hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノスペース・レーザー・X線ビデオスペクトロ顕微鏡の開発と新薬理動態解析への応用

1.ビデオナノスペース顕微鏡の開発ナノスケールの分解能を追求して、除震や画像解析手法を駆使し、明視野像で、60nmの分解能までの向上を図り、暗視野顕微法では、10nmの金コロイドが見えるようになった。2.蛍光偏光解消ビデオ顕微鏡の開発蛍光プローブを導入した細胞膜の分子運動性を可視化する為、蛍光偏光解消度の画像化システムを構築、分子の動きの追跡できる蛍光異方性像がとれるようになった。3.レーザースケーリング顕微鏡の開発:交差したレーザー光が作成する干渉縞が、光スケールとして、細胞などの2,3次元の形態を評価する新しい顕微鏡を開発した。4.新薬理動態解析法の開発高分解・明視野ビデオ顕微鏡により、好中球の貧食、開口放出に対する細胞骨格分子の寄与を、各種薬物による、挙動変化から、解析できる事を証明した。蛍光偏光解消顕微法により、小腸絨毛上皮細胞の分子が、吸収促進剤で急激に運動性を増す事が分かった。これも、吸収促進剤のスクリーニングに利用できる事を示した。パルスインジェクションフロー法により、気管繊毛へ薬物を送達し、その運動変化から去痰薬の効果が評価できる事が分かった。れら、いずれの成果も新しい薬物スクリーニング法として利用でき、本顕微分析法が、創薬の為の新しい基盤技術となると確信した。1.サブ分子レベル分分解能・顕微鏡の開発市販の倒立、微分干渉顕微鏡(購入)をベースに、捉えたビデオ像にビデオエンハンスメント手法を介する事で、分解能の向上を図った。その結果、80nmまでの分解能を得る事に成功した。同時に、オリンパス光学の設計製作の、暗視野レンズを用いると、暗視野像では、更なる分解能向上が図れる事が判明した。2.ビデオスペクトロ顕微鏡の開発その第一段階として、ビデオスペクトロメーターを開発した。CCDを検出器としたこの新しい分光器は、分解能も1nmで、TLCの分離パターンなどの1次元の光スペクトル分布の測定に威力を発揮することが分かった。しかし、装置が大きく、顕微鏡の測定システムとしては、小型化などの改善が必要である。3.分子レベル新薬理動態解析法の開発本開発用の顕微鏡の光学系に、今後の分光の為もあり、多数枚のフィルターが挿入できる、回転型フィルターホルダーを自作、取り付けた。これに、互いに偏光面が垂直な2枚の偏光子をいれ、蛍光偏光解消度の画像化に成功した。これにより、膜上分子の運動性の変化像が捉えられ、薬物付加による、膜上分子の運動攪乱の現象を捉えることに成功した。この成果を利用し、現在、新しい薬物スクリーニング法の開発を進めている。1.新顕微鏡の分解能の改善開発した本顕微鏡の除震を徹底し、ビデオエンハンスメント手法を介する事で、分解能の向上を図り、60nmまで改善できた。更にオリンパス光学の設計製作の、暗視野レンズにより、暗視野像では、10nmの金コロイドが見えるようになった。2.蛍光偏光解消ビデオ顕微鏡の開発蛍光プローブを導入した細胞膜の分子運動性を可視化する為、蛍光偏光解消度の画像化システムを構築、1秒ごとの、蛍光異方性の画像がとれるようになった。3.新薬理動態解析法の開発高分解明視野ビデオ顕微鏡により、好中球の貧食、開口放出に対する、細胞骨格分子の寄与を、各種薬物による、挙動変化から、解析した。これも、吸収促進剤のスクリーニングに利用できる。パルスインジェクションフロー法により、気管繊毛へ薬物を送達し、その運動変化から去痰薬の効果を評価できる事が分かった。これら、いずれの成果も新しい薬物スクリーニング法として利用でき、本顕微分析法が、創薬の為の新しい基盤技術となると確信した。
活動依存的な神経細胞成熟に関わる遺伝子発現制御系の解析とマウス小脳発達

本年度は、カルシウム(Ca^<2+>)シグナル依存的な脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、PACAP(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide)遺伝子のカルシウム(Ca^<2+>)シグナル応答に関わるプロモーター解析と、BDNFのシナプス形成に与える影響を検討した。1.BDNF遺伝子プロモーターBDNF-P)の解析(1)BDNF-PIと-PIIIのCa^<2+>シグナルへの異なった応答性について:電位依存性L-型カルシウムチャネル(L-VDCC)とNMDAレセプター(NMDA-R)からのCa^<2+>流入に対して、BDNF-PIはL-VDCCからのCa^<2+>流入に対してだけ応答したが、BDNF-PIIIはNMDA-R由来のCa^<2+>流入にも弱いながら応答した。(2)BDNF-PiのCa^<2+>応答エレメントの検索:BDNF-PIの部分欠失、変異型プロモーターを作製してCa^<2+>応答性を調べた所、-80-90の存在するCREが応答性に強く関わっていることが明らかとなった。また、CREBの関わりも明らかとなった。-100付近に存在するGC-boxが基本的な転写活性の制御に大きく効いていることが明らかとなった。4.BDNFのシナプス形成に与える影響:ラット大脳皮質初代神経細胞培養系でBDNFを加えて培養を行うと、シナプス形成の促進が認められた。
地域高齢者におけるプレクリニカルCAAに関する前向き縦断研究

