hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トラキア研究

当研究の目的は、先史から中世にいたるトラキアの歴史的位置を明白にすることである。そのため、東海大学隊は1983年以来、ブルガリア隊・オランダ隊と協力して、ブルガリア国スリヴェン県デャドヴォ遺跡の発掘調査を行い、また同時に関連するトラキア先史遺跡の分布調査、中世にいたるトラキア史の研究などを実施している。1989年度の調査もその継続である。東海大学隊のデャドヴォ遺跡発掘調査担当部分は、遺跡中央北側のJN/2325の14グリッド分、350m^2であるが、1989年度は各区平均15cmほど掘り上げ、竈址9、ピスト3、牛頭を粘土で固定した浅いピット1、中世ピット1を検出し、精査した。中世ピットを除く他の諸遺構は、すべて中期青銅器時代のものである。また今年は中央セクション壁東面の土堆積図を作成し、炭素化合物調査のための断片を収集し、凧による遺跡の写真撮影も試みた。竈を中心とする個別の遺構の調査例は増大したが、個別遺構を組み合わせて、住居単位で集落構造を把握する作業は、次年度以降に残されている。関連するトラキア先史遺跡の分布調査については、デャドヴォ周辺の33箇所を調査し、ブルガリア側の協力をえて作成する遺跡地図の資料を充実させることができた。トラキア史研究の部門ではプロヴディフ、スタラ=ザゴラ、プリスカ、カザンルック、シプカ、トゥルノヴォ、シュ-メン、マダラ、カピレ、プリスカ、プレスラフの諸史跡を訪ね、関連遺物の見学、関係者との懇談を行って、研究上の参考にすることができた。
液滴エピタキシー法による理想的な量子ドットの自己形成

高品質なもつれ光子対の発生を目的として、液滴エピタキシー法による(111)A基板上の高面内対称性を有する理想的な量子ドットの自己形成に関する研究を行った。ガリウム液滴形成過程の詳細な分析を行い、量子ドットのサイズ・密度制御に必要不可欠な核発生機構を明らかにした。また、(111)A上の不純物ドーピング技術を確立することより、電流注入による量子ドット発光を実現した。さらに、GaAs系に加えてInAs量子ドット作製に関する研究を新たに実施して、対称性の高い量子ドットからの通信波長帯発光を観察することに成功した。GaAs(111)A基板上に作製した高い面内対称性を有するGaAs/AlGaAs量子ドットからのもつれ合い光子対発生の実証を行った。実験には、顕微フォトルミネッセンス装置を用いた。バイエキシトン・エキシトンのカスケード発光の偏光に依存した光子相関測定を行った結果、きわめて高品質なもつれ合い光子対が発生していることが実証された。この結果に関して、Physical Review Bへ論文掲載およびプレスリリースを行った。また、同じ量子ドットを用いた、NMR応用を見据えた核スピンに関する実験をトゥールーズ大学と共同で行い、その成果がNature Communicationsに掲載された。続いて、対称性の高い形状を有する(111)面上の量子ドットを光ファイバー通信に適用可能な波長帯で実現するため、液滴エピタキシー法をInAs/InP材料系に適用する試みを行った。本テーマを開始する前に、InAs/GaAs(111)における液滴エピタキシーに関する実験も行ったが、こちらは格子不整合度が大きいため、目的の特性を持つ量子ドットの実現が困難であることがわかった。InAs/InP系では、格子不整合度は4%程度であり、低温過程を用いる液滴エピタキシー法でも光学活性な量子ドットが実現できることを見出した。量子ドットから光通信波長帯である1.3および1.55ミクロン帯の発光を確認した。量子ドットからは、室温においても高強度な発光が得られ、高品質であることが明らかとなった。格子整合系GaAs量子ドット/AlGaAs(111)Aに関しては、量子光源としての制御性をさらに向上させるため、量子ドット内の電荷を制御するチャージチューナブル構造の作製を試みた。GaAs(111)A面は分子線エピタキシー法ではシリコンによるN型ドーピングが困難であることが知られているが、成長時の基板温度及び砒素圧の最適化を行い、再現性良くドーピングできる手法を確立した。量子ドットの近傍にシリコンドープ相を形成した構造を作製し、ショットキー電極からの外部電場により量子ドットの荷電状態を自由に制御できる事を確認した。この成果は、Applid Physcs Lettersに掲載された。光ファイバー通信波長帯で発光する、InAs/InP(111)A量子ドットに関しては、顕微フォトルミネッセンスによる単一量子ドットの特性評価を行った。GaAs量子ドットと比較すると、多少の対称性の悪化は見られるものの、通信波長帯で微細構造分裂幅がほぼ0の量子ドットが存在することを確認した。また、個々の量子ドットの偏光方向はランダムであり、面内の異方性がない(111)A面の特性が反映されていることが確認された。量子ドット一個一個の半値幅に関しては、サイズの大きな量子ドット(長波長で発光する量子ドット)の方が広い傾向が、この系に於いても観察された。そこで、小さい量子ドットで、長波長の発光(具体的には、1.55ミクロン)を実現する事と目的として、量子ドットの発光波長制御を試みた。具体的には、これまでの研究ではInPと格子整合するInAlAsを障壁層として用いていたが、これをInAlGaAsとして障壁高さを低下させた。その結果、量子ドット発光のピーク波長が長波長側にシフトして、1.55ミクロンで発光する小サイズ量子ドットを実現した。今後は、これらの量子ドットの特性評価も実施する予定である。格子整合系GaAs量子ドット/AlGaAsに関して、従来の光励起から実用を見据えた電流励起に展開してエレクトロルミネッセンス(EL)によりもつれ合い光子対発生を実現することを目的として研究を実施した。平成26年度までにN型層の成長条件を確立したのに加えて、27年度は、シリコンをアクセプターサイトに導入しP型層を実現する成長条件を探索した。成長条件の精密な制御を行い基板温度580度、砒素圧1E-5 Torr以下でP型層が成長可能なことを明らかにした。一方で砒素欠損に起因する発光が生じて、量子ドットのEL発光と混ざってしまうことが分かった。そこで、AlGaAs二重障壁障とすることにより砒素欠損の存在するP型AlGaAs層に電子が注入されない構造を新たに設計した。それにより、砒素欠損の起因する発光が抑制されて、量子ドットからEL発光を観察することに成功した。顕微EL用の素子を作製して、単一量子ドットの特性評価を行ったところ、微細構造分裂がほぼゼロの量子ドットが存在することを確認した。この成果は応用物理学会に於いて発表して、光学特性評価は現在も継続している。また、電極パッドが量子ドットの偏光状態に有意な影響を与えることが明らかとなった。影響の起源としてはパッドの形状そのものの影響と、印可される電界の二つの効果が考えられる。今後電極パッド形状の工夫により積極的に偏光状態を制御することができれば、すべての量子ドットにおいて微細構造分裂幅ゼロにチューニングできる可能性がある。

