hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
各種嫌気性菌の酸素毒性耐性の比較検討

1.活性酸素・フリーラジカルの発生系は本研究室で開発したCuCl_2-H_2O_2系を用いた。これまでの研究で本系からはヒドロキシラジカル(・OH)が両薬剤の濃度に依存して発生することが明らかになっている。・OHは活性酸素種の中でも特に細胞毒性が高い活性酸素・フリーラジカルである。2.CuCl_2による殺菌:両株ともに40μMで90%以上の殺菌効果が認められ、濃度依存的に殺菌効果は増強した。3.H_2O_2による殺菌:両株ともに125mMで90%以上の殺菌効果が認められ、500mMでぼぼ100%の殺菌効果が認められた。4.CuCl_2-H_2O_2系による殺菌:125mM H_2O_2、40μM CuCl_2の混合系では、単独で用いたときと比べて約100倍の殺菌効果が得られた。5.・OH消去剤が殺菌効果に及ぼす影響:・OH消去剤のEPC-K1(千寿製薬株式会社)を反応系に添加すると、EPC-K1の濃度に依存して殺菌効果は抑制された。現在は殺菌された各細胞のGenomic DNAを抽出し、その解析を進めているところである。尚、この研究成果は1996 International Association of Dental Research(San Francisco)にて報告される。
高血圧発症の遺伝的背景とその新しい治療薬に関する研究

三年間の本研究は、キニノゲン欠損ラット(BN-Kaラット)を用いて、腎カリクレイン-キニン系が過剰摂取ナトリウムあるいはナトリウム体内貯留に対する水門として働き、腎カリクレイン分泌低下が高血圧の発症初期に主要な役割を示したものである。I.腎カリクレイン-キニン系の役割1.欠損BN-Kaラットは正常のBN-Kiラットに比し食塩負荷に感受性が高く、2%NaCl負荷で正常BN-Kiラットより尿量、尿ナトリウム排泄減少を介して高血圧を発症させた。2.non-pressor doseのアンギオテンシン(Ang)IIの持続注入によりアルドステロン分泌を介して、細胞内にナトリウムを貯留させ、高血圧となった。3.腎で産生されるキニンは尿細管腔側のB_2受容体に働き、ナトリウム利尿作用を示した。これは尿キニナーゼの一つであるcarboxypeptidase Y-like exopeptidaseを阻害するebelactone B投与により、ナトリウム利尿がおこることで証明することが出来る。II.高血圧発症における腎カリクレイン-キニン系の役割1.本態性高血圧患者の尿カリクレイン分泌量が低下していることが報告されているが、自然発症高血圧ラット(SHR)も、血圧の上昇中はWistar Kyotoラット(WKY)に比べ、尿カリクレインの分泌量が少ない。2.後葉ホルモンのオキシトシンを静注するとナトリウム利尿作用があり、この半分は尿カリクレイン分泌促進によって産生されたキニンを介する作用であった。SHRの腎における腎カリクレイン量はWKYと変わりないのに、オキシトシンを静注すると尿カリクレインの分泌量が著しく低い。このことは分泌傷害であることを意味する。3.一側腎摘出後、DOCA-食塩高血圧を正常BN-Kiラットにおいておこさせると、約10週間で血圧はプラトーとなるが、欠損BN-Kaラットでは2週間でほぼプラトーに達する。このことは、腎カリクレイン-キニン系が高血圧発症初期にナトリウム排泄を介して、血圧上昇抑制に作用することを示す。前述のebelactone B持続投与でこの上昇は抑制される。従ってoxytocinやebelactone Bが新しい高血圧治療薬となる可能性がある。先天的キニノゲン欠損ラットBN-Katholiek(BN-Ka)はキニンをほとんど産生することは出来ない。本研究の目的はこのBN-Kaラットを用いて高血圧発症の腎カリクレイン-キニン系の役割を調べることにある。1.低食塩負荷による高血圧発症:正常のBN-Kitasato(BN-Ki)ラットに2%食塩を含む食餌を与えても血圧上昇はないが、欠損BN-Kaラットに与えると高血圧を生じる。欠損BN-Kaラットは正常BN-Kaラットに比べて尿中Na排泄量が少なく、水分摂取量、排泄量共に少ない。その結果、血清中Naが上昇し赤血球内Na量も有意に増大する。欠損BN-Kaラットにキニノゲンを持続投与すると、尿キニン産生、尿量Na排泄量増大と共に全身血圧も正常に戻る。赤血球内Na量も著しく減少する(Hypertension,22:705-714、1993)。2.正常BN-Kiラットの血圧を上昇させない量(20% mug/day/rat)のアンギオテンシンIIを欠損BN-Kaラット皮下に持続注入すると、全身血圧は上昇し、血清、脳脊髄液、及び赤血球内のNa濃度が上昇した。

アルドステロン括抗薬のスピロノラクトン皮下持続注射により、全身血圧上昇、心拍数増大、脳脊髄液、及び赤血球内Na増大がすべて正常に戻った。このことはアンギオテンシンはより低濃度で副腎よりアルドステロンを分泌させ、Naの体内貯留をおこしていることを示している。事実アンギオテンシンII持続注入により尿中のアルドステロン排泄量は増大したが、BN-Ka,BN-Kiラットで差はなかった(Hypertension in press)。3.ラット尿のブラジキニン分解経路:ラット尿によるブラジキニン分解は血漿と全く異なり、neutral endopeptidase及びcarboxypeptidase Y-like exopeptidaseの二つによってなされ(Biomed.Res.,14;191-201,1993)、その阻害薬のpoststatinも見出された(Eur.J.Pharmacol.232:181-190,1993)。PoststationはDOCA-salt-高血圧ラットの血圧を下降させる。本年度の研究成果は次の通りである。1)皮下に植えこんだ浸透圧ポンプによりnon-pressor dose(20 μg/hr/rat)のアンギオテンシンIIを正常Brown-Norway Kitasato(BN-Ki)ラットに2週間投与しても血圧上昇はないがキニン生成のないキニノゲン欠損BN-Katholiek(BN-Ka)ラットに投与すると、赤血球、脳脊髄液内ナトリウム貯留と共に高血圧を生ずる。これはアンギオテンシンIIがアルドステロンを副腎皮質から遊離することによる。(Hypertension,24(1);111-119,1994)2)ラット尿中の主なキニナーゼはneutral endopeptidase(NEP)とcarboxypeptidase-Y様peptidaseであり、両者はpoststatinで阻害されるが、後者はebelactone Bで阻害されることを明らかにした。これらを投与するとナトリウム尿中キニン量の増大と共に、ナトリウム利尿が起こる。(Jpn.J.Pharmacol.,65;79-82,1994)3) ebelactone BをDOCA-salt高血圧ラットに投与し、尿中のキニナーゼを阻害し尿キニンを増量させると血圧上昇を抑制した。しかし血漿キニナーゼIIを阻害するlisinoprilでは上昇は抑制されなかった(投稿中)。4)脳下垂体後薬ホルモンのoxytocinを麻酔ラットの静脈内に投与すると、ナトリウム利尿作用があり、同時に尿カリクレイン分泌を促進した。さらにoxytocinのナトリウム利尿作用の50%以上は尿カリクレインにより生成されたキニンによることが明らかとなった。(Jpn.J.Pharmacol.,in press)。
派手な雄を選ぶ雌の利益と配偶者選択の進化

