hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酢酸菌「酸化発酵」の分子基盤解析とそれに基づく「酸化発酵」能の開発

ソルボース発・ジヒドロキシアセトン発酵・酢酸発酵を中心に酢酸菌「酸化発酵」に関与する膜結合型キノプロテインやFAD酵素,及びその酸化呼吸鎖についての分子レベルの研究をすすめそれらの(1)酸化反応における電子移動経路の解明(2)新規な基質酸化反応の発見(3)細胞内資化代謝系酵素の解明などを行うとともに生化学的解析と情報科学的解析によって,これまで知られていなかった新規な酸化発酵系酵素を見いだした。グリセロールからのジヒドロキシアセトン(DHA)発酵に関与するキノプロテイン・グリセロール脱水素酵素(GLDH)が,その他の酸化発酵,特にこれまでフラボプロテインが関与すると考えられていたケトグルコン酸発酵やソルボース発酵でもその中心として働いていることが明らかになった。本研究では,このGLDHを中心に複数の酵素が同一の発酵系に関与することの生理学的意義,それらの酵素が連結して機能する酸化発酵呼吸鎖の構造,さらに酸化生成物の資化に関わる膜輸送・資化酵素系の解析を含めて,「酸化発酵」の分子機構を全般的に明らかにしようとしている。以下,22年度に得られた成果をまとめる。(1)ソルボース発酵において中心で機能するGLDHはシアン感受性チトクロムbo_3に強くリンクしエネルギー生成に関与しているのに対し,培養後期に誘導されるフラボプロテイン・ソルボース脱水素酵素はシアン耐性オキシダーゼ(CIO)と連結し機能することが明らかになっている。今回,ケトグルコン酸発酵において2-ケトグルコン酸の生成資化に関与するフラボプロテイン・グルコン酸脱水素酵素が同様にCIOと強く連結して機能することが明らかになった。(2)GLDHが関与するDHA生成反応は,別のキノプロテイン・アルコール脱水素酵素(ADH)によるグリセリン酸生成反応と競合していることを明らかにし,GLDHおよびADHを別々に遺伝子破壊することで,グリセリン酸およびDHAの生成を増進できることを明らかにした。(3)ソルボースおよびDHAの資化に関与する細胞内資化系酵素ソルボースおよびDHA還元酵素のクローニング,精製,結晶化に成功し,現在,これらの構造・機能解析を進めている。(4)酸化発酵の1つに,キノプロテイン・キナ酸脱水素酵素の関与するデヒドロキナ酸発酵がある。この酵素遺伝子の解析を行うとともに,その発酵能力を利用したシキミ酸合成系の開発に成功した。(5)酢酸菌に4-ケトアラボン酸を生成する新規な「酸化発酵」系を見いだした。グリセロールからのジヒドロキシアセトン(DHA)、発酵に関与するキノプロテイン・グリセロール脱永素酵素(GLDH)は,ソルボース発酵などその他多くの酸化発酵で機能している。このGLDHを中心にした酸化発酵系の呼暖鎖,酸化生成物の資化に関わる膜輸送・資化酵素系の解析を含めて,「酸化発酵」の分子機構を全般的に明らかにしようとしている。(1)Gluconobacter frateurii CHM43およびそめ高温適応育種株CHM43AD株はそれぞれ37°Cおよび39°Cでのソルボース発酵能を有しているが,CHM43株のGLDHは高温下でアポ化し不活性化されるが,CHM43AD株ではPQQ生成能が増加してGLDHのアポ化が防がれ,その安定性が維持されていることがわかった。また,GLDH発現量が他の酢酸菌より優位に高いことも明らかになった。(2)GLDHによって生成されるDHAの資化能を有する菌株(Gluconobacter thailandicus IFO3255)と資化能をもたない菌株(Gluconobacter oxydans 621H)が明らかになり,さらにIFO3255株から変異剤処理によってDHA資化能を失った変異株を複数分離した。(3)末端酸化酵素の1つシアン耐性オキシダーゼ(CIO)の精製とその機能解析が終わり,それがシトクロムbdと向じヘム組成をもつにも係らず酸素反応部位の構造が異なること,酸性側で機能すること,酸素に対する親和性が低いことが明らかになった。また,その人工膜小胞への再構成を行い,同時に行ったシトクロムbo3と異なり,エネルギー生成能が低いことがわかった。(4)酸化発酵に関与する新規キノプロテインの解析において,4-ケトアラボン酸を生成酵素が新規なキノプロテインであることを見いだすとともに,ゲノム解析を基づいてさらに多くのキノプロテインが存在することを明らかにした。グリセロールからのジヒドロキシアセトン(DHA)発酵に関与するキノプロテイン・グリセロール脱水素酵素(GLDH)は,ソルボース発酵などその他多くの酸化発酵で機能している。このGLDHを中心にした酸化発酵系の呼吸鎖,酸化生成物の資化に関わる膜輸送・資化酵素系の解析を含めて,「酸化発酵」分子機構の全般的な解明を目指している。以下,本年度の成果をまとめる。1Gluconobacterの多くは2つのGLDHパラログをもつことが分かってきた。

G. thailandicus IFO3255の1つのパラログGLDH (3255_0026)の遺伝子破壊は,GLDHの関与するほぼ全ての酸化活性を消失させたため,別のパラログ(3255_0236)は別の機能をもつ新規酵素であると推定された。2G. oxydans 621Hと違いIFO3255はDHA資化能を有している。今回,IFO3255ゲノム中に,621Hに存在しないDHA kinaseパラログ(3255_2003)が見つかり,この酵素がDHA資化に関与していると推定された。3フラボプロテイン・ソルビトール脱水素酵素遺伝子(sldSLC)の上流に存在する遺伝子群(sldR, xdhA, perA)の解析によって,そのXdhA(NAD依存脱水素酵素)とPerA(トランスポーター)がソルボースの取込み資化に関与していることが示唆された。4フラボプロテイン・フルクトース脱水素酵素の遺伝子工学的解析によって,他のフラボプロテイン同様,本酵素もそのチトクロム・サブユニットを介してユビキノン還元を行っていることが示唆された。5グリセロールからのDHA生成はキノプロテインADHによるグリセリン酸生成反応と競合している。今回,培地中に含まれるメタノールがADH活性を阻害することで,グリセリン酸生成を抑制し,逆にDHA生成を増進することが明らかとなった。おおむね順調であるが、以下の2点での進展が遅れている。(1)キノプロティンGLDHの複雑な基質特異性を明らかにするためには、その構造解析ができると著しく展開できる。しかし、その結晶化がまだできていない。(2)次年度には始める予定ではあるが、酸化生成物の資化能を調べる一環で、膜輸送系の解析を予定しているが、まだ始められていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)高発現でかつ安定性が高いGLDH生産菌が見つかったので、今後、その精製・結晶化を通じて、GLDHの構造解析を進める。(2)DHA資化性変異株が取得できたので、膜輸送も含め、DHA代謝系の解析を早める。(3)末端オキシダーゼの精製と再構成に成功したので、酸化発酵呼吸鎖の解析がさらに進む予定である。(4)ゲノム情報が蓄積してきたので、新規なキノプロテイン、酸化発酵系の発見を期待して、解析を進める。
大脳皮質・海馬・嗅球におけるGABAニュ-ロンの解析

