hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性型第X凝固因子によるマクロファージ活性化を介した新しい動脈硬化進展機序の解明

FXaの受容体(PAR-1とPAR-2)は動脈硬化血管で増加する.Rivaroxaban(FXa阻害薬)やPAR-2の欠損が,ApoE欠損マウスにおける大動脈の炎症や動脈硬化病変の形成を抑制する.特にマクロファージを中心とした骨髄由来細胞のPAR-2が,大動脈の炎症や動脈硬化病変の形成に関与する.FXaーPAR-2経路は,マクロファージを中心とした血管構成細胞の炎症反応を促進する.1.活性型第X凝固因子(FXa)によるマクロファージ活性化の検討をin vitroで検討した.マウスのマクロファージ系培養細胞であるRAW264.7細胞や,野生型マウスの腹腔内マクロファージを用いて定量的RT-PCR法で検討した.その結果,FXaがマクロファージに作用し,炎症性物質の発現を亢進させることを明らかにした.また,FXaの作用受容体であるprotease-activated receptor(PAR)-1やPAR-2に対する選択的アゴニストを投与したところ,同様に炎症性物質の発現が亢進した.このことから,FXaがPARをシグナルを介して炎症性サイトカインの発現を促進するという新規の知見を得た.2.動脈硬化モデルであるApoE欠損マウスに生後8週から西洋食およびFXa因子阻害薬又は偽薬を20週間与え,動脈硬化の形成を比較した.病理組織学的解析にて,FXa因子阻害薬により大動脈の動脈硬化病変の形成が抑制され,動脈硬化巣におけるマクロファージ浸潤やコラーゲン分解が有意に抑制された.またFXa因子阻害薬の投与群では大動脈壁における炎症性物質の発現が有意に抑制された.このことから,生体内においてFXaが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.3.PAR-2欠損マウスとApoE欠損マウスを交配し,二重欠損マウスを作製し,西洋食負荷によって誘導される動脈硬化病変の大きさやプラーク性状,炎症性物質の発現などを通常のApoE欠損マウスと比較検討した.その結果,二重欠損マウスでは有意に動脈硬化の形成や不安定化,大動脈壁の炎症が少なかった.このことから,FXaの作用受容体であるPAR-2のシグナルが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.1.活性型第X凝固因子(FXa)によるマクロファージ活性化の検討をin vitroで検討した.マウスのマクロファージ系培養細胞であるRAW264.7細胞や,野生型マウスの腹腔内マクロファージを用いて定量的RT-PCR法で検討した.その結果,FXaがマクロファージに作用し,炎症性物質の発現を亢進させることを明らかにした.また,FXaの作用受容体であるprotease-activated receptor(PAR)-1やPAR-2に対する選択的アゴニストを投与したところ,同様に炎症性物質の発現が亢進した.このことから,FXaがPARをシグナルを介して炎症性サイトカインの発現を促進するという新規の知見を得た.2.動脈硬化モデルであるApoE欠損マウスに生後8週から西洋食およびFXa因子阻害薬又は偽薬を20週間与え,動脈硬化の形成を比較した.病理組織学的解析にて,FXa因子阻害薬により大動脈の動脈硬化病変の形成が抑制され,動脈硬化巣におけるマクロファージ浸潤やコラーゲン分解が有意に抑制された.またFXa因子阻害薬の投与群では大動脈壁における炎症性物質の発現が有意に抑制された.このことから,生体内においてFXaが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.3.PAR-2欠損マウスとApoE欠損マウスを交配し,二重欠損マウスを作製し,西洋食負荷によって誘導される動脈硬化病変の大きさやプラーク性状,炎症性物質の発現などを通常のApoE欠損マウスと比較検討した.その結果,二重欠損マウスでは有意に動脈硬化の形成や不安定化,大動脈壁の炎症が少なかった.このことから,FXaの作用受容体であるPAR-2のシグナルが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.本年度までに実施した研究の進展状況に関しては,交付申請書に記載した「研究の目的」,での予定どおりに進展しており,現在までの研究段階の一部を別記の如く論文として発表している.併せて,次年度に予定している研究計画の一部に関しては,既に事前準備に着手している段階である.以上の状況から,現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」と評価できるものと考えている.1.活性型第X凝固因子(FXa)によるマクロファージ活性化の検討をin vitroで検討した.マウスのマクロファージ系培養細胞であるRAW264.7細胞や,野生型マウスの腹腔内マクロファージを用いて定量的RT-PCR法で検討した.その結果,FXaがマクロファージに作用し,炎症性物質の発現を亢進させることを明らかにした.また,FXaの作用受容体であるprotease-activated receptor(PAR)-1やPAR-2に対する選択的アゴニストを投与したところ,同様に炎症性物質の発現が亢進した.

このことから,FXaがPARをシグナルを介して炎症性サイトカインの発現を促進するという新規の知見を得た.2.動脈硬化モデルであるApoE欠損マウスに生後8週から西洋食およびFXa因子阻害薬又は偽薬を20週間与え,動脈硬化の形成を比較した.病理組織学的解析にて,FXa因子阻害薬により大動脈の動脈硬化病変の形成が抑制され,動脈硬化巣におけるマクロファージ浸潤やコラーゲン分解が有意に抑制された.またFXa因子阻害薬の投与群では大動脈壁における炎症性物質の発現が有意に抑制された.このことから,生体内においてFXaが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.3.PAR-2欠損マウスとApoE欠損マウスを交配し,二重欠損マウスを作製し,西洋食負荷によって誘導される動脈硬化病変の大きさやプラーク性状,炎症性物質の発現などを通常のApoE欠損マウスと比較検討した.その結果,二重欠損マウスでは有意に動脈硬化の形成や不安定化,大動脈壁の炎症が少なかった.このことから,FXaの作用受容体であるPAR-2のシグナルが動脈硬化の形成や不安定化,動脈の慢性炎症に寄与するとの新規の知見を得た.FXaの受容体(PAR-1とPAR-2)は動脈硬化血管で増加する.Rivaroxaban(FXa阻害薬)やPAR-2の欠損が,ApoE欠損マウスにおける大動脈の炎症や動脈硬化病変の形成を抑制する.特にマクロファージを中心とした骨髄由来細胞のPAR-2が,大動脈の炎症や動脈硬化病変の形成に関与する.FXaーPAR-2経路は,マクロファージを中心とした血管構成細胞の炎症反応を促進する.本年度までに実施した研究の進展状況に関しては,交付申請書に記載した「研究の目的」,での予定どおりに進展しており,現在までの研究段階の一部を別記の如く論文として発表している.併せて,次年度に予定している研究計画の一部に関しては,既に事前準備に着手している段階である.以上の状況から,現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」と評価できるものと考えている.1骨髄特異的PAR-2欠損マウスと骨髄特異的PAR-2発現マウスを用いた検討FXaがPAR-2を介してマクロファージを活性化し,炎症を惹起して動脈硬化病変形成に重要な役割を果たすという仮説を証明するため,様々なバリエーションにおける骨髄移植を行い,骨髄特異的PAR-2欠損マウスと骨髄特異的PAR-2発現マウスを作製し,西洋食負荷下での動脈硬化性変化の程度・性状を,同時に作製する各コントロール用骨髄移植マウスと比較する.動脈硬化病変の多寡や,分子生物学的機序は,計画2-(1)と同様に解析を行なう.この実験により,骨髄由来細胞(マクロファージ)のPAR-2の動脈硬化病変形成における役割が明らかになる.2.マクロファージのPAR-2活性化におけるシグナル伝達系の解析PAR-2による細胞内シグナル伝達は,共役するG蛋白を介することが報告されているが,それ以降の,特にマクロファージにおける詳細なメカニズムに関しては,十分知られていない.そこで,本研究では,実験計画1に示したマクロファージの活性化を検討する系に,様々なシグナル伝達経路の阻害剤を作用させて,関与する経路をスクリーニングし,その上で,関連因子をsiRNAでノックダウンすることで,その経路の関与を確認する.さらに,各シグナル伝達系のreporterを用いたreporter assayなどを併用し,総合的に関連シグナル伝達系を検討する.これらの実験は,PAR-2制御による,動脈硬化性疾患の治療や予防方法の開発を視野に入れた際,非常に重要である.動脈硬化1骨髄特異的PAR-2欠損マウスと骨髄特異的PAR-
赤痢アメーバの表面レクチンを標的とした防御免疫の構築

