hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬物の前房水移行に関する研究

本研究は薬物の経口および静注投与による眼前房中への移行を薬動学的に明らかにする目的で行ったものである。Cefaclor(CCL)を家兎に経口および静注して経時的に血漿中濃度を測定し、併せて前房中濃度を定量した。ヒトにおいては白内障手術に伴う眼感染症防止のためCCLを投与された患者の血漿中濃度を経時的に測定すると共に前房中濃度を一点採取して定量した。[結果]家兎の血漿中薬物濃度ピークは経口投与30分後に現われ、前房水濃度のそれは1.5時間後にみられた。静注投与での血漿中薬物濃度は急速に低下し房水中濃度のピークは投与30分後に認められた。これら血漿中および房水中薬物濃度の推移からmadified3-compartment modelを構築しpharmacokinetic parametersを求めた。血漿-房水間の移行速度を表わすKin,Koutは経口で1.03±0.21,13.26±0.46【hr^(-1)】,静注で1.51±0.12,9.90±2.53【hr^(-1)】が得られた。得られた各種pharmacokinetic parametersを用いて新たな家兎での血漿中薬物濃度から房水中濃度を微分式を用いて予測した。経口,静注とも房水中濃度の実測値はこの理論値によくfitすることが認められた。次に白内障手術に伴う眼感染症防止のためCCL500mg,1000mg/bodyを一回経口投与されたヒトの血漿中および房水中濃度を経時的に測定し、房水を一点採取して薬物濃度を測定した。血漿中薬物濃度のピークは500mgで2時間後、1000mgで3時間後に現われ各々5.57,13.03μg/ml/であった。房水濃度のピークはいずれも3時間後に現われ各々0.62,1.05μg/mlであった。血漿中および房水中濃度の推移からmodified2-compartment modelを構築しparametersを求めた。KinおよびKoutは各々1.50,12.90【hr^(-1)】が得られ家兎の経口時と類似するものであった。各種parametersを用いて新たなヒトでの血漿中薬物濃度から房水中薬物濃度を予測すると実測値は理論値にfitした。以上ここで用いた薬動学的手法により血漿中濃度から前房中濃度の予測が可能であることが明らかとなった。
生体成分と高分子材料表面との相互作用

人工臓器の中で,現在最も多量に用いられている人工腎臓における生体成分との相互作用において,大きな問題点となっているのは,透析膜表面と補体成分との相互作用である.本研究においては,血液透析膜素材の大部分を占めるセルロース膜と補体との相互作用を調べた.ここでは特にセルロースの補体活性を抑制するための化学修飾セルロース膜と補体分子との相互作用について述べる.我々はセルロース膜の表面部分のOH基へのエステル化反応によりポリエチレングリコール(PEG)をグラフトカップリングしてセルロース表面と補体成分との相互作用を減少させ,バルク特性を変化させることなくセルロースの補体活性化を減少させることを試みた.また,比較のためにパルミチン酸(C16)もグラフトカップリングした.まずCH50測定では, CH50の減少度は,未修飾セルロースでは50%であるが, PEGをグラフトすると改善された.しかし,その改善の程度はグラフトするPEGの分子量が低いほど大きく,分子量が400と1000のPEGによるグラフトでは20%に改善された.C5_a測定では,未修飾セルロースは, 400ng/ml, PEG400グラフトで130ng/ml, C16グラフトで250ng/mlであり, PEGをグラフトすることによって大幅に改善された.次にこれらの膜へのタンパク質吸着を測定した. C16グラフトでは反応時間とともにタンパク質吸着量は増加したが, PEGでは未修飾セルロースと変わらなかった.これはC16グラフトでは血漿タンパク質の吸着によって補体成分との相互作用が減少するという, Eberhartらの報告と一致する.しかし,この表面はBSAと同様にIgGも吸着しており,これは補体系の古典経路を活性化する可能性がある.一方PEGではそのような作用とは異なり, PEG鎖がセルロース表面をカバーすることによって補体活性化が減少したと考えられる.これは水溶性グラフト鎖による生体成分との相互作用の減少によるものと考えている.人工臓器の中で,現在最も多量に用いられている人工腎臓における生体成分との相互作用において,大きな問題点となっているのは,透析膜表面と補体成分との相互作用である.本研究においては,血液透析膜素材の大部分を占めるセルロース膜と補体との相互作用を調べた.ここでは特にセルロースの補体活性を抑制するための化学修飾セルロース膜と補体分子との相互作用について述べる.我々はセルロース膜の表面部分のOH基へのエステル化反応によりポリエチレングリコール(PEG)をグラフトカップリングしてセルロース表面と補体成分との相互作用を減少させ,バルク特性を変化させることなくセルロースの補体活性化を減少させることを試みた.また,比較のためにパルミチン酸(C16)もグラフトカップリングした.まずCH50測定では, CH50の減少度は,未修飾セルロースでは50%であるが, PEGをグラフトすると改善された.しかし,その改善の程度はグラフトするPEGの分子量が低いほど大きく,分子量が400と1000のPEGによるグラフトでは20%に改善された.C5_a測定では,未修飾セルロースは, 400ng/ml, PEG400グラフトで130ng/ml, C16グラフトで250ng/mlであり, PEGをグラフトすることによって大幅に改善された.次にこれらの膜へのタンパク質吸着を測定した. C16グラフトでは反応時間とともにタンパク質吸着量は増加したが, PEGでは未修飾セルロースと変わらなかった.これはC16グラフトでは血漿タンパク質の吸着によって補体成分との相互作用が減少するという, Eberhartらの報告と一致する.しかし,この表面はBSAと同様にIgGも吸着しており,これは補体系の古典経路を活性化する可能性がある.一方PEGではそのような作用とは異なり, PEG鎖がセルロース表面をカバーすることによって補体活性化が減少したと考えられる.これは水溶性グラフト鎖による生体成分との相互作用の減少によるものと考えている.
クツラベ病における欠損酵素のクローニング遺伝子異常の解析と遺伝子治療の試み

