hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトの把持運動における感覚運動統合に関する研究

すでに提案した把持対象物に関する視覚情報と体性感覚情報を統合する神経回路モデルにモジュール構造を導入し、さらに中間層の構造を工夫することにより、把持対象物の大きさや形(円柱や球など)の情報を自己組織的に抽出するように発展させた。実測データを用いた数値シミュレーションにより、円柱と球をモジュール毎に分離し、それぞれの直径に関する情報を対応するモジュールの中間層のニューロンにおいて表現されることを確かめた。昨年度に引き続き、ヒトがコップを取りに行くような把持運動の運動計画に関する心理物理実験も行なった。今年度は主にヒトの手指にゴムを取りつけることにより、手指のダイナミクスが変わった条件で把持運動を行ってもらい、その時の腕の運動軌道への影響を調べた。普通の把持運動と比べて、この条件では手指の運動には変化があったのにも関わらず、腕の運動の方には影響を与えていないことがわかった。すなわち、手指の運動と腕の運動のそれぞれの運動計画は脳内で独立に計画されているという仮説に反しない結果となった。また、ヒトが実際にどのように視覚情報と体性感覚情報を統合しているかについての心理物理実験を行った。モータにより大きさの変わる対象物の大きさに合わせるように親指と人指し指の幅を調整させる実験を行った。このとき、運動情報の影響を除くために、指先もパソコンで制御されたモータで動かされるようにした。その結果、体性感覚のみで評価する指先の幅は指を開いて見積もる場合と指を閉じて見積もる場合で差が大きいが、指先の変化する幅をキャリブレーションすることによりその差が小さくなることがわかった。さらに他の条件で実験を行なった結果、この差を生んでいるのは視覚により認識した幅を、それに合った手指の関節角に変換する逆キネマティクスを計算する処理過程であることを示唆する結果が得られた。ヒトがコップに手を伸ばすような把持運動の際に、正しくコップの位置に手を伸ばし、コップの形に合わせて手の形を準備するように、運動指令を脳が計算していると考えられている。この把持運動の運動計画に関しては、視覚系の処理においで対象物の位置と形の知覚の処理が独立に行われ、それぞれの情報を用いて肩や肘の運動である到達運動と指先の運動である把持運動の運動指令を独立に計算し、両方の運動時間だけを合わせるような運動計画が計算されているという仮説がある。この仮説を検証するために、腕のダイナミクスを変えて、到達運動成分の運動指令を変化させた場合の把持運動成分を計測した。三次元位置計測器(OPTOTRAK)を使い、被験者の人指し指と親指の先端、手首の三箇所に位置センサを取り付け、把持運動の軌道を測定した。被験者は体の正面にある直経2.4cmの円柱を摘んでいる状態から、30cm前方にある直径6cmの円柱を握るように指示された。被験者の腕におもりをつけて腕の質量を変えた場合と、腕にゴムをつけて腕の弾性係数を変えた場合でこの把持運動を行ってもらい、何もつけない状態での把持軌道と比較する。各条件下で10回を1セットとして、20セット行ってもらった。4人の被験者で計測を行い、それぞれの条件での把持運動軌道の最大アパーチャ(親指と人指し指の開き幅の最大値)と最大アパーチャになるタイミングを求めて、各被験者毎に条件間で有意差5その結果、おもりをつけた時もゴムをつけた時も、ほとんどの被験者で最大アパーチャとタイミングに有意な差は見られなかった。すなわち、腕のダイナミクスの変化による到達運動成分の運動指令の変化が把持運動成分に影響を与えない傾向にある。したがって本研究では到達運動成分と把持運動成分の運動指令は独立に計算されている可能性を示唆する結果が得られた。

さらに他の条件で実験を行なった結果、この差を生んでいるのは視覚により認識した幅を、それに合った手指の関節角に変換する逆キネマティクスを計算する処理過程であることを示唆する結果が得られた。
口腔粘膜前癌病変の病理診断基準の確立

【方法】2011年以降に前癌病変等と病理診断された症例から94例(上皮肥厚64例、上皮内癌30例)を抽出し、病理組織像の再評価と免疫染色マーカーとしてCK13とCK17(細胞分化)、Ki-67(細胞増殖)およびTP53(がん抑制遺伝子変異)の発現パタンを評価し、正常相当か異常所見かにカテゴリ分類し、上皮内癌と上皮肥厚の判別についての有用性を多変量解析(尤度漸増法による二項ロジスティック回帰分析)で検討した。解析にはSPSS Medical Model (Ver 24, IBM)を用いた。【結果】ロジスティック回帰分析では、Ki-67(第1層)、Ki-67(多層化)、TP53(多層化)、CK17(第1層以外)、CK13(境界形成)の5項目が有意な因子であった。上皮内癌と上皮肥厚の判別は感度100 %、特異度92.2 %であり、全体の的中率は94.7 %であった。5例の上皮肥厚は免疫染色パタンからは上皮内癌と分類された。【考察】上皮内癌と上皮肥厚の鑑別には上皮基底層のKi-67陽性細胞の発現比率、Ki-67陽性細胞の多層化、TP53陽性細胞の多層化、CK17発現およびCK13陰性境界形成の染色パタンを総合することが有用であり、少数因子では不十分で、特異度や的中率が90%を超えるには少なくとも4種類のマーカーが必要である。その中でもKi-67の発現パタン変化は、各漸増ステップで有意確率が0.05以下と有意であり、有用なマーカーと考えられる。上皮内癌の分類感度は100 %であり、複合的な免疫染色結果がHE染色の形態診断を補完する有用な基準となりうる可能性を示唆しており、さらに、異なる分類となった症例は今後詳細に再評価するが、上皮肥厚の診断上のピットフォールとなる異型に乏しい高分化型扁平上皮癌の可能性があり、免疫染色結果から形態診断にフィードバックできる可能性がある。今回は、上皮内癌と上皮肥厚症例の検討を行い、有用な免疫染色マーカー確認が出来た。現在、上皮異形成症例を追加し、同様の検討を既に開始している。今後、免疫染色マーカーの内、p53については免疫染色結果と遺伝子変異との関係を確認するため、遺伝子変異を網羅的に確認できるアレイ検索を行い、免疫染色結果に反映し、より精度の高い診断基準とする予定である。これまでに本学に蓄積された口腔粘膜早期浸潤癌、上皮内癌、上皮異形成症、肥厚性カンジダ症、炎症性上皮過形成の症例から各30症例(計150症例)を電子化された症例データベースから抽出し、連結可能匿名化処理を行い、臨床病態(年齢、性別、部位、肉眼形態、病悩期間、既往歴、習慣、治療法、臨床的予後)の記録とともに病理組織像を再評価した。また、対象症例標本はヴァーチャルスライドシステムにより電子画像化した。病理組織所見は上皮の各層における細胞異型と構造異型について評価し、さらにPara-MateとDecloaking Chamberを導入し、条件を均一化した免疫組織化学染色(CK13, CK17, Ki-67, TP53, p16)により、その発現パタンについて、以下の知見を得た。(1) CK13とCK17は、正常と上皮異形成等の境界の同定に有用で、特に明瞭なフロント形成は上皮内癌に認める。(2) Ki-67は、正常では1層目5%、2層目90%の細胞に陽性で、特に1層目の発現減弱パタンは上皮内癌には認めない。(3) Ki-67は、上皮異形成と上皮内癌では1層目の発現頻度亢進(50%以上)を認める。(4) Ki-67は、上皮内癌では重層化(連続性、散在性)を認める。(5) TP53は、正常、反応性異型、上皮異形成では散在性の陽性を認める。(6) TP53は、上皮内癌では、境界を持つ重層化を認める。(7) TP53は、正常部と比較した亢進と減弱の判定が必要である。(8) p16は、病変と発現に一定の相関を認めない。(9)扁平上皮癌の上皮内進展と上皮内癌の鑑別には、構造異型のパタンが有用である。これらの免疫染色パタンを複合的に組み合わせることにより、上皮内癌と上皮異形成の鑑別に有用な診断基準が提唱できる見込みが得られた。本研究の最も重要な口腔粘膜前癌病変の病理診断の診断基準の提唱に繋がる基本的な免疫染色の複合的パタンを見出すことが出来たことは、今後の研究の展開を確実なものにする事が出来る。これらのパタンを用いて診断を進める際に必要な重み順位について、多変量解析による因子分析の項目とノンパラメトリック解析項目の設定も可能となった。一方で、TP53の非腫瘍性病変での免疫染色評価について、遺伝子変異の有無に関する裏付けを各症例で行う予定であるが、本年度は症例の選択に留まり、実施には至っていない。【方法】

