hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生痕化石の検討に基づく生物撹拌作用(バイオターベーション)の変遷史解明

白亜紀の地層に見られる生痕化石群集の更なる把握,そして3)北海道の白亜紀と高知県佐川の三畳紀を調査対象に加えることであった.1)に関しては,表層堆積物の撹拌作用が,内在型歪形ウニ類の移動活動にともなう撹拌,トビエイ類に代表される底生魚類の摂食活動にともなう撹拌,内在型環形動物類の移動と摂食・排泄行動にともなう撹拌,表層堆積物食者の摂食・排泄行動にともなう撹拌,定住生活を保証する巣穴形成にともなう撹拌,といった多種多様な生活・行動様式が複雑に関与していることが,より明瞭となった.2)では,この時代の浅海相を特徴づける生痕化石が,Phycosiphon incertum,Scalarituba isp.,Zoophycos isp.といった泥食者の摂食・排泄行動によって形成されたもので特徴づけられる一方,長期定住型生活様式を反映して形成されるOphiomorpha nodosaが,白亜紀最初期に突如出現することが確実となった.これらのことは,ジュラ紀末までは堆積物極表層部で自由生活を採用する泥食者の摂食・排泄行動が生物撹拌作用の主たる担い手であり,その後は,巣穴形成にともなう表層堆積物の鉛直方向での大きな移動と間隙水の移動が付加したことを示唆している.このことは,従来は全く知られていなかった事実であり,生物撹拌作用の解釈を大きく変更する必要性があることを意味している.3)は,達成順位の高い上記目的を優先させたため,今年度の着手がかなわなかった.ただ,高知県での調査を予定していた三畳紀の地層に関しては,宮城県の調査で代替が可能であることが判明したため研究全体への影響は大きくない.本研究は,水力学的物理営力の影響下を離れた海底の堆積物が,底生動物の活動によってどのように撹拌されるのか,そのメカニズムの解明と地質時代を通じての変遷過程を把握することに第一の目的があった.そして,生物撹拌現象が底生動物の生活・行動様式の変遷とどのようにリンクしているのかを考察することに最終目的があった.この目的を達成するため,古生代の地層から現生の干潟堆積物までを検討対象とし,そこから産する底生動物活動の化石記録である生痕化石の検討を行ってきた.その結果,底生動物の営巣活動や摂食活動が,堆積物表層部の鉛直撹拌に大きな影響を及ぼしていることが化石でも明確に確認された.生物撹拌現象は,古生代以降普遍的に起きている現象であることは周知のことではあったが,中生代ジュラ紀と白亜紀の境界付近を境として,質ならびに規模に大きな変化があることが判明したことは本研究が初めてであり大きな成果である.その背景には,白亜紀に起きた海洋表層部に由来する植物プランクトン起源の栄養フラックス量の著しい増加と,それに敏感に反応した底生動物の摂食様式の変化現象があるものと考えている.また,複雑かつ大規模なネットワーク状の巣穴を海底面下に構築する甲殻類の繁栄,そして短時間に大量の堆積物を撹拌するエイ類に代表される大型魚類の出現は,従来の研究では全く見過ごされていた視点である.本研究において,それらが生物撹拌現象に大きく貢献していることが確認された点は,今後の研究展開の新たな方向付けにもつながる重要な成果と言えよう.
エンド型グリコシダーゼを用いたリコンビナントプロテオグリカン糖鎖の再生

1.エンド-β-キシロシダーゼ活性を有するStreptomyces olivaceoviridisy由来のリコンビナントキシラナーゼを精製し,各種のプロテオグリカンに関する加水分解作用の解明を行った。その結果,本酵素はコンドロイチン硫酸,デルマタン硫酸,ヘパラン硫酸のいずれのプロテオグリカン糖鎖(グリコサミノグリカン)に作用した。その糖鎖長が短いほど活性は高く,グルクロン酸-ガラクトースーガラクトースーキシロースの4糖で最大であった。至適PH6.0,至適温度60°Cであった。本酵素はキシラン結合領域と触媒ドメインからなるが,キシラン結合領域の欠失型は野生型に比較して活性が高く,本酵素が作用するとき,キシロースが触媒部位ではなくキシラン結合部位に結合するため作用しにくいためと予想された。更に本酵素の糖転移活性を解析したところ,エンド-β-キシロシダーゼ同様に糖転移活性が存在していた。2.グリコサミノグリカンの糖鎖工学的研究のため,グリコサミノグリカンおよびそのオリゴ糖の大量精製を行った。最初に,臓器(クジラ軟骨,サケ鼻軟骨)からの抽出には酢酸が迅速かつ簡便であることを見出した。抽出したブロテオグリカンをプロテアーゼとキシラナーゼで消化し,グリコサミノグリカンを完全な形で遊離させた。一部はウシ精巣ヒアルロニダーゼで消化してオリゴ糖にした。何れもカラムクロマトグラフィー,HPLCで精製した。その結果,一回の実験室レベルの精製過程で数オーダーの完全長グリコサミノグリカンと数百ミリグラムオーダーのオリゴ糖が精製可能であった。以上の酵素および糖鎖,オリゴ糖の大量精製から容易に人工プロテオグリカンの合成が可能になり,将来的に組織再生,アンチエイジングあるいは各種疾患創薬への適用の可能性が期待された。1)デコリン糖鎖(グリコサミノグリカン)部分のオーダーメイド合成(1)糖鎖をタンパク質に導入するためには、糖鎖キャリヤーとしてタンパク質と糖鎖の橋渡し構造を持つ特別のオリゴ糖が必要である。そこで、培養ヒト皮膚線維芽細胞の培地にキシロシル-4-メチルウンベリフェロンを添加し、これをプライマーとして伸長するオリゴ糖をキャリヤーとして大量調製した。(2)キャリヤーを土台に、申請者が開発したグリコサミノグリカン糖鎖のオーダーメイド合成を行い、各種天然型グリコサミノグリカン糖鎖を数種類作製した。2)リコンビナントデコリンのコアタンパク質部分の調製(1)デコリン遺伝子cDNAの調製培養ヒト皮膚線維芽細胞からmRNAを抽出し、既報のデコリン遺伝子の塩基配列に基づいたプライマーを使用してPT-PCR法を行い、完全長のデコリン遺伝子cDNAを調製した。(2)デコリンタンパク質の発現単離したデコリン遺伝子cDNAをタンパク質発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入し、コアタンパク質のみを産生させる。これをクロマトグラフィーにより精製し、糖鎖欠損デコリン(コアタンパク質)とした。遺伝子工学的に作られるタンパク質には、その糖鎖が不完全、あるいは欠損しているため、生理活性の発現やタンパク質の安定性に問題のある例が知られている。そこで、我々はプロテオグリカン糖鎖の機能解明を目的に、最も単純なデコリンに着目し、その糖鎖を糖鎖工学的に改変する以下の研究を行った。糖鎖が不完全な場合には、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼを、糖鎖が完全に欠損している場合には、エンド-β-キシロシダーゼを用いて、それらの糖転移活性を利用した。その結果、糖鎖が不完全なヒト黄色靱帯デコリンの糖鎖をヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン4-硫酸、コンドロイチン6-硫酸などに組み換え、あるいは、修復することに成功した。また、培養ヒト皮膚繊維芽細胞由来のmRNAをtemplateにて既存のデコリン塩基配列に基づいたプライマーを使用して、RT-PCR法を行い、完全長のデコリン分子種(デコリンAとデコリンE)cDNAを調製した。調製したcDNAをタンパク質発現ベクター(pBAD/TOPO Thio fusion(Invitrogen))に組み込み、大腸菌に導入し、コアタンパク質のみを産生させた(糖鎖欠損デコリン)。さらに、デコリン糖鎖の根元に作用する新たな酵素(Streptomyces olivaceoviridis由来のキシラナーゼリコンビナント体)の開発を行った(特許出願番号PCT/JPO3/15091)。また、プロテオグリカンのグラコーム解析法として、エンド型酵素、蛍光標識、HPLC、LC-MS/MSを組み合わせたプロテオグリカン糖鎖全体の簡便な構造比較法を開発した。本研究により、遺伝子工学的に作られる糖鎖不完全プロテオグリカンリコンビナント体の欠点を補うことが可能となり、さらに、プロテオグリカンの糖鎖と機能を解明する上で有用な情報が得られることも期待される。プロテオグリカンはタンパク質に糖鎖が連結した構造体である。生体内のタンパク質の多くは糖が付加されることにより機能が保てたり、他の酵素から消化されてしまうことを免れたりしている。大腸菌に作らせたリコンビナントタンパク質が糖の付加がないので機能しなかったり、不安定であったりするのは良い例である。我々はこれらの事を踏まえ、生理作用の知られているペプチドにグリコサミノグリカン糖鎖の導入を見据えた実験系の開発を試みた。

