hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本型チャータースクールと公教育行財政様式の変容

「学校選択制」の導入は「学校と教師との管理方式の改革」や「学力テストによる成果管理」と親和的に展開し、地域・学校・教師間に経営主義的競争文化を埋め込んでいる。最も目立つ変化は、公立学校間で入学者の集中校と流出校とが生じ、その格差が拡大する傾向である。入学者数格差の発生・拡大は「学校への評判の上下」の発生を引き金としており、評判格差は拡大化と固定化の傾向にある。「評判向上」に向けた学校・教師の競争的努力がなされる一方で、不人気校での「あきらめの気分」が確認された。しかし学校教育の全般的向上や、学校の「特色化」・「学校評価」の活用、国立・私立からの生徒の回帰といった政策意図の達成は見られず、父母の学校参加意識の全般的高まりも観察されなかった。入学数が著しく減少して「学校そのものの存亡の危機」が生じた場合、学校を場とする協力・努力と学校・教師への信頼回復のケースが例外的にあったが、集中校ではそのような参加意識・行動の高まりは観察されていない。中教審が掲げる「新しいタイプの公立学校」や「公立学校の管理運営の包括的な委託」は、日本型チャータースクールにおける学校設置の自由の模索である。そこには「国家の権力性」と「市民社会性」とのせめぎ合いがある。学校設置の自由については現行法制の基本枠を維持しながら例外措置として位置づけ、むしろ学校の管理運営面で新たな選択肢を、すなわち学校運営協議会制度に学校運営への父母参画の可能性を見出そうとしている。地方でも学校統廃合や複式化の回避、通学区域のゆがみ等に起因する問題の解消といった課題意識から学校選択制度の導入が始まっているが、学校の特色化の実体を備えるに至ったとはいえない。また制度導入時には行政情報依存傾向がみられ、市民社会への浸透は今後の課題である。初年度においては、以下の3つの課題に取り組んだ。1、学校選択をめぐる周到な集団的(地域総合的)実態調査を首都圏の3地域で実施するため、その調査協力のスタッフグループを大学院生を含んで形成し、行政・学校・教師・父母・子ども・住民を対象に想定した、調査企画を作成した。これと並行して首都圏の数市・区(品川、足立、荒川、日野、八王子、町田、鎌ヶ谷)を予備訪問し、資料収集にとり組んで、次年度の3地域比較本調査の地域選定を行った。2、米国のチャーター・スクールに関する資料・文献を収集し、また同様のテーマでの研究留学から帰国した研究者を招いて、アメリカ・ミネソタ州での最新の状況や、米国教育研究界でのこの問題の動向について学習した。また「世界の新自由主義教育改革の結果評価と、市民の権利」についての調査文献の検討を行った。3、日本の「教育改革」情勢の新たな展開として、中教審の「公立学校設置・管理運営制度の組み換え」に関する中間報告(12月)・答申(3月)を対象に、分担した検討会を行い、そこにチャーター・スクールを目指すNPOの意見がどれだけ反映しているのか、いないのか、この答申が「学校をつくる自由」をめぐって新しい情勢を示すものかどうか、についてその情勢評価を行った。新しい年度には、上記1・2・3点について、より系統的な研究を計画している。
学習者の多様性に対応するWWW日本語読解教材作成支援システムに関する研究

本研究の目的は、多様化した日本語学習者の対応した読解教材を作成を支援するシステムを開発することにある。具体的には、WWW情報のキーワード検索において、各学習者に相応しい漢字難易度、語彙難易度、ジャンルに絞り込むシステムをWWW上に作成した。漢字の難易度は日本語能力試験級別漢字表を参照し、学習者が指定する級よりも上級の漢字含有率が20%未満の文章に絞り込むシステムを作った。同様に、語彙の難易度も日本語能力試験級別語彙表と照合し、任意の級よりも上級の語彙が20%未満しか含まれない文章に絞り込むようにした。ジャンルは、歴史、地名、生物、美術、文学、人物、政治、用語の中から学習者がいずれかを選択すると、さらにジャンル毎に設定してあるカテゴリ別に絞り込みを表示した。今後の課題としては、ジャンルの妥当性を検討する必要がある。また、技術面では、システムをWWWサーバから各学習者のコンピュータにダウンロードして使用する方式に改善したい。そうることにより、WWWサーバのセキュリティの強化、また各学習者によるカスタマイズが可能となり、より使いやすいシステムとなることが期待できる。本研究は、日本語学習者に読ませたい内容や教えたい日本語表現の実際の使用例をWWW情報から検索し、さらに、各学習者に相応しい漢字および語彙の難易度と内容に絞り込むシステムを開発することを目的とするものである。平成17年度は、以下3点の研究計画を行った。1.与えられたキーワードを含むWWW情報を検索し、以下の3つの情報をもとに、絞り込みをするツールの開発(1)漢字の難易度:WWW文書中に使用されている漢字のほとんどが、利用者(学習者)の日本語能力試験の級に適合したものとなっているものに絞り込む。(2)語彙の難易度:同じく、文書中に使用されている語彙の難易度についても、日本語能力試験の級にあわせて、絞り込む(3)内容:文書内容に対し、経済、歴史、教育、工学、医学、スポーツなどの分野を指定しておく。2.日本語教師による、本ツールの実証実験3.ユーザ・インタフェイスの向上本研究は、日本語学習者に読ませたい内容や教えたい日本語表現の実際の使用例をWWW情報から検索し、さらに各学習者に相応しい漢字・語彙・内容に絞り込むシステムを開発することを目的とするものである。平成18年度は、17年度に開発したツール(下記3件)の精度およびユーザ・インタフェイスの問題点を洗い出すことを目的とし、日本語教師および日本語学習者に対して調査を行った。(1)漢字の難易度:WWW文書中に使用されている灘のほとんどが、利用者(学習者)の日本語能力試験の級に適合したものとなっているものに絞り込む。本研究は,日本語学習者に読ませたい内容や教えたい日本語表現の実際の使用例をWWW情報から検索し,さらに各学習者に相応しい漢字、語彙、内容に絞り込むシステムを開発することを目的とするものである。平成19年度は,17年度18年度に開発したツール(下記3件)の精度およびユーザ、インタフェイスの問題点を洗い出すことを目的とし,日本語教師および日本語学習者に対して調査を行った。(1)漢字の難易度:WWW文書中に使用されている漢字のほとんどが,利用者(学習者)の日本語能力試験の級に適合したものとなっているものに絞り込む。(2)語彙の難易度:同じく,文書中に使用されている語彙の難易度についても,日本語能力試験の級にあわせて,絞り込む(3)内容:ジャンル(歴史,地名,生物,美術,文学,人物,政治,用語)を指定して絞り込み,さらに自動的にカテゴリ(概要,年表,代表作,参考資料など)別に結果を表示する
新規磁性体粒子による胃癌腹膜播種の克服

