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再生核理論の応用と工学的・医学的問題への新展開

我々の開発した再生核理論とチホノフの正則化理論の融合理論をもちいて,いくつかの逆問題に挑戦し,具体的な解の計算アルゴリズムを構築し,その有用性を確認した.特に医学的問題に対し新しいアプローチを行った.具体的には,医学的な分野では(細胞画像による形態解析の研究)2編の論文と3件の学会発表を行い,数学的な分野では(一般化された再生核を積分方程式の解法に応用する研究,再生核理論の立場からのゼロ除算の研究)9編の論文と18件の発表を行った.本研究課題の目的は我々のこれまでの数学としての再生核の研究成果をさらに工学・医学における具体的な問題レベルにまで展開して,工学,医学,産業界等に寄与することである.この課題に関連して,平成26年度より群馬大学医学部の松崎利行教授(生体構造学),廣村桂樹准教授(生体統御内科学)との共同研究を開始した.これは腎臓糸球体上皮細胞の走査電子顕微鏡画像による形態解析を我々の理論と画像解析,パターン認識によって行おうとするものである.まだその成果が十分得られたとは言い難いが,2件の医学系学会において発表した.医学部の先生方の従来の主観的な議論とは異なり,新しい定量的な解析方法であるため,発表現場では若干奇異に思われた節もあるが,何人かの先生方には好意的に受け止められ,更に研究を進めて従来の医学界にはない方法論を打ち立てていただきたい,との励ましの言葉もいただいた.また,この発表をきっかけに,生体構造学の他の先生から蝸牛有毛細胞(音のセンサ細胞)の組織化過程についての共同研究を行いたいとの申し出をいただいている.このように,医学方面への拡がりは順調である.数学的な研究としては,一般化された再生核を積分方程式の解法に応用する研究を行った.この成果は平成27年度8月にマカオで開催される国際学会で発表する予定である.これは従来の再生核の定義(特徴付け)を若干拡げることにより,(我々は以前より再生核の積分方程式解法への応用研究は行っていたが)従来扱えなかった複雑な積分方程式の解法にも応用しようとするものである.この研究により,再生核の応用分野がさらに広がるものと考えている.さらに,これは副産物というべき研究であるが,一般のゼロ除算に関して再生核理論の立場から新しい解釈を得た.この研究については日本数学会において研究分担者が公表したが,まだ評価が定まっていない状況である.本研究課題の目的は我々のこれまでの数学としての再生核の研究成果をさらに工学・医学における具体的な問題レベルにまで展開して,工学,医学,産業界等に寄与することである.この課題に関連して,平成26年度より群馬大学医学部の松崎利行教授,廣村桂樹准教授と共同研究を開始した.これは腎臓糸球体上皮細胞画像による形態解析を我々の理論と画像解析,パターン認識によって行おうとするものであり,平成27年度には1編の論文とすることができた.また,平成27年度からは群馬大学医学部の向後晶子講師と蝸牛有毛細胞の組織化過程の定量化に関する研究を始めた.従来,組織化過程を示す細胞の収縮・伸長の計測は手作業でおこなっていたが,この方法は作業時間,結果の客観性に問題がある.我々は計算機による画像処理により作業の高速化・自動化,計測結果の客観性の保持を目指している.具体的には細胞膜形状のボロノイ線図による近似法をにより良好な結果を得て,向後講師が医学方面学会で報告済みである.数学的な研究としては,一般化された再生核を積分方程式の解法に応用する研究をおこなっている.その成果は平成27年度8月の国際学会にて公表された.これは従来の再生核の定義(特徴付け)を拡張することにより,これまで扱えなかった積分方程式の解法にも応用可能とするものである.この研究に関しては3篇の論文,2件の学会発表,著書1冊の発刊をおこなった.これら我々の研究により,再生核の応用分野がさらに広がったと考えている.さらに,ゼロ除算に関して再生核理論の立場から新しい解釈を得ることに成功し,その成果を日本数学会にて発表した.現在は関数論の分野においてゼロ除算の有用性を見出すべく考察を続けており,成果を英文論文誌や平成28年度の数学会にて発表予定である.このような活動を通じて,我々のゼロ除算は海外でも国内でも認知が広がりつつある.医学部との新たな共同研究は順調に進んでおり,蝸牛細胞の変成に関する定量的評価法に関しては,群馬大学・医学系研究科の向後晶子講師(研究代表者),松浦(研究分担者)らの「上皮細胞間ジャンクションの再編成におけるDLG1の機能解析」が科研費(C)として平成28年度から4年間認められることとなった.糸球体上皮細胞画像の解析に関しては,撮像状況,方向性の不均一に伴う画像の不鮮明さに起因する困難さをニューラルネットの「深層学習」によって打開しようとする試みも始めている.この研究に関しては1編の論文を公にすることができた.これらのことから,本課題の目的の一つである,我々の理論の医学的問題へ展開という観点から研究は順調に進んでいると考えている.数学的研究という意味では一般化再生核を考案するができ,再生核の応用範囲を拡げたという意味で,大きな成果があった.またゼロ除算についての成果(具体的事例による意味の解明)も徐々に得られており,学会における認知も進みつつある.

本研究課題の目的は我々のこれまでの数学としての再生核の研究成果をさらに工学・医学における具体的な問題レベルにまで展開して,工学,医学,産業界等に寄与することである.この課題に関連して,平成26年度より群馬大学医学部の松崎利行教授,廣村桂樹准教授と共同研究を開始した.これは腎臓糸球体上皮細胞画像による形態解析を我々の理論と画像解析,パターン認識によって行おうとするものであり,平成27年度には1編の論文とすることができた.また,平成27年度からは群馬大学医学部の向後晶子講師と蝸牛有毛細胞の組織化過程の定量化に関する研究を始め,細胞膜形状のボロノイ線図による近似法と深層学習を用いた細胞膜生成により良好な結果を得て,医学関連学会で2件の発表を行った.またこの課題ではH28年度からは新たな科研費(向後講師が研究代表者,松浦は研究分担者)が採択された.数学的な研究としては,一般化された再生核を積分方程式の解法に応用する研究をおこなっている.その成果は平成27年度8月の国際学会にて公表された.この研究は従来の再生核の定義(特徴付け)を拡張することにより,これまで扱えなかった積分方程式の解法にも再生核理論を応用可能とするものである.この研究に関して平成27年度には3篇の論文,2件の学会発表,平成28年度には3件の学会発表をおこなった.さらに我々の再生核理論研究の(数学的な)集大成としてSpringerから専門書(全452ページ)を出した.この著書はこの分野の今後のスタンダードとなると考えている.さらに,ゼロ除算に関して再生核理論の立場から新しい解釈を得ることに成功し,平成28年度は日本数学会にて5件の発表を行い,3篇の論文にすることができた.現在は関数論の分野においてゼロ除算の有用性を見出すべく考察を続けており,我々のゼロ除算は国内外で認知が広がりつつある.我々の開発した再生核理論とチホノフの正則化理論の融合理論をもちいて,いくつかの逆問題に挑戦し,具体的な解の計算アルゴリズムを構築し,その有用性を確認した.特に医学的問題に対し新しいアプローチを行った.具体的には,医学的な分野では(細胞画像による形態解析の研究)2編の論文と3件の学会発表を行い,数学的な分野では(一般化された再生核を積分方程式の解法に応用する研究,再生核理論の立場からのゼロ除算の研究)9編の論文と18件の発表を行った.医学部との新たな共同研究も開始することができ,成果も出始めているので,本課題の目的の一つである,我々の理論の医学的問題へ展開という意味では順調に進んでいると考えている.糸球体上皮細胞画像の解析に関しては,撮像状況,方向性の不均一に伴う画像の不鮮明さに起因する困難が伴い,まだ実質的な成果を得る手前の段階であるが,このことは当初の想定内のことである.数学的研究という意味では一般化再生核を考案するができ,再生核の応用範囲を拡げたという意味で,大きな成果があったと考えている.今年度は,(昨年度から成果が得られ始めた)蝸牛有毛細胞の組織化過程の共同研究をさらに進める予定である.また,糸球体上皮細胞画像の解析に関しても(計算機環境を整え)「深層学習」でどこまで正確な分類が可能かを確認したい.研究で得られた成果は積極的に医学系学会で発表して,医学者から見た評価を得たいと思う.
糖尿病罹患表皮角化幹細胞のクローナル・コンバージョン解析による創傷治癒能の評価

