hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クモ膜下出血後の脳血管攣縮におけるアラキドン酸リポキシゲナ-ゼ産物の関与

犬の白血球は、12-リポキシゲナ-ゼを持っている、という報告があるため、ブタ白血球の12-リポキシゲナ-ゼの抗体を用い、同様に検索を行なったが、血管壁、白血球ともに染色されなかった。5-リポキシゲナ-ゼがそまらなかった理由として、抗原量の不足、白血球の5-リポキシゲナ-ゼと血管壁の5-リポキシゲナ-ゼが異種タンパクであること等が考えられ、現時点では、これ以上の検索は、無意味であると思われた。12-HPETE髄注では、犬に遅発性血管攣縮を作製することがきでたが12-HETEでは,まだ3頭と数は少ないが、15%程度の弱い収縮をおこすにとどまった。現在注入方法の検討をおこない、12-HETE注入の例数をふやし、12-HPETE注入例では、経時的に髄液を採取し、注入した12-HPETEの代謝産物の定量をおこなう予定である。アラキドン酸の12ーリポキシゲナ-ゼ産物の12ーHPETEおよび12ーHETEを雑種成犬の大槽内に髄注し、12ーHPETE>12ーHETEの遅発性脳血管攣縮を作製することができたが、経時的に髄液を採取し、検討したところ、12ーHPETEは、急速に、12ーHETEに代謝され、その12ーHETEも数時間後には、髄液中より検出されなくなった。12ーHPETEにより作製された血管攣縮は8時間以上のタイムラグをもって発生することより、12ーHPETEは、むしろ、イニシエ-タ-として作用しているものと考えられた。次に、in vitroにおけるアラキドン酸の12ーリポキシゲナ-ゼ産物の犬脳底動脈に対する薬理作用を検討するため、脳底動脈のリング切片を用いた、isorcetric tension studyを実施した。12ーHPETE投与群では、10^<-7>Mより有意な収縮を認め、10^<-5>Mにおいて、5ーHT(同濃度)の約4060%程度の収縮を認めた。12ーHETE投与群では、それほど有意な収縮は認められなかった。尚、chamber内では、12ーHPETEは比較的安定であったため、髄腔内には、12ーHPETEを能動的に代謝、吸収する経路の存在が、示唆された。また、in vivoおよびin vitroにおける12ーHPETEの作用には、かなり個体差を認めており、この点においても、臨床上、クモ膜下出血後に起こる遅発性脳血管攣縮に類似していた。更に、遅発性脳血管攣縮誘発(in vivo)および、脳血管収縮(in vitro)作用が、12ーHPETEに特異的なものであるか、あるいは、脂質過酸化物に一般的認められる作用であるのかを検討する目的で、リノ-ル酸の過酸化物の13ーHPODを同様に投与したところ、12ーHPETEと類似した作用をin vivoおよびin vitroにおいて認めた。以上のことより、血管攣縮誘発、血管収縮作用は、脂質の過酸化物に一般的に認められる作用である可能性が示唆された。
多孔性ガラスによるタンパク質の高次構造固定法の開発と2状態モデルの直接的検証

〈多孔性ガラスでヘモグロビンを安定に封入する技術開発〉、Ellerbyら(1992 Science 255,1113.)によって報告されたゾル-ゲル法を改良して、ヒトのオキシ型あるいはデオキシ型ヘモグロビンを可逆的酸素脱着能を保持したまま透明な多孔性ガラスに(リン酸緩衝液を細孔に含む状態のまま)封入することに成功した。この様にして初期状態をオキシ型あるいはデオキシ型で封入したヘモグロビンの光吸収スペクトルを通常の溶液中のスペクトルと比較したところ、両スペクトル共完全な一致が得られた。〈機能測定の結果〉初期状態をデオキシ型で封入したヘモグロビンとオキシ型で封入したヘモグロビンの酸素平衡機能を比較すると、両者共協同性は消失しており、酸素親和性の値は約500倍異なっていた。また、この時観測された酸素平衡定数は、通常のヘモグロビンに対する1個目及び4個目の酸素平衡定数とほぼ一致していたので、ヘモグロビン分子は封入時の高次構造を保持したまま安定な状態で多孔性ガラス中に存在し、リガンド脱着に伴う機能変化はほぼ完全に抑えられていることが結論された。〈構造測定の結果〉デオキシヘモグロビンの光吸収スペクトルはタンパク質の高次構造変化に伴い変化することが過去の研究から知られている。そこで、初期状態をオキシ型で多孔性ガラス中に封入した試料とデオキシ型で封入した試料のデオキシスペクトルを比較してみたところ、両者の差スペクトルは過去に報告されたデオキシRとデオキシTの差スペクトルに大きさ、形が一致した。〈まとめ〉本研究の結果は、2状態モデルの基本仮定の一つとなる4次構造と機能の一対一の関係を支持するとともに、タンパク質の構造と機能の関係を調べる新しい手法としてゾル・ゲル法が使えることを示唆している。
生命を自然観の基礎においた技術哲学の総合的研究

