hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心臓微小低酸素領域における遺伝子発現・血管新生の3次元解析を応用した治療法の開発

哺乳動物の心臓における低酸素領域における新生血管発達のメカニズムや時相は明らかになっていない。血管新生の詳細を解明することで革新的な治療が可能になるものと考えられる。我々は左室心内膜から発達する新しい血液循環の仕組みを発見し、障害心筋を救うことができることを確認した。これらはVEGFシグナルに依存していた。さらに血管新生により心内膜側の残存心筋細胞を増加することで左室のリモデリングも抑制していた。一方、いわゆる虚血境界域と言われている領域では虚血心筋のほとんどすべてが12時間以内にアポトーシスに陥り、その後の治療によって治療に期待できる細胞は同定できなかった。平成25年度においてまずアデノ関連ウイルス(AAV9: Adeno-associated virus 9)を使って遺伝子発現の確認を行う予定としていた。我々はAAV9-LacZを作成し、マウス尾静脈より5e+11、10e+12(GC)量のウイルスを投与し、各臓器でのLacZの発現をX-gal染色によって1週、2週、4週で確認した。心臓特異性の高いウイルスである報告がされていたが実際我々自身が作成したAAV9ウイルスが適切に働くことの確認を試みた。心臓においては静脈投与においても1週後にX-gal陽性心筋細胞が増え始め2週以降は過半数の心筋細胞がX-gal陽性細胞となっていた。その後4週後の標本においても7割を超える心筋細胞で遺伝子発現が確認された。同時に骨格筋、肝臓、腎臓などにおける遺伝子発現を評価した。心臓では2週後には強い発現がみえられていたが骨格筋、肝臓でわずかな陽性細胞をみるのみであった。腎臓の細胞においてはほとんど遺伝子は発現していなかった。Epiregulinの心筋梗塞における治療的効果を評価したいと考えているが同ウイルスベクターによって心臓内で充分な蛋白発現を誘導することが可能であることが確認された。続いて我々はEpiregulinをクローニングしAAV作成ベクターに導入した。遺伝子配列の確認も行い正常にクローニングがされていることを確認した。同プラスミドをリポフェクタミンによって培養細胞に導入し、プラスミドによって正確な蛋白が作成されることをウエスタンブロットによって確認した。AAV9-Epiregulinを作成するためのプラスミドが正常に作成できたことが確認されたことになる。現在このプラスミドを利用して動物実験に必要なAAV9-Epiregulin(ウイルスベクター)を作成中である。平成25年度に作成したEpiregulinプラスミドを使ってAAV9-Epiregulinウイルスベクターをクローニングにより作成した。すでにAAV9-LacZによるLacZ発現は確認してあったが、AAV9-Wnt11によるWnt11の発現を確認した。in vitroではWnt11 plasmidでも培養細胞のAAV9-Wnt11の感染によってもWestern blotによりWnt11蛋白の発現は確認された。続いてAAV9-Wnt11のマウスへの静脈内投与による蛋白発現を確認することを試みた。抗体の感受性によるものが大きいと思われるが通常動物実験で利用される投与量で、AAV9-LacZで強い発現を認めた量のAAV9-Wnt11をマウスに投与した場合、Western blotで蛋白発現を確認することはできなかった。ただし、その5倍量で投与した場合は蛋白発現を確認することが可能であった。通常量の静脈内投与でもWnt11が発現していることを確認するためにWnt11のmRNAをRT-PCRにて評価した。RNAについては通常の投与量においてWnt11が十分に発現していることが確認された。現在マウス投与に必要なAAV9-LacZおよびAAV9-Wnt11を大量に作成し、精製を進めている。また心筋梗塞モデルにこれらのウイルスを投与することによる治療効果を調べるが、心筋梗塞での炎症性細胞の評価、心エコーの確認、アポトーシスの評価などの項目について一通りの確認し、適切に評価できることを確認した。平成26年度に作成したAAV9-EpiregulinとAAV9-LacZを利用した実験を行った。心筋梗塞作成前にあらかじめAAV9ウイルスを予備実験として行った発現実験の結果をもとに静脈内投与し、発現が確認できるタイミングでマウスに心筋梗塞を作成した。続いて心エコーを経時的に行いながら2ヶ月間生存に差がないか確認した。現時点ではEpiregulin投与による生存に関する治療効果が確認できていない。そのため治療のためのAAV9の投与量を調整している。投与量を比較的少なく心筋細胞での発現が30%程度の量からほとんどすべての心筋細胞で発現が確認されるウイルス量の5倍程度の量まで投与することによる生存曲線への影響を評価する予定となっている。もし生存に対する治療効果が最終的に認められないときも、心エコーでの詳細な比較、また経過中と最終的に安楽死させた心筋組織での炎症やApoptosis、繊維化などを比較検討する予定である。上記の容量による治療効果を比較する実験のため当初必要と予測されたAAV9ウイルス量では不足する事態になり、現在ウイルスの大量作成を繰り返している。また心筋梗塞によって一般的には3割から4割のマウスが数週の間に死に至るが、負荷を小さくした場合、心筋梗塞を大きく作成して負荷を大きくした場合でも治療効果の検出に差が出る可能性もあり同時に検討が必要になることを予測している。以上の実験のために約200匹の心筋梗塞マウスとそれに必要なAAV9ウイルスの準備が必要である。予定の実験は進められているが、治療効果の確認が難しい状況にある。

