hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト骨肉腫細胞株HOSの産生する巨核球分化誘導因子の純化と遺伝子クローニング

HOS細胞培養上清中の巨核球分化誘導因子活性については、20Lの培養上清を調整し、純化を試みたが、精製過程を重ねると活性が分散し、未だ最終段階まで到達していない。そこでHOSとは別に、我々の研究室で樹立された未分化甲状腺癌細胞上清中に存在する同様な活性の純化に目標を切り替えた。KHM-5MはPCRで解析するとIL-6を産生している。そこで正常マウス骨髄非付着非貪食細胞の液体培養系でのAChE活性誘導を指標に、IL-6以外の活性を追跡した。無血清培養上清35Lを濃縮後、6Mグアニジン塩酸で溶解し、90%エタノール沈殿を行った。沈殿物を遠沈除去後、上清に残存する活性をRP-HPLCで精製した。IL-6よりも高濃度のアセトニトリルで溶出される活性画分をさらに二段階精製し、最終的に22kDaの純化標品を得た。SDS-PAGEゲルの切り出し実験で、AChE誘導活性分布と蛋白のピークは完全に一致したが、N末端アミノ酸配列を解析した結果、IL-11と確認された。しかしKHM-5Mの培養上清にはIL-11以外にも正常巨核球の分化誘導活性が認められたので、さら実験を続けた結果、新規蛋白の単離に成功した。詳細は投稿準備中だが、3段階の精製後、TSK-G300SW-XLによるゲル濾過で単一の活性ピークを示し(図4)、泳動ゲルの切り出しで活性は主蛋白バンドと一致した。そこでSDS-PAGEゲルから蛋白をPVDF膜に転写し、N末端20個のアミノ酸配列決定に成功、現在までに知られていない全く新しい蛋白と判明した。巨核球刺激因子(megakaryocyte stimulator,MKS)と仮称しているが、単独でマウス巨核球のAChE活性を誘導し、巨核球のploidyを高め、さらにmpl-リガンドとは相乗的に働く、これらのデータは全て、投稿準備中である。巨核球系造血では、mpl-リガンドが、非常に特異性が高く強力な因子として注目を浴びている。今回我々が純化したMKSが生理的な血小板産生にどの程度の役割を果たすのかは今後の課題である。現在遺伝子クローニングが進行中だが、成功後には、直ちに受容体の探索にとりかかるべく準備中である。
ウシ初代培養細胞への遺伝子導入による脂肪細胞分化の誘導とその解析

脂肪細胞分化の制御に関わる転写因子C/EBPファミリーおよびPPARγを使い、黒毛和種牛の筋肉および脂肪組織由来の初代培養細胞に対して遺伝子導入を行うことで脂肪細胞分化の誘導を試み、これによりウシC/EBPファミリーおよびPPARγの脂肪細胞分化のおける機能を検討するとともに、筋肉組織内で起こる脂肪細胞分化の制御機構を明らかにすることを目的とした。今年度は、昨年度作製したウシC/EBPα・β・δおよびPPARγ発現ベクターのうち、C/EBPβ発現ベクターをウシ筋肉組織由来の初代培養細胞に導入し、ウシC/EBPβを恒常的に発現する細胞の樹立を試みた。C/EBPβ発現ベクターをリポソーム法によりウシ初代培養細胞に導入し、抗生物質G418により導入遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞を選択し、ウシC/EBPβを恒常的に発現する細胞を樹立した。ウエスタンブロット解析では、樹立した細胞がC/EBPβを発現していることが確認された。この細胞に対し脂肪細胞への分化誘導を行い、Oil-Red Oによる脂肪染色および脂肪細胞のマーカーであるGPDH活性の測定を行ったが、形態的にも生化学的にも脂肪細胞への分化を観察することはできなかった。C/EBPβはマウス胚由来の脂肪前駆細胞株や線維芽細胞株に対して脂肪細胞分化を誘導することが報告されており、今回の結果はこれらと異なる結果となった。今年度は、既にクローニングしているウシC/EBPα・β・δおよびPPARγの翻訳領域をCMVプロモーターの下流に組み込み、動物細胞での発現ベクターを作製した。これらの発現ベクターが機能を持つ転写因子タンパク質を発現するかどうかを、Cos-1細胞への遺伝子導入実験により検討した。ウエスタンブロット解析では、ウシC/EBPα・β・δおよびPPARγの各発現ベクターを導入した細胞において、それぞれの特異抗体によりシグナルが検出され、目的のタンパク質が発現していることが確認された。またC/EBPα・β・δについては、C/EBP結合配列を持つleptinプロモーターを挿入したレポータープラスミドとの遺伝子導入実験により・これらの発現ベクターが標的遺伝子の転写を活性化することも確認した。さらに、ウシ初代培養細胞への遺伝子導入法を検討し、リポソーム法により導入が可能であることも確認した。現在、ウシC/EBPα・β・δおよびPPARγ発現ベクターを導入したウシ初代培養細胞由来の細胞株の樹立について検討している。
室内環境ストレスの総合評価に関する研究

本研究の目的は、複合環境を評価する適切な総合的な評価規準(共通の尺度)を設定し、各要因の影響を定量的に明らかにすること,及び異なった評価規準に対する環境条件の影響を比較することである。実験は男子・女子学生を被験者に用い、日常の室内環境として想定しうる環境条件(室温、夏期22,26,30,34°C冬期10,15,20,24°C:騒音40,50,60,70Leq(A):照度170,700,1480,1xの組みあわせ48パターン)を与えて行なった。実験時間を90分とし、この間に40分の単純作業を含めた。被験者は作業終了直後にアンケート用紙に室内の総合的な"不快感"の申告(3段階)を記入した。実験は男女とも3年間行ない合計2145のサンプルを得た。申告と環境要因の関係をクロス表と数量化理論2類を用いて分析した結果、以下のことが明らかになった。1.建築室内における室温・騒音・照度の複合環境は、総合的"不快感"に対し加算的に影響を与える。但し、ある要因のストレスが著しく大きければ他要因と無関係に"不快"になり、厳密には加算的ではないが、実用的には加算モデルは有効である。また、実際の複合環境条件に対する評価の予測を行なうために判別区分点を求め、評価の予測と環境設計への適用の方法がしめされた。2.実験要因以外の要因として、性別・性格・外気温と室温との差をとりあげて検討した結果、これらの要因も申告(評価)に有意な影響を与えることが明らかになった。しかし、その大きさはそれほど著しいものではなかった。3.環境の評価規準としての主観的な"不快感"と単純作業の作業成績とは明らかに異なる評価規準であるが、それぞれについて環境条件が与える影響が異なることが実験的にしめされた。このような指適は一般論としては多いが、実証的なデータは多くないので、本研究の重要な成果の一つと言える。
ESR年代測定法を用いた泥火山の形成プロセスの解明

