hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性心不全に対する新たな治療戦略ーPDE3A過剰発現マウスによる検討ー

PDE3Aが、虚血再灌流障害による心筋梗塞領域を縮小し、アンジオテンシンII負荷による心リモデリングを抑制することを、PDE3A過剰発現マウスモデルも用いて証明した。本研究は、Phosphodiesterase 3A (PDE3A)が持つ心保護作用をin vivoのモデルを用いて検討した。マウスにアンジオテンシンII持続負荷を行ったところ、野生型マウスにおいては、心肥大および心筋線維化の発生を認めたが、心臓特異的PDE3A過剰発現マウスにおいては、心肥大および心筋線維化ともに野生型マウスと比較し抑制されていることが確認された。アンジオテンシンII刺激では、一般的にTGFbの活性が上昇することが知られているが、PDE3A過剰発現マウスにおいては、心臓におけるTGFbの発現が低下していることが確認され、アンジオテンシンII負荷後に野生型マウスではTGFbの発現が上昇したが、PDE3A過剰発現マウスでは、TGFb発現上昇は認めなかった。このため、TGFbの発現抑制が心肥大、心筋線維化を抑制している機序の一つと考えられた。今後はsmad, TAK1等、TGFbの下流に位置すると考えられる分子の活性を検討して行く予定である。不全心筋においては、PDE3の発現は低下しており、そのため更なるcAMPの上昇から心筋細胞死が誘発され、心機能がスパイラルに低下していく機序が報告されている。今回の結果は、PDE3Aの発現を維持することが、心ストレス下においても心筋リモデリングを抑制し、心不全患者の予後を改善させるという新たな治療戦略の基礎研究になるものと考えられた。また、血小板から可溶性Amyloid precursor protein 770 (sAPP770)が分泌されることが知られており、血小板機能にはPDE3Aが関与している。我々はラット心筋梗塞モデルでsAPP770が上昇することを確認した。今後血小板機能と合わせ、PDE3AとsAPP770の関連も検討していく予定である。研究に使用する心臓特異的PDE3過剰発現マウスを共同研究者であるロチェスター大学Chen Yan氏から譲渡を受け交配を行った。PDE3過剰発現マウスに虚血再還流障害を作成したところ、予想通り心筋梗塞サイズが抑制されることを確認し、その後の心臓リモデリングも抑制されることを確認した。梗塞領域においては、抗アポトーシスタンパクであるBCL-2の発現維持、アポトーシス促進に働くICERの発現抑制をPDE3マウスで認めており、PDE3による抗アポトーシス効果が心筋梗塞サイズ抑制の機序と考えられた。またPDE3過剰発現マウスでは心拡大、心機能抑制を認めるものの心不全徴候はなく、自然予後も野生型マウスと差を認めなかった。これらの成果を2011年アメリカ心臓病学会で報告した。またChen Yan氏と今後の研究について討議を行った。また、アンジオテンシン持続負荷心不全モデルの作成も行った。アンジオテンシンIIによる心機能障害の程度は野生型と差を認めなかったが、興味深いことにPDE3マウスにおいては、アンジオテンシンIIによる心肥大、心筋繊維化が著明に抑制されていることを確認した。また、アンジオテンシンの急性投与において心拍数上昇がPDE3マウスでは抑制されていることを確認した。このことは、cAMP-PDE3-PKA系とアンジオテンシン系のクロストークの存在を示唆しており、興味深い所見と考えられた。PDE3マウスにおいて、虚血再還流障害を抑制することを確認し、その機序を明らかにすることができた。また、アンジオテンシン負荷モデルにおいても心肥大・心筋繊維化を抑制することを確認することができた。それらのモデルにおいても心機能評価および組織学的検索は終了しており、おおむね目的を達成できていると思われる。アンジオテンシンIIによる心筋障害がPDE3過剰発現マウスにおいて抑制される機序を解明するため、cAMP-PDE3-PKA系とアンジオテンシン-TGFβ系のクロストークを中心に分子機序を検討していく。ウエスタンブロッティングおよびリアルタイムPCRによる検討、免疫組織学的検討を行っていく。心不全モデルマウス作成のための飼育費、手術費用。ウエスタンブロッティング、免疫組織染色に使用する抗体やPCRに使用するプライマーの作成費用。単離心筋細胞を用いた興奮収縮連関検討のための各種薬剤の使用費用。学会発表のための旅費および論文作成に伴う諸経費の申請を行う予定である。
確率的組合せ論のＸ符号及び類似の離散構造への応用

本研究では,数学の一分野である確率的手法を用いて,X符号をはじめとする種々の組合せ構造の存在性や性質について理論的に明らかにすることを目的としている。X符号とは元来,製造された大規模集積回路が設計通りに製造されているかを確認するためのテスト工程の容易化に用いられる情報圧縮回路を数学的に行列の形で抽象化したものであるが,実用上の要請から,この行列の列重みは一定であることが望ましい。したがって,本年度はその中でも基本的な列重みが3で一定であるX符号に焦点を当て,X符号によってどこまで情報圧縮可能であるか,つまり,X符号の圧縮比はどこまで大きくなれるのかという理論上重要かつ解決必至の問題を考究した。本年度の研究成果のうち,特に重要なものと目されるものは,誤り訂正符号理論へのX符号の応用可能性の発見である。一般に,情報の誤りを訂正するための最も基本的な技術の一つである線形符号では,誤りを訂正する際にパリティ検査行列と呼ばれる特殊な行列を用いる。典型的な誤りの例であるビット反転だけを考える場合にはこれで十分であるが,データが読めなくなるといった消失誤りも同時に起こりうる場合には,separating行列と呼ばれる特殊なパリティ検査行列を用いることが提案されている。本研究では,separating行列とX符号の数学的構造上の類似性を指摘し,separating行列と同様,X符号でも効率的の二種類の誤りを訂正できることを示した。なお,この研究成果は国際論文誌IEEE Transactions on Information Theoryに掲載された。列重みが3で一定であるX符号の圧縮比については,特定のパラメータにおける限界式や特別な場合の限界式は知られていたが,そういった特殊な場合以外の理論研究はその重要さにも関わらず,ほとんどなされていなかった。本研究では,列重みが3で一定であるX符号の圧縮比の必要条件を,グラフ除去補題と呼ばれる極値集合論においてよく知られた補題を用いることで導出することに成功した。また,確率的手法を用いて列重みが3で一定であるX符号の存在性を示し,圧縮比の限界式を導出した。さらに,その限界式を達成するX符号を多項式時間で構成する効率の良いアルゴリズムを考案した。また,研究実績の概要で述べたように,X符号は元来,情報圧縮回路を数学的に抽象化した行列であるが,本年度の研究において,X符号の新たな応用可能性が発見された。具体的には,誤り訂正符号理論において,X符号と数学的によく似た組合せ構造であるseparating行列という特殊な行列を用いることで典型的な誤りであるビット反転とデータが読めなくなるといった消失誤りの二種類の誤りを同時に訂正できることが知られているが,separating行列の代わりにX符号を用いて,従来と同様に二種類の誤りを訂正できることが判明した。当初の予定では,列重みに何の制限の無いX符号についての既知の限界式を改良する予定であったが,期せずして,より実用的な条件を満たすX符号に対する限界式ならびに構成法の導出にいたっており,概ね順調に研究が進展していると思われる。前述の通り,本年度の研究において,X符号を用いることでビット反転と消失誤りの二種類の誤りを効率的に訂正可能であることを示した。ここで重要な事実は,従来手法で二種類の誤り訂正の際に用いるseparating行列と比べるとX符号はシンプルな構造をしており,separating行列が一般に構成するのが難しい一方で,X符号は比較的簡単に構成できる点である。つまり,X符号の誤り訂正符号理論への応用可能性の発見は,ビット反転と消失誤りの二種類の誤りの効率的な訂正方法の実用可能性を広げ得る意義深いものである。したがって今後は,X符号がseparating行列と比べてどれだけシンプルな構造なのか追求すべく,それぞれの特徴を明らかにしていくと共に,X符号とseparating行列との差分を上手く活かしたビット反転と消失誤りの訂正法などについて考究するのが望ましいと考える。これと並行して,本年度に引き続き,情報圧縮技術としてのX符号の特徴も理論的に明らかにしていき,これらの研究の中で,確率的組合せ論の他の組合せ構造への応用可能性も随時検討していく予定である。