適切な実験条件を検討することは実験の基本であり現在検討を進めている。昨年に続きAAV9-EpiregulinとAAV9-LacZの心筋梗塞における生存率に差がでないか投与量を調整しながら様々な条件下で検討を進めてきた。結果としてはいずれの条件下でも群間で生存率に差をみることができず、心エコーや組織染色でも明らかな違いを指摘することはできなかった。しかし、それらの実験の中で我々はマウスの心筋梗塞を作成した時、心内膜下に数層の心筋細胞が虚血領域であっても残存していることに気づき、同部位を詳細に評価した。同部位は虚血誘導後から低酸素状態であることを示していたが3日目から4日目にかけて低酸素状態から解除されていた。この現象から、おそらく新たな血管がいずれかの場所から発達し、同部位を還流していると予測した。還流血管を組織学的に評価することで心内膜より新生血管が発生していることを我々は見出した。同部位の遺伝子発現を調べると血管新生を促進する様々な因子が増強していた。特にその中でもVEGFの働きが大きいと考えVEGF receptorを後天的に抑制すると見事に心内膜から発生する血管は抑制されていた。さらに同部位の治療応用を考えるため心筋梗塞後から心内膜からの血管が十分に発達するまでの4日間マウスを高酸素状態に置き左心室からの酸素拡散を増強することを行った。すると予想通り残存心筋の量は増え、より心内膜から遠位にまで血管が成長していた。その効果として心エコー上左心室の拡大(リモデリング)が抑制されていた。この現象は心内膜側の心筋細胞を急性期治療によってより多く助けることができることを示しており臨床的な応用が可能であると考えられた。現に人の病理組織においても心内膜に沿って残存心筋が認められ、マウス同様の現象が起きているものと考えられた。哺乳動物の心臓における低酸素領域における新生血管発達のメカニズムや時相は明らかになっていない。血管新生の詳細を解明することで革新的な治療が可能になるものと考えられる。我々は左室心内膜から発達する新しい血液循環の仕組みを発見し、障害心筋を救うことができることを確認した。これらはVEGFシグナルに依存していた。さらに血管新生により心内膜側の残存心筋細胞を増加することで左室のリモデリングも抑制していた。一方、いわゆる虚血境界域と言われている領域では虚血心筋のほとんどすべてが12時間以内にアポトーシスに陥り、その後の治療によって治療に期待できる細胞は同定できなかった。本年度は予定通り、マウスの実験を行うのに十分な量のウイルスベクターを作成している。AAV9はキットを利用した精製が不可能なため超遠心を利用して大量作成を進めることができている。また心筋梗塞で様々な評価をするためのPreliminaryな実験も行うことができている。治療効果を確認することのできる条件設定をこのまま継続する。そのうえで心エコーによる機能評価、免疫組織染色やRNA発現の比較による治療効果発現のメカニズムの探索などを進めていく。虚血性心疾患今後
国民の労役提供義務の憲法的正当化に関する研究

本研究は,国民の労役提供義務を正当化する内外の憲法理論・法理を整理・分析することを通して,憲法18条後段(「意に反する苦役」禁止)の規範内容を明らかにした。すなわち,(1)同条後段に関して最高裁判例はいまだ明確な規範内容を定立できていない。(2)同条後段に関する広義説は,国民の労役提供義務の法定が同条後段に反する否かの評価を不確定にする点で失当であり,刑罰に準じた苦痛を伴う労役提供を義務付けることのみが同条後段に反すると解する狭義説が妥当であることを明確にした。本年度前半は,国民主権原理に関する日本の文献を網羅的に分析し,とりわけ「主権者」として「国民」は権利以外に対国家の義務(責務)(以下,「義務」)を有するかについて芦部信喜・佐藤幸治の杉原泰雄の各説について検討した。芦部のいう「主権」の「権力性の契機」「正当性の契機」はそれぞれ憲法制定(改正)への国民の直接参加,とりわけ国民代表としての立法府を通じての国民の間接参加を意味するが,いずれも国民の何らかの「義務」を内包するものとしては考えられていない。佐藤説の主権概念においても国民の「義務」を含む指摘を発見できなかった。一部で主張される民主政の共和主義的構成に理解を示しているが,自説との直接的関係を認めているわけではない。杉原説も「多数派の人権保障のための人民主権」と性格づける以上,国民(人民)主権から直ちには主権者としての国民の「義務」を導けない。主要学説の国民主権原理から直接に「義務」を引き出すことは困難だと結論し得る。本年度後半は,英・米・独の各国における国民(人民)主権と「義務」との関係について検討を試みた。この3国の間では「主権」概念がそもそも異なる上に,特に英国においては主権が国会(国王含む)にあるとされるなど,日本との直接比較を慎重に検討せざるを得ないことに改めて留意した。もっとも,「主権」概念とは別に「民主主義」概念に共和主義的解釈を加えることで国民の対国家の義務(責務)を導く憲法解釈論は少なからず確認されたが,あくまで実定憲法典(憲法的法律含む)に国民の義務(責務)規定がある場合での指摘であることにも注意が必要である。平成23年に最高裁大法廷が下した裁判員制度を合憲とする判決を素材に,憲法18条後段が禁止する「意に反する苦役」の解釈論の整理を行った。同最大判は,同条後段に関する初の判例であるが,その判示は簡潔で解釈の余地に富んでいる。そこで,同最大判の調査官解説や学説による評釈類もあわせて検討を行った。その概要は以下の通りである。同判決は,下級審判決と同様に「裁判員の職務等」を国民民に課しても同条後段には違反しないとした。しかし,その論理構成には相違がある。東京高裁が下した一部の判決は,国民主権原理を「統治の主体」としての国民に「公共的な責務」課すものと解した上で,「裁判員の職務等」を国民主権原理が許容ないし要請するものとして同条後段に違反しないとした。これに対して平成23年最大判は,国民主権原理からストレートに憲法18条後段適合性を導くのではなく,国民主権原理のもとでのありうる立法政策として「裁判員の職務等」の賦課を肯定するに止まる。学説上は,「裁判員の職務等」を憲法上やむを得ない「苦役」として正当化するものもみられるが,平成23年最大判は,結局,裁判員の辞退が柔軟に認められていることを理由に,「裁判員の職務等」の強制性自体を否定したものと解される。もっとも,同最大判が「裁判員の職務等」を参政権と類比している点には疑問が残る。参政権はあくまで憲法上の基本権であり現行法その行使を義務付ける規定はない。これに対して,「裁判員の職務等」は同最大判の思考によれば立法政策上の産物であるにもかかわらず,その行使を罰則付きで国民に義務付けている。このアンバランスについて同最大判は何も語っていない。「裁判員の職務等」を国民主権原理によって正当化する場合,このアンバランスをどのように正当化するかも問われよう。本年度は,憲法18条後段が禁止する「意に反する苦役」の現代的意義に関する論考を公表し(1),その後,人身の自由を規律する刑事手続への国民参加の意義に関する論考を公表した(2)。また,その副産物として,人身の自由を規定する統治システムに関する概説書を共著で公表した(3)。(1)は,裁判員制度を合憲とした最高裁大法廷判決を素材に,憲法18条後段が禁止する「意に反する苦役」に関する判例・学説を整理・分析したものである。同判決は,その趣旨の不明確性を必ずしも否定することができないものの,裁判員の負う義務・負担は同条後段が禁止する「意に反する苦役」」自体に当たらないと解したものとして賛同できる。他方,学説は同条後段に関し,強制労働一般を禁止する広義説を採用する傾向があったが,同説では現行諸制度の憲法適合性を説明し切れない。したがって,同条後段が明示する刑罰に準じる苦痛を与える強制労働のみが同条後段の禁止対象と解する狭義説を採用すべきと主張した。(2)は,刑事手続への国民参加を求める諸制度に関して,やや冷めた視点から検証を行ったものである。