赤痢アメーバの150-kDaレクチン(Igl1)について、全長[シグナル配列を除くamino acid(aa)14-1088]、N末端側(aa 14-382、N断片)、中央部(aa 294-753、M断片)、C末端側(aa 603-1088、C断片)に相当する組換え蛋白質を大腸菌で発現させ、精製とrefoldingの条件検討を行った。全長の組換え蛋白質の場合には、大腸菌由来の他の蛋白質の混入が見られたため、患者血清を用いたウェスタンイムノブロットによる抗原性の解析を行った。その結果、アメーバ性肝膿瘍患者やアメーバ性大腸炎患者の血清は、組換えIglに相当するバンドと明瞭に反応した。また、無症候性赤痢アメーバ嚢子排出者の血清も、組換え型全長Iglを認識していた。Iglのアミノ酸配列には多数のCXXCモチーフが存在するが、それは同じく腸管寄生原虫であるGiardia intestinalisのvariant-specific surface antigenにも存在するため、共通のエピトープが存在する可能性も考えられた。そこで、ジアルジア症患者血清を用いてウェスタンイムノブロットを行ったが、Iglには反応せず、この蛋白質が赤痢アメーバに特異的な抗原性を有していると考えられた。また、組換えIglのワクチン効果について検討するため、全長組換え蛋白質をアジュバントとともにハムスターの腹腔に接種した後、肝臓に直接栄養型虫体を接種し、一週間後に肝膿瘍の大きさを調べた。しかしながら、有意な膿瘍形成阻止効果は認められなかった。NativeなIglによる免疫は有効であったことから、今後、酵母などを用いた系での組換えIglの調製も検討していく必要があると考えられた。
グリコシル転移酵素の糖鎖合成における分子極性

ビオチンヒドラジドを還元的アミノ化により還元末端に安定的に導入した後、ストレプトアビジン金標識物で電子顕微鏡的に可視化する方法を開発し、これを関連する多糖の構造解析や酵素による合成、分解過程の観察に適用した。すなわち1.天然ミクロフイブリル構造の解析と合成方位2.結晶多系の解析3.酵素分解における選択性4.酵素の結合部位の選択性の4項目について検討した。各項日ごとに要約すると以下の通りである。(1)セルロースI,β-キチンともにパラレルアップ(還元末端がc軸方位と一致する)であり、合成方位に関しては重合が非還元末端で起こることが示された。α-キチンについては標識は片端のみに認められ、逆平行鎖構造と矛盾する結果を得た。(2)セルロースIIとIII_Iを検討した。前者は両端に染色されることがあるが、後者は全く片端のみが染色された。結果は前者が逆平行、後者が平行鎖構造であることと矛盾しない。(3)セラチア菌の生産するChitinase AとBのβ-キチンに対する分解挙動の比較をしたところ、ChiAはミクロフィブリルの還元末端側から分解するのに対して、ChiBは非還元末端側から分解することをが明らにした。(4)トリコデルマ起源のセロビオヒドロラーゼの結合モジュールが、セルロースの矩形断面の対角上にある2角(100面)に選択的に結合していることが示され、モジュール内の仮説が支持された。還元的なアミン化法を用いて、ビオチンヒドラジド化合物を糖鎖の還元末端に導入し、これを金コロイド標識されたストレプトアビジンと作用させることにより、還元末端を選択的にラベルして電子顕微鏡で可視化する方法を見出した。基質の天然セルロースIには海藻のシオグサの細胞壁を精製した。また精製したシオグサ細胞壁を超臨界アンモニア処理してセルロースIIIを得た。セルロースIIは、ラミーの繊維の両端を固定したままアルカリ処理し、繊維状マーセル化により作成した。α-キチンは、薩摩湾海底熱水噴出口付近のカニの甲羅から精製し、β-キチンは、ハオリムシの棲管から精製した。これらの基質を酸加水分解して微結晶としたものに、上述の還元末端染色法を施した。その結果、セルロースI、III,β-キチンについては、そのミクロフィブリルの片端のみがラベル化されたことから、平行鎖であることが判明した。一方逆平行鎖といわれるセルロースIIとα-キチンについては、微結晶の両端がラベル化されることは極めて少なく、ほとんどの場合は片端がラベルされた。以上の問題点として、(1)反応の効率がある種の試料では十分ではない。(2)セルロースIIおよびα-キチンの良好なフィブリル状試料作成が困難であるという点があげられる。そこで、セルラーゼのセルロース結合モジュールを用いた新しい還元末端識別の試みと、セルロースおよびキチンオリゴマーを用いた単結晶調製を開始した。天然セルロースの重合が非還元末端で起こることが明らかになったので、ほかのフィブリル状構造物に応用した。マンナンは、カサノリと象牙ヤシ、またキシランは褐藻から抽出したものを出発材料とした。試行錯誤にもかかわらず、還元末端染色に供する良好な試料を得ることができなかった。また以前報告した、β-キチンの重合方位に関する実験に誤りがあることが判明したので再度詳細に検討した。すなわちバチルス菌の生産するChitinase A1が可溶性のオリゴマーの場合を分解する際にはキチンの非還元末端から分解し、β-キチン(結晶性のフィブリル)に対しては還元末端側から働くことが明らかになった。その結果、β-キチン結晶内での分子の充填方向やキチン鎖の重合方位についても再考せざるおえなくなった。検討の結果、結晶内における充填様式はパラレルアップ(還元末端がc軸方位と一致する)であり、合成方位に関しては重合が非還元末端で起こることが示された。

