hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
概日時計がスギ花粉症舌下免疫療法の効果に及ぼす影響

生物における約24時間周期(概日)性のリズムを持つ生命活動(睡眠や覚醒、血圧等)を司っている「概日時計」がアレルギー反応の強さを時間依存的に調節していることをこれまで明らかにしてきた(JACI 2011, 2014)。それらの研究を土台として、本研究では、アレルギー性鼻炎(花粉症)におけるAIT(舌下免疫療法)の実地する時間によって効果の最適化ができるか否かを検討した。その結果、アレルギー性鼻炎(花粉症)モデルマウスにおけるAITの実地する時間を休眠期に行うことがより効果が高いことを見出した。これらの結果から、AITの効果の最適化に「概日時計」が深く関与することが示唆された。アレルゲン特異的免疫療法(Allergen specific Immunotherapy:AIT)のメカニズムについての研究が多方面から進展中であるが、AITを施行する時間が,その治療効果に与える影響についての情報はほとんど得られていない。本研究では、スギ花粉症におけるAIT(舌下免疫療法)に概日時計がどのように影響するかを解明することを目的にし、検証を行った。まず初めに、適切なスギ花粉症のマウスモデルが未だ確立されていないため、スギ花粉症状様アレルギーマウス(鼻炎モデル)の作製に着手した。特にC57BL/6マウスを用いたスギ花粉症モデルの報告は皆無であるが、遺伝子改変マウスを用いることを考慮し、C57BL/6マウスを用いたスギ花粉症モデルの作製を試みた。しかしながら、C57BL/6マウスでのスギ花粉症モデルの作製が困難であったため、これまでに報告されているBALB/cマウスでモデルを作製し、朝10時と夜10時にAITを行い治療効果に違いがあるか否か検討した。その結果、血中スギ花粉特異的IgEの減少、IgG2aの増加に違いが認められ、AIT施行時間によって効果の違いが確認できた。これらの結果からAITの効果に概日時計が関係していることが示唆された。当初予定していたC57BL/6マウスを用いた、スギ花粉症マウスモデルの作製は困難だったためBALB/cマウスを用いることになったが、スギ花粉症状様アレルギーモデルマウス作製に成功し、AITの施行時間によって効果が異なることが確認できたため、概日時計によるAITの治療化効果に違いがあることを示唆することができた。また、BALB/c系の遺伝子改変マウスの入手も達成できてたことも踏まえると、おおむね順調に進展してると考えられる。アレルゲン特異的免疫療法(Allergen specific Immunotherapy: AIT)のメカニズムについての研究が多方面から進展中であるが、AITを実施する時間がその治療効果に影響するか否かについての情報はほぼ得られていない。本研究では、スギ花粉症におけるAIT(舌下免疫療法)に生理現象の周期性を決定すると言われる「概日時計(体内時計)」がどのように影響するかを明らかにする目的で検証を行った。BALB/cマウスを用いてスギ花粉症アレルギーマウス(鼻炎モデル)を作製し、朝10時と夜10時にAITを施行し治療効果に差があるか否を検討した結果、スギ花粉特異的IgE抗体の減少、IgG2a抗体の増加に朝晩の違いが観察できた。さらにAIT朝と晩に行ったマウスにスギ花粉を点鼻し、症状(くしゃみ、鼻かき行動)を検討した結果、症状改善が有意に異なることが観察され、頸部リンパ節中の制御性T細胞の増加数と一致していることも明らかとなった。以上の結果から、AITの実施時間よって治療効果が異なることが示唆され、概日時計によって制御性T細胞の誘導の割合が異なり、その結果、AITの実施時間によってAITの治療効果が異なることが示唆された。AITの実施時間によって、治療効果が異なることが明確に明らかとなり、その原因が制御性T細胞誘導能に概日時計が関与しうる結果が得られたことを考えるとおおむね順調に進展していると考えられる。

1.AIT効果を最適化するスギアレルゲンエキス舌下投与時間についての解析上述したように、AITの施行時間によって治療効果が異なることが確認できているが、その詳細が不明である。そこで、上述したスギ花粉症様モデルマウスを用いて、朝10時あるいは夜の10時に精製スギ花粉を2週間連続して舌下投与を行う。対照群としてPBS舌下投与群を用意する。最終感作2週間後から精製スギ花粉で鼻腔投与(チャレンジ)を行い、精製スギ花粉舌下投与の時間によるスギに対する免疫寛容(トレランス)の誘導効果について比較解析する。パラメーターとしては症状スコア(鼻ひっかき行動、くしゃみ回数のカウント)、鼻粘膜好酸球数・マスト細胞数(病理標本の染色)、頚部リンパ節リンパ球の精製スギ花粉に対する反応性(IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β産生をELISA法で測定)、頚部リンパ節中のFoxp3陽性制御性T細胞(制御性T細胞)数(フローサイトメーター)、血中スギ花粉特異的IgE(ELISA法)等を用いる。2.時計遺伝子Clock変異マウスでの検討同様の検討をBALB/c系統の時計遺伝子Clock変異マウスを用いて行い、精製スギ花粉舌下投与の施行時間によるAITの効果の差が時計遺伝子に依存するものであるか否かについて検討する。1.上記で報告した検体のさらなる解析を行う予定である。頸部リンパ節の制御性T細胞の増加が検出で来ているが、その他の項目(鼻粘膜好酸球・マスト細胞数、頸部リンパ節中のリンパ節におけるスギ花粉に対する反応性:IL-4, IL-13, IL-10など)については行っていないため今後行う予定である。制御性T細胞の増加のみではなく、これらの解析によって異なる可能性が示唆される可能性がある。2.Clock遺伝子変異マウスで同様な検討を行う予定である。野生型マウスを用いた検討を主要な時計遺伝子の一つであるClock遺伝子を変異させたマウス(概日時計がない)を行うことで、さらにAITの実施時間が概日時計に依存することが明らかとなる。アレルギー研究の遂行にあたり予想以上に順調に進められたことと、当初予定していた消耗品(物品費)の価格が業者との交渉により、一部購入経費の削減が可能となったため。研究の遂行にあたり予想以上に順調に進められたこと、当初予定していた消耗品(物品費)の価格が業者との交渉により、一部購入費の削減が可能となったため。繰り越しとなった研究費は、当初の研究費とあわせて消耗品(物品費)購入のための支出にあてる予定である。
ボルナ病ウイルスの核輸送機構の解明