腹膜播種の克服は胃癌の生存率の向上に必須である。腹膜播種は、原発巣から遊離した癌細胞が、大網の乳斑や横隔膜にあるリンパ管基始部(小孔、ストマータ)と呼ばれるリンパ装置に特異的に着床して生じると考えられている。本研究では、新規磁性体粒子(イットリウム鉄ガーネット)の腹腔内投与を行い、その磁性体粒子を選択的に乳斑やストマータに集約させたのちに磁場印加による加熱を誘導せしめ、その温熱効果にて、乳班やストマータに着床している腹膜播種の原因となる胃癌細胞を根絶させる治療技術の基礎開発を行う。
高分子液晶の構造およびその温度依存性と液晶紡糸繊維の特性との関連

1.高強力・高弾性繊維の一つであるポリアゾメチン繊維は、サーモトロピック液晶よりの紡糸で得られるが、本研究では繊維内の結晶構造および液晶の構造をX線解析により決定した。最も規則性の高い結晶は240°Cでの熱処理により得られるが、この結晶は三種の結晶学的に非同価な分子鎖からなる複雑な構造をとることが明らかになった。分子鎖はC-φ-C,N-φ-Nの実質的な結合軸についてシス型をとる伸び切ったコンホメーションをとる。液晶状態では、このコンホメーションがほぼ保たれていると思われるが、トランス型などの不整も導入される。このことが、紡糸したままの繊維では極めて結晶性が悪い原因となっており、更に200°C以下の熱処理で分子鎖に治った方向の配列の乱れの原因と考えられる。2.わん曲型位置感知型比例計数管を用い、結晶の熱膨張の異方性と分子鎖方向の弾性率を測定した。ほぼ平面状の分子鎖面が積み重なった方向の熱膨張は、その垂直方向の3倍も大きい膨張率を示し、この性質は、分子鎖軸まわりの回転的振動の温度上昇による増大で説明される。また結晶性の非常に異った三種の試料の結晶弾性率は118,123,135GPaを示し、最も結晶の規則性の高い試料が最大値を示したが、紡糸したままの結晶性の悪い試料でも118GPaという相当の値を示した。このことは、不整がある試料のマクロ弾性率は40GPa程度の小さい値を示しても、結晶領域では剛直分子の性質のために、かなり高い弾性率を保つことを示している。3. 1および2の結果から、分子レベルでの構造と物性との関連について、かなり明確な知見が得られたものと思う。このような分子レベルでの知見が、実際上の繊維の高性能化に必要な要因のいくつかを明らかにし得た点で、本研究は有意義であった。
脊髄の損傷範囲が手指の運動機能回復に及ぼす影響

本研究では、サルの脊髄損傷モデルを用いることで、脊髄の損傷部位の大きさが手指の器用な運動機能の回復過程にどのような影響を及ぼし、それによって機能回復の神経基盤に違いがあるのかどうかを明らかにすることを目的とする。初年度では、1頭のマカクザルで巧緻運動課題をできるようにトレーニングを行った。手指の筋肉の活動を記録するために、筋電図電極を12個の筋肉に埋め込んだ。また、慢性的に複数の脳領域から脳活動を記録するために皮質脳波電極を埋め込んだ。脊髄を損傷させる前に、巧緻運動中の脳活動・筋活動・手指の動きを記録した。先行研究では外側皮質脊髄路のみを損傷させたモデルを用いて回復過程を調べた。その結果、手指の巧緻性は約3か月後には回復した。本実験では第4頚髄と第5頚髄間の境界部において、外側皮質脊髄路が下行する側索の範囲を超え、前索の一部まで損傷したモデル動物を作成した。脊髄損傷後、サルは毎日リハビリテーションを行い、回復過程と脳活動・筋活動を5か月間に渡って記録した。損傷から約1か月後、到達把持運動ができるようになり、徐々に手指が動くようなった。しかし、5か月経過しても巧緻性は完全に回復することなく、本研究のような大きな損傷モデルでは、巧緻性が完全に回復しないことが明らかになった。脳活動においては、損傷と反対側の一次運動野の高ガンマ帯域の活動と損傷と同側の運動前野のベータ帯域の活動が、損傷前と比べて有意に大きくなることが明らかになった。本年度では、同一個体に巧緻運動課題をトレーニングした後、筋電図電極と皮質脳波電極を慢性的に埋め込み、先行研究の損傷モデルよりもさらに大きい損傷モデルを作成し、回復過程および脳活動を記録することができた。さらに、記録終了後は下行路を確かめるため、順行性トレーサーを両側の一次運動野に注入した。このように一頭のモデル動物から損傷前後の行動データ・脳活動データ・組織データを得ることができた。今後は個体差を検討するため、別なサルを用いて巧緻運動をトレーニングし、筋電図電極と皮質脳波電極を慢性的に埋め込んで、精髄損傷後の行動データ・脳活動データを記録する。さらに、記録終了後には、下行路を確かめるため、順行性トレーサーを一次運動野に注入する。解析においては、皮質脳波電極から得られたデータを基に、各電極間のグレンジャー因果性を計算し、脳領域間の因果関係を明らかにしていきたい。既存にいた動物を使えることなり、新規に購入する必要がなくなったため。
卵巣癌に於ける転移能獲得機序の解明;遠隔臓器転移モデル・マウスと,サブトラクションクローニング法を用いて

癌の転移は複雑な生命現象である。現在まで転移を制御するマスター遺伝子は同定されておらず、多数の遺伝子が協調的に発現し、転移を成立させているものと思われる。従って、従来の単一の遺伝子に注目した解析法では、転移の全貌を明らかにするのは困難であると思われる。近年急速に普及したマイクロアレイ解析法は、同時に多数の遺伝子の解析を可能にし、転移のメカニズムの分子レベルでの解析を大きく前進させる可能性を秘めていると思われる。我々が開発した卵巣がん遠隔転移モデルにおいて、当教室で樹立した漿液性腺癌細胞株を用いた転移実験の結果、現在まで判明していることはp53,bcl-2遺伝子が癌転移に関して重要なことであるということが判明した。理由は当教室で樹立したTAC3細胞をヌードマウスの卵巣に移植しヌードマウスの生存日数、転移数、形成された腫瘍の重量を検討し最も転移したマウスの卵巣腫瘍の発現遺伝子の検討から判明した。さらにras遺伝子とmutant p53を遺伝子がともに存在する卵巣癌様細胞(正常顆粒膜細胞にmutantp53と、mutant rasを遺伝子導入した細胞株)を用いた実験から、それらを用いた実験群がより高転移能を発揮するということが判明した。そこで現在amaxa biosystem社のnucleofector TM装置(エレクトロポレーション法)を用いた遺伝子導入実験を行っている。スクリーニング法により代表的な卵巣癌細胞株のmutation遺伝子を検討した。具体的にはSKOV3,OVCAIII, PAI-1と当科で樹立したYKT, TAC3の卵巣癌細胞株を用いた。その中でもっとも活性の高いmustant p53をもつ細胞株はOVCAIIIであることが判明した。またその細胞株内にはほとんどmutant rasが存在しないことも判明した。動物実験においてもOVCAIIIの同所移植実験における転移能はほとんどないことが判明した。従ってmutant p53のみ存在する代表的な卵巣癌細胞(OVCAIII)にmutant rasを挿入し新たな高転移株樹立を試みmutantp53とmutant rasの共存が転移に対して重要であるかどうかを現在検討中である。
雄ゲノムのみに由来する個体<Paternal-derived mouse>の作製