雄の派手な形質を指標とした雌の配偶者選択において,選ばれた雄からの子への遺伝的貢献という配偶者選択の間接的利益を明らかにするため,沖縄産野生化グッピーを用いて以下のような実験を行い,次のような結果を得た。(1)グッピーにおける雌選択の指標である雄のオレンジ色の体色が餌の藻類に含まれるカロチノイド依存形質であり,藻類摂餌によって雄の体色だけでなく,成長や雌の繁殖効率が向上することを藻類添加グループとコントロールグループを比較することで明らかにした。しかし,βカロチン添加グループとコントロールグループの比較により,雄の体色はβカロチンで鮮やかになるものの,成長や雌の繁殖効率は向上しなかったことから,藻類に含まれるβカロチン以外のカロチノイド,あるいは食物繊維などの他の物質が,グッピーの成長や繁殖に関与していることが示唆された。これらの実験の結果は,"Algal-diet enhances sexualornament, growthand reproduction in the guppy (Poecilia reticulata)"という原稿にまとめ,現在,Behavioral Ecology and Sociobiology誌に投稿中である。(2)グッピーの雄の藻類採餌能力が子へ遺伝するかを明らかにするため,障壁を乗り越えて藻類を探索・採餌する能力を調べる迷路実験を行った結果,雄親の藻類採餌能力は息子および娘に有意に遺伝することが判明した。したがって,(1)の結果とあわせて,雌のグッピーはオレンジ色の体色の鮮やかな,藻類採餌能力の高い雄を配偶相手として選ぶことで,子の藻類採餌能力を高め,息子の体色の鮮やかさだけでなく,子の成長や娘の繁殖効率を高めるという間接的利益を得ていることが明らかになった。現在,(2)の結果をまとめて,投稿準備中である。(3)グッピーにおいては雄は鮮やかな体色だけでなく,尾鰭も長いという性的二形を示す。この尾鰭の長さが雌の配偶者選択に関与しているか,尾鰭や全長の異なる雄を雌に選ばせる二者択一実験を行ったところ,雌は雄の尾鰭の長さ自体を選択指標にしているのではなく,尾鰭の長さを含めた雄の全長を指標にしていることが明らかになった。雄は体そのものを大きくするより,尾鰭だけを伸ばした方がコストが少ないため,雄が尾鰭を伸ばすのは雌に選ばれるための戦略であると考えられる。しかし,雌は尾鰭の長い雄を選ぶことで,子,とくに尾鰭が伸長しない娘の体サイズが大きくなるわけではないため,雄の尾鰭の長さはオレンジ色の体色とは異なり,雌を騙す雄の不正直な形質であることが示唆された。この結果は,2002年発行のBehaviour誌に掲載された。雄の派手な形質を指漂とした雌の配偶者選択において,選ばれた雄からの子への遺伝的貢献という間接的利益を明らかにするため,沖縄産野生化グッピーを用いて以下のような一連の実験を行った。まず,グッピーにおいて雌選択の指標である雄のオレンジ色の体色が,餌の藻類に含まれるカロチノイド依存形質であること,および藻類摂餌による成長等への影響を検証するため,同じ両親由来の一腹の子を2グループに分け,一方には緑藻,またはβカロチンを含んだ餌を与え,もう一方にはコントロールとして藻やカロチンを含まない餌を与えて飼育した。その結果,藻類を与えたグループでは雄のオレンジ色の体色が鮮やかになったばかりでなく,雌雄ともに成長が早くなり,雌の繁殖開始時期も早くなった。βカロチンを与えたグループでは,雄のオレンジ色の体色は鮮やかになったが,雌雄の成長や雌の繁殖開始時期はコントロールグループと差がなかった。これらの結果から,グッピーの雄におけるオレンジ色の体色は藻類に含まれるカロチノイドによって鮮やかになることから,オレンジ色の鮮やかな雄は藻類採餌能力が高いこと,また藻類摂取によって雌雄の成長や繁殖が向上するが,これらの影響は藻類に含まれるカロチノイド以外の物質が関与している可能性があることが示唆された。さらに,藻類に対する摂餌能力が親から子へと遺伝するかを明らかにするため,障壁を越えて藻類を探索する能力を調べる迷路実験などを行った。まず,成熟した雌雄の藻類摂餌能力を調査した後,それらの子を得,親と同様の実験を行い,親と子における藻類摂餌能力の相関関係を解析した。その結果,藻類摂餌能力は雌親から子へは有意に遺伝していたが,雄親から子へは遺伝する傾向が見られたが有意な結果とはならなかった。これはサンプルサイズが小さかったためと考えられることから,今後さらに実験例数を増やして再解析する予定である。

しかし,βカロチン添加グループとコントロールグループの比較により,雄の体色はβカロチンで鮮やかになるものの,成長や雌の繁殖効率は向上しなかったことから,藻類に含まれるβカロチン以外のカロチノイド,あるいは食物繊維などの他の物質が,グッピーの成長や繁殖に関与していることが示唆された。これらの実験の結果は,"Algal-diet enhances sexualornament, growthand reproduction in the guppy (Poecilia reticulata)"という原稿にまとめ,現在,Behavioral Ecology and Sociobiology誌に投稿中である。(2)グッピーの雄の藻類採餌能力が子へ遺伝するかを明らかにするため,障壁を乗り越えて藻類を探索・採餌する能力を調べる迷路実験を行った結果,雄親の藻類採餌能力は息子および娘に有意に遺伝することが判明した。したがって,(1)の結果とあわせて,雌のグッピーはオレンジ色の体色の鮮やかな,藻類採餌能力の高い雄を配偶相手として選ぶことで,子の藻類採餌能力を高め,息子の体色の鮮やかさだけでなく,子の成長や娘の繁殖効率を高めるという間接的利益を得ていることが明らかになった。現在,(2)の結果をまとめて,投稿準備中である。(3)グッピーにおいては雄は鮮やかな体色だけでなく,尾鰭も長いという性的二形を示す。この尾鰭の長さが雌の配偶者選択に関与しているか,尾鰭や全長の異なる雄を雌に選ばせる二者択一実験を行ったところ,雌は雄の尾鰭の長さ自体を選択指標にしているのではなく,尾鰭の長さを含めた雄の全長を指標にしていることが明らかになった。雄は体そのものを大きくするより,尾鰭だけを伸ばした方がコストが少ないため,雄が尾鰭を伸ばすのは雌に選ばれるための戦略であると考えられる。しかし,雌は尾鰭の長い雄を選ぶことで,子,とくに尾鰭が伸長しない娘の体サイズが大きくなるわけではないため,雄の尾鰭の長さはオレンジ色の体色とは異なり,雌を騙す雄の不正直な形質であることが示唆された。この結果は,2002年発行のBehaviour誌に掲載された。
鶏脊髄のMarginal nucleiの形態学的研究

