hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱帯アジアにおける新規飼料資源の発掘と実用化

4期での乾物消失率の変化は、Brachiaria brizantha(4651%)、Brachiaria dictyoneura(4149%)、Pennisetum purpureum(4954%)が小さかった。いずれの消失率とも、暑雨期や涼雨期に最高を示す資源が大半で、4期を通してPaspalum atratumとPennisetum purpureumが高く、Imperata cylindricaが低い傾向を示した。ネパールにおける研究:飼料利用が見込まれる地場資源を涼乾期と暑乾期に合計75種類採取した。ムスタン郡南部における繁殖用雌ヤクの一般血液性状と血漿中ミネラル濃度から、特に血漿中アルブミンと銅の濃度が年間を通じて低いことが示された。タイにおける研究:グルタミン酸発酵副生液(KPPおよびAYT)の添加が第一胃発酵特性に与える影響を粗飼料給与(実験1)および濃厚飼料多給(実験2)条件を想定したin vitro培養系にて評価した。実験1でガス発生量はAYT区が尿素区より高かった(p<0.05)。DMおよびNDFom消化率はKPP区がAYT区より低かった(p<0.05)が無添加区より高かった(p<0.05)。実験2でガス発生量はKPP区が尿素区および無添加区より高かった(p<0.05)。DM消化率はKPP区およびAYT区で尿素区より低かった(p<0.05)が無添加区と差がなかった。また、両条件でガス発生量は尿素添加に伴い低下し、添加物と添加量の交互作用がみられた(p<0.05)。以上よりKPPおよびAYTは家畜飼料の窒素源として利用可能であり、粗飼料基質条件下ではAYTが、濃厚飼料基質条件下ではKPPがよりルーメン発酵を活性化させることが示唆された。ネパールにおける研究:ネパール中部の丘陵地域でLime種またはParkote種の水牛を飼養する小規模農家を対象に飼料利用が見込まれる地場資源として、涼乾期に採取した合計82種類の試料の栄養成分とin vitro消化率を分析した。粗タンパク質含有率はFicus glaberrimaが約16%と比較的高い一方、Oryza sativaが約2%と低かった。中性デタージェント繊維(NDF)含有率はZea maysが約96%と高く、Ficus clavataが約50%と低かった。消化率は、乾物、有機物およびNDFの消化率がZea maysで高く、Eleusine coracanaやBrassiopsis hainlaで低いことが明らかとなった。タイにおける研究では、26年度に行った食塩部分を核酸系調味料副生液(DML)に代替した試験と、キャッサバデンプン粕とビール工場から産出する液状ビール酵母を組み合わせて保存・飼料化することに関するin vitro消化試験の結果を基に、学術論文を作成している。また、グルタミン酸発酵副生液の添加が第一胃発酵特性に与える影響に関するin vitro培養系による評価を順調に行った。27年度に行った26年度に行ったフィリピンにおける地場飼料資源については、異なる時期による成分や消化性の変化を分析中である。また、in vitro分析の際に得られた培養液中の揮発性脂肪酸の分析を予定している。さらに、ネパールでの地場飼料資源の試料採取は、当初の予定どおり実施し、暑乾期における試料採取ができた。現在、採取した試料の栄養成分と山羊のルーメン液を用いたin vitroでの乾物、有機物および中性デタージェント繊維の消化率の分析に向けた調整を実施中である。
キメラ抵抗性遺伝子を用いたウイルス・卵菌類複合抵抗性の分子機構の解明

RCY1とRPP8は、キュウリモザイクウイルス(CMV)とアブラナ科べと病菌の抵抗性を支配する対立遺伝子である。RCY1、RPP8、および両遺伝子の各ドメインを交換したキメラ遺伝子を、N. benthamiana葉で一過的発現し、抵抗性発現を解析したところ、CMVに対する抵抗性応答には、RCY1タンパク質のLRRドメインが関与していた。次に、両遺伝子の発現制御機構の解析では、いずれもイントロンが、RCY1とRPP8タンパク質の高蓄積と病害抵抗性の増強を決定していた。抵抗性タンパク質の機能ドメイン解析とその蓄積量の制御に関わるこれらの新知見は、病害抵抗性の分子基盤の理解に寄与する。病害抵抗性を制御する抵抗性遺伝子が単離されているが、その遺伝子がコードするRタンパク質の機能と抵抗性の分子機構は未だに明らかではない。研究代表者が独自に単離・研究してきたRCY1/RPP8抵抗性遺伝子座は、Coiled-coil(CC)-nucleotide-binding site(NB)-eucine-rich repeat(LRR)ドメインをもつRタンパク質をコードしており、その対立遺伝子がウイルスと卵菌類の抵抗性遺伝子(RCY1とRPP8)に分化している。本年度は、キメラRCY1/RPP8遺伝子を構築し、Agroinfiltration法による一過的遺伝子発現法と同遺伝子を導入した形質転換植物を作出し、病原体応答の特異性を決定する機能ドメインの解析を行った。その結果、(1)CMV(Y)接種Nicotiana benthamiana(Nb)葉でRCY1を一過的に発現させると、過敏感反応(HR)抵抗性が誘導されたが、対立遺伝子であるべと病菌抵抗性遺伝子RPP8を同様に発現させてもHR抵抗性は誘導されなかった。(2)HAタグを付加したRCY1(RCY1-HA)とRPP8(RPP8-HA)の間で、CCまたはLRRドメインを相互に交換したキメラを作製し、同様にNb葉で発現させたところ、RCY1のLRRドメインをもつキメラのみがHRを誘導した。したがって、LRRドメインとCMV(Y)が相互作用することにより、防御応答システムが誘導されることが示された。また、(3)RCY1のLRRドメインをもつキメラ遺伝子を発現する形質転換植物は、同様にCMV(Y)抵抗性を示した。さらに、(4)Nb葉における同キメラタンパク質の蓄積について、HAタグ抗体を用いて調べたところ、HR誘導と同タンパク質の自己分解に明瞭な相関が認められた。防御システムの活性化に伴って、抵抗性タンパク質RCY1の自己分解が誘導されることが明らかになった。研究代表者が独自に単離・研究してきたRCY1/RPP8抵抗性遺伝子座は、CC-NB-LRRドメインをもつRタンパク質をコードしており、その対立遺伝子がキュウリモザイクウイルス(CMV)とアブラナ科べと病菌(Hpa)の抵抗性遺伝子(RCY1とRPP8)に分化している。本年度は、(1) RCY1とRPP8のLRRドメインを相互に交換したキメラRCY1/RPP8遺伝子(RPRPCYとCYCYRP)に加えて、RCY1とRPP8のLRRドメイン内で部分的にアミノ酸置換を誘導したキメラRCY1/RPP8遺伝子を5種類構築した。(2)得られたすべてのベクターコンストラクトを用いて、アグロインフィルトレーションによる一過的遺伝子発現法により、病原体応答の特異性を決定する機能ドメインの解析を行ったところ、RCY1タンパク質のLRRドメイン内には、CMV系統に特異的認識に関わる領域、過敏感細胞死に関わる領域、RCY1タンパク質の自己分解に関わる領域などが存在する可能性が示唆された。さらに、(3)キメラRCY1/RPP8遺伝子(RPRPCYとCYCYRP)形質転換したシロイヌナズナを作成し、CMVとHpaに対する応答を解析したところ、LRRドメインの相互置換により、両病原体に対する抵抗性応答も入れ替わることが明らかになった。また、野生型RCY1、野生型RPP8、キメラRPRPCYをそれぞれ形質転換したNicotiana benthamianaを作出し、CMVに対する応答を解析したところ、野生型RCY1およびRCY1のLRRドメインをもつRPRPCY形質転換体では抵抗性応答が生じ、野生型RPP8形質転換体では罹病性応答が誘導された。このことから、LRRドメインによるCMV認識と抵抗性誘導は、ナス科のN. benthamianaでも生じることを見出した。キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]抵抗性遺伝子RCY1とアブラナ科べと病菌分離株Emco5抵抗性遺伝子RPP8は、CC-NB-LRR型抵抗性タンパク質をコードする対立遺伝子である。

