hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリオーマにおけるＳＨＨと遊走能の関係

本研究はグリオーマ幹細胞株の樹立およびSHH pathwayがグリオーマ幹細胞の遊走に与える影響について評価することを目的とした。悪性神経膠腫組織から自動磁気細胞分離装置にてCD133陽性細胞を抽出、培養しtumorsphereを形成させた。悪性グリオーマの遺伝子解析ではほぼ全例にSHH pathwayの発現を認め、またSHHはstemnessの維持および遊走能の亢進に関与していることが示唆された。また、継代培養する過程において培養皿に接着し接着細胞として増殖する細胞群が確認されたが、これらにおいては通常の悪性神経膠腫細胞株よりも豊富にCD133陽性細胞が存在することを見いだした。本研究は培養腫瘍細胞株ならびに実験動物において、SHH pathwayが腫瘍幹細胞の遊走に与える影響について評価することを目的としている。それらCD133陽性細胞を無血清かつ種々の増殖因子の存在下に培養しtumorsphereを形成させ継代培養した。その過程において培養皿に接着し接着細胞として増殖する細胞群が確認され、それら細胞群も無血清の条件下に継代培養しmigration assayをおこなった。またCD133陽性細胞よりRNAを抽出、cDNAライブラリーを作製し、SHH pathwayに関与する分子すなわちPATCHED、SMOOTHENED、GLI1、GLI2をターゲットにRT-PCRにて検討し、それらがCD133陽性細胞に発現していることを確認した。その過程において培養皿に接着し接着細胞として増殖する細胞群が確認されたが、これらにおいては通常の悪性神経膠腫細胞株よりも豊富にCD133陽性細胞が存在することを見出した。手術にて摘出された悪性神経膠腫組織を迅速にNeural tissuedissociation kitにて細胞浮遊液とし、抗CD133抗体-マイクロマグネットビーズと反応させ、自動磁気細胞分離装置であるAuto MACSにてCD133陽性細胞を抽出した。それらCD133陽性細胞を無血清かつ種々の増殖因子の存在下に培養し、3例においてtumor sphereの形成が得られた。SHHの存在下ではsphere径が大きくなり、また抗PATCHED抗体の存在下ではsphere形態が失われることから、SHH pathwayはstemnessの維持に関与していることが示唆された。継代培養する過程において培養皿に接着し接着細胞として増殖する細胞群が確認されたが、これらにおいては通常の悪性神経膠腫細胞株よりも豊富にCD133陽性細胞が存在することを見いだした。また、CD133陽性/陰性細胞におけるSHH pathwayの遺伝子発現を解析したところ、16例中15例にPATHCED and/or SMOOTHENEDの発現を認めたが、陽性細胞/陰性細胞において特徴的な差はみられなかった。CD133陽性細胞をマウス脳に移植し悪性神経膠腫モデルマウスの作製を試みたが成功しておらず、手技上の問題に加え、手術切除標本から陽性細胞を得ていること、一度に採取できる陽性細胞数が少ないこと、腫瘍幹細胞培養の難易度が高いこと、継代培養により腫瘍形成能が低下していること等が原因として考えられ今後の課題である。脳神経外科本研究は最終的に悪性神経膠腫モデルマウスにおいてSHH系を阻害することにより腫瘍浸潤が抑制されるかどうかを検証することを目的としているが、このモデルマウスの確立が達成できていない。手技上の問題に加え、手術切除標本からCD133陽性細胞を得ているため一度に採取できるCD133陽性細胞が少ないこと、幹細胞培養の難易度が高いことから、必ずしも意図したようには新たな幹細胞株を得られないこと、以前に樹立した細胞株の継代による腫瘍形成能の低下、凍結による細胞の劣化が原因と考えている。本研究は最終的に悪性神経膠腫モデルマウスにおいてSHH系を阻害することにより腫瘍浸潤が抑制されるかどうかを検証することを目的としているが、このモデルマウスの確率が達成できていない。手技上の問題に加え、手術切除標本からCD133陽性細胞を得ていること、一度に採取できるCD133陽性細胞が少ないこと、幹細胞培養の難易度が高いことから、必ずしも意図したようには必要な細胞数を得られていないことが原因と考えている。当初の目標通り悪性神経膠腫モデルマウスの確立を目指して研究を進めていきたい。

そのためにはCD133陽性細胞をこれまで以上に効率よく培養していく必要があるため、特にそれに重点をおいて工夫していきたい。当初の目標通り悪性神経膠腫モデルマウスの確率を目指して研究を進めていきたい。悪性神経膠腫モデルマウスの確立のため実験用動物・麻酔薬に450,000円を計上した。これまでに引き続き、採取した細胞群の遺伝子発現を確認するためにRNA採取、PCR用primerに100,000円を計上した。
ソーラー試験による太陽集熱水分解水素製造システムの開発