グリコサミノグリカン鎖を部分的に酵素で加水分解し、その逆反応にて目的とするタンパク質へオリゴ糖レベルで転移させるのではなく、プロテオグリカンの長い糖鎖を無傷なままダイレクトに転移させるという手法を選択した。この手法は我々が発掘した酵素エンド-β-キシロシダーゼ(セリンと結合しているキシロースのβキシロシド結合のみを特異的に加水分解する酵素)を用いることにより可能となった。アクセプターペプチドとしてはヒドロキシル基を側鎖にもつセリン、トレオニンを含んだ合成ペプチド(Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA)を使用した。次にドナーとしては、エンド-β-キシロシダーゼが作用しやすいようにプロテオグリカンのコアタンパク質をアクチナーゼで処理することにより調製したペプチドコンドロイチン硫酸を使用した。このドナーとアクセプターをエンド-β-キシロシダーゼ存在下にてインキュベートすることにより、アクセプターペプチドへグリコサミノグリカン鎖全体を転移することに成功した。次にこの糖鎖を転移させたペプチドと転移前のペプチドをプロテアーゼの一つである活性化プロテインCに作用させた。すると糖鎖を転移させたペプチドの方が活性化プロテインCに対する抵抗性が生まれ、グリコサミノグリカン鎖導入によるペプチドの安定化を示す事ができた。この結果は、糖鎖の付加を伴わないリコンビナントタンパク質の安定化を目指す場合、一つの有用な手段となり得るであろう。1.エンド-β-キシロシダーゼ活性を有するStreptomyces olivaceoviridisy由来のリコンビナントキシラナーゼを精製し,各種のプロテオグリカンに関する加水分解作用の解明を行った。その結果,本酵素はコンドロイチン硫酸,デルマタン硫酸,ヘパラン硫酸のいずれのプロテオグリカン糖鎖(グリコサミノグリカン)に作用した。その糖鎖長が短いほど活性は高く,グルクロン酸-ガラクトースーガラクトースーキシロースの4糖で最大であった。至適PH6.0,至適温度60°Cであった。本酵素はキシラン結合領域と触媒ドメインからなるが,キシラン結合領域の欠失型は野生型に比較して活性が高く,本酵素が作用するとき,キシロースが触媒部位ではなくキシラン結合部位に結合するため作用しにくいためと予想された。更に本酵素の糖転移活性を解析したところ,エンド-β-キシロシダーゼ同様に糖転移活性が存在していた。2.グリコサミノグリカンの糖鎖工学的研究のため,グリコサミノグリカンおよびそのオリゴ糖の大量精製を行った。最初に,臓器(クジラ軟骨,サケ鼻軟骨)からの抽出には酢酸が迅速かつ簡便であることを見出した。抽出したブロテオグリカンをプロテアーゼとキシラナーゼで消化し,グリコサミノグリカンを完全な形で遊離させた。一部はウシ精巣ヒアルロニダーゼで消化してオリゴ糖にした。何れもカラムクロマトグラフィー,HPLCで精製した。その結果,一回の実験室レベルの精製過程で数オーダーの完全長グリコサミノグリカンと数百ミリグラムオーダーのオリゴ糖が精製可能であった。以上の酵素および糖鎖,オリゴ糖の大量精製から容易に人工プロテオグリカンの合成が可能になり,将来的に組織再生,アンチエイジングあるいは各種疾患創薬への適用の可能性が期待された。
多言語教育プログラムによる児童の言語習得過程とその最適化に関する研究

