hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アポトーシス制御系に基づく環境有害因子の人への健康影響評価に関する研究

人の健康影響評価法への応用には、血中レベルでアポトーシスシグナルを同定することが第一であり、環境の異なる地域住民として、東京都杉並区住民と茨城県高萩市住民より血液を採集し、また血液中のDNAフラグメントの検出方法の確立を行った。その結果、アポトーシスシグナルの一つであるDNAフラグメントを血中で検出するには、従来の方法で検出不可能であったため、PCR法による検出方法を確立し、検出感度が100倍から1000倍改善された。しかしながら、この方法では、採血方法などによると思われるアーティファクト(人為的産物)が混入する場合もあることが明らかになり、今後に課題を残した。「DNAのフラグメント化」を「血中のアポトーシスシグナル」の指標として利用することは適切ではなく、他の指標を応用しなければならない。そのためには、環境有害因子に特有な(特異的な)アポトーシス誘導機構を解明しなければならないところに来ていると言える。こうした観点から、申請者は、生理活性物質で腎アポトーシスを誘導するTNFとカドミウムによるアポトーシス誘導機構の差異を探求してきた。その結果、両者にいくつかの差異を見出した(未発表)。第一に、TNFとは異なり、カドミウムはcaspase3非依存性DNaseを活性化すること。第二に、一般的に、細胞核内のアポトーシス現象はミトコンドリアによりコントロールされていると考えられてきているが、カドミウムはミトコンドリア以外の細胞内小器官にも作用し、アポトーシスを誘導していること。第3に、カドミウムは、TNFでは見られない細胞核内に変化をもたらしていること、などである。こうした差異が環境有害因子に固有の物であるかを徹底的に調べ、それらを血中アポトーシスシグナルとしての指標に応用し発展させることが必要であると考える。重金属カドミウムと培養細胞を用いて、環境有害因子によるアポトーシス誘導の分子機構を詳細に調べた結果、カドミウムはアポトーシス関連遺伝子であるc-mycを暴露初期に活性化するが、アポトーシス誘導経路には関与しないことが証明され、早期健康影響評価法のための因子には成らないことが明らかになった。また、重金属や過酸化ストレスの軽減因子であるメタロチオネインもこれらのアポトーシス誘導経路には関与していないことが解明された。一般的に知られているアポトーシスの実行分子CADの活性化に関しては、暴露する組織によりCADの活性化の有無が異なっていた。カドミウムによるアポトーシス誘導は、亜鉛やある種の細胞増殖因子により抑制され、その時抗アポトーシスタンパク質であるBcl-2が活性化されることも明らかになった。本研究では、環境有害因子の人の健康影響をアポトーシス制御系で評価しようというものである。そのためには、1.血中レベルでアポトーシスシグナルを同定すること。2.早期高感度健康影響評価法のためのアポトーシス制御系因子の同定。

そして、3.環境の異なる地域住民の血液採集と応用を試みることである。これらの点を中心に本年度の成果を報告する。1.塩化水銀を環境有害因子としてラットを用いた動物実験を行った。塩化水銀(2mg/kq)を皮下投与し、抗血液凝固剤を用いて採血した(1ml、)。採血した血液から、市販のDNA抽出剤を用いて可溶性DNA画分を抽出し、DNAがフラグメント化しているかどうかをアガロース電気泳動で調べた。その結果、エチジームブロマイド染色法では、うつすらフラグメントが見えるか見えないかの程度であった。つまり、アポトーシスの結果をDNAフラグメント化で見ようとした場合、量的問題が残った。そこで現在PCRを応用した方法の条件検討を行っている。2.重金属カドミウムと培養細胞を用いて、環境有害因子によるアポトーシス誘導の分子機構を詳細に調べた結果、重金属によりナポトーシス関連遺伝子であるc-mycが、曝露初期に活性化されるが、重金属によるアポトーシス誘導経路には関与しないことを証明し(研究発表1)、早期健康影響評価法のための因子にはならないことが明らかになった。重金属や過酸化ストレスの軽減因子であるメタロチオネインもこれらのアポトーシス誘導経路には関与しないことが明らかになった(研究発表2)。3.環境の異なる地域住民として、東京都杉並区住民と茨城県高萩市住民の採血収集を始めた。本研究では、環境有害因子の人の健康影響をアポトーシス制御系で評価しようというものである。そのためには、(1)血中レベルでアポトーシスシグナルが同定できること。(2)早期高感度的に健康影響評価法のための新たなアポトーシス制御系因子の同定。そして、(3)環境の異なる地域住民の血液採集し、本研究で確立した方法の応用を試みることである。(1)昨年の動物実験の結果、血中アポトーシスシグナルをDNAフラグメント化で検出する場合、量的問題が残った。そこで、本年度はPCR法を用いて少量のDNAフラグメントを増幅することによりその問題解決を試みた。人工的に合成した12塩基よりなるオリゴDNAをいかなるDNAフラグメントに対しても結合することができるようなり、いかなるDNAフラグメントのPCRも可能となった。この方法では、50ngのDNAフラグメントがあれば検出可能であり、従来の100-1,000倍感度が上昇したことになる。(2)重金属カドミウムと培養細胞を用いて、環境有害因子によるアポトーシス誘導の分子機構を詳細に調べた結果、カドミウムは一般的に知られているアポトーシスの実行分子CADを活性化する場合としない場合があり、それは、暴露する組織により異なっていた(投稿準備中)。また、カドミウムによるアポトーシス誘導は、亜鉛やある種の細胞増殖因子により抑制され(研究発表3)、その時抗アポトーシスタンパク質であるBcl-2が活性化されることが明らかになった。(投稿準備中)。(3)環境の異なる地域住民として、東京都杉並区住民と茨城県高萩市住民を選択し,1-2mlずつ各地域50人以上の血液が集まった。血液からDNAを抽出する回収率を予備実験で見積もると,1ml血中当り3-5 ug DNAであった。
海洋藍藻の浸透圧応答型プラスミドの解析とその応用

