hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境汚染物質により誘起される生体内フリーラジカル反応の無侵襲測定法による研究

我々をとりまく環境には、生体にとって有害な発癌物質及びその前駆体がいたる所に存在している。これらの物質は、存在する環境条件によって生体に対してさまざまな化学反応を引き起こす可能性がある。本研究では、環境汚染物質であり、また、発癌物質でもあるニトロソ化合物を取り上げ、このニトロソ化合物が生物体内に混入した際に生体内で誘起されるフリーラジカル反応の基礎的解析を、無侵襲の測定手段であるin vivo ESR法を用いて行った。(1)無侵襲in vivoESR装置の開発:ラットまでの小動物を測定しうるin vivo ESR用のキャビティーを開発した。このキャビティーは、誘起されるマイクロ波の電場成分が試料を横切らない構造になっており、誘電損失をできる限り押さえることができたため、従来のキャビティーに比し感度を10倍程度上げることができた。(2)ニトロソ化合物が生体内で誘起するフリーラジカル:マウスの皮膚及び体内にニトロソ化合物を投与し、上記のin vivo ESR装置を用いて誘起されるフリーラジカルの観測を試みた。代表的なニトロソ化合物であり発癌物質であるニトロソベンゼンとニトロソトルエンを用いたところ、ニトロキシドラジカルに由来するESRスペクトルの観測に成功した。これは、薬物が原因で生体内で生成したフリーラジカル種を無侵襲で測定した世界で最初の快挙であった。このフリーラジカル種がどのような構造のラジカルに由来するのか、in vitro系での基礎研究を行ったところ、まず生体内でニトロソ化合物からハイドロナイトロオキシドラジカルが生成され、このラジカルが体内の不飽和脂肪酸と反応して新たなラジカル種が生成したことを明らかにすることができた。今後は、この不飽和脂肪酸に結合したラジカル種が、生体内でどのような反応に関与していくのか、検討していくつもりである。
小胞体ストレスによるプレセニリン蛋白質の成熟制御機構の解明

【目的】小胞体ストレスは虚血、蛋白の糖鎖結合障害、小胞体内カルシウム濃度低下などにより起る現象で、misfoldingを起こした蛋白を除くためにBiPなどの小胞体シャペロンの誘導、さらに、小胞体の機能破綻によりアポトーシスが誘導される。小胞体に存在し、アルツハイマー病の原因として重要なプレセニリンは、それ自身限定分解(N-末断片、C-末断片)後に両断片が複合体を形成し、活性型となる。そこで、ツニカマイシンをマウス腹腔内に投与後96時間の時点で、腎臓でのプレセニリン-1のプロセッシング(成熟)を検討した。明らかに小胞体ストレスが起こり(BiP蛋白の増加)、投与前にはごく少量であったプレセニリン-1の断片の増加を認めた。すなわち、本研究は、小胞体での蛋白質品質管理機構によるプレセニリン成熟の制御機構の解明を目的とし、さらに、アルツハイマー病の神経細胞死の機構を解明する。【研究実績】1.小胞体ストレス刺激によるプレセニリン-1の発現調節:HEK293細胞およびマウス初代神経培養細胞への小胞体ストレス刺激にて、蛋白レベルでプレセニリン-1のN末断片および全長蛋白質の増加を認めた。2.小胞体ストレスシグナルによるプレセニリン-1の発現調節機構:小胞体ストレス刺激にて活性化される転写因子(ATF6およびATF4)をHEK293細胞に遺伝子導入し、プレセニリン-1のmRNAの変化を検討した。これら転写因子がプレセニリン-1の発現調節機構に関与する知見を得た。3.小胞体ストレスによるカスペース活性化機構:小胞体ストレス刺激によるプレセニリン-1(全長)の発現により、カスペース-12の凝集さらに活性化を誘導する機構を解明した。すなわち、本研究は、小胞体での蛋白質品質管理機構によるプレセニリン成熟の制御機構の解明を目的としている。【研究実績】1.培養細胞による小胞体ストレス後のプレセニリン-1の変化:ニューロブラストーマ(SH-SY5Y)細胞に小胞体ストレスを誘導するツニカマイシンを投与すると、プレセニリン-1のN末断片の増加を認めた。末梢組織(腎臓)のみならず神経細胞にも同様な機序によるプレセニリンの制御機構の存在が示唆された。2.小胞体ストレスによるγ-セクレターゼ複合体蛋白質への影響をNicastrin、PEN-2およびAph-1の発現量の変化にて検討した。:ニューロブラストーマ(SH-SY5Y)細胞、マウス初代神経培養細胞、腎臓にて、小胞体ストレス後早期に、PEN-2の発現量の増加を認めた。3.RNA干渉法による検討:小胞体からの蛋白質分解に関与するERAD構成蛋白質のHrdlのsiRNAレトロウイルスを樹立した。
子どもの虐待が脳発達に及ぼす影響についての形態学的、エピジェネティックな検討

虐待死亡例のDNAメチル化が異常なDNAメチル化の増加であるか否かを判断するために、発育や加齢に伴うDNAメチル化の程度を調べる必要性が生じ、Pyrosequencing法により加齢に伴うDNAメチル化の程度を調査し、虐待死亡例におけるDNAメチル化のと比較することで正確な検討が可能となった。子どもの虐待死亡事件で法医解剖に供されたご遺体の脳について、REELIN,PP1等の遺伝子のプロモーターのメチル化の程度を調べ、虐待による遺伝子発現への影響を調べた。対照群は突然死した事例の脳を用いた。1)摘出した脳をフォルマリン固定した。2)前頭葉(前し頭回,中心溝回)などの脳皮質、海馬、小脳からパラフィン包埋切片を作製した。3)各切片からマイクロダイセクション法を用いて、大錐体細胞数百個程度を採取し、DNAを抽出した。4)Bisulfite処理を行い、塩基配列特異的なプライマーを用いて、PCRを行い、PP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域の増幅産物を得た。5)PCR増幅産物の塩基配列を決定し、メチル化されている塩基を決定する(Bisulfite genomic sequencing法)。6)Bisulfite処罪によりシトシンはウラシルに変化するが、メチル化シトシンは変化しないことを利用し、それらを識別できる制限酵素で、5)で得られたPCR増幅産物を消化し、メチル化の程度を推定する(COBRA法)。7)各組織切片から抽出されたDNAをBisulfite処理し、メチル化特異的プライマーや脱メチル化特異的プライマーを用いてPCRを行い、メチル化の程度を推定した(メチル化特異的PCR法)。8)各組織切片から抽出されたDNAをメチル化感受性酵素と非感受性酵素で切断し、塩基配列特異的なプライマーを用いて、PCRを行い、酵素間でのPCR増幅産物量を比較し、メチル化の程度を推定した(メチル化感受性PCR法)。今後は検体数を増やし、検討を進める。本年度は子どもの虐待死亡事件解剖例はなかったため、症例数を増やすことはできなかった。ところで、遺伝子は加齢に伴いDNAメチル化を受けることが明らかとなってきた。そのため、虐待死亡例のDNAメチル化が異常なDNAメチル化の増加であるか否かを判断するために、発育や加齢に伴うDNAメチル化の程度を調べる必要性が生じてきた。収集された試料は0歳から100歳の脳組織であり、解剖時に摘出した脳をホルマリン固定後、前頭葉上前頭回、扁桃体、海馬、小脳からパラフィン包埋切片を作製した。本研究を実行するための準備として、各組織切片からDNAを抽出し、Bisulfite処理を行い、PP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域に対する塩基配列特異的なプライマーを用いてPCRを行い増幅産物を得た。PP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域のメチル化を評価するのに最も適した方法を確立するため、Bisulfite genomic sequencing法、COBRA法、メチル化特異的PCR法、メチル化感受性PCR法、Pyrosequencing法を行い、比較検討したところ、Pyrosequencing法が最も簡便であることが判った。その方法でプロトコールを作成し、対象とする遺伝子数を増やしてゆき、加齢に伴うDNAメチル化の程度を調査することが可能となった。
高齢者における睡眠改善介入プログラムの抑うつ症状及び認知機能への効果

