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革命、内戦期ウクライナの国制史的研究―中東欧における「一民族一国家体制」の成立

前者は、1917年のウクライナへの自治導入時に臨時政府に協力的であったペトログラードの穏健派ウクライナ人集団の活動について、史料調査の成果をもとに初めて明らかにした研究であり、英文雑誌に投稿し、審査中の段階である。後者は、1918年にウクライナにあらわれた諸国家の外交政策が、目指すべきとされた国制と密接に関連していたことを明らかにしたもので、次号の『ロシア・東欧研究』に査読論文として掲載されることが決定している。さらに、『ロシア史研究』102号には、ブレスト=リトフスク条約についての最新の研究であるBorislav Chernev, Twilight of Empireの書評を、ウクライナ史研究の立場から執筆した。平成30年度の研究計画であった1先行研究の整理、2国内外での史料調査、3学会発表・論文投稿について、それぞれ当初の計画通り、一部はそれ以上の進展が見られ、研究はおおむね順調に進展しているといえる。1については、専門領域の先行研究の整理と批判的検討を行い、その成果を用い、学会発表や投稿論文において、自身の研究を研究史のなかに位置付けた。さらに、本年度には学会発表や論文投稿を行わなかった1919年以降の時期についても、準備段階として先行研究を整理した。さらに、自らの研究をより広い文脈のなかにおくため、常に他地域、他分野の研究もフォローしている。2については、三週間強にわたってベルリンおよびキエフに渡航し、充実した史料調査を行うことができた。とりわけ、ウクライナ国立図書館の手稿部では、1917年にペトログラードで活動していたウクライナ人のうち、特に重要な人物であるペトロ・ステブニツキーの個人史料を閲覧することができた。この成果は、国際学会での発表を英語論文に改稿する際に盛り込まれた。3については、国内外の学会でそれぞれ一回ずつの報告を行い、さらに邦語論文と英語論文を一本ずつ投稿した。そのうち邦語論文は査読論文として採録が決定し、また既に刊行された『ロシア史研究』107号には書評が掲載された。これは当初の予定以上の進展であり、1先行研究の整理と2史料調査の成果を、学会や雑誌での公開へと円滑につなげることに成功したといえる。今後も、1先行研究の整理、2史料調査、3学会発表と論文投稿を行っていく。そして、今年度と同様、1と2の成果を、すみやかに、かつ研究史的に意義のある議論とともに、学会や雑誌といった場所で公開していくことを目標とする。1については、平成30年度までに既に基本的な研究は整理が完了しているので、常に更新される最新の研究動向をフォローするとともに、ウクライナやロシアの専門誌など、手が届きにくい媒体の研究を積極的に探してゆく。また、平成30年度以上の比重を、他地域、他分野の関連する研究の整理に割く予定である。2については、5月から9月にかけて研究指導委託制度を用いてキエフのモヒラ・アカデミー国立大学で在外研究を行うので、その機会を利用する。平成30年度は主に首都の中央機関の文書館で作業を行ってきたが、県や市など、地方レベルの文書館の史料にも重要なものがあるので、それらも調査する。3については、平成30年度と同様に、学会報告で研究者からのフィードバックをうけ、論文投稿につなげていく。
近世地方城下町の社会構造の研究

平成24年度は、会津若松と郡山をフィールドに、それぞれ以下のようなことを研究し、明らかにした。まず会津若松に関しては、簗田氏の家の経営について検討した。特に、商人司としての側面がどのように変化するのかに注目して研究した。その結果、簗田氏は18世紀以降、商人司が本来持っていた商人を統括する権限を喪失し、一介の町役人として存在していたことが明らかになった。ただ、町役人としての職務の中に、会津若松を通過する商人の荷物の改めがあるところを見ると、商人司としての職務が町役人のそれの中に引き継がれていることがうかがえる。また、簗田氏はこの時期、小規模ながら町屋敷経営を行っており、こうしたところから収入を得ていたものと思われる。次に郡山に関しては、永原家の経営分析を行った。永原家は城下では比較的大規模な酒造屋であった。しかし、18世紀末に一時、酒造経営を休止する。そして、それと時を同じくして酒造仲間内の役職である酒造改役を降板する。このことから、酒造屋経営の盛衰と酒造仲間内での地位のあり方は、相互に連関しあっていると評価できる。また、郡山の株仲間と町についても分析を試みた。その結果、近世半ば以降、郡山では株仲間の種類と町域との間に関係性は見られないことが判明した。以上の点から、地方城下町の社会構造の一端を、家の経営・仲間組織・町の三つの要素から明らかにし得たと言える。城下町・会津若松と郡山について、計二点のことを明らかにした。(1)会津若松の塗り物商人のあり方と、19世紀以降江戸での塗り物の販売拠点となった会津藩産物会所の特異性を明らかにした。まず前者について。若松の塗り物商人は市場ごとに塗店(城下)、大坂出し、江戸出し、田舎出し(地方)の四つの仲間に分かれていた。しかし、彼らは重複して所属したり、仲間を渡り歩くなど流動的であった。ただ人数は、江戸出し、田舎出しが圧倒的に多く、これらの地域が主たる出荷先であると考えられる。以上のような具体相が、今回の研究で明らかになった。次に後者について。産物会所といえば、藩あるいは御用商人が領内の産物を一手に買い上げ売り捌く、というイメージで捉えるのが一般的である。しかし、会津藩の場合、塗り物商人の江戸での販売方式(対面販売)に規定され、上述のような産物会所の機能は果たされず、あくまでも商人の宿として存立し続けた。こうしたあり方は従来の産物会所のイメージに再考を促すものである。(2)郡山藩在方の酒造業の展開について明らかにした。同藩在方では元禄期から洒造株が藩によって公認されていた。株数自体は増えないものの、天明期までには株高を上回る酒造を行うようになっていた。ここに在方酒造の成長が窺える。また、この時期には交通の要所に位置する村に酒の「中次渡世」と呼ばれる者が発生した。彼らの手によって在方の酒は大都市消費圏へと出荷された。その流れの中で、本来は城下で造った酒以外を売ってはならないはずの郡山城下へ、これらの酒が流入した。文化期には在方での株数が大幅に増えた。特に、郡山城下の酒造株が在方の者に取得されていく、という点が興味深い。こうして、卒業論文で明らかにした城下酒造の衰退は、在方酒造の成長と表裏一体で進行することが明らかとなった。また、在方酒造の展開過程の事例検討を積み上げることにも貢献した。平成22年度は、地方城下町の社会構造を、流通政策を切り口に研究した,本年度は、フィールドを会津若松に絞り、町役人の家に残された「御国産一件」に関する一連の史料を分析した。そして、天保期に会津藩で議論された国産品政策の動向について解明した。以下、明らかになった点を述べる。(1)会津藩では近世初頭から藩の強権的介在の下、塗り物の生産が積極的に行われていたが、天保期には藩外、特に江戸への出荷量が激減した。そのため、当該期に会津藩で国産品政策を巡る議論が行われることになる。(2)「抜け荷」と呼ばれる不良品の出荷を差し止めるため出荷先を江戸に限定したいど主張する江戸藩邸側の担当役人-産物会所経営請負人と、生産量増大を計るため出荷先を限定せず全国各地に売り込みたい在藩の担当役人-町役人という対立構造が見て取れる。(3)しかし、両者とも、江戸の産物会所は"国産品を賑売する国元の商人が逗留する宿"と認識している。従来、産物会所=藩が主導して国産品を一手に売りさばく機関、との認識が一般的であったが、(3)に見るように"商人の宿"として第一義的に存在する産物会所の事例として希有なケースを明らかにしえた。

