hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝切除後エンドトキシン誘発肝障害の病態におけるインターロイキン10の因子

本研究では、肝切除後のエンドトキシン誘発性肝障害の病態における炎症性サイトカインであるTNF-αと抗炎症性サイトカインIL-10の動態と産生調節におけるKupffer細胞と脾臓の役割について調べた.【方法】Wister雄性ラットに肝切除術(H群)と切除後2日間Kupffer細胞機能を抑制するためgadolinium chloride(GdCl_3,7mg/kg)を投与したHG群、肝切除と同時に脾摘を行った後にGdCl_3とLPSを投与したHGS群と比較した.肝切除48時間後にLPS(1.5mg/kg)を静脈内投与したLPSを投与し、24時間後生存率の検討とLPS投与前、投与後1,4時間後の血漿GOT, GPT値、IL-10、TNF-α値(ELISA法)と肝脾組織中mRNA測定と組織学的検討をした.【結果】1)H群における生存率は20%であったが、GdCl_3前処置したHG群では80%へ改善した.脾摘を加えたHGS群では生存率67%と脾摘により有意差はなかった.2)LPS投与後1時間の血漿TNF-α値はH群では著明に上昇したが、HG群とHGS群では有意にその増加が抑えられた.3)1時間目の血漿IL-10値はTNF-αとは異なりHG群で有意に高値であった.4)GdCl_3前処置により肝組織中のIL-10、TNF-αmRNA発現は抑制されていたが、脾組織中には発現を認め,肝および脾臓の組織学的障害は著明に軽減した.TNF-α/IL-10比はH、HGS、HG群の順で低下し、死亡率はこの順で低率であった.【結語】、本病態の肝障害進展防止には、活性化Kupffer細胞と脾臓による炎症性・抗炎症性サイトカインの産生調節が重要であると考えられた.現在、Journal of Hepatology投稿中である.本研究では、肝切除後のエンドトキシン誘発性肝障害の病態における炎症性サイトカインであるTNF-αと抗炎症性サイトカインIL-10の動態と産生調節におけるKupffer細胞と脾臓の役割について調べた.【方法】Wister雄性ラットに肝切除術(H群)と切除後2日間Kupffer細胞機能を抑制するためgadolinium chloride(GdCl_3,7mg/kg)を投与したHG群、肝切除と同時に脾摘を行った後にGdCl_3とLPSを投与したHGS群と比較した.肝切除48時間後にLPS(1.5mg/kg)を静脈内投与したLPSを投与し、24時間後生存率の検討とLPS投与前、投与後1,4時間後の血漿GOT, GPT値、IL-10、TNF-α値(ELISA法)と肝脾組織中mRNA測定と組織学的検討をした.【結果】1)H群における生存率は20%であったが、GdCl_3前処置したHG群では80%へ改善した.脾摘を加えたHGS群では生存率67%と脾摘により有意差はなかった.2)LPS投与後1時間の血漿TNF-α値はH群では著明に上昇したが、HG群とHGS群では有意にその増加が抑えられた.3)1時間目の血漿IL-10値はTNF-αとは異なりHG群で有意に高値であった.4)GdCl_3前処置により肝組織中のIL-10、TNF-αmRNA発現は抑制されていたが、脾組織中には発現を認め,肝および脾臓の組織学的障害は著明に軽減した.TNF-α/IL-10比はH、HGS、HG群の順で低下し、死亡率はこの順で低率であった.【結語】、本病態の肝障害進展防止には、活性化Kupffer細胞と脾臓による炎症性・抗炎症性サイトカインの産生調節が重要であると考えられた.現在、Journal of Hepatology投稿中である.本研究では、肝切除後のエンドトキシン誘発性肝障害の病態における炎症性サイトカインであるTNF-αと抗炎症性サイトカインIL-10の動態と産生調節におけるKupffer細胞と脾臓の役割について調べた.【方法】Wister雄性ラットに肝切除後2日間Kupffer細胞機能を抑制するためgadolinium chloride(GdCl3,7mg/kg)を投与し、LPSを投与したHEG群、肝切除と同時に脾摘を行った後にGdCl3とLPSを投与したHEGS群と比較した.各々にコントロール群(S群)をおいた.24時間後生存率の検討とLPS投与前、投与後1,4時間後の血漿GOT,GPT値と、IL-10、TNF-α値(ELISA法)を測定した.【結果】1)肝切除+LPS投与コントロール群における生存率は15%であったが、GdCl3前処置により80%へ改善した.GdCl3前処置および脾摘群では生存率67%と脾摘により有意差はなかった.2)LPS投与後1時間目の血漿TNF-α値はHE群では著明に上昇したが、HEG群とHEGS群では有意にその増加が抑えられた.3)1時間目の血漿IL-10値はTNF-αとは異なりGdCl3投与群で有意に高値であった.

4)肝組織中のIL-10、TNF-αmRNA発現は抑制されていたが、肺、脾組織中に発現を認めた.5)肝切除のみ群では、LPS投与後4時間で肝、脾、腸管に広範な出血壊死がみられた.一方、GdCl3前処置によりこれらの組織学的障害は著明に軽減した.【結語】肝切除術後のエンドトキシン血症では、抗炎症性サイトカインに比して炎症性サイトカイン有意であった.本病態の肝障害進展防止には、Kupffer細胞と脾臓による炎症性・抗炎症性サイトカインの産生調節が重要であると考えられた.本研究では、肝切除後のエンドトキシン誘発性肝障害の病態における炎症性サイトカインであるTNF-αと抗炎症性サイトカインIL-10の動態と産生調節におけるKupffer細胞と脾臓の役割について調べた.【方法】Wister雄性ラットに肝切除術(H群)と切除後2日間Kupffer細胞機能を抑制するためgadolinium chloride(GdCl_3,7mg/kg)を投与したHG群、肝切除と同時に脾摘を行った後にGdCl_3とLPSを投与したHGS群と比較した.肝切除48時間後にLPS(1.5mg/kg)を静脈内投与したLPSを投与し、24時間後生存率の検討とLPS投与前、投与後1,4時間後の血漿GOT,GPT値、IL-10、TNF-α値(ELISA法)と肝脾組織中mRNA測定と組織学的検討をした.【結果】1)H群における生存率は20%であったが、GdCl_3前処置したHG群では80%へ改善した.脾摘を加えたHGS群では生存率67%と脾摘により有意差はなかった.2)LPS投与後1時間の血漿TNF-α値はH群では著明に上昇したが、HG群とHGS群では有意にその増加が抑えられた.3)1時間目の血漿IL-10値はTNF-αとは異なりHG群で有意に高値であった.4)GdCl_3前処置により肝組織中のIL-10、TNF-αmRNA発現は抑制されていたが、脾組織中には発現を認め、肝および脾臓の組織学的障害は著明に軽減した.TNF-α/IL-10比はH、HGS、HG群の順で低下し、死亡率はこの順で低率であった.【結語】、本病態の肝障害進展防止には、活性化Kupffer細胞と脾臓による炎症性・抗炎症性サイトカインの産生調節が重要であると考えられた.現在、Journal of Hepatology投稿中である.
PAR-2アンタゴニストはIPF急性増悪新規治療薬になりうるか？

