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環境支払いの実施に関する国際比較研究

EUと我が国の農業環境政策は、個別経営、集団に対するものという違いがある。実施に当たっては、ドイツでは個人向けに詳細な実施細則が定められているが、環境改善という目的からは、我が国の方法はより合致した方法である。オランダでも集団的性格をもつ、主体的、総合的な農業環境保全活動がみられる。我が国では、従来からの保護農政に沿って、主体性・自立性が不足気味だが、制度の継続とともに、新しい地域活動として根を下ろしうる。本年度は、ドイツについて環境支払い制度の実施状況を調査した。茨城県常総町東集落において我が国の環境支払いの実施について調査した。ドイツにおいては、各州で様々な方法で環境支払い制度が実施されているが、バーデンビュルテンブルグ州においては、MEKAと呼ばれる制度が、数度の改訂を経ながら、農家の30%程度がその制度を利用するに到っている。項目は多岐にわたり、その説明書は一冊の小さな書物と言ってよいほどの量になる。制度はじめの頃は農家もまた行政も相当の時間的コストをかけたと考えられるが、現在では農家の側でも半日程度の負担で処理できるようになっている。時間の経過と経験につれて制度の実行が形式化されてきたし、また農家の制度の利用しやすさを重視してきた結果と考えられる。ある種の害虫を防ぐフェロモンの利用は、小さな道具を下げるだけの操作であるが、この制度がなければコスト面で実施しないと農家が言うのは、現在の環境支払い制度が、個々の農家の受入可能性に明確に焦点を合わせていることをうかがわせる。一方我が国の環境支払制度ともいうべき、農地水環境向上制度は、農家側(農家以外も含むが)共同的な作業を前提にした環境保全である。今年度から実施予定の個人的な作業に対する支払いの成果も見なければならないが、両制度の国際比較の視点は、農業経営という視点と、地域の中の農業という視点との対比のように現在のところ考えられる。EUの環境支払いは、ドイツの例に見るように個別経営単位に対する支払いが原則であり、日本の農地・水・環境保全向上対策におけるような、地域の組織・団体に対するものと性格を大きくことにする。ところが今年度の調査対象国オランダでは、農業者が自発的に「環境協同組合」と呼ばれる組織を設立して、環境保全に取り組んできており、こうした地域の共同的な活動が、環境支払いで達成しうる以上の環境改善効果を得ることが期待されている。中心となっているのは景観の管理に対する補助金で、農業者はいくつかのプログラムがパッケージとなった契約を国と6年間結び、その活動に対して支払われる。組合の設立は、自発的で有りかつ多様な背景をもっており、市民、自然保護団体・政府との連携強化、'地域の問題に対する積極的な働きかけなどの活動を積極的におこなっている。さらに活動の資金面については、一般市民からの資金調達、たとえば地域の病院が患者のための散歩道整備のために、環境協同組合の組織と協同するといった例にも見られるように幅広く求め、地域にも認知されていると共に、環境の保全をこえて、新しい環境作りに取り組んでいる。我が国における事例調査地、滋賀県琵琶湖西湖岸にある鴨川地域土地改良区では、17集落、1100haという広い面積の対象地区を有して、排水路の清掃、魚類保全、遊休地の活用など活発な環境保全活動を展開している。組織が巨大なのは、琵琶湖水の調節を行う水門管理の土地改良区が母体となっているためであり、したがってオランダの環境協同組合のような自発的な組織とは大きく組織の成因が異なっている。こうした組織が、持続的に環境支払いを受け止める活動団体として維持されるための条件を検討した。他の類似組織とのネットワーク化、資金提供の可能性の探索などが求められよう。今年度の調査は、主として国内事例の調査研究に重点をおいた。我が国で2007年度から進められている農地・水・環境保全向上対策はEUと異なり、地域の組織・団体に対する支払いをおこなうもので、我が国のとくに水利を中心とする農村の集団的行動にそぐう形で、制度発足以来かなりの実績をあげてきた。制度開始後5年たって2013年度からは、集落を支える体制の強化や、水路等の施設の長寿命化、水質・土壌などの高度な保全活動への支援を拡充するなど、長期を視野にいれた対策への転換が図られている。調査は、そうした地域の長期的な環境保全の主体となり得る団体として、NPOとしての登録を行った団体が活動する地域をとりあげた。そのような団体は、全国でもまだ10団体程度であり、そのうち(秋田、福島、滋賀2、鹿児島、山口)計6地区の団体について、組織の立ち上げの背景、活動、経費の仕組み、活動と制度との関係などについての調査を行った。農業環境政策の進展、そして地域の環境意識の強まりと共に、ある程度自立的な組織が存在しうるのではないか、というのが調査前の想定であった。しかし、数少ないNPOの発足にあたっては、各NPOとも、行政主導的な性格が強く、昨年度のオランダの場合と比較して地域における主体的な活動の端緒を確認するには到らなかった。

財政的にも脆弱で、活動そのものも参加者も、大半は制度の枠組に沿ったものであると判断できる。とはいえ、オランダの場合でも、事情は異なるが、主体的な活動力が高いと判断される場合でも、農業環境政策の実施が、結果的に地域の農家やリーダーたちを動かし、活動を制度に乗せながら、長期間持続させていると見られ、地域の様々な活動と連携した施策の総合的な組み立ての必要性を検討した。政策の比較が課題であるが、外国については、調査対象者の協力が容易に得られない。当初から予想されていたものでもあるが、それ以上であった。また我が国については、初年度は震災のために東北地域の調査を見送った。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き比較政策研究を続けるが、我が国の調査を精力的に行いたい。また外国については国を絞って調査を進めたい。
マルチマーケットにおける投資情報開示の影響分析

