hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
β3インテグリンの機能調節に関わる分子のクローニングおよびその解析

(1)β3インテグリンの機能発現にはILKが重要であり、ILKのドメイン断片ではなく完全長が必要であることを明らかにした。また、ILKのキナーゼ活性はインテグリンの活性化には必須で無いことが示唆されたとともに、ILKは細胞内アダプタータンパク質、PINCHおよびParvinと複合体を形成して安定化にかかわっていると考えられた。(2)化学変異原により非活性に変異したキメラインテグリンαIIbα6Bβ3を発現するミュータント細胞株を複数獲得した。ミュータント細胞へのILK導入実験においてαIIbα6Bβ3の活性化を誘導しなかったことより、ILK以外の分子異常が非活性化に関与していることが示唆された。ミュータント細胞を用いた発現クローニングによる機能調節分子の単離を試みている。ILK機能ドメインのインテグリン活性化に関する解析我々はこれまでILKがインテグリンの活性化シグナル伝達に重要であることを明らかにした。今回、ILKの各機能ドメインのインテグリン活性化における役割について解析した。ILKのドメインセグメントであるアンキリンリピートドメイン、アンキリンリピート/pleckstrin homologyドメイン、キナーゼドメインをGFP融合タンパクとして発現させるプラスミドベクターを作製し、ILKが欠損した変異細胞にトランスフェクションした。完全長のGFP融合ILKは非活性状態のインテグリンを有意に活性化した。一方、ILKの各ドメインセグメントはいずれもそのタンパクの発現を確認できたが、インテグリンの活性化を誘導しなかった。したがって、インテグリンの活性化にはILKの全長が必要と考えられた。また、キナーゼ活性に障害のあるミュータントILKを2種類作製し、ILK欠損細胞に導入した。その結果、いずれのミュータントも中程度ではあるがインテグリンの活性化を誘導した。これにより、本細胞のインテグリンの活性化にはILKのキナーゼ活性は必須でないことが示唆された。β3インテグリンの機能発現に関わる分子のクローニングILKが再びクローニングされることを防ぐために、変異導入に用いた活性化インテグリンを発現する親株細胞にILKをトランスフェクションし、ILKを過剰に発現する細胞株を得た。ILKに結合する蛋白の同定とその役割前年度はILKがインテグリンの活性化に重要であり、その機能発現にはILKの完全長が必要であること、またキナーゼ活性は必須でないことを明らかにした。今回、ILKの結合蛋白について免疫沈降などにより解析した。恒常的に活性化したキメラインテグリンαIIbα6Bβ3を発現する親株細胞のライセートを用いた実験において、抗ILK抗体によりPINCH、抗PINCH抗体でpurvin、抗purvin抗体ではILKとPINCHがそれぞれ共沈降された。また、化学変異原(EMS)により非活性化状態に変異したαIIbα6Bβ3を発現するミュータント細胞はILKを欠損するとともにPINCHとpurvinの発現が著減することを明らかにした。一方、インテグリン活性化に必須の分子、タリンとキンドリンは親株細胞とミュータント細胞で同程度の発現を認めた。これらの成績より、ILKはPINCH、purvinと複合体を形成して安定化し、インテグリンの活性化にかかわることが示唆された。β3インテグリンの機能発現に関わる分子のクローニング親株細胞をEMSに暴露させて、活性型から非活性型に変化したαIIbα6Bβ3を発現するミュータント細胞を新たに獲得した。このミュータント細胞にILKをトランスフェクションしてもインテグリンの活性化を誘導しないことを確認した。ILK作用分子の解析これまでの研究期間に、ILKがインテグリンの活性化に重要であるとともにILKに結合する分子として細胞内アダプター蛋白質、PINCHとparvinが関わること、および3者が複合体を形成して互いの蛋白安定化に寄与する可能性を示した。今年度はインテグリン活性化シグナル伝達の最終ステップにおいてインテグリンβ3鎖の細胞内ドメインに結合し活性化を誘導すると考えられている分子、タリンやキンドリンとの関連を解析した。恒常的に活性化したキメラインテグリンαIIbα6Bβ3を発現する親株細胞を用いてタリン、キンドリン-2あるいはILKのノックダウンを行なった。また、ノックダウンした細胞ライセートにおいて少なくともこれら3蛋白質の発現をイムノブロットで確認した。その結果、3蛋白質の何れか1つが減少しても、リガンド類似抗体PAC-1(活性化した血小板インテグリンαIIbβ3特異抗体)の結合が低下することを明らかにできた。

β3インテグリンの機能発現に関わる分子のクローニング:これまでに、ILK以外の分子の単離を目的とした発現クローニングを行うため、化学変異原EMSでインテグリンが非活性状態に変異したミュータント細胞にILKを過剰発現させ、活性化を誘導しない変異株を複数得た。今回、これらの変異株にcDNAライブラリーを導入し、インテグリンの活性化を誘導するcDNAのクローニングを試みている。
ポジティブ／ネガティブマーカーを用いたタンパク質分泌経路の進化工学

