hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
仕上げエンドミル加工における過大切削抵抗抑制のための追加工工程自動計画手法の開発

本研究では、NC切削加工における新しい工程自動計画法の開発を目的とする。具体的には事前切削抵抗予測技術の開発と、削り残し領域を対象とした追加工時の工程自動計画アルゴリズムの開発を行った。期間中には、軸加減速を考慮した工具送り速度、比切削抵抗パラメータの推定手法を開発し、過大な切削抵抗が作用する除去予定領域を事前予測によって推定し、工具姿勢変更によって抵抗の作用を回避するシステムを開発した。本研究では、数値制御工作機械(NC工作機械)による精密部品加工を対象とした新しい追加工工程自動計画法の開発を目標としている。具体的には、切削抵抗および加工対象物の形状シミュレーション技術の開発と、これを用いて、仕上げ加工時に過大な切削抵抗発生の原因となる削り残し領域に対する追加工工程の自動計画アルゴリズムを実現することを目的としている。平成25年度には、過去の研究において開発した切削抵抗予測技術と、加工対象物の形状シミュレーション技術を連携させ、荒加工時に除去された領域に対して、作用トルクの最大値を履歴として記憶するシステムの開発を行った。素材形状をボクセルと呼ばれる離散空間に分割し、これらの各領域に対する工具通過軌跡との干渉状態を逐次更新することによって、切削抵抗が過大に作用する箇所を全行程のうちから特定することを可能とした。また、追加工工程の計画に際しては、その際に作用する切削抵抗が最少となる工具経路、姿勢を決定する必要がある。これについて、25年度の研究ではボールエンドミルを用いた同時多軸制御加工を対象に、作用トルクが最少となる工具姿勢をシミュレーションによって比較し、探索的に計画を実施するアルゴリズムの検討を行い、計画システムの試作を行った。開発したシステムでは、初期の工具姿勢案に対してその周囲に複数の姿勢候補を設定し、これらの新しい候補における作用トルクの最大値と、工具軸等の周辺環境との干渉を逐次調査して新しい工具姿勢候補の生成を繰り返し行う。これらの幾何形状処理や切削抵抗予測は並列計算デバイス上で実施され、短時間で工具姿勢を変更して切削抵抗を低減することが変更が可能となっている。平成26年度には、前年度の研究において作用トルクの最大値を導出する際に、切削抵抗予測値の正確さを担保するために必要になると判断された、工具送り速度の指令値からの変動の事前予測手法と、切削実験結果からの比切削抵抗値の高速な導出システムの開発をそれぞれ行った。そして、これらを用いてボクセル形状表現において各ボクセル空間を工具が除去する際に作用したトルクの履歴情報を記録する手法を開発した。設定された値よりも大きな作用トルクが発生する工具経路上の通過位置の前後を対象として、25年度の研究において開発した姿勢変更手法、および26年度の研究で開発した干渉の生じない工具経路の設定手法を適用することにより、仕上げ加工時のポケット形状等に対する急激な作用力の増加を防止する工具経路計画システムの開発を行い、計算機実験による検証を行った。生産工学平成25年度中には、金型等の大型の加工対象物を対象とした高速な切削抵抗技術を利用して、工具経路上の各瞬間における切削抵抗の予測が現実的な時間内にできるようシステムの改良を行った。工具経路と加工対象物の初期形状を構成する各部分との相対位置を追跡可能とすることで、切削抵抗が各部に作用した履歴情報を記録することが可能となり、仕上げ加工時に除去が必要となる削り残し領域の特定が実現されている。また、当初計画では特定の工具姿勢からの削り残し領域の除去工程計画法の開発を先に実施する予定であったが、研究の順序を変更し、先にボールエンドミルを用いた同時多軸制御加工における削り残し領域除去の際の工具姿勢計画法の実装を行った。こちらについては計算機実験において十分な成果が得られており、今後、この手法に工具移動中の工具姿勢が変化しない制約を加えることで、当初計画にあった特定の工具姿勢からの除去工程計画法を実現する予定としている。平成26年度は、まず前年度内に開発したボールエンドミルを用いた経路計画法の切削実験による検証を実施し、仕上げ加工における効果を確認する予定である。また、こちらの切削実験による検証と並行して、ブルノーズエンドミル、スクェアエンドミルを用いた加工における切削抵抗低減策の開発を行う。こちらの工具に手法を対応させる際には、工具姿勢の変更に加えて、工具先端の経路を変更する必要があるため、工具経路についても各姿勢に対してそれぞれ異なる座標情報を生成するシステムの開発を行う予定としている。
エピゲノム編集技術を用いた再生原理の解明：失われた再生能力を回復させる試み

本申請課題は、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の発生過程で再生能力が失われていく原因を明らかにし、普遍的な再生原理を解き明かすことが狙いである。トランスジェニック技術やゲノム編集技術といった遺伝子改変技術を用いて、個体レベルの再生研究を行った。1)高活性型TALENを用いることにより、偽四倍体で機能重複したパラログを多数持つアフリカツメガエルでも、複数遺伝子の同時破壊(KO)とF1での機能解析が可能ことを示した。また、新規の汎用性高い遺伝子挿入(KI)技術を開発し、内在性遺伝子にGFPタグを付加したり、エンハンサー・プロモータートラップに成功した。2)この技術を用いて、器官発生及び再生に関与すると思われるクロマチン関連遺伝子のKOを行ったが、その再生への関与は確認できなかった。3)器官再生中のエピジェネティクスの変動をin vivoで可視化するための分子プローブを導入したトランスジェニックガエルの作製にも成功し、器官再生初期にヒストン修飾が変動することを発見した。また、再生時におけるエピジェネティクス修飾を変化させるため、ヒストンアセチル化に関する阻害剤及び誘導剤などを試し、再生能力の影響を解析したが、明確な結果は得られなかった。4)両生類の再生能力低下は、メタモルフォーゼの進行と深い相関が見られる。この現象を解析するため、トランスジェニックツメガエルを用いて、人為的に甲状腺ホルモンシグナリングを誘導した結果、急速に尾の再生能力が低下する事実が明らかになった。5)神経を可視化するトランスジェニックツメガエルを用いて、四肢再生における神経の走行を解析した。最終年度は、2)5)を中心に行った。本研究で得られた結果は、今後、両生類における再生研究に重要なツールや知見になることが期待される。今後は、得られた知見や成果を論文化する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、アフリカツメガエルを用いた器官再生研究を行うため、ゲノム編集技術を用いた個体レベルの遺伝子改変技術開発を行った。高活性型TALENを用いることにより、偽四倍体で機能重複したパラログを多数持つアフリカツメガエルでも、複数遺伝子の同時破壊(KO)が可能となった。また、遺伝子挿入(KI)技術の開発も行い、おおよその目処がついた。加えて、器官再生中のエピジェネティクスの変動をin vivoで可視化するための分子プローブを導入したトランスジェニックガエルの作製にも成功し、尾部再生初期にヒストン修飾が変動することを発見した。両生類の再生研究における大きな課題であった、遺伝子破壊(KO)や遺伝子挿入(KI)に加えて、エピジェネティクスのin vivoでの可視化に成功した。本研究課題で得られた成果は、本領域の目的の一つである「遺伝子改変技術を駆使した再生研究」の発展に貢献できると期待している。一部の研究計画を除き、おおよそ順調であると評価する。今後は、再生能力低下の大きな原因であると考えられる、「エピジェネティクス」を制御する技術を開発する。これまでに得られた知見や技術を用いて、再生関連遺伝子の再活性化を促し、失われた再生力を回復させることを試みる。また、前年度に発見した新たな知見である、炎症・免疫系遺伝子の再生への関与も明らかにしたい。
身体特性が空間知覚に及ぼす影響の解明とバーチャルアバタへの活用

