hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ロバスト音声合成の深化と多言語音声コミュニケーションへの展開

多様で表現豊かな音声合成の実現のために,モデル学習用音声データの量や質の変動に頑健で自然性の高い合成音声を生成するロバスト音声合成技術の深化をめざして研究を行った。ロバスト音声合成の基本技術として,学習用音声データのスタイル表出度合に依存しにくいスタイル制御モデルの構築法や韻律モデリング手法を提案し,評価実験を通してその有効性を示した。また,音声資源が乏しい言語へのロバスト音声合成技術の応用や新たなクロスリンガル音声合成手法を提案し,多言語音声コミュニケーションへの展開の検討を行った。ロバスト音声合成技術の深化・発展を目指し、基本技術に関する理論的検討、既存提案手法の高度化と新手法の提案を行う共に、ロバスト音声合成の多言語への応用に関してタイ語、中国語、英語、インドネシア語について検討を行い、以下の成果が得られた。表現性にロバストな音声合成法として、任意の目標話者の読上げ調スタイル以外の所望のスタイル音声を合成することを目的として、話者正規化学習を導入した新たな手法を提案した。提案手法は目標話者の目標スタイル音声が必要ないことから、時間とコストのかかるモデル学習用音声の収録が不要となり、多様な話者性による表現豊かな音声合成がより容易にできる特徴がある。また、合成音声品質の改善を目的として、ノンパラメトリックモデルに基づく新たな音韻モデル化手法を着想し、基礎的な検討を始めた。自発音声・会話音声の合成に関しては、多様な韻律特徴のモデル化を可能とするために、基本周波数(FO)の無声音部分における観測値の不連続性を考慮し、従来の音韻単位ではなく韻律イベントを単位とする新たな統計的FOモデル化手法を提案し、実際の自発音声合成に対してその有効性を示した。また、既存の自発音声コーパスに加えて、インターネットのツィート文を対象とした音韻・韻律を考慮した音声コーパス構築法を提案した。音声資源が乏しい言語の音声合成に関しては、FO量子化コンテキストを導入したモデル化手法によるタイ語音声合成の検討を進めると共に、インドネシア語の音声合成に向けた予備的な検討として、モデル化に必要となるコンテキストの評価を行った。多言語の音声合成へのアプローチとして、平均声方式における共有決定木手法を言語の多様性に対して適用した新たなクロスリンガル音声合成手法を提案し、日本語・英語及び日本語・中国語のクロスリンガル音声合成について評価を行い、提案手法の有効性を確認した。ロバスト音声合成技術の深化・発展を目指し、初年度に続き基本技術に関する理論的検討、提案手法の高度化、新たな手法の提案を行う共に、ロバスト音声合成の多言語への応用に関してタイ語、インドネシア語、英語について検討を行い、以下の成果が得られた。1.表現性にロバストな音声合成法:学習データ量の変化に対してロバストなモデル化手法として、新たな音素コンテキストセットの利用と基本周波数に関する正規化学習の導入を提案し、評価実験を通してその有効性を示した。また、統計的音声合成手法の新たなアプローチであるガウス過程回帰に基づく音声合成手法を提案し、基礎的な検討を行った結果、スペクトルのモデル化において従来の隠れマルコフモデルに基づく手法に比べて高い性能が得られる可能性を示した。2.自発音声・会話音声の合成:初年度で提案した音韻・韻律コンテキストバランスを考慮した音声コーパス構築手法に基づいて、インターネットのツィート文等,自発性の高い音声データベース整備とそれを学習データに用いたモデル化を行い、複数ドメインコーパスを用いるモデル化手法の有効性を明らかにした。3.音声資源が乏しい言語の音声合成:タイ語音声合成において、合成音声の自然性に大きな影響を及ぼすトーン(声調)の再現性向上に着目し、ストレスの有無を新たにコンテキストとして考慮する手法を提案してその有効性を示した。また、インドネシア語音声合成に対しては、男女各1名の音声データ収録を行い、プロトタイプシステム実現に向けた検討を進めた。4.多言語の音声合成:初年度で提案した共有決定木を利用した話者適応に基づくクロスリンガル音声合成手法について、英語・日本語を対象としたシステムの詳細な検討を行った。その結果、従来法である状態マッピングに基づいた手法に比べてより高い客観性能を示すことを示した。ロバスト音声合成技術の深化・発展を目指し、第二年度まで得られた成果を基に研究を進め、基本技術に関する理論的検討、提案手法の高度化を行うと共に、ロバスト音声合成の多言語への応用に関してタイ語、インドネシア語、英語について検討を行い、以下の成果が得られた。1.表現性にロバストな音声合成法:日本語合成音声のアクセント型の誤りを減らすために、アクセント型高低パタンに基づく基本周波数正規化学習の検討を行い、評価実験を通して有効性を示した。また、統計的音声合成手法の新たなアプローチであるガウス過程回帰に基づく音声合成手法に関して、従来の隠れマルコフモデルに基づく手法で有効性が示されている系列内変動と動的特徴量を提案手法にも導入することにより、性能がさらに改善できることを示した。

2.自発音声・会話音声の合成:品質の高い合成音声を得るためには、適切にコンテキストラベリングされた学習データが必要であるが、人手による正確なラベリング作業は高コストになる問題がある。これに対し、日本語文音声音声のアクセント句・アクセント型に関する自動韻律ラベリング手法を提案し、手動ラベリングと同等な合成音声が得られることを示した。3.音声資源が乏しい言語の音声合成:タイ語音声合成において、トーン(声調)の再現性向上に有効なストレスコンテキストを自動でラベリングする手法を提案してその有効性を示した。また、インドネシア語音声合成に対しては、前年度に収録した男女各1名の音声データを用いて、プロトタイプ音声合成システムを検討した。4.多言語の音声合成:共有決定木を利用した話者適応に基づくクロスリンガル音声合成手法について、英語・日本語を対象としたシステムのより詳細な検討を行った。さらに、モデルの性能を向上するために、新たな英語・日本語バイリンガル音声データの収録とラベリングを行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。音声情報処理26年度が最終年度であるため、記入しない。研究を4項目に分けて実施した結果、それぞれ当初計画した通りに研究が進み、成果が得られた他、ロバスト音声合成に関して新たな手法の着想とその検討を始めることができたことから、概ね順調に進んでいると判断した。本研究の目的は、ロバスト音声合成技術を深化・発展させ、利用可能な音声資源が乏しい条件下においても、個性や多様性を表出可能で自然性の高い韻律を持つ音声を合成するための技術を創出し、確立した技術を東南アジア諸国の音声資源が十分でない言語を含む多言語音声合成に応用したユニバーサルコミュニケーション実現に資することにあった。この観点から研究を4項目に分けて実施した結果、それぞれの項目毎に当初の計画通りに研究が進み、期待した成果が得られたことに加え、ロバスト音声合成に関して新たな統計的音声合成のフレームワークの提案につながり、新たな検討を進めることができたことから、概ね順調に進んでいると判断した。初年度の研究は概ね計画通り進んでおり、計画の特段の変更は不要なことから、当初の計画に沿ってこのまま研究を進めていく。第二年度迄の研究は概ね計画通り進んでおり、計画の特段の変更は不要なことから、当初の計画に沿ってこのまま研究を進めていく。音声データ収録を発注予定であったが、当初構想した発話文章数を収録すると想定した金額を超過することが判明し、発話内容や収録文章数の再検討が必要になったことから、収録を次年度に延期した。研究目的達成のために必要な発話内容を客観的・主観的観点から厳選した上で、収録を行う。招聘を予定していたスラバヤ工科大の研究協力者が別予算で研究室に滞在し研究を行ったことと、研究分担者が年度半ばで研究機関を異動した関係で、必要な研究基盤整備のための金額配分が当初の予定と異なってしまったため。
ヒトの癌細胞における遺伝子増幅領域のゲノム構造解析と疾患原因の解明

