hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管収縮物質のシグナル伝達と血管平滑筋細胞の遊走、増殖の制御機構

私共は従来よりアンジオテンシンll(All)による血管平滑筋細胞の遊走と増殖促進のシグナル伝達機構の解析を行い、すでにAllがMAPキナーゼカスケードを活性化してc-fosの発現を促進することを明らかにしたが、本年度はさらに以下の成果をおさめた。1.Allはタイプl受容体とGi蛋白質を介して低分子量G蛋白質Rasの活性化を引き起こす。2.アデノウイルスベクターを用いてdominant negative Rasを発現させると、AllによるRasの活性化は完全に抑制されるが、MAPキナーゼの活性化は約30%しか抑制されない。3.血管平滑筋細胞に活性酸素を作用させるとMAPキナーゼが活性化される。4.Allの作用時には活性酸素の産生が促進される。5.AllによるMAPキナーゼの活性化は抗酸化剤で抑制される。従って、血管平均筋細胞におけるAllによるMAPキナーゼの活性化にはRasの活性化は必須ではなく、活性酸素が関与する可能性が高い。一方、血管平滑筋細胞が遊走するためには遊走促進シグナルが細胞が細胞外マトリックスに接着する接着斑(Focal Adhesion)へ伝達される必要がある。パキシリンは接着斑に局在する蛋白質であり、FAK (Focal Adhesion Kinase)は接着斑に局在するチロシンキナーゼである。私共はすでにAllの作用時にパキシリンやFAKがチロシンリン酸化されることを見い出していたが、本年度はさらにAllによるパキシリンやFAKのチロシンリン酸化反応がサイトカラシンD処理(アクチンフィラメントの重合阻害)と低分子量G蛋白質Rhoの阻害剤(C3トキシン)により抑制されることを明らかにし、All受容体から接着斑へのシグナル伝達にはアクチンフィラメント系とRhoが関与することを示した。
扁平上皮がんの悪性度の解明と臨床疫学

臨床上有用となる扁平上皮がんの新しい予後因子を解明することを目的として、扁平上皮がん関連蛋白SCC抗原(SCCA)の発現状態と病態の悪性度との関係、及び、SCCAの生物学的機能を検討した。SCCAには相同性の非常に高い2種類のSCCA1、SCCA2が存在したが、がんでは特にSCCA2の発現が有意に亢進していた。子宮頸部扁平上皮がん患者Ib-II期では、治療前血清中SCCA2値は予後不良因子となる可能性が示唆された。SCCAの生物学的機能については、両者とも腫瘍細胞が抗がん剤や放射線などの刺激によりアポトーシスに陥るのを抑えたり、細胞外に分泌されたSCCAが、腫瘍組織へのNK細胞の遊走を抑制することを報告してきたが、新たにマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9分泌を増加させ、腫瘍細胞の浸潤能を亢進させる可能性を見いだした。さらには、SCCA遺伝子のプロモーター領域の解析の結果、SCCA、SCCA2のイントロン1のエクソン2直前の領域に強いプロモーター活性を認めた。がんでのSCCA1、SCCA2の発現調節の相違に関して、プロモーター領域の-0.38kのところにあるSCCA2のGとTという遺伝子多型SNP(SCCA1ではT)が関与している可能性を見いだした。以上より、特にSCC2は扁平上皮がんの進展・予後に密接に関与している分子であり、その発現にはSNPが関与している可能性が示唆された。扁平上皮癌関連抗原であるSCC抗原(SCCA)には相同性の非常に高いSCCA1、SCCA2が存在するが、これまでに我々はSCCA1が種々のアポトーシス刺激を抑制することを明らかにし、SCCAが扁平上皮癌において腫瘍増殖的に働いている可能性を指摘してきた。本研究では、臨床症例について子宮頚部扁平上皮癌組織におけるSCCA1、SCCA2の発現状態と病態の悪性度(転移能、子後など)との関係を検討し、またSCCA蛋白(特にSCCA2)の有する生物活性と腫瘍細胞のアポトーシスや転移能との関係を研究する事を目的とするが、本年度はまず両者を特異的に測定する方法としてSCCA1、SCCA2のmRNA量測定系を確立した。さらに蛋白量測定系ではSCCA1、SCCA2のmonoclonal抗体を用いEIA法を確立した。またsampleに熱処理を加えることによりSCCA1、SCCA2を効率的かつ特異的に測定する方法を確立した。またSCCA1、SCCA2 cDNAをそれぞれ腫瘍細胞に遺伝子導入したところ放射線照射によるアポトーシスがコントロールに比べ有意に抑制され、これは活性型p38MAP kinase及びその上流の活性型MKK3/6、さらにcaspase9、caspase3の抑制を伴っていた。このことより扁平上皮癌で発現したSCCA1、SCCA2はアポトーシスの抑制を通し腫瘍の増大に関与している可能性が考えられた。またmodifiedBoyden chamber法でSCCA1がNK細胞の化学遊走性を阻止したことから、細胞内でのアポトーシス抑制のみならず細胞外でもSCCA1はNK細胞の腫瘍への浸潤を抑制することにより細胞死を抑制している可能性が示唆された。セリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)ファミリーに属する扁平上皮癌関連蛋白SCC抗原(SCCA)にはアミノ酸レベルで92%と相同性の非常に高い2種類(SCCA1、SCCA2)が存在する。今回確立した両者を特異的に測定するmRNAおよび蛋白測定法では、癌組織でSCCA1、SCCA2ともに増加していたが、特にSCCA2の発現が有意に亢進していた。また、熱安定性の差異を利用して新たに確立したSCCA1、SCCA2の分別法でも癌組織中のSCCA1/SCCA比は減少する傾向を認めた。SCCAの生物学的機能については、遺伝子導入実験により、両者とも種々の刺激で誘導されるアポトーシスを抑制する作用のみならず、細胞間接着能(カドヘリン活性)を高める働きを有し、扁平上皮癌の腫瘍形成促進に密接に関与している可能性が示唆された。また、癌で特に増加するSCCA2は、in vitroで蛋白分解酵素であるカテプシンGにより誘導されるNK細胞の化学遊走能を減弱したことから、腫瘍は細胞外にSCCA2を分泌しNK細胞の腫瘍への浸潤を抑制することでもアポトーシスから免れている可能性が考えられた。さらに、SCCA1、SCCA2には、alternative splicing productが各々存在することを見い出した。今後、これらSCCAの発現調節因子の解明をすすめると共に、新たに見い出したalternative splicing productの発現、意義についてもさらに研究を進める予定である。臨床上有用となる扁平上皮がんの進展に関わる新しい予後因子と、その理論的根拠を解明することを目的として、独自に同定したセリンプロテア-ゼインヒビタ-(セルピン)に属する扁平上皮癌関連蛋白SCC抗原(SCCA)に着目し、その発現状態と病態の悪性度(転移能、予後など)との関係、及び、SCCAの生物学的活性を検討した。SCCAには相同性の非常に高い2種類のSCCA1、SCCA2が存在したが、癌では特にSCCA2の発現が有意に亢進していた。臨床進行期Ib-II期の子宮頸部扁平上皮癌患者では、治療前血清中SCCA2値は予後不良因子となる可能性が示唆された。