クラッベ病の欠損酵素であるgalactocerebrosiraseのクローニングをめざし、平成3年度に精製酵素を用い常法にてモノクローナル抗体を作成した。得られたLgG1クラスのモノクローナル抗体1-9-1-9にて発現ベクターλgt11のヒト胎盤由来のcDNAライブラリーをスクリーニングしたが有意のpositive cloneを得る事が出来なかった。そこで精製酵素のアミノ酸配列からオリゴヌクレオナドを合成しこれをブローブとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを計画した。精製酵素をSDS-PAGEで分離した分子量約10万のバンドをPVDF膜に転与しN端のアミノ酸配列を気相シークエンサーにて求めたところ最高でアミノ酸14残基まで解続できた。このN端アミノ酸配列より予想されるいくつかのオリゴマーを合成し、これをブローブとして上記のλgt11のcDNAライブラリーをスクリーニング中である。またアミノ酸の内部配列を調べるため、PVDF膜に転写後の蛋白を膜上で酵素消化しペプチドマッピングをとり、得られたペプチドのアミノ酸情報を現在解析中である。当初、正常人胎盤を材料としてGalactocerebrosidaseの抽出法を確立したが、正常人白血球の入手が可能となったため、以後白血球から分離精製を行った。一回量約500gの白血球沈さをリン酸緩衝液とともにミキサ-でhomogenateし、1%のSodium Taurocholate(TC)を界面活性剤として用い1%濃度にて一晩撹拌して抽出した。遠心上清をTC濃度0.4%としOctylーSepharose(700ml)カラムにアプライし4%Sodium Taurocholateで溶出した。次に活性分画をConAーSepharose(30ml)カラムにアプライし0ー0.5M MgCl_2.0ー0.8Mαーmethylmannopyranosideのgradient elutionをおこない、さらに酵素分画をPhenylーSepharose(20ml)カラムにアプライし、Sodium Taurocholate 1ー10%のgradient elutionを行い酵素活性を指標に精製した。PhenylーSepharose(2ml)にて濃縮後、高速液体クロマトグラフィ-装置でゲル瀘過カラム(東洋ソ-ダSWP)を用いて精製した。精製した蛋白はゲル瀘過では分子量約10万、SDS電気泳動にて分子量約9万のバンドを認めた。現在までに総重量5100gの白血球を処理し、Galactocerebrosidaseを蛋白量として約500ー600μg、比活性として58000nmol/h/mg.proteinの蛋白を得た。これはGalactocerebrosidaseのモノクロ-ナル抗体の作成とアミノ酸配列決定に足ると思われるので、これを用いてモノクロナ-ル抗体の作成中である。クラッベ病はリソソ-ム酵素であるgalactosylcerebrosidasイの欠損によって起きる脂質代謝異常症である。この原因酵素のクロ-ニングをめざし、まず正常人のリンパ球4kgから本酵素約500μgを精製した。今年度はこの精製酵素を用い,モノクロ-ナル抗体の作成を行った。免疫方法はBALB/cマウスに希釈した精製酵素溶液をFreundのアジュバントと共に皮下注にて5ー6回投与した。マウスは6匹を免疫し血清の抗体価の上昇を認めた2匹に静注して最終免疫をして壙臓を摘出しミエロ-マ細胞と細胞融合を行った。スクリ-ニング法はELISちを用い精製酵素容液をプレ-トに吸着し、酵素を可溶化しているタウロコ-ル酸の入った緩衝液を対照として吸着させ、メディウム上清を第一抗原として吸光度を測定した。その結果最初のスクリ-ニング時に42wellにコロニ-を認め、4個のクロ-ンを選択した。そのハイブリド-マから腹水として抗体溶液を採取し、本酵素に対する単クロ-ン抗体であることを、ドットブロット法、免疫沈降法、Western法などで確認を進めているところである。また精製酵素の一部からアミノ酸配列を解析中であり、酵素の生化学的カイネティックスについても調べていく予定である。
立体選択的分子内ハロアミノ化反応の開発とその天然物合成への応用

私は、分子内ハロアミノ化反応の検討の課程においてアルデヒドと1,2-ジアミン由来のアミナールの興味深い反応を見出し、これについて引き続き研究を行っている。昨年度までに、アルデヒド由来アミナールをNBSと反応させることで、イミダゾリンが得られることを見出した。イミダゾリンは多くの生理活性化合物中に見られる重要な骨格である。本法はアルデヒドとジアミンからイミダゾリンを得る初めての方法であり、穏和な条件下で行うことが可能な優れた手法である。本年度は、本法を利用する抗腫瘍活性など様々な生物活性を持つ海綿由来のビスインドールアルカロイドの一種である天然物spongotine Aの全合成を行った。開発した反応を適用することで、Spongotine A基本骨格であるイミダゾリン-ケトン構造を効率よく合成することに成功し、初めての不斉全合成に成功し、本法の有用性を示すことができた。また、これまで本法はイミダゾリンの2位に置換基を有するものに限られていたが、用いる基質を工夫し、アルデヒドにグリオキサル酸を用いることで、脱炭酸を経る興味深い反応により、2位にプロトンを持つイミダゾリンの合成にも応用できることも明らかにした。一方、昨年度までに芳香族アルデヒドとエチレンジアミンとβ-ケトエステルが縮合しエナミノエステルを持つ[1,4]アゼパン骨格を持つ化合物が得られる新規3成分反応を見出している。本年度は、本反応の基質の拡張を目指し、エチレンジアミンの代わりに1,2-フェニレンジアミンを用いる反応への適用を試みた。本反応系においては、試薬の加え方等の実験操作に工夫を要したが、1,2-フェニレンジアミン、芳香族アルデヒド、β-ケトエステルとの3成分を縮合することに成功しワンポットで1、5-ベンゾジアゼピン骨格を構築することに成功した。現在までにシクロヘキサジエンアルデヒドと光学活性C_2対称ジアミン由来のジエンアミナールの分子内ハロアミノ化反応により、ジエンの非対称化を伴う複数の反応を経ることで、多数の不斉中心を持つ含窒素化合物が一気に得られることを見出している。この化合物は、官能基変換が容易な二重結合やプロモ基を有しているため天然物合成のキラルシントンとして大変有用である。このキラルシントンを利用することで、生物活性アルカロイドの一種であるγ-lycoraneの合成に応用した。また、分子内ハロアミノ化反応の検討の際、アルデヒド由来アミナールをNBSと反応させるとアミナールが酸化され、イミダゾリンが得られることを見出した。イミダゾリンはその骨格を持つ医薬品もあり生物活性的に興味深く、またイミダゾールなどの合成中間体としても有用である。これまでイミダゾリンの主な合成法はニトリルやエステルを原料として用いるものが知られているが強酸や高熱を必要としたり、ニトリル化合物の調整には有毒なNaCNなどを用いなければならないなどの問題があった。今回見出したアミナールからのイミダゾリンの合成法は従来の問題点を解決する新たな手法になると考えて詳細に検討した。その結果、本法は中性条件下、室温付近で行える穏和な方法であり、脂肪族および芳香族いずれのアルデヒドにも適用可能で、エステルやニトリルをはじめ種々の官能基が存在しても行える優れた手法であることを明らかとした。私は、分子内ハロアミノ化反応の検討の課程においてアルデヒドとジアミン由来のアミナールの興味深い反応を見出し、これについて引き続き研究を行っている。昨年度はアルデヒド由来アミナールをNBSと反応させることで、アミナールを酸化し、イミダゾリンが得られることを見出した。本法はアルデヒドとジアミンからイミダゾリンを得る初めての方法であり、従来のエステルやニトリルを原料として用いるものに比べ温和な条件下で行うことができる優れた手法である。本年度は、本法をより実用的な反応へと拡張するために、様々な基質に適用を試み、その適用範囲を広げることに成功した。また、溶媒として塩化メチレンを用いていたが環境に配慮した反応へと改善するために溶媒の検討を行い代替溶媒としてtert-ブチルメチルエーテルが使用できることを見出した。一方、アミナールはアルデヒドとジアミンの組み合わせによってイミン体との平衡状態にある。アミナールと良く似た構造を持つ汗タールや単純イミンへの求核反応は広く研究されている。そこで、アミナールと求核種との反応に興味をもち検討した結果、求核種としてβケトエステルを用いることで新規な3成分反応が起こることを見出した。すなわち本反応によって、芳香族アルデヒドとエチレンジアミンとβケトエステルが縮合しエバミノエステルを持つ[1,4]アゼパン骨格を持つ化合物が得られる。一般にβケトエステルは従来α位での反応性が高いが、本反応はβケトエステルがγ位で反応した珍しい、興味深い反応であるといえる。本反応における生成物はさまざまな官能基変換が可能であり医薬品合成など様々な誘導体合成に適している。