ボルナ病ウイルス(BDV)は他の動物モノネガウイルスの中で唯一、感染細胞の核内で複製する。本研究では、BDVの複製機構を解明するため、BDV主要抗原の核内外輸送機構について解析を行った。(平成14年度研究実績)BDV P蛋白質は核移行シグナル(NLS)を保持することから、単独では核に局在する。しかし、BDV持続感染細胞内ではP蛋白質は細胞質にもその局在が認められる。P蛋白質はウイルス複製、病原性に重要な因子であることから、P蛋白質の細胞内局在調節機構について詳細な解析を行った。その結果、P蛋白質はX蛋白質の存在下では細胞質に局在した。PおよびX蛋白質は同一のmRNAから合成される。そこで、PおよびX蛋白質の発現量比について検討した結果、PおよびX蛋白質の発現量比は感染細胞内で調節されていることが明らかとなった。以上の結果より、BDVは複製に必須のウイルス蛋白質の発現量を変化させることで、細胞内局在を調節し、ウイルス複製を行っていることが示唆された(投稿中)。P蛋白質領域内にはメチオニン残基に富む領域が存在している。P蛋白質はX蛋白質の存在下では細胞質に局在する。しかし、この領域のアミノ酸欠損および置換変異体ではPおよびX蛋白質は核内に蓄積した。そこで、より詳細に解析を行った結果、P蛋白質のメチオニン残基に富む領域は核外輸送シグナル(NES)として機能していることが明らかとなった。以上の結果より、P蛋白質はNLSおよびNESを保持し、BDVの核内外の輸送に深く関与している可能性が示唆された。また、X蛋白質はP蛋白質との結合により、P蛋白質のNLS機能を阻害する。このため、BDV蛋白質の細胞内局在は蛋白質間相互作用により調節されている可能性も示唆された(投稿準備中)。ボルナ病ウイルス(BDV)の脳内持続感染機構を解明するため、BDVのウイルス産生において必須の過程である核内外へのウイルスゲノム、タンパク質の輸送機構について詳細な解析を行った。[平成13年度研究実績]BDVヌクレオカプシドタンパク質(N)の輸送機構の解明BDVゲノムに直接結合し、ウイルスゲノムを含むリボヌクレオ複合体(RNP)の構成因子であるNタンパク質はその領域内に核移行シグナルに加えて、核外輸送シグナルを保持することにより、RNPの核内外輸送に深く関与することを明らかにした。さらに、Nタンパク質の核外輸送活性はBDVリン酸化タンパク質(P)により阻害されることからウイルスタンパク質間の相互作用がRNPの輸送調節に関与しているが示唆された。BDVXおよびPタンパク質の相互作用による細胞内局在の調節機構の解明同一のmRNAから翻訳されるBDVXおよびPタンパク質は、各々の発現量が感染細胞内で調節されることより、ウイルス複製に深く関与していることを明らかにした。すなわち、Xタンパク質の発現量がPタンパク質と比較して高くなるとXおよびPタンパク質複合体は細胞質に局在し、逆にPタンパク質が高くなると、これら複合体は複製の場である核内に局在した。XおよびPタンパク質はRNP構成因子であることから、BDVの核内外輸送機構はRNP構成因子の発現量比および結合様式により調節されていることが示唆された。また、これらXおよびPタンパク質複合体は相互作用することにより、単独では保持していない輸送活性を示すことから、今後より詳細にこの細胞内局在調節機構を解析する必要があると考えられる。
植物の器官サイズを決定する制御メカニズムの分子遺伝学的解析

生物界において個体、器官、組織、細胞などのサイズがいかに決定されるかという問題は基礎、応用研究上非常に重要であるが、その制御機構は解明されていない。本研究はこの問題を特に植物の器官サイズ制御の視点から明らかにすることを目的とした。シロイヌナズナの突然変異体を用いて細胞増殖、細胞伸長、細胞分化に関与する遺伝子群を同定し、それらの機能解析を通じて高等植物の器官サイズを制御する分子機構の一端を解明した。生物界において個体、また個体を構成する器官、組織、細胞などのサイズがいかに決定されるかという問題は基礎、応用研究上非常に重要であるが、その制御機構についてはほとんど解明されていない。本研究はこの問題を特に植物の器官サイズ制御の視点から明らかにすることを目的としている。植物の器官サイズは外因性、内因性の様々な要素からなる複雑な制御ネットワークによって規定されている。今年度の研究ではモデル植物シロイナズナのgain-of-function突然変異体コレクションであるFOXライン(Full-length cDNA Over-eXpression line)を用いてこれらのネットワークに関与する遺伝子群を同定すること、またそれらの機能解析を通して高等植物の器官サイズを決定する制御システムの一端を解明することを目指した。今年度はまずこれまでに単離されたた13系統の器官サイズ突然変異体について予想される原因遺伝子の野生型への再導入を行い、過剰発現によって表現型が再現できる10系統を確立した。さらにそれらの原因遺伝子のin vivoでの発現解析、またloss-of-function変異体の表現型解析を進めた。Pizza変異体及び、wind farm変異体についてはさらに既存の関連変異体との2重変異体を作成し、これまでに報告されている制御ネットワーク内でのPIZZA及びWIND FARMの位置づけについて検討した。またさらにこれまで未解析であった250系統のFOXラインを用いて器官サイズ変異体スクリーニングを行い、器官サイズ決定に関わることが予想される新規因子を同定した。これらの成果は今後器官サイズ制御をさらに明らかにしていくための重要な知見をもたらした。今年度の研究ではモデル植物シロイナズナのgain-of-function突然変異体コレクションであるFOXライン(Eull-1ength cDNA Over-eXpression line)を用いてこれらのネットワークに関与する遺伝子群を同定すること、またそれらの機能解析を通して高等植物の器官サイズを決定する制御システムの一端を解明することを目指した。特に今年度は前年度までに確立したwind farm変異体の解析を進め、WFが植物に特有なトライヘリックス型転写因子GTL1をコードすること、またWFが細胞の生長に必要なほかの遺伝子の機能を抑えることで細胞生長にブレーキをかける働きをすることを明らかにした。さらにGTL1は核相の倍加を促進するSIMと拮抗(きっこう)して、核相の倍加を調節していることが分かった。植物細胞の大きさが、細胞生長を促進する制御因子だけでなく、抑制する因子によっても規定されることが明らかになったことは、植物の器官成長を理解する上で重要な進展であるといえる。今後、GTL1の発現場所や発現時期を調節することにより、植物体を構成するさまざまな細胞の大きさや、付随する機能を自在に変えることができるようになると期待される。本研究はモデル植物シロイヌナズナのgain-of-function突然変異体を用いて、器官サイズ制御に関与する遺伝子群を同定し、それらの機能解析を通じて高等植物の器官サイズを決定する制御システムを解明することを目的としている。本年度は研究代表者が単離したgain-of-function突然変異体のうち、pizza-D変異体についての解析を中心に行った。pizza-Dは野生型に比べて葉、花を始めとする全ての器官がすべて矮化する。pizza-Dの本葉の細胞サイズや核内倍加レベルは野生型に比べてほとんど変化がみられないため、pizza-Dの矮化は細胞増殖能の低下により器官の構成細胞の数が減少することが原因であると考えられる。代表者はこうしたpizzaの表現型が植物ホルモンの一種であるブラシノステロイドによって相補されること、またPIZZAが新規酵素をコードしていることを突き止め、これらの結果をもとに、PIZZAがin vivoでブラシノステロイドの合成もしくは代謝に関与するという仮説を立てた。本年度はLC-MSを用いたpizza-Dのホルモン定量分析を行い、PIZZAの発現量とブラシノステロイドの蓄積量の関係を調べた。さらにPIZZAの植物体内での発現パターンやloss-of-function変異体の解析、またin vitroでの酵素活性解析を進めた。
革新的な応力場制御による高密度機能性ナノ構造体の成長メカニズムの解明

