hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホメオボックス転写因子Sixによる神経回路形成の制御機構

Six1およびSix4は三叉神経節プラコードと上鰓プラコードと神経堤に発現している。Six1とSix4の両遺伝子欠損ホモマウスでは鰓弓と脳神経節に低形成が認められ、プラコードのみならず神経堤の発生・分化に異常をきたしていた。鰓弓神経系の感覚神経成分について、neurofilament、Neurogenin、Sox10、TUNNEL、Phox2bの発現を解析した。プラコード細胞のマーカーであるNeurogenin1(三叉神経節)およびNeurogenin2(上鰓神経節)の発現は、これらの遺伝子が最初に発現する時期(胎生9.0日)から低下していた。神経堤細胞のマーカーであるSox10は、胎生8.5日では野生型と比較して発現に変化は観察されなかったが、胎生10.5日では著明に低下していることを観察した。さらに三叉神経節では、胎生10.5日にホモマウス特異的に神経堤由来の細胞群に変性像が観察された。プラコード由来の細胞群は野生型でもアポトーシスが観察されるが、ホモマウスではアポトーシスのピークの時期が後期にずれ、アポトーシス細胞数も上昇していた。結果として胎生11.5日の三叉神経節のサイズは極度に低下していた。また、顔面神経節では、神経堤由来の細胞群の集団が低下し、プラコード由来の細胞群は表皮内で神経細胞に分化するが脱上皮化をせず、アポトーシスも亢進し、結果として顔面神経節は形成されていなかった。舌咽神経成分では迷走神経成分と一部融合し神経節と神経束の低形成が起こっていた。これに対し、迷走神経は比較的幅広い線維束を作り下神経節は複数の小神経節に分散する傾向を示した。以上の結果から、Six1とSix4は、プラコードの神経細胞への分化を制御し、神経堤由来細胞の分化制御をし、結果として末梢グリアへの分化を制御していること、種々の脳神経節の形成に重要な役割を果たすことが示唆された。Six遺伝子はホメオボックス遺伝子ファミリーで、転写因子をコードする。Six1は、発生段階に出現するプラコードのマーカーとして知られ、その遺伝子欠損ホモマウスは感覚器(耳・鼻)や腎臓、骨格筋に発生異常を示す。一方Six4は、発生段階においてSix1とほぼ同様の時期および部位で発現しているが、その遺伝子欠損ホモマウスでは形態形成異常は検出されない。今回Six1とSix4の両遺伝子欠損ホモマウス(Six1^<-/->/Six4^<-/->)を作成し解析した。同ホモマウスでは鰓弓と脳神経節に低形成が認められプラコードのみならず神経堤の発生・分化に異常をきたすことを確認した。ホモマウスにおける鰓弓神経の感覚神経成分について、2H3、Neurogenin、Sox10、TUNEL、Phox2b、による解析した。三叉神経節では、胎生10.5日にホモマウス特異的に神経堤由来の細胞群に変性像が観察された。また、顔面神経節では、神経堤由来の細胞群の集団が低下し、プラコード由来の細胞群は表皮内で神経細胞に分化するが脱上皮化をせず、結果として顔面神経節は形成されない。

舌咽神経成分では迷走神経成分と一部融合し神経節と神経束の低形成が起こる。これに対し、迷走神経は比較的幅広い線維束を作り下神経節は複数の小神経節に分散する傾向を示す。以上の結果から、Six1とSix4は、プラコードと神経堤由来の細胞分化を制御し脳神経節の形成に重要な役割を果たすこと、そして、両者に由来する神経節細胞を結合し個々の脳神経が形成される過程における末梢グリアの機能にとって重要な関りをもつ因子であることが示唆された。Six遺伝子はホメオボックス遺伝子ファミリーで、転写因子をコードする。Six1は、発生段階に出現するプラコードのマーカーとして知られ、Six1およびSix4は三叉神経節プラコードと上鰓プラコードと神経堤に発現している。Six1とSix4の両遺伝子欠損ホモマウス(Six1^<-/->/Six4^<-/->)では鰓弓と脳神経節に低形成が認められ、プラコードのみならず神経堤の発生・分化に異常をきたしていた。鰓弓神経系の感覚神経成分について、neurofilament、Neurogenin、Sox10、TUNNEL、Phox2bの発現を解析した。プラコード細胞のマーカーであるNeurogenin1(三叉神経節)およびNeurogenin2(上鰓神経節)の発現は、これらの遺伝子が最初に発現する時期(胎生9.0日)から低下していた。神経堤細胞のマーカーであるSox10は、胎生8.5日では野生型と比較して発現に変化は観察されなかったが、胎生10.5日では著明に低下していることを観察した。さらに三叉神経節では、胎生10.5日にホモマウス特異的に神経堤由来の細胞群に変性像が観察された。プラコード由来の細胞群は野生型でもアポトーシスが観察されるが、ホモマウスではアポトーシスのピークの時期が後期にずれ、アポトーシス細胞数も上昇していた。結果として胎生11.5日の三叉神経節のサイズは極度に低下していた。また、顔面神経節では、神経堤由来の細胞群の集団が低下し、プラコード由来の細胞群は表皮内で神経細胞に分化するが脱上皮化をせず、アポトーシスも亢進し、結果として顔面神経節は形成されていなかった。舌咽神経成分では迷走神経成分と一部融合し神経節と神経束の低形成が起こっていた。これに対し、迷走神経は比較的幅広い線維束を作り下神経節は複数の小神経節に分散する傾向を示した。以上の結果から、Six1とSix4は、プラコードの神経細胞への分化を制御し、神経堤由来細胞の分化制御をし、結果として末梢グリアへの分化を制御していること、種々の脳神経節の形成に重要な役割を果たすことが示唆された。
高選択的な水移動型反応の開拓

