hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マスト細胞脱顆粒のアクチンによる分子制御機構

昨年度までに、私はマスト細胞の脱顆粒に必須な細胞外からCa^<2+>情報伝達系にアクチンや微小管による制御機構が存在することを明らかにした。これらの知見から、アレルギー反応時のマスト細胞において細胞外からのCa^<2+>流入を制御することが、アレルギーの新しい治療戦略の基礎となる可能性が示唆された。また、その標的となるCa流入経路が容量依存性のCaチャネルである可能性が強く示唆された。そこで本年度は、脱顆粒に関与するCa流入チャネルの同定を試みた。他の細胞における多くの報告から、今回はTRPcチャネルに標的を置いて解析した。ラットRBL2H3細胞において発現しているTRPcチャネルについてRT-PCRによる解析を行ったところ、TRPc1,TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6のmRNA発現が認めら、特にTRPc1とTRPc3の発現が多く認めれた。一方、マウス骨髄から分化誘導したBMMCにおいては、TRPc1,TRPc2,TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6,TRPc7のmRNA発現が認められ、TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6の発現が多く認められた。RBL2H3とBMMCで共通してmRNA発現が多かったTRPc分子種としてTRPc3に着目し、シークエンスの確認をすると共に、siRNAのオリゴヌクレオチドの構築を行った。得られたオリゴを用いて、RBL2H3細胞への導入を試みた。RBL2H3細胞は遺伝子導入効率が悪いことが知られており、我々が作製したsiRNAオリゴの導入も極めて悪く、導入効率向上のための条件設定を現在模索中である。今後、マスト細胞の抗原刺激によるCa流入チャネルを同定することにより、アクチンや微小管との関係についてさらに解析を進めていきたい。今日、我が国では国民の3人に1人がアトピー性皮膚炎、喘息、花粉症などのアレルギー性疾患に悩んでいるといわれている。従来、アレルギー反応の惹起には、外部から生体内に進入した抗原の存在が必要不可欠と考えられてきた。しかし、近年血清中のIgEが、抗原非存在下においてもアレルギー反応に関与している可能性が示唆され注目されている。本年度はin vitroの系を用いて、抗原非存在下でのIgE単独処置によるマスト細胞の脱顆粒反応能、およびマスト細胞内脱顆粒情報伝達系へのアクチン細胞骨格系の関与について詳細に検討し、以下の点を明らかにした。2、脱顆粒を誘起しない低濃度のIgE(50ng/ml)処置により、抗原非存在下において、マスト細胞内線維状アクチン量の増加が起こった。アクチン重合阻害薬Cytochalasin DはIgE(50ng/ml)による線維状アクチン量の増加を抑制した。さらに、これらのマスト細胞では、細胞内カルシウムが増加し、脱顆粒が誘起されたことから、低濃度IgEによるアクチン重合がマスト細胞脱顆粒反応において負の抑制機構の役割を担っている可能性が示唆された。本年度の研究成果から、従来、外来抗原が生体内に進入して初めて惹起されると考えられてきたアレルギー反応が、外来抗原の存在なしに誘起される可能性が初めて明らかとなった。さらに、細胞骨格が細胞内のカルシウム情報伝達系の制御に関与していることが明らかとなり、これらは今後のマスト細胞内脱顆粒情報伝達系、およびアレルギー性疾患を理解するうえで非常に重要な知見であると考えられる。獣医学領域においても、犬や猫などのペット動物が人間と同じ生活環境で飼われるようになり、アレルギー性疾患が急増している。しかしながら、アレルギー性疾患の根本的な治療法は未だ存在しない。マスト細胞は、ヒスタミンなどのメディエータを脱顆粒することで、アレルギー反応を引き起こす細胞であり、この細胞の脱顆粒機構および、その制御方法の研究は、アレルギー反応を理解し、治療法を確立する上で重要である。私は平成15年度までの研究で、細胞骨格である線維状アクチンが、マスト細胞の活性化を抑制する負のフィードバック機構を担っていることを明らかにしてきた。本年度(平成16年度)は、線維状アクチンとともに重要な細胞骨格である微小管が、細胞外からCa^<2+>を流入する情報伝達系に関与し、マスト細胞の活性化において重要な役割を担っているという全く新しい作用機序を明らかにした。さらに、微小管の脱重合薬を用いることで、ラットのin vivoにおける受身皮膚アナフィラキシー反応が抑制できることを見出し、発表した(The Journal of Immunology (2005), in press)。本年度の研究成果から、アレルギー反応時のマスト細胞における、細胞外からのCa^<2+>流入を制御することが、新しい治療戦略の基礎となる可能性が示唆された。

他の細胞における多くの報告から、今回はTRPcチャネルに標的を置いて解析した。ラットRBL2H3細胞において発現しているTRPcチャネルについてRT-PCRによる解析を行ったところ、TRPc1,TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6のmRNA発現が認めら、特にTRPc1とTRPc3の発現が多く認めれた。一方、マウス骨髄から分化誘導したBMMCにおいては、TRPc1,TRPc2,TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6,TRPc7のmRNA発現が認められ、TRPc3,TRPc4,TRPc5,TRPc6の発現が多く認められた。RBL2H3とBMMCで共通してmRNA発現が多かったTRPc分子種としてTRPc3に着目し、シークエンスの確認をすると共に、siRNAのオリゴヌクレオチドの構築を行った。得られたオリゴを用いて、RBL2H3細胞への導入を試みた。RBL2H3細胞は遺伝子導入効率が悪いことが知られており、我々が作製したsiRNAオリゴの導入も極めて悪く、導入効率向上のための条件設定を現在模索中である。今後、マスト細胞の抗原刺激によるCa流入チャネルを同定することにより、アクチンや微小管との関係についてさらに解析を進めていきたい。
タンパク質工学的手法による有機溶媒耐性酵素の作成

