hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
階層型多目的強化学習を用いた脚ロボットの歩容自律生成

本研究は,脚ロボットの歩容運動を階層的な多目的最適化問題として捉えた,歩容の自律学習を目的としている.この技術の確立により,物理的な制約やトレードオフを陽に考慮した学習が可能となり,生物のような自然な歩容生成が期待できる.平成30年度では,1)動力学シミュレーション上でのActor-Critic強化学習アルゴリズムによる4脚歩行・旋回の学習,2)多目的最適化を扱うための複数のタスクを順番に学習していくことの可能な継続学習の開発,3)4脚ロボットの開発に重点を置いて研究を実施した.具体的には,1)について,前年度に開発したV-REP上での4脚ロボットの簡易モデルを活用して,Actor-Critic強化学習アルゴリズムが歩行・旋回を学習できるかの調査を行った.その結果,全脚をまとめて制御・学習しようとすると学習の難易度が上がり所望のタスク(歩行・旋回)を学習できないことがわかった.そこで,所望のタスクが階層的かつモジュール型の問題であることに注目して,後述の継続学習手法と組み合わせながら小タスクを順を追って学習するカリキュラムを構築することで,4脚ロボットの歩容生成に成功した.2)について,必要な学習内容のみを定着させるための不要な内容の初期化機能を有したニューラルネットワークの正則化手法や学習するネットワークの構造をモジュール性を持つフラクタルネットワークに従って設計する手法を提案した.また,それに加えてタスクに対応するモジュールのみを陽に活性化させるための入力ゲートを設計することで継続学習としての性能向上を果たした.3)について,実機検証用の4脚ロボットを設計・開発し,強化学習プログラムを用いて動作生成可能であることを検証した.これらの提案手法に関して査読なし国内会議で1件,査読あり国際会議で2件発表した.歩容を階層モジュール構造として捉えることで,その学習が容易になることを動力学シミュレーション上で確認できたことが大きい.また,実験検証用の4脚ロボットや多目的最適化を行う上で必要となる強化学習に関連した要素技術の開発がある程度完了し,動作確認及び有用性検証を終わらせているため,残る最終年度の課題は実機での検証・調査となっている.以上より,本研究はおおむね順調に進展しているといえる.平成30年度の進捗状況を踏まえ,平成31年度はこれまで開発してきた実ロボットや強化学習アルゴリズムを利用した実機実験での検証を行う.その際に,相補性を活用した位置制御及び力制御をバランス良く選択するよう提案手法の改善に努める.また,実機での学習時間を短縮するためにシミュレーションでの学習結果の実機への転移技術に関しても開発を進めていく.本研究は,脚ロボットの歩容運動を階層的な多目的最適化問題として捉えた,歩容の自律学習を目的としている.この技術の確立により,物理的な制約やトレードオフを陽に考慮した学習が可能となり,生物のような自然な歩容生成が期待できる.平成29年度では,1)動力学シミュレーションにおける強化学習環境の構築と,2)要素技術となるActor-Critic強化学習アルゴリズムの開発に重点を置いて研究を実施した.具体的には,1)について,動力学シミュレーション環境としてCoppelia Roboticsが開発・提供しているV-REPを用いて,簡易的な4脚ロボットモデルを開発した.また,強化学習アルゴリズムのベンチマーク環境としてOpenAIが開発・提供しているOpenAI Gymと同一のプロトコルでV-REPでの強化学習をテストできる環境を整備した.次に,2)について,移動速度やエネルギー効率といった同程度達成したい目的を同時に学習する際に陥りやすい局所解を回避するため,目的の大域的最適解を発見しうる優れた探索能力を持ったスチューデントのt分布を利用した方策の設計を行った.また,位置制御と力制御のような干渉してしまう目的を切り替えながら学習する際に,破滅的忘却を起こさずに一つずつ学習していくことを可能にするフラクタルネットワークを利用した学習器の設計を行った.これらの提案手法の有用性は構築したシミュレーション環境にて検証した.得られた成果に基いて査読無し国内会議で1件の発表を行った.当初の計画にあった歩容生成のための報酬設計など実施できなかった課題もあるが,その一方で今後の研究を円滑に進めるためのシミュレーション環境の構築や,最新の強化学習アルゴリズムすら未だ抱えていた本研究では避けては通れない課題を解決したため,おおむね順調に進展しているといえる.本研究は,脚ロボットの歩容運動を階層的な多目的最適化問題として捉えた,歩容の自律学習を目的としている.この技術の確立により,物理的な制約やトレードオフを陽に考慮した学習が可能となり,生物のような自然な歩容生成が期待できる.平成30年度では,1)動力学シミュレーション上でのActor-Critic強化学習アルゴリズムによる4脚歩行・旋回の学習,2)多目的最適化を扱うための複数のタスクを順番に学習していくことの可能な継続学習の開発,3)4脚ロボットの開発に重点を置いて研究を実施した.具体的には,1)について,前年度に開発したV-REP上での4脚ロボットの簡易モデルを活用して,Actor-Critic強化学習アルゴリズムが歩行・旋回を学習できるかの調査を行った.その結果,全脚をまとめて制御・学習しようとすると学習の難易度が上がり所望のタスク(歩行・旋回)を学習できないことがわかった.

そこで,所望のタスクが階層的かつモジュール型の問題であることに注目して,後述の継続学習手法と組み合わせながら小タスクを順を追って学習するカリキュラムを構築することで,4脚ロボットの歩容生成に成功した.2)について,必要な学習内容のみを定着させるための不要な内容の初期化機能を有したニューラルネットワークの正則化手法や学習するネットワークの構造をモジュール性を持つフラクタルネットワークに従って設計する手法を提案した.また,それに加えてタスクに対応するモジュールのみを陽に活性化させるための入力ゲートを設計することで継続学習としての性能向上を果たした.3)について,実機検証用の4脚ロボットを設計・開発し,強化学習プログラムを用いて動作生成可能であることを検証した.これらの提案手法に関して査読なし国内会議で1件,査読あり国際会議で2件発表した.歩容を階層モジュール構造として捉えることで,その学習が容易になることを動力学シミュレーション上で確認できたことが大きい.また,実験検証用の4脚ロボットや多目的最適化を行う上で必要となる強化学習に関連した要素技術の開発がある程度完了し,動作確認及び有用性検証を終わらせているため,残る最終年度の課題は実機での検証・調査となっている.以上より,本研究はおおむね順調に進展しているといえる.平成29年度の進捗状況を踏まえ,平成30年度は階層構造を有する強化学習アルゴリズムの開発に着手する.それに付随して,脚を位置制御すべきか力制御すべきかを判断する上位層において,その目的選択に必要とされる状態を選定する.また,脚ロボットの開発を進めるが,開発速度を優先して市販されている脚ロボットの購入も検討する.平成30年度の進捗状況を踏まえ,平成31年度はこれまで開発してきた実ロボットや強化学習アルゴリズムを利用した実機実験での検証を行う.その際に,相補性を活用した位置制御及び力制御をバランス良く選択するよう提案手法の改善に努める.また,実機での学習時間を短縮するためにシミュレーションでの学習結果の実機への転移技術に関しても開発を進めていく.最新の強化学習についての情報収集を国際会議に参加せずにarXivで行ったため.その分は,市販の脚ロボットの購入にあてて開発速度を早める.本研究費にて参加を予定していた国際会議について,他の経費にて補助を受けることができたため.その分は,学習を加速させるための計算機の購入やロボットの改良にあてる.
新規ソフトアクチュエータシステムの創成