Marginalnuclei (MN)を構成する3亜核[minor (Mn), major (Mj), ventral (V) MN]ニューロンを光学及び電子顕微鏡的に観察した。MjはMnと同様に体節的に分布するとされてきた。Mjの突出部は確かに体節的に分布していたが、白質部は突出部から扇状に分布し、隣接する核と重複した分布をしていた。MnとMjのニューロンの大きさはほぼ同じで、中型に属した。Vのニューロンは非常に扁平ではあるが、大型に属した。ニューロンの大きさとニッスル物質の形状には関連性があり、小型ニューロンは塊状のニッスル物質が散在性に分布し、中型ではニッスル物質は塊状をなさず、細胞質全域に均等に分布し、大型では塊状のニッスル物質が密に分布していた。ついで、シナプスの型とその出現頻度を観察した。シナプス型には4種類、すなわち、シナプス小胞が球状の明小胞(s)のみを含むもの、主としてsからなるが有芯小胞(g)を混在するもの、sと扁平な明小胞(f)が混在するもの、3者が混在するものを認め、出現頻度はs型が最も高く5-6割、sg型は2-3割を占めていた。これらシナプス型の出現頻度には3亜核間に有意な差異がなかった。以上の結果から、MjとMnは同種のニューロン構成を待っているが、Vとはかなり異なると結論できた。しかも、Mjのうち、突出部と白質部のニューロンを区別する必要のないことも確認できた。3亜核に含まれる膠細胞にも他部位では観察されない大きな特徴が認められた。MjとVにはグリコーゲン含有星状膠細胞が分布していた。Mnは灰白質的様相を呈するにもかかわらず線維性星状細胞が分布していた。また、MnとMjには拡張した槽からなる粗面小胞体を含む線維性星状膠細胞も観察された。軸策終止部位は、腰膨大部のニューロンの軸策はより頭方の種々の高さに終わり、頚膨大部のそれはより尾方の種々の高さに終わっていた。今年度は、鶏脊髄のMarginal nucleiの細胞構築を終了し、ついで透過型電子顕微鏡による観察(この報告は次年度)と神経路に関する実験を遂行中である。細胞構築学的研究Marginalnuclei(MN)は脊髄の第122節に分布するMinor marginal nuclei(MiN)、第2332、ないしは33節に分布するMajor marginalnuclei(MjN)、下位胸髄腰仙髄に分布するVentral marginal nuclei(VN)を区別した。MiNは各節の頭側半分の範囲に分布しており、隣接する側索との境界は明瞭であった。MiNの神経細胞は比較的大型で、多極性だが長軸を頭尾方向に持つ紡錘形を呈した。ニッスル物質は微細であった。MjNは脊髄の表層に突出した主部とそれから腹角先端にかけて分布する白質部からなっていた。MjNの分布に一致して、グリコーゲンを多量に含む膠細胞も分布していた。MjNのMiNと同様に体節的に分布するとされてきたが、実際には、主部は体節的であったが、白質部は主部を起点とした扇状に広がり、隣接する核はこの部で重なり合っていた。MjNの神経細胞はMiNよりやや小型の多極細胞で、特に方向性を持たなかった。

ニッスル物質はMiNに類似していた。VNは非体節的に腹索表層を中心として分布するとされてきたが、詳細に分布を観察すると、腹根付着部を中心として分布し、体節的分布の傾向を示した。この他に、MjN間、およびMiN間の側索表層にもVN類似の細胞が散在していた。VNの神経細胞はもっとも大型で、脊髄表層に平行な面を持つ、扁平細胞であった。ニッスル物質は粗大で、他と明らかに異なっていた。神経路についてはまだ実験例が少ないが、各神経核から発した軸索は上行、下行、および反対側のかなり広い範囲に渡って、比較的短い軸索から長い軸索まで混在していることが伺われた。これから、各脊髄節間を結ぶ働きか、多シナプス性に情報を上行性、下行性に運ぶものと推察されるが、より詳細な検討が必要である。MNを構成する3亜核(minor,major,ventral M N)のニューロンを観察すると、minorとmajorのニューロンの平均的大きさはほぼ共通し、脊髄腹角のα運動ニューロンを大型とするならば中型に属していた。ventralのニューロンは非常に扁平ではあるが、大型に属した。ところで、major,minorともに、平均値は中型と言っても小型から大型のニューロンからなり、小型ニューロンは塊状のニッスル物質が散在性に分布し、中型ではニッスル物質が塊状をなさず、細胞質全域に均等に分布し、大型では塊状のニッスル物質が密に分布していた。ventralでは、構成するすべてのニューロンが大型に属し、ニッスル物質は塊状を呈して、密に分布していた。ついで、シナプスの型とその出現頻度を観察した。シナプス型には4種類、すなわち、シナプス小胞が球状の明小胞(s)のみを含むもの、主としてsからなるが有芯小胞(g)を混在するもの、sと扁平な明小胞(f)が混在するもの、3者が混在するものを認め、出現頻度はs型が最も高く5-6割、sg型は2-3割を占めていた。これらシナプス型の出現頻度には3亜核間に有意な差異がなかった。以上の結果から、majorとminorは同種のニューロン構成を持っているが、ventralとはかなり異なると結論できた。しかも、majorのうち、突出部と白質部のニューロンを区別する必要のないことも確認できた。3亜核に含まれる膠細胞にも他部位では観察されない大きな特徴が認められた。majorとventralにはグリコーゲン含有星状膠細胞が分布することはよく知られているが、今回はminorには線維性星状膠細胞が分布することを確認した。minorは灰白質的様相を呈するため、形質性が分布すると予想されたが意外な結果であった。また、majorとminorには拡張した槽からなる粗面小胞体を含む繊維性星状膠細胞も観察された。この種の星状膠細胞の報告例はない。
マイクログリア制御による頭部外傷後脳損傷の治療

ラット脳挫傷モデルを用いて頭部外傷後に選択的P2X4受容体拮抗薬である5-BDBDおよび選択的P2X7受容体拮抗薬AZ11645373を投与した際の脳内のグリア細胞の反応を観察した。ラット頭部外傷後の脳を免疫染色すると、大脳皮質や海馬などに多数の活性型マイクログリアが観察された。これらの多くは活性型のマイクログリアであった。しかし頭部外傷後に5-BDBD、AZ11645373もしくはその両方を投与した群の脳内では明らかにマイクログリアの数も、活性型マイクログリアの割合も減少していた。Western blottingを用いてIba-1とGFAPの発現を調べたところ、頭部外傷後に5-BDBDやAZ11645373を投与した群ではIba-1の発現は抑制されるが、GFAPの発現は外傷単独群に比較しむしろ増加した。次にPCRとELISAを用いて頭部外傷後のIL-1βやIL-6などの炎症関連サイトカインの分泌を観察した。頭部外傷後にはこれらのサイトカインの分泌増加がみられたが、5-BDBD、AZ11645373もしくはその両方を投与すると大脳皮質や海馬など外傷に関連する部位でその分泌抑制が観察された。特に5-BDBDとAZ11645373の両方を投与した群では単剤投与群と比較して著明なサイトカインの分泌低下が認められた。本研究により、ラット頭部外傷後に5-BDBDやAZ11645373を用いてP2X4、P2X7受容体を拮抗すると、活性型マイクログリアの発現は抑制され、一部の炎症関連サイトカインの分泌も抑制されることが分かった。これまで我々は脳挫傷による脳損傷の治療として、グリア細胞が励起する炎症反応を抑制することにより治療効果を得ようと研究を行ってきた。外傷という刺激を受けたアストロサイトはカルシウムウェーブを形成し、これは近隣のマイクログリアを活性化させながら広がっていく。このカルシウムウェーブ自体を拮抗することにより、確かにマイクログリアの活性化を抑制可能であった。しかし実際の治療を考えた場合、この方法ではアストロサイトの正常活動自体も拮抗する可能性が高く、そうであればウェーブ自体を拮抗するより、ウェーブから信号を受けるマイクログリア上の受容体を拮抗したほうが治療効果は高く、副作用も少ないのではないかと考えた。本研究ではマイクログリアがカルシウムウェーブから信号を受け取る際に重要な働きをすると報告されている、マイクログリア上のP2受容体を拮抗することがラット脳挫傷モデルにおいて有効かを検討した。予定通り平成28年度はモデルの作製を行った。ラット脳挫傷モデルとして汎用されているcortical contusion injuryを使用した。脳挫傷作成後ラット背部皮下に持続的微量投薬用の浸透圧ポンプを移植し、脳挫傷中心部に薬物が投与されるようにした。Na&iuml;ve群とコントロール群の他に、ポンプからP2X4受容体拮抗薬である5-BDBDを投与した群、P2X7受容体拮抗薬であるAZ11645373を投与した群、およびこの両拮抗薬を投与した群を作製した。脳の摘出は3日後に行った。摘出した脳からマイクログリアの活性化を観察するためのウェスタンブロッティング用の検体、各種サイトカインやケモカインのmRNA測定のための検体を保存した。ウェスタンブロッティング用の検体はタンパクを精製し、総蛋白量を定量した。mRNA測定用の検体はRNA精製後に逆転写しcDNAを作製した。おおかた研究実施計画通りの進行状況である。ウェスタンブロッティングやPCRなどの解析法の条件出しはすでに終了していることから、今後の解析はこのまま順調に進んでいくものと思われる。当初予期していなかった点としては、外傷7日後の脳を解析すると活性化しているマイクログリアの数が極端に少なく、炎症が自然に寛解しているようである。したがって7日モデルのサイトカインの定性、定量は必要性が低いと思われる。まず抗Iba-1抗体、抗Galectin-3抗体を用いて組織学的に検討したところ、外傷により発現が上昇する活性型のマイクログリアは5-BDBDやAZ11645373の投与により発現が抑制された。次に抗Iba-1抗体を用いたwestern blottingを行いマイクログリアの発現を定量した。脳挫傷群ではNaive群と比較して有意なIba-1の発現上昇が認められた。5-BDBD、AZ11645373もしくはその両方を投与した群でのIba-1の発現は外傷単独群に比較して有意に低下した。しかし抗GFAP抗体を用いたwestern blottingを行うと、5-BDBDやAZ11645373を投与した群では外傷単独群に比較し、むしろGFAPの発現は有意に上昇していた。次にPCRを用いて各種炎症性サイトカインの発現を、挫傷組織周辺の大脳皮質、挫傷から遠位の頭蓋底近くの大脳皮質および外傷側海馬組織にわけて観察した。外傷によりIL-1 beta、IL-6およびTNF alphaの発現は上昇したが、5-BDBDやAZ11645373を投与した群では外傷の近位、遠位にかかわらず多くの部位で発現が有意に抑制された。特に外傷遠位の大脳皮質におけるIL-6の発現は5-BDBDとAZ11645373による相乗効果が認められた。外傷後にP2X4受容体やP2X7受容体を拮抗するとマイクログリアの活性化が抑制され、抗炎症効果が得られると考えられた。

平成29年度までに予定した研究計画を終了した。本研究ではNaive群の他に外傷群として外傷単独群、外傷後に5-BDBDを投与した群、外傷後にAZ11645373を投与した群、外傷後に5-BDBDとAZ11645373の両方を投与した群を作製した。このすべての群において抗Iba-1抗体と抗Galectin-3抗体を用いた免疫染色を完了した。また挫傷周囲大脳皮質、外傷から遠位の大脳皮質、外傷側海馬におけるGalectin-3の定量をWestern blottingを用いて行い、これも全群で完了した。各部位における炎症性サイトカインの発現をPCR法を用いて観察した。IL-1 beta、IL-6、NF kappaB、TNF alphaのPCRを全群とも終了した。マイクログリアの遊走能の検討のためにCXCL-10のPCRを行い、これも全群で完了した。WesternblottingやPCRの結果はSPSSソフトを用いて統計学的検討を行っており、すべての群と部位においてデータの解析を終了した。ラット脳挫傷モデルを用いて頭部外傷後に選択的P2X4受容体拮抗薬である5-BDBDおよび選択的P2X7受容体拮抗薬AZ11645373を投与した際の脳内のグリア細胞の反応を観察した。ラット頭部外傷後の脳を免疫染色すると、大脳皮質や海馬などに多数の活性型マイクログリアが観察された。これらの多くは活性型のマイクログリアであった。しかし頭部外傷後に5-BDBD、AZ11645373もしくはその両方を投与した群の脳内では明らかにマイクログリアの数も、活性型マイクログリアの割合も減少していた。Western blottingを用いてIba-1とGFAPの発現を調べたところ、頭部外傷後に5-BDBDやAZ11645373を投与した群ではIba-1の発現は抑制されるが、GFAPの発現は外傷単独群に比較しむしろ増加した。次にPCRとELISAを用いて頭部外傷後のIL-1βやIL-6などの炎症関連サイトカインの分泌を観察した。頭部外傷後にはこれらのサイトカインの分泌増加がみられたが、5-BDBD、AZ11645373もしくはその両方を投与すると大脳皮質や海馬など外傷に関連する部位でその分泌抑制が観察された。特に5-BDBDとAZ11645373の両方を投与した群では単剤投与群と比較して著明なサイトカインの分泌低下が認められた。本研究により、ラット頭部外傷後に5-BDBDやAZ11645373を用いてP2X4、P2X7受容体を拮抗すると、活性型マイクログリアの発現は抑制され、一部の炎症関連サイトカインの分泌も抑制されることが分かった。平成29年度前半は採取した組織の解析を引き続き行っていく予定である。ウェスタンブロッセィングやPCRなどはこれまで我々が使用してきた条件通りに解析していく。平成29年度後半は新たにモデルを作製し組織染色用の組織を採取する。これを用いて外傷後急性期に外傷組織周辺の大脳皮質、同側の海馬のCA3、対側の大脳皮質とCA3のFluoro-Jade染色を行う。これは外傷後の二次損傷により死亡したあるいは死にゆく細胞数を定量するためである。平成30年度は最終的にこれらの拮抗薬が機能予後を改善するかを行動実験を行い解析していく予定である。
Aquaporinを標的とした、胆道癌新規抗癌剤治療の探求

組織マイクロアレイ(TMA)にて検討を行った。AQP-1は、腫瘍深達度、CEAなど、癌の進展や悪性化に伴い発現が低下した。胆汁酸暴露後の胆道癌細胞株では、AQP-1遺伝子の発現低下を認め、胆汁鬱滞や癌の進展にAQP-1が関与していた。胆道癌における予後予測因子としてAQP-1が有用であると考察された。化学療法施行の膵頭部領域癌症例の検討において、PTEN発現群は、非発現群に比較して予後良好であった(DSS ;p<0.01)。胆道癌において、AQPと癌抑制遺伝子のPTENのco-expressionがapoptosisおよび化学療法感受性と深く関連している事が示唆された。新規樹立した胆道癌細胞株(TYGBK-1、TYBDC)および既存の胆道癌細胞株の各薬剤(Gemcitabine、S-1、CDDP)に対する感受性を確認し、各々の薬剤耐性株を作成である。マイクロアレイを用いたAQP関連遺伝子の網羅的解析では、miR-21及び他癌腫において予後やS-1薬剤感受性との関連を認めた8種のmicro-RNA発現を胆道癌においても解析中である。組織マイクロアレイ(TMA)による発現解析では、最初に、AquaporinファミリーのAQP-1の発現解析を行った。AQP-1は胆道癌の進展に関与していると考えられ、膜結合型ムチンであるMUC familyの発現と比較した。その結果、癌の悪性度や浸潤性発育に関連があると言われている膜結合型ムチンであるMUC-1発現とAQP-1との相関が認められ、両因子ともに癌の悪性度や浸潤性発育に関連があることが示唆された。組織マイクロアレイ(TMA)は、2011年以降の胆道癌において累積された臨床検体を用いて新たに作成中である。癌におけるAQPの役割としては、増殖・遊走に大きく関わっているとこれまで報告してきたが、胆道癌症例において、黄疸によるAQP-1の発現低下を認め、胆汁うっ滞や、胆道癌の進展にAQP-1が関与している可能性も示唆された。化学療法感受性の研究に関しては、現在新たな細胞株を作成中であり、新しく作成された細胞株、ヌードマウス移植株での解析を追加の予定である。胆汁分泌との関連が注目されているAQP-1と胆道癌(胆嚢癌、胆管癌、乳頭部癌)における検討を行った。切除標本のformarin固定paraffin包埋切片を用いて作成した各々の組織マイクロアレイ(TMA)を用いて、免疫組織化学的にAQP-1発現を評価し、各々の年齢・性別・腫瘍径・腫瘍マーカー(CEA,CA19-9)・TNM分類・術前黄疸との関連を解析した。AQP-1発現が、胆道癌における予後予測、悪性度予測因子として有用である可能性が示唆された。また、黄疸遷延症例が有意にAQP-1発現が低下していた。胆道癌の5年生存率は,乳頭部癌69.6%,遠位胆管癌44.2%であり、CEA(≧3.4),深達度(T3,T4),リンパ節転移(+),術前黄疸(T-Bil>2.5)は予後不良因子であった(p=0.071, 0.024, 0.001, 0.003)。多変量解析では,CEA,術前黄疸が独立予後規定因子であった(p=0.019, 0.011)。AQP-1に加えて、悪性度や浸潤性発育に関連があると言われている膜結合型ムチンであるMUC-1発現を併せて検また、討した。胆道癌におけるAQP-1 positive/MUC1 negative症例は、有意な予後規定因子であった。膵頭部領域癌において、PTEN発現が化学療法感受性や予後予測に有用である可能性が示唆された。癌抑制遺伝子の一つとも考えられるPTENの異常により、アポトーシスを抑制し、抗癌剤感受性を低下させている可能性がある。AQP-1とこれら遺伝子との相互関係は今後も引き続き検討が必要ではあるが、胆道癌における予後予測、化学療法感受性および悪性度予測因子として有用である可能性が示唆された。組織マイクロアレイにおける解析により、AQP familyのうちAQP-1にターゲットを絞り、また関連する遺伝子の解析を行えている。細胞実験(細胞株作成)などは若干停滞している。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学既存の細胞株を多く用い、解析を進めることにより、薬剤感受性をはじめとした胆道癌の特性を比較、検討していく。

胃癌・膵癌の細胞株、化学療法感受性における解析結果も参考にして、胆道癌の場合との相違点から新たなターゲットを見出す検討も並行して行う27年度が最終年度であるため、記入しない。
交換結合バイアス法を用いた高周波キャリア型薄膜磁界センサのマイクロヘッド化

本研究の目的は、室温動作が可能でSQUID相当の高磁界感度を有する高周波キャリア型薄膜磁界センサにおいて、磁気ヘッド形状での小型化を実現することである。巻線の無い小型磁気ヘッド構造を実現するために、強磁性膜と反強磁性膜を積層したセンサ素子を作製し、交換磁気異方性を利用した一方向異方性の導入による磁界感度向上について検討した。この際の重要なパラメータである皮強磁性膜の組成、膜厚、積層化の順序、層数の最適化を行い、本構造での設計指針を確立。さらに、この巻線無しの小型センサ素子において、フィードバック導体ラインの配置、寸法・構造の最適化を行い、薄膜ヘッド構造のセンサ素子を実現することを最終目標とした。本年度は、前年度の知見により得られた強磁性層と反強磁性層を積層して得られる交換磁気異方性を利用した高感度センサ素子を、薄膜ヘッドとして実用化するため重要なフィードバック導体ラインの設置方法、センサ素子磁界検出方向の最適化、およびそのフィードバック動作について検討した。薄膜ヘッドにおいて、フィードバック導体ラインは磁界を検出する対象物との距離(リフトオフ)が最小となるように、センサ素子の直上に平行に配置した。このため、センサの磁界検出方向が従来の検出方向とは90度異なることになり、この場合の磁界検出特性および磁界感度を調べた。その結果、磁界感度は低下するものの、巻線無しで高感度なセンサ出力を実現できることが分かった。また、実際にセンサ直上に配置した導体ラインに電流を通電することで、センサ素子出力を制御できることを明らかとした。これらの研究成果は、高周波キャリア型磁界センサにおいて、巻線構造無しでの薄膜ヘッド化を世界ではじめて実現したものであり、本センサの高密度磁気記録や生体磁気計測応用の産業レベルでの実用化において極めて重要な成果であると言える。本研究の目的は、室温動作が可能でSQUID相当の高磁界感度を有する高周波キャリア型薄膜磁界センサにおいて、磁気ヘッド形状での数ミクロンからサブミクロン寸法での小型化を実現することである。巻き線の無い小型磁気ヘッド構造を実現するために、強磁性膜と反強磁性膜を積層したセンサ素子を作製し、交換結合を利用した一方向異方性の導入による磁界感度向上について検討する。この際の重要なパラメータである反強磁性膜の組成、膜厚、積層化の順序、層数の最適化を行い、本構造での設計指針を確立する。さらに、この巻き線無しの小型センサ素子を読み取りヘッドとした高感度磁界計測システムを構築する。本年度は、センサ素子への一方向異方性の導入のため、強磁性膜と反強磁性膜を積層した構造の薄膜センサ素子を作製し、導入する反強磁性膜の組成、膜厚、熱処理温度などを変化させた場合の交換結合磁界の強度について検討し、センサ素子に用いる強磁性膜との積層に最も適した材料および成膜条件を検討した。その結果、NiFe強磁性膜と積層した場合、反強磁性膜としてはNiO膜よりもFeMn膜の方が優れた軟磁性と交換結合磁界が得られることが分かった。また、センサ素子としての磁界検出特性においても、NiFe/FeMn積層膜で巻き線構造を用いることなく磁界ゼロ点への高感度領域の設定を可能にできるとともに、NiFe/NiO積層膜と比較してヒステリシスを小さくすることができた。さらに、NiFe/FeMn構造で一層あたりの強磁性膜厚および反強磁性膜厚を100nmから50nm程度に抑えたまま多層化することで、センサ出力を15倍程度に増大させることができた。これらは、センサ素子のマイクロ磁気ヘッド化の実現において極めて重要な成果である。
凝縮曲線におけるヒステリシス現象に及ぼす凝縮面粗さの影響に関する研究

本研究の成果は3部より成っており、各部の内容要旨を以下に記す。[第1部]一方向に粗さを持つ伝熱面を用い、滴状凝縮実験を行い、滴状凝縮時の熱流束に及ぼす粗さの影響を検討した。その結果、(1)蒸気・伝熱面間の温度差Δtを増加させると、凝縮形態は滴状から遷移凝縮を経て、膜状に移行すること、(2)各々への移行は平滑面に比べ、Δtの小さいところで起きること、(3)履歴現象は粗さが荒くその方向が水平に近づくほど顕著に表されこと等を明らかにした。[第2部]粗面上に於ける滴状凝縮時の熱流束を定量化する目的で、その推算法を検討した。即ち、滴状凝縮時の熱流束は凝縮面上存在する凝縮水量と滴の離脱周期によって表されると考え、粗面及び平滑面上の熱流束の比を各々の面上に於ける静滴離脱滴径の比(R_<max.r>/R_<max.s>)と清掃周期の比で表し、実験値を良く再現する推算式を導出した。更に、R_<max.r>/R_<max.s>及び清掃周期の比を凝縮面の幾何学的性状を表す完全粗面流れ領域の摩擦係数の比(f_r/f_sで表し、次式を導出した。[第3部]qとΔtとの関係で表される凝縮曲線は、推進力の一方に伝熱面中央部の表面温度を用いるのが常である。しかし、滴と膜とが現在する遷移凝縮では、伝熱面上の温度測定点が滴で覆われるか、否かによってΔtは大幅に異なってくる。そこで、遷移領域に於ける凝縮液膜の被覆率とΔtとの関係を実験的に求め、その関係から伝熱面表面平均温度を算出して凝縮曲線の修正を試みた。その結果、遷移凝縮領域の熱流束はΔtの小さい領域では右方向へ、またΔtの大きい領域では左方向へ移動することを明らかにした。滴状凝縮現象は蒸気・伝熱面間温度差Δtを大きくして行くと、滴状から遷移凝縮を経て膜状凝縮へと移行し、その際の熱流束は凝縮曲線と言われるN字状のカーブを描く。また、その膜状凝縮の状態から、逆にΔtを減少させると、遷移凝縮領域に於いて、熱流束は同じ経路はたどらず、いわゆる履歴現象を呈する。それ故、滴状凝縮現象を実現した凝縮器を負荷変動の激しい系で運用した場合を考えると、遷移凝縮領域に於ける熱移動機構を解明することは極めて重要である。所で、凝縮曲線を実験的に求める場合には、伝熱面に設置された1本の熱電対温度計でΔtの片側を決定するのが常である。しかし、滴と膜とが混在する遷移凝縮領域では、その1本の熱電対が滴部にあるのか、或いは膜部にあるのかによって、Δtは大きく変化するため、凝縮曲線もまた、大幅に変化する。本研究では、履歴機構解明に至る一段階として、その基本となる凝縮曲線を得るためには、如何なる方法が妥当であるかを実験的に検討した。試料伝熱面には凝縮曲線の再現が比較的容易であり、且つ工業的にも重要な粗面を用いたが、実験はステンレス製蒸気ダクトの一壁面に、3ないし5本の熱電対を挿入した試料伝熱面を設置し、その面上で遷移凝縮を起こさせることにより行った。

凝縮曲線は、伝熱面の液膜による被覆率、滴及び膜部の伝熱面温度より伝熱面の平均温度を求め決定したが、被覆率については写真撮影により求めた。その結果、遷移凝縮領域の凝縮曲線は、Δtの比較的小さな領域では既往値よりも右方向へ、またΔtの大きな領域では左方向へシフトし、全体として勾配はかなりきつくなることが分かった。本研究の実績は3部より成っており、各部の内容要旨を以下に記す。[第1部]一方向に粗さを持つ伝熱面を用い、滴状凝縮実験を行い、滴状凝縮時の熱流束に及ぼす粗さの影響を検討した。その結果、(1)蒸気・伝熱面間の温度差Δtを増加させると、凝縮形態は滴状から遷移凝縮を経て、膜状に移行すること、(2)各々への移行は平滑面に比べ、Δtの小さいところで起きること、(3)履歴現象は粗さが荒くその方向が水平に近づくほど顕著に表れること等を明らかにした。[第2部]粗面上に於ける滴状凝縮時の熱流束を定量化する目的で、その推算法を検討した。即ち、滴状凝縮時の熱流束は凝縮面上存在する凝縮水量と滴の離脱周期によって表されると考え、粗面及び平滑面上の熱流束の比を各々の面上に於ける静的離脱滴径の比(R_<max,r>/R_<max,s>)と清掃周期の比で表し、実験値を良く再現する推算式を導出した。更に、R_<max,r>/R_<max,s>及び清掃周期の比を凝縮面の幾何学的性状を表す完全粗面流れ領域の摩擦係数の比(f_r/f_s)で表し、次式を導出した。[第3部]qとΔtとの関係で表される凝縮曲線は、推進力の一方に伝熱面中央部の表面温度を用いるのが常である。しかし、滴と膜とが混在する遷移凝縮では、伝熱面上の温度測定点が滴で覆われるか、否かによってΔtは大幅に異なってくる。そこで、遷移領域に於ける凝縮液膜の被覆率とΔtとの関係を実験的に求め、その関係から伝熱面表面平均温度を算出して凝縮曲線の修正を試みた。その結果、遷移凝縮領域の熱流束はΔtの小さい領域では右方向へ、またΔtの大きい領域では左方向へ移動することを明らかにした。
超音波カラードプラ信号を用いた新しい血流量計測法の開発-ファントムによる基礎的検討および体表血管腹部血管の血流量の検討-

従来提唱されている超音波による血流量計測法とは異なった新しい測定法を確立させることを目的に以下の研究を行った。これまでの超音波を用いた流量計測法では、信頼できる平均流速が求められないこと、血管の断面積を算出するのに用いられる径の計測誤差が大きいこと、また流量に換算するには一定の数を乗ずる必要があることなど、流量計測法としては大きい問題点があった。本研究で用いる手法は、これらの問題点がを解決できるだけでなくこれまで超音波検査の長所である非侵襲的性をあわせもつ。流速計測には、超音波カラードプラ法の血流信号を用い、各フレームにおいて血管断面に任意に設定した直線の流速プロファイルを作成し、時間積分することで、単位時間または1心拍分の流量を求める手法である。この手法の精度を検討するためにを実験ファントムによる流量との検討、犬を使った電磁流量計の血流との検討に加え、誤差が10%程度であり、計測法として十分な信頼性があることを確認した。生体での検討では次の様な結果をえた。まず門脈血流の流速プロファイルについては、その形態がパラボリックでなくフラットであること、肝内血管のなす角度により最大流部が変化すること、次にヒト頚動脈を用いてそのずり応力の測定を行い、血管壁近傍において大きい応力がかかることを確認した。ヒト正常者の末梢血管・腹部の血流量の平均値は門脈本幹で820ml/min、腹部大動脈1238ml/min、頚動脈504ml/min、膝窩動脈127ml/minであった。従来提唱されている超音波による血流量評価法とは異なった、新しい血流測定法を確立することを目的とし、本年度は以下の研究を行った。これまでの方法では、信頼できる平均流速が求められない点、血管の断面積を算出するのに用いられる血管径の計測が正確でないこと、また流量に換算するには一定の係数を乗ずる必要であるなど、流量計測法としては大きな問題点があった。本年度中には、カラードプラ法を用いて流量を計測する装置の作製・手直し、実験ファントムによる検討、イヌを使った実際の血流との比較、ヒトでは流量を実験的に計測すること、流速分布についての検討を行い、以下の結果を得ることができた。その結果は、装置については市販の装置を改良することで短時間に結果が得られるような装置ができた。透析に用いるポンプを用いた実験的な結果では、ポンプの流量を100mlから300mlまで変化させたところ、ポンプによる流量測定と本手法を用いた流量計測値はy=0.886x+22.1と非常によい一次相関(r=0.999)を示した。次にイヌの腸骨動脈の流量と電磁流量計を用いて比較したところ、ファントム実験と同様に非常によい相関を示し、y=0.905x+1.75(r=0.996)となり良好であった。これ以外に、ヒトについては門脈の流速プロファイルを測定し、そのプロファイルの形がパラボリックではなく、最高流速部が平たんなフラットな流れであることが解った。従来提唱されている超音波による血流量計測法とは異なった新しい測定法を確立させることを目的に昨年度に続き以下の研究を行った。これまでの超音波を用いた方法では、信頼できる平均流速が求められないこと、血管の断面積を算出するのに用いられる径の計測誤差が大きいこと、また流量に換算するには一定の数を乗ずる必要があることなど、流量計測法としては大きい問題点があった。昨年度の、実験ファントムによる流量との検討、犬を使った電磁流量計の血流との検討に加え、本年度は以下の3つについての結果を得ることができた。まず門脈血流については、その流速プロファイルがパラボリックでなくフラットであること以外に、肝内血管のなす角度により血管の外寄りに最大流速を有するもの、また逆に内寄りに最大流速部が存在するものが認められた。すなわち動脈だけでなく門脈もその解剖学的構造によりその流速プロファイルが変化することがわかった。

次に、頚動脈を対象とした流速プロファイルを検討することによりずり応力の測定を行い、血管壁近傍において大きい応力がかかることを確認した。これは心拍動に伴ってその大きさが変化するため、これまで生体で十分に検討されていなかったずり応力について、超音波を用いることで非侵襲的な検討が可能であった。ヒト正常者を対象に、末梢動脈血流を計測したが、平均値は門脈本幹で820ml/min、腹部大動脈1238ml/min、頚動脈504ml/min、膝窩動脈127ml/minであった。なお、これらのデータはこれまで他の手法を用いて報告されているものと似た値であった。
タンパク質の局所配列・構造情報に着目した機能予測法の開発

本研究では、アミノ酸配列情報および構造情報の局所部分の一致の数に着目して、タンパク質間の類似度をネットワークのように定義する方法を、新たに構造未知のタンパク質に適用することで、アミノ酸配列だけからタンパク質の機能予測を行う新しい方法の開発を行った。まず、局所構造の両端のα炭素原子間の距離をその局所構造の「端間距離」と定義し、予測2次構造情報と配列プロファイル情報を入力とし、予測端間距離を出力する、サポートベクタ回帰をベースとしたツールを開発した。これを、さまざまな立体構造を含むタンパク質群に適用したところ、ループ長が短いところから長いところまで、予測端間距離と実際の端間距離がよく相関することが明らかになった。とくにループ領域については、これまでβターンなど、端間距離が短いものについては、アミノ酸配列と立体構造との関係性についてさまざまな研究がなされていたが、端間距離が長いものについては研究例が少なく、本研究によって、端間距離が長くなるようなアミノ酸配列傾向がとらえられたことは、局所配列が局所構造を制限し、結果として、タンパク質のフォールディングにおいて、立体構造全体の構造空間がかなり大きく制限されている可能性を示唆する興味深い結果である。また同様の解析を、複合体形成によってディスオーダーからオーダーへ転移することが知られているタンパク質領域に適用したところ、オーダー領域ほどではないが、ランダムよりもよい予測が可能であることが明らかとなった。この局所構造の端間距離予測ツールと、配列一致検出ツール、および2次構造予測ツールを組み合わせたタンパク質機能予測ツールを開発し、その性能を確認することができた。平成19年度は、構造未知のアミノ酸配列について、局所配列情報からフラグメントの局所構造情報を予測する新たな方法の開発を行った。最終的に機能予測につなげるためには、構造情報としてできるだけ淡いものを利用した方が、機能類似のタンパク質ごとの構造バリエーションに対応できると考え、予測する構造情報としてフラグメントの両端間距離を利用することにした。また、構造がある程度決まっているヘリックスやストランドよりも、それ以外のフレキシブルなループ領域の構造情報が有用であると考えられるため、予測精度はとくにループ領域に着目することとした。タンパク質構造全体の類似のために局所的な配列・構造が類似する効果をのぞくために、ASTRALデータベースからSCOPのFold代表ドメイン構造を取得した。そして機械学習Support Vector Machine(SVM)を用いた端間距離予測器を構築した。SVMへの入力には、5,9,17,33残基幅の位置特異的アミノ酸置換行列を利用し5-fold cross validationを行った。その結果、ループ領域における端間距離の予測と実際の間の相関係数は、それぞれのウィンドウ幅で0.486,0.502,0.449,0.377であり、ループ端間距離が短いものから長いものまで全体的に予測可能であることが示された。また同様の解析を、複合体形成によってディスオーダーからオーダーへ転移することが知られているタンパク質領域に適用したところ、9残基幅において相関係数は0.484であり、オーダー領域ほどではないが、明らかにランダムよりもよい予測が可能であることが明らかとなった。これによりディスオーダータンパク質についても、本研究で構築を目指す機能予測システムが利用できる可能性が示された。本内容は日本生物物理学会第45回年会にて発表した。平成20年度では、まず前年度に構築したフラグメント端間距離予測システムの精度のさらなる評価を行った。アミノ酸配列からのタンパク質立体構造予測の真のブラインドテストであるCASP8のターゲットのうち、配列類似の既知構造テンプレートがないものについて、予測精度を求めたところ、これまでの見積りと同程度の精度が得られていることが確認できた。次に、システムと2次構造予測情報の組み合わせを試みた。フラグメント端間距離予測システムに、新たな入力として。PSIPRED(McGuffin et al.2000)による2次構造予測結果を加え、端間距離予測精度の変化をみた。その結果、ループ領域においては数%から10数%程度、全領域でみたときには20%以上の性能向上がみられた。

