hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メンソール、カプサイシンが神経系を介して鼻炎、副鼻腔炎の病態に及ぼす影響

本研究は、内視鏡下鼻副鼻腔手術の術前、術中、術後の評価法を開発して提唱した。嗅覚障害の病態解明のために、メンソールを含む嗅覚研究用検査、嗅覚検査(T&Tオルファクトメトリーによる平均認知域値、静脈性嗅覚検査)の結果を検討した。術中所見は、副鼻腔と嗅裂部の粘膜と貯留物の性状からスコア化を試みた。術後評価は、内視鏡スコア(Eスコア)を提唱して妥当性と有用性を報告した。好酸球性副鼻腔炎は重症な嗅覚障害をきたして難治性であることを報告した。基礎研究は、ラット膝神経節におけるメンソール、カプサイシン受容体(TRPM8、TRPV1)などの発現が鼓索神経切断モデル後に低下することを報告した。本研究は、全行程において兵庫医科大学の倫理委員会のガイドラインに基づき、十分なインフォームド・コンセントの上で実行している。アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎に対する内視鏡下鼻内手術時に病的鼻組織を採取し、病理組織学検査で検討している。嗅覚障害を伴う慢性副鼻腔炎で、術中に採取した嗅上皮におけるTRP family(TRPM8とTRPV1)の分布を嗅神経のマーカーであるOMPの発現と共に調べる計画を立てている。ラットを用いた動物実験でも、膝神経節におけるメンソールおよびカプサイシンの受容体発現を調べている。正常および鼓索神経切断モデルの間に膝神経節におけるmRNA発現量の差を調べている。結果がまとまれば英文論文へ投稿する予定である。臨床的研究としては、術前後の嗅覚検査、画像所見、術中所見をそれぞれ照合して検討している。術前後の画像評価は、副鼻腔CT検査の結果からLund-Mackay法に従って測定して評価した。術中は内視鏡の鼻内所見を終始デジタル録画した。症例ごとに鼻腔ポリープの有無、副鼻腔粘膜の性状、副鼻腔内の貯留液の性状、嗅裂粘膜の状態を明記している。嗅覚は術前後に我々が提唱した紙一枚で簡易に嗅覚障害の程度を評価できる「日常のにおいアンケート(SAOQ:self-administered odor questionnaire)」法(Takebayashi, Tsuzuki at al. ANL, 2011)を用いて嗅覚障害の自覚の程度を測り、嗅覚検査(T&Tオルファクトメトリー、静脈性嗅覚検査)で精査している。さらにはメンソールの嗅素を含む嗅覚検査法を用いて嗅覚障害の状態を評価する予定である。とくに好酸球性副鼻腔炎における嗅覚障害の治療成績を調査して、学会および論文で報告した(都築、他:耳鼻免疫アレルギー、2014)。また、副鼻腔炎手術症例の術後経過を評価する指標として研究代表者が提唱してきた内視鏡スコアの妥当性、臨床応用に関しても研究した。この研究成果は英文論文として受理された。本研究は、全行程において十分なインフォームド・コンセントの上でアレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎に関する実験を行っている。臨床研究としては、内視鏡下鼻内手術前後の嗅覚検査、画像所見、術中所見をそれぞれ検討している。術前後の画像評価は、副鼻腔CT所見をLund-Mackay法に従ってスコア化した。今後はこの術中所見のスコア化を試みる予定である。嗅覚については、術前後に我々が提唱した紙一枚で簡易に評価できる「日常のにおいアンケート(SAOQ:self-administered odor questionnaire)」法(Takebayashi, Tsuzuki at al. Auris Nasus Larynx, 2011)を用いて嗅覚障害の自覚の程度を測り、嗅覚検査(T&Tオルファクトメトリー、静脈性嗅覚検査)で精査した。さらに、メンソールの嗅素を含む嗅覚検査法(Open Essence:嗅覚同定能力測定用カードキット:嗅覚研究用)も用いて、嗅覚障害を詳細に評価している。好酸球性副鼻腔炎は重症な嗅覚障害が生じやすく難治性である(都築、他:耳鼻免疫アレルギー、2014)。副鼻腔炎手術症例の術後経過を評価する指標として内視鏡スコアを提唱して、その妥当性と臨床応用に関する成果を英文論文として報告した(Tsuzuki K, et al. Novel endoscopic scoring system after sinus surgery. Auris Nasus Larynx, 2014.)。基礎研究としては、嗅覚障害を伴う慢性副鼻腔炎で、術中に採取した嗅上皮におけるTRP family(TRPM8とTRPV1)の発言を調べる計画である。またラットおよびマウスを用いた動物実験で、膝神経節におけるメンソールおよびカプサイシンの受容体発現を調べた。正常および鼓索神経切断モデルの間に膝神経節におけるmRNA発現量の差を調べ、結果をとりまとめて英文論文へ投稿中である。本研究は、全行程において十分なインフォームド・コンセントの上でアレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎に関する研究を行った。臨床研究としては、内視鏡下鼻内手術前後の嗅覚検査、画像所見、術中所見を検討した。