RCY1とRPP8抵抗性遺伝子、およびRCY1-RPP8間で各ドメインを交換した10種類のキメラ抵抗性遺伝子を、アグロインフィルトレーション法によりNicotiana benthamiana葉で一過的に発現し、過敏感細胞死を指標とした抵抗性発現の誘導を解析したところ、CMV(Y)に対する抵抗性応答には、RCY1のLRRドメインが関与することが明らかになった。さらに、キメラ抵抗性遺伝子を形質転換したシロイヌナズナを用いて同応答を解析したところ、RCY1タンパク質のLRRドメインの全体構造がCMV(Y)抵抗性誘導に重要であることを確認することができた。また、べと病菌分離株Emco5に対する応答を、同キメラ抵抗性遺伝子を発現するシロイヌナズナを用いて解析したところ、べと病菌抵抗性は、CC-NBドメインがRCY1でLRRドメインがPRR8に由来するキメラタンパク質の発現では誘導されず、RPP8タンパク質の全体構造が必要であることが明らかになった。次に、これまでの研究でRCY1遺伝子の高発現によるCMV抵抗性の増強を見出していることから、RCY1とRPP8遺伝子の発現を制御する機構について解析したところ、両遺伝子とも、イントロンの存在がRCY1・RPP8タンパク質の高蓄積(Intron-mediated enhancement)とそれに伴う抵抗性の増強に関わっていることが明らかになった。抵抗性発現を決定している抵抗性タンパク質の機能ドメイン構造と蓄積量制御に関わる知見は、病害抵抗性の分子基盤の理解に寄与するものと言える。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。キュウリモザイクウイルス(CMV)とアブラナ科べと病菌(Hpa)の認識特異性が、RCY1とRPP8タンパク質のLRRドメインであることが明らかにされたことから、おおむね順調に進展していると判断できる。RCY1とRPP8のキメラタンパク質の機能解析から、キュウリモザイクウイルス(CMV)に対する認識特異性と抵抗性誘導が、LRRドメインの全体的な構造により決定されていることが明らかになった。一方、CMV(Y)とCMV(B2)のキメラ外被タンパク質の機能解析から、CMV(Y)外被タンパク質のN末端構造が、RCY1による抵抗性誘導に関わっている可能性を見出したことから、おおむね順調に進展していると判断できる。これまでの研究により、(a)CMV抵抗性遺伝子(RCY1)とべと病菌抵抗性遺伝子(RPP8)のLRRドメインにより両病原体の認識特異性が決定される、(b)RCY1はCMV外被タンパク質(CP)とCPコードRNAの両方を認識し、抵抗性シグナル伝達系を活性化される、(c)RCY1のCC-NBドメインは転写因子WRKY70の相互作用を介して抵抗性シグナル伝達系を活性化させることを明らかにした。そこで今後は、(1)CMVのCPやCPコードRNAの認識特異性を規定しているLRRドメインのアミノ酸部位と高次構造の解析、(2)RPP8タンパク質のLRRドメインが認識するべと病菌エフェクタータンパク質の単離、(3)LRRドメイン内のRCY1/RPP8キメラ遺伝子シリーズを導入した形質転換植物を作出し、CMVおよびべと病菌に対する認識と応答を確認する。RCY1とRPP8のキメラタンパク質を発現する植物を用いて、アブラナ科べと病菌(Hpa)に対する抵抗性を制御しているドメインを決定する。
多角的計測に基づく歩行の環境適応メカニズムの計算論的理解

(1)運動中の脳活動は、運動の結果としての固有感覚処理に伴う脳活動を含むため、解釈には注意が必要である。そこで磁気刺激-fMRIの同時計測システムを応用し、表面筋電図の同時計測と末梢神経刺激により中枢神経系の活動を伴わない筋活動誘発条件を併用することで、運動に伴い発生する固有知覚入力量を補正することのできる脳機能イメージング手法を開発した。結果、運動閾値上の磁気刺激により誘発される脳活動の大部分は感覚処理ではなく誘発性脳活動であることが示された(投稿準備中)。(2)歩行の環境適応メカニズムを計算論レベルで理解するための基礎知識を得ることを目的として、歩行・姿勢制御課題中にバイオメカニクス的情報と脳活動を同時に測定することのできるシステムを開発した。歩行・姿勢制御に伴う動作解析のためピエゾ素子を使用した床反力計、歩行や姿勢課題時に懸念される動作ノイズに強いアクティブ電極による8チャンネル筋電図と高速カメラを統合した計測システムを構築した。脳活動の計測系としてトレッドミル歩行時の計測にも応用可能な近赤外線スペクトロスコピー装置を導入し、動作解析と脳活動の同時計測システムを完成させた。(3)経頭蓋直流電気刺激(tDCS)を下肢の一次運動野に適応することにより、健常被験者において下肢の筋力を一時的に促進しうることを初めて示した。神経リハビリテーションへの応用を目指し、tDCSが脳卒中後患者の下肢運動機能に与える影響を検討した。歩行障害患者の機能改善やリハビリテーションへ応用できる非侵襲脳刺激法の開発を目的として、頭皮上から弱い直流電流を通電させることで、一過性に脳機能を変化させる経頭蓋直流電気刺激(tDCS)を用いて下肢運動機能を向上させる予備的研究を開始し、tDCS陽極刺激により若年健常者の下肢の筋力を増強できるという有望な結果を得た。実際に歩行障害患者のリハビリテーションと併用し、リハビリテーションの効果を促進できるかどうかの検討を開始した。また、歩行などの運動課題中に計測される脳活動の解釈を深めるため、経頭蓋磁気刺激(TMS)、表面筋電図(EMG)と機能的MRIの同時測定系を用いて、一次運動野に様々な強度のTMSを与え、誘発筋電図とMRI信号変化を測定した。TMS刺激により、一次運動野だけでなく刺激部位から離れた補足運動野や刺激と反対側の小脳などにおいても、TMS強度に対して閾値下で線形的、閾値付近で非線形的に応答する脳活動が誘発されることを初めて示した(Cerebral Cortex印刷中)。引き続きEMG-fMRI同時計測下に、運動野TMS刺激条件、自発運動条件、末梢神経刺激による他動運動条件を加えて、運動計画・準備、運動生成、運動に伴って生じる固有感覚入力による運動野活動を分離する実験を行った。以上の結果は、歩行中に測定できる脳活動を各要素に応じて正確にモデル化するための貴重な基礎資料を提供すると考えられる。
メタラサイクルで安定化したチオラート鉄錯体による触媒的水素化反応の開発

