hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生態・環境科学分野における角度データに着目した解析のための統計モデリング

平成30年度には、裾の重い直線変量に対応するためのシリンダー上確率分布を構成した。この研究では、Abe and Ley (2017)で考えられているWeiSSVMモデルを基にした一般化ガンマ混合を考えることで、Pareto分布のような裾の重いデータに対応できるモデルを導出し、直線上変量における外れ値に対してロバスト性を持つシリンダー上確率分布を構成した。実際に提案モデルを東日本大震災に関する震源とマグニチュードデータに当てはめることで、大きな観測値であるマグニチュード9.0というデータだけに影響されることなく、大地震発生直前のメカニズムを見出すことができた。この研究内容については、EcoSta2018で国際発表を行っており、さらにJapanese Journal of Statistics and Data Scienceでの論文雑誌掲載が決定している。次に、円周上確率分布の離散化モデルについての研究を行った。この研究では、風向のように丸めた数値で得られる角度データに対応するためのモデル構成法を提案した。この提案手法を利用し、丸めた円周上データに対するモデルの推定と当てはめ精度の評価を、シミュレーション実験を通して与えた。その結果、データを18分割以下にした場合(方角データで言うところの、東・東北東・東北・・・のようなデータ)には、連続型の確率分布をそのまま利用するよりも、提案した離散化手法によって構成した確率分布を利用した解析の方が推定と当てはめ精度が良いことが示された。この結果については、4th ISM International Statistical Conferenceにて国際発表を行っている。1年目に計画していた柔軟な円周上確率分布構成の研究の進捗が遅れたが、3年目に計画していたシリンダー上確率分布の研究の方が順調な研究を行えたため、計画順序は逆転してしまったが、おおむね研究は順調に進展している。令和1年度には、平成30年度に提案した離散化手法を利用して構成される離散型円周上確率分布を用いて、実データへの当てはめ解析を行い、その実用性を示していく。また、研究計画段階では平成30年度に行う予定であった、幾何学的発想を用いた平均・集中度・尖度・歪度に柔軟な円周上モデル構成のための研究進展を目指す。共同研究者との研究議論のための出張を行う予定であったが、キャンセルになってしまったため、その旅費分の差額が生じてしまった。このキャンセルになってしまった研究議論を次年度に行うために差額分を使用する。
欠損型組換え麻疹ウイルスを用いた亜急性硬化性全脳炎の発症機構の解析と治療への応用

亜急性硬化性全脳炎(SSPE)由来の麻疹ウイルスに生じた変異と神経病原性との関連を検討した。ハムスターを用いた感染実験により、これらの変異が脳内での感染拡大に重要であることを示した。特に、F蛋白とH蛋白に生じたアミノ酸置換による機能的な変化が複数のSSPE由来株に共通していることを明らかにした。また、麻疹封入体脳炎(MIBE)にみられる変異のSSPEとの共通性を明らかにした。さらには、SSPEやMIBEに特徴的な高頻度偏在変異の出現をヌードマウスの感染実験系で再現することができた。これらの知見を基盤として、欠損型あるいは分節型のSSPE治療用麻疹ウイルスベクターの作製を試みた。亜急性硬化性全脳炎(SSPE)患者より分離された麻疹ウイルスには、脳内で感染を拡大できる特徴的な変異が生じている。この特徴を逆に利用すれば、SSPEの特異的治療法を開発することが可能である。また、ゲノムの大部分を欠いた欠損粒子はウイルスの増殖を抑制することが知られており、この干渉現象を治療に応用できると考えている。今年度は、麻疹ウイルスのH蛋白をコードする遺伝子を欠損した組換え麻疹ウイルスの作製のために不可欠なH蛋白発現細胞の樹立を行った。すなわち、T7ポリメラーゼを発現したBSRT7/3細胞およびSLAMを発現したB95a細胞に、IC323株のH蛋白を発現するプラスミドをトランスフェクトして薬剤耐性細胞を選択することにより、H蛋白を恒常的に発現する細胞、BSRT7-IchHおよびB95a-IchHを樹立した。それぞれの細胞でH蛋白が機能することをF蛋白との共発現実験で確認した。また、B95a-IchH細胞において麻疹ウイルスの増殖が可能であることを確認した。また、将来のより有効かつ安全な欠損干渉型ウイルスの作製をめざすため、前年度に引き続き、SSPE大阪1株のF蛋白のアミノ酸置換とハムスターにおける神経病原性との関連を検討した。また、実際の患者への応用を考慮して、ワクチン株を基に神経病原性との関連性を検討した。その結果、現行麻疹ワクチンの一つであるCAM-70株を基に作製された組換えウイルスrCAM-70のF遺伝子にT461I変異を導入してハムスターに接種したところ、ハムスターは神経症状を呈して斃死した。このことから、ワクチン株においてもわずか1か所のアミノ酸置換で致死的な病原性を獲得することが明らかとなり、麻疹ウイルス野外株で明らかになったことが、ワクチン株でも該当することが証明された。今年度は、麻疹ウイルスのH蛋白をコードする遺伝子を欠損した組換え麻疹ウイルスの作製を試みた。まず、T7ポリメラーゼと麻疹ウイルスのH蛋白を発現したBSRT7-IchH細胞に麻疹ウイルスのN蛋白、P蛋白、L蛋白を発現するプラスミド、およびH遺伝子を欠損させた麻疹ウイルスゲノムをコードしたプラスミドをトランスフェクトし、麻疹ウイルスのH蛋白を発現したB95a-IchH細胞との共培養を行った。また、これとは別の方法として、H遺伝子欠損ゲノムおよびF遺伝子欠損ゲノムをもつ2種のプラスミドをトランスフェクトすることにより、それぞれの欠損を補完する発現系を試みることにした。この目的のため、H遺伝子欠損ゲノム、もしくはF遺伝子欠損ゲノムをもつプラスミドを作製し、欠損ウイルス作製の準備を行っている。また、実際の患者への応用を考慮して、ワクチン株が潜在的にもつ神経病原性およびその増強に関与する変異についても検討した。その結果、現行麻疹ワクチンの一つであるCAM-70株そのものにも弱いながら神経病原性が存在し、そのF遺伝子にA167T変異、あるいはM94V+A167T変異を導入したところ、ハムスターに対して致死的なウイルスに変化した。これらの結果は、今後のワクチンの改良、安全性の担保にも有益な情報と考えられる。また、ゲノムの大部分を欠いた欠損粒子はウイルスの増殖を抑制することが知られており、この干渉現象を治療に応用できる可能性がある。今年度は、第一段階としてH蛋白をコードする遺伝子を欠損した組換え麻疹ウイルスの作製に着手した。まず、IC323株のF遺伝子をSSPE大阪2株のF遺伝子に組み換えることによって脳での感染が可能になり、且つ、H遺伝子を欠くために感染を拡大することができないH遺伝子欠損型組換え麻疹ウイルス作製用のプラスミドを構築した。また、将来のより有効かつ安全な欠損干渉型ウイルスの作製をめざすため、他のSSPE株のF遺伝子の構造と機能との関連性についての解析を行った。

