hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血中がん細胞を無染色識別する「イメージング・バイオマーカー」解析技術の開発

初年度に引き続き要素技術の開発を推進した。「細胞塊」をマイクロ流路系で用いる場合1細胞から巨大な細胞塊までのサイズの異なるターゲットを同時に流す事ができる流路系を用いるため、被写界深度の幅を増大させて像ぼけが起きにくい観察光学系を構築する必要があるが、ズームレンズ系と開口数の小さな対物レンズに画像処理技術を組み合わせることで必要な細胞集団の形状、細胞核の形状を同定することができるアナログ+デジタル画像処理技術を最適化することに成功した。次に、明視野像と蛍光像を同時に取得し、これをカメラの1つの受光素子で同時取得・解析するため、すでに開発・設計してきた複数の単色光明視野同時取得/比較計測技術に、新たにFPGA技術と高速デジタルカメラを組み合わせ毎秒5000個以上の細胞を実時間判別する技術の原理検討を進めた。FPGA技術には市販のNI社FPGAを組み込みフィードバック制御で細胞の流路中での流速を実時間で検出することを可能にした。さらに細胞の分離精製技術として、アルギン酸によって細胞を包むことによって細胞ごとに異なる細胞電荷に関係なく、表面のアルギン酸カプセルの電荷で安定に細胞を分取する技術の原理検討に成功した(特許出願手続き中)。またハードウエア技術の開発に並行して「細胞塊」「核状態」などの画像高速同定アルゴリズムの開発を推進し、転移がんモデル動物の血液試料を用いて「3細胞以上のクラスター」を輪郭あるいは内部の核の分布、形状などから総合的に解明、判断する技術を開発した。明視野像で得られる細胞の輪郭を画面全体で判別するのではなく、局所ごとにしきい値設定を重ね合わせて正確な「細胞(塊)」の形状を数値化する新規のアルゴリズムであり(特許出願手続き中)、従来の手法では比較解析できなかった細胞クラスター数の転移がん移植後の増加傾向や多核細胞の増加などを詳細に報告する論文の報告ができた。2年前に東京医科歯科大学から早稲田大学に転出し研究室立ち上げとあわせて研究テーマ立ち上げを行ったため、装置類のセットアップなどに時間がかかってしまったが、2018年3月(2017年度末)には、研究室内にクリーンルームも立ち上げあることができ、チップ開発を含めたマイクロ加工技術も含めた装置システムの全体的な開発が開始できるようになった。また、動物実験施設の許可も受け、今まで血中の転移がんの状態の日変化をトレースした論文はなかったが、2018年度に初めてこれを論文として公開することができた。また、装置開発も順調に進んでおり、特許出願を進めることができた。これによって2018年度は「(1)計画以上に進展している」と判断させていただいた。これまでの試作成果を踏まえ、「細胞塊」をより効率的に分析するため、新たに、粒径の違いによって連続して自動的に選別するプレ選別機構を持った微細流路を前処理として付加して、細胞塊のみに特化した計測をする計測系に改善する。この細胞塊のみが流れてくる状況での被写界深度の幅を増大させて像ぼけが起きにくい観察光学系を構築し、ズームレンズ系と開口数の小さな対物レンズ、そして画像処理技術を最適化して細胞集団の形状、細胞核の形状を同定できるアナログ+デジタル画像処理技術を完成させる。また高い時間処理能力を持った細胞形状識別技術の開発として、特に蛍光光源の入射法を工夫して、今年度成功したFPGA技術と高速デジタルカメラを組み合わせた明視野像と蛍光像の1受光素子で同時取得・解析技術の改良開発を行う。さらに細胞の分離精製技術として、アルギン酸カプセルに細胞を含ませて、アルギン酸カプセルの持つ安定した表面電荷を利用して微弱外部静電場のスイッチングで効果的に分離する技術を実用レベルまで改良する。上記、ハードウエア技術の開発に並行して、システムのソフトウエア技術開発である「細胞塊」「核状態」などの高速同定アルゴリズム(「イメージング・バイオマーカー」抽出技術)の開発をアルギン酸カプセル中の細胞判別技術に発展させて推進する。アルギン酸カプセル中の明視野像で得られる細胞の輪郭は、水中と同様に、その輝度に分布があるため既存の自動しきい値による切り出しを行うと周囲形状が欠損する可能性があるため、今年度開発に成功した局所でのしきい値設定を重ね合わせて、正確な「細胞(塊)」の形状の数値化する新規のアルゴリズムを最適化する。また、核の空間分布から、分裂細胞の核形状であるのか、多核細胞であるのか、細胞集団であるのかを識別するアルゴリズムの開発なども引き続き推進する。(1)マルチイメージング・セルソーター装置技術の開発:初年度は、3つの要素技術の開発を並行して推進した。まず、イメージングセルソーターで高速に細胞を分離するための最大の課題である、微弱電場で分離できる技術の検討、すなわち計画書での課題3「細胞の分離精製技術の改良」を進めた。当初は、従来の水中での細胞表面の持つ微弱な負の電荷を利用する従来の手法から、シリコン油が流れるマイクロ流路中に、細胞を含んだ荷電水滴を流して、これを微弱外部静電場のスイッチングで効果的に分離する流路チップ系の開発を進めたがオイルを組み合わせることの細胞系への影響の可能性から、アルギン酸で細胞を包んで細胞入りアルギン酸微粒子の分離技術の開発を試みた。ここでは、アルギン酸自体が、水中で強い電荷を持っているため、容易に微弱な電場で分離できることを確認した。また、アルギン酸をゲル化する際に用いる二価イオンをCaからBaにゲルの状態を保ちながら置換する技術の開発にも成功した。