嗅覚については、術前後に我々が提唱した紙一枚で簡易に評価できる「日常のにおいアンケート(SAOQ:self-administered odor questionnaire)」法(Takebayashi, Tsuzuki at al. Auris Nasus Larynx, 2011)を用いて嗅覚障害の自覚の程度を測り、嗅覚検査(T&Tオルファクトメトリーによる平均認知域値、静脈性嗅覚検査の反応有無)で評価した。さらに、メンソールの嗅素を含む嗅覚検査法(Open Essence:嗅覚同定能力測定用カードキット:嗅覚研究用)も用いて嗅覚障害を詳細に評価した。術中は内視鏡の鼻内所見を終始デジタル録画し、鼻腔ポリープの有無、副鼻腔粘膜の性状、副鼻腔内の貯留液の性状、嗅裂粘膜の状態を評価し、術中所見のスコア化を試みた。好酸球性副鼻腔炎は重症な嗅覚障害が生じやすく難治性であることを報告した(都築、他:耳鼻免疫アレルギー、2014)。術後評価のための術後内視鏡スコアを提唱して妥当性と有用性を報告した(Tsuzuki K, et al. Novel endoscopic scoring system after sinus surgery. Auris Nasus Larynx, 2014.)。本研究は、内視鏡下鼻副鼻腔手術の術前、術中、術後の評価法を開発して提唱した。嗅覚障害の病態解明のために、メンソールを含む嗅覚研究用検査、嗅覚検査(T&Tオルファクトメトリーによる平均認知域値、静脈性嗅覚検査)の結果を検討した。術中所見は、副鼻腔と嗅裂部の粘膜と貯留物の性状からスコア化を試みた。術後評価は、内視鏡スコア(Eスコア)を提唱して妥当性と有用性を報告した。好酸球性副鼻腔炎は重症な嗅覚障害をきたして難治性であることを報告した。基礎研究は、ラット膝神経節におけるメンソール、カプサイシン受容体(TRPM8、TRPV1)などの発現が鼓索神経切断モデル後に低下することを報告した。臨床研究に関しては、概ね目標が達成できている。副鼻腔術後の経過を評価する指標として提唱した「術後内視鏡スコア」の妥当性および有用性に関して研究した成果が、英文論文として受理された。基礎研究のTRP familyの発現に関しては、基礎研究室で大学院生も組織採取および実験系の計画を立ち上げるのに時間を要した。平成26年度には、大学院生が膝神経節の取り出し、切片作成、in situ hybridization法、免疫組織化学法を安定してできるようになった。今後も結果を重ねて再現性を確認した後に、成果を報告する予定である。前年度できなかった本研究のテーマの一つ、臨床研究であるメンソールの嗅覚に関する研究は、メンソールを含める嗅覚検査の遂行も行えている。もう一方の基礎研究では、手術時の鼻組織の採取はできている。しかしメンソールに関する実験の計画を遂行する時間が取れずに実施できていない。基礎研究室で大学院生も動物の鼻副鼻腔組織の採取および実験系の環境を整えている段階である。耳鼻咽喉科臨床研究に関しては、嗅覚障害の研究を継続して結果を集計する。嗅覚障害の原因疾患は慢性副鼻腔炎によるものが最も多く、嗅覚障害は慢性副鼻腔炎患者の6080%に認めると報告されている。しかし、慢性副鼻腔炎の程度と嗅覚障害の程度を詳細に検討した報告は少なかったため、慢性副鼻腔炎手術症例における術前の嗅覚障害の程度と副鼻腔CT所見に関連があるか調査した。
ＨＴＬＶ－１、ＥＢＶ関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的ＣＴＬの病態解析

HTLV-1のTaxの発現は、多くのATLL細胞では低下しており、Tax-specific CTLの存在の有無とATLLとの関連ははっきりしていない。また、FoxP3の発現が見られることより、抑制性T細胞由来と考えられているが、抑制性の機能についてはまだ確定されていない。今回、Tax-specific CTLとFoxP3の発現の関連をATLLのリンパ腫において研究を行ったところ、一部の症例で、ATLLのリンパ節病変内にはTax-specific CTLが認められた。また、Tax-specific CTL数はFOXp3陽性の症例では優位に低く、FoxP3による免疫抑制の関与が考えられた。HTLV-1ウイルス蛋白であるTAXは、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)細胞の増殖に重要な役割を果たし、かつHTLV-1-specific Cytotoxic T lymphocyte(CTL)の標的でもあることが知られている。しかし、HTLV-1-specific CTLがATLL患者のリンパ節の中でどのように作用するかは明らかではない。そこで現在、ATLLの患者のリンパ節検体を用いて、HLA-A24-restricted TAX-specific CTLの蛍光染色を行い、腫瘍のHLA-A24、TAX、Foxp3の発現との関係を検討している。方法:Assay 1:ATLL患者のリンパ節病変にTax-specific CTLはいるのか?PCR法にて、HLA-A24を確認したATLLのFrozen sectionを用いて、MHC dextramerによりHLA-A24 restricted TAX-specific CTLの蛍光染色を行っている。Tax-specific CTLとFOXp3の関係を解析するため、抗FOXp3抗体(Abcam)を使用し免疫染色を行っている。また、Tax-specific CTLの活性をみるため、INFγの免疫染色を行っている。その結果、一部の症例で、ATLLのリンパ節病変内にはTax-specific CTLが認められている。また、Tax-specific CTL数は、形態との関連はみられなかったが、FOXp3陽性の症例では優位に低い傾向がみられた。現在、PCR法でHLA-A24の確定できた14例のATLLの凍結材料を用い解析を行なっている。さらに、論文作成のためCD20,CD3,CD4,CD8,TIA-1の染色を行ない、解析を追加中である。HTLVー1関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的CTLの病態解析:今回の研究にあたり以下の方法:方法1,2,3は、確立できたため、今後は症例の選定、追加を行う予定をしている。また4)を行い論文の作成中である。また必要に応じて解析を追加する予定にしている。そこで、ATLLの患者のリンパ節検体を用いて、HLA-A24-restricted TAX-specific CTLの蛍光染色を行い、腫瘍のHLA-A24、TAX、Foxp3の発現との関係を検討した。方法:Assay 1:ATLL患者のリンパ節病変を用いたPCR法にて、HLA-A24を確認したATLLのFrozen sectionを用いて、MHC dextramerによりHLA-A24 restricted TAX-specific CTLの蛍光染色を行った。Tax-specific CTLとFOXp3の関係を解析するため、抗FOXp3抗体(Abcam)を使用し免疫染色を行った。その結果、一部の症例で、ATLLのリンパ節病変内にはTax-specific CTLが認められる。このことより、Tregの機能としてCTLを抑制している可能性が示唆された。以上の論文化を行なった。(Ichikawa et al. ONCOLOGYLETTERS 13: 4611-4618, 2017)HTLV-1のTaxの発現は、多くのATLL細胞では低下しており、Tax-specific CTLの存在の有無とATLLとの関連ははっきりしていない。

HTLVー1関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的CTLの病態解析:今回の研究にあたり以下の方法:方法1,2,3は、確立できたため、今後は症例の選定、追加を行う予定をしている。HTLVー1関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的CTLの病態解析については上記のように、今後は症例の選定、追加を行う予定をしている。病理HTLVー1関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的CTLの病態解析については上記のように、今後は症例の選定、追加を行う予定をしている。EBV関連リンパ腫におけるウイルス抗原特異的CTLの病態解析においては、まだ、開始を行っていないが、びまん大細胞型リンパ腫において、免疫逃避タンパクPDL-1および、その作用タンパクであるPD1の解析とEBVの感染の関連を解析予定にしており、現在、症例の選定を行っている。また、PDL-1, PD1の免疫染色については、方法は、現在確定している。
長周期・長継続時間地震動による貯水槽スロッシングが配水システムに及ぼす被害予測

