hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脱分化型胸腺上皮細胞株を用いた自己・非自己識別制御の解析とその検証

胸腺を構成する多様な皮質および髄質上皮細胞サブセット上の自己抗原分子由来ペプチドとMHC分子との複合体は、分化途上のT細胞がMHC拘束性と自己寛容性をそれぞれ獲得する上で重要なリガンドである。しかし、そのような各皮質および髄質上皮細胞サブセットにおける複合体形成の分子制御機構に対する理解はまだ不十分である。本年度は、マウス胎児胸腺から脱分化型の上皮細胞株と皮質部由来上皮細胞株の樹立と、それらの細胞株が胸腺微小環境の構築し、胸腺T細胞の増殖・分化を支持することの検証を行った。Doxycycline存在下でOct-4転写因子を発現する構造遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス胎児胸腺およびbeta5t(胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現するプロテアソームサブユニット)の発現をコードする領域に緑蛍光タンパク質(Venus)をノックインしたトランスジェニックマウス胎児胸腺からそれぞれ胸腺上皮細胞株を作製した。Doxycycline存在下でOct-4転写因子を発現する構造遺伝子を組み込んだマウス胎児胸腺から得られた細胞株は髄質上皮細胞のマーカー分子を発現し、Doxycycline存在下でOct-4およびNanogを高度に発現し脱分化型の表現系を示した。一方、非存在下ではその発現量が低下するとともに胸腺上皮細胞マーカーであるFoxn1分子の発現量が増加し、分化型に移行することが判明した。一方、beta5t領域にVenusをノックインしたマウス胎児胸腺から緑蛍光を指標に細胞を分離した結果、Foxn1分子を発現するとともに胸腺皮質細胞の形態分子マーカー(CD205)と機能分子マーカー(beta5t)を特異的に発現する胸腺上皮細胞株を得た。現在、これらの細胞株から胸腺器官培養を行い、さらにそれをマウス腎臓皮膜下に移植することで、それら細胞株の胸腺構造と機能の再構築可能性を検証している。マウス胎児胸腺からDoxycycline存在下で脱分化型の表現系を示す髄質部由来胸腺上皮細胞株及び皮質部上皮細胞特異的分子マーカー(beta5t,CD205など)を発現する皮質部由来初代胸腺上皮細胞株(b5t-TEC)をそれぞれ作製することができた。しかし、Oct4-tgマウス胎仔胸腺から樹立した培養細胞(Oct4-TEC)を用いた腎臓皮膜下での胸腺再構成はこれまで成功していない。一方、胸腺上皮細胞を単層培養した場合、Foxn1分子をはじめbeta5t分子、Aire分子など機能上重要な分子のmRNA量の著しい低下する。このmRNA量の低下は胸腺をトリプシン等で消化した直後から一時間以内の間に起こることが判明した。しかし、既に報告されているように細胞凝集塊を作りことによりこの急速な低下を防ぐことできることも確認した。単層培養した場合に胸腺機能性分子、特にFoxn1分子の発現レベルが著しく低下することも判明したので、現在、培養細胞のFoxn1分子発現レベルを維持または増加できる可能性のある凝集培養を試みている。加えて、腎臓皮膜下での胸腺再構成程度を検証するために胸腺機能性分子の一つであるbeta5t分子に対するモノクローナル抗体とサイモプロテアソームに対するモノクローナル抗体をそれそれ作製している。以上の実験が継続中であることを考えて、"やや遅れている“と自己評価した。マウス胎児胸腺からDoxycycline存在下で脱分化型の表現系を示す髄質部由来胸腺上皮細胞株及び皮質部上皮細胞
中国における学校制度の社会的機能-学校段階間の接続と地域格差に注目して-

本研究は、中国の学校段階間の接続方法(進学方法や試験、学区制、連携の問題など)と、それらに関して国・教育部(日本の文部科学省に相当)、地方教育当局、学校、親や児童生徒それぞれの事情や思惑が交錯するなかで生じている地域格差に注目することによって、中国社会において学校制度がもつ機能を明らかにすることを目的としている。今年度は昨年度までの研究を、博士論文としてまとめる作業に重点をおいたが、その過程で必要となった資料を日本国内および中国国内において収集し、これらも併せて分析対象として研究を進めた。調査・資料収集については、主に中国の北京市、藩陽市、大連市および日本国内で実施した。中国では現地の学校を見学した他、現地教育研究者と意見の交換をおこない、同時に教育関連、中国関連の資料収集をおこなった。とくに後期中等教育段階における普通教育進学者と職業教育進学者の比率の問題は、中華人民共和国成立以来まだ解決されていない部分であり、これも学校制度がもつ機能として重要であるため、歴史的考察も含めて現在までの比率の変遷をまとめ、これを分析したものを共著としてまとめた。日本国内では、日本比較教育学会において博士論文の大きな枠組みにつながる観点を口頭発表し、研究者との意見交換をおこなった。また国内の中国研究者と交流し、最新情報の交換や資料収集をおこなった。こうして収集した資料は電子ファイルとしてデータベース化し、分析をおこなった。こうして収集した情報や資料を付け加えながら、博士論文を執筆した。現在はほぼ完成し、提出の準備を進めている段階にある。本研究は、中国の学校段階間の接続方法(進学方法や試験、学区制、連携の問題など)と、それらに関して国・教育部、地方教育当局、学校、親や児童生徒それぞれの事情や思惑が交錯する中で生じている地域格差に注目することによって、中国社会において学校制度がもつ機能を明らかにすることを目的としている。本年度は主に日本国内および中国国内において、国家・地方の規定から実際の状況までを明らかにするために、調査・資料収集・分析をおこなった。調査・資料収集については、主に日本国内各都市および中国の北京市において実施した。この他、中国の学校制度の地域格差に注目する必要から、地方都市(山東省、上海市、湖南省、貴州省、雲南省、チベット自治区など)を訪問し、現地の学校や教育行政機関において調査をおこなうと同時に、教育関連・中国関連の資料を収集した。これらの調査によって、例えば雲南省では少数民族が厳しい財政状況の中、成人教育を強化することによって識字教育の普及につとめていること、貴州省では立ちゆかなくなった公立学校を地方教育当局の判断で民営化し、立て直しを図っていることなど、経済状況の厳しい地方が独自の判断で現状の打開にとりくんでいることが把握できた。その他、インターネットによっても大量の情報収集をおこなった。また、こうして収集した資料を電子ファイルとしてデータベース化し、分析をおこなった。これらの調査・資料収集・分析によって、国家・地方の公的な規定が把握できたほか、各地の抱える独特の事情によって、実際の状況に差異が生じていることが確認できた。前年度に続いて、中国における学校制度の社会的機能を学校段階間の接続と地域格差に注目して研究するために、中国および日本国内において調査・資料収集・分析をおこなった。調査・資料収集については、主に中国の北京市・上海市・江蘇省および日本国内各都市で実施した。中国では現地の学校を調査すると同時に、現地研究者と討論・意見交換をおこない、また教育関連・中国関連の資料の収集をおこなった。前年度に訪問調査をおこなった西南部の特殊な地区の状況については、文献や現地研究者からの聞き取り等によって、地域格差が生まれている要因やその打開策について詳細に調べることができ、これまで調べた各種規定・法規と関連づけた上で論文として発表した。日本国内では、日本比較教育学会において口頭発表をおこない、また日本人の中国研究者を訪問するなどして、特殊な資料や最新情報の収集と意見交換をおこなった。その他、インターネットによって大量の情報収集をおこなった。これらの調査・資料収集・分析によって、昨年度に把握できた国家・地方の公的な規定がさらに詳細に判明したほか、各地の実際の状況に差異が生じている要因を法規や社会事情と関連づけて考察することができた。