泥火山現象に対して,地下空間の有効利用や地球温暖化ガスの把握などのために,近年地球科学的な調査が実施されている.北海道道北にある上幌延泥火山の噴出年代を調査するために,電子スピン共鳴(ESR)年代測定法を,泥火山噴出物に対して適用した.電気探査やボーリング調査,化学分析,ESR測定を実施し,泥火山現象に対するESR年代測定法の適用性を確認することができ,今後の泥火山研究に貢献できる成果が得られた.本研究では,電子スピン共鳴(ESR)を用いた年代測定法を,泥火山噴出物に適用することを挑戦的な課題として掲げ,地下水やガスの分析を通して,地下深部のリザーバーの形成プロセスの解明を行うことを目的としている.対象は,北海道北部に位置する上幌延泥火山である.平成26年度は,上幌延泥火山の泥質堆積物の地下での分布状況を把握するために,電気探査を行った.本研究では比抵抗法を用いた.これは,地層を構成する物質の比抵抗の違いに着目し,人工的に外部から地盤に電流を流し,このとき発生した電位を測定し,地下の地盤状況などを把握する方法である.最初に,沼地を中心として90mの側線を2本,70mの側線を1本測量し,二次元比抵抗探査を行った.結果の解析は,有限要素法を用いた逆解析によって行った.その結果,解析が可能な深度約50m程度まで約5Ωmの低比抵抗の地盤が分布していることが分かった.そこで次に,先の結果の検証も兼ねて,2点において比抵抗法垂直探査を行った.その結果は,概ね二次元探査の結果と整合的であった.なお,電気探査の実施にあたっては,私有地の使用,河川の占用,国有林への入林などの許可申請を適切に行った.本年度はまた,遊離ガスや地下水の採取・分析を行った.ガスについては,メタンと二酸化炭素の溶存ガス量やそれらの炭素同位体組成,メタンの水素同位体組成の分析を行った.また,地下水中の一般水質分析と微量成分についての分析,酸素・水素同位体組成の分析を行った.その結果,本地域の深度1000m未満の浅部の複数点から得られているガス組成や地下水組成とは異なる結果が得られた.これらの結果は,ガスや地下水もまたより地下深部から湧出していることを示している.本研究では,電子スピン共鳴(ESR)を用いた年代測定法を,泥火山噴出物に適用することを挑戦的な課題として掲げ,地下水やガスの分析を通して,地下深部のリザーバーの形成プロセスの解明を行うことを目的としている.対象は,北海道北部に位置する上幌延泥火山である.これまでに,電気探査を行い,上幌延泥火山の泥質堆積物の地下での分布状況の把握を行った.電気探査は,90mの側線を2本,70mの側線を1本用い,二次元比抵抗探査を行った.その結果,解析が可能な深度約50mまで約5Ωmの低比抵抗の地盤が分布していることが分かった.また,遊離ガスや地下水の採取・分析を行った.平成27年度は,前年度の電気探査の結果を受けて,ボーリングを行った.ボーリングの掘削長は予算の都合上20mであるため,電気探査の結果からは,基盤岩に到達することは難しいことが予想された.そのため,最も低比抵抗部が分布する領域を対象にしてボーリングを行った.得られたコア試料を用いて柱状図を作成した.深度4-5mあたりで比較的硬い泥岩が算出したが,それ以深は概ね未固結の泥砂であり,流動性の高い状態であった.コア試料の60箇所から試料を採取し,含水比試験,全岩組成分析,鉱物組成分析を行った.これらの結果,泥質堆積物の組成は一様に分布していないことが明らかになった.また,砂質のコア試料1mから石英粒子の抽出を行った.通常のESR測定では,250&#181;m程度の粒径の石英試料が得られれば十分であるが,本研究では極細粒の試料も必要とするため,化学処理を極力さけなければならない.また,限られた時間内に作業しなければならないため,まずは石英試料の抽出法の検討から行った.その結果,水洗い,磁力分離,重液分離によって,ESR分析に堪えられる石英粒子の純度を得られることが分かった.H26年度は,物理探査(電気探査)の実施後に,その結果を用いて掘削長20m程度のボーリングを行い,ESR測定用の試料採取を行う予定であった.しかしながら,ボーリングの実施業者の都合により,2014年11月までにボーリングを実施することが出来なかった.12月から翌年の5月頃までは,現場を含め周辺は雪に覆われてしまうため,調査が行えない.そのため,ボーリングによる試料採取については,翌年(2015年)の6月に実施した.コア試料を用いたESR分析は,10月ころに一通り終えたが,その他の分析は翌年(2016年)の1月頃までかかった.予定していた学会発表に間に合わないことや,ESR分析を十分に実施する時間がなかったことから,これらを次年度へ遅らせることとした.泥火山噴出物とは、非火山性地域において泥火山現象により地下深部の物質が地上へと放出された泥質堆積物である。上幌延泥火山は、砂質成分を多く含むことが特徴である。

本研究では、石英中に蓄積された格子欠陥に起因する電子スピン共鳴(ESR)信号を測定することで、石英が地下深部の比較的高温環境から地表部へと放出された年代を測定することを狙いとしている。本研究では特に、ESR信号の成長曲線を用いた通常の年代測定法の他に、被曝線量が石英の粒径に依存することを応用したアイソクロン年代測定法を適用することが挑戦的であり、萌芽である所以である。泥質堆積物が分布する数十m四方の領域に対して、比抵抗電気探査を行い、泥質堆積物の空間分布を推定した。その結果、泥質堆積物は少なくとも深度50m程度までは一様に分布していることが明らかになった。掘削長20mのボーリング調査を実施し、コア試料(泥質堆積物)を採取した。コア観察の結果、泥質堆積物は、固結した泥岩様の岩片や粘土層、様々な礫、砂などが互層をなしていることが分かった。コア試料から60点の試料を採取し、化学組成および鉱物組成を測定した。その結果、化学組成は比較的一様であり、続成作用により形成される沸石鉱物が普遍的に認められることから、これらが地下深部からもたらされたものであることを確認した。コア試料から比較的砂質成分を多く含む層を3層選び、それぞれの試料に対して、次の様な前処理を実施し、石英粒子のみを抽出した:試料の水洗い、塩酸および過塩素酸による処理、篩い分け、磁力選鉱機による長石類との選別。得られた石英試料の一部に対して、ガンマ線照射を行い、ESR信号の測定を実施した。その結果、通常のESR年代測定では約0.6-0.2 Maの年代が得られた。アイソクロン年代測定では、約0.3 Maの年代が得られ、両結果が整合的であることが確認された。泥火山現象に対して,地下空間の有効利用や地球温暖化ガスの把握などのために,近年地球科学的な調査が実施されている.北海道道北にある上幌延泥火山の噴出年代を調査するために,電子スピン共鳴(ESR)年代測定法を,泥火山噴出物に対して適用した.電気探査やボーリング調査,化学分析,ESR測定を実施し,泥火山現象に対するESR年代測定法の適用性を確認することができ,今後の泥火山研究に貢献できる成果が得られた.物理探査(電気探査)の実施後に,その結果を用いて掘削長20m程度のボーリングを行い,ESR測定用の試料採取を行う予定であった.しかしながら,ボーリングの実施業者の都合により,2014年11月までにボーリングを実施することが出来なかった.12月から翌年の5月頃までは,現場を含め周辺は雪に覆われてしまうため,調査が行えない.そのため,ボーリングによる試料採取については,次年度へ遅らせることとした.平成28年度5月中に,これまでの成果を整理し,学会発表として投稿する.ボーリングコアの複数箇所から石英粒子を抽出し,ガンマ線照射を行う一般的なESR年代測定を行う.また,同時に,本課題のテーマである石英粒子の粒径によるESR信号強度の違いに着目したアイソクロン年代測定法についても試みる.その成果を,まとめ,論文として投稿したい.地球化学平成27年度6月中にボーリングによる試料採取を行い,7月9月にかけてESR測定を行う.環境放射能の見積もりについては,原位置に線量計を設置することが困難であるため,岩石試料の化学分析によるUやTh,Kの含有量の分析結果を用いて計算によって求めることにする.試料の採取については,試料の産状が全く未定であるため,まずはボーリング試料の観察による柱状図作成をしっかりと行った上で,試料採取箇所を決定する.採取した泥・砂試料は,化学処理と篩い作業を行い,石英粒子のみを抽出し,さらに粒径ごとのフラクションに分ける予定である.
自己組織化膜法を利用した高配向導電性高分子の電解合成

