hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血中フリーラジカルの経時的変化による脳虚血の検出:電子スピン共鳴法を用いた検討

動物実験では電子スピン共鳴(ESR)装置を使用したDMPOによるスピントラッピング法を用いて、脳虚血再灌流時の血中フリーラジカル(FR)の変化をとらえることが可能であったが、同様の方法による臨床研究では脳合併症のない群におけるデータのばらつきがあまりにも大きいため、この方法で脳虚血を検出することはできなかった。理由としては検体採取してからESR測定するまでの時間が動物実験よりも長いことと血中に流出するFR量が非常に微量であることなどが考えられた。そこでFR自体を検出する方法ではなく、増加したFRに反応して減少する血中抗酸化ビタミンに注目した。その中でも特に最も素早く反応するアスコルビン酸(AsA)は、FRと反応するとアスコルビン酸ラジカル(AFR)となるが、このAFRはESR装置によりごく短時間で非侵襲的に測定可能である。まず基礎臨床研究として血清AsAを一般的な測定法である高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて測定、また同一血清のAFRをESR装置にて測定した。その結果、AsAとAFRには有意な相関関係を認めたため、ベッドサイドのESR装置により、HPLCよりもはるかに短時間で血清AsAを予測できるということが明かとなった。この方法によると、脳合併症のない弓部大動脈置換術におけるAFRは脳分離体外循環が始まると術前より有意に減少した。一方、データが少ないため統計学的分析はできなかったが、脳合併症群ではAFRの減少の程度がより大きい傾向にあった。よって弓部大動脈置換術の周術期に急激にAFRが大幅に低下した場合、脳虚血の可能性を考慮する必要がある。今後、脳合併症群のデータがさらに増えれば、どの程度の減少で脳虚血の可能性を考慮すればよいかが明白となるであろう。まとめると、ESR装置によりAFRをリアルタイムにモニタリングしておけば脳虚血を早期に検出できる可能性が示唆された。(基礎研究)雄Wisterラットにペントバルビタール30mg/kgを腹腔内投与。採血用カテーテルを外頚静脈に挿入。続いて先端を加工した4-0nylon monofilamentをラット頚部頸動脈から挿入し、中大脳動脈を2時間閉塞後再灌流した。測定点は閉塞前、閉塞直後、30分、60分、90分、120分後、再灌流直後、30分、60分、90分、120分とし、各々外頚静脈より血液を採取し、同時にスピントラップ剤のDMPOと混合後、直ちに電子スピン共鳴(ESR)測定を用いて、ヒドロキシルラジカル量を測定した。以上を脳虚血群とし、中大脳動脈を閉塞しない群をコントロールとした。脳虚血群ではコントロールに比し、再灌流後、ヒドロキシルラジカル量が増加する傾向にあったが、測定誤差も大きい。今後もモデルの作製・検体採取、ESR測定等の改善の検討が必要である。(臨床研究)脳分離体外循環下に弓部大動脈置換術を施行される患者において、全身麻酔導入後、内頚静脈球部にカテーテルを挿入、内頚静脈球部酸累飽和度を測定し、また同時に近赤外線モニターも併用した。経時的に内頚静脈球部血を採取し、同時にDMPOと混合後、直ちに手術室内に設置したESR装置にてヒドロキシルラジカル量の測定を行った。周術期に脳合併症を有した症例はないため、正常群のみの測定であるが、ヒドロキシルラジカル量は人工心肺開始、超低体温に大きく影響されるため、さらに多くの症例において非脳合併症群でのヒドロキシルラジカルの経時的変化を検討する必要がある。続いて先端を加工した4-0 nylon monofilamentをラット頚部頸動脈から挿入し、中大脳動脈を2時間閉塞後再灌流した。脳虚血群ではコントロールに比し、再灌流後、ヒドロキシルラジカル量が増加する傾向にあった。実際の臨床では超低体温とするため、今後は脳虚血+脳低温モデルを作製、検体採取、ESR測定等の改善の検討が必要である。またヒドロキシルラジカルより安定してESR測定可能なアスコルビン酸ラジカルも同時に測定し、両群のデータを比較検討中である。(臨床研究)周術期に脳合併症を有した症例は前年に続いてなかった。正常群のみの測定であるが、ヒドロキシルラジカル量は人工心肺開始、超低体温に大きく影響されるため、安定しない。今後はESR装置にてより安定して測定可能なアスコルビン酸ラジカルの経時的変化についても検討する予定である。

理由としては検体採取してからESR測定するまでの時間が動物実験よりも長いことと血中に流出するFR量が非常に微量であることなどが考えられた。そこでFR自体を検出する方法ではなく、増加したFRに反応して減少する血中抗酸化ビタミンに注目した。その中でも特に最も素早く反応するアスコルビン酸(AsA)は、FRと反応するとアスコルビン酸ラジカル(AFR)となるが、このAFRはESR装置によりごく短時間で非侵襲的に測定可能である。まず基礎臨床研究として血清AsAを一般的な測定法である高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて測定、また同一血清のAFRをESR装置にて測定した。その結果、AsAとAFRには有意な相関関係を認めたため、ベッドサイドのESR装置により、HPLCよりもはるかに短時間で血清AsAを予測できるということが明かとなった。この方法によると、脳合併症のない弓部大動脈置換術におけるAFRは脳分離体外循環が始まると術前より有意に減少した。一方、データが少ないため統計学的分析はできなかったが、脳合併症群ではAFRの減少の程度がより大きい傾向にあった。よって弓部大動脈置換術の周術期に急激にAFRが大幅に低下した場合、脳虚血の可能性を考慮する必要がある。今後、脳合併症群のデータがさらに増えれば、どの程度の減少で脳虚血の可能性を考慮すればよいかが明白となるであろう。まとめると、ESR装置によりAFRをリアルタイムにモニタリングしておけば脳虚血を早期に検出できる可能性が示唆された。
社会的接触を求める意志力の神経機構解明

反復性社会敗北ストレスを与えたマウスにおける新奇個体に対する社会的忌避行動の解析を行う。逆行性感染するAAVベクターを利用した投射経路選択的な遺伝子発現制御を利用し、前頭前皮質から扁桃体へ投射するオキシトシン受容体発現ニューロンの社会的接触を求める過程における選択的な活動操作・活動記録を行う。意志力が重要であるにも関わらず研究が進んでいない理由は、その客観的計測の難しさにあると考えられる。申請者は、ファイバーフォトメトリーや埋め込み型in vivo顕微鏡を用いた特定神経の活動記録を行い、自由行動下における意志力の発生過程を解析することによって、この解決を目指す。
内因性抗細菌ペプチドPR-39の生物学的意義

