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APOBEC3ファミリーの抗ウイルス作用スペクトルを規定する分子基盤の解明

細胞内酵素APOBEC3ファミリー(ヒトでは7種)はHIVなどのレトロウイルスに対して強力な増殖抑制効果を示す。しかし、HIVの場合には、ウイルスがもつVifタンパク質によってこれらの酵素が破壊される。APOBEC3の抗ウイルス作用機序やVifがAPOBEC3に結合するしくみを理解する上で、APOBEC3タンパク質の分子構造を明らかにする必要がある。本研究では、その分子構造(うち2種)を決定し、さらに上述の分子機序を明らかにした。特に、APOBEC3Hの分子構造決定と二本鎖RNAが介在する新機能の発見は予想外の展開となり、今後、癌あるいは遺伝子変異の研究分野においても重要な知見につながる。レトロウイルスに対する増殖抑制因子APOBEC3ファミリーは、ヒトではAとB、C、D、F、G、Hの7種があり、それぞれが異なった抗ウイルス作用スペクトルを示すことが知られている。しかし、これらの特異性を規定する要因およびその分子機序は未だ明らかになっていない。そこで、本研究課題ではウイルス学的なアプローチだけでなく、生化学的および構造生物学的に横断的な解析手法により、APOBEC3ファミリーによる抗レトロウイルス分子機序の全容を明らかにする目的で研究を進めている。まず、X線結晶構造解析法により未決定のAPOBEC3タンパク質の分子構造を決定した。次に、決定した構造情報と生化学的データを基に機能領域を決定した。さらに、機能領域について変異型タンパク質を作製し、試験管内反応系(逆転写反応再構築系など)を活用して機能領域への影響を比較解析した。当該年度はAPOBEC3HおよびAPOBEC3Fタンパク質の分子構造決定に着手し、分子構造上へ機能領域をマッピングする解析を行った。その結果、1)X線結晶構造解析法によりAPOBEC3FのC末側ドメイン(CTD)の分子構造を決定した。2)HIV-1 Vif結合領域および基質結合領域を同定した(Journal of Virology 90:1034-, 2016)。さらに、3)他のメンバーと相同性が低いAPOBEC3Hタンパク質の立体構造決定に向けて単量体APOBEC3Hタンパク質の精製方法を確立した。APOBEC3Hタンパク質は多量体あるいは凝集体を形成しやすいため、国内外において多くの研究グループが精製に成功していない。また、4)網羅的な点変異解析法により、Vif結合に重要なAPOBEC3H上の機能領域は他のファミリーとは異なり、alpha3-4の疎水性残基で構成されることを見いだした。まず、APOBEC3F CTDタンパク質のX線結晶構造の決定(PDB ID3WUSとして登録)し、Vif結合に重要な機能領域の同定に関する学術論文として輩出できた。APOBEC3Hタンパク質に関しては、動的多量体ではなく単量体として精製する手法を見出したことは、今後、タンパク質の結晶化に進む大きな進展であると確信している。さらに、Vif結合に重要な機能領域を同定し、他のファミリーとは異なる領域であるということを見出した(論文作成中)。これは、ファミリー間の異なる抗ウイルス作用トロピズムを理解する上で貴重な情報につながると考えられる。本研究に関する成果発表について、平成28年度(5月)に米国で開催されるCold Spring Harbor Laboratory -Annual Retrovirus- Meetingにおいて口頭発表に採択され、レトロウイルス分野において注目される研究成果であると評価される。さらに、一連の研究成果について、第63回日本ウイルス学会、第56回日本熱帯医学会、第29回エイズ学会などにおいても招待講演を行い情報発信を行うとともに、討論する機会をもてた。これらことからも、当各年度の本研究課題は、総じて研究計画以上に進展していると考えられる。ヒト細胞内シチジン脱アミノ化酵素APOBEC3(以下、A3)は、レトロウイルスの増殖を強力に抑制する作用を有する。ヒトでは、AとB、C、D、F、G、Hの7種がコードされており、異なった抗ウイルス作用スペクトルを示すことが知られている。本課題では、構造生物学を駆使し、抗ウイルス作用スペクトルの違いを規定する分子機序を解明することを目的に研究を進めている。レトロウイルスであるHIVは、Vifタンパク質を感染細胞内で発現しA3を分解することによって抗ウイルス作用スペクトルを制御する。これまで、A3ファミリーのVif結合領域は3タイプ(A3C、A3G、およびA3Hタイプ)が存在し、A3CとA3Gタイプの構造学的な特徴は明らかにされてきた。しかし、A3Hに関する情報は乏しく、その責任アミノ酸すら明らかになっていなかった。その大きな要因は、ヒトA3HがVifに感受性が低い(低結合性)ことであった。そこで、霊長類由来のA3HのVif感受性を探索することにり、チンパンジーA3H(cpzA3H)がVifに対する感受性が高いことを明らかにし、97番目の残基の違いが決定要因であることを明らかにした。さらに、網羅的なStructure-guided mutagenesisにより、Vifの結合領域(9残基からなる)同定した。A3HのVif結合領域は、A3CやA3GのVif結合領域と隣接しているが異なる部位に位置していた。しかし、A3HのVif結合領域は負電荷で囲われた疎水性の浅いくぼみを形成し、他の2タイプのVif結合領域と類似した構造学的特徴を有していた(JMB 429: 1262-, 2017)。また、A3Hタンパク質の立体構造決定に向けて、独自に開発した精製方法により可溶性A3Hの精製に成功し、微結晶ではあるが、結晶化条件を絞り出す突破口を開いた。

これまで不明であったA3HのVif結合領域を同定し、その結合インターフェイスの構造学的な特徴を明らかにした。これらの成果を学術論文として輩出しただけでなく、当該年度開催された国内外の学会で口頭発表した。一方、技術的に難しいと考えられているA3Hタンパク質の実構造決定に向け、微結晶を得られる段階に到達したことは評価できると考えられる。さらに、本研究課題に付随した学術論文、総説および学会報告もなされた。これらのことからも、当各年度の本研究課題は、総じて研究計画以上に進展したと考えられる。哺乳類細胞のみがもつシチジン脱アミノ化酵素APOBEC3(以下、A3)は、レトロウイルスの増殖を強力に抑制する作用をもつ。ヒトを含む霊長類では、AとB、C、D、F、G、Hの7種がコードされており、異なった抗ウイルス作用スペクトルを示すことが知られている。本課題では、国内外の研究グループと競合的に研究を推し進め、残すは、これまで全く明らかになっていなかった高難溶性であるA3Hの構造学的な解明のところまでに至っていた。H29年度は前年度までの実績を生かし、霊長類A3Hの分子構造決定に成功し、これまでの不明であった生物学的な現象を分子・構造学的レベルで解釈するための基盤情報を得ることができた。