脳アミロイドアンギオパチー(CAA)は脳血管へ主にアミロイドβ蛋白(Aβ)が沈着し、脳血管障害や認知機能障害が生じる疾患だが、CAAの自然歴は不明な点も多い。本研究は皮質微小出血とアミロイドPETの両方が陽性の認知機能正常者をプレクリニカルCAAと定義し、地域在住高齢者におけるプレクリニカルCAAの前向き縦断研究を行い、プレクリニカルCAAの有病率及び症候性・無症候性の脳血管障害及び認知機能障害の発症リスクと危険因子・防御因子を明らかにする。また、プレクリニカルCAAに関する血液バイオマーカーを開発する。平成30年度は認知症の前向き地域コホート研究(地域在住60歳以上対象)で大脳あるいは小脳皮質のみに限局する微小出血(CAA型微小出血)を示す健常者を抽出した。平成31年3月までに認知機能検査とMRI(T2*画像を含む)とを1137名で実施した。CAA型微小出血を認めたのは28名(2.5%)であった。認知機能別のCAA型微小出血例の割合は、正常認知機能(21名/889名: 2.3%)、MCI(4名/205名: 1.9%)、認知症(3名/43名: 7.0%)であった。脳表ヘモジデリン沈着症を認めた例はなかった。CAA型微小出血を認めた認知機能正常者3名についてアミロイドPETを実施し、うち1名で皮質アミロイド沈着をみとめた。CAA型微小出血の有病率は台湾で行われた地域高齢者を対象とした疫学研究の5.1%、ロッテルダム研究の10.9 %と比べて少なかった。平成31年以降は、皮質のみに微小出血を認めた認知機能健常者について引き続きアミロイドPETを実施し、プレクリニカルCAA群を同定し追跡調査を実施していく。前向き地域コホート研究で保存して血液検体を用いてプレクリニカルCAA群、微小出血なし群の血液検体を用いて血液バイオマーカーを開発する。平成29年度に頭部MRI検査〔全国規模で実施している大規模認知症コホート研究(平成28-32年度)の一環として実施〕が予算やMRI搭載車レンタル日程等の都合で検査実施時期が遅れたため、アミロイドPET検査の対象者抽出が遅くなった。平成31年度はアミロイドPETをなるべく多く実施し、プレクリニカルCAA群の同定、有病率の検討を進めていく。頭部MRI検査で皮質のみに限局する微小出血を認めた認知機能健常者についてアミロイドPETを実施し、微小出血部位にアミロイドの沈着がみられるかを確認する(皮質微小出血とアミロイドPETの両方が陽性の認知機能正常者をプレクリニカルCAA群と定義する)。同定したプレクリニカルCAAと合わせて追跡調査を実施していく。平成29年度は認知症の前向き地域コホート研究(地域在住60歳以上対象)で大脳あるいは小脳皮質のみに限局する微小出血(CAA型微小出血)を示す健常者を抽出した。平成30年3月までに認知機能検査とMRI(T2*画像を含む)とを680名で実施した。CAA型微小出血を認めたのは24名(3.5%)であった。認知機能別のCAA型微小出血例の割合は、正常認知機能(20名/522名: 3.8%)、MCI(2名/124名: 1.6%)、認知症(2名/34名: 5.9%)であった。平成30年以降は、CAA型微小出血を認めた認知機能健常者についてアミロイドPETを実施し、プレクリニカルCAA群を同定し追跡調査を実施していく。頭部MRI検査〔全国規模で実施している大規模認知症コホート研究(平成28-32年度)の一環として実施〕が予算やMRI搭載車レンタル日程等の都合で検査実施時期がやや遅くなっており、平成30年4月平成31年3月にMRI撮像を約400件予定している。引き続きプレクリニカルCAA群の同定、有病率の検討を進めていく。

本研究は皮質微小出血とアミロイドPETの両方が陽性の認知機能正常者をプレクリニカルCAAと定義し、地域在住高齢者におけるプレクリニカルCAAの前向き縦断研究を行い、プレクリニカルCAAの有病率及び症候性・無症候性の脳血管障害及び認知機能障害の発症リスクと危険因子・防御因子を明らかにする。また、プレクリニカルCAAに関する血液バイオマーカーを開発する。平成30年度は認知症の前向き地域コホート研究(地域在住60歳以上対象)で大脳あるいは小脳皮質のみに限局する微小出血(CAA型微小出血)を示す健常者を抽出した。平成31年3月までに認知機能検査とMRI(T2*画像を含む)とを1137名で実施した。CAA型微小出血を認めたのは28名(2.5%)であった。認知機能別のCAA型微小出血例の割合は、正常認知機能(21名/889名: 2.3%)、MCI(4名/205名: 1.9%)、認知症(3名/43名: 7.0%)であった。脳表ヘモジデリン沈着症を認めた例はなかった。CAA型微小出血を認めた認知機能正常者3名についてアミロイドPETを実施し、うち1名で皮質アミロイド沈着をみとめた。CAA型微小出血の有病率は台湾で行われた地域高齢者を対象とした疫学研究の5.1%、ロッテルダム研究の10.9 %と比べて少なかった。平成31年以降は、皮質のみに微小出血を認めた認知機能健常者について引き続きアミロイドPETを実施し、プレクリニカルCAA群を同定し追跡調査を実施していく。前向き地域コホート研究で保存して血液検体を用いてプレクリニカルCAA群、微小出血なし群の血液検体を用いて血液バイオマーカーを開発する。平成29年度に頭部MRI検査〔全国規模で実施している大規模認知症コホート研究(平成28-32年度)の一環として実施〕が予算やMRI搭載車レンタル日程等の都合で検査実施時期が遅れたため、アミロイドPET検査の対象者抽出が遅くなった。平成31年度はアミロイドPETをなるべく多く実施し、プレクリニカルCAA群の同定、有病率の検討を進めていく。平成29年度までの頭部MRI検査で皮質のみに限局する微小出血を認めた認知機能健常者についてアミロイドPETを実施し、微小出血部位にアミロイドの沈着がみられるかを確認する(皮質微小出血とアミロイドPETの両方が陽性の認知機能正常者をプレクリニカルCAA群と定義する)。平成30年1月以降に新たに頭部MRI検査とアミロイドPETを行い同定したプレクリニカルCAAと合わせて追跡調査を実施していく。頭部MRI検査で皮質のみに限局する微小出血を認めた認知機能健常者についてアミロイドPETを実施し、微小出血部位にアミロイドの沈着がみられるかを確認する(皮質微小出血とアミロイドPETの両方が陽性の認知機能正常者をプレクリニカルCAA群と定義する)。同定したプレクリニカルCAAと合わせて追跡調査を実施していく。頭部MRI検査の時期が遅くなったため、アミロイドPET検査の対象者抽出が遅くなり平成29年度はアミロイドPETを実施できなかった。平成30年度に行うアミロイドPETの費用及びPET検査施設までの送迎費用として使用予定である。頭部MRI検査の時期が遅くなったため、アミロイドPET検査の対象者抽出が遅くなり平成30年度はアミロイドPETを少数例でしか実施できなかった。
新規アルツハイマー病標的膜タンパク質が誘導する成熟神経細胞の死の研究