とくに後期中等教育段階における普通教育進学者と職業教育進学者の比率の問題は、中華人民共和国成立以来まだ解決されていない部分であり、これも学校制度がもつ機能として重要であるため、歴史的考察も含めて現在までの比率の変遷をまとめ、これを分析したものを共著としてまとめた。日本国内では、日本比較教育学会において博士論文の大きな枠組みにつながる観点を口頭発表し、研究者との意見交換をおこなった。また国内の中国研究者と交流し、最新情報の交換や資料収集をおこなった。こうして収集した資料は電子ファイルとしてデータベース化し、分析をおこなった。こうして収集した情報や資料を付け加えながら、博士論文を執筆した。現在はほぼ完成し、提出の準備を進めている段階にある。
神経細胞の自律的回転・旋回運動による神経回路形成の精緻化メカニズム

申請者は最近、1)神経突起先端の成長円錐のフィロポディア(糸状仮足)が自律的に右ねじ方向に回転運動すること、2)この回転運動が左らせんモーターであるミオシンVにより駆動されること、3)フィロポディアの右ねじ回転運動が神経突起の2次元平面上での右旋回運動を引き起こすこと、を見出した(Tamada et al., J Cell Biol. 188, 429, 2010)。この成果は、神経細胞がこれまで考えられていたような直線運動だけでなく、自律的に回転・旋回運動する特性を持つという新規の概念を打ち立てるものである。本研究では、自律的で左右非対称な回転・旋回運動が、細胞移動・軸索伸長・標的認識・シナプス形成などの神経回路形成の諸過程の精緻化に寄与するという仮説を立てて、これを検証することを目的としている。本年度は前年度に引き続き、改変ミオシン分子の作成を行った。これらの分子を神経細胞に過剰発現させてコラーゲンゲル内で培養し、神経細胞のフィロポディアの回転運動の変化を解析した。次に、ミオシンの分子改変によるフィロポディアの回転運動の変化が、これまでに知られている神経突起の2次元平面上での右旋回運動にどのような影響を与えるのかという点について解析した。改変分子を過剰発現させた神経細胞を2次元基質上で培養したところ、神経突起の右旋回運動が減弱する傾向を示すことがわかった。さらに、改変ミオシン分子を脳組織に遺伝子導入し、発現細胞の挙動を生体内で解析する作業を進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は最近、1)神経突起先端の成長円錐のフィロポディア(糸状仮足)が自律的に右ねじ方向に回転運動すること、2)この回転運動が左らせんモーターであるミオシンVにより駆動されること、3)フィロポディアの右ねじ回転運動が神経突起の2次元平面上での右旋回運動を引き起こすこと、を見出した(Tamada et al,J Cell Biol. 188, 429, 2010)。本年度は、自律的で左右非対称な回転・旋回運動が、神経回路形成の諸過程の精緻化にどう寄与するのか調べるために、まず、回転を駆動するミオシンVの分子改変を行い、回転特性を変化させる手法を確立することを目標にしてきた。具体的には、ミオシンVの分子構造を変化させて神経細胞の回転特性を操作することを目指している。9アミノ酸よりなるαヘリックスの挿入によりネックを180度捻じると想定される改変分子を作成し、それを神経細胞に過剰発現させる実験を行った。その結果、本来なら一方向に右回転するはずのフィロポディアが右回転と左回転を交互に繰り返すという現象が観察された。この現象は、内在性の正常分子による右回転と過剰発現させた改変分子による左回転の拮抗状態を現しているのではないかと解釈される。神経細胞の回転運動を操作する方法に関してめどがついたため。様々な回転特性を持つ改変ミオシンV分子が完成すれば、その分子を培養神経細胞に過剰発現させて機能解析を行い、回転特性と機能の因果関係を明らかにする。
可視化によるインフルエンザウイルス出芽過程の動的解析

インフルエンザウイルスのM1に蛍光タンパク質を付加したもの(GFP-M1)と全反射照明蛍光顕微鏡を用い、ウイルス粒子形成過程の生細胞での観察を試みた。GFP-M1発現細胞にウイルスを感染させたところ、約8時間後からGFP-M1の顆粒状構造が細胞表面に観察され始め、その後、顆粒は集積傾向を示した。もう一つのウイルスタンパク質であるHAでも同様な傾向が確認された。これは、GFP-M1顆粒形成がウイルス粒子形成に対応することを示す。2波長全反射顕微鏡観察を可能とするための調整を行い、23年度よりの観察が可能となった。特に、対物ピエゾの導入により、生細胞タイムラプス観察中での焦点ずれの問題を解決できる目処がついた。全反射顕微鏡観察の予備実験として、固定細胞を用いた各インフルエンザウイルスタンパク質抗体による蛍光免疫染色試料について、共焦点顕微鏡観察により以下の観察結果を得た。(1)ウイルス膜タンパク質であるHAは、インフルエンザウイルス感染後期の細胞上で明瞭な粒子像を示し、出芽に対応する構造と考えられた。(2)ヌクレオキャプシドタンパク質(NP)は、細胞質内で顆粒構造を示したが、HA顆粒とは一致しなかった。一方、細胞内での小胞輸送に関与するRabllに対する抗体染色で見られる顆粒とは一致した。ただし、細胞膜極近傍においては、Rabllと一致しないNP顆粒も観察された。(3)ウイルスマトリックスタンパク質(Ml)は、免疫染色では細胞膜近傍で顆粒構造を示さず、HAとの一致は見られなかった。ところが、テトラシステインタグ(蛍光色素であるFIAsHを共有結合により導入できる蛍光タグ)導入M1を発現する組み換え体(FlAsH-M1)ウイルスを感染した細胞でのFlAsH蛍光像はHA顆粒と一致した。以上の観察結果を、以下のように解釈している。HAで観察される顆粒が出芽に対応するならば、NPとM1が一致しないということはあり得ない。恐らく、出芽部位では抗NPあるいは抗M1抗体が浸透し得ない構造が形成されていると考えている。このことは、FlAsH染色の結果が支持する。NPの顆粒は細胞内を輸送されるRNP(ribonucleoprotein)複合体と考えられるが、個々のRNPでなく集積体であろう。細胞膜近傍でこの複合体が解離し、出芽場所へと運ばれるのであろう。抗体を用いないNP検出を可能とする系の構築を現在検討中であり、FIAsH-M1ウイルスと組み合わせることで、インフルエンザウイルス出芽過程に関する新たな情報が得られることが期待される。インフルエンザウイルス感染生細胞での2波長全反射顕微鏡による経時的観察において、観察中の細胞の運動により、焦点ずれが起こった。そこで、22年度に導入した対物ピエゾを用い、各時間において異なる焦点(z軸スライス)での画像を複数枚撮ることで対処した。また、各細胞の感染過程の進行は異なり、少数細胞の観察では適切な画像が得られないことが判明した。これについては、多点タイムラプスにより対処した。ウイルス感染細胞においてGFP-M1タンパク質と細胞膜マーカーであるCellMask Orangeを経時的に同時観察したところ、ウイルス感染後8時間程度で細胞表面にGFP-M1の穎粒を示す細胞が観察された。今回初めて、インフルエンザウイルス出芽過程を生細胞において経時的に観察することに成功したと考える。これらの穎粒の挙動は、大きく以下の2種に分かれた。(1)感染の進行により細胞がシャーレより離れるまで点状の穎粒のまま存在するもの。(2)感染の進行とともに大きな集合体となるもの。以上の2種である。(2)に関しては、大きな集合体とほぼ同様な場所にCellMaskの集積が観察された。GFP-M1発現細胞のインフルエンザウイルス感染では、穎粒状と繊維状のウイルス粒子の存在を確認しており、(1)が穎粒状(2)が繊維状ウイルス粒子の出芽過程に対応すると考えており、この仮説の元にさらなる解析を行っている。上記の観察では細胞が極性を示さないサブコンフレントの状態で観察している。インフルエンザウイルスの生体での感染により近い、極性を持つ細胞での観察を行うために、Transwellのフィルター上で培養した細胞を用いアピカル側から観察する方法を検討した。その結果、固定した細胞での観察に、ほぼ成功した。生細胞に応用可能か検討中である。さらに、蛍光色素標識抗体を用い、ウイルスHAタンパク質の感染生細胞表面での観察に成功した。今後HAとM1両タンパク質の感染細胞での挙動を、感染生細胞において同時観察する予定である。蛍光タグ付加インフルエンザウイルスM1タンパク質を用いウイルス出芽過程のライブセルイメージングを行うことが、本研究の主眼であった。GFP付加M1(GFP-M1)と全反射顕微鏡を用いることで、出芽過程に相当すると思われる顆粒構造の形成を観察できた。GFP-M1発現MDCK

