hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マシニングセンターを用いた気中放電加工による超硬合金の高速加工に関する研究

マシニングセンター(MC)を用いた気中放電加工実現の可能性の調査,そして,形彫り放電力工機を用いた気中加工による超硬合金の加工の試みと3次元形状創成加工に関する研究を行った.まず,MCを用いて気中加工が行える可能性の調査結果から述べる.平成15年度は,MCで安定した気中加工が行える加工条件と工具電極の送り方法の調査から始め表た.その結果,微小な切込みをZ軸方向に与えてX軸方向に高速で送るよりも,加工方向をZ軸方向とし,定めた深さに達したら高速で次の加工位置まで工具電極を送る方が安定して加工が行えることが分かった.平成16年度は,MCのZ軸が持つ高速送りと高い加減速能力を利用した擬似サーボ送りによる加工を試みた.その結果,擬似サーボの効果は認められたが,重い主軸を高速で動かすことには限界があり加工速度の向上は頭打ちとなった.よって,高い周波数応答性を持つ加工テーブルを用いて加工を行うことが必要である.ここで,超硬合金の加工と3次元形状創成加工について述べる.平成15年度は,気中加工による超硬合金の加工を試みた.その結果,工具電極か工作物に超音波振動を付加させると加工速度の向上と工具電極消耗率の減少が見られた.また,3次元形状創成加工については,気中加工の方が従来の液中加工に比べて加工速度,工具電極消耗,加工精度の点で優れていた。総型電極による加工と気中加工の形状創成加工の比較では,総型電極の方が短時間で加工が終了するが,仕上げ加工で工具電極消耗が増大のために工具電極ぞ何本も準備する必要があった.よって,工具電極の製作時間とコストを考慮した場合には気中加工による形状創成加工の方が好ましい.平成16年度は,気中加工を5軸制御で3次元形状の加工を試みた.その結果,工具電極の位置を常に加工面の法線方向に制御できるため3軸制御による加工に比べて著しく加工速度が向上することが明らかとなった.マシニングセンター(MC)を用いた気中放電加工実現の可能性の調査,そして,形彫り放電力工機を用いた気中加工による超硬合金の加工の試みと3次元形状創成加工に関する研究を行った.まず,MCを用いて気中加工が行える可能性の調査結果から述べる.平成15年度は,MCで安定した気中加工が行える加工条件と工具電極の送り方法の調査から始め表た.その結果,微小な切込みをZ軸方向に与えてX軸方向に高速で送るよりも,加工方向をZ軸方向とし,定めた深さに達したら高速で次の加工位置まで工具電極を送る方が安定して加工が行えることが分かった.平成16年度は,MCのZ軸が持つ高速送りと高い加減速能力を利用した擬似サーボ送りによる加工を試みた.その結果,擬似サーボの効果は認められたが,重い主軸を高速で動かすことには限界があり加工速度の向上は頭打ちとなった.よって,高い周波数応答性を持つ加工テーブルを用いて加工を行うことが必要である.ここで,超硬合金の加工と3次元形状創成加工について述べる.平成15年度は,気中加工による超硬合金の加工を試みた.その結果,工具電極か工作物に超音波振動を付加させると加工速度の向上と工具電極消耗率の減少が見られた.また,3次元形状創成加工については,気中加工の方が従来の液中加工に比べて加工速度,工具電極消耗,加工精度の点で優れていた。総型電極による加工と気中加工の形状創成加工の比較では,総型電極の方が短時間で加工が終了するが,仕上げ加工で工具電極消耗が増大のために工具電極ぞ何本も準備する必要があった.よって,工具電極の製作時間とコストを考慮した場合には気中加工による形状創成加工の方が好ましい.平成16年度は,気中加工を5軸制御で3次元形状の加工を試みた.その結果,工具電極の位置を常に加工面の法線方向に制御できるため3軸制御による加工に比べて著しく加工速度が向上することが明らかとなった.まず,マシテングセンター(MC)で気中放電加工が行えるようした.それには,MCの加工テーブルの絶縁とMCに取付ける工具電極回転装置製作および加工電源が必要となる.加工テーブルの絶縁に関しては,工作物を取付ける精密マグネットチャックを高精度なセラミックスを介して加工テーブル上のバイスに取付けることで対応した.工具電極回転装置については,実験計画では極間隙を高速で制御するために超磁歪素子を組み込んだ装置を製作する予定であったが,まず,工具電極の回転のみを行う装置をMCに取付けて実験を行うこととした.これは,超磁歪のような特別な装置を用いなくとも,MCで安定した放電加工を行うことが出来れば実用化を考えた場合に望ましいからである.加工電源は,短いパルス幅で高いピーク電流値の放電波形が出力できるワイヤー放電加工用の電源をMCで使用できるように改造して用いた.また,工作物には,基礎実験的な要素が強いので,これまでに使用している焼入れ鋼(SKD11)を用いた.供給気体として酸素ガス,工具電極には外径1mm,内径0.4mmのCu-Wパイプ電極を用いた.以下に結果を述べる.(1) MCによる気中放電加工が可能である.(2)工具電極の回転のみで安定した加工が行える.

