hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビタミンDの新規生理作用の解明

申請者らはビタミンDの新規生理作用として褐色脂肪分化促進作用を発見した。本研究ではビタミンDの褐色脂肪分化メカニズムや生理的意義を明らかにすると共に、応用化に向けた分子基盤を構築することを目的とし、(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明(平成30-令和元年度)、(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関(平成31ー令和2年度)、(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証(平成31-令和2年度)を行う。平成30年度は当初の実験実施計画に従い、(1)の項目に関して、マウス間葉系幹細胞株C3H10T1/2を用い、ビタミンDが褐色脂肪分化作用を発揮する条件(濃度、添加時期、添加期間)の検討を行った。ビタミンDが褐色脂肪分化促進作用を発揮する濃度は活性型ビタミンDの生理的濃度である50-250 pMであった。添加時期に関しては、分化期間を通してビタミンDを添加した場合と、分化誘導開始から48時間のみ添加した場合では効果はほぼ同じであった。一方で分化誘導48時間以降に添加した場合では効果は見られなかった。従って、ビタミンDはC3H10T1/2細胞の褐色脂肪分化に対して分化初期に影響することが明らかとなった。また、白色脂肪細胞のモデル細胞である3T3-L1細胞を用いた解析を行い、ビタミンDの作用が褐色脂肪細胞特異的な分化促進作用であることを確認した。(2)の項目については平成31年度以降を予定していたが、4種類のビタミンDアナログに関して検討を行い、その内3つに活性型ビタミンDと同様に褐色脂肪分化促進作用があることを確認した。本研究課題では、(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明、(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関、(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証を柱として研究を進める。平成30年度は実験実施計画に従い、(1)を中心に実験を行い、ビタミンDが褐色脂肪化を誘導する濃度、添加時期、添加期間等を明らかにした。(2)に関しては、平成31年度以降の実施予定であったが、一部を繰り上げて実施した。また、(3)についても、褐色脂肪組織が活性化、過形成される寒冷環境下におけるビタミンDの作用を検討するために、小動物用温度調節機能付チャンバーを設置し実験準備を整えた。以上より、研究はおおむね順調に進行していると判断した。平成31年度は昨年度に引き続き、(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明、(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関、(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証を柱として研究を進めていく。(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明:ビタミンDが分化の初期段階に作用することが明らかとなったことから、初期段階を中心に解析を進め分化初期マーカーの発現に対するビタミンDの働きを検討する。また、ビタミンDの生理作用は核内にあるビタミンD受容体を介する経路と、細胞膜上の膜受容体を介する経路が報告されている。受容体のノックダウン実験やシグナルタンパク質のリン酸化状態を検討することにより、本作用におけるビタミンDの受容メカニズムを明らかにする。(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関:さらに多くのビタミンDアナログについて褐色脂肪化作用を検討し、立体構造と作用の関連性を解明していく。(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証:褐色脂肪化におけるビタミンDの作用を個体レベルで明らかにするために、ビタミンD欠乏食、あるいはノックアウトマウスを利用した動物実験を進めていく。また、褐色脂肪組織は寒冷時に活性化、過形成され、寒冷耐性獲得に必須の働きをする。そこで、本年度設置した小動物用温度調節機能付チャンバーを用いた寒冷耐性実験を行い褐色脂肪分化とビタミンDの関係を明らかにしていく。

本研究課題では、(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明、(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関、(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証を柱として研究を進める。平成30年度は実験実施計画に従い、(1)を中心に実験を行い、ビタミンDが褐色脂肪化を誘導する濃度、添加時期、添加期間等を明らかにした。(2)に関しては、平成31年度以降の実施予定であったが、一部を繰り上げて実施した。また、(3)についても、褐色脂肪組織が活性化、過形成される寒冷環境下におけるビタミンDの作用を検討するために、小動物用温度調節機能付チャンバーを設置し実験準備を整えた。以上より、研究はおおむね順調に進行していると判断した。平成31年度は昨年度に引き続き、(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明、(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関、(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証を柱として研究を進めていく。(1)ビタミンDによる褐色脂肪分化メカニズムの解明:ビタミンDが分化の初期段階に作用することが明らかとなったことから、初期段階を中心に解析を進め分化初期マーカーの発現に対するビタミンDの働きを検討する。また、ビタミンDの生理作用は核内にあるビタミンD受容体を介する経路と、細胞膜上の膜受容体を介する経路が報告されている。受容体のノックダウン実験やシグナルタンパク質のリン酸化状態を検討することにより、本作用におけるビタミンDの受容メカニズムを明らかにする。(2)ビタミンDアナログを用いた構造機能相関:さらに多くのビタミンDアナログについて褐色脂肪化作用を検討し、立体構造と作用の関連性を解明していく。(3)ビタミンDによる褐色脂肪化の個体レベルでの検証:褐色脂肪化におけるビタミンDの作用を個体レベルで明らかにするために、ビタミンD欠乏食、あるいはノックアウトマウスを利用した動物実験を進めていく。また、褐色脂肪組織は寒冷時に活性化、過形成され、寒冷耐性獲得に必須の働きをする。そこで、本年度設置した小動物用温度調節機能付チャンバーを用いた寒冷耐性実験を行い褐色脂肪分化とビタミンDの関係を明らかにしていく。理由本年度予定していたビタミンD応答遺伝子群解析のための費用を次年度に繰り越した。使用計画次世代シーケンスによる遺伝子解析費用に充てる。
極微細スピントロニクスデバイス形成技術の開発

