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更生保護施設における在所者の社会復帰に向けた介入に関する事例研究

更生保護施設における介入のあり方について明らかにするため、2つの更生保護施設でのフィールド調査を実施した。その結果、(1)更生保護施設の介入には「ケア」と「コントロール」という2つの側面があること、(2)介入における「ケア」と「コントロール」のバランスが課題になっていること、(3)元犯罪者・元非行少年の「立ち直り」における社会的排除の状況、が明らかになった。1更生保護施設職員は在所者の社会復帰に向けてどのような介入を、どのように行っているのか、2更生保護施設職員による介入が更生保護施設在所者にどのような影響を与えているのか、という2点に関して調査を行うことが本年度の目的であった.採択後から、首都圏にある更生保護施設Aには月に12回ほど、地方都市にある更生保護施設には2月に1度程度訪問し、インタヴューを中心に調査を行った。更生保護施設Aでは職員3名と在所者1名に対するインタヴュー調査を行った。更生保護施設Bでは職員3名、在所者4名に対するインタヴュー調査を行った。また更生保護施設B退所者1名に対して、継続的なインタヴュー調査を行った。インタヴュー調査に複数回協力いただいた方もいる。基本的にインタヴュー録音は業者に依頼して文字化している。インタヴュー調査と並行して、国内や欧米圏における更生保護に関する研究・文献を収集し、レビューを行い、我が国の更生保護における介入と欧米圏の更生保護における介入との相違点をふまえながら把握することを試みた。また、現代社会論に関する文献を収集し、レビューを行い、研究目的3を達成する上での準備も行った。。これまでの調査を踏まえて、更生保護施設職員の介入において「ケア」と「コントロール」のバランスが課題となっていた。また、その課題は受けた更生保護施設在所者の今後の生活に対して複合的影響があることがわかってきた。現在は学会発表(次年度の6月、11月)や投稿論文の執筆に向けた作業に取り組んでいる。【具体的内容】前年度より開始していた【職員調査】ならびに【在所者調査】の補足調査より研究を開始した。その上で2015年6月に開催された福祉社会学会大会(会場:名古屋大学)において「更生保護施設職員の『処遇』に関する社会学的考察」というタイトルの学会発表を行った。これは1更生保護施設職員は在所者の社会復帰に向けてどのような「処遇」を、どのように行っているのか、2更生保護施設職員による「処遇」が更生保護施設在所者にどのような影響を与えているのか、という「研究の目的」ならびに「研究実施計画」に応じた問いについて発表したものである。また学会報告の内容も踏まえつつ、【理論的考察】の研究成果として本田由紀編著『現代社会論』の第7章「排除ー犯罪からの社会復帰をめぐって」を執筆した。これはこれまでの更生保護施設における調査結果を活かし、「元犯罪者の社会復帰」を焦点にして、現代社会にある排除の論理を浮き彫りにした内容である。これらを踏まて、28年度以降も継続的に論文発表などの成果発表を行う予定である。【研究成果の意義およびその重要性】第一に更生保護に関する制度改正等にあたって、貴重なエビデンスをもたらしうる点である.特に刑務所出所者の社会復帰支援が重要な課題となっている昨今のなかでの貢献は小さいものではないだろう。第二に更生保護に関する実務家に対して、処遇の実態とその機能を科学的に説明する機会になり、処遇・支援計画の作成や施設運営方針の作成等においてポジティヴな影響を与えるうる点である(実践的)。この後は論文化や書籍化を進めるなどして、さらに実務家に目を通してもらえる機会は増やしていきたい。第三に更生保護の実態に関して、社会に対して広く発信する貴重な機会となった点である(社会的)。とくに、共著ではあるが、研究成果の一部を書籍として出版できたことにより、波及効果も期待できる。研究目的1と2に関しては上記の区分があてはまる。最大の理由は、更生保護施設AとBより全面的な協力が得られたことである。次年度以降の本格的な調査データ整理・分析に向けて、貴重な調査データを収集することができた。実際に次年度での成果報告や研究目的3に向けて動き出している。27年度が最終年度であるため、記入しない。犯罪社会学フィールド調査を継続しながら、本年度は成果報告に重点をおいて研究活動を行っていく。
フランスにおける発電エネルギー源選択の歴史的変容－－石炭・石油・原子力－－

報告者の研究目的は高度成長期フランスにおける電力エネルギー源の選択の歴史的な変容を捕捉することにある。現在のフランスは総発電量の8割を賄う原子力大国として知られているが、原子力が主要な発電エネルギー源となったのは70年代中葉以降であり、戦後復興期からオイルショックに至るまでの経済発展著しい期間においては火力および水力が電力生産を担った。報告者は当該期間においてフランス政府は水力・石炭火力・石油火力の三択をいかにベスト・ミックスとして捕捉していたのかについて、原子力の開発状況も視野に入れながら検証することを試みた。とりわけ2014年4月から2014年8月まではパリに滞在して国立公文書館(ピエール・フィット市)にてフィールドワークを行い、博士論文執筆に必要な史料を収集した。当該年度はとりわけフランスにおいてエネルギー開発計画を数年毎に策定した計画庁エネルギー委員会の史料の分析に時間を費やした。戦後の物資欠乏期においては石炭節約が喫緊の課題であったために水力推進策が採られる一方、物資欠乏から脱した50年代初頭には水力よりも利益率の高い火力へと傾斜されたことはすでに先行研究によって指摘されてきた。しかしながら史料を精査することで、50年代初頭においてエネルギー委員会が火力推進策を採用したことは事実であるとしても非販売用の低品質石炭を用いることで物資欠乏期と同様に石炭使用の合理化が図られたこと、50年代前半の石炭市場緩和時においては石炭業に対する配慮のために石油火力の普及に歯止めがかけられたこと、好況のため西欧全土で石炭不足に陥った50年代半ばには再び水力の推進が図られたこと、などが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は高度成長期のフランスにおけるエネルギー政策の実態について、特に発電エネルギー源選択をめぐる問題を中心に明らかにすることである。現在は原子力大国として知られるフランスであるが原子力発電が主たる発電エネルギー源となったのは70年代半ば以降のことであり、戦後フランスのエネルギー政策史は決して単線的な原子力発展史にのみ還元できるものではない。他方、戦後から高度成長期における電力政策研究はフロストによる研究に代表されるように電力公社の活動を対象としたものが多く、その焦点を政府に当てた研究は非常に限定的である。本研究では戦後のフランスにおいてエネルギー政策の基本方針の立案・策定を担った計画庁エネルギー委員会の一次史料を中心に検討することで、当該期におけるフランス政府が石炭火力、石油火力、水力などの複数の電力エネルギー源をいかに適切に組み合わせることでフランス経済全体にとって最良の解を導こうとしたのか、検討を試みる。また他方で石炭業、石油業が政府の政策に対していかに反応したかについても検討し、政府・企業間の相互連関の把握も試みる。特別研究員初年度にあたる2013年度は主に第一次近代化計画(1946-52)および第二次近代化計画(1954-57)におけるエネルギー関連委員会の決定事項および活動内容について、フランス国立文書館ピエールフィット館に所蔵されている計画庁史料の収集およびその分析に充てられた。並行して石炭公社および石油企業の史料の収集も実施した。また石炭火力の運用実態を把握するために戦後の石炭流通について調査した結果を日仏経営学会誌に投稿し、査読ののちに受理された。研究の目的に従って、高度成長期のフランスのエネルギー政策について、特に電力エネルギー源に着目しながら研究を進展させることができた。特にエネルギー委員会の活動およびその決定について一次史料を検証したことは研究の大きく進展させた。引き続き国立公文書館ピエールフィット館に所蔵されている計画庁エネルギー委員会の史料の収集およびその検証に努める。特に第三次近代化計画(1958-62)以降の計画庁エネルギー委員会による電力エネルギー源選択に関する議論・決定に注目して検証を進める。

