hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表面光反射の対称性を利用した新規結晶方位解析法

本研究では、申請者が独自に着想した結晶方位解析法について、理論の構築と解析方法の基礎固めを目的として研究を進めた。本方法は、結晶方位を反映した試料表面の光反射強度の対称性と変位を解析する方法であり、理想的には大面積の結晶方位分布を高速に得ることができる。本方法を実現するための装置を設計・導入し、検討を重ねることで、具体的な装置仕様およびこの方法のポテンシャルについての一定の知見を得た。本研究では、申請者が独自に着想した結晶方位解析法について、1解析プロセス理論の構築、2解析方法の基礎固めを目的とする。本方法は、結晶方位を反映した試料表面の光反射強度の対称性と変位を解析することで結晶方位分布を得る方法である。この方法を用いれば、試料サイズの制約がなく、また高い空間分解の結晶方位分布を高速に得ることができる。本方法を確かな解析法とするため、また本方法の実用性・ポテンシャルを見極めるため、学術的に解析理論の裏付けを行い、また基礎データの蓄積を行なう。これまでに、本方法を実施するための装置を様々な観点から検討し、設計を終えた。この検討は大きくは、照射光源と撮影装置に分かれる。照射光源には試料表面上で光強度の均一性が極めて高いこと、光の入射方向が一定(平行光)であることが要求される。この仕様を満たすための光源について、さまざまな検討を行い、十分な性能の光源を設計・構築した。撮影装置については、動作機構とそれに連動した撮影機構から構成される。これまでに、十分な撮影可能サイズを確保しつつ目的を達成するための装置設計および、装置動作の安定性や装置強度を維持するための検討を行ない、実用するうえで十分な装置の構成を得ることができた。また、これらの装置検討においては、現有の部品を利用したごく簡易的な装置を作製して予備実験を行なった。この過程において、本方法の特徴や実用上の課題を蓄積することができた。以上の新規導入装置を用いて平成26年度では実際の測定を行ない、本方法の実用性・ポテンシャルを見極める。本研究では、申請者が独自に着想した結晶方位解析法について、1.解析プロセス理論の構築、2.解析方法の基礎固めを目的とする。平成26年度ではまず、本方法を実施するための装置を設計・導入した。この装置は、照射光源と撮影装置に分かれるが、それぞれについて本方法を実現するための仕様を検討し、装置を作製した。さらに導入された装置を実際に使用して検討を重ねることで、本方法に必要な条件を取得することができた。本方法を行なう上で要求される光均一性や装置動作に起因した揺らぎの許容値についての情報を得ることができた。またこれらの要求を実現するためには、計画当初の装置構成や装置構造では不十分であることもわかり、様々な検討を行なうことで、これらの要求を実現するための知見を得ることができた。以上のように、本研究で独自に提案した結晶方位解析法について検討を行ない、この方法を行なううえでの、具体的な装置仕様およびこの方法のポテンシャルについての一定の知見が得られた。これらの成果は、権利申請をしたのち、学会や論文などで発表していく予定である。結晶工学当初計画では平成25年度内に装置設計を終えて装置を導入し、初期測定結果を得る予定であった。しかし、装置設計は終了したものの装置の導入は平成26年度に持ち越しとなった。この理由は、実際の装置設計において当初予見していなかった課題が見つかったためである。例えば、動作の安定性の確保や装置強度の問題は光学機器メーカー担当者との検討において初めて認識した課題であった。また照射光源についても、当初予定していた光源では面内均一性が不十分であり、十分な性能の光源を探しテスト・設計するために時間を要した。しかし、これらの課題に対応する過程において、本方法の特徴や実用への課題についての多くの知見を蓄積することができた。平成25年度中にこれらの課題はクリアし、装置設計を終えており、平成26年度当初に装置を導入する予定である。装置導入後は順次実験を行ない、データを蓄積する。本研究では目的達成のため、次の4つの研究項目を設定する。(1)本提案の方法を用いて結晶方位解析を可能とする簡易測定装置の設計と導入(2)試料表面垂直方向の結晶方位を特定するプロセスの確立(3)試料表面水平方向の結晶方位を特定するプロセスの確立(4)結晶方位特定の精度向上と限界精度の見極め平成25年度では(1)の装置設計を終え、平成26年度の早期には装置を導入する予定である。装置設計の過程においてもすでに、本方法の特徴や実用上の課題を多く蓄積することができた。

装置導入後、上記の研究項目を順次遂行することで、本方法の結晶方位解析方法としての実用性を見極めるとともに、本方法の角度精度の限界を明らかにし、そのポテンシャルを見極める。当初の研究計画では平成25年度に、本方法を用いて結晶方位解析を可能とする簡易測定装置を導入する予定であり、その経費を平成25年度の予算に計上していた。しかし、同装置の設計に時間を要したため、平成25年度中に同装置を導入することができなかった。そのため平成25年度予算のうち、同装置購入経費を平成26年度に使用し、同装置は平成26年度に導入することとした。先述のようにすでに、本方法を用いて結晶方位解析を可能とする簡易測定装置は装置設計を終了している。そのため、平成25年度予算からの次年度使用額を使用して平成26年度早期に同装置を導入する予定である。同装置の導入後は順次、測定実験を実施する予定である。
患者癌組織移植モデルの網羅的シークエンシング解析による泌尿器癌薬剤耐性機構の探索

