hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高機能酸塩基複合ナノ触媒の開発

酸塩基複合化学を基盤に、非共有結合性相互作用、共鳴効果、誘起効果、動的平衡を活かしたナノサイズの超分子触媒を設計し、従来法では実現困難な高難度な選択性と高い触媒活性を発現する高機能触媒を開発することを目的に研究を実施した。以下、具体的な研究実績について述べる。(1)超分子触媒のナノ空間制御に基づく高次立体選択的反応の開発:単一分子触媒では制御困難な遠隔不斉誘導や基質依存性の高い様々な反応選択性を触媒のナノ空間で制御する検討を実施した。基本となるナノ超分子触媒として軸不斉を有するキラルボロン酸エステルとB(C6F5)3から調製される錯体がDiels-Alder反応のテーラーメイド触媒として有効であった。エナンチオ選択性のみならず、エンド/エキソ選択性、レジオ選択性などを制御することに成功した。(2)イオンペア触媒のナノ空間制御に基づく高次立体選択的反応の開発:過酸化水素などの酸化剤の存在下、第四級アンモニウムヨージドを触媒前駆体として加えることにより、in situで次亜ヨウ素酸塩を発生され、これを触媒とする脱水素カップリング反応を開発している。この不斉触媒化には第四級アンモニウムカチオンのキラルナノ空間の設計が重要となる。炭素ー酸素カップリングのみならず、炭素ー窒素、炭素ー炭素カップリングへと展開できることを明らかにした。(3)酸塩基複合触媒によるエナンチオ・ジアステレオ・レジオ・サイト選択的ポリエン環化反応の開発:これまでに0.5 mol%の触媒を用いてジアステレオ選択的ブロモポリエン環化反応に成功している。本研究では触媒量でのエナンチオ・ジアステレオ選択的ブロモポリエン環化反応の開発検討を実施した。現在の所、60% ee程度のエナンチオ選択性が発現しており、今後のの展開によってはさらなる選択性の向上が期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。
季節繁殖動物における精原幹細胞ニッチシステムの解析

種の連綿を支える生殖細胞は、体細胞とは異なる特殊なシステムで制御されている。将来の精子に分化することができる細胞は精原細胞(精祖細胞;Spermatogonium)であり、体細胞分裂によりその数を増やし、その結果大量の精子の供給を可能にしている。その根源を司る幹細胞は、精原幹細胞と呼ばれ、精巣内の精細管の微小環境、すなわちニッチ内に位置する。ニッチは主にセルトリ細胞によって形成され、セルトリ細胞は精原幹細胞の定着、増殖、および分化を支持することが先行研究によって明らかとなっている。精子の幹細胞である精原細胞には未分化型と分化型が存在し、このうち未分化型を精原幹細胞と呼び、精細管内のニッチと呼ばれる微小環境に存在する。その分裂はセルトリ細胞により構成されたニッチシステムにより制御され、マウスを材料にして動態が少しずつ明らかになってきた。しかし、周年繁殖のマウスは、常に精子発生の活性が高く、このためニッチシステムが機能的に簡略化されている可能性があったことから、本研究課題においては、本質的な制御機構を解明するため、生殖細胞の数を激しく変動させる季節繁殖動物(ハムスター)を材料にして研究を行った。その結果、セルトリ細胞から分泌されるGDNF(Glialcell line-derived neurotrophic factor)と精原幹細胞の動態を区別することに成功し、曲精細管におけるニッチシステムを明らかにすることができた。さらに曲精細管と精巣網の間を繋ぐ直精細管、すなわちセルトリバルブには、曲精細管領域に比べて精原幹細胞が高頻度に観察され、活発な増殖が認められた。すなわち、マウスでは観察することができなかった新たなニッチシステムの発見に至り、このニッチシステムを「精原幹細胞セルトリバルブニッチ」と命名するに至った。精子の幹細胞である精原細胞には未分化型と分化型が存在し、このうち未分化型を精原幹細胞もしくは配偶子幹細胞と呼び、精細管内のニッチと呼ばれる微小環境に存在する。しかし、周年繁殖のマウスは、常に精子発生の活性が高く、このためニッチシステムが機能的に簡略化されている可能性がある。本質的な制御機構を明らかにするためには、生殖細胞の数を激しく変動させる季節繁殖動物を精査する必要が生じた。そこで本研究では、精原幹細胞のニッチシステムの普遍性を調べるため、季節繁殖動物のハムスターを中心に、セルトリ細胞からのGDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor)分泌と精原幹細胞の動態との関連性を明らかにし、ニッチ環境を分子レベルで解明することを目的としている。生後8週齢のハムスターを、非繁殖期へ的確に導入するため、暗条件下(明6時間・暗18時間)、低温下(16°C)で飼育し、その上で一過性の食餌制限を行ったところ、従来の手技に比べて効率よい材料供給が可能となった。5,7,9,11,13、15週後に精巣を採材して、各々の血清からLHとFSHを計測することにより、ホルモンレベルでの評価を行ったところ、非繁殖期への導入を裏付ける結果が得られた。これらの材料より精巣組織から精細管を単離し、常法に従い固定後、whole mount標本において、GDNF、GFRα1の二重染色を施し、両因子の分布パターンを検討した。特に、活発な精子発生が認められる8週齢を比較対象として、非繁殖期へと至る過程を追って比較検討したところ、精細管上での分布の相違点が一部が徐々に明らかになってきた。以上の一部は国際誌に発表した(Aiyama, Tsunekawa et al 2015)。研究代表者は、平成27年4月に研究機関の異動が生じたため、動物実験の大幅な遅延が生じることが予想されたが、研究分担者との連携により概ね回避することができた。平成27年度の計画では、(1)非繁殖期ハムスターの作出、(2)GDNF陽性/陰性領域におけるGFRα1陽性細胞のシグナル系の検討、(3)形態計測による比較解析、(4)比較形態学的解析を行った。このうち、(1)(3)については、平成27年度計画を超える成果を得ることができた。一方(4)については、異動先の動物室利用の環境整備により、やや遅延が生じた。これら総合すると、おおむね順調に進展していると考えることができる。周年繁殖のマウスは、常に精子発生の活性が高く、このためニッチシステムが機能的に簡略化されている可能性があることから、本質的な制御機構を明らかにするためには、生殖細胞の数を激しく変動させる季節繁殖動物を精査する必要がある。本研究では、季節繁殖動物であるハムスターを用い、これまで着手することができなかった点の解決を試みている。

