hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクティビティ解析に基づくKnowledge Logの構築とその応用

Knowledge Logとは,人が日々獲得している知識の記録である.従来から存在するライフログとの違いは,Knowledge Logが知識という高次記号情報をログの対象とするのに対して,ライフログは,信号情報あるいは記号であっても単純なもの(例えば人の座る,歩く,食べるなどの行動)を記述する点にある.人の知識の大半は,人の読むという行為によって獲得されていることに着目し,本研究では,読むことに関連した知識のログを中心に,その量や質について推定するための各種手法を構築した.また,その基礎となる特徴照合,文書画像検索,文字,顔,物体などの認識技術,大規模文字画像データベースについても開発した.本研究は4ヵ年計画となっている。初年度は要素技術の洗練化を目標としている。得られた成果を項目ごとに以下に示す。(1)認識・検索:複雑背景下での文字認識、文字画像の大規模データベース(学習用)、文書タイプの認識(画像、あるいは視線の分布による)、顔認識、行動認識(瞬きの時系列データ、脳波、静電容量センサーを伴うネックバンドによる)などを開発した。いずれも、本研究を推進する上で重要な要素となる技術であるとともに、世界でもあまり類を見ないセンサーや認識方式に基づいている。(2)インタフェース:カメラペンによる筆跡復元、注視やアイジェスチャを入力方式とするもの、ならびに得られた情報を重畳表示する方式について検討した。これらのインタフェースについては、現在、基礎的な検討段階にあり、すぐに利用できるレベルに到達しているわけではないが、改良の土台となる成果が得られたと考えている。(3) Reading-Life Log:知識の源は読書にあるという考えから、読書の量と質の自動計測を行った。具体的には、読んだ文書の単語数を数える手法(万語計;wordometer)、読んだテキストを認識によって全て記録する手法(認識によるreading-life log)、さらには言語知識量の推定のため基礎的な手法(視線の分布を解析して理解困難な英単語を発見する手法)の検討を行った。使用したデバイスは、モバイル・アイトラッカであり、これによりユーザが見ている画像とその中の視線データを得ることができる。(4)要素技術の基盤となる技術:上記の要素技術の基盤となる技術の研究も行った。具体的には、タブレットPCのカメラを用いたアイトラッカの実現、ならびに画像照合などのエンジンとなる近似最近傍探索や逆近似最近傍探索のアルゴリズムを考案した。以下の5点について成果を得た.(1)顔画像認識技術の大規模化:局所特徴量の照合と投票という考えを用いて,顔画像認識の大規模化を達成した.(2)文字認識技術の高度化,ならびに新しい文字認識技術の開発:文字の認識は本研究で重要な技術の一つである.ここでは,局所特徴に基づく文字認識技術の高精度化,ならびにcomputational photographyの技術を用いて得たdefocused patternに基づく文字認識の2つについて成果を得た.(3)行動認識技術の高精度化:様々な手法やセンサーを用いて行動認識を高度化した.具体的には,画像処理を用いた文書タイプの識別,視線特徴と画像特徴をあわせた行動認識,cognitive activity認識のための視線特徴の利用ならびにEOG特徴の利用,Google Glassを用いた文書アノーテーション技術,行動認識技術ならびに行動記録技術,漫画を対象とした画像解析検索技術,視線特徴を用いた英語習熟度推定技術,fNIRSを用いた文書理解度推定技術などである.(4)基礎技術の開発:近似逆最近傍探索技術の提案,ならびに,画像の種類によらない高速照合技術の開発を行った.後者については,早期認識,早期識別という概念を導入することにより達成した.本年度は,Knowledge Logを獲得するための基本システムを構築した.具体的には,様々なセンサやデバイスごとに,どのような形でKnowledge Logの獲得に貢献できるかを考慮し,システムを作成した.以下,構築したシステムについて述べる.(1)据え置き型アイトラッカを用いた処理:視線解析によってTOEICスコアのリアルタイム推定が可能となった.これによって,人が英語に関する知識をどの程度持っていて,それがどう変化しているのがが分かるようになった.(2)廉価版据え置き型アイトラッカを用いた主観的高難易度単語の推定:同様に視線解析によって,学習者にとって難易度の高い単語を取り出すことに成功した.これによって,学習者は読むだけで,復習すべき単語のリストを得ることができ,知識獲得の補助が可能となった.用いたアイトラッカは廉価版(2万円以下)であるため,技術の普及にも大きく役に立つ.(3)読みの計量:人の知識は読書量と強い相関がある.そこで,読んだ単語の量を継続的に計測する万語計を作成した.使用したデバイスは,廉価版据え置き型アイトラッカ,眼電位計測(EOG)眼鏡(JINS MEME)の2つである.アイトラッカについてはディスプレイの前に座ったときだけ計測可能であるが,EOG眼鏡の場合は常に計測可能である.(4)読んだ時間の推定:読みの量は読んだ時間にも相関がある.据え置き型アイトラッカとEOG眼鏡を用いて,読みの時間を計測する技術も開発した.また,知識の獲得は人との会話にも関係があるので,会話を検出する手法についても同時に開発した.(5)知識の出力の把握:上記の(4)までは知識の入力に関するものであった.我々は知識の出力についてもログを取るシステムを開発した.具体的には,人が文書を読んでコメントを注釈として付ける際に,それを電子的に記録するシステムを開発した.

