hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病患者における術後痛増強への酸感受性イオンチャネルの関与の解析

酸感受性イオンチャネル(Acid-sensing ion channels;ASICs)は、細胞外ドメインにprotonが結合することで開口するナトリウムチャネルである。ASICsの細胞外ドメインにはClイオン結合部位が存在しており、これはASICsの各種サブユニット間に共通してみられる。ASIC1aチャネルでは、細胞外陰イオンの変化がCl結合部位を介してチャネル機能を修飾している。Chinese hamster overy cell(CHO cell)に発現したASIC2aとASIC3チャネル、およびラット脊髄後根神経節細胞のASICチャネルで、細胞外陰イオンの変化がチャネル機能に及ぼす影響を調査した。CHO cellに発現したASIC(ASIC2a, 3)では、細胞外陰イオンの変化により脱感作速度が変化した。さらに、チャネル活性のPH依存性にも変化が認められた。しかし、各種陰イオンの効果の強度はASIC1aの場合と異なっていた。Clイオン結合部位のアミノ酸残基を変異させた場合、陰イオンによるチャネル機能の変化は、ASIC2aでは部分的に消失、ASIC3では完全に消失した。ラットの脊髄後根神経節細胞に発現したASICに対する陰イオンの効果は、CHO cellに発現したASIC1a/3ヘテロマルチマーチャネルで見られた効果と同様の変化を示した。以上のことから、陰イオンはASICチャネルの組成に応じた機能変化をもたらすと考えられる。このようなASICの特性は、糖尿病の合併症としての微小血管障害によって生じた虚血は、細胞外protonと陰イオンの変化を介してチャネル活性を調整している可能性が示唆される。糖尿病における術後痛の増強に対するASICs(Acid-Sensing Ion Channel)の関係を明らかにすることが、本研究を行う目的である。平成28年度の研究計画では、術後痛モデルを使用する前段階の準備実験を完遂することを目標としていた。主な実験内容としては、糖尿病ラットにおけるASICチャネルの変化を電気生理学的手法、免疫組織染色法により検討することであった。II型糖尿病ラットおよびコントロールのラットで、脊髄後根神経節細胞に発現する主要なASICチャネルの構成を、以下の2つの方法で明らかにする予定であった。1後肢の筋肉内にカルボシアニン色素(Dil)を注入し、脊髄後根神経節細胞を逆行性に標識する。標識された脊髄後根神経節細胞を分離培養し、電気生理学的手法(Whole-cell patch-clamp法)を用いて発現しているASICsのチャネル特性を測定する。細胞外液のpHを7.4から酸性(pH4.0-6.0)に変化させた時に生じるASIC電流を電気生理学的手法(Whole-cell patch-clamp法)を用いて測定し解析する。この際、各種ASIC阻害薬(PcTX; ASIC1aホモマルチマーの選択的阻害薬、amiloride; ASICの非特異的阻害薬)のproton-gated currentに対する抑制効果も検討する。2免疫組織染色法により、脊髄後根神経節細胞における各アイソファーム(ASIC1-4)の発現をII型糖尿病ラットおよびコントロールのラットで明らかにする。本年度は、脊髄後根神経節細胞を分離培養して実験を行うことができず、研究が遅れてしまった。脊髄後根神経節細胞を分離培養して実験を行うことができなかった。このため電気生理学的手法、免疫組織染色法による研究をすすめることができなかった。糖尿病における術後痛の増強に対するASICs(Acid-Sensing Ion Channel)の関係を明らかにすることが、本研究の目的である。平成29年度の研究計画では、昨年度の研究(コントロールラットおよび糖尿病ラットで、後根神経節細胞に発現するASICチャネルの構成を電気生理学的手法および免疫組織染色法により明らかにすること)の遅れを取り戻すこと、および術後痛モデルにおいて、術後痛と脊髄後根神経節に発現するASICチャネルを、以下の方法で明らかにする予定であった。2型糖尿病ラットとコントロールのラットでBrennanの足底切開モデルを作製し、1)刺激誘発痛み行動の試験(von Freyフィラメントテスト、Randal-Selittoテストなど)により、逃避閾値の違いを糖尿病ラットとコントロールのラットで比較する。2)Dilで標識された脊髄後根神経節細胞を分離培養し、電気生理学的手法(Whole-cell patch-clamp法)を用いて発現しているASICsのチャネル特性を測定する。3)免疫組織染色法により、脊髄後根神経節細胞におけるASICアイソファームの発現を測定する。4)上記の実験により、術後痛モデルでASICsの発現が増加すること、とくに糖尿病ラットではASICsが多く発現し術後痛も強いことが確認できた場合、ASIC阻害薬の投与実験を行う。ASIC阻害薬が術後痛を抑制する作用を有するかどうかを、刺激誘発痛み行動のテストによって評価する。今年度は、脊髄後根神経節細胞を分離培養、モデル動物の作成ができず実験が遅れてしまった。このため電気生理学的手法や免疫組織染色による研究を進めることができなかった。また、モデル動物の作成も行うことができず実験が遅れてしまった。

Chinese hamster overy cell(CHO cell)に発現したASIC2aとASIC3チャネル、およびラット脊髄後根神経節細胞のASICチャネルで、細胞外陰イオンの変化がチャネル機能に及ぼす影響を調査した。CHO cellに発現したASIC(ASIC2a, 3)では、細胞外陰イオンの変化により脱感作速度が変化した。さらに、チャネル活性のPH依存性にも変化が認められた。しかし、各種陰イオンの効果の強度はASIC1aの場合と異なっていた。Clイオン結合部位のアミノ酸残基を変異させた場合、陰イオンによるチャネル機能の変化は、ASIC2aでは部分的に消失、ASIC3では完全に消失した。ラットの脊髄後根神経節細胞に発現したASICに対する陰イオンの効果は、CHO cellに発現したASIC1a/3ヘテロマルチマーチャネルで見られた効果と同様の変化を示した。以上のことから、陰イオンはASICチャネルの組成に応じた機能変化をもたらすと考えられる。このようなASICの特性は、糖尿病の合併症としての微小血管障害によって生じた虚血は、細胞外protonと陰イオンの変化を介してチャネル活性を調整している可能性が示唆される。脊髄後根神経節細胞を分離培養して予定された研究を進める。研究を進めるためにより多くのエフォートを割く。脊髄後根神経節細胞を分離培養して予定していた実験を行う。またモデル動物の作成も行う。研究を進めるためにエフォートを割くように努める。実験を十分に進めることができず、次年度に繰り越しとなった。実験を十分にすすめることができず、次年度に繰り越しとなった。昨年度および本年度に予定した以下の研究を進め、計画した実験に使用します。1)コントロールラットおよび糖尿病ラットで脊髄後根神経節細胞に発現するASICチャネルの構成を電気生理学的手法および免疫組織染色法により明らかにする、2)2型糖尿病ラットとコントロールのラットで術後痛みモデルを作製し刺激誘発痛み行動の試験を行う、3)術後痛モデルにおいて、脊髄後根神経節に発現するASICチャネルを電気生理学的手法および免疫組織染色法により明らかにする、4)術後痛モデルでASIC阻害薬の投与実験を行う。昨年度および本年度に予定した研究を進め、計画した実験に使用します。
宇宙放射線組成線種・重粒子線によるDNA損傷とその修復機構

