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オウム病クラミジアの分類学的および分子遺伝学的研究

オウム病クラミジアのヒト、鳥類および哺乳動物由来株について、株間の遺伝学的関連性をDNA制限酵素切断像およびDNA-DNA相同性により明らかにした。DNA DNA相同性は鳥類由来の免疫学的型別Av-1型と鳥類および羊流産由来Av-2型の間で約50%の相同性がみられたが、他の猫由来Fe1、牛および羊由来Ru1、さらにヒト由来クラミジアトラコマチスのCtMoの各型間ては1から約30%であった。クラミジア属に保存されているDNA相同領域は主として45Kb(Av-1)42および56Kb(Av-2)、58Kb(Fe1)、52(Ru-1)14.3および17Kb(CtHu)および17.5および34Kb(CtMc)のSalI断片であった。これらの結果からC.PsittaciにはAv1-Av2-Fe1およびRu1の少なくとも2つのDNA群が存在し、C.trachomatisと大きく異なることが判明した。オウム病クラミジアの主要外膜蛋白質(MOMP)の精製法を確立し、そのアミノ酸組成および免疫化学的性状を明らかにした。MOMPは60Kタンパク質とジスルフィド結合し複量体で糖タンパク質である。アミノ酸組成はC.trachomatisのそれと類似し、ポ-リン様構造を持つことが判明した。MOMP上に免疫化学的解析から亜種特異的抗原決定基が存在することが明らかになった。ウシ肺炎由来前田株に対する単クロ-ン性抗体(MAb)を作出し、哺乳動物由来クラミジア株を中心に型別した結果、40および60KDal抗原を認識するMAb計13種との反応性により、55株は8つのグル-プに分けられた。I型はウシ由来株が、II型はヒツジ由来株が、III型はヒツジおよびヤギ由来株が、IV型はネコ由来株が、V型はモルモットおよびジャコウネズミ由来株が、VI型はシチメンチョウ由来株が、VII型はハト、オウム・インコおよびヒト由来株が、VIII型はC.trachomatisがそれぞれ属した。即ち、哺乳動物由来株はI、II、III、IVおよびV型に、鳥類およぶヒト由来株はVIおよびVII型に、C.trachomatisの株はVIII型に属した。このように、Cpの抗原型は哺乳動物と鳥類由来株で大きく異なり、また、由来宿主によっても異なることがわかった。オウム病クラミジア鳥類及び哺乳動物由来株について,株間の免疫化学的関連性を単クローン性抗体により明らかにした.セキセイインコ及びハトを中心とする鳥類由来株は3つの血清型に分けられた.血清型と鳥種の間に対応は認められず,むしろ地理的分布による差が明らかになった.また,哺乳動物由来株は鳥類由来株と明らかに異なる血清型を示した.一方,この型別成績から,属特異抗原であるリポ多糖体に抗原的多様性が示された.更に,主要外膜蛋白質が鳥類由来株と哺乳動物由来株で特異性が異なることから,亜種ないし型特異性を担う重要な抗原であることが示された.オウム病クラミジア株間の免疫化学的関連性を高度免疫血清を用いたイムノブロット法により解析した.

その結果,オウム病クラミジアには数種類の抗原が存在し,特に分子量約40,000の主要外膜蛋白質が型特異抗原であることを明らかにした.次いで,主要外膜蛋白質の特異性から,クラミジアは4つの型に分けられた.オウム・インコ類からなるもの,オウム・インコ類及びシチメンチョウ由来株からなるもの,ネコ及びネズミからなるもの,及びウシ由来株からなるものである.ヒツジ由来株は4つの型のいずれにも属さなかった.これらの型は互に交差せず,独立した型特異性を示した.この成績は前述の単クローン性抗体による血清型と一致していた.以上のように,オウム病クラミジアは免疫化学的性状からいくつかの免疫型に分けられることが判明した.しかも,鳥類由来株と哺乳動物由来株は抗原性が著しく異なることが明らかにされた.オウム病クラミジアのヒト、鳥類および哺乳動物由来株について、株間の遺伝学的関連性をDNA制限酵素切断像およびDNAーDNA相同性により明らかにした。DNAーDNA相同性は鳥類由来の免疫学的型別Avー1型と鳥類および羊流産由来Avー2型の間で約50%の相同性がみられたが、他の猫由来Fe1、牛および羊由来Ru1、さらにヒト由来クラミジアトラコマチスから成るCtHuおよびマウス由来クラミジアトラコマチスのCtMoの各型間では1から約30%であった。クラミジア属に保存されているDNA相同領域は主として45kb(Avー1)、42および56kb(Avー2)、58kb(Fe1)、52kb(Ruー1)、14.3および17kb(CtHu)、および17.5および34kb(CtMc)のSaLI断牛であった。これらの結果から、C.psittaciにはAv1ーAv2ーFe1およびRu1の少なくとも2つのDNA群が存在し、C.trachomatisと大きく異なることが判明した。オウム病クラミジアの主要外膜タンパク質(MOMP)の精製法を確立し、そのアミノ酸組成および免疫化学的性状を明らかにした。MOMPは60にタンパク質とジスルフィド結合し複量体で糖タンパク質である。アミノ酸組成はC.trachomatisのそれと類似し、ポーリン様構造を持つことが判明した。MOMP上に免疫化学的解析から亜種特異的抗原決定基が存在することが明らかになった。MOMPの一次構造について株間の相違を含め解析中である。オウム病クラミジアのヒト、鳥類および哺乳動物由来株について、株間の遺伝学的関連性をDNA制限酵素切断像およびDNA-DNA相同性により明らかにした。DNA-DNA相同性は鳥類由来の免疫学的型別Av-1型と鳥類および羊流産由来Av-2型の間で約50%の相同性がみられたが、他の猫由来Fe1、牛および羊由来Ru1、さらにヒト由来クラミジアトラコマチスのCtMoの各型間では1から約30%であった。クラミジア属に保存されているDNA相同領域は主として45Kb(Av-1)42および56Kb(Av-2)、58Kb(Fe1)、52(Ru-1)14.3および17Kb(CtHu)、および17.5および34Kb(CtMc)のSall断片であった。これらの結果からC.PsittaciにはAv1-Av2-Fe1およびRu1の少なくとも2つのDNA群が存在し、C.trachomatisと大きく異なることが判明した。オウム病クラミジアの主要外膜蛋白質(MOMP)の精製法を確立し、そのアミノ酸組成および免疫化学的性状を明らかにした。
マウス初期発生におけるGATA-6転写因子の発現調節機構

