hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規プロテインキナーゼ(SIK)のcAMPシグナル伝達系の抑制機構の研究

これまでに塩誘導性キナーゼ(SIK)は副腎皮質細胞において、ACTH/cAMPシグナル経路で一過性に誘導されること、誘導されたSIKはやはりACTH/cAMPによって誘導されるステロイド合成酵素の遺伝子発現を抑制することを明らかにしてきた。本年度はSIKにより抑制される遺伝子のうちステロド合成の最初のステップであるCYP11A遺伝子に着目し、そのプロモター上のSIK標的配列を同定した。SIKの標的配列はcAMP応答配列として機能するCREと呼ばれる配列で、SIKはCREに結合するCREBの転写活性化能をCREBのbZIPドメインを介して抑制することを明らかにした。さらに、SIKによるCREBの抑制にはSIKが核内に存在することが重要で、逆にSIKが核外へと移行する条件下ではSIKはCREBを抑制できないことも示唆された。SIKの核外移行にはcAMPで活性化されるPKAによるSIKのSer577のリン酸化を介することが明らかとなり、Ser577をAlalこ置換するζとで、PKAにリン酸化されない変異SIKは絶えず核内に留まり、強いCREB抑制活性を示した。これらのことは、SIKがPKAに依存して核外移行することによりcAMPシグナル系のON/OFFの切り替えがより速やかに行えることを意味し、cAMPシグナルの強弱や持続時間をより鮮明する役割があるものと考える。マウスSIKのゲノムを解析した結果、SIKのACTH/cAMPによる誘導もプロモター上のCREを介することが明らかとなり、SIKの核内外移行が自らの遺伝子発現抑制すなわち、過性の発現を実現する機構であることが示された。現在、SIKの細胞内基質や核内外移行に関与する因子の同定を試みている。また、本研究から、SIKにはよく似た別の遺伝子(SIK2)が存在することが明らかとなったため、SIK2に相当するcDNAを単離し、発現機能解析も行った。その結果、SIKおよび、SIK2はステロイド産生の調節に関与するだけではなく、細胞分化にも関与することが示唆された。今後、SIKファミリーによる生体レベルでの役割解明も試みる。下垂体からの副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)は副腎皮質細胞に作用し、cAMPを主要な2次メッセンジャーとし、ステロイドの分泌、ステロイド合成酵素の誘導、細胞増殖等を促進することが知られている。しかし、これらの反応はACTHの濃度や、刺激後の時間に依存して様々に変化する。我々の研究室では最近、ナトリウムあるいはカリウム負荷をしたラットの副腎皮質において特異的に誘導される新しいプロテインキナーゼSIK(salt inducible kinase)の単離に成功した。SIKはN-末端にSNF1/AMPKfamilyと相同性の高いkinasedomainを持つセリン・トレオニンキナーゼであることが示唆された。本研究では以下に記すSIKの重要な機能が明らかとなった。1.SIKmRNAのACTHによる誘導はcAMP/PKA系に依存し、刺激後30分から観察され、12時間で最高にする一過性の即時型の反応である。一方、SIKタンパク量は26時間の間、高いレベルに保たれ、その後徐々に減少する。2.SIKのキナーゼ活性は刺激後2時間で最高に達するが、その後はSIKタンパク量に反し、急速に減少する。この活性変動はSIKの自己リン酸化が重要でSIK特異的なタンパク脱リン酸化酵素が関与する。3.SIKmRNAのY-1細胞での持続的強制発現は、ACTH/cAMP依存的に誘導されるステロイド合成酵素の遺伝子発現を阻害する。4.SIKはステロイド合成酵素の1つであるP450sccのプロモター上で、cAMP/PKAによって活性化されるCREBの転写促進機能を阻害する。5.SIKタンパクはACTH非刺激時は核内に局在しており、ACTH刺激後、速やかに(<10分)核外へ移行する。また、24時間で核内へ戻って来る。

マウスSIKのゲノムを解析した結果、SIKのACTH/cAMPによる誘導もプロモター上のCREを介することが明らかとなり、SIKの核内外移行が自らの遺伝子発現抑制すなわち、過性の発現を実現する機構であることが示された。現在、SIKの細胞内基質や核内外移行に関与する因子の同定を試みている。また、本研究から、SIKにはよく似た別の遺伝子(SIK2)が存在することが明らかとなったため、SIK2に相当するcDNAを単離し、発現機能解析も行った。その結果、SIKおよび、SIK2はステロイド産生の調節に関与するだけではなく、細胞分化にも関与することが示唆された。今後、SIKファミリーによる生体レベルでの役割解明も試みる。
インプラント体への高分子電解質錯体の応用

本研究の目的は高分子電解質錯体を用い、新生骨の形成を促進して、インプラント体と骨組織に要する期間を短縮させることにある。実験動物は雑種成犬を用いた。キシラジン(1mg/kg)により前麻酔酸、塩酸ケタミン(10mg/kg)筋注による全身麻酔下で下顎両側P2,P3,P4を抜去した。抜歯後約3ケ月後、POI2ピース・タイプイプラントをユーザーズマニュアルに従ってインプラント裔を形成した。植立は、正中側よりFINAFIX^<(R)>(対照群、実験群)FINATlTE^<(R)>(対照群、実験群)の順に行い、更に植立できるスペースができる際は、右側にFlNAFIX^<(R)>の実験群を左側にはFINATlTE^<(R)>の実験群の植立を行った。インプラント植立後、2、3,4,8週(各3頭)に実験動物を屠殺し、下顎骨を摘出し、その後中性緩衝ホルマリンにて2週間固定を行った。固定終了した下顎骨は流水で十分洗浄し、アルコール系列にて脱水、アセトン置換後、ポリエステル樹脂にて包埋した。包埋した顎骨はバンドソーにて1つの試料を頬舌断に約180μmの非脱灰標本を1本のインプラントから5枚作製した。その標本にはHematoxylin Eosin染色を施し、現在インプラントと骨組織との結合状態を観察している。骨接触率は光学顕微鏡40倍の像をPOLASCN35で取り込み、画像解析を行い、主量的な組織学的評価を行っているところである。骨接触率はFINAFIX^<【○!R】>、FINATITE^<【○!R】>とも経日的に増加していたが、実験群は対照群と比較して2週例では有意に増加していた。本研究の目的は高分子電解質錯体(PEC)をインプラント体に応用してインプラント体へコーティングして骨結合の促進を図ることにある。まず生物学的特性の検索として、6種類のポリカチオンと15種類のポリアニオンの組合せ90種類のPECを生成し、それらを骨芽細胞MC3T3-EIを用いて細胞増殖性試験、細胞付着試験、ALP活性試験を行った。その結果3試験のいずれにおいても対照群の非コーティングディッシュと比較して同等かそれに近い値を示したPECは18種類であった。18種類のPECとチタンおよびハイドロキシアパタイト(HA)とのコーティング可能なものを検索した結果、最も良好な組合せはポリカチオンにS-110、ポリアニオンにS-chitin140の組合せでそれぞれ2×10^<-2>unitmol/l(イオン基濃度)、pH7.27.5で調整したものであった。インプラントにコーティングした表面構造をSEM像で観察したところ、チタンインプラント表面は線状の溝や隆起が縦横に走行する不均一な凹凸面にPEC膜が張り付き、地図状の膜様構造物として認められた。HAコーティングインプラント表面は類球形あるいは多角形の隆起状構造を呈した面全体にPECの膜様構造物が被覆していた。インプラント生体内植立実験は雑種成犬を用いて、PEC-コーティングチタンインプラントとPECコーティングHAインプラントとを植立したところである。
咀嚼筋における血流動態を含めた非侵襲型機能特性評価法の開発と応用