(3)工具電極の送り方法を,Z軸方向に加工ギャップ以下の微小な切込みを与えて,X軸またはY軸方向にMCの特長を生かした高速送りをするよりは,工具電極をZ軸方向に送って加工を行い,工具電極の上昇および横方向の移動を高速で行った方が加工速度が遥かに速いことが分かった.これは,Z軸方向に送って加工を行った方が工具電極端面全体で加工を行うことになり,放電頻度がX軸およびY軸方向に送る場合よりも著しく多くなるためである.本送り方法により得られた加工速度は82mm^3/minである.これは,同じ径の工具電極あるいは工具を用いた従来の液中放電加工および切削加工をも凌駕する値である.このことから,極間隙の高速制御が必ずしも必要ではないことが明らかとなった.○来年度の予定工具電極の送り方法の工夫と電気加工条件の見直しにより加工速度の更なる向上を目指す.その上で,超硬合金への加工を試みる.超硬合金の場合,鋼工作物ほど酸化反応による加工速度の向上が期待できない.従って,電気加工条件の調査が加工速度を向上させる上で重要である.そこで,各種電気加工条件において単発放電を生じさせ,単発放電痕の性状を調べることで加工速度を向上させるための指針を定める。特に,アーク柱の電流密度に大きな影響を持つ放電電流の立上りが大きな鍵を握っていると考えており,放電電流の立上りを変化させた場合の単発放電痕の性状の調査を行う.その後,超硬合金の高速加工を試みる予定である.超硬合金の加工では,鉄系工作物のように供給気体の酸素ガスとの酸化反応による加工速度の著しい向上が期待できない.気中放電加工で加工速度向上に影響を及ぼす要因の一つに加工メカニズムがある.つまり,極間に供給する供給気体による極間隙からの加工屑の排出の容易さが加工速度に与える影響は大きいと考えられる.すなわち,加工メカニズムが蒸発が主となる場合には生じる加工屑が微細なため,気体流による排出が容易となるため加工速度の向上が実現するが,加工メカニズムが溶融が主となる場合には,溶融部分の除去が気体流では困難なため溶融部分が工作物上面に残留可能性が大きいことが予想される.その結果,短絡が多発するため加工速度の著しい低下が生じる可能性が高い.加工メカニズムを蒸発を主にするには,放電アーク柱の電流密度を高くして電極と接する部分の温度を高温にして,しかも,溶融領域が成長する前にアーク柱を消沈させる必要がある.つまり,ピーク電流値が極めて大きくパルス幅が短い放電電流波形を用いる必要がある.本研究では,そのことを想定してパルス幅が短く高いピーク電流値が得られるワイヤー放電加工用の加工電源を用いて研究を行ってきた.しかし,放電が生じる箇所までの電流経路が長くインダクタンスの影響で,実際の放電で得られるピーク電流値は電源が出力できるピーク電流値の半分程度しかない.また,加工中に工具電極側面に付着する加工屑は,加工速度の低下のみならず加工精度に悪影響を及ぼす要因にもなっている.そこで,インダクタンスの影響を低減させ,かつ,工具電極側面に付着する加工屑の除去を行うために,放電が生じている極間に限りなく近い工具電極部分から直接給電が行える給電板を工具電極を挟み込むように取付けた.この給電板はエアーシリンダーによって工具電極軸方向に沿って上下に動くことが可能なため,適切なタイミングで給電板を上下に動かすことで工具電極側面に付着した加工屑の除去を行うことができる.給電位置の変更により,同じ電気加工条件の設定であってもピーク電流値は2倍以上になり,パルス幅が若干短くなった.これによって,加工速度の向上が見られた.しかし,酸化反応が期待できない場合の加工速度の低下は著しく,極間隙を適切に制御するサーボ機構を有しないMCによる加工では短絡の多発により加工速度を上げることができない.
高速シリアル通信網による並列計算機システムの構築

・ワークステーションクラスタ上での分散共有メモリの実現多数のワークステーションから構成されるワークステーション・クラスタ上においてソフトウェア制御によるコヒーレント・キャッシュ・メモリを装備したソフトウェアDSM(Distributed Shared-Memory)システムを実現した.本システム上において行列計算を例に性能向上比を調べ,通信時間と処理時間を計測することによって,システムの評価を行なった.その結果,現状のイーサネット環境においては,全体の処理時間に占める通信時間の割合が高く,充分な速度向上を得ることができなかった.しかしながら,ネットワーク環境においてワークステーションを活用することにより並列処理を行なうための共有メモリの有効性について明らかにできた.超並列計算機JUMP-1のI/Oサブシステムに関しては,STAFF-Linkの設計制作を行ない,I/Oサブシステムにおける具体的なディスクおよび画像I/Oユニットの構成を考案した.そして,ディスク装置を接続した数台のワークステーションを,STAFF0-Linkにより相互に結合した実験システムを構築し,ディスクI/Oユニットに関してデバイスドライバの作成し,基本的な性能について評価を行なった.ディスクに対する応答時間についてはバランスの取れたアクセス時間を提供しており,共有入出力バッファを有効利用することにより,ある程度の平均アクセス時間を確保できることを確認した.JUMP-1のシステムの実装と並行して,フルシステム稼働時を想定したI/Oサブシステムのシミュレーションによる評価を行なった.その結果,Video on Demandをアプリケーションとした場合の,システムのパフォーマンスの見積り値を明らかにした.・ワークステーションクラスタ上での分散共有メモリの実現多数のワークステーションから構成されるワークステーション・クラスタ上においてソフトウェア制御によるコヒーレント・キャッシュ・メモリを装備したソフトウェアDSM(Distributed Shared-Memory)システムを実現した.本システム上において行列計算を例に性能向上比を調べ,通信時間と処理時間を計測することによって,システムの評価を行なった.その結果,現状のイーサネット環境においては,全体の処理時間に占める通信時間の割合が高く,充分な速度向上を得ることができなかった.しかしながら,ネットワーク環境においてワークステーションを活用することにより並列処理を行なうための共有メモリの有効性について明らかにできた.超並列計算機JUMP-1のI/Oサブシステムに関しては,STAFF-Linkの設計制作を行ない,I/Oサブシステムにおける具体的なディスクおよび画像I/Oユニットの構成を考案した.そして,ディスク装置を接続した数台のワークステーションを,STAFF0-Linkにより相互に結合した実験システムを構築し,ディスクI/Oユニットに関してデバイスドライバの作成し,基本的な性能について評価を行なった.ディスクに対する応答時間についてはバランスの取れたアクセス時間を提供しており,共有入出力バッファを有効利用することにより,ある程度の平均アクセス時間を確保できることを確認した.JUMP-1のシステムの実装と並行して,フルシステム稼働時を想定したI/Oサブシステムのシミュレーションによる評価を行なった.その結果,Video on Demandをアプリケーションとした場合の,システムのパフォーマンスの見積り値を明らかにした.
血管作動性小腸ペプチドの口腔粘膜創傷治癒、炎症制御機能の解明と治療薬としての応用

