hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
苦味および渋味感受性に及ぼす唾液中成分ならびに味覚レセプターの遺伝子多型の影響

近年・苦味・甘味・うま味等の味覚レセプターが同定され、味覚に関して未解明な点を分子レベルで検討することが可能となってきた。苦味の感受性は個人によらて異なっており、例えばアブラナ科植物の苦味を拒否する集団が存在する。疫学的調査では、アブラナ科植物の摂取量が少ない集団での発ガン率が高い結果が出ている。これは、レセプターの感受性の個体差と関連している。本研究は、ヒト被験者の舌の表皮組織及び唾液を非侵襲的に採取して、そのDNAから味覚レセプターを個体ごとに解析して、苦味感受性の個人差を分子レベルで明らかにしようと企図した。併せて、関連性のある味とされる渋味感受性についても、被験者とラットを用いてその渋味の発生する機構を科学的に明らかにすることを目的とした。1)渋味受容に関する研究渋味の受容機構をラットの鼓索神経応答から検討した結果、酸性化グリシニンでは唾液中イオン成分が、タンニン酸では唾液中たん白質がそれぞれ渋味の受容に関与していることが推測された。また、酸性化グリシニン溶液では、NaHCO_3溶液の添加量に応じて応答が強くなったことから、酸性化グリシニンの渋味発生機構に唾液由来のNaHCO_3成分が大きく寄与していることが示された。2)ヒト被験者の苦味レセプター遺伝子SNP(遺伝子多型)解析本研究により、ヒトDNA調製法、SNP検出法が確立でき、左右の口腔内頬を綿棒でこすることによるサンプリングにより、SNPの検出が可能となった。PROP(プロピルチオウラシル)の感受性がTAS2R38のSNPの組み合わせ、ハプロタイプによって決定されていること、さらに、今回SNPアレルのホモ、ヘテロの組み合わせに規則性があり、集団をタイプ分けすることができた。今回、オーファンレセプターであるTAS2R55のnucleotide位置587、794、875の3つのSNPがカフェインの苦味感受性に関与している可能性が示唆された。近年、苦味、甘味、うま味等の味覚レセプターが同定され、味覚に関する諸問題を分子レベルで検討することが可能になってきた。苦味の感受性は個人によって異なっており、例えばアブラナ科植物の苦味を拒否する集団が存在する。疫学的調査ではブロッコリーやカリフラワーなどのアブラナ科植物の摂取量が少ない集団での発ガン率が高い結果がでている。これは、レセプターの感受性の個体差と関連している可能性がある。本研究は、被験者の舌の表皮組織及び唾液を非侵襲的に採取して試料として、その味覚レセプターと唾液中味覚修飾因子を個人・個体ごとに解析して、苦味感受性の個人差を分子レベルで明らかにするために企図した。併せて、関連性のある味とされる渋味感受性についても、被験者とラットを用いてその個人差・個体差の生ずる理由を科学的に明らかにすることとした。最初に、「唾液中の苦味または渋味修飾因子の同定」を行った。唾液中の渋味修飾因子の探索については、各個人の唾液を試料として、これまで指摘されてきているpH、proline rich protein(PRP)量の個人差についてまとめるべく検討を行った。渋味は、まだその受容機構が知られていないので、事前にラットを用いた電気生理的検討を行った。その結果、渋味が物理感覚(三叉神経介在性)ではなく、味神経によって伝えられることを、代表的なタンニン酸等のほかに渋味を感ずる酸性化大豆タンパク質を用いて味神経(鼓索神経、舌咽神経)を用いて証明した。併せて神経線維解析(fiber profile patternの解析)を行って、このことを確認した。また、唾液中の分泌タンパク質のmRNA発現とタンパク質発現の定量を行うので、マイクロプレート吸光度リーダーを購入し、その後の解析に頻繁に使用している。現在、ヒト舌表皮組織からの苦味レセプター標本のサンプリング法を確立しつつあるところである。

PROP(プロピルチオウラシル)の感受性がTAS2R38のSNPの組み合わせ、ハプロタイプによって決定されていること、さらに、今回SNPアレルのホモ、ヘテロの組み合わせに規則性があり、集団をタイプ分けすることができた。今回、オーファンレセプターであるTAS2R55のnucleotide位置587、794、875の3つのSNPがカフェインの苦味感受性に関与している可能性が示唆された。
酵母発現系を用いた甲状腺ホルモンレセプター結合因子のクローニング

1:甲状腺ホルモンレセプター結合因子のクローニング甲状腺ホルモンレセプター結合因子のクローニングを、酵母発現系を用いるTwo hybridsystemによりおこない、Hele細胞より構築されたcDNAライブラリーより、正常甲状腺ホルモンレセプターに結合する1つのクローンを得た。このクローンの塩基配列を決定したところmouse nuclear receptor co-repressor (mN-CoR)のhuman homologue (hN-CoR)であった。このクローンは部分クローンであることより、全長をクローニングするためHela細胞より構築されたcDNAライブラリーをPlaque hybridization法にてスクリーニングしたところ、N-CoRと約80%の相同性を認めるN-CoR variantであるクローンH3を得た。このクローンH3より演繹されるアミノ酸配列は、N-CoRのアミノ酸が欠失し、またそのカルボキシル端の120個のアミノ酸が異なる55個のアミノ酸に置換したhN-CoRの新たなvariantと考えられるものであった。mN-CoRは、TR、レチノイン酸レセプター(RAR)と結合し、その転写活性抑制に関与するco-repressorとされ、mN-CoRのアミノ端に転写活性抑制に関する部位が、またそのカルボキシル端にTR, RARと結合する部位があるとされている。variant H3では、N-CoRがレセプターと結合するのに必要なカルボキシル端の部位の一部のアミノ酸が置換されていることより、TR, RARとの結合が障害されているか、レセプターとの結合特異性が変化している可能性が考えられた。こうしたco-repressorのvariantの存在により、甲状腺ホルモンレセプターによる転写調節が微妙に修飾されることが示唆された。hN-CoRとそのvariantであるH3の細胞における発現を、様々なヒトの細胞株のtotal RNAを用いてRT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)を行うことにより検討した。検討した10種類の細胞株すべてにおいてhN-CoRとvariant H3の発現を認めた。このことより、N-CoRとそのvariantは普遍的に組織で発現しているものと考えられた。甲状腺ホルモンレセプター結合因子のクローニングを、酵母発現系を用いるTwo hybrid systemにより行った。Two hybridsystemとは、酵母の転写因子であるGal4のDNA結合部位及び転写活性部位を分離し、それぞれにA、Bといった別の蛋白を融合蛋白として発現させ、AとBが結合したときのみGal4転写因子が再構築され、Gal4反応性の遺伝子の転写活性増強が起こることを利用して、二つの蛋白の結合状態を検討する方法である。また、Aに既知の蛋白を使い、BにcDNAライブラリーを組み込むことにより、Aと結合する未知の蛋白をクローニングすることが可能となる。まず、このTwo hybridsystemの有効性をAに甲状腺ホルモンレセプター、BにレチノイドXレセプターを組み込み、その結合を確認した。次いでBにHela細胞より構築されたcDNAライブラリーを用いて、スクリーニングを行った結果、正常甲状腺ホルモンレセプターに結合する1つのクローンを得た。その大きさは、3.5Kbで、一部を塩基配列決定した結果、先頃同定されたTRAC(Thyroid hormone receptor associated corepressor)の一部と類似した配列を認めた。しかしながら、TRACと全く異なるアミノ酸部位を含むことにより、我々の得たクローンはTRACそのものではなく、TRACのアイソフォームと考えられた。1:甲状腺ホルモンレセプター結合因子であるNuclear receptor co-repressor(N-CoR)のvariantのクローニング既に酵母発現系を用いるTwo hybrid

