hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広汎肝切除の適応決定に必要な残存予定肝領域の予備能測定に関する研究

大きな肝硬変合併肝細胞癌に対しては、広汎肝切除が唯一の治療法であるが、術後肝不全への懸念から差し控えられることが多い。われわれは1979年以来、術前に残存予定肝領域の肝静脈血流量と、ICG除去量の測定を行って、広汎肝切除に耐え得る患者を選択し、術後肝不全を測減せしめ得た。しかしながら從来行って来た方法は二本のカテ-テルを使用する関係上操作がや、繁雑な点に問題があり、より簡単で正確な方法を開発する必要性を痛感していた。そこで必冠静脈血流量の測定に使用されているcoronary sinusflow catheter(Edwards社製)を使用することにした。これによってカテ-テルの位置合わせは不要になり、また挿入経路を解剖学的に肝静脈に挿入し易い内頚静脈経由に変更することによって檢査時間は著明に短縮した。またpersonal computerに直結しているので、直ちに血流量が算出され、精度が向上した。1988年5月から1991年2月までの間に、肝細胞癌、胆襄癌、肝門部胆管癌などの患者20例について、この方式による残存予定肝領域の肝静脈血流量とICG除去量の測定が行われ、そのうち10例に肝切除が行われた。残存予定肝領域の予備能と術後肝不問との相関について檢討すると、難治性腹水の出現、脛症状の発現、総ビリルビニ5mg/dl以上の黄疸を示したる例では、肝静DHC血流量300ml/min以下、5CG除去量3.1mg/min以下の値を示した。從って広汎肝切除をうける患者は上記の基準以上の成績を有することが必要である。大きな肝硬変併存肝癌に対しては広汎肝切除が唯一の治療法であるが、術後肝不全への懸念から差し控えられることが多い。しかしながら広汎肝切除を乗り切れば長期生存例になり得ることも判明している。われわれは1979年以来術前に残存予定肝領域の肝静脈血流量とよくG除去量の測定を行って広汎肝切除に耐え得る患者を選択し、術後肝不全を激減せしめ得たが、二本のカテ-テルを使用する関係上操作がやや繁雑な点に問題があり、簡単で正確な方法を開発する必要性を痛感していた。そこでinjection thermisterとdilnfion thermisterが一本のカテ-テルに納められているwebster社製CCS-7U-90Bカテ-テルを使用して8名の患者について測定を試みた。その結果カテ-テルが一本であるので頸部の静脈から挿入できるようになり、これまでの半分の時間で検査を終了できるようになった。また二本のカテ-テルのずれによる測定値の誤差もなくなり、パソコンによる自動計算も加わって、再現性の高い測定値が得られるようになった。3例に肝切除を行ったが、2例は肝不全をおこすことなく広汎肝切除に耐えた。1例はこの検査によって右葉切除に耐え得ないと判断し、TAEに切り替えた。その結果腫瘍の縮小がみられたので部分切除を行い、腫瘍の除去を行い得た。更に検査の簡便性を高めるためにDoppler法による肝静脈血流量の体外測定法を検討しているが、この方法は現在の装置では静脈径の測定値の再現性に乏しく、さらに解像度の高い器械が必要であることが明らかになった。広汎肝切除後の肝不全を予知する目的で、残存予定肝領域の肝予備能を肝静脈血流量とICG除去量を指種として測定、評価しているが、前年度に引続いて13名の患者について検索した。

肝切除を目的に慶應義塾大学病院外科に入院した患者13名に対して、Webster社製CCSー7uー90Bカテ-ルを使用して残存予定肝領域の肝静脈血流量とICG除去量の測定を行った。B例の内訳は原発性肝癌6例、胆裏癌1例、肝門部胆管癌1例、肝血管腫1例、転移性肝癌4例である、このうち肝切除が行われたのは例(拡大右葉切除3例、拡大左葉切除1例、肝部分切除3例)である。これら7例と昨年度に肝切除が行われた10例について残存肝予備能と術後肝不全との相関について検討した。術後肝不全で死亡した例になかったが、3例に難治性腹水の発生、脳症状発現などの肝機能悪化症状がみられた。これら3例の肝機能悪化例と肝後経過良好例を比較したところ、下記のような差達が明らかになった。1.残存予定肝領域の肝静脈血流量及びICG除去量は肝機能悪化例ではそれぞれ230.7±54.7ml/min.0.072±0.033mg/minで、術後経過良好例の531.1±193.3ml/min、0.263±0.181mg/minよりも有意に低値であった。2.従って残存予定肝領域の肝静脈血流量300ml/min以下、ICG除去量0.1mg/min以下の成績がみられた患者では、肝切除後著明な肝機能悪化がみられる可能性大である。
交通災害の抑止と補償に関する学際的研究

本研究はこれまで,三年間をかけて将来発生する交通災害の抑止および被害者の完全救済のために,法律学・経済学・工学および医学等の広い学問分野における共同研究を行ってきたが,その成果を公表して広く世に問うものである.具体的には,各班の成果を「交通災害の抑止と補償」という題名で出版するとともに,英文の成果をも出版して,これまでの研究成果を内外に公表し,今後の交通災害の抑止と被害者救済に役立てんとするものである.本研究はこれまで,三年間をかけて将来発生する交通災害の抑止および被害者の完全救済のために,法律学・経済学・工学および医学等の広い学問分野における共同研究を行ってきたが,その成果を公表して広く世に問うものである.具体的には,各班の成果を「交通災害の抑止と補償」という題名で出版するとともに,英文の成果をも出版して,これまでの研究成果を内外に公表し,今後の交通災害の抑止と被害者救済に役立てんとするものである.
ヒト肺における組織幹細胞ニッチの同定

