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常圧低酸素環境における運動が脳循環調節機能に及ぼす影響

本研究では、常酸素下運動と15%低酸素下運動が脳循環調節機能に及ぼす影響を評価した。脳循環調節機能の評価には、周波数解析・伝達関数解析および大腿カフ解除法を用いた。周波数解析・伝達関数解析の結果から、15%低酸素下運動では、運動前と比べ、高周波数帯(0.20.35 Hz:3.37.7秒/1周期)の領域で、脳循環調節機能の悪化が示唆された。しかしながら、大腿カフ解除法では脳循環調節機能の悪化の可能性は示唆されなかった。本研究は常圧低酸素環境における運動が人体の脳循環調節等に及ぶす影響を評価し、常圧低酸素室を利用するにあたり安全かつ適切にトレーニングする上で重要な情報を提示することを目的とした。2ヵ年の実験計画の期間中、健康被験者を対象として、自転車エルゴメーターを用い漸増運動負荷テストを行い、最大酸素摂取量を測定する。その後日1週間以上あけて常圧常酸素下での運動実験を行い、連続血圧波形、脳血流速度波形、心電図、脳組織酸素濃度変化、脳血液量などを測定し、脳循環調節機能の評価を行う。また、運動終了直後に大腿カフ解除法を行い、脳循環調節機能を評価する。さらに後日1週間以上あけて同一被験者を対象とし、常圧低酸素環境(酸素濃度15%)で、物理的運動強度が同一の運動実験を行い、脳循環調節機能の評価を行う。両実験ともに酸素濃度以外は被験者・測定項目・測定場所・時間も同一とする。これらの実験結果により、常圧常酸素下と常圧低酸素下における運動の脳循環調節機能に及ぼす影響の違いを明らかにする。当初研究計画では、全被験者の運動強度は自転車エルゴメーターで80wattと同一強度を予定していたが、被験者の体力レベルは異なるので、各被験者に合わせて運動強度を変更する必要があると考えている。そのため自転車エルゴメーターを用い漸増運動負荷テストを行い、最大酸素摂取量を測定した。その結果に基づき、各被験者の常圧常酸素下と常圧低酸素下における運動強度を決定した。現在の研究推進段階は各被験者の最大酸素摂取量を測定した実験を終了した段階である。近年、持久性運動能力向上を目的とした高地トレーニングのみならず、常圧低酸素ガスを利用した低酸素トレーニングが開発され、注目を集めている。常圧低酸素運動はアスリートのみならず、高地登山を目的とした一般の中高年登山者も利用し、全国的に普及しつつある。しかしながら、常圧低酸素ガスを利用した低酸素運動が人体の脳循環調節等に及ぼす影響を評価した報告はあまりない。そこで本研究では、その常圧低酸素運動の生理学的影響を脳循環調節機能の観点から評価することを目的とした。過去の研究成果から常酸素下運動前後と比較して低酸素下運動前後では血圧の自発変動が増大し、脳循環調節機能が悪化すると仮説を立てた。その仮説を検証するため、本研究では、常圧常酸素下での運動と常圧低酸素(15%酸素)下での低酸素運動が脳循環調節機能に及ぼす影響を評価した。健康男性被験者14名を対象とし、常酸素運動実験と低酸素運動実験を行い、周波数解析・伝達関数解析および大腿カフ解除法を用いて、脳循環調節機能を評価した。周波数解析・伝達関数解析の結果から、15%低酸素下運動では、運動前と比べ、高周波数帯(0.20.35 Hz:3.37.7秒/1周期)の領域で、血圧の自発変動は増大し、脳血流自動調節機能の評価指標であるCoherenceも有意に増加した。これらの結果から、高周波数帯領域での脳循環調節機能の悪化が示唆された。環境医学平成25年度の実験計画では、最大酸素摂取量を測定する実験と常圧常酸素下における運動が脳循環調節機能に及ぼす影響を評価する実験を行う予定であったが、運動負荷用心電図を購入し、実験設備・環境を整えるのに時間を要したため最大酸素摂取量を測定する実験が終了した段階である。平成25年度の実験で、各被験者の最大酸素摂取量を測定する実験を行ったので、各被験者の運動実験の運動強度を決定することが出来た。平成26年度は、常圧常酸素下と常圧低酸素下における運動を行い、低酸素下運動が脳循環調節機能に及ぼす影響を明らかにする。実験設備・環境を整えるのに時間を要したために、全ての被験者の実験を行う事が出来ずに、謝金としての金額が残額として残ったため。この運動実験を行う上での被験者への謝金および実験を行う上での消耗品購入を計画している。
肺癌患者における癌細胞殺傷蛋白グラニュライシンと癌免疫療法

