hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
初期胚の神経組織形成および体節形成過程における転写制御因子SIP1の機能解析

我々のグループによって作製されたδEF1ノックアウトマウス(以下、KOマウスと略す)においては、四肢、肋骨、頭蓋骨の骨形成の異常、特にその四肢骨の表現型はBMPファミリーの一つである、GDF5の欠損マウスと極めて類似していたこと等から、BMPシグナル系との関連が示唆されていた。最近のδEF1に構造と機能が類似したタンパク質として、SIP1が単離されてきた。SIP1は、BMPやアクチビン等を含むTGF-βシグナル系の細胞内シグナル伝達因子Smadと結合する因子として単離された。SIP1はその標的配列がδEF1と同じであること、胚発生過程における発現がδEF1と大部分重なっていることから、δEF1 KOマウスの表現型もSIP1の機能的補償によって緩和されている部分が多くあると予想される。我々はこのδEF1/SIP1ファミリー全体としての機能を知る目的で、SIP1 KOマウスも作製した。その表現型の形態的特徴は(1)turningしない、(2)神経管が閉じない、(3)体節が78体節以上形成されず、形成された体節も形が小さく不規則である。といったものであり、神経組織形成、体節形成への関与を示唆するものであった。上述したように、δEF1とSIP1はタンパクとしての構造やその活性が類似し、且つ標的配列が同じであることを考えると、それぞれのKOマウスにおいてはお互いが機能を補償し合っている可能性が高いと思われた。そこで、胚発生過程におけるδEF1とSIP1の機能の個性と共通性、およびそれらのTGF-βシグナル系との関連性について、まずδEF1/SIP1二重ホモ変異マウスを作製しその表現型を観察することを試みた。その結果、δEF1/SIP1二重ホモ変異マウスでは、SIP1ホモ変異マウスと同様に、ほぼ胎生8.5日まで発生し、体節や神経管等の表現型をともなった様相を示した。これは初期胚発生においてはSIP1がより重要な役割を担っていることを示している。しかしながら、δEF1/SIP1二重ホモ変異胚では、それぞれの変異胚と較べると、神経板の形態が異常であり、そこでのSox2の発現がより顕著に減少していた。このことは、δEF1がこの時期の神経板においてSIP1と強調してSox2の発現を制御していることを示唆している。一方、胎生12.5日のδEF1ホモ;SIP1ヘテロ変異マウスにおいては上顎突起や鼻中隔の融合不全が観察された。これはSIP1ヘテロ変異のみでは全く顔面形成は正常であること、δEF1ホモ変異に観察された二次口蓋裂が起こる時期より早く、極めて重篤な顔面形成の阻害を示した強調された表現型になっていることから、この組織においてδEF1とSIP1がそれぞれ協調的に働いていることが明らかとなった。我々のグループの大きな目標はZFHX1(δEF1/SIP1)ファミリーの生体内における機能、特に胚発生過程での機能を、個体を用いながら且つ分子レベルで明らかにすることにあるが、特に本研究では、SIP1転写因子に注目し、その初期胚神経組織過程および体節形成過程における機能を明らかにすることを目的としている。我々はすでにSIP1遺伝子のノックアウト(以下KOと略)マウスを作製しその解析を行って来た。その結果、SIP1KO胚は胎性9.5から10.5日で致死となり、神経管の開裂と神経堤細胞の一部欠失を示す。また体節は矮小で7体節以上は生じず分節化の異常を示す。結果的に体幹部の成長が停止した様相を呈する。SIP1KO胚について種々のマーカー遺伝子の発現を調べた結果、神経組織においては初期神経板で特異的に発現するSox2遺伝子発現の低下、神経板で消失すべきE-cadherinの発現の維持、Sox10遺伝子発現の低下及び一部欠失が観察された。一方、体節形成に関連する遺伝子の発現を調べた結果、Notch1,Uncx4,Mesp2の遺伝子は発現が明らかに低下しているが、その極性やパターンには変化はなかった。しかしながら、未分節中胚葉で発現するTbx6とFGF8は、前側へその発現領域が増大しており、それと呼応して。cyclicな発現パターンを示すL-Fringe,D111,Hes7遺伝子は野生型と比べると前側へ1ストライプ多い発現を呈していた。これらの結果は、SIP1遺伝子が何らかの形で初期神経組織形成過程、および未分節体節中胚葉から分節化した体節中胚葉への移行過程に関与していることを示唆する。しかしながら、初期胚においては神経板(菅)と体飾(沿軸)中胚葉はお互いに隣接しており、それぞれがお互いの組織形成に何らかの影響を与え得る可能性も考えられる。

SIP1はその標的配列がδEF1と同じであること、胚発生過程における発現がδEF1と大部分重なっていることから、δEF1 KOマウスの表現型もSIP1の機能的補償によって緩和されている部分が多くあると予想される。我々はこのδEF1/SIP1ファミリー全体としての機能を知る目的で、SIP1 KOマウスも作製した。その表現型の形態的特徴は(1)turningしない、(2)神経管が閉じない、(3)体節が78体節以上形成されず、形成された体節も形が小さく不規則である。といったものであり、神経組織形成、体節形成への関与を示唆するものであった。上述したように、δEF1とSIP1はタンパクとしての構造やその活性が類似し、且つ標的配列が同じであることを考えると、それぞれのKOマウスにおいてはお互いが機能を補償し合っている可能性が高いと思われた。そこで、胚発生過程におけるδEF1とSIP1の機能の個性と共通性、およびそれらのTGF-βシグナル系との関連性について、まずδEF1/SIP1二重ホモ変異マウスを作製しその表現型を観察することを試みた。その結果、δEF1/SIP1二重ホモ変異マウスでは、SIP1ホモ変異マウスと同様に、ほぼ胎生8.5日まで発生し、体節や神経管等の表現型をともなった様相を示した。これは初期胚発生においてはSIP1がより重要な役割を担っていることを示している。しかしながら、δEF1/SIP1二重ホモ変異胚では、それぞれの変異胚と較べると、神経板の形態が異常であり、そこでのSox2の発現がより顕著に減少していた。このことは、δEF1がこの時期の神経板においてSIP1と強調してSox2の発現を制御していることを示唆している。一方、胎生12.5日のδEF1ホモ;SIP1ヘテロ変異マウスにおいては上顎突起や鼻中隔の融合不全が観察された。これはSIP1ヘテロ変異のみでは全く顔面形成は正常であること、δEF1ホモ変異に観察された二次口蓋裂が起こる時期より早く、極めて重篤な顔面形成の阻害を示した強調された表現型になっていることから、この組織においてδEF1とSIP1がそれぞれ協調的に働いていることが明らかとなった。
次世代・圧縮型スペーサーを用いた超低侵襲・空間可変放射線治療の開発