30nm以下の微細レジストパターン形成の問題を解決するために、HMDSを用いたレジストパターン形成技術を構築した。HMDSの塗布プロセスによって、レジストパターンの形成状態に違いがあることが分かった。このプロセスの改善により、30nm以下のMTJを形成することが可能となった。30nm以下のMTJの実現に向け、CoFeB/MgO積層構造、2重MgO記録層構造の材料探索を行った。磁気トンネル接合(MTJ)を利用した不揮発性デバイスは消費電力を低減可能なことから注目されている。スピン注入磁化反転型のCoFeB/MgO垂直磁気異方性MTJは接合サイズの縮小により書込み電流が低減でき、消費電力の低減が可能であることを我々は確認している。記録保持性能を左右する熱安定性はCoFeB/MgO単界面のMTJにおいて、ニュークリエーション領域に相当する40nm以上の接合サイズでほぼ40の一定値を示す。しかしながら、2030nmスケールの微細な素子プロセスでは、レジスト流れ・レジスト倒れによる素子不良が顕著にみられ、再現性も悪いために、2030nmスケールでの熱安定性の挙動は明確になっていない。このプロセス構築に至っていない一要因として、基板とレジストとの濡れ性(親水性・疎水性)が考えられ、このデータを蓄積しプロセスに反映することで素子歩留まりの向上が期待できる。その結果、2030nmスケールでのMTJの評価が可能となり、熱安定性の知見を蓄積することで強磁性電極材料開発が加速される。前年(H24)度は、30nm以下のレジストパターンを形成する際のHMDS(密着性向上塗布剤)での処理方法について検討し、レジスト流れ・倒れの改善が可能であることを示した。また、レジストの基板との濡れ性の関連性を検討するために新規に接触角計を導入した。さらに、MTJ構造の最適化のためにMgO/CoFeB上部記録層構造の磁気異方性を調べ、磁気異方性がB組成に依存することを示した。H24年度は、レジスト流れの基板との濡れ性の関連性について接触角計を用い検討した。また、MTJ構造の最適化のためにCoFeB/MgO下部参照層構造の磁気異方性を調べた。さらに、30nm以下のMTJ素子を作製し評価した。磁気トンネル接合(MTJ)を利用した不揮発性集積回路は消費電力を低減可能なため注目されている。スピン注入磁化反転型のCoFeB/MgO垂直MTJは接合サイズの縮小により書込み電流が低減でき、消費電力の低減が可能なことを我々は確認している。記録保持性能を左右する熱安定性はCoFeB/MgO単界面記録層のMTJにおいて、ニュークリエーション領域に相当する40nm以上の接合サイズでほぼ40の一定値を示す。しかし、これまでに構築しているリフトオフプロセスで2030nmの微細な素子を形成する時に、レジスト流れ・レジスト倒れによる素子不良が顕著にみられ、再現性も悪く、2030nmでの熱安定性の挙動は明確になっていない。そこで、2030nmスケールの微細な素子を形成し熱安定性を評価することを目的に、H23年度は、基板とレジストとの濡れ性(親水性・疎水性)の観点から30nm以下のレジストパターンを形成する際のHMDS(密着性向上塗布剤)での処理方法を検討し、レジスト流れ・倒れの改善が可能であることを示した。また、その濡れ性を検討するために新規に接触角計を導入した。H24年度は、HMDSの処理方法によってレジストの接触角に違いが見られ、レジスト流れと基板の濡れ性に関連性があることがわかった。そして、CoFeB/MgO下部参照層構造の磁気特性の最適化を図るとともに、改善したHMDS条件を用いMTJ素子を作製した。作製した素子は、参照層と記録層ともにCoFeB単層を使用したために、参照層と記録層の熱安定性に大きな違いが無く、詳細なTMR特性評価には至らなかった。そこで、最終年(H25)度は、熱安定性向上のための参照層と記録層の材料・構造について検討し、さらに微細素子に関する知財化を行った。磁気トンネル接合(MTJ)を利用した不揮発性デバイスは消費電力を低減可能なため注目されている。スピン注入磁化反転型のCoFeB/MgO垂直磁気異方性MTJは接合サイズの減少により書込み電流が低減でき、消費電力の低減が可能であることを我々は確認している。一方、記録保持性能を左右する熱安定性はこのMTJにおいて、40nm以上でほぼ40の一定値を示している。しかしながら、2030nmスケールの微細な素子プロセスでは、レジスト流れ・レジスト倒れによる素子不良が顕著にみられ、再現性も悪いために、2030nmスケールでの熱安定性の挙動に関し明確になっていない。

このプロセス構築に至っていない一要因として、基板とレジストとの濡れ性(親水性・疎水性)が考えられ、このデータを蓄積しプロセスに反映することで素子歩留まりの向上が期待できる。その結果、2030nmスケールでのMTJの評価が可能となり、熱安定性の知見を蓄積することで電極材料開発が加速される。H23年度は、30nm以下のレジストパターンを形成する際に、レジスト流れ・レジスト倒れの一因として考えられる基板の濡れ性を改善するために、HMDS(密着性向上塗布剤)での処理方法について検討した。また、レジストの濡れ性検討のために新規に接触角計を導入した。さらに、2030nmスケールのCoFeB/MgO垂直磁気異方性MTJの熱安定性の調査に向けて磁気異方性のCoFeB組成依存性について検討した。30 nm以下のレジストパターンを電子線描画により形成する際のHMDS雰囲気でレジストを基板にスピンコーターを用い塗布する方法とHMDSをスピンコーターで基板に塗布しその後レジストを塗布する方法とでは、後者の方が微細なレジストパターンにおいて流れ・倒れが抑制されることが分かっている。そこで、接触角計を用い前述の2つの方法のHMDS処理を行った基板においてレジストを滴下し、基板上のレジスト形状から接触角を評価した。その結果、2つのHMDSの処理方法において、レジストの接触角に違いが見られ、レジスト流れと基板の濡れ性に関連性があることがわかった。30 nm以下のCoFeB/MgO MTJを形成し特性評価をする前に、そのMTJの最適化を図るために前年(H24)度の上部記録層構造に引続き、下部参照層構造の磁気特性について調べた。その結果、飽和磁化と界面磁気異方性エネルギーは下部参照層構造の方が小さくなっている。一方、実効磁気異方性エネルギー密度は上部記録層構造と下部参照層構造ともに同様のCoFeB組成で最大になる。このように記録層と参照層の最適化を行った後に、改善したHMDS処理を用いMTJ素子を作製した。MTJの接合部のレジスト現像後のSEM観察の結果2030nmのレジストパターンが形成されていることを確認した。MTJプロセス完了後に25nmの素子については、抵抗x接合面積積RAの値から見積もった素子サイズとも矛盾しない。作製した素子において、R-H特性を測定したところ、参照層と記録層ともにCoFeB単層を使用しているために、参照層と記録層の熱安定性に大きな違いが無く、詳細なTMR特性評価にはいたらなかった。このように、最終年度に掲げていた目標である微細なMTJでの磁気的・電気的特性評価まで達成でき、さらに、参照層の熱安定性向上のための材料・素子構造の検討に着手した。30nm以下のレジストパターンを形成する際に,レジスト流れ・レジスト倒れさらにその再現性が問題となっていた。その一因としてレジストと基板との濡れ性が挙げられる.そこで,現行プロセスでのレジスト流れ・レジスト倒れ等の基礎データをSEM観察により蓄積し,さらに、レジストと基板との濡れ性を評価するために新規に接触角計を導入し・立ち上げを行うことを目的とした。まず、30 nm以下のレジストパターンを電子線描画を用い形成する際に、レジスト流れ・レジスト倒れの一因として考えられる基板の濡れ性を改善するために、HMDS(密着性向上塗布剤)での処理方法について検討した。
高活性グルタミン酸リガンドの創製

