hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EBウイルス関連唾液腺リンパ上皮腫細胞に関する分子病理学的研究

ウィルス(EBV)感染が確実になった唾液腺リンパ上皮腫およびその他の唾液腺腫瘍といわゆる良性上皮リンパ性病変の症例を、韓国内ではソウル国立大学校ホン教授、ロシア極東地域についてはロシア医科学アカデミーがん研究所グルセビッチ教授がそれぞれ抽出してきた。ロシア症例については、今年度内3月に、朔が同研究所に出張して1080症例を共同で再検討した。さらに、太平洋沿岸のカナダ、マレーシアの病理学者と同地域における調査の可能性について協議をおこなった。(2)疫学調査:韓国・ロシアの海外共同研究者ホン、グルセビッチおよびその研究協力者とそれぞれ疫学調査の具体的方法を協議する。すなわち、未分化癌およびその他の病変の患者の氏名、年齢、性、住所、民族、初診時期、症状、経過、処置、予後等の調査方法様式を定め、今後の進行について協議した。(3)ウィルス検出実験:EBV感染について検索するために、(1)で収集した症例のパラフィンブロックから連続切片を作製し、通常のHE染色をはじめ各種EBV関連分子の免疫組織染色とEBVのコードするsmall RNA(EBER-1)のRNA in-situハイブリダイゼーション(ISH)法とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によるEBV DNA断片増幅をおこなう準備をおこなった。(4)細胞培養実験:中国上海第二医科大学の張教授および何教授の協力により、同大学付属第九人民病院における唾液腺リンパ上皮腫患者の外科手術予定を事前に連絡うけ、7月に程が、2月に朔と程が研究協力者の大学院学生、五十嵐および丸山を帯同して、それぞれ手術後直ちに摘出物の凍結保存と無菌的な組織採取から細胞培養をおこなった。中国側研究者とは常に連絡を緊密にしながら培養培養条件の改善をおこなってきた。細胞は単離して試験管内で維持できているが、増殖性の安定はまだ得られていない。現在までに初代培養できた二種の細胞は、両研究室で培養維持し、株化をめざしているところである。(1)症例収集(2)疫学調査:昨年までに収集しえた中国・韓国・ロシアの症例については、それぞれの組織パラフィンブロックをえて、薄切切片よりEBウィルスDNAを抽出して以下の検討に供した。今年度はこれに中国症例20例を追加し、合計180例となった。(3)ウィルス解析実験:(1)項のDNA標品をPCR法によってLMP-1遺伝子を増幅した。このPCR産物を直接シークエンス法によって検索したところ、特徴的30bp欠損が、中国南部と四川省の患者に特異的にみとめられた。さらに30bp欠損の有無で二グループにわけたところ、グループ特異的な点変異が症例間に共通してみとめられることが判明した。したがって、ウィルスの多様性に地理的因子が関与していることが明らかとなった。(4)LMP-1発現検定実験:上記症例の薄切切片について、免疫組織学的にLMP-1の発現を検討した。その結果、約50%の症例で陽性反応がえられた。陽性例の組織型ないし発生部位等に明らかな関連はみられなかった。(5)培養細胞による実験:前年度に引き続き、中国側共同研究者とくに上海第二医科大学病院ではリンパ上皮腫症例が多いので、新鮮症例全例を培養系に移すことを試みてきた。このうち、昨年度末に日本側に移転した細胞は増殖不能となった。その後、初代培養に成功した細胞が維持できたので、これを今年度末に新潟大学に移転した。さらに、ヌードマウス移植にも成功したので、これから培養に移し、これも新潟大学に移転した。
アクティブパッシブ回路を用いた負性インダクタンスによる不要インダクタンスの消去

本研究においては負性インダクタンスによる不要インダクタンスの消去を行うために必要な基礎的な解析・シミュレーション・基礎実験等を行い、負性インダクタンスを応用するための基礎を確立した。負性インダクタンスは、そのインダクタンスの大きさが負であるということ以外は実在する正のインダクタンスと同等な電気的特性を示す。しかし、自然には実存しないものなのでその応答などには予想外の結果をもたらす可能性を秘めている。そこで本研究では以前より提案しているアクティブパッシブリアクタンス回路(VAPAR)による負性インダクタンスについてその実験結果を解析し負性インダクタンスの発生を確認した。その結果、過渡的な振動無しに実在するインダクタンスを見かけ上、小さくする働きがあることが検証された(論文掲載決定)。また、発生させたインダクタンスは周波数特性を持つが、その特性を一次遅れ特性近似してシミュレーションを行い必要な周波数特性について検討した。負性インダクタンスの大きさが初期値の90%となる周波数を最高使用周波数と定義し、シミュレーションにより過渡応答を解析した結果、負性シンダクタンスに必要な最高使用周波数は負性インダクタンスを付加した後の回路の時定数の逆数を上回っていれば、良好なインダクタンス補償特性が得られることがわかった。その場合の必要エネルギーについても解析し、回路に必要な容量についても考察した(論文投稿予定)。また、通常使用される周波数を越えた以上周波数に対しては、回路に用いられている連係インダクタンスの特性となり、発散するような危険は無いことがわかった。
胚性幹細胞から心筋細胞への分化誘導に伴なう興奮-収縮連関機構の発現機序の検討

マウス胚性幹細胞(ES細胞)は心臓を含め全ての細胞へ分化可能である。本研究ではES細胞から心筋へ分化過程に於ける興奮-収縮連関の機能発現機序解明を目的とする。ES細胞Cell line D3から心筋への分化誘導を確立し、分化の各ステージに於ける細胞内Caシグナル伝達系路を解明するために、遺伝子解析、コンフォーカルレザー顕微鏡を用いたCa蛍光測定、クールドCCDカメラを用いた細胞内Naの蛍光測定、パッチクランプ法による電気生理学的実験を行った。それらの結果より、未分化のマウスES細胞では小胞体からのCa放出はG-protein coupled receptorsの刺激により小胞体IP3受容体を介してCaが放出される機構が確認された(IP3-induced Ca release : IICR)。この時期にはIP3受容体のサブタイプI, II, IIIの全ての遺伝子発現が認められた。一方、リアノジン受容体と電位依存性Caチャネルの機能は全く認められず、ES細胞においては未分化の時期にはCa-indnced Ca release(CICR機構)は機能していないことが判明した。細胞膜のCa流入経路としては容量性Ca流入経路が認められた。細胞膜のCaポンプ及びNa-Caの両者は既に機能しており、細胞内Caのくみ出し機構として作動していた。Na-Kポンプは低濃度のウワバインには抑制効果は小さく、心筋タイプのポンプは機能的には発現していないことが判明した。これらのCaシグナル伝達系は心筋への分化過程でどのように推移するのかの検討を行った。IICR機構は分化の全過程で認められ、心筋に分化後にも機能していた。CICR機構は分化の後半約7日後には確認あされた。この時期には電位依存性CaチャネルのLタイプ、Tタイプの両者が認められた。また、低濃度のウワバインによるNa-Kポンプの抑制も求められた。これらの結果より、心筋への分化過程に於ける細胞内Caシグナル伝達経路を初めて明らかにする事が出来た。しかし、本研究では分化の全ステージでのより詳細な検討は未だ不十分であり、今後、引き続き研究を続ける必要があると考える。本研究では胚性幹細胞embryonic stem cell(ES細胞)が心筋細胞へ分化する過程での機能変化の機序、特に細胞が興奮性を獲得する過程における、InsP3受容体とRyanodine受容体カルシウム遊離チャネルの質的、量的変化を明らかにすることを目的とする。本年度は、ATT社より購入したマウスES細胞株(ES-D3)を未分化のままで増殖させ、分化前のES細胞のCa^<2+>シグナル伝達経路の検討を行った。ES細胞に蛍光指示薬(Fluo-3)を負荷し、IP_3-induced Ca^<2+>releas(IICR)及びCa^<2+>induced Ca^<2+>release(CICR)機構が機能しているかの検討を蛍光顕微鏡及びコンフォールレザー顕微鏡を用いて行った。G-protein coupled receptorの種々のアゴニスト(ACh, ATP, Histamine等)の投与により、Ca^<2+>transientが認められたが,caffeine投与では認められなかった事より、未分化ES細胞ではリアノジン受容体の機能は未発達であり、IP_3受容体が主に機能していることが明らかとなった。また、薬理学的に小胞体のCa^