1.内因性抗菌ペプチドPR-39のN末端から15のアミノ酸のオリゴペプチドを用いて,ウサギを免疫し,PR-39に対するポリクローナル抗体を作成した.2.この抗体を用いてヒト白血球の蛋白を免疫沈降するとPR-39の大きさに相当する約5kDaのところにバンドが見られた.しかし,ブタPR-39のヒトでの類似蛋白および遺伝子はまだ発見できていない.3.PR-39はproline richな部位にras signalingに重要であるSos蛋白が持つGrb2のSrc homology 3(SH3)domainへの結合motifを5回繰り返し有しており,SH3 domainに結合するという可能性が示唆された.そこでScr遺伝子のSH3 domainの蛋白をrecombinantで作成し,PR-39のオリゴペプチドを加え,PR-39に対する抗体で免疫沈降するとSH3 domainの蛋白が共沈し,逆にSH3 domainに対する抗体で免疫沈降するとPR-39が共沈してきた.以上のことより,PR-39はSH3 domainに結合すると考えられる.4.PR-39遺伝子を肝癌細胞株に導入するとSyndecan-1の発現誘導とともに,細胞形態や浸潤能・細胞運動能に変化が起きた.この変化は,Dr Galloにより発表された,PR-39のSH3 domainへの結合能が関与していると考えられる.5.PR-39遺伝子導入肝癌細胞はPR-39蛋白を培養液中に分泌した.6.PR-39遺伝子をNIH3T3細胞のras transformantに導入するとやはり細胞形態の変化が認められ,また増殖能が著しく低下した.1.内因性抗菌ペプチドPR-39のN末端から15のアミノ酸のオリゴペプチドを用いて,ウサギを免疫し,PR-39に対するポリクローナル抗体を作成した.2.この抗体を用いてヒト白血球の蛋白を免疫沈降するとPR-39の大きさに相当する約5kDaのところにバンドが見られた.しかし,ブタPR-39のヒトでの類似蛋白および遺伝子はまだ発見できていない.3.PR-39はproline richな部位にras signalingに重要であるSos蛋白が持つGrb2のSrc homology 3(SH3)domainへの結合motifを5回繰り返し有しており,SH3 domainに結合するという可能性が示唆された.そこでScr遺伝子のSH3 domainの蛋白をrecombinantで作成し,PR-39のオリゴペプチドを加え,PR-39に対する抗体で免疫沈降するとSH3 domainの蛋白が共沈し,逆にSH3 domainに対する抗体で免疫沈降するとPR-39が共沈してきた.以上のことより,PR-39はSH3 domainに結合すると考えられる.4.PR-39遺伝子を肝癌細胞株に導入するとSyndecan-1の発現誘導とともに,細胞形態や浸潤能・細胞運動能に変化が起きた.この変化は,Dr Galloにより発表された,PR-39のSH3 domainへの結合能が関与していると考えられる.5.PR-39遺伝子導入肝癌細胞はPR-39蛋白を培養液中に分泌した.6.PR-39遺伝子をNIH3T3細胞のras transformantに導入するとやはり細胞形態の変化が認められ,また増殖能が著しく低下した.1.内因性抗菌ペプチドPR-39のN末端から15のアミノ酸のオリゴペプチドを用いて、ウサギを免役し、PR-39に対するポリクローナル抗体を作成した.2.この抗体を用いてヒト白血球の蛋白を免疫沈降するとPR-39の大きさに相当する約5kDaのところにバンドが見られた.3.PR-39がproline richであり,Src homology 3(SH3)domainに結合するという予想はあった.そこでScr遺伝子のSH3 domainの蛋白をrecombinantで作成し,PR-39のオリゴペプチドを加え、PR-39に対する抗体で免疫沈降するとSH3 domainの蛋白が共沈し、逆にSH 3domainに対する抗体で免疫沈降するとPR-39が共沈してきた.以上のことより,PR-39はSH3 domainに結合すると考えられる.4.PR-39遺伝子を肝癌細胞株に導入するとSyndecan-1の発現誘導とともに,細胞形態や浸潤能に変化が起きた.この変化は,Dr Galloにより発表された,PR-39のSH3 domainへの結合能が関与していると考えられる.5.PR-39遺伝子導入肝癌細胞はPR-39蛋白を培養液中に分泌した.1.内因性抗菌ペプチドPR-39のN末端から15のアミノ酸のオリゴペプチドを用いて,ウサギを免疫し,PR-39に対するポリクローナル抗体を作成した.2.この抗体を用いてヒト白血球の蛋白を免疫沈降するとPR-39の大きさに相当する約5KDaのところにバンドが見られた.しかし,ブタPR-39のヒトでの類似蛋白および遺伝子はまだ発見できていない.3.PR-39はproline richな部位にras signalingに重要であるSos蛋白か持つGrb2のSrc homology 3(SH3)domainへの結合motifを5回繰り返し有しており,SH3 domainに結合するという可能性が示唆された.そこでSrc遺伝子のSH3 domainの蛋白をrecombinantで作成し,PR-39のオリゴペプチドを加え.PR-39に対する抗体で免疫沈降するとSH3 domainの蛋白が共沈し.逆にSH3 domainに対する抗体で免疫沈降するとPR-39が共沈してきた.以上のことより,PR-39はSH3 domainに結合すると考えられる.4.PR-39遺伝子を肝癌細胞株に導入するとSyndecan-1の発現誘導とともに,細胞形態や浸潤能・細胞運動能に変化が起きた.

この変化は,Dr Galloにより発表された,PR-39のSH3 domainへの結合能が関与していると考えられる.5.PR-39遺伝子導入肝癌細胞はPR-39蛋白を培養液中に分泌した.6.PR-39遺伝子をNIH3T3細胞のras transformantに導入するとやはり細胞形態の変化が認められ,また増殖能が著しく低下した.
アルカデイン細胞質ドメインのリン酸化による軸索輸送制御機構の解析

