hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新卒看護師の職業継続支援に関する研究

本研究では、新卒看護師を対象に、入職後1年間の心理状況と離転職意思の変化について縦断的手法を用いて量的に調査を行った。具体的には、特性的自己効力感、精神的健康度および離転職意思の質問紙調査を、1年間に4回実施した。A病院の新卒看護師98名のうち4回すべての調査に参加した22名(22.4%)を分析対象とした。その結果、入職直後より3カ月目ごろが自己効力感は低く、精神的健康度が悪化しており、離転職意思が高いことが量的に立証された。このことにより、新卒看護師の職業継続に関する、個人への介入時期や内容について示唆を得ることができた。本研究は、新卒看護師の職業支援を促進するプログラムの開発と臨床への適用を主要な目的としている。当該年度は、これまでの先行研究および予備研究により、新卒看護師の職業支援プログラムを作成した。また来年度プログラムの評価に向け、新卒看護師の離職率の高い対象病院でのヒアリングを実施し、対象病院の現状を踏まえ実践可能な形式に、研究計画の修正を行った。さらに、研究枠組みの再構築と、概念の精選、説明モデルの理論化が終了した。このため、当該年度において、理論と実践の両者を基盤とした職業支援プログラムが開発されている。具体的には、プログラムは、社会認知理論を活用し、新卒看護師の自己効力感を支援するために、新卒看護師の職業継続に関わる不安・知識・スキルに介入援助を実施する。そのために、3回/年の介入を計画している。その前後4回/年に、プログラムの評価を、分析枠組みに則り、同様の質問紙を用いて実施する予定である。この縦断的質問紙調査では、プログラムの評価とともに、職業継続のプロセスが明らかになると考えられる。平成21年度は4月より、離職率の高い(18%以上)病院での実践を予定している。介入・調査における対象施設との調整も当該年度に実施しており、平成21年度の介入・評価において、本研究の目的を達成すると考えられる。本研究は、新卒看護師の職業支援を促進するプログラムの開発を主要な目的としている。当該年度は、昨年度の文献レビューの成果として、2題の学会発表を行い、さらに新卒看護師の職業継続支援プログラムの適用の確認と開発を実施した。新卒看護師の職業継続促進プログラムの臨床への適応を検討と新卒看護師を対象とした職業継続支援プログラムの内容を精選するために、新卒看護師の離職率の高い対象病院でのヒアリングを実施し、対象病院の現状を踏まえ実践可能な形式に、研究計画の修正を行った。具体的には、プログラムは、社会認知理論を活用し、新卒看護師の自己効力感を支援するために、新卒看護師の職業継続に関わる不安・知識・スキルの測定を実施した。そのために、5回/年の縦断的な質問紙調査を実施した。この縦断的質問紙調査では、職業継続意思の変化が明らかになり、職業継続意思に影響している要因が記述された。これにより、新卒看護師の職業継続支援プログラムの内容が厳選されるとともに、介入の時期を決定することができた。新卒看護師における職業継続支援プログラムの開発されたため、当初計画していたプログラムの評価を行うことが課題である。
DLC膜の熱分解反応の解明と同位体元素・多原子価イオン添加による耐熱性向上

2018年度はダイヤモンド状炭素(DLC)膜の熱分解過程を明らかにするために2017年度に構築した軽元素用の昇温脱離分子測定システムを使用して,DLC膜から熱分解に伴い放出されるガス分子を計測し,熱分解過程を評価した.DLC膜として,フィルタードカソーディックアーク(FCVA)およびスパッタリング法によりsp2/sp3炭素結合比の異なる3種の非水素化DLC膜を,パルスプラズマを用いて4つの炭化水素ガスを原料に用いて構造の異なる6種の水素化DLC膜を準備した.これらのDLC膜の構造をsp2/sp3炭素結合比はX線吸収微細構造(NEXAFS)により,水素量をグロー放電発光分析法(GD-OES)により評価し,構造の3元図上を網羅するDLC膜が作製できている事を確認した.これらのDLC膜を10-6Pa以下の高真空下で赤外線により1000°Cまで加熱し,その際に放出される分子の質量数と放出が開始される温度とを比較した.その結果,非水素化DLC膜に比べて水素を含むDLC膜の熱分解温度が低く,更に放出分子の分子量が低いことが示された.特に水素を最も多く含むDLC膜では350度程度から水素の放出が継続的に発生し,一方で非水素化DLC膜では質量数44以上の大きな分子の脱離が観測された.これらより,膜の構造の内,特に水素量が多いDLC膜の耐熱性が低く,文化過程に膜中の水素が大きく関与することが示唆された.このため,水素導入下での反応の評価についても2019年度に実施する予定である.これらの反応は昇温速度に依存していることが示唆された為,昇温速度に対する放出ガス分子の開始温度および放出ガスの分子量について2019年度に並行して研究を実施する予定である.2018年度は2017年度に構築した軽元素用の昇温脱離分子測定システムを使用して,ダイヤモンド状炭素(DLC)膜から熱分解に伴い放出されるガス分子を計測し,熱分解過程を評価した.フィルタードカソーディックアーク(FCVA)およびスパッタリング法により基板への印加バイアス等を調整し,sp2/sp3炭素結合比の異なる3種の非水素化DLC膜を,パルスプラズマCVD法により4つのC:H比の異なる炭化水素ガスから6種の構造の異なる水素化DLC膜を作製し,sp2/sp3炭素結合比と水素量を評価した.これらのDLC膜を10-6Pa以下の高真空下で赤外線により15°C/minで1000°Cまで加熱した.その際,放出される分子の質量数と放出開始温度を得た.水素化DLC膜の放出開始温度は最も低い試料で約350°Cと低い事が示され,放出分子の分子量も低い概ね質量数50以下が多いことが示された.一方で非水素化DLC膜は800°C以上でも熱分解しない試料があり、放出分子の質量数も44以上のものが多く観測された.これらより,DLC膜の構造の内,特に水素量が多いDLC膜の耐熱性が低く,分解過程に膜中の水素が大きく関与することが示唆され,更に昇温速度により放出される分子量が異なることも分かってきた.このため,水素導入下での加熱による放出分子の評価,昇温速度に対する放出ガス分子の開始温度および放出ガスの分子量についても2019年に実施する予定とした.2018年度の結果を受け,分解過程にDLC膜中の水素が大きく関与することが示唆されたことから,水素中での加熱による放出分子の評価を実施予定である.当初予定していた,酸素,窒素,大気等の反応性環境下での熱分解過程の評価に加え,水素の導入による膜表面からのエッチングなどの影響を評価していく.本実験は大気圧の各ガスを四重極質量分析器に直接導入できない為に質量分析器室と熱脱離用反応室間にピンホール付のセパレート用真空フランジを設置して,真空ポンプをイオンポンプ等の後方排気用接続部に接続し,作動排気系を構成し,各種ガスの大気圧下でのDLC膜の反応に伴う放出ガス分子を質量分析から特定する予定である.又,2018年度の研究より,昇温速度により放出される分子量が異なることが示されたことから昇温速度に対する放出ガス分子の開始温度および放出ガスの分子量の評価についても実施する予定である.本研究の工業的へ寄与を念頭に,当初の予定通り,耐熱性向上のためにsp2結合性炭素成分の熱分解による分解温度の上昇を狙い,多原子価イオンを生成できるアンチモン等の半金属材料をDLC膜内に導入し,膜の耐熱温度が向上するかを検討する.特に非水素化DLC膜の耐熱性が高いことが明らかとなったことから,非水素化膜に多原子価イオンを導入した膜を作製して,膜の分解挙動を評価する。又,科研の国際共同研究加速基金との相互補完による共鳴的な効果を期待し,王立タイ放射光科学研究所においてX線吸収微細構造(NEXAFS)と光電子顕微鏡(PEEM)との組み合わせにより2次元的にも評価する.