<2+>を枯渇させると容量性Ca^<2+>流入が起こったが、膜の脱分極では認められない事より、ES細胞膜にはstore-operated Ca^<2+>channelが機能し、Voltage operated Ca^<2+>channelは機能発現していないことを明らかにした。さらにこれらのチャネル機能をパッチクランプ法を用いた電流記録による解析で行っている。また、InsP3受容体のどのサブタイプ(I-III)が寄与しているかを遺伝子/蛋白レベルで検討を現在行っている。マウスES細胞(Cell line D3)をfeeder Cells上にLIF入りの培地で培養増殖後、hanging drop法を用いてをLIFを含まない培地で培養し、その後培養皿上で培養すると約14日後には多くのbeating cellsを認めることが出来、ES細胞から心筋への分化誘導を確立した。分化の各ステージに於ける細胞内Caシグナル伝達経路を解明するために、遺伝子解析、コンフォーカルレザー顕微鏡を用いたカルシウム蛍光測定、クールドCCDカメラを用いた細胞内Naの蛍光測定、パッチクランプ法による電気生理実験を行った。それらの結果より、未分化のマウスES細胞では、小胞体からのカルシウム放出はG-protein coupled receptorsの刺激により小胞体のIP3受容体を介してCaが放出される機構が確認された(IP3-induced Ca release : IICR)。この時期にはIP3受容体のタイプI, II, III全ての遺伝子発現が認められた。一方、リアノジン受容体と電位依存性Caチヤネルの機能は全く認められず、ES細胞においては未分化の時期にはCa-induced Ca release : CICR機構は機能していないことが判明した。細胞膜のCa流入経路としては容量性Ca流入経路が認められた。細胞膜のCaポンプ及びNa-Ca交換機構の両者は既に機能しており・細胞内Caのくみ出し機構として作動していた。また、Na-Kポンプは低濃度のウワバインによる抑制効果は無く、心筋タイプのポンプは機能的に発現していないことが判明した。これらの機能的変化を分化の過程でどのように推移するのかの検討を行った。IICRの機構は分化の全で認められ、心筋に分化後にも機能していた。CICR機構は分化の後半約7日後には確認された。この時期には電位依存性CaチャネルのLタイプ、Tタイプの両者が認められた。また、低濃度のウワバインによるNa-Kポンプ抑制も認められた。これら、分化過程における細胞内Caシグナル伝達経路の知見は、未だ世界で発表されておらず、我々が初めて明らかにしたものである。しかし、本研究では分化の全てのステージでの詳細な検討は未だ不十分であり、今後引き続き研究を続ける必要があると考える。
企業の財務構造(資本構成,株主構成)と経営者行動の相互依存関係の研究

1980年代以降,企業財務論の新潮流として,シグナリング・モデルとエージェンシー・モデルが注目されている。本研究では,これらの新しいアプローチを用いて,近年わが国企業が盛んに行っている自社株買いを理論的,実証的に分析することを試みた。理論研究では,自社株買いの発表以前に企業の株価が下落するという現象を説明するモデルを構築することに成功した。この現象は,アメリカにおける実証研究が報告している一方,従来の理論モデルでは説明されていないものであった。このことが,本研究の最大の成果であるといえよう。また本研究では,企業の経営者が,自社株買いの発表を通じて,自身の経営方針が株主重視であることをアピールできるという結果を導いた。これは,自社株買いの発表後に株価が上昇するという現象と整合している。企業の経営者が,自社株買いを通じて自身の経営姿勢が株主重視であることをアピールするのは,株主と経営者の間に利害対立があるというエージェンシー・モデルを用いた成果である。また,自社株買いの発表直後に株価が上昇するという結果は,シグナリング・モデルを適用した効果である。実証研究の方は,現在データを解析しているところであるが,上に述べた理論モデルの予測と矛盾しない結果が得られそうである。すなわち,わが国においても,企業の自社株買いは,株価が下落した後にアナウンスされ,その直後から株価は上昇を始めるということが言えそうである。以上を本年度の研究実績として報告いたします。前者は,企業内部と外部マーケットの間に情報が偏在している状況を想定して,企業の財務政策を議論する。後者は,企業関係者間の利害対立問題が存在する状況において,企業の財務行動を分析する。本研究では,エージェンシー・モデルにおけるエントレンチメント・アプローチを用いて,我が国企業の代表的な資金調達手段である転換社債を議論した。エンドレンチメント・アプローチでは,所有と経営が分離した大規模企業が分析対象とし,エンドレンチされた専門的経営者が財務政策の決定権を有していると考える。マーケットの圧力として敵対的買収の脅威にさらされるとき,経営者は自発的に普通社債を発行することでこの脅威を回避できる。普通社債の発行により,債務不履行の可能性が高い過大投資を見送ることがコミットでき,企業価値が高まるのである。ところが普通社債の発行では,有益な投資に付随する債務不履行リスクが除去できない。これは,一旦発行すると債務が変動しないという普通社債の性質による。転換社債は株式に転換される可能性をもつ社債である。過大投資の後には負債のまま残存し,有益な投資が実施されたとき後に株式に転換される転換社債を発行することで,経営者は,敵対的買収の脅威と有益な投資に付随する債務不履行リスクを同時に除去できる。エンドレンチメント・アプローチ自身が新しいこともあり,本研究で明らかにされた転換社債発行の経済合理性は,既存研究とは一線を画している。
サイトカインによる炎症と抗炎症のバランス制御機構の解明