まず、霊長類のA3Hの中で可溶化がヒトA3Hよりも容易であったチンパンジーA3H (cpzA3H)に着目した。X線結晶構造解析により、cpzA3Hの二量体構造を高分解能で決定することに成功した(PDB 5Z98として登録した)。この構造は既報のAPOBEC3ファミリータンパク質とは異なり、GC塩基に富む二本鎖RNA (dsRNA)を介した二量体であった。dsRNA結合領域は非常にユニークな特徴を有していた。さらに、dsRNAと相互作用する領域の変異型A3Hはユビキチン・プロテアソーム系を介して分解され、細胞内量が低く不安定であることも明らかになった。A3Hの細胞内安定性はdsRNAを介した二量体化によって制御されていること、さらに、dsRNAへの強固な結合が脱アミノ化酵素活性非依存的な抗ウイルス作用機序の主たる分子機序であることも明らかになった。以上の研究成果は、未知であったA3Hの立体構造の決定に加え、核酸との相互作用ならびに細胞内の挙動、抗ウイルス作用機序に関する重要な情報になると考えられる。細胞内酵素APOBEC3ファミリー(ヒトでは7種)はHIVなどのレトロウイルスに対して強力な増殖抑制効果を示す。しかし、HIVの場合には、ウイルスがもつVifタンパク質によってこれらの酵素が破壊される。APOBEC3の抗ウイルス作用機序やVifがAPOBEC3に結合するしくみを理解する上で、APOBEC3タンパク質の分子構造を明らかにする必要がある。本研究では、その分子構造(うち2種)を決定し、さらに上述の分子機序を明らかにした。
動きベクトル解析によるヒトiPS細胞由来心筋細胞の部位特異的性質の非侵襲的識別

本応募研究計画では、新薬開発で問題となっている抗がん剤の心筋収縮抑制を評価することを将来目標としている。研究目的は、ヒトiPS細胞を利用して、心房筋と心室筋を識別できる高精度さと慢性作用の解析を可能とする非侵襲性を兼ね備えた新規の実験系を開発することである。昨年度に、長時間測定のための実験環境を整備し、収縮弛緩の速さおよび力の平均値の10日間の変化を10%以内に抑えることに成功した。それを受けて、今年度は、抗がん剤であるドキソルビシン、スニチニブ、およびエルロチニブの慢性(亜急性)作用を調べた。ドキソルビシンおよびスニチニブについては、3日間投与に比べて8日間投与により、心筋収縮抑制作用が進展することを見出し、国内外の学会にて発表した。学生優秀発表賞の対象となった。また、これまでの報告通り、エルロチニブ投与群では、心筋収縮に関するパラメーターに大きな変化は見られなかった。安定したデータを取得するためには、インキュベーターから細胞を顕微鏡上に置くまでの間の温度低下を避けることが肝要であり、保温器等を使用して対応することで改善した。ドキソルビシンによる心抑制を回復する薬剤として、鉄キレートによるフリーラジカル抑制をもたらすデクスラゾキサンおよび論文報告があるインシュリンを試験したところ、ドキソルビシンの作用発現が遅延することを見いだした。以上の結果より、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いて亜急性毒性を評価する実験系の構築に成功したといえる。今後は、本評価系を用いて、心保護薬の探索などに期待がかかるところであるが、細胞の価格の高騰などHTSとして行うのは困難であるなど課題も残す。さらに、心房心室の識別については、細胞株ごとに結果のばらつきがみられ、ヒトiPS細胞由来心筋細胞としての見解を得るために、マウス心房筋心室筋との結果の比較を行った。本研究課題の基礎となる「長時間測定のための実験環境の整備」については、昨年度に、10日間の安定測定に成功しており、既に達成されている。今年度は、ピペッティング手技の個人差が影響することを見いだしたことから、他の予算で進行中である自動分注機開発の必要性が示唆された。特に、多くの種類の薬理作用を解析する際のピペッティングの労力は甚大であり、何かしらの改善策を要することが明らかとなった。また、毎日、人力で培地交換を行うプロトコルであるため、長期休暇や入試による登校規制などを避けて実験せざるをえず、当初の予定よりも行える実験の回数が少なくなってしまった。その結果、データポイント数が足りないため、保護薬の全体的な効果については、いまだ結論が出ていない。この進捗状況は、ほぼ当初の実験計画であるが、今後、薬理作用解析を主に行っていく過程で、自動文中システムの導入が必須であると言うことも明らかとなった。また、心房心室の識別については、データの蓄積や論文検索による調査が進んだ結果、当初に選択したマーカーがベストではないかという結論に至りつつある。最終年度に向けて、さらに解析を進めていく予定である。昨年度に行った実験の経験を踏まえ、今年度はより効率的にデータを取得することが出来る体制を整えた。これまで、学生2名を配置していたが、学業の関係上、常時1名しか主に実験を行うことができなかった。そこで、3名を配置することにより、常時2名が本実験を行う事が出来るようにする点が大きな変更点である。また、自動分注装置の開発に合わせたスループット性の向上も行う予定である。この点は、機器の開発状況におうところが大きいが、今のところ当初の予定よりも開発が進んでいるので、スムーズに計画の実行を行えると考えられる。心房心筋マーカーを選定する根拠となる基礎データについては、様々な阻害剤を試験しているところである。重金属イオンによるイオンチャネル阻害から標的を絞ったところ、あるイオンチャネル分子が心房心室の機能特性の差に重要であるという予試験結果を得た。そこで、そのイオンチャネルの特異的阻害剤を入手し、今年度に試験することを予定している。この実験により、機能的に識別するマーカーと形態的に識別するマーカーの2種類を見いだすことが出来ると期待出来る。

ドキソルビシンによる心抑制を回復する薬剤として、鉄キレートによるフリーラジカル抑制をもたらすデクスラゾキサンおよび論文報告があるインシュリンを試験したところ、ドキソルビシンの作用発現が遅延することを見いだした。以上の結果より、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いて亜急性毒性を評価する実験系の構築に成功したといえる。今後は、本評価系を用いて、心保護薬の探索などに期待がかかるところであるが、細胞の価格の高騰などHTSとして行うのは困難であるなど課題も残す。さらに、心房心室の識別については、細胞株ごとに結果のばらつきがみられ、ヒトiPS細胞由来心筋細胞としての見解を得るために、マウス心房筋心室筋との結果の比較を行った。本研究課題の基礎となる「長時間測定のための実験環境の整備」については、昨年度に、10日間の安定測定に成功しており、既に達成されている。今年度は、ピペッティング手技の個人差が影響することを見いだしたことから、他の予算で進行中である自動分注機開発の必要性が示唆された。