hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌の接合伝達機構解明と人為的高速ゲノム進化への応用

TraBタンパク質のドメイン構造は欠失解析により、膜局在ドメイン、ATPaseドメイン、DNA結合ドメインに3分割できた。膜局在ドメインはTraBのN末端に、ATPase活性を有するモータードメインは中央部に、DNA結合ドメインはC末端領域に位置していた。線状プラスミドの伝達関連遺伝子群の機能を遺伝学的に明らかにした。また線状プラスミド、環状プラスミドの各々の伝達関連遺伝子群を形態の異なるプラスミドに移植した。pSN22の遺伝子発現制御領域を含む接合必須遺伝子を放線菌S. lividansのゲノム上に組み込み、ゲノムの組換えを検出する系を用いて高効率ゲノム移動を確認した。本申請研究では、以下の三系統の研究を平行して進める予定であった。DNAチャネルとして機能するTraBタンパク質の生化学的特徴と構造的特徴を構造研究者と共同で解明し、DNAチャネルの正体とその分子特性を明らかにする分子解析;ここではTraBタンパク質のドメイン構造の簡単な分割を行った。ドメイン構造は膜局在ドメイン、ATPaseドメイン、DNA結合ドメインに3分割されると予想し、局在とATPaseドメインはその活性を明らかにし、変異解析を行った。放線菌線状プラスミドの接合伝達システムを解析し、知見が蓄積している環状プラスミドのシステムと比較することで、放線菌の接合伝達の分子メカニズムを解明・一般化する原理究明;線状プラスミドの伝達関連遺伝子群を遺伝子破壊し、予想していた各遺伝子の機能を遺伝学的に明らかにした。その活性は現在測定中である。申請者が発見した、traB関連遺伝子群を利用したゲノム可動化のしくみを利用して、高効率ゲノム可動化を行うゲノム操作応用;我々が研究してきた環状プラスミドpSN22の遺伝子発現制御領域を含む接合必須遺伝子を放線菌S. lividansのゲノム上に組み込み、ゲノムの組換えを検出する系を用いて高効率ゲノム移動を確認した。ちなみにその効率は想像を絶する高効率であり、近い将来のゲノム操作への応用を期待させる結果であった。放線菌のDNAチャネルと予想しているpSN22由来、TraBタンパク質の分子特性についてbの解析を行った。前年度の研究で完全に詰め切れなかったATPase活性と接合機能の関連を完璧とするため、再現実験を行ったところ、接合現象とATPase活性のリンクが再現できた。また、昨年度の変異だけでは論理展開にとって足らないために、新しい変異クローンを作製した。これらの活性は最終年度に完璧に測定する予定である。接合達関連遺伝子群の応用性として、接合関連遺伝子の移植による様々な巨大プラスミドの可動化の可能性について検討した。線状と環状の両複製ステージを取りえるプラスミド、pLus980を利用してpSN22由来の接合伝達遺伝子群traR, traA, traB, cltを移植したところ、環状プラスミドのみならず、頻度は低いものの線状プラスミドも可動化した。また、線状プラスミドSAP1由来の伝達関連遺伝子群を同様に移植した場合、環状プラスミドは可動化できるが、線状プラスミドはhelicaseをコードするttrA遺伝子を存在させないとほとんど可動化できなかった。また、ttraAの選択性をしらべたところ、SAP1由来のttrA遺伝子だけでなく、他の線状プラスミド由来のttrAでも有効であった。これらの知見は全くこれまで知られていなかった新しい知見である。pSN22由来のtraA, traA, traB, cltの放線菌ゲノムへ挿入し、ゲノムの水平移動がどのように変化するかを観察した。プラスミドが仲介するゲノム移行よりも千倍以上のゲノム移行効率が観察でき、この系をうまく使えば新しいゲノム操作法が期待できる。その方面に関しては挑戦的萌芽に採択され、さらなる解析を行う予定である。pSN22のTraBは菌糸間でのDNA輸送に関与するDNAチャネルであり、主要伝達タンパク質とも呼ばれる。核磁気共鳴(NMR)を用いた構造解析により、TraBの一次構造が大きく3つのドメインに大別され、アミノ末端側から順に細胞膜への係留、モーター活性、DNAへの結合の各機能を果たすことを示唆するデータを得た。TraBが有する機能を分子レベルで解明することを目的とし、in vitro, in vivoの両面から解析を試みた。まずモータードメインの機能に着目した。このドメイン内には2種類のNTP結合モチーフが存在し、Walker typeはStreptomyces属を宿主とする他のプラスミド由来の主要伝達タンパク質と高い相同性を示す。我々はTraBがATPase活性を有し、その機能を担うためにはWalker typeが重要なのではないかと考え、仮説を確かめるため、Walker type内に点突然変異を導入した変異体TraB、及びWalker typeをそれぞれ異なるパターンで欠落させた部分欠失変異体を作製し、これらのATPase活性を野生型TraBと比較した。その結果、変異型TraBの活性値は野生型に比べて50%以下に低下する傾向が見られ、保存性が高くない領域の変異でも同様の傾向を示した。また、Walker typeを欠落させた部分欠失変異体の活性値も野生型と比較して著しい減少を示した。加えてATPase活性を低下させるような変異を導入した場合において接合伝達の不活化が顕著に見られることを明らかとした。