通信波長帯InAs量子ドットに関する研究では、平成26年度はInP(111)A基板を用いていたが、汎用性の高いGaAs(111)A基板に適用させる目的で格子緩和した疑似基板を結晶成長により実現することを試み、非常に高品質なInAlAsやInGaAsをGaAs(111)A上に成長できることを見出した。高品質なもつれ光子対の発生を目的として、液滴エピタキシー法による(111)A基板上の高面内対称性を有する理想的な量子ドットの自己形成に関する研究を行った。ガリウム液滴形成過程の詳細な分析を行い、量子ドットのサイズ・密度制御に必要不可欠な核発生機構を明らかにした。また、(111)A上の不純物ドーピング技術を確立することより、電流注入による量子ドット発光を実現した。さらに、GaAs系に加えてInAs量子ドット作製に関する研究を新たに実施して、対称性の高い量子ドットからの通信波長帯発光を観察することに成功した。光ファイバー通信波長帯で発光するInAs量子ドットに関して、個々の量子ドットの物性計測を行い、もつれ合い光子対を発生可能な、極めて微細構造分裂幅の小さい量子ドットが形成されている事を確認できたことは大きな進展といえる。また、長波長の量子ドットの発光半値幅が広い問題に対して、障壁層の高さを変えることにより、量子ドットの発光波長をシフトさせて、小サイズの量子ドットでも1.55ミクロン発光が可能となったことも大きな成果である。GaAs量子ドットからのもつれ合い光子対の電流注入に関しては、N型ドーピングの条件出しを行い、電荷制御までは実現した。しかし、電流注入発光素子に関しては、InAs系の実験の急速な進展に伴い、時間が足りず、27年度に取り組むこととなった。そのため全体としては、おおむね順調に進展している、とした。半導体結晶成長格子歪み系のInAs量子ドットに関しては、歪みによる異方性促進の可能性が示唆されている。そのため、格子不整合度を低下させる新しい手法の検討を行う。具体的には、格子緩和したメタモルフィックバッファーの導入を検討する。GaAs量子ドットに関しては、P型層を形成して、電流注入による発光を試みる。ただし、計測技術等の問題もあることから、初めは、汎用の(100)基板上に電流注入型量子ドットを形成し、その電流注入発光の顕微分光測定を行う事も検討する。最終年度は、これらを通して、量子ドット光源の量子情報通信への応用の可能性を探索する。GaAs/AlGaAs材料系で、きわめて高い面内対称性を有する量子ドットを作製することに成功した。従来法では、量子ドット全体の1%にも満たない数の量子ドットのみがもつれ合い光子を発生していたのに対して、5%近い数の量子ドットがもつれ合い光子対発生に十分な特性を有していることがわかった。これはきわめて重要な成果である。また、高品質なもつれ合い光子対の発生も実証した。その品質は世界最高クラスの品質である。さらに、新しい展開として、通信波長帯で発光する量子ドット作製に関する研究もスタートして、良好な発光特性が得られる指針が得られている。
N-リン酸化タンパク質の受容体発見を目指す化学とその応用

本研究の目的は、Nーリン酸化タンパク質の受容体タンパク質を見つけ出す方法論の開発である。これを基盤として、創薬ターゲットになりうる「新規情報伝達系」を発見する。リン酸エステルであるチロシン等のリン酸化は、キナーゼを触媒として、ATPから直接酸素原子にリン酸残基が移る。一方ヒスチジン等のNーリン酸化体は「一時的な中間体」として存在し、受容体タンパク質の酸素原子に受け渡すと考えられている。生理学的な役割を担うのは後者であり、その解明なくしては、情報系の理解は進まない。本研究では、この反応プロセスを化学的に模倣するNーリン酸化アミノ酸の安定アナローグを含むペプチドと反応性官能基を利用し、受容体タンパク質を見つける。この結果をもとに新しい情報伝達系の確立を目指す。本研究は、3期に分かれる。すなわち、a化学合成を主とする準備段階、b方法論の確立と確認段階、cヒト細胞での情報伝達系を確立する段階である。研究期間内にa, b, cのすべての段階を順次確立する予定である。段階aにおける、新規安定ホスホヒスチジン誘導体を複数設計し、合成に成功した。また、スケールアップも行った。さらにライブラリー合成法自体は確立した。しかし、現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。本研究には実際の生化学実験に用いることのできるプローブの創製が必要であろ。したがって、現在直面している問題解決を避けては通れない。ライブラリー設計の再検討を始め、多くの項目を再考している。しかし現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。それらを解決すべく努力している。そのために、段階aとbについて多くの可能性について精査している。現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。この問題の解決により用いる評価系の幅が広がるためどうしても解決したい問題である。段階aとbについて多くの可能性について精査している。段階aにおいては、ライブラリー合成法の再設計を含め、検討中である。また、より安定なリン酸プロドラッグの利用を検討している。本研究課題には、この問題解決が不可欠である。そのために、現在段階aで苦労している。

さらにライブラリー合成法自体は確立した。しかし、現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。本研究には実際の生化学実験に用いることのできるプローブの創製が必要であろ。したがって、現在直面している問題解決を避けては通れない。ライブラリー設計の再検討を始め、多くの項目を再考している。本研究は、3期に分かれる。すなわち、a化学合成を主とする準備段階、b方法論の確立と確認段階、cヒト細胞での情報伝達系を確立する段階である。研究期間内にa, b, cのすべての段階を順次確立する予定である。しかし現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。それらを解決すべく努力している。そのために、段階aとbについて多くの可能性について精査している。現在、リン酸誘導体の安定性とリン酸化合物の細胞膜透過性の問題に直面している。この問題の解決により用いる評価系の幅が広がるためどうしても解決したい問題である。段階aにおけるライブラリー合成法の再設計を含め、検討中である。また、より安定なリン酸プロドラッグの利用を検討している。段階aとbについて多くの可能性について精査している。段階aにおいては、ライブラリー合成法の再設計を含め、検討中である。
冷戦期アメリカの知的ヘゲモニーとアジア地域政策-フォード財団の学術助成を中心に

