hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
本邦におけるB型肝炎ウイルスのgenotypeの分布とその臨床的意義

B型肝炎ウイルス(HBV)は世界中で2億人の感染者が存在し年間約百万人が死亡しいる。このHBVは従来4つの血清型に分類されてきたが、現在は7つのgenotypeに分類されている。しかし、現在に至るまでHBVのgenotypeの疫学的、臨床的意義については不明である。そこで本研究では本邦におけるHBVのgenotypeの臨床的・疫学的意義をみるために、北は北大から南は琉球大学までの12施設から全720症例の検体を集め、HBVのgenotypeを測定した。その結果、本邦におけるHBV genotypeの分布はA1.7%,B1.2%,C84.7%,DO.4%,混合型1.0%であった。このことは本邦ではgenotype Cが主で、genotype Bが従であると思われた。しかし、沖縄や東北地方ではgenotype Bが多く、これは日本民族の起源に関係し、縄文人がgenotype Bを、弥生人がgenotype Cを本邦に持ち込んできたためと推定された。また、HBV genotypeの臨床的意義をみるために、HBV genotypeとこれらの検体の臨床データと比較したところ、genotype Bの方がgenotype Cより肝がんは有意に少なく、HBVの増殖に関与するHBe抗原の陽性率がgenotype Cに有意に多かった。HBe抗原はCore promoterとprecore領域の変異により制御されると考えられているので、これらの変異とHBV genotypeの関係をみるためにCase control studyを行ったところ、core promoterの変異がgenotype Cに有意に多く認められた。このことはgenotype Bではcore promoterの変異が起こりにくく、precore領域の変異でHBe抗原の産生が確実に停止され、肝炎が終止し、肝がんへの進展が減少されると推察された。従来、HBVはその表面蛋白に対する血清学的な抗体反応によってadr、adw、ayr、aywの4つの主要なsubtypeに分類されていたが、わずか1つのアミノ酸の変異で見かけ上別のsubtypeの反応性を示すことが示されてから、現在ではウイルスの遺伝子配列の系統解析からA型からG型までの7つのgenotypeに分類されることになった。しかし、genotypeは遺伝子配列による分類のため、広い地域での多数の検体を測定する場合はいちいち配列を決定しなければならないため、費用や時間の問題から容易には検討できなかった。そこで我々は、PCR産物を制限酵素を用いてそれぞれのgenotypeに分類する方法を考案し、比較的容易に多検体処理が可能となったため、その方法を用いて、北海道から沖縄までの、全国12大学に通院中のHBs抗原陽性患者血清720例(男:女=469:251,平均年令=43.6±14.9才)について検討した。それぞれの患者からはInformed consentを得て採血し、その臨床所見も収集した。その結果、A型が1.7%、B型が12.2%、C型が84.7%、D型が0.4%、混合型が1.0%であった。しかし地域別に見ると、沖縄でB型が60.0%、また東北で22.9%と他地域と比べB型が多く見られた。B型とC型との臨床所見を比較したところ、B型では有意にHBe抗体陽性例が多く、HBV DNAも低値であった。以上から日本では大多数がC型であるが、南北にB型が多く見られる地域があり、また両者で臨床所見の違いが認められることが示された。全国、北は北海道大学医学部から、南は琉球大学医学部までの12施設から全720症例の検体を集め、当方でHBVのgenotypeを測定したところ、HBV genotypeA, B, C, Dは各々1.7%,1.2%,84.7%,0.4%で、混合型が1.0%であった。

このことはgenotype Cが本邦では主で、genotype Bが従であると思われた。しかし、沖縄や東北地方ではgenotype Bが多く認められ、これは日本民族の起源に関係し、縄文人がgenotype Bを、弥生人がgenotype Cを本邦に持ち込んできたためと推定された。また、従来日本に存在しないといわれていたA型とD型とまた混合型につき全塩基配列を決定し、比較したところ、genotype AとDは欧米の配列に近似し、欧米から最近持ち込まれたと推定された。混合型については、塩基配列の検討の結果、HBV genotype間のco-infectionやrecombinationが考えられたが、今後さらに症例を増やして検討する必要があると思われた。また、これらの検体でHBV genotypeの臨床的意義をみるために、HBV genotypeとこれらの検体の臨床データと比較したところ、HBVの増殖に関与しているHBe抗原の陽性率がgenotype Cに多かった。HBe抗原はCoreprcmoterとprecore領域の変異によりcontrolされるため、それらの変異とHBV genotypeの関係をみるためにCase control studyを行ったところ、core promoterの変異がgenotypeCに有意に多く認められた。このことは、genotype Cではcore promoterの変異が起こりやすく、その結果HBe抗原の産生に変化がおこり、肝硬変、肝細胞癌への進展を促進すると思われた。
制品開発のグローバル化と組織能力の構築

本研究の焦点は,海外の製品開発拠点における知識の獲得,移転,活用を促進する組織メカニズムの構築過程を明らかにすることにある。この目的から,自動車産業を主な対象として,いくつかの少数の拠点(研究所やテクニカルセンター)に絞り込んで,事例に密着した形で深く調査を実行した。調査方法としては,インタビューを中心とした質的データと質問票によって収集される量的なデータとの継続的な比較(トライアンギュレーション)を通じて,実態に即した論理を生成していくというスタイルを取った。その結果,海外拠点の製品開発でどのように組織能力が構築され,知識が獲得・活用されているのかについて,以下のような知見を得た。(1)現地の知識の活用と本国から移転された組織パターンの浸透とがトレードオフではなく補完関係にあること,(2)補完的な結合を促進するための本国の能力を雛型とした新しい能力の構築がなされていること,(3)海外に開発チームを配置する意図は潜在的な現地知識の具現化を狙った能力の構築にあること,(4)海外への組織ルーティンの移転には探索的な側面があり,それが海外独自の優位性の構築にとって重要であったこと,(5)研究拠点の発展経路は機能別の外部環境に適応する形で組織が形成され,一旦能力の分化が進んでから製品開発組織としての統合が進められること,の5つである。この知見の一部を,Academy of Management,および国際ビジネス研究学会で発表し,後者は年報に掲載予定である。この他,いくつかの論文は現在投稿中もしくは投稿準備中である。この成果を受けて,今年は日本の製造業の海外R&D拠点全体を対象とした調査の実施に向けて,調査票の開発や予備調査などを実施し,最終的にこれを配布した。なお,この知見の一部を,今年度は三菱国際コンファレンスで発表した。(1)現地の知識の活用と本国から移転された組織パターンの浸透とがトレードオフではなく補完関係にあること,(2)補完的な結合を促進するための本国の能力を雛型とした新しい能力の構築がなされていること,