一方、糖分解酵素の分子鎖に対する選択性についても可視化による検討を行った。セラチア菌の生産するChitinase AとBのβ-キチンに対する分解挙動の比較をしたところ、ChiAはミクロフィブリルの還元末端側から分解するのに対して、ChiBは非還元末端側から分解することが明らかになった。近年報告された各酵素の3D構造、特に基質結合部位が、活性中心に対して各酵素では逆方向に配置していることから、基質結合部位が分子鎖の認識に影響を及ぼすことが示唆された。最後にトリコデルマ起源のセルラーゼ結合モジュールンの吸着部位についても検討した。セロビオヒドラーゼの結合部位に周期的に配置したトリプトファンなどの芳香族アミノ酸残基がセルロース表面の疎水面(ピラノース平面)を認識するとされている。免疫標識した結合モジュールのセルロース表面への吸着を立体観察した結果、モジュールは矩形断面の対角上にある2角(100面)に選択的に結合していることが示され、上述の仮定が正しいことが示された。
日本語音声教授能力養成を目指した教材作成とその教育方法の研究

日本語学習者の日本語についてはさまざまな誤用が見られる。そのうち、他の項目に比べ、音声について母語の影響が最も顕著に現れ、その教育が難しいとされる。そこで、まず、日本語教育における音声教育の現状や日本語教師養成課程、養成講座における音声に関する授業の現状を調べた。その結果、日本語教師養成課程、養成講座では、音声学は扱われるが、音声教育についてはほとんど扱われておらず、そのため、教師は音声に対し、苦手意識を持ち、唯一絶対の「矯正」に頼ってしまうのではないかと考えた。音声学ではなく、音声教育を学ぶ方法として、実際に日本語学習者への日本語OPIを採り、それを実際に日本語教師養成課程の授業などで使用した。その結果、ただ単に日本語音声学を学んだときと比べ、日本語学習者の音声について興味を持ち、実際の音声を観察する能力が増したと思われる、また、一般に言われる母語の干渉と異なる現状や母語によらず多くの日本語学習者に見られる誤用もあることがわかり、音声教育について、より具体的、主体的な教師を育成するのに役立ったと思われる。今後は、データベースの問題点の改善やそれに付属する教材の改善を行い、また、カリキュラムについても改善を行う予定である。なお、データベースについては、研究代表者がOPIテスターに認定される以前のものも多く、また、被験者に公開の許可を得ていないものもあるので、修正を加えるなどして、平成14年度のできるだけ早い時期に、Web上などで公開する予定である。以下の口頭発表を行った。1「音声の母語別の研究はどう役立つか」第15回日本語教育方法研究会.2「実践的な音声教育に必要な能力を養成するためのプログラム実践の試み」2000年度日本語教育学会秋季大会.3「自己モニターを利用した音声教育のシラバス作り」第16回日本語教育方法研究会.1では、音声教育の基礎研究として主流になっていると思われる、日本語学習者が発話した日本語音声の誤用を分析し、その原因を解明するという研究方法が必ずしも基礎研究としての役割を果たしていないことを述べた。2では、実際の音声教授能力の養成を目的とした講座についての実践報告と課題などについて述べた。3では、特に単音に関する具体的な教育方法とそれを具現化するための教材について述べた。また、OPIにより、日本語学習者が発話した日本語音声のデータベースを作成中である。これは日本語音声教授能力の基礎となる、音声に関する知識を教授する際の材料となる。今後、これを試用していく予定である。また、現在、研究代表者が作成に携わっている音声教育教材を使用する際、どのような知識・能力が必要であるかをピックアップしている。
ベクトル移動平均過程における共和分分析

2:単位根が含まれる時系列過程について、確定トレンド変数項の「折れ曲がり」を想定した検定の改良を行った。この論文は、1997年7月に香港で開かれた国際学会「Far Eastern Meeting of the Econometric Society」において報告された。(研究成果には示していない。)5:同時方程式モデルについての外生性の検定の論文「Switching Orthogonality」は、International Economic Reviewに掲載された。この論文は外生性検定に新しい観点をもたらすもので、応用性に富むことが知られている。以上のように、当科学研究費のおかげで、この3年間研究は順調に伸展してきた。当申請を採択して下さったことを深く感謝します。平均が0の多変量ベクトル時系列より分析を始めた。この解析はJohansen (Econometrica, 1991)の自己回帰過程に関する共和分分析に対立するものであるから、困難であったが、非常に簡潔なモデルについてはおおよその検討が付いていたので、拡張はあらかじめ予定されたようにできた。この研究では実証研究として日本の貨幣供給と国民総生産の間の研究された。さらに、新たな検定法を用いて、古典的な時系列データの単位根検定が見直された。共和分が存在する場合の、日本における貨幣額と国民総生産に関する因果性研究の論文採択された。以上のような今年度の研究の進行状況からして、当科学研究費による研究は順調に成果を上げていると考えられる。1:単位根検定において、その実証上の例としてとみに有名なのは、Nelson-Plosserによる米国マクロデータの解析を行った論文である。この論文の手法を改良し、同じデータについて新しい分析結果を出したのが「ARIMA Approach to the Unit Root Analyses of Macro Economic time Series」であるが、この論文は日本統計学会誌に採択された。2:同上論文の検定の性質を理論的に分析したのが「ARMA and ARIMA Approaches to the Unit Root Analyses of Macro Economic Variables」で、雑誌「Mathematics and Computers in Simulation」に最終稿が採択された。3:同時方程式モデルについての外生性の検定の論文「Switching Orthogonality」は、International Economic Reviewに採択された。この論文は外生性検定に新しい観点をもたらすもので、応用性にとむことが知られている。単位根が含まれる時系列過程について、確定トレンド変数項の「折れ曲がり」を想定した検定の性質を、数値的に分析してきた。これはかなりの計算時間を必要としたが(3カ月)、1996年11月に明治学院大学で開かれた国際学会「最近の時系列分析の展開」で報告した。4:単位根が含まれる時系列過程について、確定トレンド変数項の「折れ曲がり」を想定した検定の改良を行った。この論文は、来る7月に香港で開かれる、世界計量経済学会極東大会において報告される。藤論文は現時点では未発表であるが、実証的にも理論的にも大きな意味を持っている。以上のように、当科学研究費のおかげで、研究は順調に伸展している。次年度は最終年度にあたるので、進行中の論文を完成し、成果をまとめたいと考えている。
近代贈位秩序の形成過程の研究