三年計画の最終年度となる本年度はこれまでの様々な研究が結実した年であった。まずこれまでのビデオやオーディオによる録画・録音データが揃ってきたところで、それらをポルトガル語、英語、日本語のネイティブスピーカーの助けを借りながら詳細にテープ起こしをし、談話分析を試みることができた。その中で少数民族の子供の母語が他の子供にとって大きい言語資源となっていることが明らかになってきた。これはピア(学友)刺激が第二・第三言語使用の触媒となって働いていることを意味している。例えば一つのエピソードとして、ポルトガル語がその日の教育・学習言語となっている場面において、ポルトガル語を母語とする児童が他の児童の発言のモデルとなったり、きっかけを作ったり、足場となって発言を助けたりしている事実が分かった。このことについてはイギリス、リード大学での第36回BAAL学会で発表し、大東文化大学紀要42号に論文発表することができた。またブラジルやアメリカからテキストや教材を多数取り寄せICS(インターナショナル・コミュニティー・スクール)の児童に取り組ませるなかで、多言語リテラシーがどの様に育まれて行くかという過程を観察した。その中で「地球プロジェクト」が考案され、地球をモチーフにした三ヶ国語読み書き学習モデルを提案した。これについては今年のJAPC誌に論文が掲載される。その他、ICS敷地内に外国語子供図書館を設置し外国語の絵本を収集する傍ら、「インターナショナル紙芝居」のボランティア活動も続けて行った。子供達にもコンピューターを用いてオリジナル英語小話のスライドを作成させ、プレゼンテーション活動を行わせた。その成果についてはJALT CALL学会で発表した。三年計画の初年度にあたる本年度は基礎資料収集、教育プログラム構築、そして啓蒙・発表活動を軸とした活動を行った。まず基礎資料収集としては、様々なバイリンガルまたはイマージョン教育実践校の視察を行った。アメリカで7校、沖縄県で2校、静岡県で1校を訪問することができた。多くのインタビューを行うと共にビデオ映像や学校資料などを集めた。また子供達の談話音声データも収集し、文字化作業を進めている。文献・資料研究の面ではバイリンガル教育、日本の言語教育に関する文献を沖縄県教育センターや琉球大学を含め、各所から収集した。教育プログラム構築の面では前橋市のインターナショナル・コミュニティー・スクール(ICS)の教育プログラム開発に大きく関わり、学校運営、カリキュラム、PTA組織、支援体制、教授法、教材研究・開発、FD、教室デザイン、テクノロジー利用、インターンシップ、等の面で様々な提言と実験的実践を行った。組織面では異文化・異言語の人達がNPOを組織する場合の困難さや流動性に対処することが難問であった。また同種の学校の多くが抱えているように教師陣や生徒の定着も流動的な面があり、問題が顕在化した。しかしその中で教師の研修活動、例えばモンテッソーリ教授法研修、を積極的にリードし、補助金によって様々な教材やコンピューターソフトウェアを購入し、教育効果や指導法の実験ができたことは有益であった。また今年度の集大成として20頁のガイドブックを日・英・ポルトガル、3ヶ国語版で発行する事ができた。三年計画の二年目にあたる本年度は様々な面で本研究課題の持つ困難な面が露見した年となったが、幾つかの成果を上げることができた。まず、本研究の対象となるインターナショナル・コミュニティー・スクール(ICS)は講師・ボランティア陣の定着化、生徒の増加、教育プログラムの充実が図られ、3ヶ国語イマージョンプログラムも順調に進むようになって来た。また、引き続き子供達の学習実態を観察、記録して行くことができた。今年度の新しい取り組みとして、「インターナショナル紙芝居」のプロジェクトグループを立ち上げることができた。これは定期的にボランティア研究グループが集まり、良く知られた民話や御伽噺などから国際協調、異文化理解に関連のありそうな物語を選び、その中にしばしば潜んでいるジェンダーの問題、偏見、差別的表現などを検討した後それらを取り除きながら更に異文化的要素を盛り込んでストーリーを練り直し、紙芝居に描いてそれを3ヶ国語で演じるという試みである。ICS内での何度かの上演も好評であり、地域の公民館や図書館でも出前上演をすることによって国際理解をより深めることを目指した。更にそれと平行してコンピュータソフト「キッドピックス」を使い、子供たちに四コマ紙芝居を描いてもらい、スライドショウにして発表してもらう試みを通して第二言語での自己表現力を育成した。この様な試みに関して青山学園大学におけるJACET全国大会でポスター発表を行い、好反響を得た。反面、幾つかの問題点もあった。研究者の健康不良などもあり、計画していた海外の学会発表は実現しなかった。またICSの前橋市から玉村町への移転問題が持ち上がり、様々な面での計画見直しを余儀なくされた。更に研究者間で児童の言語活動を資料として研究に使用する場合の倫理的側面で意見の対立が起り、保護者に理解や承諾を得るための手紙や承諾書の作成、その3ヶ国語への翻訳などに手間取った。また議論の末、若年者の生の言語データを研究に使用するのは避けるべきとの結論に達し、ビデオ映像等の生データは研究に使用できなくなった。こどもを対象にした資料収集の難しさに困惑する一年であった。

これはピア(学友)刺激が第二・第三言語使用の触媒となって働いていることを意味している。例えば一つのエピソードとして、ポルトガル語がその日の教育・学習言語となっている場面において、ポルトガル語を母語とする児童が他の児童の発言のモデルとなったり、きっかけを作ったり、足場となって発言を助けたりしている事実が分かった。このことについてはイギリス、リード大学での第36回BAAL学会で発表し、大東文化大学紀要42号に論文発表することができた。またブラジルやアメリカからテキストや教材を多数取り寄せICS(インターナショナル・コミュニティー・スクール)の児童に取り組ませるなかで、多言語リテラシーがどの様に育まれて行くかという過程を観察した。その中で「地球プロジェクト」が考案され、地球をモチーフにした三ヶ国語読み書き学習モデルを提案した。これについては今年のJAPC誌に論文が掲載される。その他、ICS敷地内に外国語子供図書館を設置し外国語の絵本を収集する傍ら、「インターナショナル紙芝居」のボランティア活動も続けて行った。子供達にもコンピューターを用いてオリジナル英語小話のスライドを作成させ、プレゼンテーション活動を行わせた。その成果についてはJALT CALL学会で発表した。
著作権政策の多国間比較分析―裁判所と制度による政策帰結への影響―

研究期間の初年度にあたる今年度は,主として二つの作業を行った。第一に,応用美術に関する規定の事例分析である。第二に,私的録音録画補償金制度に関する多国間比較分析に向けた準備作業である。以下,二つの作業についてより詳しく述べる。第一の作業においては,政治過程における重要なアクターであるにもかかわらず政策形成過程の参加者としてこれまであまり分析されてこなかった,日本の裁判所に注目した分析を行った。著作権法における応用美術の保護のあり方には大きな問題があることが1970年の著作権法全面改正時から指摘されているが,その後40年間法改正は行われず放置されている。応用美術の保護の程度という政策帰結を制定法だけに注目して捉えると,政策の決定についての重要な権限をもつ文化庁の政策選好とは一致していない。また,決定的な権限をもつ他のアクターが文化庁の政策選好に沿うような法改正に対して強く反対しているわけではない。それゆえ,裁判所による政策帰結への影響にあまり目を向けない従来の政策過程研究の観点からみれば法改正が行われる余地は十分に存在しているのにもかかわらず,実際はそうはなっていないといえる。これに対して報告者は,裁判所の出す判決が蓄積して政策帰結が変化したことに注目し,法改正を行う文化庁等のアクターのインセンティブが変化したために法改正が行われなかったという説明を提示した。この研究成果については,学会において報告用論文および口頭によって報告を行った。第二の作業においては,私的録音録画補償金制度の多国間比較分析の準備段階として,分析対象である4ヵ国(日本,アメリカ,ドイツ,イギリス)の著作権法における私的録音録画をめぐる現状の制度とそこに至る変遷の過程を把握することを試みた。次年度以降の課題は,この制度的差異と変遷に対する有力な説明変数となりうる政治的要因を明らかにすることである。
環境破壊行動をめぐるジレンマ構造の数理社会学的分析