神経細胞は細胞体、樹状突起、軸索からなる、高度に極性化された細胞である。長い軸索中では主にキネシンモーターが細胞体から軸索末端までの分子輸送を担う。軸索中の輸送は神経が正常に機能するために重要であるが、輸送分子の選択機構や輸送制御機構については不明な点が多く残されている。本研究ではキネシン1と直接結合する膜タンパク質である、アルカデインに着目した。この結合はキネシン1を活性化させ、アルカデインを含む輸送小胞は軸索中を輸送される。これまでの解析により、アルカデインの3ヶ所のリン酸化修飾がキネシン1への結合に必要であることを明らかにしており、アルカデインのリン酸化による新規軸索輸送制御機構が示唆されてきた。これを検討するため、アルカデイン非リン酸化模倣変異体を用いて軸索輸送の観察を行った。キネシン1に対する結合減弱により、軸索中の輸送方向には変化は認められなかった一方で、順行性輸送の高速化が観察された。輸送高速化の原因として、細胞体における小胞形成に着目した。アルカデインはAPP(アミロイド前駆体タンパク質)とゴルジ体で三量体を形成すると考えられるが、APPとアルカデインはそれぞれ特異的な輸送小胞を形成し、APPはアルカデインよりも高速に軸索中を輸送される。アルカデイン部分変異体について軸索中の局在を観察することで、キネシン1と強固に結合できないアルカデインは軸索APP小胞へ入り込むことで高速に輸送されていることを明らかにした。さらに、ゴルジ体からの輸送効率を測定することでキネシン1の結合がゴルジ体におけるアルカデイン特異小胞の出芽に必要である可能性を示した。このことから、アルカデイン小胞の形成はキネシン1の直接結合を必要としていること、またアルカデインの軸索輸送はリン酸化によるキネシン1のリクルートによって促進されるという新規の軸索輸送機構および制御機構についての知見を得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。キネシン1は神経軸索において多くの積み荷(カーゴ)を輸送することが知られている。しかし、カーゴがどのように選択されるか、輸送の開始や停止がどのように制御されているか不明な点が多い。本研究ではキネシン1と直接結合するアルカデインのリン酸化が強固な結合に必要であることを見いだし、更に詳細な解析を行った。アルカデイン細胞質ドメインのアラニン変異体を作製しリン酸化部位の探索を行うことで、2つのキネシン1結合モチーフの間に位置する、3ヶ所のリン酸化部位を同定した。また、この3ヶ所のリン酸化部位に特異的な抗リン酸化アルカデイン抗体を作成し、実際にマウス脳内でリン酸化が起きていることを確認した。次に、3つのリン酸化部位をアラニンに置換したアルカデインを初代培養神経細胞に発現させ、神経軸索輸送を観察した。キネシン1とカーゴの結合減弱により、順行性輸送が減少することが報告されているが、アラニン変異体の順行性輸送の割合は変化していなかった。一方で、アラニン変異体の順行性輸送は野生体よりも高速で行われていることを見出した。この速度は既知のキネシン1の速度よりも高速であるが、このような高速な輸送を受ける分子としてアミロイド前駆体タンパク質(APP)が報告されている。APPはアダプター分子X11Lを介してアルカデインと結合するが、アルカデインとは別の輸送小胞を形成し、別々に軸索上を輸送されると考えられている。現在、キネシン1と結合できないアラニン変異体はAPP小胞により輸送されている可能性を検討している。本研究により、アルカデインのリン酸化がキネシン1への結合および、適切なカーゴ小胞による輸送に必要であることが示唆された。初年度の研究計画の通り、キネシン1に対する結合を制御するリン酸化部位を決定することができた。また、リン酸化部位特異抗体の作成と評価を行い生体内におけるリン酸化を示すことができた。決定したアルカデインのリン酸化部位に変異を導入し、神経細胞内での輸送を観察・解析した。その結果、野生型と比較して変異体の輸送速度に変化が認められ、アルカデインのリン酸化が適切なカーゴ小胞の形成を制御するという、新たな知見に繋がる結果を得ることができた。得られた成果の一部を2016年の第56回米国細胞生物学会議(Cell biology 2016 ASCB Annual Meeting)で発表し、計画した内容を十分に遂行できている。

キネシン1に対する結合減弱により、軸索中の輸送方向には変化は認められなかった一方で、順行性輸送の高速化が観察された。輸送高速化の原因として、細胞体における小胞形成に着目した。アルカデインはAPP(アミロイド前駆体タンパク質)とゴルジ体で三量体を形成すると考えられるが、APPとアルカデインはそれぞれ特異的な輸送小胞を形成し、APPはアルカデインよりも高速に軸索中を輸送される。アルカデイン部分変異体について軸索中の局在を観察することで、キネシン1と強固に結合できないアルカデインは軸索APP小胞へ入り込むことで高速に輸送されていることを明らかにした。さらに、ゴルジ体からの輸送効率を測定することでキネシン1の結合がゴルジ体におけるアルカデイン特異小胞の出芽に必要である可能性を示した。このことから、アルカデイン小胞の形成はキネシン1の直接結合を必要としていること、またアルカデインの軸索輸送はリン酸化によるキネシン1のリクルートによって促進されるという新規の軸索輸送機構および制御機構についての知見を得た。アルカデインのリン酸化が適切なカーゴ小胞の形成に必要である可能性が示唆された。今後はアルカデイン非リン酸化模倣体がAPP小胞に局在しているか免疫染色法により検討する。また、非リン酸化体がキネシン1と結合できないことでカーゴ小胞を形成できない可能性を検討するため、アラニン変異体及びキネシン1結合部位を欠損したアルカデインについて、ゴルジ体からの輸送効率を測定することでアルカデインのリン酸化が適切な輸送を制御する機構を明らかにする。本研究により、キネシン1と結合するカーゴ分子の輸送制御機構について新たな知見を得ることができると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
追加学習可能なパターン認識システムの提案と顔画像認識への応用

追加学習可能なパターン認識システムの開発に必要不可欠な学習アルゴリズムを考案した.成果の概要を以下にまとめる.(2)従来のIPCAは,1つデータが与えられるたびに固有値問題を解く必要があった.これに対し,複数のデータをまとめて1回の更新で新しい固有基底を求める学習アルゴリズム(Chunk IPCA)を提案した.(3)改良IPCAアルゴリズムおよびCIPCAアルゴリズムを顔画像認識に適用し,追加学習が進むにつれて,認識精度が高まることとFalse Positive Rateが小さくなることを確認した.また,CIPCAを導入することによって,学習時間が大幅に短縮されることを確認した.(4)特徴空間の更新に伴い,識別機(ニューラルネット)の更新も同時に行う必要があり,結合荷重の更新だけでなく,入力変数の個数の変動にも追従できなければいけない.この問題に対し,長期記憶を導入したニューラルネットの記憶アイテムを特徴空間に合わせて更新し,それらを訓練データと一緒に学習するアルゴリズムを開発した.(5)従来の独立成分分析(Independent Component Analysis ; ICA)を教師あり学習に拡張する方式を提案し,独立性とクラス分離性を同時に高める学習アルゴリズムを導出した.また,いくつかのベンチマークデータで性能評価を行い,従来のICAやPCAで求めた特徴量に比べて,性能がよいデータもあることを確認した.追加学習可能なパターン認識システムの開発に必要不可欠な学習アルゴリズムを考案した.成果の概要を以下にまとめる.(2)従来のIPCAは,1つデータが与えられるたびに固有値問題を解く必要があった.これに対し,複数のデータをまとめて1回の更新で新しい固有基底を求める学習アルゴリズム(Chunk IPCA)を提案した.(3)改良IPCAアルゴリズムおよびCIPCAアルゴリズムを顔画像認識に適用し,追加学習が進むにつれて,認識精度が高まることとFalse Positive Rateが小さくなることを確認した.また,CIPCAを導入することによって,学習時間が大幅に短縮されることを確認した.(4)特徴空間の更新に伴い,識別機(ニューラルネット)の更新も同時に行う必要があり,結合荷重の更新だけでなく,入力変数の個数の変動にも追従できなければいけない.この問題に対し,長期記憶を導入したニューラルネットの記憶アイテムを特徴空間に合わせて更新し,それらを訓練データと一緒に学習するアルゴリズムを開発した.(5)従来の独立成分分析(Independent Component Analysis ; ICA)を教師あり学習に拡張する方式を提案し,独立性とクラス分離性を同時に高める学習アルゴリズムを導出した.また,いくつかのベンチマークデータで性能評価を行い,従来のICAやPCAで求めた特徴量に比べて,性能がよいデータもあることを確認した.
紀元前一千年紀後半代の東北北部における磨製石斧の流通構造の基礎的研究