これによってEDTAやEGTAなど、二価イオンのキレート能力がイオン種によってことなるキレート剤を組み合わせることで、選択的にアルギン酸ゲル微粒子を溶解させることが可能となった。この結果を踏まえて、実際に細胞が内容されたアルギン酸微粒子について課題1ズームレンズ系と開口数の小さな対物レンズ、そして画像処理技術を組み合わせることで必要な細胞集団の形状、細胞核の形状を同定することができるアナログ+デジタル画像処理技術を最適化する技術の改良と、2高い時間処理能力を持った細胞形状識別技術の開発として、明視野像と蛍光像を同時に取得し、これをカメラの1つの受光素子で同時取得・解析する技術の開発を行い、ともに識別・利用可能であることを確認した。昨年度、東京医科歯科大学から早稲田大学に転出し、新たに昨年度より研究室立ち上げとあわせて研究テーマ立ち上げを行ったため、装置類のセットアップなどに時間がかかってしまったが、2018年3月(2017年度末)には、研究室内にクリーンルームも立ち上げあることができ、これからチップ開発を含めたマイクロ加工技術も含めた全体的な開発が開始できる。したがって2017年度は「(2)おおむね順調に進展している。」とした。先に述べたとおり、2017年度末には整備も進んだため、これによって2018粘度は「(1)計画以上に進展している」にしたいと考えている。初年度に引き続き要素技術の開発を推進した。「細胞塊」をマイクロ流路系で用いる場合1細胞から巨大な細胞塊までのサイズの異なるターゲットを同時に流す事ができる流路系を用いるため、被写界深度の幅を増大させて像ぼけが起きにくい観察光学系を構築する必要があるが、ズームレンズ系と開口数の小さな対物レンズに画像処理技術を組み合わせることで必要な細胞集団の形状、細胞核の形状を同定することができるアナログ+デジタル画像処理技術を最適化することに成功した。次に、明視野像と蛍光像を同時に取得し、これをカメラの1つの受光素子で同時取得・解析するため、すでに開発・設計してきた複数の単色光明視野同時取得/比較計測技術に、新たにFPGA技術と高速デジタルカメラを組み合わせ毎秒5000個以上の細胞を実時間判別する技術の原理検討を進めた。FPGA技術には市販のNI社FPGAを組み込みフィードバック制御で細胞の流路中での流速を実時間で検出することを可能にした。さらに細胞の分離精製技術として、アルギン酸によって細胞を包むことによって細胞ごとに異なる細胞電荷に関係なく、表面のアルギン酸カプセルの電荷で安定に細胞を分取する技術の原理検討に成功した(特許出願手続き中)。またハードウエア技術の開発に並行して「細胞塊」「核状態」などの画像高速同定アルゴリズムの開発を推進し、転移がんモデル動物の血液試料を用いて「3細胞以上のクラスター」を輪郭あるいは内部の核の分布、形状などから総合的に解明、判断する技術を開発した。明視野像で得られる細胞の輪郭を画面全体で判別するのではなく、局所ごとにしきい値設定を重ね合わせて正確な「細胞(塊)」の形状を数値化する新規のアルゴリズムであり(特許出願手続き中)、従来の手法では比較解析できなかった細胞クラスター数の転移がん移植後の増加傾向や多核細胞の増加などを詳細に報告する論文の報告ができた。
環境変化に応答してRho1GTPaseがシグナルアウトプットを変化させる仕組み

Rho GTPaseは真核生物に広く保存された細胞増殖、細胞運動、ストレス応答の制御因子であり、その活性調節異常はがんや携帯形成の異常、精神疾患の原因となることが知られている。Rho GTPaseはGTPと結合することによって活性化し何種類もの下流の標的タンパク質を活性化する。しかし細胞内外からの刺激により活性化したRhoは多種類の標的分子を全て均等に活性化するのではなく、刺激(入力シグナル)の種類に応じて特定の標的(出力シグナル)のみを選択的に活性化する。入力シグナルはRhoを活性化すると同時に出力シグナル経路を規定していると予想されるがその分子機構はよくわかっていない。我々は最近タンパク質脱リン酸化酵素PP2A-Cdc55が出芽酵母Rho1の出力シグナルを制御していることを明らかにした。しかし様々な入力シグナルがどのようにPP2A-Cdc55を制御するのかおよびPP2A-Cdc55がどのような分子機構でRho1シグナル伝達系の出力シグナルを制御するのかは未だに明らかではない。本研究では出芽酵母Rho1シグナル伝達系をモデルとし、PP2A-Cdc55を含む多様なRho1制御因子群がどのようにしてシグナルの特異性を制御しているのか遺伝学、生化学、細胞生物学を組み合わせた多方面からのアプローチで解析する。最終的な目標はRhoシグナル伝達機構の特異性が生まれる分子基盤を解明することでRhoの制御異常に伴う疾患の治療法への手がかりをつかむことにある。さらにPP2A-Cdc55がどのような分子機構でRho1シグナル伝達系の出力シグナルを制御するのかを解析する過程でRho1のGAPであるLrg1とSac7がPP2A-Cdc55に活性調節を受けていることを明らかにした。さらに我々はLrg1自体はPP2A-Cdc55の直接の基質ではなかったもののLrg1の調節因子であるPxl1がPP2A-Cdc55に脱リン酸化されること、Sac7の脱リン酸化はSac7をプロテアソーム依存的な分解から防ぎ安定化させることを明らかにした。PP2A-Cdc55がRho1のGAPであるLrg1とSac7を脱リン酸化により制御していることがほぼ明らかになってきた。これからin vivoでもPP2A-Cdc55がRho1 GAPを脱リン酸化していることを証明しできるだけ早く論文として発表することも目標にしている。最終的な目標はRhoシグナル伝達機構の特異性が生まれる分子メカニズムの包括的な解明である。我々は最近タンパク質脱リン酸化酵素PP2A-Cdc55がRho1の出力シグナルを制御していることを明らかにした(Jonasson et al., JCB 2016)。さらに遺伝学的な解析からPP2A-Cdc55がRho1のGAP (GTPase-activating protein)であるLrg1とSac7の活性を調節していることを明らかにした。PP2A-Cdc55がタンパク質脱リン酸化酵素であることからRho1, Lrg1, Sac7の各々がリン酸化によって制御されている可能性を考え、現在生化学解析により仮説を検証中である。

本研究では出芽酵母Rho1シグナル伝達系をモデルとし、PP2A-Cdc55を含む多様なRho1制御因子群がどのようにしてシグナルの特異性を制御しているのか遺伝学、生化学、細胞生物学を組み合わせた多方面からのアプローチで解析する。最終的な目標はRhoシグナル伝達機構の特異性が生まれる分子基盤を解明することでRhoの制御異常に伴う疾患の治療法への手がかりをつかむことにある。我々は最近タンパク質脱リン酸化酵素PP2A-Cdc55が出芽酵母Rho1の出力シグナルを制御していることを明らかにした。さらにPP2A-Cdc55がどのような分子機構でRho1シグナル伝達系の出力シグナルを制御するのかを解析する過程でRho1のGAPであるLrg1とSac7がPP2A-Cdc55に活性調節を受けていることを明らかにした。さらに我々はLrg1自体はPP2A-Cdc55の直接の基質ではなかったもののLrg1の調節因子であるPxl1がPP2A-Cdc55に脱リン酸化されること、Sac7の脱リン酸化はSac7をプロテアソーム依存的な分解から防ぎ安定化させることを明らかにした。PP2A-Cdc55がタンパク質脱リン酸化酵素であることからRho1, Lrg1, Sac7の各々がリン酸化によって制御されている可能性を考え、現在生化学解析により仮説を検証中である。具体的にはRho1, Lrg1, Sac7のリン酸化修飾の程度を電気泳動法によるバンドシフトにより確認、および質量分析によりPP2A-Cdc55依存的なリン酸化サイトの同定を急いでいる。PP2A-Cdc55がRho1のGAPであるLrg1とSac7を脱リン酸化により制御していることがほぼ明らかになってきた。これからin vivoでもPP2A-Cdc55がRho1 GAPを脱リン酸化していることを証明しできるだけ早く論文として発表することも目標にしている。
エアロゾル輸送における山岳地形効果の解明