本研究は、環境破壊につながる人々の意識や行動がどのようなメカニズムで成立しているかを解明するために、社会的ジレンマ・モデルに基づいた数理社会学的分析をおこなった。本研究ではそのさい、環境破壊行動をもたらすジレンマ構造と個々人の環境問題に関する意識や認知といった変数との関連に着目し、地域的な事例から得られるデータをもとに計量分析を行った。すなわち具体的には、東北大学生活環境研究会(代表:海野道郎教授)の協力を得て、仙台市民に対して行ったゴミ問題に関する三つの意識調査(『生活環境(ごみ等)に関する仙台市民意識調査』(1989年)、『暮らしとごみに関する市民意識調査』(1991年)、『生活と環境に関する仙台市民意識調査』(1993年))のデータをもとに、仙台市の地域特性・生活環境・産業構造などに関する基礎的資料などから得られるデータを併せつつ、ジレンマ構造の数理モデルに基づいた計量分析のモデルを設計し、それに基づいた分析を行った。その結果として、ジレンマ構造を制御するために重要な諸要因として、環境問題に関する規範的意識、環境保護に関する重要性や利害の認知、環境問題に関する地域的な取り組み、環境問題に関する地域的な情報ネットワーク、などが析出され、それらの構造的関係も明らかにされた。なお、この研究の成果の報告については、現在学術論文としてまとめている段階であり、1995年中に公表する予定である。
浅海由来生物のエラから探るイプシロンプロテオバクテリア綱細菌の分布と機能

無脊椎動物のエラという環境は,共生細菌の住処といった点で非常に重要な部位である.深海環境では一部のプロテオバクテリア門細菌が宿主と共生関係にあることが報告されているが,浅海域における無脊椎動物のエラに生息する共生細菌群は,二枚貝から検出されているガンマプロテオバクテリア綱に留まっている.これまでに我々はメタゲノム解析により,メガイアワビのエラDNAより新規イプシロン(ε-)プロテオバクテリア綱細菌(既存種の16S rDNAと89%の相同性)が全細菌リードのうち,約40%を占めることを発見した.そこで,本細菌も深海環境の生物と同様に宿主と共生関係にあると予測し,まずは本細菌の生息環境を探索することを昨年度の目的として,以下の研究を行った.今後本細菌の単離またはFISH法による定着部位を明らかにする際に,本細菌の簡易的な検出方法または特異Probeが必要となる.そこで,本細菌の存在が明らかになっているDNAより本細菌の16S rDNAの全長を取得し,その情報から特異Primerを作製した.次に上記の特異Primerを用いて,浅海域に生息している巻貝のメガイアワビ,クロアワビ,トコブシ,サザエ,ミヤコドリガイ,二枚貝のオキシジミ,ハマグリのそれぞれエラ部位,また対照サンプルとして,7日間海水中に沈めたスポンジ,海水,小石より本細菌の検出を行った.さらにNGSを用いた細菌叢解析により各種環境の細菌叢全体の把握を試みた.特異Primerによる検出の結果,本細菌はメガイアワビおよびオキシジミより検出された.また細菌叢解析の結果,オキシジミからは検出された全リード中,本細菌はわずか0.45%しか検出されなかったが,メガイアワビでは最大53.9%も占めており,本細菌は宿主間でも非常に近縁であるクロアワビやトコブシには存在せず,メガイアワビにおいてのみ優占していることが明らかとなった.昨年度の交付申請書では,本細菌の特異Primerの作製,各種浅海生物のエラを対象とした細菌叢解析およびメタゲノム解析を研究計画として報告していた.特異Primerの作製および本細菌の生息環境の探索に関しては上記に記した通り,計画に従って進んでおり,研究成果を4件の学会にて発表し,内マリンバイオテクノロジー学会にて優秀ポスター賞を受賞した.もう一つの研究計画であるメタゲノム解析では,本細菌の代謝機能の予測を行うため,細菌叢解析により本細菌が優位に存在していることが明らかとなっている環境DNAを用いて,2x151 bpの条件でIllumina社のHiSeq Xに供し,環境DNA中の遺伝子配列を網羅的にシーケンシングした.得られた塩基配列情報をMegahitによるアセンブルに供したものの,当初予想していたよりもシーケンス効率が悪く,コンティグの数が多くなったため,新規ε-プロテオバクテリア綱細菌の代謝機能の推定に時間を要している.当初の予定に対して,生息環境の探索に関する研究はおおよそ達成できているものの,代謝機能の推定に関する解析に時間を要していることから,やや遅れていると評価した.昨年度はHiSeqを用いた本細菌の代謝機能の推定の際に,データが断片化してしまい予想していたよりも解析に時間を要していることから,今年度はNanopore社のMinIONを用いて長鎖の塩基配列情報を取得し,昨年度に行ったHiSeqにより得られたシーケンスリードを掛け合わせることにより,未培養である本細菌のゲノム情報をさらに詳細に取得する.またそのゲノム情報を基に,既存のイプシロンプロテオバクテリア綱細菌のゲノムと比較し,深海底由来の種に近いのか,陸生生物由来の種と近い遺伝子配列をもつのかを比較する.これにより,本細菌の宿主との関係性を推定するとともに,既存種と異なる代謝機能を明らかにする.また宿主との相互関係に関する情報の他に,今後本細菌の単離を試みる際に必要となる,栄養要求性に関する代謝機能にも焦点を当て解析を行う.昨年度の研究の結果,本細菌を特異的に検出できる特異Primerの作製に成功した.そこで本年度では,この特異Primerの配列情報を元に特異Probeを作製し,作製した特異Probeがサンプル中の細菌とハイブリダイズされる最適な条件を調べるとともに,作製した特異Probeにより細菌が検出されるかを確認する.上記の試験によりProbeの設計に問題がなければ,以下の試験に進み,標的細菌の検出が困難な場合は再度特異Probeの設計を行う.特異Probeが完成した後,昨年度までにライブラリー化した宿主のエラ組織標本を対象として,超薄切片を作成後,上記の試験において確認した特異Probeおよびハイブリダイズの条件を用いてFISH法を行う.これにより本細菌の定着位置を明らかにする.無脊椎動物のエラという環境は,共生細菌の住処といった点で非常に重要な部位である.深海環境では一部のプロテオバクテリア門細菌が宿主と共生関係にあることが報告されているが,浅海域における無脊椎動物のエラに生息する共生細菌群は,二枚貝から検出されているガンマプロテオバクテリア綱に留まっている.これまでに我々はメタゲノム解析により,メガイアワビのエラDNAより新規イプシロン(ε-)プロテオバクテリア綱細菌(既存種の16S rDNAと89%の相同性)が全細菌リードのうち,約40%を占めることを発見した.そこで,本細菌も深海環境の生物と同様に宿主と共生関係にあると予測し,まずは本細菌の生息環境を探索することを昨年度の目的として,以下の研究を行った.今後本細菌の単離またはFISH法による定着部位を明らかにする際に,本細菌の簡易的な検出方法または特異Probeが必要となる.