世界のサンベルト地域で太陽集熱によって水を分解して水素を製造する反応システムのプロトタイプの開発を目指し,金属酸化物(反応性セラミック)を媒体とする2段階水熱分解サイクルを用いた2つのタイプのソーラー反応器(円錐型発泡体デバイス式および粒子流動層式)の開発を行った.これらソーラー水熱分解反応器の原理で水素製造が可能であることを,3040kWth反応器のソーラー試験で立証した.両反応器の実用化の設計概念を検討した結果,流動層式反応器は1サイクル当たりの水素製造能が大きいことかMWth級システムでの実用化に,発泡体式反応器は500kWth程度の小型システムでの実用化に適していることが見出された。太陽集熱による水熱分解反応器の開発を2つの反応器コンセプトで行っている。26年度は下記の研究成果を得た。発泡体デバイス式ソーラー水分解器の開発については,1熱・物質移動解析ソフトにより円錐型と円筒型デバイスの性能比較をした結果,円錐型がより優れていることが見出された。円錐型発泡体デバイスの最適形状とこれに伴う反応器の改造について設計を行った。2既存の10kWth反応器を,円錐型発泡体デバイスによる40kWth反応器に改造した。セリア系の円錐型デバイスをスピンコート法で作製した。流動層式ソーラー水分解器の開発については3幾つかのタイプの反応器のコールドモデルを作製し,セリア粒子の流動実験を行った結果,セリア粒子の熱還元反応室(酸素製造)と水蒸気酸化反応室(水素製造)を完全に分離した反応器システムが最も有効であることが見出された。4上記の結果から,太陽集光照射による吸熱反応を行う熱還元反応器の設計を行い,これを大型サンシミュレータ及びビームダウン太陽集光システムで性能試験することとした。水蒸気酸化反応器については,発熱反応のため通常の固定相あるいは流動層反応器で十分であるので,酸素製造後の熱還元反応器に水蒸気を導入することで性能試験できる。この手法に基づき,大型サンシミュレータ用とビームダウン太陽集光システム用の両方について,反応器を設計し,作製した。27年度は下記の研究成果を得た。発泡体デバイス式ソーラー水分解器の開発については,1新たに設計した円錐型の発泡体デバイスを作製し,これを改造したソーラー水熱分解器に搭載し,韓国エネルギー研究所(KIER)所有の太陽炉を用いて,円錐型発泡体デバイス式ソーラー水熱分解器の水分解性能試験を行った。その結果,従来の平面型発泡体デバイスと比較して,非常に安定したサイクル反応性が実証できた。これはより均一な温度分布が太陽光照射時に円錐型デバイス上で実現できたためと推察された。流動層式ソーラー水分解器の開発については,23040kWth反応器システムを,新潟大学に設置したキセノンアークランプによる大型サンシミュレータと宮崎大学に設置した太陽集光システムにそれぞれ設置した。3新潟大の大型サンシミュレータでは疑似太陽集光照射によって流動層を13001700°Cまで加熱できる反応条件を見出した。4宮崎大学のビームダウン太陽集光システムでは,12月に太陽集光照射による流動層加熱試験を初めて行った。12月の比較的弱い太陽日射量でも1100°Cまで流動層を加熱できることが実証できた。27年度の交付申請書にある研究実施計画のほぼ全て実施した。太陽集熱による水熱分解反応器の開発を2つの反応器コンセプトで行った。28年度は下記の研究成果を得た。発泡体デバイス式ソーラー水分解器の開発については,1円錐型発泡体反応デバイスによる中型反応器を用いて,他金属ドープセリアを担持したデバイス(セリア担持量30wt%),及びセリア担持量を40wt%に増量すると共に焼成温度を1200°Cに高めたセリア担持デバイスを,韓国エネルギー技術研究院(KIER)の40kW太陽炉で試験した。その結果,後者によって水熱分解サイクルによる最大水素製造量を従来の2倍近くに高めることができた。また良好なサイクル反応性も確認できた。流動層式ソーラー水分解器の開発については,2まず,キセノンアークランプを用いた30kWサンシミュレータからの疑似太陽集光照射によって中型反応器を試験した。熱還元反応時にセリア粒子流動層の温度を14001500°Cまで上げることができ,1020Ndm3/サイクルの水素を水熱分解サイクルで製造することができた。即ち,粒子流動層の温度を1400°C以上に高めることができれば,本反応器コンセプトで良好に水素製造を行えることが示された。3さらに11月初旬に宮崎大学の100kWビームダウン太陽集光システムを用いてセリアを流動層粒子として大型反応器のソーラー試験を行った。太陽集光濃縮装置(CPC)を改良,かつセリア粒子の微粒子化を行うことにより,熱還元反応時の流動層温度を昨年度の1100°Cから1200°Cに高めることができた。その結果,300Ncm3/サイクルの水素製造を確認した。これにより,本システムのコンセプトによって太陽集熱で水の熱分解サイクルを行えることが初めて証明された。30kWサンシミュレータでの試験結果から示されるように,熱還元反応時の流動層温度を1400°C以上に高めることができれば水素製造量を各段に高めることができる。

世界のサンベルト地域で太陽集熱によって水を分解して水素を製造する反応システムのプロトタイプの開発を目指し,金属酸化物(反応性セラミック)を媒体とする2段階水熱分解サイクルを用いた2つのタイプのソーラー反応器(円錐型発泡体デバイス式および粒子流動層式)の開発を行った.これらソーラー水熱分解反応器の原理で水素製造が可能であることを,3040kWth反応器のソーラー試験で立証した.両反応器の実用化の設計概念を検討した結果,流動層式反応器は1サイクル当たりの水素製造能が大きいことかMWth級システムでの実用化に,発泡体式反応器は500kWth程度の小型システムでの実用化に適していることが見出された。流動層式ソーラー水分解器の開発については,次年度予定していた大型サンシミュレータ用とビームダウン太陽集光システム用の反応器の作製を,前倒しで完了した。発泡体デバイス式ソーラー水熱分解器の開発については,反応デバイスの高活性化を目指し,デバイスに担持する反応性セラミックに他金属をドープする。他金属ドープ型の小型デバイスを小型サンシミュレータで反応試験した後,高活性な反応デバイスについて大型の円錐型発泡体デバイスを作製,これを搭載したソーラー反応器を韓国エネルギー研究所(KIER)の太陽炉でソーラー反応試験する。流動層式ソーラー水熱分解器の開発については,大型サンシミュレータで反応性セラミック流動層の疑似太陽集光照射による二段階水熱分解サイクルの反応条件を詳細に検討し,反応効率を最大限に高める反応条件を見出す。また,反応性セラミック粒子を約100マイクロメートル級で球状に合成できる合成法を検討し試作する。この粒子ができれば,少ないガス流量でも十分速い流動層を得ることができ,太陽集光照射によってより高温が達成しやすくなる。さらに太陽集光濃縮装置(CPC)を改良し,流動層への集光エネルギー量の増大を目指す。最終的に宮崎大学のビームダウン太陽集光システムを用いて,設置済みのソーラー反応器を用いてサイクル反応の鍵反応である高温熱還元ステップのソーラー試験を行い,その効率を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。エネルギー化学発泡体デバイス式ソーラー水分解器の開発については,計画通り,韓国国研KIER所有の太陽炉により,円錐型発泡体デバイスによる40kWth反応器による2段階水熱分解サイクルの性能試験を行う。流動層式ソーラー水分解器の開発については,セリア粒子の熱還元反応室(酸素製造)と水蒸気酸化反応室(水素製造)を完全に分離して2段階水熱分解サイクルを行う反応器システムが最も有効であることが見出されたため,その構築を目指し,大型サンシミュレータ及びビームダウン太陽集光システムで3040kWth反応器を性能試験する。
地産地消型材料による簡易建築物の可能性に関する研究

