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大学と産業界の研究連携システムと技術移転に関する実証的研究

平成11年9月から10月にかけて、産学連携の現状と課題に関して、全国の国公私立大学の教員2,500人、276大学事務局、企業4,000社を対象に、初の全国調査を実施した。また、同じ時期に、茨城県商工労働部と合同で、県内企業1,000社の調査も実施した。また、今年度は、筑波大学の研究・技術シーズの技術評価を実施し、それをもとに実際に企業への移転を試み、さらに茨城県内の技術士や企業技術者OBなどを対象とした、技術移転方式に関するアンケート調査を実施した。その結果、産学連携や技術移転を促進するための優先度の高い施策として、以下の三つが浮かび上がってきた。1大学教員が産学連携に積極的に取り組むためにインセンティブを付与する仕組みの導入、2大学の研究資源と企業の技術上の課題を結びつけるための情報流通システムの整備、3大学の研究・技術シーズを企業に移転するためのキャンパス・インキュベーション施設の設置。現状の問題点を簡潔に整理すると、産学連携に関するシステム、ことに情報流通システムは徐々に整備され始めてきているが、大学教員の意識改革が立ち遅れているといえる。これは、大学内において、教員に産学連携に関してインセンティブを与える仕組みがまだ整備されていない状態にあるためである。また、現状では、国公私立大学を通じて、キャンパス・インキュベーション施設の整備は著しく遅れている。以上のような問題点を解決していくためには、大学自身が産学連携や技術移転を最優先の課題として取り組むとともに、産業上有用な発明を行うことが教員の業績としてカウントされるような仕組みを整備すること、全国の大学にキャンパス・インキュベーション施設を整備していくこと、大学の研究・技術シーズと企業の技術ニーズをマッチングさせるシステムの整備を支援することなどを優先課題として、国の産学連携施策が推進されていく必要がある。本研究は平成11年度12年度の2ヵ年にわたる研究である。本年度は、国公私立大学における産学連携の現状と課題に関する調査を中心として研究を進めた。すなわち、全国の国公私立大学のうち、自然科学系の学部・研究科を持つ大学276大学・2,500人の教員を対象としてアンケート調査を実施し、1,576人の教員から回答を得た。(回答率:63%)その結果、1)産学連携の成果については特許の出願手続きが行われなかったとする者が過半であり、その出願手続きは、発明者自身が行ったというのは僅かで、最も多かった回答は企業が出願したであったこと、企業が出願した理由は、特許出願に費用がかかるからと特許出願は面倒だからが多く、次いで奨学寄附金を受けたからであること、3)大学教員からみた中小企業との連携の障害となる要因については、相手になる中小企業をみつけることが困難であるが第1で、以下、時間がない、連携の方法がわからない、事務手続きが面倒、学内で評価されない、制度上の問題点、研究費への圧迫などと続いていること、4)大学教員で産学連携に関連する制度で困っている事例としては、共同研究費や受託研究費などの使途に厳しい制約があり、年度を超えて使用できないこと、次いで、受入れのための事務手続きが煩雑で負担になること、これらの研究費で若手研究者を雇用できないこと、5)大学教員側からみた促進方策としては、教員の業績評価に社会貢献や産学連携を取り入れること、次いで、共同研究費等の使途制限の撤廃や次年度以降の使用承認、事務手続きの簡略化、学生への給与の支給や若手研究者の雇用、研究スペースの拡大であったこと、などがわかった。これらの調査結果については報告書を刊行している。なお、来年度は産学連携の促進方策の研究を進める。
通勤者の出発時刻選択を考慮した3次元時空間鉄道ネットワークの均衝配分手法の確立

本研究では,輸送力増強などの供給者側の施策や,フレックスタイム制の普及;生産年齢人口減少などの社会環境の変化が,通勤鉄道の混雑緩和にどの程度寄与するのかを定量的に把握するために,「鉄道需要の時刻集中特性予測モデル」を構築した.このモデルは,鉄道輸送力,フレックスタイム制適用率など勤務制度に関するデータと駅間OD表を入力として,時空間鉄道ネットワーク上に利用者を配分することにより,時刻別・距離帯別の乗降人員,断面通過人員などを算出するモデルである.このモデルは,混雑による外部効果や勤務制度に関わる変数を明示的に取り込んでいるという特長をもっている.本モデルを首都圏の鉄道ネットワークに適用した結果,概ね良好な現状再現性を得ることができた.また,その際に棚密な鉄道ネットワークを一次元化することにより,高い操作性も確保できた.また,シナリオ分析の結果,現在事業中の路線がすべて完成し,かつ需要動向を最も楽観的に想定したとしても,「ピーク時の平均混雑率150%」という長期目標を達成するのは困難であり,ピーク時の混雑緩和実現のためにはさらなる新規整備が必要であろうことが示された.実際,2000年2月の運輸政策審議会答申18号でも,将来の東京圏の都市鉄道網について,既設線の有効活用と同時に,一定程度の新たな路線整備が示されているが,こうした政策動向は,本研究で得られた試算結果と整合したものとなっている.無論,こうしたモデルによる評価・予測には限界があり,またこの長期目標値が社会的に最適な水準であるか否かについても更なる議論が必要ではあろうが,今後の鉄道政策を考えていく上でのひとつの有用な示唆が得られたと言える.本研究では,輸送力増強などの供給者側の施策や,フレックスタイム制の普及;生産年齢人口減少などの社会環境の変化が,通勤鉄道の混雑緩和にどの程度寄与するのかを定量的に把握するために,「鉄道需要の時刻集中特性予測モデル」を構築した.このモデルは,鉄道輸送力,フレックスタイム制適用率など勤務制度に関するデータと駅間OD表を入力として,時空間鉄道ネットワーク上に利用者を配分することにより,時刻別・距離帯別の乗降人員,断面通過人員などを算出するモデルである.このモデルは,混雑による外部効果や勤務制度に関わる変数を明示的に取り込んでいるという特長をもっている.本モデルを首都圏の鉄道ネットワークに適用した結果,概ね良好な現状再現性を得ることができた.また,その際に棚密な鉄道ネットワークを一次元化することにより,高い操作性も確保できた.また,シナリオ分析の結果,現在事業中の路線がすべて完成し,かつ需要動向を最も楽観的に想定したとしても,「ピーク時の平均混雑率150%」という長期目標を達成するのは困難であり,ピーク時の混雑緩和実現のためにはさらなる新規整備が必要であろうことが示された.実際,2000年2月の運輸政策審議会答申18号でも,将来の東京圏の都市鉄道網について,既設線の有効活用と同時に,一定程度の新たな路線整備が示されているが,こうした政策動向は,本研究で得られた試算結果と整合したものとなっている.無論,こうしたモデルによる評価・予測には限界があり,またこの長期目標値が社会的に最適な水準であるか否かについても更なる議論が必要ではあろうが,今後の鉄道政策を考えていく上でのひとつの有用な示唆が得られたと言える.1.様々な勤務体系下における鉄道通勤者の出勤時刻選択行動のモデル化詳細な鉄道ダイヤを表現する時空間ネットワーク上での均衡配分理論に適用可能な形で、利用者の出勤時刻選択行動モデルを構築するための検討を行った。本モデルは、様々な勤務制度適用者それぞれについて、鉄道混雑回避行動、遅刻回避行動、ミーティング行動、勤務時間前後の余暇行動を変数として、それらの線形和として利用者の効用を表現し、効用が最大となる時刻を出勤者が選択するという形で定式化するものである。これらのモデルに取りこまれる項目の詳細について、鉄道利用者の行動データを解析した。2.3次元時空間ネットワークに適用可能な利用者均衡配分理論の確立この時空間ネットワークの構築に際しては、鉄道のサービスレベルの変化(所要時間・混雑率など)が利用者の出勤時刻選択にフィードバックするような構造とする必要がある。言いかえれば、利用者路線経路選択・列車種別選択行動と、出勤時刻選択行動を同時に選択するような構造が必要である。また同時に、ネットワークにおける各リンクコスト関数についても、上記要件を満たすような定式化が必要となる。このような必要条件について、検討を行なった。3.鉄道旅客の時刻集中特性予測モデルの構築ここでは、時空間ネットワークにおける、時刻選択を表現するリンク、列車乗車を表現するリンク、乗換えを表現するリンク、について、リンクコスト推定し、鉄道旅客の時刻集中特性予測モデルを構築する予定であったが、前段の様々な勤務体系下における鉄道通勤者の出勤時刻選択行動のモデル化と、3次元時空間ネットワークに適用可能な利用者均衡配分理論の確立が、共に研究途上にあるため、当初予定したモデルの構築には至っていない。1.様々な勤務体系下における鉄道通勤者の出勤時刻選択行動のモデル化鉄道ダイヤを表現する時空間ネットワーク上での配分に適用可能な形で,利用者の出勤時刻選択行動モデルを構築した.本モデルは,様々勤務制度適用者それぞれについて,鉄道混雑回避行動,遅刻回避行動,勤務時間前後の余暇行動を定式化し,それらの総和を利用者の効用として,効用が最大になるように出勤時刻を選択するとするものである.モデルに取り込まれる項目の詳細については,鉄道利用者の行動を調査し,データを解析した.

