hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規PAM類似体の脳内活性に関する検討

また、従来から用いてきた麻酔薬が現在は推奨されていないことから、これに替わる三種混合麻酔薬を用いた系とするために、本実験系における適正量、麻酔時間等の詳細を明らかにする必要があった。本年度は研究計画2年目である。確立した実験系に基づき、新規PAM類似体投与後の脳および血液を採取し、Acetylcholinesterase(AChE)活性測定系による解毒効果を調べた。すなわち、新たに設定した麻酔条件下で、新規合成したサリン類似体Isopropyl p-nitrophenylmethylphosphonate(INMP)を静脈投与し、急性中毒症状を確認後、硫酸アトロピンおよび新規解毒剤候補4-[(Hydroxyimino)methyl]-1-octylpyridinium bromide(4-PAO)を静脈より連続投与。その後、安楽死させ、脳および血液試料を採取し、脳を中心にAChE活性の測定を行い、解毒効果の有無を解析した。しかしながら、解析する中で、サンプル中に存在する4-PAOが基質である1,1-Dimethyl-4-acethylthiomethylpiperidinium iodide(MATP+)を直接分解している可能性が浮上した。AChE活性の測定には、Acetylthiocoline (ASCh)を基質として、5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid(DTNB)を用いたEllman法が古くから知られているが、Butyrylcholinesterase(BChE)とも反応することから、近年はBChEと反応しないAChE選択的基質であるMATP+が主に使われている。本研究でも、ASChが以前の研究でPyridinealdoxime methiodide (2-PAM)と反応することを確認していたことから、より特異性の高いMATP+を用いていた。そこで、これを明らかにするために、4-PAO自体を0-5mM最終濃度で反応させてみたところ、濃度依存的に活性が有意に上昇することを確認した。同様に2-PAMおよびDiacetylmonoxime(DAM)についても、濃度依存的に活性の有意な上昇を示した。このことから、Oxime類はMATP+と反応し、Oxime-MATP+AdductとDesacetylMATP+となっている可能性が高くなり、活性値の評価は慎重にされなければならないことが示唆された。昨年度確立した実験系に基づいて、サンプルの採取および解析を本格的に行った。静脈ラインの確保が予想以上に手間取り、予定していた動物実験を全てこなすことは困難であったが、最低限のデータを確保することはできた。また、活性測定系において、投与した新規解毒剤と基質とが反応している可能性が疑われ、その検証に時間を割かれることとなった。しかしながら、この発見はこれまでこの活性系を用いて研究してきた他の研究者にとっても重要な知見であり、すでに報告された活性値の評価にも大きく影響を与える可能性がある。したがって、今後は予定している計画に加え、生じた問題点についても詳細を明らかにする。
ナノデバイス応用に向けたカーボンナノチューブ自己複製成長法の研究

カーボンナノチューブ(CNT)のナノデバイス応用には特定構造を持った単層CNTを選択的に合成する手法の確立が必須である。本研究課題の究極的な目標は、予め特定の構造のみに分別したCNT成長核から同一構造のCNTを再成長(自己複製成長)する技術を開拓し、この問題を解決することにある。H23年度は、H22年度に引き続いて、結晶成長核(フラーレンC60)からの高効率CNT成長法の確立を進めた。フラーレンはCNT構造の一部(キャップ構造)と見なせる。フラーレンからのCNT成長はCNT自己複製成長と類似の過程で進行するため、CNT自己複製成長実現に向けた要素技術となる。さらに、ラマンスペクトルによるCNT成長の効率検証も容易である。昨年度に見出した条件をもとに、高効率成長を実現する指針を探索した結果、成長効率は炭素源ガス(エタノール、アセチレン)の組成や基板上でのフラーレン分子の会合状態に極めて敏感であることを見出した。炭素源ガスにおけるエタノール比率が高いほどCNT成長効率も向上する。しかも、フラーレンと同様に結晶性のナノ粒子であるナノダイヤモンドを成長核とした場合には全く逆の傾向が観測された。これらの結果を基に、成長最初期段階におけるキャップ構造形成と定常的なCNT成長段階におけるエッジ活性化の維持が成長効率を支配することを明らかにした。また、ポリマー状に凝集したフラーレンからCNTが著しく高効率に成長する現象も見出した。しかし、径分布の解析から、成長したCNTの径は1nmを超える場合が多く、自己複製成長と同様の様式でC60半球構造から成長した場合に期待される約0.7nmよりもはるかに太いことが判明した。これはフラーレン集合体がナノダイヤモンドと同様の固体成長核として機能するためと推定される。以上のように、自己複製成長によるCNT構造制御を高効率に行うためには、気相条件に加えて、会合状態の最適化が重要な要因であることを明らかにした。本研究課題の目標は、この問題を解決する技術として、予め特定の構造のみに分別したCNT成長核から同一構造のCNTを再成長(自己複製成長)する技術を開拓することである。H22年度は、CVD成長装置の整備を完了すると共に、CNT自己複製成長に向けた要素技術の確立を進めた。原料ガス活性化と成長の温度を独立制御可能な多温度ゾーン反応炉を装備したCVD成長装置の基本特性を通常の金属触媒やナノダイヤモンド粒子を成長核としたCNT成長により検証し、CNT再成長への基本技術を確立した。CNT構造(カイラリティ)を識別した評価手段であるラマン分光法を用いて、CNTを成長核とした自己複製成長を検証した。しかし、基板上でのCNT密度の不均一性に起因するスペクトル強度の揺らぎのため、成長前後のラマンスペクトル強度変化から自己複製成長を検証するには数10%以上の著しい成長が必要と判明した。そこで、フラーレンC60を核としたCNT成長条件の探索を当面の課題とした。フラーレンはCNTの末端部分と同様のキャップ構造を持ち、CNT自己複製成長と類似の条件で成長すると考えられる。しかもラマンスペクトル形状が大きく異なるため、CNT成長の検証は容易である。多温度ゾーンCVD装置を用いて成長条件を探索した結果、c60成長核からの単層CNT成長を確認した。さらに、石英基板を用いた方が熱酸化Siやサファイア基板よりも成長効率が高いこと、成長効率の成長条件依存性は金属触媒やナノダイヤモンド成長核とは大きく異なっていることを見出した。これらの現象は、C60核からのCNT成長機構と深くかかわっている。H24年度は、これらの知見に基づいた高効率成長により、CNT自己複製成長の検証へと展開する。
典型度に基づくＷｅｂオブジェクト検索に関する研究