ただ、町役人としての職務の中に、会津若松を通過する商人の荷物の改めがあるところを見ると、商人司としての職務が町役人のそれの中に引き継がれていることがうかがえる。また、簗田氏はこの時期、小規模ながら町屋敷経営を行っており、こうしたところから収入を得ていたものと思われる。次に郡山に関しては、永原家の経営分析を行った。永原家は城下では比較的大規模な酒造屋であった。しかし、18世紀末に一時、酒造経営を休止する。そして、それと時を同じくして酒造仲間内の役職である酒造改役を降板する。このことから、酒造屋経営の盛衰と酒造仲間内での地位のあり方は、相互に連関しあっていると評価できる。また、郡山の株仲間と町についても分析を試みた。その結果、近世半ば以降、郡山では株仲間の種類と町域との間に関係性は見られないことが判明した。以上の点から、地方城下町の社会構造の一端を、家の経営・仲間組織・町の三つの要素から明らかにし得たと言える。
エピゲノム異常が合指症を引き起こすメカニズムの解明

合指症は生まれつき隣り合った指が癒合した状態であり、少なくとも9つのタイプに分類される先天性四肢障害である。遺伝子のミスセンス突然変異やDNA配列の重複が発症原因として報告されているものもあるが、多くのタイプではその原因は不明のままである。本計画ではクロマチン因子の一つであるポリコム複合体とその共役因子であるCTBPに着目し、合指症発症の分子機構をエピジェネティクス制御機構の破綻の観点から明らかにすることを目指す。
高発生力型の新規自律振動性高分子ゲルの創製

生体は,流入するエネルギーと生体内部で散逸するエネルギーが均衡して,一定の散逸構造を持つシステムである.その生体内部には,神経細胞の膜電位,心臓の拍動,サーカディアンリズムなど,細胞レベルから一個体至るまでの階層において自律的な機能を有している.このような生体が持つ複雑かつ精密に組み立てられた時空間機能を,人工的に組み上げることができれば,生体を模倣したアクチュエータや自律歩行するゲルロボットや自律駆動ポンプなどの実現が期待できる.本研究では,生体システムと同程度もしくはそれ以上の発生力を有する自律振動性の高分子ゲルの実現を目指す.生体は,流入するエネルギーと生体内部で散逸するエネルギーが均衡して,一定の散逸構造を持つシステムである.その生体内部には,神経細胞の膜電位,心臓の拍動,サーカディアンリズムなど,細胞レベルから一個体至るまでの階層において自律的な機能を有している.このような生体が持つ複雑かつ精密に組み立てられた時空間機能を,人工的に組み上げることができれば,生体を模倣したアクチュエータや自律歩行するゲルロボットや自律駆動ポンプなどの実現が期待できる.本研究では,生体システムと同程度もしくはそれ以上の発生力を有する自律振動性の高分子ゲルの実現を目指す.近年、外部刺激(入力)に体積変化を起こす刺激応答性高分子やゲルを使った高分子アクチュエータが様々な分野において注目されている。一方、生体システムは自律的に駆動することができる。もし、生体のように自律的に駆動することができるアクチュエータを人工系において設計することができれば、これまでにない応用や展開が期待することができると考えられる。過去の研究において、PNIPAAmゲル内部で振動反応として知られているBelousov-Zhabotinsky(BZ)反応の金属触媒を共重合することで、力学的な膨潤・収縮運動を引起すことが知られている。そこで、申請者は自発的に拍動する自励振動ゲルに傾斜構造を導入し、屈曲・回復振動するゲルをラチェット効果によって自律歩行させることを実現し、さらに、自励振動ゲルのBZ反応に伴う膨潤・収縮変位を飛躍的に増大させ、自発的に的に蠕動運動する高分子ゲルを見出した。蠕動運動するゲルはBZ反応の金属錯体と温度応答性高分子であるPMPAAmを重合時に、ミクロ相分離させることで実現した。ミクロ相分離したゲルは、BZ反応の化学反応波の伝播に伴って、局所的に膨潤した領域を直接確認することができた。飛躍的なゲルの体積振動の振幅増大に伴い力学的な張力振動を計測した所、従来報告されていたゲルの約10倍程度であることが分かった。さらに、ミクロ相分離したゲルに、鎖状高分子をセカンドネットワークとして導入した所、張力振動が飛躍的に増大することが明らかとなった。生命体は,流入するエネルギーと生体内部で散逸するエネルギーが均衡して,一定の散逸構造を保つ,非平衡開放系の分子システムである.その生体内部には,神経細胞の膜電位,心臓の拍動,サーカディアンリズムなど,細胞レベルから一個体至るまでの階層においてあらゆる時空間機能を包括している.このような生体が持つ複雑かつ精密に組み立てられた時空間機能を,人工的に組み上げることができれば,生命体に近い分子システムをテイラーメイドに構築することができる.そのようなシステムを構築するため,時空間秩序を生成するBelousov-Zhabotinsky (BZ)反応に着目した.これまで,ポリマー鎖にBZ反応の金属触媒を内包させることで,心臓の拍動のようにゲルの自励的かつ周期的な構造変換を可能にしてきた.しかしながら,これまでの分子デザインでは,膨潤・収縮挙動が非常に小さいため,アクチュエータとして機能させることが困難であった.本研究では,ゲルの分子デザインと合成方法を改良することで,生体システムと同程度もしくはそれ以上の発生力を有する自律振動性の高分子ゲルの実現を目指した.さらに,本提案ゲルの物理化学的諸物性を明らかにすることで,そのメカニズムを明らかとすることも目的とした.具体的にはゲル内部にミクロ相分離機構を導入することで,特徴的なナノサイズのドメイン構造を導入することで、変位が大きくかつ発生力が大きいゲルの設計を行った.その内部構造は、SEMや光散乱によって明らかにした.
限界集落のコミュニティ・エンパワメントに関する実証的研究