一般に癌細胞においては、様々な遺伝子の増幅や欠失が認められ遺伝子発現および発現制御機構が乱されている。本研究においては、ヒトの乳癌細胞株や特殊なリンパ腫細胞株に見いだした染色体上の遺伝子が増幅している領域に注目して、分子レベルではどのような構造になっているのか明らかにして疾患原因を解明することを目的としてFISH法による解析を試みた。その結果、乳癌細胞株HCC1143株においてNOTCH3遺伝子コピー数増加と遺伝子増幅を明らかにした。原発性体腔内リンパ腫(PEL)細胞株において癌細胞の浮遊性細胞増殖に関わる共通増幅領域をゲノム上で絞り込んだ。まだ疾患原因候補遺伝子の特定には至っていない。ヒトがん細胞において遺伝子発現制御機構が破綻する要因のひとつである遺伝子増幅現象に的を絞り、ErbB2非発現乳癌細胞株HC1143株と樹立した原発生体腔内リンパ腫PEL細胞株2株において、その遺伝子増幅領域を細胞遺伝学的に解析している。(1)ErbB2非発現乳癌細胞株HC1143株の第19染色体上のNOTCH3遺伝子増幅領域を含むDNA断片であるYACクローンCTD-2538G16(171kb)をPFGEにより幾つかのDNA断片に分け、NOTCH3遺伝子近傍の2遺伝子がこの増幅領域に含まれるかどうか確認し、同時にRT-PCR法を用いて発現確認する計画であった。が、前年度に続いて適当なDNA断片が得られていない。(2)PEL腫瘍株2株に認められた共通増幅領域をカバーするBACクローンを特定して、この領域内の物理地図作成を目標にしていた。しかし、適切なBACクローンの選定には至っていない。(3)オリンパス社製高感度デジタル冷却CCDカメラおよび蛍光画像取得システムによる高感度高画質な記録による解析を可能にするための周辺機器の充実をはかり、解析環境は大いに改善された。(4)新たに、肺癌細胞株NCI-H1299株のプラスミド遺伝子増幅についてfiberFISH法で明らかにした。がん細胞に見られる染色体異常は多様であり、がん化の原因として、テロメア配列維持機構の破綻、BFB (Breakage-fusion-bridge)サイクルによる染色体分離異常の結果として生じる染色体不安定性のメカニズムを解明することは重要である。また、特定領域の遺伝子増幅現象はがん細胞の増殖にアクセルとして働いていると考えられ、そこに共通のメカニズムが存在するのかどうか明らかにすることはゲノム構成上、なぜその場所にそのユニットサイズで生じたのか、という問題も含めて充分解明する意義のあることだと考えている。ヒト癌細胞における遺伝子増幅領域のゲノム構造異常とその機能的な意義を明らかにして病因解明に迫ること、および増幅領域形成に共通するメカニズムを明らかにすることを目的として本研究をスタートさせた。当初計画していた、ErbB2を発現していない乳癌細胞株HC1143株にFISH法で同定された第19染色体上のNOTCH3遺伝子由来シグナルのうち、マーカー染色体上の遺伝子増幅しているNOTCH3遺伝子領域に注目してそのゲノム構造を明らかにすること、原発性体腔内リンパ腫PEL細胞株2株(OS-1およびPSu株)の共通増幅領域(1q31.3-q32.1)の詳細なゲノム構造解析をすること、については適切なDNAクローン取得が出来ず研究計画は進展していない。他方、ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H1299株に二本鎖切断とその後の非相同末端結合(NHEJ:non-homologous end joining)を積極的に誘発する目的で導入されたプラスミドDNAの挿入部位について、幾つかのクローンをFISH解析した。マーカー染色体上に単一挿入部位を保持している安定したクローンについて、導入されたプラスミドDNAプローブ(約7.2kb)を二分して別々に標識しFiber-FISH法を用いて詳細に解析した結果、染色体上の挿入部位においてプラスミドDNAがmulti copiesで増幅していることを見いだした。また、このマーカー染色体が5種類の染色体からなる再構成染色体であることも明らかにした。さらに新たに、免疫不全マウスに連続継代移植された患者由来ヒト腫瘍細胞の継代5代目における染色体解析を行った。その結果、マウス脾臓内で増殖している腫瘍は、46, XX, t(2;11;14) ?の核型を示す均一な細胞集団であることが明らかになった。ヒト癌細胞において遺伝子発現制御機構が破綻する要因のひとつである遺伝子増幅現象に的を絞り、ErbB2非発現乳癌細胞株であるHC1143株と樹立した原発性体腔内リンパ腫PEL細胞株2株(OS-1およびPSu)において、その遺伝子増幅領域で起こっている詳細な現象を細胞遺伝学的に解析している。(1)ErbB2非発現