プラトンの自然観において、ソーマ(物体)の無秩序な動に先だって存在するのは、「自分で自分を動かす動」としてのプシューケー(魂/生命原理)であり、プシューケーが物体よりも年長であり、先在するとされる。『ティマイオス』では、プシューケーが第一原理とされ、ソーマは副原因と認定される。『ソピステス』、『ピレボス』、『法律』でも、ソーマを第一原理とする物質主義的機械論は明確に否定され、プラトンはプシューケーを自然世界の第一原理に据えている。プラトンは、ソーマでなく、ヌース(知性)をもつプシューケーこそを自然世界の第一の原理とすべきであるとして、我々が抱く常識的自然観の根本的転換を求めている。技術と人間との関わりを問う最古の文書が、アイスキュロスの『縛られたプロメテウス』である。プロメテウスが、人間に苦しみと悲惨から解放する技術と火を与えた物語である。プラトンは『プロタゴラス』で、この神話を再解釈し、技術に重要な区別を設けた。「製作技術」と、「いましめ」と「つつしみ」を基礎にして成り立つ、国家社会をなすための「政治技術」の区別である。製作技術は、身を護る武器を生まれつきもたない人間が自然環境に適応するために得た知恵である。しかし、原初の人間が悲惨な状態であっただけではなく、製作技術しかもたない人間も再び滅びる危機に陥り、人間の生存を可能にするのは政治技術とされる。人間の絶滅を心配したゼウスは、少数の専門家に与えた製作技術とは異なり、すべての人間に「いましめ」と「つつしみ」を分配して、この技術が成り立つようにした。政治技術が与えられるのは製作技術の後であり、タイムラグが存在するとされている。製作技術の場合、技術をもたない者が、もっていると主張すれば、すぐに偽りが明らかになるが、政治技術は程度の差はあれ万人に分有されているため、不正な者が自分が正しい人間であると主張しても、その偽りがすぐには見抜けない。現代でも製作技術は個別的な利便性をもちうるので、国家体制や政治的イデオロギーに関係なく、すぐに伝播するが、政治技術は製作技術から遅れ、しかも容易には与えられない。製作技術だけでは人間の生存の十分条件にはならないとするプラトンの認識には、長く続いたペロポンネソス戦争の敗戦によって、多くの同胞市民を失い、国土が荒廃した悲惨な現実を経験していたことが背景にある。二つの技術をめぐる問題状況は現代も続いている。製作技術から区別された政治技術は、プラトンの哲人統治の思想として主題化され、「製作の技術」と「使用の技術」の区別にも形を変えて引き継がれていくと考えられる。古代原子論の技術論は、ルクレティウス『自然の本性について』第五巻で諸技術の発生と文明の発展史として扱われている。その特徴の第一は、脱神話化と合理的説明である。原初の人間の状態をか弱いとしたプロメテウス神話とは大きく異なり、人間が原初の状態において、身体が強く、他の野獣のように裸で暮らしていける生物学的適応ができていたと想定する。人間に火をもたらしたのは、雷のような自然現象であり、神々の働きは諸技術の発展の説明から排除される。第二に、家族の形成が文明の起源だとすることである。家族の誕生によって、自分の子供に対する愛情が人間の猛々しい性格を変え、弱いものを憐れむ掟の基礎になり、そのような倫理的掟が多くの者に守られた。第三の特徴が宗教批判である。自然の驚異への畏怖から宗教は誕生したとされ、人間が天上の働きや季節の変化、雨、雪、雷などの自然現象の原因を知りえなかったために、神々の計り知れない能力を想定して逃げ道をつくったにすぎないと、自然の観察に基礎を置く原子論の立場が宣言されている。神話的な枠組みや神々の働きを排除し、人間は自然を導き手として技術を見出し、技術がもたらす生活の変化が人間の身体や精神に変化を及ぼしながら、長い年月をかけてさまざまな技術を発展させてきたという、経験論的で進化論的ともいえる技術と社会発展の説明は現代のわれわれにも説得的である。自然から目的と神意を排除する自然主義的世界観のモデルとして、古代原子論が、ロック、ヴォルテール、ディドロなどの啓蒙時代の哲学者やボイルやニュートンらの科学者に与えた影響は甚大である。しかし、古代原子論者にとって、技術と自然との関係はいかあったか。技術を導くものは自然とされるが、技術そのものは自然ではない。彼らの技術の概念は、自然と人為的なものを鋭く対立させる「ピュシス対ノモス」の対立概念の俎上にのせれば、ノモスの側に組み込まれる。昨年度に引き続き、大学で領域長の役職にあり、教員評価の業績評価や、教育課程改革にともなう教員組織の再編を受けた教員評価制度の改革をはじめ、会議と実務の仕事が予想以上に多くなり、研究のための時間が圧迫されて、十分な時間がとれなかったことが研究の遅れの小さからぬ要因となった。最終年度は、プラトンとアリストテレスの技術哲学に焦点を当てた研究を行なった。

アリストテレスは、『自然学』第II巻第1章で、運動変化の始原や原因をそれ自体に内在してもつか否かで、自然と技術を区別したが、それを『ニコマコス倫理学』の観想的学問知と行為的・製作的知の区別と重ね合わせれば、自然を対象とするのは観想的学問に、技術は自然を模倣するものにすぎなくなる。対照的に、プラトンは技術知に高い評価を与え、テクネーとソピアー(知)をほぼ互換可能な仕方で用いている。そして、プラトンは、『法律』第X巻における無神論的・機械論的自然学批判において、万物の運動の種類を、他のものを動かすことができるが自分で自分を動かすことのできない運動と、自分で自分を動かすことのできる運動とに大別する。万物の運動変化の始原となるのは、自分で自分を動かす運動にほかならない。そして、自分で自分を動かしている場合に、そのものを生きていると呼ぶのであり、それゆえ生命原理としての魂は、「自分で自分を動かす動」と正式に定義される。その魂の動が、運動変化の始原である以上、万物のなかで最も古く、魂と同族とみなされる「判断、配慮、知性、技術、そして、法律の方が、硬さ、軟らかさ、重さ、軽さよりも、より先なるものになる」(『法律』892A)ことが根拠づけられる。つまり、魂の方が物体よりも先にあったとすれば、魂の気質、性格、意欲、計算、真なる判断、配慮、記憶の方が、物体の長さ、深さ、力よりも先にあったことになり、魂が善悪や美醜、正不正の原因とされる(同896C-D)。プラトンが、技術を自然とみなすとき、自然そのものの観方を根本的に転換している。技術の基本をなすものが生命そのものの働きであるとするプラトンの技術哲学の現代的意義を見出す展望が拓けた。プラトンの自然観において、ソーマ(物体)の無秩序な動に先だって存在するのは、「自分で自分を動かす動」としてのプシューケー(魂/生命原理)であり、プシューケーが物体よりも年長であり、先在するとされる。『ティマイオス』では、プシューケーが第一原理とされ、ソーマは副原因と認定される。『ソピステス』、『ピレボス』、『法律』でも、ソーマを第一原理とする物質主義的機械論は明確に否定され、プラトンはプシューケーを自然世界の第一原理に据えている。プラトンは、ソーマでなく、ヌース(知性)をもつプシューケーこそを自然世界の第一の原理とすべきであるとして、我々が抱く常識的自然観の根本的転換を求めている。本務校で選挙で領域長に選出されたことにより、会議や教員評価の仕事が急激に増えたことがあり、また、学外でも文科省の仕事をはじめ、会議や評価の仕事が増大して、研究に振り当てる予定の時間を多く失うことになった。そのため、当初計画していたホメロスやアイソポスにおける技術についてのサーベイを十分に行うことができなかった。ただし、今年度は、アリストテレスの『異聞集』の翻訳作業を通じて、『異聞集』には古代世界における技術に関する興味深い知見が含まれ、その内容が近代においては、ロバート・ボイルの最後の著作"Experimenta et Observationes Physicae" (1691)のなかに、"Strange Reports"というセクションを設けて、奇妙であるけれど、しかし、自然である諸現象を収録することにつながったことが分かった。そして、『異聞集』の本格的な註釈書を書いた、科学史家のヨハン・ベックマンが、テクノロジーという新語を作ったことを再発見できたことなどの計画していなかった成果もあった。最終年度となるために、他の仕事を極力少なくして、本課題に取り組む時間を確保することが何よりも重要である。そのうえで、遅れている計画に8月9月に集中して取り組んで、予定の計画に近づけるようにする。とくに、古代原子論が与えた啓蒙時代の哲学者・科学者への影響についてより深く掘り下げて調査することによって、本課題の中核部分の成果をあげたい。哲学・倫理学
導電性ナノマテリアルを応用した生体再建材料の開発