地震発生直後に管路に直接的な被害が無くとも急激な流量の増加と水圧の低下といった配水システムにおける異常事態に着目し,被害地震が発生した際にアンケート調査を大規模水道事業体に行った。さらに,この現象が貯水槽の水のスロッシングによる水位センサーの誤作動によるものであることを明らかにし,今後発生する巨大地震による長周期・長継続時間地震動が配水システムの異常挙動に与える影響を明らかにした。本研究では,長周期・長継続時間地震動によって上水貯水槽の水がスロッシング現象を起こし,強制引水を開始する条件をまず明らかにし,つぎに,同時に多くの貯水槽が強制引水を行ったときに上水道システムに及ぼす影響を検討し,さらに,救命ライフラインといわれる消火,医療給水に及ぼす影響を検討することを目的とする。さらに,今世紀中ごろまでに発生すると危惧されている東南海・南海地震の想定地震波形を作成し,全国のどのような都市でどのような規模でこのような現象が発生するのかを明らかにすることが最終目的である。本研究では、長周期・長継続時間地震動によって上水貯水槽の水がスロッシング現象を起こし,強制引水を開始する条件をまず明らかにし、つぎに、同時に多くの貯水槽が強制引水を行ったときに上水道システムに及ぼす影響を検討し、さらに、救命ライフラインといわれる消火,医療給水に及ぼす影響を検討することを目的としている。まず,水供給システムにおいて多地点で流量や水圧の経時変化を観測している、比較的大規模な水道事業体に対して、2007年能登半島地震,新潟県中越沖地震,2008年岩手・宮城内陸地震の発生時の配水システムの異常挙動に関するアンケート調査を実施した。異常の有無とともに、異常が顕著であった地域の住環境特性や配水地域にある貯水槽の大きさと数などに注目して調査票を作成した。それらを集計し,異常挙動の発生する条件について検討した。さらに,配水区域で比較的多くの地震動記録が得られている仙台市水道局の岩手・宮城内陸地震の例をケーススタディとして詳細な分析を行った。すなわち,配水ブロックごとの貯水槽の容量とそれぞれの数量を調査するとともに,近接する強震観測点の地震記録における卓越周期,継続時間と異常挙動の発生の程度などについて分析した。その結果,貯水槽の容量が大きいと異常挙動の程度が大きいとは限らず,地震動の卓越周期と貯水槽のスロッシング卓越周期の関係も関与していることが示唆された。さらに,速度応答スペクトル用いて貯水槽の卓越周期との関係から液体のスロッシング高さを求める、ハウスナー博士が提案した簡易式により、貯水槽で発生しうるスロッシングの高さについても検討した。本研究では、長周期・長継続時同地震動によって上水貯水槽の水がスロッシング現象を起こし、強制引水を開始する条件をまず明らかにし、つぎに、同時に多くの貯水槽が強制引水を行ったときに上水道システムに及ぼす影響を検討する。さらに、救命ライフラインといわれる消火、医療給水に及ぼす影響を検討することを目的としている。まず、昨年度に引き続き、貯水槽を用いたスロッシングの振動実験を実施した。最大スロッシング高さを計測し、地震動継続時間もパラメタとして考慮したスロッシング高さ評価式の構築を試みた。今年度は主として正弦波による実験を実施し、基礎的な資料を収集することができたので、今後想定される長周期長継続時間地震波による振動実験へと発展させる予定である。研究協力者の村田が所属する大阪市水道局の上水道システムを対象に、強制引水が水道システムに及ぼす影響に関するケーススタディを行った。すなわち、まず大阪市の対象地区を選定し、対象地区における上水貯水槽の空間分布を調査し、強制引水の条件付発生確率に基づいて、想定地震における強制引水量とその空間分布を推定した。想定地震による強制引水が発生した場合について管網解析を行い、強制引水が発生しない場合と、管網内の流量、水圧の分布を比較、検討した。今年度の解析では、ハウスナー博士が提案した簡易式により、貯水槽で発生しうるスロッシングの高さを計算したので、地震動継続時間の影響を考慮できなかった。したがって、スロッシングの経時変化を解析する手法を開発する必要性が明らかとなった。本研究では、長周期・長継続時間地震動によって上水貯水槽の水がスロッシング現象を起こし,強制引水を開始する条件をまず明らかにし、つぎに、同時に多くの貯水槽が強制引水を行ったときに上水道システムに及ぼす影響を検討する。さらに、救命ライフラインといわれる消火,医療給水に及ぼす影響を検討することを目的としている。昨年度まで用いていた,速度応答スペクトル用いて貯水槽の卓越周期との関係から液体のスロッシング高さを求めるハウスナー博士が提案した簡易式には、巨大地震の際に問題となると考えられている地震動継続時間が非常に長くなる場合については十分には考慮されていないので、VOF法を用いた3次元時刻歴スロッシング解析手法を構築した。解析結果の精度を検証するために,水槽を用いたスロッシング振動実験も行い,相互のスロッシング高さを比較したところ,良い結果が得られた。

そこで,これまでに配水システムの異常挙動が報告されている地震と,報告されていない地震の観測地震動波形を用いてVOF法を用いた3次元時刻歴スロッシング解析を行った。その結果,VOF法を用いたスロッシング解析は,地震時の矩形水槽のスロッシング挙動を分析する上で有効であることが確認されるとともに,スロッシングの継続時間もスロッシングの最大水面変位とともに,配水システムの異常挙動発生と相関があることが明らかとなった。今後は,3次元解析の利点を活用して,水位センサーの最適設置位置を検討し,水位センサーの誤作動対策を検討する予定である。本研究では、長周期・長継続時間地震動によって上水貯水槽の水がスロッシング現象を起こし,強制引水を開始する条件をまず明らかにし、つぎに、同時に多くの貯水槽が強制引水を行ったときに上水道システムに及ぼす影響を検討する。さらに、救命ライフラインといわれる消火,医療給水に及ぼす影響を検討することを目的としている。2011年東北地方洋太平洋沖地震が発生したことにより、申請時の計画を一部変更し、水道システムにおいて多地点で流量や水圧の経時変化を観測している比較的大規模な水道事業体に対して、2011年東北地方太平洋沖地震時の配水システムの異常挙動に関するアンケート調査を実施した。その結果、震度6弱が観測された仙台市や震度5強千葉県で配水システムの異常挙動が観測されたのみならず、震度4であった名古屋市や震度3大阪市でも異常挙動が観測されたことが明らかとなった。したがって、異常挙動は地震動の大きさだけによるものではないことが、再認識された。観測されている地震動記録も同時に収集し,卓越周期,継続時間と異常挙動の発生の有無との関係を検討した。地震波形を直接用いたスロッシング解析を,2011年東北地方太平洋沖地震にて記録された地震波形を用いて実施し,周期及び継続時間と最大スロッシング高さとの関係を考察した。その結果、今回の地震の特徴にひとつである、長継続時間がスロッシングに及ぼす影響を定量的に明らかにすることができた。
終脳特異的接着分子テレンセファリンの遺伝子欠損マウスの作製と解析

