hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンチセンスオリゴ法によるHTLV-I関連疾患に対する遺伝子調節治療法の開発

(1)アンチセンスオリゴの合成:HTLV-Itax蛋白翻訳開始部分を標的としたアンチセンスオリゴマー(AS・tax)とそのセンスを合成し、われわれが報告した方法(J.Bion.Chem.267,25881,1992)に基づき3'末より3塩基をホスフォロチオエ-ト化した。また同方法を用い核内転写因子NF-kB p65に対するアンチセンス核酸(AS・NF-kB)も合成した。(2)アンチセンスtax,NF-kBによるHTLV-I産生細胞株(MT-2)の細胞増殖に与える影響:(1)により合成したAS・tax,AS・NF-kBをMT-2細胞に投与した。アンチセンスの蛋白抑制効果はtaxに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより最高80%の抑制,NF-kBはゲルシフトアッセイにより88%の抑制に成功した。しかし、MT-2細胞増殖はAS-taxでは変化がなく、AS・NF-kBにより投与量に比例して抑制され最大70%の増殖抑制が認められた。(3)HTLV-I関連疾患への応用:HTLV-I関連疾患のうち、HTLV-I型関節症(HAAP)の患者より得られた培養tax発現滑膜細胞にAS・taxを投与した。8日間の投与によりAS・taxは投与2日目より滑膜細胞の形態変化を誘導し3日目より明らかに有為な増殖抑制効果が確認できた(第15回国際臨床免疫学会、ストックホルム、1994年6月学会発表;臨床免疫27,153,1995,J.Clin.Invest.投稿中)。(4)AS・NF-kBの臨床への応用検討:炎症性サイトカインによりNF-kB活性が誘導されることが知られているが今回、われわれはトロンビン刺激によってもその活性が高められることを明らかにした。このトロンビン刺激によるNF-kBの活性はAS・NF-kBにより先のレベルにまで低下させることを見い出し報告した(Biochem.Biophys.Res.Commu.204,950,1994)。
地震波形データの大規模インバージョンによる精密な地球内部3次元構造の推定

本年度の研究成果を以下に記す。(1)長周期実体波を解析するために、長周期実体波及び表面波の波形を計算するソフトウェアを開発した。(2)上記(1)の計算精度の向上を図り、以下の改善を行った。(i)質量行列、ポテンシャルエネルギー行列の定義を変更することにより、離散化に伴う計算誤差を飛躍的に減らすことに成功した。(ii)地震源に働く力を表現する際、半径方向の不連続が生じる場合がある。これをスプライン関数で表現することにより生じる誤差を、力の表現を変更することにより飛躍的に減らした。この(i),(ii)の改善は計算精度の向上であると同時に、同じ計算精度で計算する場合には、必要な計算時間を飛躍的に減らすことが出来る。我々は、上記(1),(2)の研究成果をGeophysical Research Letters誌に発表した。(3)1992年のLanders地震では、震源付近で理論的に予想されるより約10倍も大きな振幅の表面波が観測された。この振幅異常の原因の考察するために、我々は昨年度に開発した偏微分係数の新しい計算アルゴリズムのソフトウェアを応用し、観測波形の解析を行った。解析結果から、我々は震源近傍で起こる振幅異常の理論を導きだし、数値実験によりこれを確認した。我々はこの結果をBulletin of Seismological Society of America誌に発表した。
高令者頭蓋内出血例におけるアミロイド・アンギオパチーの関与

本研究は高齢者の頭蓋内出血例の転帰不良となる因子、特に脳の脆弱性の指標としてamyloid angiopathy(以下AA)の存在を重要視し、開頭手術を施行した高齢者頭蓋内出血例において病理学的にAAの存在を検索し、臨床像との比較検討を行なった。対象は1994年6月より1995年1月まで当院に入院し、脳動脈瘤破裂に伴うくも膜下出血、高血圧性脳内出血、外傷性頭蓋内出血と診断され、それに対して開頭術が成された60歳以上の高齢者例とした。内訳はくも膜下出血(7例)、脳内出血(小脳出血2例、被殻出血1例)、外傷性頭蓋内出血(1例)の計11例で年齢は60-92歳にわたり、平均69歳であった。また、60歳以上の慢性硬膜下血腫例に対する穿頭術に際し、硬膜の採取可能であった12例に関しても同様な検討を行なった。AAの存在の有無は病理所見により診断することとし、摘出標本は症例の転帰に全く影響を与えない髄膜(大多数が硬膜、くも膜の採取は多くの例で脳の侵襲の大きさを考慮し困難であった)とした。標本として髄膜をCongo-red染色し、髄膜血管のアミロイド沈着、Tunica mediaの破裂等の有無を観察した。また、頭蓋内出血における臨床、神経放射線学的所見とを対比検討し、高齢者頭蓋内出血例におけるAAの関与性を検討した。結果は、1)発症以前に痴呆症が存在する、2)CTscan上の血腫の形状が大葉性、3)明らかに容易な手術操作で脳内血腫が発生したなどの臨床的にAAの存在が疑われたのは3例であった。しかし、これらを含め11例全例において病理学的なAAの存在は証明されなかった。一方、慢性硬膜下血腫例においては、穿頭術による採取した硬膜であるため少量で、且つ手術による焼灼操作により挫滅破壊が著しく、全例不十分な標本作成となった。高齢者の開頭術の適応は限定され症例数が少ないが、症例を積み重ねるとともに、剖検例での検討も重要と考え、今後継続研究していく予定である。
Na^+/Ca^<2+>交換機構阻害薬のマウス各種疼痛モデルにおける鎮痛効果

マウスの足底部にホルマリンを皮下注することによって生じる疼痛反応である、第工相、第II相の反応様式に対して、Na+/Ca2+交換輸送体阻害薬のKB-R7943を腹腔内投与し、この反応に与える影響を評価した。この結果、KB-R7943を腹腔内投与によりホルマリン投与の第II相反応が抑制され、中枢性疼痛が抑制されることが示唆された。しかし、これではKB-R7943が中枢性に作用しているか、全身性に作用しているかが不明であるため、現在マウスの髄腔内にKB-R7943を投与し、同様にホルマリンテストに与える影響を測定中である。また、他のNa+/Ca+交換輸送体阻害薬でも同様の反応が起こるかを評価するため、bepridilを投与し、その反応を測定中である。
理科教員養成を視野にいれた化学教育実験の実践的改善-マイクロスケール実験の普及-