本研究では,山岳が移流エアロゾルの輸送に与える影響,並びに盆地から発生する局所エアロゾルの起源-生成-移流-消滅に関するエアロゾル動態評価を目的として,2020年春に長野県日本アルプス一帯を舞台にDRAGON J-ALPSを実施する.日本の人工衛星である「しきさい」,「ひまわり8号」,「いぶき2号」のデータに加え,領域気象モデルに詳細なエアロゾル特性を加味した再現実験を実施し,エアロゾル微物理量の導出解析を計画している.集中観測データはNASAデータベースに蓄積され全世界へ公開され,将来の衛星解析やモデル検証にも貢献する.本研究では,山岳が移流エアロゾルの輸送に与える影響,並びに盆地から発生する局所エアロゾルの起源-生成-移流-消滅に関するエアロゾル動態評価を目的として,2020年春に長野県日本アルプス一帯を舞台にDRAGON J-ALPSを実施する.日本の人工衛星である「しきさい」,「ひまわり8号」,「いぶき2号」のデータに加え,領域気象モデルに詳細なエアロゾル特性を加味した再現実験を実施し,エアロゾル微物理量の導出解析を計画している.集中観測データはNASAデータベースに蓄積され全世界へ公開され,将来の衛星解析やモデル検証にも貢献する.
超・極低出生体重児の咀嚼発達に関する咀嚼筋筋電図時系列分析

平成10年に超・極低出生体重児(EVLBW)の保護者を対象に咀嚼に関する調査を行ったが、5年後の平成15年に同一被検者(現年齢69歳)の保護者104名を対象に追跡調査を行った。5年前にEVLBWで有意に多く認められた口腔機能発達や形態に関する各問題点は、現在調査ではいずれも有意に減少していた。これらの結果から、EVLBWをもつ保護者は13歳頃まで児の咀嚼機能発達の遅れを強く感じているが、児が成長した69歳時点ではその遅れを感じる保護者の割合が減少していることが明らかとなった。また一方、口腔機能の発達状態を直接に、デンタルプレスケールによる(1)咬合接触面積、(2)咬合力および咬合力バランスの診査と、(3)咀嚼筋筋電図による咀嚼機能の発達について検討すると、咬合接触面積は、5年前のIIA期(5歳0か月)時にはEVLBWは平均5.0mm^2であり、コントロールの9.2mm^2と比較し有意に小さかったが、IIIA期となった現在ではEVLBWが12.2mm^2、コントロールで11.4mm^2と差がなくなっていた。また咬合力は、5年前にはEVLBWが234.9N、コントロールは391.8Nと有意差が認められたが、現在ではコントロールの520.0Nに対しEVLBWが565.1Nと差がなくなっていた。さらにガム、米飯、グミゼリー各被験食品咀嚼時の咀嚼筋活動量は、5年前には共にEVLBWが有意に大きい数値を示していたが、現在ではコントロールと比べ差が認められなくなっていた。以上、アンケートと機能検討の両者の評価から、超極低出生体重児の咀嚼機能発達は、幼児期では遅れているものの学童期前半には満期産児に追いついてくることが明らかとなった。初年度は第一段階として、本研究への被検者としての協力者選定を行っている。また予備研究として、これまで蓄積された超・極低出生体重児(Extremely & Very Low Birth Children, EVLBC)と健常小児(Full Term Children, FTC)のデータから、米飯、グミゼリー(グミ)の咀嚼開始から嚥下までの咀嚼筋筋活動量を時系列分析を含め計測方法について検討し、さらに超・極低出生体重児の咀嚼発達の特徴について検討した。被験児は、超・極低出生体重児6名(初回時平均年齢5.0歳、2回目5.7歳、3回目6.3歳、HellmanのDental Stage IIA期)と、対照群として本学小児歯科に歯科管理目的で来院している満期正常出生児で健康状態が良好なIIA期小児16名(平均年齢5.4歳)を用いた。被験食品としてガム(2g)、米飯(5g)、グミ(3g)を用い、食品咀嚼時筋活動電位を左右側頭筋前部(RTM, LTM)、左右咬筋浅部(RMM, LMM)および左側顎二腹筋前腹(DM)から導出した。ガム自由咀嚼については咀嚼開始から5発目以降の咀嚼リズムの安定した10波形を対象に平均活動量を求めた。また来

飯およびグミについては咀嚼開始から嚥下までの連続した3波形を1セクションとし連続的に筋活動量を測定し、さらに開始から嚥下までを前半、中盤、後半の3部に分割し、各部での連続する3セクション積分値を筋活動量とした。解析項目として、総筋活動量(TMA(μV・s)=(RTM+LTM)/2+(RMM+LMM)/2+DM)、ガム自由咀嚼時筋活動量に対する米飯とグミゼリー咀嚼時の活動比率(米飯/ガムx100、グミ/ガムx100(%))、さらに総筋活動量に占める各筋活動割合(TM%,MM%,DM%)について、1咀嚼運動内での時系列分析を行った。その結果、問題食行動の認められたEVLBCを平均5歳以降で筋電図学的に検討した結果、咀嚼運動は一見FTCと差はないように見えたが、実際の咀嚼筋活動はFTCと異なる活動を示していた。しかし平均6.3歳児では満期正常出生児に近づく傾向を示していた。14年度に引き続き、コントロール群としてIIA期とIIIA期の健常正常咬合児と、超・極低出生体重児はIIA期を出発点としたIIIA期の小児を対象に、デンタルプレスケールによる咬合接触面積、咬合力および咬合力バランスの診査と、咀嚼筋筋電図による咀嚼機能の発達についてのデータ収集を行っている。またそれとは別に、平成10年度に超・極低出生体重児の保護者を対象に咀嚼に関する調査を行った。が、本年度さらに同一被検者の保護者104名を対象に5年後(現年齢69歳)のアンケートによる追跡調査を行った。アンケート項目は咀嚼の問題に関して12項目、その他の問題に関して2項目の計14項目についてであった。回収できたのは、超・極低出生体重児が34名(回収率69.4%)、15002000g未満の低出生体重児が27名(回収率49.1%)であった。その結果、5年前と現在とを比較すると、5年前に超・極低出生体重児で有意に多く認められた口腔機能発達や形態に関する問題点(1.米飯の食べる量、2.食事中水分摂取、3.前歯で粉砕する硬い食品、4.臼歯で粉砕する硬い食品、5.口に含んだまま飲み込まない、6.言語発達、7.頭部変形)は、いずれも有意に減少しでいた。これらの結果から、超・極低出生体重児をもつ保護者は13歳頃まで児の咀嚼機能発達の遅れを強く感じているが、児が成長するにつれてその遅れを感じる保護者の割合が次第に減少していることが明らかとなった。平成10年に超・極低出生体重児(EVLBW)の保護者を対象に咀嚼に関する調査を行ったが、5年後の平成15年に同一被検者(現年齢69歳)の保護者104名を対象に追跡調査を行った。5年前にEVLBWで有意に多く認められた口腔機能発達や形態に関する各問題点は、現在調査ではいずれも有意に減少していた。これらの結果から、EVLBWをもつ保護者は13歳頃まで児の咀嚼機能発達の遅れを強く感じているが、児が成長した69歳時点ではその遅れを感じる保護者の割合が減少していることが明らかとなった。また一方、口腔機能の発達状態を直接に、デンタルプレスケールによる(1)咬合接触面積、(2)咬合力および咬合力バランスの診査と、(3)咀嚼筋筋電図による咀嚼機能の発達について検討すると、咬合接触面積は、5年前のII A期(5歳0か月)時にはEVLBWは平均5.0mm^2であり、コントロールの9.2mm^2と比較し有意に小さかったが、III A期となった現在ではEVLBWが12.2mm^2、コントロールで11.4mm^2と差がなくなっていた。また咬合力は、5年前にはEVLBWが234.9N、コントロールは391.8Nと有意差が認められたが、現在ではコントロールの520.0Nに対しEVLBWが565.1Nと差がなくなっていた。さらにガム、米飯、グミゼリー各被験食品咀嚼時の咀嚼筋活動量は、5年前には共にEVLBWが有意に大きい数値を示していたが、現在ではコントロールと比べ差が認められなくなっていた。本研究結果の概要は、第20回日本歯科医学会総会(横浜)および第4回アジア小児歯科学会(バンコク)において発表した。
視床下部ブロック標本を用いた中枢浸透圧受容機構・性腺連関の電気生理学的研究

