hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2光子光化学標識法を用いた膵内分泌機構の解析

インスリンは血糖調節にかかわるホルモンであり、その分泌不全は糖尿病を引き起す原因の一つと考えられている。分泌の最終過程にあたる開口放出や分泌顆粒の動員機構にも、異常の存在する可能性が示唆されている。我々は分泌顆粒や光活性型蛍光蛋白の細胞内動態を測定するために、光活性型GFPで標識した。また、膜融合の準備状態を検討するために、細胞膜に発現するSNARE蛋白であるSNAP25に、二種類のGFP変異蛋白を挿入したFRETプローブを作成し、SNAP25の複合化と膜融合の潜時の関連や生化学的性質を検討した。インスリンの作用は、我が国を含むアジア系諸国において、2型糖尿病の成因に深く関わる。そして、その分泌不全は疾患を引起す原因の一つと考えられている。分泌の最終過程にあたる開口放出、およびその準備段階にあたる分泌顆粒の動員機構にも、異常の存在が示唆される。分泌顆粒を光活性型GFPで蛍光標識するために、PAGFP-insulin,PA-venus insulin,PAvenus-VAMP2などの各種cDNAを発現するベクターを作成し、INS-1細胞、膵島などへの発現を検討してきた。並行して、インスリン顆粒内部は強酸性を示すためか、顆粒内容物を標識しても光活性化が適切に起こらないとの情報を得た。また、顆粒に発現するSNARE蛋白であるVAMP2を標識した場合には、大型有芯小胞以外の細胞内小器官も標識されることが判明した。そこで、現在はインスリン顆粒膜に特異的に発現するphogrinを蛍光標識する方針に変換してベクター作成を進めている。また、膜融合の準備状態を検討するために、細胞膜に発現するSNARE蛋白であるSNAP25に二種類のGFP変異蛋白を挿入したFRETプローブも複数作成し、SNAP25の複合化と膜融合の潜時の関連について検討した。グルコース刺激・もしくはケイジドカルシウム刺激による分泌を誘発した場合、早期に分泌される部位ほどFRET比があらかじめ高いことを示し、また、高い領域の空間分布に関する画像解析も進めている。インスリンの分泌不全は、我が国を含むアジア系諸国において、2型糖尿病の成因に深く関わっている。インスリンは他のホルモンや神経伝達物質同様に、脂質二重膜に囲まれた顆粒の中に蓄えられている。そして、刺激依存的に細胞外に放出される。分泌の最終過程にあたる開口放出においても、異常の存在する可能性が、ヒト膵島における検討、あるいは糖尿病モデルマウスの検討から示唆されている。我々は2光子励起顕微鏡を用いて、膵島標本内におけるインスリン分泌と関連分子の動態を実時間解析した。そして、分泌準備段階にあたる顆粒の動員機構や細胞膜側の因子の解析を進めてきた。SNAP25に二種類のGFP変異蛋白を融合して分子内FRETプローブを作製した。FRET値は、二種類の細胞膜性SNARE蛋白質(SNAP25とSyntaxin 1 A)のヘテロニ量体化を反映する事を、生化学的実験より確認した。生体組織に本プローブを発現させたところ、FRET値は膵島β細胞の表面で勾配を作製し、分泌量や分泌の速度に強く関連する事を見出した。高い分泌能を有する細胞膜側因子の性質を明らかにするために、次にSyntaxinの分布の検討に移った。具体的には、光活性化型GFP(PAGFP)で標識したSyntaxir 1 Aの細胞発現ベクターを作製し、任意のタイミングと領域で光活性化を行う実験系を確立した。さらに、免疫染色法あるいは発現ベクターを用いて、Syntaxinの発現量とFRET値との関連を検討する実験系を立ち上げた。高FRET領域と低FRET領域における本分子の動態の違いを可視化し、検討を続けている。
簡便法による高齢者の全身持久力評価(歩行を用いたシャトルスタミナテストの検討)

全身持久力は、全身的な運動の"できばえ(performance)"をもって評価することができる.一方、生理学的には最大酸素摂取量(VO_2max)が最も適切な評価指標とされている。しかしVO_2max測定は、特に高齢者の場合,安全面に問題がある他、特定の設備と技術を必要とし、多人数を同時に測定することも困難である。若齢者では、持久走テストがフィールドテストとしてよく用いられているが、これも長年「走る」ことに馴染みの少ない一般の高齢者にとっては無理な課題である。高齢者の全身持久力評価に関しては,未だ模索段階で,内外ともに一定の見解がないのが現状である。そこで,我々は,安全かつ簡便にフィールドでも測定可能な高齢者の全身持久力評価方法の開発を目的として,共同研究者である金子が提案するシャトルスタミナテスト(SST:10m折り返し3分間走)の「走り」を「歩き」にしたシャトル・ウオ-クテスト(SSTw:10m折り返し3分間歩行)を高齢者に試みている.平成7年度は,40歳から92歳の男性118名,女性297名を対象とし,心拍数や主観的運動強度からみたSSTwの身体的負担度,およびこのテストによる高齢者の体力(全身持久力)の特徴について検討した.SSTwの成績(歩行距離)は,1)年齢と高い相関(男性r=-0.775,女性r=-0.733)を示し,明らかな加齢変化が認められる.2)従来からのバッテリ-テスト(握力,垂直跳び,長座位体前屈,ステッピング,閉眼,開眼片足立ち,息こらえ)すべての成績と有意な相関が認められる.3)40歳代からの毎年の低下率を求めると,VO_2maxの低下率(約1.1%)にほぼ一致する.また,このような加齢変化は,4)垂直跳びの加齢変化とも一致する.5)SSTwでの心拍数は,男女各年齢階級とも予測最大心拍数の約85%である.6)主観的運動強度は,中年層ではまあまあ普通が40%前後見られるが,後年層では少しきついと回答する者が最も高率で,きついとの回答は年齢とともに増加する.以上から,SSTwは,高齢者の持久力を簡便に評価する一つの尺度になる可能性が示唆された.特に「歩行」は,高齢者の身体的自立を支え,高齢者にも無理なくできる運動であるため,これを直接評価尺度にするメリットは大きいと考える.全身持久力は、全身的な運動の"できばえ(performance)"をもって評価することができる.一方、生理学的には最大酸素摂取量(VO_2max)が最も適切な評価指標とされている。そこで,我々は,安全かつ簡便にフィールドでも測定可能な高齢者の全身持久力評価方法の開発を目的として,共同研究者である金子が提案するシャトルスタミナテスト(SST:10m折り返し3分間走)の「走り」を「歩き」にしたシャトル・ウオ-クテスト(SSTw:10m折り返し3分間歩行)を高齢者に試みている.平成7年度は,40歳から92歳の男性118名,女性297名を対象とし,心拍数や主観的運動強度からみたSSTwの身体的負担度,およびこのテストによる高齢者の体力(全身持久力)の特徴について検討した.SSTwの成績(歩行距離)は,1)年齢と高い相関(男性r=-0.775,女性r=-0.733)を示し,明らかな加齢変化が認められる.2)従来からのバッテリ-テスト(握力,垂直跳び,長座位体前屈,ステッピング,閉眼,開眼片足立ち,息こらえ)すべての成績と有意な相関が認められる.3)40歳代からの毎年の低下率を求めると,VO_2maxの低下率(約1.1%)にほぼ一致する.また,このような加齢変化は,4)垂直跳びの加齢変化とも一致する.5)SSTwでの心拍数は,男女各年齢階級とも予測最大心拍数の約85%である.6)主観的運動強度は,中年層ではまあまあ普通が40%前後見られるが,後年層では少しきついと回答する者が最も高率で,きついとの回答は年齢とともに増加する.以上から,SSTwは,高齢者の持久力を簡便に評価する一つの尺度になる可能性が示唆された.特に「歩行」は,高齢者の身体的自立を支え,高齢者にも無理なくできる運動であるため,これを直接評価尺度にするメリットは大きいと考える.
同種粒子系のエンタングルメントの特徴 : その解析と応用