SCCAの生物学的活性については、両者とも、TNFα、抗癌剤、放射線で誘導されるアポトーシスを減弱させる作用の他に、細胞外での働きとしてNK細胞化学遊走性抑制作用を有することを報告した。正常と癌で発現量に有意な差を認めなかったSCCA1に関して、プロテアーゼと反応した結果生じるcleaved formは癌組織中に異常に存在することを見い出した。さらには、SCCA発現が細胞浸潤能に及ぼす影響を、マトリゲルインベージョンチャンバーを用い検討した結果、SCCA1、SCCA2遺伝子導入細胞ではコントロール細胞に比べ有意に浸潤能が増加することが判明し、扁平上皮癌の浸潤機構においても、SCCAは重要な役割を有していることが示唆された。臨床上有用となる扁平上皮がんの新しい予後因子を解明することを目的として、扁平上皮がん関連蛋白SCC抗原(SCCA)の発現状態と病態の悪性度との関係、及び、SCCAの生物学的機能を検討した。SCCAには相同性の非常に高い2種類のSCCA1、SCCA2が存在したが、がんでは特にSCCA2の発現が有意に亢進していた。子宮頸部扁平上皮がん患者Ib-II期では、治療前血清中SCCA2値は予後不良因子となる可能性が示唆された。SCCAの生物学的機能については、両者とも、腫瘍細胞が抗がん剤などの刺激によりアポトーシスに陥るのを抑えたり、細胞外に分泌されたSCCAが、腫瘍組織へのNK細胞の遊走を抑制することを報告してきたが、今回新たにがんの浸潤に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9分泌を増加させる可能性を見い出した。以上より、SCCAは扁平上皮がんの進展・予後に密接に関与している分子である可能性が示唆された。SCCAの生物学的機能については、両者とも腫瘍細胞が抗がん剤や放射線などの刺激によりアポトーシスに陥るのを抑えたり、細胞外に分泌されたSCCAが、腫瘍組織へのNK細胞の遊走を抑制することを報告してきたが、新たにマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9分泌を増加させ、腫瘍細胞の浸潤能を亢進させる可能性を見いだした。さらには、SCCA遺伝子のプロモーター領域の解析の結果、SCCA、SCCA2のイントロン1のエクソン2直前の領域に強いプロモーター活性を認めた。がんでのSCCA1、SCCA2の発現調節の相違に関して、プロモーター領域の-0.38kのところにあるSCCA2のGとTという遺伝子多型SNP(SCCA1ではT)が関与している可能性を見いだした。以上より、特にSCC2は扁平上皮がんの進展・予後に密接に関与している分子であり、その発現にはSNPが関与している可能性が示唆された。
トロホブラスト分化におけるPLCδ1,δ3の機能解析

Phospholipase C(PLC)はイノシトールリン脂質代謝系において要となる酵素である。現在までに私達はPLCδ1ノックアウト(KO)マウスを作製し、PLCδ1が体毛形成に重要な遺伝子であることを明らかにしてきた。PLCδ1に最もよく似たPLCとしてPLCδ3が知られている。私達はPLCδ3KOマウスの解析も行ってみたものの、PLCδ3KOマウスには目立った異常は見られなかった。そこで、次にPLCδ1とPLCδ3を同時にKOしたダブルKO(DKO)マウスを作製したところ、これらのマウスはトロボブラスト幹細胞の異常によると思われる胎盤血管減少により胎生致死となることが判明した。そこで、本研究では胎児側胎盤の主な構成細胞であるトロボブラストに着目し、PLCδ1、PLCδ3の機能解析を行うことを目的とした。本年度は、DKOマウスの胎盤において発現が変化している一遺伝子をDNAマイクロアレイにより網羅的に検索し、DKOマウスの胎盤において複数の遺伝子の発現に変化が見られることを明らかにした.これらの発現変化があった遺伝子のうち、DKOマウスの胎盤においては、胎盤では本来、発現がほとんどみられないはずの内胚葉系細胞に発現している遺伝子群の発現が顕著に増加していることを見出した.また、RT-PCRおよびin situハイブリダイゼーション法によってもDNAマイクロアレイの結果と同様な結果を得ることができた。最近になり、胎盤には多能性の幹細胞が存在することが示唆されはじめてきている。それゆえ、PLCδ1やPLCδ3はトロボブラストの幹細胞のみでなく、胎盤に存在する多能性幹細胞の分化にも影響を及ぼしており、PLCδ1、PLCδ3の欠損により、これらの細胞から、異所性に内胚葉系の細胞が分化してきてしまったという可能性が考えられた。Phospholipase C(PLC)はイノシトールリン脂質代謝系においてセカンドメッセンジャー産生のトリガーとなる酵素である。δ型のPLCは進化上最も古くより保存されているPLCであり、生命現象において基礎的、不可欠な機能を持つ考えられていたが、哺乳動物における生理機能は解明されていなかった。これまでに私達はPLCδ1ノックアウトマウス(KOマウス)の作製、解析によりPLCδ1が表皮幹細胞の分化調節に関与することを報告してきた。PLCδ1が上皮系組織、細胞株に多く発現していることから、PLCδ1KOマウスの皮膚以外の上皮系組織においても異常が発生していることが予測された。しかしながら、PLCδ1KOマウスにおいて皮膚以外の上皮系組織では明確な異常が見られず、他の上皮系組織においては他のPLCにより機能相補が成されていることが示唆された。そこでPLCδ1に最も類似したPLCであるPLCδ3とのダブルKOマウスを作製し、機能相補の有無を調べたところ、PLCδ1/δ3ダブルKOマウスは胎生11.5日から13.5日の間で致死となることが明らかになった。胎生致死の原因を詳細に解析したところ、PLCδ1/δ3ダブルKOマウスの胎盤ではトロホブラストの増殖低下および細胞死の増加を伴った顕著な血管減少が観察された。また、四倍体キメラ法により胎児自体でのみ特異的に、PLCδ1/δ3を欠損させたマウスを作製したところ、これらのマウスは胎生11.5日から13.5日における致死を回避することも明らかになった。以上の結果より、PLCδ1/δ3ダブルKOマウスでは胎盤トロホブラストの異常により正常な胎盤の構造を維持することができなくなり、母体-胎児間の栄養交換不良に陥っており、この事が胎生致死の原因であることが強く示唆された。