(3)海外に開発チームを配置する意図は潜在的な現地知識の具現化を狙った能力の構築にあること,(4)海外への組織ルーティンの移転には探索的な側面があり,それが海外独自の優位性の構築にとって重要であったこと,(5)研究拠点の発展経路は機能別の外部環境に適応する形で組織が形成され,一旦能力の分化が進んでから製品開発組織としての統合が進められること,の5つである。
腫瘍幹細胞増殖制御に基づいた横紋筋肉腫治療戦略の開発

PAX3-FKHRまたはPAX7-FKHRキメラ遺伝子は胞巣型・混合型横紋筋肉腫の76%で陽性なのに対し胎児型では検出されず、生存率はキメラ遺伝子陽性の胞巣型で44.2%に対してキメラ遺伝子陰性の胞巣型では75.0%と有意に高く、胎児型の76.3%と同様だった。幹細胞マーカー発現は全ての横紋筋肉腫細胞株でCD44陽性、CD44v陰性で、CD133表出率はRh30, KYM-1, RMS-YM株では2%以下、RD株では25%で、CD133陽性細胞は抗癌剤抵抗性で免疫不全マウスにおいて高い造腫瘍能を示した。Genotypeや腫瘍幹細胞のマーカー発現に基づく新治療戦略の可能性が検討された。研究初年度の今年度は、臨床研究の基盤構築と、基礎研究のための基礎データ収集が行われた。本研究が連動している横紋筋肉腫の臨床研究は、厚生労働省革新的がん医療実用化研究事業による委託経費からの支出も合わせて進められた。腫瘍の特性と遺伝子型(genotype)、組織型(phenotype)の関連に関する今年度の解析では、キメラ遺伝子が胎児型で1例も検出されなかったのに対して、胞巣型・混合型ではPAX3-FKHRあるいはPAX7-FKHRが76%の症例で陽性で、progression free survivalはキメラ遺伝子陰性群の76.8±4.4%に対して陽性群では46.0±7.3 %と有意に陰性群で低かった。キメラ遺伝子陰性の胞巣型症例の生存曲線はprogression free survival 75.0±12.5%で、胎児型の76.3±4.9%とほぼ完全に重なった。これに基づき腫瘍組織の遺伝子型によりリスク分類する手順を確定し、遺伝子型、組織型の各分類が併記できるようにした。基礎研究では、横紋筋肉腫細胞株(Rh30, KYM-1, RMS-YM, RD)についてFACSにより候補腫瘍幹細胞マーカー(CD44, CD44v, CD133)の発現を評価した。CD44は全ての腫瘍株で発現が確認されたが、CD44vはいずれの横紋筋肉腫細胞株でも発現はみられなかった。CD133はRh30, KYM-1, RMS-YM株において表出率は2%以下であったがRD株においては25%が陽性で、CD133陽性細胞は抗癌剤(CDDP, VCR, Act-D)抵抗性ならびに免疫不全マウスにおいて高い造腫瘍能を示した。これらは横紋筋肉腫細胞の腫瘍幹細胞を検討する基礎データとなる。今年度も、引き続いて本研究が連動している横紋筋肉腫の臨床研究は、厚生労働省革新的がん医療実用化研究事業による委託経費からの支出も合わせて進められた。臨床研究の基盤構築とリスク分類に関する検証が続けられ、腫瘍の特性と遺伝子型(genotype)、組織型(phenotype)の関連に関する解析では、キメラ遺伝子は胎児型ではやはり1例も検出されなかったのに対して、胞巣型・混合型ではPAX3-FKHRあるいはPAX7-FKHRキメラ遺伝子が76%の症例で陽性であった。遺伝子型と予後の解析では、progression free survivalはキメラ遺伝子陽性の胞巣型で44.2±7.3%に留まったのに対してキメラ遺伝子陰性の胞巣型では75.0±12.5%群と有意に高く、胎児型の76.3±4.9%と、生存曲線はほぼ完全に重なった。さらに今年度の解析で、キメラ遺伝子陽性、陰性に関わらず、混合型組織を持つ症例は全例が生存しており、極めて予後良好の一群として同定された。これらに基づいて、腫瘍組織の遺伝子型に基づいたリスク分類に若干の修正が検討された。今年度新規に42例の遺伝子解析を追加している。基礎研究では、横紋筋肉腫細胞株(Rh30, KYM-1, RMS-YM, RD)についてFACSにより候補腫瘍幹細胞マーカー(CD44, CD44v, CD133)の発現が引き続き検証された。CD44は全ての腫瘍株で発現が確認されたが、CD44vはやはりいずれの横紋筋肉腫細胞株でも発現はみられなかった。昨年度までの観察結果が再検証された。小児がんにおいて腫瘍幹細胞のマーカー発現が成人癌とは大きく異なっていることが再び明らかにされ、今後の幹細胞を標的にした小児がん治療戦略を考える上で重要な情報と考えられる。今年度は先行する横紋筋肉腫臨床試験における遺伝子型と組織型の予後解析が完了し、新たな臨床試験にむけて解析結果に基づくリスク分類の改訂、新たな病理組織診断手順の完成など、臨床試験基の基盤構築も完了した。加えて低リスク群、中間リスク群の臨床試験

プロトコールも策定が完了したが、高リスク群プロトコールについてはプロトコールで選択された治療計画の一部に研究遂行上の問題が指摘され、修正を要する状況である。この結果、リスク群を限定して次年度に、臨床研究が開始できる見通しであり、臨床試験に関してはほぼ予定通りに研究計画が達成された。しかしながら今年度は臨床試験が開始されていないため、新規臨床検体は得られておらず、腫瘍組織における幹細胞マーカーの発現、先端的ゲノミクスを用いたゲノム解析などの基礎的解析や検討はまだ行われていない。In vitroの研究として、横紋筋肉腫細胞株において腫瘍幹細胞マーカーの発現が検討された。CD133はじめ一部のマーカー抗原の発現と化学療法抵抗性、造腫瘍能との関連も確認された。これらは今後、腫瘍幹細胞を検討する上で重要な基礎データを考えられ、既存の培養株を用いた研究に関してはほぼ計画通りに研究が達成できた。小児外科学次年度は高リスク群横紋筋肉腫に対するプロトコール策定など、今年度達成できなかった部分の臨床試験計画も策定を完了し、低リスク群、高リスク群と合わせて、遺伝子型によるリスク分類を取り入れた横紋筋肉腫に対する新規臨床試験の全面的施行を目指す。臨床試験は全例で完全な治療完遂にまだ数年、さらに臨床経過の観察に数年を要するため、次年度の時点では多くの症例が未だ治療途中と考えられるが、可能であれば新リスク分類、新規治療の有用性について中間解析を行う。また臨床試験の開始により、新たなプロトコールで均てん化された治療を受けた症例の腫瘍組織などの臨床検体が集積し始めるものと思われる。今年度開始できなかった腫瘍組織における腫瘍幹細胞マーカー発現の検討、次世代高速シーケンサーを用いたCSCとその下層の分化したがん細胞におけるエクソンキャプチャー、エピゲノムの網羅的解析やCSCの成立・維持を制御する特異的分子の検索など先端的ゲノミクス解析、薬剤感受性の検討などを開始し、臨床検体の解析を随時進める。既存の細胞株やTERT遺伝子導入がん化幹細胞株を用いた研究では、マーカー抗原遺伝子発現解析や増殖能の評価を進める。これらの結果を臨床試験データと付き合わせて横紋筋肉腫に対する新規治療の可能性を検討する。今年度は臨床試験基盤の整備が行われ、プロトコールがほぼ完成したが、学会の承認などの手続きにはまだ若干の時間を要し、実際の臨床試験の開始は次年度へ持ち越された。このため、臨床検体はまだ得られておらず、これに関わる試薬、物品などの費用は使用されなかった。これは次年度以降に使用する予定である。臨床試験が開始された場合、臨床検体の保管および解析に用いる試薬、分子生物学的リスク分類のために用いられる試薬や物品の購入費用などに充当される予定である。
オステオポンチンを分子標的とした悪性中皮腫の病態解明と治療への応用