グラム陰性菌のQuorum-sensingシステムは,膜透過性の高い分子(HSLs)をシグナルとして利用する非常に扱いやすいExpression system (遺伝子スイッチ)である。HSLsは種によって異なるacyl基構造をもっているが,QSレギュレータのシグナル特異性が低く,さらには標的とするDNA(Box)配列が似通っている。このため,QSシステムは相互に強く干渉しあい,これらをひとつの細胞内で独立に働かせること/複数遺伝子の発現を精緻にコントロールすることが困難であった。昨年度には,Agrobacterium tumefaciens由来のQSアクティベータTraRに我々の進化工学(機能選抜)手法を適用することで,天然QSシステムと,シグナル認識・標的配列の両面で直交性の高いTraシステムをそれぞれ取得した。本年度は,これらシステムを一つの細胞内へと導入し,直交的に実利用可能であることを示した。これまでにも,multi-cellular systemとしてDNA(Box)結合におけるクロストークを避け複数のQuorum-sensingシステムを直交的に使用する工夫がなされてきた。しかしながら,細胞ポピュレーションが外的環境(誘導条件etc...)に左右されるためシステムの堅牢性に大きな課題があった。本研究により得たQSシステムは,単一細胞内でも直交的に利用可能であるため,原理的にポピュレーションバランスの問題から解放され,非常に高い堅牢性を達成することができた。この成果は,29年度に論文として発表する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,マーカータンパク質が細胞内から分泌されたか否かを"数分の操作だけで"細胞死に対応づけることができるポジティブ/ネガティブ選択法を用いて,異種タンパク質の生産システムとして有望視されているTat分泌システムの分泌効率の向上をめざす.本年度は,機能選抜に利用するマーカー遺伝子の改良を行うとともに,Expression system (遺伝子スイッチ)の機能改良/多様化へと応用した。ネガティブマーカー(hsvtk)とポジティブマーカー(aph or cat)とを融合したデュアルマーカーを作製し,マーカータンパク質を恒常的に発現する/しない細胞をネガティブ選択試薬(dP),あるいはポジティブ選択試薬(kanamycin)で処理した時の生菌数を比較した。この結果,両選抜操作ともに106もの選択効率を達成できることが分かった。そこで,デュアルマーカー(hsvtk::aph)をLuxRスイッチの制御化に配置するとともに,LuxRのoperator配列をランダム化し,luxRスイッチの機能を多様化したライブラリを作製した。作製したライブラリに対し,種々の条件でネガティブ/ポジティブ選択を行うことによって,非誘導時には漏出発現なく,誘導時の遺伝子発現プロファイルが多様な遺伝子スイッチシリーズを得た。加えて,プロモータ(ptraI)改変およびtraR遺伝子へのランダム変異導入と上記デュアルマーカーを利用した機能選抜を行うことにより,大腸菌内において,対応するプロモータの転写を活性化できないと言われてきたTraRスイッチの機能改変も達成した。本研究では,マーカータンパク質が細胞内から分泌されたか否かを"数分の操作だけで"細胞死に対応づけることができるポジティブ/ネガティブ選択法を用いて,異種タンパク質の生産システムとして有望視されているTat分泌システムの分泌効率の向上/シグナル配列の認識特異性改変をめざす.本年度は,機能選抜に利用する改良型マーカー遺伝子を利用して,Expression system (遺伝子スイッチ)の機能改良/多様化を試みた。大腸菌内でも機能するよう機能改変したAgrobacterium tumefaciens由来のQSアクティベータTraR (前年度実績)とその他宿主由来のQuorum-sensingレギュレータ(LuxR/LasR/RhlR)の標的DNA認識・シグナル認識チャンネルにおける混線の有無を調べた。この結果,TraRはDNA認識において他と高い直交性を示すが,シグナル認識においては幅広くクロストークを示すことがわかった。そこで,TraRに対しランダム変異を導入し,その制御化に改良型マーカー遺伝子を配置した。そして,ネガティブ/ポジティブ選択を行うことによって,3種システムとシグナル認識・標的配列の両面で直交性の高いTraシステムをそれぞれ構築した。また,遺伝子発現/タンパク質生産系の工業化を見据え,大腸菌由来のコリン(Choline)応答性レギュレータBetIとT7phage由来の遺伝子転写システムを組み合わせた,誘導物質の安全性/コストおよび,"self-cloning"に分類される法的な組み換えルールという制約を満たす遺伝子スイッチの開発も達成した。本研究においてわれわれが開発したセレクション法は,従来に比べてFalse Positive / False Negativeが少なく,より細胞内におけるマーカータンパク質の存在の有無(細胞内から分泌されたか否か)と細胞の生死の対応付けを強固にするものである。本年度はこれを用いて,独立制御可能な多チャンネルの遺伝子スイッチシリーズを開発した。この結果は,分泌システムのシグナル配列の認識特異性改変に,本手法が有効であることを示すとともに,対象とした遺伝子スイッチ(quorum-sensingシステム)の非誘導時の漏出発現が少なく,誘導試薬の量に応じて,標的遺伝子の発現量を任意に制御可能であることから,今後の研究における対象遺伝子の精緻な発現制御に資するものである。これら成果のうち一つはフルペーパーとして発表しており,もう一方においても投稿予定である。現在,これら信頼できるツール(セレクションおよび発現制御系)を使って,未開拓な研究対象(分泌系の改良:遺伝子スイッチの遷移速度)の進化デザインに着手したところであり,順調な準備状況である。

HSLsは種によって異なるacyl基構造をもっているが,QSレギュレータのシグナル特異性が低く,さらには標的とするDNA(Box)配列が似通っている。このため,QSシステムは相互に強く干渉しあい,これらをひとつの細胞内で独立に働かせること/複数遺伝子の発現を精緻にコントロールすることが困難であった。昨年度には,Agrobacterium tumefaciens由来のQSアクティベータTraRに我々の進化工学(機能選抜)手法を適用することで,天然QSシステムと,シグナル認識・標的配列の両面で直交性の高いTraシステムをそれぞれ取得した。本年度は,これらシステムを一つの細胞内へと導入し,直交的に実利用可能であることを示した。これまでにも,multi-cellular systemとしてDNA(Box)結合におけるクロストークを避け複数のQuorum-sensingシステムを直交的に使用する工夫がなされてきた。しかしながら,細胞ポピュレーションが外的環境(誘導条件etc...)に左右されるためシステムの堅牢性に大きな課題があった。本研究により得たQSシステムは,単一細胞内でも直交的に利用可能であるため,原理的にポピュレーションバランスの問題から解放され,非常に高い堅牢性を達成することができた。この成果は,29年度に論文として発表する予定である。本年度は,新たなセレクションマーカーを用いたセレクション法を確立した。この選択法は,従来のセレクション法に比べ,偽陽性が少なく,細胞内におけるマーカータンパク質の不在/存在(細胞内から分泌された/されていない状態に対応)と細胞の生死の対応付けを強固にするものである。この信頼正の高い機能選抜は,分泌システムの多世代にわたる進化工学の大幅な効率化をもたらすものと期待される。また,本手法のテストランとして副次的に開発した二種の遺伝子スイッチ(改良型Luxスイッチ/Traスイッチ)は,非誘導時の漏出発現が少なく,誘導試薬の量に応じて,標的遺伝子の発現量を任意に制御可能であることから、生物(工学)分野で愛用される発現制御なるものと期待される。これら成果は,フルペーパーとして投稿予定である。信頼できる手法を得たいま,分泌系の改良や遺伝子スイッチの遷移速度など,いままで試みられたことのない細胞機能の進化デザインに着手したところであり,その進捗状況は順調である。最終年度は,研究計画調書に記載した計画通り,Tat分泌システムの多世代にわたる実験室内進化を行う。
抗LKM抗体陽性C型慢性肝炎における自己免疫機序の解析

抗肝腎ミクロゾーム抗体(抗LKM抗体)陽性C型慢性肝炎患者の自己免疫機序を知るために、血清抗体の認識するエピトープを解析を試みた。1)抗KLM抗体陽性患者3症例の血清は、間接蛍光抗体法でラット肝細胞の細胞質を均一に染色し、ラット近位尿細管を限局して染色した。2)患者血清は、ラット肝ミクロゾーム分画抗原との間に、二重免疫拡散法により、沈降線を形成し、その沈降線は標準抗LKM-抗体とミクロゾーム分画抗原との間で形成される沈降線と一致した。3)患者抹消血液リンパ球とミクロゾーム分画抗原との試験管内培養を行うリンパ球幼若化試験を確立した。現在、刺激リンパ球のphenotypeを解析するとともに、IL-1等のサイトカインの産生を検討している。4)最近、LKM抗原が、チトクロームP450であるという報告があるので、チトクロームP450抗原を使用した酵素抗体法による抗体のスクリーニングシステムを確立しつつある。
中国都市・農村の社会変動に関する実証的研究