本研究は近年話題となっているCLTに関して、住宅など小規模建築に使う方法について検討を行った。まず、薄型CLTを住宅規模建物補強に使用すること、板を自作することを目的とし、研究を開始した。板材の作成では、市販の床用接着剤と未乾燥材を使用しても作成可能であり、耐力要素となるせん断方向に使用する際には、現在市場に流通している材料と比較し、同様の性能を示すこと示した。耐力壁に使用することを想定し、耐力壁性能評価試験を実施した結果、壁倍率で2倍から7倍の壁のコントロールができることを示した。平成27年度は、当初の計画に従い、ユニットサイズの検討、パネルの製造方法の検討およびパネル性能の検証を行った。パネルサイズの検討は、岩田研究室が担当し、その成果としては、現状の国内使用では、パネルサイズを910mm1820mmとする結論を得た。これらの理由として、幅910mmのモジュールが主流であること、高さは、910mmの3倍となる2730mmとすることで板材の歩留まりが向上することが検討された。本研究では、既存住宅に対するモジュール検討だけではなく汎用性についても検討がなされた。さらに汎用性をもとめ標準化住宅を対象として割り付けモデルの検討やストック計算なども実施した。一方で、パネルの製造に関しては、CLT作成が可能な山佐木材の協力を得て通常使用されるCLTプレス機を用いた高圧プレスと学生作成ジグによる簡易プレスによる低圧条件での作成を行った。また、試験体の種類を使用するラミナの幅によって決定し、使用する板材の長さと幅の影響を検討した。試験の結果、プレス圧力については、木材のせん断破壊が接着層であった為、影響をあまり確認できなかった。一方で、板の変形性能に関しては、板材の幅と長さの影響が大きく、特に幅の影響が板材の変形性能に影響を与えることが確認された。今後の展開として、現状の1液ポリウレタン系接着剤を用い、自家製プレスを用いた接着パネルを用いる材料を工夫することにより性能をコントロールすることができる可能性が示された。当初の計画通り概ね順調に進展している。当初の計画が妥当であったとの見解である。昨年度は、600×600mmの小板での作成方法の検討を行い、その結果を考察し、本年度は900×1800mmの大板での作成を行った。また、昨年度におこなったCLT割付の検討結果をもとに耐力壁実験を実施した。一方で、当初計画のあった伊豆大島の物件は、所有者との法的な問題もあり、合意が得られず現在中止しているが、別途耐震補強への利用を検討中である。本年度の900×1800mmの大板試験体作成では、通常集成材としては使用されない、未乾燥材を使用した。昨年度までの小試験体では乾燥材を購入し、仕様していた。昨年度と変更し、未乾燥材を使用した理由は、千葉県内において、薄く乾燥した板材を購入することは難しく、本来の主題である地産地消に対する問題点であることも判明したことより、地産地消の意味で未乾燥材での制作に挑戦した。板材作成に使用したウレタン系接着剤は、木材表面の不陸やプレス圧不足を補い、十分な接着性能を担保できることが可能であるとの結論を昨年度の研究より得られたため、本年度も同様の接着剤を使用した。また、ウレタン系接着剤は湿気硬化型であることも考慮し、未乾燥材に使用することの検討もおこなった。作成に関して、試験体の制作は可能であることが示され、6人工程度あれば、1週間で30から70枚の作成が可能であるとの結論を得た。枚数の差は、主に作業台の確保と圧締作業性の観点によるものであった。作成した面材と市場流通品の耐力壁としての性能としては、自作面材と市販面材との差はほとんどなく、自作試験体の壁倍率として約2.5倍の性能を示すことがわかった。一方で、想定していたよりも鉛直力に弱く、座屈破壊の可能性が示されたため、今後検討が必要であることが判明した。板材の作成と耐力壁実験においてはほぼ予定どおりの遂行状態である。本年度は、当初計画にあった板材の物性試験を行っていないものの、耐力壁試験を実施し、その利用時の性能に関して調査が進んでいる。現段階では、すぐに利用出来る段階ではないものの、今後の進捗によっては、利用に関する検討可能であることが推察される。一方で施工に関する物件に関しては、法的な関連から現在未定となっている。このため、今後の使用に関して検討を要する。一部は予定より進んでいるが、一部は遅れている状況かいら、総合的には概ね順調に推移していると判断した。初年度からの経緯としては、初年度に板の作成に関する研究を行った。板材自作の目的は、既成品のJAS規格は、汎用材に対する製造規格のため、用途によっては過大な性能要求がある。そこで、本研究では、耐力壁としての使用に特化した性能を満たすかを判断材料とした。板材の作成においては、既存のゆか根太用の微発泡ポリウレタン系接着剤を用いることで、3層の密着を確保し、既製品の面材と引けをとらない接合部性能を示した。一方で、板材の変形を可能とし、本研究が目指す靭性を有する面材となりうる可能性を示した。

一方で、耐力壁性能では、既製品と自作品では大きな差は見られず、設計指標の策定のためには性能の安定している既製品を利用した研究が進行しやすいと判断し、3年目は既製品を用いた研究とし、最終年度として、5種類のネジを用いた耐力壁の試験とネジ接合部実験を実施した。ネジの種類を変えた実験を行う理由としては、接合部強度を変化させることで、耐力壁の性能がどのように変化するのかを確認し、最終的には耐力壁性能と接合部性能の評価を結びつけることで、同種の耐力壁を使用した際の設計のための指標となることを目指した。本研究においては、国内に100mm程度のネジが数種しか見当たらず、しかも同じ会社のものであったため、今回は海外から輸入するに至った。ネジ接合部試験の結果、接合部のせん断性能では、同様な研究として釘接合部の研究で示されているとおり、太さが初期の剛性に影響を与えることが示された。また、ネジ部長さの影響はネジ部が長いものが粘りを見せる傾向を示した。耐力壁の性能に関しても、剛性は太いネジのものが高い傾向を示したが、ネジ部長さによる粘りへの影響はあまり見られなかった。本研究は近年話題となっているCLTに関して、住宅など小規模建築に使う方法について検討を行った。まず、薄型CLTを住宅規模建物補強に使用すること、板を自作することを目的とし、研究を開始した。板材の作成では、市販の床用接着剤と未乾燥材を使用しても作成可能であり、耐力要素となるせん断方向に使用する際には、現在市場に流通している材料と比較し、同様の性能を示すこと示した。耐力壁に使用することを想定し、耐力壁性能評価試験を実施した結果、壁倍率で2倍から7倍の壁のコントロールができることを示した。28年度は実証研究の準備段階として、大型パネルの製造と実証建物の検討を行う。また、最終年度実施予定の伊豆大島確認に関して、候補となる住居を検討中であり、前倒しでの実施も検討中である。現在のところ比較的順調な計画と言える。耐力壁試験の結果、約3倍以上の壁倍率を確保できることが判明したが、鉛直力に対して座屈挙動を示し、施工上の工夫が必要なことがわかったため検討を行う。また、CLT接合金物が認定品が市場に出てきはじめたことから、これらの金物を利用した工法の検討を行う。さらに伊豆大島での実施工物件が用途変更を予定していたため、面材料の施工が困難な状況となった。以上のことから、実施工に関しては、検討し直しが必要である。一方、大規模建築物への適応の検討依頼があり、実験に関しても強度を上げた試験体の計画を実施することとした。なお、耐力試験の面材は流通品を使用し、定量的なデータ収集を行うことも検討する。木質構造
リーの球面接触構造とその力学への応用