本研究の目的は,バーチャルリアリティで自らが操るアバタの身体特性を変化させる実験系を駆使し,自己の身体特性が空間知覚に与える影響とそのメカニズムを明らかにすることである.この知見を応用し,想定される空間知覚の歪みに応じて身体特性を変化させることで現実と等価な歪みのない空間知覚の下にVRを体験可能にするアバタ表示手法を実現し,現状のバーチャルリアリティでは現実での知覚と比べて空間知覚が大きく歪むという問題を解決を図る.本研究の目的は,バーチャルリアリティで自らが操るアバタの身体特性を変化させる実験系を駆使し,自己の身体特性が空間知覚に与える影響とそのメカニズムを明らかにすることである.この知見を応用し,想定される空間知覚の歪みに応じて身体特性を変化させることで現実と等価な歪みのない空間知覚の下にVRを体験可能にするアバタ表示手法を実現し,現状のバーチャルリアリティでは現実での知覚と比べて空間知覚が大きく歪むという問題を解決を図る.
古代日本語のテンス・アスペクト組織についての形態論的研究

まず、〈ツ〉〈ヌ〉の違いについて諸家の説を検討した。それを踏まえて手始めに、落窪物語の会話文及び源氏物語の会話文の一部を資料にして、過去及び完了の助動詞の意味の違いについて概略を考えた。本格的な、古代日本語のテンス・アスペクト組織の記述には、源氏物語のカード化が完成した後とりかかった。その結果、概略を記述した際には見出せなかったいくつかの事実が明らかになった。まず第一に、〈ケリ〉の過去を表す用法は、今まで知らなかった出来事を今始めて知ったことを表す用法と関連があるものとこれまで考えていたが、そうではなくて、出来事を認識したのが過去のことであることを報告する用法と関連が深いことが分かった。これは、過去を表す〈ケリ〉は、伝承回想を表すという通説と真っ向うから対立するもので、過去を表す〈ケリ〉は、報告者が実際に見聞したことを表すものであることを示すものである。かく、〈ケリ〉が伝聞を表すものではないということになって、〈キ〉が経験を表すものとして〈ケリ〉と対立するという見方も再検討が必要になった。第二に、〈ヌ〉の用法に、これから起こることを表す用法が、落窪物語とは比較にならないほど多く見られたことも発見であった。〈ヌ〉にこうした用法が多いことは、〈ヌ〉が、単に、すでに出来事が完結しているというテンス的意味ではなく、未完了に対立するところの完了アスペクトを表すものであることを示唆するものである。ただし、〈ツ〉を同様に完了アスペクトを表すものとしてよいかどうかについては疑問が残った。第三に、〈タリ〉〈リ〉については、動きの継続や変化の結果の継続も含み込むような、広い意味での状態の持続を表す意味が中心であることがはっきりした。
リアルタイムバイオイメージングによるファイトプラズマの媒介昆虫細胞侵入機構の解明

ファイトプラズマは1000種以上の植物に感染し農業上深刻な被害をもたらす植物病原細菌であり、ヨコバイ類の昆虫によって媒介されて感染を拡大する。ファイトプラズマの有効な治療法は未だに確立されていないが、その理由の一つとして、宿主昆虫細胞侵入機構が全く明らかになっていないことが挙げられる。ファイトプラズマは細胞壁を持たない細菌であるため、宿主との相互作用にはファイトプラズマの菌体表面に存在する膜タンパク質が重要な役割を果たすと考えられている。そこで、本研究では、ファイトプラズマの膜タンパク質と結合する宿主レセプターの同定、および昆虫細胞の高精細リアルタイムバイオイメージングに基づいた、ファイトプラズマの媒介昆虫細胞侵入機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、膜タンパク質と結合する宿主レセプターを同定する目的で、宿主昆虫の酵母two hybridライブラリを作製し、スクリーニングを実施している。加えて、ファイトプラズマが植物-昆虫間のホストスイッチングに伴い遺伝子発現を変動させていることに着目し、昆虫宿主への適応に重要なファイトプラズマ遺伝子を特定するために、次世代シーケンサーを用いてファイトプラズマの転写開始点を網羅的に決定した。その結果、ファイトプラズマにおいて多くの非コードRNAが転写されていることを明らかにした。さらに、特定された転写開始点をもとに、ファイトプラズマの遺伝子発現制御に関わるシグマ因子が認識するプロモーター配列を特定した。また、シグマ因子が認識するプロモーター配列が他種ファイトプラズマにも保存されているかを調べる過程で、国内のキャッサバからファイトプラズマを初めて検出した。本年度は、ファイトプラズマの膜タンパク質と結合する宿主昆虫のレセプターの同定を酵母two-hybridと免疫沈降実験により行う予定であった。[研究実績の概要]の欄に述べた通り、宿主昆虫の酵母two hybridライブラリを作製し、スクリーニングを実施していることから、一定の進捗があったと考えている。今後は、スクリーニングを継続して行い、宿主レセプターの同定を行う予定である。加えて、特定した宿主因子について、RNAiおよび抗体を用いて機能阻害が起きるかを検証する。
二重分子識別原理に基づく新しい高精度DNA/RNA検出法

本研究は,マイナーグルーブバインダー(MGB)分子を用いた二重分子識別原理に基づく遺伝子診断法の開発を目指した。MGB分子はDNA2重らせんの小溝中に2本の鎖で結合する。標的とする被検者のサンプルのDNAやmRNA断片にまずチップ上の人工DNAが結合し、その結果形成されたDNA2重らせんの小溝と接触する部位がグアニン塩基の場合にはピロール、それ以外の場合にはイミダゾールになるように分子設計した。このDervan則によって塩基配列を正確に分子認識できる。この設計に基づき、フェロセンのシクロペンタジエニル環にカルボキシル基を経て4種類の3量体からなるポリアミドを連結したマイナーグルーブについて数種類合成しすでに合成に成功した分子とともに電気化学的酸化還元反応のCV応答を測定した。その結果,期待された応答が得られたが,金電極で測定する際に,再現性に問題があることが気がついた。今後は,再現性が確かになる電気化学応答の実験系を構築する必要があると思われる。上述した方法で合成したフェロセン標識したMGBの中で、最も優れたCVデータを示した分子を実際に活用して、その塩基識別能について詳細に検討した。この実験では,G-TやG-Aミスマッチが深刻な塩基配列をとくに選びその測定精度の正確さについて調べた。また、必要なときには、チップ側のDNA断片に2-チオウラシル基を導入して精度をさらに向上することも検討した。一方,MGB分子の長さがどれくらいが適当であるか,調べた結果,3量体でヘアピン型にすることが重要である知見が得られた。
細胞表面の糖タンパク質を標的とした口腔癌治療の開発