神経ペプチドやペプチドホルモンは様々な機能を持つことが知られている。vasoactive intestinal peptide (VIP)は小腸の血管拡張物質として発見された28個のアミノ酸からなる神経ペプチドである。今回の研究から,VIPが口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞の増殖を活性化させることが明らかになった。またVIPで誘導される血管誘導因子の発現や,細胞走化性の亢進にVIP受容体であるVPAC1の発現が関与することが明らかになった。VIPは口腔粘膜の創傷治癒を亢進させる可能性があることが考えられた。神経ペプチドやペプチドホルモンは神経伝達物質としての機能だけでなく,様々な機能を持っていると考えている。血管作動性小腸ペプチドvasoactive intestinalpeptide (VIP)は小腸の血管拡張物質として発見された28個のアミノ酸からなる神経ペプチドである。当科のグループではVIPが細菌に対して抗菌活性をもっていること,さらに唾液中に存在する抗菌ペプチドであるLL-37の抗菌活性を相加・相乗的に増加させることを報告している。さらに申請者らのグループはVIPの受容体であるVPAC1,2が口腔粘膜上皮細胞において発現していること, VIPを添加した際に口腔粘膜上皮細胞のvascular endothelial growthfactor (VEGF)の発現誘導と,細胞遊走能が増加することを発見している。一方,近年ではVIP,VPACの発現が炎症性腸粘膜疾患の炎症レベルで異なること,さらにVIPが炎症性腸粘膜の炎症を抑制することが報告されているが,VIP, VPACの発現と口腔粘膜炎症性疾患との関与や,VIPが口腔粘膜における抗炎症作用をもつ報告は国内外においてもない。今回の実験計画は口腔粘膜細胞を用いてVIPによる創傷治癒作用や抗炎症作用といった多彩な新規メカニズムを明らかにし創傷治癒薬あるいは口腔粘膜炎症性疾患に対する新しい治療法を検討することである。本年度は口腔粘膜細胞におけるVIPによる増殖,遊走因子の発現誘導と微生物構成成分を介した粘膜炎症の調節に対する検討を行った。口腔粘膜上皮細胞へのVIP添加による細胞増殖の影響をproliferation assayにて検討した結果,VIP添加は非添加と比較し口腔粘膜上皮細胞の細胞増殖活性が増加することが示された。さらにVIP添加による粘膜創傷治癒因子mRNAの発現誘導の影響をReal-time PCRで検討した結果, VIPによって濃度依存的にVEGFA, VEGFB, TGF-beta, IL-6 mRNAの発現が増加することが示された。さらにVIPの抗炎症作用を検討するためds DNA細胞内導入によって誘導される炎症性ケモカイン発現誘導に対するVIPの影響をELISA法にて検討した結果,VIPがds DNA細胞内導入で誘導されるCXCL10の発現を抑制することが示された。以上の結果によってVIPが口腔粘膜において抗菌作用,創傷治癒,抗炎症作用を併せ持つペプチドであることが明らかとなった。今回の研究計画は, VIPの創傷治癒作用,抗炎症作用を明らかにし,口腔粘膜への創傷に対する新しい治療法を検討するためにVIPの口腔粘膜細胞における細胞増殖作用,創傷治癒作用,抗炎症作用を検討した。不死化させた口腔粘膜上皮細胞RT7,不死化歯肉線維芽細胞GT1を用いて,VIP添加による細胞増殖assayを行った。またVIPが誘導する細胞走化性や創傷治癒能に対するVPAC1の影響を検討するために,siRNAを用いたVPAC 1ノックダウン細胞を作成した。また炎症性サイトカインで誘導される白血球遊走因子におけるVIPの影響を検討するためにRT7, GT1をVIPで前処理を行った後,IFN-γを添加しCXCL10の発現誘導の影響をReal-time PCR法にて検討した。その結果,RT7, GT1にVIPを添加することによって非添加と比較して細胞増殖が経時的に増加することが示された。VPAC1のノックダウンは,コントロールと比較してVIPで誘導される細胞遊走能と血管誘導因子の発現誘導を抑制した。RT7, GT1におけるIFN-γで誘導されるCXCL10の発現に対するVIPの影響は認められなかった。今回の結果においてVIPが口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞における細胞増殖を活性化させることが明らかになった。また,口腔粘膜細胞におけるVIPの細胞遊走活性や,血管新生因子の発現誘導にはVIP受容体であるVPAC1が関与していることが明らかになった。本年度はVIPの前年度で明らかとなった新規機能がVPAC1,2を介した応答であるかを検討するため,VPAC1,2のSiRNA欠失株を用いてVIPを添加した際の粘膜治癒因子の増加,炎症誘導作用の調節をELISA法を用いて検討する。

またVIPの標的蛋白を検討するため平成25年度で得られた結果からVIPで誘導される細胞増殖,遊走,分化,炎症における各種シグナル伝達阻害剤における影響を昨年度の実験系によって確認した後,cAMP/PKA, ERK,NF-kBなどの各種転写因子の誘導をWestern blotting法で検討する。さらにVIPを臨床応用するためVIP含有ゼラチンハイドロキシゲルシート(VIP含有シート)を作製しVIPの徐放濃度をELISA法にて検討する。VIPの徐放が確認された場合,口蓋粘膜を切傷した創傷治癒モデルラットを用いてVIPの創傷治癒効果を検討する。口腔外科
シミュレーション医療教育標準化のための日本発仮想患者モジュールの開発

現在医学シミュレーションセンター等で使用されている多くの高機能患者シミュレータの市場は海外のメーカに独占されているため、国内で総合的なシミュレーション教育環境を構築するには莫大なコストが必要となり、インストラクター側に相当な負担を強いている。この現状を打開するため、本研究では生体の循環・呼吸・代謝・神経制御状態を再現する数値モデルを内蔵し、各種医療シミュレータが連携して統合的な教育環境を構築するために仕様が標準化されたインターフェースを持つ仮想患者モジュールを新規開発、公開共有する。
統合失調症-卵性双生児不一致例におけるヒストンアセチル化とメチル化の解析

一卵性双生児DSM-IV統合失調症不一致例5組と健常一卵性双生児6組を対象として、そのDNAメチル化などエピジェネティックな差異を検討した。メチル化感受性制限酵素(HapII)とコントロールとして同じ配列CCGGを認識するがメチル化感受性の異なる制限酵素(MSPI)を用いて、統合失調症の候補遺伝子であるDRD2のプロモーター領域にあるHapII/MspI領域を対象として実験を行った。一卵性双生児統合失調症不一致例のDNAを制限酵素で消化し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。5例中4例はDRD2のメチル化が罹患双生児の方が程度が大きく、残りの一例はほぼ同等であるという結果となった。このことはDRD2のプロモーター領域のメチル化が双生児の不一致となんらかの関係があるという仮説と矛盾しない。また上記のうち1組の統合失調症不一致組を対象として、Affymetrix社製GeneChip Human Mapping100KSetとGeneChip Human GenomeU133Plus2.0Arrayを用いてSNP解析と発現解析を同時に行った。遺伝子発現の差を引き起こす可能性のあるものとして、発現変動した遺伝子の5'上流域に存在するSNPまたは、イントロンに存在する4つのSNPと、異なる信号強度がみられたSNPのうちで遺伝子の発現変動は起こさないが、アミノ酸置換を誘引するか、スプライシングに影響を及ぼすSNPとして、遺伝子のイントロン、エクソン内に存在する21のSNPを同定した。今回、シークエンスによってSNP自体が変化しているわけではないことが確かめられており、この近傍の領域になんらかのエピジェネティックな変化が生じている可能性が高いものと思われる。今後、これらの領域に対してヒストンのアセチル化やメチル化の差異を検出する試みを続けていく予定である。本研究の目的は、統合失調症不一致一卵性双生児を対象として、双生児間のエピジェネティックな変化を比較することにより、一卵性双生児の不一致の背景を明らかにし、統合失調症の病因に迫ることである。今年度は一卵性双生児統合失調症不一致例でSNP解析と発現解析を行い、双生児間の比較を行った。対象は51歳男性の一卵性双生児。対象者のリンパ球からゲノムDNAを抽出し、Affymetrix社製GeneChip Human Mapping100K SetにてSNP解析を行った。また、同じくリンパ球から得られたRNAサンプルをAffymetrix社製GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayにて発現解析を行った。SNP解析では116204中46SNPでコールの差が見られた。発現解析では12857の遺伝子の発現を調べた。このうち異なるコールがなされたSNPのうちで両サンプルでの遺伝子発現の差を引き起こす可能性のあるものとして、発現変動した遺伝子の5'上流域に存在するSNP(regulatory SNP)または、イントロンに存在するSNP(intoronic SNP)を探索し、4つのSNPと遺伝子を同定した。今後、今回得られたSNPから候補遺伝子を決定し、これまで報告されている候補遺伝子とあわせてそのクロマチンにおけるヒストンの修飾を解析する予定である。また現在臭上皮細胞の培養を試みているが、成功に至っておらず、条件の更なる検討が必要である。結果として一卵性双生児統合失調症不一致例の4組中1組でコピー数の変化の可能性がある領域が同定された。
NShcホスホチロシンアダプター分子のてんかん原生獲得・進展への関与