我々は世界初となる生体適合性材料を用いた不織布型・吸収性スペーサーを独自開発し、腹部悪性腫瘍に対する体内空間可変粒子線治療を提案し、小型・大型動物を用いた生物学的安全性の検証と、臨床治験を実施した。圧縮型・吸収性スペーサーに関して試作を進め、物理実験、動物実験によって性能を改良し仕様を決定した。その後スペーサーを用いた小動物(ラット)実験による生物的安全性と吸収速度の確認をした。6週齢のWislerラットの腹腔の左右に、従来のPGAスペーサーと本申請で開発した圧縮型ダブルラッセル編みPLAスペーサーを同時に挿入し、動物用CTで厚みの変化を継時的に測定した所、密度に依存して吸収速度がやや異なることを発見し、仕様を0.2g/mlに決定した。腸管とスペーサーの癒着の程度と原因を検討した。従来のPGAスペーサーの安全性評価では体重変化や摂食障害は認めないが、剖検ではスペーサーと腸管との軽度癒着が確認されている。肉眼的癒着スコアを用い、継時的変化を検討した所、セプラフイルム等の癒着防止剤が極めて有効であることを発見した。スペーサーの消褪速度や癒着に関しては、接触加減や荷重の関与を考慮するため、前臨床試験としてブタ、カニクイザル等の大型動物を用いた長期安全性試験を実施した。PGAスペーサーでは、これらの大型動物内でもスペーサーが小動物と同様の速度で少しずつ消退し、臨床使用に適するデータを得た。圧縮型・ダブルラッセル編みスペーサーも、臨床仕様のスペーサーを埋植して飼育し、体重変化や血球・血液生化学検査、並びに病理組織学的検査を行い、生体内において治療のためのスペースを治療期間中保持できる有効性(性能)、及び安全性を評価できた。吸収性スペーサーを用いた臨床治験Phase Istudyの実施し、安全性と有効性を確認出来た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、圧縮型スペーサーの試作の継続と生体内における性能評価を実施した。ポリエチレン糸を用いて弾力性を検討する編み方についてさらに改良を加え、試作品においては十分な密度と厚みを保持する試作品を作成することに成功した。ミニブタを用いた動物実験の際には、腹腔鏡を用いて厚みの異なる2種類の圧縮型スペーサーの挿入を試みたが、厚みが大きいものにおいては、挿入時の抵抗が大きく、通常の径の腹腔鏡での挿入がかなり困難であることが判明し、その対策として挿入時における圧縮性スペーサーを内装するアプリケーター等の開発の必要性が課題として抽出された。我々が独自開発した世界初の生体適合性のPGA吸収性スペーサーの優れた性能は、(1)粒子線治療期間(6ー8週)にのみ体内空間を創造し、治療後には二酸化炭素と水に分解される。(2)水の保持力があり、粒子線治療・X線治療の治療計画時に水等価性の構成体として線量計算が可能である。(3)弾性があり、厚みの保持が可能で、柔らかさがあり、各臓器の形状に沿うことが可能。の3点に集約される。これらの利点を保持しつつ圧縮性の新機能を追加できるかに絞って検討を進めている。本学において実施したラットを用いた圧縮型ポリグリコール酸(PGA)スペーサーの埋植実験では、試作したスペーサーは埋植部位により厚みの均一性が保たれていないことが判明し、次年度以降の改良の課題として挙げられ、埋植後の厚みの保持を均一にする目的での検討が必要であることが明らかとなった。現在では、PGA縫合糸を用いたさらなる圧縮性スペーサーの試作品を完成できており特許出願を準備中である。圧縮性スペーサーの開発における複数の試作品を作成し、腹腔鏡での試験を実施したことで、改良すべき課題を確認できた。また、埋植後の厚みの不均一性など新たな課題も判明し、今後改良すべき問題点が明確になった。次世代吸収性スペーサーを用いた小動物実験による生物的安全性と吸収速度の確認を6週齢のWislerラットの腹腔に圧縮型ダブルラッセル編みスペーサーに挿入し、動物用CTで厚みの変化を継時的に測定した。予想に反して圧縮型ダブルラッセル編みスペーサーでは小動物の腹腔内留置において弾性が弱く圧排され、当初予定した厚みの保持をする事が困難であった。そのため、スペーサーに用いる主材料、加工方法を改変し、弾性の評価、in vivoでの性能を評価した。新規加工法を考案、また試作品を作成する事に時間を要したが、作成できた新スペーサーではトロカールの内腔を通して体内に入れることができるよう、手で加え得る程度の力で大幅な圧縮や変形が可能であって、しかもそのような変形の後でもほぼ元の状態へと復元できた。本スペーサは生分解繊維により構成されており、表裏の主表面を有し厚みのある柔軟な構造体であり、連結部は一対の主表面部の全域にわたって両主表面部を架橋するように延びて両者を連結している密集した連結糸の集合体として構成されている。新スペーサーでは弾性は良好に確保されていた。腸管と次世代吸収性スペーサーの癒着の程度と原因の検討した。従来のPGAスペーサーの安全性評価では体重変化や摂食障害は認めないものの、剖検ではスペーサーと腸管との軽度癒着が確認された。

肉眼的癒着スコアを用い、継時的変化を確認した。顕微鏡的なスペーサー材質が吸収された後の腸管壁の損傷の有無、炎症細胞の浸潤の程度を実験動物の組織切片を作製し、光学、蛍光顕微鏡を用いて観察を行い、スペーサーの生体内における影響の機序を検討した。予想に反して圧縮型ダブルラッセル編みスペーサーでは小動物の腹腔内留置において弾性が弱く圧排されてしまっており、当初予定した厚みの保持をする事が困難であった。そのため、スペーサーに用いる主材料、加工方法を改変し、弾性の評価、in vivoでの性能を評価した。我々は世界初となる生体適合性材料を用いた不織布型・吸収性スペーサーを独自開発し、腹部悪性腫瘍に対する体内空間可変粒子線治療を提案し、小型・大型動物を用いた生物学的安全性の検証と、臨床治験を実施した。圧縮型・吸収性スペーサーに関して試作を進め、物理実験、動物実験によって性能を改良し仕様を決定した。その後スペーサーを用いた小動物(ラット)実験による生物的安全性と吸収速度の確認をした。6週齢のWislerラットの腹腔の左右に、従来のPGAスペーサーと本申請で開発した圧縮型ダブルラッセル編みPLAスペーサーを同時に挿入し、動物用CTで厚みの変化を継時的に測定した所、密度に依存して吸収速度がやや異なることを発見し、仕様を0.2g/mlに決定した。腸管とスペーサーの癒着の程度と原因を検討した。従来のPGAスペーサーの安全性評価では体重変化や摂食障害は認めないが、剖検ではスペーサーと腸管との軽度癒着が確認されている。肉眼的癒着スコアを用い、継時的変化を検討した所、セプラフイルム等の癒着防止剤が極めて有効であることを発見した。スペーサーの消褪速度や癒着に関しては、接触加減や荷重の関与を考慮するため、前臨床試験としてブタ、カニクイザル等の大型動物を用いた長期安全性試験を実施した。PGAスペーサーでは、これらの大型動物内でもスペーサーが小動物と同様の速度で少しずつ消退し、臨床使用に適するデータを得た。圧縮型・ダブルラッセル編みスペーサーも、臨床仕様のスペーサーを埋植して飼育し、体重変化や血球・血液生化学検査、並びに病理組織学的検査を行い、生体内において治療のためのスペースを治療期間中保持できる有効性(性能)、及び安全性を評価できた。吸収性スペーサーを用いた臨床治験Phase Istudyの実施し、安全性と有効性を確認出来た。昨年度の研究の中で圧縮性スペーサーの試作品の問題点が明らかになったため、既にその改良品の作成に取り組んでいる。今後は再度、腹腔鏡を用いた実装やアプリケーターの開発などを試作し、検証を重ねていく予定である。次世代圧縮性スペーサーの挿入方法としてロカールの内腔を通して体内に入れることができるよう、手で加え得る程度の力で大幅な圧縮や変形が可能であって、しかもそのような変形の後でもほぼ元の状態へと復元する放射線治療用スペーサーを検討した。そのため、圧縮され変形された状態でトロカールの内腔に入れられ、トロカールを通ってその先端から体内側に導入された後は,圧縮状態から元の状態へと復元できることから、患者を開腹せずに放射線治療に用いることが可能となるため、実用性の高い次世代スペーサーとなり得る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
バクテリアのべん毛モータのスイッチコンプレックスの構造解析