小規模集落における地域力を引き出すコミュニティ・エンパワメント・スキームの構築のため、大分県中津市山国地区、同県宇佐市院内地区、同県日出町南浜地区、同県豊後高田市玉津地区において、地域アセスメント、地域プランニング、地域アクションのそれぞれのステップを住民参加型のスキームに基づいて行い、その効果について実証的な検討を行った。その結果、とくに山国地区においては「たいしょう陣」と呼ばれる住民参加型のサロン活動が継続的に実施され、また南浜地区では「南浜停留所」と呼ばれる住民の寄り合いの場が形成されるなど、住民の関係性を活性化する地域力を引き出すことに一定成功したと考えている。平成24年度においては、小規模集落におけるコミュニティ・エンパワメントの対象地域となった大分県宇佐市院内地区、大分県豊後高田市玉津地区、大分県速見郡日出町南浜地区の3つに地区において、コミュニティ・アセスメントを行った。基本的に地域住民全数に対して、経済的側面、心身健康的側面、社会関係的側面の三つの側面からのアンケート調査と面接聞き取り調査を実施し、対象地域の住民が置かれている生活課題と、生活実態を評価する調査研究を行った。そのうえで、調査結果を各地域の住民に住民懇談会の手法を持って公表し、そこから地域住民自身がどのような問題解決の可能性を持っているか、それをブレーン・ストーミングの方法を用いて、地域課題の抽出とその解決に向けたコミュニティ・プランニングを行うところまでを平成24年度では実施した。その結果、地域住民が望んでいるのは、いわゆる落下傘型や行政主導型の地域づくりではなく、住民相互の活動による「自前のコミュニティ形成」であることが明らかになった。平成25年度は、このコミュニティ・プランニングに基づいて、地域住民自身が実際に地域の問題解決に向けて活動できるような、コミュニティ・アクションを展開してゆきたいと考えている。また、そのアクションの結果を評価することにより、一連のコミュニティ・エンパワメント・スキームの効果測定を行うことを予定している。なお、もう一つ本研究の実施対象地域であった、大分県中津市山国地区は、九州北部豪雨災害のため大きな被害を被り、残念ながら研究スキームの実施ができなかった。このことが、平成24年度の予算を全額消化できなかった最大の理由である。現地は徐々に復興しつつあり、その復興のプロセスも踏まえて、平成25年度に4地区のコミュニティ・エンパワメント・スキームの実施とその効果測定を行いたいと考えている。また、豊後高田市玉津地区では、地域のリーダーシップをとる寺院の住職が、自らの寺の境内を開放して住民の「集いの場」をもうける試みを始めたり、宇佐市院内地区では億集落ごとに「地域住民の集い」を開催してKJ法に基づくブレーンストーミングを実施し、地域住民が自らの地域作りに対して主体的に関わるための動機作りを形成するなど、各地区において「住民参加型のコミュニティ・エンパワメント・スキーム」に基づく地域アセスメント、地域プランニング、地域アクションを展開することによって、住民の「主体性」を引き出すことに一定成功するコミュニティ・エンパワメントの展開のための実践モデルの構築に一定成功することができたと考えている。今後の課題として、このスキームがどのような効果を上げることができたのか、を実証的に研修する、「評価研究」の必要性と可能性が残されていると考える。平成23年度においては、本研究のフィールドサイトとなった大分県中津市山国町において、コミュニティ・エンパワメントを推進する中核機能を担うネットワーク協議会の設立(源流の里やまくに福祉の会)、ネットワーク協議会が中心となった山国地区に住む全世帯を対象とした「生活課題実態調査」の実施とその分析、そこから析出された住民相互の連帯感情にもとづいたサロン活動「たいしょう陣」の開催、までに至る、山国町におけるコミュニティ・エンパワメントの基礎となる活動のフィールドワークを行い、周辺地域・限界集落における地域住民の主体性の形成過程についてのデータの収集を行った。また、設定されたコミュニティ・エンパワメント・モデルとの整合性を確認しながら、地域住民の主体性と可能性が引き出されてゆくプロセスを科学的に分析し、仮説的に構築されたコミュニティ・エンパワメント・モデルの実証的な検討を行った。その結果、住民の主体性に基づいた地域活動を展開してゆくことによって、周辺地域・限界集落であっても、住民自身の生活ニーズを相互に充足してゆくことが可能であることを実証した。

また、とくに住民の相互関係・相互作用の活性化によって、住民自体の主体や自主性を引き出してゆくことが可能になるような、コミュニティ・ソーシャルワークの活動の必要性についても一定の実践的蓄積を得ることができた。このような結果を基にして、次年度はコミュニティ・エンパワメントの具象化に向けた、コミュニティ・ソーシャルワーク実践の実際的な在り方を、中津市社会福祉協議会との協働において展開してゆく予定である。このことを持って、都市部とは異なった生活背景を持つ周辺部・限界集落における、住民の生活ニーズを充足しうるような地域福祉システムの構築を試みる。「やや遅れている」と評価したのは、先にも述べたように九州北部豪雨災害によって、調査対象地域が大きな被害を被り、予定していた調査ができなかったためである。しかし現地は徐々に復興しつつあり、平成25年度の調査実施に向けて現在現地と調整中である。そのほかの対象地域となった宇佐市院内町、豊後高田市玉津地区、速見郡日出町南浜地区については、当初の計画通り順調に研究は推移している。平成23年度は仮説的に構築したモデルに従い、コミュニティ・エンパワメントの理論枠組みとその具象化の方法としてのコミュニティ・ソーシャルワークの実践について実証的な検証を試みることを目的としており、とくに山国町におけるネットワーク協議会(源流の里やまくに福祉の会)との協働によって「たいしょう陣」と呼ばれるサロン活動の開催過程までを実証的に把握することができたが、地域のキーパーソンである民生委員協議会長が体調不良により入院され、そのため一連のコミュニティ・エンパワメントの活動が一時期停止したことがあった。これは予期せぬことであったが、そのために本来であればより詳細なデータ収集と分析、また実践の展開が可能であったものが、極めて限定された回数に制限されることとなった。この点は平成23年度の課題であるが、平成24年度は新しく民生委員協議会も改変され、活動の活性化が期待されるので、「周辺部・限界集落における住民の主体性に基づいたコミュニティ・エンパワメントの具体的な方法論の構築」という本研究の主題に基づいたフィールドワークを展開してゆきたい。平成25年度においては、平成24年度に実施した宇佐市院内地区、豊後大野市玉津地区、速見郡日出町南浜地区のコミュニティ・エンパワメントの効果を評価する評価研究を行うとともに、災害によって遅れていた中津市山国地区のコミュニティ・エンパワメント・スキームの展開を実施する。これら四地区のコミュニティ・エンパワメントの実践とその効果、また評価結果を研究報告書としてまとめ、年度終了までに刊行することを目的とする。平成24年度においては、一定の活動の蓄積を経てきた山国町をフィールドサイトとして、中津市社会福祉協議会との協働において、コミュニティ・エンパワメントの概念を具象化するコミュニティ・ソーシャルワークの方法論を検討し、それを実践モデルとして構築したうえで、実践展開してゆくことを検討している。
初めてのシラノン遷移金属錯体の単離とその構造および性質の解明