MRL/MpJ(MRL)マウスに出現する精巣内卵細胞の責任遺伝子は少なくとも2つあり、1つはY染色体に、もう1つはホモ劣性を示し、常染色体上に存在することがわかった。また、MRLマウス胎子精巣では、胎齢(E) 12. 514. 5にかけて、精巣の頭側辺縁や中腎との境界部に位置する一部の性染色体組成XYの始原生殖細胞が減数分裂に移行し、卵細胞へと分化することが明らかになった。通常、哺乳類の雌は卵巣内で卵のみを、雄は精巣内で精子のみを産生する。しかし、生後間もないMRL/MpJ(MRL)マウスの精巣では卵細胞が観察される。これまでの研究から、この精巣内卵細胞は卵巣内卵細胞と類似した形態学的特徴を有すること、また複数存在する責任遺伝子の内、少なくとも1つはY染色体上に存在することが明らかになっている。今年度は、MRLマウスに出現する精巣内卵細胞の出現要因の解析行うため、戻し交配系マウスの作出と観察を行った。具体的に、Y染色体のみがMRLマウスに、その他の染色体がC57BL/6(B6)マウスに由来するコンソミックマウスであるB6-Y^<MRL>、ならびにY染色体のみがB6マウスに、その他の染色体がMRLマウスに由来するコンソミックマウス、MRL-Y^<B6>マウスを作製した。MRLマウス由来のY染色体を有する戻し交配系マウスでは、コンソミックマウスを含む各世代のマウスで精巣内卵細胞が出現し、精巣内卵細胞はMRLマウス由来のY染色体のみで産生可能なことが推測された。驚くべきことに、MRLマウス由来のY染色体をもたないMRL-Y^<B6>マウスでも精巣内卵細胞が観察された。このことは、常染色体上にも責任遺伝子が存在することを意味する。さらに、雌のMRLマウスと雄のB6マウスの間で作製したMRLB6F1では精巣内卵細胞が出現しないことから、この常染色体上の責任遺伝子は、ホモ劣性を示すことが示唆された。精巣内卵細胞産生に関与する常染色体上の因子を明らかにするため、MRLマウスとB6マウスの間でN2マウスを作出し、QTL解析を行った結果、15番染色体の1117cM領域にSignificant Levelを超える相関が観察され、精巣内卵細胞産生の原因遺伝子座である可能性が示された。哺乳類の生殖細胞の性分化は胎子期に雌の生殖細胞が減数分裂に移行する一方で、雄の生殖細胞が有糸分裂で停止することにより起こり、その結果、雌は卵巣内で卵のみを、雄は精巣内で精子のみを産生する。しかしながら、生後間もないMRL/MpJ(MRL)マウスの精巣は精細胞だけでなく、卵細胞も産生する。これまでの研究から、精巣内卵細胞は卵巣内卵細胞と同様、胎子期に減数分裂を経て形成されることがわかっている。今年度は、本来胎子精巣内で阻害されているはずの減数分裂がなぜ起こるのか、そのメカニズムを明らかにするため、減数分裂開始マーカー、Stra8にGFPを融合させた導入遺伝子を有するトランスジェニックマウス(ICR.Cg-Tg(Stra8-EGFP)2Ysa/YsaRbrc;Tg)の雌とMRL雄マウス間でF1マウス(TgMF1)を作出し、その表現型を解析した。まず、生後14日齢のTgMF1マウスで、精巣内卵細胞の出現を検証した結果、精巣内卵細胞はMRLマウスとほぼ同等の出現頻度で観察された。次に胎齢(E)12.518.5の生殖腺を観察したところ、GFP陽性細胞はE12.514.5の卵巣と精巣で検出され、特に精巣内のGFP陽性細胞は中腎境界部と頭側辺縁に局在していた。また、E13.5のTgMF1マウス精巣をGFP陽性領域と陰性領域に分割し、領域間で雌雄体細胞マーカーの遺伝子発現を比較した結果、GFP陽性領域では雌性体細胞マーカーであるFoxl2がGFP陰性領域に比べて高発現していることがわかった。このように、胎子精巣内の一部の生殖細胞は、卵巣内卵細胞と同様、E12.514.5に減数分裂に移行し、後に精巣内卵細胞に分化することが示された。またこの現象には、周囲体細胞の雌化が関与していると考えられた。
口腔内での脂肪・脂肪酸認識における脂肪酸トランスポータに関する研究

研究の背景と目的不飽和脂肪酸による単離味細胞の活性化、脂肪酸トランスポータCD36/FATの有郭乳頭味蕾での発現などが報告され、脂肪・脂肪酸が味細胞で認識されている可能性が再認識されている。この仮説が真実ならば、脂肪摂取をコントロールする上で新しい方向性を与えうると考えられる。申請者は生理条件に応じて脂肪酸トランスポータの発現が調節されていることを示すことで,この仮説を強化できるとの発想から本研究を立案した。研究成果ラットの有郭乳頭及び葉状乳頭味蕾、茸状乳頭味蕾で脂肪酸トランスポータCD36/FATが発現していることを報告した。有郭乳頭と葉状乳頭では、CD36/FATの発現パターンと発現量が異なることが明らかになり、それぞれの乳頭でCD36/FATが異なる機能を発揮している可能性を考えた。そこで、異なる濃度の脂肪を短時間摂取させ、その刺激に応じて発現がどうのように変化するかをラットを用いた行動学的実験にて解析した。その結果、脂肪への嗜好性とは明確な相関は認められなかったが、葉状乳頭でのCD36/FAT変動は有郭乳頭のそれに比べ大きいということは再現され、また、葉状乳頭では酸化した脂肪に対してCD36/FATが変動している可能性が示唆された。葉状乳頭と有郭乳頭では入力している味神経が異なり(前者は鼓索神経と舌咽神経、後者は舌咽神経のみ)、また、各味神経の脂肪への応答はことなることが報告されている。したがって、この結果は、両乳頭味蕾におけるCD36/FATの機能に違いがあることを示唆していること、また、その機能が品質劣化した(酸化した)脂肪の検出または認識にある可能性が考えられた。研究の背景と目的脂肪が与える口腔内での感覚は、基本的には触覚であり、味蕾を介する化学感覚(味覚)ではないと考えられてきた。しかし、不飽和脂肪酸による単離味細胞の活性化、脂肪酸トランスポータFAT(fatty acid transporter)の味蕾での発現などが報告され、脂肪・脂肪酸が味細胞で認識されている可能性が再認識されている。研究成果ラットの有郭乳頭及び葉状乳頭味蕾での各種脂肪酸トランスポータ(FAT, FATP, VLCS)の発現をreal-time RT-PCRにて解析した。その結果,FATPとVLCSは味蕾以外の上皮細胞にも発現していることがわかったので,以降の解析から除外した。FATについては味蕾で発現していることが確認された。FATの味蕾での機能を調べるため,摂取した脂肪の量およびその嗜好性とFAT発現量との相関をラットの行動学を使って検討した。その結果,摂取脂肪量または脂肪への嗜好性の上昇とFAT発現量との間には明確な相関は認められなかった。この解析において,有郭と葉状乳頭味蕾のFAT発現パターンには違いがあることがわかった。有郭乳頭では摂取脂肪量または脂肪への嗜好性とは関わりなく,FATの発現量はほぼ一定かつ低レベルであった。一方,葉状乳頭味蕾では発現量の変動は大きく,かつ有郭乳頭の数倍から数十倍の発現レベルを示した。この結果は両乳頭味蕾におけるFATの機能に違いがあることを示唆している。また,葉状乳頭における発現の変動はスクロース共存下で顕著化する傾向を示したことから,スクロース(または,糖)との関連性の観点からも研究を進めている。
概日時計DNAシス配列のシステムバイオロジー