キノコ毒として単離されたアクロメリン酸Aや放線菌から単離されたカイトセファリン(KCP)は天然由来の優れたグルタミン酸受容体リガンドである。これら天然物の潜在的な生物活性に着目した、脳神経系を標的とするケミカルバイオロジー研究を行った。その結果、天然物が結合する受容体(分子標的)に関する詳細な知見を得るとともに、天然物を凌駕する超活性リガンド分子として(7S)-KCPの創製に成功した。これより脳神経科学研究に資するリガンドが創製できた。グルタミン酸は哺乳動物の主要な神経情報伝達物質であり複雑な脳神経機能を司っている。その失調はさまざまな脳神経疾患に関与している。グルタミン酸受容体の情報伝達をON/OFFするリガンドを提供できれば、脳神経科学研究のツールや脳疾患の治療薬の開発に繋がる。本研究では、天然由来のリガンド類であるカイトセファリンおよびアクロメリン酸Aをリードとして、AO1(標的分子探索と生物学的評価)とAO3(新方法論・合理的設計)と連携して、これらの天然リガンド類の標的分子の解明を目指す。これにより生命科学研究に資する高活性グルタミン酸リガンドを創製することを目的とする。カイトセファリンの標的タンパク質の解明を視野に、本年度はその基礎となるアクロメリン酸Aの合成研究を実施した。具体的には、ヒドロキシプロリンから誘導できる有機亜鉛試薬とピリドン部位を有するプロモ体とのカップリング反応により、天然物のみならずさまざまな誘導体合成に対応できる合成法の開発に取り組んだ。その結果、ジアステレオ選択性には課題が残るものの、望む天然物を合成できた。アクロメリン酸Aのグルタミン酸受容体との結合特性はいまだ明らかでない。イオンチャネル型グルタミン酸受容体が候補と考えられているので、サブタイプ受容体選択性を調べるためにラット脳膜画分を用いた受容体結合実験を行った。現在、その解析を進めている。カイトセファリンについても、標的分子探索に向けて、構造修飾が可能な位置の推定とそこに焦点を絞った構造活性相関研究を展開している。天然由来のグルタミン酸受容体リガンドである、カイトセファリンおよびアクロメリン酸のケミカルバイオロジー研究により、高活性グルタミン酸受容体リガンドを創製することを目的とする。H25年度は(1)カイトセファリンアナログの合成と活性評価と(2)カイノイド類の新規合成法の開発を検討した。(1)カイトセファリンアナログの合成と活性評価:カイトセファリンとイオンチャネル型グルタミン酸受容体結合ドメインとのX線結晶構造解析から、カイトセファリンの芳香環部位を標的としたアナログを設計し、それらの合成を行った。現在、合成アナログのイオンチャネル型グルタミン酸受容体との結合活性を評価している。また、カイトセファリンが受容体と結合する際に、最小限必要と思われる官能基を備えたアナログ(炭素鎖8のジアミジカルボン酸アナログ)の合成にも取り組んだ。標的化合物には2つの不斉中心が存在するため不斉中心を作り分ける手法を開発することにした。その結果、ビスデヒドロアミノ酸エステルの触媒的不斉還元反応を行うことにより望む立体化学が制御できた。(2)カイノイド類の新規合成法の開発:前年度までに、アクロメリン酸を構成する複素環単位の1つであるピリドンカルボン酸ユニットを効率的に合成する経路を確立している。これをもとにピリドンカルボン酸と置換プロリンとのカップリングを検討した。しかし低収率に終わった。この点を解決する方法として、新たに4成分カップリング法に取り組んでいる。これとは別に、活性発現に重要な「4位」にさまざまな官能基を導入する合成法の開発にも取り組んだ。グルタミン酸受容体は哺乳動物における主要な情報伝達を担う。一方で、その失調はさまざまな脳神経疾患の引き金となることが、最近の研究から明らかになってきている。そのため、さまざまな角度からグルタミン酸受容体の機能を探る研究が活発に進められている。本研究では、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に結合し、その情報伝達を遮断する天然有機化合物、カイトセファリンと、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に結合し情報伝達を活性化する天然有機化合物、カイノイド類をモチーフとして、イオンチャネル型グルタミン酸受容体の機能解析に資する情報伝達制御分子を創製することを目的としている。H27年度は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブタイプの一つ、NMDA型受容体の可視化に向けて、NMDA型受容体と高い親和性を持つカイトセファリンへの蛍光基の付与を検討した。蛍光基を導入するためにはカイトセファリンの活性を損なうことなく、リンカーとなる炭素鎖を伸長する必要がある。これまでの知見を踏まえて、芳香環部位を炭素鎖伸長のための足掛かりとし、異なる炭素鎖を導入したカイトセファリン類縁体を合成した。それらのグルタミン酸受容体への結合親和性を評価したところ、カイトセファリンとほぼ同程度のNMDA型受容体結合親和性が確認できた。これにより、蛍光基導入にむけた基盤を構築できた。あわせて、4位にさまざまな官能基を付与するためのカイノイド類合成法の開発に取り組んだ。その結果、デヒドロアミノ酸エステルのラジカル環化反応を鍵として、カイノイドの母核となる3置換ジヒドロピロール類を短段階で構築できた。イオンチャネル型グルタミン酸受容体(iGluRs)は中枢神経系における興奮性の情報伝達を担う、主要な受容体の一つである。

記憶、学習などの高次脳機能や視覚の情報伝達に関与する一方で、脳虚血疾患における神経細胞死、アルツハイマー病やパーキンソン氏病と密接に関連していることが最近の研究において示唆されている。iGluRサブタイプに選択的に作用するリガンドを提供することができれば、サブタイプの役割を調べるための有用な研究ツールとなりうる。本研究では、天然由来のiGluRリガンドであるアクロメリン酸Aとカイトセファリンをテンプレートとする、iGluR選択的リガンドの創製を目的とした。最終年度にあたる本年度は、アナログ合成、iGluRサブタイプ結合親和性の評価、構造活性相関研究、受容体・リガンド結合様式の解析を含む、包括的な研究を実施した。特筆すべき成果として、7-epi-カイトセファリンが天然物を凌駕する優れたNMDA受容体選択的なリガンドであることを見出した。これにより当初掲げた研究目標を達成できた。キノコ毒として単離されたアクロメリン酸Aや放線菌から単離されたカイトセファリン(KCP)は天然由来の優れたグルタミン酸受容体リガンドである。これら天然物の潜在的な生物活性に着目した、脳神経系を標的とするケミカルバイオロジー研究を行った。その結果、天然物が結合する受容体(分子標的)に関する詳細な知見を得るとともに、天然物を凌駕する超活性リガンド分子として(7S)-KCPの創製に成功した。これより脳神経科学研究に資するリガンドが創製できた。天然由来のグルタミン酸受容体結合リガンドである、カイトセファリンおよびアクロメリン酸Aを題材に、標的探索・超単純化アナログの創製を目的とする、ケミカルバオロジー研究を行った。カイトセファリンについては、前年度までの構造活性相関研究により、活性発現に重要な役割を果たす部位でありかつ、アンタゴニスト活性発現を担うと予想される芳香環部位について、構造活性相関研究を進めた。その結果、芳香環上の置換基(水酸基、クロロ基)を取り払っても、活性がある程度維持できることがわかった。合成と活性評価に依存したカイトセファリンの構造活性相関研究を、より精度よく進めるために、受容体とカイトセファリンの共結晶を作成し、Xー線結晶構造解析を行った。その結果、NMDA型受容体ときわめて構造が類似しているAMPA受容体との共結晶構造の解析に成功した。これによりカイトセファリンの受容体結合様式に関する精密構造情報が得られた。アクロメリン酸Aの全合成研究をH24年度に引き続き、推進した。前年度までに確立した、アクロメリン酸Aの芳香環部位(ピリドンカルボン酸)構築法を基盤として、ヨウ素体あるいはスズ置換体へと導いた。これらをアクロメリン酸Aの母核であるピロリジン環部とクロスカップリング反応により連結することを想定した。その鍵となる、クロスカップリング反応の類例がなかったので、まず、基礎的知見を得るためのモデル実験を行った。鈴木・宮浦反応、根岸カップリング、薗頭反応、Stilleカップリング、Heck反応など、各種クロスカップリング反応を検討した結果、根岸カップリング反応以外において、良好にカップリング生成物を得ることができた。また、この検討の際中に、薗頭反応条件下、新規な多成分カップリング反応が進行することを、あわせて見出した。
遺伝子と還元剤の特異的反応特性を利用する変異原および薬物センサの開発

1)核酸の触媒反応特性およびメカニズムの解明銅(II)イオンを含有する核酸(DNA)が、ジチオスレイトール(DTT)やアミノエタンチオール(AET)などのある種のSII化合物に対して、酸化触媒作用を示すことを、速度論的、分光学的な手法を用いて次実証することを目的として研究を行った。その結果、この応答には核酸の塩基対間に結合した銅(II)イオンが直接関与し、分子状酸素によるDTTやAETの酸化反応の触媒として機能することがESRにより明らかとなった。また、この際消費された酸素はOIIラジカルを経て最終的に水に変換されることをスピントラップ法により確認した。さらに、DNA-Cu錯体はアスコルビン酸やフェロシアンイオンおよびNADHなどの他の還元剤に対しては全く応答を示さず、DNAの立体構造がある種の特異性を発現することが示唆された。以上、DNA-Cu錯体がミカエリスーメンテン型の速度論に従ってある種のSH化合物の酸化反応を触媒することが解明できた。2)遺伝子固定化膜を用いた変異原および薬物センサの開発DNA-Cu錯体のSH化合物に対する触媒作用が、遺伝子結合性薬物により濃度依存的に抑制される現象に着目し、遺伝子固定化膜を感応素子とする変異原センサの開発を行った。DNA(from calf thymus)を包括固定化したポリアクリルアミドゲルを酸素電極に装着しEDTA処理後、銅(II)イオン溶液中に浸しセンサーの感応膜とした。AETによる酸化触媒電流が得られた後、キナクリンやアクリジンオレンジなどの遺伝子結合性薬物を添加して阻害電流を記録した。AET10mMで得られたキナクリンの阻害電流と薬物濃度は10^<-7>M10^<-4>Mの濃度領域で直線的な相関関係を示し、簡単な膜の洗浄操作により繰り返し測定が可能であった。以上、DNA-金属錯体固定化膜はある種の薬物の分子認識膜として有用であり、新しい測定原理に基づく変異原センサーを創案することができた。
子宮体癌の発生に伴うクコシル化糖鎖発現異常の機序とその役割に関する研究

本研究では、1.体内膜細胞の癌化に伴うフコース転移酵素(FT)の量的及び質的変化に関する解析2.体癌細胞の転移に果たすフコシル化糖鎖の役割の解明の達成を目的とし、平成6年度研究において以下の成績を得た。1.正常子宮内膜8例、体癌組織14例についてα1-2、α1-3、α1-4FT活性を測定した所、体癌組織ではすべてのFT活性が有意に増加している事が判明した。さらに、高分化型体癌由来培養細胞株SNG-IIを体癌に特異的なフコシル化糖鎖であるMSN-I認識抗原(主としてLewis^b型糖鎖)の有無により2つの亜株に分別し、各々のFT活性を測定した結果、MSN-I認識抗原を強く発現する細胞(SNG-S)では、ほとんど発現しない細胞(SNG-W)に比べα1-4FT活性が著明に増加していた。以上より、体癌におけるフコシル化糖鎖の発現異常が、フコース転移酵素活性の支配をうけている事、中でもα1-4FT活性の変化が極めて重要な役割を果たしている事が強く示唆された。2.SNG-S細胞とSNG-W細胞の組織接着能を、ヒト子宮及びリンパ節組織AMeX包埋切片に対するin situ adheSion assayを用いて検討した所、SNG-WはSNG-Sに比べ約10倍の高い接着能を有する事、しかもその接着は、MSN-I認識抗原の前駆糖鎖に対するモノクローナル抗体により濃度依存性に阻害される事が判明した。同様の結果が、ヌードマウスを用いた両細胞の尾静注及び正所性移植による肺転移モデルでも確認さらた。以上より、体癌細胞の組織接着、転移能に、フコシル化糖鎖のひとつであるMSN-I認識抗原の前駆糖鎖が密接な関連を有する事が明かとなった。しかもこの前駆糖鎖の発現は、α1-4FT活性の支配を受けている事が示唆され、体癌の高転移能獲得の機序を解明する上でも、興味ある結果であると考えられた。本研究では、1.体内膜細胞の癌化に伴うフコース転移酵素(FT)の量的及び質的変化に関する解析2.体癌におけるMSN-1認識抗原の発現に関与する因子の解明3.体癌細胞の増殖や転移に果たすフコシル化糖鎖の役割の解明の達成を目的とし、平成5年度研究において以下の成績を得た。1.体癌株3株、頚癌株4株、卵巣癌株4株におけるalpha1-2FT、alpha1-3FT、alpha1-4FT活性を測定した結果、体癌株では、頚癌株、卵巣癌株に比べ、体癌株で高率に発現してくるI型糖鎖の合成に関与するalpha1-2FT、alpha1-4FT活性の亢進を認めた。また、alpha1-2FT、alpha1-4FT活性が高い培養細胞株程MSN-1の反応性が強くなる傾向が認められ、糖鎖の発現と糖転移酵素活性との間に密接な関連があることが判明した。2.体癌組織54検体において、MSN-1認識抗原の発現(免疫組織化学染色ABC法)、およびp53遺伝子、kiras遺伝子の点突然変異のスクリーニング(PCR SSCP解析)を行った。その結果、MSN-1認識抗原の発現と、p53遺伝子の点突然変異の出現との間には、負の関係が存在することが判明した。