その結果、SSPE大阪2株と同様、SSPE大阪1株においてもF蛋白がin vitroではVero細胞における細胞融合能の増強に関与しており、in vivoではハムスターへの神経病原性と密接に関連していることが明らかになった。さらに、SSPE大阪1株では、F蛋白のF2ドメインのHR(heptad repeat)C領域とF1ドメインのHRA領域のアミノ酸置換、中でも、94番目(メチオニンからバリン)と167番目(アラニンからスレオニン)のアミノ酸置換が重要であることが明らかになった。したがって、以前にSSPE大阪2株の解析で示されたことが、変異の部位や程度が異なるSSPE大阪1株においても同じ結論に達することが明らかになった。すなわち、細胞融合能の増強と神経病原性の獲得に関与するアミノ酸置換がF蛋白に生じることがSSPEに普遍的な現象であることを証明できた。亜急性硬化性全脳炎(SSPE)患者より分離された麻疹ウイルスには、脳内で感染を拡大できる特徴的な変異が生じている。この特徴を逆に利用すれば、SSPEの特異的治療法を開発することが可能と考えられる。また、ゲノムの大部分を欠いた欠損粒子はウイルスの増殖を抑制することが知られており、この干渉現象を治療に応用できると考えている。今年度は、H遺伝子欠損ゲノムおよびF遺伝子欠損ゲノムをもつ2種類のプラスミドをトランスフェクトすることにより、それぞれの欠損を補完する実験系を試みた。この実験系によりウイルスを作製することに成功したが、当初の目的のH遺伝子欠損型のウイルスのみを分離することはできなかった。おそらく、H遺伝子欠損ゲノムとF遺伝子欠損ゲノムの2種類のゲノムを同時にウイルス粒子内に保持したウイルスとしてのみ存在できるものと考えられた。そこで、今後は、この2種類のゲノムを持つウイルスを用いて実験を継続することにした。まずはこのウイルスを用いた干渉実験を今後試みる予定である。その他、SSPE株のFおよびH遺伝子の構造と機能、神経病原性との関連性についての解析を前年度に引き続き検討した。特に、大阪2株のH蛋白のレセプター指向性の解析や神経病原性に関与する領域の特定に向けた実験を中心に行った。その結果、大阪2株ではH蛋白のC末端の変異がハムスターにおける神経病原性獲得に寄与していることが明らかになった。SSPE株のH蛋白が脳内の未知のレセプターを利用して感染拡大を行うための変異が生じている可能性が考えられ、それに関与するH蛋白の領域が明らかになると予想される。また、ヌードマウスへの感染実験により、M遺伝子の高頻度変異の再現に成功し、変異のメカニズムの一端を明らかにすることができた。これらの結果は、今後のワクチンの改良、安全性の担保にも有益な情報と考えられる。今年度は、SSPE株のH蛋白のC末端の変異がハムスターにおける神経病原性獲得にどう関与しているのかについてさらに検討した。
超新星残骸中における高温プラズマ化した噴出物と星間物質の進化の観測的研究

MAXI(Monitor of All-sky X-ray Image)は国際宇宙ステーション(ISS)の日本実験棟(愛称:きぼう)の曝露部に搭載される、全天X線監視ミッションであり、2009年7月に打ち上げられた。MAXIは90分で地球を一周する宇宙ステーションの動きを利用して0.5-30keVのエネルギー帯域を全天モニターする。検出器としては12台の比例計数管から構成されるGSC(Gas Slit Camera)と32枚のCCDから構成されるSSC(Solid-state Slit Camera)が搭載される。MAXIの第一の目的は、突発現象の早期発見と、既知のX線天体の長期間にわたる強度変動の監視である。そのために、今までにない高感度で全天を連続的に観測する。第二の目的は、SSCを用い高エネルギー分解能で全天を撮像する事である。SSCは0.5-12keVのエネルギー帯域をCCDのエネルギー分解能で全天を撮像できるため、宇宙高温プラズマの観測に適している。観測開始から二年以上たった今では、百を超える点源と幾つかの広がった構造である、宇宙高温プラズマが観測されている。今回の研究ではSSCのバックグランドの評価を行い、SSCのバックグランドが地球の磁場からの影響を大きく受けその強度やスペクトルが変化する事がわかった。また、バックグラウンドが評価できたので、SSCで観測されている宇宙高温プラズマであるCygnus Superbubble(CSB)の天体解析も行った。CSBは白鳥座にあるスーパーバブルであり、我々の銀河内にある宇宙高温プラズマのなかでも最も大きいものの一つである。発見自体は1970年代と古いが、その距離や正確なスペクトルなどは今だ解明されていなかった。SSCの観測により、CSB全体からのスペクトルが得られ、その温度や重元素組成などを明らかにする事ができた。MAXI(Monitor of All-sky X-ray Image)は国際宇宙ステーション(ISS)の日本実験棟(愛称:きぼう)の曝露部に搭載される、全天X線監視ミッションであり、2009年7月にスペースシャトルで打ち上げられ、8月に観測を開始した。検出器としては12台の比例計数管から構成されるGSC(Gas Slit Camera)と32枚のCCDから構成されるSSC (Solid-state Slit Camera)が搭載している。打ち上げが行われてから、初期チェックアウト、様々なキャリブレーションなどを行なった。現在では、解析ソフトウェアなども概ね揃い、データスクリーニングなどの作業も収束しつつあり、天体解析などを行い投稿論文を書くフェーズにきている。現在では打ち上げから一年半以上たち、SSCでは百個以上の点源を検出している。その点源以外でも研究の主題である、X線で広がった構造も見えてきた。幾つかある広がった構造のなかでも一番明るい、Cygnus SuperBubbleの解析を行い、そのスペクトルを取得する事に成功した。Cygnus Superbubble全体からの詳細なスペクトルを得るのはSSCが世界初である。
確率的近似学習のパラダイムによる遺伝的アルゴリズムの効率の解析および実働化

本研究の目的は、理論的な研究はすすんでいるが実用的な応用例に乏しいPAC学習のパラダイムと、理論的解析法の整備されないままにも実用的なアプリケーションが開発されつつある遺伝的アルゴリズムを融合し、理論と応用の両面から、生物学的データからの知識獲得を行なうシステムを開発することである。今年度は、以下の知見が得られた。1.PAC学習可能性を確かめた上でワークステーション上に実働化した知識獲得システム「BONSAI」を、並列化可能性の観点から見直し、そのプロトタイプを作成した。その中で、特に計算量を要する、パターンの検索部分に対し、遺伝的アルゴリズムを適用して、その効果を確かめた。これらの理論的な解析については、今後ともに引き続き重要な研究の課題となると思われる。また、ここで構築したシステムは、実際の遺伝子データのように、もともとの分類のはっきりしない問題に対しても有効であると期待される。2.PAC学習可能性を特徴づける組み合せ量として重要な、VC次元を求めるための計算量の評価を行った。さらに、これを一般の関数に関して拡張した次元についても同様な解析を行った。その結果、この計算量は、変数の個数を限定した論理式の充足可能性問題との還元可能性で特徴づけられ、NP完全にもなりそうにはないがPで解けそうもない、という、計算量理論の観点からも興味ある知見を得た。この結果は、学習アルゴリズムの計算量の評価とは独立した問題ではあるが、今までと異なる観点から学習モデルを評価する際に有用になると思われる。
在宅療養患者の咀嚼機能向上に寄与する，食支援のための簡便な食事姿勢探索法の確立