我々は、現在までに臨床患者癌組織由来泌尿器癌xenograftモデルを樹立してきた。本研究ではこれらのモデルを用いて分子標的薬耐性モデルを樹立して、網羅的シークエンス解析を用いて薬剤耐性獲得機構の解明を目指した。temsirolimusならびにスsunitinibに対する耐性モデルを樹立し、それぞれに全エクソンシークエンス解析を行い、いくつかの候補遺伝子変異を同定した。今後、候補遺伝子変異の機能解析などを検討している。前立腺癌と腎細胞癌は発生や進展のキーシグナルが明らかにされ、それらに対応した標的治療が実践されているが、患者個々の治療反応性の差異や抵抗性の獲得が大きな問題である。平成24年度は次世代シークエンサーを用いた解析を行う耐性モデルの樹立を行った。当科研究室で樹立し、解析を進めてきた臨床検体を用いた腎細胞癌xenograftに対してmTOR阻害剤投与を継続している。当初想定していたよりもxenograftにおいてmTOR阻害剤の感受性が高く、抵抗性獲得まで時間を要したが、耐性モデルを樹立しつつある状況である。特に抵抗性獲得したxenograftからゲノムDNAを抽出して、次世代シークエンサーによる全エクソンシークエンスを開始する予定であるo【前立腺癌xenograft KUCaP2を用いた去勢抵抗性に関わる新規ARsignalingpathwayの同定】当科研究室で樹立したKUCaP2は、移植当初はアンドロゲン依存性であるが、去勢することで腫瘍は退縮し、その後去勢抵抗性を獲得して再増殖するという、前立腺癌の臨床経過を反映したxenograftである。このxenograftの去勢抵抗性獲得前後での腫瘍組織に対し、次世代シークエンサーを用いた解析を行うことで、新規のAndrogen Receptor signaling pathwayを同定し、アンドロゲン除去療法が無効となってからの治療ターゲットとして検討を行う予定である。現在サンプルとしての組織の採取を行っている。前立腺癌と腎細胞癌は発生や進展のキーシグナルが明らかにされ、それらに対応した評定治療が実践されているが、患者個々の治療反応性の差異や抵抗性の獲得が大きな問題である。当初想定していたよりもxenograftにおいてmTOR阻害剤の感受性が高く、抵抗性獲得まで時間を要したが、平成25年度中に耐性モデルを樹立した。抵抗性獲得したxenograftからゲノムDNAを抽出して、次世代シークエンサーによる全エクソンシークエンスを開始し、現在データを解析中である。前立腺癌と腎細胞癌は、発生や進展のキーシグナルが明らかにされ、それらに対応した標的治療が実践されているが、患者個々の治療反応性の差異が大きな問題である。当科研究室で樹立し、解析を進めてきた患者癌組織由来の初期xenograftモデルを用いて、mTOR耐性モデルを樹立した。樹立した薬剤耐性モデルから抽出した腫瘍を用いて、全エクソンシークエンスを施行し、耐性獲得に関連する遺伝子変異の候補を見出した。その遺伝子変異の機能解析を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器科癌26年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要にも示したように耐性モデルの樹立にやや時間を要しており、そのためやや遅れていると判断した。研究実績の概要にも示したように耐性モデルの樹立にやや時間を要したため、やや遅れていると判断した。耐性モデル樹立に若干時間を要しているものの、現在のところ、研究計画に大きな齟齬はなく、当初の研究計画に従って進行していく予定である。耐性モデル樹立に若干時間を要したものの、現在のところ、研究計画に大きな齟齬はなく、当初の研究計画に従って進行していく予定である。
π拡張型らせん状芳香族配位子を基盤とする多次元性キラル集積構造の創出

黒鉛の単一原子層である「グラフェン」は、極めて優れた熱・電気伝導性を示すことから、次世代の機能性分子材料の有力な候補として期待されている。本研究では、らせん状にねじれたグラフェンの基本構造に対応する化学構造を持つ「らせん状芳香族化合物」と金属イオンが規則的に混合したハイブリッド型の集積構造について研究を行う。グラフェンの熱・電気伝導性とらせん状分子のキラリティーが組み合わさることで、興味深いキラルな分子物性の発現が期待できる。
食生活が歯科疾患に与える影響に関する調査研究

「食生活が歯科疾患に与える影響に関する調査研究」を行なう三か年計画のうち全ての計画を消化した。この研究は以下の4項目より構成される。1)食生活と口腔癌との関係の研究、2)食生活と齲蝕発症との関係の研究、3)食生活と顎機能異常との関係の研究、4)食生活と歯周病発症との関係の研究これらの各研究の最終結果を協議するために、平成8年1月7日から1月14日にかけて九州大学歯学部の研究者がインドネシア大学を訪問した。そして両国の研究者が共同で調査研究の最終結果について協議、発表した。その各項目ごとの内容は以下のようである。1)食生活と口腔癌との関係の研究について:高齢者における口腔粘膜疾患および口腔癌の発生状況と食生活を調査した。方法として、インドネシアと日本両国の共通プロトコールにより、高齢者の口腔粘膜状態と食事内容を調査した。対象者はジャカルタ近郊の老人ホームと福岡県近郊の老人健康保険施設に入居している高齢者で日本人612名(男性171名、女性441名)、インドネシア人347名(男性87名、女性260名)である。その結果、日本人高齢者の口腔粘膜疾患出現率は49.3%であり、全身疾患出現率は91.2%であった。インドネシア人高齢者の口腔粘膜疾患出現率は28.8%であり、全身疾患出現率は70.9%であった。このように口腔粘膜疾患と全身疾患出現率において、日本人高齢者とインドネシア人高齢者の間に差がみられた。しかし、今回の調査では、この差と食生活との差は明らかにはできなかった。2)食生活と齲蝕発症との関係の研究について:ジャカルタ市においてジャワ人小児の顎顔面形態、歯列咬合状態を調査し、日本人小児のそれと比較した。対象者はジャワ人小児40名、日本人小児58名である。方法として、歯列石膏模型採得とデンタルプレスケールによる咬合力と咬合接触面積の測定を行った。その結果、咬合接触面積と、咬合力に関して、ジャワ人小児のほうが日本人小児より大きい値を示した。このことより、咬合機能の発達に関して、ジャワ人小児と日本人小児の間に差があることが示唆された。3)食生活と顎機能異常との関係の研究について:共通の質問表を用いた顎機能と食生活に関するアンケート調査を九州大学学生を中心とした日本人学生とインドネシア大学の学生に行った。対象者は日本人学生341名(男性135名、女性206名)、インドネシア人学生295名(男性149名、女性146名)で、年齢は18才から26才までとした。その結果、日本人学生においても、インドネシア人学生においても顎機能状態に開口度を除いて明らかな男女差が認められなかった。しかし、両国学生間の比較では、顎機能状態と咬合状態、食生活の状況に統計学的に差が認められた。以上の結果より、顎機能状態と食生活との関連性が疑われた。しかしアンケート調査の限界より、それらの関連性を確実に探るためにはさらに専門家による検診や綿密な食事調査が必要と思われた。4)食生活と歯周病発症との関係の研究について:高齢者における歯周疾患および全身疾患の発生状況と食生活を調査した。方法として、インドネシアと日本両国の共通プロトコールにより、高齢者の歯周組織状態と食事内容を調査した。対象者はジャカルタ近郊の老人ホームと福岡県近郊の老人健康保険施設に入居している高齢者で日本人336名、インドネシア人153名である。その結果、日本人高齢者とインドネシア人高齢者では歯周組織状態に大差がみられなかった。両国とも高齢者の口腔衛生状態が劣悪であり、口腔保健指導の必要性が認識された。以上の結果について、日本側研究者とインドネシア側研究者で、共同研究発表を行い、議論、考察した。そして最終報告書を日本側とインドネシア側でそれぞれ作成した。