それゆえ、PLCδ1やPLCδ3はトロボブラストの幹細胞のみでなく、胎盤に存在する多能性幹細胞の分化にも影響を及ぼしており、PLCδ1、PLCδ3の欠損により、これらの細胞から、異所性に内胚葉系の細胞が分化してきてしまったという可能性が考えられた。
嘔吐誘発と摂食調節に関わる延髄最後野ニューロンの機能分化とその分子基盤の解明

摂食抑制ペプチドホルモンのアミリンとCCK-8に応答するニューロンは,摂食調節に積極的に関与すると考えられる。これらに対する最後野ニューロンの応答を調べたところ,アミリンに対する応答は全てIh(-)ニューロンに検出され,CCK-8に対する応答は42例のうち38例がIh(-)ニューロンであるという結果を得た。また,両ホルモンの受容体はシナプス前膜に存在していること明らかとなった。これらは,気持ち悪くて食べられない調節と,気持ち悪く無くても食べられない調節が存在していることが示唆された。最後野の分子基盤の異なるニューロン群が異なる摂食調節機序を担うべく,機能分化している可能性が考えられた。最後野(Area Postrema)の化学受容性ニューロン群が悪心誘発と摂食調節に関わっていることはよく知られているが,従来より同部のニューロン群の全てがこれらの機能に関与していると思われてきたが,最近の我々の研究によって機能分化がありそれぞれの機能を担当する細胞群が存在する可能性が示唆された。そこで,本研究では,同部のニューロン活動の変調を決定づけるいくつかの特徴的な分子基盤と機能分化との関連に着目し,最後野ニューロンの機能分化様式とその分子基盤の詳細を調べた。摂食抑制ペプチドホルモンのアミリン(膵ホルモン)とコレシストキニン(CCK-8,消化管ホルモン)に応答するニューロンは,摂食調節に積極的に関与するニューロンと考えられるため,これららに対する応答を調べたところ,アミリンに対する応答は全て過分極作動性カチオン電流(Ih)を示さないIh(-)ニューロンに検出され,CCK-8に対する応答は42例のうち38例がIh(-)ニューロンであるという結果を得た。このことは,摂食調節に関与するニューロン群の膜の分子基盤としてHチャネルの発現が見られないことを示すものであった。さらに,これらのペプチドホルモンの受容体はシナプス前膜に存在する事も明らかとなり,迷走神経の求心路が最後野へ投射する際に,Ih(-)ニューロンとIh(+)ニューロンを別々に認識してシナプス接続していることが示唆された。これらは,最後野ニューロンが悪心・嘔吐誘発と摂食調節の中枢神経機構を担う上で,気持ち悪くなったので食べないという調節と,気持ち悪く無くても食べないという調節が存在し,ニューロンの分子基盤とシナプス接続のレベルで区別されて合目的に機能分化している可能性を示すものであった。これらを更に詳しく調べて行くことにより,悪心・嘔吐と摂食調節の神経基盤に新たな概念を樹立できる可能性が考えられた。昨年度までの研究によって,最後野ニューロンのうち,摂食抑制ホルモンとしてよく知られているアミリンとコレシストキニン(CCK-8)に対して応答を示すのは,電気生理学的特性の分類によるサブタイプであるHチャネル活性陰性(Ih-)ニューロンにおいて認められ,CCK-8感受性については,一部のHチャネル活性陽性(Ih+)ニューロンにおいて認められるものの極めて弱い応答であった。そこで,今年度の研究においては,Ih-ニューロンが摂食調節に優位に関与するニューロンである可能性についてその分子基盤について解析することに着手した。以前の我々の研究により,最後野にはグルコース応答性ニューロンの存在を証明しているが,Ih-ニューロンがグルコース応答性を有するのか否かについて着目した。また,腹腔内に投与したL-ヒスチジンによる摂食抑制効果と最後野ニューロン活動との関連についても解析を始めた。さらに,ラットに抗がん剤であるシスプラチンを投与して悪心を誘発した場合に,神経活動の上昇を認める最後野ニューロンについてc-Fos発現を指標に同定し,それらがドパミン作動性またはノルアドレナリン作動性のいずれの性質を有するのかについて,DBH (dopamine β-hydroxylase)およびTH (tyrosine hydroxylase)の二重染色法を用いて解析を開始した。シスプラチン投与による食欲不振は投与当日から始まり,6日後まで続く事が分かり,シスプラチン投与後,6,12,24,48時間の最後野におけるc-Fos陽性細胞数において有意な増加を認めた。最後野のc-Fos陽性細胞の多くがTHに対して陽性反応を示すことから,ドパミン作動性ニューロンであることが示唆された。また,孤束核のドパミン作動性ニューロンおよびノルアドレナリン作動性ニューロンについてもパイロットデータを得ており,次年度の研究によって詳細を明らかにしたい。最後野ニューロンにはHチャネルを発現するタイプが全最後野ニューロンの約60%を占めているため,Hチャネル発現タイプとHチャネル非発現タイプに大別される.我々はこれら二つの異なるタイプの最後野ニューロンを同定して,それぞれの機能的役割について解析を行ってきた.本年の研究においては,脳スライス中の最後野ニューロンのパッチクランプ記録によって,細胞外液に投与したコレシストキニン(CCK-8)に対して応答する最後野ニューロンのタイプがHチャネル非発現タイプであることを同定すると共に,その受容機序について解析を行い,シナプス前膜上にコレシストキニン受容体が存在することを同定し,シナプス前部からのグルタミン酸の放出を増加させて最後野ニューロンを興奮させていることを明らかにした.多重免疫染色法を用いてノルアドレナリン作動性ニューロンおよびドパミン作動性ニューロンを同定し,Hチャネル発現タイプとHチャネル非発現タイプの別を検討したところ,いずれのニューロン群においてもノルアドレナリン作動性およびドパミン作動性の両方のニューロンが同定され,特異性や局在は認められなかった.

