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複素多様体のモジュライ空間上のケーラー計量の研究

従来より、点付き有限型双曲リーマン面のモジュライ空間上のWeil-Petersson計量(以後、WP計量と略す)、およびTakhtajan-Zograf計量(以後、TZ計量と略す)を調べ、それを通してモジュライ空間およびそのコンパクト化空間の幾何構造を解明しようとしてきた。2002年に初めてメリーランド大学のWolpert教授を訪ね共同研究を開始し、今年度はその研究をさらに押し進めることができた。まず、モジュライ空間の境界におけるWP計量の漸近展開のMasurによる公式を改良し、その第2項に実はTZ計量が現れることを発見した。さらにその第3項以後の項は、リーマン面の退化の位相タイプによって大きく異なることを見いだした。これについては、現在もWolpertと検討中である。一方で、以前からL.Weng, W.-K.Toと共同で調べているTZ計量に関するモジュライ空間の$L^{2}-$コホモロジーについては、リーマン面の種数が1の場合はWP計量に関する$L^{2}-$コホモロジーに一致することが示せた。種数2以上の場合は、TZ計量のコホモロジーはWP計量の$L^{2}-$コホモロジーを含み真により大きいことが証明できた。これはモジュライ空間の境界成分の一部でTZ計量が退化してしまう現象から起こることである。この退化のオーダーを完全に決定できれば残りのTZ計量の$L^{2}-$コホモロジーは求まるが、そのために最近得た退化Eisenstein級数のオーダー評価を応用していこうと考えている。Wolpertが私との議論から刺激を受け、「リーマン面の各marked pointにおいて、TZ形式の4/3倍がWitten classに等しいこと」を証明したことは著しい進展である。この結果とM.Mirzakhaniの仕事を組み合わせることにより、「すべてのモジュライ空間のTZ計量に関する体積を求める」長年の課題がついに実現した。代表者は、九大のWeng氏、シンガポール国立大のTo氏との共同研究により、「点付きリーマン面のモジュライ空間の境界で、Takhtajan-Zograf計量は、Weil-Petersson計量より真に小さいオーダーで挙動する」ことを証明した。これは、数年来の懸案で研究計画にも挙げていた問題だが、肯定的に解決できたことになる。これについては、上記2名との共著で論文を執筆中である。ただし、一方Weng氏により、コンパクト化したモジュライ空間上で、Takhtajan-Zograf束はWeil-Petersson束より(コホモロジーの意味では)より大きいことが示されており、この逆転現象の原因を解明することが、これからの新たな課題として浮上してきた。来年度以降に取り組みたい。また、代表者は科研費を利用して、メリーランド大学カレッジパークのWolpert教授を約20日間訪問し、共同研究を行った。二人で議論する中で、「以前Wolpert氏が証明したリーマン面の退化族上の接ぎ木計量の漸近展開公式に現れるある関数項が、実はtruncatedしたEisenstein級数である」ことを、示すことが出来た。これは、Wolf氏による調和写像を用いた双曲計量の漸近展開公式の結果とも矛盾なく符合する。また、Wolpert氏と共同で、「モジュライ空間の境界におけるWeil-Petersson計量の漸近展開の第2項に、Takhtajan-Zograf計量が現れるだろう」という予想を定式化し、これをThe second-term予想と名付けた。この予想についても、ごく最近肯定的な方向で解決しそうであり、Wolpert氏とともに慎重に証明を検討している状況である。今年度は、代表者が申請時に研究計画で述べた予想のひとつを、Scoot A.Wolpert氏と共同で完全に証明した。すなわち、「有限型リーマン面のモジュライ空間の境界におけるWeil-Petersson計量の漸近展開の第2項にTakhtajan-Zograf計量が現れる」ことを示した。これは異なるコンテクストで導入された両計量の直接的な結びつきを明らかにした、初めての大きな成果であるととらえている。すでにWolpert氏と共著で証明の原稿を書きあげている。2003年9月の千葉大学における数学会でも報告した。現在は、この成果のモジュライ空間の幾何への応用を模索している。Wolpert氏とアラバマ大学の山田澄生氏とも共同でこの方面での考察を進めている。最近Wolpert氏が、リニマン面上の測地線の長さをモジュライ空間上の函数として考えた測地線函数の新しい変分公式を与え、これは以前知られていた公式より有用であることを明らかにしている。代表者はこの新しい変分公式の別証明を与えることができた。私の証明により、リーマン上のあるPoincare級数が特別な事情により実は単なる定数になってしまうことが、Wolpert氏の新しい公式が簡明な表示もつ理由であることが分かる。私の証明の手法がさらに応用を生むことを期待している。また、研究結果ではないが、最近C.Voisin氏のHodge theoryの教科書の第1巻を読了した。これで、代表者が研究計画で書いた「高次元多様体のモジュライのWeil-Petersson幾何」の研究に必要な知識をほぼ身につけることが出来たと思っている。今後、この方面の研究も手掛ける予定である。

2002年に初めてメリーランド大学のWolpert教授を訪ね共同研究を開始し、今年度はその研究をさらに押し進めることができた。まず、モジュライ空間の境界におけるWP計量の漸近展開のMasurによる公式を改良し、その第2項に実はTZ計量が現れることを発見した。さらにその第3項以後の項は、リーマン面の退化の位相タイプによって大きく異なることを見いだした。これについては、現在もWolpertと検討中である。一方で、以前からL.Weng, W.-K.Toと共同で調べているTZ計量に関するモジュライ空間の$L^{2}-$コホモロジーについては、リーマン面の種数が1の場合はWP計量に関する$L^{2}-$コホモロジーに一致することが示せた。種数2以上の場合は、TZ計量のコホモロジーはWP計量の$L^{2}-$コホモロジーを含み真により大きいことが証明できた。これはモジュライ空間の境界成分の一部でTZ計量が退化してしまう現象から起こることである。この退化のオーダーを完全に決定できれば残りのTZ計量の$L^{2}-$コホモロジーは求まるが、そのために最近得た退化Eisenstein級数のオーダー評価を応用していこうと考えている。Wolpertが私との議論から刺激を受け、「リーマン面の各marked pointにおいて、TZ形式の4/3倍がWitten classに等しいこと」を証明したことは著しい進展である。この結果とM.Mirzakhaniの仕事を組み合わせることにより、「すべてのモジュライ空間のTZ計量に関する体積を求める」長年の課題がついに実現した。
脳梗塞感受性遺伝子RNF213の関連遺伝子探索研究

