hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放置竹林を活用した循環型環境教育プログラムの開発と実践

平成30年度には、「竹利用環境教育プログラム」の完成版作成を目標に研究活動を行った。またプログラムの内容として、1竹工作・2竹素材の調理への利用・3竹廃材を利用した炭焼きの3つの具体的メニューを設定した。以上のうち、1竹工作については、研究分担者安孫子を中心に、ガリガリトンボの制作とそれを利用した遊びに関する活動プログラムを作成し、宮城教育大学公開講座および宮城県立支援学校小牛田高等学園での出前授業おいて実践を行った。「竹素材の調理への利用」と「竹廃材を利用した炭焼き」については、分担者亀井と研究代表者西城との協同で、両者を組み合わせた炭焼きとその余熱を利用したプリン作りに関する活動プログラムを作成し、宮城教育大学公開講座および大学の授業において実践を行った。これらの研究実績については、研究発表欄に記したいくつかの論文にまとめた。また本研究課題の背景にある過去の里山利用や里山の現状に関わる研究発表として、研究代表者西城は、日本地球惑星科学連合2018年度大会「山の科学」セッションにおいて、口頭発表(招待講演)を行った。また本研究課題の一部である竹廃材の地域資源化については、第16回木質炭化学会および日本環境教育学会東北地区懇談会において発表した。その他では、本研究課題に関連する業績として、西城が里山利用に関する自然観察会に関する論考、および自然観察会の環境教育的意義に関する論考を寄稿した。研究実績の概要に示した3つのプログラムは、それぞれ1研究分担者(安孫子)、2研究分担者(亀井)、3研究代表者(西城)を中心に進めているものである。研究組織構成員各自が、それぞれの専門性を活かした環境教育プログラムを作成し、公開講座や授業での実践を経て、一定の成果もあげていること、実践の内容について論文等での発表を行っていること、本課題に関連の深いテーマについても学会発表や論文執筆を進めていることなどから、おおむね順調に進んでいると判断している。年度前半には、大学・小学校でのさらなる授業実践の積み重ねを試み、プログラムの効果と課題を洗い出す。とくにプログラム2調理と3炭焼きについては、授業での実践例が不足しているので、実践を繰り返すことでプログラムの完成度を高めていく必要がある。小学校においては、具体的な教科の学習との接点を探るため、社会・図工・家庭科での実践を行う予定である。とくに研究代表者の西城が、今年度より附属小学校の校長を務めることになったため、附属小の協力を得ながら、授業実践と検証を進めていきたい。また研究成果については、学会発表・論文等での公表に加え、HPを通して動画教材等も含めた成果公開を進めていく。放置竹林を題材とした循環型環境教育プログラムの開発という目的のもと、平成29年度には、1)竹の利用法のデータベース化、2)環境教育プログラムの試作版作成の2つを目標を掲げて研究活動を行った。まず目標1)については、結果的には、当初意図していたようなデータベースの作成には至らなかった。国内外の竹利用事例が膨大な数に上ること、膨大な事例に関するデータベースを作成したとしても、それが小中学校で利用可能な環境教育プログラムの開発に直結しない可能性が高いと判断されたことが、その主な理由である。そこで年度途中から方針を変更し、宮城県内および周辺地域での事例で、かつ学校教育への展開の可能性が高い竹利用に限定して資料収集を行うことにした。具体的には、水産業(牡蠣養殖)における竹筏の利用(西城)、竹素材の調理への利用(亀井)、竹の加工材としての特性把握および工作(安孫子)である(カッコ内は主たる担当者)。こうして集めた竹利用事例をもとに、2)の目標に関わって、教材化の前提となる基礎データの収集や試行実験、試行プログラム作成も行った。とくに牡蠣養殖筏に由来する廃材活用のために、研究協力者・井上の指導も受けつつ、簡易炭焼き法の開発、廃材燃焼時のダイオキシン類発生の有無について検討を進めた。その結果、学校教育でも十分実施可能で、かつ比較的良質な炭を焼くことのできる簡易炭焼き法を開発することができた。また竹筏由来の廃材を燃焼した際のダイオキシン類発生については、実験の結果、ダイオキシンの発生はほとんど認められないことが確認された。また竹素材の調理への利用、竹の加工材としての特性把握および工作について、複数回の試行実験を経て、プログラム試案を作成した。「研究実績の概要」に述べた理由から、当初計画していた竹利用に関するデータベース作成には至っていない。しかし、これは全体の研究目的に照らしてその方が妥当と判断したためであり、進捗状況の遅れとは捉えていない。データベース作成に替わり、教育展開の可能性が高い宮城県内の竹利用事例について調査を進めている。具体的には、「牡蠣養殖筏から発生する廃材を活用した炭焼き」、「竹素材の調理への利用」、「竹の加工材としての特性把握および工作」に関する資料収集や試行実験を行った。その結果をふまえた試行プログラムの作成は、「竹素材の調理への利用」と「竹の加工材としての特性把握および工作」についてはほぼ終了したが、「牡蠣養殖筏から発生する廃材を活用した炭焼き」については、教材化の前提となる基礎実験に予想以上の時間・予算を要したことから、試行プログラム作成にはまだ至っていない。以上が、現状を(3)と判断した理由である。またプログラムの内容として、1竹工作・2竹素材の調理への利用