中皮腫細胞の細胞機能に及ぼすオステオポンチン(OPN)の役割について検討した。OPN遺伝子を導入することで中皮腫細胞の抗がん剤耐性(ビノレルビン(VNR),ゲムシタビン(GEM),エトポシド(VP16))が誘導された。これら抗がん剤耐性はCD44とヒアルロン酸(HA)の結合増強に伴うMRP-1(multidrug resistance protein-1)を介することが明らかになった。これらの結果はOPNは中皮腫治療の新しい標的分子になりえることを示唆する。当初の研究計画書ではin vitroの実験は平成20年度に行う予定であったが、臨床検体の収集状況が遅延していることから、平成19年度からin vitroの実験を開始した。まずは、肉腫型中皮腫細胞株であるH28を用い、オステオポンチン(OPN)の発現を確認後、細胞接着試験、細胞遊走試験、細胞増殖試験、アポトーシス関連実験等を行った。H28はOPNとインテグリンavR3受容体を介して強固に結合し、OPNに対する強い細胞遊走、増殖活性を示した。また、OPNはH28と結合することでアポトーシスの阻害効果を示すことも明らかにした。OPNの中皮腫細胞に及ぼす機能調節はインテグリンに結合するFAK(focal adhesion kinase)の活性化を介することも明らかにした。以上のOPNの中皮腫細胞の細胞機能に及ぼす効果はOPNが抗癌剤を調節することを示唆する。この仮説を証明するためにH28にoPNのsiRNAを導入しoPNの発現抑制を試みたがoPNの発現低下は得られなかった。したがって、次にOPNの発現の低い二相型中皮腫細胞であるMeso-1にマウスOPNを遺伝子導入した遺伝子導入株Meso-1/OPNと、ベクターのみを遺伝子導入したコントロール株Meso-1/Mockを樹立し、各種抗癌剤(Gemcitabine,Pemetrexed,Vinorelbine,cisplatin,paclitaxe1,CPT-11)に対する抗癌剤感受性試験を行った。現在までに、Meso-1/OPNはMeso-1/Mockに比較してGemcitabine,vinorelbine,Pemetrexedに対してより抗癌剤耐性である結果を得ている。現在、OPNによるこれら抗癌剤耐性獲得機序について検討中である。前年度に引き続いてオステオポンチン(OPN)の中皮腫細胞機能に及ぼす影響を検討する目的でOPNの発現の低い二相型中皮腫細胞であるMeso-1にOPN遺伝子を導入した遺伝子導入株(Meo-1/OPN)とコントロール株(Meso-1/Mock)を樹立した。これらMeso-1/OPNとMeso-1/Mockを用いて各種抗がん剤対する感受性試験を行ったところ、OPN遺伝子にてvinorelbine(VNR), gemcitabine(GEM), etoposide(VPO-16)に対して抗がん剤耐性を誘導しえることを明らかにした。本年度は、臨床検体を用いて解析を行う予定であったが、分担研究者の宮元の退職により、今年は引き続きin vitroにおける中皮腫抗がん剤耐性機序について詳細な検討を行った。Meso-1にOPN遺伝子導入することで元々発現しているhyaluronate (HA) receptorであるCD44のアイソフォームに変化が生じ、その結果,HAへの結合性が亢進することが明らかになった。すなわちOPNを遺伝子導入することでCD44の高分子量アイソファームが減少し、その結果HAとの結合性が増強した。HAのCD44への結合によりAktのリン酸化が生じ、その結果、抗がん剤くみ出しポンプであるMRPの機能亢進を引き起こすことが機序と考えられた。これらのOPN遺伝子導入による抗がん剤耐性は、抗OPN抗体、抗CD44抗体、OPNsiRNA, CD44siRNAででほぼ完全に消失した。また、きわめて教務深いことに、VNRとVP-16に対する耐性は上述のMRPが関与することが明らかになったが、GEMはそれ以外の機序が考えられた。難治性腫瘍の代表である悪性中皮腫の抗がん剤耐性克服のための標的としてOPNあるいはCD44は有用であると思われた。
小線源療法と局所の化学療法との併用を可能にする生分解性温度応答性ミセル製剤の開発

体温に応答して、注射部位に留まる性質を有する薬剤送達用の生分解性キャリアを利用することで、治療標的部位局所に対して放射線治療と化学療法の併用療法を実現可能な新たなナノ粒子製剤を開発する。本研究では、これまでに開発を進めてきた生分解性高分子から構成されたミセルが本目的を達成するキャリアとして有効であるかどうかを、培養細胞および担がんモデル動物を用いて評価を進める。
広範なせん断速度下における粘土の残留強度特性