ニトリルと一級カルボン酸アミドは,有用な合成中間体や生体分子に見られ,水和反応と脱水反応によって相互変換が可能である.しかしいずれの反応においても,古典的な手法では過酷な反応条件もしくは反応性の高い試薬を利用する必要があるため,しばしば副反応による収率の低下を伴う.我々は,ニトリルとアミド間で形式的な水分子の移動が起こる反応を水移動型反応と捉え,水分子供与体と水分子受容体を合理的に設計することで,それぞれ効率的な水和および脱水反応を構築できると考えた.以上の考えにもとづき本研究では,触媒と水分子供与体/受容体の両方からなる共同的な水移動型水和-脱水触媒システムを構築することを目的とし,当該年度はシアノヒドリンの水和反応を開発した.シアノヒドリン(アルファヒドロキシニトリル)の水和は医薬品や高分子原料であるヒドロキシアミドを与える重要な反応である.金属触媒を用いたシアノヒドリンの水和反応は原理的に優れた手法であるが,シアノヒドリンの分解によって生じたシアン化水素が金属触媒を失活させるため,熱安定性の低いシアノヒドリンの水和は困難であった.アセトンシアノヒドリンの水和をモデル反応として検討した結果,硝酸パラジウム存在下,アセトンシアノヒドリンと脂肪族アミド(水供与体)を酢酸中,50 °C, 10分加熱攪拌するだけで,対応するヒドロキシアミドが収率よく得られることを明らかにした.この反応は,従来法では水和が困難なビスアリールヒドロキシニトリルからも対応するヒドロキシアミドを収率よく与えた.さらに18Oで同位体標識したアセトアミドを用いた実験や,速度論実験の結果から,この反応では文字通りアミドに含まれる“水"部分が基質のニトリルへと移動すること,単核と二核のPd種が反応に関与することを明らかにした.水和反応に関しては当初の予定以上の研究の進捗が見られた.その一方で脱水反応に関しては官能基選択性の改善に時間を要しているが,アミノ酸やペプチド誘導体の直接脱水に関しては概ね研究目標を達成できている.以上の理由から研究は順調に進展していると判断した.計画の大きな変更は伴わない.水和反応に関してはシアノヒドリン以外の重要な基質について検討を進める.脱水反応については触媒活性と選択性の改良が主な課題として浮かび上がったため,触媒の再検討を踏まえつつ基質の適用範囲の拡大を目指す.水を分子間で移動させる水移動型反応の合成化学における有効性を調査した.具体的にはアミドとパラジウム触媒を用いたニトリルの水和反応と,ニトリルとパラジウム触媒を用いたアミドの脱水反応の2反応について,反応の基本的な性質と適用範囲の一部を明らかにした.まずアルキルニトリルの水和反応について,反応パラメーター(アミドの置換基,触媒構造,反応条件)を最適化し,本反応がアルキルアミドとカチオン性のパラジウム触媒を用い,微酸性条件下で効率よく進行することを明らかにした.アルキルアミドが好ましい理由は本反応が平衡反応であるためだと考察できる.また,カチオン性のパラジウム触媒と微酸性条件が好ましかったことから,反応の触媒活性種はカチオン性のパラジウム種であることが示唆された.以上に加えて用いるアミドとパラジウム触媒が反応溶媒によく溶解することも,望みのニトリルの水和反応が進行するために必要であることも分かった.さらに基質適用範囲を精査したところ,塩基性条件で分解するニトリルであるシアノヒドリン類にもこの水和法が有効であることが分かった.またアミドからニトリルへの脱水反応についても検討した.官能基化されたプロリン由来のアミドの脱水をモデル反応として最適な反応条件を明らかにした.さらに天然に存在するアミノ酸から誘導できる20種類のアミノ酸アミドの脱水を試みたところ,そのうち16種類のアミノ酸アミドについて,対応するアミノニトリルが収率よく得られることを明らかにした.ニトリルの水和反応とアミドの脱水反応について当初目標としていた条件最適化と初期的な基質適用範囲の調査を達成したため.ニトリルと一級カルボン酸アミドは,有用な合成中間体や生体分子に見られ,水和反応と脱水反応によって相互変換が可能である.しかしいずれの反応においても,古典的な手法では過酷な反応条件もしくは反応性の高い試薬を利用する必要があるため,しばしば副反応による収率の低下を伴う.我々は,ニトリルとアミド間で形式的な水分子の移動が起こる反応を水移動型反応と捉え,水分子供与体と水分子受容体を合理的に設計することで,それぞれ効率的な水和および脱水反応を構築できると考えた.以上の考えにもとづき本研究では,触媒と水分子供与体/受容体の両方からなる共同的な水移動型水和-脱水触媒システムを構築することを目的とし,当該年度はシアノヒドリンの水和反応を開発した.シアノヒドリン(アルファヒドロキシニトリル)の水和は医薬品や高分子原料であるヒドロキシアミドを与える重要な反応である.金属触媒を用いたシアノヒドリンの水和反応は原理的に優れた手法であるが,シアノヒドリンの分解によって生じたシアン化水素が金属触媒を失活させるため,熱安定性の低いシアノヒドリンの水和は困難であった.アセトンシアノヒドリンの水和をモデル反応として検討した結果,硝酸パラジウム存在下,アセトンシアノヒドリンと脂肪族アミド(水供与体)を酢酸中,50 °C, 10分加熱攪拌するだけで,対応するヒドロキシアミドが収率よく得られることを明らかにした.この反応は,従来法では水和が困難なビスアリールヒドロキシニトリルからも対応するヒドロキシアミドを収率よく与えた.

さらに18Oで同位体標識したアセトアミドを用いた実験や,速度論実験の結果から,この反応では文字通りアミドに含まれる“水"部分が基質のニトリルへと移動すること,単核と二核のPd種が反応に関与することを明らかにした.水和反応に関しては当初の予定以上の研究の進捗が見られた.その一方で脱水反応に関しては官能基選択性の改善に時間を要しているが,アミノ酸やペプチド誘導体の直接脱水に関しては概ね研究目標を達成できている.以上の理由から研究は順調に進展していると判断した.研究計画通りに進行する.ニトリルの水和反応についてはシアノヒドリンの水和反応を中心に,合成反応として利用可能なレベルまで研究を進める.またアミドの脱水反応については,そのままでは適用ができなかったアミノ酸アミドに保護基を導入し,アミドの脱水反応が進行する条件を探索する.さらにこの脱水反応によるC末端ニトリル含有ペプチドの合成を目指す.計画の大きな変更は伴わない.水和反応に関してはシアノヒドリン以外の重要な基質について検討を進める.脱水反応については触媒活性と選択性の改良が主な課題として浮かび上がったため,触媒の再検討を踏まえつつ基質の適用範囲の拡大を目指す.
酸化ストレス応答を応用した新規 in vivo 分子イメージング法の確立

