hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
支台歯形成に影響を及ぼす因子に関する研究

(2)上顎小臼歯にDicorクラウン装着を想定した場合、クラウンやアンレーではエナメル質が外周にわずかしか残存しないので、エナメルエッチング以外の象牙質接着システムが必要であると指摘された。2.部分被覆冠(ラミネートベニア修復を想定した場合のエナメル質削除の状態と、色調回復・遮蔽との関係)(1)上顎小臼歯にDicorラミネートを想定した場合、臨床的歯頚線付近では象牙質露出の危険性がかなり高くなるので、象牙質接着システムを応用するための象牙質面処理が必要であると示唆された。(2)均一な支台歯形成を行った場合には支台歯の色調、合着材の色調およびベニアの厚みが影響していた。3.スリー・ユニット・ブリッジ(近心傾斜歯シミュレーションによるブリッジ支台歯形成の削除傾向を検討)実際の臨床例に対応させて下顎右側第2大臼歯を3段階に近心傾斜させた模型で検討した結果、第2小臼歯に変化は少なく、第2大臼歯の歯肉縁下削除や各軸面のテーパー度に影響を及ぼすことが示唆された。4.今後の研究計画について(1)支台歯形成のアプローチの違いによる影響を検討するため、支台歯形成中のタービン用ポイントの移動方向(アップカットとダウンカット方向)による削除傾向を計測し、いままでの研究の原因考察を行う。(2)支台歯形成中のレスト指(第3指および第4指レスト)の違いによる削除傾向を検討する。
エンドソーム・リソソーム系オルガネラ膜融合マシナリーの試験管内完全再構成

細胞小器官オルガネラ群を始め、複雑な内膜系を持つ真核細胞において、細胞内オルガネラ膜融合は必須かつ根源的な生体反応である。我々は、この膜融合マシナリーを分子レベルで詳細に理解するため、SNAREなど精製膜蛋白質群と人工脂質二重膜リポソームから構築する試験管内完全再構成系を手法とし研究を展開した。そして、出芽酵母エンドソーム・リソソーム膜系において、膜融合の特異性・選択性が、Qabc-SNARE複合体の適切な形成により決定されている事を初めて見出した。細胞内オルガネラ膜融合は、複雑な細胞内膜系を持つ真核細胞において、必須かつ根源的な生体反応であり、エンドサイトーシス、シナプス神経伝達、オートファジーなどの重要な生命現象にも深く関わっている。しかしながら、従来の主力である遺伝学・細胞生物学・生化学的手法だけでは、多様な膜タンパク質群と脂質群が織りなす、この「オルガネラ膜融合マシナリー」を分子レベルで解き明かすことは、非常に困難であるのが現状であった。そこで、我々は、全て精製した膜タンパク質群と人工脂質二重膜リポソームから構築する、化学的に純粋な実験系である「試験管内“完全"再構成系」を手法の中心に据える。そして、出芽酵母エンドソーム・リソソーム系をモデルの中心とし、「時空間的に厳密に制御されたオルガネラ膜融合」を分子レベルで捉え、その動作原理の更なる理解を目指す。まず、酵母エンドソーム・液胞系をモデルに、「オルガネラ膜融合の試験管内完全再構成系」を実験材料・手法の基盤とし研究を行った。オルガネラ膜融合の細胞内コンパートメント特異性に対するSNAREタンパク質の寄与について、タンパク質-タンパク質間相互作用解析および再構成プロテオリポソーム膜融合アッセイを駆使して、多くの新しい知見を得た。R-SNAREサブファミリーではなく、Qabc-SNARE複合体の適切な組合せがオルガネラ膜融合の特異性決定に重要であることを新たに見出し、この成果は原著論文として発表した(Izawa, Onoue, Furukawa, Mima, 2012, J Biol Chem)。さらには、小胞体ERおよびゴルジ体に局在するSNAREタンパク質群も研究対象に加えて、再構成プロテオリポソーム系を駆使した網羅的解析に発展させ、SNARE・SMファミリータンパク質・テザリング複合体が協調的に働く新たな分子機構を発見した。そこで、我々は、全て精製した膜タンパク質群と人工脂質二重膜リポソームから構築する、化学的に純粋な実験系である「試験管内"完全"再構成系」を手法の中心に据える。そして、出芽酵母エンドソーム・リソソーム系をモデルに、「時空間的に厳密に制御されたオルガネラ膜融合」を分子レベルで捉え、その動作原理の更なる理解を目指す。平成23年度では、酵母液胞をモデルの中心とし、「オルガネラ膜融合の試験管内"完全"再構成系」を実験材料・手法の基盤とし研究を行った。主要な研究プロジェクトとしては、オルガネラ膜融合の細胞内コンパートメント特異性に対するSNAREタンパク質の寄与について、タンパク質-タンパク質間相互作用解析および再構成プロテオリポソーム膜融合アッセイを駆使して、多くの新しい知見が得られた。その中でも、R-SNAREサブファミリーではなく、Qabc-SNARE複合体の適切な組合せがオルガネラ膜融合の特異性決定に重要であることを新たに見出し、この成果は原著論文として発表した(Izawa, Onoue, Furukawa, & Mima, 2012, J. Biol. Chem)。当初の予定どおり、酵母エンドソーム・リソソーム(液胞)系のSNAREタンパク質について、大量発現系の構築および効率的な精製方法の確立が完了した。さらに、SNAREシャペロンやテザリング複合体など、他のリコンビナントタンパク質精製の実験系もおおむね順調に進展している。また、本研究課題で精製を完了したSNAREタンパク質を用いた機能解析(蛋白質間相互作用解析、再構成リポソーム膜融合アッセイなど)についても、順調に進捗し、その成果は原著論文として発表することが出来た(Izawa, Onoue, Furukawa, & Mima, 2012, J. Biol. Chem)。平成23年度は既出のとおり、リコンビナントタンパク質の精製、再構成プロテオリポソームの調製、などの実験材料、そして蛋白質間相互作用解析や膜融合アッセイを始めとする機能解析、これら両面で順調に進捗した。