細胞にインフルエンザウイルスを感染させ、全反射顕微鏡で継時的に観察したところ、感染約8時間後からGFP-M1の顆粒状構造が観察されるようになった。その後、感染16時間程度で感染細胞は吸着ガラス面から遊離した。この間GFP-M1顆粒は細胞表面を動き回るとともに集積傾向を示した。観察された顆粒が出芽過程に対応するとすると、M1以外のウイルスタンパク質もそこに集積する必要がある。GFP-M1表面顆粒が観察される細胞を固定後、透過性処理を行い抗HA抗体で免疫蛍光染色を行った。全反射顕微鏡観察により、HA顆粒の集積と、それのGFP-M1との共局在が確認された。さらに、NPを免疫染色したところ、細胞表面顆粒は観察されず、細胞質内にのみ顆粒が観察された。NPの顆粒構造が確認されなかった原因として、GFP-M1が関与する出芽過程にはNPが参加しない。つまり、ヌクレオキャプシドを含まないウイルス粒子産生の可能性が考えられる。この点を検討するために、MDCK細胞にインフルエンザウイルスを接種し、11時間後、抗M1、HA、NP抗体で蛍光免疫染色した。HAに関してはGFP-M1細胞で観察されたと同様な顆粒の集積が細胞表面に観察された。一方、M1とNPのどちらもその集積場所への局在は観察されなかった。現在我々は以下の作業仮説従い研究を進めている。出芽過程あるいは成熟ウイルス粒子の蛍光免疫染色では、M1、NPの両タンパク質とも免疫染色され得ない様な構造にあるという仮説である。この点を明らかにすることは今後の研究遂行に必須と考えられる。本研究の最も重要な点である、生細胞においてのインフルエンザ出芽過程の観察に関しては、GFP-M1を用いた観察条件がほぼ樹立され、二波長同時観察に成功している。出芽過程に関与するタンパク質の挙動の差異を明らかにできるものと考えられる。一方、テトラシステインタグ導入M1タンパク質を用いた観察については、観察条件の確立が遅れている。蛍光標識の条件等さらなる検討が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。GFP-M1を用い、2波長全反射顕微鏡観察により、インフルエンザウイルス出芽過程の解析をさらに進める予定である。既に、出芽過程への関与が仮定されている細胞内骨格系(アクチンおよびチュブリン)また、ウイルスタンパク質の細胞膜への輸送に関与するとされるRab11、さらに、ウイルスHAタンパク質に対する生細胞用蛍光プローブが作成済みである。これらのタンパク質の出芽場所での挙動の比較を行うことで、出芽過程の詳細な解析が可能と考えられる。極性を持つ細胞での観察に関しては、生細胞での観察は困難が予想される。少なくとも、固定細胞において上記タンパク質の蛍光像の比較を行い。極性の有無の影響を検討したい。テトラシステインタグ標識に関しては、24年度には観察が可能と考えている。
セルロースナノファイバーからなる結晶性ハイドロゲルの特性解析と高機能化