2011年以降に前癌病変等と病理診断された症例から94例(上皮肥厚64例、上皮内癌30例)を抽出し、病理組織像の再評価と免疫染色マーカーとしてCK13とCK17(細胞分化)、Ki-67(細胞増殖)およびTP53(がん抑制遺伝子変異)の発現パタンを評価し、正常相当か異常所見かにカテゴリ分類し、上皮内癌と上皮肥厚の判別についての有用性を多変量解析(尤度漸増法による二項ロジスティック回帰分析)で検討した。解析にはSPSS Medical Model (Ver 24, IBM)を用いた。【結果】ロジスティック回帰分析では、Ki-67(第1層)、Ki-67(多層化)、TP53(多層化)、CK17(第1層以外)、CK13(境界形成)の5項目が有意な因子であった。上皮内癌と上皮肥厚の判別は感度100 %、特異度92.2 %であり、全体の的中率は94.7 %であった。5例の上皮肥厚は免疫染色パタンからは上皮内癌と分類された。【考察】上皮内癌と上皮肥厚の鑑別には上皮基底層のKi-67陽性細胞の発現比率、Ki-67陽性細胞の多層化、TP53陽性細胞の多層化、CK17発現およびCK13陰性境界形成の染色パタンを総合することが有用であり、少数因子では不十分で、特異度や的中率が90%を超えるには少なくとも4種類のマーカーが必要である。その中でもKi-67の発現パタン変化は、各漸増ステップで有意確率が0.05以下と有意であり、有用なマーカーと考えられる。上皮内癌の分類感度は100 %であり、複合的な免疫染色結果がHE染色の形態診断を補完する有用な基準となりうる可能性を示唆しており、さらに、異なる分類となった症例は今後詳細に再評価するが、上皮肥厚の診断上のピットフォールとなる異型に乏しい高分化型扁平上皮癌の可能性があり、免疫染色結果から形態診断にフィードバックできる可能性がある。今回は、上皮内癌と上皮肥厚症例の検討を行い、有用な免疫染色マーカー確認が出来た。現在、上皮異形成症例を追加し、同様の検討を既に開始している。今後、症例数を追加確保すると共に、課題として残されたTP53遺伝子変異を網羅的に解析できるアレイにより変異の有無を検出し、免疫染色パタンの裏付けを行う。さらに、当初の計画であるエピジェネティック解析を行い、見出した診断基準に基づく診断と予後に関連するエピジェネティック変異遺伝子を探索する。また、多変量解析により、診断項目の重みと順位に関する因子分析を実施し、実際的な診断手順について提唱する際の根拠とする。今後、免疫染色マーカーの内、p53については免疫染色結果と遺伝子変異との関係を確認するため、遺伝子変異を網羅的に確認できるアレイ検索を行い、免疫染色結果に反映し、より精度の高い診断基準とする予定である。
ショウジョウバエの産卵行動を誘導するコマンドニューロンの同定と機能解析