平成10年度は昨年度に調製した有機シリル基とアミノ基を交互に主鎖に有するポリサイラミンを主成分にしたハイドロゲルの調製及びその信号応答特性に関して以下のように検討した。i)ポリサイラミンハイドロゲルの調製:両末端にアミノ基を有するポリサイラミンを調製し、塩化アクリロイルを用いて両末端に反応性ビニル基を導入した。さらに4官能性メルカプタンと光ラジカル発生剤を混合し、光架橋を行った。ii)得られたハイドロゲルのpH及び温度に対する体積相転位挙動に関して検討するとともに、相転位前後の弾性率を測定した。この結果、通常のハイドロゲルが膨潤すると柔らかくなるのに対し、ポリサイラミンゲルはアミノ基のプロトン化に伴い膨潤するとともに堅くなる、ゴム弾性転移を示すことが確認された。実際、相転位の前後で不連続的に弾性率が一桁以上変化することが認められた。これは、ポリサイラミン鎖のプロトン化に伴う主鎖の回転束縛に起因し、高含水状態に置いてさえ、ハイドロゲルの弾性率が上昇する初めての例として評価される。新しい信号応答性ゲルを調製するにあたって、平成9年度は以下のように研究を推進した。i)新しい相転移型ポリマー:本研究では最終目標として、DDS及び生体適合性を念頭に置いているため、水中で相転移するポリマー合成を推進する。ビニル重合体の代わりに主鎖に親水性-疏水性セグメントを交互に有する新規ポリマーの合成を行う。ゲルとしての運動性を導入するため、疏水部には有機シリコン或いはシリコーンを採用した。主鎖にアミノ基と有機シリル基を有するポリサイラミンテレケリックオリゴマーがpHおよび温度変化に対応して相転移するマルチ応答性ポリマーとなることを明らかとした。また、アミノ基のプロトン化に伴い、ポリサイラミンのゴム弾性が著しく変化することを明らかとした。ii)テレケリックポリマー:上記のようにして得られた信号応答性ポリマーとともに、既存で知られているビニル重合型信号応答性ポリマーも含めて、テレケリックス化を試みた。モデルネットワーク構築のために極めて反応性の高い末端基(ビニル基、アミノ基、イソシアナ-ト基)の導入、新ネットワーク構築のため、異なる官能基の導入(ヘテロテレケリックス)等を試みた。ポリサイラミンはアニオン重付加反応で合成するため、末端にビニルシリル基、2級アミノ基を定量的に導入することが可能であった。さらに2,5-トルエンジイソシアナ-トにより、両末端にイソシアナ-ト基を有するテレケリックポリマーの合成にも成功した。
変成岩の上昇パスと造山帯の発達史

変成岩の鉱物共生関係を理解するために、Schreinemakers'の束の原理に従った作図プログラムを改良した。既存のプログラムは(C+4)相系以上の解析では、作画が手作業になるという欠点を抱えていた。本研究では、帰納的解法を導入し、DOS-V機上で使用が可能な、(C+4)相系以上の自動作画可能なソフトの開発に成功し、公開した(吉田・平島、1999)。2)マクロな岩石組織の解析方法の改良肉眼サイズ(x1倍)と顕微鏡サイズ(x100倍)の中間岩石組織の観察方法を向上させるために、デジタルスキャナーを導入した。この装置は粗粒な岩石の組織解析に大きな威力を発揮した。あ)三波川変成帯の紅簾石石英片岩の研究では、鉱物組み合わせを解析し、タルクー白雲母共生関係の安定領域を説明する相図を提案した(Izadyar et al.,2000)。い)中国蘇魯地域の超高圧変成岩研究では、精密な岩石組織解析から超高圧変成岩の上昇パスを特定する作業に重点を置いた。その結果、蘇魯地域の東北部で採集した多くの超高圧変成岩は、マントル深度(100km)から下部地殻(30-40km)まで、断熱的に上昇していたことが判った。これの成果の一部はNakamura & Hirajima(2000),Banno et al.(2000)として公表した。このような上昇パスが、蘇魯地域全域で支配的であるか否かを確認するために、蘇魯地域の中央部で採集した超高圧変成岩についてもその上昇パスを検討した。この作業には平成11年度にたマクロサイズの岩石組織観察装置が威力を発揮した。その結果、半島中央部で採取したザクロ石ペリドタイトから超高圧時に出来た鉱物組み合わせと地殻下部付近まで上昇した時に出来た鉱物組み合わせを読み取ることに成功した。これらの鉱物組み合わせに、温度圧力計や岩石成因論的グリッドを適用した結果、山東半島中央部の超高圧変成岩も断熱的に上昇したことが判った。その成果の一部は、2000年6月のWestern Pacific Geophysical Meeting(東京)で口頭発表し、現在Journal Petrlogy誌で査読中である。う)イタリアの超高圧変成岩の研究では、超高圧変成岩が沈み込んでゆくパスを岩石成因論的グリッドを用いて、より精密に制限することが出来た。この成果はCompagnoni & HirajimaとしてLithos誌に印刷中である。中-低温下で形成された変成岩の鉱物共生関係を理解するために、Schreinemakers'の束の原理に従った作図プログラムを改良した。田辺他(1993)はグラフ理論を導入することにより、Schreinemakers'の束を解くプログラムを開発した。しかし、このプログラムは(C+4)相系以上の解析では、作画が手作業になるという欠点を抱えていた。

