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少子高齢化社会の学校・園が抱える近隣トラブルの問題構造分析と関係改善に関する研究

学校や保育園・幼稚園などに対して近隣住民から、子どもの声や部活動の音、通学のマナーや、砂ぼこり、植栽などに関する苦情・クレームはあとをたたない。住民の平穏な生活環境を保護することと、子どもの成長発達にとって必要な教育機関から必然的に生じる生活騒音やマナー問題を、どのように両立させていくことが必要かをこの研究課題では探っていった。数々のアンケート調査および実態調査を重ねる中で、多くの論文を著してきたが、その集大成として『「迷惑施設」としての学校ー近隣トラブル解決の処方箋』(時事通信社、2017年)を刊行した。ポイントは、問題解決の主役は教職員ではなく児童生徒がどのような役割を果たすかにある。1.学校や保育園・幼稚園などの教育機関は、いまや保護者との関係づくりに腐心するだけでなく、学校周辺の近隣住民からの苦情やクレームに関する問い合わせ事案が急増し、一部ではこじれて紛争や訴訟にまで発展している。本研究は、こういった従来から存在はしていたが、そこに学問的な研究の視点が注がれることはほとんどなかった問題を対象にして、それを多面的な角度から分析し、問題の解決あるいは関係の改善のための方策を考察することを目的としている。2.このためにまず、社会的に大きな課題であることを周知するために、2015年6月6日に、大阪大学・人間科学部を会場にして総合的なシンポジウムを、日本教育学会・近畿地区研究会との共催で実施した。テーマは「学校・園と周辺住民とのトラブルをどう考えるか教育施設の抱える近隣トラブルの特質と良好な関係づくり」であり、NHKの番組ディレクター、音響トラブルの研究者、保育学が専門で住民とのトラブルに詳しい研究者、そして違った角度から問題に迫るために警察の生活安全課を長く経験された方の4名をシンポジストとして、研究代表者がコーディネータ役を務めた。このシンポジウムへの関心は極めて高く、102名の教育関係者の参加があり、活発な議論の展開があった。大きな成果はなによりも、従来までにはなかった企画として構成し、多彩なメンバーを集めたこのシンポジウムを成功裏に終わらせたことにあったと考える。3.また研究開始の初年度の2015年は、近隣住民トラブルを、単に学校・園という教育機関に限定せずに、より広く地域に住まう人間どうしのトラブルや紛争および関係改善に関する資料を集めての分析や検討を開始している。1.2015年6月6日に開催した、おそらく歴史上初めてとなる「学校・園と近隣住民のトラブル」に焦点をあてて実行した公開シンポジウムでは、「お互い様」とか「仲良くするためには」といったありがちな議論ではなく、実態に即しつつ、同時に矛盾をはらんだ活発な議論が展開された。2.近隣住民とのトラブルはどちらかが引っ越さない限り、長期間にわたる深刻な紛争となりやすい。これに現代的な状況としての少子高齢化、産業構造の変化から夜間勤務者の増加と夜勤明けの休養の必要性、そして個人志向のライフスタイルの浸透などが影響を与えている。「子どものためなのだから」「お互い様だよ」「寛容性がない社会がおかしい」といった理屈は本当に正しいのか、を再検討するための問題提起の機会となった。3.こういった実績は徐々に、研究代表者への講演依頼という形であらわれた。8月18日は奈良市教育委員会主催の研修会で、9月9日には枚方市教育委員会主催の研修会で、10月30日には群馬県西部教育事務所(高崎市)主催の研修会で、学校近隣トラブルをテーマとした講演を実施した。4.研究論文の実績という点では、研究計画調書を作成した2014年10月から、すぐさま「学校近隣トラブル再考」というテーマで、『内外教育』誌(時事通信社発行)に、合計8回にわたって連載原稿を執筆し、研究成果の公表に努めてきた。5.そういった評判を聞きつけて、4月18日にはNHKスペシャル「にっぽんのこれから」の番組制作ディレクターが研究代表者の研究室を訪れ、この学校・園の抱える近隣トラブルが関係するテーマでの番組制作についての助言を請われた。1.昔から地域の学校として、ある程度は親しまれ、文化の拠点として位置づいてきた小学校や中学校でも、さらには待機児童対策で注目される保育園(幼稚園・認定こども園)に対しても、1990年代以後は急速に近隣住民からの苦情が増え始め、そのトラブル対応に苦慮していることが全国的に散見される。2.こういった近隣トラブルを、学校の教職員はどのように思っているかを、逆に「一住民」という立場で考えた場合に、どのような意識を持っているかを問うた「学校・園と近隣住民との苦情・トラブルに関する質問紙調査(予備調査)」を5月から8月にかけて、研究代表者への依頼のあった全国約10箇所の講演先で収集した。約2000人ほどからのデータを、現在分析中である。3.「公共性を錦の御旗」として振りかざすことも「先住民争い」をすることも、現代社会の学校・園の近隣トラブルの解決には役に立たない。また現実に困惑している状況に対する理解のない、当事者意識のない人たちから「寛容性がない」と片づけられることは問題をこじれさせることにつながる。ではどうしたらよいのか。これまでの研究の蓄積から言えるトラブルを少なくする方法は、次の2つではないかと想定している。一つは、当事者である「児童生徒たち」が、直接にその住民からの苦情・クレームと向き合いながら、折り合うべき可能な方策を探ることである。2つめは、学校や園も「地域に住まう者(組織・団体)の一人」として「町内会(自治会)に入ろう」ということにある。