この結果よりsp2,sp3の両結合性炭素および水素のどの成分が何°Cで反応をどのように進行するかという学術的に重要な情報を得る.2017年度は真空中でのダイヤモンド状炭素(DLC)膜の熱分解過程を明らかにするために赤外線熱源、質量分析システムを発注し、これらを用いてDLC膜からの水素や炭素のような軽元素の熱脱離現象を測定システムを構築し,DLC膜から熱分解に伴い放出するガス分子を計測・特定できるように整備した.本装置に求められる分解能は炭素もしくは水素という極めて軽い原子から構成される分子の同定である為,低質量数の高感度検出が求められ、軽元素・低分子に対して高感度を有する高感度四重極質量分析器を手配し,更に真空容器のヒータ素子によるコンタミネーションを防止でき,温度の制御能が1°Cの赤外線ランプを手配し,各温度での熱によるDLC膜構成成分である炭素と水素の真空下での脱離反応を検出できることを確認した。現在,DLC膜が如何に熱により崩壊し、分解していくかを実験的に明らかにするべく研究を進めている.一方のDLC膜の構造評価についても進んでおり、被評価体であるDLC膜は4種類の現有装置(フィルタードカソーディックアーク(FCVA),スパッタリング,パルスプラズマ,高周波(RF) CVD)により、全ての作りえる構造を有する各種DLC膜が作製できる事を確認した。例えば水素量が"0 at.%"の水素を含まないDLC膜は前駆体となる炭素イオンのエネルギーを調整する事でFCVAとスパッタリング法でsp2/sp3のことなる作製できることを確認し、水素を含むDLC膜もCVD法で用いる原料を様々に変更する事で作り分けを行えることを確認している.作製した膜の構造はX線吸収微細構造(NEXAFS)とラザフォード後方散乱・弾性反跳原子検出(RBS/ERDA)測定し、構造を特定している.ダイヤモンド状炭素(DLC)膜の熱分解課程を評価する高感度四重極質量分析器と高性能真空用赤外線ランプを主構成要素とする測定系の構築とフィルタードカソーディックアーク(FCVA),スパッタリング,パルスプラズマ,高周波(RF) CVD法を用いたDLC膜の構造の作り分け技術を予定通り、2017年度は実施し、両者共に予定通りに進めることができた。また、本システムを使っての実験において新規で理解されたこととして、局所的に熱分解課程が進む場合がある可能性が示されたため、科研の国際共同研究加速基金を利用し、この局所的な熱分解課程をX線吸収微細構造(NEXAFS)と光電子顕微鏡(PEEM; Photoemission Electron Microscope)との組み合わせにより評価すべく、王立タイ放射光科学研究所と共同研究に発展させることとした。これらのことから、研究の進捗は予定よりも拡張し、発展しながら、どちらかといえば進んでいる状況である。2018年度はダイヤモンド状炭素(DLC)膜の熱分解過程を明らかにするために2017年度に構築した軽元素用の昇温脱離分子測定システムを使用して,DLC膜から熱分解に伴い放出されるガス分子を計測し,熱分解過程を評価した.DLC膜として,フィルタードカソーディックアーク(FCVA)およびスパッタリング法によりsp2/sp3炭素結合比の異なる3種の非水素化DLC膜を,パルスプラズマを用いて4つの炭化水素ガスを原料に用いて構造の異なる6種の水素化DLC膜を準備した.これらのDLC膜の構造をsp2/sp3炭素結合比はX線吸収微細構造(NEXAFS)により,水素量をグロー放電発光分析法(GD-OES)により評価し,構造の3元図上を網羅するDLC膜が作製できている事を確認した.これらのDLC膜を10-6Pa以下の高真空下で赤外線により1000°Cまで加熱し,その際に放出される分子の質量数と放出が開始される温度とを比較した.その結果,非水素化DLC膜に比べて水素を含むDLC膜の熱分解温度が低く,更に放出分子の分子量が低いことが示された.特に水素を最も多く含むDLC膜では350度程度から水素の放出が継続的に発生し,一方で非水素化DLC膜では質量数44以上の大きな分子の脱離が観測された.これらより,膜の構造の内,特に水素量が多いDLC膜の耐熱性が低く,文化過程に膜中の水素が大きく関与することが示唆された.
直腸手術における排尿, 性機能障害の病態解明と骨盤内自律神経温存手術の開発