本研究は、睡眠認知行動療法(CBT-I)を用いた教育プログラムの、高齢者の抑うつ及び認知機能への効果を、無作為化比較試験を用いて検証した。介入群とコントロール群において、ピッツバーグ睡眠質問票(PSQI)の総得点には有意差は認められなかったが、PSQIの下位尺度である入眠時間においては0.85(95%CI:0.22-1.48)ポイントと有意な違いが認められた。高齢者用うつ尺度(GDS)においては1.83(95%CI:0.50-3.17)ポイントと有意な差を認めた。本研究は、地域高齢者を対象とし睡眠衛生教育および睡眠認知行動療法を用いた睡眠改善プログラムの高齢者の睡眠、抑うつ、認知機能、QOLへの効果を検証することが目的である。初年度であるH22年度の計画は、高齢者(65歳以上)を対象とした睡眠の実態調査であった。熊本県の1つの村に居住する65歳以上の高齢者全員(563名)を対象とし、2010年6月から7月にかけて自記式質問票調査を行った。睡眠の質はPittsburgh Sleep Quality Index、抑うつ症状はThe geriatric depression scale short formを用いて評価した。その他、基本属性、社会経済状況、健康状態に関する項目について調査した。調査票を配布した563名中、481名(回答率85.5%)より回答があった。睡眠の障害を持つ高齢者は全体で187名(41.3%)、男性では71名(33.8%)、女性では(47.7%)であった。高齢者の抑うつは、必要な交絡要因を調整した後も睡眠の障害と関連し、その関連には性差が認められた。男女別に抑うつと睡眠の関連をロジスティック回帰分析にて検討した結果、男性においては、未調整時には抑うつと睡眠との間に有意な関連が認められたものの、単変量解析にて有意となった変数や全ての変数で調整した場合、その関連は有意とは認められなかった。一方、女性においては、いずれのモデルにおいても睡眠障害と抑うつとの間に有意な関連を認め、すべての変数を調整要因として投入した際のオッズ比は2.37(95%信頼区間:1.15-4.87)であった。これらの結果からも、高齢者の睡眠の改善は抑うつを予防する可能性があることが示唆され、特に女性においてその効果が大きいのではないかと期待される。本結果の一部は、22年度に学会で報告した。また、現在論文としてまとめており、23年度公表する予定である。[研究の目的]睡眠の改善は抑うつ及び認知機能の改善に結びつく可能性が示唆されている。本研究は、地域高齢者を対象とした無作為割付比較試験において、睡眠衛生教育および睡眠認知行動療法(CBTI)を用いた睡眠改善プログラムの高齢者の睡眠、抑うつ、認知機能、Quality of Life(QOL)のへの効果を検証することが目的である。平成22年度はプログラム作成のための睡眠実態調査を行った。平成23年度は睡眠改善介入プログラム実施と抑うつ症状および認知機能への効果検証が主要な計画であった。[平成23年度実施内容]1.協力自治体の保健師および看護師に、睡眠改善介入プログラムを行うための睡眠に関する教育(睡眠の種類とメカニズム,加齢と睡眠の変化,睡眠障害,良い睡眠を得るための生活指導,睡眠認知行動療法のポイント)を行った2.1農村地域にて,研究参加の同意を得た高齢者(60歳以上)54名を対象に,昨年度の睡眠実態調査をもとに作成した睡眠改善介入プログラムを実施した。3.介入群(A)と非介入群(B)に無作為クロスオーバーにて,ベースライン調査と睡眠測定を行い,睡眠改善介入プログラムを実施した.(1)睡眠測定は,自宅に訪問し脈波解析機能付き簡易腕時計型体動計を用い3日間測定した.(2)平成23年10月にAグループへのベースライン質問票調査(面接)と睡眠改善介入プログラムを実施した(Bグループが対照。Bグループへのプログラムの実施は、調査終了後の平成24年2月に実施した)。約4ヶ月後の平成24年2月、A,Bグループに効果判定質問票調査(面接)を行った.(3)ベースラインおよび効果判定質問票は、基本属性,生活状況,認知機能,抑うつ,Q0L,睡眠の状態などの項目を含む.(4)睡眠介入プログラムは集団教育,睡眠計の結果説明と個別指導,2回の電話フォローアップからなり、1の教育を受けた保健師らによつて実施した.4.上記をまとめ睡眠改善介入プログラムマニュアルを作成し、協力自治体に還元した.平成24年度の研究目標は、昨年度に引き続き、「睡眠改善介入プログラムの夜間睡眠、抑うつ、認知機能、QOLへの効果を検証する」であり、具体的には1)昨年度実施した介入の評価データを分析する、2)結果を学会および学術誌へ発表することであった。