本研究は、TEM観察により原子の拡散を実験的に解析するとともに、数値シミュレーションにより表面粗さ、残留応力、結晶構造、転位、原子密度がAlナノワイヤの高密度成長、そして高密度Fe2O3ナノ構造体の成長に及ぼす影響を解析する。また、ナノワイヤとナノ構造体の成長機構に基づき、金属ナノワイヤと半導体ナノ構造体の形状・寸法・密度・面積の高度制御を実現する。さらに、これらのナノ構造体を用いた高強度、高導電性のフレキシブル透明導電膜および超高効率な太陽光水素製造デバイスを実現する。
肺循環評価の新しい評価法の開発と診断応用-波動解析法を応用した肺動脈閉塞度の評価

肺高血圧症の病態診断に重要である肺小動脈の閉塞性病変の定量的評価法はない。本研究では肺循環を波動現象と考え2変数(圧力と流速)の位相差θにより閉塞度を評価し得るか検討した。様々な閉塞度での肺循環模擬回路内の圧ー流速変化の同時測定から算出されたθの理論値(閉塞病変がない場合θ=0°、完全閉塞θ=90°)との一致を確認した。更に臨床心臓カテーテル検査時の肺動脈内圧ー流速同時測定から算出したθと病勢と従来のパラメーターとの良好な相関を確認し、有用性が示された。理論的に求められる閉塞度ー位相角(圧力と流速の位相のずれを角度で表示)の関係と実測値からの関係の一致:一端に拍動加振器に接続した分枝なしチューブに圧ードップラー血流速度同時測定ワイヤー(0.014インチ)を組み込んだ圧力脈波伝搬回路を作成して、もう一端を閉塞させ、圧ー血流速測定データから両者の位相角θを算出した。閉塞の無い場合のθは0°(位相が一致)、完全閉塞では-90°(位相が90°変位)であり、理論値に一致していた。よって位相角は閉塞度によって0°≧θ≧ー90°の値を取ると推定された。肺動脈シミュレーション回路を用いた実測検証:分枝を有する肺動脈を模した分枝付塩化チューブを用いた回路を用いて、実測値からの位相角θを算出した。閉塞枝数に応じて0°≧θ≧ー90°の値を取ることを確認した。臨床データからの位相角の算出(予備実験):患者に肺動脈に上記の測定ワイヤーを挿入し、実測値から位相角θを算出した(大阪医科大学倫理委員会承認)。正常肺循環症例でθ=2.1°、中等度肺高血圧症例でθ=48.4°、高度肺高血圧症例ではθ=60.1°であり、いずれも臨床状態を反映する数値が得られた。現時点では多くの臨床測定値からの位相角θ-閉塞度の関係曲線を有していないため、実際に得られた位相角θに対応する閉塞度を提示することが出来ていない。しかしながら、肺動脈圧力と血流速度の位相差(位相角θ)を求めることで肺血管床の閉塞度を推定できる可能性が期待で出来た。研究発表:国内関連学会で成果を報告した。多数の意見が寄せられた。産業財産権:得られたデータを基にカテーテル測定による位相角算出法と用途を請求項目として平成26年12月19日に特許出願(特願2014ー257189)を行った。患者造影CT画像から作成した樹状3D肺動脈に拍動流ポンプを接続したヒト肺循環回路モデルを用い“血管閉塞度ー位相差関係"を測定した。閉塞度に応じての対数関数的な位相差の増加を示すことができ、かつ血管末端壁ヤング率の変化を考慮することで様々な臨床データの説明が可能となった。さらなる臨床データを蓄積した。求められた位相角(°)は、対照群(N=1)0°、肺高血圧(-)群38.2±13.1°、肺高血圧(+)群57.3±14.0°と臨床状態を反映した数値であり、肺血管抵抗値と正の相関を認め、新しい指標として有用と判断された。平成26年度で用いたものより臨床に近い3D樹状ヒト肺循環拍動流回路モデルを作成し、より精度の高い“血管閉塞度ー位相角関係"のシミュレーションが可能となった。患者からの臨床データの蓄積と解析を実施した。平成26年度で取得した臨床データの増補を行い、最終的に同意の得られた小児17症例の心臓カテーテル検査から臨床データを取得した。肺動脈内に圧-流速同時測定ワイヤーを挿入し、測定データをオフラインで位相角θ(閉塞なし=0°完全閉塞=ー90°)を算出した。対照群(1例):ー1°、軽度肺高血圧(PH)群(5例):ー38.2±13.1°、中等度高度PH群(11例):ー57.0±14.0°であった。同時に算出した従来の指標である肺小血管抵抗とr=0.48と緩やかな相関を認めた。これらより本方法がPHにおける肺血管閉塞度を予測する指標と成り得る結果が得られた。実地臨床を鑑み、位相角θを非侵襲的に測定する方法の開発が必要と判断され、データ採取法を心臓超音波検査へ置き換えることの可能性についてコンセプト検証を行った。心臓超音波検査では血流速の測定は可能であるが、圧力測定は不可能である。この課題に対し“圧力変動を血管直径の変動に置換"する理論を元に“圧力波形=血管径変化波形"を実際に血管と同じヤング率を有する弾性チューブに拍動循環を与えた循環回路モデルで測定した。圧-流速同時測定ワイヤーで同時測定して算出した従来の位相角と心臓超音波検査データから測定した位相角はほぼ同じ値となり、この置き換えは成功と判断した。この結果を基に、臨床データ収集のための最適な画像取得のための条件とデータ処理方法の検討について、心臓超音波検査器機を製造販売する国内メーカーと協働を開始した。

