hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｏｕｔｌｉｅｒアプローチによる新規がん抑制遺伝子の同定

DNAメチル化異常は、がん抑制遺伝子の主要な不活化機構の1つである。本研究では、「遺伝子が異常メチル化される際の法則」を利用し、多数の異常メチル化された遺伝子の中から、効率よくがん抑制遺伝子を同定する方法を開発することを目的とした。ヒト乳がんのメチル化解析から、280個のメチル化感受性遺伝子を同定した。このうち14遺伝子が法則に従わないOutlier遺伝子であった。Outlier遺伝子のうち、DZIP1は新規のがん抑制遺伝子、FBN2及びHOXA5は既知のがん抑制遺伝子であった。これらにより、Outlier遺伝子の探索によりがん抑制遺伝子が効率的に同定できることが示された。DNAメチル化異常は、がん抑制遺伝子不活化の主要なメカニズムである。がん細胞では、多数の遺伝子にメチル化異常がみられるが、これらのほとんどは、発がんの随伴現象であり、がん抑制遺伝子のメチル化はごく一部である。DNAメチル化異常は、特定の遺伝子に誘発されやすいという性質をもち、その機構として、RNA合成酵素が結合している遺伝子はメチル化されにくいことが知られている。本研究では、RNA合成酵素が結合しているにも関わらずメチル化されてしまう遺伝子(Outlier遺伝子)を探索することで、新規がん抑制遺伝子を効率的に同定する方法「Outlierアプローチ」を開発することを目的とした。2年目の本年度は、平成23年度に同定した乳がん臨床検体においても異常メチル化されている4個のoutlier遺伝子(FBN2、HOXA5、HOXC9及びDZIP1)のうち、DZIP1について、がん抑制遺伝子であるかどうかの機能解析をおこなった。乳がん細胞株HCC1937及びMDA-MB-436において、2種類の異なるshRNAを用いてDZIP1をノックダウンし、DZIP1が細胞増殖能に与える影響を調べた。その結果、コントロールのshRNAを導入した細胞と比べて、DZIP1をノックダウンしたHCC1937細胞では約2倍、MDA-MB-436細胞では1.5-2倍程度の細胞増殖の亢進が認められた。このことから、DZIP1は、乳がんにおけるがん抑制遺伝子であると考えられる。また、DZIP1以外の3個のoutlier遺伝子のうちFBN2及びHOXA5は既にがん抑制遺伝子であることが報告されている。以上のことから、Outlier遺伝子の探索によりがん抑制遺伝子が効率的に同定できることが示された。3年目の本年度は、平成24年度までに乳がんにおいて有効性を示した「Outlierアプローチ」を用いて、大腸がんにおける新規がん抑制遺伝子の探索をおこなった。ヒト大腸の正常細胞株1種類及び大腸がん細胞株3種類についてDNAメチル化状態をゲノム網羅的に解析し、がん細胞株でのみ高頻度にメチル化されている遺伝子を982個同定した。さらに、正常細胞におけるRNA合成酵素の結合状態及びH3K27トリメチル化状態をゲノム網羅的に解析することで、正常細胞においてRNA合成酵素が高レベルに結合しているにも関わらず、がん細胞株でメチル化されているOutlier遺伝子を225個同定した。これらのうちCDIP及びLYPD1について、大腸がん臨床検体におけるメチル化レベルを測定したところ、それぞれ13.7及び25.5%の検体において異常メチル化が認められた。今後、これらの遺伝子ががん抑制遺伝子であるかどうかの機能解析を行う必要がある。3年間の本研究の成果により、Outlier遺伝子の探索によりがん抑制遺伝子が効率的に同定できることが示された。また、乳がんにおいて新規がん抑制遺伝子DZIP1が同定された。本研究では、がんで異常メチル化される遺伝子のほとんどは、正常細胞においてRNA合成酵素が結合しておらず、H3K27メチル化を受けていることに着目し、RNA合成酵素が結合しているにも関わらずメチル化されてしまう遺伝子(Outlier遺伝子)を探索することで、新規がん抑制遺伝子を効率的に同定する方法「Outlierアプローチ」を開発することを目的とした。1年目の本年度は、乳がんにおける既知のがん抑制遺伝子BRCA1、HOXA5及びMASPINがOutlier遺伝子であることを明らかにした。

また、ヒト乳腺の正常細胞株2種類及び乳がん細胞株5種類についてDNAメチル化状態をゲノム網羅的に解析し、がん細胞株でのみ高頻度にメチル化されている遺伝子を280個同定した。さらに、正常細胞におけるRNA合成酵素の結合状態及びH3K27トリメチル化状態をゲノム網羅的に解析することで、正常細胞においてRNA合成酵素が高レベルに結合しているにも関わらず、がん細胞株でメチル化されているOutlier遺伝子を14個同定した。これらのOutlier遺伝子のうち、DZIP1、FBN2、HOXA5及びHOXC9の4遺伝子は、乳がんの臨床検体においても異常メチル化されていた。今後、これらのOutlier遺伝子について、ノックダウン法等を用い、がん抑制遺伝子であるかどうかの機能解析を進めことで、Outlier遺伝子の探索により新規がん抑制遺伝子が効率的に同定できることを示す。申請時の計画では、平成25年度にOutlier遺伝子を探索することで、新規がん抑制遺伝子が効率的に同定できることを示す予定であった。しかし、平成24年度のうちに乳がんにおける新規がん抑制遺伝子を同定することができ、Outlierアプローチの有効性を示すことができたため、当初の計画以上に進展しているといえる。申請時の計画通り、平成23年度のうちに乳がんにおける新規がん抑制遺伝子候補となるoutlier遺伝子を同定することができたため、おおむね順調に進展しているといえる。平成25年度は、Outlierアプローチを用いて大腸がんなど他のがん種における新規がん抑制遺伝子の探索をおこなう。具体的には、大腸正常細胞及びがん細胞株におけるDNAメチル化状態の解析、正常細胞におけるRNA合成酵素結合状態の解析をおこない大腸がんにおけるoutlier遺伝子を同定する。次に、outlier遺伝子のうち、がん臨床検体においてもメチル化されている遺伝子を同定する。これらの遺伝子の機能解析を行うことで、大腸がんにおける新規がん抑制遺伝子を同定する予定である。平成24年度以降は、本年度に同定したoutlier遺伝子の機能解析を行う。具体的には、乳がん細胞株において、同定したoutlier遺伝子を高発現またはノックダウンすることで、細胞増殖性がどのように変化するかを解析する。それにより、同定したoutlier遺伝子が、がん抑制遺伝子であるかどうかを明らかにし、outlier遺伝子を探索することで、新規がん抑制遺伝子が効率的に同定できることを示す予定である。平成25年度に請求する研究費は、DNAメチル化解析、RNA合成酵素結合状態の解析及び細胞培養関連試薬等への使用を計画している。平成24年度以降に請求する研究費は、outlier遺伝子の高発現用のウイルスベクターやノックダウン用のウイルスベクターの作成、細胞培養関連試薬等への使用を計画している。
ランニング障害の予防を目的とした足部インナーマッスルトレーニングの開発

