hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温障害による土壌病害の激発化プロセスの究明と克服シーズの創出

【課題2】高温障害の植物根圏に及ぼす影響解析水田リゾクトニア属菌による苗立枯症,根腐症,幼苗腐敗症の病害モニタリングを行うために、九州大学ファイトトロン(人工気象装置)において擬似的な熱帯環境を構築し、リゾクトニア属菌汚染土壌へのイネの試験栽培を行った。原因菌のリゾクトニア属菌を接種した後,発生する試験作物の病害発生の様相について病気の初期感染からイネ幼病の腐敗・枯死、病気の蔓延・拡大に至るまでを詳細に観察した。また、原因菌の生育測定、病班伸長の測定、植物根圏土壌微生物のDNA構造解析などについてデータ化し、病害発生モデリングの基礎データを構築するとともに、蛍光顕微鏡による植物根圏部分の土壌微生物のモニタリングに成功した。【課題3】植物由来の生物的防除資材の探索香草植物や薬用植物の抗菌・殺菌成分を素抽出し、土壌燻蒸(フーミゲーション)による土壌病害の生物的防除への利用可能性について検討した。その結果、ワームウッドおよびチョウジから極めて殺菌・抗菌作用の高い植物成分(製油)の抽出に成功した。【課題1】アスパラガスに発生する茎枯病の発生要因と育種対策近年の温暖化現象により、福岡県ではアスパラガスの茎枯病が大発生したため、平成26年度において、その原因を究明すべく研究に着手した。アスパラガス茎枯病菌Phomopsis asparagiは、土壌伝染性植物病原菌類の一種であり、アスパラガスでは病害抵抗性の品種がまだ確立されていない。はじめに、病原菌の侵入様相について、アスパラガスの茎上に菌を接種し、顕微鏡観察による病原菌の侵入および植物組織への進行に関する観察を行った。その結果、25°C、接種48時間内で胞子がアスパラガスに付着器を形成し、植物組織を貫通しながら内部に進行していることを観察した。また、黒色の病斑内部では、植物細胞にストレスを与えると思われる物質を分泌している場面が観察された。さらに、本病に耐性・抵抗的はアスパラガスの体内には、内生菌と思われる内在菌類が観察された。【課題2】ベトナム国中山間地区における野菜・果樹病害の被害調査平成26年9月にベトナム国タイバック大学を訪問し、ベトナムーラオス国境付近の中山間地区において、イネおよび蔬菜類に発生する植物病害の野外調査を実施した。本調査では、タイバック大学農学部植物保護学講座の教員および大学院生と共同で実施した。水田では、イネ紋枯病、イネいもち病、イネ白葉枯病の発生が著しく、灌漑施設が整っていない箇所が多く、病害の蔓延化の一因となることが示唆された。また、トマト畑では、疫病やうどんこ病、根腐病などの土壌病害が顕著であった。ジャガイモ畑では疫病およびそうか病、トウガラシ畑では細菌由来の萎凋病、ウイルス病などの被害が観察された。また、コーヒーやマンゴー、ライチなどの果樹では、虫害による被害が多発しており、ウイルス病を媒介する昆虫類の種類もまた観察された。熱帯環境微生物学平成24年度に設定した3つの課題について、各課題の進捗状況については以下のとおりである。【課題1】熱帯アジア土壌病害調査平成24年10月に研究分担者の九州大学農学部植物病理学研究室
進行甲状腺癌、特に未分化癌に対する多剤耐性遺伝子の検索と新しい癌化学療法の開発

新鮮標本からの2症例につき,JSR-1(ニモレイ)を抗体として免疫染色し,多剤耐性遺伝子P蛋白の発現を検討した.正常ウサギ血清にて非特異的反応を阻止した.一次抗体にJSB-1,ヒオチン標識抗マウス・ウサギ抗体による反応,ついでペルオギンダンゼ標識ストレプトアビジンによる反応,二次抗体との反応をおえた.P蛋白の発現は1例にみられた.これは症例3で比較的化学療法の効果が弱い症例であった.現在PCRにてP蛋白を検索している新鮮標本からの2症例につき,JSR-1(ニモレイ)を抗体として免疫染色し,多剤耐性遺伝子P蛋白の発現を検討した.正常ウサギ血清にて非特異的反応を阻止した.一次抗体にJSB-1,ヒオチン標識抗マウス・ウサギ抗体による反応,ついでペルオギンダンゼ標識ストレプトアビジンによる反応,二次抗体との反応をおえた.P蛋白の発現は1例にみられた.これは症例3で比較的化学療法の効果が弱い症例であった.現在PCRにてP蛋白を検索している
実験用ラットにおけるゲノム編集基盤技術の開発