本研究結果より、表面を自己組織化膜で修飾しないで良質のpoly(N-methylaniline)膜が得られることがわかった。得られた膜は本テーマに関連して、独特の球状のモルフォロジー(ミクロスフィア)である。ミクロスフィアはドラッグデリバリーシステムやカプセル化、医療用画像等の応用に利用できる。そこで、ミクロスフィアの形成に関して詳細な研究を行った。ミクロスフィアは化学重合法と電解重合法によって得られた。電解重合によるミクロスフィアの形成は、電極、ドーパントアニオンおよび置換基の性質や、ドーパントアニオン濃度のような幾つかの条件に依存した。一方、電位の掃引速度、モノマー濃度および重合時間によってミクロスフェアのサイズを制御することが可能であった。ミクロスフェアの形成はオリゴマーカップル重合によって説明できた。また、化学重合によって多量のミクロスフェアを得ることができた。アジピン酸のような有機酸を使用すると、過塩素酸のような無機酸を使用した場合よりも良質のミクロスフェアを作製できた。この手法では、ミセルの生成がミクロスフェアの形成に重要な役割を果たしていることがわかった。さらに本テーマに関連して、電解重合で得られた置換ポリアニリンの移動度に間する研究を行った。この結果については既に二つの国際雑誌に掲載されている。さらにもう一報の論文を投稿中である。ドーパントアニオンとしてHClから作ったPoly(N-methylaniline)膜はp-aminothiophenolの自己組織化膜で被覆した金基盤により強く付着することが示された。一方で、剥き出しの金電極上には、ドーパントアニオンにClO_4^-やBF_4^-を使ってドープしたPNMA膜を得ることが出来た。これは導電性のマイクロ球を形成することがわかった。モノマー濃度が0.8Mの溶液から、電位掃引速度50mVs^<-1>で12サイクル成長させたマイクロ球の平均直径は1.9μmであった。マイクロ球の大きさは掃引速度やモノマー濃度、サイクル数など、幾つかの実験パラメータを変化させることで制御できる。高分子化を行うために異なる酸を用いたが、HClO_4とHBF_4のみがマイクロ球を形成することが出来、HNO_3やH_2SO_4、HClでは粒状やサンゴ状の形態が観察された。アニリン環のN-位のアルキル基が大きくなると、マイクロ球の成長を阻害する傾向が見られた。マイクロ球の形成はおそらく、オリゴマーが繋ぎ合わせられる高分子化過程を通して起こっているのだろう。この結果は日本化学会年会で発表され、すでに調査報告書を国際雑誌に投稿中である。
MOCVD法による強誘電体簿膜の高速大面積成長とメモリ等のデバイスへの実用化研究

強誘電体不揮発性メモリーの実用化に向けて、MOCVD法によるチタン酸ジルコン酸鉛(Pb(Zr,Ti)O_3;PZT)を始めとする強誘電体薄膜の高速大面積成長ならびにその特性の評価を行った。68インチウェハ上にPZT薄膜の堆積を試み、組成分布±1.1%、膜厚分布±1.2%の均質な薄膜を得た。しかし、バブリングによる原料供給での成膜速度は415nm/minであり、量産化には十分とは言えない。電気的特性に関しては、Ir電極を用いることで分極反転疲労特性は改善されるが、Ir膜厚が薄く(23nm)なるとその効果が薄れることを見出した。特性が改善された膜においてはPZT/Ir界面にPb-Irアモルファス層が生成されており、それが拡散抑止層として働いているのではないかと推察した。IrO_2/Ir/PZT/Ir/IrO_2構造とすることで更なる特性の改善が確認された。また、MOCVD原料の純度と強誘電特性との関係について検討し、純度99.995%の原料を用いた場合よりも純度99.9999%の原料を用いた方が、分極反転疲労特性、リーク電流特性、絶縁破壊特性のいずれにおいても優っていることを示した。PZT薄膜のサイズ効果については、膜厚が200nm以下となると特性が劣化する傾向が見られたが、膜厚の減少とともに粒径も変化しているので、両者の効果を分離することはできなかった。そこで、下部Ir電極を変えることでほぼ同じ膜厚のPZT薄膜の粒径を制御することに成功し、粒径の効果についてのみ分離し検討した。その結果、粒径が150nm以下あたりから残留分極量の劣化が始まることを明らかにした。疲労特性やインプリント特性の原因としては、膜中の酸素空孔等の欠陥が電界や自発分極によって移動し、界面や粒界でトラップされて空間電荷分布を形成することによりヒステリシスのシフトや残留分極の低下が起こるとの結論を得た。強誘電体不揮発性RAMは、1Mbit以下のものに関してはIDカード等の特定用途向けにすでに実用化されつつあるが、不揮発性でありながら高速書き込み、低電圧駆動、低消費電力が期待できることから、さらなる高集積化が期待されている。強誘電体不揮発性RAMの研究が始まった当初から問題にされていた分極反転疲労やリ-ク電流の問題は、現在試作や市販されている製品では対応策がほどこされているわではあるが、それらの物理はまだほとんど理解されておらず、1Mbitを越す高集積強誘電体不揮発性RAMの実現には上記物性の解明が必要不可欠である。そこで本研究では、強誘電体薄膜の分極反転疲労特性およびリ-ク電流特性に焦点をあて、その物性理解を目的とした研究をおこなった。強誘電体材料としては、代表的な強誘電体であり、すぐれた強誘電性を持つジルコン酸チタン酸鉛(Pb(Zr,Ti)O_3:PZT)を用いた。薄膜作製は高集積化、大面積成長に対応可能なMOCVD法にて行い、電気的特性の評価は面内の各測定点について系統的に行った。

