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最長寿国日本における老人性喉頭のリスク因子解明および治療に関する研究

本研究は声帯の老化に伴う音声障害の臨床的特徴を把握し、病態解明と有効な治療法を探るための礎を築くことを目的としている。老人性喉頭患者を対象とした臨床研究では、声帯粘膜の3次元構造解析で声帯中央遊離縁を中心とした声帯粘膜の萎縮を確認し、音声機能の特徴を明らかにした。しかし、本疾患に特異的なリスク因子は同定できなかった。さらに、声帯の老化を再現し、音声に関する実験を行う動物モデルとして、コモンマーモセットが有用か探るため、摘出喉頭の構造解析を行った。ヒトとの構造の類似から、この小型霊長類が声帯の老化を探る動物実験系に活用しうる可能性が示唆された。本研究は声帯の加齢性変化に伴う機能的・器質的変化の実情を把握し、効果的な治療介入を臨床で行うための基盤研究が目的である。平成27年度は、老人性喉頭例に関する臨床研究を中心に、種々の音声・喉頭機能検査やコンビームCT等を用いた構造評価を行い、健常老人および他疾患治療後の音声と比較することで、疾患の特徴を検証した。本研究に先立ち行った他疾患(声門癌、前癌病変、喉頭乳頭腫)治療後の音声機能評価に関しては、それぞれ学会報告の上で英語論文化した。本疾患は声帯粘膜固有層の菲薄化、筋層の萎縮性変化に伴い、音響分析では雑音成分、揺らぎ成分が健常老人と比較し有意に悪化を認め、声門閉鎖不全を象徴し空気力学的検査でも有意に悪化を認めた。一方、当施設で積極的に行っている声帯内コラーゲン注入術の治療効果は、声帯筋層の質量変化による空気力学的検査の改善は認めたものの、音響に関しては効果乏しく、声に関する自覚的QOLは限局的な改善を認めるのみで、他疾患治療後と比較しても悪かった。上記結果は国際学会で報告したが、対象となった新規患者が当初の想定より少なかったことから、病態リスク因子解析では統計学的に有意な結果が得られず、英語論文化できていない。新たなる治療介入としては、音響の改善を目的とし、声帯粘膜固有層の菲薄化に対するアプローチが必要と考えており、当初はラットを用いた基礎実験系の確立を検討していたが、ヒト成人との声帯層構造の相違から、臨床応用に支障をきたす可能性が懸念された。そこで、よりヒトに近い霊長類(コモンマーモセット)の喉頭構造の解析を行う事から開始したため、当初の計画より遅れが生じている。新規対象症例が想定数よりも少なかったためリスク因子解析が遅れている。また、基礎実験系の確立においては、コモンマーモセットの喉頭構造の解析を行う事から開始したため、遅れが生じている。本研究は声帯の加齢性変化に伴う機能的・器質的変化の実情を把握し、効果的な治療介入を臨床で行うための基盤研究で目的である。平成27年度は老人性喉頭症例に関する臨床研究を中心に、種々の音声検査やコンビームCT等を用いた構造評価を行い、健常老人および他疾患治療後の音声機能と比較することで、疾患の特徴を検証した。本疾患は声帯粘膜固有層の菲薄化および筋層の萎縮性変化が生じている。当施設で積極的に行っている声帯内コラーゲン注入術や甲状軟骨形成術の治療効果は声帯筋層の質的変化に伴う空気力学的な音声改善は認めるものの、音響改善への効果は乏しく、音声に関する自覚的QOLの改善も限局的であった。そこで、音響の改善を目的とし、粘膜固有層の菲薄化に対するアプローチが必要と考え、当初はラットを用いた基礎実験系の確立を検討していたが、ヒト声帯との声帯層構造の相違から、臨床応用に支障をきたす可能性が懸念され、よりヒトに近い霊長類のコモンマーモセットに着目し、その喉頭構造の解析を行うことにした。平成28年度はコモンマーモセットの切片を作成し、EVG染色にて層構造がヒトと同様の3層構造を呈している可能性が示唆された。また、声帯における成体幹細胞の存在を検討するため、LGR5抗体を用いた免疫染色を行い、声帯上面喉頭室近傍の基底膜、声門下に幹細胞が存在する可能性が示唆された。本検討は1個体のみの検討であり、また、ヒトにおいては成長に伴い声帯の層構造が変化することを考慮し、マーモセットでも同様の層構造変化をきたすかどうか検証するため、出生直後老齢期までの個体を揃え、解析の準備を整えた。ヒトと類似した声帯層構造の存在が示唆されるコモンマーモセットの喉頭構造をより詳細に解析するため、出生直後から老齢期に至る個体を収集するのに時間を要した。本研究は声帯の加齢性変化に伴う機能的・器質的変化の特徴を把握し、効果的な治療介入を探るための基盤研究である。当初はラットによる実験系を予定していたが、前年度からは動物分類学上でよりヒトに近い小型霊長類のコモンマーモセットが老化に関する音声実験の対象として有用か探るため、摘出喉頭の構造解析を行った。ヒトは加齢に伴い声帯層構造の組成が変化していくという特徴を踏まえ、幼齢期・成体期・老齢期の検体の喉頭切片を作成し、EVG染色にて弾性線維と膠原線維、筋線維を評価した。コモンマーモセットは喉頭室を有し、声帯は粘膜上皮・粘膜固有層・筋層の3層構造を呈していた。