脳由来神経栄養因子(BDNF)-TrkBシグナル伝達系がてんかん原生獲得・進展に関係することが知られているが、その下流シグナル分子の機能解明には至っていない。本研究では、TrkB受容体のアダプター分子の一つであるNShcのカイニン酸誘発けいれんにおける役割を解明することを目的とした。NShc欠損マウスではコントロールマウスと比較して、カイニン酸投与にて誘発されるけいれんの重症度、てんかん性放電、海馬錐体神経細胞死が減少していた。これらの結果からNShcはカイニン酸誘発けいれんの機序に深く携わっていることが解り、NShcシグナル伝達系が新たなてんかん治療の標的になりえると考えられた。1)カイニン酸投与後の海馬電極による脳波解析:C57BL6およびN-Shc-/-マウスに対し、麻酔下に開頭後、定位的に海馬CA3領域に単極電極を留置、固定を行った。電極留置術後1週間後にデジタル脳波計に接続し、カイニン酸(KA)投与前30間、KA腹腔内投与(30mg/kg, i.p.)後から2時間の脳波記録を行った。棘波や鋭波のてんかん性発射を視察にて計測した。KA投与前は両郡ともに明らかなてんかん性発射は認めなかった。KA投与後、両郡ともにてんかん性発射を観察できたが、振幅、頻度ともにN-Shc-/-マウスで低かった。てんかん性発射の頻度は、投与直後から1時間後ではC57BL6マウスが平均5642.8±1210回/hに対しN-Shc-/-マウスで平均1046±971回/hと有意に低かった(p<0.001)。1時間後から2時間後では、C57BL/6マウスが平均8040±1573回/hに対しN-Shc-/-マウスで平均981.5±1048回/hと有意に低かった(p<0.001)。KA投与後の海馬からのてんかん性発射はN-Shc-/-マウスで抑制されることが解った。C57BL/6およびN-Shc-/-マウスの脳を摘出し、大脳皮質、海馬、視床組織に分けwestern blotを行い、TrkBレセプターおよびNShc、カイニン酸レセプター(KA1, KA2)、グルタミン酸レセプター(GluR6)の発現を調べた。N-Shc-/-マウスではN-Shcタンパクの発現を認めなかった。両郡にてTrkB、KA1、KA2、GluR6の発現に差はなかった。NShcタンパク欠損に伴うTrkB、KA1、KA2、GluR6の発現に影響はなく、N-Shc-/-マウスへのKA投与後の効果がNShcタンパク欠損によりもたらされると考えられた。現在、この研究結果を論文として関連雑誌に投稿中であり、今後逐次学会にて報告していく予定である。脳神経外科,脳腫瘍,てんかん外科,機能的脳神経外科これまでの実験でTrkB-NShc signaling pathwayはカイニン酸により誘発されるepileptiform activityにおいて重要な役割を果たしていることがわかってきた。しかし交付申請書に記載したカイニン酸投与後の海馬電極による脳波解析の実験について、ノックアウトマウスの匹数の確保に時間がかかる点や脳波計測を行う実験では一度に多くのマウスを扱えないため、研究にやや遅れが生じている。26年度は、前年度進行が遅れたカイニン酸投与後の海馬電極による脳波解析の実験を行うとともに、当初の予定されているBDNF、TrkB、N-Shcやその他の下流シグナル分子の組織免疫染色やwestern blotを行う。これによりカイニン酸投与後のけいれん発作における分子機構を明らかにする予定である。実験における道具、試薬など既存のものを使用していたため、次年度使用額が生じた。実験に用いる試薬や必要物品に使用する。
光合成の遺伝子とその発現

1.光化学系II複合体に存在する低分子量サブユニットの一つを精製し、そのアミノ酸の部分配列を決定した。この遺伝子が葉緑体ゲノムにコードされていることを明らかにし、この遺伝子をPSbKと命名した。光化学系II複合体の表在性33-KDaタンパク質と23-KDaタンパク質の前駆体をこのタンパク質をコードするcDNAから試験管内転写、翻訳系を利用して合成し、さらに葉緑体ストロマに存在するプロセシング酵素活性を利用して、第一段目のプロセシング部位を同定した。また藍色細菌の光化学系II複合体の表在性33-KDaタンパク質を大腸菌内で発現させた時の、プロセシング部位を同定した。2.エンドウのRuBiscoの小サブユニットと大サブユニットの遺伝子rbcSとrbcLの転写に対する光作用スペクトルを測定した。その結果は、rbcSの転写はフィトクロムのPfr型で誘導されること、およびrbcLの転写もフィトクロムPfr型によって誘導されるが青色光を吸収する色素によっても誘導されることを示唆した。また高等植物の非光合成細胞においては、RuBiscoのrbcLの転写はプラスチドDNAのメチル化によって抑制されていることを明らかにした。光合成細菌Chramatiumvinosumから新しいRuBisco遺伝子をフローニグし、この新しく同定された遺伝子が細胞内で発現されること、および以前にフローニングしたRuBisco遺伝子は発現されていないことを明らかにした。3.トウモロコシのPEPカルボキシラーゼのcDNAとゲノム遺伝子をクローニングし、それらの塩基配列を決定した。シコクビエのアスパラギン酸アミノアシルトランスフェラーゼのアイソザイムの一種のcDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。4.タバコの光化学系I複合体のサブユニット(15.5KDa)のcDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。(1)光化学系【II】複合体の2種の表在性タンパク質33KDと24KDタンパク質のmRNAのcDNAをエンドウからクローン化し、その塩基配列を決定した。その結果、そのtransit peptideに2段階のプロセシングに対応すると思われる二つのドメインが存在することがわかった。また、33KDタンパク質の中の二つのシスティンがS-S結合を形成していることが、機能発現にとって必須であることがわかった。(2)光合成細菌Rhodobactersphaeroidesのチトクロームb-c複合体に存在するチトクロームb-562の構造遺伝子をクローン化し、その塩基配列を決定した。推定されたアミノ酸配列から、このチトクロームは4つの膜貫通領域を持つことが明らかになった。(3)光合成細菌chromatiumvinosumのRuBisCOの大サブユットと小サブユニットの構造遺伝子をクローン化し、その塩基配列を決定した。RuBisCO遺伝子の発現は、光合成細菌では大サブユニットと小サブユニット共に類似の様式で転写レベルで制御されているのに対し、高等植物では異った様式で制御されていることが明らかになった。(4)タバコ葉緑体ゲノムDNAの全塩基配列を決定し、光合成に関与するタンパク質の遺伝子を20種同定した。また呼吸系の酵素であるNADHデヒドロゲナーゼのサブユニットと思われるタンパク質の遺伝子を6種同定した。また監色細菌の光合成のプロトン輸送性ATPaseの遺伝子構成が2つのオペロンに分れていることも明らかにした。1.光化学系IIの33kDaタンパク質の遺伝子をAnacystis nidulans R2よりクローン化し,大腸菌体内で発現させることに成功した.アラスカエンドウの光化学系IIの23kDaタンパク質のcDNAをクローン化し,その塩基配列から前駆電タンパク質の構造を推定した.2.光合成細菌Rhodobactersphaeroidesのチトクローム

