hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分子多重らせんをベースとする精密超分子の創製

我々は、高倍原子間力顕微鏡観察(AFM)により、立体規則性ポリメチルメタクリレート(PMMA)が形成するステレオコンプレックスが、高分子鎖が多重らせんを形成した超分子構造であることを既に見出している。高分子鎖多重らせんを用いれば、今までと全く異なる新規な超分子が設計できる可能性がある。本研究では、分子量分布の無い均一PMMAブロックからなるステレオジブロックを合成し、得られたステレオコンプレックスの構造をAFMを用いて検討し、1次構造がステレオコンプレックスの構造に与える影響について検討を行った。また多重らせんではなく、分子が交互にパッキングするポリ乳酸系のステレオコンプレックスについてもAFMを用いて検討を行い、分子像の観察に成功するとともに、構造の形成機構について議論した。イソタクチックおよびシンジオタクチックポリメチルメタクリレート(it-,st-PMMA)は、ステレオコンプレックス(SC)を形成する。その構造は、原料の分子量に明確に依存したサイズを持つ多重らせんの超分子構造であり、らせん間の純粋なトポロジカル的相互作用に基づいて形成されていると考えられる。本系を用いれば、金属配位結合や水素結合などの非共有結合を用いない全く新しい超分子構造の創製が期待できる。本研究では、精密に合成した均一ステレオブロック共重合体等を用いて超分子多重らせんの形成メカニズムの解明と新規高分子超分子構造の設計を実施することを目的とし研究を進めている。また、ポリ乳酸(PLA)等の多重らせんに基づかないSC系についても検討を進める予定である。本年度は、以下の結果を得た。1.末端に水酸基を有する立体規則性PMMAを合成し、超臨界クロマトグラフィーを用いて重合度分別し、均一PMMAを単離した。末端のエステル化反応によって、フェニル基をlinking単位とする均一ステレオブロックPMMAを合成・単離した。得られた均一ステレオブロックPMMAからLangmuir-Blodgett(LB)法を用いてSCを形成させた結果、SCはブレンドと同様に明確なサイズを持った超分子構造を形成し、そのサイズからit-PMMAブロック2分子で2重らせんを形成し、その周りにst-PMMAのブロック鎖が巻きついてSCを巧みに形成していることがわかった。今後、分子量やit/stの組成依存性を検討して、構造をさらに明確化し、超分子の設計指針に結び付ける。2.PMMAのSC形成と化学反応(クリック反応)を組み合わせることでさらに高度な構造形成を行うことを目的に、クリック反応可能な反応性基を有する立体規則性ポリメタクリル酸プロパギルの合成法を確立し、そのクリック反応により高分子誘導反応が可能なことを確認した。SC形成による構造制御を目指す。3.D-,L-PLAからなるSC形成をLB法を用いて検討し、SCの構造を分子レベルで初めてAFM観察することに成功した。PLA系は多重らせんに基づかないSC系であり新規な超分子構造設計を目指して検討を進める。また、ポリ乳酸(PLA)等の多重らせんに基づかないSC系についても検討を進めている。1.ステレオコンプレックスのit/st比(1:2)を念頭におき、it/st組成比1:2の均一ステレオブロックPMMAを得るため、重合度が2倍異なる末端に水酸基を有する均一it-およびst-PMMAを超臨界クロマトグラフィーを用いて単離した。今後、縮合反応を行い、均一ステレオブロックPMMAを合成し、Langmuir-Blodgett(LB)法を用いたSCの形成とその構造を精査し、超分子の設計指針に結び付ける。2. D-,L-PLAからなるSC形成をLB法を用いて検討し、SCの構造を分子レベルで初めてAFM観察できることを見出している。分子量の異なるPLAからSCの形成を検討し、低分子量体では、PLAの単独伸び切り鎖結晶が形成された後、SCが形成されるのに対して、高分子量体では、単独結晶を経ずにSCが形成されることが分かった。低分子量体を用いた場合、単独伸び切り鎖結晶からどのようにSCの結晶に転移するかを詳細に検討可能であり、検討を進めている。3.クリック反応可能なアルキン基あるいはアジド基を有する立体規則性ポリメタクリル酸エステルならびにステレオブロック共重合体の合成法を確立した。

今後、ステレオコンプレックス形成をトリガーとし、クリック反応による構造制御を目指す。1.重合度がほぼ2倍異なる末端に水酸基を有する均-it-およびst-MMAを超臨界クロマトグラフィーを用いて単離し,テレフタル酸ジクロリドを連結剤とする縮合反応を行った。反応混合物からSFCを用いて目的のステレオブロックPMMAを単離した。このうち,it-およびst-PMMAブロックの重合度,DP(it-,st-)=(19,39),(20,41),および(21,43)の均一ポリマーについて,コンプレックス形成溶媒であるアセトンを溶離液とするSEC測定を行ったところ,30°CではDP(it-,st-)=(21,43)のみが分子内コンプレックス形成によるピークを示し,コンプレックス形成の鎖長依存性が明確に示された.今後,Langmuir-Blodgett(LB)法を用いたSCの形成とその構造を精査し、超分子の設計指針に結び付ける.2,it-PMMAあるいはst-PMMAブロックとクリック反応可能なアルキン基あるいはアジド基を有する立体規則性ブロック共重合体のクリック反応を行い,立体規則性の枝を持つ分岐ポリマーを合成した.コンプレックス形成溶媒中では反応はやや抑制される傾向がみられ,分子間会合がトリガーとなる高分子反応には至らなかった.ブロックポリマーの設計,反応条件の検討がさらに必要と思われる.3。D-,L-ポリ乳酸(PLA)からなるステレオコンプレックスについてLB法で検討を行い,既にステレオコンプレックスの分子像観察に成功している.PLAとヘテロステレオコンプレックスを形成することが最近見出されたポリ-2-ヒドロキシ酪酸(P(2HB))を用いて、同様にステレオコンプレックス形成を検討した.LB膜中でもD-PLA/P(S-2HB),L-PLA/P(R-2HB)の立体規則性が対象的なペアーではステレオコンプレックスを形成するが,逆のの立体規則性が類似のペアーではステレオコンプレックスを形成せず,単独結晶を形成することを確認した.また、本ヘテロステレオコンプレックスについても分子像を観察することに成功した.非多重らせんの超分子形成法として新規な自己組織化法として検討を進める.,
多国籍企業参入の国内企業組織構造への影響－垂直・水平統合についての経済分析－

