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横穴式石室導入に見る南四国と瀬戸内の古墳展開の研究

本研究課題は、南四国と瀬戸内の横穴式石室を比較検討することにより、古墳時代後期の両地域における交流実態を明らかにすることである。資料の分析とフィールドワークを重視して研究を進めた。横穴式石室墳に関わる様々な要素は、断続的に瀬戸内から南四国にもたらされたことが明らかとなった。第1段階:明見3号型石室の導入、第2段階:舟岩型石室の導入(伏原大塚古墳)、第3段階:南国市域で横穴式石室が普及・風水的選地の導入、第4段階:角塚型石室の導入という各段階である。本年度は資料収集を中心に作業を行った。まず夏季には南国市坂ノ松古墳の墳丘測量調査・石室実測調査を実施するとともに、冬季には明見彦山1号墳の発掘調査を行った。この2古墳は南四国でも、古相を呈する横穴式石室を持つがその内容が明らかでなかった。坂ノ松古墳は石室図面が存在していなかった。明見彦山1号墳も出土遺物が知られておらず、時期が不確定であった。前者は詳細な実測図を作成してその報告書もすでに刊行し、明見彦山1号墳も副葬品の一部を明らかにしてTK209型式期(6世紀末から7世紀初頭)の古墳であることを明らかにすることができた。この2古墳は規模こそ異なるものの共通する石材使用が認められ、石室構築において関連があることが明らかとなりつつある。古墳が南国市においてどのように展開するかを明らかにする手がかりを得つつある。また、明見彦山1号墳がTK209型式期に属することも重要な知見である。明見彦山1号墳に隣接する明見彦山3号墳は、1号墳よりも1段階時期的に古い。明見彦山1号墳はいわゆる舟岩型に属し、その中でも古相に属する。3号墳は明見3号型石室である。すなわち、明見3号型石室が舟岩型石室に先行して南四国では展開する可能性が出てきたのである。現在、瀬戸内側の石室資料を収集しているところである。これらと明見彦山1号墳ならびに3号墳石室を比較することにより、どのような経路と過程を経て南四国に横穴式石室が導入されたかが、明らかになるであろう。本研究の柱の一つが南四国の横穴式石室墳の調査である。南国市明見彦山1号墳の発掘調査は予定通り今年度で終了した。その結果、本墳石室の構造がほぼ解明できた上、出土土器から築造時期も明確にできた。その結果、舟岩型と称される南四国石室の導入時期がほぼ明らかとなり、明見3号型などの石室とは時期差があることが明確となった。さらに当初の計画にはなかったが、明見彦山1号墳と類似する石室を持つ南国市小倉山古墳の測量実測調査を実施し、報告を行っている。こうした調査による資料収集だけでなく瀬戸内の横穴式石室資料の収集もあわせて行っている。南四国の横穴式石室墳の分析は順調に進み、古墳の階層差が武器・馬具と関連し、軍事的要素を持つことを明らかにしている。これにより、南四国における横穴式石室墳の展開の背景には、軍事的編成や軍事的要素があった可能性が指摘できる。また他地域間との交流については古墳の立地という新たな視点を導入して成果を見せつつある。南四国の横穴式石室墳には風水的立地にあるものが散見される。明見彦山1号墳もその1例である。しかし、瀬戸内の横穴式石室墳で風水的立地にある古墳は限られており、風水的立地を鍵として地域間交流の実態を明らかにできる可能性を示した。また時期によって、南四国が交流する地域は異なる可能性が考えられる。TK43型式期に展開する明見3号型石室は讃岐や阿波でその存在は認められない。TK209型式期の舟岩型石室導入期には、讃岐の影響が垣間見える。このように横穴式石室墳の研究により、瀬戸内と南四国の交流の具体相が明らかになりつつあるというのが現段階の状況である。ただ、南四国は基礎資料が整備されていない。そのため資料の分析とともにフィールドワークを重視して研究を進めた。本年度は南国市定林寺芝の前1号墳の墳丘測量調査ならびに石室実測調査を実施し、調査報告書を刊行した。ならびに前年度まで調査をおこなった南国市明見彦山1号墳出土遺物の整理作業を実施し、鉄器・須恵器の図化を完了した。明見彦山1号墳と定林寺芝の前1号墳はともに風水的立地にあることが判明した。南四国への横穴式石室墳の導入過程には風水的選地が一つの鍵となることが考えられたため、横穴式石室の立地について昨年度に引き続いて分析を行っている。

風水的選地は横穴式石室より12段階遅れて導入されている。土佐山田の伏原大塚古墳は風水的立地にないため、南国市に横穴式石室墳が集中して築造される段階に風水が導入された可能性が考えられる。風水的立地にある古墳は讃岐にも認められるため、こうした影響は瀬戸内から伝播したものと考えられる。ただし伊予の分析はまだなので瀬戸内のどこからかという細かな地域を特定できてはいない。しかし、横穴式石室自体も瀬戸内から導入されたものなので、横穴式石室墳に関わる様々な要素は、一時期にもたらされたものではなく、断続的に瀬戸内から南四国にもたらされたと考えられる。すなわち第1段階:明見3号型石室の導入、第2段階:舟岩型石室の導入(伏原大塚古墳)、第3段階:南国市域で横穴式石室が普及・風水的選地の導入、第4段階:角塚型石室の導入という各段階である。各段階の影響が、瀬戸内のいずこからかという発信源の特定は残された課題だが、所期の目的はおおむね達成され、予定以上の調査を遂行することができた。予定していた南国市明見彦山1号墳の発掘調査は予定通り本年度で終了した上に、計画にはなかったが比較資料として重要な同市小倉山古墳の測量実測調査も行い、後者は報告書も刊行済みである。この点は当初の計画以上の成果と進展である。瀬戸内の横穴式石室資料の収集は伊予の資料がやや遅れているが、それ以外はおおむね完了した。資料に基づいた石室の比較研究は順調に進み、古墳の立地から地域間交流を明らかにする論考も発表している。総合的にみて(1)あるいは(2)といえるが、伊予の資料収集がやや遅れているのを加味して(2)とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度は収集した資料に基づいて石室の比較研究を進展させる。これにより、南四国と瀬戸内の交流関係を具体化させる。また調査した明見彦山1号墳の整理作業もあわせて行う。
悪性リンパ腫の放射線治療による免疫応答機序の解明と効果予測法の開発