アルツハイマー病ではアミロイドβ(Aβ)が凝集し異常構造体を形成し、神経毒性を獲得する。代表者らは、アルツハイマー病(AD)患者脳より世界で初めて、神経細胞死の直接原因となる異常構造体Aβ凝集体「アミロスフェロイド(ASPD)」の単離に成功し、さらにその標的分子として成熟神経細胞にのみ発現するシナプス膜タンパク質を新たに同定した。本研究では動物個体、患者脳、成熟神経細胞を用いて総合的に検証することで、ASPDが標的分子の機能を阻害し、異常なカルシウム流入により細胞死を起こすことを分子レベルで解明した。さらに標的分子が新規の創薬ターゲットになることも解り、新たな創薬への基盤を提示出来た。アルツハイマー病ではアミロイドβ(Aβ)が凝集し異常構造体を形成し、神経毒性という異常機能を獲得する。代表者らは、アルツハイマー病(AD)患者脳より世界で初めて、神経細胞死の直接原因となる異常構造体Aβ凝集体「アミロスフェロイド(ASPD)」の単離に成功した(Noguchi et al,JBC2009)。さらに、最近我々は、ASPD毒性の標的分子として、新たな成熟神経細胞にのみ発現するシナプス膜タンパク質を同定した。本研究の目的は、この新規標的分子の機能を解明し、ASPDによる標的分子の障害がアルツハイマー病発症の分子病態を説明しうるかを、動物個体、患者脳、成熟神経細胞を用いて総合的に検証する。そのため以下3つの課題達成を目指す。課題1:標的分子の中枢神経特異的ノックアウトを作製し、個体及び細胞レベルで標的分子の機能を解析し、ASPDによる神経細胞死の作用点であるかを検証する。課題2:標的分子の分布、存在量、機能が、患者の重症度やASPD量と相関するかを検証する。課題3.:標的分子による細胞死シグナルグナルの分子レベルでの理解、特にアルツハイマー病のもう一つの特徴であるタウの異常との関連を解明する。初年度の成果として、標的分子の中枢神経特異的ノックアウトを作製し、個体作出を行った(課題1)。また、ASPDは標的分子の機能を阻害することで異常なカルシウム流入を神経細胞に引き起こし、その結果、神経細胞死を誘導することを明らかにした(論文投稿準備中、課題3)。また患者脳を用いた解析でも上記を支援する結果が得られた(課題2)。上記により、今までは説明が出来なかった神経細胞が損傷される原因とその機序について、初めて明快な説明が可能となった。さらに、今回初めて見出されたASPD標的分子が、新規の創薬標的となりうることが示され、新たな創薬への基盤を呈示した。アルツハイマー病(AD)ではアミロイドβ(Aβ)が凝集し異常構造体を形成し、神経毒性を獲得する。代表者らは、患者脳より世界で初めて、神経細胞死の直接原因となる異常構造体「アミロスフェロイド(ASPD)」の単離に成功(Noguchi et al, JBC2009)、さらに最近、ASPD毒性の標的分子として、新たな成熟神経細胞にのみ発現するシナプス膜タンパク質を同定した。そのため以下3つの課題達成を目指した。最終年度の成果として、標的分子の中枢神経特異的ノックアウトを作製したが、この個体では神経が形成されないことから、新たにウィルスベクターにmiRNAを入れたところ、ASPDによる標的分子の阻害と同様に神経細胞死が起こることを示し、細胞を使ったキネティクスの解析結果と合わせて、標的分子がASPDの作用点であることを示した(課題1)。患者脳では標的分子が減少することを組織染色及びin situで示した(課題2)。また、ASPDは標的分子の機能を阻害することで異常なカルシウム流入を神経細胞に起こし、ミトコンドリアの異常及びタウの異常を起こして、神経細胞死を誘導することを明らかにした(課題3)。上記により、当初計画をしていた全ての課題を達成した。さらに、今までは説明が出来なかったAD脳において神経細胞が損傷される原因とその機序について、初めて明快な説明が可能となり、論文をNat Communicationsに投稿した。また、新たな知財も出願している。さらに、ASPD標的分子が、新規の創薬標的となりうることが示され、新たな創薬への基盤を呈示することが出来た。

代表者らは、アルツハイマー病(AD)患者脳より世界で初めて、神経細胞死の直接原因となる異常構造体Aβ凝集体「アミロスフェロイド(ASPD)」の単離に成功した(Noguchi et al, JBC2009)。さらに、最近我々は、ASPD毒性の標的分子として、新たな成熟神経細胞にのみ発現するシナプス膜タンパク質を同定した。本研究の目的は、この新規標的分子の機能を解明し、ASPDによる標的分子の障害がアルツハイマー病発症の分子病態を説明しうるかを、動物個体、患者脳、成熟神経細胞を用いて総合的に検証する。そのため以下3つの課題達成を目指す。課題1:標的分子の中枢神経特異的ノックアウトを作製し、個体及び細胞レベルで標的分子の機能を解析し、ASPDによる神経細胞死の作用点であるかを検証する。課題2:標的分子の分布、存在量、機能が、患者の重症度やASPD量と相関するかを検証する。課題3:標的分子による細胞死シグナルグナルの分子レベルでの理解、特にアルツハイマー病のもう一つの特徴であるタウの異常との関連を解明する。今年度の成果として、標的分子の中枢神経特異的ノックアウトを作製し、個体作出を行った(課題1)。患者脳で標的分子の発現が低下していることを示した(課題2)。また、ASPDは標的分子の機能を阻害し神経細胞死を誘導することを明らかにし、結合阻害により毒性を阻止出来ることを見出した(学会発表、知財、論文投稿準備中、課題3)。上記により、今までは説明が出来なかった成熟神経細胞が損傷される原因とその機序を明らかにした。さらに、新たな創薬への基盤となるシーズを実際に見出すことに成功した。ASPD毒性について論文にし、また形成機構について学会発表を踏まえて、論文投稿中である。設定した課題1,2,3の全てにおいて初年度の計画を予定通り進めることが出来たため。25年度が最終年度であるため、記入しない。各課題について、課題1のノックアウト動物については、ハウスキーピング遺伝子であるため機能解析が出来る成熟神経細胞が取ることは困難そうであるが、細胞レベルでの解析を目的どうり達成することが出来た。課題2については、予定どおり患者脳内での発現解析をin situを用いて実施し、予定を達成出来た。。課題3については、機能解析のみならず、阻害剤候補まで今年度同定出来たので、予想より進行している。上記のとおり、設定した課題1,2,3の全てにおいて初年度の計画を予定通り進めることが出来たと考えている。課題1新規標的分子の動物における機能解析予定通り、標的分子のノックアウトの解析を実施する。細胞レベルの解析から標的分子をノックアウトすると、成熟した機i能的神経がそもそも得られない可能性も出てきたため、siRNAなどを活用したノックダウン系についても取り組んでいく。課題2新規標的分子の患者脳での病態解析初年度に選別し条件を確立した抗体を用いて、患者脳において標的タンパク質の機能や存在量が疾患の重症度やASPD量と相関するかを免疫組織化学的・生化学的に検証する。課題3新規標的分子による神経細胞死分子機構の解明初年度でASPD毒性を阻止出来た阻害剤を活用して、成熟神経細胞において標的分子の下流のシグナル伝達機構を解明し、タウの異常へと至るシグナル伝達経路を解明し、アミロイドとタウの関係を明らかにする。研究成果は知財化した上で積極的に発表していく。課題
光脱離過程によるラジカルの生成と構造に関する研究

本研究の目的は、(1)ラジカル負イオンの光脱離過程を利用して、中性化学種の反応では生成することが不可能な中性ラジカルや高励起状態のラジカル種を生成する経路を見つけ出す、(2)光電子分光法によって、それらラジカル種の構造に関する知見を得ることであった。そこで、中性ラジカルの前駆体となる負イオン種の生成法として、分子クラスター負イオンを反応試材に用いる方法を開発した。この方法では、クラスターに特有なエネルギー緩和過程によって反応熱を効率よく取り除くことができるため、通常のイオン-分子反応では得ることができない反応中間体イオンを生成することができた。さらに、光電子分光法を用いて、前駆体負イオンの構造について知見を得た。実例として、(CO_2)_nとCH_3Iとの反応では、(CO_2)_nが親核試材としてCH_3Iを攻撃しO=C-O^-基が直接導入されることを見いだした。さらに、生成した負イオン[CO_2CH_3I]^-の光電子スペクトルを測定することによって、この負イオン種が[CH_3CO_2...I]^-のような電子構造を持つ新奇な電荷共鳴錯体であることを明らかにした。O^-(N_2O)_nとCH_3Iとの反応では、S_N2反応の中間体と考えられる[CH_3O...I]^-構造を持つ負イオン種、および水素引き抜き反応の中間体と考えられる[OH...CH_3I]^-構造を持つ負イオン種を得た。これらの反応中間体負イオンは紫外領域のレーザー光を吸収して容易に中性ラジカルを生成するが、そのラジカル種は中間体負イオン内での幾何構造を反映して、高励起振動状態や準安定状態にあると予想される。今後、さらに分解能の高い光電子分光法を用いてラジカル種の内部状態や構造に関する情報を得る。
ポスト狩猟採集社会における文化変容に関する人類学的研究