フォード財団など北米の財団や財団からの学術助成を受けた大学における一次資料調査により、冷戦期のアジア研究に対する学術助成の方針、助成プロジェクト立案・実施に至る交渉およびプロジェクト実施過程において財団の果たした役割の重要性と具体的な様相が明らかになった。またアジア側における研究が、それぞれが置かれた地政的・歴史的条件と北米側の方針の相互作用の中で展開した様も具体的に明らかになった。ポスト冷戦期、グローバリゼーションが進行する中、中国の積極的なアジア地域政策をうけ、地域区分が流動化し、冷戦期に、アメリカの主導の下に展開されてきた東アジア・東南アジア研究の再検討と、それをふまえたポスト冷戦期における新たなアジア研究の展望が求められている。本研究は、その基礎作業として、冷戦期アメリカにおけるアジア研究の動向とアジア地域政策との関係を、フォード財団などによるアジア研究学術助成と、それをとりまく国際関係の文脈を再検討しつつ明らかにし、かつそれがもたらした帰結をアジアの側から、また中国の台頭という今日的視点から再吟味することを目的とする。現在ポスト冷戦期のグローバリゼーションの中で地域をめぐる区分が流動化し、とりわけ中国が積極的なアジア地域政策を展開し、東アジア・東南アジアの地域構想に大きな変化がもたらされつつあり、冷戦期、旧植民地勢力に代わってアメリカの主導の下に展開されてきた東アジア・東南アジア研究の再検討は、ポスト冷戦期のアジア研究を展望する上でも不可欠であると思われる。本研究は、冷戦期アメリカにおけるアジア研究の動向とアジア地域政策との関係を、フォード財団のアジア研究学術助成を中心に明らかにし、かつそれがもたらした帰結をアジアの側から、また中国の台頭という今日的視点から再吟味することを目的とする。初年度は予備調査と今後の研究展開のための準備段階と位置付け、以下に関する資料調査、および共同研究準備のための打ち合わせを実施した。1.米国における予備資料調査:フォード財団資料室を訪問し、冷戦期の東アジア研究・東南アジア研究への助成方針をめぐる議論と個別助成に関する資料収集を行った。補足資料調査として、1949年から70年代に至る年次報告書を収集し、助成金の分野別、テーマ別、機関別、地域別の規模等に関する資料収集した。さらにミシガン大学を訪問し、同大学における地域研究の展開に関する資料収集を実施した。2.冷戦期における東/東南アジア研究関連の博士論文の目録およびアメリカの地域政策、学術政策に関する基礎文献を収集した。博士論文のデータについては整理を進めつつある。3.次年度前半にワークショップを実施すべく、台湾、香港、中国における海外研究協力者との打ち合わせを実施した。本研究は、冷戦期アメリカにおけるアジア研究の動向とアジア地域政策との関係を、フオード財団のアジア研究学術助成を中心に明らかにし、かつそれがもたらした帰結をアジアの側から、また中国の台頭という今日的視点から再吟味する回ことを目的とする。2.上記ワークショップの結果を踏まえ、アメリカの地域政策や学術助成という側面に対して、アジア各地における知識人の形成を比較・検討する重要性が提起され、香港、台湾、タイにおいて、資料調査を進めた。特にタイに関しては、ロックフェラー財団の活動およびフルブライト奨学金の設立をめぐる交渉過程に関する資料を収集した。3.冷戦期における東/東南アジア研究関連の博士論文の目録およびアメリカの地域政策、学術政策に関する基礎文献を収集した。本研究は、冷戦期アメリカにおけるアジア研究の動向とアジア地域政策との関係を、フォード財団のアジア研究学術助成を中心に明らかにし、かつそれがもたらした帰結をアジアの側から、また中国の台頭という今日的視点から再検討することを目的としている。当該年度における成果は以下とおりである。1.フォード財団のアジア研究助成に関して収集した資料を整理するとともに、フォード財団と同様、冷戦期のアジア研究の展開に重要な役割を果たしたロックフェラー財団の中国研究、東南アジア研究に対する学術助成に関する資料調査・収集を実施した。2.アメリカの対アジア外交戦略について、国務省のForeign Relations of the United Statesを検討するとともに、冷戦期のアメリカ外交問題評議会における対東アジア・東南アジア外交に関わる討論について資料調査・収集を進めた。3.フォード財団の学術助成とならんでアメリカのアジア研究の展開に研究者の育成という側面から重要な役割を果たしたフルブライト基金について、タイを事例として、タイ国立公文書館に所蔵される一次資料を収集し、その設立の経緯を明らかにする論考を発表した。4.アメリカ主導で進められた冷戦期の東南アジア研究をポスト冷戦期の観点から位置づけるべく、韓国および中国のアジア研究について資料調査を実施するとともに、特に韓国において進展が著しいベトナム=韓国関係に関する研究を紹介する特集を『東南アジア研究』において編集・刊行した。またグローバル化時代の地域研究の特徴を歴史的かつ現代的に検討し、特にアジア諸地域において実施されている地域研究について比較検討する論考を発表した。5.2011年4月に開催されるENIUGHで発表すべく、冷戦初期におけるフォード財団およびロックフェラー財団の東南アジア研究助成に関する一次資料に基づく英文論考の執筆を進めた。

当該年度における成果は以下とおりである。1.フォード財団のアジア研究助成に関して収集した資料を整理したうえで、補足調査を行った。また同様にアジア研究の展開に重要な役割を果たした他の財団の中国研究、東南アジア研究に対する学術助成に関する資料調査・収集を実施した。さらに別途進めてきていた冷戦期日本・イギリスにおける東南アジア・東アジア研究に関する資料の補足調査を実施した。その結果、主要な財団が協力/分業して学術助成を行った様が明らかとなった。またアジアの側はアメリカの学術を直接受け入れつつも、個別の状況に応じていわば換骨奪胎していたこともみてとれる。2.冷戦期アメリカの対アジア外交戦略について、フォードなどの財団関係者も関わった外交問題評議会の討論資料を調査・収集した。3.フォード財団などから助成金をえて地域研究に従事した東アジア・東南アジア研究者の研究経歴に関して資料収集を実施した。4.ロンドンで開催された国際学会で、冷戦期アメリカにおける地域研究を比較検討するセッションで初期東南アジア研究に係る成果の一部を発表した。また東南アジアの地域主義に関する研究会で、アメリカにおける東南アジア研究の黎明期をテーマに報告した。その結果、ソ連等で同時代的に展開していた地域研究との比較の重要性も明らかとなり、さらにグローバルな文脈で位置づけを検討する必要性も提起された。加えて東アジアを中心にアジアの地域性と知域文化を論じる論考を発表した。
遠紫外光を用いる選択的超高感度プラズモンセンサーの開発