systemにより1つの甲状腺ホルモンレセプター結合因子(B1)を得、塩基配列決定によりmouse nuclear receptor co-repressor (mN-CoR)のhuman homologue (hN-CoR)であった。B1の全長をクローニングするためHela細胞より構築されたcDNAライブラリーをPlaque hybridization法にてスクリーニングしたところ、N-CoRと約80%の相同性を認めるN-CoRvariantであるクローンH3を得た。このクローンH3より演繹されるアミノ酸配列は、N-CoRのアミノ端が欠失し、またそのカルボキシル端の120個のアミノ酸が異なる55個のアミノ酸に置換したhN-CoRの新たなvariantと考えられるものであった。mN-CoRは、TR、レチノイン酸レセプター(RAR)と結合し、その転写活性抑制に関与するco-repressorとされ、mN-CoRのアミノ端に転写活性抑制に関する部位が、またそのカルボキシル端にTR,RARと結合する部位があるとされている。variant H3では、N-CoRがレセプターと結合するのに必要なカルボキシル端の部位の一部のアミノ酸が置換されていることより、TR,RARとの結合が障害されているか、レセプターとの結合特異性が変化している可能性が考えられた。hN-CoRとそのvariantであるH3の細胞における発現を、様々なヒトの細胞株のtotal RNAを用いてRT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)を行うことにより検討した。検討した10種類の細胞株すべてにおいてhN-CoRとvariant H3の発現を認めた。
造血幹細胞発生機構解明のためのマイクロデバイスの開発

本研究では、ES細胞から血液細胞への分化誘導をデバイス内の微細流路内で行い、シリンジポンプを用いてデバイス内の細胞に定量的に流れ刺激やNOによる化学刺激を与えることで、胎生期の造血を模擬した実験系の構築を試みた。送液培養の影響を調べた結果、静置培養と比較して血液細胞産生数が多いことが示された。この結果は、既報のマウスやゼブラフィッシュ胚で血流が関与するという結果と一致する。次にNO濃度の血液細胞産生数への影響を調べた。NO発生剤を加えた場合産生数の増加が見られた。NO消去剤を加えたときには、予想通り血液細胞数の減少が見られ、NOは血液細胞産生に関与していることを裏付けた。すべての血液細胞の源となる造血幹細胞は、マウスでは胎生10.5日目ごろより背側大動脈腹側血管腔から発生する。近年、ゼブラフィッシュなどを使った実験により血流による物理刺激が造血幹細胞発生を促すことが示唆され注目を集めている。この機構を解明するには、マイクロ流体デバイスを用いる実験系が最適であると着想した。本研究では、マイクロ流体デバイス内の微細流路に弾性率の異なるゲルをコート後、背側大動脈に相当する細胞を培養し、送液培養で細胞にシアストレスを与えることで、胎生期の背側大動脈における造血幹細胞発生部位を模擬した実験系を作り、造血幹細胞の発生へのシアストレスの影響を明らかにすることを目的とする。今年度は、in vitro分化誘導したES細胞(中胚葉前駆細胞)から調整した血管内皮細胞集団から造血幹細胞は発生する。この現象はどれだけの母集団があれば発生するのかわかっていない。そこで、現在の実験系より小さい数mmのチャンバーを作成し、その中に一定量のES細胞を培養し造血幹細胞の発生を調べた。直径35 mmの細胞培養用ディッシュと直径5 mmの孔を持つPDMSシートを貼り付けたカバーガラスを用いて、OP9ストロマ細胞と中胚葉前駆細胞の共培養を行った。ES細胞をflk1+・ckit+で処理した中胚葉前駆細胞をそれぞれ2080個/cm2、4160個/cm2になるように添加した。35 mmの培養皿ではどちらの添加数でも血液細胞のコロニーが出現したが、5 mmのウェルでは4160個/cm2の場合のみ血液細胞のコロニーが出現した。現在引き続き再現性を確認中である。血液細胞の源となる造血幹細胞は、マウスでは胎生10.5日目ごろより背側大動脈腹側血管腔から発生する。本研究では、マイクロ流体デバイス内に背側大動脈に相当する細胞を培養し、送液培養で細胞にシアストレスを与えることで、造血幹細胞の発生へのシアストレスの影響を明らかにすることを目的とする。当該年度では、Nakanoらにより確立されたOP9システムを用いて、マウスES細胞を血液細胞に分化させた。最初にフィーダー細胞として用いるストロマ細胞株であるOP9細胞をマイクロデバイス内での培養法を確立した。マイクロ流路内で血液細胞発生の観察をする。マイクロ流路内にOP9細胞をフィーダー細胞として培養し、その上に分化誘導をしたES細胞を一定量播種し共培養する。培地を静置条件で与えるもの、送液培養条件で与えるものをそれぞれ用意し、3日目以降に造血幹細胞の発生の有無を観察した。発生した細胞は、マーカー分子であるCD41を免疫染色することで造血幹細胞か否か確かめた。発生した血液細胞のすべてが染まるわけではなかったが、一部の細胞が染色できていることを確認できた。灌流培養の速度を変え、発生した血液細胞の数との関係を調べたところ、静置培養に近い条件よりも早い条件の場合のほうが発生した血液細胞数のほうが多かった。一方、、シアストレスに応じて発生すると考えられる一酸化窒素NOと血液細胞の発生との関係を調べるために、L-NAME(NOS阻害剤)を加えた実験も行った。阻害剤が入っているときのほうが産生数は少なくなり、これまでマウスやゼブラフィッシュで得られた結果と同様の結果を示している。本研究では、マイクロ流体デバイス内の微細流路に大動脈に相当する細胞を培養し、送液培養で細胞にシアストレスを与えることで、胎生期の背側大動脈における造血幹細胞発生部位を模擬した実験系を作り、血液細胞の産生へのシアストレスの影響を明らかにすることを目的とした。96時間後にES細胞から分化した細胞群をマーカー分子の免疫染色で確認したところ、CD41抗体で染色された血液細胞とCD31抗体で染色された血管内皮細胞が確認できた。また、96時間の分化誘導の間をTime-lapseで撮影したところ、血液細胞が中胚葉細胞から盛り上がって産生する瞬間を観察することができた。