とりわけ,裁判員制度は,国民の統治主体意識を涵養するものとして不十分な効果しかないのみならず,法曹が支配する刑事手続を変容させるものとしての効果も薄いといわざるをえない。これは,制度実施当初から,刑事手続に関する国民の役割を否定的に捉えていた帰結とみるほかないが,その一方で,死刑制度の存置に関して,国民世論を正当化の根拠にするのは矛盾していると論じた。(3)は,統治システムのなかで法の支配,安全保障,2院制,憲法改正手続がそれぞれ有する意義について,解説したものである。本研究は,国民の労役提供義務を正当化する内外の憲法理論・法理を整理・分析することを通して,憲法18条後段(「意に反する苦役」禁止)の規範内容を明らかにした。すなわち,(1)同条後段に関して最高裁判例はいまだ明確な規範内容を定立できていない。(2)同条後段に関する広義説は,国民の労役提供義務の法定が同条後段に反する否かの評価を不確定にする点で失当であり,刑罰に準じた苦痛を伴う労役提供を義務付けることのみが同条後段に反すると解する狭義説が妥当であることを明確にした。英米の共和主義・討議民主主義の検討に着手できた。「徹底したリベラリズム」「強い個人主義」との対照から,国民の労役提供義務の限界設定についても違いがあることが判明しつつある。公法学引き続き,金沢大学内外の研究者と密接な連絡を取りながら,憲法18条後段と国民の労役提供義務の関係の明確化に努める。北陸公法判例研究会のほか,日本公法学会,全国憲法研究会,憲法理論研究会,比較憲法学会に積極的に参加し,研究の深化を図る。交付申請書「平成25年度の研究計画(詳細)」において同年度前半に実施するとした日本の憲法学説のいう国民主権原理と国民の義務との関係についての検討をほぼ終えることができた。また,同年度後期に実施するとした英・米・独・仏各国の国民主権(民主主義)概念と国民の負うべき義務との関係についても,おおまかな概観を得ることができた。予定した出張の取りやめ。平成25年度後期の実施した研究においてより詳細な検討を行うべき仏・独の各国における国民の労役提供義務と実定憲法との関係について研究者相互の意見交換を北陸公法判例研究会等を利用して実施する。また,国民の労役提供義務を正当化する憲法理論の文献収集を出張等を利用して強化する。紀要等で研究経過を随時細分化して公表する。次年度の物品費にあてる。物品費(書籍)の実購入額が当初の見積額より6,000円下回ったため。次年度の物品費に充てる。
輸送ストレスがヒラメ初期胚に及ぼす影響

近年、重要海産魚種であるヒラメの人工的な採卵が安定して行われるようになったしかしヒラメ初期胚の輸送に際して、輸送時間の増加に伴った孵化率の低下、奇形出現率の増加という深刻な問題が生じており、その原因解明が急がれている。平成9年度の研究から、水温上昇が強いストレッサーであることが明らかになり、また、蛋白質の機能発現に必須の因子である分子シャペロンのヒラメHSP70およびHSC71のcDNAクローニング、各々に特異的なDNAプローブの、作製に成功した。平成10年度は、ヒラメ初期胚におけるHSC71およびHSP70のmRNAの発現を詳細に検討した。孵化適温とされる15°Cおよびさらに高い20°C(この水温では孵化後奇形発生率が上昇する)において、HSC71のmRNAは受精後-胞胚期では、その発現は僅かであった。一方、胞胚期-孵化では顕著にその発現が誘導された。胞胚期以降に50%致死の強いヒートショックを与えても高い発現レベルは維持された。HSC71は通常およびストレス条件下における発生に極めて重要であることを示唆している。一方、HSP70のmRNAは孵化水温20°Cにおいて胞胚期以降および、熱ショックを与えたときに発現が誘導された。これらの事実は、高度な生体防御系を持たない魚類初期胚においてHSC71およびHSP70は細胞レベルでのストレス応答に重要な働きをしていることを示すとともに、HSP70の発現様式は、輸送に伴うストレス状態の化学的・生理学的解明及びストレス負荷程度の判定指標に有用であることを示唆している。また、ストレス負荷程度の判定指標として求めた初期胚のエネルギーチャージは50%致死の強いヒートショックにおいて有意に減少した。さらに、初期胚由来初代培養細胞系を用いてストレスによるアポトーシス型細胞死を認めており、今後はストレス条件下における魚類初期胚の生存戦略をアポトーシスを含めて検討する必要がある。近年、重要海産魚種であるヒラメの人工的な採卵が安定して行われるようになった。しかしヒラメ初期胚の輸送に際して、輸送時間の増加に伴った孵化率の低下、奇形出現率の増加という深刻な問題が生じており、その原因解明が急がれている。そこで申請者は、ヒラメ初期発生胚に対する温度、振動、紫外線照射などの影響を検討し、これらのストレスが発生率低下の一因であることを見いだした。ところで、生体は各種ストレスに応答して細胞を防御する一群のストレス蛋白質を合成する。中でも70kDaの熱ショック蛋白質(HSP70)ファミリーは、蛋白質の機能発現に必須の因子である分子シャペロンであることから、新生蛋白質の品質管理に極めて重要な機能を果たしているもとの考えられる。申請者は、ヒラメ初期胚および初期胚由来初代培養細胞cDNAライブラリーより完全長のHSP70ファミリーの構成的発現型ストレスタンパク質(HSC71)および熱ショック誘導型ストレスタンパク質(HSP70)を得た。予想されるHSC71およびHSP70の分子量は71.2kおよび70.6kであり、650または640残基よりなるアミノ酸配列は既報の脊椎動物のものと高い相同性を示した。両者のC末端には細胞質型HSP70ファミリーに特徴的なEEVD配列が認められた。得られた塩基配列をもとに各々に特異的なDNAプローブを作製し、ヒラメ初期胚におけるHSC71およびHSP70のmRNAの発現を検討した。HSC71のmRNAは産卵後孵化するまでに常に発現していたが、特に胞胚期以降に顕著であり、HSC71は通常の発生に極めて重要であることを示唆している。加えて、HSC71のmRNAは熱ショックを与えたときにのみ発現が誘導された。

これらの事実は、高度な生体防御系を持たない魚類初期胚においてHSC71およびHSP70は細胞レベルでのストレス応答に重要な働きをしていることを示すとともに、HSP70の発現様式は、輸送に伴うストレス状態の化学的・生理学的解明及びストレス負荷程度の判定指標に有用であることを示唆している。また、ストレス負荷程度の判定指標として求めた初期胚のエネルギーチャージは50%致死の強いヒートショックにおいて有意に減少した。さらに、初期胚由来初代培養細胞系を用いてストレスによるアポトーシス型細胞死を認めており、今後はストレス条件下における魚類初期胚の生存戦略をアポトーシスを含めて検討する必要がある。
農林地の水質保全機能の評価と強化に関する研究