4.これまで著してきたいくつかの論文を基にして、新たに執筆した原稿を加えた形で、広く世の中に研究成果を還元していくために、著作の執筆に取りかかり、研究代表者著『子どもは社会の迷惑か?学校・園の近隣トラブル』(仮題)(時事通信出版社、2017年)の校正ゲラ段階まで到達している(2017年3月末現在)。1.「研究実績の概要」の4で述べたように、研究成果の社会への発信としての著書『子どもは社会の迷惑か?学校・園の近隣トラブル』(仮題)(時事通信出版社、約200頁)を上梓する準備が整って、その完成間近まできた。2.同じく「研究実績の概要」の2で述べたように、教職員に対する「学校・園と近隣住民との苦情・トラブルに関する質問紙調査(予備調査)」のデータの中から、いくつもの知見を発見できつつあること。特に研究代表者が進めている「学校と保護者との間に生じるトラブル」との比較で、興味深い近隣トラブルの内容とその特色が見られる。3.研究代表者の研究実績を聞きつけて、すでに昨年度に引き続き、学校と近隣住民との関係改善についての講演や学習会講師の依頼が、特に学校事務職員から寄せられ「大阪府学校事務研究会」(2016年11月2日)、「新潟県学校事務研究会」(2016年11月26日)で講演という形で発表したほか、研究代表者が加わった教員免許状更新講習において、また担当する教職科目「特別活動論」においても、このテーマで講義できるところまできた。なお前者については講演録というフルペーパーで「学校と周辺住民とのトラブルをどう考えるか「子どもの声は騒音かもしれない」という前提で始める良好な関係づくり」というタイトルで『第25回大阪府公立学校事務研究大会記録集』に掲載されている。4.さらに研究論文としては、日本教育経営学会編『現代の教育経営』第2巻『現代の教育課題と教育経営』に「第11章学校が抱える近隣住民とのトラブルと新たな関係づくりー学校も地域住民の一人であるー」を執筆した(印刷中)。1.現代の学校や保育園・幼稚園が抱える深刻なトラブルとして、学校周辺の近隣住民からの苦情やクレームに関する事案も多くある。「成長過程にある子どものことだから大目に見る」という寛容性は一部では残っているが、他方で住民からは「我慢にも限界がある」と感じることも少なくない。「子どもの発達・学習権の保障」と「隣人住居の平穏という人格権の保障」を、どうやって両立させていくことが可能だろうか。学校や保育園・幼稚園などを、ゴミ焼却場や精神病院などの、住民にとって望ましくないと考える公共施設=「迷惑施設」あるいはNIMBY(ニンビー)(not in my backyard、私の裏庭には作らないで)にさせないために、どのような改善策を考案していくかが、必要かつ喫緊の課題である。2.今年度は研究実績をまとめて『迷惑施設としての学校ー近隣トラブル解決の処方箋』(時事通信社、2017年6月発刊、204頁)として出版することができた。この本でのポイントは2つある。トラブル解決の主役は、学校の教職員ではなく当事者としての子ども(児童生徒)であること、学校・園も町内会に入ろう、ということである。いずれも「主体性」と「当事者性」を自覚し、双方向で打開の道を探ることの提案である。3.これをもとに、さらに実態調査を重ねた。長野県立
低質粗飼料の栄養価改善に関する研究

名古屋大学農学部附属農場では、かねてより生長期の草を緑汁液と搾汁残渣に分画し、前者からはさらに蛋白質を分離して食品原料あるいは蛋白質飼料源とし、後者はサイレ-ジにして反芻家蓄飼料として用いる研究を行っている。搾汁残渣からは、水分のみならず緩衝物質の一部も除去されているため必らず良質サイレ-ジが得られ、また、その家蓄への給与は、緑汁液が除去されているにもかかわらず適度の蛋白質を供給するのみか、ル-メン内プロピオン酸濃度ひいては熱産生効率を高めることを示した。しかし緑汁液からの蛋白質の分離は多大の経費を要し、経済的に引き合わない。そこで蛋白質に富むこの緑汁液を、豊富な資源ではあるが著しく蛋白質に欠ける稲ワラに添加してサイレ-ジとし、良質粗飼料を倍増する計画を立てた。どうせ液を添加するなら同時にアルカリ処理効果を得ようと考え、NaOHおよびNH_3も稲ワラ乾物の4%になるように緑汁液と共に添加して両者の効力を比較した。その結果、緑汁液の添加により稲ワラサイレ-ジの粗蛋白質含量は34%増加したが、水のみを添加したサイレ-ジを尿素と共に給与した場合と栄養的には差が無かった。緑汁液を嫌気発酵させて数日間放置した際の沈澱部のみを稲ワラに添加することにより蛋白質付加量を増そうと試みたが、効果は得られなかった。しかし緑汁液をNaOHで処理したのち添加することにより、それを給与したヤギのル-メン内NH_3、血中尿素および尿窒素が著しく減少し、その結果窒素の利用性が著しく向上した。NaOH処理により尿窒素が減少することは、アルファルファ予乾草にNaOhを添加して調製したサイレ-ジでも再現された。また、NaOH処理緑汁液の添加により稲ワラの繊維成分の消化率が著しく改善されたがNH_3処理には及ばなかった。その原因は窒素供給量の差に帰せられそうであるが、計画にしたがい反芻行動やバイパスアミノ酸量の差についても調査し、デ-タ解析中である。イタリアンライグラスおよびアルファルファを圧搾して得た緑汁液を、直接あるいは混合する稲わら乾物の4%に相当する水酸化ナトリウムあるいはアンモニアを添加後、水分含量70%になるように稲わらと混ぜて嫌気条件下で貯蔵した。緑汁液の添加により稲わらサイレ-ジの粗蛋白質含量は34%増加し、アンモニア処理によりさらに著しく増加した。いずれの草種を用いた場合も、緑汁液のみを添加すると発酵品質が改善されたが、アルカリ処理をした緑汁液の添加はサイレ-ジの酪酸およびアンモニア含量を著しく増加させた。しかしこのようなサイレ-ジ品質の低下も、家畜の食欲に影響を及ぼすことはなかった。緑汁液のみを添加した稲わらサイレ-ジの消化率は緑汁液が異なっても変わらなかったが、窒素蓄積量はアルファルファ緑汁液を用いた場合の方が多かった。アルカリ処理を行うと、繊維成分の消化率が高まるうえ窒素成分の利用性も向上し、なかでもアンモニア処理による効果の方が大きかった。以上の結果は、緑汁液を添加した稲わらサイレ-ジ中の窒素含量ではル-メン内微生物の最大活性を得るには不十分であり、アンモニアの添加によりこの不足が解消されたことを示している。

このことは、蛋白質含量の高いアルファルファ緑汁液を用いた場合の方が、イタリアンライグラス緑汁液を用いた場合に比し、水酸化ナトリウムおよびアンモニア処理を行った両サイレ-ジ間の消化率の差が小さかったことからも明らかである。水酸化ナトリウム処理をしたものを給与すると、無処理のものに比し蛋白質消化率は変わらないにもかかわらずル-メン内アンモニアおよび血中尿素態窒素濃度が低下し、尿中窒素量が減少した。この結果は水酸化ナトリウム処理による繊維成分の消化性向上、すなわちル-メン内発酵性エネルギ-の増加により微生物体蛋白質の合成が促進されたことを示すと考えられるが、さらに詳細な検討を行う予定である。平成元年度の実験で、稲ワラにNaOH処理を施こした緑汁液を添加して貯蔵したサイレ-ジは、水のみあるいは無処理緑汁液を添加して貯蔵したサイレ-ジよりも繊維成分の消化率が高かったがNH_3処理緑汁液を添加したものには及ばず、また、それを給与したヤギのル-メン内NH_3濃度、血中尿素濃度および尿中窒素排泄量は、緑汁液中のN量に相当する尿素とともに水添加サイレ-ジを給与した場合や、無処理の緑汁液を添加したサイレ-ジを給与した場合よりも低く、その結果、窒素保留量が増加することを示した。NH_3処理よりもNaOH処理の方が繊維の消化率が低かった原因としてN供給量の不足に基づく微生物活性の差が考えられ、また無処理緑汁液の添加よりもNaOH処理緑汁液添加の場合の方が窒素の利用性が高まったことから、アルカリ処理によるル-メンバイパス効果が考えられた。これらの点を明らかにする目的で、新たに以下に述べる2つの実験を行った。まず、緑汁液からのN供給量を増すために発酵凝固あるいは酸凝固させて静置し、沈澱部(全容量の1/3)を直接あるいはNaOH処理後稲ワラに添加してサイレ-ジを調整したが、前実験以上にN供給量を増すことはできず、動物に給与した結果からも、とくに新しい知見を得ることはできなかった。そこで高蛋白のアルファルファを直接あるいはアルカリ処理後サイレ-ジにし、これらをヤギに給与した場合の繊維成分の消化率や窒素出納を比較した。その結果、NaOH処理は粗蛋白質の消化率を有意に低下させるが尿中N排泄量も有意に低下させるところから、N保留には影響しなかった。しかしこのような若い草を用いた場合には、アルカリ処理による繊維成分の消化率の改善効果は得られなかった。緑汁液の搾汁残漬の消化性は極めて良く、その給与はル-メン内におけるプロピオン酸産生を高めるところから、育成および肥育用粗飼料に好適と考えられる。
クラスタ-の構造と機能発現との相関に関する理論的研究