熱刺激電流法によるPZT薄膜のトラップ電荷の測定から、疲労過程においてドメインをピニングしている欠陥トラップから放出された電荷によるものと思われる電流を確認した。この結果から、疲労現象を説明するモデルとして′′ドメインピニングモデル′′が有力であることが示唆された。一方、電流電圧特性の温度依存性およびポーリング方向依存性から、PZT薄膜の電気伝導機構への分極の関与が示唆された。われわれは分極が電極との界面付近の低誘電率層に発生させると思われる反電界を考え、測定された試料温度120°C以上での電流電圧特性を説明した。以上の結果から、薄膜の面内および積層方向の均質性や純度が重要となることが示唆され、今後の課題として薄膜作製プロセスのさらなる技術革新が挙げられる。強誘電体不揮発性メモリーの実用化に向けて、MOCVD法によるチタン酸ジルコン酸鉛(Pb(Zr,Ti)O_3;PZT)を初めとする強誘進体薄膜の高速大面積成長ならびにその特性の評価を行った。68インチウェハ上にPZT薄膜の堆積を試み、組成分布±★%、膜厚分布±1.2%の均質な薄膜を得た。しかし、バブリングによる原料供給での成膜速度は4l5nm/minであり、量産化には十分とは言えない。電気的特性に関しては、Ir電極を用いることで分極反転疲労特性は改善されるが、Ir膜厚が薄く(23nm)なるとその効果が薄れることを見出した。特性が改善された膜においてはPZT/Ir界面にPb-Irアモルファス層が生成されており、それが拡散抑止層として働いているのではないかと推察した。IrO_2/Ir/PZT/Ir/IrO_2構造とすることで更なる特性の改善が確認された。また、MOCVD原料の純度と強誘電特性との関係について検討し、純度99.995%の原料を用いた場合よりも純度99.9999%の原科を用いた方が、分極反転疲労特性、リーク電流特性、絶縁破壊特性のいずれにおいても優っていることを示した。PZT薄膜のサイズ効果については、膜厚が200nm以下となると特性が劣化する傾向が見られたが、膜厚の減少とともに粒径も変化しているので、両者の効果を分離することはできなかった。そこで、下部Ir電極を変えることでほぼ同じ膜厚のPZT薄膜の粒径を制御することに成功し、粒径の効果についてのみ分離し検討した。その結果、粒径が150nm以下あたりから残留分極量の劣化が始まることを明らかにした。疲労特性やインプリント特性の原因としては、膜中の酸素空孔等の欠陥が電界や自発分極によって移動し、界面や粒界でトラップされて空間電荷分布を形成することによりヒステリシスのシフトや残留分極の低下が起こるとの結論を得た。
ラボディスクのハイスループット単一細胞発現遺伝子プロファイリングへの応用

本研究ではハイスループットに細胞を単一分離するためのラボディスクを考案、作製し、これを用いて、サルモネラ菌やヒト白血球T細胞株(Jurkat Cell)を単一分離し、これらの細胞が有する遺伝子や、発現遺伝子をPolymerase Chain Reaction(PCR)や逆転写PCR(RT-PCR)法によりラボディスク上で増幅する方法を開発した。実際に単一分離、遺伝子増幅されたサルモネラ菌やJurkat Cellの細胞をラボディスク上で、蛍光プローブを用いて検出できることを示した。検出された蛍光シグナルは細胞数に応じて変化しており、遺伝子量を反映していることが明らかとなった。本研究では、これまでに当研究室で開発したハイスループットに細胞懸濁液からの単一細胞分離を行うことができるdisk上で、単一細胞の発現遺伝子を確認する手法を確立することを目的とし、マイクロ流路および集積化したチャンバーを設けたdiskを作製した。発現遺伝子を確認する方法としてはRT-PCRを用いて、mRNAの発現を測定する事を考えた。Disk上に中心から周縁に向かって遠心力で液体が流れるようにジグザグ型の流路を設け、この流路に沿って1流路あたり、313個のチャンバー(容積約1.5nl)を配置したものをシリコン基板に作製した。このdiskを用いてサルモネラ菌、Jurkat cell(ヒト急性白血病T細胞)の細胞懸濁液を単一細胞に分離し、そのままRT-PCRを行うことによって遺伝子の発現確認を試みた。サルモネラ菌について、固有遺伝子のinvAのRT-PCRを試みた。増幅産物の蛍光プローブにSYBR greenを用い、チューブ中でRT-PCRを行ったが、遺伝子の増幅は見られなかった。同じ熱サイクル条件では、ディスク上でも、チューブ中でもPCRはされていたことから、原核生物ではmRNAとDNAの配列が同じであるため、RT-PCRによってmRNAだけの発現を調べる事は難しいことが示唆された。Jurkat cellに関しては、温度(72°Cまたは95°C)や界面活性剤により細胞の壊れる条件を確定した。また逆転写活性をもつ耐熱性PolymeraseのTth Polymeraseを使用することで、チューブ内で細胞から直接Human GAPDH mRNAを逆転写しPCRによって増幅・検出することをワンステップで行うことに成功した。そこでJurkat cellについてdisk上で分離後、RT-PCRによる検出を試みたが、検出のために用いた蛍光発色物質のSYBRGreenではゲノムDNAからも蛍光がでてしまい、単一細胞から発現したmRNAのみを確認することができなかった。しかし、細胞からのワンステップでのmRNAの発現確認方法は確立できているので、発現したmRNAの増幅産物のみをターゲットとできる蛍光プローブを使用することで単一細胞からの発現遺伝子の検出の可能性が示唆された。本研究では、ハイスループットに細胞懸濁液からの単一細胞分離を行うことができるdisk上で、単一細胞の発現遺伝子を確認する手法を確立することを目的とし、マイクロ流路および集積化したチャンバーを設けたdiskを作製しているが、本年度はチャンバーの位置を自動読み取りできるように修正したdiskを設計し、シリコン基板とガラスで作製した。発現遺伝子を確認する方法としてはRT-PCRを用いて、m-RNAの発現を測定する事を考えた。このdiskを用いJurkatcell(ヒト急性白血病T細胞)の細胞懸濁液を単一細胞に分離し、そのままRT-PCRを行うことによって遺伝子の発現確認を試みた。Jurkat cellは、界面活性剤を加えなくても、95°Cで加熱するだけ細胞膜が損傷し、細胞内にあるm-RNAを逆転写できた。また逆転写活性をもつ耐熱性PolymeraseのTth Polymeraseを使用することで、チューブ内で細胞から直接Human GAPDH m-RNAを逆転写しPCRによって増幅・検出することをワンステップで行うことに成功した。さらに、本年度PCR産物を蛍光で確認するために、増幅産物に結合すると蛍光を発するDouble Dyeprobeを使用したところ、増幅に伴う蛍光の増加が確認された。さらにdisk上でPCRを行う反応条件として、polymeraseの濃度、アニーリングの温度、反応時間などを検討し、最適条件を得た。この条件下で、disk上でRT-PCRを行ったところ、2040サイクルで蛍光強度の大きな増加がみられた。Jurkat Cellを単一分離できる濃度条件で、RT-PCRを行ったところ、細胞が入っていないチャンバーと、細胞が単一分離されているチャンバーでの蛍光強度分布の差が有意に認められ、disk上で単一細胞からRT-PCRできることが示された。本研究では、ハイスループットに細胞懸濁液からの単一細胞分離を行うことができるdisk上で、単一細胞の発現遺伝子を確認する手法を確立することを目的とし研究している。