昨年度は、当初の計画に従い目的とするシラノン-遷移金属錯体の良い前駆体になり得ると予想された新規錯体[Tbt(Mes)Si(μ-O)(μ-Se)ML_n](2)の合成ルートを確立した。今年度は研究計画に基づき、2の脱セレン化反応によるシラノン錯体[Tbt(Mes)Si(μ-O)ML_n](1)の合成を検討した。熱および光照射条件下での錯体2と3価リン試剤との反応を行った。種々条件ならびに金属に対し検討を重ねた結果、400nm付近の光照射条件下で2a(M=Pt,L_n=diphenyl phosphinoethane)とHMPT(=hexamethylphosphorous triamide)との反応を行った場合に低収率ではあるものの、対応するホスフィンセレニドの生成を^1Hおよび^<31>PNMRにおいて確認した。しかしながら、架橋セレンのケイ素ならびに金属との結合が非常に強固であったために、更なる反応の進行、ならびに^1Hおよび^<31>PNMRにおいて脱セレン化によって生成した生成物の単離・同定には至らなかった。また本年度は、2ヶ月間に渡ってアイスランド大学・Ingvar Arnason教授との共同研究により、ケイ素化学の分野において長年に渡りその構造・性質・物性に非常に興味が持たれてきたものの未だその合成すら報告されていない重要な化合物であるトリシラベンゼンの合成ルートを探求し、その合成における重要な鍵になり得ると期待される新規な試剤を開発した。さらには、遷移金属錯体の素反応研究の遂行においてより高度な技術と知識を取得することを目的に、米国ロチェスター大学に渡航し、William D.Jones教授のグループにて研究を行い、芳香族炭素-ロジウム結合エネルギーに及ぼす芳香環上のフッ素置換基の熱力学的および速度論的効果を明らかにした。本研究では、シラノンの性質の解明を目的としてシラノン遷移金属錯体に着目し、ヒドロキシシランカルコゲノールTbt(Mes)Si(OH)EH{Tbt=(2,4,6-{CH(SiMe_3)_2}_3C_6H_2)}1(E=S,Se)を活用することで、ケイ素、酸素、遷移金属、カルコゲン元素から成る四員環メタラサイクルを合成・単離し、その脱カルコゲン化反応による標的化合物の合成を目標としている。本年度は、シラノン-白金錯体の合成を目指し、(1)その良い前駆体と考えられる、ケイ素、酸素、白金、カルコゲン元素からなる環状錯体の合成とその性質の解明、(2)3価リン試剤との反応による標的化合物の合成検討、を行った。まず、[Tbt(Mes)Si(μ-O)(μ-E)Pt(PPh_3)_2]2(E=S,Se)に対して、過剰量の各種3価リン試剤(R_3P)との熱反応を検討した結果、トリフェニルホスフィンを用いた場合には新たな生成物は全く確認されず、HMPT(R=Me_2N)などのリン試剤を用いた場合には配位子交換反応が進行するのみであり、目的とする脱カルコゲン化反応は全く進行しなかった。次に、キレート効果により配位子交換反応を抑制することを目的に、[Tbt(Mes)Si(μ-O)(μ-E)Pt(dppe)]{dppe=1,2-bis(diphenylphosphino)ethane}3a(E=S)および3b(E=Se)を合成・単離し、その構造的特長を明らかにした後、3と過剰量の各種三価リン試剤との熱反応では末反応であったが、2を用いた場合とは異なり、配位子交換反応は全く観測されなかった。次に光照射条件下(高圧水銀灯)で、3bと10当量のHMPTとの反応をNMRで反応を追跡したところ、^<31>P{^1H}NMRにおいて、トリスジメチルアミノホスフィンセレニド(Me_2N)_3P=Seの生成を確認した。基質ならびに反応条件の最適化について検討中である。

また本年度は、2ヶ月間に渡ってアイスランド大学・Ingvar Arnason教授との共同研究により、ケイ素化学の分野において長年に渡りその構造・性質・物性に非常に興味が持たれてきたものの未だその合成すら報告されていない重要な化合物であるトリシラベンゼンの合成ルートを探求し、その合成における重要な鍵になり得ると期待される新規な試剤を開発した。さらには、遷移金属錯体の素反応研究の遂行においてより高度な技術と知識を取得することを目的に、米国ロチェスター大学に渡航し、William D.Jones教授のグループにて研究を行い、芳香族炭素-ロジウム結合エネルギーに及ぼす芳香環上のフッ素置換基の熱力学的および速度論的効果を明らかにした。
分子疫学コホート調査に基づく生活習慣病関連新規情報伝達物質の動作原理

microRNA(miRNA)は、蛋白質翻訳制御に関与する非コードRNAである。miRNAは体液中にも存在し、疾患との関連性やバイオマーカーとしての応用が期待されている。しかし、生物学的機能は不明である。本研究では、分子疫学調査で得たデータを用いて、血清中に存在する生活習慣病関連miRNAとしてmiR-22-3pを同定した。また、寿命関連転写因子Foxo3aは、miR-22-3p発現に関与することを明らかにした。Foxoファミリーは、寿命関連転写因子として知られている。ヒトFOXO3A遺伝子におけるバリアントは、ヒト寿命に直接影響を及ぼすことが報告されている。近年、Foxo1及びFoxo3aは、カロリー制限(CR)における寿命延長及び加齢における悪性腫瘍発生に関与すること報告した(Yamaza et al, Aging Cell, 2010)(Shimokawa et al, Aging Cell, 2015)。一方、本研究着目分子であるmiR-22-3pは、Foxoファミリーと相互作用していると推察されているが、その作用機序は明らかではない。そこで、CRを施したFoxo3aヘテロ欠損ファミリー(Foxo3a+/--CR)マウスを用いて、血中Ago2結合型miR-22-3p発現を解析した。その結果、Foxo3+/--CRマウスにおいて、miR-22-3p発現は上昇していた。この結果は、Foxo3aはCRにおいてmiR-22-3p発現調節を担っていることを示唆する。平成27年度は、上記解析結果を得たと同時に、コンディショナルfoxoファミリーKOマウスの導入するに至った。現在、順調に繁殖している。以上、進行状況および本研究成果に基づく新たな今後の研究の発展性・波及性が得られたことから「おおむね順調に進展している」と判断した。miRNAは細胞内のみならず、血液中にも存在することが明らかとなっている。しかしながら、生物学的機能および病態との関連性は、未だ不明点が多い。本年度は最初に、老化および加齢に伴う生活習慣病の発症における、細胞内および血液中に存在するmiRNAのスクリーニングを行い、幾つかの候補を得た。なかでも興味深い分子的機能を示すmiR-X(Xは番号)に着目して、in vivo解析を行った。その結果、miR-Xは、加齢における代謝機能に関与するデータを得た。現在は、寿命モデルや肥満モデルマウスを作製して、miR-Xを中心とした分子メカニズム解明を行っている。分泌型miRNAは、生物学的意義は不明点が多い。その現状の中、Foxoファミリーと分泌型miRNAとの関連性を示唆するデータが得られたことは大変意義があると考えている。現在は、コンディショナルFoxoファミリー欠損マウスを用いて解析する予定である。炎症学、組織再生学、老化学支払い予定の実験動物維持費が減額したため。平成28年度の実験動物維持費に使用する予定である。
T細胞シグナル伝達機構におけるItkチロシンキナーゼの役割