2.3次元時空間ネットワークの構築およびネットワーク上の利用者配分手法の確立時空間ネットワークは,自宅から乗車するまでの課程を表すアクセスリンク,電車での移動を表す乗車リンク,そして降車から勤務先まで課程を表すイグレスリンクの三種類のリンクによって構成される.全てのリンクが時間的・空間的経過を表しており,それぞれのコストはネットワーク上の配分手法に適用可能な形になっている.3.鉄道旅客の時刻集中特性予測への適用首都圏の鉄道ネットワークに時間軸を加えて,3次元時空間ネットワークを構築する前段階として,郊外路線の上がり方向の需要集中特性をマクロ的に予測することに主眼をおき,首都圏の鉄道ネットワークを1次元・1方向に簡略化した.この簡略化により,計算時間が大幅に短縮され,操作性の向上も達成できる.この2次元時空間ネットワーク上での利用者の配分の結果,首都圏の鉄道における時刻集中特性の現状を高い精度で再現することができた.これは,この手法が首都圏鉄道のマクロな投資レベルを決定する際のツールとして利用される可能性を示している.1.東京都市圏の通勤鉄道の時刻集中特性の再現時空間ネットワーク上の利用者配分手法を東京都市圏の鉄道網に適用した.その際,郊外路線の上がり方向の需要集中特性をマクロ的に予測することに主眼をおき,首都圏の鉄道ネットワークを一次元・一方向に簡略化した.この簡略化の必然的なOD表の変換および輸送力の変換も適切な方法で行った.続いて,この簡略化された鉄道ネットワークに時間軸を加えた,この時空間ネットワークの簡略化により,首都圏の鉄道ネットワークでの通勤者の配分は短時間の計算でも可能となり,操作性が大幅に改善された.簡略化された時空間ネットワークを用いて通勤者の配分を行った結果,首都圏の鉄道における時刻集中特性の現状を高い精度で再現できた.2.東京都市圏の鉄道の混雑状況の予測および政策評価将来における労働人口の減少,フレックスタイム制や時差通勤の浸透など,勤務時間制度の変化および現在進行中の鉄道の輸送力増強計画の完成を想定したシナリオに,時空間ネットワーク上の利用者配分手法を適用し,将来の東京都市圏の通勤鉄道の混雑状況の変化を予測した.その結果,需要の減少を最も楽観的に想定し,現在進行中の鉄道輸送力増強計画の全てが完成した場合でも,運輸政策審議会が掲げる「ピーク時の平均混雑率150%」という目標を達成するのは困難であることが分かった.従って,快適な通勤鉄道を達成するには輸送力の更なる整備が必要であることが示唆できた.
金属間化合物の高温破壊靭性に関する研究

平成4年度の研究計画としては、以下の2項目があげられる。1.高温高真空衝撃試験機の開発2.各種金属間化合物の高温衝撃破壊靭性の評価この研究計画にそって、以下のような研究成果が得られた。1.高温高真空衝撃試験機の開発環境の影響を受けない金属間化合物本来のしかも高温域における破壊靭性評価のための装置として、高温高真空衝撃破断装置の開発に取り組み、その製作を完了した。本装置の最大到達真空度は約7x10^<-7>torr.であり、最高試験温度はこれまでのところ1000度Cまでとなっている。今後、真空度を1桁あげることおよび水素ガス分圧制御装置の設置を計画している。荷重及び変位を高速計測するために、サンプリングレートの速い計装器が必要であり、平成5年度研究計画に申請している。本装置の開発により高温における破壊靭性は元より、高真空中での衝撃試験(変形速度大)によって、室温近傍においても環境の影響を受けない金属間化合物本来の破棄靭性評価が可能になったと考えている。2.金属間化合物の高温衝撃破壊特性この装置を使用してN2_3(Si,Ti)、γ-TiAlの室温から1000度Cまでの衝撃破断吸収エネルギーを測定し、以下の研究成果が得られた。(1)Ni_3(Si,Ti)の破断吸収エネルギーは室温から400度Cまで試験温度の上昇と共に徐々に減少し、600度Cにおいてはほぼゼロとなった。破壊様式は、室温での延性破壊から、600度Cでの劈開/粒界の混合様式へと変化した。(2)これに対し、γ-TiAlの破断吸収エネルギーは室温から1000度Cにかけて増大した。破壊様式は室温においてはへき開割れが主であるのに対し400度C以上では粒界割れとなる。高温における劈開割れ抑制が引き起こす破壊靭性向上が認められ、γ-TiAlの破壊靭性向上のための方向付けができたと考えている。
上皮間葉転換を標的とした薬剤性肺障害克服の試み