次に、送液培養条件を静置から125 cm/hの5条件として、血液細胞産生数を比較したところ、20 cm/hで産生数が多いことが示された。また、この流量で送液時間を12時間に減らしても、24時間と同等に血液細胞の増加が見られた。一方、静置培養条件下でNO濃度の影響を調べたところ、NO発生剤SNAPを加えた場合には、5 uMのときに血液細胞産生数の増加が見られ、それ以上の濃度のときは減少した。NO消去剤Carboxy-PTIOを加えたときには、予想通り血液細胞数の減少が見られ、NOは血液細胞産生に関与していることを裏付けた。本研究では、ES細胞から血液細胞への分化誘導をデバイス内の微細流路内で行い、シリンジポンプを用いてデバイス内の細胞に定量的に流れ刺激やNOによる化学刺激を与えることで、胎生期の造血を模擬した実験系の構築を試みた。送液培養の影響を調べた結果、静置培養と比較して血液細胞産生数が多いことが示された。この結果は、既報のマウスやゼブラフィッシュ胚で血流が関与するという結果と一致する。次にNO濃度の血液細胞産生数への影響を調べた。NO発生剤を加えた場合産生数の増加が見られた。NO消去剤を加えたときには、予想通り血液細胞数の減少が見られ、NOは血液細胞産生に関与していることを裏付けた。培地の送液、およびシアストレスによる一酸化窒素は、発生する血液細胞数に影響を与えるという先行研究の傾向が、実際、私たちが開発したマイクロ流体デバイス内でも起こりうることを示した。また、免疫染色により、マーカー分子であるCD41の発現も見られたことから、信憑性の高い結果が得られたと考えている。マイクロ・ナノデバイス送液の速度を変えて、実際のマウス血流に近づけた系を実現し、また、人工的にNOを発生する試薬等も使用して先行研究で知られている現象がマイクロ流路内でどこまで再現できるのか検討する。さらに、細胞の応答を調べるために、NOのイメージング試薬なども使用する予定である。研究項目は、以下の3つを挙げており、そのうち1および2を達成できたため、おおむね目標を順調に達成できていると考えている。1.マイクロウェル、マイクロ流路中でのOP9細胞の培養法の確立2.マイクロウェル中での造血幹細胞の発生の観察3.マイクロ流路中での造血幹細胞の発生の観察当初の予定では、腹側に関わる因子を含む培地と背側に関わる因子を含む培地、どちらも含まない培地の三層流を作り、マイクロ流路内に背側と腹側の培養条件を再現する予定であったが、共同研究先からいただいたES細胞は微量なため、多くの条件を試すことが出来ず、したがって、予定した実験を行うことができなかったため。1.引き続き通常の実験系より小さい数mmのチャンバーを作成し、その中に一定量のES細胞を培養し、ES細胞数、または培養面積に依存した造血幹細胞の発生を調べる。細胞培養基板の弾性率が細胞分化に影響を与えることが知られているので、ガラス基板の上にハイドロゲルをコートした系も検討する。シアストレスのない状態での発生確率を調べたのちに、マイクロ流体デバイス内での培養に移行する。2.マイクロデバイス内でマウス胚の血流測である5 dyn/cm2付近で培地を流しながら培養し、シアストレスと一定量のES細胞から発生する造血幹細胞の数の関係を調べる。これらの結果より、造血幹細胞の発生へのシアストレスの影響を明らかにする。三層流デバイスを作製し、腹側、背側の条件を持つデバイスの開発に使用する。
高機能化した蛍光センサーによる膜近傍のイオン濃度マッピング