様々な閉塞度での肺循環模擬回路内の圧ー流速変化の同時測定から算出されたθの理論値(閉塞病変がない場合θ=0°、完全閉塞θ=90°)との一致を確認した。更に臨床心臓カテーテル検査時の肺動脈内圧ー流速同時測定から算出したθと病勢と従来のパラメーターとの良好な相関を確認し、有用性が示された。平成26年度は、到達目標としていた、理論的に求められる閉塞度ー位相角(圧力と流速の位相のずれを角度で表示)の関係と実測値からの関係の一致について肺動脈シミュレーション回路を用いて証明することが出来た。また平成28年度に計画していた臨床での実測データからの位相角θ算出がパイロット的に可能であることを実証可能であった。得られた成果の一部を国内学会で発表するに至った。また、特許申請を最終年度の到達目標としていたが、得られたデータを基に平成26年度で行い得た。平成26および27年度で得られたデータを国内外関連学会での報告のみならず論文発表を行う。更なる患者からの臨床データ収集を行う計画であるが、現時点では侵襲的な心臓カテーテルによる特殊ワイヤーの血管内挿入を行っている。しかしながらより理想的な非侵襲的手段(心臓超音波検査等)によるデータ収集方法について検討・実施する。心臓血管外科平成26年度の成果を邦文論文として早急に発表する。加えて国際特許出願(PCT出願)も考慮し、国際学会および英文誌での論文発表を行う。実際の測定値から得られる位相角θに対応する閉塞度を確定することが可能となるためには、測定値からの位相角θ-閉塞度の関係曲線を有することが必須である。平成27年度ではこの曲線作成のためにビーグル犬を用いた実験モデル(肺動脈内に圧ードップラー血流速度同時測定ワイヤーを留置し、肺動脈閉塞度を可変)を予定していたが、モデル確立が困難であると予想された。よって患者造影CT画像から作成した3D肺動脈に補助心臓ポンプを接続したよりヒトに近い循環回路を用いる方法にモデル変更し、上記曲線の作成を行う計画とした。“圧ー流量同時測定ワイヤー"購入費用部分で、一本購入価格に満たない部分の残金が生じた。当初支出を計画していた肺動脈圧ー血流測定値からの位相差計算プログラム作成費用が、外部発注から関西大学研究協力者により一部が実施されたため残金として計上された。この残金を平成28年度の研究計画での物品購入等で執行する計画である。この残金を平成27年度の研究計画での物品購入等で執行する計画である。
外国人労働者の流入に伴う地域社会構造の変容に関する実証的研究

1.本研究で対象にした群馬県太田・大泉地区では、日系ブラジル人の急増・定住化に伴って、地域社会における機構的システムないし諸制度が大きく変容している。第1に、日系ブラジル人を利用した独自の業務請負システムが構築され、第2に、行政機構が外国人が利用しやすい形に改変されている。第3に、ブラジル協会のように、エスニック・コミュニティの内部に新たな諸機構が構築されつつある。2.これに対し、ホスト住民の労働-生活世界の変化は少なかった。日系ブラジル人は職場でも、地域でもホスト住民と強いつながりをもたず、セグリゲート化が進行している。ホスト住民と接触せざるをえない場面はゴミ出し、騒音、交通事故等に限定され、むしろ、それらがホスト住民にとって外国人に対する不信感を増幅させる機会になっている。3.その中で、公立学校における子ども同士の閧係や外国人と接触するボランティア活動は、共同関係形成の1つの可能性を示している。公立学校は子ども同士が「自然体」での交流を行う場になっているし、ボランティア活動に参加した人々は外国人に対する一面的な見方を確実に変化させている。4.このように、日本人と日系ブラジル人のセグリゲート化の現状が問われると同時に、次世代の教育やボランティア活動を通じて、労働-生活世界における日本人と外国人の共同関係がどのように形成されていくかが、この地域の将来のあり方を決める重要な要素になる。1.本年は4カ年計画の初年度に当たるため、日系ブラジル人を中心とする外国人が集住する群馬県太由市・大泉町と静岡県浜松市の行政機関を対象として、来年度以降の本調査のための予備調査を行った。具体的には、群馬県太田市・大泉町と静岡県浜松市の人口・産業・教育・福祉等の特質と外国人労働者の動向について聞き取り調査を行った。2.その結果、群馬県太田市・大泉町でも、静岡県浜松市でも、不況であるにもかかわらず、日系ブラジル人を中心とする外国人労働者は決して減少していないことがわかった。しかも、いずれの地域においても、外国人の間で一定の階層分化が生じ、なかには失業者も生まれるようになっていること、とくに浜松市では、日系ブラジル人のホームレスも現れていることが明らかになった。3.群馬県太田市・大泉町、静岡県浜松市のいずれの自治体でも、外国人に対する行政サービスに努力している。しかし、それらの努力によって、しだいに自治体財政が圧迫される傾向が見られるようになっている。とくに、群馬県大泉町の場合、自治体の規模が小さいにもかかわらず、外国人が数多く存在し、その上、外国人に対して手厚い行政サービスを提供しているため、外国人の存在が自治体財政に与える影響には大きいものがあった。4.なかでも、大泉町の国民健康保険は、加入者のうち約2割が外国人によって占められ、外国人に相対的に年齢の若い者が多いこともあり、出産育児一時金が外国人に偏って支給される事態を生み出している。出産育児一時金の51.5%が外国人に対する支給となっている。その結果、周辺市町村ではもっとも低い水準であった保険料も相次ぐ値上げによって、今では周辺市町村よりも高い水準になっていることがわかった。1.4カ年計画の第2年度に当たる本年は、日系ブラジル人を中心とする外国人が集住する群馬県大泉町を対象として、(1)地域住民の外国人との交流のあり方に関する配布アンケート調査および面接調査、(2)エスニック・ビジネス経営者に対する生活の歩みと経営のあり方に関する面接調査、(3)国際交流団体のメンバーに対する国際交流の活動と機能に関する配布アンケート調査および面接調査を実施した。2.その結果、地域住民に対する調査から、日本人住民の間には、外国人に対してゴミ出し、騒音の問題等を始めとするいくつかの点で根強い不信感が見られるが、それが表だった対立や葛藤を生み出すまでに至っていないこと、その背後に日本人と外国人の間に生活上の接点がなくなっている現実が存在していることがわかった。