1日周期で繰り返す生理機能リズムは、生物が地球環境の24時間サイクルに適応して獲得した生体システムであり、このリズムを生み出す機構は概日時計と呼ばれる。哺乳類では、さまざまな組織において特徴的な遺伝子にリズム性が見られ、約43%もの遺伝子は全身のどこかの臓器においてリズミックに発現していることが報告された。そのため、体内時計の破綻は、高血圧、発癌、免疫異常、代謝異常、白内障、高次脳機能障害、など様々な疾病の発症リスクを増大させる。本研究では、時計シス配列に着目したゲノム編集技術を大規模に展開し、24時間周期の時計振動の仕組みと、そこからの時計機能出力に不可欠な転写制御を同定する。
高等植物におけるホウ素の吸収移行に必須な遺伝子の単離と解析

1.BOR1遺伝子の同定1000株のF2植物について、Bor表現型とPCRを用いた分子マーカの解析をおこなうことにより、詳細なマッピングを行なった。その結果、BOR1遺伝子が第2番染色体上の約15kbの領域に存在することを明らかにした。そこで、この領域の塩基配列をbor1-1変異株について決定したところ2ヵ所の変異が見つかった。このうち一つはあるORFに落ちていたので、bor1-2変異株においても塩基配列を決定したところ、共通のORFの異なる場所に変異が見つかった。Allelicな2種の変異株において同じORFに変異が見つかったこととから、このORFをBOR1遺伝子と考えている。このORFを含む領域を、bor1-1変異株に導入し、形質転換植物を得た。T1世代でBor表現型が回復したように思われた株も見られたので、次世代において表現型を確認するために種子を採取した。3.新規ホウ素変異株の解析新たに単離したbor1-1変異株の復帰突然弯異体のBackcrossを行うとともに、復帰突然変異株においてもbor1-1変異が存在することを明らかにした。さらに、ホウ素に関係する数種類の変異株の候補をスクリーニングによって得た。3.ホウ素栄養によって発現制御を受ける遣伝子群の解析Differential Display法やイネのマイクロアレ-を用いてシロイヌナズナにおいてホウ素欠乏によって発現制御を受ける遺伝子を検索した。1)BOR1遺伝子の詳細なマッピング本研究の開始時点では、BOR1遺伝子は第2番染色体上のマーカー40E1T7と90J19T7で挟まれる約1Mbの領域に存在することを明らかにしていた。今年度はこの領域にPCRマーカーを作成するなどして、BOR1遺伝子の存在する領域を約200Kb程度の範囲に狭めた。2)新規ホウ素変異株の解析ホウ素栄養に関する数種の変異株のスクリーニングを行った。葉の生長を指標にして行ったスクリーニングからは3つのラインが得られ、このうち一つのラインではF2世代で表現型がほぼ3:1に分離した。このラインはbor1-1との掛け合わせ実験によって、BOR1遺伝子座に変異をもっている可能性が示唆された。根を指標にしたスクリーニングからは、数種の変異株が見られ、表現型がF2で3:1に近い分離を示すラインも見つかった。3)ホウ素栄養によって発現制御を受ける遺伝子群の解析シロイヌナズナにおいてホウ素によって発現制御を受ける遺伝子のdifferential displayによる単離を試みた。発現量が異なると思われたDNA断片をプローブとして用いてノーザンハイブリダイゼーションによってRNAの検出を行ったが、ホウ素栄養によって発現制御されるtranscriptを検出することはできなかった。4)bor1-1変異株におけるホウ素の吸収実験と元素分析bor1-1変異株についての詳細なホウ素の安定同位体を用いたトレーサー実験を行ったところ、bor1-1変異株では、低ホウ素濃度域でのホウ素の吸収量が野生型に比べて大きく少ないことが明らかになった。また、低ホウ素濃度域ではシロイヌナズナは濃度勾配に逆らってホウ素を吸収していることが明らかになった。また、bor1-1変異株について元素分析を行った。ホウ素以外の必須要素や重金属では大きな違いが見られなかったが、ホウ素濃度は大幅に減少していた。
人工天然物の創製

ペプチド性天然物には、修飾型の主鎖骨格が多く見受けられる。これら特徴的な主鎖骨格は、ペプチド性天然物が強い生理活性を示す上で重要な構造モチーフであり、主鎖修飾型のペプチドは天然物としてだけでなく、人工の生物活性分子候補としても利用価値が高いと言える。本研究では、様々な人工アゾリンペプチドの合成が可能な、試験管内人工生合成系(FIT-PatD)を確立した。さらに、化学的な修飾反応を組み合わせることで、より多彩な主鎖骨格を有するペプチドの生産も実現した。生物活性天然物の改変を行った既存の研究では、化合物の構造を変更し、より良い活性や薬物動態を示す者に『改良』するものが中心であった。一方で本研究では、天然には存在しない人工の生物活性を有する天然物様化合物(人工天然物)をゼロから『創製』することを目標とする。人工天然物の候補としては、主鎖にヘテロ環骨格を持つペプチドに着目した。本計画では、1.主鎖に多彩なヘテロ環を含むペプチドの試験管内生合成系の開発、2.この系を用いて作成した化合物ライブラリーから望みの生物活性分子の探索法の確立、を小目標として設定する。これらを順次達成し、任意の生物活性を示す人工天然物の創製手法を構築することを最終目標とする。平成27年度の研究では、酵素的な翻訳後修飾反応と化学的な翻訳後修飾反応とを組み合わせることで、種々の主鎖修飾型ペプチドの試験管内生合成系の構築に成功した。具体的には、当初の計画通りに、遺伝暗号のリプログラミング法を用いた人工アミノ酸(ハロトレオニン誘導体)を含むペプチド鎖形成・PatD酵素による主鎖アミド結合の脱水ヘテロ環化・化学的な脱ハロゲン化水素反応を経ることで、メチルアゾール骨格を主鎖にもつペプチドの試験管内生合成を達成した。一方、PatD酵素により構築したアゾリン骨格を化学的に還元することで特徴的なアゾリジン骨格の生成にも成功している。これら当初の計画で立案した系に加え、アゾリンを直接的に参加し対応するアゾール環骨格へと導けることも見出した。当初計画していたメチルアゾール骨格含有ペプチド・アゾリジン骨格含有ペプチドの試験管内生合成に加え、より汎用的な酸化反応を用いるアゾール骨格含有ペプチドの生合成法の確立にも成功した。27年度に確立した人工生合成系の最適化と適用範囲を拡げる研究を展開する一方で、当該生合成系を天然物様化合物ライブラリーの構築に応用することで、新奇生物活性分子の探索も実施する計画である。ケミカルバイオロジー
B型肝炎ウイルス感染マウスを用いたゲノム編集によるHBVｃｃｃDNAの排除