平成30年度は,海外企業の川上市場でのM&Aが国内既存企業の投入財調達方法に与える影響について,独占的競争モデルを用いて分析したものをワーキングペーパーとしてまとめた.昨年度に基本部分のモデル構築を終えていたが,本年度は投入財供給者の限界費用差など,国家間の非対称性に注目した分析を進め,数値解析を行うことで,定量的な結果を整理した.M&Aによる投入財価格の上昇が,投入財の内部調達を促進する可能性を示すとともに,生産性の低い企業の退出や投入財供給者の利潤への影響,産業全体の生産量拡大について結果をまとめている.平成31年度は,他の研究者に意見を求めながら論文の改善に努める.2点目として,国内の川上・川下既存企業間で排他条件付取引契約が締結される可能性について,海外企業の参入に直面する場合に注目した分析を進めている.事例研究より,海外企業の参入に直面している国内既存企業が,自らの取引相手と排他条件付取引契約を結ぶことで参入企業に対抗していこうという例が見られており,平成30年度は,効率的な海外企業の参入に焦点を当てる際,国内企業の参入時よりも国内既存企業間で排他条件付取引契約を結ぶ可能性が上昇するような要因が存在するのかどうかを考察した.この考察を通じ,排他条件付取引契約締結の可能性を示す複数の状況を考えるに至ったが,その一つとして,国内既存企業が複数の投入財調達方法を候補として持つような海外企業の参入に直面する状況が考えられた.来年度以降,国内企業の参入の場合との比較を行いながら,排他条件付取引契約が結ばれる理由を明確にしていく予定である.1点目の研究について,定量的な分析を通し,退出や生産量,利益の変化についても分析を加えた.また,海外企業のM&Aによる国内企業の投入財調達方法の変化を考える際,調達方法の変化によって,参入企業数自体に影響することが確認されており,この影響を定量的に考慮する分析方法の検討に時間を必要としている.平成31年度は,海外企業の参入に直面する際の,国内既存企業の排他条件付取引契約の締結について分析を進める.国内企業の参入に直面する場合とどのように結果がわかってくるのか,排他条件付取引契約が締結される理由を明確にしながら分析を進める.平成29年度は,海外企業の川上市場への参入が国内企業の投入財調達方法に与える影響について,以下の2つの観点から研究を進めた.1つ目の研究として,海外企業の川上市場への参入前に,川上市場の国内企業が取引相手と排他条件付取引契約を締結し,参入を阻止する可能性について分析を行っている.英文査読誌に掲載された研究では,最終財の生産に複数の補完的な投入財を必要とし,補完財供給企業に市場支配力がある場合は,排他条件付取引による参入阻止が可能となることが明らかになった.この結果は,線形需要関数や線形費用関数の仮定に依存しておらず,より一般的な設定においても成立することも確認されており,研究の頑健性を高めることができた.2つ目の研究として,海外企業が川上市場でM&Aを行った場合の,国内の企業組織構造の変化に注目している.この研究では,独占的競争モデルをベースに,組織費用と生産性の違いにより,様々な組織形態の企業が内在する2カ国モデルを構築している.その上で,海外企業がグローバル調達を推し進めるために,国内の川上企業とM&Aを行い,そのことによって,国内川下企業の投入財調達方法へ影響を及ぼすことを理論的に分析している.分析の結果,M&Aにより,国内の川上企業数が限定されることで,投入財価格の上昇を招き,国内企業が垂直統合による調達を選択する可能性が高まることを確認している.平成30年度は,国家間の非対称性に注目した理論モデルの数値解析を進め,研究成果の外部公表に向けて,研究を推進していきたいと考えている.上記の研究を進めるにあたり,モデル設定に少し時間を要した.国際経済学のみならず産業組織論で議論される価格と組織構造についての先行研究をサーベイし、それらを参考にすることで,モデル設定を行なった.当初1カ国モデルを構築し,分析を進めていたものを2カ国モデルへ設定し直したことも,時間を要した一因となった.平成30年度は,海外企業の川上市場でのM&Aが国内既存企業の投入財調達方法に与える影響について,独占的競争モデルを用いて分析したものをワーキングペーパーとしてまとめた.昨年度に基本部分のモデル構築を終えていたが,本年度は投入財供給者の限界費用差など,国家間の非対称性に注目した分析を進め,数値解析を行うことで,定量的な結果を整理した.M&Aによる投入財価格の上昇が,投入財の内部調達を促進する可能性を示すとともに,生産性の低い企業の退出や投入財供給者の利潤への影響,産業全体の生産量拡大について結果をまとめている.平成31年度は,他の研究者に意見を求めながら論文の改善に努める.2点目として,国内の川上・川下既存企業間で排他条件付取引契約が締結される可能性について,海外企業の参入に直面する場合に注目した分析を進めている.事例研究より,海外企業の参入に直面している国内既存企業が,自らの取引相手と排他条件付取引契約を結ぶことで参入企業に対抗していこうという例が見られており,平成30年度は,効率的な海外企業の参入に焦点を当てる際,国内企業の参入時よりも国内既存企業間で排他条件付取引契約を結ぶ可能性が上昇するような要因が存在するのかどうかを考察した.

この考察を通じ,排他条件付取引契約締結の可能性を示す複数の状況を考えるに至ったが,その一つとして,国内既存企業が複数の投入財調達方法を候補として持つような海外企業の参入に直面する状況が考えられた.来年度以降,国内企業の参入の場合との比較を行いながら,排他条件付取引契約が結ばれる理由を明確にしていく予定である.1点目の研究について,定量的な分析を通し,退出や生産量,利益の変化についても分析を加えた.また,海外企業のM&Aによる国内企業の投入財調達方法の変化を考える際,調達方法の変化によって,参入企業数自体に影響することが確認されており,この影響を定量的に考慮する分析方法の検討に時間を必要としている.平成30年度は,2つ目の研究に関して,国家間の非対称性に注目した理論分析を更に進め,2カ国モデルの数値解析を行なっていく.数値解析を行うにあたり,必要に応じて先行研究のサーベイとデータの確認を行う予定である.平成30年度中に数値解析の結果を論文にまとめられるよう,研究を進めていきたいと考えている.平成31年度は,海外企業の参入に直面する際の,国内既存企業の排他条件付取引契約の締結について分析を進める.国内企業の参入に直面する場合とどのように結果がわかってくるのか,排他条件付取引契約が締結される理由を明確にしながら分析を進める.
生態系に着目した環境管理およびそれに対応する行政組織のありかた