昨年度確立した、Jurkat Cell発現遺伝子を本disk上でRT-PCRする方法に基づき、流路に10-400cells/mlの濃度の細胞をRT-PCR試薬とともに、1流路に1μLづつ流し、1流路に約300個あるマイクロチャンバーに細胞を単離したのち、加熱による細胞膜損傷、GAPDHm-RNAの逆転写反応、PCR(40サイクル)を行い、Double Dye probeを用いて、各チャンバーでの蛍光強度の増加をイメージングアナライザによって測定した。蛍光強度が増加したチャンバーの数は、細胞濃度の増加に対応して、増加した。また、各濃度において、1流路でチャンバーに捕捉される細胞数と、蛍光強度が増加したチャンバー数の相関関係を調べたところ、相関係数0.96の正の相関関係が得られ、単一細胞中の発現遺伝子が本研究で用いたマイクロ流路上で、検出できることが確認された。この成果を、2011年9月にサンフランシスコで開催されたsingle cell analysis summitで発表しBest Presentation賞を授与された。また、Analyst誌に論文として投稿し、受理された。この論文では、我々が考案した単離細胞からm-RNAを抽出する操作を行わず、加熱、温度変化のみで細胞膜破壊からRT-PCRを行う方法をHot Cell Direct RT=PCR法として提案し、この方法が認められた。さらに、イメージングアナライザでは、蛍光画像の取得方法の限界から、高い精度での測定ができないため、蛍光顕微鏡で流路上のチャンバーの蛍光画像を取得し、個々のチャンバーの蛍光強度を得られたイメージから数値化する方法について検討を進めている。
工科系学生のための語句拡張方式による英作文CAI教材の研究開発

「工科学生のための語句拡張方式による英作文CAI教材」の研究開発を、平成7年度の1年間にわたって行った。Part1「語句拡張方式による英作文問題」(設問数12ユニット×20題=240題)を、変形生成文法理論を参考にし、作成形式としては「文法事項型」に拠って作成し、プログラミングを終えた。しかし、Part1のプログラミング作業の際に、1つの問題点が生じて、当初予定していたPart2「総合英作文問題」(応用問題)のプログラミング作成が、困難となった。その問題点とは、学生による英作文問題の学習が英文そのものとしてではなくて、番号(番号付きの語句が与えられていて、番号を並び変えることによって日本語の文を表す英文を作る形式になっている)によってなされる可能性があるということである。ある英作文問題を行った学生が他の学生にその問題の答え(番号)を教えるという事態、あるいは、学生がある英作文問題を再度行った場合に、前回に行ったときの答え(番号)の暗記やノートでの書き写しといった事態が起こる可能性が十分ある。実際に、このような場合には、学生の英作文の学習の効果は薄弱となる。それ故、プログラミングにおける工夫の必要が起こった。検討した結果、番号の付いた語句を時間の経過とともに「乱数的に」変化させる(答えも、その変化につれて異なったものになる)操作をPart1のプログラミングに加えることにした。このため、アルバイト学生の時間的労働的な制約から、Part2の作成が困難となった。このPart2の作成に関しては、今後の研究開発として実現を図りたいと考えている。なお、「工科学生のための語句拡張方式による英作文CAI教材」(Part1基礎編)の研究開発の成果を冊子として作成し、各方面からの意見を聞く予定である。
中世前期における記録文学の生成と展開

本研究によって、研究発表1件、図書(単著)1点、図書(共著)1点、論文(単著)5点、論文(共著)1点を公表した。本研究では、中世前期(平安時代末鎌倉時代)における、記録と文学の関係及び記録が文学となるプロセスや歴史的必然性について、『方丈記』『発心集』『源家長日記』などの作品を手掛かりとして、分析・論究を行ってきた。事実の「記録」とされてきたものに、虚構である「文学」の視点を導入して分析することで、その「記録」が環境に要請される目的のために様々な趣向を凝らし、表現を選び、意図的な操作を行っていることを解明することができた。文学・歴史双方の分野に対して、新たな知見を提出できたと考えている。本年度は、当初、平成26年度以降に予定していた内容を織り込み、『源家長日記』の注釈作成・『方丈記』の作品研究・『発心集』(神宮文庫本)の注釈作成を軸として研究を進めた。『源家長日記』については、前半部についての注釈をまとめ、『源家長日記試解』という形で注釈書を作成し、関係各所に配布した。現在は私家版であるが、全体の注釈を終えた後に公刊化を図る。『方丈記』の作品研究においては、論文「『方丈記』論ー作品成立の場と享受圏をめぐってー」(「中世文学と隣接諸学」NO.10『中世の随筆ー成立・展開と文体ー』、竹林舎、平成26年度上半期刊行予定)を執筆した。本論は、和文の「記」である『方丈記』が、大学寮紀伝道の文章博士の世襲家であった日野家の文化圏との関わりの中で成立したことを解明し、和文の「記」というジャンルの作品がどのような必然性の下に生み出され、享受されるのかという歴史的な様相を提示したものである。『発心集』(神宮文庫本)は、巻3・4の注釈作業を行った。次年度以降、残る巻1・2・5の注釈を続ける予定である。また、これら『方丈記』『発心集』を読み解くために欠かせない作品である鴨長明の『無名抄』について、雑誌論文「鴨長明の和歌観ー『無名抄』「式部赤染勝劣事」「近代歌躰」からー」(『中世文学』58号)を発表した。さらに、このような研究成果を一般に発信する試みの一つとして、鈴木健一編『千年の百冊』(小学館)において、『方丈記』他6点の古典作品の概要・読みどころなどを紹介した。本年度は、特に『発心集』と『方丈記』についての作品研究を進めた。『発心集』については、「『発心集』の泣不動説話」(『清心語文』16号、2014年9月)において、『発心集』板本・神宮文庫本に載る泣不動説話を取り上げて分析し、『発心集』の意図を明らかにした。泣不動説話は三井寺という特定の宗教空間の内部で発生し、それが宣伝とともに外部に流布したものであり、その流布の過程において説話の形態に様々な変化が見られる。そのような泣不動説話の文学史の中に『発心集』を位置付けると、以前のものに比べ、母子の情愛に説話の焦点が結ばれていることが明らかであり、それは筆者長明の意図的な改変あるいは選択だったと考えられる。さらに、『発心集』のような形の泣不動説話が成立する背景については、同時代に一世を風靡した安居院流の唱導が母の恩愛を重視する説法を行っていたこととの関連を指摘した。『方丈記』については、「『方丈記』の辻風」(鈴木健一編『天空の文学史雲・雪・風・雨』、三弥井書店、2015年2月)を著し、治承四年(1180)4月に平安京を襲った辻風(=竜巻・旋風)を取り上げて、作中における風の表現から、平安から鎌倉時代へ移り変わる激動の時期と荒ぶる風の関係を考察した。とある事件や災害の記録が、人々の記憶の中で時代を象徴するものへと成長し、それがどのように表現されるのかを解き明かすものである。また、これらの論考や昨年度までの研究成果も併せて、単著『鴨長明研究ー表現の基層へー』(勉誠出版、2015年3月)を出版した。本年度は、最終年度に当たるため、これまでの研究成果を論文・発表として公表することに重きをおいた。昨年度までの研究成果の一つとして、『源家長日記』の注釈を作成していたが、これをもとに、論文「『源家長日記』と始発期の後鳥羽院像」(『国語と国文学』93巻4号、2016年4月)を発表した。本論文は、『新古今和歌集』の成立過程や後鳥羽院歌壇の様相をうかがう重要な資料として位置づけられてきた『源家長日記』について表現分析を行い、作品の性質・文学史的意義を考察するものである。従来、後鳥羽院歌壇における重要な和歌の催しに関する記述で筆者の記憶違いや誤りと考えられてきたものは、同時代に共有された表現史をもとにした意図的な虚構であり、そのような操作が行われた必然性は、治天の君としての後鳥羽院像の造型と院の聖代を言祝ごうとする目論見にあることを明らかにした。