すなわち、MSN-1認識抗原は、高分化な体癌程、早期の体癌程、リンパ節転移のない体癌程高率に発現するのに対し、p53遺伝子の点突然変異は、低分化な体癌程、進行した体癌程、転移を有する体癌程高率に出現した。3.SNG-II細胞を、マイクロセレクターを用いて、MSN-1認識抗原を強く発現するSNG-Sと、ほとんど発現しないSNG-Wに分け、そのMSN-1認識抗原量に差があることを、MSN-1免疫細胞化学染色、フローサイトメトリーを用いて明らかにした。SNG-SとSNG-Wにおける細胞増殖曲線より、両者の細胞倍加時間には差を認めず、また、CAS(Cell analysis cystems)を用いたDNA ploidyや増殖能の検索でも両者に差を認めていない。一方、両者のin vitroにおける形態には著しい差が認められ、SNG-SではSNG-Wに比べ多数の細胞内空胞が認められる。本研究では、1.体内膜細胞の癌化に伴うフコース転移酵素(FT)の量的および質的変化に関する解析2.体癌細胞の転移に果たすフコシル化糖鎖の役割の解明の達成を目的とし、平成6年度の研究において以下の成績を得た。1.正常子宮内膜8例、体癌組織14例についてα1-2、α1-3、α1-4FT活性を測定した所、体癌組織ではすべてのFT活性が有意に増加している事が判明した。さらに、高分化型体癌由来培養細胞株SNG-IIを体癌に特異的なフコシル化糖鎖であるMSN-1認識抗原(主としてLewis^b型糖鎖)の有無により2つの亜株に分別し、各々のFT活性を測定した結果、MSN-1認識抗原を強く発現する細胞(SNG-S)では、ほんとんど発現しない細胞(SNG-W)に比べα1-4FT活性が著明に増加していた。以上より、体癌におけるフコシル化糖鎖の発現異常が、フコース転移酵素活性の支配をうけている事、中でもα1-4FT活性の変化が極めて重要な役割を果している事が強く示唆された。2.SNG-S細胞とSNG-W細胞の組織接着能を、ヒト子宮及びリンパ節組織AMeX包埋切片に対するin situ adhesi on assayを用いて検討した所、SNG-WはSNG-Sに比べ約10倍の高い接着能を有する事、しかもその接着は、MSN-1認識抗原の前駆糖鎖(H型糖鎖)に対するモノクローナル抗体により濃度依存症に阻害される事が判明した。同様の結果が、ヌードマウスを用いた両細胞の尾静注及び正所性移植による肺転移モデルでも確認された。以上より、体癌細胞の組織接着、転移能に、フコシル化糖鎖のひとつであるMSN-1認識抗原の前駆糖鎖が密接な関連を有する事が明かとなった。しかもこの前駆糖鎖の発現は、α1-4活性の支配を受けている事が示唆され、体癌の高転移能獲得の機序を解明する上でも、興味ある結果であると考えられた。
疾患関連の異常翻訳後修飾蛋白質を特異的に人工的に細胞内で分解する新規手法の開発

癌原遺伝子産物Skiは癌細胞で過剰発現する。Skiは、翻訳後修飾SUMO化に関与する酵素Ubc9に結合し、Ubc9のSUMO化活性を増加する。これにより、癌抑制蛋白質p53を分解へ導くMDM2の、Ubc9によるSUMO化が増加する。SUMO化MDM2は、自己をユビキチン化して分解に導く活性が減少し、MDM2の細胞内濃度が増加する。SUMO化MDM2は、p53をユビキチン化して分解に導く活性は変わらないため、増加したSUMO化MDM2は、p53のユビキチン化による分解を促進する。最終的に、癌抑制蛋白質p53の細胞内濃度が減少し、癌化が進行する。本研究では、シャペロン介在性オートファジー(CMA)を利用して、正常MDM2やユビキチン化MDM2を分解せず、SUMO化MDM2のみを特異的に細胞内で分解し、癌抑制蛋白質p53の細胞内濃度を増加させ、癌化進行を抑制する手法を開発することを目指した。CMAに関与するHsc70が特異的に結合する配列(Hsc70bm)と、SUMO化MDM2が特異的に結合するSENP2の配列の融合蛋白質発現用プラスミドを構築し、細胞に導入した。また、CMAに関与するHsc70やLamp-2Aの強制発現用プラスミドも構築し、細胞に導入した。正常MDM2の発現量が顕著に変化せず、SUMO化MDM2の発現量が減少した。一方、Hsc70bm配列を有しないSENP2のみの配列の強制発現用プラスミドを構築し、Hsc70やLamp-2Aの強制発現用プラスミドと共に、細胞に導入した。正常MDM2もSUMO化MDM2も発現量は顕著に変化しなかった。これより、上記のSUMO化MDM2の発現量の減少はシャペロン介在性オートファジーで進行すると推定された。また、SUMO化MDM2の発現量が減少した時に、p53の発現量は減少しないように見受けられた。Hsc70bmとSENP2の融合蛋白質発現用プラスミドや、Hsc70やLamp-2Aの強制発現用プラスミドを細胞に導入することにより、2018年度の研究目的である、SUMO化MDM2のみを特異的に分解することができたから。SUMO化MDM2の発現量が減少した時に、p53の発現量は減少しないように見受けられたから。Hsc70bmとSENP2の融合蛋白質発現用プラスミドを、大腸癌モデルマウスの腫瘍に投与した場合の、正常MDM2とSUMO化MDM2の発現量を経時的に免疫染色で解析する。このプラスミドの導入により、正常MDM2の発現量は変化せず、SUMO化MDM2のみが特異的に分解され、発現量が減少するかを解析する。また、SUMO化MDM2の分解に伴い、MDM2によるp53の分解が抑制され、癌抑制蛋白質p53が増加するかを免疫染色で経時的に解析する。また、SUMO化MDM2の分解に伴い、癌抑制蛋白質p53が増加し、癌抑制効果が促進され、腫瘍の体積が減少するかを経時的に解析し、本研究で開発した新規手法による制癌効果を検討する。

Hsc70bmとSENP2の融合蛋白質発現用プラスミドや、Hsc70やLamp-2Aの強制発現用プラスミドを細胞に導入することにより、2018年度の研究目的である、SUMO化MDM2のみを特異的に分解することができたから。SUMO化MDM2の発現量が減少した時に、p53の発現量は減少しないように見受けられたから。Hsc70bmとSENP2の融合蛋白質発現用プラスミドを、大腸癌モデルマウスの腫瘍に投与した場合の、正常MDM2とSUMO化MDM2の発現量を経時的に免疫染色で解析する。このプラスミドの導入により、正常MDM2の発現量は変化せず、SUMO化MDM2のみが特異的に分解され、発現量が減少するかを解析する。また、SUMO化MDM2の分解に伴い、MDM2によるp53の分解が抑制され、癌抑制蛋白質p53が増加するかを免疫染色で経時的に解析する。また、SUMO化MDM2の分解に伴い、癌抑制蛋白質p53が増加し、癌抑制効果が促進され、腫瘍の体積が減少するかを経時的に解析し、本研究で開発した新規手法による制癌効果を検討する。消耗品の使用額がわずかに少なくて済んだため。2019年度分として請求した助成金と合わせて、効率的に使用する。
低血糖による動脈硬化促進機序の解明