HBV感染マウスに対し、ヒトPBMCを投与することにより、重症肝炎モデルを作製した。しかしHBV持続感染および慢性肝炎モデルの作製には至っていない。GVHDあるいは移植肝細胞と投与したヒトPBMCのアロ応答が原因と思われ、これらの反応を抑制する工夫が必要と考えている。高用量の抗HBV薬(entecavirおよびPEG-IFN)を組み合わせて投与することにより、血中HBV DBAあるいは肝臓内cccDNAは低下することが確認された。この結果は、免疫システムがなくとも、薬剤により肝臓内cccDNAを十分に低下させることにより、薬剤中止後も肝臓内HBVの制御が可能となることを示すものであったが、本研究の目的として、アデノウイルスベクターを用いたCRISPR-Cas9システムの作製およびHBV培養細胞を用いたターゲット遺伝子の探索を挙げていた。CRISPR-Cas9システムはすでに作製済みであるが、アデノウイルスベクターへの挿入するAdeno-CRIPR-Cas9の作製が未実施である。来年度以降、手技的な検討を再考し、Adeno-CRIPR-Cas9の作製を行っていく。より高度な免疫不全マウスに肝細胞移植を行い、HBV感染、ヒトPBMC投与を行い、HBV持続感染および特異的CTLによる肝炎モデルの作製を試みる。GVHDに対しては、マウスと反応を起こさないヒトPBMCを探索していく。肝細胞とのアロ応答の抑制には、あらかじめdish内にてPBMCと移植肝細胞を共培養し、応答を起こさなかったPBMCを選出し投与するなどの工夫を行っていく。抗HBV薬で肝臓内HBV cccDNAを十分低下させることに加え、さらにCRIPR-Cas9システムを用いることにより、HBV cccDNAが排除される可能性がある。引き続きHBV感染マウスを用いて肝臓内cccDNAを低下させる抗HBV薬の探索を行う。またCRISPR-Cas9をアデノウイルスベクターに挿入し、Adeno-CRIPR-Cas9を作製し、HBV発現細胞においてその有効性を検証する。昨年度と同様に本年度も研究代表者は、本研究に十分な時間を費やすことが困難であった。来年度は研究協力者と伴に研究への時間を十分に確保することとしている。最終的にはB型慢性肝炎モデルマウスを作製し、これを用いて抗HBV薬およびCRIPR-Cas9システムによるHBV完全排除を行うことを目的とする。B型肝炎ウイルス(hepatitis B virus:HBV)を感染させたヒト肝細胞移植uPA/SCIDマウスに対し、entecavir 2 mg/kg/日を連日、あるいはPEG-IFNα2a 30μg/kg×2回/週を6週間投与することにより、血中HBV DNA量はそれぞれ3.6、1.3 log copy/mL減少した。また両薬剤を併用投与することにより、より強い抗ウイルス効果を認め、血中HBV DNA量は投与5週後には検出感度以下に低下した。さらに薬剤投与量を増量し、entecavir 20 mg/kg/日連日およびPEG-IFNα2a 300μg/kg×2回/週を併用投与したところ、投与3-4週後に血中HBV DNAは検出感度以下となった。Real-time PCR法により測定した肝臓内cccDNA量は、治療前1.81±0.55copy/ hepatocyteであったが、entecavirおよびPEG-IFNα2aを高用量で6週間併用投与したマウスでは、0.12±0.10copy/hepatocyteに減少した。治療終了後さらに観察した5頭のマウスのうち、2頭のマウスでは治療終了8および9週後に血中HBV DNAが再陽性化したが、3頭のマウスでは治療終了13週後まで検出感度以下が維持された。血中HBV DNAが再上昇した2頭のマウスでは、血中のHBsAgおよびHBcrAg量が治療終了後に上昇していた。治療終了13週後の肝臓内cccDNAは、血中HBV DNAが再陽性化した2頭のマウスでは0.83±0.47copy/ hepatocyteであったが、血中HBV DNAが検出感度以下を維持していた3頭のマウスでは0.08±0.05copy/ hepatocyteとより低値だった。以上のようにHBV感染マウスを用いて、高用量のentecavir、PEG-IFNの併用療法により、より早期の血中ウイルス陰性化が得られ、肝臓内cccDNAの低下を認めることが確認された。この結果は、免疫システムがなくとも、薬剤により肝臓内cccDNAを十分に低下させることにより、薬剤中止後も肝臓内HBVの制御が可能となることを示すものと思われた。HBV感染マウスを用いて、高用量のentecavirおよびPEG-IFNを併用投与することにより、より早期の血中ウイルス陰性化が得られ、肝臓内cccDNAの低下を認めることが確認された。この結果は、免疫システムがなくとも、薬剤により肝臓内cccDNAを十分に低下させることにより、薬剤中止後も肝臓内HBVの制御が可能となることを示すものであったが、本研究の本年度の目的として、アデノウイルスベクターを用いたCRISPR-Cas9システムの作製およびHBV培養細胞を用いたターゲット遺伝子の探索を挙げていた。

GVHDあるいは移植肝細胞と投与したヒトPBMCのアロ応答が原因と思われ、これらの反応を抑制する工夫が必要と考えている。高用量の抗HBV薬(entecavirおよびPEG-IFN)を組み合わせて投与することにより、血中HBV DBAあるいは肝臓内cccDNAは低下することが確認された。この結果は、免疫システムがなくとも、薬剤により肝臓内cccDNAを十分に低下させることにより、薬剤中止後も肝臓内HBVの制御が可能となることを示すものであったが、本研究の目的として、アデノウイルスベクターを用いたCRISPR-Cas9システムの作製およびHBV培養細胞を用いたターゲット遺伝子の探索を挙げていた。CRISPR-Cas9システムはすでに作製済みであるが、アデノウイルスベクターへの挿入するAdeno-CRIPR-Cas9の作製が未実施である。来年度以降、手技的な検討を再考し、Adeno-CRIPR-Cas9の作製を行っていく。EntecavirあるいはPEG-IFNα2aなどの抗ウイルス薬で肝臓内HBV cccDNAを十分低下させることに加え、さらにCRIPR-Cas9システムを用いることにより、HBV cccDNAが排除される可能性がある。引き続きHBV感染マウスを用いて肝臓内cccDNAを低下させる抗HBV薬の探索を行う。またCRISPR-Cas9をアデノウイルスベクターに挿入し、Adeno-CRIPR-Cas9を作製し、HBV発現細胞においてその有効性を検証する。本年度、研究代表者は、本研究に十分な時間を費やすことが困難であった。来年度は研究協力者と伴に研究への時間を十分に確保することとしている。より高度な免疫不全マウスに肝細胞移植を行い、HBV感染、ヒトPBMC投与を行い、HBV持続感染および特異的CTLによる肝炎モデルの作製を試みる。GVHDに対しては、マウスと反応を起こさないヒトPBMCを探索していく。肝細胞とのアロ応答の抑制には、あらかじめdish内にてPBMCと移植肝細胞を共培養し、応答を起こさなかったPBMCを選出し投与するなどの工夫を行っていく。抗HBV薬で肝臓内HBV cccDNAを十分低下させることに加え、さらにCRIPR-Cas9システムを用いることにより、HBV cccDNAが排除される可能性がある。昨年度と同様に本年度も研究代表者は、本研究に十分な時間を費やすことが困難であった。最終的にはB型慢性肝炎モデルマウスを作製し、これを用いて抗HBV薬およびCRIPR-Cas9システムによるHBV完全排除を行うことを目的とする。
体軸情報を備えた胚様体の作製