新しい蛍光水素イオンセンサーを15種類、蛍光ナトリウムイオンセンサーを5種類合成し、種々のミセル膜近傍の水素イオン濃度、ナトリウムイオン濃度を計測した.その結果、アニオン性ミセルの親水基近傍では、静電的効果により水素イオンやナトリウムイオンが局所的に最大約150倍程度濃縮されていることを見いだした.一方、水素イオン濃度については中性ミセルやカチオン性ミセルの親水基近傍や内部において、静電的および疎水的効果により希釈されていることも明らかとなった。研究計画書の記載通り、蛍光イオンセンサーの合成を行った。市販の4-chloro-7-chlorosulfonyl-2,1,3-benzoxadiazoleを原料として水素イオンマッピング用センサーを15種類、ナトリウムイオンマッピング用センサーを3種類それぞれ新規に合成した。また、市販のアントラセンメタノールを原料としてナトリウムイオンマッピング用センサーを4種類新規に合成した。続いて、得られたセンサーのうちナトリウムイオン用センサーを用いて、膜近傍のイオン濃度マッピングを開始した。膜構造としてはミセルを選択し、アニオン性界面活性剤のtrimethylammonium dodecylsulfate、中性界面活性剤のTriton X-100およびoctyl beta D-glucopyranoside、カチオン性界面活性剤のcetyltrimethylammonium chlorideを用いてそれぞれの膜近傍のナトリウムイオン濃度を評価した。また、本研究課題の共同研究者であるA. Prasanna de Silva教授との共著書籍「分子論理ゲート」(講談社サイエンティフィクより2014年秋発刊予定)の執筆を進めた。これまでに約300ページ分の本文となる原稿を完成させており、現在、校閲段階へと入っている。本研究課題と関連の深い機能性蛍光センサーをまとめた教科書であり、本分野の教育的普及を目指している。ナトリウムイオンマッピング用センサーとしてベンゾフラザン骨格を有する新規化合物を2種類合成し、前年度までに得られていた4種類のアントラセン骨格を有する化合物と合わせた6種類の蛍光ナトリウムイオンセンサーにより、アニオン性界面活性剤trimethylammonium dodecylsulfate、中性界面活性剤のTriton X-100およびoctyl beta D-glucopyranoside、カチオン性界面活性剤のcetyltrimethylammonium chloride近傍のナトリウムイオン濃度を評価した。この際に観測された蛍光スイッチングがナトリウムイオンによるものであることを確認するために、上記6種類のセンサーに対応する対照化合物についても新たに合成し、検討に用いた。これらの結果、アニオン性界面活性剤trimethylammonium dodecylsulfateの近傍ではナトリウムイオンが7148倍濃縮されていることが明らかになった。本成果については、日本化学会第95春季年会にて学会発表し、現在、原著論文を執筆している。水素イオンのマッピングについては、前年度までに得られた33種類の蛍光センサーを利用し、アニオン性界面活性剤sodium dodecylsulfateおよびsodium laurate近傍における水素イオン濃度の評価を進めている。また、本研究とも繋がりの深い研究分野である「分子論理ゲート」の教科書を、講談社サイエンティフィクより上梓し、本分野の普及を行った。前年度までに得られた33種類の蛍光pHセンサーを利用し、アニオン性界面活性剤sodium dodecyl sulfateおよびsodium laurate近傍における水素イオン濃度を測定し、これまでに困難であったアニオン性界面活性剤近傍における水素イオン濃度のマッピングに成功した。現在、カチオン性界面活性剤cetyltrimethylammonium chloride近傍における水素イオン濃度の測定を進めており、これらの結果をまとめて原著論文として発表する予定である。さらに本年度は、この33種類の蛍光性pHセンサーを利用し、dioctadecyl dimethylammonium chlorideによって形成されるベシクル近傍の水素イオン濃度測定を試みた。ところが、ベシクルの作成段階において、分子の濃度、温度、超音波照射時間などの諸条件をどのように変えても、既報のような二重膜の生成を確認できず、水素イオン濃度測定の前段階であるベシクルの調製手順を確立し直す必要がある事が分かった。動的光散乱によって直径数十ナノメートルの粒子が出来ていることは確認できており、今後、電子顕微鏡による測定条件の最適化を含め検討を進めていきたい。また、前年度までに得られた「ミセル近傍におけるナトリウムイオン濃度測定」についての成果は、Angew. Chem. Int. Ed.誌に原著論文として公表した。この論文はエディターにより重要な論文であると認定され、Hot Paperとして選出されている。また、同内容を第75回分析化学討論会ならびに26th IUPAC International Symposium on Photochemistryにて学会発表した。おおむね研究計画調書に記載したとおり、研究を遂行できているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。化学研究の遂行に際して、特に問題は生じていないため、当初の研究計画調書に従って今後の研究を進める。おおむね研究計画調書に記載した通り、研究を遂行できているため。申請書に記載した計画と異なり、年度による傾斜配分をされたため。

研究の遂行に際して、特に問題は生じていないため、当初の研究計画調書に従って今後の研究を進める。計画書の通り、三年度に渡って全配分額をおおよそ三分の一した額を毎年使用する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請書に記載した計画と異なり、年度による傾斜配分をされたため。
複素数体上の完備直交t-デザイン系の存在・構成問題とその応用