そこで,本細菌の存在が明らかになっているDNAより本細菌の16S rDNAの全長を取得し,その情報から特異Primerを作製した.次に上記の特異Primerを用いて,浅海域に生息している巻貝のメガイアワビ,クロアワビ,トコブシ,サザエ,ミヤコドリガイ,二枚貝のオキシジミ,ハマグリのそれぞれエラ部位,また対照サンプルとして,7日間海水中に沈めたスポンジ,海水,小石より本細菌の検出を行った.さらにNGSを用いた細菌叢解析により各種環境の細菌叢全体の把握を試みた.特異Primerによる検出の結果,本細菌はメガイアワビおよびオキシジミより検出された.また細菌叢解析の結果,オキシジミからは検出された全リード中,本細菌はわずか0.45%しか検出されなかったが,メガイアワビでは最大53.9%も占めており,本細菌は宿主間でも非常に近縁であるクロアワビやトコブシには存在せず,メガイアワビにおいてのみ優占していることが明らかとなった.昨年度の交付申請書では,本細菌の特異Primerの作製,各種浅海生物のエラを対象とした細菌叢解析およびメタゲノム解析を研究計画として報告していた.特異Primerの作製および本細菌の生息環境の探索に関しては上記に記した通り,計画に従って進んでおり,研究成果を4件の学会にて発表し,内マリンバイオテクノロジー学会にて優秀ポスター賞を受賞した.もう一つの研究計画であるメタゲノム解析では,本細菌の代謝機能の予測を行うため,細菌叢解析により本細菌が優位に存在していることが明らかとなっている環境DNAを用いて,2x151 bpの条件でIllumina社のHiSeq Xに供し,環境DNA中の遺伝子配列を網羅的にシーケンシングした.得られた塩基配列情報をMegahitによるアセンブルに供したものの,当初予想していたよりもシーケンス効率が悪く,コンティグの数が多くなったため,新規ε-プロテオバクテリア綱細菌の代謝機能の推定に時間を要している.当初の予定に対して,生息環境の探索に関する研究はおおよそ達成できているものの,代謝機能の推定に関する解析に時間を要していることから,やや遅れていると評価した.昨年度はHiSeqを用いた本細菌の代謝機能の推定の際に,データが断片化してしまい予想していたよりも解析に時間を要していることから,今年度はNanopore社のMinIONを用いて長鎖の塩基配列情報を取得し,昨年度に行ったHiSeqにより得られたシーケンスリードを掛け合わせることにより,未培養である本細菌のゲノム情報をさらに詳細に取得する.またそのゲノム情報を基に,既存のイプシロンプロテオバクテリア綱細菌のゲノムと比較し,深海底由来の種に近いのか,陸生生物由来の種と近い遺伝子配列をもつのかを比較する.これにより,本細菌の宿主との関係性を推定するとともに,既存種と異なる代謝機能を明らかにする.また宿主との相互関係に関する情報の他に,今後本細菌の単離を試みる際に必要となる,栄養要求性に関する代謝機能にも焦点を当て解析を行う.昨年度の研究の結果,本細菌を特異的に検出できる特異Primerの作製に成功した.そこで本年度では,この特異Primerの配列情報を元に特異Probeを作製し,作製した特異Probeがサンプル中の細菌とハイブリダイズされる最適な条件を調べるとともに,作製した特異Probeにより細菌が検出されるかを確認する.
天然ガスの改質による高速水素製造触媒の開発

天然ガスの接触改質による水素の製造を極めて高速に行うための新しい触媒の開発と、それをより有効に作動させる反応器システムについて研究した。現在工業的に行われている飽和炭化水素の水蒸気改質による水素製造には、あえてシンタリングにより安定化させた担持ニッケル触媒が、900°C付近の高温で用いられているが、このような条件では炭素の析出が起こり触媒が劣化する。これを防ぐため過剰の水蒸気が供給されるが、このことがプロセスのエネルギー収支を悪化させている。これらの問題点を克服するため、本研究では、触媒表面における水素の表面移動が極めて速やかとなる構造配置として、ニッケルを主成分として、これに小量のセリウム酸化物と微量の白金を組み合わせた上、さらに極微量のロジウムを配した四元組成の触媒を、セラミック繊維の不繊布をアルミナで被覆した担体に担持した新触媒を開発して適用した。この触媒は、メタンの水蒸気改質、二酸化炭素改質、水蒸気・二酸化炭素共改質に極めて高活性であるばかりか、メタンの触媒燃焼にも高い活性をもつため、従来の反応温度よりも200300°C低温域で、供給メタンの一部を触媒燃焼させて、その大きな発熱を触媒層でその場(オンサイト)供給することによって、改質反応の大きな吸熱を補償させ、生成した水と二酸化炭素はさらに改質反応させる方式が実現し、ガス空間速度毎時73万,接触時間5ミリ-秒という極めて高い流通速度条件下で、メタンの平衡転化率において、水素と一酸化炭素を、触媒1リットル1時間当たりの収量(空時収量)約3000モルという拡散の限界値に匹敵する高速合成を実現した。
細胞性粘菌のアクチン結合タンパク質コフィリンの機能解析