また,MEGを用いて,悪心誘発時の脳活動を捉えるためのパイロットスタディとして,舌を前方突出させたときの口腔感覚,舌運動,舌筋電図とのコヒーレンスを解析した.さらに,脳内ヒスタミン系の賦活による摂食抑制に悪心経路が関与しているかを味覚嫌悪学習の獲得を指標に解析を行い,生理的濃度のヒスチジン摂取によって摂取後1時間の摂餌量は増加するものの,統計学的有意差は認めなかった.ヒスチジンを大量摂取させた場合には味覚嫌悪学習を獲得するため,悪心が生じていることが明らかとなった.摂食抑制ペプチドホルモンのアミリンとCCK-8に応答するニューロンは,摂食調節に積極的に関与すると考えられる。これらに対する最後野ニューロンの応答を調べたところ,アミリンに対する応答は全てIh(-)ニューロンに検出され,CCK-8に対する応答は42例のうち38例がIh(-)ニューロンであるという結果を得た。また,両ホルモンの受容体はシナプス前膜に存在していること明らかとなった。これらは,気持ち悪くて食べられない調節と,気持ち悪く無くても食べられない調節が存在していることが示唆された。最後野の分子基盤の異なるニューロン群が異なる摂食調節機序を担うべく,機能分化している可能性が考えられた。平成26年度は前年度の研究成果を踏まえて,「摂食調節ペプチドに応答を認める最後野ニューロンのグルコース感受性との連関の解明」および「L-ヒスチジン腹腔投与による摂食抑制における最後野ニューロン活動の同定」さらに「機能分化が想定される最後野のIh+ニューロンとIh-ニューロンの活動変調による行動変化の解明」を目指して研究を進め,一定の成果が得られた。最後野のグルコース応答性ニューロン活動およびノルアドレナリン作動性ニューロンについて,摂食調節と悪心・嘔吐調節の機能分化を裏付けるデータを得ており,平成27年度の研究へつなげ,さらに発展させるために十分な結果が得られた。これらのことから,上記の通り判定した。口腔生理学平成27年度の研究は本研究計画の最終年となるため,この2年間で得られた結果に加えてそれらを更に発展させて,着実にデータを蓄積する計画である。特にHチャネルタンパクの抗体を用いたIh+ニューロンの可視化を成功させたい。これが可能になれば,電気生理学的特性と化学感受性とをリンクさせて個々のニューロンの機能分化について,より直接的に解析することが可能となる。さらに,行動実験を組み合わせて行う事により,単一ニューロンの機能分化と行動変化を直接考察するこが可能となり,本研究課題の目的である最後野ニューロンの機能分化の解明を加速することが可能となる。平成25年度の研究実施計画として,「悪心・嘔吐誘発と摂食・飲水調節に関わる最後野ニューロン群の同定」を目指して実験を行った。具体的には,最後野の非Ihニューロンが摂食行動調節に特化して機能分化しているか否かを明らかにする。アミリンに応答するニューロンは全て非Ihニューロンであり,アミリンは非Ihニューロンに接続しているニューロンのシナプス前部に作用してグルタミン酸の放出を増強するという作用機序を示唆するデータについて確定して,論文発表を行った。
心筋症を伴うカルニチン欠乏マウスのNa利尿ペプチドの動態と心筋病変の解明

JVS/JVSマウスの心重量は,18日齡で既に+/JVSマウスのものに比べ大きく,3ヵ月齡のJVS/JVSで230mgと+/JVSの100mgに比べ有意に大きかった。JVS/JVS浮腫マウスでは,345mgと10ヵ月齡+/JVSマウスの116mgに比べ有意に重く,3,10ヵ月齡JVS/JVSマウスの230,290mgよりさらに重かった。JVS/JVSマウスの心筋細胞は肥大し,核も大きく,その程度は心室筋細胞が心耳筋・心房筋細胞に比べ著しかった。JVS/JVSマウスの心耳筋細胞には,脂肪滴や空胞をもつものがみられるようになり,3,10ヵ月齡、浮腫マウスにおいては,さらに,多くの空胞,ミエリン様構造物,リポフスチン顆粒,ミトコンドリアの増殖,変形した核などをもつ変性細胞が認められた。JVS/JVSマウスの心耳筋細胞がANP顆粒の数は,18日,3ヵ月齡では+JVSマウスとの間に特に差異はみられなかったが,10ヵ月齡の心肥大の著名なものにおいては有意に増加し,免疫組織学的にも強く反応した。浮腫マウスの心耳筋細胞のANP顆粒は,細胞質全体に広く分布し,その数は10ヵ月齡の心肥大の著名なものに比べ,有意に少なく,+/JVSマウス,JVS/JVSマウス18日,3ヵ月齡のものより幾分多かった。JVS/JVSマウスの心室筋細胞には,+/JVSマウスにはみられない電子密度の高いANP顆粒に類似した顆粒が核周囲に少数みら,ANPmRANの発現も高かった。浮腫マウスにおいては,これらの顆粒は比較的多数存在し,心室筋組織内ANPレベルも+/JVSに比べ有意に高かった。また,心耳筋細胞と同様,リポフスチン顆粒,ミトコンドリアの増殖,核膜の複雑な彎入(invagination,complex fold),種々の形状の核内偽封入体など変形した核を持つ変性細胞が多数みられた。心肥大を伴う心筋症にANPの活性化を示唆する知見が得られたことから,心疾患に深く関与し,正負の関係にあるANPとアンジオテンシン系について今後さらに検討する。
ＭｕＳＫ抗体陽性重症筋無力症の新治療法を可能にする病態メカニズムの研究