対象者はジャワ人小児40名、日本人小児58名である。方法として、歯列石膏模型採得とデンタルプレスケールによる咬合力と咬合接触面積の測定を行った。その結果、咬合接触面積と、咬合力に関して、ジャワ人小児のほうが日本人小児より大きい値を示した。このことより、咬合機能の発達に関して、ジャワ人小児と日本人小児の間に差があることが示唆された。3)食生活と顎機能異常との関係の研究について:共通の質問表を用いた顎機能と食生活に関するアンケート調査を九州大学学生を中心とした日本人学生とインドネシア大学の学生に行った。対象者は日本人学生341名(男性135名、女性206名)、インドネシア人学生295名(男性149名、女性146名)で、年齢は18才から26才までとした。その結果、日本人学生においても、インドネシア人学生においても顎機能状態に開口度を除いて明らかな男女差が認められなかった。しかし、両国学生間の比較では、顎機能状態と咬合状態、食生活の状況に統計学的に差が認められた。以上の結果より、顎機能状態と食生活との関連性が疑われた。しかしアンケート調査の限界より、それらの関連性を確実に探るためにはさらに専門家による検診や綿密な食事調査が必要と思われた。4)食生活と歯周病発症との関係の研究について:高齢者における歯周疾患および全身疾患の発生状況と食生活を調査した。方法として、インドネシアと日本両国の共通プロトコールにより、高齢者の歯周組織状態と食事内容を調査した。対象者はジャカルタ近郊の老人ホームと福岡県近郊の老人健康保険施設に入居している高齢者で日本人336名、インドネシア人153名である。その結果、日本人高齢者とインドネシア人高齢者では歯周組織状態に大差がみられなかった。両国とも高齢者の口腔衛生状態が劣悪であり、口腔保健指導の必要性が認識された。以上の結果について、日本側研究者とインドネシア側研究者で、共同研究発表を行い、議論、考察した。そして最終報告書を日本側とインドネシア側でそれぞれ作成した。本研究は以下の4項目より構成される。1)食習慣と口腔癌との関係の研究2)食生活と齲蝕発症との関係の研究3)食生活と顎機能異常との関係の研究4)食生活と歯周病発症との関係の研究これらの各研究を行なうために平成5年12月12日から12月18日にかけて九州大学歯学部の研究者がインドネシア大学を訪問した。そしてインドネシア大学の研究者と研究方法について打ち合せを行い各研究項目の九州大学とインドネシア大学の双方の研究責任者を決定し、その具体的研究方法を協議した。1)について:九大側の研究責任者は大関悟、インドネシア大学側の研究責任者はDr.Afi Sarsitoである。次年度の研究として、口腔粘膜に発生する癌および前癌病変に関する疫学調査を行なうための地域、対象者、方法、アンケート等について協議してまとめた。2)について:九大側の研究責任者は中田稔,インドネシア大学側の研究責任者はProf.E.H.Soendoroである。次年度の研究として、小児を対象としてその食事習慣とカリエス発症との関係について、各被検者の口腔診査およびアンケート調査を行なうが、その方々等について協議策定した。
地域教育経営の理論的・実証的研究

本研究は、教育基本法10条1項に言うところの、不当な支配に服することなく、国民全体に対して直接に責任を負って行われる(「教育の直接責任制」)ような、公教育の経営・管理システムを再構築するために公教育経営の基本原理と、それを実現する具体的なシステムの在り方を探究することを基本的課題とする。従来の教育経営学ないしは学校経営学の先行研究を「教育におけるアドミニストレーション」という視点から批判的に検討を加え、公教育の経営・管理をめぐる基礎的な理論の構造と問題点を整理した。特に、「学校の自治」論をはじめとする従来の理論枠組み・先行学説とそれをめぐる諸々の議論について総括的・批判的検討を行い、その整理の上にたって、「地域教育経営」の理論的な枠組みを提示した。次に、「地域教育経営」実践の事例の検討を日本とイギリスについて行った。国内の事例としては、北海道・宗谷管区における地域教育経営システム、そして、国際比較の観点からの事例として、イングランドとウェールズにおけるLocal Management of Schools(略称LMS.「地域的な学校の経営・管理」)の理論と実践を取り上げ、実践の概要やその理論枠組みの特徴などを、教育経営学の視点から検討を加えた。以上の研究の結果、教育経営の支配的実態を克服する展望として、公教育の地域的な経営・管理に関わる「地域教育経営」という枠組みが、理論的にも実践的にも可能性があるものであることを検証した。本研究は、公教育の地域的な経営・管理について「地域教育経営」という枠組みを仮説的に提示し、これに関わるわが国及び諸外国の公教育経営の理論と実践を吟味し、その考察をもとに、「地域教育経営」の理論と実践可能性を検証するものである。(1)教育経営論の吟味、及び「地域教育経営」論の理論的枠組みの仮説「教育におけるAdministration」についての先行研究に批判的検討を加え、公教育の経営・管理について基礎的な理論を整理し、特に、「学校の自治」論をはじめとする従来の理論枠組み・先行学説とそれをめぐる諸々の議論について総括的・批判的検討を行い、その整理の上にたって、「地域教育経営」の理論的な枠組みを仮説的に提示した。(2)「地域教育経営」実践の事例検討のための予備的調査研究次年度以降、国内の事例としては、北海道・宗谷管区における教育経営システムと個別学校づくりの実践、国際比較の観点からの事例として、特にイギリスにおけるLocal Management of Schools(略称LMS.「地域的な学校の経営・管理」)の理論と実践を取り上げるために、これらについて、実践の概要やその理論枠組みの特徴などを、教育経営学の視点から検討を加える基礎的作業を行った。本研究は、教育経営の展望として、特に、公教育の地域的な経営・管理に関わる「地域教育経営」という枠組みを設定し、これに関わるわが国及び諸外国の公教育経営の理論と実践を吟味し、その考察をもとに、「地域教育経営」の理論と実践可能性を検証するものである。本年度は、その第二年度目にあたる研究である。(1)教育経営(学校経営)学の吟味と「地域教育経営」論の理論的枠組みの設定従来の教育経営学ないしは学校経営学の先行研究を「教育におけるアドミニストレーション」という視点から批判的に検討を加え、公教育の経営・管理をめぐる基礎的な理論の構造と問題点を整理した。(2)日・英における「地域教育経営」実践の事例検討国内の事例をしては、北海道・宗谷管区における地域教育経営システム、国際比較の観点からの事例として、特にイギリス(イングランドとウェールズ)におけるLocal Management of Schools(略称LMS.「地域的な学校の経営・管理」)の理論と実践を取り上げ、特に、前者を中心に実践の概要やその理論枠組みの特徴などを、教育経営学の視点から検討を加えた。

