hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高機能性材料としてのセルロ-ス誘導体の開発のための基礎的研究

圧電率,誘電率,弾性率の測定をしたところ,結晶性の異なる2つの種類のものが得られた.特に結晶性の高いニトロセルロ-スでは,10%程度の延伸で,高温で6x10^<ー13>C/Nの値を示し,もしさらに延伸率を高めることができれば,シアノエチルセルロ-スと同等以上の高圧電性の物質を得られることになる.(3)含フッ素セルロ-ス誘導体の圧電性:フッ素の導入を試み,一部フッ素化したセルロ-スを合成出来たが,適切な溶剤を見いだすことが出来ないためフイルムにすることが出来ない.そのため,諸物性の測定を行っていない.現在,熱圧締によるフイルム化を検討している.昨年度に引き続き電気的特性を持つと考えられるセルロ-ス誘導体を合成し,電気的特性として圧電性,誘電性,さらに力学的性質について検討を行った。本年度は特に硝酸セルロ-スについて検討を行った。昨年度の実験では硝酸セルロ-スフィルムの延伸が10%程度で,高配向の試料を得ることが出来なかった。本年度は熱ロ-ラ延伸により約100%の延伸試料を得ることが出来た。置換度の異なる硝酸セルロ-スを合成した。置換度の異なる試料の圧電性を比較すると置換度の大きいほうが高い値を示した。また同じ置換度の場合,配向度の高いほうが高い圧電率を示した。昨年度では6×10^<-13>C/Nの値を示したが,本年度は昨年度の23倍の値を得ることだ出来た。さらに高圧電性の硝酸セルロ-スを得るために現在検討を続けている。一つには高延伸の高配向度の試料を得ることである。また硝酸セルロ-スを合成する前に,セルロ-スの分子鎖を切断し重合度を落とすことにより,より結晶性の高イセルロ-ス誘導体を得ることが出来るものと考えられる。現在,酸加水分解によりセルロ-スの重合度を落としたものと,放射線により重合度を落としたものを用意し硝酸セルロ-スを合成し圧電性を調べつつある。一方,高圧電性を示す硝酸セルロ-スの圧電性,誘電性,力学特性を検討している。合成した硝酸セルロ-スを熱延伸をした場合にその過程で,分子鎖の配列仕方あるいは結晶性の異なる硝酸セルロ-スが生じていると考えられる。圧電性,誘電性,弾性の温度特性を調べると,これらの温度分散がみられる。それらの温度は-80°C,-10°C,70°Cおよび130°Cであるが,圧電性の低い試料では130°Cの温度分散が認められずに,また弾性率も50°C付近から急激に低下してしまう。
ドメスティック・バイオレンス加害者に対するサポートプログラム作成

夫/恋人から暴力を受けた女性被害者6名に面接を行ったデータを分析し、暴力に繋がる加害者の価値観・信条に影響を与えていえると考えられる加害者の家族関係を、被害者がどのように意味づけているのかを明らかにした。その結果、加害者の家族関係では、「父が暴力的環境で成長」「父から母への暴力」「父から加害者への一方的押し付け」「父親の影響力大」「母の身体的虐待」「母との信頼関係不十分」「離婚」「甘やかしすぎ」「安心感がない家庭」の9のカテゴリが抽出された。被害者は、加害者の「父が暴力的環境で成長」したことが、「父から母への暴力」「父から加害者への一方的押し付け」に繋がっていると捉えていた。他に「父親の影響力大」「母の身体的虐待」から、加害者は男女・親子関係における力関係を学習し、相手の視点で物事を見ることができず、弱者への支配を身につけた。つまり、夫婦/恋人関係は対等ではなく自分が優位、妻や物事を自分の思い通りにしてもよいと感じた。そして、妻/恋人・子どもに対する共感性欠如のために、自分中心の考えや行動をとり、暴力を軽んじるようになった。また、「父から母への暴力」を見て男性優位の意識が強まり、「母との信頼関係が不十分」だったため、母から得られなかったものを妻/恋人から得ようと、女性に対する期待が高くなった。加害者はこのような生育家庭を「安心感がない」と感じ、被害者意識が強くなったと被害者は意味づけしていると考えられる。看護の世界では、患者とのやり取りを振り返ることを通じて、患者との望ましい対人関係について学ぶために「プロセスレコード」を用いる。自分の信念や価値観を明らかにし自分の傾向に気付きやすいために、特に看護学生が用いることが多い。そこで、暴力を止めたいと思っている加害者がプロセスレコードを用いることで、自分の価値観や、思考や行動パターンに気付く一助になると考える。まず、日本におけるドメスティック・バイオレンス研究の実態を把握するために、医学中央雑誌を用い、1999年から2003年の5年間において、「ドメスティックバイオレンス」と「原著、総説、会議録を除く」を掛け合わせて文献検索を行った結果、51件の文献が抽出された。次に、各文献のシソーラス用語を分析単位とした結果240件となった。この240件を見ると、【暴力】70件、【支援】57件、【研究対象】28件(「女性」21件、「小児」2件、「男性」1件、「その他」4件)、【医療機関・医療従事者】20件、【精神・心理学的観点】19件、【DVの影響】16件、【社会的見地】9件、【その他】20件、記載なし1件の8つのカテゴリーが抽出された。シソーラス用語を単位として見ると、【支援】に関する用語が多かった。【研究対象】としては、「女性」が75%と圧倒的に多く、「男性」は1件のみであった。加害者に関する研究の有無を見ると、加害者である「男性の治療に関する研究」が2件、「バタラーの心理に関する研究」が1件であった。このことから、日本ではまだ、男性や加害者男性に関する研究は少ないと言える。しかし、日本でも大阪や東京などの大都市では加害者男性を対象とした再教育プログラムを案施している機関が少数だが存在する。ファシリテーターは男性が担当しているところが多く、女性が中心になりファシリテーターを行っている機関は、現在明らかになっている限り「aware」のみである。そこで、「aware」がH15年度に主催した、「DV加害者プログラム研究」(講師は、アメリカで長年加害者プログラムを実施しているカウンセラー)を受講した。引き続き3月末に、アメリカでの支援方法を直接学ぶために、LTSC(Little Tokyo Service Center)を見学し、アメリカにおける暴力に対する取り組みについて情報収集を行う予定である。元DV被害者7名に面接を行った結果、DV加害者に関して以下の内容が示された。1.価値観・普段の態度:「妻への暴力は当然」「妻に対する支配」などの<力と支配>、<一方的なジェンダー観>、「夫があって妻がある」「自分が一番」などの<自分中心>と、「子どもをかわいがる」「協力的」などの<理想的父親・夫>からなっていた。2.親同士・親との関係:「父も暴力的」「父から母への暴力」など<暴力を見て育つ>、「親から暴力を受けた」「束縛された」など<被虐待体験>、「居心地の悪い家庭」「離婚」などの<辛い家庭環境で育つ>、「母親に構ってもらえなかった」など<母親からの愛情不足>、<甘やかされた>からなる。3.暴力の種類:「殴る」「蹴る」などの<身体的暴力>、「浮気を疑う」「性行為を強要」などの<性的暴力>、「責める」「自分を被害者と言う」などの<心理的暴力>、「何も出来ないと言う」「(お前は)