実験的咀嚼筋運動中における筋内血液反応を非侵襲に測定し理解することを目的とした.健常者により以下の4つの規定化された咀嚼筋運動を発揮した:(1)最大咬合,(2)はぎしり運動,(3)咀嚼運動,(4) 3日間に渡る低程度で長時間のくいしばり.これら研究結果より,実験的はぎしりやくいしばりには咬筋筋痛を発生(持続)させる状況がおきないことがわかった.しかしガムチューイングのようなリズミカルで動的な咀嚼筋の収縮は筋内の酸素欠乏へ導く可能性があることがわかった.結論として,はぎしりやくいしばりに特徴づけられたブラキシズム活動単独では咀嚼筋の筋・筋膜疼痛様の筋痛は発生しない,ことが示唆された.本研究は、「力と持続時間を規定した咬合力」を発揮している前・中・後の咀嚼筋、特に今回はヒト咬筋内の血流・血液組成動態を把握し、咀嚼筋疲労のメカニズムを理解する手がかりを得ることを目的とした。本事業を完了するためには、1.咬合力計とその咬合力値を被験者本人にフィードバックする装置の開発、2.咬合力、咀嚼筋内血流量、咀嚼筋内血液組成変動、咀嚼筋活動量、自律神経反応度を同時に計測できる装置の開発、が必要である。平成23年3月11日に発生した東北地方の災害により、内定額通りに補助金が交付されない可能性が出たために申請備品の購入を控え、可及的に自作による測定装置の作製、既存品、部局外の共同研究施設の既存品の借用で対応する事にした。1.は平成23年度に完成した。2.は研究代表者、連携研究者(デンマーク、オーフス大学)、研究協力者(スウェーデン、カロリンスカ研究所)、それぞれが所有している測定装置をデンマーク、オーフス大学に持ち寄って測定を行う事が決まり、平成24年度中にセットアップが完了した。具体的には、咬合力計とバイオフィードバック機能(自作のソフトウエア)を有したコンピュータ、咬筋筋内の血流と血液組成動態をそれぞれ測定する装置、筋電計、精神的ストレス度を計測するための自律神経変動測定装置、である。現在予備実験を開始している。平成25年度前半に本実験・測定が完了する予定である。咀嚼筋は特殊な筋肉の集合体で,咀嚼中を含めて一日に何千回,何万回と収縮・弛緩を繰り返すが,一過性の疲労はあるとしても慢性疲労を起こさないという理解が一般的である.一方筋・筋膜疼痛に特徴づけられる咀嚼筋の低等度のぼんやりとした慢性の咀嚼筋痛は,睡眠中や歯ぎしりや昼間のくいしばりのような咀嚼筋の過緊張やオーバーロードが原因であるとも言われ,不思議な二面性がある.これらより咀嚼筋,特に閉口筋の機能特性を知ることは歯科臨床上重要である.そこで本研究はまず,咬筋機能運動時の筋内血液動態を非侵襲で測定できる方法を確立し,バイオフィードバックを用いた規格運動中の筋内血液動態の変化を調査することを主目的とした.そして四肢筋とは全く異なる機能特性を見いだすこと,ひいては咀嚼筋固有の筋(能)力試験開発への手がかりを見いだすことを目的とした.平成23年度に研究プロトコル作成を終了し,研究セットアップを開始した.予算の関係で申請書通りの測定装置購入が出来なかったため,咬合力計は自作で対応し,他は当教室既存品を変更したものや,他研究施設のものを借用したりした.研究協力者と他施設共同研究者らの協力もあり,平成24年度に研究セットアップを完了することができた.その後予備実験へ入った.同年度中に本研究測定を開始することができた.この時測定した「規定運動」は1長時間のくいしばり,2短時間のくいしばり,3はぎしり,4ガム咀嚼,中の咀嚼筋活動状態と咬筋内血液組成の変化である.平成25年度前半に本実験を完了し,分析開始,完了まで行った.研究成果について研究協力者とディスカッション,文献検索,論文を執筆,現在は投稿直前のファイナライジング中である.平成25年前期には投稿する.実験的咀嚼筋運動中における筋内血液反応を非侵襲に測定し理解することを目的とした.健常者により以下の4つの規定化された咀嚼筋運動を発揮した:(1)最大咬合,(2)はぎしり運動,(3)咀嚼運動,(4) 3日間に渡る低程度で長時間のくいしばり.これら研究結果より,実験的はぎしりやくいしばりには咬筋筋痛を発生(持続)させる状況がおきないことがわかった.しかしガムチューイングのようなリズミカルで動的な咀嚼筋の収縮は筋内の酸素欠乏へ導く可能性があることがわかった.結論として,はぎしりやくいしばりに特徴づけられたブラキシズム活動単独では咀嚼筋の筋・筋膜疼痛様の筋痛は発生しない,ことが示唆された.