咀嚼嚥下障害を持つ患者に対し,食形態の改良や誤嚥を防止する目的で姿勢調整が行われてきた.しかし,この姿勢調整は,誤嚥を予防することを目的に行われており,これらの姿勢をとらせた際の咀嚼の行いやすさについては考慮されていない.本研究では,頭頸部の姿勢変化や体幹の傾斜角度により,咀嚼運動様相がどのように変化するかを明らかにすることを目的にした.若年健常者を対象に,咀嚼運動時において,リクライニング位,頭頸部屈曲などの姿勢をとらせたところ,ガム咀嚼時には側方の運動量が減少した.姿勢調整などのために頸部を屈曲させる際には,咀嚼運動に変調をきたす可能性について考慮する必要があることが示唆された.【研究の目的】本研究の目的は咀嚼・嚥下障害を持つ脳血管障害患者の姿勢と咀嚼嚥下様相を,モーションキャプチャなどを用いて多角的に分析し,最終的には舌圧などの簡単な計測から,各患者に最適な食事を行いやすい姿勢を得る予測式の確立を目指す.【本年度の実施内容】今年度の目標は,健常者を対象に体幹の傾斜角度を変化させた際に,咀嚼運動様相,筋活動,舌圧,口唇閉鎖力などがどのように変化するかを明らかにすることである.測定条件の予備実験として,体幹の傾斜角度30°,45°,60°,90°に変化させた際の健常有歯顎者4名における咀嚼運動の変化を,モーションキャプチャ(Viconインターリハ社製)を用いて調べた.被験食品は,当初予定していたグミゼリーから,咀嚼の進行に伴って,テクスチャーや食塊の大きさが変化しない,軟化したチューインガムを用いた.安静時において,体幹の傾斜角度がゆるくなると,オトガイと胸骨上切痕の距離が小さくなる(2点が近づく)傾向のあることが明らかになった.さらに,ナジオン(前頭鼻骨縫合部の最前点)とオトガイを結ぶ直線と,体幹の代表点,胸骨上切痕と剣状突起を結ぶ直線のなす角度は,体幹の傾斜角度が緩くなると大きくなる傾向のあることが明らかになった.体幹傾斜角度90°と比較し30°では,咀嚼運動の3次元的な運動距離が大きい傾向のあることが明らかになった.これらから,体幹傾斜角度が緩くなると,顎下部のスペースが狭くなり,物理的に咀嚼時の開口量が小さくなることが推察された.【研究の目的】咀嚼・嚥下障害を持つ脳血管障害患者の姿勢と咀嚼嚥下様相を,モーションキャプチャなどを用いて多角的に分析し,最終的には舌圧などの簡単な計測から,各患者に最適な食事を行いやすい姿勢を得る予測式の確立を目指す.【実施内容】健常有歯顎である男性10名(平均年齢26.4歳)を対象とし,体幹傾斜角は80°(座位)と30°,頸部屈曲角は0°と60°を組み合わせた4姿勢を姿勢条件として,十分軟化したガム咀嚼を指示した.運動の測定には,光学式3次元動作計測装置VICON(Vicon Motion Systems Ltd)を用いた.上顎基準点は左右外耳孔上縁,左右鼻翼下縁の4点とし,分析点は,オトガイ(Po),胸骨上切痕(SC)下顎切歯運動の代表点Mとした.体幹傾斜や頚部屈曲による,上顎基準平面(カンペル平面)に対するM点の咀嚼運動様相と,体幹とオトガイ間距離の変化について解析を行った.体幹傾斜角度によらず,頸部が屈曲すると,Po-Sc間距離が有意に短縮した.咀嚼運動の開口量と,垂直的,前後的な幅は姿勢条件による変化がないが,咀嚼運動の左右的な幅は頚部屈曲60°の条件では0°と比較し,幅が狭くなる傾向が認められた.これらは,頸部屈曲60°時もPo-Sc間距離が30mm程度で,咀嚼は開口量1015mm程度の運度であることから,頸部屈曲が開口量に与える影響は少なかったと考えられる.頸部を前屈すると,若年健常者では,咀嚼ストロークの左右幅の減少が,臼磨運動の抑制を反映している場合,咀嚼効率にも影響する可能性が考えられる.これの結果は,今後,咀嚼が行いやすい姿勢(体幹傾斜角度,頚部屈曲)を考える際の参考となり,その臨床的な意義は大きい.さらに,今後,姿勢の変化が咀嚼能率に与える影響も調べたいことから,義歯装着者の咀嚼能率を客観的に検索する方法について検討中である.今年度は,若年健常被験者の測定条件を決定する予備実験に時間がかかり,対象被験者を若年健常者から前期高齢者,さらには咀嚼・嚥下障害を持つ脳血管障害患者へと拡大することができなかった.