なお,この研究成果は国際論文誌IEEE Transactions on Information Theoryに掲載された。列重みが3で一定であるX符号の圧縮比については,特定のパラメータにおける限界式や特別な場合の限界式は知られていたが,そういった特殊な場合以外の理論研究はその重要さにも関わらず,ほとんどなされていなかった。本研究では,列重みが3で一定であるX符号の圧縮比の必要条件を,グラフ除去補題と呼ばれる極値集合論においてよく知られた補題を用いることで導出することに成功した。また,確率的手法を用いて列重みが3で一定であるX符号の存在性を示し,圧縮比の限界式を導出した。さらに,その限界式を達成するX符号を多項式時間で構成する効率の良いアルゴリズムを考案した。また,研究実績の概要で述べたように,X符号は元来,情報圧縮回路を数学的に抽象化した行列であるが,本年度の研究において,X符号の新たな応用可能性が発見された。具体的には,誤り訂正符号理論において,X符号と数学的によく似た組合せ構造であるseparating行列という特殊な行列を用いることで典型的な誤りであるビット反転とデータが読めなくなるといった消失誤りの二種類の誤りを同時に訂正できることが知られているが,separating行列の代わりにX符号を用いて,従来と同様に二種類の誤りを訂正できることが判明した。当初の予定では,列重みに何の制限の無いX符号についての既知の限界式を改良する予定であったが,期せずして,より実用的な条件を満たすX符号に対する限界式ならびに構成法の導出にいたっており,概ね順調に研究が進展していると思われる。前述の通り,本年度の研究において,X符号を用いることでビット反転と消失誤りの二種類の誤りを効率的に訂正可能であることを示した。ここで重要な事実は,従来手法で二種類の誤り訂正の際に用いるseparating行列と比べるとX符号はシンプルな構造をしており,separating行列が一般に構成するのが難しい一方で,X符号は比較的簡単に構成できる点である。つまり,X符号の誤り訂正符号理論への応用可能性の発見は,ビット反転と消失誤りの二種類の誤りの効率的な訂正方法の実用可能性を広げ得る意義深いものである。したがって今後は,X符号がseparating行列と比べてどれだけシンプルな構造なのか追求すべく,それぞれの特徴を明らかにしていくと共に,X符号とseparating行列との差分を上手く活かしたビット反転と消失誤りの訂正法などについて考究するのが望ましいと考える。これと並行して,本年度に引き続き,情報圧縮技術としてのX符号の特徴も理論的に明らかにしていき,これらの研究の中で,確率的組合せ論の他の組合せ構造への応用可能性も随時検討していく予定である。
ストレッチングがもたらす血管機能改善効果の解明と新しい動脈硬化予防法の開発