細胞培養系でAEPCsが分化する条件を確立し,その様子を詳細に観察し,AEPCsは分化に先立って細胞分裂を停止することを明らかにした.また,マイクロアレイ解析に基づいて遺伝子発現解析を行い,細胞分裂の停止には細胞接着を介した細胞内シグナル伝達系であるNotchシグナルが関与していることが明らかにした.本研究の目的は,ヒト肺組織幹細胞(AEPCs:Alveolar rpithelial progenitor cells)を肺胞上皮細胞に分化させる細胞外環境(=組織幹細胞ニッチ)を同定し,疾患肺の組織幹細胞ニッチがAEPCsの振る舞いに及ぼす影響を明らかにすることである.平成27年度は,MPC-co-BMAコートした培養ウェル内でAEPCsがスフィアを形成し,肺胞上皮細胞マーカーであるSP-Cの発現が上昇する現象を詳細に解析した.スフィアを固定して凍結切片を作成し,免疫組織化学でSP-Cの発現を調べると,SP-C強陽性細胞は主にスフィアの周辺部に存在し,スフィア内部の細胞はSP-C弱幼生であった.また,培養ウェル内で形成されたスフィアは継時的に大きくなっていった.そこで,スフィア内の細胞が増殖していると推測し,免疫組織化学でKi67の発現を調べたところ,Ki67陽性細胞はスフィア周辺部の一部の細胞に限局していた.よって,増殖している細胞がSP-C強陽性であると推測された.一方で,Ki67は細胞周期に入らず休止期にある細胞では発現しないため,スフィア内部のKi67陰性細胞は細胞周期から離脱して休止期に入ったと考えられた.培地の血清濃度を減少させたところ,スフィア周辺部のKi67陽性細胞の数は減少した.またこの時,スフィア周辺部のSP-C強陽性細胞の数も減少した.以上より,AEPCsをMPC-co-BMAコートしたウェルで培養すると,スフィア周辺部の細胞はSP-C強陽性でKi67陽性,スフィア内部の細胞はSP-C弱陽性でKi67陰性と極性が生じることが分かった.平成27年度に予定していたAEPCsスフィアのマイクロアレイ解析にまだ着手していないため,計画よりも遅れていると判断した.しかし,スフィア形成の継時解析やSP-CのみならずKi67をマーカーとした細胞特性の検出など,マイクロアレイを行うための事前データを予定よりも多く集めることが出来た.MPC-co-BMAコートしたウェルでAEPCsを培養するとAEPCsはスフィアを形成し,肺胞II型上皮細胞の分化マーカーであるSP-Cの発現が上昇する.平成27年度は,MPC-co-BMAコートしたウェルでAEPCsを培養すると,形成されるスフィアのほとんどすべての細胞が細胞分裂期のマーカーであるKi67陰性になることを明らかにした.そこでスフィア形成による細胞分裂の停止がAEPCsの分化にどのように関わるのか,また細胞分裂停止はどのようなメカニズムで生じるのかを調べるために,平成28年度はAEPCsがスフィアを形成するときのKi67の経時的な消失過程を免疫組織化学によって詳細に追跡した.その後,AEPCsを播種後にKi67陽性細胞が半減してゆき,ほぼ消失するまでの4点で細胞を回収し,マイクロアレイ解析を行った.マイクロアレイデータ解析の結果,細胞周期の推進する遺伝子の経時的な発現減少と細胞周期の停止に働く遺伝子の経時的な発現上昇を確認し,免疫染色によるKi67の消失を裏付けることができた.また,細胞を播種して1.5時間後にNotchシグナルのリガンドであるJagged1の発現が顕著に上昇し,Notchシグナルの細胞内転写因子群の発現も同様に上昇していることが分かった.一方,細胞間接着に関わる遺伝子の発現はスフィア形成過程で変化がなかった.平成27年度にできなかったマイクロアレイを施行し,AEPCsの細胞周期の停止に関するデータとともに,スフィア形成に伴う細胞間および細胞と細胞外基質間の接着タンパク質の発現変動のデータを得ることができた.また,播種後24時間以内にSP-Cの発現が上昇してくることも確認できた.これらは,細胞周期の停止と細胞分化に関わるメカニズムとスフィア状態で必要な細胞接着すなわち細胞外観環境の同定を解析するための基盤データとなり,来年度以降の研究の遂行に有用である.MPC-co-BMAコートしたウェルでAEPCsを培養するとAEPCsはスフィアを形成し,肺胞II型上皮細胞の分化マーカーであるSP-Cの発現が上昇する.平成28年度までに,スフィア形成する細胞は細胞分裂期マーカーであるKi67の発現が経時的に消失して細胞分裂が停止していくことを見出し,その時の遺伝子発現変化を調べるためにマイクロアレイ解析を行った.その結果,スフィア形成後にNotchシグナルが亢進していることを示唆する結果が得られた.そこで平成29年度は,Notchシグナルに着目した解析を行った.まず,マイクロアレイで発現上昇が見られた遺伝子の定量PCRで確認した.次に,Notchシグナルの阻害剤をAEPCsのスフィア形成時に添加し,スフィア形成や細胞分裂に影響が起きるかを調べた.その結果,スフィアは形成されるものの細胞分裂が抑制されることが分かった.また,マイクロアレイの結果,TGFbの発現も上昇していた.TGFbはNocthシグナルの亢進に関わることが知られているため,TGFbの阻害剤をスフィア形成時に添加して細胞分裂停止への影響を調べた.しかし,細胞分裂はTGFb阻害の影響を受けないことが分かった.以上の結果をまとめると,本研究によってAEPCsの培養基質に依存した肺胞II型上皮細胞への分化に先立って細胞の分裂停止が起こること,その細胞分裂停止にはNotchシグナルが関与していることが明らかになった.

細胞培養系でAEPCsが分化する条件を確立し,その様子を詳細に観察し,AEPCsは分化に先立って細胞分裂を停止することを明らかにした.また,マイクロアレイ解析に基づいて遺伝子発現解析を行い,細胞分裂の停止には細胞接着を介した細胞内シグナル伝達系であるNotchシグナルが関与していることが明らかにした.平成27年度に得たAEPCsスフィアの解析データをもとに,スフィア形成前・形成直後・形成数日後のAEPCsを回収してマイクロアレイを行い,各段階で発現している遺伝子を比較解析する.前年度の解析で,スフィアを形成するとAEPCはKi67陰性,すなわち休止期に入ることが確認された.細胞が休止期に入るメカニズムの詳細はほとんど明らかでなく,本培養系を用いて新たなメカニズムを解明できる可能性がある.そこで,当初の目的のSP-Cの発現制御に加えて休止期への進入に関わる遺伝子の発現にも焦点をあて,解析を行う.平成28年度に得たマイクロアレイのデータをもとに,細胞周期が停止して休止期に移行するメカニズムとそれが肺胞上皮細胞への分化にどのように関わっているかの検証を行う.またスフィアへの細胞外環境の影響を調べるために,形成されたスフィアを他の基質上に移して培養する,単一細胞にして播種するなどして培養したときに,細胞が休止期からまた細胞周期に入るのか,そしてその時のSP-Cの発現はどうなるのか,また細胞接着タンパク質の発現はどのように変動するのかを,培養細胞のリアルタイムPCRやウェスタンブロットなどにより解析していく.細胞生物学平成27年度に予定していたマイクロアレイ解析の実施が次年度になったため.培養に使う消耗品は所属研究室で他の研究員や学生と共同で使用しており,購入の際に研究室の共同経費から支払うことがあったため,本研究での使用額に余剰が生じた.マイクロアレイ解析を平成28年度に実施しするための研究費として平成28年度分と併せて使用する.また,現在データ解析に使用しているノートパソコンの調子が悪く,研究に支障をきたす恐れがあるため,平成28年度の物品費で購入する予定である.次年度の消耗品購入費に追加して購入に充てるか旅費の不足分の補てんに回す.
一酸化窒素センサー蛋白質グアニル酸シクラーゼの分子内情報伝達機構の解明

