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イタリアの異文化間教育の政策と実践　～中国系移民生徒に焦点を当てて～

近年はイタリアで生まれる外国人も多く、学校でもそのような外国人生徒が多く存在する。その状況では、移民生徒の言語的差異が表面化しにくい。学校関係者は、移民生徒の出身国が、学業成績に関連しているとは考えていない。しかし、出身国によって保護者は学業志向と労働志向に分かれており、彼らの意向が子弟の学業成果に影響している。また、街中では、国籍による棲み分けが存在している。この状況が学校に持ち込まれている。高校生以上になれば個人の行動は自己責任によるところが大きいが、中学生以下の子どもたちに関しては、保護者の意向に大きく左右されている。移民生徒たちの行動・交友範囲も、保護者の影響を大きく受けているのである平成26年3月に訪伊し、昨年同様カリタスへの訪問、インタビュー、セミナーへの参加を行った。毎年カリタスが発行している報告書とその他関連書籍の入手は、現地でのみ可能である。また、インタビュー及びセミナーによって、イタリア社会の移民に関する状況が確認された。イタリアの移民問題は、もはや緊急で特別な事項ではなく、常に存在する日常的とも言える事項として考えられている。ローマやミラノなどの大都市以上に、中国系移民が在住しているプラートでの学校訪問、図書館訪問を行った。ローマ・カリタスで得た情報を裏付けるごとく、学校で移民生徒たちは特別なものではなく、ごく当たり前の(学校の)構成員として存在していた。ローマやミラノのような大都市とは異なり、プラートのような小都市では、移民とその子弟たちの出入りが激しくないと考えられる。そのために、イタリア人と移民の(ある程度の)関係が構築できているのだろうと推測できる。また、プラートでは、市営図書館による異文化理解に向けた活動も活発であることが確認できた。異文化理解の活動の場が「学校」だけではなく、「図書館」もその役割を担っている点が興味深い。入手資料を整理するにあたって、改めてイタリア社会の移民政策の方向性を見直す必要があると考えている。ボローニャでは、イタリアで子育てをしている日本人女性から、子弟への母語教育の実践についてインタビューを行った。母語教育を通じて、自らと子弟の母国(日本)へのつながりを、心理的な安定および生活の戦略をはかっている様子が伺えた。本研究の対象である中国系移民の教育戦略を聞きだす資料となりえる。移民生徒たちの行動・交友範囲も、保護者の影響を大きく受けているのである初年度は、主に、資料の収集と聞き取り調査によるデータの入手と、今後の調査に続くデータを聞き取り調査によって入手できた。平成24年10月に訪伊し、有益な資料や情報を入手した。日本においてもインターネットを介して書籍を入手することは可能だが、そもそも書籍に関する情報の入手プロセスに限界がある。そのような意味で、イタリアに留学中の研究者に面会し、日本では得ることが困難だった資料に関する情報を得て、その収集が果たせたことは実りあるものだった。また、訪伊の度に訪れるローマ市に所在するカリタス(カソリックを母体とし、移民の支援や情報収集、研究を行っている団体)においても、多々の資料を得ることができた。このカリタスでは、移民に関する研究者から聞き取り(調査)を行った。パルマ市では、イタリアで子育てをしている日本人や韓国人の母親にインタビュー調査を行った。この中で、本研究の主たる調査対象である中国人移民に関する状況も聞くことができた。ローマ市カリタスも、およびパルマ市母親インタビュも、次年度に実施する調査の事前調査として位置づけられる。ローマでは、中国系移民が多く在住している地域で開催された、移民の支援をしているいくつかの団体の開催する、女性支援活動を訪問した。婦人系疾病予防のための検査が最も活発に活動していたが、分野を特定しない相談コーナーなども充実していた。(資料では「10時開始」と記されていたので、9時50分ごろから開催地へ赴いたのだが、10時くらいから準備を始める様子で、日本のようにはっきりとした「開始!」があるわけではない。そういったイタリアの文化・感覚を理解しているのだが、つい日本の感覚で参加してしまうところを気を付けないと、ストレスになる。)移民を取り囲む状況を、イタリアの支援団体の側から伺い、肌で感じることができたのは、今後の取り組みに役立つ。移民子弟を対象とした教育活動の場として、学校は大きな役割を担っている。しかし、学校だけでなく、地域の行政機関や公立図書館もまた、彼らの教育活動の重要なアクターである。この重層的な取り組みは、異文化を背景とする子どもたちの教育を支える一つの形として参考になりうる。イタリアの公立学校に通う移民児童生徒の出身地域・国は多岐にわたっている。「特に、ある地域からの出身者が多いという傾向がない」というのが特徴である。つまり、移民生徒を対象とした異文化間教育のナショナル・モデルは存在しえないと言える。各地域、各学校が、独自の対処に迫られるというわけである。

ブレシャ県キアラ市の中学校では、編入する移民生徒の配属について、彼らの学習レベルをはかるプロジェクトを、ブレシャ県との共同で展開していた。イタリアの統合政策では、移民はA2レベルのイタリア語を獲得することを求めている。そのための80100時間イタリア語習得プログラムがある。移民生徒にも活用されており、イタリア語を話せない移民生徒に対して、学校は「取り出し授業」を行っていない。上記のイタリア語習得プログラムでまかなう必要がある。学校では、移民生徒のパフォーマンスの差が出身地域によるものだとは考えていない。あくまで各家庭のインセンティブの問題だと捉えている。しかし、不就学問題を考えた時、公式のデータには記載されていないが、町で実際に目にする中国出身の子どもたちの存在を挙げることになる。学校では、公式データから逸脱する移民子弟が存在するのだ。彼らの利用可能な学習機関として、図書館がある。個人が利用する学習の場としての機能だけでなく、図書館が提供する様々なプログラムによって教育的機能も有している。幾つものセーフティネットが存在しているとも言える。ただ、セーフティネットが多様なため、それらの連携が難しいという側面をもつ。教育社会学資料収集、関連施設・機関への訪問、関係者へのインタビューなどは予定通り展開している。ボローニャおよびプラートでの調査を展開できたのも順調な進展と言えるだろう。特に、ローマ・カリタスとボローニャの母語教室では、今後も様々な情報を提供されるだろう関係を構築できていることは、研究継続にあたって有益である。関係者へのインタビューはおおむね順調と言える。しかし、中国系移民へのインタビューが実施できておらず、この点はかなり残念に思っている。科研の最後の年度である平成26年度には、必ず実施しなければならない調査である。研究計画で、全般を通して調査の中心に置いたフィールドワークについては、おおむね順調に行えた。常に研究に協力してもらっているカリタスを通して資料・情報の収集が行えたのは、予定通りだったとはいえ、十分な収穫だった。また、パルマ市では、現地で子育てをしている日本人や韓国人の母親の聞き取り調査を行い、今後の調査の方向性を再アレンジできた。しかしながら、中国系移民が多く在住している地域で活動する「エスクイリーノ(地区)社会メディエーション計画」に直接アクセスできなかったのは残念である。次年度でこの遅れは調整したい。研究計画では、文献の収集とその分析に取り組む予定だったが、実際には、収集に関しては十分に行えたが、分析が十分に行えていないので、次年度の課題とする。次年度の、現地調査へ赴く前に終了させたいところである。しかし、研究の中心である移民生徒の社会関係資本について言えば、移民支援団体の活動に接することで、その一面に接することができた。ここからさらに、地域コミュニティの実態へと踏み込んでいけるものと考える。
塩ストレス下におけるオルガネラの細胞内三次元配置変化と耐塩性との関連性の解明