2018年度は競争相手が存在する製品市場における投資情報開示の影響を明らかにする研究目的のもと、1川上企業が存在する市場環境のもと,複数の川下企業間の投資情報の開示戦略の影響分析、2開示環境がマルチマーケットに直面した企業の投資に与える影響分析、3マルチセグメント企業の投資意思決定と統合と分離の意思決定に関する分析、の3つのテーマについて研究を行った。1の研究は、川上企業が存在する市場環境のもと,川下企業間の投資情報の開示戦略について検討し,川下企業が投資情報を開示しようとしない状況を明らかにしたものである。これまでの先行研究では、製品市場において企業が情報を開示しようとするインセンティブのみを明らかにしていたことから,本研究は情報開示に関連する研究において大きく貢献するものであると考えられる。2018年度は1の研究成果の一部を「Disclosure of Investment Information in a Vertical Related Industry」というタイトルのもと,日本会計研究学会の全国大会で報告し、現在海外学術誌「Journal of Accounting and Public policy」に投稿済み(査読審査中)である。2の研究は、複数の企業が複数の製品市場で競争する状況を想定し、各市場の開示環境が企業の投資意思決定に与える影響を分析したものである。3の研究は、マルチセグメント企業が複数の製品市場を相手にどのように投資水準を決め、どのように市場競争に挑むのかを分析したものである。これらの内容はマルチマーケットという市場環境を考慮してこなかった会計研究に対して今後の研究の方向を提案する形で大きく貢献するものと考えられ、研究成果については2019年度に学会報告・学術誌に投稿する予定である。開示環境がマルチマーケットにおける企業の投資意思決定に与える影響について分析した研究成果を2018年度に海外学術誌に投稿する予定であったが、分析で明らかにしたい事項が多く増え、追加のモデル分析を実施し、1マルチマーケットコンタクト企業(複数の製品市場で同一の競争相手と競争する状況)2マルチセグメント企業(マルチセグメント企業が市場独立の企業と競争する状況)の2つのテーマで分析を実施することとなったため、投稿までの分析期間を調整した。2017年度は次の3つのタイトルのもと、研究を遂行した。以下、進捗状況である。2018年度以降は、次のように研究課題を遂行する予定である。使用時発生した端数である。当該年度に予定した学会報告等の一部を次年度に行う予定であり、執行する予定である。1川上企業が存在する市場環境を考慮し,川下企業の投資情報に関する開示戦略を分析した研究成果および2開示環境がマルチセグメント企業の投資意思決定に与える影響を分析した研究成果を海外の学会で報告する予定であったが、1については国内の学会で十分なコメントをいただき、2についてはさらなる検討事項が発見されたため、検討事項を解決後、次年度に報告する予定となった。1は既に海外学術誌に投稿済みであり、2については検討事項を反映した論文を執筆し、2019年度に海外の学会での報告と投稿を予定している。
フランス公教育の組織編制における国・地方関係の歴史構造研究

3年にわたる研究計画の第1年次には、1880年代フランス近代公教育の組織構造化の問題を、国家が県・コミューンに対して「後見的地位」を確立する文脈において検討した。革命後100年後ようやく成立した義務教育は、その組織編制の原則を「コミューンによる初等教育役務」から「国家による初等教育役務」へ根本的に転換する事で可能となった。この基本構造の確立の過程を、81年初等教育無償法、82年初等教育義務世俗法、86年初等教育組織法、89年初等教育費負担法という一連の初等教育法体系に即して実証的に検討した。第2年次は、先の基本構造が、1982年法と1983年法による「地方分権化」によって、どのように変容したのかに迫った。国家の「後見的地位」が廃止され、初等教育はコミューンの事務となったことにもかかわらず、すでに施行後10年以上経過した現在も、官僚国家フランスの性格は未だ色濃く残っているようである。最終第3年次は、日本の教育における地方分権化の問題を考察した。戦後の憲法・教育教育基本は、戦前の教育勅語体制における「教育の国家事務」を「教育地方自治(自治体固有事務)」へと原理上転換したが、現実には戦後50年の間、文部省による中央集権的教育行政が行われてきた。近年の「地方分権化」の流れの中で、文部省も対応を迫られている。そこで、文部省の動向を整理しながら、国際化・自由化・情報化等が進行する現代日本において、子どもの権利条約と親の学校参加を基本原則にして、「自治・分権型」教育行政へと構造転換していくべきであることを指摘した。今後のフランス研究は、地方分権化の中で、親・生徒の学校参加導入〈75年法(アビ法)〉や教育基本法〈89年法(ジョスパン法)〉などが、学校現場、特に経営組織・運営面においてどのようなインパクトを与えたのかを解明したい。本研究の計画1年次である今年度(平成6年度)は、フランス近代公教育の組織編制問題を国・地方の権限関係及び事務配分問題の視角からどう把握するのかを、その基本的骨格をつくることを課題とした。そのための基本的な歴史認識と構造的な枠組みを作り上げる作業を進めるために、資(史)料や文献の収集と整理をできるだけ広範に行った。研究内容に関わって具体的に行った作業をいくつかあげれば、まず第1に、フランス現代の地方分権法の動向と関連して、公教育組織化の問題とフランス地方自治制度(法)はどのような関連にあるのかを、歴史構造的に整理することをポイントにした。第2に、理論的仮説は、両者の関係を枠づけた法制上の基本構造は1880年代に確立し、その後若干の修正はあるものの、その基本的構造は1980年代分権化法成立前までの間まで約100年続いたというものである。それを実証するべく作業を進めた。第3に、フランス公教育の組織化問題に関しては、従来から私は1880年代の義務教育の組織編制のあり方をめぐる基本原理が、「コミューンによる初等教育役務」から「国家による初等教育役務」へと根本的に転換する事実に着目してきた。本研究では、その事実と並行する形で、コミューン(市町村)組織に関する基本的な法制的枠組みが1884年法でつくられたことを着目し、両者の関連を解明することで研究課題により実証的に迫った。なお、3年間にわたるこの研究計画を達成するために、関係文献・資料の収集および整理に着手した。

昨年度(平成6年度)から開始した3年度にわたる本研究は、1980年代前半にフランスで実施された地方分権が、公教育制度にどのような影響を及ぼしているのかについて、フランス公教育組織編制の歴史的視野をふまえて検討しようとするものである。昨年度は、フランス近代1880年代における公教育の組織編制問題と地方自治制度(法)の関連構造の歴史的分析を行い、今年度は2年目にあたる研究の中間的な段階であると言える。今年度の研究実績については、研究計画に従い、フランス地方分権化法の議会審議の論点の整理を行うこと、また施行後10年後の状況を把握することに努めた。また、これらの点にかかわる諸著作・諸論文を収集し分析してきたところである。そして、それをふまえて公教育の編制問題における国・地方(県・市町村)の権限関係の変化を具体的に分析することが、今年度の研究課題の核心である。成果として論考をまとめあげることはできていないが、仕上げに向けて努力しているところである。また、昨年度からの課題である文献及び歴史的資料(「1880年代以降の公教育組織編制と地方自治の関係をめぐる歴史的整理」)については、今年度に引き続き適切な文献・資料の入手に努めてきている。これらの研究作業をもとにして最終年度である次年度では、フランス教育(行政)研究の成果との関連を問いながら、本研究の最終的なまとめにつなげていきたい。3年間にわたる本研究は、フランス近代公教育の組織編制の問題を、国・地方の行政権限との関係に焦点を当てて考察することを企図したものである。第1年次は、歴史的把握とも言うべきもので、1880年代に両者とも基本的構造が確定し、基本的関係が構築されたことを実証すべく研究を進めた。第2年次は、1980年代(82年法、83年法)の地方分権法によって、この両者の基本構造が法制度的にどのような変容を遂げることになったのかという課題を検討した。第3年次である今年度は、3年間の締めくくりを意識しながら、大きく次の3つの課題に取り組んだ。まず第1に、分権化法施行後から既に15年が経過するが、どのような実態や課題があるのかを検討した。特に、公教育に与えたインパクトがどのようなものであったに注目した。第2に、明治期以降の日本の公教育の組織化と地方自治制度の関連構造について歴史的に整理しながら、フランス的な構造的特質と日本的なそれとを簡単に比較分析した。しかし、まだ大まかなデッサンの段階に留まっている。第3に、最近の日本の地方分権化の論議の中で、公教育の組織編制の問題はどんな理由でどのように位置づけられているのかを明らかにした。公教育の組織化問題に限定されるが、フランスにおける地方分権化の実施が近代日本にどんな点で参考になるのか、そのもつところの意味について考察した。以上を含めて、本研究の研究報告書を作成中である。
免疫アレルギー疾患病因タンパク質のNMR法による立体構造解析と新たな治療法の開発