1)昨年度実施した介入の評価データを分析無作為割付比較試験を用いて睡眠改善介入プログラムの夜間睡眠、抑うつへの効果を検証した。教育効果の評価は、介入前と介入3か月後の2群間における主観的な睡眠の質および抑うつの変化量を比較した。睡眠の質はピッツバーグ睡眠質問票(PSQI)を、抑うつは高齢者用うつ尺度短縮版(GDS-S-J)を用いて調べた。介入群とコントロール群におけるPSQI得点の介入前後の変化量の差は1.71(95%CI:-0.66 - 4.09)ポイントで,有意差は認められなかったが(p = 0.16),PSQIの下位尺度の入眠時間においては0.85(95%CI: 0.22 - 1.48)ポイントと有意な違いが認められた(p = 0.008).抑うつにおいてはGDSの2群間の変化量の差は1.83(95%CI:0.5 - 3.17)ポイントと有意な差を認めた(p = 0.007).2)学会および学術誌への発表本研究の結果は、平成24年度に学会発表1件、学術誌発表4件、一般雑誌寄稿1件、報告書1件にて公表した。また、研究成果の社会還元として住民や地域保健医療職を対象とした講演会を3件実施した。平成23年度の計画は全て終了し,研究の遂行は順調であった.しかし,対象が高齢者であったため,睡眠の測定を行うために自宅に睡眠計を届けたり,測定ミスによる再測定や交通の便が悪さから複数回の教育を行わなければならなかったりし,費用と時間が計画以上にかかったため対象者数が予定より減少したことは不足な点である.睡眠改善介入プログラムの実施マニュアルを作成し,協力いただいた自治体に研究成果を還元したことや,平成22年度に実施した睡眠実態調査の結果をまとめ学術誌および学会に発表したことは評価される.現在、さらに2つの論文を執筆である。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年は,平成23年の研究結果をまとめ,学術誌および学会に発表する.また,睡眠介入プログラムの実施マニュアルを改善したいと考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
副腎皮質刺激ホルモンによる細胞性癌遺伝子c-fos発現誘導の意義

生命維持に必須の副腎皮質ホルモンは、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)の刺激下で、環状AMP(cAMP)の産生増加を介して、一連の水酸化酵素が活性化されることにより生合成される。しかし、cAMPから水酸化酵素活性化に至る細胞内情報伝達機構については、殆ど明らかにされていない。蛋白合成阻害剤の投与でACTHによる副腎皮質ホルモン産生が抑制されることから、この過程には新たに合成される蛋白因子の関与することが以前から示唆されているが、未だに同定されるに至っていない。一方、下垂体摘除ラットにACTHを投与すると、副腎で細胞性癌遺伝子c-fosの発現が早期に且つ一過性に誘導される。このことは、c-fosが副腎におけるACTH作用の担い手であることを示唆する。副腎におけるc-fosの役割を解明する第一歩として、c-fos発現誘導の細胞内セカンドメッセンジャーについて先ず検討した。即ち、ラット副腎の初代培養細胞に、cAMP依存性蛋白燐酸化酵素(Aキナーゼ)を活性化するcAMP、Cキナーゼを活性化するフォルボールエステルPMA、Ca^<2+>/カルモヂュリン依存性蛋白燐酸化酵素を活性化する高濃度KClを添加して、c-fos mRNA及びコルチコステロン(B)産生の変化を観察した。その結果cAMPのみがACTHと同様に、c-fosmRNA及びBを増加させた。更に、これらの増加は、Aキナーゼの選択的阻害剤であるH-89により用量依存的に抑制された。また、蛋白合成阻害剤サイクロヘキシミドは、c-fos mRNAの発現をむしろ増加させた。以上の結果から、1)正常副腎細胞では、ACTHによるc-fos発現誘導及びB産生増加は、共にAキナーゼによる燐酸化を介していること、2)c-fos mRNAの増加には新たな蛋白合成が必要でないことが、明らかにされた。現在、c-fosのアンチセンス遺伝子を用いて、Fos蛋白の役割について検討中である。
細菌のリボソームスモ-ルサブユニットRNA配列による自動同定システムの作製

本研究は、細菌のリボソームスモ-ルサブユニットRNA(1・6SrRNA)配列情報を収集して、これらを整理し、このデータベースを基にして、簡便な同定法を確立しようとするものである。平成7年度、8年度の2年間で以下の成果を得た。まず第一に細菌類の16SrRNAデータベースを整理し、解読済みの種名、株名およびそれらの株が基準株のものかどうかのリストを作成した。平成8年度末の段階では、DNAデータベースには約2000株のデータが収録され、データベースからは基準株かどうか判定できないデータが90%以上を占め、また、株名の記載の無いデータも約30%に及んだ。そこで、このデータベースの欠点を補うため、文献記載データ等を参考にして、それぞれのデータが基準株かどうかを判定しリストとした。次に、データが大幅に不足する菌群について、データの取得を試みた。特に問題となるPseudomonas属について基準株の未解読種の基準株約70株をATCC等から入手して、配列を解読した。また、腸内細菌群種約20種およびLactobacillus属およびBifidobacterium属16種についても基準株の配列を解読した。第三に、配列決定を簡便化のため、コロニーを拾いこれから直接配列解読する方法の適用を行い、キョピラリー電気泳動装置を用いて、最速で約8時間で同定に必要な配列情報を得る方法を確立した。以上、本研究では、16SrRNA配列データの整備状況をまとめ、これを利用した1日で可能な同定手順を確立した。リボソームモ-ルサブユニットRNA配列に基づいた簡便な同定システムを完成させるため、以下の項目の検討を行った。1)データの不十分な菌種のデータの補充のため、特にPseudomonas属および腸内細菌群の各属の約50種の基準株を購入して、それらのssurRNA配列を解読した。これらの結果、いくつかの分類上の問題点が指摘された。たとえば、Flavimonas属はPseudomonas属の基準種のPseudomonas aeruginosaときわめて類似した配列を有し、Pseudomonas属に帰属すべきであると判断された。2)配列解読の簡便化のため、キャピラリーPCRよるシークエンス反応の最適化、キャピラリー電気泳動による高速化を試みた。この結果、キャピラリーPCRによるシークエンス反応は、PCRプロダクトの場合十分良好な結果を与え、またキャピラリー電気泳動による配列解読を含めた全体の配列解読時間は約3時間と短縮された。こまれでの配列解読では約2日を要していたので、大幅に短縮された。また、作業についても泳動ゲルの作製のような煩雑な操作を省略することが可能となった。3)ssurRNAデータベースの整理のため、EMBLより全てのssurRNA配列情報を引出し、これらの配列の不備な箇所をチェックした。解読ミスの少ない情報については、アライメント化した。本研究は、細菌のリボソームスモ-ルサブユニットRNA(16SrRNA)配列情報を収集して、これらを整理し、このデータベースを基にして、簡便な同定法を確立しようとするものである。まず第一に細菌類の16SrRNAデータベースを整理し、解読済みの種名、株名およびそれらの株が基準株かどうかのリストを作成した。そこで、このデータベースの欠点を補うため、文献記載データ等を参考にして、それぞれのデータが基準株のものかどうかを判定しリストとした。

また、腸内細菌群種約20種およびLactobacillus属およびBifidobacterium属16種についても基準株の配列を解読した。第三に、配列決定を簡便化のため、コロニーを拾いこれから直接配列解読する方法の適用を行い、キョピラリー電気泳動装置を用いて、最速で約8時間で同定に必要な配列情報を得る方法を確立した。以上、本研究では、16SrRNA配列データの整備状況をまとめ、これを利用した1日で可能な同定手順を確立した
食道癌におけるポストゲノムシークエンスの変異遺伝子機能解析

