hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
斜角入射波を用いる音弾性残留応力測定原理の確立

本研究は、斜角入射波を利用する新たな音弾性測定を実現するための基礎研究であり、音弾性特性の一般的な理論解析を行ない、非破壊測定の障害となる実用材料の異方性(組織異方性)が縦波、横波の音速に及ぼす効果を理論的、実験的に明らかにすることを目的にしている。実験では、鋼試料に斜角で入射する縦波の入射方位角θ,φを、ウェッジ角と送受トランスデューサ方向の回転によって変化させて、試料中の反射波の伝播時間T(θ,φ)を測定した。これらから得られた結果は以下のように要約される。1.織異方性が弱直交異方性の場合に、任意の伝播方位角に対して音速と偏り方向の摂動第1近似解を求め、特に多結晶モデルに基づく組織異方性の場合に、組織異方性の効果と応力の効果を明確な形で表現した。2.斜角縦波の音速と偏った2つの斜角横波の平均音速が、利用しやすいθ,φ依存性をもち、特に多結晶モデルに基づく組織異方性の場合には、両音速が比例する理論結果を得た。3.伝播方位角φを変える測定では、反射波の伝播時間に明瞭なφ依存性が現れ、縦波伝播時間のφによる変化が理論結果と良く一致することを示した。4.縦波伝播時間については、そのθ依存性も理論結果と良く一致しており、これによって3個の組織異方性パラメータが求められることを示した。またこの結果は、多結晶モデルに基づく組織異方性とは幾分異なることを示した。今後は,伝播時間のθ依存性をより明確に結論づけるために,測定精度の向上と横波の測定結果の有効な整理法について検討する予定である。本年度は2年計画の1年目であり、前期に(1)理論解析と(2)実験準備、後期に(3)縦波斜角入射測定と(4)横波偏り方向の測定を予定した。主な実績は以下の通りである。1.斜角入射波の伝播特性の解析異方性体中の弾性波の伝播解析に摂動法を適用し、組織異方性が多結晶モデルに基づく弱い直交異方性の場合に対して、縦波と横波の音速、及び横波の偏り方向と伝播方向の関係を明確な形に表示した。またこの結果に基づいて、音速と偏り方向に対する組織異方性と応力の効果を数値計算し、その特徴を明らかにした。これについては日本機械学会関西支部講演会(平成12年3月17日)で発表する予定である。2.組織異方性による斜角入射縦波の音速変化の測定鋼試料に縦波を斜角入射させ、反射波の伝播時間が伝播方向の方位角θ,φによって明確に変化すること、そしてこの伝播時間のφ依存性が上記1の関係式で良く説明されることを確かめた。また、反射波の経路とモード変換を考慮して、伝播時間の測定結果を縦波伝播時間と横波伝播時間に分離し、それぞれの伝播時間のθ依存性を明らかにするための基礎データを整理した。以上は、当初予定の(1)(3)についての主要な成果であり、現在は、当初予定の(4)を重点にして測定を行っている。本年度は2年計画の2年目にあたる。昨年度後半から本年度にかけて、斜角入射縦波の音速(伝播時間)と伝播方向(入射方向)の関係を実験的に求め、その結果を第4回音弾性応用計測研究会(日本非破壊検査協会、平成12年5月5日)で発表した(鋼圧延板試料)。但しこの測定結果ではまだバラツキが十分には抑えられておらず、伝播方向を表すθ(入射角)、φ(伝播面方向角)の内、θ依存性の整理結果が信頼性の乏しいものとなった。

本研究では、組織異方性の一般的な特徴を実験的に明らかにし、その結果を残留応力の非破壊測定に利用することを意図しており、音速のθ、φ依存性から組織異方性パラメータを求めることが基本的に重要となる。そのため、本年度は、実験方法を見直し、厚さの異なる3種類の鋼圧延板試料について、あらためて音速異方性の測定を行った。得られた結果は、バラツキが少なく再現性の十分なものであり、試料の組織異方性の違いを明瞭に示している。この測定結果については、組織異方性を一般の弱い直交異方性とする理論関係で整理を終えており、現在、組織異方性が理論的に予想されている特徴を有するかどうかの最終的な検討を行っている。
q-spaceイメージングによる脊髄損傷メカニズムの解明

代表研究者らは、q-space imagingによる独自の髄鞘の可視化法を開発し、霊長類コモンマーモセット損傷脊髄に対する同種神経幹細胞移植の実験に応用することにより、移植細胞の再髄鞘化が脊髄の再生メカニズムの一つであることを本研究によって示している。H22年度に掲げた研究目的、研究実施計画は本研究資金のおかげで100%遂行することができた。具体的には(1)髄鞘形成不全mutantマウスを用いたMyelin mapの精度検証と、(2)コモンマーモセット化学的脊髄損傷における脱髄と再髄鞘化の検証を行い、予想した結果を得た。(2)成体common marmosetの第5頚椎高位に、lysophatidylcholineをinjectionし、化学的脊髄損傷モデルを作成した。損傷モデルの作製およびMRIの撮像は全身麻酔下に行った。各time point(損傷前、損傷後2週、4週、10週)においてQSIとDTI,DTTを撮像した。還流固定後に凍結切片を作製しLFB染色、HE染色で組織学的評価を行った。また電子顕微鏡にて損傷後2週における脱髄と、損傷後10週における再髄鞘化を確認した。組織とQSIを徹底的に比較検討し、QSIを応用したわれわれ独自の髄鞘の可視化法"Myelin map"が同一動物において脱髄と再髄鞘化を評価できることを証明した。以上の(1)、(2)の結果より、われわれは世界で初めての髄鞘の可視化法の開発に成功し、これを"Myelinmap"と命名した。われわれは神経幹細胞移植を主軸とした脊髄再生に取り組み、移植細胞が機能回復に寄与することを報告してきたが、そのメカニズムは不明である。一方、マウスES細胞やiPS細胞由来の神経幹細胞の実験において移植細胞の再髄鞘化とglial supportが重要であることを証明し、報告してきた(Kumagai、et al,2009.,Tsuji,et al,2010)。しかし、これまでに髄鞘をin vivoで評価する方法はなく、新たなtoolの開発が期待された。そこで損傷脊髄における組織の微細な変化を捉えるために、拡散MRIの先進技術であるq-spaceイメージングを導入し、髄鞘を特異的に描出する"Myelin map"を開発したH23年度の髄鞘形成不全mutant miceと霊長類commonmarmoset化学的脊髄損傷モデルを用いた実験によって、Myelin mapが確かに髄鞘の情報を可視化していることが証明された。本年度の研究の目的は、Myelin mapが圧挫損傷においても髄鞘の情報を正確に描出できることを確認すると同時に、世界ではじめての霊長類の脊髄損傷モデルにおける同種神経幹細胞移植を実現し、Myelin mapで評価することによって脊髄再生のメカニズムの一端を解明することである。本研究は脊髄損傷の病態解明に役立つだけでなく、現在有効な治療法のない神経疾患の新規治療開発に結びつくと考えられ、将来的に世界に広く普及する可能性のある重要性の高い研究である。研究目的、研究実施計画は以下のように予定のすべての研究を遂行した。(1)霊長類脊髄圧挫損傷における脱髄の過程をMyelin mapで詳細に解析できた。(2)common marmosetE135脊髄由来の神経幹細胞を圧挫損傷脊髄に移植したところ、著しい移植細胞による再髄鞘化を確認できた。
環境中微量有害物質の量反応関係に基づいたヒト健康影響評価法の確立に関する研究

