hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘパリン結合性成長因子Midkineの胎児副腎における機能ならびに作用機構の解明

我々はマウス妊娠中期の胎児諸臓器で高発現する成長因子Midkine(MK)に着目した。ヒト副腎(妊娠中期)における検討では、成人副腎に比べ胎児では4倍以上のmRNAレベルが高く、蛋白も強く発現していることが示された。しかもMKはDZ細胞のみに増殖促進作用を示しFZ細胞には効果が見られなかった。阻害剤投与実験によりMKシグナリングに関与するpathwayを検討すると、MAPKキナーゼ、PI-3キナーゼ、Srcキナーゼの関与が示唆された。さらにMKは胎児副腎の主要なregulatorであるACTHにより発現増強されることが明らかとなった。またMKと結合しMKシグナル伝達に関与していると考えられている複数の受容体候補蛋白のヒト胎児副腎での発現に関して,syndecan-3(SDC3)がDZに特異的に局在していることを明らかとした。したがって、SDC3は我々が本研究で見いだしたMKのDZ細胞特異的増殖促進作用に関与することにより、ヒト胎児副腎においてin vivoで認められるDZ主体の細胞増殖機構の一端を担っている可能性が高いものと考えられた。また我々はMKがin vitroでコルチゾール産生のkey enzymeであるHSD3B2の発現を抑制することも明らかにし、妊娠中期までの胎児副腎におけるコルチゾール産生抑制に関与している可能性を示した。MKによるHSD3B2発現抑制作用は、ヒト胎児副腎皮質細胞のモデル系であるNCI-295細胞系でも解明を進めており同様の結果が得られている。以上、当該研究課題の成果として、MKの胎児副腎での重要な役割が明らかとなった。胎児副腎は高等動物においては胎児視床下部副腎-胎盤系の重要な部分を担っているにも関わらず、その細胞増殖、分化(層形成)、発育、機能発現のすべてにおいて未解明な点が多い。得られた成果を本研究分野の今後の礎としていきたい。胎児副腎は、妊娠維持や臓器の成熟、種によっては分娩発来に関与する重要な臓器であるが、その発育や機能の制御については不明な点が多い。ヒト胎児副腎皮質は主として外層のdefinitive zone (DZ)および内層のfetal zone (FZ)の二層からなる。in vivoにおいて、細胞増殖は前駆細胞のプールと考えられるDZにほぼ限定して認められ、FZではほとんど見られないことが知られている。これまでヒト胎児副腎に高発現し局所因子として重要であると考えられてきた成長因子は、いずれの層由来の皮質細胞に対してもin vitroで増殖効果を示し、DZ特異的に働く因子の存在は明らかでなかった。Midkine (MK)は細胞増殖、分化、遊走促進など多彩な生物活性を示しヘパリン結合性を有する成長分化因子である。マウスでは胎生中期にピークを持つ一過性の発現を示すことが知られている。本年度の研究で、リアルタイムRT-PCRを用いた検討では、ヒト妊娠中期胎児副腎のMKmRNAレベルは成人副腎に比べ4倍以上高く、MK高発現部位である脳や胎児腎臓のレベルに匹敵した。また蛋白レベルでも胎児副腎で高発現が確認された。初代培養細胞を用いた検討では、MKはDZ由来の細胞のみに増殖活性を示した。さらに胎児副腎皮質細胞に類似した表現型を有するNCI-H295A細胞に対しても、MKはDZ細胞と同様の増殖促進作用を示した。以上よりMKはヒト胎児副腎の発育において重要な役割を演じていることが強く示唆された。

また、これまでMKの作用機構に関与する受容体と報告されてきたAnaplastic lymphoma kinaseやProtein tyrosine phosphatase zeta等はDZ細胞には発現しておらず、MKはこれまで知られていない受容体を介してDZ細胞増殖促進作用を発揮するものと考えられた。前年度の研究成果に引き続き、midkine(MK)を副腎全層に由来する培養細胞に添加し48時間後にNCAM/CD56陽性細胞数(DZ細胞数)をフローサイトメトリーにより調べると、MK非添加群に比べMK添加群で有意に細胞数が増加しており、MKのDZ細胞増殖促進作用が確認された。阻害剤投与実験によりMKシグナリングに関与するpathwayを検討すると、DZ細胞増殖促進作用におけるMAPKキナーゼ、PI-3キナーゼ、Srcキナーゼの関与が示唆された。さらにMKは胎児副腎の主要なregulatorであるACTHにより発現増強されることが明らかとなった。以上より、MKはヒト胎児副腎で重要な役割を果たしており、in vivoで認められるDZ主体の細胞増殖機構の一端を担っているものと考えられた。また我々はMKがin vitroでコルチゾール産生のkey enzymeであるHSD3B2の発現を抑制することも明らかにし、妊娠中期までの胎児副腎におけるコルチゾール産生抑制に関与している可能性を示した。MKによるHSD3B2発現抑制作用は、ヒト胎児副腎皮質細胞のモデル系であるNCI-295細胞系でも解明を進めており同様の結果が得られている。以上のように、当該研究課題の成果として、MKの胎児副腎での重要な役割が明らかとなった。胎児副腎は高等動物においては胎児視床下部副腎-胎盤系の重要な部分を担っているにも関わらず、その細胞増殖、分化(層形成)、発育、機能発現のすべてにおいて未解明な点が多い。得られた成果を本研究分野の今後の礎としていきたい。
省エネルギー方式の重水分離製造プロセスの開発