ショウジョウバエの雌の産卵行動は低温・短日・饑餓の条件で著しく抑制される。昨年度までの研究により、我々は脳間部に存在するインスリン様ペプチド産生細胞(IPCs)がそれら環境・栄養情報を統合し、卵巣の発育と産卵行動を制御する中枢ニューロンであることを突き止めた。本年度は産卵を抑制する上記三つの要素のうち、特に低温がIPCsの電気的特性に与える影響を解析した。IPCsは-55mV付近に静止膜電位を持ち、通常室温(24°C)では自発的発火は起こらない。しかし、IPCsを産卵が強く抑制される低温(11°C)に曝すと、膜電位は緩やかに脱分極して閾値に達し、持続的発火が生じた。温度を室温に戻すと膜電位は過分極して元の膜電位に戻り、発火は停止した。したがって、低温刺激はIPCsの大きな脱分極とそれに伴う持続的発火を引き起こし、インスリン様ペプチドの分泌を促進すると考えられる。次に、この低温による脱分極のメカニズムを探るため、電位固定下でRamp波を与える実験によりIPCsの温度感受性成分の特性を調べたところ、その成分は-70mV付近に反転電位を持つチャネルである事が分かった。また、IPCsの入力抵抗は室温時と比べて低温時で約二倍に増加した。これらの事実から、IPCsでは低温時にK2Pチャネルが閉じ、脱分極が引き起こされるのではないかと考えられる。さらに、低温時の脱分極はGPCR阻害剤により有意に抑制された。したがって、低温によりK2Pチャネルが閉じる場合、その応答はGPCRを介している可能性が高い。最後に、低温・短日・饑餓条件で飼育したIPCsの低温に対する応答を調べたところ、上述の脱分極応答は強く抑制され、発火も生じなかった。したがって、長時間のストレス環境への曝露はIPCsの電気的特性を活性な状態から不活性な状態へと変化させ、これにより卵巣発育と産卵行動の抑制が導かれるものと考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。感覚情報と生理的シグナルがどのように統合され行動の意思決定が下されるのか、その内的機構の解明をめざし、本研究ではショウジョウバエの産卵行動に着目してその行動を司令するコマンドニューロンの生理的機能を電気生理学的手法で解明する事を目標としている。本年度は1.胚筋肉を用いた電気生理学実験、2. in vivo脳(中枢ニューロン)用実験システムのセットアップ及び電気生理学実験を行った。1.技術的難易度の高いin vivo中枢ニューロンでの実験に備え、まず当研究室で手法が確立されている胚神経筋接合部を用いた実験を行った。過去に胚筋肉の膜興奮を担うイオンチャネルの機能については詳細な報告が無かったため、本実験ではその特性を詳細に調べた。ホールセルパッチクランプ法による解析を行った結果、胚筋膜の活動電位の発生に寄与する内向き電流は解離定数が小さく、極めてゆっくりとした不活性を示す高閾値L-typeカルシウムチャネルが媒介することが明らかとなった。実際にショウジョウバエのL-typeカルシウムチャネルをコードするDmca1Dの変異体では内向き電流は完全に消失した。この研究成果は論文にまとめ、現在査読中である。2.続いて、in vivo中枢ニューロンからの記録のための実験システムの構築を行った。潅流装置、エアレーション装置の導入など実験結果を参照しつつ逐次システムの改良を進め、最終的に中枢ニューロンからの記録に成功した。また、Gal4/UASシステムを用いてマーカー標識した特定の標的ニューロンを狙った記録にも成功した。本年度は脳間部に存在するInsulin-like peptide producingcells (IPCs)の生理解析を行った。最近の当研究室の研究により、ショウジョウバエの雌は低温、短日、饑餓条件で卵巣休眠をし、産卵行動が抑制されることが明らかとなった。また、この休眠と産卵の調節にはIPCsが働くことが明らかにされた。IPCsは体内グルコース濃度を感知し、体内の栄養条件をモニターしてインスリン様ペプチドを産生することが知られている。しかし、温度と光の環境情報がIPCsにどのような作用をするのかは不明であった。そこで、低温刺激/光刺激を与えた時のIPCsの応答をin vivo whole-cell patch clamp法により解析した。IPCsの細胞体からの膜電位記録を行ったところ、立ち上がりの早いEPSPとIPSPが高頻度で記録された。したがって、このニューロンは細胞体近くにシナプスサイトを持つと考えられる。また、IPCsはall-or-none spikeを発生するspiking neuronであった。次に、温度応答を調べた結果、IPCsは低温に晒されると緩やかな脱分極応答を示した。一方、TTX存在下ではこの応答は抑制され、反対に大きな過分極応答を示した。したがって、この細胞は他の低温感受性ニューロンから興奮性の入力を受ける一方、それ自身も過分極性の低温感受性を持つ。次に、光応答を調べたところ、脳への光照射に応じてIPCsはゆっくりとした小さな過分極応答を示した。この応答は複眼を欠く変異体でも残存したが、TTX存在下では消失した事から、脳内に存在する光感受性ニューロンからの抑制性シナプス入力に由来するものと考えられる。

したがって、IPCsは栄養条件に加えて温度と光の情報を受容しており、これらの情報を統合して卵巣の発育と産卵行動を同時に制御していると考えられる。休眠と産卵を同時に制御する中枢ニューロンが、温度と光という環境要因によってその電気活動を変化させることが明らかとなった。これは環境による本能行動の適応的調節を同定ニューロンの生理学的応答から説明する道を開く発見で、当初研究計画で三年目に目指した目標に早くも到達する事が出来た。ショウジョウバエの雌の産卵行動は低温・短日・饑餓の条件で著しく抑制される。昨年度までの研究により、我々は脳間部に存在するインスリン様ペプチド産生細胞(IPCs)がそれら環境・栄養情報を統合し、卵巣の発育と産卵行動を制御する中枢ニューロンであることを突き止めた。本年度は産卵を抑制する上記三つの要素のうち、特に低温がIPCsの電気的特性に与える影響を解析した。IPCsは-55mV付近に静止膜電位を持ち、通常室温(24°C)では自発的発火は起こらない。しかし、IPCsを産卵が強く抑制される低温(11°C)に曝すと、膜電位は緩やかに脱分極して閾値に達し、持続的発火が生じた。温度を室温に戻すと膜電位は過分極して元の膜電位に戻り、発火は停止した。したがって、低温刺激はIPCsの大きな脱分極とそれに伴う持続的発火を引き起こし、インスリン様ペプチドの分泌を促進すると考えられる。次に、この低温による脱分極のメカニズムを探るため、電位固定下でRamp波を与える実験によりIPCsの温度感受性成分の特性を調べたところ、その成分は-70mV付近に反転電位を持つチャネルである事が分かった。また、IPCsの入力抵抗は室温時と比べて低温時で約二倍に増加した。これらの事実から、IPCsでは低温時にK2Pチャネルが閉じ、脱分極が引き起こされるのではないかと考えられる。さらに、低温時の脱分極はGPCR阻害剤により有意に抑制された。したがって、低温によりK2Pチャネルが閉じる場合、その応答はGPCRを介している可能性が高い。最後に、低温・短日・饑餓条件で飼育したIPCsの低温に対する応答を調べたところ、上述の脱分極応答は強く抑制され、発火も生じなかった。したがって、長時間のストレス環境への曝露はIPCsの電気的特性を活性な状態から不活性な状態へと変化させ、これにより卵巣発育と産卵行動の抑制が導かれるものと考えられる。予備的実験として行った胚筋肉の研究において内向き電流を媒介するカルシウムチャネルの詳細な特性解析を行い、その成果を論文にまとめることができた。続いて、中枢ニューロン用の実験装置のセットアップを完了し、さらに本研究課題で最大の難所と予想された中枢ニューロンからの記録にもすでに成功した。研究は段階的かつ着実に進んでおり、27年度以降は本研究課題が目標とする中枢ニューロンでの実験において大きな成果が期待できる。最初に、平成27年度の研究成果を二つの論文で発表する予定である。続いて、IPCsに入力する光応答性ニューロンの探索を行う。予備実験からIPCsへと投射し、強い光応答性を示すニューロンがすでに見つかっている。そこで、この光応答が細胞自律的であるかどうかを調べる。また、このニューロンとIPCsの同時記録に挑み、両者の接続関係を探る。
変異細胞と正常細胞の相互作用による腸上皮組織の恒常性制御機構の解明