本研究は,クラスタ-および分子集団の示す諸機能がそれらの構造とどのような相関関係にあるかを,理論化学の立場より解明し,クラスタ-の発現する諸現象の理解に役立つ新しい概念を構築することを目的としている.本年度は,静電的な力と電荷移動力の重復によってできるマイゼンハイマ-型イオン・クラスタ-の構造とその安定性を論じるとともに,第3周期以降の元素を中心原子とする5配位化合物の凝回転反応の機構を解明した.正確な化学反応ポテンシャルを描くことが分子設計,材料設計の基礎である.しかし,現在においても簡便な方法でポテンシャル曲面を反応経路全体にわたって化学的な精度で算出する理論は開発されていない.本年度は,この問題をについても研究した.この方法はMultireference MollerーPlesset摂動論である.理論の基本的な考え方は次の通りである.一体近似であるSCF法からの改善を図るには電子間の衝突,相関を取り込まねばならない.電子相関効果には2種類あり,1つはCoulomb holeに由来するDynamical Correlationであり,他の1つはnear degeneracyによるnonーdynamical correlationである.最初のdynamical correlationは電子間の衝突をそれぞれ独立に扱うIndependent electron pair approximation(IEPA)が良い近似となる.また,nonーdynamical correlationはmultireference近似が有効である.したがってstateーspecificなnonーdynamicalcorrelation効果を0次波動関数に取り込んでおけば,残りはdynamical correlationだけになり,これらはIEPAで評価できる.この考え方に基づきmultiーconfigurationalSCF波動関数をreference functionとする2次のMollerーPlesset(MP)摂動法を新しく開発した.本理論は物理的描像も簡潔であり,計算も従来の方法に比較して飛躍的に簡単になる.本研究は,クラスタ-および分子集団の示す諸機能がそれらの構造とどのような相関関係にあるかを,理論化学の立場より解明し,クラスタ-の発現する諸現象の理解に役立つ新しい概念を構築することを目的としている.本年度は,静電的な力と電荷移動力の重復によってできるマイゼンハイマ-型イオン・クラスタ-の構造とその安定性を論じるとともに,第3周期以降の元素を中心原子とする5配位化合物の凝回転反応の機構を解明した.正確な化学反応ポテンシャルを描くことが分子設計,材料設計の基礎である.しかし,現在においても簡便な方法でポテンシャル曲面を反応経路全体にわたって化学的な精度で算出する理論は開発されていない.本年度は,この問題をについても研究した.この方法はMultireference MollerーPlesset摂動論である.理論の基本的な考え方は次の通りである.一体近似であるSCF法からの改善を図るには電子間の衝突,相関を取り込まねばならない.電子相関効果には2種類あり,1つはCoulomb holeに由来するDynamical Correlationであり,他の1つはnear degeneracyによるnonーdynamical correlationである.最初のdynamical correlationは電子間の衝突をそれぞれ独立に扱うIndependent electron pair approximation(IEPA)が良い近似となる.また,nonーdynamical correlationはmultireference近似が有効である.したがってstateーspecificなnonーdynamicalcorrelation効果を0次波動関数に取り込んでおけば,残りはdynamical correlationだけになり,これらはIEPAで評価できる.この考え方に基づきmultiーconfigurationalSCF波動関数をreference functionとする2次のMollerーPlesset(MP)摂動法を新しく開発した.本理論は物理的描像も簡潔であり,計算も従来の方法に比較して飛躍的に簡単になる.
廃プラスチックを汎用性化学原料へ変換するモノマーリサイクル法の研究

研究1<炭水化物とポリカーボネート(PC)の反応>:17年度にはPCとトリオールのグリセロールとの加溶媒分解を行い所期の成果、すなわちBPAとhydroxymethyldioxorane(HMDO)が定量的に得られることを見出した。引き続き18年度では、ピラノース型ペントールのグルコースとの反応においても、環状カーボネート構造を同一分子中に二つ有するグルコース・ビスカーボネートが得られることを魅いたした。このビス炭酸エステルが形成されるグルコース環上の位置は、1,2-位のほかは予想に反して4,6-位であり、それぞれ5員環と6員環が形成された。すなわちこの3環式化合物の生成において3-位の水酸基は反応に関与しないことが示された。グルコース水酸基のcis,trans立体配置、炭酸エステル環の歪み、水酸基の反応性の差が原因となり、この観測された位置選択性が出現することを明らかにした(日本化学会87春季年会発表、報告論文作成中)。立体配置の異なる他の単糖類ならびに多糖類との反応は現在進行中である。このように、炭水化物はPCの加溶媒分解における解重合試薬としてのみならず、炭酸ユニットの受け皿、すなわち炭酸等価体としても機能することを明らかにした。研究2<ポリビニルアルコールとの反応>:研究計画1の多糖類への応用拡大と同時に、同じく典型的ポリオールであるポリビニルアルコールへ拡大した研究を進め、現在研究が進行中である。研究3<シリコーンゴムの易リサイクル架橋結合の設計>:超臨界二酸化炭素を反応媒体、ジフェニルジスルフィドを脱架橋試薬に用いた系で、架橋天然ゴムを主成分とするトラックタイヤの化学リサイクルを行い、適度に架橋を残した混練可能なゲル成分とゴム分からなるリサイクル物質が得られた。これはブレンド法を用いて再利用可能であった。このルーズな解重合処理技法を、過去の研究でアミン系アルカリ触媒によりモノマーへ解重合することが判明しているシリコーンゴムへ適用し、架橋をルーズに切断したオリゴマー状態でサイクルさせる研究を現在進行させている。研究計画1の途中経過と成果:ポリカーボネート(PCと略記)を炭水化物と複合的に化学原料化する試みとしてグリセロールをモデルに選び、PCから炭水化物へ炭酸ユニットだけを移動して環状炭酸エステル化を行い、残ったモノマーのビスフェノールAを定量的に回収する反応を検討した。その結果、期待どおりの結果を定量的に得る反応条件を見出した。このことは、廃PCを高炉還元剤や焼却エネルギー回収用に最終利用するまえに高価値の化学原料用途が多くあることを示し、PCの化学的再生循環ルートへ取り組む必要があることを明らかにした。研究計画2の途中経過と成果:上の成果を受けて、PC炭酸ユニットを受容する炭水化物材料を拡張するために、はじめにグルコース(GL)を炭水化物に炭酸ジフェニル(DPC)をPCモデルに選んで検討した。その結果DPCの炭酸ユニットはGLに取り込まれることがわかった。GLの複数の水酸基のうちどれに環状炭酸エステルが形成されるのかを現在分析中である。研究計画3の途中経過と成果:シリコーンゴムの架橋構造を解重合することに先立ち、超臨界二酸化炭素を利用した天然ゴムを中心とするジエン系ゴム加硫物のケミカルリサイクルを検討した。