本研究は、「力と持続時間を規定した咬合力」を発揮している前・中・後の咀嚼筋、特に今回はヒト咬筋内の血流・血液組成動態を把握し、咀嚼筋疲労のメカニズムを理解する手がかりを得ることを目的とした。本事業を完了するためには、1.咬合力計とその咬合力値を被験者本人にフィードバックする装置の開発、2.咬合力、咀嚼筋内血流量、咀嚼筋内血液組成変動、咀嚼筋活動量、自律神経反応度を同時に計測できる装置の開発、が必要である。平成23年3月11日に発生した東北地方の災害により、内定額通りに補助金が交付されない可能性が出てきた。そのため申請備品の購入を控え、自作による測定装置の作製、研究代表者所有の既存品、部局外の共同研究施設の既製品の借用、により本事業を完了することにした。1.の咬合力計とそのフィードバックについては、平成24年5月中に研究連携者の在籍するデンマーク、オーフス大学を訪問し、測定装置とプログラムを自作で完成させた。咬合力計は片持ち梁二本を基本構造に用い、A/D(analogue/digital)コンバータを介してUSBコネクタよりコンピュータに入力、自作のソフトウエア上で咬合力を常時確認できるようにした。実験プロトコルについては平成23年11月下旬にデンマークとスウェーデンより、本研究内容に精通している研究者を1名ずつ招聘し、完成した。2.については、研究代表者、連携研究者(デンマーク、オーフス大学)、研究協力者(スウェーデン、カロリンスカ研究所)それぞれが保有している測定装置をデンマーク、オーフス大学に持ち寄って測定を行うことが決まった。測定セットアップは平成24年度中に完了し、予備実験、本実験へ入る。実験セットアップが完了し、予備実験を開始できる状態になった。本年度中にはプロジェクトを完了できるペースであるため。予算の関係で装置購入が進まなくなりそうだったが、装置の借用で対応できた。連携研究者とも密に連絡がとれており、しかも彼らは世界的リーダーシップを発揮されている方々であるので有用なご意見をいただくことができ、研究の質も高いものになった。研究期間も3年で、十分余裕がある。進行度も研究申請時の予定と全く同じで、順調である。平成25年6月には本実験に入る事が可能であると予想する。本実験自体は3ー4ヶ月であるため、平成25年度前半には測定完了できるであろう。平成24年度中に、測定セットアップ完了、予備実験を済ませ、本測定に入る。前述のとおり全く問題点は見られず、順調に進むであろう。また、時間に余裕があれば論文のIntroductionやMaterials and Methodsセクションの執筆を開始する。研究計画の変更はなし。平成24年度は経費の節約などにより126,380円の未使用が生じたが平成25年度中に十分消費されるであろう。具体的には消耗品が主となるであろう。他は国内外の学会発表や論文投稿など研究成果報告準備と発表のための旅費が必要である。上記と分析に用いるためにパーソナルコンピュータが必要であるかもしれない。平成23年度は、経費の節約等により18,015円の未使用が生じたが、次年度で測定セットアップ完了のため、研究結果予想のための情報収集や部品等の購入だけで予算はすべて消費されるだろう。また、研究発表をpreliminary reportとして発表できるかもしれないのでその場合は印刷費に用いる。
非線形常微分方程式の漸近解析とその応用

1.半線形2階楕円型偏微分方程式系の振動理論:エムデン=ファウラー型2階楕円型偏微分方程式系を外部領域で考察し解が全て振動的であるための有効な十分条件を確立した。2.準線形2階楕円型偏微分方程式に対する振動理論:この種のテーマは従来は非線形項にある種の単調性や増大度という仮定をおいて考察されていた。本研究では、そのような仮定を置かずに効果的な振動定理を見出すことが出来た。手法は比較定理と常微分方程式に対する漸近解析である。3.非線形楕円型方程式の固有値問題の漸近解析:単振り子の方程式やロジスティック方程式に関連する1次元固有値問題の固有関数、固有値のパラメータに関する漸近公式を与えた。4.高階準線形常微分方程式の漸近解析:特に一般化された4階エムデン=ファウラー型常微分方程式を半無限区間で考察し、解の増大度評価や振動性の特徴付けを与えた。また、零点の分布状況を調べた。5.2階準線形常微分方程式の漸近解析:係数関数が独立変数の累乗のような形をもつ準線型方程式の全ての正値解の時刻無限大における挙動を明らかにした。6.半線形熱方程式の漸近解析:自己相似解の形状函数が満たす楕円型方程式を変分法とshooting methodを用いて解析し、ある種の半線形熱方程式の特異初期値問題の解の多重性を確立した。1.2階準線形常微分方程式の解の漸近挙動について:(1)正値解をその漸近挙動に依り数クラスに分類し、各クラスが空集合でないための必要条件、十分条件、必要十分条件を与えた。(2)特に非線型項が劣同次性を有する場合には全ての正値解のより精密な漸近形を見い出した。また、減衰する正値解の一意性を示した。(3)非線型項が同次性を有するとき(2階線型方程式の一般化)にいわゆる固有値問題を考察した。方程式を考察する区間の有界性に関係なく基礎的な2階線型方程式の固有値問題とのアナロジーが完全に成り立つことを証明した。(4)半線形方程式の変分固有値問題を考察した。固有関数のノルムと固有値との漸近的な関係式を導出した。2.高階常微分方程式の解の漸近挙動について:(1)3階Emden-Fowler型方程式の正値解の漸近形を精密に調べた。(2)4階準線型方程式、及びその一般化である連立系を考察し、解か全て振動的となるための条件を確立した。3.2階楕円型偏微分方程式の解の漸近的性質について:(1)半線形楕円型連立系に対する非負値非自明解の非存在定理やリューヴィユ型定理を見い出した。(2)走化性を記述しているある種の放物型偏微分方程式系の自己相似解(それはある2階楕円型方程式の解として実現される)について考察を行った。自己相似解は球対称なものに限られることが分かった。また、自己相似解の存在が方程式に含まれるパラメータに依存するということが分かり、その敷居値を具体的に求められる場合を発見した。1.準線型2階常微分方程式の漸近解析:一般化されたエムデン=ファウラー型常微分方程式の正値解の漸近形を具体的に表わす公式を導いた。特に従来よく分かっていなかった中間的な増大度を持つ正値解の漸近形が解明できた。この結果は半線型方程式の場合ですら知られていなかった。2.準線形高階常微分方程式の漸近解析:一般化されたエムデン=ファウラー型常微分方程式(系)を半無限区間で考察し振動定理と正値解の存在定理を確立した。3.準線型2階楕円型偏微分方程式に対する振動理論:この種のテーマは従来は非線型項にある種の単調性や増大度という仮定をおいて考察されていた。

本研究では、そのような仮定を置かずに効果的な振動定理を見出すことが出来た。手法は比較定理と常微分方程式に対する漸近解析である。4.非線型楕円型方程式の固有値問題の漸近解析:単振り子の方程式やロジスティック方程式に関連する1次元固有値問題の固有関数、固有値のパラメータに関する漸近公式を与えた。5.非線型常微分方程式の2点境界値問題の解の存在性:2階エムデン=ファウラー型常微分方程式に対する境界値問題を考察し、与えられた個数の零点を持つような解の存在定理を導出した。また、非線型項が特異性を持ち、主要項が退化性を持つような場合の正値解の存在性を特徴付けた。6.半線型熱方程式の漸近解析:自己相似解の形状函数が満たす楕円型方程式を変分法を用いて解析し、ある種の半線型熱方程式の特異初期値問題の解の多重性を確立した。1.半線形2階楕円型偏微分方程式系の振動理論:エムデン=ファウラー型2階楕円型偏微分方程式系を外部領域で考察し解が全て振動的であるための有効な十分条件を確立した。2.準線形2階楕円型偏微分方程式に対する振動理論:この種のテーマは従来は非線形項にある種の単調性や増大度という仮定をおいて考察されていた。3.非線形楕円型方程式の固有値問題の漸近解析:単振り子の方程式やロジスティック方程式に関連する1次元固有値問題の固有関数、固有値のパラメータに関する漸近公式を与えた。4.高階準線形常微分方程式の解の漸近的性質の解明:特に一般化された4階エムデン=ファウラー型常微分方程式を半無限区間で考察し、解の増大度評価や振動性の特徴付けを与えた。5.半線形熱方程式の漸近解析:自己相似解の形状函数が満たす楕円型方程式を変分法とshooting methodを用いて解析し、ある種の半線形熱方程式の特異初期値問題の解の多重性を確立した。6.多重調和関数の解析:正則関数に対するリューヴィユ型定理やBocher型定理を多重調和関数の場合に拡張した。
子宮筋腫におけるＸ染色体のエピジェネティクス変異機構の解析