口腔扁平上皮癌培養細胞株・臨床検体の両者において、細胞表面に発現するα-dystroglycan (α-DG)の糖鎖修飾に構造変化が生じていることが明らかになった。また、この構造変化には糖転移酵素であるLARGEが関与している可能性が示唆された。他臓器悪性腫瘍で報告されている糖修飾酵素(MGAT3, MGAT5, NEU1, NEU3, Fut8)のうち、NEU3 mRNAは正常粘膜に比べて口腔癌組織での発現量が有意に高かった。口腔癌の進展過程において、特定の糖鎖構造とこれを修飾する酵素が重要な役割を果たしていると考えられる。糖タンパク質であるジストログリカン(DG)の口腔癌における発現パターンを明らかにした。最初に口腔扁平上皮癌組織と前癌病変である白板症組織を用いて、免疫組織学染色によりDGの発現と局在を確認した。α-DGの一次抗体はラミニン結合型糖鎖を認識するII6C4を用いた。白板症組織ではラミニン結合型α-DG、β-DGともに基底膜上の細胞で細胞膜上に発現していたのに対し、口腔癌組織では腫瘍細胞の細胞質内でびまん性に広がった局在を示した。また粘膜下層へ浸潤している腫瘍細胞では、ラミニン結合型α-DGの発現が低下していた。次に正常歯肉と口腔扁平上皮癌組織におけるDAG1 mRNA、DGタンパク質の発現を解析した。DAG1 mRNAはすべての正常組織、口腔癌組織で発現していた。タンパク質発現においては、β-DGは全ての正常歯肉と口腔癌組織で同程度の発現を認めたが、ラミニン結合型α-DGは口腔癌組織で有意に低下していた。これらの結果から、口腔癌組織においては乳癌等での報告と同様に、DAG1 mRNAは正常に発現しているものの、タンパク質へと翻訳される過程でα-DGの糖修飾に異常が生じている可能性が示唆された。培養細胞株では、DAG1 mRNAは口腔扁平上皮癌培養細胞株であるHSC3、HSC4、SAS、唾液腺癌培養細胞株であるACC2、ACCMの全てにおいて発現が認められた。タンパク質発現では、全ての細胞株においてβ-DGタンパク質は発現していたが、ラミニン結合型α-DGタンパク質は低下もしくは欠失していた。これらの結果より、口腔癌においてはラミニン結合型α-DGの発現が有意に低下していることが明らかになり、糖修飾の異常が癌細胞の浸潤に関与している可能性が示唆された。昨年度までの実験結果から、口腔癌培養細胞・臨床検体の両者においてα-ジストログリカン(DG)の糖鎖に構造変化が生じており、それには糖転移酵素であるLARGEが関与している可能性が示唆された。これらの結果より、口腔癌の癌化過程では糖鎖構造の変化とそれを左右する酵素の存在が重要であると考えられる。そこで、他臓器悪性腫瘍で報告のある糖修飾酵素のうち、N-acetylglucosaminyltransferaseであるMGAT3、MGAT5、N-acetylglucosaminyltransferaseであるNEU1、NEU3、FucosyltransferaseであるFut8の5種を選択し、10例の口腔癌臨床検体を対象にして癌組織と正常粘膜でのmRNA発現量を解析した。これらのうち、NEU3 mRNAは正常粘膜に比べて口腔癌組織での発現量が有意に高かった。その他の4種mRNA発現量は有意な差は認めなかった。したがって、NEU3は口腔癌の浸潤、転移の過程において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。当科で所有している口腔癌培養細胞株においてNEU mRNAの発現を解析したところ、すべての細胞株で発現が認められた。現在、培養細胞株にNEU3 siRNAをトランスフェクションし、増殖能・遊走能・浸潤能における変化を解析中である。口腔癌口腔癌細胞におけるラミニン結合型α-DGの発現と糖転移酵素であるLARGEの発現に一定の相関を見出すことができた。糖タンパク質の機能には糖転移酵素が重要な役割を果たしていることが推測される。口腔癌組織と培養細胞を用いてジストログリカン発現のスクリーニングを行い、mRNA、タンパク質の両者に対する解析を安定して行うことができるようになった。また、その発現パターンに一定の見解を得ることができた。ラミニン結合型α-DGの発現にLARGEが直接関与しているかどうかを確認するためには、口腔癌培養細胞にLARGEを強制発現させ、ラミニン結合型α-DGの発現が回復するかどうかを検証する必要がある。培養細胞だけではなく、臨床検体においても同様の現象がみられるかどうかを検討する。また、他臓器で報告されている腫瘍マーカーの中には、糖タンパク質をターゲットとしたものが多数存在する。口腔癌の進展に伴って上昇もしくは減少するような糖タンパク質もしくは糖転移酵素が特定できれば、診断の一助になると考えられる。ジストログリカンの糖鎖修飾に影響する糖転移酵素について解析を加える。

異常を示す糖転移酵素を復元することができれば、癌化の抑制に貢献し、新しい癌治療の開発につながるのではないかと考える。また、糖鎖構造を比較プロファイルできるシステムであるレクチンマイクロアレイの使用も検討したい。平成24年11月19日から平成25年12月31日まで産前産後の休暇および育児休業によって研究を中断していたため。上記休業中に中断していた研究を継続するために必要な試薬・消耗品、および研究成果を発表するための旅費や論文投稿費などに使用する予定である。タンパク質、mRNA解析のための試薬購入レクチンマイクロアレイによる解析
魚類の神経筋運動系の使い回し仮説の検証

