hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動発現・調節における大脳皮質インターニューロンの機能的役割

本研究課題では、運動課題を遂行中のラットの一次運動野において、どのインターニューロン・サブタイプがどのように運動機能の発現や調節に関与しているのかを解明することを目指した。そして、脳定位固定状態のラットが前肢の自発運動課題を効率よく学習する装置を開発し、傍細胞記録法とマルチユニット記録法を被検動物に適用し、特にfast-spikingインターニューロンは運動指令の抑制ではなく形成に参加していることなどを示した。本研究計画の第一年目は、ラットの大脳皮質運動野における運動の発現や調節に関与する神経細胞の細胞サブタイプを同定するために、1)脳定位固定ラットに運動課題を効率よく学習させる自動訓練装置を開発するとともに、2)無麻酔(行動・睡眠)状態での傍細胞記録とマルチユニット記録の電気生理学的実験系を確立した。運動課題の訓練に関しては、頭部へのアルミニウム製固定具の取付け手術を施した被検ラットに飲水制限を課し、独自に開発した脳定位固定オペラント訓練装置(特許出願中)にて右前肢でレバーを押すことにより報酬のサッカリン水を得られる自己ペース・レバー押し運動課題を学習させた。この装置により訓練開始第一日目か二日目には運動応答と報酬獲得との相関が成立し、1週間程度で課題の学習を完成させることに成功した。さらに同訓練装置6台を自動化・集中制御化することにより、訓練済みラットを週に数頭の割合で効率よく記録実験に供することを実現した。次に、このような無麻酔・行動中の脳定位固定ラットをもちいて、傍細胞記録法により単一神経細胞の発火活動を安定して記録した後に、付加したバイオサイチンを可視化するとともにパルバルブミンやカルレチニンとの蛍光三重染色を施して、記録細胞を機能的かつ形態的に同定することを可能にした。またテトロード電極作成からスパイク分離に至るマルチユニット記録解析システムを米国ラトガーズ大学Buzsaki研究室より導入し改良を加えた。このように行動中のラットの運動野における運動関連活動を示した細胞サブタイプを同定する実験系をほぼ確立し、本格的な実験・解析過程を軌道に乗せた。本研究計画において、ラットの大脳皮質運動野における運動の発現や調節に関与する介在細胞の細胞サブタイプを同定するために、1)脳定位固定ラットに運動課題を効率よく学習させる自動訓練装置を開発するとともに、2)無麻酔(行動・睡眠)状態での傍細胞記録とマルチユニット記録の電気生理学的実験系を確立した。この装置により訓練開始第一日目か二日目には運動応答と報酬獲得との相関が成立し、2週間以内に課題の学習を完成させることに成功した。次に、このような無麻酔・行動中の脳定位固定ラットをもちいて、傍細胞記録法により単一介在細胞の発火活動を安定して記録した後に、付加したバイオサイチンを可視化するとともにパルバルブミンやカルレチニンとの蛍光三重染色を施して、記録細胞を機能的かつ形態的に同定することを可能にした。現在、約50頭の動物に課題訓練を課し、すでにその約半数から運動関連活動を示し可視化した運動野細胞(うち介在細胞は6細胞以上)の実験データを得ている。このように行動中のラットの運動野における運動関連活動を示した介在細胞サブタイプを同定する実験系をほぼ確立し本格的な実験・解析過程を軌道に乗せて、介在細胞の機能的役割を解明しつつある。

次に、このような無麻酔・行動中の脳定位固定ラットをもちいて、傍細胞記録法により単一介在細胞の発火活動を安定して記録した後に、付加したバイオサイチンを可視化するとともにパルバルブミンやカルレチニンとの蛍光三重染色を施して、記録細胞を機能的かつ形態的に同定することを可能にした。最終的に74頭の動物に課題訓練を施し、運動関連活動を示し可視化した多数の運動野細胞(うち16細胞はFS介在細胞)の実験データを得た。その結果、FS介在細胞は、大脳皮質の層に関わらず、運動の実行コマンドをゲートするのではなく、むしろ錐体細胞と協調してコマンドを形成するという結論に至った。この研究成果は学会発表を終え、現在、論文を投稿中である。
生体肝移植ドナーのケアリング・システムの構築に向けての基礎的研究

生体肝移植ドナーのQOLの向上を目指しケアリング・システムの構築のために、現状の医療の現象を把握することを目指し、生体肝移植医療に従事する看護師に対して、半構成的面接を行い、移植医療に従事知る看護師の体験の意味を明らかにした、生体肝移植医療に従事する看護師の知識不足が反映される、「分かっていても踏み込めない」という感情やジレンマを抱えながら看護に従事する姿が明らかになった。このことから、生体肝移植ドナーの看護に従事する看護師の資質の向上が必要であるという示唆が得られた。生体肝移植ドナーが受けている医療・ケアを明らかにするために、生体移植医療にかかわる看護師との深い対話をもとに、その看護師が体験を明らかにするという目的で、調査を行った。生体移植医療(腎・肝)に関わる6名の看護師にインタビューを行い、質的記述的方法で分析を行った。研究参加者となった看護師は生体移植医療には315年の経験があった。分析の結果から、11のテーマが存在し、3つの主なテーマで示される生体移植医療に従事する看護師の体験が明らかになった。「1.わかっていても踏み込めない」という体験では、移植患者の変化に気づいていても、移植の辞退をされることを恐れ、関与の仕方がわからないと言うことから積極的介入が出来ていなかった。「2.レシピエントを中心とした医療」では、看護の関心はレシピエントに集中し、ドナーには関われていなかった。そして、「3.看護を行いながら感じるジレンマ」では、移植医療は不確かな部分が多くあり、患者や家族に対して確信を持って対応が出来ていないという思いがあり、自らの関与にジレンマを感じていることが明らかになった。これらのことから生体移植医療の看護師は、移植患者に対して十分な関与が出来ていなかった。また、看護師自信もジレンマを持ちながら、確信を持った関与が出来ていない実情が明らかになった。これらのことから、本研究を行うことで、生体肝移植ドナーのケアニーズを明らかにし、移植看護学確立を目指す必要性がある。生体肝移植ドナーを対象にしたインタビューについては、新潟大学医歯学総合病院の第一外科の協力を得て、募集を行い数名の参加者との接触ができた。更にインタビューを重ねて、分析を深めていく予定である。さらに、同病院の尿器科からも協力が得られ、生体腎移植ドナーの経験者との接触を行い、インタビューを行う予定である。更に、研究参加者の獲得のために、他施設へ交渉も予定している。昨年の報告から、さらにインタビューを重ねて、生体移植に関わる看護師が以下の体験をしていることが分かった。1.分かっていても踏み込めない:術前に移植患者やドナーの動揺に気づいても、「移植をやめる」や「臓器提供をやめる」と言われたくないとう思いから踏み込めないという体験をしている。肝移植領域の看護師は、ドナーが拒否することが、患者の死につながるために踏み込むことをためらう体験をしていた。腎移植領域の経験のある看護師は、ドナーに対してもう一度よく考えるよう促していた。2.レシピエントを中心とした医療:術前・術後ともケアの必要度が高いレシピエントに対して集中し、ケアの負担に疲弊していた。また、「ドナーは健康体である」という思いこみから、ドナーへの関わりは二の次となり看護が行えていないという思いを双方の領域の看護師が同じような思いを抱いていた。3.看護を行いながら感じるジレンマ:双方の領域の看護師が、移植医療は不確かな部分が多くあり、患者や家族に対して確信を持って対応できていないという思いがあった。また、肝移植領域の看護師は不幸な転機をたどる患者にどのように対応するべきか苦慮し、患者にとって「移植」という医療が適切であったのか疑問に思うこともあるということを経験していた。これらのことからドナーのケアリング・システムの構築には看護師の移植看護への知識や技術の向上に向けた取り組みも必要であることが明らかになった。生体肝移植ドナー経験者の研究参加者の確保について、現在のところ困難さがみられているが、一定の成果が得られていると考える。今後、研究活動の見直し等を行い、さらなる成果が得られるように努力をしたい。来年度は、新しい移植実施施設に対して、研究協力を依頼し、多くのデータを得られるように活動を行う予定である。平成20度は、研究代表者が新潟大学から愛媛大学へ移動したために研究フィールドの開拓・及び研究協力者・研究参加者確保に時間を要した。そのために、成果が報告できるほどのデータ収集を行うことができなかった。特に現在の所属大学からは十分な研究協力を得ることができず、今後、さらなる所属大学との話し合い調整を行い、研究計画が実施できるように調整していきたいと考える。しかし、一方では他施設の医師からの協力も得られ、今年度末から徐々にではあるが生体肝移植ドナー経験者の参加者の確保もでき、平成20度からの研究計画の遂行を行う予定としている。