過去3年間に渡って、ダイオキシンの量・反応関係に基づいたヒト健康影響評価法について研究してきた。ラットでは、肝癌発生時のダイオキシンの肝中量は24ng/9であった。ヒトでは、ラットの肝癌発生時の濃度には決して達していないこと、何等かの影響がみられるラットでの10ng/kg/日の量にも達していないことがわかった。生産平均1日曝露量をもとに、米国EPAのダイオキシンの発癌の最も可能性のある係数(動物実験から1人のヒトが一生曝露されて1/10^6で発癌する確率:9×10^<-6>ng/kg/日)を用いて、ヒトの高濃度曝露群の全癌、肺癌、軟部細織肉腫のバックグランド発生一般人口での発生)率とダイオキシンによる発癌の率を計算し、果たしてダイオキシンによる発癌が検出されるのかどうかを計算すると、少なくとも全癌や肺癌では、たとえダイオキシンで発癌していても検出できないこと、すなわち他の原因による一般人口の発癌と区別できないこと、米国の農薬製造労働者とセベソの事故での塩素座瘡を示した者でのみ、軟部細織肉腫が有意に検出されることを示した。この場合、米国EPAの1/10^6発癌値が、仮に2倍となると全く検出されなくなった。すなわち、現在のところ、ヒトの過去における高濃度曝露者では、どんな曝露でもヒトの発癌を明らかにするだけの量に達していないこと、また、仮にダイオキシンに発癌性があるとしても、ヒトの集団の疫学でそれを検出できないことを示している。以上、本研究は、動物実験において、ダイオキシンの投与量をもとに生体影響を観察し、ダイオキシンのヒト影響を毒性学的に量と反応の関係から推定しようとするものである。これら多くのデータが集まり、ダイオキシンの生体内量の測定が行われ、そのデータが集積してくれば、より正確に耐容1日量などが計算できるものと考えられ、その日が一日も早く到来することが望まれる。ダイオキシンは、内分泌を撹乱し、発癌作用も有する環境中の微量有害化学物質であると考えられているが、現段階では、動物実験による証拠だけで、実際ヒトの健康に影響を及ぼすのかどうか明らかにされていない。それは、ダイオキシンを含む化学物質の安全性評価の手法が確立されていないからである。トキシコロジーで最も重要なのは、量・反応関係および量・影響関係である。すべての毒性は、奏効部位での量によって決まるというのが原則である。これまでのダイオキシンの生体影響は、すべて投与量(曝露量)を基に推定され、耐容1日摂取量も全て投与量を基に計算されてきた。しかし、真の毒性量や基準量を決定するのは、奏効部位の有害物質の量であるという原則に基づいてこれからの毒性量や基準量は推定される必要がある。このような量・反応関係を求めるためには、生体組織中のダイオキシンの測定を正確にすること、ダイオキシンの投与量と体内量(特に奏効部位)の関係を求めること、ダイオキシンの体内での代謝を明らかにし、生物学的半減期や臓器分布を正確に知ることが必要不可欠である。そのため、本年度は(1)血液、標的臓器、軟部組織におけるダイオキシン(TCDD)およびベンツピレンのassay系を液体クロマトグラフィを用いて確立する、

(2)予備実験をして、低用量から高用量のダイオキシン(TCDD)あるいは、ベンツピレンをラットに与え、量・反応関係の確立と投与期間を決定する予定であり、現在基礎実験が進行中である。ダイオキシンは、内分泌を撹乱し、発癌作用も有する環境中の微量有害化学物質であると考えられているが、現段階では、動物実験による証拠だけで、実際ヒトの健康に影響を及ぼすのかどうか明らかにされていない。それは、ダイオキシンを含む化学物質の安全性評価の手法が確立されていないからである。トキシコロジーで最も重要なのは、量・反応関係および量・影響関係である。すべての毒性は、奏効部位での量によって決まるというのが原則である。これまでのダイオキシンの生体影響は、すべて投与量(曝露量)を基に推定され、耐容1日摂取量も全て投与量を基に計算されてきた。しかし、真の毒性量や基準量を決定するのは、奏効部位の有害物質の量であるという原則に基づいてこれからの毒性量や基準量は推定される必要がある。このような量・反応関係を求めるためには、生体組織中のダイオキシンの測定を正確にすること、ダイオキシンの投与量と体内量(特に奏効部位)の関係を求めること、ダイオキシンの体内での代謝を明らかにし、生物学的半減期や臓器分布を正確に知ることが必要不可欠である。そのため、本年度は、(1)昨年度確立したアッセイ系を用いて、ダイオキシン及びベンツピレンの標的臓器(肝臓)への蓄積量からみた量・反応関係をラットにおいて作成中である。また(2)ラットで得られた血中(脂質中)量:標的臓器中量の比を基にして、文献的に得られたヒトの血中(脂質中)のダイオキシンあるいはベンツピレンの量から、ヒトの標的臓器中のこれらの化学物質の量を算出し、ヒトでのダイオキシンあるいはベンツピレンの量・反応関係を作成している。過去3年間に渡って、ダイオキシンの標的臓器(肝臓)への蓄積量からみた量・反応関係をラットにおいて作成し、また文献的に得られたヒトの血中(脂質中)のダイオキシンの量から、ヒトの肝中ダイオキシンの量を算出し、ヒトでのダイオキシンの量・反応関係を作成してきた。極めて少量曝露では、肝の異常巣や細胞増殖は、逆に抑えられていた。生化学的変化では、最小濃度2.5pg/gで、最も鋭敏なCYP1A1mRNAの誘導がみられた。これらの変化は、生化学的な変化がみられるものを対象にしており、その意義、すなわち、悪影響であるのか、何等かの健康障害をもたらすものであるのかなどは、全くわかっていない。明らかな異常として、病理学的変化を対象に、同様に臓器中量と影響の関係をみると、肝で500pg/g以上で、病理学的に明らかな異常が認められた(肝細胞増殖)。生化学的変化を生ずる閾値は、肝中ダイオキシン量2.5pg/g(上下に10の幅をとると、0.25-25pg/g)であり、明らかに異常な病理学的変化をもたらす閾値は、肝中ダイオキシン500pg/g(安全幅をみると、50-5000pg/g)であった。この量・反応関係のデータ(2.5pg/g-500pg/gの間には、免疫抑制(220pg/g)、レセプター調節異常(340pg/g)などが含まれる)を基に、文献的に調べたヒトのデータを当てはめると、イタリアで発生したセベソ事故などでみられた高濃度曝露による塩素座瘡ありの者(1592pg/g)以外は、ダイオキシンの曝露レベルが病理学的な異常レベルに達していないことが判明した(研究成果報告書参照)。
31種の広葉樹人工同齢単純林における18年間の林分構造変化と材積成長量の解析