本研究では近代贈位論の確立に向けた基礎的作業として、近代贈位秩序の形成過程を明らかにすることを目的に、史料の調査・収集と分析を以下のとおりおこなった。1、国立公文書館所蔵の贈位関係史料の調査・収集。ここでは、(1)公文録・公文類聚および叙位裁可書から政府内の贈位決定過程の分析(主に明治期を対象とした)、(2)贈位内申書のうち愛知県および九州地方の内申書を重点的に収集・分析、また(3)諸雑公文書から裁可には至らなかった贈位請願書を抽出。以上から、贈位の請願段階から審議にいたる内容分析をおこない、南朝「忠臣」の基準となった楠正成、維新の源流とされた高山彦九郎と蒲生君平、西郷隆盛・藤田東湖・佐久間象山・吉田松陰から始まる維新前後の国事尽力者、国家に裨益し功績顕著なる者の先駈けとなった佐藤信淵・林子平、藩祖贈位の濫觴である徳川義直など、各分野での画期となる贈位事例を明らかにした。2、一地域の事例として足助重範贈位運動に関する史料と文献の調査・収集。(1)愛知県豊田市の足助資料館所蔵の足助神社文書および(2)自治体誌・伝記などの関連文献の収集・分析から、明治期には三河の一体性を表象する「偉人」として足助重範の贈位運動が展開したことを明らかにした。足助神社文書は昭和戦前期のものも多数現存しているので、次に昭和期の贈位運動の特徴を明らかにし明治期との比較検討に取り組みたいと思っている。
小腸インクレチン細胞における転写および分泌調節機構の解明

GIPを産生するK細胞ではPdx1とPax6がその転写に重要であることを見いだし、転写活性機構を明らかにした。また、GLP-1、GIPの分泌機構に甘味受容体の関与が報告されているが、ブドウ糖以外の甘味料がインクレチン分泌を促さないことを明らかにした。免疫組織学的検討でGIP陽性細胞は常に転写因子のPax6、Pdx1を共発現していた。ヒト、ラット十二指腸においてPdx1はGIP陽性細胞だけでなく多くの粘膜上皮細胞で陽性であった。このことは、Pdx1のみでは、GIP発現に不十分であることを示唆している。一方Pax6の発現はほぼGIP陽性細胞に限定されていた。ラット空腸では、Pdx1はGIP陽性細胞にのみ発現していた。回腸では約30%のGLP-1陽性細胞がGIPを共発現しており、それらはPax6、Pdx1とも陽性であった。このことはPdx1がGLP-1の発現を抑制しないことを示している。一方、GLP-1陽性GIP陰性細胞ではPax6のみ陽性で、Pdx1は発現していなかった。興味あることにマウス網膜でもGIPの免疫染色陽性細胞を認め、GIP陽性細胞はPax6とPdx1を共発現していた。小腸内分泌細胞株であるSTC-1では、Pax6、Pdx1の発現を免疫染色およびRI-PCRで認めたが、IEC-6ではすべて陰性だった。humanGIPプロモーターによるルシフェラーゼアッセイでの検討では、STC-1はIEC-6に比較し40倍のGIP転写活性を示した。IEC-6ではPax6及びPdx1の強制発現によって、それぞれ6倍及び4倍のGIP転写活性が上昇した。また、STC-1においてGIP-184からGIP-145のプロモーター切断によって転写活性は90%低下した。STC-1において優性阻害型Pax6、Pdx1の強制発現はGIP転写活性をそれぞれ約70%、20%抑制した。ゲルシフト法によりPax6及びPdx1が近位GIPプロモーター(-193/-138)に結合することを確認した。一方、Pax6の強制発現はプログルカゴンの転写活性を25倍上昇させたが、Pdx1は上昇させなかった。STC-1において優性阻害型Pax6はプログルカゴン転写活性を約70%抑制したが、優性阻害型Pdx1は転写活性に影響を与えなかった。以上より、Pax6並びにPdx1がともにGIP遺伝子発現に重要な転写因子であることが示唆された。GIPおよびGLP-1は消化管内分泌細胞から分泌されるインクレチンホルモンで、血糖依存性に膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、食後血糖を調節する。昨年度の検討で、Pax6並びにPdx1がともにGIP遺伝子発現に重要な転写因子であることを見いだした。食物由来の糖が腸管でのGIPとGLP-1の分泌促進因子であることはよく知られているが、糖のセンシングとその下流シグナル伝達の機構についてはあまり明らかになっていない。最近、舌の味覚細胞に存在する甘味受容体とその下流分子(α-gustducin)がGIP産生K細胞やGLP-1産生L細胞に存在することが報告されている。本年度はインクレチンの糖に対する分泌機構を明らかにするため、甘味受容体のアゴニストである甘味料がin vivoでインクレチンの分泌を促進するか検討を行った。免疫組織的検討ではK細胞の約1/3はα-gustducinを共発現していた。正常ラットでは経口甘味料+腹腔ブドウ共負荷では腹腔ブドウ糖単独負荷と血糖値の推移は変わらず、経口ブドウ糖負荷と比較して有意に血糖値が高値であった。ブドウ糖は経口負荷後10分でGIPとGLP-1の血中濃度をそれぞれ約4倍と約2.5倍有意に上昇させたが、甘味料はインクレチンの血中濃度を上昇させなかった。したがって甘味受容体のアゴニストである甘味料の単回投与によって糖代謝におけるインクレチン効果、GIPおよびGLP-1分泌の促進効果は認めず、甘味受容体が急性のインクレチン分泌に関与していないことが示唆された。一方、in vitroでスクラロースはGIP、GLP-1の分泌を促進すると報告されておりインクレチン細胞での甘味受容体の役割は今後の検討課題である。
光分解型３次元培養基材を用いたテーラーメード抗がん剤感受性検査法の開発