本研究は,現代中国の都市・農村の社会変動に関する実証的研究であり,上海市(都市)と山東省〓〓市(農村)を対象として,1991年から93年度までの3か年にわたり、現地調査を中心に行ったものである。1都市班,上海市の住宅地の4地域(古くからの住宅地である静安区〔山の手風〕と閘北区〔下町風〕,1950年代に建設の楊北区と1980年代後半に建設された黄浦区の2新村)を選定し,調査研究を実施した。調査内容は(1)4地域の20歳以上の男女200名,計800名を抽出し面接聴取によるアンケート調査(有効回収票637票,回収率79.6%)(2)上記800名の中から性・年齢・世帶構成別の指標にもとづき,90人を抽出し,研究員による面接聴取のケーススタディを行った。(3)4地域の関係する区の居民委員会の中から,40居民委員会を抽出し,アンケート調査を実施,さらにそのうちの8居民委員会を対象としてインテンシィブな面接聴取及び資料集収作業を行う(4)さらに居民委員会を統轄する上級機関である街導弁亊処・区人民政府・上海市政府を対象とした聴取調査及び資料の集収以上,3か年間のうちに集収した各種資料のうち,(1)の居民調査637票については電算機処理によるデータ処理を終え,目下解析作業中である。以下,主として居民委員会を対象とした考察結果について概要を述べることにする。(1)居民委員会の性格や機構上の位置をより明らかにするため,聴取や文献等によりこの委員会の成立過程,法制上の規定,行政組織や社区工作との関係,さらに共産党との関係から再検討を加えた。(2)居民委員会の住民サービス機能(便民服務)に焦点をしぼり,40居民委員会を対象に,13項目のサービスについて調査した結果をみると,居住地域の社会環境のほかに,現代中国都市の社会変動にあって,住民の生活様式や生活要求等における変化が単的にこのサービス機能に反映していることが注目された。その二,三の例を挙げてみると,現在,総じてサービス機能のもっとも充実しているのは最新の黄浦区であり,古住宅地かつ「山の手風」の静安区においてもっとも低調である。又4地区を通じて最も活溌だったのは公用電話サービス,逆に最低のものは食堂・廃品回収・修配・洗濯站や縫刃であった。今後サービスの拡充の予想される分野としては小百袋店,反対に減退の予想されるものとして発乳・修配・洗濯站・食堂・廃品回収などがみられる。2農村班,山東省〓〓市域に含まれる2か村(伝統的社会を基礎としてゆるやかに村営企業を発展させている山間部のF村と,都市近郊の村営企業を大規模かつ急速に発展させているM村)を選定し,調査を行った。主な調査内容は(1)2か村の農家(戸主)を対象とした世帶表による面接聴取調査(F村悉皆調査・有効表156戸,M村では5つの近隣組の中の1つの組(80戸)を抽出し,悉皆調査・有効回収表80戸)(2)村内の古老や干部を対象に,村の開発の歴史をはじめ戸数・土地管理や生産・生活組織等の変遷に関する面接聴取調査(3)村営企業及び労働者に関する調査(4)村民委員会・党支部の組織と運営・財政,指導者の諸属性等に関する調査(5)村民委員会の上級機関・ある郷・花図管理区・城区,さらには〓〓市政府を対象とした聴取調査及び関係資料の集収作業この両村の比較分析を通して,村営企業を中核とする農村の変動の実態の特徴,及び変動要因ならびに派生する社会的問題について明らかにしつつある。現時点で得られた知見についてあげると,まず,両村のきわだった差異には,(1)人民公社解体後の土地管理において,F村では共同組織,M村では個別分割方式を採用した結果,F村の方が村の統合性が強い(2)村営企業の資本が,農業生産力の向上による共同蓄積(公積金)のF村に対し,都市機能の膨張に伴う農地の潰廃,それに伴う土地代金収入によるM村(3)人民公社時代から農業関連の社会資本の形成に指導力を発揮してきた,いわば農民的リーダーが中心のF村に対して,村営企業の端備と同時に頭角を現わした企業経営能力を有する非農民的リーダーのM村。以上の3点が両村の社会変動を大きく左右している。調査内容は(1)4地域の20歳以上の男女200名,計800名を抽出し面接聴取によるアンケート調査(有効回収票637票,回収率79.6%)

(2)上記800名の中から性・年齢・世帶構成別の指標にもとづき,90人を抽出し,研究員による面接聴取のケーススタディを行った。(3)4地域の関係する区の居民委員会の中から,40居民委員会を抽出し,アンケート調査を実施,さらにそのうちの8居民委員会を対象としてインテンシィブな面接聴取及び資料集収作業を行う(4)さらに居民委員会を統轄する上級機関である街導弁亊処・区人民政府・上海市政府を対象とした聴取調査及び資料の集収以上,3か年間のうちに集収した各種資料のうち,(1)の居民調査637票については電算機処理によるデータ処理を終え,目下解析作業中である。以下,主として居民委員会を対象とした考察結果について概要を述べることにする。(1)居民委員会の性格や機構上の位置をより明らかにするため,聴取や文献等によりこの委員会の成立過程,法制上の規定,行政組織や社区工作との関係,さらに共産党との関係から再検討を加えた。(2)居民委員会の住民サービス機能(便民服務)に焦点をしぼり,40居民委員会を対象に,13項目のサービスについて調査した結果をみると,居住地域の社会環境のほかに,現代中国都市の社会変動にあって,住民の生活様式や生活要求等における変化が単的にこのサービス機能に反映していることが注目された。その二,三の例を挙げてみると,現在,総じてサービス機能のもっとも充実しているのは最新の黄浦区であり,古住宅地かつ「山の手風」の静安区においてもっとも低調である。又4地区を通じて最も活溌だったのは公用電話サービス,逆に最低のものは食堂・廃品回収・修配・洗濯站や縫刃であった。今後サービスの拡充の予想される分野としては小百袋店,反対に減退の予想されるものとして発乳・修配・洗濯站・食堂・廃品回収などがみられる。2農村班,山東省〓〓市域に含まれる2か村(伝統的社会を基礎としてゆるやかに村営企業を発展させている山間部のF村と,都市近郊の村営企業を大規模かつ急速に発展させているM村)を選定し,調査を行った。主な調査内容は(1)2か村の農家(戸主)を対象とした世帶表による面接聴取調査(F村悉皆調査・有効表156戸,M村では5つの近隣組の中の1つの組(80戸)を抽出し,悉皆調査・有効回収表80戸)(2)村内の古老や干部を対象に,村の開発の歴史をはじめ戸数・土地管理や生産・生活組織等の変遷に関する面接聴取調査(3)村営企業及び労働者に関する調査(4)村民委員会・党支部の組織と運営・財政,指導者の諸属性等に関する調査(5)村民委員会の上級機関・ある郷・花図管理区・城区,さらには〓〓市政府を対象とした聴取調査及び関係資料の集収作業この両村の比較分析を通して,村営企業を中核とする農村の変動の実態の特徴,及び変動要因ならびに派生する社会的問題について明らかにしつつある。現時点で得られた知見についてあげると,まず,両村のきわだった差異には,(1)人民公社解体後の土地管理において,F村では共同組織,M村では個別分割方式を採用した結果,F村の方が村の統合性が強い(2)村営企業の資本が,農業生産力の向上による共同蓄積(公積金)のF村に対し,都市機能の膨張に伴う農地の潰廃,それに伴う土地代金収入によるM村(3)人民公社時代から農業関連の社会資本の形成に指導力を発揮してきた,いわば農民的リーダーが中心のF村に対して,村営企業の端備と同時に頭角を現わした企業経営能力を有する非農民的リーダーのM村。以上の3点が両村の社会変動を大きく左右している。本研究では,都市班と農村班の2つの研究グル-プを組織し,前者では上海市内の2つの居民委員会,後者では山東省菜蕪市内の山村を対象として本年度の調査を実施した。都市における行政組織は,市ー区ー街道ー居民委員会ー小組を通例としている。さらに居民委員会と小組の中間にインフォ-マルな単位として「塊」(自然塊)があり,数小組を包括している。この「塊」は解放前の旧里寿とも関連がみられ,居民委員会のフォ-マルな地域活動と共に,住民の生活組織を捉えるうえで旧市街地では注目される。
一回の膜貫通領域をもつアミノ酸輸送担体の分子構造および機能解析