残留強度は排水せん断または定圧せん断においてせん断応力がピーク値を越え,漸次低下して究極的な定常せん断状態に達したときの値であり,再活動地すべり斜面の安定性を評価する指標の一つである.本研究代表者は,練返したカオリンの残留強度は,排水条件が近似的に成立しているせん断速度の範囲において,対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加すること,せん断速度の増加に伴う残留強度の増加の度合いは垂直応力に依らずほぼ一定であることを示した.さらに,既往の研究結果を整理して,この他の種々の土においては残留強度がせん断速度の増加に対して増加・不変および減少するものがあることを示した.しかし,供試体の排水条件や周面摩擦力の影響はほとんど考慮されておらず,現状では上記のせん断挙動が統一的に説明されていないことを指摘した.本研究では,せん断速度を0.022.0mm/minの広範囲で変化させたリングせん断試験の結果をもとに,種々の粘土の残留強度に及ぼすせん断速度の影響を検討した.主な知見は以下のとおりである.(1)排水条件が近似的に満たされるせん断速度領域では,残留状態の粘着力はせん断速度の変化に対してゼロと仮定できるので,残留状態の内部摩擦角が対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加する.(2)他の土試料の場合も,排水条件を近似的に満たすせん断速度領域では,残留強度は対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加する.(3)上記のせん断速度領域におけるせん断速度の増加に対する残留強度の増加の度合いは26%程度である.(4)粘土含有量,塑性指数あるいは活性度が大きい土試料ほど,せん断速度の増加に伴う残留強度の増加の度合いは大きくなる傾向にある.(5)残留状態における供試体の含水比はせん断速度の増加に対して減少する傾向にあり,せん断面付近の間隙比の減少が上記(2)の原因として指摘できる.我が国における地すべりの大半は"動いたり停まったり"する再活動地すべりであり,そのすべり面では最小のせん断強度である残留強度が発揮される.このような地すべり斜面で地震や火山活動に伴う急速せん断を受けると,すべり面のせん断強度と応力状態が急激に変化して,高速流動型の地すべりが発生する可能性がある.本研究では,この現象を解明して安定性評価をするため,急速せん断を受けた土の残留強度特性をリングせん断試験により調べた.平成13年度では,まず現有のリングせん断試験装置を定圧・定体積せん断試験が兼用できるように改良し,各種機器の検定を行った.ついで,土の物理的性質が異なる4種類の粘土に対して定圧リングせん断試験を実施し,実際の地すべりの滑動速度を考慮して,せん断速度を0.0022.0mm/minの範囲で変化させた.各土試料の残留強度とせん断速度の関係を粘土含有量および塑性指数の観点で整理し,粘土の残留強度に及ぼすせん断速度の影響を考察した.今回得られた知見として,(1)排水条件を近似的に満たすせん断速度領域において,各土試料の残留強度は対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加する.(2)せん断速度の増加に伴う残留強度の増加の度合いを表すパラメータα'を導入したところ,今回の土試料に限れば,α'の範囲は0.020.06である.(3)α'と粘土含有量および塑性指数の間には直線関係が概略認められる.特に,残留強度が発現される以前のピーク強度がせん断速度の増加に対してほぼ一定であることから,すべり面の有効垂直応力は実質的に変動しておらず,供試体内部の排水条件はほぼ満足していることが分かった.したがって,せん断速度の増加によって残留強度が増加した原因として,有効垂直応力の変動よりもむしろ土の物理的性質が有力であるとの結論に達した.平成14年度には,この実験事実を定体積せん断試験により検証する.残留強度は排水せん断または定圧せん断においてせん断応力がピーク値を越え,漸次低下して究極的な定常せん断状態に達したときの値であり,再活動地すべり斜面の安定性を評価する指標の一つである.本研究代表者は,練返したカオリンの残留強度は,排水条件が近似的に成立しているせん断速度の範囲において,対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加すること,せん断速度の増加に伴う残留強度の増加の度合いは垂直応力に依らずほぼ一定であることを示した.さらに,既往の研究結果を整理して,この他の種々の土においては残留強度がせん断速度の増加に対して増加・不変および減少するものがあることを示した.しかし,供試体の排水条件や周面摩擦力の影響はほとんど考慮されておらず,現状では上記のせん断挙動が統一的に説明されていないことを指摘した.本研究では,せん断速度を0.022.0mm/minの広範囲で変化させたリングせん断試験の結果をもとに,種々の粘土の残留強度に及ぼすせん断速度の影響を検討した.主な知見は以下のとおりである.(1)排水条件が近似的に満たされるせん断速度領域では,残留状態の粘着力はせん断速度の変化に対してゼロと仮定できるので,残留状態の内部摩擦角が対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加する.(2)他の土試料の場合も,排水条件を近似的に満たすせん断速度領域では,残留強度は対数表示のせん断速度の増加に対して直線的に増加する.(3)上記のせん断速度領域におけるせん断速度の増加に対する残留強度の増加の度合いは26%程度である.

(4)粘土含有量,塑性指数あるいは活性度が大きい土試料ほど,せん断速度の増加に伴う残留強度の増加の度合いは大きくなる傾向にある.(5)残留状態における供試体の含水比はせん断速度の増加に対して減少する傾向にあり,せん断面付近の間隙比の減少が上記(2)の原因として指摘できる.
真菌感染における自然免疫の活性化とNKT細胞及びγδT細胞による制御機構

真菌は免疫低下宿主に合併する日和見感染真菌である。病原微生物が感染すると宿主細胞による認識から自然免及び獲得免疫機構の活性化へと連動し微生物の排除が行われる。この過程では、Toll-like receptors(TLR)やC-typelectin-like receptors(CLR)によって微生物の認識が行われ、引き続きNKT細胞、γδT細胞の活性化へと引き継がれる。本研究では、ペニシリウム・マルネフェイの樹状細胞による認識にTLR2及びCLRであるβグルカン受容体dectin-1が重要であることを明らかにした。一方、カンジダ及びクリプトコッカスの認識におけるdectin-1の役割は限定的であり、真菌種によって一様でないことも示した。さらに、カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルス、トリコスポロンといった真菌のDNAが樹状細胞を活性化してIL-12産生やCD40発現を誘導することが分かり、カンジダ、クリプトコッカス由来のDNAはTLR9によってエンドソーム内で認識され、MyD88を介したシグナル伝達機序によってNFκBを活性化しIL-12及びCD40の発現を誘導することが明らかとなった。実際に、一部のクリプトコッカス株では経気道感染がTLR9遺伝子欠損マウスにおいて悪化することを見出し、in vitroのみならずin vivo感染においてもこのようなメカニズムが機能している可能性が予想された。また、クリプトコッカス感染防御におけるNKT細胞の役割についてさらに詳細に解析する目的で、クリプトコッカス菌体の中にNKT細胞の認識抗原を索することを試みた。クリプトコッカスの破砕物をマウス骨髄由来樹状細胞(BM-DC)と24時間培養後、MACSカラムを用いて精製したCD11c陽性細胞を肝臓から分離したNKT細胞を含む単核細胞(LMNC)とともに48時間培養したところ、上清中にIFN-γの産生が観察された。これは抗CD1d抗体で有意に抑制され、CD1dKOマウス由来のBM-DC、あるいはJα18KOマウス由来のLMNCを用いると反応の消失あるいは有意な低下が観察されたことからクリプトコッカス菌体にCD1dに依存してNKT細胞を活性化する抗原が存在する可能性が示唆された。宿主は微生物の侵入に対して、TLRやマンノース受容体などを介したpathogen-associated molecularpattern(PAMP)の認識を契機として、自然免疫による防御システムを発動させる。また、NKT細胞やγδT細胞のような自然免疫リンパ球は、その後の獲得免疫の「質」、特にTh1-Th2バランスを決定し、微生物感染の経過に重要な影響を及ぼす。これまでに我々は、エイズの重要な日和見病原真菌であるクリプトコッカス(Cn)に対する感染防御機構においてNKT細胞が促進的に、一方γδT細胞は抑制的に機能することを明らかにしてきた。本研究では、Cn感染防御におけるNKT細胞の役割についてさらに詳細に解析する目的で、Cn菌体の中にNKT細胞の認識抗原を探索することを試みた。Cnの破砕物をマウス骨髄