主に大脳皮質のGABAニュ-ロンについて、免疫細胞化学的解析を行なった。1)単クロ-ン抗体VCI.l及びHNKーlが、GABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションの1つであるカルシウム結合蛋白パ-ブアルブミン含有神経細胞の一部を特異的に認識していることの証明。VC1.1は、ネコの視覚野をを抗原として得られた単クロ-ン抗体である。一方、HNKー1は、ヒトT cell系培養細胞の膜抗原としてつくられた単クロ-ン抗体であり、グルクロン酸と硫酸基を含有した糖鎖が抗原基であるとされている。更に、重要なことはこのHNKー1抗原基が形態形成上重要な分子である細胞接着因子(NCAM,MAG等)にかなり特異的に発現しているとされていることである。この両単クロ-ン抗体とも、成体ラット、マウスで中枢神経系かなり限られたニュ-ロン群の細胞膜近傍を認識することが報告されている。特に、大脳皮質では主に、いわゆるGABA性非錐体細胞の一部を認識するとされている。我々は、従来の大脳皮質GABA系の免疫細胞化学的解析により、GABAニュ-ロンを(1)カルシウム結合蛋白パ-ブアルブミンを含有したGABAニュ-ロン、(2)他の神経活性物質を含有したGABAニュ-ロン、(3)その他の三つのサブポピュレ-ションに分類した。これは、いわばGABAニュ-ロン細胞質に含有される物質による化学的分類である。では、細胞表面を認識するVC1.1及びHNKー1はこのような分類とはどのように関係しているのであろうか。我々がラット大脳皮質1次体性感覚野で検討したところ、VC1.1、HNKー1とも、上記のGABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションであるパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンに特異的であることが判明した。更に、VC1.1とHNKー1は、大脳皮質においては全く同一グル-プのニュ-ロンを認識していることが判明した。このことはパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンの一部は、細胞表面近傍に特異な微小環境を有していることを示している。2)ステレオロジ-による定量的解析プラスチック包埋した大脳皮質から連続した0.5μmの準超薄切片を作成し切片間距離として3μmを選びdisectorによる解析を行ない、GABAニュ-ロンがニュ-ロンの20%を占め、その約半数(10%)がパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンであることを明らかにした。本年度は主に大脳皮質のGABAニュ-ロンについて、免疫組織化学的解析を行なった。1)単クロ-ン抗体VC1.1が、GABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションの1つであるカルシウム結合蛋白パ-ブアルブミン含有神経細胞の一部を特異的に認識していることの証明。

VC1.1は、ネコの視覚野を抗原として得られた単クロ-ン抗体の一つで中枢神経系のかなり限られたニュ-ロン群の細胞膜近傍を認識することが報告された。特に、大脳皮質では主に、いわゆるGABA性非錐体細胞の一部を認識するとされている。我々は、従来の大脳皮質GABA系の免疫組織化学的解析により、GABAニュ-ロンを(1)カルシウム結合蛋白パ-ブアルブミンを含有したGABAニュ-ロン、(2)他の神経活性物質を含有したGABAニュ-ロン、(3)その他の三つのサブポピュレ-ションに分類した。これは、いわばGABAニュ-ロンの細胞質に含有される物質による化学的分類である。では、細胞表面を認識するVC1.1はこのような分類とはどのように関係しているのであろうか。我々がラット大脳皮質1次体性知覚野で検討したところ、VC1.1は、上記のGABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションであるパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンに特異的であることが判明した。このことはパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンの一部は、細胞表面近傍に特異な微小環境を有していることを示している。2)ステレオロジ-による定量的解析プラスチック包埋した大脳皮質、海馬から連続した0.5μmの準超薄切片を作成し切片間距離として3μmを選びdisectorによる解析を開始した。3)顕微測光による定量行解析本年度購入した顕微測光装置によって、蛍光抗体法に基づき蛍光量測定による単一細胞レベルでの定量解析を開始した。本年度は主に大脳皮質のGABAニュ-ロンについて、免疫細胞化学的解析を行なった。1)単クロ-ン抗体HNKー1が、GABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションの1つであるカルシウム結合蛋白パ-ブアルブミン含有神経細胞の一部を特異的に認識していることの証明。HNKー1は、ヒトT cell系培養細胞の膜抗原に対してつくられた単クロ-ン抗体であり、グルクロン酸と硫酸基を含有した糖鎖が抗原基であるとされている。更に、重要なことはこのHNKー1抗原基が形態形成上重要な分子である細胞接着因子(NCAM,MAG等)にかなり特異的に発現していることである。一方、HNKー1は、成体ラット、マウスで中枢神経系にかなり限られたニュ-ロン群の細胞膜近傍を認識することが報告されている。我々は、従来の大脳皮質GABA系の免疫細胞化学的解析により、GABAニュ-ロンを(1)カルシウム結合蛋白パ-ブアルブミンを含有したGABAニュ-ロン、(2)他の神経活性物質を含有したGABAニュ-ロン、(3)その他の三つのサブポピュレ-ションに分類した。では、細胞表面を認識するHNKー1はこのような分類とはどのように関係しているのであろうか。我々がラット大脳皮質1次体性感覚野で検討したところ、HNKー1は、上記のGABAニュ-ロンのサブポピュレ-ションであるパ-ブアルブミン含有GABAニュ-ロンに特異的であることが判明した。2)ステレオロジ-による定量的
金属錯体を経由する合成反応の理論計算に基づいた設計