1.集水域の土地利用と流出水の水質との関連調査1)北海道の農林地において、その土地利用をリモートセンシング並びに国土数値情報などにもとづいて調査し、それぞれの方法の比較を行った。また現地調査により流出水の窒素濃度を測定し、集水域の畑草地面積率と窒素濃度との関係を調べ、両者の間に相関係数0.9以上の強い相関があることを確認した。2)関東地域の野菜畑地区において、地下水、湧水の窒素濃度を年間にわたり連日測定し、高濃度の流出水が定常的に流出することを確認した。2.水田の窒素浄化機能調査1)数カ所の谷津田集水域において、流出水の窒素濃度と負荷の測定を行い、潅漑期と非潅漑期との比較から、水田が潅漑期に窒素浄化を行っていることを確認した。2)休耕田に設けた試験区において、窒素除去試験を行い、水田が大きな窒素除去機能を有することを確認し、その数式化を行った。これにより実用化への目途が立った。3.室内土壌浸透実験高濃度の窒素を含む水を土壌中に飽和浸透させ、窒素吸着量と浸透強度の関係を調べ、その量的関係を数式化した。これにより、用水の浄化並びに肥料の流出防止に対する浸透量の制御条件が明らかになった。「衛星リモ-トセンシングによる集水域内土地利用解析研究」として、本年度は北海道釧路川流域を解析対象地域に選び、水質現地調査と衛星画像デ-タ解析を行った。解析衛星リモ-トセンシングデ-タとして、MSS、MESSR、TMの3種類の画像を使用した。各々のデ-タから水質測定点に対応した集水域の範囲のデ-タを切り出し、土地利用の教師付き分類を行い、集水域内の森林面積率、畑地・草地面積率、荒れ地面積率を求めた。次に、高速液体クロマトグラフィにより現地調査の際に採水した水質サングルを硝酸態窒素濃度を測定し、集水域内土地利用面積率との関係を求めた。その結果、釧路川流域においても畑地・草地面積率との間に正相関が認められ、畑地・草地から窒素が流出しており河川水質汚濁の原因の1つとなっている可能性があることを見い出した。農林地の水質調査:面源主体の農業集水域10ケ所と畜産のある集水域において、水質調査と土地利用状況調査を行い、モデルによるシミュレ-ションを検証した。また、畜産の存在による水質濃度への影響を調ベ、その影響の大きいことを確認した。さらに畑地からの湧水中の硝酸態窒素濃度が20mg/l以上の高い値を示すことと、それが期時的にほぼ一定で流量によって大きくは変化しないことを確めた。休耕田水質浄化試験:休耕田に(1)雑草区、(2)水稲区、(3)クレソン区、(4)クレソン(流量大)区、(5)無植生区の5区を設け、年間に亘って流下過程での窒素除去量を調ベた。その結果、各試験区とも高い窒素除去機能を示した。水稲栽哉期間19回の測定では窒素除去量は約0.6g/m^2,日であったが、除去量は水温が高く植物の生育の盛んな8月に高く、最高0.8/gm^2、日に達した。1.リモートセンシングによる集水域水質解析北海道釧路地域の水質測定を昨年に引き続き行い、さらに根釧地域と帯広地域の水質についても調査した。これら3地域はそれぞれ森林卓越低水質汚濁地域、山林・牧野中水質汚濁地域、畜産畑地高水質汚濁地域と予想される地域である。国土数値情報・衛星リモートセンシングデータから各水質測定点に対応した集水域内の土地利用面積率を求め硝酸態窒素濃度との間で、単回帰分析を行い相関係数0.90という高い正の相関が得られた。この結果をもとにモデルを作成中である。2.集水域からの流出水の水質調査と解析上記の北海道3地区の他に、茨城県北浦周辺地域、千葉県千潟町、長崎県諌早湾周辺地域、宮古島、宮崎県綾町などの集水域において、窒素濃度と流出負荷量を測定し、その土地利用状況と畜産負荷との関連を調査した。

その結果、多肥の畑地の影響が大きいことと、さらに多頭飼育の養豚場の影響がより一層大きいことが判明した。今後はこれらへの対策を立てることが重要である。3.休耕田の水質浄化機能調査茨城県阿見町の休耕田において窒素除去の自然浄化能調査を昨年に続けて継続した。水稲区、雑草区、無植生区、クレソン区とも昨年以上の大きな窒素除去機能を示し、除去機能が永続性をもつことが確かめられた。3年目も継続して調査を行う予定である。4.土壌浸透水質実験室内の恒温条件下において水田土壌を充填したサンプラーにNH_4溶液を浸透させ、土壌のNH_4吸着除去能を調べた。NH_4濃度や浸透速度が大きな影響をもつことを確認し、その理論化を進めている段階である。1.集水域の土地利用と流出水の水質との関連調査1)北海道の農林地において、その土地利用をリモートセンシング並びに国土数値情報などにもとづいて調査し、それぞれの方法の比較を行った。また現地調査により流出水の窒素濃度を測定し、集水域の畑草地面積率と窒素濃度との関係を調べ、両者の間に相関係数0.9以上の強い相関があることを確認した。2)関東地域の野菜畑地区において、地下水、湧水の窒素濃度を年間にわたり連日測定し、高濃度の流出水が定常的に流出することを確認した。2.水田の窒素浄化機能調査1)数カ所の谷津田集水域において、流出水の窒素濃度と負荷の測定を行い、潅漑期と非潅漑期との比較から、水田が潅漑期に窒素浄化を行っていることを確認した。2)休耕田に設けた試験区において、窒素除去試験を行い、水田が大きな窒素除去機能を有することを確認し、その数式化を行った。これにより実用化への目途が立った。3.室内土壌浸透実験高濃度の窒素を含む水を土壌中に飽和浸透させ、窒素吸着量と浸透強度の関係を調べ、その量的関係を数式化した。これにより、用水の浄化並びに肥料の流出防止に対する浸透量の制御条件が明らかになった。
精神障害者の行動制限と人権擁護に関する研究―精神科および一般科において身体的拘束を行う看護師の葛藤と対処行動―