我々は脳卒中関連遺伝子変異RNF213 c.14576G>Aが脳卒中の主たる原因である頭蓋内狭窄に大きな関連を持つことを明らかにした。RNF213変異(c.14576G>A)は日本人の一般集団の2%と比較的高頻度に認められるが明らかとなっており、一方で頭蓋内狭窄の有病率は約1000人に1人程度(全体の0.1%程度)あり、RNF213 c.14576G>Aの保因者(全体の2%程度)がすべて発症するわけではない。疫学的な解析の結果、この変異の1/80程度の人が発症することが示唆されれた。そこで、我々はRNF213 c.14576G>Aを持っていても、頭蓋内狭窄の発症の有無、重症度に関わるさら別の遺伝子変異が存在する可能性が高いと考えられる。このような疾患発症の決定因子となる新たな遺伝的変異(遺伝子多型)を明らかにすることを目的とした。RNF213 c.14576G>Aを有する発症者群と非発症者群の2群間でwhole exome解析を行う方針としサンプル収集を行った。発症者を約100人whole exome解析を行い、また76名の非発症者(東京大学ゲノム医学センターのデータベースのデータを利用)と関連解析を行っている。いずれの解析も現在進行中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
アディポネクチン遺伝子導入マクロファージによる糖尿病壊疽の細胞治療

糖尿病壊疽の細胞遺伝子治療の可能性を探るためにアディポネクチン遺伝子発現導入による血管障害モデルの有効性について検討した。評価における再現性の乏しさより一部モデルを修正して検討したが、今回の検討ではアディポネクチン遺伝子一過性強発現による血流回復促進効果を明確に示すには至らなかった。交付申請書に記載した今年度の実施計画内容は以下であり、現在基礎検討技術の安定を図りつつ検討を行っている。1)アディポネクチン遺伝子誘導を行ったマクロファージでのVEGF産生亢進とアポトーシス細胞の貪食能の亢進の確認。:遺伝子導入についてはGFP発現ベクターを用いての検討を行っている。RAW細胞への導入はリポフェクションおよびエレクトロポレーションにて安定した導入が可能となっている。生体由来のマクロファージについては採取される細胞数が少なめで、培養後の細胞の状態がやや不安定であり、さらにどちらの遺伝子導入手技によっても細胞障害は起こるため有効に機能する細胞の質的および数的な向上には追加の条件検討が必要と考え条件検討を行っている。なお導入後の培養液中のVEGP濃度についてはELISAにての検討系は確立されている。2)糖尿病下肢壊疽のモデル動物の確立:上記1)と並行して糖尿病壊疽のモデル動物系の確立を行っている。麻酔下で通常マウスの大腿動脈を開放しカブ留置を行っている。この段階での手技的問題はクリアされているものの、同処置をおこなったマウスでのストレプトゾトシン(STZ)投与後は手術処置を行わないスマウスに比べて血糖変動が大きく全身状態も良好ではなく創傷治癒の遷延傾向が目立ち全身状態を良好に維持しにいことが問題である。並行してのマクロフォファージ採取、遺伝子導入後再投与の系の確立にはマウスの全身状態の維持に関して幾つかクリアすべき点が多いような印象であるが、手技的な向上により系の安定を図りつつ今後の発展を図りたい。平成22年度は前年度の成果を踏まえて以下の検討を行ってきた。1)血管障害部位への遺伝子導入方法の検討:骨髄細胞採取の上で培養を行い、遺伝子導入を行い、それを糖尿病下肢壊疽モデル動物(下記2))の尾静脈より注入し、局所への生着を測るという当初よりのモデルにての検討を統合的に試みてきたが、現実的に結果のばらつきが大きく評価困難である事が明らかとなってきたため、本学の血管障害モデルを検討されている先生方に御意見を伺い、一部モデルの改変を試みた。具体的には1.遺伝子導入方法についてリポフェクションとエレクトロポレーションを併行していたが、エレクトロポレーションに統一、2.骨髄細胞採取、培養のステップについても培養効率、感染の問題および導入後の免疫反応による影響が懸念され、また障害局所への細胞のリクルートを意図してのマクロファージへの導入であったが、効率を考慮して直接障害血管に隣接した筋組織への遺伝子導入を行うこととした。2)下肢壊疽のモデル動物の確立:本モデルについても血管周囲カフ留置を中心に検討を行っていたが技術的安定性が乏しい事が明らかとなり、既に確立されているモデルを用いた上で、アディポネクチン遺伝子発現による障害血管の再生効果の評価に焦点を絞るべきではないかとのアドバイスを受けて、スフィンゴシン-1-リン酸系の効果の評価が行われて成果が上がっている大腿動脈結紮モデルを中心に用いる事である程度の結果を得る見通しが立つようになってきた。それらの成果を元に現在も検討を継続している。
バクテリアの硝酸還元系の増強によるルーメン発酵の改善

乾草および濃厚飼料を基質として、ルーメン混合微生物を培養したところ、V.parvulaおよびW.succinogenesの数は大きく低下した。しかし、硝酸を添加した場合には、これらの菌数が低下しなかったことから、これらの菌は硝酸および(または)亜硝酸の還元と共役した電子伝達リン酸化によるATP生成によりエネルギーを獲得したと考えられた。一方、S.ruminantiumの数は、硝酸添加の影響を受けなかった。本菌も硝酸および亜硝酸反応と共役した電子伝達リン酸化によりエネルギーを獲得することができることから、ルーメン内には硝酸・亜硝酸還元能を持つS.ruminantiumの数は少ないと思われた。V.parvula、W.succinogenes、S.ruminantium、およびStreptococcus bovisは他の主要なルーメンバクテリアよりも亜硝酸の毒性に対する耐性が高かった。一方、メタン生成反応はバクテリア全般の増殖を阻害しないような低濃度の亜硝酸によっても阻害された。W.succinogenesはV.parvulaやS.ruminantiumよりも硝酸・亜硝酸還元能およびH_2に対する親和性が高かったが、その増殖速度は最も遅かった。硝酸とH_2を添加し、メタン菌とこれらの硝酸還元菌の菌体量を等しくして共培養したところ、メタン生成は大きく減少した。W.succinogenesは硝酸および亜硝酸の還元を増強するだけでなく、メタン生成を抑制するためにも最も効果的な菌であると考えられた。
精度保証による非線形方程式の大域的性質の解明