由来樹状細胞(BM-DC)と24時間培養後、MACSカラムを用いて精製したCDIlc陽性細胞を肝臓から分離したNKT細胞を含む単核細胞(LMNC)とともに48時間培養したところ、上清中にIFN-γの産生か観察された。これは抗CDId抗体で有意に抑制され、CDIdK0マウス由来のBM-DC、あるいはJα18K0マウス由来のLMNCを用いると反応の消失あるいは有意な低下が観察されたことからCn菌体にCDIdに依存してNKT細胞を活性化する抗原が存在する可能性が示唆された。そこで、Cnから抽出した脂質をリコンビナントCDIdをコートしたプレート上でNKT細胞ハイブリドーマを培養したところ、その活性化がわずかながら観察された。以上の結果から、NKT細胞はCn菌体成分中の何らかの脂質成分をCDId依存性に認識して活性化している可能性が考えられた。今後は、この点を含めてさらに詳細な解析を継続し、Cn感染防御におけるNKT細胞、あるいはγδT細胞の役割を明らかにしていく予定である。真菌は免疫低下宿主に合併する日和見感染真菌である。病原微生物が感染すると宿主細胞による認識から自然免疫及び獲得免疫機構の活性化へと連動し微生物の排除が行われる。通常真菌では病原性が弱いため宿主免疫機構により容易に排除されるが、免疫不全状態では感染防御能が障害されるため日和見感染症の発症へとつながる。宿主細胞による微生物の認識にはTLRsやC-type lectin-like receptors(CLRs)が中心的な役割を担うことが知られている。本研究では、エイズの日和見病原真菌であるペニシリウム・マルネフェイの樹状細胞による認識にTLR2及びCLRであるβグルカン受容体dectin-1が重要であることを明らかにした。一方、カンジダ及びクリプトコッカスの認識におけるdectin-1の役割は限定的であり、真菌種によって一様でないことも示した。さらに、カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルス、トリコスポロンといった真菌のDNAが樹状細胞を活性化してIL-12産生やCD40発現を誘導するすることが分かり、カンジダ、クリプトコッカス由来のDNAはTLR9によってエンドソーム内で認識され、MyD88を介したシグナル伝達機序によってNFkBを活性化しIL-12及びCD40の発現を誘導することが明らかとなった。実際に、一部のクリプトコッカス株では経気道感染がTLR9遺伝子欠損マウスにおいて悪化することを見出し、in vitroのみならずin vivo感染においてもこのようなメカニズムが機能している可能性が予想された。TLR9は細菌など原核生物に特徴的な非メチル化CpGモチーフを有するDNAの認識受容体であることが知られているが、共焦点レーザー顕微鏡による解析でカンジダ及びクリプトコッカスDNAがCpGオリゴ合成DNAと同様な細胞内動態を示すことが分かった。このように、宿主細胞による真菌感染の認識にはTLR9を含むTLR系が関与する機構とdectin-1といったCLR系が関与する機構が関与し、その後の自然免疫リンパ球の活性化へと連動することが明らかとなった。
霊長類の社会的認知における脳内ホルモンの役割

近年げっ歯類の研究から、社会行動にかかわる認知機能が、ペプチドホルモン(オキシトシン、バソプレシン)によって左右されるということがわかってきている。これらの研究結果から、ヒトの自閉症とペプチドホルモンの関連が指摘されているが、ヒトを含む霊長類では、げっ歯類と異なり、社会的情報処理が視覚的、聴覚的手がかりに大きく依存していること、親和的行動が非常に複雑であることを考えると、げっ歯類の研究結果を直接ヒトへ外挿することには問題があるであろう。そこで本研究では、小型霊長類であるマーモセットを対象に、社会行動における霊長類とげっ歯類の相違を明らかにした上で、社会行動における、オキシトシン、バソプレシンの役割を、それらおよびそれらの拮抗剤を投与することによって検証することを目的とする。本年度は社会行動の中でも親行動に着目し、以下の内容を実施した。1.食物分配実験の実施:マーモセット類で特徴的な親行動のひとつとして、食物分配行動がみられるが、この行動は、親の子どもへの寛容性の指標となると考えられる。親から子への食物分配が、子の週齢により変化するか否かを検証した結果、父親、母親ともに、年長の子に対して有意に多く拒絶行動を示し、年少の子に対しては有意に多く食物分配行動を示すことがわかった。2.食物分配行動における神経ペプチドの影響:父親を対象に、神経ペプチド(オキシトシン、オキシトシン受容体拮抗剤、バソプレシン受容体拮抗剤)を脳室内へ投与し、食物分配行動が変化するか否かを検証した。オキシトシン投与により、拒絶行動が減少し、オキシトシン拮抗剤とバソプレシン拮抗剤の同時投与により、拒絶行動の増加がみられた。そこで本研究では、霊長類の一種であるマーモセットを対象に、社会行動における霊長類とげっ歯類の相違を明らかにした上で、社会行動における、オキシトシン、バソプレシンの役割を、それらおよびそれらの拮抗剤を投与することによって検証することを目的とする。本年度は以下の項目の内容を実施した。1.実験個体の確保と飼育環境の整備をおこなった。実験対象の6ペアすべてにおいて妊娠、うち5ペアにおいて出産に成功した。2.全モダリティが利用可能な条件において、既知・未知個体識別、親子識別時の行動傾向を把握するため、I字迷路の両端にケージメイト(ペアメイト)と非ケージメイトをオトナ個体に、親個体と非親個体をコドモ個体に同時呈示した。その結果、ケージメイト側、親個体側に接近し、より長く滞在する傾向がみられた。3.親の子どもへの反応性の指標として、乳児を数分間分離した後親個体に呈示し、乳児を回収するまでの時間を測定する、乳児回収テストをおこなった。その結果、父親はどの個体も比較的速やかに乳児を回収したのに対し、母親では回収するまでに要した時間に、個体によって大きなばらつきがみられることがわかった。4.ペプチドとそれらのアンタゴニストを脳室内投与するための準備として、オス個体5頭を対象に、脳室の位置を特定するためMRI画像を撮像したのち、カニューレ埋め込み手術を実施した。
NF1遺伝子のプロモーター部位の解析

神経線維腫症1型(NF1)の責任遺伝子、NF1遺伝子の構造や機能について解析が進んでおり、現在NF1遺伝子には60のエクソンが確認されている。我々もPCR-SSCP法,direct sequence法を用いてNF1遺伝子の変異の検出を試みているが、今回はプロモーター部位について検索したいと考える。現在、NF1遺伝子のopen reading flameの上流約900bpの塩基配列が明らかにされ、そこにはTATA boxやCCAAT boxは見つかっておらず、転写活性化機能に関する詳しい検索は未だなされていない。まず、CAT assay,gel sift assay等により転写活性化能を持つ部位を明らかにする。次いでNF1患者DNAからプロモーター部位の変異を検索する。今回、我々はすでに20例のNF1患者について60エクソン全てのDNA変異の検索を行った結果、11例でdisease cousingと思われる変異を検出した。さらに、変異が検出されなかった残り9例を被験対象としてプロモーター部位の変異検索を行っている。すでに約900bpを3つの領域に分け、互いにオーバーラップするように三組のPCRプライマーを作成したので、これを使いPCR-SSCP法、size-shift assay,magnetic beadsを利用したdirect sequence法を用いて変異を検索している。
翻訳開始因子間の相互作用を指標とする蛋白質合成のリアルタイム可視化システムの構築