裸状型卵巣を有するサケマス類やアユでは体側筋を産卵にも用いるが、この行動を制御する神経機構は不明である。そこで産卵時に活動したニューロンを特定するためのマーカーとして、アユのc-fos遺伝子の全塩基配列を決定し、この情報をもとに作成したアユc-Fos組換えタンパク質を抗原としてアユc-Fos抗血清を得た。産卵したメスの脳から切片を作成し、上記の特異抗体で免疫染色したところ、遊泳誘発領域である中脳の内側縦束核のニューロンが他よりも強く発色した。本年度はアユのc-fos遺伝子の全塩基配列を決定し、これをもとにニューロン活動の指標、すなわち同遺伝子の発現解析に使用できる特異的プローブを作成することを第一の目的として以下の実験を行った。1.脳内c-fos遺伝子のmRNA発現を誘導するために、脳内ニューロンを網羅的に興奮させるカイニン酸をアユに腹腔内投与した。注射後30分にアユから脳を摘出し凍結保存した。2.1尾分の脳から全RNAを抽出し、cDNA(鋳型DNA)を合成した。特異的プライマーを用いてPCRを行い、アユc-fos遺伝子の部分配列を得た。この配列をもとに3'および5'RACE処理を行い、アユc-fos遺伝子の全配列を決定した。この配列は1,104bpの翻訳領域からなり、翻訳されるアミノ酸配列は368残基と推定された。また、同配列にはc-fos遺伝子の特徴であるbasicregionとleucinezipperの両配列を含んでいることからもアユのc-fos遺伝子であることが確認された。3.アユのc-fos遺伝子に特異的なプライマーを用いて、カイニン酸注射後のc-fos遺伝子の脳内発現量を定量的RT-PCR法により継時的に調べたところ、注射後3060分に発現量が極大値を示すことが明らかとなった。4.アユのc-fos遺伝子の1,3161,611番目の塩基配列に対するDIG標識cRNAプローブを作成し、上記のカイニン酸を注射したアユの脳から抽出した全RNAを試料として、ノザンブロット解析を試みたが、今のところ良好な結果は得られていない。5.したがって、産卵直後のアユ雌雄の脳標本は入手したものの、脳切片を用いたin situハイブリダイゼーションは実施していない。なお、脳地図と組換えタンパク質を抗原としたc-fos抗体は作成途中である。1.脳内c-fosのmRNA発現を誘導するために、神経細胞を網羅的に興奮させるカイニン酸をアユの腹腔内に投与した。投与後、経時的に脳を摘出、保存した。リアルタイムPCRにより、c-fosのmRNAの発現量は投与後30分をピークとして、その後減少することが、あらためて確認された。また、市販の抗体を用いたウエスタンブロッティングでは脳内のc-Fosタンパク質の発現量は投与後120分を経過しても高いレベルを維持していることが分かった。2.同じ抗体を用いて、カイニン酸投与したアユ脳の切片を免疫染色した結果、対照群よりも多くの脳ニューロンがより濃く染め出されていることが分かった。3.秋に滋賀県水産試験場の屋外水槽に設けた人工産卵場にアユ成熟親魚雌雄を放ち産卵行動の誘起を試みた。試行錯誤の末、数時間にわたる産卵行動を観察できた。観察後、魚を取り上げ、上記と同様に処理した。4.アユ脳の完全連続切片を作製し、ニッスル染色を施し、嗅球から脊髄前端までの32枚の脳地図を作成し、各脳領域を特定した。これは、今後の産卵中枢を特定する作業において重要な資料となる。5.神経トレーサーを脊髄に投与し、脳内の脊髄投射ニューロンを標識することができた。6.アユc-Fos遺伝子の塩基配列を発現ベクターにサブクローニングすることができなかったため、大腸菌による組換えタンパク質の作製と特異抗体の作成は次年度への課題となった。アユc-Fos組換えタンパク質の発現に、大腸菌のコドン使用頻度に最適化したc-fos DNAを用いた。大腸菌BL21 (DE3)からHisタグ融合タンパク質として発現させたアユc-Fosを精製し、ウサギに免疫した。得られたアユc-Fos抗血清の特異性を、アユ脳のタンパク質抽出液を用いてウェスタンブロット法で評価したところ、アユc-Fosの推定分子量付近に単一のバンドが認められた。しかしながら、神経興奮薬であるカイニン酸をアユ腹腔内に投与してから60分後にc-fos mRNA発現の有意な増加が見られたものの、c-Fosタンパク質の発現量に変動はなかった。これはアユのカイニン酸への感受性が他の魚種よりも低いため、カイニン酸による神経興奮が不十分であった可能性が考えられるが、原因は不明である。

アユの産卵誘発に必要な水流や底砂などの環境を再現した6個の水槽に、それぞれ成熟したメス2尾、オス4尾を入れて一晩放置した。翌朝、産卵した個体および対照個体の脳を4%パラフォルムアルデヒドで固定した。その後、常法によりパラフィンに包埋して脳の連続横断切片(10 μm)を作製した。この切片にアユc-Fos抗血清を用いたABC法による免疫染色を施し、顕微鏡下で観察したところ、産卵後アユの終脳から延髄までの広範囲にわたって陽性細胞が観察された。特に遊泳の開始に深く関係する内側縦束核には、対照個体よりも産卵個体により多くの陽性ニューロンが観察され、その染色態度もより強かった。一方、マウスナー細胞はどちらの個体においても免疫反応は陰性であった。以上より、アユでは左右の体側筋を使った通常の波状運動による遊泳を制御する中脳の内側縦束核ニューロンが、産卵時には高頻度でより強く発火することにより体側筋を強縮状態に至らしめる結果、腹腔内圧が高まることで卵を体外へ放出する可能性が示唆された。1.市販の抗体では特異的な染色結果が得られなかった。また独自の特異抗体も作成に至らなかった。大腸菌に組み換えタンパク質として抗原を生産させることができなかったためである。2.ノザンブロッティングでは遺伝子の発現が確認できなかった。3.人工環境でアユを産卵させることはできたが、取り上げまでに時間がかかることや、産んだ個体の識別がし難いといった問題があった。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.アユc-fosを発現ベクターに組み込み、大腸菌に組み換えタンパク質を作らせる計画であった。来年度は、用いるベクターや大腸菌の種類の検討、大腸菌で発現しやすいコドンへの変更、全鎖長ではなく、特異性の高い部分配列を組み込むなどして再挑戦する予定である。2.ノザンブロッティングの問題に関しては、プローブの長さを検討するとともに、単離・精製したmRNAを用いる予定である。3.今年度は大型の屋外水槽を産卵実験に用いたために上記の問題が生じた。来年度は、産卵個体を識別できるように、個体数、水槽の大きさともに、より小さい規模での産卵誘起実験を行う。
鎖多項式の計算理論とその応用

鎖多項式の計算理論は、成嶋を中心とするグループによって、1980年代のはじめより展開されてきた。今年度は、特に、次の2点において成果が得られた。1.体系化の面では、カナダのジォイヤルを中心とするカテゴリー論的アプローチとの関連を2,3の点で明らかにした。2.応用面では、パーソナルコンピュータによる整数型高精度計算システムを開発し、このシステムを用いてブール束、分割束、立方体束の鎖多項式の係数計算を行い、数表を整理するとともに予想や未解決問題を明らかにした。
超臨界流体の分離溶媒としての高度利用