特に、多くの種類の薬理作用を解析する際のピペッティングの労力は甚大であり、何かしらの改善策を要することが明らかとなった。また、毎日、人力で培地交換を行うプロトコルであるため、長期休暇や入試による登校規制などを避けて実験せざるをえず、当初の予定よりも行える実験の回数が少なくなってしまった。その結果、データポイント数が足りないため、保護薬の全体的な効果については、いまだ結論が出ていない。この進捗状況は、ほぼ当初の実験計画であるが、今後、薬理作用解析を主に行っていく過程で、自動文中システムの導入が必須であると言うことも明らかとなった。また、心房心室の識別については、データの蓄積や論文検索による調査が進んだ結果、当初に選択したマーカーがベストではないかという結論に至りつつある。最終年度に向けて、さらに解析を進めていく予定である。本応募研究計画では、新薬開発で問題となっている抗がん剤の心筋収縮抑制を評価することを将来目標としている。研究目的は、ヒトiPS細胞を利用して、心房筋と心室筋を識別できる高精度さと慢性作用の解析を可能とする非侵襲性を兼ね備えた新規の実験系を開発することである。これまで、心毒性評価と言えば、電気現象の解析に一辺倒であった。今回、初めて力学的現象という指標を入れようとしており、国際競争もある中、独自のシステムの発展を試みている。非臨床での心毒性評価において、いまだ力学的現象の評価が含まれていない理由は、実用化が可能なin vitro実験系がないことが問題であると考え、動きベクトル解析法とヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いて、心房・心室筋を識別できる新しいシステムを構築し、慢性的な心不全障害を評価することを発案した。今年度は、長時間測定のための実験環境の整備として、培地交換のプロトコルを定量的に評価した。その結果、1日1回半量置換法にて、収縮弛緩の速さおよび力の平均値の10日間の変化を10%以内に抑えることに成功した。予試験として、抗がん剤であるドキソルビシンの慢性(亜急性)作用を調べたところ、3日間投与に比べて8日間投与により、心筋収縮抑制作用が進展することを見出した。心房心室の識別のためのデータを追加して、収縮弛緩の速さの違いを組み合わせることで予測度が向上することを見出した。次年度以降は、ドキソルビシン以外の抗がん剤や保護剤も用いて、薬理学解析を更に進め、心房・心室の違いが薬理作用に影響するかどうかを調べる。
グラフェンフラグメントへの窒素原子ドーピングによるn型有機半導体の開発

昨年度に合成した一連の含窒素ピレン誘導体に対して理論計算を実施し、フロンティア分子軌道のエネルギー分布をもとに光学的性質、電気化学的性質に関してより深く考察した。また、含窒素ピレン類の化学的性質を解明するために、酸滴定を実施し化合物のプロトン化挙動を吸収スペクトルを用いて調べた。その結果、含窒素ピレン類の塩基性は窒素原子の導入位置、導入数の影響を強く受けることを明らかにした。すなわち、1,4,10位に窒素原子を導入したトリアザピレン誘導体が一連の含窒素ピレン誘導体の中で最も強い塩基性を示すことを明らかにした。また、ヨウ化メチルを用いて含窒素ピレン類の窒素原子をメチル化し、対応する四級アンモニウム塩を合成、単離した。これら四級アンモニウム塩の構造を明らかにするとともに、吸収・蛍光スペクトルを測定し、光学的性質を明らかにした。また、n型有機半導体としてピリジン環を有するイソキナクリドン誘導体に注目し研究を実施した。この化合物は、含窒素ペンタセンの合成中間体であるとともに、有機顔料としての機能も期待できる。2位と10位の両方がそれぞれメチル基とn-ブチル基で置換されている2種類のイソキナクリドン誘導体を合成することに成功した。これらの化合物はどちらも有機溶媒への溶解性が低くかったが、濃硫酸中で核磁気共鳴および紫外可視吸収スペクトルが得られた。硫酸中の紫外可視吸収スペクトルは、吸収極大が約320 nm、285 nmに観測された。これらの吸収帯は、時間依存密度汎関数理論(TDDFT)計算(B3LYP / 6-31G**)によって帰属することができた。前年度から実施している一連の含窒素ピレン誘導体の化学的性質の解明を引き続き行い、その研究成果をまとめて学術論文(J. Org. Chem. 2019)として報告した。また、含窒素ピレン類の窒素原子をアルキル化することによって対応する四級アンモニウム塩を合成、単離することに成功し、その構造および化学的、物理的性質を分光学的手法によって解明した。これらの研究は2018年度に実施する計画をしていたものであり、計画に従って順調に研究が進行していることを示している。一方、直線型含窒素縮合多環化合物の合成においては、ピリジン環を含むイソキナクリドン誘導体の合成とその性質評価を実施し、この研究成果を学会(2019日本化学会春季年会)で発表した。この合成法を応用して、さらに多くの誘導体の構築にも着手している。当初に計画していた、イソキナクリドン誘導体から含窒素ペンタセンへの変換は現在のところ達成できていない。イソキナクリドン誘導体の有機溶媒に対する溶解度が予測したよりも低いことが性質解明およびさらなる分子変換の課題となっている。この問題を解決するために分子設計を実施している。それに加えて、酸素原子および硫黄原子を含む縮合多環化合物の合成と性質の解明を実施した。縮合多環化合物の共役系にキノイド型構造を導入することで、特異な性質が発現することを見出しており、今後の材料設計に対して貴重な知見を得ている。この研究成果を学術論文(Asian J. Chem. 2018)として報告した。これまでの研究成果によって完成させた含窒素ピレン誘導体の合成手法を応用して、より広い共役系をもちかつ多数のピリジン環を含む含窒素縮合多環化合物を合成する。さらに、合成した含窒素縮合多環化合物の光学的性質、電気化学的性質を詳細に解明し、n型半導体材料としての可能性を探る。それに加えて、特異な光学的性質が期待できる縮合多環化合物を設計し合成する。合成した化合物の性質を詳細に解明する。イソキナクリドン誘導体の有機溶媒に対する溶解度の改善を目指して分岐鎖の導入を検討する。分岐鎖の構造を最適化し溶解度の課題を解決した後に、含窒素ペンタセン誘導体への分子変換を検討する。さらに、多数の窒素原子をもつペンタセン誘導体の合成へと研究を展開する。また、2018年度から海外研究者(Ayachi, S.教授)との共同研究を開始し、シクロペンタジチオフェン誘導体の合成と有機発光素子および有機太陽電池への応用を検討する計画をしている。この研究をさらに発展させてシクロペンタジチオフェン骨格を有する有機半導体の開発と応用を進める。縮合多環芳香族炭化水素への戦略的な窒素原子導入はn型有機半導体材料を得る効果的手法である。本年度の研究では、CーH結合の活性化を伴う芳香環どうしのパラジウム触媒カップリング反応を行った後、ワンポットでグリニャール試薬とシアノ基との付加反応および銅触媒を用いた環化反応を行うことによって2,4,10-トリアザピレン誘導体(1)を合成した。銅触媒の当量や添加物などの反応条件を最適化することで生成物の収率向上に成功した。最適化反応条件を応用することで、1,4,10-トリアザピレン誘導体さらに1,3,4,10-テトラアザピレン誘導体の合成にも成功した。トリアザピレン誘導体1の単結晶を作成し、結晶構造を解明した。その結果、結晶中ではトリアザピレン骨格は平面構造をしており、互いに積層したカラム構造をとることが分かった。合成した化合物がもつトリアザおよびテトラアザピレン骨格は合成例がない新規骨格であり、その性質に興味が持たれる。最初に紫外可視吸収・蛍光スペクトルの測定をジクロロメタン中で行った。