これらの結果はTraBがATPase活性を有し、Walker typeモチーフ内の変異によりその活性が損なわれること、及びTraBのATPase活性減少が接合伝達機構の喪失に直接関与することを示している。TraBタンパク質のドメイン構造は欠失解析により、膜局在ドメイン、ATPaseドメイン、DNA結合ドメインに3分割できた。膜局在ドメインはTraBのN末端に、ATPase活性を有するモータードメインは中央部に、DNA結合ドメインはC末端領域に位置していた。線状プラスミドの伝達関連遺伝子群の機能を遺伝学的に明らかにした。また線状プラスミド、環状プラスミドの各々の伝達関連遺伝子群を形態の異なるプラスミドに移植した。pSN22の遺伝子発現制御領域を含む接合必須遺伝子を放線菌S. lividansのゲノム上に組み込み、ゲノムの組換えを検出する系を用いて高効率ゲノム移動を確認した。目標としている部分には到達しているが、ややツメが甘い部分が有る。ATPaseに関しては遅れており、原因はGC含量の高い遺伝子の取り回しに難があったためで、現在人工遺伝子を作製し、問題解決を図っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物学、システム生物学TraBの分子特性に関しては論文化する。伝達遺伝子の特性に関しては既に全てのデータがそろっており、論文作成中である。TraBを含むDNAチャネル複合体に関しての研究をスタートさせており、複合体に関する知見の集積をはかる。構造機能相関に関してはC末端の構造が研究分担者によってほぼ決定されており、NMRでふらつきが見られる部分を確定次第論文にする予定である。TraBタンパク質の生化学的・構造的特徴の解析に於いては研究計画通りに進んだ。DNA結合に関してはやや遅れているが、膜結合領域は最小ユニットまで可視化技術を用いて絞り込んだ。ATPaseドメインに関してはこれまで最小領域と思われる領域だけの発現が困難であったが、長さを調整することでFtsKドメインと呼ばれる領域が活性を持つことを明らかにした。また、ATPaseのドメイン内に変異が入ると接合伝達能が失われることは我々が20年ほど前に明らかにしたが、その生化学的活性の裏付けをとった。驚くべきことに50%のATPase活性減少でプラスミド伝達能を消失することが明らかとなった。これらの分子特性の解明は初期計画よりも早く進んでいる。線状プラスミドの接合伝達に関しては、工業生産菌より分離されたSAP1を中心に行った。SAP1のベクター化は既に共同研究者でもある北里研究所の池田らによって進んでいるため、主に伝達メカニズムに着目して解析を行った。その結果、予想された接合関連遺伝子が伝達機能を担っていることが明らかになった。また、宿主ゲノムも低頻度ではあるが移動させうることが明らかとなった。これらは現在のところ全くわかっていなかった知見であり、想像以上の進展であった。
BSFー2/ILー6産生異常症の解析ー特にポリクローナル高γグロブリン血症をきたす疾患の病態解析

B細胞分化因子(BCDF、BSFー2)として遺伝子及び分子構造が決定されたInterloukin6(ILー6)、B細胞の分化、ミエローマ細胞の増殖を促し、抗体産生を増強するのみならず、幼若骨髄細胞の分裂を誘導、肝細胞に作用して急性期蛋白を誘導させるなど多くの生理作用を有する。ところでCastleman病は1956年、長年に亘るリンパ節腫大や発熱を主症状とし、腫大リンパ節は形質細胞の増殖、リンパ漏胞の過形成を示す原因不明の疾患である。更に貧血、高γグロブリン血症、急性期蛋白の上昇等を伴い病態すら不明である。特記すべきことは、孤立性にリンパ節腫大を示す患者の場合、その腫大リンパ節を摘出すると、症状が消失するのみならず、検査所見も正常化し完治することである。このことは本疾患の病因並びに病態の根源が腫大リンパ節に限局することを示唆し、またその多彩な臨床像からILー6が病態に関与していることを疑わせるものである。このため、孤立性及び多発性に腫大リンパ節を示す症例について、腫大リンパ節からのILー6産生、摘出前後の血中ILー6濃度を測定した。その結果、腫大リンパ節から大量のILー6の産生がみられた。他のサイトカイン(ILー1、ILー2、IFNγ、TNF等)の産生は有意でなかった。抗ILー6抗体を用いた免疫組織化学にて過形成を示す胚中心の活性化されたB細胞からILー6が産生されることがわかった(T.Mφ、Dendrict cell、静止B cellではなかった)。次に腫大リンパ節摘出により、孤立性腫大の患者は症状の改善がみられると同時に血中ILー6は高値から正常域となったが、多発性腫大の患者では症状検査所見の変化なく血中ILー6の低下も認められなかった。以上の結果は腫大リンパ節からのILー6過剰産生がCastleman病の病態に強く関与していることを示唆し、本研究によりはじめて病態解明に近づくことが出来たと思われる。本研究はまた、サイトカインと疾患との関連を示唆するはじめての研究とも云うことができる。
乳歯歯髄由来細胞による唇顎口蓋裂患者の顎裂治療

ラット骨髄間葉系幹細胞を用いた予備実験にて、細胞シート工学を応用した細胞移植方法は骨再生医療における有用な治療法となることを確認した。本手法をヒト乳歯由来歯髄幹細胞に応用したところ、in vitroにて良好な骨形成を示した。顎骨欠損モデルを用いた移植実験においても治療効果は限定的ではあったが、骨形成を確認できた。細胞シート工学を応用したヒト乳歯由来歯髄幹細胞による顎骨再生の可能性を見出すことができた。ヒト乳歯由来間葉系幹細胞(乳歯MSC)を培養し、移植実験を行った。前年度に、乳歯MSCを骨芽細胞に分化誘導させるために添加する3種類の薬剤(デキサメタゾン、β三リン酸、アスコルビン酸)の最適な濃度を決定したため、それらをもとに、培養骨作製の検討を進めた。さらに、ヌードラットを使用したin vivo実験を行った。ヌードラットの下顎骨"先天性骨癒合不全"部におよび背部皮下に移植を行い、8週間後に標本を摘出した。標本の評価としてマイクロCTによるX線学的評価と、組織学的評価を行った。マイクロCT像では、骨欠損部に石灰化物様の組織が少量みられたが、組織標本像では骨様組織は見られなかった。乳歯由来間葉系幹細胞(乳歯MSC)を使用し、培養骨の作製方法について検討を行った。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた培養骨の報告を参考にして、乳歯MSCを使用した144通りの培養骨を考案した。9サンプルの乳歯MSCを使用し、1サンプルあたり16通りの培養骨を作製した。各サンプルに対しin vitroにおける骨形成能の高い1通りの作製方法を選ぶことで、9通りの作製方法を選抜した(計画では16サンプルを使用し16通りに選抜するとしていたが、項目の組み合わせによる検討しやすさを考え、9サンプルから9通りに選抜とした)。検討項目は1乳歯MSCを骨芽細胞に分化誘導させるために添加する3種類の薬剤(デキサメタゾン、β三リン酸、アスコルビン酸)の最適濃度、2乳歯MSCをリン酸カルシウムと複合化させるために培養する最適期間、3乳歯MSCが接着し骨芽細胞へ分化しやすいリン酸カルシウム粒径の最適な大きさ、4リン酸カルシウム100mgに対して導入する乳歯MSCの最適な細胞数とした。3と4の組み合わせ9通りに対して、1と2の項目から選抜したところ全てのサンプルにおいて、デキサメタゾン濃度は100nM、β三リン酸濃度は10mM、アスコルビン酸濃度は0.28mM、培養期間は2週間で培養した場合に最も高いALP活性、カルセイン取り込みが見られた。よって、次のステップとして、今回選抜した9通りの作製方法で、1サンプルの乳歯MSCより培養骨を作製し、ヌードラット背部皮下へ移植し評価することで、最も骨形成能の高い培養骨の作製方法を決定する予定である。前年度は、ヒト乳歯由来間葉系幹細胞(乳歯MSC)を骨芽細胞へ分化させ、シート状に採取しヌードラットの下顎骨"先天性骨欠損"部へ移植実験した。移植後8週目で標本を採取し、評価を行った。しかし、micro-CT像では欠損中央部に石灰化組織が微量に見られるものの、組織標本では骨組織は全く確認できなかった。その原因は、使用した細胞の骨化能の不足が第一に考えられるが、ヒト乳歯MSCによる骨形成速度が遅く緩慢である可能性も否定できない。そこで、本年度は、骨化能のよい細胞の選別と並行して、ラット骨髄由来間葉系幹細胞を使用し、移植における骨形成の動態の確認を行った。移植後2週目では、左右の顎骨間(骨欠損部)に微小な石灰化物が散在性に認められた。それらの石灰化物は母床骨との連続性はみられなかった。移植後4週目で石灰化部位が拡大し、左右の顎骨を架橋させていた。8週目では、より強固な癒合となり、形成骨は周囲の母床骨の形態に調和していた。前回実験により得られたmicro-CT像と、今回のラット細胞による実験の2週目のmicro-CT像は似た様相を示しているため、移植した乳歯MSCは骨形成速度が遅い可能性が示された。本研究当初の計画では、ヒト乳歯由来間葉系幹細胞とリン酸カルシウムから骨化を示す最適な培養骨の作製方法を検討することであった。培養骨の作製過程で、ヒト乳歯由来間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導する際に豊富な骨基質の分泌を認め、シート状に回収することが出来た。人工骨を使用せずとも細胞の足場となり骨化を示す可能性を考え、ラットを用いた動物実験にて検証した。ラット骨髄由来間葉系幹細胞から同様の分化培養を経て、シート状の移植物を作製し、同系ラット下顎骨"先天性骨欠損“部への移植実験を行った。移植8週間後には良好な骨化を認めた。上記実験にて人工骨なしでも骨の形成が可能であることが示せたため、ヒト乳歯由来間葉系幹細胞を用いてシート状の移植物を作製しヌードラットへの移植を行った。移植8週間後に検体を摘出し、組織学的及びμCTを用いてX線学的に評価した。移植物は癌化や拒絶反応を認めず、安全性が確認された。しかし、摘出したすべての検体で微小な石灰化物が散在性に認められたものの、骨化は不十分であった。