非繁殖期に誘導により分化した精細胞は、精上皮から排斥され、GFRα1陽性の精原幹細胞を高頻度に探し当てることができ、さらに非繁殖期から繁殖期を材料にすることにより、GDNF発現とGFRα1陽性細胞の関連性を明確にした他、個体発生から生後発育過程におけるニッチシステムの成立過程にて組織学的に解析を行った。平成27年度は、精原幹細胞のニッチシステムの普遍性を調べるため、季節繁殖動物のハムスターを材料にして、セルトリ細胞からのGDNF分泌と精原幹細胞の動態との関連性を明らかにし、マウスとの詳細な比較を中心に行った。さらに平成28年度は、膨大な組織画像の解析すると共に、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマを材料にして、組織学的な比較検討を行った。その結果、マウスでは観察することのできないニッチシステムについて、比較形態学的な見地から新たな概念を提唱すことが可能になってきた。ニッチシステムは、種の連綿を支える精子の供給の根幹である。本研究を通じて得られる成果は、精原幹細胞ニッチシステムについて、その普遍性と、動物種による特殊性を示す事が可能になる。研究代表者は、平成27年4月に研究機関の異動が生じたため、動物実験の大幅な遅延が生じているが、研究分担者との連携により、また過去の研究で採材された標本を利用することにより回避することができている。1)精細管におけるGDNF陽性/陰性領域の割合、2)それらの領域に存在するGFRα1陽性細胞の割合、3)シグナル活性化の度合い、4)GFRα1陽性の細胞質突起の数値(細胞の長軸/短軸の比率、突起の長さ)を形態計測により定量化を行い、形態学的な解析を進めている。種の連綿を支える生殖細胞は、体細胞とは異なる特殊なシステムで制御されている。将来の精子に分化することができる細胞は精原細胞(精祖細胞)であり、体細胞分裂によりその数を増やし、その結果大量の精子の供給を可能にしている。その根源を司る幹細胞は、精原幹細胞と呼ばれ、精巣内の精細管の微小環境、すなわちニッチ内に位置する。ニッチは主にセルトリ細胞によって形成され、セルトリ細胞は精原幹細胞の定着、増殖、および分化を支持することが明らかとなっている。精子の幹細胞である精原細胞には未分化型と分化型が存在し、このうち未分化型を精原幹細胞と呼び、精細管内のニッチと呼ばれる微小環境に存在する。その分裂はセルトリ細胞により構成されたニッチシステムにより制御され、マウスを材料にして動態が少しずつ明らかになってきた。しかし、周年繁殖のマウスは、常に精子発生の活性が高く、このためニッチシステムが機能的に簡略化されている可能性があったことから、本研究課題においては、本質的な制御機構を解明するため、生殖細胞の数を激しく変動させる季節繁殖動物(ハムスター)を材料にして研究を行った。その結果、セルトリ細胞から分泌されるGDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor)と精原幹細胞の動態を区別することに成功し、曲精細管におけるニッチシステムを明らかにすることができた。さらに曲精細管と精巣網の間を繋ぐ直精細管、すなわちセルトリバルブには、曲精細管領域に比べて精原幹細胞が高頻度に観察され、活発な増殖が認められた。すなわち、マウスでは観察することができなかった新たなニッチシステムの発見に至り、このニッチシステムを「精原幹細胞セルトリバルブニッチ」と命名した。申請者は、採択決定後、東京大学大学院農学生命科学研究科より日本大学生物資源科学部に異動した。
概均質ベクトル空間と超局所解析の研究

この期間中には,主に,概均質ベクトル空間上の微分方程式に関する研究を行った.概均質ベクトル空間上の不変微分方程式は,線型であってしかも定数係数であるので,もっとも解析しやすい微分作用素であるが,特定の作用素に関する具体的な解析はそれほど容易ではない.実際に,波動作用素を除けば,高階の双曲型偏微分作用素の具体的な解析は進んでいない.我々は,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に対して基本解の台と特異台を明示的に決定する問題に取り組んだ.特に可換放物型の場合はその不変微分作用素が双曲型になる.この場合のsingularityの伝播を調べるには,基本解の特異台を正確に決めることがもっともオーソドックスな解法である.実際にそれを実行することで,特異性伝播集合(singularity propagation set)を定義し,それを決定することができた.注目すべき点は,双曲型の偏微分作用素に対して,singularityの伝播に関するホイヘンスの原理を確立し,それが成り立つこと例があることを計算して証明したことである.我々は,実際にこのsingularityの伝播に関するホイヘンスの原理が成立することを,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に関して確かめた.これらが,より広いクラスの微分作用素に対して成立するかどうかは興味深い問題である.というのは,実際の物理的な現象において,singularityが非常に狭いところだけを伝わるという現象が発見されれば,応用の範囲は広いと思われる.数学的な解析のあとで,対応する物理現象が観測されることは往々にしてあることで,この面からも,特に高階の定数係数の微分作用素の具体的な解析は,もっと進められるべきである.そのほか,普遍包絡環の研究に関して,一般Verma加群の零化する作用素の研究や,ランク4の鏡映群の研究などが共同研究者によって行われた.この期間中には,主に,概均質ベクトル空間上の微分方程式に関する研究を行った.概均質ベクトル空間上の不変微分方程式は,線型であってしかも定数係数であるので,もっとも解析しやすい微分作用素であるが,特定の作用素に関する具体的な解析はそれほど容易ではない.実際に,波動作用素を除けば,高階の双曲型偏微分作用素の具体的な解析は進んでいない.我々は,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に対して基本解の台と特異台を明示的に決定する問題に取り組んだ.特に可換放物型の場合はその不変微分作用素が双曲型になる.この場合のsingularityの伝播を調べるには,基本解の特異台を正確に決めることがもっともオーソドックスな解法である.実際にそれを実行することで,特異性伝播集合(singularity propagation set)を定義し,それを決定することができた.注目すべき点は,双曲型の偏微分作用素に対して,singularityの伝播に関するホイヘンスの原理を確立し,それが成り立つこと例があることを計算して証明したことである.我々は,実際にこのsingularityの伝播に関するホイヘンスの原理が成立することを,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に関して確かめた.これらが,より広いクラスの微分作用素に対して成立するかどうかは興味深い問題である.というのは,実際の物理的な現象において,singularityが非常に狭いところだけを伝わるという現象が発見されれば,応用の範囲は広いと思われる.数学的な解析のあとで,対応する物理現象が観測されることは往々にしてあることで,この面からも,特に高階の定数係数の微分作用素の具体的な解析は,もっと進められるべきである.そのほか,普遍包絡環の研究に関して,一般Verma加群の零化する作用素の研究や,ランク4の鏡映群の研究などが共同研究者によって行われた.1.不変微分作用素の基本解の構成,Cauchy問題への応用,Huygensの原理の一般化などの研究を継続した.概均質ベクトル空間の相対不変式の複素べきから,不変微分作用素の基本解を構成することができる.特に,その基本解が群の作用で不変であるという条件のもとでは,すべての基本解を,この複素べきのパラメータに関するLaurent展開係数をとることによって構成できる.これによって,波動方程式のHuygensの原理と呼ばれる現象が不変微分作用素において広く観察されることがわかった.さらにこの様相を詳しく調べることによって,従来では考えられてこなかった解の特異スペクトルの構造まで完全に決めることができた.2.共同研究者である関口次郎は冪零軌道の研究を続けた.この研究においてはとくに例外型のLie環の冪零軌道の決定とその包含関係の具体的な書き下しがテーマになる.Dbarokovicなどとの共同研究で複素例外Lie環の実型において,冪零軌道がどのような振る舞いをするかについての研究を続けている.実際にこれを決定する問題は複雑ではあるが一部明らかになってきている.主に,概均質ベクトル空間上の微分方程式に関する研究を行った.概均質ベクトル空間上の不変微分方程式は,線型であってしかも定数係数であるので,もっとも解析しやすい微分作用素であるが,特定の作用素に関する具体的な解析はそれほど容易ではない.本年の研究においては,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に対して,基本解の台と特異台を明示的に決定する問題に取り組んだ.特に可換放物型の場合は,その不変微分作用素が双曲型になる.この場合のsingularityの伝播を調べるには,基本解の特異台を正確に決めることがもっともオーソドックスな解法である.実際にそれを実行することで,特異性伝播集合(singularity propagation set)を定義し,それを決定することができた.