一人で生きていけないと言う」などの『自尊心を低める』と「仕事を認めない」「暴力の矮小化」などの『否認』などの<過小評価・否認>、「暴れる」「凶器を保持」などの『脅迫行為』、「思い通りにさせない」「妻に成りすましてメールのやり取りをする」などの『行動の支配』、『脅す』などの<強要・脅迫・威嚇>、「給料を渡さない」「カードを取り上げる」などの<経済的暴力>、「行動を束縛」「外に出るのを嫌がる」などの<社会的暴力>からなっている。4.暴力のきっかけ:「ごみが落ちている時」「彼の理屈にあっていない時」などの<加害者から見て元被害者に原因がある場合>、「ストレスがある時」「愚痴を話している時」などの<加害者に原因がある場合>、<特別な理由なし>からなっていた。5.暴力に対する言い分:「身内への暴力はOK」「病院に行く程ではない」などの<暴力の矮小化>、「傷つけられた」「妻が暴力を振るわせる」などの<自分が被害者>からなった。夫/恋人から暴力を受けた女性被害者6名に面接を行ったデータを分析し、暴力に繋がる加害者の価値観・信条に影響を与えていえると考えられる加害者の家族関係を、被害者がどのように意味づけているのかを明らかにした。その結果、加害者の家族関係では、「父が暴力的環境で成長」「父から母への暴力」「父から加害者への一方的押し付け」「父親の影響力大」「母の身体的虐待」「母との信頼関係不十分」「離婚」「甘やかしすぎ」「安心感がない家庭」の9のカテゴリが抽出された。被害者は、加害者の「父が暴力的環境で成長」したことが、「父から母への暴力」「父から加害者への一方的押し付け」に繋がっていると捉えていた。他に「父親の影響力大」「母の身体的虐待」から、加害者は男女・親子関係における力関係を学習し、相手の視点で物事を見ることができず、弱者への支配を身につけた。つまり、夫婦/恋人関係は対等ではなく自分が優位、妻や物事を自分の思い通りにしてもよいと感じた。そして、妻/恋人・子どもに対する共感性欠如のために、自分中心の考えや行動をとり、暴力を軽んじるようになった。また、「父から母への暴力」を見て男性優位の意識が強まり、「母との信頼関係が不十分」だったため、母から得られなかったものを妻/恋人から得ようと、女性に対する期待が高くなった。加害者はこのような生育家庭を「安心感がない」と感じ、被害者意識が強くなったと被害者は意味づけしていると考えられる。看護の世界では、患者とのやり取りを振り返ることを通じて、患者との望ましい対人関係について学ぶために「プロセスレコード」を用いる。自分の信念や価値観を明らかにし自分の傾向に気付きやすいために、特に看護学生が用いることが多い。そこで、暴力を止めたいと思っている加害者がプロセスレコードを用いることで、自分の価値観や、思考や行動パターンに気付く一助になると考える。
テレビ文化アーカイブズの構築─テレビ番組研究・テレビＣＭ分析を統合する視点の探求

本研究は、放送文化に関する各種アーカイブズを基礎資料と捉え、テレビ番組およびテレビCM分析をも統合する研究視点を確立することを目的として展開された。成果として、(1)テレビ文化の総合性を反映したアーカイブズを構築した。(2)それらを基礎資料として、テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求を行った。(3)さらに、総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味を探求した。共同研究としては、個別の問題関心に基づき、1テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、2テレビ映像文化の歴史的意味の探求を行った。成果発信として、学術シンポジウムの共同開催を行い、報告書3冊を刊行した。初年度(平成24年度)は、研究計画の5つのステップのうち、I. IIのステップ(I.テレビ番組・CMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備、II.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求。)で共同研究を推進した。I.テレビ番組・テレビCMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備(1)既存の番組アーカイブズの検証、(2)テレビ番組の言語化作業(検索タグの構築)(3)既存のCMアーカイブズの検証、(4)テレビCM言語化作業(検索タグの構築)具体的には、大阪市立大学石田佐恵子研究室の番組アーカイブス、他大学・他機関の番組アーカイブスの比較研究、(3)京都精華大学CMデータベースの検証と追加作業、大阪市立大学萬年社調査研究プロジェクトCMデータベースの検証と追加作業を行った。II.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求ー分析手法の確立(1)テレビ番組分析・CM分析のための方法の再検討、(2)番組アーカイブズ・CMアーカイブズからの資料選定、(3)関連情報の渉猟と整理、(4)テレビ番組分析とCM分析を統合する視点の探求。具体的には、4回の共同研究会を開催し、資料の提示・共有と討議を通じて、分析方法や研究の方針を探った。詳細については、研究会のHPを参照のこと。本研究計画は次の5つのステップで構成する。I.テレビ番組・CMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備、II.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求、III.総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求、IV.国際的に発信可能なテレビ文化アーカイブズへの提言、V.研究成果の公開と社会的共有である。平成25年度は、研究計画の5つのステップのうち、I. II. III.のステップにおいて共同研究を推進した。<I>テレビ番組・テレビCMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備1既存の番組アーカイブズの検証、2テレビ番組の言語化作業(検索タグの構築)、3既存のCMアーカイブズの検証、4テレビCM言語化作業(検索タグの構築)前年度に引き続き、大阪市立大学石田佐恵子研究室の番組アーカイブス、他大学・他機関の番組アーカイブスの比較研究、3京都精華大学CMデータベースの検証と追加作業、大阪市立大学萬年社調査研究プロジェクトCMデータベースの検証と追加作業を行った。<II>テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求ー分析手法の確立1テレビ番組分析・CM分析のための方法の再検討、2番組アーカイブズ・CMアーカイブズからの資料選定、3関連情報の渉猟と整理、4テレビ番組分析とCM分析を統合する視点の探求。<III>総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求1テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、2テレビ映像文化の歴史的意味の探求。具体的には、5回の共同研究会を開催し、資料の提示・共有と討議を通じて、分析方法や研究の方針を探った。本研究計画は次の5つのステップで構成されている。1.テレビ番組・CMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備、2.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求、3.総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求、4.国際的に発信可能なテレビ文化アーカイブズへの提言、5.研究成果の公開と社会的共有。【平成2425年度の研究の概要】初年度2年次は、上記の1.2.のステップを進めた。1.テレビ番組・テレビCMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備具体的には、(1)既存の番組アーカイブズの検証、(2)テレビ番組の言語化作業(検索タグの構築)、(3)既存のCMアーカイブズの検証、(4)テレビCM言語化作業(検索タグの構築)、(5)総合的なテレビ文化アーカイブズの構築。2.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求ー分析手法の確立具体的には、(1)テレビ番組分析・CM分析のための方法の再検討、(2)番組アーカイブズ・CMアーカイブズからの資料選定、(3)関連情報の渉猟と整理、(4)テレビ番組分析とCM分析を統合する視点の探求。【平成26年度の研究計画・方法】3年次は、これまでの継続(1、2)に加えて、3.のステップを中心的に進めた。3.総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求(1)テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、(2)テレビ映像文化の歴史的意味の探求。それそれ、アーカイブ化作業を継続するとともに、共同研究者間で研究合宿を含む研究会を企画実施し、討議を深めた。また、最終年度に向けて、成果発表(学会発表など)や成果出版の準備を進めた。研究目的:本研究は、放送文化に関する各種アーカイブズを基礎資料と捉え、テレビ番組のみならずテレビCM分析をも統合する研究視点を確立することを目的とする。具体的には次の4つである。