本研究では1618年度にかけて,岩手大学滝沢演習林の31種の広葉樹人工林37林分を対象に,18年問の林分構造と林分材積成長皿の変化特性を明らかにすることを目的とする。18年度の研究実積は以下の通りである。1.1112月,植栽木による立木度の高い19林分において植栽木の胸高直径を再測し,2年問の胸高直径成長量を推定した。2.3月,上記の19林分のうち,主要な冷温帯樹種8樹種9林分において植栽木から標準木10本ずつを選定し,生枝下高と樹高を測定した。3.広葉樹人工林の造成事例に関する資料収集のため,11月東京千代田区,1月東京千代田区に出張した。4.4月の森林学会でポスター発表し,森林計画学会誌と岩手大学農学部演習林報告に論文を1報ずつ掲載した。5.調査の結果は以下の通りである。19林分において2004年時点の胸高直径と2年間の胸高直径成長量との対応関係を調べた結果,全ての林分でサイズ依存成長が認められ,相対的に細い林木ほど成長量が低かった。現時点で植栽木の本数密度が低く林分材積純成長量が低い林分には,多くの侵入木により種間競争が激化している林分と,樹高の高い隣接林分により被圧されている林分が認められた。北米産4種の林分成長特性を解析した結果,いずれの樹種とも岩手県の標準的な広葉樹天然生林の地位1等もしくはそれ以上の樹高成長を示した。特にユリノキの林分材秋は地域のスギ人工林の地位1等に匹敵した。国内冷温帯の高木性広葉樹8種の林分成長特性を解析した結果,いずれの樹種とも岩手県の標準的な広葉樹天然生林の地位1等もしくはそれ以上の樹高成長を示した。これらの林分は1000本3083本/haと中・低密度で植栽された林分にも関わらず,羽状形の樹冠を有するウダイカンバ,シラカンバ,カツラの生枝下高は10m前後と顕著に高く,早期の間伐が必要と考えられた。本研究では1618年度にかけて,岩手大学滝沢演習林の31種の広葉樹人工林37林分を対象に,18年間の林分構造と林分材積成長量の変化特性を明らかにすることを目的とする。16年度の研究実績は以下の通りである。1.広葉樹人工林の毎木調査を10月から滞りなく遂行するため,7月に各種消耗品を購入し,78月に謝金で研究補助員を雇い,林分境界の杭打ち,植栽木と胸高直径3cm以上の侵入木の個体識別と胸高帯の塗布を行った。2.サワグルミ人工林の林分構造と成長量を定量評価する際の対照を得るため,8月に岩泉町に出張し,サワグルミ若齢天然林の林分構造と年輪のデータを得た。これは交付申請書提出後に計画に追加した調査である。3.上記1の作業の結果,演習林にはスズメバチ(以下,ハチ)の巣が著しく多く,ハチによる調査員の事故が危惧された。そのため,気温低下によりハチの野外活動が終息する11月中旬以降から12月末にかけて演習林で毎木調査を行った。研究補助員とともに植栽木と胸高直径3cm以上の侵入木について,胸高直径を測定した。4.12月に,研究補助員とともに各林分から1030本程度の標準木を選び,樹高を測定した。5.広葉樹林の構造と成長に関する資料収集のため,12月東京千代田区,1月東京文京区,3月仙台市に出張した。6.調査の結果,この10年間で植栽木の本数密度が-1003,266本/ha(平均638本/ha)減少し,平均直径が0.261.21cm/年(平均0.57cm/年)増加,平均樹高が0.080.93m/年(平均0.40m/年)増加,林分材積が-2.332.2m^3/ha/年(平均7.5m^3/ha/年)増加していることが分かった。なお,標準木の樹高調査時に,上記3の毎木調査ミス(枯損木や樹種の判定ミス)が一部確認されたため,研究成果の数値が17年度の補足調査で若干修正される。17年度の研究実績は以下の通りである。1.68月,広葉樹人工林37林分内に2m幅の帯状調査区を設置し,樹高1.3m以上胸高直径3cm未満の侵入木を対象に樹種名・樹高を記録した。各帯状調査区内に1m^2のコドラートを3箇所設置し,その中のササの種名・稈高を記録した。2.全コドラートで着葉期(8月)と落葉期(11月)のササ群落表面の光量,土壌含水率,A_0層とA層の厚さを計測した。3.広葉樹人工林の造成事例および植生データの多変量解析に関する資料収集のため,10月東京千代田区,1月東京千代田区に出張した。4.調査の結果は以下の通りである。

上層木・光量・土壌と,低木・ササの変数間での相関分析より,上層木の発達に伴い低木の樹高は低くなる傾向が認められた。このことから,林冠構成種に関係なく低木の生長は上層木の生長度合と負の関係にあると考えられる。ササについては,上層木が生長するとササの生長は被圧され,光量が増加するとササの生長も良くなった。また,上層木,光量,ササの変数を用いてパス解析を行った結果,上層木の本数密度がササ上空の光量に影響を与え,さらにその結果ササの地上部現存量に影響を与えていることが分かった。林縁部における低木とササの変数を比較した結果,低木の本数密度と樹種数は,林道側より天然林側において多く,ササの平均稈高や地上部現存量は,林道側より天然林側において少なかった。落葉性広葉樹であっても,隣接して森林のない人工林であれば,多数の樹木の侵入は期待できず,樹木種の多様性が高まらない可能性がある。本研究では1618年度にかけて,岩手大学滝沢演習林の31種の広葉樹人工林37林分を対象に,18年問の林分構造と林分材積成長皿の変化特性を明らかにすることを目的とする。18年度の研究実積は以下の通りである。1.1112月,植栽木による立木度の高い19林分において植栽木の胸高直径を再測し,2年問の胸高直径成長量を推定した。2.3月,上記の19林分のうち,主要な冷温帯樹種8樹種9林分において植栽木から標準木10本ずつを選定し,生枝下高と樹高を測定した。3.広葉樹人工林の造成事例に関する資料収集のため,11月東京千代田区,1月東京千代田区に出張した。4.4月の森林学会でポスター発表し,森林計画学会誌と岩手大学農学部演習林報告に論文を1報ずつ掲載した。5.調査の結果は以下の通りである。19林分において2004年時点の胸高直径と2年間の胸高直径成長量との対応関係を調べた結果,全ての林分でサイズ依存成長が認められ,相対的に細い林木ほど成長量が低かった。現時点で植栽木の本数密度が低く林分材積純成長量が低い林分には,多くの侵入木により種間競争が激化している林分と,樹高の高い隣接林分により被圧されている林分が認められた。北米産4種の林分成長特性を解析した結果,いずれの樹種とも岩手県の標準的な広葉樹天然生林の地位1等もしくはそれ以上の樹高成長を示した。特にユリノキの林分材秋は地域のスギ人工林の地位1等に匹敵した。国内冷温帯の高木性広葉樹8種の林分成長特性を解析した結果,いずれの樹種とも岩手県の標準的な広葉樹天然生林の地位1等もしくはそれ以上の樹高成長を示した。これらの林分は1000本3083本/haと中・低密度で植栽された林分にも関わらず,羽状形の樹冠を有するウダイカンバ,シラカンバ,カツラの生枝下高は10m前後と顕著に高く,早期の間伐が必要と考えられた。
ショウジョウバエ自然集団における味覚感度の遺伝的多型を用いた糖受容機構の解析