平成12年度は、構築したヒトIL-18発現ベクターを用い、高発現系の確立・安定同位体ラベル・大量高純度精製系の確立にもとづき、15Nラベル体、15N・13Cダブルラベル体を作成し、構造解析を行った。まずタンパクを構成するN末からC末までのアミノ酸の主鎖の各原子をNMRスペクトル上にアサインする。タンパクポリペプチド主鎖のアサインが終了後、chemical shift index法などを用いた二次構造の解析に移る。ついで側鎖の原子を含めたタンパク構成全原子のアサインを行う。その後原子間距離情報(NOE)・原子の結合角情報(coupling定数)を用いた立体構造計算を行った。免疫・アレルギー疾患病因蛋白質の立体構造・構造機能相関を研究することにより、蛋白の機能及び病態の解明・新たな治療法の開発を目的としている。本期間においては、特にリガンドの構造とリセプターとの結合様式の解明を主眼としてきた。リガンド構造をNMRで決定する一方、レセプターとの結合についてモデリングを行い生物活性の発揮に必要な結合様式の特定を目指した。結果として、原子座標をもつ精密なIL-18立体構造が得られ、かつその標的リセプターとのinterface及びその結合様式が推測された。これをもとに治療へ向けての論理的設計に基づく蛋白工学的改変、特にアンタゴニストの開発が可能となった。今後ペプチド・低分子リガンドの開発及びスクリーニングを経て、臨床応用可能な薬剤の開発につなげていく。本研究は免疫・アレルギー疾患病因蛋白質の立体構造・構造機能相関を研究することにより、蛋白の機能及び病態の解明・新たな治療法の開発を目的としている。本期間においては、特にリガンドの構造とリセプターとの結合様式の解明を主眼とし、まず、リガンドタンパクの立体構造解析に取り組んだ。現在までにマウス及びヒトのIL-18発現ベクターの構築・高発現系の確立・安定同位体ラベル・大量高純度精製系の確立は終了した。15Nラベル体、15N・13Cダブルラベル体を用いて多次元NMR法による各種相関スペクトルを測定解析し、そのデータを用いた構造解析に取り組んだ。まずタンパクを構成するN末からC末までのアミノ酸の主鎖の各原子をNMRスペクトル上にアサインし、タンパクポリペプチド主鎖のアサインを終了後、chemical shift index法などを用いた二次構造の解析を行った。ついで側鎖の原子を含めたタンパク構成全原子のアサインを行い、その後原子間距離情報(NOE)・原子の結合角情報(coupling定数)を用いた立体構造計算を行った。その結果、原子レベルでの精密な立体構造を得ることに成功した。IL-18は1995年にマウスcDNA及びそのヒトホモローグがクローニングされた新しいインターロイキンであり、現在までにいくつかの知見が得られてきているものの、機能の詳細は未だ十分に明らかにされていない。現在までの構造学的検討の結果、IL-2などのファミリーとは全く異なるものであることが解った。この構造の解明は、疾病との関連のみならず、インターロイキンそのものの理解に新たなパラダイムを与えるものと考えられる。
フェムト秒時間分解スペクトルに現れる溶液中分子のダイナミックスの理論的研究

1.本研究の目的は、溶液及び液体分子集合系でおこる数10数百フェムト秒の時定数のダイナミックスのオリジンを明らかにすることであった。2.まづ我々はヘテロダイン検出時間分解光Kerr効果スペクトルの表式を摂動論的密度行列法を用いて導出した。このヘテロダイン検出法は、CARS等のコヒーレント分光で用いられるホモダイン検出法と異なって一体の分子相関を記述しており解析しやすい。3.応用例としてクロロフォルム液体(常温)をとりあげた。以下のことが明らかになった。この流体のフェムト秒時間分解スペクトルはNelsonグループによって報告されている。(1)分子回転効果は寄与が小さい。低振動モードは分子回転自由度ではない。(2)分子内振動と低振動数をもつ分子間モードのラマン活性モードがコヒーレントに励起されている。これらの分子間振動モードの分布関数が求められた。(3)instantaneous normal modeの概念を適用することが可能である。このモードは液体状態の分子運動シュミレーションより評価される。4.分子内と分子間モードの相互作用を取り入れるのが次の段階である。又、分子間ポテシシャルの非調和性を孝慮してスペクトルの温度効果を解明したい。今回導出した時間分解ヘテロダイン検出光Kerr効果プロフィルの表式を振動数領域に変換し、ラマン散乱スペクトル表現を得たい。
心臓手術後に水分制限をうける学童への「飲みたい時に飲む」ケアのガイドライン開発