乳癌細胞株HC1143株の第19染色体上のNOTCH3遺伝子増幅領域を含むDNA断片であるYACクローンCTD-2538G16(171kb)をPFGE(パルスフィールドゲル電気泳動法)によりいくつかのDNA断片に分け、NOTCH3遺伝子の近傍の2遺伝子がこの増幅領域に含まれるかどうかを確認し、同時にRT-PCR法を用いて発現確認する予定であった。が、適当なDNA断片がまだ得られていない。(2)PEL腫瘍細胞株2株に認められた共通増幅領域をカバーするBACクローンを特定し、この領域内の物理地図を作成することを目標としていた。しかし、適当なBACクローンの選定に至っていない。(3)オリンパス社製高感度デジタル冷却CCDカメラおよび蛍光画像取得システムによる高解像度高画質な記録による解析を可能にするための周辺機器の充実をはかり、解析環境は大いに改善された。癌細胞に見られる染色体異常は多様であり、がん化の原因として、テロメア配列維持機構の破綻、BFB(breakage-fusion-bridge)サイクルによる染色体分離異常の結果として生じる細胞の染色体不安定性のメカニズムを解明することは重要である。しかし同様に、特定領域の遺伝子増幅現象は癌細胞の増殖にアクセルとして働いていると考えられ、そこに共通のメカニズムが存在するのかどうか明らかにすることはゲノム構成上、なぜその場所にそのユニットサイズで生じたのか、という問題も含めて充分解明する意義のあることだと考えている。ゲノム科学(1)ヒトiPS細胞などの幹細胞株の染色体解析を精力的に行い染色体不安定性を示唆する結果を得た。また、(2)四肢短縮タイプの矮小型ラットを産出するCCIラットにおける第1染色体トリソミー細胞が移植継代を繰り返しても発症と相関することを突き止め癌幹細胞である可能性が示された。(3)肺癌細胞株NCI-H1299株において、プラスミド遺伝子挿入部位のゲノム構成をfiber FISH法により明らかにした。複数の他のプロジェクトが進展をみせたこともあって、本研究目的の乳癌細胞株HC1143株やPEL細胞株での増幅領域を含む候補BACクローンの選定とFISH法による同定に費やした時間が少なかったために、研究実績として報告できる一定レベルの成果を挙げられていないのが現状である。ヒトiPS細胞などの幹細胞株の染色体解析による染色体不安定性や四肢短縮タイプの矮小型ラットを産出するCCIラットにおける第1染色体トリソミー細胞が移植継代の結果癌幹細胞である可能が示されたことなど、複数の他のプロジェクトが進展を見せたこともあって、本研究目的の乳癌細胞株HC1143株やPEL細胞株での増幅領域を含む候補BACクローンの選定とFISH法による同定に費やした時間が少なかったために、研究実績として報告できる一定レベルの成果を挙げられていない。乳癌細胞株、PEL細胞株および肺癌細胞株について、それぞれ以下のように研究を推進させて行きたい。(1)NOTCH3遺伝子発現の亢進が増幅領域全体で起こっているかどうかを同定するために引き続きSequential FISH法(RNA-DNA FISH法)の基本技術修得に努める。
試料局所領域精密温度測定法の研究

透過電子顕微鏡内で局所領域の温度を正確に測定することは、透過電子顕微鏡法の悲願である。Au-Si共晶合金の針状試料を用いて数100nm程度の針状試料作製し、透過電子顕微鏡内で測温を試みた。Siウェハ上にAuを蒸着し、ダイアモンド粉末を塗布した後、イオンシャドウ法を用いて試料を作製した。作製した試料を加熱ホルダーに取り付け透過電子顕微鏡内で加熱した。固液界面の移動量から、Au-Si共晶点を基準に5nmあたり10°Cの精度で測温出来ることが示された。本研究は、透過電子顕微鏡中の試料の局所領域の温度を正確に測るための、ナノサイズのデバイスを創製することを目的とする。フィラメント直接加熱型試料ホルダー、集束イオンビーム(FIB)加工装置を組み合わせることにより、Wedge Shape試料やNeedle Shape試料を作製し、試料の融解現象にともなう固・液界面位置の温度依存性によりnmサイズの位置精度で局所温度を正確に測定することを目指す。26年度は、昨年度の結果を元に最も安定して作製でき、かつ広い温度範囲で固・液界面の移動が観察できるSi-AuのNeedle Shape測温体の作製および性能検討を行った。昨年度の結果より固・液界面の移動度が、バルク近似モデルと比較して移動係数が一桁近く大きくなった問題を解決するために、試料作製法の改良を行った。試料表面に塗布するダイアモンド粉末サイズを、3μ程度から、8ミクロンと大きくし、Arイオンミリングでイオンシャドウ時間を20分程度から120分に延長し、試料表面に残留するAuの量を大幅に削減した。また、この結果Needleの頂角は18°程度のものを安定して作製することが出来るようになった。固・液界面の形成を、共晶温度である363°C近傍で観察でき、過熱・冷却に伴いほぼ可逆的な固液界面の移動を観察することが出来、温度計としての利用の可能性が確認できた。温度に対する固・液界面移動どは、状態図より推定した値の数倍となったが、界面エネルギーを取り込んだ熱力学モデルを用いることで温度誤差5°C以下に補正を行うことが出来、ナノサイズの温度計を作製することが出来た。また、界面エネルギーを取り込んだ熱力学モデルを用いることで、Au-Si液相とSi固相界面の界面エネルギーを推定できることが分かった。本研究は、透過電子顕微鏡中の試料の局所領域の温度を正確に測るための、あのサイズのデバイスを創製することを目的とする。24年度は、Wedge Shape測温体より量産が可能でサイズが小さい(1)Needle Shape測温体の作製および(2)μSamplingの可能性を検証した。まず、高融点金属(Pt, W, Mo)の基板上へ、低融点金属を上に蒸着した。その後、試料表面に1μm径程度のダイアモンド粉末を塗布し、数分間Arイオンミリングでイオンシャドウ法を行う。Arイオンビームの設定条件でNeedleの頂角を制御た。その後、試料表面を再度PlasmaCVD保護膜で覆った。高融点金属と低融点金属の組み合わせは、状態図からの考察から、Sn-Cu、Sn-Alなどいくつかの組み合わせを試した結果Si-Auが最も安定して作製でき、かつ広い温度範囲で固・液界面の移動が観察できることがわかった。また、Needleの頂角は24°程度のものを作製する条件を見出した。Si表面をアルゴン水素還元ガス雰囲気下でスパッタリングを用いてクリーニングした後Auを製膜することで安定した界面を作製できることが分かった。固・液界面の形成を、共晶温度である363°C近傍で観察できた。固・液界面の移動度を、バルク近似モデルと比較したところ移動係数が一桁近く異なった。界面エネルギーを取り込んだ熱力学モデルとの比較をを進めている。さまざまな系の探索の結果Si-Auが最も安定して作製でき、かつ広い温度範囲で固・液界面の移動が観察できることが分かり、使用物質系を固定することが出来た。また、より敏感に測温するためにはNeedleの頂角は鋭いほどよく、最も鋭いもので24°程度のものを作製する条件を見出した測温体の形状を最適化することが出来た。安定したSi-Au界面を形成するためには表面をアルゴン水素還元ガス雰囲気下でスパッタリングを用いてクリーニングした後Auを製膜するという技術的なポイントも明らかにすることが出来た。(1.測温体の作製100%達成)