特発性肺線維症急性増悪の新規治療薬の可能性を探るべく、ブレオマイシン(BLM)マウスモデルを用いPAR-2アンタゴニストの抗炎症、抗線維化作用を検証した。PAR-2阻害ペプチド(IP)を吸入させたBLMマウスでは、気管支肺胞洗浄液中のリンパ球数が有意に低下、病理でも炎症細胞の浸潤抑制がみられ抗炎症作用が示唆された。またPAR-2IP投与群では肺コラーゲン量も有意に抑制していた。さらにPAR-2IP処理群ではBLM単独群に比しVimentin発現が抑制されていたことからPAR-2IPはBLMマウスモデルに対し抗炎症作用を示し、上皮間葉転換抑制を介して抗線維化作用を示すことが示唆された。H26年度はまず、PAR-2ノックアウトマウスを用いた動物実験において、上記を証明する予定であったが、H23-25年度基盤研究を延長し、in vitroの最終的な抑制実験を中心に行っていた影響で、予定の動物実験ができなかった。本研究で行う予定のIPF患者からの臨床検体を用いた研究に備えるための準備は徐々に進めていた。特発性肺線維症(IPF)急性増悪の機序を解明し治療に結びつけるべく、H23ー25年度(延長H26年度)基盤研究C「protease activated recepror(PAR)-2制御によるIPF急性増悪の新規治療法の探求」をもとに基礎実験から進めてきた。H26年度からの本研究は、in vivoへ拡げ、同じく基盤C「PAR-2アンタゴニストはIPF急性増悪新規治療薬になりうるか?」というテーマで実験を進める方針であった。H27年度は動物実験をメインと考えていたが、まず、臨床データを使用する実験を最初に進める方針に転換した。(なぜなら同年Molecular Medicineにほぼわれわれが計画したのと同様の論文が掲載されたため)すなわち、肺線維症患者の急性増悪を起こした際の肺胞洗浄液を用い、PAR-2がどれだけ活性化されているかをcompetitive ELISAで測定する方法などである。ペプチド抗体作成のためのデザインの検討や臨床検体を整えるための倫理委員会への準備などを行った。また、動物実験へ着手する準備段階で、Molecular Medicineにほぼわれわれが計画したのと同様の論文が掲載され、当初の計画を、臨床検体を用いた実験と優先順位を入れ替えたことも遅れの理由となっている。動物実験の準備の準備に時間がかかり研究は遅れていたが、本年度はようやく動物実験を開始することができた。ブレオマイシンによる刺激は、肺に間質性肺炎を起こし肺線維症のモデルとして知られている。マウスにブレオマイシンを経気管的に投与した群と、ブレオマイシン投与かつPAR-2阻害ペプチドを経鼻的に吸入させた群を比較したところ、3日、7日、14日とも気管支肺胞洗浄(BAL)液中のリンパ球の数を有意に減少させることが分かった。また、肺組織のTGF-βやMCP1などの発現も抑えられることがreal time PCRにて示された。さらに、in vitroで得られていたPAR-2活性によるE-cadherinの抑制、Vimentinの増加が、ブレオマイシンモデル肺でも同様に認められたが、PAR-2アンタゴニストはそれを抑制することも示された。これらの変化はPAR-2阻害剤のみ投与したマウス群では見られなかった。以上の結果から、PAR-2アンタゴニストはブレオマイシンによる間質性肺炎を抑制することが示唆された。臨床データの活用面では、肺線維症急性増悪患者のBAL液を用い肺内でPAR-2がどれだけ活性化されているかを調べるためにcompetitive ELISA用のcleaved PAR-2抗ペプチド抗体を作製した。常勤施設に動物実験施設がないため、福島県立医大本学での動物実験となる。そのための手続きなど思いのほか時間がかかったことが主な要因と思われる。また、臨床検体を使用した研究に関しては、competitive ELISA用のcleaved PAR-2抗ペプチド抗体作製にも数カ月の時間を要したことも一因となっている。われわれは、特発性肺線維症(IPF)急性増悪の機序を解明し新規治療薬の可能性を探るべく、トリプシンやトリプターゼのレセプターとして知られているprotease activated receptor(PAR)に着目し一連の研究を行ってきた。H23-25(26)年度基盤C「PAR-2制御によるIPF急性増悪の新規治療法の探求」の基礎実験から引き続き、今回のH26-28(29)年度基盤C「PAR-2アンタゴニストはIPF急性増悪新規治療薬になりうるか?」というテーマで動物実験を行った。in vitroでは、肺胞上皮細胞をトリプシンやPAR-2活性ペプチドで刺激をすることによりERKのリン酸化を促しTGF-beta1の合成亢進が認められた。さらに肺の線維化につながると考えられている上皮ー間葉転換(EMT)の亢進が明らかとなった。これらはPAR-2阻害ペプチドで処理することで明らかに抑制された。今回の研究では、ブレオマイシン(BLM)処理を行った間質性肺炎マウスモデルを用いin vivoでPAR-2アンタゴニストの抗炎症、抗線維化作用を検証した。PAR-2阻害ペプチド(IP)を吸入させたBLMマウスでは、BLMマウスに比べ気管支肺胞洗浄液(BALF)中の細胞数やリンパ球数を有意に低下させた。