(i)テレビ文化の総合性を反映したアーカイブズの構築、(ii)テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求、(iii)総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求、(iv)国際的に発信可能なテレビ文化アーカイブズへの提言。研究実績の概要:本研究は、次の5つのステップで構成されている。I.テレビ番組・CMアーカイブズの検証と系統的拡充・整備、II.テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求、III.総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味の探求、IV.国際的に発信可能なテレビ文化アーカイブズへの提言、V.研究成果の公開と社会的共有。初年度3年次は、上記I.II.III.のステップを進めた。Iのステップから、1既存の番組アーカイブズの検証、2テレビ番組の言語化作業、3既存のCMアーカイブズの検証、4テレビCM言語化作業、5総合的なテレビ文化アーカイブズの構築。IIのステップから、1テレビ番組分析・CM分析のための方法の再検討、2番組アーカイブズ・CMアーカイブズからの資料選定、3関連情報の渉猟と整理、4テレビ番組分析とCM分析を統合する視点の探求。IIIのステップから、1テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、2テレビ映像文化の歴史的意味の探求、というように、順を追って研究を進めていった。最終年度は、III.IV.V.のステップを中心的に進めた。ステップIIIでは、1テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、2テレビ映像文化の歴史的意味の探求。研究成果の公開と社会的共有を目指し、国際シンポジウムへの参加や、学術シンポジウムの共同開催、アーカイブ構築のさらなる推進を行った。また、成果出版物として、報告書3冊を刊行した。本研究は、放送文化に関する各種アーカイブズを基礎資料と捉え、テレビ番組およびテレビCM分析をも統合する研究視点を確立することを目的として展開された。成果として、(1)テレビ文化の総合性を反映したアーカイブズを構築した。(2)それらを基礎資料として、テレビ番組研究とCM分析を統合する視点の探求を行った。(3)さらに、総合的なテレビ映像文化の歴史的・社会的意味を探求した。共同研究としては、個別の問題関心に基づき、1テレビ映像文化の歴史的変容過程の分析、2テレビ映像文化の歴史的意味の探求を行った。成果発信として、学術シンポジウムの共同開催を行い、報告書3冊を刊行した。ステップ1.(1)既存の番組アーカイブズの検証、(2)テレビ番組の言語化作業(検索タグの構築)、(3)既存のCMアーカイブズの検証、(4)テレビCM言語化作業(検索タグの構築)、(5)総合的なテレビ文化アーカイブズの構築。前年度に引き続き、(1)(4)については、計画通り推進できた。また、(5)については、必要機材を購入し、やや遅れているものの、作業に着手することができた。ステップ2.(1)テレビ番組分析・CM分析のための方法の再検討、(2)番組アーカイブズ・CMアーカイブズからの資料選定、(3)関連情報の渉猟と整理、(4)テレビ番組分析とCM分析を統合する視点の探求。
ヒト型マウス皮膚をもつ新規メラノーマモデルマウスの確立とメラノーマ発生機序の解明

メラノーマは、治療に最も苦渋する癌の代表であるが、その発生機序は、未だに明らかにされておらず、その機構解明が待たれている。本研究では、ヒトの皮膚の特徴を模倣するマウスに、さらに遺伝的に手を加えることにより、マウスの皮膚からヒトのメラノーマに酷似する新規メラノーマモデルマウスの作出に成功している。現在、このモデルマウス用いて、メラノーマの発生機序を詳細に解析中であるメラノーマは、治療に最も苦渋する癌の代表であるが、その発生機序は、未だに明らかにされておらず、その機構解明が待たれている。現在、このモデルマウス用いて、メラノーマの発生機序を詳細に解析中であるメラノーマは色素細胞系譜から発生する悪性腫瘍である。我々は、メラノーマの元となる可能性のある色素細胞の幹細胞を同定し、その維持において周囲の微小環境ニッチが色素幹細胞運命の決定に重要であることを示してきた(Nature 2002,Science 2006,Cell 2009)。これまでのがん幹細胞研究では、腫瘍から取り出したがん細胞やがん細胞株を免疫不全マウスに移植して腫瘍起始細胞の腫瘍起始能力を評価しているが、同種または異種の免疫不全マウスの皮下という、がん病巣内の環境や発生母地からも全く異なる環境へと人為的に移植されて評価している点で、微小環境依存性という大きなバイアスがかかっている。さらに、既知のメラノーマの動物モデルでは、腫瘍細胞は真皮において増殖し、実際のヒトでみられる表皮内での特徴的な広がりや腫瘍細胞の胞巣形成やメラノーマ細胞の浸潤は認めず、組織学的にはヒトのメラノーマとはほど遠い。そこで、ヒト型の皮膚を摸倣できるマウス(extension:K14-SCF)に、ヒトメラノーマで高頻度に見られる変異型NRAS Q61Kを色素細胞特異的に発現できるアレルを導入し、また、ヒトメラノーマで高頻度に欠損の見られるInk4a/ARFがん抑制遺伝子の欠損アレルを導入し、さらに色素幹細胞系譜がβ-galactosidaseによりラベルされるマウスの作出に成功した。色素幹細胞系譜の可視化により、このマウスからヒトメラノーマに酷似する像が得られるのかどうか、母班やメラノーマがどのように発生してくるのか、現在、詳細に解析中である。また、上記のヒト型の皮膚をもち、がん抑制遺伝子の欠損、色素幹細胞を可視化できるマウスに、ヒトメラノーマで高頻度に見られる変異型BRAF遺伝子を色素幹細胞特異的かつ成体内で薬剤依存的に誘導できるアレルを導入し、このマウスからも同様の検討を行っている。メラノーマは色素細胞系譜から発生する悪性腫瘍である。我々は、メラノーマの元となる可能性のある色素細胞の幹細胞を同定し、その維持において周囲の微小環境ニッチが色素幹細胞運命の決定に重要であることを示してきた(Nature2002,Science2006,Cell2009)。これまでのがん幹細胞研究では、腫瘍から取り出したがん細胞やがん細胞株を免疫不全マウスに移植して腫瘍起始細胞の腫瘍起始能力を評価しているが、がん病巣内の環境や発生母地からも全く異なる環境へと人為的に移植されて評価している点で、微小環境依存性という大きなバイアスがかかっている。そこで、ヒト型の皮膚を摸倣できるマウス(extension:K14-SCF)に、ヒトメラノーマで高頻度に見られる変異型NRASQ61Kを色素細胞特異的に発現できるトランスジーンを導入し、また、ヒトメラノーマで高頻度に欠損の見られるInk4a/ARFがん抑制遺伝子の欠損アレルを導入し、さらに色素幹細胞系譜がβ-galactosidaseによりラベルされるマウスの作出に成功した。このマウスにおいて、色素幹細胞系譜からメラノーマ、母斑が発生する像も得られている。現在、母斑やメラノーマがどのように発生してくるのか、詳細に解析中である。また、上記のヒト型の皮膚をもち、NRAS変異の代わりにヒトメラノーマでより高頻度に変異の見られる変異型BRAF遺伝子を色素幹細胞特異的かつ成体内で薬剤依存的に誘導できるアレルを導入し、このマウスからも同様の検討を行っている。
重度の急性呼吸器症状を呈する新型レオウイルスのコントロール法の確立に関する研究