その結果、合成したアザピレン類の長波長部の吸収末端は、ピレンと比較すると30ー75 nm長波長シフトしていた。同様の長波長シフトは蛍光スペクトルにおいても観測された。このことは、窒素原子導入によりHOMOーLUMOエネルギー差が小さくなることを示している。また、ジクロロメタン中で電気化学的測定を行った結果、合成したトリアザ、テトラアザレン誘導体はいずれも可逆な還元波を示した。一方、ピレンの還元波は、測定可能な電位範囲では観測されなかった。すなわち、窒素原子導入によってピレン骨格の電子受容性が高くなることが分かった。また、長波長シフトの大きさや第一還元電位は、窒素原子を導入する位置に依存して変化することが分かった。これらの結果は、n型有機半導体材料の設計に重要な知見を与えるものである。炭素ー水素結合を活性化する二種類の反応を組み合わせてトリアザピレン誘導体を合成する効率的かつ汎用性の高い合成法を開発した。この合成法を利用することで、市販試薬から二段階で新規トリアザピレン骨格およびテトラアザピレン骨格を構築することに成功した。開発した合成法を応用して各種アザピレン誘導体を合成することで、本手法の有効性、適用限界を明らかにした。これらの研究成果を複数の学会で発表している。アザピレン骨格を構築する新規反応の探索と合成した化合物の結晶構造、光学特性、電気化学的性質の解明は平成29年度の重要な研究課題であり、それを達成できたことは研究が順調に進行していることを示している。また、平成29年度に取り組む研究課題として、ピリジン環のみから構成される直線型縮合多環芳香族化合物およびその異性体を合成する方法の探索も挙げていた。二つのピリジン環をカルボニル基で架橋した化合物を合成し、臭素基とアミノ基の間の分子内求核置換反応によって重要な合成中間体である縮合多環化合物を合成することに成功した。しかし、目的とする縮合多環芳香族化合物を得るためには、合成中間体のカルボニル基を還元してえられる生成物を酸化して芳香族化することが必要である。現在、効率的にこの反応を進行させる手順を探索している。当初から本研究課題は、平成30年度も継続して取り組むことを計画していた。そのため、この課題に対する取り組みも計画通り順調に進んでいる。昨年度に合成した一連の含窒素ピレン誘導体に対して理論計算を実施し、フロンティア分子軌道のエネルギー分布をもとに光学的性質、電気化学的性質に関してより深く考察した。また、含窒素ピレン類の化学的性質を解明するために、酸滴定を実施し化合物のプロトン化挙動を吸収スペクトルを用いて調べた。その結果、含窒素ピレン類の塩基性は窒素原子の導入位置、導入数の影響を強く受けることを明らかにした。すなわち、1,4,10位に窒素原子を導入したトリアザピレン誘導体が一連の含窒素ピレン誘導体の中で最も強い塩基性を示すことを明らかにした。また、ヨウ化メチルを用いて含窒素ピレン類の窒素原子をメチル化し、対応する四級アンモニウム塩を合成、単離した。これら四級アンモニウム塩の構造を明らかにするとともに、吸収・蛍光スペクトルを測定し、光学的性質を明らかにした。また、n型有機半導体としてピリジン環を有するイソキナクリドン誘導体に注目し研究を実施した。この化合物は、含窒素ペンタセンの合成中間体であるとともに、有機顔料としての機能も期待できる。
キノン選択的化学発光分析法による生体キノンの定量・探索とその臨床化学的応用

生体にはコエンザイムQ10やビタミンKなどのキノン類が存在し、電子伝達系や血液凝固に関わるなど重要な役割を担っている。一方で、ある種のキノンは生体成分との付加体形成による機能阻害や、活性酸素発生作用による酸化ストレスを通じて生体へと様々な悪影響を与えるとされている。本研究では、キノンに特徴的な光化学反応及び酸化還元反応を利用して、生体関連キノンの高感度かつ選択的な化学発光分析法を開発した。さらに、開発した方法を実際に生体試料へと応用し、その臨床化学研究における有用性を評価した。キノンは紫外線照射を受けることにより、活性酸素と化学発光増強剤を同時に発生させる。このため、紫外線照射後のキノンにルミノールを添加することで、キノン濃度に応じた強い発光が生じる。本研究はこの原理に基づいて、生体キノンの高感度かつ選択的な化学発光定量法を開発し、生体試料へと応用することで、キノンの生体影響を明らかにすることを目的とする。平成22年度はp-ナフトキノン誘導体であるビタミンK類を対象にHPLC-化学発光定量法を開発し、ヒト血漿試料へと応用した。すなわち、カラムで分離後のビタミンK類にオンラインで紫外線を照射後、ルミノール誘導体L-012を含む溶液と混合し、生じる発光を検出するという方法である。開発した定量法におけるビタミンK類の検出下限(S/N=3)は0.03-0.10ng/mLと高感度であり、さらに生体成分の影響を受けず極めて選択的に血漿中のビタミンK類を定量可能であった。本法により、健常人及び関節リウマチ患者より得られた血漿試料中ビタミンK濃度を測定し、その値を比較した。その結果、ビタミンK_1濃度に有意な差は観察されなかった一方で、ビタミンK_2濃度は健常人と比較して関節リウマチ患者で有意に低値を示した。さらに、関節リウマチの重症度に伴って血漿中ビタミンK_2濃度が低下していく傾向が見られた。したがって、関節リウマチの発症に血漿中ビタミンK_2濃度が関係することが示唆された。また、発がんリスクファクターであるエストロゲンキノンや多環芳香族炭化水素キノンの定量法を開発するために、測定用標準物質として2-hydroxyestrone及びbenzo[a]pyrene-7,8-dioneの合成を行った。次年度以降はこれらのキノンを対象とする分析法の開発を行っていく予定である。キノンは紫外線照射を受けることにより、活性酸素や化学発光増強剤を発生させるという性質を有する。本研究では、このキノンに特異的な性質を利用する高感度かつ選択的なキノンの新規化学発光分析法の閉発を行っている。平成23年度は測定操作の省力化と迅速化のために、マイクロプレートリーダーによるキノンの分析法の開発を行った。