1.目的.直腸癌の手術後には排尿,性機能障害が高率に発生するが癌の治療のためには不可避なものとされていた.本研究は癌に対する治療効果を十分に得ながら手術に伴う機能障害を最小限にするため骨盤内自律神経を温存する手術術式を開発しその適応を明らかにすることを目的とする.2.排尿及び男性性機能を支配する神経は下腹神経,骨盤内臓神経と陰部神経である.われわれは下腹神経,骨盤内臓神経,骨盤神経叢及びこれからの分枝を直視下に確認して温存し直腸を切除する方法を工夫して開発した.1.直腸癌に対する自律神経温存手術の排尿機能検査.自律神経温存手術を受けた直腸癌69例に尿力学的な検査を行った.その結果,自律神経をすべて温存すると排尿障害はなかった. (0/29).また片側の第4前仙骨孔から出る骨盤内臓神経が温存されれば83.3%(5/6)に排尿機能が維持された.2.直腸癌に対する自律神経温存手術後の性機能. 65歳以下で術前に性機能障害のない53例に術後の性機能を調査した.下腹神経,骨盤内臓神経,骨盤神経叢およびその分枝をすべて温存した症例では勃起障害11%,射精障害21%であり拡大郭清例(n=29)の66%, 93%の障害と比較して明かに性機能の温存ができた.3.雑種成犬を用いた骨盤内自律神経温存及び損傷の程度と排尿機能との関係.17頭の雄成犬を用いた.神経非損傷時には尿管からCO_2を注入すると排尿反射がみられ,完全排尿となった.片側骨盤内臓神経切断時には不完全収縮ながら排尿反射がみられた.両側切断時には排尿反射は認められなかった.4.直腸癌に対する自律神経温存手術症例の手術適応.下腹神経,骨盤内臓神経をすべて温存した104例の5年累積局所再発例は20.8%,累積5年生存率は72.7%であり,拡大郭清例より良好であった.背景因子から分類して検討すると癌の占居部位,深達度にかかわらずリンパ節転移のない症例には自律神経温存手術の適応としてよいと考えられた.1.目的.直腸癌の手術後には排尿,性機能障害が高率に発生するが癌の治療のためには不可避なものとされていた.本研究は癌に対する治療効果を十分に得ながら手術に伴う機能障害を最小限にするため骨盤内自律神経を温存する手術術式を開発しその適応を明らかにすることを目的とする.2.排尿及び男性性機能を支配する神経は下腹神経,骨盤内臓神経と陰部神経である.われわれは下腹神経,骨盤内臓神経,骨盤神経叢及びこれからの分枝を直視下に確認して温存し直腸を切除する方法を工夫して開発した.1.直腸癌に対する自律神経温存手術の排尿機能検査.自律神経温存手術を受けた直腸癌69例に尿力学的な検査を行った.その結果,自律神経をすべて温存すると排尿障害はなかった. (0/29).また片側の第4前仙骨孔から出る骨盤内臓神経が温存されれば83.3%(5/6)に排尿機能が維持された.2.直腸癌に対する自律神経温存手術後の性機能. 65歳以下で術前に性機能障害のない53例に術後の性機能を調査した.下腹神経,骨盤内臓神経,骨盤神経叢およびその分枝をすべて温存した症例では勃起障害11%,射精障害21%であり拡大郭清例(n=29)の66%, 93%の障害と比較して明かに性機能の温存ができた.3.雑種成犬を用いた骨盤内自律神経温存及び損傷の程度と排尿機能との関係.17頭の雄成犬を用いた.神経非損傷時には尿管からCO_2を注入すると排尿反射がみられ,完全排尿となった.片側骨盤内臓神経切断時には不完全収縮ながら排尿反射がみられた.両側切断時には排尿反射は認められなかった.4.直腸癌に対する自律神経温存手術症例の手術適応.下腹神経,骨盤内臓神経をすべて温存した104例の5年累積局所再発例は20.8%,累積5年生存率は72.7%であり,拡大郭清例より良好であった.背景因子から分類して検討すると癌の占居部位,深達度にかかわらずリンパ節転移のない症例には自律神経温存手術の適応としてよいと考えられた.直腸癌手術の根治性を高めるために行なわれるリンパ節拡大郭清術は骨盤内自律神経を損傷して排尿障害及び男性性機能障害を発生させる。本研究では直腸癌手術の根治性を損なうことなく骨盤内自律神経を温存して機能障害をできるだけ少なくするという手術を開発することが目的の1つである。われわれは骨盤内自律神経すなわち下腹神経,骨盤内臓神経,骨盤神経叢を温存して直腸癌を切除する手術の詳細を開発して報告した。この方法による手術を133例に行なった。これらの症例のうち23例にDISAウロシステムを用いて尿流力学的検査すなわち膀胱内圧測定,尿道内圧測定,尿流測定を行なった。その結果自律神経温存手術では最小尿意は144±51.9ml、最大尿意295.8±101.6ml、最大意識圧58.3±34.9cm【H_2】O、最大尿道閉鎮圧84.7±51.1cm【H_2】

O、排尿量277.4±97.3ml、残尿量20.6±24.5ml、残尿率8.5±10.0ml、最大尿流率16.6±6.9ml/sec、平均尿流率7.9±4.2ml/sec、尿流時間48.6±36.5secであり正常人と変わらなかった。次に自律神経温存術症例と拡大郭清例を累積4年生存率で比較するとそれぞれ71.0%(n=133)、64.2%(n=195)であった。これを深達度別に比較するとそれぞれpm80.0%96.4%,SS【a_1】76.6%,70.6%,S【a_2】56.9%,55.3%であった。またリンパ節転移から比較するとn(-)78.9%,81.7%,【n_1】(+)56.1%,61.6%,【n_2】(+)65.0%,43.3%であった。このことにより神経温存術の適応はリンパ節転移のない症例と考えられる。リンパ節転移のある直腸癌症例については側方リンパ節郭清を十分に行なったうえ第4前仙骨孔から出現する骨盤内臓神経のみを温存する手術を開発した。この手術はこれまで15例に行ないこれらの尿流力学的検査を行なったところ良い成積であった。以上の研究やさらに術後男性性機能検査についてもさらに詳細に検討を続けている。
「場所」の人類学:モンゴル国・ウランバートル市の空間編制の変容から

本研究は、旧社会主義圏に位置するモンゴル国の首都ウランバートル市を事例として、冷戦後のグローバルな市場経済化と私有化=民営化の進行にともない現れつつある新たな空間性をとりあげ、その空間性が特定の知や実践と結びつきながら、どのようにわれわれの生を形作っているかを明らかにすることを目的とする。その際、焦点となるのは、モンゴルにおける2003年以降の土地私有化と、ウランバートル市の新たな都市計画という二つのプロジェクトにおける空間編制のあり方と、それらと相関的に現れる住民の居住のかたち、そして、三者の相互関係である。前年度は、近年急増しているウランバートル市への移住者の受け皿となっている市周辺部の「ゲル地区」(ゲルは天幕の意)と、ウランバートル市の都市計画研究所という二つの場所で調査を行なった。この観点からの研究成果として、昨年度に執筆した論文「ポスト社会主義のストリート」が、2009年3月に民博SER『ストリートの人類学』に掲載される。今年度はそれに加え、近年増加している、ローカルNGOによる「ゲル地区」における住民参加型のコミュニティ開発の調査、および、そのようなNGOをエージェントとして組み込むことによって、新たな都市計画の枠組みをつくろうとしているJICA調査団のゲル地区調査の調査を行った。この観点からの研究成果として、日本文化人類学会第42回研究大会(京都大学)において「公的空間と私的空間」(2008年5月)を、京都大学GCOE「生存を支える「地域/社会」の再編成」において「公共空間をつくる」(2009年1月)を発表した。後者はワーキングペーパーとして、本年度予算で刊行される予定である。本研究は、旧社会主義圏に位置するモンゴル国の首都ウランバートル市を事例に、冷戦後のグローバルな市場経済化とプライヴァタイゼーション(私有化=民営化)の進行にともなって現れつつある新たな空間性をとりあげ、その空間性が特定の知や実践と結びつきながら、どのようにわれわれの生を形作っているかを明らかにすることを目的とする。研究を進めるにあたって焦点となるのは、モンゴルにおける2002年以降の「土地の私有化」と、ウランバートル市の「新たな都市計画」という、市場経済化に対応した二つのプロジェクトにおける空間編制のあり方と、それらと相関的に現れる住民の居住のかたち、および、両者の相互関係である。そのため、本年度は、近年急増しているウランバートル市への移住者の受け皿となっている市周辺部の「ゲル地区」(ゲルは遊牧民の天幕)と呼ばれる地区と、ウランバートル市の都市計画研究所という二つの場所で調査を行なった。この調査によって、本研究では、従来から行ってきた研究を継続し、論文の執筆をすすめると共に、新たに、土地の私有化の進行にともなって生じつつある都市計画のパラダイム転換と、NGOを媒介とした「ゲル地区」での公共空間の創出という現象を考察する必要に迫られた。市場化、プライヴァタイゼーション(私有化=民営化)が地球規模に拡がる現在、国家と個、公と私などの従来からの二項図式に対して、NGOや市民社会など住民参加型のプロジェクトが注目されているが、本研究課題を遂行するためには、諸アクターの接触、交渉に注目しながら、このような枠組みが住民の生をどのように捕捉しているかを明らかにしていくことが求められる。
半導体ナノ粒子への不純物ドープによるキャリア密度制御と新規発光過程の探索