前年度までの研究結果を踏まえて、平成30年度はチオラート鉄カルボニル錯体の安定性改善に向けた新規配位子の開発と錯体合成を中心に研究を進めた。1.キノリル基をもつベンゾチオフェン誘導体を配位子前駆体に用いて、N,C,S-三座のチオラート配位子をもつ二核鉄カルボニル錯体を合成した。さらに、ホスフィン類と反応させることにより、単核のN,C,S-ピンサー鉄(II)カルボニル錯体へと誘導した。ピリジル置換ジベンゾチオフェン誘導体を配位子前駆体とする従来の錯体では、メタラサイクル周辺のビフェニル骨格にひずみが生じるが、新規に合成した鉄(II)錯体のメタラサイクルは平面性が高く、大きなひずみは見られなかった。一方、新規鉄(II)錯体の酸化還元挙動は従来の錯体と類似しており、鉄(III)カルボニル錯体とすることで光誘起CO脱離反応による配位不飽和種の形成が期待できる。2.チオフェン誘導体を配位子前駆体とするメタラサイクル鉄錯体では、配位子の還元的脱離による分解を抑制することが課題となっている。そこで中央の炭素配位をN-ヘテロ環状カルベン(NHC)に変更した配位子を設計し、合成研究を進めた。硫黄ドナー部分をチオエーテルとして保護することで、硫黄ドナーと窒素ドナーをN-置換基とするイミダゾリウム塩を新規に合成した。次に錯体の合成を試み、前駆体となりうるNHC銀錯体を単離した。また、その銀錯体がN,C,S-三座配位子をもつ二量体構造をとることを明らかにした。3.N,C,S-ピンサー鉄(III)カルボニル錯体の光誘起CO脱離反応について、実験と計算の両面から研究を進め、成果を国際誌(Inorg. Chem.)に報告した。「メタラサイクルで安定化したチオラート鉄錯体による触媒的水素化反応の開発」に向けて、平成28年度は以下の研究成果を得た。(1)N,C,S-三座配位子とホスフィン配位子をもつチオラート鉄カルボニル錯体を合成し、その酸化還元挙動、電子状態、反応性について研究した。チオラート鉄(III)錯体としては初めての安定なカルボニル錯体を単離し、可視光照射による一酸化炭素放出挙動を明らかにした。この成果は著名な国際誌(Dalton Trans.)に速報として掲載された。さらに軸位のリン配位子をホスフィンからホスファイトに変更することで可視光照射による一酸化炭素放出挙動が大きく変化することを見出した。この要因を解明するため、これらの鉄錯体について計算化学による電子状態の解析を進めている。また、一酸化炭素放出後に生じる空配位座にイソシアニドを配位させて安定化することで、置換反応生成物の単離に成功した。(2)上記のチオラート鉄(III)カルボニル錯体と水素分子の光反応により、水素分子の活性化を試みた。対照実験との比較により水素分子との反応に起因する変化を検出したものの、反応後の錯体が不安定であり、満足のいく結果は得られなかった。現在、適した反応条件や酸化状態を検討すると同時に、四座配位子に拡張することでより安定なメタラサイクル鉄錯体を構築する研究を進めている。一方で、メタラサイクル構造をもつチオラート架橋二核鉄カルボニル錯体をジホスフィン架橋配位子で安定化した錯体を合成した。この錯体を水素雰囲気下で光照射することにより、ヒドリド架橋鉄錯体が生成することを見出した。N,C,S-三座配位子をもつチオラート鉄(III)カルボニル錯体の特異な安定性を明らかにし、本研究の基盤となる光誘起一酸化炭素放出挙動に関する基礎的知見を得ることができた。さらに研究を進めて軸配位子の効果を明らかにすると同時に、光誘起配位子置換反応についても研究を進めることができた。これらのチオラート鉄(III)錯体を用いた水素分子の活性化については、反応後の錯体の安定性が問題となることが分かったが、別のチオラート鉄メタラサイクル錯体において、水素分子活性化によるヒドリド錯体の生成を確認することができた。総合的に判断するとおおむね順調に進んでいるといえる。平成28年度の研究結果を踏まえて、平成29年度はチオラート鉄カルボニル錯体の安定性改善と光誘起一酸化炭素脱離機構の解明に向けた研究を行い、以下の研究成果を得た。(1)チオラート配位子をN,C,S-三座配位子からN,N,C,S-四座配位子あるいはP,N,C,S-四座配位子に変更し、それらの二核鉄カルボニル錯体を用いて、水素分子との反応を行った。水素雰囲気下、二核鉄錯体をジホスフィンとともに反応させることで、当初期待していたメタラサイクル錯体化学種とは異なるものの、ヒドリド種の生成を確認した。そこでアセトフェノンを基質として水素化反応を試みたが、現在のところ水素化生成物は得られておらず、反応条件を検討中である。また、S,N,C,S-四座配位子についても新規鉄錯体を合成し、国際誌(Polyhedron)に報告した。(2)単環チオフェンにキノリル基を導入した配位子前駆体を用いて、N,C,S-三座配位子をもつ二核鉄あるいは三核鉄カルボニル錯体を合成した。この反応において、硫黄に隣接する炭素上の置換基が脱硫反応を阻害するのに有効であることを明らかにした。