一酸化窒素(NO)センサー蛋白質グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、NO結合により活性化され、GTPからcGMPを合成する。本研究では、本蛋白質の発現系の構築や共鳴ラマン分光法、部位特異的変異体を調製することにより、NOによるsGCの活性化制御機構を明らかにすることを目的としている。さらに、sGCのX線結晶構造解析も目指した。本年度は昨年度同様、多量のサンプルを要する本蛋白質の結晶化条件の検索を行うために、申請者は本蛋白質の大量発現系の構築を行った。申請者は、すでにNOの結合するsGCのヘム結合部位のみの大腸菌による発現に成功していたが、安定で均一な蛋白質を得ることができなかったために、良質な結晶を得ることができなかった。そこで培養・精製条件をさらに精密に検索したところ、安定な蛋白質を取ることに成功した。現在このサンプルを用いて結晶化条件を検索中である。また、昨年度成功しなかった本蛋白質の全長であるヘテロ二量体の発現系の構築は、さらなる培養条件の検索のみでなく、可溶性蛋白質をフュージョンさせ、発現後取り去る方法や、大腸菌内にInclusion Bodyとして発現されたペプチド鎖を天然の形に巻き戻すなどの方法も試みたが、いずれの場合にも良い結果は得られなかった。大腸菌による蛋白質発現系は、酵母やバキュロウイルスを用いるよりも安価で、かつ大量な試料を短時間で発現させることができるが、哺乳類由来の蛋白質の発現には向かないことが多い。今後さらなる大腸菌発現系の技術開発が期待される。本研究では、NOによるsGCの活性化制御機構を、発現系の構築や共鳴ラマン分光法、部位特異的変異体を調製することにより明らかにすることを目的としている。さらに、sGCのX線結晶構造解析も目指す。本年度は、多量のサンプルを要する共鳴ラマン分光法や、X線結晶構造解析を目指して本蛋白質の結晶化を行うために、申請者は本蛋白質の大量発現系の構築を行った。申請者は、本蛋白質の異なる2種のペプチド鎖がコードされたDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌の培養温度、時間、目的蛋白質誘導物質の添加量または添加する時間を変化させたり、またシャペロニンやチオレドキシンといった蛋白質を共発現させるなど、様々な条件でsGCを発現させた。その結果、チオレドキシンと共発現させた条件で、高いcGMP合成活性を持つ成分が得られた。しかしながら、この活性成分を精製して調べたところ、NOによる活性上昇がなく、分子量も目的のものより小さかった。この結果から申請者は、この活性成分がプロテアーゼによりペプチド鎖が切断されたsGCのcGMP合成部位と予想し、現在アミノ酸配列分析により同定を進めている。また、NOの結合するsGCのヘム結合部位のみの大腸菌による発現に成功し、精製・結晶化を進めたが、安定で均一な蛋白質を得ることができなかったために、良質な結晶を得ることができなかった。来年度は、天然のsGCと同じものを大腸菌内で発現させることを目指し研究を進めていくとともに、これまで得られているsGCのヘム結合部位、cGMP合成部位のX線結晶構造解析を目指し、精製法の確立・結晶化を行い、部分的構造からもsGCの活性化制御機構の解明にアプローチしていく。
破骨細胞の多核化機構に関する形態学的研究;単核の破骨細胞の役割とその意義の解明

硬組織を吸収する破歯細胞や破骨細胞は多核の巨細胞として知られている。近年、研究代表者は、波状縁を有する単核の破骨細胞・破歯細胞の存在を報告した。しかしながら、波状縁を持つ単核の破骨細胞・破歯細胞が、どの程度の比率で存在しているのかについては理解されてなく、さらには単核細胞を含む破骨細胞・破歯細胞の核数の分布についてもわかっていない。材料と方法:6本のヒト乳歯を用い、試料を固定・脱灰後、TRAP活性反応をアゾ色素法で検出した。その後、試料をエポン包埋し、TRAP陽性細胞の連続準超薄切片を作製し、光顕で観察した。準超薄切片上で明らかに吸収窩を形成しているTRAP陽性細胞を選択し、連続切片からそれらの核数を計測した。結果:連続準超薄切片による観察から、TRAP陽性細胞の多くは多核の細胞であったが、単核の細胞も幾つか観察された。光顕的に、これらTRAP陽性細胞は、歯根象牙質上に吸収窩を形成し、吸収部位に刷子縁striatedborderが観察された。このような特徴を持つ242個の細胞を、核数にかかわらず、本研究では破歯細胞とした。吸収窩を形成していた破歯細胞の核数の平均値は5.3、中央値は4、単核の破歯細胞は3%の頻度で存在していた。また、10核以下の核数を持つ破歯細胞は全体の94%を占めていた。結論:破歯細胞の大部分が10核以下の核を持つ小さな細胞であり、単核の破歯細胞は多核の破歯細胞と共に乳歯歯根吸収に関与することが示唆された。本研究は破骨細胞を連続的に薄切し、細胞の構造を立体的に把握することにより、破骨細胞の多核化機構を解明するものである。平成7年度中に観察された破骨細胞の核数を連続切片から数えた結果、単核で波状縁を有するものはほんのごく僅かであった。in vivo並びにin vitroの実験系において、単核の細胞がほんの僅かしか観察されなかったことは非常に興味深い現象であると思われた。このことは、破骨細胞において単核である時期が非常に短いことを意味しているのではないかと推測された。本研究では破骨細胞の連続切片から細胞を立体複構しているが、同時に核数を計測することも可能である。現時点で、数十個の破骨細胞について、得られた連続切片から、その核数と吸収窩形成の有無についても計測している。この結果、吸収窩を形成している破骨細胞の中で、2、3、4核の核数を有する破骨細胞が全体数の約60%を占めていた。また、核数が十個以上である大型の破骨細胞は僅か数%であった。従来から、破骨細胞は多核の巨細胞で、その核数は数十個にも及ぶと言われている。しかしながら、本研究の結果から、核数が数十個に及ぶ破骨細胞は殆ど存在せず、2、3、4核といった小型の破骨細胞が多いことが理解された。これら少数の核を持つ破骨細胞の存在意義を、単核の破骨細胞の役割を考慮しながら考察する必要があると思われる。骨や歯などの硬組織を吸収する破骨細胞(破歯細胞)は、一般的に、多核の巨細胞として知られている。近年、研究代表者らは、波状縁を有する単核の破骨細胞の存在を報告した。本研究では、破骨細胞の多核化機構を形態学的に解明するために、まず、単核の破骨細胞の存在に着目した。