長期宇宙滞在での宇宙放射線よる生物影響を明らかにするため、マウス個体に重粒子線の炭素線を全身照射し、小腸・精巣および骨髄幹細胞におけるアポトーシス誘導を解析した。高線量2.0 Gy照射したマウスの小腸および精巣において顕著にアポトーシス誘導が認められた。骨髄においては高線量5 Gyを照射でも、低線量0.5 Gy以下の照射でも1日後に超感受性が認められるものの、照射14日後では5 Gyを照射した場合でも生存率は回復した。これらから重粒子線誘導DNA損傷には相同組換え修復が優先的に働くと考えた。重粒子線を含む宇宙放射線の生物影響を軽減するためには、放射線防護のさらなる重要性が示された。ネズミ個体に低線量の重粒子線を被ばくさせた時の組織幹細胞に対する応答を調べた。【材料と方法】(1)ICRマウス(雄、5週齢)に、炭素線(135 MeV/u)を0.012.0 Gyで単回全身照射した。またc-PTIO(6.7 mg/kg)を照射6時間前から2時間間隔で3回腹腔内投与し、NOの寄与を解析した。(2)照射後36時間目にマウスから小腸および精巣を摘出し、正常組織反応の指標としてアポトーシスの誘導をTUNEL染色により検討した。【結果】(1)炭素線を全身に2.0 Gy照射し、36時間後に小腸および精巣を摘出し、アポトーシスの誘導をTUNEL染色により検討した。それらに顕著なTUNEL陽性細胞の誘導が認められた。これらはc-PTIOの照射前投与により抑制された。(2)炭素線を全身に0.01-0.1 Gy照射し、36時間後に小腸および精巣を摘出し、アポトーシスの誘導をTUNEL染色により検討した。それらにおいて、非照射の場合と比較して、有意にTUNEL陽性細胞の誘導が認められた。それらはc-PTIOの照射前投与により抑制された。さらに精巣小葉あるいは小腸腺窩当たりのTUNEL陽性細胞の個数に線量依存性が認められた。(3)炭素線により誘導されるTUNEL陽性細胞は精巣小葉の精原細胞あるいは精母細胞が分布する最外層および第2層目に局在し、精子幹細胞および前駆細胞に特異的にアポトーシスが誘導された。また、小腸腺窩のパネート細胞の近傍に陽性細胞が局在し、小腸幹細胞および前駆細胞に特異的にアポトーシスが誘導されていた。以上の結果から、低線量炭素線被ばくによりDNA損傷が誘発された組織幹細胞は、DNA損傷の修復されるのではなく、アポトーシスにより細胞が排除されていると示唆された。マウス個体(雄、5週齢)に、炭素線(135 MeV/u, 25 keV/μm)を0.012.0 Gyを単回照射した。照射後36時間目にマウスから小腸および精巣を摘出し、正常組織反応の指標として精巣における炭素線照射によるアポトーシスの誘導を見るために、36時間後に精巣を摘出し、アポトーシスの誘導をTUNEL染色により検討した。非照射の場合と比較して、被ばくマウス由来の精巣では、顕著にTUNEL陽性細胞の誘導が認められた。非照射の場合と比較して、被ばくマウス由来の小腸腺窩では、顕著にTUNEL陽性細胞の誘導が認められた。精巣においては、何れの陽性細胞も精細管の精原細胞あるいは精母細胞が分布する最外層および第2層目に局在し、精子幹細胞および前駆細胞に特異的にアポトーシスが誘導されていることが示唆された。小腸においては、何れの陽性細胞も小腸腺窩のパネート細胞の近傍に局在し、小腸幹細胞および前駆細胞に特異的にアポトーシスが誘導されていることが示唆された。精細管断面あるいは小腸腺窩当たりのTUNEL陽性細胞の個数に線量依存性が認められた。以上の結果から、粒子線の低線量被ばくにより小腸および精巣においてアポトーシスが誘導され、それらの誘導にはNOが関与していることが示唆された。また炭素線の0.010.05 Gyにおいて、アポトーシス細胞の出現頻度に線量依存性が認められた。これらのことは、宇宙環境において粒子線を低線量被ばくした正常組織の応答解析の重要性を示唆している。宇宙での長期滞在で被ばくする宇宙飛行士の宇宙放射線よって発現される生物影響の発現のしくみを明らかにすることを目指した。今回マウス個体に重粒子である炭素線を照射して、骨髄の幹細胞および前駆細胞の生存率を精査した。ICRマウス(雄、5週齢)に炭素線(290MeV/u, 13.3keV/μm)を0.015.0Gyを単回全身照射した。マウスをペントバルビタールで麻酔し、アクリルボードにテープで固定し、さらに全てのマウス体幹の厚みが一定となるようにアクリルカバーを装着した。非照射および0.010.5 Gyを照射したマウスからは23 x E7個の有核細胞が、1 Gy以上を照射したマウスからも1/21/3量の有核細胞が調製された。

