hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん増悪因子とその制御に作用する制がん物質の研究

1.非接着性ポリマーを用いた足場非依存増殖の定量をヒト上皮由来のがん細胞でも検討し、がん化シグナル抑制物質探索への有用性を示した。2.がん化シグナルに作用する物質の探索から得たエンジェルマイシンの化学構造を決定し、アザチロシンの分子標的を解析した。3.CMLの進展にDNAメチル化の異常が高頻度にみられること、活性なPI3-kinaseに結合する蛋白質リン酸化酵素の存在を示した。4.細胞周期においてサイクリンD1の過剰発現がG1期を短縮させる機構と、RB欠損のがん細胞を選択的にアポトーシス誘導する新規化合物の作用を解析した。5.IL-6の活性修飾物質の探索から新規化合物を見いだし、悪液質抑制効果を観察した。また、IL-6刺激により、Stat3がCRE類似部位結合性36kDa分子と複合体を形成することを見いだした。6.RGDS誘導体の中に転移を抑制する化合物を見いだしその分子機構を解析し、リゾキシンの血管新生阻害作用が血管内皮機能の抑制によることを示した。7.ヒト結腸がん5-FU耐性細胞の耐性機構を解析し、薬剤接触時間の違いが感受性を変化させること、また、多剤耐性がん細胞へM-CSF遺伝子を導入することで転移抑制効果が得られることを示した。1.がん化シグナル抑制物質の探索のために、足場非依存細胞増殖の簡便迅速な測定法を開発した。2.チロシンキナーゼやRasおよびPI3Kなどのシグナル伝達系に作用する物質の探索と制がん作用の解析を行い、ハービマイシンの抗腫瘍効果、IT-62-BのRas阻害作用、K252aのPI3K阻害作用、azatyrosineにより誘導されるCa-31遺伝子のがん化抑制作用などを明らかにした。3.がん抑制遺伝子を活性化する物質の探索系から、anguinomycin類を見いだした。4.IL-6シグナル伝達経路を解析し、H7に感受性の未知のキナーゼがSTATの転写活性化に関与すること、また、IL-6の産生調節物質の探索系から、2種類の新規化合物を見いだし、化学構造を決定した。5.転移を抑制するbestatinの作用の研究から、膜結合型アミノペプチダーゼが転移制御の標的になること、およびradicicolの誘導体が血管新生を阻害し抗腫瘍効果を発揮することを示した。6.ヒト胃がん5FU耐性株の耐性機構を解析し、deoxy-inosineが5FUの感受性を回復させること、また、多剤耐性がん細胞へのM-CSFなどのサイトカイン遺伝子の導入により、抗P糖蛋白抗体の治療効果が増強することを見いだした。
界面乱流の発生機構と構造に関する研究

界面近傍の乱流の発生機構と構造について理論,実験,計算によって調べた。まず界面として空気と水の境界である自由表面について実験を行った。自由表面を貫通して進行する鉛直円柱まわりの粘性流場において表面波の界面の乱れと近傍の速度変動をそれぞれ波高計と熱膜流速計によって計測した。その結果乱れの発生は界面の勾配が正負逆転するところとほぼ一致しており、この乱れが界面固有の不安定性起因することが示された。さらの円柱後方における界面近傍の剥離流場が深さ方向に3次元的な変化を示し,速度変動のスペクトル解析の結果,水深の深いところでは円柱からの周期的な渦放出が支配的であるのに対して,界面付近ではこの周期的な現象が変形または抑制されていることがわかった。つぎにこのような界面の乱れを伴った非線形の強い流体現象を解明するための計算方法を開発した。変形する界面に適合する動座標系を用いてナビエ・ストークス方程式を有限体積法によって離散化する。界面の運動学的条件には界面上の格子点をその法線方向に移動させる新しい方法を提案した。この方法は格子点を再配置することなく,3次元の任意性のある界面の計状を表現することが可能であり,界面においても質量の保存性を備えている。2次元非線形水波の理論値と比較することによって,この界面条件の離散化の適切性と計算の収束性を検証した。さらに自由表面を貫通する鉛直円柱まわりの3次元粘性流の数値実験を行い,円柱後方の渦構造が自由表面波の強い影響を受けて3次元的に変形し,表面近傍で破壊していく過程を明らかにした。
LGBT当事者が大学において抱える困難とニーズに関する包括的研究

本研究では、大学に通うLGBT当事者に対してインタビュー調査を行い、かれらが大学生活において抱える具体的な困難やニーズを質的に明らかにする。その結果から、LGBTに対する大学のサポート体制や学生の主観的体験が学生の精神健康度や学業の動機づけにどのように影響するかについて仮説を生成し、Web調査にて量的に仮説を検証する。本研究の結果から、LGBTを含む多様性に開かれた大学環境を実現するうえで有益な知見を提示できると考えられる。
前頭極への経頭蓋直流電気刺激（ｔDCS）によるパーキンソン病の新しい治療法の開発

パーキンソン病(PD)は、脳内のドパミンが枯渇することで振戦や固縮・無動といった運動症状だけでなく、認知機能や注意力の低下など非運動症状も来す代表的神経変性疾患である。近年増えつつある微弱な電流を用いた経頭蓋直流電気刺激療法(tDCS)は非侵襲性で、多彩なPD症状の改善に有効であるとされる。しかし、改善のメカニズムは解明されていない。本研究では、PDに対するtDCS療法の効果を生理学的側面からも検証することで、同療法のより効果的なプログラムの開発と患者へのフィードバックに繋げ、リハビリテーション医学の発展に寄与する。
フリーラジカル損傷DNAの修復に関与する酵素の研究

細胞のDNAは、毎日多数損傷されており、その修復異常が突然変異、ひいては発がんにつながることが知られている。本研究は、損傷要因の主要なものの一つであるフリーラジカルで損傷されたDNAの修復に関与する酵素の研究を目的とした。ラジカル損傷DNAは、超らせんpUC18DNAをferric nitrilotriacetate(Fe^<3+>-NTA)-過酸化水素(H_2O_2)で処理して作成した。ラジカル消去剤を用いた実験で、このDNA損傷にはヒドロキシラジカルが関与していることを示唆した。測定可能で主要なDNA損傷として、3′block一本鎖切断と塩基欠落部位(APサイト)が誘導されたが、修復系をさらに単純化するためAPサイトの修復研究には酸で脱プリンしたAP-DNAを用いた。これら損傷DNAを、APEXヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼβ、45kDa(または47kDa)タンパク質、DNAリガーゼ、4NTPs、ATP等とインキュベーションすることにより、Fe^<3+>-NTA-H_2O_2誘導一本鎖切断DNAの50%以上、AP-DNA上のAPサイトの殆ど全てが修復された。この修復系を解析した結果、APEXヌクレアーゼは3′blockを除きまたは5′APendonucleaseとしてプライミング作用を示し、45kDa(または47kDa)タンパク質は5′blockを除くことにより修復を可能にすることが示唆された。さらに、APEXヌクレアーゼと類似の性状を持つAP endonucleaseとして、別に30kDa酵素を同定し、部分アミノ酸配列を決定した。47kDa(dRpase様タンパク質)については部分アミノ酸配列を決め、当該cDNAのクローニングを試みている。この様に、フリーラジカル損傷DNAの修復に関与する酵素として、APEXヌクレアーゼ、30kDa酵素、dRpase様酵素(45kDaおよび47kDa)を同定して、さらに研究を進めている。
脳科学的観点からみた子どもの発達段階と学校カリキュラムの妥当性に関する基礎的研究