サイトカインは自然免疫系の細胞や獲得免疫系の細胞を制御する。我々はサイトカインのなかで特にTGFβを中心に病原性のTh17と抑制性T細胞Tregの産生のメカニズムを明らかにした。Tregのマスター遺伝子Foxp3はSmad2,Smad3経路によって誘導され、一方Th17はSmadに依存しない経路によって誘導された。Smad非依存性の経路としてJNK-c-junによってEomesderminという遺伝子が転写抑制される経路を発見した。またサイトカインシグナルの制御因子SOCS1がTregの恒常性維持や抑制機構に必須の役割を果たすことも明らかにした。本研究は免疫応答の恒常性を支えるシグナルバランス制御の基本原理の解明を目的に、免疫担当細胞、特にT細胞や樹状細胞の分化および活性化とシグナルバランス制御のメカニズムとシグナルバランスの破綻による免疫関連疾患発症機構を明らかにする。本年度はまずサイトカインシグナルの制御因子であるSOCSについて抑制性T細胞Tregにおける機能を明らかにした。SOCS1欠損TregはRag欠損マウスや試験管内培養によってFoxp3を失いやすく、かつIFNγやIL-17を自発的に産生し抑制活性が低下していた。よってSOCS1がnTregにおいてFoxp3の安定性およびサイトカイン産生抑制に寄与することが明らかとなった。次に新たなFoxp3発現維持機構を発見するために、nTregで発現の高い転写因子のcDNAを選択し、Foxp3プロモーター/ルシフェラーゼによる機能的なスクリーニングを行った。その結果NR4a2がFoxp3プロモーターを直接活性化することを見いだした。さらに当年度はIL-10やTGFβによらない第三の抑制システムを発見した。我々は獲得免疫系(特にTreg)を欠損するRag欠損マウスでも自然免疫系の過剰応答が起こらないことに着目し、第二の抑制系の存在を想定した。腸上皮細胞培養液や腸抽出液において樹状細胞やマクロファージのTLRリガンドによる活性化を抑制する因子が存在することを確認した。精製や解析の結果、この因子はPGE2であることを確認した。Rag欠損マウスにインドメタシンを投与しPGE2の産生を抑制したところ極めて重篤な腸炎を発症した。この腸炎はTregの移入や腸内細菌の除去、あるいはPGE2受容体EP4のアゴニストの投与によって軽快した。よってPGE2-EP4経路は個体においてもIL-10と独立して機能する抑制系であることが確認された。本年度はNaive T細胞からTh17への分化誘導におけるTGFβシグナルの解析を行った。その結果Eomesodermin(Eomes)と呼ばれる転写因子がSmad非依存的にTGFβによって負に制御される事を明らかにした。阻害剤の検索の結果JNK-cJun経路がEomesの発現抑制に必須であった。Eomesを発現するレトロウイルスベクターを構築し、primary T細胞への過剰発現の検討を行った結果、EomesはT17分化(IL-17A、RORgammatの発現)を顕著に抑制することが明らかとなった。またJNKやc-Junの強制発現でもRORgammatの発現は抑制された。TGFβはJNK/c-Junを介した経路でEomesの発現を抑制することで間接的にTh17分化を正に制御していることが明らかとなった。次にTGFβに依存しないでFoxp3を誘導するメカニズムについて検討を行った。遺伝子発現データベース検索を中心にTreg誘導に機能する候補因子を選択し、293細胞を用いたFoxp3プロモーター/ルシフェラーゼによる機能的なスクリーニングを行った。その結果核内オーファン受容体であるNR4a2がFoxp3プロモーターを直接活性化することを見いだした。レトロウイルスを用いたT細胞への強制発現およびコンデショナルノックアウト(cKO)マウスの解析からNR4a2は確かにTGFβ非依存的にFoxp3を発現誘導しうることを確認した。TGFβはナイーブT細胞にFoxp3を誘導することができるが、Th1などのエフェクターに分化したT細胞には誘導できない。活性化型TGFβ受容体RIをエフェクターT細胞に強制発現した場合の効果を検討した。その結果TGFβによるFoxp3の誘導やIFNγの抑制はナイーブT細胞でのみ観察され、一旦活性化されたT細胞に活性化型TGFβ受容体を発現させても同様の現象はみられなかった。したがって活性化されたT細胞ではSmadだけではFoxp3を誘導することは難しいと考えられる。一方でSmad2/3両欠損マウスでもnTregの発生は正常に起こっていた。

このことから胸腺においてはTGFβに依存しない何らかのFoxp3発現維持機構が存在することが示唆される。我々は活性化型T細胞を抑制型に転換するために、Smad非依存的にFoxp3を誘導しうる遺伝子を単離することをめざした。候補約150遺伝子を完全長cDNAライブラリーよりピックアップし、293細胞を用いたFoxp3プロモーター/ルシフェラーゼによる機能的なスクリーニングを行った。その結果核内オーファン受容体であるNR4a2がFoxp3プロモーターを直接活性化することを見いだした。NR4a2のみを欠損させたマウスは自己免疫疾患を自然発症しなかった。そこでNR4aファミリーの全て(NR4a1,NR4a2,NR4a3)をT細胞特異的に欠損させたTKOマウスを作成した。TKOマウスでは胸腺・末梢共にTregが全く存在しないことが明らかとなった。さらにTKO細胞ではネガティブセレクションが減弱していた。その結果、TKOマウスは激しい全身性の自己免疫疾患を発症し、生後3週間以内に死亡することが明らかとなった。これらの結果から、NR4aファミリー分子は同様の機能を持ち、互いに補い合いつつTreg分化に機能していることが明らかとなった。TGFβの重要な機能であるTh17とiTregの誘導を区別する重要な経路が見つかったことは、自己免疫疾患などの免疫疾患において免疫バランスを矯正し正常化させる方法の開発につながる。またTGFβ非依存的にFoxp3を誘導する遺伝子の発見も世界初である。24年度が最終年度であるため、記入しない。TGFβがTh17細胞を誘導するメカニズムはまだ全容が解明されたわけではない。特にこれまで我々が同定したシグナルはすべて抑制系でありpositiveなシグナルは必ず存在すると思われる。今後も引き続きTh17細胞分化誘導機構の全容を明らかにするとともに、TGFβのシグナルを標的とした自己免疫疾患の治療法の開発を進めたい。NR4a2に関しては今後はNr4a2がどのようにしてTreg誘導を制御するのか分子機構を明らかにするとともに、NR4a2の活性を増強することで免疫疾患の治療につなげる。
ピクセル型テルル化カドミウム半導体を用いた宇宙ガンマ線モニターの実証