その結果、超臨界CO2を反応媒体とすれば脱架橋試薬ジフェニルジスルフィドをゴム架橋体に高濃度かつ均一に導入できることを見出し、使用済みトラック用タイヤゴムからもルーズに架橋した混練可能なゲル成分と分子量数万のゴム分から成るリサイクル物質が得られ、ブレンド法を用いて再利用可能になることを明らかにした。この結果を学会で発表し、持続可能な社会の構築には"天然ゴム"も一つの重要な物質であて、その生産維持と再生循環の両面からのアプローチを担う「サステイナビリテイ科学」の重要性を強調した。H18年度研究計画1(炭水化物とポリカーボネート(PC)の反応):PCは、前年度に所期の研究成果があったトリオールのグリセロールを用いた加溶媒分解と同様に、ピラノース型ペントールのグルコースとの反応においても、環状カーボネート構造を同一分子中に二つ持つグルコースのビスカーボネートを生じた。このビス炭酸エステルが形成されるグルコース環上の位置は、予想に反して1,2-位と4,6-位であり、それぞれ5員環と6員環が形成された。すなわちこの3環式化合物の形成において、3-件の水酸基は反応しないことになる。グルコース水酸基のcis,trans立体配置、炭酸エステル環の歪み、水酸基の反応性の差、などが要因となってこの位置選択性が出現することを明らかにした(日本化学会87春季年会発表、発表論文作成中)。この結果をさらに多糖類との反応へ拡大した研究は現在進行中である。H18年度研究計画2(ポリビニルアルコールとの反応):研究計画1を多糖類へ拡大するのと同時に、同じくポリオールの典型であるポリビニルアルコールへ拡大した研究を進めた。現段階では生成物構造の解析が済んでいないので確定的な報告は出来ないが、環状炭酸エステルの形成はIR分析等から示されている。H18年度研究計画3(シリコーンゴムの易リサイクル架防結合の設計):超臨界二酸化炭素系における天然ゴムの化学リサイクル研究を前年度に行い、トラック用タイヤ(天然ゴム配合率が高い)から適当に脱架橋されたリサイクル可能なゲル成分が得られることがわかっていた。この処理技術を、これまでの研究でアミン系アルカリ触媒により完全にモノマー解重合できると判明したシリコーンゴムへ適用し、その架橋をルーズに切断したオリゴマー状態でサイクルさせる可能性を研究している(現在進行中)。
高温条件下で働くタンパク質リフォールディング触媒の開発と速度論解析

ジスルフィド結合は,タンパク質が正しい構造を維持する上で重要な役割を果たす。大腸菌は細胞壁ペプチドグリカンの外側にペリプラズム空間を持ち,そこに分泌されたタンパク質に正しいジスルフィド架橋を形成する酸化還元系を持つ。その機能を担うDsbAは活性中心にCPHCモチーフを持ち,チオレドキシンスーパーファミリーの中で最も酸化力の高い酵素である。これらのホモログ蛋白質ではCys残基に挟まれた2つのアミノ酸残基が酸化還元電位を決定する。本研究室ではDsbAのCys間のアミノ酸配列をランダムに変異させて野生型の約40倍活性の高いDsbA[CDIC]を発見した。本研究ではこのDsbA[CDIC]と同じ酸化還元電位値を持つが活性は低いDsbA[CRIC]について生化学的諸性質を比較した。また高度好熱菌のペリプラズムに分泌されるDsbAホモログの異種発現系を確立した。その触媒機能を解析して高温条件下でのタンパク質のリフォールディング技術を開発した。遺伝子組換え技術によって,天然には極微量しか存在しない蛋白質の生産が可能になったが,発現産物が可溶性画分に回収できない場合が少なくない。本研究では,フォールディングを触媒するジスルフィド形成/修復酵素の酸化還元電位と速度論的解析を行った。大腸菌DsbAの活性中心配列Cys-Pro-His-CysのPro-Hisをランダムなジペプチド配列に交換したDsbA[CxxC]ライブラリを構築した。新規DsbA[CXXC]について酸化還元電位とin vivo活性をプロットした結果,両者の間には直線的相関は認められずDsbAが触媒するS-S架橋形成が「平衡論支配」ではないことが示唆きれた。高度好熱菌のゲノム中にコードされているDsbAホモログ遺伝子としてTthAO610とTthA1422が存在する。これらの遺伝子を大腸菌で発現させるために,両蛋白質のN末端シグナル配列を大腸菌DsbAのシグナルペプチド配列に交換した発現系を構築した。ペリプラズム空間から回収したTthAO610では設計した位置で切断された成熟体が得られた。TthA1422は飛末端にAla-Alaの余分な2アミノ酸残基を残て切断さた。TthA0610とTthA1422の酸化還元電位測定は,それぞれ-16hV, -157mVを示した。この電位は大腸菌ジスルフィドイソメラーゼであるDsbCに相当した。高度好熱菌ではの同じ活性中心配列[CPYC]を持ち,ほぼ同じ電位を持つ2つの蛋白質をペリプラズム空間に発現させていることが分かったが,その生理的意義の解明を22年度の速度論解析によって行う。21年度は計画どおりに実験をすすめることが出来た。新規DsbA[CXXC]について酸化還元電位とin vivo活性をプロットした結果,両者の間には直線的相関は認められずDsbAが触媒するS-S架橋形成が「平衡論支配」ではないことが示唆された。高度好熱菌のゲノム中にコードされているDsbAホモログ遺伝子としてTthA0610とTthA1422が存在する。ペリプラズム空間から回収したTthA0610では設計した位置で切断された成熟体が得られた。TthA1422はN末端にAla-Alaの余分な2アミノ酸残基を残して切断された。TthA0610とTthA1422の酸化還元電位測定は,それぞれ-161mV,-157mVを示した。TthA0610とTthA1422は同じ活性中心配列[CPYC]を持ち,ほぼ同じ電位を持つ。