ファインケミカル製品等の製造プロセスにバイオ技術を導入することにより、これらのプロセスを環境適応型製造プロセスに転換することが可能となるが、ファインケミカル製品等の製造プロセスで溶媒として一般的に用いられている有機溶媒の存在下では、既存の生体触媒(酵素・微生物)を用いることができない。有機溶媒存在下では酵素は不安定で容易に失活するためである。そこで、有機溶媒存在下でも失活しない有機溶媒耐性生体触媒が切望されている。本研究では、酵素の有機溶媒耐性の原因解明とタンパク質工学的手法による新規有機溶媒耐性酵素の開発および、および有機溶媒耐性酵素や有機溶媒耐性微生物を高効率で用いるための工学的研究等、以下の項目について検討した。(1)酵素の有機溶媒耐性の原因解明(2)有機溶媒耐性付与が望まれる酵素の遺伝子の取得(3)有機溶媒耐性酵素遺伝子の発現系の構築(4)タンパク質工学的手法による有用な基質特異性を有する有機溶媒耐性酵素の作成日本を始めとする先進国における化学産業はバルク製品の製造から、より付加価値の高いファインケミカル製品の製造に移行している。これらのファインケミカル製品の製造の触媒として基質特異性の高い酵素を利用することは、環境調和型の化学プロセスを構築する上で大変有用である。しかしながら、ファインケミカル製品の多くは難水溶性の化合物であり、高効率に製造するために用いられる有機溶媒存在下では酵素は容易に変性し、その触媒機能を喪失する。本研究では、酵素の有機溶媒耐性の要因を検討し、有機溶媒耐性生体触媒の創製に必要な知見を得ると共に、それらの知見を基にして、有機溶媒耐性生体触媒を創製する。本年度は、まず、有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株由来のLST-03リパーゼ遺伝子にランダム変異を誘発し、有機溶媒耐性の異なるリパーゼの取得を試みた。その結果、有機溶媒耐性が向上した数種の変異リパーゼの取得に成功した。また、新たな有機溶媒耐性酵素の創製を目指し、補酵素を必要としない酸化還元酵素遺伝子の取得を試みた。具体的には、高価な補酵素等を必要とせずに、反応性の高いハロゲン化中間体を合成する酸化還元酵素の1つであるStreptomyces aureofaciens ATCC 10762株由来の非金属型プロモペルオキシダーゼを選択し、当該遺伝子をクローニングや異種宿主での発現系を構築した。日本を始めとする先進国における化学産業はバルク製品の製造から、より付加価値の高いファインケミカル製品の製造に移行している。本年度は、有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株由来のLST-03リパーゼ遺伝子にランダム変異を誘発により取得した有機溶媒耐性が向上した数種の変異リパーゼの変異箇所を同定したところ、これらの変異酵素には複数の変異が導入されおり、変異には共通するいくつかの特徴が見出された。また、高価な補酵素等を必要とせずに、反応性の高いハロゲン化中間体を合成する酸化還元酵素の1つであるStreptomyces aureofaciens ATCC 10762株由来の非金属型プロモペルオキシダーゼを異種宿主で発現し、遺伝子産物の精製手法を確立するとともに、当該酵素の活性や安定性等の諸性質について検討し、産業酵素としての有用性を評価した。

これらのファインケミカル製品の製造の触媒として基質特異性の高い酵素を利用することは、環境調和型の化学プロセスを構築する上で大変有用である。しかしながら、ファインケミカル製品の多くは難水溶性の化合物であり、高効率に製造するために用いられる有機溶媒存在下では酵素は容易に変性し、その触媒機能を喪失する。本研究では、酵素の有機溶媒耐性の要因を検討し、有機溶媒耐性生体触媒の創製に必要な知見を得ると共に、それらの知見を基にして、有機溶媒耐性生体触媒を創製する。本年度は、有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株由来のLST-03リパーゼの進化分子工学的手法により見出した情報に基づいて、部位特異的変異により単一の変異を有する変異リパーゼを種々作成し、有機溶媒耐性に関与する部位・領域を同定した。また、計算科学的手法を用いて、有機溶媒耐性向上の理由についても考察した。一方、有機溶媒耐性微生物P. aeruginosa PST-01株由来のPST-01プロテアーゼとサーモライシンの活性中心の構造を比較し、アスパルテーム前駆体合成活性に及ぼすプロテアーゼの活性中心付近の構造について検討した。その検討結果を基に、PST-01プロテアーゼの活性中心のアミノ酸を部位特異的変異導入により改変し、高い有機溶媒耐性を有し、アスパルテーム前駆体合成活性に優れた高い酵素を開発した。日本を始めとする先進国における化学産業はバルク製品の製造から、より付加価値の高いファインケミカル製品の製造に移行している。特に、リパーゼは難水溶性の脂質のエステル結合を加水分解する酵素であり、水分濃度が低い場合には、その逆反応を触媒することが可能である。そのため、リパーゼの反応は有機溶媒存在下で用いられることが多い。一般の酵素は有機溶媒存在下で容易に変性し、その触媒機能を喪失するが、有機溶媒耐性リパーゼを産生する有機溶媒耐性微生物が取得されている。しかしながら、有機溶媒耐性リパーゼの生産性はあまり高く、リパーゼの活性発現には分子シャペロンが必要である。そこで、高効率な多量取得を目的とし、異種宿主とした高発現系の構築を試みた。強力な大腸菌プロモーターの下流に有機溶媒耐性リパーゼ遺伝子を配するとともに、高発現が達成されるよう遺伝子を改変した。発現したタンパク質の局在を調べると共に、高効率な可溶化と高純度なタンパク質の取得法を検討した。
糖尿病網膜症における内因性分泌型AGEs受容体が及ぼす網膜循環への影響の解析