研究代表者(佐藤)は,低い次元では,Lie変換がトウィスター理論と同一であることを発見し,一般次元で接触構造の上部構造としての,Lie接触構造を定義することができた.Lieの球面接触変換の等質多様体としての球面をモデルとしての,階数つきLie代数に付随する構造で,CR-構造との類似性をもつが,古典幾何の拡張としての特徴ももつ.この構造には,自然にCartan接続が構成され,同値問題を解くことが出来る.Lie接触構造の典型的な例として,共形多様体の単位接球束があげられる.共形多様体には古典的な共形接続が存在しているが,この場合のCartan接続は共形接続から自然な手段で構成されるものに等しいだろうという予想を,複雑な計算により示すことが出来た.したがって,この場合のLie接触構造のWeyl曲率も,共形曲率より求められることとなる.また,大和,江尻はリーマン幾何学を研究し,曲率テンソルによる局所等質空間の特徴付け,極小曲面とラプラシアンの固有関数との関係付けなどの重要な結果を得た。長井はユークリド空間内である減価型ベルマン方程式の解の存在と一意性を証明し,対応する確率制御問題に応用した。小沢は数学の量子力学への応用という分野において,精力的な研究を行い,特に物理量の同時測定に関する新しい不確定性原理の厳密な定式化と証明を与えるなど,画期的な結果を得て,理論物理学者に衝撃を与えた。これらの研究は理論物理学と数学のさらなる交流,多様体の構造あるいは低次元多様体の位相の研究等に還元されていくことが期待される.研究代表者(佐藤)は,低い次元では,Lie変換がトウィスター理論と同一であることを発見し,一般次元で接触構造の上部構造としての,Lie接触構造を定義することができた.Lieの球面接触変換の等質多様体としての球面をモデルとしての,階数つきLie代数に付随する構造で,CR-構造との類似性をもつが,古典幾何の拡張としての特徴ももつ.この構造には,自然にCartan接続が構成され,同値問題を解くことが出来る.Lie接触構造の典型的な例として,共形多様体の単位接球束があげられる.共形多様体には古典的な共形接続が存在しているが,この場合のCartan接続は共形接続から自然な手段で構成されるものに等しいだろうという予想を,複雑な計算により示すことが出来た.したがって,この場合のLie接触構造のWeyl曲率も,共形曲率より求められることとなる.また,大和,江尻はリーマン幾何学を研究し,曲率テンソルによる局所等質空間の特徴付け,極小曲面とラプラシアンの固有関数との関係付けなどの重要な結果を得た。これらの研究は理論物理学と数学のさらなる交流,多様体の構造あるいは低次元多様体の位相の研究等に還元されていくことが期待される.
量子化学計算による生物無機化学の新たな展開

量子化学計算により金属酵素の構造と反応性について研究を行った。とくに、量子力学と分子力学を組み合わせた、いわゆるQM/MM法により、チロシナーゼやB12関連酵素、ビオチンカーボキシラーゼの全原子計算を行い、これらの酵素の反応機構を解明した。さらに、人工錯体による窒素分子の活性化の機構について研究を行い、これを明らかにした。メタンモノオキシゲナーゼは、鉄2核構造を活性サイトにもつ可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)および銅を活性サイトにもつ膜結合型メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO)に分類される。これまでは取り扱いの容易なsMMOの研究が盛んに行われてきたが、最近pMMOのX線構造解析が行われ、その活性中心には銅単核、銅2核、および亜鉛単核構造が含まれることが明らかとなった。これらの構造は十分に離れて位置しており、これらのいずれかがメタンを直接酸化するものと考えられている。しかし、亜鉛は結晶化処理過程における外因性のものと考えられ、その部位にはもともと鉄あるいは銅が存在するものと考えられているが、今のところその酵素機能に関する情報はほとんど得られていない。そこで、我々はpMMOによるメタンの部分酸化能における銅単核および銅2核サイトの役割を量子化学計算により比較検討することにした。QM/MM法を用いることにより約6000原子からなるプロトマーの量子化学計算を実行し、活性中心のみならずその周辺環境の影響を考慮した理論的研究を行った。その結果、銅単核および銅2核サイトに形成されたオキソ種はメタンを水酸化するのに十分な活性能力を持つが、bis(μ-oxo)Cu_2構造をもつ銅2核錯体の形成は銅単核オキソ錯体の形成に比べてエネルギー的に有利であることが分かった。このことからメタンを活性化するサイトには銅2核構造が存在するのではないかと推測される。メタンを生理的条件下で直接酸化してメタノールに変換する金属酵素である、メタンモノオキシゲナーゼの構造と反応性について密度汎関数法および量子力学と分子力学を組み合わせた、いわゆるQM/MM法を用いた理論的研究を行った。今後は、銅2核構造の反応性について、より詳細な検討を行う。ヘムや非ヘム鉄酵素による触媒反応において生成する反応性中間体は、生物無機化学や生化学の分野で熱心に研究されている。これらの研究を通じてヘム、非ヘムの鉄オキソ中間体は様々な炭化水素の酸化反応に対して重要な役割を果たすと考えられている。本研究では、Namらとの共同研究により、非ヘム鉄錯体(TPA)Fe(ClO_4)_2を用いたオレフィンの酸化反応に関して実験とDFT計算の両面からその理論的解析を行った。アルキルペルオキソ錯体[(TPA)Fe(^III)-OOtBu]がエチレンを直接酸化する反応経路とO-O結合のラジカル的な開裂を経て生成したオキソ錯体が反応活性種となるふたつの反応経路についてそのエネルギー変化を解析した。計算の結果、反応の初期段階であるO-O結合開裂の活性化エネルギーは24.5kcal/molであり、アルキルパーオキソ種が直接反応する場合の活性化エネルギー44.Okcal/molより低いことが判明した。このため、鉄オキソ種の生成が速やかに進行するものと予想される。つづくエチレンの酸化過程では、活性化エネルギーの高い第一段階目のC-O結合の生成が律速であることが示唆された。この反応経路はP450の反応と類似しており、実験結果も考慮すると非ヘムのアルキルペルオキソ鉄錯体もまた有用な酸化剤となりうると判明した。また、アルキルペルオキソ錯体の第6配位子がO-O結合の活性化に大きく影響を与えることを明らかにした。密度汎関数計算およびQM/MM計算により、ビオチンカーボキシラーゼ、チロシナーゼ、膜結合型メタンモノオキシゲナーゼの構造と反応機構の研究を行った。特筆すべき実績として、チロシナーゼによるチロシンードーパキノン転化反応に関するものがある。杉山らにより得られたチロシナーゼのX線結晶構造をもとに大規模な計算モデルを構築し、エネルギー論的に有利な反応経路の探索研究を行った。チロシナーゼのX線結晶構造をもとに計算モデルを構築した。まず、酵素反応とは直接関係しないORFタンパクと硝酸イオンは除外した。次に、X線結晶構造には水素原子が含まれていないため、CHARMMプログラムを用いて水素の添加および構造緩和を行った。以上の方法で作成した酵素の原子数は約4300個であり、活性サイトの原子数は約100個である。酵素全体を、量子力学計算のみで計算するのは非常に困難である。そのため、量子力学計算(QM法)と分子力学計算(MM法)を組み合わせたQM/MM法の一種であるONIOM法を用いた。MM領域の分子力場としてAmber力場を用い、QM領域はB3LYP法を用いた。はじめに、チロシンからプロトン移動が起こって活性サイトに結合し、その後、O-O結合の開裂が起こるこの過程が反応の律速段階になると予想される。さらに生じたフェノキシルラジカルと架橋酸索が結合しC-O結合ができる。
口腔癌の進展範囲評価におけるMRI(磁気共鳴画像)の有用性の検討

(目的)口腔癌においては、手術療法と放射線療法が主たる治療となる。手術療法においては、切除範囲の決定に正確な腫瘍の進展範囲が必要である。また放射線療法においても、照射野を決定するうえで、正確な腫瘍の進展範囲が必要である。今日、視診、触診、超音波検査、CTが治療前の腫瘍の進展範囲の決定にもちいられているが、現時点で満足すべき診断方法はない。近年、あらたな画像診断としてMRlが登場し注目をあつめている。今回、口腔癌の進展範囲決定におけるMRIの役割を明らかにする目的にてこの研究を行った。(対象と方法)1997年から1999年まで26症例の口腔癌にMRlを施行した。舌癌7例、口腔底癌5例、頬粘膜癌5例、上顎歯肉癌3例、下顎歯肉癌6例である。MRIの撮像法はT1強調画像、T2強調画像、通常の造影MRI、脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIを施行した。(結果)造影剤を用いない撮像法では腫瘍と正常組織とのコントラストが十分つかず、正確な腫瘍の進展範囲決定には不十分であった。造影剤を用いない撮像法のなかではT2強調画像のほうがT1強調画像より明確に腫瘍の進展範囲を決定できた。通常の造影MRIは、腫瘍が正常組織と同程度に造影され造影剤を用いない撮像法のT1強調画像よりさらに腫瘍の進展範囲決定には不十分であった。もつとも、腫瘍と正常組織とのコントラストが明瞭で腫瘍の進展範囲が明確に決定できたのは、脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIであった。腫瘍は造影早期から正常組織より有意に造影された。(結論)口腔癌の進展範囲決定には脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIが最も有用である可能性が示唆された。(目的)口腔癌の治療は、手術療法と放射線療法が主たる治療である。手術においては、切除範囲の決定に、また、放射線治療においては、治療範囲の決定に腫瘍の進展範囲を治療前に決定することはもっとも重要なことである。今日まで視診、触診、超音波検査、CT等が用いられているが、いまだ正確な評価法はない。近年、新しい画像診断として、MRIが登場し、注目をあつめている。われわれは、口腔癌におけるMRIの有用性の検討をおこなうため今回の研究をおこなっている。まずはじめに、MRIのどの撮像法がもっとも口腔癌と正常組織を明瞭に区別するかを決定することから開始した。(対象と方法)口腔癌15症例にたいしてMRIの撮影をおこなった。症例は、舌癌3例、口腔底癌4例、頬粘膜癌4例、下顎歯肉癌3例、上顎歯肉癌2例であった。撮像法としては、T1強調画像、T2強調画像、通常の造影MRI、脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIをもちいた。(結果)T1強調画像、T2強調画像、通常の造営MRIでは、腫瘍と正常組織との境界は不明瞭であり、腫瘍の進展範囲を決定するには、不適当であった。もっとも腫瘍と正常組織を明瞭に区別しえたのは、脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIであった。腫瘍は造影早期から正常組織より有意に造影され明瞭に腫瘍と正常組織が区別された。時間が経過するにつれて、正常組織も造影され、境界が不明瞭になっていった。(結論)脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIの造影早期像がもっとも腫瘍と正常組織を区別しうると思われた。(今後の研究の展開)脂肪抑制をおこなったダイナミックMRIの造影早期像で造影された腫瘍が切除された腫瘍と一致しているか病理標本と対比していきたい。また症例数を増やしてさらに検討していく予定である。
離散時間カオスニューラルネットワークの非線形特性を有効利用した高速画像領域分割法

画像領域分割は,医用画像診断システムなどの根幹を成す画像処理手法の一つである。研究代表者らは,離散時間カオスニューラルネットワークとよばれるシステムを提案しており,そのシステムの非線形特性を有効利用した高速画像領域分割システムについて研究した。まず,システムの特性を解析し,画像領域分割にとって適切なシステムパラメータ値を詳細に研究した。次に,カオスニューラルネットワークが画像領域分割システムとして正常に動作することを例証した。更に,提案システムを汎用ディジタルLSIへ実装した。画像領域分割は,画像計測・診断システムなどの根幹を成す画像処理手法の一つである。研究代表者らは,カオス・ニューロンと大域的抑制性素子から成るカオス・ニューロン結合系を提案している。本モデルの並列処理性と離散時間ダイナミクスを有効利用し,高速な動的画像領域分割システムを開発することが本研究の目的である。ここで,動的画像領域分割とは,静止画像における孤立領域の分割と同時に分割画像を時系列に表示する機能を指す。本モデルは離散時間力学系であるにも関わらず,適切なパラメータ値において,連続時間力学系で見られるような振動応答がカオス・ニューロン内部に生じる。動的画像領域分割はその振動応答に基づいて達成され,その成否は振動応答の種類に左右される。そこで,本モデルに生じる振動応答の種類と,それらが存在するパラメータ領域を分岐理論に基づいて解析した。なお,問題の簡単化のため, 2個又は3値のカオス・ニューロンから成る縮約モデルを解析対象とした。これらは, 2個又は3個の孤立領域を持つ静止画像に対する動的画像領域分割システムに相当する。解析の結果, 2個結合系では同相及び非同相の振動応答が観測され, 3個結合系では完全同相,部分同相,及び三相の振動応答が観測された。また,各々の存在パラメータ領域が特定され,非同相振動応答又は三相振動応答が発生するようにパラメータ値を設計することで,カオス・ニューロン結合系が動的画像領域分割システムとして正常に動作することを示した。しかしながら,そのパラメータ領域では非振動応答(安定固定点)も共存することが判明した。つまり,パラメータ値を適切に設定したとしても,カオス・ニューロン結合系に与える初期値に依存して非振動応答が発生し,動的画像領域分割システムとして機能しない可能性がある。そこで,非線形制御理論に基づいて,安定固定点の不安定化制御系を設計し,その効果も検証した。画像領域分割は,画像計測や医用画像診断システムなどの根幹を成す画像処理手法の一つである。研究代表者らは,振動応答を生成できるカオス・ニューロン及び大域的抑制性素子で構成されるカオスニューラルネットワークを提案している。提案モデルの非線形特性と並列処理性を有効利用して,高速な動的画像領域分割システムを開発することが本研究の目的である。平成21年度においては,まず,4個のカオス・ニューロンから成る縮約モデルに見られる振動応答とその分岐現象を解析した。その結果,4相振動応答が観測されるパラメータ領域が明らかになったとともに,平成20年度における解析結果と照合することにより,そのパラメータ領域において他の振動応答が共存していることも明らかにした。そのようなパラメータ値において,定常状態で観測される振動応答は初期値に依存する。そこで,初期値平面における振動応答の引力圏を解析し,それぞれの振動応答が生成されるための初期値領域を明らかにした。これらの解析結果は,動的画像領域分割システムにとって適切なパラメータ値と初期値を決定するために有益な情報となる。一方,提案システムを汎用ディジタルLSIの一つであるField Programmable Gate Array (FPGA)へ実装することも検討した。FPGA実装に際し,状態変数値及びシステムパラメータ値を固定小数点形式で符号化し,更にシステムに含まれる非線形関数を区分線形関数で近似した。種々の実験を通して,FPGA実装したシステムから,動的画像領域分割に適した振動応答が生成されることを実証した。これは,動的画像領域分割システムが,FPGA搭載のモバイル機器等へ実装可能であることを示唆しており,本システムの実用化に際して貴重な情報となる。これら研究成果の一部を国際ジャーナルや国際会議等で発表した。
凍結保存胚を用いたトランスジェニックマウス作出に関する研究

胚の凍結を行なう際、凍結保護の目的としてDMSOが添加される。これは細胞膜に小孔を開け細胞内自由水を浸透圧差により排出し、凍結時の氷結を防ぐためである。DMSO濃度は細胞の表面積と密接に関係し、場合によっては強い細胞毒性を示す結果となるため濃度設定は厳密に行なう必要がある。通常2細胞期胚の緩慢凍結の際は、最終濃度1MでDMSOが用いられている。今回はDMSOの最終濃度1Mと1.5Mで緩慢凍結を行ない、融解時の細胞の生存率と胚の発生を指標として前核期卵の凍結保護としてのDMSO濃度の設定を行なった。ホルモンでの誘起排卵後自然交配によって得たC57BL/6および(C57BL/6xDBA2)F1の受精卵を用いて上記DMSO濃度での前核期卵の緩慢凍結を行なった。この結果、融解後の卵の状態は1.5MDMSO濃度の方が良好であった。これより前核期卵の凍結操作では2細胞期胚でのDMSO濃度より若干高めがよいことが示唆された。我々の実験系では通常の前核期卵を用いたDNAインジェクションでの卵の生存率は供試卵総数を100とした場合7585%で安定している。この90%以上が2細胞期に発育する。本実験の目的はこの時用いる操作卵に凍結融解前核期卵を用いる有用性の検討であり、以下の比較検討を行い現在も継続中である。実験にはC57BL/6および(C57BL/6xDBA2)F1 CB-17-scidの受精卵を用いた。また幼若マウスの誘起排卵を行なったが、幼若マウスのホルモン投与のタイムスケジュールは極めて厳密であり今回は有効な受精卵を得ることができなかった。また、DMSO1.5Mでの凍結は前核期卵に有効であると思われるが、融解時のDMSO希釈操作が卵の生存性に影響を及ぼす結果が得られた。1.5MDMSOの凍結培地を用いた場合、融解操作の違いによって卵の生存率にばらつきが見られた。生存率のレンジは10%60%であり、それらの80%が2細胞期に移行した。2細胞期胚は偽妊娠♀レシピエント卵管に移植した。着床に関しては現在確認中である。
低温シグナル伝達因子ICE1の調節及びカルシウムチャネルによる低温感覚機構

低温シグナルにおいてMYC型転写因子ICE1は既知の最上位に位置する転写因子である。本研究ではICE1の調節機構を明らかにするため、低温刺激によって放出されるカルシウムをどのように認識してICE1を活性化するか、ICE1の活性化にはどのような因子が関わっているかを明らかにする目的で研究を行った。これまでの研究からICE1はカルモジュリン様タンパク質(CML)と相互作用することが明らかになっているので、この因子の解析を行った。カルシウムの認識に関して、シロイヌナズナに50種類あるCMLの中で、CML10及びCML12が低温依存的に相互作用が強まることが明らかとなった。また、ICE1内にカルモジュリン認識配列を調べたところ、1か所存在し、変異を導入したICE1(4RE)を用いたところ、CML10とは相互作用が見られたが、CML12では相互作用が見られなかった。このことから、ICE1はカルモジュリン認識配列付近でCMLと相互作用していることが示唆された。cml12変異体では低温感受性が見られなかったが、CML10, 12をノックダウンするRNAi体では低温感受性が見られたことから、CML10, 12ともに必要であることが明らかとなった。CML10とCML12は隣同士であるため、掛け合わせによる二重変異体の作出は無理である。そこで、CML10を認識するguideRNAをもち、CRISPR/Cas9を植物体内で発現させるためのバイナリーベクターを構築した。この遺伝子をcml12に導入して、二重変異体の作出を行っている。カルシウムの流入に関わると考えていたMCAに関して、再度発現解析を行ったが、mca1 mca2二重変異体ではDREB1や低温誘導性遺伝子の発現に変化が見られなかった。ただし、低温感受性を示したことから、MCAがDREB1経路の制御に関わっていないことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物が低温ストレスを感知した際にカルシウムが放出されるが、このカルシウムの認識に関して全く分かっていなかった。これまでの研究から低温シグナル転写因子ICE1とカルモジュリン様タンパク質CMLが相互作用することが明らかになっていたが、この相互作用がカルシウム依存的、低温依存的に強まることが本年度明らかとなった。また、CMLは植物ゲノム中に50種類あるが、特異性を調べる目的でICE1との相互作用、発現場所、及び低温依存的にICE1との相互作用が強まるかを指標に分類したところ、2つのCMLがICE1との相互作用が低温依存的に強まった。このことから、低温ストレスによって放出されるカルシウムの認識にはこの2つのCMLが関与している可能性が示唆された。カルシウムの放出に関わると考えられる細胞膜局在型カルシウムチャネルMCAが低温シグナルや低温応答性遺伝子発現の調節に関わっているかを調べた。mca変異体では低温に応答して放出されるカルシウム量が減少していたが、低温誘導性遺伝子の発現は逆に上昇していた。これはmca変異体による影響により、補償的に上昇したものと考えられる。このため、MCAからのシグナルはICE1を介した低温シグナルとは違うシグナルに伝わると考えられる。このシグナルに関しては未だ明らかにできていない。来年度の課題である。ICE1の活性化としてリン酸化が関わることが示唆された。このリン酸化のキナーゼとしてICE1と相互作用するMAPキナーゼが候補として考えられる。In vitroのリン酸化反応により、MAPキナーゼによるICE1のリン酸化が確認できた。このことから、MAPキナーゼによるリン酸化を介したICE1の活性化が考えられる。

26年度が最終年度であるため、記入しない。カルモジュリン様タンパク質によるカルシウム認識とそれをICE1依存的低温シグナル伝達機構につなげる部分を明らかに出来ている。また、50種類あるCMLから特異性を見出している。実際に植物においてこれらの2つのCMLの特異性明らかにする必要があると考えられる。リン酸化に関してはMAPキナーゼとICE1がつながることで、ICE1の活性化に関わっていることが示唆された。ICE1のリン酸化部位を特定できれば良いが、ICE1は51のセリン残基を13のスレオニン残基をもつことから、その特定はかなり難しい可能性が挙げられる。植物細胞分子生物学会、2014年度奨励賞受賞カルモジュリン様タンパク質に関しては2つのCMLの特異性を植物において明らかにするため、二重変異体の作製を行う。但し、この2つは隣合った遺伝子で、掛け合わせによる二重変異体の取得はほぼ不可能である。そこで、CRISPR/CAS9によるゲノム編集技術を用いることで、片方の変異体に変異を導入して、二重変異体の作出を目指す。カルシウムチャネルMCAに関しては、葉緑体への影響を考慮して研究を進める。葉緑体は低温ストレス応答においても重要な位置を占めると考えられるが、その詳細なメカニズムはほとんど分かっていない。藻類の研究でPTOXの活性と低温ストレス耐性にある程度の相関があることが示唆されている。また我々はPTOXプロモーターにレポーター遺伝子を融合させたコンストラクトをもつ植物体を作出している。このPTOXの活性を指標に低温シグナル伝達機構との結びつきを調べる。リン酸化に関してはMAPキナーゼ変異体を用いたDNAアレイを行い、ICE1とMAPキナーゼが同じような転写制御を受けるかを明らかにする。またMAPキナーゼ変異体におけるICE1のリン酸化の有無を明らかにすることで、in vitro, in vivo両面から、ICE1のMAPキナーゼによるリン酸化を明らかに出来るものと考える。
磁気多極型イオン源における負イオン生成過程に関する研究

核融合実験装置が大型化し,加熱用中性粒子ビームにより高いエネルギーが必要になるにつれ,負イオン加速によるNBI装置が求められるようになった.本研究は,磁気多極型イオン源内の電子温度分布を制御し,負イオンの生成に最適な条件を見出すことを目的として行われた.負イオンを生成するためには,引出し面付近の電子温度を下げることが肝要である.このためフィルター磁場を引き出し面付近に加えるが,密度も同時に低下してしまうのが欠点である.本実験では,フィラメントの位置調整により,壁面の磁場に一次電子をトラップすることをねらった.この結果,電子密度の低下なしに,引き出し面での電子温度を大幅に低下させる事ができた.更に,負イオン引出口近傍の電子温度を変化させ生成過程を制御するため,スーパーカスプ磁場によるフィルターに加え,コイル型の磁気フィルターを挿入した.フィルター電流を変えて行くと,あるところで負イオン電流が最大になることが分かった.すなわち,電子温度の制御により,負イオンの生成過程が制御できることがわかった.最後に,フィラメント材,および希ガス混合の効果を調べた.フィラメント材料にTaを用いた場合に,低ガス圧でWフィラメントと比べ負イオン引き出し電流に数割の上昇が見られた.また,Arガスを混合したときには,混合割合が10%以下と少量であったにも係らず,電子密度の著しい増加が見られた.ただし,電子温度も同時に上昇してしまったために,負イオンの引き出し量は逆に減少してしまった.これらの実験を行うと同時に,静電プローブにより電子のエネルギー分布関数を測定する手法の開発をおこない,放電電子によると思われる高エネルギーの成分を観測することが出来た.これにより,従来計算機シミュレーションでしか得られなかった一次電子の分布を実際に確認する目処が立った.核融合実験装置が大型化し,加熱用中性粒子ビームにより高いエネルギーが必要になるにつれ,負イオン加速によるNBI装置が求められるようになった.本研究は,磁気多極型イオン源内の電子温度分布を制御し,負イオンの生成に最適な条件を見出すことを目的として行われた.負イオンを生成するためには,引出し面付近の電子温度を下げることが肝要である.このためフィルター磁場を引き出し面付近に加えるが,密度も同時に低下してしまうのが欠点である.本実験では,フィラメントの位置調整により,壁面の磁場に一次電子をトラップすることをねらった.この結果,電子密度の低下なしに,引き出し面での電子温度を大幅に低下させる事ができた.更に,負イオン引出口近傍の電子温度を変化させ生成過程を制御するため,スーパーカスプ磁場によるフィルターに加え,コイル型の磁気フィルターを挿入した.フィルター電流を変えて行くと,あるところで負イオン電流が最大になることが分かった.すなわち,電子温度の制御により,負イオンの生成過程が制御できることがわかった.最後に,フィラメント材,および希ガス混合の効果を調べた.フィラメント材料にTaを用いた場合に,低ガス圧でWフィラメントと比べ負イオン引き出し電流に数割の上昇が見られた.また,Arガスを混合したときには,混合割合が10%以下と少量であったにも係らず,電子密度の著しい増加が見られた.ただし,電子温度も同時に上昇してしまったために,負イオンの引き出し量は逆に減少してしまった.これらの実験を行うと同時に,静電プローブにより電子のエネルギー分布関数を測定する手法の開発をおこない,放電電子によると思われる高エネルギーの成分を観測することが出来た.これにより,従来計算機シミュレーションでしか得られなかった一次電子の分布を実際に確認する目処が立った.核融合プラズマを加熱するために中性粒子ビーム入射(NBI)が用いられるが、装置が大型化し高いビームエネルギーが求められるようになるにつれ、中性化効率の観点から負イオン加速によるNBI装置が求められている。水素負イオンを安定して引き出すために、磁気多極型イオン源を用いた体積生成の実験を行い以下の結果を得た。1.負イオンを生成するためには、引出し面付近の電子温度を下げることが肝要である。このためスーパーカスプ磁場配位などが考え出されたが、密度も同時に低下してしまうのが欠点であった。このため本実験では、密度の低下を起こさないよう通常の磁場配位とし、壁面の磁場による一次電子のトラップを利用し、イオン源内の電子温度を低下することをねらった。フィラメントから放出された一次電子の一部は壁面の磁場に巻きつきながら、壁面に沿って運動し、イオン源中心部には出て行かない。この壁面にトラップされる電子の割合を増やすため、フィラメントを通常より壁に近づけて放電を行った。この結果、引き出し面での電子温度を大幅に低下させる事ができた。計算機による一次電子の軌道計算を行ったところ、放出点が壁に近いほど壁磁場にトラップされやすいことがわかり、実験結果と一致した。本実験の方法で密度の低下を押さえつつ、電子温度を下げられることが確認できたが、ビームとして引き出してみると電子の割合が多く、これを改善することが今後の課題である。2.引き出し電極前面にコィル型の磁気フィルターを挿入することで、負イオンの生成をコントロールすることができる。しかし、磁気フィルターによるプラズマの損失が大きく、密度を低下させてしまうのが欠点であった。この点を改善するために、磁気フィルターを静電的にバイアスする実験を行った。この結果、磁気フィルターをアークチャンバーに対して負にバイアスしたときに大きな改善が見られた。逆に正にバイアスすると、プラズマ密度が大きく低下した。

電子の熱速度はイオンに比べて大きいため、電子の損失率のほうが高く、これを押さえることがプラズマ生成に有効であることがわかった。本研究は、磁気多極型イオン源内の電子温度分布を制御し、負イオンの生成に最適な条件を見出すことを目的としている。これまでの研究から、イオン源壁の磁場を一次電子の捕捉に利用することで、密度を低下させること無く引き出し面近傍の電子温度を低下させられることが分かっている。また、このようなプラズマに更に磁気フィルターを追加することも、負イオンの引き出しに効果的であることが確かめられている。水素負イオンは水素の振動励起分子を経て生成されるが、本年度はフィラメント材料にTaを用い振動励起分子の増加を狙った実験を行った。フィラメント材はアーク放電によって徐々に蒸発し、イオン源壁面をコーティングするが、その触媒作用によって振動励起分子が増加すると考えられる。実験の結果、動作ガス圧が高い状態では一次電子との衝突による振動励起分子の生成が主であり、Taにしたことによる効果は見られなかったが、低ガス圧ではWフィラメントと比べ負イオン引き出し電流に数割の上昇が見られた。核融合NBIのイオン源としては動作ガス圧が低いほうが良く、これは望ましい結果といえる。ただし、Taフィラメントは温度上昇により変形しやすく、大電流動作が難しいことが欠点であり、今後の改善が望まれる。振動励起分子を増加させる他に、低エネルギーの電子を多量に供給することも負イオンの生成に効果がある。核融合用NBI装置ではCsの添加が用いられるが、それよりはずっと取り扱いの容易なArガスを用いて実験を行った。Arの混合割合は10%以下と少量で有ったにも係らず、電子密度の著しい増加が見られた。しかし、電子温度も同時に上昇してしまうために、負イオンの引き出し量は逆に減少することが分かった。ただし、引き出し電極を静電的に正にバイアスした時には、負イオン電流の増加が見られ、条件によってはAr添加が効果的であるといえる。平成13、14年度の研究から、引き出し電極近傍の電子温度を制御することが重要であることが結論できるが、この目的には、引き出し電極に電流を流し磁気フィルターとして利用するのが理にかなっている(PGフィルター)。磁場可変のコイル型磁気フィルターを用いて実験を行った結果から、必要な磁場は電極前面で100G程度であり、この結果を用いてPGフィルターを設計した。また、静電プローブにより電子のエネルギー分布関数を測定する手法を開発し、計算機シミュレーションでしか得られなかった一次電子の分布を実際に確認する目処が立った。本研究で得られた成果は、負イオン源の設計・開発の有用な指針と成り得る。
造精機能障害におけるＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ　２（ＣＯＸ２）の制御機構の解明

本研究では、COX-2が造精機能障害に果たす役割を解明するために、これまでに私たちが作成した実験的停留精巣モデル動物を用い、COX-2が造精機能に与える影響について検討した。停留精巣ではアポトーシスの発現が亢進して造成機能障害が認められた。また、COX-2は精巣内で強く発現していた。COX-2阻害剤を投与すると、アポトーシスがさらに亢進して造精機能障害も増強していた。これらの結果からは精巣内のCOX-2は組織の障害時に誘導され、細胞をアポトーシスから保護する役割を持つと推定された。前年度までに作成したCOXー2誘導モデルマウスを用いて、造精機能障害の原因について解析を進めた。TUNEL染色により精巣組織におけるアポトーシス細胞を検出したところ、主にパキテン期の精母細胞においてアポトーシスが誘導されていた。精細胞のアポトーシスの評価にはアポトーシス・インデックス(すべての精細管の中でTUNEL陽性細胞を含む精細管の割合を%で表す)を用いたが、COXー2inhibitor投与群においてアポトーシス細胞の有意な増加を認めた。これらの変化は経時的に増強されており、造精機能障害の程度と相関関係が認められた。続いてCOX inhibitorが本実験モデルにおいてテストステロン産生に及ぼす影響を検討したところ、明らかに有意な差は認められないが、COXー2inhibitor投与群においてテストステロンの低値が認められた。このテストステロン産生の低下がCOXー2誘導の結果としてのLeidig細胞の機能低下によるものかどうかは不明である。他の性ホルモン(LH, FSH, PRL)の変化についても解析中であるが、現時点では有意な結果は得られていない。COXinhibitor投与によるマウスの性行動への影響につき、発情させた雌マウスとそれぞれの実験グループの雄マウスを用いて、解析を行った。交尾回数を含む性行動の各項目において、COXー2inhibitor投与群では回数の有意な現象が認められた。脳内でのプロスタグランジン作用の低下がこのような結果を招いた可能性が推測される。本年度は、まず実験動物としてCOX-2誘導モデルマウスを作製した。COX2は正常精巣組織には発現していないため、実験的に造精機能障害を来たしたものをCOX2誘導モデルとした。具体的には、5週齢ICR雄マウスを麻酔下に腹部正中切開を加え、左精巣を体外にいったん脱転させたのちに腹腔内に非吸収糸で固定する。右精巣には処置を加えない。コントロールとしては、シャムオペレーションを施したものを用意した。これらのモデルマウスを一定期間(1, 2, 5週)の後に頚椎脱臼により安楽死させて、各臓器(精巣・精巣上体・陰茎・前立腺)と血液を採取した。H-E染色により、各臓器の組織像を観察し、精巣においてはJohnsen's scoreを利用して造精機能障害の評価を行ったところ、モデルマウスの精巣では精細管径の縮小や細胞数の減少がみられ、有意な造精機能障害が認められた。TUNEL染色によりアポトーシス細胞の検出を試みたところ、モデルマウスの精巣内では、精細胞のアポトーシスが著しく亢進していた。免疫組織化学染色法により、COX-1およびCOX-2の発現を検討したところ、COX-2はモデルマウスの精巣に強く発現していたがコントロールではほとんど発現がみられなかった。COX-1は両者でごく弱い発現を認めるのみで優位な違いはなかった。この結果からは、造精機能障害の強さに一致してCOX-2の発現がみられることが確認された。したがって、当初の予定通りにCOX-2誘導モデルマウスを確立することができたと考えられる。実験的停留精巣の患側において、造精機能の低下とともにCOX-2の発現が経時的に増強していた。RT-PCRにより患側でのCOX-2mRNAの発現は健側の約4倍に増加していることが確認された。COXー2インヒビター投与群において、造精機能を表すジョンセンスコアは更に低下が見られ、アポトーシス陽性細胞の増加が認められた。したがって停留精巣においてCOX-2が強く誘導されるが、インヒビター投与によって造精機能障害が増強される結果となった。このことから、誘導されたCOX-2はアポトーシスを抑制することで精細胞を傷害から保護する役割があることが推定された。アポトーシス関連遺伝子の発現について、精巣組織から抽出したmRNAを用いてRT-PCRを施行した。PPARγ、NFκB、p53、Baxといったアポトーシスを制御するとされる転写因子群の発現を解析したが一定の傾向は認められなかった。