Hl9年度は,それまでに開発した次の教材実験について学校現場での実践および学会でのシンポジウムの主催を行い、マイクロスケール実験の教育現場での普及に重点をおいた。小学校理科の教材開発:「水溶液の仲間わけをしよう」,「ものの溶け方のちがい」,「気体の発生と性質」、中学校理科の教材開発:「水の電気分解」,「爆鳴気」,「燃料電池の原理」,「水溶液の性質」,「中和反応」,「塩化銅水溶液の電気分解」,「気体の発生と性質(酸素,水素以外)」高校化学の教材開発:「紫キャベツの色素とpH」,「ダニエル電池と鉛蓄電池」,「金属陽イオンの定性分析」「未知試料の分離・確認」.小学校では、京都府木津市立相楽台小学校、京都市立稲荷小学校、同じく竹田小学校において、小6の約80名を対象に、「水溶液の性質」に関する授業実践を行った。中学校理科では大津市立北大路中学校において、中2の2クラス70名を対象に「水の電気分解」の授業を実施した.高等学校で行った授業実践は、京都府立宮津高校および山城高校において、高1受講生約100名を対象とした.大学における授業実践では,計6クラス,延べ240人の教育学部学生を対象に実施した.いずれも教材の実用性について検証するのに必要な成果を得る事ができたまた、理科教育学会においては、「マイクロスケール実験の普及をめざして-実践例の紹介と展望-」というテーマで課題研究発表を行い、多くの参加者から貴重な意見を得た。H18年度は,次の教材実験の開発と学校現場での実践を行った.小学校理科での教材開発と授業実践「水溶液の仲間わけをしよう」,「ものの溶け方のちがい」,「気体の発生と性質」中学校理科での教材開発と授業実践「水の電気分解」,「爆鳴気」,「燃料電池の原理」,「水溶液の性質」,「中和反応」,「塩化銅水溶液の電気分解」,「気体の発生と性質(酸素,水素以外)」高校化学の授業実践「紫キャベツの色素とpH」,「ダニエル電池と鉛蓄電池」,「金属陽イオンの定性分析」「未知試料の分離・確認」.現職教員および実習助手を対象にした研修講座「紫キャベツの色素とpH」,「ダニエル電池と鉛蓄電池」,「金属陽イオンの定性分析」「未知試料の分離・確認」.大学における小学校教員志望の教育学部学生を対象にした授業「気体の発生と性質」,「ものの溶け方のちがい」,「水溶液の仲間わけをしよう」.中学校理科で行ったマイクロスケール実験の授業実践は,福知山市立桃映中学校中2の3クラス受講生:82名を始めとして,計3学校,6クラス,生徒数181名を対象とした.高校化学で行った授業実践は京都府立桃山高等学校高3選択授業受講生:4講座491名を始めとして計5学校,14講座,受講生約800名を対象とした.現職教員および実習助手を対象にした研修講座(講義・実験)等は,計9講座,89名の受講生を対象として実施した.大学における授業実践では,計6クラス,延べ240人の教育学部学生を対象に実施した.いずれも教材の実用性について検証するのに必要な成果を得る事ができたHl9年度は,それまでに開発した次の教材実験について学校現場での実践および学会でのシンポジウムの主催を行い、マイクロスケール実験の教育現場での普及に重点をおいた。
重粒子線によるDNA二重鎖切断修復特異的に働くユビキチンリガーゼの機能解析

放射線治療では、がん細胞のDNA修復機構は治療効果を妨げるためDNA修復の人為的制御が望まれる。重粒子線は照射対象に集中的にエネルギーを付与する高LET(線エネルギー付与)の性質を持つ放射線であり、重粒子線によるDNA損傷は末端が複雑な二重鎖切断が形成され、修復されにくい。当課題では、重粒子線によるDNA損傷であっても、休止期のがん細胞では、ゆっくりと修復されることを見いだし、その修復経路に特徴的に働く因子群を特定した。特に、ヒストン修飾酵素RNF8が特異的に働くことと、RNF8の機能阻害に放射線治療の効果を高め、がんの再発を防ぐ効果が期待できることを明らかにした。これまで申請者は、ユビキチンリガーゼRNF8ノックダウン細胞では通常X線と比較し重粒子線後に非常に重篤なクラスターDSB(DNA二重鎖切断)修復欠損を示すことを見出している。X線によるDSBの場合、細胞核のヘテロクロマチン領域内のDSBがRNF8依存性に修復されると言われている。ヘテロクロマチン領域でDSBが生じた場合、ATMがヘテロクロマチン構成因子であるKAP-1をリン酸化することで、クロマチン構造を弛緩し修復を促進する。この場面において、RNF8は53BP1と協調し、ヘテロクロマチン構造の弛緩を助ける。従って、KAP-1ノックダウンによりヘテロクロマチン構造自体を弛緩した状態でDSBを誘発した場合には、RNF8はその必要性から回避されるためRNF8欠損細胞は修復異常を示さない。平成26年度ではRNF8がヘテロクロマチン構造緩和非依存的にクラスターDSB修復に関与するかどうかを、RNAi干渉法によりKAP1及びRNF8ノックダウン細胞を作製して検証した。ヒト正常線維芽細胞1BRhTERT及びヒト肺がん細胞A549にsiRNAを導入後、クラスターDSBを効率良く誘発する鉄線(200 keV/μm)を照射した。γH2AX抗体をDSBマーカーとして蛍光免疫染色後、蛍光顕微鏡下で修復効率を測定した。重粒子線によるクラスターDSBはRNF8ノックダウン細胞において約90%の修復欠損を示すが、RNF8とKAP1ダブルノックダウン細胞においても同様の修復欠損を示した。この結果から、RNF8がクロマチン構造に依存せず、重粒子線誘発クラスターDSBに対する修復過程に必要である事が示唆された。重粒子線通過近傍ではDSBのみならず多数の塩基損傷が生じる。塩基除去修復で中心的な役割を果たすXRCC1ノックダウン細胞を用い塩基除去の遅延がRNF8依存性のクラスターDSB修復欠損を導くか検討した。siXRCC1導入細胞とsiControl導入細胞において重粒子線誘導のクラスターDSB修復効率に有意な差は認められなかった。申請者は、H26年度までに重粒子線照射後のDNA修復が、ユビキチンリガーゼRNF8依存性経路で修復されることを明らかにした。H27年度は、ヘテロクロマチンマーカーH3K9me3抗体とγH2AXとの多重染色により、RNF8ノックダウン細胞で残存したγH2AXがユークロマチン領域に局在することを確認した。RNF8依存性経路で修復されるDNA損傷は高頻度でリセクションされていること、RNF8依存性修復はKU70/80の発現抑制には影響されないことを明らかにした。前年度までの結果も踏まえ、申請者が発見したRNF8依存性経路はクロマチン構造に関係なく、DNA損傷末端の複雑性によって選択されるユニークな修復経路であることが強く示唆された。また、肺がん細胞A549のRNF8ノックダウンに、重粒子線増感効果があることを確認した。H27年度は研究計画(3)重粒子線誘発クラスターDSBにおけるRNF8のresection、HR及び生存率への影響(4)重粒子線誘発クラスターDSB部位におけるKu80安定性に対するRNF8の影響をほぼ計画通りに遂行し、RNF8はリセクション下流のステップに機能すること、siRNF8が放射線増感効果を高めること、Ku80発現はRNF8依存性経路に影響しないことを明らかにした。放射線に誘導されるDNA二重鎖切断(DSB)は、DNA修復機構によって修復される。増殖中の細胞においては、DSBが速やかに修復されなければ増殖死を引き起す。高LET(線エネルギー付与)の放射線である重粒子線によって発生したDSBはDNA修復されにくく細胞死が誘導されやすいことを、これまで我々は報告していた。休止中の細胞においては、修復効率は極めて遅いものの、重粒子線によるDSBであっても、ゆっくりと修復されていることが分かった。本課題において、その遅延型DNA修復にはユビキチンリガーゼであるRNF8が必須であることを我々は明らかにした。遅延型DNA修復は、DNA損傷センサー因子ATMによるRNF8のリン酸化が必要であり、RNF8は53BP1をDNA損傷部位にリクルートすることで遅延型DNA修復に関わっている。この修復経路は、DNA-PKcsとXRCC5が必須でありながらATMのキナーゼ活性に依存し、またRNF8のリン酸化にMDC1を介さないという特徴を持ち、これまで報告されてきた主要なDNA修復経路「相同組換え」「非相同末端結合」どちらとも異なるユニークな経路であることが本研究で明らかにされた。がん細胞のRNF8を発現阻害すると、重粒子線に対する感受性が高まることから、RNF8依存性の遅延型DNA修復経路は休止中の細胞の放射線抵抗性の原因となっていると考えられる。