本年度は、本法を利用する抗腫瘍活性など様々な生物活性を持つ海綿由来のビスインドールアルカロイドの一種である天然物spongotine Aの全合成を行った。開発した反応を適用することで、Spongotine A基本骨格であるイミダゾリン-ケトン構造を効率よく合成することに成功し、初めての不斉全合成に成功し、本法の有用性を示すことができた。また、これまで本法はイミダゾリンの2位に置換基を有するものに限られていたが、用いる基質を工夫し、アルデヒドにグリオキサル酸を用いることで、脱炭酸を経る興味深い反応により、2位にプロトンを持つイミダゾリンの合成にも応用できることも明らかにした。一方、昨年度までに芳香族アルデヒドとエチレンジアミンとβ-ケトエステルが縮合しエナミノエステルを持つ[1,4]アゼパン骨格を持つ化合物が得られる新規3成分反応を見出している。本年度は、本反応の基質の拡張を目指し、エチレンジアミンの代わりに1,2-フェニレンジアミンを用いる反応への適用を試みた。本反応系においては、試薬の加え方等の実験操作に工夫を要したが、1,2-フェニレンジアミン、芳香族アルデヒド、β-ケトエステルとの3成分を縮合することに成功しワンポットで1、5-ベンゾジアゼピン骨格を構築することに成功した。
微量元素の中枢神経変性疾患における病因的役割とその発症の予防法についての研究

中枢神経変性疾患における微量元素の病因的役割を探求するためには、部位別に微量元素の濃度の測定が必要であり、新鮮剖検例が少ないので、ホルマリン浸漬標本が利用可能かの検討も必要である。そのために、まず、ICP質量分析計による微小量試料で高感度に多元素を分析出来る測定法を確立した。次に、その方法を用いてラットの脳及び脊髄の各部位で、ホルマリン浸漬群とそうでない対照群の21元素濃度を測定した結果、ホルマリン保存による元素の結時的濃度変化は、一部の元素を除き各部位で同様の傾向にあり、元素により減少、安定、増加型があることがわかった。保存条件が様々であるヒトのホルマリン試料での検討結果も、ラットでの結果と同様であった。その結果を踏まえて、筋萎縮性側索硬化症(ALS) 7例を含む孤発性運動ニューロン疾患(MND)患者9例のホルマリン保存試料の前角・後角の元素濃度を非神経変性疾患のコントロール10例と比較し、さらに家族性ALS (FALS) 1例の新鮮凍結脊髄と脳の各部位の元素濃度を対象群と比較した。孤発性MNDでは、脊髄前角のSe、前角と後角のCu, Mg, Znが高値であった。FALSでは、対象群に比べ全測定部位でMnが高値であり、Fe, Zn, Coは脊髄全部位で高値または高値の傾向にあった。一方、Pは脊髄、特に側索・後索は低値であり、変性によるミエリン減少の結果と考えられた。高値または高値の傾向にあった元素は、フリーラジカルを発生させたり、逆にフリーラジカル消去系酵素に関連する元素であり、このような病態にフリーラジカルが関わることを示唆した。また、各元素の機能をさらに明確にするために、化学形態別の測定が必要であることを考えさせた。本年は、ホルマリン浸漬標本における各種微量元素測定法を検討し、グラファイト炉原子吸光法による脳組織のセレン測定法を確立した。まず、ラットの脳4部位(皮質、視床、線条体、小脳)及び脊髄(頸髄)をホルマリン浸漬し、浸漬1ヵ月群、1年群と、浸漬をしていない対照群の20元素濃度を比較した。測定にはICP質量分析計(Al,As,Cd,Co,Cr,Cu,Fe,Hg,Mg,Mn,Mo,Ni,Pb,Se,V,Zn)およびICP発光分析計(Na,K,P,Ca)を用いた。その結果、ホルマリン保存による元素の経時的濃度変化は、一部の元素を除き各部位で同様の傾向にあり、元素により減少、安定、増加型があることがわかった。特に減少、安定型元素は各部位でよく一致した。減少型元素はNa,K,P,V,Mg,Zn,As,Mn,Coで、対照群の元素濃度を100%としたホルマリン浸漬1年群の元素濃度は15-60%で、元素ごとに減少の程度が異なっており、K自身の濃度が変化してしまうため、当初考えていたKによる補正は適切でないと考えられた。安定型元素はSe,Cu,Feで、1年群の濃度は対照群の70-125%であった。但し、安定型のうち、頸髄のFeだけは対照群の2倍となり、Feに関しては今後さらに検討が必要である。増加型元素はAl,Pb,Moであった。組織を浸漬していないホルマリン液の元素濃度を、対照群の組織中の濃度と較べると、増加型の元素では、対照群の濃度の10-30%で、減少型の元素では、2%以下であった。また、Pbを除くと増加は比較的一様であり、組織濃度増加はホルマリン液由来の可能性がある。

Alの増加はホルマリン液の直接接しない線条体では認められなかったことから、ホルマリン液を介した外部からの汚染の可能性が強い。グラファイト炉原子吸光法による脳組織のセレン測定法は、これまで困難とされてきたが、Pbをモディファイヤーとし、アッシングの高温化と時間の延長をはかることによって確立された。昨年度のラットで検討をもとに、保存条件が様々であるヒトのホルマリン試料を測定した時の問題点をまず検討した。保存脳試料(4ヶ月17年)中の元素濃度を分析し新鮮試料と比較した結果、ラットでの結果と同様に、Se,Cuはホルマリン保存試料と新鮮試料の差が少なかったが、Feは保存中に増加した可能性が考えられた。Hgはヒト成人では検出され、保存・新鮮試料の差はみられなかった。Mg,Mn,Znは保存試料の方が低値であり、As,Co,Vは、保存試料のばらつきが大きかった。Al,Mo,Pb,Cdは新鮮試料より1桁以上高値となるものがあり、外部からの汚染が考えられた。その結果測定値の評価に際して、Se,Cu,Hgは特に問題はなく、Mg,Mn,Znは、疾患群で高い時には問題なく、Feは注意する必要があると考えられた。上記の結果を踏まえて、筋萎縮性側索硬化症ALS7例を含む孤発性運動ニューロン疾患(MND)患者9例のホルマリン保存試料の前角・後角の元素濃度を非神経変性疾患のコントロール10例と比較した。また家族性ALS(FALS)1例の新鮮凍結脊髄(前角・後角・側索・後索)、脳(前頭葉皮質・前頭葉白質・小脳)の元素濃度を対象群(脳9例、脊髄4例)と比較した。孤発性MNDでは、脊髄前角のSe、前角と後角のCu,Mg,Znが高値であった。FALSでは、対象群に比べ全測定部位でMnが高値であった。Fe,Zn,Coは脊髄全部位で高値または高値の傾向にあった。一方、Pは脊髄、特に側索・後索で低値であり、変性によるミエリン減少の結果と考えられた。これらの結果は、フリーラジカル発生が病因に関わることを示唆した。また、各元素の化学形態別の測定が必要であることを考えさせた。
糖尿病性腎症腎組織における細胞外マトリックス関連蛋白の分子生物学的解析-光学及び電子顕微鏡によるin situ hybridization法を用いて-