本研究の目的は、終脳特異的接着分子テレンセファリン(TLN)の脳における働きを明らかにするため、TLN遺伝子のノックアウトマウスの作成することである。TLN遺伝子のノックアウトマウスの作成のために最初に、TLNの遺伝子を含むマウスゲノミックDNAのクローニングおよびそれを用いたターゲッテイングベクターの作成を行った。平成7年度にはES細胞(TT2株)由来のDNAから、TLNの全コ-デイング領域と5′上流調節領域を含むゲノミッククローンを単離し、そのクローンの制限酵素地図の作成とエクソン/イントロンの位置の決定を行い、それらに基ずいて薬剤耐性遺伝子(neomycin耐性遺伝子とherpessimplex virus thimidine kinase(HSV-tk))を組み込んだターゲッテイングベクターの作成を終了した。次に作成したターゲッテイングベクターをES細胞にエレクトロポレーションにより導入し、相同組み替えを起こしたmutant ES細胞をneomycinによる選択培養で濃縮単離を行った。平成7年度には、エレクトロポレーションによるES細胞へのターゲッテイングベクターの導入を終え、約200個のneomycin耐性のES細胞を得ることができた。さらにPCR法およびサザン法により13個の正しい相同組み替えを起こしたmutant ES細胞を得ることができた。現在、ノックアウトマウス作成の最終段階であるキメラマウス作成と、このキメラマウスと正常態マウスと交配させ、germline transmissionにより産まれてくるヘテロ接合体、そしてヘテロ接合体同士を交配させて産まれてくるホモ接合体(ダブルノックアウトマウス)の作成に着手したところである。
21番染色体ダウン症関連領域からの遺伝子単離とその解析

ヒト21番染色体ダウン症関連領域から新規遺伝子(TPRD)の単離を行い、以下のことを明らかにした。2)ホモロジー検索の結果から、コードする蛋白はtetratricopeptide repeat領域(蛋白間相互作用に関与すると推定されている34個のアミノ酸の繰り返し)、及びマトリックス蛋白と相同性の高い領域を持つことが明らかとなった。3)RT-PCRおよびノーザン解析から、TPRD遺伝子は、発生初期から、脳、心臓、肝臓等、実験に用いた全てのヒト臓器で発現していることが明らかになった。4)ラット脳を用いたin situ hybridizationの結果、TPRD遺伝子は脳全体に発現しており、特に神経細胞のおける発現が顕著であることが明らかになった。5)マウスcDNAホモログを単離し、ヒトcDNAとの相違を明らかにした。以上の結果から、TPRD遺伝子は、精神発達遅滞、形態形成異常等、ダウン症の多様な症状を引き起こす原因遺伝子の一つである可能性が推察され、現在、ダウン症発症原因との関連性について検討中である。
花粉管の伸長や誘引に関わる生理活性物質とその受容機構の解明

被子植物の花粉管は先端成長により精細胞を運ぶ細胞であり、雌性配偶体への花粉管の伸長を適切に制御することは有性生殖においてきわめて重要である。本研究では、雌組織から分泌される新規花粉管誘引物質の同定と性質の解析、ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定とその作用機序の解明、新規に発見した花粉管誘引因子及び上記で同定した新規花粉管誘引因子の花粉管における受容体の探索を目的とした。これまでに、長距離花粉管誘引因子をトレニアより新規に同定し、その組織内分布を明らかにした。また、助細胞由来の誘引因子LUREsについて、複数種のLUREsの配列比較より、種特異的な花粉管誘引に必要な部位を数アミノ酸レベルにまで絞り込むことに成功した。さらに、これまで花粉管ガイダンスや受精研究に用いられてこなかった植物で新規にin vitro花粉管ガイダンス実験系を立ち上げ、花粉管の挙動を観察することに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、(1)雌組織から分泌される新規花粉管誘引物質の同定と性質の解析、(2)ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定とその作用機序の解明、(3)新規に発見した花粉管誘引因子CALL1やLUREs、および上記で同定した新規花粉管誘引因子の花粉管における受容体の探索をおこなう。これらの解析を通じて、花粉管の伸長方向を制御するシグナル分子とその受容機構の解明を目的としている。当該年度はおもに(1)と(2)について解析を進めた。(1)独自のアッセイ系を用いた新規花粉管誘引物質の同定と性質の解析マイクロ流体デバイスを用いた花粉管誘引アッセイ系を開発し、新規誘引因子としてCALL1をトレニア胚珠抽出液から同定した。CALL1の組織内での局在を詳細に検討した結果、細胞壁の成分の1つであるセルラーゼ成分により局在が規定されている可能性が示唆された。(2)ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定とその作用機序の解明花粉管に作用する低分子化合物はAMOR以外にも存在すると考えられる。そこで、分担研究者の佐藤博士の協力により、名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(以下ITbMと略)が所有するケミカルライブラリーの化合物を用いて、花粉管の伸長や誘引に影響を及ぼす化合物を探索した。現在までに伸長を阻害する物質の候補として4分子得られている。(1)独自のアッセイ系を用いた新規花粉管誘引物質の同定と性質の解析CALL1はマイクロ流体デバイスを用いた独自の花粉管誘引アッセイ系から見いだされた、新規花粉管誘引因子である。この成果は植物の受精を制御する基礎的な知見につながる。(2)ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定とその作用機序の解明花粉管の誘引は現在の所タンパク質性の分子でしか達成されていない。これを低分子化合物に置き換えることができると、誘引物質の大量生産などの面からも役に立つと期待される。当該年度のスクリーニングでは誘引活性をしめす物質は見つかっていないが、阻害活性を示す物質は複数発見された。これらの分子も広い意味での花粉管伸長方向制御因子として用いることができると期待される。一般に、拮抗阻害が起こる場合は、阻害物質と活性物質が似た構造を採ることが多い。今回見つかった阻害物質を起点として構造活性相関をすることにより、誘引活性のある物質が見つかる可能性もある。花粉管の伸長に影響を及ぼす候補化合物を複数得ることができた。LUREの機能に重要なアミノ酸を同定することができた。