本研究では、小型衛星に立脚した次世代の硬X線・ガンマ線モニターとしての実用化を目的として、ピクセル型テルル化カドミウム(CdTe)半導体に基づく高精度なガンマ線検出器を中心とした、コンパクトで独立性の高い観測システムを制作する。17年度には、1.4mmのピクセルサイズを持つCdTe検出器とアナログVLSIを接合した検出器を開発、評価した。読み出しには次世代の高速シリアルインターフェース「スペースワイヤー」を用い、気球、小型衛星などの飛翔体への搭載を考慮した。18年度は、このCdTeピクセルイメージャを多数用いた検出器をくみ上げ、その動作を確認するとともに、大気球などの実証実験へむけて、電源、機上でのデータ処理システムなどを含む検出器システム全体の開発を行った。総計2048チャンネルからなるこのシステムは、重量1.5kg、15cm立方サイズ、消費電力10Wである。システムは正常に動作し、1.4mmの位置分解能に加え、60keVのガンマ線に対して2keV(FWHM)を切る優れたエネルギー分解能を発揮し、511keVガンマ線の分光にも成功した。これにより目的とするコンパクトで衛星搭載可能な高性能の小型ガンマ線検出器が実現した。なお、可能なら行うとしていた気球実験での実証であるが、本年度に相乗りを予定していた気球実験が延期されたため、まだ実現していない。しかし、2008年の夏にオーストラリアからあげる日米合同気球への搭載が決定し、現在、そのゴンドラの制作を共同で進めているところである。本研究の目的は、小型衛星に立脚した次世代の硬X線・ガンマ線モニターとしての実用化を目標に、ピクセル型テルル化カドミウム(CdTe)半導体に基づく高精度なガンマ線検出器を中心とした、コンパクトで独立性の高い観測システムを制作する事である。本年度は、特に1.4mmピッチのピクセル検出器を、厚さを0.5から1mmといくつかに変えて複数製作し、その比較をした。CdTe検出器の特性であるホールの低い移動度がもたらす電荷収集効率の観点から、検出器の厚さが0.75mmより大きくなると、数パーセントを切る高いエネルギー分解能を得るには、2000Vに迫るバイアス電圧を必要とする。CdTe素子の評価の結果、現状ではそれだけの電圧で安定動作するCdTeダイオードは多くない事が分かった。本計画の性質から、検出器の歩留まりの高さも無視できないため、基本的に0.75mm厚よりも薄いCdTe検出器を用いるべきという指針が得られた。これを受けて、本番用のCdTeピクセルを購入した。現在、検出器としてのくみ上げを行っている。また、SpaceWireシリアルI/Fを搭載した超小型コンピュータSpaceCubeを購入し、実績のあるアナログLSI読み出し回路システムと接続する作業も行っている。CdTe検出器とそのシステムの開発作業に加えて、400ミクロンピッチで4cm四方と言う大面積のSi両面ストリップ検出器の動作試験を実施した。この結果は、検出器の国際研究会でも発表している。この検出器は、開発しているCdTeピクセル検出器と同じ読み出しシステムを用いており、エネルギーの高いX線に対して検出効率が大きく劣るものの、同じチャンネル数でより大きな面積をカバーでき、システムを簡素にできる利点がある。試験の結果、優れたエネルギー分解能を併せ持つ事が実証され、CdTeピクセル検出器を補佐する検出器として有望であることが分がった。
蛋白質モジュール対応ペプチドの構造と機能

1.モジュールに対応する遺伝子部分あるいはその複合体の発現を、外部のリンカー等に由来する余分のアミノ酸配列を含まず、直接発現できるようなベクターを二種類開発し、'ATG-TAG'ベクターと名付けた。これは、BamH【I】部位に隣接して、あるいはNco【I】部位内に開始コドンATGを、一方、Tth【III】-【I】部位内に終止コドンTAGを含むような発現ベクターであり、夫々の制限酵素による切断、そして末端一本錯部の酵素処理により、上記二つのコドンをベクターの両末端に露出させることができるようなものである。塩基配列決定の結果、ベクターは計画どおりの構造であることが確認された。(pHT6ならびにpHT8)。2.リゾチームcDNA両端にXho【I】,Pst【I】部位を付加し、一部改変したpBR322に挿入して、成熟型リゾチーム分子のN末端リジン残基のコドンAAAの直前まで削るためのプラスシドを作成した(pHT20).そのようなクローンの選択には、BaL31消化後、上流のDra【I】部位(TTTAAA)での切断,分子内再結合によるDra【I】認識部位の再生を利用する。現在までの所、目的のクローンは得られていないが、それが得られれば、上記の発現ベクターを用いて、モジュール【I】【V】の複合体ならびにSac【I】切断によりモジュール【I】【III】の複合体を得る予定である。3.蛋白質データベースを用いたアミノ酸配列の局所相同性解析により、モジュール【II】【III】の部分が、リゾチームと酵素作用の類似する,N,O-ジアセチルムラシダーゼならびにバクテリオファージ・ラムダのエンドライシンと、モジュール【III】が、プラスミノーゲン等のクリングル構造の一部と、モジュール【V】が【I】gκ鎖V領域とホモロジーをもつことがわかり、モジュールごとに独立の素構造・素機能を持つことが示唆された。4.リゾチーム分子内の架橋構造と構造のゆらぎとの関連ならびに、モデル蛋白での三次元構造形成の経路、核となる構造等を調べた。
結晶場を利用した三次元精密重合系の開発