これは,simple-characteristicな双曲型の偏微分方程式においては,bicharacteristic curveに沿ってsingularityが伝播することの一般化になっている.すなわち,multiple characteristicな双曲型の偏微分作用素においては,singularityはcurveではなく,さらに大きな次元の集合に沿って伝播することがわかる.これは基本解の台と特異台を明示的に計算することによって初めて明らかにされたことである.このようなことから,線型偏微分作用素の基本解の台と特異台を決定する問題は重要であるがその他の例外群E_7によって不変になる偏微分作用素に対しても,その台と特異台を明示的に計算した.そのほか,普遍包絡環の研究に関して,一般Verma加群の零化する作用素の研究や,ランク4の鏡映群の研究などが共同研究者によって行われた.前年に引き続いて,概均質ベクトル空間上の微分方程式の研究を続けた.今年度の注目すべき点は,双曲型の偏微分作用素に対して,singularityの伝播に関するホイヘンスの原理を確立し,それが成り立つこと例があることを計算して証明したことである.ホイヘンスの原理は,古くから波動方程式において成立する原理として研究されて来た.近代的な立場から見れば,これは基本解のsupportが,微分作用素から決まる錐よりも次元の下がった部分に集中していることから起こる.この微分作用素から決まる錐は,基本解のsupportの上限である.したがって,supportを明示的に計算することにより,ホイヘンスの原理が成立するかどうかがわかる.これが成立すると,波が非常に小さな部分にそって伝わることがわかる.これに対して,singularityに関するホイヘンスの原理とは,その類似である.この場合は,基本解のsingularity spectrumが問題になる.まず,基本解のsingularity spectrumの上限があるかが問題になるが,これは存在する.これをHormanderの集合と呼ぶことにする.そして,実際の基本解のsingularity spectrumを計算することができて,これがHormanderの集合より小さな部分に集中しておれば,このときsingularityの伝播に関するホイヘンスの原理が成立するということする.これが成立すると,波のsingularityが非常に小さな部分にそって伝わることがわかる.我々は,実際にこのsingularityの伝播に関するホイヘンスの原理が成立することを,概均質ベクトル空間上の不変微分作用素に関して確かめた.これらが,より広いクラスの微分作用素に対して成立するかどうかは興味深い問題である,
地下水流動系から見た汚染地下環境修復の手順に関する研究