本研究で使用している画像解析ソフトImageProにおいて、植物細胞に含まれるオルガネラ接触面積の定量は行われていなかった。そのため、葉緑体・ミトコンドリア・ペルオキシソームの接触面を抽出するための最適な条件検討を行い、これらのオルガネラ間の接触面積の定量が可能となった。続いて、圃場条件で3ヶ月生育させたイネの最上位展開葉と下位葉を用いて電顕固定を行い、ウルトラミクロトームを用いて500枚程度の連続画像を取得した。葉肉細胞を3つずつ撮影し、葉肉細胞全体と葉緑体・ミトコンドリア・ペルオキシソームのトレース画像を作製した。そのトレース画像を用いてオルガネラ間の接触を定量した。その結果、1つの葉緑体の表面積に対して、ミトコンドリアとの接触面は約10%であった。一方、ペルオキシソームとの接触面は、葉緑体の表面積の約3%であった。1つのミトコンドリアの表面積に対して、葉緑体との接触面は約50%であった、一方、ペルオキシソームとの接触面は、ミトコンドリアの表面積の約10%であった。1つのペルオキシソームの表面積に対して、葉緑体との接触面は約40%であった。一方、ミトコンドリアとの接触面は、ペルオキシソームの表面積の約40%であった。最上位展開葉と下位葉を比較しても、接触面積に有意な差はなかった。続いて、各オルガネラの表面積と接触面積との関係を調べた。葉緑体の表面積とミトコンドリアとの接触面積には、有意な正の相関があったが、ペルオキシソームとの接触面積には有意な相関はなかった。ミトコンドリアは、表面積が大きくなるほど葉緑体とペルオキシソームとの接触面積が大きくなり、有意な正の相関があった。しかし、ペルオキシソームの表面積と葉緑体やミトコンドリアとの接触面積には、有意な相関はなかった。Image-Proの画像ソフトを用いた接触面積の定量解析は、これまで植物分野では行われていなかった。そのため、葉肉細胞内のオルガネラトレース画像を用いた解析に対する最適な条件を見つける必要があったため、方法論の確立に時間を要することが予想されたが、予想より早く最適条件の検討に成功した。連続画像の取得に関して、ウルトラミクロトームによる連続切片ではz軸の間隔が100 nmとなり、接触面の定量において解像度が低いことが予想された。そのため、FIB-SEMの使用も検討したが、トレースを行って画像解析を行ったところ、100 nm間隔の切片でも十分な解像度を確保できることが明らかとなった。ウルトラミクロトームとTEMは、FIB-SEMと比較して機器の汎用性が高いため、次年度以降の研究を効率的に進めることができるようになった。研究開始時点におけるImage-Proを用いた画像解析手法の確立とz軸方向の解像度の問題が解決し、対照環境で生育させたイネの葉肉細胞における葉緑体・ミトコンドリア・ペルオキシソームの接触面積の定量を行うことができた。来年度以降の塩ストレス実験に向けた研究基盤を整えることができたため、研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」とした。(1)塩ストレス下におけるオルガネラ接触面積の定量イネの耐塩性品種であるPokkalliと塩感受性品種の日本晴を用い、3週齢の植物に100 mMのNaClを含む培地で4日間栽培することで塩ストレス処理を行う(対照区はNaClを含まない培地で栽培する)。対照区と塩処理区それぞれの最上位最大展開葉を用い、電顕固定を行う。固定後の切片作製と観察は、ウルトラミクロトームとTEMによる連続切片法を用いて、葉肉細胞全体の連続画像を取得する。得られた画像から葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソームを抽出し、三次元像再構築ソフトを用いてそれぞれのオルガネラについて膜接触面積を定量評価する。塩処理による膜接触面積の増減程度を耐塩性品種と塩感受性品種で比較し、オルガネラの膜接触面積の増減は品種間で差があるのか、さらに耐塩性と関係するのかを明らかにする。(2) PEGストレス下におけるオルガネラの接触面積の定量塩ストレスは、過剰な塩に起因するイオンストレスと浸透圧ストレスの複合ストレスである。そのため、オルガネラ間の膜接触面積の変化に対するストレス要因を特定する必要がある。3週齢のイネ品種日本晴を用い、100 mMのNaClストレスと同等の浸透圧ストレス処理をポリエチレングリコール(PEG)溶液を用いて行う。対照区とPEG処理区それぞれの最上位展開葉を用いて電顕固定を行う。固定後、ウルトラミクロトームとTEMによる連続切片法により、葉肉細胞全体の連続画像を取得する。得られた画像から葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソームを抽出して、三次元像再構築ソフトを用いてそれぞれのオルガネラの膜接触面積を定量評価する。このデータと塩ストレス実験で得られたデータをつき合わせ、膜接触面積の変化におけるストレス要因を特定する。