2017年4月には、緩和的放射線治療を行った悪性リンパ腫患者16名の治療効果について後方視的観察研究を行い、国際研究会で発表した。少数例の解析ではあるが、リンパ球/単球比の減少は、放射線治療後の早期の局所再発と生命予後不良のリスク因子であることを見出した。ROC解析にてリンパ球/単球比の局所再発に対する予測指標としてのカットオフ値を2.36と定めたところ、リンパ球/単球比2.36未満の症例では、7例中3例で3ヵ月以内の局所再発を来したのに対し、2.36以上の症例では8例中1例のみ早期再発を来していた。(p=0.024)また、悪性リンパ腫および白血病を含めた造血器腫瘍の中枢神経系浸潤で薬物療法に抵抗性となった症例に対して全脳全脊髄照射を行った13例について、治療効果、生命予後および有害事象について検討を行った。照射開始時に神経症状を有した症例の2/3で症状改善効果を認めたが、生存期間中央値は6ヵ月で、無増悪生存期間中央値は2カ月と予後は不良であり、特に悪性リンパ腫症例では中枢神経再発が半数以上にみられた。またグレード2以上の血液毒性も約5割にみられた。予後改善のために新たな戦略の開発が望まれるが、全脳全脊髄照射に加えて免疫療法を組み合わせる際には血液毒性が腫瘍免疫応答に及ぼす影響を評価しておく必要性が示唆された。この結果については2018年度に国内学会および国際セミナーで報告を行った。さらに、中高度悪性リンパ腫に対して緩和的な単回照射を行った7例の検討では、照射病巣部の縮小効果の持続期間中央値は約2カ月であったのに対し、4ヵ月以上奏効していたものが1例あった。これらの奏功期間の違いについて、腫瘍組織の腫瘍免疫学的背景との関連性について今後検討していく予定である。研究代表者の所属機関の異動によって、所属機関で抱えている対象となりうる症例数や治療方針の違いが生じたために研究内容の調整に時間を要し、大幅に進捗が遅れている。当初は前向きの症例集積のみ行う予定であったが、見込まれる症例数が少ないために後ろ向き観察研究を組み入れて、既存の生検検体を用いた解析で補う予定である。当初は自施設での免疫染色・フローサイトメトリーの実施を想定していたが、研究機関と研究分担者の変更に伴い、効率化のために外部機関への解析委託をする。現在、緩和的放射線治療を行う悪性リンパ腫症例を集積中である。また、2017年4月には、緩和的放射線治療を行った悪性リンパ腫患者16名の治療効果について後方視的観察研究を行い、国際研究会で発表した。(p=0.024)さらに、悪性リンパ腫および白血病を含めた造血器腫瘍の中枢神経系浸潤で治療抵抗性となった症例に対して全脳全脊髄照射を行った20例について、末梢血リンパ球/単球比の変化と治療効果および生命予後について検討を行っている。結果について2018年度に学会報告をする予定である。研究代表者の所属機関の異動によって、所属機関で抱えている対象となりうる症例数や治療方針の違いが生じ、それにに合わせた研究内容の調整と倫理審査に時間を要したために進捗が遅れた。

これらの奏功期間の違いについて、腫瘍組織の腫瘍免疫学的背景との関連性について今後検討していく予定である。研究代表者の所属機関の異動によって、所属機関で抱えている対象となりうる症例数や治療方針の違いが生じたために研究内容の調整に時間を要し、大幅に進捗が遅れている。症例の集積を増やすために関連診療科に引き続き協力を仰ぐ。当初は自施設での免疫染色・フローサイトメトリーの実施を想定していたが、研究機関と研究分担者の変更に伴い、効率化のために外部機関への委託を検討する。当初は前向きの症例集積のみ行う予定であったが、見込まれる症例数が少ないために後ろ向き観察研究を組み入れて、既存の生検検体を用いた解析で補う予定である。当初は自施設での免疫染色・フローサイトメトリーの実施を想定していたが、研究機関と研究分担者の変更に伴い、効率化のために外部機関への解析委託をする。所属機関の異動によって研究の遅れと症例集積の遅れが生じたため、当該年度の実支出が予定より少なく、残額を次年度に繰り越した。研究の効率化のために、当初は自施設で行う予定だった研究業務の一部を外部機関へ委託をすることを検討しており、繰り越した助成金を充てる予定である。計画の大幅な遅れによって検体の解析のための費用が未使用となっている。研究計画の修正で検体の集積数が減少した分、免疫染色、フローサイトメトリー、FISHなどの解析を外部に委託して効率化を図るために使用する予定である。
脳虚血耐性現象時の高エネルギー燐酸の動態解析(燐核磁気共鳴法による)

脳虚血が引き起こされる前に、その個体にストレスを負荷すると、致死的な脳虚血が引き起こされてもその侵襲に耐え得る現象、脳虚血耐性現象が知られている。そのメカニズムには熱ショック蛋白質などが関与し、障害蛋白質の保護作用をしているという説、再潅流後の病的代謝亢進状態を抑制してるという説、あるいは最初の脳虚血により神経細胞の樹状突起数が減少し、再潅流後のカルシウムの細胞内流入などによる興奮過剰状態が生じにくくなるという説などが報告されている。また、前もって個体に負荷するストレスの種類も脳虚血より、高温環境への暴露刺激の方が熱ショック蛋白誘導効果が高いという報告もある。現在、燐核磁気共鳴を用い、前もって脳虚血負荷を与えた家兎と対照家兎の両群で致死的脳虚血負荷を与えた後の、大脳でのクレアチン燐酸、ATPなどの高エネルギー燐酸の変化を検討しているが、虚血刺激負荷家兎と対照群での再度虚血刺激前の高エネルギー燐酸には有意な変化は見られてなかった。このような結果になった理由として、in vivoの実験では、脳細胞の酸素化状態に心臓および肺機能が影響しているため、厳密に個体間で脳組織の酸素化状態を同一にするのは困難であったのではないかと考えられる。脳虚血耐性現象を正確に把握するためには、その現象が生じている脳組織の酸素分圧を厳密に規定する必要がある。そのため次の実験として、脳切片標本を用い、脳虚血耐性現象時の高エネルギー燐酸の動態を検討してゆく予定である。脳切片標本を用いた実験により、潅流液中の酸素分圧を自由に変化させることが可能であるため、in vivo動物実験を用いた場合より、低酸素障害が出現する正確な臨界点を決定することが可能と考えられる。
神経成長円錐で情報をフィロポディア形成の原動力に変換するWAVEの役割