1.糖尿病性腎症腎生検組織のメサンギウム領域の定量化昨年度に引き続き、2型糖尿病及び1型糖尿病患者の腎生検組織を電子顕微鏡所見を用いたpoint counting methodによりメサンギウム領域の拡大を客観的に定量化した。2.光学顕微鏡レベルでの各種mRNAと蛋白の発現IV型コラーゲン(α1 chain),MMP-2,3,TIMP-1の各プローブを用いて、非放射性標識法によるin situ hybridization法を継続して行った。mRNAの発現の程度を定量化するため、糸球体一つあたりの総細胞数を数えた後、その糸球体に発現している陽性細胞数を数え、糸球体の総細胞数に対する陽性細胞数の割合を百分率で求めた。求められた百分率とpoint counting methodにより求められたメサンギウム領域の拡大の程度との関係を検討した。その結果、IV型コラーゲン(α1 chain),MMP-2,3,TIMP-1の各mRNAの発現は、メサンギウム領域の拡大の程度とは負の相関を示した。すなわち、糖尿病性腎症のメサンギウム領域の拡大には、IV型コラーゲン(α1 chain)の産生亢進よりは、むしろMMP-2,3,などの細胞外マトリックス蛋白の分解酵素の産生の低下が関与していることが明らかとなった。また、蛋白レベルでの観察を行うために、各種抗体を用いた酵素抗体法を施行した。それぞれの蛋白の発現はmRNAと同様に発現していた。凍結切片まで用いて様々な方法で電子顕微鏡レベルでのin situ hybridizationを試みたが、非特異的反応が完全に除去できるような方法は、残念ながら完成せれていない。以上の結果をまとめて、論文を作製中である。1.糖尿病性腎症腎生検組織のメサンギウム領域の定量化腎生検を施行し組織学的に糖尿病性腎症と診断されたインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)及びインスリン依存型糖尿病(IDDM)患者を対象とした。IDDM患者は本邦には少ないため、米国ミネソタ大学のMauer教授より腎組織の供与をうけた。それぞれの腎生検組織を電子顕微鏡所見を用いたpointcounting methodによりメサンギウム領域の拡大を客観的に定量化し、一部はすでに終了した。今後も症例数を重ね、さらに検討を継続する。IV型コラーゲン(α1 chain),MMP-2,3,TIMPの各プローブを用いて、非放射性標識法によるin siiuhybridization法を行った。現在までの結果では、IV型コラーゲン(α1 chain),MMP-2,3,TIMP-1の各mRNAの発現は、メサンギウム領域の拡大の程度とは逆相関する傾向が認められた。すなわち、糖尿病性腎症のメサンギウム領域の拡大には、IV型コラーゲン(α1 chain)の産生亢進よりは、むしろMMP-2,3,などの細胞外マトリックス蛋白の分解酵素の産生の低下が関与している可能性が示唆された。今後もさらに症例数を重ね、検討を継続していく。さらに詳細な観察を行う目的で、電子顕微鏡レベルでのin situ hybridization法の開発も行っている。現時点では、エポン包埋の組織でmRNAのシグナルは得られないものの、Lowcryl包理非特異的な反応はあるものの陽性シグナルが得られており、今後の実験では非特異反応の消失を目的に実験を進めていく。以上の経過および結果から、来年度には有益な結果が得られることと思われる。
和歌山県田辺湾神島の樹木分布図の作成

研究目的:天然記念物として指定された神島には、1934年に南方熊楠らによって作成された顕著樹木所在図がある。1998年に田辺市が行った調査で台風の被害やウが集まったことにより植物相に変化があった。そこで、現在の樹木分布図を作成し、神島の植物相の変遷をあきらかにする。研究方法:田辺市教育委員会文化振興課の協力で、調査を実施した。GPSやGPS機能付きデジカメを用いて、顕著樹木の分布図を作成した。研究成果:1998年の調査では無かったタブノキが「おやま」にあり、幼樹もあることがわかった。「おやま」にウは現在も断続的に飛来しているため、ヨウシュヤマゴボウなどの窒素が多い土壌を好む植物が増えた林分がある。「こやま」では、崖にはハカマカズラが繁殖し、斜面に樹木も生育しているが、2011年の台風で崖の部分で大規模な岩石の崩落があり、植生の回復が遅れていることがわかった。
細胞弾性から読み解く血行性転移機構