ストレッチングが伸長部位の血液循環,血管拡張能,および動脈伸展性に及ぼす急性効果を検討するとともに,一過性のストレッチングが糖負荷後の血糖値を降下させるかどうか検討した.その結果,反復回数が少ないストレッチング条件でも伸長部位の筋酸素飽和度が上昇し,血液循環が亢進することが示された.ストレッチングによって伸長部位の血管拡張能の向上が認められた一方,動脈伸展性(脈波伝播速度)は増大しなかった.また,糖負荷後にストレッチングを行うことで血糖値が降下を示し,さらに,食後高血糖が是正される症例が認められ,ストレッチングが高血糖に伴う動脈硬化症の発症予防に有効な運動療法になり得るものと考えられた.静的ストレッチングが伸長部位の動脈伸展性(脈波伝播速度)に及ぼす急性効果の解明に取り組んだ.健常成人男性9名(非喫煙者,運動習慣無し)を対象にして,一過性の静的ストレッチングが伸長部位の脈波伝播速度(Pulse Wave Velocity;PWV)を増大させるかどうか,片脚に対するストレッチング実施後の動脈伸展性の変化を対照脚と比較した.動脈伸展性は下肢(大腿動脈-足関節)の脈波伝播速度(femoral-ankle PWV;faPWV)と上腕-足関節間脈波伝播速度(brachial-ankle PWV;baPWV)から評価した.静的ストレッチングは,片脚(右脚)の大腿部と下腿部について合計15種目を伸長時間30秒(間隔20秒),反復回数2回の条件で実施した.PWVの計測は安静時,ストレッチング10分後,30分後,60分後に行った.ストレッチングを実施せずに安静を保持するコントロール条件を設けた.実験の結果,静的ストレッチング後のfaPWVおよびbaPWVは安静条件と比較して有意な変化がなかった.本研究の結果から,健常成人男性における一過性の静的ストレッチングには動脈伸展性を増大させる急性の効果を認めなかった.さらに,静的ストレッチングの反復回数の違いが伸長部位の筋組織酸素飽和度に及ぼす影響について検討した.その結果,30秒1回の静的ストレッチングでも伸長部位の筋血流を上昇させ筋酸素飽和度が有意に上昇することを明らかにし,血液循環亢進のための静的ストレッチングの処方条件の一部を提示することができた.ストレッチングが伸長部位の血液循環,血管拡張能,および動脈伸展性に及ぼす急性効果を検討するとともに,一過性のストレッチングが糖負荷後の血糖値を降下させるかどうか検討した.その結果,反復回数が少ないストレッチング条件でも伸長部位の筋酸素飽和度が上昇し,血液循環が亢進することが示された.ストレッチングによって伸長部位の血管拡張能の向上が認められた一方,動脈伸展性(脈波伝播速度)は増大しなかった.また,糖負荷後にストレッチングを行うことで血糖値が降下を示し,さらに,食後高血糖が是正される症例が認められ,ストレッチングが高血糖に伴う動脈硬化症の発症予防に有効な運動療法になり得るものと考えられた.伸長部位の血管機能に対する一過性の静的ストレッチングの急性効果の解明に取組んだ.まず,一過性の静的ストレッチングが伸長部位局所の血管拡張機能に与える効果について検討した.健常成人男性10名を対象として,手関節の受動的伸展による静的ストレッチングを実施した.伸長時間30秒,反復回数4回(30秒間隔で実施)とし,静的ストレッチングの強度は最大伸展角度とした.血管拡張機能の評価は,上腕部をカフにて5分間の動脈血流遮断を行い,反応性充血後における前腕屈筋群の組織酸素飽和度(StO2)の回復時間(ハーフタイム)から評価した.計測は安静時,静的ストレッチング終了30分後に行った.静的ストレッチング30分後のStO2ハーフタイム(10.5±3.9秒)は安静時(13.6±3.4秒)と比較して有意に短縮した(p<0.05).一方,静的ストレッチングにより伸長していない前腕伸筋群(主に尺側手根屈筋)のStO2ハーフタイムには有意な変化がなかった.本研究における静的ストレッチングによる反応性充血後のStO2ハーフタイム短縮は,伸長部位局所の血管拡張反応が亢進したことに起因するものと推察され,このことから,静的ストレッチングは伸長部位局所の血管拡張機能を向上させる急性効果がある可能性が示唆された.しかしながら,反応性充血後のStO2ハーフタイムの生理学的意義についてはさらなる検討を行っていく.また,静的ストレッチング(30秒×3回反復)が伸長部位の筋血流を上昇させ,筋組織の酸素飽和度を有意に増加させることを明らかにし,学会報告を行った.さらに,下肢の静的ストレッチングの実施手法について検討し,下肢のセルフストレッチングのプログラムを精選した.これにより次年度に計画している片脚に対する静的ストレッチング実施後の動脈伸展性の変化についての検証を円滑に進行できると思われる.これまでに静的ストレッチングが伸長部位局所の血管拡張機能を向上させる急性の効果があることを報告し,さらに血液循環の亢進に効果的な静的ストレッチングの処方条件を明らかにしてきた.食後高血糖の状態が長期間継続すると,血管内皮機能障害を引き起こし動脈硬化の発症に寄与することが報告されている.

こうしたことから最終年度は,静的ストレッチングがもたらす血糖値低下作用の解明と食後高血糖に対するストレッチングの効果を検証した.健常成人女性8名を対象に,一過性のストレッチングが糖負荷後の血糖値低下作用を有するかどうか,糖負荷後に受動的な静的ストレッチングを実施して,その際の血糖値の変化を座位保持の対照条件と比較した.経口ブドウ糖負荷試験の30分経過後からストレッチングを30分実施する条件と座位安静を保持する条件の2条件で順序無作為に実施した.その結果,ストレッチング条件では,30分の血糖値と比較して60,90,120分の血糖値が有意に低値を示したのに対し,安静保持条件では,30分と60分の血糖値との間に有意な差がなく,30分の血糖値と比較して90分,120分の血糖値が有意に低値を示した.糖負荷30分後から60分までの血糖値降下量は,SST条件が安静保持条件よりも有意に高値を示した.食後高血糖を示した1名の症例において糖負荷後にストレッチングを行うことで,食後高血糖の改善の急性効果が認められた.これらのことから,ストレッチングには血糖値の上昇を抑制させる作用があることが示唆された.したがって,本研究成果は,高血糖に伴う動脈硬化症の発症予防にストレッチングが有効であることを示唆するものと考えられた.ストレッチングは,運動強度が低く,関節への負担が少ない安全性の高い運動であり,低体力者,高齢者でも実施できることから,本研究成果の応用が可能な対象者の範囲は広いと考える.運動生理学当初計画の静的ストレッチングが伸長部位の動脈伸展性(脈波伝播速度)に与える一過性の影響について,順調に実験計画を遂行し,結果をまとめることができている.また,静的ストレッチングの反復回数の違いが伸長部位の血液循環に及ぼす影響について検討を行い,血液循環の亢進に有効な静的ストレッチングの処方条件を提示することができ,研究計画はおおむね順調に進展している.当初計画の一過性の静的ストレッチングが伸長部位局所の血管拡張機能に与える効果については,順調に実験計画が進み,実験結果をまとめることができている.また,一過性の静的ストレッチングが伸長部位の動脈伸展性(脈波伝播速度)を増大させるかどうかについては,予備的実験が順調に進んでおり,平成25年度中に実験結果をまとめることができる.このようにおおむね研究計画は順調に進展している.これまでの血管機能に対する静的ストレッチングの急性効果および血液循環の亢進に効果的な静的ストレッチングの処方条件の探索に関する研究成果を基にして,本年度は,血管機能に対する運動療法としての静的ストレッチングの有効性を検証するとともに,静的ストレッチングがもたらす血糖値低下作用と動脈硬化症予防効果の解明に取り組む.まず,静的ストレッチングのトレーニングが伸長部位の脚の血管機能を改善させるかどうかについて検討する.片脚に対するストレッチングのトレーニングが対照脚と比較して,伸長した脚の動脈伸展性を増大させるかそうか調べる.次に,食後の静的ストレッチングの実施が食後高血糖を改善させるかどうかについて検証を進めていく.糖負荷後に受動的ストレッチングを実施して,その際の血糖値の変化を座位保持の対照条件と比較する.ストレッチング条件では糖負荷試験後にパートナーによる受動的な静的ストレッチングを実施する.
「癌細胞のクロライドシフト」による細胞接着能変化を介した癌転移メカニズムの解明