OKD-lucマウスはKeap1-Nrf2システムを応用し開発され、このマウスでは酸化ストレス下の細胞が発光タンパクであるルシフェラーゼ(luciferase;luc)を発現し発光する。今回我々は、このOKD-lucマウスの中大脳動脈閉塞モデルを作製し、酸化ストレスの経時的変化を詳細に観察した。その結果、この酸化ストレスイメージングは、酸化ストレスを生きた動物のままin vivoで検出することができ、脳梗塞の病態を評価する新規のイメージング法として大変有用であることが明らかになった。平成27年度は、1OKD-lucマウスを交配し準備した上で、8-9週齢オスのOKD-lucマウスに45分間一過性中大脳動脈閉塞術を行い、その3,6,12,24時間後,3,7日後にin vivoイメージングを行い、lucの脳における発光の半定量的解析を行った。その結果、Lucの発現は虚血後12時間後から安定して発現が認められるようになり、虚血後24時間後が発現のピークとなることが明らかになった。2免疫組織学的手法によりLuc, NRF2, Keap1の経時的な蛋白レベルでの発現を評価し、ストレスの経時的変化を詳細に観察した。その結果、ルシフェラーゼ(Luc)の発現が、実際の脳内で起こっている酸化ストレスを反映していることを確認している。今後上記のモデルを利用して、薬剤の治療効果等を行っていく予定にしている。また上記実験と平行する形でOKD-lucマウスとALSモデルマウスの交配によりOKD-luc/ALSダブルトランスジェニックマウスを作成することも進めている。当教室ではこれまで脳梗塞ならびにALSモデルのin vivoイメージングの方法を確立し、Autophagy2本を含めて英文誌5報に報告し、海外でも高い評価を得ている。また、本プロジェクトにおいても既に新たなin vivoイメージングの方法を確立できているため。平成27年度は、1OKD-lucマウスを準備した上で、8-9週齢オスのOKD-lucマウスに45分間一過性中大脳動脈閉塞術を行い、その3,6,12,24時間後,3,7日後にin vivoイメージングを行い、脳内におけるlucの発光の定量を行った。その結果、Lucの発現は虚血後12時間後から安定して発現が認められるようになり、24時間後が発現のピークとなることが明らかになった。平成28年度は、in vivoイメージングで評価を行ったOKD-lucマウスの45分間一過性中大脳動脈閉塞モデルの脳切片を作成し、免疫組織学的手法によりLuc, NRF2, Keap1の経時的な蛋白レベルでの発現の評価を行った。その結果、in vivoイメージングで検出したLucの発現パターンと、脳内のNRF2の蛋白発現パターンが相関していることが明らかになった。またこのLucの発現強度と脳梗塞体積も相関することが確認できた。これらの結果から、今回行ったin vivoイメージングは生体の脳内酸化ストレスを評価できていると考えられた。さらに2重免疫染色を行うことでNRF2が主にニューロンと、一部オリゴデンドロサイトとペリサイトに発現していることを明らかにした。以上の結果を、英語論文にまとめJ Neurosci Res誌に2017年に報告した(論文1)。今回の研究により酸化ストレスをin vivoイメージングで評価する基礎的な実験基盤が確立された。今後慢性脳虚血モデルに対してもこのin vivoイメージングモデルが応用した酸化ストレス動態の詳細な検討を行っていく予定である。当教室では、既に複数の神経疾患モデルでの手法を確立できており、この手法を用いることで、autophagyやMMP9など多様な病態を経時的に評価することが可能になってきている。今後、これらin vivoイメージングの手法を用いて様々な神経疾患モデルに様々な治療を行い、その治療効果ならびにその作用メカニズムの評価を行っていく方針である。脳神経外科学
口腔内用超音波探触子の開発とその臨床評価

今回開発した探触子の特徴は、口腔内に挿入しやすくするため、保持部分は、いわゆる歯ブラシの柄を長くした細長い形態とし、素子部とともに硬い構造物で覆った。素子配列は、良好な分解能を得やすいリニア型とし視野幅10mmとした。周波数を10MHzに設定し、走査法はBモード断層像、カラーおよびパルスドプラ法の利用を可能とした。さらに、保持部先端に注水管と空気・水抜きのため管の先端がついていて、それぞれの管の中程の弁を閉じることで密閉することができる構造となっている。さらに、探触子の素子部周囲に水袋をおくことで腫瘤表面の性状の影響を受けずに検査可能となった。この探触子の操作性と分解能を評価した。正常舌の超音波画像では、舌粘膜表面と粘膜上皮層、粘膜下層、固有筋層に分けて観察することが可能で、0.1mm単位での分解能が得られた。その他、正常な頬粘膜、口底、下唇、口蓋、下顎歯肉についても同様の解像度が得られた。舌、および頬粘膜扁平上皮癌の超音波画像において深達度の測定は0.1mm単位で正確に測定することが可能であった。その他の対象疾患は、左下唇類表皮嚢胞、左舌縁部肉芽腫、左舌下面切断神経腫、右口底部肉芽形成を伴う異物、左上唇血管平滑筋腫、右下唇粘表皮癌であった。得られた超音波画像にて内部、辺縁、境界、後方Echoを観察した。さらに、カラードプラ法にて病変内および周辺血流についても観察し、良悪性疾患の鑑別と質的診断の有用性について検討した。検討の結果、悪性の診断には、辺縁の不整と周辺血流の増大所見が最も信頼性があると思われた。内部不均一も悪性の可能性が考えられるが、境界不明瞭、後方エコーの減弱は悪性の診断的根拠としては不十分と思われた。開発した口腔内専用探触子は、口腔内での操作性に優れ、解像度も良好で、腫瘍表面の形態に影響を受けずに検査可能であった。さらにカラードプラ法を併用することで、より詳細な情報を得ることができ、病変部の質的診断にも有用であった。16年度研究業績設計図をもとに口腔内専用探触子の試作品を作成した。今回我々が開発した探触子は、探触子の表面と検査部位との間に水袋をおくことで、対象臓器の形に合わせて密着できるだけでなく、焦点距離を適切な範囲に設定しやすくした。また、操作性を向上させる目的で、柄を長くし、探触子の保全と、検者・被検者の安全性を考慮し、保持部と素子部の間を硬い構造物で覆った。さらに、水袋内の水量は注射器で量を調節できるようにした。素子配列は、良好な分解能を得やすいリニア型とし、周波数は10-15MHzの周波数帯域を利用した。走査法はBモード断層像、カラーおよびパルスドプラ法で行った。健常者を対象に口唇、舌、歯肉、口蓋、口底、頬粘膜の部位別の正常な超音波画像を撮像した。良好な操作性と画像精度の高さを確認した。水袋の水漏れを認めたため、現在改良中である。