b/c1複合体からチトクロームbー562を単離した.さらにこの遺伝子をクローン化して塩基配列を決定し,そのアミノ酸配列を推定した.3. c3植物において炭酸固定を司る酵素RuBisCOについて以下の実績を挙げた. RuBisCOの大サブユニットと小サブユニットのmRNAの光誘導がクロラムフェニコールで阻害されることを見つけ,この事実からこれらのmRNAの光誘導には葉緑体におけるタンパク質合成が必須であることを明らかにした.光合成細菌ChromatiumvinosumにRuBisCOの遺伝子が2セット存在することを明らかにし,さらにそれぞれをクローン化して大腸菌体内で発現させることに成功した.耐塩性ランソウにおいて,塩適応に伴ってRuBisCOが増加することを明らかにした.4. C4植物において炭酸固定を司る酵素について以下の実績を挙げた.トウモロコシのPEPカルボキシラーゼのcDNAの塩基配列(3335bp)を決定し,さらにこの遺伝子をゲノムDNAよりクローン化した.シコクビエのアスパラギン酸アミノアシルトランスフェラーゼのアイソザイムを解析し,その細胞内局在性を明らかにした.5.タバコの光化学系I複合体から7種のサブユニットを精製し,N末端アミノ酸配列を決定した.1.光化学系II複合体に存在する低分子量サブユニットの一つを精製し、そのアミノ酸の部分配列を決定した。この遺伝子が葉緑体ゲノムにコードされていることを明らかにし、この遺伝子が葉緑体ゲノムにコードされていることを明らかにし、この遺伝子をpsbkと命名した。光化学系II複合体の表存性23-KDaタンパク質の前駆体をこのタンパク質をコードするcDNAから試験管内転写、翻訳系を利用して合成し、さらに葉緑体ストロマに存在するプロセシング酵素活性を利用して、第一段目のプロセシング部位を同定した。また藍色細菌の光化学系II複合体の表存性33-KDaタンパク質を大腸菌内で発現させた時の、プロセシング部位を同定した。2.エンドウのRuBiscoの小サブユニットと大サブユニットの遺伝子rbcSとrbcLの転写に対する光作用スペクトルを測定した。その結果は、rbcSの転写はフィトクロムのpfr型で誘導されること、およびrbcLの転写もフィトクロムpfr型によって誘導されるが青色光を吸収する色素によっても誘導されることを示唆した。また高等植物の非光合成細胞においては、RuBiscoのrbcLの転写はプラスチドDNAのメチル化によって抑制されていることを明らかにした。3.トウモロコシのPEPカルポキシラーゼのcDNAとゲノム遺伝子をクローニングし、それらの塩基配列を決定した。シコクビエのアスパラギン酸アミノアシルトランスフェラーゼのアイソザイムの一種のcDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。
歯内療法の機械化,省力化に関する研究