シスチン尿症は、二塩基性アミノ酸輸送システムの先天的な欠損による疾患である。最近、塩基性アミノ酸輸送担体遺伝子(NBAT)の異常がI型シスチン尿症の原因であることが報告された。しかし、NBAT遺伝子より推定される蛋白は、膜貫通領域が1回という特殊な構造をもち、新しいタイプの輸送担体と考えられる。本研究では、このような膜貫通1回の蛋白がどのようにしてアミノ酸輸送担体として機能するのかを調べる目的で、各種欠損rBATを作成し機能解析を行った。ヒトNBATはC-末端に他の蛋白と二量体を形成するロイシンジッパーモチーフを有している。そこで各種C-末端欠損NBAT cRNAを作成し、卵母細胞に注入し機能発現を調べた。その結果、C-末端欠損(Δ511-685)NBATはwild typeの注入時に見られる中性および塩基性アミノ酸輸送システムb0,+に対応する輸送特性を示さず、Naイオン存在下にのみ中性アミノ酸により阻害されるy+システムの促進が観察された。y+輸送システムをコードする遺伝子(CAT-1,2)は、すでにクローニングされており14回の膜貫通域をもつことが知られているが、CAT-1,2とC-末端欠損(Δ511-685)NBATの間にホモロジーは見られない。以上の結果は、C-末端欠損(Δ511-685)NBATはwild type NBATがコードする輸送システムではなく、他の輸送システムを促進することのできる、活性調節蛋白として機能できることが明らかとなった。一方、II型及びIII型シスチン尿症患者ではアミノ酸輸送障害の程度が異なることより、これらの疾患では、NBATと相互作用している蛋白質の異常が推定された。そこで、NBATと相互作用する蛋白質をクローニングするため、酵母two-hybridシステムをもちいて、クローニングを行った。その結果、3種の陽性クローンが得られたが、これらはNBATが発現している腎尿細管および小腸上皮細胞には発現していなかった。よって、酵母two-hybrid法で得られたクローンは非特異的なものと考えられた。次に、ラット腎尿細管刷子縁膜をもちいて、各種重合剤を処理することによりNBATと相互作用する蛋白質の存在を検討した。その結果、約45kDaの蛋白が重合剤存在下にNBATと結合していることが確認された。
咀嚼が海馬神経幹細胞の増殖・分化・維持に与える影響について

咀嚼がマウスの中枢神経に与える影響を、海馬歯状回の神経幹細胞の分化動態を指標に調べた。4週齢マウスをA)通常の固形飼料を与える群(コントロール群)、B)軟食摂取のモデルとして粉末飼料を与える群、およびC)歯牙欠損モデルとして、麻酔下で両側の上下の臼歯をすべて除去し、粉末飼料を与える群、の3群に分け、各群において、咀嚼に対する海馬歯状回神経幹細胞の影響を調べた。3つの群はそれぞれの条件で10週間飼育した後、分裂した神経幹細胞のマーカーであるBrdU(bromodeoxyuridine、50μg/gb.w.)を1日1回、12日間投与した。投与終了1日後、各グループの半数を4%パラホルムアルデヒデドにて灌流固定を行い、固定後脳を取り出し、ビブラトームにて50μmの切片を作成し、海馬全体の連続切片を作成した。残りの半数はBudU陽性細胞の一定期間後の生存・分化を調べる目的で、さらに各条件で5週間飼育した後、灌流固定を行い同様の脳切片を作成した。得られた切片から3群間で神程幹細胞の増殖、分化、維持および機能発現などに違いがあるか調べた。本年度は、神経幹細胞のマーカーであるネスチン、およびアストロサイトのマーカーであるS100bの抗体を用い海馬歯状回の幹細胞数をカウントし、BrdU陽性細胞との一致を比較した。その結果、5週間飼育を続けた場合、固形飼料を与えた群に比べて、粉末飼料や抜歯後粉末飼料を与えた群で、BrdU陽性を示した細胞は、有意にネスチンと局在を一致する細胞が減少し、また、S100bに陽性を示す細胞との局在が増加した。しかし、アポトーシスのマーカーであるCaspase-3で染色した結果、BrdU陽性を示す細胞との局在の一致が見られたが、その数は全群で少なく、有意差は認められなかった。以上より、咀嚼は海馬で分化する神経幹細胞の維持に影響を与えることが示唆された。咀嚼がマウスの中枢神経に与える影響を,海馬歯状回の神経幹細胞の分化動態を指標に調べた。生後4週のマウス(C57BL/6,メス,N=79)を,1)固形食投与群(通常のマウス飼育用固形食を与えたもの),2)粉末食投与群,および3)臼歯部抜歯+粉末食投与群の3群に分け10週間飼育した。次に体重あたり50μg/gのbromodeoxyuridine (BrdU)を1日1回12日間,腹腔に投与した。投与後,各群の半数に灌流固定を行った。残りの半数はそれぞれの条件でさらに5週間飼育した後,灌流固定を行い,脳切片を作成した。切片は,各スライスの中のBrdU陽性細胞をカウントし,海馬歯状回あたりの全陽性細胞数を求め,各群の差を比較した。さらに,飼料中のカロリーや体重の変動が与える影響を調べるために,固形食群に玄米(高カロリー食)を,粉末食投与群には玄米を粉末にしたものを中心にそれぞれ与え,普通食と同様の評価を行った。海馬の歯状回のBrdU陽性細胞は,BrdU投与直後では,3群間で差は認められなかったが,5週間後では,固形食投与群に比べて,粉末食投与群および臼歯部抜歯+粉末食投与群でBrdU陽性細胞が有意に低下していた。また,玄米を与えた場合,普通食を与えた場合に比べて体重が有意に増加した。しかし,普通食投与実験と同様に,BndU陽性細胞は,BrdU投与直後では玄米群と粉末玄米群では有意差がなかったが,5週間後では,玄米群に比べ,粉末玄米郡で有意に低下していた。以上のことから、臼歯欠損や軟食摂取が海馬歯状回中の神経幹細胞の分裂数には影響を与えないが,分裂した細胞の生存率を低下させることを示した。また,高カロリー食や,体重の増加は,これらの結果に影響を与えないことが判明した。現在,咀嚼に関する情報がどのような神経回路を経由し,海馬に入力しているのか,検討中である。