ルイス酸によって促進される反応は有機合成に広く利用されている。最近、遷移金属を触媒とするエンイン環化反応が効率のよい合成反応として活発に行なわれているが、ルイス酸によるエンインの環化の報告例は少ない。我々は、ルイス酸による環化を引き起こすために、エンイン基質としてルイス酸配位可能なカルボニル基を3こ又は2こもつ反応性が高いエンインをデザインした。トリエステルまたは、ジエステル基質のルイス酸(塩化鉄、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛など)存在下での環化反応により、ハロゲン化水素付加環化合物を立体選択的に得た。本反応により、γ-ラクトン、シクロペンタン、γ-ラクタムを合成した。閉環反応の機構について、γ-ラクトン生成を例にとり、考察した。特に、環化段階におけるアルキンのルイス酸への配位と効率的環化に関する役割について、理論計算を用いて調べた。構造最適化はSCRF溶媒効果を含んだB3LYP法で行ない、基底関数として6-31G^*を用いた。モデル化合物としてエンインと臭化亜鉛の反応の計算を行なった。閉環前駆体ZnBr_2錯体において求核性アルキンの炭素がZnBr_2が配位した求電子性オレフィンの炭素を攻撃し、閉環の遷移状態を経て、双性イオンを与える。続いて、双性イオンのBr^-の分子間における立体的に有利なtrans付加が起こり、閉環中間体となる。プロトンが付加し、ブロモ-γ-ラクトンとなることがわかった。閉環前駆体において、結合が形成するC---Cの距離は2.860Åで既に短く、環化が容易に起こる構造である。閉環のエネルギー障壁は5.3kcal/molで環化が容易な過程であることがわかった。アルキンの直交する2つのp_π軌道のいずれかが空間的に自由にアルケンの求電子性中心の方向に向くことができると考えられる。双性イオンのビニルカチオン炭素とBr_2Zn-(CO_2Me)_2C-CH_3^-fのBrを3.5Åの距離に置き初期構造とし、構造最適化したところ、臭素は容易に炭素に結合した。従って、双性イオン分子間のBr^-のリレーにより、閉環中間体が生成すると考えられる。1.シクロプロパン環形成の反応機構を解明することは大変興味が持たれる。我々は1-セレノ-2-シリルエテンと電子求引性オレフィンのルイス酸存在下における反応でケイ素の1,2-転位を伴った[2+1]環化付加反応について研究を行なってきた。シクロプロパン化とシクロブタン化の選択性を解明するために理論計算による反応経路の探索を行った。構造最適化はSCRFを含んだB3LYP法で行なった。6-31G<SUP>*</SUP>と3-21G<SUP>*</SUP>からなる混合型基底関数を用いた。塩化スズにより促進されるシクロプロパン化では、Seとルイス酸金属のスズが6配位になる相互作用をする環状中間体双性イオンから、ケイ素転位と閉環が協奏的に起こり、シクロプロパンが生成することが判明した。そのΔEは+1.9kcal/molで有利な反応である。シクロブタン化の経路は、シクロプロパン化に比べΔEが高い。一方、ルイス酸ZnBr_2による反応では、中間体双性イオンで、Se-Znの配位が見られ、亜鉛は4配位の正四面体型をとっている。この中間体からケイ素転位と同時にシクロプロパン閉環が起こる。そのΔEは+13.2kcal/molであり、シクロブタン閉環の経路のΔE(+17.1kcal/mol)に比べさほど低くなく、シクロブタン形成が付随して起こる事実と一致している。2.ケテンはオレフィンと[2+2]環化付加を起こし、シクロブタノンを生成することは知られている。ケテンとオレフィンの反応で、ケテンのC=O軸が環化付加に関与するならば、オキセタンを与える。ケテンでの置換基、一置換オレフィンの組み合わせによっては、シクロブタノンよりオキセタンの方が有利に生成する可能性がある。その反応channelの優劣を分子軌道法で比較した。B3LYP/6-31G<SUP>*</SUP>でSCRFでの構造最適化を行い、反応機構を再検討した。その結果ケテンとオレフィンのオキセタン生成反応についてビス(トリフルオロメチル)ケテンの場合シクロブタノンでなくオキセタン形成が有利であることがわかった。

構造最適化はSCRF溶媒効果を含んだB3LYP法で行ない、基底関数として6-31G^*を用いた。モデル化合物としてエンインと臭化亜鉛の反応の計算を行なった。閉環前駆体ZnBr_2錯体において求核性アルキンの炭素がZnBr_2が配位した求電子性オレフィンの炭素を攻撃し、閉環の遷移状態を経て、双性イオンを与える。続いて、双性イオンのBr^-の分子間における立体的に有利なtrans付加が起こり、閉環中間体となる。プロトンが付加し、ブロモ-γ-ラクトンとなることがわかった。閉環前駆体において、結合が形成するC---Cの距離は2.860Åで既に短く、環化が容易に起こる構造である。閉環のエネルギー障壁は5.3kcal/molで環化が容易な過程であることがわかった。アルキンの直交する2つのp_π軌道のいずれかが空間的に自由にアルケンの求電子性中心の方向に向くことができると考えられる。双性イオンのビニルカチオン炭素とBr_2Zn-(CO_2Me)_2C-CH_3^-fのBrを3.5Åの距離に置き初期構造とし、構造最適化したところ、臭素は容易に炭素に結合した。従って、双性イオン分子間のBr^-のリレーにより、閉環中間体が生成すると考えられる。
炭素質コンドライト母天体の水質変成過程の探求：非晶質珪酸塩と有機物の水質変成実験