粘膜固有層浅層は線維成分が比較的疎で、中間層は弾性線維が主体を成し、深層は膠原線維が主体で組織が密であった。一方、老齢期で膠原線維の密度が増加して弾性線維が減少していた。このように浅層から深部に近づくにつれ硬くなる3次元構造で、加齢により粘弾性が低下する所見はヒトと類似していた。組織幹細胞の探索を目的に抗LGR5抗体と抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色では、冠状断切片にて声帯上面喉頭室近傍の基底膜、声門下に幹細胞マーカー陽性細胞を認め、水平断切片では声門後壁側に多かった。コモンマーモセットの喉頭は、ヒトとの構造の類似から、吹鳴実験などの動的評価や基礎実験に適し、老化を探るin vivo動物実験における霊長類モデルとして活用しうる可能性が示唆された。本研究は声帯の老化に伴う音声障害の臨床的特徴を把握し、病態解明と有効な治療法を探るための礎を築くことを目的としている。老人性喉頭患者を対象とした臨床研究では、声帯粘膜の3次元構造解析で声帯中央遊離縁を中心とした声帯粘膜の萎縮を確認し、音声機能の特徴を明らかにした。しかし、本疾患に特異的なリスク因子は同定できなかった。さらに、声帯の老化を再現し、音声に関する実験を行う動物モデルとして、コモンマーモセットが有用か探るため、摘出喉頭の構造解析を行った。ヒトとの構造の類似から、この小型霊長類が声帯の老化を探る動物実験系に活用しうる可能性が示唆された。1症例数を増やして、臨床統計から病態のリスク因子を解明していく2出生直後から高齢期までのマーモセット喉頭サンプルを採取し、加齢に伴う喉頭の構造変化を評価したうえで介入実験を計画することになる見込みである。出生直後から老齢期まで、約20個体揃えたコモンマーモセットの摘出喉頭を用いて、9.4T超高磁場MRIによる喉頭領域の線維構造の描出を試みたのちに、切片を作成して、Elastica van Gieson染色(EVG染色)にて、弾性繊維と膠原線維、筋線維などを染め分け、声帯の層構造を観察することで、ヒトと同様に加齢に伴う声帯層構造の変化をきたすか検証する。そのうえで、LGR5抗体などの幹細胞マーカーを用いた免疫染色による成体幹細胞の探索を継続していく。本検討により、ヒトにおける喉頭構造の老化の要因を探る為の動物実験系を確立する礎となる可能性を探る。喉頭科学本研究は、臨床研究と基礎研究を組み合わせて行っている。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であるが、研究の進捗状況に遅れも生じているので、次年度にずれ込む予定である。当初の研究計画から大幅な変更があり、コモンマーモセットの個体を収集していたが、他施設から無償での提供を手配できたので、物品費・人件費は抑えることができた。一方、本邦において霊長類の実験動物に着目してその喉頭構造を検討した報告は皆無であり、国際学会での情報収集に費やした。28年度は動物実験(コモンマーモセットなど)を中心に解析をすすめていく予定であり、動物の調達にかかる費用、染色用の試薬等を中心に物品費が増えるほか、臨床研究を総括する論文校正や国際学会での発表にかかる費用が引き続き必要となる見込みである。切片の作製や染色用の試薬等の物品購入などに使用していく予定である。また、得られた知見を国際学会で発表する際にかかる費用が必要となる予定である。
白色腐朽菌による低分子芳香族化合物の資化と生合成

リグニンは地球上で2番目に豊富に存在する生物資源であり、その利用法の確立は持続可能な社会の実現に向けた最重要課題のひとつである。リグニンの分解者である白色腐朽菌は、リグニンの複雑系を解消し新たな利用法を確立する鍵となるが、白色腐朽菌による低分子芳香族化合物の取り回しに関しては未解明な点が多い。本課題では白色腐朽菌と低分子芳香族化合物との関連性について2つの疑問を明らかにすることを目的とする。第一に白色腐朽菌がリグニン分解により生じた低分子芳香族化合物を資化しているか検証を行い、第二に白色腐朽菌自身が産生する芳香族化合物、ベラトリルアルコールがどのように生合成されているかについて解明に取り組む。
構造制御された前周期金属複合酸化物および固溶体酸塩基触媒の開発と活性制御因子

本申請課題はジルコニウムを中心とした3ー5族金属酸化結晶相に添加された他種元素に起因するバルク層および原子レベルの局所構造に着目した固体強酸,酸塩基触媒研究に関するものである.無機化学的アプローチ,精密構造解析および活性試験を通じて「1:固体超強酸に匹敵する強酸性質発現のためにジルコニウム系酸化物触媒が兼ね備える条件と活性種の解明」,「2:ジルコニウムを軸とした前周期遷移金属を含む新規複合酸化物固体強酸触媒の開発と原子レベル構造制御」「3:ジルコニア系複合酸化物触媒によるエタノール転換反応による含酸素化合物の合成」を行う.本申請課題はジルコニウムを中心とした3ー5族金属酸化結晶相に添加された他種元素に起因するバルク層および原子レベルの局所構造に着目した固体強酸,酸塩基触媒研究に関するものである.無機化学的アプローチ,精密構造解析および活性試験を通じて「1:固体超強酸に匹敵する強酸性質発現のためにジルコニウム系酸化物触媒が兼ね備える条件と活性種の解明」,「2:ジルコニウムを軸とした前周期遷移金属を含む新規複合酸化物固体強酸触媒の開発と原子レベル構造制御」「3:ジルコニア系複合酸化物触媒によるエタノール転換反応による含酸素化合物の合成」を行う.
可視・赤外光を有効利用する金プラズモニック光触媒による高度物質変換反応

本研究では,金粒子の粒径,金属酸化物上への接合状態を制御すること,また,異種金属(助触媒)を巧みに組み合わせることにより,光応答性制御による広範囲な可視光吸収の達成を目指す.交付申請書の「研究実施計画」には「金プラズモニック光触媒による水分解反応」を記載した.プラズモニック光触媒を用いた水の分解反応において,水の酸化反応による酸素生成反応の活性の低さが課題となっていた.当該年度は水の酸化反応に着目し,進めた.【具体的内容】金粒子を様々な方法(光析出法,析出沈殿法,コロイド光電着法)で酸化チタン上に担持し,さらに光析出法を用いて遷移金属種(クロム,鉄,ニッケル等)を担持することで金コアー遷移金属種シェルを作製した.この中でクロム種を修飾した金コアー酸化クロム種シェル担持酸化チタンを水の酸化反応に用いたところ,金単独のサンプルよりも高い活性を示し,担持量を制御することで,約2.5倍の活性となった.この反応中におけるクロム種の役割については現在調査中である.参考文献を基に酸化クロム種の役割を正孔移動層もしくは電子移動層であることを予想した.この場合の酸化反応サイトを探索する実験を含め,現在,電気化学測定を実施することで役割の理解を行っている.【意義・重要性】以上の結果より,金粒子上に適切な酸化物層を形成することにより,酸化反応活性が上昇した.これにともない水分解反応活性の上昇が期待できる.しかし,水分解反応には還元反応サイトの助触媒も必要であり,調製法を工夫する必要があるが,これまでの知見を駆使することで可能であると予想する.研究開始時に設定した目標「金プラズモニック光触媒による水分解反応」における課題点を解決し,成果を触媒討論会にて発表した.以上の事実から,研究は順調に進呈していると判断した.金粒子担持金属酸化物を用いた光触媒活性の向上および高・多機能化は金粒子の周辺の材料設計・合成手法が重要であることが,これまでの研究により明らかとなっている.このような観点から,平成31年度(令和元年度)の研究では平成30年度に達成した金粒子上への酸化クロム種シェル形成による酸化反応の活性向上の知見を水分解反応へ適応する.本研究では,Au粒子の粒径,金属酸化物上への接合状態を制御すること,また,異種金属(助触媒)を巧みに組み合わせることにより,光応答性制御による広範囲な可視光吸収の達成を目指す.交付申請書の「研究実施計画」には「Au粒子と金属酸化物との接合状態の設計を可能とする合成法の確立」を記載した.Au粒子の固定法はこれまでに研究者らが開発したコロイド光電着法を用いた.この方法を用いることで,13nmのAu粒子が固定化される.さらにこの固定化された試料を熱処理することで,接合状態の設計を行った.【具体的内容】コロイド光電着法で調製したAu担持酸化チタン(Au/TiO2)を700度で後焼成することで,TiO2上のAu粒子が半球状になることを見い出した.また,TiO2表面と接触しているAu粒子を半球状にすることで,650 nm以上の長波長光吸収することを明らかにし,これを利用した赤色LED光(中心波長:630 nm)によるAuプラズモニック光触媒反応を達成した.また,各種温度において調製した試料のアクションスペクトルを測定したところ,光吸収の変化にともないアクションスペクトルも変化することが明らかとなった.この成果として,Chemical Communicationsに掲載され,雑誌のフロントカバーに採用された.【意義・重要性】以上の結果より,簡便な熱処理を行うことでAu/TiO2の長波長応答化に成功し,調製温度,すなわちAu粒子とTiO2の接合状態を制御することで応答波長を長波長化することに成功した.研究開始時に設定した目標「Au粒子と金属酸化物との接合状態の設計を可能とする合成法の確立」を実現し,成果をChemical Communications誌に発表した.また,Au粒子担持金属酸化物を各種作製し,電子注入挙動について重要な知見を取得し,成果を日本化学会年会にて発表した.以上の事実から,研究は順調に進展していると判断した.本研究では,金粒子の粒径,金属酸化物上への接合状態を制御すること,また,異種金属(助触媒)を巧みに組み合わせることにより,光応答性制御による広範囲な可視光吸収の達成を目指す.交付申請書の「研究実施計画」には「金プラズモニック光触媒による水分解反応」を記載した.プラズモニック光触媒を用いた水の分解反応において,水の酸化反応による酸素生成反応の活性の低さが課題となっていた.当該年度は水の酸化反応に着目し,進めた.【具体的内容】金粒子を様々な方法(光析出法,析出沈殿法,コロイド光電着法)で酸化チタン上に担持し,さらに光析出法を用いて遷移金属種(クロム,鉄,ニッケル等)を担持することで金コアー遷移金属種シェルを作製した.この中でクロム種を修飾した金コアー酸化クロム種シェル担持酸化チタンを水の酸化反応に用いたところ,金単独のサンプルよりも高い活性を示し,担持量を制御することで,約2.5倍の活性となった.この反応中におけるクロム種の役割については現在調査中である.参考文献を基に酸化クロム種の役割を正孔移動層もしくは電子移動層であることを予想した.