3.エスニックビジネス経営者に対する調査からは、食料品、衣料品、引っ越しサービス、理美容、中古車販売、弁当、学習塾、ビデオレンタル、人事派遣等、多岐にわたるエスニックビジネスが展開されていること、経営者には、日本人経営者、日本国籍をもつ日系1世もいること、日本人経営者以外の場合、ビジネスの立ち上げに関して、営業許可、店舗の確保等の点で、何らかの形で特定の日本人に依存していること、ビジネスで成功した外国人の場合であっても、将来的には母国へ帰る意志が強いことなどが明らかになった。4.国際交流活動に関する調査では、当町の外国人はブラジル人がほとんどを占めているにもかかわらず、会に加入している外国人は、ブラジル国籍以外の者に限られていること、活動内容や会員の興味関心もブラジル人に関してではなく、むしろ欧米やアジアを中心としたものとなっていることなどが明らかになった。1.4カ年計画の第3年度に当たる本年は、日系ブラジル人を中心とする外国人が集住する群馬県大泉町を対象として、外国人の子弟の教育問題に関する調査研究を行った。具体的には、(1)公立小中学校へ通う外国人児童・生徒と両親、(2)日本人児童・生徒と両親、(3)外国人児童・生徒の多い公立小中学校の教師・日本語指導助手に対する配布アンケート調査および面接調査を実施した。2.その結果、日本人の子どもたちは比較的自然体で外国人の子どもに接し、とくに小学校では積極的な交流がみられること、日本人の親もその現実を積極的に受け止めていること、ただしそれは外国人の大人に対する評価と対応しておらず、むしろ「恐く」て「ルールを守らない」大人の外国人と彼らに無理やり連れてこられた「かわいそうな」外国人の子どもという見方を形成していることがわかった。3.こうした見方は教育関係者にも共通しており、外国人は学校を託児所代わりにし、教育に無関心であるという見方をする教師や日本語指導助手が多かった。しかし、子どもを公立小中学校に通わせている外国人の親は、むしろ日本の学校に通わせることを将来の子どもの進路を考慮した教育戦略として積極的に位置づけていた。たとえ、将来本国に帰ったとしても、日本の学校で学ぶことは、ビジネスや職業を国際的な視点から選択する上で有効であると考えていた。4.だが、公立小中学校に通わない外国人の子どもたちも増加している。そのため、1999年にはブラジル人学校ができた。ただ、授業料の高さのため、ブラジル人学校へも通わない子どもも増加している。彼らは、「非行」予備軍として地域住民から懸念されており、現在、彼らの存在はこの地域の最大の課題になっている。1.4カ年計画の最終年度に当たる本年は、日系ブラジル人を中心とする外国人が集住する群馬県太田市・大泉町を対象として、外国人の子弟の教育問題に関する調査研究を行った。具体的には、(1)ブラジル人学校へ通う外国人児童・生徒と両親および教師、(2)外国人との混成保育を行う保育所に子どもを預けている日本人と外国人の両親および保育士、(3)不就学のブラジル人の子どもに対する配布アンケート調査および面接調査を実施した。
生態ゲノミクスで豪州ヒノキにおける環境適応プロセスを復元する

豪州ヒノキ複合種はオーストラリア大陸全域に分布を拡大した系統群であり,砂漠・温帯・熱帯サバンナという多様な気候下で生育している.本研究では,この豪州ヒノキを対象にした生態ゲノミクスを展開することで,本種群における環境適応の遺伝的基盤を解明するとともに,遺伝的適応がその後の集団サイズや生態ニッチの拡大にどのように寄与したのかを解明することを目的としている.平成27年度は前年度までに得られたRNA-seq解析から,同義置換率に対する非同義置換率が高いアウトライヤー遺伝子座について集団リシークエンスを行い,本複合種の適応進化に関与した遺伝子座を抽出することを目的にした.解析の対象としたのは39座のアウトライヤー遺伝子座と9座のコントロール遺伝子座で,これらについてプライマーを設計してBioanalyzerを用いてPCR増幅の確認を行った.PCR増幅を行った後,Fluidigm社のAccess Array Systemを用いることにより,オーストラリア大陸全域から採取した96個体の豪州ヒノキDNAを48座について同時にPCR増幅を行った.得られたPCR産物はデスクトップ型次世代シークエンサーIonPGMを利用し,アンプリコンシークエンスに供した.シークエンスの結果,解析対象とした48遺伝子座のうち26遺伝子座でデータ欠損率の低い多型データを得ることができたが,22遺伝子座については一部の地域に由来する個体でデータが得られず,遺伝的多型の豊富な野生植物で安定して増幅できるプライマーの設計が課題となっている.研究員の所属変更に伴って,本研究は本年度途中で中断することになったが,これまでに多型データを取得できた候補遺伝子群に関する分子進化的解析を進めて,本複合種の適応進化の分子的背景を検証していく予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。豪州ヒノキ複合種はオーストラリア大陸全域に分布を拡大した系統群であり,砂漠・温帯・熱帯サバンナという多様な気候下で生育している.本研究では,この豪州ヒノキを対象にした生態ゲノミクスを展開することで,本種群における環境適応の遺伝的基盤を解明するとともに,遺伝的適応がその後の集団サイズや生態ニッチの拡大にどのように寄与したのかを解明することを目的としている.平成25年度はまず,オーストラリア大陸全域(28地点)から収集した種子に基づく共通圃場実験を行い,豪州ヒノキ複合種の稚樹に見られる形質変異を評価した.形態・成長測定・化学・同位体分析を行うことで8種類の形質データを得た.形質値と自生地の気候要因との相関を,系統的背景を考慮して推定したところ,葉長・気孔密度・葉の窒素濃度・樹形などの形質が季節降水量と有意な相関を示すことが明らかになった.同時に各形質について祖先復元を行った結果,半乾燥地環境に分布していた共通祖先が乾燥地や熱帯モンスーン帯などの気候区へと進出する中で,利用可能な水資源量が選択圧となって多様な形態・生理形質を進化させてきたことが示された.続いて,大陸全域から採取した植物試料からDNAを抽出し, RAD-seq解析を行った.RAD-seqは制限酵素で切断されたDNA断片を次世代シークエンサーで網羅的に解読することで,非モデル生物において多数のゲノム領域の塩基配列を得られる遺伝解析手法である.今年度の解析では,約120個体の豪州ヒノキ個体について4000を超える数の一塩基多型(SNPs)を検出することができた.これらのSNPsの中には自生地の気候要因と有意な相関をもつものが約100個含まれていた他,多くのSNPs同士の間には比較的強い連鎖不平衡係数が推定されたことから,オーストラリアの多様な気候環境がゲノムの複数領域に選択圧として働いた可能性が示された.豪州ヒノキ複合種はオーストラリア大陸全域に分布を拡大した系統群であり,砂漠・温帯・熱帯サバンナという多様な気候下で生育している.本研究では,この豪州ヒノキを対象にした生態ゲノミクスを展開することで,本種群における環境適応の遺伝的基盤を解明するとともに,遺伝的適応がその後の集団サイズや生態ニッチの拡大にどのように寄与したのかを解明することを目的としている.平成26年度では,豪州ヒノキ複合種について連鎖地図を作成することを目的とし研究を行った.裸子植物である豪州ヒノキにおいては,種子に含まれる胚乳組織が半数性であることから,同一母樹から採取した胚乳組織を遺伝解析することで,連鎖地図を作成することが可能である.そこで,平成25年度に大量の遺伝マーカーを生成することのできたRAD-seq解析とEST-SSR解析により,高密度連鎖地図を作成することとした.解析の結果,4,280マーカーが11連鎖群に座上する連鎖地図が構築され,マップカバー率は0.99を超えた.連鎖群数は豪州ヒノキの染色体数に対応していた.この基盤地図の有用性を検証するため,複合種を構成する2種(C. glaucophyllaとC. gracilis)の集団試料を同じくRAD-seq解析に供し,得られた多型マーカーと基盤連鎖地図との対応を調べたところ,873多型マーカーが地図上にマッピングされた.マッピングされた多型マーカーに基づいて,2種間での交雑現象を解析したところ,連鎖群上でのゲノム混合率にばらつきがあり,例えば交雑個体の第1連鎖群の先頭部ではC. gracilisのゲノム組成が非常に高いことが明らかになった.以上の解析から,今年度作成した高密度連鎖地図は豪州ヒノキの生態ゲノミクス解析に応用可能であることが示された.