GATA因子は(A/T)GATA(A/G)配列を特異的に認識する転写調節因子であり、これまで、脊椎動物において6種類が同定されている。GATA-6は、胃壁細胞に特異的に発現している胃酸分泌酵素H^+/K^+-ATPaseの転写を活性化する因子として、我々の研究室で初めて発見されたものである。Nothernおよびin situ解析の結果から、マウスGATA-6は、初期発生において心臓及び消化管系に特異的に発現し、その発現は生後もずっと維持されていることが明らかとなった。この組織特異的な発現を制御しているcis-elementを同定するために、われわれは、トランスジェニック・マウスの手法を用い、GATA-6の5'上流領域をlacZ reporter geneに融合し、lacZの発現をin vivoで調べた。その結果、GATA-6の5'上流-8.8kbを含む領域に心臓および消化系における発現に必須なエンハンサー及びプロモータ領域が含まれていることが示された。さらに、Hsp68/lacZ reproter geneを用いた解析から、GATA-6上流-8.8-7.1kbの領域に胃、腸などの内胚葉系組織に特異的なエンハンサーが存在することが明らかとなった。マウスGATA6因子は(A/T)GATA(A/G)配列を特異的に認識する転写調節因子であり、初期発生において心臓及び消化管系に特異的に発現し、これらの組織の発生と分化に必須な役割を果たしている。GATA-6自身の組織特異的な発現およびその調節機構を解明することは、GATA-6の発生・分化における機能を理解する上できわめて重要である。今年度は、この組織特異的な発現を制御しているcis-elementを同定するために、トランスジェニック・マウスの手法を用い、GATA-6遺伝子の翻訳開始点の下流にlacZ reporter geneを融合し、5'上流の領域によって駆動されるlacZ発現をin vivoで調べた。その結果、オリゴキャッピングで決定した転写開始点より上流約5kb、非翻訳ExonlおよびIntron 1領域を含むtransgeneを持つマウスでは、E8.5において、lacZ活性が心臓が形成される領域に検出された。E10.5-13.5においては、心臓のみならず、気管、胃などの組織でGATA-6の特徴的なlacZ発現が観察された。また、成体においても、lacZの心臓特異的な発現が観察された。したがって、上流約5 kbの領域にGATA-6の初期発生期のおける発現及び発現維持に必須なエンハンサー及びプロモータ領域が含まれていることが示された。次に、5'上流領域を約1.3kb及びIntron 1領域を欠損させたところ、lacZの発現が全く検出されなかった。したがって、-5.0kb-3.7kbの領域及びintron1領域にGATA-6の心臓における発現に必須なcis-elementが存在すること示唆している。さらに、以上の成果から同定されたcis-elementの配列を詳細に解析し、これらの領域に結合しうる分子の探索を進めると同時に、消化管系に特異的発現を制御するエンハンサーあるいはサイレンサー領域の同定を行っている。
外部刺激応答機能を有するハイブリッドカプセルの創成

薬剤をターゲットとなる患部に送達するドラッグデリバリーシステム(DDS)における容器となるカプセル材料には、体内における薬剤の分布の量的、空間的、時間的にコントロールする特性が求められる。そのような特性の実現のために、外部からのシグナルに応答しオンデマンドで内包物を放出する機能を付与したスマートカプセルの開発を行った。光をシグナルとして内包物を放出するカプセルは酸化チタンの光触媒機能を利用することで、磁場をシグナルとして内包物を放出するカプセルは磁性ナノ粒子の交流磁場中での発熱現象を利用することでそれぞれ実現可能であることが明らかとなった。本研究では、外部刺激応答性の新規なカプセル材料の創成を目的とする。コロイド粒子をテンプレートに用いた交互積層法と無機材料の水溶液プロセスによる合成法に着目し、外部刺激応答機能を有する有機-無機ハイブリッド型のインテリジェント中空カプセルの作製を行う。特に、高分子電解質層の表面状態の無機結晶の溶液プロセスからの析出への影響などを明らかにし、光、磁場等の外部刺激に応答して、内包物を放出する機能の発現を図る。3年間の研究計画の初年度にあたる本年度は以下のような成果を得た。コロイド粒子を鋳型にし、その表面を高分子電解質の多層膜を積層してコアーシェル粒子を作製し、鋳型粒子の除去により中空カプセルを作製した。このカプセルに脂質二分子膜をコートすることで、カプセル内部に機能性低分子を封入することに成功した。標識物質として色素を封入した脂質二分子膜/高分子電解質多層膜複合中空カプセルをさらにSiO_2-TiO_2ゲル層でコートしたハイブリッドカプセルを作製して、紫外線照射による内包物の放出特性について評価したところ、紫外線照射でカプセル殻が開裂し、色素が放出されることが明らかになった。この際に、紫外線の照射時間やその強度と放出速度が変化することが分かった。さらに、Pdナノ粒子を触媒として高分子電解質多層膜上にFe_3O_4ナノ粒子を水溶液から析出させて、Fe_3O_4/脂質二分子膜/高分子電解質ハイブリッドカプセルの合成に成功した。このカプセルに色素を封入し、交流磁場を印加すると、Fe_3O_4ナノ粒子の発熱によって脂質膜の物質透過性が変化し、内包物をオンデマンドで放出することが確認された。これらの結果から、医薬品、化粧品、電子デバイス等様々分野に展開可能な外部刺激応答性の有機-無機ハイブリッド中空カプセルの創成に成功した。コロイド粒子をテンプレートに用いた交互積層法と無機材料の水溶液プロセスによる合成法に着目し、外部刺激応答機能を有する有機-無機ハイブリッド型のインテリジェント中空カプセルの作製を行った。3年間の研究計画の2年目にあたる本年度は以下のような成果を得た。前年度までに開発したFe_3O_4/脂質二分子膜/高分子電解質ハイブリッドカプセルにおいて、内包物の放出挙動を詳細に検討した。標識物質に色素を封入し、交流磁場を印加すると、Fe_3O_4ナノ粒子の発熱によって脂質膜の物質透過性が変化し、内包物をオンデマンドで放出する。この際に印加する磁場の強度を変化させると、それに応じて内包物放出速度が変化することが見いだされ、目的に応じて放出挙動をコントロール可能であることが分かった。また、カプセルの分散液におけるカプセルの濃度を変化させた場合、一定の磁場の印加であれば、カプセル濃度に関わらず、放出速度は変化しないことが分かった。この際、分散液のFe_3O_4ナノ粒子の発熱による温度上昇は濃度が濃いものほど大きくなった。このことから、このハイブリッドカプセルにおける放出においては、磁性ナノ粒子の局所的な発熱で脂質膜の相転移をトリガーでき、分散液全体が温まる必要がないことが分かった。この結果は、薬物運搬体として、磁性粒子の発熱による正常細胞へのダメージを回避するために重要となる。これらの結果から、医薬品分野などに展開可能な外部刺激応答性の有機-無機ハイブリッド中空カプセルの創成に成功した。3年間の研究計画の3年目にあたる本年度は以下のような成果を得た。前年度までに開発したFe_3O_4脂質二分子膜/高分子電解質ハイブリッドカプセルについては、内包物の放出挙動を詳細に検討した。