まず、前年度に引き続き、同種粒子系のエンタングルメントについて研究した。この研究は、同種粒子系において見かけ上エンタングルしているように見えるにもかかわらず量子相関がとれない状態が存在することについて取り組んだものであり、前年度の研究によって、実際の測定に即した表現で状態を表すことによって、この問題が解決されることを示した。本年度は、特にこの理論におけるエンタングルメントの測定依存性について調べた。その結果、申請者の考える測定モデルにおいては、ボゾン系において、どのような測定を用いてもエンタングルした状態にならない状態の集合があることがわかり、さらにそのような状態はそれらだけしかないということを明らかにした。また、フェルミオン系においては、いかなる状態も適切な測定系を選べばエンタングルするということも明らかにした。この研究は、研究会で成果を発表するとともに、この結果についての論文を作成中である。次に、一方向量子計算におけるエンタングルメントの推移について研究した。一方向量子計算は、測定によって量子コンピューターを実装するという比較的新しい手法である。一方向量子計算の例としてもっとも基本的なものは、Controlled Not GateとRotation Gateを組み合わせて作る回路である。この組み合わせはもっとも基本的ながら、任意の演算を実行できるということが特徴的である。以前行っていたエンタングルメント測度の研究をこの系に適用することによって、回路の実行途中の状態のエンタングルメントが測定結果によらないということが示唆されていたが、今回はそれを実際に証明した。この研究は、平成23年度には間に合わなかったが、JPSJに受理され掲載予定である。第1の問題意識である、同種粒子系のエンタングルメントにおける問題を解決し、先行研究との関係も明らかにすることができた。また、その構造の中で当初予測できなかった構造を見つけ、それを解析することもできた。さらに、第2の問題意識である、一方向量子計算におけるエンタングルメントの推移の予想も厳密に示すことができた。同種粒子系におけるエンタングルメントを理解するために枠組みを作ることができたので、実際の系における解析に応用する。また、理論的には、この理論の枠組みはまだ拡張の余地があるのでより一般の場合に適用可能なようにする。この際、実際の応用上で重要な要素を完全に取り込み、かつ極度に抽象的にならないようにするため、どの要素を取り込むのかについて選択肢があるので、それをよく検討する必要がある。一方向量子計算については、実際に示したのは限定された回路の構成に関するものだったので、より一般の状況でも同様の主張がなりたつのかについて検討する。量子相関が得られない同種粒子系のエンタングルメントについて、先行研究をオペレターの制限という観点から再構築した。先行研究では、状態のみに依存してエンタングルメントを新たに定義しなおすという方法をとっているが、現象の物理的意味を考えて、オペレーターの制限という観点から議論を再構築した。この結果により、どのように測定を行うかということが同種粒子系のエンタングルメントの定義において重要な役割を果たすことが明確にわかり、その影響を詳細に調べることが可能になった。特に、先行研究は本研究結果において特殊な測定器をとっている場合に対応しているということもわかる。また、本研究は同種粒子系のエンタングルメントを扱うための基盤を整備したという意味ももっている。同種粒子系のエンタングルメントの取扱いはこれまでその場に応じて応急処置的な方法で行われてきたが、そのような方法を正当化するとともに、その背景にある測定器依存性をうかびあがらせ、現象に対する理解を深める助けとなるものである。2.クラスター状態を用いた一方向量子計算における様々な計算例を、新たに定義したエンタングルメント測定で定量的に評価することによって、新たな知見が得られるか調べた。この手法によりユニバーサル計算可能な一方向量子計算の特定のクラスにおいて計算途中の状態が互いに局所ユニタリ変換で結びつくことを示すことができた。

また、その構造の中で当初予測できなかった構造を見つけ、それを解析することもできた。さらに、第2の問題意識である、一方向量子計算におけるエンタングルメントの推移の予想も厳密に示すことができた。同種粒子系におけるエンタングルメントを理解するために枠組みを作ることができたので、実際の系における解析に応用する。また、理論的には、この理論の枠組みはまだ拡張の余地があるのでより一般の場合に適用可能なようにする。この際、実際の応用上で重要な要素を完全に取り込み、かつ極度に抽象的にならないようにするため、どの要素を取り込むのかについて選択肢があるので、それをよく検討する必要がある。一方向量子計算については、実際に示したのは限定された回路の構成に関するものだったので、より一般の状況でも同様の主張がなりたつのかについて検討する。
腸内フローラは神経性食欲不振症患者の体重増加に影響しているのか?