糖尿病を患うと創傷治癒は遷延する。さらに糖尿病が悪化して慢性腎不全になり血液透析が導入された末梢動脈疾患合併例の足(重症虚血肢)では、一層治癒が遷延する。本研究では同疾患の創傷治癒遷延に関して上皮化に焦点を当てて検討した。重症虚血肢と体幹の表皮角化幹細胞のコロニー形成能を測定することで細胞増殖活性を評価した。また表皮角化細胞の遊走能をライブイメージング可能な系で経時的に観察した。その結果、細胞増殖活性と遊走能は、重症虚血肢と体幹の間で明らかな相違はみられなかった。重症虚血肢の表皮角化幹細胞が体幹の幹細胞に比べて顕著なクローナル・コンバージョンを生じた可能性は低いと推察された。研究協力者の宮本(研究者番号:50725463)の施設(菊名記念病院)における倫理委員会承認のもと、同意を得た糖尿病患者より手術時に余剰となった皮膚を研究に使用した。採取した皮膚は組織運搬セット(株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング)内の組織運搬用チューブに清潔環境下で入れ、密封のうえ愛媛大学プロテオサイエンスセンターに輸送した。糖尿病患者の手術対象疾患は足壊疽だったため、手術の際の患部の消毒、滅菌操作だけでは、輸送中に残存する細菌が増殖するのではないかと懸念されたが全例で細菌感染による実験の中断にはいたらず研究遂行可能であった。臨床に用いる培養表皮シートは、切手サイズ程度の皮膚からGreenらの培養法[1]で作成される。しかし、今回の研究で採取可能な皮膚量は少なかったため、上記培養法で行われるトリプシン処理でのkeratinocytesの単離は困難であった。また、単離回収されたkeratinocytesの増殖も良くないことが判明した。そこでexplant法[2]を採用したところkeratinocytesの良好な単離、回収と増殖を確認した。単離・回収したkeratinocytesの増殖能をcolony forming efficiencytest[3]で検討したところ糖尿病足壊疽患者の足にもkeratinocytes stem cellsが存在することが明らかになった。平成27年度に単離・凍結保存したヒト表皮角化細胞を融解し、再度コロニー形成実験を行った結果、凍結保存前と同様に、糖尿病足壊疽患者の足の皮膚より単離された表皮角化細胞にも、増殖性の高い角化幹/前駆細胞が含まれていることが分かった。また、この培養系にアクチン・ミオシン骨格系を制御するRho-associated kinase (ROCK)の阻害剤を添加したところ、通常の角化細胞[1,2]と同様にコロニー形成能力や増殖能力が増加した。以上の結果は、創傷治癒能力が低下している糖尿病患者の表皮角化細胞においても、アクチン・ミオシン骨格系の制御によって創傷治癒能力を促進させることができる可能性[3]を示唆している。さらに糖尿病患者の体幹部と足壊疽部から単離した真皮線維芽細胞の増殖能力を調べるため、低酸素培養によるコロニー形成実験[4]を行った結果、足壊疽部の線維芽細胞から形成されるコロニーのサイズが小さい傾向が観察された。糖尿病足壊疽患者の足の皮膚より単離された表皮角化細胞を凍結保存しても、その性質が大きく変化することがなかったことから、これらの細胞を用いた細胞生物学的研究を推進できることが明らかとなった。またROCK inhibitorによって壊疽部の角化細胞の増殖が促進されたことから、糖尿病患者における創傷治癒の遅延は、角化細胞の不可逆的な増殖能停止によるものでないことが証明された。このことから、ROCK inhibitorなどのアクチン骨格を制御する化合物によって、糖尿病患者における創傷治癒の遅延を改善できる可能性がある。平成26年度と平成27年度に確立した手術の際に得た余剰皮膚を輸送し、その皮膚片より細胞を単離・培養する方法を用いることで、本年度、11例の重症下肢虚血患者の潰瘍部位より、表皮角化細胞を単離・培養することに成功した。また、同様の皮膚片より真皮線維芽細胞も単離・培養することにも成功した。単離された表皮角化細胞および真皮線維芽細胞を用いてコロニー形成実験を行った結果、これまで我々が行ってきた健常人のドナーから得られる表皮角化細胞や真皮線維芽細胞のコロニー形成実験と、ほぼ同じような結果が得られた。また1例では、潰瘍部位(足部)と正常部位(腹部)から、それぞれ表皮角化細胞と真皮線維芽細胞を単離・培養を行うことができたが、コロニー形成実験の結果、潰瘍部位と正常部位で、コロニーの形成率や大きさなどに顕著な差は見られなかった。以上の結果は、慢性潰瘍における創傷治癒の遅延の原因は、表皮角化幹細胞や真皮線維芽細胞の不可逆的な細胞特性の変化ではなく、周辺環境変化に対応した可逆的変化である可能性が示唆される。この場合は慢性潰瘍部位でも幹細胞などの再活性化が可能であり、新しい治療戦略の可能性が考えられる。一方で、今回の研究では、手術で得られた皮膚片全体より細胞を単離したが、創傷治癒の遅延した潰瘍の先端部位のみから細胞を単離した場合は、結果が大きく異なる可能性も考えられる。このような可能性も考慮しつつ、さらに詳細な研究が必要である。本年度は11例の臨床検体から、それぞれ表皮角化細胞および真皮線維芽細胞を単離・培養することに成功した。そのすべての細胞においてコロニー形成実験を行い、基本的な細胞特性の評価を行うことができた。