しかしながら、単核の破骨細胞の役割については何等の情報もなく、さらには、それらの細胞がどの程度の頻度で存在するのかについても理解されていない。本研究では、破骨細胞の多核化機構を形態学的に解明するために、まず、単核を含めた破骨細胞の核数の分布について詳細に検討した。ヒト乳歯上でTRAP(酒石酸耐性酸性フォスファクターゼ)活性陽性細胞を検出後、それらの連続準超薄切片を作製した。切片上で明らかに吸収窩を形成している242個のTRAP陽性細胞を選択し、連結切片からそれらの核数を計測した。吸収窩を形成していた細胞の核数の平均値は5.3、単核の破歯細胞は3%の頻度で存在していた。また、10核以下の核数を持つ破歯細胞は全体の94%を占めていた。以上の結果から、本研究では、吸収能を持つ破歯細胞の大部分が10核以下の核を持つ小さな細胞であり、単核の破歯細胞も乳歯歯根吸収に関与することが示唆された。また、本研究では、単核の破歯細胞と多核の破歯細胞間には細胞融合像は見られなかったが、現在、破歯細胞間における融合像を詳細に調査中である。
環境調節型がん遺伝子としてのBRAF遺伝子変異の意義

犬移行上皮癌(cTCC)におけるBRAF変異のがん遺伝子としての働きを腫瘍細胞自身に与える増殖作用とCOX2-PGE2を介して周囲環境を調節する作用の両面から検討した。その結果、BRAF変異により活性化されるRAF/MEK/ERK経路がcTCC細胞の細胞増殖に与える影響は大きくないか、阻害時にはバイパス経路が活性化することが示唆された。むしろBRAF経路の活性化は腫瘍細胞のCOX2発現とPGE2産生に強く関与することを明らかにした。臨床検体における検討ではBRAF変異症例でCOX2が高発現する傾向を見出し、またBRAF変異の有無によりCOX2が形成する炎症環境が大きく異なる可能性を見出した。今年度、申請者らは自身らが樹立したBRAF変異犬移行上皮癌細胞株を用いて、薬理学的なBRAF阻害後の経時的な下流経路(ERK/MAPK)、COX発現量及びPGE2産生量の評価を行い、ERK/MAPK経路の阻害がCOX2発現と深く関連することを詳細に確認した。一方でBRAF阻害薬を用いても下流のERKのリン酸化抑制は一時的なものであって、ERKの再活性化が何らかの要因によって起こるとともにCOX2の発現が再度誘導されることを見出した。この結果を受けて、薬理学的なBRAF阻害下で細胞より抽出したmRNAを用い、網羅的な発現変動解析を行いMAPK経路の活性化とCOX2発現を仲介する分子機構に関して、またBRAF阻害下におけるERK再活性化のメカニズムに関して検討を行う基盤となるデータを得た。これらの発現データの一時解析によってBRAF阻害により細胞が間葉上皮転換様の変化を起こす可能性が考慮されており、BRAF遺伝子変異の新たな意義が示唆されている。さらに次年度に予定していた、症例におけるBRAF変異と腫瘍の生物学的挙動に関する検討を開始している。膀胱移行上皮癌症例を膀胱尖部に発生した症例で膀胱部分摘出術を受けた群と、膀胱頚部に腫瘍を発生した症例であって膀胱全摘術を実施した群に分け、それらの両群の間でBRAF遺伝子変異が予後因子となりうるかを検討した。その結果、BRAF遺伝子変異の有無はいずれの群においても無増悪期間や生存期間などの長期予後に影響を与えないことを見出した。この結果は、国際学会にて発表された。またBRAF変異を持つ移行上皮癌細胞が多量のプロスタグランジン産生を行うという結果に関して論文投稿を行い国際誌へ発表した。本課題では、(1)犬BRAF変異株においてBRAF活性化が細胞増殖に与える影響の多面的な検討、(2)変異型BRAFによるCOX2-PGE2発現誘導の証明とメカニズム解明、(3)症例検体におけるBRAF変異と炎症誘導、腫瘍の生物学的挙動に関する検討、(4)BRAF変異腫瘍に対するBRAF-COX2-PGE2阻害の抗腫瘍効果に関する検討の4点を解決課題として挙げている。当初の計画では今年度は主に(1)、(2)に取り込む予定であったが、(2)を検討していく中で薬理学的なBRAF阻害に対し、ERKを再活性化させるバイパス経路の存在が示唆された。そのため(1)を検討する上でも広くこのバイパス経路に関する情報を得るために、BRAF阻害下で網羅的な発現解析を実施した。そのため今年度中には(1)を検討することが不可能であったが、これらの変更を補うために前倒しで(3)に取り組んでおり、順調に解析を進めて国際学会での発表を行うに至っている。そのため当初と計画の進行に変更はあったものの、新たな課題を解決するための修正も予算内で実施できており、おおむね順調に進行していると考えられる。平成28年度の結果から新たにBRAF経路阻害時にERK経路を活性化されるバイパス経路の存在が強く示唆された。研究課題の(1)、(2)、(4)に関してはこれらバイパス経路を踏まえた上での検討が必要となるため、まずは平成28年度に得た網羅的遺伝子発現解析の結果を解析し、必要に応じて薬剤スクリーニング等を追加しながらバイパス経路の解明を行っていく。それらの解析が終了したのちに、当初の計画にのっとって、バイパス経路を考慮しながら(1)、(2)、(4)の解析を進めていく。また(3)に関しては前倒しで進めている解析を継続し、症例検体におけるBRAF変異と腫瘍炎症環境との関連を明らかにする。腫瘍生物学平成28年度の予算押して画像撮影解析機器を計上していたが、共通機器を利用すること等により、購入を行うことなく研究を遂行することができたため、次年度への繰り越しが生じた。平成28年度に実施した研究結果により、BRAF阻害に対するバイパス経路の存在が強く示唆された。そのため当初の計画よりも多くの抗体やプライマー、また薬剤スクリーニングなどが必要となることが予想される。
非臨界次元の弦の場の理論とその対称性

本研究は、弦理論の個々の背景場から独立した定式化の可能性と弦の場の理論の対称性の理解を目指している。弦理論の性質を反映した模型としての、非臨界次元の弦理論・行列模型を使って、これらの事を理解する研究を行なった。この簡単な模型ではW_∞などの対称性があり、また様々な物質場を導入する事で背景場の異なる弦理論を考える事ができる。現在のところ、弦理論において作用原理が十分確立しているとはいえない。本年は前述の簡単な模型において作用原理を見出すことを目指して研究を進めた。作用を見出して理論の持つ対称性・弦の凝縮などを場の理論として標準的な理解をしたい。本年の研究は以下の様に行なわれた。トランスファー行列に対応するハミルトニアン形式が知られている。このハミルトニアンは確率過程量子化法のフォッカー・プランク演算子であるという主張があるので、行列模型から始めてこの主張の妥当性を検討した。この際、連続極限を取る段階で明確にされていなかった手続きを明らかにした。さらに、そのハミルトニアンから作用の性質を読み取る研究を行ない、現在この方向で作用原理の存在の是非を検討中である。今後、作用を定めることができれば、まず、摂動的な取り扱いが可能なのかを検討する必要があるだろう。さらに、対称性・背景場非依存性の研究に進みたい。
microRNA複合体形成経路の解析とそれに基づく標的の生化学的同定