固・液界面の形成を、共晶温度である363°C近傍で観察でき固・液界面の移動度を実験的に測定できる段階まで進んだ(実試料の測定+α50%)。しかし、固・液界面移動度は最も単純なバルク近似モデルと比較したところ移動係数が一桁近く異なった。これは、最初から予想されていたことであるが界面エネルギーを取り込んだ熱力学モデルをリファインすることで、より正確に予測することが出来ると考えられ、より精密な理論式の構築を進めている。Needle試料のμ-Samplingに関しては、当初予想していたよりはるかに多くのRedepositionが形成されることがわかり、測温Needleの取り出し方法を再考する必要が生じた(2. μ-Sampling 30%達成)。また、実験の過程でNeedle表面で、非常に薄い液相膜の形成が観察され、高融点金属の固・液界面の原始レベルでの構造解析の可能性という新しい可能性が示唆された(新しい研究の芽+α30%)。固・液界面の移動度を実験的に測定できる段階まで進んだが、固・液界面移動度は最も単純なバルク近似モデルは移動係数が一桁近く異なるため、界面エネルギーを取り込んだ熱力学モデルを用いてより正確に予測することを試みる。Needle試料のμ-Samplingに関しては、当初予想していたよりはるかに多くのRedepositionが形成されることがわかり、測温Needleの形状を崩さずに、試料任意箇所に設置するには手法の改良が必要である。測温Needleの形成をイオンシャワー法にとらわれず、FIBによる研削をより積極的に使用した方法を模索し、Needleへ形成する前にμ-Samplingを行い、測定試料上でNeedleを形成する方法を探る。また、Redepositionの形成がより少ないXeやHeイオンビームを用いたFIBによる作製を試み、実試料での測温行えるようにする。消耗品として:高純度金属試料(50万)、透過電子顕微鏡加熱ホルダー用フィラメントカセット作製費(30万)謝金等として:名古屋大学超高圧電子顕微鏡施設でのGaFIB使用料(50万)、物質材料研究機構でのHeFIB加工依頼料(30万)
加齢黄斑変性の病態特異的な遺伝子多型の同定と個別化治療への応用

日本人加齢黄斑変性(AMD)に関連する遺伝子研究を行い、ARMS2/HTRA1、CFH、CD36などの遺伝子多型と典型AMDやポリープ状脈絡膜血管症(PCV)との関連性の有無を証明。特にエラスチンやCD36遺伝子多型において典型AMDとPCV間で関連性が異なることを明らかにした。また、AMDへの治療、特に光線力学療法(PDT)と抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の治療経過をまとめ、その有効性に関わる因子の統計学的解析を行った。さらにPDTや抗VEGF療法の効果とAMDサブタイプやARMS2/HTRA1、CFH、CD36の遺伝子多型間に有意な関連性があることを証明した。1)網膜周辺部に比べて黄斑により多く存在し、酸化LDLなど脂質酸化に関与するCD36のイントロン遺伝子多型は典型AMDとポリープ状脈絡膜血管症(PCV)間で関連に有意な違いがあることを証明した。2)さらにPDTの効果とAMDの表現型や遺伝子多型間の関連を調べた結果、PDTの効果とCD36の遺伝子多型間に有意な関連性があることを証明した。CD36遺伝子多型における非リスクアレルと先に検証したARMS2遺伝子多型における非リスクアレルの同時保持者はと最も高いPDT効果を示した。一方、両遺伝子多型におけるリスクアレル同時保持者は最も低いPDT効果を示した。3)臨床分類的にPCVとされる症例群を蛍光眼底造影検査における異常血管網の所見に基づき更に2種類に分類してARMS2、CFH遺伝子多型との関連を調べた結果、ARMS2多型において上記2種類のPCV表現型間で有意な関連の違いが検出された。これは、それまで一つの疾患群として扱われていたPCVが、異なる遺伝的感受性を持つ少なくとも二つ以上の病態の集まりである可能性を示唆しており、先に観察された臨床的疾患群としてのPCVと典型AMD間にみられた遺伝的感受性の違いを説明するものである。4)抗VEGF療法に対する典型AMDとPCVの反応性の違いを明らかにし、また抗VEGF療法の1年後治療効果に関わる因子の同定を行ったところ、病型とBody mass indexに有意な関連が見られた。5)典型AMDとPCV間における光線力学療法(PDT)の5年後治療効果の違いを検証したところ、両病型間で術前からの視力変化に有意差を認めなかった。これは先に証明したPCVのPDTへの良好な反応性を否定するものとなった。治療前におけるPDT後の予後予測因子の多変量解析では年齢と治療前視力と病巣径が有意な予後予測因子であった。PCVの中に遺伝素因の異なる2種類のサブタイプが存在する事を証明し、それらが光線力学療法(PDT)などの治療効果に関連する事を明らかにした。一方で、臨床的に分類したAMDサブタイプに対するPDTや抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の治療経過をまとめ、その有効性に関わる臨床および遺伝因子の統計学的解析を行った。特にPDTや抗VEGF療法の効果とAMDの表現型や遺伝子多型間の関連を調べ、各治療法の術後視力や解剖学的改善とAMDのサブタイプやCFH、ARMS2/HTRA1、CD36の遺伝子多型間に有意な関連があることを証明した。中でもCFH遺伝子多型では疾患に対するリスクアレルがPDTの効果に対してはプラスに働くこと、特定のCFH遺伝子多型の組み合わせ(ハプロタイプ)を持つ個体は抗VEGF療法への反応性が不良である事などを発見した。1.狭義加齢黄斑変性症(AMD)200例、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)300例、および正常対照者250名についてDNAの抽出を行ない、遺伝子多型の解析を行った。2.欧米においてAMDとの関連が示されたcompliment component3 (C3)の一塩基多型(SNP)rs2230199(R102G)はアジア人を対象とする追試では関連性を認めなかった。ただ、このSNPはアジア人におけるマイナーアレル頻度が非常に低いことから、関連性の検出力に限界があった可能性を考慮し、我々はC3領域における他のSNPを広く検索した。その結果、イントロン29にあるrs2241394多型が有意に日本人AMDの疾患感受性に対して保護的に関与していることを見出した。3.酸化LDLなど酸化脂質の細胞内取り込みに関与するCD36のイントロン遺伝子多型との関連が狭義AMDとPCV間で有意に異なることを発見した(CD36多型は狭義AMDとのみ関連し、PCVとは関連なし)。4.Age-related maculopathy susceptibility 2(ARMS2)のrs10490924(A69S)多型が狭義AMDとPCV間で有意に関連が異なることをメタ解析によって証明した。5.ARMS