本テーマの目的は、腫瘍組織由来の細胞群から薬剤耐性の細胞あるいは悪性がん細胞(浸潤細胞)を選び出し、テーラーメード検査に用いる細胞材料を提供することである。H26年度は、本テーラーメード検査用の光分解型培養基材の合成を行い、細胞分離が可能な培養基材を開発し、H27年度には、クリック反応による光分解型ゲルの合成を行うことで、生理活性物質を添加できるとともに、細胞の浸潤挙動をより観察しやすいゲルを開発した。本年度は、化学発がんマウス腫瘍由来の細胞を用いた検討を実施するとともに、前年度まで改良してきたゲルを用いてマウス乳がん由来細胞の薬剤感受性試験、あるいは細胞の形態とがん細胞悪性度の関係を検討した。マウス乳がん由来細胞を光分解型ゲル中で培養し、増殖した細胞の増殖形態を基に、顆粒状細胞とコロニー状細胞の2種類の細胞に分類した。光照射により標的細胞周囲のゲルを分解し、目的とする2種類の細胞を得て実験に用いる細胞を樹立した。このとき、種類ごとに2回同様の作業を行い、細胞分離を行わない母株も併せて合計5種の細胞株を実験に用いた。これらの分離細胞を用いて、光分解性ゲル中の細胞形態とがん悪性度に関して検討を行った。光分解性ゲル中で顆粒状に増殖した細胞はスフェロイドを形成せず、コロニー状に増殖した細胞はスフェロイドを形成した。また、これらの細胞をヌードマウスに移植すると、コロニー状の細胞は皮下で腫瘍を増大する性質が強く、顆粒状の細胞は移植部から他の臓器へと転移し易い性質を示すことが分かった。一方で、薬剤感受性と細胞の形態についても、薬剤の種類によっては関連し得るデータを得た。更なるメカニズムの解析、細胞の形態と薬剤感受性あるいはその背景となる遺伝子発現・変異の検討などは今後の研究課題として残った。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究では,細胞を内包する材料として要となる光分解型3次元培養基材(光分解型ゲル)の改良を行った。光分解型ゲルは,ゼラチンが有するアミノ基を光開裂型架橋剤により架橋させることで作製した。光開裂型架橋剤にはN-ヒドロキシスクシンイミドを末端に有し,ニトロベンジルを光開裂部位として含む4本鎖ポリエチレングリコールを用いた。ゼラチン中アミノ基全てを架橋したゲルを100%架橋として,0-100%架橋させた条件のゲルを作製し,光分解性と細胞生存率を主とする検討を行った。光分解性に関しては、細胞を単離するのに十分な光分解の解像度(20umの円形状)を有することを確認した。ゲル内包時の細胞毒性は光開裂型架橋剤の添加量に依存して増加していた。これは末端に導入した活性エステルが細胞膜のアミノ基と反応することで毒性が生じたと考えられる。そこで、クリック反応をベースとしたゲルの作製材料の開発を行い,さらなる毒性の減少を目指すと同時に、アミノ基を有する成長因子などを混合させることが可能なゲルの作製を試みる。また,本計画中では悪性度に応じた細胞の分類を目的としている。そのモデル細胞として,正常胃粘膜由来細胞RGMとRGM由来がん様変異細胞株RGKを用いる。前段階の実験として,共培養を行った時の抗がん治療に対する感受性の評価法を検討した。このとき、共培養緑色蛍光発現RGM(RGM-GFP)および赤色蛍光発現RGK(RGK-KO)を用いて、共培養においても各々の細胞を判別出来る状態で実験を行った。抗癌剤の曝露、放射線治療を共培養細胞に施し、その後の細胞増殖(細胞の回復)を測定することで、治療による細胞死が最終的に正常細胞とがん細胞のどちらを優位に生かすか推定できた。ゲル中では、治療後増殖するがん細胞を摘出することで、再発の中心となるがん細胞が得られると示唆する。本テーマの目的は、腫瘍組織由来の細胞群から薬剤耐性の細胞あるいは悪性がん細胞(浸潤細胞)を選出し、テーラーメード検査に用いる細胞材料を提供することである。今年度の研究では、細胞を内包する光分解型3次元培養基材の再改良および、検体とするアゾキシメタンによる発がんマウスの作製および発がんマウスからの細胞ストックの作製を行った。前年度の研究では、細胞を内包する材料として要となる光分解型3次元培養基材(光分解型ゲル)の改良を行った。前年度の光分解性ゲルは、ゼラチン中アミノ基と、ニトロベンジルを光開裂部位として有する4本鎖ポリエチレングリコールの末端N-ヒドロキシスクシンイミド(光開裂型架橋剤)を反応させて作製していた。このゲルを特定条件にて作製することで、ゲル内包後の細胞の生存率を高く維持し、光分解により特定細胞のみ取り出せることを前年度に確認した。しかし、アミノ基と反応する架橋剤であったために、細胞膜との反応による細胞毒性が懸念されることに加え、成長因子など生理活性物質を添加したゲルが作製出来ないなどの問題があったが、クリック反応による光開裂型架橋剤を新規合成することにより、これらの問題を解決した。また、アゾキシメタンによる発がんマウスを作製し、腫瘍を目視にて確認できた臓器(原発巣と考えられる小腸、大腸、転移巣と考えられる肺)を摘出した。摘出した臓器を酵素処理により細胞間質を分解し、ディッシュ上で培養することで腫瘍由来の細胞を増殖させ、凍結ストックを作製した。

アゾキシメタンによる発がん誘発処理を行ってから腫瘍組織由来のストック作製までに5ヶ月以上要したために、薬剤感受性試験などはまだ実施していないが、上記したクリック反応による光分解性ゲル内で培養が可能であることは確認済みである。また、光分解性ゲル内に包埋した細胞が多様な形態を示すことも確認した。昨年度の研究により、3次元培養環境下への生理活性物質の添加が将来的に必要と示唆したため、その要件を満たすゲルの開発を行った。このゲルの開発により当初の研究計画よりも半年ほど遅れた進行状況となったが、必要要件を満たすゲルの作製に成功した。一方で、ゲルの開発と並行して行った発がんモデルマウスの作製は順調に進んでおり、腫瘍組織由来細胞の凍結ストック作製に至っている。先に記載したとおり研究系計画が半年ほど遅れているものの、本研究テーマ抗がん剤薬剤感受性テーラーメード検査の動物実験による検証を行う研究状況に至っているため、おおむね順調に進展していると評価した。本テーマの目的は、腫瘍組織由来の細胞群から薬剤耐性の細胞あるいは悪性がん細胞(浸潤細胞)を選び出し、テーラーメード検査に用いる細胞材料を提供することである。H26年度は、本テーラーメード検査用の光分解型培養基材の合成を行い、細胞分離が可能な培養基材を開発し、H27年度には、クリック反応による光分解型ゲルの合成を行うことで、生理活性物質を添加できるとともに、細胞の浸潤挙動をより観察しやすいゲルを開発した。本年度は、化学発がんマウス腫瘍由来の細胞を用いた検討を実施するとともに、前年度まで改良してきたゲルを用いてマウス乳がん由来細胞の薬剤感受性試験、あるいは細胞の形態とがん細胞悪性度の関係を検討した。マウス乳がん由来細胞を光分解型ゲル中で培養し、増殖した細胞の増殖形態を基に、顆粒状細胞とコロニー状細胞の2種類の細胞に分類した。光照射により標的細胞周囲のゲルを分解し、目的とする2種類の細胞を得て実験に用いる細胞を樹立した。このとき、種類ごとに2回同様の作業を行い、細胞分離を行わない母株も併せて合計5種の細胞株を実験に用いた。これらの分離細胞を用いて、光分解性ゲル中の細胞形態とがん悪性度に関して検討を行った。光分解性ゲル中で顆粒状に増殖した細胞はスフェロイドを形成せず、コロニー状に増殖した細胞はスフェロイドを形成した。また、これらの細胞をヌードマウスに移植すると、コロニー状の細胞は皮下で腫瘍を増大する性質が強く、顆粒状の細胞は移植部から他の臓器へと転移し易い性質を示すことが分かった。一方で、薬剤感受性と細胞の形態についても、薬剤の種類によっては関連し得るデータを得た。更なるメカニズムの解析、細胞の形態と薬剤感受性あるいはその背景となる遺伝子発現・変異の検討などは今後の研究課題として残った。光分解性ゲルの組成検討に際して、光架橋剤の修正が必要となり予定より多くの時間を要している。しかし、本年度中にクリック反応によるゲルの作製の検討を進められており、その組成に関しておおよその目処が立っている。そのため、おおむね順調に進展していると評価をした。H27年度の研究で、光分解型3次元培養基材の作製条件と、テーラーメード抗癌剤感受性検査法を行なうための発がんマウスの作製を行い、実験計画書に記載したテーラーメード抗癌剤感受性検査法を実施するためのIn vitroの準備が整った。
固形がんの末梢循環癌細胞を標的とした遺伝子改変T細胞移入療法の開発