平成28年度は、平成27年度に引き続き、滲出型加齢黄斑変性患者(AMD)を対象に、Advanced glycation end products (AGEs)の1つであるペントシジンと、内因性分泌型AGEs受容体(esRAGE)(デコイとして働きAGEsの作用を阻害し組織障害の進展を抑制することが知られている)血中濃度を測定し、滲出型加齢黄斑変性との関連性を検討した。研究成果AMD患者31名(典型AMD10名、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)患者21名)、非AMD(コントロール)15名を対象とした(年齢58歳から90歳)。ペントシジンと、esRAGEの血中濃度をenzyme-linked immunosorbent assay法で測定した。血中ペントシジンは、典型AMDに病因の関与する可能が示唆された。研究の成果糖尿病のないコントロール10名(64歳)、2型糖尿病患者40名(網膜症なし18名(61歳)、網膜症あり22名(61歳))の血中ペントシジン濃度をELISA法を用いて測定した。2型糖尿病患者の血中ペントシジン濃度と網膜血流の関係を検討した。網膜循環測定は、レーザードップラ眼底血流計を用い、収縮期血流速度と拡張期血流速度の比からPulsatilityRatioを算出し、血管壁硬化の指標とした。Pusatility ratioは網膜症あり群で高値であった(p<0.05)。血中ペントシジンはコントロールl群;0.042 ±0.010μg/ml(平均値±標準偏差)、網膜なし群;0.048 ±0.013μg/ml、網膜症あり群;0.059 ±0.012μg/mlで、網膜症あり群が有意に高値であった(p<0.05)。血中ペントシジンが高値であるほどPusatility ratioが高値であった。これらの結果からペントシジンが高値ほど、血管壁硬化が進行し、糖尿病網膜症発症・進行に関与することが推測された。血中esRAGEと網膜循環の関係については十分に検討できなかった。次年度に持ち越して検討する予定である。平成27年度は、平成26年度に引き続き、2型糖尿病患者と非糖尿病者を対象に、Advanced glycation endo products(AGEs)の一つであるペントシジンの血中濃度と、血中の内在性分泌型AGEs受容体(esRAGE )量を(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay法)ELISA法で測定し、網膜血流との関係の解析を目標とした。更に、他の疾患である加齢黄斑変性患者のペントシジンの血中濃度と、血中のesRAGE量をELISA法で測定し,加齢黄斑変性(AMD)との関連性を検討した。研究の成果2型糖尿病患者の血中ペントシジン濃度と網膜血流の関係を検討した。網膜循環測定は、レーザードップラ眼底血流計を用い、PulsatilityRatioを算出し、血管壁硬化の指標とした。Pusatility ratioと、血中ペントシジンは網膜症あり群が有意に高値であった(p<0.05)。滲出型AMD患者31名(典型AMD10名、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)患者21名)、非AMD(コントロール)15名を対象とし、ペントシジンと、esRAGEの血中濃度をELISA法で測定した。典型AMDの血中ペントシジン濃度(0.125 ±0.0210 &#181;g/mL;平均±標準偏差)は、コントロール(0.0245 ±0.0153 &#181;g/mL)、PCV患者(0.0221 ±0.0202 &#181;g/mL)に比べ有意に高値であった(P<0.05)。血中esRAGE濃度は、PCV患者(0.177 ±0.0991 ng/mL)で低い傾向であったが、コントロール(0.241 ±0.0918 ng/mL)、典型AMD (0.259 ±0.134 ng/mL)の3群間に有意差を認めなかった(P=0.08)。血中ペントシジンは、典型AMDに病因の関与する可能が示唆さたが、血中esRAGEは、滲出型AMDの病因への関与は低いと考えられた。平成27度は、加齢黄斑変性患者の追加研究を行ったが、糖尿病網膜症患者の研究が大幅に遅れた。その理由の一つは、外来の多忙さ、が挙げられる。測定した全患者は外来患者であり、多忙な外来診療の中では十分に患者様に研究の説明、同意を得るための時間がもてなかった。今後は、外来診療日とは別に研究日を設け、ゆとりをもって患者さんのリクルート、研究推進ができるようにしていく。平成28年度は、平成27年度に引き続き、滲出型加齢黄斑変性患者(AMD)を対象に、Advanced glycation end products (AGEs)の1つであるペントシジンと、内因性分泌型AGEs受容体(esRAGE)(デコイとして働きAGEsの作用を阻害し組織障害の進展を抑制することが知られている)

血中濃度を測定し、滲出型加齢黄斑変性との関連性を検討した。研究成果AMD患者31名(典型AMD10名、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)患者21名)、非AMD(コントロール)15名を対象とした(年齢58歳から90歳)。ペントシジンと、esRAGEの血中濃度をenzyme-linked immunosorbent assay法で測定した。血中ペントシジンは、典型AMDに病因の関与する可能が示唆された。平成26年度は、目標としていた症例数の3分の2程度であった。また、もう一つの測定項目である血中内在性分泌型AGEs受容体(esRAGE)の測定ができなかった。その理由として、外来の多忙さ、が挙げられる。測定した全患者は外来患者であり、多忙な外来診療の中では十分に患者様に研究の説明、同意を得るための時間がもてなかった。今後は、外来診療日とは別に研究日を設け、ゆとりをもって患者さんのリクルート、研究推進ができるようにしていく。esRAGEは、網膜循環を改善させ、網膜症発症・進展予防に関与しているか?。また、esRAGEの増加作用をもつ薬剤投与により、網膜循環にどう影響を及ぼし、網膜症の発症・進展抑制に関与するか?を明らかにしていく。これらを明らかにすることによりAGEs-RAGEの網膜循環への影響を解明の手がかりとなり、糖尿病網膜症の発症予防、治療法開発の一助になると考える。この遂行のため、糖尿病内科にも協力を要請していく。ペントシジンとesRAGEの抗体キットは既に所持していたため、平成27年度は購入しなくても済んだため。ペントシジンとesRAGEの抗体キットは既に所持していたため、平成26年度は購入しなくても済んだため。ペントシジンとesRAGEの抗体キットを購入する。また、学会発表の旅費、論文投稿料に使用する計画である。
家族性大腸腺腫症患者における腺腫の発生機序とcox-2発現ならびに作用機序の検討

【目的】家族性大腸腺腫症は発生頻度が稀で症例数が少なかったため家族性大腸腺腫症だけではなく孤発性腺腫および大腸癌も対象とし、1)腺腫の腫瘍径とCyclooxygenase-2(COX2)発現の関係、2)腺腫の異型度とCOX2発現の関係および腺腫内のCOX2発現の局在、3)大腸癌の形態分類とCOX2発現の関係について検討した。【方法】1)腺腫63病変に対し、RT-PCR法にてCox2発現についてRT-PCR法にてCox2 index(Cox2 m-RNA/Cox1 m-RNA)として半定量した。腺腫径は、small≦6mm、6<medium≦12mm、12mm≦largeに分類した。2)腺腫95病変に対しABC法(Mouse Anti-human Cox2抗体)で免疫染色を行った。染色陽性腺管の割合を1(030%)、2(3070%)、3(70%以上)、染色強度を0(なし)、1(0と2の中間)、2(強発現)に分類した。3)大腸癌68病変をnon-polypoid cancerとpolypoid cancerに分類し、Cox2発現については1)と同様の方法にで定量した。【結果】1)腫瘍径とCOX2発現の関係は、m-RNAレベルでは腫瘍径が大きいほどCOX2発現が増強していた(P=0.007)。2)免疫染色の結果、腺腫の異型度とCOX2発現は強い相関を示した。また、Cox2の局在は、正常粘膜および間質細胞に比べて優位に腺腫細胞の細胞質に局在し、全体の72.6%が細胞質内に認められた。3)大腸癌の形態では、Cox2はnon-polypoid cancerにおいてpolypoid cancerおよび正常粘膜より優位に高く発現していた(P=0.0002、P<0.0001)。家族性大腸腺腫症(FAP)は大腸に100個以上の腺腫を発生させ,60歳までにほぼ全例に大腸癌が発生する常染色体優性遺伝性疾患である.この疾患に対して大腸癌発生以前に数種類の予防的大腸切除術が広く行われており,大腸癌による死亡率は低下し,それら手術の効果が認められてきた.一方,上部消化管にも腺腫性ポリープが随伴することが知られ,予防的大腸切除術後の上部消化管悪性腫瘍の発生が大きな問題として注目されるようになってきた.上部消化管の中でも十二指腸乳頭部には一般集団の250300倍の危険率で癌が発生することが知られるようになり,このような病変に対する早期発見,早期治療が重要となっている.そこで外来でFAP患者40名に対してsurveillance gastroduodenoscopyを行い,十二指腸乳頭部病変の内視鏡分類を確立し,それら分類が細胞増殖の指標の一つであるproliferating cell nuclear anigen(PCNA)と相関するかどうかを検討した.内視鏡所見は正常,表層型腫瘍,隆起型腫瘍,癌の4型に分類することができた.

