hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子ノックアウトマウスを用いた細菌初期防御機構の分子基盤の解析

T細胞レセプター(TCR)β鎖、δ鎖、Jα281、インターロイキン-2レセプター(IL-2R)α鎖及びβ鎖、β_2ミクログロブリン、及びMHCクラスII(IAβ)の各遺伝子ノックアウトマウスを用いて、Salmonella choleraesuis、Listeria monocytogenes及びEscherichia coliに対する早期誘導免疫応答(NK、NKT、γδT細胞、メモリータイプCD8^+T細胞)の役割を検討し、以下の成果を得た。1)γδ型T細胞の細菌感染防御機構における役割サルモネラ感染で出現してくるNK1.1陽性γδ型T細胞は全γδ型T細胞の約15%を占めており、その中に自己MHCクラスIIを結合ペプチド非依存性に認識するγδ型T細胞の存在を明らかにした。NK1.1陰性γδ型T細胞はガンマインターフェロン(IFN-γ)を産生するTh1型とIL-13を産生するTh2型に分類できた。大腸菌感染で腹腔内に出現してくるγδ型T細胞は単一のVγ6/Vδ1を発現しており、Toll-like receptor(TLR)2を介して、大腸菌の菌体成分に反応してIFN-γを産生することが分かった。2)NK細胞の細菌感染防御機構における役割サルモネラ感染で出現してくるNK細胞は、IL-15を増殖因子として用いて、感染早期の防御に必須であることを明らかにした。3)NKT細胞の細菌感染防御機構における役割サルモネラ感染で出現してくる腹腔内のNK1.1陽性αβ型T(NKT)細胞は、早期のIL-4産生を介して、マクロファージのIL-12の産生を制御していることが分かった。一方、肝臓のNKT細胞はIFN-γ産生型であり、サルモネラ感染で誘導される肝障害のエフェクター細胞であることを明らかにした。4)メモリータイプCD8^+T細胞の細菌感染防御機構における役割サルモネラ及びリステリア感染早期においてNK、γδ、NKT細胞に加えて、メモリータイプCD44^<high>Ly6C^+CD8^+T細胞が感染局所で増加した。この細胞群がTCRのシグナル非依存性に、IL-15とIL-12の存在下でIFN-γを産生し、感染早期の防御を担うことを明らかにした。γδ型T細胞は、個体の発生早期に出現し、表皮や腸管などの上皮間に多く存在するユニークなTリンパ球である。その機能としては感染の初期防御機構として働くことが報告されている。我々はγδ型T細胞の感染防御における役割を明らかにする目的でγδ型T細胞の抗原認識機構について遺伝子ノックアウトマウスを用いて解析した。C57BL/6マウスにSalmonella choleraesuisを腹腔内に投与して6日目の腹腔内滲出Tリンパ球から抗TCRγδ抗体を用いたpositive panning法にて95%以上に純化したγδ型T細胞を回収し、さらにNK1.1陽性T細胞をセルソーターによってソーティングしてvγ/δレパートア-及びサイトカインmRNAをRT-PCR法で調べた。その結果、NK1.1陽性γδ型T細胞はVγ4/Vδ4を主に発現した。

次に、γδ型T細胞の反応系を^3-サイミジンの取り込み反応及びサイトカイン産生能で検討した。ソーティングしたNK1.1陽性γδ型T細胞はPHA刺激脾細胞を用いたときに自己反応性を示した。抗原提示細胞にMHCクラスII (IAβ)ノックアウトマウスまたはMHCクラスI(β2ミクログロブリン)ノックアウトマウス由来の脾細胞を用いたところ、IAβノックアウトマウス由来の抗原提示細胞に対するNK1.1陽性γδ型T細胞の自己反応性は認められなかった。NK1.1陽性γδ型T細胞は、wildタイプのIA^bまたはIEa52-68ペプチドをcovalentに結合した変異IA^b発現細胞にも反応した。この結果よりNK1.1陽性γδ型T細胞はMHCクラスII分子(IA)をその結合ペプチドとは非依存的に認識すると考えられる。γδ型T細胞は、個体の発生早期に出現し、表皮や腸管などの上皮間に多く存在するユニークなTリンパ球である。その機能としては感染の初期防御機構として、上皮系では上皮の分化促進や粘膜免疫制御機構として働くことが報告されている。我々はγδ型T細胞の抗原認識とその機能を明らかにする目的でLPS反応性γδ型T細胞について解析した。C3H/HeNでは、E.coli感染後γδ型T細胞の増加が認められたが、C3H/HeJではほとんど認められなかった。C3H/HeNで増加するγδ型T細胞は、N領域の多様性を認めないVγ6/Vδ1のinvariant chainを発現していた。このγδ型T細胞は抗TCRγδmAb-coated dishの上でLPSまたはLipid Aの存在下で抗原提示細胞なしで、増殖し、IFN-γを産生した。このγδ型T細胞はCD14の発現は認められず、またLPSレセプターのひとつと考えられるToll-like receptor 4(TLR-4)の発現も認められなかった。変異TLR-4を持つC3H/HeJマウスでのE.coli感染後のγδ型T細胞もLPSに反応してIFN-γを産生した。一方、腹腔マクロファージのIL-15の産生は、C3H/HeNで高く、C3H/HeJでは認められなかった。抗IL-15抗体で処理したC3H/HeNマウスではγδ型T細胞の増加は抑制され、感染抵抗性を減弱した。E.coli感染後のγδ型T細胞の出現にはIL-15が重要な役割を担うと考えられる。また、抗TCRγδmAb抗体処理マウスやTCRδノックアウトマウスでは菌の排除が遅れることより、γδ型T細胞が大腸菌の感染防御の役割を担うことがわかった。免疫系は好中球、マクロファージを中心とした抗原非特異的かつ速やかに機能する自然免疫と抗原特異的なT、Bリンパ球によって働く適応免疫に大きく分けられる。適応免疫は働くために時間がかかるが、効率のよい防御機構を提供し、また、特異的な免疫記憶を有することが特徴である。近年の免疫学の進歩によって自然免疫と適応免疫による生体防御の時間的・空間的ギャップをつなぐ防御因子としてNK細胞、γδ型T細胞、NTK細胞、CD5B細胞などによる早期誘導免疫応答の存在が明らかとなった。これらの防御因子はそれ自身は持続するような免疫にはつながらないが、適応免疫を細胞性免疫/体液性免疫に方向づける免疫制御機構としての役割が注目されている。本研究では早期誘導免疫応答の細菌感染防御機構における役割を各種遺伝子ノックアウト(KO)マウスで検討した。
スペクトル多変量回帰によるヒト体液試料の経過時間推定