本研究では、精神障害者の行動制限の中さも身体的拘束に注目した。「身体的拘束に関する看護師の葛藤および対処行動」について、精神科病棟と一般科病棟を比較検討することにより、精神科における身体的拘束の特徴を明確化することを目的とした。H15年10月から12月に渡り、某大学病院の精神科閉鎖病棟、消化器内科病棟において、クリニカルラダー・レベルIIに相当する臨床能力を持つ看護師(臨床経験年数25年)10名に、拘束に関する葛藤について半構成インタビューを行った。インタビューは、日頃の拘束場面を想起してもらい、拘束開始時、継続時、解除時の3期に分け、そこに生じる葛藤について語ってもらった。対象者了承の元で録音して逐語録にし、葛藤内容を読みとり、葛藤とそれに関連した要因を整理した。その結果、精神科と消化器内科に共通の葛藤は、「人を縛ることのつらさ」のような情緒的なもの、拘束適応を判断する妥当性に関するもの、患者の「安楽」と「事故リスク」との間に生じる葛藤などが語られた。精神科に特有な葛藤として、精神保健福祉法に関連した医師との協働に関するもの、精神疾患による患者の病理性と患者看護者関係に関するもの、暴力行為、自殺に関するもの等が語られた。消化器内科に特有な葛藤として、ターミナル期の患者理解に関するもの、一般科での精神病理の取り扱いに関するもの等が語られた。そして、葛藤は複数の要因が絡み合って生じ、患者状況や病棟文化が関連していることが推測された。また、拘束開始時には、拘束による患者の苦痛や情報収集不足に関連した葛藤、解除時には事故リスクに関連した葛藤が語られ、継続時には葛藤は少ないことが明らかとなった。また、各期とも、葛藤への対処を効果的に行うことで拘束を最小限にしていくことができると考察された。本研究では、精神障害者の行動制限の中でも身体的拘束に注目し、看護者の「身体的拘束に関する看護判断」を明確にすること、およびその視点の形成過程を明らかにすることを目的としている。精神科に勤務する看護者と一般科に勤務する看護者に、身体的拘束に関する看護判断についてインタビューし、それらの比較から精神科における特徴を明らかにしていく予定である。本年度は文献検討をし、身体的拘束に関する研究の動向を調べると共に、インタビューの構成について検討を行った。文献検討においては、本研究に関連した文献として、身体的拘束実施の状況および意識について精神科と一般科の比較を行ったという報告が見られた。身体的拘束の必要性についてのアンケートを量的に分析したもので、身体的拘束に抵抗や疑問を感じる者は、精神科よりも一般科に多いという結果が示されていた。一般科と精神科における認職の違いがあると裏付けられ、本研究のインタビューにより、その違いを質的に分析していくことで、精神科での身体的拘束に関する看護の特徴を明確にしていけるのではないかと考えられる。また、インタビューの構成としては、この先行研究においては、患者状況の違いが明らかになっていないため、身体的拘束を行う場合の患者状況を明確にし、ケアの実際と看護者の認識、看護判断を調査していくことが必要と考えられた。
特異的なフーリエ積分作用素・超局所双曲性・第2超局所解析

1(特異約なフーリ工積分作用素)線形双曲型偏微分方程式の解の(超局所)特異性の伝播の研究においては、解の特異性の分岐、conical refractionなど様々な現象が解析されてきた。特に、結晶光学に現れるconical rehactionの現象は、自然界に現れる自然なものとして多くの視点から研究が進められてきた。1985年ころから、conical refractionの研究に、余接束をその包合的な多様体に沿って爆裂して解析を行なう第2超局所解析(second microlization)を用いて分析を行なうことが試みられ、P. Laubin(LIEGE大)や私の研究により一定の結果を得る事ができた。第2超局所解析は、包合的な多様体上の超局所特異性を、余接束をその包合的な特性多様体にそって爆裂した空間上で解析を行なうものであるが、上で述べた研究で中途半端になっているものがある。超局所解析では、量子化接触変換、フーリ工積分作用素によつて、擬微分方程式が単純特性的な点において簡単な標準形にうつることが示されているが、第2超局所解析ではこの方向の研究が不十分である。すなわち、変換理論自体はあるのであるが、マイクロ函数の第2超局所特異性を分解した層を部分層として含む第2マイクロ函数の層の枠組みで構成されたものである。この研究では、解の構成に変換理論が使えるように、マイクロ函数の第2超局所特異性を分解した層の枠組みで変換理論を構成するための様々な準備を行なつた。2(第2超局所特異性の基礎的な研究)第2超局所解析で自然に現れる第2超函数の層は、正則包合的な多様体上に制限した佐藤のマイクロ函数の層を含む。この第2超函数の層を退化した偏微分方程式の境界値問題に応用した。1 (特異的なフーリエ積分作用素と第2超局所解析)線型双曲型微分方程式の解の特異性の伝播の研究においては、解の特異性の分岐、conical refractionなど様々な現象が解析されてきた。特に解の特異性のconical refractionの現象は、結晶光学の研究に現れる自然なものとして多くの視点から研究が進められてきた。1985年ころから、このconical refractionの研究に第2超局所解析を用いて分析を行うことが試みられ、P.Laubinや私の研究により一定の結果を得ることができた。第2章超局所解析は、余接束(cotangent bundle)の包合的(involutive)な多様体に沿って爆裂(blow-up)を行い、より精密に特異性の分解を行うものである。上で述べた、conical refractionの解析の中で途中のままになっているものに、第2超局所解析の枠組みでの方程式の変換理論がある。超局所解析では、量子化接触変換、フーリエ積分作用素によって、擬微分方程式が単純特性的な点において簡単な標準形(canonical form)に移ることを示されているが、この点では第2超局所解析の研究はまだ不十分である。今年度の研究は、第2超局所解析における変換理論を解のレベルでの積分作用素と関連付ける形で研究を行った。2 (第2超関数の基礎的な研究)第2超局所解析で自然に現れる第2超関数(2-hyperfunctions)の層は、正則な包合的多様体上に制限した佐藤のマイクロ関数の層を含む。この第2超関数の層を退化した偏微分方程式の境界値問題に応用する研究を行った。

特に解の特異性のconical refractionの現象は、結晶光学の研究に現れる自然なものとして多くの視点から研究が進められてきた。1985年ころから、このconical refractionの研究に第2超局所解析を用いて分析を行うことが試みられ、P.Laubinや私の研究により一定の結果を得ることができた。第2章超局所解析は、余接束(cotangent bundle)の包合的(involutive)な多様体に沿って爆裂(blow-up)を行い、より精密に特異性の分解を行うものである。上で述べた、conical refractionの解析の中で途中のままになっているものに、第2超局所解析の枠組みでの方程式の変換理論がある。超局所解析では、量子化接触変換、フーリエ積分作用素によって、擬微分方程式が単純特性的な点において簡単な標準形(canonical form)に移ることを示されているが、この点では第2超局所解析の研究はまだ不十分である。今年度の研究は、第2超局所解析における変換理論を解のレベルでの積分作用素と関連付ける形で研究を行った。2 (第2超関数の基礎的な研究)第2超局所解析で自然に現れる第2超関数(2-hyperfunctions)の層は、正則な包合的多様体上に制限した佐藤のマイクロ関数の層を含む。この第2超関数の層を退化した偏微分方程式の境界値問題に応用する研究を行った。1(特異的なフーリエ積分作用素と第2超局所解析)線形双曲型微分方程式の解の特異性の伝播の研究においては、解の特異性の分岐、conical refractionなど様々な現象が解析されてきた。第2超局所解析は、余接束(cotangent bundle)の包合的(involutive)な多様体に沿って爆裂(blow-up)を行い、より精密に特異性の分解を行うものである。2(第2超関数の基礎的な研究)第2超局所解析で自然に現れる第2超関数(2-hyperfunctions)の層は、正則な包合的多様体上に制限した佐藤のマイクロ関数の層を含む。1(特異的なフーリエ積分作用素)線形双曲型偏微分方程式の解の(超局所)特異性の伝播の研究においては、解の特異性の分岐、conical refractionなど様々な現象が解析されてきた。
発達期大脳皮質神経細胞の興奮性に対するアラキドン酸の修飾作用に関する研究