様々なデバイスを用いて,Knowledge Logに必要な様々な機能を実現した.高精度なデバイスは高精度な計測を可能とするため,それを元に作成されたシステムは一般に性能が高い.ただし,そのようなデバイスは高価であるため,データを大量に長時間記録することには向かない.そこで我々は精度はそれほど高くなくても安価なデバイスに着目した.具体的には廉価版据え置き型アイトラッカ,ならびにEOG眼鏡である.これらは,研究者ではなく一般ユーザ向けに市販されているものであり,価格も数万円と問題なく手の届く範囲である.これらのデバイスを用いてどの程度のKnowledge Logが獲得できるのかが,今年度のチャレンジの一つであった.その結果,据え置き型アイトラッカについては,読んだ語数の計量,ならびに読んだ時間の計量に有効であり,EOG眼鏡は読んだ時間の計量に有効であることが分かった.一方で,理解度や能力の推定には限界があることも明らかとなった.もう一つのチャレンジは,どの程度,英語の能力が計測できるかであった.この場合,デバイスとしては,高価なものを用いてもよく,限界を明らかにすることが動機であった.その結果,23ページの英文書を読むだけで,TOEICスコアが24点の誤差で推定可能なことがわかった.これは予想を上回る優れた結果であった.(1)学習に関する成果:知識は学習によって獲得される.本研究では英語学習を対象に,獲得した知識の量と質に関する研究を行った.具体的には,以下の3つの成果を挙げた.第一は,英語に関する一般的な知識レベルの推定である.指標としてはTOEICスコアを用いた.TOEICの長文問題(Part7)に回答する際の視線データを解析することにより,TOEICスコアを推定した.他の被験者の視線データが利用可能な問題を用いた場合,2問の視線データを用いたときの平均推定誤差は33点,そうでない場合には6問のデータを用いて65点となった.第二は,個別知識の確信度である.同様にTOEICを対象として,多肢選択問題(Part5)を対象とし,回答時の視線データに基づいて回答への確信度を推定した.その結果90%を上回る精度で推定に成功した.最後は,未知の推定である.英文読解時の視線データから未知単語を推定した.その結果,recallが99%のとき,precisionが33%という結果を得た.以上より,英語を対象とした様々なKnowledge logが獲得可能であることがわかった.(2)物体認識に関する成果:日常的な知識の獲得を検出するためには,コンテクストの把握が重要である.そのために必要な機能の一つとして,画像を用いた物体認識がある.PramidSepDropという新しいDeep Neural Networkの構造を提案し,CIFAR10, CIFAR100というベンチマークデータセットを用いて評価したところ,世界最高性能を発揮することがわかった.(3)感情解析に関する成果:知識はそれを獲得,運用したときの感情と密接な関係にある.
Ｔ細胞生存を制御するＫＤＥＬ受容体の機能解析

獲得免疫系で中心的な役割を担うT細胞は、体内で一定の数が保たれている。このT細胞恒常性は、効率的な免疫応答を誘導するために重要であり、サイトカインであるIL-7とT細胞受容体からの生存シグナルが重要であることが知られていた。今回ナイーブT細胞が大きく減少しているT-Red変異マウスの解析から、生体内でのT細胞恒常性が上記の生存シグナルと統合ストレス応答による細胞死シグナルとのバランスで成り立っていることが分かった。免疫応答の中心を担うT細胞の恒常性をより詳細に理解するために、変異導入剤ENUを用いてマウス個体に突然変異を導入し、T細胞集団に異常を持つ個体を選別した。その結果、ナイーブT細胞数が大きく減少している変異個体を得て、T-Redマウスと命名した。SNP解析から、その責任遺伝子はKDEL受容体1 (Kdelr1)であった。このナイーブT細胞の恒常性破綻の分子機構を調べた。T-RedマウスをT細胞受容体トランスジェニックマウスと交配するとナイーブT細胞数が回復したことから、V(D)J再構成の異常を疑ったが、解析の結果、V(D)J再構成は根本的には完了していることが判明し、V(D)J再構成に伴うDNA修復以外の原因もまた示唆された。遺伝子発現を網羅的に検索した結果、T-RedナイーブT細胞では統合ストレス応答(ISR)遺伝子群の発現が大きく増加していた。ISR誘導に重要な因子であるeIF2aのリン酸化もT-RedナイーブT細胞で増加しており、PP1とKdelr1が会合することがeIF2aの脱リン酸化に対して役割を果たしていることが示唆された。さらに、T-Redマウスでは胸腺内、末梢ともに生存シグナルを伝えるTCR信号を比較的強めに受けているナイーブT細胞集団がストレス下でもより生き残りやすいことが判明し、T細胞恒常性にはストレス応答と生存シグナルとのバランスが重要であることが示唆された。これらの結果は、T細胞恒常性に新たな知見を与えるものである。T細胞恒常性をより詳細に理解するために、変異剤ENUを用いてマウス個体に突然変異を導入し、T細胞に異常を持つ個体をスクリーニングした。その結果、ナイーブT細胞数が激減している変異個体(T-Redマウス)を得た。このT-RedマウスはT細胞依存的免疫応答が有為に減弱している。SNP解析から、その責任遺伝子は、ER-Golgiで物質の逆輸送に関わる膜タンパク質として知られるKDEL受容体1 (Kdelr1)であった。Kdelr1にはファミリー分子が存在するが、T細胞ではKdelr1とKdelr2の発現が認められ、Kdelr3はほぼ発現していなかった。Kdelr1の局在は、共焦点顕微鏡観察の結果、核の周辺にシグナルが認められた。T細胞受容体トランスジェニックマウスとT-Redマウスとの2重変異マウスはナイーブT細胞数が回復したことから、V(D)J再構成の異常を疑ったが、解析の結果、質的な変化は認められたものの、根本的にはV(D)J再構成は完了していることが判明し、DNA修復反応以外の原因もまた示唆された。転写産物の網羅的解析の結果、T-RedナイーブT細胞では統合ストレス応答(ISR)遺伝子群の発現が大きく増加していた。ISR誘導に重要な因子であるeIF2aのリン酸化もT-RedナイーブT細胞で増加していた。eIF2aのリン酸化を誘導するキナーゼ群の活性化は野生型と同レベルであった一方で、eIF2aの脱リン酸化が障害されている結果を得た。eIF2aの脱リン酸化はPP1 (protein phosphatase 1)によって担われており、実際にはPP1とKdelr1は会合することが判明した。これらのことは、Kdelr1の新たな機能としてPP1活性の制御があることを示し、それがナイーブT細胞の生存に必要であることが示唆される。この恒常性の維持には、サイトカインIL-7とT細胞受容体からの生存シグナルが重要であることが知られている。このT細胞恒常性は、効率的な免疫応答を誘導するために重要である。我々は、このT細胞恒常性のメカニズムをより詳細に理解するために、変異剤を用いてマウス個体に突然変異を導入し、ナイーブT細胞数が激減している変異個体(T-Redマウス)を得た。シークエンス解析から、その責任遺伝子は小胞体とゴルジ体で物質の逆輸送に関わるKDEL受容体1 (Kdelr1)であった。T-Redマウスはコラーゲン誘導性関節炎やリステリア感染などのT細胞依存的免疫応答が有意に低下していた。Kdelr1のT細胞特異的ノックアウトマウスを作成したところ、T-Redマウスと表現型が一致したことから、Kdelr1がその原因遺伝子であると結論した。