2やCD36のSNPが光線力学療法の視力予後と有意に関連することを見出した。6.理化学研究所との多施設研究に参加し、日本人AMDに特異的と考えられる新たな遺伝子多型TNFRSF10A-LOC389641(rs13278062)とREST-C4orf14-POLR2B-IGFBP7(rs1713985)を同定した。上記のごとく、典型AMDとPCV間、またはPCV内のサブタイプ間において様々な遺伝子多型の関連性の違いが確認されつつあり、またそれらが少なくともPDTに対する感受性の違いにも関連することが明らかになりつつある。特にARMS2とCD36各遺伝子多型の情報は現時点でも治療前情報として応用可能なレベルにあると思われる。また、抗VEGF療法に関連する遺伝子多型も解析が進んでおり、次年度中には全体像が明らかになる見込みである。今後は如何にして簡便に治療前遺伝子診断を行うかという実用面での工夫が試される段階に差し掛かっていると考える。上記のように、AMDの病型によって関連の異なるSNPが複数確認され、また各々が光線力学療法の予後にも関連することが示された。また、以前我々が狭義AMDとPCV間で有意に関連が異なることを発表したエラスチンrs2301995多型に関して複数の追試が行われ、いずれも狭義AMDとPCV間での関連の相違を示唆するものであった。これらの解析を更に進めることによって個別化医療の実現へ着実に前進しているものと考える。上記のごとく、次年度中には抗VEGF療法に関連する遺伝子多型の解析が完了し、AMDに対する各種治療効果と遺伝子多型の関連における全体像が明らかになる見込みである。今後はこれらの遺伝情報をAMD治療に広く活用するべく、如何にして簡便に治療前遺伝子診断を行うかという実用面での工夫が試される段階に差し掛かっていると考える。今年度中に解析を行う予定であった遺伝子多型の内、時間的な関係でいくつかの解析が次年度への持ち越しとなった(そのため研究費の一部未使用が生じた)。今後も理論的考察に基づく候補遺伝子アプローチによってAMD病型間の特異的関連遺伝子をさらに探索する。一方で、今年度の多施設研究で得られたゲノムワイド関連解析データを利用して各病型間で関連に差のあるゲノム領域を絞り込むことも試みる。光線力学療法に加え、抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の効果と関連のあるSNPの同定を進めて行く。少数例では既に抗VEGF療法の治療回数と関連のあるSNPを見出したが、更に症例数を増やして確認作業を行う。研究費は物品明細に記したように、主にリアルタイムPCR・シークエンサー用プローブおよびプライマー、実験試薬、抗体などに使用する。また、研究成果発表のための学会出張用旅費、論文投稿料および英文校正料などに使用する。上記のために本年度の未使用分を平成24年度の研究費と合わせて使用する。
膜結合型AAA-ATPase p47/p97複合体による細胞膜認識とその制御

(1)TRAPチューブBacillus subtilisの細胞質の中では、TRAP活性はanti-TRAPというタンパク質に制御されており、トリプトファンの不足している状態で、TRAPとantiTRAPは複合体を作る。したがって、RNA結合が阻害される。今まではどのようにTRAPとantiTRAPが相互作用しているか明らかではなかった。そのため、我々はこの複合体の結晶化を行い、結晶構造を決定した。TRAP-antiTRAP複合体のX線結晶構造を決定した。結晶化とともに、TRAPは11量体から12量体になった。結晶対称軸とTRAPリング軸を合わせて、非対称単位が数個の分子しか含まない。それから、通常では大きい複合体は十分に分解能回折データを測ることができないが、今回は高い分解能のデータを測ることができた。構造生物学的観点から最も研究されている膜蛋白質の二つがmsbAである。現在までに二つのX線結晶構造解析の研究が報告されている。大腸菌由来のものが3.8Å、V.cholerae由来のものが4.5Å分解能で立体構造が決定された。msbAは、脂質二重膜中の脂質を一方の膜から反対側の膜へと移動させると考えられているが、二つも構造が決定されているにもかかわらず、正確なメカニズムはわかっていない。すでにmsbAの遺伝子が大腸菌のゲノムDNAからPCR法によって増幅され、蛋白質発現ベクターに組み込まれている。現在までに判明しているmsbAの立体構造から、この蛋白質を可溶化するためのアミノ酸置換が判明しているので、早速実践している。これらアミノ酸置換を導入したmsbA発現ベクターを作成し、X線結晶構造解析に十分な量のmsbAを得ることを検討している。このmsbA作成は、「可溶化膜蛋白質」を作成するためのテストケースになるであろう。nixAは、ニッケルイオン輸送蛋白質である。最近、ニッケルイオンは、多くの病原性バクテリアの生育にとってとても重要な要素であることが明らかになりつつある。バクテリアの尿素分解酵素の活性に必須元素とわかってきたからである。実際、ニッケルイオン取り込みを阻害すると、バクテリアの生育は阻害されることもわかった。H.pylori菌は胃・十二指腸潰瘍を引き起こす細菌であるが、この細菌由来のnixAは、薬剤設計のための良いターゲットと言えるであろう。NixAに関する構造学的な知見はほとんど報告されていないが、架橋剤実験によって、この蛋白質は8回膜貫通型構造を持っていると考えられている。このH.pylori菌由来NixA蛋白質のアミノ酸置換体遺伝子を合成した。DNA配列には、ランダムに変異が入るようにPCRを行い、XLI-Redと呼ばれる大腸菌に形質転換した。可溶化蛋白質が得られた場合にGFPによって発光するような工夫をし、スクリーニングをする計画である。我々は、X線結晶構造解析の手法を使って、生体で重要なタンパク質分子の立体構造を高分解能で決定している。膜輸送系として重要視されているオートトランスポーターの一種、「Heme binding protein ; Hbp」の結晶構造解析に成功した。分子量は112kDaと巨大で、このクラスのオートトランスポータータンパク質で構造が決定されたのは世界初である。Hbpは、ヒトの腹膜炎の膿から単離された病原性大腸菌が分泌するタンパク質として発見された。Hbpの役割は、宿主のヘモグロビンを分解してヘムを奪い取り、細菌にヘムを供給することである。Hbpの分泌ドメインの結晶構造は、巨大なβヘリックス構造を中核に、トリプシン様の新規セリンプロテアーゼドメイン、分子内シャペロンドメインなどが付属した構造であった。βヘリックス構造はオートトランスポーターに共通して見られる構造であり、またセリンプロテアーゼドメインはSPATEファミリーで良く保存されている。我々は、今回得られたHbp分泌ドメインの構造が、いろいろなオートトランスポータータンパク質、つまりは病原性細菌の毒素の機能を調べるための基礎情報として、また毒素の活性を阻害する方法の開発などに役立つことを期待している。例えば、HbpのDomain-2ペプチド自体がHbpの活性を阻害するための医用ワクチン開発生産に使えるのではないかと考えている。また、Hbpは便利なペプチド合成手段として使えるかもしれない。HbpのDomain-2の場所に、他のペプチドを代わりに挿入して分泌させることも可能であろう。我々は、X線結晶構造解析の手法を使って、生体で重要なダンパク質分子の立体構造を高分解能で決定している。膜輸送系として重要視されているオートトランスポーターの一種、「Heme binding Protein ; Hbp」の結晶構造解析に成功した。この成果は、米国雑誌Journal of Biological Chemistry誌のvol.280(17)pp.17339-45に発表された。

