hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水平的情報構造が持続可能なエビ養殖業づくりに及ぼす効果分析

2018年度に筆者はベトナムとタイの集約型エビ養殖産業についての研究を行ない、博士論文を執筆して6月に博士号を取得した。この博士論文で2019年3月に東京大学新領域創成科学研究科長賞を受賞した。そして、下記の論文を執筆して夫々を海外の学術誌に投稿した。[2]筆者はベトナムでエビ養殖農家を対象に農業情報の波及効果に関するフィールド実験を行なった。検証結果に基づいて論文を書き、2018年度に応用農業経済学会(AAEA)、持続可能な開発学会、日本経済学会2018年度秋季大会で口頭発表を行った。そして、この論文を去年の12月にWorld Developmentという学術誌に投稿した。2019年4月に編集長より修正及び再提出の連絡をもらい修正中である。[3]筆者はタイのエビ農家が自発的に作ったフェイスブック上のコミュニティ・グループを対象に研究を行なった。分析結果に基づいて論文を書き、2018年度に韓国経済学会、持続可能な開発学会で発表した。また、今年の11月にミシガン大学で会開催される予定の持続可能な開発学会で口頭発表を行った。現在、同誌からのレビューを待っている。[4]2019年3月、修士論文を改正して執筆した論文が国内の学術誌(国際開発研究)に掲載された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、1.農業技術セミナーで得られた情報を自分だけのもにするのではなく、隣人にも情報を正確に伝播する伝播者を見つけること、2.農家同士の情報共有の動機を明らかにすることである。情報の伝播者を見つけるために筆者はベトナムで社会実験を行った。その結果、以下のことがわかった。1.社会ネットワーク抽出法で選ばれた処理群は隣人に情報を伝播することに積極的であった。しかし、正確な情報の伝播には効果的ではなかった。2.無作為抽出で選択された処理群は間接的波及効果が最も高かった。すなわち、無作為抽出法で選択された処理群と同じ村に住んでいる農家の知識水準の向上幅が他の処理群の村より高かった。3.層化抽出法で選ばれた処理群は情報の伝播には積極的ではなかったが、直接的波及効果が最も高かった。これは層化抽出法で選ばれた処理群が自分の隣人に正しい情報を伝播し、その人たちのエビ養殖に対する知識水準を向上させたことを意味する。次に農家同士の情報共有の動機に関する研究として、エビ養殖農家が主なメンバーであるSNS上の実践コミュニティを研究対象として選択し、仮想のコミュニティでも現実のコミュニティと同様に互恵主義が情報共有の動機であるかを検証した。その結果、互恵主義が情報共有の動機であることを明らかにした。すなわち、そのコミュニティ上で質問したことがある人が情報の共有にも積極的であり、以前情報を共有したことがある人たちが、質問にも積極的あった。本研究は水平的情報交換がよく行われていない地域において農業技術を普及する際に参考になるものだと考えられる。また、SNS上の農業技術コミュニティの管理および活性化させるための取り組みの際にも参考できるものだと考えられる。1.隣人に情報を正確に伝播する伝播者を見つけるための研究ベトナム2016年12月31日、ベトナム国カマウ省でエビ養殖農家を対象に池の水質管理についての知識および水質検査キットの使い方に関するワークショップを開催しました。そのワークショップには、1.無作為抽出、2.層化抽出法、3.社会ネットワーク抽出法で選択された農家が参加しました。2017年に追跡調査を行いました。その調査の目的は上のワークショップから8ヶ月が経った時点で前述の3つのサンプリング・グループの中でどのグループの方がワークショップに参加しなかった農家により積極的に知識共有をしているのかを検証するためのデータを収集することだった。調査は9月上旬に完了しました。帰国してから調査が完了するまでSurvey Solutionというプログラムを使って調査員のインタビューに対するコメントや質問票の修正などの仕事をしました。その調査で得られたデータを分析してその分析結果に基づいて論文を執筆して博士論文に掲載しました。2.農家同士の情報共有の動機を明らかにするための研究2017年7月、タイのエビ養殖業者たちのコミュニティ・サイ上のデータを収集し、そのデータを研究目的に合わせて分類する作業をしました。その研究の目的はネット上の農業技術コミュニティにおける水平的情報交換の動機を明らかにすることでした。コミュニティ上の投稿内容がタイ語であったため、タイ人を雇い、その投稿を情報共有または質問に分類させました。そのデータを統計的に分析してネット上の農民コミュニティでの情報交換の動機が現実のコミュニティと同じく利他主義であることを明らかにすることができました。その分析結果に基づいて論文を執筆し、Information & Managementというジャーナルに今年の3月に投稿しました。また、博士論文にもその論文を掲載しました。

検証結果に基づいて論文を書き、2018年度に応用農業経済学会(AAEA)、持続可能な開発学会、日本経済学会2018年度秋季大会で口頭発表を行った。そして、この論文を去年の12月にWorld Developmentという学術誌に投稿した。2019年4月に編集長より修正及び再提出の連絡をもらい修正中である。[3]筆者はタイのエビ農家が自発的に作ったフェイスブック上のコミュニティ・グループを対象に研究を行なった。分析結果に基づいて論文を書き、2018年度に韓国経済学会、持続可能な開発学会で発表した。また、今年の11月にミシガン大学で会開催される予定の持続可能な開発学会で口頭発表を行った。現在、同誌からのレビューを待っている。[4]2019年3月、修士論文を改正して執筆した論文が国内の学術誌(国際開発研究)に掲載された。まず、平成29年度に作成したタイのSNS事例の論文を韓国の韓国世界経済学会、ドイツの社会ビジネス学会に投稿いたしました。韓国世界経済学会での口頭発表は内定をもらっており、今年度の6月に学会に参加し、上記の論文を発表する予定です。そして、今年の2月にInformation & Managementという学術誌に上記の論文を投稿しました。現在、審査中で修正および再投稿になると修正して再投稿しようと思います。次に、平成29年度に作成した抽出法の論文を日本経済学会、米国の農業応用経済学会で口頭発表をしようと思います。農業応用経済学会の方は内定をもらっており、8月に上記の論文をその学会で発表する予定です。そして、今年度中に上記の論文を修正し、学術誌に投稿する予定です。投稿先は未定です。最後に、去年度に私たちがエビ養殖農家を対象にベトナムで行なった社会実験がその農家の社会ネットワークにどのような変化を齎したかを去年度に収集したデータを用いて分析する計画です。そのネットワークの動学的性質を考察するため、今年度中にもう一度その地域で農家の社会ネットワークを調べるための調査をする可能性もあります。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
リボザイム機能構造のネットワーク