本研究は、脳科学研究の寄与を学校のカリキュラムづくりとの関係に見て、子どもの心身の発達段階の脳科学的解明と、その成果による学校カリキュラムの妥当性の吟味を、教育学の観点から試みたものである。筆者はそのために、日本とアメリカの主要な脳科学者の著作の分析と本人へのインタヴュー調査を行い、これまでの日本の小中学校のカリキュラムが、子どもの発達段階との関連で、どの程度妥当であるのかについて検討した。その際、筆者の「子どもの興味の中心の移行による発達段階論Shifting Interest-Center Theory(SICT)」を手がかりとした。その結果、日本では、脳科学者として、津本忠治(阪大)、澤口俊之(北大)、川島隆太(東北大)、小泉英明(日立基礎研)、多賀隆太郎(東大)、ヘンシュ貴雄(理研)の各氏、外国では、アメリカのH.Gardner(Harvard U.),K.Fischer(Harvard U.),T.Foster(Univ.of Florida),ドイツのVall der Meer(Humboldt U)に直接インタヴューすることができ、とくにGardner教授からはSICT理論について、「興味」というよりも「要求」というべきではないか、との示唆を得た。現在はSICT理論ではなく、needも加えてSINCT理論として、より妥当な理論にすることができた。全体として、脳科学者からは、子どもの発達段階が複線的重層的であること、臨界期・感受期を考慮すべきこと、外部からは人間による直接刺激が重要であることなど、貴重な示唆を得たが、多くはまだ教育学の知見を科学的に解明するレベルにとどまっており、とくに新しい情報はない。しかし、これらにより小学校から高校までのカリキュラムの全体構造を一部修正して明確化できた。本年度は主として研究課題に関する文献による研究のレヴューと国内・国外の脳科学研究者への訪問調査を行った。ただし、国外については、成果を示せるには3月の2週間の海外調査で、フンボルト大学、ハーバード大学、フロリダ大学等への訪問調査の結果をまたなければならない。まず、これまでの文献調査によれば、子どもの発達段階については、脳科学的に「ある程度」明確な段階区分があることが分かった。しかし、時間軸で縦に年令を追った研究は極めて少なく、欧文ではアメリカのJ.ギード、日本では津本忠治教授や澤口俊之教授の著作によって少しずつ成果が蓄積されている。共通しているのは810歳が大きな変わり目であるということで、それ以前は頭頂葉や後頭葉、側頭葉の発達が著しいが、それ以後は前頭葉、とくにその前頭前野の機能的発達が著しいという。それに応じて、教育的な働きかけも、質的に異なったものにする必要のあることと、前頭前野の働きを促す必要のあることとが示唆された。もう一つ、カリキュラムの構造として「教科」の形に分化したものと「総合的知識」や「経験」の形に統合したものと、どちらが脳科学的に望ましいのかについては、多重知能理論(MI)を展開するH.ガードナーとそれに賛同するハーバード大学の研究者や実践家の考えを、3月のインタヴューで明確にする。脳科学的にみて「総合的学習」を展開しているからである。国内の脳科学者へのインタヴューは、東北大学未来科学技術共同研究センターの川島隆太教授、北海道大学医学部の澤口俊之教授、そして大阪大学医学部の津本忠治教授の三人に対して行い、重要な示唆を得た。三人共通して、脳科学研究によって人間を自由に操作できるものにしようなどという俗論は明確な誤りであり、今後の研究のテーマは「個人差」に向くだろうという。次年度はこのような基礎知識をもとに、安彦の「興味の中心の移行理論」(SICT)を核にして少しでも明確な構造上の枠組みを練り上げることとしたい。
リンゴ品種ふじの高日持ち特性に関する分子機構の解明

リンゴ「ふじ」の日持ち性は驚異的であり、生産量世界一の品種に至らせた大きな要因の一つである。この日持ち特性の分子機構を明らかにし次世代リンゴの選抜育種に有効なDNAマーカーを設定する目的で研究が進められた。日持ち性(硬度計により果肉軟化速度を計測)を異にする14品種(「ふじ」の親品種と「ふじ」の後代品種)を供試し、エチレン合成系や細胞壁崩壊に関わる遺伝子MdACS1,MdACS3,MdACO1,MdPG1,MdGal1,MdExp3,MdERF1,MdERF2の発現様式についてノーザン解析した結果、「ふじ」では、MdACO1の発現がスタートするものの、そのレベルは低く推移すること、またポリガラクツロナーゼ遺伝子MdPG1がほとんど発現されないことが判明した。また、MdPG1に先行してMdACS3発現が認められるが、この発現量はその後の、MdPG1発現量とパラレルであった。次ぎに、「ふじ」の芽条変異体である「弘前ふじ」(熟期が1ヶ月ほど早まる突然変異体で日持ち性が劣る)について同様の解析を進めたところ、MdPG1の強い発現が認められた。MdPG1が「弘前ふじ」で強力に発現することから「ふじ」のMdPG1に変異が生じているわけではなく、それらを制御する因子、すなわち熟期そのものを感知し、完熟プロセスを進行させる機構の中の、なんらかのトランス因子が関与している可能性が高いものと推察された。'ふじ'の日持ち性は驚異的であり、このことがその貯蔵性の高さに直結する。これまでの研究から'ふじ'にみられる成熟時のエチレン生成量が少ない遺伝特性はエチレン合成系のACC合成酵素遺伝子(ACS1)の対立遺伝子型によることが明らかにされた。しかし、'ふじ'と同一遺伝子型を有する品種・系統でも急激な硬度低下が認められることから、ACS1では'ふじ'の貯蔵特性は説明できなかった。そこで、日持ち性について果肉軟化速度を計測し、エチレン合成系や細胞壁崩壊に関わる遺伝子MdACS1,MdACS3、MdACO1、MdPG1、MdGal1、MdExp3の発現様式を解析した。その結果、MdACS3発現から始まる微量エチレンが他の完熟関連遺伝子の発現を開始させる、すなわち、完熟開始の引き金となるが、その発現はエチレンによってネガティブフィードバック制御を受けること、また細胞壁崩壊系の遺伝子発現に必要なエチレン量の閾値は数nl/lであることが明らかとなった。'ふじ'やその後代品種の果実軟化と上記の完熟関連遺伝子発現との関係を調査したところ,完熟進行にともなう軟化速度はポリガラクツロナーゼMdPG1の発現レベルに規定されること、さらに、MdPG1低発現の原因は転写因子などのトランスにあることが示唆された。日持ち性(硬度計により果肉軟化速度を計測)を異にする14品種(「ふじ」の親品種と「ふじ」の後代品種)を供試し、エチレン合成系や細胞壁崩壊に関わる遺伝子MdACS1,MdACS3、MdACO1、MdPG1、MdGal1、MdExp3、MdERF1、MdERF2の発現様式についてノーザン解析した結果、「ふじ」ではMdACO1の発現がスタートするものの、そのレベルは低く推移すること、またポリガラクツロナーゼ遺伝子MdPG1がほとんど発現されないことが判明した。また、MdPG1に先行してMdACS3発現が認められるが、この発現量はその後のMdPG1発現量とパラレルであった。