本研究は、カーボンナノチューブ(CNT)を用いた細胞培養担体の開発と、その材料上での細胞の培養および組織化を目指すものである。我々はこれまでCNTを用いた培養担体の開発のためCNTの生体親和性や細胞接着性・増殖性について研究を行ってきた。細胞組織化の基礎的な検討として、昨年度にはCNTコートディッシュとCNTコートシリコーン、糸状のCNTなど、異なった形態の培養担体上での種々の細胞培養を行っており、本年度も引き続き細胞の種類を増やし同様の検討を行った。本研究では特にCNTの導電性に着目し、電気刺激による分化促進や誘電泳動などの手法を用いた細胞の集積・配列など、材料上での細胞の組織化の方法を検討しており、これまでのところ誘電泳動を用いることで、通常接着しにくい形態の培養担体、とくに接着性の弱い細胞での細胞集積および配列が可能であったが、集積および配列後の細胞増殖のコントロールが困難であった。この問題を解決するために、低温融解アガロースゲル等を用いた固定化の方法について考案し、誘電泳動による細胞の配列を阻害しない分散濃度や添加方法の検討を行い最適な方法を検討中である。また、毒性評価に関してはCNTを表面にコーティングした培養ディッシュを用いCNT上で直接細胞培養を行うことでその影響を評価してきたが、明らかな細胞増殖能の低下や細胞分化能への影響は認められておらず、細胞種を増やしても同様の結果を得ることができた。これらのことから細胞培養条件下でも細胞組織化に有効なCNTの特性は損なわれないことが明らかになった。今後は細胞組織化の方法についてさらに具体的な検討を進めていく必要がある。出産による育児休業中のため、研究が中断されている状況である。今後の研究では誘導した細胞の固定化についての検討を引き続き行う。特に、分散液の濃度や温度管理等で条件の設定についてさらに検索を進める。また、細胞毒性の評価としては蛍光分子を用いた評価を進めていく予定である。研究再開後は、計画に従って主に誘導細胞の固定化の方法の検索を予定しており、それらにかかわる消耗品および細胞などの購入を予定している。カーボンナノチューブ(CNT)の持つ導電性を利用した細胞組織化の基礎的な検討として、CNTコートディッシュとCNTコートシリコーン、糸状のCNTを用い検討を行った。まずCNTコートディッシュでは細胞接着の促進を目的として通常付着性の弱いPC12やTHP細胞などを、誘電泳動を用いることでCNTコートディッシュ上に短時間で接着させることが可能であった。また、シリコーン表面にCNTを固定化した導電性材料では、電極となるCNT間に直線的な細胞の配列が可能であった。これは細胞により適正な周波数が異なっていた。また、本研究では付着性の細胞(本研究で使用した細胞としてはSaos-2、C2C12等)と比較し接着性の弱い細胞(PC12等)の方が集積や配列が容易であることが明らかになった。また、CNTを用いた三次元的培養を目的として通常接着しにくい形態の細い糸状CNTへ、誘電泳動を用いた細胞集積を試みた。CNTの導電性により多量の細胞を短時間で集積することは成功したが、細胞の足場としての形態としては適さなかったため集積後の細胞の接着および増殖の方法には課題が残った。これに対して、低温融解アガロースゲルを用いることでの解決を試みている。また、毒性評価に関しては、単層、および多層のCNTコートディッシュを作製し、ディッシュ上で培養した細胞を長期的に継代し細胞増殖能や細胞分化への影響を評価したが、明らかな細胞増殖能の低下や細胞分化能への影響は認められなかった。以上、本年度は、CNTを用いた導電性材料で、複数の細胞での配列および集積を行うことに成功した。また、本研究で用いたCNT材料が明らかな細胞毒性を認めないことも示された。これは今後、CNT複合材料を用いた細胞培養を進めていくにあたって非常に有用な結果と言えるだろう。

出産による育児休業中のため、研究が中断されている状況である。本研究は、カーボンナノチューブ(CNT)を用いた細胞培養担体の開発と、その材料上での細胞の培養および組織化を目指すものである。我々はこれまでCNTを用いた培養担体の開発のためCNTの生体親和性や細胞接着性・増殖性について研究を行ってきた。細胞組織化の基礎的な検討として、昨年度にはCNTコートディッシュとCNTコートシリコーン、糸状のCNTなど、異なった形態の培養担体上での種々の細胞培養を行っており、本年度も引き続き細胞の種類を増やし同様の検討を行った。本研究では特にCNTの導電性に着目し、電気刺激による分化促進や誘電泳動などの手法を用いた細胞の集積・配列など、材料上での細胞の組織化の方法を検討しており、これまでのところ誘電泳動を用いることで、通常接着しにくい形態の培養担体、とくに接着性の弱い細胞での細胞集積および配列が可能であったが、集積および配列後の細胞増殖のコントロールが困難であった。この問題を解決するために、低温融解アガロースゲル等を用いた固定化の方法について考案し、誘電泳動による細胞の配列を阻害しない分散濃度や添加方法の検討を行い最適な方法を検討中である。また、毒性評価に関してはCNTを表面にコーティングした培養ディッシュを用いCNT上で直接細胞培養を行うことでその影響を評価してきたが、明らかな細胞増殖能の低下や細胞分化能への影響は認められておらず、細胞種を増やしても同様の結果を得ることができた。これらのことから細胞培養条件下でも細胞組織化に有効なCNTの特性は損なわれないことが明らかになった。今後は細胞組織化の方法についてさらに具体的な検討を進めていく必要がある。本年度は、複数の細胞を用いて実験を進めていたがそれぞれの細胞で誘導に必要な周波数が異なり、最適の条件を検索するのに時間がかかった。また、実験室の移動もあり研究が進まなかった。今後の研究では誘導した細胞の固定化についての検討を引き続き行う。特に、分散液の濃度や温度管理等で条件の設定についてさらに検索を進める。また、細胞毒性の評価としては蛍光分子を用いた評価を進めていく予定である。今後の研究では誘導した細胞の固定化について検討が必要である。現時点では分散液中に低温融解アガロースゲルを添加し、誘導後の細胞の移動を抑制しようと試みたが、分散液の濃度や温度管理等で条件の設定が困難であり、特にこの点について検索を進める。また、細胞毒性の評価については細胞内への取り込みについても評価する必要があり、次の段階としては蛍光分子を用いた評価を進めていく予定である。出産に伴う育児休業のため研究が中断されている。本年度はこれまでに使用していた材料を継続して使用したことと、実験進行の遅れがあり研究費の使用額が少なかったため次年度使用額が生じた。
腎障害の進行における血管作動性ペプチドの役割の解明:ウロテンシンIIの検討