トランスクリプトーム解析から、T-RedナイーブT細胞では統合ストレス応答(ISR)の標的遺伝子が増加していた。ISRは小胞体ストレス等の細胞性ストレスの総称であり、翻訳開始因子eIF2αのリン酸化を起点として、ストレス応答を誘導する。実際にT-RedナイーブT細胞ではeIF2αのリン酸化が亢進していた。一方で、野生型T細胞においてもある程度のeIF2αのリン酸化が認められ、生体内で一定のストレスを常に受けていることが示唆された。eIF2αのリン酸化を除去する脱リン酸化酵素(PP1)とKdelr1が会合することが明らかになり、この会合がPP1機能を調節している結果を得た。つまり、ナイーブT細胞の恒常性にはストレスを効率的に除去するKdelr1-PP1経路が必要であり、IL-7やTCRからの生存シグナルとISRによるストレスシグナルのバランスがナイーブT細胞の恒常性に重要であることを突き止めた。免疫学Kdelr1の異常によるナイーブT細胞の恒常性破綻の分子機構について、Kdelr1の新たな機能とともに明らかにし、論文として投稿中であり、また学会発表も行ったことから順調に進んでいると考える。Kdelr1の異常によるナイーブT細胞の恒常性破綻の分子機構について、Kdelr1の新たな機能とともに明らかにし、論文投稿中であることから順調に進展していると考える。Kdelr1遺伝子に変異を持つT-RedマウスのナイーブT細胞では、統合ストレス応答(ISR)が増加しており、生存性が悪くなっている。これはTCR信号が弱いと考えられる集団に特に顕著である。TCR信号とISRがどのように分子的に関連するのか、両者の機能的なリンクを証明する。またT-Redマウスは4ヶ月齢くらいまでには明らかな外見の異常は認められない。T細胞に異常をもつ他のマウスはしばしば加齢とともに炎症などの異常を呈することがあるので、より加齢したT-Redマウスの血清などを解析し、自己免疫疾患などの症状について検討する予定である。これらによってKdel receptorのT細胞恒常性における役割とその結果生体に与える影響とを明らかにする。Kdelr1遺伝子に異常を持つT-RedマウスのナイーブT細胞では、細胞ストレスが増加しており、生存性が悪くなっていることが示唆される。細胞ストレスを除去するような遺伝子を過剰発現させることによってT-RedナイーブT細胞の生存性が回復することを確かめ、両者の機能的なリンクを証明する。また、PP1とKdelr1との会合がPP1活性を調節する機構についても、会合ドメインを決定したり、複合体の構成因子を比較するなどして検討する。Kdelrファミリーの欠損マウスを解析して、ナイーブT細胞生存における機能的重複性を調べる。T-Redマウスは4ヶ月齢くらいまでには明らかな外見の異常は認められない。T細胞に異常をもつマウスはしばしば加齢とともに炎症などの異常を呈することがあるので、より加齢したT-Redマウスを解析し、癌化や免疫疾患などについて検討する予定である。消耗品や抗体の種類、マウス使用数が予定よりも少なくて結果を得られたため。
Isolated diastolic heart failure発症機序の解明

我々が確立した現在唯一利用可能なisolated diastolic heart failureモデルを用いて、以下の新しい知見を得た。代償性心肥大期から心不全期への移行において、左室重量および心筋細胞径が増加し、左室の線維化亢進が認められたことから、拡張不全の進行に心肥大および線維化が貢献していると考えられた。心不全期の左室におけるアンジオテンシン変換酵素(ACE)mRNA、エンドセリン1前駆体(ppET1)mRNAをRT-PCR法にて定量化したところ、拡張不全モデルラットではACEmRNA、ppET1mRNAは対照群に比し有意に増加していた。これより、心不全発症にレニン・アンジオテンシン系などの神経体液性因子が関与する可能性が考えられた。そこで、高血圧発症後よりアンジオテンシンII受容体拮抗薬(Candesartan)を投与し、レニン・アンジオテンシン系の拡張不全への関与を検討した。心エコー法により求めた左室重量係数は、代償性肥大期である13週齢では、薬剤投与群とも無投薬群と有意差がなく、左室収縮能および左室流入指標にも差が認められなかった。すなわち、代償性心肥大の形成におけるレニン・アンジオテンシン系の関与は小さいと考えられた。代償性肥大期から心不全期にかけては、薬剤投与により左室重量係数の増加が抑えられた。また、心不全に特徴的な左室流入異常および左室拡張末期圧の上昇は投薬群で認められなかった。19週齢において実測した左室重量係数は投薬群において無投薬群に比し明らかに小さく、線維化の亢進も制御された。以上より、高血圧に伴い心肥大から拡張不全による心不全を呈する系においては、レニン・アンジオテンシン系が過代償の心肥大および線維化を亢進し、拡張不全による心不全発症に関与すると考えられた。1、代償性心肥大期、心不全期に拡張不全モデルラット、年齢を一致させた正常対照ラットそれぞれ心臓を摘出し組織学的に観察したところ、心筋細胞径は代償性肥大期、心不全期ともに対照群に比し有意に増加していたが、心不全期に認められるような明らかな線維化は代償性肥大期では認められず、繊維化率でも心不全期のみで有意な増加を認めた。よって、拡張不全の進行には左室の線維化が大きく貢献していると考えられた。2、心不全期において心筋組織よりアンギオテンシン変換酵素(ACE)mRNA、エンドセリン前駆体(ppET)mRNAを抽出し、PCR法にて定量化したところ、拡張不全モデルラットではACEmRNA,ppETmRNAともに対照群にし有意な増加を認めた。よって心筋組織でのレニン・アンギオテンシン系、エンドセリン系の活性化が拡張不全の進行に影響していると考えられた。特にレニン・アンギオテンシン系に関しては同時期に採血した血中のアンギオテンシンII濃度が上昇していなかったことより心筋組織での関与が強く示唆された。上記の通り心肥大、線維化の進行に神経体液性因子が関与していると考えられたため、次年度はレニン・アンギテンシン系、エンドセリン系それぞれの受容体拮抗剤を投与し拡張不全への移行を予防できるかを確かめると時に、働きの相違についても詳細に検討する予定である。また、心筋保護的に働くと考えられているナトリウム利尿ホルモン(ANP,BNP)の拡張不全における心筋内動態についても検討する予定である。昨年度は、我々が確立した現在唯一利用可能なisolated diastolic heart failureモデルを用いて、拡張不全に心肥大および線維化の亢進が貢献していることを明らかにした。また、心不全期においてレニン・アンジオテンシン系因子などの左室における発現が増加していることから、心肥大や線維化の進行に神経体液性因子が関与する可能性を示した。