この場合の酸化反応サイトを探索する実験を含め,現在,電気化学測定を実施することで役割の理解を行っている.【意義・重要性】以上の結果より,金粒子上に適切な酸化物層を形成することにより,酸化反応活性が上昇した.これにともない水分解反応活性の上昇が期待できる.しかし,水分解反応には還元反応サイトの助触媒も必要であり,調製法を工夫する必要があるが,これまでの知見を駆使することで可能であると予想する.研究開始時に設定した目標「金プラズモニック光触媒による水分解反応」における課題点を解決し,成果を触媒討論会にて発表した.以上の事実から,研究は順調に進呈していると判断した.Au粒子担持金属酸化物を用いた光触媒活性の向上には,Au粒子から金属酸化物への電子移動、可視光吸収能をさらに高め,高機能化する必要がある.また,Au粒子の粒径による光吸収能,光触媒活性の向上の検討も重要となる.このような観点から,平成30年度の研究ではAu粒子の粒径を制御したAu/TiO2を作製し,水の酸化反応への影響を検討する.また,アルケンのエポキシ化に対し,特殊な選択性を示すAu/TiO2の作製を行う.金粒子担持金属酸化物を用いた光触媒活性の向上および高・多機能化は金粒子の周辺の材料設計・合成手法が重要であることが,これまでの研究により明らかとなっている.このような観点から,平成31年度(令和元年度)の研究では平成30年度に達成した金粒子上への酸化クロム種シェル形成による酸化反応の活性向上の知見を水分解反応へ適応する.
ニューラルネットワークによる少数データコンピュータトモグラフィと微分方程式解法

多層ニューラルネットワーク(NN)の学習のための誤差評価関数として微分方程式の残差を使えばNNを微分方程式解法に適用することが可能になりNNの独特な性質を生かして多くの問題に応用することが出来る(NN法)。ナビエストークス方程式、ポアソン方程式、ローレンツ方程式等についてこの方法を適用し数値実験を行い満足すべき結果を得た。同様の考え方をコンピュータトモグラフィ(CT)に応用する方法について研究した。誤差評価関数を一般化することで本方法を更に広い範囲に応用できることを明らかにした。微分方程式、積分方程式、代数方程式の残差の二乗に適当なペナルティ係数をかけて和をとりNNの誤差評価関数を構成し学習(最適化)させる。NNの豊かな関数表現力によって種々の問題が容易に解けるようになる。その汎化機能のために平滑化や内挿が自動的になされるので誤差を含む実験データに関係した逆問題への応用が期待される。重要な応用分野の一つは気象・気候シミュレーションで不可欠のデータ同化問題である。研究期間中にデータ同化問題のモデル問題を研究し満足できる結果を得た。また、色々な分野に現れる一般化アーベル変換にも威力を発揮した。NN法との比較のために従来型標準的解法の研究を行った。まず、CTの数学的基礎である逆ラドン変換の研究を進めた。エミッションCTにおける減衰ラドン変換について球面平均を用いた反転公式とその証明を与え、数値実験を行い正当性を確かめた。また、有限要素法と代用電荷法を用いた無限領域でのポアソン方程式の解法についての研究を進めた。音場制御問題に関連して、外部領域に接続する有界領域におけるヘルムホルツ方程式の解を求める方法の研究を行った。ヘルムホルツ方程式の外部問題の時間依存解法に関して、新しい人工境界条件を見いだし、数値実験とその妥当性についての数理的解析を行った。これにより無限領域における有限要素法を用いた偏微分方程式の数値解法を研究した。音声発生問題、無限領域における地震波の研究で成果を得た。多層ニューラルネットワーク(NN)の学習のための誤差評価関数を定義するのに微分方程式の残差を使えばNNを微分方程式解法に適用することが可能になりNNの独特な性質を生かして多くの問題に応用することが出来る。ナビエストークス方程式、ポアソン方程式について数値実験を行い満足すべき結果を得た。特に、境界条件設定について詳しく調べた。同様の考え方を積分方程式の数値解法に適用して、コンピュータトモグラフィ(CT)に応用する方法について研究した。NNは優れた内挿機能と平滑化機能を備えているので、このCT像再生法は、特に、物理実験や自然観察等測定データが少ない場合に有効である。これをモデル分布についての数値実験で確認した。また、これらの応用を効率よく行うための高次のNN学習アルゴリズムの研究を行った。比較対象として従来型のCTの数学的基礎である逆ラドン変換の研究を進めた。任意の次元の空間における空間次元より小さい任意次元のラドン変換に対して、球面平均を用いた反転公式を与え、それを利用した再構成計算の数値実験を行い、この反転公式が再構成計算に適することを確かめた。エミッションCTにおける減衰ラドン変換について、球面平均を用いた反転公式とその証明を与えた。比較対象としての従来型の偏微分方程式解法に関しては、有限要素法と代用電荷法を用いた無限領域でのポアソン方程式の解法についての研究を進め、この手法の有効性を理論解析、数値計算の両面から確認した。