以上の結果については、17年4月22日の日本口腔科学会(於:徳島)にて発表する予定である。さらに、『新医療』の超音波紹介欄に投稿済みである。17年度研究業績今回開発した探触子は、探触子の表面と検査部位との間に水袋をおくことで、対象臓器の形に合わせて密着でき、焦点距離を適切な範囲に設定しやすくした。また、操作性を向上させる目的で、柄を長くし、探触子の保全と検者・被検者の安全性を考慮し、保持部と素子部の間を硬い構造物で覆った。さらに、水袋内の水量は調節できるようになっている。素子配列は、良好な分解能を得やすいリニア型とし、周波数は、10-15MHzの周波数帯域を利用した。走査法は、Bモード断層法、カラーおよびパルスドプラ法で行った。健常者の口唇、舌、歯肉、口蓋、口底、頬粘膜の部位別の正常な超音波画像、および口底異物、舌・頬粘膜癌の患者の超音波画像を平成17年4月22日の目本口腔科学会(於:徳島)にて発表した。月刊『新医療』2005年5月発刊の超音波紹介欄において、谷口の原稿が掲載された。下口唇粘表皮癌、上口唇平滑筋腫、頬粘膜類表皮嚢胞等の稀な症例の超音波画像を発表予定である。今回開発した探触子の特徴は、口腔内に挿入しやすくするため、保持部分は、いわゆる歯ブラシの柄を長くした細長い形態とし、素子部とともに硬い構造物で覆った。素子配列は、良好な分解能を得やすいリニア型とし視野幅10mmとした。周波数を10MHzに設定し、走査法はBモード断層像、カラーおよびパルスドプラ法の利用を可能とした。さらに、保持部先端に注水管と空気・水抜きのため管の先端がついていて、それぞれの管の中程の弁を閉じることで密閉することができる構造となっている。さらに、探触子の素子部周囲に水袋をおくことで腫瘤表面の性状の影響を受けずに検査可能となった。この探触子の操作性と分解能を評価した。正常舌の超音波画像では、舌粘膜表面と粘膜上皮層、粘膜下層、固有筋層に分けて観察することが可能で、0.1mm単位での分解能が得られた。その他、正常な頬粘膜、口底、下唇、口蓋、下顎歯肉についても同様の解像度が得られた。舌、および頬粘膜扁平上皮癌の超音波画像において深達度の測定は0.1mm単位で正確に測定することが可能であった。その他の対象疾患は、左下唇類表皮嚢胞、左舌縁部肉芽腫、左舌下面切断神経腫、右口底部肉芽形成を伴う異物、左上唇血管平滑筋腫、右下唇粘表皮癌であった。得られた超音波画像にて内部、辺縁、境界、後方Echoを観察した。さらに、カラードプラ法にて病変内および周辺血流についても観察し、良悪性疾患の鑑別と質的診断の有用性について検討した。検討の結果、悪性の診断には、辺縁の不整と周辺血流の増大所見が最も信頼性があると思われた。内部不均一も悪性の可能性が考えられるが、境界不明瞭、後方エコーの減弱は悪性の診断的根拠としては不十分と思われた。開発した口腔内専用探触子は、口腔内での操作性に優れ、解像度も良好で、腫瘍表面の形態に影響を受けずに検査可能であった。さらにカラードプラ法を併用することで、より詳細な情報を得ることができ、病変部の質的診断にも有用であった。
自立飛行型斜張橋ケーブル点検ロボットシステムの開発

1.本体フレームの最適化について現在所有している2種類の機体の有限要素解析モデルを作成し,複数の荷重条件で解析を実施した.それぞれの機体について得られた変位と応力に基づき,機体に必要な強度,剛性について検討した.さらに,2種類の機体軽量化案を考案し,有限要素解析によりそれらの強度,剛性を検証した.これらの成果を土木学会西部支部研究発表会で発表した.2.衝突防止機能の確立とPDI制御器による自動速度制御点検ロボットを安全に自動運転させることを目的として,主塔までの距離計測センサ,機体移動距離,速度等により機体状況を把握できるシステムを構築した.また,カメラ表示映像に情報表示することにより機体状態を把握し,高所操作,速度調整を行いやすくして安定した映像取得が可能となった.さらに,上述した各種センサーを有する点検ロボットに対して,機体の力学モデルの作成,コントローラの設計を行った.コントローラにはPID補償器を実装した.PID補償器の3つのパラメータ(比例ゲイン・積分ゲイン・微分ゲイン)の調整は,従来提案されている調整法をもとに,シミュレーションにより大まかな調整を行った.その後,実験により上昇,下降とも与えられた設計仕様を満足するパラメータを決定した.成果の一部は日本機械学会九州支部北九州講演会論文集にて発表した.3.外観展開画像作成アルゴリズムの構築撮影飛行によって集録された4系統の動画像データから,ケーブル毎の表面展開画像を作成する時間・空間方向の画像合成アルゴリズムを構築した.連続静止画像の重複領域の推定に,画像相関法に加えて,機体の搭載エンコーダから取得される速度データの演算処理を行うことで,速度が一定でない撮影飛行によって連続集録される曲面動画像から,表面展開画像を作成することができた.これらの成果を土木学会西部支部研究発表会で発表した.本研究を構成する3要素である1.機体フレーム構造の最適化,2.自立航行のための制御システムの開発,3.取得した動画から損傷を抽出する画像処理のうち,1.については当初予定より進んでおり,解析モデルの構築と一部軽量化の検討が実施できた.2.についてはおおむね当初計画通りの進捗であり,室内実験レベルでは一定の条件下で要求性能を満足することができた.3.については当初予定よりやや遅れており,4系統の動画像データから,ケーブル毎の表面展開画像を作成する時間・空間方向の画像合成アルゴリズムを構築したが,十分な精度の表面展開画像作成には至らなかった.以上のことを総合的に評価し,全体的にはおおむね順調に進展していると判断した.1.本体フレームの最適設計(中村)2018年度末,載荷試験にも利用可能なフレームを製作した.2019年度は製作したフレームを用いた載荷試験を実施することで,解析の妥当性を検証するとともに,必要な強度剛性を確保した上で,可能な限り軽量化を図るための解析的な検討を行う.2.制御システムの改良とフィールドへの適用検討(山本・下本)点検ロボットシステムのフィールド適用検討を行う.特に,点検ロボットの制御に関し目標速度で下降できるように制御切替位置の検討を行うとともに,斜張橋への適用範囲拡張のために広い傾斜角での実験を実施し制御系の改良を行う.また,成果の学会発表を行い,国内外専門家からの評価フィードバックを得てさらなるシステムの高度化を図る.3.外観展開画像作成アルゴリズムの改良と変状領域識別アルゴリズムの構築(西川)2018年度,実際に撮影された4系統の動画像データをもとにケーブル被覆表面の展開画像作成アルゴリズムについて検討し,一定の成果を得た.2019年度は,それを改良するとともに,ケーブル被覆表面の汚れや変形,劣化・損傷などの変状を画像解析によって抽出するアルゴリズムについて検討する.その際,処理速度に優れる高速抽出処理と変状の形態を識別する詳細分析処理の二つの画像解析を試みる.前者には遺伝的プログラミングを用いたフィルタ構築技術,後者には深層畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを用いることを想定している.1.本体フレームの最適化について現在所有している2種類の機体の有限要素解析モデルを作成し,複数の荷重条件で解析を実施した.それぞれの機体について得られた変位と応力に基づき,機体に必要な強度,剛性について検討した.さらに,2種類の機体軽量化案を考案し,有限要素解析によりそれらの強度,剛性を検証した.これらの成果を土木学会西部支部研究発表会で発表した.2.衝突防止機能の確立とPDI制御器による自動速度制御点検ロボットを安全に自動運転させることを目的として,主塔までの距離計測センサ,機体移動距離,速度等により機体状況を把握できるシステムを構築した.また,カメラ表示映像に情報表示することにより機体状態を把握し,高所操作,速度調整を行いやすくして安定した映像取得が可能となった.さらに,上述した各種センサーを有する点検ロボットに対して,機体の力学モデルの作成,コントローラの設計を行った.コントローラにはPID補償器を実装した.PID補償器の3つのパラメータ(比例ゲイン・積分ゲイン・微分ゲイン)の調整は,従来提案されている調整法をもとに,シミュレーションにより大まかな調整を行った.その後,実験により上昇,下降とも与えられた設計仕様を満足するパラメータを決定した.成果の一部は日本機械学会九州支部北九州講演会論文集にて発表した.3.外観展開画像作成アルゴリズムの構築撮影飛行によって集録された4系統の動画像データから,ケーブル毎の表面展開画像を作成する時間・空間方向の画像合成アルゴリズムを構築した.連続静止画像の重複領域の推定に,画像相関法に加えて,機体の搭載エンコーダから取得される速度データの演算処理を行うことで,速度が一定でない撮影飛行によって連続集録される曲面動画像から,表面展開画像を作成することができた.これらの成果を土木学会西部支部研究発表会で発表した.