転移性ガン細胞などは血行性転移と呼ばれる遠隔組織への移動を行う。この機構の解明は血行性転移の制御法にも繋がり意義は大きい。研究代表者は鳥類胚の始原生殖細胞(PGC)が血行性転移を行うことに着目し、その機構の解明と、ガン細胞の血行性転移との相関有無の確認を目的として研究を進めた。PGCは特定の毛細血管叢で循環移動を停止してその直後血管壁を通過して間葉へ移行することから、PGCが毛細血管叢にて停止する機構について調べた。結果として、PGCおいて細胞骨格因子であるActinが高弾性状態(硬い状態)を与えており、これによりPGCが狭い毛細血管叢に“挟まる"ことによって停止する可能性を突き止めた。トリ始原生殖細胞は胚内血管内を循環移動を行い、特定の毛細血管において移動停止したのち、血管内から外へと遊出する。代表者は、トリ始原生殖細胞が高弾性であり、毛細血管で移動を停止する際にその固有の弾性が重要であることを見出してきた。さらに固有の弾性はActinによって担われる可能性を見出してきている。当該年度においては、in vivoにおいてトリ始原生殖細胞の循環移動停止にActinが関わるのかについて、検証を行ってきた。当初、内在のトリ始原生殖細胞へ機能欠損型のActinをトランスフェクションする方法を試みてきたが、導入効率が上がらなかったことから、トリ始原生殖細胞の培養を行い、その細胞を材料としてin vivo解析系に用いることとした。培養条件検討の結果、トリ始原生殖細胞の大量培養に成功し、かつ遺伝子導入効率の改善も達成できた。概要で述べた通り、トリ始原生殖細胞のin vivo解析を行うことに対し、内在生殖細胞へのトランスフェクション法では不十分であることが判明したため、新たなストラテジーによるin vivo解析法を模索する必要があったためである。本年度は鳥類生殖細胞の培養に挑戦してきた。なぜなら、生殖細胞の培養が成功すれば、生殖細胞への遺伝子導入が格段に容易となり、生殖細胞のイメージングおよび細胞挙動と関連した遺伝子機能解析が可能となるためである。結果、ニワトリとウズラの生殖細胞の培養法の確立に成功した。これで大量の材料を得ることができる環境が整い、よって生殖細胞の遺伝子機能解析が可能な状況となった。この培養生殖細胞の実験系を用い、鳥類胚における生殖細胞の血行性転移の機構として、生殖細胞が特定毛細血管において循環移動停止を行うために自身が高弾性である必要性についてはじめて検証できる状況が整った。前年度までに、培養皿に取り出した生殖細胞に対し、ラトランキュリンAおよびブレビスタチン(アクトミオシンの機能阻害のため)を添加した際の結果から、生殖細胞の高弾性の実体がActinであることを明らかにしていた。そこで今年度は、生体内の生殖細胞におけるActin機能解析を行うべく、生殖細胞特異的なActin重合阻害法の確立を試みた。具体的には、ドミナントネガティブRhoA、C3、ドミナントネガティブActinを、tet-onシステムにより強制発現させることを行い、これら変異株において生殖細胞の高弾性がキャンセルされることを確かめた。次に、これらtet-onシステムによりActinが機能阻害される生殖細胞株を使った血管内挙動解析から、生殖細胞の弾性を低下させた場合には、生殖細胞は特定毛細血管において循環移動を停止できなくなることが、移植実験により明らかになってきた。生殖細胞の培養維持法の確立により、生殖細胞の遺伝子改変とそれに伴った挙動解析が可能となったため、現在ブレイクスルーが到来している。鳥類の始原生殖細胞は胚の時期、胚体外に生じ、血管内を移動することで生殖腺まで移動する。つまり、鳥類の始原生殖細胞はまるで転移性ガン細胞のように、血管へ侵入し、血流内を移動し、最終的に血管外へと遊出する挙動を行うのである。よって、始原生殖細胞の血管内移動機構の解析は、ガン細胞をはじめとした血行性転移の仕組みの理解に繋がりうる意味で大きな意義がある。近年、研究代表者は始原生殖細胞が血管内から間充織側へ遊出する仕組みに着目し、これを明らかにするべく研究を展開してきた。始原生殖細胞が血管内から遊出する前段階として、遊出する血管領域に「挟まる」ようにして循環移動を停止することを見出し、ここから始原生殖細胞が高弾性(硬い)性質を持つとの仮説を立てた。実際に始原生殖細胞の硬さを原子間力顕微鏡を用いて計測すると、1000パスカルを超える硬さを持つことがわかってきたところであった。そこで最終年度は、始原生殖細胞の硬さの実体を明らかにするべく研究を展開した。細胞骨格系に着目した解析から、始原生殖細胞では細胞膜直下にアクチンが発達していることがわかってきた。また、アクチン機能を阻害すると始原生殖細胞の弾性が大きく低下することから、アクチンが始原生殖細胞における細胞高弾性を担う分子の一つであることがわかってきた。さらに、始原生殖細胞が胚内の血流内にて循環移動を停止するためには、アクチン機能が重要であることも、始原生殖細胞への特異的遺伝子操作によるアクチン機能阻害実験から明らかになってきた。今後は、転移性ガン細胞株においてアクチン機能を阻害する実験を行い、ガン血行性転移におけるアクチンの重要性を検証する。

PGCは特定の毛細血管叢で循環移動を停止してその直後血管壁を通過して間葉へ移行することから、PGCが毛細血管叢にて停止する機構について調べた。結果として、PGCおいて細胞骨格因子であるActinが高弾性状態(硬い状態)を与えており、これによりPGCが狭い毛細血管叢に“挟まる"ことによって停止する可能性を突き止めた。今後は、当該年度に確立したトリ始原生殖細胞の培養系を用いることで、培養下で増やし、遺伝子操作したトリ始原生殖細胞を別胚の血管内に移植し、循環移動停止に影響がでるかについて解析を行う。培養の成功と移植操作の実績から解析系の推進には問題がないものと考えている。一方で、ガン細胞においても血行性転移と細胞弾性の関連について解析を進める。まず血行性転移を行うガン細胞株を選定し、原子間力顕微鏡にて細胞弾性を計測する。高弾性であった細胞株についてはin vivo解析系に移行して循環移動における表現系を確認したのち、Actinの機能欠損実験等を介して分子機構の解明を目指す。生殖細胞が硬いことによって、特定毛細血管において循環移動を停止するとの仮説を検証することが次に行うことである。HH14のニワトリ胚の血液中に、ドミナントアクティブRhoA、C3、あるいはドミナントネガティブActinを発現させた生殖細胞を移植し、その挙動を解析する。Life-Act等でActinを可視化させた生殖細胞の血管内挙動も解析し、どのような振る舞いによって循環移動停止とその後の浸潤転移が行われるのかを明らかにしたい。発生生物学本年度は、血行性転移における生殖細胞の高弾性の意義についての解析を優先的に行ってきた。当初行う予定であった、がん細胞株における高弾性と血行性転移の意義については、がん細胞株の再選定が必要となり、その後に計画して実験を次年度に移すことになったため。謝金としてアルバイト1名を雇用する(1名x50千円/12ヶ月)。物品費として、細胞培養試薬(10千円x4セット)を購入する。
細胞内シグナル伝達分子光操作ツールの開発

研究目的:光(レーザー光)によってミリ秒レベルとマイクロメートルレベルの高時空間分解能でシナプス長期増強を誘発することが可能なCaMKIIシグナル分子(photo-activatable CaMKII, paCaMKII)を遺伝子工学的に開発し、さらに、この分子を用いて、様々な時空間的パターンでシナプスを活性化したときの細胞応答を電気生理学的に計測して、神経細胞が応答する際に必要なシナプスからの入力パターンを明らかにする。研究方法:昨年開発を報告したCaMKIIシグナル分子について、現在さらなる改良を行っている。これにあたって、作業を効率化するために、二光子蛍光寿命イメージング顕微鏡による観察を行うことにした。さらに解析を効率化するために、解析ソフトウェアの自動化による効率化を進めた。1.タイムラプスイメージの処理を自動化する為、フィッティングを自動化した。2. ROI(関心領域)番号の選択をプルダウンメニューからプッシュボタンとした。プッシュボタンのカラーをROIが選択されている番号の色を変えることにより、何番が選択されているか判るようにした。3.選択解除した番号を詰める機能を増やす等、機能を増やすことにより、効率化をはかった。これらの改善により、解析にかかる時間が10倍短縮することができた。結果:二光子蛍光寿命イメージングデータの解析の自動化を進めることにより、光応答性CaMKIIシグナル分子の特性のよいものを速く開発できるようになり、当初の目的を達成できる環境が整のった。
荷重立位周期的水平揺動刺激と筋電気刺激による筋力増強法の研究