「RNAナノ構造体の人工的構築」を目的に、コンピュータープログラムにより分子デザインし、実際に構築したself-folding RNAを基本骨格として、分子エンジニアリングを行い、反応部位と触媒部位を新たに組み込んだRNAをデザインした。触媒部位は30のランダムな塩基配列を持つヌクレオチドプールとし、このプールからのin vitroセレクションの条件を設定、セレクションを行い、de novoで分子構造をデザインし、そのデザインされた分子に、活性中心を搭載して実際にRNAリガーゼ活性を有するRNAを作成することに成功した。また、つづけてこの人工リボザイムに、さらに機能を付け加えることを試み、シス型のものからトランス型のものへと分子変換に成功した。さらには、新たに小分子レセプター機能をもつ構造ユニットを組み込みアロステリックにリボザイムを制御することに成功した。これは、天然のリボザイムの機能と構造の相関関係を解析し、それを蓄積して開発した技術を実践的に応用することができた初めての例となった。このRNAの分子デザインの技術をさらに進めることにより、RNAとタンパク質の複合体であるRNPの分子デザインと作成をおこない、RNA骨格上に固定した二つの構造既知のタンパク質の間でFRETを行わせることに成功した。また、FRETの効率をRNAのデザインにより制御できることを示した。この基礎技術の開発の成功は、将来、シンセティックバイオロジーの新分野を切り開く為に有効であるものと期待される。「天然のP4-P6 RNAの分子骨格をもつ新しいリボザイム」の作成をおこなった。1)P4-P6 RNAのx線結晶構造解析の結果をもとに、同分子内に隣接する反応部位と活性中心を構築するために同分子の特定の部位に修飾を施したP4-P6 RNAの誘導体をデザイン・作成した。この誘導体RNAの立体構造が、天然のものと同様であることを確認するため立体構造解析をおこない、これを確認した。2)上記のRNAに、反応部位と触媒部位を組み込んだRNAをコンピュータープログラムを用いてデザインし、その鋳型となるDNAを作成した。また、これら鋳型DNAを用いて、効率良く大量のRNAを転写することに成功した。3)in vitroセレクションの条件を設定し、RNAリガーゼ活性を有するRNAの検知、濃縮に有効な条件を設定した。転写したRNAからのセレクションを、条件を調整・選択し、くり返し行い活性のあるRNAを濃縮した。濃縮されたRNAを単離精製し、それらの塩基配列を決定した。その結果、デザインした通りに選択された触媒部位の働きにより、RNA ligation反応が進行することがあきらかになった。4)反応は計画されたヌクレオチド間また天然のリボザイムと同じく3' -5'結合を生成し進行することを確認した。5)得られたリボザイムの活性を測定し、バックグラウンドに比べて10の4乗以上の反応の加速を行うものがあることを確認した。6)基質を含むRNA部分構造と触媒部位を含むRNA部分構造を物理的に分割し、これらによる2分子反応をおこなえることを確認した。このことから、デザイン通りにP4-P6RNAの分子骨格に依存するリボザイムの作成に成功していることを確認できた。7)現在、得られたリボザイムにランダムに変異を導入し、さらにセレクションを行うことにより、その活性を向上させることを試みている。その結果、現時点では、大幅な活性の向上は認められないが、さまざまなリボザイムの誘導体を得ることに成功した。これらはリボザイムの細部の構造の解析に有用である。「RNAナノ構造体の人工的構築」によりつくられた人工のself-folding RNAを基本骨格として、分子エンジニアリングを行い、反応部位と触媒部位を新たに組み込んだRNAをコンピュータープログラムによりデザインした。触媒部位は30のランダムな塩基配列を持つヌクレオチドプールとし、このプールからのin vitroセレクションの条件を設定、セレクションを行いRNAリガーゼ活性を有するRNAを単離精製した。また、それに含まれる分子認識ユニットである触媒部位の塩基配列を決定した。デザインされた通りにセレクトされた分子認識ユニットの働きにより、RNA ligation反応が進行することをあきらかにした。

この反応が天然の3'-5'リンケージを持つRNA結合の形成をすることを確認し、さらに分子エンジニアリングを進め、RNAを触媒ユニットと基質ユニットの二つのユニットに物理的に分割・再構成すると言う手法で人工的な分子進化を行わせることに成功した。この反応系では、反応が最終的に80%以上の高効率で進むことが分かり、この手法によるリボザイムの構築という手法が、将来的に有望なものであることが確認できた。さらに、得られたリボザイムにランダムに変異を導入し、さらにセカンドセレクションを行うことにより、その活性を向上させることに成功した。その結果、大幅な活性の向上が認められ、また、さまざまなリボザイムの誘導体を得ることに成功した。これらはリボザイムの細部の構造の解析に有用であり、この実験から触媒部位の高次構造の予測や触媒に関与する残基の推定が可能となった。最近の天然RNAの立体構造解析から、新しいRNAの構造を決定するRNA分子内相互作用が見出された。これらは、ループとレセプターの組み合わせによりRNA基本構造単位(らせん構造を連結するRNA-RNA接続ユニットである。したがって、原理的には、RNA基本構造単位(らせん構造)とこれら接続ユニットを組み合わせることにより、望みの立体構造をもつRNA分子をデザイン・構築できるはずである。我々は、実際に、これら接続ユニットを用いて人工のRNAをコンピューターによりデザインし、そのデザイン通りにRNAを作成することに成功した。そこで、小スケールのコンビナトリアムライブラリーを同RNAに組み込み、このライブラリーからのセレクションにより活性中心をインストールし、完全に人工的な新規リボザイム(リガーゼ)を創成することに成功した。また、構造既知の天然のRNAであるP4-P6 RNAを骨格として、同じく新規リボザイムを創成することが出来た。これらの研究をProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.とRNA誌に発表した。さらに生化学的解析を行い、これらは骨格となる立体構造を利用していること、これまでに得られた他のリボザイムと同様の生化学的性質を持つことを明かにした。構造化学的解析から、二つのリボザイムの活性中心を含むモジュラーユニットは全く異なる構造と成分を持つことが明らかになった。したがって、上記のように2例の異なるリボザイムを作成できることを証明したので、、我々が開発したリボザイム創成のための新しい手法は、一般的にさまざまなリボザイムの創成に応用可能であることが証明できた。(a)人工のRNA scaffoldを利用してデザイン・作成することに成功した人工のリボザイムの高次構造が、デザイン通りの高次構造をもつことを化学的構造解析やさまざまな突然変異体を構築、解析することにより確認した。また、得られた高活性活性型RNAの構造機能相関を生化学的手法により解析した。
骨・腸・代謝連関による糖脂質代謝異常の予防戦略