薬剤性肺障害は重要な疾患であるが、肺障害の発症病態に肺胞上皮細胞における上皮間葉転換(Epithelial Mesenchymal Transition; EMT)が関与する報告があり、EMTを抑制する薬剤の予防投与は薬剤性肺障害の発症や重篤化の予防に有効な可能性がある。本研究では、予め選定された候補薬剤のEMT抑制効果を薬理学的に解析し、代表的な薬剤性肺障害モデルであるブレオマイシン(BLM)投与マウスに薬剤を投与することでIn vivoにおけるEMTおよび肺障害抑制効果を検証する。現時点までに数種類の薬剤についてEMT抑制、弱体化効果を確認している。その分子生物学的機序についても検討を行っており、TGFβ-Smad経路を抑制するなどの機序についても判明している薬剤もある。引き続き薬剤の肺障害抑制に関するメカニズム、抑制経路に関しては薬剤ごとで検討していく。また、肺損傷については上記の通りマウスモデルでの検証も行っている。しかし実験系については検討中であり、どのようなBLM投与(経路、投与量、併用薬など)が適切かも含めて再検討しているところである。マウスモデルに関しても、一般的な投与経路でのBLMマウスモデルでの肺炎症抑制効果についてはやはり数種類の薬剤で改善の結果が出ている。今後新規の実験系でも炎症抑制効果について確認する予定である。また、現在薬剤の炎症抑制効果について、リンパ球や好中球などの血球の影響や上皮細胞、間葉系細胞にも着目し免疫組織染色による評価を行っているところである。BLMマウスモデルではBLMによる炎症の程度にばらつきが多く、薬効の確認に時間を要している。BLM投与の手技的な問題から、マウス個体間の創傷治癒の若干の差、体重が個々で異なる点などの問題も考えられている。EMTを評価しているIn vitroの系に関しては比較的データがそろいつつあるが、こちらも得られた結果について複数回施行し同様の結果を得るため時間を要している。ともに慎重に現状を検討しており、実験系の再調整なども視野に検討を行っている。現在、薬効を確認する動物モデルにおいて、どのような評価方法が適しているかを検討している。その一つとして病理標本の免疫組織染色であり、リンパ球や好中球などに特徴的な抗体で染色を行うことで肺障害への効果を検討し、さらに併せて上皮系、間葉系細胞の染色を行うことでEMTへの評価を行えると検討しているものの、免疫組織染色に難渋している。引き続き取り組んでいく。現在in vitroでの分子生物学的な薬剤効果の検討を行っていることと並行して、BLMや他の薬剤を用いたin vivoモデルの作成を行っている。これは現在検討している薬剤性肺障害への効果を検討するには適しているが、類似病態である間質性肺炎の急性増悪や急性呼吸窮迫症候群への応用も視野に入れている。薬剤性肺障害に対する予防ないし発症後抑制効果のある薬剤の発見は、より重篤な間質性肺炎急性増悪にも対応できる可能性があるからである。本研究の目的は、ヒト肺胞上皮細胞を用いたIn vitroモデルによるTGFβ誘導性のEMT誘導システムおよびBLMを用いたIn vivoマウスモデルにおいて、EMTを抑制する候補薬剤を選定し、薬剤による肺障害改善効果の評価を行うことである。現在、数種類のEMTを抑制する薬剤を選定しており、ヒト肺胞上皮由来細胞株をTGFβ刺激により誘導したEMT、およびTGFβ下流のシグナル経路の阻害効果を確認するためにTGFβ-Smad経路などの各転写因子の発現、リン酸化を確認しており、更に薬剤別の効果の違いなども併せて検証している。In vivoに関してもマウスへBLMを静脈投与することにより急性肺障害を誘導できることは既知の事項だが、EMTを抑制できる候補薬剤をBLM肺障害モデルマウスに併用することで肺障害抑制効果の有無を確認しており、現状ではモデルの確立および肺障害抑制の確認を行っている。また、急性肺障害、びまん性肺胞障害(DAD)発症の際には、組織における炎症性細胞の表面マーカーであるLy6GなどDADで特徴的なマーカーの発現が同モデルで有意に上昇することを免疫組織染色で確認しており、今後は各薬剤により染色細胞の減少があるかを検討する。また、気管支肺胞洗浄液に含有する炎症性サイトカインの肺障害発症による変化、減少に着目し薬剤による変化も確認する。今後は、上記により有効と考えられた薬剤を間質性肺炎合併進行肺癌の化学療法の際に併用することで、薬剤性肺炎の発症、および薬剤を誘因とした間質性肺炎の増悪を抑制することで予後の改善につなげて行きたいと考える。もともと多くの種類を検討していたこともあり、どの薬剤がEMT抑制効果が高いか、また濃度が適正かなどに多くの時間を費やした。現状では2-3種類の薬剤まで選定が終了している。さらにブレオマイシン(BLM)によるモデル作成では手技の安定化に時間を要し、現在までに比較的に安定してきたがまだマウス毎にばらつきがあり、マウスの系の確立は今後の課題でもある。

現時点までに数種類の薬剤についてEMT抑制、弱体化効果を確認している。その分子生物学的機序についても検討を行っており、TGFβ-Smad経路を抑制するなどの機序についても判明している薬剤もある。引き続き薬剤の肺障害抑制に関するメカニズム、抑制経路に関しては薬剤ごとで検討していく。また、肺損傷については上記の通りマウスモデルでの検証も行っている。しかし実験系については検討中であり、どのようなBLM投与(経路、投与量、併用薬など)が適切かも含めて再検討しているところである。マウスモデルに関しても、一般的な投与経路でのBLMマウスモデルでの肺炎症抑制効果についてはやはり数種類の薬剤で改善の結果が出ている。今後新規の実験系でも炎症抑制効果について確認する予定である。また、現在薬剤の炎症抑制効果について、リンパ球や好中球などの血球の影響や上皮細胞、間葉系細胞にも着目し免疫組織染色による評価を行っているところである。BLMマウスモデルではBLMによる炎症の程度にばらつきが多く、薬効の確認に時間を要している。BLM投与の手技的な問題から、マウス個体間の創傷治癒の若干の差、体重が個々で異なる点などの問題も考えられている。EMTを評価しているIn vitroの系に関しては比較的データがそろいつつあるが、こちらも得られた結果について複数回施行し同様の結果を得るため時間を要している。ともに慎重に現状を検討しており、実験系の再調整なども視野に検討を行っている。引き続きEMT抑制効果やそのメカニズム、肺組織での影響を検討する。In vitroでは薬物のEMTおよびTGFβ経路への効果をより深く追求し、またどのTGFβ経路が遮断されるかのメカニズムに関しても検討を行う。In vivoではモデルの確立に始まり薬剤の肺障害抑制効果を検討し、こちらもTGFβ経路やEMTの抑制阻害効果を検討する。現在、薬効を確認する動物モデルにおいて、どのような評価方法が適しているかを検討している。その一つとして病理標本の免疫組織染色であり、リンパ球や好中球などに特徴的な抗体で染色を行うことで肺障害への効果を検討し、さらに併せて上皮系、間葉系細胞の染色を行うことでEMTへの評価を行えると検討しているものの、免疫組織染色に難渋している。引き続き取り組んでいく。現在in vitroでの分子生物学的な薬剤効果の検討を行っていることと並行して、BLMや他の薬剤を用いたin vivoモデルの作成を行っている。これは現在検討している薬剤性肺障害への効果を検討するには適しているが、類似病態である間質性肺炎の急性増悪や急性呼吸窮迫症候群への応用も視野に入れている。薬剤性肺障害に対する予防ないし発症後抑制効果のある薬剤の発見は、より重篤な間質性肺炎急性増悪にも対応できる可能性があるからである。前述の通り、EMT、およびTGFβ経路抑制効果のある薬剤の探索に時間を要した。A549を用いてTGFβによる振りかけ実験を多く行ったが、同じアッセイ系を用いたためか数多く実験を行った割に出費が少なかった。In vivoに関しても同様であり、繰り返しての実験に関しては試薬などがすでに揃っていたこともあり、出費が少なく抑えられた。
多剤排出トランスポーターの薬剤排出機構に則った新規阻害法の確立と医薬への応用