マウス肺でMCP-1などのサイトカインもPAR-2IP投与によりRNAレベルで抑制していることも判明した。さらにD7の肺病理ではPAR-2IP投与群で炎症細胞の浸潤が低下しており抗炎症作用が示唆された。マウス肺のコラーゲン量も測定すると、PAR-2IP投与のBLMマウス肺では有意に抑えられており抗線維化作用も示唆された。BLMマウス肺の免疫染色でEMTを確認したところVimentinの発現が抑制されており、PAR-2IPはEMTの抑制を介して抗線維化作用を示すことが示唆された。特発性肺線維症急性増悪の新規治療薬の可能性を探るべく、ブレオマイシン(BLM)マウスモデルを用いPAR-2アンタゴニストの抗炎症、抗線維化作用を検証した。PAR-2阻害ペプチド(IP)を吸入させたBLMマウスでは、気管支肺胞洗浄液中のリンパ球数が有意に低下、病理でも炎症細胞の浸潤抑制がみられ抗炎症作用が示唆された。またPAR-2IP投与群では肺コラーゲン量も有意に抑制していた。さらにPAR-2IP処理群ではBLM単独群に比しVimentin発現が抑制されていたことからPAR-2IPはBLMマウスモデルに対し抗炎症作用を示し、上皮間葉転換抑制を介して抗線維化作用を示すことが示唆された。H28年度は下記の2点を同時並行で行う方針である。2.動物実験:1ブレオマイシン肺障害モデルにおいてPAR-2 inhibiting peptide、あるいはblocking peptideを吸入させ肺障害が改善するかを検討2PAR-2 knock outモデルを用いたブレオマイシンによる肺障害の解析1については倫理委員会の認証を得た後、ICで同意を得られた患者を登録する方針とする。2については、直ちに動物実験に移れるよう既に準備を進めている段階である。期限を1年間延長させていただき、実験を継続する。1.動物実験:ブレオマイシンマウスモデルにPAR-2阻害ペプチドを吸入させ、どのような機序で炎症を抑えるのか、機序を探る。さらに、PAR-2ノックアウトマウスを用い得られたデータをさらに確認する予定である。2.臨床検体を用い、肺線維症急性増悪にPAR-2が関わっているという確証を得る。現在、臨床検体を使用するに当たり倫理委員会の承認を受けるべく準備を進めている。呼吸器内科H27年度は、H26年度に予定していた動物実験を行う予定である。PAR-2ノックアウトマウス、ワイルドタイプの両者でブレオマイシンによる肺線維症モデルを作製し、1PAR-2ノックアウトマウスでは、ブレオマイシンによる肺傷害が抑えられるのか?2PAR-2アンタゴニスト(ブロッキングペプチド)はブレオマイシンによる肺傷害を抑制できるのか?を探る。これらによって、PAR-2阻害剤が、IPF急性増悪の新規治療薬となりうるかを検討していく。また、動物実験へ着手する準備段階で、Molecular Medicineにほぼわれわれが計画したのと同様の論文が掲載され、当初の計画を、臨床検体を用いた実験と優先順位を入れ替えたことも遅れの理由となっている。研究の進行が遅れていたために、当初H26-28年度までの予定であったものを、H29年まで1年延長させていただいた。そのため、最終年度となる本年度にすべての実験を終了すべく邁進中である。
食物線維溶液の摂取によって胃粘液を増やし胃潰瘍を予防できるかについての基礎的研究

粘度を10mPa・sと40mPa・sに調整した食物繊維粘性水溶液を24週間飲水としてマウスに飲ませ、胃粘膜にどのような影響があるか検討した。その結果、食物繊維溶液を飲むと胃粘膜が厚くなり、腺粘液産生細胞が増えることがわかった。そして、それらの作用は食物繊維の種類や分子の大きさによって異なり、アガロースやアルギン酸ナトリウムに比べてメチルセルロースやグアガムで作用が大きく、さらに同じ種類の食物繊維でも分子の大きなものの方が食物繊維の摂取量が少ないにも関わらず作用が大きいことがわかった。まず、食物せんい粘性溶液摂取による胃粘膜の肥厚が、投与する食物せんいの種類と投与溶液の粘度を変えた場合どのように変化するかを検討するために、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、グアガム、アガロースについて、粘度が40mPa・sと10mPa・sの溶液を作り、0.2mL/dayで2週間経口投与した。胃の組織を薄切標本にし粘膜厚と粘液産生細胞の変化を検討しているが、いずれの食物せんい溶液の投与によっても粘膜の肥厚が観察された。詳細は現在検討中である。他方、食物せんい溶液の継続投与によっては胃粘膜の肥厚が引き起こされるが、単回投与では胃粘膜に変化がもたらされるのかを検討した。0.5%メチルセルロース溶液0.2mL投与後の胃粘膜内のErk1/2やp38といったタンパク質(MAPK)のリン酸化や細胞分裂の指標であるMCM7量の変化を時間の経過とともに観察した。いずれにも有意な変化はみられず、食物せんい溶液を一回投与しただけでは粘膜肥厚に直接つながるような大きな影響を及ぼさないことが示された。食物せんい溶液の胃粘膜に対する作用は継続されることによって得られるものであることが示唆された。しかし、同時に測定した組織修復機能を有するヒートショックタンパク70(HSP70)はメチルセルロース溶液投与後一時的にではあるが有意な増加を示し、食物せんい溶液投与によって、胃粘膜保護作が期待できる可能性を示唆する結果であった。平成26年度は25年度に引続き、異なる食物線維による胃粘膜肥厚能の違いを検討した。食物線維は一般に高分子であるが、その中でも高分子量のものと比較的低分子量のものが市販品としてあり、入手できる食物線維(メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、グアガム、アガー)について、2種類の粘性溶液(10mPa・sおよび40mPa・s)を作成し、マウスに継続投与した結果の胃粘膜肥厚について検討した。その結果、投与溶液の粘性が高い方(40mPa・s)が胃粘膜をより肥厚させることや、同じ種類の食物線維でも高分子量のものの方が、食物線維の投与量は少ないにも関わらず胃粘膜をより肥厚させることがわかった。今回検討した投与量では食物線維による体重増加抑制効果は観察されなかったことから、体重に影響を及ぼさない少量投与で胃粘膜を肥厚させる作用があることがわかった。また、メチルセルロースとアルギン酸ナトリウムについては副細胞由来の粘液(腺粘液)の特異抗体HIK1083を用いた免疫染色による解析を終了した。その結果、両食物線維とも40mPa・s溶液投与群では有意に染色面積が増加、すなわち副細胞が増加していることが分かった。また、高分子量のメチルセルロース溶液では粘性が大きくなると粘膜肥厚も大きく伸びているのに対し、アルギン酸ナトリウム溶液では、投与溶液の粘性が大きくなることによる粘膜肥厚への影響が小さいこともわかった。この原因については、メチルセルロース溶液が非ニュートン流体なのに対し、アルギン酸ナトリウム溶液はニュートン流体であることによる可能性を研究者は考えているが、流体の性質が粘膜肥厚にどう影響するかは食物線維による胃粘膜肥厚の発生機序とともに今後の検討課題である。平成27年度は食物繊維粘性水溶液の摂取により胃粘膜を保護することができるかを、インドメタシン(IND)の経口投与(60mg/kg体重)によって誘発した実験胃潰瘍モデルを用いて検討した。実験は4群で行った。400cPメチルセルロース(MC)で10mPa・sと40mgPa・sの溶液を調整し、マウス5匹ずつに2週間自由摂取させた。効果を比較するために、レバミピド(REB:胃粘膜保護薬)をIND投与前に投与した(n=5)群と何も投与しない群(n=5)も設定した。IND投与後4時間で胃粘膜の状態を観察した。IND誘発胃潰瘍は、粘膜全面にびらんが広がり、複数の斑状の潰瘍からの出血で胃内容物には血液が混じり赤黒く変色していた。REB群では粘膜の出血斑は大きさ・発生数ともに小さくなり胃内容物の血液による着色もわずかで、潰瘍症状は明らかに軽減されていた。40mPa・s群では2/5に出血斑が見られたが胃内容物の血液による出血が確認できたのは1例だった。10mPa・s群では3/5に線状傷、1/5に少数の斑状出血がみられたが、1例はほぼ正常な観察像を呈していた。胃内容物の血液による着色は目視では観察されなかった。現在Image Jを用いて潰瘍の程度の数値化を試みているが、MC溶液の継続的飲用による胃粘膜保護作用はほぼ明らかであるといえた。研究期間全体を通じて、食物繊維の粘性水溶液摂取によって粘膜が厚くなり腺粘液分泌細胞が増えることが明らかになった。また、その作用は食物繊維の種類によって異なることや、同種の食物繊維でも分子量が大きい物の方が少量で効果があることが示された。