オートファジーは酵母からヒトまで保存された細胞内のリサイクルシステムで、細胞内のタンパク質やオルガネラを分解する経路である。オートファジーによって、大量のリボソームが分解されることから、リボソームを構成している核酸(rRNA)も適切に分解されなくてはならない。オートファジーは細胞内の代謝に深く関わっており、システムが破綻すると様々な病態に結びつくと考えられるため、オートファジーの分子機構と生理機能の両面を理解する必要がある。歴史的には、主に酵母細胞での解析から分子機能に関する研究が大きく発展しており、様々な豊富な知見があるものの、その生理機能と代謝を追求する研究はこれまでほとんど行われていない。そこで、外的栄養条件をコントロールした条件において、細胞の増殖と代謝の状態とオートファジーの関係をメタボローム解析や細胞生物学的手法を用いて解析してきた。その結果、細胞内でのイオンのホメオスタシスにオートファジーが非常に重要な役割を果たすことが明らかになってきた。現在特に注目しているのは、特定の金属イオンであり、おそらくタンパク質に結合している微量金属のリサイクルを通じて、細胞内の金属イオンを適切な形態で維持している可能性が明らかになってきた。これらの知見は、これまで全く実験的に証明されていなかったものである。現在、オートファジーの欠損株で金属結合タンパク質の含有量・局在やその活性を調べることで、オートファジーの新たな生理機能を明らかにすべく実験を行っている。また、メタボローム解析からは、その代謝物の変化からオートファジーの活性に応じて顕著に変化する代謝物を同定した。これらの代謝物は、種を超えてオートファジーの優れたマーカーとなる可能性を秘めており、動物細胞でのオートファジーを理解する上でも基礎となりうる。今後は、遺伝学操作の優れた酵母をもちいることで、その代謝の全貌を明らかにする予定である。研究の開始直後は、最初の研究計画では解決できない様々な問題に直面したが、昨年度までに違う視点て新しい課題に取り組み始めた結果、予想外の興味深い現象を捉えることができた。現在メタボローム解析も加速し迅速に細胞内の代謝の動きを把握することができるため、オートファジーを多面的に解析することが可能となっている。現在の課題は、過去の膨大な個別研究を網羅的にかつ批判的に整理した上で研究を発展させる必要がある。実験的にも綿密で系統的なデータの蓄積を必要とする。研究酵母の利点を最大限生かして、オートファジーと細胞増殖の関係や、イオンホメオスタシス、代謝におけるオートファジーの役割を理解することを最終的な目標としている。microRNAは、内在性の小さなRNAで,RISCを介して標的mRNAと結合することで、その標的自身の翻訳を抑制する。RISCの中で最も重要な機能を担う分子は、Argonauteタンパク質(Ago)である。miRNAの真の標的mRNAを同定するためには、AgoがmiRNA二本鎖を取り込み、標的mRNAを認識するまでの各素過程について、small RNAの構造とAgoの構造の両面から解析し、生化学的な特性を明らかにすることが不可欠である。今年度は主に、1)miRNA/miRNA*鎖の選別機構について、また、2)miRNAによる標的認識機構について、申請者が開発してきたネイティブゲルシステムを利用して解析してきた。その結果、miRNA鎖の持つ5'リン酸基は、miRNA/miRNA*二本鎖がAgoへの取り込まれるために決定的な役割を果たすことを明らかにした。また、天然に存在するmiRNAの最初の塩基は、大部分(90%程度)がUに偏っていることが示されている。そこで、5'末端のnucleotideの配列をU,A,G,Cに変化させたmiRNA/miRNA*を用いて、RISC形成能を比較した。その結果、5'末端がUである場合は、RISCへの取り込み段階と、その後の一本鎖化の両方の過程を促進した。5'Aの場合は、5'Uより効率は低下した。しかし、5'末端がG,Cの場合は、5'リン酸基があっても、miRNA/miRNA*の内部にミスマッチ(seed領域(miRNA鎖の2-8番目)と、3'-mid領域(13-16番目))が存在すると、Agoに取り込まれるにも関わらず、一本鎖化の過程でAgoから排除された。従って、5'末端の塩基の違いは、miRNA/miRNA*のもつ内部構造(ミスマッチの位置)とのバランスによって、Agoへの取り込み過程と、その後の一本鎖化の過程に明確な影響を与えることが明らかになった。上記の結果は、これまで解析されたAgoの結晶構造解析の結果と矛盾を生じない。よって、miRNA経路は天然のmiRNAを最大限効率的に利用するために最適化されていて、それはAgoの生化学的特性に由来することが推測された。

1)について、miRNA鎖の持つ5'リン酸基は、miRNA/miRNA*二本鎖がAgoへの取り込まれるために決定的な役割を果たすことを明らかにした。また、天然に存在するmiRNAの最初の塩基は、大部分(90%程度)がUに偏っていることが示されている。5'末端の塩基の違いは、miRNA/miRNA*のもつ内部構造(ミスマッチの位置)とのバランスによって、Agoへの取り込み過程と、その後の一本鎖化の過程に明確な影響を与えることが明らかになった。上記の結果は、これまで解析されたAgoの結晶構造解析の結果と矛盾を生じない。よって、miRNA経路は天然のmiRNAを最大限効率的に利用するために最適化されていて、それはAgoの生化学的特性に由来することが推測された。2)については、前年度までにマウスの臓器等をもちいて、モデルとして設定したmiRNAの標的の同定を試みたが、成功していない。その理由は、Agoの生化学的な特性、すなわち再構成系を利用すると、Agoが非特異的にRNAに結合してしまうことが計画していた実験に適合しなかったことに加え、実験機器等の環境が整わないこと、合成RNAが高価なことなどが理由として考えられる。そこで、新たな課題を設定し取り組むことにした。現在、オートファジーとよばれる細胞内分解経路の誘導・進行過程を、代謝という観点から解析している。核酸やアミノ酸などの量を定量するとともに、生化学的・細胞生物的実験を行っている。オートファジーは酵母からヒトまで保存された細胞内のリサイクルシステムで、細胞内のタンパク質やオルガネラを分解する経路である。オートファジーによって、大量のリボソームが分解されることから、リボソームを構成している核酸(rRNA)も適切に分解されなくてはならない。オートファジーは細胞内の代謝に深く関わっており、システムが破綻すると様々な病態に結びつくと考えられるため、オートファジーの分子機構と生理機能の両面を理解する必要がある。歴史的には、主に酵母細胞での解析から分子機能に関する研究が大きく発展しており、様々な豊富な知見があるものの、その生理機能と代謝を追求する研究はこれまでほとんど行われていない。そこで、外的栄養条件をコントロールした条件において、細胞の増殖と代謝の状態とオートファジーの関係をメタボローム解析や細胞生物学的手法を用いて解析してきた。その結果、細胞内でのイオンのホメオスタシスにオートファジーが非常に重要な役割を果たすことが明らかになってきた。現在特に注目しているのは、特定の金属イオンであり、おそらくタンパク質に結合している微量金属のリサイクルを通じて、細胞内の金属イオンを適切な形態で維持している可能性が明らかになってきた。これらの知見は、これまで全く実験的に証明されていなかったものである。現在、オートファジーの欠損株で金属結合タンパク質の含有量・局在やその活性を調べることで、オートファジーの新たな生理機能を明らかにすべく実験を行っている。また、メタボローム解析からは、その代謝物の変化からオートファジーの活性に応じて顕著に変化する代謝物を同定した。
日本におけるエレクトロニクス産業の技術発展-戦時期および戦後復興期を中心に-

