は、Hodgkin-Huxley式で記述され、(a)「カハール細胞は振動性振動子」、(b)「平滑筋細胞は興奮性振動子」と見なせる。各細胞の腎盂中の位置により、それぞれの細胞の生理学的動作パラメータを個別に作り分けることは、生物学的に「極めて高い設計コスト」となる。従って、個々の細胞の孤立状態での動作パラメータを一定とし、「細胞の並べ方、すなわち、細胞間のネットワークにより臓器の機能が発現する」と考えることが妥当である。本研究では、細胞ネットワークの空間構造と機能発現を、モデル系と天然系で比較し、構造と機能の相関を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。非線形電気化学振動子は、oscillatoryexcitatory, excitatory coupling inhibitory couplingの4状態を設定でき、かつ、集団化に数制限がない。Excitatoryに結合した電気化学振動子は、その固有周波数比が整数に近いとき、結合強度(電極間距離)に応じて、引き込みが観測される。遅い振動数の振動子は、速い振動子に引き込まれる。このことを利用して、消化管の運動を電気化学振動子集団で模擬した。消化管運動とは、蠕動運動などの、時空コヒーレンスを保った.波動(電気生理学、カルシュウム波動)の伝搬と、この波動により誘起される平滑筋の収縮であるが、本実験では、このうち、波動の伝播を再構成の対象とした。1)波動伝搬の一方向性2)上流損傷すると、下流が、集団のペースメーカとなるカスケード補償機構。3)カスケード補償の進行とともに周期が増大。以上3点の特徴すべてを満たすネットワークの構築に成功した。データ収集とモデル計算に時間が掛かり、論文発表が遅れ気味ではあるが、確実なデータと合理的なモデルを既に獲得しているため、現在論文発表準備超である。全体的に見て、新しい原理に基づく非線形ネットワークを実験理論の両面で完成できたと思われる。興奮性振動子と振動性振動子の結合に関する引き込み現象の一般則を実験と理論両面から明らかにする。このことが判れば、腎孟中の振動生細胞(カハール細胞)密度が、上流から下流に向かって減少していることと、上流部の部分損傷を補償する機能発現との間の相関が明らかになると期待できる。
骨格筋収縮依存的な分泌タンパク質による免疫機能制御機構の解明

運動は、骨格筋での代謝を直接亢進させるとともに筋発達を促進して体全体での基礎代謝量を上昇させることが広く知られている。一方、近年、運動は骨格筋以外の組織に対しても影響を及ぼすことが明らかにされてきた。例えば、運動による免疫機能の調節、脂肪組織における脂肪分解の促進などが挙げられるが、少なくともその一部は運動による骨格筋分泌タンパク質(マイオカイン)の分泌変動によるものではないかと考えられている。本研究では、申請者が開発したin vitro擬似的運動刺激系を駆使して、この運動時に生じる免疫機能変動の分子基盤を運動因子産生の観点から読み解くことを目的とした。まず、骨格筋細胞C2C12に対して電気パルス刺激(EPS)を負荷後に培養上清を回収し、マイオカイン量を測定した結果、運動によって分泌減少するマイオカインとしてCCL5およびCXCL10を新規同定することに成功した。さらにEPS依存的なシグナル伝達制御機構を解析、CCL5分泌減少にはAMPK活性化が、CXCL10分泌減少にはp38 MAPK活性化が関与していることを明らかとした。これらのマイオカイン抑制は、トレッドミルあるいはランニングホイールを用いた動物個体を用いた走行実験でも確認することができ、個体レベルでも見られる生理的現象であることが分かった。最後にCXCL10分泌減少の生理的意義を調べたところ、血管新生を促進することが明らかとなった。以上、本研究によって、CCL5やCXCL10といった運動抑制性マイオカインを介した免疫機能調節機構の一端が明らかとなった。今後、これらマイオカインネットワークの研究をさらに進めることで、運動依存的な免疫機能調節をはじめとする全身への運動効果伝達のメカニズムがさらに明らかになることが期待される。これまでに申請者は、確立した新規in vitro運動刺激系を用いて新規運動抑制性マイオカイン2種を同定した。今年度、そのマイオカイン抑制機構を解析したところ、マイオカインAについては運動依存的なAMPK活性化が分泌抑制に重要な役割を果たしていたのに対して、マイオカインBについてはp38活性化が分泌抑制に必須であることが分かった。すなわち、骨格筋における運動は、少なくとも2種類の異なるメカニズムを介してマイオカイン分泌を抑制していることが明らかとなった。以上の結果は、動物個体走行モデルにおいても同様の結果が確認されており、in vitroモデルのみならず動物個体運動によっても稼働する仕組みであることが示唆される。本結果は、予定通り国際学会にて発表を行った。