犯罪現場には、血液、精液、唾液など様々な体液資料が遺留される。犯罪捜査において、従来の体液種の同定分析に加え、その付着からの経過時間が推定可能となれば、犯行の立証や経緯の推定などに寄与し得る。本研究では、試料中の様々な分子種の検出が可能な振動分光手法と、複雑な生体試料のスペクトル特徴を解明するための多変量解析手法を利用し、体液試料の付着後に起こる化学反応過程の解明と、付着後の経過時間推定手法の開発を目指す。昨年度より、最も頻繁に遺留される「血痕試料」を対象として、785nm励起近赤外ラマン分光による経時変化の分析を行ってきた。16°C、24°C及び30°Cの恒温条件下での、34カ月間にわたるスペクトル変化を測定済みである。また多変量スペクトル分解解析により、血痕ラマンスペクトルが、経過時間及び温度に依存してスコア変化する5つの構成成分に分けられることを見出している。そこで本年度は、各スペクトル構成成分のスコア挙動について、化学反応速度論に基づく詳細な解析と、これを用いた陳旧度(経過時間)推定手法の開発を行った。5つのスペクトル構成成分のうちの2つについて、スコアの経時変化を説明する化学反応速度式を見出した。そしてスペクトル分解の最適化計算のため、各速度式への回帰を組み込んだ、新規アルゴリズムを開発した。速度式で記述される2成分のスコア比を用いて、最終的に「血痕の陳旧度指標」を提案するに至った。本指標は、様々な実験条件で相対的な陳旧度を比較可能にし、また温度履歴があれば、経過時間そのものを推定できる可能性を持つ。さらに、発展的な分析対象として、布等の干渉性担体に染み込んだ血痕試料についても、近赤外ラマンスペクトルの経時変化の測定を行った。布由来のシグナルの強い混入が見られるものの、血液由来のシグナル特徴については、純粋血痕試料と類似の経時変化が観測された。本年度は、昨年度までに測定した、血痕試料の近赤外ラマンスペクトルの温度・時間依存的変化について、スペクトル構成成分に対する速度論を踏まえた詳細な解析、及び最終的な陳旧度指標の提示までを完了した。即ち、血痕試料に対して、本研究の目的である「付着後に起こる化学反応過程の解明」と「経過時間推定手法の開発」をほぼ達成することが出来た。また本研究内容をより実践的に発展させた、布等の干渉性担体に染み込んだ場合の血痕試料の経時変化分析についても、今後の解析に必要なラマンスペクトル測定を終えている状況である。以上より、本研究の進展は順調と考えている。次年度はまず、本年度中に行った血痕試料の近赤外ラマンスペクトルによる陳旧度分析について、論文を作成し、投稿する予定である。次年度中の受理を目指す。さらに、干渉性担体に染み込んだ血痕試料の経時変化分析のため、本年度測定したラマンスペクトルデータについて、次の順序で解析を進める:(1)申請者らが以前に開発した解析手法(Anal. Chem. 89, 9797-9804 (2017))を用い、担体由来シグナルを除去する。(2)得られた血液シグナルを、純粋血痕試料で構築した陳旧度(経過時間)推定モデルへ当てはめる。(3)干渉性担体上血痕の陳旧度(経過時間)推定精度を評価する。来年度中に上記内容を完了させ、本研究課題の完成としたい。犯罪捜査において、従来の体液種の同定分析に加え、その付着からの経過時間が推定可能となれば、犯行の立証や経緯の推定などに寄与することができる。本年度は、最も頻繁に遺留される「血痕試料」を対象として、時間経過によるスペクトル変化の測定と、経過時間推定に向けたデータ解析を行った。785nm励起近赤外ラマン分光を用い、16°C、24°C及び30°Cの各恒温条件に置いた血痕試料について、34カ月の間、計4250の時間点でスペクトルを測定した。その結果、血液採取後からの時間経過により、970 cm-1、1252 cm-1などの特定のバンド強度の顕著な増加が見られ、またその変化の速度は温度によって異なるものであった。次に、血痕スペクトル中の潜在成分について調べるため、全スペクトルデータに対して主成分分析を行った。その結果、時間経過及び温度に依存して異なるスコア変化を示す、複数のスペクトル成分が含まれることが示唆された。そこで、含有する複数のスペクトル成分について化学的解釈を進めるため、全要素を非負と制約した多変量スペクトル分解を行った。その結果、血中ヘモグロビン(Hb)のヘム構造の3種の異なる酸化状態(oxyHb→metHb→Hemichrome)、ヘム-タンパク質及び蛍光にそれぞれ由来すると考えられる、5つの有意なスペクトル成分への分解が見いだされた。各成分に対応するスコアは、温度に依存した時間変化を示し、特にヘム構造の酸化状態に関する変化については、既報の化学反応モデルと良く一致するものであった。本年度は、血痕試料を対象として、時間経過によるスペクトル変化の測定及び解析に着手した。

初めに、スペクトル測定手法及び測定条件の選定、並びにスペクトルの経時変化の傾向を把握するため、予備実験として血痕試料作製から数か月間の赤外分光及び近赤外ラマン分光によるデータを測定した。その結果、赤外分光と比較して、近赤外ラマン分光では、ヘモグロビンのヘム構造の酸化状態の変化を準共鳴効果により、より顕著なスペクトル形状の変化として検出可能であることが判明した。よって、本データの測定には近赤外ラマン分光を用いることとした。さらに、スペクトル形状の変化の速さは温度に大きく依存することが示唆されたため、血中成分の化学変化を追跡測定可能かつ計画期間内に測定が完了するように、16°C、24°C及び30°Cの3つの温度条件を設定した。以上の条件検討に基づき、本データの測定を計画通り本年度内に完了することが出来た。続くデータの解析においては、測定した数千本のスペクトルデータを整理し、波数構成及び蛍光除去等の前処理を行った上、スペクトル変化の概観的分析、並びに多変量解析による複数の有意なスペクトル成分への分離及びそのスコアの時間変化の特徴把握に至った。過去の論文では、血痕スペクトル上の特定のバンドやスペクトル成分にのみ限定した報告が多くされてきたが、今回の結果から、各スペクトル成分を構成要素として、血中成分の変化の全体像を捉えられる可能性が示された。さらに今後は、ヘム構造の酸化反応などに関して、速度論と結び付けた議論への展開が考えられる。以上より、進捗としては順調と考える。犯罪現場には、血液、精液、唾液など様々な体液資料が遺留される。犯罪捜査において、従来の体液種の同定分析に加え、その付着からの経過時間が推定可能となれば、犯行の立証や経緯の推定などに寄与し得る。本研究では、試料中の様々な分子種の検出が可能な振動分光手法と、複雑な生体試料のスペクトル特徴を解明するための多変量解析手法を利用し、体液試料の付着後に起こる化学反応過程の解明と、付着後の経過時間推定手法の開発を目指す。昨年度より、最も頻繁に遺留される「血痕試料」を対象として、785nm励起近赤外ラマン分光による経時変化の分析を行ってきた。16°C、24°C及び30°Cの恒温条件下での、34カ月間にわたるスペクトル変化を測定済みである。また多変量スペクトル分解解析により、血痕ラマンスペクトルが、経過時間及び温度に依存してスコア変化する5つの構成成分に分けられることを見出している。そこで本年度は、各スペクトル構成成分のスコア挙動について、化学反応速度論に基づく詳細な解析と、これを用いた陳旧度(経過時間)推定手法の開発を行った。5つのスペクトル構成成分のうちの2つについて、スコアの経時変化を説明する化学反応速度式を見出した。そしてスペクトル分解の最適化計算のため、各速度式への回帰を組み込んだ、新規アルゴリズムを開発した。速度式で記述される2成分のスコア比を用いて、最終的に「血痕の陳旧度指標」を提案するに至った。本指標は、様々な実験条件で相対的な陳旧度を比較可能にし、また温度履歴があれば、経過時間そのものを推定できる可能性を持つ。さらに、発展的な分析対象として、布等の干渉性担体に染み込んだ血痕試料についても、近赤外ラマンスペクトルの経時変化の測定を行った。布由来のシグナルの強い混入が見られるものの、血液由来のシグナル特徴については、純粋血痕試料と類似の経時変化が観測された。
前周期遷移金属錯体を複合的に用いる新しい反応試剤の開発