複数の反応性官能基を持つ配位子および多官能性のゲストモノマーを新規に合成した。金属イオンと反応性配位子のソルボサーマル反応により、反応部位を持つナノ多孔性配位高分子を合成し、ゲストモノマーによる架橋を行った。配位結合の分解により、三官能性以上のゲストモノマーからは有機高分子ゲルが、二官能性のゲストモノマーからは有機高分子が得られた。高分子ゲルに対しては、膨潤度の測定を、有機高分子については、SECなどにより重合度と分子量分布を評価した。その結果、非反応性のピラー配位子を共存するpillared-Layer型MOFの場合、生成する結晶は直方体であるにもかかわらず、架橋により生じるゲルは、ある対角方向にのみ大きく膨潤し、平行六面体へと形状が大きく変化することが明らかになった。新しい異方変形材料である。また、新規に合成した四官能性の配位子と二官能性の配位子を混合したMOFの場合、二官能性配位子のモル分率に臨界分率があり、それが格子モデルを用いたパーコレーションのモンテカルロシミュレーションとよく一致した。本手法による架橋構造の精密制御につながる第一歩とかんがえられ、重要な知見が得られたと考えられる。また、高分子の形成については、一方のモノマーが格子に固定されているため、生成で成長が自動的に止まり、分子量の制御が可能であることが明らかになった。溶液中のモノマー間の自由な反応とは異なり、モノマーの格子の形状に支配される新しい重合である。高分子合成化学における新しい原理と思われる。また水酸基を持つ配位子を用いたウレタン形成を鍵とする新規事後修飾系も構築できた。重合性のMOFを用いた高分子合成化学の研究としては、MOFの特徴であるゲストモノマーを包接・反応できる広い空間と配位子として、格子状に規則的にモノマーが固定された格子空間での反応の本質がやっと明らかになった点は成果としてあげられる。特に格子モデルを用いたパーコレーションのモンテカルロシミュレーションの開発に成功し、パーコレーション理論からの予想と実験結果の比較から架橋構造の精密制御につながる成果が得られた点は評価できる。重合の反応系の拡張にもわずかであるが、進んでいる点は重要な成果と思われる。今後も引き続き、金属イオンや反応性有機配位子(ホストモノマー)を多数合成し、網羅的に多数のナノ多孔質結晶を作製し、それらにゲストモノマーを包接させ、架橋・重合を行い、その重合反応性とホストモノマーの三次元構造とゲストモノマーの関係を明らかにし、結晶場を用いた逐次重合の学理を明らかにする。さらに架橋構造を高次に制御した様々な高分子ネットワーク構造を構築し、多官能性モノマー間の反応による三次元重合の精密逐次重合の確立を目指す。生成物である多面体形状の高分子ゲル(多面体高分子ゲル)は他の方法では調製できない形状を持つ有機素材であり、その多様化と機能化を検討する。新規重合性配位子として、1,3,5-三置換ベンゼンを基本骨格とするアジドを持つ配位子やPillared-Layer MOFを構成する非重合性のPillar配位子について合成を検討した。並行して、これまでに開発が完了している重合性配位子を用いて、金属イオンとのソルボサーマル反応により、ナノ多孔性配位高分子を合成し、結晶架橋を行なった。その後、配位結合の分解による有機高分子および有機高分子ゲルへの変換を行い、生成する高分子ゲルに対しては、膨潤度の測定を、二官能性モノマーの場合、線状高分子を再沈殿により回収し、SECなどにより重合度と分子量分布を評価した。その結果、Pillared-Layer MOFを用いた場合、生成するゲルが異方的に膨潤する新しい現象が見つかった。これまでのMOFの架橋では結晶構造の対称性が高く、結晶面がいずれも等価なものが多く、架橋反応の異方性が低いものであったが、Pillared-Layer MOFを用いることにより、結晶軸が異方性を持つようになり、架橋反応が異方性を持つようになり、ゲルの膨潤が異方的になったと考えられる。高分子ゲルの膨潤の新しい制御法につながると期待できる。また、二官能性モノマーの場合、線状高分子の形成について検討したところ、生成する高分子がオリゴマーで成長が止まることが明らかになり、溶液中の重合とは違う挙動を示すことを明らかにし、Stochastic重合と命名した。このプロセスにおいて、結晶中に固定されたモノマーは移動することがないため、未反応の末端が結晶格子内で必ず残り、その残りやすさは、隣接するモノマーとの反応確率によって支配されることを明らかにした。自己組織化させた媒質中での重合の一般原理であり、重合科学だけではなく、材料科学における重要な発見である。新規重合性配位子の開発や新しい金属イオンを用いた新規重合性MOFの開発は当初の計画と比較してあまり進んでいないものの、既存のシステムを利用することにより、新しい現象の発見に繋がっている。特に二官能性モノマーを用いた逐次重合の反応解析より、結晶架橋の本質が明らかになった点は極めて重合であり、新しい重合制御法としての展開が期待できる。また、Pillared-Layer MOFを用いた異方性膨潤を持つゲルの構築については、本研究の提案である、本手法による架橋構造の精密制御につながる第一歩とかんがえられ、重要な知見が得られたと考えられる。

配位結合の分解により、三官能性以上のゲストモノマーからは有機高分子ゲルが、二官能性のゲストモノマーからは有機高分子が得られた。高分子ゲルに対しては、膨潤度の測定を、有機高分子については、SECなどにより重合度と分子量分布を評価した。その結果、非反応性のピラー配位子を共存するpillared-Layer型MOFの場合、生成する結晶は直方体であるにもかかわらず、架橋により生じるゲルは、ある対角方向にのみ大きく膨潤し、平行六面体へと形状が大きく変化することが明らかになった。新しい異方変形材料である。また、新規に合成した四官能性の配位子と二官能性の配位子を混合したMOFの場合、二官能性配位子のモル分率に臨界分率があり、それが格子モデルを用いたパーコレーションのモンテカルロシミュレーションとよく一致した。本手法による架橋構造の精密制御につながる第一歩とかんがえられ、重要な知見が得られたと考えられる。また、高分子の形成については、一方のモノマーが格子に固定されているため、生成で成長が自動的に止まり、分子量の制御が可能であることが明らかになった。溶液中のモノマー間の自由な反応とは異なり、モノマーの格子の形状に支配される新しい重合である。高分子合成化学における新しい原理と思われる。また水酸基を持つ配位子を用いたウレタン形成を鍵とする新規事後修飾系も構築できた。重合性のMOFを用いた高分子合成化学の研究としては、MOFの特徴であるゲストモノマーを包接・反応できる広い空間と配位子として、格子状に規則的にモノマーが固定された格子空間での反応の本質がやっと明らかになった点は成果としてあげられる。特に格子モデルを用いたパーコレーションのモンテカルロシミュレーションの開発に成功し、パーコレーション理論からの予想と実験結果の比較から架橋構造の精密制御につながる成果が得られた点は評価できる。重合の反応系の拡張にもわずかであるが、進んでいる点は重要な成果と思われる。今後も金属イオンや反応性有機配位子(ホストモノマー)を多数合成し、網羅的に多数のナノ多孔質結晶を作製し、それらにゲストモノマーを包接させ、架橋・重合を行い、その重合反応性とホストモノマーの三次元構造とゲストモノマーの関係を明らかにし、結晶場を用いた逐次重合の学理を明らかにする。さらに架橋構造を高次に制御した様々な高分子ネットワーク構造を構築し、多官能性モノマー間の反応による三次元重合の精密逐次重合の確立を目指す。生成物である多面体形状の高分子ゲル(多面体高分子ゲル)は他の方法では調製できない形状を持つ有機素材であり、その多様化と機能化を検討する。今後も引き続き、金属イオンや反応性有機配位子(ホストモノマー)を多数合成し、網羅的に多数のナノ多孔質結晶を作製し、それらにゲストモノマーを包接させ、架橋・重合を行い、その重合反応性とホストモノマーの三次元構造とゲストモノマーの関係を明らかにし、結晶場を用いた逐次重合の学理を明らかにする。
電子スピン共鳴計測用サーフェイスコイル型共振器の最適設計法に関する研究