また、食物繊維の粘性溶液摂取によって胃潰瘍などの侵襲から胃粘膜を保護できる可能性のあることがわかった。粘度を10mPa・sと40mPa・sに調整した食物繊維粘性水溶液を24週間飲水としてマウスに飲ませ、胃粘膜にどのような影響があるか検討した。その結果、食物繊維溶液を飲むと胃粘膜が厚くなり、腺粘液産生細胞が増えることがわかった。そして、それらの作用は食物繊維の種類や分子の大きさによって異なり、アガロースやアルギン酸ナトリウムに比べてメチルセルロースやグアガムで作用が大きく、さらに同じ種類の食物繊維でも分子の大きなものの方が食物繊維の摂取量が少ないにも関わらず作用が大きいことがわかった。平成26年度は、胃粘膜肥厚効果の最も高い食物線維を選定することを実験目標としている。現在はメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、グアガム、アガーについて動物を用いた投与実験を終え、顕微鏡によるデータ解析を行っており、メチルセルロースとアルギン酸ナトリウムについて解析を終えている。そのほかのサンプルについても順次解析を行っていく。食品衛生平成26年度に検討済みのNSAIDs(インドメタシン)誘発胃潰瘍の条件にしたがい、胃潰瘍を作成し、40mPa・s食物線維溶液投与については、経口ゾンデによる投与から給水瓶による自由摂取への切り替えを考えている。胃潰瘍を誘発させる実験なので、外部からの刺激(経口ゾンデ)による胃粘膜への影響を極力避けたいからである。インドメタシン誘発胃潰瘍のポジティブコントロールとして胃粘液分泌促進作用のあるテプレノンもしくはレバミピドを用いることを考えている。平成25年度の目標であった、食物せんいの種類とその溶液の粘度の違いによるマウス胃粘膜肥厚への影響の検討については、解析途中である。しかし、すでにすべての組織標本は出来上がっており、結果を得る見通しはたっている。粘膜標本作製と並行して平成26年度に検討する予定であった、食物せんい溶液単回投与による粘膜内MAPKのリン酸化や細胞分裂指標のMCM7の消長、HSP70の変化について検討し、結果を得た。これらを総合するとおおむね順調であるといえる。平成26年度に予定していた実験を平成25年度に実施したので、平成26年度にはまず25年度の実験の結果(組織標本の検討)を得るようにする。また、同じく平成25年度に実施し冷凍保存してあるサンプルを用い、食物せんい溶液投与による胃粘膜機能への影響の検討項目として、胃内容物の粘度測定を行う。
ヒト細胞系でのLPSシグナル伝達に対する調節機構の解明

細菌内毒素リポ多糖(LPS)中のリピドA部分は種々のメディエーターの産生を誘導しエンドトキシン活性発現の中心的な役割を果たす。リピドA類縁構造に対する応答で、ヒト系細胞とマウス系細胞に違いのあることが指摘されている。本研究では、構造的に関連した一連の単糖体リピドA類縁化合物を用いて、それらのヒトマクロファージ系細胞に対するサイトカイン(TNF-α及びIL-6)産生誘導効果をマウス系細胞に対する効果と比較検討した。その結果、LPS様活性化作用を示す物質としてヒト系細胞に認識されるためのリピドA類縁化合物の構造的特徴として、単糖体か二糖体かにかかわらず分子を構成する成分として、D-グルコサミン、リン酸基、炭素鎖長がC14とC12のアシル基、を1:1:3の割合で持つことが求められ、それはマウス系細胞による構造要求性に比べより厳密であることを明らかにした。一方、LPSの作用に対してヒト系細胞で抑制的作用を示すリピドA類縁構造は幅広く、マウス系細胞では活性的作用あるいは抑制的作用を示す構造と同程度の範囲にまで及ぶものであった。現在、LPSの刺激シグナルを細胞内に伝える真の受容体の究明が大きな課題であるが、この受容体の構造が動物の種により異なるのが、リピドA類縁構造に対する応答性の差の原因であることが示唆されている。本研究の成果は、この受容体によるリピドA類縁構造の認識段階で、サイトカイン産生にまで至る生産的なシグナルとして認識されたか、LPSの作用を抑制する非生産的なシグナルとして認識されたかに基づいて得られたものである可能性があり、想定されているLPS受容体の究明やLPSのシグナル伝達におけるその調節機構、更にはヒト系細胞とマウス系細胞でのこの受容体の特性の解明などに貢献できるものと考える。グラム陰性菌感染に伴って多彩な生体反応を誘導する内毒素リポ多糖(LPS)の活性中心はリピドAである。本研究では、ヒトマクロファージ系細胞株およびヒト末梢血単球細胞を使用し、リピドA類縁化合物によるサイトカイン(TNF-α及びIL-6)産生誘導効果を検討した。その結果、ヒト系細胞に活性を示す化合物として、完全なリピドA構造を有する化合物506(二糖体骨格に6個のアシル基を結合)以外に、単糖体骨格で3個のシアル基を有するGLA-60を始めとする化合物を見出した。一方、二糖体骨格で4個のアシル基を持つ化合物406は、マウス細胞系ではGLA-60を上回る強い活性を発現するにもかかわらず、ヒト系細胞には活性を示さず、単糖体化合物でもアシル基が2個や4個でマウス細胞に活性を示す化合物も、ヒト系細胞に対する活性は示さなかった。ヒト系細胞の活性化には、糖骨格と結合するアシル基の比(1:3)が重要な要素になることが示唆された。次に、ヒト系細胞へのLPSの活性化作用に対する抑制効果を検討した。この場合は、マウス細胞に対しては活性化活性を示す単糖体化合物や406をはじめ、マウス細胞に対する抑制効果を示す化合物も含む幅広い化合物が抑制活性を示した。これらの結果は、ヒトマクロファージ系細胞もマウス系細胞と同程度の範囲の構造を、LPSの刺激伝達経路上で認識するが、サイトカイン産生にまで至る正の刺激として認識するための構造要求性が強いことを示唆した。正の刺激伝達経路の解明と共に、負に作用する構造やその作用機構の解明も、エンドトキシンショックの防止に結びつく可能性が高い。