神経成長円錐はラメリポデイアさらにフィロポデイアを形成しつつ伸長する。ラメリポデイアはアクチンネットワークがその骨格をなし、それが再編されてできたアクチン束がフィロポデイアの芯を形成していく。また伸長時にはフィロポデイア先端ではアクチン重合がさかんで、引き続いてアクチン束内をアクチン分子が逆行性に移動することがわかっている。したがって先端でのアクチン重合の速度が逆行性移動の速度より大きい場合に、伸長の機械力を生み出すと考えられる。この先端部位で細胞内情報をアクチン重合へと変換の橋渡しをする分子の一つがWAVE2であることをあきらかにした。さらに今研究では神経芽腫細胞NG108をつかって以下の結果を得た。1、WAVEアイソフォーム13とEGFPの融合コンストラクトを作成し、NG108に発現させ、成長円錐での局在を観察した。その結果WAVE1はラメリポデイアのみ、WAVE2,3はフィロポデイアにも局在すること、特にWAVE2はフィロポデイア先端に強く発現することがわかった。2、WAVE2cDNAを断片化したものとEGFPとの融合コンストラクトを発現させることにより、フィロポデイア先端への局在を決定しているのはN端側に位置する52番から82番のアミノ酸からなるleucinezipper like motifであることがわかった。3、フィロポデイアの伸長にはアクチン重合のみならず、アクチン繊維を束ねる分子が必要であること。この作用をする分子の一つはファシンであることを、ファシンとEGFPとの融合タンパク質の局在を観察することにより碓認した。4、ファシン以外にアクチン繊維を束ねる作用のある新奇の分子としてLasp-1およびLasp-2があることを同様の手法によりあきらかにした。5、ファシン、Lasp-1およびLasp-2はゆるい相互作用でアクチン繊維を束ねており、アクチン繊維内の単量体の逆行性の輸送を妨げることがないことがわかった。神経の成長円錐はラメリポデイアさらにそれからフィロポデイアを形成しつつ伸長する。ラメリポテイアはアクチンネットワークがその骨格をなし、フィロポデイアはアクチン束がその芯をなしている。したがってフィロポデイア先端でのアクチンの重合と続いておきるアクチン繊維束の伸長が前進の機械的原動力になると考えることができる。この部位に存在し細胞内情報をアクチン重合へと変換の橋渡しをしている分子の一つとしてWAVEアイソフォームがある。今研究で神経芽腫細胞NG108で神経成長円錐を形成させることにより以下の結果を得た。1、抗WAVE抗体による免疫染色とローダミンファロイジンによるアクチン繊維特異的染色で内在性のWAVEがNG108に形成された成長円錐のフィロポデイアの先端およびラメリポデイアの先導端に存在することがわかった。2、WAVEアイソフォームWAVE13とEGFPの融合コンストラクトを各々作成し、NG108に発現させた。WAVE1はラメリポデイアの先導端のみにしか存在しないが、WAVE2,-3はラメリポデイア先導端のみならずフィロポデイア先端にも局在することがわかった。3、WAVE2の分子内領域の機能をあきらかにするため、WAVE2cDNAを断片化したものとEGFPとの融合コンストラクトを作成し、NG108に発現させた。その結果局在を決定しているのはN端側に位置するSHD(Src homology domain)領域であることがわかった。

さらにSHD領域内を群細に分けた断片とEGFPとの融合コンストラクトの発現により、この領域内の52番目から82番目のアミノ酸残基の間に存在するleucinezipper like motifが局在を決めていることがわかった、神経成長円錐はラメリポデイアさらにフィロポデイアを形成しつつ伸長する。ラメリポデイアはアクチンネットワークがその骨格をなし、それが再編されてできたアクチン束がフィロポデイアの芯を形成していく。また伸長時にはフィロポデイア先端ではアクチン重合がさかんで、引き続いてアクチン束内をアクチン分子が逆行性に移動することがわかっている。したがって先端でのアクチン重合の速度が逆行性移動の速度より大きい場合に、伸長の機械力を生み出すと考えられる。この先端部位で細胞内情報をアクチン重合へと変換の橋渡しをする分子の一つがWAVE2であることをあきらかにした。さらに今研究では神経芽腫細胞NG108をつかって以下の結果を得た。1、WAVEアイソフォーム13とEGFPの融合コンストラクトを作成し、NG108に発現させ、成長円錐での局在を観察した。その結果WAVE1はラメリポデイアのみ、WAVE2,3はフィロポデイアにも局在すること、特にWAVE2はフィロポデイア先端に強く発現することがわかった。2、WAVE2cDNAを断片化したものとEGFPとの融合コンストラクトを発現させることにより、フィロポデイア先端への局在を決定しているのはN端側に位置する52番から82番のアミノ酸からなるleucinezipperlike motifであることがわかった。3、フィロポデイアの伸長にはアクチン重合のみならず、アクチン繊維を束ねる分子が必要であること。この作用をする分子の一つはファシンであることを、ファシンとEGFPとの融合タンパク質の局在を観察することにより碓認した。4、ファシン以外にアクチン繊維を束ねる作用のある新奇の分子としてLasp-1およびLasp-2があることを同様の手法によりあきらかにした。5、ファシン、Lasp-1およびLasp-2はゆるい相互作用でアクチン繊維を束ねており、アクチン繊維内の単量体の逆行性の輸送を妨げることがないことがわかった。
赤血球期マラリア原虫の細胞増殖制御機構

赤血球期マラリア原虫の細胞増殖形態は、生物学的観点からユニークなものであるのみならず、その分子機構に関する研究は、感染症マラリアの化学療法の新規標的分子の提供につながる。本研究は、学術的側面と応用的側面の両面を考慮に入れ、細胞増殖に異常が見られるマラリア原虫のクローン細胞株と増殖が正常なクローン細胞株、さらにはこれらの親株から派生し、それぞれがクローン化されているキメラ子孫細胞株を用いた遺伝学的解析により、赤血球期マラリア原虫の細胞増殖に関与する原虫側因子の同定を目的としている。平成13年度には、変異型原虫細胞株が示す細胞増殖における表現型が、赤血球サイクルのどの過程の異常に起因しているのかを明らかにするための実験を行った。結果は、残念ながら、2つの親株間で明確な差異を見出すことができなかった。これは、原因因子が2つ以上のステップに関与しているため、各ステップに与える影響が今回用いた解析系の感度では検出できないという可能性が考えられる。もう一つは、この表現型を支配する遺伝子が2つ以上存在するという可能性である。本研究期間を通して、これまでに計17種類のキメラ子孫細胞株の解析が終了しており、これらの細胞増殖についての表現型は、どちらかの親株の表現型に区別され、中間の表現型を示すものが見られなかった。したがって、この表現型を決定する原因遺伝子は、1遺伝子支配である可能性が高いと考えられる。しかし、平成13年度の解析結果を考慮すると、この点をさらに確かなものとする必要があると考えられたので、さらに6種類のキメラ子孫細胞株のアッセイを終了させ、現在データを精査している。加えて、新たに5種類のキメラ子孫細胞株のアッセイを近々行う予定である。これらすべての結果をもとに、QTL解析等の統計処理を行い、原因遺伝子の存在する染色体、さらにはその座位を決定できるものと期待している。赤血球期マラリア原虫の細胞増殖形態は、学術的観点からユニークなものであるのみならず、その分子機構に関する研究は、未だ人類にとって脅威である感染症マラリアの化学療法の新規標的分子の提供につながる。本研究は、生物学的な興味とマラリア治療への応用との両面を考慮に入れ、細胞増殖に異常が見られる原虫細胞のクローン株と正常な細胞増殖を示すクローン株、さらにはこれらの親株から派生したキメラ子孫細胞クローン株を用いた遺伝学的解析により、赤血球期マラリア原虫の細胞増殖に関与する原虫側因子の同定を目的としている。本年度は、(1)変異型原虫細胞株の示す細胞増殖における表現型は、赤血球サイクルのどの過程の異常に起因しているのか、また、(2)その表現型を支配する遺伝子は、マラリア原虫のどの染色体、かつその座位はどこであるのか、を決定する実験を計画した。(1)については、赤血球サイクルの各ステップにおいて、親株の2株間で明確な差異を見出すことができなかった。これは、原因因子が2つ以上のステップに関与しているため、各ステップに与える影響が今回用いた解析系の感度では検出することができないという可能性が考えられる。(2)については、これまで13種類のキメラ子孫細胞クローン株の解析を終えており、さらに現在これら以外の10種類のキメラ子孫細胞株の解析を継続している。一連の解析結果が出揃ったところで、QTL解析等の統計処理を行い、原因遺伝子の存在する染色体、さらにはその座位を決定する予定である。また、この統計処理により、(1)で挙げた2つの可能性に対する回答が見出せると考えている。
神経筋接合部におけるＬｒｐ４の翻訳後調節とその破錠の解析