MdPG1が「弘前ふじ」で強力に発現することから「ふじ」のMdPG1に変異が生じているわけではなく、それらを制御する因子、すなわち熟期そのものを感知し、完熟プロセスを進行させる機構の中の、なんらかのトランス因子が関与している可能性が高いものと推察された。
ダブルネガティブ調節性T細胞におけるCD95細胞死システムの意義

正常ヒトダブルネガティブ(DN)T細胞は自己免疫抑制調節性機能を持つが、自己免疫性リンパ球増殖症候群(Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome : ALPS)において増加するDN T細胞ではCD95/CD95L細胞死誘導欠損により調節性T細胞(Treg)機能が低下し、自己免疫病態が拡大する。DNT細胞のTreg細胞としての特徴を正常およびALPS患者において比較解析した。ALPSのDNT細胞の細胞表面発現はCD7、CD62L、CD45RO発現が低下、CD4+Treg細胞と同様にIL-7R陰性で、CD57, CD38, CD95, HLA-DR, CD45RO陽性であった。一方、CD4+Treg細胞の特異的転写因子FoxP3蛋白発現は認められなかった。DNT細胞の培養後細胞死比率はALPS83%、健常人30%と有意にALPSにおいて有意に増加していた。DNT細胞のTCRレパートワ分布解析ではALPS14症例中5例(35.7%)、正常対照40例中3例(75%)にTCRVβの1種類以上のあきらかな増加を認めた。CDR3spectrum解析ではALPS11例(78.5%)、健常人全例で3種類以上のVβにoligo-clonal patternを認めた。また、ALPSの症状を有するがCD95誘導性細胞死が正常であったALPS III型と考えられていた症例4例のうち1例にモザイク型CD95変異が存在することを証明した。変異比率はDNT細胞では100%、他のリンパ球分画でも1-10%存在し、繊維芽細胞や口腔粘膜上皮細胞にも1%存在し、モザイク型の変異を初めて見出した。正常ヒトダブルネガティブ(DN)T細胞は自己免疫抑制調節性機能を持つが,自己免疫性リンパ球増殖症候群(Autoimmune Lymphoprolferativ Syndrome;ALPS)において増加するDNT細胞ではCD95/Cp95L細胞死誘導欠損により調節性T細胞(Treg)機能が低下し,自己免疫病態が拡大する。ALPSのDNT細胞の細胞表面発現はCD7,CD62L,CD45RO発現が低下,CD4+Treg細胞と同様にIL-7R陰性で,CD57,°CD38,CD95,HLA-DR,CD45RO陽性であった。一方,CD4+Treg細胞の特異的転写因子FoxP3蛋白発現は認められなかった。DNT細胞の培養後細胞死比率はALPS83%,健常人30%と有意にALPSにおいて有意に増加していた。DNT細胞のTCRレパートワ分布解析ではALPS14症例中5例(35.796),正常対照40例中3例(75%)にTCRVβの1種類以上のあきらかな増加を認めた。CDR3spectrum解析では4LPS11例(78.5%),健常人全例で3種類以上のVβにoligo-clgnalpatternを認めた。また,ALPSの症状を有するがCD95誘導性細胞死が正常であったALPS III型と考えられていた症例4例のうち1例にモザイク型CD95変異が存在することを証明した。変異比率はDNT細胞では100%,他のリンパ球ぶ分画でも1-10%存在し,繊維芽細胞や口腔粘膜上皮細胞にも1%存在し,モザイク型の変異を初めて見出した。正常ヒトダブルネガティブ(DN)T細胞は自己免疫抑制調節性機能を持つが、自己免疫性リンパ球増殖症候群(Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome: ALPS)において増加するDN T細胞ではCD95/CD95L

細胞死誘導欠損により調節性T細胞(Treg)機能が低下し、自己免疫病態が拡大する。DNT細胞のTreg細胞としての特徴を正常およびALPS患者において比較解析した。ALPSのDNT細胞の細胞表面発現はCD7、CD62L、CD45RO発現が低下、CD4+Treg細胞と同様にIL-7R陰性で、CD57,CD38,CD95,HLA-DR,CD45RO陽性であった。一方、CD4+Treg細胞の特異的転写因子FoxP3蛋白発現は認められなかった。DNT細胞の培養後細胞死比率はALPS 83%、健常人30%と有意にALPSにおいて有意に増加していた。DNT細胞のTCRレパートワ分布解析ではALPS14症例中5例(35.7%)、正常対照40例中3例(75%)にTCRVβの1種類以上のあきらかな増加を認めた。CDR3 spectrum解析ではALPS11例(78.5%)、健常人全例で3種類以上のVβにoligo-clonal patternを認めた。また、ALPSの症状を有するがCD95誘導性細胞死が正常であったALPS III型と考えられていた症例4例のうち1例にモザイク型CD95変異が存在することを証明した。変異比率はDNT細胞では100%、他のリンパ球ぶ分画でも1-10%存在し、繊維芽細胞や口腔粘膜上皮細胞にも1%存在し、モザイク型の変異を初めて見出した。
頸部体温計測と冷却機能を有した完全ウェアラブル型熱中症予防システム