また、音場制御問題に関連して、外部領域に接続する有界領域におけるヘルムホルツ方程式の解を求める方法について研究を進めた。具体例として2次元導波路の問題を解析し興味深い結果を得、いくつかの理論的成果を得た。さらに、ヘルムホルツ方程式の外部問題の時間依存解法に関して、新しい人工境界条件を見いだし、数値実験とその妥当性についての数理的解析を行った。ニューラルネットワーク(NN)によるCT像再構成問題と微分方程式解法において重要な誤差評価関数を一般化することで本方法を広い範囲に応用できる可能性を明らかにした。具体的には微分方程式、積分方程式、代数方程式の残差の二乗に適当なペナルティ係数をかけてNNの誤差評価関数としてNNに学習(最適化)させる。NNの豊かな関数表現力によって種々の問題が容易に解けるようになる。特に、その汎化機能のために平滑化や内挿が自動的になされるために誤差を含む実験データに関係した逆問題への応用が期待される。重要な応用分野は気象・気候シミュレーションで不可欠のデータ同化問題である。研究期間中にデータ同化問題のモデル問題を研究し満足できる結果を得た。また、いろいろな分野に現れる一般化アーベル変換にも威力を発揮した。NN法に比較するため、標準的解法の研究を進めた。十分大きな二次元有界領域の外部でヘルムホルツ方程式の解について研究した。解は遠方ではゾンマーフェルトの外向き放射条件をみたす。円の内部は有限要素法(FEM)で、円の外部は基本近似法(FSM)で離散化する。この手法の正当化に関して部分的な成果を得た。また、Helmholtz方程式の3次元外部問題を,人工境界を導入して有限領域の問題にして有限要素法で解くことについて研究した.仮想領域法とSchwartzの交互法を組み合わせた新たな計算方法を見い出し数値計算を実施した.さらに、無限領域における有限要素法を用いた偏微分方程式の数値解法を研究し、音声発生問題に対して数値シミュレーションを行い実際の母音に近いフォルマントの形状を得た。地震波における表面波の取扱についても妥当な結果を与える境界条件を見いだした。領域分割計算に関して妥当な接続条件についての知見を得た。一方、医療診断用のPET(陽電子CT)において減衰Radon変換の一つに指数Radon変換がある。この変換の反転公式を示し、その離散近似式を与えた。この近似式は対象が不連続である時も再構成誤差が十分小さく正しく画像を再構成することを確かめた。
テトラサイクリン排出タンパク質の結晶化

本タンパク質は非常に不安定で、従来結晶化に適した標品を得るのが困難であったが、酸性条件下で精製することにより安定な標品が得られることを見いだした。また、基質を認識・結合するが輸送能を失ったG141C変異体は、LacYのC154G変異体同様に結晶化にとって有用であることが予想される。これらの変異体・条件を用いてさらなる精製条件を検討した結果、ドデシルシュークロース、ノニルチオマルトシドを用いた場合に最も良好な標品が得られた。膜タンパク質はエネルギー変換、膜輸送、情報伝達等、生命現象に最も重要な役割を果たしている。その立体構造を明らかにすることは、現象の本質的理解のためには不可欠である。異物排出タンパク質は細菌の細胞質膜から高等生物の細胞膜に至るまで広く存在する膜タンパク質で、細胞内に進入した異物(消毒剤や抗生剤あるいは抗癌剤)をプロトン駆動力やATP加水分解エネルギーを利用して細胞外に排出する働きを持つ。この異物排出タンパク質を発現することが病原性細菌や癌細胞における薬剤に対する耐性獲得の主因となっている。排出タンパク質の立体構造情報は異物認識機構の解明ばかりでなく、阻害剤の開発にも道を拓くものと期待される。本タンパク質は非常に不安定で結晶化に適した標品を得るのが困難であったが、酸性条件下で精製することで、より安定な標品が得られることを見いだした。本年度は、この標品を用いて広く結晶化条件をスクリーニングした。また、同じMFS型に属するトランスポーターであるラクトース輸送体LacY(排出ではなく、取り込みを担う膜輸送体。Abramson et al.(2003))ではC154Gという変異体を用いることによって初めて構造解析に成功した。この変異によりLacYは基質を輸送できなくなるが、認識・結合能は失わずに立体構造が安定化された。このことから変異体を用いるのはトランスポーターの結晶化に有効な一手段であることが分かる。我々の手持ちのTetA(B)変異体の中には、その遺伝子導入によって大腸菌に薬剤耐性を与えないものが多数含まれている。中でもG141C変異体は、そのシステインの修飾試薬による修飾が、基質であるテトラサイクリンの存在によって著しく阻害されることが分かっている。この基質を認識・結合するが輸送能を失ったTetA(B)のG141C変異体は、LacYのC154G変異体同様に結晶化にとって有用であることが予想される。そこで、この変異を従来の大量発現系(大腸菌株RB791に野生型TetA(B)をコードするプラスミドpSYTetを導入したもの)に組み込んで変異体の大量発現を試みた。予想外に発現量が減少したが、大腸菌株W3104をホストに用いることで発現量が改善した。この変異体を用いて、酸性条件での精製に限定せずに、中性域でも精製し、結晶化条件をスクリーニングした。現在までに構造解析に適した結晶は得られていないが、変異体の結晶化に期待している。この標品を用いて広く結晶化条件をスクリーニングしている。また、同じMFS型に属するトランスポーターであるラクトース輸送体LacYではCl54Gという変異体を用いることによって初めて結晶化に成功し、構造解析がなされた。手持ちのTetA(B)変異体の中には、その遺伝子導入によって大腸菌に薬剤耐性を与えないものが多数含まれている。中でもG141C変異体は、そのシステインの修飾試薬による修飾が、基質であるテトラサイクリンの存在によって著しく阻害される。この基質を認識・結合するが輸送能を失ったTetA(B)のGl41C変異体は、LacYのC154G変異体同様に結晶化にとって有用であることが予想される。

精製条件の検討の結果、ドデシルシュークロース、ノニルチオマルトシドを用いた場合に最も良好な標品が得られた。現在結晶化条件をスクリーニングしている。本タンパク質は非常に不安定で結晶化に適した標品を得るのが困難であったが、酸性条件下で精製することで、より安定な標品が得られることを見いだした。また、同じMFS型に属するトランスポーターであるラクトース輸送体LacYではC154Gという変異体を用いることによって初めて結晶化に成功し、構造解析がなされた。この変異によりLacYは基質を輸送できなくなるが、認識・結合能は失わずに立体構造が安定化された。このことから変異体を用いるのはトランスポーターの結晶化に有効な一手段であることが分かる。手持ちのTetA(8)変異体の中には、その遺伝子導入によって大腸菌に薬剤耐性を与えないものが多数含まれている。中でもG141C変異体は、そのシステインへの修飾試薬による修飾が、基質であるテトラサイクリンの存在によって著しく阻害される。この基質を認識・結合するが輸送能を失ったTetA(B)のG141C変異体は、LacYのC154G変異体同様に結晶化にとって有用であることが予想される。しかし、その後のゲルろ過解析の結果から、いずれの標品もタンパク濃度が1mg/ml程度の低濃度(蛋白質結晶化には低すぎて不適)であれば単分散しているが濃縮した標品は非特異的会合を生じていることが分かった。本標品は結晶化に適さな事が予想されるため、他の安定化手段としてモノクローナル抗体の使用を検討した。けれども結晶化に有効な立体構造を認識するモノクローナル抗体の作製には至らなかった。今後も精製条件検討及び結晶化条件のスクリーニングを行い、構造解析可能な結晶の作成を目指す。
媒体中 浮遊粒子の光輻射圧による捕捉と捕捉粒子の物性解析