・3竹廃材を利用した炭焼きの3つの具体的メニューを設定した。以上のうち、1竹工作については、研究分担者安孫子を中心に、ガリガリトンボの制作とそれを利用した遊びに関する活動プログラムを作成し、宮城教育大学公開講座および宮城県立支援学校小牛田高等学園での出前授業おいて実践を行った。「竹素材の調理への利用」と「竹廃材を利用した炭焼き」については、分担者亀井と研究代表者西城との協同で、両者を組み合わせた炭焼きとその余熱を利用したプリン作りに関する活動プログラムを作成し、宮城教育大学公開講座および大学の授業において実践を行った。これらの研究実績については、研究発表欄に記したいくつかの論文にまとめた。また本研究課題の背景にある過去の里山利用や里山の現状に関わる研究発表として、研究代表者西城は、日本地球惑星科学連合2018年度大会「山の科学」セッションにおいて、口頭発表(招待講演)を行った。また本研究課題の一部である竹廃材の地域資源化については、第16回木質炭化学会および日本環境教育学会東北地区懇談会において発表した。その他では、本研究課題に関連する業績として、西城が里山利用に関する自然観察会に関する論考、および自然観察会の環境教育的意義に関する論考を寄稿した。研究実績の概要に示した3つのプログラムは、それぞれ1研究分担者(安孫子)、2研究分担者(亀井)、3研究代表者(西城)を中心に進めているものである。研究組織構成員各自が、それぞれの専門性を活かした環境教育プログラムを作成し、公開講座や授業での実践を経て、一定の成果もあげていること、実践の内容について論文等での発表を行っていること、本課題に関連の深いテーマについても学会発表や論文執筆を進めていることなどから、おおむね順調に進んでいると判断している。平成30年度には、前年度に作成した試作プログラムをもとに、大学での授業その他の機会を利用した授業実践を行い、「竹利用環境教育プログラム」の完成版を作成する予定である。「竹素材の調理への利用」については、竹炭焼きと組み合わせた余熱利用の蒸し料理(とくにプリン)制作を中心に、既に試作プログラムが完成しつつある。このプログラムについては、大学の授業および宮城教育大学公開講座において実践を行う予定である。また「竹工作」については、宮城県立支援学校小牛田高等学園において実践授業と指導案作成を行うことが確定している。また開発題材考案のため、民間団体の主催する竹細工教室への参加による情報収集も行う予定である。試作プログラムの完成に至っていない「牡蠣養殖筏から発生する廃材を利用した炭焼き」については、年度当初の6月までに試作プログラムを完成させる。この試作プログラムを大学の授業において実践するとともに、東松島市周辺の小学校において試行的授業実践を実施したい。また前年度に新たに開発した炭焼き法については、宮城教育大学公開講座において実践を行う予定である。このように各テーマによる試行プログラムの実践をふまえ、必要な改良を加えて、年度末には「竹利用環境教育プログラム」の完成版を作成する。年度前半には、大学・小学校でのさらなる授業実践の積み重ねを試み、プログラムの効果と課題を洗い出す。とくにプログラム
高齢者の自己実現を測定する質問票の開発および自己実現の関連因子の縦断的検討

高齢者の自己実現状況を主観的側面と客観的側面で評価する質問票を提案した。そして、この質問票に有効回答を与えた地域在住高齢者840人を3.1年間追跡し、主観的側面と客観的側面の両方が実現域、主観的側面だけが実現域、客観的側面だけが実現域、両方の側面が非実現域、の4群の間で、要介護認定を受けていない生存のオッズを比較した。多変量調整後オッズ比は、自己実現の主観的側面と客観的側面の両方または一方が非実現域だと有意に低かった。提案した質問票に予測妥当性があること、そして、自己実現が主観的側面と客観的側面の両面で達成されないと、高齢者の自立生活の維持にはつながらないことを指摘できた。自己実現の関連因子を検討する追跡調査の準備を行った。対象は、研究地域で平成22年1月に在宅高齢者全員を対象に実施した健康と生活に関する質問紙調査に回答し、要介護非認定であった4423人である。本研究で計画している2回目質問紙調査の対象者確定のため、平成26年2月末時点での追跡対象者の消息を確認した。そして、予備的な縦断研究データセットを作成した。【自己実現尺度の作成】自己実現の状況を、身体機能を使う活動、認知機能を使う活動、社会参加の3領域での状況に基づき評価した。身体機能を使う活動の状況を、一日のうち仕事や家事をする時間(P1)と、余暇における、身体活動強度が異なる4レベルの身体活動の頻度(P2)の2要素で評価した。認知機能を使う活動の状況を、6カテゴリーの趣味活動の頻度(C)で評価した。社会参加の状況を5カテゴリーの地域活動への参加頻度(S)で評価した。P1の合計時間>=3時間/日、P2での合計参加頻度>=1日/週、Cでの合計参加頻度>=1.5日/月、Sでの合計参加頻度>=1.5日/月を、それぞれの要素での自己実現状態とみなし、自己実現状態が2要素以上の者を自己実現者とした。【尺度の予測妥当性】ベースライン質問紙調査回答者のうち、5要素の構成項目すべてに回答した845人を解析対象とした。自己実現者は473人(56%)、4年1か月後の自立生存者(要介護認定を受けずに生存した者)は667人(79%)、自己実現者の非実現者に対する自立生存の性、年齢調整後オッズ比と95%信頼区間は1.9(1.3,2.8)であった。作成した自己実現尺度には、自立生存について予測妥当性があるものの、項目数の多さのため、回答者の19%しか評価できないという問題がある。次年度に自己実現状況を測定する質問紙調査に関する文献レビューを追加し、尺度に付加するべき項目の特定と、項目数を減らす検討を行う。文献検索から、自己実現状況の測定尺度として、主観的健康観が用いられることがわかった。このことから、主観的健康観を高い水準で維持することに関連する因子を明らかにすることが、本課題のねらいに合致すると考えられたので、本研究課題で収集した研究資料を解析して、主観的健康観の関連因子を、健康状態(現病歴、入院の既往、からだの痛み)、生活機能(老研式活動能力指標)、社会経済的背景(教育年数、暮らし向き、就労)、社会活動性(外出頻度、グループ活動参加頻度、親族・友人・隣人の数、携帯電話・パソコンを含む情報端末の使用頻度)の4領域について探索した。各領域でとりあげた項目が一貫して主観的健康観と関連したことは、先行研究の結果と一致した。先行研究にはない本課題にユニークな結果は、情報端末の使用状況が主観的健康観の関連因子として検出されたことである。月1回以上情報端末を使用することと高い主観的健康観との関連を表すオッズ比は、性、年齢別に検討すると、男女とも65-74歳の者で、調整する因子の領域によらず有意に高かった。すなわち、健康状態、生活機能、社会経済的背景、社会活動性(情報端末の使用頻度以外の項目)の4領域を個別に調整した時のオッズ比は、男では、生活機能を調整した時の1.6(95%信頼区間、1.1-2.2)から、健康状態を調整した時の1.8(1.2-1.5)の間に、女では、社会活動性を調整した時の2.1(1.5-3.1)から健康状態を調整した時の2.4(1.7-3.4)の間に分布した。これらの結果は、前期高齢者では、情報端末の使用が主観的健康観の維持に寄与することを示唆している。今後、主観的健康観の変化を把握できる追跡調査を加え、情報端末の使用と主観的健康観の維持との関連が縦断的にも認められるかを検証する。その結果を踏まえ、主観的健康観の向上維持を土台とする自己実現の方策を考察する。