本年度は、研究の中間まとめとして、アメリカ合衆国における生態系管理の基調となっている流域管理の具体的仕組みについて検討を重ねた。合衆国の資料収集にあたっては、マサチューセッツ州、ワシントン州を対象に選び、資料収集に努めた。その結果、東部と北西部では差異があるが、小規模の住民組織・環境団体が連合し、かなりの決定権限を付与されながら流域管理計画の作成に努める一方、自治体が小規模の土地の買い取り、事業への補助などのシステムを設けていることが判明した。流域管理システムから、日本における広範囲の生態系管理に対応する行政組織のあり方に関する有益な示唆が得られたものと解される。同時に生態系管理を科学的に進める方法としての生態系影響評価の検討に努め、多数の文献を渉猟し終えた。また、具体的成果として、現時点における環境影響評価制度の到達点と今後の問題解明のための基本的な視座を、東京在住の研究者等との研究会を通して得ることができた。その結果は、畠山編著のモノグラフィーとして刊行される予定である。研究課題の内容にそって、国内外の文献収集、研究会開催、調査等を実施した。1.まず、最近アメリカ合衆国の自然資源管理のうえで最も重視されるエコシステム管理に関する検討を行った。その結果、森林局、土地管理局、野生生物局をはじめとする多数の省庁が規則・通達によってエコシステム管理原則を定め、環境影響評価においても生物多様性や生態系への事業の影響を重視する傾向が顕著であることが判明した。しかし、生態系管理には、知見やデータが不足で不確定・未知の部分が多く、実際の行政の現場では行政裁量の余地が大きいことから、住民が裁判等の手続を通してその中身の適正さを争うことが実際には困難であることなどが判明した。また、合衆国会計検査院(GAO)の報告では、依然として省庁間協力に問題のあることが指摘されている。今後は、さらに事例を収集し、エコシステム管理をする際の実際的な問題・事務処理上の問題を検討する。2.国内については、環境法実務研究会を主として在京の研究者と協力して組織し、環境影響評価制度の研究を集中的に実施した。その成果は、判例タイムズに掲載中である。また、私の指導する若手研究者を中心に研究組織を学部内に組織し、その成果を、今年度の環境法政策学会分科会(6月)で報告し、さらに200頁程の図書として出版する予定で作業を進めている。3.国内調査では、河川、湖沼を中心に、釧路湿原、函館市松倉川、千葉県手賀沼、船橋市三番瀬などについて現地の調査、行政機関の訪問、地元住民との討論などを行い、広領域の環境問題を生態系管理という観点からをどう管理するか、その際、関係する多数の自治体、官庁、住民の利害等をどのように調整するかを検討した。1.今年度は、まず環境影響評価制度を取りあげ、その中に生態系的な視点を組み入れる方法を検討した。生態系・生物多様性保護は、最近の環境基本法・環境基本条例にの中に明記され、環境影響評価における評価項目とされている。しかし、これまでなされた生態系のアセスメントは、オオワシ等の代表的な種に対する影響をもって生態系への影響と推論するなど、きわめて大ざっぱなものであった。今後、さらに生態系リスクの視点を取り入れ、リスク管理と環境影響評価との統合の可能性を検討したい。またより早い段階における生態系への影響を考慮する手法としての戦略アセスメントに注目し検討作業を進めた。2.日本では、カモシカ、エゾシカの被害が急増し、個体数コントロールと鳥獣保護法改正が具体的日程に上がっている。そこで、シカコントロール、生態系復元の手段として合衆国で実施されたオオカミの導入に着目し、意義、手続、アセスメントの内容などを検討した。オオカミ導入に伴う家畜被害の補償については民間団体による基金が設けられたおりやや状況が異なるが、補償額の算定等に関して有益な示唆を得ることができた。また、合衆国では、サケ、在来種、絶滅種の復活が大きな課題とされており、生態系管理の観点から重要な課題を提供している。これらの問題にも視野を拡大し、資料収集に努めた。3.これまでの研究の中間総括と成果の公表を、共同報告「生態系管理の現状と課題」(98年度環境法政策学会、明海大学、6月27日)において行った。今年度も、単独報告「アメリカにおける自然保護の動向」(99年度環境法政策学会、福岡大学、6月19日)において行う予定である。
土壌の生物性評価手法としての微生物起源揮発性有機化合物の網羅的解析法の適用

土壌の微生物間における多様な相互作用は、土壌微生物の増殖や活性に影響を及ぼしており、この相互作用は土壌管理などの異なる環境条件によって変化する可能性がある。したがって、この土壌微生物間の相互作用(ネットワーク)を理解し、そのネットワークの状況を的確に判断できれば土壌の生物性の評価につながることが期待される。近年、微生物の産生する揮発性有機化合物(VOCs)の多くは微生物間(さらに微生物と植物/動物間)に様々な作用を及ぼす情報化学物質(infochemicals)であるという知見が蓄積されてきている。そこで本研究では、土壌微生物由来のVOCsを網羅的に解析して土壌の生物性を評価するための解析方法について検討している。今回は、根圏微生物のVOCsを攪乱することなく分析することを検討した。根圏の微生物由来VOCsを測定するため、大容量ヘッドスペース(LVSH)法の適用を検討した。これは、試料を専用のガラス容器に入れ、その大容量のヘッドスペースガスを低温濃縮することでGC-MSへ導入する方法であり、試料そのままの状態の微量なVOCsを測定することが可能である。植物をポットで栽培し、ポットごとそのままLVSH専用容器に移した。その一定時間後の容器中に存在するVOCs成分をLVSH法によるGC-MSにて分析した。分析方法を最適化するため、ヘッドスペースガスの濃縮条件やGC-MS分析条件を調べ、高感度で再現性の高い分析条件を検討した。その結果、ヘッドスペースガスの注入方法にはPulsed Vacuum Extraction 100ml×5回を用い、高い再現性でより多くのVOCs成分を検出することが可能となった。この方法を用いてトマト幼植物の根圏のVOCsプロファイルを解析した結果、根圏の土壌微生物由来VOCsおよび植物由来VOCsを同時に検出することが可能となった。土壌試料のVOCs測定の分析条件の最適化および植物体を含む土壌試料の大容量ヘッドスペース(LVSH)法によるGC-MS解析条件の最適化を行い、土壌微生物由来VOCsおよび植物由来VOCsを同時に検出することが可能となった。しかし、土壌管理の異なる土壌試料のVOCs分析実験が未達成であった。確立した土壌VOCs分析方法を用いて、様々な土壌(土壌の種類や土壌管理の異なる土壌)および植物体を含む土壌についてVOCsプロファイルを解析する。この時、解析に用いた土壌からDNAを直接抽出して次世代シークエンサー等による細菌のメタ16S解析(糸状菌はメタITS解析)を実施して、土壌の微生物フロラを解析する。これにより、土壌微生物の種構成と土壌VOCsプロファイルとの関係性を明らかにする。土壌微生物間には、多様な相互作用が存在しており、土壌管理などの違いによる環境条件の変化によって常に影響を受けている。そこで本研究では、土壌微生物由来のVOCsを網羅的に解析して土壌の生物性を評価するための解析方法の確立を目的とした。土壌中に存在する微量な微生物由来VOCsを測定するため、大容量ヘッドスペース(LVSH)法の適用を検討した。採取した土壌試料をそのまま500mL容量の専用容器に入れ、土壌空気中に存在するVOCs成分をLVSH法によるGC-MSにて分析した。分析方法を最適化するため、ヘッドスペースガスの濃縮条件やGC-MS分析条件、土壌試料の量、土壌水分量の影響などを調べ、高感度で再現性の高い分析条件を検討した。その結果、ヘッドスペースガスの注入方法にはPulsed Vacuum Extraction 100ml×5回を用い、土壌試料の量は30g50gとすることで、高い再現性でより多くのVOCs成分を検出することが可能となった。この方法を用いて様々な土壌のVOCsを測定した結果、平均して30種類のVOCs成分が検出され、そのVOCsの種類と存在比は土壌毎に異なっていた。すなわち、各土壌試料に異なるVOCsプロファイルが存在することが示された。土壌試料のVOCs測定の分析条件の最適化、特に土壌水分条件の影響の検討において時間を要したため、予定していた植物体を含む土壌試料の大容量ヘッドスペース(LVSH)法によるGC-MS解析条件の最適化が未達成であった。