またこの修復経路は、低LET放射線であるX線においても高線量照射後に働くことから、治療後の再発の原因の一つと考えられ、ユビキチンリガーゼ阻害剤は放射線治療の再発予防剤として有効であることが示唆された。放射線治療では、がん細胞のDNA修復機構は治療効果を妨げるためDNA修復の人為的制御が望まれる。重粒子線は照射対象に集中的にエネルギーを付与する高LET(線エネルギー付与)の性質を持つ放射線であり、重粒子線によるDNA損傷は末端が複雑な二重鎖切断が形成され、修復されにくい。当課題では、重粒子線によるDNA損傷であっても、休止期のがん細胞では、ゆっくりと修復されることを見いだし、その修復経路に特徴的に働く因子群を特定した。特に、ヒストン修飾酵素RNF8が特異的に働くことと、RNF8の機能阻害に放射線治療の効果を高め、がんの再発を防ぐ効果が期待できることを明らかにした。平成26年度の研究計画(1)は計画通りに達成され、RNF8が重粒子線誘発のクラスターDSBの修復においてはクロマチン構造に依存しないことを示した。(2)RNF8依存性のクラスターDSB修復は塩基除去修復とは連携が無いことを示唆する結果が得られた。「重粒子線による塩基損傷の可視化」は、解析に十分な解像度の画像が得られなかったため、解析法の変更が必要である。RNF8のDNA修復経路における機能は、53BP1またはBRCA1をDNA損傷部位にリクルートすることが報告されている。申請者が発見した重粒子線照射後のRNF8依存性修復経路が53BP1/BRCA1に影響されるかを確認する。生物学平成27年度は大旨研究計画(3)、(4)の通りに遂行する。塩基損傷の可視化を始めとして、今後の研究計画はより解像度の高い画像解析が求められるため、研究協力者の協力の下で、超高解像度顕微鏡DeltaVision OMXを用いて解析する。当初の計画はほぼ達成したが、課題内容に深く関わる新たな知見が報告され(Xiong et al., NAR 2015)、その知見を踏まえ、重粒子線誘発DNA損傷のRNF8依存性修復に関わる53BP1の機能を検証する。53BP1発現抑制実験のための試薬、これまでの結果を発表するための学会参加費・旅費・投稿料として使用する。
微分方程式の解の滑らかさの可視化による数値計算の品質保証に関する基礎研究

微分方程式の解の滑らかさの可視化に必要不可欠な基礎技術では、解が解析的でない点即ち特異点の位置と解の滑らかさを数値計算で特定できなくてはならない。初年度である今年度は、微分方程式の解ではなく、与えられた1変数関数に対して特異点の位置を数値的に特定するための数値計算法の確立を目指した。不連続関数に対するフーリエ級数が不連続点で振動するGibbs現象に着目して、微分方程式の様々な数値計算法の中からフーリエ級数同様補間関数を構成できるスペクトル法特に非線形問題に適用しやすいスペクトル選点法を用いることにした。与えられた1変数関数に対して、スペクトル選点法を用いて補間関数を構成し、近似の次数が異なる2つの補間関数の差を指標関数としてその振る舞いを数値的に解析した。近似の次数を上げていくと、指標関数がゼロに収束する領域とそうでない領域が区別でき、これによって特異点の場所を高精度に数値的に特定することができた。不連続関数だけでなく、滑らかに見える関数に対しても、特異点の位置の特定ができたのは驚きであった。爆発解をもつ微分方程式に対して、爆発点以外の領域における解の滑らかさの数値計算可能性を検討した結果、既に開発している爆発点の特定法とスペクトル選点法による数値計算を組み合わせる手法を考案した。実際の数値計算では非線形方程式を解かなくてはならないので、その数値計算法も検討した。ヘルダー連続な解を持つ分数階微分方程式を考案した。この方程式に対して、解の滑らかさの数値計算に有効なスペクトル選点法の適用可能性を検討した。準備研究として分数階微分の数値計算を行ったところ、丸め誤差の影響が無視できないことが判明した。その対策として、最新のCPUを持つ高性能計算機を購入して、膨大な計算機資源を必要とする多倍長演算が実行できる計算機環境を構築した。解の滑らかさの可視化に必要不可欠な、特異点の位置を特定するためのコアとなる基礎的な数値計算法が確立できた。初年度確立した、解の滑らかさの可視化に必要な基礎技術である特異点の位置を特定するための数値計算法は、1変数関数に対してのものであるため、実際の微分方程式の未知の解に対して適応できるように高度化していく。また、特異点における特異性の特定や特異点以外の領域における滑らかさの数値計算法の開発に着手する。微分方程式の解に関して、爆発解やヘルダー連続解といった、より複雑な解に対しても開発した手法が適応できるよう研究を進めていく。教員数が少ない所属学科において、11月に同僚の教員が重篤な疾病にかかり長期休職を余儀なくされた事に伴って、カリキュラムや学生指導に関して学科内で多大なる混乱が生じた。さらに個人的には、休職した教員が指導していた卒論生とM1の院生が当研究室に配属替えとなり、学習進度が良くなかった彼らの再教育に多大な時間を要したため、研究計画に支障が生じた。

また、連携研究者の五月女仁子教授が新年度から大学を異動することになり、共同研究が一時停滞することを余儀なくされた。これらの事情により11月以降の共著論文執筆や出張計画が立てられなくなった。新年度になり学科運営や院生指導が落ち着いて、また五月女教授が異動した先の大学で仕事に慣れる夏頃から、停滞した分を取り戻すべく、より活発に研究連絡・打ち合わせを含めた研究活動を行う。
完全スピン偏極ゼロギャップ半導体の創製とスピンデバイス応用