実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術を開発するため、CRISPR/Cas9システムを利用して、ノックアウト、SNP置換、十数bp挿入、数Kbp欠失などのゲノム編集ラットを作製することに成功した。長鎖一本鎖DNAを利用したGFPカセットノックイン、コンディショナルラットを作製するCLICK法、BAC等の大規模ゲノム領域をノックインする2H2OP法を開発した。2H2OP法、CLICK法については特許出願を行った。Cas9トランスジェニックラットを利用したin vivoゲノム編集技術の開発、新しいラットゲノム編集基盤技術を用いた新規パーキンソン病モデルラットの開発を行った。本研究では、CRISPRを用いた実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術の開発を目指している。平成26年度は、ラットにおけるゲノム編集として、特性が一目でわかるアルビノ(Tyr)、アグーチ(Asip)、頭巾斑(Kit)の毛色遺伝子を標的とした。1)Cas9、gRNAをin vitro転写し、DA系統の受精卵にインジェクションすることで、Tyrノックアウトラットを作製した。2)Cas9、gRNA、ssODNをF344系統にインジェクションすることで、Tyr遺伝子ミスセンス変異を野生型にSNP置換(レスキュー)した。3)Asip遺伝子の欠失変異に対して、ssODNにより十数bp挿入を行い、アグーチラットを作製した。4)Kit遺伝子のERV(9K-bp)挿入変異に対して、二つのgRNAとssODNを利用してERVを欠失させることで、全身野生色のラットを作製した。以上の研究成果を取りまとめて、英国科学誌Nature Communications(英国ネイチャー出版グループオープンアクセス誌)から報告した。また、総説として英文1編、和文6編、プロトコールとして英文1編、和文1編を取りまとめた。招待・教育・シンポジウム講演等として国際2回、国外8回の発表を行った。平成26年度は、1)遺伝子ノックアウト、2)SNP置換、十数塩基挿入ノックイン、3)大規模領域(9K-bp)欠失のノックアウトを行った(Yoshimi et al. Nat Commun 2014)。平成27年度は、引続きゲノム編集基盤技術の開発として、4)長鎖一本鎖DNA(lsODN)精製法を新たに確立し、Thy1遺伝子を標的とした効率的なGFP遺伝子(1K-bp)ノックインを行った。さらに、5)二つのgRNA(はさみ)と2つのssODN(のり)を利用して、効率的に大きなサイズのプラスミドDNAをノックインすることができる2ヒット2オリゴ法(2H2OP)を開発した。2H2OP法により、大規模染色体領域(BAC:200K-bp)の標的ノックインに成功した。また、大規模染色体領域の置換(ラットCyp2d遺伝子クラスターとヒトCYP2D6遺伝子の入替え)に成功した。以上の研究成果を取りまとめて、英国科学誌Nature Communications(英国ネイチャー出版グループオープンアクセス誌)に報告した。また、関連する研究内容を査読付き英文論文7編、図書3編に取りまとめた。2H2OP法については特許出願を行った。招待講演等として国際1回、国内8回の講演を行った。平成26年度は、ラットにおけるゲノム編集として、CRISPR/Cas9を利用したノックアウト、および一本鎖DNA(ssODN)によるノックイン技術の開発を行った。そこで平成27年度は、さらに大きなサイズの遺伝子あるいは染色体領域をノックインするために、二つの新しい方法:lsODN法と2H2OP法の開発を行った。lsODNを利用して、ラットThy1遺伝子の下流にGFP遺伝子を正確にノックインすることに成功し、2H2OP法により、ラットSirpa遺伝子上にヒトSIRPA遺伝子ゲノム領域(200K-bp)をノックインすることに成功した。以上のことから、平成27年度開始当初の研究計画に一部の変更はあったものの、おおむね順調に進展していると自己評価する。平成26年度は、1)ノックアウト、2)SNP置換、十数塩基挿入ノックイン、3)大規模領域欠失を行った(Yoshimi et al. Nat Commun 2014)。平成27年度は、4)長鎖一本鎖DNA(lssDNA)によるGFPノックイン、5)2ヒット2オリゴ法(2H2OP)による大きなサイズのプラスミドおよびBAC(200K-bp)ノックインに成功した(Yoshimi et al. Nat Commun 2016)。平成28年度は、6)二つのgRNAと長鎖一本鎖のlssDNAを利用して、2箇所に同時にloxP配列をラット受精卵にノックインすることに成功した。マイクロインジェクションの代わりにエレクトロポレーションを利用することで、簡便に、効率的にコンディショナルラットを作製することができるCLICK:CRISPRwith lssDNAinducing conditional knockout allelesを開発した。また、7)昨年度に開発した2H2OPを利用することで、ラットRosa遺伝子座にGFP-DsRedをノックインした、蛍光蛋白発現レポーターラットの作製を行った。これまでの研究成果は、論文として取りまとめて、現在投稿中である。また、関連する研究内容を査読付き英文論文6編、図書4編に取りまとめた。CLICK法については特許出願を行った。その他、招待講演等として国際1回、国内14回の講演を行った。

ラットにおけるゲノム編集基盤技術として、平成26年度にCRISPR/Cas9を利用したノックアウト、および一本鎖DNA(ssODN)によるノックイン技術の開発を行った。平成27年度は、さらに大きなサイズの染色体領域をノックインするため、lssDNA法と2H2OP法の開発を行った。平成28年度は、lssDNAを利用して効率的にfloxラットを作製するCLICK法を新たに開発し、2H2OP法を利用してin vivoゲノム編集に用いるための蛍光レポーターラットの作製を行った。以上のことから、平成28年度開始当初の研究計画に一部の変更はあったものの、おおむね順調に進展していると自己評価する。本研究では、CRISPRを用いた実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術の開発を目指している。平成26年度は、1)ノックアウト、2)SNP置換、十数塩基挿入ノックイン、3)大規模領域欠失を行った(Yoshimi et al. Nat Commun 2014)。平成27年度は、4)長鎖一本鎖DNA(lssDNA)によるGFPノックイン、5)2ヒット2オリゴ法(2H2OP)による大きなサイズのプラスミドおよびBAC(200K-bp)ノックインに成功した(Yoshimi et al. Nat Commun 2016)。平成28年度は、6)二つのgRNAと長鎖一本鎖(lssDNA)を利用して、マイクロインジェクションの代わりにエレクトロポレーションを利用することで、効率的にコンディショナルラットを作製するCLICK法を開発した(論文投稿中)。また、7)2H2OPを利用することで、蛍光蛋白発現レポーターラットの作製も行った。平成29年度は、8)GFP配列をターゲットにしたgRNAおよびCas9を発現するアデノ随伴ウイルスAAVベクターを作成した。これらAAVベクターによるin vivoゲノム編集を実施した。2H2OP法によりCas9ノックインラットも作製している。最後に、9)これまで開発したゲノム編集技術により、Snca遺伝子G51D一塩基置換ラットを作製した。さらに2H2OP法により、ヒトSNCA-G51D変異型をノックインしたパーキンソン病モデルラットを作製した。ヒトパーキンソン病治療モデルとしての評価を行っている。これまでの研究成果は、論文として取りまとめて投稿している。また、関連する研究内容を査読付き英文論文5編に取りまとめた。CLICK法については特許出願を行い、PCT出願も行っている。その他、招待講演等として国際8回、国内10回の講演を行った。実験用ラットにおける新しいゲノム編集基盤技術を開発するため、CRISPR/Cas9システムを利用して、ノックアウト、SNP置換、十数bp挿入、数Kbp欠失などのゲノム編集ラットを作製することに成功した。
リーシュマニア症の伝播および病態の解明に向けた新規リスク評価システムの構築