心臓外科術後のこどもの飲水行動は、治療による一日飲水量の制限だけではなく、入院生活で出会う見知らぬ人や自宅と違う生活(例:ナースコールを押して水をもらう、配分された水を飲水する等)への馴染めなさに左右されていた。飲水量の制限に関わらず、こどもが快適に、適切に飲水するためには、医療者がこどもの飲水行動を管理する「治療としての飲水」ではなく、こどもの「生活としての飲水」ができるシステムの必要性が示唆された。本研究はグランデッドセオリーを用いて行っており、1920年度まで行った研究の理論的仮説をもとに、理論的サンプリングを開始した段階にある。前回の研究が全患者に水分制限を行うフィールドであったため、理論的サンプリングとして疾患によっては水分制限をしないフィールドを半年かけて確保し、現在データ収集を行っている。まだ十分な対象を得られていない状況だが、水分制限を受けた子どもも受けてない子どもも、前回同様に「病院ではのどが乾かない」と共通の体験をしており、生理的欲求としては差がない傾向がみられた。また、入院生活では自宅と異なり自由に飲水できず、口渇を感じるとナースコールで水分を運んでもらうための他者への依頼が必要となり、飲水の機会そのものが減ることがわかった。よって、水分制限というだけではなく、入院したことだけで飲水方法の変化による飲水量の変化が起こっている可能性がある。水分制限の有無による特徴的な違いは、水分制限をうけるこどもは医療者から水分制限の説明を受けても、その必要性は「そこが謎」と語り理解できてはいないが、子どもが自力で前向きに治療と取り組む感覚をもつことが出来ている。逆に、水分制限がない子どもは「何もなくてここにいる意味があるだろうか」と、入院生活に疑問を感じていた。更に、水分制限を受けていないこどもに、自分の身体変化を探ろうとする傾向が強化されていた。更にデータを蓄積させ、検討したい。心臓手術後に行う水分制限(飲水量の規制)が、こどもに及ぼす影響を明らかにする目的で研究を実施し、今年度は飲水量の規制という心理的抑圧が及ぼすこどもの飲水への反応を明らかにした。水分制限のある施設とない施設の心臓外科手術後のこども計9名に対しインタビューを行い、比較分析した。その結果、まだカテゴリー化は出来ない段階だが、仮説となる得る下記の傾向が明らかになった。(1)水分制限のあるこどもは、目的意識を実感し、コントロール力を発揮しやすい可能性がある(2)水分制限がないと、口喝の知覚が不確かになる可能性ある。こどもの心不全症状や全身状態に著明な差はなかったが、やや重症者は身体の苦痛から飲水量が少ない傾向にあった。水分制限の有無とこどもの飲水量を比較すると、飲水制限のあるこどもの方が飲水している傾向にあった。水分制限がないこどもは、自由に飲水できるが、看護師に依頼して飲水するシステムであるため、多忙な看護師への気兼ねが飲水を左右する傾向にあった。前年度の科研で得た、水分制限のあるこどもから抽出された<飲みたいけど我慢する>というカテゴリーは、水分制限のないこどもからも抽出される可能性があるが、以下のような内容の違いがあると想定される。水分制限のあるこどもは、医療者から「飲むと悪いことがおこる」という潜在下のメッセージを感じ、「大切に飲む」と規制内での飲水で口渇をやり過ごしていた。しかし、水分制限のないこどもは「水は病院のもので自分のものではない」という思いがあり、「勝手に飲めない」と対処になり、飲水量が少なかった。また、水分制限のないこどもは口渇を感じていてもガマンする傾向があり、ガマンしていると口渇の知覚が薄れていく傾向があった。よって、こどもの飲水量は水分制限による口渇のみではなく、飲水方法のシステムによる違いが影響することが判明した。水分制限のない学童と、水分制限をうけた学童の体験の違いにより、水分制限という心理的抑圧が学童に及ぼす影響を明確にし、学童が適正に飲水できるための支援を検討する目的で研究を継続している。平成2022年は、心臓外科術後に水分制限を受けなかった612歳(平均9.3歳)8人のこどもの体験について、グランデッドセオリーを用いて、インタビューと参加観察により探求した。その結果、水分制限を受けなかったこどものストーリーライン(コアカテゴリー間の関係性)は、看護師に依頼して水を得るシステムであったため、こどもは遠慮から看護師に依頼できず、不足しても「おかわり」が言えず、[もらえない水]と口渇を我慢していた。また、飲水後の嘔吐や排尿の失敗等の苦痛体験から[危ない時は飲まない]と飲水を控え、口渇があっても好みの味や温度と異なる水分の摂取には[飲もうと思わない]と回避していた。このような過程を経ると、こどもは[口渇がわからない]と口渇の感覚が麻痺することを体験していた。

以上の結果を基に、看護師へのフォーカスグループインタビューを行い、対策を検討し、次の心臓外科手術後に水分制限をうけるこどもへのケア指針が示唆された。(1)医療者がこどもの飲水行動を管理する「治療としての飲水」ではなく、「生活としての飲水」に病院システムを調整する。(2)水分制限がある子とない子が同じ場にいる前提から、「飲水制限を守る指導」から「適切に飲むケア」へと援助を転換する。(3)医療者は脱水を予防するため、口渇のメカニズムを理解して早期発見し、こどもが適切に飲水できるよう促す。今後この指針を臨床で使用し、実用化に向け検討したい。
外耳・中耳の耳内環境ｐH変化と中耳真珠腫発生および進行リスク

中耳真珠腫の発症・進行機構について、耳管機能不全,鼻すすりの癖,中耳ガス交換障害(中耳乳突蜂巣の含気化不良)等の内耳環境および外因子の関与が知られている。しかし、外耳環境や内因子と中耳真珠腫成因についての研究の報告は極めて少なく、十分に解明されていない。今回、内因子候補として耳垢型の決定遺伝子ABCC11に注目し、外耳環境を含め中耳真珠腫の発症リスクとの関連性について研究をすすめている。ABCC11タンパク質はATP binding Cassette Transporterで、細胞膜に局在し、異常タンパク質など(薬物を含め)の排出機能がある。アポクリン腺に発現して代謝物を腺内腔に向けて輸送する。アポクリン腺は、外耳道、腋窩、乳腺などにあり、アポクリン腺にABCC11が多いと湿性耳垢となり、腋臭症が多い。ABCC11遺伝子多型(538G>A)が耳垢の性状(湿性もしくは乾性)を決定することがYoshiuraら(Nature Genetics 38:324ー330;2006)によって報告された。16番染色体におけるABCC11遺伝子のー塩基多型(SNP)である538G>AがGGホモあるいはGAヘテロであれば湿性耳垢、AAホモであれば乾性耳垢となる。Ishikawaら(Frontiers in Genetics 3:306; 2013)は、ABCC11遺伝子の一塩基多型解析によって、湿性耳垢がアフリカ人、ヨーロッパ人に多く、日本人に少ないことを示している。Nakagawaら(Medical Hypotheses114:19-22,2018)は、ヨーロッパ人では日本人と比較して中耳真珠腫の発生頻度が高いことを報告している。我々はABCC11遺伝子多型に伴う耳垢の乾湿の違いが、中耳真珠腫の発生リスクに影響を与える可能性について検討した。方法:口頭および書面同意を得た中耳真珠腫患者から、手術時に摘出される中耳真珠腫と術後血液を得た。血液から抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABCC11 538G>Aを含む領域をPCRで増幅し、当該一塩基多型のシーケンス解析を行った。尚、本研究は、順天堂大学医学部倫理委員会の承認を受けて実施された。結果:中耳真珠腫43症例において、乾性(538AA:16例)が37.2%に対して、今回、コントロール群として、健常耳のデータがまだ十分出ておらず比較できなかったが、前述のごとくABCC11遺伝子の一塩基多型解析では、湿性耳垢がアフリカ人、ヨーロッパ人に多く(80ー100%)、日本人は少ない(15-30%)。中耳真珠腫罹患率においては。ヨーロッパ人の方が日本人に比べは高いとされている。これらの報告と本研究結果を考慮すると、湿性耳垢が、中耳真珠腫の発症リスクになる可能性が示唆された。湿性耳垢から中耳真珠腫が発症しやすい成因として以下の仮説を立て検索中である。1)湿性耳垢の移動速度低下の伴う炎症の遷延化、デブリ貯留、2)アポクリン腺からの脂質代謝産物などの増加により耳内環境が、脱灰、骨破壊の関する蛋白分解酵素の活性化の可能性、3)耳閉感、掻痒感に対する頻回にわたる耳掃除など生活習慣を含めて検索中である。血液から抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABCC11 538G>