また、『発心集』については、「『発心集』蓮華城入水説話をめぐって」と題した研究発表を行った(国際日本文化研究センター共同研究会「説話文学と歴史史料の間に」、2016年3月)。『発心集』板本・神宮文庫本に収載される「蓮華城」という出家者の入水について、古記録(『顕広王記』『百練抄』)の記事と比較分析を行い、史実上の蓮華城入水がいかにして説話化・文学化されるのかを追った。蓮華城の入水は安元2年(1176年)8月15日に敢行されたが、当時、かなり衝撃的な事件として人々に記憶された仲秋の名月の日の集団入水であったにも関わらず、『発心集』はそれを意図的に捨象し、入水往生失敗譚として再構成を行っている。本研究の核となるテーマである「記録」と「文学」の関係に直結するもので、事実や事件が文学となるに際し、どのような焦点化が行われ、また捨象が行われるのかという現場を明らかにしたものである。本研究によって、研究発表1件、図書(単著)1点、図書(共著)1点、論文(単著)5点、論文(共著)1点を公表した。本研究では、中世前期(平安時代末鎌倉時代)における、記録と文学の関係及び記録が文学となるプロセスや歴史的必然性について、『方丈記』『発心集』『源家長日記』などの作品を手掛かりとして、分析・論究を行ってきた。事実の「記録」とされてきたものに、虚構である「文学」の視点を導入して分析することで、その「記録」が環境に要請される目的のために様々な趣向を凝らし、表現を選び、意図的な操作を行っていることを解明することができた。文学・歴史双方の分野に対して、新たな知見を提出できたと考えている。本年度は、『方丈記』『発心集』の研究を大きく前進させ、論文のみならず、単著という形で公表することができた。また、『源家長日記』については、すでに作成した注釈書(私家版)をもとに、論文の投稿を待機している。以上の理由により、研究の進捗状況としては、おおむね順調であると考えられる。人文学平成27年度は、『高倉院厳島御幸記』『高倉院昇霞記』に焦点を当てて、表現分析をもとに作品の方法・構想を明らかにする。これらの作品については、歴史史料との比較を通して、行事・体験といった出来事が、和文の「記」という作品形態に変容していく様相を掬い取ることが可能である。出来事が記録という次元を超えた表現性や象徴性を獲得して和文の「記」になる様、それを生み出す作者の構想や時代性を、「記」を作り上げる言葉・表現から読み解いていく。本年度の研究においては、当初予定していた『安元御賀記』と『高倉院厳島御幸記』『高倉院昇霞記』を翌年度以降に持ち越したが、その代わりに、26年度以降に予定していた『方丈記』『発心集』の研究を大きく進展させることができた。また、『源家長日記』の注釈に関しては、研究予定通り順調に進み、私家版ではあるが注釈書を作成することができている。以上の理由により、研究の進捗状況としてはおおむね順調であると考えられる。平成26年度は、本年度からの研究を継続して、『発心集』(神宮文庫本)の注釈作業を進め、同書に関する論文の執筆・投稿を行う。また、25年度から持ち越しとなった『安元御賀記』『高倉院厳島御幸記』『高倉院昇霞記』については、表現分析を行い、作品の方法・構想を明らかにすることで、和文体の「記」が同時代にどのように生成していったのかという文学史の動態の解明につなげる。
レジームコンプレックスとしての国際漁業資源管理：意思決定要因と有効性分析