そこで、本年度は高血圧発症後よりアンジオテンシンII受容体拮抗薬(Candesartan)を投与し、レニン・アンジオテンシン系の拡張不全への関与を検討した。心エコー法により求めた左室重量係数は、代償性肥大期である13週齢では、薬剤投与群とも無投薬群と有意差がなく、左室収縮能および左室流入指標にも差が認められなかった。すなわち、代償性心肥大の形成におけるレニン・アンジオテンシン系の関与は小さいと考えられた。代償性肥大期から心不全期にかけては、薬剤投与により左室重量係数の増加が抑えられた。また、心不全に特徴的な左室流入異常および左室拡張末期圧の上昇は投薬群で認められなかった。19週齢において実測した左室重量係数は投薬群において無投薬群に比し明らかに小さく、線維化の亢進も抑制された。以上、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は代償性心肥大よりも心不全への移行に関連した過代償の心肥大に関与していると考えられた。高血圧に伴い心肥大から拡張不全による心不全を呈する系においては、レニン・アンジオテンシン系は過代償の心肥大および線維化を亢進し、拡張不全による心不全発症に関与すると考えられた。
超強磁場での陽子サイクロトロン吸収線を手掛かりにマグネターの正体を暴く

観測事実から我々の宇宙にはB10^<15>Gもの超強磁場を持つ中性子星「マグネター」が要求されている。ところが候補天体の発見から30年を経過しても直接的な証拠が無い。本研究の目的は日本のX線天文衛星「すざく」を用いたX線・γ線の観測的研究により、陽子サイクロトロン共鳴散乱による吸収線を発見し、マグネターの存在を直接的に証明する事である。これは世界初の大発見になるだけでなく、B>4.4×10^<13>Gでのみ可能な物理学の研究が現実となる「宇宙の超強磁場実験場」の開拓になる。2008年8月22日に新候補天体(SGR 0501+4516)が発見され、私は即座に「すざく」衛星を用いた緊急観測を行った。観測中にバーストを検出し、スペクトルの約28keVに吸収線構造を見出した。起源が陽子のサイクロトロン共鳴散乱の基本波ならB4.5×10^<15>Gとなる。成果は即座に論文誌に掲載した。さらに2009年1月22日に候補天体であるAXP 1E 1547.0-5408が活発なバースト活動を示した(一日で約260個のバースト)。「すざく」衛星による緊急観測を行い、解析は現在進行中である。さらなる研究を平成21年度に行うために二つの事前提案を行った。一つは活発なバースト活動期に行う観測であり、もう一つは静穏状態の系統的な観測である。これらの事前提案は現在審査中である。
土壌病原菌の種子伝染動態解析と低環境負荷型種子処理技術の提案

1.スイカつる割病菌は根部から侵入し、維環束を経由して、茎から地上部へと進展するものの、さらに果柄経由でスイカ果実および種子へと移行する頻度は非常に低いことが、経時的な観察で明らかになった。一方、一旦茎の表面などに形成された分生子が、スイカ果実の傷から感染、果実内部および種子に移行し、種子伝染する頻度が高いことが判明した。2.平成17年度にはスイカつる割病種子伝染の低環境負荷型防除法として、温酢酸浸漬法を提案した。本年の系統では、防除効果をさらにあげることはできなかった。温酢酸浸漬後のスイカ種子では、スイカつる割病菌は観察されず、死滅したものと思われた。3.イネ馬鹿苗病菌の種子伝染の低環境負荷型防除法として、Trichoderma asperellumによる生物防除が提案されている。T.asperellumにも緑色蛍光タンパク質を導入、種子萌芽期、幼苗期における病原菌との相互作用を経時的に観察し、作用機作としてT.asperellumによるF.moniliformeの食菌が示唆された。この成果について論文としてとりまとめた。平成1718年度の2年間で、土壌病害とされる病害の病原の種子伝染過程を緑色蛍光タンパク質を利用して可視化、その危険性を明らかにすると共に、環境負荷の少ない、温酢酸浸漬や生物防除などによる種子伝染の良好な防除手段を示唆した。菌類で効率的に機能するプロモーター(TEFF)の下流にオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(green fluorescence protein:gfp)遺伝子を組み込み、この発現ベクターを用いて種子伝染性フザリウムである、スイカつる割病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、トマト萎凋病菌(F.oxysporum f.sp.lycopersici)、イネ馬鹿苗病菌(F.moniliforme)を形質転換した。形質転換後、緑色蛍光タンパク質を常時発現している形質転換株を選抜した。緑色蛍光タンパク質を常時発現している形質転換株の培地上における生育性状、分生子その他の器官形成に関わる性状、栄養要求性、抗生物質に対する感受性、マイコトキシン等の物質生産能、病原性などの性状を調査し、これらが親株と同等であることを確認した。上記で作出した緑色蛍光タンパク質常時発現形質転換株を用いて、スイカつる割病菌の種子感染過程、および汚染種子におけるスイカつる割病菌の種子存在様式を、蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡下で、可視化、観察した。また、イネ馬鹿苗病菌についても同様な方法で種子での存在様式、および種子葉鞘への移行動態を明らかにした(第31回日本農薬学会大会などで公表)。また、スイカつる割病菌について、環境負荷の少ない種子処理技術の探索を開始し、温酢酸溶液での浸漬処理が効果が高いことを見いだした。一方、イネ馬鹿苗病菌の種子伝染を抑制する微生物Trichoderma asperellumにも上記と同様に緑色蛍光タンパク質を導入、イネ種子葉鞘での動態観察、イネ馬鹿苗病菌との相互関係の可視化による防除メカニズムの解明を開始した(一部成果を平成18年度日本植物病理学会等で公表予定)。
圧電MEMSエネルギ変換デバイス高性能化のための強誘電体不揮発応力メカニズム制御