RND型の多剤排出トランスポーターはグラム陰性細菌の薬剤耐性に大きく関与しており、その機能解析や阻害剤の開発は、薬剤耐性克服に繋がると期待されている。本研究では緑膿菌の多剤排出トランスポーターMexBとMexYの阻害剤開発を行った。1. MexY阻害剤の構造活性相関研究。スクリーニングから発見されたMexY特異的阻害剤に対して、MexY阻害効果の強化を狙って構造活性相関研究を行った。その結果、リード化合物の13倍以上強いMexY阻害活性を示す化合物を見出す事に成功した。2. MexB特異的な阻害剤H-8の結合構造について。H-8はMexB阻害剤D13-9001から構造変換によって見出した阻害剤である。従って、D13-9001結合サイト周辺に点変異を加えて、MexBとH-8の機能を確認した結果、MexBのK151がH-8の阻害活性に重要である事が示唆される結果を得た。3. MexB・MexY同時阻害剤H-31の開発。H-8によって得られた知見から構造変換を行った結果、MexB・MexY同時阻害剤H-31の発見に至った。また、H-31を併用する事で、臨床分離された多剤耐性緑膿菌に対する既存の抗菌薬(AZT、CPFX、IPM等)の有効濃度が低下する効果が見られた。この結果は、本アプローチによる医薬品が多剤耐性緑膿菌に有効であろうという事を強く示唆する結果であった。4. MexB・MexY同時阻害剤H-31の作用メカニズム。H-31はH-8を改良して見出した阻害剤であるにも関わらず、H-8とは異なり、外膜障害作用に起因する機構でトランスポーター阻害を引き起こしている可能性が強く示唆された。この阻害機構はトランスポーターの特徴を突いた広域阻害剤になり得る。本研究で得られた知見は多剤排出トランスポーターを標的にした医薬品の開発に繋がるものと考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。RND(resistance-nodulation-cell division)型の多剤排出トランスポーターはグラム陰性細菌の薬剤耐性に大きく関与しており、その機能解析や阻害剤の開発は、薬剤耐性克服に繋がると期待されている。多剤排出トランスポーターの最も特徴的な部分は複雑な基質特異性であり、ちょっとした構造の変化で、基質、非基質を見分ける繊細さもある。そこで本研究では、多剤排出トランスポーターの基質認識の繊細さを利用した新規なトランスポーター阻害法を確立し、医薬へ応用する事を計画した。すなわち、基質と非基質を化学結合的させた化合物は、阻害剤になるのではないかと言う仮説の検証である。これまでに、こういった化合物を合成し評価してきたが、分子量が大きくなってしまい、菌体内への移行が確認できなかった。そこで、研究の第一段階として、プロテオリポソームによる再構築を用いたin vitro評価系の構築を初年度の目標とした。先行研究に従って、in vitro評価系の構築を試みたが、再現性が全く取れず、薬剤評価は困難であると判断した。そこで、プロテオリポソームを使った別の文献を再現する事を計画したが、これには新たにタンパク質発現系をつくる必要がある。新たなタンパク質の発現系の構築は共同研究先に依頼し、これが完成次第、in vtro評価系の構築に再着手する予定である。その間、SBDDによる阻害剤の探索合成を行っていた。緑膿菌の2つのトランスポーターMexBとMexYを同時に阻害する阻害剤を目標に開発を行った結果、目的の化合物を発見した。さらに、発見されたトランスポーター阻害剤は病院から臨床分離された多剤耐性緑膿菌に対しても有効であるという事が確認された。現在、以上の結果をまとめて、論文を準備している。研究開始時の計画では、本年度中にin vitro評価系を完成させ、新規アプローチの妥当性の検証までを行う予定であったが、計画していたin vitro評価系は再現性の面で問題があり、薬剤評価には不向きであると判断した。そこで、代替案として別の報告されている評価系を参考にすることを考えた。しかし、こちらの評価系の構築には新たに2つ以上のタンパク質を精製する必要があり、現在は新たに使うタンパク質の発現系を共同研究先に依頼している。よって、計画から遅れていると判断した。本年度の前半は計画に従って、in vitro評価系の構築を試みた。すでに先行研究によって論文が報告されていたため、これを再現すれば容易に構築できると考えていたが、実際に測定してみたところ、再現性が全く取れない事がわかった。さらに、プロテオリポソームを使った現在の評価系は、なかなか再現が取れないらしいというアドバイスをいただいた。この事から、正確な測定が必須となる薬剤の評価は、当初計画していたin vitro評価系では困難であると判断し、別の手法を計画した。新たに計画した方法では、再現性がより高く、かつ高感度に測定できる事から、従来の方法よりもより確実に薬剤の評価が行えると期待できる。しかし、従来の方法ではMexBあるいはMexYといった1種類のタンパク質のみを必要としていたが、今回新たに計画した方法ではこれらの他にMexA, MexX, OprMといった新たなタンパク質が必要である。現在、共同研究先ではこれらのタンパク質を用いた研究を計画していた為、これらの発現系の構築を依頼し、これが完成次第in vitro評価系の構築に再着手する予定である。