これは、試料を専用のガラス容器に入れ、その大容量のヘッドスペースガスを低温濃縮することでGC-MSへ導入する方法であり、試料そのままの状態の微量なVOCsを測定することが可能である。植物をポットで栽培し、ポットごとそのままLVSH専用容器に移した。その一定時間後の容器中に存在するVOCs成分をLVSH法によるGC-MSにて分析した。分析方法を最適化するため、ヘッドスペースガスの濃縮条件やGC-MS分析条件を調べ、高感度で再現性の高い分析条件を検討した。その結果、ヘッドスペースガスの注入方法にはPulsed Vacuum Extraction 100ml×5回を用い、高い再現性でより多くのVOCs成分を検出することが可能となった。この方法を用いてトマト幼植物の根圏のVOCsプロファイルを解析した結果、根圏の土壌微生物由来VOCsおよび植物由来VOCsを同時に検出することが可能となった。土壌試料のVOCs測定の分析条件の最適化および植物体を含む土壌試料の大容量ヘッドスペース(LVSH)法によるGC-MS解析条件の最適化を行い、土壌微生物由来VOCsおよび植物由来VOCsを同時に検出することが可能となった。しかし、土壌管理の異なる土壌試料のVOCs分析実験が未達成であった。植物体を含む土壌試料のVOCsを大容量ヘッドスペース(LVSH)法を用いたGC-MS解析によって分析する手法の最適化を実施する。確立した土壌VOCs分析方法を用いて、様々な土壌(土壌の種類や土壌管理の異なる土壌)および植物体を含む土壌についてVOCsプロファイルを解析する。この時、解析に用いた土壌からDNAを直接抽出して次世代シークエンサー等による細菌のメタ16S解析(糸状菌はメタITS解析)を実施して、土壌の微生物フロラを解析する。これにより、土壌微生物の種構成と土壌VOCsプロファイルとの関係性を明らかにする。土壌試料のVOCs測定の分析条件の最適化、特に土壌水分条件の影響の検討において時間を要したため、予定していた植物体を含む土壌試料の大容量ヘッドスペース(LVSH)法によるGC-MS解析条件の最適化に関する研究が実施できなかった。そこで30年度において、この植物体を含む土壌試料の分析手法の最適化実験を早急に実施し、確立した分析手法を用いて30年度計画の研究を予定通りに遂行する。植物根圏試料VOCsの大容量ヘッドスペース(LVSH)法によるGC-MS解析測定における分析条件の最適化の検討に時間を要したため、予定していた土壌管理の異なる土壌試料のVOCs解析に関する研究が実施できなかった。
試験管内実験系を利用したポティウイルス増殖機構の解明

昨年度に引き続き、クローバ葉脈黄化ウイルスの複製とエンドウの劣性抵抗性遺伝子の関係について、詳細な解析を行った。ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したクローバ葉脈黄化ウイルスの野生型cDNAクローンおよび複製能欠損変異cDNAクローンを、エンドウ葉肉プロトプラストに感染させ、ルシフェラーゼ活性を指標にウイルス複製について解析した。その結果、変異型ウイルスにおいても高いルシフェラーゼ活性が得られたことから、実験系に不備があることが判明した。原因として、植物由来のRNAポリメラーゼIIによる転写活性能が高く、変異型ウイルスcDNAクローンが多量に転写されたため、高いルシフェラーゼ活性が検出されてしまった可能性が考えられた。そこで、転写阻害剤(アクチノマイシンD)を用いることとし、アクチノマイシンDの適した濃度および適した添加タイミングについての検討を行った。その結果、30 μg/mlの濃度で、cDNA導入後12時間にアクチノマイシンDをプロトプラストに添加することで、RNAポリメラーゼIIによる転写を阻害した上で、ウイルス複製活性を評価できることが示された。この方法を用いて、再度ウイルス複製がcyv1劣性抵抗性の影響を受けるかどうかについて解析を行った。その結果、cyv1存在・非存在下で、一細胞レベルでのウイルス蓄積量に大きな差は見られなかったことから、cyv1劣性抵抗性がウイルス複製を阻害することはないということが示唆された。ダイズ液体培養細胞を用いたプロトプラストトランスフェクション実験系についての条件検討を行った。プロトプラスト化、トランスフェクション効率が非常に悪いため、効率を上げるための条件を検討中である。2018年9月に起こった北海道胆振東部地震に伴う2日間の停電の影響により、液体培養細胞のほとんどが死滅し、培養細胞ラインの立ち上げ直しや取り寄せの必要性が発生したため。引き続き、ダイズ培養細胞のプロトプラスト化、トランスフェクション実験系の確立を目指す。エンドウの培養細胞化も試みる。クローバ葉脈黄化ウイルスの試験管内での翻訳実験を試みる。クローバ葉脈黄化ウイルスの宿主であるエンドウやダイズなどを用いて、カルス化や液体培養細胞ラインの構築に着手した。ダイズ:グロースチャンバー内で育成させたダイズ(品種名ユキホマレ)の主茎を用いてカルス化の条件検討を行い、誘導されたカルスの中から適したものについて液体培地での培養を行った。現在までに、液体培地で安定的に増殖するラインを得ている。エンドウ:クローバ葉脈黄化ウイルスに感受性のエンドウおよび劣性抵抗性遺伝子をもつエンドウを用いてカルス化の条件検討を行っているが、褐色で硬いカルスしか得られておらず、液体培地での培養には至っていない。そこで並行して、植物体からのプロトプラスト単離法の確立を目指した。まず、播種後2ー4週間のエンドウ葉からプロトプラストを効率的に単離し、プラスミドDNAを導入する手法を確立した。また、ルシフェラーゼ活性を指標にウイルス増殖を定量できるよう、クローバ葉脈黄化ウイルスの感染性cDNAクローンに、ルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。感受性エンドウおよび劣性抵抗性遺伝子保有エンドウからプロトプラストを単離し、クローバ葉脈黄化ウイルスのcDNAクローンを導入することで、ウイルスの増殖効率を比較した。現段階では、感受性エンドウとcyv1劣性抵抗性エンドウとの間にウイルス増殖の差がみられておらず、cyv1劣性抵抗性は、一細胞レベルではウイルス増殖を抑制しないという可能性が示唆された。すなわち、cyv1劣性抵抗性遺伝子は、ウイルスの細胞間移行の抑制に寄与するものと考えられる。試験管内実験系の構築に向けて、ダイズの液体培養細胞ラインを作出できた。また、エンドウ劣性抵抗性遺伝子cyv1が、一細胞レベルではポティウイルスの複製を抑制しないことを示唆する新規データが得られている。

2018年9月に起こった北海道胆振東部地震に伴う2日間の停電の影響により、液体培養細胞のほとんどが死滅し、培養細胞ラインの立ち上げ直しや取り寄せの必要性が発生したため。引き続きダイズ液体培養細胞ラインの増殖効率の安定化を行う。ダイズ培養細胞のプロトプラスト化、脱液胞化、試験管内翻訳液調製までの条件検討を行う。また、エンドウ劣性抵抗性遺伝子とウイルス増殖効率との関係について詳細な解析を行う。引き続き、ダイズ培養細胞のプロトプラスト化、トランスフェクション実験系の確立を目指す。エンドウの培養細胞化も試みる。クローバ葉脈黄化ウイルスの試験管内での翻訳実験を試みる。ダイズ液体培養細胞ラインの構築が予定より順調に進んだ一方、既存の試験管内系を用いた研究を次年度以降に持ち越したため、次年度使用額が生じた。今後、ダイズ培養細胞由来の試験管内実験系の構築、エンドウ劣性抵抗性遺伝子の機能解析研究に使用する計画である。エンドウのプロトプラストを用いた、クローバ葉脈黄化ウイルスの一細胞レベルでの複製解析は進んでいる一方、2018年9月の停電の影響もあり、培養細胞を用いた実験については遅れが生じているため、次年度使用額が生じた。今後、培養細胞実験や試験管内実験の構築を目指した研究等に使用する計画である。
緑藻Botryococcus brauniiの炭化水素生成機構の細胞学的研究

単細胞緑藻Botryococcusbrauniiは、細胞乾燥重量の3060%もの多量の炭化水素を生成・分泌する。炭化水素生成過程の細胞微細構造の解析と平行して生化学的な解析を進める目的で、B.brauniiでは通常細胞質分裂直後に起こる炭化水素生成を、間期の細胞に誘導する系を確立した。間期の細胞外に蓄積した炭化水素を流動パラフィンにトラップさせて除去しても、顕著な炭化水素生成を誘導できなかった。間期の細胞を細胞壁分解酵素で適度なスフェロプラストにした場合、処理前に比べて約3倍量の炭化水素生成を誘導できた。更に、スフェロプラストの炭化水素生成量は分解酵素の除去後に時間と共に増加し、5時間後に最大量(12倍)になり、その後減少することが判った。炭化水素生成を最大限誘導したスフェロプラストの微細構造を電子顕微鏡で解析した。その結果、スフェロプラストの周囲に多量の炭化水素が蓄積していることを確認した。更に、ゴルジ体とトランス-ゴルジ-ネットワーク(TGN)は、通常の細胞周期で炭化水素を活発に生成するセプタム形成直後のゴルジ体やTGNに形態的に類似し、これらのオルガネラが炭化水素生成に関与することが強く示唆された。ゴルジ体・TGNを中心とした小胞輸送に関与するCOP被覆小胞のB.brauniiのβ-COP相同遺伝子をクローニングし(3,313塩基配列)、β-COPに対するポリクローナル抗体を作製して、免疫電子顕微鏡法でB.brauniiにおけるβ-COPの局在を明らかにした。確立した炭化水素誘導系を利用し、B.brauniiの炭化水素前駆体である脂肪酸伸張酵素に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、約54kDaのタンパク質を検出した。スフェロプラスト作製のために、B.brauniiの細胞壁構成物質組成と単糖組成を解析した結果、本藻特有のものであることも明らかにできた。単細胞緑藻Botryococcusbrauniiは細胞乾燥重量の3060%もの多量の炭化水素を生成・分泌する。本研究では、炭化水素の生成機構を細胞学的観点から解析した。細胞微細構造の解析と平行して生化学的な解析を進める目的で、B.brauniiでは通常細胞質分裂直後に起こる炭化水素生成を、interphaseの細胞に誘導する系を確立することを検討した。Interphaseの細胞外に蓄積した炭化水素を流動パラフィンにトラップさせて除去しても、顕著な炭化水素生成を誘導できなかった。次に、interphaseの細胞をプロトプラストにし、炭化水素生成を誘導することを検討した。スフェロプラスト作成条件(セルラーゼ、マセロザイム、ヘミセルラーゼ、ドリセラーゼ等の細胞壁構成物質に対する分解酵素の組み合わせ方、各濃度、処理温度、処理時間等)を検討し、プロトプラスト作製の至敵条件を決定した。Interphaseの細胞を完全なプロトプラストではなく適度なスフェロプラストにした場合、処理前に比べて100倍量の炭化水素生成を誘導できるようになった。そこで、炭化水素を誘導したInterphaseのスフェロプラストの微細構造を電子顕微鏡で観察した。通常細胞質分裂直後の炭化水素生成期にトランス-ゴルジ-ネットワークから特異的に形成され小胞が炭化水素を活発に生成・分泌しているinterphaseのスフェロプラスト内で観察された。本結果は、この小胞が炭化水素生成に関与していること、トランス-ゴルジ-ネットワークが脂質形成に関与するという我々が提出した説を強く支持した。単細胞緑藻Botryococcus

brauniiは、細胞乾燥重量の3060%もの多量の炭化水素を生成・分泌する。炭化水素生成過程の細胞微細構造の解析と平行して生化学的な解析を進める目的で、B.brauniiでは通常細胞質分裂直後に起こる炭化水素生成を、interphaseの細胞に誘導する系を確立した。Interphaseの細胞外に蓄積した炭化水素を流動パラフィンにトラップさせて除去しても、顕著な炭化水素生成を誘導できなかった。Interphaseの細胞を細胞壁分解酵素を用いて適度なスフェロプラストにした場合、処理前に比べて約3倍量の炭化水素生成を誘導できた。分解酵素を除去すると時間の経過と共に炭化水素生成量が増え、5時間後に最大量(12倍)になり、その後減少することが判った。炭化水素生成に関与するタンパク質を検出する目的で、処理前の細胞群と比較し、スフェロプラスト処理後5時間の細胞群に特異的に出現するタンパク質をウエスタン-ブロットで検出することを試みたが、検出できなかった。そこで、Botryococcus brauniiの炭化水素前駆体である脂肪酸伸張酵素に対する抗体を入手し、免疫電子顕微鏡法で炭化水素生成期の細胞の解析を始めたところである。まだ、明確な成果は得られていない。一方、細胞質分裂直後の炭化水素生成期の細胞でも、通常の超薄切片(70nm)では生成直後の炭化水素を観察できなかったが、2μmの厚い切片を超高圧電子顕微鏡で観察することに依って、生成直後の炭化水素を観察できた。この結果、炭化水素はゴルジ体やトランス-ゴルジネットワークが存在する細胞頂端部で生成され、細胞基部に蓄積することが判った。本結果は、トランス-ゴルジ-ネットワークが脂質形成に関与するという我々が提出した説を強く支持した。
義務教育期のパフォーミングアーツの経験が非認知能力に与える影響の実証分析