ショウジョウバエ自然集団における糖味覚感度の多型を用いて糖受容体遺伝子の探索を行ってきた。昨年度までの研究で、野外のショウジョウバエから確立された近交系系統(DGRP)のフルクトースの味覚感度には遺伝的多型があり、その多型に糖受容体候補遺伝子Gr64a-Gr64fが関わっていることを明らかにした(Uchizono and Tanimura, Chem. Senses, 2017)。本年度は当研究プロジェクトの最終年度として、フルクトースおよびその他8種類の糖の受容にそれぞれどの糖受容体候補遺伝子が関与しているのか調べた。Gr64a-Gr64f欠失突然変異体の唇弁味覚感覚子からの糖刺激に対する神経応答を記録し、フルクトースを含めた9種類の糖の受容にいずれもGr64a-Gr64f遺伝子が関わっていることを明らかにした。さらに、Gr64a-Gr64f遺伝子欠失突然変異体にGr64a、Gr64b、Gr64c、Gr64d、Gr64e、Gr64fの6個の遺伝子のうち5個だけをレスキューした系統を用いて唇弁味覚感覚子からの神経応答を記録し、9種類の糖の受容にそれぞれGr64a-Gr64fのどの遺伝子が関与しているのかを調べた。以上の研究成果のうち、フルクトース味覚感度とGr64a-Gr64fの各遺伝子の関わりについて論文にまとめ、Molecules and Cells誌に発表した。これまでの研究成果から、ショウジョウバエの糖受容にはGr64a-Gr64f遺伝子ファミリーが関わっていること、糖の種類に応じてGr64a-Gr64fのうち異なる遺伝子が関与していることが明らかになった。今回確立したGr64a-Gr64f遺伝子欠失突然変異体とその部分的レスキュー系統を用いた実験系は、今後ショウジョウバエの糖受容体を解明する上で役立つと期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により、キイロショウジョウバエの自然集団から確立された近交系系統DGRP(Mackay et al., 2012)を用いた味覚嗜好性テストによって、ハエ自然集団内の糖の味覚感度に遺伝的多型があることを明らかにした。また、ハエの味覚器である唇弁を糖溶液で刺激し、味細胞からの神経応答を記録した結果から、野外のハエにはフルクトース感度が大きく異なる系統が存在することがわかった。そこで、ショウジョウバエの糖受容体候補遺伝子として考えられている9個のGr(Gustatory receptor)遺伝子に着目し、フルクトース感度への関与を調べた。9個のGr遺伝子欠失系統とフルクトース低感度系統を交配して得られたF1のフルクトース感度を味覚嗜好性テストで調べた結果、Gr64a-fの6遺伝子すべてを欠失した系統とのF1のハエはフルクトース感度が低いことがわかった。一方で、ショウジョウバエの脳内で栄養センサーとして働くフルクトース受容体をコードしていることが報告されていたGr43a遺伝子(Miyamoto et al., 2012)の欠失系統とのF1のハエのフルクトース感度は、フルクトース低感度系統より高く、今回調べたDGRP2系統のフルクトース感度の違いの原因遺伝子ではなかった。そこで、Gr64a-fのうち5個の遺伝子の欠失系統とフルクトース低感度系統のF1のハエで味覚嗜好性テストを行い、どの遺伝子がフルクトース感度に関わるのかを調べた。その結果、Gr64b欠失系統とフルクトース低感度系統のF1のフルクトース感度がフルクトース低感度系統と同程度だったことから、野外のハエのフルクトース感度の違いにはGr64b遺伝子が関与していることが示唆された。これまでの遺伝解析によってGr64糖受容体遺伝子ファミリーがフルクトース感度に関わることがわかってきた。当該年度中に、Gr64遺伝子ファミリーに属する6遺伝子うちGr64dを除く5個の遺伝子の欠失突然変異体が作製され(Fujii et al., 2015)、それらの系統を入手することができたので、Gr64a-fのどの遺伝子がフルクトース感度に関わっているのか調べることができた。また、候補遺伝子の発現量解析をするにあたりセットアップが必要であった。しかし、大韓民国の研究機関KAISTへの滞在中に発現量解析前に必要な実験の一部を行うことができ、想定していたよりも短期間でセットアップを済ませ、発現量解析を始めることができた。以上の理由から、当該年度にはおおむね順調に実験を進展させることができ、ショウジョウバエの自然集団内に存在するフルクトース味覚感度の遺伝的多型に関わる候補遺伝子を絞り込むことができた。昨年度までの研究により、野外のショウジョウバエから確立された近交系系統(DGRP)におけるフルクトースの味覚感度の多型に糖受容体候補遺伝子のGr64a-Gr64f遺伝子ファミリーが関与していることがわかった。一方で、ショウジョウバエの脳内で栄養センサーとして働くフルクトース受容体Gr43a遺伝子の関与について調べるために、その欠失変異体とフルクトース低感度のDGRP系統とのF1のハエで味覚嗜好性テストを行った結果、Gr43aは私が調べたDGRP2系統のフルクトース感度の違いの原因遺伝子ではないことが示唆された。そこで28年度にはまず、Gr43aが外部でのフルクトース受容に関わっているのかをGr43a欠失変異体とそのレスキュー系統を用いた味覚嗜好性テストで調べた。