また、細胞内情報伝達経路の検討で、ヒト系細胞ではMAPキナーゼファミリー中のp38のリン酸化の亢進が著明に見られており、この活性化を1つのポイントとして研究を進めて行く予定である。細菌内毒素リポ多糖(LPS)中のリピドA部分は種々のメディエーターの産生を誘導しエンドトキシン活性発現の中心的な役割を果たす。リピドA類縁構造に対する応答で、ヒト系細胞とマウス系細胞に違いのあることが指摘されている。本研究では、構造的に関連した一連の単糖体リピドA類縁化合物を用いて、それらのヒトマクロファージ系細胞に対するサイトカイン(TNF-α及びIL-6)産生誘導効果をマウス系細胞に対する効果と比較検討した。その結果、LPS様活性化作用を示す物質としてヒト系細胞に認識されるためのリピドA類縁化合物の構造的特徴として、単糖体か二糖体かにかかわらず分子を構成する成分として、D-グルコサミン、リン酸基、炭素鎖長がC14とC12のアシル基、を1:1:3の割合で持つことが求められ、それはマウス系細胞による構造要求性に比べより厳密であることを明らかにした。一方、LPSの作用に対してヒト系細胞で抑制的作用を示すリピドA類縁構造は幅広く、マウス系細胞では活性的作用あるいは抑制的作用を示す構造と同程度の範囲にまで及ぶものであった。現在、LPSの刺激シグナルを細胞内に伝える真の受容体の究明が大きな課題であるが、この受容体の構造が動物の種により異なるのが、リピドA類縁構造に対する応答性の差の原因であることが示唆されている。本研究の成果は、この受容体によるリピドA類縁構造の認識段階で、サイトカイン産生にまで至る生産的なシグナルとして認識されたか、LPSの作用を抑制する非生産的なシグナルとして認識されたかに基づいて得られたものである可能性があり、想定されているLPS受容体の究明やLPSのシグナル伝達におけるその調節機構、更にはヒト系細胞とマウス系細胞でのこの受容体の特性の解明などに貢献できるものと考える。
炎症時に活性化される脂質生合成酵素LPCAT2の気管支喘息における役割の検討

強力な平滑筋収縮作用や炎症細胞の遊走作用をもつ生理活性リン脂質の血小板活性化因子(PAF)の生合成酵素であるリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素(LPCAT)2は炎症時に活性化される。このLPCAT2の気管支喘息に対する疾患治療標的としての可能性を探ることを目的とした。ヒト気管支喘息患者の気道平滑筋細胞を用いて、LPCAT2の役割を検討した。培養した細胞にLPACAT2のsiRNAを遺伝子導入し、PAF刺激を行った。気道収縮を引き起こす平滑筋細胞のマーカーであるα-SMAのmRNA発現はPAF投与により上昇するが、siLPCAT2群では上昇が認められなかった。LPCAT2がPAF刺激による気道平滑筋活性化に必要な因子である可能性が示唆された。気管支喘息誘発モデルを用いて、LPCAT2の気道閉塞性への影響を解析した。LPCAT2遺伝子欠損マウスを用い、卵白アルブミンによる喘息モデルを作成、メサコリン投与による気道過敏性の評価を行った。中枢気道抵抗は野生型、LPCAT2欠損マウスの差は認められなかった。高濃度メサコリン投与下にて、LPCAT2欠損マウスの気道抵抗の上昇が抑制される傾向が認められた。肺胞洗浄液から回収した白血球分画を測定したが野生型、LPCAT2欠損マウス間の有意差はなかった。LPCAT2抑制により細胞レベルではPAFによる平滑筋細胞活性化の抑制が示されたが、マウスモデルでは気管支喘息抑制効果は明らかではなかった。生体内では複数の経路や気道上皮細胞など他の細胞が病態に関与しているため、統計学的に十分な効果が認められなかった可能性がある。近年開発された抗IgEやIL-5モノクローナル抗体など喘息に対する分子標的治療薬との併用による補助的治療薬としての可能性や、気道のリモデリングといった中長期的なアウトプットへの影響など、更なる検討が必要である。気管支喘息は、気道の閉塞性変化による気流制限を特徴とする疾患であるが、そのメカニズムとして、気道炎症や気管支平滑筋収縮が関与することが知られている。血小板活性化因子(platelet-activating factor: PAF)は、強力な平滑筋収縮作用や炎症細胞の遊走作用をもつ生理活性リン脂質である。そのPAFの生合成酵素であるリゾホスファチジルコリンアシル転移酵素(lysophosphatidylcholine acyltransferase: LPCAT)2は炎症時に活性化されることがすでに報告されている。本研究では、このLPCAT2と気管支喘息の関係に注目し、気管支喘息におけるLPCAT2の役割と機序、さらには疾患治療標的としてのLPCAT2の可能性を探ることを目的としている。初年度は、マウスを用い、気管支喘息におけるLPCAT2欠損が及ぼす結果としての、気道の閉塞性変化を解析することを目的とした。まず、野生型マウスを用い、卵白アルブミン感作による気管支喘息モデルを作成した。種々の量と投与間隔・回数の検討を行い、今後の検討に最適なモデルとなるような条件設定を行った。次に、LPCAT2遺伝子欠損マウスを用い、麻酔下に、呼吸機能解析システムのFlexiVentを用いてメサコリン投与下の気道過敏性の評価、気道抵抗の測定を行った。野生型マウスモデルと比較検討した。また、肺胞洗浄を行い、洗浄液から回収した細胞成分から、白血球分画の測定を行っている。更に、肺組織における気道リモデリングの評価など、研究実施計画に沿って検討を進めている。マウスモデルの最適化と確認、呼吸機能解析システムなど機器の調整、ノックアウトマウスの繁殖・飼育に時間を要したため。

近年開発された抗IgEやIL-5モノクローナル抗体など喘息に対する分子標的治療薬との併用による補助的治療薬としての可能性や、気道のリモデリングといった中長期的なアウトプットへの影響など、更なる検討が必要である。引き続き、研究実施計画に沿って実験する。ヒト気管支平滑筋細胞株や、初代培養を用いて検討を行う。平常時(無刺激)と、各種刺激時における、メディエーター・サイトカイン・ケモカインの産生能、気道平滑筋細胞の収縮能、分化増殖能の比較など予定している。初年度のマウス実験がやや遅れていたため。残金および計画を今年度に回し、計画書に沿った実験をすすめる予定である。
縄文・弥生移行期における呪的遺物の集成的研究