本研究では,首元で簡単に使用できる完全ウェアラブル型熱中症予防システムの開発を目的とする。バイタル情報並びに環境情報を融合させることで,暑さ指数に基づく熱中症の重症度を検出し,頸動脈の冷却を行い,医療機関から適切なアドバイスが受けられるシステムを構築する。平成30年度は,体温および脈波センサ並びに温湿度センサを融合したデバイスを試作し,機能評価と妥当性確認および実証実験から頸動脈の冷却を行う制御方法について検討した。平成30年度の研究成果は以下の通りである。(1)頸部で体温および脈波並びに環境情報を無拘束で取得できるセンサを集積化したデバイスを試作した。機能評価として環境情報を温度精度±1.0°Cおよび湿度精度±3%で測定できることを確認し,無線モジュールを用いて専用のホームパーソナルコンピュータに取得データを連続記録するシステムを構築し,妥当性確認した。(2)試作したデバイスを用いて身体周辺環境とバイタル情報から頸部を冷却する制御方法について検討した。身体周辺では,室内温度より9%高い環境であるため,熱中症が発生しやすい条件で注意喚起すると危険であることが考えられる。湿度については,身体周辺とは誤差0.5%が観察された。冷却機能を想定した体温変動のトリガーとして応答特性を検証した結果,時定数5秒であり166秒で90%に到達する。体温測定の応答時間,身体周辺の環境情報の差異から熱中症予防のための冷却するタイミングとその方法を見出した。(3)熱中症診断にも活用できる簡易的な血管機能評価法として血圧推定の手法を提案した。脈波センサで測定できる脈波伝播時間から右頸部-右指尖動脈波伝搬速度を算出し,臨床データに基づいた平均血圧との相関関数に適応することで,脈波振幅から血圧を計算する。実測値と比較した結果,平均血圧,拡張期および収縮期血圧は10%程度の誤差率による推定を確認した。当初予定していたバイタル情報および環境情報を融合したセンサの試作の完了期が遅れ,屋内環境における頸部冷却手法について検討はできたが,屋外での日常生活下データが収集できておらず課題が残った。また,当初予期していなかった研究成果として,脈波から精度良く血圧を推定できる手法を提案でき,実験的検証に時間を費やしたことも遅れの理由の一つであると判断する。31年度は,まず,屋外において熱中症が発症しやすい時期でのセンサ情報を収集し、データから検討してきた冷却制御方法を見直す。次に,見直した冷却方法をもとに体温や脈波の変動から冷却時間を検証する。体温による温度差発電については基礎実験は完了しているものの,システム全体の駆動電圧の確保に課題があるため,同時に実験を行っていく。最後に,一貫したシステムで収集したデータを医療機関に開示し,医療スタッフから適切なアドバイスが受けられるシステムを構築していく予定である。環境情報並びにバイタル情報を融合させることで,暑さ指数に基づく熱中症の重症度を検出し,頸動脈の冷却を行い,医療機関から適切なアドバイスが受けられるシステムを構築する。平成29年度は,バイタル情報として体温及び脈波センサを試作し,機能評価と妥当性確認並びに実証実験から暑さ指数に基づく熱中症の重症度を検出するためのバイタル情報収集用センサの有効性を検証した。成果を以下に示す。(1)設計した体温センサは最大許容誤差±0.05°Cの高精度を実現し,標準規格として婦人体温計としても適応できることがわかった。また,室温(初期温度)±標準偏差=22.8±0.7°Cの環境下において飽和温度範囲33°Cから43°Cの範囲では,平均応答時間±標準偏差=14.2±1.5秒であった。これは30秒以内とされている標準規格に準拠していることを確認した。(2)設計した脈波センサは0.7Hz-3.4Hzの通過帯域を持つフィルタを有し,3V単電源動作を可能にした。熱中症診断等にも活用できる簡易的な血管機能評価法として,身体の2箇所として右頸部及び右指尖間の脈波伝搬速度の計測が有効であることが示唆された。(3)日常生活下における頸部での体温及び脈波測定の実験的検証を行った。結果,体温測定では,深部温では外気温の変化による作業者環境の変化を検出できないため,頸部温の測定に有用性があることがわかった。脈波測定では,動脈硬化の指標の一つでもある平均血圧値を脈波センサを取付けるだけで容易に推算し,実測値との比較から20代健常成人を対象とした場合,平均血圧値を平均誤差率±標準偏差=7.26±3.35%で測定できることがわかった。研究目的の一つである体温及び脈波センサの試作が完了し,日常生活下におけるバイタル情報から体温変動の追従性の確認や簡易的な血管機能評価法の提案を行った。当初予期していなかった研究成果を得ることができたため,検証に時間を割くこととなり,当初の計画である環境センサの複合化に着手できなかったのが大きな理由である。環境センサの試作については,デバイスに組み込むセンサの選定は完了しているものの,現在,小型化を図るためのモジュール設計段階である。

平成30年度は,体温および脈波センサ並びに温湿度センサを融合したデバイスを試作し,機能評価と妥当性確認および実証実験から頸動脈の冷却を行う制御方法について検討した。平成30年度の研究成果は以下の通りである。(1)頸部で体温および脈波並びに環境情報を無拘束で取得できるセンサを集積化したデバイスを試作した。機能評価として環境情報を温度精度±1.0°Cおよび湿度精度±3%で測定できることを確認し,無線モジュールを用いて専用のホームパーソナルコンピュータに取得データを連続記録するシステムを構築し,妥当性確認した。(2)試作したデバイスを用いて身体周辺環境とバイタル情報から頸部を冷却する制御方法について検討した。身体周辺では,室内温度より9%高い環境であるため,熱中症が発生しやすい条件で注意喚起すると危険であることが考えられる。湿度については,身体周辺とは誤差0.5%が観察された。冷却機能を想定した体温変動のトリガーとして応答特性を検証した結果,時定数5秒であり166秒で90%に到達する。体温測定の応答時間,身体周辺の環境情報の差異から熱中症予防のための冷却するタイミングとその方法を見出した。(3)熱中症診断にも活用できる簡易的な血管機能評価法として血圧推定の手法を提案した。脈波センサで測定できる脈波伝播時間から右頸部-右指尖動脈波伝搬速度を算出し,臨床データに基づいた平均血圧との相関関数に適応することで,脈波振幅から血圧を計算する。実測値と比較した結果,平均血圧,拡張期および収縮期血圧は10%程度の誤差率による推定を確認した。当初予定していたバイタル情報および環境情報を融合したセンサの試作の完了期が遅れ,屋内環境における頸部冷却手法について検討はできたが,屋外での日常生活下データが収集できておらず課題が残った。また,当初予期していなかった研究成果として,脈波から精度良く血圧を推定できる手法を提案でき,実験的検証に時間を費やしたことも遅れの理由の一つであると判断する。30年度は,まず,モジュール設計段階の環境センサの試作を完了させ,精度確認及び校正後に試作が完了している体温及び脈波センサと複合させる。次に,複合したデバイスの機能評価と妥当性確認並びに実証実験から暑さ指数に基づく熱中症の重症度を検出するための条件を見出し,最後に体温と環境温度差を利用した温度差発電と冷却機能の検証する予定である。31年度は,まず,屋外において熱中症が発症しやすい時期でのセンサ情報を収集し、データから検討してきた冷却制御方法を見直す。次に,見直した冷却方法をもとに体温や脈波の変動から冷却時間を検証する。体温による温度差発電については基礎実験は完了しているものの,システム全体の駆動電圧の確保に課題があるため,同時に実験を行っていく。最後に,一貫したシステムで収集したデータを医療機関に開示し,医療スタッフから適切なアドバイスが受けられるシステムを構築していく予定である。予定していた体温,脈波,環境センサの成型部品の製作を行わず,体温,脈波センサの筐体は3Dプリンターで試作設計し出力したため大幅なコスト削減が可能となったのが理由である。
第一原理バンド計算によるGaAs表面-吸着子相互作用の研究