本課題では、中枢浸透圧受容器とよび視床下部・下垂体後葉系を含むラット新鮮脳ブロック標本を用いて、浸透圧受容機構および性腺機能間の機能的連関の解明を目指した。まず、中枢浸透圧受容器(AV3Vに限定)、視索上核および下垂体後葉を付けた底部視床下部標本を作成し、内頚動脈枝断端よりの血管内人工脳脊髄液注入によって長時間に渡るブロック標本の神経機能維持を図った。幾つかの困難はあったが、かなりの確率で神経機能の維持が可能となってきており、下垂体後葉の電気刺激による視索上核神経分泌細胞活動の逆行性興奮を利用した同定、および他の脳部位の刺激による神経分泌細胞の順行性興奮を誘来することが可能となった。しかしながら、脳スライス標本に比べてニュ-ロンの自発活動活性が低いため、更に潅流などの実験条件の改善を行い、定常条件下での成績の集積が必要と思われ、現在も研究課題に沿った実験を継続中である。また、前回および今回の科学研究費補助を受けて、統合した成績は論文としてまとめて提出しAm.J.Physiol.(Reg.Int.Comp.Physiol.)に受理された。これは、視床下部視索上核レベルにおける浸透圧受容機構が血中の卵胞ホルモン(エストロジェン)濃度に影響を受け、その感受閾値を低下させることをin vitro実験系にて証明したもので、妊娠中毒症や電解質代謝異常などの病態を語る上で重要な基礎的成績であったと思っている。また、これに先立って、視床下部質傍核におけるニュ-ロンの化学感受性がやはり、血中エストロジェン濃度の影響を受けることを示した成績を提出していたが、本年度に受理された(Biomed.Res.)。これらの論文は本課題の解明・確立にとって基礎となるものであった為、本課題の遂行には無くてはならない成績であった。また、本課題に関連して視床下部後葉系機能の理解を増すため、二つの実験を別個に行い、すでにこれらの成績は受理されている(リスト参照)。
壁せん断応力による血管内皮細胞を介した高分子物質輸送の制御

本研究は,壁せん断応力がどのようなメカニズムで内皮細胞の物質輸送を制御しているかを把握することを目的とし,実際の生体内の流れを反映する第一段階として2枚の平行平板の間に段差を設け,その間に流体を流し段差後流で剥離流れをつくり,この剥離流れの特徴的な領域(逆流域や再付着点)において内皮細胞の物質輸送能変化に関して調べた.さらに,壁せん断応力がどのようなメカニズムで内皮細胞の物質輸送を制御しているかを把握するために,内皮細胞の情報伝達物質である細胞内カルシウムイオン濃度に着目し,壁せん断応力を負荷した際の細胞内カルシウムイオン応答を調べ,以下の結論を得た.剥離流れ場で特徴的な領域である再付着域と発達域で高分子物質の取り込みの測定をおこなった.高分子物質は蛍光標識したアルブミンを使用し,共焦点レーザ顕微鏡で蛍光強度を測定し,取り込みの評価をおこなった.その結果,再付着域では発達域に比べ取り込みが増加し,せん断応力やせん断応力の勾配が細胞の取り込みに影響を与える事を確認した.発達域でのカルシウムイオン応答の時間経過を調べた.内皮細胞は壁せん断応力が負荷されると細胞内で急激なカルシウムイオン濃度上昇が見られた.壁せん断応力負荷直後では約30%の内皮細胞がカルシウム応答を示したが,時間経過とともにその応答数は減少し,24時間後では約5%まで減少し,細胞内の情報伝達はせん断応力の負荷時間の経過とともに減少することを確認した本研究は,壁せん断応力がどのようなメカニズムで内皮細胞の物質輸送を制御しているかを把握することを第一の目的とする.内皮細胞を介した物質輸送が細胞の代謝エネルギを利用していること,さらに細胞の代謝エネルギがせん断応力の影響を受け変化することから,細胞内エネルギが物質輸送の制御に関連があると考え,内皮細胞がどのように壁せん断応力を感知し情報をミトコンドリアに伝達するかを把握する.具体的には,壁せん断応力を負荷した細胞のミトコンドリア膜電位と細胞内カルシウムイオンとの関連を調べる.第二の目的として実際の生体内の流れを反映する第一段階として本研究では2枚の平行平板の間に段差を設け、その間に流体を流し段差後流で剥離流れをつくる.この剥離流れの特徴的な領域(逆領域や再付着点)において内皮細胞の物質輸送能変化及びミトコンドリアを介した制御機構に関して調べる.本年度は,剥離流れ場における内皮細胞のアルブミン取り込みの測定をおこなった.その結果,壁せん断応力が小さくかつせん断応力勾配が大きい再付着点や淀み域において,細胞は比較的丸い形態をし,ランダムな方向を向き,アルブミンの取り込みは増大した.一方,壁せん断応力が大きくかつせん断応力勾配が小さい逆流域や発達域においては,細胞は主流方向に配向した細長い形態をし,アルブミンの取り込みは減少した.以上の結果より,流れ場の違いによる壁せん断応力やせん断応力勾配が細胞の物質取り込み機能を変化させることが新たに分かった.今後は,内皮細胞がどのように壁せん断応力を感知し情報をミトコンドリアに伝達するかを把握するために,壁せん断応力を負荷された細胞のミトコンドリア膜電位と細胞内カルシウムイオンとの関連を調べる予定である.本研究は,壁せん断応力がどのようなメカニズムで内皮細胞の物質輸送を制御しているかを把握することを目的とし,実際の生体内の流れを反映する第一段階として2枚の平行平板の間に段差を設け,その間に流体を流し段差後流で剥離流れをつくり,この剥離流れの特徴的な領域(逆流域や再付着点)において内皮細胞の物質輸送能変化に関して調べた.さらに,壁せん断応力がどのようなメカニズムで内皮細胞の物質輸送を制御しているかを把握するために,内皮細胞の情報伝達物質である細胞内カルシウムイオン濃度に着目し,壁せん断応力を負荷した際の細胞内カルシウムイオン応答を調べ,以下の結論を得た.剥離流れ場で特徴的な領域である再付着域と発達域で高分子物質の取り込みの測定をおこなった.高分子物質は蛍光標識したアルブミンを使用し,共焦点レーザ顕微鏡で蛍光強度を測定し,取り込みの評価をおこなった.その結果,再付着域では発達域に比べ取り込みが増加し,せん断応力やせん断応力の勾配が細胞の取り込みに影響を与える事を確認した.発達域でのカルシウムイオン応答の時間経過を調べた.内皮細胞は壁せん断応力が負荷されると細胞内で急激なカルシウムイオン濃度上昇が見られた.壁せん断応力負荷直後では約30%の内皮細胞がカルシウム応答を示したが,時間経過とともにその応答数は減少し,24時間後では約5%まで減少し,細胞内の情報伝達はせん断応力の負荷時間の経過とともに減少することを確認した
治験実施時に発生した副作用に対する補償業務手順標準化の構築