2009年に、小腸上皮からin vitroで腸管オルガノイドを培養する方法が確立された。また、ショウジョウバエや培養細胞を用いた研究から、正常細胞中に変異細胞が出現した際に、適応度の高い細胞が「勝者」として生き残り、適応度の低い細胞が「敗者」として排除される「細胞競合」という現象が報告されている。哺乳類の生体内においては、出現した変異細胞が「敗者」となった場合、組織はがん化から守られ、変異細胞が「勝者」となった場合は、腫瘍形成へと進展する可能性が考えられる。しかしながら、哺乳類の生体内における変異細胞と正常細胞の相互作用についてはほとんど明らかにされていない。そこで私は、「細胞競合」により、組織の恒常性が維持されているのではないかと仮説を立て、本研究に着手した。本研究では、生体内の腸上皮と高い相同性を示す腸管オルガノイドを用いることで、腸上皮組織に出現した変異細胞と周囲の正常細胞の細胞間相互作用とその意義を明らかにすることを目的としている。私はまず、腸管オルガノイドの培養条件を検討し、変異細胞をモザイクに出現させるために最適な培養条件を確立した。作成した腸管オルガノイドについては、共焦点顕微鏡を用いて細胞分布とその構造を観察することで評価した。さらに、腸管オルガノイドでモザイクに変異細胞を出現させるため遺伝子導入の条件を検討し、複数の遺伝子について発現プラスミドを設計、コンストラクションを行った。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
c-mosがん遺伝子産物の機能発現の制御と生物活性の解析

c-mosキナーゼ(Mos)は、細胞分裂抑制因子(CSF)として、脊椎動物の卵成熟を第2減数分裂中期で止める生理活性を有する。一方、Mosは体細胞で発現するとがんをひきおこす。本年度の研究では、MosのCSF活性の発現制御機構、およびMosのがん化活性と細胞周期・細胞内局在性との関係について調べた。1.卵成熟および受精におけるMosのCSF活性の制御機構Mosはツメガエルの卵成熟過程において、代謝的に不安定型から安定型へ、また機能的にも、卵成熟誘起活性からCSF活性へと変換する。40種をこえるMos変異体を用い、Mosの代謝的安定性がMosのN末端の単一のアミノ酸(Pro^2)によって規定されていること(2nd-codon ruleと命名)、CSF活性のためにはPro^2に隣接するSer^3のリン酸化による代謝的安定化が必須であることを示した。また、Mosの代謝が、ユビキチン経路によることをはじめて明らかにし、細胞周期制御におけるユビキチン系の重要性を指摘した。さらに、受精に際するMosの分解がSer3の脱リン酸化を伴うユビキチン経路によることも明らかにした。2.Mosのがん化活性と細胞周期・細胞内局在性Mosは生理的(卵成熟)には細胞周期上のG_2→M転移で機能し、がん化の際にどの細胞周期の時期で機能するかが問題となっている。そこで、M→G_1期に特異的な分解を受けるサイクリンとMosのキメラ遺伝子を作製しNIH3T3にトランスフェクトすることにより、Mosが細胞をがん化するときにはG_1期での発現が必須であることを明らかにした。この結果は、原がん遺伝子の生理活性とがん化活性の違いを細胞周期上での発現の違いとしてはじめてとらえたものである。さらに、Mosキナーゼの基質が、細胞質から核に移行する物質(たとえば、転写因子等)であることを示した。
新規エピゲノム解析技術の開発と消化器癌の個性診断・個別化治療への応用

消化器癌においてジェネティックな異常に加え、DNAメチル化やヒストン修飾異常などのエピジェネティックな異常が関与する。ゲノム上の多数の遺伝子がエピジェネティックな異常を有すると考えられ、その全貌を明らかにすることは、消化器癌の診断および治療法開発の上で重要である。本研究では、ゲノム網羅的メチル化解析法と多数の検体を定量的に解析する方法の開発を目指す。Methylated CpG island amplification (MCA)法により、メチル化しているCpG islandを効率よく増幅し、大腸癌細胞株から抽出したDNAから作成したMCAアンプリコンをCy5で、正常大腸組織より抽出したDNAから作成したMCAアンプリコンをCy3でラベルし、Agilent社のwhole genome promoter arrayにハイブリダイズすることにより得られたシグナルを解析し、高メチル化している遺伝子を同定した。また、得られた結果を、ゲノムブラウザBLAT上に表示し、クロマチン免疫沈降法(ChIP on ChIP)のデータと比較することにより、DNAメチル化、ヒストンH3リジン4、リジン27のメチル化との統合解析を可能にした。DNMTあるいはDicerを遺伝学的にノックアウトした大腸癌細胞を用いて、MCA microarrayを行い、DNAメチル化およびヒストン修飾のプロファイルを作成した。本研究により開発された新しいエピゲノム法により消化器癌発生の分子機構の解明や、診断や治療の標的遺伝子の同定に有用と考えられる。臨床検体におけるDNAメチル化を定量的にかつ高速に解析する目的で、遺伝子多型の検出技術の一つである、Pyrosequence法を利用したメチル化解析を行った。その結果96検体のDNAメチル化を30分で解析可能なシステムの構築に成功した。これまで、約30遺伝子についてPyrosequence法によるDNAメチル化の条件設定を行った。Pyrosequence法により、定量的メチル化解析を高速に行うことが可能になり、前癌病変における定量的メチル化解析による発癌リスク予測への応用が可能になった。Pyrosequence法を用いて、胃癌において、LINE-1のメチル化について定量的に解析したところ、一部の症例でLINE-1の低メチル化を認めた。LINE-1の低メチル化は、p53変異を有する症例で顕著に認められた。LINE-1をはじめとする繰り返し配列のメチル化レベルは、全ゲノムのメチル化レベルを反映すると考えられ、ゲノム全体の低メチル化により染色体不安定性に関与する可能性が示唆された。これまで、DNMTIおよびDNMT3Bを遺伝学的にノックアウトした大腸癌細胞を用いて、MCA microarrayを行い、DNAメチル化プロファイルを作成した。定量的メチル化解析を可能にするため、bisulfite-pyrosequenceの条件設定を行い、DKK3、PGP9.5、DFNA5、NTN4、FKBP6、TRIM50、OSBPL3、PON1遺伝子のメチル化を定量的に解析するシステムを構築した。さらに、胃および大腸洗浄液由来の細胞を回収後、bisulfite処理を行い、DNAメチル化を解析可能であることを明らかにした。
酸化物超電導体の線材加工に及ぼす製造条件の影響

酸化物超伝導体の線材加工およびテ-プ材の圧延加工に及ぼす諸種の要因の影響は次のようにまとめることができる。(1)金属管に封入された酸化物粉末をスウェ-ジング加工する場合、管材の破壊は内部の粉末の流動性の良否によって強い影響を受ける。すなわち黒鉛のように流動性の良い粉末の場合、YBCO粉のように流動性の悪いものに比べ著しく早期に管材の破壊が起こることが実験によって明らかにされた。しかしながら管の内面の形状はYBCO粉の場合のほうが凹凸が大きく管材の肉厚に不規則さが現れた。(2)銀シ-ステ-プの圧延において欠陥はシ-ス材の破壊という形で出現するが、この破壊に及ぼす粉の粒径、中間焼鈍および加工温度の影響を調べた。粒径は細かいほど加工性がよく初期粒径56μmの場合は冷間圧延で0.2mmの板厚で破壊が生じたが、20μmでは0.1mmまでまた0.3μmアルミナ粉では0.05mm以下までの加工が可能であった。中間焼鈍の影響はほとんど認められなかったが熱間圧延(800°C)では0.25mmでシ-ス材に破壊が現れ熱間加工は加工性には悪影響を与えることが明らかになった。酸化物超伝導体は高温で圧縮加工が可能であり、歪速度3*10^<ー5>/sでYBCOでは820°Cで50%以上、BPSCCOでは720°C以上で80%以上の加工度が得られた。YBCOでは温度低下と共に降伏応力が著しく上昇し、また降伏点現象も観察されたが、BPSCCOではこれらの現象は顕著ではなく、加工硬化現象が現れた。いずれの場合も歪速度を増大するとクラックの発生など変形能の低下が見られた。このような圧縮変形によって圧縮面でのX線のc面反射強度は増大することから、高温では(001)面すべりが起こる事が示唆された。高温変形後の酸化物焼結体の伝導特性の回復のための適当な熱処理条件を探るため、熱重量変化を調べた。その結果空気中840°Cで変形後、酸素気流中で熱分析を行った試料では900°C保持中に重量減少が生じ、X線図形にCuOの小さなピ-クが現れた。そこで酸素を吸収する斜方晶の温度域で酸素気流中の時効を施した後、熱重量分析を行った結果900°Cでの重量減少がなくなりまたCuOのピ-クも生じなかった。この熱処理によって伝導特性は回復しまたc軸優先配向も阻害されなかった。
疎なグラフに対する効率良い部分構造列挙アルゴリズムの研究