Aを含む領域をPCRで増幅し、当該一塩基多型のシーケンス解析を行った。尚、本研究は、順天堂大学医学部倫理委員会の承認を受けて実施された。結果:中耳真珠腫43症例において、乾性(538AA:16例)が37.2%に対して、今回、コントロール群として、健常耳のデータがまだ十分出ておらず比較できなかったが、前述のごとくABCC11遺伝子の一塩基多型解析では、湿性耳垢がアフリカ人、ヨーロッパ人に多く(80ー100%)、日本人は少ない(15-30%)。中耳真珠腫罹患率においては。ヨーロッパ人の方が日本人に比べは高いとされている。これらの報告と本研究結果を考慮すると、湿性耳垢が、中耳真珠腫の発症リスクになる可能性が示唆された。湿性耳垢から中耳真珠腫が発症しやすい成因として以下の仮説を立て検索中である。1)湿性耳垢の移動速度低下の伴う炎症の遷延化、デブリ貯留、2)アポクリン腺からの脂質代謝産物などの増加により耳内環境が、脱灰、骨破壊の関する蛋白分解酵素の活性化の可能性、3)耳閉感、掻痒感に対する頻回にわたる耳掃除など生活習慣を含めて検索中である。当初の計画通り研究は順調に進んでいる。次年度使用額も少額発生したが、研究費の使用に関しても概ね計画通りである。
中性子による酵素阻害剤結合部位の水和構造解析

エイズウイルスのプロテアーゼ(HIVPR)は、エイズ治療のための重要な創薬標的タンパク質の一つである。本研究では、阻害剤非結合型HIVPRの活性部位に存在する水和水の立体構造を中性子結晶解析によって観測し、その特徴を解析することを目的とした。HIVPRはプロテアーゼであり、自己消化反応が生じるために、一本鎖型HIVPRとクロスリンク型HIVPRを設計した。一本鎖型HIVPRとクロスリンク型HIVPRを調製し、阻害剤複合体のX線結晶構造解析に成功した。それらのHIVPRは中性子結晶構造解析に必要な大型結晶作製とより正確な阻害剤の親和性の評価に有利であると考えられる。本研究では、阻害剤非結合型(apo型)HIV-PRの活性部位に存在する水和水の立体構造を中性子結晶解析によって決定し、その特徴を解析する。得られる水和水の構造情報から、阻害剤の結合時に生じる水和水の脱水和のエントロピーの効果と阻害剤非結合状態における触媒残基の正確なプロトン化状態を把握する。これらの情報をholo型構造と比較することによって、水和水の脱水和効果を考慮した薬物設計の高度化に資することを目的としている。本研究を達成するためのもっとも重要な課題は、高分解能回折能を有する高質なapo型HIV-PR結晶の取得である。本年度は、そのapo型HIV-PR結晶を取得に向けて、1.基質複合体の結晶化および、2.クロスリンク型HIV-PRの調製と結晶構造解析を行った。1. 8残基からなる4種類の基質を化学合成した後、それらの基質とHIV-PRとの複合体の結晶を4°Cの低温条件で試みたが、結晶化には至っていない。2. HIV-PRは、ホモ2量体であることから、分子内に2回対称軸をもっている。そこで、その2回対称軸付近に一つのCys残基を導入し、プロトマー間でSS結合を形成させるI50CおよびG51C変異体を分子設計した。両変異体に関して大腸菌発現系を使って発現、再生および精製後、結晶化実験を実施した結果、正八面体状の単結晶を得ることに成功した。X線回折実験の結果、野生型apo型HIV-PR結晶よりも高い2.0Åの高分解能回折データの取得し、結晶構造解析に成功した。本年度(H24年度)、新たに調製したapo型HIV-PR(I50CおよびG51C)の結晶構造解析おいて、高分解能化に成功したことは、本研究において重要な成果である。本研究では、阻害剤非結合型(apo型)HIV-PRの活性部位に存在する水和水の立体構造を中性子結晶解析によって決定後、その特徴を解析し、水和水の脱水和効果を考慮した薬物設計の高度化に資することを目的とした。本研究では、HIV-PRの立体構造の特徴に着目して、新規な分子を作製し解析することによって様々な知見を得ることができた。本年度が最終年度であるため、以下に、これまでに得られた全3年間の成果を年度毎にまとめる。H23年度: HIV-PRのN末端とC末端の両末端が逆平行ベータシートを形成していることに着目し、2アミノ酸残基から成るリンカーを挿入した1本鎖型HIV-PRを設計後、調製に成功した。さらにHIV-PRの分子内の2回対称軸に着目し、プロトマー間でSS結合を形成させるN98C変異体を分子設計後、調製に成功した。H24年度: HIV-PRの可動性のフラップ領域の固定が、分解能向上に寄与すると仮定し、分子内の2回対称軸付近に存在する残基にCys導入し、プロトマー間でSS結合を形成させるI50CおよびG51C変異体を分子設計した。試料調製後、両変異体に関して正八面体状の単結晶を得ることに成功した。G51C変異体において、野生型apo型HIV-PR結晶よりも高い2.0Åの高分解能X線回折データの取得し、X線結晶構造解析に成功した。H25年度: apo型結晶作製のため、自己消化を抑制した変異体を作製した。1本鎖型HIVPRのAsp25をAsnに置換したD25N-scHIVPRを作製し、阻害剤複合体の結晶を作製後、分解能1.1Åで結晶構造解析に成功した。立体構造を精密化した結果、阻害剤との相互作用を明らかにした。本研究では、阻害剤非結合型(apo型)HIV-PRの活性部位に存在する水和水の立体構造を中性子結晶解析によって観測し、その特徴を解析する。