これまでの4例を加え、全15例の実験結果から、潰瘍部位の皮膚組織においても、角化幹細胞や増殖性の高い真皮線維芽細胞が保持されていることを明らかにした意義は大きい。平成26年度から28年度にかけて、計15例の重症下肢虚血患者の潰瘍部位より、表皮角化細胞、および真皮線維芽細胞を単離・培養することに成功した。また一部の患者では、健常皮膚より、同様に表皮角化細胞と真皮線維芽細胞を単離・培養することにも成功した。今年度は、これらの細胞を用いたコロニー形成実験の結果の比較検討を行った。その結果、やはり潰瘍部分の表皮角化細胞、および真皮線維芽細胞ともに、正常な皮膚から各々の細胞を単離し、コロニー形成実験を行った場合の結果と、大きく変わるところがなかった。さらに同一患者より、潰瘍部と正常部の両方の皮膚が得られた試料での比較においても、両者の差を検出することはできなかった。さらに、潰瘍部分皮膚を細胞培養用ディッシュ内に固定し、皮膚片から表皮角化細胞が遊走する過程のタイムラプス観察を行ったところ、角化細胞の活発な遊走が観察された。創傷治癒の遷延した潰瘍の先端部分を用いた実験はできなかったが、潰瘍周辺部分の表皮でも、十分な遊走能力を維持していることが明らかになった。以上の結果から、少なくとも潰瘍周辺部分の皮膚では、表皮角化細胞の増殖能および遊走能、また真皮線維芽細胞の増殖能について、不可逆的な低下は見られないと考えられる。潰瘍部位における創傷治癒の遷延は、潰瘍先端部位の細胞の不可逆的な機能低下の可能性を否定できないが、潰瘍部位の細胞外環境が表皮角化細胞や真皮線維芽細胞の可逆的な機能低下による可能性が示唆される。糖尿病を患うと創傷治癒は遷延する。さらに糖尿病が悪化して慢性腎不全になり血液透析が導入された末梢動脈疾患合併例の足(重症虚血肢)では、一層治癒が遷延する。本研究では同疾患の創傷治癒遷延に関して上皮化に焦点を当てて検討した。重症虚血肢と体幹の表皮角化幹細胞のコロニー形成能を測定することで細胞増殖活性を評価した。また表皮角化細胞の遊走能をライブイメージング可能な系で経時的に観察した。その結果、細胞増殖活性と遊走能は、重症虚血肢と体幹の間で明らかな相違はみられなかった。重症虚血肢の表皮角化幹細胞が体幹の幹細胞に比べて顕著なクローナル・コンバージョンを生じた可能性は低いと推察された。本研究を遂行するうえで最も困難が予想されたのは、糖尿病足壊疽患者の組織を輸送中に、残存する細菌が増殖するのではないかということであった。糖尿病足壊疽患者の手術では、周術期に感染を合併することが少なくないため[1]、細菌によるcontaminationによって実験の中止を余儀なくされることが懸念された。今回の実験システムで研究遂行可能であることが明らかになったことは意義深い。さらに研究に使用できる限られた皮膚量で実験を遂行するためのkeratinocytesの単離、回収法を確立できたことは、今後の研究を支障なく推進するうえで重要な成果と考える。保存された細胞を用いて、引き続き、糖尿病の体幹部と足部の表皮角化細胞の性質を、GTP結合型Rac1タンパク質の量や細胞内アクチン線維の配向性、運動能力の定量的評価などから明らかにしていく。また今年度明らかとなった体幹部と足部の真皮
新規ニッチへの進出能の違いを生む遺伝基盤

未開拓の新規ニッチへの進出は、新しい資源の利用を可能にし、その後の適応放散を誘導しうる。一方、新規ニッチに進出できなかった分類群も存在するが、新規ニッチへの進出能の違いを生む遺伝基盤は殆ど未解明である。新規ニッチへ進出できる系統とできない系統の違いは何であろうか?研究代表者らは、淡水進出して多様化を遂げた系統とできなかった系統を含む日本産トゲウオをモデル系としてこの問いに挑む。新しい環境への適応能が表現型多様性をうむ基礎にあるという仮説の検証を目指して、トゲウオ系統のクロマチン構造に着目する進化遺伝学的研究である。海水から淡水への適応に関係する遺伝子を網羅的に探索し、候補遺伝子およびクロマチン構造の多様性を系統間で比較することを計画している。クロマチン構造の違いが多様性の出現と維持に影響するという仮説は、明確かつ魅力的である。代表者らのチームはFads2遺伝子のコピー数が淡水進出への鍵となっていることをすでに発見しており、進化生物学の領域に新しく重要な進展をもたらすものと期待される。
有櫛動物の軸形成機構から見た後生動物の進化的起原に関する研究