1.前年度から研究を進めてきた、戦前期から戦時期にかけての電話自動交換機の共同開発について資料調査を継続し、日本の電話交換方式の選択に際して、イギリスの事例が参考にされたことをイギリスの電気工学の学会誌である、The Journal of The Institute of Electrical Engineersなどの文献を調査することから明らかにした。この成果は研究論文、「戦前期日本の電気通信産業における技術問題-自動交換機の開発を中心に-」として取りまとめられ、所属学会の一つである企業家研究フォーラムのレフェリー誌である『企業家研究』に投稿した。2.昨年度末にワシントンの議会図書館で調査した、日本企業のアメリカへのトランジスタラジオ輸出について調査を継続した。トランジスタラジオは1950年代後半の主要な対米輸出商品であり、ミシンや双眼鏡、カメラといった商品と並んで軽機械と呼ばれ、当該時期の日本経済を象徴する存在であった。すなわち労働集約的で雇用創出力があり、アメリカやヨーロッパという先進工業国への輸出が可能という意味で外貨獲得能力が高く、高度経済成長の担い手として通産省からも注目されていたのである。そこで当該産業に関する諸問題のなかで、とくに輸出活動について資料調査を進めた。国会図書館所蔵の新聞・雑誌類や日本機械輸出組合の機関誌などから、通産省によって推進された最低価格制度、または数量割当制度の意義を検討した。以上の成果は、経営史学会第42回全国大会(一橋大学2006年11月2526日)のパネルディスカッション「1950-60年代の軽機械工業-構造と役割」において、「トランジスタラジオ輸出の展開」として報告された。1.日本における電話交換システムの技術発展について、戦前期に導入された自動交換機の技術的特徴や問題点を明らかにした。先行研究は主として戦後に形成された電電公社と民間メーカーの協力関係、いわゆる電電ファミリーに注目してきたが、戦前期の動向については十分に明らかにされているとはいえなかった。そこで逓信省工務局の技師の活動を中心に、自動交換機の初期における海外調査や、導入プロセス、輸入代替政策、さらに方式統一化をめぐる技術開発を取り上げた。初期において欧米各国からの輸入に依存したために、異なる方式が混在するという問題が生じたが、これを克服するために戦前期から逓信省と民間メーカーの共同研究が進められていた。これらは終戦までに成果を出すことはできなかったものの、逓信技師を中心にこうした問題関心は戦後に引ぎ継がれ、電電ファミリーにおいて規格統一が徹底される下地を形成することになった。2.戦前期のラジオ産業における生産組織の変化について調査を進めた。国会図書館に所蔵の新聞雑誌を閲覧複写した。3.ワシントンDCの米国立公文書館所蔵の資料、および議会図書館に所蔵のエレクトロニクス産業関連の資料を閲覧および複写した。
「なかよし」の両義性の分析による幼児理解の方法の探究

「なかよし」という関係は、肯定的な側面で捉えられることが多く、葛藤的な側面を見落とされがちであった。そこで「なかよし」ということに含まれる両義性を問いながら、保育の場における幼児理解や遊びの援助に関する示唆を得ることを本研究の目的とし、幼稚園におけるフィールドワークを行った。研究のプロセスそのものを対象に幼児理解の方法に関する分析を行うとともに、幼児期の仲間関係、仲間理解に関するエピソードの検討を行った。(1)子どもたちの関係の記述方法についての検討平成16年度から継続的に同一幼稚園におけるフィールドワークを行っており、年少児クラスから見てきた子どもたちが年長児となった今年度は、主としてその年長児を中心とした観察を実施した。「なかよし」関係の中でも、あるいは「なかよし」関係であるからこそ生じる、遊びや行事に際しての役割を決めるプロセスにおける様々な葛藤場面を分析しながら、一緒に遊ぶことや仲間はずれという現象を関係の網の目から記述することを試みた。また、葛藤場面を含めた子ども達の問の出来事を記述するためには、観察者である筆者の感情をも含めたナラティヴが不可欠であることを学会発表(日本保育学会第59回大会ポスター発表「保育の場における子どもたちの世界の記述を共有するとき」及び日本質的心理学会第3回大会ボスター発表「内側から見ることと外側から見ることの往復による子どもの世界の記述の探究」など)を行いながら考察し、観察者自身を含む子どもをとりまく人々の視点、観察者自身の視点の移動によって子ども世界の記述が豊かになっていく可能性についての検討を行った。(2)保育者との子ども理解の共有方法についての検討フィールドノーツを読みやすい形にまとめたものを保育者に手渡す中で、子どもの仲間関係のありかたについて、保育者との共同的なナラティヴが生まれつつある。また、いくつかの「なかよし」場面、「いざこざ」場面のビデオ映像を用いて、幼稚園スタッフとの研究会の機会も作られた。このように保育における子ども理解のありかたを共同的に検討する中で、保育者と観察者、保育者間で子どもを語る共同的なナラティヴが作られ始めており、その記述を試みた。(1)幼稚園における「なかよし」関係のフィールドワーク同一園にて継続的に観察を行っているからこそ見えてくる「なかよし」にみえる子どもたちの関係と、その子ども達の関係を支えている関係的な網の目を、筆者自身の子どもを理解する視点を意識しつつとらえる試みを行った。今年度は、「なかよし」の形成プロセスを、特に模倣の観点から検討することを試み、年少児が共に遊んでいると見えるときの「模倣」場面の検討を行った。ある子どもの遊びの中での模倣のありかたの変化から、幼稚園という文化の中で子ども同士の間でどのように「模倣」が生じているかを考察したとき、仲間との関係、ともに遊ぶ相手としての仲間の理解の深まりを考察することができた。今後、他の子どもたちの子ども同士の「模倣」の事例も含めて、他者の意図を理解したうえで共感するような他者理解が深まるプロセスについて考察を深めていきたい。(2)保育者との共同的な「なかよし」関係の語りの探究「なかよし」におけるポジティヴな側面とネガティヴな側面をはじめとして、子どもたちの仲間関係のありかたをより多面的にとらえる試みを行った。ビデオ画像を幼稚園のスタッフと共同視聴する機会などを利用し、子ども達の仲間関係について様々なスタンスからの見えを重ね合わせ、子ども達の遊び場面ひとつとっても多声的な物語としてとらえていく必要性を自らの体験として確認していった。また、「おにごっこ」という葛藤が生じやすい場面について保育者が仲間関係をどのようにとらえているかをインタビューし、「なかよし」関係のとらえかたを検討する機会とした。「なかよし」という関係は肯定的な側面で捉えられることが多く、葛藤的な側面を見落とされがちである。この「なかよし」ということに含まれる両義性を問いながら保育の場における幼児理解や遊びの援助に関する示唆を得ることが本研究の目的であった。今年度は特に、新入園児である年少児における「なかよし」の形成プロセスを模倣の観点から見ていくことを中心に研究および研究発表をおこなった。幼稚園において子ども同士の遊び場面を中心にビデオカメラを用いて週に1回観察を行い、3歳児クラスの子ども同士の間に生じた模倣に焦点化したエピソードの分析を行った。その結果、大人の文化に子どもが参入していく際に大きな意味をもつ「模倣」は同年齢の子ども同士が遊んでいるときにも見ることができた。また、そこで見られた模倣の様相の変化は、身体的な動きに巻き込まれるような同調的な動きの模倣から、特定の他者をおいかけて真似するようなやや意図的な模倣、さらには相手の意図を理解した、互いにまなざしをおくり真似しあう模倣へと変化していることが観察された。遊びとして魅力的な動きは模倣を誘う働きを示し、それは模倣しあう仲間関係のはじまるきっかけであった。子ども同士のあいだでは、大人と子どもとの間ほどの明確なかたちでの力の差、文化の存在はみられず、仲間同士が模倣しあうことは、Corsaroの指摘する仲間文化の形成と深く関っていた。