このとき、時間分解蛍光測定用プレートリーダーを用いることで、キノンへのパルス紫外線照射によって引き起こされる化学発光の検出が可能であった。96穴マイクロプレートのウェルにキノン溶液及びルミノール誘導体L-012の炭酸緩衝液溶液を添加した後、プレートリーダーにセットする。その後、各ウェルに対して波長250nmの紫外線をパルス照射し、紫外線照射後500μsから2000μsの間に生じる発光を波長450nmにおいて測定する。この操作を繰り返し、得られた発光量を積算してキノンの定量を行った。キノンとL-012を共に添加したウェルからのみ発光が観察され、その強度はキノン濃度に比例して上昇した。本法においては、9,10-anthraquinoneをはじめとするp-quinoneでは強い発光が得られるのに対し、9,10-phenanthrenequinone等のo-quinoneは発光を示さないという結果となった。本法で高い発光を示した3種のキノン(9,10-anthraquinone, 1,4-naphthoquinone及びmenadione)について検量線を作成した結果、いずれのキノンについても0.05-150μMの濃度範囲で発光強度と濃度との間に相関係数0.999以上の良好な直線関係が得られた。また、本法におけるmenadioneの検出下限(blank+3SD)は0.01μMであった。本法における1試料あたりの測定時間はわずか5秒であり、キノンのハイスループット分析法として有用であることが明らかとなった。キノンは生体内の酸化還元サイクルに組み込まれることで活性酸素(ROS)を産生して生体に酸化的な傷害を与えるとされている。平成24年度はこの酸化還元サイクルを利用するキノン及びその生体成分付加体の化学発光定量法を開発した。本法は、キノンを還元剤DTTにより還元して酸化還元サイクルを誘起させ、これにより発生するROSをルミノールにより検出する方法である。本研究ではキノンの生体成分付加体のモデルとして、メナジオンのN-アセチルシステインへの付加体(MQ-NAC)及びグルタチオンへの付加体(MQ-GS)を合成して標準物質として使用した。

最初に、メナジオン、MQ-NAC及びMQ-GSについて、ルミノール及びDTT添加後の発光を測定したところ、MQ-NAC及びMQ-GSの発光強度はメナジオンと比較して高いという結果となり、メナジオンへのN-アセチルシステイン及びグルタチオンへの付加はメナジオンのROS発生能を増強している可能性が示唆された。次に、キノン及びその付加体の同時分析が可能なHPLC定量法を開発した。本法におけるMQ-NAC, MQ-GS及びメナジオンの検出下限(S/N=3)はそれぞれ1.4, 0.8及び128 fmol/injectionであった。さらに、本法をメナジオン投与後のラット血清へと応用した結果、MQ-NAC及びMQ-GSのピークが検出され、投与されたメナジオンがラットの体内に存在するN-アセチルシステイン及びグルタチオンと反応してMQ-NAC及びMQ-GSが生成したと考えられた。また、クロマトグラム上にはこれら以外にもメナジオン投与後にはじめて検出されるピークの存在が見出されており、これらがMQ-NAC及びMQ-GSと同様にキノンにより修飾された生体成分だと考えられた。研究計画通りに、時間分解蛍光測定用プレートリーダーを用いることによりキノンのハイスループット化学発光分析法を開発することに成功した。本法は従来までに報告されているキノンの分析法と比較して測定に要する時間を大幅に短縮化しており、様々なキノンの多検体処理に適した方法であると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。キノンの光分解によって生じる化学発光とマイクロプレートリーダーを組み合わせた新規分析法は迅速かつ高感度であることが明らかになったことから、今後は生体試料中に存在するキノンの定量へと本法を展開していく。一方で、本法において良好な発光が得られなかったo-quinone類については、キノンの酸化還元サイクルを利用する化学発光分析法といった異なるアプローチに基づく迅速分析法の開発を検討していく。
電気磁気効果を用いたナノスケール金属およびナノ粒子集合体の磁気秩序制御

大きな磁化を持つ強磁性状態を電気磁気効果を用いて制御する手法を2つの観点から研究した。まず、交換増大した金属のフェルミエネルギーを電場により変化させてストーナーの強磁性発現条件の境界で磁性制御を行う。この手法にはPdのナノ粒子と超薄膜を用いた。次に、相互作用の強い強磁性ナノ粒子集合体において、ナノ粒子の磁気異方性を電場で変化させ、相互作用と磁気異方性の比を制御して集合体の磁性制御を目指す。この手法には純鉄のナノ粒子集合体を用いた。これより、スピントロニクス分野における磁気応用技術開拓の基礎となるナノ粒子・超薄膜および強磁性ナノ粒子集合体の磁気秩序制御手法に関する多くの知見を得た。本研究では、2つの方向から電気および磁気的自由度の結合により生じる電気磁気効果を利用して物質の磁気秩序、特に大きな自発磁化を持つ強磁性状態の制御を目指す。(1)交換増大した金属のフェルミエネルギーE_Fを電場により変化させることで強磁性発現条件の境界で磁性を制御する。このために、Pdのナノ粒子および超薄膜に注目した。まず、強誘電体BaTiO_3の分極から発現する電場を用いたPdナノ粒子の磁性制御を目指す。Pdナノ粒子とBaTiO_3ナノ粒子の超格子を用いて、BaTiO_3ナノ粒子のキュリー温度T_c上下で分極の有無に伴うPdナノ粒子の磁性の変化を調べる。これまで、強誘電体BaTiO_3およびPdナノ粒子の作製、BaTiO_3ナノ粒子のキュリー温度左の評価を行った。次に、Pd(100)超薄膜ヘイオン液体を用いた電気2重層を用いて電場を印加し、帯電状態での磁性の変化を調べる。これまで、Pd(100)超薄膜では1525原子層で強磁性が発現し、その磁化が膜厚に依存して振動的に変化することを見出し、その磁性発現の起源を第1原理計算から明らかにするとともに、電界印加実験に適する膜厚を特定した。また、イオン液体を含む高分子フィルムを作製し、電気化学的評価により印加可能な電圧範囲を見積った。これらを基に素子を作成し、磁気光学効果の測定を行った。(2)相互作用の強い強磁性微粒子集合体で、微粒子の磁気異方性を電場で変化させ、相互作用とのバランスの変化を用いて磁性を制御する。このために、Feナノ粒子集合体を用い、強誘電体の分極およびイオン液体に形成される電気二重層を用いて強電場を実現する。これまで、粒径が制御されたFeナノ粒子を用いた微粒子集合体を作製した。Feナノ粒子は大気中では酸化が進むことから、予備実験としてFe_3O_4ナノ粒子をMgO層で覆ったコア-シェル粒子を作成し、ファラデー効果を測定した。Pdに電場を印加することで強磁性発現条件の境界で磁性を制御する。まず、強誘電体の分極電場を用いたPdナノ粒子の磁性制御を目指す。PdとBaTiO3のナノ粒子超格子を用いて、強誘電体キュリー温度TC上下でPdナノ粒子の磁性の変化を調べる。これまで、BaTiO3およびPdのナノ粒子を作製し、粒子混合体の磁性を調べたが、TC上下で明瞭な変化を確認するには至っていない。次に、チタン酸ストロンチウム(STO)基板上に堆積させたPd(100)超薄膜で、量子井戸状態から理解されるように膜厚に対して周期的に強磁性が発現すること、その磁化とキュリー温度がNiと同程度であることを見出し、X線磁気円二色性測定から強磁性がPd由来であることを確認した。さらに、Pd薄膜に自己組織化単分子膜(STO)の形成または酸素ガス吸着を行うことで、強磁性磁化が膜厚に対して系統的に変化することが分かり、電荷移動で磁性制御が可能であるとの見通しを得た。電場印加実験では、まず、イオン液体を用いた電気二重層を通した電場印加を行ったが磁性変化を確認するに至っていない。一方、NbドープSTO基板上にPdを堆積させ、基板とPd薄膜間に電場を印加して界面での位相シフトを変化させることで磁性を操作する手法を案出し、実験を遂行している。相互作用の強い強磁性微粒子集合体で、微粒子の磁気異方性を電場で変化させ、相互作用とのバランスの変化を用いて磁性を制御する。このために、MgO被覆Feナノ粒子集合体にイオン液体に形成される電気二重層を用いて強電場を実現する。

これまで、FeとMgOのコアーシェル粒子の作製を試みたが、MgO作製時にFeの酸化が生じたため、FeとMgOを用いたグラニュラー膜を作製して同様の実験を進めている。交換増大した常磁性金属Pdをチタン酸ストロンチウム(STO)基板上に堆積した(100)超薄膜が、膜厚に依存して振動的にNiよりも大きな磁化を持つ強磁性を発現することを明確に確認し、この挙動を量子井戸状態の形成に起因してフェルミエネルギーにおける状態密度が周期的に変動するとの描像を基に定量的に説明した。一方、磁化が極大を示す膜厚は理論計算と比較して2原子層程度シフトし、強磁性磁化の大きさは計算値より大きい。この相違の起源を検討した結果、STO基板の構造相転移に伴うPd/STO界面変調によるPd薄膜の磁性変化を観測することで、振動ピークのシフトは界面における散乱位相シフトにより説明できることを明らかにした。また、放射光を用いたPd(100)超薄膜の厳密な構造評価から面直方向に2.3%の巨大な格子膨張が存在することを見出し、この格子膨張がPdの強磁性発現に有利に働き、Pd薄膜の磁化増大を引き起こすとの知見を得た。さらに電気磁気効果によるPdの磁性操作を目指した。フェルミエネルギーのシフトを目的に膜表面への自己組織化単分子膜の堆積と電気二重層を用いた電場印加を行い、電荷移動に伴って強磁性が発現する膜厚がシフトするなどの挙動が見出され、量子井戸を基にしたPd薄膜の強磁性発現機構を支持する知見を得た。また基板との界面における散乱位相シフト変化の誘導を目的に、NbドープSTO基板とPd薄膜を用いたショットキー構造を作製し、電圧印加で界面のエネルギー障壁を変化させ、散乱位相シフトを変調させる系を構築した。強磁性微粒子集合体中に働く磁気相互作用の電気的変調を用いた磁性制御を目指した。FeとMgOグラニュラー膜(Fe:Mg = 57:43)は室温では超常磁性を示すが、ホール効果測定では超強磁性的挙動を示した。これは、電流に伴ってFe粒子間にトンネル交換相互作用が働くことに起因すると考えられ、電気的に微粒子集合体の磁気秩序の変調が実現できたものと考えられる26年度が最終年度であるため、記入しない。磁気物性工学26年度が最終年度であるため、記入しない。これまで、超格子・超薄膜などの測定試料の作製、および測定系の構築に注力してきたが、その実現に困難が生じ、計画よりも多少遅れている部分もあるが、Pd薄膜の理論・実験的研究などに関しては順調に進展している。今後、試料作製、測定系の構築の準備が整えば、研究は順調に進むものと考えられる。これまで、Pd超薄膜の磁性の特定、その起源の解明、および電場印加により磁性制御が可能であることを示唆するいくつかの根拠を得ることに成功している。また、NiドープSTO基板とPd薄膜間に電場を印加して位相シフトを変化させることで磁性制御するという新たな手法を提案し、実験を進めている。しかし、電場印加の手法に実験上の難しさがあるため磁性制御には至っていない。PdとBaTiO3のナノ粒子作製条件の絞り込みは大きく進歩したが、まだ超格子の作製に成功していない。このため、Pdナノ粒子への十分な電場印加が実現できておらず、その磁性操作には至っていない。Feナノ粒子集合体の磁性操作に関しては、MgOとのコアーシェル構造を作製する際にFeが酸化する問題を克服することができておらず。Fe/MgOグラニュラー系を作製することでこの問題を回避する方針を立てた。以上Pd薄膜の磁性制御に関しては、かなり目処がついており、その実現の可能性は高いと考えている。一方、ナノ粒子集合体の磁性制御に関しては、試料作製に大きな障壁があり、グラニュラー系の作製など別の方向からこの問題の解決を目指しているところである。
肝臓における神経支配の変化と代謝機能の関連性の解明

本研究では、ヒト肝内自律神経線維と代謝との関係を解明することを目的として、正常肝、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)における肝内の全神経線維と交感神経線維の量を検討した。肝疾患では正常肝と比較して、全神経線維・交感神経線維ともに減少していた。ALTが高値の群、線維化が進行した群では、神経線維が減少する傾向にあった。血糖や脂質の値による比較では、神経線維量に明らかな差はなかった。糖代謝や脂質代謝との明らかな関連を示唆する根拠は得られなかったが、肝疾患においては肝内自律神経線維が減少しており、何らかの傷害を受けていることが示唆された。肝内神経支配と疾患との関係を評価するために、外科手術で得られた正常肝標本5例、ウイルス性肝炎の肝生検標本40例(B型肝炎20例、C型肝炎20例)、NASHの肝生検標本30例について、抗S100抗体と抗CD56(N-CAM)抗体を用いて免疫染色を行った。抗S100抗体による染色は、抗CD56抗体と比較して背景との鑑別が容易であったため、神経線維の定量には抗S100抗体を用いた。門脈域を門脈の太さにより3群(小門脈域;門脈径≦50μm、中門脈域;50100μm、大門脈域;>100μm)に分類し、門脈域ごとの免疫染色陽性の神経線維数を比較検討した。正常肝において、小門脈域の中で神経線維が陽性の門脈域は28.57%であった。中門脈域では50.91%、大門脈域では85.19%であり、門脈域が大きくなるほど神経線維が多かった。NASHでは小門脈域で23.44%、中門脈域で66.67%、大門脈域で92.31%であり、ウイルス性肝炎ではそれぞれ55.88%、80.65%、100%であった。この結果から、ヒトの肝臓内では、炎症に伴って神経線維が増生していることが明らかになった。しかしNASHはウイルス性肝炎に比べると神経が少ない傾向にある。NASHにおいては、肝内の自律神経支配が低下するため、炎症を制御できなくなっている可能性が示唆された。また、神経線維が中枢側で切断された場合の変化をみるため、移植後肝の肝生検標本もしくは再移植時の手術標本47例についても、同様に免疫染色を行った。その結果、大門脈域の太い神経は比較的保たれるが、末梢の細い神経線維は移植後早期から消失していることがわかった。自律神経支配が失われることで、肝内の代謝にも影響があったと予想される。肝臓内にも自律神経線維が分布しており、脳との情報伝達により血流や胆汁分泌、代謝などの調節を行っている。本研究は、肝内自律神経支配が肝の代謝機能において果たす役割の解明を目的としている。昨年度は、肝内自律神経線維と肝疾患との関連を明らかにするため、肝内自律神経線維を免疫染色にて同定し、疾患ごとの門脈域の神経陽性率を比較することで、ウイルス性肝炎では非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)よりも神経陽性率が高いことを示した。今年度は、門脈域の神経陽性率の臨床における意義を解明するために、臨床データとの関連を検討した。神経細胞接着分子(N-CAM)にて免疫染色を行った、ウイルス性肝疾患とNASHの肝生検標本を用いた。標本内の末梢門脈域が3個以下の標本は検討から除外し、末梢門脈域にあたる小門脈の神経陽性率が高い群と低い群に分けた。それぞれの症例の生検直前の臨床データから、炎症の指標としてALT値、線維化の指標として血小板数とFIB-4 indexを比較検討した。その結果、神経陽性率が高い方がALT、血小板ともに低い傾向にあったが有意差は認めなかった。FIB-4 indexは、神経陽性率が高い群で有意に高かった。これにより、線維化と神経線維の増生との関連性の可能性が示唆された。また、神経線維が切断された場合として移植後肝の生検標本や再移植時の手術標本について、神経線維を免疫染色で同定し、その門脈域神経陽性率を検討した。この結果、移植直後の標本では神経は保たれるが、短期間で脱落し、その後数年をかけて神経が再生していくことが示された。当初の計画では、質量分析計を用いて移植後肝の代謝の状態を分析する予定だったが、症例により移植後の生検時期が大幅に異なり、複数回生検を実施している症例が少なかった。移植後肝標本の免疫染色による門脈域神経線維陽性率を見ると、移植後に神経線維が脱落し、数年かけて末梢まで再生していることが示されたが、代謝への影響を明らかにするまでは至らず、移植後肝における研究を中止せざるを得なかった。ウイルス性肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎の生検標本における末梢門脈域の神経線維陽性率の比較では、ウイルス性肝疾患の神経陽性率が高い傾向にあった。これらの炎症性肝疾患を合わせて神経陽性率が高い群と低い群に分け、炎症の指標として両者のALT値を比較したところ有意差はなかったが、線維化の指標であるFIB-4 indexは神経陽性率が高い群で有意に高値であり、炎症よりも線維化に自律神経支配が強く関与している可能性が示唆された。肝臓内の自律神経線維は、脳との情報伝達により肝内の血流や胆汁分泌、代謝などに関与していることが知られている。

本研究ではヒト肝内自律神経線維の代謝における役割を解明することを目的として、正常肝、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)での神経線維陽性率を比較してきた。当初は肝移植後の神経支配の変化と代謝の変化を検討する予定であったが、肝移植後の肝生検時期を揃えられず断念した。正常肝、ウイルス性肝炎、NASHの神経線維について検討したが、門脈域によっては神経線維の同定が困難なものがあり、免疫組織化学染色に用いた抗体を抗S100抗体から変更し、全神経線維を抗PGP9.5抗体、交感神経線維を抗TH抗体を用いて同定した。また、門脈域の神経の評価方法は、神経線維を認めるものを「陽性」としていたが、門脈域の面積における神経線維の面積の比で表すことで、より神経線維の変化を表現しやすくした。これらの変更により再度解析しなおした結果、肝疾患では正常肝と比較して全神経線維・交感神経線維ともに減少しており、ALTが高値であったり、線維化マーカーのM2BPGiやFIB4-indexが高い方が神経線維が減少する傾向にあった。また、空腹時血糖・HbA1cや脂質の値には明らかな差が無かった。肝疾患においては、肝内自律神経線維も何らかの傷害を受けて減少することが示唆された。現時点では糖代謝や脂質代謝に関する検査値との関連を示す根拠が得られず、今後さらなる検討が必要である。本研究では、ヒト肝内自律神経線維と代謝との関係を解明することを目的として、正常肝、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)における肝内の全神経線維と交感神経線維の量を検討した。肝疾患では正常肝と比較して、全神経線維・交感神経線維ともに減少していた。ALTが高値の群、線維化が進行した群では、神経線維が減少する傾向にあった。血糖や脂質の値による比較では、神経線維量に明らかな差はなかった。糖代謝や脂質代謝との明らかな関連を示唆する根拠は得られなかったが、肝疾患においては肝内自律神経線維が減少しており、何らかの傷害を受けていることが示唆された。2014年度は肝内神経支配と疾患との関係を評価するために、外科手術で得られた正常肝標本5例、ウイルス性肝炎の肝生検標本40例(B型肝炎20例、C型肝炎20例)、NASHの肝生検標本30例について、抗S100抗体と抗CD56(N-CAM)抗体を用いて免疫染色を行った。その結果から、ヒトの肝臓内では、炎症に伴って神経線維が増生していることが明らかになった。また、神経線維が中枢側で切断された場合の変化をみるため、移植後肝の肝生検標本もしくは再移植時の手術標本47例についても、同様に免疫染色を行ったところ、大門脈域の太い神経は比較的保たれるが、末梢の細い神経線維は移植後早期から消失していることがわかった。産前産後休暇および育児休業のため、2014年8月から研究を停止しており、現在のところ、予定よりも遅れている。肝移植後の症例は生検時期に大きなばらつきがあること、複数回生検している症例が少ないこと、長期間の臨床データがそろっている症例が少ないことから、移植後の神経線維陽性率と代謝との研究は中止せざるを得ない。これまで肝生検標本における門脈域の神経線維陽性率を評価検討してきたが、生検標本ではその中に含まれる門脈域が少ない。より確実な検討を行うために、今後は外科手術標本を用いて神経線維陽性率を評価し、臨床データとの関連を再度分析する。また、交感神経と副交感神経を区別するため、それぞれの伝達物質に関連する抗体を用いた免疫染色で染め分けを行う。これにより、交感神経と副交感神経の炎症性肝疾患における役割を明らかにしていく。消化器内科学産前産後休暇および育児休業により、研究期間の1年延長を申請している。