さらに他の移植実施施設において、看護師を対象とした調査を行っており、この成果は平成21年度内には学会への成果報告と、論文投稿をする予定である。この調査と昨年度、報告を行った研究成果から、生体肝移植ドナーに関わる看護師は、移植看護谷対する十分な知識を持たず、さらに多くのジレンマを抱えたまま看護実践を行っていることが明らかになった。これらの生体肝移植ドナーに対して十分に看護を提供するためには、これらの課題を解決していく必要がある。今回の研究活動においては、前述のような課題の存在が明らかになったが、その課題の発生要因や解決策等が明らかできるような研究を計画し、遂行していく必要があると考えられる。この3年間の成果として、研究協力施設との調整ができれば、実施可能な段階まで準備はできており、今後、調査を実施できるよう努めたい。
離散可積分系による古典直交多項式の理論とその応用

離散可積分系の理論を用いることで古典直交多項式の研究を進めた。特に、古典直交多項式の一般化である例外型直交多項式に対して、漸化式の導出に成功した。また、Bannai-Ito代数について、その応用ともに明らかにした。関連するBannai-Ito多項式においても、一般化ダルブー変換を用いることで、例外型直交多項式類似を導入するなどした。さらに、オートマトンを用いることで、箱玉系などの超離散可積分系を定式化し、オートマトンの理論を用いた新しい解析手法を提案した。廣田のタウ関数などの可積分系の理論と直交多項式の理論を用いることで,古典直交多項式とその一般化に関する以下の項目について理論的解析を個別的にすすめた.古典直交多項式とその一般化に関する研究の端緒として,例外型直交多項式を取り上げた.例外型直交多項式は,Gomez-Kamran-Milson, Odake-Sasakiらによって導入された古典直交多項式の一般化の一つであるが,現在,多くの研究者の注目をあびており,多くの具体例が知られるようになってきた.しかしながら,それらは個別的な解析が主であり,それらを統括的に扱うに至っていない.例外型直交多項式の古典性を明らかにすることで,例外型を含めたより広いクラスを扱うことが可能となる.これにより,多重超幾何関数やDarboux変換の理論などとの関係が明らかになってきた.次に,Bannai-Ito多項式の鏡像変換と一階差分からなるDunkl作用素の多項式固有関数として与えられるBannai-Ito多項式について,古典直交多項式として様々な性質が明らかになっていない.母関数表示やRodriguesの公式を明らかにしつつ,その先の例外型直交多項式の導出を行った.また,箱玉系のスペクトル解析として,運搬車付き箱玉系に対応するオートマトンを導出し,その上でのランダムウォークについて解析を進めた.この中で,オートマタ群の点燈夫群と箱玉系と直接的な対応関係が明らかにした.古典直交多項式とその拡張に関する研究として,例外型直交多項式とBannai-Ito多項式と特に取り上げることで,様々な観点から解析を加えた.まず,例外型直交多項式について,例外型Laguerre多項式および例外型Jacobi多項式の漸化式構造について新しい知見を得た.特に,漸化式の項数について,一般にこれまでより少ない項数の漸化式を満たすことを例外型の型に依らず成り立つことを示した.これは待ち行列理論への応用などを図る上での出発点となるものと考えられる.さらに,新たに古典直交多項式として見なされるに至ったBannai-Ito多項式についても,鏡映演算子を含むDunkl型微分演算子に対するDarboux変換を導入することにより,例外型拡張である例外型Bannai-Ito多項式の系列を構成することが可能となった.これらは,古典直交多項式の自然な拡張である例外型直交多項式に関する基礎的な研究である.また,オートマトン群と箱玉系との関係を調べる中で,オートマトンによって表示された箱玉系に関しても進展があった.例えば,ソリトン性を有する箱玉系として,Takahashi-Satsumaとその拡張にはみられない特徴をもつルールを与えることが可能となった.また,Lamplighter群との関係についても,単純なシフト力学系のみではなく,状態数3および4のオートマトンで表される箱玉系との類似性を見出した.本研究では,数理物理および情報学において累積されてきた古典直交多項式およびその一般化に対して,離散可積分系の立場からその多様な性質を明らかにし,関連する諸分野を横断的に研究する方法論の確立を目指してきた。最終年度である本年度は、本研究課題を通して明らかになってきたオートマトン系への応用も含め、Bannai-Ito多項式の理論と応用、双直交多項式の数値計算への応用などの具体例に基づき、これまでの理論と応用研究をまとめ上げる成果発表に努めてきた。特に、新たに古典直交多項式として認識されるに至ったBannai-Ito多項式については、鏡像変換を含むDunkl型作用素の固有関数となるなど他の古典直交多項式にはみられない性質を有している。この事実に基づき、付随するBannai-Ito代数を明らかにし、対応するRacah問題、鏡映演算子を用いた超可積分系などへの応用も考えるなど、古典直交多項式に対する理論体系の再構築を概覧してきた。また、固有値計算アルゴリズムへの離散可積分系理論の応用として、あるクラスの3重対角行列の組に付随する一般化固有値計算をこれまでの研究の中で明らかにしてきたが、実用に近づけるための工夫や、従来アルゴリズムに対する優位性を明らかにするなど、より詳細な検討を加えてきた。また、dqdアルゴリズムの超離散化から得られるTakahashi-Satsumaの箱玉系についても、オートマタ半群の立場から、これまでの平行移動の力学系ではなく、本質的に非線形力学系となる場合についても、オートマタ群の点灯夫群との類似性を数値的に明らかにした。