超臨界流体を分離溶媒として高度に利用することを試み、以下の成果を得た。(1)超臨界二酸化炭素に極性物質であるエタノールおよび無極性物質であるオクタンを少量添加し、エントレーナー効果を実験的に検討した。エタノールはステアリン酸の溶解度を著しく促進した。この原因は、水素結合にあるものと考えられる。オクタンは溶解度を増加させたが、顕著な傾向は見られなかった。(2)ゼオライトを用いた超臨界相吸着(Co_2使用)により、2,6-および2,7-ジメチルナフタレン異性体混合物の分離が可能であることが実験的に確認された。とくに、NaY型ゼオライトが効果的であった。(3)シトラスオイル成分であるリナロールおよびリモネンと超臨界二酸化炭素系の高圧気液平衡データを系統的に蓄積した。また、Peng-Robinson状態方程式による相関も可能であった。(4)温度勾配を付与した精留塔を製作し、シトラスオイル(リモネン、リナロール、シトラール)の分画を試み、その可能性を確認した。さらに、効率的な抽出条件について、詳細に検討を加えた。(5)超臨界晶析装置を製作し、ナフタレンおよびナフタレン+フェナンスレン混合物の晶析実験を行い、高純度化の可能性を見いだし、粒径分布、最大粒径および晶析物組成に関する基礎的データを蓄積した。(6)多量処理を目的とした超臨界クロマト法を開発し、カラム本来の分離効率を低下させることのない大容量試料導入法を提案し、生理活性物質の分離・精製を可能にした。本研究では、超臨界流体の特異な溶媒特性を高度に利用した新しい分離プロセスの開発を目的とし、以下の研究を推進した。1.高級脂肪酸および高級アルコールの超臨界二酸化炭素に対する溶解度データを35°Cにて蓄積した。酸およびアルコールともにメチル基1個の増減でも、ある程度の溶解解差が生ずることが示された。また、2,6-ジメチルナフタレンおよび2,7-ジメチルナフタレンの超臨界二酸化炭素に対する溶解度を35°C55°Cにて測定した。得られた溶解度曲線には交差圧力が存在するが、接近してるため述行析出法による分離は困難であった。さらに高圧循環式気液平衡測定装置を試作し検証実験を行った。2.リモネン/リナロール混合物を吸着剤ならびに精留塔で分離した。シリカゲルを用いたところ、液相で吸着分離し、超臨界二酸化炭素で脱着回収する方法が有効であった。温度勾配を付与した精留塔を備えた抽出装置を試作し、還流効果により分離性能が向上することを実証した。また、天然物固体からの抽出過程の速度論的考察を行った。3.超臨界流体晶析装置の試作を行った。装置は半回分型流通式であり、加圧・送液部、対象物の溶解・抽出部、抽出物からの高純度目的物質の晶析・精製部および溶剤である超臨界流体の流量測定部からなる。構造異性体である2,6-ジメチルナフタレンを目的物質とし、溶剤として超臨界二酸化炭素を用い、溶解度を測定した。4.多量処理用の分取超臨界クロマト法を開発するための基礎的検討を行った。多量試料の導入を可能とする新しい導入法を開発し、その最適化を行うとともに、試料高負荷時における溶出挙動の測定法を確立した。また屈折率検出器の使用を可能とするセル圧力の新しい制御法を開発した。高級脂肪酸に適用したところ、高回収率かつ高純度で、迅速な精製が可能であった。1.超臨界二酸化炭素に極性物質であるエタノールを少量添加し、エントレーナー効果を実験的に検討したところ、ステアリン酸およびステアリルアルコールの溶解度が著しく促進された。2.ゼオライトを用いた超臨界相吸着(CO_2使用)により、2,6-および2,7-ジメチルナフタレン異性体混合物の分離が可能であることが実験的に確認された。3.シトラスオイル成分であるリナロールと超臨界二酸化炭素系の高圧気液平衡データを系統的に蓄積した。また、状態方程式による相関も可能であった。4.温度勾配を付与した精留塔を製作し、シトラスオイル(リモネン、リナロール、シトラール)の分画を試み、その可能性を確認した。5.超臨界晶析装置を製作し、ナフタレンおよびナフタレン+フェナンスレン混合物の晶析実験を行い、粒径分布、最大粒径および晶析物組成に関する基礎的データを収集した。6.多量処理を目的とした超臨界クロマト法を開発し、カラム本来の分離効率を低下させることなく大容量の試料導入を可能とした。7.超臨界クロマト法(CO_2+メタノール)により、単分散ポリエチレンラテックス粒子をサンプルとして、ナノメータ径物質の分離について実験的に検討し、効率的な分離を行うための検討課題を明かにした。

オクタンは溶解度を増加させたが、顕著な傾向は見られなかった。(2)ゼオライトを用いた超臨界相吸着(Co_2使用)により、2,6-および2,7-ジメチルナフタレン異性体混合物の分離が可能であることが実験的に確認された。とくに、NaY型ゼオライトが効果的であった。(3)シトラスオイル成分であるリナロールおよびリモネンと超臨界二酸化炭素系の高圧気液平衡データを系統的に蓄積した。また、Peng-Robinson状態方程式による相関も可能であった。(4)温度勾配を付与した精留塔を製作し、シトラスオイル(リモネン、リナロール、シトラール)の分画を試み、その可能性を確認した。さらに、効率的な抽出条件について、詳細に検討を加えた。(5)超臨界晶析装置を製作し、ナフタレンおよびナフタレン+フェナンスレン混合物の晶析実験を行い、高純度化の可能性を見いだし、粒径分布、最大粒径および晶析物組成に関する基礎的データを蓄積した。(6)多量処理を目的とした超臨界クロマト法を開発し、カラム本来の分離効率を低下させることのない大容量試料導入法を提案し、生理活性物質の分離・精製を可能にした。
ATP 駆動蛋白質の機能発現における水の役割:統計力学理論解析