ランニング障害の予防には,ランニング中の過度な足部内側縦アーチの低下を制限することが重要である.本研究では,足部のインナーマッスルトレーニングによってランニング中の足部内側縦アーチの低下が制限されることを証明し,ランニング障害に対する新たな予防方法を提案する.ランニング障害の予防には,ランニング中の過度な足部内側縦アーチの低下を制限することが重要である.本研究では,足部のインナーマッスルトレーニングによってランニング中の足部内側縦アーチの低下が制限されることを証明し,ランニング障害に対する新たな予防方法を提案する.
分光イメージング走査型トンネル顕微鏡によるトポロジカル絶縁体の研究

質量を持たないDirac電子は、その内部自由度に起因して2成分の波動関数で記述される。最も典型的なDirac電子系であるグラフェンでは、この2成分はハニカム格子の二つの副格子の存在に由来する。一方、トポロジカル絶縁体の表面Dirac電子の場合、2成分はスピン自由度に起因し、磁気的性質を支配する。したがって、2成分波動関数の持つ特徴がどこにどのように現れるかを知ることは、スピントロニクス応用にとって重要である。我々は、代表的なトポロジカル絶縁体Bi2Se3を磁場中分光イメージング走査型トンネル顕微鏡によって調べ、不均一なポテンシャル中をドリフトするLandau軌道のエネルギー構造、空間構造に2成分波動関数の特徴を探った。その結果、通常の質量を有する電子と異なり、n>0のLandau準位がポテンシャルの底で2つに分裂すること、Landau軌道の空間分布に期待されるn個の節が現れないこと、の2つの大きな特徴を見出した。ポテンシャルの空間分布を取り入れた2成分Diracモデルで結果を解析したところ、ポテンシャルの底における準位の分裂は2成分を直接反映していること、また、各成分の節が空間的に異なる場所に現れるため、分光イメージングで解像される波動関数の振幅では節が消失することが分かった。この結果は、異なるスピン成分が空間的に異なる場所に現れることを意味しており、ポテンシャルの空間変化に伴い、非自明なスピン磁化の空間構造が現れることを意味している。したがって、人工的なポテンシャル制御によってDirac電子のスピンを制御するという新しいスピントロニクスの手法につながることが期待される。25年度が最終年度であるため、記入しない。トポロジカル絶縁体Bi_2Se_3表面におけるDirac電子の磁場中における性質をSTM/STSを用いて調べた。Dirac点近傍のエネルギーにおける電子状態の空間分布を詳細に調べ、実空間におけるLandau軌道は、エネルギーに依存してポテンシャルの極大、あるいは極小に局在し、Landau準位のエネルギーで非局在状態をとることがわかった。このふるまいは、量子Hall状態で観測されるものと同じである。また、Dirac点の空間分布の相関を調べることで、電子が感じるポテンシャルの分布を決定した。この、ポテンシャル分布とSTM像に見られるSe欠陥の相関を調べたところ、Se欠陥がキャリヤのドナーとして働くことで、ポテンシャル分布が決定されていることがわかった。さらに、Fermi準位近傍でも分光イメージングを行い、Fermi準位±15meVの極めて狭いエネルギー範囲で電子状態が非常に不均一になることを発見した。このエネルギーは、Seの面内振動の光学フォノンのエネルギーに対応しており、現在両者の関連について検討している。Bi_2Se_3は、典型的には10^<-19>cm^<-3>程度のバルクキャリヤを含むが、キャリヤに寄与する欠陥を減らすことのできるBi_2Te_2Seにおいても磁場中STM/STSを行った。Bi_2Se_3同様、Dirac表面状態の特徴を備えたLandau準位が観測された。この物質では、バイアス電圧を上げながら測定したトンネルスペクトルと下げながら測定したスペクトルに履歴が観測された。この履歴は、バイアス電圧が±60mVを超えると現れ、バイアス電圧の絶対値を60mV以下に保つ限り、直前に印加した最大バイアス電圧で決まる状態が保持される。すなわち、一種のメモリーとして働いていることがわかった。現在、類縁物質の系統的な測定から、メモリー効果の原因に関して検討している。当初、磁場中電子状態分布の解明と不純物効果の研究を2つ主テーマとして設定した。電子状態分布に関しては、ほぼ、当初の目標を達成したと考えている。予想外のメモリー効果の発見があったので、不純物効果の研究は若干遅れているが、必要な技術開発は進んでいるので、最終年度には何らかの結果を出したい。当初予定していた不純物効果の研究と、新たに発見したメモリー効果の研究のバランスを取りながら展開したい。

不純物の研究では、あらかじめ不純物をドープした試料の研究を行う他、STMチャンバーに蒸着源を導入して、不純物のその場制御を行う予定である。本年度、交換可能な超小型電子ビーム蒸着源ホルダーの設計、製作を行いテストしたが、熱変形によるトラブルが生じ現在解決策を検討している。材料の加工前熱処理と大きめの遊びを設けることで、当初想定した性能が発揮できるものと考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。
医療モニター用インプランタブルアンテナの開発