重水素イオン及び水素イオンを、両性イオンを固定相、脱イオン水を移動相として用いた高速液体クロマトグラフィーによって分離されたことが実験的に確認された。この研究成果は、申請者が目指している「重水の分離と精製」に直接に結びつく研究成果である。固定相としては、下記の三種類の両性イオン固定相、即ち、四級アンモニウム塩基/リン酸基タイプの固定相、四級アンモニウム塩基/スルホン酸基タイプの固定相、並びに、四級アンモニウム塩基/カルボキシル基タイプの固定相を用いて、実験した。その結果、四級アンモニウム塩基/リン酸基タイプの固定相、つまり、生体膜を構成する脂質であるホスファチジルコリン(レシチン)タイプの両性イオン固定相のみは、水素イオン及び重水素イオンを認識・分離することが分かった。水素イオン及び重水素イオンは、共に、ボスファチジルコリン(PC)と結合する。しかしながら、重水素イオン/ホスファチジルコリンの安定性は、水素イオン/ホスファチジルコリンの安定性より高い。その結果、重水素イオンは、水素イオンより遅く溶出され、水素イオンから分離されることになる。移動相としては、脱イオン水以外に、電解質水溶液、例えば、塩化ナトリウムや、塩化リチウム水溶液を用いても、分離が確認された。加えて、本研究成果は、「pHメーターの精度が低い」といった分析化学の基本問題の解決にも貢献する。重水素イオンを分取するといった観点から見た実験では、つまり、通常の酸から重水素イオンを取り出すことを試みた場合、重水素イオンの含有量が極めて低いため、水素イオンのピークのみが観察された。全く異なる固定相を合成し、より効率の高い分離システムの構築を目標にして、これからも研究を続けたいと考えている。重水素(D_2、Deuterium)は、核融合エネルギーの開発に欠かせない原料物質である。また、その酸化物、即ち、重水(Deuterium oxide、D_2O)は、原子炉の減速材として実際に使われている。しかしながら、我が国は、重水素又は重水を製造するプラントを持っていないため、海外からの輸入に依存せざるえない。周知の通り、重水素と重水は国際規制物質であるので、安定した原子力発電及び核融合エネルギーの研究・開発を維持するためには、重水素及び重水の生産技術を開発・確保しなければならない。重水又は重水素は、主として電気分解法により普通の水から取り出されている。例えば、10トンの重水を取り出すには、約10万トンの普通の水を電解する必要がある。この方法は、膨大な電気エネルギーを消費するだけでなく、既に国外において特許化されていた方法であるため、日本では利用できない。このような状況を踏まえ、研究代表者らは、レシチン(ホスファチジルコリン)つまり、生体膜を構成する主となる物質、即ち、1分子にリン酸基と四級アンモニア塩基を持つ物質、DMPC (Dimyristoyl phosphatidylcholne)を分離カラムに固定化し、このDMPC型のカラムを分離カラムとして用い、液体クロマトグラフ法による水素イオンの分離を、世界で初めて成功した。今年度は、基礎的な部分、例えば、高い分離能を持つ分離カラムの作成方法、最適な溶離液の選定などから、研究を進めてきた。これらの研究成果を踏まえ、重水素イオンを普通の水素イオンから分離・分取することができる高速液体クロマトグラフィーの開発を次年度から行いたいと考えている。重水素又は重水を低コストで且つ大量に生産することができる工業スケールの分離・製造プロセスに発展させるのを、本研究プロジェクトの最終の目標としている。今年度は、重水素イオンの分離・精製に対する最適な両性イオン交換体の開発を行った。物理修飾、化学結合又は既存の人工生体膜の利用などを視野に入れ、最も分離能の高い且つ安価な固定相(ゲル状、膜状繊維状なども含め)の開発を試みた。H^+とD^+のモル比が極めて低いことに起因するH^+とD^+の不完全分離といった問題に遭遇した。重水素は安定同位体であり、天然には普通の水素の約1/7000くらい存在する。工業用の濃硫酸又は濃塩酸から重水素イオンを分離する場合、H^+とD^+のモル比がこの数字と近く,約1/10000程度と考えられている。重水素イオンを分取する目的から見れば、なるべく大量の試料(酸)を分離カラムに注入するほうが望ましいが、H^+とD^+を完全に分離するには、分離カラムに余裕を与えなければならない。分離カラムの交換容量を計測・制御しつつ、最適な分離・分取り条件を見出すことにより、この問題点は解決を試みた。本研究の最終の目的、つまり、普通の濃酸から重水素イオンを分取するには、安定性の高い、且つ交換容量が高い充填材の開発が求められている。適切な単体に化学合成法でリン酸基と四級アミン基を創出することも視野に入れるが、既に、別の用途・目的で開発されている人工細胞膜を、固定相又D^+の選択膜として使用する方が本技術の開発時間の短縮が可能と考えられる。リン脂質極性基を有するポリマーの製造技術は、科学技術振興事業団による委託開発制度の平成5年度の研究課題として、5年間かけて開発した新しいバイオ材料である。この材料は、TDPCと全く同じ官能基、つまり、リン酸基と四級アミン基を持っているため、H^+からD^+を分離することができるものと推定している。このような人工細胞膜を固定相とする新規な分離システムの開発及びその分離機構・能力について研究する。

重水素は、核融合エネルギーの開発に欠かせない原料物質である。また、その酸化物、即ち、重水は、原子炉の減速材として実際に使われている。重水素又は重水を低コストで且つ大量に生産することができる工業スケールの分離・製造プロセスに発展させるのを、本研究プロジェクトの最終の目標としている。重水素イオン及び水素イオンを、両性イオンを固定相、脱イオン水を移動相として用いた高速液体クロマトグラフィーによって分離されたことが実験的に確認された。この研究成果は、申請者が目指している「重水の分離と精製」に直接に結びつく研究成果である。固定相としては、下記の三種類の両性イオン固定相、即ち、四級アンモニウム塩基/リン酸基タイプの固定相、四級アンモニウム塩基/スルホン酸基タイプの固定相、並びに、四級アンモニウム塩基/カルボキシル基タイプの固定相を用いて、実験した。その結果、四級アンモニウム塩基/リン酸基タイプの固定相、つまり、生体膜を構成する脂質であるホスファチジルコリン(レシチン)タイプの両性イオン固定相のみは、水素イオン及び重水素イオンを認識・分離することが分かった。水素イオン及び重水素イオンは、共に、ボスファチジルコリン(PC)と結合する。しかしながら、重水素イオン/ホスファチジルコリンの安定性は、水素イオン/ホスファチジルコリンの安定性より高い。その結果、重水素イオンは、水素イオンより遅く溶出され、水素イオンから分離されることになる。移動相としては、脱イオン水以外に、電解質水溶液、例えば、塩化ナトリウムや、塩化リチウム水溶液を用いても、分離が確認された。加えて、本研究成果は、「pHメーターの精度が低い」といった分析化学の基本問題の解決にも貢献する。重水素イオンを分取するといった観点から見た実験では、つまり、通常の酸から重水素イオンを取り出すことを試みた場合、重水素イオンの含有量が極めて低いため、水素イオンのピークのみが観察された。全く異なる固定相を合成し、より効率の高い分離システムの構築を目標にして、これからも研究を続けたいと考えている。
樹状様細胞誘導能を示す新規抗腫瘍タンパクの基盤的展開研究