リーシュマニア症の感染原虫種に関する研究では、LAMP法を用いた分子診断法を確立するとともに、FTAカードを用いた分子疫学調査法を確立し、エクアドル、ペルー、アルゼンチンなどの各流行地に分布する原虫種と病態との関連を明らかにすることができた。媒介昆虫に関する研究では、PCR法や新たに確立したLAMP法による大規模調査によって、いくつかの流行地で原虫媒介種を明らかにすることができた。また、同種のサシチョウバエでも遺伝的背景が原虫媒介能に影響を及ぼす可能性について指摘した。一方、タイの新興リーシュマニア症に関する研究では、血清診断用の抗原を同定するとともに、媒介昆虫の調査法を確立した。本研究では、新たな広がりを見せるリーシュマニア症の伝播機構や病態の解明を目指し、独自の研究材料を活用して“感染・病態リスク評価システム"を構築し、疫学調査を行うことを目的とする。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1)エクアドル・アマゾン地域で調査を行い、エクアドルで初めてのLeishmania (Viannia)naiffiの感染者を報告するとともに、同地域ではLutzomyia naiffiが原虫媒介種であることを明らかにした。2) LAMP法による簡便なサシチョウバエからリーシュマニア原虫を検出する方法の確立に成功し、サシチョウバエ調査における有用性を確認した。3)ペルー・アンデス地域のサシチョウバエの大規模調査を行い、その地域で蔓延するハイブリッド型リーシュマニア原虫のベクターを同定した。4)エクアドルにおけるヒト吸血性サシチョウバエ種の分布マップの作成を行った。エクアドルにおける重要種を明らかにするとともに、それらの地理的分布を明らかにした。5)エクアドルおよびペルーで異なる原虫種を媒介するサシチョウバエLutzomyia ayacuchensisのpopulation解析を行い、同一種のサシチョウバエが生息環境の変化に適応した結果、異なる原虫種媒介能を獲得することを示した。6)病態リスクファクターとなりうるリーシュマニア感染ウイルス(LRV)の検出系を確立した。感染者から採取したいくつかの検体で検出を試みたが、これまでのところ、LRV感染原虫は検出されていない。1)エクアドルに分布するサシチョウバエの広域調査を行い、ヒト吸血種およびリーシュマニア原虫媒介種の地理的分布を明らかにした。2)アンデス地域に分布するリーシュマニア原虫媒介性サシチョウバエの垂直分布について調査を行い、その分布域を明らかにするとともに、非流行地域にも同種のサシチョウバエが分布し、今後感染が拡大するリスクがあることを明らかにした。3)ペルーに分布するサシチョウバエの遺伝子バーコードを作製し、疫学調査への有用性を明らかにした。4)既存のサシチョウバエ捕集トラップを改良し、サシチョウバエ調査への有用性を確認した。5)エクアドルおよびペルーのアンデス地域に分布するリーシュマニア原虫媒介性サシチョウバエの種内の集団解析を行い、同一種のサシチョウバエがそれぞれの生息域に適応した結果、異なる原虫種媒介能を獲得することを示した。6)エクアドルのアマゾン地域および亜熱帯地域におけるリーシュマニア症の疫学調査について報告した。7)ベネズエラにおけるリーシュマニア症の臨床症状と治療に対する反応性について報告した。8)病態リスクファクターとなりうるリーシュマニア2本鎖RNAウイルス(LRV)の検出系を確立し、感染者から採取したリーシュマニア原虫にも感染していることを明らかにした。9)タイの感染者から分離された新規リーシュマニア原虫の遺伝子解析を行い、血清診断への応用を目的とした抗原タンパクを作製した。10)サシチョウバエの唾液から見つかった新規生理活性物質のユニークな機能を明らかにした。1)FTAカードに塗布した検体を鋳型に用いてLAMP法によりリーシュマニア原虫遺伝子を1時間以内に検出する分子診断法(FTA-LAMP)の確立に成功した。2)非定型の皮膚型リーシュマニア症、汎発型と播種型の症例を報告し、それぞれの病態の相違について比較検討を行った。3)我々が確立したマススクリーニング法を用いて、ペルーで流行するハイブリット型のリーシュマニア原虫を媒介するサシチョウバエ種を明らかにした。4)PCR法を用いたリーシュマニア原虫の分子診断の有用性について比較検討した。5)ペルーのリーシュマニア症流行地域において、分布原虫種を簡便に同定することができるPCR-RFLP法を確立し、現地で保管されていたスライド標本を用いて、現在の流行状況について明らかにした。6)エクアドルにおいて、これまで報告されていないリーシュマニア原虫種が分布していることを明らかにした。7)エクアドルに分布するリーシュマニア原虫の広域調査を行い、どの地域にどのような原虫種が分布しているのかを明らかにした。8)病態リスクファクターとなりうるリーシュマニアRNAウイルス(LRV)の検出系を確立し、感染者から採取した原虫での感染を調査した。9)タイの感染者から分離されたリーシュマニア原虫種の組換え抗原タンパクを作製し、簡易血清診断法を確立した。

H27年度の調査では、臨床症状を悪化させることが示唆されているハイブリッド型リーシュマニア原虫を媒介するサシチョウバエの同定に成功することができ、また、エクアドルではこれまで報告されていなかったリーシュマニア原虫の侵入を報告するなど、感染原虫種およびベクターに関する新たな知見を得ることができた。また、フィールドでも応用可能な分子診断法を確立することができ、フィールドでの分子診断に応用していく予定である。一方、タイにおける新興リーシュマニア症についても、新たな血清診断法の確立に関して見通しが立った。今後はこの方法を用いて、タイでの感染者の調査を実施するとともに、ベクター調査も展開したいと考えている。これら本年度に得られた研究成果は、今後のリーシュマニア症の疫学調査研究や感染・病態リスク評価システムの構築にも大いに貢献すると考えられる。本研究では、新たな広がりを見せるリーシュマニア症の伝播機構や病態の解明を目指し、独自の研究材料を活用して“感染・病態リスク評価システム"を構築し、疫学調査を行うことを目的とする。本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1)FTAカードを用いてエクアドルで流行するリーシュマニア原虫の広域疫学調査を行い、地域性と分布原虫の関連を明らかにした。また、病変が粘膜移行するリスクのある種L. braziliensisは、これまでアマゾン地域を中心に分布すると報告されていたが、太平洋側の地域にまで広く流行していることが明らかになった。2)これまで報告がないLeishmanialainsoni感染症例をエクアドルで初めて報告し、本種がエクアドルに広く分布していることを明らかにした。3)エクアドルにおけるリーシュマニア症の現状について、感染者、保虫動物、ベクターの面から詳細な検討を行い報告した。4)病態リスクファクターとなりうるリーシュマニアRNAウイルス(LRV)の感染調査を実施した。5)PCR-RFLP法を用いた簡便なリーシュマニア原虫の同定法を確立した。この方法はシークエンサーのような高価な設備を必要とせずで、現地の研究施設でも実施できる方法である。6)PCR法およびLAMP法を用いて、タイで流行するリーシュマニア原虫のベクター調査系を確立した7)タイで流行するリーシュマニア症に対する感度の高い血清診断法の確立を目指して標的抗原の探索を行い、患者血清に特異的に反応する抗原を同定することができた。8)タイの新興リーシュマニア症発生地においてベクター調査を実施し、分布サシチョウバエ種を明らかにした。リーシュマニア症の感染原虫種に関する研究では、LAMP法を用いた分子診断法を確立するとともに、FTAカードを用いた分子疫学調査法を確立し、エクアドル、ペルー、アルゼンチンなどの各流行地に分布する原虫種と病態との関連を明らかにすることができた。媒介昆虫に関する研究では、PCR法や新たに確立したLAMP法による大規模調査によって、いくつかの流行地で原虫媒介種を明らかにすることができた。
Weight Trainingの運動処方に関する生理・生化学的研究