シャペロニンの蛋白質折り畳みの援助,ABCトランスポーターの多剤排出,F_1-ATPase中のγ-サブユニットの一方向回転,F-actin上におけるミオシンの一方向移動を例題とした統計力学理論解析を行い,「ATPとレセプターの結合,レセプター中におけるATPの加水分解,ADPとPiのレセプターからの解離」なるサイクルを繰り返しながら作動するATP駆動蛋白質の機能発現機構に対し,水を主役とした新しい横断的物理描像を構築した。非常に大きな蛋白質やそれらの会合体をもかなり精密にかつ短い計算時間で扱うことのできる独自の統計熱力学理論を武器とし、「(1)F_1-モーター(F_1-ATPase);(2)ABCトランスポーター;(3)シャペロニンGroEL;(4)アクトミオシン」を主たる対象として選定して、水が果たす役割を具体的に解明する。以下の概念に注目することを特徴とする:(A)蛋白質の折り畳み、レセプターとリガンドの結合、蛋白質の会合による高次構造形成などにおいては、水の並進配置エントロピーを増加させることが強力な推進力となる;(B)F_1-ATPaseのような蛋白質会合体は、水の並進配置エントロピーをできる限り大きくするように充填された立体構造をとらされる;(C)F-actin近傍におけるミオシンには、水分子の並進移動に起因して、ミオシンおよびF-actin表面の幾何学的形状を反映したエントロピー力場が形成される。蛋白質とヌクレオチドの相互作用、「蛋白質とATPの結合⇒ATPの加水分解⇒分解生成物の遊離」の各ステップにおける蛋白質や蛋白質会合体の立体構造変化の仕方、上記エントロピー力場の変化などを解析する。その結果を踏まえ、生体内における他のATP駆動蛋白質の機能発現における水やATPの役割を横断的に解明し、水を脇役としか見ていない現存のATPエネルギー変換論を根本的に塗り替える。(1)分子性流体用積分方程式論と多極子モデルを用いて疎水性および親水性溶質の水和構造解析を行い,水和のエントロピー,自由エネルギー,比熱どの関連性を明らかにした(2)蛋白質の圧力および低温変性の分子機構を明らかにした。(3)アクチンフィラメント(F-actin)近傍におけるミオシンには,水分子の並進移動の効果に起因して, F-actinおよびミオシンの幾何学的形状を反映したエントロピー力場が形成されると我々は考えている。「ミオシンとATPの結合⇒ATPの加水分解⇒生成物の遊離」の各ステップにおいて,力場を巧妙に変化させながら,一方向への移動を実現しているはずである。この新しい概念を実証するための基礎解析として,剛体モデルと3次元積分方程式論を用い,小剛体球集団中にある立体の近傍に,大剛体に対して形成される力場を計算した。立体として,大剛体球を一列に並べた連結体と,大剛体球で構成される二重螺旋構造を考えた。大剛体として,大球および大回転楕円体を考えた。力場によって,ミオシンがF-actin近傍に閉じ込めちれることなどが分かった。(4)「一方向に回転するF1-モーター(F1-ATPase) ;リガンドを細胞内から外に排出するエクスポーター;リガンドを細胞外から内に取込むインポーター」を対象として,既存の研究論文をレビューし,問題点の特定と基本となる研究方針を検討した。(5)蛋白質や蛋白質の複合体の立体構造は,実験的に決定されていても未完成であることが多い。それらを完成させる手法について検討した。(1) F_1-ATPaseのGroup I(β_E, γ, α_E,α_<TP>)、Group II(β_<TP>, γ, α_<TP>, α_<DP>)、Group III(β_<DP>, γ, α_<DP>, α_E)に注目し、分子性流体用積分方程式論(水分子に対して多極子モデルを採用)と形態熱力学的アプローチの統合型方法論を用いて、各Groupの水和エントロピーを計算した。その結果、水の並進配置エントロピーを最大にするためには、3個のGroupsに対してパッキングの不均一性を生じさせる必要があることが分かった。この不均一性こそが、F_1-ATPaseのγの回転を生み出す鍵となっているものと考えられる。(2)生体高分子容器内への大きな溶質分子の挿入は、生体系における基本プロセスの一つである。我々は、3次元積分方程式論に基づくモデル解析によって、「かなり広い範囲の大きさを持つ溶質分子が、水分子の並進移動に伴うエントロピー効果によって容器内に挿入され、ほぼ中央にある狭い空間内に(容器内表面に接触しないで)強く閉じ込められる」ことを明らかにした。ABCトランスポーターの多剤排出機構との関連性についても考察した。(3)ミオシンS1に対する柳田らによる一分子計測の実験事実と、3次元積分方程式論に基づく我々のモデル解析の結果を総合し、F-actinに沿ったS1の一方向移動のメカニズムに対する基本的な描像を得た。

この描像では、「ミオシンとATPの結合⇒ATPの加水分解⇒分解生成物の遊離」というサイクルを繰り返すことにより、ミオシンに対して形成されるエントロピーポテンシャル場を巧妙に調節しながら、一方向移動を実現する。この描像は、水分子の並進移動に起因したエントロピー効果に主眼を置いている点で斬新である。(1)水分子の並進移動に起因して,F-actin近傍のミオシンに,エントロピーポテンシャル場が形成されることを示した。ミオシンS1に対する柳田らによる一分子計測の実験事実と,3次元積分方程式論に基づく我々のモデル解析の結果を総合し,一方向移動のメカニズムに対する基本的な描像を得た。ミオシンは,ATPまたはADP+Piと結合していないミオシンに対して形成されるF-actinに沿ったポテンシャル場と,ATPまたはADP+Piとの結合によって幾何学的形状が変化したミオシンに対して形成されるそれを行き来することによって,一方向への移動を実現する。(2)F_1-ATPaseに対し,Group I(β_E,γ,αE_,α_<TP>),Group II(β_<TP>,γ,α_<TP>,α_<DP>),Group III(β_<DP>,γ,α_<DP>,α_E)各々を取り出し,分子性流体用積分方程式論と形態熱力学理論の統合型アプローチによって,水和エントロピーを計算した。その結果,3個のGroupに対してパッキングの不均一性を生じさせる必要があることが分かった。この不均一性が,F_1-ATPaseの回転を生み出す鍵となる。γにある特定の方向を向かせると共に,Group IIIで密なパッキングを実現することが,水のエントロピーの観点から最も有利である。ところが,β_<DP>→β_E,β_<TP>→β_<DP>,β_E→β_<TP>なる変化が起こるため,γを120度反時計回りに回転させて,密なパッキングを構築し直す必要が生じるわけである。(3)シャペロニンGroELへの変性蛋白質の挿入およびそれからの折り畳みを終えた蛋白質の放出のメカニズムを明らかにした。ナノメートルスケールの空間内における水和特性効果によってGroELと蛋白質間に形成される平均力のポテンシャル(蛋白質の排除容積や表面特性に大きく依存)が,挿入と放出において重要な役割を果たしていることが分かった。ATP駆動蛋白質は,ATPの方がADPよりもレセプターとの親和性が高く,ATP濃度が十分高く,ADP濃度が十分低い条件下で機能する。その場合,ATPの結合,ATPの加水分解,ADP・Piの解離のどれも(以下より,これらを一括してATPの作用と呼ぶ)が,システムの自由エネルギー低下に結び付く,すなわち,起こってしまう。アクトミオシンにおけるアクチンフィラメント上のミオシンの一方向移動,シャペロニンの蛋白質折り畳みの援助機能(変性蛋白質を中に取り込み,折り畳みを終えた蛋白質を元へ放出する),F_1-ATPaseにおけるγサブユニットの一方向回転における我々の研究成果を元に,ATP駆動蛋白質の作動原理に対する横断的描像を構築した。水が,ミオシン-アクチンフィラメント,蛋白質-シャペロニン,溶質-トランスポーター,α_3β_3複合体-γサブユニットの各ペア間にポテンシャル場(平均力のポテンシャル)を作る。
中学校技術・家庭科「家庭生活」領域カリキュラム及び教材開発に関する研究