我々はmRNAから蛋白質への翻訳がおこなわれる過程をリアルタイムに解析するための手段として、翻訳開始因子間の相互作用の変化をFRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)を用いて可視化する手法の開発した。前年度までに直接相互作用を起こすeIF2βサブユニットとeIF5サブユニットの分子間相互作用を利用して、それぞれにCFPおよびYFPを標識した蛍光プローブの動態をFRETによりモニタリングすることに成功し、この相互作用の動態が翻訳のオンオフと同期して起きることを示した。このシステムを利用して細胞の特定の位置における翻訳状況の変化をリアルタイムに観察することが可能にした。翻訳開始因子複合体は40SリボソームをmRNAにリクルートすることにより翻訳開始を促進する機能を有するが、それと同時に複合体は解離する。最近の知見から40Sリボソームを構成するrpS2サブユニットはアルギニンメチル化酵素であるPRMT3によりメチル化を受け、40Sリボソームから80Sリボソームへの成熟を促進している。そこで海馬初代培養神経細胞のPRMT3の発現をRNA干渉法(RNAi)により抑制したところ、神経栄養因子であるBDNFによるタンパク質の誘導が阻害されたため、同じ条件下でeIF2β-eIF5間のFRETを観察した。その結果、BDNF添加後に起きる細胞体から樹状突起にかけてのCFP/YFP比の上昇がPRMT3発現抑制細胞においては有意に低下した。またタンパク質量について検討したところ、BDNFによりαCaMKIIは誘導されていないことがわかった。以上より、PRMT3がrpS2のメチル化を介してリボソームの成熟を促進することにより翻訳開始複合体を解離させることが示された。近年、神経細胞のシナプスにおいて細胞体とは独立した翻訳が行われる可能性が示唆されている(local translation)。しかし樹状突起や成長円錐に局在するmRNAからの蛋白質合成が外部からの刺激によりどのように制御され、さらに局所での翻訳が神経細胞にどのような影響を与えるのかについては未解明な点が多い。その理由のひとつがmRNAから蛋白質への翻訳がおこなわれたということをリアルタイムに解析するための手段が存在しないからである。これまでの研究手法は翻訳の最終産物である蛋白質量に依拠している。しかし蛋白質の量は翻訳以外の様々な不確定要因による影響を受けるため、翻訳動態の指標としては不適切である。そこでわれわれは翻訳開始時に起きる翻訳開始因子どうしの分子間相互作用の変化をFRET(Fluorescent Resonance Energy Transfer)を用いて可視化することにより、翻訳の過程そのものを指標とする手法の開発を考案した。翻訳開始因子複合体のなかで直接相互作用を起こすeIF2βサブユニットとeIF5のそれぞれをCFPおよびYFPで標識した蛍光プローブをラット海馬神経細胞に強制発現させ、結合・解離の動態をFRETでモニタリングする方法を採った。神経細胞をBDNFやephrinB2で刺激すると、樹状突起において青色励起波長で得られる吸収波長が長波長側から短波長側へ、すなわち黄色から青色へ変移することがわかった。我々はmRNAから蛋白質への翻訳がおこなわれる過程をリアルタイムに解析するための手段として、翻訳開始因子間の相互作用の変化をFRET(Fluorescent Resonance Energy Transfer)を用いて可視化する手法の開発した。これまでの研究手法は翻訳の最終産物である蛋白質量に依拠しているが、蛋白質の量は翻訳以外の様々な不確定要因による影響を受けるため、翻訳動態の指標としては不適切である。そこでわれわれは翻訳開始時に起きる翻訳開始因子複合体のなかで直接相互作用を起こすeIF2βサブユニットとeIF5のそれぞれをCFPおよびYFPで標識した蛍光プローブが結合・解離する様をFRETでモニタリングすることにより翻訳を可視化することにした。本年度の計画は後根神経節より単離した神経が突起を伸展するときに形成される成長円錐内で、タンパク質合成の動態をリアルタイムに観察することである。我々はFRETプローブを発現するアデノウイルスをラット後根神経節細胞に感染させた後、成長円錐内で観測されるCFP/YFPの蛍光比率の変化を可視化することを考えた。しかし後根神経節細胞はアデノウイルスの感染により多くが死滅することが分かった。また生存した細胞に関しても蛍光に暴露しているうちに、蛍光により脆弱化し長時間の観察に耐えないことが分かった。そこでelectroporationによるFRETプローブの発現を試みたところ、成長円錐における翻訳動態の変化を観察することが可能となった。

そこで海馬初代培養神経細胞のPRMT3の発現をRNA干渉法(RNAi)により抑制したところ、神経栄養因子であるBDNFによるタンパク質の誘導が阻害されたため、同じ条件下でeIF2β-eIF5間のFRETを観察した。その結果、BDNF添加後に起きる細胞体から樹状突起にかけてのCFP/YFP比の上昇がPRMT3発現抑制細胞においては有意に低下した。またタンパク質量について検討したところ、BDNFによりαCaMKIIは誘導されていないことがわかった。以上より、PRMT3がrpS2のメチル化を介してリボソームの成熟を促進することにより翻訳開始複合体を解離させることが示された。
アルケニルホスホナートを捕捉剤とする炭素及び窒素求核剤の反応開発