本研究では、帰納的解法を導入し、DOS-V機上で使用が可能な、(C+4)相系以上の自動作画可能なソフトの開発に成功し、公開した(吉田・平島、1999)。これらのソフトを用い、三波川変成帯の紅廉石石英片岩の鉱物組み合わせを解析し、タルクー白雲母共生関係の安定領域を説明する相図を提案した(Izadyar et al.,2000)。2)マクロな岩石組織の解析方法の改良肉眼サイズ(×1倍)と偏光顕微鏡サイズ(×100倍)の中間サイズの岩石組織の観察方法を向上させるために、スライドサイズ試料の画像をデジタル化できるスキャナーを導入した。ドラマイラ岩体で採集した粗粒な岩石(超高圧変成ホルンフェルス)の組織解析に大きな威力を発揮した。平成11年度の研究で開発したSchreinemakers'の束の原理に従った岩石成因論的グリッド作製ソフトウエアー(吉田・平島、1999)と、造岩鉱物の安定性を考察するための熱力学的ソフトウエアーを併用して、中国とイタリアの超高圧変成岩の変成履歴を精密に推定する作業を行った。中国関係の超高圧変成岩研究では、超高圧変成岩の上昇パスを特定する作業に重点を置いた。その結果、中国山東半島の東北部で採集した多くの超高圧変成岩は、マントル深度(100km)から下部地殻(30-40km)まで、断熱的に上昇していたことが判った。これの成果の一部はNakamura & Hirajima(2000),Banno et al.(2000)として公表した。このような上昇パスが、中国山東半島全域で支配的であるか否かを確認するために、半島中央部から採集した超高圧変成岩についてもその上昇パスを、造岩鉱物の精密組織解析から検討した。この作業には平成11年度に購入したマクロサイズの岩石組織観察装置が威力を発揮した。その結果、半島中央部で採取したザクロ石ペリドタイトから超高圧時に出来た鉱物組み合わせと地殻下部付近まで上昇した時に出来た鉱物組み合わせを読み取ることに成功した。これらの鉱物組み合わせに、温度圧力計や岩石成因論的グリッドを適用した結果、山東半島中央部の超高圧変成岩も断熱的に上昇したことが判った。その成果の一部は2000年6月東京で開催されたWestern Pacific Geophysical Meetingで口頭発表した。イタリアの超高圧変成岩の研究では、超高圧変成岩が沈み込んでゆくパスを岩石成因論的グリッドを用いて、より精密に制限することが出来た。この成果はCompagnoni & HirajimaとしてLithos誌に印刷中である。
嗅覚神経嗅球の共存培養を利用したシナプス形成、維持及び再形成に関わる分子の解析

本年度の研究では、第1に、嗅覚神経-嗅球スライスの共存培養系におけるシナプス結合の性質を明らかにするために、in vivoの嗅球との比較を行った。嗅覚神経より嗅球スライスに投射した軸索は、嗅球スライス上の僧帽細胞に対してシナプス結合を作っていることを確認した。しかしながら、培養系ではin vivoの状態とは異なり、シナプス結合の位置は僧帽細胞の細胞体付近であった。また、嗅球スライス上に糸球体が形成されることはなかった。第2に、いったんシナプス結合が形成された嗅覚神経-嗅球共存培養系において、嗅覚神経の軸索の切断を試みた。切断は、申請書に示したACAS570を用いる方法ではなく、顕微鏡下、針を用いた手作業によって行った。これは、ACAS570を用いた場合、発熱が局所にとどまらないと考えたからである。全体の1/4-1/3程度の軸索を切断した場合、切断を受けた嗅覚神経は退縮、脱落し、別の神経細胞より軸索が進展し、嗅球スライス上の僧帽細胞に対してシナプス結合を作ることを確認した。このとき、伸長する軸索の先端付近においてN-CAMが強く発現することを抗体染色によって確認した。第3に軸索再生時におけるN-CAMの役割を明らかにするために、培養液中に抗体を共存させたところ、再生過程において軸索先端が嗅球スライス上に達していない嗅覚神経はほとんどが脱落したのに対し、軸索先端が嗅球スライス上に達している場合はシナプス形成になんら影響を受けなかった。
通院しながら生活するがん患者の「調整力」尺度の開発

通院しながら生活するがん患者の調整力に関する質問紙を患者へのインタビューをもとに作成した。そしてがん看護を専門とする看護師や大学教員から意見を得て、統計学的手法を用いて内容関連妥当性を検討した。さらに実際にがん患者に質問紙への回答を依頼し、使いやすさなどを検討した。その後、郵送法によって58名を対象としたパイロットスタディを実施し、「通院しながら生活するがん患者の調整力質問紙(暫定版)」を作成した。より信頼性、妥当性の高い調整力尺度を開発するため、西日本の6施設の協力を得てデータ収集を行った。平成24年度:「通院しながら生活するがん患者の調整力質問紙(暫定版)」の作成「通院しながら生活するがん患者の調整力質問紙(暫定版)」の作成を8つのプロセスで進めた。1調整力の構成要素と関連因子の抽出:通院しながら生活しているがん患者13名に対して質的帰納的アプローチによる因子探索型研究方法を用いて、調整力の構成要素と関連因子を抽出した。分析の結果、通院しながら生活するがん患者の調整力の構成要素として、【考案する力】、【実行する力】、【評価する力】、【拠り所をつかむ力】、【方向性を変える力】、【対処方法を拡大する力】の6つが抽出された。2アイテムプールの作成:1のインタビューで得られたデータから、調整力の構成要素ごとにアイテムプールを作成した。曖昧な表現や代名詞の使用を避け、一文で単一の内容を示すよう検討し、6つの構成要素から、合計83アイテムを作成した。3尺度様式の検討:回答の選択肢を「非常によく当てはまる」から「全く当てはまらない」の5段階とした。4基準関連妥当性を確認するための尺度の検討:外的基準として、がん患者の対処を測定する尺度MAC日本語版およびQOLを測定する尺度FACT-G日本語版を用いることとした。5エキスパートによる内容関連妥当性の検討:がん看護専門看護師6名、修士号を有しがん看護に携わっている大学教員5名の計11名を対象者とした。調整力の構成要素、定義、質問項目が通院しながら生活するがん患者の調整力を適切に反映しているか、MAC、FACTーGが通院しながら生活するがん患者の対処、QOLを測定する尺度として妥当であるかを検討した。回答率を一致率(%)として算出し、80%以上を数的基準として分析を行って67項目とした。6通院しながら生活するがん患者による表面妥当性、使いやすさの検討と質問紙の修正:平成25年3月末を締め切りとして、質問紙への回答を依頼した。平成25年度:3月末を締め切りとして通院しながら生活するがん患者による、質問紙の表面妥当性、使いやすさの検討、修正を行った。次にパイロットスタディとして、がん患者が会員登録をする法人を介して調整力尺度案を含む質問紙を返信用封筒と共に113送付した。59名から回答があり(回収率52%)、そのうち67の質問項目の内、64項目で同じ選択肢を回答していた1名を除いた58名を有効回答として質問紙の検討を行った。そして、調整力尺度の選択肢番号、回答についての説明、フェイスシートの回答方法について、修正を行った。9月より中国・四国・九州にある6つの総合病院において、データ収集を開始した。当初、12月末を締め切りとしていたが、目標配布数に達していなかったため、配布期間を2月末まで延長する協力を得た。3月末の時点で有効回答数96名である。パイロットスタディの結果から、本調査では350の有効回答が得られるようデータ収集を行うことにしている。配布数はパイロットスタディの回収率52%、有効回答率98%という結果から、685の配付を目指すこととし、新たなデータ収集協力施設を九州2施設、中国2施設、関西1施設に広げ、また九州1施設で継続的な協力を得て実施中である。平成24年度に計画をしていた内容すべてを達成することはできなかった。しかし、次のプロセスの準備を同時に進めており、現在実施中の通院しながら生活するがん患者による表面妥当性、使いやすさの検討と質問紙の修正ができ次第、パイロットスタディが実施できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。質問紙の修正および印刷等準備と研究協力施設との調整、データ収集とデータ入力などを同時進行とし、研究が滞ることなく進むようにする。平成24年度は研究対象者確保に時間を要したため、平成25年度に実施するパイロットスタディと平成25年度計画1「通院しながら生活するがん患者の調整力質問紙(暫定版)」の研究協力施設の調整を早期から始める。
プラズモニックアレイによるナノ空間光マニピュレーション