【研究目的】治験中に発生する副作用は重篤な転帰を辿ることもあり、被験者の安全性を確保するために、特に迅速で適切な対応が求められる。また、副作用発生時の一次対応が適切でないと、補償のみならず訴訟問題にまで発展しかねない。本研究では、治験依頼者間・施設毎で治験実施中の被験者に対する補償対応の差異が生じている問題点を解決するために、補償対応において最低限実施すべき業務手順を構築する。【研究方法】治験依頼者に対して補償に係る調査を実施し、過去に調査したデータ(2004年)と比較し、過去と現在における補償対応の変化を把握する。また、補償対応の現状を踏まえ、医療機関で実施すべき業務内容を検討する。【研究成果】補償対応開始の契機が医療機関側85%(うちCRCは約50%)との事実よりCRCの対応次第で補償の有無が左右される可能性は否定できない。一方、依頼者が医療機関に対して「自発的な対応」を行っているのは過去と現在も僅か10%弱で変化がなく、因果関係判明時からの依頼者の積極的な対応が望まれる。また、過去の調査と同様に現在も医療機関側から依頼者に対して補償範囲を超えた要求も見受けられた。CRCの資質で被験者に対する補償対応に差異が生じるのは好ましくなく、補償対応の有無を検討する院内体制構築、及び医療機関/治験依頼者間相互で補償対応の有無をチェックできる体制整備が必要と考える。本調査結果を基に、補償に対して医療機関側が必要最低限実施すべき事項を高額補償と低額補償とで分けて手順書を作成した。しかしながら、本業務手順が妥当であるか再評価には至らなかったため、今後継続して研究を行う予定である。
タンパク質との機能融合を目指したゲノム標的機能性人工核酸の開発

ヒトゲノムの全遺伝子配列の解読終了が公表され、本格的にポストゲノムシーケンス時代に突入し、ゲノム配列情報を利用した病気の診断や治療など、様々な研究への展開が盛んに行われている。本研究では、機能性人工分子を用いることによって生体内に内在するたんぱく質本来の機能を活性化し、人工分子と生体内分子の機能を融合活用する革新的な遺伝子発現制御法の開発を目指している。その方法の一つとして、3本鎖DNA形成に着目した。3本鎖DNA形成を利用した遺伝子発現阻害、変異や修復などの生体内反応を惹起する3本鎖DNA形成分子の探索を行うために、本研究室で開発した人工核酸(WNA:W-shaped Nucleoside Analogues)を基本骨格にその誘導体の合成・評価を行った。WNAは認識塩基部位であるヘテロ環と安定化部位である芳香環をビシクロ骨格に別々に結合させた人工核酸である。これまで合成し評価した種々のWNA誘導体の結果をもとに、新たに設計を行った。その結果、WNAの変換部位の一つであるベンゼン環部分にアミノ基を有する誘導体を含んだ3本鎖形成オリゴヌクレオチドにより、非選択的な3本鎖DNA形成に成功した。さらに結果に基づく誘導体の設計・合成を行っており、認識構造の最適化を行っている。さらに、これまでに見いだしていたc-myc遺伝子に対するRaji細胞を用いた細胞増殖阻害研究に加えて、本研究ではbcl-2遺伝子に対する3本鎖形成オリゴヌクレオチドの設計・合成を行った。3本鎖形成能の評価の結果、このオリゴヌクレオチドは3本鎖DNAを形成することが明らかとなった。さらに、肺ガン細胞を用いて細胞増殖阻害能を確認したところ、まだ予備的な結果ではあるが、効果的に細胞増殖阻害活性があることを明らかにした。
次世代型創薬「ネットワーク創薬」の創成