今後は、SNAREシャペロン群およびテザリング複合体を中心に、オルガネラ膜融合に関与する因子の精製タンパク質の更なる充実を目指す。また、機能解析においても、蛋白質-脂質間結合アッセイや再構成リポソーム凝集アッセイなど、新規アッセイ法の確立を精力的に進める予定である。平成23年度から継続して、これまで大量調製したタンパク質因子群・再構成プロテオリポソーム群を試料とし、プロテオリポソーム膜融合アッセイを中心とする機能解析によって、SNAREタンパク質依存性膜融合を網羅的に解析する。さらに、新規に大量精製系が確立次第、他の膜融合因子(SNAREシャペロン群、テザリング複合体など)についても、再構成プロテオリポソーム系でそれらの分子機能を探索する。また、リポソーム膜融合アッセイに加えて、平成24年度には、SPR(表面プラズモン共鳴)、蛍光偏光解消、FRETによる、脂質膜上での「タンパク質ータンパク質間・タンパク質ー脂質間・脂質ー脂質間相互作用のリアルタイムアッセイ法」の確立に着手する。その後、膜融合アッセイで得られた機能解析の成果と、個々の分子間相互作用との相関を分析する。
高強度・高流動コンクリートの多軸定圧縮応力下の熱特性

コンクリートが温度の上昇・下降の繰り返しを受ける状態で使用される場合や、火災を受ける場合がある。また、構造部材として拘束を受ける状態で使用される場合がある。常温と異なった温度で使用され、かつ荷重を受けるコンクリートについては、コンクリートの多軸を含めた力学的性質だけでなく熱特質も重要になってくる。応力度強度比で1/3の多軸定圧縮応力を受ける場合、気乾及び湿潤状態における普通コンクリートの温度上昇時(20°Cから100°C)のひずみの算出にはクリープを考慮に入れるのがよく、乾燥状態における普通コンクリートの温度上昇時のひずみの算出にはクリープを考慮しなくてもよい。しかし、近年、高強度コンクリートの開発が盛んになり、これを用いた構造物も増えつつある。高強度コンクリートは、組成や調合が従来の普通コンクリートと異なる。内部組織が緻密であり、水分量も異なるため力学的特性や熱特性が異なる。本研究は、3種類の設計基準強度(24、48、60MPa)のコンクリート供試体を、それぞれ多軸を含む定圧縮応力状態に保持し、20°Cから100°Cまで毎時10°Cで昇温、その後30°Cに降温させ、その間のひずみを測定する。また実験から求めたクリープ量と「温度時間換算則」から温度上昇時及び下降時の予測クリープ量を算出し、定圧縮応力下における熱膨張を予測する。この結果、多軸定圧縮応力を受ける高強度コンクリートの熱膨張とクリープについて、本研究の範囲内で以下のことが明らかになった。(1)無応力状態においては、高強度コンクリートの方が普通コンクリートより温度上昇時のひずみの増分が大きくなる。(2)応力度強度比で1/3の多軸定圧縮応力を受ける場合、高強度コンクリートは、温度上昇時及び下降時におけるひずみの予測にはクリープを考慮に入れる必要がある。
胎児の体外哺育における臓器成熟とその促進に関する実験的研究

人工子宮により哺育される胎仔の臓器発育成熟を検索するために、実験動物の山羊胎仔をわれわれの開発した人工子宮システムで哺育し、気管内液の分析、剖検肺・肝・脳重量を測定、また組織学的検討を加えた。人工子宮システムは、模型人工肺を組み込んだ遠心ポンプ回路を胎仔に装着し、人工羊水中で哺育した。また、胎児治療モデル作製のため、妊娠山羊胎齢90日に胎児横隔膜ヘルニア作製手術を行った。対象は50時間以上哺育を行った3例で、2例はステロイド、甲状腺ホルモン、EGFなど成熟促進ホルモン投与哺育群とし、1例は投与しない非投与哺育群、2例の双胎の非哺育胎仔を対照群とした。ザーネン種妊娠山羊をGOF全麻下に帝王切開し、ヒト胎児約25週に相当する在胎120ー125日(満期150日)の胎児を娩出した。臍帯動脈より2本の脱血カテーテル、臍帯静脈より1本の送血カテーテルを挿入し体外循環回路に接続した。胎児手術により横隔膜ヘルニアを作製した3頭は3例とも破水または胎児死亡のため2日から6日で流産となりヘルニア修復術に至らなかった。その結果、湿重量は肺、肝、脳とも投与哺育群と非投与哺育群が対照群に比して有意に増加していた。乾燥重量では、肺は哺育群が対照群に比べ有意に増加がみられたが、成熟促進ホルモン投与群と非投与群の間には有意差はなかった。肺気管内液のレシチン分画、L/S比は哺育群が対照群に比べ高い傾向があったが、投与、非投与間には有意差はみとめなかった。肺組織はII型細胞の増加が2つの哺育群と対照群間、投与哺育群と非投与哺育群間に有意差をみとめた。肝組織は、哺育群では対照群に比べて細胞の増大がみられた。脳組織では、3群間に神経細胞の大きさ、数の変化を認めなかった。これらの結果は前年と同様であった。これらの結果から、人工子宮哺育によって、肺は発育、成熟がみられた。胎児手術のモデル作製は今後の課題とされた。人工子宮によって哺育中の胎児の肺、肝、脳などの主要臓器の発育を観察し、種々のホルモンあるいは成長因子により成熟の促進を検討する目的で実験を行い、本年はステロイドホルモンを2頭に投与し観察した。ザーネン種妊娠山羊を全麻(GOF麻酔)下に帝王切開し、ヒト胎児約25週に相当する在胎120-125日(満期150日)の胎児を娩出した。臍帯動脈より2本の脱血カテーテル、臍帯静脈より1本の送血カテーテルを挿入し、体外循環回路に接続した。体外循環は膜型人工肺を組み込み血液酸素化を行った(膜型人工肺は本研究費より充当した)。駆動は小型遠心ポンプを使用し回路内血流計により潅流量を調整した。遠心ポンプは現有の機器を使用したが、消耗品のポンプヘッドは本研究費より購入した。

