hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭蓋顎顔面領域高頻度疾患の原因究明から病態発症機序解明への最先端研究戦略

非症候性多数歯欠損症を呈す家系の疾患関連遺伝子を探索したところ、既知原因遺伝子であるMsx1の3'末端近傍にフレームシフト変異が検出された。そこで、CRISPR/Casシステムを利用してマウスでC末端領域を欠失させたところ、従来のノックアウトマウスで見られた歯の完全欠損や口蓋裂に起因する生後すぐの致死とは異なる表現型、すなわち上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた。本表現型は、検出変異が疾患関連変異であることの妥当性を裏付けるものであった。本研究は、頭蓋顎顔面領域の形態形成に影響を及ぼす原因遺伝子不明の疾患をターゲットに、次世代シーケンサーを用いた解析を柱に原因遺伝子探索を行い、新規原因遺伝子を同定すると共に、人工ヌクレアーゼによる同定変異部位の機能解析から、病態形成機序を解明することを目的とする。平成26年度は非症候性多数歯欠損症家系の唾液サンプルからゲノムDNAを抽出し、歯牙欠損症の原因遺伝子の全てのエクソンのシーケンスをサンガー法にて行ったところ、Msx1遺伝子のエクソン2にフレームシフト変異を検出した。マウスMsx1遺伝子配列中、変異検出部位近傍に標的配列を設定し、マウス1細胞期胚においてマイクロインジェクションにてCRISPR/Casシステムを適用した。胎生16.5日に胚を摘出し、Msx1ノックインマウス様表現型の確認、ならびにゲノムDNAを抽出し、標的配列のシーケンスを行った結果、歯牙欠損症を有する家系に、過去に報告のないフレームシフト変異がMsx1の3'末端領域に検出された。本変異はMsx1遺伝子最下流のMH6領域に影響を与えるため、同領域の5'側にgRNA標的配列を設定し、マイクロインジェクション法によるCRISPR/Casシステムを適用し、胎生16.5日に胚を摘出したところ、12胚中6胚で口蓋裂ならびに歯の発生異常を認めた。平成27年度はCRISPR/Casシステムの適用について、マウス1細胞期胚に対するマイクロインジェクション法だけでなく、エレクトロポレーション法の導入も試みた。その結果、遺伝子破壊の導入効率は両手法とも80%以上で、エレクトロポレーション法の方がサンプル処理速度が向上し、かつインジェクションにおける針の刺入回避による細胞の致死率減少が達成された。また、エレクトロポレーション法では、1本鎖DNAの共導入により、ノックインにも成功した。一方、平成26年度に、多数歯欠損症患者より検出した、既知遺伝子(Msx1遺伝子)内の新規フレームシフト変異の疾患原因変異としての妥当性の検証実験を進めた。当科における多数歯欠損症患者から検出された新規変異は過去の報告中、最下流に認められた。その原因変異としての真偽を検証するため、同変異により欠失するC末端領域をCRISPR/Casシステムを利用してマウスで欠失させたところ、従来のノックアウトマウスで見られた歯の完全欠損や口蓋裂に起因する生後すぐの致死とは異なる表現型が得られた。すなわち、上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた(論文投稿中)。本表現型は、検出変異の疾患関連変異であることの妥当性を裏付けるばかりでなく、従来、in vitroの系でしか検討されてこなかったDNA deletion assayのin vivoへの発展性が示唆された。脊椎動物におけるヒト疾患モデル動物の作製については、CRISPR/Cas切断領域前後の相同配列と疾患関連変異を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの共導入により、ノックインマウス作製の系を構築した。マウス1細胞期胚におけるCRISPR/Casシステムの適用を、マイクロインジェクション法だけでなくエレクトロポレーション法に拡大することで高効率化できた。さらに、小規模多数歯欠損症家系のターゲットリシーケンスから検出された既知遺伝子(Msx1)内の新規フレームシフト変異部位の下流ドメインを同手法にて欠失させたところ、歯の形成異常といった表現型が得られ、疾患関連変異であることをin vivo実験系にて検証ならびに証明した。また一方で、一本鎖オリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションにてgRNAならびにCas9 mRNAと共導入することにより、過去に報告のある疾患関連点突然変異のノックインにも成功した。胚盤胞補完法における技術確立は現在検証中である。以上より、平成27年度に予定した研究計画はほぼ実施できている。本研究は、頭蓋顎顔面領域の形態形成に影響を及ぼす原因遺伝子不明の疾患をターゲットに、次世代シーケンサーを用いた解析を柱に原因遺伝子探索を行い、新規原因遺伝子を同定すると共に、人工ヌクレアーゼによる同定変異部位の機能解析から、病態形成機序を解明することを目的とした。非症候性多数歯欠損症家系の唾液サンプルからゲノムDNAを抽出し、歯牙欠損症の原因遺伝子の全てのエクソンのシーケンスを行ったところ、Msx1遺伝子のエクソン2にフレームシフト変異を検出した。胎生16.5日に胚を摘出し、Msx1ノックインマウス様表現型の確認、ならびに標的配列のシーケンスを行った結果、過去に報告のないフレームシフト変異がMsx1の3'末端領域に検出された。

本変異はMsx1遺伝子最下流のMH6領域に影響を与えるため、同領域の5'側にgRNA標的配列を設定し、マイクロインジェクション法によるCRISPR/Casシステムを適用し、胎生16.5日に胚を摘出したところ、12胚中6胚で口蓋裂ならびに歯の発生異常を認めた。さらに、多数歯欠損症患者より検出した、既知遺伝子(Msx1遺伝子)内の新規フレームシフト変異の疾患原因変異としての妥当性の検証実験を行った。同変異により欠失するC末端領域をCRISPR/Casシステムを利用してマウスで欠失させたところ、上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた。脊椎動物におけるヒト疾患モデル動物の作製については、CRISPR/Cas切断領域前後の相同配列と疾患関連変異を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの共導入により、ノックインマウス作製の系を構築した。非症候性多数歯欠損症を呈す家系の疾患関連遺伝子を探索したところ、既知原因遺伝子であるMsx1の3'末端近傍にフレームシフト変異が検出された。そこで、CRISPR/Casシステムを利用してマウスでC末端領域を欠失させたところ、従来のノックアウトマウスで見られた歯の完全欠損や口蓋裂に起因する生後すぐの致死とは異なる表現型、すなわち上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた。本表現型は、検出変異が疾患関連変異であることの妥当性を裏付けるものであった。平成26年度の実施計画として挙げた、検体ならびに臨床情報収集と次世代シーケンサーを用いた疾患関連変異の検証については、8例のエクソーム解析に加えて、16例の孤発例(新生突然変異やX連鎖性劣性遺伝などの遺伝形式を想定)に対する既知病原性遺伝に特化したターゲットリシーケンスを行い、計24症例から5例で、疾患に関連すると考えられる責任遺伝子変異候補を検出できた。また、多数歯欠損症を呈す家系の疾患関連遺伝子を探索したところ、既知原因遺伝子であるMsx1にフレームシフト変異が検出された。しかし、転写因子であるMsx1遺伝子変異の過去における報告は、全てDNA結合領域であるホメオドメイン内かその上流で、今回検出されたフレームシフト変異は3'末端近傍であった。そこで、疾患関連変異を検証するため、それにより機能を失うMsx1タンパク質中最もC末端に存在する機能領域であるMH6に影響を及ぼすようgRNAを設定し、CRISPR/Casシステムをマウス1細胞期にて適用した。結果、Msx1ノックアウトマウス同様、口蓋裂ならびに歯の発生異常を認め、シーケンスによりMH6領域に影響を及ぼす変異が導入されていることも確認され、患者より検出された変異は疾患関連変異であることが示唆された。これは、疾患関連変異であることの証明のみならず、CRISPR/Casシステムを用いることで、in vitroでの機能解析が困難な場合、in vivoにて検証可能であることを示している。以上より、平成26年度に予定した研究計画はほぼ実施できている。平成27年度に引き続き、検出変異のノックイン/アウトマウス作製を継続するが、遺伝子発現制御領域や染色体の一部が欠失するような変異を検出した際には、同制御領域のマウスゲノム相当配列を欠失させるゲノム編集マウスを作製することで、in vivo機能解析も実施する。
抗生物質の皮膚薬動力学ー特に薬剤による皮膚内移行の差について