本研究の目的は、放射相称動物であるクシクラゲ(有櫛動物)の軸構造を、特に消化器官の軸構造に焦点をあてて理解することである。前年度までに、クシクラゲからbrachyuryを含む5種類のT-boxファミリー遺伝子を単離し、それらの発現パターンをin situ hybridization法によって明らかにした。その結果、クシクラゲbrachyury(MlBra)は消化器官の一端である口陥(原口周辺)で発現することが分かった。そこで本年度は、MlBraの機能を調べるために、モルフォリノオリゴ(MO)による機能阻害実験を行った。MlBraの機能を阻害するMO(MlBra-MO)、又は、コントロールMOをクシクラゲ受精卵に顕微注入したところ、どちらの胚も後期原腸胚まで正常に発生した。しかし、MlBra-MO注入胚では、原腸形成終了直後に始まる予定口陥細胞の陥入が抑制された。この結果から、MlBraは口陥形成のための形態形成運動に機能していることが示唆された。近年、脊椎動物においてもbrachyuryの形態形成運動への関与が明らかになっている。そこで、後生動物の進化過程におけるbrachyuryの役割を明らかにするために、MlBraをツメガエル胚に導入する実験を行った。MlBraのドミナントネガティブ体(MlBra-EnR)をツメガエル4細胞胚の背側帯域に注入したところ、初期原腸胚までは正常に発生するものの、その後の原腸陥入は阻害された。同様の結果は、ツメガエルbrachyury(Xbra)のドミナントネガティブ体を注入した胚でも観察された。よって、MlBraはツメガエル胚の中でXbraと同じように機能することが明らかになった。以上の研究から、brachyuryの本来の機能は、中胚葉の形成ではなく、消化器官の形成に関わる形態形成運動の制御にあることが示唆された。本研究の目的は、放射相称動物であるクシクラゲ(有櫛動物)の軸構造を、比較分子生物学的手法、及び、実験生物学的手法を用いて理解することである。平成16年度は、クシクラゲ消化器官の軸構造を比較分子生物学的に解析することを試みた。左右相称動物において、腸形成に関わる分子はよく保存されている。そこで、このような腸形成に関わる分子のクシクラゲホモログを単離することを試みた。まず、それぞれの遺伝子に対するdegenerateプライマーを設計し、クシクラゲの原腸胚RNAを用いたRT-PCRを行った。その結果、t-box配列を持つ5種類の遺伝子断片(約430bp)が得られた。t-box配列の特徴から、そのうちの一つはクシクラゲbrachyury(bra)である可能性が示唆された。次に、得られた断片の配列をプローブにしてwhole mount in situ hybridizationを行ったところ、クシクラゲt-box遺伝子は、それぞれ特定のパターンで発現していることが分かった。特に、クシクラゲbraと考えられる遺伝子は、原腸胚の原口に発現した。braの原口での発現は、多くの左右相称動物や放射相称動物である刺胞動物においても報告されており、このことから、bra遺伝子が持つ本来の機能は、脊索の形成に関してではなく、原腸陥入などの形態形成運動にあると考えられるようになってきている。本研究の結果もこれを支持するものであった。また、環形動物や半索動物、棘皮動物においてbraは、腸の前方(前腸)と後方(後腸)に発現している。従って、クシクラゲbraの発現パターンをさまざまな発生ステージにおいて明らかにすることは、クシクラゲ消化器官の軸構造を理解するために重要であり、今後の課題である。また、腸形成に関わる他の分子についても単離し、braと同様に解析を進めたい。本研究の目的は、放射相称動物であるクシクラゲ(有櫛動物)の軸構造を、特に消化器官の軸構造に焦点をあてて、比較分子生物学的手法、及び、実験生物学的手法を用いて理解することである。前年度の研究において、クシクラゲからbrachyuryホモログと考えられる遺伝子断片を得たが、その断片は系統学的解析を行うために必要なT-boxドメインを完全には含んでいなかった。そこで、本年度は、その断片の5'末側と3'末側の配列をRACE法により解析し、T-boxドメインを含む全長配列を明らかにした(1679bp,433aa)。続いて、T-boxドメインの配列を用いて系統解析を行い、この遺伝子がT-box遺伝子ファミリーのbrachyuryサブファミリーに属することを明らかにした。whole mount in situ hybridization法による発現パターンの解析は、クシクラゲbrachyury遺伝子が、他の生物と同様に、原口周辺に発現していることを明らかにした。また、クシクラゲから新たに4種類のT-boxファミリー遺伝子を単離・同定した。そのうちの一つであるクシクラゲTbx1遺伝子は、クシクラゲ胚において胃と呼ばれる部分で発現していた。脊索動物においてTbx1遺伝子は鰓弓や体節の形成に関わっていることが示唆されている。クシクラゲTbx1遺伝子の発現パターンはTbx1遺伝子の機能の祖先型を考える上で興味深い。尚、PCRの鋳型となるクシクラゲRNAの単離とwhole mount in situ hybridizationのためのクシクラゲ胚の調製は、クシクラゲMnemiopsis leidyiの生息地である米国マサチューセッツ州のMarine Biological Laboratory(Woods Hole, Massachusetts, USA)にて行われた。

本研究の目的は、放射相称動物であるクシクラゲ(有櫛動物)の軸構造を、特に消化器官の軸構造に焦点をあてて理解することである。前年度までに、クシクラゲからbrachyuryを含む5種類のT-boxファミリー遺伝子を単離し、それらの発現パターンをin situ hybridization法によって明らかにした。その結果、クシクラゲbrachyury(MlBra)は消化器官の一端である口陥(原口周辺)で発現することが分かった。そこで本年度は、MlBraの機能を調べるために、モルフォリノオリゴ(MO)による機能阻害実験を行った。MlBraの機能を阻害するMO(MlBra-MO)、又は、コントロールMOをクシクラゲ受精卵に顕微注入したところ、どちらの胚も後期原腸胚まで正常に発生した。しかし、MlBra-MO注入胚では、原腸形成終了直後に始まる予定口陥細胞の陥入が抑制された。この結果から、MlBraは口陥形成のための形態形成運動に機能していることが示唆された。近年、脊椎動物においてもbrachyuryの形態形成運動への関与が明らかになっている。そこで、後生動物の進化過程におけるbrachyuryの役割を明らかにするために、MlBraをツメガエル胚に導入する実験を行った。MlBraのドミナントネガティブ体(MlBra-EnR)をツメガエル4細胞胚の背側帯域に注入したところ、初期原腸胚までは正常に発生するものの、その後の原腸陥入は阻害された。同様の結果は、ツメガエルbrachyury(Xbra)のドミナントネガティブ体を注入した胚でも観察された。よって、MlBraはツメガエル胚の中でXbraと同じように機能することが明らかになった。以上の研究から、brachyuryの本来の機能は、中胚葉の形成ではなく、消化器官の形成に関わる形態形成運動の制御にあることが示唆された。
Bis-diamine誘発rat胎児におけるmicrogliaの研究

【目的】Bis-diamine誘導rat fetusおよび正常rat fetusで形態学的に差異がなかったことから、中枢神経系で免疫をつかさどるmicrogliaについて、その側頭葉を用いて免疫染色を行なった。Bis-diamine誘導rat fetusの側頭葉のmicrogliaの免疫染色を行なった。【方法】Bis-diamine誘導rat fetus(21 days)のbrainのmicrogliaが正常rat fetus(21 days)のそれと比較して免疫組織学的に差異があるのかどうかを検討するために、virgin Winster rat 4疋を用いて、精子挿入後、妊娠10日目にBis-diamineを経口投与し、妊娠21日目に帝王切開にてrat fetus 12疋を取出し、断頭後に心奇形を確認し、帝王切開により取出した。rat fetusのbrainは非常に小さいので、断頭後できるだけ早く、顕微鏡下にbrainを取出し、パラホルムアルデヒドで固定し、その後スクロースで置換して、凍結後brainの切片を作成した。本来はPLP溶液にてbrainを還流するのが理想的であるが、rat fetusが小さいためWang CCらの方法をmodifyした方法を行なった。正常rat fetus10疋についても同様の処置を行なった。OX-42、OX-42、OX-6、OX-18等を用いてmicrogliaの免疫染色等を行ないrat fetusの側頭葉のmicrogliaの形態学的・免疫学的変化を両群で比較検討した。1. Bis-diamine誘導rat fetusの形態学的検討BiS-di狛血e誘導ratfetus(21 days)のbrainが正常rat fetus(21days)と比較して形態学的に同じであるのかどうかを検討するために、virgin Winster rat4疋を用いて、精子挿入後、妊娠10日目にBis-diamineを経口投与し、妊娠21日目に帝王切開にてrat fetus 12疋を取出し、7疋は断頭後、ホルマリン固定し、brainを取り出した。残り5疋においては-80度Cドライアイス・アセトン中に投入し、瞬時凍結後胸部を凍結ミクロトームにて横断面を作成し、Bis-diamineにより先天性心奇形が作成されていることを確認した。またcontrol群で10疋のrat fetusを得たが、断頭後、ホルマリン固定後brainを取り出し、H-E染色を行ない形態学的検討を行なった。両群で脳室、側頭葉、前頭葉等の大きさや形態学的な差異がないことを確認した。現在microgliaの免疫染色を行なっているが、本来はPLP溶液にてbrainを還流するのが理想的であるが、WangCCらの方法をmodifyした方法を行なっている。帝王切開により取出したrat fetusのbrainは非常に小さいので、断頭後できるだけ早く、顕微鏡下にbrainを取出し、パラホルムアルデヒドで固定し、その後スクロースで置換して、凍結後brainの切片を作成し、OX42等の免疫染色を行なっているが、十分なOX42等の免疫染色には至っていない。今後抗体の量などを変化させながら、免疫染色を十分に行なう予定にしている。
色素上皮由来因子PEDFを利用した神経変性疾患に対する新規治療法の開発