本研究では、海洋藍藻Synechococcus sp.NKBG042902の塩濃度によってコピー数が変動するプラスミド(pSY10)の複製領域の決定を行うとともにその制御機構を解明することを目的とした。1)pSY10の最小複製領域の決定、2)RepAタンパク質のpSY10複製制御領域への結合、3)repA遺伝子の発現調節機構の解析、4)各塩濃度条件下におけるrepA遺伝子のプロモーター活性変化、の項目について研究を行った。平成8年度には、pSY10の複製タンパク質をコードするrepA遺伝子の下流領域に複製を負に制御する領域(m領域)、安定化する領域(p領域)が存在することを明らかにし、repA遺伝子とその下流領域が安定な複製に必要な領域であることを示した。平成9年度では、RepAタンパク質がm領域に結合することによってpSY10は高コピー数で維持されることを示した。特に、この現象は、内在性pSY10を保有する海洋藍藻Synechococcus sp.NKBG042902では、海水条件下で培養したときのみ確認されることより、淡水条件下においては、RepAタンパク質の発現量が少ないために、プラスミド複製の開始頻度が抑制されていることが示唆された。さらに、淡水条件下でのみRepAタンパク質の発現が抑制される要因を明らかにするために、淡水・海水条件下で、repA遺伝子のプロモーター領域に結合するタンパク質が存在するかを検討した結果、淡水条件下でのみNKBG042902のゲノムより特異的に発現し、プロモーター領域に結合するタンパク質の存在が示唆された。このタンパク質の結合によって、プロモーター活性の抑制が、リポーター遺伝子の発現量を指標にした実験によっても確認された。このタンパク質の結合によってプロモーター活性が抑制され、RepAタンパク質の発現が抑えられることにより、最終的にはPSY10の低コピーを引き起こすことが示された。NKBG042902の保有するpSY10は、生息環境である海洋条件下では、通常のRepAタンパク質支配型のプラスミドと同様の複製様式を示すが、ひとたび淡水ストレスを受けると、その情報がホストゲノムを通じて伝達され、コピー数の制御を受ける。これは、今までには報告のない新規な複製制御機構である。平成8年度は「浸透圧応答型プラスミドpSY10の複製最小領域の決定と外来遺伝子発現系への応用」という研究内容について検討した。すでに、pSY10の全塩基配列の決定は終了しており、その情報をもとにこのプラスミドがRepA関与の複製をすることが推測されている。そこで、repA遺伝子(1076bp)とその前後領域を含む1535bpDNA断片を大腸菌のベクタープラスミドに組み込み、組み換えプラスミド(PEA:4.6kb Apr)を作成し海洋藍藻Synechococcus sp.に導入した。pSY10を保有するSynechococcus sp.NKBG042902においてプラスミドのキュアリングが成功していないため、プラスミドを保有しない海洋藍藻Synechococcus sp.NKBG15041cを宿主として用いた。結果、一般的に用いられているグラム陰性広域宿主プラスミドがこの宿主内で数コピーであるのに比べ、pEAは約20倍のコピー数保持されることが確認された。

RepA遺伝子の下流域を約260bp、さらに100bp削除したプラスミドをそれぞれ作成し、同様に藍藻宿主内での複製とコピー数を調べた。260bp欠失したプラスミドのコピー数は極端に減少し、これを保持する藍藻の生育もpEA保有藍藻に比べて著しく抑制された。このことより、260bp領域にはプラスミドの安定な複製に必要な領域が含まれていることが示唆された。しかしながら、他のプラスミドで安定な複製に必要であると報告されているような領域とのホモロジーは見られなかった。さらに100bp削除したプラスミド保有藍藻では生育とコピー数の若干の回復が見られたが、pEA保有藍藻には及ばなかった。この領域には複製に負に働く部位が含まれていると考えられた。RepA遺伝子の上流域には大腸菌のσ^<70>プロモタ-と相同性の高いプロモーター配列がみられた。そこでそのプロモーター領域(Prep)を分離し下流にレポーター遺伝子を導入しプロモーター活性を大腸菌で測定したところ、大腸菌内でも十分働くことが確認された。PrepとRepA、さらにその下流域の複製に安定な部位を含む領域はpSY10の複製最小領域であり、これらを含む組み換えプラスミドは今までにない高コピーベクターとして藍藻での外来遺伝子発現系に有用であることが示唆された。これらの研究成果は国内・海外の学会にて発表され、投稿論文の準備中である。浸透圧、特に塩濃度に応答してコピー数が変化するプラスミドpSY10の複製には、複製タンパク質をコードするrepA遺伝子とその下流領域に存在する複製を安定化する領域が必要であることを平成8年度に示した。平成9年度では、pSY10上のrepA遺伝子産物(RepA)がこの領域に結合することによって複製が調節されることを明らかにした。即ち、安定化領域には複製を負に制御する領域(m領域)と安定化する領域(p領域)が存在するが、RepAタンパク質がm領域に結合することによってpSY10は高コピー数で維持される。pSY10の複製領域を持つベクターを導入した海洋藍藻Synechococcus sp.NKBG15041cでは、海水・淡水の両条件下で、RepAタンパク質の結合がバンドシフトアッセイにて確認されたが、内在性pSY10を保有する海洋藍藻Synechococcus sp. NKBG042902では、海水条件下で培養したときのみ結合が確認された。RepAタンパク質がm領域および複製開始点に結合することにより複製が促進され、その結果、プラスミドのコピー数が高くなる。NKBG042902では、淡水条件下において、RepAタンパク質の発現量が少ないために、プラスミド複製の開始頻度が抑制されていることが示唆された。さらに、淡水条件下でのみRepAタンパク質の発現が抑制される要因を明らかにするために、淡水・海水条件下で、repA遺伝子のプロモーター領域に結合するタンパク質が存在するかを検討した。結果、淡水下条件でのみNKBG042902のゲノムより特異的に発現し、プロモーター領域に結合するタンパク質の存在が示唆された。このタンパク質の結合によって、プロモーター活性の抑制が、リポーター遺伝子の発現量を指標にした実験によっても確認された。
有機層状結晶のインターカレーションの計測とダイナミクス

本研究は、有機層状結晶のナノ極微空間における、ゲスト成分の可逆的な吸着・脱離反応を調べ、これに伴うホスト分子集団のダイナミクスや結晶の形態変化を明らかにすることを目的としている。これまでに我々の研究グループは、ステロイドやサイコロ型超分子の層状結晶などで、可逆的インターカレーション現象が観測されることを見出している。これらの研究を基にして、結晶構造と反応との相関関係を調べ、ホスト分子とゲスト分子の動きが極微空間をいかに変動させるか、この変動に伴ってマクロの結晶がどのような形態変化を起こすかを検討する。以下に得られた結果を列挙する1.昨年に引き続き有機塩の層状結晶について、有用な包接ホストとなるかスクリーニングを行った。またホスト側への機能の付与を目的のため、酸性成分として機能性有機色素であるアゾベンゼン系スルホン酸、塩基性成分として種々の第一級アミンを用いた有機塩についてもスクリーニングを行い、有効なナノサイズのチャネル空間を持つゼオライト状の結晶を得た。2.得られた有機ゼオライト状結晶を用いてゲスト分子の吸着、脱離実験を行った。、この一連の操作において、結晶の形態および結晶構造がダイナミックに変化し、変化に伴い結晶のさらに色が変調するものを見出した。この色調変化は吸着するゲスト分子によって変化する。この変化について計算科学的手法を用いて詳細な検討を行った。3.また蛍光物質を用いた有機層状結晶ではゲスト分子のインターカレーションに応じて結晶の微細構造が変化し、それに応じて蛍光発光色が変化させることに成功した。この変化は固体発光では稀なアントラセンのエキシマー発光とモノマー発光の間でのスイッチングであることが明らかとなった。4.最後に本研究の総括を行なった。以下に得られた結果を列挙する1.ステロイドや有機塩の層状結晶について、有用な包接ホストとなるかスクリーニングを行った。またホスト側への機能の付与を目的のため、酸性成分として機能性有機色素であるアゾベンゼン系スルホン酸、塩基性成分として種々の第一級アミンを用いた有機塩についてもスクリーニングを行った。これらの有機塩を様々な有機溶媒から結晶化させ、単結晶X線構造解析により明らかにした。2.包接ゲストの吸着脱離反応について時間分解的な検討を行い、DSC、TG-DTAを用いた熱分析を行い、包接現象の選択性について知見を得た。非常に短時間の間にゲスト交換が進行していることが明らかとなった。このような結果は極めて珍しく、興味深い。3.デジタルマイクロスコープを用いて微小結晶の形態変化及び光学的変化について観察を行ったところ、形態的変化は起こっていないことが明らかとなった。4.また有機色素を用いた系では構造的および色調変化をともなってゲスト分子の吸着・脱離が行われていることが明らかとなった。
中国ショー話の記述的研究