以上の理由より、本年度中の完成を計画していたin vitro評価系は、現状は完成しておらず、薬剤の評価に取り掛かれていないため、遅れていると自己評価している。RND型の多剤排出トランスポーターはグラム陰性細菌の薬剤耐性に大きく関与しており、その機能解析や阻害剤の開発は、薬剤耐性克服に繋がると期待されている。本研究では緑膿菌の多剤排出トランスポーターMexBとMexYの阻害剤開発を行った。1. MexY阻害剤の構造活性相関研究。スクリーニングから発見されたMexY特異的阻害剤に対して、MexY阻害効果の強化を狙って構造活性相関研究を行った。その結果、リード化合物の13倍以上強いMexY阻害活性を示す化合物を見出す事に成功した。2. MexB特異的な阻害剤H-8の結合構造について。H-8はMexB阻害剤D13-9001から構造変換によって見出した阻害剤である。従って、D13-9001結合サイト周辺に点変異を加えて、MexBとH-8の機能を確認した結果、MexBのK151がH-8の阻害活性に重要である事が示唆される結果を得た。3. MexB・MexY同時阻害剤H-31の開発。H-8によって得られた知見から構造変換を行った結果、MexB・MexY同時阻害剤H-31の発見に至った。また、H-31を併用する事で、臨床分離された多剤耐性緑膿菌に対する既存の抗菌薬(AZT、CPFX、IPM等)の有効濃度が低下する効果が見られた。この結果は、本アプローチによる医薬品が多剤耐性緑膿菌に有効であろうという事を強く示唆する結果であった。4. MexB・MexY同時阻害剤H-31の作用メカニズム。H-31はH-8を改良して見出した阻害剤であるにも関わらず、H-8とは異なり、外膜障害作用に起因する機構でトランスポーター阻害を引き起こしている可能性が強く示唆された。この阻害機構はトランスポーターの特徴を突いた広域阻害剤になり得る。本研究で得られた知見は多剤排出トランスポーターを標的にした医薬品の開発に繋がるものと考える。新規、評価系の構築にはMexA, MexX, OprMといったタンパク質が必要である。これらの発現系の構築は、共同研究先に依頼しており、これが完成次第in vitro評価系の構築に着手する予定である。これが完成するまでの期間、本年度末に発見したMexBとMexYを同時に阻害できる化合物の結合形式解明に着手したいと考えている。現在既に、変異導入を用いた実験に着手しており、数か月以内に結果が出ると見込んでいる。その後、半年以内を目標に結果をまとめ、これらを論文として発表する予定である。同時に、次年度の後期に予定していた「基質と非基質を化学結合させた化合物」の合成を前倒しして着手する。夏までに、新規タンパク質の発現系が完成すると見込んでいるが、in vitro評価系の構築まで含めると、期間内での実験完了はやや困難と考えられる。万が一、in vitro評価家の構築が困難と判断される場合には、in vitro評価系での検証を飛ばして、直接菌体を用いた評価に移る予定である。
脂質シグナルによるイオン輸送体の活性制御機構とその構造基盤の解明

形質膜イオン輸送体は多くのシグナルによって巧妙に制御されるが、その破綻は様々な病気を悪化させる。本研究では、動物細胞Na+/H+交換輸送体NHE1制御機構を詳しく解析した。NHE1はATP結合蛋白質であり、NHE1活性はATPの直接結合によって維持されることが判明した。さらに、NHE1のホルモンによる活性化は、NHE1の脂質結合ドメインにDAGなどの生理活性脂質が結合し、ATPに代わって形質膜との親和性が増加することによって起こることを明らかにした。また、NHE1の活性化はNHE1に直接結合するカルシニュリンを介して、その下流の転写因子NFATへのシグナルを増幅できることがわかった。フォスファチジルイノシトール(4,5)=リン酸やジアシルグリセロールによるイオントランスポータ・チャネルの制御機構の解明は、生理学上重要なテーマであるが、全貌は明らかでない。本研究では、Na+/H+交換輸送体(NHE1)を題材にして、その活性調節に必須な脂質結合ドメイン(LID)の構造と機能を解明することを主眼としている。(1)LIDの結晶構造解明のための蛋白質精製。NHEの膜直下領域のリコンビナント蛋白質の精製は、その不安定さ(分解と凝集)のために困難である。そこで、主として次の二つのストラテジーに基づいて蛋白質精製を行った。(1)種々の長さのNHE1フラグメントとそのサブユニットCHP1をpDuet大腸菌発現ベクターに組み込み、共発現・共精製。(2)CHP1のC末端側にNHE1フラグメントを導入した融合蛋白質の発現・精製。Native条件下、変性条件下などあらゆる精製条件を検討したのち、PIP_2、ATP、phorbol esterなどのリガンド存在・非存在下で蛋白質安定性の検定と結晶化スクリーニングを行った。結果として、精製度および収量とも申し分ない蛋白質が精製できるが、最終的な結晶化には至っていない。安定な構造をとるために必要な因子が何かを探る必要がある。(2)NHE1がATPによって制御される機構。NHE1は二次性能動輸送体であり、ATP加水分解のエネルギーを必要としないが、不思議なことに細胞内ATPが無いと生理的なNHE1活性は失われる。このATP要求性はLIDが関与する可能性がある。平成23年度は、SF9細胞よりNHE1を精製し、これががazido-[^<32>P]ATPによってATPによって阻害されるような光架橋を受けることが判明した。変異導入などの手法によってさらなる検討を行う。本研究では、Na+/H+交換輸送体(NHE1)の活性調節に必須な脂質結合ドメイン(LID)の構造と機能を解明することを主眼としている。3NHE1の活性調節機構の仮説。以上の結果から、NHE1活性化の機構は次のように説明される。NHE1には常時ATPが結合し、静止状態で高いNHE1活性を維持している。ホルモンによってGPCRが活性化されると、DAGがLIDに結合し、形質膜内層の酸性リン脂質へのLIDの親和性が増加する。この際、ATPから酸性リン脂質への“switch"が起こると考えられる。LIDのこの動きがNHE1全体の構造変化をもたらし、細胞内H+の親和性増加を伴う活性化に導くと考えられる。フォスファチジルイノシトール(4,5)二リン酸やジアシルグリセロールによるイオントランスポータ・チャネルの制御機構の解明は、生理学上重要なテーマであるが、全貌は明らかでない。1NHE1がATPによって制御される機構。前年の結果を踏まえ、24年度は、SF9細胞より精製したNHE1を用いてATP結合の詳細を検討した。1)NHE1はazido-[32P]ATPによって光架橋を受けること、2)光架橋はmMオーダーのヌクレオチド(ATP>GTP>CTP>ADP>TTP)で阻害されること、3)透析平衡によって、ATPはLIDに結合すること、4)ATP要求性はLIDの存在に依存することが判明した。すなわち、ATPはNHE1の直接的な活性化因子であることが示唆され、学術誌に発表した(FEBS Journal, 2013)。2LIDの結晶構造解明のための蛋白質精製。