また、助細胞由来の誘引因子LUREsについて、複数種のLUREsの配列比較より、種特異的な花粉管誘引に必要な部位を数アミノ酸レベルにまで絞り込むことに成功した。さらに、これまで花粉管ガイダンスや受精研究に用いられてこなかった植物で新規にin vitro花粉管ガイダンス実験系を立ち上げ、花粉管の挙動を観察することに成功した。被子植物の花粉管は先端成長により精細胞を運ぶ細胞であり、雌性配偶体への花粉管の伸長を適切に制御することは有性生殖においてきわめて重要である。本研究では、雌組織から分泌される新規花粉管誘引物質の同定と性質の解析、ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定とその作用機序の解明、新規に発見した花粉管誘引因子及び上記で同定した新規花粉管誘引因子の花粉管における受容体の探索を目的とした。これまでに、長距離花粉管誘引因子をトレニアより新規に同定し、その組織内分布を明らかにした。さらに、これまで花粉管ガイダンスや受精研究に用いられてこなかった植物で受精に関わる遺伝子の機能を調べるため、発現解析をおこなった。新規モデル実験系の立ち上げに成功し、受精に関わる組織で発現している遺伝子を複数同定することができた。(1)花粉管誘引活性画分からの誘引物質候補タンパク質の探索これまでに、トレニア雌しべ胚珠組織由来の分泌物を陰イオン交換カラムを用いて分画することにより、花粉管誘引活性のある画分を複数得ている。抗体や質量分析によりCALL1は画分17, 18に、LUREsは画分31, 37に含まれることが分かっている。ここではまず両者を含まない画分12に着目する。質量分析によりこの画分に含まれるタンパク質を同定し、大腸菌を用いてそれらのリコンビナントタンパク質を発現・精製する。花粉管誘引アッセイによりそれらの誘引活性を調べ、新規の誘引物質を同定する。さらに、雌しべを柱頭・花柱など組織別に切り分け、花粉管誘引アッセイをおこなう。誘引活性の見られた組織を用いて、胚珠抽出液と同様の生化学的分画をおこない、新規の誘引物質を探索する。(2)ケミカルスクリーニングによる花粉管の伸長や誘引に関わる新規化合物の同定研究分担者の佐藤が所属するITbMでは、研究所独自の化合物をふくむ約30,000もの化合物ライブラリーを保有している。これらの化合物を花粉管伸長培地に加え、胚珠への花粉管誘引アッセイをおこなう。通常の培地でのアッセイと比較することにより、花粉管に対して誘引・忌避・伸長促進・破裂・胚珠への誘引の阻害といった効果を及ぼす化合物を探索する。(3)花粉管の伸長や誘引に関わる生理活性物質の花粉管における受容体の探索(1)(2)やこれまでに同定した誘引因子LUREsおよびCALL1が花粉管でどのようにして受容されるかを明らかにするため、これらの受容体を探索する。受容体が同定されれば、花粉管伸長・誘引過程でのその局在の変化などを解析し、シグナル分子がどのようにして花粉管の伸長方向を制御するかを明らかにする。花粉管の伸長に影響する化合物について、構造活性相関解析により重要な構造を明らかにする。
環境状態-生物選択-資源の3要素の相互作用から生じる自己調節フィードバックモデル

本年度の研究概要本研究では、生態系に生物が存在することによって環境状態の変動が外的撹乱から予測されるよりも小さくなることに着目し、その機序を解き明かすことを目的として数理モデルを用いた解析を行ってきた。生態学の分野において生物が物理化学的環境状態に寄与することでその状態に安定性をもたらしうることに着目したモデル研究はほとんどない。申請者は申請当初、モデル研究の拡張に際して、生物や資源の数を増やすことや生物のパラメタに進化を導入することを考えていたが、系の本質的な理解のために数学的解析が重要であることを認識し、まず2種1資源1環境系の解析を試みた。その結果、生物が環境に影響を及ぼすことで安定な共存点が現れ、共存が生じることで環境(気温やpH)が外部の撹乱に全く依存せず一定に制御されることが数学的に示された。この結果は2007年にJournal of Theoretical Biologyに掲載された。その後、微生物培養槽モデル(ケモスタットモデル)においてシアノバクテリアとpHが相互作用関係にある系を数理モデルで検証した結果、いくつかの条件が満たされれば1種の微生物でさえもpHの安定制御効果をもたらしうることが示された(これは現在投稿準備中である)。またこの研究からは環境制御効果は外的撹乱が大きくなりすぎると一気に失われてしまい、生態系の崩壊を招く危険性をはらんでいることがわかった。人間活動による外的な環境撹乱(e.x.温暖化、酸性降下物の上昇)が大きくなる昨今、生物がどのようにこれに応答し制御しうるかを知ることは非常に重要な課題であると考えられる。本年度の研究概要申請者は生物と環境とが相互作用する中から環境が安定化していくフィードバック機構の存在を2種1資源1環境モデル研究によって示唆し、研究課題に「多種多資源系フィードバックモデル、物質循環と新加速度を考慮したフィードバックモデルへの拡張」を掲げてきたが、複雑な系に取り組む前に、本質的な理解のためには数学的な解析を先んじて行うことが必要という認識を持った。そこで、平成18年度は2種1資源1環境モデルの数学的な解析を行った。その結果、1.1資源に対してトレードオフの関係にある2種の生物のうち1方でも環境状態に影響を及ぼす場合環境の恒常化と共存が生じる可能性がある2.共存状態が確立すれば必ず環境の恒常性が保たれ、またその共存状態の安定性はバックグラウンドの環境状態(無生物的に決定)、環境状態に対する生物の影響力の強度、系に存在する資源の量に依存して変化する。今後の研究の展開19年度は上記の研究課題への拡張を目標とするが、共存状態と環境の恒常化の数学的な解析においてはもっとも単純な2種1資源1環境モデルにおいても難しいことが分かったため、今後は多種多資源系に関しては数値的解析のみを行っていく方針である。また、物質循環を考慮したモデルに関しては現在窒素循環を考慮したモデルに取り組んでいる。
強相関単体金属の準粒子状態の定量解析:放射光励起による高分解能角度分解光電子分光