古典直交多項式とその一般化に関する研究として,例外型直交多項式に関する研究が進展した.特に,漸化式の構造に関する結果は,基礎的な事実であり,待ち行列理論への応用などを図る上での出発点となるもので需要であると考えている.加えて,これまでのBannai-Ito多項式に関する研究成果を下に,その例外型拡張にも成功していおり,この方向性も今後とも重要である.また,箱玉系のスペクトル解析の研究から新しい箱玉系も見出すことに成功しており,オートマトンの観点から有用性が明らかになりつつあり,今後の発展が十分期待できる.直交多項式、離散可積分系例外型直交多項式に関する研究成果である漸化式構造や古典性に関する研究をよりすすめていくことで,待ち行列理論への応用などを図る.また,オートマトンの観点から箱玉系を見直すことで,オートマトンそのものの解析手法を確立していきたい.本研究課題の目的は,古典直交多項式とその一般化に関して,離散可積分系の立場からその多様な性質を明らかにし,新たな特徴付けを与えることにより,直交多項式を含めた特殊関数に関連する諸分野を横断的に研究する新しい古典解析的方法論を確立することにある.具体的な研究課題の一つである古典直交多項式と離散可積分系理論については,例外型直交多項式とDarboux変換との関係をより直接的に準多項式固有関数を用いて統一的に捉えることをしめした.さらには,最近見出されたBannai-Ito多項式に関しても,同様の議論により例外型への拡張に成功するなど,着実に研究が進展しているといえる.また,箱玉系との関係についても,直交多項式に付随する可積分系の代表例として挙げられる戸田方程式およびLotka-Volterra方程式との関係はよく知られており,その一般化である双直交多項式におけるLotka-Volterra方程式の類似物を見つけることで,可積分系にる直交多項式理論を深めることが可能になった.さらに,予期せぬ結果として,オートマタ群の点燈夫群と運搬車付き箱玉系との直接的な対応関係が明らかになるなど,幅広い分野への応用の道筋が見えてきた.この点に関しても,高速かつ高精度の数値計算アルゴリズムに不可欠な減算なし漸化式との導入と箱玉系の超離散化手法との関係について,新たな観点が加えることが可能になったことで,これまでに提案していきたアルゴリズムの改良を図ることが可能となった.当初,海外出張を計画したが,都合により出張できなくなったため,次年度使用額が生じた.まず,古典直交多項式とその一般化に関する研究については,離散可積分系理論と離散直交多項式の対応関係を明らかにすることで,従来の個別的ではなく,本研究課題初年度で得られた包括的枠組みをより広い対象について,適用を試みていく.特に,例外型直交多項式およびBannai-Ito多項式,多重直交多項式,(p, q)型直交多項式,歪直交多項式などの具体的な例を手がかりにして,代数的な枠組みや対応する可積分系との関連を明らかにしながら,一般化された直交関数系における古典性を明らかにしていく予定である.
環境因子と皮膚老化・皮膚疾患‐AhRを中心とした分子メカニズム解析

人種差による環境因子(紫外線・喫煙・大気汚染)に対する皮膚老化の大規模調査のため、皮膚老化スコア(SCINEXA)を使用し、新たな質問表を作成した。名古屋市内で100人、大気汚染が少ない地域で100人を調査し、単一ヌクレオチド多型(SNPs)はドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所で解析を進めた。タバコ煙抽出液によるAhR経路によってTH17細胞誘導され、角化細胞・線維芽細胞においてAhR経路からコラゲナーゼが誘導、メラノサイトでもMITF発現上昇・メラニン産生の増加が見られた。同時に、紫外線やタバコなどの環境因子が関係する乾癬においても、SNPsの解析を行った。本研究では、Aryl hydrocarbon receptor(AhR)を中心とする機序解析から、皮膚老化、皮膚疾患との関連や、TH17系の免疫におよぼす作用を検討を行う予定である。分子疫学的調査:人種差による環境因子(紫外線・喫煙・大気汚染)対する皮膚老化の差違ーJAGE project(Study of extrinsicskin ageing of Japanese and German women)のー大規模調査のため、皮膚老化スコア(SCINEXA)を使用し、新たな質問表(Life style, Food, Sun exposure, Womenの4種類)を作成した。また、名古屋市内(近傍)で100人、大気汚染が少ない地域(愛知県美浜町)で100名の調査を行った。さらに、単一ヌクレオチド多型(SNPs)による網羅的遺伝子的解析(次世代シークエンサー)のため、血液サンプルも既に取得し、共同研究者であるドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所に送付を行った。また、同時に、タバコ煙抽出液によるAhR経路によるTH17細胞誘導(IL-17/IL-22誘導)されることを見いだし、また、角化細胞・線維芽細胞においてAhR経路からコラゲナーゼが誘導されることも明らかとした。Aryl hydrocarbon receptor(AhR)を中心とする機序解析から、皮膚老化、皮膚疾患との関連や、TH17系の免疫におよぼす作用を行っている。まず、分子疫学的調査:人種差による環境因子(紫外線・喫煙・大気汚染)対する皮膚老化の差違ーJAGE project(Study of extrinsicskin ageing of Japanese and German women)のー大規模調査(ドイツ側200名・日本側200名)として、皮膚老化スコア(SCINEXA)を使用し、新たな質問表(Life style, Food, Sun exposure, Womenの4種類)を作成し、名古屋市内(近傍)100名、大気汚染の少ない地域で100名の調査を行った。調査は、終了し解析を進め、共同研究者であるドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所には血液サンプルを送付した。また、タバコ抽出液によるAhR経路の活性化についても、角化細胞、線維芽細胞ではコラゲナーゼの誘導、さらに、メラノサイトでもMITF発現上昇、メラニン産生の増加を見いだした。また、紫外線やタバコの喫煙が関与する乾癬や掌蹠膿疱症の患者においても、単一ニクレオチド多型(SNPs)解析を行った。Aryl hydrocarbon receptor(AhR)を中心とする機序解析から、皮膚老化、皮膚疾患との関連や、TH17系の免疫におよぼす作用の検討を行った。さらに、単一ヌクレオチド多型(SNPs)による網羅的遺伝子的解析(次世代シークエンサー)のため、血液サンプルも既に取得し、共同研究者であるドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所に送付行い、解析を継続している。また、同時に、タバコ煙抽出液によるAhR経路によるTH17細胞誘導(IL-17/IL-22誘導)されることを見いだし、また、角化細胞・線維芽細胞においてAhR経路からコラゲナーゼが誘導、さらにはメラノサイトでもMITF発現上昇・メラニン産生の増加が見られた。紫外線照射とタバコ煙抽出液をくわえることで、さらにメラニン産生が増強し、AhRノックダウンで、MITFの発現は抑制された。重要な分子疫学調査は終了し、引き続き、ドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所とともに、解析を行っているところであり、他のアジア(中国)での解析とあわせ、人種差以外の環境因子にもさらに焦点をあてて解析をすすめている。全容の解析には、さらに今年度内、時間がかかるものと思われる。