Leukotriene B_4(LTB_4)はアラキドン酸代謝産物のひとつであり、強力な白血球遊走作用を有することで知られている。しかしながら、これは脳内で産成されているにも関わらず、その神経細胞に対する作用は明らかではない。ところで、アラキドン酸はNMDA応答を増強し、そのlipoxygenase代謝産物が2次メッセンジャーとして作用しているとの報告がある。そこで、本研究でははじめに、ラットの大脳皮質神経細胞において、アラキドン酸によるNMDA応答の増強作用が発達段階によってどの様に変化するかについて検討した。対象は生後2-18生日(P2-P18)のラットから急性単離したニューロンである。これに対してパッチクランプ法を適用し、NMDA応答に対するアラキドン酸の作用について検討した。その結果、アラキドン酸のNMDA応答増強作用はP2-4でそれ以降に比して、有意に強いことが明らかとなった。また、アラキドン酸の代謝阻害剤の効果を見ると、P2-4の時期にはcyclooxygenase代謝産物が増強に関与していることが判明した。加えて、この時期にはprotein kinase Cもアラキドン酸の効果に寄与していることも明らかとなった。次いで、LTB_4がNMDA応答に及ぼす影響について検討を行った。対象は16-19生日のラット海馬CA1から急性単離したニューロンである。細胞内から投与したLTB_4はNMDA応答の時間経過を修飾し、これはG蛋白を介したCa-activated K-channelの活性化の抑制効果に寄ることが判った。この成績はLTB_4がNMDA応答を増強させる方向に作用することを意味する。他方、LTB_4を細胞外から投与した場合はNMDA応答を抑制した。このようにLTB_4が細胞膜の内外でNMDA応答に対して増強と抑制の両作用を有しており、細胞の興奮性の調節に微妙に関与していることが示唆された。
看護系大学教員の医療安全教育力向上プログラムの開発と出前講義システムの構築

本研究は、看護系大学教員の医療安全教育力向上のための研修システムの構築を目的としている。昨年度は教育内容と方法について、看護学生および医療安全系学会に参加した看護教員および臨床の看護職への調査を行った。今年度は看護系大学の学科長および看護教員への医療安全教育の現状把握の調査を行った。学科長対象の調査項目は、設置主体、医療安全管理の教育方法、教員の専門領域、教授内容、医療安全の教育・研修歴、教員への医療安全教育の必要性と方法等であり、回収率は17.8%であった。主な結果として、安全教育の教授方法は単科22.7%、主科と複数科45.4%、複数科31.8%であった。教員の専門領域は基礎看護学、看護管理学、成人看護学の順に多く、教育・研修歴は38・5%が未経験であり、研修内容は看護師従事時の受講経験と考えられ、最新の安全知識の獲得は十分でないことが推察された。教員への安全教育の必要性では54.5%が必要と回答し、理由として教員間の格差、系統的で定期的な研修の必要性、最新の知見の獲得等を挙げていた。必要ないとの回答では、附属病院の研修への参加、医療安全を専攻する教員の活用等を実施していた。この結果を受けて看護系大学教員への調査を実施し、現在集計中である。さらに、今年度も引き続き医療安全系学会での医療安全教育についてのパネルディスカッションおよびワークショップを開催し、看護教員、看護師とのディスカッションを行った。参加者から医療安全教育の課題として、「教育と臨床の話し合いの機会や時間がない」「教育と臨床現場の乖離がある」「看護学生も新卒看護師も基礎教育での医療安全の学び方がバラバラで対応が難しい」「医療安全のカリキュラム上の位置付けや教育の標準化がされていない」等の意見があった。今後、看護教員と臨床看護職が共同して継続的に医療安全教育力の向上に取り組むシステムを構築したいと考えている。研究計画における講義システムおよび先進校への視察については、医療安全系学会におけるシンポジウムやパネルディスカッションへの医療安全教育を先進的に行っている教育機関および医療施設の講師を招聘し、研究者だけでなく広く看護教員と臨床看護職での知見および課題の共有という、さらに進んだ方法にしている。今後さらに看護系教育機関と臨床看護師が共同して医療安全教育力の向上のためのシステムを構築する。国内の医療安全に携わっている看護職が関心を示し始めているため、研究を発展させて行きたいと考える。本研究は、看護系大学教員の実践に則した医療安全の知識と事故防止技術の獲得による医療安全教育力向上のための研修システムの構築を目的としている。今年度は、1.看護学生の医療安全への意識および臨床実習でのインシデント体験と教員の関わり等についての調査、2.医療安全系学会における本研究を基にしたパネルディスカッションの開催、3.医療安全教育の状況調査、4.全看護系大学を対象とした医療安全教育への全学的な取り組み状況と課題および教員への医療安全教育・研修の必要性についての調査を行った。その結果、前述1では、インシデント発生時の実習指導者や教員の学生への指導が「責められた」と取られたりするなど、看護教育における安全教育への取り組みが不十分であることが明らかになった。2では、看護系大学教員、CNE(clinical Nurse Educator)、臨床講師等の講演により、安全教育を多角的な視点から提起し意見交換を行うと共に、本研究の主旨を説明し協力を要請した。3は、2の学会企画における調査であり、看護教員への医療安全教育の重要性についての賛同および教育内容や方法への具体的な示唆が得られた。4.については現在集計段階である。以上、今年度の研究実績より、看護系大学における医療安全教育とそれを担当する教員の医療安全教育力の獲得については、教員個々では課題あるいは問題があると考えられているが、大学全体としての取り組みには至っていないのではないかと考えられた。またそのことにより、学生への安全教育の質が保障されていないのではないかと推測された。今後上記4の集計結果を詳細に分析し明らかにしたいと考える。また、教員を対象とした安全教育の方法等も研究当初に研究者らが考えていた以上に多様な意見があり、さらに検討する必要があることがわかった。研究計画した安全教育機関への視察については、研究開始後の研究分担者および研究協力者から幾つかの候補が挙がったため現在調整を行っているが、それ以外は概ね順調に進んでいる。