また、キノリル基を導入することでチオラートを含むメタラサイクル錯体が安定化されることがわかった。この成果を国際誌(Organometallics)に報告した。現在、二核鉄錯体とホスフィン類の反応によりN,C,S-ピンサー鉄カルボニル錯体の合成を進めている。(3)配位不飽和錯体形成の鍵となる光誘起CO脱離反応について、実験と計算の両面から研究を進めた。照射光の波長と反応量子収率の関係を調査し、軸位のリン配位子のπ受容性増大が有効励起波長の長波長化に有効であることを明らかにした。また、DFT計算の結果を含めて総合的に解析することで、CO脱離に有効な遷移の帰属を行った。N,C,S-ピンサー鉄(III)錯体の光照射によるCO脱離反応について、実験と計算の両面から研究を進め、軸配位子のπ受容性と有効な遷移の関係を解明することができた。この成果は今後の分子設計において非常に有用な指針となる。一方、水素化反応に関しては、ヒドリド錯体の生成は認められるものの、触媒的水素化反応には至っていない。そこでチオラートメタラサイクル錯体の安定性を改善するため、新規配位子を用いた鉄錯体の開発を進め、その一部を論文として報告することができた。総合的に判断すると、おおむね順調に進んでいるといえる。前年度までの研究結果を踏まえて、平成30年度はチオラート鉄カルボニル錯体の安定性改善に向けた新規配位子の開発と錯体合成を中心に研究を進めた。1.キノリル基をもつベンゾチオフェン誘導体を配位子前駆体に用いて、N,C,S-三座のチオラート配位子をもつ二核鉄カルボニル錯体を合成した。さらに、ホスフィン類と反応させることにより、単核のN,C,S-ピンサー鉄(II)カルボニル錯体へと誘導した。ピリジル置換ジベンゾチオフェン誘導体を配位子前駆体とする従来の錯体では、メタラサイクル周辺のビフェニル骨格にひずみが生じるが、新規に合成した鉄(II)錯体のメタラサイクルは平面性が高く、大きなひずみは見られなかった。一方、新規鉄(II)錯体の酸化還元挙動は従来の錯体と類似しており、鉄(III)カルボニル錯体とすることで光誘起CO脱離反応による配位不飽和種の形成が期待できる。2.チオフェン誘導体を配位子前駆体とするメタラサイクル鉄錯体では、配位子の還元的脱離による分解を抑制することが課題となっている。そこで中央の炭素配位をN-ヘテロ環状カルベン(NHC)に変更した配位子を設計し、合成研究を進めた。硫黄ドナー部分をチオエーテルとして保護することで、硫黄ドナーと窒素ドナーをN-置換基とするイミダゾリウム塩を新規に合成した。次に錯体の合成を試み、前駆体となりうるNHC銀錯体を単離した。また、その銀錯体がN,C,S-三座配位子をもつ二量体構造をとることを明らかにした。3.N,C,S-ピンサー鉄(III)カルボニル錯体の光誘起CO脱離反応について、実験と計算の両面から研究を進め、成果を国際誌(Inorg. Chem.)に報告した。N,C,S-三座配位子をもつチオラート鉄メタラサイクル錯体の酸化還元挙動と電子状態の解明については順調に進展しているので、引き続き様々なリン配位子もつ鉄(II)、鉄(III)カルボニル錯体を合成し、その置換反応生成物とあわせて、実験と計算化学の両面から研究を進める。これらの鉄錯体を用いた水素分子活性化については、反応条件や配位子設計を再検討することで問題点の解決を図る。ヒドリド種の生成を見出した二核鉄錯体については触媒反応への展開を試みる。水素分子との反応によりヒドリド種が生成した錯体については、さらに反応条件を検討し、触媒的水素化反応への展開を図る。
テレビジョン撮像管技術に基づく電子走査型実時間ナノ分解能光学顕微鏡の開発

過去のものとなったテレビジョン撮像管技術を現代のナノ材料・ナノ計測技術で蘇らせ、表面近傍の光学像を分解能62nm、無染色で撮像する電子走査型超解像光学顕微鏡を開発した。光電子放出に伴う蓄積帯電電荷を読み出すアイコノスコープ方式と、蛍光点を走査して試料を照明するフライングスポットスキャナ方式の構築を目指した。前者については研究期間内に完成形を示すことはできなかったが、後者は市販の走査電子顕微鏡に組み込めるユニットの開発まで成功した。生きた細胞の観察を可能とする環境セルを開発し、位相物体が無染色で撮像できる原理がパーセル効果に由来することを明らかにし、実際に生きたままのヒト肺細胞の観察に成功した。本研究では、過去のものとなったテレビジョン撮像管技術を現代のナノ材料・ナノ計測技術で蘇らせ、表面近傍の光学像を分解能数10nm、無染色で実時間撮像する電子走査型超解像光学顕微技術へと発展させることを目指している。具体的には、光波長よりもはるかに薄い撮像面上に置かれた対象物を照明し、裏面から電子ビームで光波長よりもはるかに小さな空間分解能で走査することにより、近接場光強度分布を電子的に読み出す、これまでにない超解像光学顕微鏡を構築する。当該年度は、システムの基本部分の構築に時間を費やし、現実の撮像原理の確認には至らなかった。その代わりに、2年目、3年目に計画していたものの内、並行してできる課題を前倒しで進めた。具体的には、走査電子顕微鏡の電子線走査を外部から完全制御し、1ofAの分解能で撮像面から流れ出る電流を測定できるシステムを構築した。また、光ファイバを介して走査電子顕微鏡外部から試料室に照明光を導入できる光学系を構築した。さらに、撮像面試料を試料室全体の真空を破ることなく短時間で位置再現性良く交換できる機構を開発した。これにより、今後開発する各種撮像面の光電流特性を再現性良く比較するための基本測定系はほぼ完成したと考えている。さらに、実際の電子線走査による光学像取得の実現可能性を確認するため、フライングスポットスキャナ方式による近接場像取得を試みた。具体的にはSiNメンブレンに蛍光色素を塗布し、その上を電子線走査することで、直径100nm程度のナノ粒子の影絵として画像が取得できることを予備的に確認した。並行して、マックスウェル方程式に基づいた光学分解能の検証を開始した。モンテカルロ法による電子ビーム散乱の解析も開始した。将来重要な基本要素となる環境セルの試作も進め、その上に付着させる細胞の扱いの習得も進めた。当該年度は、前年度に構築していた電子ビーム走査系、真空下試料交換機構、微小電流測定系、光ファイバ入出力系を利用したフライングスポットスキャナ方式による超解像光学顕微鏡システムを完成させた。撮像面にはSiNメンブレンに有機蛍光色素膜を塗布したものを用い、上面に電子ビームをスポット照射し、下面に試料を付着させる。様々な屈折率のナノ粒子を観察し、回折限界を超える62nmの分解能が得られることを示した。また、モンテカルロ法による電子ビーム散乱特性、マックスウェル方程式によるダイポール放射特性の解析により、像形成機構を明らかにし、得られた画像の様々な特徴が理論的に説明できることを示した。さらに、上記発光メンブレンを真空と大気環境を隔てる隔壁として用い、内部に細胞を生きたまま密閉できる環境セルユニットを完成し、生きた細胞を無染色で回折限界を超える分解能で観察できることを実証した。観察後にも細胞が生きたままであることは観察後に生死判定蛍光染色法により確認した。以上の成果について、特許出願、論文発表を行った。