皮膚科学分子疫学調査の解析を引き続きおこなうことと、さらには、紫外線やタバコの喫煙が関与する乾癬や掌蹠膿疱症の患者においても、単一ニクレオチド多型(SNPs)解析、TH17/制御性T細胞の解析もあわせて行い、環境因子とTh17/制御性T細胞の関係を明らかにする予定である。もっとも重要な分子疫学調査が終了し、現在、ドイツデュッセルドルフ大学環境医学研究所ともに、解析を行っているところである。解析には、平成26年度内時間を要することが予想されるが、もっとも重要な疫学調査は終了した。平成25年度には、細胞レベルでの解析ができなかったものがあるので、達成度としては、重要な疫学調査が終了してという面では十分であるが、細胞レベルでの解析が一部にとどまったため、平成26年度に行うこととした。使用した試薬が予定より少なくなったため平成25年度に行うことができなかった細胞レベルとしての解析として、タバコ煙・紫外線・ディーゼルパーティクルによるメラノサイト活性化作用、タバコ煙が免疫系におよぼす影響として、遅延型過敏反応モデルなどを用い、AhRの関与・TH17/Tregバランスなども、検討する予定である。また、あわせて紫外線の影響やタバコの喫煙が関係すると思われる乾癬や掌蹠膿疱症の患者においても、単一ヌクレオチド多型(SNPs)解析を行う予定である。引き続き分子疫学調査の解析を行い、加えて制御性T細胞の解析も行うもっとも重要な疫学調査は終了したが、平成25年度には、細胞レベルでの解析ができなかったものがあるので、細胞レベルでの解析が一部にとどまったため、平成26年度に行うこととした。そのため、使用額の差額が生じた。平成25年度に行うことができなかった細胞レベルでの解析を行い、また、あわせて紫外線の影響やタバコの喫煙が関係するとおもわれる乾癬や掌蹠膿疱症の患者においても、単一ヌクレオチド多型(SNPs)解析を行う予定である。
ヒト歯髄幹細胞の培養上清をもちいた中枢神経再生療法の開発

ヒト歯髄幹細胞無血清上清をラット脊髄損傷モデルへ持続投与した結果、「炎症・免疫制御」「ミエリン脱髄抑制」「神経軸索伸長促進」「神経系細胞のアポトーシス抑制」効果により、下肢運動機能が著しく改善した。歯髄幹細胞培養上清中には約80種類の液性因子群が含有しており、In vitro解析において初代培養神経細胞の神経突起伸長効果、初代培養ミクログリアにおける抗炎症型への転換効果が認められた。本研究により、ヒト歯髄幹細胞由来液性因子群は脊髄損傷などの中枢神経系疾患への治療有用性が高いことが示唆された。ヒト歯髄幹細胞の神経再生能力は極めて高く、ラット完全脊髄切断モデルに移植すれば下肢運動機能が回復する。これらの再生効果は、移植した幹細胞から分泌される神経再生因子群によるところが大きい。歯髄幹細胞由来中枢神経再生因子が同定されれば、細胞移植を伴わない安全で臨床応用しうる理想的な治療法を確立できることが期待される。本研究ではヒト歯髄幹細胞由来の無血清培養上清を急性期脊髄損傷モデルへ投与し、その治療効果を確認した。さらに、その治癒メカニズムをin vivoおよびin vitroで詳細に解析した。脊髄損傷における炎症・免疫反応の主役となるミクログリアを用い、その初代培養系をLPSで刺激、炎症/組織破壊系ミクログリアへ誘導し、その環境下で歯髄幹細胞培養上清を作用させ、炎症性サイトカインの遺伝子発現変動や、細胞障害性因子であるグルタミン酸や一酸化窒素産生の変動を解析した。歯髄幹細胞培養上清はLPSで活性化されたミクログリアの炎症性サイトカインIL-6、IL-1β、TNF-αの発現を抑制した。これは骨髄間葉系幹細胞培養上清および繊維芽細胞培養上清でも同様の傾向を示した。また、ミクログリアからの細胞障害性因子グルタミン酸や一酸化窒素の産生を歯髄幹細胞培養上清が特異的に阻害した。さらに、非活性型ミクログリアに歯髄幹細胞培養上清を作用させると、CSPG(神経軸索伸長阻害因子であるが、近年脊髄損傷急性期におけるミクログリア刺激因子の一つとして報告されている)を介し、抗炎症/組織修復系ミクログリアマーカーであるCD206を発現を誘導し、かつ強力な抗炎症性サイトカインIL-10を産生も促進した。これらの研究成果から、損傷した脊髄に抗炎症・組織再生環境を構築することが歯髄幹細胞培養上清の神経再生効果であることが明らかとなった。中枢神経は脊髄損傷、脳虚血、神経変性疾患などにより深刻なダメージを受ける。これまでこれら難治性神経疾患に対する有効な治療法はなかった。我々は、ヒト乳歯、および智歯永久歯に含まれる幹細胞を用いた難治性神経疾患治療の開発を目指してきた。これまでに名古屋大学医学系研究科・倫理委員会の承認を受けて、口腔外科学講座で脱落乳歯・抜去した智歯から幹細胞を採取した。性状解析と神経再生機能について解析を行った結果、これら幹細胞は難治性神経疾患に優れた治療効果を発揮するための下記4つの性質を兼ね備えていることが明らかとなった。(1)神経保護作用:組織損傷による神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトのアポプトーシスを強力に抑制する。(2)神経軸索伸長作用:組織損傷によって切断された、神経軸索を伸長し、新たな神経ネットワークの形成を促進する。(3)神経幹細胞様の分化能:神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへの分化誘導に高い反応性を示す。(4)移植安全性:自己幹細胞であるため、移植における安全性が高く、倫理的問題も極めて少ない。さらに、脊髄を完全に切断した「ラット脊髄損傷モデル」を用いて検討した結果、急性期における歯髄幹細胞の移植によって下肢の運動機能が回復するという、驚くべき治療効果を見いだした。我々はこの神経再生活性の多くが歯髄幹細胞の産生するパラクライン因子によるものと考えている。本研究では、歯髄幹細胞の培養上清に含まれる成長因子群の神経再生効果、および神経再生阻害シグナルの抑制効果をinvitro細胞培養系とinvivo脊髄損傷モデルで解析し、新しい神経再生医薬品開発の可能性を検証する。末梢神経は損傷後に再生しやすいが、中枢神経(大脳や脊髄)が再生することはほとんどない。中枢神経の再生が起こらないもっと大きな理由は、「損傷後の中枢神経系に再生軸索の伸長を阻害する種々の因子が存在する」ことだと考えられている。これまでに下記2つカテゴリーの神経再生阻害因子が同定されている。これら神経再生阻害因子の存在下でも神経細胞死を抑制し、軸索の伸長効果を発揮する薬剤は見いだされていない。(1)ミエリン関連糖蛋白(MAG)やNogo-Aなど:もともと脳や脊髄の白質(有髄神経線維の多い部分)の髄鞘に存在する軸索伸長抑制タンパク質。