両蛋白質は競合するよりもむしろ協調して蛋白質の正しい構造の維持に機能する可能性が高いと考えられる。22年度は計画どおりに実験をすすめることが出来たといえる。DsbAは大腸菌の細胞外,ペリプラズム空間に分泌されたタンパク質に正しいジスルフィド架橋を形成する酸化還元触媒である。DsbAは,その高い酸化還元電位つまりチオール基に対する強い酸化力によって細胞内機能を発揮ていると理解されてきた。本研究では昨年までに活性中心Cys残基間のジペプチド配列をランダムに変異させたライブラリーを作成してその中から野生型の約40倍高い活性を示すDsbA[CDIC]を同定した。一方,DsbA[CDIC]と同じ酸化還元電位値を持つがin vivo活性は低いDsbA[CRIC]も得られた。そこで酸化還元電位が同じでも細胞内機能が大きく異なるメカニズムを検討した。大腸菌ペリプラズム空間に分泌させて発現した両酵素を精製してジスルフィドイソメラーゼ活性やシャペロニン活性を比較した。変性させたRNaseAやグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)を基質とするリフォールディング活性を評価した。まず変性RNaseAを正しく巻き戻す触媒作用においてDsbA[CDIC]がDsbA[CRIC]よりも高い触媒能を示した。また長時間(8h)反応ではDsbA[CDIC]はProtein Disulfide Isomeraseと同程度の活性回復を達成した。ジスルブィド結合を持たないGAPDHを巻き戻すシャペロニン活性においてもDsbA[CDIC]はDsbA[CRIC]よりも高い活性を示した。以上の結果よりDsbA[CDIC]は優れたジスルフィドイソメラーゼ活性とシャペロン活性を持つためにDsbA[CRIC]よりも高いDsbA活性を発現することが示唆された。なおDsbAによるインシュリン還元活性は,単純にジスルフィド還元反応なのでDsbA[CDIC]とDsbA[CRIC]は同程度の活性を示した。本研究によりDsbAの細胞内機能は平衡定数に由来する酸化還元電位よりも,タンパク質のリフォールディング速度などの速度論的性質により大きく依ることが示唆された。
細菌種特異的ゼノファジーを誘導するRab制御系ネットワークの解明

本研究では、細菌種特異的にゼノファジーを誘導するRabタンパク質制御ネットワークと、その活性化に関わる細菌性因子を特定し、細菌種特異的なゼノファジー制御系を明らかとすることを目的とする。宿主細胞内に侵入した菌は、p62やNDP52などのユビキチンへのアダプター分子を介してゼノファジーによって認識されるが、菌種をどのように認識するのかについては明らかではない。そこで、A群レンサ球菌と黄色ブドウ球菌を用いて菌種特異的な動態を示す小胞輸送制御システムであるRabの制御因子であるRabGAP/RabGEFが、細菌性因子によってどのように制御されているのかを明らかとする。
インフルエンザワクチンの接種政策変更に伴う医療経済学的効果の解明

本研究課題の目的は、日本において季節性インフルエンザの予防接種政策を変更した場合の費用対効果を明らかにすることであった。前年度から構築してきたデータベース・インフルエンザ疫学の動的モデルをもとに予防接種政策の評価を行い、かつて使用されていた3価ワクチンから4価ワクチンに変更したことで生じた費用とその効果を定量的に分析し、4価ワクチンの導入は支払者の視点、社会の視点どちらから検討してもCost-effectiveである可能性が高いという結論を得た。成果はVaccine誌に原著論文として掲載された。なお、本研究成果はドイツ・チュービンゲン大学Martin Eichner教授との共同研究であり、疫学動態を評価するための数理モデル構築に関して助力を仰いでいる。同様のデータに基づき小児・成人・高齢者それぞれの予防接種率を高めたときにどのような疫学的・医療経済学的効果が得られるかを検討し、小児に対する重点的な予防接種は費用対効果に優れ、かつ医療費を削減する可能性もあることを示した。成果は国際学会(IMAID2017)にて口頭発表され、現在原著論文を執筆中である。本研究成果は英国Public HealthEnglandの疫学者Richard Pebody, Marc Baguelinらとの共同研究であり、上記研究成果とは異なる数理モデルの構築に関して協力を得た。本研究課題は平成30年度も継続される予定であったが、現行の研究計画を進めていく上で明らかになった課題にも取り組みより包括的で堅牢な成果を得るため、若手研究(課題番号18K17369)「日本における社会構造を考慮したインフルエンザワクチン接種政策の最適化」として引き継がれることとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。
近赤外イメージングによる一酸化炭素・シアンの生体への複合作用に関する研究

CO-Hb,cyt.aa_3-CO,cyt.aa_3-CN複合体の組織内分布を近赤外イメージングにより定量的に把握するための基礎検討を行った。生体組織の光学特性をシミュレートするためのモデルファントムとして、最初に散乱係数・吸光係数が既知のラテックス粒子エマルジョン+近赤外色素を満たした円筒型ファントムに種々の大きさの光学的黒体を挿入し、位置検出能・空間分解能を評価した。ついで、より実際の生体に近いファントムとして、ラテックス粒子エマルジョンにラット赤血球・肝ミトコンドリアを懸濁させ、同様の計測を行った。以上の結果、空間分布を伴わない近赤外生体測光法と同様、近赤外イメージング法においても、各種Hb複合体・cyt.aa3複合体の定量計測が原理的には可能である事が示されたが、Hbの酸素化-脱酸素化に伴う吸光度変化に比べ、CO-Hb,cyt.aa3-CO,cyt.aa3-CN複合体の生成に伴う吸光度変化は大幅に小さく定常光を用いた近赤外イメージング法ではその空間分解能はラット頭部を四等分した程度しか得られない事が明らかとなった。この空間分解能は、我々の目的であるCO・シアンの生体への複合作用の検討には不十分であるため、近年、光散乱体中を通過してくる光のうち直進光もしくはそれに近い光成分のみを選択的に検出可能な手法として提案されている、ピコ秒時間分解測光法の適用を試みた。前述のモデルファントムを用いて同様の計測を行った結果、ゲート時間を数10ピコ秒程度に選ぶ事によって、数倍以上の空間分解能が得られる事が示された。その反面、計測系の直線性の限界・検出される光量の激減に伴うS/N比の劣化などにより、定常光を用いたイメージング装置に比べ、計測の精度は大幅に悪化した。しかしながら、この問題は、装置特性の改善により比較的容易に克服可能と考えられ、本研究における今年度の予定課題であった。実際の生体計測に先立つ計測条件の設定という目的を達し得たと思われる。
局在プラズモン角運動量制御による光ナノシェーピング