初年度の検討で考案した自己実現状況を客観的側面によって捉えるスケール(仕事や家事をする時間、余暇での身体活動の頻度、趣味活動の頻度、地域活動への参加頻度の4要素のうち、その値以上であれば望ましい状態であると操作的に定義した区分値以上を示す要素が2要素以上であれば、自己実現状態にあると判定するスケール)と、二年度の検討で、自己実現状況の主観的側面を反映していると指摘した主観的健康観の2つを組み合わせ、高齢者の自己実現状況を、「主観的側面と客観的側面の両方で実現」、「主観的側面だけで実現」、「客観的側面だけで実現」、そして「両方の側面ともで非実現」の4カテゴリーに分類した。ベースライン質問紙調査回答者のうち、自己実現状況の2つの側面の評価に必要な変数に欠測がなかった840人を、要介護認定を受けずに生存していること(以下、自立生存)をエンドポイントとする追跡の対象とした。自立生存のオッズは、多重ロジスティック回帰モデルによって性、年齢、入院歴および現病歴を調整すると、「両方ともで実現」を基準として、「主観的側面だけで実現」〔調整オッズ比0.52(95%信頼区間0.30, 0.91)〕、「客観的側面だけで実現」〔調整オッズ比0.47(95%信頼区間0.26, 0.88)〕、「両方ともで非実現」〔調整オッズ比0.34(95%信頼区間0.20, 0.58)〕のいずれのカテゴリーでも有意に低かった。高齢者の自立生活の維持という観点からは、自己実現の主観的側面と客観的側面にはそれぞれ固有の意義があり、両方の側面を評価する必要があること、また、高齢者の自己実現を自立生活の維持につなげるためには、主観的側面と客観的側面の両方での自己実現が必要なことを明らかにできた。高齢者の自己実現状況を主観的側面と客観的側面で評価する質問票を提案した。そして、この質問票に有効回答を与えた地域在住高齢者840人を3.1年間追跡し、主観的側面と客観的側面の両方が実現域、主観的側面だけが実現域、客観的側面だけが実現域、両方の側面が非実現域、の4群の間で、要介護認定を受けていない生存のオッズを比較した。多変量調整後オッズ比は、自己実現の主観的側面と客観的側面の両方または一方が非実現域だと有意に低かった。提案した質問票に予測妥当性があること、そして、自己実現が主観的側面と客観的側面の両面で達成されないと、高齢者の自立生活の維持にはつながらないことを指摘できた。自己実現状況の測定尺度として、主観的健康観が用いられることを明らかにし、主観的健康観の関連因子として、携帯電話・パソコンからなる情報端末の利用状況という、新しい因子を明らかにできた。公衆衛生学自己実現状況の測定尺度として、主観的健康観が用いられることを明らかにできたので、主観的健康観の変化を把握できる追跡調査を加える。自己実現状況を測定するための予備的尺度を作成できたが、それを改良するための文献レビューは次年度の課題である。自己実現状況を測定する質問紙調査に関する文献レビューを追加し、尺度に付加するべき項目の特定と、項目数を減らす検討を行う。改良を加える自己実現尺度について、地域の世話役を務める高齢者群と、介護保険の通所介護を利用している高齢者群との間での回答の比較(尺度の併存的妥当性の検討)、および世話役を務める高齢者への再回答依頼(信頼性の検討)を行う。
ハイブリッド医用材料の放射線照射効果

種々のハイブリッド医用材料の臨床応用に向けて、放射線滅菌の有効性が期待されるが、放射線照射によって生理活性体の機能低下を生ぜしめないことが基本要件となる。本研究の目的は、可能な限り無菌プロセスを採用して、人工材料に種々の生理活性体(酵素、タンパク質、抗体、ヘパリン、医薬など)をハイブリッド化し、さらに種々の条件下で放射線照射することによりその生物学的機能にどのような影響を受けるかを詳細に検討し、バイオバーデンを考慮した低線量による放射線滅菌の可能性を明らかにするのが最終目的である。本年度は、本研究計画の最終年度にあたるため、これまでに集積されてきた研究結果を総合的に見直し論文発表等の報告取りまとめを推進するとともに、実験技術の改善、試料の量産化の検討をを進めた。具体的には、昨年度までに引き続き、生理活性体のモデルとしての酵素蛋白の種類を増し、それらを適切な高分子担体(多糖類、天然および合成ポリペプチドなど)に共有結合法(化学反応および放射線グラフト法)で固定化する条件の適性化と、得られた固定化酵素の活性・安定性の評価および放射線照射による影響について整理した。高分子担体には、生体適合性に優れた多孔性粒子、膜、ハイドロゲルなどの形状のものについて再検討した。放射線照射の前処理は可能な限り無菌プロセスを採用した。適当な密封系を工夫した上、放射線照射を行なった。次に、固定化酵素・修飾酵素に種々の環境条件下で放射線(コバルトガンマ線)を照射し、その線量および線量率による放射線照射の影響の度合いを詳細に検討し、その耐放射線限界を確立した。種々のハイブリッド医用材料の臨床応用に向けて、放射線減菌の有効性が期待されるが、放射線照射によって生理活性体の機能低下を生ぜしめないことが要件となる。本研究の目的は、可能な限り無菌プロセスを採用して、人工材料に種々の生理活性体(酵素、タンパク質、抗体、ヘパリン、医薬など)をハイブリッド化し、さらに種々の条件下で放射線照射することによりその生物学的機能にどのような影響を受けるかを詳細に検討し、低線量による放射線減菌の可能性を明らかにすることにある。一方では、ガンマ線および電子線照射法を適用して放射線科学反応により有効なハイブリッド医用材料の設計も試みる。本年度は、生理活性体のモデルとして適切な酵素を選び、酵素単体およびそれを適切な高分子担体(多糖類、天然および合成ポリペプチドなど)に共有結合で固定化したものについて、放射線照射による酵素活性変化および放射線照射後の酵素安定性に関する実験的評価を行った。すなわち酵素単体あるいは固定化酸素を乾燥状態および水溶液中において種々の線量で放射線(ガンマ線あるいは電子線)照射して、酵素活性・安定性の変化から放射線影響を調べた。放射線の種類、線量および線量率と酵素分子への放射線照射の影響の度合いを詳細に検討し、その耐放射線限界を求めた。本年度の研究結果について論文にまとめ順次発表を行う。高次生物学的機能を付与させたハイブリッド医用材料の開発は今後の不可欠な課題であるが、それらの臨床応用に向けて、放射線滅菌の有効性が期待される。この場合、放射線照射によって生理活性体の機能低下を生ぜしめないことが必須条件となる。本研究の目的は、可能な限り無菌プロセスを採用して、人工材料に種々の生理活性体(酸素、タンパク質、抗体、ヘパリン、医薬など)をハイブリッド化し、さらに種々の条件下で放射線照射することによってその生物学的機能にどのような影響を受けるかを詳細に検討し、可能な限り低線量による放射線滅菌の可能性を明らかにすることにある。さらに、ガンマ線および電子線照射法を適用して放射線化学反応により有効なハイブリッド医用材料の設計も試みる。本年度は昨年度に続き、生理活性体のモデルとして酵素蛋白を選び、酵素単体およびそれを適切な高分子担体(多糖類、天然および合成ポリペプチドなど)に共有結合法で固定化したものについて、放射線照射による酵素活性変化および放射線照射後の酵素安定性に関する実験的知見を集積した。