先進国においては神経性食欲不振症(anorexia nervosa : AN)患者が増加しているが、その病態に関与している腸内因子については未解明である。本研究では、腸内フローラに焦点を当て、AN患者にみられる極度のるいそう状態における腸内フローラの詳細を腸内フローラ解析システム"YIF-SCAN"(Yakult Intestinal Flora Scan)を用いて明らかにし、健常者と腸内フローラと比較することを目的としている。本研究は平成23年度に九州大学病院倫理委員会において承認され、同年より患者の登録を開始している。現在のところ5名の患者が登録され、サンプルの解析が行われている。登録者が10名になった時点で中間解析を行う予定である。平成22年度においては下記の研究計画を立案し、実施するための調整、準備を行った。腸内フローラの解析は、ヤクルト中央研究所の協力を得て、腸内フローラ解析システム「YIF-SCAN」(Yakult Intestinal Flora Scan)を用いて行うこととなった。本システムは、門、属あるいは種に特異的なプライマーを用いた定量的PCR/RT-PCR法を原理としており、迅速、簡便および大量の腸内フローラ解析が可能となる。平成23年度においては、本システムを用いて以下の解析を行う予定である神経性食欲不振症患者において治療によってもたらされた体重増加(ベースラインから20%増加した時点)による腸内細菌の変化:入院患者に対する栄養法は、院内の食事による経口摂取または、定められた栄養剤による経鼻経管栄養によって行う。神経性食欲不振症患者の腸内細菌の体重増加による変化を検討するために、ベースライン時とそこから20%の体重増加を認めた時点での糞便サンプルを採取し、YIF-SCANを用いて腸内フローラを解析する。合わせて、通常診療で検査を行っている心理・生理・生化学的データ(呼気ガス分析による基礎代謝測定を含む)および消化器症状の主観的尺度を経時的に評価する。「研究の目的」先進国においては神経性食欲不振症(anorexia nervosa : AN)患者が増加しており、社会的にも大きな関心を集めているが、その病態に関与している腸内因子については未解明である。近年、腸内フローラの新しい生理作用が続々と解明されているが、なかでも肥満症の発症や維持・増悪に関与していることを解明したGordonらの報告(Nature 2006;444:1027-1031)は世界中の研究者に衝撃をあたえた。この報告以降、世界中で肥満症の腸内フローラ解析が進行中であるが、ANにおける腸内フローラ解析は極めて限られている。最近、フランスのグループよりAN患者群においてMethanobrevibacter Smithiiが増加していることが報告されたが(PLo SOne. 2009, 23;4(9):e7125)、解析したサンプル数は少なく、AN患者における腸内フローラめ詳細を明らかにするには至っていない。本研究では、腸内因子として腸内フローラに焦点を当て、AN患者にみられる極度のるいそう状態における腸内フローラの詳細を解明する。「研究実施計画」対象は、15歳以上から40歳までの構造化面接においてアメリカ精神医学会精神疾患診断統計マニュアル第IV版のANの診断基準を満たし、文書によって同意の得られた30名の外来および入院患者と、年齢を一致させた健常女性30名。研究1では、患者群とコントロール群の腸内細菌を横断的に比較する。研究2では、入院治療の適応となったAN患者群において体重増加による腸内細菌の変化を前向きに検討する。ベースラインは脱水や電解質異常が改善された入院後23週間後と定義する。糞便サンプルはベースライン、1, 2, 3ヶ月後の4回採取し、腸内フローラを解析する。また糞便からのRNA/DNA抽出と解析は、腸内フローラ解析システム"YIF-SCAN"(Yakult Intestinal FIora Scan)を用いて行う。以上の研究は九州大学病院倫理委員会にて承認されており、平成23年度より患者の登録を開始している。
現代日本の若年者の行動と意識の変容に関する総合的研究

本研究は、若年者を対象としたパネル(追跡)調査を2007年から毎年実施した。同一の個人を何年にもわたり追跡して調査することにより、(1)学校から職場への移行、(2)初期のキャリア形成と転職、(3)離家と異性との交際・結婚、(4)意識・態度、価値観といった多様な側面から若年者のライフコースを総合的に捉え、その変化を跡付ける分析を行った。本研究の目的は、若年者を対象にパネル(追跡)調査を実施することにより、教育・就業・結婚・意識に関する変化を、総合的に捉えることにある。本研究では、(1)学校から職場への移行、(2)就業行動(非典型雇用、転職など)と労働市場、(3)離家と結婚・家族形成、(4)意識と態度、という4つの分析軸から若年者の行動と意識を分析する。これらの4つの軸を個人のライフコースの流れの中で総合的にとらえることによって、若年の行動と意識の変容を明らかにし、若年雇用政策や晩婚化・少子化に関する施策を検討するための学術的基盤を提供することを目指す。平成18年度(2006年度)は初年度にあたるため追跡調査の母体となる対象者を抽出し、第1回の調査を設計・実施した。具体的には以下のような作業を行った。(1)研究体制の構築すでに東京大学社会科学研究所の中に立ち上がっていた「若年パネル研究会」を母体として、パネル調査の実施にむけた研究組織を立ち上げた。研究体制は、全体を統括する事務局を研究代表者の研究室に置き、その下に研究テーマごとに研究分担者が中心となり調査項目を検討する「調査企画委員会」を設置した。研究グループとは別個に、調査方法の検討、調査の実施管理などを担当する「調査実施委員会」を設置し、調査の実施に関して機動的に対応できる仕組みを作った。(2)調査票の設計研究分担者が中心となり、研究テーマごとに質問項目の原案を作成した。すでに日本で実施されたパネル調査だけでなく、海外のパネル調査の調査方法・項目を検討し、国際比較が可能になるような形で調査の設計に努めた。調査票全体の構成、長さ、順序、記入のしやすさなどを考慮しながら、最終的な調査票を「調査実施委員会」で作成した。調査票作成と平行して標本抽出方法、回収方法に関して専門家からの聞き取りを行い、本調査に最も相応しい方法を検討した。(3)調査対象者の抽出と調査の実施住民基本台帳をもとに全国の若年層を代表性のある形で抽出した。調査地点の抽出に関しては地域、都市規模などを層化し、都市部だけでなく地方、農村部の対象者も抽出できるようにした。対象者の抽出に関しては、性別・年齢別にグループ化し、最も補足しにくい20歳代前半男性の対象者も抽出できる工夫を凝らした。全国規模の調査であるため、調査の実施は調査会社に委託して行った。調査対象者の抽出、調査員への指示、調査回収状況などの実査に関わる実務については、「調査実施委員会」が中心となり、調査会社を指導連携して実施した。本研究の目的は,若年者を対象にパネル(追跡)調査を実施することにより,若年者のライフコース全体の中での教育,就業,結婚,意識に関する変化を総合的に捉え,相互の関連性を明らかにすることにある。この目的のために,2007年1月-4月にかけて「働き方とライフスタイルに変化に関する全国調査」を実施した。平成19年度は,この調査データのクリーニング・コーディング作業を行い,データ分析に着手した。(1)研究体制の再編すでに平成18年度には,東京大学社会科学研究所の中に立ち上げた「若年パネル研究会」を母体として「調査企画-委員会」と「調査実施委員会」という2つの研究組織を設置し,調査の設計,調査票作成,予備調査の実施,調査対1象者の抽出,本調査の実施を行った。平成19度は調査データのクリーニング・コーディング作業を行うために,2つの委員会とは別に「ワーキング・グループ」を設置した。(2)データのクリーニング・コーディング作業2007年調査データのクリーニング作業を「データクリーニング・コーディング担当ワーキング・グループ」を中心に進めた。クリーニング終了後,職業,産業に関する対象者の自由記述を職業,産業分類コードに変換するコーディング作業を行った。コーディング作業についてはコンピュータによる自動コードシステムを補助として採用し,コーディングの効率化を図った。(3)2007年調査データの確定と研究会活動によるデータ分析データのクリーニング・コーディング作業が終了後,まずデータの有効回収数の確定,回収率の確定などの作業に着手した。研究テーマに沿って研究会を開催し,それぞれの課題についての分析を開始した。分析結果は,研究会で報告した後に,順次ディスカッション・ペーパーとして成果を刊行した。2007年調査データのクリーニング作業を「データクリーニング・コーディング担当ワーキング・グループ」を中心に進めた。クリーニング終了後,職業・産業に関する対象者の自由記述を職業・産業分類コードに変換するコーディング作業を行った。