一般にアンギオテンシンII(ATII)及びエンドセリン(ET)などの血管収縮性物質は腎障害性に、血管拡張性物質は腎保護性に働く傾向が見られる。今回、その血管収縮性がATIIやETよりも強力であるウロテンシンII(UII)に着目し、UIIの心血管・腎臓障害の進行にはたす役割とその病態生理的意義を検討した。その結果、以下のような成果を得た。1)ヒト疾患群での血中UII濃度:UIIに対するラジオイムノアッセイを開発し、UIIが循環ホルモンとしてヒト血液及び尿中に存在すること、非透析腎不全患者、及び透析患者で血中濃度が有意に高いことを発見し、世界に先駆けて報告した(Totsune Lancet 358:810-11,2001)。糖尿病患者にて、糖尿病という病態でUIIの産生が増加していること、また腎機能低下は独立した血中UIIの上昇因子であることを見出した(Clin Sci 2003,Peptides 2004(in press))。心疾患患者にて、右心不全、肺高血圧患者でUII濃度が上昇し、また左心不全患者においてもNYHAレベルに従ってUII濃度が上昇することを見出した(2004年日本循環器学会発表予定)。また、本態性高血圧、褐色細胞腫、原発性アルドステロン症、クッシング症候群などの高血圧性患者群でも血中UII濃度の上昇傾向を認めた(未発表)。2)ラット5/6腎摘腎不全モデルおよびラット虚血再灌流心臓モデルを作成し、心臓及び腎臓でのUIIの遺伝子発現を検討した(未発表)。3)ヒト血管内皮細胞におけるUII及びUII受容体のmRNAの発現は低酸素刺激により変動することを認め、虚血性腎障害にUIIが関与している可能性を見出した(未発表)。4)ヒト培養腫瘍細胞に対し、UIIは増殖促進作用を有することを見出した(Clin Sci 2002)。今回我々は、その血管収縮性がATIIやETよりも強力であるウロテンシンII(UII)に着目し、UIIの腎障害の進行にはたす役割とその病態生理的意義を検討した。1)ヒト疾患群での血中UII濃度:UIIに対するラジオイムノアッセイ(RTA)を開発し、UIIが循環ホルモンとして実際にヒト血液及び尿中に存在すること、非透析腎不全患者、及び透析患者で血中濃度が有意に高いことを発見し、世界に先駆けて報告した(Totsune et al. Lancet 358 : 810-11,2001)。また、糖尿病患者でも血中UII濃度が上昇しており、UII濃度と、HbAlc、及びCcrとのあいだに有意な相関が認められ、UIIが糖尿病性心血管腎障害の進展に深く関与している可能性が高いことを示唆する所見を得た。2)ヒト組織におけるUII mRNA発現の分布:UII及びUIIレセプターのmRNAの発現をRT-PCR法を用いて検討し、ヒトの脳・心臓・副腎・腎臓を含むあらゆる臓器に発現していることを見出し、報告した(Lancet同上)。3)ヒト血管内皮細胞の培養細胞系を用いたUII産生制御機構の検討:ヒト血管内皮細胞にはUII及びUIIレセプターのmRNAが発現しており、かつその発現は低酸素刺激により変動することを認め(未発表)、虚血性腎障害にUIIが関与している可能性を見出した。4)ヒト腎でのUII産生の検討:免疫染色法を用いて、ヒト腎でのUIIの産生部位を検討し、UIIは腎尿細管に広く分布していることを見出した。

これらの成果は平成14年の日本腎臓学会総会及び国際内科学会等にて発表予定である。一般にアンギオテンシンII(ATII)及びエンドセリン(ET)などの血管収縮性物質は腎障害性に働く傾向が見られる。昨年度我々は、その血管収縮性がATIIやETよりも強力であるウロテンシンII(UII)に着目し、UIIが循環ホルモンとして実際にヒト血液及び尿中に存在し、非透析腎不全患者、及び透析患者で血中濃度が有意に高いことを発見し、世界に先駆けて報告した(Totsune et al. Lancet 358:810-11,2001)。今年度は引き続き、UIIの腎障害の進行にはたす役割とその病態生理的意義を検討した。その結果、以下のような成果を得た。1)ヒト疾患群での血中UII濃度:また、腎不全の無い本態性高血圧、褐色細胞腫、原発性アルドステロン症、クッシング症候群などの高血圧性患者群でも血中UII濃度を検討し、血中UII濃度が上昇する傾向を認めた(未発表)。2)ヒト血管内皮細胞の培養細胞系を用いたUII産生制御機構の検討:ヒト血管内皮細胞にUII及びUIIレセプターのmRNAが発現していることを世界で初めて証明し、発表した(Clin Sci同上)。糖尿病患者では血管内皮障害を伴うことが多く、糖尿病の病態にUIIが深く関与している可能性が示唆された。3)ヒト腫瘍の培養細胞系を用いたUIIの産生と細胞増殖作用の検討:未発表の成果は平成15年の日本腎臓学会総会及び米国腎臓学会等にて発表予定である。平成15年度は以下の研究を行った。1.糖尿病患者におけるウロテンシンII(U II)の役割糖尿病患者において血中・尿中U II濃度を測定し、糖尿病患者では血中U II濃度が上昇していること、また腎機能障害を合併する群で更に有意な上昇を示すことを発見した。尿中U IIの排出は腎機能の低下に伴って増大することから、糖尿病患者での血中U IIの上昇は尿中への排出低下によるのではなく、糖尿病という病態で産生が増加しているためであることが示唆された。これらの結果は、2003年米国腎臓学会にて報告し、更に2004年日本腎臓学会及び内分泌学会にて発表予定である。また、投稿中である。2.心不全患者におけるウロテンシンIIの役割心疾患におけるU IIの役割が注目されている。約100名の心疾患患者にて血中U II濃度を測定し、右心不全、肺高血圧患者でU II濃度が上昇し、また左心不全患者においてもNYHAレベルに従ってU II濃度が上昇することを見出した。これらの結果は2004年日本循環器学会にて報告予定でありまた投稿準備中である。3.虚血性心疾患におけるウロテンシンIIの役割虚血性心疾患におけるU IIの役割を検討する目的でラット虚血再灌流心臓モデルを作成し、心臓でのU IIの遺伝子発現を検討した。本研究は現在続行中である。4.ウロテンシンIIの遺伝子多型U IIの遺伝子多型が血圧、動脈硬化、臓器障害に及ぼす影響を、高血圧患者及び糖尿病患者各200名を対象として、エクソン及び5'領域に存在する主要4多型を主体に検討した。本研究は対象を2000名に拡大し、研究を続行中である。
有袋類胚における頭部神経堤細胞のヘテロクロニー的発生の制御機構の解明