我々は平成17年度において、Driven-Cavity問題の制度保証に現れる定数の導出、および、孤立波の大域的な一意存在性についての研究を行った。Driven-Cavity問題は流体の分野における典型的なベンチマーク問題であり、その厳密な解を精度保証付きで求める事は非常に重要である。この問題を3次スプライン補間を用いて有限要素法で解くとき、H^2_0ノルムで測った離散化誤差は解のH^4セミノルムで押さえられる。しかし、効率的に精度保証を行うためには、これを更にダブルラプラシアンのL_2ノルムで評価してやらねばならない。その評価に現れる定数は、存在は示されているが、今まで厳密な値は知られていなかった。この値を、いくつかの条件を仮定した上で求めることが出来た。2.孤立波の大域的な一意存在性孤立波の運動を記述した方程式としてYamadaの方程式が知られている。この方程式の正値解の大域的な存在と一意性について精度保証付き数値計算による検証を試みた。Yamadaの方程式は無限遠点を有限区間に変換しているため、非線形性が非常に強く、解を精度保証する際には困難が伴う。我々は、無限遠点に相当する点の付近で漸近解析を行い、その点の付近では漸近解析の結果を用い、それ以外の範囲においては区分2次多項式で解の範囲を限定する事により、ある一定範囲のパラーメータにおいてYamadaの方程式の正値解の大域的な存在と一意性を示すことができた。我々は既に、数値的検証法を用いることにより水面重力波の運動を記述したNekrasov方程式について、ある一定のパラメータ範囲において大域的な一意性を証明している。今年度においては、まずはこのパラメータ範囲を拡大することを目的とした。Nekrasov方程式にはμというパラメータが入っており、μが大きくなるほど解の非線形性が強くなり数値的検証法の適用が難しくなる。いままではμが40までの範囲においてしか検証が成功していなかったのを、プログラムの効率化と評価式の改良で170まで検証することができた。理論的な側面からはμが10^3程度もしくはそれ以上の場合に興味があるのだが、そういう大きなμについて検証を成功させる前段階としてはまずは170まで検証できたことは意味がある。以上の研究と平行して、我々は同じ方法を用いてStokes極限波の大域的な一意性を証明することに取り組んだ。Stokes極限波は、Nekrasov方程式の解が表現する波のμ→∞の時の極限に相当し、いわゆる頂点の尖った波を表している。この波は微分が不連続になるためにNekrasov方程式に比べて扱いが非常に困難である。我々は、特異積分のより精密な評価と、解のより良い近似方法を用いることにより数値的検証法によって解の範囲を限定し、更には縮小写像の原理によって解の一意性を証明することができた。Stokes極限波についてはStokes' conjectureと言われる未解決問題がある。これは、Stokes極限波が頂点を除いて下に凸であるという予想である。この問題に対しJ.F.Tolandは、下に凸であるようなStokes極限波が存在することを示した。よって我々の証明したStokes極限波の一意性は、そのままStokes' conjectureの証明にもつながることになる。よって非常に意味のある結果であると言える。我々は平成16年度においては、自由境界問題に対する精度保証、および、重調和方程式に対する精度保証についての研究を行った。1.自由境界問題に対する精度保証ロープの一方の端を地面から持ち上げた位置で固定した時に、ロープが地面に接する点の位置とロープの形状を求める、などの問題から生じる自由境界問題がある。これについて、U. Schaferは有限差分法的な考え方を基盤とした精度保証付き数値計算を行っているが、彼の方法は解の大域的な一意存在性を仮定するなどの非常に強い条件が必要である。我々はこの問題に対し、一意存在性などの強い仮定を置かずに一般性を残したまま、元の方程式を混合型の不動点方程式に変換し、線形化逆作用素を直接評価することにより解の検証に成功することができた。2.重調和方程式に対する精度保証二次元Navier-Stokes方程式を流れ関数を用いて定式化すると重調和方程式が導出される。この重調和方程式の数値計算や精度保証においては、通常は有限要素法が用いられるが、レイノルズ数がある程度の大きさ以上になると非常に多くの計算時間がかかってしまう。この問題に対し、スペクトル法の基底関数を用いることが出来れば検証の効率化を図れると期待できる。二次元矩形領域においてはsin関数を基底関数として用いれば良いのであるが、基底関数に境界整合性が無いので、そのままではスペクトル法を適用することが出来ない。これに対し我々は、境界条件を合わせる作用素を導入し、さらにその作用素の厳密な評価を与えることにより問題を解決した。実際にこの方法をDriven Cavity問題の数値検証に適用し、有限要素法を用いた従来の方法よりも良い結果を得ることができた。

しかし、効率的に精度保証を行うためには、これを更にダブルラプラシアンのL_2ノルムで評価してやらねばならない。その評価に現れる定数は、存在は示されているが、今まで厳密な値は知られていなかった。この値を、いくつかの条件を仮定した上で求めることが出来た。2.孤立波の大域的な一意存在性孤立波の運動を記述した方程式としてYamadaの方程式が知られている。この方程式の正値解の大域的な存在と一意性について精度保証付き数値計算による検証を試みた。Yamadaの方程式は無限遠点を有限区間に変換しているため、非線形性が非常に強く、解を精度保証する際には困難が伴う。我々は、無限遠点に相当する点の付近で漸近解析を行い、その点の付近では漸近解析の結果を用い、それ以外の範囲においては区分2次多項式で解の範囲を限定する事により、ある一定範囲のパラーメータにおいてYamadaの方程式の正値解の大域的な存在と一意性を示すことができた。
トマト葉かび病菌の新たなエフェクター因子の探索