北海道道央地方を原産地とする緑色片岩を石材として用いた磨製石斧が、弥生時代前期中期の東北地方北部にまで流通していることが明らかになった。弥生時代中期の津軽平野で特にその比率が高く、90%以上を占めている。蛍光X線分析の結果、石材の原産地は夕張川流域と推定された。また当該期には北海道道央地方で確認される太型蛤刃状の石斧も、東北北部でも確認され、石斧流通面での両地域の密接な関係が明らかになった。まずは、西日本や北海道の当該期の磨製石斧の特徴を把握するための、観察・比重計測や蛍光X線分析装置による元素分析を行った。観察と比重の計測については、北海道では北海道埋蔵文化財センター所蔵の江別市対雁2遺跡、千歳市ママチ遺跡・美々2遺跡出土磨製石斧、北海道大学埋蔵文化財調査室所蔵の札幌市K39遺跡出土磨製石斧、札幌市埋蔵文化財センター所蔵の札幌市N30遺跡・H37遺跡出土磨製石斧、石狩市砂丘の風資料館所蔵の石狩市志美遺跡群出土磨製石斧、苫小牧市博物館所蔵のタプコプ遺跡・ニナルカ遺跡・静川22遺跡出土磨製石斧について実施した。これにより所謂道央地域の観察・比重調査は8割程度終了した。また磨製石斧の製作遺跡である平取町荷負2遺跡・パンケヌツチミフ遺跡・町有牧野遺跡出土の緑色片岩製磨製石斧、登別市川上B遺跡出土の緑色片岩製磨製石斧、深川市納内3遺跡出土の青色片岩製磨製石斧については蛍光X線分析装置による元素分析を行った。西日本については磨製石斧の製作遺跡を中心に観察と比重の計測を実施した。福岡市埋蔵文化財センター所蔵の福岡市今山遺跡出土磨製石斧、松江市教育委員会所蔵の松江市佐太前遺跡出土磨製石斧、三重県埋蔵文化財センター所蔵の宮山遺跡出土磨製石斧であり、合わせて周辺遺跡出土の磨製石斧についても観察と比重の計測を実施した。また福岡県小郡市津古内畑遺跡出土の抉入柱状片刃石斧(小郡市埋蔵文化財センター所蔵)が八戸市荒谷遺跡出土の抉入柱状片刃石斧と極めて類似した特徴を持つことが判明したため、この石斧と周辺遺跡の石斧についても同様の調査を実施した。東北北部については秋田市教育委員会、五所川原市教育委員会、平川市教育委員会、青森県郷土館、むつ市教育委員会、中泊町教育委員会、外ヶ浜町教育委員会が所蔵している当該期の磨製石斧について観察と比重の計測を実施した。当該期の磨製石斧の特徴を把握し流通構造を検討するための基礎調査として、資料観察・比重計測・蛍光X線分析装置による元素分析を実施した。磨製石斧の製作遺跡である仙台市高田B遺跡、長野市榎田遺跡、北九州市高槻遺跡出土の弥生系磨製石斧についての観察と比重計測を実施し、東北北部から出土する西方の遠隔地からの搬入弥生系磨製石斧の検討にかかわる基礎資料の充実に努めた。北海道との関係については、知内町湯の里6遺跡、江差町茂尻遺跡、苫小牧市柏原5遺跡、千歳市ママチ遺跡・キウス4遺跡・美沢遺跡群、恵庭市西島松5遺跡、江別市七丁目6遺跡、由仁町川端遺跡、芦別市滝里遺跡群、釧路市幣舞遺跡、鶴居村下幌呂15遺跡、標津町伊茶仁遺跡群・古道第六遺跡・ふ化場第1竪穴群遺跡、斜里町ピラガ丘遺跡・ポンシュマトカリペツ1遺跡・9遺跡・ウナベツ24遺跡・峰浜8線遺跡、北見市常呂川河口遺跡・常呂遺跡・岐阜第三遺跡出土磨製石斧の観察と比重計測を実施し、北海道原産の緑色片岩・青色片岩製磨製石斧の東北北部への流通にかかわる基礎資料の充実に努めた。また平成25年度の資料調査により、東北北部の当該期には北海道から敲製磨製石斧が搬入されていることも確認されたため、合わせて敲製磨製石斧の流通を検討するための基礎資料の充実にも努めた。元素分析については、平成25年度から継続して北海道の緑色片岩・青色片岩製磨製石斧の製作遺跡出土品について実施し、これらがすべて終了したので借用した資料を返却した。また、これにより原産地である北海道の基礎資料が整ったため、同石材と推定される磨製石斧が出土している東北北部の八戸市是川中居遺跡・田向冷水遺跡、一戸町上野遺跡、男鹿市横長根A遺跡、秋田市地蔵田遺跡出土磨製石斧についての分析を実施した。今年度も継続して紀元前一千年紀後半代の東北北部・北海道・西日本の磨製石斧の分析を実施し、三地域間の流通構造の把握に努めた。北海道・東北北部出土の緑色片岩製磨製石斧の、蛍光X線による元素分析の計測作業は前年度までに終了していたので、今年度はそのデータ分析を実施し、当該期の東北北部の資料は北海道の夕張川流域の石材が使用された蓋然性が極めて高いことを明らかにした。従来行われていた剥片資料の偏光顕微鏡観察では、額平川流域の石材と考えられていたが、より厳密な産地同定法である元素分析で異なる結果を得ることができたのは大きな成果であった。西日本の資料に関する観察と比重計測は山陰と北陸において実施した。山陰では出雲市矢野遺跡、鳥取市本高弓ノ木遺跡資料ほかについて実施し、基礎データを得た。