本研究では,量子コンピュータの記憶素子の誤り訂正を目的として導入された量子ジャンプ符号をt-MODと呼ばれる数学的概念として定式化し,与えられた符号長,誤り訂正能力をもつt-MODの中で,最大の次元をもつ完備t-MODの組合せ構造を特徴づけ,その非存在定理と1つの構成法を与えた.さらにbinary完備t-MODは,組合せデザインのlarge setと同値であることを示した.一方,binary t-MOD(t-SEED)を有限アフィン幾何を用いて構成する方法を与え,その構成法に関連する巡回群の多重直積分解問題にlcm-closureの概念を導入して,新たな分解可能性定理を示した.この結果に加えて,論文では,t-SEEDの逐次構成法も複数与えている.さらに,Stinson and Vanstoneらが1980年代に示した鍵分散暗号への応用についても,t-SEEDを用いた場合の有効性をその鍵の数の多さの観点から示している.その後,t-SEEDをt-MODに拡張して考えることにより,線形代数的手法で,Alber, Beth, et al. (2003)の上界を達成するt-MODの特徴付けを行うことができた.この結果により,上記の論文のt-SEEDとlarge setとの関係を非常にコンパクトに証明することができ,デザインを複素数体上に一般化することにより,classicalなt-デザインの諸性質を数学的により一般化された形でしかもコンパクトに説明できる可能性を示唆していると思われる.また,t=k-1が偶数でブロックサイズがk=(n-1)/2の場合には,上界を達成する完備t-MODが存在しないことが示された.さらに,0,1でない複素数体上の1-MODの例を1つ見出すことができた.複素数体上の完備直交t-デザインの族(t-MOD)の概念は,量子ジャンプ符号の概念を数学的に定式化したものであり,研究代表者がt-MODの概念を導入した.t-MODはブロックを共有しない古典的なt-デザインの族(large set of t-design)の一般化であるが,large setの存在は特殊な場合を除いて未解決であり,当該分野では難しい問題とされている.本研究では,複素数体上のt-MODの存在問題を扱うと同時に,{0, 1}上のt-MODであるt-SEEDの存在・構成問題についても研究を進めている.研究代表者は,2ーSEEDについて,組合せデザイン,直交配列などを用いた2,3の構成法を与えているが,最近,業績リストにあるようにアフィン不変なSQSの構成法を得ており,その副産物として,3-SEEDができる可能性を見出し,その一般化にチャレンジしている.複素数体上のt-MODについては,ある種の場合に,その非存在証明を行い,また,n次元複素球面上の1-MODの構成法も得ている.この1-MODの構成を与える複素球面上の点配置はある種のdifference matrixと呼ばれる剰余環上の行列の族を用いて構成することができ,このようなdifference matrixの族を構成する方法の研究を推進している.また,複素数体上の球面デザインと呼ばれる点配置にある種の変換を施して得られる点配置の族から1-MODを構成する方法についても計算機を用いて構成法を探っている.結合行列が{0,1}行列のt-MODについてはこれまで知られている組合せデザインを用いた構成法に加えて,アフィン不変SQSの族を用いて構成する方法の着想に至り,{0,1}上の3-MODである3-SEEDの一般的な構成法の研究を行っている.また,最近,組合せデザインに巡回群が作用する場合に巡回軌道のresolutionの存在問題について成果を得ているが,この手法もt-SEEDの構成法に有用であろうと思われる.また,複素数体上の1-MODを構成するための道具として,ある種のdifference matrixを用いる方法を見出した.さらに,球面デザインの点配置に変換を施して1-MODを得るアプローチも並行して研究している.t-MODに関連してアフィン不変SQSの構成などを論文誌に発表しており,それらの成果をt-MODに適用することにより,研究が進展すると考えている.最終年度には,これまでの成果をt-MODに関する論文として公表すべく着想をまとめる.複素数体上の完備直交デザインの族は,本研究代表者が,量子ジャンプ符号を数学的に定式化して導入した概念であり,t-MOD (Mutually orthogonal partial t-designs)と名付けられている.本研究の研究開始時には,t-MODは0,1を複素数にまで拡張した概念であり,その存在は古典的な{0, 1}-結合行列をもつt-MOD(特にt-SEEDと呼ばれる)の存在より広い範囲で存在するであろうと考えていたが,必ずしもそうではなく,本研究の研究期間を通して,下記の成果が得られた.【最終年度(平成28年度)の成果】アフィン幾何を用いた2-SEEDの構成法を以前得ているが,その構成法を射影幾何の直線からなる巡回軌道の分解問題にも適用し,1-SEEDの無限系列を得た.また,その分解問題に巡回群の直和分解が関連していることを明らかにし,より一般的な組合せ構造との関係を示した.さらに,巡回群の多重分解問題の研究も行い,lcm-closureの概念を導入して,これまで知られているより広い条件での分解可能性定理を与えた.

本研究では,量子コンピュータの記憶素子の誤り訂正を目的として導入された量子ジャンプ符号をt-MODと呼ばれる数学的概念として定式化し,与えられた符号長,誤り訂正能力をもつt-MODの中で,最大の次元をもつ完備t-MODの組合せ構造を特徴づけ,その非存在定理と1つの構成法を与えた.さらにbinary完備t-MODは,組合せデザインのlarge setと同値であることを示した.一方,binary t-MOD(t-SEED)を有限アフィン幾何を用いて構成する方法を与え,その構成法に関連する巡回群の多重直積分解問題にlcm-closureの概念を導入して,新たな分解可能性定理を示した.上界を達成するt-MODの代数的特徴づけを行うことができ,H26年度に出版された論文の証明をさらにコンパクトに本質を突いた短い証明に昇華させることができた.旧来の組合せ論的なt-デザインの理論を複素数体上のデザインとしてみなすことにより,今後,より数学的な見地から新たな見方へと発展できる可能性があり,その意味で研究が進展している.また,暗号の分野への新たな応用も見出されている点も研究の広がりを見ることができる.今年度も,{0,1}上のt-MODすなわちt-SEEDの構成法の研究と複素数体上のt-MODの構成法と存在問題を並行して研究を行う.(1)t-SEEDの構成法については,afine不変なSQSの構成法,あるいは巡回デザインの巡回ブロックの分解手法を用いたt-SEEDの研究を推進したい.(2)複素数体上の1-MODの構成法については,difference matrixの族を用いた手法を一般化させ,さらにそのようなdifference matrixの族の構成法を与えたい.さらに,複素球面上の球面デザインの自己同型群を含むより大きい群を見出し,それを用いて,互いに直交する球面デザインを作る方法により1-MODを構成する方法を得たい.(3)これらの目的のために,国内外の代数分野および組合せ論分野の研究者と交流を密にして新たな研究の視点を得たい.また,研究の最終年であるため,関連する研究との関係を明らかにしてt-MODに関する研究成果をまとめて公表したい.数学基礎・応用数学(1)点の数nが奇数のときの1-MODの構成法:このテーマは平成26年度から継続しているものであり,1-MODの例は見つかっているが,無限系列などの一般的な構成法には至っていない.平成27年度以降は,昨年度に続き,点の数が奇数の場合に本質的に複素数体上での1-MODの構成問題,存在問題の一般的解決法を見出したい.(2)2-MODの存在・構成問題:tが2以上のt-MODについては,非存在を示す結果が,研究代表者及び,海外の研究者らによって得られているが,その存在を示す例は1つも見つかっていない.平成27年度は,上界を達成する完備2-MODの存在・構成問題にも取り組みたい.そのために,点集合Vから1点を除いた導来デザインが既知の1-MODとなるような拡張法を考えたい.この目的のために,計算機による計算が必要であり,大学院生にその計算を依頼したい.(3)完備1-MODとd-距離集合との関係:完備1-MODのn-1個の写像(デザイン)に関するk-元部分集合の値をn-1次元ベクトルとして複素球面上に配置した点集合がd-距離集合をなすか否かを調べたい.逆に,d-距離集合から1-MODが構成できるか否かについても調べてみたい.
誰もがいつでもどこでも手軽に発音を独習できるスマートフォン上の支援システムの構築