教員への安全教育の必要性では54.5%が必要と回答し、理由として教員間の格差、系統的で定期的な研修の必要性、最新の知見の獲得等を挙げていた。必要ないとの回答では、附属病院の研修への参加、医療安全を専攻する教員の活用等を実施していた。この結果を受けて看護系大学教員への調査を実施し、現在集計中である。さらに、今年度も引き続き医療安全系学会での医療安全教育についてのパネルディスカッションおよびワークショップを開催し、看護教員、看護師とのディスカッションを行った。参加者から医療安全教育の課題として、「教育と臨床の話し合いの機会や時間がない」「教育と臨床現場の乖離がある」「看護学生も新卒看護師も基礎教育での医療安全の学び方がバラバラで対応が難しい」「医療安全のカリキュラム上の位置付けや教育の標準化がされていない」等の意見があった。今後、看護教員と臨床看護職が共同して継続的に医療安全教育力の向上に取り組むシステムを構築したいと考えている。研究計画における講義システムおよび先進校への視察については、医療安全系学会におけるシンポジウムやパネルディスカッションへの医療安全教育を先進的に行っている教育機関および医療施設の講師を招聘し、研究者だけでなく広く看護教員と臨床看護職での知見および課題の共有という、さらに進んだ方法にしている。本研究は、看護基礎教育の教員だけでなく臨床での看護教育者や看護管理者が研究分担者および研究協力者として参加している。今年度の実績にあるように、調査およびパネルディスカッション参加者から多くの協力が得られている。そのため次年度の調査および公表についての継続した取り組みを行うことで、医療安全教育・研修システム構築への多くの示唆が得られると考える。今後さらに看護系教育機関と臨床看護師が共同して医療安全教育力の向上のためのシステムを構築する。国内の医療安全に携わっている看護職が関心を示し始めているため、研究を発展させて行きたいと考える。今年度に実施する予定であった安全教育の先進教育機関への視察について、研究開始後に更に精選する必要があり、現在視察機関を調整中である。そのため、次年度の実施時に使用する予定である。研究計画において医療安全教育の先進教育機関への視察を計画したが、シンポジウムやパネルディスカッションへの講師招聘という方法に変更したため研究者および研究協力者の旅費使用が不必要となった。今後、医療系学科での教育研修の際の施設使用料や企画費が必要である。
サンヴァラ系密教の儀礼に基づくインド密教史ー儀礼文献の原典研究ー

本研究は、インド密教において9世紀以降に登場するサンヴァラ系密教に関して、その実践的な儀礼の新たな側面を明らかにするために、儀礼文献の基軸となるサンスクリット写本を積極的に活用した批判的な検討によって、当時の社会的価値観や思想が多分に反映されていると考えられる同密教の儀礼がインド密教史の変遷と展開の中で重要な役割を担った可能性について言及するとともに、得られた結果を踏まえて錯綜したインド密教史を解明しようとするものである。
地熱貯留層における透水性低下の要因の解明

地熱発電の出力規模を決定する生産井の噴出量は,地熱流体が流動する開口性断裂の透水性に依存する。地熱流体からの熱水性鉱物の生成に伴う自己閉塞作用により,この透水性は断裂形成期から今日に至る過程で低下し,現在も進行している可能性がある。これを解明するため,岩手県葛根田地熱地域を研究対象地域とし,(1)生産井の噴気試験時に噴出した岩片の鉱物学的研究と流体包有物試験(2)地熱流体の上昇帯における代表的な熱水性鉱物である硬石膏の流体包有物試験と硫黄同位体測定(3)熱水性鉱物-地熱流体間の化学平衡論的検討(4)硬石膏のカソードルミネッセンス観察を実施した。噴出岩片は地熱流体の流入箇所付近に分布する岩石が地熱流体の流動によって削られて地表に噴出したもので,緑簾石・ぶどう石・ワイラケ沸石・自形石英などの熱水性鉱物で構成される。熱水性鉱物の共生関係は,地熱流体が地層中の開口性断裂を流動する過程で温度の低下とともに緑簾石・石英・ぶどう石が晶出することによって,断裂の透水性は次第に低下していったことを示唆する。地熱流体の上昇帯に分布する硬石膏は,第四紀葛根田花崗岩の定置後に種々の塩濃度(35wt% NaCl +CaCl_2eq.以下)を有する沸騰化石流体から主に生成したと推察される。生産井の噴気試験時に採取した噴出流体の化学組成データを用いて,熱水性鉱物-地熱流体間の化学平衡計算を行った結果,(1)硬石膏は上昇帯では現世地熱流体から生成し易い(2)地熱流体はぶどう石と平衡であることがわかった。2年間にわたる研究により,地熱流体が流動する開口性断裂の透水性はぶどう石などの熱水性鉱物の生成によって低下途上にあると結論される。今後の地熱開発事業者による開発リスクの低減を図るためには,硬石膏のような複数の生成時期をもつ熱水性鉱物については,最新の地熱流体から生成したものを特定する必要があり,カソードルミネッセンスはこの有力な方法となりうる可能性がある。地熱流体からの熱水性鉱物の生成による自己閉塞作用により,この透水性は断裂形成期から今日に至る過程で次第に低下し,現在も進行している可能性がある。これを解明するため,岩手県葛根田地熱地域の浅部生産井Well-4(掘削深度1448m)の噴気試験時に噴出した岩片について,熱水性鉱物の鉱物学的特徴を調べるとともに,流体包有物の加熱冷却実験を実施した。本噴出岩片は多孔質の熱水性鉱物であり,緑簾石・ぶどう石・ワイラケ沸石・自形石英で構成されている。EPMA分析によれば,緑簾石は最大25%のピスタサイトを含み,またぶどう石は微量のMnとMgを,ワイラケ沸石はNa_2Oを3.59%含有する。

当生産井の全深度にわたる熱水性鉱物の分布および温度検層結果によれば,本岩片は地熱流体の流入箇所付近に分布する岩石が削られた後,地熱流体に伴って地表に噴出したものであると判断される。石英中の流体包有物の最低均質化温度は228°Cを示し,噴出流体の地化学データより算出された地化学温度225°C,および静止時の検層温度224°Cと非常に良く一致し,流入箇所の流体温度は約225°Cと推定される。さらに,多数の深度における熱水性鉱物の共生組織および均質化温度測定結果から,石英の生成温度は225250°C,石英より早期に晶出した緑簾石の生成温度は300°C以上であると推定される。本研究によって,地熱流体が地層中の開口性断裂を流動する過程で,温度の低下とともに緑簾石・石英・ぶどう石が晶出し,断裂の透水性は次第に低下していったことが予想できた。葛根田地熱地域のアップフローゾーンを代表する硬石膏中の流体包有物のガス組成,均質化温度,氷点降下温度,および硬石膏の硫黄同位体の各測定を行い,カソ一ドルミネッセンス観察を実施した。さらに,平成9年度の研究成果も加味して熱水性鉱物ー地熱流体間の化学平衡論的検討を実施した。硬石膏のほとんどは産状から,葛根田地熱系の熱源と考えられる第四紀葛根田花崗岩の定置後に生成したと判断される。硬石膏中の液体包有物と多相包有物のなかには,氷点降下温度がNaCl-H_2O系の共融点よりも低いものが存在することから,包有物組成はNaCl-CaCl_2-H_2O_3成分系からなる可能性が高い。気相包有物は液体包有物と密接に共生する。硬石膏の硫黄同位体値は主に+21.6+24.2パーミルであり,生産井から噴出する熱水の硫黄同位体値より重い。これらの諸データに基づけば,アップフローゾーンに分布する硬石膏は,葛根田花崗岩の定置後に種々の塩濃度(35wt% NaCl+CaCl_<2eq>.以下)を有する沸騰化石流体から主として生成したと結論される。四重極質量分析計による硬石膏中の液体包有物のバルクガス分析結果は,浅部では天水の希釈による地熱流体の脱ガス化が硬石膏の生成後に進行したことを示唆する。カソードルミネッセンスは複数の生成時期をもつ硬石膏のうちから,最近の地熱流体により生成した硬石膏を特定することができる可能性がある。生産井の噴気試験時に採取した噴出流体の化学組成データを用いて,熱水性鉱物ー地熱流体間の化学平衡計算を行った結果,(1)地熱流体はアップフローゾーンで硬石膏に若干過飽和状態にあり,硬石膏はこのゾーンでは現世の地熱流体から生成し易い(2)地熱流体はぶどう石と平衡であること等が明らかとなった。
DNA鑑定技術による迅速な毒きのこ中毒診断システムの開発

