hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成人集団における歯科疾患管理の組織化に関する研究-特に歯周疾患を中心として-

研究の進展につれて派生した小課題に関する知見をも含めると、研究成果としてはかなり多岐にわたる結果が得られているが、要約すると以下の4点に絞ることができる。1.CPITN法を適用して各処置内容ごとの必要仕事量を時間に換算し、それを基に歯科保健チームの人的構成を立案することが可能となり、管理プログラム立案におけるCPITN法の有用性が確認された。2.Code2と評価されたsextantsのうち出血を伴わない単なる歯石付着のみの部位を処置対象から除外すると、必要処置時間つまり仕事量をかなり節減することができる。すなわちCode2の内容分析は、資源に制約のある状況下において効率的な管理プログラムを設計する際の有効な手段となり得ることが指摘された。3.唾液潜血試験紙法による唾液潜血量とCPITN値間に有意の相関があり、特に本法はポケット形成に対する簡便なスクリーニングテストとして有用であることが認められた。但しスクリーニング水準の設定あるいは特異度・敏感度において検討すべき点であることも示唆されている。4.歯科保健管理システムの構築にとっては、適切な予防プログラムの設計が必須の構成要素であるため、数集団を対象として、それぞれに適応した予防プログラムのモデルを立案実施し、その効果を検討した。その結果いずれのモデルにおいても、口腔衛生指導並びに歯石除去によって、歯周疾患及び口腔衛生状態をかなり改善し得ることが明らかとなった。かかるプログラムの実施には一定の期間が必要であるため、現在継続中のモデルもあり、これらの結果から得られる知見を統括して、口腔保健管理システムを体系化していくことが今後の課題である。またプログラムの効率性・受容性を高めるため、質問紙法及び費用・効果分析の手法を現在導入しつつある。成人歯科保健管理システムの開発に関する基礎情報を得るため、先ず歯周疾患に焦点を当て、CPITN法及び唾液潜血試験法(サリバスター)の有用性に関する検討に着手している。本年度は前年度に続き海上自衛隊第四航空軍隊員808名の調査を実施したので、得られた知見と問題点を前年度までの結果との比較において要約する。1.本群における歯周疾患の処置ニーズの状況をみると、処置を必要としない者は僅かに3.2%で、口腔衛生の改善・指導を要する者97%,歯石除去を要する者81.4%,複雑処置を要する者7.3%であり、また罹患内容の分析結果からしても、本群は前年度の離島分遺隊群に比べて、中程度の罹患状態を有する者が高率を占める集団であった。そこでこれらの処置に要する作業量を時間として試算したところ、1人平均口腔衛生の改善・指導に約40分,歯石除去に約53分,複雑処置に約4.7分が必要であり、歯科衛生士によっても行ないうる作業量の比重が高いことが示めされた。これらの知見からも集団管理におけるCPITNの有用性が再確認できたといえよう。2.サリバスターに関するスクリーニングテストとしての特異度・敏感度は、複雑処置を要する者について十十以上を陽性とすると、本群ではそれぞれ59.8%,59.3%で、離島分遺隊群はそれぞれ86.8%,40.5%であった。すなわち、対象集団の罹患状態またはスクリーニング設定水準の差によってかなり変動がみられるため、本法の有用性については、現在基礎的問題を検討している。3.CPITNについては、今後の適用範囲の拡大化を考えると、基準内容を更に詳しく設定する必要があるため、改良点を加味した基準をもとに、新たに約400名の集団についての調査を実施し、現在その分析・検討をおこなっている。

本研耕は歯周疾患を中心とした成人歯科保健管理システムの確立を最終目標としており,前年度までに,唾液潜血測定法及びCPITN法の有用性について検討し,さらに歯周疾患管理のためのman-powerの試算をおこなってきた.これらの結果は逐次関連学会で報告,発表を続けている.本年度は,前年度に引続いて,歯周疾患管理プログラムの立案基礎となる介入処置の選択,その効果,及び必要処置時間を検討したので,その結果を要約する.(1)先ず海上自衛隊海洋観測鑑乗員52名を対象として実施した厳密な処置プログラムの結果について述べる.本プログラムの概要は次の通りである.〈1〉口腔診査→〈2〉口腔衛生指導(OHE):ブラッシング指導,教育用VTRの放映,症状説明パンフレット及び教育用小冊子の配布,ブラッシングタイムの設定など→〈3〉再診査→〈4〉歯石除去(SC)→〈5〉再々診査.この結果ポケット歯数は有意に減少し,改善率はOHE後39.6%, SC後64.0%,またOHE後からSC後では40.4%であった.同時に出血歯数においても有意な改善がみられ,改善率はOHE後62.5%, SC後82.4%, OHE後からSC後では52.9%であった.すなわち口腔衛生指導のみによってもかなり歯周疾患を改善しうることが明らかとなり,管理プログラムの設定に有意義な根拠を得ることができた.なお1人平均必要時間はOHE約60分, SC約30分であった.(2)上記の集団はいわば特殊集団でもあるので,一方では,一般事業所従業員を対象とした処置効果の評価研究を実施した.本研究の概要は,〈1〉約700名に対するスクリーニング診査→〈2〉約230名を選定し対象とした処置プログラム(口腔衛生指導,歯石除去を含む)の実施→〈3〉再診査である.本研究は,本年1月に1年間コースを終え,現在集計分析中である.
試験管内ES細胞分化システムを用いたABL関連ガン遺伝子の生物学的機能の解析

ABL関連白血病遺伝子であるTEL-ABLならびにp185BCR-ABL遺伝子をテトラサイクリン反応性プロモーターの下流につないだコンストラクトを作成した。このコンストラクトでは、遺伝子の下流に、internal ribosomal entrysite (IRES)でつないだEnhanced GFPの遺伝子が挿入済みなので、GFP遺伝子の発現を調べることで、容易に導入細胞を識別できる。そこでこれらの遺伝子のコンストラクトを、申請者がすでに樹立した親株ES細胞に導入し、G418で選別し、TEL-ABL, p185BCR-ABLの発現が厳格にコントロールされるES細胞を樹立した。次に、2つ遺伝子の発現による影響がES細胞に与える影響をテトラサイクリンの存在下、非存在下で検討した。その結果、p185BCR-ABLではES細胞のコロニー形態がroundingし、著しい変化を示すのに対して、TEL-ABLを発現させた細胞では、ほとんど変化が見られなかった。次に、血液細胞に対する効果を解析するために、ES細胞をin vitroでOP9ストロマ細胞と共培養することで、強制的に血液細胞へと分化させた後、これらの遺伝子の発現を誘導した。p185BCR-ABLを発現させるとp210BCR-ABLと同様に未熟血液細胞の増加が見られたが、TEL-ABLではその効果は非常に弱いものであった。細胞表面マーカーの解析では未熟血液細胞のマーカーであるc-kit陽性、細胞系列マーカー(TER119, CD11b, B220)陰性細胞の割合の増加が、ともに遺伝子を発現した血液細胞で観察された。以上の結果はTEL-ABL, p185BCR-ABLが同一細胞に与える効果が、異なることを示唆している。今後は、細胞分化に与える影響を血液コロニー法を用いて解析する予定である。また、免疫不全マウスへの移植についてもシステム確立のための基礎実験を開始している。
災害碑アーカイブ構築を目的とした市民参加型調査の実践

本研究は、津波の到達点を示す津波碑、水害発生地点を示す水害碑等、災害の記憶を継承警告する自然災害伝承碑を市民協同で調査する仕組みを構築することを目的とする。手法としては、安価でありふれた機材(懐中電灯・スマートフォン・三脚)で誰でも簡単に素早く金石文の拓本画像が撮れる光拓本の技術を一般向けにソフトウェアとして公開する。さらに自然災害伝承碑の拓本調査を教育委員会や高校教諭と共に企画し、広く市民の参加を募り、手法の普及を図る。最終的には市民の自主調査が集約されるシステムの公開を目指す。
GWASを出発点とする関節リウマチ患者における非椎体骨折リスク診断モデルの構築

骨折を生じると労働生産性が長期にわたり低下し、時に高額な医療費も必要となるため社会的逸失利益が大きいが、関節リウマチ(RA)患者は一般よりもそのリスクがさらに高いとされている。研究期間にわたり、骨折調査を含むRAコホート研究を継続し、骨折データを収集するとともに、遺伝子関連解析だけでなく、転倒に寄与する因子を解析するために筋力や運動機能の解析や骨折に寄与する身体機能評価の解析や骨折治療に対する臨床研究も推進し、一定の成果を得た。今後RA患者における骨折に関して、遺伝子解析、運動機能解析、関節破壊との関連などさらなる研究を推進していきたいと考えている。当施設で実施中のIORRAコホートに登録されているRA患者でDNAの提供に関して書面で同意を得た患者のうち、すでにGWASデータを得られている2,423名が対象としディスカバリーフェーズをおこなった。骨折の情報はIORRAコホート開始当初から収集されており、これまで15年にわたる骨折の情報がその部位や時期だけでなく疾患活動性、投薬状況、機能障害指数などの周辺状況の情報とともに蓄積されている。骨折の情報の収集は患者のセルフリポートで行われているが、2012年までに関しては大腿骨、橈尺骨、上腕骨の骨折に関してイベントありとした全ての患者についてカルテ記載およびレントゲン写真での確認を行っている。さらに2010年までの情報に関しては電子データ化を終えているため、ディスカバリーフェーズでは2000年から2010年までの10年間での非椎体骨折(大腿骨、橈尺骨、上腕骨)をエンドポイントとして解析を行った。バリデーションフェーズにおいては現時点でDNAを採取済みの患者のうちGWASのための遺伝子多型同定を行っていない患者、ならびに新規にDNAの提供に書面で同意を得た患者となるため、新たなDNAサンプルの収集を開始する。バリデーションフェーズ開始までに800名の確保を目標としていたが、平成27年度中に600例を超えるサンプル収集に成功した。ディスカバリーフェーズは順調に進捗している。バリデーションフェーズに関しては当初800例のサンプル収集を予定していたが、600例にとどまった。検定力が十分とはいえないため、来年度以降もサンプル収集を継続して実施する。当施設で実施中のIORRAコホートに登録されている関節リウマチ(RA)患者のうち、すでにGWASデータを得られている2,423名を対象にディスカバリーフェーズをおこなった。骨折の情報はIORRAコホート開始当初から収集されており、16年にわたる骨折の情報がその部位や時期だけでなく疾患活動性、投薬状況、機能障害指数などの周辺状況の情報とともに蓄積されている。ディスカバリーフェーズにおいては2000年から2010年までの10年間での非椎体骨折(大腿骨、橈尺骨、上腕骨)をエンドポイントとして解析を行った。さらに平成27年度に収集した患者サンプルのうち564名を対象にバリデーションフェーズをおこなった。ディスカバリーフェーズではGWASのプラットフォームに約260万多型を収載したHumanOmni 2.5 Exome-8 (イルミナ社)を使用したが、バリデーションフェーズでは予算的な観点およびインピュテーションの精度向上がはかられたことから、より安価なInfinium CoreExome-24 (イルミナ社)を使用した。インピュテーションにはIMPUTEソフトウェアを用いた。QCはディスカバリーフェーズと同様に以下の手順で行った。1.Call rate < 95%のサンプルを除去、2.Call rate < 98%、non-autosomal、monomorphic, rsID以外のSNPを除去、3.MAF < 0.05のSNPを除去。QCにはGWAS解析ソフトウェアであるPLINK2を使用した。バリデーションフェーズでは2013年までの骨折調査の情報を加え、最大13年間のフォローアップ期間とした。ディスカバリーフェーズは順調に進捗したが、バリデーションフェーズは十分なサンプル収集が行えず、当初懸念されたように検定力の不足がみられ、いわゆるゲノムワイド水準に到達したSNPが確認できなかった。そのためサンプル収集を継続実施するとともに、今後は統計解析においてFDRを活用するなどしてゲノムワイド水準には到達しなかったものの実際には関連のある遺伝子多型の検出に努めるものとする。また上述の理由からトランスクリプトーム解析、エピゲノム解析の実施には至っていない。本研究の目的はゲノムワイド関連解析(genome-wide association study: GWAS)による非椎体骨折発症関連遺伝子同定を出発点として、オーム解析、公共ビッグデータ解析などにより、最適なバイオマーカーを探索して非椎体骨折リスク診断モデルを構築することであり、オーダーメイド医療に向けた基盤情報の構築を目指した。今年度は2000年以来18年におよぶ骨折調査を続けているRAコホート研究を継続し、骨折データを収集するとともに、遺伝子関連解析だけでなく、転倒に寄与する因子を解析するために筋力や運動機能の解析も行った。imputation法を利用したHLA解析によりRAのサブクラスの同定を目指した解析、抗CCP抗体陽性RAにおけるHLAとリウマトイド因子の相乗効果の解析、抗核抗体を用いてRAのサブクラスの同定を目指した解析、大腿骨頭壊死症のGWAS、疾患活動性と関節破壊の関連解析、骨折に寄与する身体機能評価の解析や骨折治療に対する臨床研究も推進し、一定の成果を得た。特にimputation法を利用したHLA解析を基盤とした解析はこれまでに困難だった非古典的HLA遺伝子の解析も可能になり興味深い知見が得られている。

今後RA患者における骨折に関して、遺伝子解析、運動機能解析、関節破壊との関連などさらなる研究を推進していきたいと考えている。骨折を生じると労働生産性が長期にわたり低下し、時に高額な医療費も必要となるため社会的逸失利益が大きいが、関節リウマチ(RA)患者は一般よりもそのリスクがさらに高いとされている。研究期間にわたり、骨折調査を含むRAコホート研究を継続し、骨折データを収集するとともに、遺伝子関連解析だけでなく、転倒に寄与する因子を解析するために筋力や運動機能の解析や骨折に寄与する身体機能評価の解析や骨折治療に対する臨床研究も推進し、一定の成果を得た。研究計画に大きな変更はない。バリデーションフェーズに必要なサンプルの収集を継続実施し、2013年までの骨折調査の情報を加え、最大13年間のフォローアップ期間とした解析を行う。Cox回帰分析をRを用いて行い、さらにハザード比を用いてディスカバリーフェーズの結果とあわせたメタ解析を行い、ゲノムワイド有意水準をクリアした遺伝子多型を非椎体骨折発症と有意な関連ありと判定する。引き続き、トランスクリプトーム解析、エピゲノム解析を実施する予定である。サンプル収集を継続実施し、バリデーションフェーズでの解析対象を拡張する。ディスカバリーフェーズで検出された遺伝子多型について、バリデーションフェーズで解析するにあたり、いわゆるゲノムワイド水準ではなくFDRの活用し、関連のある遺伝子多型の検出に努める。トランスクリプトーム解析、エピゲノム解析を実施し、公共ビッグデータを用いたIn silicoネットワーク解析により、本研究計画でGWASと網羅的オーム解析によって同定された非椎体骨折発症関連遺伝子領域のバイオマーカーを評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。整形外科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒドロシリル化触媒反応の高次制御に関する研究

(1)ルテニウム錯体触媒による末端アルキンのヒドロシリル化反応について,触媒反応に関わるすべての素反応を特定した.また,アルケニルルテニウム中間体とヒドロシランとの反応には,炭素-ケイ素結合の形成を伴いヒドリドルテニウム錯体の発生する経路と,炭素-水素結合の形成を伴いシリルルテニウム錯体を発生する経路があり,前者はσ結合メタセシス機構によって,一方後者は,酸化的付加/還元的脱離機構によってそれぞれ進行することを,反応中間体を用いた詳細な速度論的検討によって明らかにした.さらに,これらの素反応のいずれかを選択することにより,末端アルキンから(E)-および(Z)-アルケニルシランを91-99%の選択性で作り分けることができることを見いだした.以上の知見を利用して,発光性高分子であるポリ(p-フェニレンビニレン)(PPV)を,主鎖のビニレン部位の幾何構造を高次に規制して合成できることを示した.(2)1,2-ジアリール-3,4-ビス(2,4,6-トリ-t-ブチルフェニルホスフイニデン)シクロブテン配位子(DPCB)をもつメチルパラジウムおよび白金トリフラート錯体とヒドロシランとの反応により[MH (OTf)(DPCB)]型錯体を定量的に発生できることを見いだした。また、この錯体が高い酸性度を示し,ジエンのヒドロアミノ化反応,ケトンの脱水素シリル化反応,ならびにアリルアルコールの直接変換反応に対して高い触媒活性を示すことを明らかにした.(3)種々のシリル白金錯体を用いて炭素-ケイ素還元的脱離反応およびアルキン挿入反応について系統的な検討を行い,シリル錯体が有機白金錯体と比べてはるかに高い反応性を示すことを明らかにした.(1)ルテニウム錯体触媒による末端アルキンのヒドロシリル化反応について,触媒反応に関わるすべての素反応を特定した.また,アルケニルルテニウム中間体とヒドロシランとの反応には,炭素-ケイ素結合の形成を伴いヒドリドルテニウム錯体の発生する経路と,炭素-水素結合の形成を伴いシリルルテニウム錯体を発生する経路があり,前者はσ結合メタセシス機構によって,一方後者は,酸化的付加/還元的脱離機構によってそれぞれ進行することを,反応中間体を用いた詳細な速度論的検討によって明らかにした.さらに,これらの素反応のいずれかを選択することにより,末端アルキンから(E)-および(Z)-アルケニルシランを91-99%の選択性で作り分けることができることを見いだした.以上の知見を利用して,発光性高分子であるポリ(p-フェニレンビニレン)(PPV)を,主鎖のビニレン部位の幾何構造を高次に規制して合成できることを示した.(2)1,2-ジアリール-3,4-ビス(2,4,6-トリ-t-ブチルフェニルホスフイニデン)シクロブテン配位子(DPCB)をもつメチルパラジウムおよび白金トリフラート錯体とヒドロシランとの反応により[MH (OTf)(DPCB)]型錯体を定量的に発生できることを見いだした。また、この錯体が高い酸性度を示し,ジエンのヒドロアミノ化反応,ケトンの脱水素シリル化反応,ならびにアリルアルコールの直接変換反応に対して高い触媒活性を示すことを明らかにした.(3)種々のシリル白金錯体を用いて炭素-ケイ素還元的脱離反応およびアルキン挿入反応について系統的な検討を行い,シリル錯体が有機白金錯体と比べてはるかに高い反応性を示すことを明らかにした.(1)シスおよびトランス構造をもつ1,4-ビス(トリメチルシリル)-1-ブテン-3-イン(1)の触媒的ヒドロシリル化反応では1の幾何構造と触媒の選択によって反応の位置および立体選択性を高次に制御できることを見いだした。すなわち、4種類の構造異性体を93%以上の純度で作り分けることができた。(2)ルテニウム錯体触媒による末端アルキンのヒドロシリル化反応について、触媒反応に関与するすべての素反応を解明できた。すなわち反応は、ヒドリドルテニウム錯体へのアルキン挿入反応を経由するChalk-Harrod型触媒サイクルと、シリルルテニウム錯体へのアルキン挿入反応を経由するModified Chalk-Harrod型触媒サイクル、ならびに、これらのサイクルを橋渡しする2つの素反応過程から構成されている。前者のサイクルからは(E)-アルケニルシランが、一方後者からは(Z)-アルケニルシランがそれぞれ選択的に生成する。触媒反応の選択性は、それぞれのサイクル中に発生するアルケニルルテニウム錯体の反応選択性に明確に依存している。単離したアルケニル錯体を用いてそれらの機構を解析した結果、ホスフィン配位子の解離平衡を制御することによって、これらの鍵過程を精密に制御できることが分かった。反応機構に関する以上の知見を基に、(E)-および(Z)-アルケニルシランを91-99%の選択性で作り分けることができた。(1)Ru(akeneyl)Cl(CO)L_2錯体(L=ホスフィン配位子)とヒドロシランとの反応機構を基に末端アルキンの立体選択的ヒドロシリル化触媒反応を開発した。

すなわち、3分子のPPh_3配位子を持つヒドリド錯体RuHCl(CO)(PPh_3)_3を触媒として用いることにより種々の末端アルキン(RC≡CH ; R=Ph, p-tolyl, Cy, n-hexyl)とヒドロシラン(HSiMe_2Ar ; Ar=Ph,3,5-(CF_3)_2C_6H_3, 4-CF_3C_6H_4, 4-MeOC_6H_4)から(E)-RCH=CHSiMe_2Arが99%以上の選択性で、一方、嵩高いホスフィン配位子(L=PPr^i_3)を持つシリルルテニウム錯体Ru(SiMe_2Ph)Cl(CO)(PPr^i_3)_2を触媒として用いることにより(Z)-RCH=CHSiMe_2Arが91-99%の選択性でそれぞれ生成した。このようにして合成されたアルケニルシランのうちAr基として3,5-(CF_3)_2C_6H_3を持つものはパラジウム触媒によるヨウ化アリールとのクロスカップリング基質として高い反応性を示し、対応する生成物を高収率かつ立体選択的に与えた。(2)1,2-ジフェニル-3,4-ビス(2,4,6-トリ-t-ブチルフェニルホスフィニデン)シクロブテン配位子を持つ白金錯体を触媒とし、ピリジンを助触媒として用いることにより、種々のケトンの脱水素シリル化反応が起こり、シリルエノールエーテルを高収率で合成できることが分かった。この触媒系では、副反応として想定されるケトンのヒドロシリル化反応は認められなかった。すなわち、簡便かつ極めてクリーンな触媒反応が実現された。(1)ルテニウム触媒によるアルケンの立体選択的ヒドロシリル化反応を利用して、高分子発光材料として注目されているポリ(p-フェニレンビニレン)(PPV)を高い立体選択性で合成できることを見いだした。まず、HSiMe_2Ar (Ar=2-thienyl,3,5-(CF_3)_2C_3H_3)を用いるp-ジエチニルベンゼンのヒドロシリル化反応について検討し、RuHCl(CO)(PPh_3)_3およびRuCl_2(CO)(PPr^i_3)_2をそれぞれ触媒として用いることによって、(E, E)-および(Z, Z)-1,4-bis(2-silylethynyl)benzeneを99%以上および91-92%の立体選択性で合成できることを明らかにした。続いて、得られたヒドロシリル化生成物と1,4-dioctyloxy-2,5-diiodobenzeneとをBn_4NFおよびパラジウム触媒の存在下にTHF中で反応させ、主鎖のビニレンユニットが99%以上(E)配置のPPVと66%(Z)配置のPPVを、それぞれ高収率で合成した。(2)1,2-diaryl-3,4-bis(2,4,6-tri-t-butylphenylphosphinidene)cyclobutene配位子(DPCB)をもつメチルパラジウム錯体とヒドロシランとの反応によってPdH(OTf)(DPCB)錯体を定量的に発生できることを見いだした。また、この錯体が極めて酸性度の高いヒドリド錯体として働き、アリルアルコールのC-O結合を穏和な条件下に切断することを明らかにした。さらに、この知見を基に、アリルアルコールをアリル化剤とするN-およびC-アリル化触媒反応を開発した。いずれの反応も、室温から50°C程度の穏和な条件下、90%以上の収率で進行した。(3)cis-シリル(ボリル)白金錯体を合成単離した。また、この錯体を用いて、パラジウムおよび白金触媒を用いるアルキンのヒドロホウ素化触媒反応に対して従来提案されてきたすべての素反応過程を、逐次的に検証できることを示した。
Na^+輸送性液胞型ATPアーゼの構造と機能

当初の研究目的・実施計画を概ね遂行することが出来た。1.腸内連鎖球菌クロモゾーム上の本酵素遺伝子の各サブユニット欠失異株の解析から、9つのサブユニット全てが必須であることが判明した。また、部位特異的変異導入を行い、Aサブユニットの活性部位付近に存在するCys残基の重要性とSH試薬感受性の相関関係を、Kサブユニットの保存性Glu残基近傍の一次構造がイオン輸送機能に厳密に必須であることを示すことが出来た。2.再構成能のある精製標品を得、その生化学的研究を行った。活性複合体中、AからGとKとIのサブユニット全てを同定した。そのうち、サブユニットIとKが膜結合性であること、残りのサブユニットが遊離してくる触媒頭部に属することが判った。また、厳密にNa^+濃度依存であることなど酵素学的性質を調べた。3.再構成系を用いて、本ATPアーゼが起電性の真にNa^+輸送性の活性を持つことを示すことが出来た。さらに、残りの膜結合(V_0)部分だけで膜電位依存の促進拡散的なNa^+透過活性を有することを示すことができた。4.本オペロン調節領域にレポーター遺伝子(CAT遺伝子)を融合させたプラスミドを使用し、各種生育条件下の発現レベルの変化を調べ、アルカリpH及び細胞内Na^+濃度に依存して発現が制御されていることを示した。5.精製標品を用い、Na^+やATP、ADPなど基質の結合活性を調べた。膜結合部分は、常にNa^+に対し高い親和性を持っていた。ATP添加により、その親和性が低下した。つまり、結合しているNa^+を膜の外側で遊離させる段階にATPのエネルギーを使用しているという反応機構を示すことができた。6.本ATPアーゼV_1部分の精製系を確立した。X線結晶構造解析のため、V_1部分の結晶化条件を検討した。その結果、F_1部分結晶化と類似の条件が適当であると判断した。現在、本V_1部分精製標品の結晶化に成功している当初の研究目的・実施計画を概ね遂行することが出来た。現在、本V_1部分精製標品の結晶化に成功している交付申請書記載の本年度研究目的・実施計画を概ね順調に遂行することが出来た。1.本ATPアーゼ遺伝子群の分子生物学的研究を行った。9個のサブユニットのうち、特に、触媒サブユニットであるAサブユニットとイオン輸送路であるプロテオリピドサブユニットの重要なアミノ酸の部位特異的変異導入を行った。その結果、Aサブユニット活性部位付近のCys残基の重要性とSH試薬感受性の相関関係を、また、プロテオリピドサブユニットの保存性Glu残基近傍の一次構造が、本酵素の場合、イオン輸送機能に厳密に必須であることを示すことが出来た。2.クローニングした遺伝子群を用い、腸内連鎖球菌において本酵素の大量発現に成功した。次に界面活性剤存在下、一般のカラムクロマトグラフィーにより再構成能のある精製標品を得ることができた。酵素学的性質を調べ、厳密にNa^+濃度依存であること、顕著なリン脂質要求性は示さないこと、一般のV型ATPアーゼ阻害剤に感受性であること、しかしバフィロマイシンには非感受性であることが判った。また、再構成系において、起電性のNa^+輸送活性を持つことを示すことが出来た。3.各サブユニット欠失株の本ATPアーゼ活性とアルカリ性pH及び高Na^+濃度存在下の生育を調べた。

その結果、遺伝子群の中からAからGおよびIとKの9つのサブユニット全てが、ATPアーゼ活性にも生育にも必須であった。このことは、本ATPアーゼが果たす細胞膜を介するイオン濃度恒常性維持が細胞生育に必須であることを示す。4.本ATPアーゼの触媒頭部(V_1)の精製系を確立した。X線結晶構造解析のため、V_1の結晶化条件を検討した。その結果、F_1結晶化と類似の条件が適当であると推定した。交付申請書記載の本年度研究目的・実施計画を概ね順調に遂行することが出来た。1.本酵素の精製標品を用い、Na^+やATP.ADPなど基質の結合活性を調べた。膜結合部分は、常にNa^+に対し高い親和性を持っていた。ATP添加により、その親和性が低下した。つまり、結合しているNa^+を膜の外側で遊離させる段階にATPのエネルギーを使用しているというエネルギー共役機構を示すことができた。2.再構成系からEDTA処理により遊離させた触媒頭部部分(V_1)と残った膜結合部分(V_0)のペプチドの同定を行い、サブユニットIとKが膜結合性であることが分かった。サブユニットGだけはどちらとも判定できなかった。また膜結合部分のイオン透過活性を調べた結果、膜部分だけで膜電位依存のNa^+透過活性を有していた。しかし、その活性はチャンネル活性とは考えられなかった。3.カラムクロマトグラフィーを用いて、本酵素(V_1V_0)の大量精製に成功した。そこで、その結晶化を試みている。4.本ATPアーゼ触媒頭部(V_1)精製標品の結晶化を行った。現在X線照射による構造解析を行っている。また、F_1との構造類似性を基に、分子モデリングによりV_1の三次元構造を推定した。5.各サブユニット欠失株の各種条件下における生育を調べた結果、すべてのサブユニットが高塩濃度、アルカリ条件下での細胞生育に必須であることが分かった。1.本酵素の精製標品を用い、Na^+やATP、ADPなど基質の結合活性を調べた。本酵素1分子あたり6個のNa^+の結合が観察され、膜結合部分に6個のプロテオリピッドがあるとするモデルに対応していた。そのNa^+のうち3分の2は溶液のNa^+と容易に交換可能であった。ATPに対する親和性はNa^+の濃度に依存せず、独立に結合すると考えられた。ところが、ATPアナログであるATP-γSにより、すべてのNa^+が溶液のNa^+と交換可能になり、V_1部分の造変化がV_0部分のNa^+結合に影響することが判った。またエネルギー共役機構として、結合しているNa^+を膜の外側で遊離させる段階にATPのエネルギーを使用していると考えられた。2.各サブユニット欠損変異株の性質を調べたところ、NtpHサブユニットは本酵素の必須成分ではないことが判明した。3.本ATPアーゼ触媒頭部(V_1)精製標品の結晶化を行い、X線結晶構造解析を行っている。4.F_1との構造類似性を基に、分子モデリングにより本酵素、V_1部分の三次元構造を推定した。ほとんど類似した構造をもっていることが判明した。
シイタケフレーバー前駆体による高嗜好性・高機能性食品の創製

シイタケのフレーバー成分は,フレーバー前駆体であるレンチニン酸(LA)に,酵素γ-グルタミルトランスフェラーゼとC-Sリアーゼが作用して,デスグルタミルレンチニン酸(DGLA)を経て生成するレンチオニン等の環状硫黄化合物である。含硫フレーバー成分としては,ニンニクのジアリルジスルフィドやジアリルトリスルフィド等が知られているが,これらのスルフィド類は,フレーバー前駆体であるS-allyl-L-cysteine sulfoxide (ACSO)に,酵素C-Sリアーゼが作用して生成する。当研究室では,経口摂取したACSOが,生体内で代謝活性化し,様々な生理作用を示すことを既に明らかにしている。シイタケのフレーバー前駆体であるLAおよびDGLAは,ACSOと構造が類似していることから,これらも,ACSOと同様の生理活性を有することが期待できる。平成28年度は,シイタケ抽出物中のアミノ基を有する化合物をFmoc誘導体化することにより,LAおよびDGLAの検出を行った。平成29年度は,シイタケ中からLAを単離して検量線を作成した後,シイタケの品種,栽培方法,加工方法の異なるシイタケ中のLA含量を測定した。平成30年度は,レンチニン酸を高含有するシイタケ抽出物(Shiitake-H)を調製し,Shiitake-Hの血中エタノール濃度上昇抑制作用を,レンチニン酸を含有しないシイタケ抽出物(Shiitake-N)との比較により検討した。その結果,Shiitake-Hの経口投与により,有意に血中エタノール濃度の上昇が抑制された。この作用メカニズムを検討したところ,Shiitake-Hは,胃および小腸からのエタノールの吸収を抑制すると共に,肝臓においてアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を亢進し,エタノール代謝を促進することにより,本作用を示すことが明らかとなった。シイタケは,他のキノコとは異なる独特のフレーバーを有するが,この特徴的なフレーバーは,レンチオニン等の環状硫黄化合物である。これらのフレーバー成分は,シイタケの組織を破壊した際に,フレーバー前駆体であるレンチニン酸(LA)に,酵素γ-グルタミルトランスフェラーゼとC-Sリアーゼが作用し,デスグルタミン酸(DGLA)を経て生成する。一方,ニンニクの特徴的なフレーバーは,フレーバー前駆体であるS-allyl-L-cysteine sulfoxide (ACSO)に,酵素C-Sリアーゼが作用して生成する。当研究室では,無味・無臭で呈味増強作用を有するACSOが,生体内で代謝活性化し,ACSOおよびACSOを高含有するニンニク抽出物が,肝障害抑制作用,第二相解毒酵素誘導作用等の様々な生理作用を発揮することを既に明らかにしている。シイタケのフレーバー前駆体であるLA,および,DGLAは,ACSOと構造が類似していることから,これらを高含有するシイタケ抽出物も,ACSOを高含有するニンニク抽出物と同様の生理作用を有すると考え,H28年度は,まず,シイタケ抽出物中のLA,および,γ-グルタミルトランスフェラーゼを作用させて生成したDGLAの検出を行った。加熱により酵素を失活させたシイタケから水抽出物を作製し,さらに,この抽出物にγ-グルタミルトランスフェラーゼを作用させた。各抽出物中のアミノ基を有する化合物を,Fmocにより誘導体化し,その蛍光強度をHPLCにより測定した。その結果,熱水抽出物中のメインピークが,γ-グルタミルトランスフェラーゼを作用させることにより消失し,新たなピークが出現した。このことから,消失したピークはLA,新たに出現したピークはDGLAと考えられ,LAおよびDGLAを高含有するシイタケ抽出物の作製が可能となった。レンチニン酸(LA)は,細胞を破壊することにより,容易にデスグルタミルレンチニン酸(DGLA)を経て,レンチオニン等の揮発性フレーバー成分になってしまうが,加熱処理で,LAを分解せずに抽出することが可能であった。さらに,γ-グルタミルトランスフェラーゼを作用させることにより,DGLAへの変換も行うことができた。LAもDGLAも,多くの硫黄を含む化合物であり,アミノ基の部分が反応しにくいと推測されたが,Fmocにより蛍光誘導体化ができ,HPLCでの分析が可能となった。現在,カラムによりLAの精製を行っており,単離の一歩手前まできている。シイタケ(Lentinula edodes)の特徴的なフレーバーは,フレーバー前駆体であるレンチニン酸(LA)に,酵素γ-グルタミルトランスフェラーゼとC-Sリアーゼが作用して,デスグルタミルレンチニン酸(DGLA)を経て生成するレンチオニン等の環状硫黄化合物である。一方,ニンニクの特徴的なフレーバーは,フレーバー前駆体であるS-allyl-L-cysteine sulfoxide (ACSO)に,酵素C-Sリアーゼが作用して生成するスルフィド類である。平成28年度は,シイタケ抽出物中のアミノ基を有する化合物をFmoc誘導体化し,その蛍光強度をHPLCにより測定することにより,LAおよびDGLAの検出を行った。平成29年度は,シイタケ中のLA含量を定量するため,クロマトグラフィーにより精製を行い,単離したLAを用いて検量線を作成した。そして,シイタケの品種,栽培方法,加工方法の違いにより,LA含量がどの程度異なるか検討した。

その結果,菌床栽培のシイタケは原木栽培のシイタケよりもLA含量が多いことが明らかとなった。また,原木栽培により得られた品種の異なるシイタケ4種間でもLA含量は異なり,最大5倍ほどの違いが認められた。加熱法の違いでは,電子レンジ加熱で最もLA残存量が多く,次いで,茹で加熱,蒸し加熱の順であった。シイタケ抽出物から,カラムクロマトグラフィーおよびHPLCで約200回の分取を行うことにより,フレーバー前駆体であるレンチニン酸(LA)の精製を行い,単離されたLAを用いて検量線を作成した。今後の動物実験において,よりLA含量の高いシイタケを用いて試料を作製するため,栽培方法,品種,加熱加工法の違いいよるLA含量の比較を行った。その結果,LA含量は,栽培方法,品種,加工法の違いにより,最大5倍もの違いがみられた。この結果から,どのシイタケを用いて,どのように加熱加工をすればLAが高濃度に保てるか分かったので,本年度は,LAを高含有するシイタケ抽出物を調製し,LAの機能性を動物実験により評価する。シイタケのフレーバー成分は,フレーバー前駆体であるレンチニン酸(LA)に,酵素γ-グルタミルトランスフェラーゼとC-Sリアーゼが作用して,デスグルタミルレンチニン酸(DGLA)を経て生成するレンチオニン等の環状硫黄化合物である。含硫フレーバー成分としては,ニンニクのジアリルジスルフィドやジアリルトリスルフィド等が知られているが,これらのスルフィド類は,フレーバー前駆体であるS-allyl-L-cysteine sulfoxide (ACSO)に,酵素C-Sリアーゼが作用して生成する。当研究室では,経口摂取したACSOが,生体内で代謝活性化し,様々な生理作用を示すことを既に明らかにしている。シイタケのフレーバー前駆体であるLAおよびDGLAは,ACSOと構造が類似していることから,これらも,ACSOと同様の生理活性を有することが期待できる。平成28年度は,シイタケ抽出物中のアミノ基を有する化合物をFmoc誘導体化することにより,LAおよびDGLAの検出を行った。平成29年度は,シイタケ中からLAを単離して検量線を作成した後,シイタケの品種,栽培方法,加工方法の異なるシイタケ中のLA含量を測定した。平成30年度は,レンチニン酸を高含有するシイタケ抽出物(Shiitake-H)を調製し,Shiitake-Hの血中エタノール濃度上昇抑制作用を,レンチニン酸を含有しないシイタケ抽出物(Shiitake-N)との比較により検討した。その結果,Shiitake-Hの経口投与により,有意に血中エタノール濃度の上昇が抑制された。この作用メカニズムを検討したところ,Shiitake-Hは,胃および小腸からのエタノールの吸収を抑制すると共に,肝臓においてアルコールデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を亢進し,エタノール代謝を促進することにより,本作用を示すことが明らかとなった。シイタケ抽出物からLAを精製し,このNMR分析をした後,特徴的なシグナルを確認し,これにより,シイタケ中およびCrudeな抽出物中のLAの定量を可能にしたいと考えている。
新規アルド-ケトレダクターゼの構造・生理機能・基質特異性の分子進化

Ochrobactrumsp.由来ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼ(oPLDH)は一次構造上,アルド-ケトレダクターゼ(AKR)スーパーファミリーに属する.しかしながら,不可逆的な酸化反応のみを触媒すること,またNAD^+に対して非常に高い親和性を有するといった他のAKR酵素とは異なる特徴を有していることから,立体構造的に非常に興味深い酵素である.また,Mesorhizobium loti由来PLDH(6807-PLDH)は基質特異性が非常に高く,ピリドキサールのみを基質とし,触媒効率はoPLDHの約900倍である.本年度はこれら酵素の反応機構を解明することを目的とし,結晶化および構造解析を試みた.これまでoPLDHの結晶を用いて,2.0Å分解能までのX線回折データを得ることに成功したが,位相の決定には至っていない.そこで,本酵素のセレノメチオニン置換タンパク質発現系を構築した.作製した発現系から精製酵素を用いて,結晶化を行ったが,解析可能な結晶を得ることができなかった.次に,Native結晶を用いて重原子同型置換法を試みた.金(3種),水銀(3種),プラチナ(2種),ヨウ素(2種),サマリウム(1種),イリジウム(1種)などさまざまな重原子試薬を用い,重原子誘導体を作製した.また,結晶化条件のスクリーニングも再度行い,ヨウ素を含む緩衝液で良好な結晶を得ることができた.現在これら重原子置換した結晶の解析を進めている.6807-PLDHを各種カラムクロマトグラフィーにより精製し,結晶化スクリーニングを行った.結晶化条件の探索の結果,数条件で本酵素の結晶が得られたが,構造決定に十分な分解能のX線回折像を得ることはできなかった.現在更なる結晶化条件の探索を試みている.アルドーケトレダクターゼ(AKR)スーパーファミリーの新規ブランチに属する3種の酵素Ochrobactrum sp.由来ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼ(oPLDH)、根粒菌Mesorhizobium loti由来3332-PLDH、8482-PLDHの酵素科学的性質を明らかにし、比較を行った。3酵素ともダイマーであり、基質としてはPLだけではなく、threo糖にも高い反応性を示した。補基質特異性には違いがみられ、oPLDH、8482-PLDHはNAD^+を要求するのに対し、3332-PLDHはNADP^+を要求した。また、逆反応は観察されなかった。既知のAKRとの比較から、これら酵素は活性に関与する残基、補基質との結合に関与する残基を保存していた。現在3酵素の結晶化条件を検討し、得られた結晶を用いて、位相決定のための解析を進めている。また、本酵素の機能を明らかにするため、根粒菌由来の2種の遺伝子について機能解析を行った。両遺伝子の欠損は生育に影響せず、また、ビタミンB_6分解能にも影響が見られなかった。このことから、両者とも根粒菌の有するビタミンB_6分解には直接的には関与していないことが明らかとなった。そこで新たに、最近本研究室で明らかにした根粒菌のビタミンB_6分解酵素クラスターの中から、本酵素をコードしていると思われる遺伝子を探索した。その結果、mlr6807遺伝子がビタミンB6分解に直接関与するPLDHをコードしていることを明らかにした。本酵素はoPLDHとは一次構造の相同性がみられずShort-chain dehydrogenase/reductaseファミリーに属する新規酵素であった。本酵素は基質特異性が非常に高く、PL以外は基質とならなかった。また、PLに対する触媒効率はoPLDHの約900倍であった。機能解析から、mlr6807遺伝子のコードするタンパク質がビタミンB_6分解の第2段階の酵素として機能していることを証明した。本酵素に関しても、結晶構造解析をすすめており、上記酵素との活性部位の比較を今後おこなっていく予定である。Ochrobactrumsp.由来ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼ(oPLDH)は一次構造上,アルド-ケトレダクターゼ(AKR)スーパーファミリーに属する.しかしながら,不可逆的な酸化反応のみを触媒すること,またNAD^+に対して非常に高い親和性を有するといった他のAKR酵素とは異なる特徴を有していることから,立体構造的に非常に興味深い酵素である.また,Mesorhizobium loti由来PLDH(6807-PLDH)は基質特異性が非常に高く,ピリドキサールのみを基質とし,触媒効率はoPLDHの約900倍である.本年度はこれら酵素の反応機構を解明することを目的とし,結晶化および構造解析を試みた.これまでoPLDHの結晶を用いて,2.0Å分解能までのX線回折データを得ることに成功したが,位相の決定には至っていない.そこで,本酵素のセレノメチオニン置換タンパク質発現系を構築した.作製した発現系から精製酵素を用いて,結晶化を行ったが,解析可能な結晶を得ることができなかった.次に,Native結晶を用いて重原子同型置換法を試みた.金(3種),水銀(3種),プラチナ(2種),ヨウ素(2種),サマリウム(1種),イリジウム(1種)などさまざまな重原子試薬を用い,重原子誘導体を作製した.また,結晶化条件のスクリーニングも再度行い,ヨウ素を含む緩衝液で良好な結晶を得ることができた.現在これら重原子置換した結晶の解析を進めている.

6807-PLDHを各種カラムクロマトグラフィーにより精製し,結晶化スクリーニングを行った.結晶化条件の探索の結果,数条件で本酵素の結晶が得られたが,構造決定に十分な分解能のX線回折像を得ることはできなかった.現在更なる結晶化条件の探索を試みている.
高度好熱菌遺伝子操作のための薬剤耐性遺伝子の耐熱化

高度好熱菌Thermus thermophilusHB8は,遺伝子操作系が確立した生物の中で最も高温で棲息可能な生物である。この高度好熱菌とランダム変異法とを利用して,カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Kan)をコードするカナマイシン薬剤耐性遺伝子を85°Cまで耐熱化し,これまでで最も耐熱性の薬剤耐性遺伝子を作製することに作製に成功した。得られた耐熱性変異型酵素の中から約100個のクローンを選択して塩基配列を決定し,そらのアミノ酸配列を比較して,置換アミノ残基の中から耐熱化に寄与するいくつかのアミノ酸残基を同定した。耐熱化機構を調べるために,溶液中での蛋白質機能解析や分子動力学的計算を行ったところ,このKanの耐熱化は,分子の柔らかい部分を固くすることで達成されていることが示唆された。この耐熱性遺伝子を利用して,高度好熱菌の遺伝子破壊株を作製する簡便な方法を確立,アミノ酸代謝系やDNA修復系酵素群の遺伝子破壊株を作製した。それによって得られた遺伝子破壊株は,期待通りのアミノ酸代謝欠損やDNA修復能欠損の性質を示した。ここで確立した遺伝子破壊株作製法は,高度好熱菌T.thermophilusHB8の機能ゲノム科学的解析に威力を発揮し,得られた遺伝子破壊株の情報は,蛋白質の系統的立体構造解析(構造ゲノム科学的解析)の情報とともに,機能未知の蛋白質の機能解析に大いに役立つと期待される。これまでに我々のグループでは,高度好熱菌Thermus thermophilus HB8のDNA修復系などの研究を行ってきた。しかし,80°Cで使用可能な耐熱性の薬剤耐性遺伝子が存在しないために,遺伝子操作が不便であった。これまでは,例えば,ロイシン合成系の遺伝子(leuB)を欠失させた栄養要求性好熱菌を利用し,好熱菌体内にleuB遺伝子を持つプラスミドが導入されれば,好熱菌の栄養要求性が相補されるような系を用いてきた。しかし,栄養要求性で選択するための合成培地作りは,通常の培地作りよりも多くの手間や時間を必要とし,しかも,その合成培地での好熱菌の生育速度は遅いためプレートが乾燥してしまうこともある。そこで,高度好熱菌においても,大腸菌と同程度容易に遺伝子操作が行えるようにするために,カナマイシン薬剤耐熱性遺伝子を85°Cまで耐熱化した。得られた耐熱性変異型酵素の中から約100個のクローンを選択し,塩基配列を決定した。そらのアミノ酸配列を比較して,置換アミノ残基の中から耐熱化に寄与するいくつかのアミノ酸残基を同定した。さらに,野生型酵素にそれらの変異を導入して,耐熱化に寄与していることを確認した。他の薬剤耐性遺伝子についても耐熱化を行っている。
新規腫瘍壊死因子(TNF-S)の人尿路性器系悪性腫瘍に対する治療効果の検討

TNF-αのN末端分子構造がより塩基性にとんだ構造となっている新規腫瘍壊死因子(TNF-S)は、癌細胞に対する感受性の面ならびにTNF-αに比し毒性が低い点で、TNF-αとはやや性格が異なる。本研究ではTNF-Sの人尿路性器系腫瘍に対する抗腫瘍効果を、in vitro、in vivoの両面より検討した。in vitroの検索では、4種類の膀胱癌細胞株と1種類の前立腺癌細胞を用いたが、これらの細胞はTNF-αに対して抵抗性を示した。一方、TNF-Sの一種であるrTNF-Scw_1はTNF-αに比し10倍から100倍の細胞障害性を示したが、本分子は産生性が低く、生体内投与は不可能であった。他のTNF-SであるrTNF-Scw_2では、TNF-αに比し軽度の細胞障害性の増加を示すものの、長時間かつ高濃度の接触を要した。また同TNF-Sと4種類の制がん剤とを併用したが、低濃度から中程度のTNF-S濃度では、軽度の細胞障害性が認められたのみであった。TNF-Sと温熱付加によっても細胞障害性の増強または細胞代謝回転への影響は認められなかった。一方ヌ-ドマウス移植系を用いた、in vivoの検索では、膀胱癌移植腫瘍の増殖抑制がrTNF-Sam_2単独投与で認められた。本TNF-Sは産生性も高く毒性もTNF-αに比して10倍軽減されたものである。同TNF-SとcDDPの併用投与では、8匹中3匹に完全腫瘍消退が認められ、増殖抑制の程度もcDDP単独群よりも有意に強いものであった。他のBRM剤との併用では、TNF-Sの亜種であるThymosinβ_4/TNF-SとLentinanとの併用で、前立腺癌移植系の明らかな増殖抑制が認められた。他の薬剤との併用を念頭に置けば、TNF-Sの人尿路性器系癌への有用性は存在するものと思われた。TNF-αのN末端アミノ酸構造の一部を変換した新規腫瘍壊死因子(TNF-S)の人尿路系悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を、in vitro,in vivoの両面より検討した。(A)TNF-αとTNF-Sの抗腫瘍効果の比較は、人膀胱癌細胞T-24を用いたin vitro assayによっておこなったが、クリスタルバイオレット法による細胞障害性試験では、TNFとの72時間混合培養で、TNF-αが1×10^4u/mlでも細胞障害性を認めなかったのに対し、TNF-Sは9×10^3u/mlでED_<50>で認められた。しかしながら、18時間混合培養では両者共細胞障害性を認めなかった。TNF-α抵抗性の尿路腫瘍細胞に対して、TNF-Sは軽度の細胞障害性を示した。(B)TNF-Sのin vivoの抗腫瘍効果は膀胱癌細胞HUB-4のヌードマウス移植系を用いて検討した。TNF-S2×10^4Uの腫瘍局所内投与を隔日で5回施行したところ、局注後2週間は対照群に比し有意な増殖抑制が認められた。また、5×10^4uに増量した治療群では、同様に2週間の増殖抑制が認められ、5匹中1匹に腫瘍の完全消退が認められた。次に、人腎癌臨床材料より移植された腫瘍系の治療実験では、2×10^3u局注で増殖抑制を認めるに至っていない。

これらの結果より、TNF-Sの腫瘍内局所投与は、一定の濃度以上を用いた場合には、人尿路系腫瘍に有効である可能性が、示唆された。その他、予備的な検討で、TNF-Sと他種薬剤との併用効果をHUB-4移植系を用いておこなった。IFN-γとの局所内併用投与では増殖抑制の増強は認められなかった。TNF-S5×10^4uの局注ならびにcDDP4mg/kgの腹腔内投与の併用では、cDDP投与を、TNF-S治療前もしくは同治療後の投与時期でおこない、cDDP単独群と比較したが、いずれの投与時期でもcDDP投与後2週間までは、併用群の増殖抑制が有意に高く認められた。併用投与法については、次年度に更に検討する予定である。TNF-αのN末端分子構造がより塩基性にとんだ構造となっている新規腫瘍壊死因子(TNF-S)は、癌細胞に対する感受性の面ならびにTNF-αに比し毒性が低い点で、TNF-αとはやや性格が異なる。本研究ではTNF-Sの人尿路性器系腫瘍に対する抗腫瘍効果を、in vitro、in vivoの両面より検討した。in vitroの検索では、4種類の膀胱癌細胞株と1種類の前立腺癌細胞を用いたが、これらの細胞はTNF-αに対して抵抗性を示した。一方、TNF-Sの一種であるrTNF-S_<cw1>はTNF-αに比し10倍から100倍の細胞障害性を示したが、本分子は産生性が低く、生体内投与は不可能であった。他のTNF-SであるrTNF-S_<cw2>では、TNF-αに比し軽度の細胞障害性の増加を示すものの、長時間かつ高濃度の接触を要した。また同TNF-Sと4種類の制がん剤とを併用したが、低濃度から中程度のTNF-S濃度では、軽度の細胞障害性が認められたのみであった。TNF-Sと温熱付加によっても細胞障害性の増強または細胞代謝回転への影響は認められなかった。一方ヌ-ドマウス移植系を用いた、in vivoの検索では、膀胱癌移植腫瘍の増殖抑制がrTNF-S_<am2>単独投与で認められた。本TNF-Sは産生性も高く毒性もTNF-αに比し10倍軽減されたものである。同TNF-SとcDDPの併用投与では、8匹中3匹に完全腫瘍消退が認められ、増殖抑制の程度もcDDP単独群よりも有意に強いものであった。他のBRM剤との併用では、TNF-Sの亜種であるThymosinβ_4/TNF-SとLentinanとの併用で、前立腺癌移植系の明らかな増殖抑制が認められた。他の薬剤との併用を念頭に置けば、TNF-Sの人尿路性器系癌への有用性は存在するものと思われた。
パターンの関数表現による実環境中の物体の高速・高精度探索

自ら移動して環境の情報を積極的に取得して行動する知能ロボットへの応用を想定し、映像を用いた実環境中の物体の頑健でかつ高速な探索法を開発することを目的として研究を行った。高速化を実現するために、画像を多項式で表現する手法、および、多項式を用いて探索を高速に行う方法を開発した。まず、画像を関数で適切に表現する手法について検討した。様々な関数形を調査した結果、多項式により画像を十分な精度で表現できることが分かった。ただし、多項式で近似する際に最小二乗法等の良く知られた方法を用いたのでは計算誤差によって適切な近似画像が得られないことも確認された。そのため、直交多項式を用い、直交多項式の完全性を利用して画像の近似を内積計算で実現する手法を開発した。次に、画像を近似する多項式と入力画像との類似度計算を効率よく行う手法を検討した。その結果、多項式の係数ごとに類似度を計算し、それを足し合わせることで、高速に類似度計算を行う手法を開発した。実験を行い、従来の高速化法と比較して、提案手法がはるかに高速であることを確認した。ところで、一般に画像パターン認識では単一の画像を用いるよりも、複数の画像を用いて統計的に適切な認識結果を得る方が一般に性能が良い。これらを考慮し、提案手法を部分空間法に適用する手法を提案した。部分空間法では、複数の学習パターンからそのパターンを表わす基底を構築し、基底への射影成分を求めることで認識を行なう。これにより認識精度が向上するだけでなく、一般に基底は低周波成分の多いパターンとなるため、多項式による近似精度も向上させることを可能とした。さらに、本手法の考え方を、代表的な信号処理の手法である連続ウェーブレット変換の高速計算に応用した。多項式を用いた内積計算の高速化法を拡張し、連続ウェーブレット変換に必要な積分計算を高速化する手法を開発した。具体的には、カメラの位置や角度による幾何学的変形に対応するために、探索対象物体の画像を関数で表すことにより、高速・高精度な探索を実現する。本年度は、画像を関数で適切に表現する手法、および、関数を用いてテンプレートマッチングに基づく探索を高速に行う手法について検討を行った。1.画像を関数で適切に表現する手法の検討画像を関数で適切に表現する手法について検討した。関数形について、多項式、スプライン曲面、ベジェ曲面など、コンピュータグラフィクスの分野で用いられている関数形のほか、より自由度の高い陰関数多項式等を検討した。その結果、多項式により画像を十分な精度で表現できることが分かった。これにより、最小二乗法で近似した場合と比較してはるかに高精度な近似が実現できることを確認した。2.関数を用いて探索を高速に行う手法の検討画像を近似する関数と入力画像との類似度計算を効率よく行う手法を検討した。