(1)当初の研究計画神経筋接合部(NMJ)は骨格筋の基本単位である筋管と運動神経の軸索末端の間に形成されるシナプスであり、運動神経による骨格筋収縮の制御に必須の役割を担っている。NMJの機能や形成不全は易疲労性の筋力低下を伴う筋無力症の原因となる。最近、先天性筋無力症候群(CMS)の中でも原因遺伝子が不明な症例において、糖鎖修飾に関連する複数の遺伝子に病原性の変異が発見された。当該患者のNMJでは、NMJの神経伝達物質であるアセチルコリン(ACh)の受容体であるACh受容体(AChR)の発現減少とNMJの形態異常が観察されており、正常なNMJの形成に糖鎖修飾が必須の役割を持つことが予見されている。しかし、糖鎖修飾酵素に変異を持つ患者がCMSを発症する分子基盤については未解明であり、その解析が待たれている。以上の経緯を踏まえ、本研究員は、NMJの形成・維持に必須な分子であるLrp4の機能制御に重要と思われる糖鎖修飾が存在するという独自の発見を基に、当該分子の糖鎖修飾異常がCMS発症機構の一端を担っている可能性に思い至った。そこで、NMJ形成におけるLrp4の翻訳後修飾の実体とその機能の解明を通じて、CMS発症の分子基盤やLrp4の機能制御機構の理解を目指す本研究の着想を得た。(2)研究成果平成26年度の研究では、Lrp4に保存された糖鎖修飾部位のコンセンサス配列に着目し、様々な糖鎖修飾候補部位に変異を導入することで当該修飾部位の同定を試みた。作製した糖鎖修飾候補部位変異体の強制発現実験により、Lrp4が複数の糖鎖修飾を受けること、及び、当該糖鎖修飾がLrp4の細胞表面における発現制御に関与することを見出した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ペルム紀末期の大量絶滅とその後の回復および放散現象の解明

北部ベトナムには,下部中部三畳系の陸棚上に堆積した波浪堆積物が広く分布し,ペルム紀末期の大量絶滅後の回復から放散を示すテチス系の二枚貝化石を多産する.この研究では,化石の保存状態や産状から優先的あるいは特徴的な二枚貝類の生息域を復元し,下部三畳系ランソン層と中部三畳系ナーコット層の二枚貝化石群(群集)を識別した.その結果,下部三畳系の二枚貝化石群のうち,波浪限界よりも浅い環境では,表生種のClaraiaやTowapteria,Eumorphotisが主体で,これよりも深い環境では,Claraiaが卓越することが明らかになった.その一方で,中部三畳系では,内生種が卓越し半内生種や表生種を伴うことや,種の多様性が非常に高いことが明らかになった.ナーコット層の波浪限界よりも浅い環境では,Costatoria goldfussiやTrigonodusなどの内生種が特徴的で,波浪限界よりも深い外側陸棚環境では,Costatoria paucicostataと半内生種のHoernesiaが多産することが分かった.この結果は,ペルム紀末期の大量絶滅後の内生二枚貝類の回復が表生種と比べて明らかに遅れていることを示している.北部ベトナムには,下部中部三畳系の陸棚上に堆積した波浪堆積物が広く分布し,ペルム紀末期の大量絶滅後の回復から放散を示すテチス系の二枚貝化石を多産する.この研究では,化石の保存状態や産状から優先的あるいは特徴的な二枚貝類の生息域を復元し,下部三畳系ランソン層と中部三畳系ナーコット層の二枚貝化石群(群集)を識別した.その結果,下部三畳系の二枚貝化石群のうち,波浪限界よりも浅い環境では,表生種のClaraiaやTowapteria,Eumorphotisが主体で,これよりも深い環境では,Claraiaが卓越することが明らかになった.その一方で,中部三畳系では,内生種が卓越し半内生種や表生種を伴うことや,種の多様性が非常に高いことが明らかになった.ナーコット層の波浪限界よりも浅い環境では,Costatoria goldfussiやTrigonodusなどの内生種が特徴的で,波浪限界よりも深い外側陸棚環境では,Costatoria paucicostataと半内生種のHoernesiaが多産することが分かった.この結果は,ペルム紀末期の大量絶滅後の内生二枚貝類の回復が表生種と比べて明らかに遅れていることを示している.古生代のペルム紀末期に生じた大量絶滅後の二枚貝類の回復から放散過程を明らかにする目的で,北ベトナム北東部に分布する下部三畳系ランソン層や中部三畳系ナーファット層の地質調査を実施した.調査では二枚貝やアンモナイト化石の採集と地質時代を検討するためのコノドント試料の採取,堆積環境を復元するために必要な堆積学的なデータや試料の採取を行った.その結果,これまでに未記載の二枚貝類や時代決定に有効なアンモナイト化石などを含む化石産地を多数発見し,三畳系の地質時代が階レベルで明らかになったため,これらの成果については,研究協力者のDang博士と共著でベトチムの学術誌に報告した.堆積環境については,波浪堆積物が卓越する外浜陸棚環境が発達していたことが明らかになり,大部分の化石は陸棚堆積物から産出することが明らかになった.二枚貝化石群の構成やその時代的な変化については,三畳紀中期に多数の種が出現し,科レベルでも構成が変化することや,生活様式なども多様化していることが分かったため,それらの概略を論文としてまとめ, Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecologyに投稿した.なお,当初計画していたハーザン省における地質調査は,水害による冠水や地滑りの影響で中止となったため,この地域については,来年度以降に調査を実施する予定である.また,年度末には日本とベトナムの三畳紀二枚貝類の比較を目的にDang博士を日本に招聘し,野外調査や熊本大学所蔵の模式標本の観察などを行った.2009年と2010年の34月と2009年の5月に北部ベトナムに分布する二畳系三畳系の地質調査を行い、2010年10月は中部ベトチムの三畳系で調査を実施した(2009年5月と2010年34月の調査は私費で実施).北部ベトナムの三畳系ランソン層では,三畳系最下部のインデュアン階から多数の二枚短貝とアンモナイト化石を採集し,三畳系オレネキアン階まで層序が連続していることを明らかにした.また,ランソン層を整合で覆うバックテゥイ層からは,多くのアンモナイトや二枚貝化石に加えて地質年代を決める上で重要なコノドント化石ま得ることができた.予察的な観察結果では,アンモナイトやコノドント化石は,主に2層準から産出し,下部と上部オレネキアン階を指示する.二枚貝化石については,インデュアン階から従来の報告通り34種のクラライアが多産することを確認した.一方でオレネキアン階からは,12種のクラライアとポシドニアが多産した.両階の二枚貝化石の構成で共通する特徴は,化石の産出量は極めて多いものの,種の多様性は蓍しく低い点である.なお,二畳系の二枚貝化石は,保存状態が悪く,種を同定することはできなかった.