トマト葉かび病菌はエフェクター遺伝子を変異することで、宿主トマトが持つCf抵抗性遺伝子による抵抗性を回避する。日本で分離された123菌株についてエフェクター遺伝子配列を決定した結果、変異様式は(i)フレームシフト変異、(ii)Avr2へのトランスポゾンの挿入、(iii)Avr4とAvr4Eの点突然変異、(iv)Avr4EとAvr9の遺伝子の欠落、のたった4パターンであることが明らかとなった。さらに、新規エフェクター遺伝子の単離を目指し、感染葉アポプラスト液のプロテオミクス解析とRNAseqによる発現解析によりエフェクター候補を選抜した。これら候補タンパク質の中から、抵抗性遺伝子Cf-5をもつトマト品種への抵抗性反応によりAvr5遺伝子が同定され、本遺伝子が1.8Mbの小型染色体に座乗していることが明らかとなった。海外での発生報告がないレースを含む日本国内で分離されたトマト葉かび病123菌株について、レースを決定するエフェクター遺伝子の変異様式を比較するため、Avr2、Avr4、Avr4E、Avr9の遺伝子配列を決定し、一塩基多型解析を行った。その結果、海外分離菌株にはない変異様式が多数みいだされ、本病原菌の多様なレースは海外から侵入したのではなく、国内で独自の寄生性分化を遂げ、日本特有のレースが生じたものと考えられた。また、同じレースでも菌株によって変異様式が異なることが明らかとなり、新レースは各地域においてそれぞれに発生したことが推察された。解析した4つのAvr遺伝子は、対応する抵抗性遺伝子Cf-2、Cf-4、Cf-4E、Cf-9をもつトマト品種にそれぞれ抵抗性を誘導する。しかしながら、既に同定されている抵抗性遺伝子に対応するいくつかのエフェクター遺伝子は未だ同定されていない。そこで新規エフェクター遺伝子の単離を目指し、感染葉のアポプラスト液におけるプロテオーム解析を行った。一方、Wageningen大学の共同研究グループでは、RNAseqによる大規模な発現解析によりエフェクター候補を選抜した。これら候補タンパク質の中から、抵抗性遺伝子Cf-5をもつトマト品種への抵抗性反応により、Avr5遺伝子が同定された。本遺伝子と相同性を示す遺伝子はDNAデータベース上に存在せず、現在のところトマト葉かび病菌に特徴的である。パルスフィールド電気泳動によりトマト葉かび病菌の染色体を分離し、Avr5遺伝子が座上する染色体を解析したところ、二次代謝産物の生合成遺伝子群を含む1.8Mbの小型染色体であることが明らかとなった。近年、病原糸状菌において多くの病原性関連遺伝子が小型染色体に座上することが明らかにされており、トマト葉かび病菌の病原性においても小型染色体が重要な役割をもつことが示唆された。先に日本で分離されたトマト葉かび病菌が、海外での発生報告がない宿主に対する特徴的な寄生性を示すことを明らかにした。これら特徴的な123菌株について寄生性を決定する4つのエフェクター遺伝子の塩基配列を全て決定し、ドラフトゲノムが決定されている標準菌株(未公開)と、既に解析済みの日本以外で分離された菌株の配列情報と比較し、一塩基多型解析を行った。その結果、日本分離菌株のそれぞれのエフェクター遺伝子には塩基配列の欠失や塩基置換、あるいは遺伝子全体の欠失など多数の変異が蓄積していることが明らかになり、これまでに海外分離菌株には認められなかった新たな変異部位が多数見いだされた。そのため、多様なレースは海外から持ち込まれたものではなく、国内のトマト栽培施設において多くの変異が生じたことで独自の寄生性分化を遂げ、日本特有のレースが生じたものと考えられた。また同じレースでも菌株によって変異様式が異なることが明らかになり、新レースは各地域においてそれぞれに発生したと推察された。このように日本分離菌株において新たな変異部位が多数見いだされたにも関わらず、その変異パターンは海外分離菌株と同様に(1)AVR2のフレームシフト変異、(2)AVR2へのレトロトランスポゾンの挿入、(3)AVR4とAVR4Eの点突然変異、(4)AVR4EとAVR9の遺伝子の欠失、の4つであることが明らかになった。なぜたった4パターンに集約されるのか定かではないが、AVR遺伝子の本来の機能による可能性とゲノム上の位置に関係すると推測している。本研究の目的は、近年トマト生産現場で被害が拡大しているトマト葉かび病菌において、これまでに同定されていない寄生性を決定するエフェクター遺伝子の探索である。

本菌のエフェクター探索は20年以上前から行われているにもかかわらず、未同定の重要なエフェクター因子が少なくとも6つあることが分かっており、探索に用いられてきた菌株とは異なった遺伝的に特徴的な菌株を見いだす必要がある。日本で分離されたトマト葉かび病は前例のない寄生性系統であるだけでなく、今年度の成果から遺伝的に特徴的な菌株をいくつか見いだした。現在のところ当初の計画どおりであり、次年度にはこれら菌株からトマト宿主内に分泌されるタンパク質を同定し、新規エフェクターの候補を挙げることを目指す。当初の計画どおりの研究を行うが、現時点で得られたいくつかのエフェクター候補についてトマトに対する抵抗性だけでなく、その他の植物種に対する広範な作用についても研究を進展させる。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり使用する。次年度使用額6,166円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。
トウモロコシ種子の糖質代謝系酵素の発現機構

1.トウモロコシ未発芽種子にα-アミラーゼの存在を予測させる現象が観察されたが、それは他の数種の糖質代謝系酵素(たとえばα-グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、Q-酵素、D-酵素等)の協同作用による現象であると推定された。トウモロコシ未発芽種子中にはα-アミラーゼは存在せず、他の穀類種子と同様発芽によってはじめて発現することが確認された。2.イエローデントコーン種子では、発芽によって4種のα-アミラーゼが発現し、それらのアミラーゼは吸水後4日目以降に急激に増加した。3.4種のα-アミラーゼのうちのα-アミラーゼIIを各種のクロマトグラフィーによって均一な蛋白質として高度に精製した。その分子両は48,000、至適pHは4.7であり、デンプンに作用ささせたときの最終的な主生成物はマルトーである。4.生成物のアノマーはα-型であることがGLCによって確認された。5.デンプンの分解に関するBlue value曲線から本酵素が典型的なendo型の酵素であることが判明した。6.種々のα-グルカンに対する分解速度はアミロース>可溶性デンプン〓アミロペクチン>β-リミットデキストリン》グリコーゲンの順であった。7.重合度を異にするマルトオリゴ糖(G_3G_7、G┣-(/)18┫)に対する分解様式をTLCおよびGLCによって検討し、同時に各オリゴ糖に関する水解速度パラメーター(Km,ko)を測定した。8.それらの結果をもとに、各マルトオリゴ糖に対する主な切断箇所と活性部位におけるサブサイト構造を推定し、そのサブサイト親和力(Ai)を求めた。サブサイトの数は約7であり、A_1=0.3、A_2=0.7、A_3=0.7、A_4=2.7、A_5+A_6=-2.8、A_7=2.0(kcal/mol)と算出され、触媒部位は第5と第6サブサイト間に存在すると推定された。1.発芽イエローデントコーン種子中には, 3種のα-アミラーゼアイソエンザイムの存在が確認された.2.それらのα-アミラーゼ(A, B, C)の精製・分離法を検討した.各種のクロマトグラフィーにより, α-アミラーゼBをディスク電気泳動的に均一な標品にまで精製し,その精製法を確立した.3.α-アミラーゼBの分子量は49,000;至適pHは4.7;安定域はpH4.010.0であり,デンプンに作用させたときの最終主生成物はマルトースであり,他のα-アミラーゼにみられるようなグルコースの生成はほとんど確認できなかった.4.当初予想された未発芽種子のα-アミラーゼの分離は困難であった.その理由としては,未発芽種子中にはいくつかの別種の糖質代謝系酵素(潜在型β-アミラーゼ,イソアミラーゼ, Q-酵素, D-酵素,ホスホリラーゼ等)が存在しており,予備実験においてはそれらの相互作用によりα-アミラーゼが存在しているかのような結果を与えていると推定された.5.デントコーン未発芽種子中には比較的多量のα-グルコンダーゼが含まれることが確認された.各種のクロマトグラフィーによりそのα-グルコシダーゼの分離を試み,ディスク電気泳動的に均一な標品にまで精製し,その精製法を確立した.6.分離されたα-グルコシダーゼの分子量は86,000;至適pHは3.8;pH