本研究の結果から空気中では厚い(20 nm程度)、液中では薄い(10 nm程度)アルミニウムを準備することで、目的に合わせたプラズモン特性を出すことができることが分かった。さらに、濃度調整により屈折率を変化させたスクロース水溶液中でサファイヤ上のアルミニウム薄膜のSPR波長を測定したところ、屈折率に応じたSPR波長のシフトが観察され、本系の水溶液中におけるセンサーとしての有用性が示された。また、吸収のある物質を載せた場合、さらに大きなSPR波長のシフトや、SPRディップのスプリッティング(強結合)などの現象が観察され、屈折率の実部の影響だけでなく、屈折率の虚部の影響についても明らかになった。金属表面の屈折率変化を鋭敏に検出するプラズモンセンサーは、バイオセンサーをはじめとした幅広い分野で研究が進められており、その検出感度の向上は大きな課題となっている。本研究では、物質が数多くの電子遷移を示し高い屈折率を持つ、波長200 nm以下の遠紫外光を用いることで、高い感度と物質選択性を持つ新たな表面プラズモンセンサーを開発することを目的とした。本研究では減衰全反射(ATR)型のセットアップを用いて、石英あるいはサファイヤ製のプリズム上に蒸着したアルミニウム薄膜の反射率を測定した。この装置は、プリズム中に重水素ランプからの光を入射し、アルミ薄膜を蒸着した界面で全反射した光を検出する。入射角度を変えながら、波長140-300 nmのスペクトルを測定することができる。遠紫外光を検出するためには光路中の水蒸気や酸素を除去する必要があるが、装置内を乾燥窒素で置換することで真空雰囲気よりも簡便に達成した。アルミニウム薄膜の遠紫外領域を含んだ領域のプラズモン共鳴特性を測定し、さらにその屈折率依存性を明らかにすることに成功した。具体的には、石英プリズム上に製膜したアルミニウム薄膜の反射率を測定し、空気中と有機溶媒(HFIP)中で、その入射波長依存性と入射角度依存性を明らかにした。また、サファイヤプリズム上にアルミニウム薄膜を製膜することで、より多くの液体分子を測定対象とすることができることを明らかにした。さらに、屈折率の実部(Refractive index n)の影響だけでなく、屈折率の虚部(Extinction coefficient k)の影響についても検討を行い、プラズモン共鳴の吸収と分子の吸収の相互作用(強結合)を観察することに成功した。さらに2件の表彰を受けた。(1)渡利幸治ら「Al薄膜の表面プラズモン特性を利用した新しいSPRセンサーの開発に向けた研究」第10回平成夏季セミナーぶんせき秘帖巻ノ十、ポスター賞受賞(2)田邉一郎ら「センサー応用に向けたアルミニウムの遠紫外表面プラズモン特性研究」平成28年度日本分光学会年次講演会、若手講演賞受賞【研究成果報告】本研究では、遠紫外域におけるアルミニウムの表面プラズモンの屈折率に依存した分散関係を明らかにし、選択的超高感度センサーへと応用すること目的とした。2017年度は特に、アルミニウムの膜厚がプラズモン特性に与える影響を明らかにし、膜厚に応じて大気中あるいは液中で、センサーとして機能されることができることを見出した。具体的には、石英プリズム上で530 nmの膜厚に応じて空気中あるいは液中(HFIP中)での表面プラズモン共鳴角(SPR角)が観測されることを、まずフレネルの式に基づくシミュレーションで明らかにした。次に、シミュレーションの結果に合わせて空気中あるいは液中でピークを出せるように膜厚を制御したアルミニウム薄膜を作成し、狙い通り波長200 nm以下の遠紫外域でも空気中(20 nm)あるいはHFIP中(5 nm)ではっきりとしたSPRに由来する反射率の低下を観測することができた。これらの結果から、例えば真空中あるいは大気中でガスセンサーとして使いたければ厚い(20 nm程度)アルミニウムを準備し、液中では薄い(10 nm程度)アルミニウムを準備することで、目的に合わせたプラズモン特性を出すことができるということが示された。さらに、濃度調整により屈折率を変化させたスクロース水溶液中でサファイヤプリズム上のアルミニウム薄膜のSPR波長を測定したところ、屈折率に応じたSPR波長のシフトが観察され、本系の水溶液中におけるセンサーとしての有用性が示された。また、吸収のある物質を載せた場合、さらに大きなSPR波長のシフトや、SPRディップのスプリッティング(強結合)などの現象が観察され、屈折率の実部(Refractive index n)の影響だけでなく、屈折率の虚部(Extinction coefficient k)の影響についても明らかになった。今年度の成果を踏まえ、次年度は、遠紫外域の強みをさらに明確に提示していくため、以下のような計画で研究を進める。

第一段階として、波長の短い遠紫外域を利用するメリットを踏まえ、SPRセンサーとしての表面敏感性を実証する。そのために、サイズを制御したポリスチレンビーズをアルミニウム薄膜表面に担持し、それによるSPR特性の変化を検証する。金や銀を用いた可視SPRセンサーに比較して、アルミニウムを利用した遠紫外SPRセンサーは、エバネッセント波の染み出し深さが小さくなるため、ポリスチレンビーズ担持による表面凹凸(PSと空気の混合層)を鋭敏に検出することができると考えられる。また、厚さ数ナノメートルの超薄膜ポリマーを金属上に製膜することで、やはり遠紫外SPRセンサーの表面敏感性を示すことを計画している。第二段階として、抗原抗体反応センサーとしての応用を踏まえ、Anti-IgGとIgGの選択的結合に伴うSPR特性の変化を検出する。本段階では、金属表面に修飾した擬似抗体としてのAnti-IgGへの擬似抗原としてのIgGの結合を検出する。表面敏感性に加えて物質選択性についても実証するため、意図的に測定波長域に吸収をもたないスクロースなどを系に加えた検証も行う。測定する遠紫外・深紫外域に吸収をもつIgGと、吸収をもたないスクロースが混在する系に置いては、前者(IgG)がより鋭敏に検出されると期待できる。フレネルの式に基づく数値シミュレーションから、極表面(数nmから十数nm)において従来の可視プラズモンセンサーに比べて400倍以上の感度の上昇が期待できることが、明らかになっている。本研究により、表面反応に伴う屈折率の変化を従来の可視SPRセンサーよりも高感度に検出できると期待でき、その検出下限を明らかにする。物理化学、分析化学、分子分光学
ドーパ自体のカルシウムチャネル電流増大作用-孤束核パッチクランプを用いた解析-