REIC/Dkk-3遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であり、幅広い癌種においてその発現が低下をしている。本研究では、REIC遺伝子発現に伴い生成・分泌される新規サイトカイン様タンパク質REICの抗癌免疫学的な作用機序とその臨床的観点からの有用性を明らかにしたものである。今後、本研究での成果が、前立腺癌を含む癌疾患に対する革新的癌標的・免疫医療の創造につながっていくことが期待される。REIC/Dkk-3タンパクのサイトカインとしての作用、臨床的意義を解析した1)サイトカインとしての作用機序の解明(1)ヒト正常細胞での解析(in vitro) :REICタンパク質の作用を明らかにするためまず正常細胞への作用として間質細胞(線維芽細胞)へのREIC遺伝子の導入を行った。その結果ASK, p38, STAT-1, IRFの活性化を通じ通じたInterleukin-7の分泌が生じることを確認した。(2)がん細胞での解析:またこの反応はがん細胞においてはInterleukin-7の分泌が生じないことを確認した。2)臨床的意義の解析(in vitro):治療効果と安全性の評価と検証マウス前立腺癌RM9細胞のマウス皮下腫瘍モデルにおいて、精製REICタンパク質を複数回局所注入することにより、その腫瘍増殖を有意に抑制することをすでに成功しているが、今年度はその再現性・安全性を確認するとともに、摘出組織における免疫組織学的解析を行い、免疫担当細胞の局所での活性化を確認した。また治療時の血清を採取し以後のサイトカインアッセイの試料とした。これら1)2)の結果はREIC遺伝子の局所投与にともなう全身の免疫の活性化を科学的に裏付ける知見である。3)ノックアウトマウスの解析別途作成過程にあったREIC遺伝子の全身ノックアウトマウスの解析が行える環境が整ったため全身ノックアウトマウスの解析の一部を22年度からの前倒しで開始した。肉眼的観察を行うとともにそれぞれの組織を採取し、コントロール群との比較によるふえのタイプの解析に着手した。詳細については予定通り22年度に実施する。ノックアウトマウスの研究が本格化することはREICの一般的な生物学的意義を解析するという点においても今後の幅広い学際的研究の発展を可能ならしめる。当該課題においては特に免疫・サイトカインと癌治療という点に焦点を絞った研究が実施される。REIC/Dkk-3タンパクそのものが特定の末梢血免疫細胞を樹状細胞様細胞に分化させ,抗腫瘍効果を発揮するというサイトカイン様作用を有することを我々は確認しており治療薬としての臨床的有用性があることを提唱している(Int J.Oncology in press,特許出願2008-086516)。当該研究においては、REIC/Dkk-3タンパクの有するこの新たな抗腫癌効果発現における作用機序ならびにサイトカインとしての機能の詳細をあわせて解明し、新規タンパク治療の開発を含めたその臨床的な意義を明らかにすることを目的として研究を行ってきた。今年度は特にその臨床的意義をよりあきらかにするために安全性と治療効果の評価を行った。特に臨床応用を意識した種々の動物実験を実施した。(1)安全性の評価:臨床研究導入のための安全性(毒性)試験として実施した全身投与(腹腔内、静脈内)、腫瘍内投与時における安全性を以下の検討項目を用いて解析評価した。大動物(犬もしくはサル)への実験移行のための基盤データとする。その結果、体重、生存、栄養状態、各種血液学的検査の実施(肝・腎機能等の一連の項目を実施)し対照群と比較しその安全性を確認した。(2)治療効果の評価:治療効果の確認と治療効果発現の科学的根拠となる変化を解析した。全身投与、腫瘍内投与時の抗腫瘍効果を確認した。フローサイトメトリ、免疫組織化学染色による解析を実施し局所における樹状細胞の有意な浸潤が存在することを確認した。(3)REIC/Dkk-3タンパクの大量生産系の確立:治療を実施するためには有効なタンパク生産系を確立する必要があり、従来より我々が有するCHO細胞による生産系以外に複数の生産系についてその有用性を検討し採用する候補の絞り込みを行った。今後はそれらのタンパクを用いた治療効果について再確認する予定である。REIC/Dkk-3タンパク質は、特定の末梢血免疫細胞を樹状細胞様細胞に分化させ抗腫瘍効果を発揮するというサイトカイン様作用を有しており、我々は当該タンパク質に治療薬としての臨床的有用性があることを提唱している(特許出願2008-086516)。本研究においては、REIC/Dkk-3タンパク質の有するこの新たな抗腫瘍効果発現における作用機序ならびにサイトカインとしての機能の詳細をあわせて解明し、新規のタンパク質治療の開発を含めたその臨床的な意義を明らかにすることを目的として研究を行ってきた。今年度も昨年度に引き続き、特にその臨床的意義をより明らかにするために、その安全性と治療効果の評価を行った。具体的には、臨床応用を意識した種々の動物実験を実施した。(1)安全性の評価:臨床研究導入のための安全性(毒性)試験として実施した。

REICタンパク質の全身(腹腔内)投与時における安全性を解析・評価を行った。具体的には、生存、栄養状態等に関する評価を行い、対照群と比較しその安全性を確認した。今後、大動物(犬もしくはサル)への実験移行のための基盤データとする予定である。(2)治療効果の評価:治療効果の確認と治療効果発現の科学的根拠となる変化を解析した。REICタンパク質の全身投与時の抗腫瘍効果を確認した。フローサイトメトリ、免疫組織化学染色等による解析を実施し、末梢血における各種免疫担当細胞の動態を解析した。(3)REICタンパク質の大量生産系の確立:治療を実施するためには有効なタンパク質生産系を確立する必要があり、従来より我々が有するCHO細胞による生産系以外に複数の生産系について解析を行った。その中で、293細胞を用いたREICタンパク質の生産系を確立した。
次数2のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開の定式化の研究