第一原理バンド計算により、水素吸着GaAs(100)表面および、GaAs(111)表面の電子状態を調べた。GaAs(100)表面の計算では、水素の被覆率がこれまでの、0.5,1.0原子層の場合に加え、1.5,2.0原子層吸着した場合の計算も行った。吸着率が0.5,1.0原子層の場合には、これまで行ってきた吸着サイトに加え、いろいろな吸着サイトに関する計算を行い、ポテンシャル曲面を求めた。この結果、水素吸着反応の反応初期における、水素の吸着位置が正確に求まり、最もエネルギー的に有利な吸着機構を求めることができた。また、水素の表面被覆率を、1.5,2.0原子層とした計算の結果、水素の吸着反応は最終的には1.5原子層まで進むことも確かめた。これは、2.0原子層水素が吸着した場合には、electron counting模型からの要請である、電子を各結合に割り振った後、余った電子がない状態、即ち非金属的な電子状態を作れないことに由来している。この場合も、0.5,1.0原子層水素吸着表面同様、水素吸着により大きな構造変化があり、かつ、表面の化学結合数が減り、ダングリングボンド数が増える場合にも成り立つことである。また、これらの水素吸着反応はシリコン表面における水素の反応(水素が1原子吸着することにより、バックボンドが弱まり、さらに水素が接近することで、バックボンドが切断される)と良く類似していることを確かめた。さらに、水素吸着構造はシリコン表面における、Nothrupの'canted row'模型と類似しており、これらの水素反応が、半導体表面一般に言える普遍的な現象であることを確かめた。
後鳥羽上皇の水無瀬離宮ならびに都市水無瀬の復原的研究

後鳥羽上皇は、日本史の大きな転換点である承久の変との関わりなどの政治史的な側面だけでなく、和歌や蹴鞠などの文化史的な様々な分野にも大きな足跡を残している。水無瀬離宮は、この後鳥羽上皇が、とりわけ愛好した離宮であるといっても過言ではない。しかし、この離宮はその著名さにも関わらず、その全体構造に関する具体的な考察がなされていなかった。私は、平成20年よりこの水無瀬離宮に関して、文献史料・発掘調査成果・航空写真・地籍図・古図・地形図などの分析やフィールドワークを進めてきた。その結果、水無瀬離宮の位置や構造に関して輪郭を明らかにしつつある。また、従来知られていなかった園池の跡と考えられるものも航空写真の分析から新たに発見した。そして地籍図や航空写真から当時の水無瀬離宮を中心とした街区の地割の推定復元も試みた。そのような考察の結果、後鳥羽上皇にとっての水無瀬離宮(水無瀬殿)には巨視的にみて三つの変遷過程があることや、この離宮は単なる別荘という次元のものではなく、本御所、新御所、南御所(薗殿)などの御所群や上皇の御願寺である水無瀬御堂(蓮華寿院)、さらには廷臣の宿所群などから構成される都市的な構造を有するものであったこと、現在もその地割りの一部が残存すること、その関連施設は大阪府島本町東南部の桜井方面にまで展開していたことなどを指摘した。平成22年に学術振興会から科学研究費の補助金を活用することによって、これまでの研究成果を政治史、文学史、芸能史、経済史、宗教史などの側面からさらに補強することができ、離宮の機能面にも考察を深めることができた。従来の研究では、後鳥羽上皇の水無瀬離宮を都市的な観点で考察したものはなかった。水無瀬離宮を中心とした都市としての水無瀬の復元を行うことは、水無瀬を日本の都市史の中に明確に位置づけることになり、今後の日本の都市史研究の上で大きな意味を有するように思われる。この水無瀬離宮の復元的研究は、歴史学や国文学という学術分野だけでなく、高校などにおける歴史教育や古典文学の教育にも大きな影響を与えることであろう。さらにこの研究成果を、地域のためにも活用していきたいと考えている。
がん精巣抗原遺伝子群のがん細胞と生殖細胞における共通発現の意義の解明

生殖細胞は、次世代の個体を生み出すことのできる細胞であり、また、がん細胞は、無限増殖能や転移能を持つ特殊な細胞である。これら2種類の細胞に共通して高発現が見られる遺伝子が存在し、それらはがん精巣抗原(CTA)遺伝子と呼ばれている。CTAはヒトで同定されたが、ヒトの生殖細胞の解析は困難であるため、その機能や存在意義は明らかになっていない。そこで、本研究ではCTA遺伝子の発現制御機構と生理的機能を明らかにすることから、これらが生殖細胞とがん細胞に共通して発現する意義の解明を目指した。同定したマウスのCTA遺伝子(87遺伝子)から,がん細胞において細胞増殖に関わる遺伝子をスクリーニングしたところ,Tekt5ががん細胞において細胞増殖や生存に大きく機能していることが明らかになった。Tekt5はがん細胞において,チューブリンのアセチル化修飾酵素であるHDAC6の発現を制御することによって,チューブリンの安定化に関わり,安定した細胞周期を維持することに機能していることが示唆された。また,生殖細胞での機能を明らかにするため,精細管に直接siRNAをインジェクションし,生殖細胞にてTekt5の機能低下(Tekt5 KD)を行った。その結果,Tekt5 KD精巣では精子細胞への分化が抑制されている可能性が示された.生殖細胞においても,Tekt5がチューブリンの安定化に関わり,精子の形態形成に関与していると考えられた.本研究では,CTA遺伝子の生殖細胞とがん細胞における解析を行い,生殖細胞とがん細胞での機能の共通点や相違点について検討した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。がん精巣抗原(cancer/testis antigen;CTA)遺伝子は、生殖細胞とがん細胞に共通して発現が見られる遺伝子である。現在までにCTAはヒトにおいて同定されてきたため、生殖細胞における解析が行われている報告はほとんどない。本研究では、マウスを用いて生殖細胞とがん細胞、双方からのアプローチによる解析を行い、CTA遺伝子がこれら2種類の細胞でのみ共通して発現する意義とその生理的機能を解明することを目的とする。CTA遺伝子は生殖発生の一端を担う遺伝子である可能性とともに、がんの免疫治療の有望なターゲットになりうる。マウスにおけるCTA遺伝子の中から、Fthl17遺伝子に着目し、その発現制御機構を解析し、がん細胞と生殖細胞のひとつである精原幹細胞では、Fthl17遺伝子は上流のDNAメチル化状態によって発現レベルが制御されていることを明らかにした。これは、それぞれの細胞において、Fthl17上流に結合する転写因子が異なっていることが起因していると予想された。また、同定した87のマウスCTA遺伝子について、がん細胞での細胞増殖・生存への関与の検討を行ったところ、細胞数に変化が見られた遺伝子は45遺伝子見られた。そのうちTekt5はがん細胞において、ノックダウンによって細胞周期のG1期蓄積、アポトーシスの亢進を示した。精原幹細胞において、ノックダウンを行っても細胞数への影響は確認されなかった。さらに、Oip5はがん細胞の生存に関与しており、精原幹細胞で高発現が確認された。精原幹細胞でsiRNAによって一過的Oip5 KDを行ったところ、Oip5の発現低下は確認できたが、これによる細胞数への影響は見られなかった。がん細胞におけるCTA遺伝子の機能スクリーニングを行い、細胞増殖・生存に関与する可能性のあるCTA遺伝子を示すことができた。これにより、がん細胞の性質維持に大きく寄与しているCTA遺伝子を得ることができた。また、その中から、がん細胞においての機能が明らかでないTekt5について細胞周期やアポトーシスへの関与を示唆する結果を得た。しかし、生殖細胞における解析については、精原幹細胞においてDox誘導性のノックダウン株が作製できなかったこともあり、やや遅れが出ている。今後は生殖細胞での機能解析に重点を置き、研究の進展を目指す。