外国人の日本語の第一印象は、その発音で決まります。本研究では、「特殊拍(促音、撥音、長音)」、「母音の無声化」、「助詞および文節末」に焦点をあて、いつでも、どこでも、スマホで手軽に練習できるアプリ「ゆにおん」を開発しました。手本の音声を聞いて、自分の発音を録音すると点数とアドバイスが返ってきます。カラオケ感覚で繰り返し練習することで、メリハリのきいた、日本語らしい発音を実現することができます。日本語音声のリズムを考える場合、拍のほかにモジュールがある。拍はki・ta・ka・zeのようなCVであり、モジュールはk/it・ak・az/eのようなVCである。拍が単位だとすれば、子音の長さの揺れはその後の母音が、モジュールが単位だとすれば、子音の長さの揺れはその前の母音が補正していることになる。これまでの実験結果を見ると、拍長は、むしろ中国語話者の方が揺れが小さい。一方、東京語話者は、拍長とモジュール長の揺れがあまり変わらない。つまり、中国語を母語とする日本語学習者は拍を単位としてのみ長さをそろえようとしているのだが、日本語母語話者は拍とモジュールの双方を組み合わせて等時性を作り出しているということになる。本研究は、大きく二つに分けることができる。一つは、日本人の健常者(東京方言話者と熊本方言話者)、失語症者、そして、中国語、韓国語、英語、トルコ語の母語話者に「北風と太陽」を音読してもらい、精度の高い録音し、分析することによって、日本語の等時性への拍とモジュールのかかわりの仕組みを解明する。もう一つは、スマートフォン上の支援システムの構築である。前者については、日本語教育学会で発表した。後者については、すでに試用システムができている。今後は、精度の高い録音データを増やし、システムを改訂、高精度のデータとスマートフォンによる大量のデータを分析して、日本語音声のリズム、等時性の本質の解明を目指す。フォーマルな場での日本語らしい発音の実現のためには「特殊拍(促音、長音、撥音)」、「母音の無声化」、「助詞および文節末」が重要だと考えました。特殊拍とは、促音「いっち」の「っ」、長音「チーズ」の「ー」」、撥音「さんま」の「ん」のような単独で音節を構成しないが,その有無が意味の区別に関わる拍のことです。「母音の無声化」とは、母音が無声子音、あるいは、無音に挟まれる場合に声帯がその振動を止める現象のことで、日本語の発音にメリハリをつけます。「助詞および文節末」は、長すぎてしまうと、おさない、あるいは、だらしない印象を与えてしまいます。これらの要素をふくみ、日本語らしい発音の独習に有効であると考えられる語や文を、日本語教育的見地から選出し、アンドロイド版とiOS版のアプリを作成しました。スマートフォンで手軽にいつでも独習できるようにするためです。本アプリに実装した機能は、「特殊拍」の発音練習機能および聞き分け練習機能、「母音の無声化」と「助詞および文末節」の発音練習機能、聞き分け練習機能、ディクテーション機能です。各機能の判定基準は日本語教育研究者の見解に基づいており、この判定基準によって学習者の入力に点数をつけ、カラオケマシン感覚で楽しく独習できるようにしました。繰り返し練習して評点をあげることによって、発音独習に対する学習効果が期待できると考えます。今後は、日本語を学習する日本語非母語話者を対象に本アプリを利用してもらい、本アプリの有用性についてより詳しく評価していく必要があると考えています。当初、システム構築とスマートフォンへの実装を平成28年度に予定していましたが、平成26年度からすでに一部実現しており、平成27年度にはさらに充実させました。予想以上の進展です。ただ、各国語話者の音読データを収集、分析し、母語ごとの日本語音声の拍とモジュールへの影響を解析する研究がおくれています。総合的には、「おおむね順調」です。特殊拍とは、促音「いっち」の「っ」、長音「チーズ」の「ー」、撥音「さんま」の「ん」のような単独で音節を構成しないが、その有無が意味の区別に関わる拍のことです。「助詞および文節末」は、長すぎてしまうと、幼い、あるいは、だらしない印象を与えます。これらの要素をふくみ、日本語らしい発音の独習に有効であると考えられる語や文を、日本語教育的見地から選出し、Android版とiOS版のアプリを開発しました。本アプリに実装した機能は、「特殊拍」の発音練習機能、および、聞き分け練習機能、「母音の無声化」と「助詞および文節末」の発音練習機能、聞き分け練習機能、ディクテーション機能です。各機能の判定基準は日本語教育研究者の見解にもとづいており、この判定基準によって学習者の音読音声入力に点数をつけ、カラオケ感覚で楽しく独習できるようにしました。繰り返し練習して評点を上げることによって、発音独習に対する学習効果が期待できると考えます。