具体的には,昨年度,4名を対象に行った予備実験から,皮膚上に設けたオトガイの点を下顎の動きの代表点とした場合,体幹傾斜90°では30°と比較して移動距離が大きくなる者が認められた.しかし,皮膚上の点は測定精度が十分とはいえず,下顎の代表点をオトガイ上の皮膚点から下顎切歯点に取り付けた標点へと変更した.また,頭部中間位の定義があいまいだったため,頚部屈曲角度を0°と60°,体幹傾斜は30°と90°のこれらを組み合わせた4姿勢に再設定した.さらに,筋活動記録に無線の筋電計の使用を試みたが,頚部屈曲した際に,顎下部に設置した電極が大きく体幹に接触することから,有線の筋電計に戻すなど,これらの設定についても時間を要した.【目的】咀嚼嚥下障害を持つ患者に対し,食形態の改良や誤嚥を防止する目的で姿勢調整が行われてきた.しかし,この姿勢調整は,誤嚥を予防することを目的に行われており,これらの姿勢をとらせた際の咀嚼の行いやすさについては考慮されていない.本研究では,頭頸部の姿勢変化や体幹の傾斜角度により,咀嚼運動様相がどのように変化するかを明らかにすることを目的にした.【方法】顎口腔機能に異常を認めない11名の男性若年健常者(平均年齢25.5歳)を対象にした.被験者には,歯科治療椅子に深く座り,背板から延長して取り付けた板にて頭部を支える姿勢をとらせた.体幹傾斜角は80°(座位)と30°(リクライニング位)を設定した.これらの体幹傾斜角に対し,屈曲なし,頸部前屈60°と頭部前屈10°を設けた.ヘッドレストに取り付けた板に頭部を付けた状態から頭部を前屈方向に60°屈曲させた姿勢を頸部前屈位とした.オトガイ部を体幹方向に近づけて10°前屈した姿勢を頭部屈曲角10°とした.被験者には,体幹と下顎に標点を貼付し,各姿勢条件において,軟化したガムを自由咀嚼している際の標点の運動様相を,三次元動作解析装置(VICON)を用いて記録し,各姿勢間で比較した.【結果と考察】体幹傾斜角度によらず,頸部屈曲60°のとき,0°のときよりもオトガイは胸骨上切痕に有意に近づいていた.すなわち,頸部が屈曲すると,オトガイ胸骨間距離が有意に短縮した.開口量は変化しなかったが,側方成分が頸部屈曲により減少した.姿勢調整などのために頸部を屈曲させる際には,咀嚼運動に変調をきたす可能性について考慮する必要があることが示唆された.咀嚼嚥下障害を持つ患者に対し,食形態の改良や誤嚥を防止する目的で姿勢調整が行われてきた.しかし,この姿勢調整は,誤嚥を予防することを目的に行われており,これらの姿勢をとらせた際の咀嚼の行いやすさについては考慮されていない.本研究では,頭頸部の姿勢変化や体幹の傾斜角度により,咀嚼運動様相がどのように変化するかを明らかにすることを目的にした.若年健常者を対象に,咀嚼運動時において,リクライニング位,頭頸部屈曲などの姿勢をとらせたところ,ガム咀嚼時には側方の運動量が減少した.姿勢調整などのために頸部を屈曲させる際には,咀嚼運動に変調をきたす可能性について考慮する必要があることが示唆された.測定条件のための予備実験に時間がかかった.有線の筋電計を用いると,自然な機能運動を行いにくいだけでなく,線がモーションキャプチャのカメラの視野をさえぎるなど測定に困難をきたしたため,今後はワイアレスの筋電計を用いることを検討中である.さらに嚥下をモニターする予定のピエゾセンサー出力型嚥下運動記録装置は,頭頸部の角度が小さくなると,測定が困難であることが明らかになり,嚥下のモニターについて再考中である.現在,被験者の運動条件が咀嚼(ガム咀嚼)に限定されているため,すでに測定済みの嚥下運動を含めた咀嚼嚥下運動の解析を進める.さらに,現在測定対象が顎運動と筋活動のみであることから,当初の目的であった予測式の確立を目指すため,今後,口唇閉鎖力や舌圧などを追加する.さらに,対象者を若年健常者から,有歯顎の前期高齢者へと拡大する.来年度は最終年度のため,現在得られている結果をまとめて投稿する.補綴学分野健常者における体幹傾斜角度と頭頸部角度が咀嚼や嚥下運動にどのような影響を与えるかを十分に明らかにした後,患者群での測定を行うことを予定しているため,27年度も引き続き健常者を対象にデータを収集する.測定装置の移動を28年度初旬に控えており,大型の物品を購入することができなかった.モーションキャプチャの設定に時間がかかったことや,予定していた測定機器では測定が困難であることが明らかになり,被験者数を十分に増やせず謝金や,測定に使う消耗品の消費が少なかったことが理由である.測定装置移動後に,大型の物品を購入する.
重水素化アルキンタグラマンイメージングを用いた共培養時の細胞増殖評価法の確立研究

近年の細胞実験では、関連する細胞を共培養して細胞の分化や増殖を評価することが重要であるとされている。特に抗がん剤などの薬材試験では、正常細胞と癌細胞を共培養した条件下で、正常細胞には影響せずに癌細胞特異的な効果を示す結果が求められつつある。現在の共培養実験では蛍光標識を用いた細胞識別法が主流であるが、この手法では細胞増殖時や単純な拡散を理由とした蛍光物質の細胞外への漏れ出しと細胞内への再取り込みが起こり、共培養した細胞の識別ができなくなり薬剤効果による各細胞の増殖の差を正確に評価するのが困難という問題がある。そこで申請者はこの問題を解決するため、本研究で共培養に使用できる複数の細胞種を区別可能なラマンイメージング技術の開発を目指した。本手法は、蛍光標識に比べはるかにコンパクトかつ基盤となる化合物にほとんど影響を与えないラマンタグを用いるため、マーカーとして使用する化合物が与える細胞間での影響に差が出にくいことも大きな利点である。今年度は、2種類の細胞の区別が可能となる重水素化化合物を設計・合成して、合成した化合物を用いたラマンシグナル計測、化合物の安定性や細胞毒性評価などを中心に行った。その結果、特定の構造を有したアルキン化合物やいくつかの重水素化化合物で本研究的ように期待できる結果が得られた。さらに、ラマンイメージング実験では化合物に対応したラマンシグナルの細胞内分布が細胞ごとに異なることが確認できた。さまざまな重水素化化合物を設計・合成して生細胞でも安定かつラマンイメージングが可能な化合物を模索した結果、アルキン化合物の他にも重水素化によりいくつかの化合物が本研究に適用できる可能性を見出した。また、プレリミナリーな状態なため今後も検証が必要ではあるが、アルキン化合物や重水素化化合物を用いた細胞内のラマンシグナル計測において、各種化合物に対応したラマンシグナルの細胞内分布が細胞ごとに異なることが確認できた。これらの化合物をもとに各種細胞を区別可能なラマンイメージング技術の確立ができると考えている。次年度は今年度に引き続き、さまざまなアルキン化合物や重水素化化合物の設計・合成を行い、各種細胞を区別可能なラマンイメージング技術の確立を目指す。その後、これらの知見に基づいて、複数の細胞小器官マーカーを開発して最終目的である共細胞培養系への適用を目指す。初年度はさまざまな重水素化化合物の合成と細胞実験を行ったが、検討には少量で十分であり、合成際に必要な試薬や器具は購入済みのものが多かった。また、次年度には生物検定に使用する重水素化化合物の大量合成で重水素化試薬の大量購入や高価なアルキン化合物の購入、ラマン顕微鏡のメンテナンスなどに多額の費用が必要となるため。
延髄アストロサイトがトリガーする呼吸リズム形成メカニズムの解明