高熱と急性の呼吸器症状を伴うインフルエンザ様症状を呈し入院した海外渡航者からウイルスが分離された。そのウイルスは、過去3例のみ論文報告のある極めて稀なオルソレオウイルスのネルソンベイウイルスに属する新型レオウイルスであった。本研究では、その分離株の性状解析を実施すると共に、インフルエンザやSARSとの類症鑑別を視野にいれたウイルス遺伝子検出系および血清学的診断系の開発、動物感染実験を行い、新興感染症としての新型レオウイルスのコントロール法の確立を試みた。1.分離株の塩基配列決定:分離株の4つのSセグメントの全塩基配列決定を行った。特に、同時期に分離されたKamparウイルス、HK23629/07株と非常に近縁であることがわかった。2.ウイルス遺伝子検出系の開発:Sセグメントの配列情報から、(1)保存性が高く、(2)哺乳類レオウイルス及び鳥類レオウイルスに反応せず、(3)ネルソンベイウイルス群特異的なプライマーセットを作製し、RT-PCRでの迅速かつ高感度な遺伝子検出システムを構築した。3.血清学的診断系の確立:(1)ウイルス中和試験、(2)間接蛍光抗体法、(3)不活化濃縮精製ウイルスを抗原としたELISAのシステムを確立した。4.動物感染実験:マウス感染実験では致死性の呼吸症状が認められた。カニクイザル感染実験では、急性の呼吸器症状は認められたが、顕著な高熱、致死性は認められなかった。1.分離株の塩基配列決定:分離株のS1、S2、S3、S4セグメントの全塩基配列決定を行った。現在、動物感染実験で得られた臓器を用いて、その有用性を検討中である。現在、動物感染実験で得られた感染血清を用いて、ELISA法での有用性を検討中である。4.マウス感染実験:分離株のマウスでの病原性の有無を明らかにするために、感染実験を行った。感染後、体重の顕著な減少と肺の肝変化を伴う呼吸器症状が認められた。感染臓器からのウイルス分離では、呼吸器系ならびに消化器系においてウイルスが分離された。ネルソンベイウイルス群の動物感染実験報告はこれまでになく、本分離株がマウスにおいて実験的に急性呼吸器症状を示すことを明らかにした。本年度の研究では、(1)昨年度に引き続きその分離株の性状解析を実施すると共に、(2)現在までに開発したウイルス遺伝子検出系および血清学的診断系の感染臓器への適用ならびにモノクローナル抗体の作出、(3)カニクイザル動物感染実験による病原性の解析を行なった。(1)分離株の塩基配列決定:これまで分離株の4つのSセグメントの全塩基

配列決定を行いKamparウイルス、HK23629/07株と非常に近縁であることがわかった。しかし、これら近縁ウイルスのSセグメント以外の配列情報はなく、既知のレオウイルスから推定した末端配列での遺伝子増幅もできなかったことから、同定のときに実施したRDV法のプライマーセットを異なるプライマーセットに変更して実施し、さらなる部分配列情報を試み、比較的既知のレオウイルスと相同性の高い領域の部分配列(L1、L2、L3及びM1遺伝子)を得ることはできた。(2)RT-PCR、quantitative RT-PCRでの迅速かつ高感度な遺伝子検出システムを構築した。血清学的診断系として、動物感染実験で得られた感染血清を用いてウイルス中和試験、間接蛍光抗体法、不活化濃縮精製ウイルスを抗原としたELISAのシステムを確立した。また、モノクローナル抗体も4クローン作製し、それら抗原反応性も良好であることも確認した。(3)カニクイザルにおいて急性の呼吸器症状は認められたが、顕著な高熱、致死性は認められなかった。気管及び肺からウイルスが分離され、肺水腫が認められた。これまで、本ウイルスにヒトでの致死の報告はなく、急性の呼吸器症状と一致した。ネルソンベイウイルス群の動物感染実験報告はこれまでになく、本分離株がマウスに及びカニクイザルおいて実験的に急性呼吸器症状を示すことを明らかにした
非化学量論性金属酸化物中への水素の溶解挙動と電子物性に与える影響

高純度ジルコニウム(クリスタルバ-)の板状試料を673Kにおいて0.1MPaの水蒸気または重水水蒸気中で10時間酸化させることにより、水素または重水素を約1mol%含んだ厚さ約800nmの緻密なジルコニア被膜を形成させた。また、同様の温度・圧力の酸素ガス中で60時間酸化させることにより、同様の厚さの水素を含まないジルコニア被膜を形成させた。水素のジルコニア中での化学状態を調べるため、それぞれの被膜について高感度反射法により赤外吸収スペクトルを測定した。波数領域650850cm^<-1>のスペクトルに(重)水素を含む被膜と含まない被膜との間に顕著な違いが見られ、(重)水素を含む被膜でのみ810cm^<-1>に大きなピークが観察された。また、軽水素を含む被膜と重水素を含む被膜との間には、スペクトルに差異は見られなかった。このことから、810cm^<-1>のピークは水素自身の振動に起因するのではなく、水素が溶解することによりジルコニアの格子振動の状態が著しく変化したことに起因していることがわかった。なお、O-HおよびO-Dの振動に起因するピークは観察されず、水素は緻密なジルコニア中ではO-H、O-Dとしては存在していないことがわかった。水素の溶解がジルコニアの電子物性に及ぼす影響を調べるため、水素を含む被膜と含まない被膜について、X線光電子分光法を用いて価電子帯における電子の状態密度分布を測定すると共に、ケルビン法により仕事関数を測定した。価電子帯の状態密度分布には水素の溶解による顕著な変化は見られなかったが、仕事関数については水素を含む被膜の方が大きな値を示す傾向が見られた。これらの結果は、水素が溶解することによりジルコニアのフェルミ準位およびバンドギャップが変化していることを示唆している。
エピジェネティックな異常による消化器癌発生の分子機構と診断・治療への応用