現在まで、生殖細胞での機能解析のため、Dox誘導性shRNA発現レンチウイルスベクターによって精原幹細胞株であるGS細胞で目的遺伝子のノックダウンを試みていたが、発現低下が確認できなかった。これに代わって、生殖細胞での機能解析を行う系として、ノックアウトマウスの作製とin vivo knockdownを検討している。ノックアウトマウスは、エレクトロポレーション法による受精卵へのCRISPR-Cas9システムの導入によってF0個体の解析が可能である。現在、ガイドRNAベクターを作製している。in vivo knockdownでは、生体内において精巣にsiRNAをインジェクションし、目的遺伝子をKDすることで、迅速な表現型が確認できるという報告に基づいている。この系について、論文と同様のRad51 KDを試みているが、論文と異なるマウスの系統では結果が再現されなかった。現在、論文と同じC57BL/6系統のマウスで確認している。論文の結果が再現でき次第、解析候補遺伝子のsiRNAをインジェクションし、精巣での表現型を確認する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ウナギにおけるリポ蛋白質代謝

ウナギ、コイ、ニジマス等の魚類血中の脂質量は、ヒトの家族性高コレステロール症や高トリグリセリド症よりも数倍高いことが知られているが、その理由については分かっていない。血清中の脂質の大半はリポ蛋白質として存在しているので魚類のリポ蛋白質の代謝を明かにすることによりこの疑問を解くことができると考え研究を行った。リポ蛋白質代謝を検討するために、以下の4点について研究を行った。1.肝細胞におけるHDLレセプターについて、合成した蛍光物質で標識したHDLを用いて検討した結果、肝細胞にはHDLレセプターが存在し、そのKdは約20μgHDL/mlであることが分かった。また、HDLを培養肝細胞に添加するとリポ蛋白質合成・分泌が促進されることが分かった。2.魚類の脂質の特徴としてドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸等の高度不飽和脂肪酸が多く含まれている点である。そこでDHAのリポ蛋白質合成・分泌に及ぼす影響について検討した。ウナギ培養肝細胞においてDHAはリポ蛋白質の合成は促進するが、分泌を阻害すること、また細胞内トリアシルグリセロール、コレステロール合成を促進することが明かになった。3.ウナギのように回遊性の魚類では甲状腺ホルモンと回遊との間に関係があることが知られている。T4によるリポ蛋白質の合成に与える影響を検討した。T4は肝細胞における脂質合成を促進すると同時にリポ蛋白質の合成を促進することが分かった。4.産卵のために海へ下る下りウナギのリポ蛋白質合成並びに血清リポ蛋白質を、未成熟の養殖ウナギと比較した。下りウナギの肝細胞は養殖ウナギの肝細胞よりもリポ蛋白質を活発に合成し、分泌したリポ蛋白質の特徴は脂質の割合が養殖ウナギが分泌したものより高いことであった。血清リポ蛋白質は逆に養殖ウナギのものの方が脂質の割合が高くなっていることが分かった。ウナギ肝細胞は、HDLを細胞内にレセプターを介したendocytosisにより取り込まれることが分かった。HDLは、哺乳動物の場合、末梢組織からコレステロールを肝臓へ運ぶ役割を持つものとして知られている。肝臓でコレステロールは、分解され胆汁として胆嚢に蓄えられる。ところがウナギの肝細胞にHDLを添加すると、HDLは肝細胞に取り込まれるが肝細胞からコレステロール、リン脂質、トリアシルグリセロールの流出を促進することが分かった。その際、脂質はHDLとして流出するのではなくVLDL様リポ蛋白質として肝臓から分泌されることが分かった。このHDLの機能は、今まで報告されたことのない新しい機能で、魚類のリポ蛋白質代謝の特徴にあげられると思われる。一方、細胞内の脂質合成を促進させて細胞内脂質含量を増加させ、リポタンパク質の合成・分泌に対する影響を調べた。脂質合成を促進させるために、チロキシン(T4)を利用した。10^<-8>MT4を肝細胞に添加すると、脂質の合成が促進され細胞内の脂質が増加すると同時に、VLDL様リポ蛋白質の合成・分泌が促進された。即ち、肝臓内の脂質が外因性、内因性いづれの理由によって増加しても、VLDL様リポ蛋白質の合成・分泌が促進されることが分かった。

リポ蛋白質代謝を検討するために、以下の4点について研究を行った。1.肝細胞におけるHDLレセプターについて、合成した蛍光物質で標識したHDLを用いて検討した結果、肝細胞にはHDLレセプターが存在し、そのKdは約20μgHDL/mlであることが分かった。また、HDLを培養肝細胞に添加するとリポ蛋白質合成・分泌が促進されることが分かった。2.魚類の脂質の特徴としてドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸等の高度不飽和脂肪酸が多く含まれている点である。そこでDHAのリポ蛋白質の合成は分泌に及ぼす影響について検討した。ウナギ培養肝細胞においてDHAはリポ蛋白質の合成は促進するが、分泌を阻害すること、また細胞内トリアシルグリセロール、コレステロール合成を促進することが明かになった。3.ウナギのように回遊性の魚類では甲状腺ホルモンと回遊との間に関係があることが知られている。T4によるリポ蛋白質の合成に与える影響を検討した。T4は肝細胞における脂質合成を促進すると同時にリポ蛋白質の合成を促進することが分かった。4.産卵のために海へ下る下りウナギのリポ蛋白質合成並びに血清リポ蛋白質を、未成熟の養殖ウナギと比較した。下りウナギの肝細胞は養殖ウナギの肝細胞よりもリポ蛋白質を活発に合成し、分泌したリポ蛋白質の特徴は脂質の割合が養殖ウナギが分泌したものより高いことであった。血清リポ蛋白質は逆に養殖ウナギのものの方が脂質の割合が高くなっていることが分かった。
スギ花粉－トマト 共通アレルゲンの解析

スギ花粉症患者末梢血B細胞から樹立したヒトーマウスハイブリドーマから,スギ花粉アレルゲンCry j2およびトマト抽出液に結合するIgM抗体を分泌する3株を選別した。Cry j2のアミノ酸配列をもとに合成したペプチドに対する結合試験により,ふたつの抗体は一次構造上に抗体結合部位を持たないことが判明した。これに対して14-404-117抗体はCry j2のアミノ酸配列101140の範囲に結合し,抗体が認識するCry j2の中心的抗体結合配列はFKVDであった。FKVD配列を持つトマトタンパク質を検索したところ,アスコルビン酸酸化酵素,セリン/スレオニンプロテインキナーゼに同じ配列が存在した。スギ花粉アレルギー患者数人の末梢血の抗スギ花粉抗体を簡易キットを用いて測定し,抗体価の高い患者#14を選別した。患者#14からあらためて採血し,希釈した血液から密度勾配遠心によって単球画分を分離した後,シクロスポリン存在下でEpstein-Barrウィルスを感染させて複数のBリンパ芽球様細胞(BLC)を含む96グループの細胞群を得た。このような細胞は培養液中で数十回まで増殖しながら抗体を分泌することができると考えられる。スギ花粉抽出液,市販の数種の栽培種トマト抽出液,本学農場で栽培されたトマト抽出液を抗原として酵素免疫測定法(ELISA)を用いてBLCが分泌する抗体との反応性を測定したところ,トマト品種による反応性の差異が認められた。なかでも農場において有機的に栽培された品種と強く反応する抗体分泌細胞が存在することが明らかになった。スギ花粉抽出液と国産トマトの標準品種と考えられる桃太郎抽出液に共通して反応した抗体分泌細胞を選択し,スギ花粉抽出液を抗原としたトマト抽出液での抗体の結合競争阻害試験,あるいはその逆の競争阻害試験を行い,それぞれに濃度依存的阻害が見られたことから,スギ花粉抽出液とトマト抽出液には共通のアレルゲンが存在することが推論された。またこれらの研究と並行して,BLCの抗体分泌を永続させるための方法として,マウス骨髄腫細胞株を用いた細胞融合によるヒトーマウスハイブリドーマの作出を試みたが,ハイブリドーマは得られていない。ハイブリドーマの選択に用いる培地添加成分の濃度を細かく設定する必要があると考えられた。新たに抗スギ花粉抗体高陽性患者#15から末梢血リンパ球を分離した。シクロスポリン存在下でリンパ球にEpstein-Barrウィルスを感染させて芽球化して増殖を誘導し,172グループのBリンパ芽球様細胞群(BLCs)を得た。この中からスギ花粉およびトマト果実抽出液双方に反応性のある抗体分泌細胞2群を選抜し,マウス骨髄腫細胞株と細胞融合を行った。前年度から引き続き細胞融合後の選択培養条件の検討を行い,BLCを低濃度のウアバイン存在下で死滅させる条件を設定することに成功した。細胞融合の結果,ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ2クローンを樹立することができた。すでに保有しているスギ花粉アレルゲンタンパク質Cry j1およびCry j2に反応するヒトモノクローナル抗体3種とともに抗原特異性を検討したところ,トマト果実抽出液に反応するヒトモノクローナル抗体は,いずれもCry j2に結合することが判明した。Cry j2の一次構造を元に,20アミノ酸長で10アミノ酸ずつのオーバーラップを含むペプチド群を固相合成し,固相ペプチドELISAによってヒトモノクローナル抗体の結合性を調べたところ,4種のヒトモノクローナル抗体のうち,ペプチドに結合したものは1抗体のみであった。さらに結合したペプチド配列から10アミノ酸,8アミノ酸,6アミノ酸長のオーバーラップペプチドを合成し,コアとなる短いペプチド配列の存在を見いだした。このような配列と相同性を持つトマト果実アレルゲンの検索を行ったが,類似配列は見つかっていない。固相ペプチドELISA陰性であった3クローンについては,Cry j2の立体構造を認識しているものと推定された。今後,立体構造上に存在するエピトープを明らかにする解析方法の導入が必要である。平成27年度は,細胞融合後の選択培養条件の確立により,スギ花粉およびトマト果実抽出液に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するヒトーマウスハイブリドーマの作出に成功したことが大きな成果である。このうち,1抗体のみではあるが,得られたヒトモノクローナル抗体が結合するペプチド配列を明らかにすることができたことは特筆に値する。これまでスギ花粉アレルゲンタンパク質Cry j2に結合するヒトモノクローナル抗体の報告はなく,わずかに複数のスギ花粉症患者血清を用いたB細胞エピトープの解析が行われているのみであった。ヒトモノクローナル抗体のこの分野への応用は,単一エピトープの詳しい解析の強力なツールとなると考えられる。スギ花粉症患者末梢血B細胞から樹立したヒトーマウスハイブリドーマから,スギ花粉抽出液およびトマト抽出液に結合するIgMクラス抗体を分泌する3株(14-404-117,15-38-4-3,および15-85-7-13)を選別し,詳しく特異性を調べたところ,いずれの抗体もスギ花粉アレルゲンタンパク質Cry j2に結合した。Cry j2のアミノ酸配列をもとに,固相法で20アミノ酸長で10アミノ酸ずつシフトしたペプチドを合成し,3種類の抗体が結合する配列を検索した。15-38-4-3および15-85-7-13抗体はいずれのペプチドにも反応しなかったことから,一次構造上に抗体結合部位を持たないと推定した。

14-404-117抗体はCry j2のアミノ酸配列101140の範囲に結合した。そこで10アミノ酸長2アミノ酸シフトのペプチドを合成し,結合する配列を決定した。決定した配列をもとにさらに短い8アミノ酸長,6アミノ酸長,4アミノ酸長ペプチドを合成したところ,HFTFKVDGの配列中から合成した4アミノ酸長のいくつかのペプチドに結合した。HFTFKVDG配列のアミノ酸を1残基,あるいは連続する2残基ずつアラニンに置換(アラニンスキャン)したペプチドを合成して14-404-117抗体の結合を調べたところ,FKVDのいずれかがアラニンに置換された時に抗体の結合性が著しく低下することを認めた。このことから,14-404-117抗体が認識するCry j2の中心的抗体結合部位(コアエピトープ)はFKVD配列であると結論した。杉花粉症患者の一部はトマトによる口腔アレルギー症候群(OAS)を発症する。そこで,トマトタンパク質に14-404-117抗体が結合するコアエピトープが存在するかを検索したところ,アスコルビン酸酸化酵素,セリン/スレオニンプロテインキナーゼに同じ配列が存在した。スギ花粉症患者末梢血B細胞から樹立したヒトーマウスハイブリドーマから,スギ花粉アレルゲンCry j2およびトマト抽出液に結合するIgM抗体を分泌する3株を選別した。Cry j2のアミノ酸配列をもとに合成したペプチドに対する結合試験により,ふたつの抗体は一次構造上に抗体結合部位を持たないことが判明した。これに対して14-404-117抗体はCry j2のアミノ酸配列101140の範囲に結合し,抗体が認識するCry j2の中心的抗体結合配列はFKVDであった。FKVD配列を持つトマトタンパク質を検索したところ,アスコルビン酸酸化酵素,セリン/スレオニンプロテインキナーゼに同じ配列が存在した。患者#14からのBLC調製は順調に実施できた。ELISAによるBLC分泌抗体のスクリーニングにおいては,トマト品種よる抗体の反応性の差異がみられた。トマトによる口腔アレルギー症候群発症は,熱に不安定なアレルゲンによるものと考えられるが,加工用トマト品種の加工品(トマトジュース)との反応が見られる抗体もあることから,抗体が反応するアレルゲンの単離精製と詳しい解析が期待される。結合競争阻害試験も順調に進み,初年度の計画から一部平成27年度計画まで踏み込んだ研究が実施できた。未解決の問題点はヒトーマウスハイブリドーマの作出ができなかったことである。選択試薬濃度の細かい調整が必要である。具体的には,より低濃度のウアバインによってBLCを死滅させることが重要と考えられる。平成28年度は本研究の最終年度である。これまでに得られたスギ花粉およびトマト果実抽出液に対する複数のヒトモノクローナル抗体の特異性をより詳しく検討し,トマトによる口腔アレルギー症候群発症に関わるアレルゲンエピトープの解析を行う。ただし,Cry j2およびヒトモノクローナル抗体のタンパク質としての回収量がきわめて少ないことが課題の一つであることから,抗体高分泌クローンの分離を繰り返し試みる。以下に主な研究内容を記す。
ＰＳＧＬ－１を標的としたメタボリックシンドロームの新規治療薬の開発