子宮筋腫ではX染色体全体におけるDNA低メチル化変異が生じている。本研究では,筋腫の発生に筋腫特異的低メチル化変異遺伝子の発現異常あるいは,X染色体不活性化(XCI)に関わる遺伝子の機能異常が関与し得るかを検証した。その結果,X染色体に局在する筋腫特異的低メチル化変異遺伝子を2つ同定したが,これらの遺伝子では発現異常が生じていなかった。XCI関連遺伝子の発現解析により,XISTとSATB1発現の変化は同様の傾向を示し,約半数の筋腫で共通して発現低下することが明らかになった。従って,筋腫検体の一部では,X染色体の低メチル化変異にXIST-SATB1経路の異常が関与する可能性が示唆される。本課題では,筋腫の発生・進展の機序にX染色体不活性化(XCI)の破綻によるX染色体上の遺伝子の発現異常,あるいはXCIに関わる因子の機能異常が関与する可能性を考え,筋腫で共通して低メチル化変異を呈する遺伝子の検索,およびXCIの異常に関わる因子の特定の2点について検証する。平成24年度は筋腫で低メチル化変異を呈するX染色体上の2つの遺伝子を特定した。しかしながら,筋腫でこれらの遺伝子は必ずしも高発現しておらず,これらの領域のDNAメチル化は遺伝子発現に関与しないことが判明した。したがって,X染色体上の低メチル化変異遺伝子の発現異常が,筋腫の発生・進展に関与するという仮説は成立しなかった。平成25年度はXCIの異常に関わる因子の候補を絞り込むため,筋腫におけるXCI関連因子の機能および発現について解析した。まず,XCIに関与するポリコームグループ(PcG)の機能をPcGにより同様な制御を受ける刷込み遺伝子のメチル化状態を指標に評価したところ,刷込み遺伝子に低メチル化変異はほとんど生じておらず,PcGは正常に機能していることが示唆された。また,筋腫におけるPcG関連遺伝子群の発現は正常筋層と比較して変化がみられなかった。従って,X染色体の低メチル化変異はPcGの発現および機能異常に起因したものではないと考えられた。次に,XISTなど既知のXCI関連遺伝子(HNRNPU,SMCHD1,SATB1,SATB2)について,多数症例で発現解析を行った。その結果,これらのなかでSATB2のみが解析した全ての筋腫検体において高発現していることが明らかになり,この遺伝子をXCIの異常に関わる因子の候補遺伝子として特定した。今後はこの遺伝子が子宮筋腫の発生・進展および筋腫におけるX染色体の低メチル化変異に関与するかを異種移植の系を用いた機能解析により検証する。筋腫の発生・進展の機序に,X染色体不活性化の破綻によるX染色体上の遺伝子の発現異常,あるいはX染色体不活性化に関わる因子の機能異常が関与する可能性を考え,筋腫で共通して低メチル化変異を呈する遺伝子の検索,およびX染色体不活性化の異常に関わる因子の特定の2点について検証する。平成24年度は前者の検証を行った。1.筋腫で低メチル化変異を呈するX染色体上の遺伝子候補の選出:3検体の同一症例から採取した子宮筋腫組織と正常子宮筋のゲノムワイドDNAメチル化解析データを利用し,筋腫でメチル化率が30%以上低い遺伝子を抽出することで,3検体で共通して低メチル化状態にある11遺伝子を候補として選出した。2.筋腫特異的低メチル化候補遺伝子の多症例におけるメチル化解析:1.で選出した遺伝子のメチル化状態を多症例で解析し、筋腫で共通して低メチル化変異を呈する遺伝子を特定する。多検体におけるメチル化解析を簡便に出来るCOBRA法を用いて,選出した11遺伝子について22症例の筋腫と筋層のメチル化状態を比較した。その結果,それぞれ約75%および60%の筋腫検体で低メチル化変異を呈する2つの遺伝子領域を特定した。3.筋腫特異的低メチル化候補遺伝子の発現解析:メチル化状態と発現の相関をみるため,2.で同定した筋腫特異的低メチル化遺伝子のmRNAの発現をRT-PCRで解析した。その結果,低メチル化状態にある筋腫でこれらの遺伝子は必ずしも高発現しておらず,これらの領域のDNAメチル化は遺伝子発現に関与しないことが示唆された。以上の結果は,X染色体上の低メチル化変異遺伝子の発現異常が,筋腫の発生・進展の機序に関与するという仮説が成立しないことを示唆している。一方,目的の一つであった筋腫のバイオマーカーの同定については,75%および60%の症例で共通する2つの低メチル化変異遺伝子を得ることが出来た。

本課題では,筋腫の発生機序にX染色体不活性化(XCI)の破綻によるX染色体上の低メチル化変異遺伝子の発現異常,あるいはXCI関連遺伝子の機能異常が関与するとの仮説の基に,筋腫で共通して低メチル化変異を呈する遺伝子およびXCI異常に関わる因子について検証してきた。平成24年度には,筋腫で低メチル化変異するX染色体上の遺伝子を2つ特定したが,これらの遺伝子は筋腫で高発現しておらず,DNAメチル化がこれらの発現制御に関与しないことが判明した。従って,筋腫の発生がX染色体上の低メチル化変異遺伝子の発現異常に起因するとの仮説は否定された。平成25年度には,筋腫におけるXCI異常に関わる候補遺伝子を特定した。まず,XCIに関与するポリコームグループ(PcG)の機能を同様にPcGにより制御される刷込み遺伝子を指標に評価したところ,刷込み遺伝子では低メチル化変異は生じておらず,PcGの機能に異常がないことが示唆された。次に,既知のXCI関連遺伝子について,多数症例で発現解析を行った。その結果,解析した全筋腫検体で共通して高発現したSATB2をXCI異常に関わる遺伝子候補として特定した。平成26年度には,特定した候補遺伝子SATB2の機能解析とその評価のために筋腫特異的バイオマーカーの同定を行った。SATB2の機能解析は異種移植の系で検証した。まず,ヒト子宮平滑筋細胞にSATB2を過剰発現した細胞株を作製し,次に作製した細胞株を免疫不全マウスの腎被膜下に移植するというin vivo子宮筋腫形成モデルを構築した。機能解析の評価には正常平滑筋と筋腫を区別するバイオマーカーが必要だが,現在,有用なマーカーは存在しない。そこで,DNAメチル化を指標に独自の評価系を構築した。10個の遺伝子のメチル化状態を指標として,正常平滑筋と筋腫を明瞭に区別できる遺伝子セットを検索しパネル化した。分子生物学平成24年度に目的とした筋腫で共通して低メチル化変異を呈するX染色体上の遺伝子の特定については,2つの遺伝子を得ることが出来た。これらの遺伝子のメチル化状態が発現制御に関与していなかったことは予想外だったが,これらの領域のメチル化状態は現存するもっとも有効な筋腫のバイオマーカーであるMED12遺伝子の突然変異と同程度の精度で,筋腫と筋層を区別するマーカーとして利用できる。平成25年度はXCIの異常に関わる候補遺伝子の絞り込みを目的として,筋腫におけるXCI関連因子の機能および発現について解析した。その結果,解析した全筋腫検体に共通して高発現したSATB2遺伝子をXCIの異常に関わる因子の候補遺伝子として特定できた。今後はこの遺伝子が子宮筋腫の発生・進展および筋腫におけるX染色体の低メチル化変異に関与するかを機能解析により検証していく。平成24年度に目的とした筋腫で共通して低メチル化変異を呈するX染色体上の遺伝子の特定については,75%および60%の筋腫検体で共通して低メチル化変異を呈する2つの遺伝子を得ることが出来たので,ある程度目的は達せられたと評価している。これらの領域のメチル化状態は筋腫の診断
カイコの変態に関与する遺伝子のカタログ化