本研究の目的は,体力向上に最も有効なWeight Training(WT)の運動処方について生理・生化学的立場から検討することである。被検者は成人男子(1826歳)53名で,6種類のWTプログラム:(1)Endurance(ENー2sets×16repc,n=10),(2)Explosive(EXー1×16可能な限り速く,n=5),(3)Strength(STー3×'6,n=91,(4)EES(2×15を週2回,2×6を週1回,m=10)(5)SSE(2×6を週2回,2×15を週1回,n=10),(6)CWT(Ciranit Weight Training,n=9)を週3回,8週間行った。トレ-ニングの結果,ENは筋力(6項目),筋持久力(1),VO_2max,除脂肪体重,皮脂厚(3),周径(3),EXは筋力(4),脚パワ-,除脂肪体重,周径(2),STは筋力(5),脚パワ-,トレッドミル走,周径(2),EESは脚筋力,腕と脚の持久力,腕と持久力,脚と腕のパワ-,VO_2max,VEmax,トレッドミル走,%fat,体脂肪量,除脂肪体重,SSEは腕と脚筋力,腕と脚の持久力,脚と腕のパワ-,VEmax,トレッドミル走,CWTは腕の筋力,腕と脚の持久力,腕と脚のパワ-,VO_2max,VEmax,トレッドミル走,体脂肪量,除脂肪体重においてそれぞれ統計的に有意な変化が認められた。血液は32名の被検者から提供された。トレ-ニング後,総コレステロ-ルとLDLーコレステロ-ルはそれぞれ4%と11%の有意な減少を示し,HDLーコレステロ-ルは16%の有意な増加が認められた。これらの結果から,体力各要素を向上させるためにはEN,EES,CWTが秀れたWTの運動処方であることが明らかにされた。一方,EXは運動遂行上の問題,傷害などから一般には推奬出来ない。また,WT'の血液性状に及ぼす好ましい影響が示唆された。本研究の目的は, weight training(WT)の生体に及ぼす影響を生理・生化学的立場から明らかにし,体力向上に最も有効なWTの処方を検討することである.本年度は,次の異なる3種類のWTプログラム,即ち,(1)Endurance Type(EN:2sets×16reps), (2)Exploive Type(EX:1RMの40%で可能な限り速く),(3)Stren-gth Type(ST:3sets×6reps)についてトレーニング実験を行なった.被検者に,健康な成人の男子名を採用し,無作為に3つのグループに分けた.トレーニングの頻度は週3日(隔日に),期間は8週間とした.トレーニング前・後の2回,最大O_2摂取量と呼吸循環系諸指標,筋力,筋持久力,パワー,身体組成,血清成分を測定した.トレーニングの結果,筋力(腕・脚)は3群ともに増大を示し, EN・STにおいて特に顕著であった.

筋持久力は有意な向上を示さなかったが,これは本研究では筋持久力測定の負荷に相対的負荷を用いたためと思われる.腕のパワーは3群ともに向上(1316%)を示したが統計的に有意な向上とはならなかった.一方,脚のパワーではEX(11%)とST(8%)が有意な向上を示したが, ENは脚筋力で20%の有意な増大を示したが脚パワーは有意な向上とならなかった.運動直後の平均心拍数は, EN135, EX150, ST130拍/分でそれぞれ最高心拍数の70, 74, 67%に相当する運動強度であった.最大O_2摂取量は3群とも増加したが, ENのみが有意な向上(9%)を示した.トレッドミル走も3群ともそのランニング・タイムは増大したがSTのみが有意な向上(6%)を示した.EXは高い心拍数を示したが,運動時間が短かいために呼吸循環系への寄与は他の2群より少なかった.体脂肪率は3群と減少を示したが,除脂肪体重ではENのみが有意な増加(3%)を示した.以上の結果,本研究の3つのWTプログラムから, ENが生理学的諸機能・体力要素を向上させる最も有効なトレーニング・プログラムであるということが明らかにされた.本研究の目的は、weight training(WT)の生体に及ぼす影響を生理・生化学的立場から明らかにし、体力の向上に最も有効なWTの処方を検討することである。本年度は、次の異なる3種類のWTプログラムについてトレーニング実験を行なった。(1)筋力型(筋力トレーニングと週2回、持久トレーニングを週1回、SSE)、(2)持久型(持久トレーニングを週2回、筋力トレーニングを週1回、EES)、(3)スーパー・サーキット・トレーニング(cwT)。被検者に、健康な成人男子29名を採用し、ランダムに3つのグループに分けた。トレーニングの頻度は隔日に週3日、期間は8週間とした。トレーニング前・後に最大酸素摂取量、筋力、筋持久力、パワー、身体組成、血液成分を測定し比較検討した。トレーニング後、腕と脚の筋力・筋持久力はともに全てのグループにおいて有意な向上を示した。全てのグループで最高心拍数に変化は見られなかった。体重当たりの最大酸素摂取量はEES(9%)とCWT(8%)において、有意な増加が認められた。トレッド・ミル走は全てのグループでそのランニング・タイムが有意な増大を示した。除脂肪体重では、EES(5%)とCWT(3%)のみが有意な増加を示した。トレーニングの結果、筋力・筋持久力といった筋系の機能は全てのグループで向上が見られた。しかし、体力の重要な指標である最大酸素摂取量は、EESとCWTにおいて、また、体脂肪減少においても、EESとCWTが有意な向上を示した。これらのことから、本研究の3つのWTプログラムからCWTとEESが生理学的諸機能および体力要素を向上させる最も良い、効果的なトレーニング・プログラムであるということが明らかにされた。本研究の目的は、Weight Training(WT)の生体に及ぼす影響を生理・生化学的立場から明らかにし、体力の向上に最も有効なWTの処方を検討することである。本年度は、次の異なる2種類のWTプログラムについてトレ-ニング実験を行った。;(1)フリ-ウェイトを用いたConstant resistanceWTによるSuper Circuit WT(CR)、(2)マシ-ンを用いたVariableresictance WTによるSuper Circuit WT(VR)。尚、各々のcircuit statiorの間の休息の代りに自転車こぎ、なわとび、その場かけ足、踏み台昇降を採り入れた。被験者として、健康な20歳以上の男子16名を用いた。彼らをCR,VRの2つのグル-プにランダムに分けた。トレ-ニングの頻度は隔日に3日/週、期間は8週間、時間は60分とした。
グラフ電卓を利用した中・高等学校数学科教材の開発

1.現在の中・高等学校数学教科書の中で、グラフ電卓等を利用できると思われる内容について、それらの問題を解くときに必要なグラフ電卓、電卓のキ-操作解説書を作成した。この結果、その機種にあった解説書が必要であることがわかった。2.グラフ電卓を利用する中・高等学校数学科の授業を計画・実施・分析した。その結果、グラフ電卓は中学校2年から1次関数の領域で無理なく導入できることがわかった。また、高等学校では三角関数、関数の極大・極小、関数の極限など様々の内容で利用でき、このとき問題を解く方法が画期的に変わることがわかった。3.グラフ電卓を利用できそうだと思われる内容の指導案の作成や外国文献の分析を行った。この結果、2次関数、指数関数、媒介変数、数学的モデル化など、より多くの内容で使える可能性を示した。4.小学校算数において電卓を利用する算数の授業を計画・実施・分析した。その結果、電卓は算数を楽しく、また探究的に学習する有効な道具であること、また小学校4年でも効果的に使えることがわかった。5.以上の結果を報告書「算数・数学教育における電卓・グラフ電卓を利用する教材の開発」(206ページ)としてまとめた。
社会統合の文化差についての社会ネットワークアプローチ:信頼・寛容性概念に注目して