今年度は、次数2のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開の定式化の予備研究として、関連する一般球関数に対する類似研究を行い、二つの結果を得た。一つは、次数3の実シンプレクティック群Sp(3,R)の第2ヤコビ型放物部分群から誘導された主系列表現に対するホイッタカー模型についての結果であり、もう一つは次数3の複素一般線形群GL(3,C)のクラス1でない主系列表現に対するホイッタカー模型についての結果である。フーリエ・ヤコビ展開の定式化に必要である特殊関数はフーリエ・ヤコビ型球関数と呼ばれる一般球関数である。これまでの研究でその明示公式をほとんどの許容表現に対して決定してきたが、重要な許容表現のひとつであるジーゲル放物部分群から誘導された主系列表現の場合が依然残されており、フーリエ・ヤコビ型球関数の理論は未完である。この残された場合の明示公式を得ることは非常に複雑であり、今年度の類似研究はその予備研究として意義がある。今年度は、昨年度に得られていた次数3のシンプレクティック群上定義される類似の球関数についての研究をさらに進め、増大度に関してよい性質を持つ球関数の具体的な表示について新たな知見を得た。また、次数3の複素一般線形群上の球関数の考察においては、球関数が任意次元のベクトル値となるにもかかわらず、これまでにフーリエ・ヤコビ型球関数に対して行ってきた議論が有効であることを確認した。これらの類似研究を更に推進し、期待される成果をフーリエ・ヤコビ展開の定式化の問題に活用することが今後の課題である。今年度は、次数2のジーグル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開の定式化の予備研究として、関連する一般化球関数およびこれに類似した球関数に対する研究を行った。具体的には次数3の実シンプレクティック群G=Sp(3,R)の第2ヤコビ型放物部分群から誘導された主系列表現に対するホイッタカー模型を扱いこれが満たす微分方程式系を決定した。これまでの研究でこの球関数の明示公式をほとんどの許容表現に対して決定してきたが、重要な許容表現のひとつであるジーゲル放物部分群から誘導された主系列表現の場合が依然残されており、フーリエ・ヤコビ型球関数の理論は未完である。今年度は、これまでのフーリエ・ヤコビ型球関数の研究方法をさらに発展させ、Gの包絡環の中心の元を次数一般の形で組織的に構成し、ホイッタカー模型が満たすべき微分方程式系を具体的に書き下した。しかし、この微分方程式系は複雑でありこの解のよい表示を求めることは今後の課題である。なお、この類似研究には前年度の研究成果であるgl(3)の有限次表現とスタンダード表現とのテンソル積の既約表現への分解のゲルファント・ツェルヴェンスキー基底を用いた表示を援用している。一つは、次数3の実シンプレクティック群Sp(3,R)の第2ヤコビ型放物部分群から誘導された主系列表現に対するホイッタカー模型の第2種球関数についての結果であり、もう一つは次数2の実シンプレクティック群Sp(2,R)のヤコビ型放物部分群から誘導された主系列表現に対するジーゲルホイッタカー模型からホイッタカー模型への合流の記述についての結果である。今年度は、次数が2および3のシンプレクティック群上定義される類似の球関数についてより詳細な研究を行い、新しい知見を得た。すなわち、球関数がΓ級数でない超幾何型級数として得られること、および異なる球関数の間に存在する変形過程について、示すことができた。この類似研究を更に推進し、増大度との関係や行列係数との合流を調べることは今後の課題であり、その期待される成果はフーリエ・ヤコビ展開の定式化の問題の考察に役に立つと思われる。

これまでの研究でその明示公式をほとんどの許容表現に対して決定してきたが、重要な許容表現のひとつであるジーゲル放物部分群から誘導された主系列表現の場合が依然残されており、フーリエ・ヤコビ型球関数の理論は未完である。この残された場合の明示公式を得ることは非常に複雑であり、今年度の類似研究はその予備研究として意義がある。今年度は、昨年度に得られていた次数3のシンプレクティック群上定義される類似の球関数についての研究をさらに進め、増大度に関してよい性質を持つ球関数の具体的な表示について新たな知見を得た。また、次数3の複素一般線形群上の球関数の考察においては、球関数が任意次元のベクトル値となるにもかかわらず、これまでにフーリエ・ヤコビ型球関数に対して行ってきた議論が有効であることを確認した。これらの類似研究を更に推進し、期待される成果をフーリエ・ヤコビ展開の定式化の問題に活用することが今後の課題である。
ヘテロコア光ファイバを織り込んだ知覚衣服によるライフログシステムの開発

本研究では、無意識・無拘束な生体情報・生活行動計測のための新たな技術基盤として、柔軟・軽量な素材で構成されるヘテロコア光ファイバセンサを衣服の材料である繊維糸と組み合わせ、素材そのものがセンサ機能を持つ知覚衣服を開発する。この知覚衣服を携帯型の計測器と併用し、心拍・呼吸・身体動作情報から日常生活における健康状態や行動内容を認識可能なシステムを構築し、知覚衣服がライフログデバイスとして有用であると実証する。最終年度は、光源及び受光部といった機能を有する携帯型の光ファイバ計測装置と、Android OSを搭載したスマートデバイス端末を用い、知覚衣服によって検出した身体動作情報を計測・保存するモニタリングシステムを構築した。本システムを用い、着用者の日常生活行動に対する身体動作データを取得した。日常生活行動の種類は、散歩・読書・食事等といった高齢者の日常生活に基づいた活動内容とした。知覚衣服によって取得されたこられの身体動作情報について機械学習を適用し、行動内容に対する認識性能の検証を行った。生活動作を行った際の各計測値の周波数成分のパワースペクトルや平均値といった特徴量を抽出し、サポートベクタマシンを識別器に用い、学習・識別を行った。k分割交差検証による評価を行い識別性能を検証したところ、約91%の識別精度が得られた。一方、衣服を着脱した場合や運動等の激しい身体活動を行った場合は、学習時の衣服状態から基準値が変化し識別率が著しく低下した。この衣服状態の制限事項は呼吸や心拍をモニタする場合も同様であった。そのため、本システムは衣服の着用状態が変わらないという特定の条件下であれば、生体情報の取得や生活行動の判別が可能である。総括として、着用者の生体情報や日常生活行動の認識が可能な知覚衣服とライフログ機能の実装が達成できたと考える。平成29年度は光ファイバ織物による知覚衣服を用いた身体動作・生体情報計測手法の確立に取り組んだ。織り方によるセンサ感度の調整方法の検討については、織物に生じる曲げや伸縮,圧力といった形状変化に対して、平織、綾織、朱子織の順にセンサ感度が向上することを確認した。身体動作の検出については、光ファイバ織物を肘・肩・背・腰・脚といった衣服上の関節部に配置し、肘・脚・肩の一部動作を検出可能にした。また、小型無線多機能センサユニットを参照用機器として用い、関節角度変化に追従することを確認した。さらに、生体情報の検出については、左腹直筋上部に織物を配置することにより、着用状態で呼吸・心拍の同時計測に成功した。計測された心拍数は携帯型心電計による計測波形によるものと概ね一致した。知覚衣服については、織物を衣服に統合しジャケット型およびズボン型の知覚衣服を作製した。知覚織物を衣服に配置して呼吸・心拍を同時計測した結果については論文として公表に取り掛かっている。織り方による形状変化に対するセンサ感度の違い、身体動作・生体情報の検出位置の検証、知覚衣服の作製について完了しており、平成29年度の計画通りに進行している。今後は、複数チャンネルの光ファイバを同時計測するための携帯型光ファイバ計測装置を試作し、AndroidOS端末をデータロガーに用いて複数の日常生活行動に対する身体動作データを取得する。得られたデータに対しては機械学習を適用し、行動判別を試みる。判別機能をAndroidOS端末に実装し、ライフログシステムとして作り上げる。研究成果は国際学会ならびに国内学会で順次発表する。

積算していた心電計の予算よりも安い製品が見つかりそれを購入したため、差額が生じた。ただし、翌年度の携帯計測器の見積もりが予定より高くなるため、そちらに補填する。
チロシンホスファターゼ遺伝子ファミリーのクローニングおよびその発現に関する研究