本年度は、Au(110)に存在するShockley準位について放射光励起の高分解能角度分解光電子分光実験を行った。また放射光の直線偏光特性を利用する新しい高分解能光電子分光装置の設計を完了し、製作に移った。以下、詳細を記述する。1.Au(110)にはmissing rawと呼ばれる表面原子が線状に欠損する特異な表面再構成が存在する。本研究では表面Brillouin域のY^^-点に存在するShockley準位を放射光励起角度分解光電子分光を用いて詳細に調べた。その結果、分散関係及びフェルミ面の形状を初めて明らかにすることができた。分散関係からは、フェルミエネルギー、有効質量、フェルミ波数を決定した。また、フェルミ面の形状が楕円であることを明らかにした。Au(111)面のShockley準位や他の貴金属のShockley準位と比較することにより、貴金属のフェルミ面形状は、Shockley準位が存在するL点のバルクバンドギャップの形状と密接に関係していることを明らかにした。2.放射光の偏光特性を積極的に利用するとフェルミ面を構成する波動関数の対称性を議論できる。私たちは電子エネルギー分析器を放射光の偏光面に対して回転させることにより、直線偏光特性を積極的に利用する新しい高分解能角度分解光電子分光装置を建設中である。本年度、私は測定槽および試料準備槽の図面を完成させ、製作に移ることができた。本年度末までに製作品が納品され、来年度以降、立ち上げ、偏光特性実験を開始する予定である。本年度は、Ni及びCu単結晶の自己エネルギーの定量解析、Pd単結晶の清浄表面作成とフェルミ準位近傍の準粒子状態の観測、およびCe等単純金属の蒸着が可能な環境整備を主目的とし以下の通り研究を行った。(1)Ni(110)単結晶の研究は、高分解能角度分解光電子分光(HR-ARPES)で得られたd対称性を持つΣ_<2↓>バンドとsp対称性を持つΣ_<1↑>及びΣ_<1↓>バンドのスペクトルの詳細な解析から、Σ_<2↓>及びΣ_<1↓>バンドに、kink構造(フェルミ準位近傍のバンドの折れ曲がり)が存在することが明らかになった。そして、自己エネルギーの詳細な解析からkink構造の起源が電子-格子相互作用であることが分かった。また、それぞれのバンドの相互作用の成分を求め、有効質量が、電子-格子相互作用と電子-電子相互作用の和で書き表すことができ、各成分が、バンドの対称性や、スピンに依存しているという知見を得た。この得られた結果に対して、2編の論文を投稿し論文誌に掲載された。(2)Cu(110)及びPd(110)単結晶の研究は、清浄化後、sp対称性を持つΣ_1バンドのフェルミ準位近傍のHR-ARPESを行った。スペクトルの定量解析から、各物質に対して、電子-格子相互作用に起因するスペクトルの異常を確認した。この得られた結果に対して、日本物理学会での発表を行った。(3)研究代表者を含む研究グループで整備を進めているHR-ARPES装置に産業技術総合研究所と共同で開発した低温5軸ゴニオマニピュレータ(i-GONIO LT)を導入し、フェルミ面のマッピングか測定可能な環境を整備した。今後、単体金属を用い相互作用の波数依存性の研究を進めていきたい。(4)上述の測定系を用いた共同研究により、遷移金属酸化物、カーボンナノチューブ、強相関希土類化合物の電子構造を明らかにし、研究成果を共著論文として発表した。本年度は、昨年Ni(111)単結晶の低エネルギー励起角度分解光電子によって、表面準位の選択的観測が可能であることが分かった、Shockley表面準位に関してCu(111)表面準位と比較を交え詳細な測定及び解析を行った。また、i-GONIO LTを備え、放射光の偏光性を利用し、バンドの対称性を選択的に観測可能なシステムの建設に関しても図面の作成を行った。以下にその概要について記す。1.Ni(111)に存在するShockley表面準位を、10eV以下の低エネルギー励起放射光を用いて選択的に抜き出して詳細な測定を行った。測定は、産業共同研究所と共同で開発した低温5軸ゴニオマニピュレータ(i-GONIO LT)を用いた。本研究ではフェルミ面、分散関係、電子-電子相互作用の大きさのそれぞれを明らかにした。まず、フェルミ面が、等方的な円であることを明らかにし、その大きさを見積もった。次に、分散関係から、バンドの底のエネルギー、フェルミ波数をそれぞれ決定した。また、スペクトルの定量解析により、電子に働く相互作用の大きさを明らかにし、それをCu(111)のShockley表面準位と比較した。その結果、Niの表面準位では、電子-電子相互作用が重要な相互作用であり、電子-格子相互作用は、あまり重要ではないことが分かった。2.i-GONIO LTを備え、放射光の偏光性を利用し、バンドの対称性を選択的に観測可能なシステムの概念設計を行い、p-偏光配置とS-偏光配置を切り替える際の光電子アナライザーの回転機構がおおむね決定した。今後、i-GONIO LTと光電子アナライザーの立体干渉等重要な課題に取り組み、来年度中の完成を目標に取り組みたい。

本年度は、Au(110)に存在するShockley準位について放射光励起の高分解能角度分解光電子分光実験を行った。また放射光の直線偏光特性を利用する新しい高分解能光電子分光装置の設計を完了し、製作に移った。以下、詳細を記述する。1.Au(110)にはmissing rawと呼ばれる表面原子が線状に欠損する特異な表面再構成が存在する。本研究では表面Brillouin域のY^^-点に存在するShockley準位を放射光励起角度分解光電子分光を用いて詳細に調べた。その結果、分散関係及びフェルミ面の形状を初めて明らかにすることができた。分散関係からは、フェルミエネルギー、有効質量、フェルミ波数を決定した。また、フェルミ面の形状が楕円であることを明らかにした。Au(111)面のShockley準位や他の貴金属のShockley準位と比較することにより、貴金属のフェルミ面形状は、Shockley準位が存在するL点のバルクバンドギャップの形状と密接に関係していることを明らかにした。2.放射光の偏光特性を積極的に利用するとフェルミ面を構成する波動関数の対称性を議論できる。私たちは電子エネルギー分析器を放射光の偏光面に対して回転させることにより、直線偏光特性を積極的に利用する新しい高分解能角度分解光電子分光装置を建設中である。本年度、私は測定槽および試料準備槽の図面を完成させ、製作に移ることができた。本年度末までに製作品が納品され、来年度以降、立ち上げ、偏光特性実験を開始する予定である。
神経障害後の脳脊髄内伝達物質の鎮痛作用機序と下行性抑制系の経時的変化

臨床上、神経障害性疼痛の治療には抗うつ薬が処方される。その鎮痛機序として脊髄における下行性抑制系が重要な役割を担っていることがわかっているが、いまだ不明な点も多い。本研究では神経障害性疼痛モデルラットを用いた脊髄における抗うつ薬の鎮痛効果の検討として、まず抗うつ薬を全身投与し、行動実験による評価を行った。用いた抗うつ薬であるデュロキセチンおよびミルタザピンともに鎮痛効果が認められた。次に、脊髄髄腔内にノルアドレナリン神経毒であるDSP4及びセロトニン神経毒である5,7DHTを投与し、脊髄におけるノルアドレナリンおよびセロトニンを枯渇させた状態で、抗うつ薬を全身投与し行動実験を行った。その結果、ノルアドレナリンが枯渇した状態では抗うつ薬による鎮痛効果が減弱することが確認された。さらに、抗うつ薬全身投与後の脊髄後角でのモノアミンの変化を、マイクロダイアリシス法及び高速液体クロマトグラフィーを用いて評価した。デュロキセチン投与後ではノルアドレナリンおよびセロトニンの上昇が確認されたが、ミルタザピンでは前者のみ上昇が確認された。以上のことから、脊髄における抗うつ薬の鎮痛機序として、ノルアドレナリンが強く関与していることが示唆された。現在はノルアドレナリン神経線維核である青斑核およびセロトニン神経線維核である大縫線核での抗うつ薬の効果を、免疫染色法を用いて実験検討中である。当初研究目標として掲げた抗うつ薬の脊髄における鎮痛効果とその関与を、行動実験および脊髄後角でのモノアミンの変化という形で評価、検討できており、現在は抗うつ薬の青斑核および大縫線核における効果を、免疫染色法を用いて進めている段階である。当初研究目標として掲げた抗うつ薬の脊髄における鎮痛効果とその関与を、行動実験および脊髄後角でのモノアミンの変化という形で評価、検討できている。最終段階として、青斑核および大縫線核の評価を免疫染色法を用いて検討していく予定である。現在までの研究結果から、脊髄での抗うつ薬による鎮痛効果および関与が確認された。今後の研究として、脊髄に投射しているノルアドレナリン神経およびセロトニン神経の起始核の変化を検討する必要があり、抗うつ薬投与後の各々の起始核である青斑核及び延髄吻側内側核群の評価を、脳切片標本を用いた免疫染色法で検討している。