in vitroでは良好な骨形成能が確認出来るため、今後ヒト乳歯由来間葉系幹細胞により適した移植法を検討する必要がある。ラット骨髄間葉系幹細胞を用いた予備実験にて、細胞シート工学を応用した細胞移植方法は骨再生医療における有用な治療法となることを確認した。本手法をヒト乳歯由来歯髄幹細胞に応用したところ、in vitroにて良好な骨形成を示した。顎骨欠損モデルを用いた移植実験においても治療効果は限定的ではあったが、骨形成を確認できた。細胞シート工学を応用したヒト乳歯由来歯髄幹細胞による顎骨再生の可能性を見出すことができた。当科(奈良県立医科大学口腔外科学講座)にはヒト乳歯歯髄細胞が数多く凍結保存しているが、その多くのサンプルは継代を経て増殖させた細胞である。継代数を経るほどに骨化能は低下すること、ヒト細胞は増殖能や骨化能に個体差が認められることより、実際に効果を期待できるサンプル数は限られている。そのため、ラット細胞による予備実験を行い、効果的な移植方法、評価項目を検討した。現在、ヒト乳歯MSCによる実験に戻り、移植実験が進行中であるため、研究はおおむね順調に進展しているといえる。再生医療ヒト乳歯MSCを使用した移植実験が進行中である。摘出後に骨形成が確認されれば、同一個体で同一継代数の細胞を使用して、複数のヌードラットへ移植し、骨形成の有効性を経時的に評価する。また、他の細胞でも同じ手順で実験を行い、ヒト乳歯MSCを使用した骨形成治療の標準化を図る。培養骨の作製過程の検討において、乳歯MSCを骨芽細胞に分化誘導する際に、豊富な骨基質の分泌がみられた。それらの骨基質は培養細胞の足場となるため、培養細胞はシート状として採取することができた。すなわち、このシート状の採取物を使用すれば、人工骨(足場)を使用しなくても培養細胞の移植は可能と考えた。免疫不全動物であるヌードラットへの移植実験であるため、異物である人工骨を使用しないことは利点である。そこで、ヒト細胞ではなく小動物実験に戻ることとした。Fischer344ラットの骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)から同様の移植物を作製して移植実験を行い、人工骨なしでも骨形成は可能であることを確認した。その上でヌードラットへの移植を行った。一度、小動物の細胞を用いた実験に立ち戻ったため、ヌードラットへの移植とその評価は未だ一例のみしか行えていない。以前我々が採取した乳歯MSCのサンプルは、産業技術総合研究所にて凍結保存していたのだが、それらのサンプルを奈良県立医科大学へ移管するにあたり各種書類手続きが複雑であったこと、移管する細胞が膨大な量であったことより、実験のスタートまでに時間がかかった。また、長期間にわたり凍結保存していたサンプルであるため、細胞が順調に増殖しないものもみられ、再度作製せざるを得ない状況も数例でみられた。そのため、in vitroでの培養骨評価まで行い、初年度は終了した。今年度は、ヌードラットを使用したヒト乳歯MSC移植実験を中断し、ラット細胞による同系ラットへの移植実験による検討を多く行ったため、差引額(37,427円)が生じた。乳歯MSCを使用した移植実験において、ヌードラット下顎骨"先天性骨癒合不全"部には骨形成が見られなかった。原因の一つとして、使用した細胞が3継代目の細胞であったことが挙げられる。今後、継代の少ない細胞を使用して実験を行う。また、本来予定していた、人工骨を使用した培養骨移植も改めて行うこととする。骨形成が見られた際には、その方法に準じて複数の検体で実験を行う。
アジア諸社会における人口変動と移動レジームの比較分析