患者サンプルを用いたCTC解析ではこれまでに25名の患者において施行し、血中循環癌細胞濃縮回収装置を用いてCTCを確認する事ができた。免疫染色実験では、上皮性マーカー(カドへリン)と造血系細胞マーカーCD45とを用いて染色し、カドへリン(+)・CD45(-)細胞をCTCとした。PDXモデルでは、まずマウス血液と人膵がん細胞とを混合したサンプルを用いて条件検討を施行し、次に膵がんCell lineを用いたCDXモデルにおいて、CTC細胞(EGFP(-), mouse MHC(-), HLA(+))を同定した。これらの解析後、膵がんPDXを用いて同様の実験を行い、CTC細胞を同定する事に成功した。患者サンプルを用いたCTC解析ではこれまでに5名の患者において施行し、血中循環癌細胞濃縮回収装置(Clear Cell FX)のダブルランにてそれなりの細胞数を得る事ができた(治療前:13-235個/1sample、4-78個/1ml、治療後:65-305個/1sample、21-93個/1ml)。しかしながら、がん細胞である事を証明するための免疫染色実験において、EMTマーカー又はMETマーカー陽性(CTC)とCD45陽性(造血系細胞)とのダブルポジティブ細胞を多数認めるため、TAMとの鑑別を行いながら再度条件検討を行っている。PDXモデルでは、まずマウス血液と人がん細胞(MiaPaCa細胞)とを混合したサンプルを用いてClear Cell FXの条件検討を施行した。次に膵がんPDX及び胆管がんPDXを用いたCTC解析では、腫瘍組織移植後tumor volumeが1500mm3に達した時点で末梢血採血を行った。Clear Cell FXにてダブルラン施行後、CTC細胞(EGFP(-), mouse MHC(-), HLA(+))を同定する事に成功した。しかしながら、肝心のPDXモデルにおいて転移巣を確認できないため(PDX10系統において施行)、皮下移植モデルから同所移殖モデルに変更して転移巣の確認を現在行っている。予備的実験として、膵がんCell lineであるMiaPaCa2細胞を移植したCDXモデルを用いた実験を行い、このモデルでは肺転移及び肝転移を認める事を確認した。現在このモデルを用いてCTC細胞の回収を行っている。今後は、PDXモデルとCDXモデルとを並行して実験を行い、CTC細胞と原発巣及び転移巣からDNA/RNAを抽出し次世代シーケンサー解析(NGS)を施行する。患者サンプルの採取は予定通り行われており、血中循環癌細胞濃縮回収装置(Clear Cell FX)を使用した細胞の回収も良好に施行できている。しかしながら、がん細胞であることを証明するための免疫染色実験の条件検討に当初の予定よりも時間が掛かっている。予備実験では比較的きれいに染色できるが実際のサンプルを用いると概要で記したような問題が起こる。PDXモデルを用いたCTC解析では、これまでに行われたことがほとんどない実験であるため、予備実験で時間が掛かるかと思われたが比較的容易に条件検討を終えることができた。しかし、当初認められたPDXの転移巣が、PDX10系統用いてがんがかなり進行した時点においても転移巣が認められないハプニングが起こった。転移巣が認められなければ回収したCTCが予後に寄与するとは考えづらいためこの状況では前に進められない。患者サンプルを用いたCTC解析ではこれまでに25名の患者において施行し、血中循環癌細胞濃縮回収装置(Clear Cell FX)のダブルランにてそれなりの細胞数を得る事ができた(治療前:13-235個/1sample、4-78個/1ml、治療後:65-305個/1sample、21-93個/1ml)。がん細胞である事を証明するための免疫染色実験において、上皮性マーカー(カドへリン)と造血系細胞マーカーCD45とを用いて染色し、カドへリン(+)・CD45(-)細胞をCTCとしてカウントした(治療前:0-312個/1sample、0-52個/1ml、治療後:0-150個/1sample、0-25個/1ml)。次に膵がんPDXを用いたCTC解析では、腫瘍組織移植後tumor volumeが1500mm3に達した時点で末梢血採血を行った。このモデルを用いてCTC細胞(EGFP(-), mouse MHC(-), HLA(+))を同定した。今後は、PDXモデルとCDXモデルとを並行して実験を行い、CTC細胞からDNA/RNAを抽出し遺伝子解析を施行する。

免疫染色実験では、上皮性マーカー(カドへリン)と造血系細胞マーカーCD45とを用いて染色し、カドへリン(+)・CD45(-)細胞をCTCとした。PDXモデルでは、まずマウス血液と人膵がん細胞とを混合したサンプルを用いて条件検討を施行し、次に膵がんCell lineを用いたCDXモデルにおいて、CTC細胞(EGFP(-), mouse MHC(-), HLA(+))を同定した。これらの解析後、膵がんPDXを用いて同様の実験を行い、CTC細胞を同定する事に成功した。再度健常人の血液を用いた条件検討を行い、患者サンプルを用いた実験ではTAM因子も付け加えて除外解析も行う。条件をクリア出来ればCTCからDNA/RNAを回収し次世代シーケンサー解析を行い、転移巣からのデータと合わせて比較解析を行う。マウスモデルではPDXモデルとCDXモデルとを同時に進行し、同所移殖PDXモデルで転移巣を認めなければCDXモデルにて研究を継続する。腫瘍免疫患者サンプル及びPDXモデル共にCTC採取に時間が掛かっており、当該年度に施行する予定であった次世代シーケンサー解析を施行できなかったため、次年度への使用額が生じた。計画進行がやや遅れているが、CTC採取後予定通り次世代シーケンサー解析を行う。転移巣との比較解析を行い共通因子を同定できれば免疫実験へと移行する。
九州・琉球方言の文献方言史的研究