半導体ナノ粒子への不純物ドープによるキャリア密度制御を行うため、ドープしたドナー電子が受ける量子閉じ込め効果の影響について研究した。まず、CdSナノ粒子にドナーとしてAl^<3+>、アクセプターとしてAg^+をドープした試料を作製し、そのドナー・アクセプター(DA)ペア発光について調べ、DAペア発光に関与する電子はナノ粒子中に非局在化した電子であることを明らかにした。しかし、この発光機構において、ドープしたAl^<3+>イオンの発光への寄与が不明確であった。Al^<3+>イオンの発光への寄与を明らかにするためには、粒子サイズ分布が小さく、DAペア発光に加えてバンド端発光も明確に観測される良質な試料を準備し、その発光特性を詳細に検討することが必要である。そこで、次に、新しい試料作製方法を導入し、より良質な試料を作製することを試みた。これまでは、室温、大気中で容易にナノ粒子を合成できる逆ミセル法を用いてきたが、新たに高温プロセスを用いたナノ粒子合成法を確立し不純物をドープしたナノ粒子の作製に成功した。MnイオンをドープしたCdSナノ粒子では、狭い粒子サイズ分布、強いバンド端発光の観測、ナノ粒子表面欠陥による発光の低下、バンド端およびMn発光の量子収率の増加といった多くの点で、逆ミセル法によって作製した試料と比較して著しい特性の向上が確認された。同様の手法を用いて、Al^<3+>、Ag^+のドーピングも行い、DAペア発光が観測される試料の作製にも成功した。この成果によって、ドナー電子が受ける量子閉じ込め効果の影響、および発光への寄与について明らかにするためのより詳細な実験が可能になった。ドナーが関与する発光過程としてドナー・アクセプターペア(DAペア)発光に注目し、ドナー電子が受ける量子閉じ込め効果が発光過程へ及ぼす影響について調べた。試料としてドナーとしてAl^<3+>イオン、アクセプターとしてAg^+イオンをドープしたコア/シェル型CdS/ZnSナノ粒子の作製を試み、DAペア発光が明確に観測される試料の作製に成功した。作製した試料について、DAペア発光の発光エネルギーおよび発光ダイナミクスの粒子サイズ依存性を調べた。特に、粒子サイズがドナーに束縛された電子のボーア半径と同程度の場合について注目して実験を行った。発光エネルギーの粒子サイズ依存性においては、励起子エネルギーと同様の量子閉じ込め効果によるエネルギーシフトが観測された。この結果から、Al^<3+>ドナーに束縛された電子は自由電子と同様の量子閉じ込め効果を受けることが明らかになった。また、発光ダイナミクスの測定においては、発光ピークが時間と共に低エネルギー側にシフトする現象が見られ、さらに粒子サイズの減少に伴いこのピークシフトが抑制されるという結果が得られた。発光ピークの時間シフトはドナー・アクセプター間の距離の分布によって起こる。従って、粒子サイズの減少によるピークシフトの抑制は、ドナー・アクセプター間距離の上限が粒子サイズによって制限を受けることを示している。以上の結果は、粒子サイズがドナーのボーア半径程度まで小さくなった場合、浅い不純物準位に束縛された電子の波動関数は粒子全体に広がり、自由電子の波動関数との区別がつかなくなっていることを示唆するものである。
看護組織の協働学習型マネジメント力育成システムの開発：教育プラットフォームの創成

師長と、主任・副師長等プレミドルマネジャー(PMM)層各々を対象に、1マネジャー育成への各施設の取組み実態・ニーズ把握・『協働学習型マネジメント力育成システム(Mシステム)』による効果の評価指標開発、2『Mシステム』の開発を行う。Mシステムは、協働学習により実践と知識等を統合するマネジメント力育成の教育基盤(プラットフォーム)であり、他職種・他機関、多職種間・多機関間への応用が期待される。
胚培養液中における受精胚由来microRNAの同定とその臨床的意義に関する研究