近年、日本人はアメリカ人と比べて、他者一般への一般的信頼が低いことが指摘され、日本社会の流動性の低さによって説明されてきたが(山岸,1998など)、一方で、典型的には閉鎖的な社会として知られる韓国で、人々の一般的信頼がアメリカ人よりも高いという謎も提起されている(Sato,2006)。そこで、本研究では、人々の見知らぬ他者との関わりの文化差について捉え直し、その文化差をネットワークの違いによって説明することを目的としている。まず、見知らぬ他者との関わり方を行動レベルで測定するため、地下鉄内でフィールド・リサーチを行った。東京の地下鉄内でのべ21日分の観察を行った結果、昨年度行ったニューヨークとソウルでの観察と比較して、日本人は、席を譲る、乗り換えについて尋ねる、近くの人と会話するなどの見知らぬ人との相互作用を行わないことが分かった。日韓で行った社会調査データの二次分析を行ったところ、韓国では「他の人の視線を気にしてマナーを守る」のは、見知らぬ他者に対して肯定的な態度を持ち、他者や社会に積極的に関わる人であるのに対し、日本では、他者に不寛容で世の中のことよりも私生活を重視する人であった。以上のことから、日本では、マナーを守るという意識が他者への好意的な働きかけではなく、他者には関わらないという形で現れていることが示唆された。また、同じく日韓の社会調査データから、日本においてのみ、人づきあいが地理的に広く分散している人ほど、社会参加が不活発であることが示され、所属集団を超えた社会全体のつながりが弱いことが示唆された。韓国の大学生への質問紙調査の分析では、学校外の活動を通じたネットワークが広い人ほど、見知らぬ他者へも働きかけることが示され、韓国では、所属集団を超えたネットワークが他者一般への肯定的態度を醸成しているという可能性が示された。そこで、本研究では、人々の見知らぬ他者への態度や行動の文化差について、より広く"社会統合"という視点から捉え直すことを目的としている。1.まず日本と韓国の社会調査データの二次分析を行った結果、一般的信頼はSato(2006)の知見と一致して、韓国人のほうが日本人よりも高いことが確認された。また、クラスター分析を行うと、日本においてのみ「一般的信頼は低いが寛容性は高い群」が存在し、そのような人々がもっとも政治参加・集団加入が少なく、見知らぬ他者とは関わらないことが分かった。この知見は、SPSP年次大会プレカンファレンスにおいて発表した。これまで、異質な他者への寛容性は社会全体の統合を果たすための市民の望ましい特性とされてきた。しかし、日本人データを分析すると、他者や社会への関心が低く私生活のみを重視している人においては、寛容性が高いことが一般的信頼やネットワークサイズ、集団加入などと結びつかず、他者のことは「どうでもよい」が故の寛容となっていることが分かった(この結果は日本社会心理学会・日本グループ・ダイナミックス学会合同大会にて発表した)。2.次に、社会統合の一側面として、見知らぬ他者との関わり方を行動レベルで測定するため、地下鉄内でフィールド・リサーチを行った。ニューヨークとソウルでそれぞれのべ21日分の観察を行った結果、明らかに日本人よりも、アメリカ人、韓国人のほうが、見知らぬ他者との会話など多くの相互作用を行うことが分かった。この結果は、22年度の社会心理学会で発表予定である。
重い障害を持つ子どもと死別した高齢介護者のレジリエンスの様相

重症心身障害児(者)の高齢介護者は子どもの死別後社会との繋がりを失うことで、ソーシャルサポートを十分に受けられない現状があり、病的悲嘆へ移行するケースもある。しかし、そのような状況においても悲嘆の過程を乗り越え意欲的に社会貢献を行う高齢介護者もいる。重い障害を持つ子どもの母親のレジリエンスについての研究はなされているが、子どもと死別した高齢者介護者のレジリエンスについての報告はなされていない。重い障害を持つ子どもの死後、意欲的に社会貢献に至るまでの過程と、その過程に影響する要因を明らかにすることで、重い障害を持つ子どもを亡くした高齢介護者への支援について示唆を得ることが出来ると考える。
mRNAの不安定化によるアンジオテンシンII受容体の発現調節に関する研究

酵素法により確立した培養ラット血管平滑筋を用いて、アンジオテンシンII type1(AT1)mRNAの発現をノーザンブロット法で評価した。AT1mRNAの不安定化をもたらすシグナルはProtein Kinase C(PKC)の阻害により抑制されたこと、Phorbol esterがAng IIと同様の反応を示すことからPKCを会するものと考えられた。またForskolinやPGE1等のProtein Kinase A(PKA)を刺激する薬剤を前処置するとAT1mRNAの減少が抑制されたことからPKAはAT1に関してはmRNA不安定化を抑えるシグナルを伝えるものと考えられた。mRNAの不安定化をもたらす蛋白の存在を検索するために、Differential Display法により培養ラット血管平滑筋でAng II刺激により発現が誘導される遺伝子の検討を行った。Differential Display法により2個の既知の遺伝子と複数の未知の遺伝子の誘導が亢進することが明かとなった。これらの遺伝子のmRNA不安定化に対する影響を現在検討中であるが、未だ明かではない。培養ラット血管平滑筋を用いて、AII、thrombin、phorbol esterの刺激を行い、Northernblot analysisによりAT1 mRNA不安定化を観察している。Acinomycin Dで転写を阻害し、新たなmRNAの生成を抑制した状態で、AT1 mRNAの半減期を検討したところ、コントロールに比べて、AII、thrombin、phorbol esterの刺激により明らかに半減期の短縮を認めた。しかし、AcinomycinDの添加する時期が重要であり、AII、thrombin、phorbol esterの刺激02時間後の添加では、AT1 mRNAの不安定化は十分誘導されず、AII、thrombin、phorbol esterの刺激による新たな蛋白の転写・翻訳が必要であると考えられた。今後さらに他の情報伝達経路との関連について検討していく予定である。また、AT1 mRNA不安定化に関連した因子の探索を行うことにより、その制御機構についても検討していく。
複素多環芳香族化合物を用いた有機半導体材料の開発と応用