我々は、今回得られたHbp分泌ドメインの構造が、いろいろなオートトランスポータータンパク質、つまりは病原性細菌の毒素の機能を調べるための基礎情報として、また毒素の活性を阻害する方法の開発などに役立つことを期待している。例えば、HbpのDomain-2ペプチド自体がHbpの活性を阻害するための医用ワクチン開発生産に使えるのではないかと考えている。我々はタンパク質問のソフトなインタラクションについて知見を深めるため、TRAP(トリプトファンRNA結合タンパク質)を用いて研究を行っている。TRAPは熱安定性の非常に高いリング型11量体を形成する。TRAPモノマーをコードするDNAを2つ、3つ、または4つをタンデムに結合させて発現させることにより、複数のドメイン構造を持っ新しいTRAP構造体を作成することに成功した。新しく出来たTRAPはリング型12量体を形成しており、サブユニット間の水素結合パターンは11量体と12量体とで大きな差はない。12量体TRAPはペプチドリンカーにより立体構造的に無理な力がかかっているため、熱安定性が悪い。TRAPタンパク質が、11量体を形成してTRAP一分子を余らせるよりも、少々無理をしてでも12量体になったことは、タンパク質・タンパク質の間のエントロピー調節がいかに重要かを示している。現在、TRAPのトリプトファン結合の協同性について11量体、12量体TRAPでいかに違うかについて解析している。また、我々は薬剤結合型ヒトヘモグロビンの立体構造解析に成功した。L35と呼ばれる薬剤はヒトヘモグロビンの酸素親和性を下げる。長い間、L35はヘモグロビンのR状態とT状態の間の平衡状態をシフトさせることによって酸素親和性を下げると考えられてきたが、今回の我々のX線結晶構造解析により、L35はヘモグロビンのT状態構造にもR状態構造にも結合することがわかった。L35分子の結合部位がヘモグロビンの酸素結合部位と離れているにも関わらず、酸素親和性が下がることがわかったのである。これはタンパク質自体の動きによって情報が伝わっていると考えざるを得ない。我々はタンパク質間のソフトなインタラクションについて知見を深めるため,TRAP(トリプトファンRNA結合タンパク質)を用いて研究を行っている。TRAPモノマーをコードするDNAを2つ,3つ,または4つをタンデムに結合させて発現させることにより,複数のドメイン構造を持つ新しいTRAP構造体を作成することに成功した。新しく出来たTRAPはリング型12量体を形成しており,サブユニット間の水素結合パターンは11量体と12量体とで大きな差はない。12量体TRAPはペプチドリンカーにより立体構造的に無理な力がかかっているため,熱安定性が悪い。
装飾とデザインのジャポニスム―西欧におけるその概念形成と実作の研究

3年間で英、仏、ベルギー、独、スペイン、米における装飾とデザインのジャポニスムの研究を行った。この研究課題は、今まであまり取り組まれてこなかった装飾とデザインというマイナーと見做されてきた分野を扱うとともに、西洋人の日本観を知るためにジャポニスムの言説に関するものも研究対象としている。その結果、各地での特色の相違はあるものの、装飾とデザインにおいて、日本における「自然主義」「工芸の高い評価」「優れた技術」「生活に密着」といった点が高く評価され、それまでの西洋になかった新しいパラダイムが誕生したことを確認することができた。全員が今後の研究に必要な基礎的資料を収集し、さらに幾つかの具体的テーマに絞って研究を進めた。馬渕はアール・ヌーヴォーの立役者であるジークフリート・ビングの同名の店の指針について研究した。とりわけ彼が1888年から3年間にわたって出版した雑誌『芸術の日本』における言説を分析すること、アメリカなど外国からの情報をどのように取り入れたか、の検証をおこなった。また、この時期に日本美術がどのように市場に出回ったかについて,コレクションの売立てを検証し次頁の図書において報告した。天野は両大戦間に漆装飾で活躍したジャン・デュナンを中心に基礎的な研究を進め、フランス国立図書館等において当時の批評を中心とした文献資料および作品を調査した。また当時の室内装飾において輸入品を含めた漆作品が使用される例を定期刊行物等を通じて調査した。その結果デュナンの作品は、それまでの日本の漆作品の模倣とは異なり、両大戦間フランスの装飾芸術を特徴づけるモダンな特質が注目されたこと等が確認された。池田は日本美術・工芸の普及に寄与したハンブルク工芸博物館の館長ユストゥス・ブリンクマンのもとで働いたふたりの人物、日本人の原震吉とフリードリヒ・デーネケンを中心に調査した。ハンブルク工芸博物館に保存されている原の出張記録を閲覧することで、当時の各地の工芸博物館における日本美術・工芸品をめぐる状況を調査した。またドイツ工作連盟資料館では、デーネケンとヘルマン・ムテジウスの書簡を閲覧することで、日本美術・工芸品が近代デザインの発展にどのように寄与していたかを調査した。高木は日本の造形を伝える媒体であった染め型紙に注目して、一般大衆が理解した日本を翻案する消費財としての英国のジャポニスム、それを最新の装飾芸術として需要し、前衛美術の要素としたベルギーのアンリ・ヴァン・ド・ヴェルドの例を調査し、2012年4月に刊行されるKATAGAMI Style展図録で発表した。馬渕は、前年度からの繰り越し分の調査をナンシー派美術館(ナンシー)、およびラリック美術館(ヴィンゲン=シュル=モーダー)において、今井朋(連携研究者)の協力を得て行い、ナンシーのガレ周辺において、日本美術の収集や模写が積極的に行われていたことを示す資料を収集した。また、バルセロナの特別展「スペインのジャポニスム」展で、今までほぼ未開拓だったスペインでも、多くの装飾工芸家がジャポニスムを展開していた資料を収集した。またパリの装飾工芸作家、ファリーズやヴェヴェールの活動を調査した。天野は前年の国際シンポジウムで発表した内容を元に報告書掲載論文として「アール・デコ期における漆装飾ージャン・デュナン」を執筆し、両大戦間におけるジャン・デュナンの漆のあり方と日本との、複雑な関係の様態と特質を明らかにした。高木は上記の国際シンポジウム「装飾とデザインのジャポニスム」で「ブリュッセルのズグラフィート装飾にみる都市型住宅ファサードのジャポニスム」について発表した時に提示した課題を研究するため、ブリュッセルの近代建築アーカイブ、ブリュッセル自由大学図書館、王立図書館にて、関連資料を調査した。池田は、ドイツにおけるユーゲントシュティールならびにジャポニスムの代表的作家とみなされているオットー・エックマン(Otto Eckmann, 1865-1902)を中心に研究を進めた。彼の仕事の変遷を追いつつ、それに伴う主要な美術雑誌・新聞における彼の作品に対する批評の言説を「自然」および「日本」という観点から分析した。全員が前年のシンポジウム内容を論文にするため、精度を高める調査研究を行い、その成果をシンポジウム報告書で発表した。平成24年度は、12月に予定されている国際シンポジウムの発表に向けて各自調査研究を行った。馬渕はパリ装飾美術館およびオルセー美術館資料室において、1900年前後の装飾工芸デザイナーによって、日本美術がどのように応用されたか、彼ら自身あるいは周辺の言説で日本美術のどの要素が応用に値すると考えられていたか、を調査した。天野はパリ装飾美術館や国立図書館において、アンリ・デュナンやアイリーン・グレイといった漆を用いた工芸作家がどのような技法を用いて、どのような美学で作品を制作したかを調査した。池田はハンブルクにおいて1890年代の工芸美術館の館長であったブリンクマンの論文の分析や、工芸デザイナーのオットー・エックマンの作品調査を通じて、日本美術の応用の美学と実践を調査した。高木はブリュッセルの建築・工芸家が日本のどのようなデザインの要素を用いて建築装飾を行ったかの調査を行った。