この400遺伝子での解析が、他施設の3万遺伝子の全ゲノム解析とほぼ同様の結果が得られることに気づいた。1.次世代シークエンサーを用いた臨床検体における変異遺伝子の同定2.食道癌臨床検体150検体における遺伝子変異解析ATM,NIN遺伝子に対しては、さらにサンガー法にて症例数を計150症例まで増やしていく予定で、現在臨床検体からGenomicDNAを150例抽出終了した。食道癌手術症例のうち48検体について、Truseq Custum Trial kit(Cancer Gene)の400遺伝子についてシークエンスを終了し、T1からT2、T2からT3へと進行するにしたがって増える遺伝子変異を統計解析し、現在までに7種類同定した。またN0とN1の比較において8種類の変異遺伝子を同定した。現時点でN因子に関わる候補変異遺伝子は、BCR、CARD11、FANCA、JAZF1、NIN、NSD1、RAMBP17、REQL4であり、これらについても個々の遺伝子につき、Wild typeの発現ベクター(pcDNA3.1)およびhot spotのmutant発現ベクターを作成中である。変異症例のcDNAから、RT PCRをかけて遺伝子領域を増幅したのち、発現ベクター(pcDNA3.1)にクローニングする予定である。特に転移能を獲得するにいたった遊走能に着目したい。研究協力者の変更、転勤により、人員不足によりベクター作成が進まなかった。また発現ベクターの作成は、困難なものもあり、進行が遅れた。SNPデータベースとの比較に予想以上に時間がかかったため。学会発表などで、この400遺伝子での解析が、3万遺伝子の全ゲノム解析とほぼ同様の結果が得られていることに気づいた。そのため、食道癌で半数に変異が見られたp53のstatusを再度確認したところ、やはり半数に変異が認められた。さらに10%程度の頻度の変異であるが、NOTCH1の詳細な検討を行った。その結果、NOTCH1については、免疫組織染色で核に発現している症例は予後不良であった。これらが変異とどう関与しているか、directシークエンスを施行予定であるが、NOTCH1の配列が非常に長いため、cDNAのPCRによる増幅についてもうまくいっていない。今後再検討し、Wildtypeの発現ベクターは作成したため、これらを導入するため、細胞株におけるstatusを確認する予定である。変異解析については、現在までのデータをまとめ、論文作成中である。今後GenomicDNAをPCRで増幅し、ダイレクトシークエンスを行い、次世代シークエンスで得られた変異部位、Hot spotの有無などをさらに確認する。また食道癌細胞株TEシリーズ、KYSEシリーズに関しても候補遺伝子に関するダイレクトシークエンスを行い、statusを確認する。医歯薬学今後GenomicDNAをPCRで増幅し、ダイレクトシークエンスを行い、次世代シークエンスで得られた変異部位、Hot spotの有無などをさらに確認する。野生株ベクター、変異ベクター作成も同時に行っていく予定である。細胞実験を行う前のWeb上での検討、統計処理などに時間をとられたため、使用額を満額使用するにいたらなかった。27年度は計画通り、進めていく方針で、使用できると考える。細胞実験において、26年度の残金と27年度予算で使用予定。
単純分化微生物のプロテアーゼ・インヒビター間コミュニケーション

当初の研究実施計画にしたがい、まずSSI様インヒビター(SIL)生産菌の培養上清より精製単離したSILタンパク質の全一次構造決定と阻害特性の解析を行った。その結果、SSIの機能構造を形成する上で重要と考えられた部分は高度に保存されており、機能構造領域を浮き彫りにした。SILインヒビターの構造相同性を利用し、最大節約法と近隣結合法を用いて作成した進化系統樹は、生産菌自身の系統関係と正の相関があった。次にSSI消失変異株を取得したところ、胞子形成能の低下、生育速度の低下、プロテアーゼ生産の増大など多面的形質の変化が走査型電顕によって観察された。そこで、SSIと相互作用する菌体外の内因性標的プロテアーゼをアフィニティーカラムにて複数単離した。その一つ、SAM-P20の遺伝子クローニング、組換え発現を行った。構造/活性から、SAM-P20はキモトリプシン属の新メンバーであることがわかった。また、アルカリ領域、高温領域でも活性を有するユニークな性質を示した。SAM-P20のプロテアーゼ活性は明らかにSSIによって阻害を受けることがインビトロ実験において明らかとなった。SAM-P45遺伝子も同様の戦略により単離することに成功した。配列分析の結果から、本プロテアーゼは約110kDaから成る巨大前駆体が生合成され、少なくとも3段階のプロセシングを経て活性化されることが推定された。今後は、SAM-P20あるいはSAM-P45とSSIとの複合体形成の詳細な解析を実施する予定である。さらに、他の内因性標的酵素についても同様の研究を推進していくことを考えている。
非線形複雑系の3次元数値計算