PCNA-labelling index(LI)の中央値は正常,表層型腫瘍,隆起型腫瘍,癌でそれぞれ,34.0(29-35),37.1(34-43),41.5(36-49),60.6(24-97)であった.また,病理組織学的所見でのPCNA-LIは,異常なし,低・中等度異型腺腫,高異型度腺腫,癌でそれぞれ33.6(29-35),37.1(34-41),53.0(44-57)であった.内視鏡所見分類の癌群および組織学的分類の高異型度腺腫・癌群では有意に他群よりPCNA-LIが高値であった.これらの結果より,PCNA-LIは生物学的マーカーとして有用であることが示唆された.家族性大腸腺腫症は発生頻度稀で,標本は貴重なものであるので,今年度はまず,孤発性腺腫における蛋白レベルでのCOX-2発現を免疫組織化学的に検討できるようにした.孤発性腺腫96病変(内視鏡的に摘除,または大腸癌切除標本に併存していたもの),正常大腸粘膜49検体,大腸癌54病変を対象とした.ホルマリン固定した検体を4μmに薄切し,ウサギ抗ヒトCOX-2抗体を一次抗体としてABC法にて染色を行った.筋層または粘膜筋板の染色強度を2+として内部標準とし,03+の4段階評価を行った.正常,腺腫,癌それぞれの上皮および間質におけるCOX-2発現を比較した.腺腫を径によりsmall:φ≦6mm,medium:6mm<φ≦12mm,large:12mm<φに分類した.腺腫細胞におけるCOX-2発現は,平均1.9+(0:5%,1+:25%,2+:43%,3+:27%)であり,正常大腸粘膜の0.7+(0:33%,1+:61%,2+:6%,3+:3%)に比べて有意に増強していた.大腸癌における発現も2.4+(0:0%,1+:17%,2+:38%,3+:48%)で,有意にCOX-2発現が増強していた.腺腫small群,medium群,large群のCOX-2発現はそれぞれ1.2+、2.0+、2.5+であった.径が大きいほどCOX-2発現が増強し(P<0.001),large群では癌と同程度のCOX-2発現を認めた.間質細胞におけるCOX-2の発現は,正常0.9+,small群1.9+,medium群1.9+,large群1.8+,癌1.8+であった.腺腫の間質におけるCOX-2の発現は,正常より強く癌と同程度であった.孤発性腺腫においては,腺腫径が小さい時からCOX-2が蛋白レベルで発現しており,その発現量はsize-dependentに増強していた.【目的】大腸腺腫におけるCOX-2発現の局在を明らかにし、大腸発癌における、COX-2発現の役割を検討した。【対象と方法】散発性大腸腺腫95病変を対象とし、COX-2抗体(IBL社のMouse Antl-human COX-2抗体)を用いて、ABC法にて免疫染色を行った。評価法は染色陽性腺管の割合を(0%):0、(030%):1、(3070%):2、(70%以上):3、染色強度を0、(0と2の中間):1、(強):2と分類し、その合計を05+とし、02を陰性群、35を陽性群とした。腺腫の異型度はWHOの基準に従い、mild dysplasia、moderate dysplasia、sever dysplasiaに分類した。また径によりsmall : 6mm≧φ、medium : 6mm<φ≦12mm、large : 12mm<φに分けたCOX-2発現と臨床病理学的因子との関係は、多重ロジスティック回帰分析を用いて統計学的検討を行い、P<0.05を有意差ありとした。さらにCOX-2と細胞増殖との関係を検討するために、連続切片においてKl-67抗体による免疫染色を行い、Kl-67 1abeling index(Ll)を測定し、COX-2発現細胞との関係を検討した。【結果】(1)大腸腺腫におけるCOX-2発現は、正常粘膜及び間質細胞に比べて優位に腺腫細胞の細胞質に局在し、全体の69例(72.6%)に認めた。(2)臨床病理学的因子との関係では、COX-2発現は異型度と強い相関を示した。
魚類加工品製造現場における簡便・迅速な魚種判別法の開発およびマニュアル化

【目的】原材料魚種や産地の表示が、JAS法で義務づけられているが、食品の表示を巡る偽装は後を絶たない。フグ類などの中には有毒成分が含まれる魚種もあり、迅速・簡便な種判別法の開発が重要である。また、食品製造業者や販売業者間では、製造過程や製品の原材料魚種判別技術の開発が求められている。そこで、DNAマクロアレイ分析をもとに食品製造現場で可能な原材料魚種判別法の開発を試みた。【方法】フグ類標品としてサバフグ属4種、トラフグ属8種およびヨリトフグを用いた。カワハギ類標品としては、カワハギ、ウマヅラハギおよびウスバハギを用いた。筋肉から抽出したDNAを鋳理に、ミトコンドリアcytochrome b遺伝子およびD-loopの一部領域を対象に5種類のプライマーを作成した。プライマーセットdot_15022-F/dot_16075-Rを用いてPCR増幅したDNA断片をメンブレン上にブロットしてアレイを作成した.プライマーセットdot_15619-F/dot_16069-Rを用いた領域についてはdigoxigeninで標識して種特異的プローブを作成し、DNAアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。フグ類およびカワハギ類加工品についても同様の分析を行って原材料魚種を調べた。【結果】サバフグ属4種、ヨリトフグ、カワハギ類3種については、DNAアレイ分析の結果、すべての魚種を特異的に検出することができた。トラフグ属については、種特異的に検出された魚種もあったが、複数種との交差反応が見られた魚種もあった。フグ類およびカワハギ類を原材料とする加工品について同様に分析を行ったところ、いくつかの加工品で複数種と弱い交差反応を示したが、商品に表示されていた原料魚種をほぼ表示通り検出することができた。一連のDNAマクロアレイ分析中、DNA抽出キットやTOYOBO PerfectHybなどの試薬を用いて、分析にかかる時間の短縮を可能にした。しかしながら、原材料魚種判別には最低でもPCR装置や画像検出設備が必要であり、食品製造現場での種判別には課題が残された。
半乾燥熱帯アフリカの風土にあった有機物施用指針の策定

1.マラウイの中でも古くからの人口密集地域において、家畜堆肥のほか、エコサントイレ導入による屎尿利用に取り組むパイロット農家を現地NGOの協力を得て、選定した。2.衛星画像やドローンによる空撮を通じて、対象地域の特徴づけを行った。3.有機物施用の作物や土壌に対する効果を養分量、物理性、物質収支の観点から再評価するための圃場試験を開始した。4.篤農家の家屋そばに、エコサントイレを設置した。5.対象地域の基礎情報として、土地利用、家畜飼養、土壌、作目、地形などの農学的情報を収集した。当初の予定通り、パイロット農家の選定、エコサントイレの設置、圃場試験の実施を遂行することができたため。1.前年度、エコサントイレを導入したパイロット農家の圃場において、エコサントイレにより製造した肥料を用いて圃場試験を実施し、肥料の効果を検証する。2.衛星画像やドローンによる空撮や住民への聞き取りを通じて、研究対象地域の自然・社会条件を明らかにする。3.有機物施用の作物や土壌に対する効果を養分量、物理性、物質収支の観点から再評価するための圃場試験を継続する。4.パイロット農家によるエコサントイレ利用状況のモニタリングから、トイレの継続利用にかかる課題を発見し、解決する。
粉末緑茶の摂取と運動療法による閉経後骨粗鬆症予防効果の検討