中部三畳系からは,多種多様な二枚貝化石を採集し,北部および中部ベトナムの双方でコスタトリアなどを主体とする二枚貝化石群を識別することができた.これらの二枚貝化石群は,波浪卓越型の外浜や陸棚相から産出し,種の多様性が非常に高いことが分かった.これは,古生代末期の大量絶滅後,二枚貝類が放散したのは,中期三畳紀であったことを示している.なお,北部ベトナムの三畳系の調査結果については,ベトナムで開催された国際会議で公表し,その成果の一部については,すでに国際誌に受理されている.また,これらの調査時に採集した現生のオストラコーダについても報告した.北ベトナムのランソン省に分布する下部三畳系で地質調査を行ない,二枚貝やアンモナイトなどの大型化石とコノドント,放散虫,オストラコーダなどの微化石を複数のセクションで大量に採集した.これらの化石からランソン層の大部分は,インデュアン階からオレネキアン階下部であり,バックテュイ層は,オレネキアン階下部の中部(スミシアン階中部)からオレネキアン階上部の下部(スパシアン階下部)であることが明らかになった.さらにアンモナイトや二枚貝は,南中国やインドなどと共通する三畳紀のテチス海東域に特徴的な種が主体であるが,北米やヨーロッパと共通する種や折縁たグループも含まれていることが分かった.また.二枚貝化石の構成は、三畳紀中期めものと全く異なっており,三畳紀前期の二枚貝類との共通性が高い.放散虫化石は,テチス海東域でも東南アジアや南中国に特徴的なグループが多産した.中部三畳系については,中部ベトナムのテンホア省で調査を継続し,産出したアンモナイトや二枚貝化石の一部を報告し,中部ベトナムに広く分布するクイラン層の地質年代が中期アニシアン期の後期であることを明らかにした.また,クイラン層から産出する二枚貝化石の構成は,北部ベトナムのナーコット層のものと極めて類似していることを確認し,その堆積環境は典型的な波浪卓越型の陸棚であることが分かった.下部中部三畳系の二枚貝類の放散現象については,19年度と20年度までの研究結果をまとめて公表したが(この研究成果の具体的な内容については,昨年の研究実績報告書に記入済み),この研究ではオレネキアン階や中部ベトナムのデータについて.詳しく報告していなかったため,現在,これらのデータを加えた論文をまとめている.
中枢ミエリン形成不全症の分子病理とモデルマウスの作製による病態解析

本研究ではPelizaeus-Merzbacher(PM)病が疑われた患者の遺伝子解析を行い、変異と病態の関係を明らかにし、さらにPLPの機能を調べるために培養細胞レベルでPLPの過剰発現系を作製し、将来マウス個体のPLP遺伝子を操作する上での基礎的研究を行った。(1)遺伝子診断にはPCR-SSCP法を導入した。SSCPでは検出感度が問題にされるが、増幅するDNAを300bp以下にすると検出感度は高く、1次スクリーニングとして有用であることが明らかとなった。本研究では主に次のクライテリアを満たす症例について解析した。(1)X連鎖遺伝形式、(2)眼振、(3)精神運動発達遅滞、(4)痙性四肢麻痺、(5)聴性脳幹反応の異常、(6)MRIでのミエリン形成異常である。これまでに26家系の解析が終了し、7家系において新しい変異(ミスセンス変異(3)、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライス異常(2))を見いだした。この中にはPM病より軽症である痙性対麻痺の家系も含まれており、関連疾患まで対象を広げて検索することにした。さらに、PLP遺伝子の異常が無い患者については新たな病因遺伝子の検索を目指して研究を進めている。(2)PLP/DM20の高発現系を培養細胞で作成するために、MMTVプロモーターの下流にDM20のcDNAを連結したベクターを構築しC6グリオーマに導入した。ステロイドホルモンでmRNAの発現誘導のかかる安定形質転換体(C6-DM20)が得られた。また、蛋白レベルでの発現を検出するために抗体を作製した。現在、C6-DM20を用いて形態の違いを観察し、自身の増殖に及ぼす影響を調べている。また、浮遊培養を行なって細胞接着性を検討している最中であり、結果がまとまり次第報告する予定である。本研究の目的はミエリンプロテオリピド蛋白質(proteolipid protein,PLP)の異常で起こるPelizaeus-Merzbacher病(PM病)患者の遺伝子解析を進めると同時に、培養細菌レベルあるいは個体レベルでPLPの機能を解析し、両者の結果を相互にフィードバックしながらその変異と病態の関係を明らかにすることにある。今年度はまず、PM病のPLP遺伝子診断を迅速化するためにPCR-SSCP法を導入した。7つのエクソンからなるPLP遺伝子を10個の領域に分割し、PCR-SSCP法により変異のある領域を同定してからその塩基配列を直接塩基配列決定法により決定した。増幅するDNAを300bp以下にすると検出感度は高く、この方法が有効であることがわかった。その結果これまでに17家系中、5家系において新たなPLP遺伝子変異を検出している。さらに、PLP遺伝子のコード領域の上流500bpを解析する系を作製し10人のPM病患者を調べたところ、この領域に異常は無いことが解かった。次に、PLP/DM20の高発現系および発現抑制系を培養細胞で作成するために、MMTVプロモーターの下流にDM20のcDNAセンスあるいはアンチセンスに連結したベクターを構築し、C6グリオーマに導入した。ステロイドホルモンでmRNAの発現誘導のかかる安定形質転換体が得られたことがRT-PCRおよびNorthern blotttingにより確かめられた。また、蛋白レベルでの発現を検出するために坑体を作製した。PLPのcDNAを利用してGSTとの融合蛋白を作製し坑原に用いた。この坑体はラット脳の組織切片でミエリンを染色し、Western blottingではPLPおよびDM20に結合した。現在細胞レベルでその発現様式を検討中である。本研究の目的はミエリンプロテオリピド蛋白質(proteolipid protein, PLP)の異常で起こるPelizaeus-Merzbacher病(PM病)