安定域はpH3.010.0であった.1.イエローデントコーン未発芽種子に発現する4種のα-アミラーゼのうちのα-アミラーゼIIを各種のクロマトグラフィーによって均一なタンパク質として高度に精製した。その分子量は48,000、至適PHは4.7であり、デンプンに作用させたときの最終的な主成物はマルトースである。2.生成物のアノマーはα-型であることがGLCによって確認された。3.デンプンの分解に関するBlue value曲線から本酵素が典型的なendo型の酵素であることが判明した。4.種々のα-グルカンに対する分解速度はアミローズ>可溶性デンプン〓アミロペクチン>β.-リミットデキストリン>>グリコーゲンの順であった。5.重合度を異にするマルトオリゴ糖(G_3G_7、G_<18>)に対する分解様式をTLCおよびGLCによって検討し、同時に各オリゴ糖に関する水解速度パラメータ(Km、ko)を測定した。6.それらの結果をもとに、各マルトオリゴ糖に対する主な切断箇所と活性部位におけるサブサイト構造を推定し、そのサブサイト親和力(Ai)を求めた。サブサイトの数は約7であり、A_1=0.3、A_2=0.3、A_3=0.7、A_4=2.7、A_5+A_6=-2.8、A_7=2.0(kcal/mol)と算出され、触媒部位は第5と第6サブサイト間に存在すると推定された。
無痛自動採血のための振動穿刺法に関する研究

【目的】本研究では皮下の血管への自動穿刺を実現するために、蚊が皮膚や血管を穿刺する際に一対の鋸状の針を振動させていることに着目し、この針のモデルを作製して血管の弾性変形を押さえるのに最適な針の形状、振動数などのパラメータを求めることを目的とした。【方法】蚊の鋸状の一つの歯の大きさは10μmと小さく、1μm程度の三次元加工精度を必要とする。そこで現在の機械加工技術を用いて数10100μmの大きさの歯を持った製作を試みた。また並行して穿刺に最適な形状を力学的に評価するための数値シミュレータの作製を行った。【結果】蚊の鋸針の直径の10倍の大きさのモデルを施盤加工により作製し、ラテックスゴムの穿刺実験を行った。鋸針は0.4mmの市販注射針を2分割し、鋸状の溝をネジのように彫ることで鋸歯の代わりとした。鋸歯を振動させると穿刺力が最大で約50%減少し、穿刺対象の弾性変形を押さえることに効果的であることが確認された。しかしながら加工精度のバラッキのため、最適な針の形状や振動数などを見いだすのは困難であった。また皮膚穿刺の数値シミュレータは皮膚を均一な弾性体をみなした有限要素モデル表現し、針を押しあてたときの変形及び破断を模擬するように動作させた。動形状、同サイズ(厚さ0.2mm,直径5mm)のラテックスゴムやシリコーンゴムに市販の注射針を穿刺したときの様子をシミュレーション比較した結果、破断までの形状変化が一致する事を確認した。今後、蚊のような複雑な形状の針をモデル化することにより蚊の皮膚穿刺のメカニズムを力学的に解析し、自動採血への応用を試みる予定である。
胎児・新生児期に発症する遺伝性不整脈の遺伝的背景と臨床的表現型に関する研究

早期に発症する先天性QT延長症候群(LQTS)の全国調査を行った。胎児・新生児期から心室頻拍や房室ブロックを伴って重症な経過を辿るのはLQT2型、3型、8型および遺伝子型未確定例であった。これらの症例を救命するためにはβ遮断剤、メキシレチン、Mgを主体とする多剤薬物療法とペースメーカ治療が推奨される。また、独自に開発した独立成分分析法(ICA)と主成分分析(PCA)を用いて心電図T波を解析した結果、LQTSではT波を構成する過剰な成分が検出され、PCA ratioが高値を示した。これはLQTSの心筋再分極過程の不均一性によると考えられ、ICA、PCAはLQTSの診断に有用であると考えられた。胎児・新生児期に発症する先天性QT延長症候群の我が国における実態を把握するため、小児循環器科医が所属する全国の主要な施設を対象として、発生状況の調査を継続した。症例数は増加し、全国48施設から計82例が登録された。遺伝子検査は61例(74%)で行われていて、遺伝子型が判明したのは45例(74%)で、LQT1が16例、LQT2が12例、LQT3が13例、LQT8が4例であった。胎児・新生児期から乳児期の早期にかけて、心室頻拍や2:1房室ブロックなど重症な不整脈を呈するのはLQT2, 3, 8型であったが、これらの家族癧陽性率は遺伝子型によって038%であり、家族歴からは診断できない症例が多いことが判明した。一方、LQT1は家族癧やスクリーニング心電図のQT延長自体から診断されることが多かった。従って、重症なLQTを早期に診断して、速やかに治療を開始するためにはその代表的な表現型を知ることが重要である。診断の契機となった重要な心電学的表現型は、洞性徐脈、機能的房室ブロック、torsade de pointes/心室頻拍の3者であり、これにLQT/突然死の家族歴を加えた4者のうち、2項目以上がある場合はLQTを疑って早期診断に努め、突然死の予防、救命のために多剤薬物療法とデバイス治療による早期介入を行う必要がある。また、本年度は機能的2:1房室ブロックを伴った症例について、長期予後についての追加調査を行った。その結果、著明なQT延長は長期にわたって持続するが、房室ブロックは乳幼児期に消失する症例が多いことが判明した。このことは同じ遺伝子変異を持っていても乳児期と成人期におけるイオンチャネルに違いがある可能性や、他の修飾因子の関与が示唆されて、分子生物学的にも興味深い。機能的房室ブロックは予後不良を示す所見の一つであり、ペースメーカ植込み術を含めた積極的な介入が望まれる。(1)症例の全国調査:胎児新生児期に発症する遺伝性不整脈症例の全国調査を継続している。登録数は小児循環器科医が所属する病院を中心に、45施設から61症例となった。その約55%で遺伝子変異が判明し、遺伝子型と臨床的表現型の解析を進めている。(2)登録症例の臨床像の検討:海外の症例と合わせた検討により、先天性QT症候群の胎児は各在胎週数において、正常胎児と比較し有意に徐脈傾向(特に正常児の<3パーセンタイル)にあることがわかった(Mitchell, Cuneo, Etheridge, Horigome, et al. Circulation 2012)。同症候群の早期発見のための重要な表現型と考えられた。(3)新しい心電図波形解析によるLQTSの診断:独立成分分析によるLQTSのT波成分解析を行い、LQT1診断の精度が主成分分析より高いことを示した。(4)遺伝子検査:1家族および施設倫理委員会の承諾を得た上で、先天性QT延長症候群家系(本人、第一子が罹患者)の第二子となる胎児に対して心磁図による同疾患のスクリーニングを行った。先天性QT延長症候群は新生児期・乳児早期に致死的な不整脈を来すことがある。家族歴や胎児スクリーニングで同疾患が疑われる場合、非侵襲的な出生前診断を行い、疾患に合わせた胎児治療や出生後早期の対応を行うことにより、致死性不整脈による新生児死亡を減らすことができる。2文献上まだ報告されていないQT延長症候群関連遺伝子の変異がチャンネル機能に与える影響、すなわち病的変異かどうかを調べるため、パッチクランプ法を用いてイオンチャンネル機能解析を行う計画を進めている。現在までに野生型遺伝子を培養細胞に遺伝子導入し、イオンチャンネルを発現させた。今後、変異遺伝子で発現させたイオンチャンネルの機能を野生型と比較、解析をすすめていく予定である。