(3)2007年調査データの確定と研究会活動によるデータ分析データのクリーニング・コーディング作業が終了後,まずデータの有効回収数の確定,回収率の確定などの作業に着手した。研究テーマに沿って研究会を開催し,それぞれの課題についての分析を開始した。分析結果は,研究会で報告した後に,順次ディスカッション・ペーパーとして成果を刊行した。本研究の目的は、若年者を対象にパネル(追跡)調査を実施することにより、′若年者のライフコース全体の中での教育・就業・結婚・意識に関する変化を総合的に捉え、相互の関連性を明らかにすることにある。このため2007年1月-4月にかけて第1回「働き方とライフスタイルに変化に関する全国調査」を実施した。(1)第1回調査データの分析研究テーマに沿って定期的に研究会を開催し、分析の進行状況を報告する機会を設けた。分析結果は、順次論文としてまとめ、パネル調査ディスカッションペーパーとしてホームページ上からもダウンロードできる形で公開した。平成20年度は11本のディスカッションペーパーが刊行された。(2)学会報告と研究成果の公開今年度は、日本教育社会学会と日本社会学会において、パネル調査プロジェクトグループが共同で複数の報告を行った。日本教育社会学会では、「JLPS(東大社研パネル調査)に見る若年者の意識変化(1)-変容する意識の国際比較(2)-<働くこと>をめぐる意識に着目して-」という′2つのセッションを企画し、合計7名が報告した。日本社会学会では「働き方とライフスタイルの変化に関する全国調査(JLPS)の分析(1)-(5)」として5つの報告を行った。2008年秋にプレスリリースを行い、調査結果をメディアに発信した。2009年2月には、社会科学研究所パネル調査プロジェクト研究成果報告会を開催し、分析結果を広く公の場で発表する機会を設けた。(3)2009年調査の設計と実施調査企画委員会が中心となり分析テーマごとに調査項目の原案をまとめ調査票を作成した。調査実施委員会が中心となり、2008年秋には予備調査を行い、2009年1月-3月に「働き方とライフスタイルに変化に関する全国調査2009」を実施した。本研究の目的は、若年者を対象としたパネル(追跡)調査を実施することにより、若年者をライフコース全体の中で捉え、教育・就業・結婚・意識に関する変化を相互の連関性を明らかにしながら、総合的に分析することにある。今年度は、下記のような成果をあげた。(1)2009年実施の追跡調査に関するデータ・クリーニング・コーディング作業2009年1月から3月にかけてに実施した追跡調査のデータ・クリーニングの作業を実施委員会のメンバーが中心になり実施した。
920km不連続面およびマントル遷移層の地震学的研究

本研究の目的は、我々が発見してイギリスの科学誌Natureに1994年に発表したマントルの深さ920km付近にある地震波速度の不連続面の研究を続け、その地球科学的な意味を明らかにすることであった。2年間の研究期間ではその全貌を明らかにすることは出来なかったものの、マントル遷移層周辺の構造と下部マントル状況下での沈み込んだスラブ物質のふるまいについて、新しいきわめて重要な成果を得ることができた。J-array及び米国カリフォルニアのarrayデータを使った新たな研究により、この不連続面の深さは当初考えていたよりも地域性があることがわかった。日本から小笠原弧にわたる沈み込み帯では南に下がるにつれて945kmから970kmに深くなるのが観測され、インドネシア弧下では西へいくに連れて940kmから1080kmに深くなるのが観測された。さらにインドネシア弧下では、不連続面の深さ変化に対応して地震波の高速度異常が西に行って深くなるのが最近のトモグラフィーモデルから読み取れ、920km不連続面が沈み込んだスラブの残骸と思われる高速度異常と深く関連している可能性のあることが明らかになった。しかしながら地震波形の解析から、地震波速度は不連続面を境にして増えていなければならない。このことは不連続面が、沈み込んだスラブに対応する高速度異常の底であるという単純な解釈では説明できないことを意味する。ひとつの可能性としては、スラブ物質はマントル遷移層を突き抜けて下部マントルに落ちたあと化学的な分化をおこして不連続面を構成している、と考えることができる。もしこのようなことが地震学的データから立証できれば、今までの我々の下部マントルの物質観は大きな修正を迫られ、全地球のダイナミクス・進化といった観点からいっても極めて重要なものとなる。残念ながら既存の地震学的データからだけではこれ以上の決定的な結論を導き出すのは難しく、本研究の成果は新しい観測点の設置等を含む新たな研究計画に発展的に継続されていく必要がある。我々が発見してイギリスの科学誌Natureに発表した、マントルの深さ920km付近にある不連続面の研究を続け、今年度は以下のふたつの成果を得た。(1)J-array及び米国カリフォルニアのarrayデータを使った新たな研究により、この不連続面の深さは当初考えていたよりも地域性があることがわかった。この深さ変化は、660km不連続面のそれと比較して23倍大きく、もしこの不連続面が相変化によるものであるならば、温度依存性が非常に大きいことを示唆する。また、この境界が科学的な物質境界である可能性もおおいにあることを示唆する。我々の研究を受けて、沈み込んだ海洋プレートは、660kmでなく、920km辺りの深さにたまっているとする研究結果もいくつか提出されており、この新しい不連続面との関係も興味深い研究対象である。(2)現在我々は、920km不連続面が全地球的に存在するのか、局所的に限られた地域にだけ存在するのかを調べるための新しい解析方法の開発に努めている。

そのために開発した観測点直下のマントル不連続面の構造を決定する解析方法を、実験的に、日本および中国北西部の広帯域地震計観測点のデータに応用したところ、日本海溝から沈み込んだ海洋プレートがマントル遷移層の底にぶつかる中国北西部の地下深部660-780kmに、三つの複数連続面に相当する速度の異常があることがわかった。この複雑な構造は今まで考えられていたものとかなり違い、沈み込んだ海洋プレートがどのようにマントルに同化していくのかなどに示唆を与える新しい観測結果である。(1)(2)については、日本および米国の学会で発表し、(2)については論文の掲載がすでに決定している。(1)については、現在論文を執筆中である。本研究の目的は、我々が発見してイギリスの科学誌Natureに1994年に発表したマントルの深さ920km付近にある地震波速度の不連続面の研究を続け、その地球科学的な意味を明らかにすることであった。2年間の研究期間ではその全貌を明らかにすることは出来なかったものの、マントル遷移層周辺の構造と下部マントル状況下での沈み込んだスラブ物質のふるまいについて、新しいきわめて重要な成果を得ることができた。J-array及び米国カルフォルニアのarrayデータを使った新たな研究により、この不連続面の深さは当初考えていたよりも地域性があることがわかった。日本から小笠原弧にわたる沈み込み帯では南に下がるにつれて945kmから970kmに深くなるのが観測され、インドネシア弧下では西へいくに連れて940kmから1080kmに深くなるのが観測された。さらにインドネシア弧下では、不連続面の深さ変化に対応して地震波の高速度異常が西に行って深くなるのが最近のトモグラフィーモデルから読み取れ、920km不連続面が沈み込んだスラブの残骸と思われる高速度異常と深く関連している可能性のあることが明らかになった。しかしながら地震波形の解析から、地震波速度は不連続面を境にして増えていなければならない。このことは不連続面が、沈み込んだスラブに対応する高速度異常の底であるという単純な解釈では説明できないことを意味する。ひとつの可能性としては、スラブ物質はマントル遷移層を突き抜けて下部マントルに落ちたあと化学的な分化をおこして不連続面を構成している、と考えることができる。もしこのようなことが地震学的データから立証できれば、今までの我々の下部マントルの物質観は大きな修正を迫られ、全地球のダイナミクス・進化といった観点からいっても極めて重要なものとなる。残念ながら既存の地震学的データからだけではこれ以上の決定的な結論を導き出すのは難しく、本研究の成果は新しい観測点の設置等を含む新たな研究計画に発展的に継続されていく必要がある。
バイオインフォマティクス手法による細胞発現糖鎖の網羅的解析と生物学的意義の検討

質量分析装置(MS)と液体クロマトグラフィー(LC)を組み合わせたLC-MSのデータをバイオインフォマティクス手法により解析するソフトウェアの開発に協力し市販されるに至った。このソフトウェアを用いて様々な病態の小児白血病細胞を分析したところ、統計学的にそれぞれの病態で異なった発現糖鎖パターンを示すことを明らかにした。特に乳児性白血病ではこれまで報告のない糖脂質Ln3Cerが発現していることを見いだした。本研究は、高感度で構造解析が可能な質量分析装置(MS)と液体クロマトグラフィー(LC)を組み合わせたLC/MSを使用して様々な細胞が発現する糖鎖を分析し、得られた発現糖鎖情報をマイクロアレイで培われたバイオインフォマティクス的手法を応用して各試料間のデータの統計学的データ解析を行って発現糖鎖パターンによる細胞の判別や診断等に応用する基礎技術を確立するとともに、様々な細胞の発現糖鎖をこの手法で解析して細胞機能と発現糖鎖の関連性を調べることを目的とする。糖鎖は、核酸、タンパク質に続く第三の生命鎖と呼ばれ、発現が遺伝子に直接支配されない機能分子の一つとして細胞機能に重要な役割を発揮することが知られている。核酸やタンパク質鎖が直鎖状であることに対して、糖鎖は構成単糖が多様であること、結合位置・様式が多様であることに加え、分枝構造が存在するなど構造が非常に複雑である。細胞に発現する糖鎖発現パターンは細胞の種類によって異なることに加え、成熟やがん化に伴って複雑に変化するため、これら細胞の機能に何らかの役割を担っていると考えられているが、詳細については不明な点も多い。そのためこれまでゲノミクス分野で行われている網羅的な発現遺伝子解析と、細胞機能の関連を調べるようなバイオインフォマティクス的アプローチを発現糖鎖解析に応用することで、細胞の機能や働きと発現する糖鎖の機能解明に利用できる可能性がある。LC/MSは非常に高感度に試料中に含まれる成分をLCで分離しながら順次マススペクトルを取得する装置である。LC/MSから得られるデータは糖鎖の構造情報に加え、マイクロアレイのように非常に膨大な数の発現情報などが得られる。本研究では、様々な細胞の糖鎖をLC/MSで分析し、得られたデータをマイクロアレイで培われたバイオインフォマティクス手法で解析して細胞機能と発現糖鎖の関連性を調べる。昨年度までにおいて、LC/MSにより取得されたデータをライフィクス社より開発されたLC/MS用データ解析ソフトウェアSignpost MSにより読み込ませ、LC-MSによる各分析で起こるアライメントのズレを補正することができた。さらに様々な細胞から抽出した糖脂質をこの手法で解析してそれぞれの細胞に発現する糖脂質の発現パターンの相違について統計学的な解析を行った。本年度は様々な試料に対してアライメント補正した結果を統計学的に解析し、細胞特有な糖鎖発現パターンについて検証する。これまで、LC/MSにより取得されたデータをライフィクス社より開発されたLC/MS用データ解析ソフトウェアSignpost MSにより読み込ませ、LC-MSによる各分析で起こるアライメントのズレを補正することができた。本年度は様々な病態の小児白血病の細胞検体を分析したところ、統計学的にもそれぞれの病態で異なった発現糖鎖パターンを示すことが明らかになった。その結果を詳細に検証すると、過去の報告とも一致することに加え、乳児性白血病にはこれまで報告のない中性糖脂質Ln3Cerが発現していることを見いだすことができた。今後更に解析する検体数を増やし、実際の診断への有用性を示す必要がある。
非天然化合物の微生物分解に関わるプラスミドとトランスポソンに関する研究

ハロ酢酸脱ハロゲン酵素遺伝子をコードするプラスミドpUO1の構造解析と、有磯塩素系除草剤ダラポン(2,2-ジクロロプロピオン酸)を分解する土壌細菌Burkholderia sp.B7aM株、および有機リン系殺虫剤ダイアジノンを奔解する土壌細菌Sphingomonas sp.No.6株の分解酵素遺伝子およびそれを運ぶプラスミド、トランスポソンを解析した。(1)プラスミドpUO1の構造解析デハロゲナーゼH-2の遺伝子は2つのIS1071に挟まれたクラス1複合トランスポソンであった。デハロゲナーゼH-1の遺伝子も大きな(15.6-kb)トランスポソン様構造を成していたが、単独では転移能はなかった。Tn21のtransposaseとresolvaseのトランス共存により転移が認められた。(2)ダラポン分解に係わるデハロゲナーゼ遺伝子ダラポン分解菌Burkholderia sp.の有する約70kbのプラスミドには、ダラポンを脱塩素化するデハロゲナーゼの遺伝子がコードされている。遺伝子周辺領域35kbの塩基配列を解析した結果、約3kb下流域に挿入配列IS1071が存在し、約16kb上流域にもIS1071の部分配列が存在していた。従ってデハロゲナーゼ遺伝子は2つのIS1071に挟まれた複合型トランスポソンであった可能性が示唆された。この大きなトランスポソン様構造の中には別の2つのIS(1.2kb)に挟まれたシグマ54アクチベーター遺伝子が認められ、プラスミドの複雑な成り立ちが推察された。本デハロゲナーゼは2-クロロプロピオン酸のD,L両異性体に作用する。部位特異的変位導入により基質特異性の変化した酵素を創製した。(3)ダイアジノン分解に係わるチオリン酸エステラーゼ遺伝子ダイアジノン分解菌Sphingomonas sp.が有する約50kbのプラスミドはダイアジノン分解に関与していなかった。ダイアジノン分解酵素チオリン酸エステラーゼの遺伝子はゲノムDNAに存在し、本遺伝子の上流および下流に挿入配列IS6100が認められたので、クラスI型複合トランスポソンである可能性が示唆された。しかし、その転移能は確認できていない。本菌はスミチオン、パラチオンなど他のリン系農薬もよく分解するので、これら農薬で汚染された土壌や排水の浄化のための実証試験を行った。50ppmの農薬で汚染された土壌、排水は、分解菌の散布により2日間で完全に浄化された。in situバイオリメディエーション実施例の約80%は栄養塩散布などによる土着微生物の活性化(biostimulation)で、分解微生物の導入(bioaugumentation)例は少ない。その主な理由は、導入微生物が汚染現場に馴染まず、分解機能の発揮や定着が難しいためで、導入微生物の現場適応技術の開発が課題となっている。その打開策の一つとして、プラスミドやトランスポソンの伝達能や転移能を利用して、導入微生物の分解能を汚染現場に棲息する微生物に水平拡散させ、機能させる戦略が考えられる。本研究では有機塩素化合物や農薬を分解する微生物を広く探索し、分解能を担うプラスミドやトランスポソンを検索すると共に、分解能遺伝子をクローン化し、広宿主域プラスミドへの組み込みやトランスポソン機能の付与を図ることを目的とした。非天然化合物として有機塩素系除草剤ダラポン(2,2-ジクロロプロピオン酸)と、有機リン系殺虫剤ダイアジノンをターゲットとし、土壌より分離した各分解菌の分解能に関わるプラスミド、トランスポソンを検索・解析した。(1)ダラポン分解土壌より分離した分解菌はPseudomonas sp.(16S rDNA解析ではBurkholderia sp.)と同定された。本菌にはダラポンを脱塩素化し、ピルビン酸に変換するデハロゲナーゼが存在した。この酵素は本菌の有する約50kbのプラスミドに支配されていることを確認した。デハロゲナーゼ遺伝子をクローニングし、その塩基配列を解析した。(2)ダイアジノン分解分離した分解菌はFlavobacterium sp.(16S rDNA解析ではSphingomonas sp.)と同定された。本菌にはダイアジノンを分解して2-isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinolに変換するチオリン酸エステラーゼが存在した。本菌には約50kbのプラスミドが存在したが、ダイアジノン分解には関与していないことが分かった。ゲノムDNAより酵素遺伝子をクローニングし、塩基配列を解析した。遺伝子の下流に挿入配列IS6100の存在を確認した。

(2)ダラポン分解に係わるデハロゲナーゼ遺伝子ダラポン分解菌Burkholderia sp.の有する約70kbのプラスミドには、ダラポンを脱塩素化するデハロゲナーゼの遺伝子がコードされている。遺伝子周辺領域35kbの塩基配列を解析した結果、約3kb下流域に挿入配列IS1071が存在し、約16kb上流域にもIS1071の部分配列が存在していた。従ってデハロゲナーゼ遺伝子は2つのIS1071に挟まれた複合型トランスポソンであった可能性が示唆された。この大きなトランスポソン様構造の中には別の2つのIS(1.2kb)に挟まれたシグマ54アクチベーター遺伝子が認められ、プラスミドの複雑な成り立ちが推察された。本デハロゲナーゼは2-クロロプロピオン酸のD,L両異性体に作用する。部位特異的変位導入により基質特異性の変化した酵素を創製した。(3)ダイアジノン分解に係わるチオリン酸エステラーゼ遺伝子ダイアジノン分解菌Sphingomonas sp.が有する約50kbのプラスミドはダイアジノン分解に関与していなかった。ダイアジノン分解酵素チオリン酸エステラーゼの遺伝子はゲノムDNAに存在し、本遺伝子の上流および下流に挿入配列IS6100が認められたので、クラスI型複合トランスポソンである可能性が示唆された。しかし、その転移能は確認できていない。本菌はスミチオン、パラチオンなど他のリン系農薬もよく分解するので、これら農薬で汚染された土壌や排水の浄化のための実証試験を行った。50ppmの農薬で汚染された土壌、排水は、分解菌の散布により2日間で完全に浄化された。前年度に引き続き、有機塩素系除草剤ダラポン(2,2-ジクロロプロピオン酸)および有機リン系殺虫剤ダイアジノンを分解する士壌細菌の、分解に関わる酵素遺伝子およびプラスミド、トランスポソンを解析した。(1)ダラポン分解遺伝子ダラポン分解菌Pseudomonassp, (16SrDNA解析ではBurkholderia sp. )有する約70kbのプラスミドについてその構造を解析した。ダラポンを脱塩素化するデハロゲナーゼの遺伝子はこのプラスミド上にコードされており、その遺伝子は既にクローン化し塩基配列を解析した。その周辺領域の塩基配列を解析した結果、下流域に挿入配列IS1071が存在し、上流域には別のISに挟まれたシグマ54アクチベーター遺伝子が認められた。サザン解析の結果、IS1071はこのプラスミド上に2つ在ることが判明レたので、デハロゲナーゼ遺伝子は2つのIS1071に挟まれた複合型トランスポソンである可能性が示唆された。(2)ダイアジノン分解遺伝子ダイアジノン分解菌Sphingomonas sp.にはダイアジノンを分解して2-isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinolに変換するチオリン酸エステラーゼが存在した。本菌の有する約50kbのプラスミドはダイアジノン分解に関与していないことが分かったので、ゲノムDNAより酵素遺伝子をクローニングし、その周辺域の塩基配列を解析した。その結果、遺伝子の上流および下流に挿入配列IS6100の存在を確認し、このエステラーゼ遺伝子は複合型トランスポソンである可能性が示唆された。
ミニマックス型非線形計画法に基づくリンク機構の力学解析と最適形状設計

あるリンク機構を原動節、媒介節、および従動節に分割した時、形状設計問題は要求された従動節の運動に必要な原動節の能力を最小にする媒介節の機構形状を最適に決定する問題として把握できる。上記原動節の必要能力は一般に作用する力または動力の最大値に基づいて決定されるから、結局設計問題は上記最大値を最小化するミニマックス型最適化問題に帰着される。本研究の主目的は、上記の考え方に基づき、原動節機素数が複数の機構に対する最適形状設計法の確立と、実験的確認を行うことである。考察の対象とした機構は、土木工事用大型パワー・ショベル部リンク機構で、三つの原動節である油圧シリンダにより、バケットの平面運動を定める三自由度機構である。上記機構の動力学的解析を行うにあたって各要素の運動方程式を導く必要があるが、対象とした機構の各要素はお互いに複雑に拘束し合っており、また複雑な微分を行う必要が生じる。本研究では、数式処理プログラムであるREDUCEを活用することにより、ラグランジェの運動方程式を導出しこれらを最適化問題における制約条件式として考慮した。また、三つの油圧装置の各シリンダ力の最大値の総和を最小化すべき目的関数として採用し、リンク機構の形状に関する設計変数を決定する問題を一つのミニマックス型非線形最適化問題として定式化した。上記問題に対して、一般縮小勾配法と機構の動特性シミュレーション・モデルを有機的に結合した解法アルゴリズムを開発した。また、本解法のアルゴリズムの有効性を検証するために、実在機器のデータに基づく数値計算を行い、最適化により合理性に富む形状設計が実行できることを確認した。また、上記設計手法の有効性を実験的に検証するために、実験装置を作成した。しかしながら、予算の関係上、機構各部に作用する力の測定を行うには至らず、今後の研究課題とせざるを得なかった。
ヒーリング・オリゴールの視聴覚情報が人間におよぼす感性効果の基礎研究

・平成12年度の研究により得たヒーリング・オルゴール試作機の超広帯域録音物を呈示試料として、非定常なゆらぎを伴う高周波成分を豊富に含む音(FRS)と、そこから22kHz以上の高周波を除いた音(HCS)とを被験者に呈示し、それぞれの音について最適聴取音量を求める行動学的評価実験および、脳波を指標とした生理実験、質問紙調査による心理実験の平行実験を行った。その結果、FRSはHCSよりも大きな音量で聴取されるという行動反応にあわせて、FRS呈示下では、HCS呈示下よりも脳波α波が統計的有意に増強すること、多くの被験者が音の快適性を求めて音量を調整していたことが示された。以上の結果は、可聴域をこえる高周波成分を豊富に含む音が人間の脳深部の活性にプラスの影響を与え、音を快適に感じさせるという先行研究の知見(hypersonic effect)に一致する。・また、オルゴール以外の金属製楽器(ガムラン)の演奏音を呈示刺激として上記と同様の比較評価実験を行った結果、FRSをHCSよりも大きな音量で聴くという行動反応が認められたものの、その差は、ヒーリング・オルゴールの演奏音の時ほど顕著でなかった。予備的な検討により、この原因に、可聴域に属する音響成分と可聴域上限をこえる超高周波成分とのバランスの違いが関与している可能性が示唆されている。・以上の研究成果について、関連学会での報告を行った。・微細なフラクタル構造をもつ天然素材から成る美学的に高度な造形を具えた複数のアンティーク楽器や調度品の調査を行い、ヒーリング・オルゴールの筐体の造形について、その基本設計を行った。ヒーリング・オルゴール試作機の演奏音について、高速標本化1ビット方式による超広帯域ディジタル録音を行い、高速フーリエ解析による周波数パワースペクトルの分析を行った。また、最大エントロピー法を応用した解析手法によって、広帯域における時間的な変化を調べた。その結果、ヒーリング・オルゴール試作機の演奏音には、時間的にミクロなゆらぎ構造を伴う50kHz以上に及ぶ可聴域上限をこえる高周波成分が豊富に含まれることを見いだした。次に、ヒーリング・オルゴール演奏音の超広帯域録音物を呈示試料として、非定常なゆらぎをともなう高周波成分を豊富に含む音(FRS)と、そこから22kHz以上の高周波を除いた音(HCS)とを被験者に呈示し、それぞれの音について、最適聴取音量を調整する行動学的評価実験を行った。その結果、高周波成分を豊富に含むFRSは、その高周波成分を除いたHCSよりも大きな音量で聴取されるという行動的反応が、統計的有意に導かれた。あわせて行った質問紙調査による心理的評価では、被験者は音が快適であり、耳障りでない音量に調整していたことが示された。さらに、FRSをHCSよりも大きな音量で聴取するという行動的反応が、何らかの原因でFRSがHCSよりも小さな音として知覚されているのではないかという作業仮説の成立可能性を検証するため、FRSとHCSとについて、主観的に同じと聴こえる音量(主観的等価値)を求める知覚実験を行った。その結果、FRSとHCSとの主観的等価値の間に明瞭な差はみられなかった。以上の検討から、FRSをHCSよりも大きな音量で聴くという行動的反応には、FRSはHCSよりも人間の心身にとって適合性・親和性が高いという先行研究による知見(ハイパーソニック・エフェクト;大橋ら)が関与している可能性が高いと考えられる。
細胞間結合チャネルの高分解能単粒子解析

クライオ電子顕微鏡単粒子解析で既に解かれた線虫innexin-6(INX-6)の原子構造はギャップ結合を形成した状態で、かつ可溶化状態のチャネルであった(Oshima et al. (2016))。本来膜タンパク質が機能する脂質二重膜中に再構成された状態で構造解析できれば、より天然に近い状態での機能の解明につながる。また、ギャップ結合形成メカニズムを理解するためには、ギャップ結合が外れたヘミチャネルの状態で構造解析を行う必要がある。これらの目的を達成するため、INX-6ヘミチャネルを脂質二重膜に再構成した状態でクライオ電子顕微鏡構造解析に取り組んだ。ナノディスク再構成した野生型INX-6ヘミチャネルの構造はチャネルの通路の中に二重層の密度が現れ、細胞外領域の第2ループが不安定化していた。可溶化状態の野生型INX-6チャネルとナノディスクに再構成したN末端欠失変異体の構造と比較すると、脂質二重膜が存在するか否かでN末端の配置が異なっており、ナノディスク再構成によってチャネルの通路が妨げられていると解釈されるものであった。共同研究に基づく分子動力学シミュレーションでは脂質分子が隣接するサブユニットの膜貫通領域の間に入り込む様子が確認され、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的機能解析の結果はintactなN末端が正常にチャネルを開くのに不可欠であることを示すものであった。これらを総合して、INX-6ギャップ結合チャネルが持つ大きな通路が脂質二重膜中でどのように閉じるのかという問題について、脂質分子がチャネルの通路に入り込むと同時にINX-6のN末端が構造変化を起こし、通路を塞ぐというメカニズムが示唆された。線虫が持つギャップ結合チャネルタンパク質innexin-6(INX-6)の高分解能構造解析を目的として、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行った。試料調製において、フリーの界面活性剤ミセルを除く目的でGraDeR(Hauer et al. (2015) Structure)を適用したのち、精製INX-6チャネルを凍結してクライオ電子顕微鏡観察を行った。K2 summitdirect detection cameraによって約1000枚の電子顕微鏡像を撮影したのち、INX-6のヘミチャネル部分を約34万粒子、ギャップ結合チャネル部分を約3万5千粒子集め、画像解析の結果、それぞれ3.3Å分解能、3.6Å分解能で三次元再構成し、原子モデルの構築に成功した。INX-6は16量体構造および単量体構造ともにCx26と類似しており、N末端ファネル、膜貫通へリックスの並び位置、細胞外ループに存在するβヘアピンとS-S結合の位置が共通していた。また細胞質ドメインがギャップ結合チャネルとして初めて明らかになり、細胞内ループとC末端が共にヘリックス-ターン-へリックスを作りながら相互作用してコアを形成していた。これが隣接サブユニット間で接触して屋根型ドームを形成し、N末端ファネルから伸びるループを細胞質側から押さえ込む配置にあった。本構造から明らかになったINX-6とCx26の構造の類似性は、2つのファミリーは遺伝的に相関があり、早期の分岐から非常に長い時間を経て相同性が見られないほどにアミノ酸配列が変化した可能性を示唆する。そしてN末端ファネルがギャップ結合チャネルの機能に重要であると考えられ、これはイネキシン、コネキシンの両ファミリーでおそらく保存されていると推測される。この結果はNature communications誌に発表した。1年目にして可溶化状態のINX-6チャネルの原子モデルの構築に成功し、単粒子解析の高分解能化には試料調製の最適化が最も重要であることが分かった。これにより、今後も膜タンパク質の高分解能単粒子解析を推進することができるようになった。クライオ電子顕微鏡単粒子解析で既に解かれた線虫innexin-6(INX-6)の原子構造はギャップ結合を形成した状態のチャネル、かつ可溶化状態であった。GraDeRを用いてフリーの界面活性剤ミセルを除去したが、膜貫通領域は界面活性剤ミセルに覆われている。これらの目的を達成するため、INX-6ヘミチャネルを脂質二重膜に再構成した状態での構造解析に取り組んだ。脂質二重膜への再構成法にはナノディスクを用いた。INX-6チャネルを大量に発現、精製したのち、脂質、MSP、INX-6精製タンパク質の混合量比を検討してバイオビーズで界面活性剤を除去した結果、INX-6のヘミチャネルがナノディスクに再構成されたと思われる試料を得ることができた。このことは界面活性剤フリーで行うゲル濾過クロマトグラフィーと負染色電子顕微鏡像で確認した。この試料を用いてクライオ電子顕微鏡用の凍結試料を作製し、クライオ電子顕微鏡像から二次元クラスアベレージを計算した結果、二次構造が確認できるINX-6のヘミチャネルの平均像が得られた。クライオ電子顕微鏡像の中にはINX-6のギャップ結合状態のものが混じってはいるが、二次元クラスアベレージの中には典型的なギャップ結合チャネルの平均像がなく、ギャップ結合状態のチャネルの割合は低いものと考えられた。現在は三次元再構成に向けたクライオ電子顕微鏡像の収集を行っている。INX-6のギャップ結合状態のチャネルは既にクライオ電子顕微鏡で原子構造が解析された。

脂質二重膜に再構成した状態のINX-6チャネルも、ナノディスクを利用することによってクライオ電子顕微鏡単粒子解析に適した試料が作製でき、残りの期間で高分解能解析が期待できると思われるため。クライオ電子顕微鏡単粒子解析で既に解かれた線虫innexin-6(INX-6)の原子構造はギャップ結合を形成した状態で、かつ可溶化状態のチャネルであった(Oshima et al. (2016))。本来膜タンパク質が機能する脂質二重膜中に再構成された状態で構造解析できれば、より天然に近い状態での機能の解明につながる。また、ギャップ結合形成メカニズムを理解するためには、ギャップ結合が外れたヘミチャネルの状態で構造解析を行う必要がある。これらの目的を達成するため、INX-6ヘミチャネルを脂質二重膜に再構成した状態でクライオ電子顕微鏡構造解析に取り組んだ。ナノディスク再構成した野生型INX-6ヘミチャネルの構造はチャネルの通路の中に二重層の密度が現れ、細胞外領域の第2ループが不安定化していた。可溶化状態の野生型INX-6チャネルとナノディスクに再構成したN末端欠失変異体の構造と比較すると、脂質二重膜が存在するか否かでN末端の配置が異なっており、ナノディスク再構成によってチャネルの通路が妨げられていると解釈されるものであった。共同研究に基づく分子動力学シミュレーションでは脂質分子が隣接するサブユニットの膜貫通領域の間に入り込む様子が確認され、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的機能解析の結果はintactなN末端が正常にチャネルを開くのに不可欠であることを示すものであった。これらを総合して、INX-6ギャップ結合チャネルが持つ大きな通路が脂質二重膜中でどのように閉じるのかという問題について、脂質分子がチャネルの通路に入り込むと同時にINX-6のN末端が構造変化を起こし、通路を塞ぐというメカニズムが示唆された。今回得られたINX-6の構造は可溶化状態で、膜貫通領域を界面活性剤ミセルが囲んでいる。本来膜タンパク質が機能する脂質二重膜中における構造を解明するため、INX-6を脂質二重膜に再構成した状態での構造解析に取り組む。この時、再構成法としてナノディスクを用いて単粒子解析に利用する。当初計画に入れていたヘリウム温度での単粒子解析は、本計画中に液体窒素温度での撮影の方が良質な画像を得られることが判明したため、当面窒素温度でデータ収集を行うものとする。当初の研究計画では脂質二重膜のシートにINX-6を再構成させる予定であったが、単粒子解析に適した試料ができなかったため、ナノディスクに変更した。その結果、INX-6のヘミチャネルが再構成されたナノディスクの試料が精製できているので、本年度でクライオ電子顕微鏡のデータ収集を行って、高分解能を目指した三次元再構成を行う。