土壌地下水汚染が顕在化した現場において,現場の地質学的特徴や地下水流動が汚染の拡散や修復対策に及ぼす影響を評価した.有機ヒ素化合物による汚染では,不法投棄されたコンクリート様の塊から溶出した有機ヒ素化合物が帯水層中を拡散していく過程を再現し,汚染メカニズムを明らかにした.揮発性有機塩素化合物による汚染では,汚染物質の自然減衰速度とバイオレメディエーション(微生物分解処理技術)を実施した場合の分解速度の算定を行い,自然減衰の100倍程度の分解促進効果が得られることを確認した.土壌地下水汚染が顕在化した現場において,現場の地質学的特徴や地下水流動が汚染の拡散や修復対策に及ぼす影響を評価した.有機ヒ素化合物による汚染では,不法投棄されたコンクリート様の塊から溶出した有機ヒ素化合物が帯水層中を拡散していく過程を再現し,汚染メカニズムを明らかにした.揮発性有機塩素化合物による汚染では,汚染物質の自然減衰速度とバイオレメディエーション(微生物分解処理技術)を実施した場合の分解速度の算定を行い,自然減衰の100倍程度の分解促進効果が得られることを確認した.土壌や地下水の汚染は,私有地あるいは私有財産と不可分の関係にある点で,顕在化している他の環境汚染とは一線を画する.土地取引に土壌地下水汚染調査が必須の時代にあって,綿密な調査と,汚染が発見されたときの適切な修復技術の選択と修復効果の評価は,水工学に期待されている現在的課題の筆頭といえる.こうした背景から本研究では,これまでに土壌地下水汚染が顕在化し修復対策の実施されてきた汚染現場のうち,トリクロロエチレンなどの揮発性有機塩素化合物,重金属類と硝酸性窒素を事例的に取り上げる.汚染現場の地質学的特徴や水循環,汚染物質の点源,面源の違いや地下水流動の規模など,修復コストに係わる諸量について整理し,共通因子を抽出するとともに,低コスト低負荷な修復のあり方と修復手順を明らかにする.さらにこの手法を研究対象にした汚染現場に模擬的に当てはめ,より効果的な修復対策のあり方を提案する.3ヶ年計画の本研究の初年度である平成18年度には,これまでに得られている既存データの再整理を行った.また,効果的な修復対策手順の提案のためには,土壌・地下水中における有害物質の動態を明らかにしたうえで,汚染の将来予測を行うことが求められる.そこで,地下水流動と汚染物質輸送を解析する数値シミュレーションモデルの開発を行った.本研究で対象としている有害物質のなかでは,揮発性有機塩素化合物が土壌・地下水中で最も複雑な挙動を示す.特に,土壌・地下水中で生じる微生物分解過程の解析は,微生物を利用した汚染浄化技術(バイオレメディエーション)や科学的自然減衰(MNA, Monitored Natural Attenuation)の評価において,非常に重要になってくる.このため,揮発性有機塩素化合物の微生物分解過程として相応しい反応モデルの検討,および分解速度の推定を行った.その結果,分解過程は一次反応モデルで近似できること,自然条件下での一次反応速度定数が10^<-3>/d程度になることなどを明らかにすることができた.土壌や地下水の汚染は,私有地あるいは私有財産と不可分の関係にある点で,顕在化している他の環境汚染とは一線を画する.土地取引に土壌地下水汚染調査が必須の時代にあって,綿密な調査と,汚染が発見されたときの適切な修復技術の選択と修復効果の評価は,水工学に期待されている現在的課題の筆頭といえる.こうした背景から本研究では,これまでに土壌地下水汚染が顕在化し修復対策の実施されてきた汚染現場のうち,トリクロロエチレンなどの揮発性有機塩素化合物,重金属類と硝酸性窒素を事例的に取り上げる.汚染現場の地質学的特徴や水循環,汚染物質の点源,面源の違いや地下水流動の規模など,修復コストに係わる諸量について整理し,共通因子を抽出するとともに,低コスト低負荷な修復のあり方と修復手順を明らかにする.さらにこの手法を研究対象にした汚染現場に模擬的に当てはめ,より効果的な修復対策のあり方を提案する.平成19年度には,研究初年度(平成18年度)に整理した現場データおよび構築した数値シミュレーションモデルを利用して,地下水流動が修復効果に大きく影響するバイオレメディエーション技術について検討を行った.その結果,微生物分解速度に関する以下の知見を得た.1)帯水層における自然浄化機能を利用する科学的自然減衰(MNA,Monitored Natural Attenuation)では,揮発性有機塩素化合物の一次反応速度定数がほぼ10^<-3>/dである.2)栄養剤を帯水層に添加して微生物分解を促進させる方法では,地下水の流れを制御することで分解速度が自然条件下より100倍から1000倍程度大きくなる.土壌や地下水の汚染は,私有地あるいは私有財産と不可分の関係にある点で,顕在化している他の環境汚染とは一線を画する.土地取引に土壌地下水汚染調査が必須の時代にあって,綿密な調査と,汚染が発見されたときの適切な修復技術の選択と修復効果の評価は,現在的課題の筆頭といえる.こうした背景から本研究では,これまでに土壌地下水汚染が顕在化し修復対策の実施されてきた汚染現場のうち,トリクロロエチレンなどの揮発性有機塩素化合物と重金属類を事例的に取り上げた.まず,汚染現場の地質学的特徴や水循環,汚染物質の点源,面源の違いや地下水流動の規模などについて整理した,続いて,数値解析技術などを利用して,より効果的な修復対策のあり方について検討した.

平成20年度には,これまでに収集,整理した現場データおよび構築した数値解析モデルを利用して,有機ヒ素化合物の地下水汚染メカニズムの解明および地下水流動が修復効果に大きく影響するバイオレメディエーション技術の効果について検討を行った.1)茨城県神栖市で生じた有機ヒ素化合物による地下水汚染は,不法投棄されたと思われる廃棄物から溶出した有機ヒ素化合物が密度効果で帯水層深部に浸透した後,地下水流れに乗って下流へ運ばれたことで拡大していったと推察された.2)土中微生物の栄養物を帯水層に注入することで揮発性有機塩素化合物の分解無害化を促進させるバイオスティミュレーションに関する挙動解析モデルを構築し,本研究で対象とした添加剤を適用した場合には,自然減衰の100倍程度の分解促進効果が得られることを確認した.
下垂体隆起部におけるニューロメジンU発現の日内リズム形成メカニズムの解明

ラットの隆起部で発現するニューロメジンU (NMU)の発現制御機構の解明を行った。ラット隆起部ではメラトニン受容体MT1aとアデノシン受容体A2bが高発現していることが定量PCRにより示された。ラット脳スライス培養実験系において、隆起部NMU mRNA発現はメラトニンによって有意に抑制され、アデノシンによって有意に促進された。アデノシンとメラトニンが拮抗的に作用することで隆起部NMUの日内リズム発現が形成されていることが示唆された。本研究は、下垂体隆起部で産生されるニューロメジンU(NMU)の発現制御メカニズムを解明することを目的としている。これまでの応募者の研究において、隆起部NMU発現レベルは、明期に高く、暗期に低くなる日内リズムがみられることを示してきた。平成27年度の成果は以下の通りである。(1)ラットへ明期にメラトニンを投与すると、隆起部NMU発現が低下する結果が得られた。メラトニンは通常生理状態下では暗期に分泌されるホルモンである。このことから、暗期に分泌されるメラトニンが、NMU発現を抑制的に制御していることが示唆された。(2)本研究費においてマイクロスライサーを購入し、脳スライスの作成が可能となった。それ故、隆起部を含む脳スライスを作成しスライス培養法を用いてメラトニンの作用を検討した。メラトニンの2時間の作用で隆起部NMU発現の抑制効果がみられた。このことから、メラトニンは隆起部NMU発現を直接的に制御していることが示唆された。今後は濃度や作用時間の詳細な検討、さらにはアンタゴニストの影響を検討する予定である。(3)またNMU発現制御に関する新たな因子を探索していただが、アデノシン受容体アゴニストの作用によりNMU発現が促進する傾向がみられた。今後は、アデノシン受容体を介した制御メカニズムの解明も進める。in vivo実験系だけでなく、in vitroとして脳スライスを用いた実験においてメラトニンによる隆起部NMUの抑制作用を確認できた。そのためメラトニンは直接的に隆起部NMUを抑制していることを明らかにすることができた。さらに、隆起部NMU発現制御因子の候補として新たにアデノシンを同定できたため、今後の研究の発展が期待される。隆起部ニューロメジンU (NMU) mRNA発現の制御メカニズムの細胞内シグナル系を解明するために、隆起部NMU発現の転写制御因子の同定をin vitro実験系で行った。NMUは隆起部だけでなく他の部位でも発現しており、特に消化管での発現がメジャーである。しかしながら、隆起部NMUのみならず消化管で発現するNMUを含めて、これまでに転写因子に関する報告はほとんどない。そこでまずは、データベースからの解析を試みた。現在データベース上に登録されているラットNMU配列の5'UTR領域は、転写開始点を含む第一エクソンのみから成り(GenBank No. NM_022239)、その上流がNMUプロモーター領域と考えられた。ラットNMU遺伝子の転写開始点より上流1000bpの範囲をプロモーター予測ツールにて解析してみると、E-boxやCRE領域を含む多くの転写調節サイトが同定された。特に、転写開始点よりマイナス200bp程の位置に、多くのCRE領域が存在していた。前年度の結果より、ラット脳スライス培養法においてアデノシンが隆起部のNMU mRNA量を上げることが示されている。また、ラットの隆起部では、アデノシン受容体サブタイプのうち、2b型が高発現していることも、PCRおよびリアルタイムPCRの解析により確認できた。そこで、細胞株を用いて、アデノシンのラットNMUの発現活性への影響を解析したところ、アデノシンの作用により、直接的に、転写が促進されることが明らかとなった。今年度は、脳スライス培養法を用いて隆起部NMUの制御因子の候補を探索したが、その結果として、アデノシン受容体A2bのアゴニストNECAを作用させることでNMU発現が増加する傾向が見られた。今後は、NECAの濃度、投与時間を詳細に検討し、アデノシンによる隆起部NMU発現制御を詳細に検討する。さらに、これまでに明らかにしたメラトニンによる抑制的な制御機構との関連を検討する。アデノシンとメラトニンの共投与や、メラトニンによる前処理後にアデノシンを作用させるなどして両者による隆起部NMUの発現制御を検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。内分泌学28年度が最終年度であるため、記入しない。
楕円変調方式の提案および実用化を目指した多角的研究