患者の遺伝子解析を進めると同時に、培養細胞レベルあるいは個体レベルでPLPの機能を解析し、両者の結果を相互にフィードバックしながらその変異と病態の関係を明らかにすることにある。PM病でPLP遺伝子のエクソンに変異が検出されるのは全体の1/3程度で過ぎない。そこで我々は遺伝子診断を迅速化するために7つのエクソンからなるPLP遺伝子を10個の領域に分割し、PCR-SSCP法により変異のある領域を同定してからその塩基配列を決定している。今年度はSSCP法に若干の改良を加えた結果、再現性よくPCR産物が得られ、安定した解析結果を得ることができた。今年度新たに依頼のあったPM病家系9家系について遺伝子解析を行ったところ、2家系において新たな変異(エクソンIIのミスセンス変異とエクソンIIIのスプライス変異)が見つかった。以前の結果と合わせてスプライス異常が原因と推定される家系は2家系となったが、まだ証明はされていない。PLPはその発現が中枢神経に現局しており解析が困難であるが、最近になって患者の皮膚線維芽細胞由来の培養細胞でわずかながらPLP遺伝子産物が発現しRT-PCRで検出可能であることが解かった。現在この系を使って、実際どのようなalternative spilcingが起こっているのか検討中である。本研究ではPelizaeus-Merzbacher(PM)病が疑われた患者の遺伝子解析を行い、変異と病態の関係を明らかにし、さらにPLPの機能を調べるために培養細胞レベルでPLPの過剰発現系を作製し、将来マウス個体のPLP遺伝子を操作する上での基礎的研究を行った。(1)遺伝子診断にはPCR-SSCP法を導入した。SSCPでは検出感度が問題にされるが、増幅するDNAを300bp以下にすると検出感度は高く、1次スクリーニングとして有用であることが明らかとなった。本研究では主に次のクライテリアを満たす症例について解析した。(1)X連鎖遺伝形式、(2)眼振、(3)精神運動発達遅滞、(4)痙性四肢麻痺、(5)聴性能幹反応の異常、(6)MRIでのミエリン形成異常である。これまでに26家系の解析が終了し、7家系において新しい変異(ミスセンス変異(3)、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライス異常(2))を見いだした。この中にはPM病より軽症である痙性対麻痺の家系も含まれており、関連疾患まで対象を広げて検索することにした。さらに、PLP遺伝子の異常が無い患者については新たな病因遺伝子の検索を目指して研究を進めている。(2)PLP/DM20の高発現系の培養細胞で作成するために、MMTVプロモーターの下流にDM20のcDNAを連結したベクターを構築しC6グリオーマに導入した。ステロイドホルモンでmRNAの発現誘導のかかる安定形質転換体(C6-DM20)が得られた。また、蛋白レベルでの発現を検出するために抗体を作製した。現在、C6-DM20を用いて形態の違いを観察し、自身の増殖に及ぼす影響を調べている。また、浮遊培養を行なって細胞接着性を検討している最中であり、結果がまとまり次第報告する予定である。
有機/有機ヘテロ接合界面における欠陥準位のXPS観測

本研究は、接合界面のポテンシャルが欠陥準位に蓄積する電荷によって変化することに着目し、これを直接XPSで観測するバイアス印加XPS法を用い、有機/有機ヘテロ接合界面の欠陥準位を検出することを目指している。また、測定試料としてフタロシアニン(H_2Pc)の正孔輸送層、PTCDAの電子輸送層、そして金属電極からなる有機薄膜太陽電池構造を選択し、界面準位とデバイス(太陽電池)特性の相関を明らかにすることを目指している。ただし、H_2Pcは基板の種類によって配向が変化することが知られており、また、配向の変化に伴い有機/有機ヘテロ界面の分子間相互作用ならびに界面準位の変化することが予想される。従って、本研究では分子配向制御法を確立した上で、配向を制御した有機ヘテロ接合の界面準位の計測を行うことを目指した。具体的には、ガラス基板ならびに透明導電膜上にPTCDA配向膜を形成し、その上にH_2Pc薄膜を形成することで、基板上のH_2Pc薄膜の配向制御を試みた。通常、これらの基板上にH_2Pc薄膜を直接形成した場合、基板-分子間相互作用が弱いためH_2Pc分子面は基板表面に対し垂直方向に配向するが、PTCDA配向膜上のH_2Pc薄膜では、H_2Pc-PTCDA間に働く強い相互作用を利用して、H_2Pc分子面が平行に配向する(α-H_2Pc構造のb軸が基板に対し垂直に配向する)様子が観察された。また、PTCDA配向膜の膜厚を5Åまで薄くした時にも、H_2Pc薄膜の配向を制御できることが明らかになった。さらに、H_2Pc分子面が基板に対し平行に配向したH_2Pc/PTCDA/glass構造では、垂直に配向したH_2Pc/glass構造に比べ光吸収係数の増大する様子が観測され、分子配向の制御がデバイス特性の向上に不可欠であることを示した。現在、H_2Pcの分子配向を変化させた有機太陽電池構造における界面準位の計測を行っている。本研究では、接合界面のポテンシャルが欠陥準位に蓄積する電荷によって変化することに着目し、これを直接XPSで観測するバイアス印加XPS法を用い、有機/有機ヘテロ接合界面の欠陥準位を検出することを目指している。本年度は、高エネルギー加速器研究機構BL-11Bにおいて2keVの励起光源を用いたXPSの観測を行い、銅フタロシアニン、鉛フタロシアニンの正孔輸送層、PTCDAの電子輸送層、そして金属電極からなるヘテロ接合界面から放出される光電子検出を試みた。銅フタロシアニン薄膜上にPTCDA薄膜を膜厚50Å以上形成したヘテロ接合では、銅の内殻準位からの光電子を検出できなかった。一方、鉛フタロシアニン薄膜上ではPTCDA薄膜を100Å以上形成しても、十分な強度の鉛の光電子の検出が可能であった。これは、フタロシアニンの中心金属である鉛と銅の光イオン化断面積が大きく異なるためである。一方、これらの試料上にMg等金属電極を15Å以上形成後すると、いずれの正孔輸送層の場合にも接合界面からの光電子を検出する事ができなかった。これは、フタロシアニンの中心金属の密度が小さいことや、光強度の不足による。なお、金属電極に電圧を印加するためには、最低30Å以上の膜厚が必要になるため、今後、光強度の一桁大きいBL-2Aを利用した実験、ならびに中心金属の密度の高くなる有機分子の探索を行う。一方、本研究では最終的に、配向を制御した有機薄膜を用いた有機/有機ヘテロ接合界面の欠陥準位を検出することを計画している。このため、実用的なガラス基板上におけるフタロシアニン配向制御法の開発を行った。その結果、PTCDA配向層を5分子層ガラス基板に蒸着すると、フタロシアニンの分子面が基板面に対し垂直から平行に変化することが明らかになった。今後この技術の開発をさらに進め、高度に配向を制御した試料の欠陥準位観測を行う予定である。