またMethoCult培地を用いたコロニー形成法による生存率の解析では、0.010.5 Gyを照射したマウスの骨髄幹細胞および前駆細胞の生存率は非照射マウスと変わらない値を示し、生存率はほぼ1.0であった。1 Gy以上を照射したマウスの骨髄幹細胞および前駆細胞の生存率は、徐々に減少し、5 Gyを照射したマウスで約0.8であった。骨髄細胞においては照射1日後では重粒子線による0.5 Gy以下の照射により低線量超感受性が認められ、また高線量照射においては大きな肩を有する生存率曲線を示した。しかし、照射14日後では、5 Gyを照射したマウスにおいても骨髄幹細胞および前駆細胞の生存率は0.8まで回復していることが示された。これらの結果から、重粒子線の低線量被ばくした正常骨髄幹細胞は一時的に死滅するが、徐々に回復していくことが示唆された。また生存率曲線の形状から、骨髄幹細胞においては相同組換え修復が優先的に機能していることが示唆された。これらのことから、重粒子線の低線量被ばくした寛骨(腸骨)骨髄幹細胞の応答(反応)解析の重要性が示唆された。長期宇宙滞在での宇宙放射線よる生物影響を明らかにするため、マウス個体に重粒子線の炭素線を全身照射し、小腸・精巣および骨髄幹細胞におけるアポトーシス誘導を解析した。高線量2.0 Gy照射したマウスの小腸および精巣において顕著にアポトーシス誘導が認められた。骨髄においては高線量5 Gyを照射でも、低線量0.5 Gy以下の照射でも1日後に超感受性が認められるものの、照射14日後では5 Gyを照射した場合でも生存率は回復した。これらから重粒子線誘導DNA損傷には相同組換え修復が優先的に働くと考えた。重粒子線を含む宇宙放射線の生物影響を軽減するためには、放射線防護のさらなる重要性が示された。宇宙環境の主環境は微小重力と宇宙放射線である。宇宙環境はエネルギーの異なる多種の宇宙放射線を含んでいる。その中でも生物効果が高く出るとされる高エネルギー放射線などの環境変化がDNAに損傷をもたらすことや温熱をヒト培養細胞やネズミ個体に施すことにより、生物影響の現れ方がことなるのかの実験を進めてきた。学会でそれらに関する経過報告を発表できた。さらに、今後の研究の発展させていく。放射線生物学宇宙環境の特徴の一つである高エネルギー放射線である重粒子線による生物影響に焦点を絞って研究を進めてきたが、低エネルギー放射線であるX線をコントロールとして、生物影響の現れる効率(生物効果比)を比較し、重粒子線がその影響効率もたらすしくみを比較・考察していく。そのことによって、宇宙環境における人体の健康維持をめさした宇宙放射線の防御研究へと発展させていきたい。さらに細胞へのさまざまなストレス環境がもたらす影響へと発展させていきたい。宇宙放射線はエネルギーの異なる多種の放射線を含んでいる。その中でも生物効果が高く出る放射線の生物影響が特に注目されている。そのためには、低エネルギーに当たる放射線をコントロールと比較した、比較研究が重要である。環境因子でDNAに損傷をもたらす放射線や温熱をヒト培養細胞やネズミ個体に施すことにより、生物影響の現れ方の実験を進めてきた。DNA損傷と修復に関する成果を論文にすることができ、学会でそれらに関する経過報告を発表できた。さらに、今後の研究の発展のための、放射線に感受性を示すDNA修復欠損変異株を準備した。これらを用いてさらに研究を進めていく。実験遂行上、本年度の成果結果を考慮して次年度への使用のために繰り越すことにした。
照射下微細組織変化予測のための点欠陥クラスタ安定性評価

高エネルギー中性子の照射により材料中に生じる、点欠陥の集合体の照射下での成長/消滅挙動に関し、イオン照射実験をもとに、集合体が周囲に形成する点欠陥を捕獲する領域を評価し、これまでの想定よりも大きく、かつ歪み場により形成されること明らかにした。これをもとに微細組織変化シミュレーションを行い、集合体密度が飽和を生じる機構及び集合体の安定性を正確に定めることに成功し、将来的な照射損傷制御法の端緒を得た。高エネルギー中性子等の照射がもたらす、材料の硬化、脆化等の原因は、主に照射生成点欠陥の集合体(クラスタ)形成とその成長による微細組織の変化にある。この変化を計算機で予測する能力を向上させれば、多くの資源を要する原子炉での照射実験の軽減等が可能になる。本提案では、この計算機シミュレーションにおける最重要因子の一つである「点欠陥クラスタが点欠陥を吸収する力(クラスタの状態の影響を含む)」の推定を、イオン照射実験や計算機実験等で明らかにし、予測精度を高めた計算コードの構築を導く。H20年度には、電子顕微鏡による照射下微細組織のその場観察、及びMD法によるクラスタと点欠陥に働く力等に関する計算機実験等を実施した。このうち、その場観察実験では、純金属に加えて、照射で著しい硬化を示す1-2%程度のNiやSiを含む鉄合金に、Feイオン照射(200KeV程度)や電子線照射を行い、Fe-Ni合金では、カスケード損傷が大きさ数nm程度の微細な点欠陥クラスタの形成を強く促進させること、しかし、この挙動は特異であって、他の多くの場合、カスケードがクラスタの生成を助長する範囲は、照射の初期段階に限られ、照射量の増加と伴に影響が減じることを明らかにした。この結果は、クラスタが点欠陥を吸収する力が、クラスタの大きさに従って増加することを示唆する。一方、計算機実験では、MD法に計算速度を高める工夫を加え、従来よりも大きい寸法範囲での点欠陥と点欠陥クラスタの結合エネルギーの計算に成功した。結果は、実験結果からの結論に沿ったものであり、これらをもとに、クラスタの1次元運動をも考慮した速度論コードを構築し、これまでのKMC法等による報告で、再現能力に根本的な問題があった「クラスタのサイズ分布」の予測能力向上に成功した。但し、計算可能な範囲が限られるため、さらに、改良を進める。この変化を計算機で予測する能力を向上させるば、多くの資源を要する原子炉での照射実験の軽減等が可能になる。本提案では、この計算機シミュレーションにおる最重要因子一つである「点欠陥クラスタが点欠陥を吸収する力(クラスタの状態の影響を含む)」の推定を、イカン照射実験や計算機実験等で明らかにし、予測精度を高めた計算コードの構築を導く。H21年度には、電子顕微鏡による照射下微細組織のその場観察、及びMD法と反応速度論による微細組織変化に関する計算機実験を実施した。このうち、計算機実験では、前年度に明らかにした点欠陥クラスタと点欠陥の相互作用を基に、この結果を反応速度論による計算に組み込むことで、従来のモデルでは説明がつきにくかった微細組織変化の照射量依存性について、よい近似が得られる結果を得た。一方、その場観察実験では、純金属中に生じる微細な点欠陥クラスタの移動、合体に関するデータを集め、さらにクラスタ密度の照射速度依存性の評価を行い、クラスタの数密度を決める因子が、基本的には点欠陥反応であることを明示した。加えて、マルチスケールモデリングへの展開に向けて、微細組織と硬化の関係及び塑性の構成式を数値計算に導入し、照射による変化モード変化を扱い得る構造を持つモデル及び計算方法を世界で始めて示した。高エネルギー中性子等の照射は、照射生成点欠陥の集合体(クラスタ)形成とその成長による微細組織の変化をもたらし、温度域によってはクラスタの密度が高くなる結果、材料が硬化、脆化等を示す。この微細組織の変化の過程を計算機で予測する能力を向上させれば、多くの資源を要する原子炉での照射実験等を軽減できよう。本提案では、この計算機シミュレーションにおける最重要因子の一つである「点欠陥クラスタが点欠陥/他の点欠陥クラスタを吸収する力(クラスタの状態の影響を含む)」の推定を、イオン照射実験や計算機実験等で明らかにし、予測精度を高めた計算コードの構築を導く。H22年度は、本課題の最終年度であり取りまとめも進めた。電子顕微鏡による照射下微細組織のその場観察、及びMD法と反応速度論による微細組織変化に関する計算機実験を進め、妥当な計算方法を見いだした。計算機実験では、前年度の成果を発展させ、点欠陥クラスタと点欠陥の相互作用を反応速度論計算に組み込み、従来のモデルでは説明がつきにくかった、照射下でのクラスタの消滅過程のモデル化を進め、微細組織変化の照射量依存性の予測精度を向上させた。