研究代表者池田は,反応拡散方程式系の並列計算スキームの有限要素法によるコーディングを完成した.これは領域分割法と前処理付き共役勾配法に基づくものである.領域を分割することにより生成される内部界面では整合しない三角形分割も許されるモルタル法のような手法もあるが,我々は分かり易さを前面に押し出す方針を採用した.その結果,三角形分割は内部界面において整合条件を満たさなければならないが,通常の有限要素法と同一の数値計算結果が得られるという特徴を備えている.大腸菌のある種の変異株が,複雑な過程を経て,形成するストライプ・スポット状のパターンの並列計算を行い,並列スキームがほぼ予定通りに機能することを確認した.研究分担者三村は,反応拡散系と界面ダイナミクスの数理解析を分担し,発熱反応拡散系に現れる時空間パターンの特異極限解析と計算機シミュレーション,競争拡散系に現れる棲み分けパターンを捉えるための界面ダイナミクス法の導出,活性抑制因子反応拡散系に現れるパルスダイナミクスの数理解析,バクテリアコロニーの時空間パターンのモデル化とその計算機シミュレーションを行った.渦と乱流場に関しては,岡本が水の波の数値計算および渦層の巻き上げの数値計算において重要な貢献を行い,木田が渦構造の同定と抽出,管状渦と剪断流の3次元相互作用の2点を中心に詳細な研究を行った.高橋はすべての独立変数と従属変数を離散化する超離散化法の理論を交通流モデルおよびソリトン系に応用することに成功した.今井は自由境界問題の高精度数値解法の開発と応用,ポアソン方程式の差分離散化法およびSOR法の収束率などの研究を,友枝は多孔質媒体を流れる流体によって形成される浸透領域のダイナミクスなどの研究を推進した.グラフィックスワークステーションIris Indigo2 High-ImpactとIris Indy ZXを導入し,既存の機器と有機的に統合することによって可視化システムを構築した.主要な機能は(1)静止画像の描画とカラー印刷,(2)C言語あるいはOpen GLのプログラムによる描画と動画像のコマ撮り,(3)Open Inventorのプログラムによる描画と偶発的な動きにも対応できる動画像のコマ撮り,(4)AVS(Application Visualization System)による描画と動画像のコマ撮り,(5)動画像のノンリニアー編集である.また,並列計算の出発点として離散化によって得られた計算プログラムを並列計算機用にチューニングする方法を採用し,IBM SP-2をターゲットマシンとして,界面のダイナミックスを記述する反応拡散系から差分近似によって導出される連立1次方程式系を共役勾配法およびスケールド共役勾配法で解くプログラムのチューニングを行った.池田は,双安定反応拡散系のパルス進行波解の分岐構造を詳細に調べ,パラメータに依存してパルス進行波解がホップ分岐により不安定化し,代わりにパルス状の進行脈動波解が現れるという構図を,数値計算だけではなく数学的にも示した.また,悪環境下で大腸菌などを培養する際に非平衡過程として菌が形成するスポットパターンの前処理付き共役勾配法を用いた数値計算に成功した.三村はパルス進行波解の後方発火や2次元スパイラル波の崩壊現象を内蔵する新しい型の拡散-興奮系に現れる界面の運動の研究を推進した.河原田は田孔性媒質である砂の中での流体の自由境界問題となる傾斜している海岸における波動現象の数値シミュレーションを行い,今井と中村は磁場中に置かれた導電性の流体の熱対流現象に対して,縮約モデルの数値計算によりカオス的な挙動の根源であろうアトラクターの構造の研究を進めた.研究代表者池田は,反応拡散方程式系によって表現される界面ダイナミクスの研究の一層の発展を目的とし,領域分割法と前処理付き共役勾配法に基づいた並列計算スキームの構築を企画した.複雑な過程を経て大腸菌のある種の変異株が形成するスポット状のパターンを最初のターゲットに選び,ほぼ予定通りの水準の並列アルゴリズム提供することができた.研究分担者岡本はNavier-Stokes方程式の理論解析,水面波の分岐現象の数値シミュレーション,渦法によるEuler方程式の数値計算の高精度化などに成功した.木田は回転球殻の内外の球面上の温度差によって回転軸に平行な5対の渦柱状の熱対流パターンが現れることを示し,一様剪断流中に置かれた直線渦系のまわりにらせん状に巻き付く渦系の複雑な構造を求めた.また,西田は熱対流系における分岐問題を計算機の支援を受けて解析する接近方法を用いて,定常分岐,周期解の分岐,自由表面がある場合のロール解やホップ分岐の存在などに関して着々とその成果を挙げている.今井は主として自由境界問題を扱い,任意精度の数値計算法の開発,時間発展項を陽には持たない方程式系の数値計算法の開発,解の爆発が起こりうる問題の数値的解析などを行い,中村は今井とともにスペクトル選点法によるアトラクターのフラクタル次元の高精度計算の実用性を示した.友枝は多孔体媒体中の流体現象を扱い,空間1次元の場合に解のサポートが分離するための十分条件を厳密に導き,多次元問題へも適用できることを確認した.河原田は多元最適化法の開発を行い,流れの自由境界の制御と熱伝導問題に適用した.四ツ谷は天体力学の松隈の方程式や微分幾何の共形スカラー方程式の解析を進め,高橋は可積分な非線形波動方程式に対して超離散化と呼ばれる手続きのを通して差分方程式をセルオートマトンに翻訳することに成功した研究代表者池田は,反応拡散方程式系の並列計算スキームの有限要素法によるコーディングを完成した.

これは領域分割法と前処理付き共役勾配法に基づくものである.領域を分割することにより生成される内部界面では整合しない三角形分割も許されるモルタル法のような手法もあるが,我々は分かり易さを前面に押し出す方針を採用した.その結果,三角形分割は内部界面において整合条件を満たさなければならないが,通常の有限要素法と同一の数値計算結果が得られるという特徴を備えている.大腸菌のある種の変異株が,複雑な過程を経て,形成するストライプ・スポット状のパターンの並列計算を行い,並列スキームがほぼ予定通りに機能することを確認した.研究分担者三村は,反応拡散系と界面ダイナミクスの数理解析を分担し,発熱反応拡散系に現れる時空間パターンの特異極限解析と計算機シミュレーション,競争拡散系に現れる棲み分けパターンを捉えるための界面ダイナミクス法の導出,活性抑制因子反応拡散系に現れるパルスダイナミクスの数理解析,バクテリアコロニーの時空間パターンのモデル化とその計算機シミュレーションを行った.渦と乱流場に関しては,岡本が水の波の数値計算および渦層の巻き上げの数値計算において重要な貢献を行い,木田が渦構造の同定と抽出,管状渦と剪断流の3次元相互作用の2点を中心に詳細な研究を行った.高橋はすべての独立変数と従属変数を離散化する超離散化法の理論を交通流モデルおよびソリトン系に応用することに成功した.今井は自由境界問題の高精度数値解法の開発と応用,ポアソン方程式の差分離散化法およびSOR法の収束率などの研究を,友枝は多孔質媒体を流れる流体によって形成される浸透領域のダイナミクスなどの研究を推進した.
超電導マグネットのクエンチ現象に関する研究

超電導マグネットの信頼性ある設計と運転のために安定性と安全性の両面について検討した。まず安定性については各種機械的擾乱の性格を明らかにするための検出法ならびにクエンチ予測について考察した。テストマグネットは単層、多層NbTiマグネットを用い、擾乱検出は従来の電圧振動法の代りにマグネットの表面ひずみ測定を行ない、AEとの相関を調べ次の成果を得た。(1)AEは励磁回数を重ねるごとに減少するが表面ひずみは殆ど励磁回数に依存しない。(2)マグネット軸方向には圧縮ひずみが、半径方向には引張りひずみが現われ、引張りひずみには多層の場合でもヒステリシスは少ないが、圧縮ひずみには大きなヒステリシスがあり、これとAEとが密接な関係があるという知見が得られた。(3)多層マグネットになると更に軸方向に対するねじれが現われ、これも特徴的AE(クエンチ近くで通常の30倍程度の急激なエネルギー増加)になりクエンチ予測の手掛かりとなることが判明した。次にマグネットの安全性にとって重要となるクエンチ時の常電導伝播をマグネットの巻線構造との関連において実験的理論的に検討した。まず単層ソレノイドコイルにおいて巻線方向とこれに垂直方向の常電導伝播速度を独立に測定することによって層内常電導伝播には2つの伝播モードがあることを明らかにした。さらに、2つの伝播モード間の転移条件や各モードにおける2方向の伝播速度を定量的に説明するために、巻線間の熱的結合を考慮して2次元的常電導伝播を解析した。その結果、巻線間の熱的結合が層内の常電導伝播に重要な役割を持っていることがわかり、実測値もこの解析法によってうまく説明できた。又、マグネット内の巻線構造中の典型的構造である導体部と非導体部からなる積層構造中での常電導伝播を積層構造を均質化することによって平均的に評価する解析法を提案し、その妥当性を検討した。
permissive hypercapniaにおける人工呼吸管理の研究