有袋類は有胎盤類に比べて未熟な状態で生まれるが、母乳を飲むために顎が早く発生する。本研究の研究代表者は、顎原基形成に関わるSox9遺伝子が神経堤において早期に発現を始めることや、Sox9の神経堤エンハンサーに有袋類特異的な変異があることを示している。このエンハンサーの活性制御についてウズラ胚を用いて解析した結果、神経堤発生に重要なWntシグナルはエンハンサー活性に影響を及ぼさず、神経境界形成に働くMyb遺伝子が重要であることがわかった。一方、同様の解析をオポッサム胚/由来細胞でおこなうことを計画したが、全胚培養法の開発、iPS細胞や神経堤細胞を誘導する実験が不調に終わり、課題として残った。(1)これまでの研究で、マウスのSox9遺伝子の神経堤エンハンサーにGFPをつないだレポーター遺伝子および、エンハンサーにオポッサム型の変異を導入したレポーターを鳥類胚に導入した場合、前者は神経堤細胞で活性化されるのに対し、後者は神経堤が誘導される前段階の神経境界領域で活性化されることがわかっていた。今年度は、このオポッサム型変異レポーターが神経境界域で活性化される機構を明らかにするために実験をおこなった。オポッサム型Sox9エンハンサーに神経境界形成にかかわるc-Myb結合配列があることから、鳥類胚にレポーターとともにc-Myb発現ベクターを導入したところ、異所的なレポーターの活性化が見られたことから、c-Mybの関与がが示された。そこで、これらのエンハンサーにルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポーターを作成し、繊維芽培養細胞株を用いてアッセイをおこなったが、c-Mybによる特異的な活性化は認められなかった。したがって、オポッサム型エンハンサーの神経境界における活性化には、さらに別の因子が必要であると考えられた。(2)オポッサム胚を用いてエンハンサー解析をおこなうために、全胚培養系の条件検討をおこなった。抗酸化剤の添加や子宮組織との共培養などを試みたが、良い結果は得られなかった。(3)オポッサム胚から神経堤細胞を大量に取り出すことが難しいため、線維芽細胞を神経堤細胞にダイレクトリプログラミングすることを計画した。条件検討のため、マウスの線維芽細胞を用いて実験を行った。Sox10神経堤エンハンサーGFP遺伝子をTol2システムでゲノムに挿入し、同時に導入したSox10遺伝子をTetOnシステムで発現誘導する実験系を構築した。これにより、GFP陽性細胞が得られることがわかった。オポッサム胚の全培養系が確立できておらず、また線維芽細胞から神経堤細胞へダイレクトリプログラニングする手法も条件検討の段階であるため、エンハンサー活性の解析をオポッサムの細胞ではなく鳥類胚や培養細胞株でおこなわねばならなかったため、進捗状況が全体的に遅れ気味であった。また、年度末が近づくにつれ、研究費が枯渇し、必要な試薬類を十分に入手することが困難になったことも要因と思われる。(1)これまで、マウスSox9遺伝子の神経堤エンハンサー、及びその配列にオポッサム型の変異を入れたものを挿入したGFPレポーターを作成した。それらを鳥類胚に導入すると、マウス型エンハンサーが神経堤で活性化されるのに対し、オポッサム型では神経堤形成前の神経境界領域で活性化されることがわかっていた。オポッサム型には神経堤境界形成に関わるc-Mybの結合配列があり、c-Mybの共導入によりレポーターの異所的な活性化が見られている。昨年度、培養繊維芽細胞株においてc-Mybによるオポッサム型エンハンサーの直接的な活性化を検出できなかっため、鳥類胚を用いて直接的な活性化を定量的に検出することを試みたが、遺伝子導入された細胞を十分に得ることが難しく、うまくいかなかった。(2)オポッサム胚の全胚培養を試みている。オポッサム胚より血清を採取することができたので、これを用いて培養実験を行ったが、目立った改善はみられなかった。その後は十分なオポッサム胚が入手できなかったため、培養条件の検討は進んでいない。(3)オポッサムの皮膚から培養した線維芽細胞をリプログラミングして神経堤に分化転換する実験を引き続きおこなった。ニワトリSox10遺伝子の神経堤エンハンサーをレポーターとして用いたが、特異性が低かったため、マウスエンハンサーも用いたが結果は同様で、神経堤にリプログラミングされた細胞を選別することはできなかった。(4)オポッサム型のSox9神経堤エンハンサーを鳥類胚に導入した場合、後脳より後方の神経境界でしか活性化がみられない。本年度はオポッサムSox9遺伝子上流に前中脳にかけての神経境界領域で活性化に関わるエンハンサーの探索を始めた。現在およそ200kbの配列についてEGFPレポーターを60個ほど作成してトリ胚に導入したが、前中脳レベルでの活性化は検出できていない。オポッサムのコロニーの不調により胚の入手が困難だったこと、c-Mybによるオポッサム型Sox9エンハンサーの活性化が検出できなかったこと、線維芽細胞の神経堤へのリプログラミングがうまくいかなかったことが要因である。昨年度から開始した、オポッサム胚において予定頭部神経堤領域でSox9遺伝子が早く発現するために必要な、時間的かつ空間的活性をもつヘテロクロニーエンハンサーの探索をおこなった。1.方法:オポッサムのゲノムよりPCRにてSox9遺伝子周辺のDNA断片(1箇所につき15kb程度)を多数幅し、EGFPレポータープラスミドに挿入した。作成したレポーター遺伝子を神経板形成期のウズラ胚(発生ステージ3.54)の予定頭部神経堤

領域付近に電気穿孔法にて導入し、6、12、24時間後にEGFP遺伝子の発現を観察した。2.結果:現在までに、プロモーターから350kb上流までの部分、ヒトで変異が生じると顎に異常が生じることが知られている配列に対応する領域付近100kb、さらにイントロンについて探索した。いままでのところウズラの頭部神経堤で特異的に活性を持つエンハンサーは発見されておらず、イントロンに予定神経板領域で一過的かつ弱い活性があるエンハンサーを見つけるに留まっている。3.考察:まだ1.5Mbpにおよぶ長さのオポッサムSox9遺伝子の周辺を探索しきれておらず、さらなる実験が必要である。一方で、ウズラ胚を用いた解析ではオポッサムの頭部神経堤特異的エンハンサーの活性を検出できない可能性が依然として残されており、オポッサムのiPS細胞の作成とそこからの神経堤誘導の実験系や、オポッサム胚の全胚培養と遺伝子導入実験系の確立をすすめめる必要があるかもしれない。有袋類は有胎盤類に比べて未熟な状態で生まれるが、母乳を飲むために顎が早く発生する。本研究の研究代表者は、顎原基形成に関わるSox9遺伝子が神経堤において早期に発現を始めることや、Sox9の神経堤エンハンサーに有袋類特異的な変異があることを示している。このエンハンサーの活性制御についてウズラ胚を用いて解析した結果、神経堤発生に重要なWntシグナルはエンハンサー活性に影響を及ぼさず、神経境界形成に働くMyb遺伝子が重要であることがわかった。一方、同様の解析をオポッサム胚/由来細胞でおこなうことを計画したが、全胚培養法の開発、iPS細胞や神経堤細胞を誘導する実験が不調に終わり、課題として残った。(1)エンハンサー活性の定量について、鳥類胚を用いてルシフェラーゼアッセイをおこなうことを検討している。また、c-Myb以外にA-MybやB-Myb、RXRなど他の転写因子の関与の可能性について検討をおこなう。(2)オポッサム胚の全胚培養系について、より一般的な牛胎児血清やラット血清では無くオポッサム血清を培養液に添加することを検討している。現在、少量ながらオポッサム血清が採取できている。(3)線維芽細胞をダイレクトリプログラミングして神経堤細胞に転換する実験については、さらに条件検討を進める。最近になって、マウス由来細胞を用いる場合にc-MybとKJF4遺伝子を共導入すると効率が上がることが報告されたので、同様の方法についても検討する。(1)オポッサムのコロニーの不調を改善すべく、新しいオポッサム成体の導入を進めており、これにより培養条件の検討を進めることができる。アガードロップを用いた新しい培養法のアイデアもあるので、これを試したい。(2)前中脳レベルの神経境界で活性化されるオポッサムSox9遺伝子のエンハンサーの探索を引き続きおこなう。現在200kbを調べたが、あと800kbほどで可能性のある領域を網羅できるため、解析終了は時間の問題であり、これができれば大きなプログレスが見込める。発生生物学・進化生物学
SPECTを用いた脳解析-MR機能画像および事象関連電位との比較-