プラズモン共鳴を励振する際に生じる局所温度上昇は、微粒子のプラズモントラッピングにおける安定性を考える上で極めて重要であることがら、本年度は1.熱伝導性の高い基板をヒートシンクとして用いる方針と、2.プラズモニックナノ構造に代わって、高屈折率を持ち誘電体の虚数が小さい半導体ナノ構造を用いる方針で課題克服に向けて取り組んで来た。1.について具体的には、熱伝導性がガラスの数十倍高いサファイアを基板として用い、これまでと同じように電子線ビームリソグラフィ/リフトオフ法によってナノ構造を作製し、SEMやAFMによって形状を、顕微分光によりプラズモン共鳴特性を、近接場顕微鏡により光局在場分布を評価し、シミュレーションで用いたモデルと極めて近い形状・特性を得る事ができた。サファイア基板上金ナノブロックペアを用いて100nm粒子のプラズモントラッピングをしたところ、ガラス基板を用いた場合と比べナノ粒子の位置揺らぎが1/5まで抑えることが可能であることを明らかにした。次に、2.についてSiやGaPのナノブロックペアを対象に可視光照射に伴う局所温度上昇を計算によって見積もったところ、Siナノ構造については金を使った場合に比べ1/100の温度上昇、GaPナノ構造については誘電率の虚部がゼロのため全く温度上昇しないということを見出した。SiやGaPナノ構造で生じる局在場が微粒子捕捉で働く放射圧をMaxwell応力法によって計算したところ、金を使った場合にくらべ1/3程度になることがわかり、金ナノ構造を使った場合より3倍以上の光照射をすれば放射圧の大きさを同程度に保ちながら、局所温度上昇の影響をかなり抑えることができる可能性を示す事ができた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。プラズモン光局在場でナノ粒子に働く放射圧を計算するMaxwell応力法プログラムを構築し、ナノブロックペアのブロックサイズ、ギャップサイズ、材質をパラメーターに放射圧ポテンシャルの計算を行い、実験で使用する波長1064nmのレーザー光照射によってナノ粒子を数ナノメートルの小さな位置揺らぎで長時間安定に捕捉するためのナノ構造を見いだした。最適化したナノ構造は、電子線ビームリソグラフィ/リフトオフ法によって作製し、SEMやAFMによって形状を、顕微分光によりプラズモン共鳴特性を、NSOMにより光局在場分布を評価し、シミュレーションで用いたモデルと極めて近い形状・特性の金ナノブロックペアを得る事ができた。100nmナノ粒子の位置揺らぎ情報を元に捕捉ポテンシャルを求めたところ、入射強度が60kW/cm^2の場合、光バネ定数は金ナノブロックペアの短軸方向に沿ってkx:2.2[fN/nm]長軸方向に沿ってky:2.0[fN/nm]と得られた。ばね定数は短軸方向の方が長軸方向よりも大きくなっていることがわかり、この結果はMaxwell応力法によって得られた計算値と良い一致を示している。また、従来の集光レーザーを用いた光ピンセットではk=2.2×10-3[fN/nm]となり、プラズモントラッピングは従来の光ピンセットよりも約3桁強い力で捕捉できることがわかった。さらに、長軸偏光の光を照射した場合、単一のポテンシャル井戸が観察され、短軸偏光の光を照射した場合は、ポテンシャル井戸が二つに分離し、そのポテンシャル井戸間距離は回折限界以下である約230nmであった。この結果は、プラズモン局在場を用いる事によってナノ粒子を超解像で光トラッピングできることを証明する世界で初めての結果であり、従来の集光レーザーでは決して実現できない事からプラズモントラッピング特有の新しい応用への展開が期待できる。90nmの距離に二つのナノギャップを有するダブルナノギャップ構造を新たに発案し、前年度に構築したプラズモン局在場で働く放射圧を計算するMaxwell応力法を使ってナノブロックサイズ、ギャップサイズをパラメーターに放射圧ポテンシャルの計算を行い、実験で使用する波長1064nmのレーザー光照射によってナノ粒子を90nm離れた二つのギャップ上において数ナノメートルの小さな位置揺らぎで長時間安定に捕捉するためのナノ構造パラメーターを見いだした。最適化したナノ構造は、電子線ビームリソグラフィ/リフトオフ法によって作製し、SEMやAFMによって形状を、顕微分光によりプラズモン共鳴特性を、近接場顕微鏡により光局在場分布を評価し、シミュレーションで用いたモデルと極めて近い形状・特性を得る事ができた。次に、前年度に開発した高速で運動している捕捉ナノ粒子の正確な位置揺らぎ情報を獲得するシステムを使って、最適化したダブルナノギャップ構造を用いた100nmナノ粒子光トラッピングを解析したところ、みごと90nmの距離を隔てた二つのポテンシャル井戸の観察に成功した。さらに、このダブルポテンシャル井戸を用いて、二つのナノ粒子を同時に光捕捉することによって、ギャップの配列に沿って回折限界以下の空間に二つの粒子を配列できることを明らかにした。このような2個のナノ粒子の超解像光トラッピングは従来の集光レーザーを用いた方法では実現が不可能であり、今後単一分子レベルでのタンパク質分子間相互作用力の直接観察および定量的測定に発展する極めてインパクトの高い結果である。実際、ダブルナノギャップ構造を用いることによって単一100nmだけでなく単一40nmのナノ粒子トラッピングも現在のところ成功しており、さらなる最適化を行えば単一タンパク質分子のプラズモントラッピングも十分可能性があると考えている。