カチオン錯体の示す、ルイス酸としての独特の反応性に着目し検討を加えた。すなわち、アセチレンのヒドロジルコニウム化反応によって得られるアルケニルジルコニウムは、カルボニル基に対する付加反応性に乏しい。しかし、過塩素酸銀(触媒量)により反応は著しく促進され、高収率でアルケニル化体を与えることを見出した。発生するカオチン型錯体による効果的なカルボニルの活性化が起きるためと考えられる。この効果は、オレフィンより調製したアルキル錯体でも見られる。この反応形成をプロパルギルシランに適用すると、付加に続いて1、4ー脱離により、ジエンを与えた。さらに離囲を拡大し検討を加えた結果、NbCl_5がルイス酸として特異な反応性を示すことを見出した。例えば、桜井反応では、1当量目のアリルシランの付加に続き、ニオブアルコキシドの脱離とホモアリル型の隣接基関与により、最も安定なカオチン種が2当量目のアリルシランによる捕捉が起き、シクロプロパンを含む2重付加生成物を与えた。さらに、2級ホスフィンのカルボニル化合物への付加反応でも、最初の単純な付加に続く分子内酸化還元過鍋をNbCl_5が特異的に触媒することが分った。一方天然物合成への応用としてアリ-ルCーグリコシド系抗生物質の合成研究を行った。この種の化合物は、その構造のみならず、抗腫瘍性など生理活性的にも注目されている。ここで、合成上の最大のポイントであるCーアリ-ルグリコシド結合の形成に新たなアプロ-チを開発した。すなわち、ルイス酸条件下、フッ化糖と遊離のフェノ-ルとの反応を行うと、低温で速やかにOーグリコシド化が起こる。続いて、徐々に、昇温するとOーグリコシドからCーグリコシドへの変換が起き、フェノ-ル性水酸基のオルト位に選択的にCーグリコシド結合が形成される。この反応は、通常のルイス酸でも進行するが、収率、選択性などの点でCp_2HfCl_2とAgClO_4との複合系がはるかに優れていることが分った。この反応を利用して、ビネオマイシノンB_2およびギルボカルシンMの全合成を行うことに成功した。
実験的骨粗鬆症における顎骨の変化と薬物療法

骨粗鬆症時の顎骨変化に対して検討した報告は少ないことから,実験的骨粗鬆症ラットを用いて,顎骨と大腿骨との相違,および新しい薬物療法の可能性を検討した。高齢雌ラット(40匹)の卵巣を摘出し,低カルシウム飼料(カルシウム0.1%含有)を給餌することにより実験的骨粗鬆症ラットモデルを形成した。20匹はsham operatedcontrol,20匹はintact control,20匹は有機ゲルマニウム(Ge-132)投与群とした。骨粗鬆症の形成は実験開始後3ヵ月で認められ,特に大腿骨で顕著に見られた。下顎骨を摘出し,pQCTを用いて大腿骨と下顎骨の相似点を検討したところ,下顎骨においては,臼歯直下の歯槽骨において大腿骨の骨吸収と同様な所見が得られた。すなわち,骨粗鬆症ラットの下顎骨において,臼歯直下の海綿骨の吸収が著しく,それに反して皮質骨での変化はほとんど見られなかった。Ge-132投与群では,第1大臼歯下の海綿骨の骨密度が有意に高く,また,第1大臼歯近心部での顎骨骨密度が有意に高かった。このことは,骨のリモデリングにおいて,骨粗鬆症ラットでは大腿骨と同様に皮質骨で負の代謝回転は少なく,臼歯直下の海綿骨で大きな負の代謝回転がなされていることをも意味する。骨粗鬆症患者において,歯槽骨の脆弱化および咬合力の低下が示唆される。このような骨粗鬆症ラットにGe-132を投与することにより,骨粗鬆症の進展が抑制されることが示唆された。20匹はsham operatedcontrolとし,20匹はintact controlとした。

すなわち,骨粗鬆症ラットの下顎骨において,臼歯直下の海綿骨の吸収が著しく,それに反して皮質骨での変化はほとんど見られなかった。Ge-132投与群では,第1大臼歯下の海綿骨の骨密度が有意に高く,また,第1大臼歯近心部での顎骨骨密度が有意に高かった。このことは,骨のリモデリングにおいて,骨粗鬆症ラットでは大腿骨と同様に皮質骨で負の代謝回転は少なく,臼歯直下の海綿骨で大きな負の代謝回転がなされていることをも意味する。骨粗鬆症患者において,歯槽骨の脆弱化および咬合力の低下が示唆される。このような骨粗鬆症ラットにGe-132を投与することにより,骨粗鬆症の進展が抑制されることが示唆された。
構成的アルドステロン産生に着目した副腎皮質リモデリングの分子機構