1。脳波測定SPECTでの脳波測定は特別な装置は用いずに可能であった。MRIでの脳波測定は銀電極を使用しなくてはならないこと、リ-ドにはカーボンファイバーを用いなくてはならないことがわかった。しかしながら画像採取時点ではノイズが多すぎ、有効な測定が出来なかった。MR用のノイズフィルターの作成が必要であると考えられた。I-131 IPMとTc-99mECDによる測定を行った。負荷前の両各種には有意の相関が認められ、Tc-99mECDを用いた脳血流測定の定量性は確保されていると考えられた。しかしながら同一患者でTc-99m ECDを用いた2回投与法(1回目少量投与、2回目大量投与法)を用いた場合、1時間を越える検査では遊離Tc-99mが観察され、定量性が疑われた。検査計画の見直しが必要であると考えられた。echo planerを用いたスキャン法でZ-検定を用いると、再現性良好な負荷画像を得ることが出来た。4。ソフトウエアー開発上記結果を解析するため、画像解析ソフトウエアーを開発した。これにより、脳内白質灰白質の分離解析が可能となった。また統計画像処理ソフトウエアーも開発した。問題はこれらは患者ごとの解析は可能であるが、患者群としての解析が出来ないことにある。このためには日本人の脳の標準化が必要である。1。4。1.明らかになった点MR撮像時に脳波をとる為に、必要な条件として1)電極は銀電極が必要なこと,2)導線としては通常の導線は使用できず、カーボンファイバーを用いた導線が必要なことが明らかになった。B.使用核種の選択1-123IMPとTc-99mECDを比較した。この結果1)正常血流の範囲では1-123IMPとTc-99mECDとの間に大きな差はないこと、2)血中半減期、エネルギー、および反復使用の可能性からTc-99mECDの方が今回のテーマにあった核種であることを明らかにした。このことは日本核医学会総会にて発表した。C.ソフトウエアーの開発選択したある特殊な領域を一点を決定するだけで、3次元的にその範囲を指定できるソフトウエアーを開発した。この副産物としてMR angiographyに応用するを試み成功した。この成果は日本磁気共鳴学会総会、および神経放射線研究会にて発表した。D.精度管理の問題SPECT画像の精度問題について検討した。この結果現在の吸収補正法は、特に頭頂部で問題があることがわかった。このための補正プログラムは現在開発中である。E.画像モダリティー間のネットワークの開発CT,MRI,SPECTの各画像をワークステーション、およびパーソナルコンピューターと接続し、解析するシステムを構築した。2.今後の問題点今後耐磁性をもったプレアンプの開発が必要である。B.現在行っている正常人に対する検索を、精神神経患者に対して行う必要がある。C.ソフトウエアー開発各画像装置相互の位置決めに現在のシステムでは難点があり、位置決めprogramの開発が必要である。1。

検査計画の見直しが必要であると考えられた。echo planerを用いたスキャン法でZ-検定を用いると、再現性良好な負荷画像を得ることが出来た。4。ソフトウエアー開発上記結果を解析するため、画像解析ソフトウエアーを開発した。これにより、脳内白質灰白質の分解解析が可能となった。また統計画像処理ソフトウエアーも開発した。問題はこれらは患者ごとの解析は可能であるが、患者群としての解析が出来ないことにある。このためには日本人の脳の標準化が必要である。
20世紀初頭ドイツにおける都市失業保険の展開-「社会都市」論の実証的研究-

ドイツでは20世紀初頭、国家的失業保険が未整備の中、都市レベルでの失業保険が実施された。その主流となったのは、失業した組合員に失業手当を給付する労働組合に対してその給付額に応じて都市自治体が補助金を支出する、ガン・システムであった。本研究では、同時代の政策思想分析ならびに大ベルリン圏諸都市の事例分析を通じてガン・システムが受容された歴史的コンテクストを明らかにし、仮説的にではあるが、自発的な集団的自助を促進するための公的介入が「社会都市」形成の基盤となっていたという結論を導き出した。本研究は、近代ヨーロッパの「社会都市」の歴史的意義を実証的に考察する一環として、20世紀初頭ドイツにおける都市自治体による失業保険制度(ガン・システム)の導入プロセスとその政策思想上の背景、そして運用実態を実証的かつ総合的に明らかにすることを目的とする。特に分析上の重点を置くのは、ガン・システムが普及しえた社会的コンテクスト、ならびにその成果と限界である。この研究を通じて、現代の「社会国家」(「福祉国家」)の思想的起源となった「介入的自由主義」の生成過程を都市史の観点より照射することをめざす。本年度は、まず、都市失業保険の導入が可能となった政策思想上の背景を明らかにするために、1911年に開催されたドイツ都市会議の議事録を翻訳・検証し、資料紹介として『経済系』(関東学院大学)に掲載した。これをふまえた上で、ベルリン圏を中心に個別都市の事例研究を進めた。特に都市失業保険の導入にあたって対照的な帰結が見られたシェーネベルクとシャルロッテンブルクの両都市の比較分析を行い、その成果の一部を2010年6月に開かれた社会経済史学会第79回全国大会において発表した。個別都市の事例研究と並行して、『ドイツ都市統計年報』をはじめとする同時代の行政報告書を手掛かりとして、都市失業保険の運用実態の全体像の把握につとめた。その分析結果に、ドイツ都市会議の議事録の検討を通じて明らかにした知見を加味し、2010年11月に開催された政治経済学・経済史学会秋季学術大会において、「都市と公共性」の観点から中間報告を行った。以上2件の口頭報告を論説として学術誌に掲載するとともに、研究の最終的な取りまとめを行うことが次年度の課題である。本研究の目的は、近代ヨーロッパの「社会都市」の歴史的意義を実証的に考察する一環として、20世紀初頭ドイツにおける都市自治体による失業保険制度の導入プロセスとその政策思想上の背景、そして運用実態を実証的かつ総合的に明らかにすることである。研究最終年度の本年度は、昨年度に行った2回の学会報告の報告原稿を元に、『社会経済史学』と『歴史と経済』で論文を発表するとともに、研究成果の最終的な取りまとめを行った。その骨子は次の通りである。ドイツは世界に先駆けて1880年代に一連の社会保険制度を導入したが、失業保険だけは導入が遅れ、最終的に成立するのは1927年のことである。だが、都市レベルではすでに1900年代よりその萌芽がみられた。1907年に導入が始まり、都市失業保険の代名詞となったガン・システムがそれである。ガン・システムとは、失業した組合員に失業手当を支給する労働組合に対して、その支給額に応じて都市自治体が補助金を支出する制度である。こうした特徴を有する都市失業保険は、公的介入を通じて何よりも都市内の階級対立の抑制を目指していた点において、当時の都市政策理念となっていた「都市の社会的課題」の目的に適うものであった。また、「都市の社会的課題」の方法論的特徴は、自発的な集団的自助を促進するための公的介入にあり、それゆえ失業保険においても、対象を自助可能層に限定し、労働組合の失業手当という既存の集団的自助を促進するガン・システムに重点が置かれていたと考えられる。このような特徴は、「介入的自由主義」を体現していた同時代のイギリスの国家的失業保険と比較すると、より明瞭となる。以上より、20世紀初頭ドイツの都市失業保険は、国家的失業保険の不在という与件の下、「都市の社会的課題」の論理にその普及要因を求めることができるとともに、それゆえに生じた「介入的自由主義」との乖離点にその限界があったといえよう。
光駆動ATP再生小胞を用いた新規な高効率無細胞タンパク質合成システムの創成