人体内部と体表面や体外の間で通信を行うため,体内に埋め込むタイプのインプランタブルアンテナの開発を行った。本研究では, Bluetoothに用いられている2.45GHz帯を動作周波数とし,小型化と機械的強度に重点を置いたキャビティ付H型スロットアンテナと, 400MHz帯を動作周波数とし,心臓ペースメーカの無線通信に用いる板状逆Fアンテナについて研究を行った。これらのアンテナを設計し,計算機シミュレーション及び測定実験からアンテナの有用性を検討した。その結果,開発したアンテナは回線設計で設定した動作基準を満たしており,インプランタブルアンテナとして十分有用であることを確認した。また,計算機シミュレーションと測定結果は概ね一致したことから,本研究の妥当性を示した。体内植え込み型心臓ペースメーカは,常時患者の心拍を監視し,必要に応じて電気刺激を心臓に与えるため,患者の症状にあわせて動作プログラムを書き換える機能を有している。このプログラムの書き換えは低周波帯での磁気結合方式により行われており,通信距離が短いためプログラマヘッドを患者の皮膚表面に接触させる必要があるだけではなく,通信速度も低く患者の拘束時間も長い。そのため高周波無線方式による通信距離の増大,患者拘束時間の短縮が望まれており,米国や我が国の総務省において,403.5MEz帯を用いた無線方式による通信規格整備が進められている。本研究では,この403.5M且z帯無線規格にて利用可能なペースメーカ装荷用アンテナの実現をひとつの目標とし,コンピュータシミュレーションと試作アンテナの実測により検討を行った。同様の人体植え込み型アンテナに関する検討では,人体を均一媒質のモデルに模擬した検討例が多い。しかしながらペースメーカは胸部鎖骨下の皮下脂肪層直下に植え込まれるため,ペースメーカ周囲の筋肉,脂肪,皮膚等の各生体組織がアンテナ特性に影響を与えることが予想されるので,これら生体組織を模擬した多層媒質モデルによる検討もあわせて行った。その結果,提案したアンテナが403.5MHz帯無線規格において利用可能であることを確認した。また,患者の腕などに埋め込み医療情報を伝送するシステムのため,より多くの情報量を伝送できる2.45GHz帯に対しても検討を行った。人体に埋め込み可能な構造のアンテナを設計、試作し,計算通りの入力インピーダンス,指向性,利得が実現できることを確認した。そのため高周波無線方式による通信距離の増大,患者拘束時間の短縮が望まれており,米国や我が国の総務省において,403.5MHz帯を用いた無線方式による通信規格整備が進められている。本研究では,この403.5MHz帯無線規格にて利用可能なペースメーカ装荷用アンテナの実現をひとつの目標とし,コンピュータシミュレーションと試作アンテナの実測により検討を行った。人体に埋め込み可能な構造のアンテナを設計・試作し,計算通りの入力インピーダンス,指向性,利得が実現できることを確認した。
麻疹ウイルスのトロピズムと病原性の研究

1、Vero細胞とVero/SLAM細胞を用いて麻疹患者体内のウイルスのレセプター特異性を定量的に調べ、患者体内のウイルスの大部分はSLAM(CD150)をレセプターとして使っており、CD46をレセプターとするものはほとんど存在しないことを明らかにした。2、末梢血から分離したばかりの単球にはSLAMの発現は認められないが、末梢血単核球をマイトゲンで刺激すると容易にSLAMの発現が誘導されること、未成熟樹状細胞はSLAMを発現していないが成熟樹状細胞はSLAMを発現していることを明らかにした。3、麻疹ウイルスと同じグループのウイルスであるイヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルスがそれぞれイヌ、ウシのSLAMをレセプターとして使りていることを示した。4、細胞における麻疹ウイルス感染を定量的に測定するために、green fluorescent proteinを発現する組換え麻疹ウイルスを作製した。このウイルスを用いることにより、麻疹ウイルスは、SLAM陽性の細胞に比べると100-1000分の1の効率であるが、SLAM陰性の細胞にも侵入できることを明らかにした。上皮細胞、内皮細胞、神経細胞のようなSLAM陰性細胞における麻疹ウイルス感染の少なくとも一部は、(SLAMやCD46以外の)この低効率レセプターで説明できることを示した。5、麻疹ウイルス感染細胞や、麻疹ウイルスH蛋白発現細胞と混合培養したSLAM陽性細胞においてSLAMが細胞表面からdownregulationされることを明らかにした。麻疹ウイルスによる免疫抑制は様々な機序が関与していると考えられるが、SLAMのdownregulationもその一因である可能性を示した。我々はリンパ球の活性化に関与しているSLAM(CD150)が麻疹ウイルスのレセプターであることを先に明らかにした。麻疹ウイルスワクチン株についてはCD46がレセプターとして働くことが既に報告されている。そこで、我々は麻疹患者体内におけるウイルスのレセプター特異性を定量的に調べるために、元々CD46を発現しているVero細胞と、SLAM遺伝子を導入してCD46とSLAMの両方を発現するようになったVero/SLAM細胞を用いて、患者咽頭拭い液中の麻疹ウイルスのplaque titrationを行なった。その結果、患者体内のウイルスの大部分はSLAMをレセプターとして使っており、CD46をレセプターとするものはほとんど存在しないことを示した。SLAMは主にリンパ球に発現されており、麻疹ウイルスの重要な標的細胞である単球における発現は報告されていない。我々は、末梢血から分離したばかりの単球にはSLAMの発現は認められないが、末梢血単核球をマイトゲンで刺激すると容易にSLAMの発現が誘導されることを示した。さらに、未成熟樹状細胞はSLAMを発現していないが、成熟樹状細胞はSLAMを発現していることを明らかにした。単球や成熟樹状細胞の麻疹ウイルス感染はSLAMに対する抗体で阻止された。したがって、単球や樹状細胞の感染もSLAMをレセプターとして起こっていることが明らかになった。病理所見で麻疹ウイルスの感染が報告されている呼吸器上皮や神経細胞におけるSLAMの発現についても現在検討を進めている。さらに、麻疹ウイルスと同じグループのウイルスで、トロピズムや動物に起こす病気が良く似ているイヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルスについてもレセプターを検討し、それがそれぞれイヌ、ウシのSLAMであることを証明した。本研究で、麻疹ウイルスのトロピズムと病原性に関して我々が明らかにした新知見は以下のとおりである。1、Vero胞とVero/SLAM細胞を用いて麻疹患者体内のウイルスのレセプター特異性を定量的に調べ、患者体内のウイルスの大部分はSLAM(CD150)をレセプターとして使っており、CD46をレセプターとするものはほとんど存在しないことを明らかにした。

2、末梢血から分離したばかりの単球にはSLAMの発現は認められないが、末梢血単核球をマイトゲンで刺激すると容易にSLAMの発現が誘導されること、未成熟樹状細胞はSLAMを発現していないが成熟樹状細胞はSLAMを発現していることを明らかにした。3、麻疹ウイルスと同じグループのウイルスであるイヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルスがそれぞれイヌ、ウシのSLAMをレセプターとして使っていることを示した。4、細胞における麻疹ウイルス感染を定量的に測定するために、green fluorescent proteinを発現する組換え麻疹ウイルスを作製した。このウイルスを用いることにより、麻疹ウイルスは、SLAM陽性の細胞に比べると100-1000分の1の効率であるが、SLAM陰性の細胞にも侵入できることを明らかにした。上皮細胞、内皮細胞、神経細胞のようなSLAM陰性細胞における麻疹ウイルス感染の少なくとも一部は、(SLAMやCD46以外の)この低効率レセプターで説明できることを示した。5、麻疹ウイルス感染細胞や、麻疹ウイルスH蛋白発現細胞と混合培養したSLAM陽性細胞においてSLAMが細胞表面からdownregulationされることを明らかにした。麻疹ウイルスによる免疫抑制は様々な機序が関与していると考えられるが、SLAMのdownregulationもその一因である可能性を示した。
不揮発性メモリ内蔵型超低消費電力動的再構成可能マイクロプロセッサの開発