本研究の目的は、アフリカ狩猟採集社会における文化変容を、仮面儀礼や音楽舞踊の実践といった人々の社会的相互行為の実態に即して解明することである。また調査地域の現状を記録し、後年、文化変容の比較研究がおこなえるようにビデオによる撮影を行い、民族誌映画(記録映画)を作成することも目的としている。本年度は、カメルーン共和国において仮面儀礼や音楽舞踊、集落の人口動態や歴史に関する聞き取り調査をおこない、あわせて撮影もおこなった。また、映像による記録とその活用について知見を深めるため、ニューヨーク(USA)で開催された世界屈指の民族誌映画祭(Margaret Mead Film and Video Festival)に参加し、情報の収集と関係者との情報交換をおこなった。また、報告者の制作した民族誌映画を国内外の上映会、映画祭で上映し、専門家、一般の観衆とともに討議を重ねた。本年度の成果としては、「カメルーン東部州、バカ・ピグミー社会における音楽の実践と継承」という題目で、ポスト狩猟採集社会の文化変容の一面を仮面儀礼や音楽舞踊の実践の分析から明らかにした論文を発表した。また、バカ・ピグミー社会において最も重要視されている「ジェンギ」という精霊儀礼と音楽舞踊に関する民族誌映画『Jengi』を制作し、日本アフリカ学会、日本文化人類学会の学術大会において上映し討議した。同作品は、2008年3月に沖縄大学で開催された日本映像民俗学の会でも上映され、5月にはドイツのゲッティンゲンで開催される国際民族誌映画祭でも上映されることになっている。また、その後ヨーロッパ諸国で上映される予定である。本研究は、アフリカ狩猟採集社会の文化変容を継続的に明らかにするため、現状を映像によって記録し、視聴覚資料を蓄積することを目的のひとつとしている。また、制作した映像民族誌は、比較・参考の有効な資料として、多くの研究者に視聴されることが望まれる。そのため、2005年5月29日に開催された日本アフリカ学会第42回学術大会において、「映像フォーラム」という部門を主催し映像民族誌の上映と質疑応答を行った。また、12月23日に開催された京都人類学研究会においても、同様に上映と質疑応答を行った。さらに、海外においても2006年3月10日から19日にかけてフランス、パリで開催された国際ドキュメンタリー映画祭(Cin ma du R el)に作品が入選し、招待上映と質疑応答が行われ、広く一般に研究成果を発表する機会を得た。2005年の8月から9月にかけて実施したカメルーン共和国東部州における調査では、1996年以来継続しているBakaの人口動態の調査を行い、さらに政府機関においても人口統計資料の収集を行った。また、仮面儀礼や音楽舞踊、儀礼と密接な「精霊」に関するインタヴュー調査を実施し、近年の実践状況や人々の認識の変化に関する資料を得た。また、ビデオによる音楽実践の撮影も併せて行った。これらの研究成果の一部は、「木霊する森-ピグミーと精霊-」と題する論文として(「神奈川大学評論」第51号掲載)、また、「ピグミーの森の音楽」と題するエッセイとして(「ソトコト」12月号掲載)発表した。また、3月に滞在したフランスでは、中央アフリカの狩猟採集社会に関する資料を収集するとともに、民族音楽学者をはじめとする研究グループ(Centre National de la Recherche Scientifique)の会合に参加し、発表・討論を行った。また調査地域の歴史の解明や、現状を記録するためのビデオによる撮影、民族誌映画の作成も重要な目的としている。本年度は、カメルーン共和国において現地調査をおこなうと共に、映像による記録とその活用について知見を深めるため海外の映画祭にも参加した。現地調査では、継続的におこなっている仮面儀礼や音楽舞踊の調査や、調査村の人口動態や地域史に関わる聞き取り調査、ならびにビデオによる撮影をおこなった。本年度の成果としては、アフリカ狩猟採集社会の文化変容の一面を仮面儀礼や音楽舞踊の実践の分析から明らかにした研究は、『ポスト狩猟採集社会の文化変容-仮面儀礼の受容と転用-』という題目で、学術誌「アジア・アフリカ地域研究」に投稿し掲載された。また、民族誌映画の制作の経緯や問題点、可能性を記した論文「『他者』としての私を撮る-カメルーン、森の民とともに-」は、共著書の一章として出版された。映画祭等への参加としては、アムステルダムで開催されたBeeld voor Beeld映画祭ににおいて、危機的な状況にある文化を映像によって記録するプロジェクトと、熱帯博物館における視聴覚資料による無形文化財の展示に関するセミナーに参加したこと。アフリカの映像作家と協働し、アフリカ地域において映像記録を活用する可能性を探るためにブルキナファソ、ワガドクで開催されたアフリカ最大の映画祭FESPACOに参加したことが挙げられる。その他にも、本研究に関する発表は、日本アフリカ学会、日本文化人類学会、日本マスコミ学会、各種研究会において行った。

また、映像による記録とその活用について知見を深めるため、ニューヨーク(USA)で開催された世界屈指の民族誌映画祭(Margaret Mead Film and Video Festival)に参加し、情報の収集と関係者との情報交換をおこなった。また、報告者の制作した民族誌映画を国内外の上映会、映画祭で上映し、専門家、一般の観衆とともに討議を重ねた。本年度の成果としては、「カメルーン東部州、バカ・ピグミー社会における音楽の実践と継承」という題目で、ポスト狩猟採集社会の文化変容の一面を仮面儀礼や音楽舞踊の実践の分析から明らかにした論文を発表した。また、バカ・ピグミー社会において最も重要視されている「ジェンギ」という精霊儀礼と音楽舞踊に関する民族誌映画『Jengi』を制作し、日本アフリカ学会、日本文化人類学会の学術大会において上映し討議した。同作品は、2008年3月に沖縄大学で開催された日本映像民俗学の会でも上映され、5月にはドイツのゲッティンゲンで開催される国際民族誌映画祭でも上映されることになっている。また、その後ヨーロッパ諸国で上映される予定である。
ヒト女性乳癌における男性ホルモン、アンドロゲンの局所産生と作用機序の解明