従来ドパミンの前駆体にすぎないとされてきたアミノ酸「ドーパ」の神経伝達物質仮説を提起、検証してきた。本研究においては、ラット孤束核単離細胞のパッチクランプを施行し、ドーパの電位依存性カルシウムチャネル(HVA)電流増大作用の解析を行ない、以下の知見を得た。1)ドーパ(L体,1μM)適用によって生じるHVA電流(I_<Ba>)増大(約30%)は、-50mVから-30mVにかけての、HVAチャネル活性が比較的低い電位においてより顕著であった。2)このドーパ応答の大半は、競合的ドーパ拮抗薬DOPA methyl ester処置によって抑制された。3)同濃度のドパミンはHVA電流に対して無作用、一方、noradrenalineはHVA電流を顕著に抑制した。従ってこのドーパ作用はカテコラミンへの変換を介さない、ドーパ自体の作用であると考えられる。4)このドーパ応答は、10,100nM,1μMと濃度依存的に増大した。5)パッチピペット内GDP-βS添加は、ドーパのHVA電流増大成分を抑制した。孤束核単離細胞に発現するドーパ受容体はGタンパク質連関型受容体である可能性が高い。本研究によって、孤束核におけるドーパの興奮性作用機序解明にあたっての電気生理学的および分子基盤となる成果が得られた。従来ドパミンの前駆体にすぎないとされてきたアミノ酸「ドーパ」の神経伝達/修飾物質仮説を提起、検証してきた。ドーパはラット下位脳幹部血圧制御諸部位における伝達物質候補であり、孤束核等へのドーパ外来投与は、グルタミン酸と同用量・同程度の興奮性血圧・心拍応答を惹起する。しかし、ドーパ受容体、およびドーパ応答の電気生理学的基盤は全く未知である。本研究においては、ラット孤束核単離細胞のパッチクランプを行ない、ドーパの電位依存性カルシウムチャネル(HVA)電流増大作用の解析を行なう。本年度は、以下の知見が得られた。1)ドーパ(L体)1μM適用によって生じるHVA電流(I_<Ba>)増大(約30%)は、-50mV→ー30mV付近のステップ、すなわちHVAチャネル活性が比較的低い電位において顕著であった。2)ドーパによるHVA電流増大成分のうち約70%が、競合的ドーパ拮抗薬のDOPA methyl ester(DOPA ME)1μM処置によって抑制された。3)同濃度のドパミンはHVA電流に対して無作用、一方、noradrenalineはHVA電流を抑制した。これらの知見は、ドーパの作用がカテコラミンへの変換を介さない、すなわちドーパ自体の作用であることを強く示唆する。5)パッチピペット内へのGDP-βSの添加は、ドーパ(L体)1μMによるHVA電流増大を抑制した。これはまだ少数例(n=2)の知見であるので、さらなる検討が必要である。
TPD54に結合するタンパクの同定および、複合体形成による翻訳後修飾機構の解析

本研究計画では、TPDファミリーを構成する一つのタンパクであるTPD54のエピジェネティックな発現制御機構、特に、翻訳後修飾、それに伴って変化する細胞内での局在の変化、さらには、これと複合体を形成する新規タンパクを検索することで、口腔癌細胞における新たな分子標的治療としての、分子生物学的な基礎的研究を行った。その結果、TPD54は扁平上皮癌細胞の増殖・浸潤に関与するある分泌タンパクの分泌を細胞内での結合によって調整し、扁平上皮癌細胞の増殖・浸潤能を制御していることが明らかとなった。申請者は、in vivo Time-Of-Flight Mass Spectrometry(TOFMASS)を用い、ヒト口腔扁平上皮癌において特異的に発現しているTPD54(TPD52L2)というTPDファミリーに属する機能が未解析のタンパクを見出し、このタンパクは癌細胞の増殖およびマトリクス金属プロテアーゼ(MMP)活性には全く影響を及ぼさないが、Talin 1の発現を抑制することで、細胞外基質への接着および細胞外基質依存性の細胞の移動を負に抑制していること、さらには、この制御系はAkt/PKBのリン酸化に依存していることを見出し、TPD54は扁平上皮癌細胞のnegative regulatorで、同ファミリーに属するTPD52の扁平上皮癌における転移亢進作用を拮抗的に抑制していることを世界に先駆けて報告した(Mukudai et al. Cellular Oncol. 2013)。そこで本研究は、この延長として、ヒト口腔扁平上皮癌および腺癌においての、同タンパクのエピジェネティックな転写後発現制御機構を、最近Promega社より発売された新規万能タグベクターHalo Tag(http://www.promega.co.jp/halotag/index.html)を用いて解析を行うものである。具体的には、TPDファミリーを構成する一つのタンパクであるTPD54のエピジェネティックな発現制御機構、特に、タンパクのリン酸化などの翻訳後修飾、それに伴って変化する細胞内での局在の変化、さらには、これと複合体を形成する新規タンパクを検索することで、口腔癌細胞における新たな分子標的治療としての、分子生物学的な基礎的研究を行うことにある。そこで、本研究計画では、以下の【現在までの進捗状況】に記した研究を今年度に行った。本年度には、以下の研究を行った。・TPD54に結合するタンパクの同定pFN21A HaloTag7 CMV(プロメガ社)ベクターにヒトTPD54遺伝子を組み込み、これをSAS細胞(ヒト口腔扁平癌細胞)にトランスフェクションする。コントロールには、空ベクター発現株を用いた。これらの細胞から、Halo Tag Mammalian Pull-Down and Labeling System(プロメガ社)を用いて、タンパクPull-Downアッセイを行い、TPD54特異的結合タンパクを溶出した。得られたタンパクを二次元電気泳動に展開し、コントロールと比較し特異的タンパクを切り出し、LS MS/MS質量分析法用いて、データベースから目的のタンパクを複数同定した。そこで、本年度までには以下の【現在までの進捗状況】に記した研究を行った。本年度までに、以下に記した研究を行った。1. TPD54に結合するタンパクの同定:昨年度に詳細を報告した。2. in vitroでのTPD54タンパクのエピジェネティックな制御機構の解析ア. Halo Tag Pull-Down法による二量体形成の検索:昨年度に単離されたタンパクのcDNAを強制発現ベクターに組み込み、アデノウイルスを用いたHalo Tag-TPD54安定発現SAS細胞株にトランスフェクションし、Pull-Downアッセイを行うことで、実際に二量体が形成されるを検索する。イ.二量体形成に対する扁平癌細胞の増殖・浸潤・転移に関する影響の検索:Halo Tag-TPD54野生体および変異体導入したSAS細胞の恒常発現株に、上述した強制発現ベクターあるいは、shRNA発現ベクターをトランスフェクションし、癌細胞の増殖・浸潤などに関する各種バイオアッセイをin vitroにておこなう。