振動型圧電MEMSデバイスにおいて,動的に共振周波数可変な機構を導入し飛躍的な高性能化を図る。積層圧電ダイアフラム構造においてはダイアフラムの座屈に依存した周波数シフトが確認されている。本年度は座屈撓みを逆圧電応力により変化させパルス応答振動モードを評価した。良好な圧電性を持つ強誘電体PZT薄膜によるキャパシタとシリコン熱酸化膜の二重構造からなるダイアフラムについて,座屈撓み12μm程度に対して10V程度までの電圧を印加することにより,撓み量を2μm程度まで減少させることができた。各種撓み量をもつ段階でのダイアフラムにパルス超音波を印加して,走査型レーザドプラ振動計にて振動モードを計測し固有周波数を評価した。撓み量が8μm程度よりも大きい領域では,従来知られていた静的座屈をもつダイアフラムと同様に少数の振動モードのみが現れ,しかも振動振幅は特定の主要なモードのみが大きくほぼ単一の振動モードが支配的となった。さらに印加電圧を上昇させて撓み量を小さくすると,今度は従来の静的座屈ダイアフラムの場合と異なり多数のモードに分岐することなく,各モードの周波数が一様に変化するのみとなった。これは逆圧電効果によりダイアフラム面内に強い引張応力が生じたため,複雑なモードの出現を抑制したものと考える。また共振周波数変化の観点で捉えると,印加電圧の上昇に伴い撓み量が減少するに従い,従来と同様に共振周波数が低下した。一方さらに印加電圧を上昇させると,抗電界に対応する電圧の前後から共振周波数が上昇する現象が見られた。これらのことは,印加電圧に対する周波数変化が,従来知られていた平坦ダイアフラムでの上向きバタフライと座屈ダイアフラムでの下向きバタフライの間で途中遷移しているものと推測される。次年度以降この観点でさらに詳細に共振挙動を追究したい。実施計画としていた,電圧印加による逆圧電応力を利用した共振周波数シフトについて,新たに導入した走査型レーザドプラ計測法により,これまで分離できていなかった共振周波数変化と支配的振動モードの遷移を分離して把握理解できる可能性が示された。これによりダイアフラムの座屈に依存した共振周波数シフトの変化が説明できる可能性があり,次年度以降の具体的な研究推進方向が明確になったため。MEMSデバイスの共振周波数制御方法について,新しい計測方法を導入することにより示唆された,共振周波数変化と支配的振動モードの遷移を分離して理解・把握できるように計測方法と測定計の改良を進め,ダイアフラムの座屈に依存した共振周波数シフトの変化の原因を追究する。(理由)サンプル作製を行ったがむしろ作製したサンプルの測定評価に時間がかかったため消耗品の支出が少なく当初予定より使用金額が少なくなった。(使用計画)

2年度め以降多数のサンプルを作製するとともに,昨年度の測定評価系に工夫の余地があることがわかっており,測定系の改良にも支出する予定である。
ラマン分光を用いた胆嚢、胆道系腫瘤診断のための基礎的研究

ホルマリン固定された正常肝部、胆管炎、胆管癌、原発性肝癌、転移性肝癌(原発大腸癌)を研究対象とした。測定は1064nmの近赤外線励起レーザーを、ファイバープローブを介して対象に照射し、分光解析を行った。測定関心領域は、850-1700cm^<-1>とした。正常肝部と癌病巣の鑑別では、全例で1051、1130、1443Raman Shift/cm^<-1>において、正常部は癌部より高いピークを有していた。原発性肝癌と転移性肝癌における対比では、解析可能であった全例において、1447Raman Shift/cm^<-1>のラマン強度が転移性肝癌において高値を呈した。胆管癌病巣における計測は不能であった。以上の結果から、ラマン分光法を用いて、正常肝と癌部の鑑別は1051、1130Raman Shift/cm^<-1>の計測を行うことで可能で、病巣部の鑑別においては、原発性肝癌と転移性肝癌との鑑別は1447Raman Shift/cm^<-1>の強度計測を行うことで可能であった。胆管癌においては、胆汁が付着した状態では計測が不可能であった。正常胆管と胆管炎、胆管癌の近赤外ラマン分光測定を行った。使用した励起レーザーは1064nmの近赤外線で、ファイバープローブを用いて測定した。測定関心領域は850-1700cm^<-1>とした。ラマン分光システムは1064nmNdYAG laserから発信したものをNDフィルター通過させた後、照射用ファイバーを介して摘出標本に照射した。ラマン散乱光は検出器導入用ファイバーで収集し、F/2.5collimating lensおよびHolographic notch filterを通過させた後、Multichannnel polychromatorで測定した。測定は各症例10回行った。レーザーパワーは56mW、積算時間は120秒とした。分光波形の評価は3名が独立して行った。以下に結果を示す。炎症症例では全例において、正常胆管と同一部位にそれぞれ正常胆管より高いピークを認めた。胆管癌症例では上記3ピークのうち1450Raman Shift/cm^<-1>のみが、正常のそれと比較して識別可能な急峻なピークを呈していた。現時点で検討しえた胆管癌症例は5例で、今後症例数をより増やしてその再現性を検討する予定である。使用した励起レーザーは1064nmの近赤外線で、新規に開発したファイバープローブを用いて測定した。ラマン分光システムは1064nmNdYAGlaserから発信したものをNDフィルター通過させた後、照射用ファイバーを介して摘出標本に照射した。測定は各症例5回以上行った。レーザーパワーは22mWから30mWとした。積算時間は5-20分である。正常胆管壁では昨年度同様1250Raman Shift/cm^<-1>,1320Raman Shift/cm^<-1>,および1450Raman Shift/cm^<-1>に低いピークを全例で認めた。それぞれAmide III、CH3,CH2 wagging,CH2 bendingを反映したものと考えた。以上の結果は昨年度の研究成果とほぼ同一である。