1.電子スピン共鳴計測用-フェイスコイル型共振器の共振尖鋭度と充填率(試料内にある磁気エネルギーと共振器の蓄えるエネルギーの比)の評価を可能にするためにそれらの定式化を行った。その際、生体試料内で生じる電磁波の損失を表す等価的な抵抗の値を求めることを可能にした。2.1でおこなった定式化に基づいて数値計算を行えるようにし、電子スピン共鳴計測の際に得られる信号強度の推定を可能にした。3.数値計算と定式化の妥当性を検証するために、計算モデルと同様の共振器を試作し、実際の電子スピン共鳴計測を行った。その結果、実験結果と数値計算の結果が一致することを確認した。4.信号強度の評価法が妥当であることが確認できたので、その評価法を用いたサーフェイスコイル型共振器の設計指針を明らかにした。その結果、試料の寸法と媒質の物理定数が与えられたとき、サーフェイスコイル型共振器の全長が短いものほど大きな信号が得られること、並びに信号強度が最大となるようなサーフェイスコイルの寸法が存在することが明らかになった。この研究により、当初の予定通り信号強度を最大とするようにサーフェイスコイル型共振器を設計することが可能になった。
音楽経験・パーソナリティー・嗜好性と音楽聴取による変化との関連の生理・心理的研究

本研究では音楽経験とパーソナリティー傾向の関連と、音楽聴取による心理・生理学的変化における音楽経験の有無と質の影響について検討した。第一に、音楽聴取前後の生理学的指標の変化を検討した。その結果、音楽聴取によるストレスの減少が示唆されたが、音楽経験の有無による差異は認められなかった。第二に、音楽聴取による心理的作用を検証し、音楽経験と心理的作用の関連について検討した。その結果、音楽経験のない方が分析的に音楽を聴取しないため気分変化をもたらしやすいと推察された。第三に、パーソナリティーと音楽経験の関係について、音楽経験は創造性や積極性に影響を与え、音楽活動が共感能力に影響を与えるとの考察を得た。平成24年度、本調査を引き続き行った。調査では、音楽経験に関する質問紙、気分調査であるPOMS、不安を測定するSTAI、パーソナリティーに関するYG検査、同じくパーソナリティーに関するエゴグラム、唾液採取によるデーター収集を実施した。POMS、STAI、YG検査、エゴグラムについては、因子ごとの数値を算出するなど、データーの計算がすべて終了した。唾液調査については、株式会社SRLによって、クロモグラニンA・分泌型IgA・コルチゾールについて、可能な限りの解析がなされた。また、研究結果報告の第1段階として、エゴグラムと音楽経験の因果関係をパス解析を用いて検討した。その結果、音楽経験とエゴグラムのFC、音楽活動時期の大学生とFCに強いパスが認められ、音楽の芸術性が創造性の向上や情操面に影響しているのではないかという考察を得た。なお、FCに関しては渡辺等の他の研究で育児ストレスの軽減に関与するとの結果が得られており、育児ストレスと音楽経験との関連も今後の検討課題であると思われる。さらに、音楽経験の頻度とNP、音楽活動時期の高校生・大学生とNPにも強いパスが認められ、音楽の非言語的コミュニケーション性が共感性の向上に影響しているのではないかという結論を得た。加えて、どのような音楽経験であったか(楽器の種類・音楽活動の種類など)とエゴグラムにも因果関係が認められることから、この事に関する更なる考察が必要であると推察された。上記の結果については日本音楽教育学会東海地区例会にて『音楽経験とパーソナリティーの関連についての一考察』という演題名で発表を行った。平成24年度までに収集した気分調査であるPOMS、不安を測定するSTAI、パーソナリティーに関するYGとエゴグラム、唾液アミラーゼやクロモグラニン等の生理学的指標の数値を入力し、統計解析を行った。まず第一に、パーソナリティーと音楽経験の関係を検討するため、音楽経験の有無や頻度・音楽経験の種類・音楽経験の形態・音楽経験の時期を独立変数として、エゴグラムの各下位得点を従属変数として、パス解析を行った。その結果、主に音楽経験や頻度・活動時期の大学とエゴグラムのFCに因果関係が認められた。さらに、音楽経験の頻度・活動時期の高校と大学・声楽とエゴグラムのNPに因果関係が認められた。この事から、音楽経験は創造性や積極性に影響を与える可能性があると推察された。加えて、音楽活動を頻回に行うことによって共感能力に影響を与えることが出来るのではないかとの考察が得られた。第二に、音楽聴取によって心理的作用があるのか否かを検証し、その上で、音楽経験が心理的作用とどのような関連があるのかについて検討した。まず、POMSとSTAIについて信頼性を確認した後に、音楽聴取の前後で群内比較を行った。さらに、音楽経験の有無で群分けし、比較した。また、それらの結果を受けて、上記に示した独立変数に対して、従属変数を音楽聴取のPOMS・STAIの前後差としてパス解析を行った。その結果、音楽経験のない方が分析的に音楽を聴取しないため気分変化(心理学的変化)をもたらしやすいのではないかと推察された。第三に音楽聴取前後の生理学的指標の変化について検討した。その結果、唾液アミラーゼでは音楽聴取後に数値が有意に減少し、クロモグラニンと分泌型IgAでは有意に上昇、コルチゾールは有意な差は認められなかった。音楽経験に関する質問紙を作成した。質問紙作成にあたっては、義務教育以外における音楽経験の質として、「音楽経験の期間(ex.個人的なレッスン等の受講の期間)」「音楽経験の頻度(ex.週に一回程度の練習)「音楽経験の種類(ex.ピアノ、声楽、合唱など)」「音楽経験が集団か個人か」などの関する質問項目を含んだ。上記の質問紙とYG検査(矢田部ギルフォード性格検査)と東大式エゴグラム(TEG)を用いて、15名の大学生に予備調査を実施した。なお、予備調査に先立ち、金城学院大学ヒトを対象とする研究計画等審査委員会(いわゆる倫理委員会)の審査を受け、承認された。