続いて、圃場条件で3ヶ月生育させたイネの最上位展開葉と下位葉を用いて電顕固定を行い、ウルトラミクロトームを用いて500枚程度の連続画像を取得した。葉肉細胞を3つずつ撮影し、葉肉細胞全体と葉緑体・ミトコンドリア・ペルオキシソームのトレース画像を作製した。そのトレース画像を用いてオルガネラ間の接触を定量した。その結果、1つの葉緑体の表面積に対して、ミトコンドリアとの接触面は約10%であった。一方、ペルオキシソームとの接触面は、葉緑体の表面積の約3%であった。1つのミトコンドリアの表面積に対して、葉緑体との接触面は約50%であった、一方、ペルオキシソームとの接触面は、ミトコンドリアの表面積の約10%であった。1つのペルオキシソームの表面積に対して、葉緑体との接触面は約40%であった。一方、ミトコンドリアとの接触面は、ペルオキシソームの表面積の約40%であった。最上位展開葉と下位葉を比較しても、接触面積に有意な差はなかった。続いて、各オルガネラの表面積と接触面積との関係を調べた。葉緑体の表面積とミトコンドリアとの接触面積には、有意な正の相関があったが、ペルオキシソームとの接触面積には有意な相関はなかった。ミトコンドリアは、表面積が大きくなるほど葉緑体とペルオキシソームとの接触面積が大きくなり、有意な正の相関があった。しかし、ペルオキシソームの表面積と葉緑体やミトコンドリアとの接触面積には、有意な相関はなかった。Image-Proの画像ソフトを用いた接触面積の定量解析は、これまで植物分野では行われていなかった。そのため、葉肉細胞内のオルガネラトレース画像を用いた解析に対する最適な条件を見つける必要があったため、方法論の確立に時間を要することが予想されたが、予想より早く最適条件の検討に成功した。連続画像の取得に関して、ウルトラミクロトームによる連続切片ではz軸の間隔が100 nmとなり、接触面の定量において解像度が低いことが予想された。そのため、FIB-SEMの使用も検討したが、トレースを行って画像解析を行ったところ、100 nm間隔の切片でも十分な解像度を確保できることが明らかとなった。ウルトラミクロトームとTEMは、FIB-SEMと比較して機器の汎用性が高いため、次年度以降の研究を効率的に進めることができるようになった。研究開始時点におけるImage-Proを用いた画像解析手法の確立とz軸方向の解像度の問題が解決し、対照環境で生育させたイネの葉肉細胞における葉緑体・ミトコンドリア・ペルオキシソームの接触面積の定量を行うことができた。来年度以降の塩ストレス実験に向けた研究基盤を整えることができたため、研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」とした。(1)塩ストレス下におけるオルガネラ接触面積の定量イネの耐塩性品種であるPokkalliと塩感受性品種の日本晴を用い、3週齢の植物に100 mMのNaClを含む培地で4日間栽培することで塩ストレス処理を行う(対照区はNaClを含まない培地で栽培する)。対照区と塩処理区それぞれの最上位最大展開葉を用い、電顕固定を行う。固定後の切片作製と観察は、ウルトラミクロトームとTEMによる連続切片法を用いて、葉肉細胞全体の連続画像を取得する。得られた画像から葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソームを抽出し、三次元像再構築ソフトを用いてそれぞれのオルガネラについて膜接触面積を定量評価する。
ドイツ語におけるモダリティの言語類型論的考察 1

言語表現は、事柄の客観的記述である命題部分と事柄に対する話者の主観的心的態度を表す部分であるモダリティから成り立っている。本研究は、ドイツ語におけるモダリティの表現を日本語、英語などと対比しつつ、より普遍的な形式によって記述しようとしたものである。本研究によって得られた知見は次の点に要約される:1)モダリティの表現形式は、日本語では、文型、助動詞、副詞、副助詞、終助詞などが、また、ドイツ語では、動詞の話法、話法の副詞、心態詞、挿入文、特定の文型、音調などがある。2)従来epistemic modalityと呼ばれてきたものは、単なる断定保留の場合と推量の確かさの程度を表す場合とに分かれる。また、判断の様式を表すものとして、外界の徴候にもとづく推量(evidentials)と論理的推論による推量がある。また、これらのモダリティは法副詞との密接な呼応関係において記述できる。3)日本語の複合動詞は多様な文法カテゴリーの表示を担うが、中でも、て+くる・いく、て+やる・もらう・くれるなどは話者の視点の置き方と関係した主観性を表すものであり、命題表現とモダリティ表現との中間に位置するものである。4)命題を表す形式とモダリティを表す形式とが連続的に移行していく様を観察することができた。5)deontic modalityおよびepistemic modalityを表すドイツ語の助動詞についても日本語の場合と同様の相互承接がみられる。6)日本語授受動詞などに見られる話者の視点の置き方による主観性の表現は、ドイツ語では動詞の区別よりもいわゆる関心や利害の3格やコンテクストによることが明らかになった。言語表現は、事柄の客観的記述である命題部分と事柄に対する話者の主観的心的態度を表す部分であるモダリティから成り立っていると考えられる。本年度はまず最初に、モダリティの概念内容について検討した。どこまでを話者の心的態度の表現内容と見るかは諸家によってさまざまである。広く捉える立場では、否定、時制、アスペクトなどを含める場合もあるが、むしろこれらは語用論との関連で考察されるべきである。モダリティの中核的部分は、真偽判断、価値判断、伝達態度などであると考えられるから、これらを記述の枠組みとして取り上げることにした。また、これらの間の階層的関係も記述の過程で考慮することが必要であることが明らかとなった。次いで、個別言語によってきわめて多様であるモダリティ表現について、ドイツ語と日本語を中心に、それらの形態的手段を検討した。ドイツ語では、主に動詞の話法、話法の副詞、心態詞、挿入文、母型文などの特定の文型、音調などが考えられる。また、日本語では、助動詞、副詞、副助詞、終助詞などが考察の対象となる。現在、これらの個別言語的表現手段を整理した上で、相関的に記述し、上述の枠組みの中で個別言語的体系を相互に対照し、普遍的なレベルでの記述を試みつつある。また、このような演繹的な理論構築と並行的に、理論の実証的検証のために、日本語とドイツ語の例文を収集し、コンピュータに入力してデータベースを作成する作業に着手した。この作業には、書物などの形で印刷されたテクストを読み取り機にかけてファイルを作り、それを修正してデータベース化することが作業のスピードアップにきわめて有効なことが判明した。本研究は、ドイツ語におけるモダリティの表現形式について、日本語、英語、朝鮮語などと対比しつつ、類型論の視点から、より普遍的な形式によって記述しようとするものである。本年度は日本語のモダリティ表現を中心に考察をすすめた。