得られた切片から3群間で神程幹細胞の増殖、分化、維持および機能発現などに違いがあるか調べた。本年度は、神経幹細胞のマーカーであるネスチン、およびアストロサイトのマーカーであるS100bの抗体を用い海馬歯状回の幹細胞数をカウントし、BrdU陽性細胞との一致を比較した。その結果、5週間飼育を続けた場合、固形飼料を与えた群に比べて、粉末飼料や抜歯後粉末飼料を与えた群で、BrdU陽性を示した細胞は、有意にネスチンと局在を一致する細胞が減少し、また、S100bに陽性を示す細胞との局在が増加した。しかし、アポトーシスのマーカーであるCaspase-3で染色した結果、BrdU陽性を示す細胞との局在の一致が見られたが、その数は全群で少なく、有意差は認められなかった。以上より、咀嚼は海馬で分化する神経幹細胞の維持に影響を与えることが示唆された。
抗CCP抗体陰性の関節リウマチ患者における特異的自己抗体の網羅的探索

関節リウマチ(RA)は多関節に炎症を生じる自己免疫疾患であり,進行性の関節破壊を生じる難治性の疾患である.本研究ではRAの早期診断を目的として,血清中に存在する自己抗体を探索した.約9000種類のヒトタンパク質に対する自己抗体を探索し,RA患者に高発現する自己抗体を複数抽出した.この結果を検証するためにさらに大規模サンプルにて詳細に検証したが,特異的な自己抗体の確定には至らなかった.昨年度は1次スクリーニングとしてプロテインマイクロアレイにより抗CCP抗体陽性RA患者,抗CCP抗体陰性RA患者,および健常者各5例の血清中に存在する自己抗体を網羅的に探索し,抗CCP抗体陰性RA患者に特異的に存在すると考えられる自己抗体の候補を抽出することを目的として研究を開始した.まずRAの診断が確定している抗CCP抗体陽性RA患者,抗CCP抗体陰性RA患者,健常者の血液を収集し,1次スクリーニングとして複数の遺伝子ファミリーに由来する約9000種のヒトタンパク質を高密度に配置したプロテインマイクロアレイであるProtoArray; Human Protein Microarray v5.0を用いて,血清中に存在する自己抗体の網羅的探索を行った.抗CCP抗体陰性RA患者と健常者間での比較検討が最も重要と考え,抗CCP抗体陰性RA患者7例,および健常者7例の計14例にて解析を行った.これにより抗CCP抗体陰性RA患者に高発現している自己抗体が複数抽出され,これらは過去の報告にはないものであった.本年度はさらに本結果を確証するために,2次スクリーニングとして抗CCP抗体陽性RA患者36例,抗CCP抗体陰性RA患者43例,健常者51例の計130検体の血液を,研究内容および試料採取に関する詳細な説明を患者本人に対して直接行いインフォームドコンセントのもとに収集した.これらに対してLUMINEXシステムを用いてビーズに候補自己抗体が認識する特異的抗原を固定し,蛍光標識2次抗体を用いることでサンプル中の抗体を同時に多数定量した.しかしながら今回の2次スクリーニングでは3群間に有意差は認められず,抗CCP抗体陰性RA患者に特異的と言える自己抗体の確定には至らなかった.1次スクリーニングにおけるサンプル数の限界が結果に影響しているものと考えている.関節リウマチ(RA)は多関節に炎症を生じる自己免疫疾患であり,進行性の関節破壊を生じる難治性の疾患である.本研究ではRAの早期診断を目的として,血清中に存在する自己抗体を探索した.約9000種類のヒトタンパク質に対する自己抗体を探索し,RA患者に高発現する自己抗体を複数抽出した.この結果を検証するためにさらに大規模サンプルにて詳細に検証したが,特異的な自己抗体の確定には至らなかった.本年度は1次スクリーニングとしてプロテインマイクロアレイにより抗CCP抗体陽性RA患者,抗CCP抗体陰性RA患者,および健常者各5例の血清中に存在する自己抗体を網羅的に探索し,抗CCP抗体陰性RA患者に特異的に存在すると考えられる自己抗体の候補を抽出することを目的として研究を開始した.まず東京女子医科大学病院に通院中の患者より,RAの診断が確定している抗CCP抗体陽性RA患者,抗CCP抗体陰性RA患者,健常者の血液を収集し,血液は遠心分離後に血清を凍結保存した.1次スクリーニングとして複数の遺伝子ファミリーに由来する約9000種のヒトタンパク質を高密度に配置したプロテインマイクロアレイであるProtoArray®Human Protein Microarray v5.0を用いて,血清中に存在する自己抗体の網羅的探索を行った.抗CCP抗体陰性RA患者と健常者間での比較検討が最も重要と考え,抗CCP抗体陰性RA患者7例,および健常者7例の計14例にて解析を行った.プロテインマイクロアレイはライフテクノロジーズジャパン社のプロトアレイ受託サービス免疫応答バイオマーカープロファイリングにての委託解析とした.これにより抗CCP抗体陰性RA患者に高発現している自己抗体が抽出され,過去の報告にはないものであった.さらに本結果を確証するために,血清サンプルの追加収集,大規模サンプルでの2次スクリーニングの準備段階である.本年度の研究は実施計画通りに進行したと考える.交付申請書に記載通りに1次スクリーニングが完了し,第2段階へ進行可能な結果を得ることができたため.1次スクリーニングにて得られた候補自己抗体の特異性を検証するため,第2段階としてより大規模なサンプルにて得られた候補自己抗体をELISAで検証し,早期診断に応用しうる自己抗体を同定する.さらに得られた自己抗体およびその抗原の機能を解析し,RAの病態形成との関与を検討する.大規模サンプルでの自己抗体の存在を測定するためのELISAキット,データ解析用のPCワークステーション,研究結果報告のための出張旅費に研究費を使用する予定である.
がん幹細胞性におけるミトコンドリア動態の果たす役割を明らかにする