細胞性粘菌をもちいてコフィリンの機能解析を行っている。前年度において、試験管の中でコフィリンがアクチン繊維を切断することによりアクチンの網状構造体を束状構造体に変換しうることを示した。さらに、細胞性粘菌においてコフィリンを大量に発現すると、アクチン繊維の束化が促進され、また、細胞の運動が約2倍ほどに促進されることを示した。細胞性粘菌の細胞内において、コフィリンの下流でおこるこの2つの現象の因果関係を明らかにすることがコフィリンの役割の1つを明らかにすることである。その第一歩として本年度は間接蛍光抗体法ならびにGFPコフィリン発現法により、細胞内におけるコフィリンの局在についての詳細な検討を行った。餌に接触した粘菌細胞は、接触刺激に誘発されて貧食口を餌の周囲に発達させる。この反応において、コフィリンは貧食口の餌との接触面に形成されるアクチン束に結合していた。餌に遭遇していない細胞においても、粘菌細胞は王冠状構造を延ばしたり縮めたりしている。コフィリンは、この王冠状突起構造が伸長した後に収縮する直前に、王冠の辺縁部に形成されるアクチン束に一過性に結合していた。また、粘菌細胞をDMSOで処理すると、細胞表面に発達していた突起状構造体が全て細胞体に収縮する。コフィリンはこのときに細胞膜直下に一過性に形成されるアクチン束に結合していた。これらのアクチン束はすべて、細胞の激しく運動する場所において収縮力を発生するための構造であると考えられる。以上の観察結果は、コフィリンが収縮性アクチン束の形成を促進することによって、細胞運動に必要な力を発生させている可能性を支持している。
過小グラフトを用いた成人生体肝移植の安全性向上に関する研究

本研究の目的は、過小グラフト成人生体肝移植に対して新しいドナー適応基準を構築することである。我々は移植後の肝再生過程における肝静脈の3次元的変化に着目し、変化に対応した新しい肝静脈再建法を考案した。これにより、肝移植適応外とみなされていた患者に安全な肝移植を与えるだけでなく、ドナーの安全性を高める可能性を示しており、意義ある研究成果を得られたと考えられる。本研究の目的は、過小グラフト成人生体肝移植に対して現在我々が行っているInflowの軽減とOutflowの増加を目的とした新しい手術法における術後グラフト肝機能を評価し、より安全な手術法、周術期管理法を確立し、新しいドナー適応基準を構築することである。成人生体肝移植における肝静脈再建法はこれまで静脈口径の開大の重要性のみが強調されていたが、我々は移植後の肝再生過程における肝静脈の3次元的変化に着目し、変化に対応した新しい肝静脈再建法を考案した。本年は2006年より行っているこの術式の工夫と術後成績の向上を国内外の学会にて報告した。これらのデータは現在論文投稿中である。また、肝静脈再建の工夫により術後肝機能の向上がみられていることをふまえ、肝グラフトの適応基準をグラフト体重比0.8以上から0.7以上に拡大している。この適応拡大により、全体の11%にしかすぎなかった左葉グラフト肝移植が2006年以降、65%に増加した。左葉グラフト肝移植は、右葉グラフト肝移植に比べ有意にグラフト体重比が小さいにもかかわらず、上記の適応基準内では、術後肝機能変化、術後合併症、入院日数は両者に差を認めないことが本年の解析により証明された。このことは、これまでの基準では十分なグラフト容量をもつドナー不在のため、肝移植適応外とみなされていた患者に安全な肝移植をうけるチャンスを与えるだけでなく、右葉グラフトより少ない合併症率であることが報告されている左葉グラフトの使用を増加させ、ドナーの安全性を高める可能性を示しており、意義ある研究成果であると考えられた。この結果は、フランス韓国で行われた国際学会にて報告された。これらの成果は今後症例を増やし、術後肝機能変化の詳細な検討を加え、論文投稿予定である。この適応拡大により、全体の11%に過ぎなかった左葉グラフト肝移植が2006年以降、65%に増加した。左葉グラフト肝移植は、右葉グラフト肝移植に比べ有意にグラフト体重が小さいにもかかわらず、上記の適応基準内では、術後肝機能変化、術後合併症、入院日数は両者に差を認められない事が本年の解析により確実なものとなった。これらの成果から、来年度も症例を増やし、術後肝機能変化の詳細な検討を加えていきたいと思っている。左葉グラフト肝移植は、右葉グラフト肝移植に比べ有意にグラフト体重が小さいにもかかわらず、上記の適応基準内では、術後肝機能変化、術後合併症、入院日数は両者に差を認められない事が本研究の解析により確実なものとなった。

このことは、これまで基準では十分なグラフト容量をもつドナー不在のため、肝移植適応外とみなされていた患者に安全な肝移植をうけるチャンスを与えるだけでなく、右葉グラフトより少ない合併症率であることが報告されている左葉グラフトの使用を増加させ、またドナーの安全性を高める可能性を示しており、意義ある研究成果を得られたと考えられる。
昆虫の抗菌性蛋白を利用した耐病性transgenic植物の作製

有用な遺伝子を導入して植物の種を改良する試みは,国の内外を問わず広く行なわれつつある。本研究は,センチニクバエというハエの産生する抗菌性蛋白のcDNAを植物に導入し,バクテリアやカビに対する抵抗性を賦与した植物体の作出を試みようとしたものである。センチニクバエの抗菌性蛋白としては,ザルコトキシンI,IIというグラム陰性菌に対して有効な蛋白を取り上げた。これらの蛋白に対するcDNAのクロ-ニングはすでに行なわれていた。また,本研究の過程で,同じセンチニクバエから,Candidaや酵母等に殺菌的に働く蛋白が精製され,そのcDNAが軍離されたので,このcDNAも用いることにした。まず,ザルコトキシンIのcDNAをプラスミドpGA643のマルチクロ-ニングサイトに組みこみ,Agrobacterium LBA 4404に導入してタバコに感染させた。このタバコの葉の細胞からカナマイシン耐性のカルスを分化させて植物体を得た。この組み替えDNAは,カリフラワ-モザイクウイルスの35S RNAプロモ-タ-を利用してザルコトキシンIを発現するように構築してある。このようにして育てた植物体からRNAを抽出し,ザルコトキシンIのmRNAが存在するかどうかをNorthern法により解析した。その結果,予想されたサイズのmRNAの存在が確認された。次に,この植物体の粗抽出液中に抗菌活性が認められるかどうか,大腸菌に対する抗菌活性を調べたところ全く認められなかった。そこで,この抽出液中にザルコトキシンIが存在するかどうか,イムノアッセイで検定したところ,蛋白の存在は確認できなかった。この結果は,mRNAは存在するものの,蛋白にまで翻訳されていない可能性を示唆する。全く同様の結果がザルコトキシンIIについても得られている。今後の課題として,植物細胞中で何故昆虫のmRNAが翻訳されないのか,検討する必要がある。この研究は、センチニクバエの抗菌蛋白のcDNAを植物遺伝子の中に導入し、発現させることにより、耐病性の植物を作ることを目的とする。センチニクバエの抗菌蛋白は、ザルコトキシンI,II,IIIおよびザ-ペシンという4種類の蛋白が知られている。この中、ザルコトキシンは主としてグラム陰性菌に、またザ-ペシンは主としてグラム陽性菌に対して至死的に作用する。本研究ではまず、すでに単離されている、ザルコトキシンIAのcDNAをタバコに導入し、transgenicな植物体をつくることを目的とした。簡単に記すと、ザルコトキシンIAのcDNAをプラスミドpGA643につなぎ、T-DNA欠失のAgrobacteriumをつかってタバコ葉ディスクに感染させた。次にこのディスクをカナマイシン入りの培地で選別し、耐性株を分離しカルスとする。これを茎葉分化培地で培養し植物体を育てる。このような方法でいくつかのカナマイシン耐性の株化植物を取得した。ついで、各植物からRNAを抽出し、ザルコトキシンIAのcDNAをプロ-ブとして、新しく導入したザルコトキシンIAcDNAが転写されているかどうかを、ノ-ザンブロット法により解析した。その結果、単離した8株の形質転換体の中6株に、ハイブリダイゼイション陽性のバンドが見られ、RNAの大きさはいずれも、0.60.7kbと推定された。この中、185-1、185-5の2株は、かなり強いシグナルが出ており、ザルコトキシンIAcDNAが、植物体の中で転写されていることがわかった。そこで、このmRNAが翻訳されてザルコトキシンIAが植物体の中に存在するかどうかを、ラジオイムノアシセイ法により検定した。