本年度は、西日本の縄文・弥生移行期の社会における、呪術具の役割とその様相を検討するため、基礎的な集成作業を行った。対象は石製呪術具に絞ったが、土偶等の土製呪術具についても補完的に検討した。集成作業は、中四国地域・近畿地域・九州地域に分け、各地域の研究者の協力を得てほぼ各地域の全体像をつかむことができた。これまで、西日本の呪術具に関しては、晩期段階での西北九州・近畿・北陸・中部東海各地域での呪術具の増加について、外来文化に対する文化的抵抗の最前線での祭祀強化を示すという小林達雄氏による「祭祀強化説」が主張されていた。しかし、東海以東の地域については具体的な様相がわかっているものの、近畿地方以西の地域における具体相につていは、実はよくわからないというのが現状である。そこで、今回はこうした具体相の理解への基礎的作業として集成を行ったわけである。そして、集成作業の結果、主に次のような重要な点が明らかとなった。1.縄文時代中期以降、西日本各地に中部・北陸系の呪術具が拡張し、後晩期段階に急増する。2.中四国地域では、石棒の他、石冠、独枯石、十字形石器、綿刻礫、石偶など予想以上に多種類の石製呪術具が分布する。3.晩期後半以降、中四国では結晶片岩製石棒が急増し、特に徳島から南四国に多数分布する。4.出土点数からみた場合、縄文時代全般を通じて山陰・南四国地域では一定量分布するが、瀬戸内海沿岸の地域では、極めて少ない。5.弥生時代に入っても、結晶片岩製石棒は残存し、弥生時代の祭祀に取り込まれている。6.弥生時代前期になり、縄文時代に石製呪術具が少なくなかった地域に男根状石製品(オハゼ形石製品)が分布しはじめる。異常の結果を受けて、集成作業をもとにデータベースの作成を行った。
シナプス前終末における伝達物質放出可塑性の細胞内機序の解析

1.ニワトリ胚毛様体細胞節の杯状シナプス前終末を用いて、シナプス前終末からの伝達物質放出がニューロモデュレータにより修飾される細胞内機序を解析した。2.シナプス後細胞の興奮性シナプス電流EPSCはノルアドレナリン1-10μMにより増強され、増強は10-60分以上持続した。このときノルアドレナリンがアセチルコリン応答に影響しなかった。低Ca^<2+>高Mg^<2+>条件下でEPSCの素量解析を行うことにより、ノルアドレナリンが単位素量よりはむしろ平均素量数を増大させることが示された。以上により、ノルアドレナリンはシナプス前終末からの伝達物質放出を促進しているものと結論された。3.ノルアドレナリンによる促進作用は、phentolamineおよびpropranorolによる抑制を受けなかった。また、α_1アドレナリン受容体、α_2アドレナリン受容体、βアドレナリン受容体それぞれに選択的なアゴニストはEPSCの増強を示さなかった。このことから、促進作用に拘わる受容体は、α_1、α_2、βのいずれにも属さないアドレナリン受容体であることが示唆される。α_2受容体アゴニストは反対にシナプス伝達を抑制した。4.シナプス前終末の活動電位にともなう細胞内Ca^<2+>の増加はノルアドレナリンにより抑制された。この抑制はα受容体阻害薬のphentolamineにより拮抗された。しかし、伝達物質放出促進を説明しうる変化は認められなかった。すなわち、ノルアドレナリンがCa^<2+>増加以後の伝達物質開口放出機序を抑制することが明らかになった。
新規極性強磁性体における電気磁気応答の巨大化およびネール型スキルミオンの開発

スキルミオンとはスピンの渦巻き状の構造であり、反転対称性の破れた結晶中で安定化することが理論的に予言されている。スキルミオンにはブロッホ型、ネール型というスピン渦の巻き方に応じて異なる名前が付けられているが、これまで発見されているスキルミオン物質の大部分はブロッホ型であり、ネール型スキルミオンの物性に関する研究は欠損硫化スピネルGaV4S8のグループを除いてほとんど進んでいない。これに対し、我々はVOSe2O5という亜セレン酸塩に属する磁性体の単結晶育成法を開発し、磁気測定・小角中性子散乱実験を行うことによってネール型スキルミオンが発現している実験的証拠を得ることに成功した。この成果論文としてまとめられ、現在査読中である(arXiv:1710.04000)。本系は結晶自体が自発分極をもつ極性構造であり、マルチフェロイクスとしての性質も持つと考えられる。自発分極と自発磁化をあわせもつマルチフェロイクス(極性強磁性体)が巨大な電気磁気(ME)特性を示すことが近年報告されており、その機構解明および巨大なME効果の活用が期待されている。極性磁性体のME効果の増大は特に転移点近傍で見られることが多く、転移点直下で発現するスキルミオンとの相関に興味がもたれる。今回発見されたネール型スキルミオンを有する新規磁性体のME特性をさらに詳しく調べることでこれまでわからない部分が多かったネール型スキルミオンのME特性を利用する新しい指針を得るとともに、さらなるME効果の巨大化を目指すことが期待できる。
移植による中枢神経系の再構築と再生

哺乳動物中枢神経の損傷からの再生について、ラット脊髄-小脳路を用いた実験を行った.生後1週間までの幼弱なラット脊髄を鋭利なナイフで切断し、切断部を通って上行する神経軸索を順行性に標識して再生線維の走行を追った.また、切断部近傍のastrocyteとmicrogliaを免疫組織化学的に標識してその分布・形態変化を見た.その結果として、1.切断後3-5日の時点で、切断された神経軸索は切断部を乗り越えて再生を始めているものがあり、その先端には成長円錐が観察された.同時に、切断部より後退している軸索もみられ、それらは先端が球状に膨らんでいた.2.1の時点では(1)reactive astrocyteが切断部を中心にして増殖し、既にgliosisが生じていた.(2)microgliaが周辺かなり広い範囲に多く現れていた.3.1カ月以上たった時点で、再生した脊髄-小脳投射は正常と同じように小脳のanterior lobeとlobuleVIIIに終止した.4.特に良く再生した例ではその行動は正常と区別出来ないほど機能回復していた.以上の結果からastrocyteとmicrogliaが再生へ及ぼす影響は判定し難いが、少なくとも決定的な抑制因子ではないことは分る.以前から再生の報告のあった小脳出力路や皮質-脊髄路に加え、脊髄上行路も再生を示したことは、再生現象が中枢神経の特定の経路だけに限らない可能性を示すものである.哺乳動物中枢神経の損傷からの再生について、ラット脊髄-小脳路を用いた実験を行った.生後1週間までの幼弱なラット脊髄を鋭利なナイフで切断し、切断部を通って上行する神経軸索を順行性に標識して再生線維の走行を追った.また、切断部近傍のastrocyteとmicrogliaを免疫組織化学的に標識してその分布・形態変化を見た.その結果として、1.切断後3-5日の時点で、切断された神経軸索は切断部を乗り越えて再生を始めているものがあり、その先端には成長円錐が観察された.同時に、切断部より後退している軸索もみられ、それらは先端が球状に膨らんでいた.2.1の時点では(1)reactive astrocyteが切断部を中心にして増殖し、既にgliosisが生じていた.(2)microgliaが周辺かなり広い範囲に多く現れていた.3.1カ月以上たった時点で、再生した脊髄-小脳投射は正常と同じように小脳のanterior lobeとlobuleVIIIに終止した.4.特に良く再生した例ではその行動は正常と区別出来ないほど機能回復していた.以上の結果からastrocyteとmicrogliaが再生へ及ぼす影響は判定し難いが、少なくとも決定的な抑制因子ではないことは分る.以前から再生の報告のあった小脳出力路や皮質-脊髄路に加え、脊髄上行路も再生を示したことは、再生現象が中枢神経の特定の経路だけに限らない可能性を示すものである.
脊椎動物由来味覚受容体タンパク質を基盤にした呈味物質センサーの創出