前年度までの研究により、細胞内Cl-が細胞遊走能の制御に関わっているcSrcの活性化に影響することが明らかになった。cSrcは自己リン酸化部位であるpY416のリン酸化によって活性化されることが知られているが、細胞内Cl-が低下すると、pY416のリン酸化レベルは有意に減少していた。また、cSrcの細胞増殖に対するシグナルカスケードの下流分子であるSTAT-3のリン酸化は有意に減少していた。従って、細胞内Cl-はcSrcの活性を制御し、Srcシグナルカスケードを介して細胞増殖、細胞接着や細胞運動に影響を与えている可能性が強く示唆された。平成30年度は、前年度までの結果をふまえ「癌細胞のクロライドシフト」形成に必須と考えられるイオン輸送体であるanion exchanger(AE)と細胞内の重炭酸イオン(HCO3-)濃度の維持に必要な酵素である炭酸脱水酵素(CA)の役割について明らかにすることを目標とした。そこで、AE(I)とCA(IIII)をコードする遺伝子配列にCRISPR-CAS9法を用いて変異を加え、それらが機能しない変異HT-29細胞の作製を目指した。また、二酸化炭素分圧(pCO2)が細胞内Cl-に与える影響について検討を行うため、クリーンベンチとCO2インキュベーターを新規購入し、5%CO2分圧以外の新たな実験環境を構築することが可能となった。また、細胞の代謝活性を亢進させることで、細胞内のCO2発生量を上昇させた際に細胞内Cl-濃度が変化するか確認するという新たな評価方法についての検討も行った。本研究では、原発巣と転移巣における癌細胞の細胞外環境変化が細胞内Cl-濃度変化(癌細胞のクロライドシフト)させることで細胞の接着能や運動能が変化し、一連の癌転移が起こるという仮説の検証を行う。これらの結果から、「癌細胞のクロライドシフト」が癌転移の分子メカニズムである可能性を検討する。平成28年度は、pCO2変化が癌細胞の細胞内Cl-濃度へ与える影響、細胞内Cl-濃度変化が癌細胞の細胞接着因子発現、細胞接着能にあたえる影響について検討した。pCO2変化時の細胞内Cl-濃度に与える影響については、pCO2変化時の細胞内Cl-濃度測定系の確立を目指した。細胞内Cl-濃度変化が、癌細胞が転移する際に発現が変化すると報告されている細胞間や細胞-細胞外マトリクス間の接着に関わる各細胞接着因子(E-cadherin、N-cadherin、EpCAM、Integrins等)の発現に与える影響について検討を行った。細胞内Cl-濃度を低下させたところ、上皮細胞の細胞外マトリクスへの接着に関わっているE-cadherinやIntegrinα2、Integrinβ1といった細胞接着分子の発現が有意に低下した。また、細胞接着だけでなく癌細胞の増殖シグナル伝達にも関わっているEpCAMは、発現量の変化は認められなかったが、増殖を亢進する活性化(断片化)が低Cl-濃度環境下では認められなくなった。細胞の細胞外マトリクスへの接着能については、コラーゲン(type4)をコーティングしたマルチウェルプレートに対する細胞接着能の評価を行った。その結果、低Cl-濃度環境下では、コラーゲンコーティングしたプレートへの接着能が有意に低下することが明らかになった。以上の結果から、細胞内Cl-濃度変化は細胞接着分子の発現や活性化を介し細胞接着能に影響を与える可能性が示唆された。pCO2変化による影響について安定した測定系の確立に苦慮している。現在使用しているCl-濃度測定系では、細胞内Cl-濃度測定時にサンプルを一定のCO2環境下に安定させために必要な時間が測定群間でばらついてしまうため、測定結果が安定しないと考えられる。一方、細胞内Cl-濃度が細胞接着因子や細胞外マトリクスへの接着能に与える影響についての検討は安定した結果が得られており、順調に推移しているといえる。平成29年度は、細胞内Cl-濃度変化が癌細胞の運動および浸潤能に与える影響について検討を行った。また、癌細胞において細胞接着能や運動能を制御していると考えられているSrcシグナル伝達経路への影響についても検討を行った。また、前年度代謝活性の亢進によるpCO2変化が細胞内Cl-濃度に与える影響について安定した結果を得ることが難しかったため、新たな評価法についても検討を行った。まずヒト大腸癌由来細胞株HT-29細胞を用いて、細胞内Cl-濃度を変化させた際の細胞遊走に与える影響をwound-healing assayにより検討した。細胞内Cl-を低Cl-培地中で強制的に低下させると、wound-healing処理後の細胞遊走能が有意に低下した。次に、細胞遊走能の制御に関わってるcSrcの活性化に与える影響について検討を行った。cSrcは自己リン酸化部位であるpY416のリン酸化によって活性化されることが知られており、細胞内Cl-がpY416のリン酸化レベルに与える影響について検討を行った。細胞内Cl-が低下すると、pY416のリン酸化レベルは有意に減少していた。一方、cSrcの細胞増殖に対するシグナルカスケードの下流分子であるERKとSTAT-3についても検討を行った。ERKのリン酸化は細胞内Cl-濃度が減少しても変化しなかった。しかし、cSrcの下流分子で細胞増殖に関与するSTAT-3のリン酸化は有意に減少していた。従って、細胞内Cl-はSrcキナーゼの活性を制御し、Srcシグナルカスケードを介して細胞増殖や細胞接着に影響を与えている可能性が強く示唆された。

以上の結果から、細胞内Cl-は細胞増殖や細胞接着など癌細胞の生理的機能に対する重要な制御因子の一つであることが示された。本年度は、細胞内Cl-濃度変化が癌細胞の運動および浸潤能に与える影響および細胞接着能や運動能を制御していると考えられているSrcシグナル伝達経路への影響についても検討を行い、概ね当初の予定通りに研究を進めることが出来た。一方、前年度からの継続事項であったpCO2が細胞内Cl-に与える影響については継続して検討を行っている。また、細胞の代謝活性を亢進させ、細胞内のCO2発生量を上昇させた際に細胞内Cl-濃度が変化するか確認するという新たな評価方法についての立案を行い、来年度に向けてその実施を目指す。前年度までの研究により、細胞内Cl-が細胞遊走能の制御に関わっているcSrcの活性化に影響することが明らかになった。cSrcは自己リン酸化部位であるpY416のリン酸化によって活性化されることが知られているが、細胞内Cl-が低下すると、pY416のリン酸化レベルは有意に減少していた。また、cSrcの細胞増殖に対するシグナルカスケードの下流分子であるSTAT-3のリン酸化は有意に減少していた。従って、細胞内Cl-はcSrcの活性を制御し、Srcシグナルカスケードを介して細胞増殖、細胞接着や細胞運動に影響を与えている可能性が強く示唆された。平成30年度は、前年度までの結果をふまえ「癌細胞のクロライドシフト」形成に必須と考えられるイオン輸送体であるanion exchanger(AE)と細胞内の重炭酸イオン(HCO3-)濃度の維持に必要な酵素である炭酸脱水酵素(CA)の役割について明らかにすることを目標とした。そこで、AE(I)とCA(IIII)をコードする遺伝子配列にCRISPR-CAS9法を用いて変異を加え、それらが機能しない変異HT-29細胞の作製を目指した。また、二酸化炭素分圧(pCO2)が細胞内Cl-に与える影響について検討を行うため、クリーンベンチとCO2インキュベーターを新規購入し、5%CO2分圧以外の新たな実験環境を構築することが可能となった。また、細胞の代謝活性を亢進させることで、細胞内のCO2発生量を上昇させた際に細胞内Cl-濃度が変化するか確認するという新たな評価方法についての検討も行った。今後は、pCO2変化時の細胞内Cl-濃度に与える影響の解明を目指し、Cl-濃度測定系の確立を目指す。測定環境のCO2濃度を安定させるために必要な時間のばらつきをなくすため、ガス混合装置の設定見直しや細胞培養dishなどの条件設定を再度見直し、安定した測定結果が得られるよう改良を行う。また、現在行っている蛍光顕微鏡を用いる方法に加え、短時間に多数の細胞内Cl-濃度を測定可能なCell Lab Quantaを用いた測定系の確立も平行して行い、pCO2が細胞内Cl-濃度に与える影響について検討を行う。また当初の予定通り、平成29年度では、細胞内Cl-濃度変化が細胞の運動および浸潤能に与える影響について検討する。また、癌細胞において細胞接着能や細胞運動能を制御していると考えられているSrcシグナル伝達経路への影響についても検討を行う。
ガロア・タイヒミュラー被覆塔をめぐるモジュライ空間と数論