本研究では芸術活動の教育的な効果に注目し、義務教育期に近年導入されているダンスなどのパフォーミングアーツの経験が問題解決力やコミュニケーション力などの非認知能力を涵養するという教育効果を持つことを定量的に明らかにする。この分野における研究では、パフォーミングアーツを経験したグループとしていないグループにわけて純粋に経験のトリートメント効果を測定した分析はない。また、教育分野で注目を浴びている非認知能力との関係を議論した研究も少ない。そこで、本研究では独自の調査によってデータを構築し、学校外でのパフォーミングアーツ経験に応じた傾向スコアマッチング法を用いた定量評価を行う。
コミュニケーション状況に即した文形式の使い分けに関する基礎的研究

コミュニケーション現場の状況が言語形式にどう関与するかについて、用例データの収集・整理を行うと同時に文法記述としてどう理論化するかについて考察した。言語発達との関連についてもデータを分析した。具体的に以下のようにまとめた。(1)「『丁寧な依頼』のストラテジーと運用能力」(1995.『日本雑学』14-11)では、依頼状況と表現選択、表現配列を検討し、中学大学生に致る発達、過程をふまえて、総合的なポライトネス分析のモデル化を提案した。(2)「ド思ウ、ハズダ、ニチガイナイ、ダロウ、福祉φ-不確実だが高い確信があることの表現-」『日本語類義現の文法』(宮島達夫、仁田義雄編、くろしお出版)では、推量表現の使いわけについて、従来の議論を整理し、問題点として「状況との相関」が考察されていないことを指摘し、不確定性の理論などの新知見から用法の違いを具体的に分析した。(3)「情動的感動詞1/5」(語文63、1996)[印刷中]では、認知状況を一語に凝縮した感動詞について、その使いわけを具体的に整理・分析し、情動変動の記述モデルを提出した。(4)「推量・比喩比況、例示-「よう/みたい」の多義性をめぐって-」(『日本語の研究』1995明治書院)では、表題の意味関係を「よう/みたい」の語義と構造の違いから分析した。
自己濃縮血小板の白血球分画がBMP徐放性と骨芽細胞分化に及ぼす影響

自己濃縮血小板は細胞増殖・分化を促進する増殖因子の供給源として再生医療の分野で広く応用されている。本研究では末梢血より分画される多血小板血漿(Platelet-trich plasma: PRP)と多血小板フィブリン(Platelet-rich fibrin: PRF)について、血小板に含まれる骨形成タンパク質(BMP)の徐放性について解析、および間葉系幹細胞に対する骨芽細胞への分化誘導効果を評価を行うことで、骨再生における機序の一部を明らかにする。本研究期間において、自己濃縮血小板の調整方法によるサイトカイン徐放性の差異を解析するため、末梢血を異なる手法で遠心分離し、得られたサンプルからのBMPの経時的徐放濃度をサイトカイン定量を行った。その結果、BMP-2の徐放速度はPRFとPRPのサンプル間で異なることが分かった。また間葉系幹細胞の骨芽細胞分化促進効果についても違いがみられることから、このBMP徐放性の違いが細胞分化誘導に影響している可能性が示唆された。この研究結果の一部は国際研究誌へ投稿掲載されている。臨床的には、再生医療におけるPRP・PRFの作用機序の一部を解明することによって、特性に応じた応用方法を確立、拡大を図り、より確実な組織再生療法への生物学的活性をもった自己由来材料を提供することを果たすことが期待される。今後サイトカイン徐放性による骨芽細胞分化への作用機序についてさらなる検討が必要と考えている。
一酸化窒素から酸素分子を産生する金属酵素の同定

NO不均化反応(2NO →N2 + O2)を触媒すると推定されているNO不均化酵素(NOD)を研究対象とする。NODの配列をもつ遺伝子を入手し、大腸菌での発現系を構築する。精製したNODの機能解析を行い、NO不均化活性を示すか調べる。機能をもつNODが調製できれば、時間分解分光計測や構造解析から、NODの構造機能相関および酵素反応機構を解明する。得られる結果を基盤に、これまでに報告例のない酵素によるNO不均化反応の分子機構を提案する。
化学発光法に基づく新しい核酸の標識法の開発-非RIによる簡便なRNAの塩基配列決定法を目指して-

初年度では3量体のレベルでRNAを3'末端ビオチン標識する新規ビオチン化法を開拓できた。そこで、本年度ではさらに3'末端ビオチン標識による化学発光法によるRNAの塩基配列の決定法への応用を3量体からオリゴマーレベルに研究を移行した。まず、ビオチンをシチジンの塩基のアミノ基に連結したシチジン3'、5'-ビスホスフェート誘導体を用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルした。この標識体をビオチン-アビジンの抗原-抗体反応を原理とする化学発光法により、塩基配列を決定した。その結果、UVクロスリンク領域が3'末端付近ではあまりないことがわかり、3'末端から10塩基残基は解読できないことがわかった。そこで、ビオチンを3'末端のリン酸基に連結したデオキシシチジンを含むオリゴチミジレート(17量体)を合成した。これを用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルしたところ、フェニルアラニルtRNAの3'末端まで明瞭に塩基配列を解読できることがわかった。さらに、酵母のフェニルアラニルtRNAの5'末端標識法も開発することが出来た。5'末端にビオチンを導入したオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、3'末端にはRNAリガーゼのよい基質になるプリン塩基をもつオリゴリボヌクレオチドを連結した。このキメラオリゴヌクレオチドと酵母のフェニルアラニルtRNAをRNAリガーゼで連結させたところ、ビオチン標識されたサンプルを得ることができた。これを用いて、化学発光法により塩基配列を決定した。その結果、フェニルアラニルtRNAの5'-末端付近も明瞭に塩基配列を読み取ることができた。以上の検討で、当初の目標通りRNAの3'および5'末端標識法を確立することができた。本研究は現在RNAの基礎研究が活況を呈し大きくクローズアップされている現状をみて、非RI法によるきわめて簡便なRNAの塩基配列決定法を早急に開拓することを目的とするものである。本年度は、ビオチニルアミノヘキシルホスホロイミダゾリドを5'-末端リン酸基をもつRNAにジホスフェート結合を介して連結するビオチン標識反応で、金属イオンの存在で標識化反応が著しく加速されることを見いだした。特に、マグネシウムイオンが標識反応を均一系の溶液で行なえ、しかも反応収率もよいことを明らかにすることができた。一方、5'末端ビオチン化の実用的な条件として、金属イオンを全く含まない溶媒を経時的に濃縮する簡便な効率よい方法も見いだすことができた。また、核酸の5'末端のビオチン化は5'末端リン酸基が必要であるが、5'末端に5'リン酸基をもたないRNAに5'リン酸化反応の基礎研究として、この反応に必要な試薬であるビス(2-シアノ-1、1-ジメチルエトキシ)ジエチルアミノホスフィンを開発した。化学発光法で3'末端のビオチン化の3'末端近傍も塩基配列の読み取りが困難である問題をビオチン化剤に適当なオリゴチミジル酸リンカーを介在させることにより、世界ではじめて克服することができた。このように、初年度では、本研究の基礎となる種々のビオチン化標識法について、詳細な反応条件の検討を行ない、実用化に向けての具体的な研究成果を得ることができた。本研究の実用化は近いうちに達成できるものと思われる。まず、ビオチンをシチジンの塩基のアミノ基に連結したシチジン3'、5'-ビスホスフェート誘導体を用いて。

RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルした。この標識体をビオチン-アビジンの抗原-抗体反応を原理とする化学発光法により、塩基配列を決定した。その結果UVクロスリンク領域が3'末端付近であまりないことがわかり、3'末端から10塩基残基は解読できないことがわかった。そこで、ビオチンを3'末端のリン酸基に連結したデオキシシチジンを含むオリゴチミジレート(17量体)を合成した。これを用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルしたところ、フェニルアラニルtRNAを3'末端まで明瞭に塩基配列を解読できることがわかった。さらに、酵母のフェニルアラニルtRNAを5'末端標識法も開発することが出来た。5'末端にビチオンを導入したオリゴデキシヌクレオチドを合成し、3'末端にはRNAリガーゼのよい基質になるプリン塩基をもつオリゴボヌクレオチドを連結した。このキメラオリゴヌクレオチドと酵母のフェニルアラニルtRNAをRNAリガーゼで連結させたところ、ビオチン標識されたサンプルを得ることができた。これを用いて、化学発光法により塩基配列を決定した。その結果、フェニルアラニルtRNAを5'-末端付近も明瞭に塩基配列を読み取ることができた。以上の検討で、当初の目標通りRNAの3'および5'末端標識法を確立することができた。
ハタ養殖の革新的技術開発

はじめに、ヤイトハタの生殖腺の性分化過程を組織学的に解明した。孵化直後から39日目までの生殖腺は、大型で少数の始原生殖細胞と生殖細胞を取り囲む体細胞からなる性的に未分化な状態であった。孵化後4774日目の生殖腺に卵巣腔形成のための2つの体細胞の集塊が出現した。この時期に卵巣の分化が開始することが明らかとなった。しかし、生殖細胞は大型の生殖原細胞で、卵形成のための減数分裂は認められなかった。孵化後74日目の生殖腺は、全ての個体で卵巣腔の形成が認められ、全個体は雌となることが明らかとなった。孵化後47日目以降の卵巣は、体細胞が急激に増加するが、生殖細胞の増加は少なく、少数に止まり体細胞組織中に単独で分布した。次に、性分化と性ホルモンとの関係を明らかにするために、ステロイド代謝酵素のコレステロール側鎖切断酵素(SCC)、アロマターゼ(Arom)および11β-水酸化酵素(11βH)の発現を免疫組織化学的手法により明らかにした。ステロイドホルモン合成のバイオマーカーとなるSCCおよび雌性ホルモン合成に関与する酵素のAromは、形態的な性分化以前の孵化後18日目の生殖腺に既に発現が見られた。雄性ホルモン合成に関与する酵素の11βHは、形態的な性分化が完了する孵化後74日目前後ではじめて発現が見られた。11βHとAromの発現する細胞とは明らかに異なる細胞であった。このように雌性ホルモン合成に関与するAromが性分化期以前に発現し、卵巣分化に伴い陽性細胞が発達することから性分化には内因性の雌性ホルモンが重要な働きをしていることが示唆された。さらに、雄性ホルモン合成に関与する細胞は雌性ホルモンとは全く異なる細胞で、性分化後に発現が見られたことから、雄性ホルモンは性分化に直接関与している可能性は低いと考えられた。以上の結果は、論文として国際誌に掲載された。ヤイトハタEpinephelus malabaricusの生殖腺の性分化過程を組織学的に観察した。また、性分化と性ホルモンとの関係を明らかにするために、ステロイド代謝酵素のコレステロール側鎖切断酵素(SCC)、アロマターゼ(arom)および11β-水酸化酵素(11βH)の発現を免疫組織化学的手法により調べた。孵化後4774日目にかけて、生殖腺の体側側に2つの体細胞の集塊が出現した。この集塊はその後の発達から他の硬骨魚で見られる卵巣腔形成と一致したことから、卵巣腔の分化であると判定された。孵化後74日目の生殖腺は、全ての個体で卵巣腔の形成が認められ、全個体の生殖腺は卵巣として分化することが明らかとなった。生殖原細胞の卵母細胞への分化は、卵巣腔の形成から遅れて、孵化後243日目あたりに始まった。ステロイドホルモン合成のマーカーとなるSCCおよび雌性ホルモン合成に関与する酵素のaromは、形態的な性分化以前の孵化後18日目の生殖腺に既に発現が見られた。雄性ホルモン合成に関与する酵素の11βHは、形態的な性分化か完了する孵化後74日目前後ではじめて発現が見られた。このように雌性ホルモン合成に関与するaromが性分化期以前に発現し、卵巣分化に伴い陽性細胞が発達することから性分化には内因性の雌性ホルモンが重要な働きをしていることが示唆された。性分化直後の未熟な個体で17α-Methyltestosterone(MT)経口投与による早期性転換誘導を試みた。六ヶ月投与した個体の生殖腺では、活発な精子形成が行われていた。このことから、ヤイトハタの未熟な卵巣中の生殖細胞は、卵、精子の両方に分化できる潜在能力を持つことが明らかになった。

このように雌性ホルモン合成に関与するAromが性分化期以前に発現し、卵巣分化に伴い陽性細胞が発達することから性分化には内因性の雌性ホルモンが重要な働きをしていることが示唆された。さらに、雄性ホルモン合成に関与する細胞は雌性ホルモンとは全く異なる細胞で、性分化後に発現が見られたことから、雄性ホルモンは性分化に直接関与している可能性は低いと考えられた。以上の結果は、論文として国際誌に掲載された。
破骨細胞に特異的な「骨の鮮度」を識別する新規受容体の探索と同定

骨リモデリングにおいて骨吸収を担う破骨細胞は、「古い骨」をどのようにして「認識」するのか、未だ解明されていない。一方、マクロファージは、古い細胞組織の除去を、受容体により「認識」して行うことが明らかである。申請者らはこれに着目し、マクロファージと類縁の破骨細胞も、特異的に発現している受容体を、古い骨の認識に利用している仮説を立てた。本申請課題では、古い骨の認識分子を、破骨細胞特異的受容体の中から、同定する。これは、ゲノム編集による候補分子ノックアウトマウスの作製と骨形態の解析、分化破骨細胞の骨吸収能解析により解明する。本研究成果は、破骨細胞の骨認識を標的とした、骨粗鬆症治療薬の開発につながる。
好熱性水素酸化細菌からの耐熱性酵素の精製とそれを用いたエネルギー変換系の開発