本年度は大きく二つの研究課題に取り組んだ。一つ目の研究では、語の上位下位関係を用いて、入力クエリに対する同位語らしい語および上位語らしい語を発見する手法を提案した。提案手法では、語の上位下位関係を基に作られる2部グラフに対してHITSアルゴリズムを拡張した手法を適用することで、同位語らしさ、上位語らしさを求める。例えば、「落合博満」というクエリに対しては、同位語らしい語として「野村克也」や「イチロー」といった語が、上位語らしい語として「野球監督」や「野球選手」といった語が得られることが期待される。実験では、クラウドソーシングを用いた大規模な実験を行い、提案手法の有用性を明らかにした。二つ目の研究では、社会認知量に基づく典型度と、データ量に基づく典型度に差がある情報は意外であるという仮説の基、意外な情報の発見を目的とした。特に語間の関係の典型度に着目し、上記の仮説を検証するために、クラウドソーシングを用いて社会認知量に基づく関係の典型度および関係の意外度を取得した。さらに、語の認知度および同位語を考慮することで社会認知量に基づく典型度の推定手法を提案した。最後に、社会認知量に基づく典型度、データ量に基づく典型度、オブジェクトの認知度を用いて情報の意外度の推定を行った。本研究の手法を用いることで,既存手法により求められる関連度は高いが関係の認知度が低い語を「非典型的な語」としてユーザに提示することが可能になった。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は,大きく2つの研究課題に取り組んだ.1つ目は,典型性の中でも非典型性に着目し,非典型的かつ有用な情報の発見を目的とした研究を行った.本研究において対象とする意外な情報とは,例えば「落合博満はガンダムのファンである.」のようなものである.我々は,「落合博満」や「ガンダム」のように,意外な情報を形成するうえで欠かせない語をエンティティと呼ぶ.提案手法では,そのようなエンティティの組を大規模に収集し,各組についてそれらのエンティティの同位語間の関連の強さをWikipediaの単語間のリンク構造に基づいて求める.これにより,通常はクエリの同位語集合が関連を持たない同位語集合およびエンティティが求められる.非典型的な情報にはノイズとなるようなものが多く,その中から有用な情報を発見することは意義深いと言える.2つ目は,属性の組み合わせに基づくオブジェクト集合検索に関する研究を行った.本研究ではオブジェクト間の相性を測るためにある観点における属性の「類似性」と「バランス性」という考えを導入する.我々が対象とするクエリは「3つの観光地からなる観光コース」などである.本論文で提案するオブジェクト集合検索により,このようなクエリに対して「三十三間堂,大覚寺,大徳寺はいずれも本殿の様式という観点では入母屋造である」(類似性に基づく検索)や「壬生寺,南禅寺,大仙院はそれぞれ東洋の美術家という観点では長谷川等伯,狩野探幽,狩野元信と関連がある」(バランス性に基づく検索)といった検索が可能となる.オブジェクト間の共起関係などに基づきオブジェクトの組み合わせを検索するのではなく,属性の組み合わせを考慮することで他のオブジェクトとあまり共起しないマイナーなオブジェクトに対しても相性の良いオブジェクトを発見できる点で意義深いと言える.平成25年度は,大きく2つの研究課題に取り組んだ.1つ目は検索結果の多様化に関する研究であり,入力クエリに対する典型的なトピックから非典型的なトピックまで網羅的にカバーできるように検索結果をリランキングすることを目的とした.検索結果の多様化に関する研究はこれまで様々なものが行われてきたが,本研究ではクエリに関する各サブトピックの検索意図(InformationalやNavigational)を考慮して検索結果の多様化の手法を提案した点が特徴的である.2つ目は,オブジェクトと属性値を入力として与えたときに,オブジェクトと属性値の関係の認知度を推定するための手法を提案した.提案手法を用いることで,たとえばオブジェクトを「中国」,属性値を「ワイン」としたとき,「中国」と「ワイン」は実際の関連度は高いがその関係の認知度は低い,といったことが求められる.提案手法では, (1)オブジェクトの認知度が高(低)ければ,オブジェクトと属性値の関係の認知度は実際の関連度よりも高(低)くなる.(2)オブジェクトの多くの類似オブジェクトと属性値の関係の認知度が高(低)ければ,オブジェクトと属性値の関係の認知度は実際の関連度よりも高(低)くなる.という仮説のもと関係の認知度を推定する.評価実験では,クラウドソーシングを用いて関係の認知度に関する正解データを作成し,提案手法と既存の語間の関連度推定手法を比較した.実験の結果,提案手法より有意に高い精度で関係の認知度を推定できることが明らかになった.本研究の手法を用いることで,既存手法により求められる関連度は高いが関係の認知度が低い語を「非典型的な語」としてユーザに提示することが可能になると考えられる.本年度は大きく二つの研究課題に取り組んだ。

例えば、「落合博満」というクエリに対しては、同位語らしい語として「野村克也」や「イチロー」といった語が、上位語らしい語として「野球監督」や「野球選手」といった語が得られることが期待される。実験では、クラウドソーシングを用いた大規模な実験を行い、提案手法の有用性を明らかにした。二つ目の研究では、社会認知量に基づく典型度と、データ量に基づく典型度に差がある情報は意外であるという仮説の基、意外な情報の発見を目的とした。特に語間の関係の典型度に着目し、上記の仮説を検証するために、クラウドソーシングを用いて社会認知量に基づく関係の典型度および関係の意外度を取得した。さらに、語の認知度および同位語を考慮することで社会認知量に基づく典型度の推定手法を提案した。最後に、社会認知量に基づく典型度、データ量に基づく典型度、オブジェクトの認知度を用いて情報の意外度の推定を行った。本研究の手法を用いることで,既存手法により求められる関連度は高いが関係の認知度が低い語を「非典型的な語」としてユーザに提示することが可能になった。26年度が最終年度であるため、記入しない。典型性だけでなく,非典型性に関する研究を行い,知見を得ることができたため.また,オブジェクト集合の典型性を測る上で,オブジェクト間の共起関係だけでなく,属性にも着目した研究課題に着手することができたため.人の認知特性を考慮したうえで,非典型的かつ有用な情報,つまり意外な情報の発見を目的とした研究を行い,クラウドソーシングを用いた大規模な評価により提案手法の有用性を定量的に示すことができたため.属性に着目したオブジェクト集合検索をさらに発展させ,ある属性で類似性や相補性を満たすオブジェクト集合の典型性を測る手法の提案および手法の評価を行う.これまでの研究では,語間の関係の認知度に関する評価は行ったが,最終的な目的である意外な情報の発見精度に関する評価はまだ行っていないので,クラウドソーシングを用いた大規模な評価を行う予定である.
オンチップ再構成細胞系とAFM超微量分子採取技術を用いた細胞内一分子計測系の構築

細胞内での分子マーカー発現とコミュニティー効果を一分子レベルで調べるアプローチとして、金微粒子を標識として用いた、細胞内マーカー一分子発現解析法の新規樹立の評価を行った。具体的には、マーカー分子に相補的な合成DNAを修飾した金微粒子を標識として用いた上で標的マーカー分子(発現mRNA等)を標識し、走査型電子顕微鏡(SEM)と原子間力顕微鏡(AFM)を用いて直接観察を行い、金微粒子数をカウントすることにより標的分子数を定量化した。SEMを用いた観測法では、合成DNAをモデル標的分子として基板上に固定し、金微粒子プローブを反応させることにより評価を行った。金微粒子プローブの反応特異性の検討を行った結果、S/N比1800以上という高い感度で検出することが可能であるとわかった。また、基板上の標的DNA数を変化させて検出を行う実験より、電子顕微鏡観測法を用いて標的分子数を定量化することが可能であることが分かった。さらに、サイズが異なる金微粒子にそれぞれ異なる種類のDNAを固定しプローブとして用いることにより、複数種類の標的分子を選択的に検出することが可能であるとわかった。AFMを用いた観測法では、粗い表面上に固定された金微粒子のサイズを識別するための方法の確立を行った。具体的には、高さではなく粒子頂点付近の曲率から粒子径を推定する「曲率再構成法」の構築を行った。探針形状の影響を小さくするために先端径が揃ったカーボンナノチューブ探針を用いて乾燥細胞上で金微粒子の凹凸像を取得し、曲率再構成法により粒子径を推定した。比較として、同じ視野をSEMにて観測し、両観測結果より得られた粒子径を比較した。その結果、粒子頂点付近10%程度の曲率より粒子径再構成することにより、細胞上にランダムに分布した30nmと50nmの粒子を識別することに成功した。細胞内での分子の振る舞いとコミュニティー効果を調べるアプローチとして、原子間力顕微鏡(AFM)による超微量分子採取技術を用いて、細胞内から目的分子のみを特異的に微量採取し、解析を行う手法を確立するために検討を行った。はじめに、AFMを用いて単一生細胞内から特定の分子のみを特異的に、効率よく採取するために、AFM探針に化学修飾を施し分子を固定する方法について検討した。従来からよく用いられているアミノシラン化法を用いて分子を固定することを試みたが、同方法は温度や湿度等の環境条件に非常に敏感で、探針表面にアミノ基単分子膜を再現性良く生成する条件を確立することは非常に困難であることが分かった。そこで、金微粒子表面に分子を固定し、修飾金微粒子を探針へ取り付ける方法を提案した。金微粒子への分子固定の条件を検討し、成果を日本生物物理学会年会にて報告した。次に、生細胞内、特に細胞核内から分子を採取する際に細胞へ与えるダメージの大きさを検討するために、マイクロマニピュレータを用いて細胞核へ針を挿入し、挿入後の細胞の様子を経時的に観察した。実験の結果、針を挿入した細胞は死ぬこともあったが、あるものは針を挿入後も生存し、分裂も行うことが出来たことから、細胞核に針を刺して分子を採取することは不可能でないことが分かった。しかし、針の挿入後に細胞の形状が大きく変化することから細胞へのダメージは大きいと考えられ、針を挿入する際には細胞へ加える圧力や針の形状を慎重に検討する必要があると結論付けた。得られた結果は米国生物物理学会年会にて報告した。細胞内での分子の振る舞いとコミュニティー効果を調べるアプローチとして、金微粒子を分子マーカーとして用いた、細胞内一分子発現解析法の新規樹立を行うために検討を行った。細胞内発現分子解析の標的としてmRNAにターゲットを絞り、細胞内での分子発現状態を、空間分布を保ったまま定量的に調べる方法の確立を目的とした。方法は、表面に各種合成DNAを修飾した金微粒子プローブを分子マーカーとして用いた上で標的mRNAを標識し、走査型電子顕微鏡を用いて直接観察することにより標的分子数を定量化した。金微粒子を用いる利点は、蛍光分子のように褪色することがない、電子顕微鏡を用いて数を数えることにより標的分子数を定量化することが可能である、各大きさの微粒子を用いることにより多種類の標的分子を同時に標識することが可能である等の点が挙げられる。実験手法を確立するためにmRNAでなく合成DNAをモデル標的分子として基板上に固定し、金微粒子プローブを反応させることにより測定条件の検討を行った。相補的な配列を持つDNAと相補的でないDNAを標的として用いて検討を行った結果、相補的な配列を持つ標的DNAをS/N比1800以上という高い感度で検出することが可能であるとわかった。また、基板上の標的DNA数に比例して検出される金微粒子数が変化することから、本手法を用いて標的分子数を定量化することが可能であると分かった。さらに、10nm、20nm、40nmの3種類の金微粒子にそれぞれ異なる種類のDNAを固定しプローブとして用いることにより、3種類の標的分子を選択的に検出することが可能であるとわかった。

SEMを用いた観測法では、合成DNAをモデル標的分子として基板上に固定し、金微粒子プローブを反応させることにより評価を行った。金微粒子プローブの反応特異性の検討を行った結果、S/N比1800以上という高い感度で検出することが可能であるとわかった。また、基板上の標的DNA数を変化させて検出を行う実験より、電子顕微鏡観測法を用いて標的分子数を定量化することが可能であることが分かった。さらに、サイズが異なる金微粒子にそれぞれ異なる種類のDNAを固定しプローブとして用いることにより、複数種類の標的分子を選択的に検出することが可能であるとわかった。AFMを用いた観測法では、粗い表面上に固定された金微粒子のサイズを識別するための方法の確立を行った。具体的には、高さではなく粒子頂点付近の曲率から粒子径を推定する「曲率再構成法」の構築を行った。探針形状の影響を小さくするために先端径が揃ったカーボンナノチューブ探針を用いて乾燥細胞上で金微粒子の凹凸像を取得し、曲率再構成法により粒子径を推定した。比較として、同じ視野をSEMにて観測し、両観測結果より得られた粒子径を比較した。その結果、粒子頂点付近10%程度の曲率より粒子径再構成することにより、細胞上にランダムに分布した30nmと50nmの粒子を識別することに成功した。
脊髄に於ける疼痛受容機構とion cotransportersの役割

脊髄腔内カテーテルを留置した慢性ラットモデルを作製し、Na^+-H^+、Na^+-K^+-2Cl^-、などのイオントランスポーターであるアミロライド、フロセミドの脊髄鎮痛効果を、Tail-flicktestとFormalin testを用いて、Na^+-K^+-ATPase(ouabain)との相互作用の比較の上で検討した。アミロライドを脊髄くも膜下腔投与はウアバインと同様に、機械的刺激による疼痛作用を抑制した。この作用は局所麻酔薬リドカインと相乗効果を示した。一方、フロセミドの脊髄クモ膜下腔内の投与では抗侵害効果が確認されなかった。リドカインの添加によっても影響を受けなかった。これらのイオントランスポーターの脊髄クモ膜下腔への投与結果から、イオントランスポーターは、少なくとも一部は、脊髄の侵害受容機構に関与していることが明らかとなった。脊髄疼痛シグナル伝達とその制御機構に於けるイオントランスポーターの役割は、イオンチャンネルや脊髄ニューロンのオピオイドやα_2-アドレナリン受容体を介した複雑なものであることが示唆された。Na^+-K^+ATPase(Na^+ポンプ)阻害薬のウアバインは脊髄レベルでの強い鎮痛作用をもつ(ZengW,DohiS,1999)。さらにそれがオピオイドとはsynergicな効果をもつが、Na^+チャネルに作用する局所麻酔薬リドカインとはそのような作用をきたさないとう結果から、同じ腰部脊髄くも膜下腔に微小カテーテルを留置したラットモデルで、侵害熱刺激に対する潜時(Tail flick latency;TFL)から、α_2-アドレナリン受容体アゴニストのクロニジンとの相互作用を検討した。タロニジンはアセチルコリン(ACh)作用をもつカルバコールと同様にウアバインと相互作用を示した。その作用は、アトロピンで遮断されたので、脊髄におけるAChを介するものであることが示唆され、ACh受容体のどのサブタイプによるかは今後の検討課題である。また同じ方法で、Na^+-H^+antiporterのアミロライドは脊髄レベルで著明な鎮痛作用をきたすが、Na^+-K^+-2Cl^-cotranspoterの遮断ではそのような作用はないことを観察し、リドカインによるNa^+チャネルのブロックによってはNa^+-H^+antiporterもNa^+-K^+-2Cl^-cotranspoterの作用は影響を受けないことを観察した。しかし、K^+ATPチャネルの脊髄鎮痛効果はα_2-アドレナリン受容体アゴニストで増強し、Na^+-K^+ATPase阻害の効果はα_2-アドレナリン受容体アゴニストやACh作動薬カルバコールで増強するので、脊髄疼痛制御機構に於けるイオントランスポーターの役割は、イオンチャネルや脊髄ACh受容体を介した複雑なものであることが示唆された。
犬の悪性腫瘍由来マイクロパーティクルによる凝固活性化とDICの診断・治療への応用

本研究の目的は、犬の悪性腫瘍に続発する播種性血管内凝固(DIC)における血漿中組織因子由来凝固促進活性(TF-PCA)の診断および予後マーカーとしての有用性を検討すること、および組織因子含有マイクロパーティクル(TF-MP)の放出抑制による治療法を検討することである。診断および予後マーカーの検討については、最終年度では更なる症例データの蓄積および総合的な実験結果の解析を行った。非DIC群、Pre-DIC群、DIC群における血漿中TF-PCAは、特にDIC群で高値である傾向が認められたが、いずれの群間においても統計学的な有意差は認められなかった。治療前後で比較が可能であった症例では、臨床徴候の改善または悪化やDICからの離脱と血漿中TF-PCAの関連が認められた。これらの結果から、血漿中TF-PCAのDICにおける予後マーカーとしての有用性が示唆された。TF-MP放出抑制による治療法の検討については、前年度までの成果として、培養細胞において試験したいずれの薬剤においても期待されたTF-MPの放出抑制効果は認められなかったが、その中の一つであるシンバスタチンは、様々な犬の腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を示すことが明らかになった。この結果を受けて、最終年度ではその抗腫瘍効果についてさらに検討した。その結果、シンバスタチンによる抗腫瘍効果は細胞によって感受性が異なること、およびその機序の一つとしてがん化に関わる重要なシグナル分子の一つであるRasタンパク質の活性化抑制が関与している可能性が示唆された。犬の血漿中マイクロパーティクルの由来を解析するための基礎的研究として,マイクロパーティクル上に存在する抗原マーカーの検出法を検討した。その結果,血小板由来マイクロパーティクルおよび単球由来マイクロパーティクルは,それぞれCD41陽性集団およびCD14陽性集団として検出可能であった。一方,血管内皮細胞由来マイクロパーティクルはCD62E,CD144,CD146をマーカーとして用いたいずれの場合においても検出できなかった。組織因子については,腫瘍細胞株および正常細胞から放出されたマイクロパーティクルのいずれにおいても検出できなかった。以上より,犬のマイクロパーティクル上に存在する血管内皮細胞マーカーおよび組織因子の検出については,検出用抗体のさらなる検討など,検出感度の向上が必要であると考えられた。次に悪性腫瘍由来マイクロパーティクルが正常細胞に及ぼす作用を検討した結果,犬の血管肉腫およびリンパ腫細胞由来マイクロパーティクルが,in vitroにおいて末梢血単核球における組織因子活性を上昇させることが明らかとなった。このことは,これらの悪性腫瘍症例においてしばしば認められる凝固活性化を反映している可能性が考えられた。今後はこの組織因子活性の上昇に関するより詳細なメカニズムを明らかにすることにより,悪性腫瘍症例における凝固活性化の病態解明および新規治療法の開発に貢献できるものと考えられた。その他として,血漿中組織因子由来凝固促進活性(TF-PCA)の播種性血管内凝固(DIC)診断マーカーとしての有用性については,対象症例を蓄積し解析中である。予定より遅れている点として,犬のマイクロパーティクル上の組織因子および血管内皮細胞マーカーの検出法が確立できていないこと,マウスモデルを用いたin vivoの解析に至っていないことが挙げられる。その他の点については,予定通りまたは一部については当初の予定より進行している。本研究の目的は,犬の悪性腫瘍に続発する播種性血管内凝固(DIC)における組織因子由来凝固促進活性(TF-PCA)の診断マーカーとしての有用性および将来的な治療ターゲットとしての可能性を検討することである。DIC診断マーカーとしての有用性については,前年度より引き続き犬の症例における血漿中TF-PCAの測定を行った。血漿中TF-PCAは,DIC群において上昇している傾向が認められたが,その他の群と比較して統計学的な有意差は認められなかった。一方,多くの症例において,血液凝固異常の改善とともに血漿中TF-PCAの低下が認められたため,治療マーカーとしての有用性が示唆された。その他のデータの詳細については現在解析中である。治療ターゲットとしての可能性については,いくつかの薬剤について,犬の腫瘍細胞株(血管肉腫,悪性黒色腫,乳腺腫瘍,リンパ腫)を対象としてin vitroにおけるマイクロパーティクルの放出阻害作用を検討した。その結果,いずれの薬剤についてもマイクロパーティクルの放出を特異的に阻害する作用は認められなかったが,シンバスタチンでは多くの細胞株で強い細胞傷害作用が認められた。これまでの研究から,シンバスタチンは腫瘍細胞にアポトーシスおよびG0/G1期における細胞周期停止を引き起こすことが明らかとなった。その抗腫瘍効果のさらなる詳細については現在解析中である。なお,前年度からの課題であった犬の血漿中TF含有マイクロパーティクルの由来細胞の解析については,抗体の感度不足や必要な検体量の問題から解析を中止した。代替としてマウスモデルでの解析を検討している。遅延の一番の理由として,当初予定していた犬の血漿中TF含有マイクロパーティクルの由来細胞の解析が抗体の感度不足や必要な検体量の問題の解決に至らず,解析を中止せざるをえなかったことがあげられる。それにより,当初予定していたマウスモデルを用いた実験の計画が遅延している。

診断および予後マーカーの検討については、最終年度では更なる症例データの蓄積および総合的な実験結果の解析を行った。非DIC群、Pre-DIC群、DIC群における血漿中TF-PCAは、特にDIC群で高値である傾向が認められたが、いずれの群間においても統計学的な有意差は認められなかった。治療前後で比較が可能であった症例では、臨床徴候の改善または悪化やDICからの離脱と血漿中TF-PCAの関連が認められた。これらの結果から、血漿中TF-PCAのDICにおける予後マーカーとしての有用性が示唆された。TF-MP放出抑制による治療法の検討については、前年度までの成果として、培養細胞において試験したいずれの薬剤においても期待されたTF-MPの放出抑制効果は認められなかったが、その中の一つであるシンバスタチンは、様々な犬の腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を示すことが明らかになった。この結果を受けて、最終年度ではその抗腫瘍効果についてさらに検討した。その結果、シンバスタチンによる抗腫瘍効果は細胞によって感受性が異なること、およびその機序の一つとしてがん化に関わる重要なシグナル分子の一つであるRasタンパク質の活性化抑制が関与している可能性が示唆された。基本的には当初の計画通りに遂行する予定であるが,本年度に進捗が遅れた点については対応策を講じる。すなわち,抗犬組織因子抗体の作製など,より高感度にマイクロパーティクルを解析するための工夫を行う。in vitroのシンバスタチンを用いた解析において抗腫瘍効果が認められたため,その作用機序の解析を行う。また,in vivoの解析として,犬腫瘍移植マウスモデルを用いて血漿中腫瘍由来マイクロパーティクルおよびTF-PCAの解析を行うとともに,シンバスタチンの抗腫瘍効果および血漿中TF-PCAに対する効果を検討する予定である。本年度に予定していたマウスモデルを用いた実験計画が,実験手技の習得や予備的な条件検討などに予想以上の時間を要したため予定通りに遂行できなかった。H29年度にマウスモデルを用いた実験を予定していたが,計画の遅延により実施できなかったためその分の未使用額が生じた。H30年度の経費と合わせてマウスモデルの実験に使用する。当初の予定通りにマウスモデル実験に対して使用する。また,当初の計画にはなかった抗犬組織因子抗体の作製にも一部充当する予定である。
敗血症に対するβ遮断薬投与の臓器保護効果と機序の解明

本研究では、敗血症に対するβ遮断薬投与の脾臓内Tリンパ球に対する効果について検討を行った。まずは生体外実験にて、カテコラミン刺激がマウスの脾臓Tリンパ球のアポトーシスを誘導するかどうかを検討し、濃度依存性にTリンパ球のアポトーシスを誘導することを示した。次に盲腸穿孔術によって作成したマウス敗血症モデルに対するβ遮断薬投与の脾臓Tリンパ球への効果を検討したところ、敗血症にて激減する正常Tリンパ球の数を維持することを見出した。平成26年度は、まず生体外実験として、マウスの脾臓から抽出したTリンパ球を用いて、カテコラミン(エピネフリン、ノルエピネフリン)がTリンパ球のアポトーシスに与える影響を検討した。全身麻酔下にマウスから脾臓を取り出し、脾臓を膜で濾して試薬により赤血球を溶血させたのち、nylon wool columnを用いてTリンパ球を抽出した。Tリンパ球を培養液に移し、24時間カテコラミンによる刺激を様々な濃度で(0, 0.1, 1.0, 10, 100 uM)行った。フローサイトメトリーによる評価にて、カテコラミン刺激は濃度依存性にTリンパ球のアポトーシスを誘導した。生体内実験では、盲腸穿孔術による敗血症マウスモデルを用いた。まず敗血症の脾臓内Tリンパ球アポトーシスに対する影響を検討するために、盲腸を結紮する位置を変えることによって3群の重症度がことなる敗血症モデルを作成した。24時間後に生体外実験と同じ方法にて脾臓からTリンパ球を抽出し、正常Tリンパ球の数とアポトーシスの割合を調べたところ、アポトーシスの割合は変化がなかったが、正常Tリンパ球の数は重症度に比例して減少した。次に、盲腸穿孔術を行ったマウスを生理食塩水の持続皮下注を行うcontrol群とβ遮断薬であるエスモロールの持続皮下注を行うesmolol群に分け、同じように24時間後に脾臓内Tリンパ球の数とアポトーシスの割合を調べたところ、エスモロール投与はアポトーシスの割合に対しては効果がなかったものの、脾臓内正常Tリンパ球数の減少を抑えることができた。これらの結果より、敗血症におけるカテコラミン刺激はTリンパ球の細胞死に関与し、β遮断薬の投与は脾臓内正常Tリンパ球数を維持する効果があることが示された。本研究では、敗血症に対するβ遮断薬(エスモロール)の効果、特に脾臓Tリンパ球のアポトーシスに対する効果について検討を重ねている。アポトーシスの評価ならびに正常Tリンパ球の数の評価はフローサイトメトリーにて行っている。平成26年度では、まず生体外実験において、カテコラミンによる刺激がマウスの脾臓から抽出したTリンパ球のアポトーシスを濃度依存性に誘導することを見出した。次に、盲腸穿孔術による敗血症モデルを使った生体内実験では、24時間後の脾臓Tリンパ球のアポトーシスの割合には変化がなかったものの、その重症度に比例して正常Tリンパ球の絶対数が減少することを示した。さらに、生理食塩水投与(持続皮下注)を対照群としてエスモロール投与(持続皮下注)の効果を検討した生体内実験では、盲腸穿孔術によって生じる脾臓内正常Tリンパ球の減少をエスモロール投与が抑制できることを見出した。平成27年度では、Tリンパ球のなかでもどの細胞が特に影響を受けやすいかについて検討を行った。Tリンパ球のなかでもヘルパーT細胞とナチュラルキラーT細胞に着目して実験を行った。盲腸穿孔術による正常細胞数の減少やβ遮断薬(エスモロール)のその抑制効果に関しては、ヘルパーT細胞とナチュラルキラーT細胞との間で特に差はなかった。これにより、Tリンパ球の種類に関係なく同じように影響を受けることが判明した。現在は、盲腸穿孔術に対するβ遮断薬(エスモロール)投与の生存率に与える影響についての実験を行っているところである。当初の予定では、平成27年度にて生存率に関する実験を終了し、脾臓Tリンパ球以外の臓器(心臓、腎臓、腸管リンパ節)のアポトーシスの評価を始める予定であったため、やや遅れていると判断している。前年度までは、in vitroの実験にてカテコラミン刺激がマウスTリンパ球のアポトーシスを誘導することを証明し、盲腸穿孔術により作成したマウス敗血症モデルでは、侵襲の程度に応じて脾臓内の正常Tリンパ球の数が減少することを示した。さらに、当研究室ではこれまで、β遮断薬、エスモロールの敗血症に対する投与が、心筋保護効果や腸管機能維持効果を発揮することを示してきたが、本研究ではマウス敗血症モデルを用いて、エスモロール投与の脾臓内Tリンパ球数減少に対する効果を検討してきた。β遮断薬、エスモロールの投与は、敗血症モデルで生じる脾臓内Tリンパ球数の減少を、生理食塩水を投与した対照群と比較して、有意に抑制することを証明することができた。敗血症の高い死亡率は、高炎症反応に引き続いて起こるリンパ球アポトーシスを含めた免疫能低下が一つの原因と考えられるため、今年度は同じマウス敗血症モデルを用いて、β遮断薬、エスモロール投与の炎症性サイトカイン産生に与える影響と生存率への影響についての研究を行った。生存率に関しては、生理食塩水を投与した対照群と比較して、エスモロール投与群で改善傾向を示したものの、有意な差には至らなかった。血中のサイトカインについては、血液検体は既にあるため、これから測定する予定である。

明らかな生存率の改善を証明することはできなかったものの、炎症性サイトカインの抑制を通して脾臓内Tリンパ球数の減少を抑えることができれば、敗血症の治療戦略になり得るものと考えている。本研究では、敗血症に対するβ遮断薬投与の脾臓内Tリンパ球に対する効果について検討を行った。まずは生体外実験にて、カテコラミン刺激がマウスの脾臓Tリンパ球のアポトーシスを誘導するかどうかを検討し、濃度依存性にTリンパ球のアポトーシスを誘導することを示した。次に盲腸穿孔術によって作成したマウス敗血症モデルに対するβ遮断薬投与の脾臓Tリンパ球への効果を検討したところ、敗血症にて激減する正常Tリンパ球の数を維持することを見出した。平成26年度は、生体外実験においてカテコラミンがTリンパ球のアポトーシスに与える影響についての結果を得ることができ、生体内実験においては、敗血症の重症度による正常脾臓内Tリンパ球の数に与える影響とそれに対するβ遮断薬の効果についての実験結果が得られたため、交付申請書に記載した研究の目的を概ね満たしているものと思われる。本年度は最後の年度となる。まずは、現在行っている盲腸穿孔術に対するβ遮断薬(エスモロール)投与の生存率に与える影響の実験を完結させ、それと同時に、盲腸穿孔術による敗血症モデルにおいて、心臓や腎臓などの他の臓器細胞ではアポトーシスがどの程度生じているか、それに対するβ遮断薬投与の効果はあるのか、についての評価を行う予定である。また、採血して凍結保存してある血漿中のサイトカイン濃度の測定を行い、盲腸穿孔術の重症度や正常Tリンパ球の数と並行して炎症性サイトカインがどのように推移しているのかを検討していく予定である。麻酔学、集中治療医学平成26年度の研究では、カテコラミンが敗血症における脾臓内Tリンパ球の細胞死に関与し、β遮断薬がその数を維持する効果があることが示された。今後は、採血して冷凍保存してある血漿中の炎症性サイトカイン濃度の測定やcontrol群とesmolol群で生存率に違いがあるかについての検討を行っていく。また、esmololの投与による、Tリンパ球の分画の変化についても検討していく。さらに脾臓内Tリンパ球のみならず、凝固系に与える影響や他の臓器に与える影響についても今後は検討を重ねる予定である。次年度使用額が生じた理由としては、当該年度において、保存してある検体を使ってサイトカイン濃度の測定などを行う予定であったが、それが次年度に持ち越しとなったこと、学会発表するまでのデータがそろわなかったため、旅費としての使用がなかったこと、高額の物品を購入する必要がなかったこと、が挙げられる。次年度使用額が生じた理由としては、備品として申請して購入したCO2インキュベーターを当初の見積額より安価で購入できたことがあげられる。平成28年度では、これまで保存していた検体ならびにこれから採取する検体を用いてサイトカイン濃度の測定やアポトーシスの評価を行う際にかかる費用、実験で使用する消耗品に対する費用、学会参加の旅費、に充当させて頂く予定である。平成27年度は高額の備品を購入する予定はないが、実験で使用する消耗品を中心に使用し、学会参加の旅費にも使用する予定である。
地域連携による地域交通ネットワークの効果的整備の可能性に関する研究

地方分権化社会における地域間交通基盤施設の整備と維持の方策について,地方政府自身が自己財政基盤のもとで主体的に整備の量と質を決定するという「地方分権的な交通基盤整備」について理論モデルを用いてその基本構造を解明した.特に,「ただ乗り」誘因など戦略的行動の構造を明らかにし,整備の非効率性および地域間不衡平性を明らかにした.特に,意思決定のタイミングや投資関数の相補性/代替性の重要性が明らかとなった.地方分権化社会における地域間交通基盤施設の整備と維持の方策について,地方政府自身が自己財政基盤のもとで主体的に整備の量と質を決定するという「地方分権的な交通基盤整備」について理論モデルを用いてその基本構造を解明した.特に,「ただ乗り」誘因など戦略的行動の構造を明らかにし,整備の非効率性および地域間不衡平性を明らかにした.特に,意思決定のタイミングや投資関数の相補性/代替性の重要性が明らかとなった.わが国で近年急速に進展しつつある地方分権の議論とその中での地方交通サービスおよび地域間交通サービスの位置づけについて特の整備方策に関する調査を行った.また,ゲーム理論における定型形成ゲームにおける提携安定性概念およびネットワーク形成概念をレビューし,分権的交通基盤施設の地域間の連携整備との関係を調べた.地域提携形成を明示的に組み込んだ多地域による分権的地域間交通基盤施設整備の理論基礎モデルの構築に向けては,道路整備に反応して立地地域を変更する企業の行動を明らかにするため,2地域一般均衡モデルを構築し,各地域による分権的な道路整備が産業の立地変更に与える影響を分析した.特に,シミュレーション分析を行い,地域間の人口分布の違いおよび分計整備の方策の違い(各地域が非協力的であるか連携的であるか)が均衡産業立地および社会構成に与える影響を分析した.地域政府による道路整備の効果が産業立地に与える影響を把握しない場合,戦略的な非協力的道路整備は,国土全体として非効率的な状況をもたらす可能性があることを示した.地域の産業立地効果を把握しない整備行動は,地域間で人口差が激しい場合は安定的な産業立地均衡をもたらすが,人口等がほば同質な地域間にあっては,産業が地域間での再立地を繰り返す不安定な均衡が現れることが明らかになった.さらに,こめ特徴は,地域間が連携して整備を行う場合も保持されることが示された.わが国で近年急速に進展しつつある地方分権の議論とその中での地方交通サービスおよび地域間交通サービスの位置づけについて特の整備方策に関する文献調査を行った.また,ゲーム理論における定型形成ゲームにおける提携安定性概念およびネットワーク形成概念をレビューし,分権的交通基盤施設の地域間の連携整備との関係を調べた.地域提携形成を明示的に組み込んだ多地域による分権的地域間交通基盤施設整備の理論基礎モデルの構築に向けては,道路整備に反応して立地地域を変更する企業の行動を明らかにするため構築した2地域一般均衡モデルを拡張し,労働者のみならず産業が地域間を移動可能なモデルを構築した.このモデルの分析により,地方政府による道路整備が地域間産業立地パターンに与える影響について明らかにした.特に,中央政府による道路整備が低いとき(高いとき)その後の整備の地方分権化は整備を遅らせる(推進する)可能性を示した.また,各地域の道路整備タイミングの違いが地域の戦略的な整備行動の結果として最終的なネットワーク整備水準に及ぼす影響を分析するため,スオールオープンな2都市モデルを構築し,整備タイミングの効果を分析した.その結果,多くの場合他地域の整備を待つインセンティブが生まれ,全体として整備が進まない様子見状態が安定的な状態となることを示し,これ打開する制度(たとえばマッチング整備誘導方策)の必要性を示した.本研究では,地方分権化社会における地域間交通基盤施設(特に地域間の地方道路ネットワーク)の整備と維持の方策について,地方政府自身が自己財政基盤のもとで主体的に整備の量と質を決定するという「地方分権的な交通基盤整備」の帰結について理論モデルを用いてその基本構造の解明を試みた.さらに,開発した理論モデルを用いて地方分権的道路整備による地方道路ネットワークの整備状況について分析した.分析では,特に地域間の個別の整備における「ただ乗り」誘因など戦略的行動の構造を明らかにし,整備の非効率性および地域間不衡平性を明らかにした.さらに,このような分権的整備における地域の戦略的行動のみならず,地域間での交通基盤整備に関する協力である「連携整備」の自発的創発のメカニズムとその効果的誘導のための中央政府の政策について検討した.特に,前年度の産業立地行動の分析に引き続き,地域の交通基盤整備決定のタイミングが整備水準に与える影響に関する分析を進めた.また,開発した分権整備に関する地域間一般均衡モデルを我が国の地域に適用して数値分析を行い,その均衡ネットワーク整備状況を分析した.交通基盤施設の地方分権的整備と地域連携の可能性に関する理論的な解明は重要な研究課題と考えるが,申請者の知る限り国の内外を問わずほとんど扱われていない,整備決定に提携形成ゲーム概念を用いたのが本研究の特に独創的な点であり,本研究で「交通基盤施設の分権型整備」の戦略的行動の帰結とその基本構造が明らかになり,来るべき地方分権化社会の交通基盤施設の整備に関する理論的な裏づけと政策的含意を与えると考える.
難治性炎症性眼免疫病のゲノム構造解析による分子遺伝学的発症機構の解明

ベーチェット病,Vogt-小柳-原田病をはじめとした難治性炎症性眼免疫病は,その分子遺伝学的発症機序にHLAが深く関与していることが示唆されている.したがって.HLA遺伝子領域の詳細な解析を行うため,HLAクラスI領域の全塩基配列,1.9Mb(1.9X106bp)を正確に決定した.さらに既存のDNAデータバンクとのホモロジー解析およびGrail, Hexon解析の結果,23個の発現既知遺伝子,12個の発現新遺伝子,22個のESTと一致する領域,67個の偽遺伝子および3個の発現可能な塩基配列の計127個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域を見出した.また,この領域に存在するマイクロサテライト(反復配列)を検索した結果,25塩基の反復配列からなる計758個のマイクロサテライトを見出した.また,HLAクラス領域に存在する10数種類のマイクロサテライトを用いて本疾患の原因遺伝子のマッピングを日本人,ギリシャ人,イラン人,イタリア人,サウジアラビア人,トルコ人および中国人について行った.その結果,いずれの民族においても本病の原因遺伝子はMICAHLA-B遺伝子間の46kbに絞り込むことが出来た.またベーチェット病の病因遺伝子はHLA-B遺伝子近傍,特にHLA-B遺伝子のハプロタイプの一つであるHLA-B51と高い相関を示すことを報告した.次に,ベーチェット病患者のHLA-B51遺伝子領域とそのプロモーター領域の塩基配列を決定し,健常者の塩基配列との比較解析を行った結果,HLA-B遺伝子のイントロン領域,プロモーター領域にはいくつかのSNP多型がみられたがベーチェット病特異的な多型はみられなかった.このことから,HLA-B51アリルを特徴づけるSNP多型そのものが,本症発症に関与していると思われた.したがって,ベーチェット病はHLA-B51抗原が病因発症に第二義的に働き,それと関係したその他の遺伝・環境要因がからみ合って症状を発症するものと思われる.また,トルコ人のベーチェット病患者におけるMICAアリル解析を行い,疾患感受性について検討した結果,MICA*009アリル頻度が患者群で有意に上昇していた(R. R. =7.1 P=0.000046)ことがわかった.以上のことから,ベーチェット病では人種をこえてHLA-B51と第一義的に相関を有し,さらにその他の遺伝子素因として,HLA-B51抗原に連鎖しているMICA*009アリルの有意な増加があり,MIC-A*009-HLA-B*51ミニハプロタイプが本病発症に重要な役割を担っていることが示唆された.現在,他の難治性眼免疫病についても詳細な検討が進行中である.ベーチェット病,Vogt-小柳-原田病をはじめとした難治性炎症性眼免疫病は,その分子遺伝学的発症機序にHLAが深く関与していることが示唆されている.したがって.HLA遺伝子領域の詳細な解析を行うため,HLAクラスI領域の全塩基配列,1.9Mb(1.9X106bp)を正確に決定した.さらに既存のDNAデータバンクとのホモロジー解析およびGrail, Hexon解析の結果,23個の発現既知遺伝子,12個の発現新遺伝子,22個のESTと一致する領域,67個の偽遺伝子および3個の発現可能な塩基配列の計127個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域を見出した.また,この領域に存在するマイクロサテライト(反復配列)を検索した結果,25塩基の反復配列からなる計758個のマイクロサテライトを見出した.また,HLAクラス領域に存在する10数種類のマイクロサテライトを用いて本疾患の原因遺伝子のマッピングを日本人,ギリシャ人,イラン人,イタリア人,サウジアラビア人,トルコ人および中国人について行った.その結果,いずれの民族においても本病の原因遺伝子はMICAHLA-B遺伝子間の46kbに絞り込むことが出来た.またベーチェット病の病因遺伝子はHLA-B遺伝子近傍,特にHLA-B遺伝子のハプロタイプの一つであるHLA-B51と高い相関を示すことを報告した.次に,ベーチェット病患者のHLA-B51遺伝子領域とそのプロモーター領域の塩基配列を決定し,健常者の塩基配列との比較解析を行った結果,HLA-B遺伝子のイントロン領域,プロモーター領域にはいくつかのSNP多型がみられたがベーチェット病特異的な多型はみられなかった.このことから,HLA-B51アリルを特徴づけるSNP多型そのものが,本症発症に関与していると思われた.したがって,ベーチェット病はHLA-B51抗原が病因発症に第二義的に働き,それと関係したその他の遺伝・環境要因がからみ合って症状を発症するものと思われる.また,トルコ人のベーチェット病患者におけるMICAアリル解析を行い,疾患感受性について検討した結果,MICA*009アリル頻度が患者群で有意に上昇していた(R. R. =7.1 P=0.000046)ことがわかった.以上のことから,ベーチェット病では人種をこえてHLA-B51と第一義的に相関を有し,さらにその他の遺伝子素因として,HLA-B51抗原に連鎖しているMICA*009アリルの有意な増加があり,MIC-A*009-HLA-B*51ミニハプロタイプが本病発症に重要な役割を担っていることが示唆された.現在,他の難治性眼免疫病についても詳細な検討が進行中である.ベーチェット病、Vogt-小柳-原田病をはじめとした難治性炎症性眼免疫病は、その発症にHLAが深く関わっていることが示唆されている。

したがって、HLA遺伝子領域の詳細な解析を行うため、また、ヒトゲノムプロジェクトの一環として、今年度、我々はHLAクラスI領域の全塩基配列、1.9Mb(1.9X106bp)を正確に決定した。既存のDNAデータバンクとのホモロジー解析およびGrail、Hexon解析の結果、23個の発現既知遺伝子、12個の発現新遺伝子、22個のESTと一致する領域、67個の偽遺伝子および3個の発現可能な塩基配列の計127個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域を見出した。また、この膨大な塩基配列をもとに、この領域に存在するマイクロサテライト(反復配列)を検索した。その結果、25塩基の反復配列からなる計758個のマイクロサテライトを見出した。これらの内70個について多型性を検索したところ、38個が高度な遺伝的多型性を有し、HLA領域に存在する多くの遺伝病の原因遺伝子の詳細なマッピングに有用な遺伝多型マーカーとなり得ると考えられた。したがって、日本人、ギリシャ人、イタリア人、ヨルダン人、イラン人ベーチェット病患者を対象として、これらのマイクロサテライト多型解析およびMICA遺伝子解析を行ったところ、HLA-B^*51対立遺伝子が本病発症に第一義的に関与し、患者群で高度に保存されているMIC-A^*009-HLA-B^*51ミニハプロタイプが本病発症に重要な役割を担っていることが示唆された。今後、全染色体を対象としたゲノムワイドなマイクロサテライト多型性解析が必要と考えられた。また、これらの本病関連候補遺伝子を導入したトランスジェニックマウス(Tg)の開発では、今年度、細胞表面でのHLA-B51蛋白の発現量を増加させるため、HLA-B51Tgとヒトβ2mTgの交配により、両遺伝子を持つTgを作製した。今後、このマウスとマウスβ2mノックアウトマウスとの交配を計画している。ベーチェット病,Vogt-小柳-原田病をはじめとした難治性炎症性眼免疫病は,その分子遺伝学的発症機序にHLAが深く関与していることが示唆されている.したがって,HLA遺伝子領域の詳細な解析を行うため,またヒトゲノムプロジェクトの一環として,これまでに我々はHLAクラスI領域の全塩基配列,1.9Mb(1.9X10^6bp)を正確に決定し,ベーチェット病の病因遺伝子はHLA-B遺伝子近傍,特にHLA-B遺伝子のハプロタイプの一つであるHLA-B51と高い相関を示すことを報告した.そこで今年度,ベーチェット病患者のHLA-B51遺伝子領域とそのプロモーター領域の塩基配列を決定し,健常者の塩基配列との比較解析を行った結果,HLA-B遺伝子のイントロン領域,プロモーター領域にはいくつかのSNP多型がみられたが,ベーチェット病特異的な多型はみられなかった.このことから,HLA-B51アリルを特徴づけるSNP多型そのものが,本症発症に関与していると思われる.よって,ベーチェット病はHLA-B51抗原が病因発症に第一義的に働き,それと関係したその他の遺伝・環境要因がからみ合って症状を発症するものと思われる.今年度,トルコ人のベーチェット病患者におけるMICAアリル解析を行い,疾患感受性について検討した結果,トルコ人の健常人群(51人対象)のMICAアリル(13種類)で最も頻度の高いアリルMICA*008(47.1%)でつづいてMICA