アルドステロンは、体液量保持に不可欠な役割を持つステロイドホルモンとして副腎皮質で合成される。ヒト副腎からの過剰なアルドステロン産生は、原発性アルドステロン症を起こす。本研究では、副腎皮質に過剰アルドステロン産生病変が形成される過程に着目して、アルドステロン産生部位と体細胞変異の解析を行った。その結果、近年研究代表者らがヒト正常副腎皮質に発見した自律的アルドステロン産生細胞クラスターは、思春期以降に生じること、それらの一部はイオンチャネル・ポンプ遺伝子の体細胞変異を伴って腺腫形成へ至る移行性病変へ変化することが示唆された。本課題の全体構想は、副腎皮質のアルドステロン(ALDO)産生機能と組織構築の統御、そこからの逸脱に関わる分子機構の解析により、正常組織の形成・維持から病態に至る分子基盤を理解することである。近年、正常副腎皮質の細胞層形成は、被膜細胞から前駆細胞へ、さらに選択的ホルモン産生能を持った実質細胞への分化と内奥部への移動によることが示された。これに対し研究代表者らは、このスキームでは説明できない組織様式を正常副腎に発見した。すなわち正常及び非腫瘍部副腎の被膜下に自律的にALDOを産生する細胞集塊(ALDO産生細胞クラスター, APCC)が生じることを示した。一方、ALDO産生腺腫(APA)にイオンチャネル・ポンプ遺伝子4種の体細胞変異が報告され、ALDO産生の自律性に関与することが示された。APCCはAPA同様に自律的にALDOを産生することが推定されることから、研究代表者はAPCCにもAPAに検出された体細胞変異が存在することを疑った。明らかな腺腫を認めないが原発性ALDO症により摘出された副腎2例に対してALDO合成酵素CYP11B2の免疫組織化学を行ったところ、APCC部とマイクロAPA部から構成される融合病変(進展型APCC)が検出された。これらの進展型APCCにおける体細胞変異の解析を行った。進展型APCCと非病変部の薄切試料からゲノムDNAを調製し、イオンチャネル・ポンプ遺伝子4種についてAPAに検出された既知の体細胞変異近傍を次世代シーケンサーにより解析した。その結果、進展型APCCにおいてもAPAに検出されたKCNJ5 (p.G151R)などの既知の体細胞変異が検出された。同一副腎の中の異なる病変には異なる体細胞変異が生じうること、APAでは報告のない新規の体細胞変異を持つ病変が存在すること、既知の変異を持たない進展型APCCが存在することが判明した。本研究の目的は、副腎皮質のアルドステロン(ALDO)産生機能と組織構築の統御、そこからの逸脱に関わる分子機構を解明することである。近年、正常副腎皮質の機能分化細胞層の形成は、被膜細胞から前駆細胞へ、さらに特異的ホルモン産生能を持った実質細胞への分化と内奥部への移動によることが示された。しかし研究代表者らは、このスキームでは説明できない組織様式をヒトの正常副腎に発見した。すなわち正常及び非腫瘍部副腎の被膜下に自律的にALDOを産生する細胞集塊「ALDO産生細胞クラスター(APCC)」が生じることを示した。一方、ALDO産生腺腫(APA)にイオンチャネル・ポンプ遺伝子群の体細胞変異が報告され、ALDO産生の自律性に関与することが示された。研究代表者はAPCCにもAPAに検出された体細胞変異が存在することを疑った。明らかな腺腫を認めないが原発性ALDO症により摘出された副腎標本に対してALDO合成酵素(CYP11B2)の免疫組織化学を行ったところ、APCC様部位と微小APA様部位から構成される病変を検出した。この病変を、その形態及び性状から仮称として「APCCからAPAへの移行病変(APCC-to-APA transitional lesion, AATL)」と呼び、体細胞変異の解析対象とした。複数のAATLにおけるAPCC様部位と微小APA様部位から別々にDNAを調製した。イオンチャネル・ポンプ遺伝子群について報告された既知の体細胞変異領域の塩基配列を解析した。解析の結果、(1)一部のAATLでは、APCC部位と微小APA部位に同一変異が検出された。この結果は、APCC様部位と微小APA様部位が同一細胞から生じたことを示唆する。(2)別のAATLでは、APCC部位には変異は検出されなかったが、その内奥の微小APA部位には既知の変異が検出された。この結果は、APCCの一部に体細胞変異が生じて、それが微小APA形成に関与することを示唆する。これらの結果は、APCCからAATLを経てAPAが生じる仮説を支持する。これまでの本研究において、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから作製された薄切標本上の微量組織を用いてDNAを調製し、ゲノム内の限定された部位を対象とした塩基配列の解析が可能であること、APA関連変異が仮称APCC-to-APA transitionallesion(AATL)に生じていることが判明した。AATLは、被膜下の部位および内奥部の部位から構成され、形態と機能的特徴からそれぞれAPCC様およびAPA様である。ここで、AATLに検出された変異について、APCC様部位と微小APA様部位に変異の分布の異同が存在するかという疑問が生じた。

この疑問に対する答えが得られれば、AATLの成因やAPAへの移行病変であることを示唆する証拠が期待された。そこで、両部位から別々に調製したDNAを用いて変異解析を行い、変異が両部位に共通に検出されるか、あるいは、一方の部位だけに検出されるか詳細な検討を行った。得られた結果は、研究代表者らが仮説としている「被膜下にAPCCが生じ、移行病変AATLを経てAPAが生じる」を支持すると考えられた。以上の研究経過から、本年度は研究目的の遂行を前年度に引き続き推し進めることができたと思われる。本研究の目的は、副腎皮質のアルドステロン(ALDO)産生機能と組織構築の統御、そこからの逸脱に関わる分子機構を解明することである。近年、正常副腎皮質の細胞層形成は、被膜細胞から前駆細胞へ、さらに特異的産生能を持った実質細胞への分化と内奥部への移動によることが示された。しかし研究代表者らは、このスキームでは説明できない組織様式をヒトの正常副腎に発見した。すなわち正常及び非腫瘍部副腎の被膜下に、自律的なALDO産生を行う細胞集塊“ALDO産生細胞クラスター(APCC)"が生じることを示した。一方、ALDO産生腺腫(APA)にイオンチャネル・ポンプ遺伝子群の体細胞変異が報告され、ALDO産生の自律性に関与することが示された。これまでの本研究により、APCCが正常組織とAPA形成を結び付ける組織構造であることが示された。今年度は第1に、小児から成人の正常副腎(解剖試料)のAPCCの検出を行って、加齢とAPCCの形成の関係を検討した。その結果、小児副腎では層状機能分化が認められ、APCCが検出されないこと、思春期以降にAPCCが検出され、成人ではAPCC数が加齢と共に増加することが判明した。これらの結果は、原発性ALDO症を発症する時期が主に中高年であることと対応してしている。第2に、非家族性若年性の原発性ALDO症の1例では、両側副腎とも過剰ALDO産生病変としてAPCC様部位とAPA部位を持ち、これらの病変部位には両側とも同一の体細胞変異が検出された。この結果は、副腎皮質の発生過程を考慮したとき、中胚葉形成期までに体細胞変異が生じ、その変異を持つ子孫細胞が左右副腎に分配されたことを示唆する。腫瘍部にはこの変異に加えて腫瘍形成を起こす要因が加わった可能性がある。また、副腎を含む中胚葉由来組織の一部は、単一体細胞変異に関する組織モザイクであることを示唆する。アルドステロンは、体液量保持に不可欠な役割を持つステロイドホルモンとして副腎皮質で合成される。ヒト副腎からの過剰なアルドステロン産生は、原発性アルドステロン症を起こす。本研究では、副腎皮質に過剰アルドステロン産生病変が形成される過程に着目して、アルドステロン産生部位と体細胞変異の解析を行った。その結果、近年研究代表者らがヒト正常副腎皮質に発見した自律的アルドステロン産生細胞クラスターは、思春期以降に生じること、それらの一部はイオンチャネル・ポンプ遺伝子の体細胞変異を伴って腺腫形成へ至る移行性病変へ変化することが示唆された。代表者は、APCC及び進展型APCCに疑われる体細胞変異の解析にはゲノム全体を対象とすべきであると考えていた。しかし、病変が微小であることから、病変部位から必要量のDNAを調製することが困難であった。最近APAに起きた体細胞変異解析の報告が蓄積しつつあり、その結果によるとイオンチャネル・ポンプをコードする4遺伝子に特定の塩基置換が集中的に起きていることが判明した。
聴覚障害幼児のボディバランスと運動能力の発達に関する研究