(抄録なし)乳癌多くの症例でエストロゲン受容体/プロゲステロン受容体の発現が認められ、エストロゲン依存性の増殖を示す。従って、抗エストロゲン阻害剤が治療薬として用いられる。また、HER2陽性症例についても同様にその阻害剤が効果を示す。一方これらの治療標的因子のいずれもが発現しない症例(Triple Negative Breast Cancer: TNBC)では、特異的治療法がなく、TNBCに対する新たな標的因子の発見が待たれる。本研究ではアンドロゲンの作用に注目し、TNBC(n=208)におけるアンドロゲン受容体(AR)、アンドロゲン合成酵素(5αreductase type 1:5αR1;17βhydroxysteroid dehydrogenase tipe 5:17βHSD5)の発現について免疫組織化学にて評価し、その意義について統計学的に検討した。結果:5αR1陽性症例では有意にAR発現が高く、同様の傾向は17βHSD5でも確認することができた。また、癌細胞増殖のマーカーとしてKi-67の発現を同様に評価し、これら因子との関係を解析した結果、5αR1とARの発現が共に高い症例では、AR低発現5αR1高発現もしくはAR低発現5αR1低発現症例と比較して有意にKi-67の発現が低いことが明らかとなった。5αR1は癌組織局所でのアンドロゲン濃度に寄与すると考えられ、5αR1高発現症例では局所でのアンドロゲン濃度が高いと推測される。さらに、ARの発現を伴うことにより局所で合成されたホルモンはアンドロゲン作用を発揮すると考えられる。今回の結果から、アンドロゲン作用は癌細胞の増殖抑制に働くと考えられ、TNBCの新たな治療に向けた標的因子となる可能性が示唆される。エストロゲン受容体(ER),プロゲステロン受容体(PR)および乳癌増殖因子であるHER2が発現していないtriplenegative breast cancer(TNBC)と位置付けられる患者群では特異的治療法がない事からその臨床予後は決して良好ではない。一方、乳癌細胞の網羅的遺伝子発現研究からこれらTNBC患者の中に男性ホルモンであるアンドロゲンに対し感受性がある一群が含まれている事が示された。アンドロゲンがTNBCに対して促進的あるいは抑制的に作用するのかどうか、TNBC症例の中でどの患者がアンドロゲン治療の対象になるのかなど根本的なところでの不明点が多い。そこで本研究では本邦の女性TNBC症例で男性ホルモンであるアンドロゲンがどのような作用を及ぼしているのかを腫瘍局所でのホルモン合成、代謝動態も含め総合的に検討し、TNBC患者に対し新たな特異的内分泌療法の基盤を確立させる事を目的とした。TNBC症例からAR陽性、陰性症例の腫瘍内アンドロゲン合成動態の詳細を解明した。これらの成果の論文はCancer Scienceにて発表した。本研究の新規性および重要性が認められ、米国内分泌学会において優秀ポスター発表賞を受賞した。その他様々な学会に出席し、非浸潤性乳管癌(DCIS)患者およびリンパ節転移乳癌患者におけるアンドロゲンの特徴とアンドロゲン代謝酵素についての研究成果を公表した。また、乳癌培養細胞MDA-MB-231細胞を用い、AR陽性と陰性のTNBC組織から単離した間質/線維芽細胞との共培養系を確立させる為の実験を始めたところである。当初の計画通り、ARの免疫組織化学をTNBC208症例で行い、TNBCにおけるARの発現意義を明らかにできた。計画では300症例の予定であったが、次年度に計画していた5αR1、17βHSD5の発現までを検討する事が出来たので、「おおむね順調に進展している」と判断した。臨床データの解析は1頂調に進んだが、培養細胞を用いた実験は、細胞の増殖が遅い為、やや時間が掛かっている。その他については当初立てた研究計画通りに進めることができた。今年度からさらに症例数を増やし、目標の300症例での解析を目指す。症例については東北大学病院、さらにはマヒドール大学(タイ)の症例を使用することで同意が得られている。これらの症例のうち予後が明らかな症例を用いて、アンドロゲン作用の予後におよぼす影響を検討する。また、本邦とタイの症例間での差異に関する検討へと研究の発展が見込まれる。当初の計画通り進める予定であるが、共培養系を確立させる為の実験に関しては最適条件の検討が必要である。平成25年度の国際および国内の学会において成果報告を積極的に行い、併せて論文の執筆も行う。(抄録なし)
周期性四肢麻痺の新規遺伝子探索と病態解明

骨格筋イオンチャネル病の中で、病態がもっとも未解明な周期性四肢麻痺を中心に、遺伝学的・病態生理学的解析を行った。家族歴を認めず遺伝性と考えられていなかった孤発性周期性四肢麻痺について、一塩基多型の解析を行い、遺伝的背景の存在を明らかにした。また、疾患原性が疑われる複数の変異を有する症例を見出し、両変異による機能異常が重症化に寄与していることを示した。同様の症例は網羅的遺伝子解析の普及により今後ますます見出される可能性が高い。これらの研究成果はレアバリアントによる症状修飾というチャネル病のあらたな病態機序を示した点で重要である。イオンチャネル病の中でも、もっとも病態が未解明な低カリウム性周期性四肢麻痺について、生理学および遺伝学的手法を用い、新たな原因遺伝子の探索、病態メカニズムの解明を行った。遺伝学的検討としては、骨格筋型Na、Caチャネル、Kir3.Xファミリーについてサンガー法で全エクソン領域の解析を行うとともに、次世代シークエンサによるターゲットリシークエンシングの系を構築し解析を行った。現在のところ低カリウム性周期性四肢麻痺に関しては新たな原因遺伝子は同定されていないが、次世代シークエンサによる解析で反復発作性運動失調症2型の2家系でこれまでに報告のない新規変異を同定することができた。いっぽう生理学的解析としては、骨格筋型NaチャネルとClチャネルの両者に変異を有する稀有な症例を経験したことから、培養細胞に変異チャネルを発現させパッチクランプ法でチャネル機能を解析した。有症状の親にClチャネルの変異のみしか存在せず、重症な子で見られた変異Naチャネルの解析で活性化の障害が明らかになったことから、NaチャネルとClチャネルの両者の機能異常が相加・相乗的に寄与し重症化につながっていることが示唆された。いっぽう、広義のイオンチャネル病でもある筋強直性ジストロフィーの心臓伝導障害についてフランス、ドイツ、アメリカの研究者らと国際共同研究を行い、成果を論文発表することができた。剖検組織で心筋型Naチャネルのスプライス異常が存在し、変異チャネルが活性化の障害を示すこと、シミュレーションにて伝導障害が生じうることまで示すことができた。また、低カリウム性周期性四肢麻痺について、以前同定したゲーティングチャージが不変の変異についても現在電気生理学的に機能解析を行っている。遺伝子解析については想定以上の結果がでている。計画では、サンガーシークエンシングの後にエクソムシークエンスを行う予定であったが、次世代シークエンサによるターゲットリシークエンシングの系も構築し、中枢神経系のイオンチャネル病である反復発作性運動失調症2型の新規変異を同定することができた。生理学的解析については、計画のKir3.xファミリーの骨格筋における生理的機能の解析、ゲーティングチャージが不変の変異の機能解析について解析中である。生理学的解析には時間を要するため、想定どおりである。いっぽう、筋強直性ジストロフィーの心臓伝導障害の機序など、計画にはなかった成果も結実している。骨格筋のイオンチャネル病は、周期性四肢麻痺と非ジストロフィー性ミオトニー症候群とに分けられる。周期性四肢麻痺、中でも低カリウム性周期性四肢麻痺(hypoPP)の原因や病態が十分に解明されていないことから、生理学および遺伝学的手法を用い病態メカニズムの解明を行った。hypoPPの遺伝的原因は、骨格筋型電位依存性NaチャネルあるいはCaチャネルの電位センサー部位に規則的に配列する塩基性アミノ酸、Argが、中性アミノ酸に置換するものが大部分である。しかしながら臨床的にhypoPPと診断される症例のうち、2/3以上で、これら既知原因遺伝子変異を認めない。それらの症例のほとんどが、家族歴が無く、甲状腺機能も正常である、いわゆる孤発性低カリウム性周期性四肢麻痺である。甲状腺中毒性低カリウム周期性四肢麻痺において、疾患感受性一塩基多型(SNP)が複数報告されたことから、我々の蓄積する孤発性周期性四肢麻痺の検体についても検討した。すると、孤発性周期性四肢麻痺においても、これらのSNPの遺伝子頻度が、正常対象に比し優位に高いことが明らかとなった。これらのSNPは、周期性四肢麻痺の原因であるKCNJ2遺伝子の近傍に存在することから、病態に直接関与する可能性が高い。また、遺伝性のhypoPPの症例において、既知遺伝子のArgの変異であるが、同じ塩基性アミノ酸であるLysに置換する変異を見出した。このチャネルの機能について電気生理学的解析を行った。ゲーティングポア電流の軽度の増加が認められており、詳細な解析を継続している。また、チャネル機能解析を以前から継続していた骨格筋型NaチャネルとClチャネルの両者に変異を有する非ジストロフィー性ミオトニー症候群の症例については、NaチャネルとClチャネルの両者の機能異常が相加・相乗的に寄与し重症化につながっていることが明らかになり、論文報告した。計画では、サンガーシークエンシングの後にエクソームシークエンスを行う予定であったが、一塩基多型の解析で今後の病態解明につながる結果が得られた。生理学的解析については、電位センサーのゲーティングチャージが不変の変異のチャネル機能についてデーターが得られてきている。骨格筋のイオンチャネル病は、周期性四肢麻痺と非ジストロフィー性ミオトニー症候群に大別される。計画通り、病態が未解明な低カリウム性周期性四肢麻痺(hypoPP)について、生理学的・遺伝学的手法を用い、新たな原因遺伝子の探索、病態メカニズムの解明を行った。さらに、骨格筋の関連疾患や中枢神経のチャネル病についても対象を拡げ研究を行った。