受精胚を培養したDay3ならびにDay5の培養液を集積した。それぞれの培養液からmicroRNAを抽出して、胎盤特異的microRNAであるmiR-518bならびに胎盤と比較して胎児から有意に発現するmiR-323-3pの発現パターンを解析した。Day3の培養液中にはmiR-518bが検出されるサンプルが含まれていたが、miR-323-3pは全てのサンプルで検出されなかった。一方、Day5の培養液中にはmiR-518bとmiR-323-3pとを検出できるサンプルが含まれていた。Day3の培養液でmiR-518b陽性ならびにDay5のそれでmiR-518bとmiR-323-3pとが陽性のとき、妊娠に至る受精胚が含まれている傾向が認められた。一方、Day3あるいはDay5の培養液にmiR-518bの発現を検出できないとき、凍結胚できる受精胚が含まれていない傾向が認められた。受精胚を培養した培養液中のmicroRNAを定性解析することで、良好胚をスクリーニング出来る可能性が示唆された。平成28年度は、検体集積、臨床データの蓄積、ならびに培養液中で検出可能なmicroRNAの同定を行った。まず、受精胚を培養した受精3日目と受精5日目の培養液を一組として計32組を集積した。臨床データについては、受精3日目のVeek分類と受精5日目のGardber分類のデータ、胚移植の有無、胚移植後の妊娠生率の有無、生児獲得の有無について調査した。32例のうち、11例について、胎盤特異的に発現するmicroRNAであるchromosome 19 microRNAscluster region(C19MC領域)のmiR-517cならびに胎児・胎盤で有意に発現しているC14MC領域のmiR-323-3pの培養液中における発現の有無を定性的に解析した。11例の培養液中のmicroRNAの発現パターンは、受精5日目の培養液中にmiR-517cならびにmiR-323-3pの発現を検出し得たものは3例であり、いずれの胚もその後の妊娠成立ならびに生児を得たことが確認された。いずれのmicroRNAの発現も認めなかった2例は、胚移植後の妊娠は確認されなかった。いずれか一方のmicroRNAの発現が認められた6例のうち、2例は胚移植後の妊娠成立と生児の獲得が確認された。受精5日目の培養液中におけるmiR-517cならびにmiR-323-3pの発現解析は、良好な受精胚を選別するバイオマーカーに成り得ると期待された。平成28年度の研究計画である検体集積、臨床データの蓄積、ならびに培養液中で検出可能なmicroRNAの同定を行うことができた。また、C19MCおよびC14MCのmicroRNAの発現パターンは、胚移植後の妊娠成立ならびに生児獲得につながる臨床転帰と関連していることが示唆される知見を得ることができた。H28年度の研究計画はおおむね実行された。平成28年度の研究成果により、受精5日目の培養液中におけるmiR-517cならびにmiR-323-3pの発現解析は、良好な受精胚を選別するバイオマーカーに成り得ると期待された。そこで、平成29年度は、受精3日あるいは5日の培養液を用いた受精胚機能検査キットの開発を目指した。しかし、受精胚特異的microRNAについて、Veeck分類/Gardner分類(形態的分類)との関連を解析したが、有意な関連は認められなかった。ついで、受精胚特異的microRNAについて、妊娠成功例と妊娠不成立例とを最も区別しうる受精胚特異的microRNAマーカーセットをROC解析で選定し、胚培養液を用いた受精胚機能検査法の開発を試みた。しかし、胚培養液中から抽出されるRNA量が微量であること、ならびにTaqMan PCR法によるmicroRNA定量精度が不安定であることから、研究データの正確性を高める必要があり、研究の完遂に至らなかった。また、廃棄される胚培養液中のcell-free DNAを用いた受精胚DNA診断の可能性については研究自体を実施することができなかったため、研究期間を平成30年度まで1年間延長した。受精胚特異的microRNAについて、Veeck分類/Gardner分類(形態的分類)との関連を解析したが、有意な関連は認められなかった。ついで、受精胚特異的microRNAについて、妊娠成功例と妊娠不成立例とを最も区別しうる受精胚特異的microRNAマーカーセットをROC解析で選定し、胚培養液を用いた受精胚機能検査法の開発を試みたが、研究の完遂に至らなかったため、研究期間を平成30年度まで1年間延長した。平成30年度には、平成29年度に予定されていた研究計画を実行する予定である。Day3の培養液でmiR

-518b陽性ならびにDay5のそれでmiR-518bとmiR-323-3pとが陽性のとき、妊娠に至る受精胚が含まれている傾向が認められた。一方、Day3あるいはDay5の培養液にmiR-518bの発現を検出できないとき、凍結胚できる受精胚が含まれていない傾向が認められた。受精胚を培養した培養液中のmicroRNAを定性解析することで、良好胚をスクリーニング出来る可能性が示唆された。平成28年度は、主に検体集積と臨床データの蓄積を行った。そして、培養液で検出可能なmicroRNAの同定については、私どものこれまでの研究成果で既に定量法が確立しているC19MCおよびC14MCのmicroRNAの検出が培養液中で可能なのか否か検討した。11例のみの解析であったので、PCR解析はすでに現有している試薬を使用して行い、新規に購入する必要がなかったので、本研究費を使用しなかった。本年度の研究でC19MCおよびC14MCのmicroRNAの発現を培養液中に検出できることが明らかになったので、平成29年度は、平成28年度に実施する予定であった次世代シークエンス解析を実施して、広範囲に培養液で検出可能な受精胚由来microRNAを同定する予定である。そして、胚培養液中における受精胚由来microRNA検出による受精胚機能検査としての有用性の評価ならびに培養液を用いた受精胚の非侵襲的着床前診断の可能性を探る。受精3日あるいは5日の培養液を用いた受精胚機能検査キットの開発を目指す。受精胚特異的microRNAについて、妊娠成功例と妊娠不成立例とを最も区別しうる受精胚特異的microRNAマーカーセットをROC解析で選定し、胚培養液を用いた受精胚機能検査法を開発する。胚培養液中から抽出されるRNA量が微量であること、ならびにTaqMan PCR法によるmicroRNA定量精度が不安定であることから、研究データの正確性を高める必要が生じた。PCR法の精度向上などの条件設定に時間を要したので、当初計画していた集積した検体を用いたPCR解析を実施できなかったこと、廃棄される胚培養液中のcell-free DNAを用いた受精胚DNA診断の可能性については研究自体を実施することができなかったため、次年度使用額が生じた。研究期間を平成30年度まで1年間延長し、集積した検体を用いたmicroRNA定量解析ならびに受精胚DNA診断のための胚培養液中cell-freeDNAを用いたマイクロアレイ解析を実施するため、研究計画の遅延に伴い生じた次年度使用額は適正に使用される。平成28年度の研究成果でC19MCおよびC14MCのmicroRNAの発現を培養液中に検出できることが明らかになったので、平成29年度は、平成28年度に実施する予定であった次世代シークエンス解析を実施して、広範囲に培養液で検出可能な受精胚由来microRNAを同定する予定である。そして、胚培養液中における受精胚
水素吸蔵・放出過程における格子欠陥形成機構の解明