すなわち酵素単体あるいは固定化酵素を種々の実験条件下で放射線照射を行い、酵素活性・安定性の変化から放射線影響を調べた。放射線線量および線量率を変えて酵素分子への放射線照射の影響の度合いを詳細に検討し、その耐放射線限界を求めた。本年度の研究結果について論文にまとめ順次発表を行う。種々のハイブリッド医用材料の臨床応用に向けて、放射線減菌の有効性が期待されるが、放射線照射によって生理活性体の機能低下を生ぜしめないことが基本要件となる。本研究の目的は、可能な限り無菌プロセスを採用して、人工材料に種々の生理活性体(酵素、タンパク質、抗体、ヘパリン、医薬など)をハイブリッド化し、さらに種々の条件下で放射線照射することによりその生物学的機能にどのような影響を受けるかを詳細に検討し、バイオバーデンを考慮した低線量による放射線減菌の可能性を明らかにするのが最終目的である。本年度は、本研究計画の最終年度にあたるため、これまでに集積されてきた研究結果を総合的に見直し論文発表等の報告取りまとめを推進するとともに、実験技術の改善、試料の量産化の検討を進めた。具体的には、昨年度までに引き続き、生理活性体のモデルとしての酵素蛋白の種類を増し、それらを適切な高分子担体(多糖類、天然および合成ポリペプチドなど)に共有結合法(化学反応および放射線グラフト法)で固定化する条件の適性化と、得られた固定化酵素の活性・安定性の評価および放射線照射による影響について整理した。高分子担体には、生体適合性に優れた多孔性粒子、膜、ハイドロゲルなどの形状のものについて再検討した。放射線照射の前処理は可能な限り無菌プロセスを採用した。適当な密封系を工夫した上、放射線照射を行なった。次に、固定化酵素・修飾酵素に種々の環境条件下で放射線(コバルトガンマ線)を照射し、その線量および線量率による放射線照射の影響の度合いを詳細に検討し、その耐放射線限界を確立した。
抗体を利用した分子イメージングによる腫瘍血管の発達評価法の構築

本申請課題では、腫瘍血管特異的なモノクローナル抗体を利用した、医・工・薬連携のimmuno-SPECT,immuno-MRIによる、腫瘍血管の発達イメージングを達成しようとするものである。本研究課題では、我々が保有する腫瘍血管内皮マーカー(VEGFR2、Robo4)特異的抗体の細胞内侵入特性に着目し、その特性評価を行った。その結果、細胞内侵入抗体が腫瘍血管内へと効率的に集積する、優れたイメージング抗体になり得ることを見出した。MRI造影剤としては、金複合酸化鉄ナノ粒子造影剤にPEG修飾を施すことで、その体内動態を制御できることを見出した。PEGで修飾したAu/Feridexは、効率的に腫瘍へと集積し、モデルマウスの腫瘍を高感度に検出可能であった。また、このPEGの先端に抗体を修飾する技術も確立し、これによる腫瘍血管内皮特異的MRIの実現が可能となるものと期待できる。現在、抗体自身をSPECT用核種である123Iでラベル化する技術を確立し、現在、協力研究者の大阪大学大学院医学系研究科、畑澤教授の協力の下、抗体による腫瘍イメージング実験を実施中である。今後、これらの確立された技術を用い、実際のイメージングへ展開し、その評価を行うことで、本申請課題の目指す、腫瘍血管の発達評価が達成できるものと期待できる。本申請課題では、薬学研究者による腫瘍血管特異的なモノクローナル抗体開発と、工学研究者によるイメージングのためのマテリアル開発、さらには、医学研究者の分子イメージング技術を融合することにより始めて可能となる、医・工・薬連携のimmuno-SPECT, immuno-MRIによる、腫瘍血管の発達イメージングを達成しようとするものである。本年度、「イメージングプローブ設計グループ」では、Robo4, TEM7, TEM8, VEGFR2、4種の腫瘍血管マーカー抗体のscFv型リコンビナント蛋白質の精製系の構築に成功した。このscFvは、FLAG-tag融合型とSPECTラベル可能なCys-tag融合型双方の作成に成功し、現在本精製系で、全ての抗原に対するscFvの作製に着手している。また、生体内半減期に優れるIgG型抗体の精製系については、現在検討を開始しつつある。また、MRI用のプローブとして、直径20nm程度の酸化鉄ナノ粒子MoldayIONをコアとした金磁性ナノ粒子の合成に成功し、現在、そのMRIプローブとしての有用性を検証中である。「腫瘍血管のバイオロジー解明グループ」では、近年VEGFRシグナルに抑制的に働き、腫瘍血管新生に重要な役割を担うと考えられるRobo4の機能をin vivoで解析するため、2種の遺伝子改変マウス(ノックアウトマウス、テトラサイクリン依存性血管内皮細胞特異的Robo4強制発現マウス)の作成を完了し、現在、病態モデルを用いた解析を行っている。以上の結果を元に、H21年度では、作成されたプローブを用いたイメージングを中心的に行い、SPECT、PET、MRIなどによる抗体の動態評価、腫瘍血管発達イメージングへの展開を予定している。本年度、「イメージングプローブ設計グループ」では光Robo4,VEGFR2のに対する腫瘍血管マーカー抗体を毒素蛋白質との融合体として発現し、これらが、in vivoで顕著な抗腫瘍効果を発揮することを見出した。本結果は、これらの抗体が確かにin vivoにおいて腫瘍血管を認識し得る高品質なものであることを示しており、イメージング研究への展開が期待されるところである。また、MRI用のプローブとして、直径20nm程度の酸化鉄ナノ粒子MoldayIONをコアとした金磁性ナノ粒子に対し、効率的にモノクローナル抗体をラベル化・精製する技術の開発にも成功し、これらが確かに抗原発現細胞に結合することが確認された。「腫瘍血管のバイオロジー解明グループ」では、近年VEGFRシグナルに抑制的に働き、腫瘍血管新生に重要な役割を担うRobo4のノックアウトマウスが、全身性炎症に抵抗性を持つことを発見した。