SNSによって本アプリのアナウンスを国内外に発信し、さらに、韓国、中国では本研究メンバーが日本語教育機関で使用方法を解説しました。また、インドネシア、トルコ、米国、ポーランド、英国、ブラジルでは、現地の日本語教師に依頼し、授業その他で試用してもらいました。今後は、広報につとめ、使用者の音声データを統計処理、分析し、母語ごとの発音傾向を数値化していかなければなりません。外国人の日本語の第一印象は、その発音で決まります。本研究では、「特殊拍(促音、撥音、長音)」、「母音の無声化」、「助詞および文節末」に焦点をあて、いつでも、どこでも、スマホで手軽に練習できるアプリ「ゆにおん」を開発しました。手本の音声を聞いて、自分の発音を録音すると点数とアドバイスが返ってきます。カラオケ感覚で繰り返し練習することで、メリハリのきいた、日本語らしい発音を実現することができます。平成26年度は,汎用大語彙連続音声認識エンジンJuliusを援用し,音長比較による日本語発音独習のためのスマートフォン向けアプリケーション(以下,アプリ)を実現すべく,そのプロトタイプ・システムを検討・開発した.当該プロトタイプ・システムは,大きく二つの部分で構成される.(a)音声分析ソフトPraatによる音声分析図を参照しながら,手作業で音を切り出し,長さ(音長)を測定していたこれまでの手順を自動化すべく,Juliusを援用し,音声データから音の切り分け,その音長計測を自動的に処理可能な音素自動ラベリング・音長データ収集システム.(b)日本語非母語話者の発音の音長に着目し,拍とモジュールの双方において等時性を実現することが,より日本人らしい発音につながる,という先行研究の成果をもとにした,音長比較による日本語発音独習アプリ.日本人らしい発音と認められる各音素の基準音長に対する適切な範囲は,日本語教育研究者らの知見を踏まえた上で,8つの評価項目((1)促音,(2)撥音,(3)長音,(4)助詞,(5)母音の無声化,(6)文末の母音,(7)上記以外の子音,(8)上記以外の母音)ごとに決定した.外国人留学生4名の童話「北風と太陽」の音読音声を対象に,本プロトタイプ・システムを評価したところ,例えば,「旅人の外套を脱がせたほうが勝ちです」という文に対し,本プロトタイプ・システムでは,評価項目(3)で「ほう」の長音の発音が短いと判定した.その他の評価項目の判定についても,本プロトタイプ・システと日本語教育研究者との見解が一致した.本システムを用いれば,童話「北風と太陽」を対象に,日本人らしい発音と認められる各音素の基準音長との距離が定量的にわかるため,日本語非母語話者の発音独習に寄与でき,日本語教育研究において意義のあることであると考える.すでに稼働している独習アプリによって、世界中の日本語学習者の音声が収集されています。蓄積されているデータを解析し、拍とモジュールの関係、各母語の日本語音声への影響を計算、関数化しなくてはなりません。一方で、独習アプリの日本語音声分析は、既存の音声認識エンジンJuliusを利用したものです。音の長さの計測の精度がどの程度のものなのか、アプリがどの程度正確に学習者の音声から音の長さを切りだしているのかの検証がいまだなされていません。今後は、システムによって大量に集められたデータと、研究室で独自に収集、分析したデータとをつきあわせ、アプリの精度を確認します。
腎症候性出血熱ウイルスの分子生物学的診断法の確立と非感染動物作成への応用

1)腎症候性出血熱ウイルスBー1株のSセグメントのクロ-ニングと全塩基配列をMセグメントに用いたのと同様の方法で決定した。その結果、アミノ酸シ-クエンスのホモロジ-は同じ血清型のSRー11株とは98.4%、Hantaan株とは83.2%、Hallnas株とは61.7%を示した。また、DNAの塩基配列のホモロジ-からHantaan株からBー1株そしてフレ-ムシフトによりSRー11株に進化したものと考えられる。さらに、血清型に対して特異的に変位する部位が1ないし2カ所存在した。Sセグメントの場合、アミノ酸シ-クエンスはHantaan株とは83.0%、Hallnas株とは73.5%のホモロジ-を示した。このことはHantavirusにおいてLセグメントが最も保存されていることを示している。さらに、RNA依存RNAポリメラ-ゼの活性中心と予測される部位の保存性は非常に高かった。また、Lセグメントにおいても血清型に対して特異的に変位する部位の存在が示された。2)Hantaanウイルスからプラ-ク単離法により得られた2つのクロ-ン(HV clー1とHV clー2)は乳飲みマウスに対する病原性は全く異なり、HV clー1株は致死的だが、HV clー2株は全く病原性を示さない。そこで、この2株間の遺伝子の塩基配列の比較を行ったところ、Mセグメント上に唯一、1124番目のアミノ酸のSerがHV clー2株ではGlyに変異していた。この変異がHV clー2の細胞融合能の低下とCTL誘導能を増加に関与し、その結果、マウスに対する病原性が低下したものと考えられる。3)ラットの場合、ウイルスキャリアは持続感染個体であり、しかも血清中にはウイルスは検出されず、骨髄細胞と白血球中においてのみRNA依存RNAポリメラ-ゼだけが検出される個体も存在する。Hantavirusに49年前に感染し、今では抗原は全く検出されないが、高い抗体価を有するヒトの血液からHantaan型のウイルスゲノムが検出された。これは人においてもウイルスが遺伝子だけで長期間個体内に存在することを示している。1)HFRSウイルスは増殖能が低く、単離のかなり困難なウイルスであるので、これまでのような方法ではとうていクロ-ニングは不可能であった。そこで遺伝子増幅法(PCR)を用いた、大腸菌を用いない、新たなクロ-ニングシステムの開発に成功した。2)HFRSウイルスには4種類の血清型が存在している。既にその内の1つであるHantaan株のウイルスゲノムの内のエンベロ-プとヌクレオキャプシドタンパク質に対するcDNAはクロ-ニングされているので、他の3株の内、実験動物を取り扱う上で一番問題となっているラット型HFRSウイルスであるBー1株のエンベロ-プタンパク質のcDNAのクロ-ニングを行い、その遺伝子配列を明らかにした。その結果、遺伝子とアミノ酸の双方とも、Bー1株とHantann株間での相補性は約70%であることが明かとなった。3)Bー1株とHantaan株のウイルスゲノムRNAの構造比較を行い、その遺伝子配列を基に適切なプライマ-を合成し、そのプライマ-を用いて共通部分と特異部分を検出するPCRを確立した。