【研究方法】呼吸不全を作成した雑種成犬を持続鎮静し、pressure support ventilationで人工呼吸管理した。サポート圧を30、25、15、5cmH2Oの4段階に変え、各々の30分後に、血液ガス、換気力学諸指標、心循環動態を測定した。【結果】PSVのサポート圧が15cmH2Oでは、呼吸回数、最大呼気流量、呼吸仕事量、心拍数が増加したが、PaCO2の上昇が起こらなかった。サポート圧が5cmH2OではPaCO2も上昇した。【結論】自発呼吸を残した換気モードでpermissive hypercapniaは可能であるが、呼吸回数や呼吸仕事量、心拍数が増加し、PaCO2が上昇してくるようであれば困難である。実験2.PaCO2上昇、pH低下と心循環動態、脳圧および組織酸素代謝、組織酸塩基平衡への影響【研究方法】ビ-グル犬を持続鎮静し、筋弛緩薬で不働化し人工呼吸管理した。人工呼吸モードをVolume control ventilationとして、一回換気量を10ml/kg体重、呼吸回数を25回/分とした。その後、換気量を20%、40%減少させ、PaCO2、pHの変動と心循環動態、脳圧の変化を観察した。また、同時に酸素消費量の測定、トノミーターによる組織酸素代謝状態の測定を行った。【結果】20%の換気量の減少により1時間後にはPaCO2は40mmHgから約60mmHgへと上昇し、pHは7.2台へ低下した。40%の減少では1時間後には90100mmHgとなり、pHは7.0台まで低下した。肺動脈圧と脳圧は著しく上昇したが、他の循環系諸指標は変化が少なかった。組織血流/酸素状態、組織酸塩基平衡状態は危険な状態とはならなかった。【結論】脳圧亢進、心不全などの場合はpermissive hypercapniaは避けた方がよい。しかし、これらに問題がない場合は組織酸素代謝、組織酸塩基平衡に危険な障害を及ぼすことは少ないであろう。【研究目的】以下の目的で実験を施行した。【研究方法】オレイン酸肺水腫を作成した雑種成犬をケタミン、ミダゾラムの持続鎮静し人工呼吸管理した。実験中はPaO_2を100mmHg前後に維持し、換気力学モニタを気管内チューブに装着し、また、肺動脈カテーテルを挿入した。1.換気力学動態の測定2.心循環動態および脳圧の測定人工呼吸モードをpressure control ventilation(PCV)として、換気圧/呼吸回数を調節するとによってPaCO2を変動させ、心循環動態を測定した。また、脳圧は脊髄腔へカテーテルを挿入して測定し、PaCO2の上昇と脳圧の上昇を観察した。【結果】1.PSVのサポートレベルを低下することによって自発換気量、呼吸回数、呼吸仕事量が増加した。しかし、PaCO_2上昇が起こらず、hypercapnia状態を作成できなかった。2.心循環動態および脳圧に関しては、PaCO_2上昇が早いほど心循環諸指標に与える影響が大きいことがわかった。しかし、脳圧に関しては脊髄圧を観察したが現在のところ大きな変化は得られていない。以下の目的で実験を施行した。2.PaCO2上昇、PH低下と心循環機能、脳圧および組織血流/酸素代謝への影響を明かにする。【研究方法】

ビ-グル犬をチアミラールで麻酔導入後、静脈路を確保しケタミン、ミダゾラムで持続鎮静し、マスキュラックス投与下に非働化し人工呼吸管理した。血液ガス測定と観血的動脈圧測定のために動脈内にカテーテルを挿入した。実験中はPaO2を100mmHg前後に維持し、換気力学モニタを気管内チューブに装着した。また、連続心拍出量測定が可能な肺動脈カテーテルを大腿静脈より挿入し、脳圧センサーを開頭して硬膜外腔においた。さらに、内蔵領域の組織血流状態を判定するために胃内とS状結腸内にトノミーターカテーテルを挿入した。1.換気量減少とPaCO2上昇、PH低下の時間推移の検討人工呼吸モードをVolume control ventilation(VCV)として、コントロール値は一回換気量を10ml/kg体重、呼吸回数を30回/分とした。その後、換気量をコントロールの20%、30%、40%の3段階で減少させていき、PaCO2の上昇、PaCO2の低下を30分毎に検討した。2.心循環動態、脳圧および酸素の測定PaCO2、PHの変動と心循環動態、脳圧の変化を観察した。また、同時にFickの原理による酸素消費量の測定、酸素抽出率の測定、トノミーターによる組織血流/酸素代謝状態の測定を行った。【結果】1.体温が37-38°Cの調節呼吸下の犬では、20%の換気量の減少により1時間後にはPaCO2は40mmHgから約60mmHgへと上昇し、PHは7.2台へ低下する。しかし、その後の上昇は少ない。30%の換気量減少では1時間後にPaCO2は80mmHg台へ上昇し、その後もPHは7.1台へ低下する。40%の減少では30分後にすでにPaCO2は80mmHgを越え1時間後には100mmHgを越えた。PHは7.0台まで低下した。2.PaCO2の上昇では、血圧、心拍数などには大きな変動はなかった。しかし、脳圧は著しく上昇した。3.組織血流/酸素状態に関しては現在解析中である。
胃癌における新規アダプター蛋白XB130によるc-Myc発現制御機構の解明