本研究の目的は、カイコを用いて、変態や脱皮時の組織からcDNAライブラリーを作製し、そのシーケンスを決めることによって変態や脱皮に関与する遺伝子群を網羅し、かつ、それら遺伝子の発現様式を調べることにより、変態や脱皮に伴う成虫組織の形成機構、器官再生機構を分子生物学的に解明することである。平成10年度では、変態に伴う遺伝子発現パターンの変化を調べ、変態に関わる遺伝子を網羅するために、変態前後の4つのステージ(V-4,SO,S2,S3)の翅原基のcDNAライブラリーを比較した。S2期でエクジソン値が最大となり、蛹化が始まる。5令4日目(V-4)とSO期では翅形成の遺伝子発現はみられず、それ以外の様々な遺伝子が発現している.その中で、5種類のDNA修復遺伝子や幾つかのクロマチン構造形成に関わる遺伝子が見い出された。これらは変態開始直前の時期に特異的に発現しており、組織分化に伴うクロマチン構造の変化を示唆する。エクジソン値が最大のS2期ではUrbainやACE(angiotennsin convertingenzyme)の発現が特異的にみられる。その後、変態が進行するに従い、Tubulin,Keratin,Cuticle,Mucinなどの翅形成に必須の構造遺伝子の発現が極めて活発になる。UrbainやACEの発現と構造タンパク質遺伝子の発現が1日ずれていることは、変態ホルモンによる遺伝子活性化のカスケードを示唆するものである.また、翅原基の変態を通してユビキチンやユビキチン経路に関わる遺伝子のほとんどが発現しており、ユビキチン経路が変態過程に重要な役割を担っていることをあきらかにした。
色素幹細胞をモデルとした幹細胞維持機構の解明

1.色素細胞にGFPを発現させたトランスジェニックマウスを作成し、FACSにより色素幹細胞を含む様々な分化段階にある色素細胞を単離した。これらからcDNAライブラリーを作製し、マイクロアレー解析により、幹細胞に強く発現する遺伝子を約200種類を同定した。これらの中には、NotchシグナルおよびTGF/BMPシグナルの活性化に関わる分子や、Wntシグナル系を抑制する分子が同定された。この結果より、これらのシグナル系が色素幹細胞維持に関わっていることが示唆された。2.色素前駆細胞に対するNotchシグナル系の役割を明らかにする目的で、胎児表皮器官培養系にγ-secretase阻害物質を添加しNotchシグナル系を抑制したところ、表皮中の色素前駆細胞がアポトーシスにより完全に消失することを認めた。次に、下流分子であるHes1の機能を調べた。Dominantnegative体のHes1を培養色素前駆細胞に発現させたところ、同様にアポトーシスが誘導された。また、色素細胞にHes1を発現するトランスジェニックマウスを作成し、γ-secretase阻害物質で処理したところ、色素前駆細胞のアポトーシスが認められなかった。このことから、Hes1がNotchシグナル系の下流に存在し、色素前駆細胞のアポトーシスを抑制していることが示された。また、Dominant negative体のHes1を色素細胞に発現するトランスジェニックマウスを作成したことろ、毛周期が進むにつれ毛色が白色化することが認められた。免疫組織染色からこのマウスでは色素幹細胞が消失していることが示された。以上のことからNotchおよびHes1は幹細胞の維持に対して重要な働きを担っていることが示された。1.色素幹細胞およびそのニッチを構成する細胞に特異的に発現する遺伝子の単離色素細胞特異的にGFPを発現させたトランスジェニックマウスを作成し、色素幹細胞、分化した色素細胞、および、色素幹細胞の周囲に存在するニッチ様細胞を単離した。それぞれの単一の細胞からcDNAライブラリーを作成し、サブトラクションクローニング法により、色素幹細胞に強く発現する遺伝子またはニッチ様細胞に強く発現する遺伝子をそれぞれ濃縮した。これら濃縮したクローン約7000クローンをピックアップし、純化したDNAをナイロン膜に固定化し、マクロアレーを作成した。このマクロアレーを用いて、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法により、幹細胞またはニッチ様細胞に特異的に発現するクローンを選別した。こうして選別したクローン全てについてシークエンス解析を行い、最終的に、約100種類の幹細胞特異的遺伝子と約150種類のニッチ様細胞特異的遺伝子を単離することに成功した。これらの内、幹細胞特異的遺伝子30種類については、RT-PCR法により、実際に遺伝子発現量に差があることを確認している。これらの中には、転写因子、レセプター、増殖因子など、幾つかの興味深い遺伝子が含まれており、現在、これらの遺伝子の幹細胞維持に関わる機能を調べている。2.色素幹細胞培養系の構築1.で単離した遺伝子の機能を調べるために、色素幹細胞培養系を用いた簡便なアッセイ系を構築した。色素細胞特異的にGFPを発現させたトランスジェニックマウスから色素幹細胞を単離し、さまざまな培養条件を検討してところ、FGF, SCF存在下で無血清培養したときに、未分化性を保ちながら色素幹細胞を培養できることが判明した。今後、この培養系を用いて、レンチウイルスによる遺伝子を強制発現系を構築する。
コホンウナギにおける初期卵成長機構の解明