本研究では、完全スピン偏極かつ高移動度のキャリアを有するスピンギャップレス半導体(SGS)の創製とスピントロニクス応用を目的とした。成果として、ホイスラー合金Mn2CoAlがSGSとして非常に有望であり、イオンビームアシストスパッタ法で高品質MCA薄膜が得られる事及び、MCAが電界印加によりスピン偏極したホール又は電子を切り替えて供給可能な新規スピン注入源になる事を初めて明らかにした。本年度は主として、ホイスラー合金型完全スピン偏極ゼロギャップ半導体(スピンギャップレス半導体:SGS)の最有力候補であるMn2CoAl(MCA)高品質薄膜の作製を試みた。MCA薄膜については、イオンビームアシストスパッタ法を用いる事により、格子ミスマッチの比較的良好な(2%)MgO及びMgAl2O4基板上に、成長温度300-600°Cでエピタキシャル成長する事を見出した。また低温(300-400°C)で成長したMCA薄膜は、高温成長で作製したもの(500-600°C)と比較して結晶性等は悪いが、磁気及び電気特性が優れている事が分かった。この理由はMCAは基板と反応性が高く、高温で基板との界面拡散・反応が生ずる事に由来すると思われる。また、高磁場下でのホール効果測定はMCAの様な磁性(強磁性、フェリ磁性等)半導体のキャリア濃度や移動度を決定するのに必須となるが、既有の装置と組合わせて新たな測定系を立ち上げ、7テスラ、2-300Kの高磁場・低温下でのホール測定が実施可能となった。この装置を使用してMCA薄膜のホール測定を行った所、低温(4K)でのキャリア濃度及び移動度が、7.4×1020 cm-3及び16 cm2/Vsとなった。移動度は他グループのMCA薄膜の値(<0.7 cm2/Vs)より2桁大きかったが、我々の薄膜が他グループよりも品質が高い為だと思われる。これらの内容について近日中に論文投稿予定である。また、MCA以外でSGS的特性を示す材料として、理論計算でSGSとなると予測されているTi2CoSiについても薄膜化を試みたが、ホイスラー相とするのが難しく安定相で無い可能性が出てきた為、今後の研究は、MCAのデバイス化及び光電子分光法による直接バンド構造観察に注力する事とする。現状、初年度の主目標としていた高品質Mn2CoAl薄膜の作製及び、高磁場低温下で測定可能なホール測定装置の新規立ち上げはほぼ終了しており、順調に研究が進展していると思われる。本年度は前年度に得られた結果を参考に、スピンギャップレス半導体として最も有望な材料であるMn2CoAl(MCA)のバンド構造に関する直接的情報を得る試みを行った。まず、角度分解光電子分光測定を用いMCAのバンド構造を得る試みを行ったが光電子分光で対象となる最表面の試料品質が十分でなく、バンド構造の直接観測ができなかった。原因として、スパッタ法によるMCA薄膜の作製の際のプラズマダメージを考えられるが、この表面劣化は製膜手法そのものに由来するものである為改善は容易ではないと判断し、電気特性からMCAのバンド構造に関する情報を得ることとした。そこでギャップレス半導体として既に確立した材料であるグラフェンを参考に、FET構造を用いた電界効果測定からギャップレス半導体に特有の両極性を確認し、MCAのバンド構造について議論する事とした。我々はグラフェンに関する研究も行っており(2報の論文発表)、既にこれらの電界効果測定技術を有している。MCAを用いたサイドゲート型FET構造を作製し電界効果測定を行ったが、大きなキャリアを誘起できるイオン液体(DEME-TFSI)をゲート絶縁層とした。ゲート電圧(VG)の印加によりMCAの電気伝導性、キャリア量や移動度は系統的に変化し、VG= 0.6V付近でpからnへのキャリア型の変化(両極性)と電気伝導度が最小となる事を確認した。これらはギャップレス半導体特有の現象であり、MCAがギャップレス半導体となっている事を意味している(論文投稿中)。磁化測定等からこのMCA薄膜がフェリ磁性体(=有限のスピン偏極)である為、MCA薄膜はスピン偏極したギャップレス半導体であると思われる。また、これらの結果は、MCAがゲートバイアス印加によりスピン偏極したホール又は電子の供給が可能な新規スピン注入源として有望である事を示唆している。MCAを対象として、材料の極性制御、(p型及びn型のMCA作製)及び、両者を組み合わせたpnダイオードの作製を試みる。p-n制御については不純物のドープ(AlサイトにSiドープ等)や基板とのミスマッチを利用したSGSへの格子歪みの印可等によりフェルミ準位をシフトさせ実現する。SGS材料のpnダイオードが作製できれば、そのスピン偏極性と併せて、スピン偏極電流の整流が可能なスピンpnダイオードの作製成功となる。また、スピン分解光電子分光法を用いたMCAのバンド構造の直接観察を行い、MCAがSGSである直接的証拠を得る試みも行う。半導体材料・デバイス
形質転換手法による植物の器官分化に関与する遺伝子の単離と解析

植物の発生および形態形成のプログラムは、胚発生時に決定される動物と異なり、生長の際に維持される生長点(分裂組織)の分化により決定される。この生長点分化については、従来、細胞学的な観察が多く、分子レベルでのメカニズムを調べることが求められる。本研究では、トランスジーンをもちいた挿入突然変異体の解析により、植物の器官分化にかかわる遺伝子を同定するため、人為的抑制のできるプロモーターを植物染色体にランダムに挿入し、誘導可能な突然変異体作成のシステムを構築することを目的とした。そして、これまでは成熟個体では検出の困難でるような遺伝子の機能を、植物の生長の各段階の細胞で変異体の表現型を誘導し考察する系を確立することを目指した。ハイグロマイシン耐性のTiベクターpGV1503のT-DNAライトボーダーに向けてテトラサイクリンリプレッサータンパク質結合サイトをもつCaMV由来の35Sプロモーターを挿入し形質転換用ベクターを構築した。これを、アグロバクテリウムを介し、Leaf disc法によりテトラサイクリンリプレッサータンパク質を高発現しているタバコに導入した。まずノザン法によりランダムに染色体上に組み込まれた改変プロモーターが機能するかどうか調べた。真空浸透法によりテトラサイクリンを形質転換体の葉に与えたところ、導入プロモーターによる転写が誘導され、非誘導時には転写が起こらなかった。すなわち形質転換により導入したプロモーターの発現誘導がテトラサイクリンの有無で制御できることが確認された。また、本来植物で転写されている遺伝子の領域にトランスジーンの挿入されている形質転換体を選択し、植物のもつ本来の転写の影響を調べるために、プローブとして使用できるDNA断片をIPCR法により回収した。現在、植物が本来持つ遺伝子の発現の導入プロモーター由来のアンチセンスRNAによる制御が可能か検討中である。
悪性骨軟部腫瘍に対する放射線治療を併用したテロメライシン局所投与療法の開発