プラズモン共鳴を励振する際に生じる局所温度上昇は、微粒子のプラズモントラッピングにおける安定性を考える上で極めて重要であることがら、本年度は1.熱伝導性の高い基板をヒートシンクとして用いる方針と、2.プラズモニックナノ構造に代わって、高屈折率を持ち誘電体の虚数が小さい半導体ナノ構造を用いる方針で課題克服に向けて取り組んで来た。1.について具体的には、熱伝導性がガラスの数十倍高いサファイアを基板として用い、これまでと同じように電子線ビームリソグラフィ/リフトオフ法によってナノ構造を作製し、SEMやAFMによって形状を、顕微分光によりプラズモン共鳴特性を、近接場顕微鏡により光局在場分布を評価し、シミュレーションで用いたモデルと極めて近い形状・特性を得る事ができた。サファイア基板上金ナノブロックペアを用いて100nm粒子のプラズモントラッピングをしたところ、ガラス基板を用いた場合と比べナノ粒子の位置揺らぎが1/5まで抑えることが可能であることを明らかにした。次に、2.についてSiやGaPのナノブロックペアを対象に可視光照射に伴う局所温度上昇を計算によって見積もったところ、Siナノ構造については金を使った場合に比べ1/100の温度上昇、GaPナノ構造については誘電率の虚部がゼロのため全く温度上昇しないということを見出した。SiやGaPナノ構造で生じる局在場が微粒子捕捉で働く放射圧をMaxwell応力法によって計算したところ、金を使った場合にくらべ1/3程度になることがわかり、金ナノ構造を使った場合より3倍以上の光照射をすれば放射圧の大きさを同程度に保ちながら、局所温度上昇の影響をかなり抑えることができる可能性を示す事ができた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。当初、2年間で行うことを計画していた実験およびシミュレーションを1年間で遂行し、その内容を論文にまとめ、現在投稿中にある。さらに同時進行で、計画段階において困難としていた内容について新しい切り口を提案することができた。まだ系が最適化されていないもののこのアイデアについての理論シミュレーションを行い、Natureの姉妹紙であるScientific Reports紙でみごと論文が掲載されている。研究課題の核となる部分についてはすでにほとんど達成しており、その成果についてもナノサイエンス分野最高峰とされるNanoLetters紙に掲載することができた。さらに、この研究課題を強く飛躍させるため、プラズモニクスで有名なロンドンのインペリアル・カレッジに長期間海外渡航し、これまでの方法を遥かに上回る精度および最適化を実現するシミュレーション系を新たに構築することに成功している。来年度は、今年度に提案した超解像プラズモントラッピングのさらなる分解能を目指すとともに、これまでは単に一点でナノ粒子を位置させるだけであったプラズモントラッピングをナノ空間マニピュレーションへと展開する。また、プラズモン共鳴を励振する際に生じる局所温度上昇は熱対流の原因となり粒子捕捉を妨げる結果となる。そこで、金属ナノ構造を熱伝導性の高い基板に作製するによって、その基板をヒートシンクとして用いることを検討している。
牛から分離される非Ｏ１５７志賀毒素産生性大腸菌の病原因子に関する分子遺伝学研究

志賀毒素産生性大腸菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli : STEC)における強毒型菌の制御や診断法開発につながる病原因子や表現型を解明することを目的とし、平成25年度には全国の牛群から糞便を収集しSTECの分離を行った。今年度は分離したSTEC菌株について、血清型別、phylogenetic groupの同定、志賀毒素遺伝子(stx)型別、インチミン遺伝子(eae)などの病原因子の同定および薬剤感受性試験を行った。分離株の血清型別の結果、43種のO血清群が同定された。このうち、人の食中毒起因菌として一般的な血清群の分布は次の通りであった: O26、5株; O103、2株; O157、2株; O121、1株; O145、1株。Phylogenetic groupでは、牛の常在大腸菌で分離頻度が高いAおよびB1が全体の9割以上を占めた。stx型は多様であり、stx1では1a(86.4%)、stx2では2a(64.7%)が最も多いサブタイプであった。病原因子の同定では、eaeはO157などの上記一般的STECの他にO108、O115、O150、O156で陽性であった。このうち、O108, O115, O156については、強毒型STECの指標の一つとされるstcEを保有しており、強毒株である可能性が示唆された。また、薬剤感受性試験の結果、46株(41.1%)が少なくとも一剤に対する耐性を有し、耐性頻度の高い薬剤はテトラサイクリン(31.5%)およびストレプトマイシン(24.5%)であった。以上の結果から、牛由来STECの病原因子保有状況は多様であり、O157をはじめとする強毒なSTECを保有することが示された。一方、phylogenetic groupおよび薬剤感受性試験の分布は牛の常在大腸菌と類似していることが明らかとなった。本研究課題は平成26年度で廃止のため、記入しない本研究課題は平成26年度で廃止のため、記入しない本課題の最終的な目標は牛から分離される非O157志賀毒素産生性大腸菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli : STEC)の分子遺伝学的特徴とその保菌を減らす飼養管理方法を明らかにすることである。今年度はなるべく多くの牛から糞便を収集することと、多検体を効率的に処理できるSTEC分離法を確立することを目的として実験を行った。具体的には家畜保健衛生所の協力のもと牛糞便を採材し、同時に飼育管理方法に関する19項目について情報を収集した。牛糞便を材料としてコロニーハイブリダイゼーション法によるSTEC分離を試み、分離株については、志賀毒素1型遺伝子(stx1)、同2型遺伝子(stx2)、III型分泌装置の一部であるインチミン遺伝子(eae)および大腸菌O157、O26、O111、O103、O145、O121、O45特異的遺伝子の保有状況をPCR法により調べた。牛糞便は、15県の110農場から各56検体、計551検体を収集した。コロニーハイブリダイゼーション法を用いることで、全ての検体についてSTEC分離を試みることができた。その結果、121検体から計132株のSTECが分離された。1株以上のSTECが分離された農場の割合は56.4%(110農場中62農場)であった。分離された菌株のstx保有状況は、stx1単独保有株が25株、stx2単独保有株が90株、stx1およびstx2保有株が17株であった。このうち、eae遺伝子を保有している株は、10.6%(14株)であった。O血清型特異的なPCRから、3株がO103、2株がO145、2株がO157、1株がO26、1株がO121と同定された。残りの123株は、型別不能であった。血清型が同定できた9株はいずれもeaeを有していた。今年度の結果から、国内の牛群にはSTECが広く分布し、その中には人での分離頻度が高い血清型が含まれることが明らかとなった。一方、定型的なIII型分泌装置を有さない菌株の割合が高く、これらの菌の病原性についてさらに調査する必要があると考えられた。