T細胞の活性化におけるチロシンキナーゼItkの機能的役割を明らかにする目的で、各種T細胞表面抗原を単クロン抗体により刺激し、Itkのチロシンリン酸化が惹起されるか検討した。その結果、抗CD2,抗TCR/CD3および抗CD28抗体で架橋後速やかにItkのチロシンリン酸化が起こった。このリン酸化の経時変化を調べたところ、刺激後1分でリン酸化が最大になっていた。また、Itkのチロシンキナーゼ活性を検討したところ、抗CD2,抗TCR/CD3および抗CD28抗体の架橋により活性が約5倍まで上昇した。以上より、T細胞活性化へのItkの関与が示唆されたため、T細胞表面抗原からのシグナル伝達の最終的な標的であるIL-2プロモーターの対するItkの必要性を検討した。野生型Itk,チロシンキナーゼ活性を欠損したItk(ItkK391E)を発現する発現ベクターあるいはコントロールベクターをヒトT細胞株Jurkatに遺伝子導入し、表面抗原刺激に対するIL-2プロモーター活性をIL-2ルシフェラーゼ(IL-2Luc)を用い検討した。抗CD2、CD3あるいは抗CD2、CD3、CD28の両刺激により惹起されるIL-2プロモーター活性化は、K391Eにより強く抑制された。一方、野生型ItkはIL-2Lucを増強した。さらに、IL-2プロモーターの各種反応性エレメントの中でも特に重要であることが判明しているNFAT反応性エレメントに対する影響をNFATLucを用いて検討した。その結果、K391EはCD2,TCR/CD3のいずれの刺激に対しても強く抑制を招来した。以上の結果から、ItkはCD2,TCR/CD3からIL-2プロモーターなかんずくNFATに至るシグナル伝達に必要であり、T細胞活性化に極めて重要な役割を担っていることが証明された。
単層カーボンナノチューブ垂直配向膜の制御CVD合成と熱・光デバイスの試作

熱・光デバイス応用に期待される垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の高度な構造制御技術を開発した.ナノチューブ膜厚さやナノチューブ直径の制御,また基板上へのパターニング法などデバイス応用には必要不可欠な合成法やその成長メカニズムに関する多くの知見を得ることができた.さらに,単層カーボンナノチューブ膜の熱伝導率の計測を様々手法で行うことにも成功した.熱・光デバイス応用に期待される垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の高度な構造制御技術を開発した.ナノチューブ膜厚さやナノチューブ直径の制御,また基板上へのパターニング法などデバイス応用には必要不可欠な合成法やその成長メカニズムに関する多くの知見を得ることができた.さらに,単層カーボンナノチューブ膜の熱伝導率の計測を様々手法で行うことにも成功した.本研究の目的である,アルコール触媒CVD法による垂直配向単層カーボンナノチューブ膜を用いた熱,光,電子デバイスへの応用に向けて欠かせないナノチューブ直径を制御した選択的合成に向けて,生成メカニズムの理解及び制御研究と進めた.まずは,ディップコート法を用いて,環境条件を変化させながら触媒を調整し,合成された単層カーボンナノチューブの特性への影響を観察し,そのメカニズムを考察した.さらに,触媒金属の微粒子径のサイズや膜厚を分布させたスパックー膜を用いたコンビの手法で制御した基板を用いたアルコール触媒CVD法を行い,分子動力学シミュレーションの結果と併せて生成機構を検討した.さらに詳細な実験によってナノチューブの成長がチャンバー内の微量な不純物ガスの存在に左右されることが分かったことを踏まえて,実験条件を的確にコントロールできる高真空CVD装置を開発し,成長機構の検討及び制御を行った.触媒を担持したシリコン基板を通電加熱によって直接加熱することによって,様々な実験条件下でアルコール触媒CVD合成を行い,結晶性の良い単層カーボンナノチューブが安定に合成できる実験条件を明らかにした.また,反応炉に直接ガスセルを連結して,フーリエ変換赤外吸収分光(FTIR)により反応後のガス分析を行い,さらに低次元化学反応シミュレーションと比較検討することで,アルコールの熱分解反応を含めた反応機構を同定した.アルコールCVD法などによる単層カーボンナノチューブの垂直配向膜合成においては, CVD温度,ガス圧力,ガス流量への依存性が複雑に関連する.膜厚と吸光度が比例することから,レーザー光の吸収を測定することでCVD中にリアルタイムでの膜厚測定を行う技術を用いて反応の現象論的なモデル化を進めた.触媒におけるナノチューブ合成初期反応速度はガス圧力が低圧の場合には,圧力に比例し,一次反応であることが分かった.また, CVDの進行と共に触媒の活性が失われ,反応速度が指数関数的に減少する.ところが,ガス流量が小さい場合にはCVDの進行にともなって反応速度が増大するような特異な現象が現れる.エタノールの分解反応モデルを用いたCFDなどの予測も加えて,エタノールの気相での熱分解の影響が大きいことが明らかとなった.とくに,エチレンやアセチレンなどの熱分解生成物の反応速度が大きく,エタノールガス中にこれらを微量に添加することで合成速度の急激な上昇なども確認された.一方で,これらの反応速度の速い炭素源を用いると合成される単層カーボンナノチューブの質の低下がみられる.ナノチューブは擬一次元構造を有することで,多次元物質に比べフォノン散乱が弱く,又炭素の強い共有結合による高いフォノン群速度により,その熱伝導率は非常に高いことが期待される.そこで,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の熱伝導率について,薄膜3ω法によって測定を行った.金属薄膜を垂直配向単層カーボンナノチューブ膜に直接蒸着をすることによって電極として,様々な膜圧のサンプルについての測定を行った.基板とカーボンナノチューブ膜との間の界面熱抵抗が大きく,測定精度のさらなる向上が必要ではあるが,予想に反してカーボンナノチューブ1本あたりの熱伝導率は100W/mK程度以下の小さなものとなった.ナノチューブ複合材料のモデル計算なども進めてこの原因を検討中である.単層カーボンナノチューブのデバイス応用には,その構造制御(直径,長さなど)だけでなく,任意の位置・方向に合成する技術が必要である.自己組織化単分子膜(SAM)を用い,基板表面の濡れ性を制御することで,シリコン基板表面上において単層カーボンナノチューブのパターニング合成に成功している.さらに,位置制御の精度や分解能を高めることができ,今後の応用に向けた重要な結果を得ることができた.また,垂直配向SWNTの熱伝導率を,ラマン散乱分光法を用いて計測した.垂直配向単層カーボンナノチューブ膜に対してレーザーを照射すると,レーザースポット内の単層カーボンナノチューブが加熱される同時に,その表面からラマン散乱が生じる.そのラマン散乱スペクトルは顕著な温度依存性がある為,この温度依存性から単層カーボンナノチューブの温度を計測することができる.垂直配向膜の厚さや,レーザーパワーなどを変化させることで,レーザースポット内の温度分布を分析し,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の軸方向の熱伝導率を解析した.さらに,単層カーボンナノチューブの熱伝導デバイス応用に向け,ポリマーを用いて垂直単層カーボンナノチューブ複合材料の作成を試みた.シリコン基板上に合成した垂直配向単層カーボンナノチューブに,加熱し融解させたポリビニルアルコール(PVA)を流し込み,室温にて凝固させた.得られた単層カーボンナノチューブ・PVA複合材料をSEM観察やラマン散乱分光法を用いて分析を行った.
硬組織におけるPTHの新規作用に着目したミネラル代謝異常に関する 基礎的研究