(2)グリア瘢痕の主要構成分子であるコンドロイチン硫酸:損傷後にはグリア細胞であるアストロサイトが損傷部周辺で増加し(反応性アストロサイト)、受傷後1週間程度(亜急性期)からグリア瘢痕を形成する。このグリア瘢痕由来のコンドロイチン硫酸が神経再生を阻害する。今回我々は、歯髄幹細胞の培養上清が様々な神経再生阻害因子の効果を抑制し、神経突起の伸張を促すことを見いだした。骨髄間葉系幹細胞や皮膚線維芽細胞の培養上清にはこのような神経再生活性が検出できなかった。さらにpre-liminaryな解析結果ではあるが、ラット圧挫型脊髄損傷モデルに歯髄幹細胞の培養上清を持続投与すると脊損ラットの下肢運動機能が劇的に回復することを見いだした。骨髄間葉系幹細胞や皮膚線維芽細胞の培養上清を投与したラットの下肢運動機能は回復しなかった。つまり、我々は「本研究は初期研究課題である、歯髄幹細胞の培養上清の強力な神経再生活性をin vitroおよびin vivoで検証するシステムの構築」に成功した。本研究は、歯髄幹細胞の培養上清の神経再生効果を検証するとともに、中枢神経に特有な神経再生阻害システムに対する影響を解析する。平成23年度は(1)培養上清に含まれる成長因子の網羅的蛋白発現解析, (2) MAG (Myelin associated glycoprotein)やPSCG(コンドロイチン硫酸)をコーティングした培養皿上でPC12や初代培養の小脳顆粒細胞を培養し、中枢神経損傷部位における環境をinvitroで再現することを試みた。平成24年度はIn vivoにおける培養上清の中枢神経再生効果の検証を行う。圧挫型脊髄損傷のラットモデルを制作し、ポンプにてくも膜下腔に培養上清を投与する。これらの解析結果を踏まえて培養上清の神経再生能力を検証する。さらに網羅的な蛋白発現解析を進め培養上清に含まれる神経再生因子の同定を目指す。平成24年度は以下in vivo研究のためにラット購入費・飼育費・マイクロインフィージョンポンプ購入費・組織染色用の抗体や細胞培養関連試薬の購入を行う。【In vivoにおけるDPSC-NRFの中枢神経再生効果の検証】雌成体SDラットをペントバルビタールナトリウムで全身麻酔する。第10胸椎椎弓切除し、硬膜外よりPrecision Systems and Instrumentation社製Infinite Horizon Impactorを用いて200kDynの脊髄圧挫損傷を加え、脊髄不全損傷圧挫モデルとする。損傷直後より完全埋め込み式マイクロインフュージョンポンプに連結したチューブをくも膜下腔に挿入し,先端を損傷部直上におき,約二週間にわたって長時間持続的にDPSC-NRFまたはPBSを投与する。評価方法は、(1)ラット下肢運動機能評価をBasso, Beattie, and Bresnahan (BBB) scaleにて評価。(2)脊髄損傷急性期における脊髄組織のアポプトーシス抑制効果をTUNEL染色法にて評価。(3)大脳運動野にBDA-biotin神経軸索トレーサーを注入する。注入後2週間で屠殺。BDA-biotinを組織染色で検出。下肢運動能を制御する皮質脊髄路が損傷部位を超えているか解析することで、軸索伸長効果を評価する。さらに培養上清の抗体アレイ解析を外部委託にて行い、歯髄幹細胞の培養上清に特異的な発現する因子を見いだす。
タウのリン酸化亢進によって惹起される認知機能障害のメカニズム解明