EGCGの卵巣摘出(OVX)ラットの骨強度減少に対する効果を調べた。卵巣摘出は、有意に骨強度を低下させ、EGCGの投与はこの低下を抑制した。EGCGは破骨細胞株(RAW264.7)における破骨細胞形成を抑制した。健康教室に通っている60-80代の女性11名を対象として、粉末緑茶摂取と運動の影響について検討した。骨密度計による測定結果では、56日後の結果で、EGCG投与郡に有意な増加傾向が認められた。これらの結果から、EGCGは閉経後骨粗鬆症の症状を緩和する可能性が示唆された。(1)更年期によるエストロゲン量低下に伴う骨量低下に対する、粉末緑茶と運動による効果を明らかにする。(2)破骨細胞株及び骨芽細胞株を用いて、緑茶成分を添加して骨代謝動態に及ぶす影響を明らかにすることで、緑茶成分の作用を判定する。(3)健常閉経後女性ボランティアで、二重盲検法によるプラセボコントロール試験を行い、粉末緑茶の摂取と運動療法により閉経後骨粗鬆症予防が可能であるかを明らかにする。研究の目的骨粗鬆症とは「骨折リスクを増すような骨強度上の問題を既に持っている人に起こる骨格の疾患」と定義され、発症する前の予防が重要なキーワードと考える。そこで、本研究では、(-)epigallocatechin-3-gallate(EGCG)を多量に含む粉末緑茶を摂取させ、さらに、骨へのカルシウムの沈着を促すための運動療法を組み合わせて行うことにより、「粉末緑茶の摂取と運動療法による閉経後骨粗鬆症予防効果」を明らかにすることを目的とする。本年度は、トレッドミルトレーニングを負荷した更年期モデルラットのエストロゲン濃度と骨強度を測定することにより、更年期によるエストロゲン量低下にともなう骨量低下に対する、粉末緑茶と運動による効果を明らかにすることを目的とした。平成18年度結果の概要1.更年期モデルラットの作成飼料、水は自由摂取とし、飼料摂取量と体重を毎日測定した。経時的に採血し、中性脂肪とエストラジオール濃度をキットにて測定した。その結果、ほぼ4-6週後に、血清エストラジオール濃度に変化が見られ、更年期モデルラットの作成が確認できた。2.トレッドミルトレーニング、粉末緑茶投与と骨強度への影響卵巣摘出後、トレッドミルトレーニング(傾斜6度、13m/分、60分/日、週3回)を行ない、大腿骨を破断して骨強度を測定した。その結果、対象となるシャムオペレーションラットと比較すると、卵巣摘出により骨強度が低下し、トレーニングが骨強度低下を緩和する傾向が見られた。研究の目的:骨粗鬆症とは「骨折リスクを増すような骨強度上の問題を既に持っている人に起こる骨格の疾患」と定義され、発症する前の予防が重要なキーワードと考える。本年度は、骨芽細胞を培養し、細胞の機能に対する、EGCGの作用を明らかにすることを目的とした。19年度の研究実績の概要1.破骨細胞活性に及ぼす影響の検討マクロファージ様細胞株RAW264.7細胞をDMEM培地を用いて培養した。その後、EGCGを含むreceptor activator of NF-κBligand(s RANKL)入りα-MEM培地で分化誘導させた。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)の染色行い、TRAP陽性破骨細胞数の染色の強さと1個当たり面積を測定した。その結果、EGCGの濃度依存的にTRAP陽性細胞数の減少が認められた。2.破骨細胞機能に及ぼす影響破骨細胞活性アッセイ用基質プレート(OAASTM)を用いて骨吸収孔を形成させ、骨吸収孔数を数えた。その結果、EGCGの濃度依存的に骨吸収孔数の減少が認められた。以上の事実から、EGCGの破骨細胞陽性細胞形成における濃度依存的な抑制作用が明らかとなり、EGCGが骨粗鬆症の予防効果につながる可能性が示された。骨粗懸症とは、「骨折リスクを増すような骨強度上の問題をすでに持っている人に起こる骨格の疾患」と定義され、発症者は2010年には1,245万人に達すると予想されている。発症する前の予防が重要と考えられ、特に骨量の減少を抑制することが必須である。そこで、本研究は、粉末緑茶の主成分であるEGCGに着目し、骨強度と破骨細胞への効果を明らかにするために行われた。

9ヶ月令のSD系多産ラットに卵巣摘出術(OVX)を行った結果、OVXを施していないScham郡とOVX群の血清エストラジオール(E2)値を比較すると、OVX郡の血清E2値の低下が見られ、子宮湿重量も有意に減少した。これらの結果から、更年期モデルラットの確立が明らかとなった。骨強度を測定すると、Scham郡と比べ、OVX群では優位な骨強度の減少が認められ、同時にEGCGを投与した郡では、この減少が抑制されることが明らかとなった。本年度は、この事実に基づき、健常閉経後ボランティアによる粉末緑茶と運動の効果を明らかにしたいと考える。健常閉経後女性ボランティアで、二重盲検法によるプラセボコントロール試験を行い、粉末緑茶の摂取と運動療法による閉経後骨粗鬆症予防が可能であるかどうかを明ちかにすることを目的とし、運動と緑茶の摂取が骨量減少の緩和に有効であるかを検討した。週に1回、健康教室に通っている60代80代の女性11名を対象とした。口頭及び文書による充分な説明を行い、サプリメントの摂取、体組成及び骨量の測定の希望ならびに、調査協力の意志が得られたものを対象とした。サプリメントはカテキンとビタミンDを含むものをアクティブとし、ビタミンDのみのものをプラセボとして使用した。超音波骨内伝播速度(SOS)の28日後、56日後、84日後のプラセボとアクティブのt検定を行ったが、いずれも危険率5%で有意差はなかったが、アクティブ群にSOSの増加傾向がみられ、56日後では、危険率5%で有意差が認められた。今回の対象者は身体活動量があり、食事も充足率からみて充分に摂取しており、骨年代も実年齢よりも若かったことが原因と考えられる。また、骨量が年齢の割には充分にある集団であったため、その変化が少なく有意差がみられない原因となったと考えられる。また、食事調査の結果よりカルシウム及びビタミンDの充足率は充分であったため、骨量も高かったと考えられる。今回の調査期間は、3ヶ月間であったが、SOSの推移をみるには長期間の継続調査が必要と思われる。
小児がん発症期の家族に対するサポート体制の構築