抗PSGL-1抗体は2型糖尿病モデルマウスにおいて、内臓脂肪細胞の肥大化と内臓脂肪組織局所での炎症を抑制し、さらにインスリン抵抗性を改善することを確認した。ムチン型硫酸化多糖化合物であるフコイダンを分子量により大中小分子に分離精製を行い、In vitroにおいて血管内皮細胞と単球細胞に対する細胞接着阻害効果について検討を行っている。今後は最も細胞接着阻害効果の高い化合物を2型糖尿病モデルマウスに経口投与し、インスリン抵抗性など検討を行っていく。まず2型糖尿病モデルマウスに対する抗PSGL-1抗体の投与実験を行った。抗体投与群では空腹時血糖値は有意に低下し、腹腔内ブドウ糖負荷試験や腹腔内インスリン負荷試験の結果でも有意にインスリン抵抗性の改善を認めた。また精巣周囲脂肪組織の検討では、抗体投与群において炎症関連遺伝子やPSGL-1などの接着分子のmRNA発現の有意な低下を認め、さらに脂肪細胞のサイズも有意に小さいことが分かった。以上より、抗PSGL-1抗体投与により内臓脂肪細胞の肥大化が抑制され、内臓脂肪組織局所での炎症が改善した結果、インスリン抵抗性が改善したと考えられた。次に2型糖尿病モデルマウスに対するムチン型硫酸化多糖の投与実験については、フコイダンを用いてマウスに皮下注射投与し実験を繰り返し行ったが、一定の結果が得られなかった。フコイダンの皮下投与では吸収にばらつきがあるものと考えられた。したがって当初の予定を変更し、先にフコイダンを神戸天然物化学(株)に委託し分子量により大中小分子に分離精製を行った。In vitroにおいて、血管内皮細胞と単球細胞に分離精製した各分子量のフコイダンを投与し細胞接着阻害効果について検討を行っており、今後は最も細胞接着阻害効果の高い分子量のムチン型硫酸化多糖化合物を2型糖尿病モデルマウスに経口投与し、インスリン抵抗性や脂肪・肝臓の組織学的変化など検討を行っていく予定である。近年、インスリン抵抗性が内臓脂肪での炎症に起因していることが明らかとなり、我われは炎症の起点がマクロファージの浸潤であると考え接着分子の阻害に着目した。我われの高脂肪食負荷PSGL-1ノックアウトマウスでは血糖、脂質の改善効果を認めており、ムチン型硫酸化多糖化合物はPSGL-1と結合作用のあるセレクチンの阻害活性を有しているため、安全性およびコスト面でも創薬として実現の可能性が高いと考えている。予定実験1)2型糖尿病モデルマウスに対する抗PSGL-1モノクローナル抗体の投与実験を実施した結果、抗PSGL-1抗体投与群では対照群と比較し、体重、内臓脂肪重量、脂質代謝データに有意差を認めなかったが、空腹時血糖値の有意な低下を認めた。また、腹腔内ブドウ糖負荷試験において、抗PSGL-1抗体投与群では対照群に比べて血糖値、IRIともに有意な低下を認め、腹腔内インスリン負荷試験の結果でも、抗PSGL-1抗体投与群では対照群に比べて血糖値の有意な低下を認めた。以上より体重が変わらないにも関わらず、抗PSGL-1抗体投与による有意なインスリン抵抗性の改善を認めた。さらに、精巣周囲白色脂肪組織におけるmRNA発現の検討では、マクロファージマーカーであるCD68や炎症に関連するMCP-1、接着分子であるPSGL-1、P-selectinのmRNA発現の有意な低下を認めた。精巣周囲白色脂肪細胞の面積の検討では、抗PSGL-1抗体投与群において脂肪細胞のサイズが有意に小さいことが分かった。以上の結果から、抗PSGL-1抗体投与により、内臓脂肪組織細胞の肥大化が抑制され、内臓脂肪組織局所での炎症が改善した結果、インスリン抵抗性が改善したと考えられた。次に、予定実験2)2型糖尿病モデルマウスに対するムチン型硫酸化多糖の投与実験については、現在フコイダンを用いてマウスに皮下注射投与を行い、実験が進行中である。平成24年度の予定実験1)は予定通り終了したが、予定実験2)2型糖尿病モデルマウスに対するムチン型硫酸化多糖(Fucoidan、ヒアルロン酸、スルファチド)の投与実験については、投与量や投与期間、投与方法の予備実験に時間を要したため、予定よりやや実験が遅れている。しかし、前年度から行っていた他実験「早期糖尿病性腎症におけるテルミサルタンの抗酸化作用の検討」の実験が、今年度追加実験も終了し論文が掲載されたため、次年度は本実験に研究時間を集中できると考えられる。平成24年度のマウス投与実験に用いたムチン型硫酸化多糖化合物であるフコイダンを分子量により大分子、中分子、小分子に分離精製する(以上は、神戸天然物化学(株)に委託する)。In vitroにおいて、刺激した血管内皮細胞と単球細胞に各分子量に分離精製したフコイダンを投与し、細胞接着阻害効果について検討する。

最も細胞接着阻害効果の高い分子量のフコイダンを2型糖尿病モデルマウス(db/dbマウスおよび高脂肪食負荷BL6マウス)に経口投与し、対象(非硫酸化多糖投与)群と比較して腹腔内投与ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験にてインスリン抵抗性の変化を検討する。また、内臓脂肪組織を採取し、組織学的にマクロファージや脂肪細胞のサイズの変化を検討する。内臓脂肪組織よりRNAを抽出し、F4/80, MCP-1, TNF-α, IL6, iNOSなどの炎症関連遺伝子や, PSGL-1, P-selectin, ICAM-1などの接着分子のmRNAの変化を検討する。また肝臓組織における中性脂肪含量や組織学的変化を検討し、内臓脂肪組織と同様に炎症関連遺伝子のmRNA発現の変化についても検討する。さらに、当大学研究施設にあるIVISR SPECTRUM(Xenogen)と小動物用CTを用いて、経口投与した薬剤が、内臓脂肪組織へ吸収、分散しているか確認を行う。該当なし