さらに、それらの神経の制御にかかわっている上位核の関与も、脳におけるマイクロダイアリシス法を用いて検討していく予定である。当初研究目標として掲げた抗うつ薬の脊髄における鎮痛効果とその関与を、行動実験および脊髄後角でのモノアミンの変化という形で評価、検討できている。最終段階として、青斑核および大縫線核の評価を免疫染色法を用いて検討していく予定である。端数のため試薬の購入に使用するため。
スペイン領フィリピン社会における変動期の諸相―「マニラ公正証書原簿」の研究―

本研究は、これまで必ずしも十分に活用されてこなかったフィリピン国立文書館所蔵の「マニラ公正証書原簿」(各公証人による公正証書の登録簿)のうち、スペイン領フィリピン社会の変動期(近代移行期)にあたる18世紀末葉19世紀早期にかかるものについて調査・収集し、その内容を精査することをとおして、人びとの日常生活の諸相を把捉し、当該期のスペイン領マニラ社会の諸相の一端を解明した。本研究では「マニラ公正証書原簿」に登録されている「公正証書」の内容が当時の植民地の社会経済構造の変容を反映していることから、スペイン領フィリピン社会、特にスペイン領マニラの歴史研究に有用な史料群であることも確認された。本研究計画は5年計画であり、本年度はその初年度であった。まず、先行研究および、これまでに入手している資・史料の整理・分析を行った。これらの作業の成果の一部として、「フィリピン国立文書館蔵『マニラ公正証書原簿』について」と題して「2009年中国四国歴史学地理学協会大会」において報告を行った(2009年7月5日、愛媛大学)。本報告では、現存の「マニラ公正証書原簿」の成立の経緯を説明し、スペイン領フィリピンの変動期の諸相の解明にあたっての史料的価値を明らかにするとともに、他の東南アジア諸国における史料事情について質疑応答を通じて専門家と意見交換を行うことができた。本年度の現地調査としては、校務の関係もあって当初の計画より短期間かつ年度末での実施となったが、2010年3月13日から3月21日までの9日間の日程で、フィリピン国立文書館において「マニラ公正証書原簿」の調査を行った。18世紀末葉の公証人による「原簿」の一部について、保存状態に応じて筆写、電子複写およびデジタルカメによる撮影によって収集したので、これらの整理・分析作業を継続的に進める予定である。これらの作業によって得られた知見を踏まえて、先行研究および関連のスペイン文書の分析を合わせた検討を行い、その研究成果の一部として「スペイン領フィリピンにおける他者認識-中国人統治をめぐって-」を著して、フィリピン総督府とマニラの中国人移民との関係を中心に、フィリピン社会の変動期の諸相の一端を示した。本研究計画は5年計画で、本年度はその第2年度であった。昨年度に引き続いて、先行研究の検討を継続し、また昨年度末の調査で新たに収集した「マニラ公正証書原簿」を含めて、これまでに入手している資・史料の整理・分析作業を行った。また学内の共同研究プロジェクト「文化伝統の継承とアイデンティティ形成-記憶の場をめぐって-」に参加し、その活動をとおしてスペイン領フィリピン社会の変動期について「記憶の場」としてのスペイン領マニラという観点から諸事象を明らかにするという分析視角において、「マニラ公正証書原簿」の史料的価値を検討する視点を得た。本年度の現地調査としては、校務の関係もあり当初の計画より短期間となったが、2010年11月29日-12月12日の日程でフィリピンに渡航し、フィリピン国立文書館において「マニラ公正証書原簿」の調査を行った。18世紀末葉から19世紀初頭の公証人の一部について、昨年度と同様に、保存状態に応じて筆写、電子複写およびデジタルカメラによる撮影によって収集したので、これらの整理・分析作業を継続的に進める予定である。これらの作業によって得られた知見を踏まえて、先行研究および関連のスペイン文書の分析を合わせた検討を行い、その研究成果の一部として「スペイン領マニラにおけるコスモポリタン性と『他者』」を著して、マニラ公正証書原簿にみえる具体的事例を紹介するとともに、これがスペイン領マニラにおける「他者」活動を担保する機能をもっていたことを指摘し、フィリピン社会の変動期の諸相の一端を示した。本研究計画は5年計画で、本年度はその第3年度であった。昨年度に引き続いて、先行研究の検討を継続し、また昨年度の調査で新たに収集した「マニラ公正証書原簿」を含めて、これまでに入手した資・史料の整理・分析作業を行った。また、学内の共同研究プロジェクト「歴史と考古における資料学研究の方法」および「文化伝統の継承とアイデンティティ形成-記憶の場の比較研究-」に参加し、それらの活動をとおして、前者においては「マニラ公正証書原簿」の分析手法について、アジア史における資料研究のあり方との比較の観点から、後者については、スペイン領フィリピン社会の変動期について「記憶の場」としてのスペイン領マニラという観点から諸事象を明らかにするという分析視角において「マニラ公正証書原簿」の史料的価値を検討する視点を得ている。本年度の現地調査としては、校務の関係もあり当初の計画より短期間となったが、2012年3月10-21日の日程でフィリピンに滞在し、フィリピン国立文書館において「マニラ公主証書原簿」および関連する史料の調査・収集を行った。