このカプセルは標識物質として色素を封入したものに交流磁場を印加すると、Fe_3O_4ナノ粒子の発熱によって脂質膜の物質透過性が変化し、色素をオンデマンドで放出する。前年度までに磁場の強度を変化させると、それに応じて内包物放出速度が変化することを見出したが、今年度はカプセルに組み込むFe_3O_4ナノ粒子の量を変化させることで、同じ磁場強度でも放出挙動をコントロール可能であることを明らかにした。さらにコロイドテンプレート法のみならず、脂質二分子膜ベシクルに疎水化した磁性ナノ粒子と温度感受性高分子を組み込むことでも磁場応答性カプセルが得られることを明らかにした。このベシクルはコロイドテンプレートで作製したカプセルよりも小さいサイズでの作製が可能であり、ガン細胞に選択的に取り込まれるEPR効果を狙うことが可能になる。これらの成果より、本研究課題では医薬品分野などに展開可能な外部刺激応答性の有機-無機ハイブリッド中空カプセルの創成に成功した。
核酸医薬デリバリーにおける自然免疫活性化機構の解明とその制御に関する研究

核酸は抗体医薬に次ぐ新規医薬品として期待されているが、その効果獲得には送達システムの開発が重要である。本検討では全身投与後の自然免疫システムによる認識(TLR familyや補体による認識、炎症性サイトカインの誘導)機構の一端を明らかにすると同時に、これを回避する方法論の提案をすることができた。本検討を通じ、安全で機能的な核酸キャリアの開発に寄与しうる情報を発信した。平成27年度は、核酸含有PEG修飾リポソームによるanti-PEG IgM分泌誘導および炎症性サイトカイン分泌機構の解明を目指し検討を行った。我々のこれまでの検討から、siRNA-PEG修飾キャリア複合体ではTLR7を、pDNA-PEG修飾キャリア複合体ではTLR-9を介して自然免疫系を活性化し、脾臓が存在しない条件下でもanti-PEG IgM分泌亢進を誘導することが明らかになっている。これまで注目していたMZ-B(核酸非搭載PEG修飾リポソームに反応)以外に、血中のB細胞が寄与しているとの仮説をたて検討を行ったが、若干の反応(anti-PEG IgMの分泌)を生じるものの、大きな寄与ではないことが明らかとなった。そこで細菌の腹腔内感染時にT細胞非依存的に抗体を分泌することが知られているOmentum中のB細胞の寄与を疑い検討した。その結果、脾臓およびOmentumを除去した動物で、核酸含有PEG修飾リポソームを投与してもanti-PEG IgMの分泌が生じないことが明らかとなり、OmentumのB細胞が核酸含有PEG修飾リポソームによるanti-PEG IgM分泌誘導に大きな役割を果たしていることが新たに明らかとなった。Omentumは腹部にある胃などの臓器を取り囲むように存在している腹膜(腹腔の内側を覆っている薄い組織)のひだであり、腹腔内での炎症に反応してひだ内の免疫系が機能することは知られているが血行性の抗原に対する反応は報告されていない。新規な発見であり、免疫学の新たな領域を開く可能性がある。核酸含有PEG修飾ナノキャリアによるanti-PEG IgM分泌にこれまで想定していた脾臓辺縁帯B細胞、血液中のB細胞以外にOmentum中のリンパ球が関与しているという新事実が明らかになったため。多くのキャリアが報告されているが、臨床試験の初期段階でドロップアウトしている。これは、薬理効果の優劣によってのみ評価が進められ、生体にとって外来異物である核酸・キャリア複合体と生体との相互作用に関する基礎的な検討が行われていないためである。本研究は、単に効果を追求するのではなく、真に重要な核酸・キャリア複合体の生体適合性に着目し、全身投与後の自然免疫システムによる認識、即ちToll-like receptor (TLR)による認識機構、炎症性サイトカインの誘導、これに伴う副反応を詳細に検討することを特色とする。このような検討を通じ、安全で機能的な核酸キャリアの開発に寄与しうる情報を収集し、実際に応用する。当該年度は、免疫回避型(ステルス)核酸含有キャリアの開発を目的として研究を行った。新規高分子修飾剤(ポリグリセリン(PG))の有用性を検討したところ、PGに対する抗体の誘導は確認されず、免疫の回避という観点からは有用性が確認された。その一方で、血中滞留性はPEGと比べると低かったことから、核酸送達キャリアとしての機能は低い事が明らかとなった。ついで、ガングリオシド修飾の有用性について検討した。シアル酸含有糖脂質であるガングリオシドは、α2, 3結合シアル酸を有する糖脂質であり、B細胞上の抑制性の受容体であるsiglec-Gに結合し、抗原特異的なB細胞のアポトーシスを誘導することが知られている。ガングリオシドをPEG修飾リポソーム膜中に組み込んだところ、anti-PEG IgMの誘導が顕著に抑制され、興味深いことに核酸のTLR刺激によるサイトカインの誘導も抑制された。これは、リポソームがPEGを介してMZ-B細胞や血中のB細胞と結合した後、ガングリオシド-siglec-Gの相互作用によりPEG特異的な免疫反応を抑制したからではないかと考えている。免疫回避型(ステルス)核酸含有キャリアの構築に成功するとともに、抗がん剤封入PEG修飾リポソームとの併用によっても核酸含有キャリアによる免疫活性化を回避できることを明らかにすることができたため。PEG含有化粧品をラットに塗布した際の抗体産生評価ならびに化粧品によって誘導される抗PEG抗体によるPEG修飾医薬品の動態変化について検討を行った。本検討の結果から、皮膚に浸透しやすい化粧水によってanti-PEG IgMの分泌が生じ、このピークは塗布開始35日前後となることが分かった。PEG含有化粧水によるanti-PEG IgM分泌量はラットの個体差が大きい結果となったが、最もanti-PEG IgM分泌量の多かったラットの抗体価はPEG修飾リポソームの0.0001 &micro;molphospholipids/kg投与によって誘導されるanti-PEG IgMと同程度の抗体力価を持つことが確認され、これはDoxil投与4時間後の血中濃度を50%程度低下させる力価を保持していた。また、PEG含有化粧水誘導のanti-PEG IgMはPEG修飾リポソームに対して高い親和性を持っていた。しかしながらこのanti-PEG IgMは、補体活性化能はなく、Doxilの動態変化を引き起こす可能性は低いと考えられる。

実際にPEG含有化粧水塗付によってanti-PEG IgMが誘導された状態のラットにDoxilを投与しても、血中濃度の低下は確認されなかった。以上の結果より、PEG含有化粧水によってanti-PEG IgMが誘導されるが、補体活性化は生じないため、他のPEG修飾製剤の体内動態変化を発現させる可能性は低いことが示唆された。そのため、Doxilのような血中濃度と薬効が相関する薬剤に対しては治療効果に影響を及ぼす可能性は低いと考えられた。その一方で、PEG化タンパク製剤のような中和抗体の存在を考慮しなければならない薬剤に対してはその薬効を減弱させる可能性も考えられるため、注意が必要であると思われる。核酸は抗体医薬に次ぐ新規医薬品として期待されているが、その効果獲得には送達システムの開発が重要である。本検討では全身投与後の自然免疫システムによる認識(TLR familyや補体による認識、炎症性サイトカインの誘導)機構の一端を明らかにすると同時に、これを回避する方法論の提案をすることができた。本検討を通じ、安全で機能的な核酸キャリアの開発に寄与しうる情報を発信した。新たな事実が明らかになるなど、研究は良好に進んでいる。次年度以降も当初の研究計画を踏まえ、新たに明らかになった事実を加味し、研究を効率的に進める。新たな技術の確立を実現するなど、研究は良好に進んでいる。29年度が最終年度であるため、記入しない。薬剤学29年度が最終年度であるため、記入しない。
日清戦後の対外問題をめぐる政治的競合と立憲政友会創設への道程