平成30年度は、中国江西省武寧県、吉安市、資渓県、信豊県、広東省梅州市などのショー族が住む村へ赴き、ショー話の調査を実施しデータを収集した。調査の目的は主にショー話の音韻体系を分析するためであることから、一、約1500の漢字音の調査、二、同音字表作成及び確認、三、基本語彙収集、を現地調査で行った。漢字音の調査中は、基本語彙表を参考に漢字音調査表を適宜調整し一部補充した。それゆえ今回のショー話の漢字音調査ではより多くのショー話漢字音を収集したと確信している。ショー話のアクセント及び音声をpraatを使用して分析を行った。ショー族の村は江西省、広東省、福建省など山岳地帯の交通不便な地域に点在しているにもかかわらず、どこのショー話にも音韻的、音声的に共通した特徴が見らえるが、今回の調査でショー話の第一音節以外の音節を強く発音する多音節アクセントも共通していることを確認した。調査を実施した広東省博羅県酥醪村は山岳地帯の孤立した村で、隣村はわずか3キロしか離れていないショー族の村1つしかないところにあり、酥醪の言葉は調査されていない未知の言語であった。調査の結果、酥醪村の言葉はショー族の言葉ではなかったが、声母とアクセントがショー族の言葉と共通していることを発見し、ショー話のアクセントは中国南方地方のプロトタイプ的なものだということがわかった。江西省ショー族の「ゆりかご」と言われている信豊県のショー族球獅村の言葉も今まで調査されていなかった。調査の結果、球獅ショー族の言葉は客家方言であることが判明したが、少数の語彙と音韻・音声的にショー話と若干共通した点が見られた。その結果をまとめた論文を中国の研究機関に投稿し発表した(「信豊県正平鎮球獅客家話的音韻特点」(『客家方言調査研究』、pp.117-pp.131、2018年、中山大学出版社)。平成30年度は、数ヶ所のショー族の村(福建省、江西省、広東省)に行き、筆者が作成した同音字表の内容を確認をした。それゆえ、より正確なショー族の音韻体系を把握できるようになった。広東省の調査では中国中山大学中文系の協力と助言を得たおかげで、調査を順調に進めることができた。しかし、大部分の村での調査は順調であったが、江西省の吉安市と資渓県の2つの村での調査は困難をきわめた。それは調査前に連絡した被調査者2名が今年度の調査前に他界したため、新たに被調査者を探すことになったからである。数年前に会った被調査者のショー話は周辺の漢語方言の影響をあまり受けていない言葉であったが、今回の調査で新たにお願いした非調査者2名の言葉は、周辺の漢語方言と中国の共通語(普通話)の影響をかなり受けていたことから、彼らの言葉からショー話の音声・音韻的特徴を探すのに苦労した。吉安ショー話と資渓ショー話は再調査が必要である。平成30年度は江西省を中心にショー話の漢字音の調査を実施し、同音字表をまとめた。令和元年からは、語彙調査を実施するだけでなく、残りの浙江省と福建省のショー族の村も調査し、同音字表をまとめ語彙表のデータを収集する予定である。調査結果をまとめ、研究会・学会等で報告を行う。調査後データがまとまり次第、ショー話の研究成果を上梓する予定である。

その結果をまとめた論文を中国の研究機関に投稿し発表した(「信豊県正平鎮球獅客家話的音韻特点」(『客家方言調査研究』、pp.117-pp.131、2018年、中山大学出版社)。平成30年度は、数ヶ所のショー族の村(福建省、江西省、広東省)に行き、筆者が作成した同音字表の内容を確認をした。それゆえ、より正確なショー族の音韻体系を把握できるようになった。広東省の調査では中国中山大学中文系の協力と助言を得たおかげで、調査を順調に進めることができた。しかし、大部分の村での調査は順調であったが、江西省の吉安市と資渓県の2つの村での調査は困難をきわめた。それは調査前に連絡した被調査者2名が今年度の調査前に他界したため、新たに被調査者を探すことになったからである。数年前に会った被調査者のショー話は周辺の漢語方言の影響をあまり受けていない言葉であったが、今回の調査で新たにお願いした非調査者2名の言葉は、周辺の漢語方言と中国の共通語(普通話)の影響をかなり受けていたことから、彼らの言葉からショー話の音声・音韻的特徴を探すのに苦労した。吉安ショー話と資渓ショー話は再調査が必要である。平成30年度は江西省を中心にショー話の漢字音の調査を実施し、同音字表をまとめた。令和元年からは、語彙調査を実施するだけでなく、残りの浙江省と福建省のショー族の村も調査し、同音字表をまとめ語彙表のデータを収集する予定である。調査結果をまとめ、研究会・学会等で報告を行う。調査後データがまとまり次第、ショー話の研究成果を上梓する予定である。
凍害を受けた表層部コンクリートの品質に関する研究