マウスのES細胞を浮遊培養すると、胚様体という凝集塊を形成する。その後、三胚葉を形成し、様々な組織を形成するが、極めて無秩序に分化するため、人為的に分化を制御することは難しい。そこで胚様体の性質のばらつきを調べるために、in situ hybridization法で各種分化マーカの染色をおこなった。その結果、同一シャーレ内の胚様体間だけでなく、単一胚様体内の細胞間でも性質のばらつきが非常に大きいことが明らかになった。特に中胚葉マーカは、day 8の胚様体でも約半数しか発現しておらず、さらに単一胚様体内においても発現細胞の分布はまばらであり、マウス胚のようにクラスター化されていなかった。また、原条前方マーカの発現も同様のばらつきを示したので、中胚葉の運命決定も無秩序であることが示唆された。そこで中胚葉の運命決定を均一なものにするために、FGFシグナルに着目した。マウス初期発生において、中胚葉の運命決定はFGFシグナルの濃度に依存する。したがって化学合成阻害剤でFGFシグナルのレベルを均一化できるのではないかと考えた。まず阻害剤の選別のために、マウス胚を各種FGFシグナル阻害剤で全胚培養し、FGFシグナル標的遺伝子の発現を調べたところ、PD173074という阻害剤が最も特異的かつ効果的であった。また、この阻害剤で受精後6-7日のマウス胚を培養したところ、Fgf8やその受容体Fgfr1の欠損胚と同様、沿軸中胚葉や中軸中胚葉マーカの発現異常を示した。特に沿軸中胚葉マーカの発現は阻害剤の濃度依存的に低下した。以上の結果より、胚様体のFGFシグナルをコントロールするための阻害剤として、PD173074は最も有力な候補であり、マウス胚においてはFGFシグナルのレベルを時期特異的にコントロールできることが明らかになった。マウスES細胞懸濁液を浮遊培養すると、胚様体と呼ばれる凝集体を形成することが知られている。本研究代表者はマウス初期発生胚に近い性質の胚様体を得ることを目的とし、既報の胚様体形成法を試し、最初に形態観察で比較した。培地はDMEMにウシ血清を加えたものを使用した。Feeder細胞上にてLIF含有培地で培養したES細胞をtrypsinizeし、その懸濁液をLIF不含培地で浮遊培養およびhanging drop培養を行ったが、臓側内胚葉様の細胞層の形成がほとんど見られないだけでなく、内側の細胞は胚盤葉下層様の形態を示さなかった。そこで今度はtrypsinizeしたES細胞をLIF不含培地で接着培養し、三日後に短時間のtrypsin処理で得られた細胞凝集体をLIF不含培地で浮遊培養した。この条件では臓側内胚葉様の細胞層の形成が高頻度に見られ、内側の細胞は胚盤葉下層様の円柱上皮形態を示した。以後、この条件で胚様体を作製し、各種マーカ遺伝子の発現をin situ hybridization法で調べ、初期発生胚の発現パターンと比較した。臓側内胚葉マーカは浮遊培養開始後1日(d1)より発現が見られ、d3までに最外層に限局した。内部細胞塊マーカはd3より発現の低下が見られ、内層で胚盤葉下層マーカの発現に置き換わっていくのが観察された。後者はd6より発現が低下し、それと呼応するように中胚葉マーカの発現が内層で観察された。このように、本法で作製した胚様体は、初期発生胚と同様の発現パターンと時間変化を示すことが明らかになった。

以上の結果より、胚様体のFGFシグナルをコントロールするための阻害剤として、PD173074は最も有力な候補であり、マウス胚においてはFGFシグナルのレベルを時期特異的にコントロールできることが明らかになった。
π^+π^-原子の寿命測定によるQCDの検証