Ar^+レーザー(488nm、TEM_<00>を用い、1)SiO_2、ローダミンB吸着SiO_2等の空気中浮遊粒子について、レーザー輻射圧による捕捉位置とレーザー出力、捕捉位置におけるレーザービーム径の検討を行った。レーザー出力一定の時、捕捉位置におけるビーム径は、集束光の立体角に依存せず、一定であり、捕捉位置は集束レンズの焦点上方2.5±0.5mmであった。またレーザー出力100mw以上では、捕捉位置に変化なく、一方100mw以下では出力を下げるに従い、捕捉位置は低下し焦点に接近した。2)水中に分散したポリスチレン球を捕捉するため、(1)捕捉用光学システム、(2)ポリスチレン球のサイズ及び単位体積中の粒子数、(3)セル形状について検討を行った。(1)交差ビーム光学システムを組み立てた。即ちレーザービームをビームスプリッターで2方向にわけ90゚プリズムで方向を変え、最終的に集束レンズを介して左右の対向ビームを一直線上に合わせた。この時焦点距離が異なる集束レンズを用いて焦点間距離を変化させた。焦点間距離は捕捉の可能性及び安定性に影響を与えた。(2)球径3μm、20μmのポリスチレン球懸濁液を各々1個/1mlになるように希釈した。粒子濃度が大となると粒子同士の衝突および凝集により、更に多数の粒子が存在すると粒子によりレーザー光が遮られ、陰となる部分が多くなり捕捉が困難となった。(3)セル内での水の対流による影響を減らすためセル厚、水深共5mmとした。以上、各々の要因を検討した結果、焦点間距離:0.6mmの時、集束レンズの焦点距離f=10mmで3μmのポリスチレン球の捕捉が可能であった。又f=50mmで20μmの球が捕捉される傾向を示した。
2層系分数量子ホール状態における巨視的量子コヒーレンスの検証

2層系分数及び整数量子ホール状態について、詳細な活性化エネルギー測定を中心に、量子輸送現象測定を行った。特に、電子と複合フェルミオンとの関係にある2層系ν=1整数量子ホール状態及び2層系ν=1/3分数量子ホール状態について、相互の類似点及び相違点が明らかになり、ともに巨視的量子コヒーレンスを持つ可能性について示唆する興味深い結果となった。マイクロ波照射の測定については現在も継続中であり、今後の展開が有望視される。年度は、京都大学・低温物質科学研究センターにおける15Tまでの高磁場発生用超伝導磁石を含む希釈冷凍機を用いて、トランスポート測定による分数量子ホール領域での新規な量子相の探索を行った。半導体試料は、新たに京都大学においてクリーンルームが整備されたことにより、デバイス化が容易に行えるようになった。さらに、2層の電子面のそれぞれに独立に電気的なコンタクトを取れるゲート電極の配置(2層独立コンタクト)を持つ新しいデバイス化技術の開発に取り組んでいる。希釈冷凍機にデバイス化された2層系量子ホール試料を取り付け、トランスポート測定を行った。トンネリング・エネルギーが11Kの試料を用いて、総電子密度・電子密度差を変化させ、活性化エネルギーを測定することにより、2層系v=1/3量子ホール状態の相図を作成した。また、面内磁場を印加することにより、電子密度差のある状態で整合-非整合的な相転移が起こることを見出した。現在はトンネリング・エネルギーが1Kの試料を用いて測定を行っている。また、兵庫医科大学においても、量子ホール効果測定を行うため、4.2KGM冷凍機を購入し、超低温・強磁場環境の整備を進めている。本年度は、京都大学・低温物質科学研究センターにおける15Tまでの高磁場発生用超伝導磁石を含む希釈冷凍機を用いて、トランスポート測定による分数量子ホール領域での新規な量子相の探索を継続して行った。半導体試料は、京都大学のクリーンルームでデバイス化を行った。さらに、2層の電子面のそれぞれに独立に電気的なコンタクトを取れるゲート電極の配置(2層独立コンタクト)を持つ新しいデバイス化技術の開発に引き続き取り組んだ。今年度は、主にトンネリング・エネルギーが1Kと非常に小さい試料を用いて、総電子密度・電子密度差を変化させ、活性化エネルギーを測定することにより、2層系ν=1及び1/3量子ホール状態について詳細に調べた。2層系ν=1量子ホール状態について、面内磁場を印加することにより、整合-非整合相転移点付近で、ソリトン格子相と見られる活性化エネルギーの極小がわずかに存在することを見出した。さらに、2重量子井戸構造を持つ半導体試料を用いて、ν=2/3量子ホール状態の動的核スピン偏極についても探索を行った。また、兵庫医科大学においても、量子ホール効果測定を行うためのGM冷凍機の運転を行い、3K程度の極低温環境の創出に成功した。
金融リスク管理のための新ITモデルの研究と開発