ラット頭頂骨由来骨芽細胞(in vitro)およびマウス頭蓋骨(ex vivo)を用いて、PTHによる線維芽細胞増殖因子(FGF)23の発現調節について検討したところ、PTHはFgf23のプロモーター活性を促進したが、mRNAおよびタンパクレベルでの変動には有意差が得られなかった。一方、活性型ビタミンD3(1,25D)によるFGF23発現誘導下では、PTHは1,25DによるFgf23mRNAおよびタンパク発現誘導を抑制した。その一因として、PTHによるビタミンD受容体およびIII型ナトリウム依存性リン酸トランスポーター(Pit1)の発現低下が認められた。また、PTHはPKAシグナルを介してERKの脱リン酸化酵素MKP1のリン酸化を促進し、FGF23のシグナルを減衰させることが明らかとなった。副甲状腺から分泌される副甲状腺ホルモン(PTH)は、活性型ビタミンD3(1,25D)とともに血中のリン(Pi)やカルシウム(Ca)の調整に深く関わっている。しかし、慢性腎不全の患者は高Pi血症および低Ca血症に陥っており、改善するため副甲状腺からPTHが分泌される結果、副甲状腺過形成となってPTHが恒常的に過剰分泌されるようになる。本件申請者らはこれまで、1,25D、PTHおよびその他の因子(FGF23、老化関連タンパクKlotho等)による骨局所でのミネラル代謝調節において研究を行っており、中でも分泌型Klothoが直接血中PiおよびCa濃度に影響することなく骨の石灰化を調節していることを明らかにした。本件ではさらに、ラット頭頂骨由来骨芽細胞(in vitro)およびマウス頭蓋骨(ex vivo)を用いて、PTHによるFGF23の発現調節について検討したところ、PTHはFGF23のプロモーター活性を促進するが、mRNAおよびタンパクレベルでの変動には有意差が得られないことが明らかとなった。一方、1,25DによるFGF23発現誘導下では、プロモーター活性は促進するもののその程度が低下し、1,25DによるFGF23 mRNAおよびタンパク発現誘導が抑制されることが明らかとなった。また、FGF23はMAPKカスケードのERKをリン酸化することがわかっているが、PTHはPKAシグナルを介してERKの脱リン酸化酵素MKP1のリン酸化を促進し、FGF23のシグナルを減衰させることが明らかとなった。以上より、PTHによるFGF23の発現およびシグナル調節の機序が一部解明された。これを元に、より詳細な下流因子の特定が期待される。現在日本の二次性副甲状腺機能亢進症(sHPT)患者は約10万人いると推定され、内科的治療の効率性向上に大きな期待がかかっている。一方、本研究代表者らはこれまで、活性型ビダミンD、PTHおよびその他の因子(FGF23、Klotho等)による骨局所でのミネラル代謝調節において研究を行っており、中でも分泌型Klothoを用いて血中PiおよびCa濃度に影響することなく骨の石灰化を調節することに成功するなど、骨を基軸とするミネラル代謝異常の治療を現実的なものにしつつある。そこで本研究代表者は、PTH-FGF23フィードバック機構の正常化を主とする骨からのアプローチがsHPTの新規治療法の開拓につながると想定し、骨におけるFGF23のシグナルを抑制するPTHの下流因子を特定し、直接血中Ca濃度に影響することなくPTHの分泌を抑制し、骨・関節症状や異所性石灰化を軽減・消失させるという治療の可能性に着目した。当該年度では、PTHによるFGF23のシグナル抑制のメカニズムを明らかにするためにPTHR1発現調節モデルの作成およびsHPTモデルラットの作成を計画していた。前者は想定通り継続中であるが、後者については代謝ケージを用いた飼育が困難なため、外注委託に変更検討中である。また、RC細胞を用いたPTHの下流因子(FGF23シグナル抑制因子)の同定あるいは限定を目的とした実験について、PTHの下流因子候補の絞り込み(PKA・PKCリガンド、Gタンパク共役型受容体リガンド等)を行い、PTHおよび下流因子候補を用いたFGF23シグナル抑制有無で変動する遺伝子を網羅的に解析、検討中である。先述のsHPTモデルラット作成については、外注委託をしない場合、正常ラットに浸透圧ポンプを皮下埋入し、恒常的に高レベルのPTHを維持するモデルの作成も検討する。その他、以下の3点を行う。・RC細胞を用いたPTHの下流因子(FGF23シグナル抑制因子)の同定あるいは限定・RC細胞およびPTHR1発現調節モデルにおけるPTH下流因子を標的としたFGF23シグナル正常化の検討

・sHPTモデルラット(もしくは浸透圧ポンプを用いた正常ラット)におけるPTH下流因子を標的とした治療検討・PTHの下流因子をRC細胞およびPTHR1発現調節モデルにおいて再現性確認関連経費:培養試薬・器具・RC細胞にPTH投与下あるいはPTHR1発現調節モデルにおいて、PTH下流因子を阻害(中和抗体・アンタゴニストの作製完了が期間中に困難な場合は、効果の検討はsiRNA等の遺伝子操作のみ行う)することでFGF23シグナルが抑制されないことを確認、その効果によって以降の実験に用いる手法を選択する関連経費:培養試薬・器具、中和抗体・アンタゴニスト作製依頼または購入費、遺伝子操作(siRNA等)関連試薬、リアルタイムRT-PCR等の発現解析試薬・sHPTモデルラット(もしくは浸透圧ポンプを用いた正常ラット)に対してPTH下流因子を標的とし、1)で効果的と判断した手法で治療(投与方法は要検討e.g.キャリアの有無、腹腔・皮下・静注等)、「FGF23シグナルが正常化するか否か」「直接的に血中Ca濃度が上昇しないか否か」「骨・歯(硬組織)および血管(軟組織)への石灰化の影響したか否か(X線および組織学的)」を検討する。関連経費:ラット飼育維持費、処置材料費、腎および血中マーカー測定キット、リアルタイムRT-PCR等の発現解析試薬、X線μCT解析費、一般組織・免疫染色用試薬
協同的DNA分子認識能を有する遺伝子治療薬の分子設計