聴覚障害者を対象とした運動能力についての研究や平衡機能についての研究では、いずれも健聴者と比較して低い傾向にあることが示されている。聴覚障害者と健聴者との差は、どこから始まっているのだろうか。先行研究より、文部省(現・文部科学省)が毎年実施している体力・運動能力調査結果と同年代の聴覚障害児・者の結果との比較から、種目によっては小学校低学年から優位な差が認められることが指摘されている。このため、小学校入学以前の聴覚障害幼児を対象とした運動能力テストおよび平衡機能測定を実施し、この年代における実態を把握することは非常に重要だと思われる。そこで、本研究は、聴覚障害幼児の運動能力および平衡機能を測定し、そのスタンダードを作成すること。さらに運動環境を含む生活環境との関連を検討し、聴覚障害者と健聴者との運動能力の差が何に起因するのかについて明らかにすることを目的とし,3年次計画で遂行した。本年度は3年次計画の最終年度として,これまでの研究の総括として,実験協力校での測定の継続,収集した測定結果のデータベースを作成するとともに,さまざまな要因との関連性について検討した。その結果,聴覚障害幼児の運動能力は健聴幼児と同様に低下傾向にあること,対象校内での運動能力の個人差が大きいこと,生活環境要因のなかで兄弟との関連が認められないことなどが明らかとなった。また聴覚障害から派生する要因が,聴覚障害幼児の運動能力やボディバランスに影響を及ぼしていることが示唆され,得られた成果を学会等で発表するとともに,論文として投稿している。本研究は、聴覚障害幼児の運動能力および平衡機能を測定し、そのスタンダードを作成すること。さらに運動環境を含む生活環境との関連を検討し、聴覚障害者と健聴者との運動能力の差が何に起因するのかについて明かにすることを目的として,3年次計画で遂行されている。今年度はその初年度として,以下の項目について実施した。1.測定用具の作成・準備2.調査対象校の決定および打ち合わせ:幼稚部を持つ聾学校を全国で9ブロック(北海道,東北,関東甲信越,中部東海,北陸,近畿,中国,四国,九州沖縄)に分け,各ブロックより1校以上を調査対象として依頼した。その結果36校から研究協力の回答を得ることができ、次年度に実施する測定についての打ち合わせを実施した。3.予備調査の実施:調査対象校より予備調査協力校(T聾学校,O学校,Mろう学校)を選出し,当該校における資料収集、予備実験、およびビデオ撮影を実施した。1)在籍する幼児の月齢・性・形態(身長,体重)・障害の程度2)運動能力テスト試行3)生活環境、活動時間と内容、活動量の調査4)対象校のネットワーク環境4.動画マニュアルの作成予備調査の結果,運動能力テスト6種目(東京教育大学体育心理学研究室作成の運動能力検査に捕球を加えたもの)は,保育担当者がマニュアルを基に準備・測定を行う方法で実施できることが確認された。さらに,予備調査終了後,実施において注意が必要であると思われるところに画像(ハードコピー)または動画(WEB)による解説を加えた実施マニュアルを作成した。これらは平成15年4月に実施対象校へ配布・配信の予定である。また,聴覚障害以外の障害を併せている幼児もいるため,測定条件に適応できない場合は調査対象から除外することとした。次年度は,今回の予備調査をもとに全国規模での測定を実施する予定である。さらに運動環境を含む生活環境との関連を検討し、聴覚障害者と健聴者との運動能力の差が何に起因するのかについて明らかにすることを目的とし,3年次計画で遂行している。本年度は3年次計画の2年目として,平成14年度中に協力対象校として登録された全国の聾(ろう)学校幼稚部を対象として,全国規模の運動能力テストを実施し,聴覚障害幼児の運動能力に関する資料収集を行いデータベースを作成することを中心に研究を進めた。なお,この全国規模の運動能力テスト実施に当たっては,事前に保護者および対象校に研究の趣旨を説明したうえで研究協力可能であるとの回答を得た幼児の中から対象児を抽出して実施した。その結果,走,跳という運動の基礎的な能力には,男性優位傾向があるものの,健聴幼児に認められるような明らかな性差が認められないことが示された。今後は,生活環境などの要因との関係について詳細な検討を加えながら,同一対象児童の縦断的な変化についても追跡していく。なお,研究成果の一部は,医療体育研究会およびアジア障害者体育・スポーツ学会において発表した。

先行研究より、文部省(現・文部科学省)が毎年実施している体力・運動能力調査結果と同年代の聴覚障害児・者の結果との比較から、種目によっては小学校低学年から優位な差が認められることが指摘されている。このため、小学校入学以前の聴覚障害幼児を対象とした運動能力テストおよび平衡機能測定を実施し、この年代における実態を把握することは非常に重要だと思われる。そこで、本研究は、聴覚障害幼児の運動能力および平衡機能を測定し、そのスタンダードを作成すること。さらに運動環境を含む生活環境との関連を検討し、聴覚障害者と健聴者との運動能力の差が何に起因するのかについて明らかにすることを目的とし,3年次計画で遂行した。本年度は3年次計画の最終年度として,これまでの研究の総括として,実験協力校での測定の継続,収集した測定結果のデータベースを作成するとともに,さまざまな要因との関連性について検討した。その結果,聴覚障害幼児の運動能力は健聴幼児と同様に低下傾向にあること,対象校内での運動能力の個人差が大きいこと,生活環境要因のなかで兄弟との関連が認められないことなどが明らかとなった。また聴覚障害から派生する要因が,聴覚障害幼児の運動能力やボディバランスに影響を及ぼしていることが示唆され,得られた成果を学会等で発表するとともに,論文として投稿している。
加齢に伴う脳内セリン合成能低下による脂質代謝変動と病態発症機序の解明