これらの情報をholo型構造と比較することによって、水和水の脱水和効果を考慮した薬物設計の高度化に資することを目的としている。本研究を達成するためのもっとも重要な課題は、高分解能回折能を有する高質なapo型HIV-PR結晶の取得である。本年度は、そのapo型HIV-PR結晶を取得に向けて、(1)1本鎖型および(2)クロスリンク型HIV-PRの調製と結晶化実験を行った。(1)1本鎖型HIV-PR: HIV-PRは、触媒部位と反対側の位置に、互いに異なるプロトマー由来のN末端とC末端をもっており、両末端が逆平行ベータシートを形成している。そこで、立体構造情報からリンカーを挿入し1本鎖型HIV-PRを設計した。2アミノ酸残基から成るリンカーを導入して野生型と同様の方法で調製を試みた結果、1本鎖型HIV-PRの取得に成功した。(2)クロスリンク型HIV-PR: HIV-PRは、ホモ2量体であることから、分子内に2回対称軸をもっている。そこで、その2回対称軸付近に一つのCys残基を導入し、プロトマー間でSS結合を形成させるN98C変異体を分子設計した。N98C変異体の調製を試みた結果、SS結合を形成したN98C変異体の取得に成功した。単量体への解離がない1本鎖型およびクロスリンク型HIV-PRの取得は、apo型HIV-PRの結晶の作製において問題となる自己消化が抑制されることから、本研究において重要な成果と言える。研究計画に従って、高分解能の回折データを与えるKNI-272複合体結晶(holo型HIV-PR)を結晶核としてマクロシーディングを行い、基質複合体のHIV-PRの結晶の作製を試みたところ、結晶の取得が困難であった。一方で、これまでに報告がない新たな結晶を作製し、高分解能の構造解析を実施するために、クロスリンク型HIV-PRを新たに設計した。今回設計した変異体は、HIV-PRの自由度の高い領域を固定するために、高分解能化が期待できる。実際に、試料を調製し、結晶を取得後、2.0Åの高分解能回折データを収集し、高分解能化に成功した。さらに、昨年度(H23年度)調製した1本鎖型およびクロスリンク型HIV-PRを用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)により、臨床で使用されている2種の阻害剤を含め計10種の阻害剤について親和性を評価した。HIV-PRの解離の効果が含まれない状態での解析に成功した初めての例である。SPRを用いた阻害剤の評価は、薬物設計の高度化に貢献できることから、当初の予定以上の達成度がある。研究計画に従って、高分解能の回折データを与えるKNI-272複合体結晶(holo型HIV-PR)を結晶核としてマクロシーディングを行い、apo型HIV-PRの結晶の作製を試みたところ、結晶の取得が困難であることがわかった。そこで、自己消化が問題と考え、単量体への解離がない1本鎖型およびクロスリンク型HIV-PRを取得したことが評価できる。それぞれのHIV-PRは、大腸菌で不溶性タンパク質として発現したしたものを再生処理し、陽イオンおよび逆相カラムクロマトグラフィーによって精製しているが、クロスリンク型HIV-PRの発現大腸菌の培養液あたり収量は、野生型ものと同等であり、多くの試料を必要とする中性子結晶構造解析に有利である。さらに、1本鎖型およびクロスリンク型HIV-PRの創製は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いた阻害剤の評価を可能にした。プロトマー間に共有結合をもたないHIV-PRでは、阻害剤の結合にHIV-PRの解離の効果が含まれてしまう。
自己血漿と骨髄間葉系幹細胞を併用したハイブリッドマテリアルによる骨再生療法の検討

PPP、PRP、PRFをそれぞれイヌ抜歯窩に填入し、自己血漿中の構成成分の違いによる骨形成能の比較を行った。新生骨面積はPPP群が最大値を示し、PPP群、PRF群では対照群に比べて骨形成が促進されていた。また、イヌの背部筋肉内にβ-TCPに濃縮骨髄穿刺液を含侵させ移植したところ、濃縮骨髄穿刺液に含まれる幹細胞が濃縮され、フィブリンを足場に異所性骨誘導能を有しているという結果が示唆された。自己血漿中の構成成分の違いによる骨形成能の比較を行うにあたり、ビーグル成犬の抜歯窩治癒過程を検討した。PPP、PRP、PRFをそれぞれ抜歯窩に填入し、対照として無処置群を加えた4群で術後4週、8週で比較した。SEMによるフィブリンの形態はPPPとPRPが疎な網状構造を呈していたが、PRFは密な束状を呈しており、フィブリン重合がより強度である可能性が示唆された。抜歯窩欠損歯肉の上皮化までの平均日数はPRF群、PRP群、対照群、PPP群の順に短い傾向を示した。術後4週における抜歯窩の新生骨面積はPPP群が最高値を示し、PPP群とPRF群がPRP群、対照群に比べて有意に高い値を示した。術後8週においても新生骨面積はPPP群が最大値を示した。PRP群、PRF群は高濃度の成長因子の作用により抜歯窩の上皮化が早いと考えられた。歯槽頂部での骨の形成に関してはPRP群は促進されなかったが、PPP群、PRF群では対照群に比べて骨形成が促進された。抜歯窩内部の骨の成熟はPRP群、PRF群の方が明らかに早く、作用部位の環境によって成長因子の効果が異なる可能性が示唆された。また、ビーグル犬の濃縮骨髄穿刺液の骨誘導能についても検討した。背部筋肉内にβ-TCPに濃縮骨髄穿刺液を含侵させ移植した濃縮骨髄群、β-TCPに骨髄穿刺液をそのまま含浸したものを移植した骨髄群、β-TCPをそのまま移植したTCP群で比較した。濃縮骨髄群の骨髄細胞数は骨髄群と比べて平均4.9倍に増加していた。移植後3週6週共に新生骨面積は濃縮骨髄群が最大値であり、TCP群では最小値であり、濃縮骨髄群とTCP群間で差が認められた。今回の方法は濃縮骨髄穿刺液に含まれる幹細胞が濃縮され、フィブリンを足場に異所性骨誘導能を有しているという結果が示唆された。自己血漿中の構成成分の違いによる骨形成能の比較においては近交系F344ラットを用いてPRF・PRP・PPPを作製し、PRP・PPPのフィブリノーゲン量、血小板数を計測し、予測通りの結果が認められた。同ラット頭蓋骨に径5mmに円形の骨欠損を作製し、いずれかの血漿を補填して、X線学的・組織学的に骨形成能を評価した。PRPの結果がまだ評価できていないが、μCTと組織標本からの結果で、PRFよりもPPPの骨形成能が優位にあった。さらにPRF、PPP共に対照群と比較すると優位な結果となった。また、同様の血漿成分での骨形成能の比較をイヌの抜歯後骨欠損部に用いて比較を行った。ラットの頭蓋部骨欠損とは細胞成分の量や術後骨形成の場の圧力がかかる程度が異なるため、結果が異なる可能性を想定して追加して実験を行っている。自家骨髄間葉系幹細胞の濃縮・分離法の検討としては抗凝固剤を含ませて、イヌ骨髄穿刺液を採取し、遠心分離して得られた細胞を培養、増殖させ、in vitroでの骨分化能を評価し、骨髄穿刺液の細胞回収率、増殖能を比較検討した。濃縮した骨髄群と濃縮しない骨髄群で採取した骨髄穿刺液を1週間培養した細胞数を比較したところ濃縮骨髄群の骨髄細胞数は非濃縮骨髄群と比べて平均4.9倍に増加していた。また、in vivoでの骨形成能を検討するためにイヌの背部皮下にβTCPと混合させて移植し、異所性骨形成能をみたが、移植後3、6週の平均新生骨面積は濃縮骨髄群で最も優位であり、濃縮骨髄群とTCP群間で有意差が認められた。イヌの抜歯後骨欠損部での血漿成分の違いによる骨形成能の比較検討を追加していることもあるが、ラットも含めて骨形成をみる評価時期が時間を要することが理由としてあげられる。さらにμCTによる撮影時間、組織標本作成(標本切り出し、脱灰時間、切片作成)、これらの形態計測すべてに膨大な時間を要している。しかし、評価に時間がかかってはいるが、実験自体は順調に進行している。自己血漿中の構成成分の違いによる骨形成能の比較を完結させて、今後の実験の再評価を行う。自家骨髄間葉系幹細胞の濃縮・分離法の確立としては、in vitroでの検討をmRNAの発現解析を含めて詳細に行う。それにより、骨形成に作用している機構をできるかぎり解明したい。