発癌におけるエピジェネティックな異常の分子機構に関して未知の点が多い。DNAメチル化は、RASやWNT、p53、microRNAなど細胞内シグナルに重要な遺伝子の不活化に関与する。また、細胞老化に関連するIGFBP7の不活化が、CIMP陽性腫瘍が細胞老化を回避する機構として重要であることを明らかにした。DNAメチル化は大腸粘膜剥離液などの献体から検出可能で、癌の診断に有用であると考えられた。異常メチル化により不活化されている遺伝子の網羅的解析により、RASSF2、TCF2、ACMG1、EPHB2、WIF-1を異常メチル化の新規の標的遺伝子として同定した。RASSF2の異常メチル化は大腸癌の約40%に認められ、遺伝子発現抑制に関与していた。RASSF2の異常メチル化はK-rasあるいはBRAFの変異を有する腫瘍で高頻度で認められ、Rasシグナルの活性化には、Oncogenicな変異だけでなく、シグナルを負に制御している因子の不活化が必要であることが示唆された。RASSF2を腫瘍細胞に遺伝子導入することによりアポトーシスを誘導でき、RASSF2によるRasシグナル抑制経路が治療の新しい標的として重要と考えられた。異常メチル化はゲノム上に固定した情報であり、遺伝子変異と同様癌の存在診断のマーカーとして有用と考えられる。大腸癌の早期診断に異常メチル化を利用する目的で、便からのメチル化検出を試みた。大腸癌においてRASSF2の異常メチル化を認めた症例では便でのメチルが検出され、分子マーカーとして有用な可能性が示唆された。これまで、分裂期チェックポイント遺伝子CHFRが大腸癌および胃癌において異常メチル化により不活化されていること、CHFRが異常メチル化している腫瘍細胞が微小管阻害剤であるドセタキセルに感受性が高いことを報告してきた。本年度は、CHFRがメチル化していない腫瘍細胞においても、CHFR遺伝子のノックダウンにより、微小管阻害剤であるドセタキセルの感受性を増強できることを明らかにした。今後、CHFRのユビキチン活性を阻害する薬剤がドセタキセルの効果を増強する可能性を示した。また、メチル化酵素阻害剤5-aza-dCが大腸癌、胃癌、膵癌において低酸素誘導性アポトーシスを増強すること、その機序としてBNIP3の発現誘導が関与することを明らかにした。本研究ではメチル化により不活化される遺伝子の網羅的解析により、消化器癌の発生と進展におけるエピジェネティックな異常の役割を明らかにし、新しい診断法や治療法開発へ向けた基礎的研究および臨床応用を行うことを目的とする。本年度は、メチル化されている遺伝子の機能解析を行い、RASSF2遺伝子のアポトーシス誘導に核から細胞質への局在の変化が重要であること、CHFRの癌抑制機能に、NF-κB経路の抑制が関与することを明らかにした。また、大腸癌や胃癌におけるWNT経路の活性化には、WNTの制御遺伝子であるSFRP遺伝子ファミリーの異常メチル化が重要な役割を果たすことを報告してきた(Nat Genet, 2004, 0ncogene, 2007)。本年度はWNTの新しい制御遺伝子であるDKK1およびDKK2遺伝子が大腸癌および胃癌において高頻度に不活化されており、消化器癌の発生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。DKK1およびDKK2を大腸癌細胞に導入すると細胞増殖を抑制するが、そのメカニズムとして、non-canonicalなWNT経路の関与が示唆された。マイクロサテライト不安定性を有する大腸癌において、腫瘍免疫に関与するHLA関連分子や、血管新生の抑制に関与する分子がエピジェネティックな異常により発現低下していることを明らかにした。これらの腫瘍において、メチル化阻害剤の投与により、抗原提示機能が回復させることにより腫瘍免疫能の活性化が期待される。また、胃癌において、EPHB2遺伝子が高率に変異を認め、EPH/EFNシグナル経路が新たな治療の標的として重要である可能性を示した。本研究は、消化器癌におけるDNAメチル化やヒストン修飾異常などの、エピジェネティックな遺伝子サイレンシングの分子機構を解明し、新しい診断法・治療法開発のための基盤的研究および臨床応用を目的とする。本年度は、Dicer機能を低下させた大腸癌細胞におけるDNAメチル化について解析し、RNA干渉系がDNAメチル化の維持に関与することを明らかにした(Cancer Res, in press)。また、大腸癌において、microRNA前駆体の発現がDNAメチル化により抑制されていることを明らかにした(Cancer Res, in press)。癌における糖鎖の異常は腫瘍の転移や浸潤に重要な役割を果たす。我々は胃癌におけるSda抗原の糖鎖異常に糖転移酵素B4GALNT2のDNAメチル化による不活化が関与することを明らかにした(Gastroenterol, in press)。ヒストン修飾異常による遺伝子サイレンシングについては未知の点が多い。大腸癌および胃癌においてPRDM5遺伝子がヒストンH3K27のメチル化により不活化されていること、ヒストンメチル化酵素EZH2のノックダウンによりPRDM5の発現は回復することを明らかにした。ヒストンメチル化酵素が消化器癌治療の分子標的となる可能性を示した。

DNAメチル化は前癌病変においても認められ、DNAメチル化を発癌リスク予測のマーカーとしての利用出来る可能性が示唆される。H.pylori関連慢性胃炎は発癌リスク群として有用であるが、実際に胃癌を発症する症例は少なく、発癌リスク予測のための分子マーカーの開発が急務である。慢性胃炎における遺伝子メチル化レベルについて解析し、胃大部における炎症の強度と遺伝子のメチル化に相関を認めた。前癌病変におけるメチル化レベルは発癌高リスク群の予測に有用であると考えられた。本研究では、大腸癌および胃癌におけるDNAメチル化異常の網羅的解析により、消化器癌の発生と進展におけるエピジェネティックな異常の役割を明らかにすることを目的とする。本年度は、以下の項目について検討を行った。(1)大腸癌のシグナル経路異常におけるDNAメチル化の役割の解析:大腸癌の一部は、ゲノムワイドなメチル化の異常、CpGisland methylator phenotype (CIMP)を示す。われわれは、大腸癌におけるBRAFの負の制御遺伝子IGFBP7のメチル化を検討したところ、CIMP-high群に高頻度にIGFBP7遺伝子の異常メチル化を認めることを明らかにした。BRAF変異を起こした細胞がCIMPを獲得することでsenescenceを免れて癌化している可能性が考えられた。また、IGFBP7はp53の標的遺伝子であり、CIMP陽性腫瘍において、p53の変異が少ない原因の一つに、p53標的遺伝子がDNAメチル化により不活化されることが原因であることを明らかにした。(2)癌抑制遺伝子の不活化におけるRNA干渉の役割の解析:RNA干渉がDNAメチル化に果たす役割を検討する目的で、Dicerを遺伝学的にノックアウトした大腸癌細胞を用いて、Histone H3K27のメチル化を網羅的に解析した。Dicer機能の異常により、一部の遺伝子でH3K27のメチル化レベルが低下しており、Dicerが癌におけるエピジェネティック異常に関与する可能性が示唆された。(3)DNAメチル化を指標とした癌の悪性度診断および発癌リスク予測:mir-34bcの異常メチル化が胃癌の多発癌症例、大腸癌の浸潤癌においてメチル化レベルが値を示すことを明らかにした。遺伝子メチル化を利用した癌の再発予測、悪性度診断への応用が可能になることが示唆された。癌におけるエピジェネティック異常の新たな標的動態のため、マイクロアレイや候補遺伝子アプローチにより、ゲノム網羅的にメチル化異常を解析し、IGFBP7、RASD1、BMAL1、IRF4遺伝子を新規メチル化の標的遺伝子として同定した。IGFBP7の異常メチル化はBRAFの変異により誘導される、細胞老化回避機構として重要であることを明らかにした。IRF4の異常メチル化は健常患者に比べ、胃癌患者の背景胃粘膜で高値を示し、発癌リスク予測のマーカーとして有用である可能性が示唆された。
脊髄内視鏡を用いた選択的神経根ブロックの臨床応用に関する基礎的研究