現代の日本社会では、移動レジーム(人のライフコースを組織化する制度的配置)に影響を及ぼす大きな社会変動が4つ進行している。グローバリゼーション、新自由主義の台頭、サービス産業化、少子高齢化がそれである。本研究プロジェクトでは、これらの変動、とりわけ少子高齢化に焦点を当て、現代アジア社会における移動レジームの変容が社会階層と雇用・生活リスクに及ぼす影響を分析した。その結果、少子高齢化が移動レジームに及ぼす影響は階層によって異なり、それゆえ雇用・生活へのリスクの変容も階層ごとに詳細に検討する必要があることが明らかになった。今年度は研究プロジェクト初年度だったので、研究メンバー間で研究目的と研究手法に関する情報を共有して、研究を推進した。研究プロジェクト全体としては、人口動態(とりわけ少子高齢化)が移動レジームの変動をもたらし、その結果として社会階層と雇用・生活リスク分布の変動をもたらすメカニズムをより具体的に分析した。第1に、少子高齢化は高齢者に関する商品や労働力の需要を高めると同時に若年層に関するそれらの需要を低下させる。その結果として、産業構造や労働市場が変化する。そしてその変化が人々の間の不平等や雇用・生活リスクの分布を変化させる。個々のメンバーの主な研究成果としては、次のものが挙げられる。(1)合理的選択理論の視点から、人々が世代内移動を行うメカニズムの分析を行い、高階層の人々が前向き合理性に基づいて、低階層の人々が後ろ向き合理性に基づいて転職行動を行うため転職結果に違いが出る可能性を検討した。今後は、このようなミクロな行為選択が移動レジームを生み出すメカニズムについて詳細に分析する。(2)移動レジーム論の視点から、主に社会階層と社会移動全国調査データを用いて、グローバル化の進展により、失業リスクが階層性を伴いながら全体的に高まっていることを明らかにした。また初職が非正規になるリスクについては、女性において人的資本による差が1990年代以降拡大していることが明らかになった。これらのリスク変容に対する構造的要因(新卒一括採用、女性の高学歴化、就職差別の相対的改善など)の影響を詳細に検討した。全体研究会を2回開催し、上述したように研究プロジェクトの研究目的と研究手法をメンバー間で共有するとともに、各メンバーが研究報告をして、相互に建設的な批判を行い、研究の質を高めた。そしてその結果を学会報告や論文執筆に展開していった。また2名の海外共同研究者とは本研究プロジェクトの研究会や研究代表者が本務校で開催したシンポジウムなどを通じて綿密に連携している。さらに、新たに大学院生2名を新しくメンバーとして加え、研究プロジェクトに新しい視点を導入するとともに、次世代研究者の育成も行っている。なお本研究プロジェクトは2次データや歴史的資料の分析を主な研究手法としているため、当初予期していない事態は生じていない。これらのことから「おおむね順調に進展している」という自己評価ができる。平成28年度は本研究プロジェクトの中間年なので、前年度の研究成果を踏まえた上で、研究会メンバーが研究会等で連携して、さらに研究を推進した。その成果は多くあるが、以下に代表的なもの2点を記す。(1)少子高齢化が、移動レジームにどのような影響を及ぼすのかという点から、少子高齢化と産業構造の変化が、職業の分布にどう影響するかを検討した。職業を時間当たり賃金で序列化し、5つの層に分割して、1992年から2002年にかけての分布の変化を見たところ、とりわけ、賃金で中位水準の職業が、増加していることがわかり、その大半は、保健・医療・福祉に関する職業であることがわかった。また、賃金で下位の職業も増加しており、これらは、非正規雇用の増加と大きく関係していることもわかった。(2)60歳代以上の1割以上が公的年金以外に頼れる収入源がないと認識しており、男性では資産形成の困難が、女性では家族形成にかかわるリスクが影響していた。特に、女性ではこのタイプの経済状態が悪い。また、60歳未満の層では、公的年金への期待が低く、期待を維持しているのは大企業正社員など厚生年金、共済年金に加入している層であった。このことから、将来年金への依存が高くなると予測される人たちの中で年金への期待が低く、そのことが国民年金の拡充への支持が広がらない一因になっていると考えられる。また、失業や貧困が社会的排除に与える影響についても研究を行い、男性においてのみ失業や貧困が家族外のネットワークからの排除につながることを明らかにした。上記「研究実績の概要」で述べたように、研究会における各メンバーの報告などを通じて着実に研究成果をあげている。今年度は研究プロジェクト最終年度なので、3年間にわたる研究活動を取りまとめた報告書『移動レジームと社会的不平等』を刊行した。そこに収められた知見は数多いが、以下のものはその代表的なものである。(1)「ポスト・バブル経済期に正規雇用セクターから非正規雇用セクターへの移動が容易になったのと同時に非正規雇用セクターから正規雇用セクターへの移動は難しくなったという」という先行研究の経験的知見に対して「労働市場の中核部分における安定性と周辺部分における流動化が共存しているだけでなく、中核部分が縮小している」という視点から説明した。(2)日本社会における人口変動は、少子高齢化によって大きく特徴付けられる。労働力人口が減少する中、日本はますます海外からの移民労働者への依存を強めていく。そうしたなか、海外からの移民労働者が、日本の労働市場のどのようなセクターに組み込まれ、いかなる社会経済的状況に置かれているのかを、社会調査データ等を用いて、失業を軸に分析を行った。

分析の結果、海外からの移住者の失業は、産業や雇用関係によって大きく左右され、また、その地域の労働市場の動向にも大きく左右されることが分かった。また、自営業層を軸とするエスニック・コミュニティは、移民の失業を抑制し、移民に対して一定の雇用機会を提供することも明らかになった。(3)年金制度への支持に対して年金システムがあたえる影響を、職歴における自営業、非正規、無職期間の割合が年金制度支持に与える影響の分析によって、検証した。2015SSMデータを用いた分析の結果、職歴における非正規雇用の期間が長いことによって、年金制度から得られる利益を低く見積もり、その結果として年金制度への支持が低下することを示した。このことは、年金制度の階層化によって得られる利益に対する認識の分断が生じ、結果として年金制度への支持が分断されていることを示している現代の日本社会では、移動レジーム(人のライフコースを組織化する制度的配置)に影響を及ぼす大きな社会変動が4つ進行している。グローバリゼーション、新自由主義の台頭、サービス産業化、少子高齢化がそれである。本研究プロジェクトでは、これらの変動、とりわけ少子高齢化に焦点を当て、現代アジア社会における移動レジームの変容が社会階層と雇用・生活リスクに及ぼす影響を分析した。その結果、少子高齢化が移動レジームに及ぼす影響は階層によって異なり、それゆえ雇用・生活へのリスクの変容も階層ごとに詳細に検討する必要があることが明らかになった。今年度は順調に研究計画が進展しているので、来年度も同じ方針で研究を推進する予定である。平成29年度は最終年度なので、前年度までの研究成果を踏まえた上で、研究会等を通じて研究プロジェクトとしての総括の議論をする。29年度が最終年度であるため、記入しない。社会学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ノックアウトマウスを用いたATF2遺伝子ファミリーの機能解析