生命維持に必須な呼吸リズム形成のメカニズムは未解明である。本研究では、脳幹部グリア細胞、特にアストロサイトが、呼吸リズム形成と低酸素呼吸応答に関与しているかを明らかにするため、ラット摘出脳幹脊髄標本において延髄腹外側部の細胞活動をカルシウムイメージング法により解析した。その結果、呼吸出力に同期したアストロサイトの存在が確認された。また、高度の低酸素を負荷した無麻酔のマウスでは、まず呼吸増強が、その後に呼吸抑制が認められたが、アストロサイトの活性化を阻害すると、低酸素負荷時の呼吸が減弱した。以上より、アストロサイトは、呼吸リズム形成および低酸素性呼吸応答において重要な働きをしていると考えられた。呼吸リズム形成のメカニズムについては、従来、ニューロンネットワークによるとするネットワーク説と、ペースメーカーニューロンの活動に牽引されることによるとするペースメーカー説とが提唱されてきたが、いずれの学説とも矛盾した実験結果が得られており、呼吸リズム形成のメカニズムは未解明であった。最近の神経科学の進歩により、グリア細胞、なかでもアストロサイトは、ニューロンと協調して脳の情報処理において重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。本研究では、延髄のアストロサイトが、呼吸リズム形成およびその機能増強にどのように関与しているかを解明するべく、以下の検討を行った。(1)低酸素は頸動脈小体の興奮を介して呼吸リズム形成機構の機能を増強させるが、増強した呼吸出力は、低酸素刺激後も数分間以上持続する。この現象は、短期呼吸増強と呼ばれ、呼吸リズム形成機構を増強する重要な機能であるが、その細胞機構は不明であった。そこで、無麻酔覚醒マウスにおいて、アストロサイトの活性化を抑える薬剤arundic acidを用い、その前投与は低酸素後短期呼吸増強を抑えることから、短期呼吸増強は、少なくとも低酸素刺激による場合は、アストロサイトの活性化を介することを示した。(2)摘出脳幹標本において、カルシウムイメージング法により各数十個のニューロンとアストロサイトの活動を計測し、計測された細胞の細胞内カルシウム濃度変化のパターンから得られた細胞をニューロンとアストロサイトに分類する方法を開発した。計測後の標本中の細胞をニューロンに特異的な抗NeuN抗体と、アストロサイトに特異的な抗S100b抗体で染め、細胞内カルシウム濃度変化のパターンによる細胞弁別法の妥当性を検討した。そのうえで、脳幹部における呼吸リズムがニューロンとアストロサイトの協調作用により形成されると考えることができ、そのモデルを提唱した。脳幹部での呼吸リズムの形成機構、低酸素応答機構におけるニューロンとアストロサイトの役割を解明するため、ラット摘出脳幹脊髄標本を用いた解析を行った。すなわち呼吸リズム形成の場である延髄pre-Botzinger complexの吻側端で脳幹を横切断し、吸息性神経出力を記録しつつ、カルシウムイメージングにより脳幹切断面からpre-Botzinger complex領域内の細胞活動を計測し、記録された細胞をニューロンとアストロサイトに分類した。ニューロンは、TTXにより特異的に抑制され、また、低カリウム状態では過分極してさらに抑制されるが、アストロサイトは、低カリウム状態に置くとアストロサイトに特異的に発現しているカリウムチャネルKir4.1を介した細胞外陽イオンの非選択的な細胞内流入が促進されるという特性を利用し、記録した細胞を高効率でニューロンとアストロサイトとに分類できるようにした。その結果、pre-Botzinger complex領域の吻側端レベルにおいて吸息性神経出力と同期した活動を示す細胞、すなわち、吸息性ニューロン、前吸息性ニューロン、吸息性アストロサイト、前吸息性アストロサイトを検出した。これら結果に基づいて、呼吸リズム形成は、呼吸性ニューロンと呼吸性アストロサイトとの相互作用によってなされるというコンピュータモデルを構築し、米国神経科学学会で発表した。低酸素に対する呼吸応答機構でもニューロンとアストロサイトの相互作用が重要であると考え、その際のアストロサイトの役割を解明するため、無麻酔非拘束のマウスにアストロサイト活性化阻害薬arundic acidの投与前後での低酸素呼吸応答を解析した。その結果、低酸素刺激は、末梢化学受容体のみでなく、脳内のアストロサイトでも感知され、脳内呼吸ネットワーク興奮を介して換気を増強させることを見出し、論文として発表した。カルシウムイメージングにより記録した細胞をニューロンとアストロサイトに分類することは、重要な課題で、前年度から継続して様々な方法を試行錯誤しつつ、検討してきた。その結果、時間がかかったが、上記のように、TTXと低カリウム負荷を行うことにより、高効率でニューロンとアストロサイトに分類することができるようになった。その成果を踏まえ、呼吸に同期した多数のニューロンとアストロサイトの計測を行えており、研究は順調に進んでいる。呼吸リズム形成メカニズムについて、従来、ニューロンネットワークによるとするネットワーク説と、ペースメーカーニューロンによるとするペースメーカー説とが提唱されてきたが、いずれの説とも矛盾した実験結果が得られており、真のメカニズムは未解明であった。最近、グリア細胞、特にアストロサイトは、ニューロン活動を支配し、様々な脳機能の発現で積極的な役割を果たしていることが明らかになってきた。そこで、本研究では、延髄のアストロサイトによる呼吸リズム形成への関与を検討することとした。呼吸リズム形成の場である延髄腹外側部のpre-Botzinger complex(preBotC)領域のニューロンとアストロサイトの活動を計測するため、新生ラット摘出脳幹脊髄標本を用いてカルシウムイメージングを行った。実験では、preBotC吻側レベルで延髄を横切断し、その断面からpreBotC領域にカルシウム蛍光色素を注入し、頚髄C4前根の吸息性神経出力を記録しつつ、共焦点顕微鏡でpreBotC領域の細胞活動を計測した。

通常の計測の後、標本にTTXを投与すると、ニューロン活動のみが抑えられ、さらに、灌流液のカリウム濃度を0.2 mMへ低下させるとアストロサイトのみが興奮性を呈することから、ニューロンとアストロサイトとを分別した。その結果、preBotC内に、吸息性、前吸息性、および呼息性のアストロサイトが見出された。これらアストロサイトは、TTXでニューロン活動を抑えても自発活動を呈し、ニューロンに依存しない自律的なリズム形成能を有していることが明らかとなり、アストロサイトの呼吸リズム形成への関与が示唆された。これらの成果は、様々な呼吸調節障害の病態理解と治療法開発に基礎的知見を提供すると期待される。この成果は、平成29年3月に第94回日本生理学会大会で報告したが、さらに原著論文として発表すべく準備中である。生命維持に必須な呼吸リズム形成のメカニズムは未解明である。本研究では、脳幹部グリア細胞、特にアストロサイトが、呼吸リズム形成と低酸素呼吸応答に関与しているかを明らかにするため、ラット摘出脳幹脊髄標本において延髄腹外側部の細胞活動をカルシウムイメージング法により解析した。その結果、呼吸出力に同期したアストロサイトの存在が確認された。また、高度の低酸素を負荷した無麻酔のマウスでは、まず呼吸増強が、その後に呼吸抑制が認められたが、アストロサイトの活性化を阻害すると、低酸素負荷時の呼吸が減弱した。以上より、アストロサイトは、呼吸リズム形成および低酸素性呼吸応答において重要な働きをしていると考えられた。本年度は、3年計画の1年目であるが、まず短期呼吸リズム増強機構について、アストロサイトが重要な関与をしていることを証明した。また、呼吸リズム形成の細胞ネットワーク機構の解析を行っていくにあたり、カルシウムイメージングで計測された各細胞について、細胞内カルシウム濃度変化のパターンによる細胞弁別法を検討した。さらに、まだ比較的単純なものではあるが、脳幹部における呼吸リズムがニューロンとアストロサイトの協調作用により形成されるとするモデルを提唱することもできたので、初年度としては、十分な達成度と言える。今後、呼吸中枢での呼吸リズム形成過程に関わるニューロンとアストロサイトのイメージング実験を継続して行い、酸素化レベルを変えるなど様々な生理学的条件下でのデータを集積する。それらの実験データに基づいて、ニューロンとアストロサイトよりなる、より精緻な数理モデルを構築し、コンピュータシミュレーションを行い、イメージング実験の結果と合わせて、呼吸リズム形成過程におけるアストロサイトの役割を解明する。その成果に基づき、ニューロンとアストロサイトの相互作用による脳内情報処理機構の普遍的な理解を深めていく。
リボソーム-RRF複合体の立体構造にもとづく機能解明と創薬への応用