(1)GluOCが培養した膵臓alpha細胞様細胞に直接作用してGLP-1分泌量を修飾する機序解明を進展させた。GluOCによるGLP-1産生への変換酵素PC1/3の発現の促進や、PC1/3の内在性阻害因子Pcsk1n遺伝子の発現抑制には、転写因子Pax6の発現上昇や、成熟alpha細胞マーカーの発現低下、すなわちalpha細胞の未成熟化が関与することを示唆する結果を得た。(2)GluOCによって脂肪細胞にnecroptosisが誘導される分子メカニズムを検討した。GluOCによるcAMPの産生とPKAの活性化→核内PKA触媒サブユニットによるSIK2の不活化とヒストンアセチルトランスフェラーゼp300の活性化→転写因子FoxO1とFasLの発現亢進→Fasシグナルの活性化→脂肪細胞におけるカルシウム流入・活性酸素産生・ミトコンドリア分裂→細胞死という経路であることを解明した。(3)GluOCによる代謝改善作用はGLP-1シグナルを介することを解明した。GLP-1受容体欠損マウスではGluOC刺激により糖新生酵素の発現を調節する転写因子FoxO1およびコアクチベーターであるPGC1alphaの発現が上昇し、糖新生が増強するが、GLP-1シグナルがそれらを抑制し、生体内でバランスをとっていることが分かった。30年度には1GluOCがalpha細胞に直接作用し、グルカゴン産生からGLP-1産生へと変換させる転写因子群の解明2高濃度GluOCにより脂肪細胞(3T3-L1)がnecroptosisを起こすメカニズムを分子レベルで解明3GluOCによる代謝改善効果はGLP-1を介した作用が優位であることをGLP-1受容体の欠損マウスを用いて解明4妊娠母体が摂取する栄養やGluOCが胎児肝Pygl遺伝子のメチル化を制御するメカニズムを明らかにしたことの4点について、順調に研究実績をあげていることから、概ね計画通りに研究は進展していると判断できる。また、当初の目標にはなかったが、GluOCのマウスの自発運動に及ぼす影響について検討したところ、運動に対するモチベーションに加えて運動能力も高める作用があることが分かったことなどからも、順調に進捗していると判断できる。今後は、下記について重点的に検討する。(1)GluOCによるalpha細胞における産生ホルモンの転換について、関与する転写因子群の発現を調節するシグナル経路を同定し、機序の全体像の解明を目指す。(2)GluOCによる代謝改善効果において性差が生じる原因、とくにテストステロンの影響に関して解析を行う。予備的解析で最も顕著な影響が現れた脂肪組織と肝臓を中心に、テストステロン濃度を調整したマウスを作成して糖・脂質代謝関連遺伝子群の発現変化を網羅的に解析し、変調の分子基盤の解明を目指す。(3)妊娠母体へのGluOC投与が、GluOCを直接投与していない成熟後の仔の肝Pygl発現を増強させているメカニズムについて、仔の肝GluOC発現制御にも着目しながら解析する。(4)GluOCが運動に対するモチベーションを高めるメカニズムについて、脳内報酬系の活性化に着目しながら検討する。また、GluOCが糖代謝の亢進に関与する機構に関して、骨格筋細胞に特化したメカニズムを探る。29年度の実績は下記の4点にまとめられる。(1)α細胞様細胞株aTC1-6細胞を用いてGluOCがα細胞に直接作用してGLP-1分泌量を修飾する機序について検討した。GluOCはGLP-1産生への変換酵素PC1/3の遺伝子発現を促進し、培地グルコース濃度などが影響する傾向を認めた。またPC1/3の酵素活性を阻害する内在性因子のPcsk1n遺伝子の発現が低下する傾向を新たに見出した。(2)高濃度OCの3T3-L1脂肪細胞に対する影響について以下の点を明らかにした。1cAMP濃度およびCREBのリン酸化亢進2CREBの転写共役因子p300の脱リン酸化亢進3PKA触媒サブユニットの核内局在亢進4多点タイムラプス動画による細胞膜破壊像および脂肪滴分解像の取得これらから、高濃度OCでは脂肪細胞の脂肪滴縮小や細胞死がもたらされることが分かった。(3)肝臓と脂肪に対するGluOCの代謝改善作用はGLP-1を介する経路が優位であることを示した点である。GLP-1受容体欠損マウス、あるいはGLP-1受容体阻害薬を投与したマウスに対して継続的にGluOCを経口投与すると、耐糖能の悪化と脂肪細胞の肥大が見られた。単離ラ氏島を用いた実験から、耐糖能悪化はインスリン分泌低下によるものではなく、肝臓における糖新生亢進によるものであることが明らかになった。(4)妊娠母体が摂取するGluOCにより、成熟後の雌仔の肥満や糖脂質代謝の改善が認められる機序について、遺伝子発現のエピゲノム制御(特に、DNAメチル化修飾)に焦点を当てた解析を行った。網羅的メチル化解析の結果、雌仔の肝臓において、妊娠母体の糖脂質負荷およびGluOC飲用の有無によって、仔の肝Glycogen phosphorylase(Pygl)遺伝子プロモーター領域のメチル化レベルに変化が生じ、その発現が制御されていることを見出した。29年度に設定した目標:1GluOCがα細胞に直接作用し、GLP-1産生への変換酵素PC1/3発現上昇に至るまでの道筋の解明2高濃度GluOC添加により脂肪細胞(3T3-L1)がnecroptosisを起こすメカニズムを解析すること

3GluOCによる代謝改善効果はGPRC6Aを介した直接作用とGLP-1を介した作用のどちらが優位であるかを検討することの3点について、順調に研究実績をあげていることから、その様に判断できる。また、当初の目標にはなかったが、妊娠母体が摂取するGluOCにより、成熟後の雌仔の肥満や糖脂質代謝の改善が認められる機序について、遺伝子発現のエピゲノム制御の観点からの解析に着手し、一定の成果が得られたことなどからも、順調に進捗していると判断できる。(1)GluOCが培養した膵臓alpha細胞様細胞に直接作用してGLP-1分泌量を修飾する機序解明を進展させた。GluOCによるGLP-1産生への変換酵素PC1/3の発現の促進や、PC1/3の内在性阻害因子Pcsk1n遺伝子の発現抑制には、転写因子Pax6の発現上昇や、成熟alpha細胞マーカーの発現低下、すなわちalpha細胞の未成熟化が関与することを示唆する結果を得た。(2)GluOCによって脂肪細胞にnecroptosisが誘導される分子メカニズムを検討した。GluOCによるcAMPの産生とPKAの活性化→核内PKA触媒サブユニットによるSIK2の不活化とヒストンアセチルトランスフェラーゼp300の活性化→転写因子FoxO1とFasLの発現亢進→Fasシグナルの活性化→脂肪細胞におけるカルシウム流入・活性酸素産生・ミトコンドリア分裂→細胞死という経路であることを解明した。(3)GluOCによる代謝改善作用はGLP-1シグナルを介することを解明した。GLP-1受容体欠損マウスではGluOC刺激により糖新生酵素の発現を調節する転写因子FoxO1およびコアクチベーターであるPGC1alphaの発現が上昇し、糖新生が増強するが、GLP-1シグナルがそれらを抑制し、生体内でバランスをとっていることが分かった。30年度には1GluOCがalpha細胞に直接作用し、グルカゴン産生からGLP-1産生へと変換させる転写因子群の解明2高濃度GluOCにより脂肪細胞(3T3-L1)がnecroptosisを起こすメカニズムを分子レベルで解明3GluOCによる代謝改善効果はGLP-1を介した作用が優位であることをGLP-1受容体の欠損マウスを用いて解明4妊娠母体が摂取する栄養やGluOCが胎児肝Pygl遺伝子のメチル化を制御するメカニズムを明らかにしたことの4点について、順調に研究実績をあげていることから、概ね計画通りに研究は進展していると判断できる。また、当初の目標にはなかったが、GluOCのマウスの自発運動に及ぼす影響について検討したところ、運動に対するモチベーションに加えて運動能力も高める作用があることが分かったことなどからも、順調に進捗していると判断できる。今後は、下記について重点的に検討する。(1)PC1/3発現調節への関与が知られるSTAT3シグナルに着目しながらPcsk1nの発現調節機構とあわせてα細胞においてGluOCが機能するシグナル経路同定を目指す。
イネの高温登熟耐性遺伝子・ＱＴＬの特定