昨年度までに、本研究で構築した電子ビーム走査系、真空下試料交換機構、微小電流測定系、光ファイバ入出力系を利用したフライングスポットスキャナ方式による超解像光学顕微鏡システムを完成させ、また、内部に細胞を生きたまま密閉できる環境セルユニットを完成し、生きた細胞を無染色で回折限界を超える分解能で観察できることまで実証していた。当該年度は、蓄積型撮像管方式への移行に向けて、AgまたはAuナノ粒子の紫外光による光電子放出の結果、基板との間で形成される微小コンデンサに電荷蓄積が起こるか、さらに、それを電子ビーム走査、微小電流測定により検出可能かを明らかにすることを目標としていた。見通しの良い系で検証を進めるため、微細加工により制御されたAuナノ粒子アレイを極薄誘電体膜上に作製した。深紫外光による光電効果による電荷蓄積の代わりに、適切な加速電圧の電子ビームによる予備走査で電荷蓄積状態を作っておき、それを電子ビーム走査時の微小電流により読み出す方式を試みたが、現時点で有意なレベルの信号を得るに至っていない。実験は研究期間終了後も引き続き継続している。一方、数値計算による超解像画像取得の原理検証に関しては、予定していたソフトウェア環境を整備し、超解像画像の取得が可能との結果を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。複合新領域26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した計画の内、具体的な撮像面構成としてAgナノ粒子を用いたアイコノスコープ型あるいは光導電性半導体膜を用いたビジコン型を採用し、撮像面の照明に対して、電子ビーム走査に対応して撮像面から流れ出す電流が現実に得られるかどうか、吸収性物体として表面に散布したAuナノ粒子などの強度分布が実際に画像化できるか、の検証に至らなかった点、その結果、対外的な発表に至らなかった点でこのように評価した。しかしながら、システムの構築は計画通りに達成し、さらに、次年度以降に計画していた環境セルの試作も進め、その上に付着させる細胞の扱いの習得を前倒しで進めた点、システムの検証のためにフライングスポットスキャナ方式による近接場像取得を試み、直径100nm程度のナノ粒子の画像化を確認できた点では計画よりも進展している。前年度はシステム構築に終始した点で遅れていると判断したが、並行して前倒しで進めていた各種シミュレーション手法の習得、細胞の取扱い技術の習得、環境セルの開発のすべてが有機的に結合し、1つの電子ビーム走査型顕微鏡システムとして結実したことをもって、遅れを挽回したと判断した。極薄撮像メンブレンと極微小電子ビーム走査による近接場光学撮像という抜本的なアイデアの実証には成功したが、これはあくまでも通過点であり、本研究で究極的に目指す直積型撮像膜(AgあるいはAu粒子を用いたアイコノスコープ方式、光導電性半導体膜を用いたビジコン方式)のいずれでもない。その点で計画以上の進展とは見なせない。今後は、初年度に構築した基盤要素を用いて、いよいよテレビジョン撮像管方式による光学像が取得可能かどうかの実験に移る。具体的には、最初にAgあるいはAu粒子を用いたアイコノスコープ方式に着手する。また、数値計算による超解像画像取得の原理検証を進める。電子ビーム散乱については、初年度に、散乱領域が計画前に想定していたよりも大きいことが明らかになりつつある。
金属タンパク質の分布測定を指向した多次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の開発

「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているのかを計測する」ことは重要であるが非常に困難である。そこでこれを実現するために新規なポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を開発した。一つは汚染金属イオンをタンパク質の分離場から高度に除去可能な汚染金属イオンスウィーピングPAGEであり,もう一つはゲル分画中の超微量金属イオンを検出可能な金属検出PAGEである。さらに金属タンパク質だけを試料から単離可能なホロ/アポ変換二次元MICS-PAGEの開発にも成功した。これらの新規PAGEによって生体試料中の新規金属タンパク質を発見することにも成功した。本課題では,「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているか」を計測するためのゲル電気泳動法を基盤とした簡易で高感度なスペシエーション技術を確立することを最終目的とする。本年度は,これまで検出困難であった置換活性なタンパク質結合型金属イオンの検出をするために,金属タンパク質からの金属解離(分解)を抑制した「ソフトな分離場」の開発を行った。まず,解離不活性なカチオン性およびアニオン性錯体を形成する配位子を利用し,分離系に存在する汚染金属イオンの電気泳動的な掃引による新規汚染金属除去法(双極方向汚染金属スウィーピング法,MICS)を考案した。汚染金属イオンが存在すると,バックグラウンド信号が大きくなり,ppb以下で存在するタンパク質結合型金属の検出が不可能になる。さらに汚染金属のタンパク質への誤取り込みや金属置換反応による解離反応の促進が起きてしまう。そのため,これまで低濃度で存在するタンパク結合型金属イオンを分離検出することは非常に困難であった。しかし,MICS-ブルーネイティブ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(MICS-BN-PAGE)を低温化で用いることにより,汚染金属が分離場に存在せず(一桁pptレベル以下),かつタンパク質が泳動中に汚染金属と一切接触せずに分離できる系の構築に成功した。このMICS-BN-PAGEで分離したゲル分画中の金属イオンを酸溶出し,金属蛍光プローブを用いる金属検出PAGEによりppb以下のタンパク質結合型銅イオンを明確に検出できることが分かった。この方法を血清試料に用いたところ,従来は金属解離してしまうため検出が困難であったアルブミン結合型銅イオンの検出に成功し,血清中銅イオンの分布が明らかとなった。本課題では,「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているか」を計測するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を基盤とした簡易で高感度なスペシエーション技術を確立することを最終目的とする。本年度は,前年度に開発に成功した汚染金属イオンスウィーピング(MICS)-ブルーネイティブ-(BN)-PAGE/金属検出PAGEシステムを用いて紅色光合成細菌のペリプラズム空間試料中の銅イオンの分布の計測を試み, CopIタンパク質が新規銅結合性タンパク質であることを明らかにした。このことは,MICS-BN-PAGEが新規金属タンパク質(メタロタンパク質)の同定手法として有用であることを示している。MICS-BN-PAGEではホロ型(金属結合型)とアポ型(金属解離型)タンパク質で異なる位置にメタロタンパク質が泳動されることが分かっているが,この現象を利用して一次元目でMICS-BN-PAGEを行い,ゲル中のメタロタンパク質から金属イオンを溶離させてアポ型へと化学種変換し,その後,二次元目として再度MICS-BN-PAGEを行うホロアポ変換-二次元MICS-BN-PAGEの開発を行った。この方法では原理的にホロ型のメタロタンパク質だけが対角線上から外れて泳動されるはずである。そこで鉄結合性タンパク質のトランスフェリン(Tf)および銅結合性タンパク質であるCpとスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)のホロおよびアポ型タンパク質の混合溶液を,このホローアポ変換二次元MICS-BN-PAGEに用いたところ,実際にホロ型タンパク質を二次元図の対角線上から単離することに成功した。今後はこれらのメタロタンパク質に結合していた金属イオンを金属検出PAGEで検出できるかを検討すると共に,および実試料中のメタロタンパク質の測定が出来るかを試みる予定である。本課題では,「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているのか」を計測するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を基盤とした簡易で高感度なスペシエーション技術を確立することを最終目的とする。前年度までに汚染金属イオンスウィーピング(MICS)-ブルーネイティブ(BN)-PAGE/金属検出PAGEシステムを確立し,実試料として紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusのペリプラズム空間試料中の銅イオンの分布計測を行い,その結果,CopIタンパク質が銅結合性タンパク質であることを初めて見出している。本年度は銅イオンを過剰に添加しないR.gelatinosus試料ではCopIが発現せず,かつその他の銅イオン結合性タンパク質も発現していないことを見出し,これらの知見を論文化した。さらに,カドミウムイオンを過剰に添加したR. gelatinosus試料中のカドミウムの分布を調査し,現在のところメタロタンパク質の同定には至っていないものの,カドミウムイオンがある特定のタンパク質分子量分画に局在化することを見出した。また,前年度から進めていたメタロタンパク質を単離するための二次元対角法であるホロ/アポ変換二次元MICS-PAGEの開発を推し進め,PAGEの分離様式としてBN-PAGEだけではなく,尿素-PAGEも効果的であることを見出した。ホロ/アポ変換二次元-MICS-尿素-PAGEによって鉄結合性タンパク質トランスフェリン(Tf)の4つの化学種(Fe2-Tf, Fe-Tf〔CローブおよびNローブ結合型〕,Tf)の単離に成功した。