しかし、6株の植物体ともに、ザルコトキシンIAは検出されなかった。可能性として、プラスミドの構築過程でフレイムがずれたことが考えられ、現在植物体からDNAを回収し、塩基配列を分析している。この研究は,センチニクバエの抗菌性蛋白のcDNAを植物遺伝子の中に導入し、発現させることにより,微生物の感染に抵抗性の植物を作出することを目的としている。センチニクバエの抗菌性蛋白には,ザルコトキシン群に代表される,グラム陰性菌に対して致死的に作用する蛋白と,ザ-ペシンと命名された,グラム陽性菌に対して致死的に作用する蛋白があり,これらの蛋白に対するcDNAがクロ-ニングされている。これらのcDNAの中,ザルコトキシンIAおよびIIAのcDNAをタバコに導入する実験を試みているが,昨年度の実績概要に書いたとうり,mRNAは検出されるものの,蛋白を検出することが出来なかった。本年度は,この研究を継続した結果,ザルコトキシンIAの抗体と交叉する蛋白の発現を認めた。しかし,まだシグナルが弱く,本当にザルコトキシンIAの蛋白があるのかどうかという点について,もう少しくわしく検討する必要がある。従って、このラインの研究は継続して実施する予定である。一方,センチニクバエの幼虫の体液の中に,新しく抗真菌活性を示す蛋白の存在を認めたので,この蛋白の精製とその性質の検討を行なった。植物の病原菌としては,バクテリアよりも真菌類の方が重要であり,抗真菌性蛋白が確認されれば,本研究の重要性が増すことになる。ヒトのカンジダ症の原因となるカンジダアルビカンスに対する致死活性を指標に精製を進め,単一蛋白として純化することが出来た。この蛋白のアミノ酸分析を行なった結果,含まれるアミノ酸は13種類しかなく,アミノ酸組成に片寄りのある蛋白であることがわかった。また,最近になって,この蛋白のcDNAの単離に成功し,完全なアミノ酸配列が決定できた。それによるとこの蛋白は67個のアミノ酸から出来ており,グリシンとレスチジンに富んでいる。次年度はこの蛋白の植物病原菌(真菌)に対する有効性を追求する予定である。この研究は、センチニクバエの産生する抗菌性蛋白のCDNAをタバコに組みこみ、耐病性の植物の作出を試みようとするものである。本年度は、まず昨年度単離した、抗真菌性蛋白の性質を検討した。植物の病原菌としては、バクテリアよりも真菌の方が重要で、真菌に有効な蛋白があればその利用価値はきわめて高い。センチニクバエの抗真菌性蛋白の性質の中、次の三点は注目すべきものであった。第一に、この蛋白は、抗菌性蛋白ザルコトキシンIの共存下に、きわめて強い抗真菌活性を示すことがあげられる。この事実は、この蛋白とザルコトキシンIを同時に発現させることにより、きわめて強い防御システムを構築できる可能性を示している。第二に、この蛋白の植物細胞に対する毒性は殆んど認められないことである。これは、植物中に発現させる場合重要な性質である。第三に、この蛋白は、カンジダアルビカンスだけでなく、酵母類に対しても有効である。このことは、この蛋白の抗菌スペクトルがかなり広いことを示唆している。
第２級アルキルボランを用いた高選択的炭素－炭素結合形成反応の開発