豪州ヒノキ複合種はオーストラリア大陸全域に分布を拡大した系統群であり,砂漠・温帯・熱帯サバンナという多様な気候下で生育している.本研究では,この豪州ヒノキを対象にした生態ゲノミクスを展開することで,本種群における環境適応の遺伝的基盤を解明するとともに,遺伝的適応がその後の集団サイズや生態ニッチの拡大にどのように寄与したのかを解明することを目的としている.平成27年度は前年度までに得られたRNA-seq解析から,同義置換率に対する非同義置換率が高いアウトライヤー遺伝子座について集団リシークエンスを行い,本複合種の適応進化に関与した遺伝子座を抽出することを目的にした.解析の対象としたのは39座のアウトライヤー遺伝子座と9座のコントロール遺伝子座で,これらについてプライマーを設計してBioanalyzerを用いてPCR増幅の確認を行った.PCR増幅を行った後,Fluidigm社のAccess Array Systemを用いることにより,オーストラリア大陸全域から採取した96個体の豪州ヒノキDNAを48座について同時にPCR増幅を行った.得られたPCR産物はデスクトップ型次世代シークエンサーIonPGMを利用し,アンプリコンシークエンスに供した.シークエンスの結果,解析対象とした48遺伝子座のうち26遺伝子座でデータ欠損率の低い多型データを得ることができたが,22遺伝子座については一部の地域に由来する個体でデータが得られず,遺伝的多型の豊富な野生植物で安定して増幅できるプライマーの設計が課題となっている.研究員の所属変更に伴って,本研究は本年度途中で中断することになったが,これまでに多型データを取得できた候補遺伝子群に関する分子進化的解析を進めて,本複合種の適応進化の分子的背景を検証していく予定である.本年度は豪州ヒノキにおいて初めて連鎖地図を作成することに成功し,その地図を集団多型解析に応用できることを確かめることができた.この成果から,当初の研究実施計画に即して順調に研究が進展していると評価した.27年度が最終年度であるため、記入しない。RAD-seq解析で得られた基盤連鎖地図に基づいて,複合種の様々な種ペアに関してゲノムスキャン解析を行い,ペアの間でゲノムの分化パターンを比較する.また,降水勾配に沿って分布している集団を対象にRNA-seq解析を行い,集団統計学的解析によって自然選択の影響を受けている候補遺伝子を抽出する予定である.本年度は共通圃場実験によって,豪州ヒノキに自然選択圧として働いた環境要因の特定とそれに応答して起きた形質進化を示すことができた.また, RAD-seq解析により多数のSNPsを得ることができ,その中に各種気候要因と相関をもつSNPsが多数含まれることを示すことができたことから,当初の研究実施計画に即して順調に研究が進展していると評価した.27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度のRAD-seq解析で得られた,適応に何らかの形で関連している可能性のあるSNPsが,豪州ヒノキのゲノム上のどのような場所に位置するのかを明らかにするために,今後は大配偶子体法に基づいて連鎖地図の作成を進め, SNPsのマッピングを行う.同時に,豪州ヒノキのトランスクリプトームライブラリからは非同義置換率が特に高い遺伝子がリスト化されており,それら候補遺伝子について次世代シークエンサーを用いてリシークエンス実験を行い,得られた塩基配列データについて中立進化の検定を行う予定である.
ヒト老化に伴うSHMT2とGCAT遺伝子発現抑制が誘発するのは短命か長寿か？

応募者は最近、ヒトの老化の原因が従来の定説のように「mtDNA突然変異の蓄積」にあるのではなく、「核ゲノムのゲノム修飾」であり、核ゲノムにコードされる少なくとも二つの遺伝子(SHMT2とGCAT)の発現抑制が関係するという老化機構のパラダイム転換を提案した。本申請は両遺伝子を破壊したマウスを活用し、これらのマウスが長寿になるか短命になるかを明らかにすることで応募者の仮説の正否を明らかにする。
振動血管内の流動機構に関する基礎研究

振動を受ける血管内の流動を解明するため、管内径9.0mmの直管を管軸方向に010Hzの範囲で振動させ、流速を変化させて管の損失に及ぼす影響を実験的に明らかにした。実験は管路系全体を振動させる場合と直管のみを振動させ、上下流の水槽を静止させる場合の二種類に対して行ない、以下の成果を得た。1.管路系全体が振動する場合には、乱流へ遷移するときの臨界レイノルズ数は振動数の増加とともに減少し、管の振動数が流れの不安定に及ぼす影響は大きい。また加振時の壁圧変化の位相は、振動数が増すにつれて次第に遅れる。2.管のみを振動させ、上流静止水槽から振動直管に流入させると、管路の流動損失はわずか増加する。しかし、上述1.で述べたような遷移レイノルズ数の変化は観察できなかった。以上の主な成果からさらに今後の計画として以下の点を明らかにすべきである。1.管の振動数を、10100Hzにして、流れ状態の変化を明らかにする。2.管の材質を弾性のあるものに変え、管直径を周期的に変化させる。3.管の振動を管軸と垂直方向とし、その振動による流動状態の変化を調べる。
トランスジェニックマウスを利用した、悪性脳腫瘍に対する遺伝子療法の基礎的研究

1.遺伝子導入の確認:PCRによる遺伝子解析の結果、雄IL-2トランスジェニックマウスと雌正常マウスを掛け合わせるとその子孫の約1/3でヒトIL-2遺伝子が陽性となった。一方、IL-2Rβトランスジェニックマウスはホモで生育が可能なため、その子孫のほとんどは、PCRで陽性となった(>90%)。2.Tumor growthcurve:IL-2あるいはIL-2Rβトランスジェニックマウスおよび正常マウスに26G細胞株を皮下に接種し、その成長曲線を比較すると、IL-2トランスジェニックマウスでは正常マウスとくらべ腫瘍増大は明らかに抑制されたが生存期間は正常マウスと有意差がなかった。一方、IL-2Rβトランスジェニックマウスでは腫瘍増大の抑制とともに生存期間も延長し、そのうち約20%の腫瘍は消失した。4.トランスジェニックマウスの細胞よりのIL-2産生量skin fibroblastで10I.U./ml/10^5 cells/24hrs,spleen cellsで12I.U./ml/10^6 cells/24hrsとわずかであった。5.in vivocytotoxic assay:(1)Winntype neutralization assay--IL-2あるいはIL-2Rβトランスジェニックマウスおよび正常マウスより採取したCTLsを腫瘍細胞と混合して正常マウスの皮下に接種し、effectorとtargetの混合細胞液の比によりin vivo cytotoxic活性を比較した.14日目の腫瘍形成率で比較するとIL-2トランスジェニックマウスのCTLが最も腫瘍形成の抑制がみられた(10-20%)。(2)養子免疫療法モデル--腫瘍細胞を皮下接種の3日後、IL-2あるいはIL-2Rβトランスジェニックマウスおよび正常マウスより採取したCTLsをeffector cellsとして尾静脈より静注、腫瘍増大曲線、腫瘍形成率、あるいは生存曲線にて判定した.IL-2トランスジェニックマウスCTLsで治療すると腫瘍の1/4は消失した。6.今後の計画:本研究によりIL-2あるいはIL-2Rβトランスジェニックマウスでは皮下腫瘍の増大が抑制され、腫瘍の排除のための免疫反応が高まっていることが示唆された。トランスジェニックマウスのどの細胞が腫瘍増大抑制に関わっているか調べるにより、最も効果的に遺伝子治療を行うのに有効な細胞を選ぶことができると考えられる。またトランスジェニックマウスを用いることで分離して継代培養して遺伝子導入が困難な免疫担当細胞にautocrine or paracrine刺激を加えることが容易であり、本研究ではIL-2遺伝子導入CTLが活性が高くin vivo studyにおいても興味深い結果を得ることができた.今後、他の免疫担当細胞を用いてサイトカイン産生vehicleとしてcytokine gene transferred fibroblastsを組み合わせて有効な遺伝子治療の方法を検討していきたい。
腎細胞癌におけるMN/CA9遺伝子発現の機序に関する研究