申請者はすでに四種のナフトジチオフェン(NDT)誘導体の合成に成功しており、それらの物性測定を行った。その結果、屈曲型NDTと直線型NDTでは大きく物性が異なっていた。これは屈曲型はクリセン、直線型はテトラセンと等電子構造であるためであると考えられ、分子構造により電子状態が変化すると考えられる。また、これら四種のNDTのフェニル誘導体をFET材料に応用したところ、いずれの化合物においても典型的なp型FET挙動を示した。しかし、そのFET特性は大きく異なっており直線状かつ、チオフェンがアンチ型に縮合した化合物が最も優れた特性を示し、分子構造によりFET特性が変化することが分かった。続いて、これらのNDTを主鎖構造に組み込んだポリマー材料の合成を行いFET特性の評価を行った。四種のNDTとビチオフェンとのコポリマーにおいてFET特性の評価を行ったところ、p型FET挙動を示したが、やはり分子構造によりFET特性が大きく異なっていた。しかし、低分子材料の時とは異なり、最も優れた特性を示した化合物は屈曲型のNDTを主鎖に持つ材料であった。高分子材料においても分子構造により特性の違いが見られたが、なぜこのような違いが生じるかを調査するため、量子化学計算を用いたトランスファーインテグラルの算出を行いった。その結果、低分子体ではいずれも薄膜中ではヘリンボーン型の充填様式であり、その構造では直線状のNDTで、効果的にHOMOが相互作用でき優れた特性を示すと考えられる。一方ポリマー材料では薄膜中でπスタックしており、その構造では屈曲型のNDTで効果的にHOMOが相互作用し、優れた特性を示すと考えられる。以上より、分子構造により分子軌道が変化し、その軌道の形状に適した充填様式があると考えられる。この結果はFET材料開発な分子設計指針を与えるものであり、FET材料開発に大きく貢献するものである。
Bisphosphonateの局所投与によるインプラント周囲骨の改善

骨粗鬆症治療薬Bisphosphonate(Bps)は、破骨細胞の活性を抑制するだけでなく、骨芽細胞にも作用し、破骨細胞形成を阻害する因子の産生を、また細胞の分化、増殖、石灰化を促進する。さらには顎骨を浸潤する口腔癌細胞の活性を抑制するとも云われている。本剤をインプラントに固定するとともにその徐放性を制御することにより、本剤の局所投与効果を発揮させることが可能になると考えられる。本研究は、インプラント周囲の母床骨を改善することにより、インプラントの適用範囲を広め、高齢者にも応用できるインプラント材を開発することを目的とし、Bisphosphonateの局所投与効果を発揮させる方法について検討した。先ず、BpsをHydroxyapatite(HAp)の結合機構をFT-IRにて解析した結果、BpsはCaイオンとの配位結合による結合様式が支配的であること、本剤の加水分解抵抗性のP-C-P構造および薬理効果部位には固定化により影響を与えず、固定後にも本剤の薬理効果は発揮できることが明らかとなった。その後、Bpsの徐放性を制御するために、担体であるHApの焼成温度を変化させ、結晶性、比表面積、溶解性を検討するとともに、焼成温度の異なるHApとBisの複合体(Bps-HAp複合体)からのBisの徐放量を測定した。その結果、焼成温度が低いほど結晶性が小さく、比表面積が大きくなり、溶解性は上昇した。また、Bps-HAp複合体からのBpsの徐放量は、HApの焼成温度が引くほど大きくなった。破骨細胞のBps-HAp複合体への投与実験を行った結果、破骨細胞の生存率は、Bps-HAp複合体投与群がコントロールと比較して有意に減少した。以上より、HApの焼成温度を制御することにより、Bps-HAp複合体からのBpsの徐放量を制御できることが明らかとなり、Bisphosphonateの薬物送達システム(DDS)による局所投与の応用の可能性が見いだされた。さらに、チタンメッシュ製Scaffbldに分子プレカーサー法にて炭酸アパタイトをコーティングする方法、およびその物性について検討した結果、炭酸アパタイトがScaffold内部までコーティングできることが明らかとなり、本コーティング膜にBisphosphonateを固定することにより、強度を必要とする部位への骨再生療法の展望が開けた。骨粗鬆症治療薬Bisphosphonate(Bis)は、破骨細胞の活性を抑制するだけでなく、骨芽細胞にも作用し、破骨細胞形成を阻害する因子の産生を、また細胞の分化、増殖、石灰化を促進する。本剤をインプラントに固定して、その局所投与効果を発揮させ、インプラント周囲の母床骨を改善することにより、インプラントの適用範囲を広め、高齢者にも応用できるインプラント材を開発することを目的とした。骨粗鬆症治療薬Bisphosphonate (Bis)は、破骨細胞の活性を抑制するだけでなく、骨芽細胞にも作用し、破骨細胞形成を阻害する因子の産生を、また細胞の分化、増殖、石灰化を促進する。

本剤をインプラントに固定して、その局所投与効果を発揮させ、インプラント周囲の母床骨を改善することにより、インプラントの適用範囲を広め、高齢者にも応用できるインプラント材を開発することを目的とした。昨年度までに、担体に用いるHydroxyapatite (HA)顆粒の結晶性の比較、SEM観察、比表面積の測定を行うとともにBis-HAp複合体からのBisの徐放量の測定を行った結果、800°Cおよび1200°C焼結顆粒は400°Cに比べて結晶性が大きく、比表面積は焼結温度の上昇により低下した。また、Bisの徐放量は、24時間後、72時間後における徐放量は、HAの焼結温度が高くなるに従って減少する傾向を示した(p<0.01)。以上の結果から、Bisの徐放量はHAの焼結温度を調節することによりコントロールできることが示唆された。本年度は、ウサギ(日本白色種、オス、七日齢)からの分離破骨細胞へのBps-HAp複合体投与実験を行い、投与後72時間での破骨細胞の生存率を調べた。Bps-HAp複合体による破骨細胞生存率実験において、Bps-HAp複合体投与群では、破骨細胞の生存率はBps400で36.1士18.2%、Bps800で58.8±20.7%、Bps1200で96.2士9.9%であった。複合体投与群であるBps400とBps800においては、コントロールと比較して有意に破骨細胞の減少が認められた(p<0.01)。以上より、焼成温度を制御することにより、Bps-HAp複合体からのBpsの徐放量を制御できることが明らかとなり、Bisphosphonateの薬物送達システム(DDS)による局所投与の応用の可能性が見いだされた。骨粗鬆症治療薬Bisphosphonate(Bis)は、破骨細胞の活性を抑制するだけでなく、骨芽細胞にも作用し、破骨細胞形成を阻害する因子の産生を、また細胞の分化、増殖、石灰化を促進する。さらには顎骨を浸潤する口腔癌細胞の活性を抑制するとも云われている。昨年度までに、担体に用いるHydroxyapatite(HA)顆粒の結晶性の比較、SEM観察、比表面積の測定を行うとともにBis-HAp複合体からのBisの徐放量の測定を行った結果、800°Cおよび1200°C焼結顆粒は400°Cに比べて結晶性が大きく、比表面積は焼結温度の上昇により低下した。また、破骨細胞へのBps-HAp複合体投与実験を行い、投与後72時間での破骨細胞の生存率を調べた。その結果、焼成温度を制御することにより、Bps-HAp複合体からのBpsの徐放量を制御できることが明らかとなり、Bisphosphonateの薬物送達システム(DDS)による局所投与の応用の可能性が見いだされた。本年度は、チタンメッシュ製スカホールドに分子プレカーサー法にて炭酸アパタイトをコーティングする方法、およびその物性について検討した。
Cu基超弾性合金の電子機器および医療機器材料への新しい展開