遺伝学的検討としては、サンガー法による各チャネル遺伝子の解析に加え、次世代シークエンサによるターゲットリシークエンスやエクソームシークエンスの系を構築し網羅的解析を行った。遺伝性のhypoPPにおいて、既知のArg残基であるものの、同じ塩基性アミノ酸(Lys)に置換する変異を見出した。電気生理学的解析により、チャネルのゲーティングポア電流の増大を認めたことから、ゲーティングポア生成のメカニズムについてあらたな知見を見出した。複数の原因チャネル遺伝子に疾患原性が疑われる変異を見出し、両変異による機能異常が相加・相乗的に重症化に寄与していることを生理学的に示した。同様の症例は網羅的遺解析の普及により今後ますます見出される可能性が高い。さらに、非遺伝性と考えられていた、孤発性周期性四肢麻痺において、周期性四肢麻痺の原因として知られるKCNJ2遺伝子近傍の一塩基多型(SNP)のマイナアレル頻度が、優位に高いことを明らかにし、遺伝的背景が存在することを明らかにした。存在部位から考えると、このSNPが病態に直接関与する可能性が高い。脳のチャネル病のひとつである反復発作性失調症についても研究を拡げ、エクソーム解析で未報告の変異2例を同定した。広義の骨格筋チャネル病でもある筋強直性ジストロフィーの心臓伝導障害について、仏、独、米国との国際共同研究を行い、心筋型Naチャネルのスプライス異常が原因であることも明らかにした。骨格筋イオンチャネル病の中で、病態がもっとも未解明な周期性四肢麻痺を中心に、遺伝学的・病態生理学的解析を行った。家族歴を認めず遺伝性と考えられていなかった孤発性周期性四肢麻痺について、一塩基多型の解析を行い、遺伝的背景の存在を明らかにした。また、疾患原性が疑われる複数の変異を有する症例を見出し、両変異による機能異常が重症化に寄与していることを示した。同様の症例は網羅的遺伝子解析の普及により今後ますます見出される可能性が高い。これらの研究成果はレアバリアントによる症状修飾というチャネル病のあらたな病態機序を示した点で重要である。遺伝子解析について、サンガー法、次世代シークエンサによるターゲットリシークエンシングでスクリーニングを行ったうえで、予定通りエクソームシークエンスを行い周期性四肢麻痺および関連疾患の原因遺伝子解析を進めていく。生理学的解析については、計画のKir3.xファミリーの骨格筋における生理的機能の解析、ゲーティングチャージが不変の変異の機能解析について次年度も継続して行っていく予定である。
食餌誘導性脂肪肝マウスに由来する新規な脂質代謝関連遺伝子の機能解析