本研究の目的は、金融リスク管理のための新しいITモデルの研究と開発である。・金融リスク評価の精緻化まず、信用リスクの定量分析のための中小企業の財務データベースを構築した。そのデータベースを利用して、新しいタイプの銀行ローンの適正貸出金利算出モデルを開発した。モデルの主要な特徴としては、財務データベースに基づく伝統的な統計的アプローチと確率解析によるクレジット・デリバティブの価格付け手法とを組み合わせたものであるということである。また、多目的遺伝アルゴリズムによる信用スコアリングモデルのチューニングに関する研究を行った。・最適化技術の向上不確実な状況下においてトラッキングエラーを最小化するモデルを構築した。また、その最適解を効率よく求める手法を開発した。リスクを回避するため、考えうる最悪の状況下での誤判別率を最小化する判別問題についての基礎研究を行った。適用できる確率微分方程式のクラスに制限がなく高次近似が可能な、楠岡近似の画期的なアルゴリズムの開発に成功した。さらに、この手法が数理ファイナンスの問題に非常に有効であることを実証した。・IT環境の構築電子商取引において重要なディジタル署名に関して、structured aggregatesignatureという署名法を構築するとともに、Rabin型署名の既存の安全性証明の誤りに対する訂正法を導出した。信用情報共有基盤技術としてのXBRLおよびサイバー金融システムの研究を行った。そして、日本における金融庁のEDINET、東京証券取引所のTDnetに代表されるXBRLの取り組みの支援をした。以上の研究成果を合計19本の論文(査読付き)と1冊の図書で発表を行った。また、研究期間中にシンポジウムやワークショップを計6回開催することにより、積極的に情報収集を行うとともに、上記の研究成果を内外に周知した。本研究の目的は、「ファイナンス」「最適化」という金融リスク管理の核となる理論を、ネットワークやセキュリティ等の「IT」と融合させることにより、共通資源である市場・信用情報データベースと個々の経済主体のリスク管理技術を効率的かつ安全に連携させることを可能にする新しいITモデルの研究・開発を行い、それを高度化・複雑化した経済システムに対応した「社会インフラ」として実現させることである。今年度の主な成果は以下の通りである。・金融リスク評価の精緻化本トピックに関して「信用リスク管理の実務と理論」というシンポジウムを開催し、資料収集を行った。中小企業の財務データベースを構築し、財務指標をベースにした統計的手法に基づくデフォルト判別分析モデルの研究に着手した。また、シドニーの国際ワークショップに参加し、企業間の信用力相関のモデルと実用化に関して資料収集を行った。・最適化技術の向上本トピックに関して、ドイツの数学研究所で行われた最適化会議に参加し、研究発表と資料収集を行った。また、金融リスク最小化問題について、パラメータが不確実な場合にも適用できるよう、ロバスト最適化に関する基礎研究を実施した。・IT環境の構築本トピックに関して、「電子投票と暗号技術」「信用情報共有基盤:XBRL技術の基礎と応用」「研究開発部門におけるステージゲート管理と技術価値評価」という3件のシンポジウム、ワークショップを開催して資料収集を行った。・金融リスク評価の精緻化中小企業の財務データベースを整備し、統計的手法に基づくデフォルト予測モデルおよび適正な貸出プライシング・モデルの研究を行った。特に、本データベースに基づきデフォルト時の債権回収率を推定し、信用リスクに見合う適正貸出金利を算出するモデルの研究は、国内で2件の学会報告をし、現在論文を投稿中である。また、多目的遺伝的アルゴリズムGAによる財務スコアリングモデルのチューニングに関する研究で国内外で学会報告を行った。コーポレートガバナンスの観点からの研究については5本の学術論文が発表された。・最適化技術の向上最適化の国際シンポジウムで研究発表と資料収集を行った。最適化に関して2本の学術論文が発表された。金融リスク最適化に関して,不確実なパラメータを含む場合のトラッキングエラー

最小化問題を研究し,その問題が二次錘計画問題に帰着でき,内点法などにより効率よく解くことができることを示した.確率数値解析に関しては、楠岡近似の記号計算を伴わないで実行可能な新たなアルゴリズムの開発に成功し、その結果を国際学会で報告し、現在論文準備中である。・IT環境の構築電子商取引において重要なディジタル署名に関して、structured aggregate signatureという署名法を構築するとともに、Rabin型署名の既存の安全性証明の誤りに対する訂正法を導出した。いずれも国内学会で報告し、論文を英文誌に投稿予定である。さらに、信用情報共有基盤技術としてのXBRLおよびサイバー金融システムに関して、国内外の会議で発表・講演を行った。・全体「金融リスク管理のための新ITモデルの研究と開発」という2日間のシンポジウムを開催し、各研究課題についての研究成果の発表と情報収集が行われた。・金融リスク評価の精緻化中小企業の財務データベースを利用したデフォルト予測モデルおよび適正な貸出プライシング・モデルの研究を継続して実施し、実際の財務データからデフォルト時の債権回収率を推定し、信用リスクに見合う適正貸出金利を算出するモデルの研究論文1本を発表し、国際学会報告も実施した。また、コーポレート・ファイナンスの研究について2本の論文発表を行った。・最適化技術の向上金融リスク評価に関連して、最悪の場合の誤判別率を最小化させる判別問題を多クラス判別問題に拡張し、さらに線形判別のみでなく2次関数を使った判別について研究し、その成果を3つの国内研究集会で報告した。また、実務上現れる非常に大規模なポートフォリオ最適化問題を解くために、PC-クラスタ上で内点法を効率よく並列計算する手法を提案・実装し、その成果を2本の論文にまとめ、国際学会でも報告した。確率数値解析に関しては、適用できる確率微分方程式のクラスに制約がなく高次近似が可能な、楠岡近似の画期的なアルゴリズムの開発に成功した。さらに、この手法が数理ファイナンスの問題に対して非常に有効であることを実証し、その結果を国際学会で報告した。・IT環境の構築テレワークおよびメッセージ制限付き署名の新しいモデルと構成法の研究についてそれぞれ研究報告を行った。さらに、信用情報共有基盤技術としてのXBRLの実用化および現状と展望に関して、国内外の会議で講演と情報収集を行った。
細胞障害発生における脂質過酸化の意義:その消去酵素-グルタチオン・ペルオキシダーゼの細胞生物学的特性解明の面からアプローチ