本研究は楕円を用いた新しい変調方式を提案するものであるが、本研究期間内での成果として振幅、周波数、位相の各次元における楕円の変調方式を具体的なパラメータを用いて実現し、その性能評価を行った。まず長軸固定モードにおける、軸角度に基づく各種変調方式の確立、離心率の変化に基づく変調方式の確立と、位相変調との組み合わせであるEPSK方式を提案、構築を行い、各方式に関してはDSPによる実波形の生成、復調、周波数スペクトラムの測定、BER特性取得などを行った。具体的には、長軸固定モード、長軸回転モードにおける波形の導出は楕円信号処理装置、ならびに楕円信号処理システムで行いその基礎特性を取得した。長軸固定モードでは、オフセット長軸角度と離心率の組み合わせで各種伝送情報を表現した他、更に、振幅、位相、周波数での変調を組み合わせて、その特性を周波数スペクトラムの観点と、BER特性の観点で性能評価を行った。位相変調との組み合わせであるEPSK(Elliptical Phase Shift Keying)では4array,8arrayでの位相楕円変調方式を提案し、その特性を解析したほか、DS-CDMAとの組み合わせなど、様々な切り口で評価を行った。理論解析結果より従来方式と比べて信号対雑音特性など、高い性能が得られることが明らかになった。まず長軸固定モードにおける、軸角度に基づく各種変調方式の確立、離心率の変化に基づく変調方式の確立と、位相変調との組み合わせであるEPSK方式を提案、構築を行い、各方式に関してはDSPによる寒波形の生成、復調、周波数スペクトラムの測定、BER特性取得などを行った。長軸回転モードでは、長軸の回転速度、回転方向(右回転、左回転)、あるいは回転速度、回転方向の変化のさせ方、離心率のパラメータを各種組み合わせ、それぞれの周波数スペクトラムと、BER特性の関係について調べた。更に、振幅、位相、周波数変調と組み合わせ、それぞれの特性も導出する。また、同時に理論モデルの構築も行い、BER等の理論式の検討を行った。また、受信に関してはコリレイターを用いた方式で従来方式よりも優れた特性が得られているので、具体的なシステムとして検討を行った楕円変調波形は全て楕円信号処理システムおよび楕円信号処理装置で生成され、現有設備であるオシロスコープにより波形を解析した。
高圧合成法による新超伝導体の探索と物性

高圧合成法を用いて我々が始めて合成に成功した電子ドープ型無眼層超伝導体(Sr,La)CuO_2について、基本となる結晶構造は明らかであるが、超伝導性の出現機構との関連においてその局所構造には不明な点が多かった。本年度はまずX線吸収スペクトル(XAS)および電子エネルギー損失スペクトル(EELS)によって、上記の新超伝導体はホールドープ型ではなく、電子ドープ型であることが確認された。従来からの非超伝導性無限層化合物に関してのバンド計算や中性子回折の実験から、無限層構造中の酸素位置がCuO_2導電面上からC軸方向に少し変位している可能性が指摘されていた。本研究でも中性子回折およびEXAFで調べたが、室温では酸素位置に関して異常は見つからなかった。しかし低温での測定ではEXAFSによる酸素の温度因子がTc以下で大きくなる可能性が見つかった。またラマン分光法でもLa^<3+>をドープすることによって新らたに現われる150cm^<-1>付近の吸収強度が、測定温度によって変化することが見出された。これらのデータを十分に集積することにより、電子ドープ系超伝導の発現機構をかなり明らかにできると考えている。高圧下で合成できる試科量は大変少なく、また均一性を保つことも容易ではない。本研究では原料の混合を均一にするためにゾル-ゲル法を用い常圧下で無限層超伝導体を合成する可能性についても検討した。金属酢酸塩を原料とし酒石酸で滴定する方法によって、酸化物原料混合粉からの合成が困難なCa_<1-x>CuO_2を容易に合成でき、Ca^<2+>のNa^+への部分置換も可能であった。Ca_<1-x>SrxCuO_2非超伝導無陸層化合物はゾル-ゲル法で合成しても生成域は0.09【less thanor equal】X【less thanor equal】と従来法による結果と大差はなかった。Na^+やK^+による部分置換も試みた。これらの生成物では弱い反磁性の観察される場合があった。
インスリン抵抗性獲得における尿酸の寄与とその分子機序解明