1.今年度も、直接の研究対象時期である日清戦後(18951903)に期間を限定せず、第二次大戦後の五五年体制形成期までの政党政治の足跡を視野に入れ、幅広い観点から文献や史料の調査を行った。具体的には、国立国会図書館憲政資料室や徳富蘇峰記念館(神奈川県二宮町)、福岡市立博物館で、政治家の書翰を中心とする原史料の調査を行った。昨年度と同様、本年度も研究に利用できる史料を数多く見つけることができた。とりわけ、福岡市立博物館で調査した鍋島直彬宛書翰(「鹿島鍋島家文書」所収)によって、日清戦後から明治末年にかけての貴族院議員の政治ネットワークを解明する一端が得られた。2.日清戦争前と戦争下に行われた二度の総選挙を、自由党と敵対した対外硬派の視点から分析し、その成果を今年度の日本選挙学会の研究大会で報告した。本報告では、現職代議士の不出馬による不戦敗などの事例を踏まえ、対外硬派が党勢拡大に失敗した理由のひとつとして、組織力の弱さという論点を打ち出した。この報告原稿を土台に、データの補充を行い、活字化する準備を行っている。3.今年度は、日清戦争前後に対外硬派の一角を占めた立憲革新党の動向を、ジャーナリスト徳富蘇峰の政治戦略と絡めて分析した。そして、責任内閣と自主的外交という政治理念を共有する徳富と立憲革新党は、同党の長谷場純孝を介して密接な関係にあったことを明らかにした。その成果は、鳥海靖教授の古希記念論文集(吉川弘文館より刊行)に掲載される予定である。
ニワトリ二分脊椎モデルにおける歩行異常の病態解明

本研究テーマは、手術部位と歩行異常との関係、運動神経の異常、脊髄の神経細胞におけるホメオドメイン転写調節因子発現の変化、感覚神経細胞の異常、感覚回路の異常等より成る。(1)本研究では、ニワトリ胚神経管の蓋板切開により二分脊椎胚を作製し、これを孵化させることに成功した。孵卵開始後3日目のニワトリ胚の背側要仙部で神経管を再開裂させ、二分脊椎モデルを作製した。(2)二分脊椎ヒヨコはヒト二分脊椎症患者の併発症、すなわち後肢運動機能障害に似た症状を示した。(3)ニワトリ胚二分脊椎モデルの脊髄前角運動ニューロンの発生をLIMホメオドメイン型転写因子の1つであるIslet-1を用いて免疫組織化学的に検討した。孵卵開始後3日目に神経管を再開裂させ、その後、発生を継続させ、孵卵開始後4日から12日の各発生段階において採材した。採取した胚は固定後、定法に従い、第3腰髄節横断面での凍結切片を作製した。一次抗体としてマウス抗Islet-1モノクローナル抗体を用いDABで染色し、陽性細胞数をカウントした。正常発生群ではIslet-1陽性細胞数は孵化開始後4.5日においてピークを迎え、その後徐徐に減少し、孵化開始後12日以降では、陽性細胞数の大きな変化は観察されなかった。一方、二分脊椎群においては、Islet-1陽性細胞数の増加が正常発生群に比べ遅延し、孵化開始後5.5日において陽性細胞数が最多となった。正常発生群においては脊髄前角のlateral motor column(LMC)の内側の細胞群(LMCm)にのみIslct-1に対する免疫染色性が観察されたが、二分脊椎群では、LMC全域に染色性が観察された。(4)感覚線維の走行について検討した。正常と二分脊椎において後根神経を切断してその変成線維染色により走行を追跡した。感覚線維の走行は両者で大きく異なり、このことが二分脊椎の病態の一つであると考えられる。切開長の違いによる二分脊椎の状態の違い(7日胚)孵卵69,72,75,78,84時間後に各5例の腰仙髄部の背側を0,1,3,5,7体節切扉を加えた。その結果各時間とも0-3体節再開裂では二分脊椎は形成されなかった。3体節再開裂例では背部皮膚に陥凹のみが認められた。一方、5,7体節再開裂ではほぼ全例に二分脊椎が形成された。それぞれの手術部中央部のH.E..染色切片の観察では、1,3体節再開裂ではほほ正常であるが、5体節再開裂例では中心管が一部背側に開口していた。7体節再開裂例では中心管は完全に背側に開口し、後角が外側に分かれ基板は背側に押し上げられた形であった。正常では脊髄内部の構造は外側に白質、内側に灰白質が有り最内側に中心管を取り巻く胚芽層が有り各層の境界が比較的明瞭であるが、7体節再開裂二分脊髄例ては腹側に白質、背側に灰白質、さらに背側に幼若な胚芽層が有り各層、特に灰白質と胚芽層の境界は不明瞭であった。