軟部肉腫に対してOBP-702と放射線治療との併用効果に関する研究を行った。in vitroでは、放射線治療併用群が単独群よりも抗腫瘍効果が有意に高く、併用による相乗効果も示された。western blotでは併用によりp53の発現増強、アポトーシス抑制遺伝子MCL-1、BCL-XLの発現低下を認め、OBP-702は放射線治療誘導性アポトーシスを増強すると考えられた。In vivoでは、単独群と比較して併用群で有意に腫瘍増殖抑制を認め、組織免疫染色でKi-67染色陽性細胞数の減少を認めた。OBP-702は単独でも強力な抗腫瘍効果を有するが、放射線療法との相乗効果を示す事から、併用療法は放射線抵抗性の軟部肉腫に対する新規療法となる可能性が示された。テロメラーゼ活性依存的に増殖を制限した腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301、テロメライシン)を開発し,化学療法や放射線治療との併用による相乗効果なども確認してきた.さらにp53の発現カセットを挿入したOBP-702を作成し,骨・軟部肉腫に対する有用性を検討した。これらのウイルス治療は単独で投与するよりも、放射線治療と併用することで、強力な抗腫瘍効果を認めている。今後行う予定であるテロメライシン臨床応用でも、単独投与ではなく、放射線治療との併用療法を考えて、プロトコールを作成している。また、テロメライシンと抗PDL-1抗体を使用した免疫療法との併用療法に関する基礎研究も開始しており、preliminaryではあるが有効な結果が得られている。臨床応用へ向けた基礎研究は、ほぼ予定どおり行うことができた。テロメライシンの肉腫患者への臨床応用については、PMDAとの相談も行ってきたが、今年度までに当院で開始することができなかった。食道癌での臨床応用はすでに開始されており、肉腫での早期臨床応用に今後も努力していく。テロメラーゼ活性依存的に制限増殖しp53の発現カセットを挿入した腫瘍融解アデノウイルス(OBP-702)を用い、2種類の骨肉腫細胞株(U2OS,、MNNG/HOS)をDoxorubicin(DOX)で持続処理して樹立したDOX耐性骨肉腫細胞が薬剤排出ポンプmultidrug resistance protein 1(MDR1)を高発現していることを確認し、DOX耐性骨肉腫細胞に対するDOXとOBP-702の併用効果とMDR1を介した薬剤耐性克服機序を検討した。in vitroにおいて、XTT assayにより親株細胞およびDOX耐性細胞に対する抗腫瘍効果を比較し、CalcuSyn softwareを用いてcombination indexを算出することにより併用効果を検討した。また、併用治療によるアポトーシス増強効果と薬剤耐性克服機序を検討するために、Western blotでCleaved PARPとMDR1の発現を確認した。さらに、MDR1の抑制がDOXの抗腫瘍効果に与える影響を検討するためにsiMDR1とDOXの併用によるCleavedPARP発現の変化を確認した。in vivoでは、DOX耐性MNNG/HOS細胞マウス皮下腫瘍移植モデルを作成し、DOXとOBP-702の併用効果を検討した。in vitroにおいてOBP-702はいずれのDOX耐性骨肉腫細胞に対しても相乗的な抗腫瘍効果を示した。Western blotではDOXにOBP-702を併用することによりCleavedPARP発現の増強とMDR1発現の抑制を認めた。また、DOXにsiMDR1処理を併用することによりCleaved PARPの発現増強を認めた。マウス皮下腫瘍移植モデルにおいて、併用治療群はPBS治療群と比較して有意に腫瘍増殖を抑制し、DOXおよびOBP-702の単独治療群と比較して腫瘍増殖を抑制する傾向を認めた。これらの結果から、OBP-702はDOX耐性骨肉腫細胞に対してMDR1の発現を抑制し,DOXの抗腫瘍効果を増強した. DOXとOBP-702の併用治療は化学療法抵抗性の骨肉腫に対する有用な治療戦略となり得る。臨床応用を行うため、悪性骨軟部腫瘍細胞に対する腫瘍融解アデノウイルスの効果を検討する基礎実験は、ウイルスを開発した消化管外科と共同研究を行っている。実際に研究を行っている大学院生を中心に、様々な骨軟部腫瘍細胞を使用し、腫瘍融解ウイルスと放射線治療・化学療法を併用した研究が順調に進んでいる。しかし、この腫瘍融解ウイルスを使用して行う臨床応用に関しては、プロトコールを作成中であるが、どのような患者さんを対象にするかといったinclusion criteriaに関して、整形外科内だけでなく、ウイルスを開発した消化管外科とも統一したコンセンサスが得られていない。そのため、ウイルス治療臨床応用のプロトコールを現在も引き続き改訂・作成中である。軟部肉腫に対するテロメラーゼ依存腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301)の有用性を報告し、その化学療法や放射線治療の併用による相乗効果を確認してきた.今回は、軟部肉腫に対して,OBP-301にp53がん抑制遺伝子の誘導能を導入し,更に抗腫瘍効果を高めたOBP-702と放射線治療との併用効果に関して検討した。3種類の軟部肉腫細胞株HT1080(線維肉腫), NMS-2(悪性末梢神経鞘腫瘍), SYO-1(滑膜肉腫)を用いて研究を行った.

OBP-702単独,放射線治療単独,OBP-702+放射線治療併用に分けて処理し,XTT assayを用いて無治療群と比較検討した.相乗効果に関しては薬物併用効果分析ツールであるCalcuSyn software (BioSoft)を用いてcombination indexを算出し評価した.また,in vivoにおいてHT1080をヌードマウスの背部皮下に移植し,PBS群,OBP-702投与単独群,放射線治療単独群,OBP-702+放射線治療併用群の4群に分けて治療を行い,抗腫瘍効果を比較検討した.すべての細胞株で併用群が単独群よりも抗腫瘍効果が有意に高く,併用による相乗効果も示された.また,western blotでは併用によりp53の発現増強,アポトーシス抑制遺伝子MCL-1の発現低下や二本鎖DNA損傷マーカーであるγH2AXの発現遷延を認め,OBP-702は放射線治療誘導性アポトーシスを増強すると考えられた.In vivoにおいても単独群と比較して,併用群において有意に腫瘍増殖抑制を認め,組織免疫染色でもTUNEL染色陽性細胞数の増加を認めた。OBP-702はOBP-301と比較し強力な抗腫瘍効果を有し,かつ放射線療法との相乗効果を示す事から,軟部肉腫に対する新規療法となる可能性が示された.テロメライシンを悪性骨軟部腫瘍に臨床応用するため、腫瘍融解アデノウイルスの効果を検討する基礎実験を、ウイルス治療を開発した消化管外科と共同で研究を行っている。実際に研究を行っている大学院生を中心に、様々な骨軟部腫瘍細胞を使用し、腫瘍融解ウイルスと放射線治療・化学療法を併用した研究が順調に進んでいる。この腫瘍融解ウイルスを実際の骨軟部腫瘍患者さんの治療に用いる臨床応用について、臨床プロトコールのドラフトを作成した。対象とする骨軟部腫瘍の症例について、inclusion criteriaを現在検討しているところである。整形外科内だけでなく、ウイルスを開発した消化管外科と協力して、臨床応用プロトコールを完成させる必要がある。軟部肉腫に対してOBP-702と放射線治療との併用効果に関する研究を行った。in vitroでは、放射線治療併用群が単独群よりも抗腫瘍効果が有意に高く、併用による相乗効果も示された。western blotでは併用によりp53の発現増強、アポトーシス抑制遺伝子MCL-1、BCL-XLの発現低下を認め、OBP-702は放射線治療誘導性アポトーシスを増強すると考えられた。In vivoでは、単独群と比較して併用群で有意に腫瘍増殖抑制を認め、組織免疫染色でKi-67染色陽性細胞数の減少を認めた。OBP-702は単独でも強力な抗腫瘍効果を有するが、放射線療法との相乗効果を示す事から、併用療法は放射線抵抗性の軟部肉腫に対する新規療法となる可能性が示された。テロメラーゼ活性依存的に増殖を制限した腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301、テロメライシン)を開発し,化学療法や放射線治療との併用による相乗効果なども確認してきた.さらにp53の発現カセットを挿入したOBP-702を作成し,骨・軟部肉腫に対する有用性を検討した。これらのウイルス治療は単独で投与するよりも、放射線治療と併用することで、強力な抗腫瘍効果を認めている。今後行う予定であるテロメライシン臨床応用でも、単独投与ではなく、放射線治療との併用療法を考えて、プロトコールを作成している。
膵B細胞のグルコ-ス認識機構ー甘味受容機構との関連ー