また、より確実で早い骨形成の確立のために成長因子であるrhBMPー2の併用効果を検討し、rhBMPー2の最適化を併せて行う。ヒトMSC・血漿を用いた検討を前述の実験結果を踏まえて、ヒト骨髄穿刺液を採取し、同様の実験をおこなう。in vitro、in vivoも同様の評価を行う。1.自己血漿中の構成成分の違いによる骨形成能の比較ラットを用いたPRF・PRP・PPPの血小板由来成長因子であるTGF-β1濃度、PDGF-AB濃度を計測する。mRNAの発現解析、フローサイトメトリーを用いた細胞成分の解析、SEMによる形態学的検討などを行う。ラット、イヌ共に組織標本を完成させる。μCT、組織標本から新生骨の形態計測を行う。以上すべての結果から総合的に評価し、今後の実験の再評価を行う。2.自家骨髄間葉系幹細胞の濃縮・分離法の確立濃縮した骨髄群、非濃縮骨髄群、対照群でのin vitroでの骨分化能を検討する。1と同様にmRNAの発現解析、フローサイトメトリーを用いた細胞成分の解析、SEMによる形態学的検討などを行う。また、rhBMPー2の併用効果をin vivoでの同様の実験方法で比較し、rhBMPー2の最適化を併せて行う。3.ヒトMSC・血漿を用いた検討前述の実験結果を踏まえて、ヒト骨髄穿刺液を採取し、in vitroで同様の実験をおこなう。in vivoではヌードマウスの背部皮下へβTCPと混合させて移植し、異所性骨形成能をみる。骨髄穿刺液採取量の違いによる濃縮条件の設定や骨形成能の違いを検討する。
極低温電子顕微鏡によるロッド・軸受け・フックの高分解能構造解析

(1)フックの高分解能での構造解析低分解能での解析にとどまっていた(約15A分解能)フックの高分解能解析(7A分解能)に成功した。フックはユニバーサルジョイントとしてモータとフィラメントを繋ぎ柔軟に曲がる。これまで明らかになっていなかったフックチューブの中心構造は短長2本のαヘリックスからなり、この長さの違う2本のαヘリックスが繊維軸方向にルーズにパッキングしており、外側にある2つのドメイン間相互作用だけでなく、この中心部分の分子間相互作用も曲げに柔軟な構造に寄与していることが新たに明らかになった。本成果をStructureに発表した(Fujii et al,2009,Structure)。(2)分解能3Aを目指したロッドとフックの構造解析(高分解能情報を保持した画像取得法の探索)画像解析上の工夫では、らせん状複合体由来の制約条件を単粒子解析法に取り入れることで、アラインメントの精密化と良い画像を選別するプログラムを作成した。極低温電子顕微鏡による撮影条件の系統的評価をおこない、氷包埋試料の作成におけるより良い条件を見つけ出した。この条件により高質画像取得の歩留まりがよくなり高分解能解析(7A)をハイスルーブットで行なうことができるようになった。TMVコート蛋白質のディスク複合体において、主鎖や大きな側鎖が解像できる原子分解能レベルである3.8A分解能を達成した。その研究で培った技術を用いて現在ロッド、フックのデータを収集解析中であり、原子分解能での構造解析を目指している。(1)distalロッド-Pリング軸受け複合体大量精製万法の確立ClpP遺伝子の欠損によって菌体あたりのべん毛の数が増えることが知られており、これによってべん毛基部体の精製量をこれまでの約4倍に増やすことに成功した。この菌株からのdistalロッド-Pリング軸受け複合体を使って現在、極低温電子顕微鏡によりデータを収集中である。(2)フックの高分解能での構造解析低分解能での解析にとどまっていた(約15Å分解能)フックの高分解能解析(7Å分解能)に成功した。これまで明かになっていなかったフッチューブの中心構造は短長2本のαヘリッグスからなり、この長さの違う2本のαヘリックスが繊維軸方向にルーズにパッキングしており、外側にある2つのドメイン間相互作用だけでなく、この中心部分の分子間相互作用も曲げに柔軟な構造に寄与していることが新たに明らかになった。(論文準備中)(3)分解能4Åを目指したロッドとフックの構造解析(高分解能情報を保持した画像取得法の探索)画像解析上の工夫では、らせん状複合体由来の制約条件を単粒子解析法に取り入れることで、アラインメントの精密化と良い画像を選別するプログラムを作成した。この条件により高質画像取得の歩留まりがよくなり高分解能解析(7Å)をハイスループットで行なうことができるようになった。今後、収集データを増やすことによって4Å分解能を目指す。
導電性ポルフィリンラジカル単結晶の電解構築と機能化