「家庭生活」領域のカリキュラム及び教材開発の基礎資料を得るために、広島県下の1.現場技・家担当先生の「家庭生活」領域に関する実態、2.中学生の郷土食摂取実態、3.中学生とその保護者の「生活環境を考える」学習の実態を調査・分析、4.1・2・3をふまえた地域の実情に即するカリキュラム例作成、5.実践のための教材考案・選択、授業実践・分析までを行い、「研究成果報告書」として一冊の冊子にまとめた。〈研究の成果〉1.現場技・家担当先生の「家庭生活」領域に関する実態は、(1)男女共修10年以上実施校と12年校に分かれた。(2)「家庭生活」領域への取り組みは、殆ど男女共学・35時間扱いで1年生に実施、不安・悩みの最高は具体的教材であった。(3)現場先生の使用文献・資料、参加研究会名等多くの提供を得た。2.中学生の郷土食摂取実態は、現代食摂取に差はみられず、郷土食摂取に地域差がみられ、好まれている郷土食は、晴れの日の料理が多かった。3.中学生とその保護者の「生活環境を考える」学習の実態は、ごみ出しの主担者は母親で、生徒・保護者共にごみ問題最初記述者が最も多く、その他海洋汚染・地球の温暖化等にも関心が持たれていた。4.地域の実情に即するカリキュラム例作成は、3つの実態調査から得られた結果を、どのように「家庭生活」領域のカリキュラムに生かすことが出来るか、という視点でまとめた。5.授業実践・分析では、事前調査結果グラフをみない(対象)場合と、みてから授業実践した場合との事後調査結果の大差、即ち、後者に授業効果の上がったことが挙げられる。今後に検証の課題を残してはいるが、このことから2つの提言、ア)授業へのグラフ活用、イ)市のごみ分別推進へこの結果の活用が考えられる。〈今後の課題〉1.実態調査結果を更に様々な視点で分析し・考察する。2.事前調査結果グラフの効用を検証する。
医学研究用マウス由来ネズミ盲腸蟯虫の伝播経路を探索する

【目的】蟯虫の感染経路については、感染マウスとの接触および感染マウス飼育ケージ内の床敷きを介して感染することは知られているが、それ以外の感染経路が存在するか否かは未だ不明である。今回、長崎大学先導生命科学研究支援センター動物実験施設において、ネズミ盲腸蟯虫の駆虫薬による駆虫後に再発を経験したこともあり、再発を防止するためには蟯虫卵の飼育室内分布状況を明らかにし、感染経路を探し出すことが必要と考え、実験を行うこととした。【方法】ネズミ盲腸蟯虫の感染を粘着テープ法により確認したAKRマウス♂9匹を実験に使用した。飼育方法は、木製チップを入れたプラスチックケージに給餌器兼用のステンレス製フタに飼料と給水瓶をセットして3匹ずつ3ケージに分けて入れ、一方向気流方式飼育ラック内で1週間飼育した。蟯虫卵分布の観察ポイントとして、ケージ本体、フタ、給水瓶、床敷き、給餌後残飼料、飼育棚、排気ダクト内粉塵、ケージ交換時着用手袋と実験着及び実験台、マウス固定器、電子天秤用体重測定カップの12カ所を設定した。蟯虫卵の検出は対象物により飽和庶糖液による浮遊法または粘着テープ法で行った。今回実験着以外は浮遊法で検査を行ったが、前処理として対象物を0.05%Tween20液1Lで洗浄後、その洗浄液を金網製ザルで濾した後、遠心分離機にて3000rpm10分間遠心して沈渣を検査に供した。【結果及び考察】今回の実験で蟯虫卵が検出されたのは、検出個数が多い順に、床敷き462個、ケージフタ33個、ケージ15個、飼育棚8個、マウス固定器・給水瓶3個、排気ダクト内粉塵2個、手袋・体重測定カップ・実験台1個で、実験着と給餌後残飼料は0個であった。今回の実験の結果から感染経路を推測すると、使用済みの床敷き、ケージ、フタを介して感染している可能性が高く、また、飼育棚、マウス固定器、給水瓶、排気ダクト内粉塵、手袋、体重測定カップからの感染も少なからずあることが示唆された。
メガリンの細胞内輸送を調節する分子学的機序の解明

メガリンの細胞質領域と蛋白複合体を形成する新規蛋白non-muscle myosin heavy chainIIA(NMHCII-A)を培養細胞(IRPTC)からimmunoprecipitation法と質量分析の手法で同定した。NMHCII-AはDab2を介してメガリンの細胞質領域と結合することが明らかになった。NMHCII-Aの機能阻害するblebbistatinを培養細胞に添加すると、メガリンのリガンドであるlactoferrinの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。さらに、blebbistatin投与下でのメガリン受容体の動きを可視化すると、メガリンはリガンド結合後も細胞表面に留まっているように見えた。このことからNMHCII-Aはメガリンのエンドサイトーシスにおいて、機能的に重要な働きを有していることが明らかになった。Sucrose gradientと超遠心を組み合わせて細胞内の各コンポーネントを分画したところ、メガリン、Dab2、NMHCII-Aは同一のendosomal fractionに存在することも明らかになった。以上よりIn vivoにおいてもこれらの三者は協調しながらメガリンのエンドサイトーシスを調節している可能性が示唆された。今後、さらに知見が蓄積されることで、複雑なエンドサイトーシスの分子学的機序が明らかにされることが期待される。1.平成18年度はメガリンを発現する培養細胞と抗メガリン抗体を用いて免疫沈降法を行い、得られたバンドを質量分析法で解析を行った。その結果non muscle myosin heavy chainIIA (NMHC-IIA)、actin、disable-2 (Dab2)などがメガリンと蛋白複合体を形成することを突き止めた。NMHC-IIAはactin上を移動するモーター蛋白であり、メガリンの細胞内輸送を調節する可能性のある初めての分子が同定された。NMHC-IIAはラットの腎臓では近位尿細管の管腔側にメガリンとほぼ一致した分布を示した。メガリンとNMHC-IIAがどのように作用しているかを調べる目的にメガリンの細胞質領域を含むGST融合蛋白(GST-MT)を作成した。NMHC-IIAをin-vitro translation法で合成しGST-MTを用いてpull downを実施したが、両者は直接結合しないことが判明した。そこでNMHC-IIAはどのようにメガリンと蛋白複合体を形成するかを検討する目的にGST-Dab2も用いてpull downを実施した。この検討の結果NMHC-IIAはDab2と結合し、メガリンとはDab2を介して結合していることが明らかになった。平成19年にNMHC-IIAの阻害薬であるblebbistatinを作用させメガリンのエンドサイトーシスがどのように変化するか検討する。さらに種々の疾患モデルを用いて、病的状態でのメガリン、NMHC-IIA、Dab2などの分布に変化が生じないかについて解析を行う予定である。2.メガリンを発現する培養細胞にAngIIを作用させるとメガリンの発現が減少することが明らかになった。この機序を解明する目的にAngIIを作用させたあとのAT1受容体以下で起こる情報伝達経路を解析した。平成19年度にはメガリンの発現低下に関わる詳細な経路を明らかにし、メガリンの発現調節機構を明らかにしたい。1.昨年メガリンを発現するラット培養細胞(IRPTC)ライセートと抗メガリン抗体を用いた免疫沈降法からnon muscle myosin heavy chainIIA(NMHC-IIA)がメガリンと蛋白複合体を形成していることを明らかにした。NMHC-IIAはアクチン上を移動するモーター蛋白であり、メガリンのエンドサイトーシス機構を解明するための突破口となることが予測された。本年はNMHC-IIAの阻害薬として知られているblebbistatinを培養細胞に添加し、メガリンのエンドサイトーシスに及ぼす影響を調査した。モノクローナル抗メガリン抗体を4°Cで培養細胞に作用させると、細胞表面に発現しているメガリンをラベルすることができる。培養細胞を37°Cの条件に戻すとラベルされたメガリンは速やかにエンドサイトーシスを開始し、約30分で細胞内のエンドソームに集積し、60分後にはラベルされた一部のメガリンは細胞表面へと再輸送される。