また、音楽聴取の前後で日本版STAI(State Trait Anxiety Inventory)、POMS(Profile of Mood State)への記入と唾液採取を行い、クロモグラニンA、コルチゾール、分泌型IgAを解析した。その結果、音楽聴取による生理学的・心理学的変化について、音楽経験の有無と質がどのように影響するのか、また、音楽経験の有無と質が音楽の嗜好性やパーソナリティー傾向とどのような関連があるのか、パーソナリティー傾向が音楽の嗜好性にどのように影響するのかについての検討が、予備調査の方法で行えるのではないかと推察された。そこで、前倒しで本調査を行った。本調査はJ-POP群として、予備調査の15名に加えて、合計27名に行った。その結果について、まず、クロモグラニンA、コルチゾール、分泌型IgAを解析した。対応あるt検定の結果、クロモグラニンA、分泌型IgAにおいて、音楽聴取前後に有意差が認められた。交付申請書にあるとおり、平成24年度以降に本調査を行いデーター収集を実施することになっている。前述のように、平成24年度に本調査が実施され、データーの計算も終了した。さらに、エゴグラムと音楽経験との因果関係についてパス解析を行い、音楽経験とFCの関連が認められること、音楽経験の頻度とNPの関連が認められることなどある一定の結論を得た。従って、現在までに、本研究は概ね順調に進展していると思われる。質問紙とYG検査(矢田部ギルフォード性格検査)と東大式エゴグラム(TEG)を用いて、15名の大学生に予備調査を実施した。その結果、予備調査の方法によって、概ね、目的とするデーターを収集できるのではないかと考えられた。そこで、本調査の一部を実施した。本調査はJ-POP群に行い、予備調査分と合わせて合計27名に実施することが出来た。従って、本研究は概ね順調に新訂していると考えられる。今後、可能であればさらに対象者数を増やすため、音楽経験に関する質問紙、POMS、STAI、YG検査、エゴグラム、唾液に関する調査を継続して行う。調査が実施された場合には、順次、各質問紙について因子ごとの数値の算出などを行いデーター計算を実施する。また、前年度収集し計算したデーターをすべて入力する。入力は8月末頃までに終了する予定で、その後、統計的な分析を行う。上記の追加調査については、計算が終了次第、逐次、追加入力する。その分析結果を考察し、研究成果としてまとめる予定である。今後は本調査のデーター収集を引き続き行う。J-POP聴取群もさらに人数を増やして検討する。また、クラシック聴取群、JAZZ聴取群は未収集であるので、これらの群についてもデーターの収集を行う。また、データー収集が順調に進めば、前倒しでデーター入力を行い、順次解析をする。追加調査を行う場合には、POMS、STAI、YG検査、エゴグラムなど質問紙の購入費として使用する。
転写因子Ｎｒｆ１による神経変性疾患の治療に向けた分子基盤解析

筋萎縮性側索硬化症(ALS)等の神経変性疾患の病因の一つとして、プロテアソームの機能不全が考えられているが、詳細は未だに不明である。本研究課題では、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進する因子Nrf1をALSのモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子の遺伝子発現(Tg)マウスに導入し、Nrf1の活性化が神経変性の進行に及ぼす影響を検討した。Nrf1Tgマウスとヒト変異SOD1Tgマウスとを交配したDouble-Tgマウスは、運動失調の発症は変異SOD1-Tgマウスと同様であったが、発症から死亡に至る期間の短縮の傾向が観察され、Nrf1の活性化が病態に関与することが示唆された。筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患は、神経細胞への異常タンパク質の過剰な蓄積が病態の発症に寄与している。近年、プロテアソームの機能不全と神経変性との関連性が明らかになってきた。さらに生体防御関連遺伝子の発現を制御する転写因子Nf1が、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進し、プロテアソームの活性化を代償していることが明らかになった。このような研究背景を元に、本研究課題では神経変性モデル動物である変異SOD1遺伝子発現マウスにNf1遺伝子を導入し、Nf1の活性化と神経変性の軽減を検討した。Double-Tgマウスは正常の比率に誕生するが、成育における体重の増加は野生型や各Tgマウスに比して低下傾向が見られた。さらにH46R変異SOD1-Tgマウスと比較して、Double-Tgマウスでは生存日数の減少が観察された。この結果は我々の立てた仮説「Nf1の活性化が神経変性の軽減に貢献する」と逆であった。より信頼性の高い結果を得るために、現在各遺伝子型のマウス数を増やして解析を行っている。その原因の一つとして、近年、プロテアソームの機能不全の関与が明らかになりつつあるが、詳細な機構は未だに不明である。最近、生体防御関連遺伝子の発現を制御する転写因子Nrf1が、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進し、プロテアソームの活性化を代償していることが明らかになった。この知見を元に、本研究課題では神経変性モデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子発現マウスにNrf1遺伝子を導入し、Nrf1の活性化が神経変性の軽減に貢献するかを検討する。平成24年度は、ALSモデル動物であるH46R変異SOD1遺伝子発現マウス(H46R変異SOD1-Tgマウス)と、転写因子MafG遺伝子の遺伝子発現制御領域にNrf1cDNA配列を連結したMGRD-Nrf1トランスジェニックマウス(MGRD-Nrf1Tgマウス)を交配して、hSOD1(H46R)Tg/+::Nrf1Tg /+(Double-Tg)マウスを作製した。転写因子MafGは、Nrf1とヘテロ二量体を形成して転写調節を行うことから、MafG遺伝子の発現制御領域を用いた本TgマウスのNrf1遺伝子の発現パターンは本来のNrf1遺伝子の発現パターンに準じていると予想された。現在、Double-Tgマウスは、正常に誕生・成長しており、hSOD1(H46R)Tgマウスで観察される神経変性のNrf1遺伝子の導入による軽減を次年度に確実に明らかにする。筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患の病因の一つとして、プロテアソームの機能不全による異常タンパク質の過剰な蓄積が考えられている。生体防御関連遺伝子の発現を制御する転写因子Nrf1は、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進し、プロテアソームの活性化に機能することが報告されていることから、本研究課題では、ALSのモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子発現マウスにNrf1遺伝子を導入し、Nrf1の活性化と神経変性の軽減の関連を検討した。転写因子MafG遺伝子の遺伝子発現制御領域(MafG regulatory domain; MGRD)にNrf1 cDNAとFLAG配列、polyA配列を連結したMGRD-Nrf1トランスジェニックマウス(MGRD-Nrf1Tgマウス)とALSモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子発現マウス(H46R変異SOD1-Tgマウス)とを交配してDouble-Tgマウスを作製した。次に同マウスの体重を測定して神経変性に伴う筋肉重量の低下を解析し、運動失調の程度を歩行動作やクラスピング(マウス尻尾を吊るした時の足の折り曲げ行動)により測定した。Double-TgマウスがNrf1遺伝子の導入によりSOD1-Tgマウスの運動症状等の神経変性の進行が遅れるかを経時的に調べたところ、期待した結果と反対に神経変性症状の悪化が観察された。MGRD-Nrf1Tgマウス単独では、同じ期間内(20-25週)の体重の減少と運動失調が観察されなかった。以上のように予想された結果(Nrf1の活性化による神経変性の軽減)と反対の結果となったことから、計画を変更してNrf1遺伝子の減少(Nrf1へテロ遺伝子欠損マウスとの交配)による神経変性の軽減を試みることとした。