問題点は胆汁で濃染された部位で、積算時間を20分まで延ばしても蛍光が強くラマン信号を得ることができなかった。また、壁構造が1mm以下の部分では筋層以外に壁外の脂肪の信号も同時に積算してしますことがわかった。対象:ホルマリン固定された正常肝部、胆管炎、胆管癌、原発性肝癌、転移性肝癌(原発大腸癌)を対象とした。方法:近赤外ラマン分光測定に使用した励起レーザーは1064nmの近赤外線で、48mW、5分間の励起を行った。レーザー照射は前年度開発したファイバープローブを用いて行った。測定関心領域は、前年の成果をもとに850-1700cm^<-1>とした。測定機器、方法に関しては前年度の結果を踏まえて、F/2.5collimating lensおよびHolographic notch filterを通過させた後、Multichannnel polychromatorで測定した。測定は各検体に対して2回、計32回施行した。分光波形の評価は3名で行った。結果:正常肝部と癌病巣における近赤外ラマンスペクトラムを対比すると、全例で1051、1130、1443Raman Shift/cm^<-1>において、正常部は癌部より高いピークを有していた。原発性肝癌と転移性肝癌における近赤外ラマンスペクトラムの対比では、両者のスペクトラムの差分結果を検討した。解析可能であった全例において、1447Raman Shift/cm^<-1>のラマン強度が転移性肝癌において高値を呈した。胆管癌病巣における計測は不能であった。結論:以上の結果から、ラマン分光法を用いて、正常肝と癌部の鑑別は1051、1130Raman Shift/cm^<-1>の計測を行うことで可能であった。病巣部の鑑別においては、原発性肝癌と転移性肝癌との鑑別は1447Raman Shift/cm^<-1>の強度計測を行うことで可能であった。胆管癌においては、胆汁が付着した状態では計測が不可能であった。
アニオン応答性環状π電子系の開拓と機能性マテリアルの創製

独自に設計・合成したπ電子系イオンペアを用い、適切な条件における集合化を行うことで、π電子系イオンの規則的な配列構造を基盤とした次元制御型集合体(結晶、ゲル、液晶など)の創製を展開した。π電子系イオンペアの形成方法として、デザインしたアニオン応答性π電子系のアニオン会合体とその対カチオンを利用する方法(会合型イオンペア)、および「真」のπ電子系イオンを用いる方法(非会合型イオンペア)を開拓した。適切なイオン交換条件を確立したことによって、多様なイオンペアの形成が可能となった。π電子系イオンペア集合体は半導体特性をはじめとした機能性の発現が可能であることが分かった。適切な形状および電子状態を有するπ電子系イオンペアを設計・合成し、最適な条件における集合体の形成をおこなうことで、π電子系イオンの明確な配列構造を基盤とした次元制御型集合体の創製および機能性を開拓した。たとえば、非会合型のイオンペア集合体に着目すると、シクロペンタジエニルアニオン(PCCp-)を基盤としたイオンペア集合体について、PCCp-の対カチオンの形状や電子状態に依存し、結晶や液晶をはじめとしたバルク状態における電荷積層型や電荷種分離配置型集合体の形成を明らかにし、それらの特徴的な電気伝導性(ホール輸送性)を見出した(Chem. Eur. J. 2016, in press (DOI: 10.1002/chem.201600686))。また、多様な周辺修飾や電子状態のチューニングが期待されるポルフィリン金錯体を基盤としたイオンペアの設計・合成にも成功し、単結晶において電荷積層型集合体を形成することを明らかにした。一方、会合型のイオンペア集合体(π電子系レセプター-アニオン会合体と対カチオンからなる集合体)について、アルキル鎖を直接導入した非環状π電子系レセプターを合成し、レセプターのみ、およびレセプター-アニオン会合体・カチオンからなるイオンペアにおいて液晶中間相の発現を明らかにした(論文投稿中)。さらに、オリゴピロールを基盤とした環状・非環状型レセプターの基本ユニットとして、強い電子求引性置換基であるパーフルオロヘキシル基を導入したピロールを合成し、アニオン会合能の評価をおこなった。とくに、溶液中ではピロールNHのみの単座型水素結合にもかかわらず、Ka = 21,000 M-1(-50 °C)という高い会合能を有することを明らかにした(Chem. Commun. 2016, in press (DOI: 10.1039/c6cc03619h))。種々のπ電子系イオンペア(非会合型・会合型)の合成に成功し、それらの集合体の構造解析および物性評価に成功しているため。独自に設計・合成したπ電子系イオンペアを用い、適切な条件における集合化を行うことで、π電子系イオンの規則的な配列構造を基盤とした次元制御型集合体(結晶、ゲル、液晶中間相など)の創製を展開した。たとえば、会合型のイオンペア集合体に着目すると、ピロールβ位に芳香環を導入したジピロリルジケトンBF2錯体(π電子系アニオンレセプター)の合成を行い、結晶中において電荷積層型集合体の形成を明らかにした。また、ピロールβ位芳香環に長鎖アルコキシ基を導入したレセプターはイオンペア集合体からなる液晶相を発現した(Chem. Commun. 2017, 53, 3834)。ほかにも、ジピロリルピリミジンの合成にも成功し、溶液中における[1+1]型のアニオン会合挙動を明らかにし、さらに、結晶状態において電荷積層型集合体の形成を解明した(Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 8035)。一方、非会合型の「真」のπ電子系イオンを基盤としたイオンペア集合体を展開した。とくに、+1価のπ電子系カチオンであるポルフィリン-AuIII錯体を基盤としたイオンペアの合成および対アニオン交換方法を確立することで、多様なイオンペア集合体の調製を開拓した。たとえば、π電子系カチオンに適切なアニオンを組み合わせることで、サブマイクロメーターサイズのファイバーからなる超分子ゲルの形成や、広い温度領域において電荷積層型集合体からなる液晶中間相を発現した(論文投稿準備中)。π電子系イオンペアの形成方法と集合化に関する研究を展開したことで、π電子系イオンペアを基盤とした多様な次元制御性ソフトマテリアルの創製が可能となった(総説:Chem. Commun. 2017, 53, 2894)。継続して新規π電子系イオンペアの創出と集合体の機能開拓を展開する。とくに、新規骨格を有する環状・非環状型π電子系レセプターの合成に着手しており、最終年度ではそれらレセプターを基盤とした多様なイオンペア集合体を展開したい。28年度が最終年度であるため、記入しない。
基質認識に基づいた特異性の高い自殺基質の分子設計