4)ネガティブストランドRNA(ウイルスゲノムRNA)とポジティブストランドRNA(mRNAとcRNA)の半定量的検出法を確立し、ウイルスの活性化状態の検討を行えるようになった。5)PCRによって求められたウイルスゲノム量とウイルス感染能力であるプラ-ク形成単位(PFU)との相関関係が得られた。1)HFRSウイルスにはアポデムス型、ラット型、クレスリオノミス型、ミクロトス型の4種類の血清型が存在している。これまでに明らかになっているアポデムス型、ラット型、クレスリオノミス型ウイルスのMゲノムセグメントの遺伝子配列と我々が明らかにしたラット型ウイルスのBー1株とを比較した結果、血清型に対して特異的な変異部位が存在することを明らかにした。この変異部位は感染性に関与している可能性が示唆された。2)野外ラットから単離したKIー262株のMゲノムセグメントの遺伝子配列を決定した。KIー262株は実験室ラットから単離された株に比べ、病原性は弱く、変異部位はG2タンパク質上に非常に多く存在していた。病原性に関与しているのはG2タンパク質かもしれない。3)Bー1株とHantaan株に感染したマウスの白血球を材料とし、PCRを用いたウイルスのゲノム診断法の確立をした結果、感染後1週間でウイルスゲノムは検出された。これは抗体検出よりも感染早期の診断が可能となった。また、ウイルス抗体は検出されても抗原がすでに検出されなくなった持続感染マウスからもウイルスゲノムは検出された。さらに、この診断において血球のサンプリングの方法により検出感度の変わることも明かとなった。すなわち、採血時のヘパリンの使用はリバ-ストランスクリプタ-ゼの活性を阻害することから、ヘパリンの代わりにEDTAを用いることにより、よい結果を得ることができた。4)確立されたPCR診断法を用いて、実験用マウスのHFRSウイルス保有状況を検討した結果、サンプル数は少ないのではっきりしたことは言えないが、現時点においてBー1株やHantaan株の遺伝子を有した個体は検出されていない。1)賢症候性出血熱ウイルスB-1株のSセグメントのクロ-ニングと全塩基配列のMセグメントに用いたのと同様の方法で決定した。その結果、アミノ酸シ-クエンスのホモロジ-は同じ血清型のSR-11株とは98.4%、Hantaan株とは83.2%、Hallnas株とは61.7%を示した。また、DNAの塩基配列のホモロジ-からHantaan株からB-1株そしてフレ-ムシフトによりSR-11株に進化したものと考えられる。さらに、血清型に対して特異的に変位する部位が1ないし2カ所存在した。Sセグメントの場合、アミノ酸シ-クエンスはHantaan株とは83.0%、Hallnas株とは73.5%のホモロジ-を示した。このことはHantavirusにおいてLセグメントが最も保存されていることを示している。さらに、RNA依存RNAポリメラ-ゼの活性中心と予測される部位の保存性は非常に高かった。また、Lセグメントにおいても血清型に対して特異的に変位する部位の存在が示された。2)Hantaanウイルスからプラ-ク単離法により得られた2つのクロ-ン(HV cl-1とHV cl-2)は乳飲みマウスに対する病原性は全く異なり、HV cl-1株は致死的だが、HV cl-2株は全く病原性を示さない。
炎症性腸疾患におけるNOD2遺伝子の役割:ノックアウトマウスの作製による検討

NOD2はヒトクローン病や遺伝性の肉芽腫性関節炎(Blau syndrome)の病因遺伝子の1つとして報告され大きな注目を浴びている。しかも、NOD2遺伝子のSNPが、正常のヒトの4%に見られることも、本遺伝子に対する多くの研究者の興味を喚起している。NOD2は現在、感染・免疫学の分野で最も注目されている分子であるにもかかわらず、NOD2がどのような臓器・細胞に発現しているのか、その発現調節機構はどのようになっているのか、さらに下流の情報伝達系がどのようなものであるのかは、依然不明な点が多い。本研究では、NOD2の発現調節機構やその下流の情報伝達機構について検討した。まず、腸炎モデルとしてTNBS誘発腸炎マウスを作製し、粘膜と筋層でのNOD2発現について検討したところ、NOD2のmRNA発現は粘膜層で増加していることが明らかになった。さらにNODのリガンドを同定するために、マウス由来の培養マクロファージを用いて各種菌体成分によるNOD2発現について検討したところ、LPS、リポタイコ酸、ペプチドグリカンにより増加することを観察した。また、TNFα、IFNγ刺激によりNOD2の発現量が増加することを明らかにした。さらに、TNFα中和抗体投与やTNFαKOマウスから単離したマクロファージを用いてLPS刺激をしたところ、NOD2の発現量の増加は抑制されていた。他方、マクロファージにおけるNOD2の発現をRNAi法によりDown regulationしたところ、IL-1βやIL-6の発現が増加することを見いだした。すなわち、NOD2はIL-1βやIL-6発現における負の制御機構として機能している可能性が考えられた。以上の成績から、NOD2が確かに細菌の菌体成分をリガンドとして利用していることや、炎症性サイトカインのオートクライン作用によりその発現量が増加することが示唆された。また、RNAi法による解析から、NOD2がサイトカイン産生に対して負の制御機構として機能している可能性も考えられた。NOD2は、LPS受容体として知られるToll-like Receptor (TLR)と同様にロイシンリッチリピート構造(LRR)を持ち、またnucleotide binding domain(NBD)と、これとリンクするcaspase recruitment domain (CARD)を持っている新規遺伝子である。NOD2の変異がクローン病と関連することが近年報告され注目されているが、NOD2の生理機能は全く明らかではない。本研究では、細胞レベルならびに個体レベルでNOD2遺伝子をノックダウンし、NOD2のTLRとの相互作用や、下流のサイトカイン産生など、NOD2の生理機能を解明することを目的とした。初年度は、NOD2遺伝子の全クローニングを開始した。RT-PCR解析より、NOD2遺伝子の発現が乳腺組織由来RNAに最も多く発現していたことから、これを材料にLRR, NBD, CAERDの各パーツごとにクローニングを行った。一部のパーツに関しては同じNODファミリーであるNOD1を確実に識別できるNOD2特異的プライマーの設定が困難であり、研究進行が遅延している。そこで、同時に、細胞レベルでのNOD2ノックダウンを並行して行った。マウス由来の培養マクロファージ(RAW264.7)を用いて、RNAi法を用いてNOD2のノックダウンを試み、NOD2の発現を70-80%抑制した細胞を得た。現在、LPS、LTA、PGN刺激によるサイトカイン産生への影響などについて検討をしている。また、RAW264.7細胞を用いて、LPS、LTA、PGN刺激によりNOD2 mRNA発現が増加するかについても検討した。結果、LTA刺激によりNOD2 mRNA発現量は刺激後4時間をピークに増加した。LPS刺激においては弱いながらも類似した成績が得られ、PGNはNOD2mRNA発現に影響しなかった。すなわち、TLR2あるいはTLR4受容体を介したNOD2発現調節機構の存在が示唆され、NOD2とTLRとの相互作用についてさらに検討を加える予定である。

すなわち、NOD2はIL-1βやIL-6発現における負の制御機構として機能している可能性が考えられた。以上の成績から、NOD2が確かに細菌の菌体成分をリガンドとして利用していることや、炎症性サイトカインのオートクライン作用によりその発現量が増加することが示唆された。また、RNAi法による解析から、NOD2がサイトカイン産生に対して負の制御機構として機能している可能性も考えられた。