登熟時の高温による白未熟粒の発生に強い品種育成のため、ハバタキ・ササニシキ染色体断片置換系統を用いて、高温耐性に関与する遺伝子座の解明を行った。この高温耐性QTLは、第3染色体に座乗しており、その存在範囲を絞り込んだ。このQTLがハバタキ型の場合には、登熟時の気温の上昇幅が同じでも、白未熟粒の増加割合がササニシキより小さいことから、真の登熟期高温耐性である。このQTLの近傍に、整粒割合を増加させるQTLも見出した。この2つのQTLは、共にハバタキ型で整粒割合を増加させる方向に働くため、これらのQTLを含む領域を導入することにより、日本型イネの整粒割合増加と白未熟粒減少方向に改良可能となる。近年、登熟時の高温により、米粒が白濁するいわゆる白未熟粒の発生により、米の品質低下が問題になっている。そこで、高温でも白未熟粒の発生が少ないインド型品種ハバタキの高温登熟耐性QTLの探索を行い、高温登熟耐性品種育成の基礎とする。ハバタキの第3染色体にある高温登熟耐性QTLの候補領域付近をササニシキに導入したF8分離後代を栽培し、乗換え系統の探索と分離系統による高温耐性の評価を行った。その結果、マーカー125495-8近辺の狭い範囲のみをハバタキ型で持つ準同質遺伝子系統が得られた。この系統は、同領域がササニシキ型の系統に比べて、白未熟粒(乳白+基部+腹白+死米)の割合が有意に低く、また整粒割合も有意に高かった。この領域内には6個の候補遺伝子が含まれていた。しかしこのハバタキ領域のうちの片側が欠けて、ハバタキ型領域が更に狭くなった別の系統では、白未熟粒減少の効果が見られなかった。このことから考えて、この欠けた領域に白未熟粒の発生を抑制する機能が座乗していると考えられる。しかしながら、この領域には遺伝子の構造遺伝子部分は含まれておらず、遺伝子の発現を調節する機能が座乗している可能性が高いと考えられる。したがって、ここから最も近い位置に座乗する遺伝子が原因遺伝子であり、この部分により発現が調節されている可能性が高い。以上のことから、高温登熟耐性に関与する遺伝子は、ほぼ特定できたと考えている。今後、遺伝子発現解析等により、これが本当に原因遺伝子なのか検証する必要がある。また、同じ第3染色体の別領域に見いだされたハバタキ型で整粒割合を増やすQTLについても、準同質遺伝子系統が得られており、整粒割合を増やす効果が確認された。しかしこの領域は、まだ690kbpの長さがあり約70個程度の遺伝子が含まれているため、今後の絞り込みが必要である。高温登熟に耐性の品種育成のため、高温登熟耐性に関与する遺伝子座の解明を行っており、インド型品種「ハバタキ」が高温でも白未熟粒の発生が少ないことから、ハバタキ・ササニシキ染色体断片置換系統を用いて高温登熟耐性を持つQTLの探索を行った。ハバタキの第3染色体の一部を持つSL418をササニシキを戻し交配したF7分離後代のうち、高温登熟耐性QTLの候補領域付近で乗換えを起こした系統を選抜し、圃場で高温処理栽培して玄米品質を判別し、高温登熟耐性を持つ遺伝子領域を狭めた。その結果、白未熟粒(乳白+基部+腹白+死米)は、マーカー125495-8近辺で高いLOD値を示し、相加効果はマイナスになった。このことは、この領域がハバタキ型の遺伝子型になることにより、白未熟粒割合が減少することを示している。また、その効果は、高温処理を行うことにより強まることから、このQTLを持っていない系統は高温で品質が著しく低下するのに対し、持っている系統では品質の低下が少ないことが分かった。このQTLについては、候補遺伝子が3個程度にまで絞り込めているが、栽培条件等による変動が大きいため、その領域のみを含む順同質遺伝子系統を作成しての検証が必要で有り、その作成を行っているところである。また、同じ第3染色体だが、この白未熟粒のQTLとは異なった座乗位置に、ハバタキ型で整粒割合を増やすQTLが確認された。こちらは、高温登熟条件で強まるわけでは無いので、高温耐性のQTLではなく、品質向上のQTLと考えられるが、両者を持つことにより、より品質が向上すると考えられるため、両者およびそれぞれを導入した系統を作って解析を行う準備をしている。