北陸では福井市甑谷遺跡、小松市八日市地方遺跡、羽咋市吉崎次場遺跡資料ほかについて実施した。北海道については羅臼町タッカリウス北岸1遺跡、札幌市H37遺跡・K39遺跡資料ほかについて実施し、基礎データを得た。これにより、北海道の緑色片岩・青色片岩製磨製石斧や三面石斧に関する主な資料の比重データを得ることができた。今年度のもう一つの大きな成果は、北陸の八日市地方遺跡で九州北部系の層灰岩製片刃石斧と北海道系の三面石斧を確認できたことである。層灰岩製片刃石斧は肉眼観察と、これまで実施してきた九州北部から山陰での比重調査の結果から判断して、九州北部からの搬入品と判断される。北海道系の三面石斧も肉眼観察とこれまでの比重調査の成果から、北海道もしくは東北北部からの搬入品と判断される。九州北部系と北海道系の磨製石斧を同一の遺跡で確認できたのは、これが唯一の事例であり、はじめて当該期における両地域間の流通構造上の接点を把握できた。東北北部の当該期に、西日本から灌漑水田が波及する背景を考える上でも重要な成果である。北海道道央地方を原産地とする緑色片岩を石材として用いた磨製石斧が、弥生時代前期中期の東北地方北部にまで流通していることが明らかになった。弥生時代中期の津軽平野で特にその比率が高く、90%以上を占めている。蛍光X線分析の結果、石材の原産地は夕張川流域と推定された。また当該期には北海道道央地方で確認される太型蛤刃状の石斧も、東北北部でも確認され、石斧流通面での両地域の密接な関係が明らかになった。北海道出土の磨製石斧の観察・比重計測・元素分析は進んでいるが、平成25年度の調査により北海道の敲製磨製石斧が東北北部にまで流通していることが判明したため、これにかかわる調査を今年度も追加して実施したものの、完結したわけではない。また西日本などについても観察・計測は進んでいるが、山陰から北陸の調査を平成26年度は実施することができなかったため、やや遅れていると評価した。日本考古学平成25年度の調査により北海道で製作された敲製磨製石斧が東北北部にまで流通していることが明らかになった。北海道の様相を把握するために、平成27年度は当初の予定に追加して道東地域の一部と道北地域・島嶼部の当該期の磨製石斧についても資料調査を実施する予定である。また山陰から北陸の当該期の磨製石斧についても、製作遺跡の資料調査を実施する予定である。したがって、調査対象地が当初の計画よりも拡大するため、旅費の不足が予想される。当初の計画では平成27年度に研究成果を報告書として印刷・刊行する予定であったが、すでに現在までに研究成果は2本の研究論文として投稿しており(平成27年4月時点では未刊行)、27年度の成果についても年度末までに投稿の予定である。報告書で記載予定の内容をこうした論文で公表することを代替として、報告書の印刷費用を旅費に流用して、研究の完結を図る予定である。当初の計画通り平成25年度は北海道の資料の基礎的な研究を実施することができた。特に各所蔵機関の協力により緑色片岩・青色片岩製磨製石斧の製作遺跡出土品の蛍光X線分析装置による元素分析を行うことができた。また西日本についても当該期の磨製石斧の製作遺跡出土品の観察・比重計測を実施できたので、おおむね順調に進展していると考えている。平成25年度の北海道道央地域の調査により、北海道と東北北部との磨製石斧の流通関係は、当初予想していた緑色片岩・青色片岩製磨製石斧に限らず、太型蛤刃石斧についても両地域は密接な関係を有することが判明した。太型蛤刃石斧については道北・道東地域との関係が深いため、当初の予定を変更して、これらの地域の資料調査も実施することにする。
国際バカロレアの構造と教育効果に関する研究

本研究は、「国際バカロレア」のカリキュラムがどのような構造から成り立っているのか、また、学習者はどのような教育効果を得ているのか、カリキュラム分析と学習者及び教員へのインタビュー調査を実施した。その結果、国際バカロレアは、獲得すべきスキルとその達成基準のカリキュラム構造をもち、その構造は、学習の途中過程である学習内容や方法の柔軟性を促進させていた。また、学習者が身につけるべきスキルや能力とその達成すべき基準を対象者に明確にすることにより学習者はこれまで涵養が難しいとされていたスキルや能力をレベルを含め認識し、能力が身についている理解していることが明らかとなった。本研究は、国際的に通用する大学資格として「グローバル・スタンダード」と称される国際バカロレア(以下、IBとする。)教育プログラムの高等教育接続に関わる教育効果と、それを支える教育システムを明らかにすることを目的にしている。研究初年度であった本年度は、分析枠組みとして設定したインプット(IB機構の構造とその取組みに関する実態調査)、プロセス(教員養成)、アウトプット(IB受講生の学習成果)のうち、インプットにあたるIB機構の体制に着目した調査を実施した。具体的には、IB機構のステークホルダーであるIB認定校・候補校、政府、教員へ対してどのようなサポート体制を構築しているのか、また、どのように連携し合い組織運営をおこなっているのかの実態調査である。この課題を解決するため、世界3か所設置されているグローバル・オフィスのうちアジア太平洋地域にあるIBAP(シンガポール)へ、研究協力者とともに訪問調査をおこなった。IBAPに所属する各担当スタッフへのヒアリングの結果、1IB認定校までの流れ、2教員研修のサポート体制、3各国へのIB教育プログラムの導入事例、について運営体制、評価基準、広報活動の観点から情報収集をおこなった。国際的な教育プログラムであるIBのシンガポールにおける導入事例にも着目し、IB認定校(2校)、日本人学校に訪問し、シンガポールに在籍している日本人の教育選択の視点から教員、生徒、保護者へのヒアリング調査を実施し、より包括的な調査をおこなった。以上の調査で得た情報については、研究分担者との定期的な研究会によって分析、まとめている。さらに研究成果については、次年度である2015年度の日本教育学会において発表し、報告書にまとめる予定となっている。)教育プログラムの高等教育接続に関わる教育効果と、それを支える教育システムを明らかにすることを目的としている。研究2年目であった本年度は、分析枠組みとして設定したインプット(IB機構の構造とその取組みに関する実態調査)の研究成果発表と、プロセス(教育内容及び教員養成)、アウトプット(IB受講生の学習成果)のうち、プロセスとアウトプットに該当する教育内容及び教員養成、受講生の学習成果に関する調査を実施した。昨年度の成果報告として、3回の学会発表及びシンポジウム報告を行った。実施調査の具体例としては、IBはどのような教育内容を提供し、それを扱う教員はどのようなトレーニングを受けているのか、更に、IBを受講した生徒への学習成果はどのように理解すべきか、を明らかにするための実態調査である。この課題を解決するため、昨年度の調査結果の分析を踏まえ、IB教員及びIBディプロマ資格取得者へのインタビュー調査(教員15名、資格取得者22名)を実施した。加えて、IB研究の中心地であるバース大学(英)とIBプログラム開発当初から導入しているUWCアトランティック・カレッジへ調査訪問を行った。以上の調査で得た情報については、研究分担者との定期的な研究会によって、分析を行っている。その成果は、研究最終年度である2016年度の日本教育学会及び日本教育社会学会で発表し、論文にまとめる予定とする。当初の研究計画では、イギリス調査ではIB Assessment Centre(カリキュラム・評価部門)への調査訪問する予定であった。しかし、2015年度に行われた岡山大学AP採択事業シンポジウム「国際バカロレアの「学びの評価」と高校・大学教育改革への活用」において、IBカリキュラム・評価部門からCarolyn Adams氏(Chief Assessment Officer, IBO)が来日・登壇し、報告が行われた。更にと同じく登壇した申請者は、直接連絡・質問する機会を得た。そのため、イギリス調査では、IB組織ではなく、実施現場であるIB認定校とIB研究を行っているバース大学への訪問調査への変更を行った。よって、訪問箇所の変更を行ったが、当初から計画書に記した必要な情報については入手できている。よって、本研究はおおむね順調に進展していると評価できる。研究計画の3年目であった本年度は、昨年度に引き続き、分析枠組みとして設定したインプット(IB機構の構造とその取組み関する実態調査)の研究成果発表と、プロセス(教育内容)、アウトプット(IB受講生の学習成果)に関する実態調査及び実態調査結果の分析を行った。本年度の成果報告としては、2件の学会発表と2本の論文執筆を行った。具体的に行った調査及び分析は、以下の2点である。第一に、教員養成に関する調査である。シンガポールのIB機構を訪問し、教員養成の運営に関するヒアリング調査を行うとともに、実際にIBの教員研修を受講した教員へもヒアリングを実施し、国際的な教育プログラムを運営するための教員養成の仕組みについて組織とそこで働く人の両面から調査を行った。