1.抗MuSK(muscle-specific kinase)抗体で発症する重症筋無力症(MG)は従来の治療法に対して難治性の症例が多く、急速に筋萎縮に至る症例もあり、発症機序が抗AChR抗体で発症するMGとは全く異なる.本研究で、MuSK-MGの疾患モデルマウスに対してラパマイシンが有効であることを明らかにした.2.本研究より、抗LRP4抗体でMGを発症するマウスモデルを作成することに成功した. LRP4は成体の神経筋シナプスの構造維持において必須の分子であり、LRP4の機能抑制が神経筋シナプスの変性を介して筋力低下を引き起こすことが証明された.1.抗MuSK(muscle-specific kinase)抗体で発症する重症筋無力症(MG)は従来の治療法に対して難治性の症例が多く、急速に筋萎縮に至る症例もあり、発症機序が抗AChR抗体で発症するMGとは全く異なる.本研究で、MuSK-MGの疾患モデルマウスに対してラパマイシンが有効であることを明らかにした.2.本研究より、抗LRP4抗体でMGを発症するマウスモデルを作成することに成功した. LRP4は成体の神経筋シナプスの構造維持において必須の分子であり、LRP4の機能抑制が神経筋シナプスの変性を介して筋力低下を引き起こすことが証明された.本プロジェクトは患者病態を忠実に反映するマウスモデルの開発に成功しており(24年度にジャクソン研究所のホームページで紹介:http://jaxmice.jax.org/news/2012/Myasthenia_gravis.html)、それを使って発症・病態メカニズムに基づく有効な治療薬・治療法を開発することを目的としている.(1)MuSK MGを改善する3.4-DAPをモデルマウスに投与し作用機序と効果の解析.本年度上半期に3,4-DAPがマウスモデルに対して有効であることを論文発表した.海外のグループが、我々の研究結果を追試して同じ結果を25年に発表して、我々の結果が正しいことを示した.我々の結果を基に、MuSK MG患者に対する3,4-DAPの臨調試験が国内外で開始された.(2)Th2細胞による自己抗体産生制御MuSK MGの自己抗体は補体結合能を欠くIgG4サブクラスがほとんどを占めており、Th2細胞が自己抗体産生を制御していると予想される.また、我々の開発した疾患モデルマウスでもMuSK抗体が系統差なくTh2サイトカインで制御されるIgG1サブクラスが主体であること発見し論文投稿した(Autoimmunity review,25年度アクセプト済).引き続き、Th2細胞の免疫制御を標的とした治療法を検討する.(3)発症メカニズムに関与する蛋白分解酵素系の検討.MuSK MG患者、疾患モデルのMuSK MG抗体はMuSKを活性化するにも関わらず、MuSK機能を抑制する.自己抗体刺激はMuSKシグナル分子のDok7を分解するがプロテアソーム阻害剤で抑制されないことを発見した.(4)疾患モデルに対するラバマイシンの有効性を検証当初計画には含まれていなかったが、(2)との関連からラバマイシンを疾患モデルマウスに投与したところ有効である可能性が示された.次年度以降、この検証と作用機序を追加して解析する..抗MuSK( muscle-specific kinase)抗体で発症する重症筋無力症はAChR抗体で発症する重症筋無力症で使われている治療法に対してむしろ症状が悪化したり、さらに難治性で急速に筋萎縮に至る症例もあることから、MuSK抗体重症筋無力症に有効とされているステロイド以外の治療薬が求められている.そこで、本課題ではMuSK抗体で発症する重症筋無力症のモデルマウスを使い,発症・病態メカニズムを明らかにして有効な治療薬・治療法の開発研究を行うことを目的としている.申請者らが開発した疾患モデルマウスにおいては、MuSKの細胞外ドメイン蛋白を2回免疫すると、約1ヶ月で急速に体重が減少して筋萎縮と全身の筋力低下を伴う重症無力症を、100%の確率で発症するため薬物の効果判定と作用機序に適している.申請者らは治療薬候補として放線菌から発見されたラパマイシンに注目して有効性を解析した.その理由としては、ラパマイシンは欧米では免疫抑制剤として、また我が国においても抗癌剤として認可されているため、疾患モデル動物に対する有効性が示されれば、臨床治験が比較的容易である.これまで得られた結果として, (1) 2回目の抗原免疫と同時にマウスに投与すると体重減少と筋力低下が顕著に抑制される.(2)抗MuSK抗体値の上昇が抑制されること.(3)筋電図所見として重症筋無力症で観察されるcompound action potentialの漸減反応が無く、電位幅も大きい.(4)発症したモデルマウスで観察される神経筋シナプスの病理学的な形態変化、すなわち運動神経終末の縮小とsprouting,およびアセチルコリン受容体の凝集減少が顕著に抑制されていた.以上の結果から、ラパマイシンがMuSK抗体重症筋無力症に対して有効である可能性が強く示唆された.1抗MuSK( muscle-specific kinase)抗体で発症する重症筋無力症(MuSK-MG)は抗AChR抗体陽性MG(AChR-MG)に対する従来の治療法に対してむしろ症状が悪化するケース、さらに難治性で急速に筋萎縮に至る症例もあるが、申請者はラパマイシンがMuSK-MGモデルに有効であることを発見しており、本年度はその効果の再現性と抗体価や病理学的解析の検証を行ないデータ収集と解析を行った.

2MuSK-MGのモデルマウスに対するラパマイシンの有効性の機序を解明するために、regulatory T細胞測定方法の確立を行った.免疫システムの対する効果の解析は今後も検討が必要である.3抗LRP4抗体陽性MG(Lrp4-MG)モデル作製と病態解析を行い、論文投稿の準備を進めている.筋電図は典型的な漸減反応を示し、骨格筋の免疫染色によりシナプス全体の形態変化を認めた.マウスから採取した骨格筋を顕微鏡下でシナプスに直接電極を挿入して、静止状態および神経刺激による単一筋線維の電位測定を行うことで伝導障害を定量的に計測する手法を確立した。また、電気生理学的解析とあわせてFM-143色素を使い、MGモデルマウスのシナプス機能の病態解析を行う手法の確立を行った.4LRP4-MGモデルマウスのプレシナプスに存在するアクティブゾーンの定量的形態を共焦点顕微鏡で行いデータ収集と解析を完了した.プレシナプスのアクティブゾーンの量が減少すること、一方で密度は正常と較べてわずかに減少することがわかった.26年度が最終年度であるため、記入しない。神経学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画の研究計画の項目を遂行したが、TH2産生阻害剤、プロテアソーム阻害剤のin vivo投与実験は次年度に繰り越した.一方、初年度において当初計画以外に新たな治療法(ラバマイシン)についてin vivo投与により有効性の可能性を見いだした.昨年度の目標として、TH2産生阻害剤とプロテアソーム阻害剤のin vivo投与による探索型の実験も計画していたが、ラパマイシンが顕著に有効である可能性を発見することができた。本年度はさらにその有効性を示す明確なエビデンスを得ることができた.26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に加え、新たな治療法(ラバマイシン)についても有効性と作用機序について次年度以降検討する.ラパマイシンの有効性について、疾患モデルマウスを使ったエビデンスをさらに蓄積する必要がある.また、作用機序についてもあわせて明らかにして論文発表を通して臨床治験の意義を提唱する予定である.26年度が最終年度であるため、記入しない。新たな治療法の可能性を発見したため、初年度の研究費の使用計画を変更して次年度計画で遂行する.初年度計画に加え、新たな治療法(ラパマイシン)について顕著な有効性を見出しており研究計画に変更が生じたため。新たな治療法の臨床治験を可能にする報告を最終年度にあたる次年度できるよう使用計画を再構築した。
衛星画像と海水粒子追跡数値実験との比較による表層水塊の形成と大気との相互作用

大気海洋相互作用の仕組みを理解するには大気変動に対する海洋の応答過程を解明することが重要であるが、北太平洋における1つの重要な応答現象として、黒潮の大蛇行とそれに伴う熱や物質の輸送現象がある。鳥羽ら(1989)は大蛇行時での熱赤外画像を解析し、本州南海域の熱収支や水塊形成に重要な影響を与える大規模な"Warm Outbreak"が発生することを報告している。本研究では衛星によって初めてとらえられたこの輸送現象を、黒潮大蛇行時の流路変動に伴う実質としての海水のラグランジュ輸送に起因するという仮説をたて、大蛇行時の流速場の数値実験を行い、更にオイラ-・ラグランジュ法による粒子運動追跡数値シミュレ-ションを行った。このことは、本州南海域での水塊形成機構やまた画像にとらえられた現象の物理構造を理解する上で重要である。この結果、大蛇行流路へ移行する小蛇行の東進に伴いその周辺域で粒子群の相対的な回転運動が局所的に加速され、効果的なcrossーstream exchangeが発生することが分かった。つまり、東進する小蛇行の前面では蛇行の峰付近において外洋水が黒潮流域へ侵入し、谷付近では黒潮水が外洋へ流出するという交換が生じる。蛇行流路の後面では峰付近において黒潮水が外洋へ流出し、谷付近では外洋水が黒潮流域へ侵入する。そして大蛇行流路に至る直前には日本南岸からの小蛇行への渦度の補給が活発になるため、このcrossーstream exchangeが増大し、そのため鳥羽らの指摘した大規模な"Warm Outbreak"が発生することを初めて解明した。大蛇行流路完成以降は、蛇行流路の東西振動に伴って蛇行域の黒潮水が切離し外洋水と混合する。その後しばらくして大蛇行流路が復元される時、上と同様な機構によって大規模な"Warm Outbreak"が発生することが明かとなった。この結果は観測結果と合致している。なお、この一連の研究によって大蛇行の切離機構も解明出来たことを付言しておく。
スマートホンによる耳認証システムの構築