小児がんの初期の家族に対するサポート体制を検討するために、家族の経験や心情からの"発症期"を設定した。発症期を設定することで、"発症期"としての診療の初期段階に必要とされるサポートが明確となった。小児がんの子どもの家族が必要とするサポートを明らかにする小児がんの初期の家族に対するサポート体制を検討するために、家族の経験や心情からの"発症期"を設定した。当該年度においては、文献検討において以下のことが明らかとなった。国内における患者・家族支援においては、入院中の患者・親の心情のほかに兄弟などに対するや支援の必要性について明らかにされている。又小児がんの子どもをもつ親の苦悩や役割期待なども明らかにされてきている。最近では、在宅での生活問題や復学の問題などを含めた退院に際して必要な支援も明らかにされるようになってきている。また、終末期に必要なサポートも検討されるようになってきている。海外においては、病名告知の際の親の衝撃や支援の必要性がいわれており、病名告知および臨床治験への参加についての意思決定に対する指針やその際の親の心情に対する支援の必要性はいわれてきている。その他小児がんの子どもが自信の病気について理解できるようにするためのITの利用やソーシャルサポートへの期待についても明らかにされてきている。又最近では病名告知の際に必要なサポートについても明らかにされてきている。現行サポート体制の調査については、実際にサポートを受けた親からの面接調査を実施した。小児がんが疑われての転院時や確定診断が出るまでの状況や精神状態が明らかになり、心理面に対するサポートや、小児がんの子どものきょうだいに対する配慮などの必要性が示された。また、小児がんの子どもと付き添っている家族が入院生活において必要とするサポートを明らかにすることができた。しかし、今回の面接調査は付き添いを許可している病院が中心であったため、入院生活に必要なサポートに焦点があたっていることや、公的サポートや病院外からのサポートについての詳細な情報が少ないことが示された。そのため、付き添いを許可していない病院で入院していた子どもの家族が必要とする、あるいは期待するサポートについても面接調査を実施する必要性が認められた。また、サポートを必要とする家族側の希望であることから、家族側の期待だけでは、可能なサポートであるかが問題となる。そのため、サポートする側の支援体制や支援に対する準備状況などについても明らかにする必要性も認められた。さまざまな関連職種による現行サポートについて、先行研究より分析した。それぞれの専門職が、院内学級や退院指導、前籍校への復学支援など、それぞれの立場からのサポートを実施し、評価を得ていることが明らかとなった。しかし、これらのサポートが、家族が必要とするサポートであるのか、それぞれのサポートを組み合わせることでの相乗効果などについての今後の調査の必要性も認められた。現行の調査では、外来治療か外来フォロー中の時期による調査であり、レトロスペクティブ調査である。小児がん発症と診断され治療が開始されるまでには、徴候が認められ近医を受診するまで、近医で小児がんが疑われて専門病院を紹介されるまで、専門病院にて診断確定するまでの3期となるが、専門病院にて診断確定する時期の記憶が近医受診と混同され、寛解導入療法時期とそれ以外の治療時期が混同され、それぞれほぼ同時期に起こったことと認識されていることが明らかとなった。小児がんを疑って近医を受診しているのではないため、小児がんが疑われて専門病院を紹介されることは非常に大きな衝撃となっている。また近医での小児がんが疑われたことですでに小児がんを発症したと認識しており、専門病院における確定診断は後付けと認識されている。しかし、発症の衝撃を受けた直後でありながら、近医で小児がんが疑われて専門病院を紹介され、専門病院を受診するまでのサポートがほとんどないことが明らかとなった。小児がんの発症から治療開始まででは、発症の衝撃と過程における生活の現状維持のための努力についての印象が強く、発症の衝撃と同様に、これまでの家庭生活の維持が重要な課題となっている。子どもに対する病名告知や治療受け入れについての印象はほとんど明らかにされなかった。小児がんの徴候が認められ診断確定までを混同していることは、発症の衝撃を示すものである。しかし、近医での紹介から専門病院受診までのサポートの空白期間も認められることから、空白期間におけるサポートを検討する必要がある。まだ経過に沿ったサポートとするためには、より詳細なデータ収集かプロスペクティブな調査が必要といえる。発症の衝撃や家庭生活の維持への配慮が親としての重要課題であることから、子どもに対する病名告知や治療受け入れについての関心が向きにくい状況となっている。子どもに対する関心を高めるためにも発症の衝撃や家庭生活の維持に向けたサポートを検討する必要がある子どもの尊厳や権利の尊重のために、意思決定への子どもの参加を考える時、親の意向が大きく影響する。特に入院初期の親の心理状態は、その後の闘病生活や子どもの意思決定への参加に対する意向にも大きく影響する。小児がんの入院治療終了後の外来通院中の子どもの親への面接を質的に分析した小児がんの確定診断までの家族の経験は、「尋常でない徴候」「症状と診断のギャップ」「最初の衝撃」「予想外の展開」「奈落の底への突き落とし」の過程を経ることが明らかとなった。入院初期の親の関心ごとに焦点は、「検査を待つこと」「確定診断の衝撃」「家庭生活の維持」であることが明らかとなった。

家族の経験からは、近医受診によって、「症状と診断のギャップ」に戸惑い「最初の衝撃」を受け、「予想外の展開」につながったことからの、「最初の衝撃」や「予想外の展開」への支援の必要性から近医受診が家族支援の開始時点と定義する必要性や「予想外の展開」からの主に転院の途上におこり、精神的支援は実施されていないことによる、看護師の施設問の連携の重要性が示唆された。入院初期の家族支援としては、発症に対する恐怖心の軽減に向けた看護師の声かけのほか、発症という危機的状況を乗り越えるための情報提供が重要であり、闘病生活のなかで家庭生活の維持するためには、未知の経験であることを踏まえて段取りしやすいような、疾患に関すること・今後の闘病生活で予測されることのほかに、慢性特性疾患以外の公的扶助や医療支援の存在などの情報提供も、重要であることが示唆された。
メタ認知的アプローチによる美術鑑賞学習方略の効果と課題