その結果、IBの教員養成では、eラーニング上での研修システムの確立とそれをマネジメントする経験豊富なファシリテーターの存在が各国に散らばるIBの運営の駆動力として機能している子を明らかにした。全国で実施される研修システムは、単に教員の能力開発に資するだけでなく、教員の専門的能力への評価機関の存在によりより活発に運営している。さらに教員への専門職団体のネットワクーク形成にも寄与していることを指摘した。第二に、IB修了生へのヒアリング調査である。受講生当時の学びに加え、その後の人生にIBの教育プログラムがどのように関わっているのかについて、大学進学及びその後のキャリアも含めて調査し検討した。現在、分析の途中であり、その結果は、日本教育学会や日本国際バカロレア学会での学会発表、論文執筆を通して広く公表する予定である。当初の研究計画では、IB修了生を対象としたアンケート調査を実施する予定であったが、教員養成の調査とも重なり修了生の人数を確保することが難しい状況となった。そこで、教員養成に関する調査を拡大し、IB機構へのヒアリングや研修会への参加、教員へのインタビューデータの確保に着手した。その結果、予定していたより多くのデータを入手することができた。一方、量的分析から質的分析へと変更する必要が出てきたため、多くの時間を割く必要となった。結果として当初の計画よりも分析に時間を要している状況にある。本研究の本研究の目的は、国際的に通用する大学入学資格として「グローバル・スタンダード」と称される国際バカロレア教育プログラムの高等教育接続に関わる教育効果と、その効果を支える教育システムを明らかにすることである。研究最終年度の平成29年度は、研究初年度に実施した国際バカロレアグローバル・オフィスへの実態調査と、平成27から28年度実施した日本、イギリス、シンガポールで実施した国際バカロレア認定校の訪問調査、そして、昨年度実施した本研究の中心的課題である国際バカロレア教育プログラムの教育効果についての調査結果の分析作業及び、統合作業を行うことであった。教育効果に関する調査方法は、国際バカロレアディプロマ取得者を対象にヒアリング調査とし、調査の主な目的は以下の3点であった。(i)IBディプロマ取得者は、中等教育段階でどのような能力を身につけているのか、(ii)身につけた能力は高等教育(大学)で活かされているか、(iii)我が国の教育課程を受けた学生と何が異なるのかである。調査の結果、IBグローバルオフィス1機構、IB認定校7校、IBディプロマ取得者30名、IB教員25名から回答が得られた。これらの分析結果を統合し、分析枠組みをもとに検討・統合作業を実施した。さらに研究の最終成果として、日本比較教育学会大会、日本国際バカロレア教育学会にて学会発表を行い、また、「日本国際バカロレア教育研究」への研究論文を執筆した。
細菌感染,細菌内毒素によるマクロファージ活性化における分子機序の解析

若干の計画の変更はあったものの多くの成果が得られた。LSP応答の細胞内シグナル伝達経路を明らかにすることを目的に、CD14分子依存性、および非依存性でLSPのシグナル伝達にどの様な違いが見られるかを検討した。CD14陽性細胞(J774.1)は、LPS刺激によりTNF産生、NO産生ともに誘導された。一方、CD14陰性細胞(J7.DEF3)では、Re LPS刺激によるTNF産生は見られるものの、NO産生は著しく低値を示した。この結果よりLPS刺激によるTNF産生とNO産生は、異なるシグナル伝達経路を介すること、即ち、TNF産生は、CD14依存性、非依存性の両経路で誘導され、NO産生は、主としてCD14依存性の経路によって誘導されることが示唆される。J774.1細胞のNO産生が抗CD14抗体で抑制された結果からも裏付けられる。また、LPS刺激によるJ774.1細胞のNO産生は抗IFN-β抗体により抑制さた。しかし、J7.DEF3細胞をINF-β存在下にLPS刺激してもNO産生は認められず、IFN-β産生能の欠如によりNO産生が抑制されるのではない。CD14依存性、非依存性両経路でこの様な活性の解離が明らかになったことから、細胞内での分子動態の差異について解析を進めている。細胞内寄生菌Mycobacteriumintracellulare感染によるマクロファージ細胞内リン酸化タンパク質の解析を行った。本菌は遅延発育型の菌であるためか^<32>P標識マクロファージでのリン酸化タンパク質検出法で可能な測定時間内では顕著なリン酸化タンパク質のパターン変化は見られなかった。今後、測定条件の改善が必要である。
ポリグルタミン鎖ダイマー形成が及ぼす神経変性機序の解明