太陽系初期の無機・有機物進化を考える上で、太陽系初期の有機物が存在している環境を知ることは、様々な母天体環境での物質の進化を知ることが重要である。探査機はやぶさがS型小惑星イトカワ表面から採集したレゴリス粒子について、表面観察を行ったところ、粒子表面に、数十nmの多角形状の炭素物質が多数観察された。軟X線分光器を備え付けたFE-SEM用いて、イトカワ粒子表面の高分解能観察・軟X線分光分析を行った。結果、付着物からはC, O, Nの吸収ピークが確認され、有機物の可能性が高いことが分かった。隕石中の不溶性有機物は多くのCがグラファイトに類似した高分子が主要な構成物であることが分かっている。この付着物の軟X線スペクトル形状はグラファイトよりもポリマーのスペクトルに似ていた。結果として、この測定では有機物であることが明らかとなったが、有機物質の起源を同定するには至らなかった。また本年度は、大気のない小惑星表面上で起こる物質進化に注目し、太陽風による宇宙風化を模擬したイオン照射実験を行った。特に異なるイオンフラックスのHeイオン(4keV)ビームをカンラン石試料に照射し、照射試料の評価を行った。観察の結果、総イオン量が等しくても、フラックスが異なる場合、試料損傷も異なることが分かった。今後、試料の評価も容易なカンラン石試料について宇宙風化の発展を正確に議論することができれば、より複雑な構造を持つ水質変成を経た層状ケイ酸塩や有機物の宇宙風化模擬実験を行うことで、太陽風の宇宙風化による炭素質コンドライト母天体表面での有機物進化を議論できると期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。太陽系初期の無機-有機物進化を考える上で、太陽系初期に存在した様々な母天体環境での物質の進化を知ることが重要である。そこで炭素質コンドライト母天体とは異なり、有機物はほとんど存在していないと考えられるS型小惑星イトカワ表面から採集したレゴリス粒子について、粒子の表面に有機物や水環境の存在を示す構造を探すため、イトカワ粒子の電界放出型-走査型電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて表面観察を行った。観察の結果、粒子表面には、表面に付着しているように見える、数十nmの多角形状の物質が観察された。この物質は、サンプル保管の際の汚染物、もしくは粒子に元々付着していた物質である可能性が考えられる。汚染物ではない場合、この物質は、宇宙空間に暴露されている期間に粒子表面に付着した物質である可能性、もしくは自形をもっているようにみえることから、母天体内部で水が存在する環境で沈殿した結晶物質である可能性がある。現段階ではこの物質の元素情報などについては分かっていない。今後、AFMラマン測定等の技術を用いて、詳細な分析を行う予定である.また、イトカワ粒子の表面観察の過程で、大きさ数十nmのドーム状の構造を発見した。このドーム構造のFE-SEM,透過型電子顕微鏡(TEM/STEM)を用いた断面構造の観察を行った。結果、小惑星表面に、主に太陽風が照射されることによって形成される宇宙風化リムであることが明らかとなった。本研究の観察から、地球外物質の宇宙風化リムの表面モルフォロジーがFE-SEMによって非破壊で観察できることが初めて示された。粒子表面のリムの分布から、レゴリス粒子は、小惑星表面で衝突現象に起因する振動により破砕・移動/かき混ぜが起こっていることが分かった。小惑星表面の宇宙風化は小惑星の反射スペクトルを変化させると同時に、小惑星表面での化学進化を促す現象として重要である。今回の観察から小惑星全体の宇宙風化の進行は、天体表面で起こる振動等の活動と密接に関連していることが示された。また、上記のイトカワ粒子観察を通じて、本年度は水質変成実験生成物の観察に必要な透過型電子顕微鏡の観察技術を習得した。

今後、試料の評価も容易なカンラン石試料について宇宙風化の発展を正確に議論することができれば、より複雑な構造を持つ水質変成を経た層状ケイ酸塩や有機物の宇宙風化模擬実験を行うことで、太陽風の宇宙風化による炭素質コンドライト母天体表面での有機物進化を議論できると期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。水質変成実験に関して必要な透過型電子型顕微鏡の技術習得を行った。また、実験に必要な装置導入、MgO-SiO_2を用いた水質変成予備実験が進行している。ただ本年度はイトカワ粒子の観察を主要な分析対象としたため、実験計画からやや遅れている。本年度を通じて、実験試料観察に必要な透過型電子型顕微鏡の技術習得を行った。また、MgO-SiO_2を用いた水質変成予備実験を行った。来年度、Fe、有機物を含めた出発物質を使用した水質変成実験を行う計画である。
権威主義体制のガバナンス向上と議会の役割に関する比較研究―湾岸産油国を中心に