べん毛モータのスイッチ・コンプレックスは、回転方向の制御、トルク発生、べん毛モータの構造形成等の複雑な現象に直接関与する多機能構造体で、FliG,FliM,FliNの3種類のタンパク質からなる複合体である。前年度までの知見をもとに、スイッチ・タンパク質の所在を明らかにするのが本年度の研究目標である。精製したタンパク質を用いた試験管内再構成実験において、FliGはMSリング(FliFの集合体)に直接結合することが示された。また、FliMとFliNは結合しやすく、大きな凝集体を作って沈澱した。FliMはMSリングと結合するが、FliNは結合しなかった。その後エール大学のマクナブらによりFliF-FliGの融合タンパク質が正常に働くことが示され、FliGがMSリングに直接強固に結合していることが明らかとなった。我々はMSリングのどの部位にFliGが結合するのかを明らかにするために、融合タンパク質からなるMSリング-FliG複合体のドメイン構造をトリプシン処理により調べた。MSリング自身トリプシンには敏感であるが、融合タンパク質からなる複合体も同様にトリプシンの作用を受けやすく、Sリングとロッド部分を残して他の部分は分解された。分解され残った部分のアミノ酸配列解析から、FliFのN端とFliGを含むC端がそれぞれ100残基余り消化されたことがわかった。さらに、FliFのC端約100残基を欠損した遺伝子を作製し、これからできたMSリングを電子顕微鏡で観察したところ、Mリングの周辺が欠けていた。以上のことから、FliGはMリングの周辺に直接、比較的強固に結合していることが明らかである。FliMは弱く結合し、またFliNはMSリングに直接結合はしないで、FliMを通して結合している。結合部位はまだわからない。べん毛モ-タのスイッチ・コンプレックスは、回転方向の制御、トルク発生、べン毛モ-タの構造形成等の複雑な現象に直接関与する多機能構造体である。それはFliG,FliM,FliNの3種類の蛋白質からなる複合体であるが、その所在や性質など不明の点が多い。我々はスイッチ・コンプレックスにおけるこれら3つの蛋白質の結合様式やストイキオメトリ-を明らかにするために、それぞれの蛋白質の精製を試みた。各蛋白質をコ-ドする遺伝子をクロ-ン化して大量発現系に導入し、個々の蛋白質をカラム・クロマトグラフィ-により精製することに成功した。精製した蛋白質を用いて試験管内再構成実験において、FliGはMSリング(FliFの集合体)に直接結合することが示された。改良法により精製したべん毛基部体には、従来法では洗い流されていた蛋白質成分が結合している。精製したスイッチ蛋白質を元に作成した抗体を用いたイムノ・ブロット法で、それらの一つがFliGであることが確かめられた。FliNは検出されなかった。以上のことから、MSリングに直接、比較的強固に結合しているのはFliGであり、FliMは弱く結合している。また、FliNはMSリングに直接結合はしないで、FliGかFliMを通して結合していると思われる。
「何をどれだけ食べたらよいか」－食育と家庭科を結ぶ体系的・系統的な教材の開発－