仁田義雄、益岡隆志、Palmer,Traugott,Frawley,Bybeeなどの理論を参照しつつ、仁田の用語に従って、モダリティを発話・伝達のモダリティと言表事態めあてのモダリティに大別した上で、とくに、言表事態めあてのモダリティの中の判断のモダリティについて検討した。この判断のモダリティはさらに、話し手の断定を表すものと推量を表すものに分かれる。この推量を表すものは従来epistemic modalityと呼ばれてきたが、これはさらに単なる断定保留の場合と、推量の確かさ、蓋然性の程度を表す場合とが区別されなければならず、またその他にも、判断の様式を表すものとして、外界の徴候にもとづく推量(evidentials)と論理的推論による推量があり、これら4つのモダリティは、モダリティの副詞との密接な呼応関係において記述できることが明らかとなった。次いで、仁田のいう、日本語におけるさまざまな真性モダリティ形式と疑似モダリティ形式について検討したが、命題を表す形式とモダリティを表す形式とが連続的に移行していく様を観察することができた。また、実証的な研究として、テキストデータベースからの用例の採集は欠かすことができないが、そのためのOCRによるテキストデータベースの構築と並んで、EDRに採録された日本語、英語の各22万にのぼる用例と記述も本研究にきわめて有効なことが判明した。言語表現は、事柄の客観的記述である命題部分と事柄に対する話者の主観的心的態度を表す部分であるモダリティから成り立っていると考えられる。本研究は、ドイツ語におけるモダリティの表現形式について、日本語、英語、朝鮮語などと対比しつつ、類型論の視点から、より普遍的な形式によって記述しようとするものである。本年度は、日本語のモダリティ表現は、法副詞の他に、断定、推量、希望、伝聞、様態、可能などの助動詞が重要な役割を占めているが、これらの助動詞が本来動詞から派生したものであり、日本語にあっては複合動詞がさまざまな文法カテゴリーの表示を担うというのが基本的パターンであるという事実に鑑み、動詞+動詞、動詞+て+動詞の形式を体系的に検討した。その結果、これらの形式はヴォイス、アスペクトなどを表すだけでなく、て+くる・いく、て+やる・もらう・くれるなどは話者の視点の置き方と関係した主観性を表すものであり、命題部分とモダリティ表現との中間に位置するものであることが判明した。次いで日本語との対比において、deontic modalityおよびepistemic modalityを表すドイツ語の助動詞について体系的な記述を試みた。その結果、これらのドイツ語の助動詞についても日本語の場合と同様の相互承接がみられることが確認された。また、日本語の授受動詞などにおける話者の視点の置き方による主観性の表現に関して、ドイツ語ではどのような形態によって表現されるのかを分析したが、ドイツ語にあっては動詞の区別よりもいわゆる関心や利害の3格やコンテクストによることが明らかになった。また、今年度もCD-ROMなどのテキストデータベースの拡充に努めた結果、日本語、ドイツ語などのモダリティの用例収集にかなり有用であることがわかった。
腫瘍選択的増幅型ハイブリッドウイルスベクターの開発とその制御機構の解明

癌の遺伝子治療において様々なベクター系が用いられているが、より高い臨床的効果を期待するために、さらなる改良が求められている。腫瘍内で治療遺伝子を増幅させ遺伝子発現増強とベクターの拡散を促すシステムの実用化をめざし、ハイブリッドベクターの開発とアデノウイルス初期遺伝子群の機能解析を行うことを目的とした。本年度は、引き続きアデノウイルス初期遺伝子群E1、E2、E4、およびVAの機能を応用し、細胞内で治療ベクターの複製を誘導するシステムを推進した。アデノウイルス初期遺伝子群発現ベクターが生体内でサイレンシングを受けにくくするために、MSCV-LTRの抑制性転写因子結合領域欠失レトロウイルスベクターを応用した。HSV-放発現治療ベクターAAVTk、E1B55k欠失E1遺伝子発現ベクターAAVE1、E1B55k遺伝子発現ベクターAAVE1B55、E2遺伝子発現レトロウイルスベクターDNE2、E4-VA遺伝子発現レトロウイルスベクターDNE4VA、およびRep/Cap発現レトロウイルスベクターDNRepCapの混合感染を腫瘍細胞の系で行った。治療遺伝子として搭載されたHSV-tk遺伝子のコピー数を測定し、ベクターの複製効率と感染条件を検討した。さらに、腫瘍細胞における遺伝子発現を向上させてベクターの複製効率を増強させるため、ベクター感染時にHDAC阻害剤を併用し、遺伝子発現増強効果やその作用機構を解析した。より強力な自殺遺伝子治療の開発を期待して以下の検討を行った。(1)アデノ-レトロハイブリッドウイルスを構築し、腫瘍内レトロベクター産生システムによる治療効果を検討した。さらに、動物モデルにおける効果を確認するためにベクターやドキシサイクリンの投与方法について至適条件の検討を行っている。(2)正常組織に対して安全性が高いAAVを腫瘍細胞内において増幅し、優れた遺伝子導入効率を有するシステムを検討した。腫瘍細胞におけるp53の機能異常に依存するだけでは腫瘍特異性が完全ではないことが臨床治験において報告されており、さらに高い腫瘍特異性を獲得するために構造蛋白質を腫瘍特異的に発現させる工夫を検討している。(3)AAVを効率良く調整するためAAV作製細胞株の開発を試みた。Rep蛋白質の発現を調節可能としたAAV作製細胞株はAAVベクターを効率良く調整するために有用であることが予想されるが、AAV作製前駆細胞が継代につれて徐々に増殖が遅くなることが問題である。アンチセンスの発現状態でもRep蛋白質の発現を完全には制御できていない可能性があり、長期間におよび効率良く制御するシステムの開発が今後の課題として残る。(4)将来における幹細胞の癌治療への応用の前段階として、アデノウイルスと細胞との接着機構を応用したアデノウイルスベクターの感染標的アダプター分子を開発した。血管新生抑制遺伝子等を用いた応用に向けて、動物モデルにおける幹細胞の腫瘍内での動態をさらに詳細に解析する必要がある。現在、動物モデルを用いて以上の基盤技術の検討を行っている。以上の様に、遺伝子導入方法、治療遺伝子および治療方法の各段階における基盤技術の検討を行うことにより、臨床応用に向けた治療システムの開発が期待される。より強力で安全な自殺遺伝子治療への応用を期待して、ハイブリッドベクターを応用した腫瘍内複製型治療ベクターの検討を行った。(1)腫瘍内でレトロウイルスベクターを産生させ拡散させるシステムとして、自殺遺伝子を搭載したアデノ-レトロハイブリッドウイルスベクターを構築し、担癌動物モデルでの治療効果を確認した。治療遺伝子の効果を上げる工夫として、互いに異なる機序でアポトーシスを誘導するBH3因子(Bim)遺伝子およびHSV-tk遺伝子を腫瘍細胞に導入し、その相乗効果を検討した。さらに、未分化細胞優位に遺伝子導入を行うことを期待し、アデノウイルスと細胞との接着機構を応用した感染標的アダプター分子を開発した。(2)安全性が高いAAVベクターを複製させて癌治療に応用するシステムを検討した。まず、各血清型AAVの感染様式の特徴を比較した。次に放射線や抗癌剤を用いてAAVの一本鎖DNAゲノムから発現型の二本鎖への変換を促進し、遺伝子発現の増強効果を検討した。さらに、治療ベクターと共に、AAVの溶解感染に必要なアデノウイルス初期遺伝子やAAV蛋白質などをアデノウイルスベクターを用いて腫瘍に発現させ、AAVベクターの複製を確認した。以上の基盤技術を各腫瘍の治療モデルに応用することにより、より有効な治療システムの開発が期待される。癌に対するより強力な自殺遺伝子治療システムを開発するため、ハイブリッドベクターを応用した腫瘍内増幅型ベクターの構築と機能解析を行った。(1)まず、アデノウイルスを骨格としたレトロウイルスとのハイブリッドベクターの開発を引き続き推進した。レトロウイルスの誘導をより厳密に制御するため、ヘルペス単純ウイルスのVP-16由来の最小活性化領域を反復縦列に並べたmutant rtTAを用い、tet-on遺伝子発現制御系の応用の可能性を検討したmutantrtTA下にtet-responsive element (TRE)-minCMVプロモーターおよびd2EGFPを搭載した単一発現カセットを構築した。この単一発現カセットを293細胞に導入し、Doxycycline投与前後の遺伝子発現を検討し、バックグラウンドの低い発現制御が可能であることを確認した。さらに、マウス下肢筋肉にべクターを注入し、生体内における遺伝子発現制御効果を確認した。(2)腫瘍内自己複製型ベクターとして、腫瘍細胞内でアデノウイルス初期遺伝子群を発現させ、AAVベクターを複製させるシステムを推進した。