本研究では腎近位尿細管での尿酸再吸収モデルURAT1/GLUT9共発現MDCK2細胞を用いて、インスリンが尿酸の再吸収に及ぼす影響を検討した結果、インスリンによる解糖系の亢進に依存して尿酸再吸収を促進することが示された。URAT1の尿酸輸送の交換基質であるlactateが解糖系による増大することが考えられることから、URAT1単発現HEK293細胞を用いた検討を行った結果、同様に解糖系の亢進が尿酸の細胞内取り込みに寄与することが示された。高尿酸血症は2型糖尿病を合併しやすいことで知られ、それらは相互に病態の進展に関与していると考えられているがその相関機構は詳しく解明されていない。これら病態の悪循環を理解するためには、それぞれの病態から他方の病態を進展する機序を両面から検討する必要があると考られる。そこで、今年度は糖尿病によって血清尿酸値を上昇させる機序を検討した。まず、腎近位尿細管での尿酸再吸収モデル細胞として樹立した尿酸輸送体URAT1及びURATv1発現MDCKII細胞(イヌ腎臓尿細管上皮細胞)を用いて尿酸の細胞透過性を評価したところ、インスリン処理によって尿酸透過は有意に増加した。また、その増加はグルコースを枯渇することによって抑制された。また、インスリン非存在下ではグルコース濃度を0-100 mMで変化させても尿酸透過性に影響が見られなかったことから、インスリンは解糖系を亢進することで尿酸の透過性を増大させていることが示唆された。また、内因的にURATv1及びインスリンレセプターを発現するHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞)にURAT1をトランスフェクションして尿酸の取り込みを評価した結果、尿酸の取り込みはインスリン処理により増大し、グルコース枯渇によって抑制された。さらにインスリンによる尿酸取り込み増大は解糖系阻害剤2-deoxy-glucose存在下では処抑制された。これらの結果より、インスリンは解糖系を亢進することで尿酸の再吸収を促進し、血清尿酸値を上昇させる可能性が示された。高尿酸血症は2型糖尿病をはじめ心血管疾患や肥満などの慢性炎症疾患と相関することが知られ、それらは相互に病態の進展に関与すると考えられている。これら病態の悪循環を理解するためには、病態の進展について両面から検討する必要がある。糖尿病時の血清尿酸値上昇機序の探索において、腎近位尿細管での尿酸再吸収モデル細胞を用いた検討によってinsulinによる解糖系の亢進が再吸収を促進した。尿酸輸送体URAT1はlactateとurateを交換輸送することから、insulin刺激時の細胞内lactate量の変化について検討中である。また、高尿酸血症と相関する心血管疾患についても検討したところ、血管内皮細胞において尿酸処理濃度依存的に尿酸取り込みクリアランスが増大した。また、尿酸処理によって尿酸排出に寄与する輸送体の発現及び輸送活性の減少が示されたことから、尿酸による輸送体の発現変動が尿酸蓄積を増大させて血管内皮障害を引き起こしている可能性が示された。当初は尿酸がインスリン抵抗性を惹起する機序を明らかにすることを目的としていたが、高尿酸血症と2型糖尿病は相互に病態の悪循環を引き起こすと考えられていることから、それぞれの病態が互いに他方の病態を引き起こすことを明らかにする必要があると考えた。そこで、まずはインスリンの上昇が高尿酸血症を引き起こす機序の検討を行ったため、当初の計画よりもやや遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は申請時の計画にあった尿酸によっインスリン抵抗性が誘導される機構を検討する。また、インスリン抵抗性はメタボリックシンドロームと高い相関を示す。尿酸は慢性炎症や酸化ストレスを惹起することで高血圧及び肥満を引き起こすことが報告されていることから、尿酸にるメタボリックシンドロームを介したインスリン抵抗性誘導機構も考慮した計画をする必要もあると考えられる。
血管壁断面内の異方性弾性率分布の測定

生体中で大きな比率を占める軟組織の力学的特性を測定する場合、主として生体ゆえの取扱いにくさから、既存工業材料に対する測定法をそのまま用いることは困難である。また、血管壁などのように微細な領域の局所的な特性を知る必要がある場合にも、従来の引張試験に代表される測定法は適さない。そのため、生体軟組織に適した簡便な力学的特性の測定方法の開発は不可欠である。このような視点に立って、本研究では、従来細胞レベルの弾性率測定に用いられてきたマイクロピペット吸引法の原理に基き内径がサブミリオーダーのピペットを利用した初期弾性率測定法を提案し、実際の測定に応用した。ピペット吸引法は、試料表面に押し当てたピペット内の圧力を吸引によって下げることで試料の一部をピペット内に吸い上げ、その変形量と吸引圧力の関係から測定対象の弾性率を求める方法である。まず、有限要素法による測定の詳細な数値シミュレーションを実施して実験と比較することで測定の精度向上をはかった。この場合の解析から、ピペットの壁厚、測定対象の板厚および異方性が測定結果に影響を与え得る主なパラメータになることがわかり、特にピペットの壁厚と測定対象の板厚については、ピペットの内半径で無次元化した場合それぞれある値以上で影響がなくなることがわかった。実験では実際にウサギの大動脈を対象として基礎的なデータを取得した。これにより、従来測定が困難であった血管壁の厚さ方向弾性率を求めることができることを示し、その値が他の方法で推定されている値に極めて近いことを確認した。また、測定対象が力学的な異方性を示す場合、従来の円形断面ピペットでは測定が困難であった異方性弾性率もアスペクト比が5程度以上の長方形断面形状のピペットを用いることで容易に求められることを解析で示した。
周期運動に対するパワーアシスト制御：ヒトを含めた人間-機械システム全体の最適化

自転車のペダリングは日常で繰り返しおこなう運動であるにもかかわらず,フォームの指導を受ける機会は少ない.その結果,目的に合わない姿勢の下でペダリングすることにより,本来のトルクを生成できていない場合がある.本研究では,ヒトの運動姿勢の最適化と同時にその運動をアシストすることで,人間-機械システム全体にわたる最適化の実現を目的としている.自転車のペダリングは日常で繰り返しおこなう運動であるにもかかわらず,フォームの指導を受ける機会は少ない.その結果,目的に合わない姿勢の下でペダリングすることにより,本来のトルクを生成できていない場合がある.本研究では,ヒトの運動姿勢の最適化と同時にその運動をアシストすることで,人間-機械システム全体にわたる最適化の実現を目的としている.
慢性C型肝炎におけるオートファジーの生理学的意義の解明