1.根管模型でニッケルチタンファイルに生じる荷重・トルクを測定した.RaCeのほうがProFileよりもトルクが小さかった.(小林千尋)2.4種類のニッケルチタンファイルと4種類の低速回転電気エンジンハンドピースを組み合わせて、透明湾曲根管模型の根管拡大を行った.ニッケルチタンファイルによる形成は手指によるものと比較し,必ずしも早くなかった.(永井旺介)3.7種類のニッケルチタンファイルの組成を分析をしたが,NiとTiの比率に差はなかった.(小林健二)4.電気的根管長測定器APITと連動する回転拡大装置を試作した.(小森規雄)5.根管模型で各種ニッケルチタンファイルを用い形成し,彎曲根管における形成方法に関して有用な示唆を得た.(飯田浩司)6.根管模型で,タックエンドファイルの追従性の良好なことを確認した.(庄司茂)7.Nd : YAGレーザーによる根管形成においてにおいて,200μmのファイバーを用いれば軽度の彎曲根管を形成できることが分かった.(中嶋正人)8.ステンレスファイルでは400°C1時間以下であれば加熱しても機械的性質が変化しないことが分かった.(栢豪洋)9.RTファイルのエンジンでの使用の可能性を検討した.(都築民幸)10.根管拡大形成時、術者の手腕部の筋活動は手用根管拡大器具のハンドル径および術者の手首の角度により影響を受けることがわかった.(小澤寿子)11.根管壁の反射光の強度スペクトラムを調べ、汚染状態を調べる方法をさらに発展させた(井川資英)12.根管壁をファイバースコープで観察する方法を発展させた.(高柴正悟)13.各種根管清掃法の比較では、NaOCl浴下での超音波洗浄がもっとも優れた効果を示し、12%濃度ではほぼすべての細菌が殺菌された.(竹中彰治)14.二酸化チタン光触媒と低濃度過酸化水素による,変色無髄歯への漂白効果の有用性を検討した.(田中享)1.根管模型でニッケルチタンファイルに生じる荷重・トルクを測定した.RaCeのほうがProFileよりもトルクが小さかった.(小林千尋)2.4種類のニッケルチタンファイルと4種類の低速回転電気エンジンハンドピースを組み合わせて、透明湾曲根管模型の根管拡大を行った.ニッケルチタンファイルによる形成は手指によるものと比較し,必ずしも早くなかった.(永井旺介)3.7種類のニッケルチタンファイルの組成を分析をしたが,NiとTiの比率に差はなかった.(小林健二)4.電気的根管長測定器APITと連動する回転拡大装置を試作した.(小森規雄)5.根管模型で各種ニッケルチタンファイルを用い形成し,彎曲根管における形成方法に関して有用な示唆を得た.(飯田浩司)6.根管模型で,タックエンドファイルの追従性の良好なことを確認した.(庄司茂)7.Nd : YAGレーザーによる根管形成においてにおいて,200μmのファイバーを用いれば軽度の彎曲根管を形成できることが分かった.(中嶋正人)8.ステンレスファイルでは400°C1時間以下であれば加熱しても機械的性質が変化しないことが分かった.(栢豪洋)9.RTファイルのエンジンでの使用の可能性を検討した.(都築民幸)10.根管拡大形成時、術者の手腕部の筋活動は手用根管拡大器具のハンドル径および術者の手首の角度により影響を受けることがわかった.(小澤寿子)11.根管壁の反射光の強度スペクトラムを調べ、汚染状態を調べる方法をさらに発展させた(井川資英)12.根管壁をファイバースコープで観察する方法を発展させた.(高柴正悟)13.各種根管清掃法の比較では、NaOCl浴下での超音波洗浄がもっとも優れた効果を示し、12%濃度ではほぼすべての細菌が殺菌された.(竹中彰治)14.二酸化チタン光触媒と低濃度過酸化水素による,変色無髄歯への漂白効果の有用性を検討した.(田中享)小林千尋らは,二種類のガッタパーチャを注入する新し根管充填法「ダブルインジェクション法」の臨床応用を進めた.新しい,ガッタパーチャおよびガッタパーチャ注入装置を開発中である.中嶋らは,出力900mJ/P,直径400μmのフィパーを用い,上顎前歯の根尖部まで根管拡大が可能かを検討したところ,オリジナルの根管壁を均一に切削することはできなかったが、根尖部まで拡大できることが示唆された.庄司らは,ニッケルチタン製ファイル(GC社試作:タックエンドファイル)に関して,拡大/形成に要する時間、および彎曲根管での変位量について透明レジンでの模擬根管を用いて検討を行った.その結果、彎曲根管での追従性が良く、作業時間の短縮が望めることが判明した.栢らは,加熱により表面処理を行い,ファイルの切削能率および機械的強度を測定した.結果として,500°Cを超える熱を加えると,切削能率,機械的強度とも著明に低下した.

小澤らは,根管形成時の術者の手腕部筋活動について研究し,手用根管拡大器具のハンドル径および衛者の手首の角度による影響を受けることが分った.井川らは,ヒト抜去歯割断面の汚染歯質および健全歯質に対して白色光を照射した際に得られる反射光の強度スペクトラムを調べた結果,汚染歯質からは光源自体の強度ピークに加え約650nmにもピークが得られた.村山らは,市販のCCDカメラでは,解像度の問題から根管深部における診断では利点が見いだせなかった、髄床底付近あるいは露髄確認においては強拡大像を得られることで診断の信頼性が高まった.田中らは,ヒト抜去前歯を選別し根管充填後,ヒト血液及び硫化鉄を用い人工的に変色歯を作製した.数種の色差計により変色歯作製前後で測色し,作製した変色歯が漂白試験に用いうることと最適な測色方法を確認した.1.クワンテックと比較して、タックエンドファイルは、切削に要する時間が短く、また根管形成時の逸脱が少なかった。(庄司茂)2.無髄歯漂白のための変色歯の作成法を検索し、変色歯試料を作成した。コンポジットレジン用の光照射器とくに高出力の光照射器での光照射をWalking Bleach法に応用し効果発現の時間短縮を期待するものであったが現時点の評価では著名な効果出現を認めていない。(田中享)3.各種根管清掃法の比較では、NaOC1浴下での超音波洗浄がもっとも優れた効果を示し、12%濃度ではほぼすべての細菌が殺菌された。(竹中彰治)4.4種類のニッケルチタンファイルと4種類の低速回転電気エンジンハンドピースをいろいろ組み合わせて、透明湾曲根管模型の根管拡大を行った。拡大時間、拡大中の不都合および拡大後のクオリティーについて詳細な分析を行っているところである。(永井旺介)5.根管拡大形成時、術者の手腕部の筋活動は手用根管拡大器具のハンドル径および術者の手首の角度により影響を受けることがわかった。(小澤寿子)6.ヒト抜去歯割断面の汚染歯質および健全歯質に対して白色光を照射した際に得られる反射光の強度スペクトラムを調べた結果、汚染歯質からは光源自体の(強度ピーク約560nm)に加え約50nmにもピークが得られた。(井川資英)7.湾曲根管において緊密な根管封鎖を行うためには、根管径や湾曲の度合いよりも、スプレダーの根管深部への到達を可能とする根管のテーパー量が最大の要因となることが判明した。(都築民幸)8.アクリル根管模型で8人の術者が根管形成し、ファイルに生じる荷重・トルクをリアルタイムで測定した。その結果、個人差が大きいことが判明した。(小林千尋)1.根管模型でニッケルチタンファイルに生じる荷重・トルクを測定した。RaCeのほうがProFileよりもトルクが小さかった.(小林千尋)2.4種類のニッケルチタンファイルと4種類の低速回転電気エンジンハンドピースを組み合わせて、透明湾曲根管模型の根管拡大を行った.ニッケルチタンファィルによる形成は手指によるものと比較し,必ずしも早くなかった.(永井旺介)3.7種類のニッケルチタンファィルの組成を分析をしたが,NiとTiの比率に差はなかった.(小林健二)4.電気的根管長測定器APITと連動する回転拡大装置を試作した.(小森規雄)5.根管模型で各種ニッケルチタンファイルを用い形成し,彎曲根管における形成方法に関して有用な示唆を得た.(飯田浩司)6.根管模型で,タックエンドファイルの追従性の良好なことを確認した.(庄司茂)7.Nd : YACレーザーによる根管形成においてにおいて,200μmのファイバーを用いれば軽度の彎曲根管を形成できることが分かった.(中嶋正人)8.ステンレスファイルでは400°C1時間以下であれば加熱しても機械的性質が変化しないことが分かった.(栢豪洋)9.RTフアイルのエンジンでの使用の可能性を検討した.(都築民幸)
Immediate Feedback And The Use Of Polling Systems For EFL Instruction