生体認証手法の一つとして本研究では耳介や外耳道の音響伝達関数を用いた認証システムの実現可能性について検討している。先行研究では、イヤホン、ヘッドホン、携帯電話を通じて測定した耳介伝達関数(PRTF:Pinna Related Transfer Function)による個人認証の可能性について簡単な実験検証が行われ、イヤホンおよびヘッドホンにおいては個人認証が可能であることが示唆されている。しかし、認証毎にヘッドホンやイヤホンを装着する必要がある認証システムはかなり特殊な環境および状況でのみの利用となり、利便性が著しく損なわれると考えられる。一方で携帯電話やスマートホンを利用できれば、気軽に個人認証が可能である。例えば、呼び出し音が鳴った際に、スマートホンを耳に当てるだけで、その時の呼び出し音の反射音で個人認証ができれば、特別な操作なしに個人認証した上で会話を楽しむことができる。そこで本研究では、スマートホンを利用して個人の耳介形状の違いに伴うPRTFの差異から個人認証を行うシステムについて、その可能性とシステム構築を目指す。スマートホンを利用した場合には耳介に対するスマートホンの相対位置は毎回変化することから、それに伴いPRTFも変化する。このことがイヤホンやヘッドホンを利用した個人認証に対するスマートホンを利用した個人認証が困難な理由である。このことから、耳介に対して異なる方向からPRTFを測定し、それらを有機的に結合・統合して認証に用いることで個人認証の可能性が高まると考えられる。それを確認するための実験を行ったところ、スマートホンの耳介に対する相対位置がある程度一定であるならば高い認証率を実現できることを実証した。また、取得したデータに対する前処理手法についてもさまざまな方法について検討した結果、サブバンド化による前処理を施すことで高い認証率を実現できることも実証した。本年度はスマートホンの耳介に対する相対位置を様々に変更させて耳介伝達関数の測定を行った。耳に関しても様々なモデルを用意することで多数のデータを作成することに成功した。また、それらのデータに対してさまざまな前処理手法を適用し、もっとも認証率が高くなる手法についても検討し、明らかにした。さらに、スマートホンの相対位置がある程度固定される状況では高い認証率を実現できることも実証した。以上の検討は研究計画に沿って順調に研究が進められたことを意味する。これまでの研究によりスマートホンの耳介に対する相対位置がある程度定まれば高い認証率を実現できることを実証できた。したがって、いかに相対的位置に基づいて認証するのかが重要となる。そこで今後はスマートホンに搭載されているさまざまなセンサ(ジャイロ、加速度センサ、距離センサ、カメラなど)の情報に基づいて現在のスマートホンの相対位置情報を掴むことで、それらの情報に基づき識別器を選択したり、それらの情報も含めて機械学習を行うなど、より現実に即した認証方法及びアルゴリズムについて検討を行う。
中性子星の磁場構造を解き明かすX線偏光イメージャーの開発研究

SOIピクセル検出器は、X線天文学におけるCCDの弱点を克服できる、画期的な検出器として、将来のX線天文学に於いて重要な役割を持つ可能性がある。KEK(高エネルギー物理学研究所)が、素子の設計、製作を行い、X線天文への応用素子であるXRPIXは京都大学が中心となって、開発を進めている。本研究では、私が実績をもつマルチコリメータ実験をXRPIX検出器に適用することを目指し、基礎研究を行ってきた。マルチコリメータ実験とは、画素よりも十分小さな径をもつ微細なピンホールを等間隔で格子状に開けた金属プレートをピクセル検出器の直前に配置し、平行X線ビームを照射することで、一回の照射でX線ビームが画素内の様々な箇所に入射し、等価的に画素内サンプリングを実現することで、高効率、高精度に信号電荷の画素内入射位置依存性をあぶり出す実験技術である。画素間の個性が小さい多数画素の撮像素子には非常に有効な手法で、すでに、光子計測型のX線CCDに対して、実績がある。本年度は、昨年度までに達成した常温での動作試験に続き、恒温槽内に、素子と電子回路を設置し、-80°Cまで冷却した環境下でバイアス電圧を上げて動作試験を実施した。また、本研究で設計製造した超高アスペクト比を実現した金製マルチコリメータについて、非撮像型X線検出器を用いて、透過率から有効な穴径を算出した。結果、直径4μmであり、画素サイズ(30μm)より十分小さいことを確認した。平行X線ビームは、Oxford社製のマイクロフォーカスX線源を用いることとし、そのスポットサイズの微細さから、数10cm離せば、拡がり数秒角の疑似平行ビームが得られ、コンパクトな実験システムが実現した。実験実施に必要なコンポーネントの構築がほぼ完了したので、今後、実験システムを組み上げて、XRPIX素子における信号電荷の画素内非一様性、および電荷雲形状の実測を行いたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、繰り上がり採択であったため採択決定が6月末となったが、決定後、速やかにハードウェアを入手する手続きをとった。SOI素子を駆動するためのデジタル回路(SEABAS)、アナログ回路を購入した。搭載SOI素子としては、X線天文学応用を念頭に、京都大学とKEKがノイズの低減を主眼において開発したXRPIX2b素子等を導入した。初期実験であることを考慮し、実績ある方面照射型(FI)パッケージング品について、有感層暑が異なる二種類の素子(CZ=250um, FZ=500um)を購入し、9月末より東大実験室で立ち上げを開始した。基本動作試験に先立ち、先駆研究グループである京都大学に出向き、情報共有を実施した。基本動作検証としてまず、常温動作によるデータ取得機能の検証を試み、CZ素子、FZ素子ともにバイアス電圧5VでX線イベントを検出していることを確認した。続いて、本予算で購入した-80度まで冷却可能な小型の恒温槽にシステムをセットアップし、温度を下げたことによるリーク電流の低減効果を確認するとともに、低リーク電流環境のもとで、バイアス電圧を徐々に上げていき、検出効率の増加傾向を確認する実験を行った。結果、本年度導入したSOI素子においては、-20度でバイアス電圧200Vでも0.4nA以下と非常にリーク電流が小さいことがわかった。これは、将来の衛星搭載機器としての設計を考えた際に、ごく低温での運用が必要ないことを意味しており、意義深い。スペクトル性能としては、フレーム読み出しで17keVのX線に対してエネルギー分解能が約0.7keVで駆動させることができ、イベント駆動型の読み出しにも成功した。SOIの駆動システム立ち上げと駆動方法の習得、実績あるSOI素子を用いた基礎性能測定を研究初年度の目標としていたので、予定通り達成できた。