これまで私達はJNKやp38で活性化される転写因子ATF-2ファミリーメンバーのin vivoでの生理的な役割を理解するために、それぞれの欠損マウスを作製してきた。1,ATF-2遺伝子ヘテロ欠損マウスは雌で生後一年以上経過すると高頻度で(18例/31匹)乳癌の発症が見られた。この乳癌はスキルス硬癌と診断され、肺や肝臓への転位を伴うものであった。2、乳癌発症のメカニズムを探るために野生型及びヘテロ、ホモ欠損胎児から初代培養細胞を採取しチップテクノロジー法を用いて発現している遺伝子を比較したところAPCとc-junの発現が変異細胞で低下していた。3、3T3法で樹立した細胞株を用いて2と同様に解析したところ、新たにGadd45遺伝子の発現誘導がATF-2欠損細胞で著しく低下することが明らかになった。特にアニソマイシンによるシグナル伝達系が阻害されていた。4、正常乳腺ではGadd45遺伝子の発現が見られたが、乳癌組織ではいずれも著しく発現が低下していた。5、また野生型及びヘテロ、ホモ欠損胎児から初代培養細胞を採取し活性型RASを発現させた後、ヌードマウスに移植した結果、ヘテロとホモの場合は100%腫瘍を形成したが、野生型では全く形成されなかった。6、以上の事からATF-2ヘテロ欠損マウスは腫瘍になるポテンシャルが非常に高く、生後1年程度の間に新たな変異が導入されるとβーカテニンの蓄積やGadd45の誘導不全等により、腫瘍を発症すると考えられる。1、ATF2遺伝子ヘテロ欠損マウスは雌で生後一年以上経過すると高頻度で(18例/31匹)乳癌の発症が見られた。この乳癌は結合組織が発達しているのでスキルス硬癌と診断され、肺や肝臓への転位を伴うものであった。3、APCの発現が低下すればβ-カテニンの蓄積が予想される。そこで乳癌組織を用いて免疫染色法でβ-カテニン蛋白質の蓄積を解析した結果、複数のサンプルでβ-カテニン蛋白質の蓄積が観察された。4、3T3法で不死化させた細胞株を用いて2と同様に解析したところ、新たにGadd45遺伝子の発現誘導がATF2欠損細胞では正常細胞と比較して著しく低下することが明らかになった。5、免疫染色法とRT-PCR法で乳癌組織と正常乳腺組織においてもGadd45遺伝子の発現量に差の有る事が確認された。6、また野生型及びヘテロ、ホモ欠損胎児から初代培養細胞を採取し活性型RASを発現させた後、ヌードマウスに移植した結果、ヘテロとホモの場合は100%腫瘍を形成したが、野生型では全く形成されなかった。7、以上の事からATF2ヘテロ欠損マウスは腫瘍になるポテンシャルが非常に高く、生後1年程度の間に新たな変異が導入されるとβ-カテニンの蓄積やGadd45の誘導不全等により、腫瘍を発症すると考えられる。

3、3T3法で樹立した細胞株を用いて2と同様に解析したところ、新たにGadd45遺伝子の発現誘導がATF-2欠損細胞で著しく低下することが明らかになった。特にアニソマイシンによるシグナル伝達系が阻害されていた。4、正常乳腺ではGadd45遺伝子の発現が見られたが、乳癌組織ではいずれも著しく発現が低下していた。5、また野生型及びヘテロ、ホモ欠損胎児から初代培養細胞を採取し活性型RASを発現させた後、ヌードマウスに移植した結果、ヘテロとホモの場合は100%腫瘍を形成したが、野生型では全く形成されなかった。6、以上の事からATF-2ヘテロ欠損マウスは腫瘍になるポテンシャルが非常に高く、生後1年程度の間に新たな変異が導入されるとβ-カテニンの蓄積やGadd45の誘導不全等により、腫瘍を発症すると考えられる。
生体内由来の酸化ＬＤＬの選択的回収とその酸化成分の解析

動脈硬化症の発症と進展に関与することが知られている酸化LDLの特徴を明らかにするために、循環血中のLDL画分から酸化LDLを回収するための方法を構築した。陰イオン交換カラムによる分離と抗酸化ホスファチジルコリン抗体によるアフィニティ抽出を組み合わせることにより、酸化リン脂質に富む酸化LDLの効率的な分離に成功した。また様々な酸化を受けたコレステロール類やリン脂質分子種の存在が明らかとなり、銅酸化LDLとは異なった脂質組成が示された。生体内におけるLDL酸化では、他の脂質分子種へのリモデリングなどダイナミックな変化を受けることが示唆された。平成25年度は研究代表者が留学中であったことから、当該研究計画を実施することができなかった。このため、本研究課題の補助事業期間を平成26年度まで延長する手続きを行った。ヒトおよびウサギのLDLをin vitro酸化させたときの酸化脂質生成の経時変化をLC-ESI-MS/MSを用いて網羅的に解析した結果、PUFA-PCから生成する種々の酸化PC分子種が見いだされただけでなく、lysoPCもまた酸化LDLの主要成分として著しく増加すること、またlysoPC生成にはLDL中に含まれるPAF-AH活性が大きく関与することを見いだしたことについて論文報告した(Sasabe N et al, Lipids Health Dis. (2014) 13:48)。1. microtiter plateを用いた生体内酸化LDL回収法の構築:酸化PC特異的モノクローナル抗体(DLH3)または非免疫IgMをコートしたwellにヒト血漿LDL画分を添加し、回収された脂質成分をLC-MS/MS(QTRAP5500)により解析した。DLH3のwellから回収されたサンプルには、IgMや抗体なしから回収したものと比較してより多くのコレステロールエステル(CholE)、PC類が検出された。このことからmicrotiter plateを使用した酸化LDL回収が有効であり、これらが酸化LDL由来の脂質成分であると考えられた。2. native LDL、銅酸化LDLおよび生体内酸化LDLの間での脂質成分の比較:生体内酸化LDLでは未酸化のCholE(リノール酸、アラキドン酸エステル)がnative LDLと比較して極めて少なかった。MRM測定により分子種分析を行ったところ、銅酸化LDLではCHO、COOH基を含む短鎖型酸化CholE含量が高かったのに対し、生体内酸化LDLでは短鎖型酸化CholEは極めて少なく、hydroxy、hydroperoxy、keto型といった長鎖型酸化CholEが大部分を占めた。さらにPC成分についても同様に分子種分析を行ったところ、銅酸化LDLでは不飽和脂肪酸含有PCの減少が著しく、LysoPCの含有率が約20%と最も高かった。一方、生体内酸化LDLでは不飽和脂肪酸含有PCはnative LDLと銅酸化LDLの中間の値を示し、LysoPCが確認されなかった。また銅酸化LDLでは長鎖型酸化PCと短鎖型酸化PCがどちらも増加したのに対し、生体内LDLでは長鎖型酸化PCが増加し、短鎖型酸化PCの増加はほとんどみられなかった。以上の結果から銅酸化LDLと生体内酸化LDLでは不飽和脂肪酸を含む脂質成分の組成が大きく異なることがわかった。循環血中のLDL画分から極めて微量の酸化LDLを効率よく回収する方法を構築するために、陰イオン交換カラムを用いて陰性荷電に富むLDLを分離するステップを組み合わせた方法を新たに試みた。健常人の血漿からLDL画分を超遠心法により分離し、陰イオン交換カラム(HiTrapQ)に流して500 mM NaClで溶出される画分(LDL(-))について、サンドイッチELISAにより酸化LDLとapoBを定量した結果、酸化LDL/apoB比がカラム非吸着画分(LDL(+))よりも46倍を示したことから、酸化PCに富む酸化LDLがLDL(-)に濃縮されることがわかった。そこでこの方法を冠動脈疾患患者の心臓カテーテル治療により得られる残余血液のLDL画分についても検討したところ、健常者血液よりも高効率で濃縮された。次に、抗酸化ホスファチジルコリン抗体(DLH3)を用いたアフィニティ抽出をLDL(+)とLDL(-)に対して行い、回収された脂質成分についてLC-ESI-MS/MSにより脂質分子種を解析した。その結果、LDL(+)とLDL(-)の間で脂質含量の違いがより明確となり、LDL(-)には酸化LDLが豊富であることがさらに裏付けられた。またタンパク質成分の酸化修飾についてもLC-ESI-MS/MSにより解析した結果、apoBのリジン残基におけるマロンジアルデヒドやアクロレイン修飾が検出された。以上の結果から、陰イオン交換カラムによる陰性荷電LDLの分離とアフィニティ抽出を組み合わせた方法は、酸化LDLの回収とその分子レベルでの解析に極めて有効な方法であることを新しく見出した。このようにして回収された生体内