荷重立位で周期的身体揺動刺激とそれに同期した筋電気刺激を同時に加えることのできる装置を開発した。この装置を用いて運動習慣のない健常な女子大学生6名に新しい筋力トレーニングを3ヶ月間行わせたところ、等速性膝伸展・屈曲筋力がそれぞれ38%と44%増加した。さらに膝前十字靱帯再建術後早期患者10人に新しい筋力トレーニングを3ヶ月間行わせたところ、CKCでの筋力測定では、患健側比でリハビリ前が平均46.6%であったが、3か月後の終了時は平均65.4%まで有意に改善した。(1)人体における身体揺動刺激と電気刺激の併用作用の解析荷重立位で周期的身体揺動刺激とそれに同期した筋電気刺激を同時に加え、その相乗効果を詳細に検討するために電気刺激併用型水平揺動運動装置を試作した。また、筋電計測機能付きEMS装置の一次試作を行った。本研究では、第1に随意運動と電気刺激を併用した場合の筋線維組成の変化の基礎的検討、第2に立位揺動刺激時の電気刺激による適切な刺激部位と、その刺激手法について検討を行うこととした。第1の検討においては等尺性CKC訓練用実験装置、およびそのインタフェース、更には訓練前後筋活動特性の記録用多チャンネル筋電位表面電極の基礎的検討を進めた。第2については、連続揺動刺激においては、基本的な足・股関節型をもとに新しい表現が必要であることが示唆された。例えば周波数を2Hz以上に上げていくと反応のバラツキが大きくなっていく。これは筋電図でも確認できるが、股関節周囲筋のみならず、足関節周囲においても変化が大きくなる。単一揺動刺激では高齢化に伴い腰部の反応の遅れなどが顕著であることは実験を通じて確認しているが、連続揺動刺激時の反応についても更に検討を進める。(2)電気刺激神経細胞培養による電気刺激の作用の解析我々は、ラット副腎髄質褐色細胞腫由来の神経細胞であるPC12変異細胞(PC12m3)に直接電気を与え、その影響を調べている。100mAで30分通電したところ非常に高い神経突起の形成が観察されたが、電気刺激の時間を100mAで60分にしたところ多くの細胞はアポトーシスを起こした。健常成人男性7名(21.4±2.0歳)について呼吸代謝測定装置AE-280SRC(ミナト医科)を用いて分析を行い静止立位と比較した。酸素摂取量は静止時5.6±0.6ml/kg/min、前後揺動刺激を加えた状態が8.5±0.8ml/kg/min、前後揺動刺激と電気刺激を併用した状態が15.3±2.0ml/kg/minであり、相互に有意差(p<0.05)を認めた。筋力については週3回の頻度で前後揺動刺激を振れ幅を前後80mm、1秒間に3回転の速さで20分行わせそれに同期した電気刺激を同時に加えると1ケ月経過後から等速性膝伸展・屈曲筋力(60°/s)について有意に増加を認めた。健常高齢者の揺動刺激時の特性分析では、前後方向単一揺動刺激時の反応として、後方刺激時に前傾傾向があると股関節型の反応様式がほとんど観られないこと、腰部の反応が遅れることなどが、少数の高齢者であるが再確認できた。また、電気刺激を併せて訓練した時の評価方法について、坐位での大腿四頭筋の6週間程度の刺激後の筋線維の変化を調べているが、評価指標としては筋音と筋電位をあわせた情報が有効である可能性が示唆された。電気刺激装置の開発では、刺激の繰り返しタイミングに合わせて、複数の筋をパターン的に刺激することを可能にするシステムの開発を進めてきた。8チャンネル刺激構成で上記インタフェース部の最も基本的な構築を終了した。ハードウェアでは機能的な試作を終了し、ソフトについてはWindows上の基本構成部分の構築を実現できた。1.人体における身体揺動刺激と電気刺激の併用作用の解析:術後の筋萎縮が問題となる膝前十字靱帯再建術後患者10人(男性4人、女性6人、平均年齢26歳)に振れ幅前後80mm、1秒間に3回転の前後揺動刺激とそれに同期した電気刺激を患側大腿部に加える運動を1回2030分間、週3回の頻度で12週間行わせた。CKCでの筋力測定では、患健側比でリハビリ前が平均46.6%であったが、3か月後の終了時は平均65.4%まで有意に改善した。筋力の改善は終了時には患側で平均1.88倍、健側で平均1.31倍といずれも有意に改善した。健常高齢者における立位揺動刺激時の反応について、前後方向後方刺激時に前傾気味の姿勢であると(10deg以上)股関節型の反応様式がほとんど観られないこと、また腰部の反応の遅れが確認された。さらに左右方向刺激においても腰部の反応が遅れることが観られた。

以上の結果から立位時の姿勢の重要性と腰部反応の重要性が強く示唆された。高齢者の運動を行うには転倒防止の配慮が必要であり、転倒防止懸架装置およびハーネスを特注製作し臨床応用を開始した。2.電気刺激装置の開発:電気刺激装置ハードウエアのシステム開発については最終年度を迎えおおよそ臨床応用可能なシステムを構築することが出来た。電気刺激時の筋疲労の評価に有用な刺激時筋反応、筋音によるモニター機能と併せて実用化を進め、臨床応用を図っていく予定である。3.電気刺激神経細胞培養による電気刺激の作用の解析:電気刺激はPC12m3細胞において神経突起形成をp38MAPキナーゼ経路で誘導することが明らかとなった。
消化管内分泌系を介する慢性炎症発症回避の機構解明：免疫系細胞と脂肪細胞の連関