高度回遊魚のマグロの乱獲問題に対して、国際社会はどのように対応しているのか。特に、刺身マグロ(大西洋クロマグロ、太平洋クロマグロ、ミナミマグロ)やカツオを大量に消費する日本の対応はどうなのか。世界の五大地域漁業管理機関による同魚種の保全管理に関した本研究による実態調査の結果、資源状態が比較的良好であるうちに適正な漁獲量規制を行うことが、持続可能は漁業にとって不可欠であることが明瞭になった。初年度から研究対象である主な地域漁業管理委員会の年次会合に、正式なオブザーバーとして出席することができ、加盟国等による当該地域の資源管理の現状と今後の取り組みに関する審議を傍聴できた。南マグロ保存委員会(CCSBT)の年次会合では、親魚資源の現状に対する懸念を多くの参加国が表明し、管理計画に予防的な措置を導入する必要が指摘された。他方、遵守監視業務増加に見合うだけのスタッフがいないことや協力的非加盟国が漁獲量の報告などをほとんどしていない、という現状に対する懸念も表明された。また、中西部太平洋マグロ類委員会(WCPFC)では、EU、米国、日本等がマグロ類の保全向ために漁業規制を求める一方、フォーラム漁業機関(FFA)を形成する南太平洋諸国は自国の発展のために漁業資源の主権的開発権を主張している状況を具に観察することができ、今後の研究にとって貴重な知見を得ることができた。また、基本的に2ヶ月に1回以上の研究会を開催して、理論的な枠組みの整理や各委員会に関する知識を習得した。まず、ウェブスターの理論を解説し、その欠点が明らかになったこと。例えば、一人あたりGDPではなく、別の指標が適切であること;消費国と輸出国の区別をしていないこと;CPUE(旋網と延縄の区別)を使った方がよさそうなことなど。また、制度間相互連関に関しては、オーバーチュア=ゲーリングの分析枠組みのRFMOsへの適用可能性を検討し、因果経路の分類の修正、蓄積効果が同定できない欠点、ノンレジームが相互連関を発現させる可能性があること、などが指摘できた。また、大西洋マグロ類委員会(ICCAT)全米マグロ類委員会(IATTC)などの外交資料なども収集が進んだ。さらに、国際的機関や国際的制度レジームの相互連関に関する研究も進んだ。本年度の研究の成果の一部は、学会で報告されるとともに学術誌に掲載された。本年度の研究目的は、「脆弱性反応モデル」の本格的適用、有効性を説明する理論モデル、因果経路に関するプロセストレーシングによる考察、脆弱性反応モデルの概念枠組みの修正案の構築、制度間相互作用の管理に関する分析などである。脆弱性反応モデルの適応に関しては、南まぐろ保存委員会(CCSBT)と中西部太平洋まぐろ類委員会(WCPFC)の北委員会に関して、両委員会での参与観察と報告書の熟読によるプロセストレーシング方法によって、詳細に検討を加えた。また、脆弱性反応モデルの概念枠組みに修正を加えた上で、中間報告論文を国際関係学会(ISA)で報告した。これらの一連の作業を通して、主要漁業国についての脆弱性反応モデルの独立変数(競争力と柔軟性)では、研究対象主要国の最近の行動が説明しきれないことが判明した。その背景には養殖の世界的拡大とグローバル経済化の進展に伴い、特に外国船員の雇用に関する国内規制の強弱と国内市場のサプライチェーンが、主要国の国際漁業管理政策に影響を与える独立変数として重要であることが明らかになりつつある。さらに、有効性の理論の精緻化作業の一環として、地球環境ガバナンス研究における今日に至るまでの研究成果をテーマとした国際的な協同作業企画に参加し、「有効性概念」の発展について小論文にまとめた。また、有効性を問題特性と問題解決能力により説明する既存のモデルを用いて南極海洋生物資源保存委員会(CCAMLR)の有効性を評価し、ISAで報告した。制度間相互作用に関しては、ある国際制度における非行動が他の制度のもとでの行動を引き起こす相互作用の形態をサメ類と鯨類の事例分析に基づき指摘したほか、制度間の不整合や齟齬に対するアクターの調整行動を相互作用の管理の視点を用いて分析し、環境政策・経済学会でシンポジウムを企画し報告した。本年度の研究目的は、「脆弱性反応モデル」の修正案、すなわち「逆脆弱性反応モデル」の理論化の試み、有効性を説明する理論モデルの構築の試み、因果経路に関するプロセストレーシングによる考察の継続、制度間相互作用に関する分析などである。逆脆弱性反応モデルの適応に関しては、南まぐろ保存委員会(CCSBT)と中西部太平洋まぐろ類委員会(WCPFC)の北委員会に関して、両委員会における参与観察と報告書の熟読によるプロセストレーシング方法によって、詳細に検討を加えた。この研究の中間報告的論文を国際関係学会(ISA)で報告した。これらの一連の作業を通して、本研究の理論的モデルは、脆弱性反応モデルでは説明できない、200海里の排他的経済圏(EEZ)制度以降の主要漁業国の行動を説明できるようになった。前年度の研究実績とも関係するが、養殖の世界的拡大と経済のグローバル化の進展と国内の規制官庁との関係、特に外国船員の雇用に関する国内規制の強弱と巻網とはえ縄などの漁具の違いも漁業資源状況に大きな影響を与えていることも、主要漁業国の行動を説明する要因として重要であることが明らかになった。本年度の研究目的は、太平洋クロマグロとミナミマグロを中心として「逆脆弱性反応モデル」の理論の精緻化、有効性を説明する理論モデルの精緻化、因果経路に関するプロセストレーシングによる考察の継続、制度間相互作用の管理に関する分析などである。

逆脆弱性反応モデルの適応に関しては、昨年度同様、ミナミマグロ保存委員会(CCSBT)と中西部太平洋まぐろ類委員会(WCPFC)の北委員会に関して、両委員会における参与観察と報告書の熟読によるプロセストレーシング方法によって、詳細に検討を加えた。本研究の中間報告的論文、定量的な有効性分析の枠組みに関する報告、また、全米熱帯マグロ類委員会(IATTC)に関する管理保全政策の歴史的変遷を、8月にドイツのフランクフルトで開催された世界国際関係学会(WISC)で報告した。また、研究の広報活動に類する活動として、これまでの同研究の成果報告会である「マグロの資源管理ガバナンスー国際的管理の現状と到達点ー」というセミナーを本年度末(平成27年3月)に早稲田大学で開催した。漁師、水産業者、元水産庁の高官、水産資源研究所の研究員、マスコミ関係者、国際法学者などの参加を得て、研究報告後に活発な意見交換ができて有意義なセミナーとなった。本年度は本研究の最終年度であるため、過去5年間の研究成果を様々な機会を通じて発表することを主な目的としつつ、今後の研究の発展に向けてセミナーやワークショップを開催した。まず、本研究成果の広報のためにウェブページを完成させた。研究方法については、本年度においても、本研究が対象とする地域漁業管理委員会(RFMOs)における参与観察を行いつつ、各RFMOsの公式文書を精査するというプロセストレーシングの方法に基づいて、レジームの有効性評価に関する定性的研究も行った。また、特に、本年度の研究では太平洋クロマグロを巡る日本の資源管理の問題点について多くの知見が得られて、調査研究の成果の出版や業界紙などの紙面で同問題に関する客観的な記事の連載なども行った。今後の研究の発展の方向性を探るために、2016年1月に、本国際漁業ガバナンス研究グループと国際漁業法研究グループの合同セミナーを開催した。同セミナーのための講演者として、専門家を招聘して、日本の漁業法制、水産行政の特徴・問題点および今後の課題等について検討した。このセミナーでは、今後の研究の発展のために、国内の政治過程と国内法の形成・実施過程の研究が不可欠であることを認識した。さらに、本年度の研究を通して、養殖の世界的拡大と経済のグローバル化の進展に伴い、サプライチェーンの拡大と深化が国内の規制官庁の規制に内容に影響を与えること、また、外国船員の雇用に関する国内規制の強弱と巻網とはえ縄などの漁具の違いも漁業資源状況に大きな影響を与えていることも、主要漁業国の行動を説明する要因として重要であることを再確認した。最後に、2016年3月に国際漁業資源管理に関する国際的な研究ネットワークを形成するために、この問題を研究する諸外国の第一人者とともに国際ワークショプ(於アトランタ)を開催し、今後の国際的な共同研究の方向性を探った。高度回遊魚のマグロの乱獲問題に対して、国際社会はどのように対応しているのか。特に、刺身マグロ(大西洋クロマグロ、太平洋クロマグロ、ミナミマグロ)やカツオを大量に消費する日本の対応はどうなのか。世界の五大地域漁業管理機関による同魚種の保全管理に関した本研究による実態調査の結果、資源状態が比較的良好であるうちに適正な漁獲量規制を行うことが、持続可能は漁業にとって不可欠であることが明瞭になった。
ErbB1/ErbB3のヘテロ二量体化に着目した新規抗がん活性ペプチドの創製研究