脳内のセリン合成酵素Phgdhの発現量は加齢に伴い減少すること、またセリン欠乏は、細胞障害作用を持つ新奇スフィンゴ脂質1-デオキシスフィンガニン(doxSA)の産生を促すことなどが明らかとなっていることから、老化に伴う脳内セリン合成能低下は、脂質代謝恒常性の破綻を介したアルツハイマー病等の加齢性脳神経系疾患への脆弱性増加や病態進行促進に繋がる可能性があると考えられる。本研究は、セリン欠乏が誘発する脂質代謝異常が病態へ関与する可能性と、その分子基盤、また、セリンの病態防御因子としての役割を明らかにすることを目的に、実験的検証を行うものである。解析には、Phgdh KO胚由来線維芽細胞: KO-MEF(Phgdh KOマウス胎児より樹立した不死化線維芽細胞:セリン含有培地で野生型と同等に増殖可能)を用いた。まずセリン欠乏に伴うシグナル伝達系経路/転写制御系の詳細な分子機序を明らかにするため、遺伝子発現解析を行った。その結果、脂肪酸合成やコレステロール合成に関わる遺伝子の発現が、セリン制限(6h, 24h)培地で培養した細胞で有意に変動していることが明らかとなった。中でも特にコレステロール合成の最終段階に関わる酵素の遺伝子発現が顕著に減少しており、これはタンパク質発現解析でも確認できた。また、セリン欠乏は、細胞レベルで増殖能低下・細胞死といった表現型を呈すが、ある脂質をセリン制限培地に添加すると細胞増殖能が回復することが明らかとなったことから、今後、この脂質が関わる経路について詳しく解析を行う予定である。研究機関を移ったことで環境(使用できる設備や機器)が大きく変わり、検体採取が完了していないが、これまでに採取できた検体からの予備検討で有用な結果を得ている。引き続き、セリン欠乏が脂質代謝に及ぼす影響を遺伝子/タンパク質発現解析および活性化レベルの測定により明らかにしていく。また、セリン欠乏により産生される細胞障害性スフィンゴ脂質、doxSAに応答する情報伝達系候補の選出並びにdoxSAの標的分子の同定を行うべく、doxSA添加実験を行い、遺伝子/タンパク質発現解析からdoxSAの関与する情報伝達経路を決定していく。さらに、セリン制限培地下において、コレステロール合成酵素の著しい発現低下が認められたことから、実際にセリン欠乏によりコレステロール含量の低下が認められるかを、脂質分析により確認する。セリン欠乏に連関した脂質代謝基盤の解明を通して、セリン欠乏が誘発する脂質代謝異常が、正常細胞に及ぼす影響及び病態へ関与する可能性を明らかにしていくことを目指す。初年度に行えなかった脂質分析の費用に充てるため、次年度使用額とした。次年度の脂質分析の費用に充てる。
ポリコーム複合体PRC2の多様性の分子基盤の解明

ポリコーム群複合体PRC2は、ヒストンH3の27番目のリジンをメチル化することで、発生・分化の過程で決定される遺伝子発現パターンの確立・維持を行います。しかしPRC2がどのように制御されているかはまだよくわかっていません。私たちは全PRC2構成因子に対して、免疫沈降による複合体精製とその質量分析器を使った解析を行い、PRC2構成因子間のタンパク質間相互作用ネットワークを明らかにしました。その結果、構成因子を使い分けることでいくつもの種類のPRC2複合体が形成されることがわかりました。ポリコーム群複合体PRC2は、発生・分化の過程で決定される遺伝子発現パターンの維持に必要であり、ヒストンH3の27番目のリジンをメチル化(H3K27me)することで遺伝子発現の抑制を行う。PRC2による発現抑制の代表例には、HOX遺伝子群の制御やX染色体の不活性化が知られている。しかし、PRC2がどのように多種多様な遺伝子領域を見分けて制御するのか、ヒストンH3の9番目のリジンのメチル化(H3K9me)を介したもう一つの遺伝子抑制システムとの関係など、PRC2の制御メカニズムは未だ明らかになっていない。そこでPRC2複合体の全貌を明らかにするために、我々が見いだした新規因子を含む全14種類のPRC2構成因子に対して、免疫沈降による精製とその質量分析器を使った同定を行い、PRC2構成因子間の相互作用マトリックスを作成した。その結果、排他的にPRC2複合体に含まれる構成因子と、必ず含まれるを構成因子を見いだすことができ、構成因子を使い分けることでPRC2複合体には少なくとも6種類存在することを見いだした。また、新規PRC2構成因子のゲノム上での作用点を明らかにするためのChIP-seq解析の準備を行い、特異的抗体の整備、クロマチン断片化条件の設定を行うことができた。PRC2による発現抑制の代表例には、HOX遺伝子群の制御やX染色体の不活性化が知られているが、PRC2の制御メカニズムの全貌は未だ明らかになっていない。本研究では、これまで全PRC2構成因子をベイトとした免疫沈降による複合体精製と質量分析器によるその解析によって、PRC2構成因子間の相互作用ネットワークを明らかにしてきた。その結果、細胞内には何種類ものPRC2複合体が存在することが明らかとなった。2013年度は、前年度までの知見を発展させるため、以下の研究を行った。(1)同定したPRC2構成因子に対するモノクローナル抗体の整備を行い、免疫沈降、ウエスタンブロットそれぞれに適した抗体を作製できた。これらを用いて内在性のPRC2複合体の構成を解析し、外来性のPRC2構成因子の発現によって得られた相互作用ネットワークが、内在性のPRC2でも成り立っていることが明らかにできた。(2) PRC2構成因子間の直接的なタンパク質間結合を評価するために、ヒト細胞における過剰発現系、酵母ツーハイブリッド系などを試みた。その結果、昆虫細胞を用いた発現系がもっとも適していることがわかり、PRC2活性コアの精製や、制御因子間の結合を評価できる系を立ち上げることができた。分子細胞生物学網羅的な免疫沈降ー質量分析器による解析によりPRC2複合体の構成因子間の関係を明らかにでき、いままで明らかでなかった複数種のPRC2複合体が存在することを明らかにできた。またそれらの機能的違いを明らかにするための実験系、材料を準備することができた。前年度に準備のできたChIP-seq解析系を用いて、見いだしたPRC2複合体それぞれが、どこでいつ機能しているのかを明らかにする。また排他的にPRC2複合体に含まれる構成因子が、どのようなメカニズムでその排他性が補償されているのかを、結合領域の同定を通じて明らかにする。PRC2構成因子のChIP-seq解析を行うにあたって、まず綿密な条件検討を行うことを優先したため、最も費用のかかる次世代シーケンサーによる解析の中に次年度となったところがあるため。次世代シーケンサーを用いた解析に使用する。
配列解析による知能マルウェア対策スキームに関する研究