数論と代数幾何学の交錯する豊かな理論が期待されている分野として,遠アーベル幾何学を推進し,とりわけ代数曲線とそのモジュライ空間から生じる数論的基本群の系列がなすガロア・タイヒミュラー被覆塔について国際研究交流を推進した.特に2010年の10月に京都大学数理解析研究所で第3回日本数学会季期研究所を開催し,その研究成果を論文集「Galois-Teichmueller theory and Arithmetic Geometry」として出版した.また無限遠を除いた楕円曲線の数論的基本群から生じるモノドロミー表現について研究を進め論文発表を行った.数論と代数幾何学の交錯する豊かな理論が期待されている分野として,遠アーベル幾何学を推進し,とりわけ代数曲線とそのモジュライ空間から生じる数論的基本群の系列がなすガロア・タイヒミュラー被覆塔について国際研究交流を推進した.特に2010年の10月に京都大学数理解析研究所で第3回日本数学会季期研究所を開催し,その研究成果を論文集「Galois-Teichmueller theory and Arithmetic Geometry」として出版した.また無限遠を除いた楕円曲線の数論的基本群から生じるモノドロミー表現について研究を進め論文発表を行った.今年度は,ケンブリッジのニュートン数理科学研究所のプロジェクト研究"Npn-Abelian Fundamental Groups in Arithmetic Geometry"に参加し,研究打合せや情報収集するとともに,長年の懸案であった楕円曲線マイナス1点の基本群に生じるガロア表現(ないしモノドロミー表現)に対して,射影直線マイナス3点の基本群における伊原級数(普遍ヤコビ和級数)の類似を構成する問題に一定の結論をまとめることに成功した.この問題の萌芽は1984年のS. Blochの示唆(Deligneへの手紙)に発祥し,これを継承した1990年代前半の角皆宏・筆者の研究(いずれも1995年に発表)を発展させることにあり,今回のポイントは,これまで楕円曲線の定義体に無限個の等分点の座標を添加した体の上でしか定義できなかった級数表現を,楕円曲線の定義体そのものの上に降下する自然な関数の系列を導入し定量的にアプローチする手段を確立した点にあり,とりわけこれらの明示公式を1995年の筆者の論文の公式を精密化する形で拡張できた点にある.このことから複素普遍楕円曲線のモノドロミー表現に適用することで,一般デデキント和との関連も明らかにすることが出来た.以上の成果は,"On arithmetic monodromy representations of Eisenstein type in fundamental groups of once punctured elliptic curves"というプレプリントにまとめ,京都大学数理解析研究所のPreprint Series (RIMS-1691)として発表した.またケンブリッジでは,とりわけF. Pop, L. Schnepsと綿密な打合せをして,京都大学の玉川安騎男氏・星裕一郎氏とともに企画する2010年10月に予定している研究集会および合宿型セミナーのための準備を進めることが出来た.また年度末には,研究分担者の角皆氏と岡山大学において研究打合せを実施し,筆者と角皆氏と安田正大氏との遠アーベル幾何に関する共同研究において重要な役割を果たしたカルダノ・フェラーリ写像の一般化に向けた情報収集について報告していただいた.1980年代初頭にA.Grothendieckは研究プログラムの概要として,ガロア群と代数曲線やそのモジュライ空間の数論的基本群に現れるディオファントス的な性質の緊密な相互関係を研究することを提唱した.1990年代以来のわが国の研究者による重要な研究に続き,今世紀に入ってからも新しく開発された遠アーベル的な手法により基本的な予想の解決も含め多くの成果が挙がっているが,一方で,未解決の予想や新たな問題をめぐり国際的に活発に研究されており,全貌を総括する機会が望まれていた.このような背景の中,日本が指導的存在である遠アーベル予想とグロタンディーク・タイヒミュラー理論に関する国際研究集会として,日本数学会は「第三回日本数学会季期研究所」に,研究代表者の提案を採用したため,今年度の前半は10月に連続して主催した2つの研究集会-京都大学数理解析研究所合宿型セミナー「Galois-Theoretic Arithmetic Geometry」(October 19-24,2010)および第3回日本数学会季期研究所「Development of Galois-Teichmuller theory and Anabelian Geometry」(October25-30,2010)-の成功に向けて準備に主力を傾注した.その甲斐もあり,多くの海外からの来訪者と国内からの研究者を若手からベテランまでの幅広い世代から参加していただくことが出来て,学術的に意義深い国際交流が実現できた.後半は,研究集会で得た多くの情報の分析と報告集の編集のための下準備を行った.また代数計算ソフトを利用して,写像類群の次数加群に現れるシンプレティック群と対称群の表現分解について以前の結果を更新する作業を行った.前年度に引き続き,1進polylogの関数等式の精密化や楕円曲線マイナス1点の基本群から生じるEisenstein型不変量の振る舞いの性質の研究を進めた昨年度に引き続き,数論的基本群をめぐる様々な不変量記述の精密化を進めた.楕円曲線マイナス1点の基本群から生じるアイゼンシュタイン型不変量については,合同周期性というべき性質として値の合同類を与える法にレベルを乗じた平方周期性が存在することを証明する論文を"Some congruence properties of Eisensteininvariants associated to