本申請では、ErbB1/ErbB3のヘテロ二量体化に着目した新規抗がん活性ペプチドの創製を提案した。以前、ErbB1の二量体化アームをミミックした環状ペプチド(1)がErbB1の自己リン酸化を阻害すること、また、細胞内に取り込まれることを明らかにしている。本年度は、1ErbB1ホモ二量体を標的とした二価結合型リガンドの創製、また、2ErbB1陽性がん細胞選択的な細胞内送達に着手した。細胞膜上に発現しているErbBsの二量体構造に対して、適切な受容体間の距離を保つリンカー構造を有するリガンドが阻害剤として機能するかどうかはこれまで明らかにされていなかった。そこで、peptide 1を剛直かつ長鎖なポリプロリンリンカーで架橋した二価結合型リガンドを設計・合成した。ErbB1自己リン酸化阻害活性を評価した結果、プロリン15残基から成るリンカー構造を有する場合に阻害活性が上昇した。この結果より、適切なリンカー構造を有する二価結合型リガンドはがん細胞膜上のErbBsの二量体構造を標的とした阻害剤になりうることが示された。また、siRNAによるErbB1のノックダウン実験により、peptide 1の細胞内移行量とErbB1の発現レベルの間に正の相関関係が見られたことから、ErbB1に対する選択性が確認できた。アポトーシス誘導ドメイン(PAD)ペプチドは細胞膜透過性とがん細胞特異性の欠如によりその使用に限界があった。そこで、PADペプチドとpeptide 1とをプロテアーゼで切れるリンカーを介して連結させた分子を設計した。ErbB1陽性がん細胞A549を用いて、細胞生存率を評価した結果、有意な増殖抑制作用が確認された。一方、PADペプチド単独では、影響は見られなかった。これらの結果から、peptide 1はErbB1陽性がん細胞選択的な細胞内送達分子として有用なツールであると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
血管形成術後の再狭窄に対するDNA/RNA合成阻害剤による治療法の開発

経皮的血管形成術が成功しても、その約3ヶ月後に30-40%の患者に血管再狭窄が生じることは、患者の良好な予後を阻んでいる大きな問題である。再狭窄の中心的な病態は、内皮細胞および血管平滑筋の増殖であり、その増殖作用をもつ原因物質として、fibroblast growth factor(FGF)、vascular endothelial growthfactor(VEGF)、などの関与が重要であると考えられているが、最近、血管内皮由来の強力な収縮物質であるエンドセリン(endothelin)の役割の重要性が報告され注目されている。血管狭窄モデルとして、くも膜下出血後に遅発性に生じる脳血管攣縮と類似した実験モデルを使用し、エンドセリンmRNAの発現の変化をRT-PCR法で検討し、RNA合成阻aドキソルビシンの投与が血管狭窄を実際に予防し、エンドセリンのRNA発現も抑止しているか、を検討した。ラットの大腿動脈の血管狭窄は、血液を周囲におおった7日後(Day7)には、対照の血管径の約60%にまで狭窄した。病理学的検索では、平滑筋細胞の増殖が認められた。ドキソルビシンを0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kgの3種類の容量にふって、Day1にだけ腹腔内投与したところ、明らかな容量依存性をもって血管狭窄を抑制し、0.06mg/kgでは効果を示さなかったが、0.2mg/kgでは、対照の約90%に狭窄を軽減し、0.6mg/kgでは完全に血管狭窄を抑止した。RT-PCR法による解析では、エンドセリンのmRNA発現はごく微量のためか、狭窄血管のみに発現が示され、ドキソルビシンの投与は、エンドセリンのmRNAの発現を抑止した。以上の結果は、エンドセリンが血管狭窄の病態に役割を果たしており、RNA合成阻害剤の投与が狭窄の抑止に有効であることを示している。経皮的血管形成術の後に生じる再狭窄には、fibroblast growth factor(FGF)やvascularendothelial growthfactor(VEGF)をはじめ幾つかのペプチドが強く関与している可能性が報告されてことから、我々は、RNA合成阻害剤であるアントラサイクリン系抗癌剤のアドリアマイシンを用いて、動物モデルにて再狭窄が実際に抑制できるか検討を行った。ラットの大腿動脈の血管攣縮モデルにおいて、アドリアマイシンが0.6mg/kg腹腔内投与で血管攣縮を完全に抑制することを確認し、その後、両薬剤が同じ容量でendothelin-1(ET-1)の血管における過剰発現を完全に抑制することをRT-PCRで確認した。続いて、ラットの総頚動脈において、内皮をバルーンカテーテルにて剥離し血管再狭窄を起こす実験モデルを使用し、アドリアマイシンの効果を検討した。内皮の剥離は総頚動脈の右側のみとして、左側は無処置としてコントロールに用いた。アドリアマイシンは0.6mg/kgを、手術直後と7日後に腹腔内投与し、動物を14日後に環流固定した。左右の血管内腔径を計測し、血管再狭窄の程度を狭窄側の対側コントロールとの比(%)で表わすと、無治療群では55.3±15.6%(n=6)の狭窄を来したのに対して、アドリアマイシン治療群では78.6±23.0%(n=6))と狭窄を有意に抑制した(P<0.05)。RT-PCRにて、ET-1の発現を検討したところ、無治療の狭窄側の血管にはET-1の発現が認められたが、アドリアマシンの投与で、その発現が消失していた。以上の結果は、ET-1も血管内皮、平滑筋の増殖に作用し再狭窄の原因の一つとなっている可能性と、RNA合成阻害剤が再狭窄に対する治療薬として臨床応用できる可能性を示唆している。血管再狭窄の病態には、内皮細胞および血管平滑筋の増殖が関与しており、vascularendothelial growthfactor(VEGF)等の因子(タンパク)が増殖を誘導していると考えられている。DNAおよびRNA両方の合成阻害作用を持つアントラサイクリン系抗癌剤アドリアマイシンは、ラット総頚動脈を用いた血管再狭窄モデルにて、再狭窄を有意に抑制し、エンドセリン-1など少量のmRNA発現はほぼ完全に抑制しているが、βアクチンなど大量のmRNA発現は全く抑制できないことをRT-PCR法にて確認した。続いて、アドリアマイシン以外のアントラサイクリン系抗癌剤として、RNA合成阻害作用のみが強いアクチノマイシンD、DNA合成阻害作用をもちつつRNA合成阻害作用がアドリアマイシンよりl0倍強いとされるアクラルビシン、アドリアマイシンと向様のDNA/RNA合成阻害作用だが心毒牲が弱いファルモルビシン、さらにDNA合成阻害作用のみが強いマイトマイシン、RNAから夕ンパク合成の過程での阻害剤シクロヘキシミド、の再狭窄抑制効果をラット総頚動脈モデルにて検討した。薬剤は手術直後と7日後に腹腔内投与し、14日後に検討した。再狭窄の抑制効果は、アクラルビシンが一番優れ、続いてアドリアマイシン、ファルモルビシン、アクチノマイシンDと続いた。マイトマイシンは殆ど効果無く、また、サイクロヘキシミドは個体差が大きく、再狭窄が抑制されている動物と効果が全くない動物とばらつきが多かった。以上の結果は、血管再狭窄の病態には、何らかの因子の過剰発現を介した細胞増殖が生じており、DNA合成阻害は有効でなく、RNA合成阻害剤により、原因となる何らかの因子の発現を抑制することが最も効果的であることを示している。