様々なステルス技術を備えたマルウェアの検出率を高める為、本研究では、配列解析に基づいた計算知能技術をマルウェアから生成した配列に適用し、信頼性の高い検出・分類手法について研究開発を行った。新たに提案した編集距離カーネル関数とスペクトラムカーネル関数では、配列の類似度を定量的に評価することが可能になり、それらのカーネル関数を最先端のサポートベクトルマシン分類器に組み込むことによって、高精度且つ効率的にマルウェアを検出できる分類器の実現が可能になる。本提案手法は、25種類のパッカーによる難読化された検体データベースで実証実験を行い、99%以上の精度でパッカー特定ができることを実証した。本研究は、「効率のよい配列解析新手法の提案」及び「提案手法を基づいた信頼性の高いマルウェア分類技術の実現」を目的とする。平成25年度では、パックツールを特定する手法の性能向上と機能拡張について研究開発を行った。新たに提案したスペクトラムカーネル関数に基づいたサポートベクターマシン分類器は、25種類のパッカーで生成した評価用データセットの上で、99%以上の汎化能力(先行研究と同じレベルの精度)を維持しながら、計算複雑度をO(N^3)からO(N)に削減した(Nは分類器の訓練データ数である)。学習時間が大幅に削減することは、本研究の実用性の向上に繋がり、高速マルウェア解析技術を確立するための重要な柱である。これらの提案についての論文は、国際会議IEEE ASIAJCIS 2013で評価され、優秀論文賞を受賞した。尚、関連解析手法を評価するため、25年度では、効率的にデータベースの作成環境を構築した。「サイバーセキュリティ領域においてパッカー特定問題の重要性」及び「マルウェアが持つステルス機能の対策」について、技術向上を目的として、データの一部をInternational Cybersecurity Data Mining Competition (CDMC) 2013に提供した。これらのデータ提供は社会還元の重要な施策の一つとして、高い評価を得た。本研究は、「効率のよい配列解析新手法の提案」及び「提案手法を基づいた静的と動的要素を同時配慮する信頼性の高いマルウェア分類技術の実現」を目的とする。様々なステルス技術を備えたマルウェアの検出率を高める為、平成24年度では、配列解析を基づいたマルウェア解析手法とサイバーセキュリティ関連分野の応用に関する文献調査を行い、当研究分野の現状を把握した。また、従来のマルウェア対策技術の補充手法として、配列解析に基づいた計算知能技術をマルウェアのバイナリコード配列に適用し、静的な視点からマルウェアの行動を分析して、信頼性の高いマルウェア分類・検出手法について研究開発を行った。シグネチャ・ベースのスキャナを回避するため、マルウェアはパッカーによる圧縮や暗号化をすることが多い。暗号化されたマルウェアは使用するパッカーにより大きく異なり、マルウェアの静的解析に大きな支障がある。従って、マルウェアの自動解析システムを構築するため、パッカーによるマルウェアの難読化が一つの課題となっている。24年度の主な研究実績は、未知のパッカーで暗号化されたマルウェアを解析する時、自動的にアンパック・ツールを特定するシステムの実証実験を行った。新たに提案したバイナリ・コードの特徴を解読する配列解析カーネル関数をサポート・ベクトル・マシンという汎化能力が優れるかつ計算速度が早い分類器に適用し、マルウェアに含まれるアンパックコードを解読して、入力されたマルウェアに使用されているパッカーを特定するシステムを実装した。実験では、25種類のパッカーを評価用データセットとして使用し、99%以上の精度でパッカー特定が可能であることを実証した。上記の研究活動で、配列解析技術の有効性と実用性を実証した。また、その技術に基づいたパッカー特定システムは自動マルウェア解析技術を確立するための重要な役割を果たしている。新たに提案した編集距離カーネル関数とスペクトラムカーネル関数の特徴として、配列の類似度を定量的に評価できる点が挙げられる。これにより悪意を持つ検体の高精度かつ効率的な検出が可能となる。評価実験では、提案手法をシステム化し、大規模データベースに対して評価を行い、提案手法の有効性を実証した。一方、近年、スパムメールを介した悪意あるサイトへの誘導や特定の企業・個人を狙って送られる標的型メールの被害が深刻化している。スパムメール中にURLが記載されている場合、ユーザ;自身が悪性度を判定することは非常に困難である。本研究ではこれらのスパムメールの中から悪性度の高いものを検出することで、ユーザを攻撃の脅威から守ることを目指す。この目的のため、URLに接続必要のないスパムメール悪性度判定システムの開発を進めてきた。具体的には、提案手法を利用して、スパムメールの悪性度を悪性/非悪性の2段階に自動判別可能なシステムを実装した。

性能評価用の教師データは、当機構内で収集したダブルバウンスメールに、URLを自動巡回するクローラ(当機構のマルウェア収集・解析機能を有するSPIKEシステム)を適用して作成した。2013年3月から8月までに収集されたスパムメールに対し、提案手法は、平均90%程度の汎化能力を達成し、提案手法の有効性が実証できた。また、システムにオンライン学習機能を導入して、新たな未知の攻撃にも対応可能な悪性スパムメール検出システムの実装ができた。なお、社会還元の重要な施策として、「マルウェア対策技術の促進」を目的に、本研究成果の外部公開に積極的に取り込んだ。サイバーセキュリティ平成25年度で予定したパッカー特定研究に関しては、データの収集及びシステムの実証実験が完了した。また、当初の計画通り、「提案手法の実用性(時間的効率)の向上」について、実証実験が完了し、高い評価を得た。従来平成25年度で行う予定のパッカー特定の研究に関しては、データの収集や、システムの実証実験に必要な作業量が多いため、24年度にて、優先的に実験環境構築と性能評価に関する研究開発を行った。一方、上述の計画調整のため、可変長Nグラム文字列カーネル関数に関する研究は、25年度に変更した。25年度中、従来の研究目標を実現するため、実用システムの構築等の実用性研究と新しいデータ分析手法の提案などの理論性研究の進捗を適切に調整し、研究を進める予定。平成26年度は、従来の研究目標を実現するため、「マルウェア解析の実用性研究」と共に「その他のセキュリティ問題への応用研究」を適切に調整し、研究を進める予定。マルウェア解析システムの実用性研究では、提案した学習モデルに基づいたマルウェアパッカー特定システムや、マルウェアの動的解析システム実証実験を行い、実用システムを構築する。また、既存研究が未知のカテゴリに属するマルウェアについては有効分類のできない課題を解決したい。提案手法の応用の一つとして、情報通信研究機構で収集したマルウェア動的解析データベース及び構内メールサーバで収集したスパム・メール・データベースの上で実行する予定。また、提案した文字列カーネル関数を他のカーネル学習法に活用して、スパム・メールのフィルタリングやメール検体のクラスタリング等の探索的データ解析を検討している。また、本研究により得られた解析技術を、その他のサイバーセキュリティ問題への効果的に活用方策を提案し、産業界と連携しながら有効的なサイバーセキュリティシステムを構築していく。平成25年度では、「マルウェア解析システム構築の実用性研究」と共に「効率のよいデータ分析手法の提案の理論性研究」を同時に推進する。理論性研究では、可変長文字列カーネル関数の実装と性能評価を進める。
重症呼吸不全に対する液体換気の有効性と安全性に関する基礎的検討