平行X線ビームは、Oxford社製のマイクロフォーカスX線源を用いることとし、そのスポットサイズの微細さから、数10cm離せば、拡がり数秒角の疑似平行ビームが得られ、コンパクトな実験システムが実現した。実験実施に必要なコンポーネントの構築がほぼ完了したので、今後、実験システムを組み上げて、XRPIX素子における信号電荷の画素内非一様性、および電荷雲形状の実測を行いたい。新しい検出器の立ち上げフェーズであることを踏まえ、大学院修士の学生に参加してもらって、研究を進めたことがスムーズに進んだ要因であると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者が他大学に異動したことによる雑務が生じるが、前任大学との協力を継続しつつ、異動先で新たなシステム構築を行う。また、昨年度よりASICON株式会社と打ち合わせを重ねてきた高アスペクト比の金コリメータを購入し、SOI素子内で生成する電荷雲形状を世界で初めて実測するための実験を進める。
パターン投影検査システムにおけるパターン・シミュレータと液晶を用いた照明の開発

工業製品の欠陥検査において,パターン照明を投影して欠陥を強調することで検出・評価する外観検査手法では,投影するパターンがその検査精度に大きく影響する.そこで昨年度は検査対象に合わせた最適な投影パターンの検討を行うツールとして光学シミュレータを開発した.本年度は検討したパターンを実際に対象に投影し,検討したパターンの検証を行う照明装置を開発し,シミュレータとその照明装置を統合し,照明パターン検討システムを構築した.構築した照明パターン検討システムにおけるシミュレーション結果の評価は,シミュレーション画像を画像処理し,欠陥像の面積などで行うことが可能である.照明装置としては任意のパターンが投影でき,さらに瞬時にパターンの切り替えが可能であることを第一条件として考え,比較的安価に手に入る液晶ディスプレイを用いた照明装置を開発した.実際に,パターンを投影しシミュレーションと同様な画像が取得できることを確認した.また,照明装置や対象などの設定条件より自在にパターンを投影できるソフトウェアを開発した.昨年度までの線形な濃度傾斜を持つパターンに加え,より汎用性の高いバイナリパターンのシミュレーションを可能とし,平面充填の可能な3種のバイナリパターン(格子,市松模様,三角形市松模様)についてシミュレーションによる検討と照明装置による確認を行った.その結果,(状況にもよるが)微細な欠陥においては三角形市松模様が欠陥像の強調に関して最も性能の良いパターンであることが分かった.また,外観検査用のパターンのシミュレーション以外にも,面光源の照明むらなどのシミュレーションも可能であることを確認し,これによって照明むらのある照明系での検査や評価の際に,あらかじめその影響について検討できることを示した.工業製品の欠陥検査において,パターン照明を投影して欠陥を強調することで検出・評価する外観検査手法では,投影するパターンがその検査精度に大きく影響する.そこで検査対象に合わせた最適な投影パターンの検討を行うツールとして光学シミュレータを開発した.開発したシミュレータでは,粗さ測定機やレーザ変位計などの形状測定機器によって得られた欠陥の3次元形状データを用いて光学シミュレーションを行うことが可能である.また任意に作成したモデルの形状データについても同様に取り扱えるため,未知の欠陥に対する検討を行うことも可能である.シミュレーションは,形状データの各要素に映り込む光の投影パターン上の位置を,光線追跡によって特定し,そのパターン上の濃度値を用いて画像化するものである.本年度は,線形な明るさの変化を持つパターンや格子パターンにおいて,自由に大きさや向きなどを変えてシミュレーションすることが可能となった.今後は任意の投影パターンを取り扱う手法について検討する予定である.一般的に形状データは画像のレベルから比較してオーバーサンプリングであり,生の形状データをそのままシミュレーションに用いると実画像と異なる結果が得られた.そこで撮像するCCDの空間解像度を考慮して,CCD空間解像度と同程度の低域通過フィルタリングや平滑化などを施した形状データを用いることで,より実画像に近いシミュレーション結果が得られることを確認した.最適パターンの決定における明確な手法は,本年度は確立できなかったが,シミュレーション画像に対して実際の検査で行う画像処理を施し,得られる欠陥像を評価することで最適パターンを決定できると考えられる.工業製品の欠陥検査において,パターン照明を投影して欠陥を強調することで検出・評価する外観検査手法では,投影するパターンがその検査精度に大きく影響する.そこで昨年度は検査対象に合わせた最適な投影パターンの検討を行うツールとして光学シミュレータを開発した.本年度は検討したパターンを実際に対象に投影し,検討したパターンの検証を行う照明装置を開発し,シミュレータとその照明装置を統合し,照明パターン検討システムを構築した.構築した照明パターン検討システムにおけるシミュレーション結果の評価は,シミュレーション画像を画像処理し,欠陥像の面積などで行うことが可能である.照明装置としては任意のパターンが投影でき,さらに瞬時にパターンの切り替えが可能であることを第一条件として考え,比較的安価に手に入る液晶ディスプレイを用いた照明装置を開発した.実際に,パターンを投影しシミュレーションと同様な画像が取得できることを確認した.また,照明装置や対象などの設定条件より自在にパターンを投影できるソフトウェアを開発した.昨年度までの線形な濃度傾斜を持つパターンに加え,より汎用性の高いバイナリパターンのシミュレーションを可能とし,平面充填の可能な3種のバイナリパターン(格子,市松模様,三角形市松模様)についてシミュレーションによる検討と照明装置による確認を行った.その結果,(状況にもよるが)微細な欠陥においては三角形市松模様が欠陥像の強調に関して最も性能の良いパターンであることが分かった.また,外観検査用のパターンのシミュレーション以外にも,面光源の照明むらなどのシミュレーションも可能であることを確認し,これによって照明むらのある照明系での検査や評価の際に,あらかじめその影響について検討できることを示した.
概日リズム形成を担う時計遺伝子の新規分子機構の解明