リボソームとリボソーム再生因子(RRF)複合体の立体構造をもとに新規抗菌剤の開発を目指して研究を行った。RRFはEF-Gと協同して蛋白質生合成終結後のリボソーム-tRNA-mRNA複合体を解離する。解離後の遊離リボソームは再度開始過程に導かれてリサイクルされる。NMR及びX線結晶構造解析による立体構造の結果、RRFは2つのドメインより構成されること、及びドメインIIがドメイン1に対して角度60度の範囲で揺らぐことを明らかとした。ドメイン1に相当するモデルペプチド(RRF-DI)を合成し相互作用解析を行った結果、RRFのリボソームとの結合部位はドメイン1であることを明らかにした。RRF-DIとリボソーム50Sサブユニットの複合体の立体構造から構築したRRF、EF-G、70Sリボソーム複合体のモデルから、RRFの作用機構を明らかにした。さらにRRF-DIとリボソーム50Sサブユニットの結晶構造中の結合部位の立体構造をもとにRRF阻害能を有する分子を設計し評価を行った。RRF単独の溶液構造及び結晶構造をもとにバーチャルスクリーニング法でRRFと結合する低分子分子を探索し、得られた候補化合物数十種類に関して実際に表面プラズモン共鳴法によりRRFとの結合を調べたが、解離定数K_DがサブmMのものしか得られなかった。そこで、RRF-DIとリボソーム50Sサブユニットの結晶構造中でRRFと直接接触しているrRNA部位をテンプレートとする分子を探索した結果、解離定数K_Dが数μMの化合物が得られた。この化合物をもとにRRFとの相互作用様式を考慮して低分子化を試み、同等の解離定数を示す数種類の化合物を得た。リボソーム再生因子(RRF)はEF-Gと協同して蛋白質生合成終結後のリボソーム-tRNA-mRNA複合体に作用し、tRNA、mRNAを解離する。解離反応後の遊離リボソームは再度開始過程に導かれてリサイクルされる。我々はリボソーム再生の機構を解明し新規抗菌剤を開発するためRRFの構造とリボソームとの相互作用を研究してきた。NMR及びX線結晶構造解析による立体構造決定を行った結果、RRFは三本鎖ヘリックスバンドル構造を持つドメインIとβ/α/βのサンドウィッチ構造をとるドメインIIよりなること、及びドメインIIがドメインIに対して角度60度の範囲で揺らぐことを明らかとした。ドメインIに相当するモデルペプチド(RRF-DI)を合成し相互作用解析を行った結果、RRFのリボソームとの結合部位はドメインIであることを明らかにした。さらに、RRF-DIとリボソーム50Sサブユニットの複合体の結晶化に成功し3.3Å分解能で構造を精密化した。結晶構造中でRRF-DIは50Sサブユニット上のA部位とP部位に跨る様に結合していた。これは翻訳終結後の複合体でP部位にあるtRNAがRRF-DIの結合に伴いP/E部位に移動することを示すものである。得られた複合体の立体構造から構築したRRF、EF-G、70Sリボソーム複合体のモデルから、EF-G結合により70Sリボソーム中のRRFのドメインIIはドメインIに対して60度回転し50Sと30Sのサブユニット間の相互作用がさらに弱まる可能性が示された。これによりRRFとEF-Gが50Sと30Sのサブユニットを解離すると考えられる。さらにRRF-DIとリボソーム50Sサブユニットの結晶構造をもとにrRNAをテンプレートとする低分子分子を探索した結果解離定数K_Dが数μMの化合物が得られた。
人工臓器のカオス制御による加齢現象のコントロールに関する研究

世界中の人工心臓研究施設の検討によって、完全置換型の全人工心臓による長期慢性実験においては、平均動脈圧の慢性的な上昇、中心静脈圧の上昇、甲状腺ホルモンの異常等、加齢に伴う循環動態の慢性的な変化が加速して発現することが報告されてきた。これらの現象を鑑みれば、いずれも加齢による病態変化と合致するものであり、一種の加齢促進モデルと位置づけることが出来る。従って、これらの変化を多変量解析による方法論を駆使して定量化することにより加齢現象の促進モデルとその加齢現象の定量的な評価システムを具現化することができるものと考えられる。そこで、平成11-14年度にわたってこれまで行ってきた動物実験の経験の蓄積を応用して慢性動物実験による検討を行った。成山羊を用いて慢性動物実験を行い、各種人工臓器を装着し、時系列データのカオス解析によって加齢現象解析のための時系列データの蓄積を始めると同時に得られた時系列曲線に対して非線形力学を応用した解析の試みを行った。すなわち無拍動、拍動、高周波振動流などの各種人工心臓の慢性動物実験を行い、覚醒状態で心拍変動や動脈圧、右房左房の圧時系列曲線や人工心臓拍出量などを慢性的に長期的に連続記録を行った。得られた人工心臓慢性動物実験の循環動態の時系列曲線は、データレコーダに蓄積した後にオフラインでADコンバータを介してコンピュータ入力を行い、フラクタル次元解析アルゴリズムの確立を試みた。平成11-14年度における具体的には拍数単位で定量化された時系列をスプライン補間した後に再サンプリングを行って高速フーリエ変換や最大エントロピー法を駆使したスペクトル解析を試み、周期性のゆらぎ成分や1/fゆらぎについて検討すると同時にカオス力学やフラクタル理論に基づいた非線形解析を試み、加齢現象における非線形ダイナミクスの情報量変動の重要性が明らかにされた。現在、これらの研究成果を臨床に還元するべく、医学部附属病院におけるホルター心電図解析アルゴリズムへの応用も試みつつある。平成11年度は成山羊に各種人工臓器を装着し、時系列データのカオス解析によって加齢現象解析のための時系列データの蓄積を始めると同時に得られた時系列曲線に対して非線形力学を応用した解析の試みを開始した。すなわち人工心臓の慢性動物実験を行い、覚醒状態て心拍変動や動脈圧、右房左房の圧時系列曲線や人工心臓抽出量などを慢性的に長期的に連続記録を行う。これまでの世界中の人工心臓研究施設や東北大学などの検討によって、完全置換型の全人工心臓による長期慢性実験においては、平均動脈圧の慢性的な上昇、中心静脈圧の上昇、甲状腺ホルモンの異常等、加齢に伴う循環動態の慢性的な変化が加速して発現することが報告されており、これらの変化を多変量解析による方法論を駆使して定量化することにより加齢現象の促進モデルとその加齢現象の定量的な評価システムを具現化することができるので平成11年度にはこれらの結果と経験の蓄積を応用して慢性動物実験の検討を行った。次年度以降に更に透析血漿交換等代謝系人工臓器にもこの概念を拡大するのはもちろんてある。現在本年度に得られた人工心臓循環動態の時系列曲線は、データレコーダに蓄積した後にオフラインでADコンバータを介してコンピュータ入力を行っている。具体的には拍数単位でで定量化された時系列をスプライン補間した後に再サンプリングを行って高遠フーリエ変換や最大エントロピー法を駆使したスペクトル解析を試み、周期性のゆらぎ成分や1/fゆらぎについて検討すると同時にカオス力学やフラクタル理論に基づいた非線形解析を試みつつある。