液体換気(liquid ventilation,LV)とは特殊な液体であるフルオロカーボンを酸素ガスの代わりに人工呼吸に用いる全く新しい人工呼吸法である.液体を用いて人工呼吸することによって肺洗浄効果及び虚脱肺拡張効果が期待され,重症呼吸不全の肺酸素化能を改善することができる.一方,液体を用いることから,施行中の人工呼吸器の操作条件が呼吸生理に与える影響はガス呼吸とは異なる可能性がある.そこで今回LVを有効かつ安全に施行するための基礎的検討を行った.まず.成熟ラットを用い,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理を小動物用人工呼吸器を用いて行った.これをコントロール(GasV群)とした.GasV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.次に,フルオロカーボンをラットの肺内にあらかじめ注入した後,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(LV)を行った.これをLV群とした.GasV及びLV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.次に,先のデータを用いて,分時換気量(MV)と呼吸回数(RR)および吸気呼気時間比(I:E)を種々変化させたときのGasVとLVにおけるPaCO2,PaO2の変化の違いを検討した.操作条件の影響はGasV群に比しLV群では大きく,その影響はMVが低い場合により顕著となった.このことよりLVにおける人工呼吸器の操作条件に対するPaO2,PaCO2の変化はGasVとは全く異なるため,LVを安全かつ有効に施行するためにはPaO2,PaCO2をモニタリングしながら操作条件を決定する必要があると結論された.今後はFIO2などの操作条件を変更させ,さらに検討する予定である.液体換気(liquid ventilation,LV)とは特殊な液体であるフルオロカーボンを酸素ガスの代わりに人工呼吸に用いる全く新しい人工呼吸法である.液体を用いて人工呼吸することによって肺洗浄効果及び虚脱肺拡張効果が期待され,重症呼吸不全の肺酸素化能を改善することができる.一方,液体を用いることから,施行中の人工呼吸器の操作条件が呼吸生理に与える影響はガス呼吸とは異なる可能性がある.そこで今回LVを有効かつ安全に施行するための基礎的検討を行った.まず.成熟ラットを用い,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理を小動物用人工呼吸器を用いて行った.これをコントロール(GasV群)とした.GasV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.次に,フルオロカーボンをラットの肺内にあらかじめ注入した後,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(LV)を行った.これをLV群とした.GasV及びLV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.次に,先のデータを用いて,分時換気量(MV)と呼吸回数(RR)および吸気呼気時間比(I:E)を種々変化させたときのGasVとLVにおけるPaCO2,PaO2の変化の違いを検討した.操作条件の影響はGasV群に比しLV群では大きく,その影響はMVが低い場合により顕著となった.このことよりLVにおける人工呼吸器の操作条件に対するPaO2,PaCO2の変化はGasVとは全く異なるため,LVを安全かつ有効に施行するためにはPaO2,PaCO2をモニタリングしながら操作条件を決定する必要があると結論された.今後はFIO2などの操作条件を変更させ,さらに検討する予定である.液体換気(liquid ventilation, LV)とは特殊な液体であるフルオロカーボン(FC)を酸素ガスの代わりに人工呼吸に用いる全く新しい人工呼吸法である.LVには気道内すべてにFCを充填し専用呼吸器を用いて施行するLV(total liquid ventilation, TLV)とFCを肺内にあらかじめ注入した後,酸素ガスを用いた通常の人工呼吸を行うLV(partial liquid ventilation, PLV)の大きく2種類の施行様式がある.PLVとTLVの比較検討を行うことでLVの利点と欠点,さらには安全性についても明らかする.研究代表者の平成17年10月1日付け研究機関異動に伴い、本学医学部附属病院救急部において研究の開始をする運びとなった。1.酸素ガスを用いた従来の人工呼吸施行中の人工呼吸器の至適操作条件の検討実験用動物として300gの成熟ラット(Sprague Dawley rats)を用い,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(GasV)を小動物用人工呼吸器を用いて行う.GasV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対するラットにおける血行動態,血液ガス分析値,各種mediator血中濃度の変化を検討する.これをコントロール(GasV群)とする.2.PLV施行中の至適人工呼吸器条件の検討次に,FCとして3M社製FC, FC-77を用い,PLV施行中に人工呼吸器の操作条件を種々変更し,PLV施行中の各操作条件に対するラットにおける血行動態,血液ガス分析値,各種mediator血中濃度の変化を検討し,PLV施行中の至適人工呼吸器条件を決定する.3.TLV施行中の至適人工呼吸器条件の検討

最後に,我々の開発したラット用TLV専用人工呼吸器を用いてTLVを施行する.TLV施行中に人工呼吸器の操作条件を種々変更し,TLV施行中の中の各操作条件に対するラットにおける血行動態,血液ガス分析値,各種mediator血中濃度の変化を検討し,TLV施行中の至適人工呼吸器条件を決定する.研究代表者の平成17年10月1日付け研究機関異動に伴い,本学医学部附属病院救急部において研究の開始をする運びとなった.18年度前半までに研究設備を整えることができ,後半より本格的に本研究をスタートさせた.1.酸素ガスを用い縦来の人工呼吸施行中の人工呼吸器の至適操作条件の検討まず.実験用動物として30Ogの成熟ラット(Sprague Dawley rats)を用い,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(GasV)を小動物用人工呼吸器を用いて行った.GasV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.これをコントロール(GasV群)とした.次に,フルオロカーボン(FC)として3M社製FC-77を用い,FCをラットの肺内にあらかじめ注入した後,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(PLV)を行った.PLV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.これをPLV群とした.3.人工呼吸器の操作条件のPaO2及びPaCO2への影響最後に,分時換気量(MV)と一回換気量(VT)を種々変化させたときのGasVとPLVにおけるPaCO2,PaOの変化の違いを検討した.PaO2はGasV群,PLV群ともMVが大きいほど上昇し,PaCO2は両群ともMVが大きいほど低下し,その変化の仕方に差はなかった.しかし,MVを一定としてVTを変化させたときのPaO2,PaCO2はGasV群で大きな変化はなかったものの,PLV群では操作条件によって大きく変化した.PLV群ではVTが大きすぎても小さすぎても,言い換えれば呼吸回数が多すぎても少なすぎてもPaO2は低下し,PaCO2は上昇することが判明した.本年度も前年度に引き続き以下の研究を行い,新たな知見を得た.まず.成熟ラットを用い,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理を小動物用人工呼吸器を用いて行った.これをコントロール(GasV群)とした.GasV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.次に,フルオロカーボンをラットの肺内にあらかじめ注入した後,従来の酸素ガスを用いた従量式人工呼吸管理(PLV)を行った.これをPLV群とした.PLV施行中,操作条件を種々変更し,各操作条件に対する血行動態,血液ガス分析値の変化を検討した.最後に,先のデータを用いて,分時換気量(MV)と一回換気量(VT)および吸気呼気時間比(I:E)を種々変化させたときのGasVとPLVにおけるPaCO2,PaOの変化の違いを検討した.MVを変化させたときのPaO2はGasV群では変化なかったものの,PLV群では,I:E=1:2の時にはMVが大きいほど上昇し,I:E=1:1の時には極大値を持った.PaCO2は両群ともMVが大きいほど低下し,その変化率はPLV群の方が大きかった.次にVTを変化させたときのPaO2,PaCO2はGasV群で大きな変化はなかったものの,PLV群ではVTが小さいほどPaO2は低下し,PaCO2は上昇することが判明した.