通常、これらの基板上にH_2Pc薄膜を直接形成した場合、基板-分子間相互作用が弱いためH_2Pc分子面は基板表面に対し垂直方向に配向するが、PTCDA配向膜上のH_2Pc薄膜では、H_2Pc-PTCDA間に働く強い相互作用を利用して、H_2Pc分子面が平行に配向する(α-H_2Pc構造のb軸が基板に対し垂直に配向する)様子が観察された。また、PTCDA配向膜の膜厚を5Åまで薄くした時にも、H_2Pc薄膜の配向を制御できることが明らかになった。さらに、H_2Pc分子面が基板に対し平行に配向したH_2Pc/PTCDA/glass構造では、垂直に配向したH_2Pc/glass構造に比べ光吸収係数の増大する様子が観測され、分子配向の制御がデバイス特性の向上に不可欠であることを示した。現在、H_2Pcの分子配向を変化させた有機太陽電池構造における界面準位の計測を行っている。
全空間上の非線形楕円型方程式、特に共形スカラー曲率方程式の球対称解の構造の解明

平成6年度科研費支給期間において、以下のことを解明した。1)球対称解の構造を決定した柳田の条件が成立しないとき、正値rapid-decay解の近傍は振動解(無限個の零点を持つ解)のみであることを示した。従来、rapid-decay解は孤立していることが知られていたが、その近傍の様子は柳田の条件が崩れたときには、知られていなかった。このことにより、今までに知られていた解の構造以外のものがあることがわかった。これは、砲撃法(shooting法)と変分法を組み合わせることにより、スケール不変量をうまく見つけだしたことによるものである。いままでは、変分法(関数解析的手法)と常微分方程式の関係がはっきりしなかったのであるが、それを解明したものである。今後は大域的な構造も明らかにしたい。2)m-Laplace方程式の指定された零点を持つ解の存在を示した。この方程式は、Laplace方程式の自然な拡張であるが、技術的にいくつかの困難を伴っている。それを克服し、一般性のある方法にするため、r=1での初期値問題を考え、全域に応用したものである。方程式は、r=0,r=∞に特異点を持つため、r=1から問題を解くことの方がやさしい。さらに、零点の数が指定されているので極座標に変換して零点の数を指定に添うようにした。極座標にすることで、Dirichlet,Neumann以外の境界値問題にも応用が容易になった。
肝細胞癌のＴ細胞不活化経路を標的とした癌治療法の臨床導入を目的とした研究

T細胞不活化経路の一つであるHVEMに着目した研究を行った。HVEMとはHerpesvirus-entry mediaterのことで、ウイルス感染やアレルギー、免疫に関連する因子として注目されてきた。近年、HVEMが腫瘍免疫に関わることが報告された。今回我々は肝細胞癌のHVEMの発現に着目して研究を行った。肝細胞癌のHVEMの発現は独立した予後不良因子であった。腫瘍内浸潤リンパ球とリンパ球内の細胞障害性顆粒であるグランザイムB、パーフォリンについて検討すると、HVEMの発現はこれらと逆相関した。これは肝細胞癌のHVEMの発現が腫瘍免疫に関わる腫瘍内浸潤リンパ球の活動を阻害していると考えられた。ヒト肝細胞癌における臨床検体(パラフィンブロック、及び新鮮凍結標本)を用いて検討を行った。HVEMの発現が予後と有意な逆相関を認めることを確認しており、その機序の解明についての研究を中心に行った。また、臨床データをさらに詳細に検討し、HVEMの発現が肝細胞癌の肝外転移、肝内転移(2年以内の肝内再発)に強く影響を及ぼしていることを確認した。また、たの臨床病理学的因子も含めた多変量解析においてもHVEMの発現は独立した予後不良因子であることも確認した。1パラフィンブロックを用いた免疫染色での切除標本において腫瘍内浸潤リンパ球(CD4+、CD8+、CD45RO+)についての検討を行った。その結果、腫瘍内浸潤リンパ球数とHVEMの発現は有意に逆相関が得られた。このことは肝細胞癌にHVEMが発現することで腫瘍免疫にかかわるリンパ球の腫瘍内浸潤が阻害されることを示した。2新鮮凍結標本を用いた,Real-time PCRの検討において、腫瘍のHVEMの発現はCD4、CD8、IFNγ、granzymeB、perforinと有意な逆相関を示した。このことは腫瘍のHVEM発現が腫瘍内リンパ球の浸潤、及びリ腫瘍内でのリンパ球の活動性を阻害していることをRNAレベルにおいて示した。上記の実験から肝細胞癌のHVEMの発現は腫瘍免疫にかかわるリンパ球の活動を阻害することにより、その浸潤、転移に影響を及ぼしている可能性が示された。このことはHVEM経路の阻害は肝細胞癌の再発、転移を抑制する新規治療のターゲットとなりうることを示した。この成果の論文を作成し、現在投稿中である。(具体的内容)肝細胞癌の新鮮凍結標本60症例からRNAを抽出し、cDNAを作成した。同cDNAを用いてReal time PCRを行い、RNAレベルでの検討を行った。具体的にはCD8、CD4、IFNγ、パーフォリン、グランザイムBについて検討した。結果はHVEMの発現群ではこれらいずれの発現も有意に低下していた。また、臨床病理学的背景とHVEMの発現とを検討したところ、腫瘍径とHVEM発現との間に有意な相関がみられた。肝細胞癌では腫瘍径は予後不良因子の一つであり、また遠隔転移との関連性も指摘されている。この機序の一つとしてHVEMの発現が関連している可能性が示唆された。また、さらに症例数を増加させ、適宜再検討を実施している。(意義)以前パラフィンブロックから免疫染色を行った検討では肝細胞癌のHVEMの発現が腫瘍内浸潤リンパ球と逆相関し、予後不良因子となることを確認していた。今回の結果はRNAレベルでもHVEMの発現が腫瘍内浸潤リンパ球の浸潤、およびその機能を抑制していることを示している可能性が示唆された。また、巨大肝細胞癌の予後が不良となる要因としてHVEMの発現が関連している可能性が示唆された。(重要性)肝細胞癌のHVEMの発現が予後不良因子となることが示され、HVEMをターゲットとした新規治療の可能性が見いだされた。今後はさらに細胞レベル、動物モデルでのデータを得るよう検討中である。病理標本のパラフィンブロックでの検討に加えて、新鮮凍結標本からのRNAレベルの解析でもHVEMの発現が予後不良因子となりうることを確認した。今後はさらに細胞レベル・動物モデルのレベルで確認したいと考えている。マウス肝細胞癌細胞株(BNL-HCCなど)を同型マウスに皮下移植し,腫瘍を確立させる.HVEM siRNAをアテロコラーゲン局所投与用とともに,腫瘍に直接接種し,in vivoモデルにおけるHVEM knock downを試み,HVEM knock downによる抗腫瘍効果を経時的に比較する.また,HVEM knock down群とコントロール群で,腫瘍内浸潤T細胞,腫瘍局所における免疫活性を,免疫染色,リアルタイムPCR等で比較する.HVEMの新規バイオマーカーとしての意義を検討する.術前後の肝細胞癌患者の血清中HVEMの発現をモノクロナール抗体を用いたFACS