GKラット頸動脈にバルーン障害を加え、腹腔内に生食投与群(S群)、インスリン(15U/kg)投与による反復低血糖群(S群)、インスリン(15U/kg)、ブドウ糖を同時投与による低血糖回避群(IG群)に分け検討した所、I群ではS群およびIG群と比較し細胞増殖を伴う有意な頸動脈新生内膜形成増加を認め、興味深い事にα1受容体拮抗薬の併用投与を行うと新生内膜形成の増加が有意に抑制された。ラット平滑筋の検討ではアドレナリン刺激により濃度依存的に細胞増殖能が増加しており、α1受容体拮抗薬前投与により細胞のG0/G1からS期への移行を抑制することで平滑筋細胞増殖抑制に寄与することが判明した。低血糖が動脈硬化進展に関わっている可能性が示唆されるも詳細なメカニズムは明らかではない。本研究では、11週齢GKラットの頸動脈をバルーンで傷害し、3日毎に生食を腹腔内投与する群(S群)、インスリン(15U/kg)を投与し繰り返し低血糖を起こす群(I群)、インスリン(15U/kg)と共にブドウ糖を投与し低血糖を回避する群(IG群)に分け、低血糖の新生内膜形成に与える影響について検討した。更に低血糖によるアドレナリン(AD)の増加が新生内膜形成に与える影響を検討するために、生食投与+普通食群(SN群)、生食投与+α1受容体拮抗薬(塩酸ブナゾシン)混餌群(SB群)、インスリン投与による低血糖+普通食群(IN群)、インスリン投与による低血糖+α1受容体拮抗薬混餌群(IB群)に分け、バルーンによる血管傷害後、3日毎にこれらの注射を繰り返した。また、培養ラット血管平滑筋(SMC)を用いてAD刺激による細胞増殖に関して検討した。S群およびIG群と比較しI群では低血糖と血中ADの増加を認めた。この結果、I群ではS群およびIG群と比較し、細胞増殖を伴って、頸動脈の血管傷害後の新生内膜形成は有意に増加していた。一方で、低血糖によりADの増加を認めたものの、α1受容体拮抗薬を投与しているIB群では、IN群と比較し細胞増殖の抑制と伴に血管傷害後の新生内膜形成の増加が有意に抑制されていた。In vitroではラットSMCはAD刺激により濃度依存的にBrdUで評価した増殖能の有意な増加を認めた。一方でAD作用はα1受容体拮抗薬を同時に投与することにより有意に抑制された。これらの結果、繰り返す低血糖刺激によるAD作用の増加はα1受容体を介してSMCの増殖をもたらし、血管傷害後の新生内膜形成を促進させる可能性が示唆された。本研究は、冠動脈形成術などを施行された糖尿病患者の管理において、低血糖の発症により留意すべきであることを示唆する意義のある研究と考えている。低血糖が心血管イベントを増加させるメカニズムとして、急激な低血糖は交感神経を活性化させ大量のエピネフリンを放出させ、心血管系へ影響を与えること、あるいは、低血糖は、炎症、血小板機能、凝固や線溶に影響を与え、心血管イベントの発症に関与している可能性が示されている。しかし、実際の作用機序や実際にプラークの破綻に低血糖が関わっているかは不明な点が多い。そこで、本研究は、動脈硬化モデルであるapoE欠損マウスのプラーク破綻に重症低血糖が影響を与えるか否かを検討した。apoE欠損マウスに普通食を投与し、12週令時点でマウスの右頸動脈に150μm径のワイヤーを伴走させた上で2か所結紮し、ワイヤーを取り除き、狭窄部を作成した(不安定プラーク形成モデル)。このマウスに5週間の間、週1回もしくは2回インスリンを腹腔内に投与し繰り返し低血糖を引き起こすモデルを作成した。コントロールには生食を注射した。その後、還流固定し、大動脈を抽出した。大動脈の切片を作成し、動脈硬化の面積を比較検討するため、切片をoil redO染色した。インスリンを注射すると実際に血糖値が50mg/dl以下程度に低下することを確認した。インスリンあるいは生食を投与中に3群間に摂食量や体重に大きな差を認めなかった。大動脈の切片に関しては、3群間でoil red O陽性面積に差を認めなかった。すなわち、低血糖の回数が増えても動脈硬化が促進することはなかった。以上より、apoE欠損マウスおいて低血糖は動脈硬化層の面積を増加させることはなかった。今後は、本研究の主要な目的であるプラークの質への低血糖の影響を検討する。低血糖が動脈硬化進展に関わっている可能性が示唆されているが、詳細は明らかではない。本研究では低血糖モデルラットを作成し、低血糖が血管障害後の内膜新生に与える影響を検討し、in vitroではその詳細なメカニズムを検討した。11週齢GKラットの頸動脈をバルーンで傷害し、3日毎に生食を腹腔内投与する群(S群)、インスリン(15U/kg)を投与し繰り返し低血糖を起こす群、インスリン(15U/kg)と共にブドウ糖を投与し低血糖を回避する群(IG群)に分け、低血糖の新生内膜形成に与える影響について検討したところ、各群間で体重や脂質代謝に関しては差を認めなかったが、I群ではS群およびIG群と比較し、細胞増殖を伴い頸動脈の血管傷害後の新生内膜形成が有意に増加した。