これまでの研究により、淡水中で養成した雌化ニホンウナギの卵巣は秋から冬にかけて発達した後、春にかけて退行すること、また、卵巣の変化に伴って生殖腺刺激ホルモン(GTH)の発現、11-ケトテストステロンの血中量が変化することが解かっている。雌化養成ウナギの人為催熟を様々な季節に行った結果、成熟誘起率と孵化率は養成2年目の9月から12月に高く、翌年の4月には低下することが明らかになった。雌化養成ウナギの卵巣の季節変化を詳細に調べた結果、卵黄球の蓄積は養成2年目の9月に開始し、翌年の1月にかけて卵黄形成が進行した。その後、1月から3月にかけて先頭卵群の卵母細胞が退行する結果、4月には卵巣内に卵黄形成期の卵母細胞が占める割合が減少した。さらに、養成3年目の6月には新たに産生、成長したとみられる染色仁期から油球期初期の卵母細胞が多く出現し、卵巣内に次群卵母細胞が占める割合が増加した個体がみられた。また、卵巣の濾胞刺激ホルモン受容体のmRNA量は養成2年目の11月に最も高く、その後、翌年の1月以降に減少することが解かった。これら卵巣内の卵母細胞ステージの組成やGTH受容体の発現の季節変化が外因性の生殖腺刺激ホルモンに対する雌化養成ウナギの卵巣の反応性に影響し、成熟誘起率と卵質が変動する原因になっていることが示唆された。また、養成1年目に雌化を目的として行っているエストラジオール-17β(E_2)投与の期間が異なる群を設けた結果、卵巣ステージに差がみられる傾向があったことから、稚魚期のE_2投与が雌化養成ウナギの初期卵成長および人為催熟開始時の卵巣ステージに影響する可能性が示唆された。本研究の成果は、ニホンウナギの最適な親魚養成法の開発に貢献し、人工種苗生産技術の改善に役立つことが期待される。ニホンウナギ(Anguilla japonica)の人為催熟法を改善するためには、人為催熟に用いる雌化養成ウナギの卵巣と生殖関連ホルモンの周年変化を解析し、前卵黄形成期の卵成長機構を明らかにすることが有効である。ウナギの前卵黄形成期の卵成長には、これまで知られていた11-ケトテストステロン(11KT)以外にも、脳下垂体から放出される成長ホルモン(GH)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、黄体刺激ホルモン(LH)などが関与していると考えられるが、その詳細は分かっていない。本研究は、雌化養成ウナギの卵巣の周年変化とそれに伴い発現が変化する内分泌因子を解析することで、前卵黄形成期の卵成長機構を明らかにし、雌化養成ウナギの生殖生理学的特性を解明することを目的とした。卵巣と生殖関連ホルモンの周年変化を解析した結果、卵径は養成2年目の2月から9月にかけて緩やかに増加した後、翌年の2月にかけて急激に増加し、その後減少した。脳下垂体のGHmRNA量は養成2年目の4月から翌年の2月にかけて体成長あるいは卵巣の発達に伴って減少した。FSHβmRNA量は養成2年目の春から秋には卵径の増加に伴った明確な変化は認められなかったが、翌年の2月に減少した。LHβmRNA量は養成2年目の9月から11月に上昇したが、翌年の2月に減少した。血中11KT量は養成2年目の9月にかけては比較的低値を示した後、11月から翌年の2月に上昇し、その後、減少した。これらの結果から、雌化養成ウナギの卵巣は秋から冬に最も発達し、それに伴って脳下垂体のLHβmRNA量と血中11-KT量の上昇が起こることが明らかになった。本研究の成果は、ニホンウナギの最適な親魚養成技術の開発に貢献し、人為催熟法の改善に役立つことが期待される。これまでの研究により、淡水で養成した雌化ウナギの卵巣が秋季から冬季にかけて急激に発達し、それに伴い生殖関連ホルモンの発現が変動することや、卵巣の発達度が飼育水の塩分の影響を受けることが解かっている。前年度に引き続き雌化養成ウナギの卵巣と生殖関連ホルモンの解析を行った結果、前卵黄形成期から卵黄形成初期にかけては脳下垂体の濾胞刺激ホルモン(FSH)は高い発現を維持した一方、成長ホルモン(GH)発現の減少と黄体形成ホルモン(LH)発現および血中11-ケトテストステロン(11KT)量の増加が起こることが解かった。また、養成2年目の2月にFSHβサブユニット(FSHβ)、LHβサブユニット(LHβ)mRNA量の減少とともに卵母細胞の退行が起こったことから、FSH、LH発現の減少が卵巣の退行の一因であることが示唆された。冬季から春季にかけての卵母細胞の退行を防ぐ技術を開発するため、養成2年目の雌化養成ウナギを11月から翌年の3月にかけて海水で蓄養した結果、淡水で蓄養する場合に比べて脳下垂体のLHβmRNA量と血中11KT量が高値を示し、卵母細胞の退行をある程度防ぐことが可能であることが解かった。また、前述の卵巣と生殖関連ホルモンの周年性を考慮し、ウナギを長日条件で飼育し続けることにより秋季から冬季にかけての卵成長とその後の退行を抑制することが可能であるかどうかを検討した結果、雌化ウナギを養成2年目の9月から翌年の1月にかけて長日条件で飼育することで、一部の個体で卵黄形成の抑制が認められた。本研究の成果はニホンウナギの最適な親魚養成技術の開発に貢献し、人為催熟法の改善に役立つことが期待される。

これまでの研究により、淡水中で養成した雌化ニホンウナギの卵巣は秋から冬にかけて発達した後、春にかけて退行すること、また、卵巣の変化に伴って生殖腺刺激ホルモン(GTH)の発現、11-ケトテストステロンの血中量が変化することが解かっている。雌化養成ウナギの人為催熟を様々な季節に行った結果、成熟誘起率と孵化率は養成2年目の9月から12月に高く、翌年の4月には低下することが明らかになった。雌化養成ウナギの卵巣の季節変化を詳細に調べた結果、卵黄球の蓄積は養成2年目の9月に開始し、翌年の1月にかけて卵黄形成が進行した。その後、1月から3月にかけて先頭卵群の卵母細胞が退行する結果、4月には卵巣内に卵黄形成期の卵母細胞が占める割合が減少した。さらに、養成3年目の6月には新たに産生、成長したとみられる染色仁期から油球期初期の卵母細胞が多く出現し、卵巣内に次群卵母細胞が占める割合が増加した個体がみられた。また、卵巣の濾胞刺激ホルモン受容体のmRNA量は養成2年目の11月に最も高く、その後、翌年の1月以降に減少することが解かった。これら卵巣内の卵母細胞ステージの組成やGTH受容体の発現の季節変化が外因性の生殖腺刺激ホルモンに対する雌化養成ウナギの卵巣の反応性に影響し、成熟誘起率と卵質が変動する原因になっていることが示唆された。また、養成1年目に雌化を目的として行っているエストラジオール-17β(E_2)投与の期間が異なる群を設けた結果、卵巣ステージに差がみられる傾向があったことから、稚魚期のE_2投与が雌化養成ウナギの初期卵成長および人為催熟開始時の卵巣ステージに影響する可能性が示唆された。本研究の成果は、ニホンウナギの最適な親魚養成法の開発に貢献し、人工種苗生産技術の改善に役立つことが期待される。
医療におけるラショニングと差別に関する倫理学研究