あるいはELISA法によって検討する.また,術後再発患者あるいは切除不能患者の血清を用いて同様の検討を行い,患者の予後あるいは各種血清学的,免疫学的パラメーターとの相関を検討して,新規バイオマーカーとしての有用性を明らかとする.上記計画のため、ヒト肝細胞癌株、マウス肝細胞癌株の購入、および細胞培地の費用、マウスの実験環境の維持等に用いる予定である。
マウス腎癌を用いたミニ移植のモデルの作成と抗腫瘍効果の免疫学的検討

白血病に対する骨髄移植で、Graft-versus-leukemia効果(GVL効果)が注目され、固形腫瘍に対しても同様の免疫反応が期待されることから、より広範に移植片対腫瘍効果(Graft-versus-tumor効果:GVT効果)と称されている。このGVT効果を前面に出し、移植の安全性も高めた治療法が、骨髄非破壊的同種移植(ミニ移植)であり、NIHのChildらが転移性進行腎癌患者に行ったミニ移植で50%以上の奏効率を報告して現在非常に注目されている。しかし、GVHDとGVT効果は背中合わせで、時として致死的な合併症を引き起こすこともあり、臨床的に両者をいかにコントロールするかは極めて重要であるが、現状では確立された方法はない。上述のごとく、ミニ移植は臨床の現場で考案されてきた治療であるため、基礎的研究は少なく、特に腎癌については我々が調べ得た限りでは皆無であった。腎癌に対するミニ移植の動物モデルを作成すれば、臨床の現場での問題点について試行錯誤することができ、臨床へのフィードバックが期待できると考え、マウス腎癌を用いて安全かつ確実なミニ移植のモデルを作成した。我々のモデルでは抗腫瘍効果の誘導にドナーリンパ球輸注(DLI)は必須であったが、ドナー由来細胞の完全キメラは誘導されていなかった。さらにミニ移植を行って腎癌を拒絶したマウスにおいては腎癌特異的な抗腫瘍免疫が獲得されていた(Cancer Res.65:10032-10040,2005)。今年度は我々が確立したマウス腎癌に対するミニ移植の系を用いて、DLIのタイミングを遅らせることで、抗腫瘍効果を維持しつつ、GVHDのみを軽減させることに成功した(Clin Cancer Res.13:1029-1035,2007)。この概念がヒト腎癌に対するミニ移植の現場へ応用されることが期待される。1.マウス腎癌を用いて安全かつ確実なミニ移植のモデルを作成するという目的については、BALB/cマウスに同系の腎癌であるRenca細胞を皮下投与するモデルで実験を進めた。癌の治療を前提にしたモデルであるから腫瘍の生着を確認した上で処置を開始した。ヒトのミニ移植の時と同様にMHC(主要組織適合抗原)が一致するDBA/2マウスの脾細胞(SC)と骨髄細胞(BMC)を静脈内投与して、その2日後にcyclophosphamide(CP)を腹腔内投与した。我々の既報のごとく、この方法でドナーとレシピエントのバランスが取れた混合キメラが誘導されるので、このバランスをドナー側にシフトさせる目的でドナーのリンパ球(LNC)をCPの翌日に追加投与した。以降、経時的にtumor growthを計測したところ、ドナーLNC投与(臨床ではDLIに相当)群においてのみ腫瘍の増殖は著明に抑制され、40-60%のマウスで腫瘍の消失が認められた。2.ドナー由来細胞の割合すなわちキメラ状態を経時的にモニタリングするという目的についても、末梢血におけるドナー由来細胞の割合をフローサイトメトリーにて解析した。ドナーLNC投与群において最も高いキメリズムを認めたが、全体としてキメラのレベルは低く、その割合は徐々に低下して、移植後100日過ぎには検出できなくなった。3.DLIの効果の検証という目的についても1で示したごとく、実際の臨床におけるDLIの場合と同様にドナーLNC投与による明かな抗腫瘍効果を確認できた。4.ミニ移植を行ったマウスにおける腎癌特異的な抗腫瘍免疫の獲得の有無については、ドナーLNC投与後に腫瘍を拒絶したマウスの脾細胞をRenca細胞と培養して、培養上清中のサイトカイン産生能をELISA法にて解析した。また、腫瘍を拒絶したマウスにRenca細胞をrechallengeして、腫瘍特異的な抗腫瘍免疫の獲得についてin vivoで検討したところ、いずれにおいても腎癌特異的な抗腫瘍免疫の獲得が認められた。以上のように当初の目的のかなりの部分を現在までに示すことができ、その結果を英文論文にまとめて現在投稿中出る。ヒトのミニ移植の時と同様にMHC(主要組織適合抗原)が一致するDBA/2マウスの脾細胞(SC)と骨髄細胞(BMC)を静脈内投与して、その2日後にcyclophosphamide (CP)を腹腔内投与した。この方法でドナーとレシピエントのバランスが取れた混合キメラが誘導されるので、このバランスをドナー側にシフトさせる目的でドナーのリンパ球(LNC)をCPの翌日に追加投与した。以降、経時的にtumor growthを計測したところ、ドナーLNC投与(臨床ではDLIに相当)群においてのみ腫瘍の増殖は著明に抑制され、40-60%のマウスで腫瘍の消失が認められ、実際の臨床におけるDLIの場合と同様にドナーLNC投与による明かな抗腫瘍効果を確認できた。末梢血におけるドナー由来細胞の割合をフローサイトメトリーにて解析したろ、ドナーLNC投与群において最も高いキメリズムを認めたが、全体としてキメラのレベルは低く、その割合は徐々に低下して、移植後100日過ぎには検出できなくなった。それらのマウスにRenca細胞をrechallengeしたところ、腎癌