膵B細胞のグルコ-ス認識機構を解析をするため,甘味受容体に作用する種々の物質の膵B細胞に対する作用を検討し,次の結果を得た。1.甘味受容体の特異的競合的阻害剤であるpーnitropheny1ーDーglucopyranosiceのαアノマ-(αーPNPーGlu)は,膵島グルコ-ス酸化を阻害することなく,グルコ-スによるインスリン分泌を特異的競合的に阻害したが,舌と同様,βアノマ-には阻害作用はほとんどなかった。2.正常ラット膵島とは異なり,NIDDモデルラット(自然発症GKラットおよび新生児streptozotocin投与ラット)膵島からのグルコ-スによるインスクリン分泌は,αーPNPーGluによって抑制されなかった。インスクリン分泌をフオルスコリンで増幅しても,抑制作用は認められなかった。3.阻害剤の分子構造と作用発現の関連を見るため,PNP化合物のヘキソ-ス部分をマンノ-スまたはガラクト-スに置換した化合物の作用を検討した結果,前者のαアノマ-にαーPNPーGluと同様の作用を認めたが,後者ではいずれのアノマ-にも作用を認めなかった。またPNP化合物より作用は弱いが,同様の甘味阻害作用をもつmethy1ー4,6ーdichloroー4,6ーdideoxyーαーDーglucopyanosideおよびUmethy1ー4,6ーdichloroー4,6ーdideoxyーαーDーgalctopyranosideは,共に軽度にグルコ-ス酸化を抑制したが,インスリン分泌抑制作用は前者が有意に強かった。これらの知見は,ヘキソ-ス部分の構造が作用発現に重要であることを示唆する。4.glycyrrhizinは,甘味の特異的阻害剤として知られるギムネマ酸と類似の構造を有し,旦つそれ自体強力な甘味物質である。グルコ-スによるインスリン分泌の第2相にglycyrrhizinを作用させると,分泌は直ちに抑制され,同剤を除去すると,直後より著明な2相性のインスリン分泌が惹起された。なおglycyrrhizinは膵島グルコ-ス酸化を抑制しなかった。膵B細胞のグルコ-ス認識機構を解析するため,甘味受容細胞のレセプタ-に作用する各種物質の,グルコ-スによるインスリン分泌に対する影響を検討し,次の結果を得た。1.特異的競合的甘味阻害剤であるpーnitrophenylーDーglucopyranodideのαアノマ-は,膵島グルコ-ス酸化を阻害することなく,グルコ-スによるインスリン分泌を用量依存的に阻害するのに対して,βアノマ-にはこの作用がほとんど見られないことを報告したのに続いて,同mannoおよびgalactopyranosideについても検討した。その結果,mannopyranosideにはglucopyranosideと同様の阻害作用が見られるが,galactopyranosideには阻害作用がなく,この阻害剤のヘキソ-ス部分が作用発現に重要であることを見出した。2.膵B細胞をアロキサンで処理すると,その後のグルコ-ス刺激に対してインスリン分泌が見られなくなるが,アロキサン処理の際pーnitrophenylーDーglucopyranosideのαアノマ-を共存させると,膵B細胞はアロキサン毒性から保護されることを見出した。βアノマ-の保護作用は弱かった。3.非代謝性人工甘味物質であるacesulfameKにはインスリン分泌刺激作用があることで注目されるが,新らたに合成したacesulfame Naには単独では分泌刺激作用はなく,刺激作用は主としてK^+によるものであることを明らかにした。しかしcAMPを上昇させるforskolinの存在下ではacesulfame Naにもインスリン分泌刺激作用が見られ,acesulfame分子自体にも何らかの分泌刺激形成作用があることが示唆された。以上の諸結果は,膵B細胞と甘味受容細胞の糖認識機構の共通性を示し,既成の概念では説明できない現象であるので,今後検討を続ける。

これらの知見は,ヘキソ-ス部分の構造が作用発現に重要であることを示唆する。4.glycyrrhizinは,甘味の特異的阻害剤として知られるギムネマ酸と類似の構造を有し,旦つそれ自体強力な甘味物質である。グルコ-スによるインスリン分泌の第2相にglycyrrhizinを作用させると,分泌は直ちに抑制され,同剤を除去すると,直後より著明な2相性のインスリン分泌が惹起された。なおglycyrrhizinは膵島グルコ-ス酸化を抑制しなかった。
AT(アタキシア・テランジェクタシア)の原因遺伝子の単離

リンパ網内系の悪性腫瘍の好発を特徴とするヒト遺伝病のAT(アタキシア・テランジェクタシア)の原因遺伝子を単離するとこを目的として研究をおこない以下の成果を得た。1.ATの原因遺伝子が座位するヒト染色体11q23領域に切断点をもつX/11転座染色体を含むヒト/マウス雑種細胞A9(3552)-2を用いて11q23領域の微小ヒト断片をもつ放射線ハイブリドを作成した。クローンRH12/1はAT細胞の放射線高感受性を相補し、他の2クローン(MH12/1,MH12/3)は相補しなかった。両者の差異領域にAT遺伝子が存在するという作業仮説を設定して以後の解析をすすめた。2.11q23領域の11個のDNAマーカーの存否を調べたところ、3クローンともD11S144とD11S351の2マーカーのみを保持して他のマーカーを欠失し、RH12/1に固有の既知のマーカーはなかった。注目されるのは、リンケージ解析からAT遺伝子にもっとも近接するとされるD11S384をも欠いていることであり、遺伝子がD11S384よりテロメア側DRD2D11S351領域内にあるという新しい可能性を示唆する。3.RH12/1からsCos1をベクターに用いてコスミドライブラリーを作成した。50万個のクローンから256個のヒト由来のクローンを分離し、21個の11番染色体由来クローンを同定したが、この中にはAT遺伝子を含むものはなかった。一方RH12/1からのIRS-PCR産物のなかから単離したプラスミドpBM8.9は11番染色体上のRH12/1に固有の領域内にあり、AT遺伝子にきわめて近接する可能性が高い。このマーカーをもとにAT遺伝子を探索してゆきたい。なお購入した微量高速遠心機は、ライブラリー作成、コスミドおよびプラスミドDNAの抽出など実験の全行程にわたって使用した。
過分極作動性HCN1チャネルを介したてんかん発症の調節メカニズム解析