2月に単著(『死ぬ権利はあるか:安楽死、尊厳死、自殺幇助の是非と命の価値』、春風社、2019年)を出版した。とくに第三章では、本研究課題の中心的な問題である、高額延命医療の利用の年齢制限の是非の問題を扱った。例えば70才や75才といった年齢を基準に、それより高齢の患者には延命に必要でも一部の高額医療の利用を許容しないとする政策の是非を論じた。一方では、こうした政策は、高齢者差別であると非難されることが多い。しかし、他方、差別には当たらないとする擁護論もある。本書では、とくにノーマン・ダニエルズによる擁護論に注目し、検討を加えた。ダニエルズの論において、特定の社会状況(世代間の人口の増減や経済環境の変化が無視できるほど小さい)や、望ましい人生観が前提されていることを指摘するとともに、こうした前提が、現実の日本の社会状況や、他のありうる人生観の可能性と突き合わせ・比較をした際に、必ずしも妥当とは見なせないことを明らかにして述べた。また、第一章では、病人の生命維持医療の差し控えの是非に関する判断のレベルとして、臨床レベルにおける判断と、政策レベルにおける判断の二者があること、またこれらが互いにどのように関係しているかの点について確認、検討を行った。また、日本医学哲学倫理学会の公開講座で、「機能障害者の生活満足度調査の結果から分かること」と題し、研究発表を行った。まひ、視覚・聴覚障害、透析を必要とする慢性腎疾患、ダウン症などの機能障害を持つ人々のQOLに関する調査結果の意義について検討した。この他、自殺幇助の是非に関する過去の論文(「自殺幇助は人格の尊厳への冒涜か」、『倫理学年報』、2015年、日本倫理学会の学会賞を受賞)を英語に訳した。日本倫理学会の欧文誌に掲載の予定である。また日本末梢神経学会誌『Peripheral Nerve』のため研究倫理に関する論文を執筆した。本年度は、これまで終末期医療の倫理に関するこれまでの研究の成果をまとめるかたちで単著(『死ぬ権利はあるか:安楽死、尊厳死、自殺幇助の是非と命の価値』、春風社、2019年)を出版することができた。また、学会の総会と公開講座で教育講演、研究発表を行った。加えて、論文を2本まとめ、いずれも次年度に学会誌に掲載される予定である。そこで、研究は概ね順調に進展しているといってよいように思われる。来年度以降は、高額医療利用の年齢制限等の分配理論に関し、ダニエルズの議論以外の議論についても、整理する。順次、批判的な検討を加えていく予定である。次年度の書籍等の購入に充てる計画である。
多種多様な通信プロトコルを活用する情報配信・収集システムに関する研究

本研究では、災害時の安否確認といった重要なメッセージ交換を想定し、システムの一部が停止していても簡単には停止しない情報伝達サービスの実現を目指し、(1) NNTPに基づくネットニュースシステムを活用した私信配送基盤システム、(2)複数のインターネット上のサービスを併用しいずれかのサービスが停止していることを気にすることなくメッセージのやりとりができるシステム、(3)大学などの組織向け接続ネットワークシステムを安全に開放するための無線LANや接続端末の識別システム、に関する成果を得た。本研究の目的は,阪神淡路大震災や東日本大震災のような大規模災害時を想定し,ある組織の構成員の状況を集めることを念頭においた情報の収集活動の実施ができる環境を構築することである.本年度は、まず,私信配送基盤システムとして,NNTP (Network News Transfer Protocol, RFC3977)に基づくネットニュースシステムを活用する方式について、記事の暗号化の為の鍵交換の仕組みを公開鍵暗号システムを元にした実装を行った。その上で実験環境を構築した結果を成果投稿したが、不足点が指摘され採録には至らなかった。また、複数の通信手段を併用して頑強性を向上させるシステムに関しては、事前の研究成果を整理し、汎用化を試みた設計結果を発表した。「災害時の利用を想定した複数の通信手段を併用するメッセージングシステムの提案」(2014/12)、「電子メールUIを有するロバストなメッセージングシステムの検討」(2014/12)さらに、災害時には、キャリア系のインターネット接続性自体が損傷を受ける可能性が高いため、大学のような比較的強力なインターネット接続環境を持つところが、一時的にシステムを開放することで、インターネットへのアクセス手段を増やすことも考えるべきである。その前段階として、利活用できる組織内に散在している無線LAN APの情報を集約しておくためのシステムを考案し、その結果を発表した。「既知APの信号強度と位置情報を利用した組織内における未知AP探索システムの提案と評価」(2015/03)本研究の目的は,阪神淡路大震災や東日本大震災のような大規模災害時を想定し,ある組織の構成員の状況を集めることを念頭においた情報の収集活動の実施ができる環境を構築することである.さらに、災害時には、キャリア系のインターネット接続性自体が損傷を受ける可能性が高いため、大学のような比較的強力なインターネット接続環境を持つところが、一時的にシステムを開放することで、インターネットへのアクセス手段を増やすことも考えるべきである。その前段階として、多種の管理外のデバイスが接続される場合を想定した機器の分別システムを検討し、その結果を発表した。「ブロードキャストパケットを用いたネットワーク接続機器の分別手法の提案」(2016/03)平成27年度の実施計画では、ネットニュースシステムを利用した私信配送基盤の構築まず,私信配送基盤システムとして, NNTP (Network News Transfer Protocol, RFC3977)に基づくネットニュースシステムを活用したうえで,複数のサーバ間で情報を同期させることを目的とし,複数のプロトコルを同時並行で利用することによって冗長性を高めた仕組みの構築を目指す予定であった。NNTPを用いるシステムの成果については、ジャーナル論文として採録されている。また、複数の通信手段を併用して頑強性を向上させるシステムに関しては、事前の研究成果を整理し、汎用化を試みた設計結果について国際会議で採択され発表している。さらに、多種の管理外のデバイスが接続される場合を想定した機器の分別システムを考えるべきという点について、成果が出ている。本研究の目的は,阪神淡路大震災や東日本大震災のような大規模災害時を想定し,ある組織の構成員の状況を集めることを念頭においた情報の収集活動の実施ができる環境を構築することである.想定する環境としては,インターネット基盤の一部が不調であることや,組織内に特化したネットワークを活用することを念頭においている.本年度は,情報配送基盤システムとして広く使われている電子メールサービスについて,配信を阻害する要因として,レピュテーションサービスによる誤認によって電子メールメッセージが配信されない事態を回避する仕組みについて検討し,成果を発表した. (石また,組織内のネットワークを災害時に開放することを考慮し,ネットワークから収集した利用者属性を活用できるようにしたネットワークシステムの検討をすすめた.本システムは対外発表にはこぎつけられなかったが,学内に配置したWi-Fiアクセスポイントの情報を収集することでデバイスの識別をしたり, pfsenseを用いて接続時認証を実施する仕組みについて,実現できそうであるという見込みを得ている.本研究では、災害時の安否確認といった重要なメッセージ交換を想定し、システムの一部が停止していても簡単には停止しない情報伝達サービスの実現を目指し、(1) NNTPに基づくネットニュースシステムを活用した私信配送基盤システム、(2)複数のインターネット上のサービスを併用しいずれかのサービスが停止していることを気にすることなくメッセージのやりとりができるシステム、(3)大学などの組織向け接続ネットワークシステムを安全に開放するための無線LANや接続端末の識別システム、に関する成果を得た。この部分の成果については、発表にはこぎつけなかったが、コメントを貰うことができている。さらに、組織内の無線LANインフラの活用についてもあわせて考えるべきという点について、成果が出ている。平成28年度は,当初の計画通り、開発した情報同期プロトコルを活用し,実際に情報伝達・収集システムの構築を行い,実証実験が行えるように進める。また、あわせて管理外を含む多種のデバイスが接続されることを想定し、そのデバイスのステータスに応じた情報提供ができる仕組みについても検討を進める。分散システム平成27年度は、当初の計画通り、複数のサーバ間で情報を同期させることを目的とし,複数のプロトコルを同時並行で利用することによって冗長性を高めた仕組みの構築を目指す.また、あわせて組織内の無線LANインフラの具体的な活用方法についても検討を進める。
血管内皮細胞ＭＨＣ分子の抗原提示能の解析と臨床応用