前核の運動神経と思われる大きめの細胞は正常では中間帯の細胞群と連続していたが、7体節再開裂二分脊髄例では白質の中に取り残された島状の構造物となった。切開長の違いによる二分脊椎の状態の違い(14日胚)前核の運動神経細胞は7日胚では形態に大きな違いは認められなかったが、14日胚のもので比較すると正常では円形で細胞質には多くのニッスル小体が認められるが、7体節再開裂二分脊椎例では楕円形であり細胞質のニッスル小体は正常に比較しかなり少なかった。運動神経細胞の量的変化よりも質的変化が重要と思われる。我々はこれまでに二分脊椎症で見られる神経損傷の病態を詳細に解析するためにヒト二分脊椎症患者に似た後肢の運動障害や骨変形を示す二分脊椎ヒヨコを開発した。正常では脊髄内部の構造は外側に白質、内側に灰白質が有り最内側に中心管を取り巻く胚芽層が有り各層の境界が比較的明瞭であるが、7体節再開裂二分脊髄例では腹側に白質、背側に灰白質、さらに背側に幼若な胚芽層が有り各層、特に灰白質と胚芽層の境界は不明瞭であった。前角の運動神経細胞は7日胚では形態に大きな違いは認められなかったが、14日胚のもので比較すると正常では円形で細胞質には多くのニッスル小体が認められるが、7体節再開裂二分脊椎例では楕円形であり細胞質のニッスル小体は正常に比較しかなり少なかった。運動神経細胞の量的変化よりも質的変化が重要と思われた。そこで、平成15年度では、このモデルの脊髄奇形領域における脊髄神経、特に運動神経に変化について焦点を合わせ、コリン作動性神経細胞のマーカーであるアセチルコリントランスフェラーゼの特異抗体を用い、二分脊椎ヒヨコの奇形脊髄の免疫染色を行った。すなわち、二分脊椎例及び正常発生例、それぞれ5例の第3腰髄の15μm厚の連続切片を作製し、各個体につき3切片毎(30μm毎)・25切片上の抗体陽性細胞数を数えた。二分脊椎例では872.5±48.2個、正常発生例では752.0±37.0個であった。この結果から二分脊椎ヒヨコの奇形脊髄領域には正常発生例以上に多くの機能的な運動神経細胞が存在していることが示唆された。本モデルで見られる後肢の運動機能障害が運動神経細胞の機能異常によるものでなく、脊髄介在神経細胞などの運動神経の上位にある機能調整系の機能不全によって引き起こされたものであると推論した。本研究では、ニワトリ胚二分脊椎モデルの脊髄前角運動ニューロンの発生をLIMホメオドメイン型転写因子の1つであり、脊髄前角の運動ニューロンに発現することが報告されているIslet-1を用いて免疫組織化学的に検討した。艀卵開始後3日目のニワトリ胚の背側腰仙部に、実体顕微鏡下で、神経管を再開裂させ、二分脊椎モデルを作製した。その後、発生を継続させ、孵卵開始後4日、4.5日、5日、5.5日、6日、9日、12日(E4、E4.5、......E12)の各発生段階において各4個体を採材した。採取した胚は、4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液(pH7.2)で固定後、定法に従い、第3腰髄節横断面での15μm厚の凍結切片を作製した。一次抗体としてマウス抗Islet-1モノクローナル抗体を用いDABで染色し、陽性細胞数をカウントした。対照群と二分脊椎群の第3腰髄節の脊髄前角におけるIslet-1陽性細胞数を各発生段階において計測した。正常発生群ではIslet-1陽性細胞数は孵化開始後4.5日においてピークを迎え、その後徐徐に減少し、孵化開始後12日以降では、陽性細胞数の大きな変化は観察されなかった。一方、二分脊椎群においては、Islet-1陽性細胞数の増加が正常発生群に比べ遅延し、孵化開始後5.5日において陽性細胞数が最多となり、その後正常群と同様に減少し、孵化開始後12日においては陽性細胞数について正常群との有意差はなく、大きな変化は観察されなかった。加えて、免疫組織
同位体から昆虫の機能形質を評価する

地球規模で生じている生物の種構成の変化が,生態系機能に及ぼす影響を明らかにすることは環境学の重要な課題である.現在,植物群集の種ごとの機能形質をもとに,その生態系機能を評価する研究が広く行われている.一方,多様な表現型を持つ昆虫など動物については,共通の機能形質を測定することが困難なため,そのような研究はほとんどない.本研究では,動物の食性を反映する同位体を用いて,昆虫の生態系機能に関連する形質を評価することを目的としている。本年度はまず調査方法の確立を行い、その後、当初予定していたモニタリング1000の3サイト(半田山(岡山県)、椎葉(宮崎県)、小佐渡(新潟県))において6月と9月の2度にわたりアリ類、トビムシ類、糞虫類や土壌有機物(リターと土壌)の採集を行った。昆虫試料については、個体数の計測や同定、同位体分析用試料の作成を行った。土壌試料については栄養塩の測定等、土壌特性の評価を行った。その結果、これら3地点での昆虫群集組成の違いや調査地ごとの特性が把握できた。昆虫試料の一部については連続フロー型同位体比質量分析計を用いて炭素、窒素同位体分析を行った。また、放射性炭素濃度については、封管法により昆虫試料から二酸化炭素を生成、グラファイトを作成し、加速器質量分析計によって放射性炭素分析を行った。また、一部の昆虫については形態計測を行い、外部形態に基づく形質評価も行った。現在、これら得られたデータの解析中である。調査方法の確立、3地点の生物試料の採集と同定が完了し、一部については同位体分析も完了するなど当初の予定通り研究が進展しているため。本年度は採集済み試料について同位体分析や形態計測を行いつつ、新たに3地点の調査を行う予定である。この他、採集済み土壌については、リン脂質酸分析による土壌微生物群集の評価も予定している。
ローカル商品をめぐる多元的な語り―博物館学芸員による市民参加型の民俗学的研究

最終年度は除雪用具であるスノーダンプも分析対象に加え、調査研究を進めた。スノーダンプは除雪と運搬の機能を兼ね備えた道具であり、雪の積載、運搬、投雪の流れを容易にした。三六・三八豪雪を契機に、除雪体制や消融雪施設の整備が官民ともに急速に進められた。その動きが1970年代のスノーダンプの普及につながった。東北地方の積雪地帯ではプラスチック素材のスノーダンプが使用される中、新潟県内では鉄製スノーダンプがローカル商品として流通する。鉄の素材は新潟の湿った雪質に適し、豪雪地の屋根除雪でその効果を発揮している。その効率性の追求から、改良を加えたクマ武式スノーダンプなどの新製品が生まれ、豪雪地である魚沼地方での使用が卓越する。調査の結果、県内の鉄製スノーダンプの生産は、燕の金属加工業や、農機具・手押一輪車などの近代工業の中から生まれたことが明らかとなった。それは時代の趨勢によって産業転換を迫られる中、鉄製スノーダンプの需要増加を見込んだ生産戦略であった。ローカル商品として食される海藻の「えご」の調査研究も継続して実施。近年、新潟県のえご草の漁獲低迷により、県内では青森県産のえご草が多く流通している。えごは新潟の郷土料理や伝統的な食文化とされながらも、その原料であるエゴノリは青森県産に依存しているのが現実である。そこで、今年度は青森県の調査を優先し、産地から生産者・卸業者・小売業・消費者に至る流通過程を明らかにした。その成果の一部については、博物館利用者及び越後えご保存会会員とともに協働で講座を開催し、成果を発表した。本研究は特定の商品がローカルに流通し、消費されていく現象を明らかにするため、スーパーマーケットの新聞折り込み広告チラシの比較分析を行い、それを媒介とした調査者・販売者・消費者の対話の中から多元的な語りを引き出し、対象へと接近するものである。ローカル商品が現出化する状況を明らかにするため、本研究を遂行する基礎作業として、本年度は新聞折り込み広告チラシの収集整理を行った。また、海藻食品であるえごについて、博物館利用者とともに市民参加の現地調査を行った。具体的にはお盆時期に県内各地のスーパーマーケットや農産物直売所、定期市などを学芸員と一緒にめぐり、えごをはじめとしたお盆商品の販売状況を確認した。このほか、消費者のえごの入手方法や利用方法などについても市民とともに現地調査を行い、盆棚へのえごの供え方なども現地で観察した。えごの利用については、新潟県内の上越や中越、佐渡が盛んで、村上市などの下越地方では希薄であった。その代わり村上市周辺では、お盆の時期に「てんぐさ」が利用され、盆棚には「鏡てん」と呼ばれる供物を供えていることが明らかとなった。今後は現地で直接観察や聞き取り調査の結果を踏まえた上で、新聞折り込み広告チラシの分析を進める予定である。さらに、本年度はえご採取を行う漁村を訪問し、調査を実施することができた。具体的には柏崎市で素潜り漁を行っている女性から聞き取りを行った。えごと呼ばれているものにも2種類あることがわかり、漁師と消費者のあいだに認識のずれがあることが明らかとなった。今後も市民の疑問点に応えるかたちで、博物館を核とした調査研究を進める予定である。長岡周辺のチラシの収集は順調に進んでおり、今後収集範囲を拡げる必要がある。海藻のエゴ食文化に強い関心をもつ博物館利用者がおり、今年度はエゴを中心に分析を進めた。平成27年度の広告チラシへに掲載されたお盆商品を分析した結果、盆の準備開始に合わせ8月6日にお盆商品の掲載がはじまり、13日に各店で特集の紙面を組む傾向にあった。この中でエゴが多く登場するのは13日で、すべて既製品のエゴである。チラシに掲載されるエゴの多くは、酢味噌付きで、パッケージを開封して切るだけで手軽に食べられる既製品のみである。海藻の状態のエゴ草がチラシに掲載されることはない。その意味において、エゴ食文化は持続しつつも、エゴ練りといった調理する文化は衰退に向かっていることをあらわしている。また、長岡市のエゴ生産加工業者に聞き取り調査を行ったところ、通常の黒色のエゴに加え、白くさらしたエゴを盆の時期のみ生産していることが明らかとなった。この白色のエゴは小千谷市及び十日町市限定で販売されており、生産加工業者が地域の年中行事や食文化のニーズに合わせて、戦略的に販売していることが明らかとなった。そのほか、博物館ボランティアや博物館友の会会員とともに、エゴ食文化が広がる長野県や石川県で調査を実施し、各地の食文化やエゴ草の流通経路等を把握した。ローカル商品の消費者に加え、生産者への聞き取り調査を進めることができた。平成29年度も、新潟県内のお盆の行事食として利用される海藻のエゴを中心に追跡調査を進めた。前年度までの店頭の観察調査において、新潟県内では長野県茅野市の問屋が卸すエゴ草が流通している実態を把握。そこで今年度は茅野市内のエゴ草卸売業への聞き取り調査を行い、その動向の把握に努めた。