近年の急速な高齢化社会への移行により神経疾患の発症率は年々高まっており、効果的な治療薬の開発が急がれている。そこで本研究では、色素上皮由来因子PEDFを利用した神経変性疾患に対する新規治療法の開発を目的に研究を行った。1.変異型PEDF蛋白を用いた神経保護活性発現ドメインの解析PEDFの神経保護効果及び血管新生阻害作用には異なる領域のペプチドが関与していることがin vitro実験系により明らかとされている。そこでこれらのペプチド領域が実際にin vitroでの神経保護効果に関与しているのかどうかを明らかとするため、各活性発現ドメインを欠損させた変異型PEDF蛋白の過剰発現系を構築し、活性発現部位の有無による神経保護効果への影響についてキノリン酸誘発線条体神経細胞死モデルラットを用いて評価を行った。その結果、in vitroでの知見と異なり、神経保護活性発現ドメインを欠損させたPEDF蛋白で神経保護作用が認められ、血管新生阻害活性発現ドメインを欠損させたPEDF蛋白で神経保護作用が消失した。2.脳内PEDF産生細胞の同定PEDFの脳内における役割を明らかとするため、脳内PEDF産生細胞の同定を行った。正常成熟ラットの大脳皮質及び線条体におけるPEDFの主な供給源は神経細胞及びアストロサイトであることが明らかとなった。一方、一過性脳虚血モデルラットの大脳皮質及び線条体におけるPEDF蛋白及びmRNAの発現は、反応性アストロサイトにおいて観察された。3.in vivoにおけるPEDF産生促進物質の効果の検討レポータージーンアッセイによりPEDF遺伝子転写促進活性が見いだされた和漢薬成分をマウスに皮下投与し、その脳及び眼球におけるPEDF mRNA発現量の変化をRT-PCR法により検討したが、変化は認められなかった。1.PEDFの神経保護作用の解析脳梗塞モデルラットに対するPEDFの神経保護効果を検討した。組換えアデノウイルスによりPEDFを過剰発現させたラットでは、一過性脳虚血後の梗塞体積や脳浮腫率の低下とともに変性ニューロン数の減少が認められた。また、脳虚血負荷により認められるマイクログリアの活性化、炎症関連遺伝子の発現誘導、アストロサイトやオリゴデンドロサイトの変性は、PEDFの過剰発現により強く抑制された。さらに、PEDFの過剰発現によりグルタミン酸トランスポーターやMn-SODの発現誘導が観察された。以上の結果より、PEDFは脳内においても神経保護作用を有することが初めて明らかとなり、その作用に、グルタミン酸毒性軽減作用、抗炎症作用、抗酸化作用、脳浮腫抑制作用など複数のメカニズムが関与していることが推定された。正常成熟ラットの小脳におけるPEDFの主な供給源はプルキンエ細胞であることが明らかとなった。一方カイニン酸を投与することで神経細胞の変性脱落を誘導したラット小脳におけるPEDF蛋白及びmRNAの発現は、反応性アストロサイトにおいて観察された。3.レポータージーンアッセイによるPEDF産生促進物質の探索PEDF産生制御に基づく新規薬物の開発を目的にPEDF産生促進物質の探索を行った。植物由来単離化合物及び植物由来エキスについてスクリーニングを行った結果、和漢薬成分2種類及び植物由来エキス3種類にPEDF遺伝子転写促進活性が見いだされた。
肺上皮細胞の気液界面培養を利用する気体のバイオアッセイ手法の確立