stx型は多様であり、stx1では1a(86.4%)、stx2では2a(64.7%)が最も多いサブタイプであった。病原因子の同定では、eaeはO157などの上記一般的STECの他にO108、O115、O150、O156で陽性であった。このうち、O108, O115, O156については、強毒型STECの指標の一つとされるstcEを保有しており、強毒株である可能性が示唆された。また、薬剤感受性試験の結果、46株(41.1%)が少なくとも一剤に対する耐性を有し、耐性頻度の高い薬剤はテトラサイクリン(31.5%)およびストレプトマイシン(24.5%)であった。以上の結果から、牛由来STECの病原因子保有状況は多様であり、O157をはじめとする強毒なSTECを保有することが示された。一方、phylogenetic groupおよび薬剤感受性試験の分布は牛の常在大腸菌と類似していることが明らかとなった。本研究課題は平成26年度で廃止のため、記入しない本研究課題は平成26年度で廃止のため、記入しない今年度は家畜保健衛生所の協力を得て、15県の110農場から、計551検体の糞便を収集することができた。また、コロニーハイブリダイゼーション法を用いたSTEC分離法を確立した。本法では1検体あたり約1000コロニーのstx遺伝子保有状況を1度に調査できるので、偽陰性を減らすことが可能となる。これにより今年度収集した551検体全てについて菌分離を試みることができ、121検体から計132株のSTECを分離した。多数の牛糞便収集とSTEC分離法の確立という所期の目標を達成できたことから、研究は順調に進展していると評価できる。今後は、牛糞便の収集を続けるとともに、分離したSTEC菌株および情報の解析を進める。牛糞便の収集は、新たな15都道府県を対象に行う。これにより、全都道府県の3分の2を網羅することになり、各地域の傾向を偏りなく明らかにすることができる。分離STECの血清型、stx subtype、大腸菌のphylogroup、各種薬剤への耐性などを調査する。また、免疫磁気ビーズ法によってO157およびO26の分離を行う。さらに、牛糞便と共に収集した飼育管理方法に関する情報を用いて疫学解析を行い、STEC陽性農場に特徴的な衛生管理指標を明らかにする予定である。
免疫グロブリンH鎖遺伝子の染色体転座と相手遺伝子による多発性骨髄腫の病型分類

多発性骨髄腫(MM)105例中69例(66%)に免疫グロブリンH(IGH)鎖遺伝子の染色体転座を認めた.PRAD1-IGH再構成は,38例の評価可能症例のうち27例(71%)が陽性であった.c-MYC-IGHの融合は,35例中11例(31%)に,FGFR3-IGHは48例中8例(17%)に,MUM1-IGHは38例中8例(21%)に検出した.PRAD1,c-MYC, FGFR3の全ての遺伝子について検討できた43症例のうち9例(21%)で,double IGH転座を認めた.臨床的には,PARD1-IGH再構成は形質細胞性白血病に認められ,FGFR3-IGH再構成は骨病変の頻度が高かった.次に,IGH転座のおきたBリンパ球の分化段階を検討した.骨髄または末梢血より単核細胞を分離し,preB細胞(CD38+,CD19-),幼弱骨髄腫細胞(CD38+,CD19-,MPC-),成熟骨髄腫、細胞(CD38+,CD19-,MPC+)をsortingし,DC-FISH法を施行した.17症例のMMを検討した.FGFR3を転座相手とした場合では,幼弱骨髄腫、細胞にのみ転座が認められた症例と,逆に成熟細胞にのみ転座が認められた症例,幼弱と成熟いずれの、細胞群にも転座が認められた症例とが存在した.一方,CCND1を転座相手とする症例では,すべて幼弱と成熟いずれの細胞群にも転座が認められるパターンであった.[結論]FGFR3/IGH転座はBリンパ球の分化成熟段階の早期と後期にも関与するが,CCND1/IGH転座は骨髄腫発生の早期変化と考えられる.多発性骨髄腫(MM)105例中69例(66%)に免疫グロブリンH(IGH)鎖遺伝子の染色体転座を認めた.PRAD1-IGH再構成は,38例の評価可能症例のうち27例(71%)が陽性であった.c-MYC-IGHの融合は,35例中11例(31%)に,FGFR3-IGHは48例中8例(17%)に,MUM1-IGHは38例中8例(21%)に検出した.PRAD1,c-MYC, FGFR3の全ての遺伝子について検討できた43症例のうち9例(21%)で,double IGH転座を認めた.臨床的には,PARD1-IGH再構成は形質細胞性白血病に認められ,FGFR3-IGH再構成は骨病変の頻度が高かった.次に,IGH転座のおきたBリンパ球の分化段階を検討した.骨髄または末梢血より単核細胞を分離し,preB細胞(CD38+,CD19-),幼弱骨髄腫細胞(CD38+,CD19-,MPC-),成熟骨髄腫、細胞(CD38+,CD19-,MPC+)をsortingし,DC-FISH法を施行した.17症例のMMを検討した.FGFR3を転座相手とした場合では,幼弱骨髄腫、細胞にのみ転座が認められた症例と,逆に成熟細胞にのみ転座が認められた症例,幼弱と成熟いずれの、細胞群にも転座が認められた症例とが存在した.一方,CCND1を転座相手とする症例では,すべて幼弱と成熟いずれの細胞群にも転座が認められるパターンであった.[結論]FGFR3/IGH転座はBリンパ球の分化成熟段階の早期と後期にも関与するが,CCND1/IGH転座は骨髄腫発生の早期変化と考えられる.多発性骨髄腫(MM)107例,形質細胞性白血病4例,形質細胞腫2例の計113例を対象に,IGH遺伝子の染色体転座を解析した.(対象と方法)男性58/女性55例.M蛋白は,IgGκ52例,IgGλ26例,BJκ12例,BJλ10例,IgAκ8例,IgAλ5例.腫瘍細胞の比率は12100%.骨髄液,末梢血,胸水を型のごとく固定し,double-color FISH(DC-FISH)を施行した.IgH.転座の陽性例では,PRAD1,c-MYC,FGFR3,MUM1(IRF4),BCL2遺伝子との融合を検討した.(結果)評価が可能であった105例中69例(66%)にIgH遺伝子のスプリットを認めた.t(11;14)をPRAD1/IgHの融合として検出し,評価が可能であった38例のうち27例(71%)で陽性であった.t(8;14)はc-MYC/IgHの融合として検出し35例中11例(31%)が,t(4;14)はFGFR3/IgH融合として検出し48例中8例(17%)が,t(6;14)はMUM1/IgH融合として検出し38例中8例(21%)が陽性であった.PRAD1,c-MYC,FGFR3の全てについて転座相手を検討できた43症例のうち9例(21%)で,2種類のIGH転座を認めた.FGFR3/IgH陽性例8例中7例では,RT-PCRでFGFR3の過剰発現を認めた.FGFR3転座例では骨病変を示す症例が有意に多かった.(考察)

MMの66%にIgH転座を認め,t(11;14)とt(8;14)の頻度が高頻度であった.同一症例で2種類の転座相手の見出される場合があり,IgH遺伝子座の不安定性がMMの病因に密接に関与していると考えられる.[目的]多発性骨髄腫(MM)におけるIgH遺伝子の転座がBリンパ球のどの分化段階で生じたのかを検討した.[方法]骨髄または末梢血よりFicoll-Paqueで単核細胞を分離し,preB細胞(CD38+,CD19-),幼弱骨髄腫細胞(CD38+,CD19-,MPC-),成熟骨髄腫細胞(CD38+,CD19-,MPC+)をsortingした.分画したこれらの細胞群にDC-FISH法を施行した.[結果]17症例のMMあるいはMGUSを検討し,13例(76.4%)でIgH遺伝子座のSplitを検出した。転座相手は、FGFR3が7例,c-MYCが4例,CCND1が4例であった.また,4例では複数のIgH転座を検出し,FGFR3+CCND1が3例,FGFR3+c-MYCが1例であった.IgH転座の陽性例でも,preB細胞にはIgH遺伝子のsplitは検出されなかった.骨髄腫細胞の成熟度とIgH転座の関連を検討すると,FGFR3を転座相手とした症例では,幼弱骨髄腫細胞にのみ転座が認められた症例と,逆に成熟細胞にのみ転座が認められた症例,幼弱と成熟いずれの細胞群にも転座が認められた症例とが存在した.一方,CCND1を転座相手とする症例では,すべて幼弱と成熟いずれの細胞群にも転座が認められるパターンであった.[結論]FGFR3/IgH転座はBリンパ球の分化成熟段階の早期と後期にも関与するが,CCND1/IgH転座は骨髄腫発生の早期変化と考えられる.Double IgH転座の存在は,がん遺伝子が段階的に転座しMMの発症と進展に関与していることを示唆している.
勅撰和歌集と古代礼楽思想の和漢比較研究