本研究計画は、申請者らのこれまでの研究を延長して、ヒト口腔扁平上皮癌においての、同タンパクのエピジェネティックな転写後発現制御機構を解析するものであった。この目的を達成するために、エピトープタグを付与したTPD54タンパクの発現を活用し、以下のような研究を行った。1.プルダウン法によるTPD54タンパクに結合するタンパクの検索口腔扁平上皮細胞にHaloTag-TPD54遺伝子を強制発現させ、Promega社のHaloTagプルダウンキットおよび、TOF MS/MS解析を用い、同タンパクと二量体を形成する既知あるいは未知のタンパクの同定を行った。その結果、分子シャペロンである1HSP関連タンパクと、2扁平上皮癌細胞の増殖に関与する分泌タンパクがクローニングされた。2. TPD54のエピジェネティックな制御機構の解析TPD54タンパクの細胞内局在の変化の翻訳後修飾が及ぼす影響についても検討した。すなわち、口腔扁平上皮細胞であるSAS細胞にTPD54遺伝子、および1で単離されたタンパクを強制共発現させ、ライブイメージングによるTPD54タンパクの細胞内局在の変化を観察した。また、TPD52タンパクの変異体を用いても、同様の検索を行った。その結果、上述2のタンパクの分泌はTPD52ファミリーとの結合によってエピジェネティックに制御されていることが明らかとなった。現在、これらの研究をまとめて、原著論文を作成している。近日中に、適切な学術誌に投稿予定(表題および投稿雑誌は未定)である。なお、同論文において、上述1および2のタンパク名を明らかにする予定である。本研究計画では、TPDファミリーを構成する一つのタンパクであるTPD54のエピジェネティックな発現制御機構、特に、翻訳後修飾、それに伴って変化する細胞内での局在の変化、さらには、これと複合体を形成する新規タンパクを検索することで、口腔癌細胞における新たな分子標的治療としての、分子生物学的な基礎的研究を行った。その結果、TPD54は扁平上皮癌細胞の増殖・浸潤に関与するある分泌タンパクの分泌を細胞内での結合によって調整し、扁平上皮癌細胞の増殖・浸潤能を制御していることが明らかとなった。研究計画に従って、今後は以下の研究を推進する予定である。・in vitroでのTPD54タンパクのエピジェネティックな制御機構の解析Halo Tag Pull-Down法による二量体形成の検索、および、二量体形成に対する扁平癌細胞の増殖・浸潤・転移に関する影響の検索。さらには、Halo Tag-TPD54野生体および変異体導入したSAS細胞の恒常発現株に、上述した強制発現ベクターあるいは、shRNA発現ベクターをトランスフェクションし、癌細胞の増殖・浸潤などに関する各種バイオアッセイをin vitroにておこなう。平成29年度・in vivoでのTPD54タンパクのエピジェネティックな制御機構の解析研究計画に従って、以下に記した研究を行う予定である。3. in vivoでのTPD54
ニューロンの活動と逆行性軸索内輸送

化学シナプスにおいてはシナプス小胞がシナプス前膜と融合して開口放出により伝達物質をシナプス間隙に放出するが、シナプス小胞の膜が融合することによって増加するシナプス前終末部の細胞膜は、喰作用を受け再び細胞内に取り込まれシナプス小胞として再利用されると云う仮説がある。従ってシナプス前ニューロンの活動は直接終末部の膜の再循環を促進し、取り込まれた膜の一部は軸索終末部から逆行性に細胞体に向かって輸送される顆粒を形成する可能性が考えられる、ニューロンの活動と対応した軸索終末部内の顆粒の変化、逆行性軸索内輸送の変化を調べるのに、シビレエイの発電器官を用いた。シビレエイの発電神経の電気刺激で、発電器官(発電板)からは安定した潜時で大きな電位が記録される。発電器官を薄くスライスし、特別に用意した装置に装着して急速凍結装置にセットし、凍結直前に電気刺激を行いシナプス電位を記録しながらシナプス伝達の様々な時点で標本を急速凍結して、電子顕微鏡を用いて軸索終末内の顆粒の増減を調ベたが、有意の変化は観察されなかった。又、終末部の膜にシナプス小胞が開口している像、あるいは逆に食作用を示すかのような所見も認められなかった。薄くスライスした発電器官を微分干渉顕微鏡で観察し、そのビデオ画像をデジタル画像強調を行うことにより、軸索終末部周辺の軸索内を移動する顆粒状物質を認めた。これらの顆粒の移動の速度および数は、当初の予測に反して神経刺激によって特に増減するとは言えなかった。今回の限られた実験からだけから結論は出来ないが、通常のシナプス伝達に当たっては開口放出されるシナプス小胞の数は検出可能なほど多くはなく、従って膜の食作用も特に増進せず、軸索内を逆行性に輸送される顆粒の数にもシナプス伝達の促進の効果は殆ど認められなかったとも考えられる。交付申請書に記載した実験材料・カエルの神経筋標本を用いての基本的実験も行なったが,同時に,おそらくこの実験目的にはカエルの神経筋標本より適当であろうとおもわれる別の標本・シビレエイの発電器官へのシナプス接合部を用いて一連の実験を行なった.シビレエイはMS222で麻酔し,その発電器官の一部あるいは可能な限りの全体を摘出した.(1)発電器官の上面と下面に置いた金属電極から電位記録を行ないながら,発電器官へ向かう神経(発電神経)を電気刺激すると,数十ボルトの一過性の電位変化が記録された.(2)発電器官を薄切すると刺激により発生する電位は小さくなるが,それでも通常の電位記録装置で安定して記録可能な充分の振幅の電位変化を生じ続けた.(3)薄切標本を微分干渉光学顕微鏡で観察すると,層状をなす発電器官(電気板)の間を細い神経が走行していることを認めた.更にそれら神経の中を移動している顆粒を観察した.(4)東京都神経科学総合研究書・遺伝学研究室・金関悳先生との共同実験で,液体ヘリウムで冷却した高純度の銅に薄切発電器官を電気刺激しながら接触させ,組織を急速凍結し電子顕微鏡で観察した.その結果,発電器官にシナプス結合する発電線型の軸策終末の超微細構造に関しての幾つかの興味深い知見を得た.化学シナプスにおいては、シナプス小胞がシナプス前膜と融合して開口放出により伝達物質をシナプスに間隙に放出するが、この際、シナプス小胞の膜が融合することによって増加するシナプス前終末部の細胞膜は、喰作用を受け再び細胞内に取り込まれシナプス小胞として再利用されると云う仮設がある。