世界中の人工心臓研究施設の検討によって、完全置換型の全人工心臓による長期慢性実験においては、平均動脈圧の慢性的な上昇、中心静脈圧の上昇、甲状腺ホルモンの異常等、加齢に伴う循環動態の慢性的な変化が加速して発現することが報告されてきた。これらの現象を鑑みれば、いずれも加齢による病態変化と合致するものであり、一種の加齢促進モデルと位置づけることが出来る。従って、これらの変化を多変量解析による方法論を駆使して定量化することにより加齢現象の促進モデルとその加齢現象の定量的な評価システムを具現化することができるものと考えられる。そこで、平成12年度にはこれらの結果と、平成11年度を通して行ってきた動物実験の経験の蓄積を応用して慢性動物実験による検討を行った。成山羊を用いて慢性動物実験を行い、各種人工臓器を装着し、時系列データのカオス解析によって加齢現象解析のための時系列データの蓄積を始めると同時に得られた時系列曲線に対して非線形力学を応用した解析の試みを行った。すなわち無拍動、拍動、高周波振動流などの各種人工心臓の慢性動物実験を行い、覚醒状態で心拍変動や動脈圧、右房左房の圧時系列曲線や人工心臓拍出量などを慢性的に長期的に連続記録を行った。次年度以降に更に各種人工臓器にもこの概念を拡大して、加齢現象と制御する人工臓器の慢性動物実験体系の方法論を更に拡充するとともに、11-12年度に得られた人工心臓慢性動物実験の循環動態の時系列曲線は、データレコーダに蓄積した後にオフラインでADコンバータを介してコンピュータ入力を行っているで、これに対するフラクタル次元解析アルゴリズムの確立を試みる。具体的には拍数単位で定量化された時系列をスプライン補間した後に再サンプリングを行って高速フーリエ変換や最大エントロピー法を駆使したスペクトル解析を試み、周期性のゆらぎ成分や1/fゆらぎについて検討すると同時にカオス力学やフラクタル理論に基づいた非線形解析を試みる予定である。更にこれらの研究成果を臨床に還元するべく、医学部附属病院におけるホルター心電図解析アルゴリズムへの応用も試みつつある。完全置換型の全人工心臓による長期慢性動物実験においては、平均動脈圧の慢性的な上昇、中心静脈圧の上昇、甲状腺ホルモンの異常等、加齢に伴う循環動態の慢性的な変化が加速して発現することが世界中の人工心臓研究施設で報告されている。そこで、平成13年度にはこれらの結果と、平成11-12年度に行われてきた動物実験の経験の蓄積を応用して成山羊を用いて慢性動物実験を行い、各種人工臓器を装着し、時系列データのカオス解析によって加齢現象解析のための時系列データの蓄積と同時に最新の非線形力学理論を応用した解析の試みを行った。すなわち無拍動、拍動、高周波振動流などの各種人工心臓の慢性動物実験を行い、覚醒状態で心拍変動や動脈圧、右房左房の圧時系列曲線や人工心臓拍出量などを慢性的に長期的に連続記録し、解析を進めている。
磁性超微粒子を用いるIntracellular Hyperthermia

昭和62年度の計画において、500KHZ帯の誘導加温装置を用い、Fe Iron Metal(200mesh)、SUS 430LAN(100mesh)、MnZnフィライト、3C、Fe_3O_4などの励起状態について報告した。すなわち、Fe_3O_4、Fe Iron Metal、SUS 430LANついで3Cが高い励起率を示し、Fe_2O_3、MnZnフィライトは低い励起率にとどまった。今回のin vivoの実験ではAH60C(ラット腹水肝癌)の腹水腫瘍を用い、40日後の延命率ではコントロール群がすべて20日前後で死亡したのに比して、Fe Iron Metal、Fe_3O_4は66%と高く、3Cは40%であった。腹腔内のAN60C細胞を組織学的に検討し、細胞内磁性体の存在を確認できた。この磁性微粒子は腹腔内や腫瘍組織内において凝集したり、分布が均一にならないなどの欠点を有し、効果が不確実になることが判明した。また代謝性が極めて悪いなどの特徴がある。昭和63年度は主に、この欠点を補うためデキストランと金属磁性体との複合体デキストランマグネタイトを用いて実験を試みた。このデキストランマグネタイトは1mlあたりFe207mg、デキストラン84mgで、大きさは80100〓と小さく、急性毒性は極めて低い。血清中でも凝集することなく、静脈内、腫瘍組織内、ことに動脈内でも使用できる極めて安定性がよい磁性超微粒子である。このデキストランマグネタイトの1.25%、2.5%の励起率を前記した微粒子と比較したところ更に能率よい励起性を示した。AH60Cを用いたin vivoの腹腔内投与を試みたところ、コントロール群の生存日数が13.6±2.6日であったのに比して、1回加温群は18.2±5.8日、2回加温群では20±4.2日と更に延命した。今回用いた磁性微粒子デキストラン複合体はコロイド安定性に優れ、生体内での特定組織への均一分散性が良好であり、従って温熱効率がよいことより今後温熱療法に広く応用できることが期待できた。磁性超微粒子を用いる細胞内加温治療の基礎的実験を本年購入した高周波リニアアンプを接続し,高エネルギーのもとで施行し,以下の結果を得た.用いた超微粒子は,Fe Iron Metal(200mesh),SUS430LN(100mesh),MnZnフェライト,3Cフェライト,Fe_3O_4およびFe_2O_3である.方法としては周波数500KHzの誘導加温装置でアプリケータとしてはパンケーキ型コイル(4巻)を用いた.ファントムとしてはInvitro実験では寒天ファントムで磁性体をそれぞれ32,16,8,4,2%となるように混合せしめた. Invionで実験ではラットの腹水肝癌AH60Cを用い,60%グルコースにFe_2O_4,Fe Iron Metalを50mg/ml/ratとし3Cでは50mg/ml/ratと500mg/ml/ratとし腹腔内に注入し,癌細胞が〓食しているのを確認し,加温は24時間および96時間後に40°C以上,10分間を目標に印加し,腹水肝癌ラットの延命率を検討した.

Invivoの実験では3Cが良好な励起を示し,印加時のラット腹壁の温度分布をサーモグラフ下に確認した.延命率の検討においては,最も著明な延長を示してのはFe Iron Metal,Fe_3O_4の注入された腹水肝癌群でその40日後の生存率は66%(4/6)を高く,3Cでは50mg/ml/rat群において40%(2/5)の生存率を得た.コントロール群はすべて20日前後で死亡した.注入直後,第一回目印加後,第2回目印加すに腹水貯癌細胞を組織学的に,細胞内磁性〓の存在を検討したところ,24時間ですでにほとんどの癌細胞内に粒子が存在し,加温が有効に作用し得ることを示唆していた.今回用いた微粒子で興味を引くのは3Cフイライトであり,Tc=43°Cと異常高温になる危険はなく臨床応用に一歩近づいたと考えている.昭和62年度の計画において、Fe Iron Metal、SUS430LAN、MnZnフェライト、3C、Fe_3O_4などの励起状態を報告した。この内で、3C、Fe_3O_4のInvivoのラット腹水腫瘍AH60Cにたいする誘導加温後の40日後の生存率では、コントロール群がすべて40日以内に死亡したのに比較して、Fe_3O_4で66%、3Cでは40%が生存していた。しかし、これらのSubmicron particleは腹腔内投与時、凝集し分布が不均一になることが明らかになり、その結果、効果が不確実となることが判明した。この不均一を解決するため新たな強磁性体として、我々はFe_3O_4の高い励起性を生かし、凝集性のない、均一分散性を有するsubmicron particleの研究に取り組み、デキストランとFe_3O_4との複合体デキストランマグネタイトを作成し、初期の目的を達成することができた。新しく開発された複合体デキストランマグネタイトは、分散性がよく、血清中でも24時間以上凝集することがないことを認めた。1mgあたり、Feを207mgを含み、デキストランを84mg、その大きさは80100mg程度であった。生理食塩水中での1.25%と2.5%の励起率をFe Iron Metalと3Cと比較したところ、更に良好な励起率を認めることができた。AH60Cを用いたIn vivoの腹水腫瘍にたいする誘導加温後の延命率を検討したところ、コントロール群の生存日数が平均13.6±2.6日であったのに比較して、1回加温群では18.2±5.8日、2回加温群では20.7±4.2日と更に延命し得た。腹腔内の分散性においても均一に、凝集することがなくコロイド安定性にすこぶる優れていることがIn vivoにおいても証明できた。今後の誘導加温による温熱療法にとって、より優れた、温熱効率のよい、臨床に応用できるSubmicron particleとして期待できることがはっきりした。
キメラ型腫瘍融解性ウイルスとその細胞デリバリー系を用いた消化器固形癌の治療

難治性の消化器固形腫瘍に対する治療成績の向上は、癌治療における大きな課題の一つである。そこで生体の免疫応答を抑制しがちな従来の化学療法、放射線療法とは異なり、その可能性のないアデノウイルスを用いた殺細胞効果を検討した。すなわち、細胞傷害活性を有する同ウイルスの増殖を腫瘍細胞特異的に惹起し、正常細胞を傷害せず、腫瘍のみに細胞死を誘導しようとするものである。また腫瘍選択的な抗腫瘍効果をウイルスの改変で増強しうるかどうか、さらに抗がん剤との併用効果の有無についても検討した。そこで生体の免疫応答を抑制しがちな抗がん剤、放射線療法とは異なり、その可能性の少ないアデノウイルスを用いて、当該ウイルスによる細胞傷害活性化能を応用した殺細胞効果を検討した。そのために、膵がんにおいて転写活性化能の優れた調節領域で当該ウイルスのE1領域遺伝子の発現を制御し、かつ当該腫瘍において,遺伝子導入効率の高いCD46分子を細胞受容体とするタイプ35型ウイルスのファイバー・ノブ領域を使用したキメラ型ウイルスを構築した。これらのウイルスは、いったん腫瘍に感染すると、ウイルスの増殖や感染細胞の細胞周期を調節するE1AおよびE1B初期転写産物を当該腫瘍内で発現させることが可能であり、事実腫瘍細胞でのウイルスの増殖とそれに引き続く細胞死が惹起された。また、腫瘍細胞に特異性を有して細胞死を誘導するMDA-7(インターロイキン24)を発現するアデノウイルスを使用して、膵がんに対する抗腫瘍効果について検討した。また、従来の抗がん剤(5-FU,CDDP,MMC,VP-16)との併用効果も合わせて検討した。その結果、当該ウイルスはおもにG2/Mにおいて細胞周期を停止させたが、抗がん剤の作用する細胞周期はさまざまであった。しかも両者の併用によっては有意な相乗効果、相加効果とも観察されなかった。しかし、MDA-7を発現しうるアデノウイルスに感染させた後、熱ショック蛋白であるHSP90阻害剤を作用させると、MDA-7の発現レベルが上昇し、殺細胞効果が向上する可能性が示唆された。難治性の消化器固形腫瘍、とりわけ膵癌に対する治療成績の向上は、当該疾患にわける重要な課題である。そこで本研究では従来の治療法とは異なり、アデノウイルスの細胞傷害活性を利用した手法を検討した。すなわち、ヒト膵がん細胞で活性を有する転写調節領域を用いて、当該ウイルスの増殖に必須のE1A遺伝子の発現を制御しうるウイルスを作成し、その抗腫瘍効果を検討した。しかし従来より頻用されているウイルスベクターはタイプ5型であり、ヒト膵がんにおいてしばしば当該ウイルスの受容体が低下することから、同細胞傷害性ウイルスによる抗腫瘍効果が低下すると考えられた。そこで、ヒト腫瘍で高発現のCD46分子を受容体とするタイプ35型ウイルスを使用すれば、抗腫瘍効果は維持されるはずであり、このため受容体結合領域であるファイバー・ノブ領域をタイプ35型としたキメラ型ウイルスを構築した。両者の抗腫瘍効果を比較すると、キメラ型のウイルスの方が、従来のタイプ5型のものに比較して、より高い効果を惹起することが判明した。また、使用した膵がん細胞はすべてp53がん抑制遺伝子の変異があったが、当該遺伝子を発現するタイプ5型ウイルスを用いても、ほとんど殺細胞効果がみられなかった。しかし、上記キメラ型で細胞傷害活性を有するウイルスと併用すると、両者は相加効果を示すことが判明した。また、腫瘍の細胞死を誘導するMDM-7遺伝子を発現するタイプ5型アデノウイルスと上記のキメラ型ウイルスを併用しても、やはり両者は相加効果を誘導した。したがって、キメラ型ウイルスは細胞受容体の異なるタイプ5型ウイルスの遺伝子導入ベクターと併用することが可能である。