Cu基超弾性合金の電子および医療材料への展開を試みるため、超弾性特性の向上に有効と考えられる集合組織の形成を、特に線材、箔について、加工熱処理法による集合組織形成を検討した。また、変位センサー・圧力センサー等への応用を検討するため、超弾性効果に伴う合金の電気抵抗変化を調査し、次の知見を得た。(1)焼鈍および冷間伸線後、再結晶させることにより、<110>繊維集合組織が形成されることが分かった。特に、α相分率(8184)16β相分率の比率を有するα+β2相組織にて冷間伸線を行う事により、その後の再結晶により強烈に<110>繊維集合組織が形成することが明らかとなった。一方、<110>繊維集合組織は、線材軸方向に<110>が揃うが、軸周りではランダムな配向になるため、回復歪み量は、完全ランダム方位を有する線材と変わらない。(2)箔(30μm)についてもα+β2相組織にて冷間圧延を行う事により強烈な集合組織が形成され、特に{112}<110>集合組織が発達し、67%程度の回復歪み量が得られる。{112}<110>集合組織を有する板材あるいは箔では、現象論解析結果を用いた変態歪みの方位依存性解析より予測された圧延方向から45°回転させた方向において、9%程度の回復歪みが得られる事が明らかとなった。(3)本Cu-Al-Mn基合金は、応力誘起マルテンサイト変態に伴い、電気抵抗は上昇する。その歪み感度(歪み量変化に対する電気抵抗変化率)は6.5と大きく、一般的に歪みゲージ等に使用されているCu-Ni合金の3倍以上である事が分かった。また、Ni-Ti形状記憶合金に比べて、歪み変化に対する電気抵抗変化の直線性が良く、6%程度の歪みを電気抵抗変化により可逆的に検出できる。また、歪み感度は、マルテンサイト変態温度に大きく依存する。Cu基超弾性合金の電子および医療材料への展開を試みるため,Cu-Al-Mn系合金の溶体化後の焼き入れ速度と変態挙動の関係をフォーマスター装置にて調査し,また,超弾性を有する医療用ガイドワイヤーの手元部の高剛性化の検討およびCu-Al-Mn系超弾性箔の作製・評価を行った結果,次の知見を得た。1.60%以上の高冷間加工性を有する低Al組成合金では,約100°C/sec.より遅い焼き入れ速度においてβ→β+α変態が生じる。また,その変態挙動は,β相結晶粒径に大きく依存し,結晶粒径の減少に伴い,変態が開始する焼き入れ速度が速くなる。2.低Al組成を有するCu-Al-Mn系合金を300°C程度で低温時効することにより硬さが上昇する。低温時効による硬さの上昇は,ベイナイト変態に伴う微細なα相の析出およびβ相の規則度上昇に起因する。上述の低温時効硬化を利用し,150°C300°C範囲の温度傾斜炉を用いることによって,先端部は超弾性,手元部は高剛性といった傾斜機能化が可能であり,その試作を行った。このような傾斜機能特性を有するガイドワイヤーは,血管内での突き出し性,トルクコントロール性等に非常に優れている。3.低Al濃度のCu-Al-Mn系合金は,α+β2相組織にすることにより,80%以上の冷間圧延が可能であり,簡単に30μm程度の箔を作製できる。30μm程度の箔においても,6%程度の回復可能歪み量を有し,板材と同様,その超弾性特性は,β相結晶粒径に大きく依存する。また、Ni-Ti形状

記憶合金に比べて、歪み変化に対する電気抵抗変化の直線性が良く、6%程度の歪みを電気抵抗変化により可逆的に検出できる。また、歪み感度は、マルテンサイト変態温度に大きく依存する。
ミクロクロマトグラフィー免疫バイオセンサーの開発

免疫バイオセンサーは内分泌撹乱物質(環境ホルモン)をはじめとする環境中の微量物質の有力な分析法として期待されている。本研究は簡単な非標識高性能免疫バイオセンサーとしてミクロクロマトグラフィーバイオセンサーを提案している。上記バイオセンサーの基礎的知見を得るために、はじめに96wellマイクロプレートによるサンドイッチ酵素免疫測定法の測定範囲や再現性について調べた。次に抗原抗体複合体と遊離抗体のサイズ認識分離(SEC)を検討した。抗原にBSA、フェリチン、抗体に抗BSA抗体、抗フェリチン抗体を用いて抗原抗体複合体と遊離抗原、遊離抗体の分離挙動を高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)を用いて検討した。HPSECカラムはTSKSuperSW3000(4μm,4.6mmI.D.x30cm)を使用し移動相10mMphosphate buffer+0.1M Na_2SO_4、流速0.2mL/min,温度25°C,sample 10μLで実施した。BSAのピークが低くなり、BSAは抗BSA抗体と結合して抗原-抗体複合体を形成したことが分かった。また、複合体、遊離抗体、遊離抗原はよく分離されている。しかしながら、モノクロナール抗体を使用しても単純な1対1や1対2の複合体が形成されるのではなく、低濃度でも巨大な凝集体が形成される場合がほとんどであり、遊離での抗原抗体複合体形成の複雑さが明らかとなった。多くの酵素免疫測定法の開発においては抗原蛋白上に繰返エピトープのないあるいは少ないMAbを探しているのではなく初期段階から高感度を示すクローンを選択しているので抗原上に存在する繰返しエピトープを認識する抗体をスクリーニングしていることが示唆された。以上HPSECの抗原抗体複合体の分離実験より抗体の性質を調査することができることが明らかとなった。この方法により適切な抗体を選定することにより従来の酵素免疫測定法とミクロHPSECによる分析の、それぞれに新しい展開が期待できる。本年度は上記バイオセンサーの基礎的知見を得るために、はじめに96wellマイクロプレートによるサンドイッチ酵素免疫測定法の測定範囲や再現性について調べた。1)酵素免疫測定法の基礎的検討抗原にウシ血清アルブミン(BSA),抗体に抗BSA抗体を用いて、96wellマイクロプレートによるサンドイッチ酵素免疫測定法の基礎的検討を行った。妨害物質の顕著な影響は確認されなかった。抗体濃度が2μg/ml以下では反応生成量が少なくなるものの630μg/mlの範囲では影響はないことが分かった。抗体固定化時間について1分にまで短くするとほとんど検出できなくなるが10分以上固定化させると安定した測定結果が得られた。10ng/mLから100ng/mLが良好な測定範囲であった。2)抗原抗体複合体と遊離抗体のサイズ認識分離抗原にBSA、抗体に抗BSA抗体を用いて抗原抗体複合体と遊離抗原、遊離抗体の分離挙動を高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)を用いて検討した。HPSECカラムはTSKSuperSW3000(4μm,4.6mmI.D.x30cm)を使用し移動相10mMphosphate buffer+0.1MNa_2SO_4、流速0.2mL/min,温度25°C,sample10μLで実施した。