また,ホロ/アポ変換-二次元MICS-BN-PAGEによって,銅イオンを過剰に添加したR. gelatinosusのペリプラズム空間試料中のCopIタンパク質の単離に成功し,ホロ/アポ変換二次元MICS-PAGEが実試料にも有効であることを実証した。「生体中微量金属イオンがどのタンパク質にどれだけ結合しているのかを計測する」ことは重要であるが非常に困難である。そこでこれを実現するために新規なポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を開発した。一つは汚染金属イオンをタンパク質の分離場から高度に除去可能な汚染金属イオンスウィーピングPAGEであり,もう一つはゲル分画中の超微量金属イオンを検出可能な金属検出PAGEである。さらに金属タンパク質だけを試料から単離可能なホロ/アポ変換二次元MICS-PAGEの開発にも成功した。これらの新規PAGEによって生体試料中の新規金属タンパク質を発見することにも成功した。当初の研究計画通りに,金属タンパク質に特化した二次元電気泳動法(ホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGE)が混合標準タンパク質試料に対して機能することを見出し,原理通りに機能していることが確認できた。また,昨年に開発した汚染金属イオンスウィーピング(MICS)-ブルーネイティブ-(BN)-PAGE/金属検出PAGEシステムが細菌試料に対しても有効に機能することを示すことにも成功し,新規金属タンパク質の発見に至っており,順調に研究は進展している。分析化学今後は,計画にあるホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGEに金属検出PAGEを統合し,メタロタンパク質を単離するだけでなく,そこに結合していた金属イオンの種類と量を計測できるホロ-アポ変換二次元-MICS-BN-PAGE/金属検出PAGEシステムの開発に挑戦する。さらにこれまでに金属検出PAGEで検出できなかった金属種を検出可能な蛍光プローブの開発も併せて行う予定である。研究の目的の一つである「金属タンパク質からの金属解離(分解)を抑制した「ソフトな分離場」の確立」を,「双極方向汚染金属スウィーピング法(MICS法)」によって達成した。これは,測定の妨害となる汚染金属を平衡論的および速度論的に安定な錯体に変換し,両極方向へ電気泳動的に掃引することで,ゲル中に汚染金属が侵入せず,さらに,汚染金属が除去された直後の非常にクリーンな分離場でタンパク質分離する新規電気泳動法である。MICS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)を用いると,血清中の銅イオンを結合しているタンパク質から解離させることなく分離可能であることが分かった。分離したゲル分画に含む微量銅イオンを金属検出PAGEで測定することにより,タンパク結合型銅イオンのスペシエーションが可能となった。その結果,従来の報告とは異なる銅イオンの正確な分布(99%セルロプラスミン,1%以下アルブミン)が明らかとなった。
ST2陽性Th2細胞に着目したステロイド抵抗性喘息の病態解明と新規治療の展望

申請者は、気道上皮細胞から産生されるインターロイキン33(IL-33)が好酸球性炎症を惹起することを示し、マウスを用いて1その機構の中心的細胞であるIL-33受容体(ST2)陽性Th2細胞の機能とステロイド抵抗性、2炎症に続く線維化(リモデリング)への関与を検証し、更には3ヒト肺検体でST2陽性Th2細胞を同定することを目的とした。【マウスモデルを用いた検討】我々は千葉大学免疫発生学講座との共同研究により、マウスの肺には恒常的にST2を発現するTh2細胞が常在し、IL-33の刺激により好酸球性炎症を直接的に惹起する事を免疫不全マウスにTh2細胞を移入する系を用いて証明した。さらにこのST2陽性Th2細胞はCD44high CD62LlowCD69highより組織常在型かつ記憶型T細胞のフェノタイプを示し、ステロイド存在下でも細胞数、サイトカイン産生ともに低下せずステロイド抵抗性を示す事を明らかにした。その機序としてIL-33によりMAPKが活性化されることから、p38を介して細胞内のステロイド受容体を阻害する機序が想定された。さらに線維化への関与ではST2陽性T細胞に加えてAmphiregulin産生CD103陽性T細胞が出現し、後者がより線維化に寄与することが示され更にRNA seqを行い機能解析を進めている。【ヒト肺検体を用いたST2陽性Th2細胞の検討】では、当学の倫理委員会で承認を得て(承認番号:遺18-変01)、我々は間質性肺疾患で手術をした症例の肺検体の一部を採取し、免疫染色でST2陽性Th2細胞の同定を開始した。ST2陽性Th2細胞は予備実験において慢性過敏性肺炎における気道周囲の集積が確認され、現在症例を蓄積し検討を進めている。【マウスモデルを用いた検討】は千葉大学免疫発生学講座との共同研究で進行しているが、申請者が自治医科大学所属であり遠隔地での実験のため、日程の都合等で物理的な遅れを生じている。【ヒト肺検体を用いたST2陽性Th2細胞の検討】当学の倫理委員会で承認を得て順調に解析を開始したが、ST2陽性Th2細胞の発現が見込める免疫機序を介した線維化を認める症例は一部であり、さらなる症例の集積が必要である。またST2抗体の染色性がやや弱く、最適な抗体について再度検証する。【マウスモデルを用いた検討】は千葉大学免疫発生学講座との共同研究で進行しており、研究分担者の平原に助力を仰ぎ、研究の推進を図る。【ヒト肺検体を用いたST2陽性Th2細胞の検討】予め間質性肺炎と診断されていない症例でも喫煙者や何らかの抗原暴露者では気道周囲には早期変化を呈している場合もあり、さらなる症例集積のため当院呼吸器外科に協力を依頼し当院で肺切除を行った症例から遍く肺組織を採取するように運用を変更し、症例の集積を推進する。また抗体の最適化を病理学講座とも相談し進める。

【マウスモデルを用いた検討】は千葉大学免疫発生学講座との共同研究で進行しており、研究分担者の平原に助力を仰ぎ、研究の推進を図る。【ヒト肺検体を用いたST2陽性Th2細胞の検討】予め間質性肺炎と診断されていない症例でも喫煙者や何らかの抗原暴露者では気道周囲には早期変化を呈している場合もあり、さらなる症例集積のため当院呼吸器外科に協力を依頼し当院で肺切除を行った症例から遍く肺組織を採取するように運用を変更し、症例の集積を推進する。また抗体の最適化を病理学講座とも相談し進める。購入予定であった顕微鏡を他資金より捻出可能であったため物品費が想定よりも減少した。次年度には繰越金を用いて免疫染色、フローサイトメトリーの抗体購入、肺組織検体の輸送用の物品、試薬を購入し、移送費も計上される予定である。
組換えウイルスを用いたウマヘルペスウイルス1型の病原性遺伝子の解析

ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)の強毒HH1株をウシ腎臓(BK)細胞で長期間連続的に継代して弱毒化されたBK343株では1番遺伝子(機能不明)、24番遺伝子(テグメントタンパク)および71番遺伝子(膜糖タンパク)に変異のあることをこれまでの研究で明らかにした。本研究では71番遺伝子の変異と病原性との関連を調べるために3種類の71番遺伝子の組み換えウイルスを作出して、その病原性をマウスモデルを用いて解析した。組み換えウイルスは相同組み換えにより、HH1株の71番遺伝子内にβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)遺伝子を挿入したもの(β-71株)とβ-71株の71番・β-gal結合遺伝子をBK343株の71番遺伝子あるいはHH1株の71番遺伝子に置き換えたもの(それぞれ、3F-71株,Res-71株)を作出した。これらのウイルスの生物性状を培養細胞を用いて検討したところ、ウイルス複製に大きな差はみられないものの、β-71株の細胞外へのウイルス放出量の減少傾向がみられた。また、組み換えウイルスのプラック形成能は、株化ウマ皮膚(E. Derm)細胞を用いるとすべてHH1株と同様であったが、BK343株ではプラックサイズは小さかった。これらのウイルスをマウスに経鼻接種し、マウス肺でのウイルス感染価を測定したところ、β-71株とBK343株の感染価はHH1株の約1/100であったが、3F-71株とRes-71株の感染価はHH1株とほぼ等しかった。以上の成績より、71番遺伝子産物は病原性に関与することが示唆された。しかし、HH1株の71番遺伝子をBK343株の71番遺伝子に置き換えた3F-71株では増殖能の低下が認められなかったことから、BK343株の病原性低下には71番遺伝子の変異以外の要因も関与していることが示唆された。現在、1番遺伝子と24番遺伝子について同様の検討を進めている。
戦後失業対策事業・失対労働者関係史料の整理・公開に関する研究

本年度は、全国の史料調査・ヒアリング調査と関西地域での史料調査とヒアリング調査を行った。全国の調査では東京都などでの調査を引き続き継続した。関西地域の資料館・文書館・大学図書館などで史料収集と写真撮影を継続的に行った。本年度の研究成果は、1「書評・藤野裕子『都市と暴動の民衆史』」(大阪歴史学会『ヒストリア』264号、2019年6月掲載予定)、2「書評・西川祐子『古都の占領』」(日本史研究会『日本史研究』掲載予定)口頭発表として、1「戦時下銃後奉公会の活動実態に関する覚書ー京都市正親銃後奉公会を事例にー」(社会福祉形成史研究会、2018年8月4日)2「社会大衆党の政治的基盤ー研究史の整理と課題ー」(法政大学大原社会問題研究所「無産政党資料研究会」2018年8月28日)3「戦後初期民団における「民生問題」に関するノート」(世界人権問題研究センター「京都における在日コリアン史研究会」2018年10月19日)、4「社会民衆党の社会政策論に関する覚書」(法政大学大原社会問題研究所「無産政党資料研究会」2018年12月21日)5「戦後初期民団における「民生問題」に関するノート」(社会福祉形成史研究会、2019年2月11日)6「米騒動研究の現段階と課題ー京都市域の事例を中心にー」(第50回人権交流京都市研究集会第5分科会「変わる米騒動像」、2019年2月23日)おおむね予定通り、史料調査・ヒアリング調査を行うことができた。その史料調査の成果を生かし、研究報告も行うこともできた。来年度もこの調子で史料調査や研究報告を行っていきたい。おおむね順調に史料調査・ヒアリング調査を行うことができたが、東京都などの遠隔地は、今後も年数回のペースで行っていきたい。また、関西地域の史料調査も約週1回のペースをできるだけ維持して、各地の資料館、文書館、大学図書館などで基礎的な史料を収集していく。戦後失業対策事業・失対労働者研究の史料集編纂事業に関与しているので、そのための資料収集も本格化し、進めていきたい。できるだけ、研究報告や依頼原稿を積極的に引き受け、さまざまな指摘や批判を受けて、研究の水準をブラッシュアップしていきたい。今後も、歴史学、社会政策学、社会福祉学などの全国学会誌に論文投稿も行い、積極的に研究成果を発信していきたい。全国の調査では東京都での調査を引き続き継続した。資料館・文書館・大学図書館などで史料収集と写真撮影を継続的に行った。本年度の研究成果は、1「戦後失対労働者における自立演劇サークルの上演活動」(世界人権問題研究センター編『問いとしての部落問題研究ー近現代日本の忌避・排除・包摂ー』2018年3月)2「戦後失業対策事業・失対労働者における在日朝鮮人ー1950年代前半を中心にー」(社会事業史学会『社会事業史研究』53号、2018年3月)、3「新刊紹介今村家文書研究会編『今村家文書史料集』上・下巻」(日本史研究会『日本史研究』657号、2017年5月)4「災害展示の現状と課題ー人と防災未来センター資料室の事例からー」(『第25回全国科学博物館協議会研究発表大会予稿集』、2018年2月)口頭発表は、1「戦後失業対策事業・失対労働者研究の意義と射程」(第64回四国地区人権教育研究大会大学部会、2017年7月14日)2「戦後失業対策事業・失対労働者における在日朝鮮人」(第115回史学会大会近現代史部会、2017年11月12日)3「災害展示の現状と課題ー人と防災未来センター資料室の事例からー」(第25回全国科学博物館協議会研究大会、2018年2月15日)、4「戦後失業対策事業・失対労働者における在日朝鮮人」(社会福祉形成史研究会、2018年2月19日)、5「戦後失業対策事業・失対労働者における在日朝鮮人」(同志社大学人文科学研究所第17研究会、2018年2月24日)、6「戦後失業対策事業と労働運動ー戦後独立プロ映画にみるー」(「映像(幻灯と映画)に見る戦後の失業・貧困問題と労働運動」、2018年3月2日、エル・ライブラリー)おおむね予定通り、史料調査・ヒアリング調査を行うことができた。本年度の研究成果は、1「書評・藤野裕子『都市と暴動の民衆史』」(大阪歴史学会『ヒストリア』264号、2019年6月掲載予定)、2「書評・西川祐子『古都の占領』」(日本史研究会『日本史研究』掲載予定)