1.チロシンホスファターゼ(Leukocyte common antigen-related phosphatase:LRP)cDNAのクローニングPCR法にて得られた部分cDNAの塩基配列をもとにヒト腎cDNAライブラリーよりPCR法を利用し、ヒトLRPの全蛋白翻訳領域を含むクローンを得て、その塩基配列を決定した。ヒトLRPは793のアミノ酸よりなり、また、膜貫通部を有し、2つのチロシンホスファターゼ触媒ドメインを有する受容体型チロシンホスファターゼであった。2.ヒトRPゲノム遺伝子のクローニングおよびその構造解析1.にてクローニングしたヒトLRP cDNAをプローブとして、ヒトLRPゲノム遺伝子のスクリーニングを続行し、得られた陽性クローンの解析を行った。しかしながら、未だにヒトLRP遺伝子の5'端をカバーするクローンを得られず、さらに解析中である。3.糖尿病状態におけるチロシンホスファターゼ遺伝子発現ラットLRP部分cDNAをRT-PCR法によりクローニングをおこない、これをプローブとして用い、ノザン法にて、遺伝子発現を検討した。正常コントロールラット各組織(脳、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、大腸、骨格筋、心筋、膵)において、LRP遺伝子発現が認められた。特に、脳でその発現レベルが高かった。次に糖尿病状態(ストレプトゾトシン投与、デキサメサゾン投与)および摂食状態(自由摂食、絶食3日間、絶食後再摂食)における脳、肝、腎、骨格筋において、LRP発現レベルの明かな変化は認められなかった。以上より現在のところLRPの糖尿病との関連は否定的であると考えられた。今後LRP遺伝子発現を細胞レベルで検討するため、In situ hybridi-zation法の応用を検討中である。(1)チロシンホスファタ-ゼゲノム遺伝子のクロ-ニングおよびその高造解析平成3年度は我々が既にクロ-ニングしたヒト受容体型チロシンホスファタ-ゼ(Leukocyte commonantigenーrelated phosphatase:LRP)cDNAをプロ-ブに用いて、ヒトゲノム遺伝子ライブラリ-をスクリ-ニングし、現在9個の陽性クロ-クを得て、順基配列の解析を進行中であるが、なお全cDNAをカバ-していないことが判明し、全範囲をカパ-するべくさらにスクリ-ニングも進めており、現在一次スクリ-ニングにて新たに8個の陽性シグナルを得ており、さらに解析中である。また、ヒトLRP遺伝子の制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism:RFLP)についてもプレリミナリ-な検討をおこなっているが、現在のところRFLPを認めていない。(2)糖尿病状態におけるチロシンホスファタ-ゼ遺伝子発現平成3年度は糖尿病モデルであるストレプトゾトシン糖尿病ラットを作製し、膵、肝、筋肉等よりRNAの抽出を行った。当初、ノザン法による解析時のプロ-ブとしてはヒトLRPを用いる予定であったが、動物種の違いによる塩基配列の基を考慮し、新たにラットLRPのcDNAのクロ-ニングを行った。既に報告されているマウスLRPの塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマ-を作製し、ラット肝より抽出したRNAを鋳型にReverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RTーPCR)法を施行し、ラットLRP部分cDNAのクロ-ニングに成功した。本クロ-ンをプロ-ブとして用いることにより種差を考慮に入れる必要なく、ノザン法による解析が可能となった。(1)チロシンホスファターゼゲノム遺伝子のクローニングおよびその構造解析平成3年度に引続き、我々がクローニングしたヒト受容体型チロシンホスファターゼ(Leukocyte common antigen-related phosphatase:LRP)cDNAをプローブとして、ヒトLRPゲノム遺伝子のスクリーニングを続行し、得られた陽性クローンの解析を行った。しかしながら、未だヒトLRP遺伝子の5'端をカバーするクローンを得られず、さらに解析中である。

(2)糖尿病状態におけるチロシンホスファターゼ遺伝子発現ラットLRP部分cDNA(平成3年度にRT-PCR法によりクローニングしたもの)をプローブとして用いるノザン法にて、まず正常コントロールラット各組織(脳、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、大腸、骨格筋、心筋、膵)におけるLRP遺伝子発現を検討した。LRP遺伝子発現は検討した全ての組織において認められた。特に、脳でその発現レベルが高かった。次に糖尿病状態(ストレプトゾトシン投与、デキサメサゾン投与)および摂食状態(自由摂食、絶食3日間、絶食後再摂食)における脳、肝、腎、骨格筋における発現レベルの変化についてノザン法にて検討した。糖尿病状態や摂食状態によるLRP発現の明かな変化は認められなかった。以上より現在のところLRPの糖尿病との関連は否定的であると考えられた。今後LRP遺伝子発現を細胞レベルで検討するため、In situ hybridization法の応用を検討中である。
広帯域安定駆動を目的としたマイクロ・スマート複合材の開発