生体防御関連遺伝子の発現を制御する転写因子Nrf1は、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進し、プロテアソームの活性化を代償することが報告されていることから、Nrf1がタンパク質分解経路を制御し、神経変性の抑制に作用している可能性が考えられた。この仮説を検証するために、本研究課題ではALSのモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子発現マウスにNrf1遺伝子を導入し、Nrf1の活性化と神経変性の軽減の関連性を検討した。本研究では、Nrf1とヘテロダイマーを形成して機能する転写因子MafGの遺伝子発現制御領域(MafG regulatory domain; MGRD)にNrf1 cDNAとFLAG配列、polyA配列を連結して作製したNrf1トランスジェニックマウス(MGRD-Nrf1Tgマウス)とALSモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子発現マウス(H46R変異SOD1-Tgマウス)を交配してDouble-Tgマウスを作製した。次に、Nrf1遺伝子の導入によりSOD1-Tgマウスの運動症状等の神経変性の進行を経時的に解析した。さらに、Nrf1へテロ遺伝子欠損マウスと交配し、Nrf1遺伝子の減少(50%低下)による神経変性の進行の増減の解析を試みた。筋萎縮性側索硬化症(ALS)等の神経変性疾患の病因の一つとして、プロテアソームの機能不全が考えられているが、詳細は未だに不明である。本研究課題では、プロテアソームのサブユニットタンパク質の転写を促進する因子Nrf1をALSのモデル動物であるヒト変異SOD1遺伝子の遺伝子発現(Tg)マウスに導入し、Nrf1の活性化が神経変性の進行に及ぼす影響を検討した。Nrf1Tgマウスとヒト変異SOD1Tgマウスとを交配したDouble-Tgマウスは、運動失調の発症は変異SOD1-Tgマウスと同様であったが、発症から死亡に至る期間の短縮の傾向が観察され、Nrf1の活性化が病態に関与することが示唆された。平成26年度は(1)実験計画の変更と、(2)マウスの繁殖の遅延が発生したことにより本計画研究の達成度に遅れを生じている。(1) Double-Tgマウスの神経変性症状について期待した結果(Nrf1の活性化による神経変性の軽減)と反対に神経変性の症状悪化が観察されたため、計画を変更してNrf1遺伝子発現量の減少(Nrf1へテロ遺伝子欠損マウスとの交配)による神経変性の軽減を試みることとし、解析の進行の遅れが生じた。(2)平成25年度はH46R変異SOD1-Tgマウスの繁殖が順調であったが、平成26年度に入り、同マウスの繁殖が順調に進まなかったことから、MGRD-Nrf1Tgマウスと交配して作製する、Double-Tgマウスの繁殖に遅れが生じた。神経科学Nrf1遺伝子発現量の減少によるH46R変異SOD1-Tgマウスの神経変性の進行の遅延を試みるために、Nrf1へテロ遺伝子欠損(Nrf1+/-)マウスとH46R変異SOD1遺伝子発現マウスを交配し、hSOD1-Tg:Nrf1+/-複合変異マウスを作製する。同マウスを定時的に体重を測定し、神経変性に伴う筋肉重量の低下を解析する。また、運動失調の程度を歩行動作やクラスピング等から測定し、Double-Tgマウスの結果を比較し、神経変性の軽減化を検討する。さらにhSOD1-Tg:Nrf1+/-複合変異マウスとDouble-Tgマウス、H46R変異SOD1-Tgマウスにおいて、脊髄前核細胞の形態やユビキチン陽性タンパク質の凝集、軸索変性、神経細胞の欠落を病理学的に観察し定量的に評価する。
脂質メディエーターの過酸化を介する神経系細胞死誘導機構の解明

アストログリアのモデル細胞として培養型C6ラットグリア細胞腫株を用い、このGSHの枯渇下によるアポトーシスの過程で、本研究では不飽和脂肪酸とくにアラキドン酸のアポトーシスに及ぼす影響を調べた。ラットグリア細胞腫はグルタミン酸で細胞内GSHを枯渇誘導すると、細胞内活性酸素が増え、かつ脂質メディエーターであるアラキドン酸からの12-リポオキシゲナーゼ代謝過酸化物を含む脂質のラジカル連鎖反応による過酸化が増大することで細胞膜強度が低下し、同時にアポトーシス関連酵素の失活もしくは減少を来たした。染色体DNAでは、細胞内活性酸素OHラジカルによってグアニン塩基が水酸化反応を受け酸化反応による8-hydroxy-2-deoxyguanosine(8-OH-dG)産生の増加が認められた。一方でDNAの酸化反応を引き起こしながらネクローシス様の細胞死を誘導増進することが明らかになった。紫外線による細胞死誘導において、アラキドン酸またはその過酸化物がどのような役割をしているかを、グルタチオン(GSH)枯渇による細胞死誘導の過程で観察された染色体DNAの断片化及び特定の細胞内生理活性物質の変動を調べ、比較検討した。初期段階で活性酸素非依存性の巨大DNA断片化を引き起こし、カスパーゼの活性化を伴うアポトーシスと考えられ、アラキドン酸はDNA断片化を増長させながら紫外線照射による細胞死を促進し、アラキドン酸またはその過酸化物によってその細胞死の一部はNAD,ATPの枯渇を伴うネクローシスに転換されるものと示唆された。これらのGSH枯渇誘導及び紫外線誘導細胞死の実験結果より、グリア細胞腫におけるGSH枯渇誘導での細胞死は、つまり活性酸素関与の場合のその機構はネクローシスであり、活性酸素非依存の場合はアポトーシスによる機構が働くと示唆された。グリア細胞はグルタミン酸による細胞外シスチンの取り込み抑制やL-buthionine-(S, R)-sulfoximine (BSO)によるグルタチオン(GSH)合成阻害による細胞内GSHの減少・枯渇によってアポトーシスが引き起こされることをこれまでに報告してきたが(1、2、4),アストログリアのモデル細胞として培養型C6ラットグリア細胞腫を用い,このGSHの枯渇下によるアポトーシスの過程で,今回は不飽和脂肪酸とくにアラキドン酸のアポトーシスに及ぼす影響を調べた。C6細胞を10mMのグルタミン酸で処理すると,細胞内GSHの減少とともに過酸化脂質が蓄積した。この系に,50-100μMのアラキドン酸を添加すると12-リポオキシゲナーゼ酵素活性と細胞内の脂質過酸化は著しく増大した。それと共にカスパーゼ-3活性の低下,caspase-activated DNase (CAD)の細胞外流出、細胞内ATPの減少・枯渇,ミトコンドリア膜電位の低下が観察され,かつアポトーシスで観察されるラダー様DNA断片化は消失した。DNAでは酸化反応による8-hydroxy-2-deoxyguanosine産生の増加が認められた。以上のことから,C6グリア細胞腫はグルタミン酸もしくはBSOによってGSHが枯渇すると,細胞内活性酸素が増え,かつアラキドン酸からの12-リポオキシゲナーゼ代謝過酸化物を含む脂質のラジカル連鎖反応による過酸化が増大することで細胞膜強度が低下し,同時にアポトーシス関連酵素の失活もしくは減少を来たし,一方でDNAの酸化反応を引き起こしながらネクローシス様の細胞死を誘導増進することが示唆された。脂質メディエーターであるアラキドン酸またはその過酸化物が、紫外線による細胞死誘導においてどのような役割をしているかを、グリア細胞のグルタチオン(GSH)枯渇による細胞死誘導の過程で観察された染色体DNAの断片化と、特定の細胞内生理活性物質の変動を調べ、比較検討した。