1.内視鏡の製作;内視鏡は、イメージファイバー、ライトガイド、フラッシュルーメンを組み込んで外径1.8mm(1800画素)、および外径2.8mm(4200画素)としたものを製作して用いた。内視鏡、CCDビデオカメラ、ビデオレコーダー、モニターを組み合わせて、実験システムとした。脊髄硬膜外腔、クモ膜下腔の内視により、脊髄、神経根、血管等の構造が弁別された。2.内視鏡下に目的とする分節に対応する脊髄後根を固定する試み;本実験では、内視鏡下に脊髄誘発電位を測定することにより、神経根の支配領域を鏡視下に特定する試みを行った。助間神経上の刺激電極から、矩形波を通電し、硬膜外腔、クモ膜下腔に、内視鏡下に位置を確認して挿入した導出電極から、脊髄誘発電位を導出した。脊髄誘発電位の測定は、電気刺激装置、反応加算、ヒストグラム解析装置、メモリオシロスコープで行い、パーソナルコンピュータでディジタル記録した。双極電極からの導出部位を、脊髄に沿って被刺激後根の近傍で上方から下方に移動させてゆくと、導出される脊髄誘発電位は、当該後根の進入部付近で振幅が大きくなり、その後根の上下で位相の反転が見られた。すなわち、脊髄誘発電位の振幅と位相の特徴から、被刺激後根と導出電極の位置関係を推定することが可能であった。内視鏡下に神経根と導出電極を直視確認することで、当該神経根を特定することができる。15EA03:3.本手法を用いて、後根根糸とその支配領域との対応について現在さらに検討を加えている。さらに、以前われわれが開発した内視鏡下レーザ手術装置を用いた選択的神経根切離術の可能性についても、今後研究を進める予定である。1.極細径内視鏡を製作し、脊髄組織を直視すること。:内視鏡として、イメージファイバー、ライトガイド、フラッシュルーメンを組み込んだものを製作した。実験動物として成ヤギを用い、極細内視鏡をクモ膜下腔に挿入し、内腔を観察した。直視下では神経根・脊髄は拍動等により動きがあるため静止画像より弁別しやすい事が判明した。従って拍動等が弱まると観察しにくくなった。問題点として、現在使用中の内視鏡は、先端の操作性が悪く、経皮的に、任意の脊髄レベルの神経根に到達する事は容易でなかった。2.内視鏡下に、目的とする分節の脊髄神経後根を同定する方法を検討すること。動物実験では、患者の応答の得られない全身麻酔中の患者と同様に、電気生理学的な方法が孝えられた。:脊髄電位測定用の電極(脊髄電極)を内視鏡挿入部位より高位の分節に予め挿入した。内視鏡のフラッシュルーメンから電極を挿入して、直視下に神経根(後根)に刺入した。皮膚からの電気刺激に対して脊髄誘発電位と、後根電位を測定した。誘発電位による皮膚の電気刺激の部位弁別能を見るため、異なる皮膚分節上に刺激電極をおいて、計測を繰り返した。脊髄誘発電位の潜時、及び後根電位の波形は、刺激電極の部位により異なることが観察された。波形の解析により、目的とする皮膚分節に対応する後根を同定しうることが示唆された。3.選択的後根ブロックの試み:次年度の課題として、後根を直視下に局所麻酔薬でブロックした場合の、効果と、分節選択性を確認するために、上記の手法による脊髄誘発電位と後根電位のブロック前後での変化を観察する予定である。4.次年度の課題としてさらに、動物実験の結果を踏まえ、臨床応用上の問題点を検討する予定である。

1.内視鏡の製作;内視鏡は、イメージファイバー、ライトガイド、フラッシュルーメンを組み込んで外径1.8mm(1800画素)、および外径2.8mm(4200画素)としたものを製作して用いた。内視鏡、CCDビデオカメラ、ビデオレコーダー、モニターを組み合わせて、実験システムとした。脊髄硬膜外腔、クモ膜下腔の内視により、脊髄、神経根、血管等の構造が弁別された。2.内視鏡下に目的とする分節に対応する脊髄後根を固定する試み;本実験では、内視鏡下に脊髄誘発電位を測定することにより、神経根の支配領域を鏡視下に特定する試みを行った。助間神経上の刺激電極から、矩形波を通電し、硬膜外腔および、クモ膜下腔に、内視鏡下に位置を確認して挿入した導出電極から、脊髄誘発電位を導出した。脊髄誘発電位の測定は、電気刺激装置、反応加算・ヒストグラム解析装置、メモリオシロスコープで行い、パーソナルコンピュータでディジタル記録した。双極電極からの導出部位を、脊髄に沿って被刺激後根の近傍で上方から下方に移動させてゆくと、導出される脊髄誘発電位は、当該後根の進入部付近で振幅が大きくなり、その後根の上下で位相の反転が見られた。すなわち、脊髄誘発電位の振幅と位相の特徴から、被刺激後根と導出電極の位置関係を推定することが可能であった。内視鏡下に神経根と導出電極を直視確認することで、当該神経根を特定することができる。3.本手法を用いて、後根根糸とその支配領域との対応について現在さらに検討を加えている。さらに、以前われわれが開発した内視鏡下レーザ手術装置を用いた選択的神経根切離術の可能性についても、今後研究を進める予定である。
細胞のくびれ運動を駆動する収縮環と細胞膜の相互作用メカニズムの解明