1.表層部コンクリートの強度について表層部コンクリートの強度に及ぼす内的要因として取り上げた、材料や配合、表層部の緻密化を図るための透水シートを使用して、表層強度測定用の埋め込み鋼片の深さを変化させながら、これらについて表層強度を測定した。コンクリートの表層強度は、材料(セメント種類や骨材寸法)、水セメント比によって変化することや表面からの深さ別で表層強度の値が異なることを明らかにした。また、透水シートを用いることによって型枠側コンクリート表層部の余剰水が排出され、水セメント比が低下し、表層強度が大きく増加することやコンクリート表面の気泡が減少して美観が向上することなどを明らかにした。2.凍害を受けた表層部コンクリートの強度と品質について凍害を受けた表層部コンクリートの強度変化性状について知るため、ASTM C-666 B法に準じて凍結融解試験を行い、コンクリート表面から深さ別での表層強度を測定し、凍結融解に対する抵抗性について明らかにした。(1)長期材齢では潜在水硬性によって強度増進のある高炉セメントを用いたり、透水シートを用いてコンクリート表層部の余剰水を排出させて水セメント比を小さくすることにより、凍害による強度の低下割合を抑えることができることなどを明らかにした。(2)凍害を受けたコンクリートの表層強度は、表面に近いほど、凍害を受ける前の基準コンクリートの表層強度に比べてその低下割合が大きく、凍害による表層部コンクリートの組織の弛緩は表面から内部に向かって進行していくことを実験的に明らかにした。以上のように、凍害を受けた表層部コンクリートの品質劣化は、表面から内部へと進行することを実験的に明らかにし、これらに対する抵抗性を向上させるためには、内的要因となる材料や配合の適切な選択や表層部の緻密化を図ることが重要であることなどを明らかにした。また、表層部コンクリートの品質を評価する上で、Pull-out試験は有用な試験方法の一つであることも示した。表層部コンクリートの品質特性を明らかにするため、研究計画に基づいて実験・研究を実施し、次のような知見を得た。1.表層部コンクリートの強度表層部コンクリートの強度に及ぼす内的要因として取り上げた、材料・配合、表層部の緻密化を図るための透水シートを使用し、表層強度測定用の埋込み鋼片の深さを変化させながら、これらについて表層強度を測定した。コンクリートの表層強度は、骨材寸法、水セメント比によって変化する事や表面からの深さ別で大きく表層強度が変化する事を明らかにした。また、透水シートを用いることにより、型枠側コンクリート表面の余剰水が排出されて水セメント比が低下し、コンクリート表面の気泡が減少して美観が向上するだけでなく、表層強度が大きく増加する事などを明らかにした。2.凍害を受けたコンクリートの強度凍害を受けた表層部コンクリートの強度変化性状について知るため、ASTM:C-666 B法に準じて凍結融解試験を実施し、コンクリート表面からの深さ別による表層強度の凍結融解抵抗性について明らかにした。(1)凍害を受けたコンクリートの表層強度は、表面に近いほど、基準コンクリートの表層強度に比べてその低下割合が大きく、凍害によるコンクリート表層部組織の弛緩が表面から進行していくことを実験的に明らかにした。(2)透水シートを用いて余剰水を排出させたり、コンクリートの配合における水セメント比を小さくする事によって、凍害による強度の低下割合を抑えることができることを明らかにした。

以上のように、凍害を受けた表層部コンクリートの劣化は、表面から内部へと進行することを実験的に明らかにし、これらに対する抵抗性を向上させるためには、表層部の緻密化を図る事やコンクリートの内的要因である配合が重要である事を明らかにした。凍害を受けた表層部コンクリートの品質特性を明らかにするため、研究計画書に基づいて実験・研究を進め、次のような知見を得た。1.表層部コンクリートの強度について表層部コンクリートの強度に及ぼす内的要因として取り上げた、材料や配合、表層部の緻密化を図るための透水シートを使用して、表層強度測定用の埋め込み鋼片の深さを変化させながら、これらについて表層強度を測定した。コンクリートの表層強度は、材料(セメント種類や骨材寸法)、水セメント比によって変化することや表面からの深さ別で表層強度の値が異なることを明らかにした。また、透水シートを用いることによって型枠側コンクリート表層部の余剰水が排出され、水セメント比が低下し、表層強度が大きく増加することやコンクリート表面の気泡が減少して美観が向上することなどを明らかにした。2.凍害を受けた表層部コンクリートの強度と品質について凍害を受けた表層部コンクリートの強度変化性状について知るため、ASTM C-666 B法に準じて凍結融解試験を行い、コンクリート表面からの深さ別での表層強度を測定し、凍結融解に対する抵抗性について明らかにした。(1)長期材齢では潜在水硬性によって強度増進のある高炉セメントを用いたり、透水シートを用いてコンクリート表層部の余剰水を排出させて水セメント比を小さくすることにより、凍害による強度の低下割合を抑えることができることなどを明らかにした。(2)凍害を受けたコンクリートの表層強度は、表面に近いほど、凍害を受ける前の基準コンクリートの表層強度に比べてその低下割合が大きく、凍害による表層部コンクリートの組織の弛緩は表面から内部に向かって進行していくことを実験的に明らかにした。以上のように、凍害を受けた表層部コンクリートの品質劣化は、表面から内部へと進行することを実験的に明らかにし、これらに対する抵抗性を向上させるためには、内的要因となる材料や配合の適切な選択や表層部の緻密化を図ることが重要であることなどを明らかにした。
納得の医療のためのSDMに基づく小児アレルギー看護ガイドラインの開発