既存の無細胞タンパク質合成系は、エネルギー源となるATPの減少により、反応の効率や持続性、コストの面で課題がある。本研究では、我々が開発したATPバイオセンサーおよび光駆動ATP再生小胞を用いて光のエネルギーから安価、持続的にATPを再生することで、本課題の解決を目指した。その結果、従来よりも高感度な蛍光ATPバイオセンサーの開発に成功したが、光駆動ATP再生小胞と無細胞タンパク質合成系、シャペロンが共に機能する条件を見出すことはできなかった。また、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系を用いて、モデルタンパク質としてG蛋白質共役受容体の合成に成功した。はじめに、大腸菌由来無細胞合成系と、SFGFPの組み合わせで実験を行った。その結果、蛍光分光光度計により、リアルタイムでSFGFPの合成を確認することができた。しかし、光駆動ATP再生小胞による合成促進の効果は見られなかった。今回使用した大腸菌由来の無細胞合成系は市販品で、化学反応共役型のATP再生系がすでに含まれていたため、再生小胞による効果が現れにくかったと考えられる。そこで、化学反応共役型のATP再生系を含まない、ウサギ網状赤血球由来の無細胞合成系を用いて実験を行ったところ、SFGFPの蛍光は、光照射条件ではほとんど現れず、暗条件での合成でわずかに見られただけであった。今回の実験で使用したプロモーターやSFGFPの遺伝子配列では、大腸菌に比べ、ウサギ網状赤血球由来の無細胞合成系で、合成効率が大幅に落ちるのかもしれない。あるいは、ウサギ網状赤血球由来の無細胞合成系は、鮮血色をしており、系自身がSFGFPの緑色の蛍光を吸収してしまう可能性も考えられた。また、SFGFPの励起波長(485nm)がデルタロドプシンを駆動させる光の波長に近いため、使用する無細胞合成系に関わらず、そもそも合成時に光を当て続けることで、SFGFPの蛍光団に悪影響を及ぼすことも懸念された。そこで、SFGFPの代わりに、励起・蛍光波長の短い蛍光タンパク質であるシリウスを使用した。大腸菌由来の無細胞合成系で実験を行ったところ、十分な蛍光の上昇が見られた。しかし、光照射の有無に関わらず、蛍光の上昇速度に大きな違いは見られなかった。さらに、ウサギ網状赤血球由来の無細胞合成系で、シリウスの合成を試みたが、明暗条件いずれの場合もシリウスの蛍光は見られなかった。ここにさらにシャペロニンを加えてみたが、やはり蛍光は見られなかった。
ヒト免疫グロブリンの糖鎖構造を指標とした、人類集団の分子進化

ある糖蛋白質糖鎖は遺伝子の一次産物である多くの糖転位酵素と糖分解酵素が複雑に関与して作り上げられた、遺伝子の二次産物である。糖転位酵素は互いに類似しているのでその精製は最も困難なものの一つでありまた幾つかの糖転位酵素の一次構造が明らかになったとしてもその酵素の作り出す糖鎖構造がわかるわけではなく糖鎖構造はそれ自身を直接分析してみなければわからない。人類集団の分子進化を論ずる為にIgGは非常に良い材料である。なぜならIgGには少なくとも20種以上の異なった糖鎖をもつ分子種が存在しており、個人によって糖鎖パタンに差があることを申請者は既に観察していたからである。以下に得られた結果を述べる。1.人類、男女、地域等の起源の明らかなヒトの血液をできるだけ多数、個別に採取し、IgGを単離精製した。2.IgG糖蛋白質からグリコペプチダーゼにより糖鎖を切り離し、その還元末端を蛍光ラベルして高速液体クロマトグラフィで展開し、得られた糖鎖パタンを比較した。申請者はこれに先立ち比較的簡単な操作でIgGの十数種の糖鎖の量比が一目でわかる糖鎖マップ法を完成している。それにより各個人のIgG糖鎖の微細な相違を明らかにする事ができた。3.しかしこの研究の成否は如何にして多種多様なIgG試料を集めるかということにかかっており、現在ではまだ20例足らずの試料の解析をしたに過ぎないので、統一的な結論は下せない。将来なるべく広範囲、多数のヒトの個体からIgGを得てその糖鎖を分析し、人種、家系、地域的分布等による差異を詳しく調べることにより日本人のルーツ、人種的類縁関係までを推定できるのではないかと期待している。
DNA鑑定に関する包括的研究