肺上皮を構造する二種の細胞(肺気道上皮及び肺胞上皮)のうち、気液界面培養条件下で高感度であった肺胞細胞を利用して,近年都市大気汚染の元凶とされている浮遊粒子状物質(SPM)の直接負荷による新規評価系の確立に焦点をあてて研究を行った.国立環境研究所や旧国立公衆衛生院の研究グループによって採取調整された国内SPMサンプルを,気液界面培養されたモデル肺胞細胞(A549)に,さまざまな表面密度で負荷したところ,負荷量に対して48時間後の生存率に良好な用量作用関係が見られたことから,ヒト肺胞への実際の曝露形態を忠実に模倣した急性毒性の評価が可能であることが明らかとなった.一方,用いたSPMサンプルに吸着している種々の化学物質をジメティルスルフォキシドを用いて溶出し,最終濃度0.5%となるように液中培養で負荷したところ,48時間では全く毒性が検出されなかった.これは,ジメティルスルフォキシドの最大添加濃度の制限によるものであった.すなわち,モデル肺胞の気液界面培養を利用する新規アッセイ系は,ヒトへの曝露形態を模倣できるばかりでなく,高濃度のSPM負荷が可能となるため,迅速または高感度の検出が可能であるとの結論を得た.一方,肺胞への障害性評価への利用に加えて,肺胞を経由した体内への毒性物質取り込み評価への利用をも検討した.ここでは,SPMに吸着された化学物質のうち,肝細胞のチトクロームP4501A1/2活性(EROD活性)として生物応答を指標として包括的な評価が可能な芳香族炭化水素に着目し,肺胞上面に負荷された総量に対して,48時間後でどの程度が基底膜側(体内側)に透過してくるのかを,バイオアッセイにて定量化した.その結果,48時間では,特に表面負荷濃度が低い場合に,最大で10-20%の透過が見られることがわかった.このようなin vitro肺胞モデルにおいて,SPMから肺胞上面への薄い液層への化学物質の溶出・細胞内への透過・細胞内への蓄積・基底膜側への透過といった現象を記述する簡単な数理モデルを構築し,生物学的・物理化学的パラメータを決定,それをin vivo条件(ラットやヒトへの長期曝露)に拡張することで,動物実験を経ずにヒトへのリスクを予測する手法を開発した.肺上皮を構造する二種の細胞(肺気道上皮及び肺胞上皮)のうち、気液界面培養条件下で高感度であった肺胞細胞を利用して,近年都市大気汚染の元凶とされている浮遊粒子状物質(SPM)の直接負荷による新規評価系の確立に焦点をあてて研究を行った.国立環境研究所や旧国立公衆衛生院の研究グループによって採取調整された国内SPMサンプルを,気液界面培養されたモデル肺胞細胞(A549)に,さまざまな表面密度で負荷したところ,負荷量に対して48時間後の生存率に良好な用量作用関係が見られたことから,ヒト肺胞への実際の曝露形態を忠実に模倣した急性毒性の評価が可能であることが明らかとなった.一方,用いたSPMサンプルに吸着している種々の化学物質をジメティルスルフォキシドを用いて溶出し,最終濃度0.5%となるように液中培養で負荷したところ,48時間では全く毒性が検出されなかった.これは,ジメティルスルフォキシドの最大添加濃度の制限によるものであった.すなわち,モデル肺胞の気液界面培養を利用する新規アッセイ系は,ヒトへの曝露形態を模倣できるばかりでなく,高濃度のSPM負荷が可能となるため,迅速または高感度の検出が可能であるとの結論を得た.一方,肺胞への障害性評価への利用に加えて,肺胞を経由した体内への毒性物質取り込み評価への利用をも検討した.ここでは,SPMに吸着された化学物質のうち,肝細胞のチトクロームP4501A1/2活性(EROD活性)として生物応答を指標として包括的な評価が可能な芳香族炭化水素に着目し,肺胞上面に負荷された総量に対して,48時間後でどの程度が基底膜側(体内側)に透過してくるのかを,バイオアッセイにて定量化した.その結果,48時間では,特に表面負荷濃度が低い場合に,最大で10-20%の透過が見られることがわかった.このようなin vitro肺胞モデルにおいて,SPMから肺胞上面への薄い液層への化学物質の溶出・細胞内への透過・細胞内への蓄積・基底膜側への透過といった現象を記述する簡単な数理モデルを構築し,生物学的・物理化学的パラメータを決定,それをin vivo条件(ラットやヒトへの長期曝露)に拡張することで,動物実験を経ずにヒトへのリスクを予測する手法を開発した.今年度はまず,肺上皮細胞(肺胞由来A549細胞および肺気道由来Calu-3細胞)の気液界面培養を用いた揮発性有機溶媒の簡便なバッチ式ガス負荷装置を開発した.これは1リットルのガラスデシケータの底面に,気液界面培養のための半透膜・有機溶媒添加のための液だまり・湿度保持のための水たまり,を持つものである.有機溶媒は液として添加されるが,短時間のうちに蒸発し、添加量に対応した気相濃度に達して平衡となる.ガスの濃度は2日後でも70-80%保持された.この装置を用いて,肺胞と肺気道由来の細胞を気液界面培養すると,前者は非常に低い膜電気抵抗値のままであったが,後者は徐々にそれが上昇し,肺胞のそれの10倍以上に達した.

これは,in vivoと同じ状況に細胞を置くことで,それぞれの由来組織に応じた分化形態をそれぞれの細胞が部分的に再現したものと考えられた.このような状況下で,細胞表層に液層の有無でどの程度毒性が異なるかを調べたところ,液層中のガス拡散のために,細胞表層の正味の負荷濃度が特に負荷直後において低下し,結果的に2日後の生存率は有意に高まった.また,そのED50値を動物実験のLD50値と比較すると,厚い気道細胞への負荷ではED50は大きかったが,薄い肺胞由来細胞への負荷ではED50は動物実験のLD50とほぼ同等の値となった.このことから,人体への毒性評価系としては,特に肺胞の気液界面培養によるガス直接暴露が望ましいという結果が得られた.これらの結果に基づいて,A549細胞の気液界面培養を利用し,近年深刻な問題となっている浮遊粒子状物質の直接負荷実験を進めている.従来は例えばハイボリュームエアーサンプラーなどで捕集された粒子をDMSOなどの有機溶媒を用いることで毒性物質を溶出させた後に細胞試験などのバイオアッセイに供しているが,もし直接に気液界面培養した細胞へ負荷する手法が確立できれば,in vivoの負荷形態をよりよく模すだけでなく,その感度も著しく高くなることが期待される.次年度では,この粒子状物質の直接負荷による評価法の確立に焦点を当てて研究を進めていく予定である.平成14年度は,肺上皮を構成する二種の細胞(肺気道上皮及び肺胞上皮)のうち,気液界面培養条件下で高感度であった肺胞細胞を利用して,近年都市大気汚染の元凶とされている浮遊粒子状物質(SPM)の直接負荷による新規評価系の確立に焦点をあてて研究を行った.国立環境研究所や旧国立公衆衛生院の研究グループによって採取調整された国内SPMサンプルを,気液界面培養されたモデル肺胞細胞(A549)に,さまざまな表面密度で負荷したところ,負荷量に対して48時間後の生存率に良好な用量作用関係が見られたことから,ヒト肺胞への実際の曝露形態を忠実に模倣した急性毒性の評価が可能であることが明らかとなった.一方,用いたSPMサンプルに吸着している種々の化学物質をジメティルスルフォキシドを用いて溶出し,最終濃度0.5%となるように液中培養で負荷したところ,48時間では全く毒性が検出されなかった.これは,ジメティルスルフォキシドの最大添加濃度の制限によるものであった.すなわち,モデル肺胞の気液界面培養を利用する新規アッセイ系は,ヒトへの曝露形態を模倣できるばかりでなく,高濃度のSPM負荷が可能となるため,迅速または高感度の検出が可能であるとの結論を得た.一方,肺胞への障害性評価への利用に加えて,肺胞を経由した体内への毒性物質取り込み評価への利用をも検討した.ここでは,SPMに吸着された化学物質のうち,肝細胞のチトクロームP450 1A1/2活性(EROD活性)として生物応答を指標として包括的な評価が可能な芳香族炭化水素に着目し,肺胞上面に負荷された総量に対して,48時間後でどの程度が基底膜側(体内側)に透過してくるのかを,バイオアッセイにて定量化した.その結果,48時間では,特に表面負荷濃度が低い場合に,最大で10-20%の透過が見られることがわかった.このようなin vitro肺胞モデルにおいて,SPMから肺胞上面への薄い液層への化学物質の溶出・細胞内への透過・細胞内への蓄積・基底膜側への透過といった現象を記述する簡単な数理モデルを構築し,生物学的・物理化学的パラメータを決定,それをin vivo条件(ラットやヒトへの長期曝露)に拡張することで,動物実験を経ずにヒトへのリスクを予測する手法を開発した.
現代日本における高年初産の社会学的研究

本研究は、現代日本における高年初産について聞き取り調査と文献を用いてその実態を明らかにするものである。聞き取り調査では(1)対象者に高年初産が選択される背景が多様であること、(2)対象者の年齢に対する意識が近年において変化していること、(3)対象者が考える高齢出産のメリットとデメリットについて考察した。文献調査では(1)高年初産のリスクとされることが年代ごとに変容していること、(2)かつては若い女性たちにとって特別なものであった高年初産が現在ではいつか選択するかもしれないことに変化していること、(3)高年初産・高齢出産に対する差別的な意識について分析した。初年度にあたる平成17年度においては以下のとおり研究が遂行された。(1)基本文献の蒐集:研究の全体的な見取り図を作成する為に、生殖や母性、医療についての文献が収集された。また大宅壮一文庫雑誌記事検索CD-ROMが購入された。(2)データベース化:国立国会図書館の雑誌記事検索システムを利用し、戦後の日本において発表された高年初産、高齢出産についての論文のデータベース化が進められた。またその主要なものを複写した。(3)聞き取り調査:高年初産を経験した女性6名に対して聞き取り調査をおこなった。この内容はテープレコーダに収められ、トランスプリクトが作成された。このデータを参考にして来年度以降、より多くの情報提供者を対象に聞き取り調査をおこなう予定である。これらの作業によるまとまった分析は今後すすめられる予定であるが、そのいくつかを先取りして言うならば以下のことがいえる。まず、「高年初産」をひとくくりにすることはできず、論者や経験者の実感から鑑みて35-39歳を「前期高年初産婦」、40歳以上を「後期高年初産婦」と呼ぶことができるのではないかということ。また、高年初産の選択は必ずしも本人のキャリア形成上の戦略というような職業生活とのかねあいでばかりはかられるわけではない。これには不妊のためといった、出産を望んでも得られない状態が多く含まれたり、他方で産むことについてあまり意識をせず気づいたら高年初産の年齢にさしかかっていたりと多様な理由がある。事例の多様性を生かしながらいかに高年初産を分析するかが次年度以降の課題となるだろう。研究期間の2年目にあたる平成18年度においては以下のとおり研究が遂行された。1基本文献の蒐集:(1)昨年度購入した「大宅壮一文庫雑誌記事検索CD-ROM」によって、1988年から2004年における「高年初産」「高齢出産」関連の雑誌記事を検索し、当該の記事を国会図書館等で複写した。(2)「高年初産」「高齢出産」にかんする新刊書を購入した。2データベース化:上記の複写が可能であった記事および購入した書籍について、エクセルを使ってデータベースを作成した。3聞き取り調査:高年初産を経験した女性、および出産経験はないものの出産の希望を持っている30代後半の女性について、聞き取り調査をおこなった。内容は録音され、これに基づいてトランスクリプトが作成された。以上で集められた研究素材をもとにした分析は今後も継続しておこなわれる。今年度に遂行された研究によって、さしあたり以下の点が今後の研究課題として浮き彫りにされた。すなわち「出産」というライフイベントをめぐる、戦後の女性たちの態度の変容についてである。たとえば、戦後のベビーブームとその後の出生抑制について、または平均的な出生時数が2児で止まり続けたことを規定する条件、そして最近の超少子化現象が分析対象として考えられる。それらの現象は、政府主導という言葉がふさわしいときもあるし、市場や文化など別の牽引主体が力を持っている場合もある。果たしてその場合、女性たち自身の意思というものはどの程度反映されてきたのであろうか。この点について、フェミニズムや家族社会学の研究で従来言われてきたような「物語」に足をすくわれることなく、実証的な手続きを丁寧に踏むことによって明らかにしていきたい。研究期間の3年目にあたる平成19年度においては以下のとおり研究が遂行された。1基本文献の蒐集:(1)昨年度までに購入した「高年初産」「高齢出産」関連の雑誌記事の充実をさらにはかるべく、当該の記事を国会図書館等で複写した。

今年度に遂行された研究によって、さしあたり以下の点が今後の研究課題として確認された。(1)これまで高年初産の原因は「女性の社会進出の結果」であるとひとくくりにされてきたが、人によってその内情が多様であること、(2)高年初産の「リスク」の一つとして30代後半女性の生活習慣病・婦人科疾患の罹患率の高さが考慮されねばならないこと、(3)親世代と妊娠・出産・育児観が違うことの問題、(4)第二子の妊娠・出産の選択について岩い世代より猶予がないこと、(5)妊娠・出産・子育てを選択するものであるととらえ、それへの肯定感が強いこと、である。この内容は論文にまとめられ勤務校の紀要に掲載許可を得た。1文献の追加的な蒐集過去の研究年度に引き続き、生殖や医療、母性にかんする文献の蒐集をおこなった。本年度はとくに、国立国会図書館に蔵書されている一般向けに書かれた妊娠・出産の手引書(戦後に出版されたもの)に可能な限り目を通すことに重点を置いた。また、一般向けおよび保健医療系の雑誌記事で高齢出産・高齢妊娠・高年初産にかかわりのあるものについても追加的に閲覧・複写をおこなった。2資料の整理とデータベース化過去に蒐集した資料に本年度蒐集した資料を加えて、エクセルによるデータベース化をすすめたが、これは奔放において初の高年初産・高齢出産文献のデータベースであり、このテーマに関心を持つ研究者に有益であると思われる。3補足的な聞き取り調査とトランスクリプトのリライト、情報収集高年初産の経験者と産婦人科の医師に対し追加的な聞き取り調査とトランスクリプトの作成をおこなった。また、これまで調査を進めたほかのインフォーマントのものも含めて報告書への掲載をめざしてトランスクリプトのリライト作業をすすめた。また、日本家族社会学会等へ出席し、家族や生殖についての研究動向の把握につとめた。4研究成果公開への準備これまでの研究成果を公表するために、報告書の執筆を進行中である。
新型ＳＰＹ－Ｑシステム心筋血流評価による交感神経刺激心筋保護法の研究