Gr43a欠失変異体のフルクトース感度はフルクトース低感度系統の感度と同程度で、レスキュー系統ではフルクトース高感度系統の感度と同程度であることがわかった。また、Gr43a遺伝子を脳内のGr43a発現細胞でのみレスキューした系統ではフルクトース感度がレスキューされず、Gr43a欠失系統のフルクトース感度とほぼ同じであったことから、末梢の味覚器で発現するGr43aもまたフルクトース感度に関与していることが示唆された。以上の結果と昨年度までの研究成果を合わせて論文にまとめ、英国学術誌Chemical Senses(2017年2月5日付オンライン速報版)に発表した。当該年度の研究計画として、糖の味覚感度の多型に関わる遺伝子の探索を予定していた。現在までに、野外のショウジョウバエから確立されたDGRP系統のフルクトースの味覚感度の多型に糖受容体候補遺伝子のGr64a-Gr64f遺伝子ファミリーが関わっていることを明らかにできた。また、ショウジョウバエの脳内で栄養センサーとして働くフルクトース受容体Gr43a遺伝子(Miyamoto et al., 2012)についても末梢の味覚器でのフルクトース感度に関わっているが、私が調べているDGRPの2系統のフルクトース感度の違いには関与していないことを明らかにできた。これらの研究成果を当該年度中に国際学術誌に発表できたことに加え、翌年度に予定している「糖感度の多型の分子レベルでの解明」に向けた一部の実験を当該年度中に行うことができたことから、当初の計画以上に研究が進展していると判断した。ショウジョウバエ自然集団における糖味覚感度の多型を用いて糖受容体遺伝子の探索を行ってきた。昨年度までの研究で、野外のショウジョウバエから確立された近交系系統(DGRP)のフルクトースの味覚感度には遺伝的多型があり、その多型に糖受容体候補遺伝子Gr64a-Gr64fが関わっていることを明らかにした(Uchizono and Tanimura, Chem. Senses, 2017)。本年度は当研究プロジェクトの最終年度として、フルクトースおよびその他8種類の糖の受容にそれぞれどの糖受容体候補遺伝子が関与しているのか調べた。Gr64a-Gr64f欠失突然変異体の唇弁味覚感覚子からの糖刺激に対する神経応答を記録し、フルクトースを含めた9種類の糖の受容にいずれもGr64a-Gr64f遺伝子が関わっていることを明らかにした。さらに、Gr64a-Gr64f遺伝子欠失突然変異体にGr64a、Gr64b、Gr64c、Gr64d、Gr64e、Gr64fの6個の遺伝子のうち5個だけをレスキューした系統を用いて唇弁味覚感覚子からの神経応答を記録し、9種類の糖の受容にそれぞれGr64a-Gr64fのどの遺伝子が関与しているのかを調べた。以上の研究成果のうち、フルクトース味覚感度とGr64a-Gr64fの各遺伝子の関わりについて論文にまとめ、Molecules and Cells誌に発表した。これまでの研究成果から、ショウジョウバエの糖受容にはGr64a-Gr64f遺伝子ファミリーが関わっていること、糖の種類に応じてGr64a-Gr64fのうち異なる遺伝子が関与していることが明らかになった。今回確立したGr64a-Gr64f遺伝子欠失突然変異体とその部分的レスキュー系統を用いた実験系は、今後ショウジョウバエの糖受容体を解明する上で役立つと期待される。
外国人旅行者にオリエンテッドなヘルス情報ツールの開発

本研究は,年間約2,900万人(2018年),さらにオリンピックに向けて急増が予測される外国人旅行者の目的や関心事,特性(国,性,年齢等)を分析し,それぞれのグループに対応した日本滞在中の病気やけがの予防に伴う,効果的でオリエンテッド(利用者重視)なヘルス情報ツールの開発である.そのために、(1)外国人旅行者調査,(2)医療機関調査を経て,(3)両方を合わせたヘルス情報を明らかにし,(4)オリエンテッド型情報提供ツールの開発をする.外国人を受け入れる側が,ユーザ重視でカスタマイズした情報提供する予防的な対応は,世界的にも既存の研究では見当たらず,日本のヘルスにおけるおもてなしを目指す.本研究は,年間約2,900万人(2018年),さらにオリンピックに向けて急増が予測される外国人旅行者の目的や関心事,特性(国,性,年齢等)を分析し,それぞれのグループに対応した日本滞在中の病気やけがの予防に伴う,効果的でオリエンテッド(利用者重視)なヘルス情報ツールの開発である.そのために、(1)外国人旅行者調査,(2)医療機関調査を経て,(3)両方を合わせたヘルス情報を明らかにし,(4)オリエンテッド型情報提供ツールの開発をする.外国人を受け入れる側が,ユーザ重視でカスタマイズした情報提供する予防的な対応は,世界的にも既存の研究では見当たらず,日本のヘルスにおけるおもてなしを目指す.
疎水性有機汚染物質の生物利用性に与える溶存有機物質の影響評価

溶存有機物質による毒性緩和効果を把握するため、疎水性有機汚染物質の生物利用性に与える影響をモデル細胞膜の利用により評価した。ピレン、1-アミノピレン、1-ヒドロキシピレン、フルオキセチンの生物利用性は溶存有機物質への収着により低下することが確認された。低下率は荒川において1.1%以下であり、下水処理水においては5.2%以下であった。荒川や下水処理場の溶存有機物質のピレンに対する収着能は、米国着色河川の溶存有機物質と同等であった。本研究の目的は、モデル細胞膜への疎水性有機汚染物質の分配に与える水環境中および排水中の溶存有機物質の影響を定量し、生物利用性や毒性への影響を把握することで、バイオアッセイによる水質管理に有用な情報を提供することである。今年度の成果を以下にまとめる。1.生物を模擬したモデル細胞膜としてSovicell社製Transilを利用した。実験系の確立のため、モデル細胞膜の保存性(堅牢性)や既存の研究でよくモデル細胞膜として使用されるリポソームを用いた結果との比較を行った。アントラセンを用いた分配係数測定の結果から、モデル細胞膜は4°Cで保存すると2週間は使用可能であることが分かった。また、PAHsに関して卵黄ホスファチジルコリンで構成されたTransilへの分配は、流動相のリポソームに対するものとほぼ同じ程度となった。これらよりTransilは疎水性有機汚染物質の生物細胞膜への分配を評価するために使用できることが分かった。また操作性はリポソームより優れていた。2.多環式芳香族炭化水素類や3種類の医薬品の溶存有機物質共存下での定量法を構築した。イフェンプロジルのモデル細胞膜への分配実験から、表面付近に静電的相互作用で収着していることが示唆された。また、アントラセンなどPAHsは溶存有機物の共存により、細胞膜への分配が減少したが、イフェンプロジルはほとんど影響を受けなかった。3.次年度に使用する溶存有機物質の濃縮と構造に関する特性解析を行った。荒川水系の支川の上流域から抽出した溶存有機物質はタンパク質や糖質の含有率が高く、高分子量であり、下流域のものとは異なる性質を有していた。このことから、とくに親水性官能基を有する疎水性有機汚染物質に対する影響は下流域のものと異なることが推測された。本研究の目的は、水環境中に存在する溶存有機物質(DOM)が疎水性有機汚染物質の水生生物への取り込みに与える影響を評価することである。DOMは河川水および下水処理水から抽出し、疎水性有機汚染物質の生物への取り込みはモデル細胞膜への分配係数の測定により評価した。本年度の成果を示す。1.荒川4地点、琵琶湖、下水処理水からDOMを膜装置(分画分子量1000Da)により抽出し、三次元励起蛍光スペクトル法などで特性解析を行った。膜装置を透過する低分子のDOMに対するピレンの収着係数(Kdoc)はほぼゼロであることが確認され、その挙動に影響を与えるのは高分子成分であることが分かった。本研究で採用した抽出方法の妥当性が確認された。2.疎水性有機汚染物質のモデル細胞膜への分配は、実環境から抽出したDOMの共存によって低下することが確認された。低下の程度は実河川中のDOM濃度レベルでは大きくなく、例えばピレンでは荒川で2%程度であった。低下量からピレンのKdocを推算した結果、蛍光消光法で実測したKdocと比較的よく一致した。このことから疎水性有機汚染物質はDOMに収着することで細胞膜に分配されなくなる機構が確認された。荒川のDOMのKdocは市販されている米国スワニー川NOMと同程度からやや小さく、琵琶湖のものはかなり小さかった。3.多環式芳香族炭化水素類、医薬品およびエストラゲンなどのKdocを測定した結果、Karickhoff(1981)の式を用いてKowから計算した推測値とあまり変わらないものが多かったが、イフェンプロジルや1-アミノピレンのように正の電荷を持つものは推測値より大きなKdocとなった。疎水性の大きい、正の電荷を持つ物質についてはDOMの共存により水生生物への取り込みが大きく減少することが示唆された。
機能性キャピラリー固相マイクロ抽出法に基づく薬毒物濃度と毒性の同時分析法の開発