由来酸化LDLはlysoPC含量が低く、銅酸化LDLとは異なった脂質組成の特徴を示した。以上の結果は、生体内においてはLDL中の脂質は酸化ストレスや酵素反応による直接的な酸化だけでなく、様々な代謝や脂質リモデリングによってさらに多様な脂質分子種に変化していることを強く示唆するものである。生化学研究代表者が留学中であり、今年度は当該研究計画を実施できなかったため。1. DLH3抗体を用いたin vivo酸化LDLの回収法の最適化と脂質成分の定性・定量解析系の構築:生体内酸化LDLを回収するための方法として、microtiter plateを用いた新たな方法の構築に取り組んだ。その結果、酸化LDL由来の脂質成分として様々な分子種のCholEやPCの酸化物を検出することができた。またこれらは、銅酸化LDL中の成分とは異なった脂質組成が示されたことから、本方法が生体内酸化LDLに含まれる酸化脂質成分の分析に有効であることがわかった。2.酸化LDLに含まれるタンパク質成分の修飾構造の解析:native LDLと銅酸化LDLのタンパク質成分の酸化修飾構造をより詳細に調べるために、LC-MS/MS(TripleTOF5600)を用いて分析した。その結果、LDLの主要タンパク質成分であるapoB-100のsequence coverageはnative LDLでは95%、銅酸化LDLでは85%と以前の測定より向上することに成功し、これによりacrolein、hydroperoxynonenal、oxononenal、malondialdehydeなどの脂質過酸化生成物による修飾や、ニトロ化、酸素付加を受けたアミノ酸残基を新たに同定することができた。また同じアミノ酸残基にこれら修飾が複数生じている部位が多く検出され、LDL粒子の不規則な酸化修飾を生じていることが明らかとなった。健常者血液を用いた上記の予備的実験によって、冠動脈疾患患者などから得られる臨床サンプルの解析において着目すべき酸化脂質やタンパク質酸化修飾構造を明らかにすることができたと考えている。平成26年8月より、もとの所属研究機関に復職し、当初の研究計画を再開する予定であることから、本研究課題の補助事業期間を平成26年度まで延長する手続きを行った。これまでに構築した酸化LDLの回収と脂質およびタンパク質成分の分析手法を、冠動脈疾患患者の心臓カテーテル治療から得られた血液サンプルに応用し、動脈硬化性疾患に伴って引き起こされる酸化LDL含有脂質の組成変化や、酸化脂質の生成について解析を行う。健常者由来の酸化LDLでは見られない特徴を明らかにし、動脈硬化性疾患の発症に関連する酸化LDLの特徴を明らかにする。これにより"生体内酸化ストレスマーカー"となり得る成分の発見を目指す。なお、平成24年8月から海外留学をしており、日本において本研究課題を進めることができていない。平成26年7月に帰国予定であるため、平成25年度で終了予定の本研究課題を平成26年度まで1年延長させていただくように申請する予定である。当該研究代表者が留学中のため、未使用額が発生した。平成26年8月より、もとの所属研究機関に復職して当初の研究計画を再開する予定であるので、未使用額をその経費に充てることとしたい。
地方分権下における自律的学校経営の構築に関する総合的研究

1.本研究は、わが国の自律的学校経営がどのように展開されているか、その実態と課題を、(1)学校予算、(2)人事管理、(3)学校選択、(4)学校管理規則、(5)学校組織、(6)情報公開、(7)学校評議員制度、(8)学校評価、(9)教職員配置、そして(10)校長のリーダーシップの観点から実証的に明らかにした。2.その主な研究成果は、次の通りである。(1)学校管理規則の見直しは、学校評議員の設置や職員会議の明確な位置づけ以外は、あまり進んでいない。(2)校長の裁量予算の実施は、ほとんどの学校で見られず、概して学校予算編成面での改革は進んでいない。(3)校長のエンパワーメントが最も発揮されているのは「学級担任の選任」「主任の選任」「校務分掌組織の編成」などの学校組織内の教員配置の経営領域であり、逆に校長のパワーを保有していない経営領域は「学校予算の校内配分」である。(4)学校評価は、概ね教育長や校長によって、その意義が認識され、実施されているが、今後は、学校評価を学校改善に効果的に活用していく態勢をどう構築していくか、そして児童生徒の参加型評価や第三者を含めた新しいタイプの評価をどう実施していくかが大きな課題となろう。(5)自治体の人口規模によって、自律的学校経営に対する教育長や校長の意識や改革の定着度に違いが認められる。今後、自律的学校経営の改革に当たっては、自治体の地域特性を十分に考慮に入れる必要がある。3.今後は、自律的学校経営が学校改善や特色ある学校づくりにどう繋がるのか、そのプロセスやメカニズムを詳細に分析すること、及び教師・生徒・保護者等の立場からの分析が必要である。1.本研究は、最近の教育改革の動きを受けて、わが国の自律的学校経営がどのように展開されようとしているのか、その実態や課題を事例研究により明らかにすることを目的としている。2.その結果、わが国の自律的学校経営について、次のようなことが明らかにされた。(1)校長のリーダーシップを特色づけているのは、組織統括領域の変革志向性である。(2)「教育指導費」に計上される「学校個性化推進事業費」などの補助事業費が、学校の自由裁量予算を拡大するという意味で大いに注目される。(3)「総合的な学習の時間」をめぐっては、各学校の対応は新たな課題に対する問題解決の過程として捉えることができるが、それをどのように意味づけるかという方略においても、実際の取り組みにおいても、多様な姿のあることが確認できた。(4)特色ある教育活動を行う学校ほど、情報公開を行って説明責任を果たし、協働関係を構築することが求められる。そうしてこそ、自律的学校経営が有効に機能する。情報公開は、自律的学校経営の基本条件の1つであることが確認できた。(5)実践的な有用性をもつ学校評価とするためには、学校はそれぞれの実態に応じてどのような工夫をなすべきかに関して組織的対応を行う必要がある。(6)「人事考課」は人事労務管理の中心に捉えられており、今後、人事考課の在り方を考える場合、人事管理システムの全体像を見通しながら検討する必要がある。3.本研究で得た知見を一般化できるかを検証するため、「自律的学校経営に関する全国調査」を実施するつもりである。なお、本研究の成果は、平成13年度日本教育経営学会奈良大会で発表する予定である。1.本研究の目的は、最近の教育改革の動向を受けて、わが国の自律的学校経営がどのように展開されようとしているのか、その実態と課題を、都道府県教育長、市町村教育長・学校長を対象とした全国調査をもとに明らかにすることである。2.調査の結果、わが国の自律的学校経営について、次のようかことが明らかにされた。

(1)学校教育法施行規則の改正以降、学校評議員の設置、職員会議の役割の明確化、許可・承認等の縮減等に関して、学校管理規則の見直しは、全国レベルで見ても、期待されているほどには、進んでいないことが明らかとなった。(2)教育長の意識を見る限り、特色ある学校づくりを主体的に推進していくためは、(1)校長の権限の強化、(2)学校の情報公開の促進、そして「学校の評価システムの確立」が重要な方略要因であることが分かる。(3)校長の専決権については、全国市町村教育委員会の約6割が、それを認めているものの、校長の裁量予算については、全国市町村教育委員会の約1割のみがそれを認めており、全体としてみた場合、校長が主体的自律的に学校予算を編成できる状況には必ずしもない。3.今後は、今回の調査結果を踏まえながら、学校評価、学校組織運営、情報公開等の面から、さらに学校の自律的学校経営の現状と課題を探ることとしたい。なお、本研究の成果は、平成14年6月に開催される日本教育経営学会(岡山大学)において、その一部を発表する予定である。1.本研究は、わが国の自律的学校経営がどのように展開されているか、その実態と課題を、(1)学校組織、(2)情報公開、(3)学校評議員制度、(4)学校評価、そして(5)校長のリーダーシップの観点から実証的に明らかにした。2.その結果、わが国の自律的学校経営の実態と課題について、次のようなことが明らかにされた。(1)校長のエンパワーメントが最も発揮されているのは「学級担任の選任」「主任の選任」「校務分掌組織の編成」などの学校組織内の教員配置の経営領域であり、逆に校長のパワーを保有していない経営領域は「学校予算の校内配分」である。(2)学校評価は、概ね教育長や校長によって、その意義が認識され、実施されているが、今後は、学校評価を学校改善に効果的に活用していく態勢をどう構築していくか、そして児童生徒の参加型評価や第三者を含めた新しいタイプの評価をどう実施していくかが大きな課題となろう。(3)自己点検・自己評価の結果を公表している学校はほとんど見あたらない。今後、教育委員会は、教育情報公開制度の法的整備を進める一方で、学校は、情報公開が公平で客観的な情報の保持と管理に資するだけでなく、学校の説明責任を果たしたり、学校と保護者・地域との連携協力の促進を図る上でも、有効な手段たりうることを認識し、より積極的に情報公開に努める必要がある。3.本研究で、わが国の自律的学校経営がどのように展開されているか、その実態と課題はかなり明らかになったと思う。しかし、自律的学校経営が学校改善や特色ある学校づくりにどう繋がるのか、そのプロセスやメカニズムを詳細に分析することができなかった。この点が今後に残された課題である。なお、本研究の成果は、平成14年度日本教育経営学会(国立教育政策研究所)で発表する予定である。
原始的アリ類における社会構造の多様性とその意義

西南日本に分布する各種ハリアリ類の社会構造を、営巣場所などの生態的特性とともに調査した。合計7属11種(Amblyopone silvestrii,Discotyrea sauteri,Proceratium itoi,P.japonicum,P.watasei,Hypoponera nubatama,H.sauteri,Cryptopone sauteri,Ponera komoku,P.japonica,Brachyponera chinennsis)のコロニーが採集された。これらの属は、Amblyopone属を除くと、従来働きアリによる受精・産卵は報告されていない。今回の調査でも発見できなかった。また、いずれの種類も働きアリの受精嚢は消失していた。ただし、鹿児島県以南に分布するツシマハリは、近縁の東南アジア産種の社会構造を考えると、働きアリが受精産卵していてもおかしくないが、今回の調査では確認できなかった。既に報告されているが、H.nubatamaでは有翅女王と無翅女王が繁殖していた。コロニー内の産卵女王数は、A.silvestrii,H.nubatama,B.chinennsisは多女王制であったが、他の8種は単女王制コロニーしか採集できなかった。女王アリと働きアリの卵巣小管数は多くの種でカスト間に差がなく68本だが、Hypoponera属2種とB.chinennsisでは働きアリの卵巣が消失していた。またB.chinennsisの女王は2426本の卵巣小管を持ち、受精嚢も巨大であることが明らかになった。繁殖個体の分散という点に注目すると、3種の多女王制種は分散せず巣に居残る個体がいると考えられるが、それぞれの生息地は森林、林縁部も含めた森林、河川敷と多様で、生息地の環境との明瞭な関係は明らかではなかった。
家族性Ｍｏｙａｍｏｙａ病の分子発症機構の解明と脳血管疾患の予防医療の確立