この結果を受けて、フラグメント単位で配列プロファイル情報の類似、2次構造予測結果の類似、端間距離予測結果の類似から、構造類似度を定義し、類似フラグメントの数を数えることで、タンパク質間あるいはフォールド間の構造類似度を計算するツールを開発した。配列プロファイルの類似度には、よい性能を示す報告が多い相関係数を用いた。さらに、構造類似と機能類似の関係を解析するために、2つのタンパク質の間の機能類似度をGene Ontology(GO)をもとに計算するツールを開発した。機能類似度の定義は、両者で共通するGOキーワードの出現確率をもとにした方法を採用した。そしてこれらのツールを統合し、既存のフォールドの問の機能・立体構造の類似度を求めてネットワーク構造を構築した。最終的に、未知のアミノ酸配列を入力として、その配列の既知フォールドとのフラグメントでの予測構造類似をもとに、求めたネットワーク構造の上に入力配列を置き、機能予測を行うためのシステムの構築に成功した。
脂質・糖・骨代謝異常と歯周病との共通遺伝子・修飾要因の解明および疾患モデルの構築

閉経後の女性を対象に、ADRB、PPARgamma、およびIL-6-572には歯周病との間に相互作用があるか評価した。歯周病マーカーを従属変数に、遺伝子多型および関連要因と伴に独立変数に設定しポアソン分析で評価した。BMIが25以上では歯周病マーカーに対するADRBのPRRsは0.13-0.70、PPARgammaのPRRsは0.66-3.14であった。これら2つの遺伝子多型の相互作用項のPRRは1.69-12.61 (p<0.0001-0.329)であった。IL-6-572Gのアレルを持っていない対象者では、BMDが低いグループで有意にPPD≧4の部位の割合が高かった。肥満や糖尿病、骨粗鬆症罹患患者における、脂質代謝、糖代謝、および骨代謝のそれぞれの異常が歯周疾患の発症および進行に対する影響を明確にすることで、歯周疾患の発症および進行に対する臨床基準を示し、国際的ガイドラインの構築を目指している。本調査では、この基盤を確立するため、40歳以上の成人を対象にし、(1)脂質、糖、骨代謝および歯周疾患に関連する共通遺伝子多型の解明、(2)遺伝子多型の発現に対する喫煙、栄養摂取状況の修飾程度の解明、(3)肥満、糖尿病、骨粗霧症および歯周疾患を加えた関連疾患の多角的発症およびその進行モデルの構築、を目的としている。今年度、β3アドレナリン受容体遺伝子と歯周疾患の病態との関連について肥満状況を踏まえながら評価した。6575歳の閉経女性339名を対象とした。日中、食後6時間以上が経過した状態で採血を行った。HbA1Cおよびβ3アドレナリン受容体遺伝子を測定およびタイピングを行った。また、身長と体重からBMIを測定した。半口腔法に基づき口腔診査を実施し、現在歯数、およびクリニカルアッタッチメントレベル(CAL)を測定した。BMIレベルに基づき対象者を選定した後、多重ボアソン分析を実施し、Incidence-rateratio(IRR)を測定した。その際、6mm以上のCALの部位数を従属変数に、β3アドレナリン受容体遺伝子のタイプ、年齢、HbA1C、および現在歯数を独立変数に採用した。その結果、BMIが25以上でβ3アドレナリン受容体遺伝子のタイプと6mm以上のCALの部位数とのIRRは明確に上昇し、BMI30以上ではIRRは20.4(p<0.0001)であった。このことから肥満者においてはβ3アドレナリン受容体遺伝子のタイプと歯周病の病態には正の関連があることが示された。肥満および歯周病に関連する遺伝子として、IL-6-572、およびbeta-3 adrenergic receptor遺伝子多型を用い、それぞれの疾患への影響度、および環境要因としてBMIや骨密度を考慮した場合の相互作用について評価した。その結果、IL-6-572 GGに対しCCにおいて、アレルの保有群と非保有群を比較すると、低BMD群(健康な30代なBMDの80%より低いグループ)において、Cアレル保有群は有意にPPD≦4mmの割合が大きかった。年齢・遺伝子多型・血清中のアルブミン量で調節後、多重回帰分析を行うと、low BMDと歯周病の間に有意差が見られた。Cアレルの保有群と非保有群を比較すると、低BMD群(健康な30代なBMDの80%より低いグループ)において、Cアレル保有群は有意にPPD≦4mmの割合が大きかった。また、BMIで<18.5、18.5-25.0、>25.0の3群で分けた後、それぞれの値をカットポイントとし、ポアソン分析によりprevalence rate ratio (PRR)を算定した。その結果、BMIが25以上の集団では、Beta-3 adrenergic receptorと6mm以上のClinical attachment levelの部位数には正の関連が認められた。またその関連はBMIの増加と共に顕著となり、BMIが30以上ではPRRは3.10であった。IL-6-572遺伝子多型が、歯周病やBMDとの間に単独で関係している事は示されなかったが、歯周病とBMDの疾患間に修飾因子として働いているかもしれない。また、Beta-3 adrenergic receptorと歯周病との関係には肥満が関連していることが考えられた。つまりそこにはgene-environmental interactionが生じていると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。