食事誘導性肥満において、脂肪組織やさまざまな臓器で慢性的な炎症が生じる。食事摂取後のリンパ管には脂質以外にも様々な食事由来抗原が流入し、これらの抗原に免疫系が応答すると考えられる。本研究ではリンパ管カニュレーション法を適用して、脂質吸収時にリンパ管に流入する因子を評価した。脂質吸収開始後数時間でinterleukin-6 (IL-6)およびglucagon-like peptide-1濃度が投与前より有意に増加した。絶食時及び脂質食摂取時の消化管粘膜での遺伝子発現解析結果から、脂質の吸収に伴いIL-6産生細胞の粘膜への遊走が生じた可能性が示唆された。メタボリックシンドローム発症には脂肪組織での慢性炎症の関与が知られている。過剰な遊離脂肪酸は炎症を惹起させることから、毎食後の脂質吸収の増加に伴い、脂肪組織は常に炎症が引き起こされるリスクにさらされている。本年度は脂質投与後のリンパ液中の消化管ホルモンとサイトカインの経時的変化の解析、より生理的なリンパ液回収法の検討、3T3-L1を用いた脂肪細胞分化実験系の導入、脂質吸収に寄与する抱合型胆汁酸の消化管バリアに及ぼす作用の検証を実施した。ラットを用いて十二指腸へ脂質エマルジョンを投与した後、経時的にリンパ液を採取した。この中の全GLP-1濃度を測定したところ、リンパへのGLP-1流入した後にIL-6濃度が一過性に上昇することを見出した。リンパ節存在する免疫系細胞に及ぼす脂肪酸などの作用を評価するために、より生理的な条件でのリンパ液回収方法の条件検討に着手し、概ね実験系の導入ができた。3T3-L1を用いた脂肪細胞分化、また、in vivo及びex vivoの実験系で脂質吸収に関与する抱合型胆汁酸が消化管組織のバリア機能の脆弱化に関与することを見いだした。以上のことから、脂質吸収直後に一過性に増加するGLP-1は、吸収された脂質より先に腸間膜リンパ節に到達し、炎症反応の調節に寄与する可能性が考えられる。過剰な遊離脂肪酸は炎症を惹起させることから、毎食後の脂質吸収の増加に伴い、脂肪組織は常に炎症が引き起こされるリスクにさらされていると言える。食事脂質は、脂肪酸が脂肪組織に到達するよりも前に、腸管上皮に散在する消化管内分泌細胞に認識され、消化管ホルモン分泌を促す。しかし、消化管ホルモンと脂肪組織、免疫系の関係については明らかにされていない。本研究では、栄養素摂取により分泌される消化管ホルモン(消化管内分泌系)が、日々の食事摂取により起こりうる不必要な炎症反応を抑えるかを検証し、そのメカニズムを解明することが目的である。腸間膜リンパ節細胞及び腸間膜脂肪組織を分離し、消化管ホルモンであるGLP-1やGLP-2の受容体に加え、脂質吸収に関与する胆汁酸の受容体gpbar1及びfxrの発現解析を実施した。より生理的な条件で免疫機能に及ぼす脂肪酸の作用として評価するために、腸管リンパにカニュレーションを実施し、脂質吸収後のリンパ液を経時的に回収した。この中の全GLP-1濃度を測定したとこと、脂質がリンパ節に流入する以前にGLP-1が流入すること、またある種のサイトカインが一過性に上昇すること、またその時の濃度は血中よりはるかに高濃度存在であることを見出した。以上のことから、脂質吸収直後に一過性に増加するGLP-1は、吸収された脂質より先に腸間膜リンパ節に到達し、炎症反応を調節する可能性が考えられる。食事誘導性肥満において、脂肪組織やさまざまな臓器で慢性的な炎症が生じることが知られている。食事摂取後のリンパ管には脂質だけでなく、様々な食事由来抗原が流入する。さらには粘膜やリンパ節では外来抗原に応答して分泌される物質の放出が起こると考えられる。腸間膜リンパ節はこの経路上に存在し、抗原に曝される。脂質摂取により濃度が大きく変動する脂肪酸や胆汁酸は腸間膜リンパ節に存在する免疫応答に関わると考えられる。昨年度までに、リンパカニュレーションを用いた脂質吸収実験において、脂質の吸収に伴いリンパ液でのglucagon-like peptide-1だけでなくinterleukin-6 (IL-6)の濃度が一過性に上昇にすることを見出している。そこで、このIL-6の由来を探るため、絶食および再給餌2時間後の、消化管粘膜におけるIL-6濃度の変化を解析した。Wistar-ST系雄性ラット(7週齢)を6日間馴化し、一晩絶食後にそのまま、または脂質20%食(2 g)摂取3時間後に解剖した。解剖時、十二指腸、空腸、回腸をそれぞれ回収し、粘膜を剥離回収した。また上部および、下部小腸パイエル板を回収した。

各組織からタンパク質抽出後、ELISAを用いて抽出液中のIL-6濃度を測定した。その結果、脂質食再給餌後に空腸、回腸粘膜でのIL-6濃度が有意に増加した。脂質の吸収に伴いIL-6保有細胞の粘膜への遊走が生じた可能性が示唆される。食品栄養学平成25年度に腸管リンパカテーテル留置を施し、拘束下で脂質吸収後のリンパに流れる因子を解析する予定であったが、より正常な食事摂取後の状態を反映する実験条件で、食事摂取後のリンパ液を回収できる方法を導入することとした。当初計画で策定したものより生理的な条件でのリンパ液回収法の検討に時間を要したため、当初計画よりやや遅れている。当初計画で含まれていた脂肪細胞の分化に及ぼす作用は実施できていない一方、当初計画で策定したもの以上に生理的な条件での評価を可能した点を考慮すれば概ね順調と判断できる。より生理的なリンパ液回収の実験系が概ね導入ができたので、この実験系を用いて消化管内分泌系が慢性炎症に及ぼす作用を検証する。当初計画では提示していないが、腸管リンパにカニュレーションを用いて、脂質吸収時に生じる消化管ホルモンやサイトカインのリンパ液中の経時的変化をもとにした、生理的な条件に即した評価系を構築している点は本研究を推進する上で極めて有用な特徴と考えられる。したがって、できるだけ生理的な条件で得られた情報を基盤として消化管内分泌系が慢性炎症に及ぼす作用を検証する方向で研究を実施する。平成25年度に腸管リンパカテーテル留置を施し、拘束下で脂質吸収後のリンパに流れる因子を解析し、学会発表をおこなう予定であった。しかし、より正常な食事摂取後の状態を反映する実験条件として、胸管リンパへカテーテル留置を施し無拘束状態で食事摂取後のリンパ液を回収できることが分かり、この方法を導入することとしたため、未使用額が生じた。このため、上記胸管リンパカニュレーションによる食事摂取後のリンパ液分析及び関連実験とそれに関する学会発表を次年度に行うこととし、未使用額をその経費に充てることとしたい。本研究において備品購入の予定はない。消耗品費としては、主に遺伝子解析に必要な試薬、加えて分離細胞の表面マーカー解析用の特異抗体、ホルモンやサイトカイン測定のためのELISAキットなどの購入を予定している。また、実験動物としてのラット及びその飼育に関わる飼料成分購入、さらに分離細胞を培養系で維持するために細胞培養器具類などの購入を予定している。旅費としては、成果発表としての国内旅費あるいは外国旅費としての支出を予定している。
シンタキシン ノックアウトマウスを用いた行動的解析