この研究はEFL(第二外国語としての英語)教育での即時フィードバックの可能性と効果を調査したものである。我々はその広範多機能性からクラウドシステムを採用した。これらは文法語彙指導、課題管理、学生同士/自身による相互評価システム構築に用いられデータ収集と即時フィードバック付与を実現した。これらは実に有用で革新的活用法である。被験者にはクラウド学習への意識調査も併せて行われ、その非常に好意的反応からこれらがEFL教育において今後より強固に導入統合されることを示唆している。研究成果は国際論文および研究発表で披露され更なる出版や発表も数多く進行中でありこの研究がより多大な貢献をもたらす事が予想される。
産業用素材としてのデンプンを合成する育種素材の作出

将来産業用に応用できるデンプンをイネ種子に生産するバイオ技術を開発するために、合成に関与するさまざまな酵素群の機能を制御した変異体と遺伝子組換え体のライブラリーを作製した。その性質を精査した結果、各酵素アイソザイムの活性レベルとデンプン分子構造、デンプン品質間の関係を明らかにすることができ、今後、こうした各イネ系統を育種素材として使うための初のデータベースが構築された。主要酵素の性質も明らかにした。本研究では、イネをモデル植物として、種子デンプンの構造をバイオテクノロジーによって改変する技術を確立し、デンプンを新産業用素材として使用する基盤を築く。この成果を踏まえ、新規デンプンを生産するイネ品種の育成をめざし、コメ需要の飛躍的な拡大に資する。産業利用を意識したバイオ技術によるコメデンプンの開発につながる基本技術を確立し、育種素材を作出する。(1)イネデンプン形質転換体および変異体ライブラリーを作製した上で、アミロペクチンの分子構造やデンプン構造および物性をバイオテクノロジーによってどの程度まで改変し得るのか、その可能性の限界と範囲を見極める。(2)こうして作成したテーラーメイド・デンプンがどのような物性を有するかを解析し、将来どのような産業分野で利用可能かを調査・試行する。(3)デンプン合成代謝にはまだ未解析で機能が不明な酵素(ホスホリラーゼ、DPE酵素など)がある。これらの遺伝子の機能を解明する。また、複数の酵素間の相互作用を解析する実験系を確立した上で明らかにする。(4)研究実施期間中に、国際シンポジウムを開催し、成果を世界にアピールするとともに、世界のリーダーと意見交換し、共同研究の可能性を討議する。今年度は研究の開始に当たり、材料の作製、研究法の整備などに重点をおいて研究を行い、以下の主要成果を得た。1.組換え体、変異体による新規デンプンの作製1)イネ形質転換体ライブラリー作製用の汎用コンストラクトの作製ライブラリーを作製するため多種類の遺伝子制御に使用可能な汎用型の組換え用DNAコンストラクトを作製した。汎用コンストラクトとして、遺伝子発現を抑制するRNAi法用、および遺伝子をセンス方向に導入してイネ変異体に発現させる用を作製した。2)主要デンプン合成関与遺伝子を制御したイネ形質転換体の作製(1)RNAi法によって、3種類のBE遺伝子(BEI,BEIIa,BEIIb)について、単独および複数の遺伝子発現を同時に制御する形質転換体を作製した。(2)lSA1とISA2の発現を抑制した形質転換体をRNAi法で作製した。また、ISA2遺伝子を高発現させた形質転換体を作製した。2.イネ形質転換体、変異体の基本形質の解析およびデンプン物性の解析(2)多数の変異体のアミロペクチンの分子構造を調べるために蛍光-キャピラリ電気泳動法で鎖長分布を解析した。(3)各変異体、組換え体デンプンのレオロジー特性を網羅的かつ効率的に測定するために、(1)粘性特性、(2)動的粘弾性特性、(3)曳糸特性、の分析法の整備・準備を行った。3.イネデンプン変異体の選抜とデンプン変異体ライブラリーの構築イネ変異体集団の中から、デンプン合成関連酵素の活性とタンパク質量をアクリルアミド電気泳動法で検出することによって標的変異体を選抜する方法を検討し、SS,DBE,Pho1,BEI活性が制御された変異体を選抜することに成功した。本年度は2年目に当たり、以下の研究を推進した。1.組換え体による新規デンプンの作製1)イネ種子のホルモンレベルを改変する形質転換体用コンストラクトの作製イネ種子の登熟初期に種子のシンク機能の発現を制御するために、ホルモンレベルが変動する形質転換体を作製し研究材料に使用する。本年度はWaxyプロモーターに使用した発現用コンストラクトを作製した。2)主要デンプン合成関与遺伝子を制御したネ形質転換体の作製(1)ISA1 ISA2め発現を抑制したイネ形質転換体、また、ISA1が欠損したイネsugary1変異体にISA2遺伝子を高発現させた形質転換体の形質を詳細に分析し、ISA1ホモ酵素が胚乳のデンプン合成に必須であることを植物で初めて証明した。3)主要デンプン合成関与酵素機能のin vitro解析BE,DBEアイソザイムの酵素学的な特性をin vitro実験系で解析し、それぞれの新機能が続々明らかにされてきた。BEの基本的な反応機構のいくつかが初めて明らかになった。2.形質転換体の基本形質の解析およびデンプン物性の解析(1)アミロペクチンの分子構造が異なる形質転換体や変異体のデンプン形質を調べるために、DSC法で熱糊化特性を分析し、データベースを作った。(3)イネ変異体のデンプンのレオロジー分析法の整備・準備を行い、データ収集した。またグルカンの分子量測定のための分析条件を検討した。3.イネデンプン変異体の選抜とデンプン変異体ライブラリーの構築