本研究は、薬物-標的タンパク質-疾患関連タンパク質-疾患と繋がる薬物-疾患統合分子ネットワークを構築し、薬物作用のネットワークシミュレーションに基づく新たな創薬手法「ネットワーク創薬」の開拓を目指すものである。昨年度では、複数のキナーゼ阻害剤によるキナーゼファミリーの多重標的阻害の網羅的実験とその計算予測モデルの構築を行った。これらの成果にネットワーク的な概念を導入するために、本年度は薬物投与下における遺伝子発現ネットワークを計測し、その薬物作用のネットワーク表現とその予測計算手法の開発を行った。具体的には糖尿病治療薬として開発されたトログリタゾン、ピオグリタゾン曝露時のマイクロアレイデータを用いて、薬理作用遺伝子ネットワーク、毒性作用遺伝子ネットワークを自動抽出し、その薬理効果・毒性作用を予測するシステムを構築した。ここで、ネットワークの構築エンジンとしては、十分な実用性を有する遺伝子発現パターンの相関性に基づくネットワーク構築手法を用いた。すなわち、遺伝子発現パターンの相関性により、共発現遺伝子クラスターを定義し、薬物応答、毒性発現のそれぞれの遺伝子ネットワークの構造比較によって薬理作用・毒性特異的遺伝子ネットワークの抽出を試みた。本システムで予測抽出された薬理作用・毒性特異的遺伝子ネットワークに関して、強制発現系の細胞毒性実験を行い、このネットワーク予測手法の有効性を検証したところ、予測された相互作用ネットワークの正当性が確認された。本研究では、薬物作用のネットワークシミュレーションに基づく新たな創薬手法「ネットワーク創薬」を開拓するために、薬物-標的タンパク質-疾患関連タンパク質-疾患へと繋ぐ薬物-疾患統合ネットワークを構築し、それに基づく薬物作用ネットワークシミュレータを研究開発することを目標としている。本年度は、ネットワークシミュレータの基盤となる、薬物-標的タンパク質-疾患関連タンパク質-疾患を繋ぐ分子ネットワークの構築を図った。まず、薬物と標的タンパク質問の薬物-タンパク質問ネットワークの構築にあたって、申請者が手がけてきた「ケミカルゲノミクス情報に基づく化合物-タンパク質相互作用予測法」を、GPCRやキナーゼなど代表的な薬物標的ファミリーならびに、薬物代謝、毒性に深く関与しているCYPファミリーやトランスポータに適用し、相互作用ネットワークの推定を行った。また、標的タンパク質と疾患関連タンパク質の生体分子間ネットワークの構築のために、NCBI GEOデータベースに収められている大規模なマイクロアレイ遺伝子発現データを対象として、発現プロファイルの類似性に基づく検索と、検索結果をもとにした遺伝子間ネットワークの構築を行うシステム「GEM-TREND」を開発した。本システムは、遺伝子とフェノタイプ(薬剤応答、疾患など)間や、フェノタイプ-フェノタイプ間のネットワーク推定にも用いることができるため、GEM-TRENDの開発は、本研究の重要な成果として位置づけられる。このようにして推定したネットワークは、次年度以降の検証実験によって評価し、シミュレータの改良につなげていく。最終的に構築されるシミュレータは、病態・薬理作用メカニズムの解明および毒性などの他の薬物効果の推定にも繋がるものと期待できる。
光化学系1複合体のアセンブリー装置の分子生物学的解析

光合成の電子伝達系で機能する光化学系1複合体は、膜タンパクを含む10以上のサブユニットと100以上のコファクターから構成される超分子複合体である。各構成成分が機能的な複合体へアセンブリーされる過程は明らかにされておらず、その反応を介添えする装置は同定されていない。我々はすでに葉緑体ゲノム上の機能不明な読み取り枠の一つycf4が光化学系1複合体のアセンブリーに必須な因子をコードすることを明らかにした。このYcf4タンパクに対する抗体を用いた解析の結果、Ycf4は新たに合成された光化学系1複合体と一過性的に結合し、さらにYcf4も大きな複合体を形成していることが明らかにされた。このYcf4複合体は光化学系1複合体のアセンブリー装置であると考えられるので、これをショ糖密度勾配超遠心法、イオン交換カラムクロマトグラフィー法、およびゲルろ過カラムクロマトグラフィー法を利用して精製した。精製度はまだ不十分で他のタンパクの混入が認められるが、この複合体のサイズは分子量180万であることを決定した。さらにYcf4複合体を精製するために、緑藻クラミドモナスの葉緑体形質転換系を利用してYcf4にタグを融合し、アフィニティークロマトグラフィーで複合体をさらに高度に精製することを試みた。異なる原理により生成したYcf4複合体の構成サブユニットを解析した結果、10以上のポリペプチドが存在することが初めて明らかにされた。この研究と関連して、もう一つの光化学系2複合体の酸素発生系のマンガンクラスターのアセンブリーを部分的に阻害する反応中心タンパクD1のアミノ酸を置換した形質転換体の解析を進めている。その結果、D1のC末端領域の構造がマンガンクラスターの機能に重要であることを確かめた。光化学系1複合体の合成に必須で、葉緑体遺伝子にコードされるYcf4タンパクが形成する複合体の精製を行った。緑藻クラミドモナスのチラコイド膜をTriton X-100で可溶化し、ショ糖密度勾配超遠心にかけると、Ycf4タンパクは一部の光化学系1複合体と結合して分離された。タンパク質を短い時間パルスラベルした細胞からYcf4を結合する光化学系1複合体を単離すると、この画分の光化学系1タンパクが特異的にラベルされていた。パルスラベルの時間を長くすると、Ycf4を含まない光化学系1複合体画分にラベルは移行したので、Ycf4タンパクは新たに合成された光化学系1複合体と結合することが示された。したがって、Ycf4は光化学系1複合体のアセンブリー装置を構成する成分であると考えられる。次に、アセンブリー装置として機能するYcf4複合体を精製するため、Ycf4にヒスチジンタグを融合した形質転換体を作出した。しかし、アフィニティカラムによりYcf4複合体は精製できなかった。ところが、ヒスチジンタグを融合したYcf4の機能が部分的に損なわれ、光化学系1複合体の機能が影響を受け、より多くの活性酸素を生成するようになった。これは、Ycf4複合体が機能的な光化学系1複合体のアセンブリーに関与する証拠である。現在、Ycf4に別のTAP(tandem affinity purification)タグを融合させ、アフィニティクロマトグラフィーにより精製を可能にしたり、アミノ酸置換により機能を改変し光化学系1複合体のアセンブリーに影響を与えたりした形質転換体を作製中で、Ycf4が形成するアセンブリー装置の構造と機能の解析を更に進めていきたい。光化学系1複合体の合成に必須で、葉緑体遺伝子にコードされるYcf4タンパクは、複合体を形成し光化学系1複合体のアセンブリー装置として機能することを示してきた。

本研究では、緑藻クラミドモナスのチラコイド膜のYcf4複合体の精製を進め、光化学系1複合体のアセンブリー装置の構造解析を進めた。まず、チラコイド膜の可溶化条件の検討を行い、従来用いていたTriton X-100よりドデシルマルトシドの方がその後のYcf4複合体の精製に適当であることが分かった。そこで、チラコイド膜をドデシルマルトシドで可溶化後、ショ糖密度勾配超遠心法でYcf4と光化学系1複合体を含む画分を分離した。さらに、DEAE-Toyopearlイオン交換クロマトグラフィーでYcf4を高度に分離できることが分かった。また、FPLCによるSuperdex S-200やSuperose 6を用いたゲルろ過クロマトグラフィーもYcf4複合体の精製に有効であることが分かった。これらクロマトグラフィーによる分離の結果、Ycf4複合体は少量の光化学系1反応中心タンパクを結合していることが確かめられた。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離の結果、Ycf4複合体の見かけの分子量は数十万以上と予想以上に大きいことが明らかになった。今後は、Ycf4複合体を生化学的に高度に純化し、そのタンパク組成を決定し、それらのcDNAクローンをクラミドモナスのESTデータベースから検索し、その塩基配列の決定を進めたい。また、合成途中の光化学系1がYcf4複合体と結合していると考えられるので、このYcf4-PS1複合体の光合成色素組成や光化学活性などの解析も進めていきたい。
時分割ラウエ法による酵素反応機構の動的解析実験法の開発