本研究の最重要課題である「第2級アルキルボランの利用」を試みた。シクロプロパン骨格は医薬品などに広く見られ、また特異な反応性を示す。そのため、シクロプロパン化合物の効率的な合成法の開発が望まれる。本研究では、有機ホウ素化合物を利用したエナンチオ選択的なキラルアリルシクロプロパンの合成法の開発を目指した。初期検討として、市販のシクロプロピルホウ酸エステルの利用を検討した。カップリング反応は進行せず、未反応の基質が観測されるのみであった。ホウ素/銅の金属交換反応に着目し、よりLewis酸性の高いトリアルキルホウ素化合物の利用を試みた。調製の簡便性を考慮し、系中にてシクロプロピルボランを発生させる手法を検討した。つまり、取り扱いの容易な臭化プロパルギルに対して、2段階ヒドロホウ素化の後、当量の塩基と反応させることでシクロプロピルボランを調製し、その利用を検討した。結果、2段階ヒドロホウ素化により得られる1,1-ジボリルアルカンを、塩基および銅触媒存在下、リン酸アリル基質と反応させることで、完璧な位置選択性・高いエナンチオ選択性を伴ってカップリング反応が進行することを見出した。本手法により、入手容易な臭化プロパルギルから単離精製することなく、アリル求電子剤にシクロプロパン環をエナンチオ選択的に導入可能である。本反応は、有機ホウ素化合物を利用した触媒的不斉アリル化反応によりシクロプロピル基を導入した初めての例である。本反応において、系中にてシクロプロピルホウ素化合物が生じていると考えられる。つまり、第2級アルキルホウ素化合物とアリル求電子剤の反応が銅触媒存在下、位置選択的かつエナンチオ選択的に進行しているといえる。本研究では、かさの小さなシクロプロピル基の導入に限定されているが、今後かさの大きなアルキル基を多種多様に利用することができれば、合成化学の発展に大きく貢献する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アリルホウ酸エステルを求核剤に用いた高選択的銅触媒不斉アリルーアリルカップリング反応を開発した。第2級アルキルボランの不斉アリル系カップリングの開発にあたり、高反応性のアリルホウ素化合物を用いて予備的検討を行った。その結果、銅(I)/キラルN-ヘテロサイクリックカルベン(NHC)錯体触媒存在下、中程度のエナンチオ選択性で反応が進行することを確認していた。そこで、さらなるエナンチオ選択性の向上を目指し、キラルNHC配位子の設計合成を行った。その結果、独自に開発したフェノール性水酸基を有するキラルNHC-銅(I)錯体触媒を用いることで、アリルホウ酸エステルのアリル位置換反応が高いエナンチオ選択性で進行することを見出した。アリルホウ酸エステルと第1級リン酸アリルのカップリング反応が、触媒量のCuCl (10 mol%)、フェノール性水酸基置換型キラルN-ヘテロ環カルベン前駆体(10 mol%)、1.2当量のMeOK存在下、THF溶媒中-40°Cの条件において、優れた位置(分岐)選択性およびエナンチオ選択性で進行した。本触媒反応により、アリル/ホモアリル位に不斉sp3炭素中心を構築することができる。本反応は高い官能基許容性を有しており、エステルやブロマイド、アミンなどを含む様々なリン酸アリル基質との反応が高選択的に進行する。また塩基性条件下において比較的不安定なトシル保護されたものも用いることができる。本手法により、多様なキラル1,5-ジエン誘導体が合成可能となった。申請当初、予備的知見として検討していたものが、その内容が有機合成化学において重要であることが文献調査によりわかった。そして、その成果を学術論文という形にしてAngewante Chemie Interanational Edition誌に公表することができた。それに伴って、学会にてポスター発表を実施することができ、優秀ポスター賞にも選出された。これらより、本研究が第3者により高く評価されたと言える。その過程で有機ホウ素化合物を用いた銅触媒アリル位置換反応における立体化学の知見が得られた。この知見をもとに今後、より挑戦的な課題への取り組みが期待出来る。具体的には、連続不斉炭素中心を含む複雑系骨格化合物の一挙合成や、立体的要因により合成が難しいとされる第4級不斉炭素中心の構築への展開を想定している。これら反応の開発に成功した暁には、当初予定していた通り、よりかさ高い第2級アルキルホウ素反応剤を用いた、エナンチオ選択的アリル位置換反応へと展開していくことが可能となる。また、見出した反応により合成可能なカップリング体を、さらに変換することで既知化合物に誘導することができる。これにより形式全合成を行うことで、開発した反応の価値を高めることができる。以上のように、今後さらなる展開が期待される新たな銅触媒不斉アリル位置換反応の開発に成功した。これは有機合成化学に貢献できたと言えるので、「おおむね順調に進展している」と言える。昨年度、独自に開発したフェノール性水酸基を有するキラルN-ヘテロサイクリックカルベン(NHC)-銅(I)錯体触媒を利用することで、アリルホウ酸エステルを用いたエナンチオ選択的アリルーアリルクロスカップリング反応が進行することを見出した。

利用したキラルNHC配位子の側鎖に位置する水酸基が効果的に機能することで、本反応は優れた位置およびエナンチオ選択性で進行する。本手法は、有機ホウ素化合物を用いているため官能基許容性に優れており、多種多様なキラル1,5-ジエンを供給することができる。本年度はまず、本反応の反応条件をより精査した。具体的には、銅塩や溶媒を検討することで最適条件を定めた。その最適条件下、基質一般性の調査を行なった結果、光学活性なアリル基質を用いることで、連続不斉炭素中心を有するキラル1,5-ジエンを合成できた。また、グラムスケールにおいても本反応が高効率に進行することを見出した。さらに以前の知見と合わせて、立体化学に関する考察を行い本反応における詳細なエナンチオモデルを提唱した。現在これらの知見を基に、他の有機ホウ素化合物を用いた銅触媒不斉アリル位置換反応における独自開発したキラルNHC配位子の有効性を検討している。具体的には、アリルホウ酸エステルの代わりにアレニルホウ酸エステルを用いることで、アリル求電子剤とのクロスカップリング反応がエナンチオ選択的に進行することを見出した。本反応は、上述の反応同様、優れた官能基許容性を示し、様々なカップリング体を供給できる。有機ホウ素化合物としてアレニルホウ素化合物だけでなく、ジボロンやシリルボランを用いることも可能である。つまり、キラルNHC-銅(I)錯体触媒を用いることで、アリル位ホウ素化およびアリル位シリル化がエナンチオ選択的に進行することがわかっている。第2級アルキルホウ素化合物を用いた触媒的不斉合成に取り組むにあたり、予備的に調査したアリルホウ素化合物を用いた銅触媒アリル化反応において新たな触媒の創出に至った。本触媒に関して、第2級アルキルホウ素化合物の反応に限らず、多くの反応への適応が期待できるため、十分な成果であると言える。そのため、これを利用した新たな反応性の調査は必須課題であると考えている。これを考慮すると、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。今後、本配位子に関する知見を利用することで、予定していた第2級アルキルホウ素化合物の銅触媒不斉アリル位アルキル化反応の開発に着手する。本研究の最重要課題である「第2級アルキルボランの利用」を試みた。シクロプロパン骨格は医薬品などに広く見られ、また特異な反応性を示す。そのため、シクロプロパン化合物の効率的な合成法の開発が望まれる。本研究では、有機ホウ素化合物を利用したエナンチオ選択的なキラルアリルシクロプロパンの合成法の開発を目指した。初期検討として、市販のシクロプロピルホウ酸エステルの利用を検討した。カップリング反応は進行せず、未反応の基質が観測されるのみであった。ホウ素/銅の金属交換反応に着目し、よりLewis酸性の高いトリアルキルホウ素化合物の利用を試みた。調製の簡便性を考慮し、系中にてシクロプロピルボランを発生させる手法を検討した。つまり、取り扱いの容易な臭化プロパルギルに対して、2段階ヒドロホウ素化の後、当量の塩基と反応させることでシクロプロピルボランを調製し、その利用を検討した。結果、2段階ヒドロホウ素化により得られる1,1-ジボリルアルカンを、塩基および銅触媒存在下、リン酸アリル基質と反応させることで、完璧な位置選択性・高いエナンチオ選択性を伴ってカップリング反応が進行することを見出した。