グラフとは,もの(頂点)のつながり(辺)を表す離散構造であり,実世界の多くのデータを表現することができる.これらのグラフデータ解析では,密な部分グラフ列挙手法が盛んに研究されている.例えば,任意の2頂点間に辺を持つ部分グラフであるクリークは,代表的な密部分グラフである.その一方で,疎なグラフ,つまり辺が多くないグラフの解析はあまり研究されておらず,グラフの疎性を用いた解析法があまり知られていない.そこで,本研究では疎なグラフに対する効率良い部分グラフ列挙アルゴリズムの開発を行う.グラフとは,もの(頂点)のつながり(辺)を表す離散構造であり,実世界の多くのデータを表現することができる.これらのグラフデータ解析では,密な部分グラフ列挙手法が盛んに研究されている.例えば,任意の2頂点間に辺を持つ部分グラフであるクリークは,代表的な密部分グラフである.その一方で,疎なグラフ,つまり辺が多くないグラフの解析はあまり研究されておらず,グラフの疎性を用いた解析法があまり知られていない.そこで,本研究では疎なグラフに対する効率良い部分グラフ列挙アルゴリズムの開発を行う.
時空間マルチスケールイメージングによる生体理解と制御

本研究では、生体に特化したイメージングデバイスとはなにか、特に、新しいセンサ(CMOS、InGaAs、赤外センサ)、情報処理、光学素子(液体レンズ)を取り入れ、生体を可視化するシステムを開発した。基礎理論だけでなく、知財、プロトタイプ、実データ取得まで行った。スケーラブルな生体撮影を行うデバイスを超小型軽量で作成し、手術中でのテスト運用を行った。さらに、波長域を可視化領域だけでなく、近赤外さらに中・遠赤外までひろげ、生体構成分子の分光解析を目指した。生体撮影で大きな問題となるモーションファクトを除去するため、リアルタイムでの撮像タイミングの制御を行い、ソフト・ハードの両側からアプローチを行った。広いスケールに対応した生体イメージングシステムからは、マクロ・ミクロが網羅され血球の挙動と組織反応の両者がとらえられた。内分泌・代謝・循環器疾患をはじめ、血栓止血、炎症、再生反応の解析に有力であった。今回の研究により、通常の二光子顕微鏡だけでなく、赤外結像、超広視野・高画素CMOS撮影、が融合して行われた。従来バイオイメージングは仮説確認のツールとして使われることが多かったが、広スケールなイメージングからは新たな仮説が探索された。生体内部の血行動態のうち新たな物理因子(流れの乱れ)の造血支配が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。現在、西村らは生体レベルでのミクロとマクロをカバーするイメージングモダリティを開発している。特に、病態形成のように非常に長時間かかり、空間的にも広い視野でおきる生活習慣病に対しては、超解像技術を導入した改良型二光子顕微鏡および、広光路共焦点イメージングロボットを開発した。網膜のような生体深部でも明瞭に可視化が行えるようになり、新生児未熟血管の血管新生・血管退縮を観察している。一方、高画素CMOSセンサーでは血栓イベントの最初期の同定(内皮傷害)と最終的なイベント転帰のリンクを可視化観察している。今後はロボティクス、制御工学、情報工学との連携をはかり、得られた画像データへの解析フローも検討していく。その際、イベントの先頭にある好中球、あるいは、慢性化した病変での線維芽細胞への光制御による特異的治療を目指す予定である。また、手持ち可能なデバイスなど、実際の医療現場へ応用も考慮している。本システムは特許申請を完了した。なお、生体での細胞動態をとらえた動画はそのわかりやすさとインパクトから、NHKスペシャル「細胞」をはじめとしたマスメディアでの科学健康番組にもしばしば使われており、現在も次期番組への取材協力をおこなっており一般国民への科学啓蒙に貢献している(記者会見も予定)。また、初等教育にも積極的にかかわり、昨年度でも小学生から高校生まで、実演をまじえた出張授業・研究室公開を行っている。西村は、循環器内科医としての臨床経験を元に、生体イメージングによる生活習慣病の基礎病態研究をすすめている。個体全体をみつつ、特定の一細胞レベルの解析を行うためには、顕微鏡レンズ特有の開口数・視野角制限を外す必要がある。西村は、文字通り独自に部品から顕微鏡システムを開発しており、オリジナルの光路設計で明瞭な生体画像を撮影している。実時間で変動していく生体材料に対して、ロボット制御、光化学反応による細胞操作、フェムト秒による組織改変といった双方向性を高めているが、同様の研究は例をみない。さらに、昨年度だけでも、50を超える講演・発表をおこなうなど積極的な学会活動をおこなうとともに、CRDS・8K応用研究会・未来創造事業・赤外ワークショップをはじめ複数の政策への提言をおこなっている。また、複数のシステム開発を独自にしており、昨年度だけでもマクロミクロ結像システムについて単独特許申請、また、攪拌培養デバイスを筆頭申請者として共同出願している。最近では、4K/8K CMOSセンサーを用いて広視野と高解像度を両立しており、画像技術への医療転用をはかっている。手持ちサイズでも運用できる4K内視鏡については、外科処置支援をアプリケーションとして考え、実用化・産業化にむけて事業化もすすめている。基礎研究における生体の網羅的把握、および、臨床現場での光診断を目指した生体イメージングデバイスを開発する。生活習慣病における慢性炎症がいかに維持されるか、生体に傷害をあたえ修復過程を観察し全貌を明らかにする。特に、ミクロとマクロをカバーするイメージングモダリティを開発し、個体全体をみつつ、特定の一細胞レベルの解析を行える基盤技術を開発する。29年度には、これらの基礎となる結像系を新たにデザインし実証データを得た。さらに、実際に稼働するプロトタイプを作成し、現在臨床現場での評価を行っている。手持ち可能な極小化したイメージングデバイスに加え、超解像技術を導入した改良型二光子顕微鏡および、広光路共焦点イメージングロボッを開発している。高画素CMOSセンサーを活用するために、半導体工学研究者および民間企業とも連携を行っている。ロボティクス、にくわえ、制御工学、情報工学を融合し、システム開発を行う。「めでみえないものをみて」「画像から理解を直結させる」ために、実時間で変動していく生体材料に対して網羅的解析を試みている。また、臓器不全増悪の予知・予防を目的とし、赤外分光技術を元にした非侵襲での代謝イメージング・センシングデバイスを開発している。可視光領域では見えない新たな生体情報を可視化評価するために、赤外線領域に焦点をあてている。吸収結像によるInGaAsカメラ(近赤外線)