低血糖によるアドレナリンの増加が新生内膜形成に与える影響を与えていると考え、次に生食投与+普通食群(SN群)、生食投与+α1受容体拮抗薬(塩酸ブナゾシン)混餌群(SB群)、インスリン投与による低血糖+普通食群(IN群)、インスリン投与による低血糖+α1受容体拮抗薬混餌群(IB群)の4群で検討した所、低血糖によりアドレナリンの増加を認めたもののα1受容体拮抗薬を投与しているIB群では、IN群と比較し細胞増殖の抑制と伴に血管傷害後の新生内膜形成の増加が有意に抑制された。以上から低血糖の際のアドレナリン作用によりバルーン障害後の内膜新生が亢進されると考えられた。更にIn vitroではラットSMCはアドレナリン刺激により濃度依存的にBrdUにて評価した増殖能は有意に増加し塩酸ブナゾシンを前投与することで抑制できた。以上から繰り返す低血糖によるアドレナリン作用の増加は、平滑筋細胞の増殖を促進し、バルーン傷害後の内膜の新生が増加することが示唆され、臨床においては特にインスリン治療中の患者の低血糖の合併に十分留意する必要がある。GKラット頸動脈にバルーン障害を加え、腹腔内に生食投与群(S群)、インスリン(15U/kg)投与による反復低血糖群(S群)、インスリン(15U/kg)、ブドウ糖を同時投与による低血糖回避群(IG群)に分け検討した所、I群ではS群およびIG群と比較し細胞増殖を伴う有意な頸動脈新生内膜形成増加を認め、興味深い事にα1受容体拮抗薬の併用投与を行うと新生内膜形成の増加が有意に抑制された。ラット平滑筋の検討ではアドレナリン刺激により濃度依存的に細胞増殖能が増加しており、α1受容体拮抗薬前投与により細胞のG0/G1からS期への移行を抑制することで平滑筋細胞増殖抑制に寄与することが判明した。繰り返す低血糖がアドレナリン(AD)作用の増加を介してラットの平滑筋細胞の増殖と血管傷害後の新生内膜形成を促進させることを既に論文報告した。即ち11週齢GKラットの頸動脈をバルーンで傷害し3日毎に生食を腹腔内投与する群(S群),インスリン(15U/kg)を投与し繰り返し低血糖を起こす群(I群),インスリン(15U/kg)と共にブドウ糖を投与し低血糖を回避する群(IG群)に分け低血糖の新生内膜形成に与える影響について検討した。更に低血糖によるAD増加が新生内膜形成に与える影響を検討するために生食投与+普通食群(SN群),生食投与+α1受容体拮抗薬(塩酸ブナゾシン)混餌群(SB群),インスリン投与による低血糖+普通食群(IN群),インスリン投与による低血糖+α1受容体拮抗薬混餌群(IB群)に分け、バルーンによる血管傷害後3日毎にこれらの注射を繰り返した。又培養ラットSMCを用いAD刺激による細胞増殖に関して検討した。S群およびIG群と比較しI群では低血糖と血中ADの増加を認めた。この結果I群ではS群およびIG群と比較し細胞増殖を伴って、頸動脈の血管傷害後の新生内膜形成は有意に増加していた。一方で低血糖によりADの増加を認めたもののα1受容体拮抗薬を投与しているIB群では、IN群と比較し細胞増殖の抑制と伴に血管傷害後の新生内膜形成の増加が有意に抑制されていた。In vitroではラットSMCはAD刺激により濃度依存的にBrdUで評価した増殖能の有意な増加を認めた。また、ADは細胞増殖シグナルERKの活性化とフローサイトメトリの検討から細胞のS期へ移行を促進させていることがわかった。これらのADによる作用はα1受容体拮抗薬を同時に投与することにより有意に抑制された。本研究では予定実験はプロトコールどおり進み検体は既に抽出済で今後抽出した検体の病理学的な評価を中心に行う。代謝内分泌学(糖尿病学・内分泌学)
証明スコア法に基づく革新的仕様検証技術の研究

証明スコア法により問題仕様(問題領域や応用領域における組織、規則、活動、処理の仕様やモデル)の検証を可能とする革新的仕様検証技術の開発を目指して研究を行い、以下の成果を得た。1適切な抽象度の実現法について、提案している観測遷移シヌテム(OTS:Observational Transition System)がデータ型とプロセス型を適切に定義することで、適切な抽象度を実現する一般的なスキーマと成り得ることを、実用規模の事例開発を通じて確認した。2推論型×探索型検証法の実現法について、(1)帰納法に基づく反例発見法(IGF:Induction Guided Falsification)と(2)推論に基づく抽象化と探索に基づく反例発見を組み合わせる方法、の2つの方法が有効であることを例題に基づき確認した。3電子商取引プロトコル事例については、上記の「推論型×探索型検証法」を実例に基づき確認することに焦点を当てて研究を行った。具体的にはiKP(Internet Keyed Payment Protocols)を取り上げ、帰納法に基づく反例発見法(IGF)の有効性を確認した。この事例開発では、CafeOBJ言語システムで形式仕様を開発し、Maude言語システムの高効率の探索機能を利用する方法論についても研究を行い、そのための方法論と支援ツールも開発した。
インスリン非依存型糖尿病の発症機構に関する研究

膵島内でのグリセルアルデヒド(GA)の蓄積がインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)の発症あるいは進展に関与する可能性があると考えられるので,膵島中におけるGAの有無を調べるとともにその定量を行うことにした。まず,その定量に用いるべきトリオキナーゼ(GAをリン酸化する酵素)をブタ腎臓から完全に精製した。精製は,ポリエチレングリコール分画,陰イオン交換クロマトグラフィー,ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー,疎水的クロマトグラフィー,およびゲル濾過により行った。本酵素は同じサブユニット2つからなり,分子量は12.2万であった。D-グルセルアルデヒドに対するKmは11μMと小さく,最適pHは7.5であり,また比較的安定で,GAの定量に適した性質を有していた。ついで,本酵素を用いる膵島中GAの定量法を確立した。本法は,GAにトリオキナーゼとグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を作用させてNADHを生じさせ,それを酵素的サイクリング法で増幅した後、生成したNADHの蛍光強度を測定するものである。単離ラット膵島を20mMグルコース含有メディウム中で1および5時間培養した際のGA量は,それぞれ約70および270fmol/膵島となり,膵島中には確かにGAが存在し,また高グルコース持続下ではGA量が著明に増加することがわかった。GAはグルコースに比べ,グリケーションや自動酸化による細胞障害作用がはるかに強いことを考え合わせると,この結果はGA蓄積が膵島B細胞障害を引き起こし,それがNIDDMの発症あるいは進展の原因となりうることを示唆する。精製グルコキナーゼ(GK)にグリセルアルデヒド(GA)を作用させると,濃度依存的な活性阻害が起った。阻害は不可逆的であった。高濃度グルコース共存下では不活性化は完全に阻止されたが,基質ではないガラクトースや3-0-メチルグルコースを共存させても全く阻止されなかった。GAを作用させたGKのアミノ酸分析の結果,GA処理によりリジン残基が修飾されることがわかった。これらから,GAはGKの活性部位のリジン残基をグリケートすることによりGKを失活させると考えられる。GAはGK以外の解糖系酵素(ヘキソキナーゼI型,ヘキソキナーゼII型,グルコースリン酸イソメラーゼ,ホスホフルクトキナーゼ,グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素,ピルビン酸キナーゼ)に対してはほとんど阻害しないか,あるいはわずかに阻害するのみであった。従って,GAはかなり特異的にGKに作用すると考えられる。ラット単離膵島に6mM GAを37°Cで1時間作用させると,ヘキソキナーゼ活性には全く変化がなかったが,GK活性は有意に低下した。また,その際GA刺激およびロイシン刺激インスリン分泌能には影響がなかったのに対し,グルコース刺激インスリン分泌能は有意に低下した。膵島を1mMGA存在下で17時間培養してもGK活性およびグルコース刺激インスリン分泌能の有意な低下が見られた。以上の結果から,GAはGKをグリケートして失活させ,それによりグルコース刺激インスリン分泌能が低下すると考えられる。GAは膵島内で生じると考えられるので,生体内においても上記と同様のことが起りうるか否かについて鋭意研究中である。また,GAによるGKの失活が,糖尿病時における膵島のグルコースアノマー感受性の変化と関連があるかどうかについても検討中である。