常温、1000 Pa以下で水素吸蔵放出するMg-Ni膜について、収差補正付環境制御型透過電子顕微鏡(ETEM)を用いて、試料周りに水素ガスを導入しながら水素化反応その場観察を行った。80 Paに保持した水素雰囲気中で6Mg-Ni膜を30万倍以上の高倍で観察したところ、観察開始から20秒以内でMg-Niアモルファスから2-5 nmの微結晶が生成・成長する様子が動的に観察され、Mg-Ni膜の水素化初期過程を格子像でとらえることに成功した。高分解能TEM像とフーリエ変換像を解析した結果、高分解能観察開始後20秒以内で単斜晶Mg2NiH4が生成し、約1分後にMgH2が生成し始めることが明らかになった。常温、1000 Pa以下で水素吸蔵・放出するMg-Ni膜について、環境制御型透過電子顕微鏡(ETEM)を用いて、水素ガスを導入しながら水素化反応のその場観察を行った。ETEMは差動排気型真空排気システムを装備し、電子銃真空度を10-6 Pa台に保ちつつガス導入前の試料室真空度を10-5 Pa台に低下させ、1800 Paまでガス導入を可能にしたETEM(TitanETEM,FEI Company)を使用した。観察した試料はマグネトロンスパッタ法を用いて作製したMg6Ni膜で、イオンミリング法によりTEM観察用断面試料を作製し、通常の電界放出型TEMで予備観察を行った。その後、ETEMに挿入し、試料まわりに80 Paまで段階的に水素を導入し、0.05秒/フレームごとに膜の構造変化を記録した。80 Paで水素雰囲気を保持し、30万倍以上の高倍で観察したところ、観察開始から20秒以内で、Mg-Niアモルファス中で1nm以下のクラスターが結晶核となり、そこから2-5 nmの微結晶が成長する様子が動的に観察された。また、結晶化初期過程において0.22 nmの格子面間隔がしばしば観察されたが、電子線照射、観察開始直後から1分ほど経過すると0.14ー0.15 nmの短い周期性を持つ結晶が現れることがわかった。さらに詳しく解析するために、同じ試料について80 Paの水素雰囲気で、20秒ごとに逐次撮影を行った。その高分解能像とフーリエ変換像を解析した結果、間隔0.22 nmの格子面は単斜晶Mg2NiH4の(222)面であり、0.15 nmの格子面は正方晶MgH2の(002)面であることが明らかになった。これによりMg2NiがMgより先に水素化することが明らかになり、Mg2NiがMgの水素化に対して触媒作用を持つことが示された。Ti-V系BCC合金は、常温常圧付近で最大3.8 wt%の水素を吸蔵することが報告されており、燃料電池自動車用水素貯蔵タンクの材料として応用が期待されている。しかしながら、構成元素の割合により、最大水素吸蔵量と水素放出の際の死蔵量に違いがあり、特に水素吸蔵・放出繰り返し過程における死蔵量は水素吸蔵・放出の際に形成される格子欠陥の種類や量と関係するものと考えられる。本研究では、Ti-V二元系合金についてV/Ti比を変えた合金をアーク溶解により作製し水素化・脱水素化を行うと同時に、水素化後の合金を透過電子顕微鏡(TEM)により観察した。その結果、V/Ti比の小さいV0.4Ti0.6,V0.5Ti0.5で水素吸蔵後にFCCの(111)面に平行に双晶境界と積層欠陥が多く形成されていることが明らかになったが、V/Ti比の大きいV0.8Ti0.2,V0.6Ti0.4では双晶境界はほとんど観察されなかった。また、常温、1000Pa以下で水素吸蔵・放出するMg-Ni膜について、環境制御型透過電子顕微鏡のカラム内に水素ガスを導入しながら、水素化反応のその場(in-situ)観察を行った。具体的にはマグネトロンスパッタ法を用いて作製したMg6Ni膜について、イオンミリング法によりTEM観察用断面試料を作製し、予備観察を行った後、試料まわり(TEMのポールピース内)に100Paまで段階的に水素を導入し、0.1秒ごとに膜の構造変化を記録した。100Paで水素雰囲気を保持し、特に膜/基板界面付近を30万倍以上で観察すると、Mg6Ni膜中のMg2Ni結晶の(002)面が基板側に成長していったり、アモルファス中から微結晶が生成したりするなど、結晶化が進行する様子が観察された。水素雰囲気中で30分以上保持した後は、Mg2NiHxと考えられる結晶が生成していることが明らかになった。

常温、1000 Pa以下で水素吸蔵・放出するMg-Ni膜について、環境制御型透過電子顕微鏡(ETEM)を用いて、水素ガスを導入しながら水素化反応のその場観察を行った。観察した試料はマグネトロンスパッタ法を用いてSi基板上に作製し、表面に酸化保護膜としてPdを蒸着した6Mg-Ni, 2Mg-Ni, 10Mg-Ni膜で、イオンミリング法によりTEM観察用断面試料を作製し、通常の電界放出型TEMで予備観察を行った。その後、ETEMに挿入し、試料まわりに80 Paまで段階的に水素を導入し、0.05秒/フレームごとに膜の構造変化を記録した。6Mg-Ni膜について80 Paで水素雰囲気を保持し、30万倍以上の高倍で観察したところ、観察開始から20秒以内で、Mg-Niアモルファス中で1nm以下のクラスターが結晶核となり、そこから2-5 nmの微結晶が成長する様子が動的に観察された。また、結晶化初期過程において0.22 nmの格子面間隔が多く観察されたが、電子線照射、観察開始直後から1分ほど経過すると0.14ー0.15 nmの短い周期性を持つ結晶が現れることがわかった。高分解能TEM像とフーリエ変換像を解析した結果、間隔0.22 nmの格子面は単斜晶Mg2NiH4の(222)面であり、0.15 nmの格子面は正方晶MgH2の(002)面であることが明らかになった。2Mg-Ni膜では、水素ガス導入前後で約7%の膜厚増加が観察された。一方、10Mg-Ni膜ではMg2Niの水素化はSi基板に近い部分で主に観察され、Pdとの界面付近では水素化が起こる初期にMgH2の生成が観察された。水素化に伴う体積増加は、Mg→MgH2の場合で23.9%, Mg2Ni→Mg2NiH4で21.6%であることから、Mg2Ni膜における膜厚増加は水素化前の膜の密度や水素化後の結晶化度と関係しているものと考えられる。材料学、固体化学、電子顕微鏡平衡圧1000Pa以下のMg-Ni膜について、水素雰囲気でのTEMその場観察を行い、水素化の様子を結晶格子レベルでとらえることができた。得られた格子像を解析した結果、Mg2NiH4がMgH2より先に生成することが明らかになり、Mg2Niの存在がMgの水素化を促進する触媒効果を持っていることが示唆された。さらにMg2NiH4(222)面の間隔とMgH2(111)面の間隔が近いことと実験で得られた高分解能TEM像から、Mg2NiH4(222)面に平行にMgH2(111)面が生成・成長する可能性があると考えられる。Mg-Ni膜については、水素化前の微構造を含め、室温で数分以内で速やかに水素化するメカニズムが不明であった。本研究では、水素雰囲気でのその場観察を格子レベルで実現し、Mg-Ni膜の水素化メカニズムを明らかにすることができた。今後は、平衡圧の高い水素貯蔵材料についても、水素雰囲気でのその場観察が格子レベルで可能になるよう、試料作製条件や観察条件を検討していく。実用材料のベースとなるV-Ti合金について、V/Ti比と水素吸蔵・放出に伴い形成される格子欠陥の関係について明らかにすることができた。また平衡圧1000Pa以下のMg-Ni膜について、水素雰囲気でのTEM in-situ観察を行うことができ、Mg2Niの結晶化・水素化が観察された。具体的には水素化に伴って膜全体で結晶化が進行し、ポアが発生するなどのマクロな組織変化が観察されると同時に、膜/基板界面、Pdキャップ層/膜界面付近を高倍で観察することができ、水素化物と考えられる微結晶の生成・成長を明らかにすることができた。水素化におけるMg-rich相とMg2Ni相の関係や、Mg2Ni水素化における優先成長方位なども検討する必要がある。
ヨード状態を軸とした新生児期化学物質暴露による甲状腺ホルモン系かく乱の定量解析