本研究は、植物細胞壁の骨格物質でもある「セルロースナノファイバー(CNF)」の優れた力学特性を活かして、従来の高分子ゲルとは異なる特異な構造および性質を有する「高結晶性ナノファイバーゲル」を創製し、その特性解析およびさらなる高強度化・高機能化により、CNFの新しい分野への応用展開を図ることを目的としている。アルカリ膨潤したCNF同士の交互嵌合により、結晶性ナノファイバーからなる連続的なネットワークが形成され、優れた引張特性を示すゲルとなる。本手法は、同じく天然由来の結晶性ナノファイバーであるα-およびβーキチンにも適用され、いずれも安定な高強度ゲルが得られた。本研究は、あらゆる植物細胞壁の基本骨格物質でもある「セルロースナノファイバー」の優れた力学特性を活かして、従来の高分子ゲルとは異なる特異な構造および性質を有する新規材料「高結晶性ナノファイバーゲル」を創製し、その特性解析およびさらなる高強度化・高機能化により、セルロースナノファイバーの新しい分野への応用展開を図ることを目的としている。本年度前半では、前年度に明らかになったキチンナノファイバーのゲル化についてその詳細なゲル化条件および特性解析を行った。簡潔に言えば、35wt%以上の水酸化ナトリウム処理によりイカの甲等から単離されるβ-キチンナノファイバーから安定なゲルが形成されることが明らかになった。ゲル化機構においても、セルロースと同様に平行鎖構造を有するβ-キチンが強アルカリ処理によりα-キチンへと結晶変態する過程でナノファイバー間が嵌合し連続的なネットワークを構築することに由来すると考えられる。得られたキチンナノファイバーゲルは表面が脱アセチル化(キトサン化)されていることから、医療系材料への応用も期待される。強度においては、キチンの結晶弾性率がセルロースのそれに比べて低いことから、セルロースナノファイバーゲルに比べて弾性率および引張強度も低いが、その分破壊ひずみが大幅に向上され、粘り強い材料であることが示された。また当初の目的の一つであるセルロースナノファイバーの高強度化・高機能化については、北海道大学のGong先生らのダブルネットワークゲルの手法を参考にゼラチンやグルコマンナンを組み合わせることにより膨潤率および強度の向上が確認された。前年度までの結果によりセルロースナノファイバーと同様にβ-キチンナノファイバーからNaOH処理により結晶性ゲルが得られることが明らかとなった。本年度前半では、このゲル化機構を詳細に解析するため、セルロースナノクリスタルを用い、(1) NaOH膨潤状態、(2)中和・湿潤状態、(3)乾燥状態、におけるX線回折測定を行った。それら結果は、NaOH膨潤状態の結晶性ナノファイバー同士が交互嵌合することにより連続ネットワークを形成するという従来の仮説を支持するものであった。後半では、これまでの手法ではゲルの作製が不可能であったα-キチンナノファイバーにおいて、様々な条件を試み、同様の結晶性ゲルの作製に取り組んだ。結果、低温でのNaOH処理によるゲル化が確認された。量的に豊富なα-キチンから高結晶性・高強度のナノファイバーゲルが作製可能になったことより、医療系材料への応用もより期待される。樹木から単離した幅15nmのセルロースナノファイバー水懸濁をアルカリ水溶液に浸漬させることにより、結晶性ナノファイバー骨格を有するハイドロゲルが作製されることが明らかになっている。初年度はこの高結晶性ナノファイバーゲルの特性解析、とくにその力学特性を中心に明らかにすることを目標とした。湿潤ナノファイバーシートを9w%または15wt%のNaOH水溶液に50°Cで浸漬することで、2種類のナノファイバーゲルを作製した。X線回折測定の結果、作製したゲルはそれぞれセルロースI型およびII型の結晶構造を有し、両者のセルロース結晶性は極めて高い値を示した。2種類のナノファイバーゲルの引張特性はいずれも一般的な高分子ゲルに比べて遥かに高く、またII型ゲルはI型ゲルより高い引張特性を示した。15wt%NaOHで処理した際、ナノファイバー結晶全体が膨潤し近傍のナノファイバー同士で癒合することにより強固な連続ネットワークが形成されるため引張特性が向上すると考えられる。ナノファイバーの結晶膨潤を利用して作製するゲルは従来のゲル構造とは全く異なるものであり、今後天然由来の高強度ゲルとしての利用が多いに期待できる。

またセルロースと同様、自然界に豊富に存在する結晶性ナノファイバーであるキチンを用いてアルカリ処理によるゲル化現象を確認し、その作製法を詳細に検討した。ナノファイバーゲルは、結晶性ナノファイバー同士の嵌合により連続的かつ強靭なネットワークが形成され、その結果、優れた引張強度を示すことが特徴である。しかし、その一方で、結晶性ナノファイバーの使用はゲルの膨潤度を低下させ、また圧縮強度も低いことが問題であった。しかしながら、ゼラチンやグルコマンナン等の水溶性ポリマーをナノファイバーゲル中に含浸させた後、ゲル化を行うことによりダブルネットワークが形成され、ゲルの膨潤度および圧縮強度が劇的に向上されることが示された。天然由来のナノファイバーゲルを同じく安価で天然由来のゼラチンやグルコマンナンで補強され、また有機溶媒の使用も無いことから低環境負荷の材料であるといえる。また、当初の予定には無かったキチンナノファイバーからのゲル化についても様々な知見が得られた。結晶性ナノファイバーとして天然に豊富に存在するセルロースおよびキチンから容易に強靭なゲルが作製可能であることは、高分子ゲルの応用の幅を一層広げると考えられる。さらに、キチンナノファイバーゲルにはセルロースにはない特徴が多数示され、例えば、中和時にエタノールを使用することで再生されたキチンの結晶性が劇的に向上することや、温度によってキチン/キトサンの割合が変化することは興味深い知見である。とくに、高温で調製して得られたキトサンナノファイバーゲルは温度やpHに応じて膨潤および溶解するという性質は非常に興味深く今後詳細に検討する必要がある。以上の点において本研究は当初の計画以上に進展している。高弾性・高強度を示すセルロースナノファイバーを骨格とするハイドロゲルにおいて、その力学特性は非常に興味深い。初年度の成果において、I型およびII型の結晶形を有する結晶性ナノファイバーゲルの引張特性が一般のセルロース系ゲルと比べて非常に高い値を示すことが明らかになった。これにより結晶性ナノファイバーからなる新規ゲルの特異性が示され、初年度の達成度は非常に高い。とくに、セルロースI型からII型への結晶変態を利用したナノファイバー間の癒合がゲル内に強固な連続ネットワークを形成させ、その力学特性を飛躍的に向上することが明らかになったことは有意な成果であった。しかしながら、本来初年度後半から取り組む予定であったナノファイバーのさらなる高強度化・高機能化については十分に行うことができなかった。それは上記の実績概要に示したように、キチンナノファイバーのゲル化現象を明らかにすることを優先したためである。天然に存在する直鎖状の結晶性高分子がセルロースとキチンのみであるため、これら2種類の天然ナノファイバーから同様に結晶性ゲルを作製することが可能になったことは天然由来の高強度ゲルの利用展開を促進する上で有意義な結果であったと考える。キチンナノファイバーゲル独自の特性解析および高強度・高機能化を中心に進める。
確率推論課題における推論様式の認知発達的研究

本研究では,ベイズ型推論課題の解決におけるコンピテンス要因とパフォーマンス要因の影響を区別した。コンピテンス要因とは,課題の解決に不可欠な課題解決者の知的操作である。パフォーマンス要因とは,知的操作の働きに影響を与えると考えられる課題解決者の既有知識や課題の親近性,課題内容等である。当該年度に実施した研究の具体的内容は,以下の通りである。ベイズ型推論課題に見出される(a)最もプリミティブな判断から最も高次の正判断に至るまでの推論様式の多様性と,(b)「形式的な課題」と「主題化された課題」の間にみられる推論様式の多様性とを認知発達的観点から包括的に説明した。「形式的な課題」とは,「課題構造」は維持しながらも「課題内容」は可能な限り単純化することによって,課題解決者のコンピテンスが結果にダイレクトに反映されるようにした課題である。「主題化された課題」とは,課題内容に富んだ,パフォーマンス要因の影響を受けやすい課題を指している。当該年度の研究は,Kahnemanらによる2つのシステム(System 1・System 2)を想定する二重過程理論(Kahneman & Frederick,2002)の問題点を克服し,ベイズ型推論課題に見出される基準率無視を含む様々な誤判断と正判断の出現メカニズム(多様性(a))と,「形式的な課題」と「主題化された課題」にみられる判断タイプの出現メカニズム(多様性(b))とを,確率量化操作の発達という観点から包括的に説明できるようになったという点で,意義および重要性をもっているのではないかと考えられる。コンピテンス要因(確率推論課題の解決に不可欠な課題解決者の知的操作(確率量化操作))とパフォーマンス要因(知的操作の働きに影響を及ぼすと考えられる課題解決者の既有知識や課題の親近性,課題内容など)を区別する立場から,ベイズの定理を用いて推論するベイズ型推論課題(P(H|D)を問う確率推論課題)における推論様式を認知発達的に分析する研究を行った。具体的には,以下の内容を明らかにした。基準率無視を含む様々な誤判断と正判断の出現メカニズム,および,形式的な課題と主題化された課題に出現する推論様式の関係は,課題解決者の確率量化操作の獲得水準という観点で説明できる可能性があること,課題の表記法は,課題の成績に影響を及ぼすパフォーマンス要因の一つであると考えられたが,異なる表記法を用いて出題したベイズ型推論課題の結果から,ベイズ型推論課題の難しさの要因は,パフォーマンス要因にあるというよりも,コンピテンス要因の問題にあると考えられること,問われているP(H|D)の解釈がP(D|H)まで浮動するかどうか(基準率無視の出現)は,事象Hと事象Dの関連性(課題内容)に依存すると考えられること,子どもであってもベイズ型推論課題が解けるという先行研究の主張には,確率量化操作の水準という観点に立つと疑問の余地があること,などが明らかになった。これまでの確率推論研究は,大人を対象に行ったものが多く,子どもを対象とした研究は少なかったように思われるが,認知発達的観点から確率推論課題における推論様式を分析した当該年度の研究は,課題に出現する最も初歩的な誤判断から最も高次の正判断に至るまでの多様な推論様式を,確率量化操作の水準という単一の基準で説明できる可能性を示した点で,意義および重要性をもっているのではないかと考えられる。
タンゲンテンフリューゲルの総合研究

上野学園所蔵のタンゲンテンフリューゲル(以下TFと記す)の抜本的な修復を目指し、ヨーロッパ各地にて10台のTFを実地調査した結果、ほぼ制作当初の形に復元することができた。鍵盤の破損の原因であった鉛を除去し、すべての鉛を除去してしまうと鍵盤の端が上がってしまうという状況が確認できたため、暫定的に小さな錘をつけた。すでに楽器から外されてしまっていた3つの変音機構のうち、2つ(モデレーター及びハープ・ストップ)を復元製作してTFに装着した。その結果、より繊細で美しい音色の可能な楽器に生まれ変わった。演奏表現における可能性を追求するためにさらなる調査を続けていく。稀少楽器タンゲンテンフリューゲル(以下TFと略)のオリジナル状態追究を目的に、平成27年2月4月にヨーロッパに現存するこの楽器の調査旅行を実施した。直接に見て、詳細な調査ができたSpath & Schmahl製作のTFは10台。加えて各博物館所蔵の同時代の鍵盤楽器約50台も見学した(以上の調査旅行の科研関係者を対象とする報告会は平成27年5月29日に実施)。その結果、次の諸点が明白となった。1)本学所蔵のTF鍵盤表面奥に装着されている鉛は、調査した10台のうち9台には装着された形跡すら見られなかった(1台は鍵盤奥を見ること不可)。2)詳細な調査を行ったすべてのTFには、ダンパー、モデレーター等のストップ機能が装着されていた。本学所蔵の楽器に残されていた穴の存在理由がこれにて解明された。3)調査協力を得た学芸員、楽器研究家、同修復家の証言により、TFは18世紀後半19世紀初頭のドイツのレーゲンスブルクを中心とする限定された地域で製作された新しい鍵盤楽器の試作品であったにも関わらず、「時代の楽器」としてウィーンやイタリアで広く流布した流行の楽器であったことが判明した。4)Giovanni Paolo di Stefano氏がTF研究により博士号を取得後、研究を継続しているので、同氏より最新情報を得られよう。5)Myklos Spanyi、Linda Nicholson, Christine Schornsheim等の鍵盤楽器奏者が最近TFに注目し、演奏会や録音などの機会を増やしている。以上の諸点から、調査旅行で得た情報やデータ詳細を参考にしつつ、本学の楽器の修復を目指す、という結論に至った。日本に唯一現存するこの楽器のオリジナルの音を再現することは責務だが、大変繊細な状態であるため、楽器の状態をみながら修復方法を検討すべきである。1)楽器修復方針の決定:平成27年2月4月にかけて実施されたヨーロッパに現存するタンゲンテンフリューゲル〔以下TFとする〕調査旅行の結果については、昨年5月末提出の「研究実績の概要」にて報告した通りである。この調査結果を分析・精査し、平成27年度末までに今後実施される楽器修復について次の方針を決定した。1響板は基本現状維持/2弦はすべて交換/3ハープストップとモデレーターを復元して装着(調査対象のシュパート&シュマール製楽器を参照)/4タンジェントの交換および皮の装着/5鍵盤の修理(鉛の除去)以上の修復作業は本年(平成28年)7月12月にかけて実施予定である。この修復が実施され、楽器がオリジナルに近いかたちで恒常的に演奏可能になれば、日本に一台しか現存しないTFの存在意義は格段に深まる。2)研究成果の報告の演奏会について:上記の修復後、平成29年3月に修復披露を兼ねたコンサートを本学講堂にて開催予定である。本公演は、同時期に上野にて開催の第20回国際音楽学会東京大会(International Musicological Society 20th Quinquennial Congress in Tokyo)のプロジェクトとしても参画することが同学会国際大会実行委員会の承認を受け、決定した。その際には船山研究代表が楽器に関する講演を行い、研究員の渡邉順生が修復後の楽器演奏を行う。その際の演奏曲目については、修復後の楽器の状態・音色等を考慮した上で、また現在進めているTFと同時代の作曲家との関連性の研究の結果も踏まえ、決定する予定である。楽器の修復についての方針はようやく決定したものの、楽器と作曲家、レパートリーとの関わりについては、TF自体の文献資料が少なく苦慮している。1)昨年5月末提出の「研究実績の概要」で報告した楽器修復方針に則りタンゲンテンフリューゲル(以下TFとする)を修復し、製作当初のオリジナルな形にほぼ復元することができた。但し、弦とタンジェントの交換については行わず、基本的に現状のものを使用した。鍵盤の劣化の原因となっていた、はめ込まれた鉛を除去したが、鉛を全て除去すると、鍵盤の端が上がってしまう、という状況が発生した。それは元来、小さな錘が付けられていた証左であるが、どこにどの程度の錘が付けられていたのかが不明のため、暫定的に小さな錘を付けた。1ヶ月余りのヨーロッパ各地の調査に基づき、本学のTFを改めて調査したところ、ネームボードの両端に、それぞれストップが装着されていたと思われる、2つの四角い穴が見つかった。また、本体の裏面には第3の膝レバーが装着されていたと思われる痕跡も確認された。これらの痕跡は、この楽器には初めから5種類もしくは6種類のストップが装着されていたことを示唆しているが、今回の修復に当たり、ハープストップとモデレーターの2つのストップを復元して製作し、装着した。

その結果、4つの変音機構を備えることになり、微妙な音色・音強の変化を実現し得る楽器に変身した。2)研究成果の報告を兼ねた演奏会を、国際音楽学会東京大会2017への協力プロジェクトとして平成29年3月21日に実施した。前半では船山研究代表が、本学園所蔵のTFの歴史と現在について、後半では「18世紀ドイツの鍵盤楽器における新たな視点」と題して、渡邊研究分担者がレクチャーと演奏を行った。復元された新たなモデレーターおよびハープストップが適宜使われることにより、修復前には予想できなかった、多様な音色を駆使した、「18世紀の響き」を披露した。3)研究分担者上尾教授は、TFと関わりあるクラヴィコードの歴史に関する詳細な研究を行い、論文にまとめている。上野学園所蔵のタンゲンテンフリューゲル(以下TFと記す)の抜本的な修復を目指し、ヨーロッパ各地にて10台のTFを実地調査した結果、ほぼ制作当初の形に復元することができた。鍵盤の破損の原因であった鉛を除去し、すべての鉛を除去してしまうと鍵盤の端が上がってしまうという状況が確認できたため、暫定的に小さな錘をつけた。すでに楽器から外されてしまっていた3つの変音機構のうち、2つ(モデレーター及びハープ・ストップ)を復元製作してTFに装着した。その結果、より繊細で美しい音色の可能な楽器に生まれ変わった。演奏表現における可能性を追求するためにさらなる調査を続けていく。当初、申請時は調査旅行は平成26年8月に実施する予定であったが、西ヨーロッパの博物館の開館状況などを鑑み、平成27年2月末4月上旬へと移行した。結果、調査旅行の成果を見据えた修復方針の検討、調査報告のとりまとめは、今後の課題となっている。タンゲンテンフリューゲルが多く制作されていたレーゲンスブルク一帯の文化的背景、また近年TFについての研究を進めているLatcham氏やStefano氏の研究等を参考に、現在考察を進めている。とかくTFと結びつけて演奏される機会の多いエマーヌエル・バッハの作品については、地域的・時代的にみても「関連性は薄い」とみなす渡邉研究員の見解から、また修復後の楽器の状態・音色等も考慮の上で、演奏曲目を決定する予定である。西洋音楽史調査旅行の報告会実施の後、報告書を作成する。また旅行の調査内容を踏まえた上で修復方法を吟味し、楽器の修復にとりかかる。その状態をみながら、最終的な公開演奏会の実現の可否を決定する。前年度末からの調査旅行の精算を当該年度に行ったため、旅費費用の出費が今年度になった。また調査旅行が申請時当初の計画より長期にわたったため、旅費の費用が予定よりも嵩む結果となっている。一方、最終的には楽器修復費用を優先するため、当該年度は物品などの出費は極力控えた。調査旅行の実施が、平成26年78月より、平成27年2月末から4月上旬へと時期が移行したため、初年次旅費として確保していた予算140万円について、平成26年度内の使用は一部渡航費のみに限られた。今後出費が見込まれる演奏会開催費および楽器修復費用については、予算で確保している「その他」の費用の他、物品費、間接経費より算出する予定である。調査旅行は4月上旬に終了したので、報告を受け、平成27年度の使用分として繰越して計上予定である。
歯髄再生過程における象牙質形成とＷｎｔシグナルの役割解明に関する研究

本研究では、歯の再植・移植後には殆どの象牙芽細胞がアポトーシスにより死滅し、歯髄広範にわたる細胞増殖の後に歯髄幹細胞が象牙芽細胞に分化し、歯髄幹細胞が死滅すると歯髄内に骨組織が惹起されるが示唆された。また、歯の損傷後の歯髄には非歯髄固有細胞が歯髄内に侵入すること、歯髄幹細胞が存在すると思われる歯髄中央部血管周囲に古典的Wntシグナルが一過性に発現が上がることから、歯髄幹細胞ニッチの維持へのWntシグナルの関与が見られた。以上より、歯の再植・移植後の歯髄では、ダイナミックなドナー・ホスト間または歯髄・歯周組織間相互作用が起こり、歯髄構成細胞が大きく変化することが示唆された。歯の損傷後のBrdUラベル細胞と細胞増殖活性・アポトーシスとの関連を調べるために、胎生期ラベリング法によりラベルした2週齢マウス第一臼歯を抜去後、歯を再植する実験とラベルマウス・非ラベルマウス間での他家移植を行った。経時的(1日8週)に動物を固定し、通法通りパラフィン切片を作製し、Ki67免疫染色、TUNEL染色を行った。さらに、BrdU・Ki67二重染色、BrdU・TUNEL二重染色を施し、歯髄幹細胞/前駆細胞の増殖能・アポトーシスを検証した。歯の他家移植後には歯髄腔が象牙質または骨組織で閉塞されるのに対し、歯の再植後には長期間歯髄腔が維持される(Cell Tissue Res 325: 219-229, 2006)ことから、他家移植と再植では、ホスト・ドナー相互作用に起因する幹細胞ニッチ維持機構が異なることが予想された。歯の損傷後のBrdUラベル細胞と細胞増殖活性・アポトーシスとの関連を調べるために、胎生期ラベリング法によりラベルした2週齢マウス第一臼歯を抜去後、ラベルマウス・非ラベルマウス間、GFPマウス・野生型マウス間での他家移植を行った。(1)歯の移植後3日で歯髄広範なアポトーシスが惹起されたが、7日後以降にアポトーシス細胞数は減少した。一方、術後7日に歯髄広範にアポトーシスが持続する標本が観察された。(2)歯の移植後57日で歯髄広範な細胞増殖が観察されたが、術後14日には細胞増殖が減少した。一方、術後14日に歯髄内で細胞増殖が亢進している標本が観察された。(3)歯の移植後に歯髄内にオステオポンチン陽性細胞およびペリオスチン陽性細胞が出現した。(4)GFPマウスと野生型マウス間での他家移植を行った結果、移植歯の歯髄にはホスト由来間葉細胞と血管内皮細胞の侵入が見られた。以上より、歯の移植後にホスト・ドナー相互作用により歯髄の治癒パターンが規定されることが明らかとなった。歯の他家移植後には歯髄腔が象牙質または骨組織で閉塞される(Histochem Cell Biol 136: 649-661, 2011)のに対し、歯の再植後には長期間歯髄腔が維持される(Cell Tissue Res 325: 219-229, 2006)ことから、他家移植と再植では、ホスト・ドナー相互作用に起因する幹細胞ニッチ維持機構が異なることが予想される。本年度は、1胎生期ラベリング法で歯髄幹細胞/前駆細胞をラベルしたマウスと非ラベルマウスを用いて、マウス臼歯の再植・他家移植後の歯髄治癒過程におけるBrdUラベル細胞と歯髄内細胞増殖活性・アポトーシスとの関係の検索と2Wntシグナルの活性化を可視化できるTOP/GALマウスを用いて歯の再植後の歯髄治癒過程におけるWntシグナルの関与を検索した。結果をまとめると、1歯の再植・移植後には殆どの象牙芽細胞がアポトーシスにより死滅し、歯髄幹細胞が象牙芽細胞に分化すると考えられた。2歯の再植・移植後に歯髄幹細胞が死滅すると歯髄内に骨組織が惹起されるが示唆された。3歯の再植後には歯髄広範にわたる細胞増殖の後に象牙芽細胞分化が起こることが明らかになった。4歯の移植後の歯髄には非歯髄固有細胞が歯髄内に侵入することが明らかになった。5歯の移植後の歯髄には、歯根膜マーカーであるペリオスチン陽性細胞が歯髄内に出現することが明らかになった。

以上より、歯の再植・移植後の歯髄では、ダイナミックなドナー・ホスト間または歯髄・歯周組織間相互作用が起こり、歯髄構成細胞が大きく変化し、その結果、歯髄分化能にも影響を当たることが示唆された。βカテニンを介する古典的なWntシグナルの活性化を可視化できるWntシグナルレポーター(TOP/GAL)マウスを用いて、同様な実験を実施した結果、再植後に歯髄幹細胞/前駆細胞が存在すると思われる歯髄中央部血管周囲にX-Gal染色陽性を示し、歯髄治癒過程で一過性に発現が上がることから、歯髄幹細胞ニッチの維持へのWntシグナルの関与が見られた。歯内療法学βカテニンを介する古典的なWntシグナルの活性化を可視化できるWntシグナルレポーター(TOP/GAL)マウスを用いて、歯の再植・他家移植後の歯髄治癒過程におけるWntシグナルの関与と幹細胞ニッチ維持との関連を明らかにする。本実験はTOP/GALマウスを所有する新潟大学で実施し、組織学的解析については代表者の研究室で実施する。TOP/GALマウスの使用については、研究協力者の大島勇人教授から確約を得ている。細胞分化検索について、象牙芽細胞の分化マーカーとしてネスチン、骨芽細胞の分化マーカーおよび基質接着因子としてオステオポンチンタンパク質・遺伝子発現と細胞増殖活性を検索する。申請者らは、胎生期ラべリング法においてDNA合成期に核内に取り込まれるBrdUを妊娠マウス腹腔内に毎日1回(150mg/kg)3日間(胎生1517日)投与した後、2週間以上置くと歯髄幹細胞が強くラベルされることを確立しこの手法を用い平成24年度はラベルマウス・非ラベルマウス間での再植および他家移植をし、BrdU・Ki67二重染色、BrdU・TUNEL二重染色を施し、歯髄幹細胞/前駆細胞の増殖能・アポトーシスを検証した。実験手技において申請者のグループですでに確立されており、実験の遂行に制約はない。Wntシグナルレポーター(TOP/GAL)マウスにおいて胎生期ラベリング法(Cell Tissue Res 348: 95-107, 2012)を実施し、非対称分裂をする幹細胞/前駆細胞をラベルし、深麻酔下で歯の再植・移植実験を行い、1日8週間後にアルデヒド系固定液で灌流固定し、EDTA脱灰後、パラフィン切片を作製し、抗BrdU、抗Ki67抗体を用いた免疫染色、TUNEL染色を施すので、妊娠マウス、各種抗体、染色キットを購入する。マイクロアレイ解析については、RNA抽出後の解析は外注する予定である。平成25年度は2週齢マウス第一臼歯を抜去後、ラベルマウス・非ラベルマウス間での他家移植を引き続き実施し、BrdU・Ki67二重染色、BrdU・TUNEL二重染色を施し、歯髄幹細胞/前駆細胞の増殖能・アポトーシスを検証する。さらに、歯の再植実験も行い、経時的(1日8週)に動物を固定し、通法通りパラフィン切片を作製し、Ki67免疫染色、TUNEL染色を行う。さらに、BrdU・Ki67二重染色、BrdU・TUNEL二重染色を施す。また、歯の再植・移植後の歯髄を取り出し、マイクロアレイにより象牙質形成と骨組織形成に働く環境因子を検索する予定である。歯の損傷後のBrdUラベル細胞と細胞増殖活性・アポトーシスとの関連を調べるために、胎生期ラベリング法によりラベルした2週齢マウス第一臼歯を抜去後、ラベルマウス・非ラベルマウス間、GFPマウス・野生型マウス間での他家移植を行った。経時的(1日8週)に動物を固定し、通法通りパラフィン切片を作製し、Ki67免疫染色、TUNEL染色を行った。実際の予算計画時より代替え品等の使用により、実質支出が少なかったためである。Wntシグナルレポーター(TOP/GAL)
サイトカイン、転写因子測定による新生児仮死と脳室内出血の免疫学的病態解析

新生児仮死のあった正期産児5例、および早産児3例、新生児仮死の無かった正期産児5例および早産児4例の出生時、日齢1、2、3における17種類の末梢血サイトカイン濃度の測定を行った。正期産児、早産児、いずれにおいても、炎症性サイトカインは生後早期には高値を示し、経時的に低下した。インドメタシン投与による脳室内出血予防をうけた超低出生体重児15例と、インドメタシン投与を行わなかった超低出生体重児11例の、末梢血サイトカイン濃度の測定を、出生時、日齢1、2、3、7、14に行った。炎症性サイトカインは対象群で生後低下傾向を示したのに対し、比較対照群では増加ないしは横ばいで経過し、両群間で有意差を認めた。炎症性サイトカイン上昇と脳室内出血発症が示唆され、これら炎症性サイトカイン産生を抑制することが、インドメタシン投与による脳室内出血予防の機序であると考えられた。本研究のために自治医大倫理委員会の承認を得て、研究を開始した。患児のご家族から同意書を得て、検体採取を始めた。脳室内出血予防のためのインドメタシン投与を行った超低出生体重児4例、新生児仮死のなかった早産児3例から、のべ42検体を採取できた。測定は予定通り、Bio rad社のBio-plex 200 systemを用いて測定した。Quality Controlがその範囲内に入り、問題なく測定できた。測定の結果、脳室内出血予防のためのインドメタシン投与を行った超低出生体重において、生後早期にIL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1βがいずれの症例でも高値を示し、IL-6、IL-8については、経時的に低下するが、生後7日14日に再上昇するという、興味深い結果が得られた。いずれの症例も、臨床的には脳室内出血は発症していない。比較対照症例の検体採取は、獨協医大NICUに依頼しており、獨協医大での倫理委員会の承認を得た。今後、比較対照症例の検体が得られ次第、当院にてサイトカインおよび転写因子の測定を行い、当院での測定結果と比較し、脳室内出血の病態解析を進めていく。新生児仮死症例については、いまだ適切な症例がなく、今後、検体採取をすすめていく予定である。研究は概ね順調に進んでおり、2年間の研究で良い成果が得られると期待される。これまでに、自治医大NICUに入院した15例の超低出生体重児と独協医大NICUに入院した11例の超低出生体重児のサイトカイン測定を行った。子宮内感染の有無による、サイトカイン濃度の検討において、子宮内感染を伴った症例では、出生時よりIL-6、IL-8、TNFα、INFγ、G-CSF、MCP-1が高値を示し、生後低下することが確認された。一方で、子宮内感染を伴わず出生した超低出生体重児においては、同様のサイトカインが生後に上昇し、子宮内感染症例よりも高値を取ることが確認された。子宮内感染のあった症例では、慢性肺疾患などとの関連が報告されているが、子宮内感染を伴わない超低出生体重児においても、長期合併症と慢性炎症との関連が示唆された。この内容は、第115回日本小児科学会学術集会で報告した。また、脳室内出血予防のためのインドメタシン投与を行っている自治医大症例(INDあり群)と、インドメタシン投与を行っていない独協医大症例(INDなし群)のサイトカイン濃度の比較では、IL-6,IL-8,MCP-1は両群で差がなかったが、TNFα、IL-1β、IFNγ、IL-10など炎症に関わる他のサイトカインは、INDあり群で生後低下傾向を示したのに対し、INDなし群では低下せず、両群間で有意差を認め、インドメタシンによる脳室内出血予防の機序の一つであることが推測された。この内容は、本年7月の第48回周産期新生児学会学術集会で報告予定である。転写因子については、まだ測定できておらず、今後、測定する予定である。また、仮死の症例数が少なく、症例が集まり次第、サイトカイン、転写因子を測定し、その病態解析を進める予定である。
ストロンチウム89療法におけるT細胞B細胞の放射性組織障害に関する検討