本研究を構成する3要素である1.機体フレーム構造の最適化,2.自立航行のための制御システムの開発,3.取得した動画から損傷を抽出する画像処理のうち,1.については当初予定より進んでおり,解析モデルの構築と一部軽量化の検討が実施できた.2.についてはおおむね当初計画通りの進捗であり,室内実験レベルでは一定の条件下で要求性能を満足することができた.3.については当初予定よりやや遅れており,4系統の動画像データから,ケーブル毎の表面展開画像を作成する時間・空間方向の画像合成アルゴリズムを構築したが,十分な精度の表面展開画像作成には至らなかった.以上のことを総合的に評価し,全体的にはおおむね順調に進展していると判断した.1.本体フレームの最適設計(中村)2018年度末,載荷試験にも利用可能なフレームを製作した.2019年度は製作したフレームを用いた載荷試験を実施することで,解析の妥当性を検証するとともに,必要な強度剛性を確保した上で,可能な限り軽量化を図るための解析的な検討を行う.2.制御システムの改良とフィールドへの適用検討(山本・下本)点検ロボットシステムのフィールド適用検討を行う.特に,点検ロボットの制御に関し目標速度で下降できるように制御切替位置の検討を行うとともに,斜張橋への適用範囲拡張のために広い傾斜角での実験を実施し制御系の改良を行う.また,成果の学会発表を行い,国内外専門家からの評価フィードバックを得てさらなるシステムの高度化を図る.3.外観展開画像作成アルゴリズムの改良と変状領域識別アルゴリズムの構築(西川)2018年度,実際に撮影された4系統の動画像データをもとにケーブル被覆表面の展開画像作成アルゴリズムについて検討し,一定の成果を得た.2019年度は,それを改良するとともに,ケーブル被覆表面の汚れや変形,劣化・損傷などの変状を画像解析によって抽出するアルゴリズムについて検討する.その際,処理速度に優れる高速抽出処理と変状の形態を識別する詳細分析処理の二つの画像解析を試みる.前者には遺伝的プログラミングを用いたフィルタ構築技術,後者には深層畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを用いることを想定している.
東南アジア港市の船体考古資料調査と保存研究

本研究は、時代の異なる数十隻の船体が海底に埋没する中部ベトナム・クアンガイ省ビンソン県湾での調査を通じて、同湾港市の歴史的活動を明らかにする。同湾で沈没した船は、最古級で8ー9世紀代交易船、中国海商の1718世紀代南シナ海商船と想定される。これら複数の船体考古資料の詳細研究、船材の保存処理と船体原位置保存を実施する。港市沖の沿岸の浅海で、時代幅のある多数の商船の残骸が埋没する事例は世界的にも稀な事例である。海事考古学と文化財科学、両分野蓄積を生かした学際連携により、東南アジア海域史における港市と交易船遺跡の具体像の解明につながる研究を目指す。
生物の同期現象において外れ値が系にもたらす効果の検証

生物の振動・同期現象において,例外的な挙動を示す“外れ値"が普遍的に観測される.その外れ値の挙動の観察を通して,外れ値が何らかの形で系の維持・安定性に寄与するという仮説の下で,本研究では同期している集団の外れ値が系にもたらす効果を明らかにする.具体的には,シオミズツボワムシの個体数変動を対象に数理解析を行い,生活史が同期している集団に大きな撹乱が与えられたときの外れ値による緩衝作用,すなわち個体数の維持や回復における役割を検証する.生物には様々な振動・同期現象がみられる.例えば,心臓の周期的な拍動は個々の心筋細胞の拍動が同期することによって実現する.生物における振動・同期現象は数理モデルによって次々に解き明かされつつあるが,多くの場合は実験で観測された値が数理モデルによって完全に再現されない.実際の系では,モデルによって記述された振動・同期現象から独立したような挙動を示す“例外"が観測されるからである.そのような例外は外れ値として議論の対象から除かれる.そのため,外れ値の検出や判定に関する統計学的な手法が発展する一方で,外れ値が生まれる原因や系に与える影響が十分に議論されないままとなっている.申請者はその外れ値の挙動の観察を通して,外れ値が何らかの形で系の維持・安定性に寄与するという仮説を着想した.そこで,本研究では同期している集団の外れ値が系にもたらす効果を明らかにする.本研究では,単為生殖のみを行うシオミズツボワムシBrachionus plicatilisの石川株を対象とし,以下の3点を通じてクローン集団における世代交代の同期現象について数理的解析を行い,集団に大きな攪乱が与えられた際の外れ値が系に与える効果を明らかにする.1シオミズツボワムシ生活史の同期現象の数理モデル化:個々のシオミズツボワムシの生活史を記述する数理モデルを構築する.2実測値から例外的な挙動を示す個体の抽出: 1のモデルをもとに,飽食条件でシオミズツボワムシを培養したときの生涯産卵数および寿命の実測値から“外れ値個体"を抽出する.3個体数変動のシミュレーションによる外れ値の緩衝作用の検証:外れ値の存在比率をパラメータとして,大きな撹乱(死亡率の急上昇など)を与えた個体群変動のシミュレーションを行う.当初の計画通り,シオミズツボワムシの生活史について連続モデルを構築した.さらに加えて,離散モデルも構築した.これにより,大規模シミュレーションによる個体群の解析だけでなく離散モデルを用いた数学的解析も可能となった.また,シオミズワムシの培養実験によって十分な実測値が得られており,例外的な挙動を示す個体の抽出を計画を前倒して着手できた.外れ値の存在比率をパラメータとして大きな撹乱(死亡率の急上昇など)を与えた個体群変動のシミュレーションを行い,外れ値個体による緩衝作用を検証する.シミュレーション結果と実測データ(絶食培養や熱ストレス付加した場合)を比較する.生物の振動・同期現象において,例外的な挙動を示す“外れ値"が普遍的に観測される.その外れ値の挙動の観察を通して,外れ値が何らかの形で系の維持・安定性に寄与するという仮説の下で,本研究では同期している集団の外れ値が系にもたらす効果を明らかにする.具体的には,シオミズツボワムシの個体数変動を対象に数理解析を行い,生活史が同期している集団に大きな撹乱が与えられたときの外れ値による緩衝作用,すなわち個体数の維持や回復における役割を検証する.生物には様々な振動・同期現象がみられる.例えば,心臓の周期的な拍動は個々の心筋細胞の拍動が同期することによって実現する.生物における振動・同期現象は数理モデルによって次々に解き明かされつつあるが,多くの場合は実験で観測された値が数理モデルによって完全に再現されない.実際の系では,モデルによって記述された振動・同期現象から独立したような挙動を示す“例外"が観測されるからである.そのような例外は外れ値として議論の対象から除かれる.そのため,外れ値の検出や判定に関する統計学的な手法が発展する一方で,外れ値が生まれる原因や系に与える影響が十分に議論されないままとなっている.申請者はその外れ値の挙動の観察を通して,外れ値が何らかの形で系の維持・安定性に寄与するという仮説を着想した.そこで,本研究では同期している集団の外れ値が系にもたらす効果を明らかにする.本研究では,単為生殖のみを行うシオミズツボワムシBrachionus plicatilisの石川株を対象とし,以下の3点を通じてクローン集団における世代交代の同期現象について数理的解析を行い,集団に大きな攪乱が与えられた際の外れ値が系に与える効果を明らかにする.1シオミズツボワムシ生活史の同期現象の数理モデル化:個々のシオミズツボワムシの生活史を記述する数理モデルを構築する.2実測値から例外的な挙動を示す個体の抽出: 1のモデルをもとに,飽食条件でシオミズツボワムシを培養したときの生涯産卵数および寿命の実測値から“外れ値個体"を抽出する.3個体数変動のシミュレーションによる外れ値の緩衝作用の検証:外れ値の存在比率をパラメータとして,大きな撹乱(死亡率の急上昇など)を与えた個体群変動のシミュレーションを行う.当初の計画通り,シオミズツボワムシの生活史について連続モデルを構築した.さらに加えて,離散モデルも構築した.これにより,大規模シミュレーションによる個体群の解析だけでなく離散モデルを用いた数学的解析も可能となった.