高脂肪食摂取によって著明な脂肪肝を呈するモデルマウス(SMXA-5)を用いた遺伝解析により脂肪肝感受性遺伝子座(Fl1sa)を第12番染色体に見出し、その候補遺伝子として機能未知なIah1に注目した。Iah1遺伝子と脂肪肝形成との関係性を明らかにするために、全身性Iah1遺伝子欠損マウスの作製を行って高脂肪食を負荷したところ、Iah1遺伝子発現量の低下が脂肪肝発症に関与することが示唆された。また、Iah1遺伝子の上流領域に約100 bpの欠失、約400bpの挿入変異をもつマウス系統では、Iah1発現レベルが低いことを明らかにした。本研究では、各個人の遺伝的素因に栄養状態の変化が加わる遺伝子ー食事因子間の相互作用によって発症が増加している生活習慣病の中でも脂肪肝に注目している。今までの研究からモデルマウスを用いて、食餌誘導性脂肪肝の原因遺伝子の候補遺伝子Iah1を抽出したが、この遺伝子の哺乳動物における機能についての報告は存在せず、機能未知な遺伝子である。今年度は、以下の3つの研究に着手した。1Iah1タンパク質の機能解析(in vitro):マウスIah1タンパク質を培養細胞において発現させ、組換えタンパク質の精製を行なった。酵母Iah1の基質であるエステルに対して酵母Iah1組換えタンパク質の酵素活性を測定したところ、既報のようにエステラーゼ活性を確認することができた。この測定系において、マウスIah1組換えタンパク質を酵素として用いてエステラーゼ活性の測定を行なったが、酵素量が充分でなくエステラーゼ活性の有無を評価することが出来なかった。2Iah1遺伝子転写調節領域の同定(in vitro):我々が昨年度までに見出したIah1遺伝子の上流に存在する119bpの欠失変異を有するDNA領域をクローニングし、プロモーターアッセイを行なった。119bpの欠失を有するマウスの肝臓ではIah1の遺伝子発現量が低値を示すことから、欠失配列では正常配列に比べてプロモーター活性の低下を期待したが、両配列間でプロモーター活性に差は観察されなかった。この欠失は遺伝子発現量制御には関与しないと考えられた。3Iah1遺伝子の肝臓特異的欠損による脂肪肝形成の検証(in vivo): Iah1遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを作製するために、IKMCよりIah1エクソンを挟んでloxP配列を有するターゲッティングマウスを入手した。そして、肝臓特異的にCreを発現するマウスについても入手し、交配に着手した。食事因子と遺伝因子との相互作用によって発症する食事誘導性脂肪肝の原因遺伝子を探索するために、脂肪肝モデルマウスSMXA-5を用いて研究に取り組んできた。このモデルマウスの遺伝解析より見出されたマウス第12番染色体上の脂肪肝感受性遺伝子座Fl1saの候補遺伝子としてIah1を抽出したが、この遺伝子の哺乳動物における機能についての報告は存在せず、機能未知な遺伝子であった。今年度は、以下の2つの面からの機能解析を行った。昨年度はIah1タンパク質の精製量が不十分だったことから、His-tag融合マウスIah1タンパク質を大腸菌に発現させ、His-trapカラムで精製する方法に切り替えた。これによって、組換えタンパク質の大量精製が可能となった。パラニトロフェノールと炭素数の異なる脂肪酸とのエステルに対して酵母およびマウスIah1組換えタンパク質のそれぞれの酵素活性を測定したところ、炭素数2のエステル基質でのみエステラーゼ活性を確認した。これによりパラニトロフェニルエステルを基質として用いた場合には、酵母とマウスのIah1は共にエステラーゼ活性が低く、酵素活性を評価する基質として適切ではない可能性が示された。そこで、炭素数の異なるアルコールと酢酸のエステルを基質として用いたところ、酵母とマウスのIah1は炭素数6までのアルコールと酢酸のエステルに対して、同等の活性を示すことが明らかとなった。2Iah1遺伝子のノックアウトマウスにおける脂肪肝形成の検証(in vivo)昨年度入手したloxP配列を有するIah1ターゲッティングマウスと全身でCreを発現するマウスを交配して、全身Iah1ノックアウトマウスの作製に成功した。腎臓、肝臓、肺、小腸でのIah1タンパク質発現が欠損していることを確認した。脂肪肝モデルマウスSMXA-5は高脂肪食の摂取により脂肪肝を呈する。このモデルの脂肪肝感受性を決定する責任遺伝子を同定するために研究に進めている。遺伝解析により、マウス第12番染色体上の高脂肪食誘導性脂肪肝感受性遺伝子座Fl1saを同定して、その領域の候補遺伝子としてIah1を抽出した。しかし、Iah1遺伝子の哺乳動物における機能についての報告は存在せず、機能未知な遺伝子であった。今年度は、1昨年度作製した候補遺伝子Iah1の全身ノックアウトマウスの機能解析に着手した。同時に肝臓特異的なIah1のノックアウトマウスの作製を進めた。また、2Iah1遺伝子の発現調節機構を解明するためにプロモーター領域のルシフェラーゼアッセイを行った。1Iah1遺伝子のノックアウトマウスにおける脂肪肝形成の検証(in vivo)昨年度、loxP配列を有するIah1ターゲッティングマウスと全身でCreを発現するマウスを交配して、全身Iah1ノックアウトマウスの作製に成功した。このマウスは腎臓、肝臓、肺、小腸でのIah1タンパク質発現が欠損している。今年度は、このマウスを高脂肪食で12週間飼育して、血中脂質と肝臓脂質の測定用にサンプルの採取を行った。肝臓特異的なIah1ノックアウトマウスも作製にも取り組んだ。2Iah1遺伝子転写調節領域の同定(in vitro)Iah1

発現量の低いA/Jマウスにおいて、Iah1遺伝子の上流に約400bpの挿入配列を発見した。そこで、この挿入変異を含む転写開始点の約900bp上流のプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイで確認したが、この領域の変異は転写には影響しなかった。そのため、Iah1の転写調節にはさらに上流の変異が関与していると考えられた。1Iah1遺伝子のノックアウトマウスにおける脂肪肝形成の検証(in vivo)今までにloxP配列を有するIah1ターゲッティングマウスと全身でCreを発現するマウスを交配して、全身Iah1ノックアウトマウスの作製に成功した。このノックアウトマウスの表現型解析には、雄、雌の野生型、ヘテロノックアウト、ホモノックアウトの6群を用いるために、ヘテロの雌雄個体を交配した。得られた各遺伝子型を12週間高脂肪食で飼育し、血中脂質、肝臓脂質測定用のサンプルを採取した。しかし、ヘテロ同士の交配の繁殖が予想していたよりも悪かったため、今年度中に解析に充分な個体数を得ることが出来なかった。そのため、今年度までに予定していた実験に遅れが生じ、本研究期間を1年延長して平成28年度にIah1遺伝子と脂肪肝形成との関係性を明らかにすることにした。全身でのIah1遺伝子欠損の場合、肝外組織におけるIah1遺伝子が2次的に肝臓に作用して肝臓脂質蓄積に影響を及ぼしている可能性がある。そこで肝臓特異的ノックアウトマウスについても作製を進めており、こちらも平成28年度に表現型解析を行う予定である。2Iah1遺伝子転写調節領域の同定(in vitro)Iah1遺伝子の転写開始点ー900bpの領域にA/Jマウスでは約400bpの挿入配列、約120bpの欠失配列を同定した。この2種の大規模な変異について、レシフェラーゼアッセイで転写活性能を評価し、これらがA/JマウスのIah1発現量低下に関与する可能性が低いことを明らかにすることが出来た。しかし、Iah1の発現量の低下のメカニズムは未解明である。脂肪肝の感受性遺伝子座Fl1saの有力な候補遺伝子Iah1の機能解析を行うため、C57BL/6マウスの遺伝的背景でCre-loxPシステムを用いてIah1を全身において欠損するIah1ノックアウト(KO)マウスを作製して、その表現型解析を行った。同時にアルブミンCreマウスとの交配から肝臓特異的Iah1-KOマウスを作製した。本研究において作製に成功した全身性Iah1-ホモKOマウスとその同腹子のヘテロ欠損および野生型(WT)マウスを高脂肪食で11週間飼育したところ、最終体重、血中脂質濃度に有意な差は認められなかったが、肝臓トリグリセリド(TG)含量および肝臓総脂質含量がKOマウスでWTマウスに比べて高値を示した。ヘテロ欠損マウスにおいては、WTと有意な差が見られず、中間値を示した。そこで、肝臓における全身性Iah1-ホモKOによる遺伝子発現レベルの変動を網羅的に解析するために、DNAマイクロアレイ解析を行った。
ヒドラの生体制御に関与するペプチド性シグナル分子とその受容体の網羅的解析