高性能かつ超低消費電力のマイクロプロセッサの開発を目的として、新規不揮発性メモリ回路の提案、詳細な回路設計と回路シミュレータによる評価を行った。また、限られた面積で複数の演算処理が高速に達成できる動的再構成可能プロセッサの設計を行い、不揮発性メモリ回路を動的再構成可能プロセッサ内で使用する方法について検討を行った。以上により、不揮発性メモリ内蔵型超低消費電力動的再構成可能マイクロプロセッサの礎を築くことができた。本研究の目的は、新世代の超低消費電力高速マイクロプロセッサとなり得る動的可変論理プロセッサを開発することである。記憶部に高速不揮発性素子を使用し、動的電源遮断を行えるようにすることで、超低消費電力化を達成する。最終的には回路レイアウトまで行って、LSIチップを作製し、動的再構成機能、電力遮断効果等の動作を検証することを目標としている。本年度は、まず、可変論理回路ブロック(RLB)内に組み込む不揮発性メモリモデルの開発を行った。不揮発性素子には電流誘起磁化反転機構を有した磁気抵抗トンネル素子(MTJ)を使用したSRAM、フリップフロップ回路等を提案し、主にアナログ回路シミュレータHSPICEによって動作検証を行い、本研究に合致する高速記憶、高速情報復帰が可能であることを確かめた。これらの回路は、CMOS製造プロセスとの相性が極めて良好で、早期実現が可能であると考えている。一方で、可変論理回路ブロック(RLB)内部の配線および論理演算ユニット(ALU)の検討を行った。乗算や動画処理で使用される動き予測などのアプリケーションを想定して必要な機能を組み込んだ。また将来演算アルゴリズムが変わっても対応できるようにするため、回路規模が肥大化しない範囲で冗長性を持たせた。さらに、可変論理回路ブロック(RLB)を集積した可変論理回路ユニット(RLU)を構成し、必要な機能が実行可能であることをVerilogシミュレーションにより検証した。最終的には回路レイアウトまで行って、LSIチップを作製し、動的再構成機能、電力遮断効果等の動作を検証することを目標としている本年度は、可変論理回路ブロック(RLB)内に組み込む不揮発性メモリモデルの高精度化と新しい不揮発メモリ素子モデルの開発を行った。不揮発性素子には電流誘起磁化反転機構を有した磁気抵抗トンネル素子(MTJ)を使用した擬似スピンMOSFETを有するSRAM、フリップフロップ回路等を提案し、主にアナログ回路シミュレータHSPICEによって動作検証を行い、本研究に合致する高速記憶、高速情報復帰が可能であることを確かめた。また、ユニポーラ型抵抗変化素子のモデル化を行い、不揮発性SRAM動作をシミュレーションにより確認した。これらの回路は、CMOS製造プロセスとの相性が極めて良好であることが特徴である。一方で、昨年度に引き続き、可変論理回路ブロック(RLB)内部の配線および論理演算ユニット(ALU)の検討を行った。また、電源遮断の方法について設計したRLBに適合する方式について検討を行った。回路レイアウトまで行って、動的再構成機能、電力遮断効果等の動作を検証することを目標としている。本年度は、昨年度に引き続き、可変論理回路ブロック(RLB)内に組み込む不揮発性メモリモデルのさらなる高精度化と新しい不揮発メモリ素子モデルの開発を行った。不揮発性素子には電流誘起磁化反転機構を有した磁気抵抗トンネル素子(MTJ)を使用した擬似スピンMOSFETを有するSRAM、フリップフロップ回路のほかに、本年度から抵抗変化素子を使用した回路を提案し、主にアナログ回路シミュレータHSPICEによって動作検証を行い、本研究に合致する高速記憶、高速情報復帰が可能であることを確かめた。プロセッサ応用のためには、演算速度を落とさないことが重要であり、不揮発性メモリ素子をどのように使用するべきかを検討し、学会発表を行った。また、電源遮断による低消費電力化では電源遮断動作に要する電力が、電源遮断によって節約できる電力よりも小さい必要があり、電源遮断時間の関数となっている。そこで、これらを評価して、プロセッサ中での使用に耐えるかどうかを検証した。また、電源遮断の方法について設計したRLBに適合する方式について検討を行い、RLBを構成した。
熱物性顕微鏡によるAlGaN薄膜の熱物性評価とその組成依存性

平成20年度に茨城大学に設置の熱物性顕微鏡に実施した改良に基づき、AlGaN薄膜の熱浸透率の高精度測定に平成21年度も取り組んだ。平成20年度に実施した測定では、測定した熱浸透率の値にAlNの濃度差によるに差異が認められ、AlNのモル分率の増大に伴い減少する傾向が見られた。しかし、一部の測定では同じ試料の測定でも測定によっては測定結果に違いが見られていた。これはAlGaN薄膜の表面状態が平滑な面と平滑で無い面があり、この影響があったためと考えられた。そこで、今年度の測定では表面状態の良い場所のみを測定するとともに、偶然誤差の影響を小さくするために、測定箇所1箇所に付き50回の測定を実施し算術平均した値を5回もとめた。このように測定回数を増やし、試料の表面状態の良い場所を適切に選ぶことによって、バラツキの少ないデータを得ることができた。さらに、熱物性顕微鏡で測定した熱浸透等率から、AlN、GaNのモル分率および文献値の密度および比熱のデータを組み合わせて熱伝導率を求めることができた。AlGaN薄膜の算出された熱伝導率を従来のAlGaN薄膜の測定データと比較した。従来データのAlNの組成範囲はAlNの少ない側に限られていたが、それらより広い範囲で、AlNの高濃度側の測定データを得ることができた。また、得られた熱伝導率は従来データの延長上にあることがわかった。さらに、測定データはバーチャルクリスタルモデルにより推定されたAlGaNの組成依存性を良く再現していることが判明した。以上のように熱物性顕微鏡の改良と試料の測定する表面を適切に管理することによって、良い精度薄膜の熱伝導率の評価が可能になった。アルミニウムガリウムナイトライド(AlGaN)の熱物性を知るために、熱物性顕微鏡用いてサファイア基板上に成膜されたAlGaN試料の熱浸透率測定を試みた。測定した試料は厚み440μmのサファイア基板上にCVDでAlGaNを100μm140μm成膜したものである。この試料は表面の平滑性が悪かったため研磨を行ない、その上に100nmのモリブテンスパッタを施した。研磨は表面粗さの断面曲線の最大粗さが1μm以下、2乗平均粗さが0.2μm以下、算術平均粗さが10nm以下という条件で行った。この試料の5つの領域から試料を切り出し、熱物性顕微鏡を用いて測定を行った。信号の強度を改善するために次の3点の装置改良を実施した。1.加熱レーザはプローブレーザと同一の光路を通り対物レンズでプローブレーザと同一箇所に集光されていたが、レンズやスプリッタによるレーザの減衰を防ぐために加熱光が試料に直接照射されるようにした。2.加熱レーザを直接照射するには対物レンズと試料の間に十分な距離がなくてはならない。そこで対物レンズを無限補正対物レンズに変えることで、差動距離を3mmから20mmにして加熱光の直接照射を可能にした。3.フォトディテクタのスピードとゲインは反比例の関係にあり、2つを同時に上げるにはオペアンプの段数を増やすことが必要となる。今回はオペアンプを2段にすることにより、5MHzまで受光可能にした。改良した熱物性顕微鏡を用いて研磨で平滑性を良くした5つのAlGaN試料を測定し、測定した位相差から熱透率の値を得ることができた。測定した5つの領域はAlGaN中のAlNの組成が変化しており、AlNの増加に伴い浸透率が減少する結果が得られた。
地球規模での炭素循環に関与する未知アーキアの解明－ゲノム情報を活用した分離培養－