クウェートとバーレーンを対象に、議会における野党勢力の政府に対する説明責任要求と、それに対する政府の対応を中心に、議事録や各種報告書、報道等のテキスト分析と関係者への聞き取り調査を行い、成果として、権威主義体制下であっても、議会での野党勢力の要求を通じて、汚職対策政策を中心に、政府の対応としてガバナンス向上への取り組みを引き出しうることが確認された。しかしながら、政府の対応の程度については、議会の権限、政府の政策にどの程度拒否権を行使しうるか、制度的な制約に加え、政治の司法化によって、司法の独立性にも左右さつつある点について留意する必要があり、引き続き、今後の課題としたい。研究計画の2年目にあたる本年度は、議会議事録や委員会報告書、官報などの公文書、報道アーカイブ資料の収集と分析を昨年度から継続して行った。現地調査について、クウェートでは7月に実施された第15回国民議会選挙に際し、Kuwait Transparency Societyが取りまとめ役となった国際選挙監視団に参加して、立候補者や議員経験者、政府関係者への聞き取り調査を行った。また、国際選挙監視団に参加していたアラブ各国のTransparency Society関係者や学識経験者との意見交換によって、透明性と説明責任の評価基準や、クウェートおよびバーレーンのガバナンスに対する相対的な評価を把握することができた。バーレーンでは政治的な情勢から野党の活動について現地調査が困難と思われたため、代替的に上述の国際選挙監視団に参加していたバーレーンのTransparency Societyメンバーや、英国で開催されたGulf Research Meetingに参加していた元議員らに聞き取り調査を行った。クウェートの調査に関しては、憲法裁判所の違憲判断が政治プロセスに大きく作用しており、政府と野党の双方が政策やそのもととなる関連法の妥当性について司法判断を仰ぐ傾向が強まっていることが確認された。この点に関する研究成果として、日本比較政治学会において「アラブ諸国の政治変動における司法の役割:エジプトとクウェートにおける議会解散をめぐる政治過程」という題目で研究報告を行った。本報告ペーパーを基に論文を執筆し、ジャーナルへ投稿の予定である。本年度は、二次文献資料の収集と分析を経常的に行った。現地でのインタビュー調査と一次資料収集については、バハレーンにおける政治状況と研究環境が厳しくなったため、止むを得ずクウェートに限定して行った。クウェート調査では解散に伴い12月に実施された国民議会選挙について、最高国民選挙委員会より選挙監視員の資格を得ることができたため、内務省選挙事務局と各投票所内での観察調査と、事務運営担当者や選挙管理者(裁判官)、立候補者の代理人、運動員等への聞き取り調査を行った。この調査によって、選挙プロセスについて、事前準備の段階から投開票までの実態を把握することができた。7月の英国への海外出張ではケンブリッジ大学で開催されたGulf Research Meeting 2012のワークショップ"The Arab Spring: Impacts and Consequences on the GCC"にて研究報告を行ったほか、エクセター大学で開催されたGulf Conference 2012に参加し、湾岸諸国を専門とする各国の研究者やアナリストらと意見交換を行うことができた。研究成果としては、非民主主義体制における議会の役割という観点から分析を進め、6月の日本比較政治学会において「中東湾岸君主国における議会の役割」という題目で研究報告を行い、議員たちが政府や王族による不透明な利益配分に対し、閣僚への問責質問権を積極的に活用し、行政に対する監視機能を果たしていることを明らかにした。報告内容は論文「中東湾岸君主国における議会政治の展開」として学内紀要に収録されたほか、2月に刊行された単著『中東湾岸諸国の民主化と政党システム』(明石書店刊)の内容の一部にも反映されている。研究計画の3年目となる本年度の計画は、継続調査として、議会や選挙活動における野党勢力からの汚職批判や説明責任と透明性向上といった要求に対し、政府側の対応とガバナンス向上への取り組みについて分析をすすめること、前年度までの現地調査の後、分析を通じて生じた新たな問題点について確認のための現地調査を行うこと、研究成果をまとめて刊行するための準備に取り組むことであった。継続調査については、前年度までの現地調査および収集した資料の分析を進めた。クウェートでは会計検査院とは別の汚職対策機関の設置が進められていたため、その設立過程や実際の職掌がどのようなものであるかについて収集した公開情報を整理し、現地調査で関係者に聞き取りを行って分析を進め、政府の取り組みとして評価できるものの、実際の権限に不明な部分が多く、実効性については今後の推移を見ていく必要があることが明らかとなった。バハレーンに関しては、2014年11月に実施されたバハレーン下院選挙の時期に合わせて、候補者の選挙活動についての参与観察を行い、またTransparency Society等の現地組織関係者や識者、議員経験者との意見交換を通じて、政府のガバナンス向上への取り組みに対する評価についておおまかな傾向を把握することができた。研究計画の3年目にあたって、本年度はシンポジウムや海外学会での成果発表に注力し、研究成果をまとめるにあたって有益なフィードバックを受けることができた。最終年度にあたる今年度は、前年度までの現地調査の成果をもとに、クウェートでは、独立の汚職対策機関の設置をめぐって、議会での審議には時間を要したものの、議員が政府を押し切って会計検査院と同等の独立性を付与することに成功した政治過程についてまとめ、権威主義体制におけるアカウンタビリティという分析枠組みの中で、日本政治学会にて「レンティア国家における政治参加はガバナンスの向上をもたらすか:中東湾岸諸国における腐敗防止と議会・司法の役割」という題目で報告を行った。

研究期間全体通じた成果としては、権威主義体制下であっても、議会における野党勢力の要求を通じて、汚職対策政策を中心に、政府の対応としてのガバナンス向上の取り組みを引き出していることが確認された。ただし、政府の対応の程度は、野党がどれだけ政府の政策に拒否権を持ちうるか、制度的な要因に制約される点、政治の司法化によって、司法の独立性にも左右されている点について留意する必要があり、今後の課題としたい。クウェートとバーレーンを対象に、議会における野党勢力の政府に対する説明責任要求と、それに対する政府の対応を中心に、議事録や各種報告書、報道等のテキスト分析と関係者への聞き取り調査を行い、成果として、権威主義体制下であっても、議会での野党勢力の要求を通じて、汚職対策政策を中心に、政府の対応としてガバナンス向上への取り組みを引き出しうることが確認された。しかしながら、政府の対応の程度については、議会の権限、政府の政策にどの程度拒否権を行使しうるか、制度的な制約に加え、政治の司法化によって、司法の独立性にも左右さつつある点について留意する必要があり、引き続き、今後の課題としたい。本年度も資料収集と分析についての進捗はおおむね見込み通りであった。現地調査についても、一時は政治情勢も懸念されたバハレーンにおいて、研究協力者とともに調査を実施することができた。成果の発表の面では、今年度は海外での学会報告、国際シンポでの報告を行い、最終的な研究成果の取りまとめにむけて有益なフィードバックを受けることができた。以上から、現在までの達成度については総合的にみておおむね順調に進展している。比較政治学研究成果をまとめる段階にあるが、ジャーナルに投稿するにあたり、司法の役割に着目した類似の研究が最近になって出てきているため、研究動向に注意を払いつつ執筆作業を進めたい。現地調査についても、昨年度に拡大・構築できた現地との研究協力関係をもとに、議会のパフォーマンス向上に関わる議員の活動について、より細かな聞き取り調査を実施することができた。政府のガバナンス向上への取り組みについても、各kTransparency Societyの評価レポートや担当者への聞き取り結果をもとに、野党議員の活動との関連性を検討をすすめる段階に至った。バーレーンでの現地調査は本年度も困難な状況であったが、代替的な手法で聞き取りを行うことができた。研究成果に関しては、本年度も学会報告を行い、報告ペーパーを基に論文投稿をすすめている段階にある。他方で、バハレーンについては二次文献資料の収集と分析および英国出張時に海外研究者との意見交換を行うことはできたものの、現地調査を行うことはできなかったため、当初の見込みほどには研究を進展させることはできなかった。研究成果としては国内と国外で各1回研究報告を行った。
シアノバクテリアの時計タンパク質による概日時間の生成機構