口頭発表として、1「戦時下銃後奉公会の活動実態に関する覚書ー京都市正親銃後奉公会を事例にー」(社会福祉形成史研究会、2018年8月4日)2「社会大衆党の政治的基盤ー研究史の整理と課題ー」(法政大学大原社会問題研究所「無産政党資料研究会」2018年8月28日)3「戦後初期民団における「民生問題」に関するノート」(世界人権問題研究センター「京都における在日コリアン史研究会」2018年10月19日)、4「社会民衆党の社会政策論に関する覚書」(法政大学大原社会問題研究所「無産政党資料研究会」2018年12月21日)5「戦後初期民団における「民生問題」に関するノート」(社会福祉形成史研究会、2019年2月11日)6「米騒動研究の現段階と課題ー京都市域の事例を中心にー」(第50回人権交流京都市研究集会第5分科会「変わる米騒動像」、2019年2月23日)おおむね予定通り、史料調査・ヒアリング調査を行うことができた。その史料調査の成果を生かし、研究報告も行うこともできた。来年度もこの調子で史料調査や研究報告を行っていきたい。おおむね順調に史料調査・ヒアリング調査を行うことができたが、東京都などの遠隔地は、長期滞在が必要なためできなかった。日程調整の上、行っていきたい。また、関西地域の史料調査も約週1回のペースをできるだけ維持して、各地の資料館、文書館、大学図書館などで基礎的な史料を収集していく。戦後失業対策事業・失対労働者研究の史料集編纂事業に関与しているので、そのための資料収集も本格化したい。できるだけ、研究報告や依頼原稿を積極的に引き受け、さまざまな指摘や批判を受けて、研究の水準をブラッシュアップしていきたい。今後は、歴史学、社会政策学、社会福祉学などの全国学会誌に論文投稿も行い、積極的に研究成果を発信していきたい。おおむね順調に史料調査・ヒアリング調査を行うことができたが、東京都などの遠隔地は、今後も年数回のペースで行っていきたい。戦後失業対策事業・失対労働者研究の史料集編纂事業に関与しているので、そのための資料収集も本格化し、進めていきたい。今後も、歴史学、社会政策学、社会福祉学などの全国学会誌に論文投稿も行い、積極的に研究成果を発信していきたい。資料整理用ノートパソコンの購入が間に合わなかったため。ノートパソコンを購入して使用する。資料データ用パソコンを購入するため。次年度購入する。
タンニン酸を使用した象牙質コラーゲンの強化と象牙質接着耐久性の向上

象牙質と樹脂含浸層を介して接着することから接着性レジンセメントが多用されているが,経年的に接着性が低下することがわかっている。その原因として樹脂含浸層内にある象牙質コラーゲンの加水分解が挙げられる。本研究は,象牙質を強化することで接着耐久性を向上させることを目的とした。始めに,象牙質コラーゲンの抽出法の確立を検討した。牛象牙質をタービンで切削,または機械的に粉砕し,象牙質粉末を作成した。これらの粉末をEDTAで処理して抽出した象牙質コラーゲンの熱変性温度を測定した。その結果,それぞれ5565°C,7580°Cであり,象牙質コラーゲンの抽出は機械的に粉砕した粉末をEDTAで処理することとした。現在臨床において歯冠補綴装置装着時に接着性レジンセメントが主に使用されている。本申請では,接着性レジンセメント使用の際に行われる酸処理によるコラーゲンへのダメージを抑制し,接着強さを向上させるため,タンニン酸を使用した接着システムを構築する。すなわち1.象牙質コラーゲンの抽出法の確立2.象牙質コラーゲンに対するタンニン酸の影響3.タンニン酸による象牙質面処理が接着強さに及ぼす影響について,象牙質コラーゲンを取り出し,タンニン酸を作用させ,熱変性温度を測定することにより,タンニン酸がコラーゲンの強化に及ぼす影響を明らかにし,これらの結果を基に,象牙質面にタンニン酸を作用させることによる接着強さへの影響を明らかにする。このうち,平成27年度においては,1についての研究を行った。ウシ象牙質は,高速回転切削器具(タービン)にて切削したもの,ミルを使用し機械的に粉砕したもの,電気カッターを用いブロック状に切り出したものの3種類を準備し,それぞれ脱灰前に示差走査熱量測定装置(DSC)にて測定をおこなったが,有機質の熱変性による挙動は検出されなかった。また,示差熱-熱重量同時測定装置(TG-DTA)にて有機質を完全燃焼させると,2030%の有機質が存在していることが明らかになった。2030%の有機質が存在するにも関わらず,DSCにて熱変性の挙動を検出できない原因が,無機質に対する有機質の絶対量が少ないことであると考え,これらの無機質をEDTAにて脱灰し,無機質の量を減少させた後,DSCにて熱分析を行うこととした。申請者は,タービンにて切削した象牙質粉末,機械的に粉砕した象牙質粉末,および象牙質ブロックを用い,熱分析を行った。それぞれの試料をTG-DTAにおいて900度まで加熱し,有機質が2530%存在することが確認できたが,DSCにてその有機質の熱変性による挙動を検出することができなかった。これは,象牙質全体の無機質の量が多く,有機質の絶対量が少ないためであると考えた。そのため,これらをEDTAにて24時間および7日間脱灰し,無機質を減少させた後にDSCにて有機質の熱変性の挙動を確認したところ,有機質の絶対量が増えるとDSCにて有機質の熱挙動が検出されることが判明した。しかし,タービンにて切削したものに関しては,熱挙動を示さなかったため,現在,その原因を解明しているところである。歯科臨床では,象牙質に対して接着性を示すことから,歯冠補綴物の装着に,接着性レジンセメントが多用されている。象牙質と接着性レジンセメントとの接着は,象牙質側に形成される樹脂含浸層によって行われる。しかし,この樹脂含浸層は経時的に接着耐久性が低下する。その原因として,歯冠補綴物装着時に行われる象牙質の酸処理によって象牙質コラーゲンがダメージを受け,長期間にわたる樹脂含浸層内への水の浸入によって加水分解してしまうことであるとされている。本研究では,タンパク収斂作用を有するタンニン酸を用いて象牙質コラーゲンを強化し,樹脂含浸層による象牙質と接着性レジンセメントとの接着耐久性を向上させることである。始めに,象牙質コラーゲンの抽出法の確立の検討を行った。牛歯象牙質を歯科用タービンまたはクラッシャー(機械的粉砕機)を用いてそれぞれ200メッシュ以下の象牙質粉末を作製した。各々の粉末をEDTA緩衝液にて1,3,6,12,24時間脱灰した後,蒸留水にて洗浄・乾燥し,抽出した象牙質コラーゲンを示差熱ー熱重量同時測定装置(TG-DTA)にて有機・無機成分量を,示差走査熱量測定装置(DSC)にてコラーゲンの熱変性温度を測定した。その結果,EDTA12時間処理までは,脱灰量が安定しなかったものの, EDTA24時間処理では,タービンまたはクラッシャー粉末の有機・無機成分の割合に差がなかった。また,象牙質コラーゲンの熱変性温度はタービン粉末で5565°C,クラッシャー粉末で7580°Cであったことから,タービンによる切削粉末はEDTA処理前に切削時に生じる摩擦熱で象牙質コラーゲンが変性している可能性があると考えられる。このことから,象牙質コラーゲンの抽出にはクラッシャーによる機械的粉砕とEDTA24時間処理によって行うこととした。