NHE1の膜直下領域のリコンビナント蛋白質の精製は、その不安定さ(分解と凝集)のためにこれまで困難を極めた。NHE1フラグメントとそのサブユニットCHP1をpDuet大腸菌発現ベクターに組み込み、共発現・共精製を行い、結晶化試料とした。ATPによる蛋白質安定化、二つのタグを用いた精製などの工夫を重ねて、現在では"良い"蛋白質が得られるようになっており、さらなる試みを行う。申請書に記載したいくつかの研究計画において、2年目以降につながる結果を得ている。特にNHE1がATP結合蛋白質であるという新しい知見を得ていること、また脂質結合ドメインに関わるNHE1の制御を阻害する化合物の探索においても興味深い結果を得ている。結晶化のための蛋白質精製に関しては、平成23年度に1年間地道に取り組んだけれども、このプロジェクトが本質的に難しい問題を有することを認識できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。申請書に記載したいくつかの研究計画において、3年目以降につながる結果を得ている。特に、NHE1がATP結合蛋白質であるという新しい知見を得た。ATPはNHE1の直接的な制御因子であることが示唆され、論文発表した。また脂質結合ドメインに関わるNHE1の制御を阻害する化合物の探索では、スタウロスポリンに代表されるインドロカルバゾール骨格を有する化合物が直接NHE1と相互作用するのではないかという知見を得ており、最終年度はその研究完結をめざす。ATPや化合物のNHE1との相互作用は、結晶構造の安定性に寄与できることを示唆しており、本研究計画の最大の難関テーマである結晶構造の解明に向けて極めて重要なヒントになる。最終的には、これまで得られた知識に基づいて、様々なリガンド存在下での蛋白質精製、結晶化を試みるつもりである。本研究は、脂質シグナルによる活性制御機構の解明に重点をおいている。その方向性では、1)NHE1へのATP結合の役割、2)NHE1活性化に特化した薬物の検索、3)機械的刺激によっておこる活性化のメカニズム、などに関して興味深い知見を得ており、発展が期待される。こうした脂質結合ドメインのより詳しい性質の理解が結晶構造解析へのステップになると思う。また、計画の一部を変更し、イオン輸送の活性化の結果として起こる細胞機能変化にも着目した研究に今後よりシフトする方針である。計画段階では、1)NHE1へのATP結合の役割、2)NHE1活性化に特化した薬物の検索、3)機械的刺激によっておこる活性化のメカニズム、4)脂質結合ドメインの結晶構造決定、をメインに計画した。このうち、1)ATP結合に関しては、研究がスムーズに進み論文発表できた(FEBS Journal, 2013)。2)について、直接作用する薬物が見つかっており、25年度に論文発表できる予定である。3)に関しては仮説段階であり、次年度につながるような結果を得ることに注力したい。4)に関しては、すでに10年以上取り組んでいるテーマだけに大変困難であるが、これまでの2年間の研究で脂質結合ドメインと相互作用する因子の知識が増えており、蛋白質をより安定に保つヒントを得て、再度チャレンジするつもりである。
セカドベスト下での各種廃棄物処理・リサイクル政策の比較分析

近年、先進諸国において、さまざまな使用済み耐久消費財について廃棄物処理・リサイクル政策が整理されつつある。その一方で、中古品やスクラップを先進国から輸入している途上国では、不適正なリサイクルがおこなわれており、甚大な環境汚染が生じていることが中国およびベトナムでのフィールド調査により再確認された。途上国においてもこの問題は深刻に受け止められており、先進国型のリサイクルシステムを試験的に導入しているが、必ずしもうまく機能しているわけではない。国内の適正処理施設に廃家電が集まらないのである。その背景には、途上国において環境に配慮しない不適正リサイクル部門が存在するために、スクラップが適正価格以上の高価で取引されている事実がある。環境に配慮した適性処理施設は不適正処理部門が買い取っているような高価で買い取ることができず、その結果、使用済み家電製品が適正処理施設に集まらない。したがって、途上国での適正リサイクルを担保するためには、輸入関税や輸出禁止などの貿易政策を含む包括的なインセンティブスキームを考案する必要がある。同時に、途上国側のリサイクルシステムと先進国側のリサイクルシステムは相互依存の関係であるため、先進国と途上国のマテリアルフロー全体を視野に入れた包括的なリサイクルシステムを検討していく必要がある。このような観点から、新品・中古品・スクラップの3つを扱える貿易モデルを構築し、輸入関税等の貿易政策を含む最適な廃棄物処理・リサイクルシステムを検討した。その結果、中古品に関しては輸入禁止等の貿易制限をかけた方が望ましいこと、また、スクラップの輸入に関しては、輸入関税を高めに設定し、適正処理施設に補助金を出すというデポジット・リファンドシステムを導入することが望ましいこと、先進国側でDF方式が採用されていると中古品輸出の増加をもたらすことなど、いくつかの重要な結果を得た。本研究の目的は、主として耐久消費財の廃棄物処理・リサイクル政策のあり方について研究することである。平成15年度においては、分析の基礎となる耐久消費財モデルの構築を行った。消費者の選好が同質的か非同質的であるかによって結果は異なるが、主要な結果は次のようである。まず、消費者の選好が同質的である場合、新品から新品への買い替え、新品の継続的使用、中古品から中古品への買い替え、中古品から新品への買い替えのすべてのオプションが無差別となること、さらに、市場において中古品の質に対する保証制度が完備されれば競争均衡が社会的に最適な状態を達成していることをはじめとする基本的な事実が確認された。次に、消費者の選好が非同質的である場合、消費者の耐久消費財に対する支払意思額の大きさに対応して、新品から新品への買い替えを選択する消費者、中古品から中古品への買い替えを選択する消費者、耐久消費財を保有しない消費者の3つに市場が分割されることが確認された。また、消費者の選好が非同質的であることに加えて耐久消費財市場が独占市場である場合、独占者が選択する耐久消費財の耐久性は社会的最適な水準と比較して大きくも小さくもなりうることがわかった。これは独占者が消費者のリペアに関する判断(リペアして中古市場に売却するか、廃棄するか)を考慮するからである。現在は、上記の独占市場モデルのなかで、廃棄物処理費用の支払い時点(新品購入時点か廃棄時点)を変えることによってどのような違いが生じるのかについて研究中である。近年、さまざまな使用済み耐久消費財についてこれまでのDF(廃棄物処理費用の後払い)方式にかわってADF(廃棄物処理費用の先払い)方式が採用されている。しかしながら、耐久消費財には一般に中古品市場が存在し、新品の購入者と廃棄者が異なることが多い。また、故障した中古品を修理するか廃棄するかは所有者の判断にゆだねられており、ADF方式かDF方式かの違いはその判断に影響を及ぼしうる。本年度の研究においては、ADF方式では社会的最適な結果を達成することができないことが明らかにされた。また、ADF方式では、社会的最適な状態と比較して大量生産(消費)・大量廃棄・耐久消費財の短命化という歪みがもたらされることも明らかにされた。さらに、競争市場均衡として社会的に最適な結果を実現するためには、故障した中古品の修理に対して補助金を支給することが必要となることがわかった。しかしながら、補助金の支給に伴って莫大な取引費用が発生するものと思われる。このような取引費用を考慮すると、不法投棄と取引費用の両方を発生させないADF方式はセカンドベスト政策となりうる。製品一個あたり修理費用と廃棄物処理費用という二つのパラメータによる比較静学を行うことによって、ADF方式がもたらす社会的損失が小さい領域、したがってADF方式がセカンドベストとなる領域を特徴付けた。その結果、修理費用が大きく、廃棄物処理費用が小さいような使用済み耐久消費財についてはADF方式がセカンドベスト政策となることがわかった。環境に配慮した適性処理施設は不適正処理部門が買い取っているような