中枢神経系のシナプス伝達において、シナプス小胞の開口放出が障害されることで、脳の高次機能にどのような影響を与えるか検討するため、開口放出を制御するSNARE蛋白質の欠損マウスの作成を計画し、それを用いた解析を行った。その結果これらのマウスで顕著な行動障害が見られ、ヒト精神神経疾患に関わる可能性が示唆された。昨年度までの研究に引き続き、シンタキシン1Aノックアウトマウスの表現型の解析を行った。その結果、このマウスは自閉症様の行動障害を示すことが明らかになった。この行動障害はホモミュータントのみならず、ヘテロミュータントでも認められた。非常に興味深いことに、ヘテロでの行動障害の程度はホモで見られる障害よりも軽度であり、シンタキシン1Aの遺伝子発現量に応じて行動障害が現れる可能性が示唆された。現在、この解析結果をまとめ、論文に投稿する準備を行っているところである。また、シンタキシン1Aノックアウトマウスを用いた共同研究で、一部の小胞の分泌に障害があることが明らかになった。本年度は、JAXよりSNAP-25のノックアウトマウスを購入した。このマウスを用いた行動学的解析を行うために、B6Jに戻し交配を行った。総計で68代にわたり戻し交配をしたにもかかわらず、得られたマウスのほとんどの毛色は茶であった。毛色が黒のものも数匹得られたが、成熟前に死亡したり、成熟しても不妊であったりしたため行動解析は行えなかった。現在、毛色が黒のマウスが得られない原因を明らかにするために、異なる遺伝的背景によりSNAP-25のノックアウトによる表現型が異なるか発生学的手法を用いて詳細な検討を行っている。また、もう一つの本研究目的のシンタキシン1Bノックアウトマウスの作成は、これまでのところ目的とするES細胞が得られていない。そのため、現在新しくベクターを作り直し、来年度以降で再度マウスの作成を試みるつもりである。本研究は、プレシナプスによる神経可塑性の調節機構が、脳の高次機能の制御にどのように関与するかについてノックアウトマウスを用いた解析により明らかにしようと試みているものである。1)シンタキシン1Bのノックアウトマウス作成ノックアウトベクターを新たに作成しなおし、ES細胞のスクリーニングを行った。そこで得られたES細胞を使いキメラマウスの作成を試み、5匹のキメラマウスを得た。このキメラマウスとC57BL6マウスを掛け合わせ、シンタキシン1Bのヘテロ変異マウスの作成に成功した。現在、ホモ変異マウスが致死となるか確認している。また、C57BL6へ戻し交配を行い、このマウスの表現型を解析する準備を行っている。2)シンタキシン1Aのノックアウトマウスの解析シンタキシン1Aのノックアウトマウスで行動異常が生じる理由について検討する目的で、ペプチド性の伝達物質の放出について解析した。その結果、このマウスでは視床下部からのCRH分泌が抑制されていることが明らかとなり、HPA-axisが障害されている可能性が示唆された。現在、この障害がノックアウトマウスでの行動異常に関与しているかについて検討している。また、このマウスで認められた5HT伝達の異常がこれらの障害と関連があるか検討している。3) SNAP-25のノックアウトマウスを用いた解析シンタキシン1Aのノックアウトマウスで行動異常がプレシナプスの障害によるものかどうか検討するためにSNAP-25のノックアウトマウスの行動解析を行っている。これまでのところ、このマウスでシンタキシン1Aのノックアウトマウスの場合と比べ顕著な違いは見出されていない。現在、より詳細な解析を行っているところである。中枢神経系のシナプス伝達において、シナプス前終末でシナプス小胞の開口放出が障害されることで、脳の高次機能にどのような影響を与えるか検討した。そのため、開口放出を制御するSNARE蛋白質の欠損マウスを用いた解析を行った。神経細胞のSNARE蛋白質は、形質膜にシンタキシン1(STX1)、SNAP-25が発現している。このうちSTX1は、STX1AとSTX1Bの2つのアイソフォームが発現している。はじめに、STX1A欠損マウスを作成し、その解析を行った。In vitroでの実験結果と異なり、このマウスでは基本的なシナプス伝達に異常はみられなかったが、記憶、認知機能に障害が認められた。興味深いことに、これらの異常の一部はセロトニン作働薬の投与により改善された。そこで、セロトニン分泌について解析を行った結果、STX1A欠損マウスではその分泌が顕著に抑制されており、セロトニン刺激により促進される神経機能の障害が認められた。これらの結果から、STX1Aを欠損したときのその大部分の機能はSTX1Bにより代償されうるが、セロトニンなどの一部のシナプス伝達は代償できないことが示唆された。つまり生体内でSTX1AとSTX1Bがやや異なった機能を持つ可能性が推測される。そこで、STX1B欠損マウスの作成を試み、その解析を行った。STX1B欠損マウスは、STX1A欠損マウスと異なり、生後14日までに致死となった。

これまでの解析から、その障害は小脳で顕著であり、運動機能障害がその致死となる直接の原因のようである。また、STX1Bのヘテロマウスでは高頻度に痙攣発作を認めた。現在、このマウスでのシナプス伝達の詳細について検討を行っている。このように、当初は同じ機能を持っていると予想されたSTX1AとSTX1Bの欠損マウスで異なる表現型が認められたので、SNAP-25欠損マウスの解析もあわせて行っている。
新規抗マラリア薬の創製研究

マラリアの撲滅に薬物療法は不可欠であることは言うまでもない。とりわけ、マラリアの治療を困難にしている薬剤耐性マラリアを治療出来る新しい抗マラリア薬の開発への期待は極めて大きいものがある。しかしながら、新規抗マラリア薬の開発ペースは10年間で平均一薬剤であり、治療薬開発からのマラリア制圧への貢献度は、未だ満足出来る状況に達しておらず、多剤耐性マラリアの出現は現有の治療薬の効果を減弱し十分な治療効果をなくしつつある。我々は、分子標的治療によるマラリアの治療を目指し、新しい抗マラリア薬の分子標的を明確にし、それを制御する分子標的治療を大きく推進し、マラリア制圧に大きく寄与することを目的として研究を行い、以下の研究成果を得ることが出来た。1,2,4,5-テトラオキサシクロヘキサン類に、体内動態の解析が可能な置換基(クロロキンやロダシアニン色素等)を付加した誘導体を合成し、抗マラリア活性を有する誘導体を得た。特に、シクロアルカン系列の化合物、即ちN-251置換基に琥珀酸、及びアミノ酸を付加した誘導体の合成研究から、N-251置換基に琥珀酸を付加した化合物に強い抗マラリア活性とクロロキン耐性マラリア原虫にも薬効を示すことを明らかにした。薬剤耐性マラリアの機構を解析するためには、耐性機構の解析が必要である。そこで、既存抗マラリア薬であるアルテミシニンの耐性原虫、及びメフロキンの耐性原虫の作成研究を行い、3年間のアルテミシニン、及びメフロキンプレッシャーにより両抗マラリア薬の共存下(アルテミシニンは3×10^<-8>M、メフロキンは2×10^<-6>M)で培養できる熱帯熱マラリア原虫株を得た。特に、メフロキン共存下で培養した患者分離株(523aよりクローニングで得たclone 24株)は、メフロキン感受性のマラリア原虫より863倍のメフロキン耐性を示した。この耐性機構を解析するため、抗マラリア薬の薬剤耐性に関与すると言われているpfmdr1遺伝子の全長塩基配列の解析を行い、TからCへのアミノ酸変異を伴う新しい変異ヶ所を見出した。この部位をターゲットにしたアンチセンスオリゴヌクレオチドをマラリア原虫に作用したところ、メフロキンのEC_<50>値が48倍回復する結果を得た。この結果は、我々が見出したpfmdr 1遺伝子のアミノ酸変異がメフロキン耐性に関与する事を間接的に証明できた。マラリアは毎年世界中で2億7千万人がマラリア原虫に感染し、その内200万人が熱帯熱マラリア(悪性マラリア)で死亡している熱帯感染症の一つである。マラリアの特効薬で有るキニーネやクロロキンに耐性を示す熱帯熱マラリア原虫が出現し、薬剤耐性原虫は全世界に広がり、現在はほとんどの抗マラリア薬に耐性を示す多剤耐性熱帯熱原虫が出現している。私たちは新しい、且つ作用機序の明らかな抗マラリア薬の開発を研究目的とし、下記の研究を行った。