この系を用いてblebbistatinの影響を検討したところ、ラベルされた一部のメガリンは培養細胞を37°Cに戻したあとも細胞表面にとどまっていた。このことからNMHC-IIAはメガリンのエンドサイトーシスのごく初期に関わっている可能性が示唆された。平成20年度はNMHC-IIAと共同してメガリンのエンドサイトーシスを調節している分子群を抽出して、複雑なエンドサイトーシス機構の解明につなげたい。2.アンギオテンシンIIを培養細胞(OK細胞)に添加するとメガリンの発現がmRNAレベル、蛋白レベルでともに低下することを発見した。この発現抑制はARBの投与により抑制された。さらにアンギオテンシンIIによるメガリン発現抑制はERKおよびPKC阻害薬の投与により解除され、PI3K阻害薬の投与では発現抑制が増強された。この培養細胞において、AT1a受容体以下のERK、PKC、PI3K系シグナルを介したメガリンの発現調節機構が明らかになった。高血圧による微量蛋白尿の発生機序などを考える上で興味深い知見であり、さらに検索を進めたい。メガリンは腎臓近位尿細管上皮細胞の管腔側に発現するエンドサイトーシス受容体である。アルブミンや薬剤などの再吸収に重要な働きをしている。メガリンのエンドサイトーシスにはDab2やARHなどのアダプター蛋白の関与が重要であることが知られている。メガリンのエンドサイトーシス機構を解明するためにメガリンやそのアダプター蛋白に対する抗体を用いた免疫沈降法を行い、これらと分子学的複合体を形成する分子群を同定した。ラットの腎臓ライセートと抗ARH抗体を用いた免疫沈降法から、ARHはモーター蛋白の一種であるdyneinと複合体を形成していることが明らかになった。ARHはメガリンが細胞内を移動する際に終始共局在することから、メガリンの細胞内移動にもARHを介したdyneinの関与が推察される(Lehtonen S, etal. Molecular Biology of the Cell, 2008, p2949-2961)。ラット近位尿細管由来の培養細胞であるIRPTCと抗メガリン抗体を用いた免疫沈降からnon-muscle muosin heavy chainIIA(NMHC-IIA)が検出された。メガリンとNMHC-IIAの結合はDab2を介して行われることも明らかになった。NMHC-IIAの機能阻害薬であるblebbistatinを培養上清に添加すると、メガリンは細胞表面にとどまり、メガリンのリガンドを添加してもエンドサイトーシスが起こりづらくなることが明らかになった。このことからNMHC-IIAはメガリンのエンドサイトーシスのinitial stepを調節する因子である可能性が示唆された(Hosaka K, et.al. Kidney international, in press)。
小笠原諸島における日本語の言語使用・方言接触

昨年度の研究の結果を学会にて発表した。内容は主にアクセントの生成と知覚についてである。生成については日本方言研究会で「方言接触地域の名詞アクセント」と題して2002年5月17日に発表した。小笠原に元から住んでいた成人被験者と、新たに移住した成人被験者のアクセント読み上げを分析した結果、コイネー化を起こして互いに似てきていることがわかった。さらに、小笠原で生まれた高校生被験者について音韻的に分析したところ、東京式アクセントに近いことが分かったが、音響的に分析したところ、無アクセントである元からの住民のように読み上げ音声のピッチ幅が狭いことがわかった。知覚については社会言語科学会で「東京語アクセントの聞き取りに影響を及ぼす地元意識・方言意識」と題して2002年9月21日に発表した。小笠原の中高生に東京語アクセントを聞かせて、正しいアクセントを答えさせたところ、正答率は個人によってかなりの違いあり、出来る人も出来ない人もいることがわかった。その正答率を規定する社会的・心理的要因をアンケート結果から多変量解析した。その結果、正答率を上げる要因は、地元が嫌いで言葉の違いに対してあまりはっきりした意識を持ってなく、東京や地元との関連が少ないという要因、正答率を下げる要因は、言葉の違いに対してはっきりした意識を持ち、地元との関連が多いという要因が関与していることがわかった。また、さらに、小笠原での結果を東京生まれの話者と比較した結果を学会誌に投稿予定である。比較の結果、東京語話者の正答率も個人によってかなりの違いあり、出来る人も出来ない人もいることがわかった。また、小笠原も首都圏の被験者も、正答率を上げるのは「よそ者(interloper)」であり、下げるのは「内部の者(insider)」であることが分かった。また、都会志向といった「社会的野心を持つ者(aspirer)」が正答率を上げたり下げたりする。しかし、小笠原では正答率を上げる要因を持つ人々が存在しないため、聞き取りが得意な人が少ないということがわかった。そのため、小笠原の正答率が東京よりもやや低いのである。小笠原では、「よそ者」が「よそ者」のままでいることができにくい社会であるということも示しているだろう。上記以外に、研究を社会に還元する活動を行った。2002年8月29日31日にかけて、調査地小笠原諸島父島において、「第2回公開研究会小笠原諸島の言語・歴史・社会」に出席し、「小笠原の豊かな島言葉:八丈島だけではない、その源」と題して、島民の方々を対象に講演を行った。また、2003年1月には小笠原自然文化研究所発行の季刊誌『i-Bo』6・7合併号に「絶滅の危機に瀕した「固有種」小笠原の島言葉」と題して寄稿した。また、2003年1月には小笠原自然文化研究所発行の季刊誌『i-Bo』6・7