本研究は、教育基本法10条1項に言うところの、不当な支配に服することなく、国民全体に対して直接に責任を負って行われる(「教育の直接責任制」)ような、国民教育の経営・管理システムを再構築するために、公教育経営の基本原理と、それを実現する具体的なシステムの在り方を探究することを基本的課題としている。本年度は、本研究における「地域教育経営」の実践の事例検討のうち、特に、国際比較的な観点からの研究を重視し、英国におけるLocal Management of schools(略称LMS.敢えて日本語に訳すなら「地域的な学校の経営・管理」)の理論と実践を取り上げ、イギリスにおける「市場原理」の理論枠組みと、その枠組みの教育経営システムの全体構造への組み込まれ方に注目して、検討した。イギリスの学会誌における研究論文や書物、あるいは教育行政関係者の論稿などの文献をもとに、1988年教育改革法の施行後に実際にLMSを施行した複数の地方教育当局において、LMS下における「市場原理」の適用についてどのような枠組みが組み立てられ、それが実際にはどのように運用されているのかについて、検討した。そして、前二年度の研究成果、及び申請者のこれまでの研究蓄積をふまえて統括的なまとめの作業を行ない、それらをもとに報告書にまとめた。
トランスジェニックマウスによるGAD遺伝子機能の解析

グルタミン脱炭素酵素(GAD)は、グルタミン酸からγアミノ酪酸(GABA)を生成する酵素であり、中枢神経系において抑制性神経伝達物質であるGABAニューロンに存在する。GADにはGAD65とGAD67の2種(分子量が65kDaと67kDa)があるが、申請者はシナプスへの局在がより明らかなGAD65についてのトランスジェニックマウス作成に際して、まずマウスGAD65 cDNAのクローニングを行なった。マウス脳cDNAライブラリー(λgt10ファージ)よりRT-PCRにて作成した0.3kbpのマウスcDNAをプローブとしてスクリーニングを行い、1.4kbpおよび2.2kbpの2種類のGAD65cDNAクローンを得た。それぞれのクローンについてシークエンスを行いマウスGAD65cDNAの全長の塩基配列(2761bp、585アミノ酸)を決定した。トランスジェニックマウス作成の予備実験として、培養系を用い神経系細胞であるNeuro2aおよび非神経細胞であるCHO細胞にGAD65cDNAをそれぞれトランスフェクトしGAD65発現株を確立し、GADの細胞内局在およびGABAの生成、分泌に関して検討した。GAD65cDNAによるGABA合成を確認した後、前脳神経細胞に特異的に発現可能なカルモジュリンキナーゼIIαプロモーター(8.5kbp)を有するトランスジェニック用発現ベクター(PNN279)にGAD65cDNAを組み込み、トランスジェニックコンストラクトを作成した。さらにES細胞を用いたキメラマウス作成のために、薬剤耐性遺伝子であるpuromycin N-acetyl transferase gene(pac)を、現在ベクターに組み込み中である。
腎機能障害進展抑制におけるNa利尿ペプチド系の意義とその分子機構

Na利尿ペプチドファミリー(ANP,BNP,CNP)と呼ばれる血圧、体液量あるいは増殖を調節している心臓血管ホルモンの腎保護作用について、以下の知見を得た。1.腎疾患モデルにおけるNa利尿ペプチド系の病態生理学的意義我々は腎障害モデル動物(抗糸球体基底膜腎炎、STZ糖尿病性腎症および尿細管結紮水腎症モデル)をラット・マウスで確立し、Na利尿ペプチドならびにその受容体の局在をNothern blot法および既に開発に成功した抗ANP、抗BNP、抗CNPモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的方法により検討し、Na利尿ペプチド系が腎障害の進行の指標になる可能性が示された。2.Na利尿ぺプチド系とレニン・アンジオテンシン系の相互作用に関する検討Na利尿ペプチド系はレニン・アンジオテンシン系に拮抗的に働くが、その細胞内機序を検討する目的で培養メサンギウム細胞などを用いて細胞内情報伝達系、TGF-β、CTGFや細胞外基質の発現アポトーシス誘導についての相互作用を検討した。我々はラットCTGFをクローニングしその構造を決定し、さらにCTGFに特異的な抗体作製に成功し、ヒト血中尿中CTGF濃度測定システムを確立した。3.BNP過剰発現マウスの腎保護作用とその分子機序我々はBNP過剰発現トランスジェニックマウスを用いて腎内レニン・アンジオテンシン系を活性化する5/6腎摘モデルを作製し、対照マウスでは著明な糸球体肥大と腎障害を示すのに対し、BNP過剰発現マウスではその変化は極めて軽度であり、過剰なBNPが腎保護的に働く結果を得、これを報告した(JASN)。このマウスを用いて尿細管結紮水腎症モデルを作製し腎間質障害も対照マウスに比べて軽度でありBNPが糸球体とともに間質障害に関しても腎保護的に働くことを見出した。さらにこのトランスジェニックマウスに抗糸球体基底膜腎炎、STZ糖尿病性腎症などのモデルを作製しその腎保護効果を示した。Na利尿ペプチドファミリー(ANP,BNP,CNP)は血圧、体液量あるいは増殖を調節している心臓血管ホルモンでその局在はレニン・アンジオテンシン系と極めて類似しているとともに機能的には拮抗して作用していて腎機能障害の増悪進展に抑制的に働き臨床的に腎保護作用を有する可能性が期待されている。今回、Na利尿ペプチドの腎保護作用について以下の知見を得た。1.腎疾患モデルにおけるNa利尿ペプチド系の病態生理学的意義我々は腎障害モデル動物(抗糸球体基底膜腎炎、STZ糖尿病腎症及び尿細管結紮水腎症モデル)をラット・マウスで作製し、Na利尿ペプチドならびにその受容体の局在をNorthern blot法および既に開発した抗ANP,抗BNP,抗CNPモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的方法により検討した。2.Na利尿ペプチド系とレニン・アンジオテンシン系の相互作用に関する検討Na利尿ペプチド系はレニン・アンジオテンシン系に拮抗的に働くと考えられておりその細胞内機序について検討する目的で、培養メサンギウム細胞を用いて細胞内情報伝達系、TGF-β、CTGFや細胞外基質の発現誘導についての相互作用検討している。このため我々はラットCTGFをクローニングしその特異的な抗体作製に成功した。