構造プロテオミクス、プロテオーム解析など網羅的なタンパク質の機能解析の一方で、各論的な分子機能解析も今後の重要な課題となる。本研究の目的は分子機能解析の一環としての自殺基質を用いた糖質関連酵素の活性中心の一般的な探索法の開発である。自殺基質(EAG)は、酵素が基質を認識する機構を考慮した糖分子と反応基にはカルボキシ基と反応性の高いエポキシ環を用い、これら二つの分子群の距離をアルキル基鎖長を増減することで調節し、より特異性の高い自殺基質を設計した。酵素失活の分子機構解析に関しては失活が自殺基質的であることを反応動力学的に実証した。応用例も開発した。1.自殺基質の失活反応の解析;自殺基質の効果を解析するモデル酵素としてisomalto-dextranaseを用いた。アルキル基の長さ(炭素数3-6)が異なる自殺基質(E3GE6G)を混合し阻害効果を調べた。各自殺基質(EAG)濃度で失活の擬一次速度定数を求め、EAG濃度に対して擬一次速度定数をプロットすると両者の関係は直線ではなく飽和曲線となりMichaelis-Menten型の失活反応を示すことがわかった。すなわち失活はメカニカルベースであることがわかった。またE5Gの二次速度定数は他のEAGの6倍から10倍高くなっており、アルキル基の鎖長が自殺基質としての能力に重要なファクターであることがわかった。2.EAGを用いたα-amylase活性の特異的測定法;EAG利用の応用として生物試料破砕液からα-amylase活性を特異的に測定する方法の開発を試みた。β-amylase阻害剤E4Gとα-glucosidase阻害剤CBEをα-amylase:β-amylase:α-glucosidase混液と混合し後者二酵素を特異的に失活させ、α-amylaseのみの活性測定に成功した。このことは酵素を精製することなく粗酵素液中などで特定の酵素を失活させることができること示している。またこの結果は標識した自殺基質を用いて修飾後、ペプチドマスフィンガープリントなどにより、粗酵素液でも特定の酵素の活性中心のアミノ酸配列を知ることができるツールに成り得る可能性を示している。3.自殺基質との複合体立体構造の解析については期間内に解析を完了することはできなかった。現在も引き続き進行中である。その一環として自殺基質を用いた活性中心の探索法の開発が本研究の目的である。自殺基質の設計に関しては、基本骨格である糖分子と反応基であるエポキシ環までのアルキル基の長さを増減することで、基質結合部位から触媒残基までの距離を調節する。酵素失活の分子機構解析に関しては失活が自殺基質的であることを反応動力学的に実証する。自殺基質の効果を解析するモデル酵素としてBTDEXを用いた。組み換えBTDEXの生産を大腸菌により行った。培養液1LからSDS-PAGEで単一なバンドを示す30mgの精製酵素標品が得られた。精製酵素の基質特異性を解析するとBTDEXはデキストランおよび糖残基数4以上のイソマルトオリゴ糖に対して特異性を示すことがわかった。BTDEXとアルキル基の長さ(炭素数3-6)が異なる自殺基質(E3GE6G)を混合し阻害効果を調べた。アルキル基の炭素数が5のE5GのみがBTDEXの活性を阻害した。E3G、E4G、E6Gは阻害剤として作用しなかった。阻害作用をもつE5GとBTDEXを混合し、35°Cで13h保持した後、超純水で透析し、濃縮した。その試料をMALDI-TOF MS分析に供した。MALDI-TOF MSによる質量分析によりBTDEXに1000Da程度の質量の増加がみられた。修飾処理した酵素試料をtrypsin消化した試料をMALDI-TOF MSで分析したが、修飾されたペプチドの同定をすることはできなかった。応用例も開発した。

またE5Gの二次速度定数は他のEAGの6倍から10倍高くなっており、アルキル基の鎖長が自殺基質としての能力に重要なファクターであることがわかった。2.EAGを用いたα-amylase活性の特異的測定法;EAG利用の応用として生物試料破砕液からα-amylase活性を特異的に測定する方法の開発を試みた。β-amylase阻害剤E4Gとα-glucosidase阻害剤CBEをα-amylase:β-amylase:α-glucosidase混液と混合し後者二酵素を特異的に失活させ、α-amylaseのみの活性測定に成功した。このことは酵素を精製することなく粗酵素液中などで特定の酵素を失活させることができること示している。またこの結果は標識した自殺基質を用いて修飾後、ペプチドマスフィンガープリントなどにより、粗酵素液でも特定の酵素の活性中心のアミノ酸配列を知ることができるツールに成り得る可能性を示している。3.自殺基質との複合体立体構造の解析については期間内に解析を完了することはできなかった。現在も引き続き進行中である。
修飾血清タンパク質による炎症誘導機構の解明と食による制御に関する研究