平安から室町時代にかけて編まれた21代にわたる勅撰和歌集編纂を支える思想基盤には中国を中心とする東アジア儒教文化圏に共通する古代儒教による「礼楽」思想が一貫して存在し,この礼楽思想の日本的展開我が国固有の変容の成果として勅撰和歌集が編纂され続けたことさらに,この「礼楽」の思想的基盤(特に,中国古代音楽論)への認識を深めることが,勅撰和歌集研究に不可欠の要件であること等の諸点を明らかにした。古典研究にあって、ブッキッシュな出典論・材原論では届かない手法的限界に、どのように向き合うのか。勅撰和歌集の序文の解読に際し、古代礼楽思想-先秦から宋学を経て知の基盤を成す儒教的人間観(性情論・世界観)の体系的な理解-が、研究上いかに必要不可欠な前提であるか、についての考察を進め、「詩歌の発生論と<型>-「古今集序」の理解をめぐって-」(古代文学会連続シンポジウム<型>のダイナミズム-古代文学の普遍と固有-)、「古典解釈における『近代』と『前近代』」(西田幾多郎生誕140周年記念国際シンポジウム日本文化-その価値観の多様性-)等の国内外の招待シンポジウムでの発表・討論及びこれに付随する文献調査・資料収集を行った。これらを通じ、(1)現在大きな疑念も抱かれず一般化された近代以降の通説の一例を批判的にとりあげ、中・近世の古注釈類の解釈例をも参照しながら、前近代の"儒教的な思想的枠組み"を復元的に共有することによって、それらをベースとして成り立っ古代の言説の同時代的な("本来の""あるべき")解釈を呈示し、一定の成果を収めるとともに、(2)従来の和漢比較研究における出典・材原論の限界性(なぜ、その時期にそのようなものをこのように意味づけ体系化したかという本質的な解答に迫り得ない)を打破するためには、当代文化の考え方の枠組み-礼楽を基本とする儒学的世界観の通時、共時的な思考体系(個々の材料を統括し意味づける大きなロゴス)を理解することが、古典注釈に不可欠であること等、次年度以降に向けた各勅撰和歌集序の注釈的研究手法上の有益な指針を得ることができた。前年度に引き続き、古典研究にあって、ブッキッシュな出典論・材原論では届かない手法的限界に、どのように向き合うのか。勅撰和歌集の序文の解読に際し、古代礼楽思想-先秦時代から宋学を経て知の基盤を成す儒教的人間観(性情論・世界観)の体系的な理解-が、研究上いかに必要不可欠な前提であるかについての考察をさらに進めるとともに、「仮名散文の創出-古今集序をめぐって」(国文学解釈と鑑賞76-8)、や同済大学(上海)・北京日本学研究センター等での招待講演や研究者交流及びこれに付随する文献調査・資料収集を行った。これらを通じ、(1)現在大きな疑念も抱かれず一般化された近代以降の通説の一例を批判的にとりあげ、中・近世の古注釈類の解釈例をも参照しながら、前近代の"儒教的な思想的枠組み"を復元的に共有することによって、それらをベースとして成り立つ古代の言説の同時代的な("本来の""あるべき")解釈を呈示し、前年度の成果を基にさらに検証を加えるとともに、(2)従来の和漢比較研究における出典・材原論の限界性(なぜ、その時期にそのようなものをこのように意味づけ体系化したかという本質的な解答に迫り得ない)を打破するためには、当代文化の考え方の枠組み-礼楽を基本とする儒学的世界観の通時、共時的な思考体系(個々の材料を統括し意味づける大きなロゴス)を理解することが、古典注釈に不可欠であることを確信し、最終年度に向けた成果公刊のための著書原稿の作成を進め、完稿の目途をつけた。前年度に引き続き、勅撰和歌集の理解にあたっては、古代礼楽思想ー先秦時代から宋学を経て知の基盤を成す儒教的人間観(性情論・世界観)の体系的な理解ーが、研究上いかに必要不可欠な前提であるかについての考察をさらに進めるとともに、1「日本古典文学における和漢比較研究」(北京日本学研究センター・11月1日、14時16時)等での招待講演や研究発表会「日中比較文学(古典)研究発表討論会」(台湾輔仁大教授、北京大副教授、北京交通大教授、対外経済貿大教授、法政大教授ほか)及び研究者交流及びこれに付随する文献調査・資料収集を行い、これまでの和漢比較研究の手法的反省のうえに立ち、今日的観点からの方法的指針を再検証した。なお、本出張は、当初「日中国交正常化40周年事業」参加として計画されたものだが、中国教育部の指導により開催が延期されたため、当初の規模を見直して行われたものである。また、212月4日、ワルシャワ大学東洋学部長を表敬訪問するとともに、これより先、3日午後に、日本学科修士・博士課程院生約20名を対象とし、「日本文化と自然・四季」と題する記念講演を行い、さらに、同学科教授、ヤギエル大学准教授と研究交流を行い教育研究上の有益な知見を得た。

これらを通じ、3真名序・仮名序の文体的特性の位相差から、仮名序の後進性(完成奏上時には附属されていなかったこと)が確認された。4従来の和漢比較研究における出典・材原論の限界性を打破するためには、当代文化の考え方の枠組みー礼楽を基本とする儒学的世界観の通時、共時的な思考体系(個々の材料を統括し意味づける大きなロゴス)を理解することが、古典注釈に不可欠であることを確信したが、これらの検証にはなお多くの課題もあり、平成25年度27年度の科研採択課題に接続させ、より深化させ大成させることとした。一部の注釈・校本作業は、なお課題が残るが、礼楽思想を基盤とする勅撰和歌集の和漢比較研究にあらたな知見を盛り込んだ、これまでの科研課題に係る一連の研究成果を一書にまとめた『和歌の詩学』(仮題・単著)を今年度中に刊行する目途がおおむねついた。24年度が最終年度であるため、記入しない。勅撰和歌集が生み出され、それらがカノン化されてゆく背景基盤の動態的な理解のためには、日本の中・近世期における儒教(宋学を含む)の受容・変容過程における礼楽思想の古典注釈世界等における総体的な究明が不可欠との認識に至ったが、これらについては、更に新たな研究課題を設定して追求してゆくことにしたい。
RNA干渉を用いた血管内皮細胞インターロイキン発現抑制による敗血症組織傷害の緩和