3.BNP過剰発現マウスの腎保護作用とその分子機序我々はBNP過剰発現トランスジェニックマウスを用いて腎内レニン・アンジオテンシン系を活性化する5/6腎摘モルを作製し、対照マウスでは著明な糸球体肥大と腎障害を示すのに対し、BNP過剰発現マウスではその変化は極めて軽度であり、過剰なBNPが腎保護的に働く結果を得、これを報告した(JASN)。更に現在このトランスジェニックマウスを用いて、尿細管結紮水腎症モデルや他の腎障害モデルを作製してBNPの腎保護作用の有無とその機序について検討している。1.腎疾患モデルにおけるNa利尿ペプチド系の病態生理学的意義腎障害モデル動物(抗糸球体基底膜腎炎、STZ糖尿病性腎症および尿細管結紮水腎症モデル)をラット・マウスで確立し、Na利尿ペプチドならびにその受容体の局在をNothern blot法および既に開発に成功した抗ANP、抗BNP、抗CNPモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的方法により検討し、腎障害の進行の指標になる可能性が示された。2.Na利尿ペプチド系とレニン・アンジオテンシン系の相互作用に関する検討Na利尿ペプチド系はレニン・アンジオテンシン系に拮抗的に働くが、その細胞内機序について検討する目的で培養メサンギウム細胞などを用いて細胞内情報伝達系、TGF-β、CTGFや細胞外基質の発現アポトーシス誘導についての相互作用を検討した。ラットCTGFをクローニングしその構造を決定し、さらにCTGFに特異的な抗体作製に成功し、ヒト血中尿中CTGF濃度測定システムを確立した。3.BNP過剰発現マウスの腎保護作用とその分子機序既に、BNP過剰発現トランスジェニックマウスを用いて腎内レニン・アンジオテンシン系を活性化する5/6腎摘モデルを作製し、対照マウスでは著明な糸球体肥大と腎障害を示すのに対し、BNP過剰発現マウスではその変化は極めて軽度であり、過剰なBNPが腎保護的に働く結果を得、これを報告した。このマウスを用いて尿細管結紮水腎症モデルを作製し腎間質障害も対照マウスに比べて軽度でありBNPが糸球体とともに間質障害に関しても腎保護的に働くことを見出した。さらにこのトランスジェニックマウスに抗糸球体基底膜腎炎、STZ糖尿病性腎症などのモデルを作製しその腎保護効果を示した。
視神経切断後の外側膝状体における興奮性・抑制性アミノ酸受容体応答の可塑性変化

正常ならびに視神経切断時における外側膝状体ニューロンの興奮性ならびに抑制性アミノ酸受容体応答について電気生理学的に調べるために、逆行性トレーサーを流入して外側膝状体ニューロンを同定した。その後、目的のニューロンを酵素と機械的処理で単離した後、電気生理学的学的手法を用いて検討した。1.ニューロンに対する興奮性アミノ酸応答の力価の強さの順はKA>NMDA>AMPA>Gluであった。3.NMDA存在下のP_<Ca>/P_<Cs>=9.57、KAのそれは0.16であった。4.加齢によって細胞内Cl^-濃度が変化した。02日齢で35mM、2週齢で22mM、6ヶ月齢で15mMとなった。すなわち、幼若期においてはGABAは外側膝状体ニューロンに脱分極を起こし、細胞の興奮をもたらす。神経軸策切断によって、細胞内Cl^-濃度の上昇とNMDA応答に対するMg^<2+>ブロックの減弱が発現した。シナプス・ブートン標本を用い、抑制性GABA性神経終末部にNMDA、AMPA、KAの受容体があり、GABAの遊離を促進させるシステムが存在することが明らかとなった。この他、本神経終末にはGABA_B、mGluレセプターを介するオートレセプターも存在し、GABAの遊離を抑制した。当初の計画では、初年度にスライスパッチ標本、次年度に急性単離ニューロンを用いる予定であったが、研究の初期から定量的な解析を行う必要性を認識し、初年度から急性単離ニューロンを用いた実験を遂行した。生後2週目の仔ラットの大脳皮質視覚野に逆行性蛍光トレーサー(latex beadsあるいはdil)を注入し、単離した外側膝状体ニューロンを同定することに成功した。同ニューロンを用いてニスタチン穿孔パッチクランプ法による膜電位固定を行い、興奮性アミノ酸受容体アゴニストであるNMDA、カイニン酸、AMPAを投与して、濃度-応答特性、電流-電圧特性、Ca^<2+>透過性などを検討した。さらに、視覚系の内因性神経伝達物質と考えられているN-acetyl-aspartyl-glutamate(NAAG)に対する応答を解析し、1)NAAG応答がNMDA受容体のアンタゴニストであるAP5により部分的に抑制されること、2)1mMのMg^<2+>存在下でグリシンを除去した細胞外液中では、応答が減弱するもののNMDA応答と異なって残存する成分が認められること、3)この残存する成分はAMPA受容体の脱感作を抑制するcyclothiazideにより影響されないことなどから、NAAGがNMDA受容体とカイニン酸受容体の両者を活性化することを見いだした。また視神経を切断したラットにおいてNMDA、カイニン酸、GABA、グリシンの応答を検討したが、少なくとも濃度-応答特性に関して対照群との差異は認められなかった。以下の3点について検討した。(1)生後2週齢の仔ラットの大脳皮質視覚野に逆行性蛍光トレーサー(latex beads)を注入し、同定した外側膝状体ニューロンを酵素と機械的パイペッテイング処理により単離した。同ニューロン群にグラミシジン穿孔パッチ記録法を適用して膜電位固定下にGABAで惹起されるGABA_A応答への加齢効果を電流・電圧曲線より得られる平衡電位のシフトより検討し、発達に伴うGABA応答の変化が細胞内Cl^-濃度の生後変化によることを解明した。その結果、生後02日齢、2週齢と6ヶ月齢ラットニューロンの細胞内Cl^-濃度はそれぞれ35mM,22mMと15mMであり、幼若期でのGABA応答は脱分極を惹起し細胞の働きを抑制するより興奮させるものと結論できた。(2)ラット網膜から発した視神経は視交叉でほぼ全交叉して単シナプス性に外側膝状体を支配し、さらに外側膝状体の神経線維は単シナプス性に大脳皮質視覚領のニューロンに投射する。視神経を切断すると外側膝状体のグルタミン酸受容体やヒスタミン受容体のリガンド結合能が促進されることが知られているが、生理的視野から見た機能的な研究はなされていない。

また外側膝状体ニューロンの神経線維を切断するいわゆる神経外傷がニューロンの受容体の性質をどう変えるかも知られていない。今回は本実験を行う予備実験として蛍光組織学的により同定しやすい迷走神経背側運動核ニュートロンを用いて、神経線維切断によるNMDA受容体応答について検討した。その結果、外科的神経外傷を与えると23日以内にNMDA応答のMg^<2+>による阻害が弱くなること、しかし術後1週間後にはMg^<2+>感受性が元に戻ることが明らかとなった。(3)共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて外側膝状体ニューロンにおけるCa^<2+>シグナルの伝播が細胞内の部位ごとに異なる時間経過をとることが明らかとなった。神経終末部多数が附着したシナプス下中枢ニューロンを2週齢ラットより単離した。この標本を「シナプス・ブートン標本」と呼び、以下の実験を行なった。神経終末より自発的に放出されるGABA性の抑制性シナプス後電流(sIPSC)を記録しながら、興奮性アミノ酸の各種受容体を選択的に刺激するNMDA、AMPAとKAを短時間作用させるとsIPSCの振幅(大きさ)を変えることなく発現頻度のみが増加した。この増加はNMDA>KA>AMPAの順により強く現われた。このことは、GABAを放出する抑制性神経終末部にNMDA、AMPAやKA受容体が存在することを証明する。すなわち、同一ニューロンに投射する興奮性神経終末部から多量の興奮性アミノ酸が遊離され、これによるシナプス下膜の興奮が異常に進行するような場合に、シナプス間隙に蓄積した興奮性アミノ酸が抑制性神経終末部に存在する興奮性受容体に作用して、GABAの遊離を促進し、興奮性の異常亢進に抑制をかける、すなわちネガティブフィードバック作用を惹起する。このようなオートレセプターのしくみは従来から良く知られている`シナプス前抑制'に加わる新しい発見で、中枢制御システムに関する今後の研究に大きな影響を与えるものと考える。加えて、GABA_B受容体によるsIPSCの制御機構も同一神経終末部に存在することがバクロフェン、ファクロフェンの使用により明らかとなった。
視覚創作系と聴覚創作系との双方向的置換の試み