我々が見い出した抗生物質デュオカルマイシンがディスタマイシンなどの他種分子とヘテロダイマーを形成による協同的なDNAの配列認識の分子機構を明らかにし、その成果を基礎に、DNAを特定位置で切断できる協同的分子認識能を持つ新しいタイプのアルキル化剤の分子設計を行った。さらに、それらのDNAアルキル化能力と生物活性を評価し、適宜改良を加えることにより、実際に実用に耐え得る高度な配列特異性をもつ遺伝子治療用の医薬品を開発を目指した。1)協同的DNAアルキル化反応の分子レベルでの解析・我々が、見い出したデュオカルマイシンのヘテロダイマーを形成による協同的にDNAの分子認識によるアルキル化についてその分子機構を詳細に解析した。750MHz1H NMRを用いて、ヘテロダイマーの構造をディスタンスジオメトリー法により解明した。3)コンピューターグラフィックスシステムを用いてこれらの相互作用を視覚化し、既存のDNA切断分子の巧妙な協同的分子認識について詳しく評価し、アルキル化に最適なリンカーの開発を行った。全自動シーケンサーを利用してDNA切断の解析を効率よくまた迅速に行う手法を確立した。2)新しいDNA切断分子の分子設計・上記の検討で得られた知見に基づき、高いDNA塩基配列認識能もつ協同的分子認識能を持つ新しいタイプの分子対の設計を行い化学合成した。具体的にはDuocarmycin B2のNaOMeによる加水分解により得られるDuo AのA環生成物にメチルイミダゾール、メチルピロールペプチドのDNA結合性認識ユニットを共有結合させた種々の化合物を合成し、その反応性について検討した。その結果400塩基対の2本鎖DNAを1ヶ所で切断する分子の合成に成功した。我々は抗生物質や光反応によるDNA切断についてその分子認識と切断の化学について研究を行い、抗生物質や光によるDNAの修飾や切断が高い特異性を有した原子レベルで特異的な反応により起こっていることを明らかにしてきた。これらの反応はこれらの小分子がDNAの決まった部位に反応部位を巧妙に近づけることにより達成していることを見い出している。また最近、我々は抗生物質デュオカルマイシンがディスタマイシンなどの他種分子とヘテロダイマーを形成し協同的にDNAの分子認識を行ない、デュオカルマイシン単独の場合とは異なる塩基配列を、ほぼ1万倍の反応速度でアルキル化することを発見した。本研究の目的は、これら天然物による協同的なDNAの配列認識の分子機構を明らかにし、その成果を基礎に、DNAを特定位置で切断できる協同的分子認識能を持つ新しいタイプのアルキル化剤の分子設計を目的としている。まずデュオカルマイシンのヘテロダイマーを形成による協同的にDNAの分子認識によるアルキル化についてその分子機構を詳細に解析した。750MHz1HNMRを用いて、ヘテロダイマーの構造をディスタンスジオメトリー法により解明した。さらにこれらの相互作用を視覚化し、既存のDNA切断分子の巧妙な協同的分子認識について分子認識の体系化を試みた。全自動シーケンサーを利用してDNA切断の解析を効率よくまた迅速に行うう手法を確立した。上記の検討で得られた知見に基づき、高いDNA塩基配列認識能もつ協同的分子認識能を持つ新しいタイプの分子対の設計を行い化学合成した。具体的にはDuocar mycin B2のNaOMeによる加水分解により得られるDuoAのA環生成物1にメチルイミダゾール、メチルピロールペプチドのDNA結合性認識ユニツトを共有結合させた種々の化合物を合成し、その反応性について検討した本研究の目的は、最近、我々は抗生物質デュオカルマイシンがディスタマイシンなどの他種分子とヘテロダイマーを形成による協同的なDNAの配列認識の分子機構を明らかにし、その成果を基礎に、DNAを特定位置で切断できる協同的分子認識能を持つ新しいタイプのアルキル化剤の分子設計を目的とする。

さらに、それらのDNAアルキル化能力と生物活性を評価し、適宜改良を加えることにより、実際に実用に耐え得る高度な配列特異性をもつ遺伝子治療用の医薬品を開発しようというものである。1)協同的DNAアルキル化反応の分子レベルでの解析・著者らが最近、見い出したデュオカルマイシンのヘテロダイマーを形成による協同的にDNAの分子認識によるアルキル化についてその分子機構を詳細に解析した。750MHz1HNMRを用いて、ヘテロダイマーの構造をディスタンスジオメトリー法により解明した。現有のコンピューターグラフィックスシステムを用いてこれらの相互作用を視覚化し、既存のDNA切断分子の巧妙な協同的分子認識について詳しく評価し、その体系化を試みた。全自動シーケンサーを利用してDNA切断の解析を効率よくまた迅速に行うう手法を確立した。2)新しいDNA切断分子の分子設計・上記の検討で得られた知見に基づき、高いDNA塩基配列認識能もつ協同的分子認識能を持つ新しいタイプの分子対の設計を行い化学合成した。具体的にはDuocarmycin B2のNaOMeによる加水分解により得られるDuo AのA環生成物にメチルイミダゾール、メチルピロールペプチドのDNA結合性認識ユニットを共有結合きせた種々の化合物を合成し、その反応性について検討した。その結果400塩基対の2本鎖DNAを1ケ所で切断する分子の合成に成功した。
癌の転移におけるＣ１Ｄの役割解明と創薬展開