イメージング、反射系を用いたボロメーター(遠赤外線)、あるいは、分光技術を応用し、物質特異的な生体イメージングを行っている。従来、赤外イメージングは特別な機材を必要としていたが、現在可視光と赤外の同時観察・評価を顕微鏡で解析可能にしている。イメージングデバイスは医療への応用も視野にいれ、赤外線イメージングを手術室でおこないスマート医療への応用を検討している。近年、生活習慣病・悪性腫瘍といった慢性疾患の背景には持続する炎症が存在することが示され、「慢性炎症」を鍵とした病態解明が試みられている。しかし、多種・多数の細胞が関わるこれらのプロセスを包括的に理解するツールが存在していない。西村らは継続的に、生体イメージングツールを開発・学会発表・知財申請しつづけている。国内外の研究者にもイメージングに関わるソリューションを呈示し、多くの企業と産学連携を続けている。30年度は、マクロ・ミクロをカバーする生体イメージング技術を開発し、さらに、紫外線・可視光・赤外線のすべてを無収差・同一レンズで撮像できる結像システム(全波長顕微鏡)を開発している。さらに、発光と蛍光の同時撮影など、従来のイメージングでは不可能だった解析を可能にしている。本研究では、生体に特化したイメージングデバイスとはなにか、特に、新しいセンサ(CMOS、InGaAs、赤外センサ)、情報処理、光学素子(液体レンズ)を取り入れ、生体を可視化するシステムを開発した。基礎理論だけでなく、知財、プロトタイプ、実データ取得まで行った。スケーラブルな生体撮影を行うデバイスを超小型軽量で作成し、手術中でのテスト運用を行った。さらに、波長域を可視化領域だけでなく、近赤外さらに中・遠赤外までひろげ、生体構成分子の分光解析を目指した。生体撮影で大きな問題となるモーションファクトを除去するため、リアルタイムでの撮像タイミングの制御を行い、ソフト・ハードの両側からアプローチを行った。広いスケールに対応した生体イメージングシステムからは、マクロ・ミクロが網羅され血球の挙動と組織反応の両者がとらえられた。内分泌・代謝・循環器疾患をはじめ、血栓止血、炎症、再生反応の解析に有力であった。今回の研究により、通常の二光子顕微鏡だけでなく、赤外結像、超広視野・高画素CMOS撮影、が融合して行われた。従来バイオイメージングは仮説確認のツールとして使われることが多かったが、広スケールなイメージングからは新たな仮説が探索された。生体内部の血行動態のうち新たな物理因子(流れの乱れ)の造血支配が示された。目で見えないものを新たに可視化する、全く新しい展開として赤外線領域に焦点をあてる。InGaAsカメラ(近赤外線)、ボロメーター(遠赤外線)、あるいは、分光技術を応用し、物質特異的な生体イメージングを目指す。さらに、赤外線イメージングを手術室でおこないスマート医療への応用を検討する。同時にAI技術を用いた生体画像の解析をおこなう。
レセプトデータを用いた脳卒中・大腿骨頸部骨折における地域医療連携体制の評価

福岡県後期高齢者医療広域連合の診療報酬明細書(レセプト)データを用いて、脳卒中・大腿骨頸部骨折における地域医療連携がケアプロセス全体にわたる医療費・診療日数に与える影響を明らかにした。地域連携診療計画を伴い他病院へ転院している群を転院群、同一病院内の回復期病棟へ転棟している者を転棟群、残りをその他の群に分類し、一般化線型モデルを用いて、急性期/周術期在院日数、回復期在院日数と医療費を推計した。いずれの疾患においても、その他の群に比べ、連携群は急性期/周術期ではより短い在院日数であったが、回復期在院日数と医療費との関連は見られなかった。平成26年に行われた第6次医療法改正では、医療計画の策定プロセスが大きく見直され、病床機能報告制度の導入による病床機能の明確化、機能分化・連携構築・ネットワーク化促進が図られることとなった。地域医療連携体制の評価は政策的にも特に重要な課題であり、レセプトデータ等の保健医療情報を保健医療行政に活用することの重要性も増している。しかしながら、先行研究では退院後の維持期・慢性期にわたる長期評価は行われていない。そこで、本研究では、地域医療連携体制が医療資源の効率的利用に貢献しているかどうかを評価するために、福岡県後期高齢者医療広域連合、全国健康保険協会福岡支部の医科・DPCレセプトデータを用いて、脳卒中・大腿骨頸部骨折における地域連携診療計画策定の有無がケアプロセス全体にわたる医療費・診療日数に与える影響を明らかにすることを目的とした。研究計画時には九州大学大学院医学研究院・医療経営・管理学講座の馬場園明研究室に保管されている福岡県後期高齢者医療広域連合、全国健康保険協会福岡支部の特定健康診査・レセプト等データベースを共同利用する予定であったが、それぞれの保険者に対して共同研究契約とデータ利用に関する届出を行う運びとなった。平成27年度は、福岡県後期高齢者医療広域連合から承諾を得て、後期高齢者医療制度のレセプトデータベース構築と脳梗塞地域医療連携体制の評価のための解析を行い、回復期までの在院日数・医療費に与える影響を明らかにし、その成果について国内学会での発表を行った。なお、倫理面の配慮として、福岡県保健環境研究所疫学研究倫理審査委員会に諮り、承認を得た。研究計画の通り、先行研究との結果の整合性を確認するために、脳梗塞についての急性期・回復期・全体の医療費及び診療日数を連携群、連携群、転棟群で比較した。その結果、連携群において急性期の診療日数は有意に短く、医療費が低いという先行研究と一致した結果が得られた。その一方で、転棟群では診療日数短縮効果は明らかでないが、医療費は有意に低い傾向にあった。また、転棟群では回復期、全体の診療日数は有意に短く、医療費は有意に低かったが、連携群では関連していなかった。これは地域医療連携診療計画を策定している患者では急性期での在院日数が短縮され、医療費の抑制につながっているが、退院後全体の診療日数や医療費とは明確な関連がないという研究当初の予測とほぼ一致した結果であり、転院先に在院日数短縮のインセンティブが働かないことに起因していると考えられる。加えて、平成27年度のデータベース構築・解析に際し、回復期以降の追跡を行うためには後期高齢者における誤嚥性肺炎等による再入院を考慮する必要があることが明らかになった。本研究では、地域医療連携体制が医療資源の効率的利用に貢献しているかどうかを評価するために、福岡県後期高齢者医療広域連合の医科・DPCレセプトデータを用いて、脳卒中・大腿骨頸部骨折における地域連携診療計画策定の有無がケアプロセス全体にわたる医療費・診療日数に与える影響を明らかにすることを目的とした。平成28年度は福岡県後期高齢者医療広域連合の平成22-27年度医科・DPCレセプトデータを用いて、脳出血/大腿骨頸部骨折入院患者を追跡し、地域連携診療計画を伴い、他病院へ転院している群を転院群、同一病院内の回復期病棟へ転棟している者を転棟群、残りをその他の群に分類し、脳出血/大腿骨頸部骨折における医療連携体制と医療資源利用についての解析を行った。平成27年度に実施した脳梗塞についての解析と同様に、以下のような結果が得られた。(1)その他に群に比べ、連携群、転棟群ともに急性期・周術期在院日数の有意な短縮が認められた。(2)転棟群では回復期、全体の診療日数は有意に短く、医療費は有意に低かったが、連携群では関連していなかった。これらの結果から、より効率性の高い連携診療計画に対して診療報酬上のインセンティブを付与することが、治療プロセス全体における効率性を高めるために必要であると考えられた。また、今後は介護保険データと突合する研究を行う必要性があると考えられた。脳梗塞・脳出血に関する成果について、英文学術雑誌に投稿し、受理された。また、大腿骨頸部骨折の周術期治療・医療連携体制についての英語論文を2編作成し、投稿した。