1)肝組織内におけるオートファジーとC型肝炎ウイルス量・肝炎症・線維化・治療効果との相関についての検討昨年度にひきつづき、症例数を増やしインターフェロン(IFN)導入前C型慢性肝炎患者の肝細胞内オートファジーの数量的評価を電子顕微鏡観察にて行い、HCVウイルス量やIFN感受性・肝炎症や線維化との相関を統計学的に解析し検討を行った。C型慢性肝炎28症例の解析では、ウイルス量と肝細胞質内オートファゴソーム数は統計的有意差をもって正の相関を示し、ウイルス量が多いほどオートファジーが亢進することが証明された。一方、肝炎症や肝線維化に関しては有意な相関を示さなかった。IFN治療効果に関する検討は、多くが1b型症例であった為に治療期間が48週間必要なため解析途中である。しかし臨床的にウイルス量が多いほど治療抵抗性になることからオートファジーが誘導されるほどIFN治療抵抗性を示すものと推測された。2)HCV感染下でのオートファジーと細胞死の関与の解明肝組織内におけるオートファジーと肝炎症・繊維化の検討C型慢性肝炎患者10症例より肝組織を採取し、電子顕微鏡下の組織観察を行った。C型肝炎症例では肝細胞の細胞質100μm2あたりにオートリソソームが4.7±0.28個認められ、通常の肝細胞ではオートリソソームの検出が困難であることを考慮するとC型肝炎ウイルスが感染した肝細胞ではオートファジーが誘導されると考えられた。また肝炎症や肝線維化との相関の検討では肝炎症が強く肝線維化が強いほどオートリソソームの細胞質発現が増加する傾向にあったが、統計的に有意な所見を得るには検体数がまだ少ない状況であった。インターフェロン感受性なども含め、さらに症例を集める必要があると考えられ、19年度も引き続き検討を行うこととした。オートファジー抑制薬と抗ウイルス効果の検討リソソームやオートファジーにおける蛋白分解を阻害する作用を有する抗マラリア薬クロロキンの抗ウイルス効果をin vitro実験系(HCVレプリコン導入細胞)にて検証した。クロロキン1×10^<-5>MをHCVレプリコン導入細胞に添加すると18時間後には細胞質にオートリソソームが約13倍に蓄積した。クロロキンの蛋白分解阻害によりオートリソソームが自己融解せずに細胞質内に貯留したものと考えられた。またクロロキンは濃度依存的にHCVレプリコンの複製を抑制し、50%細胞毒性濃度(IC50)は3.6×10^<-5>Mで、50%効果濃度(EC50)は2.2×10^<-7>Mであった。クロロキンとインターフェロン(IFN)の同時添加はIFN単独添加と比較して有意にレプリコン複製を阻害し、7日間のIFN単独処理ではレプリコンが21日後に再複製してくるのに対しクロロキンを併用するとレプリコン複製の消失が維持された。クロロキンは抗ウイルス作用を有し、さらにIFNの抗ウイルス作用を増強する事が明らかとなった。2)HCV感染下でのオートファジーと細胞死の関与の解明
ビリジルアミノ化法を用いた精密人工複合糖質の作成

ニワトリ卵60個よりIgYを4g得、PA-糖鎖を調製した。得られたピリジルアミノ化糖鎖混合物よりBA-2-PAを精製し、1-アミノ-1-デオキシ誘導体(BA-2-NH_2)にした。1)BA-2のフルオレセイン誘導体を用いたBA-2結合蛋白質の検索。前年度に調製したBA-2のフルオレセイン誘導体を糖鎖プローブとして用いた。マウスの大脳、小脳、肝臓、腎臓をホモジナイズし、蛍光が肝臓や腎臓には見られず、大脳と小脳にのみ観察された。さらに大脳と小脳については、それらのホモジネイトの細胞分画を行い、核画分、ミトコンドリア画分、ミクロソーム画分、サイトゾル画分を調製した。これら4画分の一部をニトロセルロース膜にドットブロットし、BA-2のフルオレセイン誘導体を結合させた。余分の試薬を洗浄した後、紫外ランプ下で観察した所、蛍光がミトコンドリア画分とミクロソーム画分にのみ観察された。2)多価の糖鎖プローブの調製。Mana1-3(Mana1-6)Manb1-4GlcNAcb1-4GlcNAc-PAの過ヨウ素酸酸化物にBA-2-NH_2を反応させた。その後、ゲルろ過で分離したところ、糖鎖を結合した2つのピークが得られた。大きい方は1分子当たり2分子のBA-2構造を持ち、他のピークは1分子当たり1分子のBA-2構造を持つ事が質量分析による方法で明らとなった。3)BA-2構造の結合した樹脂の作製;BA-2-NH2を市販の活性エステルを結合した樹脂と反応させた。スクシンイミドエステルで活性化した樹脂を用いBA-2を結合した樹脂を作製した。これを用いて脳のホモジネイトの中に、BA-2を認識する蛋白質を検出する予定である。
新生産フラックスと植物プランクトの硝酸同化制御機構

植物プランクトンの硝酸同化は硝酸濃度、アンモニア濃度、光の3つの主要な環境要因によって制御されると考えられる。この制御機構を明らかにすることは海洋における新生産フラックスの規模と変動についての解析を行う上で不可欠である。この制御機構の研究は現場の自然群集についての研究と培養藻類による室内実験系と用いた研究を平行して行う必要がある。これまでの研究代表者の研究で、貧栄養環境の自然群集について、硝酸を添加後約10時間で活発な硝酸同化が現れてくることが明らかになった。このときのアンモニア濃度は検出限界以下であったことから、従来よくいわれている12μM以上のアンモニアの存在による硝酸同化の抑制とその解除とは異なった現象である可能性がある。今年度は比較のため海岸域の海水に栄養塩類を添加して珪藻の人為ブルームを発生させる系を用い、その過程での硝酸取込みの推移をモニターする実験を行った。この結果、珪藻ブルームの系ではアンモニア濃度の低下が硝酸取込みをすみやかに誘導する、従来の知見と合致した結果から得られた。貧栄養海域の現象を生理学的に解析するため、単細胞性ラン藻Synehococcnssp.(StrainSYN)の連続培養系も確立するとともに、基本的な増殖パラメータの定置を行った。また連続培養系か貧栄養海域での実験を行う上で技術的な制約となっている硝酸およびアンモニアのナノモルレベルの分析システムの開発・検討を行った。硝酸については減圧化学発光法で必要な感度を有する分析システムを構成し、方法を確立した。またアンモニアについてはオルトフェニルフェノールを用いたインドフュノール改変法を開発し、新たに固相抽出を組み合わせる方法でナノモルレベルの分析が可能であることを確めた。
量子情報変換に向けたシリコン量子ドット素子の開発