視覚創作系(美術)と聴覚創作系(音楽)との置換モデルに基づき,以下の装置及び関連資材を開発した。1.「色⇔音」置換プログラム&当該回路。2. LEDカラーセンサ。3.置換装置本体。4.色走査用プローブ。5.走査用カラースペース。6.色面と音階との印象比較実験用風力装置。7. PureDataを利用した「音⇒色」変換プログラム。また,5.を利用した「色楽譜」を制作し,色発音装置による音楽演奏を試みた。本研究の最終目的となる実験作業については,現在装置の調整を行っている段階である。本年度においては初年度計画の通り、1「視覚→聴覚系」置換装置の制作及び、2「聴覚→視覚系」置換装置の制作(PureDataを用いたプログラム制作)を行った。1については、音階(音律)と色相との対照方法について、色相(体系)を重視する方法[分離型]とRGB(個別の色)を重視する方法[RGB型]の2種について試作を試み、色域の広さを考慮し後者で進めることを決定した(前者については、より合理的システムと判断したのだが、今後の展開によって利用を考えることとした)。当該装置制作に関する現行の状況は、最終プログラムの制作を終え、試作機を確認し最終回路制作を行っている段階である。またこれと並行して、センシングされる色空間の制作を行った。課題であったのは、音階の集合(音律)に対応する色空間の集合具合(色相)をどのように体系化するかだった。一般に流通している色空間においては、RGB系の場合、明度の段階化が無視されているため、循環性(=段階化)が獲得できない状況にあり、またCMY系においては、RGBとの整合性において課題があった(センシングの際段階化ができない)。そこで本研究では、RGB系色空間において「原基」を設定(汎用性、再現性を考慮し、フリーソフト『GYMP』環境でのシステムカラー(色数256個)によって制作)。それを基準に、明暗それぞれにむけて明度の段階化を展開。それらに展開された全体から各1色相内(1オクターブ内)に循環できるカラーチップを1個づつ合致させる方法によって色空間の体系化を行った。そのことによって5オクターブ分の広域の色空間を創出が可能となった。2については、マルチメディア制作を行えるPureDataによって、当該目的に似合ったシステムを制作した。現在は、MIDI領域とデジタル領域との整合性の調整と、視覚&聴覚それぞれの体系を構成する属性群同志の写像関係を構築中。前年度(H25年度)の成果(1色→音の変換発音装置の試作機の評価/2音→色の発色プログラムの基本確認)を元にして,当該年度においては先ず,当初の研究計画に合わせ装置の制作を行った。1色→音変換発音における[RGB型]装置群は,5センサ×2セット,15センサ×1セット,24センサ×1セットの3種類,計4セットの複数個の制作を行うことができた。このとこについては,当初1個程度を予定していたことからして予想以上の成果と考える。また,その内の5センサ及び15センサ用装置については,屋外使用などのポータビリティを考慮し,バッテリー内臓に対応できるものとしたことも評価できる。当該装置全体の概要は,長方6面体とし,底面部において色をセンシングすることとし,当該センシング部分においては透明のアクリル板を用い,その内側に各センサを取り付ける構成である。すなわち色面の走査(センシング)においては,透明窓を通して行うスタイルとした(指定URL参照)。この点においては,当初予定していた決められたレール上を沿わせて行わせる走査方法より操作性及び自由度が格段に上がったものと評価している。但し現在,センサのキャリブレーションの調整に困難が生じている状況である。この問題は,複数のセンサを利用する場合に異なる色同志が同じ音階を発音してしまう障害を発生させている。このことの解決策構築に現在鋭意取り組んでいる。解決策としてプログラムにおける対応を模索しているが,資金的に困難な場合,方式の変更もあり得る(現行のRGB値を固定してその対応値を音階に変換する[RGB型]から,色相値をベースにした方式への変更する等。但しその場合,発音できる音域が大幅に狭まってしまう弊害が生じる。現在検討中である)。前年度の課題(キャリブレーションの不調)について、プログラムによる対応が困難だと判断し、走査可能の色域を256色に限定し、それぞれのセンサ毎に色値を読み込む手動的方法による対応をとった。そのために読み込み色値の総数は、数万を超えることとなった。また、前年度において対応できなかった、「視覚試料(色面)と聴覚試料(音階)との印象の比較調査」について実施をこころみたが、両者創作物の性質が異なる点(前者が二次元的試料であるのに対し後者が時間軸をもつ試料)が問題を生じさせた。具体的には比較実験の際、単に色面を連結型色センサによって順番に走査するという方法であると、そこに「無作為性の問題」が発生することが判明した。そこでその解決策として考えたのが、試料となる色面を複数個の「色チップ」に細かく分解したことである。それらを風力によって巻き上げ、下面に上に向けて設置した色センサにより走査する方法をとることによって「ランダム性」を発生できた。本年度においてはその装置の制作をし、現在その調整中である。また本年度については「音→色変換」装置_ポータブルについての制作を行った。※指定URL参照。