キャピラリーカラムやその内壁に機能性を持たせた分子認識キャピラリーを用いて、生体試料や食品・環境試料中の微量の薬毒物及び食品・環境汚染物質を効率的に抽出・濃縮する固相マイクロ抽出法を考案し、液体クロマトグラフィー.質量分析法(LC-MS)と連結したオンライン自動分析法を開発した。また、薬毒物代謝酵素(CYP)活性測定法を確立し、薬毒物や汚染物質の濃度とCYP酵素阻害活性を指標とした毒性を同時に分析できるシステムを検討した。19年度は、実施計画に基づき、分子インプリントキャピラリーの作製及び遠心型SPMEサンプリングデバイスの検討を行った。また、オンラインインチューブSPME法を用い、様々な薬毒物や環境汚染物質の分析に適用した。特に、食品・環境汚染物質や生体内反応マーカーを効率よく抽出濃縮して簡便迅速に定量する方法を開発し、それらの湯要請を評価した。さらに、新規マイクロ固相抽出法を開発するために、充填キャピラリーの作成や生体ガスサンプリング器材を考案し、皮膚ガスを直接採取して、GCの熱脱着装置を用いて分析するシステムを検討している。1.分子インプリント法により、エストラジオールやカフェインを鋳型とした分子認識ポリマー(人工医薬品受容体)の合成法を検討し、その選択性や吸着能を評価した。フロロカーボン糸をキャピラリー内へ挿入して分子認識ポリマーをコーティングする新技術を考案し、類似構造を持つ化合物に対し選択性の高い分子認識能を示し、異なる骨格を有する化合物にはほとんど選択性は得られなかった。2.ヘマトクリットローターを用いて遠心型SPMEサンプリングデバイスを検討したが、キャピラリーへの試料の導入が困難で、負荷量も少ないなど、濃縮分析には解決しなければならない問題点がある。しかし、遠心力を利用して多検体の同時処理が可能であることから、上記の問題点を解決する方法を現在検討中である。3.SPME法を用い、悪臭物質であるジオスミンやメチルボルネオールの環境水分析法を確立した。また、オンラインインチューブSPME法によるPFOSやPFOAなどの有機フッ素化合物の選択的濃縮法を確立し、環壕分析に応用した。さらに、これまで困難であった水溶性化合物の効率的濃縮に極性キャピラリーを用い、アミン類やアミノ酸類、ニコチンやコチニンの分析法を確立して、食品試料や生体試料分析に適用できることを明らかにした。4.活性炭や様々なポリマー、イオン交換樹脂を充填したキャピラリーやモノリスキャピラリーを用いた新規SPME法の開発、固定化酵素ビーズや磁気ビーズを充填した機能性キャピラリーについて検討中であり、今後、薬毒物濃度と毒性の同時分析のためのパラレル多検体同時処理法についても検討する予定である。20年度は、実施計画に基づき、機能性キャピラリーを用いるオンラインインチューブSPME法により、様々な薬毒物や生体成分の分析法を開発し、実試料分析へ応用した。また、薬物代謝活性酵素シトクロムP450(CYP)の分子種の活性測定法を開発し、活性阻害による毒性評価法を確立して食品成分による相互作用を調べた。現在食品成分と毒性評価を同時に測定できるシステムを検討中である。1.オンラインインチューブSPME/LC-MS法を用いて、尿中ドーピング薬物や大麻代謝物の高感度迅速分析、パツリンやアフラトキシン類などの食品中かび毒(マイコトキシン)の汚染分析、ベンゾ(a)ピレンなどの食品中多環芳香族炭化水素類のインチューブSPME/HPLC-蛍光分析法を開発した。いずれの方法も、有機溶媒をほとんど必要とせず、オンラインで試料の抽出濃縮、自動分析が可能であり、実用的な方法として、生体試料や食品試料の分析に適用できることがわかった。2.ファイバーSPMEを用いて、皮膚から放出されるガスや滲出成分を効率よくサンプリング、抽出濃縮できる手法を開発し、GC-MS法との連携で高感度選択的なアルコールや体臭の簡易分析法を確立した。本法を用いれば、非侵襲的に生体成分をサンプリング可能であり、疾病診断への応用が期待される。3. CYP酵素分子種の活性測定法を開発し、カプサイシンやクルクミンなどの香辛料成分にCYP阻害効果が認められた。成分量と阻害効果による毒性を同時評価するために、キャピラリーへの酵素の固定化を検討したが、期待する効果はまだ得られていない。機能性キャピラリーを用いるオンラインインチューブSPME法は、抽出濃縮効果と自動分析を可能にしたが、今度毒性効果も同時測定できるようになるためには、さらなる改良と工夫が必要である。
資源循環型流域水環境管理を目的とした農地土壌系の窒素流出メカニズムの解明