胎児は、二重恒温水槽中の人工羊水中で哺育したが、血液回路中にはブドウ糖、電解質、ビタミン等の栄養輸液および抗凝固剤としてヘパリンを投与した(麻酔薬、人工羊水、輸液剤を本研究費より充当した)。胎児は、60時間、75時間水中哺育できたが、その間ドップラー超音波検査計により血行動態を計測した(計測紙、フィルムは本研究費により購入した)。本実験群の2頭には血液中にステロイドホルモンを注入し、組織、生化学的に検索した。肺は、病理学的に肺胞II型細胞の定量、生化学的に肺組織内サーファクタント定量により成熟を検索した。脳、肝ではそれぞれ重量、組織学的に細胞検索をおこなった。これらの結果を帝王切開時に得た双胎の一児と比較検討し、肺では成熟に有意の差を認めたが、肝脳では有意の差はみられなかった。また、以前に行った同じ潅流時間の否投与群の胎児とも有意差は認めなかった。人工子宮により哺育される胎仔の臓器発育成熟を検索するために、実験動物の山羊胎仔をわれわれの開発した人工子宮システムで哺育し、気管内液の分析、剖検肺・肝・脳重量を測定、また組識学的検討を加えた。人工子宮システムは、膜型人工肺を組み込んだ遠心ポンプ回路を胎仔に装着し、人工羊水中で哺育した。対象は50時間以上哺育を行なった8例で、4例はステロイド、甲状腺ホルモン、EGFなどの成熟促進ホルモン投与哺育群とし、4例は投与しない非投与哺育群、4例の双胎の非哺育胎仔を対照群とした。ザーネン種妊娠山羊をGOF全麻下に帝王切開し、ヒト胎児約25週に相当する在胎120-125日(満期150日)の胎児を娩出した。臍帯動脈より2本の脱血カテーテル、臍帯静脈より1本の送血カテーテルを挿入し体外循環回路に接続した。その結果、湿重量は肺、肝、脳とも投与哺育群と非投与哺育群が対照群に比して有意に増加していた。乾燥重量では、肺は哺育群が対照群に比べ有意に増加がみられたが、成熟促進ホルモン投与群と非投与群の間には有意差はなかった。肺気管内液のレシチン分画、L/S比は哺育群が対照群に比べ高い傾向があったが、投与、非投与間には有意差はみとめなかった。肺組識はII型細胞の増加が2つの哺育群と対照群間、投与哺育群と非投与哺育群間に有意差をみとめた。肝組識は、哺育群では対照群に比べて細胞の増大がみられた。脳組識では、3群間に神経細胞の大きさ、数の変化を認めなかった。これらの結果から、人工子宮哺育によって、肺は発育、成熟がみられたが、脳、肝は浮腫を認めたが成熟では明らかでなく、促進ホルモンの投与効果も不明であった。胎児治療モデル作製のため胎児手術は胎児長期生存が得られず今後の課題となった。
脳ステロイドホルモン合成の増強によるアルツハイマー病治療法の研究

アルツハイマー病は、アミロイドβが蓄積することで発生する。神経ステロイドの合成は、コレステロール→プレグネノロン変換から始まり、従ってコレステロールのミトコンドリアへの輸送を行うtranslocator protein(TSPO)によって制御されている。本研究はTSPOを活性化させるTSPOリガンドであるRo5-4864を投与することによって、可溶性のアミロイドβの蓄積を抑制できるかどうかを解析した。同時にグリアの疾患を引き起こさないかどうかも解析した。主に精巣摘出ラットを対象に、TSPOを活性化させるTSPOリガンドであるRo5-4864の投与によって解析した。TSPOリガンドの腹腔内投与は、1週間に一回投与と毎日の投与の二通りを1か月にわたり行った。TSPOリガンドの主要な標的はグリア細胞はであるとの予測で解析した。TSPOリガンドの投与は空間記憶と短期記憶を改善した。TSPOリガンドを投与すると、海馬のアミロイドβ蓄積が低下することを、ELISA法で定量し発見した。TSPOリガンドはグリアを活性化し、アミロイドβの貪食を活性化し、アミロイドβ分解酵素の発現を増加させた。これらは、グリア機能のマーカー(GFAP,MHCII)、アミロイドβ食食マーカー(SR-A1,SR-B1)、アミロイドβ分解経路(IDE,NEP)に関与するmRNAの解析から結論した。しかし、このとき有害な炎症を引き起こすサイトカインIL-1β,TNF-αは産生させなかった。これらの発見はTSPOリガンドが次世代のホルモン補充療法の標的として良い候補であることを示唆する。(1)コレステロールをミトコンドリアに運ぶTranslocator protein receptor(TSPO)のmRNAがラット海馬や視床下部などで高発現していることを世界で始めて発見した。これまでは、TSPOの放射性リガンドを用いた結合分布に基ずき、TSPOは脳ではグリア細胞に非常に低発現しているのみであると思われていた。TSPOは良い抗体も存在しない。今回はプライマーを特別に設計してRC-PCR解析を行ったところ予想外の高発現で、脳ステロイド合成酵素の中でも一番発現量が多かった。これによりTSPOアゴニストであるRo5-486の投与で、海馬で脳ステロイド合成が上昇する効果が期待できる。現在実験継続中である。(2)アルツハイマーモデルマウス3xTg ADを用いて、Ro5-486を投与したところ、若い7ヶ月齢では男性ホルモンのテストステロンの濃度が上昇していることを質量分析で見出した。老化した12ヶ月齢ではテストステロンの濃度は上昇していなかった。老化のせいで応答が弱くなったものと考えられる。プレグネノロン・プロゲステロン濃度には、老若共に変化は無かった(3)神経行動学的解析によって、精巣摘出をいったラットにRo5-486を皮下投与したところ、認知成績が向上することを見出した。これを男性ホルモンの増加と関連ずけることを目指している。(4)老化ラットにRo5-486を皮下投与して、神経シナプスが増加するかどうかの実験を継続中である。認知症の治療に効果があるかどうかの実験である。(5)質量分析を用いて、老化ラットでは、テストステロンが1/100くらいに低下することを見出しつつある。(1)アルツハイマーモデルマウスTg2576(ヒトAPP導入型メス)を用いて、神経シナプスへの)アルツハイマー病の影響を解析した。シナプス後細胞=スパインの減少を詳しく解析した。アルツハイマー病が発症する老齢12か月のマウスでは、正常老化マウスと比較して、神経スパインが減少し、スパイン頭部直径でsmall-head(0.2-0.4um),middle-head(0.4-0.5um),large-head(0.5-1.0um)と分類した結果、large-headスパインが選択的に減少することを発見した。このlarge-headスパインは特に記憶能力が高いものなので、アルツハイマー病による記憶力の減退をよく説明できる。(2)アルツハイマーモデルマウス3xTg AD(オス)を用いて、老化の影響を解析した。コレステロールをミトコンドリアに運ぶTrans locator protein receptor(TSPO)は、アミロイドβの蓄積を減少させることを見出した。Ro5-4864というTSPOアゴニストを週1回1月注射することにより、若い7ヶ月齢および老化した12ヶ月齢ともにアミロイドβの蓄積を減少させることを見出した。(3)TSPOのmRNAの海馬での発現は非常に多いことを発見した。またTSPOは老化に伴い、むしろ発現が110%へ上昇することを見出したので、老化マウスでもRo5-4864の効果があることを説明できる。これまでは、TSPOの放射性リガンドを用いた結合分布に基ずき、TSPOは脳ではグリア細胞に非常に少ない量で発現しているのみであると思われていた。(4)神経行動学的解析によって、精巣摘出をいったラットにRo5-486を皮下投与したところ、認知成績が向上することを見出した。

(5)Ro5-486を皮下投与した場合、コレステロール→プレグネノロン→プロゲステロンとDHEA→テストステロン、というカスケードでテストステロンが増加して、これが海馬でのアミロイドβの蓄積を減少させ、海馬記憶機能を活性化するものと、解釈できる。もう一つはプロゲステロンそのものが保護活性を持つのかもしれない。アルツハイマー病は、アミロイドβが蓄積することで発生する。神経ステロイドの合成は、コレステロール→プレグネノロン変換から始まり、従ってコレステロールのミトコンドリアへの輸送を行うtranslocator protein(TSPO)によって制御されている。本研究はTSPOを活性化させるTSPOリガンドであるRo5-4864を投与することによって、可溶性のアミロイドβの蓄積を抑制できるかどうかを解析した。同時にグリアの疾患を引き起こさないかどうかも解析した。主に精巣摘出ラットを対象に、TSPOを活性化させるTSPOリガンドであるRo5-4864の投与によって解析した。TSPOリガンドの腹腔内投与は、1週間に一回投与と毎日の投与の二通りを1か月にわたり行った。TSPOリガンドの主要な標的はグリア細胞はであるとの予測で解析した。TSPOリガンドの投与は空間記憶と短期記憶を改善した。TSPOリガンドを投与すると、海馬のアミロイドβ蓄積が低下することを、ELISA法で定量し発見した。TSPOリガンドはグリアを活性化し、アミロイドβの貪食を活性化し、アミロイドβ分解酵素の発現を増加させた。これらは、グリア機能のマーカー(GFAP,MHCII)、アミロイドβ食食マーカー(SR-A1,SR-B1)、アミロイドβ分解経路(IDE,NEP)に関与するmRNAの解析から結論した。しかし、このとき有害な炎症を引き起こすサイトカインIL-1β,TNF-αは産生させなかった。これらの発見はTSPOリガンドが次世代のホルモン補充療法の標的として良い候補であることを示唆する。初期に計画した「コレステロール輸送増強剤Ro5-486の投与による、コレステロール→プレグネノロン→プロゲステロンとDHEA→テストステロン、合成の増加を介した、これが海馬でのアミロイドβの蓄積を減少と、海馬記憶機能の活性化」、というストーリーを、かなりの部分検証できつつあるから。Ro5-486やテストステロンの投与による、アミロイドβの蓄積の減少が、ミクログリアの活性化やアストログリアの活性化によるものであるかどうか?あるいは神経への直接作用であるのかどうか?を、これらの活性化マーカーを調べて、はっきりさせることも重要であると考えている。
適応的アクティブ制振機構の研究

従来の受動的制振機構に代る、状態フィードバック制御方式によるアクティブ制振手法の開発が本研究の目的であった。その場合の問題点は制振対象となる振動系がパラメータ未知で検出不能な外部外乱入力を受ける非線形方程式系としてしかモデル化されない点にある。このような系を制御するためには簡便な制御理論では不可能である。また、高精度な理論は複雑なアルゴリズムとなり、実時間でのフィードバック計算機制御が難しい。以上の観点から以下の諸点について研究を行なった。1.適応制御アルゴリズムの簡素化。未知パラメータ系を制御する現存の適応制御方式は複雑すぎるため、構成が簡単で、ロバスト性、収束性も良好な適応制御アルゴリズム(リレー方式,可変減衰方式,VSS)を開発した。〔研究発表論文4編〕2.外乱推定機構理論の開発。外乱をシステムモデルを用いて推定し、その際に生ずる乱れ及び推定遅れを平均フィルタ及び多項式外乱モデルを用いて修復する手法を開発した。3.適応アクティブ制振機構の設計と実験による検証上記1,2の手法を結合し、1自由度振動系を対象として、制振機構を設計し、サーボ系とミニコンで実験装置を試作し、実験で検討した。制御アルゴリズムはミニコンに収納し、サンプリングタイム14msで制振制御を行なった。その結果、周期1.5sの正弦波外乱に対し平均して約88%の振巾低下が実現できた。このことから計算速度がはやいCPUを用いれば、さらに効果的な制振が期待できることが解った。上記のように所期の研究目的は達成されたが、今後一層の発展を期したい。成果は学会で公表する予定である。
肝がんにおける肝星細胞形質転換の意義

肝硬変とは、肝実質が活性化された星細胞(HSC)や筋線維芽細胞などの間質細胞で置換されてI型コラーゲンを主とする細胞外マトリックス物質が蓄積した慢性の線維化病であり、年率8%で肝がんが発生する。本研究室で発見されたサイトグロビン(Cytoglobin, CYGB)は肝内ではHSCにのみ特異的に発現しガス結合能を有するタンパク質であり、私たちはCYGB欠損が線維化・発がんに関与することを見出した。これは、CYGBの欠損によりHSCの活性化形質が変化した結果、酸化ストレス制御の喪失によりがんの発生や生育に至適な微小環境を提供したと考えられた。そこで本研究では、CYGB欠損(KO)腫瘍形成モデルを活用し、CYGBの欠損が腫瘍形成にどのように影響を与えるかを検証した。そのために、まず同種マウスから樹立された肝がん細胞株(Hepa1-6)を脾臓から注入し肝臓へ移植する異種移植肝がんマウスモデルを作製し、およそ100%の確立で腫瘍形成を成功させるに至っている。このマウスモデルを用いてCYGB KOマウスと野生型マウスでの腫瘍形成能を比較したところCYGB KOマウスでは腫瘍形成数が増加し、腫瘍血管の成熟能が低下することが分かった。さらに、CYGBのKOマウスから樹立した初代マウスHSCを活性化後H2O2に暴露したところ、野生型HSCに比べ、内在性酸化ストレスの蓄積が上昇したことから、HSCはCYGBが消失することで酸化ストレスによるDNA損傷をより受けやすいことが示唆された。また本年度は、この腫瘍形成マウスモデルを用いてin vivo cDNAスクリーニングをするためにAAV6発現ベクターの作製を行った。本研究の申請にはCYGBのKOおよび同腹野生型マウスへNormal water (NW)/Chow diet (CD)食与えた群を対照とし、Sugar water (SW)/Western diet (WD)食による、脂肪肝から線維化さらに一部の肝臓では肝がんに至るヒトNASHを最も再現したマウスNASHモデル(J Hepatology 2016;65:579-588)を作製し、CYGBの機能解析に活用する事を考えていた。しかし、このNASHモデルでは早期でマウスの体重減少が著しく腫瘍形成に至るまでに健康状態を維持することが困難だったため上記の異種移植肝がんマウスモデルに切り替えることになった。しかし、CYGB KOと野生型マウスとの腫瘍形成能に差が見られたため一年間の進捗状況としてはおおむね順調に進んでいると考える。今後、AVV6発現ベクターを用いてHSC特異的にCYGB遺伝子をノックインすることで病態が軽減し、このKO+AVV6-CYGB投与肝臓から抽出したmRNAの発現が減少することを確認する。さらに、AVV6発現ベクターのcDNAライブラリーの構築に着手する予定である。

今後、AVV6発現ベクターを用いてHSC特異的にCYGB遺伝子をノックインすることで病態が軽減し、このKO+AVV6-CYGB投与肝臓から抽出したmRNAの発現が減少することを確認する。さらに、AVV6発現ベクターのcDNAライブラリーの構築に着手する予定である。
抗不整脈薬による催不整脈作用発生時の電気的除細動に対する抵抗性の検討

初年度は電気的に心室性不整脈を発生させその電気的除細動閾値に与えるメキシレチンの影響について研究を行った。その結果、血中メキシレチンの濃度と除細動必要エネルギーとの間に相関はみられなかった。他のクラスI-Bの抗不整脈剤と異なりメキシレチンは、臨床使用量(11.5mcg/ml)の4倍近くまで濃度を上昇させても除細動閾値に影響を与えなかった。患者が急変し、重篤な心室細動に陥ったときに他の抗不整脈剤に比べメキシレチンは安心して使用できるという可能性を示唆する。そこで2年度はクラスCのフレカイナイドとの相互作用について研究を行った。〈方法〉成犬を使用し、実験の準備は初年度と同じである。フレカイナイド2mg/kg投与後に維持量を投与し、メキシレチンの投与量を漸増させて前回と同じ方法で心室細動発生/除細動(Fibrillation/Defibrillation)F/D試験を行った。〈結果〉フレカイナイドの濃度を一定に保った状態では、メキシレチンの投与量が増加するにつれて心室細動を誘発するのに必要なエネルギー量、又その心室細動から電気的に離脱するのに必要なエネルギー量も増加した。〈考察と結論〉クラスI-Bのメキシレチンで心室性不整脈を治療するときに、予めクラスCのフレカイナイドが投与されている患者では、メキシチールの投与量が増加するにつれて除細動が難しくなる可能性がある。フレカイナイドで加療中の患者が突然、心室細動に陥ったときメキシチールの量をなるべく増加させずに除細動を試みるべきである。メキシレチンは心室性不整脈の治療薬として使用されているが、一方では心筋の除細動域値を上げ、電気的除細動に抵抗性を示す(Marinchak 88)とされているが詳細な研究は行われていない。そこで今年度は心筋除細動域値に与えるメキシレチンの影響について研究を行った。〈方法〉成犬を使用し、全身麻酔下に気管内挿管を行い、人工呼吸器へ接続した。吸気中の酸素、麻酔薬濃度、呼気中の炭酸ガス濃度などは本研究費で購入した呼気ガスモニターで行った。動脈圧、肺動脈圧、心拍出量を測定しながら血行動態を一定にし、心室細動発生/除細動(Fibrillation/Defibrillation:F/D)試験を計100回施行した。成犬は第4肋骨を切除、開胸し、F/D試験は直視下に本研究費で購入した細動発生器・除細動器を使用して行った。メキシレチンは1mg、2mg、4mg、6mg、8mg/kgのワンショット注入のあと、同量/kg/時の投与を60分間続け、この間10分毎にF/D試験を行った。投与中止後30、45、60分のwashout phaseでもF/D試験を行った。〈結果〉血中メキシレチンの濃度は06.2mcg/mlで、除細動に必要なエネルギーは210jouleの範囲であった。これらの対応する100ポイントの濃度と除細動必要エネルギーとの相関をみたところ、両者の間に相関性はみられなかった。〈考察〉これまで他のクラスI-Bの抗不整脈剤と同様に心筋の除細動域値を上昇させると思われていたメキシレチンは、臨床使用量(11.5mcg/ml)の4倍近くまで濃度を上昇させても除細動域値に影響を与えなかった。

しかし、他剤との相互作用については今後の課題であり、次年度はこの点について研究を行う。初年度は電気的に心室性不整脈を発生させその電気的除細動閾値に与えるメキシレチンの影響について研究を行った。その結果、血中メキシレチンの濃度と除細動必要エネルギーとの間に相関はみられなかった。他のクラスI-Bの抗不整脈剤と異なりメキシレチンは、臨床使用量(11.5mcg/ml)の4倍近くまで濃度を上昇させても除細動閾値に影響を与えなかった。患者が急変し、重篤な心室細動に陥ったときに他の抗不整脈剤に比べメキシレチンは安心して使用できるという可能性を示唆する。そこで2年度はクラスCのフレカイナイドとの相互作用について研究を行った。<方法>成犬を使用し、実験の準備は初年度と同じである。フレカイナイド2mg/kg投与後に維持量を投与し、メキシレチンの投与量を漸増させて前回と同じ方法で心室細動発生/除細動(Fibrillation/Defibrillation)F/D試験を行った。<結果>フレカイナイドの濃度を一定に保った状態では、メキシレチンの投与量が増加するにつれて心室細動を誘発するのに必要なエネルギー量、又その心室細動から電気的に離脱するのに必要なエネルギー量も増加した。<考察と結論>クラスI-Bのメキシレチンで心室性不整脈を治療するときに、予めクラスCのフレカイナイドが投与されている患者では、メキシチールの投与量が増加するにつれて除細動が難しくなる可能性がある。フレカイナイドで加療中の患者が突然、心室細動に陥ったときメキシチールの量をなるべく増加させずに除細動を試みるべきである。
鶏における腫瘍関連糖蛋白質(105Kgp)産生機構解析のための基礎的研究

鶏における腫瘍増殖関連糖蛋白質(105Kgp)に関する基礎的研究を実施し,下記の事項を明らかにした.(1) 105Kgpの精製:イモビライン電気泳動法及び抗105Kgpモノクローナル抗体を用いたアフィニティ・クロマトグラフィによって,鶏血清105Kgpの精製法を確立した.(2)精製105Kpgの物理化学的諸性状について, 105Kpgの細胞増殖活性を示標として検討し, 105Kpgは耐熱性糖蛋白質であり活性発現にはその高次構造を必要とすることを明らかにした.(3)血清中105Kpgの定量法を検討し,抗105Kpgモノクローナル抗体及び抗105Kpgポリクローナル抗体を用いた2抗体法によるELISAの有用性を明らかにした.(4)精製105Kpgの細胞増殖活性は,鶏細胞に対する種特異性が高く,かつ鶏リンパ芽球様細胞株や鶏胎児細胞のようなgrowing Typeの細胞に対してその活性は顕著であった.(5)酵素免疫組織学的手法を用いて,腫瘍中に105Kpg強陽性細胞を見い出した.陽性細胞は腫瘍内崩壊部位に浸潤している大型細胞であったが,細胞を同定するまでには至らなかった.すでに鶏マクロファージが105Kpg陽性であることを照明してあることから,この大型浸潤細胞も同様にマクロファージである可能性は高いと思われる.鶏における腫瘍増殖関連糖蛋白質(105Kgp)に関する基礎的研究を実施し,下記の事項を明らかにした.(1) 105Kgpの精製:イモビライン電気泳動法及び抗105Kgpモノクローナル抗体を用いたアフィニティ・クロマトグラフィによって,鶏血清105Kgpの精製法を確立した.(2)精製105Kpgの物理化学的諸性状について, 105Kpgの細胞増殖活性を示標として検討し, 105Kpgは耐熱性糖蛋白質であり活性発現にはその高次構造を必要とすることを明らかにした.(3)血清中105Kpgの定量法を検討し,抗105Kpgモノクローナル抗体及び抗105Kpgポリクローナル抗体を用いた2抗体法によるELISAの有用性を明らかにした.(4)精製105Kpgの細胞増殖活性は,鶏細胞に対する種特異性が高く,かつ鶏リンパ芽球様細胞株や鶏胎児細胞のようなgrowing Typeの細胞に対してその活性は顕著であった.(5)酵素免疫組織学的手法を用いて,腫瘍中に105Kpg強陽性細胞を見い出した.陽性細胞は腫瘍内崩壊部位に浸潤している大型細胞であったが,細胞を同定するまでには至らなかった.すでに鶏マクロファージが105Kpg陽性であることを照明してあることから,この大型浸潤細胞も同様にマクロファージである可能性は高いと思われる.
rhbFGF/α,β-TCP複合体のイヌ前頭洞内骨形成とインプラント周囲骨の観察

1)実験動物(ビーグル犬)実験には生後約2年のビーグル成犬(体重1012kg)を使用.本学動物実験センターにて1週間通常飼育し,異常を認めなかったものを本学動物実験センターの指針に従い実験に使用した.実験部位は左右の前頭洞とした.前頭洞への移植手術は,前投薬にジアゼパム2mg/kgの筋注と硫酸アトロピン0.1mg/kgの皮下注,麻酔導入薬として塩酸ケタミン製剤10mg/kgの筋注を行い,チオペンタールナトリウム20mg/kgの経時的静脈投与による全身麻酔下で行った.前頭部の開窓方法は,術野の剃毛,イソジン液【○!R】の消毒後塩酸リドカインの浸潤麻酔を行い,皮膚,骨膜を順次切開剥離して頭部の前頭洞前壁の骨面を露出させ,インプランターII【○!R】を使用して,注水下,800rpmの低速回転でサージカルラウンドバーにて縦15mm,横10mmの大きさに開窓部を形成した.洞粘膜挙上部の作成は,従来のサイナスリフトの術式に準じて,洞粘膜に穴を開けないように行った.洞粘膜挙上部に対し,2gのrhbFGF/TCP複合体(rhbFGFを合計1000μg含む)を滅菌生理食塩水に浸し,Bonetite注入器を使用して,洞粘膜挙上部に移植.対照側はTCPのみを滅菌生理食塩水に浸して移植した.1)実験動物(ビーグル犬)実験には生後約2年のビーグル成犬(体重1012kg)を使用.本学動物実験センターにて1週間通常飼育し,異常を認めなかったものを本学動物実験センターの指針に従い実験に使用した.実験部位は左右の前頭洞とした.前頭洞への移植手術は,前投薬にジアゼパム2mg/kgの筋注と硫酸アトロピン0.1mg/kgの皮下注,麻酔導入薬として塩酸ケタミン製剤10mg/kgの筋注を行い,チオペンタールナトリウム20mg/kgの経時的静脈投与による全身麻酔下で行った.前頭部の開窓方法は,術野の剃毛,イソジン液【○!R】の消毒後塩酸リドカインの浸潤麻酔を行い,皮膚,骨膜を順次切開剥離して頭部の前頭洞前壁の骨面を露出させ,インプランターII【○!R】を使用して,注水下,800rpmの低速回転でサージカルラウンドバーにて縦15mm,横10mmの大きさに開窓部を形成した.洞粘膜挙上部の作成は,従来のサイナスリフトの術式に準じて,洞粘膜に穴を開けないように行った.洞粘膜挙上部に対し,2gのrhbFGF/TCP複合体(rhbFGFを合計1000μg含む)を滅菌生理食塩水に浸し,Bonetite注入器を使用して,洞粘膜挙上部に移植.対照側はTCPのみを滅菌生理食塩水に浸して移植した.
水晶体クリスタリンプロテオーム（クリスタローム）解析による新しい生物分類学の展開