味物質の受容を行う味覚受容体を利用し、呈味物質に対して安定的な数値を提示する味センサーの作製を行った。最も嗜好される味である甘味を測定するために、ヒト甘味受容体を安定的に発現する培養細胞を作製した。甘味物質を投与した際に観察される細胞内カルシウム濃度変化を蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度変化として測定することで、長期間安定的な数値を提示しうる甘味センサー細胞となりうることを示した。近年、味物質を受容するいわゆる味覚受容体の実体が明らかとなった。そのうち甘味や旨味の受容体はGタンパク質共役型受容体であり、細胞外領域が大きいTIRファミリーのヘテロダイマーにより構成される。本研究においては、甘味・旨味受容体タンパク質を利用した「呈味物質センサー」を創出することを試みる。受容体タンパク質を発現生産し、固定化したチップを用いた相互作用の検出や分光学的な手法により受容体と呈味物質との結合を検出することで、呈味物質センサーとして機能するかを検証する。本年は脊椎動物に由来する甘味受容体のサブユニットの細胞外領域について、大量発現系の構築を試みた。外来タンパク質を多量に発現させることが可能な昆虫細胞発現系を用い、バキュロウィルス感染により大量発現を試みた。TIRサブユニットの細胞外領域(N末端500アミノ酸残基程度)に精製用タグ配列(His、FLAG、Myc)を付加した変異体をデザインし、Bacmidを作製後、Sf9細胞に遺伝子導入しバキュロウィルスを作製した。その後、昆虫細胞(HighFive)に感染させ、培地中への分泌生産を行った。リコンビナント受容体タンパク質について、培地中への分泌生産が確認されたので、ニッケルカラム・抗体結合カラムを用いて精製を行った。その結果、Hisタグ付加タンパク質については、還元条件下SDS-PAGE後の銀染色において、ほぼ単一のバンドが検出される程度の精製度にまで精製することが可能となった。今後、大量発現を行い、必要量のリコンビナントタンパク質の獲得を行う。本研究においては、甘味・旨味受容体タンパク質を利用した「呈味物質センサー」を創出することを試みた。本年度は細胞系を用いた呈味物質センサーの改良を行った。ヒト甘味受容体について、安定発現株の構築を試みることにより、応答性の向上が可能となるかについて検討を行った。甘味受容体を機能解析するためには、甘味受容体サブユニット(T1R2とT1R3)とキメラGタンパク質の計3遺伝子を発現させる必要がある。我々は配列特異的組換えを用いることによってゲノム中に1コピーのみを導入することが可能な市販の遺伝子導入システム(Flp-Inシステム)を利用することを考えた。この方法においては、外来遺伝子の安定的発現が期待されるものの、複数のタンパク質を同時発現させる際には発現させたい遺伝子を1つの発現プラスミドに集約する必要がある。そこで3遺伝子を発現させる発現コンストラクトを、複数のプロモーターならびにIRES配列を利用することによって構築した。作製した発現コンストラクトについて、安定発現細胞の作出を行った。このようにして得られたヒト甘味受容体安定発現細胞においては、従来法と比較して甘味物質に対する応答性が劇的に向上した。応答細胞の頻度が顕著に上昇したのに加え、応答感度も上昇した。これまで応答測定が困難であった砂糖(スクロース)に対する応答も十分に確認することが可能であった。応答測定の簡便化のため、マルチウェルプレートを用いたセルベースアッセイを行ったところ、多種の甘味物質に対する濃度依存的な応答が確認できたことから、「呈味センサー細胞」としての利用ができる可能性が示された。
歴史的景観および交通路として旧東海道の総合的継承手法の研究

本研究は、滋賀県内における旧東海道の歴史的景観の現況の把握、旧東海道の歩行者道としての構成の特質の把握、その交通路としての現況の把握と今後の利用のありかたを考察したものである。旧東海道沿道における伝統的建造物の保存状況については、大津地域では3040%、草津地域3050%で、草津では外観を近代的に改造した例が多い。栗東以東は伝統的建造物が多く、栗東および甲西地区6070%、土山地区およそ60%である。土山地区では新しい建物で町並みとの調和をはかる和風事例が多い。水口、土山には伝統的町並み景観がある。宿場間の集落では、沿道全域にわたり農家の前庭に和風庭園が形成され、旧宿場以上に良好な景観が見られる場所が多い。明治以後の和風建築は沿道全域で似通っているが、江戸時代・明治初期の建物には、各宿場ごとの形態の変化が見られる。社寺など、近世の案内記に記載された名所はその殆どが現存し、景観的状況もかなりよい。いっぽう、河川、橋など公共空間内の歴史的景観要素については歴史的景観が失われているが、最近、歴史性を表現する修景が橋で始められている。松並木は殆ど現存しない。交通路としての調査は旧草津宿でおこなった。旧東海道としての認知は高齢者を除いて一般に低く、道としても余り好まれていない状況である。沿道では自動車通行の利便性を高めることを望む意向が高い。しかし、旧東海道であることの認知を高め、その利用法を沿道景観形成と一体で示した上で、再度意向を確かめる必要があろう。各行政区域ごとに交通路の体系的計画があり、旧東海道の歩行者道としての利用計画の作成は簡単ではなく、今後も検討を続ける予定である。本年度は、滋賀県内の旧東海道全域(大津市・草津市・栗東町・石部町・甲西町・水口町・土山町の2市5町におよぶ範囲)で調査研究を行った。1)東海道の景観の復元:『東海道分限延絵図』および名所図会類、浮世絵風景画を資料として、街道景観の復元的考察を行い、松並木、常夜灯、橋、高札場、一里塚、家並み、それに遠景の眺望地点について分布の復元を行った。2)現況景観の調査:以下の3つの視点で調査を行った。(1)街道筋およびその周辺に位置する街道施設(石標、常夜灯、橋、松並木など)の分布と現況(2)街道沿いの伝統的建造物の所在とその保存度(3)眺望景観の状況3)交通路としての旧東海道の現況:草津市内の旧東海道沿線地区について、住民意識調査を実施し、旧街道の自動車路および歩行者路としの利用状況を調査した。(この意識調査では町並み景観に関する質問も合わせて行った。)以上総じて言えば、旧東海道沿線にはまだかなりよく昔日の面影があり、落ち着いた緑豊かな集落景観の中を行く歩行者路として適当かと思われる部分も多い。大津市内は伝統的町家が多く残っており、他の旧宿場は景観整備を始めている町と旧東海道に無関心な町とで景観に大きな差が出ている。本年度は調査に終始したので、次年度は分析的考察と利活用計画を主眼に研究を進める予定である。本年度は次のような調査研究を行った。1)旧東海道の街道景観の総合的分析:1-1.道路の屈曲と宿場等の家屋配置の関係:宿場のほぼ両端部で街道が屈曲する傾向があり、宿場の景観に内部的な雰囲気を与えている。特に土山と瀬田では神社正面の参道に横から街道がぶつかる形の配置があり、街道の雰囲気の急激ともいうべき変化を演出している。1-2.街道沿いの町並:

街道沿いの建築物は1二階の背の低い伝統的様式建築2二階の背の高い近代の伝統的様式建築3モルタル塗等現代的家屋の3者から構成されるが、1,2が現在まで一部で造り続けられている。1は大津から土山まで徐々に形態の変化が見らるが、2,3は全体を通して同じ形式であり、街道景観の個性を希薄にする傾向が見られる。1-3.街道沿いの集落景観:道路から一定距離後退はしているが、切妻平入の町家的な形態を取っている。街道との間の前庭はかつては作業スペースであったが、戦後そこが庭園化され、街道が庭園の中を行くごとく、ある意味で江戸時代以上に美しい景観が形成されているとも言える。2)交通路としての街道の分析:明治以降各年代の地図により、街道沿いの集落規模の変化と道路の整備状況の関係を年代順に整理し分析した。3)歩行者路としての街道の整備計画:案内標識の整備が先ず必要である。歩行者および自転車の両者の利用を考えるべきである。一部に単調な景観や寂しい場所が長く続く箇所があり、休憩所等の整備が求められる。また町並だけでなく、三上山などの眺望視線の保護が魅力ある歩行者道のために必要である。交通量の多い箇所があり、バイパスの設置が求められるが、その経路の計画は今後の課題として残った。
ヒト着床における子宮内膜上皮細胞の運動動態の解明と新規着床支援療法の確立

ヒト着床の分子機序解明は、生殖補助医療の最大の障害となっている着床ロスの軽減に向けて渇望されている。従来、胚が子宮内膜の間質に陥入し妊娠が成立するには、通過すべき子宮内膜上皮細胞層が細胞死を引き起こすことで胚の陥入ルートを形成するとされてきた。本研究によって、着床期の子宮内膜上皮細胞層の破壊は細胞死によるだけでなく、子宮内膜上皮細胞の特異な遠心方向の運動によって構成されていることが明らかとなった。生殖補助医療とりわけ体外受精での不成功原因の最大因子は着床障害であり、原因はその機序が受精過程に比較して解明されていない点にある。前年度に子宮内膜上皮細胞層のreal time video recordingを用いた顕微鏡動画像の観察によって、「胚陥入路形成のための子宮内膜上皮細胞層の破壊は、従来唱えられてきた細胞死説よりも胚からの逃避運動亢進による迅速な生体反応の方が大きく寄与している」ことを明らかにしつつあるが、平成25年度は、その子宮内膜上皮細胞の運動機序に焦点をあてて解析を進めた。異種細胞間の接触に始まる「着床」において子宮内膜上皮細胞に胚モデル回避的な遠心性の運動が生じるのが、子宮内膜上皮細胞に特異な現象であるのか検討を加えたところ、種々の細胞株を使用した結果から、回避運動に程度の差は認めるものの、子宮内膜上皮以外にも認める現象であることが明らかとなった。これはヒト病理的に子宮内膜のない部位に着床する異所性妊娠の機序解明につながる知見である。子宮内膜上皮に着床期に有意に発現するタンパク質としてGlycodelinが知られるが、使用した細胞株のうち、興味深いことに、Glycodelin発現を認める細胞株ほど回避運動が顕著な傾向にあった。また、回避運動が種々の上皮に認められる現象として存在するにしても、回避運動のトリガーとなるのは胚モデル特異的な現象であるか否かの解析も着床機序解明には有用となる。そこで絨毛癌由来のJAR細胞以外の細胞株やマテリアルを用いて、その椅子細胞間相互反応である「着床」の胚側から子宮内膜へのアプローチの機序にも着目して検討している。生殖補助医療における妊娠率向上の障壁として倫理的にアクセスの難しいヒト着床の不明な機序が存在する。これまでin vitro解析系を用い、子宮内膜上皮細胞層では、上皮間充織転換(EMT)と呼ばれる特殊な細胞形質転換が起こり着床機序に関与していることを明らかにしてきたが、本研究ではEMTが実際に子宮内膜上皮細胞の運動を誘発し、着床に有利に働くことをリアルタイム観察で捕捉し、新たな体外受精胚移植の治療アプローチの技術的基盤の確立を目的としている。平成24年度は「胚陥入路形成のための子宮内膜上皮細胞層の破壊は、胚からの逃避運動亢進による迅速な生体反応」であり、その生体反応の基盤はGlycodelin発現と上皮間充織転換(EMT)に裏打ちされると仮定している。その仮説立証のためにヒト着床モデルにおける子宮内膜上皮細胞層のreal time video recordingを用いた顕微鏡動画像の観察を種々の条件下で実施した。その結果in vitroヒト着床モデル解析系において、1胚モデル(JAR細胞spheroid)の子宮内膜上皮細胞層モデル(Ishikawa細胞飽和培養)への対峙・接着をトリガーとして(接着前の子宮内膜上皮細胞層への細胞運動能への影響は認めず)、2細胞死による子宮内膜上皮細胞の非働化と同時に、3胚接着点から遠位方向への胚回避的細胞運動による子宮内膜上皮細胞層の間隙形成がなされることが明らかになった。さらにその胚回避的細胞運動が、4卵巣ステロイドホルモン(エストラジオール+プロゲステロン)によって加速されることと、5in vitro着床系において子宮内膜上皮細胞の接着能・分化能・運動能を促進的に制御しうるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるSuberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)によっても、胚回避的運動が促進されることが示された。前年度までに明らかにしつつあった「胚陥入路形成のための子宮内膜上皮細胞層の破壊は、従来唱えられてきた細胞死説よりも胚からの逃避運動亢進による迅速な生体反応の方が大きく寄与している」という新知見に対して下記を明らかにした。胚接着によって開始する上皮細胞の胚回避様細胞運動は、(1)卵巣ステロイドホルモンの添加によって加速される。(2)遺伝子転写制御化合物であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の添加によって、卵巣ステロイドホルモン添加以上に加速される。(3)細胞死による胚陥入ルート形成も認められるものの、その割合は圧倒的に回避細胞運動によるものの方が面積的に優位である。(4)子宮内膜