(1)胎児新生児期に発症する遺伝性不整脈の全国調査小児循環器科医が所属する主要な施設を対象として胎児・新生児期に発症する先天性QT延長症候群(LQTS)の調査を行い、全国48施設から計82例が登録された。遺伝子検査は61例(74%)で行われていて、そのうち遺伝子型が判明したのは45例(74%)で、LQT1: 16例、LQT2: 12例、LQT3: 13例、LQT8: 4例であった。重症な経過を呈したのはLQT2, 3, 8型であったが、これらの家族歴陽性率は038%と低かった。診断の契機となった重要な心電図所見は、洞性徐脈、機能的房室ブロック(AVB)、torsade de pointes/心室頻拍の3者であった。AVBは幼児期以降に消失する傾向があり、同じ遺伝子変異を持っていても乳児期と成人期におけるイオンチャネルに違いがある可能性や、他の修飾因子の関与を示唆していた。これらの不整脈や家族歴がある場合はLQTを疑って早期診断に努め、救命のために多剤薬物療法とデバイス治療による早期介入を行う必要がある。(2)LQTSのT波の解析LQTSにみられるT波異常は再分極過程に含まれる過剰成分に由来するという仮説を立て、独立成分分析(ICA)と主成分分析(PCA)でこの成分の検出を試みた。LQT1: 22例、LQT3: 12例および健常者30例を対象とした。ICAの結果:対照群全例でT波は4つの基本独立成分(IC)から構成されていたのに対して、LQT1では5-6個、LQT3では6-7個のICが検出された。PCAの結果:PCA ratio (第2主成分/第1主成分比)は健常群に比してLQTSで有意に高値を示した。このことは、ICAやPCAは再分極過程の不均一性の評価に有用であることを示している。しかし、有症状例と無症状例の比較では有意差が認められず、今後の検討が必要である。小児科学、小児循環器病学、胎児・新生児学全国から登録された症例を中心に診断・治療の現状について継続してきた。全体の登録症例数は順調に増加していて、1例のみでも症例報告に値するような貴重な症例を含め、82例に達している。また、今年度は特殊なタイプについて、長期予後に関する新たな調査を追加し、有用なデータが得られた。本疾患に対するこのような規模の研究成果は世界的にみてもほとんどなく、代表的な遺伝子型と臨床的表現型の関連が判明し、遺伝子型を背景とした適切な管理指針、治療法が確立されつつある。しかし、遺伝子検査が未施行の症例数がかなりあること、LQTの遺伝子検査は13型および8型を中心に行われているため、頻度が極めて低い他の遺伝子型については情報が得られていない。胎児・新生児期に発症する遺伝性不整脈の遺伝的背景と臨床的表現型を解析するには、十分な症例数とデータの蓄積が不可欠であるが、前述の通り、現在まで十分な症例登録があり、遺伝子変異の検出率も上昇しているため、解析が可能となっている。また、イオンチャネル機能解析システムの準備も順調に進んでいる。(1)先天性QT延長症候群に限らず、最近明らかとなってきた他の遺伝性不整脈についても調査に含め、胎児・新生児期に発症する遺伝性不整脈症例の全国調査を継続し、さらに十分な症例数を蓄積する。既登録例については、臨床像の検討、特に長期経過と生命予後について情報を再収集する必要がある。(2)先天性QT延長症候群については、今までは1型3型と8型の遺伝子検査を行ってきたが、これらに属さない稀少な遺伝子型のなかにも重症な臨床経過を示す症例がかなり含まれている可能性があるため、他の遺伝子型の検査を積極的に進める。
赤血球の変化と鉄欠乏が循環器疾患に与える影響の解析

近年、疫学的研究により、赤血球容積分布幅(Red cell distribution width: RDW)が大きいと心不全や脳梗塞、静脈血栓塞栓症等の血栓性疾患の発症リスクが増加すると報告された。赤血球の大きさや膜構造の違いが発症に関わっている可能性があるが、それらが血栓形成に与える影響について詳細に検討されていない。そこで本研究では、RDWと血栓形成の関連に着目し、赤血球の変化が循環器疾患に与える影響を解明することを目的としている。血栓モデルでの赤血球の解析:野生型マウス(C57BL/6J)の下大静脈を露出し、10%塩化鉄溶液で血管を傷害し血栓を形成させた。手術前、手術5日後、12日後に採血し、RDW等を自動血球計数装置(UniCel DxH800)で測定した。塩化鉄傷害モデルでは、5日後、12日後ともにRDWが増加傾向を示した。しかしながら、採血手技による影響も排除できないので、今後、n数を増やす、もしくは採血方法を改善する必要があると考えている。血栓モデルマウスでの赤血球の解析を行うことができたが、手技等の改善を図る必要があるかもしれない。比重分離した赤血球の解析:週齢の異なるマウスより採取した赤血球をパーコール液を用いて比重分離する。分離した赤血球のトロンビン生成能、ホスファチジルセリン露出赤血球数等を測定する。妊娠期母体鉄欠乏が循環器疾患に与える影響の解明:野生型雌マウスに、交配4週間前から離乳期まで(全期群)、妊娠前期のみ(前期群)、妊娠後期のみ(後期群)に鉄欠乏餌を与え、3群の鉄欠乏妊娠マウスを作製する。離乳後、仔マウスに通常食を与え、幼少期あるいは青年期まで発育させ、幼少期および青年期でのRDWや赤血球膜組成、トロンビン合成能等を評価する。1マウスの週齢によるRDW、網状赤血球数の変動: 4週齢、7週齢、25週齢の野生型マウス(C57BL/6J)を用いて、RDWおよび網状赤血球数を測定した。その結果、4週齢のマウスは7週齢および25週齢のマウスに比べてRDWが大きいことが分かった。また、網状赤血球数も4週齢のマウスで多いことが分かった。2鉄欠乏に伴うRDW、網状赤血球数の変動:野生型マウスに離乳後より鉄欠乏餌を与え、鉄欠乏に伴うRDWの変動を測定した。鉄欠乏餌を与えられたマウスでは、測定不能になるほどRDWが増大した。しかし、ヒトの鉄欠乏性貧血と異なり、今回の鉄欠乏モデルマウスでは網状赤血球数が増加しており、ヒトの鉄欠乏状態と異なる赤血球産生状態を示していた。3RDWの異なる赤血球の血液凝固関連機能の測定: RDWの異なるマウス(4週齢、7週齢、25週齢)の血液から洗浄赤血球液を調製し、赤血球のトロンビン生成能をトロンビンの発色基質S-2238を用いて測定した。さらに、ホスファチジルセリン露出赤血球数をAnnexin Vの蛍光標識体を用いてFACSで解析した。トロンビン生成能は、RDWが大きい4週齢マウスに比べて、RDWが小さい7週齢、25週齢マウスで高い傾向にあった。ホスファチジルセリン露出赤血球数は、4週齢、7週齢、25週齢で著明な変化はみられなかった。赤血球の凝固機能の測定やRDW測定は当初の予定通り行うことができたが、血栓症モデルでの検討を行うことができなかった。今後、赤血球を比重によって分離し、血栓形成能等の違いを検討する。