ポリグルミン病において、近年、封入体形成は細胞死に対し抑制的に働くと唱えられ、細胞傷害性のある構造の同定が望まれている。本研究ではFRET (fluorescence resonance energy transfer)技術を応用して封入体形成に先行するポリグルタミン鎖オリゴマーを可視化し、ポリグルタミン鎖が、長さ依存性に方向性をもってオリゴマー形成することを明らかとした。ポリグルタミン鎖を安定発現するSH-SY5Y細胞株を神経分化誘導後にFRET陽性細胞群、FRET陰性細胞群、封入体形成群間の細胞生存期間解析をおこない、FRET陽性細胞群において強い神経細胞死を認めた。これにより、ポリグルタミン鎖は、自己重合したオリゴマー状態で強い細胞毒性を獲得することを証明した。【今年度の研究目的】研究基盤となる疾患モデル細胞株を製作し,ポリグルタミン鎖の細胞内微小重合形成(オリゴマー形成)による細胞障害性を検証する。【方法】ポリグルタミン鎖(部分DRPLA蛋白およびハンチンチンexonl)にmCFP (donor),mYFP (acceptor)を付加したプラスミドを作成し培養細胞(COS7)に一過性導入し共焦点レーザー顕微鏡(CSU10)を用いFRET解析を行った。さらにポリグルタミン鎖を安定発現するSH-SY5Y細胞株を確立し、レチノイン酸、BDNF添加により神経細胞に分化誘導後、FRET陽性細胞群、FRET陰性細胞群、封入体形成群の3群において細胞生存期間を観察した。【研究成果】(1)ポリグルタミン鎖は、一定の方向性をもって蛋白間相互作用を示し、グルタミン伸長数依存性にFRET陽性細胞の出現頻度が増加した。(2)FRET陽性細胞の経時的観察では、一旦、封入体が形成されると、封入体のFRET値が急速に増大するとともに、細胞質のFRET値は急速に低下した。(3)ポリグルタミン鎖安定発現SH-SY5Y細胞での生存期間解析;FRET陽性細胞、FRET陰性細胞、封入体形成細胞の3群で平均生存日数は3.0日,4.0日、6.0日であった。すなわち、ポリグルタミンオリゴマーが形成されているFRET陽性細胞群では生存期間が有意に短縮し、すでに封入体を形成した細胞群では生存期間が延長していた(p<0.0001)。免疫染色による活性型Caspase-3の陽性率も、FRET陽性細胞群では封入体形成群に比べ有意に増加していた。【考察・結論】ポリグルタミンオリゴマーを含有する細胞(FRET陽性細胞)は、細胞死のリスクが高いことを示した。また封入体形成はオリゴマー構造物を取り込み、細胞障害性に対し防御的に働くことが示唆された。オリゴマー形成はグルタミン伸長数依存性に増加する性質を有し、ポリグルタミン病の病態機序の基盤となる重要な細胞障害因子と考えられた。【今年度の研究目的】ポリグルタミン鎖のオリゴマーがもたらす細胞障害機序を検討、および、オリゴマー形成を抑制する薬剤の選定を主な目標とした。【方法】(1)細胞内Ca^<2+>濃度変調に及ぼす影響;ポリグルタミン鎖発現細胞(COS7)をFRETmicroscopyによりオリゴマー形成細胞と非形成細胞を判別し、細胞膜透過型蛍光指示試薬: fluo-4 AM(Molecular Probes)を細胞外添加(終濃度5μM)し、30分間37°C下でincubationした。添加前後の蛍光強度比△F/F(excitation 488nm, emission 515555nm)を測定し、オリゴマー形成細胞、オリゴマー非形成細胞、ポリグルタミン鎖非発現細胞とで細胞内Ca^<2+>levelを比較検討した。(2)ポリグルタミン鎖オリゴマー形成を抑制する化合物の評価・選定: FRETmicroscopyにより生細胞下でオリゴマー形成を可視化しつつ、既報化合物や新規候補化合物を細胞外添加し、オリゴマー形成の阻害効果を評価した。【研究成果】(1)ポリグルタミン鎖(Q80)のオリゴマー形成細胞群、非形成細胞群、ポリグルタミン鎖非発現細胞群間において、細胞内Ca^<2+>濃度には有意な変化を認めなかった。(2)アミロイドβ形成阻害効果が報告されている化合物D-KLVFFAやibuprofenはポリグルタミン鎖のオリゴマー形成には影響を及ぼさず、PGL-135では若干のFRET抑制効果を認めた(FRET陽性率: PGL-13523%,対照30%)。これらに対し、FRET systemを用いた新規選定により、新たなオリゴマー形成を有効に阻害する化合物を同定し得た(未発表)。

この化合物は濃度依存性にFRET陽性細胞率の減少(10mM ; 25%, 20mM ; 15%,50mM ; 12%,対照30%)が確認され、オリゴマー形成に対する強い抑制効果が確認された。【考察・結論】新たなオリゴマー形成を抑制する化合物を選定しえた。今後は、この化合物の効果について、細胞死抑制、動物モデル(DRPLA transgenic mice)への投与による表現型や生存期間、中枢神経病理所見の改善などの検討に発展させていく予定である。
乳酸脱水素酵素を標的とする難治性てんかん制御剤の開発