C1Dは基本転写やDNA修復に関与するDNA結合タンパク質であるが、その機能は不明である。そこで、本研究ではC1Dのヌクレオソームにおける動態ならびに紫外線(UV)照射によるIL-8の転写におけるその役割について調べた。HeLa細胞においてC1Dタンパク質は通常ヌクレオソームに存在しているが、UV照射を受けるとE3リガーゼのCHIPを介してユビキチン・プロテアソーム系により急速に分解され、それに伴いIL-8 mRNAの発現が亢進することが明らかとなった。本研究により、C1Dはクロマチンにおける転写抑制因子として機能し、C1Dの恒常性の維持によってIL-8の転写が制御されることが示唆された。本年度は紫外線(UV)照射によるC1Dタンパク質の分解機構に関与するE3リガーゼやC1Dにより発現が制御される分子の同定を行った。また、慢性骨髄性白血病(CML)の病因遺伝子産物であるP210BCR-ABLのC1D分解への関与を調べた。UVによるC1D分解に関与するE3リガーゼを同定するため、HeLa細胞にCul4AのsiRNAを導入したところ、UV照射によるヌクレオソームのC1D分解はCul4Aのノックダウンにより抑制された。また、CHIPの遺伝子欠損マウス(KO)由来胎仔線維芽細胞(MEF)を用い同様に検討した。その結果、野生型マウス(WT)由来MEFではUVによりC1Dが分解されたが、CHIPKO由来MEFではUVによるC1D分解はWT由来MEFに比べ抑制されていた。従って、UVによるC1D分解に関与する実行分子としてCul4AとCHIPの関与が示唆された。C1DのsiRNAを導入したHela細胞ではUVによるIL-8、CHOPのmRNA発現が対照に比べ亢進していた。従って、これら分子はC1Dにより発現が制御されることが示唆された。P210BCR-ABLはUVと同様にDNA損傷を引き起こし、ATM/ATR経路を活性化する。そこでP210BCR-ABLのC1Dの分解への関与をP210BCR-ABL発現Rat-1細胞を用いて調べた。その結果、P210BCR-ABL発現Rat-1ではヌクレオソームのC1Dが対照のRat-1に比べ、著しく減少していた。従って、P210BCR-ABLのC1D分解への関与が示唆された。P210BCR-ABLの関連実験として、P210BCR-ABLの発現によりカスパーゼ-1が活性化されることを見出し、研究成果は第2回新学術領域自然炎症+脂質マーシナリー合同若手ワークショップ(徳島県鳴門市)で口頭発表を行った。本年度はC1Dの基礎解析として、C1Dタンパク質の安定性に対する紫外線(UV)の影響や培養細胞へのUV照射によるサイトカイン遺伝子の発現変動におけるC1Dの関与について検討した。C1Dタンパク質の安定性に及ぼすUVの影響はヒト子宮頸癌HeLa細胞を用い検討した。HeLa細胞にUVを照射すると30分後の核分画においてC1Dタンパク質は対照に比べ著しく減少していた。さらに、同核分画を用いてショ糖密度勾配遠心分離により、ヌクレオソーム分画を調製したところ、C1Dはヌクレオソーム分画に存在することが明らかになった。UV照射によるC1Dタンパク質の減少はプロテアソーム阻害剤MG132の前処理により、顕著に抑制されることから、C1Dタンパク質はUV照射により、ユビキチン・プロテアソーム系を介して速やかに分解されることが示唆された。UV照射によるサイトカイン遺伝子の発現変動はHeLa細胞およびヒトリンパ腫由来単球様細胞株U937を用いてqPCR法により網羅的解析を行った。その結果、UV照射により発現が上昇する遺伝子としてIL-8、S100A8他が、発現が減少する遺伝子としてIL-1β他がリストされた。なお、C1D mRNAの発現はUV照射により、減少傾向を示していた。さらに、C1Dの安定化に寄与するTFIIHの構成因子であるXPB遺伝子をsiRNAによりノックダウンすると、IL-8他mRNAは対照に比べ、UV照射時の発現が増加していた。従って、XPBはC1Dの安定化を介して、UV刺激によるIL-8などの遺伝子の発現を負に制御する可能性が示唆された。本年度はC1Dタンパク質の恒常性維持機構について調べるため、DNA損傷刺激として紫外線(UV)に加えて、慢性骨髄性白血病の病因遺伝子産物であるP210BCR-ABLチロシンキナーゼのC1D動態への影響について検討するとともに、C1Dと基本転写因子TFIIHの構成因子とのクロマチンにおける相互作用やIL-8転写に及ぼす影響についても検討した。HeLa細胞にP210BCR-ABL-Flagを発現させるとUV照射の場合と同様にIL-8 mRNA発現が亢進した。P210

BCR-ABLによるC1Dのヌクレオソーム動態に及ぼす影響について調べるため、P210BCR-ABL発現Rat-1細胞にプロテアソーム阻害剤であるMG132の処理を行ったところ、ヌクレオソームにおけるC1D量の増加が認められた。P210BCR-ABL発現Rat-1細胞にE3リガーゼCHIPのsiRNAを導入しCHIPのノックダウンを行ったところ、ヌクレオソームにおけるC1D量は対照と同程度であり、UVによるヌクレオソームのC1Dの分解機構とは異なることが示唆された。クロマチン免疫沈降(ChIP)を行い、C1DとTFIIHの構成因子であるXPBやCdk7との相互作用を検討したところ、XPBに結合したC1DはUV照射後1時間で一過性に亢進すること、Cdk7に結合したC1DはUV照射後6時間まで経時的に増加することが明らかとなった。また、ChIP-qPCRによりIL-8プロモーター領域へのC1Dのリクルートを検討したところ、UV照射後15分、1時間、8時間においてC1DのIL-8プロモーター領域への結合が増加していた。これら結果より、C1Dはヌクレオソームに結合して存在し、通常はIL-8の転写を抑制しているが、UVなどのDNA損傷刺激を受けるとCHIPを介してユビキチン・プロテアソーム系により速やかに分解され、IL-8の転写が亢進することが示唆された。腫瘍生物学今年度はC1Dの基礎解析としてUV照射によるヌクレオソームのC1D分解に関与するユビキチンE3リガーゼを同定するため、遺伝子ノックダウンおよび遺伝子欠損マウス由来細胞を用いた実験を行い、Cul4AおよびCHIPを同定することが出来た。C1Dの遺伝子ノックダウン実験により、C1Dにより発現が制御される分子としてIL-8、CHOPを同定することができた。また、P210BCR-ABLはUV照射と同様にヌクレオソームのC1Dの分解を引き起こすことを見出した。今年度はC1Dの基礎解析としてUV照射によるC1Dタンパク質の分解や生化学的手法によりヌクレオソームにおけるC1Dの存在を明らかとし、そのDNA損傷修復過程への関与を示唆する結果を得ることができた。また、培養細胞へのUV照射によるサイトカイン遺伝子の発現変動を網羅的に解析することにより、UVにより発現が顕著に変動する数種類の遺伝子を同定することができ、このうちの一部はC1Dの安定化に寄与するXPB遺伝子によりその発現が制御される可能性が示唆された。今後の研究の推進方策は次の通りである。(1)P210BCR-ABL発現Rat-1細胞においてプロテアソーム阻害剤のMG132の前処理を行い、C1Dタンパク質の分解が抑制されるか否かを検討する。また、P210によるC1Dの分解に関与するE3リガーゼを同定するため、CHIPのsiRNAを用いたノックダウン実験により、P210によるC1Dの分解が抑制されるか否かを調べる。P210BCR-ABLがUV刺激と同様にIL-8、CHOPのmRNA発現を亢進するか否かを定量的PCR法により調べる。(2)癌の転移や転移前炎症性変化におけるC1Dの関与について、in vivoではB16細胞の尾静脈移入による転移モデルと皮下移植による転移前モデルを用いて解析する。