さらに血栓症モデルを作成し、RDWの変動や赤血球の血栓形成能を測定する予定である。比重分離した赤血球の解析:週齢の異なるマウスより採取した赤血球をパーコール液を用いて比重分離する。分離した赤血球のトロンビン生成能、ホスファチジルセリン露出赤血球数等を測定する。妊娠期母体鉄欠乏が循環器疾患に与える影響の解明:野生型雌マウスに、交配4週間前から離乳期まで(全期群)、妊娠前期のみ(前期群)、妊娠後期のみ(後期群)に鉄欠乏餌を与え、3群の鉄欠乏妊娠マウスを作製する。離乳後、仔マウスに通常食を与え、幼少期あるいは青年期まで発育させ、幼少期および青年期でのRDWや赤血球膜組成、トロンビン合成能等を評価する。
各種元素の2,6-ジメトキシフェニル誘導体

3. Fc-CHΦ^aOHは少過剰の酸により暗紫色のカルベニウム塩[Fc-CHΦ^a]Xを生じた(塩酸中のpK_R+値は3.0)。この塩はi-PrOH中でFc-CH_2Φ^aに還元され,1,3,5-トリメトキシベンゼンと反応してFc-CHΦ^a_2を生じた。4. 1,4-ベンゼンジメタノール,p-HOCΦ^b_2C_6H_4CArΦ^bOH(Ar=Φ^b,4-MeC_6H_4,4-MeOC_6H_4),に酸を作用させるとAr-基がp-フェニレン環上に転移することを見い出した。6. MAr_3(M=As,Sb,Bi)の新しい合成法を開発した。まず,金属酸化物とΦ^bSHの反応によりM(SΦ^b)_3を得,これとLiArの反応によりMAr_3にする。ΦSHもM(SΦ^b)_3も結晶性で取扱が容易である。2,6-ジメトキシフェニルリチウム、ΦLi[Φ=2,6-(MeO)_2C_6H_3],とジエチル-p-フタール酸の反応で3置換化合物,p-HOCΦ_2C_6H_4C(O)Φ(1),あるいは1,4-ベンゼンジメタノール,p-HOCΦ_2C_6H_4CΦ_2OH(2a),を得た。さらに,化合物1とアリールリチウム,ArLi,の反応により1,4-ベンゼンジメタノール,p-HOCΦ_2C_6H_4CArΦOH(Ar=4-MeC_6H_42b,4-MeOC_6H_42c),を得た。ジメチルスルホキシド中で化合物2aに酸を作用させると予想外な生成物3-(2,6-ジメトキシベンゾイル)-3-(2,6-ジメトキシフェニル)-6-[ビス(2,6-ジメトキシフェニル)メチレン]-1,4-シクロヘキサジエン4a,が定量的に得られた。この反応は,まずカルベニウムイオン,[p-Φ_2C^+-C_6H_4CΦ_2OH](3a),が生成し,その陽電荷がp-フェニレン環のpara-位にも分極するためにそこに隣接するΦ-基のひとつがp-フェニレン環上に転移したものと理解できる。アセトン中で化合物2aに酸を作用させると4aあるいは(2′,6′-ジメトキシ-4-ビフェニリル)ビス(2,6-ジメトキシフェニル)カルベニウム塩,[(4-ΦC_6H_4)CΦ_2]ClO_4,の暗紫色結晶が得られる。エタノールやメタノール,熱2-プロパノール中では還元体,(4-ΦC_6H_4)Φ_2CHが得られた。2bや2cもジメチルスルホキシド中で酸と反応して3-メチレン-1,4-シクロヘキサジエン誘導体を生じた。^1H-NMRスペクトルによりカルベニウムイオン中間体3a-cの生成を証明することもできた。1.2,4,6-トリメトキシフェニルリチウムΦ'Li[Φ7'=2,4,6-(MeO)_3C_6H_2]とジフェニル炭酸あるいはギ酸メチルの反応でトリス(2,4,6-トリメトキシフェニル)メタノールΦ'_3COH1およびビス(2,4,6-トリメトキシフェニル)メタノールΦ'_2CHOH2を合成した。1は2-プロパノール中で少過剰の過塩素酸と反応してトリアリールカルベニウム塩[Φ'_3C]X3(X=ClO_4)の暗紫色結晶を生じた。この塩は熱エタノール中でも安定である。1は1M塩酸に溶解し3(X=Cl)の溶液を生じる。この溶液を1M水酸化ナトリウムで中和すると1を再生するのではなく4-ビス(2,4,6-トリメトキシフェニル)メチレン-3,5-ジメトキシ-2,5-シクロヘキサジエノンを生じた。2もメタノール中で少過剰の過塩素酸と反応してジアリールカルベニウム塩[Φ'_2CH]X4(X=ClO_4)の暗赤色結晶を生じた。

3は熱メタノール中でもかなり安定に存在するが,1級および2級アルコール中ではビス(2,4,6-トリメトキシ)メタンΦ'_2CH_2に還元された。他方,3の1M塩酸溶液を加熱するとトリアリールメタンΦ'_3CHを生じた。これは4のΦ'-C結合が加水分解されて1,3,5-トリメトキシベンゼンΦ'-Hを生じ,これが4と反応して生じたものであることが判った。2.トリアリール金属MAr_3(M=As,Sb,Bi)の新しい合成法を開発した。本法は,金属酸化物を出発原料とした2段階反応からなる。まず,金属酸化物を酸触媒の存在で2,6-ジメトキシベンゼンチオールΦSH[Φ=2,6-(MeO)_2C_6H_3]と反応させて金属チオラートM(SΦ)_3に導く。ついでこの金属チオラートM(SΦ)_3を有機リチウム試薬LiArと反応させることによりトリアリール金属MAr_3に導く。副生するリチウムチオラートLiSΦは水溶性であるので水中へ抽出分離し,酸を加えると2,6-ジメトキシベンゼンチオールΦSHが結晶として再生され,再使用することができる。2,6-ジメトキシベンゼンチオールΦSHも金属チオラートM(SΦ)_3も共に無臭で空気中で安定な結晶性化合物であるので取扱が容易である。2,4,6-トリメトキシフェニル基をΦ^a,また2,6-ジメトキシフェニル基をΦ^bで表わす。
肝転移モデルを用いたHGFの肝細胞癌に対する抗腫瘍効果:トランスジェニックマウスを用いた検討