また,シオミズワムシの培養実験によって十分な実測値が得られており,例外的な挙動を示す個体の抽出を計画を前倒して着手できた.外れ値の存在比率をパラメータとして大きな撹乱(死亡率の急上昇など)を与えた個体群変動のシミュレーションを行い,外れ値個体による緩衝作用を検証する.シミュレーション結果と実測データ(絶食培養や熱ストレス付加した場合)を比較する.
延辺朝鮮語の用言に関する音韻論的研究

本研究では,延辺朝鮮語動詞・形容詞のアクセントについて,母語話者7人から得られたデータに基づき,調査・分析を行った。中期朝鮮語(15-16世紀)の用言語幹は,活用アクセントパターンに基づき複数のアクセントクラスに分類され,そのアクセント分類は,語幹の音節構造と相関性があることが知られているが,本研究により,延辺朝鮮語の用言語幹にもそれに対応するクラス分類が原則として見られること,一部の例外や話者間のゆれは,中期朝鮮語以降に生じた様々な音変化のために,延辺朝鮮語における用言語幹の音節構造とアクセントクラスとの相関性が部分的に曖昧化したことに基づくことを明らかにした。a)インフォーマント調査の実施:昨年度に引き続き,延辺朝鮮語用言のアクセント(5活用形)について,母語話者を対象にインフォーマント調査を行った。また,既に収拾した語彙について,延辺朝鮮語話者自身による使用頻度の情報を収集した。b)収集したデータの組織化:収集した語彙資料を,見出し語,IPA表記,意味,延辺アクセント,使用頻度,中期朝鮮語アクセントが一覧できる,辞書形式の資料にまとめた。c)延辺朝鮮語動詞・形容詞アクセントの通時的・共時的研究:中期朝鮮語の動詞・形容詞語幹は,活用アクセントパターンに基づき複数のアクセントクラスに分類され,またそのアクセント分類は,語幹の音節構造と強い相関性があることが知られている。延辺朝鮮語における用言アクセントクラスも,基本的に中期朝鮮語と同様の,音節構造との相関性を示しているが,さまざまな例外が見られる。これらの例外や,話者間に見られる共時的なゆれは,中期朝鮮語以降に生じた様々な音変化(複数の音素の合流)及びアクセント体系の変化のために,延辺朝鮮語における用言語幹の音節構造とアクセントクラスとの間の相関性が,部分的に曖昧化したことに基づく。即ち,延辺朝鮮語用言アクセントにおける不規則な対応や共時的なゆれは,この新しい相関関係に適応するよう,再構成されたものと言える。一方,分節音に見られるゆれとは異なり,延辺朝鮮語用言アクセントにおいては,特定の活用形にのみ基づく類推変化は明確には確認されない。本研究では,このような延辺朝鮮語用言アクセントの歴史的発展と共時的なゆれについて,重み付け制約(weighted constraints)を用いて分析を行った。a)延辺朝鮮語語彙調査の実施:各動詞・形容詞の57活用形について,延辺朝鮮語母語話者5人を対象に,アクセント情報を含め,語彙調査を実施した。各調査項目について,異形態が存在するかどうかも逐一確認し,様々なバリエーションの情報を取得した。調査内容については,高性能リニアPCMレコーダーにより,録音(44.1 kHz,16 bitのWAVファイル)を行った。b)録音データの音声学的分析:録音したデータについて,音声解析ソフト(Praat,Boersma & Weenink 2011)による分析を進めた。具体的には,調査済みの語彙についてアクセントパターンを再確認するとともに,イントネーションやフォーカスの影響,文中の位置における様々な実現形に関して,考察を進めた。c)延辺朝鮮語動詞・形容詞アクセントのクラス分類:中期朝鮮語の動詞・形容詞語幹は,活用アクセントパターンに基づき複数のアクセントクラスに分類され,またそのアクセント分類は,語幹の音節構造と強い相関性があることが知られている。平成24年度は,まず30種以上の中期朝鮮語資料を精査し,500語程度について,各動詞・形容詞語幹のアクセントクラスを特定した。その上で,延辺朝鮮語の動詞・形容詞語幹にもそれに対応するクラス分類が見られるか,a)で述べた調査に基づき確認を行い,同様のアクセント分類が存在することを明らかにした。更に,中期朝鮮語との対応についていうと,80%程度は規則的なパターンで現れるものの,20%の語は何らかの変容を示していることを見いだした。延辺朝鮮語母語話者複数名を対象に,順調に調査を進めることができており,高性能リニアPCMレコーダーによる録音資料の蓄積もある。また,調査した内容は,各話者ごとに整理し,入力済みである。一方,中期朝鮮語動詞・形容詞のアクセントクラスも,30種以上の中期朝鮮語文献を精査した結果,既に特定してあり,延辺朝鮮語との比較に基づく研究の基礎はできている。中期朝鮮語・延辺朝鮮語の基本的な対応関係についても,既に掌握してあり,現在,その詳細について,分析を進めているところである。a)インフォーマント調査の継続:これまでに行った調査の一部内容について,必要に応じ再確認を行うとともに,データの追加等,補足的作業を行う。また,既に収拾した語彙について,延辺朝鮮語話者自身による使用頻度のランク付け等,付加的情報の調査を実施する。