概日時計は生命の活動を地球の昼夜サイクルに正確にフィットさせている。その仕組みは細胞の遺伝子発現制御によると考えられていたが、シアノバクテリアの3つのKai蛋白質は試験管内で安定した24時間周期の概日リズムを示し、その周期と温度補償性はKaiCのATPase活性が規定している。本研究ではこの時計蛋白質に埋め込まれた概日時計のメカニズムを解明し、その最終的理解を得るため、突然変異体を利用したKaiCの生化学的解析と構造生物学的解析をおこなった。その結果、KaiCが機械式振子時計のように時を刻んでいる新たな概日時計のモデルを提案することができた。さらに真核生物の概日時計についても同様な可能性を検討している。本研究課題の目的は,シアノバクテリアのKaiタンパク質時計を題材に,概日時計の最も基本的な発振原理を解明し,さらには情報処理能力を備えたタンパク質ファミリーの存在や生物学的意義について検討することである.本年度は,次の4つの点について研究を展開した.1)KaiCのATPase活性とリン酸化サイクルのメカニズムKaiCのATPase活性は,概日リズムの振動数と比例しかつ温度補償されているという事実からも極めて重要である.周期を決定するATPaseがkinase活性およびphosphatase活性とどのようにカップリングしているかを解明するため,各種変異体を用いた詳細な生化学的活性測定を行った.2)KaiCの構造生物学的解析/生物物理的機能解析構造解析に向けた準備として,Kaiタンパク質および各種変異体の調製方法を最適化した.また,整備された蛍光計測システムを用いてKaiCの概日揺らぎを計測し,KaiCの動的な構造変化をアミノ酸レベルでピンポイント計測した.さらに,酵素活性の制御工学的解析等を行った.3)細胞内でのKaiCリン酸化サイクルの動態KaiCリン酸化サイクルの同調がKaiAの相対濃度の変化によっておこる可能性を明らかにした.4)真核生物のKaiCホモログの探索KaiC様の情報処理機能を備えたタンパク質の候補としてATPase群を広範囲に1次スクリーニングし,幾つかの候補について,2次スクリーニングを行った.本研究課題の目的は,シアノバクテリアのKaiタンパク質時計を題材に,親日時計の最も基本的な発振原理を解明し,さらには情報処理能力を備えたタンパク質ファミリーの存在や生物学的意義について検討することである。昨年度に引き続き,本年度も次の4点について研究を展開した。1) KaiCのATPase活性とリン酸化サイクルのメカニズムKaiCのATPase活性は,概日リズムの振動数と比例しかつ温度補償されているという事実からも極めて重要である。周期を決定するATPaseがkinase活性およびphosphatase活性とどのようにカップリングしているかを解明するため,各種変異体を用いた詳細な生化学的活性測定を行った。特に2つのATPaseの活性の分別について様々な検討を行った。2) KaiCの構造生物学的解析/生物物理的機能解析高精度蛍光計測システムを用いてKaiCのATPaseドメインの概日揺らぎを計測し,その動的な構造変化をアミノ酸レベルで計測した。さらに, ATPase活性の制御工学的解析等を推進し,その緩和過程に概日スケールの時定数が織り込まれていることを証明した。その時定数の分子科学的起源を突き止めるため, 2オングストロームを切る高精度の構造解析を行い,制御メカニズムの同定に取り組んだ。3)細胞内でのKaiCリン酸化サイクルの動態KaiCのC端のリン酸化機構を解明した。また変異KaiCのハイブリッドを解析し六量体構成の機能を解析した。4) KaiCホモログの探索KaiC様のタンパク質群を広範囲に1次スクリーニングした。本研究課題の目的は,シアノバクテリアのKaiタンパク質時計を題材に,概日時計の最も基本的な発振原理を解明し,さらには情報処理能力を備えたタンパク質ファミリーの存在や生物学的意義について検討することである.本年度も次の4点に注力して研究を進めた.1) KaiCのATPase活性とリン酸化サイクルのメカニズムKaiCのATPase活性は,概日リズムの振動数と比例しかつ温度補償されているという事実からも極めて重要である.各種変異体を用いた生化学的活性測定を行い, ATPase活性とkinase/phosphatase活性の関係性について詳細に調べた.また,計測機器(UPLC)の自動測定機能を利用し,再現性,感度・時間分解能を向上させることにより, ATPase活性の時間変化を正確かつ再現性よく記録できるようになり,この高精度データから生物時計の時定数を見積もることに成功した.とくに高い再現性をもつ温度切り替え装置を開発し,懸案であった2つのATPase活性の分別が可能となった.2) KaiCの構造生物学的解析/生物物理的機能解析KaiCの諸活性を計測する際,その単量体を安定的に取り扱う技術が必要不可欠となる.種々の安定化剤についてスクリーニングを行い,機能を保った状態でKaiC単量体が保持されるよう溶液条件を最適化した.また, KaiC変異体について2オングストロームを切る高精度の構造解析を行い, KaiCに織り込まれている時定数の分子科学的起源の一端を突き止めた.3)細胞内でのKaiCリン酸化サイクルの動態KaiCのC2ドメインにおいてADPがATPと交換されるプロセスが,リン酸化反応を促進することを発見した.4) KaiC突然変異体の系統的解析を進め,周期を調整する変異体のほかに, 2つのATPaseの共役の変異体, CIIの駆動力低下変異体を分離し,解析を進めた.5)哺乳類におけるKaiCホモログの探索

昨年度よりも探索範囲を広げて, KaiC様の蛋白質群をスクリーニングした.シアノバクテリアの3つのKai蛋白質はATPとともに混合するだけで安定した24時間周期の概日リズムを示す。その振動の周期や温度補償性は2つのATPaseから構成されるKaiCが規定している。本研究ではタンパク質に埋め込まれた概日時計の最終的理解を得るため、突然変異体を利用したKaiCの生化学的解析と構造生物学的解析を行い、以下の4点を目的としている。(1)このタンパク質に潜む、安定した概日振動発生機構を解明すること。(2)生命がいかにして24時間という地球の自転周期をタンパク質分子内に記憶したかをタンパク質構造をもとに理解すること。(3)細胞内でどのように多くの生理機能の時間的統合が実現されているかを、6量体の機能として解明すること。(4)真核生物で同様の可能性をさぐること。27年度は極めて弱いKaiCのATPaseをできるだけ高い時間分解能で測定し、CIとCIIのATPase活性を分別する可能性のある測定精度を得た。さらに温度などの測定条件を再現性よく行う装置も開発し、この方法を多数の周期変異体、CIとCIIの相関を司る脱進器機構の変異体、およびリン酸化サイクルの変異体に適用し、KaiCタンパク質による時計機構のモデルを提案した。さらに、CIIドメインのATPase活性が脱リン酸化反応を進めるための重要な素反応であることを示した。また、KaiC単独のATPase活性が減衰振動を示すことを見出し、その解析から振動成分の固有振動数が野生型で0.91/日と見積もられた。KaiCの周期変異体を用いて研究を行ったところ、KaiCの固有振動数がKaiAとKaiB共存下のリン酸化リズムや転写翻訳リズムの振動数と良い一致を見せることを見出した。1日に1020個のATPという極めて弱い低いKaiCのATPase活性はKaiCが時計機構の中核であることと不可分であると考えられるが、その機能の解析には温度変化や基質の投与などへの応答を詳細に調査することが不可欠である。またKaiCは時定数を規定するCIとリン酸化サイクルを行うCIIからなっており、それぞれが異なった動きを示す。さらにこの2つの活性は相互に作用し計時機能を実現しており、その機能の検定には本来の動作を保証した条件で、温度など変更に伴う変動を追跡する必要がある。そこで高性能液体クロマトグラフ(UPLC)を細心の注意で自動運転し、活性を追跡することでKaiCの2つのATPase活性の分別測定への道を開いた。この技術的改良により、2つのATPaseのカップリングの解明に道が拓け、我々が提案したモデルの検証が可能となった。一方、KaiCの固有振動数と密接に関係しているATPase活性の制御機構を調べるため、KaiCのN末端ドメイン(CI)のX線結晶構造解析に取り組んだ。野生型に加えて周期変異体を含めた計9個の構造解析を従来よりも高分解能で行ったところ、「遅さの根源となる局所構造」や「温度補償を実現する分子構造の対称性破れ」等
ヘリコバクターピロリ定着に影響を与える胃粘液糖鎖構造の変化