本研究の目的は、ヒドラの生体制御に関わるペプチド分子とその受容体(Gタンパク質共役型受容体;GPCR)を同時に同定することにある。これまでにヒドラESTプロジェクトから約40種のGPCR遺伝子の全長cDNAを調整した。そのうちの9種について、これまで同定した神経ペプチド(Takahashi, et. al.2006)に対する反応を細胞培養系及びアフリカツメガエル卵母細胞を用いて調べたが同定に至らなかった。ヒドラペプチドプロジェクトにより、新たに新規神経ペプチド2種(FRamides)を同定し、その機能を解析した(Hayakawa, et. al.2007)。その結果、FRamide-1は上皮ヒドラの胴体部の内胚葉上皮筋を収縮させ、胴体を伸ばす効果を示した。一方、FRamide-2は外胚葉上皮筋を収縮させ、胴体を縮める効果を示した。同一遺伝子上にコードされている神経ペプチドが相反する機能を持つ例はこれが初めてである。この2種の神経ペプチドに対する受容体を現在同定中である。ヒドラESTデータベース上からオーファンGPCR遺伝子を抽出する過程で、アセチルコリンに対するムスカリン性アセチルコリン受容体を3種同定した。この結果は、刺胞動物における受容体とそのリガンド同定の初めての例であるということだけでなく、ヒドラにアセチルコリンが存在し、"ヒドラには古典的伝達物質のアセチルコリンは存在しない"というこれまでの定説を覆す新たな知見である。これら3種のうちの1種が、免疫組織化学的手法により刺胞細胞前駆体に局在していることを見出した。現在、この受容体の機能解析のために、トランスジェニックヒドラを作成中である。そのうちの9種について、これまで同定した神経ペプチド(Takahashi et al.,2006)に対する反応を細胞培養系及びアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて調べたが同定に至らなかった。ヒドラペプチドプロジェクトにより、新たに新規神経ペプチド2種(FRamides)を同定し、その機能を解析した(Hayakawa et al.,投稿中)。また、リガンドの候補として、マイクロアレイ及びin situハイブリダイゼーション法により、神経特異的に発現するペプチドの前駆体遺伝子を同定した。現在、この前駆体遺伝子上にある神経ペプチドの構造を推定中である。これら3種の受容体の発現細胞は今のところ不明である。そこで、これら受容体の発現細胞を同定する目的で、マイクロインジェクション法を用いてトランスジェニックヒドラの作成に着手する予定である。
多発性嚢胞腎発症におけるERストレスの役割の解明

AQP11は腎臓の近位尿細管細胞に発現しているが、AQP11ノックアウトマウスの腎臓では皮質深部の近位尿細管細胞はGRP78を過剰発現し盛んに増殖して、最終的に嚢胞を形成するのに対して、皮質表層中間層に位置する近位尿細管細胞はCHOPを発現してアポトーシスを起こして死滅していく。CHOPもGRP78もERストレス関連蛋白であることは既知であるので、これらの現象にERストレスが深く関与していることが明らかとなった。本年度も申請書に記載した「研究目的」および「研究実施計画」に基づき実験を行ったが、技術的な問題から公表するに足る結果を得ることができなかった。さらに検討を重ねて当初の目的を達成するべく努力をする一方で、並行して行っていた実験から次のような極めて興味深い知見が得られた。即ち、そもそも多発性嚢胞腎の発症には尿細管上皮細胞由来の嚢胞上皮細胞の異常増殖と、その嚢胞上皮細胞における嚢胞内へのイオンや水の積極的な分泌が必要であるが、この後者に関して主要な役割を果たしているのが嚢胞性線維症の原因遺伝子産物であるcystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein(以下CFTR)と考えられている。そこで、我々のAQP11ノックアウトマウスにおいても嚢胞形成にCFTRが関与していないかどうかを調べるため、抗CFTR抗体を用いた免疫組織染色を行った。すると、もともと正常なマウス腎の近位尿細管のS3と考えられる部位にはCFTRが発現しているが、AQP11ノックアウトマウスの嚢胞上皮細胞においてもCFTRが豊富に発現していた。従って、AQP11ノックアウトマウス腎の嚢胞形成においてもCFTRが深く関与していると推察される。Preliminaryなdataではあるが、AQP11ノックアウトマウスの嚢胞腎発症機構を明らかにするにあたり、重要な示唆を与えてくれるものと考えられた。即ち、そもそも多発性嚢胞腎の発症には尿細管上皮細胞由来の嚢胞上皮細胞の異常増殖と、その嚢胞上皮細胞における嚢胞内へのイオンや水の積極的な分泌が必要であるが、この後者に関して主要な役割を果たしているのが嚢胞性線維症の原因遺伝子産物であるcystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein (以下CFTR)と考えられている。そこで、我々のAQPllノックアウトマウスにおいても嚢胞形成にCFTRが関与していないかどうかを調べるため、抗CFTR抗体を用いた免疫組織染色を行った。すると、もともと正常なマウス腎の近位尿細管のS3と考えられる部位にはCFTRが発現しているが、AQPllノックアウトマウスの嚢胞上皮細胞においてもCFTRが豊富に発現していた。従って、AQPllノックアウトマウス腎の嚢胞形成においてもCFTRが深く関与していると推察される。Preliminaryなdataではあるが、AQPllノックアウトマウスの嚢胞腎発症機構を明らかにするにあたり、重要な示唆を与えてくれるものと考えられた。平成22年度報告書にも記載した通り、AQP11ノックアウトマウス腎の嚢胞上皮細胞にはCFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)が豊富に発現していた。そこでこれについて詳しく検討したところ、CFTRは生後14日の野生型マウスの近位尿細管上皮細胞にもある程度発現していが、AQP11ノックアウトマウス腎においては皮質深部の近位尿細管細胞で発現が大きく増強していた。以前の我々の検討からこれらの近位尿細管上皮細胞は将来的に嚢胞を形成することが判明している。従って、CFTRはAQP11ノックアウトマウスの嚢胞形成に関与していることが推察されたが、実際に生後21日になると野生型マウスにおけるCFTRの発現に変化はほとんどないものの、AQP11ノックアウトマウス腎においては皮質深部のCFTR発現細胞は嚢胞上皮となっていた。以上からCFTRの発現ととAQP11ノックアウトマウスにおける多発性嚢胞腎発症には深い関連があると判断し、CFTR阻害実験を行った。AQP11ノックアウトマウスの腹腔内にCFTRの阻害薬であるCFTR(inh)-172(C2992, Sigma-Aldrich, Inc.)を5mg/kg of body weight/dayとなるように、生後14日から21日までの7日間、12時間毎に投与した。対象として同体積の生理食塩水を同様にAQP11ノックアウトマウスの腹腔内に投与した。生後21日に腎臓を取り出しPAS染色標本を作製したが、残念ながらAQP11ノックアウトマウスの嚢胞形成には、嚢胞の数や大きさの点でも変化は見られなかった。

これは、CFTRとAQP11ノックアウトマウス腎の嚢胞形成に関連がないと考えることも可能であるが、CFTR阻害薬(CFTR(inh)-172)の投与方法(量あるいは間隔)に問題があった可能性もあり、結論を下すには更なる検討が必要と考えられた。