セラチア菌プロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼの二種のZnプロテアーゼ(分子量約5万)の反応機構を時分割ラウエ法を適用して原子レベルで解明するには、良質結晶調製法や反応トリガー技術の開発、反応速度低下法と中間体捕獲法の確立などの実験法の開発が必要である。それには、まず基礎となる両酵素の静的構造を高分解能で精度よく決定する必要がある。アミノ酸配列に60%相同性を有するセラチアプロテアーゼと緑膿菌アルカリプロテアーゼのX線結晶構造解析を独立に行い、両酵素とも2.0Åという高分解能にもかかわらずR因子19%の高精度で構造を決定した。その結果、両酵素はβ-ヘリックスと呼ばれる新規構造を含む類似の立体構造を有する同じ酵素ファミリーに分類されうることが明らかになった。更に動的構造解析によって反応メカニズムを明らかにするために重要な酵素/阻害剤複合体の静的構造の決定を試みた。酵素/阻害剤複合体の結晶構造を解析し、酵素自身の構造と比較することによって基質結合時の酵素の構造変化及び基質結合様式を明らかにすることができる。両酵素に対するタンパク質性阻害剤としては現在のところα2マクログロブリンのみしか発見されていない。α2マクログロブリンは、高分子量タンパク質で本目的には適しない。そこで、ペプチド性阻害剤を調製して解析に用いた。この阻害剤は、動的構造解析のための阻害剤/基質転移物質を開発するうえで基本になると期待されるものである。差フーリエ合成法による解析の結果、阻害剤は酵素の活性部近傍に結合しているものの、阻害剤の溶解度が低いこともあって占有率に改良の余地があることが判った。今後この点を改良して活性部の構造を解明し、pHジャンプによる反応開始トリガー法の開発を行なう。
クラウド環境での機械学習アルゴリズムの高速分散実行機構

本研究提案では、Twitterのような非常に高速な大規模時系列データ群をリアルタイムに機械学習アルゴリズムに入力、実行可能な分散実行機構の構築を目指した。しかし実際には、クラウド等の十分に計算資源が確保可能な環境では、パイプライン化により数十台の計算機により入力データをほぼ処理することが可能であることが明確になった。GPGPUなどを含めた、より並列度が高い環境を対象とした分散実行機構実現のためには、データ入力速度の高速化が重要であるとの知見を得た。本研究提案は、学習アルゴリズムの並列分散を実行可能とし、対象とする計算環境や計算機アーキテクチャに特化した高速化ライブラリを構築することを目的としている。初年度である平成22年度は、比較的研究が進められているアルゴリズムから着手する予定であったことから、頻出パターン検出アルゴリズムの並列化とGPUを用いた高速化に着手した。バスケット解析などに代表される頻出パターン検出問題は、実社会での需要が高い解析手法のひとつであり、近年では超大規模データの解析に対する要求が高まっていることから、高速化への需要が多いアルゴリズムのひとつである。頻出パターン検出アルゴリズムの逐次実行アルゴリズムとしては、FP-growthが最も高速であるとされている。FP-growthは、入力データを木構造で表現し、最底辺の葉から根に辿ることで解を探索する。したがって、従来の手法よりも入力データスキャンの回数を大幅に削減可能であり、また問題探索空間を小さくすることが可能であるため、高速であるとされている。一方で、FP-growthで用いる木構造は、多くの場合には枝の数が一定でなく、深さもバラバラであるため、FP-growthアルゴリズムをそのまま並列化しても、十分な高速化を実現することが難しい。以上の状況を踏まえ、本プロジェクトでは、GPGPUによるFP-growthアルゴリズムの並列化手法を実装・提案した。具体的には、並列化効率を下げる木構造でのデータ表現ではなく、GPGPUに適したバイナリ表記でのデータ表現を用いた。また、木探索ではなく、ビット演算による解探索手法を提案した。本研究課題では、機械学習アルゴリズムの分散実行機構を構築し、ライブラリとして実装・公開することを目的としていた。機械学習アルゴリズム中で生じる学習状態や学習パラメタの共有が原因となり生じるボトルネックや、十分な並列分散効果を得るための入力データへのアクセスの高速化が重要な技術的課題であった。さらには、前年度の研究を踏まえて、並列分散環境としてGPGPUにターゲットを絞ることが今年度の計画であった。今年度の研究計画でGPGPUにターゲットを絞るに至った原因は、MapReduceを用いてクラウド上で機械学習アルゴリズムを並列分散実行する仕組みについては、Apache Mahoutプロジェクトが従来より取り組んでおり、Apache MahoutプロジェクトとGoogleの提携でMahoutプロジェクトの実装が急速に充実したこと、MapReduceを適用可能な機械学習アルゴリズムは限られていることなどであった。そこで、本研究課題では並列分散環境としてのターゲットをGPGPUに変更し、より多用な機械学習アルゴリズムに対応することや、GPGPUを用いることでクラウドのような分散環境と比較して、極めて高速に入力データにアクセスできる効果を狙った。しかし研究を進めるにつれ、GPGPUのように並列度が高く、データアクセスが比較的高速な環境で並列実行効果を十分に得るためには、そもそものアプリケーションが生成するデータ量が十分に膨大でなくてはならないことが予備実験から明らかになった。また、こうした膨大なデータを高速生成するアプリケーションは一定の需要があるものの、学術分野から実データにアクセスすることが極めて難しく、現実的な実験を行なうことができなかった。しかし、技術的な課題がより明確になったことから、今後は入力データの高速化にターゲットを絞り、本研究課題をさらに発展させていく予定である。
全国の公立図書館所蔵日本文学関係資料の所在に関する総合的研究