抗生物質により,皮膚内移行に差がみられるが,その差が何に由来するのかはなお不明である。蛋白結合率との関連を検討するため以下の実験を行った。1.各種抗生物質の皮膚内移行とヒト血清,ラット血清およびラット皮膚蛋白結合率を測定した。結果、経口セフェムは皮膚内移行0.4以下の群,耐性ブドウ球菌用ペニシリンは0.40.7の群、テトラサイクリン系,アミノグリコシド系,リンコマイシン系,ニュ-キノロン系は0.7以上の群になる。各群の蛋白結合率には幅があり,皮膚内移行と蛋白結合率との間に明らかな相関はみられない。2.炎症部皮膚への移行をハムスタ-を用いて測定した。結果,セファクロ-ル,セファロリジン,オキサシリン,クロキサシリン,オフロキサシンでは正常皮膚と比較して炎症部皮膚への移行は良好であった。ミノサイクリンはフィルタ-を通すと測定できなかった。3.連続投与時の皮膚内移行と蛋白結合率を測定した。結果、ラットにセファロリジンを2時間間隔で2回投与し,経時的に皮膚内移行と血清および皮膚蛋白結合率を測定した。この場合にも皮膚内移行と蛋白結合率には相関はみられなかった。4.ラット血清濃度を変えた場合の蛋白結合率を測定した。結果、セファロリジンでは蛋白量の減少に伴ない,結合率も減少したが,ミノサイクリンでは8倍希釈でやっとバイオアッセイ可能であった。PBSに溶解した(すべて遊離型)セファロリジン,ミノサイクリンの回収率はそれぞれ96.0%,56.0%とミノサイクリンではフィルタ-を通しての回収率が低かった。以上、今回の実験では,皮膚内移行と蛋白結合率との間に明らかな相関はみいだせなかった。皮膚内移行の差については,他の薬剤の性状など併せて検討する必要がある。ラットでの実験では正常皮膚への移行であるため、炎症部皮膚への移行でみる目的で、ハムスターに実験的膿痂疹を作製して炎症部皮膚への抗生物質の移行を検討した。(1)方法:100g前後の雄ゴールデンハムスターの背部に伝染性膿痂疹より分離の黄色ブドウ球菌を接種し、24時間後に抗生物質を胃内に投与、あるいは殿筋内に注射して、一定時間後に採血、採皮した。濃度測定はバイオアッセイ法を用いた。検体は濃度測定前に0.45nmのミリポアフィルターで濾過した。

(2)結果:オキサシリン(20mg/kg、15分後、n=4)では血清4.76±1.07μg/ml、正常部皮膚1.64±0.40μg/g、炎症部皮膚2.69±1.21μg/g、セフィクロール(20mg/kg、30分後)では正常ハムスター(n=5)血清2.38±0.40μg/ml、皮膚2.71±0.81μg/g、炎症作製ハムスター(n=5)血清2.53±0.59μg/ml、皮膚2.63±0.61μg/g、セファロリジン(20mg/kg、15分後、n=5)では正常部皮膚4.54±1.11μg/g、炎症部皮膚5.00±1.15μg/g、オフロキサシン(20mg/kg、30分後、n=5)では正常部皮膚1.65±0.48μg/g、炎症部皮膚2.00±0.28μg/g、ミノサイクリン(20mg/kg、15分後、n=5)では正常部皮膚、炎症部皮膚、血清ともに濃度測定不能であった。しかしミリポアフィルターを通さずに測定する(n=1)と、血清0.67μg/ml、正常部皮膚1.50μg/g、炎症部皮膚1.02μg/gと測定可能であった。以上、正常部皮膚への移行に比し、炎症部皮膚への抗生物質移行は良好であった。ミノサイクリンにおいては、限外濾過法での蛋白結合率測定の際にもうかがわれていたが、ミリポアフィルターを通すことにより濃度測定不能であり、ミノサイクリンそのものの膜への吸着性が高いものと推測された。雄ゴ-ルデンハムスタ-での炎症部皮膚(伝染性膿痂疹より分離した黄色ブドウ球菌を背部皮内に接種し、“実験的膿痂疹"を作製:組織学的には真皮から脂肪織にいたる縫窩織炎)への抗生物質の移行を薄層カップバイオアッセイ法にて検討した。セファクロ-ル(20mg/Kg、30分後、n=4)では、検体をミリポアフィルタ-を通さずに測定すると、炎症作製ゴ-ルデンハムスタ-では血清1.31±0.33μg/ml、皮膚1.19±0.18μg/ml、正常コントロ-ルコ-ルデンハムスタ-では、血清1.57±0.61μg/ml、皮膚1.05±0.53μg/gで、炎症部皮膚において血清に対する皮膚内濃度は26.4%増加していた。クロキサシリン(20mg/Kg、15分後、n=4)ではミリポアフィルタ-を通して、血清5.86±1.52μg/ml、炎症部皮膚3.45μg/g、正常部皮膚1.80μg/gであった。セフタジジムでは検量線、試料ともバイオアッセイ法にて阻止円できず、技術的問題が残った。そこでウィスタ-系雄ラット(150g前後)でのセフタジジム(10mg/Kg、筋注)の皮膚内移行を経時的に検討した。(n=4)。血清(μg/ml)15分後、30分後、1時間後、2時間後、4時間後、各々、4.63±0.47、8.60±0.57、1.46±0.18、0.36±0.09、測定不能、皮膚(μg/g)では各々、2.91±0.29、4.75±0.67、1.06±0.13、0.41±0.09、定不能であった。皮膚内移行(血清に対する皮膚内濃度)は0.55で,注射用セフェム系抗生物質の皮膚内移行(0.4から0.7)と同じ群に属す。ゴ-ルデンハムスタ-での炎症部皮膚内移行については、第88回日本皮膚科学会総会(金沢市,平成元年)において発表した。200g前後のウィスタ-系雄ラットにセファロリジン20mg/kgを2回,2時間間隔で大腿筋に筋注し,初回投与後,0.5,1,2,2.5,3時間後に採血,0.5,1,2時間後に採皮し,血清内濃度,皮膚内濃度を各群3匹で測定した。さらにその血清,皮膚を用いて,限外口過法にて血清,皮膚蛋白結合率を測定した。その際,試料が少ないため,血清,皮膚ともに各群3検体をまとめ,1検体として測定した。血清内濃度平均は,0.5,1,2,2.5,3時間後でそれぞれ,14.1,10.9,3.0,15.9,9.5μg/ml,皮膚内濃度平均は0.5,1,2時間後でそれぞれ6.3,3.6,1.5μg/gであった。血清内濃度においては連続投与による2.5時間後の再上昇がみられた。皮膚内移行(血清内濃度に対する皮膚内濃度比)は0.5,1,2時間後でそれぞれ0.45,0.33,0.50であった。同時に測定した血清蛋白結合率は,17,7,29,4,26.7,34.0,18.9%で一定の傾向はみられなかった。皮膚蛋白結合率は10.4,7.0,0%と時間の経過につれて減少した。いずれにしても皮膚内移行と蛋白結合率との間には相関はみられなかった。