12月のシンポジウムでは英、米、西の研究者を招へいし連携研究者も含めて10名の発表を行い、世紀末から20世紀の欧米で日本美術を参照した多くのジャポニスムの装飾とデザインの例が示され、各国、各美術家がどのような視点でそれらを制作し、その意義はどのようなものだったのかの分析が示され、多くの専門家との質疑討論が行われた。その結果を更なる調査研究にフィードバックして、翌年度の報告書の刊行に向けて精度を高めることになった。なお、今年度は調査館の都合で、予定していたナンシーでの調査が先送りとなった。基礎的な資料については全員が過去からの蓄積をもっているので、次の段階に進むことができ、各国の図書館レベルでの刊行物による資料の収集や分析は進んでいるが、次のレベルにおける原資料(書簡、博物館公式記録、作家遺族との連絡)等において、まだ十分な時間をかけることが出来ていない。しかし、各自が次の段階の課題を把握し、時間と手間をかけることでそれを乗り越えることができると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。各自の調査研究成果を、2年度目に国際シンポジウムで発表し、意見交換を行った。その結果、情報と論の不足を補う方策を入手し、3年度目に継続して研究の精度を高めることができる。次年度12月に予定している国際シンポジウムにおいて、研究の前半の報告を行い、海外から招聘する研究者との交流において、情報を収集しさらなる課題を設定する。そのため、次年度前半は原資料の収集と分析に時間をかける予定である。今回はジャポニスムに関して、代表的な機関や美術家の装飾とデザインの実作と理論に関わる研究を行ったが、近年ジャポニスムがさらに広い地域で発展した例証が出てきている。たとえばイタリアやスペイン、北欧など。そのような地域での同様の問題を調査研究する必要があると考える。
ACTN1異常症の分子機構の解明

所属機関の異動により研究環境が変わり、本年度は実質的な研究は進めることが出来なかったが、研究の前段階である遺伝子組み換え実験の倫理審査を受け承認を得た。所属施設の異動により、研究環境が変化したため。研究環境の整備から始めなければならなかったため。本年度は遺伝子組み換え実験施行可能な基本的研究機器を整備し、ACTN1発現ベクターを作成し、発現実験を行う。人を対象とする医学研究における倫理審査承認を得て、ヒト検体の解析が再開できるようにする。当該年度には研究活動が出来なかったため、直接経費の支出は行わなかった。次年度には研究活動の再開を予定している。
建築物の性能的火災安全設計のための可燃物情報の体系化

建築物の性能的火災安全設計を行うためには、「設計火源(設計用入力火災)」を設定することから始まる。しかし、建築物内の可燃物の燃焼は、種々の要因により大きなばらつきがあって、告示式で与えられるように一義的なものではない。設計火源は、どのような可燃物を建築設計上考慮すべきか(用途区分別の特性的可燃物配置)という建築計画学としての整理を行った上で、特定された可燃物の燃焼性状を工学的にモデル化することが必要である。本研究においては、建築空間内に存在する可燃物の代表寸法と可燃物間の配置、壁面や柱等の建築要素との位置関係に注目して、建物用途、室用途の組み合わせ毎に、典型的な可燃物の配置パターンを作成すべきことを提案し、例題として事務所の廊下、教育施設の玄関ロビー、鉄道駅などの配置パターンを抽出してモデル化を行った。また、可燃物の燃焼性状に関しては、既往の文献資料を整理して、可燃物の一般的呼称毎に発熱速度曲線を集積して統計処理を行った結果、椅子、ソファ、クリスマスツリーなどの設計火源を提案した。これらを用いて、鉄道駅のプラットホーム構造物の耐火設計ケーススタディを行い、調査結果に基づき可燃物を想定し、燃焼性状の予測を行う標準的方法を提案すると同時に、現時点での知見で不足している点を指摘した。以上の成果は、(社)日本建築学会・防火委員会・火災安全設計小委員会の傘下に設置された「局所火災に対する耐火設計ワーキンググループ」との連携の下に行われ、シンポジウムを開催して成果を公表するとともに、建築設計者の意見を収集した。
フォトニック結晶構造をもつ生分解性バイオチップの開発