腫瘍組織内で、ウイルスの複製に必要な遺伝子を安定に発現させるために、PCMV-LTRのU3領域における抑制性転写因子結合領域を欠失させたレトロウイルスベクターを用いたEGFP遺伝子発現ベクターを構築しヌードマウス皮下腫瘍での発現経過を検討したところ、抑制性転写因子結合領域を欠失させた場合には、そうでない場合と比較して安定した発現が認められた。このベクターを用いてAAVの複製に必要なRep/Cap、およびアデノウイルス初期遺伝子群(E1,E2,E4/VA)を発現するベクターを各々構築し、複製効果を確認した。以上の基盤技術を各腫瘍の治療モデルに応用することにより、より有効な治療システムの開発が期待される。癌の遺伝子治療において様々なベクター系が用いられているが、より高い臨床的効果を期待するために、さらなる改良が求められている。腫瘍内で治療遺伝子を増幅させ遺伝子発現増強とベクターの拡散を促すシステムの実用化をめざし、ハイブリッドベクターの開発とアデノウイルス初期遺伝子群の機能解析を行うことを目的とした。本年度は、引き続きアデノウイルス初期遺伝子群E1、E2、E4、およびVAの機能を応用し、細胞内で治療ベクターの複製を誘導するシステムを推進した。アデノウイルス初期遺伝子群発現ベクターが生体内でサイレンシングを受けにくくするために、MSCV-LTRの抑制性転写因子結合領域欠失レトロウイルスベクターを応用した。HSV-放発現治療ベクターAAVTk、E1B55k欠失E1遺伝子発現ベクターAAVE1、E1B55k遺伝子発現ベクターAAVE1B55、E2遺伝子発現レトロウイルスベクターDNE2、E4-VA遺伝子発現レトロウイルスベクターDNE4VA、およびRep/Cap発現レトロウイルスベクターDNRepCapの混合感染を腫瘍細胞の系で行った。治療遺伝子として搭載されたHSV-tk遺伝子のコピー数を測定し、ベクターの複製効率と感染条件を検討した。さらに、腫瘍細胞における遺伝子発現を向上させてベクターの複製効率を増強させるため、ベクター感染時にHDAC阻害剤を併用し、遺伝子発現増強効果やその作用機構を解析した。
走査プローブ法と伝導度測定によるグラフェンへのバンド・ギャップ誘起の研究

本研究では、グラフェンへのバンド・ギャップ誘起とそのメカニズムの解明を目標とし、原子/分子吸着の効果と、細孔によるグラフェン加工の効果を調べた。前者では吸着子がグラフェンのカイラル対称性を破ることが期待されたが、バンド・ギャップ誘起を示す結果は得られなかった。一方、後者ではグラファイト表面にジグザグ端で囲まれた単原子層深さの六角形ナノピットを多数作成することに成功し、低温磁場中走査トンネル顕微・分光法により、ナノリボンでのエネルギーギャップ誘起の観測に成功した。また、グラフェンにおける量子ホール端状態とジグザグ端状態の関係を実空間で示すことに成功した。本研究課題では、グラフェン上に原子あるいは分子を(√3x√3)R30°構造で吸着させることによって期待されるカイラル対称性の破れと、それによるバンドギャップ誘起を走査トンネル顕微/分光法(STM/S)による局所的な測定と、電気伝導度測定による巨視的な測定を併用して調べることを目的とする。昨年度はKr原子を吸着子として、SiO2上に劈開して作成した劈開グラフェンの伝導度測定を行った。申請時までにはグラフェンの抵抗のゲート電圧依存性にはKr吸着の効果は観測されず、希ガスであるKr原子ではグラフェンの電子状態を変化させるほどの効果をもたないと考えていた。しかし吸着量を増やすことでグラフェンへの電子ドープが観測された。一方、SiC結晶上にエピタキシャル成長して得られたSiCグラフェンに対するSTM/S測定では、Kr原子はグラフェンと基板との間にインタカレートすると同時にディラック点エネルギーがマイナス側にシフトする様子が観測された。これはグラフェンへの電子ドープに対応し、伝導度測定の結果とも符合する。同時に、申請者はグラフェンおよびグラファイト上にジグザグ構造の端を選択的に作成する研究も進めてきた。ジグザグ端で挟まれたナノリボンでは、グラフェンへのバンドギャップ誘起とジグザグ端状態の解明というグラフェン研究の2大課題を同時に取り扱うことができる。昨年度は作成したジグザグ端の電子状態の低温、高磁場中でのSTM/S観測にも着手した。本研究課題ではグラフェンへのバンドギャップ誘起とそのメカニズムの解明を目標とする。そのために、ここでは2つの手法に注目する。ひとつは原子あるいは分子をグラフェンに(√3x√3)R30°構造で吸着させることで期待されるカイラル対称性の破れと、それによるバンドギャップ誘起。もうひとつは細孔を周期的に開けることにより対称性を破る方法である。後者の手法では、バンドギャップ誘起の可能性と共に、ハニカム構造に特有のスピン偏極したジグザグ端状態の観測も期待できる。こうしたグラフェンの物性制御を、走査トンネル顕微/分光法(STM/S)による局所的な測定と、抵抗測定による巨視的な測定を併用して調べる。前者の手法に対しては、Kr原子を吸着子としグラフェンの抵抗のゲート電圧依存性を測定した。Kr原子はグラファイト上で(√3x√3)R30°構造で吸着することがSTM観測からも明らかであるが、様々な吸着量や温度、グラフェン試料に対してもKr吸着によるグラフェンの有意な物性変化は観測されなかった。酸素分子によるホールドープ効果は観測されるものの、極性分子であるN2Oに対しても、グラフェンの物性変化は観測されなかった。これは基板からの影響が強すぎるために、吸着子の効果が覆い隠されている可能性がある。一方、グラフェン上への細孔およびジグザグ端の作成のために、原子状水素と水素プラズマによるグラファイト表面のエッチングを試みた。その結果、原子状水素では単原子層深さの溝やステップが作成され、そのほとんどがジグザグ構造をなしていることが分かった。加えて、水素プラズマを用いたエッチングでは、ジグザグ端で囲まれた単原子層深さの六角形ピットが作成できることが分かった。この場合、六角形の辺内では強磁性的、辺間では反強磁性的な相互作用が期待され、六角形に挟まれた領域にはジグザグ端で挟まれたナノリボンを得ることもできる。本研究課題では、グラフェンへのバンドギャップ誘起とそのメカニズムの解明を目標とし、そのために2つの手法に注目して研究を進めた。ひとつは原子あるいは分子をグラフェン上に(√3X√3)R30°構造で吸着させることで期待されるカイラル対称性の破れと、それによるバンドギャップ誘起であり、もうひとつは細孔を周期的に開けることにより対称性を破る方法である。前者に対しては、グラファイトをSiO2基板上に劈開して得られるグラフェンの電気伝導度測定を通して研究を進めた。昨年度までに、原子・分子吸着によるバンドギャップ誘起は観測されず、SiO2基板の凹凸や不純物の影響が無視できないことが考えられた。そこで今年度はSiO2基板を部分的に削ることで浮遊グラフェンを作成し、電荷ドープや不純物散乱の効果を抑えた清浄度の高いグラフェンを用意した。しかし、Kr原子吸着によるバンドギャップ誘起の効果を電気伝導特性の変化として測定することはできなかった。以上の結果から、原子・分子吸着によるバンドギャップ誘起の効果は極めて弱いか、少なくとも、電気伝導特性という巨視的な物理量では容易に観測できないことが分かった。一方、後者に対しては、グラファイト表面にジグザグ端で囲まれた六角形ナノピットを作成して得られるジグザグ端やジグザグ・ナノリボンにおける電子状態をSTM/Sにより直接観測した。