従って、シナプス前ニューロンの活動は直接終末部の膜の再循環を促進し、取り込まれた膜の一部は軸索終末部から逆行性に細胞体に向かって輸送される顆粒を形成する可能性が考えられる。このニューロンの活動と対応した軸索終末部内の顆粒の変化、逆行性軸索内輸送の変化を調べるのに、シビレエイの発電器官を用いた。シビレエイの発電神経の電気刺激で、発電器官(発電板)からは安定した潜時で大きな電位が記録される。発電器官を薄くスライスし、特別に用意した装置に装着して急速凍結装置にセットし、凍結直前に電気刺激を行いシナプス電位を記録しながら、シナプス伝達の様々な時点で標本を急速凍結して、電子顕微鏡を用いて軸索終末内の顆粒の増減を調べたが、有意の変化は観察されなかった。また、終末部の膜にシナプス小胞が開口している像、あるいは逆に食作用を示すかのような所見も認められなかった。薄くスライスした発電器官を微分干渉顕微鏡で観察し、そのビデオ画像をデジタル画像強調を行うことにより、軸検終末部周辺の軸索内を移動する顆粒状物質を認めた。これらの顆粒の移動の速度および数は、しかし、当初の予測に反して神経刺激によって特に増減るすとは言えなかった。今回の限られた実験からだけから結論は出来ないが、通常のシナプス伝達に当たっては、開口放出されるシナプス小胞の数は検出可能なほど多くはなく、従って膜の食作用も特に増進せず、軸索内を逆行性に輸送される顆粒の数にもシナプス伝達の促進の効果は殆ど認められなかったとも考えられる。
オーキシン非要求性変異株(タバコ)より得たAX1159遺伝子の解析

本年度は,ダイズ,完全長AxicDNA単離と得られた遺伝子断片がAX1159遺伝子と同じ活性を示すかどうかを明らかにすること、及びタバコ中でのAxi遺伝子の発現様式をオーキシン処理や他のストレスを与えた状態で調べた。1.RACE(rapid amplification of cDNA ends)法によりダイズの全長AxicDNAを合成.単離することに成功した。ダイズより得られたAxicDNAは,2073bpであり,タバコAxi遺伝子の5'側が抜けていた。タバコAxi遺伝子とのアミノ酸レベルのホモロジーは両端を除いた489アミノ酸残基において66.9%であった。遺伝子中央付近に存在する浸水性親水性部分は非常によく保存されていた。c末端付近(ホモロジーはない)には、酸性アミノ酸が多くみられ、両遺伝子とも酸性領域を形成していた。2.ダイズAXI遺伝子は,タバコプロトプラストにオーキシン非要求性を付与するか。昨年度は、得られた5'が完全ではないダイズAxi cDNAを発現ベクターであるpRT101(プロモーターはCaMV35SRNAプロモーター)に挿入し,これをタバコ(SR1)の葉肉プロトプラストにPEG法により導入し,3日間暗所で培養した後,プロトプラスの分裂状況を観察した。3回行ったの実験において,プロトプラストは,オーキシン非要求性を示すことを報告した。現在得られた完全長ダイスAxicDNAが同様の活性を示すかどうかを検討中であるが,同様の結果まだ得られていない。3.タバコAxi遺伝子の発現様式Axi遺伝子の発現量は非常に少なく、通常のノーザン解析は容易ではなかった。そこで、RT-PCRによりタバコにおけるAxi遺伝子発現の解析を試みた。野性型タバコの葉においては、Axi遺伝子の発現量は極めて少ない。しかしながら、葉の表面に傷をつけると30分で発現が最高になり、以後発現量は減少し、一時間後には、通常のレベルに戻る。発現の増加の割合は、10倍以上である。オーキシンとしてNAAを10-5M与えて一日後、Axi遺伝子の発現は増加した。同様の実験をサイトカイニンについて行ったが発現の増加は見られなかった。
骨髄移植による節ジストロフィー再生治療の基礎的研究

骨髄移植法は臨床的に治療法として既に確立されており,種々の臓器に対する再生医療の手段として注目されている。我々は筋ジストロフィーの治療法としてこの骨髄移植法を用い、骨髄細胞中に存在している筋原性幹細胞(myogenic stem cell)を骨格筋細胞へと分化誘導し、罹患筋中に健常筋を再生させるという再生治療法を目指している。臨床応用へ進む最初の段階として、筋ジストロフィーのモデルマウスにおいて骨髄移植法が有効であり再生治療として実現可能であるか検討することを本研究の目的とした。筋ジストロフィーのモデルマウスとして、細胞外マトリックスの1つであるラミニン(laminin)に異常のあるdyマウスと、筋細胞膜に存在するジストロフィン複合体の構成要素の1つであるdystrophinに異常のあるmdxマウスを用いた。dyマウスはヒトにおける先天性筋ジストロフィーの、mdxマウスはDuchenne型筋ジストロフィーのモデルとされている。研究は以下のような計画で実施した。1.dyマウス,mdxマウスをレシピエント,EGFPマウスをドナーとして、尾静脈より骨髄移植を行った。その後レシピエントのモデルマウスに対して、2.ドナー由来筋の発現の解析3.外見、体重、寿命等臨床所見の解析4.生理学的機能として握力・呼吸機能の測定5.レシピエント筋の病理組織学的解析を行った。その結果、モデルマウスのみ,mdxマウスいずれもドナー由来の細胞の生着が認められた。しかしmdxマウスにおいては、骨髄移植によるドナーの生着はみられたものの、表現型の改善をもたらすほどの効果は得られなかった。一方dyマウスでは寿命が延長し、体重も有意に増加した。また、握力や呼吸機能の改善もみられた。以上の結果より、骨髄移植法は筋ジストロフィーの治療法としても有効であると考えられた。また、細胞外マトリックスの異常と筋細胞膜構成成分の異常という筋ジストロフィーの発症機序の相違によって、骨髄移植の効果が異なる可能性が示唆された。したがって筋ジストロフィーに対して幹細胞を含む骨髄移植を実施する場合は、その対象疾患によって得られる効果が異なり、細胞外マトリックスであるラミニンに異常があるタイプの方がより効果が期待できるものと考えられた。これらの成果は、日本神経学会総会、厚労省筋ジストロフィー班会議で発表したとともに、英文誌に投稿した。我々は筋ジストロフィーの治療法としてこの骨髄移植法を用い、骨髄細胞中に存在しているmyogenic stem cellを骨格筋細胞へと分化誘導し、罹患筋中に健常筋を再生させるという再生治療法を目指している。筋ジストロフィーのモデルマウスとして、細胞外マトリックスの1つであるlamininに異常のあるdyマウスと、筋細胞膜に存在するジストロフィン複合体の構成要素であるdystrophinに異常のあるmdxマウスを用いた。