ミトコンドリアの形態は、絶え間ない融合と分裂により変化し、その特異的な形態、また細胞内局在は、ミトコンドリアの多彩な機能、特にカルシウム制御に関与する。グリオーマ細胞の幹細胞集団において、断片化し特異的な細胞内局在のミトコンドリアを観察しており、ミトコンドリア動態が、がん細胞の可塑性や不均一性の根幹である幹細胞性に関与している可能性がある。本研究は、(1)がん幹細胞集団の特異的なミトコンドリア形態を制御する因子は何か?、(2)がん細胞の特異的なミトコンドリア動態が、どのようにがん幹細胞性の獲得や維持に関与しているか?について、カルシウム制御に着目し、ミトコンドリア動態の役割を解明する。
光のスクイ-ズド状態の生成と干渉計への応用

進行波型パラメトリック増幅によって、広帯域にわたる真空場のゆらぎの大きな圧搾を行うことを目標として、前年度までに行ったBazNaNb_5O_<15>結晶における実験につづいて、次の項目の実験的研究を行った。1.Mgoをド-プしたLiNbO_3結晶によるスクイ-ジング2.KNbO_3結晶によるスクイ-ジング3.3倍の長さ(15mm)のKNbO_3結晶によるスクイ-ジング4.励起光をパルス圧縮したスクイ-ジング第1の実験では、非線型感受率はBaNaNbO_3の1/3であるが、長い結晶が得られたので、相互作用長を長くとれる。第2の実験では、結晶の光による損傷が起りにくいので、最も大きな入力を入れることができる。これらの実験結果を列挙すると次のようになった。この実験のKNbO_3で得られた圧搾量-1.8dBは世界的に見て2番目に大きな量である。第3の実験では、位相整合をとるため180°Cの高温に上げたところ結晶の温度が不均一になり、マルチドメインになって使用不能となった。第4の実験では、パルス圧縮が不完全で、未だ良い圧搾が得られていない。これらの実験は今後も継続の予定である。来年度は、これまでのスクイ-ジングの実験と干渉計を組合せ、干渉計の感度の向上を確かめる実験を行う予定である。
細胞死抑制蛋白による内耳障害の新しい治療法(蛋白治療)の開発

細胞死を防御する蛋白質を投与して、内耳障害の予防・治療に応用する蛋白治療を開発した。ミトコンドリアからのチトクロームcの放出を抑えるBcl-XLの三つの水素結合を除去したanti-apoptotic蛋白(FNK)を作成し、これにHIV/Tat蛋白のProtein Transduction Domain(PTD)をくっつけて細胞内に導入できるようにした(FNK-PTD)。まずこの蛋白にmycをtagとして付けたものをモルモットの腹腔内投与し、1-6時間後に断頭し、蝸牛を固定し、パラフィン切片を作成した。その後Myc抗体を用いた免疫染色により蝸牛での発現について検討した。その結果、投与1時間後からこの蛋白は蝸牛内に出現し、3時間後に発現量がピークとなり、6時間後には著明に減少することがわかった。発現部位は、主にコルチ器、ラセン神経節であった。つぎにFNK-PTDが蝸牛有毛細胞の細胞死を予防できるかどうか検討した。カナマイシン((1)200mg/kg、または(2)400mg/kg)およびエタクリン酸((1)40mg/kgまたは(2)50mg/kg)によりモルモットの蝸牛有毛細胞を広範に障害し、この前後にFNK-PTDまたは生食を投与した。1週間後ABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationにより残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制し、内外有毛細胞ともに有意に細胞死を抑制した。また(2)の条件で障害8時間後にcPARP陽性細胞を調べるとFNK-PTDにより有意に減少していた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、耳毒性薬剤による有毛細胞の細胞死を抑制することを示している。その後Mycに対する抗体を用いた免疫染色により蝸牛での発現について検討した。発現部位は、主にコルチ器、ラセン神経節、蝸牛側壁であった。つぎにFNK-PTDが蝸牛有毛細胞の細胞死を予防できるかどうかについて検討した。カナマイシン((1)200mg/kg、または(2)400mg/kg)およびエタクリン酸((1)40mg/kgまたは(2)50mg/kg)によりモルモットの蝸牛有毛細胞を広範に障害し、この前後に数回、FNK-PTDまたは生食を投与した。1週間後にABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationをロダミン染色し、蛍光顕微鏡下で残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制した。細胞カウントでは、(1)の障害条件では内外有毛細胞ともに有意に細胞死が抑制していた。(2)の障害条件では障害が強く、外有毛細胞は治療・未治療とも全部死滅したが、内有毛細胞は治療群で有意に細胞死が抑制されていた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、有毛細胞の細胞死を抑制するように働くことを示している。

1週間後ABRを測定し、断頭後蝸牛を固定し、surface preparationにより残存有毛細胞の数をカウントした。その結果FNK-PTD投与群では(1)および(2)のどちらの障害においても有意にABR閾値の上昇を抑制し、内外有毛細胞ともに有意に細胞死を抑制した。また(2)の条件で障害8時間後にcPARP陽性細胞を調べるとFNK-PTDにより有意に減少していた。この結果はFNK-PTDが蝸牛に発現して、耳毒性薬剤による有毛細胞の細胞死を抑制することを示している。
歯周病関連菌の病原性と口腔環境ストレスとの相互作用