いずれの疾患においても、その他の群に比べ、連携群は急性期/周術期ではより短い在院日数であったが、回復期在院日数と医療費との関連は見られなかった。平成28年度は平成22年4月から平成28年3月診療分の福岡県後期高齢者医療広域連合、全国健康保険協会福岡支部のDPCレセプトデータから、非外傷性硬膜下血腫以外の非外傷性頭蓋内血腫、くも膜下出血(ICD10コード:I61、I63)を、平成24年4月から平成28年3月診療分の医科・DPCレセプトデータから大腿骨頸部骨折(S72.0)を主傷病として入院し、骨折非観血的手術(診療報酬点数表コード:K0441)、観血的整復固定術(K046-2)、骨折観血的手術(K0461)、関節脱臼非観血的整復術(K0611)、関節脱臼観血的整復術(K0631)、人工骨頭挿入術(K0811)、鋼線等による直達牽引(K083)が行われた退院患者のうち、隣接していない県外への入院例、死亡例と再発・再手術例を除外し、少なくとも退院後1年間観察できるものを抽出する。脳出血、くも膜下出血による入院患者を対象とした解析では、転院・転棟先の病棟毎に層別し、急性期病院退院後の医療費及び診療日数を目的変数とし、性、年齢、病型(脳出血・くも膜下出血)、手術の有無、併存疾患の有無、転棟・地域医療連携診療計画策定の有無、転院先病棟の施設基準、廃用症候群の有無、早期リハビリテーションの有無、人工呼吸の有無及び救命救急入院・集中治療室利用の有無を独立変数とした統計解析を行う。大腿骨頸部骨折による入院患者を対象とした解析では、転院・転棟先の病棟毎に層別し、術前・術後の医療費及び診療日数を目的変数とし、性、年齢、併存疾患・術後合併症の有無、転棟・地域医療連携診療計画策定の有無、早期リハビリテーションの有無及び手術の種類を独立変数とした統計解析を行。これらの解析から明らかにされた地域医療連携診療計画策定の有無の医療費及び診療日数への影響についてとりまとめ、学会発表及び論文投稿を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。医療政策学28年度が最終年度であるため、記入しない。
ニューキノロン耐性を中心とする薬剤耐性淋菌に関する研究

1各種薬剤耐性淋菌の分離状況2001年に福岡市で分離された淋菌208株の各種抗菌薬に対する感受性を測定し、各種薬剤耐性菌の分離状況を検討した。薬剤感受性測定はアメリカ法に準じた寒天平板希釈法を用い、β-ラクタマーゼ産生能はニトロセフィン法で測定した。キノロン耐性淋菌(ciprofloxacin MIC≧1μg/ml)、ペニシリン耐性淋菌(MIC≧2μg/ml)、テトラサイクリン耐性淋菌(MIC≧2μg/ml)の分離頻度は、それぞれ64.4%、13.4%、13.9%であった。なお、ペニシリナーゼ産生淋菌(PPNG)の分離頻度はわずか1.4%であった。セフェム中程度耐性淋菌(cefixime MIC≧0.5μg/ml)は1株も分離されなかった。しかし、cefiximeのMICが比較的高い0.120.25μg/mlに分布する株の分離頻度は23.6%と高かった。スペクチノマイシン耐性淋菌(MIC≧128μg/ml)は1株も分離されなかった。19932000年までの各種薬剤耐性淋菌に関する我々の成績と比較して、今回の成績では、キノロン耐性淋菌の著明な増加傾向を認め、またテトラサイクリン耐性淋菌およびペニシリン耐性淋菌の分離頻度も高かった。2.淋菌のセフェム耐性機構セフェム系薬に耐性を示す淋菌の耐性機構を、ペニシリン結合蛋白(PBP)2の構造遺伝子であるpenA遺伝子の変異を解析することで検討した。2000年に分離された6株のセフェム中程度耐性淋菌(cefixime MIC=0.5μg/ml)および3株の感受性淋菌を対象とした。中程度耐性株は全株がβ-ラクタマーゼ陰性で、キノロン系薬に耐性または中程度耐性であった。PBP2における323480番目のアミノ酸配列のうち33カ所にモザイク状のアミノ酸置換が認められた。一方、感受性株にはアミノ酸置換は全く認められなかった。以上の結果、セフェム中程度耐性淋菌においては、PBP2のアミノ酸変化による本酵素に対する薬剤の結合親和性の低下が耐性獲得に関係している可能性が示唆された。1999年に福岡市で分離した淋菌246株に対する各種薬剤の最小発育阻止濃度(MIC)をNCCLS法に準じた寒天平板希釈法で測定し、19811984年分離淋菌に対するMICと比較するとともに、各種薬剤耐性淋菌の分離頻度を算出した。また、Catlinの方法に準じて淋菌の栄養要求型別を行った。キノロン系薬のciprofloxacin(CPFX)の1999年分離株に対するMIC90値(8μg/ml)は、19811984年分離株に対する値(0.06μg/ml)より128倍も高い値を示した。また、同系統のnorfloxacin、levofloxacin、およびsparfloxacinの1999年分離株に対するMIC90値も、19811984年分離株に対する値より64128倍も高い値を示した。セフェム系薬のcefiximeの1999年分離株に対するMIC