ラット血清を用いて,抗生物質量を一定(50μg/ml)にし,蛋白量を変えて,セファロリジン,ミノサイクリンで蛋白結合率を測定してみると,セファロリジンでは蛋白量の減少に伴ない,結合率は53.3,
藻食魚クロソラスズメダイとそのなわばり内に純群落を形成する藻類との相利共生

サンゴ礁は最も生物多様性が高い生態系の一つとして知られており、多様な藻食性生物のかじり食によって、海藻群落の発達は著しく制限されている。しかし、サンゴ礁の中には多くの種のスズメダイ類がかじり食者からなわばりを防衛し、その中に糸状藻類の繁茂した藻類群落、すなわち藻園を維持している。多くの藻園は様々な藻類が入り混じったものであるのに対し、私は今までの研究で、琉球列島のクロソラスズメダイの藻園は例外的に一種の藻類ハタケイトグサのみによって優占されており、クロソラスズメダイは藻食者からの防衛に加えて除藻を行っていることを発見した。そこで、藻園の単作と混作の生態学的意義を明らかにするため、同所的に生息する同属のホシゾラスズメダイ(Stegastes obreptus)と、クロソラスズメダイとで、藻園の構造とその管理行動を比較した。その結果、ホシゾラスズメダイは除藻を伴なわない粗放的な管理によって広い混作藻園を維持しているのと対照的に、クロソラスズメダイは集約的な藻園管理によって、狭いながらも面積当たりの現存量が高い単作藻園を維持していることが明らかになった。琉球列島における集中的な採集と分子実験によって、ハタケイトグサは藻園の外には全く見られず、クロソラスズメダイにその生存を強く依存していることがわかった。こうして、クロソラスズメダイとハタケイトグサとは、生息場所と餌資源とをそれぞれ提供して、その生存を支えあう栽培共生の関係にあることがわかった。サンゴ礁は海の生態系の中で最も生物多様性が高い場所として知られており、多様な藻食性生物のグレージングによって、海藻群落の発達は著しく制限されている。しかしそのようなラグーンの中には多くの種のスズメダイ類のなわばりが各所に点在しており、そのなわばり内にはしばしば海藻が繁茂している。これらのスズメダイ類の多くは、なわばりを防衛し、その中に生育する藻類を主食としており、そのような藻類群落は藻園と呼ばれてきた。それらのスズメダイ類の中で、クロソラスズメダイは特徴的な糸状紅藻ハタケイトグサの単作の藻園を例外的に維持している。これまでの研究で、単作の藻園管理にはクロソラスズメダイによる除藻と侵入する藻食者の徹底的な排除が見られることを示した。本研究は、その藻園管理の影響を評価し、さらにクロソラスズメダイとその藻園内に生育する藻類との生態学的関係を明らかにしようとしたものである。沖縄県瀬底島のサンゴ礁において、クロソラスズメダイの藻園からのケージによる囲い出し実験を行ない、ケージ内の藻類群落の遷移を追跡した。その結果、クロソラスズメダイの藻園管理を取り除くと、ハタケイトグサは本来除藻されるべき藻類に被覆され、藻園は崩壊することが明らかになった。この結果は、クロソラスズメダイが藻園管理によって、藻類遷移を押しとどめ、本来はパイオニア種であるハタケイトグサの単作を維持していることを示唆している。ハタケイトグサはなわばり外にも見られず、クロソラスズメダイの管理下のみで生存・繁殖できる。また、クロソラスズメダイはハタケイトグサを主な餌として利用・依存している。すなわち、両者は防衛という奉仕と同化産物という報酬を提供しあう栽培共生の関係にある。このような発達した共生関係は、ヒトと栽培植物とに次ぐ新たな例であるといえる。
歯周病巣局所におけるT細胞機能の解析

歯周炎病巣歯肉中にはT細胞が局在し、病巣局所における免疫応答を調節していると考えられる。本研究では、T細胞による歯周病原性細菌に対する特異免疫応答の調節機構の解析を目的として、歯周炎患者末梢血あるいは病巣歯肉リンパ球に存在するPorphyromonas gingivalis線毛抗原特異的T細胞の解析を行った。成人性歯周炎患者の末梢血単核球(PBMC)を所定濃度の線毛抗原とともに培養し、^3H-チミジン(^3H-TdR)の取り込みを指標に抗原特異的細胞増殖反応を検討した結果、歯周炎患者群においては0.550mug/mlの濃度の線毛抗原に対して濃度依存的な増殖反応が認められたのに対し、歯周組織の健康な健常者群より分離したPBMCはこのような反応は示さなかった。また、50mug/mlの線毛抗原を添加した培養で得られた刺激指数(SI)は、患者群で平均1.73±0.21であるのに対し、健常者群では0.86±0.07で有意に高く、歯周炎患者末梢血中に線毛抗原に反応する細胞群が存在することが明らかとなった。さらに、増殖した細胞を比重遠心法により回収し、フローサイトメーターを用いて解析した結果、CD3^+細胞の比率が59.7%から81.1%にまたCD4^+細胞が32.6%から60.2%に増加し、線毛抗原に反応してCD4陽性T細胞が増加したことが示された。さらに線毛抗原に対して増殖反応がみられた被験者のPBMCよりCD4^+T細胞を分離し、線毛抗原および抗原提示細胞(APC)とともに培養すると、SIはPBMCの場合と比較して上昇し、線毛抗原に対する応答はより明確となった。さらに、CD4^+T細胞の増殖はAPC非存在下ではみられず、この反応が線毛のmitogenesityによるものではなく、抗原特異的であることが明らかとなった。すなわち、本研究により歯周炎患者末梢血中にP.gingivalis線毛抗原特異的ヘルパーT細胞が存在し、線毛抗原に対して明確な増殖応答を示すことより、これらの抗原特異的T細胞群よりクローンを得る可能性が示された。
ソルボリシスにおける置換機構仮説の実証