茅野市は古くから寒天の産地として知られ、その原料となるテン草の配合藻として日本海沿岸のエゴ草が利用されていた。しかし、昭和30年代以降のエゴ草の高騰によって、エゴ草を寒天の配合藻として利用せずに、エゴ食文化が卓越する地域に乾物として直接販売するしくみが形成されていった。ある長野県の卸売業者は各地のエゴ食の有無や嗜好を熟知しており、地域の食文化やニーズに合わせてエゴ草を加工して出荷している状況が明らかとなった。特定の商品がローカルに流通し、ローカルに消費されていく現象は、地域を越えた多様なアクターが関わるかたちで展開している状況を理解することができた。企業の中にはローカル食品を地域の伝統食として保存しようとする運動もある。その動向を把握するため、エゴやコンニャクなどの食品製造業者が組織する「越後えご保存会」の活動に参加し、調査を進めた。当会は見学会や料理教室、PRイベントなど幅広い事業に取り組んでおり、当会の動向については今後も継続して調査を進める計画である。また、本研究では博物館を核とした市民参加型の調査研究の成果を社会に発信する手法についても検討課題として掲げている。研究代表者が所属する博物館の友の会メンバー企画講座としてエゴ作り体験や各地のエゴを試食するワークショップを平成29年11月に開催した。当日は友の会会員が調べたエゴの歴史に関するパネル展示コーナーを設け、市民参加型の調査研究成果の一部を紹介した。ローカル商品にかかわる卸売業や、食文化を保存する地域活動についても調査を進めることができた。最終年度は除雪用具であるスノーダンプも分析対象に加え、調査研究を進めた。スノーダンプは除雪と運搬の機能を兼ね備えた道具であり、雪の積載、運搬、投雪の流れを容易にした。三六・三八豪雪を契機に、除雪体制や消融雪施設の整備が官民ともに急速に進められた。その動きが1970年代のスノーダンプの普及につながった。東北地方の積雪地帯ではプラスチック素材のスノーダンプが使用される中、新潟県内では鉄製スノーダンプがローカル商品として流通する。鉄の素材は新潟の湿った雪質に適し、豪雪地の屋根除雪でその効果を発揮している。その効率性の追求から、改良を加えたクマ武式スノーダンプなどの新製品が生まれ、豪雪地である魚沼地方での使用が卓越する。調査の結果、県内の鉄製スノーダンプの生産は、燕の金属加工業や、農機具・手押一輪車などの近代工業の中から生まれたことが明らかとなった。それは時代の趨勢によって産業転換を迫られる中、鉄製スノーダンプの需要増加を見込んだ生産戦略であった。ローカル商品として食される海藻の「えご」の調査研究も継続して実施。近年、新潟県のえご草の漁獲低迷により、県内では青森県産のえご草が多く流通している。えごは新潟の郷土料理や伝統的な食文化とされながらも、その原料であるエゴノリは青森県産に依存しているのが現実である。そこで、今年度は青森県の調査を優先し、産地から生産者・卸業者・小売業・消費者に至る流通過程を明らかにした。その成果の一部については、博物館利用者及び越後えご保存会会員とともに協働で講座を開催し、成果を発表した。チラシの収集について引き続き行い、今後はシーズン別の収集を県内全域で実施するよう収集範囲を拡げる予定である。
有性化因子を起点に近縁種プラナリアの有性化機構を比較して生殖戦略の進化を紐解く

ある種のプラナリアは無性生殖と有性生殖を環境に応じて巧みに転換することができる。リュウキュウナミウズムシOH株を用いて、無性個体に別種の有性個体のミンチを投餌することで有性化させる実験系が確立されている。このことは、有性個体中に有性化を誘導する化学物資(有性化因子)が存在することを示している。我々は、この有性化実験系を用いて有性化因子や有性化に関わる遺伝子を複数同定してきた。本研究では、それらの因子に着目して、様々なプラナリアに共通する有性化機構を明らかにすることを目的としている。プラナリアは種によって無性状態が異なり、リュウキュウナミウズムシは卵巣原基のみを有するが、近縁種であるナミウズムシは卵巣原基と精巣原基を有している。通常、リュウキュウナミウズムシの有性化実験は20°Cの条件で行なっている。まず、近縁種であるナミウズムシのSSP株を用いて同条件で有性化を試みたところ、有性化する個体は見られなかった。しかしながら、この条件ではほとんどのSSP株が分裂していたため、分裂により再生が誘導されて有性化が阻害されている可能性が考えられた。そこで次に、14°Cという低温下で実験を行なった。その結果、分裂は起こらずにSSP株のほとんどの個体が有性種のミンチを投餌することで有性化した。以上の結果より、リュウキュウナミウズムシは有性化因子のみで有性化するが、ナミウズムシは有性化因子に低温を加えることで有性化することが考えられた。リュウキュウナミウズムシで確立されている有性化実験系を近縁種のナミウズムシでも応用することができ、近縁種間の有性化機構を比較する準備が整った。リュウキュウナミウズムシとナミウズムシの有性化機構の比較を行う。有性化過程の比較を組織レベルで行い、卵巣や交接器官に加えて、外部形態で確認できない精巣や卵黄線の分化の比較を行う。また、これまで特定のアミノ酸が有性化活性を有していることを見出している。トリプトファンを初めとした有性化因子による効果の違いを両者で比較する。本年度に国際学会へ参加したが、その旅費の一部を学校の予算でまかなうことができたため。パソコンの調子が悪いため、繰越し金と翌年度以降の予算を合わせて、新しいパソコンを購入する予定である。
慢性関節リウマチ病変局所におけるシグナル伝達機構の解析:Jak-Stat系の関与