水晶体構造タンパク質クリスタリンは、個々の生物種によりその進化の過程で既存のタンパク質が無作為に転用されてきた。ウシガエル特異的ρクリスタリンの起源タンパク質を解明するため各組織中に存在しているρクリスタリン様タンパク質のmRNA配列を解析しその特性を分析した。クリスタロームの裏付けとなるようなプロテオーム解析法として、リジン残基のアミノ基を特異的に標識する新規の安定同位体ラベリング試薬Py-Tagについての評価を行い、ペプチド・蛋白への応用に進展させるべく基礎データを収集した。その後、クリスタリン解析への応用にも発展させようと考えた。ρクリスタリン解析の目標としていた5科のうち,今年度は,アカガエル科,アオガエル科,ヒキガエル科,アマガエル科の4科について水晶体ρクリスタリンのmRNAシーケンス解析を行った.サンプルはアカガエル科では21個体(産地別トノサマガエル13個体,ナゴヤダルマガエル3個体,トウキョウダルマガエル1個体,ツチガエル1個体,ニホンアカガエル1個体,ナガレタゴガエル1個体,タゴガエル1個体),アオガエル科では3個体(モリアオガエル1個体,カジカガエル1個体,シュレーゲルアオガエル1個体),ヒキガエル科では2個体(アズマヒキガエル1個体,ナガレヒキガエル1個体),アマガエル科では1個体(アマガエル1個体)の合計27個体について解析した.その結果,アカガエル科17個体,ヒキガエル科1個体で発現しているρクリスタリンのアミノ酸配列が完全に一致した(A群).またアカガエル科1個体とヒキガエル科1個体が一致し(B群),A群とは15アミノ酸の違いがあった.更にアカガエル科1個体とアオガエル科1個体が一致し(C群),A群とは20アミノ酸の違い,B群とは23アミノ酸の違いがあった.A群,B群,C群の蛋白の分子量と等電点は,それぞれ,36,880,7.60,36,962,7.61,37,133,7.61であった.この解析と並行して,今年度計画していたPyラベル化試薬を用いたプロテオーム解析法についても開始した.リゾチームを標準蛋白質としてPyラベル化ペプチドのMS測定を行った.当該年度は,ρクリスタリンに注目した.これまでに当研究室において,カエル水晶体のアルド・ケト還元酵素を精製しアルデヒド還元酵素の存在を確認している.ヒト,ラット,マウス,ウサギ,イヌなど多くの動物種では水晶体のメジャーなアルド・ケト還元酵素としてアルドース還元酵素が発現しているが,カエル水晶体ではアルドース還元酵素は全く発現していなかった.我々は,カエル水晶体のρクリスタリンの起源がアルドース還元酵素である可能性を考えている.そこでカエルの他の臓器におけるアルド・ケト還元酵素の発現を調べることにした.各臓器から抽出した蛋白質についてρクリスタリン抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った結果,多くの臓器でρクリスタリン抗体に陽性なバンドが検出された.臓器によって,水晶体からの抽出蛋白質で検出されたバンドと同じ分子量サイズのものとそれより少し大きな分子量サイズのバンドが観られた.次に各臓器から抽出したRNAを用いてRT-PCRで発現を確認した.既知のρクリスタリン遺伝子の配列をプライマーとして用いたところ,レンズ,角膜,網膜以外に,脳,脊髄,舌,食道,胃,精巣に同じサイズのPCRプロダクトが得られたので,それらのシーケンス解析を行った.脳,脊髄では水晶体と同じ配列のρクリスタリン遺伝子が確認できた.また,舌,食道,胃,精巣ではρクリスタリン遺伝子とかなりのホモロジーを持つ配列の遺伝子が見つかった.更に並行して,当初より計画していたPyラベル化試薬を用いたプロテオーム解析法については,BSA(ウシ血清アルブミン)を標準蛋白質としてリシルエンドペプチターゼおよびトリプシンによる消化後のペプチドをPyラベル化しMS測定を行った.本研究の目的は,水晶体の構造タンパク質であるクリスタリンのプロテオーム解析を行い多様な進化の過程を解明することである.クリスタリンは生物進化の過程で既存のタンパク質が無作為に転用されてきたものであり,その元になるタンパク質は種によって異なる.起源となるタンパク質がまだ判っていない種が多くあるので,そのタンパク質の解析をすることの重要性を考え,当初計画していた研究に加えた研究の必要となった.本研究の目的は,水晶体の構造タンパク質であるクリスタリンのプロテオーム解析を行い,多様な進化の過程を解明することである.クリスタリンは生物進化の過程で既存のタンパク質が無作為に転用されてきたものであり,その元になるタンパク質は種によって異なる.起源となるタンパク質がまだわかっていない種が数多くあるので,そのタンパク質の解明の一つとして,日本ウシガエル水晶体のρ-クリスタリンの起源となるタンパク質の候補を探すことに着手した.すでに,ρ-クリスタリンをコードする遺伝子配列のプライマーでRT-PCRすることにより得られたウシガエル組織由来の塩基配列を確認した.現在,その遺伝子をクローニングしタンパク質発現用ベクターを作製し,発現タンパク質の性質を調べることにより,ρ-クリスタリンの起源となるタンパク質を確認しようとしている.一方,並行して行っているPyラベル化試薬を用いたプロテオーム解析法については,リジンだけでなく,アミノ基を有する低分子やリジンを有するペプチドに対するラベリングを行い,Pyラベル化試薬の評価を行っている.更に,ペプチド・タンパクへの応用に進展させるべく基礎データを収集している.

その後,クリスタリン解析への応用にも発展させようと考えている.ウシガエル組織由来の塩基配列を確認することは出来たが,その遺伝子をクローニングしタンパク質発現用ベクターを作製することに困難があり予想外の時間がかかってしまった.そのため,当該年度は起源となった可能性のあるタンパク質の発現まで至らず,研究期間を延長し,現在も続行している.発現用ベクターが作製できればそのタンパク質の性質を調べることができ本研究の進展が期待される.また,最終的にプロテオーム解析のツールとして安定同位体ラベル化試薬のPy-Tagを用いてクリスタリンの解析も行いたいところであるが,プロテオーム解析の測定に欠かせない質量分析装置の不調による研究の遅延も生じている.本研究の目的は、水晶体の構造タンパク質であるクリスタリンのプロテオーム解析を行い、多様な進化の過程を解明することである。クリスタリンは生物進化の過程で既存のタンパク質が無作為に転用されたものであり、その元になるタンパク質は種によって異なる。起源となるタンパク質がまだわかっていない種が数多くあるので、そのタンパク質の解明の一つとして、日本ウシガエル水晶体のρ-クリスタリンの起源となるタンパク質の候補を探すことに着手した。既に、ρ-クリスタリンをコードする遺伝子配列のプライマーでRT-PCRすることにより得られたウシガエル組織由来の塩基配列を確認した。今回決定したアミノ酸配列(ρ-11)を,ρ-クリスタリンおよび、既に登録されている他種のアルド・ケト還元酵素の配列とアライメント解析したところ,アルドース還元酵素とも相同性が高く,近縁であることが分かった.実際,ρ-11にはアルドース還元酵素の活性ドメインと推定されているアミノ酸が保存されているため,酵素活性が残存している可能性が示唆された.これらの結果から,ρ-クリスタリンがアルドース還元活性を持つρ-11から変異し酵素活性を失活後に転用されたことを示唆された.これはこれまでの分子進化の報告によく一致する.更にその遺伝子をクローニングしタンパク質発現ベクターを作製し、発現タンパク質の性質を調べることにより、ρ-クリスタリンの起源となるタンパク質を確認しようとした。このタンパク質は配列のホモロジーの高さからアルド・ケト還元酵素スーパーファミリーに属するものであると考えられたので、酵素としての特性を調べるために様々なアルド・ケト類を基質とした場合のアッセイを試みたが十分な活性と再現性が得られなかった。水晶体構造タンパク質クリスタリンは、個々の生物種によりその進化の過程で既存のタンパク質が無作為に転用されてきた。ウシガエル特異的ρクリスタリンの起源タンパク質を解明するため各組織中に存在しているρクリスタリン様タンパク質のmRNA配列を解析しその特性を分析した。クリスタロームの裏付けとなるようなプロテオーム解析法として、リジン残基のアミノ基を特異的に標識する新規の安定同位体ラベリング試薬Py-Tagについての評価を行い、ペプチド・蛋白への応用に進展させるべく基礎データを収集した。その後、クリスタリン解析への応用にも発展させようと考えた。
硫化水素の消化管機能制御機構の解明:H2Sは内因性伝達物質か