琉球方言については、早く本土方言と分離した大方言として本土全体のことばと対比してその古態性や独自性が強調されることが多かった。たしかにそのような面もうかがえるが九州方言との共通性もまた強く感じられる。この連続性は、琉球方言の性格をときほぐすもう一つの重要な手がかりであるはずである。琉球には、『おもろさうし』のような重要な古文献があり、同じころ以降の九州は全国的にみても地方語文献がかなり豊富な地域である。本研究は、この双方の文献を活用した方言史を考えることで、両地域の方言の性格を少しでも明らかにしようとしたものである。対馬の江戸時代の方言の研究をかなり進めることができた。対馬の朝鮮語通辞養成のための教科書『交隣須知』の日本語が対馬方言であることを同じく対馬の方言書『日暮芥草』との対比で明らかにした。このことは同時に『交隣須知』と密接に関係して成立した朝鮮の日本語辞書『倭語類解』のことばの性格の一端を考えることになった。これら三書に共通する一見二段活用の一段化とも見える動詞活用の特色が一段化現象というよりラ行五段化との関連で捉えるべきことを提案した。このラ行五段化は九州西南部から琉球に速なる現象で、琉球の変化は古語「おはす」のラ行五段化したおもろさうしの「おわる」に象徴されていることを説いた。日暮芥草に見えるkw>pの音変化は、琉球八重山方言などのw>bの変化を思わせる。この変化は、琉球方言に「ヰ・イ」「ヲ・オ」の別などを残したが、鹿児島のゴンザ資料はこのこととの関連を思わせる記述を残している。琉球方言の調査については、久保智之研究分担者、荻野千砂子研究協力者の全面的な支援を受けた。琉球方言は、日本本土方言と早く分離して古い時代の日本語の痕跡を残す、姉妹語に近い大方言として扱われることが多かったが、新しい変化と思われる部分で実は思いの外九州方言と連続するところが多い。九州方言、琉球方言を正当に評価するためにも、その特異性を強調するだけでなく、連続面にもっと注意を払うべきではないかとしてはじめた研究で、研究代表者は、『おもろさうし』に見える「おわる」という敬語の成立を考察し、その言語変化を推し進めたエネルギーは、鹿児島から熊本、長崎、対馬など九州西海岸にも同じように強く見られることを指摘した。いわゆるラ行五段化の強い指向であるが、この傾向は江戸時代の対馬にも見られる。そのことを示す『交隣須知』などの朝鮮語学習書の資料的価値を明らかにするために、関連の深い方言書『日暮芥草』の地道な解読作業を引き続きすすめた。非常に大部な資料で、全部を解読し終えるにはなお相当の時日を要するものと思われる。『おもろさうし』による琉球方言の研究に資するために、現地の現在琉球方言の調査を研究分担者と協力して実施したが、非常に有益であった。また江戸時代の長崎方言で書かれた『長崎在所子供訛』を見出すなど資料収集も引き続き進めている。本研究は、地方語文献を発掘精査して方言史を再構、これまでの中央語中心の日本語史を見直すことを目的にしたもので、比較的地方語文献資料の豊富な九州地方を中心に取り上げた。(1)朝鮮語通辞養成のためのテキスト『交隣須知』の成立、言語の性格についての調査考察をすすめた。諸本の収集、写本相互の関係などの基礎的作業を行い、朝鮮資料『倭語類解』との関係を手がかりにその成立について考察し、雨森芳州製作説に疑問を呈した。(『交隣須知』の成立

存疑・2006)また、『交隣須知』のことばと対馬方言との関連を実証する上で貴重な江戸時代の対馬の方言書『日暮芥草』の解読考察をすすめた。全20巻のうち現存するもの10巻であるが、それでも九州地方における江戸時代最大の方言書で、広く紹介される意味は大きい。(2)『交隣須知』『日暮芥草』に見られる動詞活用には、九州方言としてはむしろ不審とも言える一段化例が顕著に見られる。江戸時代の鹿児島方言を反映していると思われるゴンザ資料(ロシア資料)、琉球の『おもろさうし』の動詞活用などと考えあわせる五段化を軸にした動詞活用の大きな動きを予想できそうで、その見通しのもとにそれぞれの資料の分析と関連についての考察をすすめた。(3)ゴンザ資料のキリル文字による表記からうかがえる鹿児島方言の音韻傾向と現代琉球方言との間に重要な関連があると考えられたために数度にわたる琉球方言調査を試みた。『おもろさうし』の表記の問題、『おもろ』に頻出する敬語「おわる」と八重山方言との関連、指示詞の問題など多様なテーマについて調査考察をすすめた。琉球の調査については、久保智之研究分担者、荻野千砂子研究協力者の全面的な支援をうけた。琉球方言については,早く本土方言と分離した大方言として本土全体のことばと対比してその古態性や独自性が強調されることが多かった。たしかにそのよ,うな面もうかがえるが九州方言との共通性もまた強く感じられる。この連続性は,琉球方言の性格をときほぐすもう一つの重要な手がかりであるはずである。琉球には,『おもろさうし』のような重要な古文献があり,同じころ以降の九州は全国的にみても地方語文献がかなり豊富な地域である。本研究は,この双方の文献を活用した方雷史を考えることで,両地域の方言の性格を少しでも明らかにしようとしたものである。対馬の江戸時代の方言の研究をかなり進めることができた。対馬の朝鮮語通辞養成のための教科書『交隣須知』の日本語が対馬方言であることを同じく対馬の方言書『日暮芥草』との対比で明らかにした。このことは同時に『交隣須知』と密接に関係して成立した朝鮮の日本語辞書『倭語類解』のことばの性格の一端を考えることになった。これら三書に共通する一見二段活用の一段化とも見える動詞活用の特色が一段化現象というよりラ行五段化との関連で捉えるべきことを提案した。このラ行五段化は九州西南部から琉球に連なる現象で,琉球の変化は古語「おはす」のラ行五段化したおもろさうしの「おわる」に象徴されていることを説いた。日暮芥草に見えるkw>pの音変化は,琉球八重山方言などのw>bの変化を思わせる。この変化は,琉球方言に「イ・イ」「ヲ・オ」の別などを残したが,鹿児島のゴンザ資料はこのこととの関連を思わせる記述を残している。琉球方言の調査については,久保智之研究分担者,荻野千砂子研究協力者の全面的な支援を受けた。
樹種共存の葉層分割仮説と透過率分化仮説の並行検証