高価で買い取ることができず、その結果、使用済み家電製品が適正処理施設に集まらない。したがって、途上国での適正リサイクルを担保するためには、輸入関税や輸出禁止などの貿易政策を含む包括的なインセンティブスキームを考案する必要がある。同時に、途上国側のリサイクルシステムと先進国側のリサイクルシステムは相互依存の関係であるため、先進国と途上国のマテリアルフロー全体を視野に入れた包括的なリサイクルシステムを検討していく必要がある。このような観点から、新品・中古品・スクラップの3つを扱える貿易モデルを構築し、輸入関税等の貿易政策を含む最適な廃棄物処理・リサイクルシステムを検討した。その結果、中古品に関しては輸入禁止等の貿易制限をかけた方が望ましいこと、また、スクラップの輸入に関しては、輸入関税を高めに設定し、適正処理施設に補助金を出すというデポジット・リファンドシステムを導入することが望ましいこと、先進国側でDF方式が採用されていると中古品輸出の増加をもたらすことなど、いくつかの重要な結果を得た。
植物細胞内への機能性小分子送達技術の開発

動物細胞で有用な蛍光小分子インジケーターの多くは、植物細胞では細胞壁を通らないか、液胞にたまってしまうために細胞内局在制御が困難である。本研究では、セカンドメッセンジャーの代表格であるカルシウムイオンを植物細胞内で可視化するため、小分子カルシウムインジケーターをサイトゾルへ送り届ける化学的戦略として、タンパク質リガンドを導入したリガンド連結カルシウムインジケーターを開発し、これを用いてモデル植物細胞内でのカルシウム動態の可視化に成功した。この成果は、様々な機能性分子を植物細胞内に送り届ける基盤技術として発展が期待される。本研究では、植物細胞・個体内において、機能性分子を望みの小器官へ送達する分子設計指針を確立し、セカンドメッセンジャー等の生理活性物質を時空間的に可視化する蛍光ケミカルセンサー開発につなげることを目標とする。市販の蛍光小分子センサー群は、動物細胞では頻繁に利用されてきたものの、植物細胞に特有の小器官である細胞壁への透過性と、液胞に疎水性分子が集積しやすいために、ほとんど利用できないのが現状である。この二つの小器官をかいくぐる新たな戦略を開発すべく、様々なアプローチから植物細胞内での小分子の局在制御を目指す。本年度は、植物培養細胞内において、蛍光カルシウムインジケーターの局在制御に成功した。戦略は、植物細胞壁に透過性を有する天然物タンパク質リガンドを小分子センサーに共有結合で連結するものであり、このリガンドは植物細胞の細胞質及び核に発現させたタンパク質に認識され、小分子インジケーターの細胞内局在を制御するものである。この研究過程で、市販されている多くのカルシウムインジケーターが細胞壁を通らないか、通っても液胞に集積することを確認した。一方今回開発したリガンドを連結したインジケーターは、細胞質及び核に集積することが確認され、タバコ由来培養細胞へのカルシウム流入をリアルタイムに可視化することに成功した。この成果は、本研究の目的とする機能性分子の植物細胞内局在制御を達成する足がかりとして、次年度以降の進展が期待できる結果であった。本年度は植物培養細胞において、植物細胞壁に透過性を有する天然物タンパク質リガンドを小分子センサーに共有結合で連結した新規蛍光カルシウムインジケーターの開発と、その局在制御に成功した。このリガンドは植物細胞の細胞質及び核に発現させたタンパク質に認識され、小分子インジケーターの細胞内局在を制御するものであり、今後様々な植物細胞での展開が期待できる。一方で、本系は標的タンパク質を過剰発現した植物細胞では機能するものの、標的の濃度が低い野生型細胞では、分子が液胞に局在することが判明した。また、小分子インジケーターと天然物リガンドとの間のリンカー構造のわずかな違いによって、細胞壁への透過性が著しく変化することが確認された。これらの点は今後様々な機能性小分子の植物細胞内での局在制御を達成する上で重要な知見ではあるものの、未だ一般的な方法論にはつながっていないのが現状である。これらの状況から、予期せぬ様々な新知見は得られておりおおむね順調に進展しているものの、今後の展開ではさらなるブレイクスルーが必須であると考えられる。生命現象を分子レベルで理解する上で、細胞内/個体内で起こっているシグナル伝達ネットワークを、リアルタイムで時空間的に可視化する技術は必要不可欠である。ただし、これを実現するためのツールとして、動物細胞では当たり前に利用されている各種小分子センサー分子が、植物細胞では実用性に欠けることが多く、植物における動的なシグナル伝達挙動はほとんど解明されていないと言わざるを得ないのが現状である。その理由は、植物細胞特有の組織/小器官としての(1)細胞壁による小分子センサーの細胞透過性の低さと、(2)細胞内栄養貯蔵庫でもある巨大な液胞への疎水性分子の吸着である。このような植物細胞では、主にシグナル伝達が起こる細胞質や核、ミトコンドリアといった細胞小器官に、小分子センサーを送り届ける新たな方法論の開発が望まれている。このような背景の元、申請者は「植物細胞内小器官に機能性小分子を送達する」新たな分子設計指針を確立し、セカンドメッセンジャー等の生理活性物質を時空間的に可視化する蛍光ケミカルセンサー開発に繋げることを目標として研究を行った。具体的には、セカンドメッセンジャーの代表格であるカルシウムイオンに焦点を当て、植物細胞内カルシウム動態の可視化等に成功した。今後この分子設計指針を元に、様々な植物、特に遺伝子組換えが困難な実用植物におけるセカンドメッセンジャーの可視化、および関連するシグナル伝達機構の解析につながることが期待される。本年度にて得られた様々な新知見を軸に、知見に乏しい「植物細胞内の局在制御」について効率的に構造を最適化するため、「小分子連結型蛍光分子」のライブラリーを構築する。