またこの作業と並行して産業界資料センターに所蔵されている石炭公社史料およびトタル本社に所蔵されている石油企業史料を収集・検証し、政府のエネルギー政策に対してこれらの企業がいかに反応したかについて検証を進める。
ＩＬ－１１を用いた歯根膜組織再生の解析

ヒト歯根膜幹細胞において、機械的負荷はアンジオテンシンIIやAT2がIL-11を調節することにより、細胞増殖活性を調節し、また骨芽細胞あるいはセメント芽細胞分化への誘導能にも関与していることが示唆された。今回の研究成果は、歯根膜組織における恒常性の調節機構に関して新たな知見を獲得しただけでなく、IL-11が歯根膜組織再生に及ぼす影響に関しても情報を得ることができた。ヒト歯根膜細胞において、適度の負荷によって誘導されるIL-11のシグナル経路について解析を行い、また、ヒト骨芽細胞株および申請者たちが樹立した未分化なヒト歯根膜幹細胞株を用いてIL-11がその分化に及ぼす影響について明らかにするため、2年目の研究を行った。IL-11が未分化なヒト歯根膜細胞の分化に及ぼす影響について解析した。申請者たちが樹立した未分化なヒト歯根膜幹細胞株(1-11細胞株、1-17細胞株)を用いて、IL-11がセメント芽細胞への細胞分化(線維芽細胞、骨芽細胞、セメント芽細胞)に及ぼす影響について、遺伝子発現解析(real-time RT-PCR法)を行い、石灰化機能解析についても解析を行った。その結果、1-17細胞株においてIL-11がセメント芽細胞に影響を与える結果が出たため、データを揃え、Journal of Periodontal Researchに論文投稿を行った。現在、acceptの返信を既に受けており、発行準備中である。in vivo動物実験モデルを用いたIL-11の歯根膜組織再生能の検討についても、現在解析中であるが、発表できるデータはまだ揃っていない。申請者は、in vitroで適度の負荷を付与したヒト歯根膜細胞においてIL-11の発現が上昇した結果に加えて、in vivoのラット歯周組織では、IL-11が歯槽骨側およびセメント質側の歯根膜組織に強く発現している結果を最近報告した。本研究の学術的特色としては、メカニカルストレスが負荷されたヒト歯根膜細胞におけるIL-11の発現に着目し、歯根膜組織における恒常性の調節機構への関与について解明することがあげられる。さらに、そのIL-11が歯根膜組織再生に及ぼす影響についても明らかにすることを計画しており、実際の臨床に活かすことができる研究となることが期待できる。本研究の独創的な点として、以下の2点(a, b)があげられる。a:ヒト歯根膜組織における恒常性の機構を解析する研究において、適度の負荷にIL-11の発現が誘導され、その局在が歯槽骨およびセメント質側に強発現していることに着目した点。このような申請者が企図したような研究は報告されておらず、歯根膜組織の研究分野に新たな活路を開く可能性が期待できる実験であることがあげられる本研究の結果をもとにして、IL-11を用いた新規の歯根膜組織の再生療法の開発へと繋げていくことを企図しているが、IL-11はすでに血小板減少症に対する治療薬として米国では認可を受けて使用されており、また現在日本においても臨床試験の途上にあることから、歯周組織再生薬として臨床研究への早期移行が期待できる薬剤であると考えられる。本研究では、[1]適度の負荷が加えられたヒト歯根膜細胞におけるIL-11の発現のメカニズム(レポーターアッセイ、リン酸化酵素のインヒビターを用いたシグナリング解析)、[2]ラット臼歯部非咬合モデルにおけるIL-11の発現(動物実験モデルを用いて組織学的解析)、[3] IL-11が骨芽細胞の分化に及ぼす影響(骨関連タンパク・破骨細胞調節因子の発現ならびに石灰化誘導能の解析)、[4] IL-11が未分化なヒト歯根膜細胞の分化に及ぼす影響(歯根膜幹細胞株を用いて線維芽細胞・骨芽細胞・セメント芽細胞への分化誘導能の解析)、[5] in vivo動物実験モデルを用いたIL-11の歯根膜組織再生能、の5項目を計画として挙げたが、現在[1][4]の4項目について研究を進めており、データも揃ってきている。現在、そのデータを揃えて論文を執筆中であり、今年度中に投稿する予定である。また、[5]に関しても現在計画中であり、[1][4]のさらなる解析に加えて、準備が整い次第、実行にうつしていく所存である。これらの状況から、順調に進展していると評価した。in vivo動物実験モデルを用いたIL-11の歯根膜組織再生能の検討を3種類の方法で計画している。(A) SCIDマウス背部皮下への幹細胞移植モデルを用いたIL-11の歯周組織形成能の検討。(B)ラット臼歯部再植モデルの確立。(C)ラット臼歯部再植モデルを用いたIL-11の歯根膜組織再生能の検討。研究計画を遂行するにあたって、研究体制は平成24年度のままで問題ないと思われるため、次年度以降も継続する。さらに、検討した結果データを抽出して論文執筆を行っていく。

細胞培養が必須であるため、消耗品は前年度と同様に使用することが考えられ、今年度はin vivoモデルを積極的に研究に用いていくため、新たな費用を捻出する必要がある。消耗品費、旅費、謝金等およびその他の経費については本研究を適切に遂行し、また研究結果について広く公表していくために適正な旅費である。設備備品費、旅費、謝金等が全体の研究経費の90%を超える計画は無い。
血小板による好中球機能の制御