細胞膜の過分極によって活性化されるHCN1チャネルは心臓や脳に多く分布し、自発性リズム形成やペースメーカーの役割を担っている。近年、HCN1チャネルはてんかんや振戦などの神経疾患の発症に関与することが報告されているが、その発症制御における機能メカニズムは不明である。本研究は新たに作出されたHCN1チャネル欠損ラット、あるいはHCNチャネル遮断薬ZD7288を用いて、てんかん発症におけるHCN1チャネルの役割とそのメカニズムについて、行動薬理学的および神経化学的手法を用いて解析する。さらに、根本的治療法のないてんかんに対する「HCN1チャネルをターゲットとした新規治療法の考案・創出」を目指す。
骨代謝関連内分泌ホルモンが根尖性歯周炎の発症に及ぼす影響

根尖性歯周炎の発症および進展における内分泌ホルモン(カルシトニンおよび副甲状腺ホルモン)の影響について、7週齢で副甲状腺あるいは甲状腺を摘出したラットを用いた実験群と摘出を行わない正常ラットで比較検討した。副甲状腺を摘出したラットには副甲状腺ホルモン、甲状腺を摘出したラットにはカルシトニンおよび副甲状腺ホルモンを投与する補充療法を8週齢から行い、11週齢で全てのラットに実験的根尖病変を作製した。根尖病変内の浸潤細胞およびX線による骨吸収量を正常ラットと比較検討した結果、補充療法を行った実験群では破骨細胞の誘導による骨吸収を抑制させる可能性があることを示した。1、各群の体重変化は、8週齢では正常ラット群に対して全ての実験群で有意な体重減少を示し、11週齢の根尖病変作製時、病変作製後1週および3週では正常ラット群に対して甲状腺摘出群で有意な体重減少が認められた。2、骨吸収面積は、病変作製後1週および3週において正常ラット群と比較して各実験群の骨吸収面積に有意差は認められなかった。3、組織学的所見は、正常ラット群および各実験群で病変作製後1週において根尖病変内に膿瘍形成が認められ、病変作製後3週では根尖部まで歯髄壊死が認められ、炎症性細胞の増加と病変の拡大が認められた。正常ラット群と比較して各実験群においてほぼ同様の所見を示した。4、TRAP陽性細胞は、正常ラット群および各実験群で病変部辺縁の骨表層に沿って認められた。TRAP陽性細胞数は、病変作製後1週および3週において正常ラット群と比較して各実験群で有意差は認められなかった。恨尖牲歯周炎の発症および進展における内分泌ホルモン(カルシトニンおよび副甲状腺ホルモン)の影響を副甲状腺あるいは甲状腺を摘出したラットを用いて比較検討した。実験的根尖病変内の浸潤細胞およびX線による骨吸収量を正常ラットと比較検討した結呆、副甲状腺摘出および甲状腺摘出によるPTII分泌およびCT分泌抑制は、破骨細胞の形成を促進させ骨吸収を促進させる可能性のあることを示した。(1)副甲状腺摘出群及び甲状腺摘出におけるラット体重は、コントロール群と比較して有意な低体重を示し、術後3週でコントロール群は順調な体重増加を示したが、副甲状腺摘出群および甲状腺摘出群においては体重増加がわずかであり、コントロール群と比較して約1/2の増加量であった。(2)骨吸収面積は、術後1週では各実験群の骨吸収面積に有意差は認められなかったが、術後3週ではコントロール群と比較して副甲状腺摘出群および甲状腺摘出群で有意に骨吸収面積が増大した。(3)組織学的所見は、術後1週において根尖病変内に膿瘍形成が認められた。術後3週では各実験群において根尖部まで歯髄壊死が認められ、炎症性細胞の増加と病変の拡大が認められた。各実験群においてほぼ同様の所見を示した。(4)TRAP陽性細胞は、病変部辺縁の骨表層に沿って認められた。TRAP陽性細胞数は、術後1週において副甲状腺摘出群で有意に増加し、術後3週では副甲状腺摘出群および甲状腺摘出群で有意に増加した。また、1mm当たりのTRAP陽性細胞数密度については、術後1週および3週ともに各実験群で有意な変化は認められなかった。
JCウイルスによる脳腫瘍発生機構の解析-ヒト脳腫瘍との相関

本邦にてはじめて分離培養したJCウイルス(Tokyo-1株:以上JCTと略)はハムスター脳に高率に脳腫瘍を誘発することが判明した。なかでもヒト小児の悪性腫瘍である小脳髄芽腫が常に誘発される事、外国にて分離されたJCウイルスに比し腫瘍誘発宿主域が広い事、および腫瘍誘発率が高い事が判明したのでそれぞれの項目につきウイルス遺伝子学的な検討を行った。1.JCウイルスによる髄芽腫発生母細胞に関する研究:JCTのDNAをクローニングし、T抗原のmRNAをインサイト・ハイブリダイゼーション法にて検出する方法を確立し、JCT感染後腫瘍発生するまでの期間をハムスター小脳にて検索した。その結果、小脳外顆粒層細胞が内顆粒層へと移動している過程にJCTのmRNAを検出し得た。以上の所見から生後1日目に外顆粒層に存在する細胞がウイルスゲノムを持ったまま内顆粒層へと移動し、そこから腫瘍が発生する事を証明し得た。2.JCTと外国での分離ウイルスとの相異点をヒトPML-脳より直接抽出したDNAおよび継代培養後のウイルスDNAとを各種制限酵素にて切断し、DNA切断部位の差を検討した。その結果、Hinc【II】,Pvu【II】にてそれぞれ2個所に分断される特徴がJCTにあった。この事はJCTの腫瘍宿主域の広さを示すものと思われた。3.JCTの高い腫瘍原性を調べるためDNA初期の塩基配列を決定して他種との比較を行った。その結果、JCTではプロモーター領域に続き23塩基対の挿入がみられ、かつこの塩基配列はエンハンサーに相当することが判明した。従ってこのエンハンサーの挿入が高い腫瘍原性に関連しているものと推測された。
ras細胞におけるThy-1発現抑制の分子機構の解析