金属2次元ナノギャップ構造体にラゲールガウス(LG)ビームを照射して多重極局在プラズモンを励振し、LGモードの運動量(波数)・スピン角運動量(円偏光)・軌道角運動量(螺旋波面)を転写して多重極モードの近接場干渉を制御するという独自のアイデアにより、ナノスケールで電場振幅・位相分布を自在に成形する光ナノシェーピングを世界に先駆けて実現することを目的としている。本年度は、四重極プラズモン場を誘起する金ナノ四量体構造、および、ナノ円偏光場を誘起するための金ナノ三量体構造の数値解析的なデザインを進め、電子線描画装置を用いて実際にナノ構造を作製し、電子顕微鏡により設計値通りに構造が作製できているかどうかを確認した。電子線描画装置のドットの広がりを考慮した設計やドーズ量の調整により、三量体構造のギャップ部を15nm程度のサイズまで小さくすることに成功し、よりギャップ部に強い局在場を誘起することが可能となる構造の作製に成功した。この試作構造の散乱スペクトルの測定を行なった結果、散乱スペクトルの測定結果と数値解析結果の比較により、両者がよく一致することを確認し、金ナノ四量体構造のギャップ部に四重極場が、金ナノ三量体構造のギャップ部に円偏光場が実際に誘起されることを確認した。また、試作した金ナノ三量体構造に水中で波長1064nmの円偏光レーザー光を照射し、水溶液中のナノ粒子を実際にナノ円偏光場で捕捉することに成功した。また、ナノ粒子の位置解析を行なった結果、ギャップ部に誘起されるナノ円偏光場のスピン運動量がナノ粒子運動に転写され、ギャップ部周辺においてナノスケールの軌道回転運動が誘起されることを確認した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、光の「大きさ」をナノサイズまで小さくするだけでなく、ナノスポットにおける光電場振幅・位相分布をシングルナノスケールで制御する、すなわち、光の「形」をナノ空間でコントロールする、新奇なナノプラズモニックシステムの創製に挑戦する。この光ナノシェーピングが実現できれば、分子・分子集合体の波動関数と光のナノ形状をマッチングさせることにより、禁制遷移の選択励起・許容遷移の完全抑制・均質媒質の第二高調波発生など、これまでの常識を打ち破る物質の光励起ダイナミクスや光反応プロセスが実現できる。金属2次元ナノギャップ構造体にラゲールガウス(LG)ビームを照射して多重極局在プラズモンを励振し、LGモードの運動量(波数)・スピン角運動量(円偏光)・軌道角運動量(螺旋波面)を転写して多重極モードの近接場干渉を制御するという独自のアイデアにより、ナノスケールで電場振幅・位相分布を自在に成形する光ナノシェーピング技術を世界に先駆けて開発している。また、デザインされた周期に金属ナノ構造体を配列することにより、LGビームを高効率にカップリングさせて多重極プラズモンを高Q値で共鳴励振するシステムを開発し、超高効率光反応プロセスや超高感度センサーに展開している。さらに、角運動量を付与したLGもつれ合い局在プラズモンを生成して、古典光の限界を超える微細多光子重合パターン形成の実現を目指して研究を進めている。本研究は、これまでの常識を打ち破る光物理・光化学現象の誘起や光分子認識などへの展開が期待できると考えている。平成26年度は、金属2次元ギャップ構造にLGビームを照射したときの3次元電磁界分布を高速・高精度に数値計算する新しいシミュレーション解析手法を開発した。本手法を用いて、2次元ギャップ構造の形状・対称性・サイズをパラメータとして局在プラズモン場の3次元振幅・位相分布をシミュレーションし、電場分布の局在性・増強度・多重極特性・偏光回転特性など光子のナノシェープを解析して最適な金属ナノ構造をデザインした。次に、LGビームの周波数・偏光・方位角モード次数・径方向モード次数・ビーム広がりを設定して局在光の3次元形状を数値計算し、多重極ギャッププラズモンモードの選択励起特性・カップリング効率について詳細に解析して、光ナノシェーピングの最適制御システムを設計した。また、光子とプラズモンのスピン角運動量・軌道角運動量・全角運動量の転写やキラリティー保存性について理論的に考察した。さらに、高次径方向モードを利用して金属ナノリング構造に長距離伝搬プラズモンを誘起し、高Q値の多重極プラズモンモードを励振するシステムについてもデザインの最適化を行った。

また、デザインされた周期に金属ナノ構造体を配列することにより、LGビームを高効率にカップリングさせて多重極プラズモンを高Q値で共鳴励振するシステムを開発し、超高効率光反応プロセスや超高感度センサーに展開している。さらに、角運動量を付与したLGもつれ合い局在プラズモンを生成して、古典光の限界を超える微細多光子重合パターン形成の実現を目指して研究を進めている。本研究は、これまでの常識を打ち破る光物理・光化学現象の誘起や光分子認識などへの展開が期待できると考えている。単一の金属ナノギャップ構造とLGビームのカップリング効率は回折限界により制限される。カップリングを増強するために、金属ナノ構造体を多数個配列させてフォトニック結晶構造にし、キャビティ効果によりQ値を向上するプラズモニック結晶の提案がある。しかし、LGビームをプラズモニック結晶全体に照射すると、個々の金属構造体は位相が異なる円偏光で励振されるだけで渦構造の中心にないので、軌道角運動量を転写して多重極プラズモンモードを励振することは困難に見える。ところが、配列周期を共鳴条件に設定すると、個々の金属構造体のモードが強くカップリングするため、周期構造体全体でLGビームと結合して多数の多重極子が恊働的に共振する状態にできることを、我々は理論的に予測してきた。本年度は、開発したシミュレーション解析手法を用いて、金属ナノギャップ周期構造にLGビームを照射したときの3次元電磁界分布およびスペクトル特性を、配列構造(正方格子、六方格子)・周期・モード次数・ビームサイズを設定して解析し、Q値・カップリング効率等を見積って最適な構造をデザインした。高分解微細加工技術により金ナノギャップ周期構造体を作製し、光ナノシェーピング制御システムを用いて周期ナノ構造体多重極プラズモンの共鳴励振を実現した。本研究は、光の「大きさ」をナノサイズまで小さくするだけでなく、ナノスポットにおける光電場振幅・位相分布をシングルナノスケールで制御する、すなわち、光の「形」をナノ空間でコントロールする、新奇なナノプラズモニックシステムの創製に挑戦する。この光ナノシェーピングが実現できれば、分子・分子集合体の波動関数と光のナノ形状をマッチングさせることにより、禁制遷移の選択励起・許容遷移の完全抑制・均質媒質の第二高調波発生など、これまでの常識を打ち破る物質の光励起ダイナミクスや光反応プロセスが実現できる。金属2次元ナノギャップ構造体にラゲールガウス(LG)ビームを照射して多重極局在プラズモンを励振し、LGモードの運動量(波数)・スピン角運動量(円偏光)・軌道角運動量(螺旋波面)を転写して多重極モードの近接場干渉を制御するという独自のアイデアにより、ナノスケールで電場振幅・位相分布を自在に成形する光ナノシェーピング技術を世界に先駆けて開発している。本年度は、光ナノシェーピング制御システムにより、これまでの常識を打ち破る
放射性セシウム汚染農用地再生に向けたネピアグラスによるセシウム吸収除去法の確立