今日の医療では十分な説明と選択肢が保証された子ども・家族と医療チームとのshared decision making(SDM)によって、治療計画管理へのアドヒアランスが向上することが知られている。長期管理が必要なアレルギー疾患において、SDMに基づく看護実践は子どもと家族の納得の医療のために不可欠です。調査結果に基づき、子どもと家族への説明や教育の役割を担う機会の多い小児外来看護の重要ポイントをガイドラインにまとめた。日常の診療場面でSDMを促進するための看護実践ガイド25、アレルギー診療に携わる看護師に求められる前提条件3、SDM促進の実践ヒント集15で構成されたポケット版を作成できた。十分な説明と選択肢が保障された子ども・家族と医療チームとのShared Decision-making(SDM)によってアドヒアランスは向上する。SDMに基づく看護実践は、納得の医療のために不可欠であり、小児アレルギーの外来診療における子ども・家族と医療チームとのSDM実践に向け、看護職がどのように専門性を発揮しているか、質的内容分析から明らかにすることを研究目的とする。平成25年11月大学倫理審査承認(承認番号2013-0194)を受け、5タイプに分類した医療機関総数60か所に第1段階の調査協力依頼を行った。これまでに調査協力「承諾」の回答が得られた約20か所に対して、訪問調査の日程調整の結果、3月初旬から聴き取り調査を開始し、3月末時点で5か所への調査を実施した。なお、調査に先立ち、研究メンバー全員で小児アレルギー医療を専門的に行っている医療機関への視察訪問を実施した。現段階において、当初の想定通りに1外来診療に携わる医療専門職(医師・薬剤師・栄養士・外来看護師(小児アレルギーエデュケーターを含む)・病棟看護師・外来看護管理者および、2患者である子どもとご家族のすべてのバリエーションにおいて、面接を実施しデータ収集を行っている。面接データの総数は、1医療専門職(4職種)20名、2子どもとご家族のべ8組である。面接データの逐語録化も進めており、今後分析をすすめるところである。現在の課題としては、当初想定した5タイプの医療機関のうち、大学病院の調査協力施設が確保できていない点であるが、追加依頼を行う。医療機関別では、クリニックおよび専門病院等の中規模病院の協力が多かった。また、アレルギー疾患(気管支喘息・アトピー性皮膚炎・食物アレルギー)の偏りなく情報収集が進んでいる。平成26年度は前年度に行った第1段階面接調査(職種別・個人面接)のデータ分析を中心に行い、海外での成果発表を行った。また、個人調査結果から抽出された内容の補足・精選化を目的として、結果に基づき第2段階のFGI調査(2組)を実施した。分析結果から、看護師の専門性発揮の基礎となる「看護師の役割」に対する他職種の認識では、医師と薬剤師ではほぼ類似した5点が提示された。<子どもと家族の日常生活を把握し、変化に気づく><子どもと家族の情報を的確に提供する><子ども・家族に応じたコミュニケーションをとり医療者との間で仲介する><子どもと家族にしっかり伝える><不安を解消し安心させる>などであり、看護師に期待することは、<患者に近い位置での支援><専門的知識・技術・経験による判断能力><地域に活躍の場を広げる><専門的スタッフの育成><自己研鑚を続ける>などであった。一方、子ども・家族の面接では、外来看護師とのかかわりの経験として<医療処置を行うとき声をかけてもらう><体調を訊ねられる><関心を示すかかわり(直接診療とは関連しない関わり)><スキンケアの指導><受診の手続き的関わり>が示された一方で、<外来で看護師と話す機会がない>も多くの親子から語られた。さらに、看護師の専門性への期待として明確に語られた内容はほとんどなかった。しかし、ケアで嬉しかったこととして<関心を示すかかわり><子どもの成長を一緒に喜び見守る><不安なことにじっくり対応してくれる>など他職種からの期待に類似していた。質の高いコミュニケーションによって子どもと家族の生活や変化の状況を把握し、子どもと家族の理解と安心につながる説明やかかわり≒他職種との関係を補完する役割が期待されている。看護師も発揮役割として自負すると考えるが、現状では必ずしも十分に発揮されていないことが課題として確認された。子どもと家族が安心・安全な医療を納得して受けるため、子ども・家族と医療チームとのShared Decision-making (以下SDM)に基づく小児アレルギーケアガイドラインを開発することを目的とし、「SDMのための小児アレルギー看護ガイドライン試案」(対象の属性を含む100項目)を作成した。本試案を用いて、小児アレルギー外来をもつ医療施設に勤務する医師、看護師、および、Pediatric Allergy Educator(看護師・薬剤師・栄養士)を対象にデルファイ法(全3回)による無記名アンケート調査に着手し、第1回目デルファイ調査調査を開始した。なお、この試案は第1段階の研究(承認番号2013-0194)で、小児アレルギーの外来診療における看護職の実践や役割の現状を医師・薬剤師・栄養士等を含めた多職種への面接調査・フォーカスグループインタビューなど質的研究により多様な視点から、看護実践の重要な要素を抽出した。この質的研究に基づき、研究グループでSDMを促進するために必要なコア概念として「目標共有の為のコミュニケーション」「疾患と治療の理解」「セルフケア支援」「日常生活の把握」「意思決定支援」「役割認識と連携」の6つを見出し、重複概念/項目を整理し、93項目にまとめた。

専門職のデルファイ法による無記名アンケート調査によりガイドライン項目を精選し、SDMに基づく納得の医療を創る看護実践のコアとなる要素として一定のコンセンサスを得たケアガイドライン案にまとめる。本ガイドライン試案は、1SDMに基づく小児アレルギー看護共通項目、および2アレルギー3疾患別看護(気管支喘息・アトピー性皮膚炎・食物アレルギー)項目により構成されたものである。研究代表者は、期間中にリーディング大学院プログラム執行委員に就任、ならびに、副学科長(平成27年度&#12316;)を拝命するなど、予測し得なかった本務にも従事することとなった。そのため、業務多忙により本研究に十分な時間を割くことが難しくなった。さらに、本研究第1段階の面接調査データの質的分析に時間を要したことから、第2段階のデルファイ調査用質問紙作成が遅れてしまった。そのため、予定していたデルファイ調査(全3回)を期間までに終了することができなくなった。しかしながら、平成27年12月には質問紙調査原案を完成させ、平成28年3月にはデルファイ調査の第1回目に着手することができた。したがって、今年度中には予定のデルファイ調査(全3回)を終了し、納得のためのSDMに基づく小児アレルギー看護ガイドライン(案)を完成できる見込みである。【目的】小児アレルギー疾患は治療ガイドライン(以下GL)が整備され、治療の中心は外来にシフトしている。十分な説明と選択肢を保障した子ども・家族と医療チームとのShared Decision-making (SDM)では治療へのアドヒアランスが向上する。外来での医師による十分な説明は困難な現状にあり、質の高い看護実践が求められる。子どもと家族が安心・安全な医療を納得して受けるようSDMに基づいた看護実践GLを開発することを目的とした。【方法】第1段階は多様な小児アレルギー医療機関で医師、看護師、薬剤師、栄養士、子どもと家族に調査し看護実践に必要な要素を質的に分析し93項目のGL試案を作成した。第2段階では属性7+93の計100項目に4段階で同意の程度を訊ねる紙媒体・Web併用デルファイ調査を実施した。初回依頼は小児アレルギー診療施設778から360をランダム抽出して郵送した。さらに、アレルギー関連学会や専門医有志等のMLを通して依頼した。分析は同意率による項目精選とPAE到達目標や家族支援の意思決定試案の枠組みによる質的検討を併用した。大学倫理審査承認(承認番号2015-0464)を受け実施した。【結果】GL試案93項目は、目標共有のためのコミュニケーション、疾患と治療の理解、セルフケア支援、日常生活の様子、意思決定支援、役割認識と連携の6下位概念で構成された。第1回調査回答数176件中、SDMを促進するうえで求められる看護ケアとしての同意率90%未満の項目は6/93項目、非常にそう思うの回答率40%未満は12/93項目中(共通11,AD1)あり、これを除外した81項目で第2回目調査を行った(回答126件)。
新腫瘍マーカーグルタチオンS-転移酵素P型の基礎的,臨床的研究