本研究では好熱性水素酸化細菌Bacillus schlegelii中で電子伝達体として機能していると考えられるフェレドキシンおよび水素の吸収発生を触媒するヒドロゲナーゼを単離精製し、それらの性質を調べた。本フェレドキシンは77アミノ酸残基よりなり、その分子中に3核および4核の鉄硫黄クラスターを各1分子ずつ含んでいる7鉄型フェレドキシンであることがわかった。そのアミノ酸配列は、これ迄に報告されている他の7鉄型フェレドキシンと高い相同性を示した。本フェレドキシンは、NADPH、FNRによるチトクロームc還元反応系において効率的な電子伝達体として機能することがわかった。フェレドキシンの電子伝達体活性は、フェレドキシンを熱処理することにより一度上昇する。これは、熱処理によりフェレドキシン中の4核鉄硫黄クラスターが3核鉄硫黄クラスターへ構造変化するためであることがわかった。さらに熱処理を続けると、電子伝達体活性は次第に低下する。これは、フェレドキシン分子中の3核鉄硫黄クラスターが分解してしまうためである。本反応における電子伝達体活性には、フェレドキシン分子中の3核鉄硫黄クラスターのみが関与しており、4核鉄硫黄クラスターは反応に関与していない。これは、4核鉄硫黄クラスターの酸化還元電位が非常に低いため、本反応系においては4核鉄硫黄クラスターを還元できないためであると考えられる。Bacillus schlegeliiより精製したヒドロゲナーゼは水素吸収反応を優先的に触媒するアップテイク型ヒドロゲナーゼであった。本酵素は70度で5時間あるいは、80度で2.5時間熱処理した後でも、熱処理前の約50%の活性を有していた。このことから本酵素が非常に高い熱安定性を有していることがわかった。本研究では好熱性水素酸化細菌Bacillus schlegeliiからのヒドロゲナ-ゼの精製を行った。本ヒドロゲナ-ゼは膜結合型であったので、まず非イオン性界面活性剤Brij58による可溶化を行った。可溶化後、陰イオン交換、ゲルろ過、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィ-を行うことにより電気泳動的に均一なヒドロゲナ-ゼを得た。ゲルろ過法により本ヒドロゲナ-ゼの分子量は約100,000と求った。本ヒドロゲナ-ゼは分子量66,000、28,000の二つのサブユニットより成る二量体であった。ICP発光分析、電子スピン共鳴、吸収スペクトル等の測定より、本ヒドロゲナ-ゼは、分子中に鉄硫黄クラスタ-とニッケルを含む鉄ニッケルヒドロゲナ-ゼであることがわかった。酵素一分子中に含まれる鉄とニッケルの割合は、約7対1であった。本ヒドロゲナ-ゼの基質特異性を調べると、これまでに報告されている中温性水素酸化細菌由来の膜結合型ヒドロゲナ-ゼと同様な傾向を示した。本ヒドロゲナ-ゼを触媒とする水素によるメチレンブル-還元反応では、反応温度を30度から90度までに変化させると、反応温度の上昇とともに反応速度は増加した。60度において12時間熱処理した後でも、ヒドロゲナ-ゼ活性は90%以上保持されていた。このことから、本ヒドロゲナ-ゼは高い熱安定性を示すことが明らかとなった。また、本ヒドロゲナ-ゼは還元型メチルビオロ-ゲンからの水素発生反応を触媒する事もわかった。本研究では好熱性水素酸化細菌Bacillus schlegelii(ATCC 43741)からヒドロゲナーゼの精製を行いその性質について研究を行った。

本菌体から精製したヒドロゲナーゼはその分子中に鉄およびニッケルを含む鉄ニッケルヒドロゲナーゼであった。プラズマ発光法によりヒドロゲナーゼ中に含まれる鉄およびニッケルの含量を測定した結果、鉄とニッケルの割合は7対1であることが分かった。低温下において本ヒドロゲナーゼの電子スピン共鳴スペクトルを測定すると、他の常磁性種と磁気的に相互作用している鉄硫黄クラスターにもとずくと考えられるシグナルが観測された。このことから、本ヒドロゲナーゼ中の鉄は、鉄硫黄ラクターの形で含まれていることが分かった。得られたシグナルは、これまでに報告されている鉄ニッケルヒドロゲナーゼの電子スピン共鳴スペクトルとほぼ同様のスペクトルであった。これらのことから、鉄硫黄クラスターと磁気的相互作用している常磁性種は三価のニッケルであると考えられる。また、ヒドロゲナーゼ中において、ニッケルサイトは水素の活性化反応の活性点、鉄硫黄クラスターは電子伝達体として機能していると考えられる。本ヒドロゲナーゼの水素酸化反応および水素発生反応の比活性を比べると、前者が後者の約100倍であることが分かった。このことから本ヒドロゲナーゼはアップテイク型ヒドロゲナーゼであることが分かる。ヒドロゲナーゼ活性に及ぼす各種遷移金属塩の効果を検討したところ1mMのCu^<2+>、Hg^<2+>はヒドロゲナーゼ活性を完全に阻害したのに対し、Ni^<2+>、Co^<2+>は阻害効果を全く示さなかった。本研究では好熱性水素酸化細菌Bacillus shlegelii中で電子伝達体として機能していると考えられるフェレドキシンおよび水素の吸収発生を触媒するヒドロゲナーゼを単離精製し、それらの性質を調べた。本フェレドキシンは77アミノ酸残基よりなり、その分子中に3核および4核の鉄硫黄クラスターを各1分子ずつ含んでいる7鉄型フェレドキシンであることがわかった。そのアミノ酸配列は、これ迄に報告されている他の7鉄型フェレドキシンと高い相同性を示した。本フェレドキシンは、NADPH、FNRによるチトクロームc還元反応系において効率的な電子伝達体として機能することがわかった。フェレドキシンの電子伝達体活性は、フェレドキシンを熱処理することにより一度上昇する。これは、熱処理によりフェレドキシン中の4核鉄硫黄クラスターが3核鉄硫黄クラスターへ構造変化するためであることがわかった。さらに熱処理を続けると、電子伝達体活性は次第に低下する。これは、フェレドキシン分子中の3核鉄硫黄クラスターが分解してしまうためである。本反応における電子伝達体活性には、フェレドキシン分子中の3核鉄硫黄クラスターのみが関与しており、4核鉄硫黄クラスターは反応に関与していない。これは、4核鉄硫黄クラスターの酸化還元電位が非常に低いため、本反応系においては4核鉄硫黄クラスターを還元できないためであると考えられる。Bacillus schlegeliiより精整したヒドロゲナーゼは水素吸収反応を優先的に触媒するアップテイク型ヒドロゲナーゼであった。本酵素は70度で5時間あるいは、80度で2.5時間熱処理した後でも、熱処理前の約50%の活性を有していた。このことから本酵素が非常に高い熱安定性を有していることがわかった。