水田に関する一連の研究課題によって得た知見から、窒素ガスに還元する唯一の自然のプロセスである生物学的脱窒を直接的な硝酸態窒素除去の方法として着目し、その窒素流出メカニズムの解明を試み、農地1筆単位からの硝酸態窒素の排出負荷量を制御する方策を探った。農地下での地下水層帯での脱窒の有無を明らかにするため、その特徴が再現されやすい扇状地で調査を行い、畑地から水田への土地利用連鎖系における地下水の水質変動の実態を把握するとともに、冬期の非湛水状態における水田心土層内の地下水層帯での硝酸態窒素除去の主因が生物学的脱窒であることを明らかにした。この研究成果から、農地の心土層に還元層を人為的に創出することによって、周年にわたる生物学的脱窒作用が発現できるのではないかと着想し、その条件を満たす農地として新しい農地構造を有した汎用化水田に着目し、野外ライシメータ試験や土壌カラム実験を行った結果、硝酸態窒素減少率が92%となり、高い数値で地下水層帯における硝酸態窒素除去が認められ、その有用性が明確となった。その減少の主因である脱窒菌には、湛水土壌系での優占種(易分解性有機物を利用する従属栄養微生物)だけではなく、それとは異種の硫黄酸化細菌(CO_2を利用する独立栄養微生物)が大きく関与している可能性が示唆された。さらに、多肥集約型畑作物の安定した収量を目指した栽培試験を行うとともに、水質測定を継続して行い、農作物の品質と収量の安定性が保証された条件下において、窒素除去を数値として明確に示した。畑地の深部を想定した土壌カラムによる脱窒速度実験を室内で行った。実験は,カラムの上部に水分不飽和土壌(以下,不飽和層)カラムの下部に水分飽和土壌(以下,飽和層)を充填し,地下水位が比較的浅い畑地の深部を切り出した状態を想定した.カラム全長を80cmとした.供試土壌として、東京大学田無農場の黒ボク表層土1030cmを用い,飽和層の土壌については蒸留水で洗浄したものを用いた.当土壌をρd=0.82g/cm^2で充填し,飽和層の体積含水率θ=65.22%となった.飽和層の土壌にNO_3-N濃度溶液と炭素を全層均一になるように与え,水は静止状態とした.地表面から供給される酸素の影響をみるために不飽和層の厚さを変化させ,飽和層のNO_3-N濃度を測定した.その後,不飽和層を20cmに固定し,不飽和層の水分量,投入炭素量を変化させて飽和層のNO_3-N濃度を測定した.各実験の初期NO_3-N濃度溶液を300mg/Lとした.カラムを温度一定(16°C)とした暗室バイオトロン内に設置した.また,カラム分解後に試料を炉乾して水分量を測定した.その結果,不飽和層の厚さによって飽和部分の還元の度合いは異なり,不飽和層50cmでは,不飽和層8cm,20cmと比較してNO_3-N濃度が高く、深度によってその濃度が異なった.脱窒の進行速度は,投入炭素量の多いほうが速く進行した.この時のEh値に差は認められなかった.また,地表面からの深さによる脱窒の進行速度の差については,炭素量の少ない条件下の方が顕著に表れた.炭素量の少ない条件下で,深部の脱窒の進行速度が早かったことは,還元の度合いが大きく影響したと考えられる.また,カラムの深部で濃度分布が上昇した原因としては,Ehの値が若干,酸化状態となった影響と,上下の溶液密度差による対流が生じたことが考えられる.他の実験でも同様の傾向が認められた.一般に、汎用化水田を畑地利用する場合、暗渠を常時開放しておくので、多肥作物に吸収利用されなかった肥料由来の硝酸態窒素が著しく溶脱する。

暗渠を閉じたとしても、硝酸態窒素が心土層を通じて地下水へ容易に溶脱する。そこで、現在、減肥あるいは輪作を行う等の施肥管理方法が模索されているが、いずれの方法にしても、農地1筆の作目は制限される。そこで、本研究では、本問題を解決するひとつの方法として、汎用化水田が遮水性の畦を有した構造体だけでなく、心土層の底面に畦と密着した不透水層を有した構造体として新たに整備されるとともに、この不透水層の存在と不透水層上部の心土層に配した暗渠の閉鎖により、畑地作土層からの浸透水を心土層に貯めることで還元層をつくり、この還元層での脱窒作用を利用し、溶脱された窒素の除去を行うことを考えた。こうした圃場構造条件を満たすものとして、本研究では、土中埋設型野外ライシメータを選び、水質試験を行い、地下水位と土層内の窒素負荷量の変動から窒素除去の有無を明確にし、窒素減少量(窒素減少率)を算出した。なお、本研究のように、汎用化水田の転換畑利用時において、心土層に還元層を創出することによって窒素の系外流出の改善を試みた事例は存在しない。試験区と対照区を設定し、試験区の心土層にだけ高濃度硝酸態窒素溶液を投入し、両区の暗渠水の水質と地下水位の変動を測定した。完熟堆肥・腐葉土・籾殻等、一般的な畑作で投与される量を施用するなど、両基とも同じ条件で試験を行った。その結果、試験後の薬品由来による窒素減少率は92%と算出され、心土層に蓄積した硝酸態窒素について、高い数値で窒素除去が認められた。その除去の原因として、易分解性有機物が必要な脱窒菌の活性によって、脱窒作用が進行し、窒素負荷量とTOC負荷量の値が減少していることが示唆された。転換畑作土層からの溶脱窒素の除去を目的とした、土中埋設型野外ライシメータによる水質試験を行い、本試験データから、独立栄養型と従属栄養型の脱窒菌に着目し、化学反応式を用いて、それぞれの脱窒量の算出を試みた。隣接するライシメータ(試験以前は長期間湛水状態)2基を使用し、試験区と対照区とした。試験区にだけ高濃度の硝酸態窒素溶液(硝酸カリウム、414.56kg・N/ha)を加えた。その他は両基とも同じ条件で試験を行った。試験期間は、2004年8月3日2005年11月15日の470日間であった。なお、試験期間中、両基とも無植生であり、表面流出はなかった。2004年8月3日同年9月8日に各層の暗渠から毎日定刻に採水を行い、同年9月8日2005年11月15日では、隔週1回定刻に採水した。全サンプル数は1,252本であった。その結果、全試料で、T-N濃度≒NO_3-N濃度であり、対照区では各土層、0.1932.22mg/Lで推移した。試験区では、時間経過とともに土壌水中のT-N濃度が低下していく傾向が認められ、2005年7月19日以降は各土層で、0.482mg/L前後となり、対照区と同程度の値となった。従属栄養型脱窒菌による脱窒量は12.6gとなり、硫黄酸化細菌のよる脱窒量が83.4g以上と算出された。これより、硫黄酸化細菌によって、薬品由来の硝酸態窒素の少なくとも62.1%が除去されたことが示唆された。また、2005年2月15日に暗渠の栓が抜けために流亡した量が0.533gであり、試験終了後の残存窒素量から試験開始前の残存窒素量を差し引いた量が0.180gであった。これらを合計して、薬品投入量である134.3gから差し引くと、37.59gとなった。この値については、土壌への負の吸着量を検討するとともに、硫黄酸化細菌による脱窒量の算出誤差の検証を行うことで明確にしたい。
GBST、VEMPの伝導経路と前庭神経機能検査としての有用性の検討