細胞膜と細胞骨格の相互作用の正確な制御は動物細胞の細胞質分裂にとって必須であるが、その分子機構は明らかでない。本研究では種々の細胞骨格細胞膜結合性因子の分裂期細胞内動態、機能解析を通して、細胞質分裂を司る膜、細胞骨格相互作用機構の理解を目指した。我々はERMタンパク質が細胞質分裂期に他の膜結合タンパク質とは異なる特徴的な細胞内動態および局在依存性を持つことを発見した。ERMタンパク質の欠損は細胞質分裂の完了を阻害しなかったが、膜収縮運動の特性を変化させた。興味深いことに、他の膜因子の発現を抑制するとERMの分裂位置への集積が顕著に増加し、収縮運動により積極的に寄与するようになることがわかった。細胞周期の最後、細胞膜のくびれ運動により細胞が二分される「細胞質分裂」は、生命継承に必須の現象である。くびれ運動は、分裂位置に現れる「収縮環」によって駆動されるが、構成要素の激しい分子交換と解体を伴って収縮する収縮環が、細胞膜と継続的な相互作用を維持しながら、細胞膜に変形力を伝搬する仕組みは不明である。その要因は、収縮環と細胞膜を係留する分子装置の実体が明らかでないことにある。これまでに細胞膜と細胞骨格を係留するリンカータンパク質が数多く同定されてきたが、それらが協調して細胞質分裂の制御に関わる仕組みは不明である。本研究では、収縮環係留因子を網羅的に同定し、それらの動態や機能を比較解析することで、収縮環と細胞膜の間で起こる細胞装置間相互作用の実態を明らかにすることを目指す。当該年度は、十数種の膜タンパク質のGFP融合遺伝子を作成し、HeLa細胞のくびれ位置に局在した因子について、高分解能生細胞観察や蛍光褪色後回復法(FRAP)を用いて、膜や細胞骨格への結合性や細胞内動態の比較解析を行った。これらのリンカー因子はいずれも通常収縮環と細胞膜の間に存在したが、興味深いことに、人為的擾乱によって細胞膜と収縮環を物理的に乖離させると、細胞膜側もしくは収縮環側に残留するグループに二分された。また、これらの中には、くびれ位置での分子交換速度が極端に遅いもの、逆に収縮環構成因子よりもはるかに速い分子交換速度を示すものが存在していることも明らかになった。さらにRNAiによる機能阻害実験で、リンカー因子ごとに分裂細胞の膜動態や収縮環収縮における役割が大きく異なることがわかった。上記の結果から、くびれ位置に数多く存在するリンカータンパク質について、収縮環や細胞膜への結合性の点において多大な多様性が存在しており、分裂の進行における機能に関しても著しい機能分化が起こっていることが示唆される。研究協力者として当該年度から本研究に参加している大学院生に関して、細胞生物学実験の基礎的なトレーニングなどの観点から顕微鏡を多用した実験を主に推進することが望ましいと判断されたため、当初1年目に予定していたプロテオミクス解析を後回しにして、先に(当初2年目に予定していた)生細胞を用いた高分解能顕微鏡観察や細胞内分子動態解析を行うことにした。これにより、プロテオミクスを用いた解析については結果が出ておらず、遅れが生じているが、一方で、当初2年目に計画していた生細胞観察については概ね順調に研究が進行したため、次年度は当初1年目に予定していた実験に十分な時間を費やせると考えられる。当該年度の顕著な成果として、GFPタギング法を用いた細胞内局在解析によって、収縮環と細胞膜を係留する因子を数種類特定し、蛍光褪色後回復法や、高解像生細胞イメージングによって、それらの細胞内分子動態や局在依存性、くびれ運動における機能に著しい多様性が存在することを明らかにすることができた。これらは、当初の計画で想定していなかった発見であり、収縮環と細胞膜の複雑なオルガネラ間相互作用の分子機構を理解する上で重要な知見を与えるものであると考えられる。細胞周期の最後、細胞膜のくびれ運動により細胞が二分される「細胞質分裂」は、生命継承、恒常性維持に必須の現象であり、その制御機構の解明は医学、生物学の重要課題である。本研究では細胞を物理的に二分するための細胞膜変形制御の物理メカニズムを理解することを目標としている。細胞膜のくびれ運動は、分裂位置に現れる収縮環を構成するアクチン繊維とミオシンの滑り運動によって駆動される。しかし、構成要素の激しい分子交換と解体を伴って収縮する収縮環が、どのように細胞膜との継続的な相互作用を維持し、細胞膜に変形力を伝搬するのか、また細胞分裂位置以外の細胞膜と細胞骨格の相互作用がどのように制御されるのかは全く明らかでない。本研究では、分裂細胞の細胞骨格・細胞膜界面で働く種々のタンパク質の動態および機能解析を通して、正確な細胞分裂が実現する仕組みを理解することを目指した。ライブセルイメージングにより、細胞質分裂期に細胞分裂位置に局在する細胞骨格・細胞膜相互作用タンパク質数種類の動態および、それぞれのタンパク質の局在相互依存性を比較解析した。その結果として、解析したタンパク質のうちERM(Ezrin/Moesin/Radixin)タンパク質が、細胞膜画分での分子交換速や、細胞膜局在のためのシグナル依存性、細胞膜脂質依存性などの点で他の細胞骨格・細胞膜相互作用タンパク質と顕著に異なる性質を持つことを見出した。さらに機能解析から、ERMタンパク質は収縮環による細胞分裂位置での細胞膜変形には全く関与しない一方で、分裂位置以外での細胞表層における膜変形の駆動に関与することで分裂細胞全体の形態の制御を行っていることを見出した。

現在上記の成果を学術論文にまとめ投稿段階にある。今後は、細胞の異なる箇所で細胞膜変形を制御する因子群の機能がどのように統合され、正確な分裂が制御されるのかを明らかにしていきたい。細胞膜と細胞骨格の相互作用の正確な制御は動物細胞の細胞質分裂にとって必須であるが、その分子機構は明らかでない。本研究では種々の細胞骨格細胞膜結合性因子の分裂期細胞内動態、機能解析を通して、細胞質分裂を司る膜、細胞骨格相互作用機構の理解を目指した。我々はERMタンパク質が細胞質分裂期に他の膜結合タンパク質とは異なる特徴的な細胞内動態および局在依存性を持つことを発見した。ERMタンパク質の欠損は細胞質分裂の完了を阻害しなかったが、膜収縮運動の特性を変化させた。興味深いことに、他の膜因子の発現を抑制するとERMの分裂位置への集積が顕著に増加し、収縮運動により積極的に寄与するようになることがわかった。本年度は、前年度手薄になったプロテオミクスによる未知の収縮環係留因子の網羅的解析に本格的に着手する。当初の計画通りに、レクチンを用いて、分裂位置特異的な糖鎖修飾を足がかりに相互作用因子を同定するアプローチに加えて、前年度に同定したリンカー因子の相互作用因子を免疫沈降法によって単離精製するアプローチも新規に追加して、未知の収縮環係留分子装置を同定したい。また、前年度、予想外の発見として、収縮環と細胞膜の係留に関わる数種類の膜表在性タンパク質に関して、それらの収縮環・細胞膜結合性や細胞内分子動態に著しい多様性が備わっていることがわかってきた。そこでこの発見を受け、本年度は、それらの因子の収縮環および細胞膜結合部位を特定した上で、因子間でそれらの部位を交換した変異体を作成し、各因子の細胞内動態や機能にどのような影響がでるかを詳細に解析したい。さらに、micropippet aspiration法などの細胞の力学計測法を導入し、各因子の機能欠損時の分裂細胞の力学的性質の変化を定量解析したい。これらのアプロートを新規にとりいれることで、前年度明らかになった分子動態の多様性が、実際の細胞分裂の制御においてどのように機能的な重要性を持っているかを明らかにしていきたい。細胞生物学
銅の腐食防止を目的としてアルカンチオール自己集合膜の表面化学修飾