1.好中球ー血小板の接着・凝集反応における相互作用のFICによる解析我々は,フローサイトメーターにCCDカメラ(画像撮影機能)を組み込んだフローイメージサイトメーター(Flow Imaging Cytometer:FIC)を開発している.FICは,前方散乱より得られる細胞の大きさに関する情報とデジタルカメラからの画像情報より,従来は困難であった血小板凝集塊と赤血球・白血球・単一血小板との鑑別を可能にした.このFICを用い,全血をADP・セロトニンなどの血小板アゴニストで刺激した際に,好中球・血小板の混合凝集塊を明瞭に観察できることを確認した.その定量評価が可能になるべく,種々の条件検討を重ねたが,現時点では確立できていない.装置の構成上,200枚の画像しか処理できず,FICによって検知できる混合凝集塊が絶対数として極めて低レベルであることが,主な理由である.将来的には,この混合凝集塊形成における,接着分子の関与を検討したい.2.好中球をはじめとする各種血球・血管内皮細胞に対するスフィンゴ脂質の効果我々は,活性化血小板からsphingosine 1-phosphate(Sph-1-P)が放出されること,スフィンゴ脂質の観点より血小板ー各種血球・血管内皮細胞クロストークを考えることの重要性を報告してきた.好中球に対して,Sph-1-Pは明らかな作用を示さなかったが,ジメチルスフィンゴシン・Sph・セラミドは,この順で,好中球アポトーシスを誘導することを形態学的変化・フローサイトメトリー法にて確認した.血管内皮細胞では,Sph-1-P産生に対するSphキナーゼ阻害剤の効果の検討を行い,Sph-1-Pが血小板内セカンド・メッセンジャーとして作用しえないことを明らかにした.1.好中球ー血小板の接着・凝集反応における相互作用のFICによる解析我々は,フローサイトメーターにCCDカメラ(画像撮影機能)を組み込んだフローイメージサイトメーター(Flow Imaging Cytometer:FIC)を開発している.FICは,前方散乱より得られる細胞の大きさに関する情報とデジタルカメラからの画像情報より,従来は困難であった血小板凝集塊と赤血球・白血球・単一血小板との鑑別を可能にした.このFICを用い,全血をADP・セロトニンなどの血小板アゴニストで刺激した際に,好中球・血小板の混合凝集塊を明瞭に観察できることを確認した.その定量評価が可能になるべく,種々の条件検討を重ねたが,現時点では確立できていない.装置の構成上,200枚の画像しか処理できず,FICによって検知できる混合凝集塊が絶対数として極めて低レベルであることが,主な理由である.将来的には,この混合凝集塊形成における,接着分子の関与を検討したい.2.好中球をはじめとする各種血球・血管内皮細胞に対するスフィンゴ脂質の効果我々は,活性化血小板からsphingosine 1-phosphate(Sph-1-P)が放出されること,スフィンゴ脂質の観点より血小板ー各種血球・血管内皮細胞クロストークを考えることの重要性を報告してきた.好中球に対して,Sph-1-Pは明らかな作用を示さなかったが,ジメチルスフィンゴシン・Sph・セラミドは,この順で,好中球アポトーシスを誘導することを形態学的変化・フローサイトメトリー法にて確認した.血管内皮細胞では,Sph-1-P産生に対するSphキナーゼ阻害剤の効果の検討を行い,Sph-1-Pが血小板内セカンド・メッセンジャーとして作用しえないことを明らかにした.1.好中球-血小板の接着・凝集反応における相互作用のFICによる解析全血中の血小板凝集塊を検出する目的で,我々はフローサイトメーターにCCDカメラ(画像撮影機能)を組み込んだフローイメージサイトメーター(Flow Imaging Cytometer;FIC)を開発している.FICは,前方散乱より得られる細胞の大きさに関する情報とデジタルカメラからの画像情報より,従来は困難であった血小板凝集塊と赤血球・白血球・単一血小板との鑑別を可能にした.このFICを用い,全血をADP・セロトニンなどの血小板アゴニストで刺激した際に,好中球・血小板の混合凝集塊を明瞭に観察できることを確認した.今後,種々の条件下において検討し,FICによる混合凝集塊形成における最適の条件を探すとともに,その定量評価が可能になるようにしたい.2.好中球アポトーシスの血小板による制御機構我々は血球細胞(主に血小板)を用い,スフィンゴ脂質の代謝・機能を研究してきている.特に,sphingosine 1-phosphate(Sph-1-P)が血小板由来の新規脂質メディエーターとして重要な機能を担いうる(当然,好中球にも作用しうる)ということを報告している.今回,基礎検討として,各種スフィンゴ脂質の好中球に対する効果を検討した.形態学的変化・フローサイトメトリー法にてアポトーシス誘導能を調べたところ,ジメチルスフィンゴシン,Sph,セラミドの順で,アポトーシスが誘導されることを確認した.一方,Sph-1-Pは,アポトーシスの誘導,細胞内カルシウム動員ともに引き起こさなかった.また,平行して,血管内皮細胞でも同様な検討を行い,Sphがアポトーシスを誘導する一方,Sph-1-Pが生存能を高める方向に作用することが明らかとなった.

1.好中球-血小板の接着・凝集反応における相互作用のFICによる解析我々は,フローサイトメーターにCCDカメラ(画像撮影機能)を組み込んだフローイメージサイトメーター(Flow Imaging Cytometer;FIC)を開発している.FICは,前方散乱より得られる細胞の大きさに関する情報とデジタルカメラからの画像情報より,従来は困難であった血小板凝集塊と赤血球・白血球・単一血小板との鑑別を可能にした.このFICを用い,全血をADP・セロトニンなどの血小板アゴニストで刺激した際に,好中球・血小板の混合凝集塊を明瞭に観察できることを既に確認していた.その定量評価が可能になるべく,種々の条件検討を重ねているが,現時点では確立できていない.装置の構成上,200枚の画像しか処理できず,FICによって検知できる混合凝集塊が絶対数として極めて低レベルであることが,主な理由である.現在,FICの紹介に関する論文を作成すべくまとめており,好中球・血小板の混合凝集塊の定量評価に関する実験は凍結している.2.好中球アポトーシスの血小板による制御機構各種スフィンゴ脂質の好中球に対する効果を検討した.昨年報告した血管内皮細胞での検討とは異なり,Sph-1-Pは,好中球に対しては明らかな作用を示さなかった.一方,形態学的変化・フローサイトメトリー法にてアポトーシス誘導能を調べたところ,ジメチルスフィンゴシン,Sph,セラミドの順で,好中球アポトーシスが誘導されることを確認した.これらの知見は,Br.J.Haematol.に発表した.また,このスフィンゴ脂質研究の過程で,血小板カルシウム動員・Sph-1-P産生に対するSphキナーゼ阻害剤の効果の検討を行い,その成果をJ.Biochem.に発表した.
細胞の前後極性のリポソーム内再構成

細胞は細胞外からの刺激入力がなくても自発的に運動する。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化原理の理解につながる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、細胞膜上で生成するPI(3,4,5)P3の時空間パターンのダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、前年度までに構築した再構成実験系を用いて、同一リポソームにPI3K、PTEN、PI(3,4,5)P3(あるいはPI(4,5)P2)蛍光レポータータンパク質を内包させ、PI(4,5)P2からPI(3,4,5)P3へのリン酸化およびその逆反応である脱リン酸化を同時に起こす実験を試みた。結果として、現在までのところ細胞内で観察された様なPI(3,4,5)P3の時空間パターンを完全に再現する条件を見いだすまでには至っていない。そこで、ダイナミクスに必須の因子がさらに必要である可能性を考慮してその最有力候補であるRasに注目し、Rasの活性化因子であるRasGEFおよび不活性化因子であるRasGAPの探索を行った。作業の簡便化のため、細胞性粘菌を用いて全てのRasGEF遺伝子およびRasGAP遺伝子の過剰発現株を作成し、自己組織化ダイナミクスに現れる表現型のライブセルイメージング解析を行い、いくつかの候補遺伝子を絞り込むことに成功した。今後比較的早い時期に、これらの成果を生かし、リポソーム内での自己組織化ダイナミクスの再現に繋げる予定である。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化の原理の理解に繋がる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的シグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、ダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、このネットワークにおいて中心的な役割を果たすことがすでに分かっているPI(3,4,5)P3代謝酵素PI3KおよびPTENについて、これらのリコンビナントタンパク質をそれぞれ活性のある状態で精製しリポソーム内に封入することに成功した。3'リン酸化酵素PI3Kの基質であるPI(4,5)P2あるいは3'脱リン酸化酵素PTENの基質であるPI(3,4,5)P3を任意の組成で含むリポソームを作成した。PLCdeltaあるいはAkt/PKBのイノシトールリン脂質結合ドメインとGFPとの融合タンパク質を精製してこれらのリポソーム作成時に封入し、PI(4,5)P2あるいはPI(3,4,5)P3に対する蛍光プローブとしての特異性を確認した。さらに、精製した酵素のいずれかを追加してリポソームを作成した結果、リポソーム内でのPI3KあるいはPTENの活性をイメージングにより検出することができた。これらの基礎的技術を元に、今後はPI3KとPTENの同時封入による前後極性シグナルのダイナミクスの再現を目指す。計画通りにPI3KとPTENを同時に封入したリポソームの作成まで達成できた。現時点では、PI(3,4,5)P3、PI(4,5)P2、PI3K、PTENの4成分の存在下で前後極性シグナルのダイナミクスを再現できる条件は見つかっていない。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化の原理の理解につながる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、ダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、リポソーム内でPI(3,4,5)P3のリン酸化・脱リン酸化反応を任意のATP濃度において行うために、主に次の3点について再構成実験系の改良を行った。まず、リポソームの調整条件を最適化した。これにより比較的均一なリポソームを再現性良く調整することが可能になった。次に、ビオチン・アビジンを用いてカバーガラス表面へのリポソームの固定化を行った。これによりリポソーム外液の対流の影響をうけずに同一リポソームの蛍光強度の時間変化を顕微鏡下で計測することが可能になった。最後に、ヘモリシンを用いてリポソーム膜に孔を形成し、リポソーム外液の交換によってリポソーム内の低分子の濃度を操作することを可能にした。これにより、リポソーム内のPI3Kによるリン酸化反応を任意のタイミングでATPを添加して開始させることが可能となった。以上より、PI3KとPTENを同時に内包するリポソームの膜におけるPI(3,4,5)P3の時空間ダイナミクスを幅広い化学反応条件下でイメージング解析する実験系を構築できた。今後、これらの基盤技術を元に、生細胞の細胞膜で見られるPI(3,4,5)P3のダイナミクスが再現される条件を探索する。

計画していた通りに、細胞内で見られるダイナミクスの再現に必要な最小構成要素を網羅的な化学反応条件下で探索するために不可欠な基盤技術を構築することに成功した。細胞は細胞外からの刺激入力がなくても自発的に運動する。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化原理の理解につながる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、細胞膜上で生成するPI(3,4,5)P3の時空間パターンのダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、前年度までに構築した再構成実験系を用いて、同一リポソームにPI3K、PTEN、PI(3,4,5)P3(あるいはPI(4,5)P2)蛍光レポータータンパク質を内包させ、PI(4,5)P2からPI(3,4,5)P3へのリン酸化およびその逆反応である脱リン酸化を同時に起こす実験を試みた。結果として、現在までのところ細胞内で観察された様なPI(3,4,5)P3の時空間パターンを完全に再現する条件を見いだすまでには至っていない。そこで、ダイナミクスに必須の因子がさらに必要である可能性を考慮してその最有力候補であるRasに注目し、Rasの活性化因子であるRasGEFおよび不活性化因子であるRasGAPの探索を行った。作業の簡便化のため、細胞性粘菌を用いて全てのRasGEF遺伝子およびRasGAP遺伝子の過剰発現株を作成し、自己組織化ダイナミクスに現れる表現型のライブセルイメージング解析を行い、いくつかの候補遺伝子を絞り込むことに成功した。今後比較的早い時期に、これらの成果を生かし、リポソーム内での自己組織化ダイナミクスの再現に繋げる予定である。まず、上述の4成分がネットワークの最小構成要素である可能性について徹底的に調べる。リポソーム内をより細胞内の状態に近づけるために例えばATP再生系などを導入し、ダイナミクスの再現を目指す。再現できる条件が見つからなかった場合には、PI3Kの活性化に働くことが知られているRasおよびRasの活性化・不活性化因子をリポソームに追加するための実験系の構築に着手する。PI(3,4,5)P3代謝系における自発的なシグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種がPI3K、PTEN、PI(4,5)P2およびPI(3,4,5)P3の4種である可能性について、網羅的な化学反応条件下で再構成実験を行って検証する。このため、今年度までに構築した実験系を用いて、多様な濃度の組み合わせでこの4成分を内包するリポソームを作成して幅広いATP濃度において反応を開始し、リポソーム膜上のPI(3,4,5)P3レベルの時空間変化を蛍光タンパク質性レポータを介して共焦点顕微鏡を用いて計測する。これにより実際の細胞で観察されるPI(3,4,5)P3の進行波あるいは一過性ドメイン生成のダイナミクスを再構築することを目指す。これらのダイナミクスを再現できなかった場合には、最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種はこの4種以外にも存在すると考えられる。そこで、PI3Kの活性化に働くことが知られているGTP結合型RasおよびRasの活性化・不活性化因子を再構成実験系に追加して、PI(3,4,5)P3のダイナミクスの再構成を目指す。4成分による再構成系の条件検討を継続しており、外部からリポソームにタンパク質を追加する実験系の立ち上げには着手しなかったため。
対称性と相関によって生じる多様な量子秩序相の研究

本年度は、時間反転なトポロジカル超伝導体におけるマヨラナ励起の磁場応答の一般論を構築した。素粒子論で議論されるマヨラナ粒子とは異なり、超伝導体表面に現れるマヨラナ励起は結晶対称性からの制約を受けており、異方的磁場応答を実現する。我々は一般的な磁気点群を考慮し、磁気多極子の観点からマヨラナ励起の磁場応答を分類した。その結果、ギャップ関数の表現と磁気応答の表現の一致を見つけるとともに,磁気双極子応答や磁気八極子応答が出現することを明らかにした。さらには、磁気八極子応答はハーフホイスラー合金のような髙スピンを持つトポロジカル超伝導体で実現されることも明らかにした。またJ=3/2の電子からなるトポロジカル物質を起源とする超伝導体のトポロジカルな性質を調べ,通常の電子によるトポロジカル超伝導体とは異なり,高次の巻きつき数をもつトポロジカル超伝導体となることを明らかにした.また,実験家に協力して,鉄系超伝導体におけるトポロジカル超伝導体の理論を構築した.さらには,昨年度の手法を通してアンチペロブスカイト型ディラック電子系における磁気円二色性の性質を明らかにし,光吸収係数・フォトルミネッセンスの解析を行った.また,前年度に発展させたトポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の理論的枠組みを発展させ,Atiyah-Hizebruchの完全系列とよばれるホモロジーの手法を用いて系統的にトポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の分類が可能であることを示した.結晶対称性からの制約によりトポロジカル超伝導体上のマヨラナ励起が素粒子論で議論されるマヨラナ粒子と本質的に異なった振る舞いを示すことを明らかにすることに成功し,またトポロジカル結晶絶縁体の分類にも進展があった.対称性の枠組みを拡げ,非エルミートハミルトニアンなど従来見落とされてきていた系の量子秩序相の研究も進める.本年度は、時間反転なトポロジカル超伝導体におけるマヨラナ励起の磁場応答の一般論を構築した。またJ=3/2の電子からなるトポロジカル物質を起源とする超伝導体のトポロジカルな性質を調べ,通常の電子によるトポロジカル超伝導体とは異なり,高次の巻きつき数をもつトポロジカル超伝導体となることを明らかにした.また,実験家に協力して,鉄系超伝導体におけるトポロジカル超伝導体の理論を構築した.さらには,昨年度の手法を通してアンチペロブスカイト型ディラック電子系における磁気円二色性の性質を明らかにし,光吸収係数・フォトルミネッセンスの解析を行った.また,前年度に発展させたトポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の理論的枠組みを発展させ,Atiyah-Hizebruchの完全系列とよばれるホモロジーの手法を用いて系統的にトポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の分類が可能であることを示した.結晶対称性からの制約によりトポロジカル超伝導体上のマヨラナ励起が素粒子論で議論されるマヨラナ粒子と本質的に異なった振る舞いを示すことを明らかにすることに成功し,またトポロジカル結晶絶縁体の分類にも進展があった.結晶対称性は空間群だけでも230あり,さらには磁気構造から生じる磁気結晶対称性,あるいは異方性超伝導性を生み出す超伝導ギャップの対称性の違いも加えると考慮すべき対称性は膨大なものとなる.したがって,結晶対称性から生じる新奇な量子秩序相の系統的な研究には,まずそれらの複雑な対称性を見通しよく取り扱える理論を構築する必要がある.とりわけ,トポロジカル量子秩序相の構造の解明には,K群と結晶対称性の融合を可能とする同変K理論を物性理論の立場から整備する必要がある.そこで,まず,本年度は,数学理論である同変K理論を物性理論の立場から構成し直し,結晶対称性によって守られたトポロジカル結晶絶縁体およびトポロジカル結晶超伝導体の完全な分類を与える一般的な枠組みを構築した.その一方,研究を効果的に進めるには,具体的な現象に即した研究も行う必要がある.この目的を果たすため,異方的超伝導体におけるラインノードの安定性に関する研究を行い,付随するトポロジカル量子現象を明らかにした.まず,非共型結晶構造や磁気秩序を考慮し,結晶の対称性により保護されるラインノードを包括的に分類した.さらに,バルク・エッジ対応と有効模型を用いることで,反強磁性秩序を持つ超伝導体-UPd2Al3-において新奇トポロジカル表面状態が存在することを明らかにした.

並行してアンチペロブスカイト型ディラック半金属の研究も行い,高次スピンにともなう特異な光学特性を明らかにするために,その系における磁気円二色性の計算手法を構築した.非共型結晶構造や磁気秩序を含む一般の結晶対称性を考慮したトポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の分類理論の枠組の構築に成功するとともに,それらの対称性より生じる新しい量子秩序相を明らかにすることに成功している.対称性の枠組みを拡げ,非エルミートハミルトニアンなど従来見落とされてきていた系の量子秩序相の研究も進める.トポロジカル結晶絶縁体・超伝導体の分類と進めるとともに,その励起の特性を明らかにする.特に,トポロジカル超伝導体特有の励起であるマヨラナフェルミオンと結晶対称性の関係を明らかにしていく.
明細胞肉腫の肺転移に対するホウ素中性子捕捉療法を用いた新たな治療方法の開発

明細胞肉腫は若年成人の四肢に好発する稀な悪性軟部腫瘍である。明細胞肉腫は、化学療法あるいは放射線治療に抵抗性であるため、治療は手術による全切除が基本である。しかし、特に肺に転移した症例では、手術不能である場合が多く有効な治療方法は無い。そこで、新たに明細胞肉腫をヌードマウスの肺に移植した肺転移動物モデルを作成してホウ素中性子捕捉療法(BNCT)による抗腫瘍効果を調べた。その結果、肺転移動物モデルの明細胞肉腫に選択的にホウ素製剤が集積し、BNCTによる全肺照射にて明細胞肉腫の肺転移部のみが選択的に死滅することが明らかとなった。手術不能な肺転移例に対しBNCTによる局所制御の可能性を初めて示した。明細胞肉腫は、若年成人の四肢に好発する稀な悪性腫瘍であり予後は悪い。治療は、手術による切除が基本であるが、化学療法、放射線療法は効果が無く、特に、再発や肺転移を来たした手術不能例では有効な治療方法が無い。ところが、近年、悪性黒色腫のホウ素中性子捕捉療法(BNCT)による良好な治療成績が報告された。BNCTは、それ自体では放射活性を持たないホウ素を腫瘍内に集積させ、続いて病巣部に生体障害性がきわめて低い熱中性子を生体外から照射し、ホウ素と中性子捕獲反応により生じた重荷電粒子で腫瘍を選択的に死滅させようとする治療方法である。明細胞肉腫も悪性黒色腫と同様にメラニンを産生するため、明細胞肉腫細胞株を四肢の皮下に移植した担癌動物モデルを用いてBNCTを施行したところ、同様に抗腫瘍効果が得られることが判明した。そこで、本研究ではさらに生命予後を大きく決定する肺転移についても、BNCTによる肺転移に対する抗腫瘍効果を検討することとした。平成25年度は、まずBNCT検討のための明細胞肉腫の肺転移動物モデルを開発した。肺転移動物モデルは、培養した明細胞肉腫細胞をマトリックスゲルに分散させ、それを、注射針を用いて左肺実質に直接腫瘍細胞を注入することで作成した。マイクロCTにより、肺転移巣の腫瘍形成を確認した後に、肺を摘出し組織検査にても肺実質内に単独で腫瘍が形成されることを確認した。また、BNCTでは、ホウ素製剤を投与した後の肺腫瘍部、正常肺、および正常臓器の経時的なホウ素濃度の計測値が、照射線量、照射時間を決定するのに非常に重要である。そこで、作成した動物モデルを用いて、ホウ素製剤投与後の各組織のホウ素濃度を計測し、腫瘍選択的なホウ素の集積を確認した。これらの結果は学術集会等で報告した。しかし、再発・転移を来した症例、特に肺に転移した症例では、手術不能である場合が多く有効な治療方法は無い。このような現状で、我々は、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)が明細胞肉腫の治療に有効であることをヒト由来の明細胞肉腫細胞株を四肢に移植した担がん動物モデルを用いて報告してきた。そこで、さらに明細胞肉腫の肺転移に対するBNCTの効果を調べる目的にて、新たに明細胞肉腫をヌードマウスの肺に移植した肺転移動物モデルを作成してBNCTによる抗腫瘍効果を調べた。すると、肺転移についても、BNCTによる全肺照射にて明細胞肉腫の肺転移部のみが選択的に腫瘍細胞が死滅することが明らかとなり論文にて報告した。また、胸部の上縦隔に生じた悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)については、2症例に対して既にBNCTが施行されており、肺転移へのBNCTによる治療の可能性を探る目的にて検討した。すると、上縦隔においてもBNCTによる抗腫瘍効果を認め、さらに新たに作成したMPNST担がん動物モデルにてもBNCTの抗腫瘍効果が確認され論文にて報告した。以上より肺転移の臨床例でもBNCTによる抗腫瘍効果が期待され、今後の臨床研究による更なる検討が必要である。骨・軟部腫瘍動物モデルの作成については、肺に限局した単発性の腫瘍を形成させることに成功した。また、その動物モデルを使用してホウ素製剤の体内動態を評価することが可能となり、形成した腫瘍細胞に選択的なホウ素の集積を確認した。上記の結果により、肺転移動物モデルに対するホウ素中性子捕捉療法(BNCT)による良好な抗腫瘍効果が期待できたため、肺転移動物モデルに対するホウ素中性子捕捉療法(BNCT)を施行した。引き続き、明細胞肉腫の肺転移動物モデルを用いてそのホウ素中性子捕捉療法(BNCT)による抗腫瘍効果を検討する。

そして、得られた結果を詳細に検討し、実際の臨床現場への応用にはどのような条件が必要か解析し学会等にて報告する。さらに、今回、新たに作成した単発性の肺転移モデルは、明細胞肉腫のみならず他の肉腫の場合の解析にも有用である。一般的に、一部の肉腫を除いて殆どの肉腫についても、明細胞肉腫と同様に手術による完全な切除以外に治療方法は無い。このような現状からホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、肉腫に対する新たな治療方法の一つとして大いに期待されている。そこで、可能であれば他の肉腫についても、明細胞肉腫へのホウ素中性子捕捉療法(BNCT)の治療効果を比較・検討する目的にて研究を行う。87,398円の次年度使用額が生じた。これは、動物モデルを作成した際の組織標本作成を外部業者に委託しなかったこと、および学会が、近隣で開催されたため交通費を要しなかった等の理由による。次年度使用額については、海外発表の際の英文原稿の校閲費、および依頼原稿作成時の英文原稿の校閲費等に使用する。
簡便・迅速なオンサイト型脱窒細菌生菌数計測法の開発と廃水処理精密管理への応用

脱窒プロセスの精密管理には、脱窒プロセス内の生菌数の情報が重要である。これまでに様々な技法が考案されたが、脱窒細菌を迅速・簡便に測定する技法は皆無であった。本研究では、この目的のために5-cyano-2,3-ditolyl-2-tetrazolium chloride (CTC)法を応用することを考案した。nirSおよびnirK型脱窒細菌と活性汚泥を用いて、CTC濃度、CTC反応時間および硝酸呼吸阻害剤濃度を最適化した。その結果、CTC法の最適条件は、0.2mM CTC、反応時間1時間および1mM硝酸呼吸阻害剤であり、本CTC法を用いることで80%以上の脱窒細菌生菌数の計測が可能であった。生物学的脱窒プロセスは水質指標のみで管理されており、脱窒細菌の特性に見合った制御・管理が難しい。従って、ひとたび処理効率が悪化した場合、現状回復に多大な労力を必要とする。この問題を克服するためには、プロセス内で硝酸除去を担う脱窒細菌の生菌数も指標化し、水質指標と微生物指標を合わせた相互補完的な管理体制の強化が望ましい。しかしながら、現在までオンサイトにおいて迅速・簡便に脱窒細菌の生菌数を計測する技術は知られていない。そこで本研究では、好気性細菌の呼吸活性菌計測方法で用いられる5-cyano-2,3-ditolyl-2H-tetrazolium chloride(CTC)染色を脱窒細菌に応用する技法の開発と蛍光アプタマーによる同時染色技術の開発を最終的な目標とした。数種の脱窒細菌および好気性細菌を用いてCTC法の最適化を行った。硝酸呼吸に基づくCTC染色菌を明確にするためには、CTC濃度を極力抑えて、硝酸呼吸阻害剤によってCTC還元を促進させることが重要であった。特に、diethyldithio carbamate(DDC)を0.51 mM添加することにより、CTC濃度を上げた時とほぼ同等までCTC染色率を高める効果が確認できた。脱窒条件下の活性汚泥に対しても同様の実験を行った結果、CTC濃度(0.2 mM)、反応時間(1時間)およびDDC濃度(1 mM)の条件下において、蛍光性CTCフォルマザン由来の脱窒細菌生菌数を測定することが可能であった。蛍光アプタマーによる同時検出を行うために、まずは従来のFluorescent in situ hybridization法による同時検出が可能かを評価した。その結果、細胞の脱水処理の工夫によって、EUB338プローブを用いたFISH法とCTC法の同一視野における検出が可能であった。生物学的脱窒プロセス内の高活性脱窒細菌の正確な計測は、亜硝酸還元酵素遺伝子などの脱窒関連遺伝子の転写物を標的としたfluorescence in situ hybridization法や定量RT-PCR法などの非培養的な技法を選択することが望ましい。しかしながら、これらの方法は、高度な知識を要するだけでなく、操作の迅速性や簡便性と言う点で未だ問題がある。そのため、現在のところ、脱窒細菌の生菌数を正確に測定する迅速・簡便な技法は未だ知られていない。脱窒細菌の生菌数を迅速・簡便に計測する技法を確立するために、好気性細菌の呼吸活性菌計測法で用いられている5-cyano-2,3-ditolyl-2-tetrazolium chloride(CTC)染色法と蛍光性アプタマーを利用することを考案した。本年度は、CTC法を原理とした計測法の確立のために、脱窒細菌の数種の純粋株を用いて、硝酸呼吸由来のCTC還元反応の最適条件の検討を行った。nirS型およびnirK型の数種の脱窒細菌を用いてCTC法(CTCの濃度と反応時間)の最適化を行った。CTC濃度1 mMの条件下においてCTC反応時間(172時間)の検討を行ったところ、いずれの反応時間においても90%以上のCTC染色率を示した。そのため、CTC反応時間を1時間と決定した。次に、CTC濃度の検討を行った結果、CTC濃度を1 mM以上にすることによって、脱窒細菌の純粋株の90%以上が、細胞内に蛍光性CTCフォルマザンを蓄積していることが観察された。このことは、CTC濃度を過剰に添加することによって、偽陽性細菌であってもCTC陽性菌として検出されることを示していた。そこで、硝酸呼吸に由来するCTC染色菌を明確に計測するためには、CTC濃度0.10.2mM程度とし、硝酸呼吸阻害剤を使用して反応性向上化させることが重要であることが分かった。脱窒細菌に対してCTC法を適用する際の問題として、CTC反応方法を工夫しないと酸素呼吸由来のCTC反応微生物を測定してしまう。

そのため、気相部をアルゴン置換した密栓バイアルを用いることと、適切な濃度の硝酸呼吸阻害剤を利用することで、脱窒細菌由来の正確なCTC染色結果が得られると推測した。また、適切なCTC反応条件を検討し、脱窒細菌に対してCTC法を適用することが、非脱窒細菌由来の非特異的な蛍光を除く上で欠かせないことを予測していた。そこで本年度は、脱窒細菌生菌数の測定の核となるCTC法の最適化を実施した。CTC法の最適化のために、数種のモデル脱窒細菌を用いてCTC濃度とCTC反応時間(または短縮化)の検討を実施し、最適反応条件の決定および反応時間の短縮化することに成功することができた。しかしながら、上記条件検討に時間を割かれたことと、実験装置の故障・復旧などの問題が発生したことにより、当該年度に予定していたCTC反応性向上のための硝酸呼吸阻害剤の種類や濃度の検討や偽陽性細胞を除くための蛍光アプタマーへの研究に着手することができなかった。平成25年度の前半は、24年度に実施できなかったCTC反応性向上のための硝酸呼吸阻害剤の種類や濃度の検討を行う。これらの条件が最適化された暁には、非脱窒細菌と脱窒細菌を既定量で混ぜ合わせて、CTC最適反応条件下で染色を行い、脱窒細菌のみが染色されることをフローサイトメーターと分子生物学的技法で評価する。次に、ラボスケール脱窒プロセスの汚泥に対して、開発したCTC法を適用して、本技法によって脱窒細菌が計測できるかを判定する。平成25年度中盤から後半にかけて、偽陽性細胞を除くための蛍光アプタマーの探索を行う。非脱窒細菌と脱窒細菌をモデル微生物として、系統学的広く分布している脱窒細菌を網羅的に捉えられる細胞表面膜タンパク質を標的するアプタマーの探索を目指す。本年度終盤を目処に、モデル脱窒細菌を標的する蛍光アプタマーとCTC法との同時検出が可能かどうか評価する。平成25年度の研究費(総額1,200千円)の使用計画としては、CTC関連試薬および測定備品の調達(350千円)、アプタマー探索のためのSELEX法に関連する備品および試薬の調達(530千円)、スライドガラスやカバーガラスなどの蛍光観察関連備品(100千円)、プラスチックやガラス器具類の調達(70千円)および研究成果発表旅費(50千円)を計画している。
樋状根モデルマウスを用いた歯根形態形成に対する分子遺伝学的研究

樋状根を有するC57L/Jと樋状根が全く認められないC57BL/6Jマウスの戻し交配(C57L/JxC57BL/6JXC57BL/6J)から得られた66匹を試料として用いた。マウス常染色体上に存在するSSLPマーカーの一つであるMitマーカー約800個の中から2系統間に多型性を示すマーカーをアガロース電気泳動にて検出し、すべての染色体上に約20cM間隔で34個の有用なマーカーを設定した。戻し交配マウスすべての遺伝子型タイピングを行なったところ、染色体5、8、17番が有力な候補染色体となることが示唆された。歯の発育初期の上皮-間葉系相互作用に重要な役割を演じている遺伝子が多く存在する染色体5番に注目し、樋状根出現の有無を表現型として、19個のMitを用い詳細な連鎖解析を行なったところ、D5Mit161(expectation:nonexpectation=42:24、x^2=4.91、p<0.05)、D5Mit29、321および427(expectation:nonexpectation=41:25、x^2=3.88、p<0.05)で強い連鎖を示す結果が得られた。D5Mit161、29、321および427は、染色体5番の動原体より約70cM付近にマップされており、この領域に候補遺伝子の存在する可能性が疑われた。今後、近傍に位置するBmp3、Dmp1、Ycf1ならびにPedfa遺伝子の構造解析を行なっていく予定である。1.原因遺伝子の存在する染色体の特定樋状根を有するC57L/Jと樋状根出現が全く認められないC57BL/6Jマウスの交配実験から得られたbackcrossマウスの中で、樋状根が認められた25匹を試料として研究を行った。試料とした25匹のDNAをpoolし、DNA pool PCR法から、染色体5,8,15,17および19番でlinkageを疑う結果が得られた。さらにInternal mappingのためのSSLPマーカーを検出し、linkage解析を行ったところ染色体5および15番が候補染色体である可能性が示唆された。2.Candidate geneの特定(特にマウス染色体5番についてのlinkage解析)マウス染色体5番上には、歯の形態形成に重要な役割を演じているMsx1遺伝子やBmp3遺伝子、FGF3のreceptor遺伝子が存在することから、backcross25匹の各サンプルの遺伝子型タイピングを行い、candidate geneの特定を試みた。SSLPマーカーの1つであるMitマーカーのうち、多型性を示す有用なマーカーの検出を行った。120個のマーカーの中から13個の有用なマーカーが検出できたことから、これらのマーカーを用いて樋状根を有するbackcross各サンプルの遺伝子型タイピングを行ったところ、染色体ポジションが約60cM付近のD5Mit161、D5Mit427およびD5Mit166で強い連鎖が認められた。これらの結果から、現在のところ樋状根成因に強く関与する遺伝子の1つが染色体5番に存在する可能性が考えられた。マスス染色体5番の約48cM付近にはBmp3が存在することから、今後candidate geneの1つとして捉え、詳細なlinkage解析を進めていく予定である。
細胞内部温度をナノスケールで測定可能な温感性蛍光ナノプローブの開発と評価系の構築

細胞内部温度情報を把握することは多様な生命現象への理解を押推し進める可能性を秘めている。本研究課題では、解析用ナノプローブとして、温度応答性ポリマーで被覆された蛍光性有機ナノ結晶の開発を目指した。その結果、温度温感性ポリマーの機能で蛍光がオンオフし、かつ水分散安定なナノ結晶化が可能であり、かつ温度応答性ポリマー被覆下で結晶成長が抑制される等の、一連の作製上のハードルを越えることは容易ではないことが分かった。これらの条件を満たさなければイメージングプローブには適していないと考えられた。今回明らかとなった課題と有益な知見を基に、今後のナノプローブの開発及び細胞内イメージングに繋げていきたい。研究課題の目的は、未だ十分に明らかにされていない、細胞内部の温度測定による細胞内生命活動の熱力学的解明に向けた極めて価値が高く挑戦的な研究課題に取り組むことである。具体的には、1.単一細胞内部の温度を、ナノスケールの解像度で測定可能な温度応答性蛍光有機ナノ結晶(温感性蛍光ナノプローブ)の研究開発を行う、2.本プローブを細胞内に導入し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡と顕微鏡用培養装置のセットアップ下で細胞のリアルタイム蛍光イメージング観察を行う、3.温度依存的な蛍光強度(蛍光像・蛍光スペクトルから取得)を検量線を用いて温度に変換させる。これらのステップにより、単一細胞内部の特に細胞小器官(核、小胞体、ミトコンドリア等)を対象に、ナノスケールの解像度(200 nm程度)で、温度測定に基づいた定量的な熱力学的解析を行うことを目標としている。特に平成27年度の目標は(1)温感性蛍光ナノプローブの作製および(2)細胞内部のリアルタイム温度測定評価系の構築である。(1)の温感性ナノプローブの作製においては一定の成果を得ているが、(2)に関わる細胞培養下でのリアルタイムイメージングの環境設定・最適化の実施については試行錯誤を要することが考えられるため、まだ十分なレベルではなく引き続き検証を要する段階である。平成27年度の目標は(1)温感性蛍光ナノプローブの作製および(2)細胞内部のリアルタイム温度測定評価系の構築である。(1)の温感性ナノプローブの作製においては一定の成果を得ているが、(2)に関わる細胞培養下でのリアルタイムイメージングの環境設定・最適化の実施については試行錯誤を要することが考えられるためまだ十分なレベルではないと考えているため。研究目的)未だ十分に明らかにされていない、細胞内部の温度測定による細胞内生命活動の熱力学的解明に向けた極めて価値が高く挑戦的な研究課題に取り組む。具体的には、単一細胞内部の温度を、ナノスケールの解像度で測定可能な温度応答性蛍光有機ナノ結晶(温感性蛍光ナノプローブ)の研究開発を行い、細胞内に導入し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用い、単一細胞内部の細胞小器官の熱力学的解析を行う。実施した研究結果で明らかになったことは、温度応答性蛍光プローブの作製において、温度応答性ポリマーと蛍光色素ナノ結晶との組み合わせは、任意に何でも良いというわけではないことである。蛍光色素の蛍光挙動として、有機溶媒中に分子状態で分散した蛍光色素は蛍光を発するが、ひとたび水中等で蛍光色素が凝集する貧溶媒系では、蛍光色素が蛍光しない現象がある。一方で、有機溶媒中の分子状態で蛍光し、かつ、ナノ結晶状態でも蛍光する有機蛍光色素が存在することも分かってきた。特に明らかになってきたことは、水中で結晶状態でも蛍光を発するような蛍光性ナノ結晶は、温度応答性ポリマーとブレンドしても水環境場での温度変化による蛍光挙動の劇的な変化を捉えることは難しいということである。おそらく元々水中でも結晶形で蛍光を発するため、温度応答性ポリマーによる温度依存的な親水・疎水環境場の影響を受けた蛍光挙動が蛍光性ナノ結晶では現れにくいためと推測している。一方で有機溶媒中では蛍光を発し、水中では消光するような有機ナノ結晶の方が、温度応答性ポリマーとのブレンドには適しており、環境場の温度の変化に伴う温度応答性ポリマー由来の疎水・親水場の影響に感応し、蛍光挙動が変化する傾向があった。これらの結果により、理想的な新規プローブへの考察を深めることができた。平成29年度では、環境温度に反応して多様な蛍光挙動を示す温度応答性蛍光プローブの実現を実施予定である。平成28年度の計画では、温感性蛍光ナノプローブを用いた細胞内部のリアルタイム温度測定評価を予定していたが、先立ち、細胞内部のリアルタイム温度測定評価系の構築について十分な検証と整理も必要と考えており平成29年度においても引き続き研究課題の遂行が必要な状況である。本研究は、未だ十分に明らかにされていない、細胞内部の温度測定による細胞内生命活動の熱力学的解明を目指す、極めて価値が高く挑戦的な研究課題である。具体的には、単一細胞内部の温度を、ナノスケールの解像度で測定可能な温度応答性蛍光有機ナノ結晶(温感性蛍光ナノプローブ)の研究開発を行い、細胞内に導入し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて、単一細胞内部の細胞小器官の熱力学的解析を行う。本年度の知見は以下である。温感性蛍光ナノプローブの作製は、蛍光ナノ結晶の表面を温度応答性ポリマーで被覆し、かつ、有機ナノ結晶が水中にコロイド状態できれいに分散された有機ナノ結晶水分散系の構築を得ることにある。主にボトムアップ法(沈澱法)を作製手段として用いる。しかしながら、有機ナノ結晶水分散液の作製を試みた場合、水中でナノ結晶の結晶サイズ成長が生じ凝集沈殿を生じる系が多数あることが判明し、同時にナノ結晶の結晶成長を抑制することが困難な状況に直面した。