近年の機械システムや家電製品の小型・高性能化に伴い,使用される小型精密デバイスの更なる高速化・高精度化が求められており,これらを達成するためには,小型デバイスの効果的な振動制御手法の開発が必要である.本研究課題では,先端複合材料である炭素繊維強化材料と圧電アクチュエータからなるスマート複合材に関して,統合的な振動制御性能の最大化を目的とした最適設計手法,効果的な数値計算モデル,実験計測による振動特性の詳細な評価技術開発を行った.1.スマート複合材の振動制御性能の統合的な向上を目的とした多目的最適化昨年度の研究においてスマート複合材の圧電材による能動的な振動制御性能を向上する目的で最適化を行った結果,最適な繊維配向角度および圧電材配置を有するスマート複合材の制御性能は向上したが,構造物自体の固有振動数は他の代表的な複合材よりも低くなるという結果が得られた.しかしながら,外乱による共振を避けるため,構造物の固有振動数を調整することは,受動的な振動制御手法として有効であり,受動的な制御能力を犠牲にして能動制御性能のみを向上する手法ではスマート複合材の統合的な振動制御性能向上を達成したとは言えない.そのため,本年度は相反する目的に対する非優越解群(パレート解)を算出するため,能動的および受動的(基本振動数の最大化)制御性能の両者を目的関数とした多目的最適化手法(修正非優越ソート遺伝的アルゴリズム,NSGA-II)を適用した.その結果,高い基本振動数を有する解から高性能な能動制御能力を有する解,またその中間的な特性を示す解など,多様な設計案も求めることができた.以上の結果は,次年度において国際学会で発表予定であり,また論文として投稿する予定である.2. Zigzag理論の適用によるスマート複合材の数値モデル精度向上昨年度はレーザー加振を用いたマイクロ・スマート構造物の振動制御システムを構築したが,数値計算結果と実験結果の間には,同様の傾向が見られるものの,実験精度および計算モデルの再現性の向上が必要であることがわかった.そのため,本年度はZigzag理論を用いた積層複合材の振動計算数値モデルの開発を行った.本理論はTimoshenkoはりの仮定に基づく,一次せん断変形理論にZigzag関数を導入することで精度を向上している.本成果は論文としてまとめ査読付き雑誌に掲載された.近年の機械システムや家電製品の小型・高性能化に伴い,使用される小型精密デバイスの更なる高速化・高精度化が求められており,これらを達成するためには,小型デバイスの効果的な振動制御手法の開発が必要である.本研究課題では,先端複合材料である炭素繊維強化材料と圧電アクチュエータからなるスマート複合材に関して,統合的な振動制御性能の最大化を目的とした最適設計手法,効果的な数値計算モデル,実験計測による振動特性の詳細な評価技術開発を行った.本研究では,小型精密デバイスの高速化・高精度化を目標として,スマートマイクロ複合材の振動制御性能向上に関する,要素技術を開発することが目的であり,平成24年度実施計画は,「1.スマート複合材の統合最適化手法の開発」および「2.レーザー加振を用いたマイクロ・スマート複合材の振動制御システムの構築」の2点の基礎技術を構築することであった.「1.スマート複合材の統合最適化手法の開発」に関しては,振動制御性能の向上を目的とし,積層複合材の繊維配向角度,制御用アクチュエータの配置,制御システム内の重みを同時に設計する手法を提案した.最適化手法として,遺伝的アルゴリズムを用い,計算負荷が大きい有限要素解析(FEA)を最適化計算中で繰り返し実施することを避けるため,振動制御システムを構築する上で必要となるモーダルパラメータ(固有振動数,固有振動モード)を含んだデータベースを予め作成し,最適化計算の効率化を図った.実施計画では,データベースの作成手法に高精度なメタモデルを適用する予定であったが,本年度はメタモデルの適用によるデータベース作成の実施までは至らなかった.「2.レーザー加振を用いたマイクロ・スマート複合材の振動制御システムの構築」に関しては,極めて短時間に生じるレーザーアブレーション現象を構造物の加振力として利用が,通常の加振器やインパルスハンマでは加振困難な微小構造物に対して効果的であり,より高周波帯域まで励起可能であることがわかった.また,加振応答をレーザードップラー振動計により非接触で測定することで,計測機器付加による質量増加も抑制することができた.振動制御実験による結果は数値計算結果と同様の傾向が示されたが,実験精度や数値計算による実現象の再現性を向上する必要があることがわかった.上記「研究実績の概要」に示した通り,当初計画では,「1.スマート複合材の統合最適化手法の開発」において,統合最適化に用いるデータベースの作成の効率化を図るため,統計理論に基づいて空間データを補完するKringingモデル等の高精度なメタモデルを適用する予定であったが,本年度は使用するモデルの検討および選定にとどまった.しかしながら,次年度の研究計画の一部であった柔軟圧電材(PVDFよりも高出力のMFC)を使用したシェル構造物に関する数値計算および実験を前倒しで実施できたことや,「2.レーザー加振を用いたマイクロ・スマート複合材の振動制御システムの構築」に関しても,改善の余地が残されているものの,基礎的な技術は確立できたため,当初の計画通り,順調に進展していると判断できる.次年度は最終年度であり,研究の推進方策は以下の通りである.

今年度,実施に至らなかった,モーダルパラメータ(固有振動数,固有振動モード)を含んだデータベースの効率的な作成方法を確立する.当初計画していた高精度メタモデルを適用することを含め,ニューラルネットワークの一種である自己組織化マップ(SOM)の援用による,データベースの自己クラスタリングなど,多方面から効率化の検討を行う.さらに,実験結果との適合性を高めるため,数値計算において非理想的な境界条件や試験片作成誤差を含んだ数値計算モデルの構築,構造物への影響は小さいとしてモデル化する際には考慮していなかったアクチュエータとなる圧電材自体の剛性や質量を数値モデルに含めるなどの工夫を行う.また,マイクロスマート複合材の振動制御実験に関する基礎となるシステムは,本年度に構築できたため,更なる実験精度や信頼性の向上を目指して,制御実験システムの改善を行う.具体的には,スマート複合材の把持治具の精度向上や,アクチュエータ接着の高精度化などがあげられる.該当なし
深層中層表層の流速を高精度推定する「海流速度鉛直プロファイリングシステム」の創出

本研究は、海の表層から深層までの海流の流速をまとめて推定するための新しい技術を創出することを目指すものである。その技術は、数値計算法・計測方法。数値計算と計測との融合させる方法、この3つの方法から構成される。2018年度はその初年度であり、数値計算法の開発と計測方法の設計とに着手した。この技術では海水中に鉛直方向に垂れ下がる長大弾性構造物の揺れを数値計算でシミュレーションすることと、その揺れを計測することが不可欠な要素となる。シミュレーション方法としては、研究代表者らがこれまで開発をしてきた計算手法を発展させ、本研究の目的を果たす形に改造を加えた。構造物の揺れを記述する構造力学、構造物周囲の流体の作用による荷重を記述する流体力学、また、構造物下端に付加される重りの運動学、この3つの力学を結合させた計算を可能とするプログラムを作成し、妥当なシミュレーションができるようになった。また、計測方法の設計については、変位センサ、加速度センサ、荷重センサの3つを用いることを想定し、これらセンサの出力を用いて、海流速度の推定が良好に行われるかどうかを調査した。その結果、変位センサの単独使用は良好な結果をもたらさないが、加速度か荷重センサを単独で使用するか、もしくは変位・加速度・荷重各センサを組み合わせることで、良好な推定ができることを見出した。こうしたセンサを上限なく設置することは、技術のコストと単純性の観点から望ましくないため、なるべく少数のセンサから海流推定を可能とするための方法も検討し、その素案をかためることができた。構造力学・流体力学・水中不可物体の運動力学を結合させた数値計算法に開発が計画通りに進んだ。計測方法の設計についても、次年度以降につながる素案をつくることができた。長大弾性構造物の揺れを変位・加速度・荷重センサで計測する方法について、本年度に作成した素案を、より詳細なものに昇華させる。また、少数センサでの海流速度推定を可能とするような数学的理論、およびその実装方法を検討していく。
新たな農地利用を通じた都市近郊農地の保全に関する研究