前年度までに,タウのリン酸化の増減を制御する因子を同定し,それに関して解析を開始した。神経細胞において,この因子の発現を抑制するとリン酸化タウが増加することがわかった。そこで,当該年度に関しては,この効果を生体内で実証することにした。まず,野生型マウスの海馬に,この因子の発現を抑制するベクターを導入したところ,リン酸化タウが増加することがわかった。次に,ヒト型タウをノックインしたマウスに対して,同様の実験を行った。このマウスにおいても,やはり,リン酸化タウが増加することがわかった。発現抑制ベクターをインジェクションしてからの時間に依存して,リン酸化タウがどのように変化するかを解析したところ,数ヶ月が経過しても,リン酸化タウのレベルが上がった状態が維持されていることが分かった。そこで,ある程度の時間が経過してから,このマウスの脳内の界面活性剤不溶性タウについて検討を行った。界面活性剤不溶性タウは,脳内に蓄積するタウの前段階と考えられるためである。解析を行った結果,海馬では顕著な差は見られなかったものの,大脳皮質の或る部分においては,それが増加している傾向が認められた。また,当該年度においては,ヒト型タウを導入したマウスに対する間歇的低酸素負荷実験を実施した。野生型マウスにおいては,リン酸化タウを増加させることが分かっているが,ヒト型タウを導入したマウスに対しての知見はない。実験の結果,既報通り,ヒト型タウを発現するマウスにおいても,リン酸化タウの増加が起きることが分かった。また,界面活性剤不溶性タウについて検討を行ったところ,このモデルにおいても,海馬では顕著ではないものの,大脳皮質のある部分においては,増加している傾向が認められた。さらに,間歇的低酸素負荷が神経の過活動と類似した反応を起こしている可能性があることを,以前に発表した論文で指摘したが,それに関する検証を行った。タウのリン酸化の亢進は,アルツハイマー病をはじめとするタウオパチーの発症,進行に密接に関与していると考えられている。これまでに,間歇的低酸素負荷がタウのリン酸化を亢進することを明らかにし,そのメカニズムの解明を通じて,タウのリン酸化制御の意義を解明しようと試みている。当該年度においては,タウのリン酸化を制御すると考えられるいくつかのリン酸化酵素,脱リン酸化酵素に着目した解析を行った。その結果,タウのリン酸化と並行して動いているリン酸化酵素を一つ同定した。少なくとも,間欠的低酸素負荷によって惹起されるタウのリン酸化の亢進に関与する経路の候補を一つ提示することができた。ここまでの結果については,当該年度内に,論文として発表した。また,タウのリン酸化が減少する実験系も新たに見出し,その解析を行った。特に,脳内のタウのリン酸化が減少していると思われる条件において,行動解析を実施した。そのなかで,マウスに,2種類の物体を判別させる行動試験を新たに樹立した。本研究の目的の一つは,シナプスに存在する神経伝達物質受容体の局在制御機構とタウとの関係を模索するものである。そこでしばらくは,培養細胞系を用いた実験系で,詳細な解析を行うことを予定している。その準備として,必要なDNAコンストラクトの樹立や細胞培養の条件設定等を当該年度において実施した。実験条件の最適化は次年度の課題として残している部分もあるが,おおかたは本年度内に実施することが出来た。論文の発表に至ることが出来たこと,また,動物実験の結果を更に詳しく解析するための培養細胞実験の準備が大いにはかどったことが,その理由である。リン酸化タウのレベルの増加は,アルツハイマー病をはじめとするタウオパチーの発症,進行に密接に関与していると考えられている。しかし,平素,タウのリン酸化がどのように制御されているかは不明な点が多い。本研究の目的を達成するためには,まず,この点に関して理解する必要がある。そこでこれまで,比較的生理的な条件下で,生体内のリン酸化タウの量が変動する条件を探索してきた。その結果,間歇的低酸素負荷がリン酸化タウのレベルを増加させることを見出した。また,リン酸化タウのレベルを減少させる条件も見出した。本年度は,これらの情報を基に,リン酸化タウの増減に関与する因子を探索すべく,遺伝子解析データの比較を行った。いくつかの因子が候補として上がってきたが,それらの中から,文献等を参照し,特に関与が有望な因子を絞り込んだ。一方で,ここで絞り込んだ因子が,リン酸化タウの増減に対して与える影響を評価するため,本年度はまず,培養細胞を用いたアッセイ系を確立した。その過程で,まず,リン酸化タウが減少する条件に関し,細胞系での再現が取れるかを解析した。薬理学的実験を行なったが,生体でのデータと矛盾しない結果を得ることができた。また,その過程で,リン酸化タウが増加,減少する条件を,ある程度絞り込むことができた。次に,生体データの比較によって抽出した因子に関し,その因子がリン酸化タウの変動に与える影響を解析した。当該年度中は主に,見出した因子のはたらきを阻害する実験を,薬理学的手法によって実施した。その結果,阻害したときに,リン酸化タウが増加する傾向が認められた。この結果は,間歇的低酸素負荷によってリン酸化タウが増加するメカニズムの一旦を説明するものだと考えている。当初の予定通り,細胞系での評価系を確立し,それを利用して,解析を行うことができた。

今後も解析を継続する意義のある成果を得ることができたと考えている。前年度までに,タウのリン酸化の増減を制御する因子を同定し,それに関して解析を開始した。神経細胞において,この因子の発現を抑制するとリン酸化タウが増加することがわかった。そこで,当該年度に関しては,この効果を生体内で実証することにした。まず,野生型マウスの海馬に,この因子の発現を抑制するベクターを導入したところ,リン酸化タウが増加することがわかった。次に,ヒト型タウをノックインしたマウスに対して,同様の実験を行った。このマウスにおいても,やはり,リン酸化タウが増加することがわかった。発現抑制ベクターをインジェクションしてからの時間に依存して,リン酸化タウがどのように変化するかを解析したところ,数ヶ月が経過しても,リン酸化タウのレベルが上がった状態が維持されていることが分かった。そこで,ある程度の時間が経過してから,このマウスの脳内の界面活性剤不溶性タウについて検討を行った。界面活性剤不溶性タウは,脳内に蓄積するタウの前段階と考えられるためである。解析を行った結果,海馬では顕著な差は見られなかったものの,大脳皮質の或る部分においては,それが増加している傾向が認められた。また,当該年度においては,ヒト型タウを導入したマウスに対する間歇的低酸素負荷実験を実施した。野生型マウスにおいては,リン酸化タウを増加させることが分かっているが,ヒト型タウを導入したマウスに対しての知見はない。実験の結果,既報通り,ヒト型タウを発現するマウスにおいても,リン酸化タウの増加が起きることが分かった。また,界面活性剤不溶性タウについて検討を行ったところ,このモデルにおいても,海馬では顕著ではないものの,大脳皮質のある部分においては,増加している傾向が認められた。さらに,間歇的低酸素負荷が神経の過活動と類似した反応を起こしている可能性があることを,以前に発表した論文で指摘したが,それに関する検証を行った。確立した実験系を用いて,シナプスに存在する受容体の局在解析とタウのリン酸化との関係性を明らかにしていく。またその結果得られた新たな知見が,間歇的低酸素負荷モデルにて見られるかも検証していく。これまでに細胞系を用いて解析を行ってきた。今後は,生体内での解析を行う。特に,前年度で見出した因子のはたらきが低下することが,記憶学習障害に繋がるのか,神経伝達物質の受容体の発現等に着目しながら解析を継続したいと考えている。特に理由はなく,消費税等の端数のよって生じたものである。研究計画の大幅な遅延によって残額が生じたわけではない。繰り越しが出来ることを生かし,次年度の研究遂行に充てる予定である。消費税の端数によるものであり,研究の遅滞によるものではない。次年度に,消耗品費として使用する予定である。研究計画に記載したように,実験に必要な試薬類の購入等に充てる。
経路積分とその関連する諸問題の研究