その結果、ナノリボンでは確かにフェルミエネルギー周りで電子状態密度が抑制される様子が観測された。ただし、これがバンドギャップ誘起によるものかどうかは、引き続き精査していく必要がある。本研究では同時に、端に局在するジグザグ状態とランダウ準位の関係に注目し、ジグザグ端状態と最低指数のランダウ準位(LL0)が端近傍で共存することを示すと共に、LL0が高次のランダウ準位とはジグザグ端近傍で異なる振る舞いを示した。本研究では、グラフェンへのバンド・ギャップ誘起とそのメカニズムの解明を目標とし、原子/分子吸着の効果と、細孔によるグラフェン加工の効果を調べた。前者では吸着子がグラフェンのカイラル対称性を破ることが期待されたが、バンド・ギャップ誘起を示す結果は得られなかった。一方、後者ではグラファイト表面にジグザグ端で囲まれた単原子層深さの六角形ナノピットを多数作成することに成功し、低温磁場中走査トンネル顕微・分光法により、ナノリボンでのエネルギーギャップ誘起の観測に成功した。また、グラフェンにおける量子ホール端状態とジグザグ端状態の関係を実空間で示すことに成功した。これまでの研究から、(√3x√3)R30°構造の形成が期待される吸着量や温度においてKr原子は劈開グラフェンの電気伝導特性に何の効果も及ぼさないが、一方で、SiCグラフェンに対するSTM/S測定では、Kr原子はグラフェンの下に潜り込むと同時に、電子ドープを示唆する電子状態の変化を誘起することが観測されていた。本研究において、十分な面密度でKrを吸着させた場合には、STM/Sの結果と同様に電子ドープを示唆する電気伝導特性の変化が観測された。しかし、これは異なるグラフェン試料に対しては再現せず、加えて極性分子であるN2Oに対しても有意な物性変化が観測されなかったことから、吸着子の効果を観測するには、基板の効果が無視できないことが分かった。そこで本研究ではさらに、溝を掘った基板を用いることで、基板から浮いたグラフェンを作成した。こうして得られた浮遊グラフェンに対して原子や分子を吸着させることで、吸着子がグラフェンに及ぼす寄与の観測が期待できる。一方、これまでにはArガスによるエッチングで細孔を開けたグラファイト表面に対してのSTM/S測定によって、細孔周りにエッジ状態を示唆する大きな状態密度の観測に成功していた。しかし、こうして作成された細孔は不定形である。そこで本研究では水素プラズマによるエッチングを試み、ジグザグ端で囲まれた六角形の細孔の作成に成功した。作成時の温度や時間、プラズマを生成する高周波電力を変えることで、細孔の大きさや密度をコントロールできることも分かった。今後のSTM/S測定によって、細孔列の作成によるバンドギャップ制御やスピン偏極ジグザグ端状態についての知見が得られると期待される。このように、必ずしも当初の計画通りではなく、研究期間の延長も必要となったが、目標達成へ向けて、研究結果を受けて計画を修正した結果であり、全体としては順調に進んでいると考えている。低温電子物性溝を掘った基板上に作成した浮遊グラフェンに対して、希ガスであるKr原子や極性分子であるN2Oを吸着させることによるグラフェンの物性変化の観測を目標とする。浮遊グラフェンは基板が存在することによる凹凸や不純物の効果を排除した理想的なグラフェンと考えられる。
海象リモートセンシングの実用化とその応用研究