慢性関節リウマチ(RA)ではTNF、IL-1をはじめとする種々のサイトカインが過剰に産生され、これらが滑膜増殖、組織傷害に関与していると考えられている。サイトカインレセプターからのシグナル伝達にはスフィンゴミエリン-セラミド系やJAK-STAT系をはじめとする多くの経路が知られており特にセラミドは、TNFレセプター、IL-1レセプターのsecond messengerのひとつでありRAに深く関与していると考えられる。本研究では滑膜細胞におけるこれらのシグナル伝達経路の役割を解析した。細胞透過性セラミド(N-アセチルスフィンゴシン)は、PDGF添加無血清培地では10μM、5%FCS培地では50μM以上でRA患者由来培養滑膜細胞のDNA合成を阻害し、球状の形態変化を誘導した。この形態変化はセラミド添加4時間後より認められ、24時間後まではセラミド除去により可逆性であった。しかし、48時間後の時点では、Hoechst33258を用いた蛍光染色でクロマチンの凝縮、断片化を認め、フローサイトメトリー法(PI染色)ではDNA含量の減少が観察された。DNA電気泳動ではアポトーシスに特徴的なラダー形成が認められた。一方、TNFやIL-1でみられるようなDNA合成の促進効果は、セラミドには認められなかった。以上より、滑膜細胞においてセラミドはアポトーシスを誘導するメディエーターであり、TNFやIL-1による滑膜細胞増殖にはスフィンゴミエリン-セラミド系以外の経路が重要であることが示唆された。今後JAK-STAT系等の役割を解析していく予定である。
経管栄養が口腔フローラの攪乱に及ぼす影響の解明

寝たきりの高齢者98名を経管栄養摂取者群と経口栄養摂取者群に分けて、T-RFLP解析により舌苔細菌叢の比較を行った。HaeIII消化の簡易T-RFLP解析パターンが、両群で大きく異なることから、細菌種構成比率の違いが推察された。そこで、より詳細な細菌叢の違いを明らかにするため、HaeIII以外のRsaI, MspIおよびHhaIの制限酵素の消化で得られた複数のT-RFLPピークパターンの組み合わせで独自に開発したコンピュータソフトによりデータを再解析した。しかし、経管栄養摂取者に特異的に認められたTRFはいずれもHOMDに登録された口腔細菌種に対応しないことから、これらのTRFは通常の口腔細菌種に由来しないものと考えられた。そこで、パイロシーケンスによる経管栄養摂取者の舌苔細菌構成の解明を試みた。パイロシーケンス解析の対象者には経管栄養摂取者から17名、寝たきりの経口栄養摂取者から17名を選んだ。得られたDNAシークエンスを解析した結果、経管栄養摂取者の口腔には健康な口腔において通常検出されることのないStreptococcus agalactiaeやCorynebacterium striatumが高い比率で検出されることが明らかになった。さらに呼吸器系疾患の病原性細菌と言われるHaemophilus influenzaやPseudomonas aeruginosaも経管栄養群にのみに検出されたことから、経管栄養摂取を行うことで、口腔細菌叢が大きく破綻していることが確認できた。さらに、経管栄養摂取者に特徴的な菌種と全身状態との関連性についての検討を進め、パイロシーケンスから推定される菌種の中で経管栄養摂取者に特異的に認められたいものについて、それぞれの菌種量と、サンプル採取前後一年間の発熱日数、肺炎の発症との間の関連を検討したが、単独で臨床症状に有意に関連性を示した細菌種は認められなかった。HaeIIIによる簡易T-RFLP解析の結果から、経管栄養摂取者の細菌叢が経口栄養摂取者に比較して、極めて異なることが推察された。そこで本研究ではより詳細な細菌叢の違いを明らかにするため、HaeIII以外の制限酵素であるRsaI, MspIおよびHhaIによる消化で得られた複数のT-RFLPピークパターンの組み合わでデータを再解析した。本解析にあたっては複数のピークパターンからHOMDに登録された様々な細菌種がフローラ全体に占める割合を近似解を用いて理論的に計算できるコンピューターソフトを予め独自に開発した。しかし、経口栄養摂取者に比較して経管栄養摂取者に特異的に認められたTRFはHOMDに登録された細菌種にいずれも対応しないことから、経管栄養摂取者に特異的に認められる細菌種はHOMDに登録されていない細菌種から構成されているものと考えられた。2.パイロシーケンスによる経管栄養摂取者の舌苔細菌構成の解明パイロシーケンス解析の対象者として、経管栄養摂取者から15名、寝たきりの経口栄養摂取者から16名を選んだ。得られたDNAシークエンスを解析した結果、経管栄養摂取者の口腔にシュードモナス属やアシネトバクター属や通常ヒトの口腔では検出されることが少ないコリネバクテリウム・ストリアツムやストレプトコッカス・アガラクチアなどが認められた。3.経管栄養摂取者に特徴的な菌種と全身状態との関連性についての検討パイロシーケンスから推定される菌種の中で経管栄養摂取者に特異的に認められたいものについて、それぞれの菌種の量と、サンプル採取前後一年間の発熱日数、肺炎の発症との間の関連を検討したが、単独でこれらの臨床症状に有意に関連性を示した細菌種は認められなかった。