elliptic curves"のタイトルでまとめた.写像類群のモノドロミー像の余核に関しては,上智大学の角皆宏氏と京都大学の高尾尚武氏と共同研究を進め,引き続き継続している.この中で森田トレースの安定性についての結果を得た.また種数0の場合のモノドロミー像の対称群作用での表現を,計算代数システムを用いて計算するアルゴリズムを確立し,高次数まで計算を進めた.この過程で対称群の表現については,様々な局面で一般にヤング図形の第2腕以下の形についての安定性が存在することが確かめられた.ニース大学のWojtkowiak氏とは,エル進ポリログ関数の関数等式について共同研究を進めるとともに,対数的エル進アソシエーターの展開係数の様子について新たな問題意識を共有し,データの分析を進めた.以上の進展は,本課題が目指すガロア・タイヒミュラー塔から生じる深い数論性を取り出して制御する理論の裾野と展望をさらに広げる可能性がある.今年度は,このほか前年度に主催した二つの研究集会,京都大学数理解析研究所合宿型セミナー「Galois-Theoretic Arithmetic Geometry」(October19-24,2010)および第3回日本数学会季期研究所「Development of Galois-Teichmullertheory and Anabelian Geometry」(October25-30,2010)のプロシーディングス報告集の編集を開始し,おおむね順調に経緯している.今年度は,当該課題期間に投稿した論文On arithmetic monodromy representations of Eisenstein type in fundamental groups of once punctured elliptic curvesが出版され,成果発表に一区切りがついたともに,ここで確立した楕円曲線の不変量の幾何学的解釈や拡張・深化に向けた考察に取り組んだ.年度途中で岡山大学から大阪大学への研究拠点の移転を挟み,研究環境の空間的移動に時間を割かれる中で, 2次形式論との関連性に着目し,将来の方向性を模索する活動を開始した.そうした中で2次形式の整数論の研究で著名なジョンズホプキンス大学の小野孝名誉教授を迎え, 2013年12月21日から23日の日程で大阪大学中之島センターにて研究集会「Modular functions and Quadratic forms」を木田雅也氏(東京理科大学),森下昌紀氏(九州大学), Ken Ono氏(エモーリー大学),渡部隆夫氏(大阪大学)とともに企画開催し,斯界の若手から重鎮にいたる幅広い世代の研究者による講演発表のプログラムを実施した.
非浸潤性乳癌における性ホルモン作用の解明:内分泌療法の更なる向上をめざして

浸潤性乳癌(IDC)の前段階である非浸潤性乳癌(DCIS)の特性を理解するため、DCISのエストロゲン作用を検討した。その結果、(1)DCISのエストロゲン作用はIDCとは異なり、c-MYB、RbAp46、survivinなどの働きが重要であること、(2)アロマターゼ阻害剤投与後のDCIS組織ではエストロゲン濃度が著名に低下しており、92%のエストロゲン応答遺伝子の発現量、細胞増殖能が減少すること等を明らかにした。以上よりアロマターゼはDCISのエストロゲン合成に必須であり、その阻害が有効な治療法であると考えられた。本研究課題に関する、平成22年度の主な研究成果は以下の如くである。1.非浸潤性乳癌組織におけるエストロゲン受容(ER)及びエストロゲン応答遺伝子の解析非浸潤性乳管癌(pDCIS)20例及び浸潤癌成分(IDC-c)と乳管内癌成分(DCIS-c)をともに含むIDC20例を用いて免疫染色を行ったところ、エストロゲン受容体(ER)の発現頻度は3群とも大きな違いはみられなかったが、Ki67はpDCISで最も低かった。更にER陽性例(3群とも4例づつ)に対してマイクロアレイを施行した結果、pDCISは他群とは大きく異なるエストロゲン応答遺伝子の発現パターンを示した。従ってpDCISにおけるエストロゲン作用はDCIS-cやIDC-cとは異なっている可能性が示唆されるため、来年度はそのなかでも増殖や悪性度に関係すると思われる新規性の高いいくつかの遺伝子に関し、非浸潤性乳癌における発現意義を精査する予定である。2.ER陽性閉経後DCIS患者におけるアロマターゼ阻害剤の有効性の解析UMINCTR臨床試験登録(UMIN 000003101)を開始した。平成23年度末まで登録を行い、平成24年度に「非浸潤性乳癌組織における性ホルモン濃度の検討」、「非浸潤性乳癌における性ホルモン応答遺伝子の発現と内分泌療法に対する意義」に関する解析を行う予定である。3.ER陽性DCIS培養細胞株の作製ERを強制発現したDCIS細胞を作製中である。この細胞を用いて、来年度「非浸潤性乳癌細胞における性ホルモン応答遺伝子の発現意義」に関する解析を行う。本研究課題に関する、平成23年度の主な研究成果は以下の如くである。1.非浸潤性乳管癌(DCIS>におけるエストロゲン応答遺伝子の発現意義の解析昨年度行ったマイクロアレイ解析の結果をもとに、c-MYB,RbAp46,survivinという3つのエストロゲン応答遺伝子の発現を、DCIS53例及び浸潤性乳管癌(IDC)27例を用いて、免疫組織化学的に検討した。その結果、いずれもDCISにおいて有意に高発現しており、c-MYBはDCIS症例においてKi67と逆相関を示した。survivinは高齢者のDCISで高発現していた。昨年度の結果とあわせると、DCISにおけるエストロゲン作用はIDCとは異なっており、DCISにおいては、c-MYBの細胞増殖抑制作用、RbAp46によるエストロゲン作用の修飾、survivinの抗アポトーシス作用などが重要と考えられた。これらの研究成果を現在欧米誌に投稿中である。2.ERエストロゲン受容(ER)陽性閉経後DCIS患者におけるアロマターゼ阻害剤の有効性の解析昨年度開始したUIN CTR臨床試験登録(UMIN 000003101)を平成23年12月31日で終了した。合計12例の登録が得られたので、来年度に解析を行う予定である。本研究課題に関する、平成24年度の主な研究成果は以下の如くである。非浸潤性乳癌における性ホルモン応答遺伝子の発現と内分泌療法療法に対する意義。本科研費で行っていたUMINCTR臨床試験(UMIN 000003101)では、2009年11月から2011年12月までの2年間の登録期間中、術前アロマターゼ阻害剤療法が行なわれた10例の閉経後エストロゲン受容体陽性非浸潤性乳管癌症例が登録された。それに対して解析を行なったところ、アロマターゼ阻害剤投与後の非浸潤性乳管癌組織では腫瘍内エエストラジオール及びエストロン濃度がそれぞれ対照群の1.5%、0.6%ときわめて低値を示し、マイクロアレイ解析では、92%のエストロゲン応答遺伝子が治療開始前の発現レベルより1/2以下に減少していた。超音波による腫瘍径の計測では、治療期間が長かった群において有意な減少が観察され、T2強調MRI画像では治療による特異的な変化がみられた。免疫組織学的解析では、プロゲステロン受容体や細胞増殖

能のマーカーであるKi-67やプロゲステロン受容体が有意に減少しその変化は治療期間によらず速やかに観察されたが、エストロゲン受容体やアロマターゼの発現は治療の前後で有意な変化はみられなかった。以上よりアロマターゼは非浸潤性乳管癌においてエストロゲン合成に重要な役割を担っており、その阻害が非浸潤性乳癌においても治療上重要な選択肢となりうる可能性が示唆された。以上の研究成果は現在一流英文誌に投稿中である。DCISにおけるエストロゲン応答遺伝子の解析では大変有意義な研究結果を得ることができ、計画以上の進展と考える。DCIS患者に対する解析は、患者登録に想定以上の時間を要したが、来年度中に解析を終える予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、UMIN CTR臨床試験(UMIN 000003101)に登録された12例に関し、「非浸潤性乳癌組織における性ホルモン濃度の検討」、「非浸潤性乳癌における性ホルモン応答遺伝子の発現と内分泌療法に対する意義」等を解析する。
ナトリウム利尿ペプチドの内軟骨性骨化におけるクロストーク

BMPは軟骨細胞の増殖・分化に影響を与えていることが明らかとなっていることから軟骨細胞であるATDC5を用いてin vitroにおけるCNPがBMP下流シグナルに与える影響を増殖能を解析できるMTTアッセイを用いて検討した。具体的に、6-wellにATDC5細胞を一定数それぞれまいてVehicle群、CNP単独添加群、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群の4群に分けてコンフルエントに至る前の段階で6日間添加培養を行ってMTTアッセイを行った。その結果、Vehicle群、CNP単独添加群では同様の結果であった。しかし、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群ではVehicle群、CNP単独添加群と比べてそれぞれ有意に低下を認めた。だが、BMP2単独添加群、共添加群では有意な違いは認めなかった。前年度の結果と合わせてこの実験系ではBMP2がATDC5細胞の増殖能を抑制することが明らかとなった。また、BMP2単独添加群、共添加群では有意な違いは認めなかったことからBMP2のATDC5細胞の増殖能抑制作用はnon-smad経路である可能性が示唆された。次に、軟骨細胞の分化マーカーであるALPアッセイを4群で検討した。コンフルエントに達した6-wellのATDC5細胞に3日間添加した。また、BMP2単独添加群、共添加群ではVehicle群、CNP単独添加群と比べてそれぞれ有意に増加を認めた。前年度の結果と合わせてこの実験系ではBMP2のALP活性作用はnon-smad経路である可能性が示唆された。ATDC5においてVehicle群、CNP単独添加群、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群の4群でのcGMP産生量をELISA法を用いて測定した。Vehicle群およびBMP2単独添加群ではcGMP値は低値であったが、既報の通り、CNP単独添加群では著明にcGMP値は上昇を認めた。BMP2およびCNP共添加群においてもCNP単独添加群と同様に著明にcGMP値は上昇を認めたが、CNP単独添加群と比較して有意差を認めなかった。よって、BMPがCNP下流シグナルであるCGMP産生に与える影響は認められなかった。以上より、これまでの研究結果を総合すると、CNP/GC-B/cGMP系はBMP2の下流シグナルであるリン酸化smad1/5/8を抑制することにより、さらに下流のId2やRunx2などの遺伝子発現を抑制していた。また、BMP2の下流でALP活性が促進されるが、この系ではこれはsmad経路を介しているのではなくnon-smad経路を介していることが示唆された。これらの新たな知見をまとめて、今後、論文投稿を予定している。CNP/GC-B/cGMP系とTGFβ/BMPファミリーの相互作用を明らかにするためにまずCNPがBMPの下流シグナルに与える影響から検討した。ICRマウスの脛骨を取り出してVehicle群、CNP単独添加群、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群の4群に分けて4日間器官培養を行った。その結果、Vehicle群に比較してCNP単独添加群、BMP2単独添加群では脛骨長の増加を認めたが、BMP2およびCNP共添加群では予想よりも脛骨長の増加は少なかった。次に、軟骨前駆細胞であるATDC5におけるウエスタンブロット法を用いてBMP2単独添加群とBMP2およびCNP共添加群においてBMP2の下流シグナルである転写因子smad1/5/8のリン酸化タンパク量を検討した。その結果、smad1/5/8のリン酸化タンパク量はBMP2単独添加群に比較してBMP2およびCNP共添加群において減少を認めた。よって、CNPはBMP下流シグナルを阻害することが示唆された。次に、軟骨前駆細胞であるATDC5においてBMPのさらに下流の標的遺伝子であるIdファミリーやRunx2、p21のmRNA発現量をVehicle群、CNP単独添加群、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群の4群で定量PCR法で比較した。その結果、Vehicle群と比較してBMP2単独添加群では著明な発現増加をIdファミリー、Runx2、p21それぞれで認めた。それに対して、BMP2およびCNP共添加群ではBMP2単独添加群と比較してIdファミリー、Runx2、p21の発現量の低下を認めた。以上の結果からいづれの検討からもCNPがBMP下流シグナルを阻害することが明らかとなった。BMP2を野生型マウスおよびCNPトランスジェニックマウスの筋肉内に注射して異所性石灰化を誘発することを予定していた。しかし、当初の投与量では異所性石灰化を誘発することは困難であった。よって、当初は予定していなかったBMP2投与量の調節を目的とした予備実験を行う必要が出てきたため、当初の予定より計画が遅れることとなった。実験計画を順調にこなし、実験結果も新規性に富み、興味深い結果を得ている。また、実験を繰り返し行い、検討を重ねることで結果の信頼性を上げることができた。しかし、その反面、実験を繰り返すことで時間がかかり、全体の進捗に遅れが生じてしまった感が否めない。

また、当初の計画はかなり順調に実験が進んだことを想定して作成したことも影響していると考えている。実験計画を順調にこなし、実験結果も新規性に富み、興味深い結果を得ていることから、この結果をさらに発展させるために生体における生理的な意義を確認することを主眼としてさらなる検討を当初の研究計画に従って行っていくこととする。具体的にはBMP2を野生型マウスおよびCNPトランスジェニックマウスの筋肉内に注射して異所性石灰化を誘発することを予定しており、BMP2の異所性石灰化に与えるCNPの影響を検討する。ATDC5においてVehicle群、CNP単独添加群、BMP2単独添加群、BMP2およびCNP共添加群の4群でのcGMP産生量をELISA法をするためにELISAの測定キットを購入する。また、ATDC5細胞を培養するために培養皿や培養液や試薬の購入を行う。BMP2をマウスの筋肉内に投与することで異性骨化を誘導する手法を用いて、CNPノックアウトマウスやCNPの循環血中濃度が上昇したCNPトランスジェニックマウス(CNPの末梢投与モデルマウス)に異所性骨化を誘導することでCNPがBMPシグナルがもたらす異所性骨化に与える影響を解析する。解析方法としてはレントゲン画像による異所性骨化の表面積の測定することで評価することを計画していることから動物の飼育費やBMP2の試薬購入費用、レントゲンフィルムの購入を予定している。平成23年度の研究進捗がやや遅れたこともあり、42万円程度の繰越金が発生した。よって、この繰越金を平成24年度分の予算と合算して当初の研究計画に従って、平成23年度分の残りの研究計画と平成24年度分の研究計画を実施していくこととする。具体的にはBMPは軟骨細胞の増殖・分化に影響を与えていることが明らかとなっていることからATDC5およびマウスの脛骨を用いて細胞増殖および分化に対する影響を検討する。さらに、BMPは細胞周期およびアポトーシスに影響を与えることが報告されていることからATDC5およびマウスの脛骨器官培養における影響を検討する。加えて、CNPノックアウトマウスやCNPトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変マウスを用いてその筋肉内にBMP注射を行うことで異所性骨化を誘導しCNPの影響の有無を解析する。
水産有用魚類におけるゲノム情報の高度利用化に関する研究