環境中の化学物質には甲状腺ホルモンかく乱作用を有する化合物があり、その発達期における影響が危惧されている。本研究では、そのような化学物質である臭素化難燃剤の一部が、ある組織や臓器ではホルモン作用物質と働く一方で、別の標的組織や別の種では、抗ホルモン作用をする可能性が示された。またラットモデルにおいて、新生仔期での甲状腺ホルモンかく乱の影響が成体期の遺伝子発現にまで及ぶことを明らかにし、発達時期影響の指標となることがわかった。[目的]環境化学物質による甲状腺ホルモン系へのかく乱作用は比較的最近明らかになり注目されるようになってきたが、in vivo影響については未だ不明である。胎生期、新生児期での、甲状腺ホルモンのかく乱は、形態形成異常や中枢神経系の発達障害を引き起こす重大なリスクであり、それに関与する因子や毒性メカニズムを明らかにする必要がある。本研究では、下垂体-甲状腺-肝臓軸の中で特に肝臓に注目し、まずそこでの内分泌かく乱指標となる遺伝子群を同定し、in vivo影響を定量的に解析する。その上で、ヨード環境による影響の違いを明らかにする。[方法]雄のF344ラットを用い、生後1, 3, 5日にトリヨードサイロニン(T3)を、0.04100μg/kg体重で投与し、8週齢で肝臓を摘出してtotal RNAを抽出した。ジーンチップによるcDNAマイクロアレイ解析により、無処置群とT3群との間で、網羅的な発現比較し、発現変動のある遺伝子同定を行った。同定された遺伝子について、全群で定量測定を行った。また、血中T3, T4, TSHの測定をRIAで行った。[成果]ジーンチップ解析により、T3の新生仔暴露の発現影響が、成体期まで残る遺伝子としてUGT2他7つの遺伝子が同定され、その発現の投与量依存性も示された。血中のT3, T4, TSHレベルには有意な変化は見られなかった。[考察]昨年度研究では、アジレンドのcDNAマイクロアレイにより同様の検索を行ったが、十分な定量的再現性が得られなかった。今回、改良した実験プロトコルにより、目的としていた指標遺伝子がリストできた。発現影響は、血中ホルモン値への影響が出ないレベルで見いだされており、新生仔期の低用量の甲状腺ホルモン作用により、長期的影響がみられることが示唆された。【目的】家電製品や家具を不燃化するために多量の難燃剤ー主として臭素化難燃剤(BFRs)が使用されてきた。BFRsは、生体への蓄積性は低いものの、分解されにくいため環境中に「蓄積」され、ヒトおよび野生生物が定常的に曝露されており生体内に常に見いだされる(体内汚染)。これらのBFRsとその代謝物のいくつかが、甲状腺ホルモン(TH)系へのかく乱作用を持つことが比較的最近になって明らかになり、特にその胎生期新生時期曝露の影響が危惧されている。本研究課題では、1)TH系に大きな影響を与える因子としてのヨード摂取量(ヨード状態)を軸として、THの新生時期影響を、TH関連遺伝子発現を指標として定量解析し、また、2) BFRsのTHの作用について、レポータージーンアッセイにより解析した。【結果】1)低ヨード食投与成体ラットはTHに対する感受性が上昇したが、新生仔ではむしろ対照群と差がなかった。2)成体期肝でのTH関連遺伝子発現を指標として影響を検索した結果、新生時期は「高感受性時期」であることが証明された。3) BFRsのTH作用は、アッセイに使う細胞依存的にアゴニスト・アンタゴニスト活性が変更されうることが示された。【考察】BFRsの幾つか(特に水酸化体)は比較的強いTH作用を示したが、それらの活性は標的細胞依存的に変化しうることが示され、これまでの報告で矛盾していたデータが統一的に理解できるようになった。本研究では、新生時期はTHによる成体時影響を受けやすい高感受性の時期であることが示された一方で、低ヨードの影響は明確に見いだされなかった。今回検討しなかった新生時期後期(生理的にTHが上昇する時期)で強く影響を受ける可能性があり、今後の研究課題である。〔目的〕環境化学物質による甲状腺ホルモン系への攪乱作用は比較的最近になって注目されてきたが、胎生期、新生児期の影響は、形態形成異常・中枢神経系の発達障害を引き起こす重大なリスクであり、関与する因子やその毒性メカニズムを早急に明らかにする必要がある。本研究では、下垂体甲状腺肝臓系での内分泌攪乱の指標となる遺伝子群を同定して、それによりin vivo影響を定量的に評価する。〔方法〕雄のF344ラットを用い、生後1、3、5日目にトリヨードサイロニン(T3)、サイロキシン(T4)をそれぞれ0.04mg、4mg/kg bw投与した。8週令で屠殺し、下垂体、甲状腺、肝を摘出してAGPC法によりtotal RNAを抽出した。

肝臓のtotal RNAについて、アジレントのcDNAマイクロアレイを用いて、新生仔期無処置群とT3投与群の間の、遺伝子の発現レベルの比較を行った。定量的RT-PCR法により、マイクロアレイにより同定された遺伝子発現の確認および甲状腺ホルモン代謝遺伝子等のmRNAレベルを定量した。〔成果〕T3、T4新生仔期投与群において、ホルモン応答性遺伝子RLT3-2, RLT3-24の発現が上昇し、ホルモン受容体関連遺伝子としては、TRα2 mRNAが増加した。また、ホルモン代謝関連遺伝子では、Sult1C3の発現上昇、DIOsの発現変動が見られた。〔考察〕甲状腺ホルモンの新生仔期一時暴露により、成体期の下垂体甲状腺系の各組織で、甲状腺ホルモン関連遺伝子の発現が不可逆的に変更されることが示唆された。特に肝臓においては、マイクロアレイ解析により新生仔期影響を受ける遺伝子を新規に同定した。1年目のアジレンドのcDNAマイクロアレイ解析では、定量的再現性が得られず、甲状腺ホルモン投与方法を改良し、再度のアレイ解析をおこなうことが必要であった。このため、当初計画より遅延が生じたが、今回、再現性をもった指標遺伝子のリスト化が完了した新生仔期影響が遺伝子発現プロファイルの変化として同定できたため。1)ヨード環境による、新生児期影響の現れ方の違いを明らかにする2)臭素化難燃剤暴露による新生児期影響の評価甲状腺ホルモンの新生仔期一時暴露により、成体期の下垂体甲状腺系の各組織で、甲状腺ホルモン関連遺伝子の発現が不可逆的に変更されることが示唆された。これらの遺伝子発現を指標することで、化学物質の新生仔影響を定量的に検索できると考えられ、今後、臭素化難燃剤等の甲状腺ホルモン作用をもつ環境化学物質の作用について検証する。実験動物(ラット)特殊飼料(低ヨード食)遺伝子発現定量解析用試薬抗体実験動物(ラット)特殊飼料(低ヨード食)遺伝子発現定量用試薬類発現ベクター作成、導入試薬
Piwi-piRNAによるエピゲノム制御機構の解明