「原簿」については、18世紀末葉から19世紀初頭の公証人の一部にかかって、昨年度と同様に、保存状態に応じて筆写、電子複写およびデジタルカメラによる撮影によって収集したので、これらの整理・分析作業を継続的に進める予定である。これらの作業によって得られた知見を踏まえて、先行研究および関連のスペイン文書の分析を合わせた検討を行い、「スペイン領マニラにおけるコスモポリタン性と『他者』-19世紀初頭における植民地社会の諸相-」「スペイン領マニラにおける貿易の諸相-1803-04年のマニラ税関文書から-」等を著して、「マニラ公正証書原簿」にみえる具体的事例を紹介するとともに、その背景にある当時の対外貿易事情について検討し、フィリピン社会の変動劾の諸相の一端を示した。本年度は5年計画の最終年度であった。これまでのフィリピン国立文書館での史料調査によって収集した「マニラ公正証書原簿」の整理・分析作業を継続するとともに、調査・収集作業も継続した。フィリピン国立文書館での史料調査・収集作業は、2013年11月11-13日、11月29日-12月6日の日程で実施したが、この間、最新の図書等資料の収集も行った。さらに先行研究の検討や同時代の他の史料の分析と合わせて、スペイン領フィリピン社会の変動期について、当時の植民地社会に生きた人びとの具体的な諸相を明らかにする基礎作業を行った。これまでの研究蓄積について、2012年10月28-30日の日程でアメリカ・ミシガン州立大学で開催された「第9回国際フィリピン研究学会(ICOPHIL-9)」で報告したものに加筆・修正して『愛媛大学法文学部論集(人文学科編)』36号に掲載した。また2014年2月28日-3月1日に京都大学東南アジア研究所で開催された「フィリピン研究会議(PSCJ2014)」では、研究成果の一部として、スペイン領フィリピン社会の変動期の具体的な諸相の一端を明らかにする報告を行い、18世紀末葉から19世紀初葉のスペイン領フィリピン社会は、マニラを中心としてコスモポリタン化が進展し、様々な人びとの生活が重層・交錯する場であったことを具体的に示した。本年度は、5年計画の第4年度目であった。昨年度に引続いて、これまでに調査により収集した「マニラ公正証書原簿」の整理・分析作業を継続するとともに、先行研究の検討を行った。また、フィリピン共和国マニラ首都圏のアテネオ・デ・マニラ大学で2013年2月8-9日に開催された、歴史学研究の方法・史料・意義をめぐる国際会議(Historiography and Nation Since Pasyon and Revolution)に出席し、最新の学界の知見をえ、意見交換を行った。なお、本年度は、校務等の関係から、本科研費での現地文書館調査を行えなかったが、上記の会議後、引続き1週間の日程で、関連史料の調査・収集を行うことができた。また、本研究の成果の一部を、学内共同研究の成果と併せて「19世紀転換期におけるスペイン領マニアのコスモポリタン性」(「文化伝統の継承とアイデンティティ形成」研究プロジェクト報告書)として発表した。
遺伝子配列特異的組換え酵素の創製と感染細胞でのHIV失活への展開

本研究では亜鉛フィンガータンパク質融合型DNA組換え酵素を用いた標的遺伝子配列の切除反応について、反応効率の向上に向けた酵素デザインの検討を行った。ZFPモジュール数およびDNA結合親和性、もしくは酵素のリンカー長が反応効率に影響することが明らかになった。これらの知見に基づき、活性の高いDNA組換え酵素のデザインに応用することで様々な遺伝子関連疾患の治療への応用が期待される。HIVゲノム配列から45対程度の標的候補配列を選択し,それらの配列に対して特異的に結合する亜鉛フィンガータンパク質(ZFP)をデザインした。デザインしたZFPについてドメイン数46(認識するDNA配列: 12塩基18塩基対)のバリエーションを持たせて構築した(合計30種類のZFP)。これらのZFPはMBP融合体として大腸菌内で発現し,アフィニティー精製を行った』DNA結合親和性の評価には定量的ELISAを用い,ドメイン数が5および6のZFPについて結合親和性として10nM400nMという値を得た。この値は,標的配列に対して特異的に結合するために十分な結合親和性であると考えられる。これらのZFPをDNA組換え酵素のDNA結合ドメインとして用いるために,Tn3を基にして作成された活性が確認されているDNA組換え酵素のドメインとの融合体を構築した。第1段階として,標的配列をGFP遺伝子の両端に置いたモデル配列をもつプラスミド遺伝子を作製し,それに対する組換え反応について検討した。結果として, 50%程度の反応効率を示すことが明かになった。次に,用いた酵素ドメインの遺伝子配列をランダム化してベクター上での組換え反応効率をPCRで確認した結果,アミノ酸の配列による酵素活性への影響の一端が明かになった。また,酵素ドメインが働く部分のDNA配列(スペーサー配列)の長さについても検討を行い,今後の組換え酵素のデザインに有用な知見を得ることができた。このように標的とするDNA配列に対して特異的に反応する酵素(プログラム可能な酵素)は近い将来の実用化を見据えた場合に現存する医薬品(合成化合物,抗体医薬など)とは一線を画した長所を有しているため,それらとの併用,もしくは単独での使用でこれまでにない成果を挙げる可能性があると考えられる。DNA組換え酵素のDNA結合ドメインを亜鉛フィンガータンパク質に変換することで配列特異性を有する組換え酵素を構築する。これにより任意のゲノム配列に対して機能する、つまり組換え反応により特定の遺伝子部位をノックアウトすることが可能になる。本年度においてはDNA結合親和性、および酵素ドメインとDNA結合ドメインをつなぐリンカー配列の長さが組換え反応効率に与える影響について検討した。反応の系としてはプラスミドDNA上に組み換え酵素遺伝子とスペーサー配列をもつ標的配列を置き、大腸菌内に導入した。組換え反応によってプラスミドの長さが変化するため、ゲル電気泳動によって定量的に評価できた。結果として、フィンガードメインの数が増加し、DNA結合親和性が増大するほど反応効率が向上し、リンカー配列については長くなるほど反応効率が低下することが明らかになった。組換え効率は最大で60%程度であった。次に哺乳類細胞内における反応効率についても検討を行った。標的配列はスペーサーとしてCMVプロモーターおよびEGFP遺伝子を有する配列を用いてゲノムに安定的に導入した細胞株(CHO-K1細胞)を樹立した。この細胞では組換え反応によってEGFPの蛍光が消失すると考えられた。導入する組換え酵素遺伝子をコードするプラスミドはIRES配列を介してDsRedを発現するようにし、プラスミドの細胞内導入効率も評価した。プラスミドの導入効率、および組換え反応効率の評価はそれぞれDsRed、EGFPの蛍光をフローサイトメトリーで評価した。遺伝子導入後、48時間後に組換え反応効率を評価した。結果として、プラスミド導入細胞において組換え効率はおよそ5%程度であることが明らかになった。また、細胞内における組換え反応効率は大腸菌内と同様にDNA結合親和性に依存するが、結合親和性が最大のものでは逆に組換え反応効率が低下するという結果が得られた。