短波海洋レーダから波浪スペクトルを求める手法を開発した。短波海洋レーダから推定された波浪データと,現場観測及びモデルで予測された波浪データの相互比較を行った。中間周波数帯の波浪エネルギーは,低・高周波数帯のそれらよりも良く一致した。中間周波数帯は最もエネルギーの大きな周波数帯である。一方,波向きは高周波数帯で最も良く一致する。レーダで求めた平均波高分布とモデル推算による平均波高分布も類似していた。研究代表者は,短波海洋レーダによる海流・波浪観測に関する研究を行っている。短波海洋レーダとは,短波帯の電波を海面に照射し,海面で散乱されて戻ってきた電波をスペクトル解析することによって,表層の海流や波浪などを観測する装置である。特に短波海洋レーダによる波浪観測の実用化が今回の研究の目的である。(1)ドップラースペクトルの品質管理手法スペクトル解析によって得られたスペクトルは,ドップラー周波数の関数として表される。これをドップラースペクトルという。雑音の影響が大きなドップラースペクトルを波浪推定に用いることは不可能である。従ってそのようなドップラースペクトルを選別する手法を開発した。(2)波浪スペクトル値は全方程式(ドップラースペクトルと波浪スペクトルの関係を表す積分方程式、定常としたエネルギー平衡方程式など)の重みつき二乗和を最小にするような未知数として求めている。この重みの最適値は海況(うねりが卓越するかどうかなど)によっても異なる。そこでこの重みの最適値を簡便に決定する手法を開発する。(3)海洋レーダの特徴は,海流・波浪などの物理量の水平分布を得られることである。ところが波浪に関してはその水平分布の妥当性が調べられたことはなかった。レーダ・現場観測・モデルによる波浪スペクトルの相互比較を行うことによって波浪データの水平分布の妥当性を調べる。短波海洋レーダによる海流データと人工衛星リモートセンシングデータを用いて,沖縄本島西方海域の海流・海上風・海面水温の関係を調べた。短波海洋レーダとは,沿岸から,短波帯の電波を海面に照射し,海面で散乱されて戻ってきた電波をスペクトル解析(得られたスペクトルをドップラースペクトルという)することによって,表層の海流や波浪などを観測する装置である。海上風はマイクロ波散乱計によるもの、海面水温はマイクロ波放射計によって得られたものである。この沖縄本島西方海域の観測例は少なく、海洋環境の実態は殆ど知られていない。この海域は黒潮(西岸境界流)の東側の再循環域に相当する。従って北上する黒潮に対して,南下する流れがあると考えられる。海洋レーダによる海流の観測期間は1999・2000年内の各々約1ヶ月程度である。観測期間が短いため,2003年から2005年までのJCOPE(Japan Coastal Ocean Predictability Experiment)による同化データも使用した。海洋レーダによる海流データと人工衛星リモートセンシングデータを解析した結果,この海域の平均海流は南向きであること,この海流の向きは海面水温と対応していることが示された。この南向き流は強くなることがある。また黒潮の東側の海上では,正負の風応力カールが見られる。そして南向き流は強いときは,この風応力カールが強化されることが示された。これらの結果は,JCOPEデータによっても確認された。この成果は海象リモートセンシングの応用研究の一部となるものである。短波海洋レーダによる波浪推定の,実用化のための研究を行った。短波海洋レーダとは,沿岸から,短波帯の電波を海面に照射し,海面によって散乱されて戻ってきた電波をスペクトル解析することによって,表層の海流や波浪などを観測する装置である。スペクトル解析によって得られたスペクトルは,ドップラー周波数の関数として表される。ドップラースペクトルには,一次散乱という大きなピークと二次散乱と呼ばれる小さなピークが見られる。波浪スペクトル推定には,一次散乱のみならず二次散乱も用いる。従って雑音の影響を受けやすい。さらにドップラースペクトルが雑音の影響を受けた場合,波高を過大評価してしまう。そこで短波海洋レーダから得られた波浪データを品質管理を簡便に行う手法を開発した。まずドップラースペクトルの雑音を評価する。その雑音を差し引いたスペクトル値から波浪スペクトルを推定する。それでも雑音が十分に除去されていない場合もある。この波浪スペクトル推定手法は,波浪スペクトルとドップラースペクトルの関係式の他に,エネルギー平衡方程式を用いている。従ってエネルギー平衡方程式における伝搬項及びソース関数を見積もることができる。それらから波浪スペクトルの時間変化率を見積もることが可能である。この方法で,レーダによって推定された波浪スペクトルから波高の時間変化率を評価する。この波高の時間変化率を基に得られた波浪データの品質管理を行った。その結果,雑音の影響を受けた波浪データを除去することが可能となり,現場観測との比較結果も向上した。

またレーダ・現場観測・モデルとの相互比較を行い,波浪スペクトル推定の評価を行う研究にも着手した。研究代表者は,これまで波浪スペクトル推定手法の開発を行ってきた。しかし現場観測との比較は、波高データの比較のみにとどまり、不十分である。そのためレーダ・現場観測・モデルとの相互比較を行い、波高データのみならず、スペクトルについても比較できるようにした。そこで波浪推算モデルを作成した。波浪推算モデルに関しては遠距離を伝搬するうねりに関してもそれを再現できるようにした。遠距離を伝搬するうねりの場合,波浪スペクトルの幅が狭い。従って現実的な波浪推算モデルにおける周波数・方向分解能では,そのような波浪スペクトルを分解することが出来ない。その結果,推算波高の水平分布は,奇妙な形状となってしまう。これをGarden Sprinkler Effect (GSE)と呼ぶ。研究代表者は,GSEを除去する新しい手法を開発した。この手法の原理は,低スペクトル分解能において,隣り合う周波数(或いは方向)の推算波浪スペクトルの水平分布から,それらの周波数(方向)の中間の周波数(方向)のスペクトルの水平分布を補間するものである。この手法の特徴は,従来の手法とは異なり,低スペクトル分解能の推算波浪スペクトルから高スペクトル分解能の波浪スペクトルを再現することである。従って従来のGSE除去手法では不可能であった波浪スペクトルの幅なども求めることが可能である。この波浪推算モデルをもとにレーダ・現場観測・モデルとの相互比較を行った。ここでは,波高などの波浪パラメータの他,波の周波数スペクトルや波高の水平分布などについても,モデル推算とレーダ推定値の比較を行った。短波海洋レーダから波浪スペクトルを,インバージョンによって求める手法を開発した。短波海洋レーダから推定された波浪データと,現場観測及びモデルで予測された波浪データの相互比較を行った。中間周波数帯の波浪エネルギーは,低・高周波数帯のそれらよりも良く一致した。中間周波数帯は最もエネルギーの大きな周波数帯である。一方,波向きは高周波数帯で最も良く一致する。これは,高周波数帯の波向きは風向に最も近く,風向は一次散乱の比から求められるからである。レーダで求めた平均波高分布とモデル推算による平均波高分布も類似していた。また沖縄島東方沖における海洋レーダ流速ベクトル分布図から,その分類法に関する比較研究を行った。比較したのは自己組織化マップ(SOM)解析とクラスター法である。分類の結果,観測域東側で強い南向きの流れがあるパターンと,時計回りの渦のような流れがあるパターンとが示された。次に経験的直交関数(EOF)解析によって,データの次元を圧縮し,そのデータ分類への影響を調べた。流速ベクトル分布データをEOF上位モード番号で表現することにより,データの次元を圧縮する。
不連続・極小空間での透水係数と流体挙動の観察

地下空間の有効利用では、地下水の流動特性は極めて重要である。しかし、地下水の流動特性は、不可視の条件下での現位置透水試験でのみ評価されており、地下水の流動を含めた対応にはなっていない。また、地下水の流動特性は透水係数のみで評価され、水の流れ状態を含めた評価にはなっていないのが現状である。本研究は、地下空間で多く観察させる極小空間での流路不連続下での透水試験を行い、空間内の流れ構造を実験的に把握する目的で実施する。実験は変水位透水試験装置を自作し、供試体内を可視化できるよう工夫した。極小空間を連続した場合と、鉛直方向に交差させた場合(鉛直軸での不連続)、および水平方向で断面を変化させた場合(水平軸での不連続)での、透水係数の計測と可視化による観察を行った。なお、本実験では予備実験の結果、供試体内の水の動が小さく流出量が少なかったため、流入量を精度よく計測することに配慮した。なお、透水係数の算出は移動が小さく流出量が少なかったため、流入量を精度よく計測することに配慮した。なお、透水係数の算出は一般的な変水位透水試験と同様とした。その結果を以下に示す。・鉛直軸での不連続:極小空間を同方向に合わせた場合、流路断面積が倍になるため、透水係数は高くなる。また、鉛直軸方向に回転させると、透水係数は角度に関わらず単一の状態と同程度になることが確認できた。・水平軸での不連続:空間を場所的に拡大・縮小させた結果、その透水係数は連続の値と同程度であった。・流れの可視化:スタンドパイプから色素を混入させ、その流況を観察した。その結果、鉛直軸方向に回転させた場合、水平軸方向に変化させた場合ともに、流況による違いはなく一様に流下することが確認できた。
ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いた生体内筋弛緩剤の網羅的微量分析法の開発