1.研磨洗浄した多結晶99.999%銅電極を1N HClO_4中で定電位還元した後、合成した11-メルカプト-1-ウンデカノールHO(CH_2)_<11>SHのエタノール溶液(5mM)中に30分間浸漬して自己集合膜を作製した。この銅電極を50mMのアルキルトリクロロシランC_nH_<2n+1>SiCl_3(n=1,4,6,8,12,18)を含むヘキサデカン-四塩化炭素-クロロホルム溶液に30分間浸漬した後、水を飽和したクロロホルム溶液中に10分間浸漬した。以上の操作は大気に触れないようにして行った。この表面化学修飾により、アルカンチオール自己集合膜は銅電極上でアルキルシロキサン化され、また、隣接分子との間にシロキサン結合を生成し重合した。2.化学修飾した自己集合膜について、X線光電子分光法および反射FTIR分光法によってSによる銅上への化学吸着、アルキルシロキサン結合等の構造を確認した。3.大気解放0.5M Na_2SO_4水溶液中における上記の化学修飾した自己集合膜で覆われた銅電極のインピーダンス測定を行った。インピーダンスより電荷移動抵抗R_tおよび界面容量Cを求めた。n=48においてR_tは最大、Cは最小となり、この間で最も緻密な耐食性のある皮膜が生成することが明らかにされた。n=18における耐食性の低下は、長鎖のアルキル基が立体障害によって配列を乱すためと考えた。分極測定の結果も同様であった。腐食防止率はアルカンチオール自己集合膜の最大値80%が化学修飾によって93%と向上した。4.同様に処理した銅円板を用いて水滴の接触角を測定した。アルキルシロキサン化でアルカンチオール自己集合膜と同等の撥水性が得られたが、nによる変化は明確でなかった。5.今後の課題として、回転電極を用いて自己集合膜中の酸素拡散について検討する予定である。
DMEKインジェクターの開発

細胞密度3000/mm2を超える培養角膜内皮細胞シートを用いて、細胞障害が少ない角膜内皮移植術(DMEK)専用のインジェクターの検討、開発を行った。In vitroで10%、ex vivoで20%の内皮細胞減少率であったDMEKインジェクターを用いて水疱性角膜症ウサギモデルに移植し、術前より機能マーカーのタンパク発現が増強することがわかった。臨床手術に施行し、操作性に問題はなく、手術は合併症を起こすことなく終了した。今後ドナーグラフトのみならず、再生医療分野で培養内皮細胞シート、iPS細胞分化内皮シートを利用した角膜移植が行われる際のインジェクターとして用いることが可能であることがわかった。平成25年度の研究目標は培養内皮細胞シートを使用し、内皮細胞減少率を改善しうる角膜内皮移植術(DMEK)インジェクターの開発を行うことである。DMEK術後の内皮減少率は角膜内皮移植術(DSAEK)より高く、術後6ヶ月の減少率が36-40%と報告されている。内皮細胞減少の原因として、DMEKグラフト作成および挿入時の侵襲、術後前房内環境などが考えられ、特にDMEK術中の侵襲が大きく関与していると考えられる。ドナー不足の現状において、ドナー角膜を利用した術式検討は不可能である。培養内皮シートを作成し、内皮細胞減少を抑制しうる術式を開発することは有用であると考える。我々はまず培養内皮細胞シートを作成し、細胞密度、細胞マーカーの発現を検討した。細胞密度は3000/mm2であり、ZO-1、Na-K ATP-aseが発現していることを確認した。市販されているIOLインジェクター(A, B)、DMEK用インジェクター(C)を使用し、in vitroで内皮シートの装填およびリリースを行った。いずれもシートの装填に時間を要し、リリースにおいてもシートがちぎれる、リリースできないなどのトラブルが起き、臨床応用に適さないと考えられた。最近、DMEK専用インジェクターが2社より発売された。これらの有用性について今後実験をおこなう。また、ex vivo豚眼モデルにおいて、内皮シートの挿入における簡易性、術中操作性を評価していく。本研究の目的は水疱性角膜症に対する角膜内皮移植術の1つであるDMEKのインジェクターを開発することである。DMEKは内皮移植術後の内皮減少率は40-60%と高く、術式として完成されていない。特に術中のシート操作による内皮減少が最もたかいと考えられ、より低侵襲なデバイス開発が必要である。我々は培養角膜内皮細胞シートを用いて、操作性が高く、細胞傷害が低いDMEKインジェクター開発を検討した。既に報告されている培養方法(Kimoto et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014)を用いて培養角膜内皮細胞シートを作成した。DMEKインジェクター開発にあたって、既に販売されている3つのDMEKインジェクターを用いて、内皮細胞シートの可塑性、操作性をin vitroで確認した。DMEKインジェクターは1D社(外径3mm)、2G社(外径4mm)、3GE社(外径1.6mm)を使用した。8mmカットした培養角膜内皮シートを生食で満たした100mmシャーレに浮遊させ、5ccシリンジに連結したインジェクターにシートを引き込み、シリンジを押し出し培養内皮シートの操作性を確認した。3社とも引き込み、押し出しは行うことができたが、G社、GE社の製品は引き込みに時間を要し、D社は容易に引き込みを行うことができた。取り出した内皮シートはlive/dead assay kitを用いて、内皮細胞のviabilityを測定した。その結果、内皮細胞傷害は3社ともに10%程度と良好な結果を得た。昨年度に継続してin vivoウサギ水疱性角膜症モデルに細胞密度3000/mm2の培養ヒト角膜内皮細胞シートを移植し、術直後および術翌日の内皮細胞密度減少率、バリア機能のマーカーであるZO-1、細胞接着のマーカーであるN-cadherin、細胞骨格のマーカーであるPhalloidinの発現変化を免疫染色を用いて測定した。インジェクターとして3種類を比較した結果、3種類ともに内皮減少率は10%程度と良好であった。しかし、免疫染色においてDorc社のインジェクターが免疫染色で発現がよく、細胞形態が保たれており、最も良好な結果であった。上記の結果によって、Dorc社の製品を用いて臨床使用した。Fuchs角膜内皮変性の症例に対する角膜内皮移植(DMEK)を施行し、挿入器具として上記を使用した。術前細胞密度が2600/mm2であった。術中操作に問題なく、合併症もなかった。術後10日目で角膜内皮細胞密度は1500/mm2だったが、角膜浮腫は消失し、良好な術後経過であった。