いくつかの蛍光ライブイメージングで汎用的に利用される蛍光色素を母核として、本年度活用した天然物リガンドを含め、複数種類の小分子タグをClick化学により効率的に連結し、分子全体の疎水性などの物性を加味したライブラリーにすることで、見出された各種オルガネラへの局在化タグ(細胞壁、細胞質、核、ミトコンドリア等)を植物細胞オルガネラ用の小分子タグとして一般化することを目指す。それらの知見をもとに、pHやカルシウム等重要な生理活性物質イメージングにつなげ、実用植物での興味深い未知の現象を分子レベルで明らかにすることを目指す。また本年度の検討にて、小分子インジケーターと天然物リガンドとの間のリンカー構造のわずかな違いによって、細胞壁への透過性が著しく変化した、という事実が何に起因するのかを調べるため、分子全体の疎水性以外に会合特性などその他の物理化学的性質を詳細に解析し、今後の分子設計指針につなげることも計画に盛り込む。これらの知見を総合し、最終的には、これまでにほとんど達成されていない植物細胞内での分子の局在制御を、いかなる機能性分子でも可能とする画期的な方法論へとつなげることを目指す。ケミカルバイオロジー本年度は申請時に予備実験的に計画、実行した合成分子を用いて、培養細胞を譲渡いただきながら細胞実験を進めることができ、実際に論文及び複数の学会発表につなげることができた。植物培養細胞の扱いについても、異なる目的で使用した形質転換体を本研究に併用できた。一方、次年度以降は新たな合成分子ライブラリーの構築に必要な消耗品費、植物細胞の培養、蛍光イメージングなどの展開を計画しており、それに付随して学会や論文発表が複数可能となることが予想されたため、多くを次年度に繰り越すことにした。本研究で目的とする機能性小分子の植物細胞内局在の制御に向けて、新たな有機合成分子の合成、及び植物細胞の形質転換や細胞培養、蛍光イメージングを実施し、そのために必要な消耗品費を物品費として計上した。またこれに付随して今年度中に本研究を元にした成果について複数の国内外の学会発表を計画しており、これにかかる旅費を計上した。またこの成果についての論文掲載等にかかる費用も合わせて計上した。
葉緑体RNAエディティングの部位認識因子の研究

高等植物葉緑体の転写産物は、CからUへのRNAエディティングにより配列の一部が変換する。この反応はmRNA中のシチジン残基の約1000個に1個を正確に認識する必要がある。この部位認識機構の解明を目指し、以下の成果を得た。1.葉緑体調製法の改良RNAエディティングのトランス因子を調製するために、多量のタバコ葉よりシヨ糖ステップグレジェント遠心法で安価で短時間で調製可能となった。無傷葉緑体の検定にはドイツ側の助言を得た。以前に開発したin Vitro RNAエディティング系はP32標識mRNA基質を用いるため煩雑であった。そこで、蛍光標識による新しい活性測定法の開発に成功した。この系を用いて、タバコ葉緑体のNADH脱水素酵素サブユニットのmRNAのエディティング効率を測定した。その結果、ndh-2の30%という高い効率から活性のほとんど検出できないものまであった。このうちndh-2とndhFのエディティングのシス配列をそれぞれ106ヌクレオチドの1ヶ所、ndhF mRNAでは4036と156ヌクレオチドの2ヶ所がシス配列と同定した。シス配列が2ヶ所に分かれるのは初めての例で、エディティング機構の新しいモデルを考察した。3.エディティング部位の認識因子の単離In vitro活性の最も高いタバコ葉緑体psbE mRNAに対する56kDaのトランス因子を12kgのタバコ葉より調製し、ゲル電動泳動で相当バンドを切り出し、MS/MS法で部分アミノ酸配列を決定した。BLAST探索で対応する配列が見出せなかったので、タバコ固有のタンパク質と考えられる。4.部位認識因子の同定タバコ葉緑体ndhFとrpoBのmRNAエディティングのトランス因子をUVクロスリンク法で各々82kDaと60kDaと同定した。この反応はmRNA中のシチジン残基の1000個に1個を正確に部位認識する必要がある。1.葉緑体調製法の改良我々が開発したin vitroRNAエディティング系を用いてpsbE mRNAエディティングのトランス因子が56kDaタンパク質であることを同定した。この因子を大量に調製するために、タバコより大量の葉緑体調製法の改良を行った。シヨ糖ステップグレジェント遠心法で安価で短時間で調製可能となった。無傷葉緑体の検定にはドイツの研究者の助言が有効であった。以前に開発した「in vitro RNAエディティング系」はP32標識mRNA基質を用いるため煩雑であった。そこで、簡素化のため非アイソトープ法として、蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせた新しい活性測定法の開発に成功した。この手法ではP32標識基質の作製が困難なmRNAにも対応可能である。3.エディティングの部位認識因子の単離既に、4種のエディティング部位のトランス因子を同定したが、そのうちでin vitro活性の最も高いpsbE mRNAエディティングに対する56kDaのトランス因子の単離を進めた。タバコ緑葉10kg相当より葉緑体を単離し、硫安分画法とゲル濾過法でin vitroエディティング活性を指標に精製を行いほぼ単一のタンパク質を得た。従来のin vitro系では、RI標識したmRNA基質を用いるため、基質の調製法が煩雑で短期間しか使用できなかった。一昨年度、系の簡素化のため、蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせた新しい非RI法の確立を試み開発に成功したので、さらに高感度化を行った。次いで、この系を用いて、タバコ葉緑体の光

化学系成分のNADH脱水素酵素サブユニットをコードするmRNAのエディティング部位についてin vitroエディティング効率を測定した。その結果、ndh-2の30%という高い効率から活性のほとんど検出できないものまであった。このうちndh-2とndhFのエディティングのシス配列を変異mRNA群を調製して分析し、ndh-2 mRNAでは106ヌクレオチドの1ヶ所、ndhF mRNAでは4036と156ヌクレオチドの2ヶ所がシス配列と同定した。シス配列が2ヶ所に分かれるのは初めての例で、エディティング機構の新しいモデルを考察した。2)エディティング部位の認識因子の単離昨年度に引き続き、in vitro活性の最も高いタバコ葉緑体psbE mRNAエディティングに対する56kDaのトランス因子について12kgのタバコ葉より大量のタンパク質を調製し、硫安分画、ヘパリンカラム、ゲルろ過法などを組み合わせて単離した。ゲル電動泳動で56kDa相当のバンドを切り出し、MS/MS法で部分アミノ酸配列を決定した。BLAST探索で対応する配列がデータベース内に見出せなかったので、タバコ固有のタンパク質と考えられる。3)部位認識因子の同定既に4種のトランス因子を同定したが、更にタバコ葉緑体ndhFとrpoBのmRNAエディティングのトランス因子をUVクロスリンク法で同定した。ゲル電気泳動で各々82kDaと60kDaであることが示された。