間質性肺炎の分子病態の解明と治療法の開発研究

間質性肺炎の発症後の肺線維化にはヘルパーリンパ球が関与することがすでに報告されている。また、最近、ロイコトリエンC4(LTC4)も肺線維化に関与することが報告されているが、その役割は明らかでない。そこで本研究は、間質性肺炎・肺線維症の治療法の開発・確立を目的とし、抗原特異的なリンパ球の活性化やLTC4によって誘導される気道炎症がブレオマイシン誘導性肺線維化にあたえる影響について解析を行った。本研究では卵白アルブミン(OVA)/alumによって腹腔内感作したLTC4合成酵素遺伝子(LTC4S)トランスジェニック(Tg)マウスおよび野生型マウスに対し、ブレオマイシンおよびOVAの経気道内暴露によって誘導される肺線維化について以下の解析を行った。OVA単独暴露後のリンパ球および好酸球を主体とする気道炎症は野生型マウスに比べ、LTC4S-Tgマウスで増強し、肺胞洗浄液中のサイトカイン(IL-4, IL43)およびTGF-bの増加を認めた。さらにブレオマイシン追加暴露により、野生型マウスおよびLTC4S-Tgマウスいずれにおいても気道炎症が増強し、特にLTC4S-Tgマウスでその程度が強かった。野生型マウスにおいて、OVAおよびブレオマイシン同時暴露による気道炎症は、非感作マウスに比べ、感作マウスで増強したことから抗原暴露後の気道炎症はブレオマイシン誘導線維化を促進する可能性が考えられる。また、感作野生型マウスと比べ、感作LTC4S-TgマウスではOVAおよびブレオマイシン同時暴露ではTGF-β産生の増加を伴った気道炎症の増強、気道内Th2サイトカインおよびTGF-β産生の増加を認めたことから、LTC4はTh2型気道炎症の促進を介して線維化を悪化させることが考えられる。抗原暴露およびLTC4による肺の線維化に対する影響を確認するための組織学的解析も合わせて行った。1)BCL6トランスジェニックマウスによる実験的間質性肺炎モデルの確立間質性肺炎の病態におけるTh2型リンパ球機能の役割を検証するためにlck遺伝子のプロモーターの支配下にBCL6をT細胞に特異的に強発現させたTgマウスをそれぞれ作製した。これらのマウスを卵白アルブミン(OVA)で腹腔感作し(day0)、day14にブレオマイシン(Bleom)(0.5mg/kg)単独またはOVAとBleomの併用でそれぞれ気道内投与し、day21の肺炎症を解析した。その結果、Bleom単独投与の場合、気管支肺胞洗浄液中(BALF)のマクロファージ、好中球、リンパ球はLck-BCL6-Tgマウスで減少を認めた。一方、OVAとBleomの併用投与では野生型マウスで軽度、好酸球が増加し、また、Bleom単独投与時のリンパ球の増加が抑制されたのに対し、Lck-BCL6-Tgヤウスでは、Bleom単独投与時と比べて好中球およびリンパ球の増加を認めた。以前、我々は、OVA感作による喘息モデルで、Lck-BCL6-Tgマウスの気道内リンパ球はTh1サイトカインの産生は正常で、Th2サイトカインの産生が抑制されることは既に確認していることから、以上の結果はBleomによって誘導される肺炎症に対してTh2サイトカインは、抑制的に作用することを示唆している。

また、Lck-BCL6-Tgマウスで見られるTh1サイトカインが相対的に優位な生体環境ではBleom誘導性肺炎症を増悪させる可能性があると考えられた。現在、これら気道内の炎症所見と間質性肺炎の病理学的変化との関係について解析中である。2)BCL6の標的遺伝子の検索BCL6の作用を細胞レベルで解析するために、マウスの間質性肺炎モデルマウスの肺由来の培養線維芽細胞をにおけるmRNAの発現の動態についてDNAチップを用いて解析し、BCL6の標的遺伝子として間質性肺炎・線維化肺に於ける発症関連因子の遺伝子を検索中である。間質性肺炎の肺上皮細胞の繰り返す傷害・損傷は線維化の発症および進行に重要な役割を果たす可能性が考えられている。特にヘルパーT細胞由来のサイトカインは間質性肺炎の病態に深く関わる因子であると考えられているが、その作用機序は不明である。本研究ではT細胞のサイトカインの産生に対する抑制的な機能を持つ転写制御因子BCL6の間質性肺炎の発症における役割を明らかにすることを目的とする。(1)卵白アルブミン(OVA)感作マウスのブレオマイシンおよびOVA誘導性肺線維症に対するリンパ球の機能を解析した。その結果、BCL6トランスジェニックマウスでは肺炎症が抑制されることが明らかになった観察された。その機序として、BCL6トランスジェニックマウスはlckプロモーターを利用しているため、サイトカイン産生の減少はリンパ球に限定されることから、間質性肺炎・肺繊維化にはヘルパーT細胞が重要な役割を果たすと考えられた。(2)CD4Tリンパ球のサイトカイン産生や増殖および細胞死に対するBCL6の役割について解析した。継代培養したBCL6ノックアウト(Ko)マウス由来のTh1はおよびTh2細胞は野生型に比べてサイトカイン産生が増強し、細胞死の増加を認め、活性化の亢進を呈した。以上の結果より、BCL6はリンパ球や気道上皮細胞の機能の恒常性の維持を制御する転写制御因子であり、その作用の破綻は間質性肺炎・肺線維症の発症に関与すると考えられた。間質性肺炎の発症後の肺線維化にはヘルパーリンパ球が関与することがすでに報告されている。また、最近、ロイコトリエンC4(LTC4)も肺線維化に関与することが報告されているが、それぞれの役割は明らかでない。そこで本研究は、間質性肺炎・肺線維症の治療法の開発・確立を目的とし、抗原特異的なリンパ球の活性化やLTC4によって誘導される気道炎症がブレオマイシン誘導性肺線維化にあたえる影響について解析を行った。卵白アルブミン(OVA)/alumによって腹腔内感作したLTC4合成酵素遺伝子(LTC4S)トランスジェニック(Tg)マウスおよび野生型マウスに対し、ブレオマイシンおよびOVAの経気道内暴露によって誘導される肺線維化について以下の解析を行った。(1)OVA単独暴露後のリンパ球および好酸球を主体とする気道炎症は野生型マウスに比べ、LTC4S-Tgマウスで増強し、肺胞洗浄液中のサイトカイン(IL4, IL-13)およびLTC4の増加を認めたことから、LTC4は抗原誘発後のTh2型気道を増強する作用を認めた。(2)ブレオマイシン単独暴露では野生型マウスおよびLTC4S-Tgマウスいずれにおいても、ほぼ同程度の好中球増加を主体とする気道炎症を認めた。(3)野生型マウスにおいて、OVAおよびブレオマイシン同時暴露による肺繊維化は、非感作マウスに比べ、感作マウスで増強したことからTh2型気道炎症はブレオマイシン誘導線維化を促進すると考えられた。