この研究の目的はπ+πの束縛状態A_<2π>の寿命の直接測定実験をおこなうことにより,QCD(量子色力学)のカイラル対称性の破れに関する低エネルギー領域での検証を行う実験(PS212,通称DIRAC)をCERNで行うことである.実験は1997年秋からビームラインの建設が始められ,1998年春からスペクロトメータ及び検出器の設置にかかり,同秋からテストビーム,1999年から本実験にかかる予定になっている.この計画の中で我々は日本側の主に担当するセカンドレベルトリガーに関連する検出器,すなわちScifiホドスコープとdE/dxカウンター,及びその読出しのためのピークセンシング回路の制作と最終テストを行った.シンチレーティングファイバーを用いたビームホドスコープについてはピークセンシング読み出し回路とともにテストを行って十分所期の性能(検出効率,位置・時間分解能)が得られることを実証した.それと平行してトリガーシグナルを作るための論理回路を設計し,プロトタイプを制作し,ビームを用いてテストを行った.この結果に基づいて本実験に向けて現在回路の制作が進められている.さらにすでに準備されてきたプラスティックdE/dxカウンターに変えてシリコンのマイクロストリップを用いたdE/dxカウンターを使用するための準備を開始した.この研究の目的はπ+πの束縛状態A_<2π>の寿命の直接測定実験をおこなうことにより,QCD(量子色力学)のカイラル対称性の破れに関する低エネルギー領域での検証を行う実験(PS212,通称DIRAC)をCERNで行うことである.実験は1997年秋からビームラインの建設が始められ,1998年春からスペクロトメータ及び検出器の設置にかかり,同秋からテストビーム,1999年から本実験にかかる予定になっている.この計画の中で我々は日本側の主に担当するセカンドレベルトリガーに関連する検出器,すなわちScifiホドスコープとdE/dxカウンター,及びその読出しのためのピークセンシング回路の制作と最終テストを行った.シンチレーティングファイバーを用いたビームホドスコープについてはピークセンシング読み出し回路とともにテストを行って十分所期の性能(検出効率,位置・時間分解能)が得られることを実証した.それと平行してトリガーシグナルを作るための論理回路を設計し,プロトタイプを制作し,ビームを用いてテストを行った.この結果に基づいて本実験に向けて現在回路の制作が進められている.さらにすでに準備されてきたプラスティックdE/dxカウンターに変えてシリコンのマイクロストリップを用いたdE/dxカウンターを使用するための準備を開始した.本DIRAC実験(PS212)はCERNのSPSLCによって正式に推薦を受け,実施のスケジュールが決り,ビームラインの建設が始められることになった.本年度中にはトリガーカウンター,後方ホドスコープ,チェレンコフカウンタ,ドリフトチェンバー等についてプロトタイプモジュールを製作しテストを行った.日本側の主に担当するシンチレーティングファイバーを用いたビームホドスコープについては,実際の1/3のプロトタイプ2基を製作し,さらに読出し情報のディジタイゼーションのためのピークセンシング回路(PSC)を製作して高強度ビーム中でのテストを行い,期待どおり十分なアクセプタンスと不要イベントの棄却率が得られることを実証した.このカウンター情報とdE/dxカウンターからの情報を組合わせてトポロジカルトリガーシグナルを作るためのTLCについてもプロトタイプを製作しテストを行った.これについてはさらにシミュレーション等を用いてデザインの改良を行い,テストを続け,1997年春までにプロトタイプを完成の予定で準備を進めている.さらにホドスコープ情報をトラッキング情報として読込むためのディジタルパイプラインについてもデザインが完成した.さらにdE/dxカウンターのバックアップ及びトラッキング情報の補完のための半導体マイクロストリップチェンバーについてもその準備を始めつつある.今後の予定としては1997年中にはテストビームが4月から9月まで与えられ,テスト実験は1998年より,本実験は同年9月から開始されることになったため,それに合わせてハード,ソフトの準備を進めている.さらに上記のトポロジカルトリガーデバイスについての今までの研究結果を出版した.この研究の目的はπ+πの束縛状態A_<2π>の寿命の直接測定実験をおこなうことにより,QCD(量子色力学)のカイラル対称性の破れに関する低エネルギー領域での検証を行う実験(PS212,通称DIRAC)をCERNで行うことである.実験は1997年秋からビームラインの建設が始められ,1998年春からスペクトロメータ及び検出器の設置にかかり,同秋からテストビーム,1999年から本実験にかかる予定になっている.本年度にはそこで日本側の主に担当するセカンドレベルトリガーに関連する検出器の制作と最終テストを行った.シンチレーティングファイバーを用いたビームホドスコープについてはフルモデルを制作し,ピークセンシング読み出し回路とともにテストを行って十分所期の性能(検出効率,位置・時間分解能)が得られることを実証した.それと平行してトリガーシグナルを作るための論理回路を設計し,プロトタイプを制作し,ビームを用いてテストを行った.この結果に基づいて本実験に向けて現在回路の制作が進められている.さらにすでに準備されてきたプラスティックdE/dxカウンターに変えてシリコンのマイクロストリップを用いたdE/dxカウンターを使用するための準備が開始された.
認定看護師教育におけるポートフォリオを導入した教育支援プログラムの開発

緩和ケア認定看護師教育課程にポートフォリオを導入した。ねらいは入学時に自分で目的を設定し、自身で学習計画を立案実施できること、自己の成長が可視化でき、教育課程修了時には成長を自己評価できることである。学習プログラムの内容は、面接4回、研修生同士のピア評価、発表会を計画的に行った。その結果、ポートフォリオの活用は緩和ケア認定看護師に必要な対人関係能力、自己学習能力の向上に役立つことが明らかになった。本研究はホスピスケア(現:緩和ケア)認定看護師教育におけるポートフォリオ導入による教育支援プログラムの開発を目的としている。今回は、研修期間を修了した受講生を対象にインタビュー調査を行ない、同意を得られた22名の結果を分析し、ポートフォリオの効果を考察した。その結果、「自己の内面を見つめ仲間に表出する」「仲間との共有・分かち合う関係を構築」「自己の思考・自己の課題の明確化」「自己肯定」の4つのカテゴリーが抽出された。対象の痛みを全人的に捉えることが重要な緩和ケアにおいて、緩和ケア認定看護師にはスピリチュアルケアの実践能力が期待されている。そのため、看護を提供する看護師自身が対象の苦しみに向き合う勇気や姿勢が必要である。ポートフォリオを活用することで、各々が自己の内面をみつめ自分の弱みや強み、過去の自分を捉え直し肯定的に自己を捉えることにつながっていた。この体験は苦しむ患者の気持ちに寄り添う心を育むものであると考える。従って、ポートフォリオの活用は、対象の内面をみつめ、スピリチュアルペインに気づく力、対象に向き合える心を養うのに役立っていると考えられる。また、自己表現力、対人関係能力の向上は、認定看護師に期待されるマネジメント能力などを養うのにも有効ではないかと考えられた。さらに、この結果をもとにポートフォリオガイドを作成し、19年度入学生16名に教育支援プログラムを実践した。現在、修了時のインタビュー調査によりその効果を分析しているところである。次年度に向けて、緩和ケア認定看護師教育に有効なポートフォリオ導入による教育支援プログラムの内容精選および教育方法の構造化を明らかにしたい。本研究は緩和ケア認定看護師教育におけるポートフォリオ導入による教育支援プログラムの開発を目的としている。今回は、前年度の結果をもとにポートフォリオガイドを作成し、実践した。その構造は、まず、入学時に(1)1年後の認定看護師像を思い描く(2)なりたい自分に近づくための目標を立てる(3)自己と組織をみつめる(4)自分の課題を克服するための計画を立てるという4つのシートを作成する。そして、座学中心の3ヶ月間は目標達成に向けて実践する。その内容は、(1)実践および1週ごとの振り返り(2)他者との共有として、教室にポートフォリオを置き、開示する。さらにクラスメイトや教員が自由に閲覧し、メッセージを送りあう(3)後半の実習に向けて目標を設定する(4)3ヶ月経った時点での自己の目標の達成度について発表する。その後の実習期間においては、実習に向けての実践・振り返りをし、最終的に自己の成長のまとめとして、成長エントリーおよび認定看護師としての活動計画書を作成する。なお、この6ヶ月のプログラムの中に、教員との面接が4回組まれている。この教育支援プログラムを平成20年度入学生20名に実践した。成長エントリーにおける学びを分析した結果、【内省により自己を承認】【専門的知識・技術の習得】【自己教育力の向上】【他者への肯定的評価】【組織で活動する自己をイメージ】の5つのカテゴリーが抽出された。現在、この結果をふまえ、さらなる内容の精選および教育方法の構造化を構築しているところである。最終年度である今年度は、開発した緩和ケアに必要な資質の育成に役立つポートフォリオ学習支援プログラムの有効性を検証した。昨年度までの研究成果で得られた結果をもとに自己の内省や自己理解を促す内容を取り入れた教育支援プログラムは、(1)自己の目標と達成するための計画立案(2)1週間の振り返り(3)受講生同士のピア評価(4)教員との4回の面接(5)中間発表会(3ヶ月経った時点で自己の成長を発表する)(6)成長のまとめ(研修修了時)で構成した。研究方法として、緩和ケア認定看護師教育課程の受講生20名に対し、開発した教育支援プログラムを実施し、研修修了時に独自に作成した無記名自記式質問紙にて調査した。質問紙の構成は、属性とプログラムを体験して修得した能力および自己の成長に影響したプログラムについての評価(5段階評価)とした。その結果、回答者数は20名、有効回答は100%であった。平均年齢は34.8±8.6歳、平均看護師経験年数は11.8±4.4年であった。プログラムを体験して修得した力は、8項目中、「内省する力(平均4.65±0.49点)」「自己評価力(4.1±0.99点)」「表現力(4.0±0.65点)」の順に得点が高く、「リーダーシップ能力(3.1±0.79点)」