しかし、観察の中で、模倣が生じない関係、さらには模倣を拒む関係も見られ、力関係のはじまりと見てとることもできたことから、「なかよし」の葛藤的側面と模倣は深くかかわっていることが推察された。今後、「なかよし」関係の形成プロセスの葛藤的側面を模倣を通してさらに検討していきたい。
散発性アルツハイマー病解明に向けた脳におけるアポE含有リポタンパク代謝経路の解析

アポE4は散発性アルツハイマー病の主要な危険因子である。しかし、散発性アルツハイマー病発症における役割については未だほとんど明らかにされていない。脳内におけるアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク(アポE-nHDL)として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれると考えられている。我々は、糖鎖修飾を受け、脳内に近い形のヒト・アポEをin vitro系で大量に得られる実験系を確立した。また、アポEにおける糖鎖修飾アミノ酸部位を同定し、そこへ置換変異を導入することで糖鎖修飾を受けないアポE変異体を得る事にも成功した。しかし、糖鎖修飾を受けないアポE、特にアポE4は発現培地中のpH低下で容易に変成し、アポE4の発現低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、アポE4を発現する培地にpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えたところ大幅に発現効率を高めることが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではその変換効率を上げることができなかったばかりか、これら添加剤が変換培地からアポE4-nHDLの精製を阻害することが明らかとなった。我々はまた、アポE-nHDLを脳室内に注入することでin vivoにおけるアポEの動態を解析した。マウス脳室内に様々な濃度の蛍光標識アポE-nHDLを注入したところ、神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいてアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれないことが明らかになった。そこで、これまでの報告を参考に神経損傷モデルを使用する必要があると考え、様々な濃度のカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行ったが、蛍光標識アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4は発現培地のpH低下で容易に変成し、発現量低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、発現培地に様々なpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えて試験したところ大幅に発現効率を高める条件を見出した。このため、アポE発現系のアデノウイルスによる大量発現系が構築できなかった場合に予定していた大腸菌で発現する方法の構築は回避することが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではこれら添加剤が変換培地からのアポE4-nHDLの精製を著しく阻害することが明らかとなった。そのため、アポE-nHDLを脳室内に注入するのに十分な量を得られていないため、in vivoにおけるアポEの動態の解析が実施出来ていない。これに加えて、マウス脳では神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいて脳室内に注入したアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれない。これまで神経損傷モデル動物では損傷を受けた神経にアポEが検出されることが報告されていることから、神経損傷モデルを作成し、脳室内に蛍光標識アポE-nHDLを注入することで、その取り込みを観察した。海馬神経破壊作用のあるカイニン酸を様々な濃度で投与することで神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行った。しかし、アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。上述の通り、研究は難航しており、当初の目標の半分程度しか達成できていない。糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4からアポE4-nHDLへ変換させるin vitro系では脳室内に注入するのに十分な量のアポE4-nHDLが得られていないため、in vivoにおけるアポEの動態の解析が実施出来ていない。pH安定化剤は変換培地中に加えすぎると細胞毒性が上がり、又タンパク質安定化剤をプロテアーゼ阻害剤混合物では効果はあるものの費用がかかり過ぎるのが難点である。今後も脳室内に注入するのに十分な量のアポE4-nHDLが得られるin vitro系の条件を検討する。現在最も困難だと思われる点は、マウス脳では神経初代培養細胞とは異なり、脳室内に注入したアポE-nHDLが神経細胞にほとんど取り込まれないことである。特に、カイニン酸による神経損傷モデルでのアポE-nHDLの神経細胞への取り込みが観察できなかったのは予想外である。というのも、神経細胞は定常状態ではほとんどアポE-nHDLを取り込まないが、神経細胞の増殖、神経突起の進展、損傷修復等の時には盛んにアポE-nHDLとしてコレステロールを要求することが示されている。また、脳虚血・再灌流モデルのスナネズミ海馬では、損傷を受けた海馬神経細胞に多量のアポEが沈着することが報告されている。さらに、ヒトの脊髄損傷でも、損傷を受けた部位の神経細胞にアポEの沈着が報告されているからである。カイニン酸による神経損傷モデルで良好な結果が得られなかったことから、再現性に不安を残すがドライアイスなどによる直接的な神経障害モデルを試みる。だだし、この方法は操作が煩雑であるため、各個体の障害レベルをコントロール出来ないため、再現性や定量性に不安を残す可能性がある。もし、ドライアイスによる直接的な神経障害モデルでもアポE-nHDLの取り込みが認められなかった場合は、in vivoによる実験系を放棄せざる負えないかもしれない。