1.MN/CA9遺伝子5'領域のCpGメチル化とMN/CA9遺伝子発現の関係ヒト腎細胞癌培養細胞株、ヒト腎細胞癌組織を用いてMN/CA9遺伝子5'領域のメチル化状態とMN/CA9発現を調べた結果、-74bpのCpGの低メチル化とMN/CA9発現の間に強い相関関係を認めた。メチル化状態はbisulfite genomic sequencingprotocolで判定し、MN/CA9発現はRT-PCRで確認した。2.メチル化阻害剤によるMN/CA9発現の誘導MN/CA9遺伝子5'領域が完全にメチル化されているMN/CA9発現陰性のヒト腎細胞癌培養細胞株をメチル化阻害剤(5-aza-2'-deoxycytidine)投与下に1週間培養することにより、MN/CA9の発現が誘導されることを確認した。3.MN/CA9プロモーター領域の同定MN/CA9遺伝子5'領域(-1246/+42bp)をルシフェラーゼリポータープラスミドに組み込みExo/mung beans methodを用いたdeletion analysisを行った。これによりminimum promoterの5'側が-158bpと-58bpの間にあり、上記1で検討した-74bpのCpGがほぼプロモーター領域にあることを確認した。4.MN/CA9プロモーター領域のCpGメチル化の転写活性に与える影響MN/CA9プロモーター(-158/+42bp)上のすべてのCpGをCpGメチラーゼ(SssI)でメチル化した場合にプロモーター活性が著しく抑制されることを確認した。また、-74bpのCpGだけをCpGメチラーゼ(HhaI)でメチル化した場合も同様にプロモーター活性が強く抑制された。以上の結果から、ヒト腎細胞癌におけるMN/CA9発現にプロモーター領域(-74bp)CpGの低メチル化が大きく関与していることが示唆された。平成11年度は下記の5つの点について検討し以下の結果を得た。1.ヒト腎細胞癌培養細胞株におけるMN/CA9遺伝子の発現:7種のヒト腎細胞培養細胞株(SKRC1,6,10,12,14,44,59)において、RT-PCR法を用いてRNAレベルでのMN/CA9遺伝子の発現の有無を調べ、5種の培養細胞株(SKRC-1,6,10,44,59)で発現を認めた。2.ヒト腎細胞癌培養細胞株におけるMN/CA9遺伝子のメチル化状態:上記1のヒト腎細胞癌培養細胞株に対し、5'上流領域(-142bpから+92bpまで)の7部位のCpGのメチル化の有無について、Bisulphite genomic sequencing protocol法を用いて調べた。遺伝子発現の見られない2種の培養細胞株において7部位のCpGは完全にメチル化されていた。一方、遺伝子発現のみられる5種の培養細胞株全てに低メチル化が観察された。3.ヒト腎細胞癌組織におけるMN抗原の発現:13例の腎細胞癌組織と3例の非癌部腎組織において、mAbG250抗体を用いた免疫染色を行い、MN抗原の発現の有無を調べた。10例の腎細胞癌においてMN抗原陽性であり、残り3例の腎細胞癌と3例の非癌部腎組織においてMN抗原陰性であった。4.ヒト腎細胞癌組織におけるMN/CA9遺伝子のメチル化状態:上記3の組織サンプルに対し、上記2と同様の検討を行った。免疫染色上、MN抗原陽性腎細胞癌(10例)において高率(90%)に低メチル化が観察された。

一方、MN抗原陰性腎細胞癌、非癌部腎組織において低メチル化は認められなかった。5.メチル化阻害剤によるMN/CA9遺伝子発現誘導:MN/CA9遺伝子発現が認められず、5'上流領域(-142bpから+92bpまで)が完全にメチル化されている2種のヒト腎細胞癌培養細胞株(SKRC12,14)に対し、1.0μMの5-aza-2'-deoxycytidineを7日間投与した。MN/CA9遺伝子発現がRNAレベルで誘導され、5'上流領域の脱メチル化も観察された。平成12年度は下記の2つの点について検討し以下の結果を得た。ヒトゲノムDNAコスミドライブラリーよりMN/CA9遺伝子5'領域(-1246/+42bp)を吊り上げ、ルシフェラーゼリポータープラスミドに導入し、サブクローニングを行った。Exo/Mung beans法を用いて、4種の欠失変異体(-416/+42bp,-244/+42bp,-158/+42bp,-58/+42bp)を作製し、MN/CA9遺伝子発現陽性のヒト腎細胞癌培養細胞株(SKRC-44)にリポフェクション法を用いて遺伝子導入した。各変異体のルシフェラーゼアッセイの結果、-416/+42bp,-244/+42bp,-158/+42bpの変異体には活性を認めたが、-58/+42bpの変異体には活性を認めなかった。このことより、最小プロモーター領域の5'端は-158bpと-58bpの間にあることを確認した。プロモーター活性を有する上記欠失変異体の一つ(-158/+42bp)を用い、プロモータ上の6つのCpGすべてをCpGメチラーゼ(SssI)でメチル化した場合と-74bpの部位のCpGだけをCpGメチラーゼ(HhaI)でメチル化した場合のルシフェラーゼ活性をSKRC-44細胞に遺伝子導入して調べた。いずれの場合においてもコントロールに比べてプロモーター活性は強く抑制された。
軌道衛星画像データの解析処理システムの開発