小・中・高等学校家庭科では、「何をどれだけ食べたらよいか」の量の把握が困難とされてきた。そこで、調理後の食品容積から調理前の食品重量を把握できる「料理容積法」を開発した。この方法を応用して、小学校で、量を扱わないでバランスの良い1食分の献立作成学習方法として、野菜の量で主菜と副菜を2グループ化して、少ないものと多いものを組み合わせることによりバランスがとれる、料理の実物大写真教材を開発した。また、中学校の1日分のバランス献立作成web教材を開発した。中学校技術・家庭教科書では、「何をどれだけ食べたらよいか」の量に関する学習方法として、従来、「食品群別摂取量」および「ポイント制」が採用されてきた。しかし、食品群別摂取量は料理前の可食部重量で表し、喫食者にはわかりにくいこと、また、ポイント制は、食品群により単位が異なる等によりわかりにくい等の問題が指摘されてきた。また、小学校等における食育では「食事バランスガイド」を取り上げている学校もある。これは、食べ物を、食品群別摂取量ではなく献立要素でグループ分けし、量を独自のサービングで表すもので、中学校家庭科の指導方法とは異なるため、両者を学ぶ学習者に混乱をきたしかねない問題をはらんでいる。研究代表者は、「食品群別摂取量」と「食事バランスガイド」の橋渡しの役割も果たし、喫食者にもわかりやすい量的把握方法として、食品群別摂取量を調理後の食品容積で表す「料理容積法」を開発し、各学校段階における実践的学習内容の検討を進めている。そのひとつとして、小学校家庭科における1食分のバランスの良い献立作成に関する学習方法を検討した。現行小学校家庭科教科書2社では、主食・主菜・副菜・みそ汁の一汁二菜の献立作成学習が記載されている。小学校で量の指導を行わないで、しかもバランスのよい献立を理解させ、献立作成を行う方法として、1教科書の調理実習教材レシピを食品群別摂取量を超えない範囲に修正すること、2修正した料理の実物大写真教材を作成し、野菜量により、主菜と副菜の組合せグループを指定することにより、バランス食の献立作成ができる方法を開発した。また、小学校において、実践検証した。また高校生以上の、購入した野菜を使い切る野菜料理のマネジメント手法として、野菜の重量や個・本・袋等の単位と調理後食品容積の関係がわかり、しかも野菜を使い回しして使い切るための教材を開発した。中学校・高等学校家庭科の食生活に関する学習において、「何をどれだけ食べたらよいか」の「量」に関する実践的能力の育成が最も困難とされてきた。従来より、中学校技術・家庭教科書の「ポイント制」は、食品量を、主として「料理前の食品可食部重量(g)」で表しており、喫食者にはわかりにくい実態があった。一方、平成17年に食育基本法が施行、平成18年に食育推進基本計画が策定され、学校教育における食育がスタートした。食育では「何をどれだけ食べたらよいか」に関する学習内容として、農林水産省・厚生労働省の「食事バランスガイド」を試行する小学校が漸増している。食物量を、前者は重量で、後者は主に容量で把握させるという抜本的な違いがあり、両者を結びつけられる手段がなかった。このままでは、小学校の食育で「食事バランスガイド」を学んだ児童が中学校家庭科で「ポイント制」を学ぶと、混乱の可能性がきわめて大きい。研究代表者は、喫食者が唯一目測できる「料理後の食品容積」に注目し、150種類以上の食品について、日常的な料理後の食品容積と、料理前の食品可食部重量を実測して、「料理の食品容積と食品可食部重量の早見表」に集約した。この早見表と国民健康栄養調査結果をもとに、「食品群別摂取量の目安(重量)」を、日本人の平均的な食品摂取をした場合の「料理後の食品群のめやす容積」として換算した。容積の基本単位は、誰でも正確に把握しやすい鶏卵容積(60ml)とした。食品群別摂取量は、渋川・金子、女子栄養大学の2種類を用い、年齢性別にめやす容積を算出した。このめやす容積に、日本の伝統的な献立要素の配膳図を取り入れて、「めやす容積配膳図」としてまとめた。また、めやす容積を視覚的に体感させるために、鶏卵容積を基本とする「食品群別色俵」等の教材を作成した。高等学校、大学および現職教員を対象に実践を行い検証した。中学校・高等学校家庭科の食生活に関する学習において、「何をどれだけ食べたらよいか」の量の把握が最も困難とされてきた。中学校技術・家庭の教科書には、従来「食品群別摂取量」と「ポイント制」が記載されていたが、いずれも料理前の可食部量で表すことに加え、「ポイント制」は食品群により単位が異なる等により、わかりにくいと指摘され、後者は近年、教科書からの記載がなくなったところである。一方、小学校における食育では「食事バランスガイド」を取り上げている学校もある。これは、食べ物を献立要素でグループ分けし、量を独自のサービング単位で表すもので、これを学んだ児童が、中学校家庭科で食品群別摂取量を学ぶと混乱する可能性が高い。研究代表者は、「食品群別摂取量」と「食事バランスガイド」の橋渡しの役割となり、喫食者にもわかりやすい量的把握方法として、食品群別摂取量を調理後の食品容積で表す「料理容積法」を開発し、各学校段階における実践的学習内容の検討を進めている。平成26年度は、主に中学校の献立学習における「料理容積法」教材として、小・中学校家庭科教科書の調理実習教材を中心とする1日分のバランス献立作成Web教材の開発を行った。

その結果、新たに2つの問題が見えてきた。一つは小・中学校家庭科教科書の調理実習教材が、バランス献立学習にふさわしい分量とは限らないこと、もう一つは、Web教材を試用実践したところ、学習者はバランス献立の作成が難しく、バランス献立の考え方がわかる誘導や仕組みが必要であることである。平成27年度はこれらの点を修正改良して実践検証を行い、研究をまとめる。小・中・高等学校家庭科の食生活に関する学習において、「何をどれだけ食べたらよいか」の量の把握が最も困難とされてきた。その主な理由は、調理前の食品群別摂取量(g)を、調理後の食品量と結びつけて把握することが困難なためであった。著者はこれまでの研究で、調理前の食品重量と調理後の食品容積の関係性を整理して互換することができる料理容積法を開発した。本研究ではまずH24年度に、この方法を応用して、食品群別摂取量のめやすを調理後の食品容積で表すめやす容積配膳図を開発した。次にH25年度に、小学校家庭科教科書における、主食・主菜・副菜・みそ汁の一汁ニ菜の献立作成学習方法として、小学校では量の指導を行わないで、しかもバランスの良い献立を理解させる必要があることから、教科書の調理実習教材レシピを食品群別摂取量を超えない範囲に修正し、野菜量により、主菜と副菜の組み合わせグループを指定して選ぶことを学ぶ、料理の実物大写真教材を開発し、実践検証を行った。次いでH26年度に、中学校家庭科教材として、小・中学校家庭科教科書の調理実習教材を中心とする1日分のバランス献立作成Web教材の開発を行った。その結果、新たに2つの問題点が見えた。1つは小・中学校家庭科教科書の調理実習教材が、バランス献立学習にふさわしい分量とは限らないこと、もう1つは、Web教材を試用実践したところ、学習者はバランス献立の作成が難しく、バランス献立の考え方がわかる誘導や仕組みが必要であることであった。そこでH27年度は、小・中学校家庭科教科書の調理実習教材のレシピを1日の食品群別摂取量を超えない範囲に修正し、バランス献立作成の誘導方法を開発してWeb教材を改良し、実践検証して、大幅な改善を確認した。また、高校家庭科教科書の調理実習教材を中心とする一般コースも作成した。小・中・高等学校家庭科では、「何をどれだけ食べたらよいか」の量の把握が困難とされてきた。そこで、調理後の食品容積から調理前の食品重量を把握できる「料理容積法」を開発した。この方法を応用して、小学校で、量を扱わないでバランスの良い1食分の献立作成学習方法として、野菜の量で主菜と副菜を2グループ化して、少ないものと多いものを組み合わせることによりバランスがとれる、料理の実物大写真教材を開発した。また、中学校の1日分のバランス献立作成web教材を開発した。研究代表者が開発した料理容積法を用いて、これまでに、小学校における1食分のバランス献立作成教材の開発、中学校以上のバランス献立作成Web教材等の開発を行ってきた。中学校技術・家庭の教科書(3社)別にコースを設定した。教科書の調理実習教材を中心にして、食品量は、調理後の食品容積で表す料理容積法で表記した。バランス献立作成の考え方を学びながら、どうしても食べたい料理は最初に優先して選べるようにする等、楽しく献立作成できる。
耳下腺Ca^<2+>-非依存性ホスホリパーゼA_2の多様性とその生理的機能分担