Feynman経路積分は、量子物理学より出ずる問題であるが、近年、偏微分方程式論、確率論、多様体上の幾何学に重要な新しい視点をあたえている。本研究の成果は、次の4つの部分からなる。1.一瀬は、論文〔Ann.Inst.H.Poincare〕において、電磁ポテンシャルが必ずしも滑らかでないときに、相対論的Weyl量子化ハミルトニアンを定義し、加藤の不等式を確立することにより、その本質的自己共役性を証明した。これは、電磁ポテンシャルが滑らかで有界のとき、一瀬-田村〔Commun.Math.Phys.105(1986)〕で与えたこのハミルトニアンに対する半群の経路積分表示から、予想されていたことであった。論文(Feynman path integral to R.Q.M.)は、加藤敏夫教授(カリホルニア大学バ-クレイ校)を讃える国際会議(於東京大学)での一瀬の講演を発展させたサ-ベイである。2.田村博志は、AlbeverioとHφegh-krohnによる非線型電磁場の量子論において、Wilsonル-プの期待値が面積則に準ずる性質を持つことを証明し、この理論が電荷を閉じ込めるモデルであることを示した。ただ鏡映正値性は満たしていないが、興味深いことである。3.林田和也は、論文〔Proc.AMS〕において、多孔質媒質の方程式の解の滑らかさを示した。松村昭孝は、論文〔Lect.Notes Num.Appl.Anal.〕において、1次元圧縮性粘性流体を記述する非線型偏微分方程式の解の漸近挙動を考察し、吸収集合やアトラクタ-の存在を証明した。4.藤本担孝は、論文〔J.Diff.Geometry〕において、m次元ユ-クリッド空間内の完備極小曲面のGauss写像Gが非退化なとき、Gの像がm-1次元複素多様体のm(m+1)/2個より多くの一般の位置にある超平面を除外することはあり得ないこと、及び、奇数のmのときこの結果が最良であることを証明した。杉山健一も複素多様体の研究を進めた。
MEK1阻害薬のくも膜下出血後脳血管攣縮および認知機能障害に対する治療効果の検証

本研究では、くも膜下出血(以下SAH)後の脳血管攣縮の原因の一つにMEK-ERK経路の活性化が関与していることに着目し、ERK1/2抑制作用を有する天然フラボノイドのケルセチンの投与がSAH後の脳血管攣縮を予防するかを、ラットSAHモデルを用いて検証した。ラットSAHモデルの作成:SDラットを用いた。全身麻酔、人工呼吸下で脳定位固定装置に固定し、bregmaより前方6.5mmにスパイラル針を挿入後、SAH群には自己動脈血(450μl)を投与した。Sham群には同量の生理食塩水を投与した。ラットSAHモデルの死亡率は約20%であり、モデルとしては問題なかった。SAH発症後48時間後のケルセチンによるERK1/2抑制効果の評価:1SAH後60分にケルセチン(50mg/kg/day)を投与した。ランダムにVehicle群、Sham群も作成。2SAH発症48時間後の深麻酔下にラットを還流固定した。3HE染色法を用いた脳血管攣縮に対する効果には優位差を認めなかった。続いて免疫染色法を用いて、脳動脈血管壁におけるpERK1/2の発現を観察したが、ケルセチンのERK1/2抑制効果も優位差を認めなかった。本年度はウェスタンブロット法を用いて、pERK1/2の発現を観察した。最初は還流掖で固定したサンプルを用いて前頭前野のpERK1/2を定量したが、結果が安定しなかったため、サンプリングまでの時間を短縮する目的で還流を省いて測定したが結果は大きく変化無かった。そのため、以降は手技が簡単な還流をしない方法で実験を行なった。手技を変えたが、前頭前野で優位差を認めなかった。更に、海馬、大脳皮質、小脳についても同様に定量を行なったか優位差を認めなかった。ラットSAHモデルにおいて、SAH発症後60分でのケルセチン投与は、pERK1/2の抑制効果、脳血管攣縮の予防効果は認めなかった。本研究では、SAH後の脳血管攣縮の原因の一つにMEK-ERK経路の活性化が;関与していることに着目し、ERK1/2抑制作用を有する天然フラボノイドのケルセチンの投与がSAH後の脳血管攣縮を予防するかを、ラットSAHモデルを用いて検証する。本年度は以下のような計画で実験を行った。1、ラットくも膜下モデルの作成:雄性SDラット(250-350g)を用い、イソフルラン麻酔下に人工呼吸を行う。ラットを脳定位固定装置に腹臥位で固定し、bregmaより前方6.5mmにあけた穴にスパイラル針を挿入する、SAH群には自己動脈血(450μl)を投与する。生食(Sham)群には同量の生理食塩水を投与する。作成したラットくも膜下モデルは死亡率は約20%であり、モデルとしては問題ないと考えている。2、ケルセチンの至適経口投与量および投与開始時間の決定:ケルセチンの効果を確認するため、まずは、モデル作成前日から薬剤の投与を行い、50mg/kg/day、Vehicle群、Sham群間での治療効果を判定しているところである。3、HE染色を用いた脳血管攣縮に対する効果判定:これまでの予備実験から、血管攣縮はSAH後24-48時間に強く起こることが判明しているので、本実験では48時間後に効果判定を行っており、現在各群のサンプル数を増やしているところである本研究では、SAH後の脳血管攣縮の原因の一つにMEK-ERK経路の活性化が関与していることに着目し、ERK1/2抑制作用を有する天然フラボノイドのケルセチンの投与がSAH後の脳血管攣縮を予防するかを、ラットSAHモデルを用いて検証する。ラットくも膜下モデルの死亡率は約20%であり、モデルとしては問題ないと考えている。2、SAHモデルを用いて、SAHは発症後48時間後のケルセチンによるERK1/2抑制効果の評価:1SAH後60分にケルセチン(50mg/kg/day)を投与した。平行して、ランダムにVehicle群、Sham群も作成。2SAH発症48時間後の深麻酔下にラットを還流固定し、脳を摘出、凍結標本を作製する。3免疫染色法を用いて、脳動脈血管壁におけるpERK1/2の発現を観察する。4ウェスタンブロット法を用いて、pERK1/2の発現を観察する。モデルの完成度については、検証済みで問題ないと考えている。現在、脳の凍結標本を用いて、組織中のpERK1/2の発現を観察しているところである。ケルセチンの投与開始時間はSAH発症後60分で現在行っているところであるが、ケルセチンのpERK1/2活性への影響は明らかになっていない。効果を明らかにするには、もう少しサンプル数を多くする必要があると考えられる。また同時に還流固定の方法等の手技的な影響も否定し得ないため、それらの検証も行なっているところである。