平成5年8年の4年間に、日本全国各地の公立図書館に所蔵される日本文学関係資料の所在を調査して、(1)調査台帳の作成、(2)蔵書目録の収集、(3)情報の交換、(4)正式の調査と撮影の許可交渉、(5)個々の図書館における具体的な書誌調査、などの作業を行い、日本古典文学研究の基盤を構築することを目指した。対象を公立の図書館・文庫に絞ったのは、公開を前提とし、閲覧が容易との理由による。本研究は年度毎に重点調査地区を決めて行い、各図書館における蔵書資料の実態や伝来、質量や傾向などの概要を掌握することに努めたが、緊急に調査すべき図書館については優先的に調査するなどの配慮をした。以上の調査を踏まえて、(1)各(都道)府県毎に、県下の日本文学関係資料を一括把握している県と、そうでない県との区別がかなり目立つこと、(2)教育委員会をはじめ、既に調査の進んでいる文庫、図書館については、関与しにくい状況があること、などが具体的問題点として残ったが、最終的には、(1)日本全国各地の公立図書館・文庫の蔵書点数の概要を把握し、(2)各図書館・文庫がそれぞれ独自に刊行する具体的な(和古書)蔵書目録を知り得たなど、当初の目標をほぼ達成し得ている。今後、私立図書館・文庫にまで本研究の趣旨を徹底することが可能になるならば、書目毎の日本文学資料の一覧たる『図書総目録』に対して、文庫・図書館毎の「和古書総目録」とも称すべき業績も可能になるとの見通しが立った。まず、国文学研究資料館が過去に調査した公立図書館のリストを作成し、何がどこまでなされているか、目録刊行の有無などについて総点検した。また、全国図書館案内などをもとに、全国の公立図書館の所在や分布を掌握した。それによって、当館が試みた過去の調査実績の比率をみると、全体の半数にも満たない、三分の一程度であることが分かった。特に各地域の文化振興政策などとも対応して、想像以上に公共図書館の数が多く、充実化しており、教育委員会を柱にした目録の整備も着々と進んでいるところが少なくないことを併せてうかがえた。課題はそうした個別の調査をいかに総合的に把握するかにある。さらに、公立図書館の調査と銘うったものの、各地域によっては国文学関係の和本類は郷土資料館や公民館、博物館に保管されている場合が多く、文化財保護の問題などとも併せて、「図書館」と和本との関連についての認識の根本的なありかたを考えさせられた。今年度は、予算配分に応じて、主に西日本の地域を重点的に調査することを目標にし、近畿の宮津市立図書館・舞鶴市立西図書館・京都府立総合資料館、中国の三原市立図書館、四国の徳島県立図書館・高知県佐川町立青山文庫、九州の長崎県立対馬歴史民俗資料館・厳原郷土館・沖縄県立図書館・県立博物館・石垣市八重山博物館等々の調査に赴いた。これ以外にも比較的遠距離の東北地区の各図書館の調査も試みた。中にはすでに目録も刊行された著名な図書館もあるが、ほとんどその存在を知られていない所もあり、いまだにその全貌がつかめていない図書館も少なくない。そうした格差を是正し、国文学関連資料の全貌をつかむための基礎的な目録作りや総合的な実体調査が急務であることを改めて実感した。調査の完了した所から順次、目録を作成、刊行していきたいと念願している。前年度作成した、国文学研究資料館が過去に調査した公立図書館のリスト(基礎台帳)をもとに、従来充分に調査されていない図書館の調査を行った。またその後得られた情報や資料にもとづいてさらに台帳の整備充実をはかった。近畿・中部地区を今年度はおもな対象にし、浜松市立図書館・磐田市教育委員会・名古屋市博物館等々の調査を試みたが、情報に応じて特定の地域に限定せず、緊急を要する箇所を重点的に行った。須賀川市立図書館、白河市立図書館、大石田町立図書館、愛媛県立図書館、長崎県立対馬歴史民俗資料館、沖縄県立図書館宮古島分館等々に赴き、種々の情報交換を行い、所によっては可能な範囲で実際の調査に入ることができた。

前年来、続いている沖縄県立図書館の東恩納文庫は調査が完了し、ひき続き収集に入る予定である。昨年終了した石垣市立八重山博物館とあわせ、沖縄の資料の主要な部分がかなり解明されたといえる。琉球文学の日本文学における意義をとらえる最も基礎的な作業であり、いずれも目録を刊行したいと考えている。近年とみに各地の図書館が充実してきており、個人の蔵書も図書館に寄託されるケースがふえ、今まで知られていない資料が次々と発掘されつつある。すでに目録も刊行された著名な図書館もあるが、一方でほとんどその存在を知られていない埋もれた図書館の資料やいまだにその全貌がつかめていない図書館も少なくない。そうした格差を是正し、国文学関連資料の全貌をつかむための基礎的な目録作りや総合的な実体調査が急務であることを改めて実感した。実に息の長い仕事であることを痛感する。本年度も、前年度に引き続き、全国各地の公立図書館に所蔵される日本文学関係資料の所在に関する調査を進め、(1)調査台帳の継続的作成(2)目録の収集(3)情報の交換(4)正式の調査と撮影の許可交渉(5)個々の図書館における具体的な蔵書調査、などの活動・研究を行った。本研究は年度毎に重点対象地区を設定し、平成7年度は、主に近畿・中部地区を中心に調査を行ったが、大阪府・京都府・兵庫県・愛知県などでは、既に各種の目録が比較的多く刊行されていることが分かり、それらを収集し総合することで、日本文学関係資料の所在の概要を把握し得るとの見通しを持った。また、三重県下では、三重県立図書館・津市立図書館・松阪市立図書館などに日本文学関係の古典籍が所蔵されることを知ったが、主に業務用として纏められた目録のうちには、歴史資料を文書学の立場から分類したものが多く、その中から日本文学関係資料のみを抽出するという作業が必要となる。なお、三重県では県立図書館が中心となり、県下に所蔵される日本文学古典籍資料の総目録作成の構想が進行中である。この他、静岡県下の静岡市立図書館・浜松市立図書館・掛川市立図書館等にも古典籍が所蔵されることをつきとめたが、一部は未整理のまま保管されているものもある。全国的なネットワークのもとに調査を遂行する上で、各地の公立図書館の刊行する目録類に依存する割合は大きいが、それらを通見して、各(都道)府県毎に、県下の日本文学関係資料を一括把握している県とそうでない県との区別を、具体的に掌握しつつあり、また、教育委員会はじめ既に調査の進んでいる機関については、関与しにくい状況のあることも分かった。本年度も、初年次3年次に引き続いて、日本全国各地の公立図書館に所蔵される日本文学関係資料の所在を調査して、(1)調査台帳の継続的作成、(2)目録の収集、(3)情報の交換、(4)正式の調査と撮影の許可交渉、(5)具体的な個々の図書館における書誌調査、などの作業を行なった。本研究は年度毎に重点調査地区を決めて行う計画の下に、本年度は主に関東地区を中心に調査を実施し、各図書館における蔵書資料の実態や伝来、質量や傾向などの概要を掌握することに努めたが、併せて、前年度までの計画で遂行し得なかった地域や箇所をも補填的に調査し、また、緊急に調査すべき図書館についても優先的に調査を実施した。本年度は本計画の最終年度に当たるので、前年度までに調査を実施し得た地域や図書館に関する調査記録をまとめ、近い将来の研究成果の刊行に向けて、総括的な整備を行った。