地球上の多くの生物には、様々な生理現象を支配する約24時間周期の概日リズムが存在する。時計タンパク質に特異的に作用する化合物は、リズム障害薬の開発候補として期待されているが、有効な化合物はほとんど存在しない。そこで、小分子化合物ライブラリを用いて時計遺伝子Per1を特異的に誘導する化合物を同定した。質量分析法により化合物とCRYタンパク質は物理的に相互作用し、CRYタンパク質の持つ転写抑制能を消失させることを見出した。以上の結果から、この化合物は時計遺伝子の新たなる分子基盤の理解と、リズム障害に対する薬剤の開発に貢献する可能性があることが示唆される。地球上の多くの生物には、睡眠覚醒や体温、血圧、ホルモン合成や免疫機能など様々な生理現象を支配する約24時間周期の概日リズムが見出される。概日リズム形成を担う転写・翻訳のフィードバック機構に関わる新規分子機構の解明とそれに作用する化合物等の探索を行うことを目的とするため、本研究では、Period1 (Per1)のmRNA発現を特異的に誘導する化合物のスクリーニングを行った。その結果、いくつかの候補分子を得ることができ、中でも最も特異的、かつPer1誘導能が高い化合物を選択し、このPer1誘導能の作用メカニズムについて検討を行った。Per1プロモーターの上流5kbの中には5つのE boxが存在する。スクリーニングで得た化合物がE boxを介してPer1の発現を誘導するのかどうか検討を行った。まず、Per1プロモーター上流5kbをルシフェラーゼに連結したレポーターベクターを作成し、Bmal/Clock結合能を失う変異型E boxをそれぞれのE boxに置換したレポーターベクターも同時に作成した。これらのレポーターベクターをNIH3T3細胞に遺伝子導入を行い、スクリーニングで得た化合物を処理し、得られたルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、特定のE boxに対してのみ、ルシフェラーゼ活性が上昇し、この化合物は特異的なE boxを介してPer1の発現を誘導することが明らかとなった。この新事実は未だかつて報告されていない新事象であり、概日リズム形成の新規分子機構の存在を示唆するものである。来年度は、化合物によるPer1誘導のさらなるメカニズムの解析と、Bmal/Clock, Cryを含めた作用機序についての検討を行う予定である。地球上の多くの生物には、様々な生理現象を支配する約24時間周期の概日リズムが存在し、時計遺伝子群の緻密な転写制御、翻訳制御機構により体内時計の振動の自律性が保たれている。CLOCK/BMAL1複合体がEbox配列に結合すると、Per1の転写が誘導されるが、同時に誘導されるCRYPTOCHROME (CRY)はCLOCK/BMAL1複合体に結合しその機能を抑制する。Per1遺伝子は光刺激によって誘導され、行動リズムと光同調に関わる遺伝子として重要であることは従来より示されてきたが、機能については未だ不明な点が多い。そこで、Per1遺伝子の発現誘導を指標にした化合物ライブラリを用いて、Per1特異的誘導能を持つ新たな化合物を同定した。平成26年度は主に化合物の薬理作用を解析した。Per1の上流約5kbのプロモーターには5つのEboxが存在し、これらのEboxをCas9ゲノム編集法により欠損させた細胞を作成した。特定のEboxを欠損した細胞では化合物によるPer1誘導能は消失した。またBmal1欠損マウスから調製した線維芽細胞に対して化合物を作用させても、Per1の誘導は見られなかった。以上の結果から、この化合物は特定のEboxを介してCLOCK/BMAL1依存的に作用することが明らかとなった。最終年度では化合物の時計タンパク質に対する影響について検討した。この化合物によるPer1の誘導はCRYによって抑制されず、PER2によって完全に抑制された。さらにこの化合物を処置した細胞内ではCLOCK/BMAL1に対するCRYの結合能が増加することが明らかとなった。さらに質量分析を用いた解析からCRYタンパク質と化合物との相互作用が検出できた。以上の結果より化合物はCRYに直接作用し、CLOCK/BMAL1に対する転写抑制能を消失させる機能を持つことを明らかにした。本研究では、Per1特異的な誘導能を持つ化合物をスクリーニングによって得ることができた。さらにその作用メカニズムの解析を行った結果、特定のE boxを介してPer1の転写を促進することを明らかにした。この発見は未だかつて報告されていない新事象であり、概日リズム形成を担う時計遺伝子の新規分子機構の解明のための大きな手掛かりになる結果である。本研究課題を始めた当初は全く新規分子機構の発見の手掛かりすらつかめていなかったが、この新事象を発見できたことによって今後の検討課題も設定できたことから、研究はおおむね順調に発展していると考える。今後はPer1誘導に関する他の転写因子も含めた詳細なメカニズムの解析を行う必要がある。

生化学本研究では、特定のE boxを介してPer1の転写を誘導する化合物をスクリーニングによって得ることができた。今後検討すべき課題は、特異的なE boxを介してPer1の転写を誘導するのかについてのメカニズムを明らかにすることである。まず初めにこのE boxを介してPer1の転写を誘導する転写因子はBmal/Clock依存的かどうかを決定する。そのためには、CRISPR/Cas9と特定の塩基配列を認識できるガイドRNA (gRNA)を用いたゲノム編集技術によって、Bmal1, Clockをそれぞれノックアウトした細胞株を作成する。その細胞株に対してスクリーニングで得た化合物を処理した後、Per1のmRNA発現上昇について検討を行う。同様のゲノム編集技術を用いて目的のE box配列を除去した細胞株も作成し、この細胞に化合物処理を行い、Per1のmRNA発現を検討する。これらの実験を行うことで、化合物の作用はBmal/Clock依存的かどうか、また内在性のプロモーターのE boxを除去することで特定のE boxが実際に機能しているかの確認が可能である。さらにこの化合物が生物リズムにどのような影響を与えるかどうか検討を行う。12時間の明暗サイクルの中で飼育したマウスを暗暗条件にし、化合物投与の時間条件を振って、マウス行動リズムに与える影響についてロコモーターを用いて検討を行う。以上の実験を行うことで、時計遺伝子の新規分子機構の発見の詳細が解明されるとともに、化合物が生物リズムを改善するような作用を持つ場合、創薬的観点からも有用である。不規則な生活、時差ぼけなど生物リズムの異常は、睡眠障害、鬱など精神疾患の原因にもなり、深刻な症状を抱えている人も多く存在する。今後は時計遺伝子をターゲットとした薬剤の開発も視野に入れ研究を推進していくことを目標とする。本研究ではPer1を誘導する化合物のスクリーニングを行い時計遺伝子に作用する機能を持つことを明らかにした。ところが、最初にスクリーニング化合物を得ることができたのは、当初予定していた計画よりもやや遅れてからであった。本年度ではその化合物の作用メカニズムの解析をある程度すすめる予定であったが、その化合物の作用メカニズムの検討を始める時期が遅くなってしまい、それに伴って年度内に使用予定の費用を翌年に繰り越す必要が生じた。次年度ではスクリーニングで得た化合物のPer1誘導能のメカニズムを解析するため、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、Eboxに結合する転写因子群のノックアウト細胞株を作成する。そのため、次年度使用額は、gRNA発現ベクターの構築を行うための合成オリゴDNAの作成に充てる。