343名の舌苔フローラについて、HaeIIIに加えてAluIの制限酵素によるT-RFLP解析行い、両者のピークパターンの組み合わせによるT-RFLP解析を行い、データの再分析を行った。この解析では、複数のピークパターンから各細菌種が全体に占める割合が計算できるよう独自開発したPCソフトを使用した。しかし、分析結果を詳細に検討すると細菌種の同定結果に若干の矛盾点があったことから、T-RFLPはパターン分類に限定して用いて、舌苔フローラに占める細菌種の同定にはパイロシーケンスを用いた。T-RFLPパターンでは経口摂食者群(297名)と経管栄養者群(46名)間で細菌叢の構成が明らかに異なることが確認され、さらに対象者を寝たきりの者に限るため施設を絞った98名の場合(経口栄養者:54名、経管栄養者:44名)でもその差は明らかであった。パイロシーケンス解析の対象者は、前述の寝たきりのものから経口栄養摂取者16名、経管栄養施行者15名とした。得られたDNAシークエンスをRibosomal Database Project等の公共の16S rRNA遺伝子配列データベースに照合することで、その細菌群集に含まれる菌種の構成と割合を計算したところ、また,菌属レベルでは、T-RFLP解析で予測された通り、口腔常在菌として一般的なベイヨネラ属,ストレプトコッカス属が少ない一方,マイナーなバクテリアであるコリネバクテリウム属,ペプトストレプトコッカス属,フゾバクテリウム属など22菌属が有意に高率で検出された。また,経管栄養者のみで,シュードモナス属(1人)やアシネトバクター属(3人)が認められた。さらに詳細に調べると,通常ヒトの口腔では検出されることが少ない好気性グラム陽性桿菌であるコリネバクテリウム・ストリアツムやB群β溶血性連鎖球菌のストレプトコッカス・アガラクチアが検出された。当初計画した内容は既に学術論文として国際誌に報告しており、計画は順調に進行している。当初の計画通り経管栄養施行高齢者に認められる菌種について、それぞれの菌種の量と、サンプル採取前後一年間の発熱日数、肺炎の発症との間に関連がないか検討する。その他、歯列の状態(残存歯数、DMF歯数、補綴の種別)、口腔衛生状態(プラークインデックス、歯石沈着)、義歯の状態、舌の状態(舌苔量、舌の湿潤度)とこれらの菌種との関連についても検討を加える。本年度に計画して本研究の学会発表については、予定していた学会の日程と講義の日程が重複したため、本年度は学会に参加して研究成果を発表することを断念したため、146659円の研究経費が次年度に繰り越された。この経費については今年度の、学会発表の経費として上乗せして、大学院生の学会発表の旅費として充当することとした。また、パイロシーケンスの受託解析が物品費として計上されるものとして予算立てしていたが、実際にはその他の経費として計上されることから、最終的には物品費からその他の経費に予算を大きく移すことになる。
キラリティーの実用的比色分析法を提供し得る金ナノ粒子キラルセンサーの開発

キラリティーの迅速分析を達成する革新的手法を確立するために、キラルレセプターで表面修飾された金ナノ粒子のキラル認識と色調変化を活用し、目視により迅速かつ高感度にキラル分析できる実用的センサー材料の開発を検討した。その結果本研究では、キラル化合物の添加により、そのキラリティーに依存して異なる色調変化を示す金ナノ粒子の合成に成功した。また、本研究を通して、金ナノ粒子の化学構造とキラル認識能の関係性など、さらなるキラルセンサーの開発にとって非常に有用な知見が得られた。本研究では、製薬を含む多岐にわたる産業および有機化学を初めとする幅広い学術分野において今日強く求められている「キラリティーの迅速分析」を達成するために、光学活性化合物のキラリティーに依存して異なる色調を示す機能性金ナノ粒子の開発を目的とした。具体的には、キラルレセプターで表面修飾された金ナノ粒子を創製し、キラル物質に対する金ナノ粒子の色調変化を詳細に評価した。この際、特にキラル認識能や検出感度に焦点を絞り、得られた結果を分子設計にフィードバックすることで、センサーポリマーの最適構造を探索した。様々なキラルレセプターで表面修飾された金ナノ粒子を設計、合成し、構造とキラル認識能の関係を調査した。この様な検討を通して、実際に、認識部位としてキラルアミノ基で表面修飾された金ナノ粒子が、光学活性カルボン酸のそれぞれのエナンチオマーに対し、異なる色調変化を示すことを見出した。従って、当該年度において本研究の目的としていたキラルセンサーに応用可能な基盤物質の創製に成功したと言える。当初達成を目指した、それぞれのエナンチマーに対して異なる色調変化を示す金ナノ粒子の合成に成功した。また、分子設計と色調変化の関係性が明らかになりつつあり、さらに有効な金ナノ粒子センサーの開発にとって有用な知見が大いに得られた。従って、本研究では当初の目的を十分に達成しており、計画通りの進展が達成されたと言える。また、これらの研究成果は複数の学会等で発表されており、関連分野の進展および領域の拡大に貢献したものと考えられる。本研究では、製薬を含む多岐にわたる産業および有機化学を初めとする幅広い学術分野において今日強く求められているキラリティーの迅速分析を達成するために、光学活性化合物のキラリティーに依存して異なる色調を示す機能性金ナノ粒子の開発を目的とした。今年度は、前年度で得られたキラル金ナノ粒子のキラル認識能や検出感度における知見を分子設計にフィードバックし、様々なキラルレセプターで表面修飾された新たな金ナノ粒子を設計、合成し、金ナノ粒子の最適化と適用可能なキラル化合物の範囲の拡大を図った。例えば、L-酒石酸誘導体で表面修飾された金ナノ粒子を合成し、キラル認識能の評価を行った。合成した金ナノ粒子の溶液(水/2-プロパノール= 2/1)は表面プラズモン共鳴由来の鮮やかな赤色を呈していた。この金ナノ粒子にD体のリンゴ酸を添加したところ、D-リンゴ酸の添加量に伴い、赤色から赤紫色の変色、さらには沈殿の生成が生じた。一方で、L体のリンゴ酸を添加した場合、より少量の添加により色調の変化が生じた。すなわち、この金ナノ粒子はリンゴ酸のキラリティーに依存して異なる色調変化を示すことが明らかとなった。紫外可視吸収スペクトル測定からは、リンゴ酸のキラリティーに依存し、表面プラズモン共鳴に由来する吸収に明瞭な差が生じていることを確認した。また、リンゴ酸以外のキラル化合物に対しても、キラリティーの比色識別が可能であることを見出した。さらに、金ナノ粒子の分子設計が色調変化やキラル認識能に及ぼす影響に関して多くの知見を得ることが出来た。目的としていた様々な種類のキラル金ナノ粒子を設計、合成し、キラル化合物に対する色調変化の挙動を評価することができた。また、その内のいくつかについては、比色キラル識別に適用可能な特性を有していることを見出しており、キラル識別可能なキラル物質の適用範囲を拡大できたため。本研究では、製薬を含む多岐にわたる産業等で広く求められているキラリティーの迅速分析を達成するために、光学活性化合物のキラリティーに依存して異なる色調を示す機能性金ナノ粒子の開発を目的とした。具体的には、様々なキラルレセプターで表面修飾された新たな金ナノ粒子を設計、合成した。得られたこれらの金ナノ粒子は局在表面プラズモン共鳴に由来する鮮やかな赤色を呈していたが、これらの金ナノ粒子にキラル物質を添加したところ、そのキラリティーに依存して異なる色調変化を示すことが明らかとなった。金ナノ粒子の色調応答に関しては、紫外可視吸収スペクトル測定を行い、詳細に評価した。また、動的光散乱測定による金ナノ粒子の粒径の評価を併せて行い、金ナノ粒子の凝集と色調変化との間の関係性を明らかにした。色調変化やキラル認識能、感度等を評価し、得られた結果を金ナノ粒子の分子設計にフィードバックすることで金ナノ粒子の最適化を図った。また、粒子表面を修飾するキラルレセプターを調節することで、分析可能なキラル化合物の適用範囲の拡大を図った。以上の検討を通して、本研究では研究目的として掲げたキラリティーを色調から迅速に分析できる金ナノ粒子の開発に成功した。