我々はMoyamoya病感受性遺伝子としてmysterinを同定し、東アジアに共通する創始者多型p.R4810Kを見いだした。Moyamoya病患者の協力によりMoyamoya病疾患iPS細胞を樹立し、分化誘導した血管内皮細胞において、健常者と比較しp.R4810K保因者は血管形成能の低下やSecurinを含むM期関連遺伝子群の発現が低下していることが分かった。またmysterin p.R4810K過剰発現によりMAD2機能阻害、M期の延長と有糸分裂異常およびゲノム不安定性の増加が見られた。mysterin p.R4810Kは、血管内皮細胞障害を引き起こし、脳血管の狭窄につながると考えられる。日本人に多い脳血管疾患の中で、Moyamoya病、脳動脈瘤および脳動静脈奇形は遺伝的負荷が強い。特にMoyamoya病は若年性脳梗塞の原因となるが、その感受性遺伝子は不明であった。我々は、常染色体優性遺伝形式を示す3世代家系でのPositional Cloningを行い、遺伝子座17q25.3にMoyamoya病感受性遺伝子として新規タンパクをコードするMysterinを特定した。本研究では、1Moyamoya病患者よりiPS細胞の樹立と血管平滑筋および内皮細胞、マクロファージへの分化2細胞生物学的観察とMysterinの発現解析、3Mysterinと他分子とのcrosstalkについて検討することにより、脳血管疾患に共通した脳血管特異的な機能上、構造上の分子メカニズムを解明し、脳血管疾患の新たな予防医療の確立を目指す。家族性もやもや病患者3名から樹立したもやもや病特異的iPS細胞から内皮細胞へ分化誘導を行い、TRA1-60陰性、Flk1およびVE-cadherin共陽性である細胞をフローサイトメトリーで単離し、血管内皮マーカー(CD31, VE-cadherin, vWF, CD34)の発現をRealtime-PCR、免疫染色法で確認し、得られた細胞が血管内皮細胞として機能していることが分かった。Realtime-PCRにより分化誘導した血管内皮細胞でMysterinの発現をRNAレベルで検討した。今後は、もやもや病非発症者由来のiPS細胞より分化した内皮細胞と比較検討を行い、もやもや病の本態である内頸動脈閉塞に果たす役割の解明が課題である。我々は、常染色体優性遺伝形式を示す3世代家系でのPositional Cloningを行い、遺伝子座17q25.3にMoyamoya病感受性遺伝子として新規タンパクをコードするmysterin(RNF213)および創始者変異R4810Kを同定した。本研究では、R4810Kを有するMoyamoya患者よりiPS細胞を樹立し、血管内皮細胞(iPSECs)への分化を行ったところ、患者および遺伝子保因者由来のiPSECsで血管形成能の低下していることを示した。またmysterin R4810Kの強制発現は血管内皮細胞株において血管形成能の低下を再現したが、siRNAによるmysterin抑制では血管形成能に影響を与えなかった。さらにマイクロアレイ解析により患者iPSECsでは細胞分裂に関与する多数の遺伝子群の発現の低下を認めた点から、mysterin R4810Kが細胞分裂機能に与える影響を検討した。その結果mysterin R4810K強制発現細胞および患者iPSECにおいて細胞分裂M期の延長とmitotic failureの上昇を認めた。またmysterin R4810KはM期進行を制御するMAD2と共局在してMAD2の異常な局在を引き起こすこと、mysterin R4810Kは野生型と比較してMAD2とより強固に複合体を形成することが証明され、mysterin R4810KがMAD2への吸着により正常な局在を阻害することが示唆された。さらに患者線維芽細胞では薬剤によるM期停止処理化で染色体異数性が観察され、mysterin R4810Kがゲノム不安定性を導くことを示した。Moyamoya病は、日本人で多い脳血管疾患の中で若年性脳卒中の主要な原因の一つであり、内頸動脈終末部閉塞とそれに伴うもやもや血管を含めた側副血行路の発達を特徴とする。その感受性遺伝子は長く不明であったが、近年、我々は、Moyamoya病感受性遺伝子として新規タンパクをコードするmysterinを同定した(Liu W. et al. 2011)。内頸動脈の閉塞の原因として血管内皮の異常増殖などの質的異常が指摘されているが、その病態は不明な点が多い。

本研究では、(1)Moyamoya病患者由来のiPS細胞を樹立し、罹患細胞種へと分化させ、(2)細胞生物学的観察とmysterinの発現解析、(3)mysterinと他分子とのcross talkについて検討することにより、脳血管疾患に共通した脳血管特異的な機能上、構造上の分子メカニズムを解明し、脳血管疾患の新たな予防医療の確立を目指す。3世代にわたる常染色体優性遺伝形式で伝達されている家族性Moyamoya病家系の研究参加者3名の皮膚生検を採取し、京都大学iPS研究所にて皮膚生検を行い、得られた皮膚繊維芽細胞に山中4因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC)をレトロウイルス用いて導入し、iPS細胞コロニーを樹立した。樹立したiPS細胞より、定量的PCR法を行い、得られたコロニーから最適なクローンを選択した。また得られたクローンは、我々が報告したMoyamoya病感受性遺伝子mysterinの多型p.R4810K(Liu W. et al. 2011)の有無、免疫染色、胚様体形成、核型解析、エピゲノム解析、Short tandem repeat解析を行い、クオリティコントロールチェックを行った。更に得られたクローンを内皮細胞へ分化誘導を行い、得られた内皮細胞の血管内皮マーカーを用いて分化を確認した。現在までに、3世代にわたる常染色体優性遺伝形式で伝達されている家族性Moyamoya病家系の研究参加者由来のiPS細胞コロニーを樹立し、免疫染色、定量的PCR、胚様体形成、奇形種形成、核型解析、エピゲノム解析、Short tandem repeat解析を行い、得られたコロニーから最適なクローンを選択できた。iPS細胞の樹立ともやもや病の罹患細胞腫である内皮細胞への分化、血管内皮細胞の細胞生物学的観察とMysterinの遺伝子発現解析より、本年度の研究目的に達成していると考える。Moyamoya病患者由来のiPS細胞を樹立し、iPSのクオリティコントロールは完了した。また罹患細胞種の1つである血管内皮細胞へと分化、単離できた。本年度で得られたMoyamoya病患者由来の血管内皮細胞を用いて細胞増殖など細胞生物学的な観察を行う。またMoyamoya病患者の血管内皮細胞由来のcDNAを用いたDNAマイクロアレイによって網羅的遺伝子発現の解析を行い、更に、血管新生に関わるシグナル伝達経路を標的として解析し、シグナル伝達の異常からMysterinとcross-talkする分子を特定する。H23年度に樹立したMoyamoya病患者から樹立したiPS細胞から内皮細胞へと分化誘導し、単離した血管内皮細胞を使って、細胞増殖、遊走、アポトーシスなど細胞生物学的観察やMoyamoya病感受性遺伝子Mysterinの発現をrealtime-PCR,ウエスタンブロット法、免役染色法によりRNA、タンパクレベルで検討する。該当なし。iPS細胞の維持、血管内皮細胞への分化誘導と単離後の維持に要する消耗品代として使用する。また分子生物学的手法であるwestern blotting、免疫染色、細胞生物学的観察、DNAマイクロアレイに必要な試薬などの購入に要する消耗品代として使用する。