本研究では、海底堆積物中に普遍的かつ優占的に生息することが知られている門レベルで未培養なアーキア群(Deep-Sea Archaeal group: DSAG)に属するアーキアの分離・培養に成功し、詳細な生理学的・遺伝子学的特徴を解明した。さらに、本DSAGアーキアの分離・培養を進めて行く過程において共存していた2種類の新目レベルで新規なChloroflexi門に属するバクテリアを分離し、それらの詳細な生理学的特徴を理解することができた。以下にその詳細について述べる。本研究で対象とした系統分類学上高次レベルで未培養であった微生物たちは、極めて遅い増殖速度(倍加時間は20-30日程度)であり、その最大到達菌体密度(10^5 cells/ml程度)も極めて低かった。この特徴から、これらの微生物は細胞分裂にエネルギーを使用するよりも、可能な限り一つの細胞を存続させることを優先したエネルギー節約型のライフスタイルをとると考えられた。これは、海底堆積物環境のような極限環境で生き残るための生存戦略と考えられる。加えて、これら微生物のゲノム情報を得ることにも成功し、そのゲノム情報から詳細な代謝プロセスの解明を行った。ゲノム情報を活用することで集積ならびに分離操作を効率よく進めることができた。さらに、培養に成功した微生物は記載・命名に必要となる基本的な生理学的特徴の調査だけでなく先端的な種々の顕微鏡観察や安定同位体ラベルを利用した培養実験等を行う事で、ゲノム解析だけでは理解することができない新しい代謝機能を発見するに至った。以上、本研究により、これまで海底堆積物に優占しているにも関わらず、機能未知であった未培養微生物を培養することに成功し、「生きた微生物」を用いた実験を通じて、これらの微生物の代謝機能や物質循環における役割を解明した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で対象としているアーキアは、系統分類学において新しい門を代表することから、分離・培養し、その生理学的・遺伝子学的な詳細を解明することができれば、新しい代謝経路・遺伝子の発見が十分に期待できる微生物群である。本年度は、以下の2点を基軸として研究を遂行した。1)ショットガンゲノム解析アプローチによる全ゲノム配列の決定2)純粋培養へ向けた培養条件の検討1)のゲノム解析に関しては、本研究で対象としているアーキアの増殖速度の遅さと菌体収量の低さから、全ゲノム配列を解読することは難しく、今年度はドラフトゲノム配列(全ゲノム配列に対して90%程度の完成度)の決定に留まった。そのため、ゲノム配列に基づいた代謝経路を推定するにはやや信頼性に欠けるデータであり、引き続き、ドラフトゲノム配列の深度(各リードの厚み)を深め、サンガーシーケンスを用いて全ゲノム配列の決定を行う予定である。一方で、2)の培養条件の検討については、本研究で対象としているアーキアの培養系に培養初期から存在しているバクテリアを分離することに成功し、その一部の生理代謝機能を明らかにすることができた。このバクテリアも海底下堆積物中に優占して存在している未培養バクテリアであることが知られており、本研究で対象としているアーキアと同様に数種類の有機物を利用して生育することができることがわかった。本年度に得られた結果から、次年度以降は分離したバクテリアの情報や本研究で対象としているアーキアの全ゲノム配列から予想される代謝経路から炭素源として利用できそうな基質を用いて純粋培養を進めて行く予定である。難培養性であるために取り扱いが煩雑なアーキアを対象としている研究にも関わらず、遺伝子学的特徴だけでなくその生理学的特徴を着実に明らかしている。さらに、同一の培養系内に存在していた未培養バクテリアの分離に成功し、遺伝子学的特徴とその生理代謝機能を明らかにしつつある。ただし、どちらの微生物についても生理学的特徴についてさらに詳細な理解が必要であり、今後は利用できる基質について調査を進める。以上の理由から総合的に判断すると本研究は、おおむね順調に進展していると考えられた。本研究で対象としているアーキアは新しい門を代表する生物種であり、分離・培養を介してその生理生態学的な特徴を解明することで新たな微生物学的な知見の拡充が大きく期待できる微生物である。1)ショットガンゲノム解析アプローチによる全ゲノム配列の解読2)細胞構造の理解本年度は、完全長ゲノム配列を得るために1)の研究について遂行した。まず、昨年度の研究で得られた未培養アーキアのドラフトゲノム配列をベースにし、さらにそのゲノム配列の信頼性を確保するため、ドラフトゲノム配列の深度(各リードの厚み)を補強した。この未培養アーキアは菌体収量が極めて低いアーキアである(最大細胞密度: 10^5 cells/ml)ため、ゲノム配列を解読するのに必要なゲノム量を確保するのに数ヶ月の培養を要した。時間はかかったものの期待通りにゲノム配列の精度を上げることができ、さらに、全ゲノム配列の取得にも至った。したがって、今年度は、当初の目的であった完全長ゲノムの決定を完遂することができた。次に、昨年度の成果である本アーキアが高度に集積された培養系を用いて2)の細胞構造についての観察を行った。新規な微生物を分離した際に重要なことの1つは、その微生物の形やどのような細胞構造を持っているのかを確認することである。