ソルボリシス反応におけるイオン性中間体からの原系復帰の定量的追跡はソルボリシスの詳細機構の解明に不可欠である。アルコキシ炭素の^<13>C-NMRは^<16>Oと^<18>Oの直接置換により同位体シフトを示し、そのシグナル分裂より^<16>O/^<18>Oを定量する事ができる。目的の炭素の^<13>C標識は^<13>C-NMRによる直接反応の追跡を可能する。この新手法を^<13>C、^<18>Oの二重標識のネオフィル、2-フェニルプロピル、2-フェニルエチル、2-(p-メトキシフェニル)エチル、およびベンジルトシラ-トのアセトリシス反応の原系復帰の研究に応用した。アセトリシス反応及びO-交換プロセス(原系復帰)が、少量のラベル化合物を使用し、直接NMR試料管中で^<13>C-NMRを測定する事により追跡できた。また2-アダマンチルトシラ-トは^<13>C非濃縮体を用いて追跡に成功した。ネオフィル系では^<18>Oスクランブリングは見られず、従来の仮説の妥当性を初めて実証した。フェニルプロピル、フェネチル系でintimateイオン対からのリタ-ンは^<18>O不完全スクランブリングを与え、溶媒介在イオン対では完全スクランブリングを与え、イオン対の性質がスクランブリングにより区別でき定義できる。また、対称なフェノニウムイオン経由のフェネチル系で、リタ-ンの際、^<18>Oの攻撃が両メチレンに等価に起こる事実は、リタ-ンがカチオン-アニオンにイオン化後起こると言う決定的証拠を与えた。ベンジルトシラ-トでも、イオン対復帰が観測され、従来のS_N2型機構が否定された。また古典的k_c基質としてソルボリシス機構の解析の基準反応と考へられてきた2-アダマンチル系に大きいリタ-ンが見られた。これは反応機構研究にきわめて重大な影響を与える。この^<13>C-NMRによる同位体シフト法はソルボリシスの^<18>O平衡法に一般的に用いることができ、マススペクトルを使った従来の破壊検査法に較べ優れている。1.^<13>C,^<18>Oラベルトシレートの合成:ネオファルアルコール, 2ーフェニルプロピルアルコール, 2ーフェニルエチルアルコール(無置換体及びpーメトキシ体),ベンジルアルコールの反応中心炭素の^<13>Cラベル体を95%^<13>C炭酸バリウムより合成した.スルホニル^<18>Oラベルトシルクロリドを98%^<18>O重水より合成し,アルコールを^<13>C, ^<18>O二重ラベルトシレートに変えた.2.^<13>CNMRによる^<18>Oスクランブリングの追跡:二重ラベル体のアセトリシス反応をNMR測定管中で行い,原系エステルのアルコキシ酸素への^<18>O同位体の取り込みを^<13>

Cシグナルの同位体分裂ピークの観測により追跡し,その経時変化より原系復帰速度を求めた.3.原系復帰とソルボシス機構:ネオフィルトシレートのアセトリシス反応では全反応を通じて, ^<18>Oのスクランブリングは検出されず,現在仮定されている原系復帰のないアリール関与イオン化律速のソルボリシス機構であることが実験上初めて実証された.2ーフェニルプロピル系では原系の一級トシレートへの復帰はなく二級の転位トシレートへの復帰には^<18>Oスクランブリングが認められた.しかしカチオンーアニオンの再結合でスルホネート部の三つの酸素は等価でなく,元の^<16>Oがかなり優先的に再結合する結果が得られた.この事実はintimateイオン対ではカチオン,アニオン間の相互作用が強く保たれているという重要な情報を与える.2ーフェネチル系の無置換体の原系復帰はプロピル系と同様不完全スクランブリングで起こる.一方, pーメトキシ体では完全スクランブリングで起こっており,溶媒介在イオン対ではアニオン部の三つの酸素は完全に等価な構造をもち,両イオン対の性質の差に対する情報が得られた.ベンジル系では大きな^<18>Oスクランブリングが観測され,原系復帰速度はソルボリシス速度と同程度であり,現在一般に考えられている求核関与機構ではなくイオン化機構をもつという新事実が明らかになった.3ーフェニル-2ーブチルブラシラートのアセトリシスにおける置換基効果を検討し、k_Δとk_Sの両機構への分離を行なった結果、kΔ機構に対してρ=-3.3、γ=0.55が得られ、フェニル関与機構の遷移状態の1級系のネオフィル、βーフェネチル系のほぼ完全な類似性が明らかになった。前年度、フェネチル系のフェノニウムイオンに関する^<18>Oスクランブリングの研究の結果、イオン対の種類と性質等、中間体インオ対構造に関して得られた知見と比較するため、この二級系の^<18>Oスクランブリングを検討中である。前年度の2ーフェニルプロピルおよび2ーフェネチル系において、intimateイオン対からのリターンの場合、完全スクランブリングを伴わない元のOがそのままリターンする機構が存在する事が判明したので、αー^<13>Cラベルの2ーフェネチルー1ー^<13>Cとβー^<13>Cラベルノ2ー^<13>Cのスルホニルー^<18>O_2ラベルトシラートを用いて^<18>Oスクランブリングがフェノニウムイオンに対し対称に起こるか否かを追跡した。イオン対での^<18>Oの攻撃が両メチレン炭素に等価に起こっていること事が実証された。架橋陽イオンの両炭素が^<18>Oに対し完全に等価である事実は、リターンが元のCー0結合のイオン切断後起っており、ソルボリシス反応に伴うリターンは必ずイオン化、中間体イオン対生成、再結合の過程を経由することが明らかになった。これらk_Δソルボリシス系で得られた^<18>Oスクランブリングによる原系復帰の研究からsimpleなアルキル系ソルボリシスでも^<18>Oスクランブリングの量以上にリターンが起こっていると考えるべきであり、又、強いアニオンーカチオンの相互作用により、よりintimateなイオン対では元の酸素での再結合が更に優先すると予測される(hiden return)。^<18>O交換反応から、完全^<18>Oスクランブリングの溶媒介在イオン対とintimateイオン対が区別され、またこれによって両イオン対の定義の可能である事が判明した。ソルボリシス反応におけるイオン性中間体からの原系復帰の定量的追跡はソルボリシスの詳細
近世庭園の様式と地域性に関する基礎的研究－重森編年への検証として