既存薬が有効でない「難治性てんかん」の制御機構を明らかにし、創薬開発へと繋げるため、本研究では以下3項目を実施した。まず第一に、難治性てんかんに有効な「ケトン食療法」に着目し、抗てんかん作用を示す乳酸脱水素酵素阻害剤を同定した。第二に、アセト酢酸(ケトン食の代謝産物)が電位依存性カルシウムチャネルを阻害することを見出し、抗てんかん作用を有するアセト酢酸類似体も同定した。最後に、難治性てんかんモデルマウスの発作制御に、アセチルコリンが関与していることを見出した。てんかん患者の約3割は、既存の治療薬でコントロールできないことが知られている。この難治性てんかんの制御機構を明らかにし、治療薬開発に繋げることは重要である。そこで本研究において我々は、難治性てんかん制御剤の開発に向けて、以下3項目を行った。1、我々はこれまで、治療薬耐性の難治性てんかんに有効な食事療法として知られる「ケトン食療法」の作用機構解明に取り組み、その抗てんかん作用に関わる生体内分子として乳酸脱水素酵素を同定し、さらにそれに作用する化合物として抗てんかん薬スチリペントールを同定した(Sada et al, Science, 2015)。そこで本年度は、スチリペントールを出発点とする新規抗てんかん薬開発に向け、新たな乳酸脱水素酵素阻害剤の探索を行った。プレートリーダーを用いたスクリーニングシステムを構築し、スチリペントール類似体を評価した結果、より強力な乳酸脱水素酵素阻害剤を複数同定した。2、ケトン食療法時に体内で増加し、抗てんかん作用を示す生体内物質としてケトン体(アセト酢酸)が知られている。そこで、アセト酢酸によるシナプス作用をスライスパッチクランプ法を用いて検討した。その結果、アセト酢酸による興奮性シナプス(グルタミン酸作動性シナプス)の減弱作用は、てんかん様活動時に増強することを見出した。さらに、より強力なシナプス阻害作用を持つアセト酢酸類似体を我々は既に同定しているが、こちらも同様のシナプス作用を示すことも明らかとなった。3、難治性てんかんとして知られる海馬硬化症を伴う側頭葉てんかんに関し、そのモデルマウスを作製し、制御機構解明に取り組んだ。海馬における主要な神経修飾物質としてアセチルコリンが知られている。そこで海馬硬化症モデルマウスのてんかん焦点に、アセチルコリン制御剤を微量投与したところ、自発的なてんかん発作活動が抑えられることが明らかとなった。本研究の目的は、新しい作用機序を持つ難治性てんかん制御剤の開発である。平成27年度(1年目)において、ケトン食療法に基づく治療薬開発に向け、乳酸脱水素酵素阻害作用を持つスチリペントール類似体を複数同定した。さらに、ケトン食療法の作用機構解析(ケトン体の神経作用)を別角度から進めるだけでなく、新たな難治性てんかん制御システムとしてアセチルコリンシグナル系も見出した。上記を踏まえ、順調に研究が進展していると評価した。既存の治療薬が有効でない「難治性てんかん」の制御機構を明らかにし、創薬開発へと繋げるために、本年度は下記3項目を実施した。1、難治性てんかんに有効な食事療法として「ケトン食療法」が知られている。我々はこれまで、ケトン食療法による抗てんかん作用に関わる分子として乳酸脱水素酵素を見出し(Science, 2015)、その乳酸脱水素酵素を阻害する化合物としてスチリペントール類似体を複数同定してきた。そこで本年度は、これらの乳酸脱水素酵素阻害剤に関してin vivoでも抗てんかん作用を示すか評価した。2、ケトン食療法時に上昇する生体内物質として「ケトン体(アセト酢酸)」が知られている。我々はこれまで、アセト酢酸が興奮性シナプス伝達を抑制することを見出し、さらにより強力な抑制作用を持つアセト酢酸類似体も同定してきた。そこで本年度はこれらの標的を調べ、作用分子として電位依存性カルシウムチャネルを同定した。さらにin vivo抗てんかん作用を調べ、これらが腹腔投与により抗てんかん作用を示すことを明らかにし、このアセト酢酸類似体が抗てんかん作用を発揮するのに必要な脳内濃度も決定した(Epilepsia, in press)。3、難治性てんかんとして知られる「海馬硬化症を伴う側頭葉てんかん」に関し、そのモデルマウスを用いた解析を行い、これまでにアセチルコリンが重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。そこで本年度は、我々が開発してきたアセチルコリンセンサーを当該てんかんモデルに適用し、てんかん活動と脳内アセチルコリン濃度の同時測定を行い、てんかん発作時のアセチルコリン挙動を解析した。本研究の目的は、難治性てんかんの新たな制御法を見出し、それに沿って創薬開発を進めることである。平成28年度(2年目)までに、ケトン食療法に基づく治療薬開発に向け、その作用分子として乳酸脱水素酵素と電位依存性カルシウムチャネルを同定するだけでなく、それらを阻害し抗てんかん作用を示す化合物も同定している。また、新たな難治性てんかんの制御機構としてアセチルコリンを同定し、その作用機構解析も進めている。以上を踏まえて、本研究は順調に進展していると評価した。てんかん患者の約3割を占める「難治性てんかん」の制御機構を解明し、治療薬開発へと繋げるため、本研究では下記3項目を実施した。1.我々はこれまで、難治性てんかんに有効であることが知られるケトン食療法の作用機序解析を進め、制御分子として乳酸脱水素酵素を見出すだけでなく、それに作用する化合物として抗てんかん薬スチリペントールを報告してきた(Sada et al, Science, 2015)。

そこで本研究では、スチリペントールの化学構造を改変することで、乳酸脱水素酵素阻害剤を多数見出すだけでなく、in vivoでも抗てんかん作用を示す化合物も同定した(PCT/JP2016/053764)。2.ケトン食時に体内で増加するケトン体(アセト酢酸)の作用点を調べ、アセト酢酸が電位依存性カルシウムチャネルを阻害することを見出した。アセト酢酸は、てんかん様活動を示すスライス標本において、興奮性シナプス伝達を強く阻害した。さらに、アセト酢酸の化学構造を改変することで、より強力に電位依存性カルシウムチャネルを阻害するだけでなく、興奮性シナプス伝達も阻害し、in vivoでも抗てんかん作用を示す化合物を同定した(Kadowaki et al, Epilepsia, 2017)。3.難治性てんかんとして知られる「海馬硬化症を伴う側頭葉てんかん」のモデルマウスを作成し、その制御機構を調べた。本モデルマウスのてんかん焦点に、アセチルコリン制御剤を微量投与したところ、自発的なてんかん発作活動が抑えられることを見出した。さらに、我々が開発してきたアセチルコリンセンサーをマウス脳内に適用することで、てんかん活動と脳内アセチルコリン濃度の関係を解析するとともに、スライスパッチクランプ法を用いた作用機序解析も行った。既存薬が有効でない「難治性てんかん」の制御機構を明らかにし、創薬開発へと繋げるため、本研究では以下3項目を実施した。まず第一に、難治性てんかんに有効な「ケトン食療法」に着目し、抗てんかん作用を示す乳酸脱水素酵素阻害剤を同定した。第二に、アセト酢酸(ケトン食の代謝産物)が電位依存性カルシウムチャネルを阻害することを見出し、抗てんかん作用を有するアセト酢酸類似体も同定した。最後に、難治性てんかんモデルマウスの発作制御に、アセチルコリンが関与していることを見出した。平成27年度において、より強力な乳酸脱水素酵素阻害作用を持つスチリペントール類似体が明らかとなった。そこで平成28年度において、てんかんモデルマウスにこれらを投与し、抗てんかん作用をin vivoで評価する。また、ケトン体であるアセト酢酸およびその類似体による興奮性シナプス抑制作用を踏まえ、平成28年度は創薬開発に向けその標的分子を探索する。さらに、アセチルコリンによる抗てんかん作用に関しては、平成28年度はその作用メカニズム解析を進める予定である。平成29年度において、これまで見出してきた乳酸脱水素酵素阻害剤のin vivo抗てんかん作用について、引き続き検討する。細胞レベルの電気生理学的測定を用いたメカニズム解析も行う。また、アセチルコリンによる抗てんかん作用に関しては、その作用メカニズムを明らかにするため、脳スライス標本を用いたパッチクランプ法により細胞レベルの解析を行う。神経生理学