そこで、走査型電子顕微鏡を用いた観察結果を行ったところ、本アーキアは球菌でその細胞サイズは、直径が300-500 nm程度と極めて小さく、その細胞は集塊体となり増殖していることが明らかとなった。一方で、透過型電子顕微鏡観察では、菌体量が少なかったことが影響したのか、明瞭な細胞内部の構造を観察することは困難であった。したがって、来年度に再度、前処理方法などを検討し、細胞内部の構造の理解を進める。最大細胞密度(10^5 cells/ml)に達するまでに数ヶ月も要する難培養性アーキアであるにも関わらず、その全ゲノム配列を決定し、さらにはこのアーキアが高度に集積された培養系を維持できている。さらに本年度は細胞構造の詳細な観察まで行うことができた。これらの成果は、これまで人為的に培養できないと考えられていた新門に属するアーキアを世界で初めて「培養」することに成功し、その詳細に迫った研究であり高く評価できる。一方で、本年度においても培養条件の検討を行ったが、その増殖を促進することはできなかった。この結果が意味することは、地球上に存在している大部分の未培養微生物は、我々の想像以上にゆっくりとした代謝を行っているため、これまで培養することができないと考えられていたが、それは常識外れな生き方をする微生物の存在を見過ごしていただけだと考えられる。したがって、本研究のように着実に培養を進めていけば未培養系統分類群も培養が可能であることを科学的に示すことが可能であった。以上の理由から、総合的に判断すると本研究は、おおねむ順調に進展していると考えられた。本研究では、海底堆積物中に普遍的かつ優占的に生息することが知られている門レベルで未培養なアーキア群(Deep-Sea Archaeal group: DSAG)に属するアーキアの分離・培養に成功し、詳細な生理学的・遺伝子学的特徴を解明した。さらに、本DSAGアーキアの分離・培養を進めて行く過程において共存していた2種類の新目レベルで新規なChloroflexi門に属するバクテリアを分離し、それらの詳細な生理学的特徴を理解することができた。以下にその詳細について述べる。本研究で対象とした系統分類学上高次レベルで未培養であった微生物たちは、極めて遅い増殖速度(倍加時間は20-30日程度)であり、その最大到達菌体密度(10^5 cells/ml程度)も極めて低かった。この特徴から、これらの微生物は細胞分裂にエネルギーを使用するよりも、可能な限り一つの細胞を存続させることを優先したエネルギー節約型のライフスタイルをとると考えられた。これは、海底堆積物環境のような極限環境で生き残るための生存戦略と考えられる。加えて、これら微生物のゲノム情報を得ることにも成功し、そのゲノム情報から詳細な代謝プロセスの解明を行った。ゲノム情報を活用することで集積ならびに分離操作を効率よく進めることができた。さらに、培養に成功した微生物は記載・命名に必要となる基本的な生理学的特徴の調査だけでなく先端的な種々の顕微鏡観察や安定同位体ラベルを利用した培養実験等を行う事で、ゲノム解析だけでは理解することができない新しい代謝機能を発見するに至った。
ER exit sitesの構造形成・機能発現制御機構の解明

ER exitsites(ERES)は、小胞体(ER)からゴルジ体へ向かう輸送小胞の形成プラットフォームである。われわれは先行研究により、膜タンパク質であるYip1AをERESのマーカー膜タンパク質とし、M期におけるERES構造体分解の制御機構を明らかにしている。しかし、本研究実施の過程で、Yip1AはGFP-tag依存的にERESの存在し、多くはゴルジ体に局在化することを発見した。そこで、本研究では、ゴルジ体におけるYip1Aの機能探索を中心に研究を進めた。そのため、小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送(順行輸送と逆行輸送)をゴルジ体に局在化するGT-GFP(ガラクトシルトランスフェラーゼのGFP融合タンパク質)をプローブとしFRAP法を用いてそのキネティックスを含めて定量的に解析する手法を構築した。次に、セミインタクト細胞内で細胞質依存的に生起する小胞体→ゴルジ体間輸送(順行輸送)とゴルジ体→小胞体間輸送(逆行輸送)素過程を分割してアッセイする方法を構築した。次に、Yip1Aの細胞質ドメインのペプチド領域(N末から1-109番目)及び(1-65番目)部分のGST融合タンパク質を調製し、細胞質とともにセミインタクトCHO細胞に加えて順行・逆行輸送アッセイを行った。その結果、興味深いことに、逆行輸送のみがそれらペプチドにより有意に阻害されることが判った。これは、Yip1Aの細胞質側ドメインが細胞質またはゴルジ体表面の輸送装置に作用して、ゴルジ体からのGT-GFPの逆行輸送を競争的に阻害したことを意味する。この他にも、この細胞質ペプチド領域は、VTC/ERGICからのp58の逆行輸送を阻害しなかったこと,RNAi法によりHeLa細胞の内在性のYip1AをノックダウンするとShigatoxinのエンドソーム→ゴルジ体→小胞体の逆行輸送が阻害されることなどから、Yip1Aはゴルジ体からのCOPI依存的な逆行輸送に関わることを示唆する結果を得た(論文投稿中)。本年度は、以下に示す3つの結果を得た。1.Yip1A-GFPは、CHO細胞ではERESに局在したが、HeLa細胞においては主にゴルジ体に局在化することが判った。間接蛍光抗体法では、その局在はcis-ゴルジ体のマーカーであるGM130やtrans-ゴルジ体マーカーであるp230と部分的に共局在した。2.分割ユビキチン膜タンパク質酵母two-hybrid法を用い、Yip1A全長をベートにして相互作用分子を探索し、候補分子としてGRASP-55を得た。GRASP-55は、ゴルジ体層版のスタッキングに関わるとされている表在性膜タンパク質である。HA-tagを融合させたGRASP-55をHeLa細胞に発現させYip1A-GFPとの共局在を調べるとゴルジ体付近に関してはほぼ共局在が観察されたが、ERES構造では全く共局在は観察されなかった。また、免疫共沈実験を行ったが、生化学的には両蛋白質の結合は観察されなかった。3.ERESに局在化するYip1Aの形態に攪乱を与えるキナーゼを探索するため、先ず、18種類のキナーゼ阻害剤を用いてキナーゼのタイプを絞り込み、続いて、ヒトキナーゼsiRNAライブラリーを用いて特定のキナーゼ分子をRNAi法を用いて網羅的に探索した。その結果、diacylglycerol kinase ε、diacylglycerol kinaseζ、casein kinase Iαなどを得た。これらのsiRNA処理により、ERESに局在するYip1A-GFPは小胞体ネットワーク中に拡散したが、ERESの別のマーカーであるCOPIIコンポーネントの一つSec13のシグナルに変化が観察されなかったことより、これらのキナーゼはERES構造体の攪乱を誘起したのではなく、むしろERES膜ドメインにYip1-GFPを繋留しておくための装置がこれらキナーゼにより制御されていることが予想された。