本研究は、桃山時代から江戸時代の寺院や邸宅の庭園の網羅的な調査を基にする編年研究として唯一であった重森三玲による様式編年を検証することを目的とする。本年度は、編年を検証する上で、重要な資料となる『築山庭造伝』前編・後編について、昨年度実施したデジタル化に加え、文字起こしをおこなった。そして本書で使用されている庭園にかかる用語やその概念、登場する構成要素の整理・分析をおこない、重森による解釈との照らし合わせをおこなった。本研究は、桃山時代から江戸時代の寺院や邸宅の庭園を対象に現地調査をおこない、網羅的な調査を基にする編年研究として唯一であった重森三玲による様式編年を検証することを目的とする。本年度は、その前提となる重森三玲の編年観の整理として、『日本庭園史大系』1971-1976をはじめとする重森の著作のうち、特に近世庭園の様式について言及する論考を収集し、その内容の整理をおこなった。この作業を通じて、重森がおよそ3040年単位で、特に池と築山の規模・形状に注目した上で様式変遷を認めていることが判明した。また、現地調査の対象とする庭園のうち、特に近畿圏の対象について資料収集をおこなうとともに、一部現地調査をおこなった。本研究は、江戸時代の寺院や邸宅の庭園を対象に現地調査をおこない、網羅的な調査を基にする編年研究として唯一であった重森三玲による様式編年を検証することを目的とする。本年度は、次年度に引き続きその前提となる重森三玲の編年観の整理として、『日本庭園史大系』1971-1976のうち、特に近世庭園の様式について言及する論考を収集し、その内容の整理をおこなった。この作業を通じて、重森が大系に掲載した江戸時代の庭園が、全国でおよそ900件あり、そのうち国・県・市の文化財指定を受けていない庭園が740件におよぶことがあきらかとなった。当研究以外の職務従事のための時間配分が計画時より非常に多く、併せて年度半ばの妊娠により現地調査の実施が困難となり、現地調査が多くを占める当研究の進捗に遅れが生じた。本年度は、その前提となる重森三玲の編年観の整理として、重森の著作のうち、特に『日本庭園史大系』1971-1976掲載論考における近世庭園の様式についての言及内容を整理したが、研究中断の措置を取ったため、実質1カ月間の作業に留まった。今後は、上記の作業を継続すると共に現地調査を実施し、具体的な検証に研究を進めていく。育児休暇取得により調査研究を中断したため、現地調査が多くを占める当研究の進捗に遅れが生じた。本年度は、年度初頭に研究中断から再開し、特に三重県、鳥取県の庭園について、現地調査前の資料収集およびデータ整理をおこなった。また、編年を検証する上で、重要な資料となる『築山庭造伝』前編・後編を入手してデジタル化をおこない、既刊行の翻刻本との照らし合わせをおこなった。育児により遠方への調査旅行の実施が難しくなったこと、日常業務との両立を図る中で本研究に対するエフォートが極端に減少してしまったことが理由である。当研究以外の職務従事のための時間配分が計画時より多く、併せて育児休暇取得後の家庭状況から遠方での調査の実施が困難となり、現地調査が多くを占める当研究の進捗に遅れが生じた。引き続き、重森の編年観をあらわすとみられる考察を分析し、論文発表をおこなう。また、他の職務に関係する地域の近隣を当研究の現地調査先に組み込むなど、調査地域の見直しを随時行いつつ、調査を進める。重森三玲の編年に関する内容の分析をおこない、その具体的な特徴を明らかにして、論文発表をおこなう。また庭園の現地調査先について近隣地域を優先するなど、調査地域の見直しを随時おこないつつ、調査を進める。また調査協力者に依頼し、調査を円滑に進める。日常業務においても関わりのある、三重県および鳥取県を中心に、現地調査をおこない、その具体的な特徴および年代観について論文としてまとめる。平成26年度引き続き、重森三玲の編年に関する資料を収集し、その具体的な特徴を明らかにして整理し、論文発表をおこなう。また他の職務に関係する地域の近隣を当研究の現地調査先に組み込むなど、調査地域の見直しを随時行いつつ、調査を進める。旅費では遠方への調査を複数回計画していたが実施することができなかったため、人件費ではアルバイトを依頼できる庭園史研究に明るい人員を確保できた時期が遅くなったため、その他では研究の遅れのために学会等の発表に至らなかったため。

育児休業を取得し、調査研究が中断されたため。育児と研究活動との両立において、遠方への調査旅行をおこなうのは難しくなったため。今後は、三重県、鳥取県を中心に現地調査をおこなうこと、成果の公表手段として冊子体の資料集を作成費や、学会投稿料にあてる。物品費では初年度に必要としていた機材が計画より安価に入手できたため、旅費では遠方への調査を複数回計画していたが実施することができなかったため、その他では研究の遅れのために学会等の発表に至らなかったため。引き続き対象の庭園に関する資料を収集するとともに、近畿圏を中心に現地調査を実施し、その際には調査を手助けする人員を雇用することで、調査研究の遅れを取り戻す。また学会発表をおこない、旅費、学会投稿料に当てる。個別の庭園に関する資料を収集するとともに、近畿圏および中国地方の庭園の現地調査を実施し、学会等で発表をおこない、これらの資料購入費、旅費、学会投稿料にあてる。平成27年度は、引き続き対象の庭園に関する資料を収集するとともに、近畿圏および中国地方の庭園の現地調査を実施し、学会等で発表をおこない、これらの資料購入費、旅費、学会投稿料にあてる。
第3生体窓の光で誘起する非線形光学効果を用いた深部高空間分解能光音響イメージング

本研究では、第2の生体窓より生体透過性の高い第3の生体窓光(波長1550-1850 nm)で誘起する希土類錯体の高次非線形な光学応答と光音響トモグラフィ技術を用い、生体深部を1細胞レベルの空間分解能で可視化する技術を開発する。本技術が実現できれば、生体に移植した幹細胞の観察・追跡、生体中の腫瘍組織のがん細胞とその周囲環境(間質細胞など)などの1細胞レベル解析が可能になり、医学・生命科学を大いに加速させる意義深い情報を提供できると考えられる。
プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング

生物が生命活動を維持していくためにはタンパク質がその機能を正しく発現していることが必須である。それためには各々のタンパク質が機能する場所に輸送される局在化という段階と,それが活性化され,完成型タンパク質となるマチュレ-ションの段階を正しく受ける必要がある。枯草菌をはじめとするグラム陽性菌の分泌蛋白質ではプロ構造を持った前駆体として培地中の分泌され,完成型となる酸素が多く知られており,プロ構造のプロセシングを解析するのに有効な系である。そこでグラム陽性菌の中で最も遺伝学的基礎研究が進んでいる枯草菌を材料としてそのプロセシングの機構を解析した。枯草菌における分泌タンパク質のプロセシングやプロ構造が分泌に与える影響を解析するために枯草菌αーアミラ-ゼ・シグナルペプチドと完成型耐熱性αーアミラ-ゼの間に大腸菌プラスミドpBR322 DNA由来のペプチドを挿入した融合耐熱性αーアミラ-ゼを構築した。融合耐熱性αーアミラ-ゼを大腸菌および枯草菌に導入して発現させたところ,pBR322DNAに由来するペプチドの挿入によって、ほとんどの場合,酸素タンパク質の分泌量は低下した。しかし21アミノ酸からなるペプチドを挿入させたものでは,枯草菌の場合親株の約1.7倍の分泌生産量が増大した。これによりプロ構造の改良により分泌量を増大させ得る可能性が示された。枯草菌および大腸菌により分泌された耐熱性αーアミラ-ゼの分子量およびN未端付近のアミノ酸配列の解析の結果、大腸菌ではプロセシングを受けず前駆体として合成されるのに対し,枯草菌では正しくプロセシングされた完成型酸素として分泌されていた。枯草菌におけるプロセシングを調べるために大腸菌で合成した前駆体をinortro系で解析したところ、枯草菌のアルカリ性プロテア-ゼがプロセッシングの主要酸素として働いていることを明らかにすることができた。多くの蛋白質やホルモンは分子量の大きな前駆体として合成され、プロセシングを受けて完成型となる。この過程の間に酵素やホルモンは本来働くべき部位に移行し、活性化される。蛋白質の移行に関しては膜透過やオルガネラへの移行に見られる種々のシグナル(シグナルペプチド等のアミノ酸配列)の存在が明らかにされてきた。しかし、そのプロセシングに関係する酵素等の解析についての研究は少い。枯草菌および大腸菌における分泌蛋白質の局在性・膜透過・プロセシングの過程の解析およびフロセシングに関与する酵素群の解析を行うために、枯草菌α-アミラ-ゼ高生産株Bacillus subtilis NA64より遺伝子をクロ-ン化し、そのプロモ-タ-およびシグナルペプチドをコ-ドするDNA断片を調整した。次に指標酵素としてB.stearotherusophilus A631の耐熱性α-アミラ-ゼを利用するために、その遺伝子をクロ-ン化し、そのプロモ-タ-およびシグナルペプチドをコ-ドするDNA部分を除いた、完成型酵素部分をコ-ドするDNAを得て、HindIIIリンカ-DNAを介して連結させた。その結果amyE^1-amyT融合遺伝子が構築できた。そこでpBR322DNAを製限酵素で分解し、小断片を調整後、HindIII末端を付加し、融合遺伝子のHindIII切断部位に導入した。reading frameが正しい融合遺伝子ではプレプロ構造を持った融合蛋白質が合成され、培地中に分泌生産された。導入された多くのプロ構造によって、耐熱性α-アミラ-ゼの生産は阻害された。阻害の割合は大腸菌と枯草菌ではほぼ同じであった。