森林生態系の樹木群集は、従来、撹乱からの再生過程に沿った耐陰性の異なる種間の分化や水平分布不均質性、確率的な種交代の観点から解析されてきた。これに対し、本研究では、多層構造を組み込んだ競争方程式を用いて、光資源勾配にのみ制限される水平的に均質な系でも、葉群の垂直分布や樹冠特性の分化を介して、多種の共存解が安定である条件(平橋共存条件)と不安定である条件を理論的に整理した。熱帯林から亜高山帯林に至る森林の観測データの解析に基づいて、各仮説の検証を行い、生活史および樹冠形質パラメータの種間トレード・オフの共存影響を明らかにするとともに、種内可塑的変異と種間分化を区別して同時解析する手法を開発した。【理論研究】(1)森林の垂直葉群分布を二層に単純化した一般化競争モデルおよび安定性解析手法を検討した。一種だけの場合でも、下層での繁殖の貢献が上層のそれより大きいときに、不安定解(サドル解)で分割される複数の安定解が現れることを見出した。(2)個体成長の確率的変動を扱うサイズ・齢分布動態モデルを解析し、最適生活史戦略に関する理論を構築した(既発表, Oizumi and Takada 2013)。【野外検証】(3)葉群分割仮説と透過率仮説を北海道雄阿寒岳の亜高山帯永久調査区において、アカエゾマツとトドマツの葉群垂直分布と樹冠透過率をポータブル・ライダーを用いて観測した。両樹種稚樹の樹高および樹冠水平成長と稚樹樹冠の光環境観測を行った。(4)葉層分割仮説と透過率分化率仮説を検証するために,北茨城市の小川学術参考林の落葉広葉樹林において野外調査を行い、林冠構造の水平・垂直分布に対応した主要樹種の実生・稚樹の空間分布特性を指標するデータを取得した。(5)インドネシア・ボルネオの中カリマンタンにおいて、泥炭湿地林とヒース林の主要構成樹種の樹冠アロメトリーおよび葉÷茎特性と成長速度・死亡率の関係を解析した(一部発表: Atikah et al. 2014)。【調査区データ解析】(6)種多様性の高い熱帯多雨林を対象に葉層分割仮説の予測を検証するために、マレーシアのパソー保護区50ヘクタール調査区データを用いて種間のサイズ依存的な成長速度・死亡率および加入速度の比較を階層ベイズ統計モデルを用いて解析した(一部発表: Iida et al. 2014)。(7)台湾亜熱帯林に設定されたフーシャンの25ヘクタール調査区で、主要樹種の葉特性と成長速度・死亡率それぞれのサイズ依存的な変化を解析し、種間分化と共存のメカニズムを考察した。1.数理モデル解析:平衡状態において葉群の鉛直分布構造に違いのある種間の競争モデルを、鉛直的に2層ないし3層構造がある場合について解析した結果をまとめて、「葉群分割仮説」を初めて論文発表した(Kohyama and Takada 2012)。発表論文の議論のなかで、本課題の興味である葉群分割仮説と透過率分化仮説を対比的に論じた。2.亜高山帯アカエゾマツートドマツ混交林調査:9月上旬に雄阿寒岳山麓の1ヘクタール調査区の再測定(8年後、2回目)を、中旬に遠音別岳原生地域の1/4ヘクタール調査区×4の再測定(前回から6年目、6回目)を実施した。雄阿寒プロットでは、樹冠の鉛直構造のライダー観測の試行も行った。3.大規模調査区のデータ解析:熱帯林(マレーシア、Pasoh)と亜熱帯林(台湾、Fushan)の永久調査区データを用いて、樹木種の生長と死亡の樹木サイズ依存性をベイズモデルにより解析し、「葉群分割仮説」の必要条件である、樹種のサイズ分布がデモグラフィーと結びついているかについて解析を始めた。4.海外との共同研究:飯田佳子(博士研究員*)をMichigan州立大のNathan Swenson博士の研究室に派遣し、世界各地の森林調査区の動態と生理・形態形質のメタ解析を共同で進めた。鈴木牧は、ポーランドのクラコフ農業大学森林学科のJerzy Szwagrzyk研究室を訪問し,同研究室の主要な動態研究サイトであるニエポウォミツエ州立公園(Puszcza Niepolomicka)森林保護区,カルパチア山地Babia Goraの針広混交林,亜高山帯林,ブナ林調査地を視察,セミナーと共同研究の計画の打ち合わせを行った。【理論の野外検証】(1)北海道雄阿寒岳の亜高山帯林1ヘクタール調査区において、一昨年度にポータブル・ライダーを用いて林冠垂直構造を観測した同一121地点で、全天写真による開空度観測を行った。樹木直径の測定を実施し、2004年から10年間の直径成長・死亡・加入動態を解析できるデータを得た。さらに、アカエゾマツとトドマツの稚樹について、年枝による樹高成長を観測した。また、大陸内陸性の森林群集パターンとの比較検証のために、モンゴルの植生の視察を行った。(2)北茨城の小川学術参考林の落葉広葉樹林において、高木優占種の実生・稚樹と低木優占種の分布相関を調査・分析した。いずれの種ペア間でも,空間分布は無相関か,弱い正の相関を示した。(3)屋久島の暖温帯多雨林(照葉樹林)において、樹冠上部のシュート伸長・分枝動態の種間比較観測を行った。

また、台湾の亜熱帯林と南日本の暖温帯降雨林の比較解析について、第4回台湾・日本生態学ワークショップに於いて共同研究を提案した。【データ解析】(4)葉層分割理論および遷移ニッチ理論の予測を対比検証するために、マレーシアのPasoh保護区50ヘクタール調査区データを用いて種間のサイズ依存的な成長速度・死亡率および加入速度とサイズ分布の関係を解析した。葉群分割理論を支持する結果を得て、American Naturalistに発表した。(5)台湾亜熱帯林に設定されたFushan植物園25ヘクタール調査区で、主要樹種43種の葉特性と成長速度・死亡率のサイズ依存的な変化を解析した結果を、Journal of Ecologyに発表した。(6)中国安徽省の常緑-落葉広葉樹移行帯の広域パターンの地形による変異を解析し、Journal of Vegetation Scienceに発表した。(7)小川学術参考林の1997年から2013年までの毎木調査データを分析し,耐陰性の高い高木種間に,葉層分割説の前提となる生活史戦略のトレードオフの存在をあきらかにした。最終年度でのとりまとめに向けて、以下のように、順調に成果を発表できた。熱帯多雨林・亜熱帯多雨林・暖温帯常緑-落葉広葉樹林移行帯を対象とした群集解析の成果を国際誌に発表した。【野外調査】(1)屋久島・照葉樹原生林の樹冠シュート成長の観測を行った。(2)ネパール・Langtang国立公園の亜高山帯針葉樹林の調査を実施し、寡占種Abiesspectbilis個体のアロメトリーと成長履歴観測した。(3)モンゴル・Hustai国立公園に散在するBetula platyphylla&#8211; Betulafusca混成林の調査を実施し、個体群構造と当年シュートの機能形質を測定した。(4)雄阿寒岳・亜高山帯林で、アカエゾマツとトドマツの樹形アロメトリーの変化を観測し、光環境の変異を、携帯式ライダーと全天写真により測定した。(5)インドネシア・中カリマンタン州Bawan湿地林1-ha調査区の再測定を、インドネシア科学院生物学研究所に依頼し、追跡観測データと葉・シュート試料を得た。【解析(1)樹形アロメトリーの種間変異と個体群内変異を、インドネシア熱帯林から雄阿寒岳亜高山帯林に至る樹木群集を対象にベイズ統計手法を用いて解析した。その結果、従来の解析では種間変異とされてきた個体間変異が、樹種のサイズ分布差を反映したバイアスに過ぎないことを見出した。今後、種間変異と種内個体間可塑的変異を同時に解析する必要があることを認めた。(2)新規加入率の算定手法を整理した。森林の樹木集団の加入・死亡率の推定バイアスを、観測変化個体数と、集団内構造(群集を構成する種、地域集団差、種内の遺伝型等)について解析し、分構造を組み込んだ推定手法を提示した。以上を論文原稿にまとめた(Kohyama, Kohyama and Sheil, in prep.)(3)苫小牧・冷温帯広葉樹林、屋久島・暖温帯多雨林、モンゴル・カンバ2種で、個葉と当年シュートの機能形質解析を行った。前者について成果を論文をまとめた。(Miyata and Kohyama, under minor revision)森林生態系の樹木群集は、従来、撹乱からの再生過程に沿った耐陰性の異なる種間の分化や水平分布不均質性、確率的な種交代の観点から解析されてきた。