本研究では,形態では識別不可能なきのこの同定をDNAレベルで行うための基礎的な研究を行った.その概要は,以下の通りである.まず,ホンシメジを材料として,単胞子分離が困難なきのこの生物種の検定方法を開発すると共に,その生物種を推定するのに適した遺伝子の探索を行ったところ,ミトコンドリアSSUのV4領域の塩基配列の比較が,適当であることが分かった.続いて,加工調理したきのこにDNA鑑定が適用可能かどうかを調べるため,市販の生のきのこ,缶詰のきのこ,レトルト包装されたきのこを調理して,そこからDNAを抽出し,PCRを行った.その結果,缶詰やレトルト包装きのこを調理した場合でも,250bp程度までの断片であれば,増幅可能であることが分かった.最後に,日本における毒きのこによる食中毒で発生件数の内原因となるきのこがわかっているもの77%を占める、ツキヨタケ、クサウラベニタケ、ドクササコ、カキシメジについて、シークエンスなどの時間を省略するため種特異的なプライマーを設計し、それによるPCRでこれら4つの種を特異的に検出する方法を開発した。またPCRはPCRやPCR後の電気泳動に掛かる時間を短縮するため、リアルタイムPCRを用いて行った。その結果,毒きのこの中毒の原因となるきのこを1時間30分と迅速に同定する方法を開発した。また一回の反応も50円程度にコストダウンすることができた。これらの技術は、毒きのこによる中毒が起こった時のような救急医療の現場で、原因となるきのこの迅速で安価な同定のほか、保健所のような食中毒のデータの収集が求められる機関における、原因となるきのこの簡便で安価な同定や、2002年2006年までの食中毒でも発生件数の内32%を占めている不明の内、きのこの同定が不可能で不明となっているもの簡便で安価な同定による減少や、科学捜査研究所などにおける法医学鑑定の進歩に役立つと考えられる。毒きのこの中毒が疑われる患者が発生した場合、迅速に適切な治療をする必要があるが、そのためには原因となるきのこを正確に同定することが重要である。しかし、中毒が起こった時には、きのこは調理された後で、同定するのに十分な形態を保持していないことが多い。そこで、きのこが欠片しかない場合や、専門的な知識がない人でも中毒の原因となるきのこを正確に同定する方法が求められており、本研究ではDNA技術を使って種を同定する方法の開発を目的とした。本研究は、まず日本の毒きのこによる食中毒の原因となるきのこと、それに形態のよく似た食用きのこ19種の菌糸体または子実体を集め、そして、DNA配列の収集を行った。まず調理したきのこからPCR反応に十分なDNAが抽出可能かどうかを調べた。"焼き","炒め","揚げ","茹で"の調理したきのこからDNAを抽出し、得られたDNAの大きさなどをアガロース電気泳動により調べた。その結果、"焼き","炒め","揚げ"の調理をしたものでは、未調理と比べDNAはやや分解していたが、20kbp程度のサイズの大きなDNAが確認できたものもあり、また小さい場合でも、5kbp程度の大きさのDNAが確認できた。一方、"茹で"の調理をしたものは"焼き"、"炒め"や"揚げ"の調理をしたものよりもDNAの断片化が激しかったが、それでも500bp以上のDNAが電気泳動によって確認できた。次にこれらのDNAを用いてPCRを行い、DNAが増幅するかどうかを調べた。その結果、どの調理をしたきのこから抽出したDNAを鋳型にしても、PCR法によりDNA断片の増幅を確認することができた。

以上のことから、増幅産物の遺伝子の塩基配列シークエンスを決定し、DNAデータベースと相同性検索することで、種の同定が可能であると考えられる。本研究では,形態では識別不可能なきのこの同定をDNAレベルで行うための基礎的な研究を行った.その概要は,以下の通りである.まず,ホンシメジを材料として,単胞子分離が困難なきのこの生物種の検定方法を開発すると共に,その生物種を推定するのに適した遺伝子の探索を行ったところ,ミトコンドリアSSUのV4領域の塩基配列の比較が,適当であることが分かった.続いて,加工調理したきのこにDNA鑑定が適用可能かどうかを調べるため,市販の生のきのこ,缶詰のきのこ,レトルト包装されたきのこを調理して,そこからDNAを抽出し,PCRを行った.その結果,缶詰やレトルト包装きのこを調理した場合でも,250bp程度までの断片であれば,増幅可能であることが分かった.最後に,日本における毒きのこによる食中毒で発生件数の内原因となるきのこがわかっているもの77%を占める、ツキヨタケ、クサウラベニタケ、ドクササコ、カキシメジについて、シークエンスなどの時間を省略するため種特異的なプライマーを設計し、それによるPCRでこれら4つの種を特異的に検出する方法を開発した。またPCRはPCRやPCR後の電気泳動に掛かる時間を短縮するため、リアルタイムPCRを用いて行った。その結果,毒きのこの中毒の原因となるきのこを1時間30分と迅速に同定する方法を開発した。また一回の反応も50円程度にコストダウンすることができた。これらの技術は、毒きのこによる中毒が起こった時のような救急医療の現場で、原因となるきのこの迅速で安価な同定のほか、保健所のような食中毒のデータの収集が求められる機関における、原因となるきのこの簡便で安価な同定や、2002年2006年までの食中毒でも発生件数の内32%を占めている不明の内、きのこの同定が不可能で不明となっているもの簡便で安価な同定による減少や、科学捜査研究所などにおける法医学鑑定の進歩に役立つと考えられる。