また、Robo4のリガンド探索実験においては、3種のSLITファミリータンパク質がRobo4に結合することを明らかにし、SLITが腫瘍血管内皮細胞に親和性を持つ新しい分子である可能性を示すことができた。以上の結果を元に、H22年度では、作成されたプローブを用いたイメージングを中心的に行い、SPECT、PET、MRIなどによる抗体の動態評価、腫瘍血管発達イメージングへの展開を予定している。本申請課題では、薬学研究者による腫瘍血管特異的なモノクローナル抗体開発と、工学研究者によるイメージングのためのマテリアル開発、さらには、医学研究者の分子イメージング技術を融合することにより始めて可能となる、医・工・薬連携のimmuno-SPECT,immuno-MRIによる、腫瘍血管の発達イメージングを達成しようとするものである。本年度は、どのような特性を有する抗体をイメージングに供するべきかを評価する目的で、Robo4,VEGFR2のに対する腫瘍血管マーカー抗体(細胞内侵入抗体及び細胞内非侵入抗体)をRIでラベル化し、その体内動態を評価した。その結果、同じ抗原を認識する場合であっても、細胞内に浸入する活性を有する抗体の方が、非侵入抗体よりも数倍、腫瘍集積性が高いことを見出した。また、同様のRIラベル抗体を用いたin vitroでの血管内非細胞への取り込み実験から、細胞内侵入抗体は、効率的にVEGFR2などの標的の継続的な供給を促し、細胞内へと蓄積する性質を有することが示された。本性質は、本申請課題が目指す、腫瘍血管内皮細胞の特異的ラベリングに有用なものとなるものと期待できる。また、MRI用プローブとしては、直径20nm程度の酸化鉄ナノ粒子MoldayIONだけでなく、直径100nm程度のFeridexを用いたPEG化Au-Feridexの腫瘍造影能を評価したところ、本造影剤は、血中から速やかに消失し、腫瘍を高いS/N比で検出できることが示された。血中滞留性の高いMoldayION型造影剤と腫瘍造影のS/N比に優れる今回のFeridex型造影剤は体内分布が全く異なるため、今後どちらの造影剤が本研究課題の目的に合致するかを検証する必要がある。SPECT、PETへの展開については、抗体をSPECT用核種である123Iでラベル化する技術を確立し、現在、協力研究者の大阪大学大学院医学系研究科、畑澤教授の協力の下、抗体による腫瘍イメージング実験を実施中である。今後、これらの確立された技術を用い、実際のイメージングへ展開し、その評価を行うことで、本申請課題の目指す、腫瘍血管の発達評価が達成できるものと期待できる。
PSR1259-63のX線・ガンマ線放射メカニズムの研究

PSR1259-63は連星系の中にある若い電波パルサーである。相手の星はBe星で、それは高速で自転し、その赤道面にそって質量放出を起していることでよく知られている。1keV-200keV領域でのスペクトルはベキ型で、X線強度にパルスはみられない。この事から観測されたX線はパルサー本体からの放射ではなく、パルサー風とBe星風との相互作用でつくられた相対論的電子による非熱的放射と考えられる。PSR1259-63システムにおけるX線、ガンマ線の放射メカニズムを明らかにすること、および得られた相対論的粒子のスペクトルをもとにパルサー風や粒子加速メカニズムおよびBe星風の性質について知見を得ることを目的として本研究を開始した。ここ一年間の研究により次のようなことが明らかになった。1.パルサー風とBe星風との衝突で衝撃波ができ、そこで電子は加速され、相対論的エネルギーになる。X線はこの相対論的エネルギーの電子からシンクロトロンプロセスによって放射される。2.近星点で急な傾きのX線スペクトルを与える電子のエネルギー分布は、逆コンプトン散乱によってはできない。急な傾きの電子分布の原因はシンクロトロン放射である。3.近星点近傍と遠星点近傍でのX線光度の違いから、パルサー風のmagnetization parameterがパルサーからの距離とともに減少することが示唆される。4.TeVガンマ線は近星点と遠星点との中間ぐらいの位置で最も強く、観測にかかる可能性がある。
ウイルスから探る分裂期染色体へのRNP局在機構の解明

本研究課題では,ボルナ病ウイルス(BDV)の,RNAとタンパク質の複合体であるRNPの染色体上への局在機構を明らかにすることを目指した。その結果,(1)間期と分裂期においては,RNPの存在様式が異なること,(2)特定のタンパク質との相互作用,あるいは細胞周期における核膜の崩壊が,分裂期染色体上へのRNPの局在を制御していること,が明らかになった。これらの結果により,RNPの染色体上への一般的な局在機構が説明されることが期待される。真核生物の染色体は細胞分裂時には高度に凝集し,娘細胞に等分配される。細胞分裂時の染色体上にはRNA,あるいはRNAとタンパク質の複合体であるRNP(ribonucleoprotein)の存在が認められるものの,分裂期染色体とRNAあるいはRNPとの関連に関する情報はあまりにも少ない。本研究では,細胞周期を通してクロマチンと相互作用し,さらに分裂期染色体上にそのRNPが局在することが分かっているボルナ病ウイルス(borna disease virus: BDV)のRNPを分裂期染色体と相互作用する核内RNPのモデルとしてとらえ,分裂期染色体と核内RNPの相互作用メカニズムの詳細を明らかにしようとするものである。まずはBDVのRNPが局在する分裂期染色体の生化学的な単離,精製を行った。単離した分裂期染色体上のRNPの存在を確認した結果,RNPが結合した状態で分裂期染色体を生化学的に単離,精製できることが明らかになった。次に共免疫沈降法により,RNPと相互作用する分裂期染色体上の因子の探索を試みた。その結果,分裂期染色体上においてRNPは,ヒストンだけでなく特定の細胞骨格タンパク質や核タンパク質と相互作用していることが明らかになった。特に細胞骨格タンパク質に関しては,その分裂期染色体上の存在は示唆されていたものの,その存在意義や染色体との相互作用のメカニズムに関しては明らかにされておらず,今後の研究対象とする予定である。一方で,分裂期染色体上のBDVのRNPの詳細な局在を,超解像顕微鏡法により観察することを試みた。その結果,分裂期染色体上では,RNPは間期とは異なった形態をとっていることが示唆された。真核生物では,間期において核に存在する染色体は,細胞分裂時に高度に凝縮することで娘細胞に等分配される。凝縮した染色体上には,RNAとタンパク質の複合体であるRNP(ribonucleoprotein)が存在することが分かっているが,分裂期染色体とRNPとの相互作用に関する知見は不足している。本研究では,核内に特有の構造体を形成し,分裂期には凝縮した染色体上に局在するボルナ病ウイルス(borna disease virus:BDV)のRNPを,凝縮した染色体と相互作用する核内RNPのモデルとし,それらの相互作用メカニズムを明らかにすることで核内RNPの分裂期染色体への局在機構に関する知見を得ることを目指す。まずは,核内においてBDVのRNPが相互作用する宿主タンパク質を同定することを試みた。同定された候補タンパク質群の中から,RNA結合タンパク質であり,クロマチンと相互作用することが明らかになっているタンパク質であるRBMXに着目した。次に共免疫沈降法により,RBMXがBDVのRNPと結合することを明らかにした。さらに,RBMXをノックダウンすることで,間期の核に見られるBDVのRNPが形成する構造体は崩壊し,RNPはヘテロクロマチン領域に集積すること,またその際見られるBDVのRNPの構造は分裂期染色体において見られるRNPの構造と類似するものであることが明らかになった。RBMXのノックダウンによりBDVのRNPの構造が変化するメカニズムに関しては今後明らかにする必要があるものの,RNPの分裂期染色体への局在においては,特定のRNA結合タンパク質やクロマチン結合タンパク質との相互作用が1つの要因であることが示唆された。本研究の研究計画は,(1)RNP-染色体間相互作用に関与する因子の同定,(2)同定された因子が担う,RNP-染色体間相互作用に対する役割の解析,および(3)RNPと同定された因子の,分裂期における相互作用の時空間的解析,の3つの段階から構成される。これまでに,(1)の因子の同定に関しては成功していたが,それ以降の解析に関しては顕著な進捗が見られなかった。そこで視点を変え,間期のクロマチンに結合する因子に着目し,そこからRNPと分裂期染色体の相互作用に関する知見を得ることを試みた。その結果,クロマチン結合タンパク質であるRBMXをノックダウンすることで,間期の核内に見られるRNPの構造は崩壊し,分裂期染色体上に見られるような構造に変化することを見出した。この結果は,RNPと分裂期染色体の相互作用に特定のクロマチン結合タンパク質が関与していることを示唆するものである。以上の結果を踏まえ,当初の研究計画からの変更は生じたものの,分裂期染色体へのRNPの局在機構の解明といった目的には着実に近づいていると考えられるため,本研究はおおむね順調に進展している,とした。真核生物の染色体は,細胞分裂時には高度に凝縮することで娘細胞に等分配される。凝縮した染色体上には,RNAとタンパク質の複合体であるRNPの存在が認められるものの,分裂期染色体とRNPとの相互作用に関する知見は不足している。ボルナ病ウイルス(BDV)は,間期には,そのRNPが核に特異的な構造体(vSPOTs)を形成し,分裂期にはRNPが染色体上に局在するRNAウイルスである。

