hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラム様性細菌における蛋白質の膜透過および局在化に関与する遺伝子の解析

枯草菌secY遺伝子の変異によって胞子形成が温度感受性になった株をさらに解析した結果、この株が正常に胞子形成をするためには、T_0からT_5までの間許容温度にいる必要があることが明かとなった。この期間はちょうど胞子形成特異的な非対称隔膜の形成からフォアスポアの形成期に当たり、この過程にsecY遺伝子が何らかの機能を果たしていることを示唆している。一方、胞子形成の初期過程においては細胞内外の種々のシグナルが集積されてSpoOA蛋白質の増幅を起こすことが、胞子形成をつぎの段階へ進めるキ-になる現象と考えられているが、secY変異株では、このspoOA遺伝子の発現が抑制されており、新たな情報伝達経路の存在が示唆された。一方、spoOAの転写活性促進に関与しているSpoOKに対する影響についても、この蛋白質の機能と考えられている抗生物質ビアラフォスに対する感受性が低下しており膜蛋白質であるSpoOKの膜への局在化に影響していることが示唆された。またsecEに相当する遺伝子については、大腸菌との相同性から、リボソ-ム蛋白質L11をコ-ドするrplK遺伝子の上流領域をクロ-ン化することによって検索したが、若干の相同性を持つ短いオ-プンリ-ディングフレ-ム(orfE)を見いだした。OrfEはただ一つだけ膜貫通ドメインを持つと考えられ、大腸菌secEcs変異株に導入して相補実験を行なったところ、低温における増殖能、および外膜蛋白質OmpAのプロセシングの両方とも相補することができた。したがってorfEは、大腸菌secEに相当する枯草菌の遺伝子であると考えられた。
破骨細胞における新規ＤＡＰ１２会合受容体の機能解析

Siglec-15は成熟破骨細胞の形成に働き、その機能にはDAP12との会合に関わるK272が必須である。さらにSiglec-15の細胞質内領域には微小管関連タンパク質SBP1(仮称)と結合する機能領域が存在することを見出した。本機能領域までのSiglec-15K272A変異体とDAP12のITAM下流を連結したキメラタンパク質がSiglec-15の機能を代償し得たことから、Siglec-15がDAP12と協調的に働くことが示された。Siglec-15の骨組織における機能を解析するため、遺伝子欠損マウスを独自に樹立した。本申請では破骨細胞における新規DAP12会合受容体Siglec-15の骨代謝における意義、またその作用機序をin vivoおよびin vitroで明らかにすることを目標とする。Siglec-15には酵素活性領域を有していないことから、その機能には他タンパク質との会合が重要であると考えられる。実際に破骨細胞抽出液をNative-PAGEにより分離し抗Siglec-15抗体でウェスタンブロットした結果から、Siglec-15は約250kDaの複合体を形成していることが示唆された。そこでHis6タグおよびFLAGタグをタンデムにC末端に付加したSiglec-15を破骨細胞に強制発現させ、その細胞抽出液からNi-NTAレジンならびに抗FLAG抗体ビーズを用いたアフィニティー精製によりSiglec-15複合体を精製した。精製したタンパク質群を質量分析法により解析した結果、DAP12とともに新規Siglec-15会合タンパク質SBP1 (仮称)の同定に成功した。Siglec-15とSBP1の会合様式について検討した結果、SBP1との会合に必要なアミノ酸配列がSiglec-15の細胞質内領域にあることを見出した。さらに本配列を欠失したSiglec-15変異体はSiglec-15遺伝子欠損マウス由来破骨細胞の表現型を回復し得ないことからSiglec-15の機能にはSBP1との会合が必要であることが強く示唆された。Siglec-15は成熟破骨細胞の形成に必須であり、その機能にはシアル酸化糖鎖の認識に関わるV-setドメインおよびDAP12との会合に必須なK272が必要である。これに加えて本研究では細胞質内領域がSiglec-15の機能に必要であること、また微小管結合タンパク質SBP50(仮称)が本領域に会合することを見出していた。以上を踏まえて本年度は、Siglec-15の細胞外領域、内在性DAP12との会合し得ないK272A変異を持つ膜貫通領域、および微小管関連タンパク質SBP1会合領域と、DAP12細胞質内領域を融合させたキメラタンパク質発現ベクターを構築した。本ベクターをこれまでの研究にて作成したSiglec-15遺伝子欠損マウス由来破骨前駆細胞に遺伝子導入した。Siglec-15遺伝子を欠損した破骨細胞が成熟破骨細胞を形成し得ないのに対し、本キメラタンパク質を強制発現した際には骨吸収活性を有する多核破骨細胞が形成された。本キメラ変異タンパク質はDAP12と結合し得ないことから、内在性DAP12を介さずにSiglec-15の機能を代償し得ると結論づけた。さらに本キメラタンパク質がシアル酸認識能およびITAM依存的にSiglec-15の機能を代償することを示すために、糖鎖認識に必須なV-setドメインの欠失変異体およびITAMのチロシン残基点変異体を作成した。これらとともにSiglec-15遺伝子欠損マウスの戻し交配を行い、C57BL/6の遺伝子背景へ純化させることに成功した。本申請では破骨細胞における新規DAR分子Siglec-15/RADIOの骨代謝における意義、またその作用機序をin vivoおよびin vitroで明らかにすることを目標とする。in vitro分化誘導系を用いた解析から、Siglec-15遺伝子を発現抑制すると多核細胞形成が顕著に低下することが明らかとなった。これまでの知見とあわせてSiglec-15はDAP12とともに働き、破骨細胞の多核化ならびにアクチンリング形成を制御することにより成熟破骨細胞の形成に必須な働きを担うと結論付け、本成果を学術論文として報告し受理された(研究発表論文参照)。骨代謝におけるSiglec-15の機能を検討するため、Siglec-15遺伝子欠損マウスを作成した。交配実験の結果Siglec-15遺伝子欠損マウスはメンデルの法則に従い出現することが確認された。本マウス由来破骨細胞ではSiglec-15タンパク質の発現は認められなかった。Siglec-15遺伝子欠損マウス由来破骨細胞では、Siglec-15遺伝子発現抑制細胞と同様に多核細胞形成の顕著な低下が認められた。

本マウスはマウス3系統が混合した遺伝子背景にあるため、戻し交配によりC57BL/6純系の遺伝子改変マウス作成を試みている。Siglec-15の機能には他タンパク質と複合体を形成して働くことが予想される。His6タグおよびFLAGタグをタンデムにC末端に付加したSiglec-15を破骨細胞に強制発現させ、その細胞抽出液からNi-NTAレジンならびに抗FLAG抗体ビーズを用いたアフィニティー生成によりSiglec-15複合体を精製する条件設定に成功した。現在会合タンパク質の同定を試みている。Siglec-15は成熟破骨細胞の形成に必須なレクチンであり、その機能にはシアル酸化糖鎖の認識を司るV-setドメイン、DAP12との結合に必須な膜貫通領域内リジン残基(K272)、および微小管関連タンパク質SBP50(仮称)と会合する細胞質内領域、が必須である。以上の結果はSiglec-15が破骨細胞における重要なDAP会合受容体であることを示唆するものであるが、証明するまでには至らない。そこで昨年度はK272A点変異を導入したSiglec-15の細胞外領域から細胞質内機能領域とDAP12のITAM以下の細胞質内領域を融合させたSSDKA317を作成した。本年度は1)SSDKA317をSiglec-15遺伝子欠損破骨細胞に導入した結果、本キメラタンパク質が野生型Siglec-15とほぼ同程度の活性を有すること、2)V-setドメインおよびITAM中のチロシン残基がSSSDKA317の活性に必須であること、3)SSDKA317がSBP50との会合能を有していること、4)SSDKA317はDAP12と複合体を形成し得ないこと、を見出した。以上の結果からin vitro分化誘導系において、Siglec-15はDAP12のITAMを介してシグナルを伝達することが証明された。以上の知見を踏まえて、破骨細胞特異的にSSDKA317を発現する発現単位を設計した。今後、本発現単位を導入した遺伝子改変マウスを作成し、Siglec-15遺伝子欠損マウスと交配することによりSiglec-15が破骨細胞におけるDAP12会合受容体であることをin vivoで証明しうると考えられる。骨代謝学本年度はSiglec-15遺伝子欠損マウスの骨代謝ならびに骨組織の解析は未だなしえていない。これはノックアウトマウス作成時に129系由来ES細胞を用いたため、得られる遺伝子改変マウスの遺伝的背景が通常解析に用いられるC57BL/6とは異なるため戻し交配を行う必要があるためであり、想定内である。また平成24年度中にほぼ十分な戻し交配を完了しており、本解析は平成25年度中に行い得る。本年度はSiglec-15遺伝子欠損マウスの骨代謝ならびに骨組織の解析を通じて本遺伝子の骨代謝における機能を明らかにすることを計画していた。しかし本年度の研究からin vitro分化誘導系を用いた解析により上記キメラタンパク質がSiglec-15の機能を内在性DAP12との結合を介さずに代償し得ることが示されてきた。以上を踏まえて、本キメラタンパク質を破骨細胞特異的に発現するトランスジェニックマウスを作成し、Siglec-15遺伝子欠損マウスやDAP12遺伝子欠損マウスと交配しその産仔の骨組織ならびに代謝を検討することで、Siglec-15の骨代謝における役割を明らかにするだけでなくDAP12会合受容体としての機能を検討しうることが想定された。
地方分権に対応した地方公共団体の課税自主権のあり方に関する研究

地方分権に対応した課税自主権のあり方について、地方税の減免についての判例と地方公共団体の運用実態を調査・分析し、その制度設計と運用の明確な基準を示すことが課税の公平と安定した地方税財政運営、財政の自主性、財政規律の担保の視点から重要であることを示した。また、アメリカの州・地方税における法事企業課税の現状と課題を分析し、課税自主権の拡充が応益課税と税収普遍性の地方税原則の視点からの問題を生じさせうることを明らかにした。平成24年度の研究成果は3本の論文において公表している。成果1「固定資産税の減免措置のあり方について」では、課税自主権の一つである地方税の減免、課税免除等に焦点をあて、固定資産税を事例に、特定の対象の住民や企業等の負担を軽減する減免等が多くの地方公共団体によって利用されている一方で、一旦導入されたものが社会経済の変化の中でその意義を失っていても存続しているケースが多いという実態を明らかにした上で、減免等の根拠のうちの公益性の判断について、企業立地や人口増による地域活性化を「公益」の概念と結び付ける際に、一定の制約があることを論じた。研究代表者は実際に名古屋市と大阪市の地方税減免制度の検討作業において、それぞれ原案作成委員会委員、有識者会議のメンバーとして参画しており、本論文における減免見直し基準の考え方は両市の減免制度の見直しにも反映されている。成果2「人口減少時代の地域活性化と固定資産税」では、地方税の減免等が住民の居住地選択や企業立地に対して非中立的な影響を及ぼすプロセスを明らかにし、人口減少と空家率のデータを用いて課税自主権の活用をめぐる環境が厳しさを増していることを論じた。また、アメリカのTIF(Tax increment financing)を企業立地の促進や人口増加のための、課税自主権の新たなあり方として示し、わが国において導入する際の条件(レベニュー債の制度化など)を検討している。成果3「課税自主権の視点から見た地方税の減免」では、地方税の減免と課税の公平、地方分権、財政規律の関係に焦点をあて、課税庁が公益性の再定義を急ぐべきこと、減免が一種の補助金であるため予算化を図り、議会での審議対象とするべきこと、課税の透明性を強化すべきことを課税自主権拡大のための条件として論じている。アメリカでは企業立地を含め地域経済のさまざまな局面で州間や地方自治体間での激しい競争が存在し、企業の立地選択においては企業の州・地方税負担が大きな影響を及ぼす。そのため、各州とも他州との競争を考慮しながら州・地方企業課税の制度設計を行っている。平成25年度の研究では、そうした州・地方企業課税の課税自主権の視点からみた実態について、税収の企業課税への依存度や実効税率(企業課税の税収/民間部門州内総生産)等の指標に係る時系列と地域間比較のデータを、州税協議会(The Council on State Taxation)やLincoln Institute of Land Policy & Minnesota Center for Fiscal Excellence、The Tax Foundation、商務省統計局などから得て分析を行った。企業の州・地方税負担は州・地方税全体の約45%を占め、税目別には地方財産税が最も重く、売上税、法人所得税、失業保険税と続き、これら4税で企業負担全体の7割以上を占める。この負担の構成に州間での大きな違いは存在しない。州・地方税の企業課税への依存度は州によって異なるが、全体として大きな地域格差は存在せず、同じことは実効税率という別の指標でも確認できた。このことは裁量的な課税権を行使できるアメリカにおいても、それが企業負担面に強く及ぶものではないことを示している。しかし、その一方で、企業の州・地方公共サービス受益量(推定値)と負担を対比させた受益・負担比率では州間での大きな格差が存在することがわかった。すなわち、企業課税への税収依存が小さくない州・地方税において、各州はその強力な裁量権にもかかわらず他州と大きく異なった制度・政策を選択せず、その歪みを企業対象の歳出面で調整していることが明らかとなった。平成23年度の研究計画は、地方分権、地域主権の実現に不可欠な課税自主権の拡充が個人や企業の経済活動に及ぼす影響、及び課税自主権の拡充と地方公共団体の財政規律との関係、を明らかにするという本研究の目的にそって、(1)現行の地方自治法・地方税法の枠組みでの課税自主権の現状と課題を整理すること、(2)連邦制の下で分権的財政システムを採用しているアメリカの課税自主権の実態を経済への影響と財政規律の視点から分析すること、であった。【(1)に関する研究成果概要】わが国では課税自主権を拡充する場合、法定外税の同意基準にもある「住民の負担が過重とならないこと」が重要な意味を有する。そこで、負担が過重となるか否かの判断材料として、市町村基幹税の住民税と固定資産税の負担の実態を大阪府と兵庫県、愛知県の市町村について調査・算出した。

その結果、自治体間での課税標準額の差異から生ずる負担格差が存在し、とりわけ固定資産税の土地(とくに商業地)のそれが大きく、課税自主権の活用の可能性に影響を及ぼしうることが明らかとなった。また、家計の固定資産税負担額について、年齢階級別に推計を行い、高齢世帯の負担額が全世帯平均の1.51.7倍に達し、地域の高齢化の進行度により課税自主権の活用も制約を受けるという結論を得た。研究成果は、「土地評価適正化後の固定資産税:次の課題」『資産評価情報』183号(2011年7月)で公表している。【(2)に関する研究成果概要】アメリカの課税自主権運用の一形態である、地方財産税に係るTIF制度(税収を再開発事業のための地方債の償還財源に特定財源化し、民間投資を誘導する仕組み)に焦点をあて、その運用実績に関する先行研究や実態調査の研究により、東日本大震被災自治体の復興事業への活用の条件を導出した。研究成果は「自治体の震災復興財源とTIF」『経済学論究』65巻2号(2011年9月)で公表している。【平成26年度の研究成果】1.アメリカの地方基幹税である財産税の企業負担の実態や、その企業活動、地域経済に及ぼす影響について、CCHの州税関係資料やMinnesota Center for Fiscal Excellenceの50-State Property Tax Comparison Study等のデータを入手し、州別の企業の財産税負担の実態と格差の存在を明らかにした。また、企業に応益課税として財産税を賦課することに社会的合意は得られているものの、居住用資産に比して商業用や製造業用資産の税率が高く設定されていたり、土地・建物だけでなく償却資産や動産が課税されることもあって財産税負担が企業の立地選択に強い影響を及ぼしていることも明らかにした。成果は論文「アメリカにおける企業の財産税負担の現状分析」『経済学論究』68巻2号(2014年9月)として公表した。2.今後、人口減少により不動産価格の下落=固定資産税収の減少が懸念されるが、とりわけ人口減少率と空き家率の上昇が同時に進行している地域でそれが深刻な問題となる。人口減少下でも不動産価格を安定させるためにアメリカのTax Increment Finance手法をわが国においても活用できるような制度面での条件整備が必要である。成果は論文「人口減少下における固定資産税のあり方について」『経済学論究』68巻4号(2015年3月)として公表した。【研究期間全体を通じての研究成果】わが国の地方税制度・政策の現状と課題の分析、分権型システムをとるアメリカの州・地方税制度の実態分析を通じて、課税自主権を拡充し、わが国の地方税財政の中長期的な安定化を図るために、高齢納税者の増大への対応や、財政規律の担保、減免における公益性と経済中立性の調和、人口減少下での税収制約を見すえた課税自主権の積極的な運用が重要であることを明らかにした。財政学本研究の目的は、地方分権の重要な要素となる地方公共団体の課税自主権について、その経済効果と財政規律の関連を理論的、実証的に分析し、課税自主権をどこまで拡大すべきか、拡充の要件・基準は何かを明らかにすることである。
エージェント型データマイニングに基づく知識発見法の開発と応用

本年度はWWWにおけるユーザのブラウジングを支援するために、Webのリンク構造を解析してツリーを作成するツール(WebMap)を設計し、ブラウザに統合した。WebMapという名称はP.Domel(NCSA,1994)の開発したブラウジング履歴を木構造で視覚化させるヒストリシステムに由来する。一方、訪れたサイトが一望できるようにHyperbolic Tree(J.Lamping,PARC,1994)を利用したウエブの情報構造を表示する支援方法がある。本研究で設計したWebMapは、Hyperbolic Treeによる本構造の表示にヒストリの視覚化機能を加え、文書を示すノードに高さをつけられるようにレイアウトした。この高さには、サーバのアクセス解析の結果を反映させたので、ユーザは人気度の高い文書がどこにあるかを理解することが可能になる。また、WebMapをブラウザに統合したことにより、WebMapからブラウザに文書を表示することや、ブラウザからWebMapのツリーを変化させるといった機能を可能にした。WebMapを評価するために、学生にWebMapを用いた場合と用いない場合でブラウジングしてもらった所、一定時間におけるアクセス時間が増加し、また人気度の高い文書へアクセスする割合も増加した。これより、WebMapを用いることで、後戻りのいらないブラウジングが可能になることと、ノードの高さによりどこに人気のある文書があるかが発見しやすくなることが立証された。
光硬化型グラスアイオノマーセメントの研磨要件に歯ブラシ磨耗がおよぼす影響

充填用光硬化型グラスアイオノマーセメントは従来型グラスアイオノマーセメントに比較して感水性や表面物性が優れている。そこで、申請者らは本セメントの研磨の要件について検討することを目的として、その研磨深さについて歯ブラシ磨耗をパラメーターとして検討した。材料は、市販の光硬化型グラスアイオノマーセメントであり、その照射面および削除面の磨耗試験を行った。すなわち、白色テフロン型に練和したセメント泥を填入し、加圧整形し、直ちに、照射光線を470±40nmの波長域で、600w/m^2の光強度に規定した可視光線照射器OPTILUX400(Demetron)を用いて、硬化させた。その後、試片は照射後1時間、温度23±1°C、相対湿度50±5%の恒温恒湿室で遮光条件下に保管し、未削除、0.5mm削除および1.0mm削除の3条件に試片を調整した。これらの試片を37°C24時間恒温恒湿槽内に保管した。保管期間終了後、重量を測定し、これを磨耗前試片重量とした。磨耗試験はブラシ磨耗試験器(GC)を用いて、ブラシ磨耗を行った。試験終了後、超音波洗浄器で20分間2回試片を洗浄した。そして、37°C24時間同様に保管後、試片の重量を測定し、磨耗試片重量とした。磨耗前試片重量から磨耗試片重量を引いたものを百分率で換算し、それを各条件の磨耗量とした。その結果、0.5mm削除が最も磨耗量が少なく、未削除および1.0mm削除は磨耗量が多かった。これは、光硬化型グラスアイオノマーセメントの照射面および深部の重合率が光重合型レジンと同様の傾向を示すことがすでに判明しており、磨耗量もこの重合率と相関して、0.5mm削除例に最も少なかったものと考えられた。。本研究の結果から、光硬化型グラスアイオノマーセメントの研磨深さとしては、歯ブラシ磨耗の観点から照射面から0.5mmまでの削除が必要であることが判明した。。
生体骨における力学的刺激と骨形成の関係,及びその理論モデルに関する研究

力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは,これまでの研究で明らかにされているが力学的刺激の大きさ及び種類との関係については,未だ不明な点た多い.これを明らかにすることが本研究の目的である.動物実験には日本白色ウサギを用い,右脛骨の近位端,遠位端に70mmの間隔をあけて1本ずつピンを刺入し,2本のピンの中点に径3mmの円孔を作成した.平成4年度に作製した荷重刺激装置を用い,ピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間,荷重量49N,周期0.5Hzで間欠的に与えた.圧縮刺激群,引張刺激群,対照群の3群につき,それぞれ1週,2週,4週群を設定し,各群とも5羽とした.骨形成量の定量化は画像解析処理ソフトウエアにて行った.円孔周囲に作用する力学的刺激量として有効応力を3D-FEMにより求めた.前年度までに圧縮刺激群,引張刺激群のいずれにおいても04.1(MPa)の有効応力が生じた部位よりも2.710.8(MPa)の有効応力が生じた部位に有意に多くの未熟骨の形成を認めており,圧縮ひずみ,引張ひずみはともに骨形成を促進し,骨形成量はひずみの大きさに依存することが確認されている.本年度は実験動物にテトラサイクリンを投与し,円孔周囲の骨研磨標本を作成した.新生骨に一致してテトラサイクリンによる標識を認めた.第2次骨単位には対照群ではテトラサイクリンによるリングを認めたが圧縮刺激群,引張刺激群ではリングは認められなかった.力学的刺激を与えない骨ではturn-overの促進を伴った骨粗鬆化が生じており,圧縮刺激,引張刺激により骨粗鬆化が防止されると考えられた.また今回Beaupreらの骨再構築理論を本実験に適用し,円孔における骨形成をコンピュータによりシミュレーションを行った.シミュレーションの結果は実験結果とほぼ一致しており,この理論の有効性が確認された.力学的刺激が骨の形成や吸収に関与していることは,これまでの研究で明らかにされているが力学的刺激の大きさ及び種類との関係については,未だ不明な点た多い.これを明らかにすることが本研究の目的である.動物実験には日本白色ウサギを用い,右脛骨の近位端,遠位端に70mmの間隔をあけて1本ずつピンを刺入し,2本のピンの中点に径3mmの円孔を作成した.平成4年度に作製した荷重刺激装置を用い,ピンを介して圧縮または引張荷重を1日1時間,荷重量49N,周期0.5Hzで間欠的に与えた.圧縮刺激群,引張刺激群,対照群の3群につき,それぞれ1週,2週,4週群を設定し,各群とも5羽とした.骨形成量の定量化は画像解析処理ソフトウエアにて行った.円孔周囲に作用する力学的刺激量として有効応力を3D-FEMにより求めた.前年度までに圧縮刺激群,引張刺激群のいずれにおいても04.1(MPa)の有効応力が生じた部位よりも2.710.8(MPa)の有効応力が生じた部位に有意に多くの未熟骨の形成を認めており,圧縮ひずみ,引張ひずみはともに骨形成を促進し,骨形成量はひずみの大きさに依存することが確認されている.本年度は実験動物にテトラサイクリンを投与し,円孔周囲の骨研磨標本を作成した.新生骨に一致してテトラサイクリンによる標識を認めた.第2次骨単位には対照群ではテトラサイクリンによるリングを認めたが圧縮刺激群,引張刺激群ではリングは認められなかった.力学的刺激を与えない骨ではturn-overの促進を伴った骨粗鬆化が生じており,圧縮刺激,引張刺激により骨粗鬆化が防止されると考えられた.また今回Beaupreらの骨再構築理論を本実験に適用し,円孔における骨形成をコンピュータによりシミュレーションを行った.シミュレーションの結果は実験結果とほぼ一致しており,この理論の有効性が確認された.
アントニン・レーモンドの設計手法に関する研究―戦前のスタッフとディテールを中心に

本研究は、モダニズムの展開に大きな足跡を残した建築家アントニン・レーモンドの、第二次世界大戦前の日本時代を対象に、その設計を支えたスタッフによって構成される組織に焦点を当て、設計手法の展開と醸成を探ったものである。文献や現存する図面から、スタッフの全体像や組織の特徴を解明した上で、担当者とデザインの対応を探り、自らが「5原則」と呼んだレーモンドの設計手法がどのように形成されたのか、その過程で現れたデザインがどのように生み出されたのかをある程度明らかにした。本研究は、日本を中心に建築作品を造り、モダニズムの展開に大きな足跡を残した建築家アントニン・レーモンドの第二次世界大戦前の設計について、それを支えたスタッフによって構成される設計組織に焦点を当て、設計手法の展開を探ろうとするものである。平成25年度の研究では、まず、フランク・ロイド・ライトの下から独立した大正10年以後、戦前のレーモンドの設計スタッフを、諸文献や原図に記されたサインから明らかにすることを試み、また、その組織の規模と変化と特徴を把握した。これによって、独立からほどなく、30人を超えるスタッフを抱える組織に成長すること、スタッフの構成が、外国人主体から関東大震災を機に日本人主体へと変わることなどを明らかにした。続いて、構造スタッフがどのように変わるのかを考察し、外国人構造技師から内藤多仲門下の早稲田大学出身者に変わっていく様子を明らかにした。さらに、近年まで謎の存在だったチェコ人スタッフ、ヤン・ヨセフ・スワガーの、レーモンドにとっての位置づけを明らかする試みに、予定を前倒しして着手した。関東大震災直後という事務所の体制が刷新される過渡期にスタッフとなったスワガーは、しかし、力量の面でレーモンドの期待に応えられず、聖路加国際病院の設計を機に袂を分かち、独立することになるが、これまでレーモンドの証言からしか知ることのできなかったその独立の原因を、スワガーが携わった建築作品の分析を通して、信仰的背景や建築設計に対する思想の違いが影響した可能性があることを指摘することができた。また、こうした分析を通して、レーモンドが戦後提唱する近代建築の5原則の成立過程を解明する手がかりが得られつつある。以上が平成25年度の成果となるが、建築家だけでなく、その周辺を見ることの重要性を考えて始めた研究が、その重要性を確認できつつあり、その意味で意義深い研究となっている。本研究は、日本を中心に建築作品を造り、モダニズムの展開に大きな足跡を残した建築家アントニン・レーモンドの第二次世界大戦前の日本時代の設計について、それを支えたスタッフによって構成される設計組織に焦点を当て、設計手法の醸成と展開を探ろうとするものである。本年度の研究では、前年度に引き続き、まず、戦前のレーモンドの設計スタッフを、諸文献や設計原図に記されたサインから明らかにすることを試みた。これによってさらに所属したスタッフの存在が明らかになった。また、これらスタッフの経歴調査も昨年以上に精緻に進めた。この結果、これまでスタッフと思われていた者には、自営者もいたことが明らかになるなどした。そうした中には、レーモンドと同じくフランク・ロイド・ライトに学んだ遠藤新の作品の施工に携わった工務店に所属していた者もいたというように、レーモンドやライトの周辺では、これまで知られていた以上に、複雑で重層的な交流のあった様子を浮き彫りにすることができた。続いて、それらのスタッフの、レーモンド事務所退職後の作品の収集に努めた結果、レーモンドの影響の色濃く見える作品を遺した者がいる一方で、影響の薄い者もいることが分かった。経歴調査で明らかにされた戦後のこれら元スタッフの動向にも注目すると、レーモンドの影響の色濃い者が、戦後再開されたレーモンド事務所に戻っているという傾向も明らかとなった。以上が平成26年度のおおよその成果となるが、建築家だけでなく、その周辺を見ることの重要性を考えて始めた研究が、その重要性を確認できつつあり、その意味で意義深い形で進められていると考えている。最終年度の研究では、前年度に引き続き、まず、戦前のレーモンドの設計スタッフの経歴調査を進め、これによってさらに所属したスタッフの存在が明らかになり、75名を数えるに至り、またそれら多くの在籍期間を把握することができた。また、設計原図に記されたサインの読み解きによっても、作品に関与したスタッフの解明を進めた。とはいえ、本来は、この作業は前年度中に完了させる予定であったが、追加資料が発見されたことと、資料の読み解きに誤りのあることが発覚し、追試を余儀なくされた。それでも、この作業の継続の結果、スタッフの来歴の把握についてはかなりの到達点に至ったものと考えている。続いて、それらのスタッフの、関与した作品に注目すると、フランク・ロイド・ライトの下からの独立直後の、ライト事務所から移籍したスタッフのライト風の作品への関与や、ヴォーリズ事務所から移籍した者のヴォーリズ風の作品への関与が、あるいは、吉村順三の木造作品への影響や、鉄筋コンクリート造作品への前川國男の影響、構造に対する内藤多仲門下生の影響、といったものをうかがい知ることになった。また、こうした分析を通して、レーモンドが戦後提唱する近代建築の5原則の成立過程をおおよそ解明することができた。以上が最終年度のおおよその成果となる。

本研究は、建築家だけでなく、その周辺を見ることの有用性を予想して着手した研究であったが、その重要性を一定程度確認することができたと考えている。本研究は、モダニズムの展開に大きな足跡を残した建築家アントニン・レーモンドの、第二次世界大戦前の日本時代を対象に、その設計を支えたスタッフによって構成される組織に焦点を当て、設計手法の展開と醸成を探ったものである。文献や現存する図面から、スタッフの全体像や組織の特徴を解明した上で、担当者とデザインの対応を探り、自らが「5原則」と呼んだレーモンドの設計手法がどのように形成されたのか、その過程で現れたデザインがどのように生み出されたのかをある程度明らかにした。アントニン・レーモンドはじめ、フランク・ロイド・ライトに学んだ者の周辺に関する研究はこれまでにも多く、すでに新たなことが知り得る余地がないと思われていた面もあった。しかしながら、平成26年度の研究で、設計スタッフの経歴調査をより詳細に進めたことにより、従来の研究では得ることのできなかった成果を得られている。このため、研究の進捗は比較的順調と考えているが、本研究では、スタッフの調査に留まらず、それらによって形作られる建築の、詳細な特徴の分析も最終的な課題としており、この点が平成26年度までの研究では不十分であって、平成27年度の課題となる。建築史平成25年度・26年度の研究で、スタッフはじめ設計に関与した人物をかなりの程度明らかにした。本年度は、これをさらに進めることも重要ではあるが、今後は、1つ1つの上積みに要する時間がこれまで以上にかかることが予想される。そのため、本年度は、スタッフの経歴調査も進めつつも、それよりはむしろ、それらのスタッフが関わった作品を分析することで、どのようなスタッフによってどのような作品が出来たかを、より詳細に検討することに傾注していきたい。なお、レーモンドの設計における構造の重要性を考慮して、そうしたスタッフとしては、意匠担当者ばかりでなく、内藤多仲の門下生である構造担当者にも留意して進めていくことを考えている。また、可能であれば、設計思想の分析を当時の設計の標準と比較するなど、アントニン・レーモンドの設計思想の解明を従来以上に深めていくことに努めたいとも思っている。アントニン・レーモンドに関する研究はこれまでにも多く、得られる資料も時間とともに失われることから、すでに新たなことが知り得る余地がないと思われる嫌いもあった。また、ヤン・ヨセフ・スワガーについては、すでに経歴を明らかにする研究が現れているが、それ以上に分析する手立てがないように思えていた。しかしながら、平成25年度の研究で、従来の研究では活用されずにいた図面資料の分析に着手したことで、それを手がかりに、多くの次につながる成果を得られつつある。このことは、それなりに予想はしてはいたものの、おおむね予想した成果を得ることができ、研究の進捗は極めて順調と考えている。平成26年度に予定していた図面のスキャンニングが、所有者の事情で遅れたため。平成25年度の研究で、スタッフはじめ設計に関与した人物に注目することの意義が確認できたため、平成26年度と27年度の研究では、これをさらに推し進めていく。具体的には、まずスタッフとなった人物の把握と把握できた人物の経歴調査の継続がある。
鉄代謝制御因子ヘプシジンの発現制御機構の解明

本研究は、ヘプシジンやフェリチンなどの鉄代謝関連分子の基礎的および臨床的研究を通して、鉄代謝異常症の病態解明と、診断法および治療法の開発を目的として行った。本研究によって、肝がん細胞のヘプシジンの発現がpHによって変化すること、鉄貯蔵蛋白フェリチンのなかでH-フェリチンがトランスフェリン受容体1を介して赤芽球系細胞に取りこまれること、高フェリチン血症が造血幹細胞移植後の細菌感染症や再発の頻度の増加と関連していることが明らかになった。本研究は、血液疾患を含めた先天性および後天性の鉄代謝異常症の病態の理解を深め、診断法および治療法の開発をめざしている。本年度は、生体内の鉄代謝の制御機構について、細胞レベルでのヘプシジンの発現制御機構と、血液疾患における個体レベルでの鉄代謝関連分子の動態を解析した。(1)細胞レベルでの鉄代謝制御機構の解析肝細胞株にさまざまな刺激を加えた後のヘプシジン・プロモータールシフェラーゼアッセイ、定量的real-time PCR、LC-MS/MS法による培養上清中の成熟ヘプシジン25の定量により、ヘプシジンの発現を制御する因子を検索した。また、細胞膜表面に発現する鉄代謝関連分子(TfR1,TfR2,HJV,HFE,IFPN1,マトリプターゼ2など)の相互作用について、293T細胞に共発現させて、免疫沈降-ウエスタンプロット法により解析を行った。さらに、貯蔵鉄のマーカーである血清フェリチンがヘプシジン発現ときれいな正の相関を示すことから、ヒトのフェリチン(HおよびL型)を合成して、さまざまな細胞への取り込みの解析を行った。これらの解析は、現在進行中である。(2)血液疾患患者の鉄代謝関連分子の動態のモニタリング鉄過剰症患者および様々な血液疾患患者の血清、尿中のヘプシジン、GDF15、フェリチン、リポカリン2などを経時的に測定した。造血幹細胞移植前の血清ヘプシジン値が高いと、移植後の感染症が増加して予後に負の影響を与えること、移植前の高フェリチン血症は独立した予後不良因子であることを明らかにした。本研究は、血液疾患を含めたさまざまな鉄代謝異常症の病態の理解を深めることと、これらの診断法および治療法の開発を目的としている。前年度に引き続き当該年度も、主に細胞レベルでのヘプシジンの発現制御機構と、血液疾患における個体レベルでの鉄代謝関連分子の動態を解析した。(1)細胞レベルでのヘプシジン制御機構の解析ヘプシジンの発現制御因子を、肝細胞株をモデルシステムとして検索している。その結果、微小環境中の水素イオン濃度がヘプシジンのmRNAの安定性を介して発現に影響を与えていることを見いだした。すなわち、細胞周囲の環境が酸性に傾くと、ヘプシジンの発現が増加する(論文投稿中)。細胞膜表面に発現する鉄代謝関連分子の相互作用に関しては、フランスの研究グループから赤芽球系細胞でTfR2がEPO受容体と複合体を形成するという興味深い報告が出された。われわれはこれを追試して確認するとともに、さらに若干の新規データを得て考察を加え、臨床血液誌に発表した。鉄貯蔵蛋白フェリチンに関しては、合成フェリチンの細胞への取り込みの解析を行い、結果の一部は日本血液学会にて発表した(Sakamotoら)。さらに、ヘプシジンを抑制する液性因子GDF15の赤芽球系細胞における発現制御について解析を行い、結果の一部を日本血液学会にて発表した(Uchiyamaら)。(2)血液疾患患者の鉄代謝関連分子の動態のモニタリング鉄過剰症患者および様々な血液疾患患者の血清、尿中のヘプシジン、GDF15、フェリチン、リポカリン2などを経時的に測定し、その臨床的な意義について解析を行った。その結果、(1)造血幹細胞移植前のフェリチン値が移植後早期の細菌感染症を予測する因子であること(Kanda, et al.Bone Marrow Transplant 2011)、(2)骨髄異形成症候群や骨髄線維症などのさまざまな血液疾患で血清GDF15が異常高値を示すことを見いだした。また、血清GDF15値が貧血の重症度と比例して高値を示すことをみいだし、日本血液学会にて発表した(Uchiyamaら)。本研究は、血液疾患を含めたさまざまな鉄代謝異常症の病態の理解を深めることと、これらの診断法および治療法の開発を目的として進めてきた。当該年度の主な研究成果は下記の通りである。1鉄代謝調節ホルモンであるヘプシジンのプロモーター活性に影響を与える因子を96wellベースでスクリーニングできるバイオアッセイ・システムを構築した。これに健常者あるいは血液疾患患者の血清を添加すると、一部の患者血清中にヘプシジン発現抑制物質が含まれていることが分かった。また、このシステムを用いて、京都大学薬学研究科の化合物ライブラリーをスクリーニングしたところ、いくつかの化合物にヘプシジン発現抑制活性がみとめられた(投稿準備中)。

2蛍光標識したさまざまな種類の遺伝子組み換えフェリチンを用いて、細胞へのフェリチンの取り込み機序についての解析を進めた。健常者の末梢血あるいは骨髄中のさまざまな細胞のなかで、赤芽球系細胞だけが特異的かつ選択的にヒトのH-フェリチンを取り込むことを見いだした。また、H-フェリチンがトランスフェリン受容体1を介して細胞に取り込まれていること、その取り込みはトランスフェリンとは競合しないことなどを見いだした(一部はすでに日本血液学会で発表。投稿準備中)。3骨髄線維症においては、血清中のGDF15が異常に増加している。間葉系幹細胞や線維芽細胞などを用いて、その病態生理学的な意義についての解析を進めている(一部はすでに日本血液学会などで発表。投稿準備中)。4血液腫瘍に対する造血幹細胞移植前の高フェリチン血症が、移植後の予後不良因子であること、急性GVHDの発症頻度には影響を与えなかったが慢性GVHDの発症頻度を減少させて、血液腫瘍の再発を増加させる因子であることを見いだした(Sakamoto, et al. Int J Hematol, 2013)。ヘプシジン発現制御に関する基礎実験は、スクリーニングの系の確立、動物実験など、当初の計画通りに進んでいない点もある。一方で、ヘプシジンの発現に関連した液性因子であるフェリチンやGDF15については、その発現制御や導体の解析を行い、日本血液学会などで成果を発表できた。また、臨床検体を用いた疫学研究についてはいくつかの論文および学会発表を行えた。総合的にみて、進捗状況はおおむね順調と考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度にはヘプシジンのプロモーターにGFP遺伝子を結合して安定的に肝細胞株に発現させる系を樹立しており、平成24年度はこれを用いたヘプシジン発現制御物質のスクリーニングを計画している。これ以外にも、これまでに行ってきた基礎研究・臨床疫学研究を継続・発展させる予定である。
長鎖細胞外領域を有する新規Secretin様受容体の機能解析

Gタンパク質共役型受容体(以下GPCRと略す)は、進化的に保存された膨大な数からなる大きなファミリーを形成している。それらはホルモンや生理活性分子の受容体として機能し、癌をはじめとした種々の疾患の原因遺伝子である例も知られている。また、今日市販されている医薬品の中にはGPCRの作動薬や拮抗薬が数多くあり、現在使われている医薬品の50%近くがGPCRをターゲットにしていることから、GPCRファミリーは非常に注目度の高い分子群である。我々は、膜貫通領域の構造はGPCRファミリーB(タイプ2とも呼ばれる)に属し、かつ細胞外領域が非常に長いGPCRが、その遺伝子の長さと複雑なエキソン-イントロン構造のためにまだほとんど機能解析が進んでいないことに着目した。そこで、ヒトゲノム情報をもとに新規GPCRをコードする領域を同定し、ヒトおよびマウスのcDNAクローニングを行い、DREGと命名した。DREGは成体においては肺で高い発現が見られること、さらにマウスの初期胚において発現が高いことを明らかにした。また、DREGはプロセシング(タンパク質切断)を受けることが予想される配列を有しており、このことをDREGのアミノ酸置換変異体あるいはヒトIgGのFc領域とのキメラタンパク質を作製することで示した。さらに別の部位でプロセシングを受けることを見い出し、この切断にはproprotein convertaseファミリーが関与していることを明らかにした(Moriguchi et al.,2004)。一方、DREGの個体レベルでの機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作製したところ致死になることが明らかになった。現在、ノックアウトマウス表現型の詳細な解析を続けるとともに、DREGの細胞外領域と結合する分子の探索を進めている。また、今日市販されている医薬品の中にはGPCRの作動薬や拮抗薬が数多くあり、現在使われている医薬品の50%近くがGPCRをターゲットにしている。我々は、膜貫通領域の構造上family Bに属し細胞外領域が長いGPCRが、その遺伝子の長さと複雑なエキソン・イントロン構造のためにまだほとんど機能解析が進んでいないことに着目した。RT-PCR法およびホールマウントin situハイブリダイザーション法により、DREGは成体においては肺で高い発現が見られること、さらにマウスの初期胚において発現が高いことを明らかにした。また、DREGはプロセシング(タンパク質切断)を受けることが予想される配列を有しており、このことをDREGのアミノ酸置換変異体あるいはヒトIgGのFc領域とのキメラタンパク質を作製し明らかにした。さらに別の部位でプロセシングを受けることを見いだし、この切断にはproprotein convertaseファミリーが関与していることを明らかにした。現在、生体内での機能を明らかにするためにノックアウトマウスの作製を行い、解析を続けている。
上皮成長因子EGFがヒト口腔癌細胞の遺伝子不安定性と悪性形質獲得に与える影響

1:in vitroにおいてSAS、Ca9-22にEGFを作用させ、EGF濃度変化が浸潤能に与える影響を検討した。・HUVECを用いたin vitro invasion assayにおいてSAS、Ca9-22ともにEGF処理によりその浸潤能が有意に促進された。・EGF濃度を1,5,10,20,50,100ng/mlで処理を行ったところ20ng/mlまで濃度依存性に浸潤能が促進された。2:EGFがヒト口腔癌細胞の運動能に与える影響を検討した。Ca9-22よりEGFに対し高感受性をしめすs-1を樹立した。以下、s-1を使用した。・PMAによりPKCを活性化することによりs-1細胞の運動能は促進され、PKC阻害剤によりs-1細胞の運動能は抑制された。・EGF刺激によりs-1細胞のPKCは細胞質から細胞膜への局在変化を示した。以上のことより、EGFが癌細胞の転移形成に必要不可欠な運動能を促進する際の細胞内情報伝達経路として、EGF受容体自己リン酸化後のPLCγの活性化とPKCの活性化が深く関与している可能性が示唆された。3:EGF長期間処理が遺伝的不安定性に与える影響ヒト口腔癌の系では明らかとはならなかったが、ラット乳癌の系にてEGF長期間処理が遺伝的不安定性を増強することをDNAフィンガープリンティング法にて明らかとした。a)HUVECを用いたin vitro invasion assayにおいてSAS、Ca9-22ともにEGF処理によりその浸潤能が有意に促進された2:EGF処理期間がヒト口腔癌細胞の浸潤能に与える影響を検討した。EGF処理時間は24時間、48時間、1週間、1か月間とし、また、EGF処理濃度は20ng/mlとして、おのおのの処理期間についての浸潤能に与える影響を検討したとともに、細胞運動能に与える影響についても検討を行った。SASにおいてin vitro invasion assayでは、EGF処理時間が24時間、,48時間、1週間では可逆的な浸潤能の変化を示すのに対し、1か月間のEGF処理では非可逆的変化が生じ、恒常的に高い浸潤能を示すようになっていた。同様にphagokinetic track assayにて細胞運動能の評価を行ったところHUVECに対する浸潤能に相関し、EGF処理時間が24時間、48時間、1週間では可逆的な運動能の亢進を示すのに対し、1か月間のEGF処理ではやはり非可逆的変化が生じ、恒常的に高い運動能を示すようになっていた。3:細胞内活性酸素量の測定EGF処理したSASを活性酸素感受性の蛍光色素プローブであるDCFH-DAにて処理し、吸光度計にて細胞内活性酸素量の測定を現在進めている。・HUVECを用いたin vitro invasion assayにおいてSAS、Ca9-22ともにEGF処理によりその浸潤能が有意に促進された・EGF濃度を1,5,10,20,50,100ng/mlで処理を行ったところ20ng/mlまで濃度依存性に浸潤能が促進された。

3:EGF長期間処理が遺伝的不安定性に与える影響ヒト口腔癌の系では明らかとはならなかったが、ラット乳癌の系にてEGF長期間処理が遺伝的不安定性を増強することをDNAフィンガープリンティング法にて明らかとした。
口腔癌細胞由来RNAヘリカーゼのクローニングと機能解析

本研究は、浸潤転移能の高い癌細胞のRNAヘリカーゼを同定・クローニングして口腔癌治療における新たな分子標的療法を開拓する目的で行った。癌細胞に強く発現するペプチド抗原に対する抗体を作製した後、このペプチド抗原を発現するクローンを扁平上皮癌に由来するcDNAファージミドライブラリーを用いてスクリーニングした。分離したクローンからssDNAを精製してダイデオキシ法でcDNA塩基配列を決定した。塩基配列から推測されるアミノ酸配列を決定してホモロジー解析を行った。アラインメントの検索では,類似性の高い部分を局所的に検討するローカルアラインメントと、配列全体の類似性をみるグローバルアラインメントを行った。RNAヘリカーゼの細胞内局在の検討は口腔扁平上皮癌細胞の細胞内分布を免疫染色法で検討した。その結果、λphage-cDNAライブラリーから得られたクローンの遺伝子配列から推測される蛋白の分子量は85kDaでウイルスの外套蛋白の配列に類似した部分が存在した。このクローニングされた蛋白には9つのヘリカーゼモティーフが存在し、この部分はウイルスからヒトに至るまで54.3%の相同性を認めた。さらにローカルアラインメントではO-グリカナーゼ(α-N-acetylgalactosaminidase)と17.1%の相同性がみられた。免疫染色では、この蛋白は癌細胞の核内と細胞質の一部に存在した。特に核内への移動は細胞周期と関連していることが示唆された。これらは、1.正常細胞に比べ癌細胞に発現していること、2.細胞の増殖や蛋白合成に関わるヘリカーゼのモティーフを有すること、3.ウイルスエンベロープ蛋白にも存在していることなどから、本蛋白が癌遺伝子産物の形質を有すると考えられた。ヘリカーゼは、mRNAの巻き戻し(unwinding)を行う細胞増殖に必要な酵素で、癌細胞では蛋白合成や浸潤、転移に影響を与えると考えられる。癌細胞のRNAの巻き戻し作用とその後に生じる蛋白合成を抑制する阻害剤を開発すれば、新しい癌治療法が開発される。そこで、以下の手順で口腔扁平上皮癌細胞に由来するRNAヘリカーゼについて、1、頭頸部癌細胞由来のRNAヘリカーゼのDNA断片の単離、2、完全長cDNAをクローニング、3、抗体の作製、4、ライブラリーの作製、5、癌細胞由来ヘリカーゼ蛋白発現細胞の検討を行った。まず、頭頸部癌細胞(HSG)を無血清培養し、細胞抽出液および培養上清を回収した。その培養上清は、セントリコンプラス20で濃縮し、ゲル濾過カラム、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンカラム、アフィニティカラムを用いてFPLCで最終分画した。。精製蛋白は、フロイントアジュバントを用いてSPFウサギに免疫し、ヒトRNAヘリカーゼに対する抗血清を得た。抗体の有用性を抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認したところ、約48kDaの蛋白バンドを得た。RNAヘリカーゼ活性の高い頭頸部癌培養細胞と正常細胞(ケラチノサイトまたは線維芽細胞)からAGPC法でtotal RNAを抽出し、オリゴdTカラムでmRNAを抽出した。微量核酸測定用分光光度計で260nm/280nmでmRNAを定量後、純度を確認してcDNAを合成した。UNIZAPIIファージベクターにスブクローニング後、in vivo excisionによりファージミドライブラリーとした。このファージライブラリーから抗体陽性プラークを採取した。このプラークより得たファージミドを用いて形質転換させた細胞では、細胞増殖と蛋白合成能が亢進することが明らかとなった。
口腔癌化学放射線療法の併発障害に対する骨髄由来幹細胞を用いた革新的細胞療法の確立

本研究の目的は、口腔癌に対する超選択的動注化学・放射線療法(SSCR)の副作用として惹起される重度唾液腺萎縮と晩期顎骨壊死を対象にした骨髄由来細胞(BMDC)による細胞治療について、その可能性を検討するものである。本研究期間では、まず唾液腺萎縮・顎骨壊死併発障害モデルを作出した上で、特に萎縮唾液腺へのBMDC投与の効果について、詳細に検討を行なった。まずBMDCの投与方法について、尾静脈投与と顎下腺への直接投与を行ない比較した。その結果、投与後の唾液分泌量や唾液腺の重量の回復について大きな差は認められなかった。さらに、投与するBMDCのドナーの年齢について8週齢と22週齢のマウスについて検討したところ、これについても効果に大きな差は認めなかった。又、BMDCから培養増殖させた間葉系幹細胞(MSC)の投与を行なったが、培養MSCの群では投与直後に死亡するマウスが多く、又、その効果もBMDCと比較して大きな差は認めなかった。BMDCの萎縮唾液腺への投与に関して、非培養BMDCの静脈投与は、唾液腺への直接投与と効果に大差なく、栓塞も起こしにくいため、将来的に有用な方法であると考えられた。又、ドナーの年齢が高齢であっても一定の効果が得られる可能性が示唆された。本研究は、口腔癌に対する超選択的動注化学・放射線療法(SSCR)の副作用として惹起される重度口腔乾燥と晩期顎骨壊死を対象に、骨髄由来細胞(BMDC)による細胞治療を展開することで、これらの障害の予防や組織の再生を図る治療技術を開発することにある。本研究は、SSCR後のBMDCを使用した細胞治療について、晩期顎骨壊死にまで適用拡大できる効果的な技術を開発することを最終的なゴールとしており、移植されたBMDCの障害部位での挙動解析を行なうことを目的としている。本年度は、昨年度に作出した唾液腺萎縮・顎骨壊死併発障害モデルを使用し、特に萎縮唾液腺へのBMDC投与の効果について、検討を行なった。まずBMDCの投与方法について、尾静脈投与と顎下腺への直接投与を行ない比較した場合、投与後の唾液分泌量や唾液腺の重量の回復について大きな差は認められず、さらに投与するBMDCのドナーの年齢について8週齢と22週齢のマウスについて検討したところ、これについても効果に大きな差は認めなかった。又、BMDCから培養増殖させたMSCの投与を行なったが、培養MSCの群では投与後に死亡するマウスが多く、又、その効果もBMDCと比較して大きな差は認めなかった。培養を介しない新鮮細胞の方が、栓塞を起こしにくく、又、組織への移行性が良いことが示唆された。現在、得られたデータを総合的に解析し、BMDCの効果発現のメカニズムを探ると共に、それらに含まれる有効な細胞分画について検討を加えているところである。本研究の目的は、口腔癌に対する超選択的動注化学・放射線療法(SSCR)の副作用として惹起される重度口腔乾燥と晩期顎骨壊死を対象に、骨髄由来細胞(BMDC)による細胞治療を展開することで、これらの障害の予防や組織の再生を図る治療技術を開発することにある。本研究は、SSCR後のBMDCの細胞治療について、晩期顎骨壊死にまで適用拡大する効果的な技術を開発するのと同時に、移植されたBMDCの移植部位での挙動解析を詳細に行なうことも目的としている。それにより、BMDCの移植部位で果たす役割をより正確に把握できれば、他の骨や唾液腺疾患などにおけるBMDCの細胞治療の可能性を検討できると考えられる。当該年度は、まずSSCRによる唾液腺萎縮と顎骨壊死の傷害モデルの作出から開始した。実験動物は8週齢のC3Hマウスを使用して、顎下腺から下顎骨を含む範囲にγ線の照射を行い、傷害の付与を試みた。γ線は、10-22Gyの間の線量で照射を試みたところ、15Gy以上の照射で、照射後8週において50%量の唾液分泌量の低下と唾液腺組織の萎縮を認めた。さらに、照射後13週において唾液腺組織内の腺房細胞の顕著な消失と、下顎骨内の骨髄組織の変性が組織学的に認められた。

しかしながら、18Gy以上の線量において、照射後8週を経過したところで、死亡するマウスが増加したことから、現在は16Gyの線量にて、実験を行なっている。さらに、BMDC移植については、同種骨髄より単離したBMDCについて、投与方法の検討として、静脈内投与と顎下腺への直接投与について効果を比較している。その結果、顎下腺への直接投与においても、照射後8週にて唾液分泌量の増加を認め、その増加率は静脈内投与を行なった場合と大きな差はなかった。当該年度にて、SSCRの顎骨壊死と唾液腺萎縮の併発モデルの作出が終わり、現在、細胞移植実験の評価が実験の主体となっている。来年度中には、効果的な細胞移植条件と効果発現のメカニズムについて、一定の結果を得ることができると思われる。細胞投与の条件として、EPCと培養MSCの各細胞群の効果発現の評価を、経静脈内投与と直接投与の投与方法の比較を併せておこなうことで、より効果的な細胞治療法の開発を行なっていく。実験用動物の購入に加えて、移植用器具や採取した障害組織の解析に関わる試薬、抗体や器具が必要である。又、次年度は口腔外科学会総会での学会発表を予定しており、そのための旅費も必要である。