本研究は軌道衛星に搭載された受動式センサーにより抽出された画像データを処理するシステムSAIASを改良し更新した。その更新されたIBASYSシステムの内容は下記の通りである。(1)FORTRAN言語記述プログラムをC^<++>言語記述とし、ワークステーションあるいはパーソナルコンピュータで処理可能とした。(2)解析準備に不可欠なデータ性状検証、パターンの色調付けを7Band対応から18Band対応へと拡張した。(3)画像の幾何変換の処理効率を向上させるために、マンマシン処理の誤差分析処理と画像変換処理に階層性を取り入れた。(4)教師なし分類手法にK-means法を追加し、ラスタ処理に適した分類過程を取り入れアルゴリズム化した。(5)トレーニング地区の選定が画像データに対して適用しているかどうかを検証する概念をアルゴリズムの中に取り入れることができた。(6)分類法の拡張として、ファジ-理論とニューラルネットワーク法を結合したFNN分類法を理論的に検討し、軌道衛星画像データを分類可能とした。軌道衛星画像データの解析システムの開発計画を2ヶ年とし、システムの内容を研究分担者全員で検討し、システム開発に必要な資料収集を主要大学を中心に実施した。これらの資料を参考にしながら、WINDOWS95のOSを用いて、C言語にてソフトウェア開発を実施した。その主な内容は下記の通りである。(1)リモートセンシング画像データのBILもしくはBSQ形式からBMPフォーマット形式へ変換するツールを開発し、カラー画像表示モジュールを作成した。(2)トレーニングデータの抽出をカラー合成画像より摘出できるモジュールを作成した。(3)トレーニング地区データとテスト地区データの統計量を算出するプログラムを開発した。(4)バックプロパゲーション学習法を含めたニューラルネットワーク分類法を新規に開発し、出力層の1次候補以外に2次候補も出力可能とし、アクティブィティ尺度による複合領域の判定を行うモジュール開発を行った。この結果の稼働性を実験するために最尤法(MLH)とニューラルネットワーク法(NN)の比較研究を試み、学会にてその内容を公表した。
リンパ節転移機構の解明による新規口腔癌治療戦略の確立

センチネルリンパ節生検対象症例であるcStage1-2の口腔癌患者のリンパ節および原発組織を用いて検討を行った。非センチネルリンパ節に比較しFoxp3やCD68およびCD163がセンチネルリンパ節において発現量の亢進が認められ、VEGF-Cもセンチネルリンパ節においてより発現量の亢進が認められた。また、原発組織の検討においては、PDL1の発現は、転移陰性症例に対し転移陽性症例で発現量の亢進が認められた。術前血清を用いた予後予測因子バイオマーカーの探索では、DFSにおいてIL-6 , IL-8の2つのサイトカインが予後予測因子としてのバイオマーカーとなりえる可能性が示唆された。近年、多くのがん種においてinterleukin-6 (IL-6)の予後予測因子としての有用性が報告されており、われわれも早期口腔扁平上皮癌患者における術前血清IL-6の予後予測の有用性について報告してきた。しかしながら、そのメカニズムについては、いまだ十分な知見が得られていないのが現状である。本研究では、近年報告されてきたIL-6と血管新生また、リンパ管新生を中心とする癌進展との関連について検討を行った。2006年から2012年までに当科を受診した早期口腔扁平上皮癌患者53症例について術前血清IL-6値をELISAにて測定し、予後との比較を行った。また、手術検体を用いて抗IL-6抗体および抗CD34抗体を用いた免疫組織学的染色法にて局所評価を行った。さらにIL-6の局在を確認後、口腔扁平上皮癌患者の手術検体より正常部線維芽細胞および腫瘍部線維芽細胞を培養し、主要な血管新生因子であるVEGF-A、リンパ管新生因子であるVEGF-Cの発現を検討した。予後予測因子として術前血清IL-6低値群は,高値群に比較してDisease free survivalの延長が有意に認められた(P<0.05).また、局所における評価では、IL-6は腫瘍部に比較して腫瘍間質部に大部分の局在が認められ、術前血清IL-6と腫瘍間質のIL-6発現には強い相関が認められた(P<0.001)。さらにCD34陽性細胞数と血清IL-6値にも相関が認められた(P<0.001)。また、手術検体から培養した腫瘍部線維芽細胞は、正常部線維芽細胞に比較し、腫瘍関連線維芽細胞のマーカーであるαSMAの高発現が認められ、また、VEGF-AおよびCの高発現が認められた。口腔扁平上皮癌の進展において腫瘍関連線維芽細胞は重要な役割を担っていることが示唆され、IL-6と腫瘍関連線維芽細胞との関係は口腔扁平上皮癌の治療における新たなアプローチとしての可能性が示唆された。昨年度得られた結果を踏まえ、樹立した腫瘍部線維芽細胞および正常部線維芽細胞における検討を行った。免疫染色において、両者ともにvimentin陽性であり、αSMAは腫瘍部線維芽細胞のみ陽性であった。また、口腔扁平上皮癌細胞株と比較し、有意差をもって、IL-6の分泌能が両者ともに高く、かつ、腫瘍部線維芽細胞は有意差をもって正常部線維芽細胞よりIL-6の分泌能が高いことをELISAにて確認した。本年度はまず、血管新生因子との関連を検討した。抗ヒト化抗IL-6レセプター抗体を用いて、IL-6の阻害を行った結果、腫瘍部線維芽細胞および正常部線維芽細胞において、有意差をもってVEGFの分泌抑制が認められた。in vitroにおいて、口腔扁平上皮癌細胞株、正常部線維芽細胞、腫瘍部線維芽細胞における抗ヒト化抗IL-6レセプター抗体による増殖抑制や促進は認められなかった。また、口腔扁平上皮癌細胞株と各線維芽細胞のco-cultureにおける増殖抑制や促進も認められなかった。in vivoにおいては、抗ヒト化抗IL-6レセプター抗体および抗マウス化抗IL-6レセプター抗体による腫瘍増殖抑制効果が認められた。以上より、口腔扁平上皮癌において、IL-6は予後予測因子のバイオマーカーとなる可能性と、IL-6シグナルは治療標的となる可能性が示唆された。リンパ管新生、血管新生における重要な分子として、IL-6を同定し、そのシグナル阻害による抗腫瘍効果を確認できた。のこるリンパ節転移機構の解明に着手できる段階まで進めることができたため。昨年度得られた結果を踏まえ、新たな手術検体にて腫瘍部線維芽細胞および正常部線維芽細胞の樹立を継続した。結果、3症例でのcultureに成功した。いずれの症例においても、腫瘍部線維芽細胞においてαSMAの高発現を確認できた。また、抗IL-6抗体を用いてリンパ管新生関連マーカーであるVEGF-C等の発現解析を行ったが、両群で有意差は認められなかった。そこで、当科にて2006年から2013年の間に、口腔扁平上皮癌と診断された新鮮症例55例を対象とし、術前血清を用いたmultiplex suspension array法を用いたスクリーニングおよび生化学的検査による検討を見直した。Interleukin (IL)-2, 4, 6, 8, 10, Granulocyte macrophagecolony-stimulating factor (GM-CSF), Interferon (IFN)-γ, Tumor necrosis factor (TNF)-αを対象とし、リンパ節転移関連因子の検討を再度行った。結果、TNFαとの強い相関が認められ転写因子であるNF-κBが重要な分子となる可能性が考えられた。