消化管機能の制御に関与する知覚神経細胞と腸管クロマフィン細胞のモデルRIN14B細胞を用い,硫化水素ドナーNaHSの作用の検討を行ったところ,硫化水素はTRPA1を活性化して細胞内Ca2+濃度を増加させ,神経の興奮及び分泌反応を生じることが明らかとなった.また神経細胞モデルPC12細胞には硫化水素合成酵素AST(aspartateaminotransferase)/MPST(mercaptopyruvatesulfurtransferase)が発現し,硫化水素を合成することが示された.腸管組織の神経系細胞は管腔内の硫化水素によって反応を引き起こすだけでなく,自ら硫化水素を合成することで消化管機能を制御している可能性が示唆された.硫化水素の消化管機能制御機構に対する役割を明らかにするために,腸管クロマフィン細胞モデルであるRIN-14B細胞を用いて硫化水素の作用を検討した.硫化水素ドナーのNaHSの適用で,RIN-14B細胞の細胞内カルシウム濃度は上昇し,この効果はTRPA1の活性化による細胞外からのカルシウム流入によることが示された.NaHSによるTRPA1活性化は,RIN-14B細胞からカルシウム依存性の5-HT放出を引き起こすことも明らかとなった.この放出作用は,還元剤のDTTで有意に抑制されたが,より還元力が強いが膜透過性が低いTCEPでは抑制されなかったことから,硫化水素の作用点はTRPA1の細胞内ドメインにあることが示唆された.内因性に産生された硫化水素は,腸管神経叢の知覚神経などに作用し,消化管運動を調節している可能性がある.そこで,神経モデル細胞であるPC12細胞を用いて,神経系細胞における内因性硫化水素産生について検討した.PC12細胞では,硫化水素合成酵素のCBSとAST・MSTの発現が認められたが,CSEは検出されなかった.さらにCSE及びCBSによる硫化水素産生は認められなかった.一方,AST・MSTによって硫化水素が産生され,この反応はAST阻害剤のアミノオキシ酢酸とアスパラギン酸によって抑制された.AST・MSTによる硫化水素産生は,pH8.5付近にピークをもつベルシェイプ状のpH依存性を示した.ミトコンドリアのpHは細胞質より高く8.0前後であることや,AST・MSTはミトコンドリアに多く発現していることから,PC12細胞における硫化水素産生部位として,ミトコンドリアが重要な役割を果たしているのかもしれない.以上の結果から,腸管組織の神経系細胞は硫化水素によって反応を引き起こすとともに,硫化水素を自ら産生することで,消化管機能の制御を行っている可能性が示唆された.消化管機能の制御に関与する知覚神経細胞と腸管クロマフィン細胞のモデルRIN14B細胞を用い,硫化水素ドナーNaHSの作用の検討を行ったところ,硫化水素はTRPA1を活性化して細胞内Ca2+濃度を増加させ,神経の興奮及び分泌反応を生じることが明らかとなった.また神経細胞モデルPC12細胞には硫化水素合成酵素AST(aspartateaminotransferase)/MPST(mercaptopyruvatesulfurtransferase)が発現し,硫化水素を合成することが示された.腸管組織の神経系細胞は管腔内の硫化水素によって反応を引き起こすだけでなく,自ら硫化水素を合成することで消化管機能を制御している可能性が示唆された.硫化水素の消化管機能制御機構に対する役割を明らかにするために、消化管神経叢を構成する知覚神経細胞と腸管クロマフィン細胞のモデルとなるRIN14B細胞を用い、硫化水素ドナーであるNaHSの作用の検討を行い、以下の結果を得た。1.ラットより後根神経節知覚神経細胞を分離培養した。この知覚神経細胞とRIN14B細胞にCa蛍光指示薬を負荷し、細胞内Ca濃度を測定した。また、ホールセル電位固定法によって膜電流反応を、HPLC法により5-HT放出反応を測定した。2.NaHSは細胞内Ca濃度の増加を引き起こし、この反応は細胞外Caの除去により著しく抑制された。また、このCa増加反応は、TRPV1阻害薬や電位依存性Caチャネル遮断薬では抑制されなかったが、TRPA1阻害薬によって抑制された。さらにNaHSによりCa反応は、ジスルフィド(S-S)結合を還元するDTTによって抑制された。知覚神経細胞とRIN14B細胞は、TRPA1作動薬であるマスタードオイルによっても細胞内Ca濃度増加反応を引き起こした。3.知覚神経細胞において、NaHSは内向き電流反応を引き起こした。この膜電流反応はTRPA1阻害薬によって抑制された。4.RIN14B細胞において、NaHSは5-HT放出反応を引き起こした。この放出反応は、細胞外Caの除去およびTRPA1阻害薬によって抑制された。以上の結果より、硫化水素はTRPA1を活性化することが明らかとなった。硫化水素はチャネルタンパクのシステイン残基と共有結合することで、チャネルを開口させると考えられる。硫化水素は、消化管の神経細胞の活性化や、内分泌細胞からの伝達物質放出を介して消化管機能の調節に関与している可能性が示唆された。交付申請書に記載した「研究の目的」について、ほぼ全ての内容が達成されたため。今後も、研究計画通りに研究を推進する予定である。分離腸管クロマフィン細胞における硫化水素の作用を検討するため、ラット腸管からのクロマフィン細胞分離培養の実験系を確立する。また、内因性硫化水素の作用を検討するため、硫化水素合成酵素の発現解析と硫化水素産生測定実験を行い、硫化水素の産生、放出を制御する因子の探索を行う予定である。知覚神経を用いた実験系において予想外のデータが一部とれたため、その確認のために培養細胞実験の一部を次年度へと変更した。

それに伴い次年度使用となった研究費については、培養実験系での消耗品の補充に充てる。翌年度の予算については、計画通り消耗品の購入に充てるとともに、研究成果発表のために学会参加費と投稿論文のための英文校閲として使用する計画である。