60年, 61年度の本研究を通して,肝細胞マクロファージ(Mφ)など種々の細胞で発生する脂質過酸化によりGSH-POの蛋白合成促進がもたらされることが判明したが,この事実を基盤として,ヒト及び家兎大動脈に発生した,粥状硬化巣について以下の実験と観察を行った.当研究室で,ヒト赤血球より抽出,精製されたhumanglutathione peroxidase(H・GSH-PO)に対する抗体を家兎で作製し,本抗体が動脈壁のH・GSH-POと特異的反応を示すことを"Western bloting"などによって証明した後,これを用いて正常から高度の粥状硬化症に至るまで種々の程度の動脈硬化性病変(50例)におけるH・GSH-PO局在の酵素抗体法による観察を行った.その結果,粥状硬化病変の中枢を成す増生,蓄積した泡沫細胞(マクロファージ=Mφと変性内膜平滑筋細胞=SMCよりなる)に顕著なGSH-POの増強を認めた.また,ラット腹腔Mφにアラキドン酸カスチードの活性化を主体として脂質過酸化の増強をもたらすことにより,同細胞に顕著なGSH-POの増強が招末されたことから,上記泡沫細胞のGSH-PO増強も,同細胞における脂質過酸化増強に基くものと推定された.これらヒト粥状硬化巣に見られた泡沫細胞の変化の出現の経時的変化を観察すべく,家兎に高コレステロール食(オリエンタル酵母社製)を与え,それぞれ, 2, 4, 8, 16週における動脈粥状硬化巣の免疫細胞化学的観察(抗家兎GSH-PO抗体を用いた酵素抗体法)を行った.その結果, 2週間目には内皮細胞直下に少数のMφ由来の泡沫細胞が出現し,これにGSH-PO局在を認めた.また8週以降,内膜に増生して来る変性SMCとその泡沫細胞にもGSH-POの著名な局在を認め,粥状硬化巣発現における脂質過酸化関与が強調された.60年, 61年度の本研究を通して,肝細胞マクロファージ(Mφ)など種々の細胞で発生する脂質過酸化によりGSH-POの蛋白合成促進がもたらされることが判明したが,この事実を基盤として,ヒト及び家兎大動脈に発生した,粥状硬化巣について以下の実験と観察を行った.当研究室で,ヒト赤血球より抽出,精製されたhumanglutathione peroxidase(H・GSH-PO)に対する抗体を家兎で作製し,本抗体が動脈壁のH・GSH-POと特異的反応を示すことを"Western bloting"などによって証明した後,これを用いて正常から高度の粥状硬化症に至るまで種々の程度の動脈硬化性病変(50例)におけるH・GSH-PO局在の酵素抗体法による観察を行った.その結果,粥状硬化病変の中枢を成す増生,蓄積した泡沫細胞(マクロファージ=Mφと変性内膜平滑筋細胞=SMCよりなる)に顕著なGSH-POの増強を認めた.また,ラット腹腔Mφにアラキドン酸カスチードの活性化を主体として脂質過酸化の増強をもたらすことにより,同細胞に顕著なGSH-POの増強が招末されたことから,上記泡沫細胞のGSH-PO増強も,同細胞における脂質過酸化増強に基くものと推定された.これらヒト粥状硬化巣に見られた泡沫細胞の変化の出現の経時的変化を観察すべく,家兎に高コレステロール食(オリエンタル酵母社製)を与え,それぞれ, 2, 4, 8, 16週における動脈粥状硬化巣の免疫細胞化学的観察(抗家兎GSH-PO抗体を用いた酵素抗体法)を行った.その結果, 2週間目には内皮細胞直下に少数のMφ由来の泡沫細胞が出現し,これにGSH-PO局在を認めた.また8週以降,内膜に増生して来る変性SMCとその泡沫細胞にもGSH-POの著名な局在を認め,粥状硬化巣発現における脂質過酸化関与が強調された.【I】.セレン(Se)依存性について。GSH-POはその補欠分子核としてSeを含み、またそれが活性基に当っていることはつとに知られた事実であるが、本研究ではA.Se欠乏食餌で飼育したラットにおけるGSH-POの消長を【◯!1】生化学的活性測定、【◯!2】EIA(エンザイムイムノアッセイ)、【◯!3】光顕、電顕酵素抗体法などにより観察した。その結果、肝では2週後、【◯!1】【◯!2】【◯!3】のいずれの観察によっても、ほぼ完全に同酵素は消失した。また、この消失の時期は、細胞によって異なり、副腎皮質細胞、視神経細胞(ミトコンドリア内に多量のGSH-POを含む)、マクロファージ(Mφ)、腎遠位尿細管上皮細胞などでは6週位まで残存した。B.GSH-POが完全に消失したラットについてSeを亜セレン酸の形で投与した所、肝細胞では、24時間後に僅かながら、48時間後にはほぼ確実にGSH-POの再発現を見た。以上の実験結果より、SeはGSH-POの活性発現のみならず、その蛋白自身の合成に不可欠であることが明らかにされた。現在、Seが蛋白合成過程のどのステップから組み込まれるのかの検討を含め、GSH-POの合成誘導の機構に於けるSeの意義を追求すべく、mRNAの精製、それを利用しての無細胞系蛋白合成、cDNAのクローニングを行っている。

【II】.GSH-POのミトコンドリア(M)内局在性の観察とその意義の追求: GSH-PO局在の電顕観察で、正常肝細胞でも少数ながらM内のマトリックスにその局在が確認されていたが、4-APP(aminopyrazols pyrimidine)投与で、GSH-PO陽性Mの格段の増加が確認された。そこで、このM内GSH-POが、主たる局在部位であるCytosol(C)内のそれと同一蛋白であるかどうかを確認するため、MとCそれぞれから精製されたGSH-POのアミノ酸配列をエドマン分画法で検索した所、N末端から15番目まで同一であり、まず同一蛋白であることが示唆された。Cで合成されたGSH-POのMへの輸送機構について検討中である。前年(60年)度精査したglutathione peroxidase(GSH-PO)の細胞生物学的特性を基盤に,脂質過酸化が発生する組織学的,超微形態学的"場"の検討の面から各種細胞傷害のPathogenesisにおけるその意義を追求した。【I】肝脂肪変性(脂肪肝)における脂質過酸化:ラットに【CCl_4】など肝細胞傷害性刺激(薬物など)、その刺激の種の違いにより、小葉中心性と周辺性の脂肪肝に明確に分けられた。A.小葉中心性脂肪肝:【CCl_4】がその代表的なもので、ラジカル発生から脂質過酸化を起すことをその傷害の主機序とするものであった。前年度の報告にも見られた様に、生体内でもっとも有効な過酸化脂質消去作用を有するGSH-POは、肝小葉周辺部に多く、中心部には極めて少ない所から、過酸化脂質蓄積が脂肪変性の主因となっていることが確認された。B.小葉中心性脂肪肝:エチオニン、4-aminopyrazolopyrimidine(4-APP)の様な蛋白合成阻害剤によって招来された。これらによって、アポ蛋白の合成阻害によるリポ蛋白の生成、分泌低下が原因となって、脂肪の排出阻害→蓄積が起ることがその機序とされたが、小葉周辺に多いGSH-POの合成も阻害される所から、その部位における過酸化脂質蓄積もその要因となっていることが示唆された。事実、リポ蛋白の分泌阻害は来たすが、蛋白合成阻害(GSH-POも含む)や、脂質過酸化をもたらさないオロチン酸投与では、脂肪肝発生が数日遅かった。【II】3-methyl DABによる発癌過程におけるGSH-POの変動と脂質過酸化:DAB投与後68週で、前癌病変といわれる"hyperplastic nodule(HN)"の発生を見たが、この部分では、GSH-POが選択的に減少していた。一方、これらDAB投与ラットに(1)脂質過酸化を顕著に発生せしめる【CCl_4】と(2)それを起さないオロチン酸を投与したが(1)ではHNに脂肪変性を認めなかったが、(2)では顕著であった。現在その機序究明中である。
エンドトキシン活性値を指標とした牛の炎症性疾患の病態生理解明と迅速予後診断の確立