われわれは、肝細胞特異的にHGFの発現するトランスジェニックマウスを作成した(G.Shiota etal.Hepatology19,962-972,1994)ので、本マウスを用いてin vivoのHGFの抗腫瘍効果を検討した。具体的には、HGFトランスジェニックマウスとヌードマウスのキメラマウスを用いて肝癌細胞の肝臓への転移能の検討と、肝腫瘍の発生を促進すると報告されているTGF_αやc-mycのトランスジェニックマウスを用いた検討した。1、HGFトランスジェニックマウスでの肝細胞癌の転移能の検討経門脈的に1X10^6個の肝癌細胞を導入し、肝転移を作成した。HuH7細胞を用いた場合、肝転移率は対照群の80%で、HGF群では20%へ低下した。Hep3B細胞、FaO細胞では、各々対照の83%、80%に対し、HGF群では40%、50%であった。総合して、肝転移率は対照群の81%に対し、HGF群では35%へと有意に低下した(p<0.05)。2、HGFとTGF_αのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍発生の検討TGF_αマウスでは約15か月で肝腫瘍が60%に発生した。HGFマウスでは0%であり、両者のダブルトランスジェニックマウスでは33%へ減少した。3、HGFとc-mycのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍の検討16か月の検討では、c-mycのトランスジェニックマウスは92%にうアデノーマが発生し、58%に肝細胞癌が発生した。一方、HGF/c-mycのダブルトランスジェニックマウスではアデノーマは33%であり、肝細胞癌は0%と有意に肝腫瘍の発生が抑制された。われわれは、肝細胞特異的にHGFの発現するトランスジェニックマウスを作成した(G.Shiotaet al.Hepatology19,962-972,1994)ので、本マウスを用いてin vivoのHGFの抗腫瘍効果を検討した。1、HGFトランスジェニックマウスとヌードマウスのキメラ化肝癌細胞を拒絶反応なく移植するため、HGFトランスジェニックマウスとヌードマウスのキメラ化が必要である。HGFトランスジェニックマウスはFVBを使用しているので、まず両者を交配し、HGFとヌードの両alleのヘテロザイゴ-ト(HGF/+,nu/+)を得た。さらに、ヌードマウス(+/+,nu/nu)と交配し、HGFとヌードマウスの両者のフェノタイプを有するキメラマウス(HGF/+,nu/nu)を作成した。本マウスは、肝臓にHGFトランスジーンを発現するヌードマウスである。われわれは、14匹のHGFとヌードのキメラマウスを作成した。2、われわれは14匹のキメラマウスを使用して、肝転移モデルにおけるHGFの肝癌細胞の肝転移へ及ぼす効果を検討した。まず、HUH7肝癌細胞株にて検討した。1X10^6個の細胞を経脾経門脈性に注入し、肝転移を作成した。同時に抗アシアロGM1抗体を投与し、ナチュラルキラー細胞の活性を抑制した。4週間後に、肝臓の転移の有無、転移数、腹膜転移について検討した。その結果、対照では4/5(80%)に転移を認め、平均52、3個に対し、HGFキメラマウスでは1/5(20%)、平均18個に減少した。腹膜転移は対照で2/5(40%)に対し、0/5(0%)であった。Hep3B,FaO細胞を用いた時も、ほぼ同様の結果を得た。

以上を総合すると、肝転移を対照で13/16(81%)に認めるが、HGFキメラマウスでは5/14(35%)であり、また転移の平均個数は対照で46、4個に対し、HGFキメラ群で21、6個にそれぞれ有意に減少した。腹膜転移は、対照群で6/16(37%)に対し、HGFキメラ群で1/14(7%)へと有意に減少した。われわれは肝細胞特異的にHGFが発現するトランスジェニックマウスを作製し(Hepatology 19:962-972,1994)、本マウスを用いてin vivoのHGFの抗腫瘍効果を検討している。具体的には、HGFトランスジェニックマウス(FBV)とヌードマウスのキメラマウスを用いての検討と、肝腫瘍発生を促進するTGFαやc-mycのトランスジェニックマウスとのダブルトランスジェニックマウスを用いての検討を進めている。1、HGFトランスジェニックマウスでの肝細胞癌の転移能の検討経門脈的に1X10^6個の肝癌を導入し、肝転移を作製した。HUH7細胞を用いた場合、肝転移率はヌードマウスでは80%に対し、HGF/ヌードでは20%へ減少した。Hep3B細胞、FaO細胞の検討では、それぞれヌードマウスで83%、80%に対し、HGF/ヌードでは40%、50%であった。総合するとヌードマウスで転移率81%に対し、HGF/ヌードでは35%と有意に(p<0、05)低下した。2、HGFトランスジェニックマウスとTGFαトランスジェニックマウスのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍発生の検討TGFαマウスでは、約15か月で肝腫瘍が60%で発生した。HGFマウスでは0%であった。両者のダブルトランスジェニックマウスでは33%へと減少した。3、HGFトランスジェニックマウスとc-mycトランスジェニックマウスのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍発生の検討16か月の検討では、c-mycトランスジェニックマウスは92%にアデノーマが発生し、58%に肝細胞癌が発生した。一方、HGF/c-mycのダブルトランスジェニックマウスではアデノーマは33%であり、肝細胞癌は0%と有意に肝腫瘍の発生が減少した。われわれは、肝細胞特異的にHGFの発現するトランスジェニックマウスを作成した(G.Shiotaet al.Hepatology19,962-972,1994)ので、本マウスを用いてin vivoのHGFの抗腫瘍効果を検討した。具体的には、HGFトランスジェニックマウスとヌードマウスのキメラマウスを用いて肝癌細胞の肝臓への転移能の検討と、肝腫瘍の発生を促進すると報告されているTGFαやc-mycのトランスジェニックマウスを用いて検討した。1、HGFトランスジェニックマウスでの肝細胞癌の転移能の検討経門脈的に1X10^6個の肝癌細胞を導入し、肝転移を作成した。HuH7細胞を用いた場合、肝転移率は対照群の80%で、HGF群では20%へ低下した。Hep3B細胞、FaO細胞では、各々対照の83%、80%に対し、HGF群では40%、50%であった。総合して、肝転移率は対照群の81%に対し、HGF群では35%へと有意に低下した(p<0.05)。2、HGFとTGFαのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍発生の検討TGFαマウスでは約15か月で肝腫瘍が60%に発生した。HGFマウスでは0%であり、両者のダブルトランスジェニックマウスでは33%へ減少した。3、HGFとc-mycのダブルトランスジェニックマウスでの肝腫瘍の検討16か月の検討では、c-mycのダブルトランスジェニックマウスは92%にうアデノーマが発生し、58%に肝細胞癌が発生した。