本研究では,BDVのRNPを,凝縮した染色体と相互作用する核内RNPのモデルとし,それらの相互作用メカニズムを明らかにすることで核内RNPの分裂期染色体への局在機構に関する知見を得ることを目的とした。最終年度においては以下の結果を得た。間期および分裂期におけるBDVのRNPの詳細な構造を,超解像顕微鏡法により観察した。その結果,BDVのRNPの構成タンパク質であるNとPは, vSPOTsにおいては外縁付近のみで共局在が見られた一方で,分裂期染色体上のシグナルはごく近傍に見られた。また,分裂期染色体に局在する際に,核膜が崩壊する直前である前期ではvSPOTsの構造は確認され,核膜が崩壊した直後の前中期にはvSPOTsの構造は崩壊しRNPは染色体上に局在した。またこれまでに,クロマチン結合タンパク質であるRBMXをノックダウンすることで,BDVのRNPが形成するvSPOTsの構造が崩壊し,BDVのRNPはヘテロクロマチン上に集積すること,またそのRNPの構造が,分裂期染色体上のRNPのものと類似するものであることを明らかにした。これらを総括すると,間期と分裂期に見られるRNPはその存在様式が異なり,特定のタンパク質との相互作用および核膜崩壊などのスイッチが,分裂期染色体上へのRNPの局在を制御していることが示唆された。こうしたことは,RNPの染色体上への一般的な局在機構を説明し得るものとして期待される。本研究課題では,ボルナ病ウイルス(BDV)の,RNAとタンパク質の複合体であるRNPの染色体上への局在機構を明らかにすることを目指した。その結果,(1)間期と分裂期においては,RNPの存在様式が異なること,(2)特定のタンパク質との相互作用,あるいは細胞周期における核膜の崩壊が,分裂期染色体上へのRNPの局在を制御していること,が明らかになった。これらの結果により,RNPの染色体上への一般的な局在機構が説明されることが期待される。本研究の目的は,(1)RNP-染色体間相互作用に関与する因子の同定,(2)同定された因子が担う,RNP-染色体間相互作用に対する役割の解析,および(3)RNPと同定された因子の,分裂期における相互作用の時空間的解析,の3つに要約される。本年度においては,とくに(1)の相互作用関連因子の同定に焦点を当てた。その結果,ヒストンといった染色体を構成しているタンパク質だけでなく,細胞骨格タンパク質や特定の核タンパク質といった,これまでには分裂期染色体との関連が明らかにされていなかった因子を同定することができた。こうした因子の同定は,相互作用メカニズムの詳細な解析といった次のステップに進むために必要不可欠な作業であるため,特定の因子の同定によって次年度の研究計画の実施にスムーズに移行できるものと思われる。一方で,超解像顕微鏡法により,分裂期染色体上のRNPの詳細な局在を観察することを試みた。これは当初は研究計画には記載していなかったが,本研究の研究目的を達成するために必要性が生じたために実施した。その結果,核内RNPは,間期と分裂期では異なる形態をとっている可能性を示唆する結果を得ることができた。以上を踏まえ,若干の具体的な研究計画の変更は生じたものの,研究の目的そのものには変更はなく,本研究はおおむね順調に進展していると思われる。
ラット脳脊髄液を用いた中枢神経機能評価法とその病態生理学への応用に関する研究

血管性痴呆の病態生理およびそれに対する薬物投与の影響を神経化学的側面から評価することを目的として、マイクロダイアシス法を応用し、脳血管性痴呆モデル動物の脳脊髄液(CSF)中神経伝達物質濃度の無麻酔無拘束下での定量を試みた(CSFマイクロダイアリシス法)。血管性痴呆モデル動物として、自然発症の血管性痴呆モデル動物として注目されている脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)を用いた。ラットの大槽に埋め込んだガイドカニュ-レに挿入した透析プロ-ベを介して微量注入ポンプにて低速潅流し、集めた潅流液について、アセチルコリン(ACh)およびその代謝産物であるコリン(Ch)をHPLCーECDで測定した。さらに、痴呆による学習・記憶障害を改善することが知られている薬物(フィゾスチグミン、M_1ー受容体作動薬AF102B)を腹腔内投与し、その効果をCSF中神伝達物質濃度を測定することによって神経生化学的に評価した。本方法によって、CSF中のAChおよびCh濃度を3時間以上にわたって、連続測定することが可能であった。また、正常血圧ラットにフィゾスチグミン、AF102Bを投与すると、AChあるいはCh濃度は投与後30ー60分をピ-クとして上昇した。これに対して、末梢性のACh分解酵素阻害薬であるネオスチグミンはこれらの反応を示さなかった。一方、SHRSPのCSF中ACh農度は正常血圧ラットに比較して有意に低下していた。AF10BはSHRSP中Ch濃度を上昇させた。受動回避反応を指標とした記憶・学習能力試験において、SHRSPは反応潜時の短縮を示し、これはAF10Bの投与によって改善された。これらの結果から、SHRSPでは記憶・学習能力の低下があり、中枢コリン作動性神経機能低下と関連性が推測された。このように、CSFマイクロダイアリシス法は中枢神経機能をとらえる上で有用であると考えられ、病態生理学的あるいは薬理学的研究に応用していく予定である。
RFDD-PCR法による心慢性拒絶反応に関する未知遺伝子同定の試み