本研究では、くも膜下出血(以下SAH)後の脳血管攣縮の原因の一つにMEK-ERK経路の活性化が関与していることに着目し、ERK1/2抑制作用を有する天然フラボノイドのケルセチンの投与がSAH後の脳血管攣縮を予防するかを、ラットSAHモデルを用いて検証した。ラットSAHモデルの作成:SDラットを用いた。全身麻酔、人工呼吸下で脳定位固定装置に固定し、bregmaより前方6.5mmにスパイラル針を挿入後、SAH群には自己動脈血(450μl)を投与した。Sham群には同量の生理食塩水を投与した。ラットSAHモデルの死亡率は約20%であり、モデルとしては問題なかった。SAH発症後48時間後のケルセチンによるERK1/2抑制効果の評価:1SAH後60分にケルセチン(50mg/kg/day)を投与した。ランダムにVehicle群、Sham群も作成。2SAH発症48時間後の深麻酔下にラットを還流固定した。3HE染色法を用いた脳血管攣縮に対する効果には優位差を認めなかった。続いて免疫染色法を用いて、脳動脈血管壁におけるpERK1/2の発現を観察したが、ケルセチンのERK1/2抑制効果も優位差を認めなかった。本年度はウェスタンブロット法を用いて、pERK1/2の発現を観察した。最初は還流掖で固定したサンプルを用いて前頭前野のpERK1/2を定量したが、結果が安定しなかったため、サンプリングまでの時間を短縮する目的で還流を省いて測定したが結果は大きく変化無かった。そのため、以降は手技が簡単な還流をしない方法で実験を行なった。手技を変えたが、前頭前野で優位差を認めなかった。更に、海馬、大脳皮質、小脳についても同様に定量を行なったか優位差を認めなかった。ラットSAHモデルにおいて、SAH発症後60分でのケルセチン投与は、pERK1/2の抑制効果、脳血管攣縮の予防効果は認めなかった。初年度の目標の一つである、ラットのくも膜下出血モデルの作成については達成できたと考える。ケルセチンの投与量の投与開始時間の検証は現在行っているところであるが、くも膜下出血直後のラットにケルセチンを経口投与しても、消化管からどこまで吸収されるか不明であり、別の投与方も検討中である。血管攣縮の検証については、現在染色を行っている最中であり、今後さらにサンプル数を増やして行く予定である。ラットSAHモデルの完成度については、検証済みで問題ないと考えている。現在、脳の凍結標本を用いて、組織中のpERK1/2の発現を観察しているところである。結果が安定しない理由は以下の可能性があると考えており、今後、一つずつ検証する予定である。1還流固定法を変更する:SAH後は血管攣縮により、組織の還流が悪くなっており、還流固定をすることでSAH群の方が逆にPERK1/2の活性が不安定になっている可能性がある。サンプルを採取する際に、還流固定をせずにそのまま、採取してすぐに凍結保存してみる。2投与経路を腹腔内投与に変更する:現行では、ケルセチン50mg/kg/dayを経口投与している。しかし、経口投与では、SAHと全身麻酔の影響で、腸管からの吸収が安定しない可能性が考えられる。現在、くも膜下出血の開始前からケルセチンの経口投与を行い、48時間後の脳血管攣縮に対する効果を検証しているところである。まずは、このままサンプル数を増やし効果を判定する。もし効果が見られなければ、投与法の変更、投与量の変更も検討する。物品や試薬が当初より安く手に入ったこと、本年度遂行予定の実験が来年度にずれ込んだことで未使用額が生じた。
レム睡眠の操作が可能なマウスを用いた睡眠の質が記憶に及ぼす影響の解明

哺乳類の睡眠は、レム(急速眼球運動)睡眠とノンレム睡眠から構成され、どちらもユニークな脳活動を伴う。レム睡眠は夢を生じることから注目され、古くから記憶学習や情動への関与が提唱されてきた。しかしながら決定的な証拠がなかった。そこで本研究では、これまでにレム睡眠を正負に制御するニューロンの双方を同定したことを活かし、レム睡眠が記憶学習に関わるか否かの検証を目指してきた。単純に被験体がレム睡眠に陥ったら起こす、という方法では、起こすための刺激そのものが大きなストレスとなり、レム睡眠の影響と区別することが難しい。そこで私たちは、外部からの刺激に依ることなく、長期的にレム睡眠を阻害できるマウスを確立し、記憶学習への影響を検討した。そのために、脳幹橋において、レム睡眠の維持に重要なニューロン群に選択的にCre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製して、Cre依存的に細胞死誘導遺伝子DTAを発現するウイルスベクターを局所的に注入することで、これらのニューロン群を遺伝学的に破壊した。その結果、数週間にわたって高効率でレム睡眠を減少させることに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。レム睡眠は夢を生じる性質が注目され、古くから記憶学習への関与が提唱されてきた。本年度はまず、レム睡眠を従来よりも効率よくかつシンプルなトランスジェニックマウスのシステムで操作できる系の確立に取り組んだ。これまでに、脳幹において、レム睡眠を誘導するニューロン群に選択的にCre遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを得て、ウイルスベクターで化学遺伝学遺伝子を導入することで、一過的かつ高効率でレム睡眠を誘導することに成功した。さらに、行動実験の際には、化学遺伝学遺伝子を薬剤の腹腔内投与により活性化すると、腹腔内投与の注射刺激そのもののストレスの影響が懸念されたため、電子制御可能なミニポンプを腹腔内容に埋め込み、非侵襲的にレム睡眠を誘導する系の確立にも成功した。さらに、このポンプを利用することで、数日にわたる長期的なレム睡眠の増加にも成功した。本系を利用することで、記憶学習の課題の特定のフェーズで一過的にレム睡眠を誘発できるものと期待される。当初予定していたレム睡眠を効率よく、かつ非侵襲的に増加させる系の確立に成功した。また、同系の確立により、レム睡眠を長期的に操作することに成功した。そして行動実験の導入にも成功した。これら全ての環境が整ったことで、これまで大きな謎であったレム睡眠が記憶学習に関わるか否かについて、次年度以降に解明できるものと期待される。従って、本年度は計画通りに研究が進み、おおむね順調であると判断される。レム睡眠の記憶学習への関与について明らかにするために、来年度は主に次の項目について研究を進める。一点目)レム睡眠の増加が成体の記憶学習に与える影響の解析。上記で開発した効率的なレム睡眠の操作が可能なマウスについて、マウスの様々な記憶学習実験に適用し、習得から想起に至る各過程における、レム睡眠の増加の効果を明らかにする。二点目)レム睡眠の増加が認知症による記憶学習の低下に与える影響の解析。レム睡眠を操作した影響は、脳機能の破綻による記憶学習能力の低下時に、より検出しやすい可能性がある。特に、アルツハイマー型認知症では、ノンレム睡眠中のデルタ波の低下という、私たちのレム睡眠阻害マウスと共通の症状が知られる。そこで、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、レム睡眠の増加が記憶学習能力に与える影響も明らかにする。