次に、Yip1Aの細胞質ドメインのペプチド領域(N末から1-109番目)及び(1-65番目)部分のGST融合タンパク質を調製し、細胞質とともにセミインタクトCHO細胞に加えて順行・逆行輸送アッセイを行った。その結果、興味深いことに、逆行輸送のみがそれらペプチドにより有意に阻害されることが判った。これは、Yip1Aの細胞質側ドメインが細胞質またはゴルジ体表面の輸送装置に作用して、ゴルジ体からのGT-GFPの逆行輸送を競争的に阻害したことを意味する。この他にも、この細胞質ペプチド領域は、VTC/ERGICからのp58の逆行輸送を阻害しなかったこと,RNAi法によりHeLa細胞の内在性のYip1AをノックダウンするとShigatoxinのエンドソーム→ゴルジ体→小胞体の逆行輸送が阻害されることなどから、Yip1Aはゴルジ体からのCOPI依存的な逆行輸送に関わることを示唆する結果を得た(論文投稿中)。
北陸地方における降雪期の歩行者・運転者の交通事故における人体損傷の分析

交通事故の発生には車輌、人間、環境等の様々な要因が関与している。環境要因として北陸地方には冬季に多量の降雪があるという特徴がある。そこで、降雪期に発生した歩行者・車輌間および車輌・車輌間の衝突事故において、今回特に交通死亡事故に焦点を当て、人体損傷調査と事故状況・車輌損傷の調査を総合的に行ってその結果を考察したところ、それぞれの事故に特有な興味ある所見を見出したので報告する。平成5年から平成7年までの3年間の12月、1月、2月、3月に発生した交通死亡事故96件について、事故の発生と降雪あるいは積雪との間に密接な因果関係がある事例を抽出した。これらの事例の中、被害者について当教室で司法解剖が行われたものはその解剖所見を調査対象とし、解剖が行われなかったものについては可能な限りの医学的調査を行った。また事故当時の気象状況は富山地方気象台の観測資料を用いた。積雪あるいは降雪、当時の気温等の気象条件によって道路には特有の状況が生じ、事故発生の場面を提供している。車輌のスリップは、車輌速度、減速率、車輌重量、道路の形状等を要因として発生し、スリップ距離は車輌速度と車輌重量が関係している。また車輌破壊および人体損傷は衝突速度および衝突角度、車輌間の重量関係や車輌構造等に密接に関係していた。しかし、事故の主原因は車輌速度であり、運転の速度に対する甘い見通しによってスリップが発生している。なお特記すべき事例として、バック走行時にピ-ピ-という警戒音が出る車輌構造になっていれば、歩行者が車輌の接近に気付いて事故が起きなかったのではないかと考えられるものがあり、車輌メーカーにこの点の改良を求める必要がある。
世界戦略的ロボット手術研究教育拠点作成のための教育モデルの確立

ロボット手術のトレーニング効果77人の外科医を対象とし手術支援ロボットはda Vinciを使用した。プログラムは2日間で行い、胆嚢摘出術及び消化管吻合術の習得を目的とし、その前後にDry Labでの実際の手術手技に基づく5つのTask(Pegboard Pattern,Running string,Pattern cutting,Ligation,Suturing)を2回行うことでトレーニング効果を判定した。各Taskの評価は完遂するまでの時間(speed)と正確さ(error)により評価した。さらにそのTotal scoreの上昇がspeedとerrorのいずれに起因するのかを検討した。すべてのTaskにおいてトレーニング前後で有意にTotal scoreの上昇を認めた。(すべてP<0.0001)またすべてのTaskにおいてのSpeedの有意な向上(すべてP<0.0001)を認めた。ErrorではTask1(P<0.001),4(P<0.005),5(P<0.001)において有意な改善を認めた。5つのTaskのうちRunning StringやPattern Cuttingなどの比較的簡単な操作においてはTotal Scoreの改善は速度の向上によるものであり、LigationやSuturingなどの実際に行う手術手技では、Errorの減少によりTotal Scoreの改善が認められた。内視鏡下外科手術の経験の多寡にかかわらず、Scoreの向上を認めており、ロボット手術のトレーニングは短期間でも安全で確実な手術操作の習得をもたらすものと考えられた。遠隔ロボット手術実験Operation Lindbergにより遠隔手術が現実のものとなったが以降海外を結ぶ臨床例は行われていない。我々は国産の低侵襲手術支援システムを用いこれまで国内(東京-静岡:150km)および国外(ソウル-福岡:540km・バンコク-福岡:3700km)を結び遠隔ロボット手術実験を行った。大動物を対象とし術式はすべて腹腔鏡下胆嚢摘出術を行った。接続回線は東京-静岡:ISDN,ソウル-福岡:KJCN,バンコク-福岡:JGNIIを,画像転送はそれぞれMPEG,DVTS,MPEG2を使用した。すべての実験で手術に成功した。術者体感時間遅れ(msec)は東京-静岡:592.5,ソウル-福岡:592.5,バンコク-福岡:582.4であった。遠隔ロボット手術の普及には高価な専用回線よりも安価なインターネット回線の利用が現実的で、そのためにはセキュリティと、手術可能品質を維持した遅延最小限の映像伝送が必要である。1.ロボット手術トレーニングセミナー平成15年7月より国内初となる手術支援ロボット(da Vinci^<TM>)のトレーニングセミナーを、日本コンピューター外科学会、日本内視鏡外科学会、九州内視鏡外科手術研究会の後援をうけ、先端医工学診療部トレーニングセンターにて行っている。平成17年3月現在まで、27回のロボット手術トレーニングを行い、内外から116名の医師・工学技術者・企業開発者が参加した。第1日目はda Vinci^<TM>の構成・操作・取り扱い上の注意点を習得する事が目的で、トレーニングモデルを使って本センターが規定するタスクを行った。