高感度かつ短時間分析が可能なUPLC-MS/MS(超高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析装置)を用いて、生体内筋弛緩薬の網羅的な微量分析方法確立を研究目的とした。中枢性筋弛緩薬は、高感度かつESI(エレクトロスプレーイオン化)ポジティブ/ネガティブモードの並行測定が可能なUPLC-MS/MSを用いることで、数種類の血漿中筋弛緩薬の迅速同定・定量が可能であった。また末梢性非脱分極筋弛緩薬は、ESIモードの測定では定量性に問題があったが、ESI-APCI(大気圧化学イオン化)同時イオン化モードを用いることで、血中筋弛緩薬の迅速同定・定量が可能であった。高感度なUPLC-MS/MSを用いることで、4種類の血中筋弛緩剤の3分以内の迅速同定・定量が可能であった。ラットに投与したロクロニウムの検出・定量も可能であった。但し、2種の筋弛緩剤は検量線に直線性を示さず、濃度による解離状態の変化が示唆された。以上の結果を第50回国際法中毒学会で報告した。昨年度までで、UPLC-MS-MSのESIイオン化法を用いて、血液中筋弛緩剤の一斉分析方法確立を試みたが、数種類の筋弛緩薬の定量性に問題があった。本年度は、UPLC-MS-MSのESI-APCI同時イオン化モードを用いて、血中非脱分極性筋弛緩薬一斉分析法の検討を行った。前処理は、筋弛緩薬を添加した血液100 uLにアセトニトリル200 uLを加え除タンパク法により精製を行った。抽出した試料は乾固後、100 uLの初期移動相に溶解し、UPLC-MS-MSに導入した。測定条件は以下のとおりである。装置: Waters Acquity UPLC-TQD、カラム: Waters CORTECS C18 (50 ×2.1 mm i.d., 1.6 um)、カラム温度: 40°C、移動相: A (0.025%ギ酸含有ギ酸アンモニウム)、B (アセトニトリル)、グラディエント: 90% A / 10% B (0 min) - 5% A / 95% B (4 min)、流速: 0.5 mL/min、検出: ESI-APCIポジティブ同時測定モードで行った。ESIモードで検量線の直線性に問題のあったベクロニウム、パンクロニウムが、APCIモードを用いることによって検量線の直線性を得ることが可能であった。UPLC-MS-MS ESI-APCI同時イオン化モードを用いることで、血中筋弛緩薬の迅速同定・定量が可能であった。ESIモードの方が検出感度は自体は優れているため、並行利用すれば、非脱分極性筋弛緩薬の微量分析法を確立する可能性が期待できる。本成果を、第38回日本医用マススペクトル学会年会でポスター発表し、論文発表に向けて準備を行っている。初年度はUPLC-MS/MSシステムを用いて、中枢性筋弛緩剤について、迅速・高感度検出及び定量法の開発を行った。9種類の筋弛緩薬を添加した血漿100μLをアルカリ性にした後、固層抽出法により精製を行った。抽出した試料は乾固後、100μLの0.1 %ギ酸含有25%メタノールに溶解し、UPLC-MS/MSに導入した。装置: Waters Acquity UPLCsystem, Acquity TQD、カラム: Waters Acquity UPLC BEH C18 (2.1 ×50 mm i.d., 1.7 μm)、カラム温度: 40°C、移動相: A (0.1%ギ酸)、B (0.1%ギ酸含有アセトニトリル)、グラジエント: 90% A / 10% B (0 min) - 50% A / 50% B (3 min)、流速: 0.5 mL/minで行った。高感度かつESIポジティブ/ネガティブモードの並行測定が可能なUPLC-MS/MSを用いることで、9種類の血漿中筋弛緩剤の3分以内の迅速同定・定量が可能であった。検量線は良好な直線性を示し、検出限界は0.5 - 2 ng/mLであった。UPLC-MS/MSはわずかな検体量・短いサイクルタイムで、様々な化学構造の薬物の並行測定を可能としており、これを応用すれば網羅的な分析方法が見出されていなかった薬毒物の微量分析法を確立する可能性が期待できる。

本成果を、第95次日本法医学会学術全国集会で口頭発表し、Analytical & Bioanalytical Chemistry誌に論文発表を行った。当該年度中に末梢性筋弛緩薬迅速測定法開発を完成させる予定が、途上になっており、国際学会発表は行ったものの、論文発表が行えていないため。初年度の計画通りに中枢性筋弛緩剤の迅速一斉測定法を開発し、その成果を論文の形で報告できたため、おおむね順調に進展していると判断できる。末梢性筋弛緩剤迅速測定法を開発する。ターゲットイオンを複数個持つことで、濃度ごとの解離変化に対応する戦略である。また、代謝物分析をメタボロミクス分析手法を応用して行う予定である。末梢性筋弛緩剤に関しても、中枢性筋弛緩剤と同様に測定条件の確定を目指し、1)UPLC/MS/MSを用いて末梢性筋弛緩剤各個純品の測定条件の確定する、2)生体試料(全血、血漿、尿)からの末梢性筋弛緩剤分離方法を固相抽出法を中心に検討し、高回収効率の抽出法を確立し、3)次いで試料に添加実験を行い、日内、日差間の精度、再現性の測定を実施する。4)マウスによる動物投与実験を行い、末梢性筋弛緩剤の作用機構の確認、臓器分布濃度の微量分析を施行し、5)薬物の代謝に関して、薬物動態解析を行い、投与生物の生存時の代謝と死後の分解に関しての検討を行う予定である。その上で、もし可能であれば、実際の鑑定試料の測定も試みる予定である。上述の結果を踏まえた上で、より個々の物質に対応した精製及び測定条件の設定に引き続き、最終的に中枢性・末梢性筋弛緩薬を一斉分析する系の構築を目指す予定である。新たな機器の購入は必要ないが、分離カラムは通常のLC用と比較して粒子径が小さく、消耗品であるため、定期的に交換する必要がある。加えて実験試薬、抽出用カラム、実験動物など、消耗品経費が必要である。また、学会での研究成果の発表を予定しており、その参加費、旅費で使用予定である。現在、UPLC-MSシステムは愛知医科大学で所有しているが、故障中であるため、修理費用を研究費で充てる予定である。また、新たな機器の購入は必要ないが、分離カラムは通常のLC用と比較して粒子径が小さく、消耗品であるため、定期的に交換する必要がある。また、国際学会での研究成果の発表を予定しており、その参加費、旅費で使用予定である。