コロイド結晶テンプレート法により生分解性高分子を用いてフォトニック結晶構造を有する生分解性バイオチップを作製した。37°Cの緩衝溶液中においてその多孔質構造が崩壊する過程でモデル薬物が放出されることを明らかにした。単分散コロイド粒子を用いてコロイド結晶を作製した。その作製法としてスピンコート法を用いることで、高結晶性のコロイド結晶が得られた。次に、コロイド結晶テンプレート法により、多糖類からなる反転オパール構造体の作製を行った。コロイド粒子の粒径を200500nm程度としたことで、対応する孔径をもつ多孔質構造体の作成に成功した。また、可視から近赤外域の光を選択的に反射する性質を有することが分かった。多糖類には、安価で市販されているセルロースおよびキチンを用いた。これらの多糖類は、強固な分子間(内)水素結合により通常の水溶液および有機溶媒には溶解しないことから、特殊溶剤を用いた各種方法により溶液化を行い、これをコロイド結晶に含浸させた後、溶媒を完全に除去した後、コロイド粒子を留去する操作により、目的とする多糖類多孔質体を得た。作製した構造体の3次元規則多孔質構造については、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて確認した。テンプレートに用いたコロイド結晶では、(111)面方向に結晶成長するため、基板垂直方向に六方最密構造が形成されていることが分かった。構造体においては、コロイド結晶の粒子占有空間と空隙との反転により、空気孔の相互連結構造が形成されることが期待できる。また、X線回折、紫外可視赤外吸収、ラマン散乱、熱分析などの各種測定を行い、合成条件によって構造体の化学構造が異なることが分かった。以上により、初年度においては、生分解性反転オパール構造体の作製法を確立し、その多孔質構造・化学構造に関する基礎データを集積することで、次年度に実施予定の物性・機能評価のための基礎を固めることができた。反転オパール構造に由来する構造色および光反射特性について、CCD透過反射型顕微鏡、および反射測定用高分解能ファイバ分光システムを用いて調べたところ、作製した試料が選択的光学反射特性を有することが明らかとなった。反射特性に影響を与える屈折率を多波長アッベ屈折計により測定し、ブラッグースネル式により反射波長の計算値を算出したところ、実験値とほぼ一致することが分かった。次に、構造体の分解に伴う反射特性および多孔質構造の変化について評価を行った。SEM観察より擬似生理的環境下において反転オパール構造が崩壊することが明らかとなり、同時に最大反射波長が長波長シフトし、反射強度が低下することが分かった。また、光学顕微鏡観察により、試料表面に亀裂が入り微小片化することが分かった。構造体のDDS機能を評価するために、構造体の作製段階において、メチレンブルーをモデル薬物として反応系に導入し、この構造体を緩衝溶液中で段階的に分解させる実験を行った。このときのモデル薬物の放出量については紫外可視吸収スペクトル測定により評価した。その結果、構造体の分解伴い緩衝溶液中にモデル薬物が放出することが分かった。また、構造体の反射波長が生体組織への透過性の高い近赤外領域に位置する場合には、生体組織に埋入状態においても反射測定を行うことが原理的には可能である。これは、生分解性バイオチップとして用いた場合に、その分解状態および薬物放出状況をリアルタイムかつ非侵襲でその場計測できることを意味する。そこで、構造体をモデル生体組織である豚皮で被覆した状態で反射測定を行ったところ、反射強度は弱いが測定可能であることが分かった。
心臓性突然死症例におけるドパミン系遺伝子関連領域の遺伝子学的診断マーカーの検

今年度は昨年度に引き続き、これまでに得られた健常人集団におけるドパミン系遺伝子関連領域(DAT1、DRD4、COMTなど)の遺伝的多型のデータと、心臓性突然死症例(主に心筋梗塞)より得られた多型データとの比較、検討を行ったが、最終結果としてDNAレベルでは両者間に有意差は認められないことが判明した。そこで今年度は主に、心筋梗塞発症時のRNAレベルでの変化を検索するため、開胸下にラット冠動脈を結紮することで虚血による心筋梗塞モデルを作成した。そして近年、心筋梗塞による細胞死にはアポトーシスの関与が示唆されていることに加え、ラットにおいてもその発現が確認されているアポトーシス関連遺伝子Bcl-2及びBaxに着目し、虚血再灌流によるBcl-2mRNA及びBax mRNAの発現量の変化を定量的RT-PCR法、さらにmRNAの配列異常をRT-PCR-SSCP法を用いて検索した。まずmRNAの配列異常については変異は認められなかったものの、定量的RT-PCRの結果、虚血30分の段階ではBax/Bcl-2発現比は減少傾向にあったが、再灌流によりBax/Bcl-2発現比は増加傾向を示した。これは、両者がヘテロダイマーを形成し、再灌流によってBax優位の状態が生じ、その結果アポトーシスを促進させているという説を支持するものであった。そこでさらに、冠動脈血リンパ球より採取したBcl-2mRNA量を定量した結果、虚血時から再灌流時にかけても減少傾向を示していた。これはリンパ球から放出されるある種のサイトカインがアポトーシスを促進させる結果、リンパ球Bcl-2のアポトーシス抑制能を減少させている可能性があり、遺伝子学的診断マーカーとしての応用性を示唆するものである。今年度はまず最初に、これまでに得られた健常人集団におけるドパミン系遺伝子関連領域(DAT1、DRD4、COMTなど)の遺伝的多型のデータと、心臓性突然死症例(主に心筋梗塞)より得られた多型データとの比較、検討を行い、その結果、DNAレベルでは両者間に有意差は認められないことが判明した。そこで次に、心筋梗塞発症時のRNAレベルでの変化を検索するため、まず動物実験を第一段階として、開胸下にラット冠動脈を結紮することで虚血による心筋梗塞モデルを作成した。そして近年、心筋梗塞による細胞死にはアポトーシスの関与が示唆されていることに加え、ラットにおいてもその発現が確認されているアポトーシス関連遺伝子Bcl-2に着目し、虚血再灌流によるBcl-2mRNAの発現量の変化を半定量的RT-PCR法、さらにmRNAの配列異常をRT-PCR-SSCP法を用いて検索した。その結果、Bcl-2mRNAの発現は、虚血30分再灌流06時間の間で認められ、半定量的にはその発現量にほとんど変化は認められなかった。さらに、RT-PCR-SSCP法によるBcl-2mRNAの塩基変異の検索の結果、変異は認められなかった。これらのことから、Bcl-2mRNAをターゲットとする遺伝子学的診断マーカーへの応用は困難と考えられたものの、心筋細胞における虚血再灌流時のアポトーシスの関与を検索する上では、非常に興味深い知見を得た。今後は引き続き動物実験において、ドパミン系遺伝子関連領域についてのRNAレベルでの検索を行うとともに、第二段階として、心臓性突然死症例におけるRNAレベルでの検索を行う予定である。