DNA鑑定は、ヒトゲノム情報の社会的な利用の一つであるが、運用によっては社会の利益のために個々のプライバシーを侵害する行為ともなりうる。欧米ではヒトゲノムプロジェクトの進展に伴って、ヒトゲノム情報利用についての社会的、法的、倫理的問題にかなり多くの費用を投じて検討を重ねている。DNA鑑定についても同様で、とくに米国ではDNA鑑定法を成立させ、巨額の予算をこの研究に投じはじめている。一方、我が国では、DNA鑑定はもちろんのことヒトゲノム情報の社会的利用全般についてあまり研究が進んでいない。本研究の目的はDNA鑑定を代表とするヒトゲノム情報の社会的利用についての研究に効率的かつ集中的に予算を投じ、21世紀に向ってのゲノム情報利用の基本的戦略を確立することを重点領域として申請することであった。本研究では、3回の班会議を開催し、重点領域の計画研究を次第に具体化していった。3回の班会議後には「DNA鑑定ニュースレターNo.1-3」を発行して班活動の周知をはかった。また、平成7年11月30日には「DNA鑑定の日本の現状」と題する公開シンポジウムを開催した。当初はDNA鑑定そのもので重点領域の申請を行うことを考えたが、関連する領域である“ゲノムサイエンス"との調整を検討していく過程で、ヒトゲノム情報の社会的応用全般を取り扱うことの重要性を認識するようになった。そして、最終的に「21世紀のゲノム情報活用戦略」との重点領域を平成8年2月16日に人文・社会系へ申請した。これは、ゲノム情報利用の倫理的、法的、社会的研究、DNA鑑定、遺伝子診断の三つの計画研究班と総括班により構成され、5年間にわたり研究計画である。
多発性嚢胞腎における尿細管上皮細胞極性欠如の分子生物学的機序解明

多発性嚢胞腎の動物モデルを用いて、病的尿細管上皮細胞の極性欠如の機序を解析した.尿細管上皮細胞のE-cadherin/β-Catenin依存性細胞制御の破綻が尿細管部位特異的嚢胞形成・増大に関与していることが示された.多発性嚢胞腎の動物モデルを用いて、病的尿細管上皮細胞の極性欠如の機序を解析した.尿細管上皮細胞のE-cadherin/β-Catenin依存性細胞制御の破綻が尿細管部位特異的嚢胞形成・増大に関与していることが示された.PKDにおける病的尿細管上皮細胞の極性欠如の機序解明のため、以下の研究を開始した。【1】CPKモデルにおけるE-カドヘリン発現量のE-カドヘリンエンドサイトーシスアッセイによる定量●CPKマウスは、ARPKDモデルで、尿細管上皮細胞における極性異常を示す。近年原因遺伝子がクローニングされ、PCRにより遺伝子型の決定が可能である。●生後0、7、14、21、28日のCPKおよび同日齢の同腹(対照)を用いる。各目齢5匹から腎検体を採取する。腎検体は、細胞接着部位分離、免疫組織学的検討、およびその他の実験系のための採取をおこなう。●細胞接着部位の抽出マウス腎組織よりE-カドヘリンの豊富に含まれる細胞接着部位を抽出する。●エンドサイトーシスされたE-カドヘリンの分離細胞接着分画を適切に調節された条件下で、中速遠心分離、ピペッティングにより、エンドサイトーシスされたE-カドヘリン分画とされていない分画に分離し、最終的に高速遠心分離によりエンドサイトーシスされたE-カドヘリンの分画を精製する。●エンドサイトーシスされたE-カドヘリンの定量精製したE-カドヘリン分画をSDS-PAGEにより分離し、抗E-カドヘリンモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体で免疫プロッティング後、ECLキットで化学発光させ、デンシトメーターで定量する。●CPKマウスのコロニーを当大学の動物飼育施設において確立したが、実験にもちいるホモマウスの出生が予想される数と比較してきわめて少なく、予定通りの研究の進行ができなかった。さらに後に、動物施設のマウス肝炎ウイルスの流行が発覚し、そのためマウスのクリーニング作業に用いる個体以外のマウスを処分せざるを得なかった。ホモマウスの出生率の低下が、マウス肝炎感染によるものかの確定は困難であるが、可能性はある。PKDにおける病的尿細管上皮細胞の極性欠如の機序解明のため,以下の研究を実施した。CPKマウスのコロニーを当大学の動物飼育施設において確立したが,実験にもちいるホモマウスの出生が予想される数と比較してきわめて少なく,予定通りの研究の進行ができなかった。そのため,PCKラットを用いて研究を実施し,下記の結果を得た。【目的】E-cadherinとβ-cateninの発現をPCKラット(ヒトARPKDと相同遺伝子変異を有するモデル)で尿細管部位特異的に検討し,嚢胞形成様式との関連を検討する。【方法】生後0日,1,3,10,14週と4か月の雄PCKと対照各々5匹の腎連続切片を,E-cadherinとβ-cateninに対する抗体ならびに尿細管部位特異的マーカーで染色し,嚢胞形成様式と比較検討した。E-cadherin量は,ウエスタン法でも評価した。【結果】正常対照では,すべての月齢で,E-cadherinは,遠位尿細管,集合管で発現が強く,一方,近位尿細管で低いレベルを示した。PCKでも非嚢胞性上皮細胞では同様の発現がみられた。PCKの嚢胞形成は,正常対照でE-cadherin発現の強い部位でより重篤であった。嚢胞性尿細管上皮のE-cadherin発現レベルは嚢胞増大に伴い減弱し,加齢に伴い細胞間接着部位に限局した。β-catenin発現は,E-cadherinと類似の様式を示した。ウエスタン法では,対照と比較しPCKの腎E-cadherinは低下しており,加齢に伴い低下が強くなった。【結論】E-cadherin/β-catenin依存性細胞制御の破綻がPCKラットの尿細管部位特異的嚢胞形成・増大に関与していることが示された。多発性嚢胞腎における病的尿細管上皮細胞の極性欠如の機序解明のため、以下の研究を実施した。CPKマウスのコロニーを当大学の動物飼育施設において確立したが、実験にもちいるホモマウスの出生が予想される数と比較してきわめて少なく、予定通りの研究の進行ができなかった。そのため、PCKラットを用いて研究を実施し、下記の結果を得た。CPKマウスのコロニーを再構築し、当初の予定の研究中も進行中である。【目的】E-cadherinとβ-cateninの発現をPCKラット(ヒトARPIKDと相同遺伝子変異を有するモデル)で尿細管部位特異的に検討し、嚢胞形成様式との関連を検討する。【方法】生後0日、1、3、10、14週と4か月の雄PCKと対照各々5匹の腎連続切片を、E-cadherinとβ-cateninに対する抗体ならびに尿細管部位特異的マーカーで染色し、嚢胞形成様式と比較検討した。

E-cadherin量は、ウエスタン法でも評価した。【結果】正常対照では、すべての月齢で、E-cadherinは、遠位尿細管、集合管で発現が強く、一方、近位尿細管で低いレベルを示した。PCKでも非嚢胞性上皮細胞では同様の発現がみられた。PCKの嚢胞形成は、正常対照でE-cadherin発現の強い部位でより重篤であった。嚢胞性尿細管上皮のE-cadherin発現レベルは嚢胞増大に伴い減弱し、加齢に伴い細胞間接着部位に限局した。β-catenin発現は、E-cadherinと類似の様式を示した。ウエスタン法では、対照と比較しPCKの腎E-cadherinは低下しており、加齢に伴い低下が強くなった。【結論】E-cadherin/β-catenin依存性細胞制御の破綻がPCKラットの尿細管部位特異的嚢胞形成・増大に関与していることが示された。