α,β-不飽和カルボニル化合物に対する有機金属化合物及びヘテロ原子求核剤の共役付加反応は有機化合物の骨格形成の根幹をなす炭素-炭素結合や炭素-ヘテロ原子結合の形成法として極めて重要であり汎用されてきた。一方、アルケニルホスホナートは不飽和カルボニル化合物と同様に共役付加反応における捕捉剤の一つであるが、その反応特性の理解、その特性を生かした合成化学的利用が未だ不充分である。本研究の目的はアルケニルホスホナートに対する炭素求核剤及び窒素求核剤の反応特性の理解の深化とその特性を利用した新規合成反応の開発である。本研究により昨年までにアルケニルホスホナートのHorner-Wadswors-Emmons型反応を用いる新規アレン合成法及び分子内に二つのアルケニルホスホナート部位を有する基質を用いる分子内環化反応について報告した。本年度は昨年度報告した環化反応を用いて酒石酸から誘導したキラル環状ビスホスフィンオキシドを中間体としてキラル環状ビスホスフィン、及びキラル環状ホスフィノカルボン酸を合成した。キラル環状ビスホスフィンオキシドをロジウム触媒による不斉水素化反応の不斉配位子として用いると、プロキラルなエナミドから高収率、高エナンチオ選択的に光学活性アミノ酸誘導体が得られた。またキラル環状ホスフィノカルボン酸をパラジウム触媒による不斉アリル化反応の不斉配位子として用いると、マロン酸エステルが良好な化学収率、高いエナンチオ選択性でアリル化されることを見いだした。α,β一不飽和カルボニル化合物に対する有機金属化合物及びヘテロ原子求核剤の共役付加反応は有機化合物の骨格形成の根幹をなす炭素ー炭素結合や炭素ーへテロ原子結合の形成法として極めて重要であり汎用されてきた。更に、ホスホナートがエステル基のイソスターである観点からもその化学が重要である。本年度の研究でプロペニルホスホナートに対するリチウムアミドの反応では予測通り1,4-付加、α-脱プロトン化、β-脱プロトン化のいずれもが生じることが分かった。速度論的にはα-脱プロトン化、熱力学的にはβ-脱プロトン化が進行することも明らかにした。さらに、α-脱プロトン化したプロペニルホスホナートは容易に分子間での共役付加反応が進行する事も明らかにした。一方、フエニルリチウム、ナフチルリチウム等のアリールリチウムがプロペニルホスホナートに共役付加することを明らかにした。本反応も容易に分子間での共役付加反応が進行した。これらの反応を分子内環化反応に応用した。リチウムアミドを用いた場合α-脱プロトン化後、分子内共役付加が進行して生成するオレフィン環化体のみが選択的に高収率で得られた。一方、フェニルリチウムを用いた場合、ダブルマイケル付加環化体とオレフィン環化体の混合物が得られることを明らかにした。LDAはアルケニルホスホナートに対して、求核剤としては作用せずに、塩基として作用し、α位の脱プロトン化が速度論的に優先して進行することを明らかにした。このα-リチオアルケニルホスホナートは炭素求電子剤であるアルデヒドやケトンに求核付加しアルコール体を与える。このアルコール体はKH若しくはKH-18-crown-6処理によりHorner-Wadswors-Emmons型の脱離が進行し効率的にアレンに変換されることが明らかになった。さらに、分子内に二つの不飽和ホスホナートを有する基質にLDAを作用させると一方のホスホナートのα位がリチオ化されると同時にもう一方の不飽和ホスホナートに捕捉され、環化体を与える事を明らかにした。不斉のビスホスフィンオキシドに対してこの環化反応を適用したところ環状ビスホスフィンオキシドを与えた。この環化体は官能基変換により、ホスフィンリガンドに導いた。パラジウム触媒によるアリル化反応でこのリガンドを用いると高い選択性で生成物を与えることを明らかにした。

本研究の目的はアルケニルホスホナートに対する炭素求核剤及び窒素求核剤の反応特性の理解の深化とその特性を利用した新規合成反応の開発である。本研究により昨年までにアルケニルホスホナートのHorner-Wadswors-Emmons型反応を用いる新規アレン合成法及び分子内に二つのアルケニルホスホナート部位を有する基質を用いる分子内環化反応について報告した。本年度は昨年度報告した環化反応を用いて酒石酸から誘導したキラル環状ビスホスフィンオキシドを中間体としてキラル環状ビスホスフィン、及びキラル環状ホスフィノカルボン酸を合成した。キラル環状ビスホスフィンオキシドをロジウム触媒による不斉水素化反応の不斉配位子として用いると、プロキラルなエナミドから高収率、高エナンチオ選択的に光学活性アミノ酸誘導体が得られた。またキラル環状ホスフィノカルボン酸をパラジウム触媒による不斉アリル化反応の不斉配位子として用いると、マロン酸エステルが良好な化学収率、高いエナンチオ選択性でアリル化されることを見いだした。
オートファジーの「定説」への挑戦

細胞の自己成分大規模分解機構であるオートファジーは近年急速に理解が進んだが、念入りな検証が行われないまま流布している「定説」もある。本研究では、現在広く信じられている選択的オートファジーにおける標的認識モデルについて詳細な検討を行い、いわゆるアダプタータンパク質とLC3の結合だけでは認識は説明できないことや、標的自身が認識対象で無い場合もあることを示した。24年度に計画していた細胞死に関する解析については、残念ながら進展が無かった。しかし、本研究のもう一方の課題である選択的オートファジーについては、計画を上回る成果をあげることが出来た。すなわち、アダプターモデルの中心となるLC3が標的にリクルートされなくても隔離膜は形成されること、LC3のリクルートはAtgのかなで最後であること、病原体の場合はそれ自身がユビキチン化されているのでは無く病原体を含むエンドソームの膜タンパク質がユビキチン化されていることが判明し、一般に受け入れられている通説が誤っていることを実証出来た。さらにそれだけに留まらず、Atg5複合体のサブユニットがユビキチン化を認識することやAtg間の相互作用があること、病原体以外の原因で損傷を受けたエンドソーム・リソソームが損傷をオートファジーで除去されないと個体レベルでの疾患重篤化が起こることなどを見出し、通説の否定に留まらず新たなモデルの構築にまで至った。1)LC3は選択的オートファジーの鍵を握るのか?ポリスチレンビーズにトランスフェクション試薬をまぶし培養細胞に加えると、細胞に取り込まれた後サルモネラ同様オートファゴソームに選択的に包まれるので、その系を用いた解析を行った。まずAtg5-KOやAtg7-KO細胞などLC3-IIが形成されず標的にLC3がリクルートされない細胞でも、他のAtgタンパク質は全てリクルートされオートファゴソーム膜がビーズ周囲にできることを明らかにした(ただし、完全に閉じたオートファゴソームはできない)。次に主なAtgタンパク質についてビーズにリクルートされる順序をビデオ顕微鏡で検討し、LC3のリクルートが一番最後であることを示した。最も早く現れるのはAtg5複合体であった。Atg5複合体のリクルートがユビキチンに依存していることを、E1酵素阻害剤で確認した。さらにAtg複合体がどのようにしてユビキチンを認識するのか、その分子メカニズムを明らかにした。2)標的がユビキチン化されているのか?上記の人工ビーズがオートファゴソームで包まれた後、細胞を破砕しビーズを細胞分画法にて精製したところ、LC3などと共に多数のユビキチン化タンパク質が検出された。ビーズはサルモネラのように自己のタンパク質を持たないので、これらは宿主細胞由来のタンパク質と考えられる。実際、ビーズを包むエンドソーム膜に存在するトランスフェリン受容体を調べると、通常は起こらないユビキチン化が観察された。また、LLOMeなどによってリソソームを傷つけてもユビキチン化が起こり、ユビキチン化されたリソソームのみがオートファジーの標的となった。まず実績概要に示したように、LC3がリクルートされなくても他のAtgタンパク質がリクルートされ、かつオートファゴソーム膜の形成が開始されること、LC3より先に他のAtgタンパク質がリクルートされることを明らかにしたことでLC3が選択的オートファジーの最重要因子であるという従来の定説を完全に覆した。さらに、Atg5複合体が最初にユビキチンを認識することや認識のメカニズムを解明し、従来説に代わって選択性を説明するモデルを提示した。そして選択性を規定するユビキチン化はこれまで考えられていたように病原体で起こる必要は無く、むしろ病原体を包むエンドソーム膜が傷ついたときにそこで起こることを示した。目標としていた成果を全て得ることができ、最初の年度の達成度は100%だと言える。計画では2年目に、細胞死説の検証を行う予定になっている。過剰なオートファジーが起こる変異細胞の取得を試みるが、もしそれが難しい場合は、オートファジーを負に制御する因子のノックアウトなどで細胞死が起こるかを検討する。平成24年度は当初の計画通り1,400,000円の予算を、2年目に予定している実験遂行のため主に消耗品の購入にあてる。
感性の形成過程における経験や環境要因の影響