従来のヒラメ解析家系に加えて、DNAが配布可能な新規のヒラメ基準家系を作出し、両者の統合を図った。新規基準家系において199マーカー座と5SrRNA遺伝子の合計200マーカー座を用いた遺伝子連鎖地図を作成した。マッピングに用いられたうちの107マーカー座は新規開発したものである。その結果,雌の遺伝子連鎖地図で160マーカー座、雄の遺伝子連鎖地図で168マーカー座の遺伝子連鎖地図を作成することが出来た。雌の遺伝子連鎖地図上の71マーカー座,雄の遺伝子連鎖地図上の62マーカー座は,従来の解析家系による遺伝子連鎖地図上にもマッピングされており,2つの遺伝子連鎖地図を統合する際にアンカーのマーカー座となることが期待された。また,シンテニーに利用できるランドマーク遺伝子としての5SrRNA遺伝子のマッピングにより,5SrRNA遺伝子座は連鎖群24にあることが明らかとなった。作出した新規基準家系において,遺伝子連鎖地図のさらなる詳細化を行った。新規開発したマイクロサテライトマーカーなどの新規マッピング,ESTマーカーのマッピング,および平成16年度まで用いていた解析家系における遺伝子連鎖地図との統合の結果,マイクロサテライトマーカー400マーカー座とESTによるSNPマーカー144マーカー座,およびMHC遺伝子座,5SrRNA遺伝子座の合計546の座位を用いた遺伝子連鎖地図を作成することが出来た。なお,MHC遺伝子領域のBACクローンの塩基配列から開発したマイクロサテライトマーカーのマッピングにより,MHC遺伝子座は連鎖群13にあることが明らかとなった。また、ヒラメの染色体数は2n=46と2n=48との報告があり、混乱していたが、北海道、岩手県、秋田県、山形県、福島県、新潟県、神奈川県、石川県から採取した40個体を精査した結果、いずれも2n=48であり、ヒラメの染色体数は基本的には2n=48であると考えられた。また、基準家系の用いたヒラメも2n=48であった。今後の問題点として、新規マイクロサテライトマーカーの開発,マッピングによるさらなる遺伝子連鎖地図の詳細化(高密度化)が必要であると考えられる。また,フグやメダカなどの連鎖地図との詳細なシンテニー解析のためには,MHC遺伝子や5SrRNA遺伝子の様に,それぞれの遺伝子連鎖地図のアンカーポイントとなる遺伝子領域のマッピングの推進が重要である。なお、本成果の育種への応用として、QTL解析によるヒラメのリンホシスチス病抵抗性に関する原因遺伝子座の推定を行い、同病の発症抑制と強く連鎖するDNAマーカーを得たことを付記する。1.遺伝子連鎖地図:150500bpのゲノムDNAを挿入断片にもつプラスミドライブラリーからCA繰り返し配列を含むコロニーを単離し、PCRプライマーを設計した。DNA多型を確認し、多型の見られた100個のマイクロサテライトマーカーを用いて常法によりジェノタイピングを行った。

得られたデータの連鎖解析を行い、新たなマイクロサテライトマーカーのヒラメ遺伝子連鎖地図へのマッピングを試みた結果、雌の遺伝子連鎖地図で177マーカー座、雄の遺伝子連鎖地図で174マーカー座となり、詳細化を進めることが出来た。2.基本的物理地図作製の準備:ヒラメ白血球培養では培養液にL-15を用いた試験区で最も高い分裂頻度が得られた。マイトジェンについては、PHA(90μg/ml)、LPS(100μg/ml)、Poly I : C(100μg/ml)の3種類を混合した試験区でそれぞれ最も高い分裂頻度が得られた。染色体の形態や広がりについては、コルセミド処理を250ng/mlの濃度で1.5時間施した試験区で、低張処理を0.075M濃度のKCL水溶液で20分間施した試験区でそれぞれ最も優れていた。上記全てを最適化した条件で作成した染色体標本は分裂頻度が高く染色体腕が適度に伸長しており、染色体縁辺部も明瞭であった。また上記染色体標本は銀染色法、C-バンド法、R-バンド法の分染色法に適用可能であることを確認した。更にFISH法を用いてヒラメの5SrRNA遺伝子は1番染色体のセントロメア近傍に、18SrRNAは1番染色体の二次狭窄部位に局在していることを明らかにした。また2-color FISH法を用いてこれら2種類のrRNA遺伝子座が同一染色体上に位置することを確認した。これらの結果から上記で作成した染色体標本はFISH法に使用可能であることが確認された。1.遺伝子連鎖地図:新たにマイクロサテライトマーカーをマッピングし、合計255マーカー座を用いた遺伝子連鎖地図を作製した。雌の遺伝子連鎖地図で208マーカー座、雄の遺伝子連鎖地区で204マーカー座となり詳細化を進めることができた。2.基本的物理地図作製:複製Rバンド法を用いた結果、全てのヒラメ染色体に明瞭な分染パターンが観察され、各相同染色体対を長さの順序(124番)に分類したヒラメの複製Rバンド分染核型を作製した。核型はすべて端部着糸型染色体から構成され、1番染色体には二次狭窄が認められた。3.ランドマーク遺伝子(cDNA):ヒラメ下垂体cDNAライブラリーから1133クローンのワンパスシークエンスを行い、NCBIのBlastシステムで検索し、GENETYX-MAC/ATSQでアッセンブルした。その結果、264種類の遺伝子を単離することができた。それらのうち118種類が、トラフグゲノムデータベース及びミドリフグデータベースを用いてミドリフグの染色体上に新たにマップできた。ミドリフグの連鎖群は、21個であることから、昨年度の成果と合わせると、ミドリフグの染色体にマッピングできた遺伝子の総数は342種類となり、1連鎖群あたり平均約16種類のヒラメランドマーク遺伝子が得られたことになる。4.シンテニーの比較:ヒラメランドマーク遺伝子をミドリフグゲノムデータベース及びトラフグゲノムデータベースでBlast, Blat検索することにより、イントロンの挿入部位を明らかにすることかできたので、ヒラメゲノム上でも多型が期待できる。