我々はこれまで、新規アダプター蛋白XB130をクローニングし、その機能解析により、甲状腺癌・肺癌細胞株における細胞周期・アポトーシス制御機構を明らかにしてきた。本研究では、胃癌・食道癌におけるXB130の機能解析・臨床病理学的意義の検討を試みた。その結果、c-Mycやp21を介するG1/Sチェックポイント制御機構が存在する可能性を見出し、細胞周期におけるXB130の新たな機能を解明した。また、胃癌・食道癌患者の手術標本の免疫組織化学により、XB130の核内での高発現が、独立した予後因子となることを解明した。これらは、上部消化器癌におけるXB130の分子マーカーとしての可能性を示すと共に、XB130を分子標的とした新たな腫瘍制御概念を構築するきっかけとなる成果と考えられる。胃癌細胞株(MKN7 ,MKN28, MKN45, MKN74, KATO-III, NUGC-4)における、XB130の発現をウェスタンブロット法で解析したところ、MKN45, KATO-IIIにおいてXB130の高発現を認めた。同様に、c-MYCの発現を解析すると、MKN74以外の細胞株において、c-MYCの発現が確認された。XB130を高発現するMKN45, KATO-IIIを用い、XB130 siRNAをトランスフェクション後、定量的RT-PCRにより解析すると、XB130の発現レベルが著明に抑制された。また両細胞株において、XB130のノックダウンにより、c-MYCの発現が有意に抑制されることが、定量的RT-PCRにより明らかになった。さらに、XB130のノックダウンにより、p21の発現が増強されることが明らかになり、細胞周期制御への関与が強く示唆された。また、胃癌手術標本のパラフィンブロックを用い、XB130免疫染色を行ったところ、多くのサンプルで、癌組織内でのXB130高発現が確認された。同様に、食道癌細胞株(TE2, TE5, TE9, TE13, KYSE170)を用い、ウェスタンブロット法、蛍光免疫染色により、XB130発現解析をおこなったところ、TE2, TE5, TE13においてXB130の高発現が確認された。これらTE2, TE5, TE13を用い、siRNAによりXB130をノックダウンしたところ、G0/G1停止がおこり、p21の発現が増強されることが明らかになった。また、食道癌手術標本の免疫染色により、約70%のサンプルで、癌部でのXB130の高発現が確認された。さらに、XB130の発現パターンと、臨床病理学的因子の関係を解析したところ、XB130の核内での高発現が、食道癌患者の独立した予後因子となることが明らかとなった。
隔離膜伸展におけるユビキチン様修飾システムの役割

ユビキチン様タンパク質Atg8(autophagy-related 8)は細胞内分解システムであるオートファジーに必須なタンパク質であり、オートファジーを担う中心的なオルガネラであるオートファゴソーム(AP)の形成に機能している。オートファジーのシステムは真核生物に広く保存されているが、申請者は分子生物学的・遺伝学的に多くの知見が蓄積されている出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いてAP形成の根本となる分子機構の解明を進めている。Atg8は合成された後、Atg8のC末端の切断を担うペプチダーゼ/アミダーゼであるAtg4によって切断を受け、グリシンが露出したAtg8G116となる。Atg8G116はユビキチン様タンパク質修飾システムを介してリン脂質phosphatidylethanolamine(PE)と共有結合しAtg8-PEとなる。Atg8-PEは再びAtg4による切断を受けAtg8G116となって再利用される。このように、Atg4は二段階の切断を介してAP形成に関わっている。APは中間構造体である隔離膜が伸展することにより形成される。最近になって、我々は自身の開発した隔離膜可視化法を使用して、隔離膜伸展にAtg4によるAtg8-PEの切断が必要であるという結果を得た(Hirata et al., 2017)。平成29年度は、哺乳動物細胞Atg8-PEを切断することが知られているRavZタンパク質を出芽酵母内で発現させ、RavZタンパク質が出芽酵母Atg8-PEを切断しオートファジーを阻害することを明らかにした(未発表データ)。現在Atg4の活性中心変異体とRavZの融合タンパク質を作製し、Atg8-PE切断の制御機構を解析している。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、成熟が早くかつ蛍光の明るい蛍光タンパク質を使用する工夫と、Atg4の活性中心の変異体を使用してAtg4の酵素活性を低下させAtg8-PEに結合している時間を延長する工夫を施すことで、Atg4が隔離膜に局在することを明らかにした(未発表データ)。Atg4の局在を明らかにするために、成熟が早くかつ蛍光の明るい緑色蛍光タンパク質mNeonGreenを使用したところ、Atg4がオートファジー関連構想帯に局在することが明らかとなった(未発表データ)。また、Atg4の活性中心C159, D334, H336に変異を導入することで酵素活性を低下させAtg8-PEに結合している時間を延長することで局在を同定することにも成功した(未発表データ)。

上記のように、平成28年度の研究は順調に進捗しているので、今後の研究も当初の計画通りである。まず、Atg4のAtg8-PE切断活性が異常な変異体のスクリーニングに着手する。Atg4にランダムな変異を導入すると共に欠損変異体を作製する。スクリーニングの戦略は極めてシンプルである。変異を導入したAtg4発現プラスミドをatg4破壊株に導入し、得られたコロニーからタンパク質を抽出しウェスタンブロット解析に供する。Atg4の活性に欠損のある株はオートファジー活性がなくなるので、オートファジー活性の指標となる液胞酵素アミノペプチダーゼI(Ape1)の成熟が不能となる。またAtg8-PEの生成も同一のメンブレンで確認可能である。つまり、Atg8-PEの生成は見られるがApe1の成熟に欠損のある株が目的とする変異体である。申請者はAtg1の温度感受性変異体を取得する際に同じ手法を用いた経験がある。Atg1は897個のアミノ酸残基からなるタンパク質であり、その温度感受性変異体中には22カ所の塩基置換が存在した。そのうち同義置換が13カ所、非同義置換が8カ所、C末端近くに終止コドンが導入されていた。つまり、約120塩基(40残基)につき一カ所の塩基置換が生じていることになる。同じ手法で494個のアミノ酸残基からなるAtg4に対して、どの塩基にも一カ所の割合で変異が入ったものを取得することを考えると、約800個のコロニーを調べれば良い計算になる。一日に50株の解析を行うと考えれば約16日を要するので、十分に実現可能なスクリーニングである。29年度が最終年度であるため、記入しない。
アジア民族間の口腔表在性癌発症背景の分子病理疫学的比較研究