b)収集したデータの編集・組織化:収集した語彙資料を,見出し語(ハングル表記・アルファベット転写表記),IPAによる音声表記,意味(日本語・英語),アクセント,使用頻度,注釈(調査に際し気付いた点など)が一覧できる,辞書形式の資料にまとめる。c)延辺朝鮮語動詞・形容詞アクセントの通時的・共時的研究:既に調査・分類したアクセントクラスについて,中期朝鮮語動詞・形容詞のアクセントクラスとの比較を行い,延辺朝鮮語動詞・形容詞のアクセントがどのような歴史的発展を遂げてきたのか,音韻論的に分析する。d)バリエーションの研究:収集した様々な動詞・形容詞の用例に基づき,延辺朝鮮語動詞・形容詞における類推変化について,以下の4点を明らかにする。(1)特定の活用形を基本形にして,類推変化が生じているか。(2)もし特定の活用形を基本形にして類推変化が生じているのであれば,なぜその活用形が基本形として選択されたのか。一方,特定の活用形を基本形にして類推変化が生じていない場合,どのような要因によって基本形が変動しているのか。(3)音節構造や,語形・活用形等の使用頻度と,類推変化の方向性に統計学的傾向があるか。(4)言語獲得の一般的傾向との関連性は見られるか。e)研究成果の公開:論文・学会発表の形で公開する他,収集したデータをwwwサイト上で公開する準備を進める。上記の研究計画を踏まえ,次年度の研究費は,(a)インフォーマント調査のための謝金,(b)分析を進めるためのハードウェア・ソフトウェア購入費,(c)学会発表・調査・研究打ち合わせのための旅費として,使用する予定である。
個人適応学習を実現するセンサベースドエジュケーション

学習者の生理・行動・環境からなる学習場を計測し,学習の質向上のために学習者個人に適応して学習場をオンラインで最適化する教育・学習法であるセンサベースドエジュケーションを提案し,その学習システムの構成法を明らかにすることを目的とする.学習場のマルチモーダルな多次元時系列データの分析に基づき,統合的な「学習の質」を指標化する.これにより学習場の計測に基づきオンラインで「学習の質」を予測・評価し,時々刻々変化する学習場の状態に合わせて学習者個人に適応した行動の提案や環境制御で学習場を最適化する学習システムの構成法を明らかにする.学習者の生理・行動・環境からなる学習場を計測し,学習の質向上のために学習者個人に適応して学習場をオンラインで最適化する教育・学習法であるセンサベースドエジュケーションを提案し,その学習システムの構成法を明らかにすることを目的とする.学習場のマルチモーダルな多次元時系列データの分析に基づき,統合的な「学習の質」を指標化する.これにより学習場の計測に基づきオンラインで「学習の質」を予測・評価し,時々刻々変化する学習場の状態に合わせて学習者個人に適応した行動の提案や環境制御で学習場を最適化する学習システムの構成法を明らかにする.
視床からバレル内局所回路への投射に対する制御

大脳皮質には前脳基底部よりアセチルコリン含有繊維の密な投射を受けており皮質内情報処理に重要な役割を果たしていると考えられているが、その制御様式の詳細については不明な点が多く残されている。これまで、ニコチニック受容体の作用に注目し、体性感覚野(バレル皮質)から視床-皮質標本を作製して、視床刺激によるシナプス反応を皮質において観察してきた。その結果、短期間のニコチン投与後、サイレントシナプスが活性化されその効果が長期的に持続することが明らかとしてきた。また、ニコチンはシナプス前性サイレントシナプスを活性化したことを示唆してきた。皮質細胞種とニコチンの作用については、幼弱時には興奮性、抑制性いずれの細胞も促通作用を受けたが、臨界期以降特にP14以後になると興奮性細胞でのニコチン感受性が減少していた。また、ニコチン投与により、興奮性の細胞に複シナプス性の抑制性シナプス後電位が高頻度に出現することが認められた。このことは、視床から4層を経て2/3層へと信号を伝搬する興奮性細胞の発火時期(スパイクタイミング)を、より短い範囲内に収めるという意味において大変重要であると思われる。実際、ニコチン存在下では、興奮性細胞のEPSPのピーク位置の範囲は有意に減少しており、ニコチン投与によりフィードフォワード抑制が強化されることの生理学的意味が明確となった。また、このようなフィードフォワード抑制が働くためには視床からの神経支配において興奮性細胞よりも抑制性細胞への潜時が短い方が効率的に働くと推定される。この点について実験的に検討したところ、同一バレル内においては、例外なく抑制性細胞の潜時が短いことが判明した。
2点配位型ルイス酸触媒の開発

本研究者は、十年以上も前からルイス酸としての有機アルミニウム化合物の化学に取り組んでおり、数多くの研究データを蓄積している。これらの知見をもとに「二点配位型ルイス酸」としての二点配位型有機アルミニウム反応剤の創製に取り組んだ。すなわち、適当な位置に二つのフェノール性水酸基を有する化合物を二座配位子として用い、これをトリアルキルアルミニウム、2当量と反応させることにより、二つのアルミニウム原子が望ましい原子間距離に位置し、二点配位が可能な有機アルミニウム系ルイス酸を作り上げた。この二点配位型ルイス酸を用いると、4-tert-ブチルシクロヘキサノンのカルボニル酸素の二つの非共有電子対をうまく配位させることができ、続いてこのケトン-アルミニウム錯体にアルキルリチウム化合物を加えることにより、高いエクアトリアル選択性が獲得できた。一方、この二点配位型アルミニウム反応剤に2当量のケトンを加え、その後、アルキルリチウムを加えても何らエクアトリアル選択性が得られないことから、ケトンを1当量加えた場合には、二つのアルミニウム原子がケトンカルボニル酸素の二つの非共有電子対にうまく配位していることが示唆された。また、α,β-不飽和アルデヒドを二点配位型アルミニウム反応剤に配位させ、その後、アルキルマグネシウム化合物を加えることにより、共役付加体が優先して得られることを見い出した。通常、アルキルマグネシウムは、α,β-不飽和アルデヒドに1,2-付加をするため、二点配位型ルイス酸を活用することにより、本来の選択性を換えることに成功した。
原環境の復元