しかし、分泌生産された融合蛋白質は一部分解されるか又は分解されずに存在していたのに対し、枯草菌の培地中のものは融合部分が完全に切断除去され、完成型と同じ分子量のもののみが得られた。枯草菌分泌蛋白質のプロセシングのメカニズムについて解析するため,31アミノ酸残基からなる枯草菌αーアミラ-ゼ・シグナルペプチドをコ-ドするDNAとB__ー.<stearo thermophilus>___ー田未完成型耐熱性αーアミラ-ゼのDNAの間に大腸菌プラスミドpBR322より制限酵素切断によって得られる小断片を導入した複合プラスミドを構築した。得られたもののうち,pTUBE638は21残基からなるペプチドが導入され,その結果約1.7倍の耐熱性αーアミラ-ゼを分泌生産することができた。このプラスミド中の耐熱性αーアミラ-ゼ遺伝子を大腸菌で発現させると,耐熱性αーアミラ-ゼのN末端にコノアミノ酸残基余分に持った前駆体として,ペリプラズムに存在していた。一方枯草菌では18アミノ酸残基余分に持った前駆体が培養初期に分泌され,その後プロセシングを受けて,完成型αーアミラ-ゼと同じN末端を持つ酵素とそれより1アミノ酸残基余分に持った酵素とに1:3の割合で作られた。枯草菌で起っているプロセシングに関係している酵素を検索するため,プロテア-ゼ阻害剤であるEDTA,PMSF,Antipain,pepstatin,Chymostatinについて,それらの阻害効果を調べた。PMSHで完全に阻害されることから,枯草菌の主要菌体外プロテア-ゼであるアルカリ性プロテア-ゼが関係している可能性が考えられた。そこで<in>___ー<vitro>___ー系を開発し,このプロセシングを解析するために,大腸菌より前駆体を調製し,枯草菌より調製したプロテア-ゼを用いて解析した。その結果アルカリ性プロテア-ゼが主要なプロセシング酵素として働いていることが明らかとなった。アルカリ性プロテア-ゼの酵素活性としての至適pHは10.5であるが,プロセシングにおける至適pHは8.09.0であった。
高度な地物データGISを用いた都市流域の洪水・低水流出統合水収支モデルの構築

都市流域において,地物一つひとつに設置されている雨水浸透施設の情報を付加して高度な地物データGISを作成し,雨水の地下水涵養過程を忠実に表現する都市流域地下水涵養モデルを構築した.このモデルを実流域に適用してシミュレーションを行い,対象流域における浸透施設の地下水涵養および流出抑制に対する効果を評価するとともに,将来増加が予測される雨水浸透施設の設置シナリオを想定し,その効果を予測・評価した.都市流域において,地物一つひとつに設置されている雨水浸透施設の情報を付加して高度な地物データGISを作成し,雨水の地下水涵養過程を忠実に表現する都市流域地下水涵養モデルを構築した.このモデルを実流域に適用してシミュレーションを行い,対象流域における浸透施設の地下水涵養および流出抑制に対する効果を評価するとともに,将来増加が予測される雨水浸透施設の設置シナリオを想定し,その効果を予測・評価した.本年度は以下に示す主として2項目の研究を実施した.1.地物データGIS用いた洪水流出・氾濫浸水予測モデルの構築に関する研究東京都内の神田川上流域(流域面積約12km^2)を具体的な対象流域として取り上げ、対象流域の観測データとして,河川水位,河川への下水道からの流出量,降雨時の道路冠水状況などのデータを収集し,構築する洪水氾濫予測モデルの未知パラメータの同定資料とした.次いで,対象流域の基礎的なGISデータを収集する共に,ベクトル形式の1/2500数値地図データ(国土地理院発行),1/2500東京都地形図データ,5mメッシュ標高データ,下水道台帳の雨水・下水道管路データから,雨水流出・洪水氾濫浸水予測に用いる高度な地物データを効率よくGISデータベース化するためのデータ作成システムを構築した.次に,提案した予測モデルの信頼性を総合的に評価するために,流出過程に用いる基礎方程式は同一とし,適用する位置情報要素データのスケールとパラメータの影響について検討した.2.地物データGISを用いた地下水涵養モデル・低水流出モデルの構築に関する研究まず,地物毎に地下水涵養量を算定するためのモデルとして,表層土壌浸透モデルとしては安藤らが提案したSMPTモデルを用い,また浸透量が算定された後の地下水流動については20mメッシュによる既存の広域地下水平面2次元モデル等を用いて,また蒸発散量算定に関してはとりあえず簡単なハモン式を採用し,地物データGISを用いたプロトタイプの地下水涵養モデルを完成させた.次に,東京都が保持している密な地質柱状図データより,対象流域の帯水層を抽出し,帯水層厚や透水係数などを同定し地下構造を推定した.そして,日降水,時間降水データを入力し,本モデルにより数年間の長期流出解析を行い,計算地下水位や河川への流出量の変動を検証した.本年度は以下に示す主として2項目の研究を実施した1.地物データGIS用いた洪水流出・氾濫浸水予測モデルの構築に関する研究東京都内の神田川上流域(流域面積約12km^2)を具体的な対象流域として取り上げ、高度な地物データGISを構築した.これを基に,直接流出として雨水が地表面を流下している間においても浸透現象を考慮する新たな洪水流出・氾濫浸水モデルとしてTokyo Storm Runoff (TSR)モデルを提案した.本TSRモデルをこれまでのTSRモデルと比較することにより,河道の流量予測という観点では両モデルの解析結果に違いはあまり見られなかったものの,河道に到達するまでの流出過程の水文量変化(浸透量,地表面貯留量,雨水・下水道管路内貯留量)に対する影響は無視できないことを明らかにした.次に,都市型洪水への対策の一つとして,保水セラミックスを建物の屋上などに敷設する事によって雨水を一時貯留し,洪水ピーク流量を軽減することが考えられているが,これに対し本TSRモデルを適用するための地物データGISを構築した.また本効果評価のためのシミュレーションシナリオを検討した2.地物データGISを用いた地下水酒養モデル・低水流出モデルの構築に関する研究都市流域においては,洪水流出の抑制効果を期待して,浸透ます,浸透トレンチ,透水性舗装などの,地中の浅い部分に雨水を浸透させる浸透施設の設置事例が増えており,浸透施設や流出抑制施設が家屋などの個々の人工物に設置されることに着目し,都市流域を家屋,道路などの地物(地物データGIS)に基づいてモデル化する手法を提案した.次に,対象流域に実際に設置されている浸透ますの個数と浸透トレンチの長さ,透水性舗装の面積を,各地物に実際に割り当てる作業を行い雨水貯留浸透地物GISを構築した.さらに,浸透ます・浸透トレンチ・浸透性舗装の浸透過程を定式化し,これらをモデルに組み込んだ本年度も以下に示す主として2項目の研究を発展させた.1.地物データGISを用いた洪水流出・氾濫浸水予測モデルの構築に関する研究本研究課題で提案・構築した洪水流出・氾濫浸水予測モデルを,さらに個別の地物情報を考慮し,密集市街地での氾濫浸水を精度良く予測できるモデルに改良し,TSRモデル(Tokyo Storam Runoff Model)として予測精度向上の度合いを評価した.次いで,都市型洪水への対策の一つとして保水セラミックスの活用が考えられており,これを建物の屋上などに敷設する事によって雨水を一時貯留し洪水ピーク流量の軽減効果を評価するため,本TSRモデルを用いて保水セラミックスを建物に敷設した場合の洪水流出解析を行い,保水セラミックスによる雨水流出抑制効果の評価を行った.