高齢化社会への移行に伴い口腔がん、とりわけ表在性扁平上皮癌、が増加しているが、その発生背景を究明するため、アジア諸国とわが国の口腔表在性癌症例を比較検討することを計画しして、各地で症例を収集した。まず、科学的根拠に基づく病理診断基準を確立し、その基準にしたがった診断法を各地の研究施設間で均霑化した。ついで、口腔表在性癌の病因は各地で大きく相違するにも関わらず、特定分子の発現を客観的指標に診断を実践することの正当性を証明した。とくに、口腔表在性癌に特徴的に高分化傾向はケラチン(K)17発現で規定される皮膚型正角化という特異的共通項で括られるという事実を確認し、その細胞生物学的意義も説明しえた。1)症例収集:口腔癌およびその前癌病変症例を、中国では上海交通大学口腔医学院李教授、四川大学華西口腔医学院呉教授、ミャンマーでは国立医学研究所のミン副所長らに、それぞれ抽出を担当してもらうことについて協議した。肉眼的診断(写真撮影を含む)、口腔細胞診、採血、生検等の試料採取にはそれぞれの大学付属病院の歯科医師の協力が得られた。これらの症例については、現地研究者と組織標本のバーチャルスライドをそれぞれ検鏡しうる環境の基盤整備を行った。申請者らの確立してきた口腔表在性癌の診断基準を理解してもらい、診断の均てん化をはかるべく連絡をとりあっている。とくに、ケラチン分子種ならびに細胞増殖マーカ、細胞外基質の免疫組織化学によって、異型上皮・上皮内癌・微小浸潤癌を的確に区別して正確な診断をおこなうことが可能であるという共通認識を確立しつつある。2)バーチャルスライド化:以上の病理組織標本の顕微鏡での検討による抽出は病理学的フィールドワークの基本であるので、初期の診断基準に関する技術移転は極めて重要なステップとなった。すなわち、今年度はスライドスキャナーの設備を導入し、各国から収集した症例の病理組織標本からバーチャルスライドを作成し、ネットワーク上に保存し、次年度以降の研究実施の準備をすすめた。1)前年度に続いて、症例収集と疫学調査をおこなった。口腔扁平癌と上皮内癌ならびにその前癌病変症例を、中国では上海交通大学、四川大学、ミャンマーでは国立医学研究所に、それぞれ抽出してもらっていたが、本年度は台湾大学歯学部にも協力を要請して拡充を図った。それらの症例については、組織標本のバーチャルスライドを蓄積した。コンピュータネットワークによる相互観察討議ができるような環境整備をおこない、実際に稼働を開始した。2)中国の上海交通大学口腔医学院の口腔病理学教室の李江教授および台湾大学歯学部の口腔病理学教室の張玉芳准教授を新潟に招聘し、申請者らの確立してきた口腔表在性癌の疾患概念と診断基準をより具体的に理解してもらい、診断の均てん化をはかった。とくに免疫組織化学による異型上皮・上皮内癌・微小浸潤癌を的確に区別して正確な診断をおこなう技術的協力インフラストラクチャを確立した。口腔扁平癌と上皮内癌ならびにその前癌病変症例を、中国では上海交通大学、四川大学、ミャンマーでは国立医学研究所につづき、台湾では国立台湾大学歯学部にも抽出してもらい、症例収集を拡充した。コンピュータネットワークによる相互観察討議ができるよう環境整備し、実働しているところである。2)日本側の研究代表者程ならびに分担者朔が中国の上海交通大学口腔医学院を訪問し、口腔病理学教室の李江教授をはじめ現地の研究協力者の口腔病理医と症例を相互に検討して申請者らの確立してきた口腔表在性癌の疾患概念と診断基準について討議した。また、國立台湾大学歯学部長で口腔病理学教担当の江俊斌教授を新潟に招聘し、台湾の口腔表在性癌症例について診断基準の均てん化をはかった。とくに乳頭型の組織像について今後の検討が必要という認識を持つ3)その一部の成果をまとめて、「アジア癌研究サミット2015」や「口腔がん国際フォーラム2016」等の学会にて発表した。基本的に当初の研究の目的と計画に沿っている。とくに、日本側研究者が中国の上海への調査と研究打ち合わせをおこなって、台湾大学歯学部の江教授の新潟大学訪問が実現し、症例選定の基準について、実地に詳細な検討を継続的におこなうことができたことで大きな前進があった。口腔扁平上皮癌と上皮内癌ならびにその前癌病変症例を、中国では上海交通大学、四川大学、ミャンマーでは国立医学研究所、台湾では国立台湾大学歯学部、インドネシアのジェンバー大学、スマトラ・ウタラ大学、バイチュラマ大学歯学部にも抽出してもらい、症例収集をさらに拡充した。それらの症例については、組織標本のバーチャルスライドを蓄積し、コンピュータネットワークによる相互観察討議ができるよう環境整備した。2)今年度は研究代表者程ならびに分担者朔がインドネシアのメダン市とパダン市を訪問し、ジェンバー大学のMei Syafriadi教授をはじめ、スマトラ・ウタラ大学のAmeta Primasari Tarigan准教授、バイチュラマ大学のDewi Elianora副学部長ならびに現地の口腔病理医と共に症例を相互に検討して申請者らの確立してきた口腔表在性癌の疾患概念と診断基準について討議した。また、中国成都市の四川大学を訪問し、研究協力者の呉蘭雁教授らと口腔表在性癌症例について診断基準の均霑化をはかった。

とくに乳頭型の組織像について今後の検討が必要だという共通認識を得た。3)新たな病理組織学的診断基準による収集した口腔粘膜表在性癌症例について、口腔癌内相対的発生頻度、これら患者の口腔衛生・感染・全身栄養状態とその地域間の異同と相関を解析した。同時に、各地で収集した症例のパラフィン切片について、keratin (K) 10、K13、K17、K19の発現動態と細胞ー細胞間接着分子cloudin-1、zonula occludens-1、細胞増殖因子SOX9の発現レベルを評価し、HPVとHHV-1感染も重ねて組織レベルではin-situ組織化学によって確認した。以上の成果の一部については国際学会ならびに国際誌にて発表した。高齢化社会への移行に伴い口腔がん、とりわけ表在性扁平上皮癌、が増加しているが、その発生背景を究明するため、アジア諸国とわが国の口腔表在性癌症例を比較検討することを計画しして、各地で症例を収集した。まず、科学的根拠に基づく病理診断基準を確立し、その基準にしたがった診断法を各地の研究施設間で均霑化した。ついで、口腔表在性癌の病因は各地で大きく相違するにも関わらず、特定分子の発現を客観的指標に診断を実践することの正当性を証明した。とくに、口腔表在性癌に特徴的に高分化傾向はケラチン(K)17発現で規定される皮膚型正角化という特異的共通項で括られるという事実を確認し、その細胞生物学的意義も説明しえた。基本的に当初の研究の目的と計画に沿っている。とくに、中国の上海交通大学口腔医学院の李教授および台湾大学歯学部の張准教授の新潟大学訪問が実現し、症例選定の基準について、実地に詳細な検討をおこなうことができたことで大きな前進があった。その後、症例収集も順調に進んでいる。海外調査では現地共同研究者の協力が成否を決定するので、昨年度と同様、現地の共同研究者を日本に招聘し、あるいは、国内の研究代表者ならびに共同研究者が常に現地を訪問して、意思疎通をはかりながら収集症例が精確に選別できるように努力するとともに、日常的にネットワーク上で意見交換し、密な連絡と信頼関係を築きながら調査を継続させたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。口腔病理学海外調査では現地共同研究者の協力が成否を決定するので、昨年度と同様、現地の共同研究者を日本に招聘し、あるいは、国内の研究代表者ならびに共同研究者が常に現地を訪問して、意思疎通をはかりながら収集症例が精確に選別できるように努力するとともに、日常的にネットワーク上で意見交換し、密な連絡と信頼関係を築きながら調査を継続させたい。とくに病理標本のバーチャルスライド化を実現するための第一歩として、スライドスキャーナーの設備を導入した。現地調査、症例収集、バーチャルスライド化なども順調に進行している。今年度末に、インドネシアにて共同研究調査を実施する予定であったが、そのための旅費を確保したが、ジェンバー大学口腔病理学教室のMei Syafriadi教授からの現地事情により、次年度の5月に延期したいとの要望に応じて、研究代表者次年度使用額として担保した。