さらに今年度は、運動依存的な細胞外小胞(EVs)分泌変動を解析するための実験系の構築を行なった。細胞から得られた培養上清(Conditioned medium)を異なる遠心分離プロセスを行うことでEVsの単離・精製を行った。精製したEVsは、電子顕微鏡、ウエスタンブロットによる特異的表面抗原の確認、さらにはナノパーティクルトラッキングによって精製度を確認した。以上の予備検討によってEVsの精製方法が確立され、さらにEVs含有タンパク質あるいはRNA解析にどの程度の培養上清が必要か確認された。来年度以降、申請者らが開発したin vitro運動刺激系を用いて、運動依存的なEVs分泌解析を行なっていく予定としている。運動因子の探索及びその産生制御機構の概要についての解析はほぼ終了した。一部産生制御機構のメカニズム詳細についてはさらなる解析が必要であるが、代替としてEVs精製方法についての検討は予想以上に進行している。総合的に見ると研究計画に沿った成果が上がりつつあり、研究は順調に推移していると考えられる。本研究計画では、骨格筋収縮依存的に分泌されるタンパク質(運動因子)の網羅的に同定、発現調節機構および生理作用を解明する。特に、運動依存的な免疫機能調節における運動因子の役割を明らかにし、その制御方法を探索することを目的とした。まず申請者らは、収縮可能な培養筋細胞系とサイトカインアレイ法を併用し、複数の新規マイオカインの同定に成功した。特に世界で2例目、3例目となる「運動によって分泌減少するマイオカイン」としてCXCL10およびCCL5を同定した。培養細胞系で得られた結果について動物実験を用いた確認を行った後、その分泌制御メカニズムを明らかにした。さらにCXCL10については運動依存的な減少の生理的意義についても解析を行い、この減少が運動依存的な血管新生促進に関与している可能性を見出した。本結果は、既に2報の論文として公表済である(Ishiuchi et al., Biosci Biotechnol Biochem. (2018) 82(1):97-105.; Ishiuchi et al., Cytokine. (2018) 108:17-23.)。既に運動によって制御される新規マイオカインを複数同定しており、さらにその産生制御機構および生理的役割の一端を解明、複数の学会および学術論文で成果公表も行ったことから、当初の計画以上に進展していると考えられる。

まず、骨格筋細胞C2C12に対して電気パルス刺激(EPS)を負荷後に培養上清を回収し、マイオカイン量を測定した結果、運動によって分泌減少するマイオカインとしてCCL5およびCXCL10を新規同定することに成功した。さらにEPS依存的なシグナル伝達制御機構を解析、CCL5分泌減少にはAMPK活性化が、CXCL10分泌減少にはp38 MAPK活性化が関与していることを明らかとした。これらのマイオカイン抑制は、トレッドミルあるいはランニングホイールを用いた動物個体を用いた走行実験でも確認することができ、個体レベルでも見られる生理的現象であることが分かった。最後にCXCL10分泌減少の生理的意義を調べたところ、血管新生を促進することが明らかとなった。以上、本研究によって、CCL5やCXCL10といった運動抑制性マイオカインを介した免疫機能調節機構の一端が明らかとなった。今後、これらマイオカインネットワークの研究をさらに進めることで、運動依存的な免疫機能調節をはじめとする全身への運動効果伝達のメカニズムがさらに明らかになることが期待される。来年度以降も研究計画に沿って、免疫学的解析を中心に運動因子の生理作用の解析を進めていく。既に同定に成功した新規マイオカインは、免疫系を調節する性質を持つことが分かっている。今後、運動によるこれら新規マイオカインの減少が、実際に免疫系の制御を行うために十分な変化かについて解析を進めていく。以上のアッセイ系確立はすでに終了しているため、本年度中に研究完了するための時間は十分に確保されていると考えらえる。さらに、新規マイオカインの探索も継続して進めていく。研究計画における運動因子産生シグナル同定の項については予想より早く同定できたものの、さらに詳細なメカニズムについては実験系の不安定さなどの要因により若干の遅れが生じている。本年度は実験系の安定化を優先したため、次年度使用額が生じることとなった。同定した新規マイオカインの遺伝子発現を確認する実験に関して、予定よりも安定したデータ取得が可能となったため残額が生じている。一方、本研究計画で新規マイオカインスクリーニングの探索のために用いた実験系が、予想以上に強力であることが分かったため、これをさらに進めていく予定としている。次年度開始後、研究計画に沿った運動因子産生シグナルについての解析を早急に行う予定としている。大幅な研究計画の遅れとはいえず、開始早々には当初予定通りの研究計画進行が可能になると考えられる。