脂質異常症患者血清より単離した酸化型血清アルブミンのS-チオール化修飾部位を解析した結果、これまで酸化修飾の唯一のターゲットと考えられていた遊離のCys34のみならず、分子内ジスルフィド結合を形成しているCys90やCys101、Cys392、Cys487などのシステイン残基もS-チオール化修飾を受けていることが確認された。システイン残基のS-チオール化修飾について更なる解析を行うため、血中高ホモシステイン濃度を示すモデルマウスの血清を用いて検討を行った。その結果、Cys34のS-ホモシステイン化修飾に加え、分子内ジスルフィド結合を形成しているシステイン残基であるCys101やCys265においてもS-ホモシステイン化修飾が確認された。以上の結果から、遊離のシステイン残基だけでなく、分子内ジスルフィド結合を形成しているシステイン残基もS-チオール化修飾を受けていることが明らかとなり、これらの修飾が血清アルブミンの機能や活性を変化させ、炎症誘導に関与することが予想された。また昨年度までの検討により、血清アルブミンはS-ホモシステイン化修飾により炎症誘導活性を獲得することが明らかになった。そこでS-ホモシステイン化修飾血清アルブミン誘導性の炎症誘導メカニズムを解析した結果、S-ホモシステイン化修飾血清アルブミンは細胞膜ドメインである脂質ラフトの構造変化と、それに伴う上皮成長因子受容体のリン酸化の亢進および下流シグナルを活性化により炎症関連分子の発現を誘導することが明らかになった。これまで血中のホモシステイン濃度と種々の疾病の発症率や死亡率の相関が報告されていたが、そのメカニズムは不明であった。本研究により、S-ホモシステイン化修飾血清アルブミンは炎症誘導活性を有することが明らかになり、この修飾血清アルブミンが種々の疾病発症に関与する可能性が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。炎症誘導活性を有する修飾タンパク質を同定するため、脂質異常症患者血清のHPLC分析を行った結果、健常者血清と比較して有意に増加するピークが確認された。そこで、脂質異常症患者で増加が認められたピークについて単離・精製を行い、詳細な検討を行った結果、血清アルブミンが同定された。詳細な解析の結果、同定された血清アルブミンは分子内のシステイン残基が低分子チオール化合物とジスルフィド結合を形成した可逆的な酸化を受けている可能性が示唆された。そこで、血清アルブミンがどのような低分子化合物とジスルフィド結合を形成しているか検討を行うため、LC-MS/MSを用いて検討を行った。チオール基に特異的に反応する誘導体化試薬を用いて誘導体化した後、誘導体化試薬由来のプロダクトイオンを検出するペアレントイオンスキャンによりチオール基を有する低分子化合物の網羅的な解析を行った。検討の結果、還元型血清アルブミンと比較して酸化型血清アルブミンでは、システインおよびホモシステインが有意に増加していることが明らかとなった。培養細胞を用いてシステイン化およびホモシステイン化血清アルブミンの炎症誘導活性の評価した結果、ホモシステイン化修飾によって血清アルブミンがCOX-2誘導活性を有することが明らかとなった。さらに、チオール低分子化合物により修飾を受けた酸化型血清アルブミンの機能を評価した結果、ホモシステイン化修飾により血清アルブミンの結合能が増加する傾向が認められた。今年度は、酸化修飾血清アルブミンの同定を目標として研究を進めてきた。検討の結果、タンパク質のシステイン残基のホモシステイン化が炎症誘導活性に重要であることを明らかにした。炎症誘導活性を有するタンパク質の同定だけでなく、ホモシステイン化修飾によりもたらされるタンパク質の構造や機能性に変化についても検討を行い、修飾による低分子化合物との結合性の変化などを示唆する結果を得た。これらのことから、十分に当初の目標を達成できたと考える。

これまで血中のホモシステイン濃度と種々の疾病の発症率や死亡率の相関が報告されていたが、そのメカニズムは不明であった。本研究により、S-ホモシステイン化修飾血清アルブミンは炎症誘導活性を有することが明らかになり、この修飾血清アルブミンが種々の疾病発症に関与する可能性が示唆された。ホモシステイン化修飾による血清アルブミンの機能性変化について詳細な検討を行う予定である。また、血清アルブミンのホモシステイン化修飾部位について更なる解析を行い、タンパク質の構造変化や機能性変化に影響を与えるシステイン残基についても検討を行う予定である。さらに、生体サンプルからのホモシステイン化修飾血清アルブミンの検出や、COX-2発現誘導メカニズムを解明することにより、種々の疾病との関わりについて明らかにしていく。また、ホモシステイン化アルブミンによる炎症誘導を抑制する食品成分の探索を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヤマビル汚染から白神山地を保護する研究

ニホンヤマビル(Haemadipsa zelanica japonica)は,山林に生息する体長約28cmの吸血性環形動物である.秋田県は,全国的に有名なヤマビル大繁殖地域(北限)であり,世界遺産に指定されている白神山地にヤマビルが侵入すれば駆除する手立ては無い.そこで,ヤマビル汚染から白神山地を保護するためにヤマビルの生態に関する研究をおこなった.ヤマビル消化管内に残る血液のDNA分析の開発・調査をおこなった.その結果,秋田県の主な宿主はカモシカであることを特定した.また、センサーカメラを用いた野生動物生息状況の調査から,ツキノワグマ,アナグマ,タヌキ,ホンドテン等がヒル蔓延に関与することが示唆された.ヤマビル生息域は,まだ白神山地まで達していなかったが,年ごとに確実に北上していることが明らかになった.神奈川・千葉県の放牧地に生息するヒルは,ウシを吸血していることが明らかとなったことから,ヤマビルが家畜を襲い大増殖することが懸念される。隣県の岩手県は牧場周辺までヒル生息域が広がっていることが調査から判明した.また,温暖化の影響で宿主となるニホンジカ生息域が北上化していた。それに伴い、ヤマビル生息北限(宮城県北部)も岩手県北部まで北上していた。ヤマビル忌避効果の高い薬剤を明らかにし,安全かつ薬剤効果の高いヤマビル忌避剤を探索した.スクリーニングした結果,サリチル酸2-ヒドロキシエチル,サリチル酸メチル,サリチル酸,アセチルサリチル酸,L-メントールおよびバニリンは,ヤマビルに対する忌避効果を有することが明らかとなった.ヤマビル忌避剤として使用することで,吸血被害を無くし白神山の環境保全と里山復興事業に貢献するものと考えられる.ニホンヤマビル(Haemadipsa zelanica japonica)は,山林に生息する体長約28cmの吸血性環形動物である.秋田県は,全国的に有名なヤマビル大繁殖地域(北限)であり,世界遺産に指定されている白神山地にヤマビルが侵入すれば駆除する手立ては無い.そこで,ヤマビル汚染から白神山地を保護するためにヤマビルの生態に関する研究をおこなった.ヤマビル消化管内に残る血液のDNA分析の開発・調査をおこなった.その結果,秋田県の主な宿主はカモシカであることを特定した.また、センサーカメラを用いた野生動物生息状況の調査から,ツキノワグマ,アナグマ,タヌキ,ホンドテン等がヒル蔓延に関与することが示唆された.ヤマビル生息域は,まだ白神山地まで達していなかったが,年ごとに確実に北上していることが明らかになった.神奈川・千葉県の放牧地に生息するヒルは,ウシを吸血していることが明らかとなったことから,ヤマビルが家畜を襲い大増殖することが懸念される。ヤマビル忌避効果の高い薬剤を明らかにし,安全かつ薬剤効果の高いヤマビル忌避剤を探索した.スクリーニングした結果,サリチル酸2-ヒドロキシエチル,サリチル酸メチル,サリチル酸,アセチルサリチル酸,L-メントールおよびバニリンは,ヤマビルに対する忌避効果を有することが明らかとなった.ヤマビル忌避剤として使用することで,吸血被害を無くし白神山の環境保全と里山復興事業に貢献するものと考えられる.