近年、米の生産において、登熟時の高温による白未熟粒の発生が問題になっている。高温登熟に強い品種育成のため、高温耐性に関与する遺伝子座を解明する必要があり、ハバタキ・ササニシキ染色体断片置換系統を用いて高温耐性のQTLの探索を行った。昨年までに、高温耐性を持つQTLを第3染色体の遺伝子6個程度まで絞り込んでおり、本年度は、その発現解析を行った。その結果、そのうち2遺伝子は登熟中の粒で発現がみられず、実質4遺伝子にまで絞り込めた。また、このうちの1遺伝子は、ハバタキ型では高温処理により発現量が2倍以上に増加するが、ササニシキ型では高温で減少した。したがってこの遺伝子が原因遺伝子である可能性が高い。今後、候補遺伝子の発現抑制等により、原因遺伝子であることの証明を行う。期間全体を通しては、登熟時の気温の上昇幅が同じでも、ハバタキの白未熟粒の増加割合がササニシキより小さいことから、ハバタキが真の登熟期高温耐性を持っていることを明らかにし、この高温耐性QTLの座乗範囲を第3染色体の4遺伝子にまで絞り込んだ。これに加えて、このQTLの近傍に、胴割れ粒の発生を抑制することにより、整粒割合を増加させるQTLも見出した。この2つのQTLは、共にハバタキ型で整粒割合を増加させる方向に働き、間に悪影響を及ぼすQTLが無いため、これらのQTLを含む領域を導入することにより、ササニシキのような日本型のイネを、整粒割合を増加させる方向に改良可能となる。これらの経緯については、現在論文を投稿中である。また、この研究と並行して、同じ材料を用いて、コメのタンパク質含量に関するQTLを調べていたが、この原因遺伝子がイネの短稈遺伝子であるsd1であり、そのアリルの変化によりタンパク質含量が変化することを明らかにした。これについては、論文として発表を行った。イネの収量・品質に関する遺伝子・QTLの解析高温登熟耐性QTLに関する準同質遺伝子系統が得られ、それにより高温登熟耐性の違いが検証できた。この準同質遺伝子系統の中には、6個の候補遺伝子が含まれているが、マップベースでの解析により、そのうちの1遺伝子が原因遺伝子であることがほぼ特定できた。この遺伝子については、RNAiにより発現抑制を行って、耐性機能が失われるかどうかを調べる予定であり、現在そのベクターの構築を行っている。また、ハバタキ型で整粒割合を増やすQTLについても、準同質遺伝子系統が得られ、それにより原因遺伝子が座乗する範囲が特定できた。これについては、遺伝子特定にはまだかなりの時間が必要だが、QTLとして特定することにより、品質向上に向けた育種に応用可能と考えている。高温登熟耐性QTLの絞り込みは順調に進んでおり、現在候補遺伝子は3個程度にまで絞れている。ただし、圃場で高温処理するため、毎年の登熟期気温が異なり、ある年の無処理が別の年の高温処理と同程度の気温になる等、環境条件の変動により効果が安定しないため、確証を得るのが難しい。グロースチャンバーでの高温処理を併用しているが、処理個体数に限度があるため、絞り込みに使うのは難しかった。しかし現在、候補領域を絞り込むことができ、また候補領域を狭い範囲で持つ準同質遺伝子系統が得られてきているため、グロースチャンバーで栽培可能な程度に少ない個体数で検定が可能になってきており、この問題点はほぼ解消したと考えられる。また、もう一つの問題点は、当初1つであると考えていたQTLが、候補領域中に2つ以上存在する可能性が高まったことである。そのうちの1つは高温登熟耐性QTLであり、現在順調に絞り込めているが、もう一つの整粒割合を向上させるQTLに関しては、絞り込みを始めたばかりであり、当初計画以上の進展はない。
循環器外科領域における中枢神経系保護に関する研究

胸部大動脈瘤(弓部大動脈瘤・胸腹部大動脈瘤)手術時の脳・脊髄保護法の確立が、これらの手術の成否の鍵を握ると考えられる。この保護法確立のための基礎実験を行った。雑種成犬の頭部分離体外循環モデルと逆行性脳分離循環モデルを用いて、これらの補助手段施行時とその後の急性期経時的変化を、微小循環観察法で評価した。いずれの補助手段も、脳保護法施行時間が1時間以内の時にはその微小循環変化は認められなかった。脳虚血時間を延長しての、微小循環の変化・脳間質への水分の移行などの変化を観察する実験を継続中である。一方、家兎腎動脈下腹部大動脈単純遮断モデルを用いて、脊髄虚血の軽減・防止に、高燐酸エネルギー化合物の細胞外への流出を防止する目的から、5'-nucleotidase inhibitorの使用を検討した。本酵素阻害薬の効果が、心臓の虚血時高燐酸エネルギー化合物の保持に有効であったことから、これを応用した。血流遮断前にこれを投与し、遮断後にも継続的に投与することにより、本モデルでの対麻痺発生頻度を低くすることが可能であった。これにアロプリノールを添加し、oxygen free radicalの発生とそれに伴う脳・神経障害の発生防止効果があるかどうかを現在検討している。
リーンスタートアップ製品開発のためのユーザーが生み出す機能面の再考

本研究の対象であるリーンスタートアップ製品開発は、暫定的な製品を使い手に供給し、そこからフィードバックされる情報によって、価値をつくる確度の高い製品を開発する考え方である。そのため、当初案の設計のプロセス、当初案の使われ方のプロセス、改善案の概念設計へのフィードバック、という3段階の流れを精査しながら、重要な点を明示化しなければならないと考えている。特に、本研究は、フィードバックにおける根本的な考え方を再考し、これまでになかった体系的な整理を行うことを第一の課題であると考えている。そのために、以下の3点を重要な課題と位置づけ、研究を進めていくものである。・製品分野ごとに、つくり手による「設計機能」と、使い手による「発生機能」を論理的仮説に基づいて類型化し、類型ごとに対象を抽出する。・「設計機能」をつくり手への調査により「発生機能」を使い手への調査により、具体的に記述していく。この時、影響要因、複雑性、不確実性についての理論体系を確立していく。・理論体系に基づき、具体的な国内のリーンスタートアップ製品開発の影響要因を整理しながら機能面に関する理論的フレームを考察し、具体的な手法の確立への貢献を目指す。具体的な今年度の実績としては、査読論文2本、国際学会発表1本などにまとめている。また、現在も研究成果をまとめつつある論文が2本、国際学会発表予定論文が1本あり、引き続き成果を発表していくものである。そのため、当初案の設計のプロセス、当初案の使われ方のプロセス、改善案の概念設計へのフィードバック、という3段階の流れを精査しながら、重要な点を明示化しなければならない。また、研究計画の概要としては、「具体的な対象の抽出」、「設計機能と発生機能の記述」、「改善設計へのフィードバックの理論的フレームの構築」が要点であると考えてきた。ここまで、議論が大変に深まり、当初に予想していなかった堅強な理論的なフレームワークが構成されつつある。これは、一般的な製品やサービスが、どのようなプロセスで、考案され、設計され、生産され、使われていくのか、という一連の流れを全て含むものとなっている。このフレームワークは、経営学や社会学ですでに議論されてきたものに加え、工学的な観点からつくり手の視点を厚めに反映したものであり、極めて有用性の高いものであると考えている。この成果は、当初の予定より、充実した成果となりつつあると言える。一方、使い手の取りだす機能の把握については、調査や分析を行いつつも、単純化することが出来ず、体系化が進み難いことが認識された。そのため、製品領域や産業領域の領域特性を体系化していくことにより、当初と異なるレイヤーをターゲットとすることを検討している段階である。ここまでの研究で明確になってきた、製品やサービスの創造プロセスに関する俯瞰的な体系化を基盤とし、その上に各製品分野や産業分野の事例を重ね合わせていくことを進め始めている。現段階では、自動車、建築、空調機械製品、衛生陶器製品、建具製品、印刷産業の組織に協力を求めてきたが、家具製品、電気製品を加え、より一般化させた内容を目指して調査・分析を進めていく。この時、当初の目的に沿い、つくり手と使い手が関与することによって生じる2種類の機能について徹底的に議論していくものである。また、このような一般的な製品やサービスに加え、製薬領域、医療領域なども対象としていくことを検討しており、すでに医師との議論を始めている。理論展開や、調査の分析に関する考察については、国内の研究者、および海外の研究者に協力を求め、様々な偏りの要因を排除していくものである。最終的には、製品やサービスに関する創造プロセスを出来るだけ一般化しながら、できるだけ正確に記述し、現行製品から次世代製品設計へのフィードバックを中心に、多くの経済的活動に有用な考え方を示すことを目指しているものである。本年度は,全体の予算が変更されたことに対応するため,研究のプロセスを修正しながら,粛々と進み始めた。特に,リーンスタートアップの現状の情報収集をメディアを使った範囲にとどめながらも収集しつつ,製品を開発するプロセスの問題点,顧客が製品をどのようにとらえて価値を取り出すのかについてのとらえ方についての基盤的な議論を中心に進めたものである。具体的なテーマとしては,「機能の視点から見る製品開発」,「製品開発中に含まれる不確実性」,「使い手が取りだす価値」の3つから議論を進めている。これらについては,それぞれのテーマで論文にまとめ,年度末に日本建築学会の方で発表している。また,同時に査読論文の入稿もしており,審査を受けているところで年度をまたいでいる。こちらの論文は,これらの基盤的なテーマを基に,実際の設計活動についての考察を行ったものであり,2年目以降にはさらに進めていく内容となっている。一方,研究全体の進捗を円滑にしていくため,国内外の研究者で,本研究に強い興味を持つ方々にも,様々な形で参加して頂く方向となっている。これらの方々は,研究費を分担するかたちが必要ない方が多いものの,学術的視点は強く共有できるため,次年度以降に実質的にご協力いただける方向となってきたものである。初年度には,5名の海外の研究者と直接議論し,本研究の可能性と課題を中心に検討を始めながら,各研究者の学術的視点とのすり合わせを行い,2年目,遅くても3年目に,論文等の具体的な学術成果を出す方向で進めることとなっている。

初年度として,早めに研究活動を介したことにより,研究グループでの議論も進み,3題の論文にまとめることができた。また,査読論文の入稿も行うことができている。特に,内容として,今後の展開に重要な,製品開発の価値創造と価値獲得についての基盤的なものを,一通り考察することができたと考えている。これにより,予算の変更に伴って研究計画の見直をしているが,その内容に対して概ね順調に進展しているということができると考えられる。本研究の対象であるリーンスタートアップ製品開発は、暫定的な製品を使い手に供給し、そこからフィードバックされる情報によって、価値をつくる確度の高い製品を開発する考え方である。そのため、当初案の設計のプロセス、当初案の使われ方のプロセス、改善案の概念設計へのフィードバック、という3段階の流れを精査しながら、重要な点を明示化しなければならないと考えている。特に、本研究は、フィードバックにおける根本的な考え方を再考し、これまでになかった体系的な整理を行うことを第一の課題であると考えている。そのために、以下の3点を重要な課題と位置づけ、研究を進めていくものである。・製品分野ごとに、つくり手による「設計機能」と、使い手による「発生機能」を論理的仮説に基づいて類型化し、類型ごとに対象を抽出する。・「設計機能」をつくり手への調査により「発生機能」を使い手への調査により、具体的に記述していく。この時、影響要因、複雑性、不確実性についての理論体系を確立していく。・理論体系に基づき、具体的な国内のリーンスタートアップ製品開発の影響要因を整理しながら機能面に関する理論的フレームを考察し、具体的な手法の確立への貢献を目指す。具体的な今年度の実績としては、査読論文2本、国際学会発表1本などにまとめている。また、現在も研究成果をまとめつつある論文が2本、国際学会発表予定論文が1本あり、引き続き成果を発表していくものである。そのため、当初案の設計のプロセス、当初案の使われ方のプロセス、改善案の概念設計へのフィードバック、という3段階の流れを精査しながら、重要な点を明示化しなければならない。また、研究計画の概要としては、「具体的な対象の抽出」、「設計機能と発生機能の記述」、「改善設計へのフィードバックの理論的フレームの構築」が要点であると考えてきた。ここまで、議論が大変に深まり、当初に予想していなかった堅強な理論的なフレームワークが構成されつつある。これは、一般的な製品やサービスが、どのようなプロセスで、考案され、設計され、生産され、使われていくのか、という一連の流れを全て含むものとなっている。このフレームワークは、経営学や社会学ですでに議論されてきたものに加え、工学的な観点からつくり手の視点を厚めに反映したものであり、極めて有用性の高いものであると考えている。この成果は、当初の予定より、充実した成果となりつつあると言える。
パブリック・マネジメントにおける地域サービス再構築のための地域勘定に関する研究

本年度は、地域価値・市民価値を形成・創造にあわせた合意形成・計測、実現のためのフレームワークに焦点を当てた。都市・地域マネジメントのゴールであるベンチマークの設定については、SWOT分析を中心とした戦略マネジメントを都市・自治体向けに修正した意思決定プロセスを明確化した。都市・自治体マネジメントでは、○○市という行政区域と○○市という行政組織・団体の二つのマネジメント・プロセスを融合する必要があり、前者については、参加・協働型の意思決定が前提となる。つまり、都市・地域のベンチマークの設定にあわせて、行政・NPO・コミュニティなどとの責任・役割分担とそれぞれの組織の目標の設定が必要になる。これは、福祉・教育などの地域サービスの個々の領域ごとに設定され、公共サービスの供給に反映されていく。このような都市・地域マネジメントの先駆例として「エコバジェット」があり、例えばハイデルベルク市などですでに活用されている。大気汚染であれば物量データベースで、市としての目標を決め、経済界・行政・地域などで市の目標に対する責任・役割分担からそれぞれの数量ベースでの目標値を決定する。定期的に現状を評価しながら、都市・地域としてのマネジメント・サイクルを実践している。同様のアプローチは、市民生活に密着した福祉・教育サービスでも適用可能である。公共サービスのカテゴリーごとに行政・NPO・コミュニティでのサービス供給のすがたを描き、公共サービスの受け手である市民の立場からサービスを組み替え、数量ベースで捉えることで、地域における公共サービス勘定が概念的には構築できることが明らかとなった。これは、デンハートらが主張するニュー・パブリック・サービスの実務的な発展であり、自治体CRMの実証的なモデルへと応用可能である。本年度は、研究のフレームワークであるソーシャル・マネジメントの全体像と地域価値・市民価値を形成・創造するための方法論に焦点を当てた。1980年代半ば以降形成されたNPMは、公共サービスの標準化を図ることによる執行部門の効率化を意図した。しかしながら、公共サービス分野で単純に標準化が可能な領域はあまり多くなく、英国・ニュージーランドなどの古典的なNPMはトップマネジメントや都市・地域マネジメントを重視するかたちで進化する。しかしながら、地域価値や市民価値を設定するためには、有効な方法論の開発が必要である。その代表的な手法が、トップマネジメントでは、都市・地域ビジョンを導出するための自治体SWOTであり、執行のマネジメントでは、市民価値を高めるための自治体CRMである。いずれも企業経営での経営手法であり、都市自治体への適用に当たっては、マネジメントの対象が行政を超えた行政区域全体をとすることなどから派生する所要の方法論上の修正を図る必要がある。地域価値からみれば、ビジョン・政策目標に対するシェアード・アウトカムの議論であり、行政側では施策展開へとリンクさせる。市民価値からみれば、市民の生涯価値を高める観点での公共サービスの再構築へと発展する。これらの目標は数値で示されることが多いが、公共サービスの再構築のためには、個々の領域で市場生産への転換が望ましい。しかしながら、地域通貨などとの連携事例では、必ずしも厳密な市場価値への転換が必要とはされていない。次年度は、地域における循環モデルにCSRや地域通貨などを組み入れた検討を行うこととする。
初期ゴルジ品質管理機構の破綻によって生じる神経疾患の分子病態

本研究課題は、申請者らのゴルジ体に存在する異常膜タンパク質の新たな品質管理システム(初期ゴルジ品質管理機構)の発見に基づき、その生理的役割と分子機構を明らかにし、その破綻によって発症する疾患の病態解明に繋げることを目的としている。昨年度までの研究から、初期ゴルジ体品質管理機構の分子選別装置として機能するRer1の大脳特異的欠損マウスを作製し、1大脳サイズが著しく減少する、2不安様行動が減少する、3神経幹細胞数が減少することを見出した。また、Rer1がγ-セクレターゼ複合体の量的制御に関わることを明らかにした。本年度は、Rer1欠損による大脳発生異常の分子機構を明らかにすることを目的に研究を行った。その結果、Rer1を欠損した大脳では、脳内のγ-セクレターゼの量と活性が減少しており、神経幹細胞の未分化性を制御するNotchシグナルが低下し、神経幹細胞の増殖・維持に異常を生じることが示唆された。また、Rer1欠損細胞を用いた解析から、Rer1遺伝子を欠損するとγ-セクレターゼの一部が組み立て完了前に小胞体以降に搬出されてしまい、リソソームへ運ばれ分解されることが明らかとなった。以上の結果より、大脳においてRer1の機能を欠損させると、γ-セクレターゼの細胞膜量が減少し、神経幹細胞の増殖・維持に関わるNotchシグナルの不全が起こると考えられた。またその結果として、大脳形成異常や行動異常を引き起こしている可能性が示された。以上の研究成果をまとめ学術論文として発表した。初期ゴルジ品質管理機構の生理的役割と分子機構を明らかにするという本研究の目的に対し、大脳発生におけるRer1の生理的重要性を見出し、その分子機構としてγ-セクレターゼ複合体の成熟に関する分子メカニズムを明らかにすることができた。初期ゴルジ品質管理機構の関わる疾患の予防・治療法の開発に関する研究を遂行する。本年度は、初期ゴルジ体品質管理機構の分子選別装置として機能するRer1の生理的役割を明らかにするために、大脳特異的Rer1欠損マウスを作製し、Rer1の高次脳機能における役割を解析した。大脳特異的Rer1欠損マウスは、大脳サイズが著しく減少し、様々な行動異常を認めた。そこで、Rer1欠損による大脳発生異常の分子機構を明らかにするために、Rer1結合タンパク質の探索を行った。その結果、Rer1がγ-セクレターゼ複合体の構成因子と相互作用することを見出した。Rer1欠損細胞では、γ-セクレターゼ複合体形成には異常を認めないものの、γ-セクレターゼ複合体量が顕著に減少していた。Rer1欠損細胞においては、γ-セクレターゼ複合体がリソソームに輸送され分解されることから、Rer1がγ-セクレターゼ複合体の成熟化に機能しており、未成熟のγ-セクレターゼ複合体がリソソームに輸送され分解される可能性が示唆された。γ-セクレターゼ複合体は大脳発生に重要な役割を果たすNotchシグナルの制御に関与することから、今後はRer1の欠損による表現型とNotchシグナルとの関連を解析する予定である。本年度の研究において、大脳特異的Rer1欠損マウスを作製し、Rer1の欠損が様々な脳機能異常を示すことを明らかにできた。また、Rer1の標的タンパク質としてγ-

セクレターゼ複合体を見出しており、Rer1の欠損による大脳発生異常の原因をγ-セクレターゼ複合体機能制御の観点から分子レベルで解析できる状況にある。今後詳細な分子機構の解析を行うことで、本研究課題の目的である初期ゴルジ品質管理機構の破綻によって生じる神経疾患の分子病態を明らかにできると考えている。初期ゴルジ品質管理機構の関わる疾患の予防・治療法の開発に関する研究を遂行する。以下の研究を推進する予定である。1.Rer1によるγ-セクレターゼ複合体機能制御機構の解析2.Rer1欠損による大脳発生異常とNotchシグナルとの関連の解析当初の予定よりも初期ゴルジ品質管理機構の生理機能と分子機構に関する研究がスムーズに進んだため、次年度に関連疾患の予防・治療法に関する研究を加える必要があると判断した。このため、本研究目的を遂行するにあたり、次年度使用を計画した。
ヤマトヒメミミズに見る有性生殖と無性生殖を転換する機構とその意義の探究

ヤマトヒメミミズは日本ではじめて無性生殖で殖えるpotwormとして見出されたが、生育環境に応じて、有性生殖と無性生殖を切り換えることができるという特徴があり、無性生殖で自切したミミズの断片を有性化誘導条件で飼うと生殖巣が分化する。これまで無性生殖にネオブラストの関与が示唆されているが有性生殖はネオブラストとは異なる機構が考えられている。しかし、ヤマトヒメミミズの遺伝情報は極めて乏しく、二つのライフサイクルを説明するには十分ではない。本研究では有性化を誘導した細胞を材料に相補DNAを作成し、de novo RNAシークエンシングを行い。有性生殖の細胞分化に関連する遺伝子の同定を試みた。ヤマトヒメミミズは成虫でも体長1015mm程度の小型のミミズである。ヤマトヒメミミズは単一個体が710断片に自切し、7日程度完全個体に再生する無性生殖で繁殖するが、個体密度などの環境条件により有性化して虫卵を産卵する。2つの繁殖方法の使い分けは外的環境に応答したヤマトヒメミミズの生存戦略ではあり、特異的なシステムであることが予想されるが、再生課程においてどのようにして無性化と有性化が切り換えられるのか、切り換えのシグナルはどのような機構によるものなのか大変興味深い。無性生殖のなかで再生した個体を低密度環境下で高栄養価の飼料を与えて飼育すると再生過程で20%の個体で生殖器の分化が観察される。このとき、生殖細胞の分化に関与すると言われるVASA遺伝子の相同遺伝子Vlg1及びVlg2の発現量に変化がする。本研究ではVlg1及びVlg2以外にnanos遺伝子はPiwi遺伝子など他の種において生殖器に特異的な発現が知られているこれらの遺伝子と相同な遺伝子を単離し、これらの遺伝子をVlg1およびVlg2と共に有性化の指標として用いる。Vlg1及びVlg2の発現を指標に有性化誘導の条件を検討した上で、有性化を誘導個体から抽出した転写産物を出発材料にcDNAライブラリーを作成し、有性化関連遺伝子の特定を試みる。現時点でヤマトヒメミミズのヌクレオチド配列の情報は乏しく[Nucleotide (236), EST (356)]、さらなる網羅的情報の拡充が必須である。これまで、自切再生過程の各段階で有意に発現する遺伝子を特定するために各段階の転写産物よりcDNAライブラリーを作成しサンガーシークエンス解析を進めているが、また本研究ではde novoシークエンシングにいる網羅的解析を部分的に導入しすることでより多くの情報から有性化に関連する遺伝子の特定することで、生殖機構の転換を明らかにする。体長1015mm程度の小型のミミズのヤマトヒメミミズ(Enchytraeus japonensis)は環境に応じて繁殖システムを切り換える独自の生活環を持つ。無性生殖では1個体の成虫が25の体節ごと自切して10断片となり、個々の断片が1週間で再生、10個体となる。断片化した個体を低密度で高栄養価の飼料で飼育すれば再生過程で生殖器が分化し有性個体として他の個体と接合、産卵する。ヤマトヒメミミズの特異的な生殖システムであることが予想されるが、再生・分化の過程でどのように生殖器分化の切り換えられるのか、再生・分化のモデルとして大変興味深い。本研究では飼育条件を検討し、85%以上の個体群が無性生殖で再生した個体が分化過程で有性化する飼育条件で有性化を誘導去れ、生殖細胞の分化に関与すると言われるVASA遺伝子の相同遺伝子Vlg1及びVlg2が発現することを確認した。極めて遺伝情報の少ないヤマトヒメミミズではde novoシークエンス解析および既知情報のアノテーション解析は目的の候補遺伝子を見出す有効な手段となる。本研究では有性化を誘導した自切後3日目の再生過程個体群から抽出した転写産物を用いてde novoシークエンス解析および既知情報のアノテーション解析を行った結果、自切断片化直後から顕著に発現する遺伝子や既知遺伝子のホモログや性決定因子として知られるSryや生殖器で特異的発現が知られるPiwiやnanosのホモログやと推定されるcDNAを含む既知の73,710のORFが見出された。大学組織の大幅な改編などの影響で共通機器を含めたの実験機器類など利用環境が申請時とは大きく変化した。その結果、自動分注システム等を利用した多検体の処理を利用した作業計画が困難となり、サンガーシークエンス解析が予定通りに進めることが出来なくなった。しかし、委託による次世代シークエンス解析の費用が引き下げられたため、有性化に関連する遺伝子の網羅的検索の一部について次世代シークエンスを導入した。断片化直後から有性化を誘導した個体由来の転写産物についたde novoシークエンス解析を行ったところ、モデル生物で性分化や発生時に発現が知られる遺伝子と相同な遺伝子と推定されるものを見出した。

サンガーシークエンス解析で得られた候補遺伝子を含めこれらの候補遺伝子の発現時期や有性化との関係を明らかにする。Vlg1およびVlg2遺伝子発現を指標とする有性化誘導の最適条件の検討について、一定温度下での飼育として飼料となる粉末状のオートミールを基本に培地等を割合を変えるなどの検討を行ったが、これまでの有性化条件よりも最適な条件は得られていない。現在は飼育温度を変えるなどより詳細な飼育管理温度検討中であり、引き続き最適化を目指す。Vlg1およびVlg2のsiRNAによる阻害実験は着手できていないが、実験環境を整備を継続する。分子生物学Vlg1およびVlg2遺伝子発現を指標とする有性化誘導の最適条件の検討について引き続き検討する。現在はVlg1およびVlg2遺伝子の発現を有性化が誘導されていると仮定し、有性化と関連する遺伝子の特定を行っている。しかし、形態観察から生殖器を確認出来る個体数は全体の25%程度であり、少なくとも6080%以上の個体が有性化した条件が望ましいく、再現性のある条件設定を目指す。Vlg1およびVlg2遺伝子の他に他の種において性決定に関与するSry遺伝子や生殖器での特異的発現が知られているNanos (Nanog)遺伝子、Piwi遺伝子など既知遺伝子の相同遺伝子を単離して、新たなマーカーとする。有性化したヤマトヒメミミズ成虫の性腺が位置する7節ー8節でPiwi遺伝子が特異的に発現することが知られている(Tadokoro T. et. al., Curr. Biol. 16:1012, 2006)。既にショウジョウバエのNanog (Nanos)遺伝子と相同な遺伝子の単離を試みている。極めて遺伝情報の少ないヤマトヒメミミズではde novoシークエンス解析および既知情報のアノテーション解析は目的の候補遺伝子を見出すのに有効な手段となる。有性化を誘導した個体の転写産物を用いてde novoシークエンス解析および既知情報のアノテーション解析を行った結果、生殖器の分化に関与するSry遺伝子との相同性が示唆される候補遺伝子などが複数見出すことが出来た。サンガーシークエンス解析で得られた候補遺伝子を含めてこれらの遺伝子がどの時期に発現するのか、また有性化誘導との関連性について個別に検討を進める。試薬等の消耗品の購入に支出を予定していたが、適当な物品を購入することが出来なかった。カスタムオリゴ合成などの消耗試薬品費に当てる。
歯周病細菌の宿主細胞への侵入に関わる因子の分子生物学的検討

Mycobacteriatuberculosisの侵入関連遺伝子であるpZX7の塩基配列から2つの19merのoligonucleotidesを設計し、合成した。以下に2のoligonucleotidesをしめす。このoligonucleotidesをPCRプライマーとして、歯周病原細胞7株のgenomicDNAからpZX7に関連している塩基配列をPCR反応から検出した。以下に用いた歯周病原細菌を示す。P.gの3株、A.a Y4、C.r33238、C.o27872では、PCR産物が検出できた。特にP.gの3株には、共通して約1.0kbと約1.3kbの2つのメジャーなPCR産物を検出できた。今後、この2つのPCR産物を塩基配列を決定することにより、侵入関連遺伝子と関係しているかどうか解明していきたいと考えている。Mycobacteria tuberculosisの侵入関連遺伝子であるpZX7の塩基配列から2つの19merのoligonucleotidesを設計し、合成した。