2,地物データGISを用いた地下水涵養モデル・低水流出モデルの構築に関する研究都市流域においては,洪水流出の抑制効果を期待して,浸透ます,浸透トレンチ,透水性舗装などの,地中の浅い部分に雨水を浸透させる浸透施設の設置事例が増えている.浸透施設は洪水流出の抑制効果だけでなく,平常時の河川流量の確保,地下水位の維持,湧水の保全など,都市流域の水循環改善への効果が期待されている.本研究ではこれら個別の浸透施設をできる限り忠実にモデル化し,その効果を定量的に評価できる都市流域地下水涵養モデルを構築した.次いで,実流域の地物毎の雨水貯留浸透施設データを,都市流域地下水涵養モデルに組み込み,日降水,時間降水データを入力し,数年間の長期流出解析を行い,雨水貯留浸透施設の地下水涵養効果を評価した.さらに,構築した都市流域地下水涵養モデルを,洪水時に適用し,洪水時における雨水貯留浸透施設の雨水流出抑制効果を評価した.
前庭感覚と体性感覚の統合的処理が姿勢制御反応に与える影響の検討

本研究の目的は、電気的前庭刺激を用いて内耳にある前庭感覚器を刺激した際の姿勢制御反応が、指先への体性感覚入力から受ける影響を明らかにすることであった。前庭感覚は姿勢制御に大きな役割を果たしているが、そこに体性感覚が与える影響は十分調べられていなかった。健常者において、姿勢が安定した座位で前庭感覚器に刺激を与えたときに、指先を安定面に触れることで姿勢反応が大きくなる事態を明らかにした。さらに、片側の後部島質損傷患者において、それが反射ではなく、脳皮質で起きる体性-前庭感覚の統合的処理である可能性が示された。本研究の目的は、電気的前庭刺激(GVS)を用いて内耳にある前庭感覚器を刺激した際の姿勢制御反応が、指先への体性感覚入力から受ける影響を明らかにすることである。実験計画では、初年度に健常者を、次年度に脳損傷患者を対象とした実験を行う予定であったが、適切な患者が見つかったため、今年度に患者研究を先に行った。前庭皮質と考えられる島皮質の後部周辺領域の損傷患者2名(59歳、69歳、どちらも男性)を対象として実験を行った。脳梗塞による一側損傷で、マヒや認知機能の障害はなかった。統制群の健常被験者(62歳と65歳の男性)と比較すると、座位でのGVSによる姿勢制御反応とそれへの体性感覚の影響に、損傷の左右差が影響していた。左損傷患者では、姿勢制御反応に低下が見られたものの、体性感覚入力による姿勢制御反応の増大は健常者と同様に観察された。一方で、右損傷患者では、姿勢制御反応は健常者と同様にあったが、体性感覚入力の影響が見られなかった。先行研究から、前庭皮質は右半球優位であることが示唆されているが、前庭の単一モダリティー入力よりも、体性感覚との相互作用、またはマルチモダリティーの統合的処理を右前庭皮質が担っていることが示唆された。実験計画では、初年度に健常者を、次年度に脳損傷患者を対象とした実験を行う予定であったが、前年度に適切な患者が見つかったため、そちらを優先した。今年度は健常成人を対象として、前庭-体性感覚の統合的処理の平均と個人差を検討した。男性10名、女性4名の計14名の成人を対象に実験をおこなった。代表者らが予備的実験の少数の被験者において発見したGVSによる姿勢傾斜反応が指つきによって増大する事態を多くの被験者において再現することができた。前年度の脳損傷患者研究の結果から、右島皮質の後部周辺領域が前庭-体性感覚の統合的処理に関わっていることが示唆されていたが、健常者においても、右半球優位、左手指への体性感覚入力が右よりも強く姿勢制御反応を引き起こすことが示された。これまで前庭処理は体の動きに伴う眼球や頸部の運動を引き起こすものとして、自動的な反射に関わるもとの考えられてきた。視覚による立ち直り反射は視覚皮質が関わることが知られていたが、体性感覚が皮質レベルで前庭処理に影響を及ぼすことは知られていない。皮質での情報の統合は、複雑な処理が可能であることと高次機能への影響を示唆している。それは前庭感覚入力がない状態、例えば寝たきりの状態や、微小重力下や無重力状態で長期間生活することが運動・感覚機能だけではなく高次認知機能にも影響を与える可能性を示唆する。重力環境の変化による心的機能の変化とその補正法を検討する上で、本研究成果は重要な役割を果たすことが期待できる。前年度に適切な脳損傷患者が見つかったため、当初の計画を変更して患者研究を先に実施し、健常者を対象とした研究を本年度に実施した。その変更に伴い、実験場所と設備の確保、被験者リクルートに時間がかかってしまった。本研究の具体的目的は、電気的前庭刺激(GVS)を用いて内耳にある前庭感覚器を刺激した際の姿勢制御反応が、指先への体性感覚入力から受ける影響を明らかにすることであった。そこで、姿勢が安定した座位で前庭感覚器に刺激を与えたときに、指先を安定面に触れることで姿勢反応が大きくなる事態を検討することで、前庭感覚と体性感覚の相互作用を明らかにした。その体性-前庭相互作用は反射ではなく、脳皮質で起きる高次な処理であることを仮定し、刺激入力の左右差を検討することでその仮説を検証した。また、脳損傷患者を対象とすることで姿勢制御反応に関する体性-前庭感覚の統合的処理の神経メカニズムを検討した。具体的には、前庭皮質損傷患者と健常成人において、個人差はあったが、GVSによる姿勢傾斜反応が指つきによって増大する結果を得た。右半球優位、左手指への体性感覚入力が右よりも強く姿勢制御反応を引き起こすことが示された。最終年度は、健常成人6名と健常高齢者3名のデータを追加し、前年度までの結果と一致する傾向が得られた。