piRNAは生殖細胞特異的な小分子RNAであり、PIWIタンパク質と複合体を形成することで、核内外でトランスポゾンの発現抑制を行う。それにより、トランスポゾンの宿主ゲノムへの侵略を防ぎ、生殖細胞ゲノムの品質管理を担う。これまでの解析から、核内でのトランスポゾン発現抑制にはヒストン修飾などのエピジェネティックな制御が介在することが示唆されているが、その分子機構の詳細はまったく明らかになっていない。本研究の目的は、Piwi-piRNA複合体が核内でどのようにしてトランスポゾンの発現を抑制しているのか、その分子作用機序を明らかにすることである。具体的には、ショウジョウバエ卵巣由来培養細胞OSCを用いてPiwi相互作用タンパク質を単離し、Piwi-piRNAが標的とする分子実体を明らかにする。Piwi相互作用タンパク質及び、核内piRNA因子であるMaelstrom (Mael)の相互作用タンパク質をショットガン質量分析法により解析した結果、転写活性化因子Brahma (Brm)を共通因子として同定した。Brmはトランスポゾンの転写活性化に寄与し、正常細胞ではPiwiによってBrm機能が不活性化されているためトランスポゾンの発現が抑制されていることを明らかにした。さらに、PiwiはMaelとBrmの相互作用を促進し、MaelによるBrm機能の抑制に寄与することがわかった。Brmは、BAPとPBAPの2つの複合体の構成因子であり、トランスポゾンはいずれかの複合体によって転写活性化されていることがわかり、少なくともBAPに関して、MaelはBAPの構成因子であるOsaとBrmの相互作用を阻害することでBAPの活性を抑制することを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。まず、免疫沈降法を用いた解析からPiwi相互作用タンパク質には、核内piRNA因子であるMaelstrom (Mael)やリンカーヒストンH1、ヌクレオソームが含まれていることを明らかにした。また、Piwi相互作用タンパク質をショットガン質量分析法により解析した結果、転写活性化因子Brahma (Brm)を同定した。BrmとPiwiのRNAi実験から、Brmはトランスポゾンの転写活性化に寄与し、正常細胞ではPiwiによってBrm機能が不活性化されているためトランスポゾンの発現が抑制されていると考えられた。さらに、Maelの機能を抑制すると、PiwiとBrmの相互作用が減少することから、MaelはPiwiとBrmの相互作用を促進し、PiwiによるBrm機能の抑制に寄与することが示唆された。加えて、Maelを抑制するとPiwiと転写活性型ヒストン修飾の相互作用も減少することからも、Brmがトランスポゾンの転写を活性化し、Piwiがその機能を抑制するというモデルを支持する。本研究では、Piwiが相互作用しているゲノムDNA、および、ヒストン修飾の解析を進めてきた。ゲノムDNAについては、現在、次世代型シーケンサーを用いた配列の同定と解析を進めている一方、ヒストン修飾については大きな発見があった。我々は、Piwiが様々なヒストン修飾と相互作用していることを明らかにし、中でも活性型ヒストン修飾の含有量が高いことを見出した。さらに、Maelをノックダウンすると、Piwiと活性型ヒストン修飾の相互作用レベルが低下することを明らかにした。これまでのモデルでは、Piwiが標的とするトランスポゾンのゲノム領域は転写抑制型ヒストン修飾であるH3K9me3が多くみられ、PiwiはH3K9me3修飾に寄与すると考えられていたが、我々の結果は、これまで予想されていたモデルとは異なり、Piwiは活性型ヒストン修飾を多く持つゲノム領域のトランスポゾンを標的としていることを示唆する。次いで行ったPiwi相互作用タンパク質の解析から、我々は、Piwiが標的とする分子実体であるBrmを同定することに成功した。現在の我々の作業モデルでは、Piwiが転写活性化因子Brmに相互作用し、その転写活性機能を抑えることで、トランスポゾン発現の活性化を抑制していると考えている。Brmはトランスポゾンの転写活性化に寄与しており、そのゲノム領域は転写活性型ヒストン修飾が多く存在すると考えられる。このモデルは、Piwiが相互作用するヒストンには転写活性型修飾が多いというと結果とも矛盾しない。これらの成果は当初の計画を大きく上回るものであり、引き続き、PiwiによるBrm機能の抑制機構の解明を進めていく。

これまでの解析から、核内でのトランスポゾン発現抑制にはヒストン修飾などのエピジェネティックな制御が介在することが示唆されているが、その分子機構の詳細はまったく明らかになっていない。本研究の目的は、Piwi-piRNA複合体が核内でどのようにしてトランスポゾンの発現を抑制しているのか、その分子作用機序を明らかにすることである。具体的には、ショウジョウバエ卵巣由来培養細胞OSCを用いてPiwi相互作用タンパク質を単離し、Piwi-piRNAが標的とする分子実体を明らかにする。Piwi相互作用タンパク質及び、核内piRNA因子であるMaelstrom (Mael)の相互作用タンパク質をショットガン質量分析法により解析した結果、転写活性化因子Brahma (Brm)を共通因子として同定した。Brmはトランスポゾンの転写活性化に寄与し、正常細胞ではPiwiによってBrm機能が不活性化されているためトランスポゾンの発現が抑制されていることを明らかにした。さらに、PiwiはMaelとBrmの相互作用を促進し、MaelによるBrm機能の抑制に寄与することがわかった。Brmは、BAPとPBAPの2つの複合体の構成因子であり、トランスポゾンはいずれかの複合体によって転写活性化されていることがわかり、少なくともBAPに関して、MaelはBAPの構成因子であるOsaとBrmの相互作用を阻害することでBAPの活性を抑制することを明らかにした。本研究の結果から、トランスポゾンの転写はBrmによって活性化されており、さらにPiwiが相互作用することによってその機能が抑制されることで不活性化されていると考えられる。その分子機構を詰めるために、以下の推進方策をとる。1) Brm依存的トランスポゾンの同定と解析-Brmがどのような機構でトランスポゾンの転写を活性化しているのは不明である。まず、Brmをノックダウン(KD)した細胞におけるトランスポゾンの発現レベルを調べる。さらに、Brmが標的とするトランスポゾンをPiwiの標的トランスポゾンと比較解析する。2)トランスポゾン活性化に必要なBrmの機能ドメインの解明- BrmはATPaseドメインなどの既知のタンパク質ドメインをいくつかもっており、どのドメインが転写活性に必要なのかを調べる。3) BrmとPiwi、Maelの分子間相互作用の解明- BrmとPiwi、Maelの相互作用部位についてドメイン欠損変異体を用いて調べる。さらに、それぞれのKDを行い、Brmとの相互作用レベルを調べる。4) Piwi、MaelによるBrm転写複合体形成(抑制)機構の解明- Brmは転写複合体を形成することで標的遺伝子の転写を促進する。Piwi、MaelがBrm機能をどのように抑制するのかを明らかにするために、それらのKD細胞を用いてBrmと複合体構成タンパク質の相互作用レベルを比較解析する。5)その他の共通タンパク質の機能解明- PiwiとMaelの核内相互作用タンパク質の機能解析を進める。