「交渉力(2.8±1.19点)」の得点が低かった。また、自己の成長に影響したプログラムの内容は、6項目中、「メッセージカードの活用(4.65±0.67点)」「教員との面接(4.4±0.68点)」「中間発表会(4.35±0.88点)」の順に得点が高く、「目標設定・計画立案を4.0±0.97点)」が最も低かった。以上より、今回開発したポートフォリオ教育支援プログラムは自己理解に効果があると考えられた。さらに、この効果は緩和ケア認定看護師に求められている他者理解の基盤になると考える。
細胞極性形成機構の三次元網羅解析

ホヤ胚における体構築を共焦点レーザー顕微鏡により,3次元的に画像取得し,実際に1細胞レベルの解像度で個体全体を俯瞰できる画像データベースFABAおよびFABA2(http://chordate.bpni.bio.keio.ac.jp/faba2/2.0/top.html)を開発した.さらにこのFABAにおける3次元胚画像をもとに、原腸陥入期における個体全体の細胞の形態変化を定量化し脊索形成に重要な遺伝子の過剰発現胚における形態異常の検出に応用した。その結果、脊索遺伝子の過剰発現胚の形態異常を定量的に検出できた.ホヤ胚における体構築を共焦点レーザー顕微鏡により,3次元的に画像取得し,実際に1細胞レベルの解像度で個体全体を俯瞰できる画像データベースFABAおよびFABA2(http://chordate.bpni.bio.keio.ac.jp/faba2/2.0/top.html)を開発した.さらにこのFABAにおける3次元胚画像をもとに、原腸陥入期における個体全体の細胞の形態変化を定量化し脊索形成に重要な遺伝子の過剰発現胚における形態異常の検出に応用した。その結果、脊索遺伝子の過剰発現胚の形態異常を定量的に検出できた.本年度は1.共焦点レーザー顕微鏡を用いたホヤ胚の時間空間的イメージングと三次元胚発生データベースの構築、1及び2.細胞極性に関わる遺伝子と組織特異的プロモータ領域の配列クローニングを行った。1に対しては初期胚発生における細胞極性の関わる原腸陥入運動の詳細な三次元イメージングを行い、そこから得られた画像データを利用しコンピュータによる定量的基盤の構築をするために、卵から発生17時間後の孵化幼生までの発生段階を正確に30分毎に区切り、各発生ステージで固定後、細胞膜をAlexaPhalloidine546蛍光試薬で標識し共焦点顕微鏡によるイメージングを行った後、コンピュータ上で三次元再構築を行った。共焦点レーザー顕微鏡を用いた精密な共焦点顕微鏡撮影と3次元画像処理装置を用いた3次元再構成を組み合わせることで複雑な細胞形態の動態を個体全体レベルで時間・空間的に捉えることができた。ダイナミックな細胞動態を個体全体レベルでイメージングし360度あらゆる軸から胚のダイナミクスを同時にみられる系はおそらく世界で初めての試みであり新たな知見を得た。今後、核あるいは紡錘体を膜と二重に蛍光標識することにより細胞内の分裂方向や周期の情報も含んだ胚全体の三次元画像の取得も行う予定である。このような三次元胚発生画像データを含んだ「ホヤ胚発生三次元データベース」を構築し国内・国際学会で発表した(ABA : Ascidian Body Atlas、論文投稿中、発表と同時に公開予定)。2に対してはこれまでに細胞極性に関わる遺伝子のクローニングと組織特異的プロモータの単離を目指しホヤゲノムおよび、ホヤ初期胚cDNAライブラリーからそれぞれ細胞極性関連遺伝子を3つと表皮、脊索、神経で特異的に発現する組織特異的プロモータをそれぞれ単離した。今後イメージングにより得られてきた画像データはコンピュータを用いて解析され、形態形成運動に関わる種々の情報(タンパク質の位置・速度情報や空間的力学的情報)を抽出し、細胞一つレベルの定量的解析を行う。これら情報の抽出にあたってはそのための画像処理アルゴリズムの開発を行い、既存の画像解析ソフトウェアも活用する予定である。本年度は原腸形成運動理解のためのBrachyury下流遺伝子データベース(CINOBI、http://hottapc.lab.nig.ac.jp/notochord/cibra)の構築および、共焦点レーザー顕微鏡画像に基づく三次元ホヤ胚データベース(FABA ver. 1.1、http:/chordate.bpni.bio.keio.ac.jp/faba/)の構築を行った。CINOBIを用いてBrachyury下流遺伝子セットを調べると、「細胞極性に関わるシグナル分子の転写を制御している」分子群と、「脊索形成に関わる分子の転写を制御している」分子群に分けられることがわかった(Hotta, et. al., 2007)。このことは脊索をもたない動物におけるBrachyuryの機能として「細胞極性に関わるシグナル分子の転写を制御している」役割が古くからあり、脊索動物ではさらに「脊索形成に関わる分子の転写を制御」する役割が付加されたのではないかと考えられる。このようにCINOBIから細胞極性遺伝子群の転写レベルの制御がBrachuryという遺伝子によって制御されている可能性を下流遺伝子群からはじめて示唆した。後者データベースFABAは卵から孵化幼生までの三次元データベースである。このデータベースにより原腸陥入過程の細胞形態変化を時系列に沿って1細胞レベルで個体全体を見渡しつつ明らかにすることができた。以上の成果は国内・国際学会で発表した(第二回ホヤ研究集会5月、第40回日本発生生物学会5月、日本動物学会第78回大会9月、4th International Tunicate Meeting6月)。FABAは論文公開後、国内外において高く評価され、発生生物学の国際誌Developmental Dynamicsでは前者FABAがハイライトに取り上げられ、"次世代の標準発生ステージ表"として高い評価を得ている。本年度は原腸形成運動理解のための後期ホヤ胚発生3次元データベース(FABA2、http://chordate.bpni.bio.keio.ac.jp/faba2/2.0/top.html)の構築および、共焦点レーザー顕微鏡画像に基づく3次元バーチャル胚構築によるホヤ胚原腸陥入時における形態変化の1細胞レベルでの定量解析を行った。発生過程において原腸陥入運動は極性を伴った細胞レベルの運動が個体全体の形に影響を及ぼす重要なイベントである。データベースFABA2はFABA