放射性ストロンチウム治療は認可見通しとなっていたが、予期せぬ事態から現在も治験延長中である為に、放射性ストロンチウム治療を対象に検討できない。そこで、比較対照として同様な骨転移除痛目的で行われる放射線照射治療について、放射線組織障害を予備的に検討することを考えた。骨転移除痛目的で行われる放射線治療に比して、骨への照射範囲が広く・照射量が多いと考えられる食道癌患者の放射線治療を対象に、リンパ球の組織障害を検討した。対象は、正常者8名及び放射線治療の食道癌患者(12名)である。方法、治療前及び治療後一週間以内に患者より採血してした血液を、遠心・分離しリンパ球を得た。リンパ球を培養液上で分裂刺激剤であるPHAを投与し、培養44時間後には分裂阻止剤であるCytochalasin Bを投与した。全培養は72時間にて終了した。リンパ球をAcridine orangeで染色し、蛍光顕微鏡にて観察し検討した。二核細胞500個当たりの小核細胞の出現数として算出した。また、0-2Gyまで段階的に正常リンパ球に照射をin vitroで行いそれぞれの小核細胞の出現率を評価した。結果は、正常者では照射量と小核細胞の出現数には正の相関が見られた。リンパ球の二核細胞500個当たりの小核細胞数は、放射線治療前は8.8±1.8で治療後は52±10.7で、有意の増加を示したが頻度は軽度であった。我々が確立した小核試験により、放射線のリンパ球に対する組織障害を評価可能であることが明らかとなった。食道癌における放射線治療では、リンパ球の放射線組織障害が小核試験によって軽度検出された。以上の結果より、骨転移の放射線治療の短期的な副作用であるリンパ球に対する放射線障害の程度は、最低限度と推測された。小核試験としては、Fenech&Morleyの方法がある。我々はリンパ球における小核試験を確立するために、上記方法を基本としてin vitroでの基礎的実験を施行して、我々の小核試験法を確立することを試みた。材料及び方法は、主に上記の方法に準じて行った。正常者(10名)から採血してした血液をリンパ球分離溶液であるLymp Sep 7mlあたり7mlの血液となるように調整し1700回転30分遠心・分離しリンパ球を得た。分離したリンパ球を3回洗浄し、培養液上で調整した。培養液あたり最終的に5μg/mlとなるように分裂刺激剤であるPHAを投与した。培養44時間後には分裂阻止剤であるCytochalasinBを投与した。終了後遠心分離したリンパ球を、林らが考案した方法であるAcridine orangeで染色し、蛍光顕微鏡にて観察し検討した。観察は二核細胞500個当たりの小核細胞の出現数として算出した。結果、正常者ではすべて小核細胞の出現数は12未満であった。従来の報告と同様と考えられ、我々の方法で実際に小核試験が可能であることが確かめられた。次に上記の方法で、in vitro照射における正常リンパ球の小核細胞の出現率について検討した。0-2Gyまで段階的にリンパ球に照射をin vitroで行いそれぞれの小核細胞の出現率を評価した。照射量と小核細胞の出現数には正の相関が見られ、我々が確立した小核試験にて放射線のリンパ球に対する組織障害を評価可能であることが明らかとなった。今回の基礎的検討から我々の小核試験法を確立するこができた。

放射性ストロンチウム治療は認可見通しとなっていたが、予期せぬ事態から現在治験延長中である為に、放射性ストロンチウム治療を対象に検討できない状態となっている。そこで、比較対照として骨転移除痛目的で行われる放射線照射治療について、放射線組織障害を予備的に検討する。そこで、骨への照射範囲が広く・照射量が多いと考えられる放射線治療の内、食道癌患者対象に検索する。我々の基礎的検討から確立するこができた小核試験法を用いて、リンパ球の放射線組織障害について評価する。対象は、放射線治療の食道癌患者(6名)である。治療前及び治療後一週間以内に患者より採血してした血液を、リンパ球分離溶液であるLymp Sep 7mlあたり7mlの血液となるように調整し、1700回転30分遠心・分離しリンパ球を得た。分離したリンパ球を3回洗浄し、培養液上で調整した。培養液あたり最終的に5ug/mlとなるように分裂刺激剤であるPHAを投与した。培養44時間後には分裂阻止剤であるCytochalasin Bを投与した。全培養は72時間にて終了した。終了後遠心分離したリンパ球を、林らが考案した方法であるAcridine orangeで染色し、蛍光顕微鏡にて観察し検討した。観察は二核細胞500個当たりの小核細胞の出現数として算出する。結果は、リンパ球の二核細胞500個当たりの小核細胞数は、放射線治療前は8.8±2.3で治療後は52.2±11.9で、有意の増加を示した。食道癌における放射線治療では、in vivoにおいてリンパ球の放射線組織障害が小核試験によって検出された。しかし、放射線治療の短期的な副作用であるリンパ球に対する放射線障害の程度は、比較的軽度と考えられた。対象は、放射線治療の食道癌患者(6名)である.治療前及び治療後一週間以内に患者より採血してした血液を、リンパ球分離溶液であるLymp Sep 7mlあたり7mlの血液となるように調整し、1700回転30分遠心・分離しリンパ球を得た.分離したリンパ球を3回洗浄し、培養液上で調整した。結果は、前年分と合わせてリンパ球の二核細胞500個当たりの小核細胞数は、放射線治療前は8.8±1.8で治療後は52±10.7で、有意の増加を示した。