ラット肝化学発癌過程で前癌病変の良いマーカーとして同定されたダルタチオンS-転移酵素P型(GST-P)およびこれと免疫学的性質などで関連性のあるヒト胎盤型GST-πの腫瘍マーカーとしての諸性質を検討して以下の成績を得た。1.GST-Pについて。抗GST-P兎抗体を用いた免疫学的定量法や免疫組織化学的方法により、多くのラット肝化学発癌剤によって誘発される肝前癌病変巣はGST-P陽性単一細胞またはミニ巣として極めて早期(DENなどでは一週以内、FAA,3'-Me-DABでは34週後)から検出可能で、感度、特異性において従来の前癌マーカー酵素よりはるかに優れていることが確認されたが、非突然変異性肝発癌剤の一部、例えばクロフィブレートではGST-P陽性巣が誘発されないことが判明した。また硝酸鉛1回(100μmol/kg)投与後数日にして肝小葉全体にGST-Pが誘導されることが新たに認められ、遺伝子発現機構解明上注目された。われわれのGST-P抗体は国内外でラット、ハムスター肝(膵)化学発癌過程の解析に、発癌剤、発癌修飾因子の検索に広く活用されつゝある。2.GST-πについて。ヒトGST-πは蛋白化学的にはラットGST-Pと異なるが免疫学的共通抗原性を有し、特にN末端のホモロジーが高い。GST-π兎抗体を用いた免疫組織学的方法(ABC,PAP法)でGST-πは分化型肝癌の一部,食道癌,胃癌と膵臓癌(ともに粘液癌を除く),大腸腺腫および癌,子宮頸部異型上皮および癌,乳癌,皮膚癌(ページェット細胞,有棘細胞癌,悪性黒色腫)などに種々の程度に細胞質のみならず核質にも発現することが認められた。定量的には、食道癌,大腸癌,子宮頸部癌でそれぞれ正常部分の約10倍上昇していた。担癌患者血清中のGST-π量は、ELISA法で正常のcut off値を3.7mg/mlとすると、胃癌,食道癌の3050%に510倍の上昇が認められ、予後や再発のモニターとして役立つことが示唆された。
高迎角物体まわりの剥離流の曳航実験による研究

走行装置を用いて、いわゆる曳航風洞のPIV計測と四塩化チタンによる可視化を行い放物-円柱体については,迎角40°以上の軸対称放物体の剥離渦について、主渦の周りに渦管のループが等間隔で並ぶ「渦ループ構造」を確認することができた。渦ループ構造は一次渦と二次渦の相互干渉からCrow不安定性によって形成された渦がせん断層を変形させ主渦に巻き込まれることによって形成されるといえる。球頭円柱については,頭部の剥離:キャップ渦に阻まれながらも渦ループは弱いながら生じている。頭部が放物曲面の鈍頭円柱まわりの流れについて、広い範囲のReynoldss数や30度以上の高迎角のもとで実験とシミュレーションを行い剥離線から伴流渦(物体直径の数倍下流)までの流れの構造、特に主渦まわりのせん断層と乱流の寄与を剥離特性を解明するしつつ、曳航(チャンバー)風洞での実験の優位点を見出す予定であったが部分的に達成した。より高速が可能な曳航風洞の作成にはアクチュエーターの納入が秋になったが、新アクチュエーターにより模型移動速度を1.5[m/S]から3[m/S]に上げたが模型本体を使っての計測=本格的画像計測は開始できていない。曳航風洞準備で時間が掛かっていためで併行して、成果に寄与するデータのため後退平板翼背後に形成される剥離渦を,翼に平行断面と垂直断面についてPIV計測を行った。翼に垂直な断面についてのPIV計測からは,渦度の等高線図により,渦の間隔は平板傾斜角に依存性が無く,後退角0°の場合とほぼ差が無いことが分かった.また,巽に平行な断面については、スパン方向に伸びる渦軸と渦軸に直行する新たな渦のPIV計測を行うことに成功した(飛行機シンポジウムで発表済).鈍頭円柱模型の結果と比較することにより,渦ループ構造の発生メカニズムの解明に寄与すると期待される.Navier-Stokes方程式の差分解法で渦領域の数値解を得ることについて,2009年3月現在は層流計算であるがノーズより後部は乱流モデルの適用が必要であることが渦ループ構造可視化で確認できている。頭部が放物曲面の鈍頭円柱まわりの流れについて、広い範囲のReynolds数や30度以上の高迎角のもとで実験とシミュレーションを行い剥離線から伴流渦(物体直径の数倍下流)までの流れの構造、特に主渦まわりのせん断層と乱流の寄与を剥離特性を解明するしつつ、曳航(チャンバー)風洞での実験の優位点を見出す作業を開始した。より高速が可能な曳航風洞の作成できた2008年秋以降、1年半になったが、新アクチュエーターにより模型移動速度を1.5[m/s]から3[m/s]に上げたが模型本体を使っての計測=本格的画像計測は開始され画像速度計測のデータがある程度得られた。曳航風洞渦のPIV計測を行うことに成功した(成果は3rd International Symposium on Bifurcations and Instabilities in Fluid Dynamics,および6th International Symposium on Turbulence, Heatand Mass Transferにおいて発表した).鈍頭円柱模型の結果と比較することにより,渦ループ構造の発生因として,当初有力したケルビンヘルムホルツ不安定よりCrow不安定が有力という指摘の立証に寄与すると期待される.Navier-Stokes方程式の差分解法で渦領域の数値解を得ることについて,2010年3月は時点で用いているのは層流計算であるがノーズより後部は乱流モデルの適用が必要であることが渦ループ構造可視化で確認できている。頭部が半球の鈍頭円柱まわりの流れについて、広い範囲のReynolds数や30度以上の高迎角のもとで実験とシミュレーションを行い剥離線から伴流渦(物体直径の数倍下流)までの流れの構造、特に主渦まわりのせん断層と乱流の寄与を剥離特性を解明しつつ、曳航(チャンバー)風洞での実験の優位点を見出す作業を開始した。より高速が可能な新アクチュエーターにより模型移動速度を3[m/s]に保って球頭円柱を使っての計測=本格的画像計測が開始され画像速度計測のデータがある程度得られた。曳航風洞での渦のPIV計測を行うことに成功した(成果は8th Euromech Fluid Mechanics Conferenceおよび27th International Congress of the Aeronautical Seiencesにおいて発表した).放物ノーズ円柱模型の結果と比較することにより,新たに試みた球頭円柱ではノーズ剥離が明確に強く発生してより下流での軸方向速度が小さくなるためか、渦ループは発生範囲も狭く主渦を回り込むほど持続しなかった。

これらのことは渦ループ構造の発生因として,Crow不安定が有力という指摘の立証に寄与すると期待される.Navier-Stokes方程式の差分解法で渦領域の数値解を得ることについて,2011年1月時点で用いているのは層流計算であるが渦ループ構造において渦間隔の予測は良好であるが、渦がその間隔を保って後部へ進行することの予測にまでには至ってないことが確認できている。
脊椎動物の陸上進出による新奇形質の誕生―環境変化により揺らぐ形態形成経路に迫る―

脊椎動物は陸上への進出に伴い、高濃度の酸素環境に曝されることとなった。本研究では、上陸に伴う酸化ストレスによって、新奇形質を生み出した形態形成プロセスの揺らぎの解明を目指す。羊膜類の四肢の形成過程では、指間領域の細胞が細胞死によって取り除かれ、指が分離する。一方、両生類アフリカツメガエル幼生の肢芽では、指間細胞死のシステムが確立しておらず、それぞれの指が伸長することによって分離する。このことから、指間細胞死は、脊椎動物が進化の過程で新しく獲得した形質であると考えられている。本研究では各種脊椎動物をモデルに、酸化ストレスによってのみ指間細胞死という新奇形質が出現する系を用いて、四肢の形態形成プロセスの揺らぎを検出し、その分子機構に迫ることで、脊椎動物の上陸に伴う環境変化が新奇形質を生み出す原理を明らかにすることを目的とする。2018年度は、環境酸素濃度によって大きく揺らぎ、生体内にROSを大量に産生させうると考えられる経路のうち、(1)グルコース代謝の揺らぎが、新奇形質を獲得させた可能性を検証した。この目的で、指間領域のメタボローム解析や、肢芽におけるグルコース代謝関連遺伝子の発現解析、及びグルコース代謝が細胞死に与える影響の検証を行った。その結果、肢芽の発生過程では、細胞増殖期から指間細胞死期を通して、酸化的リン酸化によるグルコース代謝が行われていることが明らかとなった。そこで、当初の計画に加えて、(2)血管形成との関連性についての検証も始めることとした。まず、ニワトリ胚を用いて、指間における血管形成段階とROSと細胞死の関係を経時的に検証したところ、血管リモデリングがおこる場所で順番に指間でのROSレベルがあがり、細胞死が引き起こされることが明らかとなった。研究計画では、2018年度は、(1)高濃度酸素環境に曝されたことにより、代謝経路が好気的リン酸化経路に切り替わり、ROSを大量に産生することになった可能性の検証のみを行う予定であったが、計画書にあったメタボローム解析、遺伝子発現解析等の研究をすべて行った上で、肢芽の発生過程では、細胞増殖期から指間細胞死期を通して、酸化的リン酸化によるグルコース代謝が行われており、代謝の切り替えは起こっていないことを明らかとした。そこで、当初の計画に加えて、(2)血管形成との関連性についての検証も始め、血管リモデリングがおこる場所でROSレベルがあがり、細胞死が引き起こされることを明らかにした。これらのことから、当初の計画以上に進展していると判断した。2018年度までに、(1)グルコース代謝経路との関連性について明らかにしたので、2019年度は、(2)血管形成との関連性について、さらに検証する。これまでの研究から、指間細胞死が検出される領域では血管網が発達していること、さらに人為的な血管網の発達により指間細胞死を誘発できることを確認している。また、脊椎動物が高濃度酸素に曝されることと指間領域の血管網の発達との関連性、さらに、血管網の発達がROSの産生を促す機構も不明であった。2019年度は、これらの点を明らかにする目的で、1酸化ストレスと指間領域における血管形成の関連の検証、及び2指間領域における血管形成期にROSの産生を促すソースの探索を行う。これらの研究により、環境変化が四肢形成過程のどの経路の揺らぎに働き、指間細胞死という新しい形質を生み出し得たのか、その進化原理を明らかにする。

研究計画では、2018年度は、(1)高濃度酸素環境に曝されたことにより、代謝経路が好気的リン酸化経路に切り替わり、ROSを大量に産生することになった可能性の検証のみを行う予定であったが、計画書にあったメタボローム解析、遺伝子発現解析等の研究をすべて行った上で、肢芽の発生過程では、細胞増殖期から指間細胞死期を通して、酸化的リン酸化によるグルコース代謝が行われており、代謝の切り替えは起こっていないことを明らかとした。そこで、当初の計画に加えて、(2)血管形成との関連性についての検証も始め、血管リモデリングがおこる場所でROSレベルがあがり、細胞死が引き起こされることを明らかにした。これらのことから、当初の計画以上に進展していると判断した。2018年度までに、(1)グルコース代謝経路との関連性について明らかにしたので、2019年度は、(2)血管形成との関連性について、さらに検証する。これまでの研究から、指間細胞死が検出される領域では血管網が発達していること、さらに人為的な血管網の発達により指間細胞死を誘発できることを確認している。また、脊椎動物が高濃度酸素に曝されることと指間領域の血管網の発達との関連性、さらに、血管網の発達がROSの産生を促す機構も不明であった。2019年度は、これらの点を明らかにする目的で、1酸化ストレスと指間領域における血管形成の関連の検証、及び2指間領域における血管形成期にROSの産生を促すソースの探索を行う。これらの研究により、環境変化が四肢形成過程のどの経路の揺らぎに働き、指間細胞死という新しい形質を生み出し得たのか、その進化原理を明らかにする。
不活性ガスを含む泡消火法に関する研究

ハロン系消火剤に代わる新消火法の確立とその設備開発が急務となっている。本研究は火炎基部からの空気の流入を絶つことが消火に極めて有効との考えから、水生の気泡内に不活性ガスを閉じ込めて、これを火炎基部に集中させることで安全かつ効率的な消火を実現させることを目的としている。以上の状況を踏まえて、平成11年度は不活性ガスを含む水性気泡消火実験装置を製作し,不活性ガスの種類、水流量およびガス流量をいろいろ変えて消火実験を行い、最適な消火条件についての検討を行った.平成12年度は直径20cmの液体プール火災を対象に、界面活性剤を含む水と消火ガス(窒素、二酸化炭素、イナージェンガスおよび比較のための空気)を混合して泡ヘッドより火炎に噴射し、消火までの時間とその様子を高速度ビデオで詳細に観察し,消炎の機構に着いて検討を行った。以上の結果、以下の知見を得た。1)ガス流量一定の条件での消火時間は液流量の増加とともに減少するが、ある流量以上で一定になる。2)液流量一定の条件での消火時間はガス流量の増加とともに減少するが、あるガス流量以上で一定となる。3)上記の1)と2)から、消火時間が最小となる最適な水流量とガス流量が存在する。3)気泡内の不活性ガスとしては二酸化炭素が最も消火時間が短く、消火の効率が高い。4)本実験での二酸化炭素のみでの消炎濃度が約24%であるのに対して、泡消火による二酸化炭素の消炎濃度は25%に減少する。5)泡が火炎に近づくと崩壊して,内部の不活性ガスがおよそ0.30.5m/sの速度で火炎面に流入する.不活性ガスの流入により火炎は後退し消火に至る.以上のことから、不活性ガスを含む泡消火法は不活性ガスのみの消火に比べ消炎濃度を大幅に下げることが可能で、人体への安全性が向上することが確認された。本研究で得られた成果を基本にして,平成13年度からガスフォーム消火装置の製品開発が民間企業との共同研究として開始することになった.ハロン系消火剤に代わる新消火法の確立とその設備開発が急務となっている。以上の状況を踏まえて、平成11年度は1.不活性ガスを含む水性気泡消火実験装置を製作する、2.不活性ガスの種類、水流量およびガス流量をいろいろ変えて消火実験を行い、最適な消火条件を見出す、の2項について研究を遂行した。消火実験は直径20cmの液体プール火災を対象に、界面活性剤を含む水と消火ガス(窒素、二酸化炭素、イナージェンガスおよび比較のための空気)を混合して泡ヘッドより火災に噴射し、消火までの時間とその様子を高速度ビデオで観察した。

4)本実験での二酸化炭素のみでの消火濃度が約24%であるのに対して、泡消火による二酸化炭素の消火濃度は25%に減少する。以上のことから、不活性ガスを含む泡消火法は不活性ガスのみの消火に比べ、消火濃度を大幅に下げることが可能で、人体への安全性が向上することが確認された。次年度は消火の機構について検討を行う。ハロン系消火剤に代わる新消火法の確立とその設備開発が急務となっている。本研究は火炎基部からの空気の流入を絶つことが消火に極めて有効との考えから、水生の気泡内に不活性ガスを閉じ込めて、これを火炎基部に集中させることで安全かつ効率的な消火を実現させることを目的としている。以上の状況を踏まえて、平成11年度は不活性ガスを含む水性気泡消火実験装置を製作し,不活性ガスの種類、水流量およびガス流量をいろいろ変えて消火実験を行い、最適な消火条件についての検討を行った.平成12年度は直径20cmの液体プール火災を対象に、界面活性剤を含む水と消火ガス(窒素、二酸化炭素、イナージェンガスおよび比較のための空気)を混合して泡ヘッドより火炎に噴射し、消火までの時間とその様子を高速度ビデオで詳細に観察し,消炎の機構に着いて検討を行った。以上の結果、以下の知見を得た。1)ガス流量一定の条件での消火時間は液流量の増加とともに減少するが、ある流量以上で一定になる。2)液流量一定の条件での消火時間はガス流量の増加とともに減少するが、あるガス流量以上で一定となる。3)上記の1)と2)から、消火時間が最小となる最適な水流量とガス流量が存在する。3)気泡内の不活性ガスとしては二酸化炭素が最も消火時間が短く、消火の効率が高い。4)本実験での二酸化炭素のみでの消炎濃度が約24%であるのに対して、泡消火による二酸化炭素の消炎濃度は25%に減少する。5)泡が火炎に近づくと崩壊して,内部の不活性ガスがおよそ0.30.5m/sの速度で火炎面に流入する.不活性ガスの流入により火炎は後退し消火に至る.以上のことから、不活性ガスを含む泡消火法は不活性ガスのみの消火に比べ、消炎濃度を大幅に下げることが可能で、人体への安全性が向上することが確認された。本研究で得られた成果を基本にして,平成13年度からガスフォーム消火装置の製品開発が民間企業との共同研究として開始することになった.
小胞体トランスロコンでのタンパク質輸送の一分子解析

真核細胞の小胞体のトランスロコンで進行するタンパク質の膜透過は、生命現象の基本的事象の一つである。本研究では、トランスロコンのチャネル内でのタンパク質のポリペプチド鎖の動きを一分子レベルで観察することに挑戦した。トランスロコン内の動きを同調的に追跡する実験系を確立し、ポリペプチド鎖上に存在する2ー3残基の正荷電アミノ酸残基によって動きが著しく減速することを実証した。真核細胞で作られる大半の膜タンパク質の膜組み込みと、全ての分泌タンパク質の膜透過は、小胞体にある『トランスロコン』と呼ばれるタンパク質膜透過チャネルによって行われる。小胞体トランスロコンにおけるポリペプチド鎖輸送の駆動機構、動きの制御、膜タンパク質の膜内配向形成機構、などを理解するために、本研究では、これらのトランスロコン機能を、無細胞系で再現し、ポリペプチド鎖一分子レベルで観測することによって、物理原理にせまることを目的とした。そのため、無細胞系での同調的機能解析系の整備に重点をおいた。(1) streptavidin bindingpeptide tag(SBP-tag)を有するポリペプチド鎖を無細胞系で合成し、トランスロコンの存在する粗面小胞体膜に移行させ、streptavidinとの結合によって膜透過時の動きを一時的に抑制し、biotinによって同調的に透過を開始させることに成功した。(2)その動きは、膜脂質に存在するコレステロールによって多面的に大きく影響されることを見出した。(3)リボソームからポリペプチド鎖をピューロマイシンによって解離させることで同調的に透過を開始させる観察系も設定できた。その際、リボソームでの終止コドンの作用が下流の配列に依存することを見出した。(4)整備された実験系を使って、ポリペプチド鎖の動きを秒単位の時間分解能で解析することが可能になった。これで、ポリペプチド鎖上に存在する2ー3残基の正荷電アミノ酸残基によって動きが著しく遅くなること、疎水性アミノ酸残基はある閾値以上の数で協調的に作用すること、などを見出した。この実験系でのポリペプチド鎖の蛍光ラベルを検討した。最適化には至っていないが、一分子観察につながる成果を得た。小胞体トランスロコンを通した新生ポリペプチド鎖輸送の一分子観察を目指して、実験系の設定を進め下記の成果を得た。【1】イヌ膵臓より調製した粗面小胞体を添加した、タンパク質合成・膜透過無細胞実験系を効率化した。【2】無細胞実験系によって、小胞体トランスロコンでの新生ポリペプチド鎖の膜透過に対して、コレステロールが多面的な阻害作用を示すことを明らかにした。リン脂質二重層に存在するコレステロールはシグナル配列によるトランスロコン標的化を部分的に抑制するばかりではなく、リボソームが小胞体に標的化した後にもトランスロコンでの正電荷の動きを抑制することを見出した。逆にポリペプチド鎖上の疎水性配列は動きが促進された。疎水性配列に対する動き促進作用は、コレステロールによるトランスロコンチャネルの横方向への開放の阻害と考えられた。一分子解析系の膜成分の最適化およびトランスロコンの機能調整機構について重要な知見である。【3】小胞体でのタンパク質膜透過に対して、負電荷リン脂質であるフォスファチジルセリン結合タンパク質ラクトアドヘリンが阻害作用を示すことを見出した。【4】小胞体におけるポリペプチド鎖の動きを解析する中で、膜結合リボソームが新生鎖を迅速に遊離するためには、伝令RNAの終止コドンの後方に10塩基以上のRNA配列が必要であることを明らかにした。無細胞タンパク質合成系の合成効率を向上させ、コレステロール組成の効果を発見し、リボソームの作用に必要な伝令RNAの非翻訳領域の寄与を明らかにした。一方、一分子観察に必要な、新生ポリペプチド鎖の蛍光ラベル系の構築にまで到達できていない。蛍光ラベル産物の検出に不可欠な高感度検出装置が稼動し始めたが、蛍光ラベルを有する非天然アミノ酸を結合したtRNAの作成方策の策定に時間を要している。蛍光ラベルされた非天然アミノ酸を有するtRNAの作成に集中的に取り組み、SDS-電気泳動後に蛍光分析装置で検出可能な量の新生鎖の合成条件を設定する。さらに、溶液条件とエバネッセント蛍光顕微鏡による固定場条件での検出条件を最適化する。さらに、小胞体でのポリペプチド鎖の輸送駆動要因解明に向けて小胞体内腔因子の同定と、一分子観察系による機能解析を目指す。無細胞タンパク質合成・膜透過実験、蛍光ラベルアミノ酸-tRNAの合成条件至適化のための物品の購入に充てる。