高分子糖蛋白質を構成成分とする胃粘液は、Helicobacter pylori(H.pylori)の生息部位であり、その糖鎖構造が菌体の定着に影響を及ぼすことが考えられている。本研究において、動物間で認められる糖鎖構造の違い、あるいは薬物処理により変化を受けた胃粘液糖鎖構造がH.pylori定着にどのように影響するかを検討した。ヒト、ラット、マウス、スナネズミ、ウサギ、ブタ、カエルの胃粘液中の中性ムチン、酸性ムチンやシアル酸、硫酸基、フコースおよびルイス^b(Le^b)を含むムチンを組織学的に染め分けて検討した結果、胃粘液糖鎖構造において種差が認められ、H.pyloriの実験動物に対する定着制は胃粘液の糖鎖構造により影響されるものと考えられた。また、ムチンとH.pylori(患者由来)の結合糖鎖について、ブタ由来胃ムチン(和光純薬)を吸着させたELISAプレートに各種レクチンおよび抗ルイス^b抗体を添加し、H.pyloriの結合に及ぼす影響を検討した。UEA-IおよびMAL-IIレクチン、抗ルイス^b抗体の添加で結合は有意に阻害され、フコース、シアル酸およびLebはいずれもH.pyloriの定着に影響するものと思われた(論文作成中)。さらにアスピリンの5日間連続投与により表層粘液中のシアル酸含量が著しく増加したことからH.pyloriの定着に影響することが予想された(第97回米国消化器病学会発表、第5回欧州消化器病学会発表、投稿中)。現在、この胃粘液を分離・抽出して精製ムチンを得ており、アスピリンがH.pylori定着にどのように影響するのかを検討する予定である。
可塑性の高い状態にある樹状突起の可視化の試み

神経細胞は、発生過程を経て極めて複雑な形態を取る。情報の出力に働く軸索は、標的細胞に発現する分子の分布に依存して軸索枝を伸ばしてその形態を獲得すると考えられる。情報の入力に働く樹状突起は、中枢での領域に依存して特徴ある形態をした幹の樹状突起を伸ばし、続いて小さいな枝となる樹状突起を伸ばして成熟した樹状突起の形態を獲得する。後者の小さな枝の形態は、年齢とともに変化したり、シナプスの分子的可塑的変化に続き変化することからも、中枢神経可塑性の基盤となることが想像される。しかしその形態形成の基盤となる分子の研究は、白紙に近い状態にある。どの様にして幹となる部分が形成され、可塑性の高い状態にある樹状突起側枝が形成されるのかを探る目的で、樹状突起の主要分子であるMicrotuble-Associated Protein2(MAP2)に着目して研究を進めた。MAP2は、には、同一遺伝子からの選択的スプライシングによって生じた高分子量(HMW MAP2; MAP2a/b)と低分子量(LMW MAP2; MAP2c/d)のスプライシング・バリアント(SV)がある。近年さらに10種以上のMAP2-SVが見つかり、これらの発現は時間的、空間的な調節を受けていることが知られる。これまでに、それぞれのSVの分布を可視化する目的で、エキソンの繋ぎ目に対する特異抗体の作成と、エキソンの繋ぎ目に対するin situ RT-PCRの技術の確立を目指して努力してきたが、まだ成功には至っていない。それゆえ本年度は、新しいMAP2-SVの探索とその記載に終始した。我々はヒト胎児脳(2130週齢)cDNA試料からのPCRと5'-RACE、およびラットE16、E17胚の脳から得られたmRNAのRT-PCRによって新規MAP2-SVを複数クローニングした。この中には新規エキソンを持つもの、いくつかのエクソンを欠き、MAP-kinaseの制御を欠くSVも新たに見つかった。
親和性成熟に伴う抗体の抗原認識機構変化と動的構造変化の解明