甚急性乳房炎の予後判定においてエンドトキシン(ETX)活性値の評価は有用であるが実用的ではない。近年、携帯用ETX測定器(PTS)が市販されたのでCow Side Test(CST)として牛の炎症性疾患の予後診断に有効か評価した。65頭の生乳を用いた。100倍希釈生乳ではPTSおよび標準法であるリムルス比濁時間法(KTA)の測定値間で有意差が認められた。200または400倍希釈生乳では両測定方法ともにPTSおよびKTA法の測定値間で有意な相関が認められた。PTSは実験室法であるKTA法と比較して、同等の正確度、感度、相関が認められた。本法はCSTとして生乳中ETX活性値の測定が可能である。(1)健常および乳房炎牛におけるKinetic-Limulus amebocyte lysateassayによる血漿および乳中エンドトキシン活性値測定法および参照値の確立:乳房炎を罹患していない健常牛、および本学附属動物病院で各種乳房炎牛の血漿および分房乳を採取し、血漿および乳中エンドトキシン活性値を測定するための前処理方法、測定方法(LAL-KCAおよびカイネティック比濁時間法)の確立および参照値の設定を行った。(2)Kinetic-Limulus amebocyte lysateassayによる肺胞洗浄液中エンドトキシン活性値測定法および参照値の確立:LAL-カイネティック法を用いてMycoplasma感染の認められた牛複合性呼吸器疾患(BRDC)子牛の肺胞洗浄液(BALF)および血漿中エンドトキシン動態を評価した。その結果、BRDC群のBALFおよび血漿中エンドトキシン活性値の中心値は105.8および0.334 EU/mLであり、対照群よりも有意に高値を示した。BALF(Se=81.3%, Sp=84.6%)および血漿(Se=92.9%, Sp=100%)においてエンドトキシン活性値によるBRDCの診断能は有意であり、それぞれの閾値は6.05および0.078 EU/mL以上であった。また、BALFと血漿中エンドトキシン活性値は有意な正の相関を示した。(3)Kinetic Limulus Amebocyte Lysate assay(Kinetic-LAL)を標準法としたEndosafe PTSTMの精度および正確度評価:近年、携帯用エンドトキシン測定システム(PTS)がCharles River社より市販されている。本研究では、PTSを用いて血清中エンドトキシン活性値の測定が可能か否かを正確度及び精度評価、および標準法であるLAL-カイネティック比濁法(KTA)と比較した。その結果、20倍希釈、80°C、10分の加熱処置をして測定に用いたとき、PTSTM法と測定値間で差は認められず、有意な正の相関が認められた。これらの成果の一部についてはJournal of Veterinary Medical Scienceにおいて受理され2015年8月に掲載予定である。【目的】甚急性乳房炎の予後判定においてエンドトキシン活性値の評価は有用だが、測定が煩雑かつ時間を要するため実用的ではない。本研究ではPTSを用いて生乳中エンドトキシン活性値の測定が可能か否かを正確度および精度評価し、標準法であるLimulus Amebocyte Lysate(LAL)-カイネティック比濁法(KTA)と比較した。【方法】乳房炎を罹患していない29頭の健常ジャージー種より搾乳した生乳を用いた。生乳をendotoxin free waterを用いて100、200または400倍希釈し、PTSおよびKTA法によりエンドトキシン活性値を測定した。PTS法はLAL-カイネティック比色法であり、LAL試薬と既知の標準エンドトキシンが充填されたカートリッジにサンプルを用いて測定した。得られたデータの比較はFriedman検定を、相関性はピアソンの積率相関を用いて評価した。【結果】100倍希釈生乳ではPTSTMおよびKTAの測定値間で有意差が認められた(p<0.001)。一方、200または400倍希釈生乳では両測定方法ともに満足のいく正確度および精度が得られ、また両測定法間で有意な差は認められなかった。200倍(p<0.001)および400倍希釈生乳(p<0.001)ではPTSおよびKTA法の測定値間で有意な相関が認められた。【考察】PTSは実験室法であるKTA法と比較して、生乳を200または400倍希釈して用いたとき同等の正確度、感度および相関が認められた。エンドトキシン・チャレンジ(ETX)子牛における白血球および肝臓中STAT-3 mRNA発現量の経時的変化【目的】牛の大腸菌性乳房炎および呼吸器疾患においてエンドトキシンが重篤度や予後と関連性が高い。エンドトキシンがTLR-4に作用すると活性化されたNF-kBが核内移行してIL-6やTNFαなどの炎症反応を誘導するが、STAT-3はIL-6ポンプの中心のシグナルとなってNF-kBファミリーの発現を調節しているが、牛ではその詳細は明らかではない。よって、ETX子牛を用いて白血球および肝臓中STAT-3のmRNA発現量を調査した。【方法】健常子牛12頭のうち2.5μg/kgのO-111:B4由来LPS試験群と無投与対照群に群設定した。

ETX前、投与直後および30分、1、2、4、8、12、24時間目に臨床記録、採血および肝生検を行い、血漿エンドトキシン活性値を測定した。また、白血球浮遊液および肝生検サンプルを用いてSTAT-3、IL-6、TLR-4、NF-kB1およびB2のmRNA発現量をRealtime PCRを用いて測定した。【結果】エンドトキシン活性値は30分をピークとし、4時間後には0に復した。STAT-3のmRNA発現量は白血球で投与後2時間、肝臓で投与後4、8時間に有意に増加した。NF-kB2のmRNA発現量は白血球で投与後14時間、肝臓で24時間に有意に上昇したが(p<0.05)、NF-kB1のmRNA発現は認められなかった。【考察】牛の全身性炎症反応においてNFk-B1ではなく白血球および肝臓でSTAT-3、NF-kB2のmRNA発現量が有意に増加したことから、両遺伝子は炎症評価に有用なマーカーであることが示唆された。また、NF-kB2とSTAT-3の両者は全身炎症を相互調節している可能性が示唆されたため、今後精査していく予定である。15員環マクロライド(ツラスロマイシン)のエンドトキシン抑制効果【目的】マクロライド系製剤は細菌のタンパク合成を阻害して静菌作用を示すが、新作用としてモチリン様作用、好中球の集蔟抑制、気道上皮細胞の水分分泌抑制が知られており、エンドトキシン(ETX)の炎症誘導に関連したNF-kB活性化抑制など慢性呼吸器疾患に有用である。本年度は牛用15員環マクロライド(ツラスロマイシン)のETXに対する効果を血漿および肺胞洗浄液(BALF)中ETX活性値を指標に評価した。【方法】各群6頭の子牛に対してETXチャレンジ前10、7、4および1日前に生理食塩液(対照群)または2.5mg/kgのツラスロマイシン(Drax群)を投与した。O111:B4-LPSを静脈内投与して経時的に血漿中およびBALF中ETX活性値をそれぞれLAL法により測定した。【成績】ETXチャレンジにより投与後30分目から子牛は呼吸器症状を呈し、ETXに関連する臨床徴候は4時間継続した。対照群の血漿中ETX活性値は投与前の0.503±0.258EU/mLに対して投与後30分目に5.512±2.052EU/mLの最高値を示した。同様にDrax群の血漿中ETX活性値も投与前の0.677±0.511EU/mLに対して投与後30分目に2.513±0.851EU/mLの最高値を示したが、そのピーク値は対照群のそれよりも有意に低値を示した。24時間目のBALF中ETX活性値は対照群の70.7±28.4EU/mLに対してDrax群では48.1±5.8 EU/mLと有意に低値を示した。【考察】15員環マクロライドはETXの炎症回路においてNF-kBを抑制する(H28報告)。本研究によりツラスロマイシンを投与された子牛では血漿およびBALF中ETX活性値を低値に抑制することが示唆されたため、今後はETX抑制機序解明を行う。甚急性乳房炎の予後判定においてエンドトキシン(ETX)活性値の評価は有用であるが実用的ではない。近年、携帯用ETX測定器(PTS)が市販されたのでCow Side Test(CST)として牛の炎症性疾患の予後診断に有効か評価した。