同じタスクを内視鏡外科手術鉗子を用いて行った場合と比較すると、全てのタスクでda Vinci^<TM>を用いた方が速く精確に達成できた。第2日目には実験用動物を使って、より実践的なトレーニング(胆嚢摘出術、消化管吻合、その他の術式)を施行した。最後に1日目と同じトレーニングモデルによるタスクを行い、第1日目とタスク達成度を比較した結果、全員が初日より達成度の向上が見られた。2.アジア地域におけるロボット手術の普及および遠隔指導システムの構築ロボット手術トレーニングセミナーに台湾からの医師5名の参加が得られた。遠隔医療に関しては、平成17年3月2日に東京大学光石研究室のマスター・スレイブ型ロボットを用いて韓国ソウル漢陽大学と九州大学を光ファイバーで結び、動物の胆嚢摘出術に成功した。3.手術ナビゲーションシステムの開発術中3次元超音波画像の獲得および腹腔鏡画像との統合を行った。磁気式3次元位置センサによって超音波プローブ先端の位置姿勢を計測しており、周囲の金属製品による歪みを補正する方法を確立した。動物実験による腫瘍ファントム実験や血管の重ね合わせの実験で、肝臓内の血管をドップラー超音波で撮影し、3次元再構成して内視鏡画像に重ね合わせることも成功した。1.ロボット手術のトレーニングの効果の検討平成15年7月からロボット手術のトレーニングセミナーを開始しており、その有効性に関して詳細な検討を加えた。[対象と方法]77人の外科医を対象とした。手術支援ロボットはda Vinci^Rを使用しプログラムは2日間で行い、胆嚢摘出術及び消化管吻合術の習得を目的とし、その前後にDry Labでの実際の手術手技に基づく5つのTaskを2回行うことでトレーニング効果を判定した。各Taskの評価は完遂するまでの時間(speed)と正確さ(error)により評価した。さらにそのTotal scoreの上昇がspeedとerrorのいずれに起因するのかを検討した。[結果]すべてのTaskにおいてトレーニング前後で有意にTotal scoreの上昇を認めた(P<0.0001)。またすべてのTaskにおいてのSpeedの有意な向上(P<0.0001)を認めた。Errorでは3種類のTaskおいて有意な改善を認めた。[考察]5つのTaskのうち比較的簡単な操作においてはTotal Scoreの改善は速度の向上によるものであり、LigationやSuturingなどの実際に行う手術手技で、なおかつ従来の内視鏡下外科手術において体腔内において困難とされていた手技は速度の向上のみならず、Errorの減少によりTotal Scoreの改善が認められた。内視鏡下外科手術の経験の多寡にかかわらず、Scoreの向上を認めており、ロボット手術のトレーニングは短期間でも安全で確実な手術操作の習得をもたらすものと考えられた。
マウス順遺伝学の技術革新に基づく難聴の発症原因解明と聴力正常化近交系の樹立

多くの近交系マウスは遺伝的背景に潜在するゲノム多型の効果によって難聴を発症する。本研究ではコンソミック系統、ゲノム編集およびアレル発現量の定量を取り入れた順遺伝学的アプローチを用いて近交系マウスの難聴発症に関与するゲノム多型の同定を試みた。本研究のアプローチはB6マウスの難聴発症の解明に特に有効であった。我々はカドヘリン23遺伝子の多型のゲノム編集とMSMマウス由来の第12番染色体ゲノム領域の導入によってB6マウスの聴力をMSMレベルまで正常化すること、およびコンジェニックマッピングとアレル発現量データを活用することによって第12番染色体に新たな難聴発症関連遺伝子の候補を同定することができた。順遺伝学的手法は難聴発症原因遺伝子の同定のための主要なアプローチであり、多くの遺伝子変異を同定に貢献してきたが、多因子性(QTL)の難聴発症原因の同定はいまだ困難な状況にある。そこで本研究はゲノム編集、精密な遺伝子発現量計測を導入した順遺伝学的手法の技術革新によって多因子性難聴の原因を解明すること、および聴力を正常化したマウス系統の樹立による新たなバイオリソース構築することを目的に、本年度は以下の解析を実施した。本年度はC57BL/6J(B6)の1対のMSM/Ms(MSM)染色体を置換したコンソミック系統のうち、特に12番染色体の一部を置換した(サブ)コンソミック、B6J-Chr12C@MSMの遺伝解析を実施した。第1に、本研究ではB6J-Chr12C@MSMとB6Jを交配し、F2個体を作製し、連鎖解析を実施した。その結果、セントロメア領域に統計学的に有意なQTLを検出した。しかしながら、予想したようにQTL解析の結果においてノイズが検出され、現在B6Jの主要な難聴原因遺伝子変異であるカドヘリン23 (Cdh23)のahl変異(Cdh23-753A)(Kikkawa & Miyasaka, 2016)をCdh23-753Gへゲノム編集により置換したノックインB6マウス(Miyasaka et al., in press)との交配によるF2個体の聴力表現型データを蓄積している。一方、遺伝解析の過程でF2個体の聴力には雌雄差が存在し、雌個体が有意に聴力低下を示すことが明らかとなった。2.ゲノム編集によるLrrc30ノックインマウスの作製B6Jマウスの難聴発症への関与が予想されるLrrc30の遺伝子発現領域に存在する遺伝子多型のノックインゲノム編集を試みた。しかし、現時点で目的の多型を置換した個体は得られていない。本年度はコンソミック系統に基づく遺伝解析によって、B6Jマウスの難聴抑制効果をもつQTLの候補を同定した。実施予定だったCdh23-753Gゲノム編集個体との交配系の解析結果が出るまでには至らなかったが、この結果は新たな難聴遺伝子の同定のための重要な情報となると思われた。しかし、ノックインゲノム編集が現時点でうまくいっておらず、予定していたLrrc30ゲノム編集個体はいまだ得られていない。一方、本年度は(B6J ×MSM) F1および(MSM ×B6J) F1の雌雄個体の内耳蝸牛のRNA-Seq遺伝子発現解析を実施し、予定を上回り早期にデータを得ることができた。ゲノム編集および精密な遺伝子発現量計測を導入した順遺伝学の技術革新による新たな難聴遺伝子の同定および聴力正常化したマウス系統の樹立による新たなバイオリソース構築を目的に研究を実施し、本年度は以下の結果を得た。1.新規難聴発症関連遺伝子座hfhl4の同定:C57BL/6J(B6J)系統の第12番染色体の広範囲ゲノム領域をMSM/Ms(MSM)系統由来の配列に置換したB6J-Chr12C@MSMサブコンソミックマウスは高周波音の早発性難聴発症が抑制される。そこでこの高周波音難聴の原因となる遺伝子を同定するため、B6J-Chr12C@MSMとB6Jマウス間の交配により得た染色体組換え個体群を用いた遺伝子座マッピングを実施した。その結果、染色体組換え個体群の高周波難聴の発症はセントロメアから約10 Mbの領域に存在する遺伝子座high frequency hearing loss 4 (hfhl4)を同定することができた。また、B6J, MSMおよびB6J-Chr12C@MSMマウスの内耳遺伝子発現比較解析の結果、B6J-Chr12C@MSMマウス特異的発現変動がゲノムワイドに検出された。2.NOD/Shi系統のゲノム編集:早発性重度難聴を発症するNOD/Shiマウスのカドヘリン23(Cdh23)遺伝子のゲノム編集を実施し、マウスの難聴発症の原因・促進に関与する753番目のアデニンをグアニンへと置換したマウスの作製に成功した。3.内耳発現遺伝子のB6JーMSM系統間の対立遺伝子特異的発現量の計測:昨年度得たB6JーMSM系統間のF1個体群(正逆交配の雌雄個体の計4個体群)のRNA-Seq解析データについて新学術領域「先端ゲノム支援」のサポートを受け解析し、両系統由来の対立遺伝子の発現量計測を実施した。本年度目標にしていたDBA/2Jマウスのゲノム編集は実施できなかったが、その他の目標についてはほぼ完了することができた。