本年度は計画の初年度にあたり,今後3年間続く研究の基礎となる数値地図デ-タの整備と利用システムの開発を行った.国土庁/国土地理院の標高(DEM)・土地利用・地形分類・表層地質・土壌などのデ-タ,国土庁/気象庁の月降水量・気温・降雪量のデ-タ,農林水産省のグリ-ンエナ-ジ計画関係の日射量・風力,統計局の人口デ-タ,環境庁の植生デ-タを入手し,ファイル変換を行ないフォ-マットを統一しデ-タベ-スとした.これらのデ-タについて,「ファイル操作」,「各種統計処理」,「表示」などの処理機能を持った『ラスタ型数値地図処理システム』(別冊報告書)を開発し,EGIS(環境地理情報システム)を構築した.次にこのデ-タベ-スと処理システムを用いて,蒸発量,暖かさの指数など,2次的に誘導できる水文・気候要素の計算を行った.また従来,気候図として蓄積されているデ-タの有効利用を図るため,既存気候図の投影変換を行ない,この研究で用いているデ-タベ-スのフォ-マットとの整合性を図った.また植生とその分布を支配している要因との関係,特に植生と暖かさの指数との関係,土壌と地形・地質・植生・気候などとの関係について統計的相関関係を明らかにした.これらの研究は環境要素間の単相関に関するものが主であるが,次年度以降の多変量解析的な研究の基礎となるものである.以上の研究実積は関係する学術雑誌に論文として印刷され,あるいはこの重点領域の総轄班が発行する研究報告書の論文といて収録されている.本年度は計画の初年度にあたり,今後3年間続く研究の基礎となる数値地図デ-タの整備と利用システムの開発を行った.国土庁/国土地理院の標高(DEM)・土地利用・地形分類・表層地質・土壌などのデ-タ,国土庁/気象庁の月降水量・気温・降雪量のデ-タ,農林水産省のグリ-ンエナ-ジ計画関係の日射量・風力,統計局の人口デ-タ,環境庁の植生デ-タを入手し,ファイル変換を行ないフォ-マットを統一しデ-タベ-スとした.これらのデ-タについて,「ファイル操作」,「各種統計処理」,「表示」などの処理機能を持った『ラスタ型数値地図処理システム』(別冊報告書)を開発し,EGIS(環境地理情報システム)を構築した.次にこのデ-タベ-スと処理システムを用いて,蒸発量,暖かさの指数など,2次的に誘導できる水文・気候要素の計算を行った.また従来,気候図として蓄積されているデ-タの有効利用を図るため,既存気候図の投影変換を行ない,この研究で用いているデ-タベ-スのフォ-マットとの整合性を図った.また植生とその分布を支配している要因との関係,特に植生と暖かさの指数との関係,土壌と地形・地質・植生・気候などとの関係について統計的相関関係を明らかにした.これらの研究は環境要素間の単相関に関するものが主であるが,次年度以降の多変量解析的な研究の基礎となるものである.以上の研究実積は関係する学術雑誌に論文として印刷され,あるいはこの重点領域の総轄班が発行する研究報告書の論文といて収録されている.
細胞内タンパク質フォールディング機構の解明-invivoタンパク質相互作用解析-

細胞内のタンパク質フォールディングに重要なGroELの反応機構を解明するため、invivo光クロスリンク技術により、細胞内のGroEL/GroES相互作用を解析した。細胞内で形成されたGroEL複合体をクロスリンクした後にウェスタンブロッティングで解析し、フットボール型反応中間体の形成を明らかにした。また、蛍光蛋白質を融合したGroESを用いて蛍光相関分光法(FCS)により、細胞内の複合体の検出が可能となった。シャペロニンGroELの反応サイクルは、2つのリングが交互に機能しながらはたらくことが通説として定着してきた。しかし我々は最近、これまでの作用機構モデルでは存在しえないフットボール型反応中間体(2つのリングに同時にGroESが結合した複合体)の重要性を確認したため、シャペロニンの新しい作用モデルの確立が必要である。本研究では、細胞内光クロスリンク技術を使い、大腸菌の細胞内で形成されたGroELのフットボール型複合体の検出を目指した。光反応性のアミノ酸アナログであるパラベンゾイルフェニルアラニン(pBpa)をGroESのGroEL結合部位に取り込ませ、pBPAとGroELとの間に紫外線照射によって架橋を形成させて細胞内で形成したGroEL複合体の解析を行った。pBpaの導入部位の指定は、終始コドンの1つであるアンバーコドン(UAG)を用い、変異導入GroES遺伝子はアンバーサプレッサーtRNA、pBpa特異的アミノアシルtRNA合成酵素とともに大腸菌内で発現させた。宿主大腸菌はゲノム上のGroESの発現をアラビノースの有無によって制御可能なMGM100株を使用することで、大腸菌内のほとんどのGroESは変異型となる。大腸菌がある程度生育した後、紫外線を照射して細胞内GroEL/GroES複合体を光架橋し、Native PAGEとウェスタンブロッティングで解析したところ、GroEL、GroELに1分子のGroESが結合した弾丸型複合体、フットボール型複合体の形成を確認することができた。これにより、細胞内においてもin vitroでの知見と同様に、GroELが同時に2分子のGroESを結合したフットボール型複合体を形成して機能していることが示唆された。しかし我々は最近、これまでの作用機構モデルでは存在しえないフットボール型反応中間体(2つのリングに同時にGroESが結合した複合体)の重要性を確認したため、シャペロニンの作用モデルを見直す必要がある。Native PAGEによる分離条件を検討し、ウェスタンブロッティングで解析したところ、細胞内において、1分子のGroELに1分子のGroESが結合した"弾丸型"GroES-GroEL複合体に加え、1分子のGroELに2分子のGroESが結合した"フットボール型"GroES-GroEL-GroES複合体が形成していることが確認できた。また、蛍光相互相関分光法(FCCS)によって大腸菌内でフットボール型複合体の形成を確認することを目指し、まずは、GFP融合GroESを大腸菌内で発現させて蛍光相関分光法(FCS)を行ったところ、複合体分子量(約800kDa)に相当する分子の蛍光が観察できた。これにより、GroESを別の蛍光ラベルで同時発現させることで、FCCSによるフットボール型複合体の確認が可能であると考えられた。しかし、これまでの作用機構モデルでは存在しえないフットボール型反応中間体(2つのリングに同時にGroESが結合した複合体)の重要性を確認したため、シャペロニンの新しい作用モデルの確立が必要となった。本研究では、in vivoにおけるGroELの作用機構を検証するため、大腸菌の細胞内で形成されたGroELのフットボール型複合体を2つの異なる方法で検出する事を目的としている。細胞内光クロスリンク技術を用いて、細胞内で形成されたGroEL、GroEL-GroES(弾丸型)、GroES-GroEL-GroES(フットボール型)の3種の複合体を分離・検出することに成功した。培養時の温度を3742°Cで変化させ、各複合体の量を比較したところ、いずれの条件でも3種の複合体が検出され、熱ストレスによる顕著な量的差異は見られなかった。また、GroES-GFPを用いた蛍光相関分光法(FCS)により、GroEL/GroES複合体と近い分子量を持つ複合体が観察できており、大腸菌内GroEL/GroESの結合・解離の動的観察が可能となった。これを蛍光相互相関分光法(FCCS)に展開するために、7量体GroESを1つの遺伝子で発現させたtandem-GroESを用いて(Nojima et al., J. Biol. Chem., 2008)、GroES7-GFP、GroES7-mOrangeを発現させることに成功した。

2種のGroESを同時に発現させた大腸菌のFCCSを行うことで、細胞内でGroEL/GroESフットボール型複合体が形成されていることを検証している。大腸菌細胞内で形成されたフットボール型複合体を、細胞内光クロスリンク技術で検出することができ、FCCSでも検出できる目処が立った。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、各複合体の生成比と培養条件による変化を細胞内光クロスリンク技術で分析する予定である。また、FCCSによるフットボール型複合体の検出も予定通り行う。