本研究は、ラット耳下腺細胞におけるCa^<2+>-非依存性ホスホリパーゼA_2(iPLA_2)の多様な存在特性を明らかにするために、その耳下腺細胞内分布および性状を検討したものである。iPLA_2の細胞内分布に関しては、平成9年度に各細胞画分における活性検索が終了しており、既に報告した分泌顆粒(SG)と腺腔側形質膜(PM)に加え、新たに細胞質でもiPLA_2の存在が確認された。本年度は引き続き3画分由来iPLA_2の詳細な特性観察を進めその相同性を検討した。3画分のiPLA_2のうち、細胞質iPLA_2(Cyt-iPLA_2)は1)ATPとTriton X-100で活性化される、2)Ca^<2+>-依存性PLA_2特異的阻害剤(AACOCF_3)でほとんど阻害されずbromoenol lactone(BEL)で阻害される点から、VI型に分類される酵素であると考えられた。一方SGとPM由来iPLA_2(SG-iPLA_2、PM-iPLA_2)は、ATP、界面活性剤およびAACOCF_3に対してCyt-iPLA_2と類似の挙動を示したが、BELで阻害されない点でCyt-iPLA_2と異なっていた。また、SG-およびPM-iPLA_2には、既知の細胞内PLA_2に共通の阻害剤(metyl arachidonyl fluoro-phosphonate)も無効であったことから、両酵素は新たなタイプのiPLAであると考えられた。SG-およびPM-iPLA_2はsn-2位不飽和型中性リン脂質を最も良い基質とするなど基質特異性の面でも類似しており、一連の生化学的性質からは両者を明確に区別することができなかった。以上の結果は、耳下腺細胞内にはVI型に分類されるCyt-iPLA_2と、SGとPMに共通して存在する新たなタイプのiPLA_2の少なくとも2種類の酵素が存在する可能性を示唆するものである。今後はSG-およびPM-iPLA_2の精製と構造解析を進め両酵素の相同性を厳密に検討すると共に、これら耳下腺iPLA_2の開口分泌などの生理機能への関与を検討していく予定である。Ca^<2+>-非依存性ホスホリパーゼA_2(iPLA_2)の耳下腺細胞内局在性についての検討は、現在までに各種膜画分においてほぼ終了しており、分泌顆粒膜と腺腔側形質膜でbromoenol lactone(BEL)非感受性iPLA_2の存在を確認している。そこで、本研究では、未検討であった細胞質について新たなiPLA_2の検索を開始した。sn-2位のアシル鎖を放射標識したホスファチジルコリンを外因性基質として用いたところ、細胞質中にCa^<2+>-非依存性のsn-2位脱アシル化活性を検出した。本活性は1)ATP存在下で著しく上昇する、2)Ca^<2+>-依存性ホスホリパーゼA_2の特異的阻害剤AACOCF_3で影響されない、などの点で分泌顆粒由来iPLA_2と類似していた。しかし、本活性はBELによって顕著に阻害されたことから、BEL非感受性の分泌顆粒由来iPLA_2とは異なる酵素であると考えられる。用いた基質等の制約のために本反応がA_2タイプであるか否かは未確認であるが、これらの結果を総合すると細胞質に新たなiPLA_2が存在する可能性が強い。現在、反応経路確定のために適切な基質の選択と実験系の改良を検討中である。一方、これら耳下腺のiPLA_2の相同性を厳密に議論するためには、各酵素の精製が必須である。特に分泌顆粒由来iPLA_2は膜結合性であるため、まず可溶化する必要がある。そこで各種界面活性剤間で分泌顆粒由来iPLA_2活性に与える影響及び顆粒膜タンパク質の可溶化率を比較検討したところ、0.5%Triton X-100処理で顆粒膜タンパク質の約30%が可溶化され、24%のiPLA_2活性が上清に回収された(Mizuno-Kamiya Et al.,1998,J.Biochem.)。可溶化iPLA_2もATPによって顕著に活性化されており、本酵素の可溶化による特性変化はほとんど認められなかった。以上の結果から、Triton X-100が本酵素の可溶化剤として適当であると考えられる。今後は可溶化された分泌顆粒膜iPLA_2および細胞質iPLA_2について、その精製をさらに進めていく予定である。3画分のiPLA_2のうち、細胞質iPLA_2(Cyt-iPLA_2)は1)ATPとTriton X-100で活性化される、2)Ca^<2+>-依存性PLA_2

特異的阻害剤(AACOCF_3)でほとんど阻害されずbromoenol lactone(BEL)で阻害される点から、VI型に分類される酵素であると考えられた。一方SGとPM由来iPLA_2(SG-iPLA_2、PM-iPLA_2)は、ATP、界面活性剤およびAACOCF_3に対してCyt-iPLA_2と類似の挙動を示したが、BELで阻害されない点でCyt-iPLA_2と異なっていた。また、SG-およびPM-iPLA_2には、既知の細胞内PLA_2に共通の阻害剤(metyl arachidonyl fluoro-phosphonate)も無効であったことから、両酵素は新たなタイプのiPLAであると考えられた。SG-およびPM-iPLA_2はsn-2位不飽和型中性リン脂質を最も良い基質とするなど基質特異性の面でも類似しており、一連の生化学的性質からは両者を明確に区別することができなかった。以上の結果は、耳下腺細胞内にはVI型に分類されるCyt-iPLA_2と、SGとPMに共通して存在する新たなタイプのiPLA_2の少なくとも2種類の酵素が存在する可能性を示唆するものである。今後はSG-およびPM-iPLA_2の精製と構造解析を進め両酵素の相同性を厳密に検討すると共に、これら耳下腺iPLA_2の開口分泌などの生理機能への関与を検討していく予定である。
エアパワーメータの開発とその応用推進

今年度の研究内容は主に、製品化向けの調査及び宣伝であった。これらに当たっては次のことを行った.1.製品化への推進1)試作したエアパワーメータを当研究室実験室に取付け,日常の空気エネルギー消費状況を調査した.数箇所での調査結果により,エネルギー配分及びエネルギー損失を解明することができ,エアパワーメータの工業有用性を実証した.2)空気圧システムによるエネルギー消費の国内現状および省エネの動向やニーズに関して,データ調査を行った.3)上記した調査などに基づいて,(株)妙徳に説得し,エアパワーメータの換算ユニットAPM-001を製作し今後で製品化してもらうことになった.2.成果発表2)エアパワーメータの試作品が(株)妙徳によりゼミコンジャパン2004に出展された.今年度の研究内容は主に、以前で提案したエアパワーメータを開発することであった。エアパワーメータは空気圧パイプラインから流量と圧力を検出し、エアパワーを算出・積算・表示する機能を有するものである。その開発に当たっては次のことを行った。1)エアパワーメータの心臓部である、流量と圧力の入力及びエアパワーの演算を機能とする基板を開発した。その基板を用いて計測ユニットを試作した。計測ユニットは流量センサと圧力センサのアナログ信号を入力し、エアパワーの瞬時値表示、積算及び積算値表示の機能を有すると同時に、流量と圧力の瞬時値表示、流量の積分値である空気消費量の算出表示の機能も備える。2)工場ラインに多用されている熱式、応答の速いピトー管式の流量計と、半導体式圧力センサを計測部とし、前述した計測ユニットを演算表示部としてエアパワーメータを12セット試作した。末端設備の空気消費管理用とするため、流量レンジを500NL/minに設定した。来年度は、これらの試作品を工場の現場で使ってもらい、空気圧エネルギー消費の現状把握や省エネへの貢献度を確認する予定である。4)日本フルードパワーシステム学会主催の特別講演会「空気圧システム入門と省エネルギー」、精密工学研究所の公開と町田テクノフェアにエアパワーメータを紹介し、試作品を展示した。5)エアパワーメータの開発は日刊工業新聞2003年10月31日号に「空気圧機器・システムの技術動向」の中に紹介された。これらに当たっては次のことを行った.1.製品化への推進1)試作したエアパワーメータを当研究室実験室に取付け,日常の空気エネルギー消費状況を調査した.数箇所での調査結果により,エネルギー配分及びエネルギー損失を解明することができ,エアパワーメータの工業有用性を実証した.2)空気圧システムによるエネルギー消費の国内現状および省エネの動向やニーズに関して,データ調査を行った.3)上記した調査などに基づいて,(株)妙徳に説得し,エアパワーメータの換算ユニットAPM-001を製作し今後で製品化してもらうことになった.2.成果発表2)エアパワーメータの試作品が(株)妙徳によりゼミコンジャパン2004に出展された.
大地下空洞掘削のための不連続性岩盤の調査・解析システム