1.環境変動因子としてグルコースに加え、歯周ポケット浸出液成分としてのアルブミンおよび唾液成分としてのムチンの影響を調べた。Piはアルブミンとムチンをともに利用し菌の増殖は増加した。さらに、菌体外プロテアーゼであるキモトリプシン様活性、エラスターゼ様活性、カゼイン分解活性が増加した。一方、グルコースの存在で菌の増殖は増加するもののプロテアーゼ活性は減少した。2.増殖基質によってプロテアーゼ活性が変化したことから、酵素活性調節は基質の代謝と密接に関わっていると考えられた。そこでPiおよびPnの主要代謝経路すなわち(1)アミノ酸代謝経路と(2)グルコース代謝経路を決定した。(1)前年度に決定されたアスパラギン酸代謝経路に加え、さらにバリンとロイシンの代謝経路が決定された。バリンとロイシンはともに分枝アミノ酸トランスアミナーゼと分枝オキソ酸酸化還元酵素によって代謝され、それぞれイソブチル酸とイソバレリアン酸になることがわかった。(2)グルコースはエムデン・マイヤホフ解糖系を経て代謝され、コハク酸、酢酸、ギ酸になることがわかった。さらにグルコースはグルコース6リン酸を経てグリコーゲンとなり菌体内に蓄積されることが明らかになった。以上の結果から、細胞毒性代謝産物であるアンモニア、イソブチル酸、イソバレリアン酸はアミノ酸代謝によって産生されることがわかった。また、グルコース代謝時は解糖系でのエネルギー獲得効率が良いためアミノ酸代謝が抑えられ、その結果、細胞毒性代謝産物産生量が減少すると考えられる。さらに、グリコーゲン蓄積能は口腔環境中でのこの細菌の生存能力を高める一因と思われる。グルコースによるプロテアーゼ活性の減少はいわゆる「カタボライト・リプレッション」の可能性が高いが、さらなる検討が必要である。1. Fn、PiおよびPnではpH5.0-7.0で増殖が可能だった。一方、PgはpH6.0-7.0というより中性に近いpHでのみ増殖した。さらにFn、PiおよびPnはアミノ酸やペプチドの代謝に伴い、アルカリを産生し低pH環境を中和した(J Dent Res 1997、Oral Microbiol Immunol 1997)。2. PiとPnはともにグルコースを含まない培地ではアンモニア、イソブチル酸およびイソバレリアン酸などの細胞為害性代謝産物を大量に産生し、高い菌体外プロテアーゼ活性を示した。しかし、グルコースが存在するとこれらの代謝産物の産生と菌体プロテアーゼ活性はともに有意に減少した。Pgはグルコースの影響を受けなかった(J Dent Res投稿準備中)。3.特に環境の影響を受けやすいPiの代謝産物産生能と菌体外酵素に注目し、この調節機構を明らかにするために、まず、Piの主要代謝経路と考えられたアスパラギン酸の代謝経路および代謝酵素を検討した。その結果、アスパラギン酸は脱アミノ(アンモニア産生)後、オキザロ酢酸になり(1)一部は還元されコハク酸に(2)残りはオキザロ酢酸への脱炭酸の後、ギ酸と酢酸に代謝されることが明らかになった(Oral Microbiol Immunol投稿準備中)。次年度は、以上の結果をもとにPiを嫌気条件で連続培養し、Piの病原性の一つである細胞為害性代謝産物産生能および菌体外酵素の調節機構を明らかにする予定である。
油症事件の被害構造と油症被害者の受容克服過程に関する社会学的研究

日本と台湾の油症事件の被害構造とそれに対する政策に着目した調査研究を実施した。台湾油症事件においては、いまだかつて社会学的調査研究がなされなかったため、まず事件に関係する主体連関図作成から始まり、現地で調査が実施できるような関係つくりから始めた。成果として日本においては、潜在患者の顕在化を促した五島市の油症政策に着目した結果、ソーシャルワーカーの存在が患者との良好な関係を築き、患者の顕在化を促してきたことが確認された。さらに2012年制定の油症患者救済法と2015年に台湾で制定されたケア法の制定過程とその内容も検証した。その結果、日本と台湾では、被害の捉え方に違いがあることが確認された。今年度は台湾油症事件に関する調査研究を主に実施した。具体的には台湾油症研究の第一人者である台湾大学の研究者へのヒアリング調査を実施し、台湾油症患者に対する現状を医学的側面から学ぶとともに、台湾油症患者、すなわち被害者に対するヒアリング調査実施のための患者紹介もしていただき、台中の弘光科技大の先生からの紹介で被害者の方々にお会いする事ができた。その他、台湾油症事件に関するドキュメンタリーを作成した監督、台湾油症事件に関する本の執筆者、台湾油症の支援団体にもヒアリング調査を実施した。特に台湾油症被害者の方々に対するヒアリング調査では、6月、7月から8月、3月と回を重ね、2世の油症患者も含め、約10人ほどにお会いすることができた。聞いた項目は体調を含め油症にかかったことによる生活設計の障害や困難の有無、職業や社会生活上での不利益の経験、医療機関や行政、企業との接触での経験の有無等であった。それ以外にも台湾油症被害者を直接・間接に支援する支援団体の理事長、新旧事務局員にも、台湾油症事件が抱えている現状と求められる救済制度についてヒアリング調査を実施した。現在、台湾でも日本と同様に油症患者に対する救済的側面からみた法制度の構築が行われている。それらの動きや各主体が抱えている課題等に関する資料収集等も行った。他方、国内のカネミ油症事件に関する調査研究では、患者数が多く患者に寄り添う形で多様な支援計画を実施している長崎県五島市のカネミ油症政策に関する現状と課題を論文としてまとめた。五島市では「カネミ油症被害者に対する支援行動計画」を平成20年からたて、油症患者に対する法律が成立した以後も積極的に油症被害者に対する支援行動を実施している。法制定後による認定患者の数は五島市が他市町村に比較して飛び抜けている事からも、五島市の政策が油症患者の認定化への力となっていることが確認された。今年度は昨年度実施した台湾油症における現地調査で得られたヒアリング記録や収集資料等の整理・分析に着手した。他方で日本のカネミ油症における油症患者へのヒアリング調査を実施した。特に日本においては油症に関する救済法が成立し、原因企業を含む三者協議会が開始された。そこに出席している油症患者へのヒアリング調査、ならびにいまだ救済のめどがたっていない、2世の油症患者へのヒアリング調査も実施した。その結果、多数ある被害者団体と原因企業、政府との間でのやりとりはすすんではいるものの、その効果としては微々たるものであり、次年度の救済法見直しにむけては被害者団体の要求等がうまく展開していないことが確認された。さらに2世に関してはほとんど表に出てくる患者もなく、かなり困難な状況におかれていることも確認された。また年があけて、台湾油症において台湾版救済法と言われる「ケア法」が成立したため、急遽現地に調査に行き、資料収集ならびに台湾油症患者と研究者にヒアリング調査を行ってきた。その結果、台湾油症では公衆衛生を専門とする研究者が台湾油症患者のQOLを調べ、例えばエイズ患者より台湾油症患者のQOLが低いことを提示したことや、さらに患者が代表である支援者団体の運動も契機となり、ケア法が成立したことがわかった。台湾油症のケア法の場合、地域や職場等で差別的発言等を受けた場合、罰金を課すということが法的に規定されていることや、総統府令としてだされたことから、たとえ政権が交替しても、その法律は消滅しないことなどが聞き取られた。しかし、台湾油症においても、いまだ潜在化している患者が多くいると思われる中部での患者の救済問題が一つの大きな課題となっていた。本年度は最終年度として報告書を作成し、4本の論文と食品公害に関する3つの年表、さらに資料として日本と台湾の油症患者における法律を原文・日訳とともに掲載した。以下内容を述べる。最初の論文は食品安全行政に関するもので、食品安全基本法を中心にその成立経緯と特性、さらに食品安全委員会の報告書分析から見えてくる各アクターの位置づけをまとめた。次にカネミ油症推進法制定後、被害者と国と企業の三者協議が数回実施されてきたが、その経緯と内容に関して論じたものが2本目の論文である。法制定から3年がたっても、2世3世の問題、医療費・生活費の問題等なかなか解決していない現状であることがわかった。3本目は、油症患者の掘り起こしにある程度貢献している地方自治体である長崎県五島市の油症患者政策において、2014年に執筆した内容にさらに付け加える形で2015年以降の油症政策をフォローした。2015年において前年度の油症政策の検証が行われていた事が、新しく確認されたことであった。最後に台湾油症に関してのレビューと台湾油症ケア法に関する被害の語られ方をまとめた。