本研究は、農業以外の新たな農地の利用を通じた都市近郊農地の保全の可能性を明らかにすることを目的とした。その結果、近畿圏において新たな農地利用として7類型268事例を収集し、先進的な事例に対するヒアリング調査から、農地所有者と新たな利用主体をつなげるマッチングシステムが重要であること、行政、JAなどによる協議会方式のマッチングが効果的であること、株式会社によるマッチングは行政との差別化を図ることで、実績を伸ばしていることなどを明らかにした。生業である農業以外の新たな農地の利用を通じた都市近郊農地の保全の可能性を明らかにするため、1.農地の分布、規模、市街地との距離など都市近郊農地の存在形態の特徴の把握、2.新たな農地利用の取り組み事例の概要把握、3.新たな農地利用の取り組み主体へのヒアリング調査を実施した。北摂地域を対象として土地利用データを用いてGISによるメッシュ分析を行い、農地の存在形態について10の類型が得られた。市街地内に農地が小規模に分散する地区が3類型で面積割合51.8%と最も多く、一方集塊性の高い農地と市街地が併存する地区は3類型で28.3%にすぎず、市街地内で小規模に分散する農地に対する方策の検討の重要性を明らかとした。行政へのアンケート調査の他、WEBサイト、書籍などから新たな農地利用の取り組み事例を把握するとともに、その概要を把握した。具体的な取り組み場所を把握することができた43事例についてマッピングし、法規性とオーバーレイすることで、分布の特徴を把握した。さらに先進的な取り組み6事例を対象として実施主体に対するヒアリング調査を実施した。ヒアリング結果から、継続して新たな農地利用を続けるためにはその所有のあり方によるところが大きく、取り組み主体が所有していたり農家との密接な信頼関係を構築することが不可欠であることが明らかとなり、農地所有者である農家と取り組み主体をつなげるコーディネータの重要性が明らかとなった。また、コーディネータはこれまで行政によるところが大きかったが、民間の任意団体が担っている事例もあり、ヒアリング結果から、実績を上げつつありさらに農家と取り組み主体の両者からのニーズも高いことが把握され、その重要性を明らかにした。本研究は、開発や担い手不在により消失しつつある都市近郊農地を対象として、都市住民等による新たな農地利用を通じた都市近郊農地の保全の可能性を明らかにすることを目的としている。前年度調査の成果を踏まえ、農地所有者と都市住民等をマッチングするコーディネータへのヒアリング調査を行った。貸し農園を事例として、都道府県レベルと民間企業による事例のヒアリングを実施した。県へのヒアリングの結果、県、JAなどを含めた協議会方式でのマッチングシステムの運用が効果的であることが明らとなったが、マッチングの実績から費用対効果の面で課題が大きいことが明らかとなった。また、民間の株式会社によるマッチングへのヒアリングでは、企業としての収益性の観点から、農地の利用料金を高く設定せざるを得ないが、管理代行や指導員による栽培指導をセットにすることで他の農園との差別化を図ることで、実績を伸ばしていることが明らかとなった。これらのことから、対象とする利用者や農地の利用方法など、行政と民間が担う役割を調整していく必要性が明らかとなった。さらに、市町村レベルの貸し農園の運用事例へのヒアリングから、現行法制度のもとでは、農家以外の主体による農地利用は借地によらざるを得ず、相続発生時に相続税の納税猶予が受けられないため、貸し農園を廃止する事例が多く、継続性の担保が課題であることが明らかとなった。この点は、コーディネータの有無やその形態、利用主体によらず共通する課題であり、農地の無償借地契約と固定資産税の非課税措置を連動させて運用する仕組みの有効性を明らかにした。さらに、都市近郊農地にかかる税制の見直しの必要性の他、都市近郊農地の位置づけの見直しの必要性とその方向性について明らかにした。
Subrenal Capsule Assay(SRCA)による薬剤感受性の研究

SRCAは生着率80%以上の感受性テストであるが,マウスの宿主反応が最大の障碍である.植え付けた人癌に対して,好中球,リンパ球,組織球などが侵潤し,これが肉眼での計測値を誤らせる原因となる.そしてこの事実は本法の開発者であるBogdenらの原法が果して正確な感受性を示しうるかの疑問となった.この点に関して精力的な研究が実施された.まずくり返し研究可能なヌードマウス継代の人癌を用いての組織学的検索が行なわれた.その結果,原法では4日目までは,ある程度の癌組織が残存しているが, 6日後には殆んど残っていないか,著明な細胞侵潤が認められた.臨床材料を用いた時も同様な現象が認められたが,この場合は残存する組織の量が癌の種類,組織型によってことなる結果を示した.即ち,食道癌,肺癌などの扁平上皮癌では,間質の少い組織型で癌組織が多く残り,一方間質の多い扁平上皮癌と腺癌では殆んど残らなかった.そして胃癌,大腸癌でみると,腺癌の中では分化型の方が良く残存し,未分化型は癌組織は殆んど残らなかった.よってBogdenらの原法は非常に限られた条件下のみで応用可能と判断された.宿主反応を抑制する研究へと進んだ.サイクロフォスファシド(CPM),サイクロスポリン(CYA),ブレジニン(Bred)などの免疫抑制剤の併用である.CPMは前投与しなくてはならない不便さがあるが6日目まで宿主反応を良く抑制した. CYAとBredは同時投与で6日目まで癌組織が保たれ, CYAでは9日目まで延長可能であった.よってこれら3剤の単独投与,他の抗癌剤との併用時の至適投与量が決定された.SRCAは現時点で臨床応用可能な最も効率の良い感受性テストである.その方法の最大の障碍は克服されたといえよう.今後は免疫抑制剤を併用しての臨床効果との相関が研究課題となる.SRCAは生着率80%以上の感受性テストであるが,マウスの宿主反応が最大の障碍である.植え付けた人癌に対して,好中球,リンパ球,組織球などが侵潤し,これが肉眼での計測値を誤らせる原因となる.そしてこの事実は本法の開発者であるBogdenらの原法が果して正確な感受性を示しうるかの疑問となった.この点に関して精力的な研究が実施された.まずくり返し研究可能なヌードマウス継代の人癌を用いての組織学的検索が行なわれた.その結果,原法では4日目までは,ある程度の癌組織が残存しているが, 6日後には殆んど残っていないか,著明な細胞侵潤が認められた.臨床材料を用いた時も同様な現象が認められたが,この場合は残存する組織の量が癌の種類,組織型によってことなる結果を示した.即ち,食道癌,肺癌などの扁平上皮癌では,間質の少い組織型で癌組織が多く残り,一方間質の多い扁平上皮癌と腺癌では殆んど残らなかった.そして胃癌,大腸癌でみると,腺癌の中では分化型の方が良く残存し,未分化型は癌組織は殆んど残らなかった.よってBogdenらの原法は非常に限られた条件下のみで応用可能と判断された.宿主反応を抑制する研究へと進んだ.サイクロフォスファシド(CPM),サイクロスポリン(CYA),ブレジニン(Bred)などの免疫抑制剤の併用である.CPMは前投与しなくてはならない不便さがあるが6日目まで宿主反応を良く抑制した. CYAとBredは同時投与で6日目まで癌組織が保たれ, CYAでは9日目まで延長可能であった.よってこれら3剤の単独投与,他の抗癌剤との併用時の至適投与量が決定された.SRCAは現時点で臨床応用可能な最も効率の良い感受性テストである.その方法の最大の障碍は克服されたといえよう.今後は免疫抑制剤を併用しての臨床効果との相関が研究課題となる.
シロイヌナズナＤＣＬ１を用いた種子特異的ｐｒｅ-ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング

miRNAの生合成因子であるDCL1タンパク質と結合するmiRNAの前駆体pre-miRNAを植物体から精製するために、抗体反応に必要なタグ配列をつないだDCL1遺伝子を過剰発現する形質転換体シロイヌナズナを作成した。形質転換体シロイヌナズナにおいてmRNA量やタンパク質量を測定し、導入したDCL1が発現していることを確認した。タグ配列を認識する抗体を用いた免疫沈降法を利用して、目的のpre-miRNAを精製する実験系を確立した。特定の器官・組織や生長反応で発現する既知のmiRNAの遺伝子座の同定と、そこに関わる新奇miRNAの単離・同定を行うために、シロイヌナズナDCL1と結合するpre-miRNAsの発現プロファイリングを目指して、本年度は以下のことを行った。免疫沈降法を用いてDCL1と結合するpre-miRNAを共沈降させるため、DCL1とFlagタグを融合させたタンパク質を発現させる形質転換体シロイヌナズナを作成した。DCL1遺伝子は野生型由来と、HYL1タンパクと結合してpre-miRNA切断複合体を形成するがその切断が起こらないと予想されるdcl1-7変異体由来の配列を用いた。また、これらFlagタグ融合タンパク質の生育に対する影響を少なくするために、その融合遺伝子をデキサメタゾン(DEX)処理により発現が誘導されるDEX誘導性プロモーターの下流につないだコンストラクトを使用した。現在、アグロバクテリウムを介した形質転換法を用いて、作成したコンストラクトをシロイヌナズナに導入し、得られた形質転換体からラインの整備を行っている。他方で、DCL1と切断複合体を形成するHYL1にHAタグをつないだ融合タンパク質を、CaMV35Sプロモーターで恒常的に発現させる形質転換体も作成した。抗HAタグ抗体を用いて免疫沈降を行えば、内在するDCL1と結合するpre-miRNAが得られることができ、FlagタグのDCL1とpre-miRNAの結合に対する影響をなくすことが期待される。今後は両方の形質転換体を用いて、pre-miRNAライブラリーの作成を行う予定である。特定の器官・組織や生長反応で発現する既知のmiRNAの遺伝子座の同定とその反応に関わる新奇miRNAの単離・同定を行うために、シロイヌナズナDCL1と結合するpre-miRNAsの発現プロファイリングを目指して、本年度は以下のことを行った。免疫沈降法を用いてDCL1と結合するpre-miRNAを共沈降させるため、前年度作成した、DCL1とFlagタグを融合させたタンパク質を発現させる形質転換体シロイヌナズナでの融合タンパク質の発現を確認した。この形質転換体では融合遺伝子がデキサメタゾン(DEX)誘導性プロモーターによって発現するため、10μMのDEXを形質転換体幼植物に処理した。DEX処理をした幼植物からtotal RNA及び全タンパク質を抽出し、定量的RT-PCR法とFlag抗体を用いたウエスタンブロッティング法を利用して、融合タンパク質の発現量が高い形質転換体ラインを選抜した。現在、Flag-DCL1融合タンパク質とpre-miRNAを共沈降させるためのFlag抗体を用いた免疫沈降法の条件検討を行っている。他方で、HYL1-HAタグ融合タンパク質の過剰発現する形質転換体について、その発現量を元にラインの選抜を行った。hyl1突然変異体では一部のpre-miRNA分子種においてスプライスバリアントが蓄積することが報告されており、作成したHYL1-HA過剰発現株を用いた免疫沈降法でHYL1と結合するpre-miRNAが得られることが新たに期待された。そこで現在、HA抗体を用いた免疫沈降法の条件検討も進めている。
色素性乾皮症A群連者の分子生物学的診断と臨床像との関係

遺伝的相補性テストによってA群と同定された46例のうち41例(89%)が、AlwNlを用いたPCR-RFLPで検出可能なイントロン3のスプライシング変異のホモ接合体であり、この患者の多くは、UDSが5%以下で、皮膚神経症状ともに重症で皮膚癌発生も早い典型的なA群と考えられた。1例がHphlを用いたPCR-RFLPで検出可能なエクソン6のナンセンス突然変異でこのホモ接合体の症例は皮膚癌の初発は24歳で、神経学的にも症状は軽いようであった。突然変異の箇所が異なると、臨床症状にも差があることが示唆された。2例においてイントロン3のプライス変異とエクソン6のナンセンス変異の複合へテロ接合体、1例が、イントロン3のスプライス変異とエクソン3のナンセンス変異であった。残りの1例はイントロン3のスプライス変異と未知の突然変異をもつことが示唆されたので、PCR-SSCP法でスクリーニングし、塩基配列を決定した結果、エクソン5の最後の塩基がG-Cへ変異をおこしていることが見いだされた。以上、日本のXPA群においては、イントロン3のスプライシングのホモ接合体が非常に多く、XPA群を疑った場合、スクリーニングとして、AlwNl-PCR-RFLPを行うことによって90%近くの症例で確定診断を行うことができること、それ以外の変異が疑われた場合にも、Hphl,Msel及び、今回、新たに見つけられたMaellを用いたPCR-RFLPも組み合わせることによって、99%近くの症例で遺伝子診断を行うことができることが明らかになった。また、未知の変異が疑われた場合、PCR-SSCPを用いたスクリーニングが有用である。次に、チュニジアのXPA群7例についてXPA遺伝子の変異箇所を調べたところ、7例中6例(86%)が、Hphlで検出可能な、エクソン6のナンセンス突然変異のホモ接合体であった。これらの症例の多くは、20歳前後に皮膚癌を初発しており、日本の症例においても、Hphlで検出可能な、エクソン6のナンセンス変異のホモ接合体は症状が軽かったことと合致する所見である。XPA遺伝子の変異に少なくとも二地域で、創始者効果がみられ、たことよりこの遺伝子が比較的安定で、極めて稀に突然変異が起こり、それが、ある地域で集積している可能性が、考えられた。色素性乾皮症(XP)は、紫外線(UV)よるDNAの損傷を修復する酵素が欠損している高発癌性遺伝病で細胞レベルでも臨床的にもUVに感受性が高い。XPは、遺伝的相補性テストにより、A-G群に分けることができるが、日本では、除去修復能が低く、皮膚症状が重く、露光部の癌の発症も早く、神経症状を伴うA群が最も多い。最近XPA患者細胞の修復能を相補するXPA complementing(XPA complementing(XPA)遺伝子がクローニングされたので、XPA患者の分子生物学的診断の確立を試みた。日本のXPA患者では、XPAC遺伝子のイントロン3、エクソン3、エクソン6の異常が多く、それぞれ、AlwN I,Mse I,Hph Iを用いた制限酵素断片長多型(RFLP)で検出することができる。