本研究は、鑑賞文作成プログラムにおける鑑賞スキルの学習効果とメタ認知の関連について考察したものである。方法としては、美術鑑賞文作成の過程においてメタ認知を促す学習プログラムをデザインし実施した。考察の結果、メタ認知の高まりは学習効果にかかわる要因のうちの一つであることが示唆された。また、メタ認知的支援は、美術の特質について普段あまり考えることの少ない初心者に対して有効であることが示唆された。本年度は、本研究課題の第一段階であり、美術鑑賞プロセスにおけるメタ認知のかかわりについての理論的なフレームワークを具体化し、以下のように考察を進めた。1.美術鑑賞プロセスにおけるメタ認知のかかわりと定義の検討まず、美術鑑賞学習におけるメタ認知のかかわりに関する先行研究をレビューした。特に美術鑑賞学習において、メタ認知がいかにかかわるのかについて、(1)発達的視点、(2)熟達化方略、(3)学習の転移、(4)学習者の資質のそれぞれの観点から検討した。次に、美術鑑賞学習におけるメタ認知の定義について検討した。一般にメタ認知は、メタ認知的知識とメタ認知的活動に分けられ、その両者が相互的に機能する活動ととらえられている。このメタ認知の分類をふまえ、美術鑑賞の学習におけるメタ認知的知識とメタ認知的活動を措定し、鑑賞スキルにかかわる活動を具体化し、それらをもとに鑑賞スキルにかかわるメタ認知活動の分析指標を作成した。2.鑑賞スキルを方略的知識とするメタ認知支援の効果についてメタ認知を促す支援方策の効果を検討するために、学習者のどのようなメタ認知的知識が活用されて、どのようなメタ認知的活動が促されているかを明確にする必要があり、本研究では鑑賞スキルを方略的知識とする観点に着目した。つまり、メタ認知的支援としては、鑑賞スキルの観点を学習者に理解させる活動の支援に焦点をあて、鑑賞スキルの観点が学習者のメタ認知的活動においてどの程度活用されるか、そして鑑賞スキルの学習効果とどのように関連しているかを検討した。具体的には2009年度に実施した大学生のデータから、鑑賞での思考を文字として外在化した鑑賞文とふり返りの記述を分析の対象とし、すでに開発した鑑賞スキルの熟達指標と、鑑賞スキルのメタ認知活動の分析指標との関連について分析を進めた。本年度は、本研究課題の第二段階であり、鑑賞プロセスでのメタ認知を支援する具体的方策を開発し、次のような課題の検討を進めた。1.鑑賞者の思考の構造化を促すメタ認知的支援ツールの検討鑑賞プロセスにおいて鑑賞者の思考が構造化される状態は、鑑賞の深まり状態の一つと考えられ、美術鑑賞において鑑賞者の思考の構造化を促す方策をメタ認知的支援の観点から具体化する試みを検討した。今年度は、思考の構造化を促すために次の三つの支援方略に着目し、具体的ツールを開発し、その有効性と課題を検討した。(1)作品に関する問いをメタ認知させつつ、思考の構造化を促す観点、(2)鑑賞スキルにおける作品要素と鑑賞行為をモニタリングさせていく観点、(3)ヒエラルキー・ダイアグラムを活用して鑑賞者が自らのキー概念をメタ認知するように促す観点である。この成果については第33回lnSEA世界会議において発表した。2.美術鑑賞文の評価判断におけるメタ認知的モニタリングの検討美術鑑賞におけるメタ認知では、鑑賞者自身が鑑賞プロセスで自らの活動をモニタリングするメタ認知方略とともに、他者の鑑賞や鑑賞文を評価するプロセスで自らの鑑賞の観点を省察するメタ認知方略も重要と考えられる。今年度は、他者が書いた鑑賞文を任意の観点で評価するプロセスを意図的にもたせることで、鑑賞のキー概念をメタ認知的に顕在化させていく可能性と課題を検討した。具体的には、他者が書いた鑑賞文を学生が評価する際、最初は評価者の任意の観点で評価し、各自の評価観点を記録した。その後、同じ評価者があらかじめ設定された評価観点にもとづいて同一の鑑賞文を評価し、任意の観点での評価と比較した省察を記録した。それらの記録データをもとにしたテキストマイニング分析により、鑑賞文の評価観点と鑑賞でのキー概念との関連について検討を進めた。本年度は、本研究課題の最終段階であり、鑑賞文評価におけるメタ認知的モニタリングの分析を継続して進めるとともに、メタ認知的アプローチによる美術鑑賞学習の事例を集約し、ホームページを構築した。1.美術鑑賞文評価過程におけるメタ認知的モニタリングのテキストマイニング分析他者が書いた鑑賞文を評価する営為は、評価者に自らの評価の観点の明確化を促し、評価者自身の鑑賞の観点を省察させるメタ認知的モニタリングの機能を果たすと考えられる。そこで、他者が書いた鑑賞文について、大学生に任意の観点での評価と、すでに設定された観点にもとづく評価を行ってもらい、両者の評価記録と評価後のコメントを記録した。本年度はそれらの記録データをもとにテキストマイニング分析を進めた。特に大学生が他者の書いた鑑賞文を任意の観点で評価する場合の観点をカテゴリーとして抽出し、各観点間についての構造モデルを検討した。また、あらかじめ設定された観点での評価と比較し、鑑賞で重視される概念を事例分析した。2.メタ認知的アプローチによる美術鑑賞学習教材集の作成とホームページの構築

これまで開発した美術鑑賞学習を効果的に促す教材事例を整理し、学校等で教育実践できるように各発達段階に対応したメタ認知的アプローチによる美術鑑賞支援ツールの集約作業を進めた。理論編では美術鑑賞学習におけるメタ認知的アプローチの概念、構造モデルを明確化し、実践編では具体的鑑賞支援ツールの事例を類別した。また、それらのコンテンツをもとにして新たなホームページ「鑑賞支援ツールのひろば」(http://www.geijutsu.tsukuba.ac.jp/kansho/)を構築した。さらに鑑賞支援ツールについては、教育実践における活用を考慮し、簡便な作り替えや応用がしやすいワークシートや鑑賞ツールをPDFファイルで作成し、ダウンロードできるようにした。本年度の研究計画を計画的に進めることができ、鑑賞者の思考の構造化を促すメタ認知的支援ツールの検討については、その成果を第33回InSEA世界会議において発表することができた。また、美術鑑賞文の評価判断におけるメタ認知的モニタリングの検討についても、現在データ分析を進めているところで、次年度にその成果を発表する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は本研究の最終年度であり、これまでの成果を総括しつつ、メタ認知的アプローチによる美術鑑賞学習について各発達段階に対応した具体的教材を作成し、学校での教育実践に展開できるよう検討を進めていく。また、それらの成果については関係学会で発表するとともに、新たにホームページを開設し公開していく予定である。
臓器移植における慢性拒絶反応の抑制のための基礎的研究

臨床の臓器移植では、免疫抑制剤、臓器保存、手術術式などの進歩により、移植初期には良好な成績を得られるようになった。長期生着が得られるようになった現在、最大の問題は慢性拒絶反応である。この慢性拒絶反応の機序を解明するため、研究代表者の米国での研究成果である動物実験モデルを用いて、各種の免疫学的manipulationを加え、慢性拒絶反応の変化を調べた。本動物実験モデルは、ラットの異所性心移植のモデルで、心移植100日後に慢性拒絶反応が発現し、病理組織像でその程度を判定するものである。この実験系を使い、免疫学的manipulationとして4種類の薬剤を用いて、細胞レベルで免疫経路をblockする方法を試みた。予備実験により、本実験モデルで慢性拒絶反応を再現できることが確認できた。細胞浸潤の全くない、即ち、急性拒絶反応の全くない、純粋に血管内膜肥厚を主体とする小動脈の硬化性変化であり、慢性拒絶反応の病像を示した。この慢性拒絶反応モデルに、各種薬剤を投与し、慢性拒絶反応の有無、程度を検討した。FTY720とIPDの2種類は明らかに慢性拒絶反応を抑える効果が見いだせ、薬剤の用量依存性を検討するため、本実験を行った。この結果、これらの薬剤の移植後2週間だけの投与によって、移植後100日目の病理組織所見において血管内膜肥厚を主体とする小動脈の硬化性変化を、用量依存性に抑制した。シクロスポリンやプログラフなどの従来の免疫抑制剤ではこれらは抑制されなかった。たった2週間の投与により慢性拒絶反応を抑制する作用機序について検討したが、明確な結果は得られなかった。本実験の結果は臨床応用可能な慢性拒絶反応抑制法として、今後の発展が期待される。慢性拒絶反応の機序を解明するため、研究代表者の米国での研究成果である動物実験モデルを用いて、各種の免疫学的manipulationを加え、慢性拒絶反応の変化を調べた。本動物実験モデルは、ラットの異所性心移植のモデルで、心移植100日後に慢性拒絶反応が発現し、病理組織像でその程度を判定するもので、米国での実験系を、本研究のために日本で再現することが出来た。予備実験により、このうちの2種類は明らかに慢性拒絶反応を抑える効果が見いだせ、薬剤投与量依存性を検討するため、本実験を行った。この結果は、全ての動物が移植後100日に至っていないので、未だ全ての結果が出てはいないが、本研究の2年目の初めに間違いなく出す事が期待される。本実験に用いた薬剤を用いた類似の実験結果は今年度発表したが、慢性拒絶反応に関する今回の実験の結果は、2年目に発表予定である。この予備実験の結果と本実験について、研究代表者が米国で以前に慢性拒絶反応について共同研究を行っていたテキサス大学ヒューストン校医学部外科臓器移植部門Kahan教授のもとを訪れて、討論し最新の知見について議論してきた。

細胞浸潤の全くない、即ち、急性拒絶反応の全くない、純粋に血管内膜肥厚を主体とする小動脈の硬化性変化であり、慢性拒絶反応の病像を示した。この実験系を使い、免疫学的manipulationとして4種類の薬剤を用いて、細胞レベルで免疫経路をblockする方法を試みた。予備実験により、このうちのFTY720とIPDの2種類は明らかに慢性拒絶反応を抑える効果が見いだせ、薬剤の用量依存性を検討するため、本実験を行った。この結果、これらの薬剤の移植後2週間だけの投与によって、移植後100日目の病理組織所見において血管内膜肥厚を主体とする小動脈の硬化性変化を、用量依存性に抑制した。シクロスポリンやプログラフなどの従来の免疫抑制剤ではこれらは抑制されなかった。たった2週間の投与により慢性拒絶反応を抑制する作用機序について検討したが、明確な結果は得られなかった。この予備実験と本実験の結果について、研究代表者が米国で以前に慢性拒絶反応について共同研究を行っていたテキサス大学ヒューストン校医学部外科臓器移植部門Kahan教授のもとで、討論し最新の知見について議論した。この結果、本実験の結果は臨床応用可能な慢性拒絶反応抑制法として、今後の発展が期待された。
ショック時における自律神経および内分泌系の中枢調節機構

本研究はショック初期に見られる自律神経一内分泌系の反応を調節、統合している脳内の物質をとらえることを目的とし、push-pullカニューレを脳内に挿入して還流し、還流液中の種々の物質がショックの進行とともにどのように変化するか測定したものである。2年間の研究期間において特に大きな成果の得られた研究は出血性ショック時における脳内のthyrotropin-releasing hormone(TRH)の変化であり、いくつかの論文を発表することができた。TRHは脳内において内分泌系のみならず自律神経系の調節にも関与していることが知られるニューロペプチドであり、TRHが出血性ショック時の心血管系の中枢性調節に関与していることが本研究においてはじめて明らかになった(Brain Research,474,399ー402,1988)。本論文中で明らかにした点は下記の3点である。1)出血性ショック(全血の30%の血液の急速脱血)直後、第四脳室中にTRHの遊離が増加するが、20分以内に元のレベルにもどる。2)第四脳室にあらかじめ抗TRH血清を投与しておき遊離されたTRHの作用を阻害すると出血性ショック時の血圧の低下の程度が大きく長時間低血圧が持続する。3)正常な動物に抗TRH血清を投与しても血圧、心拍数に有意な変化はない。以上のことから出血圧ショック時には脳内のTRHの遊離がふえ血圧の回復を早めていると推定される。現在第四脳室の遊離されたTRHの源を探るため、脳内部位をいくつか選んで同様の還流を行なっている。さらにこの変化が出血性ショックに特有のものかあるいは動物がストレスにさらされた時の一般的な反応であるかを探るため他のモデルにおいても同様の測定を試みている。今年度はpush pullカニューレを作成し,ラットの脳で還流することにより脳内の物質,特にthyrotropin-releasing hormone(TRH)を連続的に測定できるようにすること,さらに循環動態の指標として血圧,心拍数などを同時にモニターすることを目標とし,これを達成することができた.今,度中に得られた成果としては下記のようなものがあり,一部は論文として発表した.1.push-pullカニューレは計画書どおり作成し,ラットを覚醒下にて血圧,心拍数をモニターしながら第4脳室を還流して連続的にサンプルを得ることができた.測定する物質により還流速度を変える必要があり, TRHの場合は10μl/min,又はアミノ酸やグルコーマ,ラクテードなどは25μl/minが適当である.2.脳内のTRHの量で循環系の変化との関係を知るために,静脈内にTRHを投与し,脳還流液中のTRH濃度と血圧,心拍数を測定した結果, TRHの脳への移行と,脳からの消失のパターンが血圧,心拍数の変化のパターンをよく相関することから, TRHの中枢性の交感神経刺激作用の直接的な証拠を得た.(Okuda C.efalLife Sci.42 1988)3.循環ショックの際の脳内の内因性のTRHあるいはアミノ酸などの変化に関する予備実験的データもいくつか得ることができた.特に出血性ショックおよびエンドトキシンショックモデルにおいて脳内アミノ酸やグルコーマラクテートなどの変化に関して代謝面からの考察を加え,一部学会発表した.また, push pull penfvsiun法を循環ショックの病態解析に用いる意義に関しても報告した. (奥田,医学のあゆみ)