すでにPCR-DD法で、イムノグロブリン遺伝子の発現を確認していたので、その病態上の意義をまず検討した。慢性拒絶心では、アロ免疫応答が消退し急性拒絶像が慢性拒絶像に切り替わる、新生内膜進展期に、病的内膜特異的なB細胞の浸潤を認めた。B細胞遊走因子と受容体あるいはB細胞活性化分子の発現検討から、この過程は非アロ応答性B細胞の活性化に基づく能動的なものであることが示された。また、再移植直後には認められないIgM抗体とIgG抗体の沈着が、進展期の病的内膜特異的に認められ、血管病変局所での病的内膜特異的なB細胞応答が、心慢性拒絶反応の進展機構上意義を持つことが示唆された(論文印刷中)。RFDD法は、より再現性と感度に優れた未知遺伝子検出法として期待されたが、本法で心慢性拒絶反応進展期に発現が検出された遺伝子は、クラスII組織適合性抗原遺伝子とCD11b遺伝子の2つに止まり、上記の知見を更に支持する知見ではあったが、さらに新しい病態上の知見につながるものではないと考えられた。以上、現状の2つのmRNA differential display法によって、心慢性拒絶反応の進展機構に、血管病変局所で行われる病的内膜特異的な抗体産生が関与する可能性が示された。ラット心再移植モデルにmRNA differential display法を応用して、慢性拒絶心に発現する未知遺伝子を同定することを目的とした。これまでの通常のPCR-basedmRNa differential displayによる検討で、慢性拒絶心での高い免疫グロブリン遺伝子の発現が同定されていたので、まず再移植心中のB細胞分布と抗体沈着を免疫組織学的に検討した。その結果、移植心がドナーおよびレシピエントと同系の宿主に再移植された後でかつ血管内膜肥厚病変が進行する時期(再移植30日後)の病変血管周囲にB細胞の強い浸潤が認められた移植心にはB-lymphocyte chemoattractant遺伝子、CD40 ligand遺伝子、B7、2遺伝子の強い発現が、B細胞浸潤時期に一致して認められ、同系のB細胞が能動的に移植心に浸潤し、活性化されていることを示唆した。移植直後の冠状動脈内膜には抗体沈着は全く認められなかったが、同系宿主への再移植30日後には、病的新生内膜に1gMの、病的内膜と用囲中膜に1gGの強い沈着が認められた。これまでアロ抗体産生が認められないという理由で本モデルに液性免疫は関与しないと考えられてきたが、本結果は自己抗体産生による液牲免疫の慢性拒絶反応への関与との可能性を示した(論文投稿準備中)。本モデルでのmRNA differential display解析の有用性がさらに確認された。そこで、発現量がより低い未知遺伝子の同定を目脂して、Restriction fragment length polymorphism based differential(RFDD-PCR)法の準備を進めた。解析出来る資料数に制限があることと予備実験の結果から、今後は再移植後14日の移植心の比較による解析を行っていく予定である。以下の4つのサンプルを用いて、C-1, C-2サンプルに発現誘導のある遺伝子探索をRFDD-PCR法を用いて行った。B:再移植14日、3日目再移植WKY心(非冠動脈硬化群: pooled from 6 rats)C-1:再移植14日、5日目再移植WKY心(冠動脈硬化群: pooled from 3 rats)計24バンドがA, Bには検出されないか弱い発現を見るのみで、かつC-1, C-2の両方により強い発現を示した。差の大きい12バンドを選択し、再増幅したところ11バンドが再増幅された。核酸配列を決定しGeneBankなどの公的遺伝子データベースに対してHomology searchを行ったところ、既知遺伝子と全く相同性が無く新規遺伝子と考えられるもの(2個)、既知遺伝子と有意の相同性を持つ未知遺伝子(4個)、既知遺伝子(4個)とArtifactと考えられるribosomal RNA断片に分類された。同定した10個の遺伝子に対してreal-

time RT-PCR法による遺伝子発現測定系を作成し、再移植後1,14,30,60日後の移植心を用いて、各遺伝子発現が動脈硬化症の発生と時間的に相関するかをさらに検討した。その結果、移植後動脈硬化症と関連あると判定された遺伝子は、2つの既知遺伝子: CD11bとMHC class II抗原であった。心再移植法による移植後動脈硬化症に関与する遺伝子をRFDD法によって同定する試みは、技術的には成功した。しかし、同定された2つの遺伝子は、本症に対するマクロファージおよびB細胞の関与を示唆するもので、既知の知見を確認するに留まった。本症に関与する新規あるいは予想外の遺伝子同定には、なお研究を要すると考えられた。
在宅認知症高齢者の急変時対応に関するリスク管理モデルの開発