その場観察実験では、クラスタ密度の照射速度依存性の評価を進め、クラスタの数密度を決める因子として、移動による合体、空孔の吸収による収縮等を抽出した。当初の目標を概ね達成し、加えて、マルチスケールモデル化を進め、国際会議での発表準備等も進め、平成23年度初旬に発表の予定である。
近世障壁画付属の引手金具に関する研究

まず現地調査として、京都市周辺の正伝寺・天寿庵・円満院等および宮城県瑞巖寺という中小規模障壁画群と、二条城という大規模障壁画群について、付属の引手金具の全点調査を行った。計測・写真撮影と現位置確認、引手の付け替え痕跡などを記録し、一点ごとの資料カードとデーターベースを作成した。これらのデーターに基づき、個々の引手群について型式分類と組列作業を進め、障壁画制作当初にともなう型式と後補型式の弁別を図った。さらにこれらを相互に比較することで、以下の点が明らかとなった。1)16世紀後葉までの引手が、楕円形ないし四花形といったシンプルな外形で彫金装飾も最低限の範囲にとどまっているのに対して、17世紀初頭の慶長年間後半ころより、笄形区画のある大形縁座を作り出すいわゆる御殿引手が急速に流行する。彫金装飾はいたって豪華で、鍍金や墨差しなどの着色も一般化する。2)引手デザインのうちとくに鍍金・墨差しの有無といった外観の色合いは、襖絵との釣合いを念頭に決定されたようで、金碧画には鍍金のみのもの、淡彩・水墨画には未鍍金ないし鍍金後墨差しをした落ち着いた色調のものが対応することが多い。3)17世紀前半の慶長期から寛永期へといたる過程で、引手の装飾性が急激に高まる。具体的には、加飾密度の高まり、月や花桶といった具象的意匠の登場、七宝技法の採用などの点が挙げられる。あわせて、個々の引手に工人ごとの個性があまり目だたなくなり、技術の平準化も進むことが判明した。4)障壁画の規模により、引手を担当した工房の工人組織にも大小の差が明瞭に見られた。
革新的磁石材料の為の新規SmFe5磁性化合物の開発

非ネオジム系の高性能希土類磁石として知られるサマコバ磁石の磁石機能を担うのはSmCo5磁性化合物であるが、SmFe5は平衡状態図上に存在しない。SmFe5は安価な高性能磁石としての大きな可能性を有しており、その開発意義は大きい。本研究では外的および内的圧力を用いてSmFe5化合物の合成法の確立を目指す。RE-TM化合物(RE:希土類、TM:遷移金属)の形成は、REとTMの原子半径比の最適条件を得ることが重要であり、このSmFe5相合成の最適条件を見出し、単相化を目指し、諸性質にについても調査する。
プラズマ溶射を用いた熱遮へいコーティングの耐酸化性・耐はく離性の向上

これまでの研究から熱遮へいコーティング(TBC)の劣化は,TBCとボンドコートであるMCrAIYの界面に生成する熱成長酸化物(TGO)が熱応力を引き起こすことおよびこのTGOが多くの気孔を有するために応力集中源となり接合強度を低下させることが駆動力であることを提案してきた.昨年度の研究では,TGO内に発生する気孔を抑制し,界面強度の高いTBC作製を目標にボンドコート材料の改善を行った.その結果,微量Ce, Si添加により,TGOの酸化形態は顕著に異なり,木の根のようにボンドコート内部にTGOが成長し,くさび効果をもたらした.さらに,TGOの気孔発生要因であるNiやCoの酸化物を抑制することも可能となった.四点曲げ試験によるTBC/MCrAIY界面強度評価においては,従来のMCrAIYを使用したTBC材に比べ,MCrAIYにCe, Si添加したTBCは,ひずみ量にして3倍以上の強度向上が認められた.今年度はCe, Si添加ボンドコート材料に関し溶射条件を変化させ,耐酸化および耐はく離性に優れたTBCの開発を目的とした.さらに,TGO内に生成する気孔を抑制するためには,初期に生成するAIの酸化物を緻密にすることが重要であるため,レーザ照射により緻密な酸化層を生成させ,TBC界面強度の向上および酸化特性の改善についても実施した.MCrAIYCeSiボンドコートを用いたTBCにおいては,溶射電流等を変化させることで,酸化物形態が大きく異なることを明らかにした.電流を低くし,パウダーを半溶融状態にしたもので木の根のようにボンドコート内部に成長するTGOを得ることができ,くさび効果により界面強度が向上した.また,従来からのMCrAIYボンドコートを使用した場合でも,ボンドコート溶射後,その表面をレーザで再溶融することにより緻密なアルミナ膜が生成し,良好な耐酸化特性を示すことを明らかにした.これまでの研究から熱遮へいコーティング(TBC)の劣化は,TBCとボンドコートであるMCrAIYの界面に生成する熱成長酸化物(TGO)が熱応力を引き起こすことおよびこのTGOが多くの気孔を有するために応力集中源となり接合強度を低下させることが駆動力であることを提案してきた.昨年度の研究では,TGO内に発生する気孔を抑制し,界面強度の高いTBC作製を目標にボンドコート材料の改善を行った.その結果,微量Ce, Si添加により,TGOの酸化形態は顕著に異なり,木の根のようにボンドコート内部にTGOが成長し,くさび効果をもたらした.さらに,TGOの気孔発生要因であるNiやCoの酸化物を抑制することも可能となった.四点曲げ試験によるTBC/MCrAIY界面強度評価においては,従来のMCrAIYを使用したTBC材に比べ,MCrAIYにCe, Si添加したTBCは,ひずみ量にして3倍以上の強度向上が認められた.今年度はCe, Si添加ボンドコート材料に関し溶射条件を変化させ,耐酸化および耐はく離性に優れたTBCの開発を目的とした.さらに,TGO内に生成する気孔を抑制するためには,初期に生成するAIの酸化物を緻密にすることが重要であるため,レーザ照射により緻密な酸化層を生成させ,TBC界面強度の向上および酸化特性の改善についても実施した.MCrAIYCeSiボンドコートを用いたTBCにおいては,溶射電流等を変化させることで,酸化物形態が大きく異なることを明らかにした.電流を低くし,パウダーを半溶融状態にしたもので木の根のようにボンドコート内部に成長するTGOを得ることができ,くさび効果により界面強度が向上した.また,従来からのMCrAIYボンドコートを使用した場合でも,ボンドコート溶射後,その表面をレーザで再溶融することにより緻密なアルミナ膜が生成し,良好な耐酸化特性を示すことを明らかにした.先進ガスタービンにおいて必要不可欠な熱遮へいコーティング(TBC)は、高温・長時間の過酷な条件下での使用により、はく離・脱落等の発生が危惧される。一般に、高温での使用によりTBCとボンドコート界面には熱成長酸化物が生成し、それに伴う熱応力の発生がTBCはく離・脱落の主要因と考えられている。しかし、熱応力のみが劣化要因であるのか、劣化の起点がどこであるのか等不明確な点が多い。耐はく離特性を向上させるためには、主要因と考えられる酸化特性の見極めと劣化メカニズムの解明が重要である。そこで本研究においては、従来から使用されてきたTBCに関し、時効処理を施し、時効にともなう劣化を詳細に調査し、そのメカニズムを明らかにした。その結果、TBCとボンドコート界面に生成する熱成長酸化物は異なる二種類の酸化物から構成され、その一方に多くの気孔を含んでいることからこの気孔を通って界面でのき裂が進行していることがわかった。すなわち、劣化のメカニズムとしては、これまで言われてきた熱応力の発生に他に気孔発生による応力集中と接合強度の低下が考えられる。さらにこれらの結果を鑑み、プラズマ溶射に用いる溶射粉末の化学組織を変化させ、ガスタービンプラントの長寿命化を目的に、耐はく離性に優れたTBCの開発を行った。本研究で開発したボンドコート材料は四点曲げ試験による界面強度評価試験において、従来から使用されてきたTBCに比べ、良好な強度を有することがわかった。これは、微量添加したSiおよびCeが、酸化物界面に入り込み、酸化物をボンドコートの内側へ成長されることにより、くさび的な効果を生じ、その結果として界面強度が向上してものと考える。

これまでの研究から熱遮へいコーティング(TBC)の劣化は,TBCとボンドコートであるMCrAlYの界面に生成する熱成長酸化物(TGO)が熱応力を引き起こすことおよびこのTGOが多くの気孔を有するために応力集中源となり接合強度を低下させることが駆動力であることを提案してきた.昨年度の研究では,TGO内に発生する気孔を抑制し,界面強度の高いTBC作製を目標にボンドコート材料の改善を行った.その結果,微量Ce, Si添加により,TGOの酸化形態は顕著に異なり,木の根のようにボンドコート内部にTGOが成長し,くさび効果をもたらした.さらに,TGOの気孔発生要因であるNiやCoの酸化物を抑制することも可能となった.四点曲げ試験によるTBC/MCrAlY界面強度評価においては,従来のMCrAlYを使用したTBC材に比べ,MCrAlYにCe, Si添加したTBCは,ひずみ量にして3倍以上の強度向上が認めらた.今年度はCe, Si添加ボンドコート材料に関し溶射条件を変化させ,耐酸化および耐はく離性に優れたTBCの開発を目的とした.さらに,TGO内に生成する気孔を抑制するためには,初期に生成するAlの醸化物を緻密にすることが重要であるため,レーザ照射により緻密な酸化層を生成させ,TBC界面強度の向上および酸化特性の改善についても実施した.MCrAlYCeSiボンドコートを用いたTBCにおいては,溶射電流等を変化させることで,酸化物形態が大きく異なることを明らかにした.電流を低くし,パウダーを半溶融状態にしたもので木の根のようにボンドコート内部に成長するTGOを得ることができ,くさび効果により界面強度が向上した.また,従来からのMCrAlYボンドコートを使用した場合でも,ボンドコート溶射後,その表面をレーザで再溶融することにより緻密なアルミナ膜が生成し,良好な耐酸化特性を示すことを明らかにした.
身体活動時系列に基づく双極性障害の病相転移時期の予測技術の開発

躁病相とうつ病相を繰り返す双極性障害における各病相の客観的評価、および病相転移時期の予測に関する基盤技術の確立を目的に、双極性障害患者の身体活動、自覚症状の超長期連続計測(>6カ月)を行い、疾患の病態変化に伴う行動変容を記述する客観的・定量的かつ頑健な行動指標の開発を行った。さらには、開発した行動指標が持つ病相変化の予測可能性を検証した。これらの結果は、連続計測可能な身体活動から双極性障害の日常生活下での病態モニタリング、さらには病態変化や発症予測が客観的・定量的に行える可能性を示唆する。双極性障害患者の日常生活下の自発的身体活動を腕時計型加速度計測装置を用いて超長期(>6ヶ月)にわたり連続的に計測し、「病相転移」時期を含む身体活動および気分データを得た。病相変化に伴う身体活動パターンの変化および病相転移タイミングの予測可能性を検討する目的で、先行研究で提案した身体活動パターンの間欠性を定量化する行動指標γ(Nakamura et al, Phys. Rev. Lett. 2007)の病相依存性を評価した。うつ病相では寡動性の精神行動異常が確認され(γの低下)、軽躁病相では、そのような行動変化の改善がみられた(γの増加・正常化)。さらに、行動指標γを連続的に評価し、気分スコアとの共変性を評価したところ、有意な相関関係を確認した。また、気分変動データの局所分散および自己相関特性を解析したところ、病相転移前にその前兆とも考えられる気分変動の振幅および相関係数の増大を確認した。一方、時間解像度の高い評価手法の確立を目的に、Ecological Momentary Assessmentで計測した健常人および大うつ病性障害患者の日内の自覚症状の変動と身体活動の間欠性の増大を反映する局所統計量との共変性をマルチレベルモデルにより解析した。両群において、身体活動の間欠性の増大が日内の抑うつ気分の上昇と有意な共変関係にあることを確認した。さらに、うつ病患者において個人適合化モデルを構築したところ、モデル構築に使用していない評価データにおいて、身体活動の統計指標のみから有意に抑うつ気分が推定可能であることを確認した。これらの技術は、客観的かつ連続計測可能な身体活動から、日常生活下の抑うつ気分を連続的に評価することが可能であることを意味し、双極性障害をはじめとする精神疾患の客観的かつ定量的な病態モニタリング、さらには病態変化や発症予測に寄与すると考えられる。双極性障害患者および健常人の日常生活下の自発的身体活動をアクチグラフを用いて超長期(患者:>6ヶ月、健常人:>3ヶ月)にわたり連続的に計測した。病相転移時期を含む身体活動および気分データを得た。病相変化に伴う身体活動の変化および病相転移タイミングの予測可能性を検討するため、先行研究で提案した身体活動時系列の間欠性指標γを評価した。また、気分変動データの局所分散および自己相関特性を解析したところ、病相転移前にその前兆とも考えられる気分変動の振幅および相関係数の増大を確認し、病相転移の際に気分状態・情動の不安定化(背後のシステムの分岐現象)が存在することを示唆した(投稿準備中)。一方、時間解像度の高い評価手法の確立を目的に、Ecological Momentary Assessmentで計測した健常人および大うつ病性障害患者の日内の自覚症状変動と身体活動の間欠性を反映する局所統計量との共変性をマルチレベルモデルにより解析した。さらに、うつ病患者において個人適合化モデルを構築したところ、モデル構築に使用していない評価データにおいて、身体活動の統計指標のみから有意に抑うつ気分が推定可能であることを確認した(投稿中)。これらは、客観的かつ連続計測可能な身体活動から日常生活下の抑うつ気分を連続的に評価することが可能であることを意味し、双極性障害をはじめとする精神疾患の客観的かつ定量的な病態モニタリング、さらには病態変化や発症予測に寄与すると考えられる。生体情報工学双極性障害患者の臨床データの計測は順調であり、また病相・病態の客観的評価や病相転移予測に関する研究成果が得られつつある。前年度に引き続き患者および健常人の計測データを追加するとともに、行動指標の開発・同定、予測技術の確立を行う。また、時間解像度の高い予測技術の開発も同時に実施する。当初予定していたよりも順調に患者の長期連続計測が実施できたため、追加補充予定であった身体活動計測用デバイスおよび気分計測装置を初年度に購入する必要性がなくなったため。・患者群の追加および健常者対象群のデータ計測のためのデバイス購入と謝金。・国内および国際学会で研究発表を行うための旅費と経費。
天台大師智〓と嘉祥大師吉蔵の法華経観の比較

智〓は法華経至上主義者ではなく、むしろ円教至上主義者であると言いたい。一般的に、中国の教判は、あくまで釈尊在世の説法の整理を目指したものであり、教判の研究対象の空間と時間はインドと釈尊の在世に限定されている。しかし、智〓が釈尊の経教を研究して、自らの時代と地域において、真実の仏教を確立しようとする時には、彼の問題意識は、釈尊在世の教判の整理という問題意識と異なっている。智〓は、釈尊の経教を研究して、すべての大乗経典に共通に説かれている最高の真理である円教の存在を認めていることを重視するならば、智〓は法華経至上主義者であると言うよりも、むしろ円教至上主義者と呼ぶ方が適当である。智〓にとって重要なことは、釈尊の教えの究極である円教を我が身に体得することである。そして、釈尊在世の時の声聞と同じように、智〓在世においてもさまざまな機根の衆生が存在するのであるから、智〓はその機根の多様性にも配慮して、円教を体得する実践法を考案しようとした。そして、智〓の時代の衆生の機根の多様性は、釈尊在世の時とそれと同じであるわけではない。そこで、智〓は、円教を体得する実践法として、円頓止観=摩訶止観を考案したけれども、衆生の機根の多様性に配慮し、漸次止観、不定止観をも考案したのである。また、円頓止観についても、同様に衆生の機根の多様性に配慮して、四種三昧という複数の三昧を考案した。その場合、『法華経』以外の『般舟三昧経』『方等陀羅尼経』『文殊問般若経』などの大乗経典に依拠する三昧が説かれても何ら驚く必要はない。なぜならば、それらの『法華経』以外の諸経の活用は智〓の法華経至上主義とは矛盾するけれども、智〓の円教至上主義とは矛盾しないからである智〓は法華経至上主義者ではなく、むしろ円教至上主義者であると言いたい。なぜならば、それらの『法華経』以外の諸経の活用は智〓の法華経至上主義とは矛盾するけれども、智〓の円教至上主義とは矛盾しないからである研究課題「天台大師智〓と嘉祥大師吉蔵の法華経観の比較研究」を進めるために、まず吉蔵の最後の法華経疏である『法華統略』の研究に取り組んだ。とくに真福寺宝生院(名古屋市中区大須2-21-47)に所蔵される吉蔵(549-623)『法華統略』の写本の調査を行なった。真福寺本は、現存する諸写本のなかで最も良質なものなので、この原文の翻刻と訳注研究を進めている。また、原文を電子資料(データベース)として残す予定なので、その入力を行なっている。次に、智〓(537-598)に関する研究としては、彼の法華経観を解明するために重要な教判概念である蔵教・通教・別教・円教の「化法の四教」について考察するために、『維摩経玄疏』『四教義』の研究を進めて、論文を発表する予定である(1999年3月刊行予定)。また、「智〓は果たして法華経至上主義者か」という論文を準備中であり、これは吉蔵の法華経観と智〓の法華経観とを比較する内容となるものである。また、研究課題に関して、中国の北京市在住の仏教学者の指導を受けた。吉蔵

『法華統略』の鎌倉時代写本を有する真福寺宝生院(名古屋)での写本調査を踏まえて、写本の翻刻、訓読訳、注を含む『法華経注釈書集成7・法華統略(下)』(2000.3、大蔵出版、総432頁)を刊行することができた。従来、『法華統略』の研究は、『大日本族蔵経』所収本によってなされてきたが、これは誤写が多く、また釈訳草喩品・釈授記品・釈化城喩品を欠いていた。今後は、私の校訂した『法華統略』によって研究を進めることを望む。また、『法華統略』の訳注研究の過程で、『法華統略』の諸写本を収集したが、本年度は丸山孝雄氏所蔵の写本を見ることができた。真福寺宝生院所蔵本以外の諸写本と同系統のようであり、同様の多くの誤写を含んでいる。また、『法華統略』の原文を、研究助手の助けを受けて、電子テキストとして作成中であり、来年度には完成できる予定である。今年度の研究実績としては、第一に、吉蔵『法華統略』の訓読訳・注の完成(『法華経注釈書集成6・法華統略(上)』大蔵出版、1998年、『法華経注釈書集成7・法華統略(下)』大蔵出版、2000年)を受けて、『大日本続蔵経』所収本と真福寺宝生院所蔵本の比較的大きな相違点を整理して発表した(「吉蔵撰『法華統略』写本(真福寺宝生院所蔵)について」を参照)。第二に、智〓は法華経至上主義というよりも、むしろ円教至上主義と呼ぶべき立場に立って、大乗経典はすべて円教を説いていると見なしている点は、大乗経典を平等視する浄影寺慧遠、吉蔵と共通の教判思想を持つものと捉えられることを明らかにした(「智〓と吉蔵の法華経観の比較-智〓は果たして法華経至上主義者か?」を参照)。中国天台宗が法華経至上主義に変化していくのは、華厳宗、法相宗などと厳しく対抗した湛然の影響が強いのではないかとの見通しを持っているが、それを学問的に論証するのは今後の課題とせざるをえない。第三に、『法華経』の中心思想(一仏乗の思想・久遠の釈尊の思想・地涌の菩薩の思想)が智〓や吉蔵をはじめとする中国の法華経注釈家によってどのように受容されたのか、そこにどのような中国的特色が見られるのかについて考察した(「中国における『法華経』の思想の受容」を参照)。
水和効果に注目した蛋白質の部分モル体積及び圧縮率の理論的研究