これまでの三年間における本研究及び制作についての主な成果品は以下などである。1色センサチップ×36個、2「色→音変換」装置/2-1_色相型×1set、2-2 _RGB型×3sets、2-3 _MIDI型×1sets、3センサー/3-1_5連型×2、3-2_15連型×1、3-3_22連型×1 4風力型色→音変換装置×2、5「音→色変換」装置_ポータブル。※成果品については指定URL参照。本研究についてはH28年度科研にて申請していた#16K12677「「色音変換発音装置」を利用した視覚障害者用誘導システム」において、本研究結果が応用されることとなる。今後は本研究を受け継ぎさらなる発展を目指したい。視覚創作系(美術)と聴覚創作系(音楽)との置換モデルに基づき,以下の装置及び関連資材を開発した。1.「色⇔音」置換プログラム&当該回路。2. LEDカラーセンサ。3.置換装置本体。4.色走査用プローブ。5.走査用カラースペース。6.色面と音階との印象比較実験用風力装置。7. PureDataを利用した「音⇒色」変換プログラム。また,5.を利用した「色楽譜」を制作し,色発音装置による音楽演奏を試みた。本研究の最終目的となる実験作業については,現在装置の調整を行っている段階である。当初の予定では,当該年度の目的達成は,1装置の制作,2実験準備&一部実施であったが,1の装置制作については完了したのであるが,センサのキャリブレーションの調整問題(下記「今後の研究推進方策等」参照)が生じ,実験に入れていない。問題が深刻な部分であり,対応方法を慎重に検討しているところである。本年度7月末頃までに対応方法を決断し,もし変更するのであれば,それに応じ,実験の目的を見直す。具体的には,視覚試料(色面)と聴覚試料(音階)との印象の比較調査の幅(色域と音域)を狭めて対応することになる。もっとも創作表現の革新という目的については,たとえ方式変更となっても十分に対応できるものであるので,このことについての作業については改良作業と並行して行っていく。デザイン発音装置の制作及び,走査のためのカラースペースの設定は終了したのであるが,現在,センサのキャリブレーションの調整に困難が生じている状況である。この問題は,複数のセンサ(15,24個使用の大領域タイプ)を利用する場合に異なる色同志が同じ音階を発音してしまう障害を発生させている。このことの解決策としてプログラムにおける対応を模索しているが,場合によっては方式の変更もあり得る(現行のRGB値を固定してその対応値を音階に変換する「絶対値で変換する方法(=[RGB型]」から,色相値をベースにした方式(「相対値で変換する方法(=[分離型]」)への変更)。しかしその場合,発音できる音域が,4オクターブから1オクターブと大幅に狭まってしまう重大な弊害が生じる。本課題は,当該研究全体にとって重要であるので,外部ワークショップと慎重に検討を行っているところである。初年度に計画予定であった、両装置(「視覚→聴覚系」
脊椎動物体節形成における時空間情報の統合機構の解析

体節は脊椎動物の発生過程において一過的に形成される繰り返し構造であり、発生過程の沿軸中胚葉において分節時計とwavefrontによって作り出される時空間情報をもとに形成される。このような時空間情報による体節形成制御機構を明らかにするため、このような時空間情報の下流で体節形成に必須な役割を果たすことが知られているrippy遺伝子の発現制御機構の解析を行った。具体的にはゼブラフィッシュripply2発現制御領域を含む上流8kbのプロモーター解析を行い、ヒト培養細胞においてripply2のプロモータ活性は分節時計構成因子であるHerによって直接的に抑制されることを見出し、ゼブラフィッシュ胚においてもHer1及びHer7がripplyの発現を抑制することにより体節形成のタイミングを制御することを明らかにした。また、ヒト培養細胞においてwavefrontの分子実体であると考えられるFgfシグナルの下流因子であるERKシグナルはTbx6依存的なripply2プロモーターの活性化を抑制することを見出した。この時にTbx6はERK依存的にリン酸化されていることから、ERKによるTbx6のリン酸化を介してwavefrontはripplyの発現を制御する可能性が考えられた。現在ゼブラフィッシュ胚を用いてこれらの可能性の検討を行うとともに、この様な時空間情報によるripply発現制御ネットワークの動体を明らかにするためシミュレーションモデルの作成を行っている。当初予定していたATAC-seqを行わずにripplyの制御機構が明らかにできつつあり、比較的順調に進展しているといえる。平成30年度までに分節時計によるripplyの発現制御機構は概ね明らかにすることができている。またwavefrontによる制御機構に関してはヒト培養細胞を用いた実験から概要は明らかにできつつあるが、実際の個体を用いた検証が不十分である。そこで令和元年度は体節形成過程のゼブラフィッシュ胚におけるERKシグナルによるTbx6のリン酸化の役割についての解析を行うとともに、これらの結果をもとにしたシミュレーションモデルを作成し、その検討を行う。分節時計とwavefrontによって作られる時空間情報をもとにした周期的な体節の形成機構を明らかにするため、これらの時空間情報の下流で体節形成に重要な役割を果たすことが知られているRipply2の発現制御機構の解析を行った。具体的には内在性の発現を再現するのに十分な領域を含むゼブラフィッシュripply2遺伝子上流8kbpの領域のプロモーター活性を解析し、培養細胞においてripply2プロモーター活性は分節時計の主要構成因子の一つであるHer1によって直接的に抑制されることを見出した。また、ゼブラフィッシュ胚において内在性のripplyの発現はHer1の過剰発現により抑制されること、及び体節形成時にHer1タンパク発現領域においてripply2の発現が抑制されていることを確認した。これらの結果より、ゼブラフィッシュ体節形成においてはHer1による周期的なripplyの発現抑制を介して、分節時計によって作られた時間情報が体節の分節境界へと変換されていると考えられた。また、ripply2プロモーター上にはTbx6結合配列が存在し、培養細胞およびゼブラフィッシュ胚においてはripply2の発現はTbx6によって活性化されると考えられた。培養細胞においてこのようなTbx6によるripply2プロモーターの活性化はwavefrontの分子実態であると考えられるFgfシグナルの下流経路の一つであるRAS-ERKシグナルの活性化により抑制され、ゼブラフィッシュ胚においてもERKの活性化阻害剤の処理によりripplyの発現領域が後方へと拡大することが確認された。また、培養細胞においてERKの活性化によりTbx6のリン酸化が亢進することが確認され、これらの結果より、wavefrontはERKによるTbx6のリン酸化を介してripplyの発現を空間的に制御する可能性が示された。Ripply2の転写制御機構の解析に関しては概ね予定通りに解析が進んでおり、当初予定していた分節時計とwavefrontにより作り出される時空間情報によるripplyの発現制御機構の概要が明らかになりつつある。光遺伝学を用いた解析に用いるトランスジェニックフィッシュの作成も現在のところ特に問題なく進んでいる。