これまで前庭処理は体の動きに伴う眼球や頸部の運動を引き起こすものとして、自動的な反射に関わるもとの考えられてきたが、本研究により体性感覚が皮質レベルで前庭処理に影響を及ぼすことが明らかになった。皮質での情報の統合は、複雑な処理が可能であることと高次機能への影響を示唆しており、前庭感覚入力がない状態、例えば寝たきりの状態や、微小重力下や無重力状態で長期間生活することが運動・感覚機能だけではなく高次認知機能にも影響を与える可能性を示唆する。本研究の目的は、電気的前庭刺激を用いて内耳にある前庭感覚器を刺激した際の姿勢制御反応が、指先への体性感覚入力から受ける影響を明らかにすることであった。前庭感覚は姿勢制御に大きな役割を果たしているが、そこに体性感覚が与える影響は十分調べられていなかった。健常者において、姿勢が安定した座位で前庭感覚器に刺激を与えたときに、指先を安定面に触れることで姿勢反応が大きくなる事態を明らかにした。さらに、片側の後部島質損傷患者において、それが反射ではなく、脳皮質で起きる体性-前庭感覚の統合的処理である可能性が示された。実験計画で予定していた脳損傷患者と対照被験者を対象として実験を行うことができた。被験者数を増やす必要はあるが、現時点で得られた結果は新奇性が高く、学術的意義が大きいと考える。実験計画では健常成人の被験者を30名を予定していたが、約半数しかデータを集めることができなかったため、次年度に被験者数を増やす。また、前年度の脳損傷患者2名は本年度の健常成人よりも高齢であったため、年齢を統制した健常群との比較が必要であるため、来年度にそれを行い、とりまとめて発表する。認知神経科学次年度は、多くの健常成人を対象として、前庭-体性感覚の統合的処理の平均と個人差を検討する。さらに適切な損傷患者が見つかれば、症例数を増やし、中枢神経系における処理の左右差を検証する。被験者数を確保できなかったため、その謝金とデータ整理の学生アルバイトへの謝金、それらをまとめて発表するための出張・学会参加費が次年度使用額となる。被験者がボランティアで参加したため、謝金が発生しなかった。また、異動のため学会参加の時間がとれず、旅費の支出が少なくなった。被験者数を増やし、研究成果をまとめて発表するために使用する。次年度の学会等での成果発表を積極的に行う。
泌乳牛のグレリン分泌と作用に関する研究

本年度は、成長ホルモン(GH)促進因子であるグレリンの分泌を中鎖脂肪酸によって増加せ、乳生産をコントロールできるかについて検討するため、搾乳牛11頭を用いて泌乳試験を行った。1.5%中鎖脂肪酸給与(MCFA)区と対照(CON)区を設け、1期14日間の反転法で実施した。乳量と摂取量の測定および血液と胃汁の採取を行い、これまでの解析でみられる傾向としては、MCFA区はCON区と比較して血漿グレリンおよびグルカゴン濃度が高く、血漿GHおよびインスリン濃度に差は認められないが、採食に伴う血糖値の減少が大きかった。MCFA区におけるT-CHO、TGおよびNEFA濃度の増加やケトン体濃度の増加は認められなかった。ルーメン液性状については、MCFA区において総VFA濃度が低下する傾向があった。乳量および乳質は処理区間で有意な差は認められなかったが、増体量はMCFA区において増加した。MCFA区では脂肪酸を摂取したにも関わらず、血漿NEFA濃度やケトン体濃度が増加しなかったのは、MCFA摂取乳牛の体内の代謝状況が同化にシフトしたために、体脂肪動員に由来して血中に増加するNEFAや肝臓から合成されるケトン大量が減少し、結果として血中濃度に差が表れなかったのかもしれない。本実験ではグレリンの増加に対してGH分泌が応答せず、それに付随しておこる体組織の動員や体内で利用可能な栄養素の優先的な乳腺への分配が起こらなかったと考察された。目的とするホルモンの人為的な操作によって、乳量のコントロールを行うことはできなかったが、本実験のような血中マーカー(内分泌系と代謝物)の相互作用、さらには生産性との関係性についてアプローチした研究データは、高度化する乳牛の飼養管理技術に応用させることができる可能性を見出した。(抄録なし)本研究は、「乳牛の栄養管理による乳生産の向上」を課題とし、消化管ホルモンであるグレリンに着目し、栄養素摂取によるグレリン分泌の増加が増乳ホルモンであるGH、IGF-1や栄養代謝ホルモンであるインスリン、グルカゴンなどの分泌を介して乳生産を高めることが可能であるかについて検討することを目的としている。本年度は、グレリン分泌を高める栄養素として中鎖脂肪酸を使用し、中鎖脂肪酸の摂取が血漿グレリン濃度および乳生産に及ぼす影響について検討し、以下の成果を得た。1.乳牛への中鎖脂肪酸の給与は、血漿グレリン濃度を増加させる。2.中鎖脂肪酸の摂取によって、血漿GH濃度には影響がみられず、血漿IGF-1濃度は減少した。3.中鎖脂肪酸によって、乾物摂取量が減少し、乳量が減少する傾向がみられたが、摂取エネルギーに対する乳生産効率は高まる傾向がみられた。4.中鎖脂肪酸の摂取によって、血漿NEFA、T-CHO濃度の増加、血漿インスリン濃度の減少などがみられ、栄養代謝が変化していることが示唆された。以上から、中鎖脂肪酸の摂取は、グレリン分泌を高める栄養素として有効であるが、乳生産に及ぼす影響については、摂取量の違いから明確にならなかった。本年度は、グレリンの分泌を高める栄養素を用いた泌乳試験を実施することを計画していたが、おおむね目的としていた実験を遂行することができた。本年度は、グレリン分泌を高める栄養素として中鎖脂肪酸を用いた乳牛の泌乳試験を実施した。結果、中鎖脂肪酸によって乾物摂取量が減少したため、乳生産への影響は明確にならなかった。そこで、次年度は、中鎖脂肪酸摂取区と同等の摂取量の対照区(Pair-fed)を設け、泌乳試験を実施することを計画しており、これによって中鎖脂肪酸が乳生産に及ぼす影響を明確に示すことができると考えている。