BSAのピークが低くなり、BSAは抗BSA抗体と結合して抗原-抗体複合体を形成したことが分かった。また、複合体、遊離抗体、遊離抗原はよく分離されている。以上マイクロプレート法で再現性と精度を確かめたBSA-抗BSA抗体系をHPSEC分離したところ抗原抗体複合体を簡単に分離定量できる可能性が示唆された。免疫バイオセンサーは内分泌撹乱物質(環境ホルモン)をはじめとする環境中の微量物質の有力な分析法として期待されている。本研究は簡単な非標識高性能免疫バイオセンサーとしてミクロクロマトグラフィーバイオセンサーを提案している。上記バイオセンサーの基礎的知見を得るために、はじめに96wellマイクロプレートによるサンドイッチ酵素免疫測定法の測定範囲や再現性について調べた。次に抗原抗体複合体と遊離抗体のサイズ認識分離(SEC)を検討した。抗原にBSA、フェリチン、抗体に抗BSA抗体、抗フェリチン抗体を用いて抗原抗体複合体と遊離抗原、遊離抗体の分離挙動を高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)を用いて検討した。HPSECカラムはTSKSuperSW3000(4μm,4.6mmI.D.x30cm)を使用し移動相10mMphosphate buffer+0.1M Na_2SO_4、流速0.2mL/min,温度25°C,sample 10μLで実施した。しかしながら、モノクロナール抗体を使用しても単純な1対1や1対2の複合体が形成されるのではなく、低濃度でも巨大な凝集体が形成される場合がほとんどであり、遊離での抗原抗体複合体形成の複雑さが明らかとなった。多くの酵素免疫測定法の開発においては抗原蛋白上に繰返エピトープのないあるいは少ないMAbを探しているのではなく初期段階から高感度を示すクローンを選択しているので抗原上に存在する繰返しエピトープを認識する抗体をスクリーニングしていることが示唆された。以上HPSECの抗原抗体複合体の分離実験より抗体の性質を調査することができることが明らかとなった。この方法により適切な抗体を選定することにより従来の酵素免疫測定法とミクロHPSECによる分析の、ぞれぞれに新しい展開が期待できる。
バイオとＭＥＭＳの融合－チャネル膜タンパクセンサの創製

本研究ではMEMS技術を利用して、小型チップ上に効率良く、安定して脂質膜を再構成できる計測プラットフォームを実現し、ロボットによる自動膜タンパク質解析システムを構築する。H23, H24年の二年間で以下の二つの課題に取り組んだ。計測プラットフォーム構築ーMEMS技術と液滴接触法の組み合わせによってマイクロ孔に安定な人工平面二分子膜を形成する。マイクロ孔中に形成した脂質膜の安定性を機械的振動や経時安定性を試験することで評価した。また接触法による高い安定性を持つ人工膜を利用して、脂質膜のアレイ化を行った。チャネル膜タンパク質の再構成ー人工脂質膜への膜タンパク質の導入は、精製した膜タンパク質をnmサイズのリポソームに再構成し、それらを平面膜上に展開することで行われる。再構成したチャネル膜タンパク質のチャネル電流計測を行なうことで人工膜中での、チャネル活性を評価した。またチャネル阻害剤を用いてチャネル開閉状態活性の計測を行い、創薬スクリーニング試験を試みた。領域内共同研究についても活発に推進した。人工膜システムによるイオンチャネル計測法が確立できたので、これを用いて抗菌性ブロックポリマーの脂質二分子膜中におけるチャネル応答挙動の解明をA02青島グループと共同で進めた。またマイクロ流体技術を他の班員の研究へ応用・展開も行った。A03竹岡グループとは均一サイズのマイクロドロップレット中でシリカ微粒子のアモルファス二次結晶の作製・光学応用、A02奥村グループとはマイクロ流路中での粘性液体の浸透・混合現象解析、A03宮田グループとはマイクロ流路中での外部刺激応答性ゲルの合成、について共同研究を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。生体分子は自発的な集合により、人為的には不可能な精緻さ・優美さでナノ構造を創る。特に脂質膜内に形成される膜タンパク質チャネルは、小分子の自己集合により数Åから数nmの超微小孔をいとも簡単に形成する。本研究は、これまでMEMS技術による創薬支援の膜タンパクチップ作製の技術基盤を応用することにより、生体分子が自己集合して作るナノチャネルをマイクロ構造中に組み込むことで融合マテリアルを創製する。特に本提案では、環境分子を一分子で計測できるバイオセンサのみならず、創薬スクリーニングシステムに展開していく予定である。膜タンパク質は細胞膜中に存在し、細胞の内外への物質輸送・排出、シグナル伝達・変換などにおいて重要な役割を果たしており、創薬の半数以上が膜タンパク質をターゲットにしている。たとえばGタンパク質共役型受容体(GPCR)に関する製薬の世界市場規模は年間約600億ドルに上り、他にもイオンチャンネルやトランスポータなど、各種の膜タンパク質の機能や特性を解明することが、基礎研究のみならず次世代の創薬・医療分野における重要な課題となっている。これまでの検討によりマイクロ構造体にチャネルを形成する方法は確立している。申請者らは微小溶液ハンドリングや並列化が得意なMEMS技術に適した膜形成法の一つとして脂質単分子膜を接触させて簡単に人工細胞膜(リン脂質膜)形成が可能であることを見いだした。しかしながら接触法により形成した脂質膜は、液滴同士が融合し壊れることがあり、その安定性は不十分だった。そこでH23年度は脂質膜の安定性向上のため、単分子膜が接触する界面に微小孔を有するパリレンフィルムを配置することで安定性の向上を目指した。その結果、形成した脂質二分子膜は所望の膜たんぱく質を保持したまま二週間以上安定であり、チャネルシグナル計測も可能であった。接触法の改良により、非常に安定な脂質二分子膜形成系が可能になった。これを利用し本年度は脂質二分子膜、および膜たんぱく質のアレイ化にとりくむことができた。その結果、16chアレイデバイスで、膜たんぱく質のチャネルシグナルの同時計測に成功した。これは創薬のハイスループットスクリーニングに発展する重要な成果と言える。

24年度が最終年度であるため、記入しない。創薬に重要な膜たんぱく質を実際に、本システムに適用可能か検証を行う。具体的には神経細胞などに多量に発現しているカルシウム依存性のカリウムチャネルを用い、人工細胞膜で薬物阻害実験を行う。