平成29年度に主に培養細胞系を用いて示されたripplyの発現制御ネットワークの体節形成における役割を、免疫組織学的な手法を用いて検証する。具体的には、分節時計、wavefrontおよびripply mRNAの動態を多重染色により可視化し、ネットワークから予測される動態と比較することにより、これらの制御ネットワークの妥当性を評価する。また、平成29年度に予定して実施されなかったATAC seqを用いたripplyプロモーター上の転写因子結合部位の網羅的な同定を行い、平成29年度の解析では同定できなかった新たな転写調節因子の探索を試みる。また光遺伝学的手法を用いて分節時計やwavefrontの挙動を人為的に操作し、それらの体節形成に与える影響を解析することにより、体節形成における時空間情報のダイナミクスの役割を解析する。最終的には既存のclock and wavefrontモデルにこれらの情報を統合し、より実際の胚発生を反映したモデルを作成する。平成30年度までに分節時計によるripplyの発現制御機構は概ね明らかにすることができている。またwavefrontによる制御機構に関してはヒト培養細胞を用いた実験から概要は明らかにできつつあるが、実際の個体を用いた検証が不十分である。そこで令和元年度は体節形成過程のゼブラフィッシュ胚におけるERKシグナルによるTbx6のリン酸化の役割についての解析を行うとともに、これらの結果をもとにしたシミュレーションモデルを作成し、その検討を行う。ripply2のプロモーター解析に関して、平成29年度は次世代シーケンサを用いたATAC seq解析を予定していたが、既存の転写因子結合配列データベースを用いた解析が予想以上に上手くいったためATAC seqを行わずに解析を行った。平成30年度は従来の研究計画に加え、平成29年度からの繰越分の予算を用いて、平成29年度に実施されなかったATAC seq解析を行い平成29年度に行ったデータベース解析では同定できなかった因子の探索を行う予定である。当初予定していたATAC-seqを実施することなくFgfシグナルによるripplyの発現制御機構を明らかにすることができたため、予定よりも使用額が減少した。次年度に行う予定であるシミュレーションモデルの検証のために当初予定していなかったripply1及びripply2抗体及びher7-mscarletノックインフィッシュの作成が必要になっており、本年度の未使用額を融通する予定である。
ヒト化マウスを用いた腫瘍関連マクロファージ誘導モデルマウスの樹立と治療薬の探索

腫瘍関連マクロファージ:TAMのモデルマウスの作製を試みた。免疫系ヒト化マウスに移植したヒト腫瘍組織内に浸潤したヒトマクロファージは極めて微量であった。そこで他の腫瘍微小環境構成細胞である線維芽細胞に着目した。ヒト線維芽細胞株を胆管がん細胞株の培養上清で培養すると、腫瘍増殖に重要なIL-6、MCP-1の産生が誘導され、これらサイトカインの産生はステロイドやp38、HSP90阻害剤により抑制されることが明らかとなった。ヒト線維芽細胞とヒト胆管がん細胞をマウスに共移植すると、腫瘍単独移植に比べ腫瘍の増殖が激しいことを明らかにしたが、この増殖促進効果はp38阻害剤で抑制することが出来なかった。腫瘍組織はがん細胞に加えて炎症細胞や線維芽細胞、細胞外基質などの間質組織から構成され、これらは腫瘍微小環境を構築し、がん細胞の浸潤、悪性化、転移の誘導に重要な役割を果たしている。このような腫瘍微小環境はin vitroでは再現することが難しく、in vivoモデルの樹立が重要である。腫瘍組織に浸潤したマクロファージはTAMへと形質変化し、腫瘍の増殖をサポートすることが知られている。本研究はヒト化マウスを用いてTAM誘導マウスモデルを樹立し、TAMの誘導機序の解明と、TAMを標的とした新規治療法の確立に供するものである。まず、高度免疫不全マウス(Nude GFP-Rag2/Jak3欠損マウス)の新生仔マウスに臍帯血由来の血液幹細胞(CD34陽性細胞)を移植し、ヒト化マウスを作成した。FACSにて、マウス体内でヒト免疫系が構築されたのを確認した後、ヒト胆管癌細胞株M213をマウス背部に皮下移植した。腫瘍の直径が5mmを超えた時点でマウスを解剖し、摘出した腫瘍に浸潤したヒト免疫細胞をFACSにより確認した。その結果、ヒトマクロファージの腫瘍組織への浸潤が確認されたが、極めて微量であり腫瘍組織内の非がん細胞の多くはマウス線維芽細胞とマウスマクロファージで占められていた。したがってTAM誘導マウスモデルを作成するにあたり、さらなる改良が必要であることが示唆された。そこで腫瘍微小環境構成細胞の一つである線維芽細胞に着目した。ヒト線維芽細胞株OUMSをヒト胆管癌細胞M213の培養上清中で培養すると、マクロファージの浸潤、増殖に重要であるIL-6, MCP-1の産生が強力に誘導されることを確認した。当初の研究計画通り、初年度はヒト化マウスの作製、ヒト癌細胞の移植、TAMの表現型解析を行った。しかし移植したヒト胆管癌細胞より形成された腫瘤内へのヒトマクロファージの浸潤が予想外に少なく、マウスモデルの改良が必要であることが示唆された。その過程で、ヒト線維芽細胞が胆管癌細胞周辺に浸潤し、マクロファージの浸潤、増殖に重要であるIL-6、MCP-1を産生することが明らかとなり、間接的にTAMの誘導、浸潤を促進する可能性が示唆された。また、阻害剤ライブラリーを用いた解析から、これらサイトカインの産生誘導はステロイドやMAPK阻害剤、HSP90阻害剤により顕著に抑制されることを明らかとなり、当初の計画にはない知見が得られた。腫瘍微小環境は腫瘍の増殖や浸潤、転移などに重要な影響を与えている。本研究はヒトの免疫系がマウス体内で構築された免疫系ヒト化マウスを用い、腫瘍に浸潤するマクロファージ(腫瘍関連マクロファージ:TAM)の腫瘍増殖に与える影響をin vivoにて検討し、TAMを標的とした新規治療法の確立に供するものである。2016年度までに、ヒト胆管がんの腫瘍組織内にヒトマクロファージが浸潤するか免疫系ヒト化マウスを用いて検討したが、浸潤したヒトマウロファージは極めて微量であった。そこでマクロファージ以外の腫瘍微小環境構成細胞である線維芽細胞に着目した。ヒト線維芽細胞株OUMSを様々な胆管がん細胞株の培養上清で培養したところ、マクロファージの浸潤、増殖に重要なIL-6とMCP-1の産生が強力に誘導された。阻害剤スクリーニングより、これらサイトカインの産生誘導はステロイドやMAPK阻害剤、HSP90阻害剤により抑制されることが明らかとなった。2017年度は線維芽細胞が腫瘍増殖に与える影響を検討した。トランスウェルを用いた線維芽細胞の浸潤能を検討したところ、線維芽細胞はMMPを活性化することにより腫瘍細胞に浸潤することが明らかとなった。また、免疫系ヒト化マウスの皮下にOUMSとヒト胆管がん細胞株M213を共移植したところ、M213単独移植したものに比べ、腫瘍の増殖は激しかったが、ヒト化していない高度免疫不全マウスでも同様の現象がみられたことから、線維芽細胞はマクロファージ非依存的に腫瘍の増殖をサポートしていることが示唆された。また線維芽細胞とM213細胞を共移植してもヒトマクロファージの浸潤は確認できなかった。さらに、この線維芽細胞による腫瘍増殖促進効果は抗IL-6抗体で抑制されたが、MAPK阻害剤では抑制することが出来なかった。今後ステロイドやHSP90阻害剤との相乗効果も検討していく。