先ずLPS刺激によりHUVECがIL-8ならびに活性酸素(ROS)を産生することを確認した。次にIL-8刺激によりHUVECがROSを産生すること、IL-8誘導ROS産生はLPS誘導ROS産生(2時間以上)に比べ、短時間(1時間以内)であること、IL-8受容体(CXCR1, 2)の中和抗体やIL-8特異的siRNAの前処理によりLPS誘導ROS庫生が部分的に抑制されることを明らかにした。これらの所見から、HUVECにおいて、LPS刺激によるROS産生はIL-8を介することが示唆され,た。また、LPSおよびIL-8誘導ROS産生はNox阻害剤であるDPIの前処理により完全に抑制されることから、両者ともにNox依存性であることが明らかとなった。現在までにNoxは5種類のアイソザイムが知られており(Nox1-5)、HUVECにおけるNoxファミリーのmRNA発現を検討したところ、Nox2, 4は恒常的に発見し、Nox1はLPSやIL-8刺激により誘導されることが明らかとなった。誘導型NoxであるNox1の生体内の役割は不詳な点が多く、敗血症病態への関与は明らかでなかったため、Nox1に焦点を当てて検討を行った。その結果、Nox1特異的siRNAでHUVECを処理したところ、LPS誘導ROS産生は有意に抑制された。敗血症において、播種性血管内凝固症候群(DIC)は重要な合併症の一つであり、DICの発症には凝固カスケードの最上流に位置する組織因子(tissue factor, TF)の発現が重要な役割を果たす。TF発現はLPS刺激により誘導されるが、ROS消去剤であるNACの前処理によりLPS誘導TFの発現が抑制され、TF発現におけるROSの関与を示した。また、IL-8およびNox1各々の特異的siRNAをHUVECに導入したところ、LPS誘導TF発現が抑制された。以上の所見から、HUVECにおいて、LPS刺激は先ずIL-8産生を誘導し、次いでNox1発現を介してROSを産生し、さらにROSはTFの発現を誘導することが明らかとなった。本年度は1.ヒト血管内皮細胞の培養、2.ヒトIL-8のsiRNAの配列設計と作成、3.siRNAのヒト血管内皮細胞への導入、4.リアルタイムPCRによる遺伝子レベルでのRNAi効果の確認ならびに5.ゲル電気泳動ならびにELISAによるタンパクレベルでのRNAi効果の確認を行った。ただしヒトIL-1βのsiRNAについては、IL-8の作用を検討するに手一杯で、検討はできなかった。1.ヒト血管内皮細胞の培養2. siRNAの配列設計と作成ヒトIL-8の活性をノックダウンするためのsiRNA(ポジティブsiRNA)の配列を決め、合成を行った。この時、RNAi効果を持たないネガティブコントロール用のsiRNA(ネガティブsiRNA)も合成した。3. siRNAのヒト血管内皮細胞への導入と細胞死への影響教室保有の遺伝子導入用電気穿孔装置Amaxaを使って、合成したヒトIL-8siRNAをHUVECに導入したる。方法は、元来は接着細胞であるHUVECをトリプシンで処理して浮遊細胞状態とた状態でsiRNAの電気穿孔法による導入を行った。細胞死への影響はMTTアッセイにて検討した。4.リアルタイムPCRによる遺伝子レベルでのRNAi効果の確認HUVECに導入したsiRNAがRNAi効果を発揮したか否かを遺伝子レベルで確認するため、ポジまたはネガのsiRNAを導入したHUVECをLPSで刺激した時のIL-8のmRNAの発現量の低下をリアルタイムPCR用いて確認した。5.ゲル電気泳動ならびにELISAによるタンパクレベルでのRNAi効果の確認HUVECに導入したsiRNAがRNAi効果を発揮したか否かをタンパクレベルで確認するため、ポジまたはネガのsiRNAを導入したHUVECをLPSで刺激し、IL-8の発現量の低下を、HUVECの細胞溶解液を試料として、ゲル電気泳動を行って確認した。一方で、IL-8の産生量の低下を、HUVECの培地(上澄)を試料として、IL-8測定用ELISAキットとマイクロプレートリーダーを用いて確認した。

敗血症において、播種性血管内凝固症候群(DIC)は重要な合併症の一つであり、DICの発症には凝固カスケードの最上流に位置する組織因子(tissue factor, TF)の発現が重要な役割を果たす。TF発現はLPS刺激により誘導されるが、ROS消去剤であるNACの前処理によりLPS誘導TFの発現が抑制され、TF発現におけるROSの関与を示した。また、IL-8およびNox1各々の特異的siRNAをHUVECに導入したところ、LPS誘導TF発現が抑制された。以上の所見から、HUVECにおいて、LPS刺激は先ずIL-8産生を誘導し、次いでNox1発現を介してROSを産生し、さらにROSはTFの発現を誘導することが明らかとなった。
園芸作物におけるエチレンの生成と作用に関する研究

エチレンは高等植物のホルモンとして、生長制御、組織の老化、種子の発芽など植物体の分化を調節する重要な作用を有している。園芸作物では特に果実の成熟、花の萎凋、野菜の老化、落葉、落果などの生理作用を有し、収穫後の園芸作物の生理、生化学的変化と密接な関連を有している。今年度の研究では特にカボチャ果実傷害組織、カーネーションの花組織を用いて、エチレン生成の誘導、エチレン生成に関連する酵素の誘導、中間体の生成、代謝などを調べ、エチレン生合成の機構とその制御について研究した。一方カーネーションの花では生成されたエチレンが花の萎凋生理にどのようにかかわっているかを研究した。1.セイヨウカボチャ(Cucurbita maxima)果肉組織は傷害により著しくエチレンが生成される。これは傷を与えることにより、S-アデノシルメチオニンから1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)(エチレン生成の前駆体)に転換する反応の酵素である。ACC合成酵素が顕著に誘導されてくることが最も大きい要因であった。この結果、ACCが大量に生成され、エチレンの著しい生成へとつながる。傷害によるACC合成酵素の誘導はある種のオリゴ糖が生理活性物質として関与している可能性が存在する。生成したエチレンは組織中で酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼを誘導する因子となっている。傷害は植物体でエチレン生成の重要な要因の1つであり、植物における傷害反応の生理を解明する上でエチレンの生成、作用を研究することは重要である。2.カーネーション(Dianthces Caryophyllus)の花は萎凋(老化)する際に著しくエチレンを生成する。これは花弁で老化に伴いACC合成酵素が誘導され、ACC生成が著しく高まることに起因している。チオ硫酸銀や2、5-ボルナジェンはこれらの誘導、生成を抑え、その結果、花の萎凋を著しく抑制し、花の日持ちを顕著に増大させた。