90値は、19811984年分離株に対する値より4倍高い値を示したものの、その他の抗菌薬の1999年分離株に対するMIC90値には、目立った上昇はなかった。各種薬剤耐性淋菌の分離頻度は、キノロン耐性淋菌が22.8%(56株)で最も高く、以下、ペニシリン耐性淋菌16.3%(40株)、テトラサイクリン耐性淋菌8.1%(20株)、セフェム低感受性淋菌2.8%(7株)の順であった。なお、ペニシリナーゼ産生淋菌(PPNG)の分離頻度はわずか1.2%(3株)であり、スペクチノマイシン耐性淋菌は1株も分離されなかった。このようにキノロン系薬に対する淋菌の耐性化が特に目立った。淋菌の各種栄養要求型の頻度は、proline要求型が56.9%(140株)で最も高く、以下、prototrophic16.7%(41株)、arginine要求型1.6%(4株)などの順で、以前の検討と比べproline要求型が増加していた。CPFXのproline要求型に対するmedian MIC値(0.25μg/ml)は、それ以外の栄養要求型に対する値(0.008μg/ml)より有意に高かった(p<0.0001)。このようにキノロン耐性淋菌の増加にproline要求型の増加が関係している可能性が示唆された。2000年に福岡市で分離した淋菌190株に対する各種薬剤の最小発育阻止濃度(MIC)をNCCLS法に準じた寒天平板希釈法で測定し、19811984年分離淋菌に対するMICと比較するとともに、各種薬剤耐性淋菌の分離頻度を算出した。キノロン系薬のciprofloxacinの2000年分離株に対するMIC90値(16μg/ml)は、19811984年分離株に対するMIC90値(0.06μg/ml)より256倍も高い値を示した。また、同系統のnorfloxacin、levofloxacinの2000年分離株に対するMIC90値も同様に、19811984年分雌株に対するMIC90値より256倍も高い値を示した。セフェム系薬のcefiximeの2000年分薩株に対するMIC90値は、19811984年分離株に対する値より4倍高い値を示したものの、その他の抗菌薬の2000年分離株に対するMIC90値には目立った上昇はなかった。各種薬剤耐性淋菌の分離頻度は、キノロン耐性淋菌が40.0%(76株)で最も高く、以下、ペニシリン耐性淋菌27.9%(53株)、テトラサイクリン耐性淋菌24.7%(47株)セフェム低感受性淋菌3.2%(6株)の順であった。なお、ペニシリナーゼ産生淋菌(PPNG)の分離頻度はわずか0.5%(1株)であり、スペクチノマイシン耐性淋菌は1株も分離されなかった。このようにキノロン耐性淋菌の分離頻度は著明に高く、また他系統の薬剤に対する耐性淋菌も高い分離頻度を示した。1999年分離淋菌227株を対象に、キノロン系薬の標的酵素であるDNAジャイレース・サブユニットGyrA、およびトポイソメラーゼIV、サブユニットParCにおけるアミノ酸変化解析した。212株がGyrA、ParCにアミノ酸変化を有していた。その内訳は、GyrA(1カ所)37.7%、GyrA(2)+ParC(1)22.2%、GyrA(1)+ParC(2)15.1%、GyrA(2)+ParC(2)14.2%などであった。GryAにおいては91番目のセリンからフェニルアラニンヘの変化が最も多く(64%)、ParCにおいては87番目のセリンからアルギニンヘの変化が最も多かった(43.7%)。1.各種薬剤耐性淋菌の分離状況:2001年に福岡市で分離した淋菌208株の各種抗菌薬に対する感受性を測定し、各種薬剤耐性菌の分離状況を検討した。
超分子システム内での1分子機能・分子間協調の顕微画像化と解析

キネシン分子モーターの"歩く"仕組み:キネシンと微小管との1分子結合力を、1)AIP非存在下、2)AMP-PNP(AIPのアナログ)とADPの共存下、3)ADP存在下、そして4)AMP-PNP存在下という、hand-over-handモデルにおける鍵となる4つのヌクレオチド状態で顕微計測した。その結果、1)と2)での平均破断力が7pN、3)で3pN、4)でのそれが15pNと見積もられた。これらのことから、2)と3)では単頭結合、4)では双頭結合であると結論でき、hand-over-handモデルが支持された。ミオシンVの運動性:ミオシンVが13個先のアクチン分子を選びながらアクチンフィラメントの周りを左巻きに回転しつつ歩くことを示す顕微鏡観察の結果を得た。筋収縮系の自励振動(SPOC)は外部力学刺激に同調する:骨格筋筋原線維の両端をガラス微小針に固定したのち、SPOC条件(ATP、ADP、無機リン酸(Pi)共存、Caイオン非共存)で、半筋節あたり10nm(分子モーターのサイズ)程度のステップで長さを変動したところ、シンクロして全ての筋節が一斉に伸びること、従って外部力学刺激に対して長さ振動がシンクロすることが分かった。しかも、自発的には振動していないADP収縮条件で硬い針を振動させたところ、これにシンクロして筋原線維が振動することも見出された。これらの結果は、分子モーターという力学酵素における力と酵素活性とのカップリングの本質を捉えたものと考えられる(論文準備中)。心筋収縮系におけるSPOC現象:SPOC周期が動物種(ウシ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット)によらず心拍周期に比例していた。このことは、心筋収縮系自体が振動系であり、心拍リズムを担う土台として適応していることを示している。心筋再構成系:細いフィラメント再構成心筋収縮系を用いてCBの動力学を検討した。本年度は、顕微画像化・解析装置のアップグレードを行う一方で、1分子機能顕微解析の対象として以下の3つの実験系を取り上げた。1)アクチン・ミオシン分子モーター系:アクチン・ミオシン(HMM)分子間の硬直結合状態における破断力分布を、様々な負荷上昇速度のもとで計測した。その結果、負荷上昇速度が大きいと、破断力分布は7pN付近と15pN付近に2つのピークをもつが、負荷上昇速度が小さくなると、15pN付近のピークが消えることが分かった。このことから、ミオシン分子は硬直結合状態において単頭結合と双頭結合の平衡状態にあると結論された。2)微小管・キネシン分子モーター系:微小管・キネシン分子間結合の破断力と、キネシン分子の弾性率を、ATP非存在下(硬直状態)とAMPPNP存在下(ATP状態)で計測した。そこで1)と同様に、破断力と弾性率の負荷上昇速度依存性を計測した。その結果、破断力、弾性率ともに、硬直状態ではATP状態の約半分であることから、前者では単頭結合、後者では主に双頭結合であることが分かった。さらに負荷上昇速度依存性から、双頭・単頭結合間に平衡関係が成り立っていることが分かり、そこでの速度定数が見積もられた。3)心筋収縮系:最大等尺張力に対するpHの作用は、心筋と骨格筋では異なる。アクチンフィラメント再構成心筋を用いて、pH減少に伴う張力減少の程度がトロポミオシンによって制御されることを明らかにした。4)シャペロニン: