hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオン液体によるマイクロ抽出を用いた生体試料中薬毒物の超高感度LC/MS分析

1.研究目的薬毒物中毒事案の発生時には,原因究明や犯罪捜査のため,中毒者の体液や遺留された飲料といった各種水性試料の分析が行われる.しかし,パラコート(PQ)やジクワット(DQ)のようなイオン性薬毒物の分析では,対象が高親水性であるため抽出が容易ではなく,煩雑な前処理が必要となる.以前我々は,イオン液体の一種で極めて高いPQ抽出能を持つ1-エチル-3-メチルイミダゾリウム・ビス(ノナフルオロブタンスルホニル)アミド([EMIm][NNf_2])を用いたin situ溶媒形成マイクロ抽出(ISFME)によって,水中PQ・DQを迅速かつ簡便に抽出できることを示した.また, [EMIm][NNf_2]抽出試料の高速液体クロマトグラフィーによる分析法を構築した.本研究では,手法の高度化を目指し,生体試料への適用および抽出試料の液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)による分析を試みた.2.研究方法PQ・DQを添加した尿または血清に, [EMIm]ClおよびLi[NNf_2]の各水溶液を順次添加し, ISFMEを行った.遠心分離後の上清を除去して得た残さにメタノールを加えて懸濁させ,そのろ液をLC/MS試料とした. LC/MSは, Merck製ZIC-HILICカラムを用いたギ酸アンモニウム緩衝液(pH3.5)とメタノールのリニアグラジエント条件により行った.3.研究結果尿および血清に対しても[EMIm][NNf_2]によるISFMEを適用でき, PQ・DQの回収率は82-103%と良好であった.また,カラム直後で流路を分岐して, [EMIm][NNf_2]を含む分析開始直後の移動相を廃液とし,その後流路をMSへ切り替えることで, [EMIm][NNf_2]試料をLC/MSで分析することができた,さらに,構築された手法によって, ppbレベルの尿および血清中PQ・DQの定性・定量が可能であった.1.研究目的薬毒物中毒事案の発生時には,原因究明や犯罪捜査のため,中毒者の体液や遺留された飲料といった各種水性試料の分析が行われる.しかし,パラコート(PQ)やジクワット(DQ)のようなイオン性薬毒物の分析では,対象が高親水性であるため抽出が容易ではなく,煩雑な前処理が必要となる.以前我々は,イオン液体の一種で極めて高いPQ抽出能を持つ1-エチル-3-メチルイミダゾリウム・ビス(ノナフルオロブタンスルホニル)アミド([EMIm][NNf_2])を用いたin situ溶媒形成マイクロ抽出(ISFME)によって,水中PQ・DQを迅速かつ簡便に抽出できることを示した.また, [EMIm][NNf_2]抽出試料の高速液体クロマトグラフィーによる分析法を構築した.本研究では,手法の高度化を目指し,生体試料への適用および抽出試料の液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)による分析を試みた.2.研究方法PQ・DQを添加した尿または血清に, [EMIm]ClおよびLi[NNf_2]の各水溶液を順次添加し, ISFMEを行った.遠心分離後の上清を除去して得た残さにメタノールを加えて懸濁させ,そのろ液をLC/MS試料とした. LC/MSは, Merck製ZIC-HILICカラムを用いたギ酸アンモニウム緩衝液(pH3.5)とメタノールのリニアグラジエント条件により行った.3.研究結果尿および血清に対しても[EMIm][NNf_2]によるISFMEを適用でき, PQ・DQの回収率は82-103%と良好であった.また,カラム直後で流路を分岐して, [EMIm][NNf_2]を含む分析開始直後の移動相を廃液とし,その後流路をMSへ切り替えることで, [EMIm][NNf_2]試料をLC/MSで分析することができた,さらに,構築された手法によって, ppbレベルの尿および血清中PQ・DQの定性・定量が可能であった.
メタボローム技術を活用した“和野菜”の風味因子の解明と生成制御

和食は近年世界的に注目を浴びており、そこに使われる薬味や食材は独特の風味を持つ。本研究では、和食で用いられる和野菜の、主に香気特性に着目し、メタボロミクス手法を用いてその特徴成分の特定および生成制御に関与する因子を解明することを目的とした。ショウガ、サンショウ、ゴボウ、ミツバの香気特性に寄与する成分の特定、その生成制御について調べた。ショウガ、サンショウについては、その香気を担うテルペン系香気成分の生合成に関与する酵素群の活性を確認し、いくつかのコードする候補遺伝子の機能同定ができた。ゴボウ、ミツバについては香気寄与度の高い香気成分の特定し、使用部位によりその含量が異なることを明らかにした。「和食」は世界的にも人気があり、日本独特の野菜食材(和野菜)と調味料によって醸し出される風味が特徴である。本研究では、和野菜の風味のうち香気特性に着目し、その生成制御に関与する因子を解明することを目的とした。特に和野菜のうち、日本料理に独特に使用されるショウガ、サンショウに着目して研究を進めた。各野菜の香気成分は、簡便でデータの再現性のよいSPME(固相抽出)法により捕集し、GC-MS(ガスクロマトグラフィ質量分析計)で分析を行った。1ショウガについては、ショウガは生魚の口直しなどの目的で甘酢漬けで摂取されることが多い。そこで、甘酢漬けによる香気組成の変化について、網羅的に解析した。その結果ショウガのさわやかな香気に関与するgeranialが酢漬け貯蔵中に減少することが分かった。2サンショウ類は遺伝的な分類は不明な点が多く、一部のサンショウ属植物以外は、どのような成分が含まれているのか報告された例はほとんどない。そこで市場に出回るサンショウ属(Zanthoxylum)植物葉に着目し、揮発性成分プロファイルを比較し、種による特徴を調べることを目的とした。さらに、日本で汎用されるZ. piperitum(ブドウ山椒)におけるテルペン系揮発性成分の生成に関与するテルペン合成酵素遺伝子のクローニングを行った。主成分分析の結果、食用に用いるサンショウに属する種(ブドウサンショウ、アサクラサンショウなどのZ. piperitum)は、いずれも近いクラスターを形成し、Citronellalなどのモノテルペン類の種類が多いことが分かった。また、テルペン合成酵素遺伝子をクローニングした結果、2種の遺伝子について完全長cDNAを得ることができ、大腸菌での発現系およびタバコでの一過的発現系において、揮発性テルペンの生成を確認することができた。27年度は、1品種、収穫地、収穫時期、保存などの条件による香気プロファイルのメタボローム解析による検証2各和野菜の香気寄与成分の特定3各和野菜の香気寄与成分の生合成酵素系の検証の3項目について計画したが、いずれも当初から1年間では完結しない内容と判断し、計画当初から2年間での目安として提案している。そのため、現在の進捗状況は妥当であると判断している。また、当初、ショウガについても品種による違いを見る予定であったが、出所が定かなショウガの品種の収集が困難であること、品種間で量的な違い以外は大きな差がないことなどから、ショウガについては保存中の変動をみることとした。本研究では、各和野菜が持つ嗜好に関わる風味、とくに香気特性について、寄与成分の組成と生成について、着目して研究を進めている。本年度は、以下の研究実績を得た。1ショウガの主要香気成分であるcitralの生成に関与するgeranyl acetateからgeraniolへのエステラーゼ活性について、酵素レベルで確認を行った。ショウガ植物体を部位に分け、粗酵素を抽出し、酵素活性とgeraniol類(geranylacetate、geraniol、citral)の含量を比較した。その結果、部位による酵素活性の差はほとんどないことがわかった。一方、geraniol類は葉や新根茎の量が多かったことから、geraniol類の含量およびcitralの組成制御はエステラーゼ活性によるものでなく、基質量およびエステラーゼ下流のgeraniolからcitralが生成するゲラニオール脱水素酵素の活性によるものであることが考察された。2サンショウのRNA-Seqデータに対し、既知のテルペン合成酵素遺伝子配列との相同性を元に解析した結果、3つの遺伝子ZpTPS1, ZpTPS2, ZpTPS3を選抜した。大腸菌発現系を用いて組換え酵素を作製し、in vitroで酵素アッセイを行った結果、farnesyl diphosphateを基質としてZpTPS1はβ-phellandreneを、ZpTPS2はgernacrene Dを生成した。一方、ZpTPS3はgeranyl diphosphateを基質としてβ-phellandreneを生成する活性がみられた。3ゴボウスプラウトの香気特性について、他のスプラウトと比較した。主成分分析で解析を行ったところ、ゴボウ特有の香気成分の存在と、C6化合物による青臭い香気成分が特徴的であることがわかった。本年度の研究目的では、ショウガの香気生成に関与するエステラーゼの特徴、サンショウの特徴香気成分の生成機構を目的としたが、予想に反し、エステラーゼが部位特異的ではないことが分かったことと、モノテルペン合成酵素を見出したものの、最も香気寄与が高いcitronellalの生成についてはまだ進んでいない点があるからである。一方、ショウガサンショウのみならず、他の和野菜の香気特性とその組成についても進めることができた。特にゴボウおよびゴボウスプラウトの研究はかなり進めることができた。

「和食」は世界的にも人気があり、日本独特の野菜食材(和野菜)と調味料によって醸し出される風味が特徴である。本研究では、和野菜の風味のうち香気特性に着目し、その生成制御に関与する因子を解明することを目的とした。今年度は以下の点について研究を進めた。1ショウガの主要香気geranialの生成に関与するgeranylacetate加水分解酵素について:昨年の粗酵素を用いた実験により、ショウガ根茎中にはgeranylacetateエステラーゼ活性があることが分かった。そのため、トマト果実の香気エステルに対するエステラーゼ酵素遺伝子情報を元に、ショウガESTデータベースを用いてエステラーゼに関与する候補遺伝子をスクリーニングし、完全長cDNAを得た(3種)。それぞれ大腸菌における異種発現により酵素を得て活性を調べたが、いずれもgeranylacetateに対する活性が認められなかった。現在、さらに他の候補遺伝子についても活性確認中である。2ゴボウの独特な香気に着目し、香気抽出物を得、まず香気寄与成分の確認を行った。Aroma Extraction Dilution Analysis法により確認したところ、未同定成分1つを含む5種の香気成分が顕著に寄与することがわかった。そのうち、土臭い香気をもつ2-methoxy-3-(2-methylpropyl)-pyrazineおよびその異性体である2-methoxy-3-(1-methylpropyl)-pyrazineの寄与が高かった。それぞれ定量を行ったところ、これらの成分含量は産地によって大きな差はなかったが、ゴボウ根の先端部よりも地上部に近い太い部分のほうが含有量が大きいことが分かった。また、加熱による変化もないことを確認した。和食は近年世界的に注目を浴びており、そこに使われる薬味や食材は独特の風味を持つ。本研究では、和食で用いられる和野菜の、主に香気特性に着目し、メタボロミクス手法を用いてその特徴成分の特定および生成制御に関与する因子を解明することを目的とした。ショウガ、サンショウ、ゴボウ、ミツバの香気特性に寄与する成分の特定、その生成制御について調べた。ショウガ、サンショウについては、その香気を担うテルペン系香気成分の生合成に関与する酵素群の活性を確認し、いくつかのコードする候補遺伝子の機能同定ができた。ゴボウ、ミツバについては香気寄与度の高い香気成分の特定し、使用部位によりその含量が異なることを明らかにした。1年目において、ショウガとサンショウ以外に、ミツバ、ゴボウ、ダイコンもサンプル対象として研究を進める予定であったため、実際に予備実験においてデータを取得した。ただし、ショウガとサンショウにおいて予想外の新規性のあるデータも得られたことから、特にこれらの2種に着目してさらに研究を深める予定である。ミツバ、ゴボウ、ダイコンについては、香気組成における品種による違いはあまり見られないため、調理過程中の変化に着目し、研究を進める予定である。引き続き、ショウガおよびサンショウの香気成分の生成制御について調べる。
肺炎起因菌に対する抗菌ペプチドの細胞死誘導機構の解析と治療戦略の基盤研究

抗菌ペプチドの抗菌機構について解析した。抗菌ペプチドは大腸菌に対して、その抗菌活性と膜透過性亢進がほぼ相関した。ある抗菌ペプチドは、活性酸素のみを誘導した。一方、抗菌ペプチドは黄色ブドウ球菌の膜透過性を亢進し、活性酸素の産生を誘導した。さらに、抗菌ペプチドはマイコプラズマに対して膜透過性を亢進しないが、活性酸素を誘導した。hydroxyl radical除去剤は大腸菌、マイコプラズマにおける抗菌ペプチドの活性を阻害した。以上より、抗菌ペプチドには、膜透過性亢進、およびhydroxyl radicalによる抗菌機構が存在し、菌種により抗菌活性における活性酸素依存度は異なることが明らかとなった。細菌感染症において、非特異的感染防御機構の一つとして塩基性抗菌ペプチドが重要であることは広く知られている。その特徴は、抗菌スペクトルが広く、また薬剤耐性菌にも抗菌活性を示すことにある。しかし、その抗菌作用機序は、膜透過性亢進の関与が考えられているが、完全に解明されていない。ところで、近年、β-ラクタム、キノロン薬剤等の抗菌剤による細菌細胞死の機序として、SOS反応、酸化反応由来のhydroxyl radical等の関与が示唆されている。そこで、本研究において、抗菌ペプチドによる細胞死の誘導機構を膜透過性、活性酸素、細胞内反応シグナル等の観点から解明し、抗菌ペプチドの活性を増強する方法を探り、臨床的に感染症治療の効率化を図る基盤的なデータを得ることを目的とする。前年度、抗菌ペプチドの抗菌活性と膜透過性亢進が概ね相関することを見出した。しかし、一部の抗菌ペプチドは、膜透過性亢進を示さなかったが、強い抗菌活性を示した。さらに、ペプチド処理により過酸化水素が産生誘導されることを観察した。今年度、抗菌活性機構について、さらなる解析を加えた。活性酸素の中でもとりわけ、hydroxyl radicalの酸化作用が最も強いことが知られており、そこで、hydroxyl radicalの検出、およびその酸化産物である8-OHdGの検出をおこなった。抗菌ペプチド処理後、両者を検出することができた。この結果から、抗菌ペプチドによる抗菌活性発現には、hydroxyl radicalの関与が強く示唆された。次に、hydroxyl radicalの除去剤存在下に抗菌アッセイを行ったところ、20から50%程度の抗菌活性の阻害を認めることができた。これらの結果から、抗菌ペプチドには、膜透過性亢進による抗菌作用に加え、hydroxyl radicalによる抗菌活性が存在することが明らかとなった。最近、β-ラクタム、キノロン薬剤等の抗菌剤による細菌細胞死の機序として、SOS反応、酸化反応由来のhydroxyl radical等の関与が示唆されている。そこで、本研究では、抗菌ペプチドの抗菌機構における活性酸素の関与について検討した。これまで、抗菌ペプチドはグラム陰性である大腸菌に対して、その抗菌活性と膜透過性亢進がほぼ相関することを見出した。しかし、一部の抗菌ペプチド(KWW)は、膜透過性亢進を示さなかったが、過酸化水素の産生を誘導した。今年度、数種の抗菌ペプチドの抗菌機構について、標的細胞を黄色ブドウ球菌、マイコプラズマへ拡大して、さらなる解析を加えた。抗菌ペプチドは、黄色ブドウ球菌の膜透過性を亢進し、活性酸素(hydroxyl radical、8-OHdG)の産生を誘導した。ところが、大腸菌の膜透過性を亢進しないKWWは、黄色ブドウ球菌の膜透過性を亢進した。抗菌ペプチドと膜透過性には菌種特異性が存在することが明らかとなった。また、マイコプラズマにおいて、抗菌ペプチドは膜透過性を亢進しないが、活性酸素を誘導した。さらに、hydroxyl radicalの除去剤存在下に抗菌アッセイを行ったところ、大腸菌、マイコプラズマでは抗菌活性が阻害されたが、黄色ブドウ球菌では阻害を認めなかった。以上より、抗菌ペプチドには、膜透過性亢進、およびhydroxyl radicalによる抗菌機構が存在し、菌種により抗菌活性の活性酸素依存度は異なることが明らかとなった。細菌感染症において、非特異的感染防御機構の一つとして塩基性抗菌ペプチド(デフェンシン、カテリシジン等)が重要であることは広く知られている。ところで、近年、β-ラクタム、キノロン薬剤等の抗菌剤による細菌細胞死の機序として、SOS反応、酸化反応由来ハイドロキシラジカルOH-等の関与が示唆されている。

そこで、本研究において、抗菌ペプチドによる細胞死の誘導機構を膜透過性、活性酸素、細胞内反応シグナル等の観点から解明し、抗菌ペプチドの活性を増強する方法を探り、臨床的に感染症治療の効率化を図る基盤的なデータを得ることを目的とする。本年度、抗菌ペプチド(デフェンシン、カテリシジンを含む直鎖状の塩基性ペプチド等)の抗菌作用機序の解明、とりわけ、抗菌ペプチドが膜へ作用した後、細胞死へ至る機序の解明を計画した。本年度の実績は、先ず、抗菌ペプチドが、細菌の膜透過性亢進を誘導するか、そしてその抗菌活性を検討し、またペプチド処理により、過酸化水素が産生誘導されるかを検討した。概ね、膜透過性亢進の誘導を可能な抗菌ペプチドは抗菌活性も示した。しかし、一部のペプチドは、膜透過性亢進を示さなかったが、強い抗菌活性を示した。即ち、膜透過性亢進以外の機構で細菌の増殖が阻害されることが示唆された。また、過酸化水素は、ペプチド処理後に誘導されたが、その産生レベルは低く、抗菌活性発現における意義は現在のところ、明確でない。本研究では、抗菌ペプチドの抗菌作用における活性酸素の関与について検討した。これまで、抗菌ペプチドはグラム陰性である大腸菌に対して、その抗菌活性と膜透過性亢進が相関することを見出した。しかし、一部の抗菌ペプチドは、膜透過性亢進を示さず、過酸化水素の産生を誘導した。さらに、標的細胞を黄色ブドウ球菌、マイコプラズマへ拡大して、さらなる解析を加えた。抗菌ペプチドは、黄色ブドウ球菌の膜透過性を亢進し、活性酸素(hydroxyl radical等)の産生を誘導した。ところが、大腸菌の膜透過性を亢進しない抗菌ペプチドは、黄色ブドウ球菌の膜透過性を亢進した。また、マイコプラズマに対して、抗菌ペプチドは膜透過性を亢進しないが、活性酸素を誘導した。さらに、hydroxyl radical除去剤存在下に抗菌アッセイを行ったところ、大腸菌、マイコプラズマでは抗菌活性が阻害されたが、黄色ブドウ球菌では阻害を認めなかった。本年度、黄色ブドウ球菌が活性酸素を産生しているにも拘わらず、hydroxyl radicalの除去剤による抗菌活性阻害を認めなかったことから、カタラーゼの関与を検討するため、抗菌ペプチド処理した黄色ブドウ球菌、大腸菌のカタラーゼ産生を調べた。抗菌ペプチド処理により、黄色ブドウ球菌は有意にカタラーゼを産生した。その産生量は大腸菌のそれと比較して有意に高かった。即ち、黄色ブドウ球菌ではカタラーゼが抗菌ペプチドにより誘導された過酸化水素を分解するため、活性酸素はその細胞死誘導に強く関与しないと推定する。以上より、抗菌ペプチドは膜透過性亢進、および活性酸素(hydroxyl radical等)による抗菌機構を有することを明らかにした。しかし、菌のカタラーゼ産生レベルが抗菌ペプチドの活性酸素依存性抗菌活性に影響することを見出した。
樹体内炭素動態に基づいた森林土壌の炭素放出プロセスの解明

光合成により樹木に取り込まれた炭素は、幹や根・菌根菌(根圏)に配分・呼吸として再放出されるのに加え、根圏から炭素を分泌(滲出物)し、根圏まわりの土壌有機物分解を促進する。炭素収支研究では、測定手法の限界から光合成由来の炭素を介した土壌炭素放出プロセスの把握は進んでいない。本研究では、樹木の葉群から菌根菌糸に至る各部位の炭素吸収・放出速度を網羅的かつ高頻度で測定できる手法と樹体内炭素動態を測定できるパルスラベリング法を用いて、樹木全体の炭素吸収・放出速度の環境応答特性を評価し、樹体内炭素動態と関連付けることで、地上部ー地下部生態系間のつながりに着目した森林土壌炭素放出プロセスを定量的に解明する。
知的統合生産システム(ICIM)のモデル化と知識ベ-スに関する研究

今年度の研究の主な成果は以下のようにまとめられる.1.ICIMの主な構成要素であるCAD、CAPP、CAM、CAPMに共通して使用しうる製品モデル、機械、設備モデル、工場モデル、管理モデルの基本仕様を分析し、構造化手法に基づく基本参照モデルの作成を行なった。2.ICIMに対する国内外の研究動向の調査・分析を行い,モデル化の観点から体系化を行なった.また,構築に必要なツ-ル群に対して調査,検討を行い、ICIMの静的な機能構造と振舞いの双方をモデル化する手法を実現し、記述ツ-ルの作成を行なった.3.オブジェクト指向デ-タベ-スシステム(OODBS)のICIMへの適用可能性を分析し,デ-タベ-スに要求される基本機能の提案を行なった。4.ICIMにおけるrapid manufacturingを実現する実体モデル作成機のプロトタイプの試作を行い,その有効性の検証を行なった.さらに今後の研究の発展方向としては,現在,その必要性が盛んに叫ばれているコンカレント・エンジニアリング(concurrent engineering)の概念と本研究において取り扱ったICIMとの融合化の方法論と、情報インフラストラクチャの確立があげられる。本研究の本年度の研究実績をまとめると,以下の通りである.1.生産に関わるモデルの統合に関する調査・検討知的統合生産システムにおける各アクティビティ(CAD/CAPP/CAM/FMS/工場内移動/工場管理)のそれぞれについて,これまでの研究・開発動向の調査を行い,それぞれのモデルの相関について検討を行なった.2.ICIMのモデル化ICIMの構築のためのモデルの検討を,購入したマッキントッシュ上においてシミュレ-ションシステムならびにシステム仕様記述システムを用いて行なった.またシステム構築の際の中核となる統合デ-タベ-スに必要とされる基本用件(デ-タと操作の融合,デ-タの永続性,デ-タの階層性等々)を明らかにした.3.デ-タベ-ス・システムの検討国内外における統合システムのためのデ-タベ-ス・システムに関して,その研究・開発動向について調査を行なった.とくに,オブジェクト指向デ-タベ-スシステムの代表的なものについて調査を行い,その利用可能性を検討した.4.実体3次元モデル作成機のインタフェ-スの作成購入した実体3次元モデル作成機をコントロ-ルするためのセンサならびに計算機システムとのインタフェ-スを開発した.今年度の研究の主な成果は以下のようにまとめられる.1.ICIMの主な構成要素であるCAD、CAPP、CAM、CAPMに共通して使用しうる製品モデル、機械・設備モデル、工場モデル、管理モデルの基本仕様を分析し、構造化手法に基づく基本参照モデルの作成を行なった。2.ICIMに対する国内外の研究動向の調査・分析を行い,モデル化の観点から体系化を行なった.また,構築に必要なツ-ル群に対して調査,検討を行い、ICIMの静的な機能構造と振舞いの双方をモデル化する手法を実現し、記述ツ-ルの作成を行なった.3.オブジェクト指向デ-タベ-スシステム(OODBS)のICIMへの適用可能性を析し,デ-タベ-スに要求される基本機能の提案を行なった。4.ICIMにおけるrapid manufacturingを実現する実体モデル作成機のプロトタイプの試作を行い,その有効性の検証を行なった.さらに今後の研究の発展方向としては,現在,その必要性が盛んに叫ばれているコンカレント・エンジニアリング(concurrent engineering)の概念と本研究において取扱ったICIMとの融合化の方法論と、情報インフラストラクチャの確立があげられる。
機能進化ゲノミクス：進化解析を用いた共生遺伝子のゲノム網羅的探索とその実験的検証

根粒形成や窒素固定を伴うマメと根粒菌の相互作用にとって、重要な役割をもつ共生遺伝子群は、他の一般的遺伝子とは異なる、特別な進化を経てきた可能性がある。様々なバクテリアのゲノム情報を比較して、この特別な進化をたどることで、根粒菌に特異的と考えられる共生遺伝子を新しく推定し、その進化を解析した。その結果、従来αプロテオバクテリア起源と考えられてきたマメ科根粒菌の起源が、βプロテオバクテリアにあるであろうことを発見した。さらに、今まで共生機能が知られていなかった遺伝子の中に、根粒菌に特徴的な分子進化を経た可能性があるものがあることがわかった。これらへの遺伝子破壊により共生機能の確認を行っている。1万を超えるゲノム計画が進み莫大な配列情報が蓄積する現在、従来の比較ゲノミクスでなされてきた「配列類似性による遺伝子機能推定」を拡充した解析法が望まれている(Eisenberg et al. 2000, Nature)。そこで本研究では新しく『進化的特徴の類似性に基づく遺伝子機能推定法』を開発することにより、機能進化ゲノミクス(Functional Evolutionary Genomics)分野を展開したいと考えている。ここでは『注目する形質にとって重要な遺伝子と同じ進化的特徴をもつ(機能未知)遺伝子を、ゲノムを網羅して数理的に探索し、実験的に形質への関与(機能)を検証すること』を具体的目標とする。ここから本研究の目的は(1)分子生物学的には「機能未知遺伝子の進化的機能推定法の開発」(2)進化学的には「推定遺伝子の祖先機能復元実験による進化理論の実証」となる。本研究は平成18-19年度特定領域研究比較ゲノム「遺伝子水平伝播による共生系の起源と進化の統合的解析-理論的推定および実験的検証-」(代表者青木誠志郎)を拡張し、機能と進化の分野を繋げ、数理と実験を解析の両輪とする複合研究を目指している。本課題の成果として、まず系統樹トポロジー解析の試行的な結果が挙げられる。共生関連遺伝子群(nod遺伝子群)の数多くの特徴のうち、遺伝子水平移行による感染機能伝播に焦点を当てた計算を行い、既知の根粒菌感染遺伝子nodA-nodZの23遺伝子のうち18遺伝子が根粒菌における共生機能に特有の性質を持つことが予測できた。また転写因子やアデニル酸サイクレースを含め数多くの生理機能未知の遺伝子を新たな共生関連遺伝子として推定できた。現在、遺伝子重複や平行進化自然選択に注目した探索アルゴリズムを開発し、さらに新規な共生関連遺伝子を発見しつつある。次にこれらの推定は、本当に新しい共生関連遺伝子を発見し得たのかについて、推定遺伝子の遺伝子破壊を菌に施し、得られた遺伝子破壊菌株を感染させることで実験的検証を行った。そして遺伝子破壊と感染実験系の導入に成功し、いくつかの試行的な実験結果を得た。本研究以前の多くの研究で見つかった共生関連遺伝子はその破壊により根粒形成能力が低下することがわかっている。本研究でもそのような感染数低下型の遺伝子がいくつか見つかったが、その逆に遺伝子破壊により感染数が増える遺伝子を発見した。根粒の半径を測定したところ、野生株よりも遺伝子破壊株の方が、半径は小さくなるという結果を得た。これはホスト側の表現型可塑性戦略により、1つあたりの根粒菌共生体積の減少が感染数で補償されている可能性を示している。さらに本課題この仮説の検証とともに、数多くのその他の遺伝子の機能も大量遺伝子破壊により現在解析を行っている。共生関連遺伝子の進化的特徴の解析を行なった。多くのnod遺伝子に根粒菌での単系統性が見つかった。またnod遺伝子群全体の転写因子として鋤くnodD遺伝子には,遺伝子重複がみつかった。Nod因子の基質となる単糖の合成に働くnodM遺伝子には、2つの独立な系統における遺伝子機能の平行進化が、Nod因子の宿主特異的な修飾に働くnodEF遺伝子群において、遺伝子水平移行に伴う宿主特異性進化が起きたことが推定された。このような共生遺伝子の特徴のうち、遺伝子水平移行と遺伝子重複に焦点を当て、23個の根粒形成遺伝子nodA-Zについて解析したところ、18遺伝子が本研究の方法で予測可能であることがわかった。そこでMesorhlzobiumゲノムの遺伝子配列を用い100種強のバクテリアと比較ゲノム解析した結果、nod遺伝子以外に共生アイランド全体の検出に成功した。一方でこの領域内に数多くの共生とは関係のないハウスキーピング遺伝子の存在が推測され、ここから複数回の共生アイランド水平移行とゲノム内遺伝子転移の可能性が示された。さらに本解析による機能推定により1つ1つの共生関連遺伝子(nod,nol,nif,fix genes)の検出に成功し、また共生アイランドの外に今まで共生への関与が知られていなかった数多くの遺伝子が発見された。

本当に新しい共生関連遺伝子が、これらの推定で発見し得たのかどうかを調べるため、推定遺伝子の遺伝子破壊菌株を作成し、植物に感染させている。その結果、いくつかの遺伝子でその破壊により根粒数の減少が見受けられた。また逆に遺伝子破娘により着生数が増える遺伝子がいくつも見つかった。根粒菌着生域の半径を測定したところ、根粒数が減少した時には根粒体積が大きくなり、逆に増加した時には体積が減少する事がわかった。数と体積にみうけられる反比例の関係に注目しさらに解析を続けている。本解析により、いくつかの共生関連遺伝子に特有な進化的特徴がみつかった。これまでに遺伝子重複と正の自然選択、遺伝子機能の平行進化、遺伝子水平移行に伴う宿主特異性進化のような進化現象を見つけている。特に本年度は遺伝子の重複と水平移行について論文執筆のための詳しい解析を行った。既知の根粒菌感染遺伝子nodA-nodZについて解析したところ、23遺伝子のうち数遺伝子についてはっきりとした重複起源が解析でき、その後の水平移行についても追跡可能であることがわかった。また、先年より続けているMesorhizobiumゲノムの全蛋白質を用いた解析を続けた結果、共生アイランド全体の詳しい検出に成功した。一方でこの領域内に数多くの共生とは関係のないハウスキーピング遺伝子の存在が推測され、ここから複数回の共生アイランド水平移行とゲノム内遺伝子転移の可能性が示された。さらに本解析による機能推定は1つ1つの共生関連遺伝子の検出に成功し、他にも共生アイランドの外に今まで共生への関与が知られていなかった数多くの遺伝子を見つけることに成功しつつある。これまでに、これらの推定で、本当に新しい共生関連遺伝子を発見し得たのかどうかを調べるため、それら推定遺伝子の遺伝子破壊菌株を作成してきた。植物に感染させ、共生機能の実験的検証を行ったところ、新しい結果が得られつつある。過去の多くの研究で見つかった共生関連遺伝子では、その破壊により根粒形成能力が低下することがわかっている。本研究の推定遺伝子の破壊でも、確かにそのような感染数低下型の遺伝子がいくつか見つかったが、逆に遺伝子破壊により感染数が増える遺伝子を発見した。さらに本課題では、数多くのその他の遺伝子の機能について、大量遺伝子破壊により解析する予定である。共生関連遺伝子の進化的特徴の解析により、nod遺伝子群の起源とその後の進化過程についての解析を行った。とくに共通nod遺伝子群への解析を行い、この遺伝子群の特徴のうち、遺伝子水平移行と遺伝子重複に焦点を当て、23個の根粒形成遺伝子nodA-Zについて解析したところ、18遺伝子が本研究の方法で予測可能であることがわかった。そこでMesorhizobiumゲノムの遺伝子配列を用い100種強のバクテリアと比較ゲノム解析し、共生アイランド全体の検出に成功した。この領域内に数多くの共生とは関係のないハウスキーピング遺伝子の存在が推測され、ここから複数回の共生アイランド水平移行とゲノム内遺伝子転移の可能性が示された。
肝吸虫による胆管癌についてのメコン川流域と中国西江流域の分子疫学的比較研究

肝吸虫感染は胆管癌の重要なリスク要因である。タイ肝吸虫感染関連胆管癌33例患者、散発性胆管癌98例患者、正常肝臓21例の病理組織において、がん幹細胞マーカーCD44v9を免疫組織染色法により検出した。CD44v9は正常胆管細胞では染色性を示さなかったが、胆管癌組織においては散発性胆管癌、タイ肝吸虫感染胆管癌ともに陽性であった。タイ肝吸虫感染胆管癌においては散発性に比べ有意に高いCD44v9陽性率であった。より強い炎症が幹細胞を誘導する可能性が示された(Mediators of Inflammation. 2018)。中国西江流域肝吸虫(CS)感染関連胆管癌16例患者の病理組織において、CD44v9、SOX9および炎症誘発性サイトカインHMGB1を免疫組織染色法により検出した。CD44v9は胆管癌組織においてはCS肝吸虫感染胆管癌は散発性胆管癌に比べ有意に高いCD44v9陽性率であった。SOX9、HMGB1はCS感染関連胆管癌細胞では強い染色性であった。CS感染により強い炎症が幹細胞および炎症性サイトカインを誘導する可能性が示された。また、CS関連胆管癌細胞ではより強い8-ニトログアニンの陽性発現であった。慢性的な酸化・ニトロ化ストレスが胆管細胞のDNA損傷を起こし、幹細胞における遺伝子損傷が発がんの分子機構の一端を担うことが示唆された。CS感染ラットモデルの作製に成功し、肝臓において感染させた各時期にCSの寄生を確認した。HMGB1、CK19、SOX9などの発現を解析している。SOX9、HMGB1はラット肝臓において、CS感染後45日から異常に増生した胆管上皮細胞に強い発現が確認された。肝吸虫感染による胆管細胞は、幹細胞マーカーであるCD44v9、CK19、およびDNA損傷塩基である8-oxodGと8-ニトログアニンの局在が一致していることを示した。タイ肝吸虫感染Opisthorchis viverrini関連胆管癌での新規バイオマーカーCD44v9発現と強い炎症が肝細胞を誘導する可能性を明らかにし、国際学術雑誌に発表した。また、Clonorchis sinensis感染関連胆管癌においてSOX9、CK19、HMGB1が発現異常を惹起し、がん幹細胞に寄与する可能性を示した。炎症関連発がんにおける炎症と幹細胞の関与を示す結果を得ており、研究はおおむね順調に進展していると考える。1. Clonorchis sinensisとOpisthorchis viverriniが炎症関連における幹細胞異常・がん幹細胞の発現の役割解明と予防法を検討する。2. Clonorchis sinensisとOpisthorchis viverrini感染関連胆管癌における早期発見のバイオマーカー候補を探索する。川魚を生で食べる習慣がある中国西江流域とタイ東北部やラオス中南部にかけてのメコン川流域は、肝吸虫の感染率が高く、胆管癌の多発地域である。平成29年度は、タイと中国で肝吸虫関連肝内胆管癌患者の生体試料収集を行った。インフォームドコンセントを得て、タイおよび中国の肝吸虫患者から手術検体を採取した。新規がん幹細胞バイオマーカー発現に注目し、タイの肝吸虫(OV)と中国の肝吸虫(CS)の肝内胆管癌患者群の病理組織において、有意に差があるがん幹細胞バイオマーカーを見出した。CS関連発がん91症例の中には肝癌合併慢性B型肝炎症例が多く、胆管癌の発症は2割程度であった。OV関連肝内胆管癌患者の検体は78症例を収集した。これらの検体からOVとCSに関連する胆管癌の新規がん幹細胞マーカーの検索を行った。OV、特にCS関連胆管癌細胞において、局在と高発現がみられるがん幹細胞マーカーを確認した。今までのOV研究結果を踏まえて、CS関連胆管癌細胞にニトロ化DNA損傷、炎症バイオマーカーなどの増強を確認した。また、CSは中国において現地調査を行い、西江流域の淡水魚から得たCS幼生のメタセルカリアをSDラットに経口感染させることに成功した。CS感染による発癌過程との関連性および予後因子としての役割の解析を進めている。平成29年度は予定通りに研究を行った。中国のCSおよびタイ国のOV流行地域において、肝吸虫に関連する肝内胆管癌患者の癌組織および一部血清サンプルの採集、新規癌幹細胞マーカーおよび炎症バイオマーカーなどの免疫染色の観察・データ解析は順調に進んでいる。中国のCS感染淡水魚からメタセルカリアをSDラットに経口感染させ、CS感染実験動物モデル作製に成功したことから、今後、胆管癌患者のサンプルに加えて、動物モデルをもちいて、感染過程における発がんバイオマーカーの変化を解析する研究が実施可能になった。

中国西江流域肝吸虫(CS)感染関連胆管癌16例患者の病理組織において、CD44v9、SOX9および炎症誘発性サイトカインHMGB1を免疫組織染色法により検出した。CD44v9は胆管癌組織においてはCS肝吸虫感染胆管癌は散発性胆管癌に比べ有意に高いCD44v9陽性率であった。SOX9、HMGB1はCS感染関連胆管癌細胞では強い染色性であった。CS感染により強い炎症が幹細胞および炎症性サイトカインを誘導する可能性が示された。また、CS関連胆管癌細胞ではより強い8-ニトログアニンの陽性発現であった。慢性的な酸化・ニトロ化ストレスが胆管細胞のDNA損傷を起こし、幹細胞における遺伝子損傷が発がんの分子機構の一端を担うことが示唆された。CS感染ラットモデルの作製に成功し、肝臓において感染させた各時期にCSの寄生を確認した。HMGB1、CK19、SOX9などの発現を解析している。SOX9、HMGB1はラット肝臓において、CS感染後45日から異常に増生した胆管上皮細胞に強い発現が確認された。肝吸虫感染による胆管細胞は、幹細胞マーカーであるCD44v9、CK19、およびDNA損傷塩基である8-oxodGと8-ニトログアニンの局在が一致していることを示した。タイ肝吸虫感染Opisthorchis viverrini関連胆管癌での新規バイオマーカーCD44v9発現と強い炎症が肝細胞を誘導する可能性を明らかにし、国際学術雑誌に発表した。また、Clonorchis sinensis感染関連胆管癌においてSOX9、CK19、HMGB1が発現異常を惹起し、がん幹細胞に寄与する可能性を示した。炎症関連発がんにおける炎症と幹細胞の関与を示す結果を得ており、研究はおおむね順調に進展していると考える。調査地域において、肝内胆管癌患者の癌組織・血清および感染者のサンプルを収集し、発がん関係バイオマーカーを測定する。また、我々が蓄積したOVと胆管癌に関する分子疫学的研究成果をもとに比較することにより、CSのB型肝炎重複感染やCS感染の流行状況、胆管癌の発生状況、他リスク因子の寄与度と胆管癌との相関を分析する。CS関連胆管癌やリスク要因とバイオマーカーとの関連を解析し、CSとOVに共通するマーカーを選別し、感染・炎症関連発がんのリスク評価の応用をめざす。1. Clonorchis sinensisとOpisthorchis viverriniが炎症関連における幹細胞異常・がん幹細胞の発現の役割解明と予防法を検討する。2. Clonorchis sinensisとOpisthorchis viverrini感染関連胆管癌における早期発見のバイオマーカー候補を探索する。
多種部位深部加温を目的としたリエントラント型ハイパーサーミアシステムの構築

本研究では、多種部位深部癌の非接触加温治療を目的として、リエントラント型ハイパーサーミアシステムを開発した。以下に、本研究で得られた主な研究成果は、以下に示すとおりである。(1)3次元有限要素法による電磁界分布計算および温度分布解析結果から、本加温方式の有効性を示し、本加温システムで用いるリエントラント型空胴共振器の設計・試作を行った。(2)深部腫瘍の加温治療を目的とした空胴共振器を試作した。・本加温システムは、空胴共振器、インピーダンス整合器、高周波増幅器、励振用アンテナ、およびコンピュータから構成されている。・コンピュータ・シミュレーションおよびその加温実験結果から、異なる共振モード(TM010およびTM012-like-mode)を用いることによって、非接触状態で、しかも直径25cm程度の深部種瘍の加温が可能であることを示した。・加温対象の設置する位置を移動することによって、ホットスポットの発生する位置を制御することが可能である。・コンピュータ・シミュレーション結果と加温実験結果との比較結果を述べた。共振周波数は、誤差1%以内で一致した。また温度分布は、10%程度以内で一致した。(3)電磁波の影響が大きな社会問題となっているが、本試作システムの漏れ電磁界は、環境への影響は殆どないことが分かった。以上のことから、本加温システムによれば、様々な部位の腫瘍を、その位置および大きさに応じて非接触状態で有効に加温可能であることを示した。本研究では、多種部位深部癌の非接触加温治療を目指して、リエントラント型ハイパーサーミアシステムの設計・試作を目的としている。以下に、本年度の主な成果を示す。(1)形状可変空胴共振器内の電磁界分布の理論的検討:3次元有限要素法プログラム(JMAG-Studio)を用いた電磁界解析を行い、空胴共振器の形状と共振周波数および共振時の電磁界分布パターンとの関係を明らかにし、共振器の設計・試作の可能性を確認した。(2)周波数および形状可変空胴共振器ならびに励振用アンテナの設計・試作:(1)での解析結果をもとに、アルミ製のリエントラント型空胴共振器を設計・試作した。さらに、空胴共振器内部に電磁波を励振するためのループアンテナを設計・試作し、空胴共振器内部に組み込んだ。(3)インピーダンス整合器および広帯域高周波電源装置の設計・試作、システム制御用ソフトウェアの開発:市販のインピーダンス整合器、高周波アンプをベースに、高周波電力を空胴共振器内部で有効に消費するための整合器、深部腫瘍を4344°C程度に加温するための広帯域高周波アンプを試作した。さらに、共振器内部の内円筒の移動およびシステムを制御するためのソフトウェアを開発した。(4)基礎加温実験:頭部、肝部および胃部の腫瘍を模擬した寒天ファントムを自作し、本試作加温システムによる加温実験を実施した。赤外線熱画像装置および光ファイバ温度計を用いた温度計測結果から、本試作加温システムによれば、人体深部の様々な部位に生じた腫瘍を加温できる可能性のあることを確認することができ、本年度の目標を達成できたと考えている。本研究では,多種部位深部癌の非接触加温治療を目指して,リエントラント型ハイパーサーミアシステムの設計試作を目的としている,以下に、本年度の主な成果を示す.1.空胴共振器型加温システムによる加温実験試作・開発した加温装置について,人体各部の形状等を考慮した人体等価寒天ファントムを自作し,これを用いた加温実験を実施した.(1)胴体ファントムの加温:人体の胴体程度の大きさを有する寒天を作成し,この寒天の周囲に脂肪層を巻き付けた.そして,直径80cm,高さ80cmの空胴共振器を用いて加温実験を実施し,基礎データを収集した.その結果,脂肪層の異常加温は発生せず,胴体深部を楕円状に加温できることを確認した.

(2)頭部ファントムの加温:人体の頭部程度の大きさを有する寒天を作成し,加温を実施した.使用した空胴共振器は,頭部専用を予定しており,直径40cm,高さ80cmである.その結果,ファントム内部を同心円状に深部加温できることを確認した.(3)環境への漏れ電磁波の測定:空胴共振器側面に設けたウインドウからの漏れ電磁波を測定した.ウインドウ部から20cm程度離れた遠方では,15V/m以下であることを確認した.2.研究総括人体の頭部および胴体程度の大きさを有するファントムの模擬臨床加温実験を実施し,本試作加温システムの基本的な非接触深部加温特性を明らかにした.更なる目標として,他の共振周波数における加温パターンを検討する予定である.本研究では,多種部位深部癌の非接触加温治療を目指して,リエントラント型ハイパーサーミアシステムの設計試作を目的としている.以下に,本年度の主な成果を示す.1,空胴共振器型加温システムによる総合評価実験(1)胴体ファントムの加温:直径140cm,高さ100cm,8分割式空胴共振器を作成し,人体胴体部程度の大きさを有する寒天ファントムに対して,加温実験およびコンピュータシミュレーションの両面からその深部を非接触状態で有効に加温できることを確認した.(2)頭部ファントムの加温:前年度までに試作した直径40cm,高さ80cmの小型空胴共振器を用いて,加温実験およびコンピュータシミュレーションの両面から,複数の共振周波数に応じた異なる加温パターンの得られることを初めて実証した.(3)周囲への漏れ電磁界の影響:上記(1)および(2)で試作した空胴共振器の側面に,人体挿入用の円形ウインドウを設けた.このウインドウ部から周囲へ漏れ出る電磁界の検討を行った.その結果,周囲20cm程度離れた空間での漏れ電界強度は15V/m以下であることを確認した.2.研究総括本研究の最終年度である本年度は,本試作加温装置の総合評価から臨床応用への可能性を検討した.その結果,所期の研究目的を達成することができ,工学的には臨床応用に近いと確信している.今後,次の研究課題として,医学部との連携をさらに確立し,臨床試験を目指したいと考えている.さらに,関連学会において,本研究成果を発表した際に,非接触状態で深部加温が可能であることから,糖尿病に対しても,有効な治療が期待できるとの評価を得た.早急に取り組みたいと考えている.
ICEファミリープロテアーゼ阻害剤によるX線誘発アポトーシスの機構の解析

ヒトT細胞型白血病由来MOLT-4細胞のX線誘発アポトーシスは、胸腺細胞の場合と類似点が多い。本研究では、多様なX綿誘発アポトーシスの1つの機構を明らかにするため、MOLT-4細胞におけるp53依存性アボトーシスに対するICEファミリープロテアーゼ(caspases)の関与の解析を行った。1. p53の蓄積、ICEファミリープロテアーゼ(caspases)の阻害とX線誘発アポトーシスの関係MOLT-4細胞ではアポトーシスに先行してX線によるp53蛋白質の蓄積がおこるが、この蓄積は、p53蛋白質の分解速度の低下によること、アポトーシスの発現にcaspase-1は関与しないが、caspase-3が関与することおよび、caspase-3阻害剤であるAc-DEVD-CHO処理によりX線照射後のcaspase-3活性上昇が抑制されること、またこの阻害剤存在下でX線照射を行うとp53蛋白質の蓄積が認められることを明らかにした。以上の結果よりp53の下流にcaspase-3が作用することか示唆された。2. caspase-3阻害剤によるアポトーシスの抑制と細胞死の解析MOLT-4細胞におけるX線誘発アポトーシスの場合、caspase-3阻害剤は、DNAラダー形成および色素排除能テストによる細胞死を著しく抑制する。このアポトーシス抑制効果が一時的なもので細胞増殖の回復を示すものかどうかという点について検討した。caspase-3阻害剤投与によりエリスロシン染色で検出される細胞死の誘導が抑制され、ギムザ染色像からアポトーシス像とは異なる(正常とも異なる)像が認められた。一方、細胞死をコロニー形成により検討した結果、caspase-3阻害剤存在下X線照射による死細胞率の軽減はなかった。この系において、caspase-3は形態的なアポトーシスの誘導に関与するが、細胞死の決定はcaspase-3より上流でなされていることが明らかとなった。ヒトT細胞型白血病由来MOLT-4細胞はX線によりアポトーシスを示す。X線誘発アポトーシスの機構を明らかにするため、胸腺細胞のX線誘発アポトーシスのモデル系としてMOLT-4細胞を用い、本年度は1.p53蓄積機構の解析と、2.ICEファミリープロテアーゼ(caspase)の関与の解析を行った。1.p53蓄積機構の解析X線照射後MOLT-4細胞では、X線感受性の異なるサブクローンMOLT-4N1、N2ともにアポトーシスに先行してp53蛋白質の増加がみられる。この増加はmRNAの誘導合成を伴うものではないことから、X線はp53mRNA量の変化をおこさず、蛋白量を増加させることが明らかとなった。また、蛋白合成阻害剤シクロヘキシミドによる合成阻害時のp53蛋白量の変化およびRI標識アミノ酸によりラベルしたp53蛋白質の免疫沈降により、p53蛋白質蓄積はX線による分解速度の低下に困ることが示唆された。ICEファミリープロテアーゼは、現在caspaseと呼ばれている。caspase-1の阻害剤YVAD-CHOとcaspase-3の阻害剤DEVD-CHOを用いて、MOLT-4細胞のX線誘発アポトーシスへの抑制効果について検討した。DNAラダーの検出および色素排除能テストによりアポトーシスへの影響を検討した。YVAD-CHOにはアポトーシスへの抑制効果はなく、DEVD-CHOでは、濃度に依存してアポトーシスが抑制された。この系におけるアポトーシスでは、caspase-1ではなく、caspase-3の関与が重要であると考えられる。
抗原・抗体間相互作用におけるタンパク質の動的構造変化の解明

抗体は様々な分子を識別し、結合するタンパク質で、タンパク質の動的構造変化の解明に向けて、格好の研究対象と言える。本研究では、抗原タンパク質を化学修飾法やジスルフィド結合を欠損させることで、その構造を変化させ、この変化を抗体が如何に識別するかを、主に速度論的、及び熱力学的に解析した。その結果、タンパク質が溶液中で存在する複数の構造体、すなわち揺らぎの寄与を、数値として定量化することに成功した。Hen Egg Lysozyme (HEL)の各S-S結合を欠損させた4種類の変異体の大腸菌発現糸を構築し、各精製タンパク質を得た。センサーチップ上に固定化した4種類の抗HEL抗体(ハイブリドーマ細胞から調製)との分子間相互作用を、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて解析した結果、いくつかの抗原抗体の組み合わせで、明らかに野生型HEL結合との違いが認められた。また還元アルキル化したHELと抗体の相互作用解析も行ったところ、結合速度依存的な結合力の低下が認められ、HELの結合構造の存在確率に依存する「population-shift」型の結合機構が示唆された。特にX線結晶構造ではnative HELと同様と報告された1つのアルキル化HELに対して、4種類の抗体の1つでは、明らかな結合力の低下が認められた。同抗体はそのアルキル化部位近傍を認識しており、結晶構造として観測される最安定構造ではなく、溶液中で存在する「ある結合構造」を特異的に認識することが明らかになった。また一般的にもタンパク質抗原の構造依存性エピトープの同定は困難であることを鑑み、本対象抗体のHEL上の抗体認識部位を簡便に同定すべく、重水素交換法と質量分析法を組み合わせた手法の開発に取り組んだ。その最初の段階として、HELをペプシンにより断片化する最適条件を決め、さらにHEL単独時と抗体との複合体形成時の重水素交換経時変化を解析した。後者については、最大で6Daの質量差が認められ、これはエピトープが抗体によりマスクされた差に相当すると考えられる。試料調製にあたり、Hen Egg Lysozyme(HEL)の各S-S結合を欠損させた4種類の変異体の調製に成功したが、NMR測定ラベル化試料用としての効率的調製に難航しており、さらに大腸菌発現後の巻き戻し効率の改善が必要となっている。一方、化学修飾や熱処理したHELやovalbumin(OVA)の調製は予定通り成功した。また抗体のsingle-chain Fv(scFv)について、HEL同様に巻き戻し効率のさらなる改善は必要なものの、表面プラズモン共鳴(SPR)解析には十分な精製タンパク質を得ることができた。質量分析法による抗体のエピトープ解析について、一連の実験条件を確立できたので、平成24年度には、モデル系となる抗原抗体複合体に適用する。抗原抗体間相互作用について、主にSPRと等温滴定型熱量計(ITC)を用いた解析を行い、特に各種HELと4種類の抗HEL抗体(ハイブリドーマ細胞から調製)との結合で、興味深い知見が得られた。その1つとして、酸性条件下で熱変性処理したHELとの結合は、未処理HEL結合に比べて、結合エントロピー量が不利に働いたことから、HEL中での揺らぎの程度の違いが示唆された。さらに同処理したHELの結晶化に成功し、X線構造解析を行ったところ、Asp101とGly102の間のペプチド結合部位に違いが認められた。今後はさらに、同抗体のエピトープ解析と並行して、立体構造と結合熱力学量や速度論量との相関を明らかにしていく。蛋白質抗原として、Hen Egg Lysozyme(HEL)とOvalbumin (OVA)を、ハプテン抗原としてニトロフェニル基(NP)を対象とし、それぞれに対するモノクローナル抗体との分子間相互作用解析から、各蛋白質抗原や抗体蛋白質の動的挙動の解明を目指した。1)HELについて、酸性pHでは熱変性後も可逆的に巻き戻るとされているが、同処理した酸変性HELと抗体の結合を、等温滴定型熱量計を用いて解析したところ、結合エントロピー変化量は不利に働き、これを補完するように結合エンタルピー変化量が有利に働くことが明らかになった。これはX線結晶構造解析結果として、酸変性HELでは少なくとも2種類の立体構造の混合物であることから、蛋白質が本来、溶液中で取りうる複数の構造を捉え得たものと考えられる。2)OVAについて、アルカリ処理で得られるS-OVAと、新規に取得した14種類の抗OVA抗体との分子間相互作用を、主に表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて解析した。その結果、すべての抗体がOVAとS-OVAを厳密に識別しており、うち4種類の抗体はS-OVAに対する結合力を失っていた。OVAとS-OVAの結晶構造は、Ser 3残基が異性化構造をとること以外、ほぼ同一であることから、これら部位特異的な構造の違い、あるいはその影響による動的構造の違いを、抗体が識別するものと考えられる。3)抗NP抗体の一本鎖Fv抗体を大腸菌発現系を用いて新規に調製し、そのマイクロ秒からミリ秒スケールの動的挙動を高速X線1分子追跡法により解析した。

親和性成熟前後の抗体、及び抗原結合前後の抗体の動的挙動を比較すると、成熟前の抗体、及び抗原結合前で、より大きな動きが観測された。この結果は、成熟前の抗体が結合力は弱いものの抗原を捕捉しやすい柔らかい状態にあり、抗原結合後は固い状態に移行する動的挙動変化を示唆する。HEL変異体の大量調製に難航しているものの、熱処理HELの立体構造や分子間相互作用解析において、興味深い知見が得られたことから、全体としては「おおむね順調に進展している」と判断される。24年度が最終年度であるため、記入しない。HELやOVAの各種変異体や化学修飾体と、抗体との分子間相互作用解析を行い、各抗原の立体構造情報と結合速度や熱力学情報とを相関付け、特にタンパク質の動的構造変化の解明を目指す。さらに抗体のscFvを利用して、高速X線1分子追跡法やthree pulse photonechoshift測定なども行い、抗原結合に伴う各抗体の動的構造解析を行う。