本研究の目的は交感神経および、Ganglion Plexusを持続刺激することで、安全な心停止を得ることである。電極間距離3mmのペン型双極刺激デバイス(25-30Hz,矩形波双極パルス,出力8V,パルス幅0.4ms)を使用し、Ganglion Plexusを左右同時刺激することで安定した心停止を得た。刺激開始後、速やかに心停止し(30分)、刺激中止後約10分で刺激前の脈、血圧に復した。心停止中、心筋酸素飽和度、心筋血流は低下することなく、本研究から交感神経刺激心停止法は、心筋酸素代謝を低下させることなく、結果心機能障害も低減できる有用な方法であると考えられた。本研究の目的は、迷走神経、肺静脈近傍のGanglion Plexusを電気刺激することで心停止を行ない、その間の心筋酸素代謝を調査し、さらに刺激終了後に、どの程度の心筋再還流障害が生ずるかを研究するものである。実験の成果として、胸部迷走神経を左右別々に20-50Hz、双曲パルス、出力10V、パルス幅0.4msで刺激した場合、25-35Hzの刺激では、完全心停止が得られることが判明、ただし約1分で心拍は徐々に再開(心拍数20-30bpm)し、15分刺激終了後脈拍は直ちに再開し、約1分で術前より40-50%増加した心拍数となり、約5分で術前値の脈拍に復した。血行動態は、刺激中止後、心拍の出現とともに血圧も復帰、約3分で術前血圧に復した。人工心肺下の状態での心筋酸素飽和度は、心拍動時82%が、心停止と同時に90-92%に上昇、心停止後から徐脈となっている15分間は82%以上の値を維持した。片側のみの迷走神経刺激では、15分間完全心停止は得られないため、上記刺激で1分間ずつ左右交互に刺激を行ない同様な実験を行なった。しかしやはり刺激開始1分後より心拍再開、1分後反対側迷走神経刺激にて再度心停止にはなるが、2-3回の交互刺激後には心停止は得られず、10-20bpmの徐脈を維持する結果となった。血行動態、心筋酸素代謝は片側刺激と有意差は認めなかった。Ganglion Plexusの刺激実験では、前年度報告したが、個体により安定した心停止が得られず、前回の科学研究テーマでの実験同様、10Hz以下で心房細動を誘発、さらに高出力40Hz以上の刺激では、不可逆性の心室細動が誘発され、この損失細動は電気的除細動によっても全く停止せず。完全体外循環下モデルによる、刺激実験でも同様の結果となった。この発生機序に関してはいまだ不明であり、もう少し追加実験が必要である。本研究の目的は前回の研究から引き続き、実験豚の交感神経および、Ganglion Plexusを持続刺激することで、安全な心停止が得られるかを立証することである。安定した交感神経刺激による心停止は、自己作成した電極間距離3mmのペン型双極刺激デバイスを使用し、左右上肺静脈近傍のGanglion Plexusを25-30Hz,矩形波双極パルス,出力8V,パルス幅0.4msで刺激することで得られることを確認した。特にこの効果は左側の迷走神経心臓枝からGanglion Plexusの刺激によって強く生じた。しかし、右側のみの刺激では、刺激と同時に心停止が得られるものの、数分で自然心拍が再開し、その後いったん刺激を中止すると、再度刺激しても心停止を誘発できないことも判明した。そこで刺激装置を2台使用し、左右を同時に刺激(上記条件)することで30分にわたる心停止を得ることができた。臨床に準じた手術を想定し、実験豚に上行大動脈送血、上下大静脈脱血の完全体外循環を確立。常温、心拍動下に、パイロットスタディで得られた刺激条件にて心停止を誘発し、30分後に刺激中止し心拍動を再開させた。【結果】脈は刺激中止後、ただちに心拍動再開、3分以内に心停止前HRに復した。血圧は心拍再開後5分で、人工心肺を停止し術前血圧に復した。脈、血圧とも術前値と有意差は認めなかった。また術前、心停止30分後,心拍再開30分後の心筋逸脱酵素にも有意差は認めなかった。さらに体外循環下、電気刺激心停止状況下で、心筋酸素飽和度は90±4%と心拍動下時の82±7%に比して有意に高いことが判明。SPYシステムでも心停止時の心筋血液還流低下を認めなかった。【結語】本研究から交感神経刺激心停止法は、心筋酸素代謝を低下させることがなく、その結果心機能障害も減少できる有用な方法であり、臨床応用も可能であると考えられた。

心停止中、心筋酸素飽和度、心筋血流は低下することなく、本研究から交感神経刺激心停止法は、心筋酸素代謝を低下させることなく、結果心機能障害も低減できる有用な方法であると考えられた。平成20年の科研で,左右上肺静脈近傍のGanglion Plexusを25ー30Hz,双極パルス,出力8V,パルス幅0.4msで刺激することで心停止が得られることを確認した.本研究では刺激電極装置の形状をペン型の固定しやすいものとし,新規に購入した電気刺激装置を使用し,パルス形状,幅を変更して安定した心停止を得ることである.【実験】実験ブタを全身麻酔下に左右別々に肋間開胸し,左右の肺静脈を露出.右上肺静脈,上大静脈接合部と,左上肺静脈に電気刺激を行なった.双極パルス,出力10V,パルス幅0.51.0msの刺激で安定した心停止が得られたので(4頭).この刺激法で心停止実験を行なった.右心房脱血,大腿動脈送血の完全体外循環下に30分,60分の電気刺激を行なった.【結果】心機能測定;30分刺激心停止後,心臓は速やかに心拍動を再開した.停止前の心拍数,血圧に復帰するまでには6±5分を要した.60分刺激では,心拍数,血圧復帰まで12±7分を要した.4例中,2例は除脈のためカテコールアミンの持続点滴を必要とした.心筋逸脱酵素測定:30分,60分停止グループとも,CKMBの術前値からの有意な上昇は認めなかった.心筋酸素飽和度:連続モニターによる心筋酸素飽和度は,心拍動時82±4%が,心停止とともに92±2%に2分以内で上昇,徐々に低下し最終的に平均74±5%でプラト-に達した.心拍再開後,速やかに80%まで上昇し,再開後5分で83±5%のプラト-に復した.電気刺激により心停止が得られることは完全に確認できた。心肺下に15分間の刺激により心筋酸素代謝は低下しないこと、心機能には影響を与えないことも確認された。当初の研究では、30分、60分に及ぶ電気刺激による心停止を予定していたが、現時点の刺激方法では、15分までが限界であり、刺激持続により神経伝達物質枯渇による影響か、刺激によって徐脈、心停止が誘発されないことが解ってきた。これを踏まえ、徐脈作動薬剤を併用による、さらなる心停止時間の延長が可能かを検討する必要がある。本研究の主たる目的は,心房特定部の特殊パルス電気刺激を行い,長時間の心停止状態を得ようというものであり,この刺激停止後の心機能回復に問題がないか,臨床に適応できるかを知ることである.これまでの結果から,安定した心停止を電気刺激により得ることが出来てた.またさらに完全心停止(30,60分)からの心機能の回復は,臨床的に十分満足できるものであり,今後症例をもう少し(6頭まで)増やし,安定した結果が得られるかを確認できればよいと考えている25年度は、これ以上の刺激による心停止延長は今のところ望めず、さらなる停止時間を得るためには、薬剤を付加した上記補足実験が必要である。しかし現在までに、本実験による心停止時には、心筋酸素代謝が低下しないことは確実で、その結果、心筋機能リカバリーも問題なく、このような電気刺激心停止を、心筋代謝からみた研究はなく、実験結果をまとめるためのある程度のデータは収集できたと考えている。本年度はデータ解析、論文作成を主眼において研究したいと考えている。24年度は,今年の実験結果を踏まえ,症例を増やすことと,研究の方法にも述べたようにSPY-Qsystemを使用し,心停止時の心筋血流の変化をリアルタイムに客観的な指標ととして計測したいと考えている.本システムを使用しての,心停止時の血流測定は過去に報告はなく.電気心停止時の心筋血流の新しい知見がえらると思われる.