DT細胞におけるThy-1発現抑制の分子メカニズムとして、1)Thy-1蛋白質の早期分解、2)Thy-1蛋白質の糖鎖付加の異常などが考えられるが、本研究では発現クローニングの手法によってThy-1発現抑制のメカニズムを解明しようとした。GPIアンカー蛋白質の発現異常は、Thy-1蛋白質に糖鎖を付加しホスファチジルイノシトールを結合する過程での数種の酵素のうちのいずれかの欠損によることが多い。現在までにGPIアンカー蛋白質の合成に関する8種類の相補性細胞群の存在が知られているが、ヒトでその酵素遺伝子が解明されているのはPIG-AとPIG-Fのみであり、マウスではPIG-Aのみが明らかにされているにすぎない。しかし、"2倍体の哺乳動物の細胞では欠損するものが劣性である場合は、発現クローニングによっては解明できない"ということを大阪大学医学部微生物病研究所免疫異常部門の竹田潤二教授から学んだ。欠損するものが劣性であるか否かをNIH3T3細胞とDT細胞とのfusionなどによって調べることが必要であり、優性の場合にはcomplementation assayによって欠損遺伝子を明らかにすることができるが、劣性の場合は発現クローニングによっては困難であることがわかった。そこで、すでにマウスの遺伝子構造が明らかとなっているPIG-Aについてreverse transcriptase-PCR(RT-PCR)法によってメッセージの発現を解析した。すなわち、マウスPIG-A遺伝子に相補的な2組のPCR primer setsを合成し、544および1023bpのバンドが検出される系で検討した。DTおよびNIH3T3細胞の両者に544bpのバンドが、1023bpのバンドはDT細胞においてのみ検出された。この結果は、DT細胞にPIG-A遺伝子が欠損しているという予測に反するものであり、PIG-A以外の欠損が示唆された。NIH3T3細胞からRNAを抽出し、cDNAライブラリーの作製を試みているが、これまでのアイソゲン(日本ジーン社製)を用いた方法によって量的・質的に満足できるmRNAが精製できず、本研究の遂行は初期の段階から困難を極めている。そこで、申請者らがこれまで行なってきた脂質代謝の方面からアプローチ、すなわちDGキナーゼのcDNAトランスフェクションによる脂質代謝の変動について検討を加えた。ras導入DT細胞においては恒常的にジアシルグリセロール(DG)量が高くCキナーゼ(PKC)活性は部分的にダウンレギュレートされており、DT細胞におけるCa^<2+>オシレーションの誘導にはPKCの部分的なダウンレギュレーションが必要である。そこで、DG量を変化させて、PKCの活性変動やCa^<2+>オシレーションに対する効果を検討するために、DGの代謝酵素であるDGキナーゼ(DGK)のαアイソザイムcDNAをDT細胞に導入した。DGKαのcDNAを導入しDT/D細胞の発現量はノーザンおよびウェスタンブロッテイング法によって確認し、そのDGK活性は部分的なダウンレギュレーションは解除され、親細胞に近似した活性が得られた。一方、アンチセンスDGKを導入した細胞(DT/K)細胞とは逆の結果、すなわちDG量はさらに高くなり、PKCのダウンレギュレーションはさらに進んだ。これらの細胞のブラジキニン刺激によるCa^<2+>オシレーションについて検討したところ、DT/D細胞ではCa^<2+>オシレーションが消失し、DT/K細胞ではこれがむしろ増強された。一方、DT/D細胞を[^3H]グリセロールで標識し、ブラジキニン刺激したが、対照細胞に比べて著明なホスファチジン酸(PA)の産生は認められなかった。

DGキナーゼにはいくつかのアイソザイムの存在が知られており、刺激に伴うPA産生には導入したDGキナーゼの関与が少ないこと、あるいはホスファターゼ活性が高くリン酸化されたPAが直ちにDGに変換される可能性も考えられた。DT細胞におけるThy-1発現抑制の分子メカニズムとして、1)Thy-1蛋白質の早期分解、2)Thy-1蛋白質の糖鎖付加の異常などが考えられるが、本研究では発現クローニングの手法によってThy-1発現抑制のメカニズムを解明しようとした。GPIアンカー蛋白質の発現異常は、Thy-1蛋白質に糖鎖を付加しホスファチジルイノシトールを結合する過程での数種の酵素のうちのいずれかの欠損によることが多い。現在までにGPIアンカー蛋白質の合成に関する8種類の相補性細胞群の存在が知られているが、ヒトでその酵素遺伝子が解明されているのはPIG-AとPIG-Fのみであり、マウスではPIG-Aのみが明らかにされているにすぎない。しかし、"2倍体の哺乳動物の細胞では欠損するものが劣性である場合は、発現クローニングによっては解明できない"ということを大阪大学医学部微生物病研究所免疫異常部門の竹田潤二助教授から学んだ。欠損するものが劣性であるか否かをNIH3T3細胞とDT細胞とのfusionなどによって調べることが必要であり、優性の場合にはcomplementation assayによって欠損遺伝子を明らかにすることができるが、劣性の場合は発現クローニングによっては困難であることがわかった。そこで、すでにマウスの遺伝子構造が明らかとなっているPIG-Aについてreverse trans-criptase-PCR(RT-PCR)法によってメッセージの発現を解析した。2組のPCR primer setsを合成し、544および1023bpのバンドが検出される系で検討した。DTおよびNIH3T3細胞の両者に544bpのバンドが、1023bpのバンドはDT細胞においてのみ検出された。この結果は、DT細胞にPIG-A遺伝子が欠損しているという予測に反するものであり、PIG-A以外の欠損が示唆された。
都市景観の色彩様相に関する研究(色彩様相と心理評価の関係)

■1995年3月10日現在までの成果を、研究のフローに従って、以下に報告する。1.都市景観における色彩様相のモデル化・体系化の試み1)現地調査による様相の種類の確認調査対象として、(1)御堂筋沿い(心斎橋付近)の景観、(2)道頓堀川沿い戎橋付近の景観、(3)OBPオフィスビル群の景観を選定した。条件として、様相の種類が豊富で、かつ、建物群を一望できる空間(広幅員の道路、河川等)があることを考慮した。2)3属性による様相の表現方法の検討1)の調査を通して、都市景観の様相が、(1)様態、(2)明るさ輝き、(3)実体性の3属性により表現できることを再確認した。さらに、各属性を数段階に区分する方法を設定した。2.コンピューターグラフィックスによる都市景観の様相のシミュレーション3)都市景観の様相と、コンピューターグラフィックス上の表色系との対応づけ1)の現地調査で得た景観写真を、コンピュータ画面上に読みとり、様々な様相の画素値をRGBにより検出した。以上の作業により、色彩の様相と、コンピューターグラフィックスの表色系との関係を調べた。4)コンピューターグラフィックスによる様相の操作コンピューター画面上の実景観写真について、上記3)の結果をもとに、様相を操作し、再現性を検証した。5)コンピュータグラフィックスによる都市景観の様相のシミュレーション色彩の様相を画像処理により操作し、様相による様々景観パターンを作成し、約70シーンをストックした。操作パターンは3つの属性についてそれぞれ、46段階で操作した。様態:6段階、明るさ輝き:5段階、実体性:4段階3.都市景観の様相と心理的効果との関係6)視覚的実験により、上記5)で作成したサンプルの評価実験を行う。現在実験方法を検討中である。サンプル数としては、実験時間や被験者の疲労等を考慮し、3040程度を考えている。■今後の課題色彩の様相は、物体表面の特性と、周辺の環境条件に影響されて現れる。従って、都市景観の色彩様相を考える場合、物体表面に現れる様相のみを検討するだけでなく、天候・太陽高度・街路の方向・周辺建物が形成する空間形態等の環境条件も考慮する必要がある。今回の研究では、平面的なイメージデータにより、操作対象の物体表面のみ扱ったが、環境条件を操作しなかったため、様相の再現性に限界があった。環境光やテクスチャーの条件を設定できる3次元グラフィックスモデル用いれば、再現性の高い様相のモデルを作成することが可能と考えられる。