(1)3D-RISM理論を用いて、16残基の人工ペプチド(AK16)のヘリックス-コイル転移に伴う部分モル体積変化を調べた。得られた体積変化を幾何学的な寄与と水和の寄与に理論的に分割することにより解析した。その結果、平均的に見ると、ヘリックス-コイル転移に伴う体積増加はコイル状態で生成する空洞の体積の寄与が最も重要であり、その一部がペプチド-水間の静電的な体積変化と相殺することが明らかになった。ただし、コイル構造は体積の観点で見ると必ずしも均一の性質を持っておらず、ヘリックスよりも体積の小さい伸びたコイル構造とヘリックスより体積の大きい通常のコイル構造に分類できることが分かった。(2)麻酔の圧拮抗の分子機構を明らかにするため、3D-RISM理論を用いて、リゾチームとキセノン(麻酔薬の一つ)の結合に伴う部分モル体積を調べた。キセノンがリゾチームの基質結合部位に吸着した際、体積が増加する(つまり圧力で抑制される)ことが分かった。一方、キセノンがリゾチーム内部に結合した場合は体積変化がほとんど起こらないことが分かった。前者の体積増加は、キセノンが結合部位にルーズに結合したため生成する空洞が主な原因であることを明らかにした。これらの結果に基づき、麻酔の圧拮抗は、麻酔薬が蛋白質にルーズに結合した結果起こる現象であるという仮説を提案した。(3)蛋白質内部に閉じ込められた水分子の平衡配置と個数が3D-RISM理論を用いて正確に予測できることを示した。(実験的にも分子シミュレーション等の他の理論的手法でも一般的にそのような水分子を検出することは難しい。)1、3D-RISM理論を用いて、2つのペプチド(melittin, erabutoxin B)と6つの蛋白質(BPTI, ubiquitin, RNase A, lysozyme, β-lactoglobulin A, α-chymotrypsinogen A)の部分モル体積を求めた。この計算は分子液体論を蛋白質水溶液に応用した最初の例となった。さらに、得られた部分モル体積から水和による寄与を取り出すことに成功した。水和による寄与は、水のパッキングによる寄与と蛋白質-水間の静電的相互作用による寄与に分け、それぞれについて次のような知見を得た。水のパッキングによる寄与は蛋白質の幾何形状に因らず蛋白質の表面積に比例する。蛋白質-水間の静電的相互作用による寄与は、その大部分が表面に露出した荷電残基によるものであり、極性残基の影響は一般に考えられているほど大きくない。また、同様の解析をlysozymeの高圧構造に応用した。熱力学的関係により、高圧構造は常圧(天然)構造よりも幾分小さい部分モル体積を持つと予想される。3D-RISM理論により得られた部分モル体積を比べると、実際に120cm^3/molだけ高圧構造の部分モル体積が小さいことが分かった。また、その体積差は、主に蛋白質内部の空隙の体積が減少したものであり、この場合は水和の寄与があまり効いていないことを明らかにした。2、蛋白質の変性に伴う疎水基の露出が、その体積変化にどのように寄与するかを調べるために、モデル疎水分子の疎水的環境から水への移行に伴う体積変化についてRISM理論を用いて解析した。その結果、体積変化は移行前の環境の圧縮率(体積的な揺らぎ)に本質的に依存することを明らかにした。また、体積変化と溶質サイズ及び移行前の環境の圧縮率の依存性を調べた結果、揺らぎの大きい環境に置かれている大きい疎水基が露出した場合、負の体積変化を伴うが、その逆の場合は正の体積変化を伴うことを示唆する結果を得た。)
ゲノム編集技術を基盤としたスフィンゴシン-1-リン酸の造血発生における機能解析

スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞内のスフィンゴシンをスフィンゴシンキナーゼ(Sphk1とSphk 2)がリン酸化することにより生成される脂質メディエーターである。哺乳類のS1Pは、生体内において細胞の増殖やリンパ球の移動などを制御していると考えられているが、形態形成過程におけるS1Pの機能は不明な点が多い。スフィンゴシンキナーゼは酵母、ショウジョウバエから哺乳類まで保存されているが、S1P受容体(S1PR)は脊椎動物でのみ同定されているので、無脊椎動物から脊椎動物へ進化する過程でS1Pに新たな機能が付加された可能性が考えられる。我々は、心臓発生に不全を示すゼブラフィッシュ変異体の機能解析からS1P輸送体であるSpns2が原因遺伝子であることを同定した。spns2変異体とs1pr2変異体の機能解析から、ゼブラフィッシュではS1Pシグナルが心臓前駆細胞の移動を調節していることを明らかにしている。我々のグループは、独自に速攻型CRISPR/Cas9法を開発し、ゼブラフィッシュにおける標的遺伝子の破壊を簡便に遂行できるシステムを確立している。本研究では、網羅的に7つの全てのS1PRに対する遺伝子の破壊を行い、それら変異体の表現型解析を行う。ヒトでは、S1Pシグナルが自己免疫疾患や癌などの難治性疾患に関連することが指摘されており、本研究で得られる知見は、それら疾患の病態の解明につながる可能性が考えられる。現在、全てのS1PRに対し機能欠損変異体の樹立に成功しているので、これらS1PRの多重変異体の機能解析からS1Pシグナルの新しい機能の解明を目指す。本研究の目的は、脂質メディエーターであるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の生体内での新しい生理機能を、独自に開発した速攻型CRISPR/Cas9による網羅的なS1PR遺伝子破壊ゼブラフィッシュの表現型解析から明らかにすることである。現在、全てのS1P受容体(s1pr1-s1pr5b)に対する機能欠損変異体の作製に成功しているが、s1pr2変異体以外は成魚まで生育できている。そこで、S1P受容体(s1pr1-s1pr5b)に対する二重遺伝子破壊系統を作製し表現型解析を行った結果、s1pr3b-s1pr4二重変異体において、赤血球の数が4日胚で減少する予備的知見が得られた。その後、s1pr3b-s1pr4二重変異体も成魚まで生育が可能であることが明らかとなり、発生致死の表現型までではない可能性や初期発生過程で他のS1PRによる機能の補完が働いている可能性も考えられた。そこで、この二重変異体を基盤に全てのS1P受容体を破壊した変異体の作製を試みた。驚いたことに、s1pr2を除く6S1PR遺伝子破壊変異体が成魚まで生育可能であることが分かった。これに対し、全てのS1PRが破壊された7S1PR変異体は胚性致死の表現型を示すことが明らかとなった。現在、6S1PR変異体と7 S1PR変異体が樹立できているので、様々な組織特異的なマーカー遺伝子の発現動態の相違を広範囲に調べることで(この過程で新規の組織特異的マーカー遺伝子であるcart-likeやslurp1-likeなどの遺伝子も単離した)、S1Pシグナルが造血発生や循環器系を含め形態形成のプロセスでどのような役割を担っているかを解明する。本研究の目的は、S1PR遺伝子破壊ゼブラフィッシュの表現型解析から形態形成におけるS1Pシグナルの新規機能を明らかにすることである。現在、s1pr2以外のS1PRを破壊した6S1PR変異体と全てのS1PRを破壊した7S1PR変異体が樹立できている。驚いたことに6S1PR変異体は成魚まで生育可能であり、これに対して7S1PR変異体は胚性致死の表現型を示した。6S1PR変異体と7S1PR変異体を用い様々な組織特異的マーカー遺伝子の発現動態をwhole-mount in situ hybridization法やリアルタイムPCR法で解析することにより、S1Pシグナルがどのような細胞分化を制御しているかを包括的に解析する。この時、我々のグループが組織特異的遺伝子として単離したcart-like, slurp1-likeやbilkf/klf17の発現動態も解析する計画である。さらに、6S1PR変異体と7S1PR変異体で発現強度が異なる遺伝子群をマイクロアレイ解析あるいはRNAシークエンス解析により探索することを計画している。これらの解析で得られた候補遺伝子の機能は、速攻型CRISPR/Cas9でF0胚での表現型解析を行うことで生理活性を明らかにする。予備的知見として、7S1PR変異体において循環器系の異常に加えて造血発生の異常も認められている。造血発生過程では造血幹細胞から赤血球、リンパ球やミエロイド系細胞など性状が異なる細胞が生成されるので、その分化過程を蛍光タンパク質の発現として可視化できるトランスジェニック系統を用い継時的な画像解析を行う。特に、各細胞系譜を生成する微小環境(ニッチ)の形態や機能に関しては不明な点が多いので、6S1PR変異体と7S1PR変異体の機能解析から造血発生ニッチに関する新たな知見が得られることを期待している。脂質メディエーターであるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞内に局在するスフィンゴシンキナーゼ(Sphk1, 2)によるスフィンゴシンのリン酸化により生成される。

S1P受容体(S1PR)は無脊椎動物のゲノムには見つかっていないので、脊椎動物への進化の過程で多様な生理活性を獲得したと考えられる。S1Pは、哺乳類ではリンパ球の再循環を調節していることが知られている。我々は、心臓発生に異常を示すゼブラフィッシュ変異体の原因遺伝子としてS1P輸送体Spns2を発見し、新規の生理機能としてS1Pシグナルが心臓前駆細胞の移動を制御していることを明らかにした。ヒトでは、S1Pと癌や自己免疫疾患との関連性が指摘されており、S1Pの生理機能の解明は、上記の難治性疾患の理解につながる可能性がある。Sphk1, 2二重欠損マウスやspns2およびs1pr2ゼブラフィッシュ変異体は発生致死であるので、形態形成におけるS1Pの役割は不明な点が多い。本研究は、S1Pの新しい生理機能をS1PR機能欠損ゼブラフィッシュ変異体の表現型解析から解明することを目的としている。我々は、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用い全てのS1PR変異体の作成に成功している。それらの表現型解析からs1pr2変異体が二叉心臓の表現型を示すことが明らかになっているが、それ以外のS1PRを単独で破壊した場合には(s1pr1,s1pr3a, s1pr3b, s1pr4, s1pr5a,s1pr5b変異体)、顕著な発生異常は認められておらず、S1PR間で機能的に補完している可能性も考えられた。本研究では、S1PRに対する多重遺伝子破壊系統を作成し、S1Pシグナルの形態形成における役割を明らかにする。我々は、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いS1P合成酵素(sphk1, 2)および全てのS1P受容体(s1pr1-s1pr5b)に対する機能欠損ゼブラフィッシュ変異体を作成した。sphk2変異体とs1pr2変異体が二叉心臓を伴う胚性致死の表現型を示したが、それ以外の変異体は初期発生過程に顕著な異常が認められなかった。そこで、S1PR二重変異体を樹立し表現型解析を行った結果、s1pr3b-s1pr4二重変異体が4日胚において血液細胞の数が減少することが観察された。ゼブラフィッシュの造血発生は、一次造血(血島)から二次造血(後部静脈叢・腎臓)へと移行する。血液細胞の分化過程に関して化学染色法を用いて解析した結果、成熟した赤血球と好中球を示す染色が弱いことが明らかとなった。s1pr3b-s1pr4二重変異体胚は、発生過程で血液細胞の数が減ってはいたが成魚まで生育できる個体が得られている。これらの結果は、他のS1PRによる機能の補完が生じている可能性も考えられ、s1pr3b-s1pr4二重変異体を基盤としたS1PR多重変異体の作成を計画している。スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞内のスフィンゴシンをスフィンゴシンキナーゼ(Sphk1とSphk 2)がリン酸化することにより生成される脂質メディエーターである。哺乳類のS1Pは、生体内において細胞の増殖やリンパ球の移動などを制御していると考えられているが、形態形成過程におけるS1Pの機能は不明な点が多い。スフィンゴシンキナーゼは酵母、ショウジョウバエから哺乳類まで保存されているが、S1P受容体(S1PR)は脊椎動物でのみ同定されているので、無脊椎動物から脊椎動物へ進化する過程でS1Pに新たな機能が付加された可能性が考えられる。