原子力廃棄物の地層処分や石油の岩盤地下備蓄の例にみられるとおり、大型地下空洞掘削技術の確立は社会的ニ-ズの高い分野として注目されている。この研究は、画像処理等の最新技術を応用して、地質情報の数量化を図ると共に、地質情報を積極的に取り込んだ不連続性岩盤の弾・塑性解析、応力との連成を考慮した浸透解析を一つのシステムにまとめることを目的に組織された。得られた結果を要約して以下に示す。1)不連続性岩盤の写真に、入力2値画像化、細線化、特徴点間直線近似などの処理を施すことによって、不連続面は画像上に線として認識される。また、線化された画像は、クラックテンソルの形式で数量化することによって、その特徴を具体的に把握できる。2)不連続性岩盤は、クラックテンソルを内部変数とする連続体で近似できる。すなわち、岩盤の弾性コンプライアンス、降伏条件、塑性ポテンシャル、透水テンソルなど、その水理・力学的解析に必要な構成関係式は、クラックテンソルを用いて定式化された。また、構成式は、ミロナイトを使った室内実験や、浸透に関する数値実験によって検討され、その有効性が実証された。3)不連続性岩盤を対象とした数値解析モデルは、イ)三次元弾性解析、ロ)二次元弾・塑性解析ハ)応力と水の連成を考慮した二次元弾性解析の三点に絞って検討された。特に、三次元弾性解析については、現在石油地下備蓄の工事が進行中の串木野から得られたデ-タとの照合を通して、解析モデルの信頼性が検討された。その結果によると、クラックテンソルを用いた不連続性岩盤の数量化は、ほぼ妥当なものであることの結果に達した。4)以上の通り、当所の研究目標はおおむね達成され、大型地下空洞掘削のための地質調査から解析に至る一連のシステムが構築された。岩盤の水理・力学的性質は、含まれる地質不連続面(クラック)に強く依存している。しかし、クラック面は複雑な幾何学模様を作っていて、その水理・力学に及ぼす効果を具体的に把握することは至難とされている。この研究は、1)地質情報の数量化、2)画像処理技術の応用による地質調査の省力化、3)地質情報を織り込んだ岩盤の解析モデル化、についてそれぞれ検討すると共に、4)岩盤の地質調査から設計に至る一連の作業を新しい観点から再構築することを、その目的としている。今年度の研究成果は次のように要約できる。1)不連続性岩盤の透水性:昨年度の研究より、不連続性岩盤の透水性は、クラックの幾何学的特性を表すテンソルによって具体的に定式化され、その結果の妥当性は、数値実験の結果から裏づけられている。今年はさらに、透水性の応力依存性を取り上げ、理論と数値実験との両面から検討し、理論の拡張を行った。2)実岩盤でのケース・スタディ:石油の地下備蓄基地として工事が進行中の菊間(愛媛県)と串木野(鹿児島県)を取り上げ、実地に地質調査並びに試料収集を行なった。特に、現地透水係数のデータを解析し、理論的予測との整合性が明らかとなり、本研究で提案する調査・解析システムが実岩盤に適用し得ることを確認した。3)大地下空洞の三次元弾性解析:岩盤の弾性変形解析を行なった。1)初期地圧の主軸方向、2)地質構造の異方性の主軸、3)掘削軸の方向が岩盤の変形挙動に及ぼす影響について、FEMによる三次元解析を行なうことによって明らかにした。

解析には、串木野の地質データを用い、また、現在実測による変位との比較を行っていて、解析精度についてもなんらかの結論が得られるものと期待できる。岩盤の水理・力学的性質は、含まれる地質不連続面(クラック)に強く依存している。しかし、クラック面は複雑な幾何学模様を作っていて、その水理・力学に及ぼす効果を具体的に把握することは至難とされている。この研究は、1)地質情報の数量化、2)画像処理技術の応用による地質調査の省力化、3)地質情報を織り込んだ岩盤の解析モデル化、についてそれぞれ検討すると共に、4)岩盤の地質調査から設計に至る一連の作業を新しい観点から再構築することを、その目的としている。今年度の研究成果は次のように要約できる。1)不連続性岩盤の透水性:昭和6263年度の研究より、不連続性岩盤の透水性はクラックの幾何学的特性を表すテンソルによって具体的に定式化され、その結果の妥当性は、数値実験の結果から裏づけられている。今年、透水性の応力依存性を取り上げ、特に、深さに伴う透水係数の変化について理論と数値実験との両面から検討した。2)実岩盤でのケ-ス・スタディ:石油の地下備蓄基地として工事が進行中の串木野(鹿児島県)を取り上げ、実地に地質調査並びに試料収集を行なった。本年度は、得られた資料を用いて、1)初期地圧の主軸方向、2)地質構造の異方性の主軸、3)掘削軸の方向が岩盤の変形挙動に及ぼす影響について、主にFEMによる三次元解析を行なうことによって明らかにした。解析結果は、現在、実測による変位との比較を行うことによって、解析の信頼性について具体的に検討している。
卵巣癌における“hot spot”変異解析に基づく新規薬剤の探索