1,dyマウス,mdxマウスをレシピエント,EGFPマウスをドナーとして、尾静脈より骨髄移植を行った。その後レシピエントのモデルマウスに対して、2,ドナー由来筋の発現の解析3,外見、体重、寿命等臨床所見の解析4,生理学的機能として握力の測定5,レシピエント筋の病理組織学的解析を行った。その結果、モデルマウスのdy,mdxマウスいずれもドナー由来の細胞の生着が認められた。生着の組織像は両者で異なっていた。またdyマウス,mdxマウスいずれにおいても骨髄移植群は移植非実施のコントロール群と比較して、体重や寿命また筋力の有意な改善が認められた(p<0.05)。特にdyマウスではmdxマウスに比較して改善の程度が大きかった。以上より、骨髄移植法は筋ジストロフィーの治療法としても有効であると考えられた。また、細胞外マトリックスの異常と筋細胞膜構成成分の異常という筋ジストロフィーの発症機序の相違によって、骨髄移植の効果が異なる可能性が示唆された。骨髄移植法は臨床的に治療法として既に確立されており,種々の臓器に対する再生医療の手段として注目されている。我々は筋ジストロフィーの治療法としてこの骨髄移植法を用い、骨髄細胞中に存在している筋原性幹細胞(myogenic stem cell)を骨格筋細胞へと分化誘導し、罹患筋中に健常筋を再生させるという再生治療法を目指している。臨床応用へ進む最初の段階として、筋ジストロフィーのモデルマウスにおいて骨髄移植法が有効であり再生治療として実現可能であるか検討することを本研究の目的とした。筋ジストロフィーのモデルマウスとして、細胞外マトリックスの1つであるラミニン(laminin)に異常のあるdyマウスと、筋細胞膜に存在するジストロフィン複合体の構成要素の1つであるdystrophinに異常のあるmdxマウスを用いた。dyマウスはヒトにおける先天性筋ジストロフィーの、mdxマウスはDuchenne型筋ジストロフィーのモデルとされている。研究は以下のような計画で実施した。その後レシピエントのモデルマウスに対して、2,ドナー由来筋の発現の解析3,外見、体重、寿命等臨床所見の解析4,生理学的機能として握力・呼吸機能の測定5,レシピエント筋の病理組織学的解析を行った。しかしmdxマウスにおいては、骨髄移植によるドナーの生着はみられたものの、表現型の改善をもたらすほどの効果は得られなかった。一方dyマウスでは寿命が延長し、体重も有意に増加した。また、握力や呼吸機能の改善もみられた。以上の結果より、骨髄移植法は筋ジストロフィーの治療法としても有効であると考えられた。
活性酸素種による中枢神経系細胞のJNK,p38MAPK情報伝達活性化機構の解析

本研究は脳虚血・再灌流障害や老化過程に関与すると考えられるラジカル反応性の高い活性酸素種の作用メカニズムとそれによるDNA傷害からの修復機構を解明することを目的としている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNAの断片化に代表されるDNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すこと、H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジシではなくチミジンの取り込みを促進し、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存すること、さらに、チロシンキナーゼやp38 MAPK情報伝達系も影響を及ぼすことを明らかにしてきた。そこで本研究の2年目は、p38 MAPK情報伝達系の下流域にあたる転写因子の活性化をリン酸化を指標にし、また、遺伝子発現の可能性をディファレンシャル・ディスプレイ法により検討した。アストロサイトのH_2O_2による処置は短時間においては転写因子ATF-IIを活性化した。p38 MAPK阻害薬はこのリン酸化を抑制した。前年度の研究よりp38 MAPK阻害薬はH_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死を抑制したことより、p38 MAPKの活性化とそれにより活性化される転写因子ATF-IIの活性化は、H_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死に関与することが明らかになった。また、H_2O_2によるアストロサイトにおける障害や回復に関与する可能性のある蛋白質発現をディファレンシャル・ディスプレイ法により遺伝子レベルで検討したところ、いくつかの差異遺伝子を検出した。これらの差異遺伝子が発現量に差があるmRNAに由来するのかを今後、確認するとともに、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて、シーケンシングやノーザンブロットなどを行い検討することとしている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNAの断片化に代表されるDNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すこと、H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジンではなくチミジンの取り込みを促進し、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存すること、さらに、チロシンキナーゼ情報伝達系も影響を及ぼすことを明らかにしてきた。そこで本研究の初年度は、サイトカインをはじめとした種々のストレスによって活性化されることが知られている細胞内情報伝達系が、H_2O_2によるDNA障害と修復機構に対していかなる影響を及ぼすかについてウエスタンブロットを用いて検討した。アストロサイトのH_2O_2による処置は短時間においてp38 MAPKを活性化した。p38 MAPK阻害薬はH_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死を抑制した。これらのことより、H_2O_2によるチミジン取り込みと細胞死に対して、p38 MAPKの活性化が関与することを明らかにした。これらの差異遺伝子が発現量に差があるmRNAに由来するのかを現在確認するとともに、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて、シーケンシングやノーザンブロットなどを行い検討することとしている。
ビルドアップ型の反応解析法を用いた低密度リポタンパク質酸化メカニズムの詳細解明

本研究では、生活習慣病の一因と言われる低密度リポタンパク質(LDL)酸化の効果的な防止法の確立を目的とし、複雑さゆえほとんど明らかになっていない反応メカニズムの詳細解明を行う。本年度は、LDLの主な構成成分のうち、酸化に関する知見の少ないコレステロールに着目して、モデルLDLとなるリポソームを調製し、コレステロール酸化実験を行い、(1)生体内でLDL周囲の血液中に存在する水溶性ラジカルの影響、(2)LDLに含まれる代表的な脂溶性抗酸化剤であるビタミンEの影響、について検討を行った。そして、コレステロールの酸化は、主に酸素よりも水溶性ラジカルによって開始されること、ビタミンEによって抑制されるがビタミンE自体もラジカルによって消費されること、を明らかにした。そこで、これまでに明らかにしたコレステロール自体の酸化機構、および酸素の外部水相からリポソーム脂質相への物質移動に加え、水溶性ラジカルによるリポソーム表面でのコレステロール・ビタミンE酸化開始機構、ビタミンEによるコレステロール酸化抑制機構、およびビタミンE自体の酸化機構を考慮することで新たな速度論モデルを構築した。このモデルは、種々の初期水溶性ラジカル濃度、ビタミンE濃度条件において、コレステロールおよびビタミンE濃度の減少挙動を良好に表現することができた。本研究で得られた知見から、コレステロールの酸化抑制には水溶性ラジカルの捕捉が有効であることが示唆された。