抗ニトロフェニル(NP)抗体の親和性成熟型の1つC6について、その一本鎖Fv(scFv)抗体とNPとの複合体の結晶化に成功し、高分解能で立体構造を決定した。既報の親和性成熟前の抗体N1G9の結晶構造と比較し、抗原結合親和性向上の要因を解明した。特に成熟の鍵となる抗体重鎖95番のアミノ酸残基の役割について、主に同残基に続くループ構造に与える影響から、初めてその構造基盤を明らかにした。なお本成果は、近日中にも論文投稿する予定である。また着目する重鎖95番をC6と同じくGlyとして、他のアミノ酸配列を系統的に変えて親和性成熟の分子機構を解明すべく、9TG、9T7、9T13(この順で親和性成熟が進行)という一連の抗NP scFv抗体、さらにC6から成熟が進んだE11 scFv抗体を創製した。E11 scFv抗体については、蛋白質発現後のリフォールディングに問題があり、十分な構造形成に至っていない。一方、9TG scFv抗体については、適切な構造形成を確認し、等温滴定熱量計を用いた抗原結合解析や示差走査熱量計を用いた熱安定性解析などを行った。その結果、抗原結合定数はC6 scFv抗体よりも1桁以上小さく、予想される結果となった。一方、熱安定性は、抗原結合前、結合後ともに、N1G9 scFv抗体と同様に高く、N1G9とC6で示した先行研究の結果を支持した。9T7や9T13の各scFv抗体の試料調製も進め、親和性成熟という尺度で、抗原結合活性と安定性のトレードオフが認められるかの検証を進めている。親和性成熟過程にある各種scFv抗体の発現、精製にあたって、E11 scFv抗体の調製に問題が生じているが、9TG scFv抗体の調製に成功し、抗原結合能や熱安定性の解析を行い、一定の成果を挙げることができた。またC6 scFv抗体を用いて抗原との複合体の結晶化に成功し、高分解能の立体構造情報を得たことは、当初の計画以上の進展である。当初の計画通り、系統的な親和性成熟過程にある9TG、9T7、9T13の各scFv抗体を調製し、個々の抗原結合能と熱安定性を解析し、N1G9とC6の結果に基づき論文報告した結合と安定性のトレードオフの一般性を検証する。さらに各scFv抗体の結晶化も行い、結合と安定性の構造基盤を解明する。またNMRやX線1分子回折実験(DXT)による動的構造解析も進め、アンサンブル量と1分子解析結果を相関付け、各scFv抗体の抗原結合能や安定性における動的構造の寄与を評価する。

またNMRやX線1分子回折実験(DXT)による動的構造解析も進め、アンサンブル量と1分子解析結果を相関付け、各scFv抗体の抗原結合能や安定性における動的構造の寄与を評価する。
Ｕｂｅ３ａ遺伝子座における超長鎖非コードアンチセンスＲＮＡの構造・機能解析

次世代シーケンサーによるRNA-seq配列解析を続行した。サンプルは独自に樹立した遺伝的多型を有するES細胞(C57BL/6とMSM/Ms間のF1亜種間雑種ES細胞:C57BL/6(B6)が父親、MSM/Ms(MSM)が母親の組み合わせ)をin vitroで神経細胞へ分化させたものである。Ube3a遺伝子座におけるアンチセンスRNAはUbe3a遺伝子センス鎖の転写単位の領域に於いて転写されたアンチセンスRNAが蓄積をしていることが昨年までの解析で判明しているが、Ube3a遺伝子座を含む近傍のゲノム刷り込みされた領域全体を解析すると、(Ube3a遺伝子からみて下流の方向に)3Mb離れた領域からアンチセンス鎖側からの転写が断続的に行われている様子が判明し、更に広い領域でゲノム刷り込みが制御されていることが示唆された。今年度は、母親と父親の組み合わせが逆のES細胞(母親がB6、父親がMSM)のRNA-seqも行い、確実にゲノム刷り込みが起きている様子を確認した。アンチセンスRNA転写単位同定の試みの1つとしてRNAポリメラーゼIIのChIP解析も行い、現在、次世代シーケンサーによる配列を解析中である。また、アンチセンスRNAを条件的にノックダウンするためのコンストラクトを作製し、ES細胞の染色体に組み込むところまで終了した。今後、Ube3aアンチセンスRNAの発現とUbe3aセンス鎖の(母親由来のみの)片アレル発現の関係を解析する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。in vitro分化系で誘導した神経細胞ではRNA-seqの結果、Ube3a遺伝子はほとんどが母親由来の染色体から転写されたものであり、Ube3aアンチセンスRNAは父親由来の染色体から転写されたものが優勢であった。更にcDNA作製時にoligo dTプライミングを行わないことによりポリA鎖を持たないRNAを用いて配列解析を行ったところ、Ube3aアンチセンスRNAのほとんどがポリA鎖を持たないRNAとして細胞内で存在していることが判明した。また、アンチセンスRNA自体は(イントロンを含む)Ube3a遺伝子座全体に渡って存在しており、Ube3a遺伝子座の下流領域からsteady-stateで蓄積していることが観察された。すなわち見かけ上はUbe3a遺伝子座の少し下流から転写が始まっているように見える。次世代シーケンサー(イルミナHiseq2000)による配列解析では配列決定はペアエンドで行っているため、現在、ペアエンド間でゲノム上の距離の離れた配列やイントロンを含む配列の存在を解析中である。Ube3aアンチセンスRNAの転写単位を同定する為の方法としては次世代シーケンサーによるものしか行えていないが、転写単位をより正確に決めるためにはPolIIのChIP解析が有効であると考え、in vitro分化系においてちょうどUbe3aアンチセンス転写が始まる時期において検討中である。また、ゲノム刷り込み研究において亜種間雑種F1個体の遺伝的多型を用いた解析ではF1固体の親の組み合わせを変えても同様の結果を得ることが必要な条件となっている。計画では25年度において(昨年度用いたES細胞とは逆の親の組み合わせである)C57BL/6が母親、MSM/Msが父親由来のES細胞を樹立し、更にはin vitroにおける神経細胞への分化系の確立を行い、実験の再現性を検討する予定であったが、24年度中にC57BL/6が母親、MSM/Msが父親由来の新しいES細胞を樹立し、in vitroにおけるUbe3a遺伝子のゲノム刷り込みを確認した。現在、このサンプルもRNA-seq解析中である。以上のように遅れている部分と進んでいる部分があり、おおむね順調である。現在、Ube3aアンチセンスRNAが存在している領域から候補を選び、アンチセンスRNAのノックダウンコンストラクトを作成中である。主にUbe3a遺伝子座の反対鎖領域、及び少し下流領域から選んでいる。アンチセンスRNAが発現を開始するのはin vitro分化系においては神経細胞前駆体が神経突起を伸長させる時期と一致している。

薬剤添加による発現制御されたshRNA発現ベクターをES細胞に組み込み、アンチセンスRNAが上昇する時期にノックダウンを試み、Ube3a遺伝子の組織特異的ゲノム刷り込みへの影響を解析する。また、同時期からのサンプルでPolIIのChIP解析を行うことによりアンチセンスRNAのプロモーター領域の同定を試みたい。Ube3aアンチセンスRNAはUbe3a遺伝子座から数百Kbも下流であるSnurf/Snrpn遺伝子座領域から転写されているとの報告もあるので、RNA-seqの配列データのペアエンド配列を詳細に解析することにより、実際にアンチセンスRNAがそのような距離が離れたところから転写されている証拠となるペアエンドが存在するかなどを含めた詳細な配列解析を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。