脳内におけるアポEはコレステロールなどの脂質と複合体を形成し、いわゆるアポE含有リポタンパク(アポE-nHDL)として存在し、アポEを認識する受容体を介して神経細胞に取り込まれると考えられている。我々は、糖鎖修飾を受け、脳内に近い形のヒト・アポEをin vitro系で大量に得られる実験系を確立した。また、アポEにおける糖鎖修飾アミノ酸部位を同定し、そこへ置換変異を導入することで糖鎖修飾を受けないアポE変異体を得る事にも成功した。しかし、糖鎖修飾を受けないアポE、特にアポE4は発現培地中のpH低下で容易に変成し、アポE4の発現低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、アポE4を発現する培地にpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えたところ大幅に発現効率を高めることが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではその変換効率を上げることができなかったばかりか、これら添加剤が変換培地からアポE4-nHDLの精製を阻害することが明らかとなった。我々はまた、アポE-nHDLを脳室内に注入することでin vivoにおけるアポEの動態を解析した。マウス脳室内に様々な濃度の蛍光標識アポE-nHDLを注入したところ、神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいてアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれないことが明らかになった。そこで、これまでの報告を参考に神経損傷モデルを使用する必要があると考え、様々な濃度のカイニン酸投与による海馬神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行ったが、蛍光標識アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。糖鎖修飾を受けないアポE変異体、その中でもアポE4は発現培地のpH低下で容易に変成し、発現量低下及びアポE4からアポE4-nHDLへの変換効率を低下させる。そこで、発現培地に様々なpH安定化剤及びタンパク質安定化剤を加えて試験したところ大幅に発現効率を高める条件を見出した。このため、アポE発現系のアデノウイルスによる大量発現系が構築できなかった場合に予定していた大腸菌で発現する方法の構築は回避することが出来た。ところが、アポEからアポE-nHDLへ変換させるin vitro系ではこれら添加剤が変換培地からのアポE4-nHDLの精製を著しく阻害することが明らかとなった。そのため、アポE-nHDLを脳室内に注入するのに十分な量を得られていないため、in vivoにおけるアポEの動態の解析が実施出来ていない。これに加えて、マウス脳では神経初代培養細胞とは異なり、in vivoにおいて脳室内に注入したアポE-nHDLは神経細胞にほとんど取り込まれない。これまで神経損傷モデル動物では損傷を受けた神経にアポEが検出されることが報告されていることから、神経損傷モデルを作成し、脳室内に蛍光標識アポE-nHDLを注入することで、その取り込みを観察した。海馬神経破壊作用のあるカイニン酸を様々な濃度で投与することで神経損傷モデルを作成し、同様の実験を行った。しかし、アポE-nHDLの神経細胞への取り込みは観察できなかった。上述の通り、研究は難航しており、当初の目標の半分程度しか達成できていない。
発話表現意図に関わる文末形式・イントネーションの分析と指導法の開発

ダロ-・デショー、ジャナイ・ジャナイデスカで終わる文の、文末のイントネーションを分析した。これらの形式は、助動詞ダの活用形からできたもので、ダロ-は推量、デショーはそのていねいな形、ジャナイは否定デハナイの縮約形、ジャナイデスカはそのていねいな形の疑問の形式である。これらの形式は助動詞としての用法のほかに、聞き手に対する話者の働きかけを表す、終助詞と似た用法を持つ。この研究の目的は、助動詞的な用法と終助詞的な文末表現としての用法の違い対応したイントネーションの違いが見られるかどうかを明らかにすることである。テレビ番組をビデオ録画して、用法を収集した。用例は用法(助動詞か、文末表現としての確認要求か)によって分類した。文末のピッチの上昇・下降を判定した。下降調はすべての用法の文末に現れた。ダロ-・デショーの推量の用法、不定詞と共起する疑問文はすべて下降調を取っていた。しかし、上昇調しか現れない用法はなかった。これは、文を終始するイントネーションとしては下降調が無標であることを示唆する。確認要求の用法では上昇調を取るものが比較的多く現れた。デショーで65%、他の形式で2428%であった。しかし、上昇調を確認要求の必須のピッチパタンとするほど強い傾向ではなかった。ジャナイのFOを音響分析した結果、否定の意味の時と確認要求のときとで類型的なピッチパタンの差が見られた。これは否定に特有のピッチパタンがあるということで、確認要求のピッチパタンは否定のパタンの特徴が顕在しないパタンというように、ネガティブな形で定義することになる。イントネーションによって表現形式のあいまいさが解消される文末形式として、「だろう/でしょう」と「じゃない/じゃないですか」を取り上げ、これらの文末表現の実際の使用状況を把握するために、TVの対話番組4本と独話番組1本を録画した。その結果、番組によって用例の分布に大きな偏りが見られた。ひとつは談話の種類による偏りで、独話や対話でも独話に準じるような解説的な番組ではでは、聞き手に同意を求める「でしょう」や「じゃない」は使用されていない。もうひとつは待遇度による偏りである。これには言語形式の待遇度と言語行動の待遇度があり、丁寧な対話では待遇の低い形式ばかりでなく、相手に同意を求めること自体が避けられている。「だろう」「じゃない」ばかりでなく「じゃないですか」も使用されない。資料中の文末に現れる「でしょう・だろう」、「じゃない・じゃないか・じゃないですか」のピッチ・カーブを分析した。「でしょう」は文末でピッチが下降するものとしない(上昇を含む)ものに大別でき、下降しないものは<念押し>の用法に対応する傾向が見られた。文末で上昇する場合、上昇の程度を左右する条件はあきらかでない。上昇調のものは、最後の母音が短く発音される傾向があるが、下降調でも短いものもあり、母音の長短は用法の違いに対応しているわけではない。それに対して「じゃない」類が下降調で発話されたの場合、否定の助動詞と<念押し>の用法は文末の自然下降と重なりはっきりとしたピッチの差を示していない。また、<念押し>と解釈できる「じゃないですか」が上昇調で発話しされた例もあり、イントネーションが用法を決定しているとはいえない。イントネーションによって表現形式のあいまいさが解消される文末形式として、ダロ-/デショー、ジャナイ/ジャナイデスカを取り上げた。

テレビ番組を1チャンネル17分ずつ1日7回録画し、その一週間分を資料とした。上記の4形式に他の形式が付加せず、そこで言い切りになって文が終止している例が全体で200余例あった。デショーが約120例、ついでジャナイデスカ(36例)>ジャナイ(23例)>ダロ-(16例)である。対話では4形式すべてが用いられているが、ニュースなどの読み言葉ではジャナイ系は出現しないと言う文体による分布の偏りがあった。共起関係などの語彙的・統語的基準、話者の交代の有無などの語用論的基準、意味的基準から用例を分類し、文末イントネーションの上昇・下降との関連を調べると、下降調はすべての場合に現れたが、上昇調の出現には用法によってばらつきがあった。例えばデショーは、「いつ・何」等の疑問を表す語と共起する疑問文、および「推量」の場合はすべて下降調だった。それに対して「確認要求」の例では上昇・下降のどちらも現れ、上昇調がやや優勢だった。下降調は文を終止する無標の音調、上昇調は有標という仮説で、上昇調を使うことのできる、あるいは、使うことのできない条件の分析を進めている。ジャナイに見られる否定の助動詞と文末形式の音響的な違いは、当該部分のピッチパタンの違いばかりでなく、否定文のフォーカスの部分との関係も視野に入れて分析する必要がある。