資料は限定されてはいるが、やはり台湾油症事件においても社会学的な視点が少ないこと、さらにケア法を見る限りは、被害が時間的・空間的に幅広く捉えられていた。年表は、食品公害の原点とされる森永ひ素ミルク事件の被害者の動き、政策の動き等を中心に作成した。それ以外には日本のカネミ油症事件の推進法制定後の年表、台湾油症事件に関する年表を作成し、掲載した。なお資料としてカネミ油症推進法と台湾油症ケア法を提示した。台湾油症ケア法に関しては原文提示とともに日本語訳も合わせて掲載した。今後は、日本と台湾の油症被害構造のさらなる提示と、それを規定する各要因について、食の科技術史も踏まえたうえで展開していくことが課題となる。日本と台湾の油症事件の被害構造とそれに対する政策に着目した調査研究を実施した。台湾油症事件においては、いまだかつて社会学的調査研究がなされなかったため、まず事件に関係する主体連関図作成から始まり、現地で調査が実施できるような関係つくりから始めた。成果として日本においては、潜在患者の顕在化を促した五島市の油症政策に着目した結果、ソーシャルワーカーの存在が患者との良好な関係を築き、患者の顕在化を促してきたことが確認された。さらに2012年制定の油症患者救済法と2015年に台湾で制定されたケア法の制定過程とその内容も検証した。その結果、日本と台湾では、被害の捉え方に違いがあることが確認された。初年度は台湾油症事件についての調査研究が主であったが、今年度は日本の救済法制定をふまえ三者協議(患者・国・原因企業)が実質開始された段階での、油症患者へのヒアリング、さらにいまだ救済制度が構築されていない2世の患者へのヒアリング調査が可能となった。さらに台湾油症において、救済法と言われているケア法が年度末近くに制定し、そのことに関しても資料収集と関係者によるヒアリング調査が実施できたことは大きい成果であった。環境社会学今年度は、調査研究活動に多くの時間はさけず、昨年度の記録おこし等が中心の作業となったが、日本でのヒアリング調査の実施、台湾油症事件でのケア法に関する調査研究が短期間ではあるものの実施可能となった。そのため、今後はそれらの資料やデータの整理整頓、分析をすすめるとともに日台油症事件の救済制度からみた比較考察、さらに被害の実態の比較考察もおこなっていき、次年度をまとめの年度としたい。当初は、台湾油症事件の関係者の方々にお会いできるか、また被害の実態と受容克服過程を明らかにするために、特に被害者の方々にお会いできるかという不安的要素があった。しかし、言葉の壁はあったものの、台湾での研究者の方々に支えられ、被害者の方々を含み、関係者への調査が実施できた。今後は、ヒアリング調査のデータを分析していき、さらに補足調査をすることで、台湾での被害の実態と被害構造の明確化、油症被害者の受容克服過程を明らかにしていくことが可能となった。そして、それらのデータと日本でのカネミ油症事件の被害の実態と被害者の受容克服過程の比較考察を試みる。サバティカルイヤーも終わり、日台油症事件に関する調査研究に多くの時間は割けなくなったが、平成25年度に実施された調査データの整理整頓ならびに分析を年度前半に実施したい。その上で、台湾ならび国内(特に長崎県)の油症事件の現場における補足調査を実施する。
Chlamydomonasにおける過酸化水素消去系遺伝子の発現機構の解明

本研究では、1)光合成生物で初めて見いだされたChlamydomonas reinhardtiiのグルタチオンペルオキシダーゼ(GSHP)の発現機構、2)GSHPと共役して機能するグルタチオンレダクターゼ(GSHR)の酵素学的および免疫学的性質、3)Chlamydomonasに存在するH_2O_2消去系酵素の役割分担を含めたH_2O_2消去系の機能を明かにした。Chlamydomonasを亜セレン酸ナトリウム(3mg/l)を含む培地で培養すると既存のアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(AsAP)が消失し代わりに動物特有と考えられていたGSHPが発現した。牛赤血球GSHPに対するポリクローナル抗体を作製し、これを用いて免疫滴定を行ったところ、セレン(Se)添加によるGSHP活性の上昇はタンパク質の合成によることが明らかになった。また、本酵素の誘導は高CO_2濃度(3-5% CO_2)や暗黒処理により著しく阻害された。このことからChlamydomonasGSHPは光合成偽循環型電子伝達系でO_2を介して生成されるH_2O_2の消去に有効に機能していることが示唆された(Plant Science,94,81-88(1993))。ChlamydomonasのGSHRを精製し酵素学的性質を調べたところ、高等植物およびEuglenaのそれと類似していた。しかし、これまで報告されているGSHRは同一のサブユニットからなる2量体であるのに対し、ChlamydomonasのGSHRは分子量56kDaのモノマーであった。精製酵素はEuglenaおよびホウレンソウ葉のGSHRに対するポリクローナル抗体に反応した(J.Gen.Microbiol.,139,2233-22388(1993)).Chlamydomonas細胞に存在するH_2O_2消去酵素の局在性を検討したところ、Se添加(+Se)細胞に存在するGSHPはGSHRと共に細胞質に、Se無添加(-Se)細胞に存在するAsAPはAsA再還元系を構成する酵素と共に葉緑体に局在していた。H_2O_2消去酵素の役割分担についてみると、+Se細胞ではH_2O_2消去は主にGSHPにより行われていた。一方、-Se細胞では60%のH_2O_2がカタラーゼにより、そして残りはAsAPにより消去されていた。また、Chlamydomonasより単離した無傷葉緑体を高酸素および強光下に置くと葉緑体外へのH_2O_2の移行が認められた(Plant Peroxidases:Biochemistry and Physiology,257-262(1993))。研究成果は1993年に行われた国内(4回)および国際学会(植物ペルオキシダーゼ会議;デンマーク、国際植物学会;横浜)で発表し、上記の外国雑誌論文に掲載した。

研究成果は1993年に行われた国内(4回)および国際学会(植物ペルオキシダーゼ会議;デンマーク、国際植物学会;横浜)で発表し、上記の外国雑誌論文に掲載した。