前年度までに作製したイネ種子胚乳澱粉変異258系統について遺伝様式の解明を行い、全て単因子変異であることを確認した。また、水稲品種金南風及び台中65号のMNU受精卵処理後代より新たに150を超える変異を選抜した。本年度は3年目に当たり、以下の研究を推進した。1.組換え体による新規デンプンの作製イネ種子の登熟初期に種子のシンク機能の発現を強化するために、ホルモンレベルが変動する形質転換体を作製する。本年度はWaxyプロモーターに制御されるサイトカイニン合成遺伝子iptをイネヘ導入し、十分量の形質転換体を作製した。2.形質転換体・変異体の基本形質の解析およびデンプン物性の解析イネ変異体のデンプンのレオロジー分析法の整備・準備を行い、データ収集した。またグルカンの分子量を決定し、変異体ごとに分子量の異なるデンプンができていることを明らかにした。3.イネデンプン変異体の選抜とデンプン変異体ライブラリーの構築前年度までに得た稲品種金南風及び台中65号のMNU受精卵処理後代より選抜した胚乳変異系統について、固定化を進めた。これまでに得た変異系統について、原品種との交配及び戻し交配を行い、自殖F2(146組合せ)及びF3で遺伝様式を確認するとともに、同質遺伝子系統形成を進めた。さらに、既知の変異系統との交配F2(188組合せ)の解析を行い、同座性の確認と遺伝子相互作用について解析を進めた。新たに交配を行い、330組合せのF1種子を得た。4.変異体や形質転換体のデンプンの産業利用分野の調査および試験変異体デンプンの菓子への応用を槍討するために、デンプン物性と食品の機能性(難消化性)や加工性の関連を調べた結果、興味あるデータを得た。5.主要デンプン合成関与酵素機能のin vitro解析イネのBE, Phoアイネザイムの酵素学的な性質をリコンビナント酵素標品を用いて解析し、両者が強くかつ互いの機能を活性化することによってグルカン合成を行うとの特筆すべき成果を得た。特に、酵素間の相互作用は相乗的であることを初めて明確にした点は、デンプン代謝制御研究の新分野を開拓することにつながる成果と考える。6.国際シンポジウムの開催これまでの成果を問うために、本分野の世界的な研究者を招待して秋田で国際シンポジウムを開催した。国内外で現在最も活発に研究成果をだしている研究者が参加し、活発な討議が行われ、新たな共同研究が提案された。平成23年度に、プロシーディングスを発刊する計画である。本年度は、以下の研究を推進した。1.組換え体による新規デンプンの解析本年度は、イネ種子のホルモンレベルを改変し、登熟初期に種子のシンク機能を強化する形質転換体用を作成する目的で、Waxyおよびプロラミンプロモーター下流にサイトカイニン合成遺伝子を連結した。得られた種子を調査した。玄米一粒あたりの重量は強いプロモーターのWA:ipt3では117142%で、増収になったことが示された。イネー粒におけるアミロース含量は、ipt導入イネでアミロース含量が増えていた。以上の結果から、ホルモン調節によって、デンプンを質量ともに制御できる可能性が強く示唆された。2.形質転換体・変異体の基本
妊娠恒常性維持機構における羊膜マトリクス細胞蛋白の役割

(1)各妊娠時期での羊膜マトリクス細胞蛋白の発現変化:SPARC mRNA発現は、妊娠後期に40%減少し、TSP1は3倍に増加した。(2)羊膜プロスタグランジン合成酵素の発現変化:COX2 mRNAのみが妊娠後期に2倍に増加した。(3)流動細胞計測法を用いた羊膜上皮細胞分離法の確立:当初の上皮細胞増殖が不安定で、実験計画の変更を余儀なくされたため、新たな分離法を確立した。(4)羊膜上皮細胞における網羅的遺伝子発現解析:初代培養で増殖因子のmidkineやFGF2発現が低く、免疫抑制因子HLA-G発現は高かった。継代後midkine、FGF2の発現は急速に増加し、HLA-G発現は減少した。【目的】本研究では,羊膜における細胞外マトリクス蛋白の一種であり,組織修復や細胞増殖・分化制御を担うマトリクス細胞蛋白について検討することで,妊娠恒常性維持機構における羊膜の役割を究明することを目的とする.近年,生理活性物質であるプロスタグランジンが子宮収縮や陣痛に関連し,分娩発来機構で重要な役割を担うとされ,また,プロスタグランジンE2が細胞外マトリクス中のフィブロネクチンの軟化を即すことが示されている(Tamba et al., PNAS, 2008).平成24年度では,プロスタグランジンの合成酵素の羊膜における発現について,妊娠に伴う経時的変化を含めて解析検討した.【結果】プロスタグランジン合成酵素のうち,COX2 mRNAのみが妊娠中期から後期にかけて,約2倍の増加を示した.一方で,COX1,PTGES1,PTGES2,PTGES3については明らかな変化を認めなかった.【結論】妊娠中期から後期に向かって,妊娠羊膜上皮細胞におけるCOX2 mRNAのみが増加した.この妊娠による経時的な発現変化は,COX2を介するプロスタグランジン合成が分娩発来に向けて羊膜に影響を与えている可能性が考えられた.【目的】本研究の目的は,妊娠恒常性維持機構における羊膜の役割について究明することである.本年度では,前年度までの羊膜上皮細胞および間葉細胞の単層初代培養方法に細胞・組織増殖の不安定性が認められたため,flow cytometryを用いた新たな上皮細胞分離法を確立することを目的とした.【方法】妊娠後期羊膜(3739週)を採取し,トリプシン・コラゲナーゼ処理を行って,細胞懸濁液を作製する.羊膜上皮特異的蛋白であるEpiCAMを用いて,蛍光活性化セルソーター(FACS)で細胞分離を行う.分離された細胞の形態評価,EpiCAMおよび間葉細胞特異的蛋白のVimentinを用いて免疫染色を行い,羊膜上皮細胞を確認する.【結果】FACSの結果,90%以上の特異性をもってEpiCAM陽性細胞と陰性細胞の分離が可能であった.また,死細胞の指標であるPropidium Iodide陽性細胞は2030%に抑えることができた.さらに,分離された細胞でそれぞれEpiCAM,Vimentinの特異的発現が認められた.【結論】FACSを用いて,羊膜からの羊膜上皮細胞の安定的な分離方法を確立した.(1)各妊娠時期での羊膜マトリクス細胞蛋白の発現変化:SPARC mRNA発現は、妊娠後期に40%減少し、TSP1は3倍に増加した。マトリクス細胞蛋白の羊膜における発現の検討【目的】本研究では,羊膜における細胞外マトリクス蛋白の一種であり,組織修復や細胞増殖・分化制御を担うマトリクス細胞蛋白の発現,機能について検討することで,妊娠恒常性維持機構における羊膜の役割を究明することを目的とする.平成23年度では,羊膜におけるマトリクス細胞蛋白の発現について,妊娠に伴う経時的変化を含めて解析検討した.【方法】妊娠中期羊膜(18ー23週)および妊娠後期羊膜(37ー39週)から羊膜上皮細胞を単層初代培養し,マトリクス細胞蛋白であるsecreted protein, acidic and rich in cysteine(SPARC), Thrombospondin1(TSP1), TSP2, Tenascin-C(TNC)のmRNAの発現について,TaqMan realtime RT-PCR法により検討した.【結果】SPARC mRNAの発現は,妊娠中期から後期にかけて,約40%の低下傾向を示した.一方で,TSP1の発現は妊娠後期が中期の約3倍と増加していた.TSP2,TNCについては明らかな変化を認めなかった.【結論】妊娠中期から後期に向かって,羊膜上皮細胞におけるSPARC mRNAが減少し,TSP1 mRNAは増加するといったマトリクス細胞蛋白発現の変化が認められた.この妊娠による経時的な発現変化は,羊膜における細胞外マトリクス構築に影響を与えている可能性が考えられた.【目的】