在宅認知症高齢者に絞り、突発事故や症状及び容態の急変しやすい疾病等について、実態調査をしたうえで、急変から緊急介入を含めた一連のリスク管理モデルの開発を目的とした。その結果、実質調査を行うことで、現場ならではの疾患と症状の関連等が明らかとなった。また、家族側に起こっている現象を明らかにするためにインタビューを重ね、質的因子探索的分析を進めることで、家族の思いが明らかとなってきた。家族介護者の負担には、心理的ストレスや自身の生活への支障、将来の見通しに対する不透明感などの介護負担に加え、被介護者の介護場面における容態急変時等を含めた医学的判断が求められる場面への遭遇が知られている。また、被介護者の現在の疾患に加えて、更なる発病やそれらに伴う障害、突発的な事故が起こり、医療依存度が増大した場合、または新たに加わった場合、家族による在宅介護は忽ち成り立たなくなる。そこで、平成21年度には、認知症高齢者とその家族介護者に関する文献レビューと研究者がこれまで行ってきた研究周辺領域の家族の認識等に関する報告に加え更なる家族側の認識の調査、緊急搬送受け入れ病院の実態調査を行った。研究周辺領域の報告をすることで、課題の明確化が速やかに実施できる。また更に家族側の認識調査と受け入れる総合病院側の実態調査を行ったことで、現在は統計処理中であるが、急変時対応と症状等との関連が明らかになってゆくと考える。以下、家族側の意識調査の結果を示す。・認知症高齢者の急変時対応に対する家族介護者の思いとして、3カテゴリー<親しい親戚><まさかの時のための近所付き合い><皆で考えてくれる家族の会>が抽出された。「一番頼りになるのは...長年の付き合いもあり、弟、弟の嫁、主人の兄」等、親戚の中でも特に長年の付き合いの関係からターゲットを絞り、いざという時に頼りになると表現していた。また、「まさかの時は...隣の人と親しくしている」等、いざという時に頼りになる親戚以外の他者として、近所の人の中からも特に選定した、信用できそうなグループを作り始めていたることを語った。また、「認知症の医師の何気ない一言がきつかった。会でそんな病院はやめて、と声があり...皆で考えてくれてありがたいと思った」等、辛い体験を家族の会等で話すことにより意見を貰えることにより、感謝の気持ちが表現されていた。そこで、平成22年度には、認知症高齢者とその家族介護者を中心に、急変時対応に関する思いを調査した。実情を明らかにする報告が稀有である現在、認知症高齢者の急変時の対応をあらゆる角度から現象を含めた現状を調査する意味は非常に大きい。また更に介護施設に焦点を当て、そこでの認知症高齢者の急変時対応について調査を行った。現在は統計処理中であるが、急変時対応と症状等との関連が明らかになってゆくと考える。急変時対応の経験を有しない,家族介護者の思いとして,4カテゴリー〈娘がいるので安心〉〈有事の対応の認識〉〈命の危険なら救急ヘリコプター〉〈思うようにならないのが認知症の症状〉が抽出された.「急変については娘がいるから...どうにかなるかなっと思っている」等と語ることで介護している夫に何か不測の事態が生じた場合でも娘が頼りになると考えていると語っていた.また,「命にかかわることなら・・・救急ヘリコプターが来るし」等と,よっぽど緊急を要する事態であれば救急ヘリコプターが来るシステムであることを語った.在宅認知症高齢者の家族介護者の急変時対応に関する思いについては,認知症症状は思うようにならないと認識しているが,いざという時に頼める人材の確保と非常時の重症度による対応手段のイメージ化をしていることが明らかとなった.しかし,具体的な症状やその結果生じるかもしれない葛藤などまでは語られなかった.家族介護者は、介護期間に起こりうる予測できない被介護者の有事に関する不安は大きい。本研究課題としては、在宅認知症高齢者に絞り、突発事故や症状及び容態の急変しやすい疾病等について、実態調査をしたうえで、急変から緊急介入を含めた一連のリスク管理モデルの開発を目的とした。研究実施計画では、まず在宅認知症高齢者の急変時、緊急受け入れを行う医療機関を対象に、原因病態や症状に関して実態調査を行い、その結果から緊急度別対応ランク分類を作成しプレ調査を行う。またその結果をもとに、家族介護者対応のリスク管理モデルの構築をする、3段階の実施計画を立案した。

研究成果としては、医療機関を対象にした分析では、認知症高齢者の急変の有無と基礎疾患および外来受診時(搬送時)の症状との関連性の検討において、統計学的に有意な関連を示したものは感覚機能障害であったことから、それは知覚や運動麻痺、転倒等であり、身体的な異常として、第3者からはっきりと認識できる障害や異常であることから、認知症高齢者の急変時の医療機関への速やかな受療行為に繋がりやすかったともいえる。しかし、持病など基礎疾患との有意な差は見られなかった(Kirino,2011)。次に、家族介護者側のリスク管理に関する思いについて、インタビューを重ね、質的因子探索的に分析をすることで、様々な認識の在り様が明らかとなった。<娘がいるので安心><有事の対応の認識><命の危険なら救急ヘリコプター><思うようにならないのが認知症の症状>等のカテゴリーに集約された(Matsumoto,2011)。また、<症状の出現による受診><症状の重症性の認識不足><受診後の診断名に不信感><出来得る手段で得ようとした安心感><認知症の特異性><医師への不信感>等のカテゴリーとして抽出された(Matsumoto,2011)。また、急変時対応に関する看護師側からの思いとしては、<認知症高齢者を理解する><急変するにいたった患者の状況を知りたい><患者が安心・安全に治療を受けられるよう工夫する><認知症高齢者を生活に織り込む家族を理解する><患者望む自宅へ退院できるよう協力しあう><公立病院としての責務を遂行する>等のカテゴリーが抽出された(Nagoshi,2011)。
胸腺のPOSITIVE SELECTIONにおけるメカニズムの解明

これまでの研究でpositive selectionが誘導でき,それに伴いBcl-2の上昇がみられることを確認しているため,この系を利用してpositive selectionのシグナル伝達物質の阻害剤を加えることによりBcl-2の上昇がどのように変化するのかをRT-PCRで確認した。Positive selectionに関わるとされている伝達物質として主にMAPKK,PI3K,p38MAPK,PKC,PKCθ,protease,calcineurinが知られており,各々の阻害物質を用いた。まずこれらの阻害物質を加えて培養後positive selectionを誘導し,mRNAを抽出してRT-PCRを行った。培養方法はLuciferase assayの系とほぼ同様で行った。阻害物質の濃度をそれぞれ変えて培養を行ったところ,阻害物質の濃度勾配に伴いmRNA発現量が変化し,至適濃度ではBcl-2mRNA発現量が最も低下する結果となった。これは実験に用いた全ての阻害物質において同様であり,MAPKK,PI3K,p38MAPK,PKC,PKCθ,protease,calcineurin全てがpositive selectionの系に関与していることが示唆された。しかしBcl-2mRNAが最も低下する至適濃度は培養条件や検体ごとに異なり,一定したものは得られなかった。またどの伝達物質の系が最もpositive selectionに関与しているかは,この実験系では伝達物質相互間の比較は不可能であり,明らかにすることはできなかった。以上の結果より,胸腺のpositive selectionにはMAPKK,PI3K,p38MAPK,PKC,PKCθ,protease,calcineurinが関与するが,それらが各々どのような強さや順序で関わるのかについては明らかにできなかった。1.Luciferase assayを用いたBcl-2 promoterの転写活性の実験を行った。提供していただいたBcl-2-luciferase plasmidを、インフォームドコンセントのもと摘出した小児胸腺から胸腺細胞を抽出し、Nucleofectionにより導入した。我々のこれまでの研究でPMA(phorbol12-myristate 13-acetate)2ng/mlとionomycin(calcium ionophore)2μg/mlを加えることによりpositive selectionが誘導されることを確認しており、この系を利用してpositiveselectionにおけるBCl-2の転写活性を検討したところ、control群と比較して明らかにBcl-2のpromoter活性に差を認めた。3.Positive selectionのシグナル伝達経路としてNFAT, NFκB, MAPK, JNKを介する経路が知られているが詳細は不明であり、シグナル伝達経路に関するさらなる情報の収集とデータの整理を行う。またシグナル伝達経路の阻害剤として、MAPKK inhibitor、PI3K inhibitor、P38MAPKinhibitor、PKC inhibitor、PKCθinhibitor、protease inhibitor、Ascormycin: FK506(calcineurin inhibitor)を用意しており、これら物質を加えてpositive selectionを誘導することにより、Bcl-2発現量がどのように変化するのかを確認する。