D-グリセルアルデヒドに対するKmは11muMと小さく,最適pHは7.5であり,また比較的安定で,GAの定量に適した性質を有していた。ついで,本酵素を用いる膵島中GAの定量法を確立した。本法は,GAにトリオキナーゼとグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を作用させてNADHを生じさせ,それを酵素的サイクリング法で増幅した後,生成したNADHの蛍光強度を測定するものである。単離ラット膵島を20mMグルコース含有メディウム中で1および5時間培養した際のGA量は,それぞれ約70および270fmol/膵島となり,膵島中には確かにGAが存在し,また高グルコース持続下ではGA量が著名に増加することがわかった。GAはグルコースに比べ,グリケーションや自動酸化による細胞障害作用がはるかに強いことを考え合わせると,この結果はGA蓄積が膵島B細胞障害を引き起こし,それがNIDDMの発症あるいは進展の原因となりうることを示唆する。
民族誌資料としての琉球風俗画の基礎研究

平成7年度以降、三ヵ年にわたって「琉球風俗画」の調査および研究をおこなった。このなかで、「琉球風俗画」の中にこれまで知られていなかった資料ををいくつか加えることができた。新出資料のうちもっとも重要なものは『宮良長延坐像』である。中国の西洋写実画の系譜をくむ技法であるという絵画史上の価値に加えて、石垣島の頭職の風俗を考える上で重要である。またこの肖像画は、戦争で焼失した第二尚氏歴代の肖像画である「御後絵(うぐえ)」を復元する際に欠くことのできない資料となりうる。同じく新出のジュリ(尾類)という那覇・辻の娼婦を描いた風俗画は、高級娼婦の姿を知る資料としてのみならず、八重山の「うやんまあ」を描いた風俗画とならんで琉球美人画の代表作としても高く評価されるものであろう。こうした新出資料のほかに、『那覇港貿易図屏風』のような大画面に描かれている士族や平民のさりげない描写のなかに、多くの文化要素が抽出でき、それが描かれた時期の風俗を考える重要な資料となり得ることを確認しえた。現存する「琉球風俗画」はいくつかの伝写系統にまとめることができる。そしてそのなかには18世紀を遡る作品は存在しないといっていい。理由のひとつに戦争がある。沖縄戦のなかで失われた文化財は数多くあるが、絵画も焼失文化財のひとつに加えられる。そしていまひとつの理由は、18世紀以前にはかかる風俗画を必要としなかったのではないかというものである。「琉球風俗画」の研究の最大の成果は、この種絵画の内在する問題点の確認にあったといって過言ではない。そして、まさにそれ故に、琉球絵画史というひとつの研究分野を開拓する可能性を見い出したし、風俗研究資料としても欠くべからざる存在であることを指摘しえた。しかし、ともかく研究の緒にはついたのである。今年度は『八重山風俗図』(石垣市立八重山博物館)および『十王図』(石垣市桃林寺蔵)など石垣島地区の琉球風俗画について調査を行ない,画像入力,Phot.C.D化を終えた。前者は廃藩置県直後の八重山風俗を伝えるものとして,重要であり,また後者は日本最南端の『十王図』であり,かつヤマト出来であることが確認できた(『十王図』に関しては東京国立文化財研究所美術部中野照男技官の研究協力を得た)。また滋賀大学経済学部資料館保管の『那覇港貿易図』の調査も併せて行ない,およそ300人ほどの人物について画像入力を行なった。本年度は国内の琉球資料(絵画)の所在調査を行なう傍ら、引き続き画像入力の行なっている。その中で、東京国立博物館保管の『琉球風俗画巻』が、奄美大島における風俗画であり、『南島雑話』系の善本であることが確認できた。また、未調査ではあるが、石垣島いおいて『八重山風俗図』と深く関わる、蔵元絵師系の絵画作品を一点確認し、来年度の調査を接衝中である。
ライソゾーム性筋疾患の分子病態解明と治療法開発に関する研究

AVMについては、LAMP-2欠損症において相同性の高いLAMP-1の過剰発現により治療可能かどうかを見ることを目的として、LAnfP-2ノックアウト(KO)・LAMP-1過剰発現マウスを作製した。まず、LAMP-2KOマウス骨格筋の表現型を解析した。トレッドミルでの生理学的テストでは、最高運動能力では野生型マウスと差がなかったものの、持続運動能力は著明に劣っていた。単離した骨格筋の収縮力測定では、野生型マウスと同様の収縮力を示した。筋病理解析では、筋線維内にリソソームの集積などヒトLAMP-2欠損症で見られる病理像を再現していた。また、縁取り空胞は局在した筋線維に形成されていた。次に、LAMP-1過剰発現Tgマウスを作製した。このマウスは、はぼ正常と同様に産出し、外観上異常は認められなかった。掛け合わせで得られたLAMP-2KO・LAMP-1過剰発現マウスは、持続運動力に改善が見られた。この結果は、LAMP-1の過剰発現により、LAMP-2欠損症が治療可能であることを強く示唆した。DMRVについては、DMRVモデルマウス(GNEノックアウトで変異GNEを発現するマウス)を用いて、筋線維内にリソソームの集積などの病理解析を行った。アミロイド沈着が縁取り空胞形成に先行することが明らかになった他、リソソームの集積は主にタイプ2B線維に観察された。また、筋線維内分布は、LAMP-2KOマウスでの空胞形成と同様であり、両者の発症機序を考える上で、興味深い結果が得られた。DMRV患者で認めるGNEミスセンス変異を有する組み換え蛋白質を作製し、酵素活性を測定した。GNEドメインの変異ではGNE活性の低下を、MNKドメインの変異ではMNK活性の低下を認めた。in vitroでの実験から、患者細胞(皮膚線維芽細胞および筋管細胞)では低シアリル化を来していること、この低シアリル化は、GNE代謝産物の投与により回復可能であることを示した。現在、本邦DMRV患者で最も多いc.1765G>C(V572L)変異を有するヒトGNE transgeneを導入したマウスとヘテロ接合型GNEノックアウトマウスを交配させ、GNEノックアウト・バックグランドで、V572L変異を有するGNE-/-,Tg GNE c.1765G>Cを作製中である。今後、行動テストおよび組織学的解析を行い、DMRVのモデルマウスとして使用可能かを検討する予定である。オートファジープロセスの可視化については、現在Tg LC3-GFPマウスとLAMP-2ノックアウトマウスを交配中である。これまでの研究から、DMRVでは、GNEミスセンス変異により、低シアリル化を来していること、少なくともin vitroでは、GNE代謝産物またはシアル酸の投与により回復可能であることを示してきた。そこで、本邦DMRV患者で最も多いc.1714G>C(V572L)変異を有するヒトGNE transgeneを導入したマウスとヘテロ接合型GNEノックアウトマウスを交配させ、GNEノックアウト・バックグランドで、V572L変異を有するGNE-/-,TgGNE c.1765G>Cを作製した。このマウスは、生後32週以降より、筋力低下、CK値上昇、骨格筋内での小角化線維出現とアミロイド沈着を認め、さらに54週以降で、縁取り空胞を認めた。このことは、我々が世界で初めて、DMRVモデルマウスの作製に成功したことを示している。興味深いことに、我々のマウスでは、ヒトと異なり、前頚骨筋よりも腓腹筋が、またハムストリングよりも大腿四頭筋が強く侵されていた。