腫瘍特異的T細胞が血液から固形腫瘍内へと特異的に浸潤するメカニズムを明らかにした。また、このしくみを利用した、抗腫瘍活性の高い免疫方法を開発した(論文2報を再投稿中)。1.血管内皮細胞の抗原提示によるCD4 T細胞の腫瘍内浸潤のメカニズムまず、腫瘍抗原特異的CD4 ThとCD8 CTLの腫瘍内浸潤のkineticsを、蛍光標識したT細胞クローンを使って解析した。その結果、先にThが先に浸潤し、1日遅れてCTLの浸潤ピークがあることがわかった。すなわち、自然な腫瘍血管で血管内皮細胞が抗原提示細胞として働き、最初に腫瘍の場所を見つけて侵入するのはThであることが明らかとなった。また、固形腫瘍から血管内皮細胞を単離して、顕微鏡下でThのtransmigrationを観察した。その結果、死んだ腫瘍細胞を貪食した血管内皮細胞では、抗原依存性、MHC class II依存性にThのtransmigrationが起こることが観察された。次に、Thが浸潤した固形腫瘍にはCTLが効率よく浸潤するメカニズムを明らかにするため、ケモカインの遺伝子発現、および遺伝子KO T細胞を使ってCTLの浸潤を調べた結果、IFN-γ依存性ケモカインの関与が明らかとなった。これらはタンパク質レベルでも分泌が確認され、Thの出すIFN-γに依存していた。2.腫瘍特異的ThとCTLの両方を誘導するペプチド免疫療法の開発上記メカニズムを利用して、Th誘導性ペプチド、CTL誘導性ペプチドの両方を使って免疫をし、後者単独の場合と、in vivoの抗腫瘍活性を比較した結果、格段の抗腫瘍活性が認められた。さらに、Th誘導性ペプチドは、腫瘍抗原の場合は制御性T細胞を誘導する可能性もあるため、ペプチドを修飾することにより、Th誘導活性を100倍前後高める工夫をし、特許出願をした。24年度が最終年度であるため、記入しない。1. MHCクラスII分子KOマウスとの骨髄キメラを用いた、腫瘍特異的CD4 T細胞の固形腫瘍内への浸潤機能の解明MHCクラスII分子KOマウスと正常のCBF1マウスの間で相互の骨髄キメラを作製し、ovalbumin(OVA)を腫瘍抗原に見立てた実験系で、CD4 T細胞の抗原特異的腫瘍内浸潤の程度を調べた。その結果、血管内皮細胞(EC)および、樹状細胞(DC)を主とする骨髄由来の抗原提示細胞の両方にMHCクラスII分子が発現されることが、腫瘍抗原特異的CD4 T細胞の腫瘍内浸潤に必要であることがわかった。実際、ECは、死んだ腫瘍細胞を貪食し、外因経路で抗原提示をすることがわかった。2.腫瘍特異的CD4 T細胞によるCD8 T細胞の腫瘍組織への動員機構の解明これはH24年度に計画していたが、1.2.の内容を連報として投稿する方が説得力があるため、急遽まとめて、1.の再投稿と連著にして投稿した。固形腫瘍内に浸潤したCD4 T細胞は、腫瘍内でさらにDCに提示された腫瘍抗原を認識してIFN-γを産生する。このIFN-γ依存性に、ECではI-TAC、IP-10らのchemokinesの産生が起こり、流血中のCD8 T細胞を腫瘍内に呼び寄せることがわかった。このため、腫瘍特異的CD4およびCD8 T細胞の両方を活性化する方法で担がんマウスを免疫すると、これまでCD8 T細胞のみでは困難であった固形腫瘍を縮小する効果も期待できることがわかった。3. Th細胞誘導効率を数百倍高めた免疫方法の開発詳細な研究はH24年度に譲るが、自己抗原ペプチドに代表されるCD4 T細胞に至適な結合親和性を持たないペプチドを対象に誘導を行うためには、効率のよい免疫方法の開発が重要である。今回、数百倍のT細胞誘導効率を持つ免疫方法のデザインができ、特許の出願を行った。2.腫瘍

特異的ThとCTLの両方を誘導するペプチド免疫療法の開発上記メカニズムを利用して、Th誘導性ペプチド、CTL誘導性ペプチドの両方を使って免疫をし、後者単独の場合と、in vivoの抗腫瘍活性を比較した結果、格段の抗腫瘍活性が認められた。さらに、Th誘導性ペプチドは、腫瘍抗原の場合は制御性T細胞を誘導する可能性もあるため、ペプチドを修飾することにより、Th誘導活性を100倍前後高める工夫をし、特許出願をした。24年度が最終年度であるため、記入しない。2.CD8 T細胞の腫瘍内浸潤機構の研究は予想より早く進み、また、1.の論文投稿の際に、2.の内容も含めて発表した方が、説得力があると考えられたため、急遽仕上げて、1.2.を連報として投稿した。また、計画していなかったが、研究の過程で、Th細胞の誘導効率を数百倍高める工夫ができたため、特許出願を行った。予定を越える成果を得ることができた。順調に進展しているので、現在投稿中の2論文の受理にこぎつける。また、手元のデータを論文化することに集中する。ECによる抗原提示の仕事はユニークな貢献であり、概念の確立をしたい。このため、ECを大量に調製する方法を工夫できたので、今後、遺伝子KOマウスのECとの機能比較等を行いたい。また、3.で計画しているMHCクラスI分子KOマウスを使った骨髄キメラを使った研究も進めており、計画期間内の論文化をはかる。Th誘導効率を高める免疫方法の工夫は、in vivoの実験を加えてPCT出願を希望するため、JST等の出願費用助成に応募予定である。