本研究は浪江町の警戒区域内の高レベル汚染農地(137Cs:23,00028,000Bq/kg土壌)で,ネピアグラスを用いて,植物体に最大に放射性Csを吸収させる除染効率向上手法を確立するための実証試験を行った結果,除染率は土壌中の腐植量が多い土壌ほど高いことや,慣行カリ肥料施与量に対し,80%減らした20%カリ肥料施与条件下(低カリ肥料施与区)で単位面積当たりに株数を多く植付けする高密植条件で年2回刈取りが最も有効であることを明らかにした.農地除染を行う際は土壌中のカリ養分減少に伴う地上部乾物収量の減少が除染率の減少につながるため,カリ肥料施与が不可欠であることを明らかにした.平成25年度は福島県浪江町からの要請のもと,警戒区域内の高レベル汚染農地(137Cs:23,00028,000Bq/kg土壌)で,ネピアグラス4品種の中から最も乾物収量が多くかつCs吸収率が高かった1品種を用いて,植物体に最大に放射性Csを吸収させる除染効率向上手法を確立するための検証試験を次の5つの点に注目して行った.1)土壌性質の違い(特に土壌中の腐植量に注目).2)栽植密度の違い. 3)刈り取り回数の違い.4)植物と共生する共生菌根菌の効果.5)除染効果が高いとされているソルガムと比較.その結果,1)ネピアグラスの乾物収量は土壌種類の違いよりも土壌中の腐植量の多少による影響が大きく,腐植量が多い土壌ほど乾物収量が高く,Cs吸収率(Bq/kg乾物)も高かった.2)密植により,1株当たりの茎葉部乾物収量は減少するが,単位面積当たりの乾物収量は大きく増加した.特に高密植区(11株/m2)では慣行区(1株/m2)に比べて水田跡地の方で平均8.4倍,牧草地跡地で平均4.6倍乾物収量が増加した.一方で異なる栽植密度間でのCs吸収率に大きな差はなかった.3)2回刈取り区の乾物収量は1回刈取り区に比べて低かったが,逆に吸収率は2回刈取り区の方が極めて高かった.これは1回刈取り区が2回刈取り区に比べて乾物収量が高かったため,吸収されたセシウムが希釈された結果,吸収率が低くなったと考えられる.4)3種類の共生菌根菌を接種した結果,ネピアグラスの根における菌の感染率は無接種区に比べて有意に高かったが,いずれの試験区においてもネピアグラス乾物収量やCs吸収率に及ぼす効果は小さかった.5)ネピアグラスの除染率(最大0.72%)は除染に効果があるとされるソルガムより623倍,アマランサスより4倍程度と極めて高い水準にあり,これまでの除染に用いた植物種の中で最も高い除染率を示した.放射性セシウムの吸収率向上法を確立するため,一作目の平成25年度に引き続き,2作目の平成26年度にも除染実証試験を行い,下記の結果が得られた.1ネピアグラス乾物収量や除染率は1作目と同様に牧草地に比べて腐植量が比較的多い水田の方が高く,137Cs除染率は土壌性質の差異よりも土壌中の腐植量に大きく影響されることや,密植することにより除染率が向上すること,年2回刈取りが年1回刈取りより効果が高かったことが2作目の平成26年度の結果からも明らかになった.2剥ぎ取った高レベル汚染表土(137Cs:平均45890Bq/kg土壌)の除染可能性をポット条件で調べた結果,ポット条件であるため,茎葉部乾物収量は圃場レベルに比べて少ないが,吸収率が高く(137Cs:平均3576Bq/kg乾物),高レベル汚染土壌での除染にも十分に適用できると考えられた.3ポット条件(異なる接種菌密度)や圃場レベル(根元接種)で菌根菌接種手法を改善しても,いずれもネピアグラスの根における感染率は高かったものの,ネピアグラス茎葉部乾物収量と除染率に及ぼす効果がなく,イネ科作物に生育促進効果あるとされる供試共生菌根菌種(Gigaspora margarita主体)にネピアグラスの生育促進効果(除染効果)は考えにくいことがわかった.4貯蔵温度や栄養体に含まれている水分を調整し,長期間保存を行ったところ,栄養体のカビ発生率を大きく抑制したものの,貯蔵5ヶ月後の栄養体からの出芽は見られなかったため,さらなる手法改善が必要と考えられる.作付けを重ねるにつれて除染率の低下とともに,除染率を決める地上部乾物収量と吸収濃度ともに減少した.