単結晶電極は、ナノスケールで構造のはっきりした電極材料の一つであるが、これまで研究されたものは主に金属や無機半導体の単結晶電極であり、導電性の有機単結晶電極ではなかった。本研究では、メタロイドポルフィリンの電解反応により導電性のラジカル単結晶が得られることを利用し、この単結晶の基本的物性を解明するとともに、新しい電極材料の開発と機能界面の電気化学的構築を行い、さまざまな電気化学反応への応用を試みる。本年度は、導電性ポルフィリンπラジカル単結晶の電解形成過程に関する研究と、その物性の評価を行った。具体的には、置換基の異なるメタロイドポルフィリンを用いて、さまざまなポルフィリンラジカル単結晶の構築と基本的評価を試みた。その結果、さまざまな軸配位子(塩素イオン、メトキシ基、フェノキシ基など)をもつリンポルフィリンでもπラジカルの電解結晶化が可能であることが明らかになった。また、さまざまな軸配位子(塩素イオン、メトキシ基など)をもつアンチモンポルフィリン誘導体でもπラジカルの結晶が得られることが明らかになった。この場合、結晶性には置換基依存性と溶媒依存性がみられた。さらに、リンポルフィリンの場合、あらかじめ多量体にしておいたものを電解還元すると、単量体の場合よりも早く結晶化が起こることが明らかになった。生じたラジカルは、πラジカル多量体であるが、電解電位によっては、多量体の中の一部のポルフィリンを部分的に還元したラジカルも得られることが明らかになった。これらのラジカル結晶の中の電子のモビリティーをクロノアンペロメトリーにより測定したところ、結晶内の電子の見かけの拡散係数は、10^<-8>cm^2s^<-1>程度であることが明らかになった。この値は、通常の分子修飾電極と同程度の値である。
消化器癌のリンパ節微小転移の成立機序とtumorigenesisの解析

本研究(課題番号:12470264)では、癌の「リンパ行性微小転移の成立機序とそのTumorigenesis」について研究を進めてきた。この研究によって得られた研究実績の概要は下記のごとくであり、別記のごとき論文にて発表した。臨床材料を用いた研究では、リンパ節内の微小転移には、single cellとclusterを形成するものとがあり、サイトケラチンによる免疫組織化学染色においても前者にはstromal reactionにより死滅傾向のある細胞が存在することが確認された。また、予後の良い癌においては、clusterを形成する微小転移は、従来のHE染色で同定されるリンパ節転移の予後とリンパ節転移陰性の予後の中間に位置付けられた。臨床的な観点からのさらなる課題は、これら微小転移がすべて臨床的に転移として成立、発展するかどうかである。動物実験では、MTT Invasion Assayを応用して確立されたリンパ行性高転移株を用いて、微小転移の成立機序、特性に関してヌードマウスを用い検討してきたが、癌の組織型とくに分化度が影響することを明らかとなった。また、微小転移成立にあたっては、リンパ節内での免疫応答の発現が重要であることを臨床材料の解析にて明らかにした。しかし、特殊な条件下での結果であり、微小転移の成立機序の解析にはさらなる適切な研究モデルを求められた。そこでマウスから作成されたCell Line(B17F1メラノーマ細胞)を自己腫瘍としてC56BLマウスに移植したリンパ節微小転移モデルを開発した。リンパ節微小転移の成立過程とリンパ節環境の変化に関して、興味ある成果が得られつつあり、その一部は既に報告した。すなわち、B16F1細胞を接種すると、接種後10週目にはリンパ節転移を形成するが、2週目に原発巣を切除して、膝下リンパ節を観察すると、経解き的に種々の微小転移が確認された。リンパ節内での免疫応答に関しても抗腫瘍エフェクター細胞群の浸潤が関与している興味ある所見が得られた。今後の研究の展開としては、微小転移の癌のキャラクター解析が必要であり、マイクロダイセクショシによる遺伝子解析が必要である。また、臨床的には微小転移を、最初にリンパ節転移が生じるセンチネルリンパ節内での位置付けについても明らかにする必要がある。平成12年度のこれまでの研究実績は、大きく3つのプロジェクトとしての成果に分けられる。すなわち、1)胃癌のリンパ節転移陰性(HE染色)例における微小転移の実態とその予測に関する研究、2)消化器癌におけるSentinel Nodeの微小転移の実態とその有効性に関する研究、3)リンパ節高転移株、低転移株の接着浸潤能に関する研究、である。1)胃癌のリンパ節転移陰性(HE染色)例における微小転移の実態とその予測に関する研究:67例の胃癌患者から得られた、通常の組織学的診断法(HE染色)にて転移陰性の診断された1761個のリンパ節の微小転移について検索した。対象症例はT1(早期胃癌)33例、T234例である。検索はanti-cytokeratin AE1/AE3 monoclonal antibodyを用いた。

その結果、T1症例33例中18%に、T2症例34例中24%と比較的高い頻度に微小転移が認められ、其の予後は不良であった。また、対象リンパ節1761個の1.5%に微小転移が認められた。接着因子の1つであるE-カドヘリンの発現を術前の生検材料を用いて検索した結果、微小転移を有する症例においてはその発現が減少していた。すなわち、組織学的に転移陰性と診断されるリンパ節にも微小転移が存在すること、その予測に生検材料におけるE-カドヘリンの発現の有無が有用であること報告した(Anal of Surgical Oncology,2001)。さらに食道癌患者においては、VEGF-C(vascular endothelial growth factor-C)の発現がリンパ節転移と関連する事を、新鮮材料を用いてのWestern Blot法ならびに免疫組織染色にて確認し学会(第55回日本消化器外科学会、第100回日本外科学会)にて発表するとともに.現在微小転移との関係について検討中である。2)消化器癌におけるSentinel Nodeの微小転移の実態とその有効性に関する研究これまで消化器癌臨床例においていて、Radio Isotopeならびに色素を用いたSentinel Nodeの解析を行いその結果を報告(CancerLet;2000、消化器外科;23)してきた。また同定されたSentinel Nodeの微小転移の実熊について検討し、その実態を明らかにしつつある。現在までに術中に45分以内に正確にその存在を診断する分子生物学的手法を確立し、臨床に応用しているところである。現在、トレーサーの種類、投与方法などを中心に、Sentinel Nodeの微小転移の検出感度を含め検討し、その成果を学会(AGA;2000,SNNS;2001,第24回日本リンパ学会)に発表してきた。さらには消化器癌における各臓器別の臓器特異性やリンパ流との関連性を検討中である。3)微小転移の成立機序に関する研究:微小転移の着床について局所免疫の立場から免疫応答細胞樹状細胞ならびにNatural Killer細胞との関連性について興味ある知見を得て報告(Cancer;2000,Cancer Let;2000)してきた。さらに、リンパ節高転移株の細胞運動能、細胞外基質分解能について、サイトフルオロメーターを用いてChemotaxisis assayならびにFluorometric invasion assayを用いて検討中である。また、TP(Tymidine Phosphorylase)の関与についても検討中である。前者に関しては、高転移株においては細胞運動能、細胞外基質分解能ともに亢進していることを確認し発表(Cancer Research,2000)しているが、現在までのところTP発現との関係は明らかなpositive dataは得られていない。以上が、平成12年度の研究成果の概要であるが、引き続き計画に従い、微小転移の実態と転移としての意義の解析ならびに微小転移の成立機序に関する研究、解析を進めているところである。平成13年度の本研究の研究実績については、平成12年度の研究に引続いての3つのプロジェクトとして、以下の成果が得られた。1.各種消化器癌のリンパ節微小転移に関する研究