げっ歯類は捕食動物の匂いに対して先天的に恐怖・ストレス反応を示すことが知られている。我々はこれに対して、経験や環境に存在しなくてもこれらのストレス反応を緩和する、いわゆる癒し効果のある匂い物質が存在すること、さらにこれらの効果には少なくとも2種類の異なる作用機序があることを明らかにした。これらの知見は嗅覚情報処理過程の解明に重要であるだけでなく、ストレスを緩和する機序としての礎となるものと考えている。近年、実験動物に全くその存在すら知らない筈の捕食動物の匂いを嗅がせると恐怖・ストレス反応が惹起される事が明らかとなり、これらの反応は経験や環境に影響されない可能性が示唆されてきている。そこで、本研究ではまず、これらの反応とは逆に、経験や環境に存在しなくても反応できる何らかの“癒し"効果のある匂い物質が存在するのかどうかについて検討した。所謂“癒し"効果の期待される匂い物質の候補としては、薔薇の香り(バラ臭)もしくは木の香り(ヒノキ臭)を用い、実験動物(マウス)に捕食動物の匂いとこれらのバラ臭もしくはヒノキ臭を嗅がせ、脳内で活性化した神経細胞を最初期遺伝子c-Fosに対する免疫組織化学的手法でマッピングし、比較・検討した。その結果、バラ臭もヒノキ臭もマウスにとっては全く未知の匂い物質であるにも係わらず、捕食動物の匂いによって惹起されるストレス関連部位での神経細胞の活動パターンが見られなかった。つまり、両者ともに、経験や環境要因に影響されない、持って生まれたストレス緩和効果(所謂“癒し"効果)があるものと推察された。動物が捕食者の匂いに対して恐怖・ストレス反応を生じる事は、自然の流れとして理解し易いが、逆に特定の匂いによる、ストレス緩和や癒される・落ち着くといった反応も、経験や環境要因によらずに保存されている可能性があると思われる。しかし、バラ臭とヒノキ臭の“癒し"効果の間には、その活性化神経細胞の分布に相違が見られ、両者が同じメカニズムで“癒し"効果を発現していない事が考えられた。つまり、両者ともに、ストレス緩和効果はあるものの、その過程は異なっている可能性が示唆された。そこで現在、これらの相違について更なる解析を進めている。昨年度の研究において、経験や生育環境に存在しなくても反応できる"癒し"効果のある匂い物質が存在するのかどうかについて検討し、2種類の匂い物質をその候補として見出したが、そのストレス緩和過程が異なっている可能性が示唆された。そこで本研究では、捕食動物の匂いによって誘発されるストレス反応に関わる神経回路の中でどの過程に、癒し効果のある匂い物質が関与するのかを明らかにすることを目的とし、まず、嗅球の中での神経細胞の活動を電気生理学的に検出し捕食動物の匂いに反応する神経細胞を特定した。続いてこれらの部位に刺激電極を刺入し、嗅球の直接刺激による脳内ストレス関連部位での神経活動マップと、捕食者の匂いを直接嗅がせた動物の神経活動マップとを比較・検討した。神経活動マップは脳内で活性化した神経細胞を最初期遺伝子c-Fosに対する免疫組織化学的手法で標識して作成した。その結果、まず捕食者の匂いに反応する神経細胞は、嗅球の内側部と外側部に分かれて存在していた。そこで、嗅球の直接刺激は、内側部のみ、外側部のみ、内側部と外側部の両方と3群に分けて検討したところ、ストレス関連部位での神経活動パターンが匂い物質を直接嗅がせた動物と同様に見られたのは、内側部と外側部の両方を同時に刺激した群のみであった。つまり嗅球内で、内外に分かれて存在する反応細胞の両者共に活性化されないとストレス反応を惹起しないと考えられた。このことは、嗅球内での活動が内外のどちらか一方でも変化すればストレス反応の抑制につながる可能性が高いことを意味し、他の匂い物質が嗅球の中で局所的に競合や抑制に作用でき得ることが示唆された。現在"癒し"効果のあると思われる匂い物質の作用について更なる解析を進めている。これに対して我々はこれまでの研究で、経験や生育環境に存在しなくてもこれらのストレス反応を緩和する、いわゆる癒し効果のある匂い物質が存在することを明らかにしてきた。さらに、ストレス緩和効果を示す匂い物質にはその活性化神経細胞の分布に相違が見られる事などから、少なくとも2種類の異なる作用機序がある可能性を示してきた。そこで今年度はこれらの作用機序の相違について解析を行った。いわゆる癒し効果の期待される匂い物質の候補としては、薔薇の香り(バラ臭)もしくは木の香り(ヒノキ臭)を用い、実験動物(マウス)に捕食動物の匂いとこれらのバラ臭もしくはヒノキ臭を嗅がせ、脳内で活性化した神経細胞を最初期遺伝子c-Fosに対する免疫組織化学的手法でマッピングし、比較・検討した。またストレスの指標としては血中のホルモン(ACTH)濃度を測定した。その結果、バラ臭は、捕食動物の匂いに選択的に反応する脳領域における活動神経細胞数を減少させた。つまり、ストレス誘発神経活動を相殺することで緩和効果を示すものと推察された。

一方でヒノキ臭は、匂いに関係する脳領域全体の脳活動を一斉に活性化した。つまり、周囲の神経細胞を全体的に活動させることで、捕食動物に特異的な反応を覆い隠し(マスキングして)ストレスの惹起を抑制したものと考えられた。またこれまで脳内の分界条床核の内側部がストレス反応の発現に重要ではないかと示唆されていたが、本研究により、同神経核の内側部の活動だけでは実際のストレス反応と一致せず、内側部と外側部の活動比が重要であることが示された。これらの知見は嗅覚情報処理過程の解明に重要であるだけでなく、ストレスを緩和する機序としての礎となるものと考えている。