卵巣癌において最も予後不良の組織型である卵巣高異型度漿液性腺癌(High-grade serous ovarian carcinoma; HGSOC)について研究を行った。そして、HGSOCの4つの遺伝子発現サブタイプに該当する病理組織分類を樹立し、その分類とタキサン感受性との相関を示した。この結果により、HGSOCの中で、タキサンを含む化学療法レジメンのためのバイオマーカーを明らかにできる可能性がある。1)卵巣癌組織の凍結組織のエクソームシークエンシングを28サンプル行い、現在解析中である。卵巣癌は診断時には進行例が多く、手術のみでは完治せず、化学療法が必須である。しかし、化学療法を行っても、効果がない症例があり、その選別が重要である。またいったんは化学療法が奏功しても、再発し、最終的には薬物療法抵抗性となることが多い。卵巣癌の中で、卵巣高異型度漿液性腺癌(high-grade serous ovarian carcinoma; HGSOC)は、最も頻度が高く、予後不良の組織型である。そこで、我々は、HGSOCに対する、薬物療法感受性のバイオマーカーの探索、および、新規薬物療法の開発を研究の目的とした。まず、自施設におけるHGSOC症例の病理組織像を検討すると、癌細胞が間質にばらけて浸潤する像を示す腫瘍は予後不良で、多数のリンパ球が浸潤する腫瘍は予後良好であった。The Cancer Genome Atlas (TCGA)データセットにおいて、卵巣漿液性腺癌の遺伝子変異、コピー数異常、遺伝子発現マイクロアレイデータを解析すると、遺伝子発現プロファイルによる分類が最も予後と関連していた。我々は、自施設のHGSOCの遺伝子発現マイクロアレイデータと比較検討し、HGSOCの遺伝子発現プロファイルを反映する病理組織細分類を樹立した。さらに、その分類がパクリタキセル感受性と相関することを示した。パスウェイ解析の結果、卵巣漿液性腺癌において、BMPシグナルががん細胞の増殖亢進させることを見出した。そして、BMPシグナル経路阻害剤が治療薬として有望であることを示した。婦人科腫瘍卵巣癌の遺伝子変異の検出を目的として、もともとは遺伝子を絞ってターゲットシークエンシングを行う予定であったが、エクソームシークエンシングの価格の低下もあり、エクソームシークエンシングを行った。すると、非常にそのデータのクオリティーがよく、免疫組織染色の結果とも合致していることがわかった。あと20サンプルほどエクソームシークエンシングを追加し、ゲノムワイドな遺伝子変異解析を行う予定としている。また、shRNAライブラリーによって見いだしたanoikis関連遺伝子であるABHD2については、さらに機能解析を進めて行く方針としている。エクソームシークエンシングの価格低下により、当初予定していたターゲットシークエンシングを中止してエクソームシークエンシングを行うこととした。そのため、ターゲットシークエンシングにかかる予定であった諸費用を、翌年度に繰り越すこととなった。エクソームシークエンシングを追加し、ゲノムワイドな遺伝子変異解析を行う予定。
非農家主導型地産地消の成立条件と効果に関する研究

非農家による地産地消には、民間主導型と行政主導型がみられる。民間主導型では、個人的なつながりから発展したものが多く、それ以上に広がりを見せない。一方、行政主導型でも、地産地消の場合には、物流への支援を行うところもあるが、物流の支援ではなく、調理を伴う食とセットにした地産地消の推進方策を立ち上げているところでは、立ち上がりは行政主導ではあっても、一度展開すると、民間が独自に地産地消を発展させる動きを作っていく傾向のあることがわかった。また、行政主導型でも、市町村による主導と都道府県による主導でその成立条件と効果に違いがみられた。市町村主導による地産地消では、市長の意向が強いこと、職員にキーパーソンがいることなどが必要条件と考えられ、学校給食における取組は大変教育効果が高くなると推察される取り組み方法で展開していることが明らかとなった。一方、都道府県行政主導による地産地消は、観光振興、伝統食の保全や新メニューによるブランド開発などにつながることが明らかとなった。最新の地産地消の事例収集を行うために、全国農業新聞、農業共済新聞から関連記事を分類した。また、他研究者からの情報提供などを元に、今年度は2か所を選定し、ヒアリング手法による研究を実施した。一つは、神戸市垂水区にある垂水商店街の事例である。ここでは、垂水商店街と旧八千代町(現多可町)が連携関係を結び、商店街にアンテナショップを展開している。その成立過程には、役場職員がキーパーソンとなったこと、神戸新聞社が都市と農村とを結ぶパートナーシップ提携の支援をする事業を展開していたこと、垂水商店街は商店街としての機能を元々果たしていたことが明らかとなり、アンテナショップが開店する日には、その前の通りの通行人が増加することなどが明らかとなった。また、もう一つの事例は、宇治田原町立保育所の事例(以下、保育所と記す)である。保育所では、栄養士がキーパーソンになっていること、町民の多くが本保育所に通っており、本保育所は給食費が町の支援金等で潤沢に確保できることが主たる要因であることが明らかとなった。また子どもたちの食育的側面で、保育所に野菜を提供している農家の好意で、園内に野菜を育て、子どもたちの関心を引き付けている。さらに本保育所では、子どもたちの給食メニューレシピの一部を直売所で提供している。直売所と保育所の関係を密にするための取組であるが、アンケート調査より、直売所で本メニューを積極的に得ている人は少ないことが明らかとなった。しかし、子どもたちが、直売所で買い物体験をする取組も実施されており、子どもたちは喜んでいる。子どもたちと地産地消を結び付ける試みは、実現可能であるが、一般消費者にまで影響を及ぼすことは難しいということが明らかとなった。このように今年度は、情報の収集と近畿圏内2か所での調査を実施した。1年目は個別の事例について、詳細にみていったが、その展開過程と課題についてみてみると、市町村自治体の支援が多かれ少なかれ見られることが明らかとなった。そのため、自治体の取り組みにも注目し、実証的にその効果について明らかにした。多くの自治体では、地産地消の推進が、食育推進基本計画の中で定められているが、食に関する条例を設定しているところは少なく、その先進的な地域として福井県小浜市と愛媛県今治市を対象に自治体の取り組みについて調査を進めた。一方、地産地消推進を後押しする認証制度なるものを都道府県単位の自治体が行っている例も少ない。そこで、先進的に行っている事業として、地産地消認証を行っている群馬県および鹿児島県で調査を進めた。小浜市、今治市のように市町村単位で進める場合には、市長の方針に由来するところが大きいこと、職員にキーパーソンがいること、規模の大小はあるが、地方卸売市場が機能していることが必要条件として考えられた。また、その展開は学校教育現場と密接につながることが明らかとなった。一方、都道府県単位で認証を進める地域は、認証を受けた店舗の情報を行政関連のホームページや行政が作成したパンフレット等に掲載し、消費者への情報提供が充実する。そのため、観光振興につながっていることが明らかとなった。また伝統的品種など、特徴ある農産物に注目が集まるようになり栽培が始まり、それらを活用するような伝統的な調理法の普及や新メニューの開発が見られることが明らかとなった。食文化構築につながっていると言える。都道府県認証のある地域では、JAが地産地消推進に積極的に関わり、直売所を展開していていること、また市街地にJAのアンテナショップを展開する段階にきていることが明らかとなった。
芳香族アミノ酸「ドーパ」を介した植物-微生物の根圏共栄メカニズムの解明