一側性前庭障害のモデルとして聴神経腫瘍症例を用い、開眼・閉眼下でのGBSTを施行してそのデータを比較し、検査に対する注視の有無の影響を検討した。評価のパラメータとしては重心動揺の潜時、速度、偏倚距離を用いた。その結果、閉眼により重心の動揺の速度と距離は大きくなるが、潜時には影響は見られなかった。一方、健側と患側の比については、重心動揺速度を用いた場合でのみ開閉眼間で相関を認めた。これらのデータから、開眼・閉眼のデータを同時に処理する際の計数を算出した。研究の次のステップとして、前庭障害者の姿勢制御に関する研究に着手した。一側性聴神経腫瘍症例を対象に、重心動揺検査を開眼・閉眼下で施行し、そのデータをフーリエ変換して動揺の周波数別の視覚入力寄与について検討を始めた。視覚入力で制御される重心動揺の特徴周波数の特定が期待される。また、健常被験者および片側・両側前庭障害症例を対象として、椅子から立ち上がる際の頭部と体幹の角度の制御を磁気センサーを用いて計測した。その結果、前庭障害症例では頭部を体幹に対して固定する傾向が認められた。これは、前庭からの入力が弱いため、空間での前庭の角度を一定に保つ必要がないことによると考えられる。さらに、ガルバニック刺激による重心の偏倚を計測し、視線の向きを変化させることでその重心動揺の方向も変化することを確認した。今後、これにさまざまな視運動負荷を加えることにより、眼球運動とガルバニック刺激の姿勢に対する相互作用を検討していく。GBSTの伝道経路を検討するため、当科で中頭蓋窩法により手術を施行した聴神経腫瘍症例において、術前・術後にGBSTを施行し、その結果を起源神経、カロリックテスト、聴力レベルと比較した。その結果、術前VEMPの検出された11例中、4例で術後もVEMPが保たれていた。下前庭神経由来の聴神経腫瘍10例中3例でVEMPが保存され、VEMPの伝導経路は下前庭神経のみではなく、上前庭ないしは蝸牛神経も関与すると思われた。下前庭神経由来症例中のVEMP保存例では聴力レベルは正常に保たれ、術中所見では上前庭神経は保存された。これら3症例すべてで、カロリックテストよりもABRの結果のほうがVEMPの結果との関連が見られた。そのうち1症例ではVEMPの潜時は術後短縮し、術前に存在した伝導障害の解除が考えられた。蝸牛神経を介した伝導経路としては、直接蝸牛神経核にいたる経路と脳幹を介する経路の2通りが考えられた。また、中枢疾患の機能評価の前段階として、脊髄小脳変性症や進行性核上性麻痺を含む中枢性変性疾患99例についてENG所見を詳細に検討した。その結果、滑動性眼球運動の障害と上向きのocular dysmetriaは90%以上の確立で検出され、中枢性変性疾患の検出に有用と思われた。それに対し急速眼球運動速度の低下やopsoclonus、ベル現象の消失やsquare wave jerkは出現頻度が極めて低かった。水平方向のocular dysmetriaや注視方向性眼振、rebound nystagmus、垂直方向の頭位変換眼振、visualsuppressionの障害、視運動性眼振などは異常出現頻度が中等度で、障害の部位や程度を反映するものと考えられた。カロリックテストでの半規管機能低下と自発眼振の方向との間には関連はみられなかった。疾患別の特徴をみると、SCA6とSCA3ではすべての方向に注視方向性眼振を認めやすいのに対し、進行性核上性麻痺では他の方向と比べて上向きの注視方向性眼振が出やすい傾向にあった。また、全症例中で垂直方向の頭位変換眼振は皮質小脳萎縮症で検出されやすく進行性核上性麻痺で検出されにくかった。
キュウリモザイクウイルスの宿主適応におけるコドンバイアスの役割の検証

植物ウイルスの宿主適応におけるウイルス遺伝子のコドンバイアスの役割を解明するために,大規模な同義置換を導入した変異外被タンパク質(CP)をもつキュウリモザイクウイルス(CMV)の病原性と競合的適応性を調べた。変異CMVでは,宿主植物におけるウイルスRNA蓄積量が減少し,適応性が野生型CMVと比較して減少した。しかしながら,変異CMVを宿主植物で数回継代接種するとRNA蓄積量は回復し,変異CPに12個のアミノ酸変異が認められた。CP遺伝子のコドンバイアス改変はウイルスRNAの二次構造を変化させ,それによりウイルス病原性が低下するが,CPのアミノ酸変異によりその病原性は回復すると考えられた。キュウリモザイクウイルス(CMV)の外被タンパク質(CP)遺伝子の9アミノ酸について,全てのコドンを単子葉で使用頻度の高いメジャーコドン(Mmaj)あるいは使用頻度の低いマイナーコドン(Mmin)に同義置換した変異CMVを作出した。CP遺伝子全長を改変するとCMVの感染性が喪失するため,CP遺伝子の前半領域のみあるいは後半領域のみを同義置換した4種の変異CMV(Mmaj/wt,Mmin/wt,wt/Mmaj,wt/Mmin)を作出し,双子葉宿主であるベンサミアナタバコにおける病原性を調べた。全ての変異CMVは最終的に野生型と同様の病徴を示したが,病徴部位における全ての変異CMVの蓄積量が野生型と比較して減少しており,さらに,後半部分を改変したwt/Mmajとwt/Mminはウイルスの全身感染性が顕著に低下していた。病原性や全身感染性が低下しなかったMmaj/wtとMmin/wtにおいてもベンサミアナタバコにおける適応性は野生型CMVと比べて顕著に減少していたが,Mmaj/wtとMmin/wt間では適応性には差が見られなかった。4つの変異CMVを単子葉宿主であるトウモロコシに接種して病原性を調べたところ,単子葉で使用頻度の高いメジャーコドンをもつMmaj/wtとwt/Mmajは野生型同様に感染が認められたが,使用頻度の低いマイナーコドンをもつMmin/wtとwt/Mminの蓄積量は減少していた。予定していた実施項目を遂行し,全身感染性が野生型とほとんど変わらない変異ウイルスを得ることができた。今後は,前半領域を改変した変異ウイルスを使って継代接種による実験室内適応進化試験を行う。昨年度に,CMV CP遺伝子の前半領域の9アミノ酸について,全てのコドンを単子葉で使用頻度の高いメジャーコドン(Mmaj)あるいは使用頻度の低いマイナーコドン(Mmin)に同義置換した2種の変異CMV(Mmaj/wt,Mmin/wt)は,双子葉宿主であるベンサミアナタバコにおいても,ウイルスRNA蓄積量と競合的適応性が野生型CMVと比べて顕著に減少していることを示していた。本年度は,これら2種の変異CMVをベンサミアナタバコにおいて継代接種を繰り返し,ウイルスRNAの病原性が回復するのかどうか,また,CP遺伝子配列がどのように変異するのかを解析した。Mmaj/wt,Mmin/wt,および野生型CMVについて,それぞれ独立した3つの継代ラインを用いて,15世代まで継代接種を繰り返し,継代5,10,15回目にウイルスRNAの蓄積量とCP遺伝子配列を解析した。継代10回目にはMmaj/wtの2ラインおよびMmin/wtの3ラインすべてでウイルスRNAの蓄積量が野生型CMVと同等まで回復していた。Mmaj/wtとMmin/wtの全てのラインでCP遺伝子に12のアミノ酸変異が認められ,CPのアミノ酸変異によりウイルスRNAの蓄積量が回復していることが考えられた。一方で,ウイルス蓄積量が回復した継代ラインの変異CMVでも,競合的適応度は野生型CMVと比較して減少したままであった。キュウリモザイクウイルス(CMV)の外被タンパク質(CP)遺伝子前半領域のコドンバイアスの改変は,双子葉宿主であるベンサミアナタバコと単子葉宿主であるトウモロコシにおける全身感染性には大きく影響を与えないことが分かったので,今後は,Mmaj/wtとMmin/wtを使って継代接種による実験室内適応進化試験を行う。ベンサミアナタバコとトウモロコシでMmaj/wtとMmin/wt,野生型CMVの継代接種を繰り返し,継代1回目,5回目,10回目のウイルス蓄積量とCP遺伝子配列を解析する。さらに,継代10代目のウイルスの適応性を比較して,継代接種により変異ウイルスの適応性が回復するかどうかを明らかにする。植物病理学