その原因として,腐植などに多く吸着していた交換態の137Csが作付け1年目に多く吸収され,2年目はその量が減ったこと(吸収濃度の減少)や,作付け2年目もカリ肥料施与なしで行ったため,土壌中にカリ養分が不足したこと(地上部乾物収量の減少)が明らかになった.2ヵ年の実証試験の結果を踏まえ,試験3年目(平成27年度)では慣行カリ施肥量に対し,施肥量を40%, 80%減らした低カリウム肥料施与区でネピアグラスを栽培し,低カリウム肥料施与が除染率に及ぼす影響をカリウム無施与区と比較し,吸収濃度と地上部乾物収量の両面から除染率向上の最適条件を調べた.その結果,1地上部乾物収量はカリ肥料無施与区に比べてカリ肥料施与量の増加に伴って増加したが,吸収濃度は逆にカリ肥料施与量の増加に伴って減少した.2乾物収量と吸収濃度からなる除染率(%)は20%カリ肥料施与区(慣行カリ肥料に対し,80%減)がカリ肥料無施与区および60%カリ肥料施与区に比べて高かった.320%カリ肥料施与区ではカリ肥料無施与区に比べて乾物収量が大きく増加したのに対し,吸収濃度の減少が小さかったために除染率が最も高かった.4試験3年目の除染率(牧草地のみ)は2ヵ年の実証試験の結果と同様に,高密植区が密植区や慣行区に比べて高く,20%カリ肥料施与区の高密植区の除染率はカリ肥料を施与せずに行った2ヵ年の除染率(1年目:0.406%,2年目:0.347%)を大きく上回る結果(最大0.519%)であり,ネピアグラスによる除染は20%カリ肥料施与の上,高密植条件が最も有効であると考えられた.5土壌粘土鉱物に強く吸着している137Csを植物が吸収できる状態にする等の物理・化学的手法も併せて行う必要があると考えられた.本研究は浪江町の警戒区域内の高レベル汚染農地(137Cs:23,00028,000Bq/kg土壌)で,ネピアグラスを用いて,植物体に最大に放射性Csを吸収させる除染効率向上手法を確立するための実証試験を行った結果,除染率は土壌中の腐植量が多い土壌ほど高いことや,慣行カリ肥料施与量に対し,80%減らした20%カリ肥料施与条件下(低カリ肥料施与区)で単位面積当たりに株数を多く植付けする高密植条件で年2回刈取りが最も有効であることを明らかにした.農地除染を行う際は土壌中のカリ養分減少に伴う地上部乾物収量の減少が除染率の減少につながるため,カリ肥料施与が不可欠であることを明らかにした.放射性セシウムの吸収率向上法を確立するために行った平成26年度の除染実証試験の結果が下記の通りに得られたため,概ね順調であると考える.1平成25年度の1作目と同様にネピアグラス乾物収量や除染率は,腐植量が多い土壌で高く,株間を狭くした密植区で高く,年2回刈取りで高いことが2作目の平成26年度の結果からも明らかになった.従って,今後,ネピアグラスで行う農地除染には腐植量,密植,年2回刈取りの手法が有効であることを明らかにした.2表土剥ぎ取りで大量発生する高レベル汚染表土(137Cs:平均45890Bq/kg土壌)を,ネピアグラスで除染が可能かをポット条件で調べた結果,茎葉部乾物収量は圃場レベルに比べて少ないが,吸収率が極めて高く(137Cs:平均3576Bq/kg乾物),高レベル汚染土壌での除染にも適用できると考えられた.3菌根菌接種手法を改善し除染効果向上を調べたポット条件(異なる接種菌密度)や圃場レベル(根元接種)のいずれもネピアグラスの根における感染率は高かったものの,ネピアグラス茎葉部乾物収量と除染率に及ぼす効果がなく,イネ科作物に生育促進効果あるとされる供試共生菌根菌種(Gigaspora margarita主体)にネピアグラスの生育促進効果(除染効果)は考えにくいことがわかった.4貯蔵温度や栄養体に含まれている水分を調整し,長期間保存を行ったところ,栄養体のカビ発生率を大きく抑制できたが,貯蔵5ヶ月後の栄養体からの出芽は見られなかったため,さらなる手法改善が必要と考えられる.1.ネピアグラスによる放射性セシウムの除染2.浪江町における広範囲農地除染と除染植物のバイオマスを活用したバイオ燃料生産の取り組み環境農学研究3年目の平成27年度もこれまでに実証試験を行った浪江町警戒区域内の水田跡地と牧草地跡地の2ヶ所で引き続き除染実証試験を行う予定であり,平成27年度は下記の3点に重点をおいて進める.
栄養源検知機構制御による新しい内耳障害予防戦略の構築

本研究では、新しい内耳障害の予防戦略を構築するため、mTORC1複合体シグナルに着目した。mTORC1を抑制すると、異常ミトコンドリアを排除するなど細胞内の品質管理に貢献するオートファジーが誘導される。我々は、mTORC1の下流シグナルであるオートファジーのモニターが可能であるGFP-LC3トランスジェニックマウスの蝸牛器官培養系を用い、有毛細胞においてオートファジー活性の検出系を確立し得た。聴覚および前庭平衡覚の受容器である内耳の障害は、薬物、加齢、騒音など様々な原因で生じるが、多くは不可逆性の障害である。本研究では、内耳障害の予防戦略として、栄養源検知機構であるmTOR(mammalian target of rapamycin)シグナルに着目している。mTORは、細胞内の栄養環境を感知し、細胞の増殖や代謝、生存における調節因子の役割を果たす、セリンスレオニンキナーゼである。mTORC1(mTOR Complex1)阻害剤投与やカロリー制限によるmTORC1シグナルの低下は、マウス個体の寿命を延長させるという報告がある。本研究で行ったマウス蝸牛器官培養系を用いた予備実験により、アミノグリコシド系薬剤(硫酸ゲンタマイシン)投与による有毛細胞障害を、mTORC1阻害剤(ラパマイシン)が予防する可能性が示唆された。次に、マウス内耳器官培養において、mTORC1の下流シグナルの応答を検出する実験系の確立を目指した。mTORC1の下流シグナルであるオートファジーのモニターが可能であるGFP (green fluorescence protein)-LC3(MAP1LC3, microtubule-associated protein 1 light chain3)トランスジェニックマウスを導入し、内耳器官培養において、有毛細胞でオートファゴソームが形成されることを確認した。本研究では、内耳障害の予防戦略として、栄養源検知機構であるmTOR (mammalian target of rapamycin)シグナルに着目することにした。mTORは、細胞内の栄養環境を感知し、細胞の増殖や代謝、生存における調節因子の役割を果たすセリンスレオニンキナーゼである。この酵素が形成するmTORC1 (mTOR Complex1)複合体シグナルは、細胞内のバルク分解系であり、異常ミトコンドリアを排除するなど、細胞内の品質管理に貢献するオートファジーを誘導する。本研究では、マウスの内耳器官培養系において、mTORC1の下流シグナルの応答を検出する実験系の確立を目指し、mTORC1の蝸牛シグナルであるオートファジーのモニターが可能である(green fluorescence protein)-LC3(MAP1LC3, microtubule-associated protein 1 light chain 3)トランスジェニックマウスを導入した。本マウスでは、オートファゴソームの形成がLC3のドット状の蛍光像(以下LC3 dots)で確認できる。研究代表者らは、内耳器官培養系において、内耳の感覚細胞である有毛細胞でLC3 dotsが多く形成されていることを確認した。次に、有毛細胞におけるオートファジーの活性を見るため、内耳器官培養系にリソソームプロテアーゼ阻害剤であるpepstatin AとE64dを投与したところ、非投与群と比較してLC3 dotsの蓄積がより多く認められることを確認した。本研究により、内耳有毛細胞において、mTORC1の下流シグナルであるオートファジー活性の検出系を確立し得た。耳鼻咽喉科学マウス内耳器官培養系において、有毛細胞内のオートファゴソームの形成が確認できたことから、mTORC1阻害剤投与および低栄養条件により、mTORC1の下流シグナルが実際に阻害されているかを検出できる可能性が広がった。研究目的の進展は、概ね順調であると考えられる。前年度確立した実験系を用い、mTORC1阻害剤投与および低栄養条件により有毛細胞におけるmTORC1の下流シグナルの応答の低下を確認する。アミノグリコシド系薬剤投与による有毛細胞障害が、mTORC1阻害剤あるいは低栄養条件により予防されうるかをさらに検討を重ねる。平成25年度の物品費の使用が、予定より少なかったため。物品費として、培養用器具・試薬、分子生物学用試薬、動物購入・飼育費に使用する予定である。また旅費等については、主として国内・海外の学会発表に使用する予定である。