将来的な量子光通信への応用を目指し、シリコン量子ドット素子の開発を行った。サイズの異なるシリコン量子ドットを2つ結合させた素子を作製し、各量子ドットにおける量子的なエネルギーの異なる状態を実現した。また、安定的に動作するシリコン量子ドットを実現した。具体的には、薄膜化したシリコンを用いて量子ドットを作製し、量子ドットの帯電エネルギーの増大を実証した。大きな帯電エネルギーは、光照射時の素子の安定性のために必要である。これらの成果は、学術論文誌や、国際会議、国内学会において公表を行った。本研究の目的は、将来的な量子光通信の実現を目指し、ナノ構造素子における光応答の解明に向けた関連技術の開発を行うことにある。原理的に絶対安全な通信である量子光通信の基盤技術開発を目指す挑戦的な研究である。選択的に光励起が可能なシリコン二重量子ドットを実現できれば、シリコン量子ドット内の電子スピン状態を利用して、光子と電子スピンの相互作用制御・情報転写を行うことが可能となる。本年度の研究においては、設計通りにシリコン2重量子ドットを形成し、各量子ドットに1つずつ電子が入った状態を実現することができた。この状態は、光照射の効果について物理を詳細に調べるために必要である。また各量子ドットの電子数を制御し、量子ドット内の電子状態を異なる状態にすることも達成した。この状態は、各量子ドットにおける励起エネルギーが異なり、ある波長の光に対して選択的に光励起を行える状態を実現できた可能性がある。これらの結果は、学術論文誌や、国際会議、国内学会において公表を行った。選択的に光励起が可能なシリコン二重量子ドットを実現できれば、シリコン量子ドット内の電子状態を利用して、光子と電子スピンの相互作用制御・情報転写を行うことが可能となる。本研究によって、設計通りにシリコン2重量子ドットを形成し、各量子ドットに1つずつ電子が入った状態を実現することができた。また、各量子ドットの電子数を制御し、各量子ドット内の電子状態を異なる状態に調整することも達成した。最終年度には、より安定的に動作するシリコン量子ドットを実現することに成功した。具体的には、薄膜化したシリコンを用いて量子ドットを作製し、厚み方向の閉じ込めを強めることによって、量子ドットの帯電エネルギーの増大を実証した。設計通りにシリコン2重量子ドットを形成し、各量子ドットに1つずつ電子が入った状態を実現することができた。この状態は、光照射の効果について物理を詳細に調べるために必要であり、重要な進展があったと言える。量子技術、固体物性、電子デバイススピン依存トンネル現象のダイナミクス、光照射効果について詳細を調べるための測定系構築を進め、物理の解明を行う。新規に作製したシリコン量子ドットデバイスを測定したところ、新しい現象が観測されたため、ダイナミクスの測定系の構築を次年度に変更した。高周波や光に対する応答の測定系の構築に必要な装置、部品類を購入する。
一酸化窒素による光応答性ニトリルヒドラターゼの活性制御機構の解明

Rhodococcussp.N-771由来のニトリルヒドラターゼ(NHase)は非ヘム鉄を含む酵素で,ニトリルからアミドを合成する.本酵素は、菌体を暗条件に置くと酵素に一酸化窒素(NO)が結合して不活性化され、光を照射するとNOが解離して活性化する.光応答の詳細な機構を解明するため、本年度はR.sp.N-771のNO合成酵素の探索,プロテアーゼ消化による光応答部位の解析に加え,不活性型酵素のX線結晶構造解析を行った.1.R.sp.N-771のNO合成酵素の探索NO合成系の基質を同定するため,NO捕捉剤を用いて培地中における生菌体のNO合成活性を測定したところ、NO合成はL-アルギニンでは促進されず、亜硝酸イオンの添加によって促進された。この結果は,R.sp.N-771におけるNO合成は亜硝酸還元酵素によって行われている可能性を示唆している.2.光応答部位の解析不活性型酵素から単離したαサブユニットをトリプシン消化した後、逆相クロマトグラフィーを行い、鉄とNOが結合した状態でN_<105>K_<128>の24残基のペプチドを単離することに成功した.この領域は種々のNHase間で極めてよく保存されており、金属結合部位と思われる^<109>C-S-L-C-S-^<114>CのCysクラスターを含んでいた.さらにこの断片の質量分析、アミノ酸組成分析を行い、^<112>Cysの側鎖が特異的に酸化され、スルフィン酸となっていることを明らかにした.3.不活性型酵素のX線結晶構造解析硫安を沈殿剤とし、少量のジオキサンを加えた系でミクロシ-ディング法を行い、良質な菱形板状結晶を得ることに成功した.この結晶では、2.0Å分解能で良質なX線回折強度データ(R因子5.5%)を収集できた.さらにパタ-ソン関数を明瞭に説明でき、且つNHase上の結合位置が異なる3種類の重原子同型置換体の調製に成功し、それらを基にして、位相計算、溶媒平滑化を行い、初期電子密度図を得た.現在、分子模型の構築を行っている.Rhodococcussp.N-771由来のニトリルヒドラターゼ(NHase)は非ヘム鉄を含む酵素で,ニトリルからアミドを合成する.本酵素は、菌体を暗条件に置くと酵素に一酸化窒素(NO)が結合して不活性化され、光を照射するとNOが解離して活性化する.光応答の詳細な機構を解明するため、本年度はR.sp.N-771のNO合成酵素の探索,プロテアーゼ消化による光応答部位の解析に加え,不活性型酵素のX線結晶構造解析を行った.1.R.sp.N-771のNO合成酵素の探索NO合成系の基質を同定するため,NO捕捉剤を用いて培地中における生菌体のNO合成活性を測定したところ、NO合成はL-アルギニンでは促進されず、亜硝酸イオンの添加によって促進された。この結果は,R.sp.N-771におけるNO合成は亜硝酸還元酵素によって行われている可能性を示唆している.2.光応答部位の解析不活性型酵素から単離したαサブユニットをトリプシン消化した後、逆相クロマトグラフィーを行い、鉄とNOが結合した状態でN_<105>K_<128>の24残基のペプチドを単離することに成功した.この領域は種々のNHase間で極めてよく保存されており、金属結合部位と思われる^<109>C-S-L-C-S-^<114>CのCysクラスターを含んでいた.さらにこの断片の質量分析、アミノ酸組成分析を行い、^<112>Cysの側鎖が特異的に酸化され、スルフィン酸となっていることを明らかにした.3.不活性型酵素のX線結晶構造解析硫安を沈殿剤とし、少量のジオキサンを加えた系でミクロシ-ディング法を行い、良質な菱形板状結晶を得ることに成功した.この結晶では、2.0Å分解能で良質なX線回折強度データ(R因子5.5%)を収集できた.さらにパタ-ソン関数を明瞭に説明でき、且つNHase上の結合位置が異なる3種類の重原子同型置換体の調製に成功し、それらを基にして、位相計算、溶媒平滑化を行い、初期電子密度図を得た.現在、分子模型の構築を行っている.