芳香族アミノ酸「ドーパ」は植物根圏において異種間生長抑制作用をもたらすアレロケミカルであり、本研究ではドーパの濃度調節を介して植物(宿主)とコミュニケーションする細菌としてPseudomonas putidaに着目した。本菌種はドーパをドーパミンに変換する「芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)」を有し、本酵素活性によりドーパがもたらすアレロパシーを軽減できる。研究の結果、ドーパ存在下において本菌がAADCの転写活性を選択的に誘導していることをDNAマイクロアレイにより確認し、本転写誘導に関与する機能未知ORFを得ることにも成功した。本結果は、AADCを介した共生モデルの詳細に迫るものである。Pseudomonas属細菌のもつ芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)の活性が、芳香族アミノ酸であるドーパの存在下で強く誘導される情報をもとに、当該細菌の遺伝子発現を網羅的に解析した。P. putida KT2440株のトータルRNAを抽出して逆転写を行ってcDNA化を行い、カスタムDNAチップを作成してDNAマイクロアレイに供した。その結果、AADCの構造遺伝子発現量は1 mMドーパ存在下において予想通り50倍程度上昇しており、全遺伝子中最も高い発現向上であることが明らかになった。このことから、環境中にドーパが存在する場合に本酵素活性によってドーパミンに変換することが何らかの生理的意義に繋がっている可能性が示唆された。本結果は、アレロケミカルとして生長抑制をもたらす根圏域のドーパを解毒する働きを本菌株が有しているという、本研究における予想と合致するものである。また、NAD(P)H脱水素酵素の発現が1415倍に上がっているほか、azoreductaseの発現量も1014倍に上昇しており、双方ともNAD(P)Hの酸化還元に関わる酵素であることから、何らかの電子受容体を介した酸化還元反応が細胞内において亢進していることも示唆された。これらの結果を精密化することにより、ドーパの代謝機序とその生理的意義を明らかにでき、根圏におけるドーパを仲立ちとした植物ー微生物間相互作用の一端を明らかにできると考えている。現在、P. putidaにおいてAADCの欠損株を作成中であるほか、遺伝子クラスター中の周辺遺伝子であるPP_2554 (putative 4-hydroxyphenylpyruvate dioxigenase)のクローニングも終了したところである。Pseudomonas属細菌が保持する芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)の遺伝子周辺の転写単位についての解析を行った。当初、AADC上流に存在する2つの遺伝子(LysR型転写調節因子および機能未知タンパク質)と本遺伝子が同一の転写単位(オペロン)を形成していると考えていたが、解析の結果、AADC遺伝子のみが単独で発現していることが判明した。遺伝子上流側にはプロモーター様配列は存在しないにもかかわらず本遺伝子のみが単独の転写単位となっていることから、独自の未知転写因子がドーパ存在下における誘導発現を担っていることが示唆された。そこで、AADC遺伝子のプロモーターと転写調節領域が存在すると考えられる遺伝子上流域約600 bpを大腸菌由来β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)と連結してレポーター遺伝子を構築し、大腸菌内で該転写因子をPseudomonasゲノムライブラリー中から同定するスクリーニング系を現在作成している。レポーター遺伝子を保持するプラスミドとともにゲノムライブラリを大腸菌に共導入することによって、レポーター活性を指標に転写因子を同定、ドーパ誘導の詳細機序の解明を行う予定である。また、同様の活性を持つ他の細菌のAADC (Enterococcus属由来)についてはドーパによる発現誘導が起こらないことも確認しており、AADCのドーパ誘導がPseudomonas属細菌に特異的な現象であることを示唆する結果も取得した。根圏細菌Pseudomonasputidaの芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)は芳香族アミノ酸ドーパの存在下においてその構造遺伝子の転写が数十倍に活性化される。このドーパ存在下における誘導発現機構の解明に向けて、大腸菌におけるlacレポーターシステムを構築し、AADCプロモーターの転写活性化を担う調節因子の同定を試みた。レポーター遺伝子はAADC遺伝子のORF上流域約700 bpに大腸菌由来lacZ遺伝子を連結したものを使用し、プロモーター領域の上流およびlacZ遺伝子の下流にそれぞれ大腸菌由来の強力な転写終結部位であるrrnBターミネーターを挿入して誤転写を防ぐコンストラクトとした。P. putida KT2440株のSau3AI部分分解ゲノム断片を調製してプラスミドライブラリー(挿入断片長37 kb)を構築し、上記のレポーター遺伝子とともに大腸菌DH5α株に導入してβ-ガラクトシダーゼ活性の著しい向上がみられる2つのクローンを取得することに成功した。導入されていた遺伝子の塩基配列を解読したところ、機能未知の2つのタンパク質をコードするORFが共通して導入されており、これらがAADC転写活性化を担う因子であると考え現在解析を進めているところである。また、P. putida AADC欠損株の取得を継続して行っているが、AADCの欠損カセットを保持するプラスミドのP. putidaゲノム上への導入に成功しており、現在は挿入されたプラスミドをループアウトにより除去する操作を行っている。

研究の結果、ドーパ存在下において本菌がAADCの転写活性を選択的に誘導していることをDNAマイクロアレイにより確認し、本転写誘導に関与する機能未知ORFを得ることにも成功した。本結果は、AADCを介した共生モデルの詳細に迫るものである。平成25年度に行ったDNAマイクロアレイの結果をもとに、さらにAADCの遺伝子レベルでの転写活性化を詳細に解析し、本遺伝子が未知の転写因子によって発現調節されることを示唆する結果を得た。また、他の細菌のAADCの発現様式も合わせて解析することで、AADCのドーパ誘導がPsedomonasにおいて特異的であることを示す結果も得られた。しかし、当初完了予定であったAADC欠損株の作製は難航し本年度完了することができなかった。そのため、植物根圏における宿主-細菌間相互作用の解明段階までは現在至っておらず、計画からはやや遅れ気味である。応用微生物学大きな研究遂行計画の変更はないが、今後は本年度までに完了できていないAADC欠損株作製について実験を鋭意続行し、早急に当該株取得を行うことを第一の目標とする。欠損株が得られれば、速やかに植物根圏への野生株及び欠損株の定着能を調査する実験を遂行する。また、AADC遺伝子クラスターの存在意義を明らかにする研究を続行し、AADCのドーパ誘導の基盤となる転写因子の解明および周辺遺伝子産物によって行われるドーパ代謝の様式解明を鋭意行う。AADCの生体機能への関与を精査するためのDNAマイクロアレイ解析を予定通り終了した。研究開始当初は、ドーパ天下による細胞走化性の変化や、バイオフィルム形成関連の遺伝子発現変化が起こることも予想していたが、それらの変化はマイクロアレイの結果確認されなかった。しかし、上記のようにNAD(P)H関連の酸化還元酵素に一括した発現変化がみられるなど、細胞内の生理状態がドAADC発現量向上に伴って明らかに変化を示唆する結果が得られている。AADC欠損株の作製は現在試みているところで終了していないが、周辺遺伝子の取得・クローニングも同時に進行しており、研究進展状況は順調である。本年度はAADC欠損株の取得を完了、その後欠損株および野生株の植物根圏への定着能の差異等を評価し、それに際した菌叢解析や代謝物解析のための費用も一部予算中に見込んでいたが、欠損株の取得に未だ成功していないため解析を充分に進行することができなかった。そのため、次年度に当該部分の解析費用を持ちこすこととした。今後は、実際にAADCの機能が植物根圏における生物間相互作用に関わっていることを証明していく必要がある。そのために、一刻も早くAADC遺伝子欠損株を完成させて機能評価を行う必要があるほか、実際にマメ科植物の根圏においてAADC保持型のP.putidaが優勢化するか否かを確かめる必要がある。