無差別的な細胞傷害性を示さない分子標的薬剤を用いて癌性胸膜炎で胸に細胞浸出液が貯留した肺癌患者を行い、その際に廃棄される胸水を用いることで細胞障害性キラーT細胞が分泌する細胞障害因子グラニュライシン(Gra)を測定し治療反応性との相関を検討した。グラニュライシン(Gra)(9k,15k)の肺癌細胞殺傷効果とその機序およびシグナル伝達、アポトーシスへの影響について検討を行った。(1)9k-,15k-リコンビナントGraの作成には、をCos7細胞の培養上清に分泌させる系を用いた。これにより培養肺癌細胞におけるin vitroでの15k Graの抗腫瘍効果を得た。したがってin vivoでの肺癌細胞殺傷効果を解明する。(2)Graによる抗腫瘍効果発現の際にアポトーシス、シグナル伝達に影響を与える因子として、細胞骨格タンパク・サイトケラチン(CK)と上皮細胞成長因子受容体(EGFR)に注目した。非小細胞肺癌(NSCLC)においては最も発現レベルの高い2型CKであるCK8に加え、しばしば1型CK19の過剰発現が見られ、血中に逸脱したCK19フラグメントはCyfra21-1として臨床的にも重要な腫瘍マーカーである。1型、2型CKによるCKフィラメントの維持・代償機構について、肺癌細胞株(腺癌A549、HI1017および扁平上皮癌EBC1)において検討を行いCK19発現がCKフィラメントの維持・代償に重要であることを明らかにした。CKは一部が細胞表面に露出しており、肺癌で過剰発現したCK19は腫瘍特異抗原の可能性がある。(3)EGFRはチロシンキナーゼ阻害分子標的薬ゲフィチニブ(商品名イレッサ)の標的分子であり、遺伝子変異または増幅によって恒常的なEGFR活性化がおこる。新規に樹立した10種類の細胞株を含めた16種類のNSCLC細胞株において、EGFR遺伝子増幅はEGFR遺伝子変異のある株においてのみ検出され、EGFR遺伝子の増幅と変異には密接な関連があることが示唆された。変異・増幅したEGFRは癌免疫監視機構の標的となりうると考えられた。CD 9k-,15k-リコンビナントGraの作成には、をCos7細胞の培養上清に分泌させる系を用いた。(2) Graによる抗腫瘍効果発現の際にアポトーシス、シグナル伝達に影響を与える因子として、細胞骨格タンパク・サイトケラチン(CK)に注目した。CKの一部は細胞外に露出しており血中にも出現する。我々はCK8のELISA測定系を開発し、CK8は小細胞癌に比べてNSCLCに発現が高く、血中CK8は病期の進行と予後に相関することを明らかにした。また、Cyfra21-1は1型CK19が断片化して血中に出現したものであるが、CK8は55kDの全長のまま血中に出現することが示された。我々の報告は1型と2型CKの翻訳後修飾の違いに基づき、血中のCK8が全長であることを明らかにした最初の報告である。肺癌で過剰発現するCK8,CK19は腫瘍特異抗原として免疫療法への応用が期持できる。癌の分子標的治療では免疫機能の温存が可能であり、癌の免疫療法は今後いっそう重要となる。細胞障害性キラーT細胞が分泌する細胞障害因子グラニュライシン(Gra)の分子標的治療における役割を検討した。ヒト生体内におけるGraの癌細胞に対する殺細胞効果を評価するためのモデル病態として進行期肺癌における癌性胸膜炎を利用した。すなわち、癌性胸膜炎合併肺癌患者に対して分子標的薬による化学療法を行うと同時に血中、胸水中の分子標的薬の薬物動態を解析した。同時にGra動態および胸水中癌細胞の変化を観察した。臨床経過との比較をおこない、Graの役割を検討した。対象は(i)病理学的に確定診断のついた癌性胸膜炎合併の病期IIIB-IV期非小細胞肺癌、(ii)症状緩和のために癌性胸水の排液が必要となった症例、(iii)本邦で最も広く使用されている分子標的治療薬ゲフィチニブによる治療適応のある症例である。(1)平成18年6月から平成20年8月までに20例の癌性胸膜炎合併肺癌症例に胸水ドレナージとともにゲフィチニブ治療を行った。

男12例、女8例、年齢中央値67.5歳、臨床病期IIIB8例、IV期12例、20例全例が腺癌であった。(2)全症例から経時的に血液と胸水を採取し、ゲフィチニブ濃度を測定し、ゲフィチニブの薬物動態を検討した。(3)癌性胸膜炎合併非小細胞肺癌に対するゲフィチニブ治療による効果、予後、有害事象を明らかにした。(4)血中、胸水中Graを経時的に測定した。ゲフィチニブ治療に対する反応性と血中・胸水中Graとの関連を検討した。血中および胸水中Graは、ゲフィチニブ治療を受けた癌性胸膜炎合併非小細胞肺癌の治療反応性および予後と関連する可能性が示唆された。
低酸素関連転写因子を介した下垂体腺腫の浸潤の機序に関する分子生物学的研究

本研究は下垂体腺腫の分子レベルでの浸潤機構の解明を目的とした。下垂体腺腫は、臨床上しばしば(18-28%)周辺の海綿静脈洞などの正常組織への浸潤を来たす病態を示すことが知られている。今回我々は培養下垂体腺腫細胞を低酸素状態で培養して1)cDNA microarray,2)real-time RT-PCR,3)cell invasion assayを行い、変化する遺伝子のうち、細胞浸潤と関連すると思われるfactorの遺伝子を同定し、臨床症例の免疫染色で発現と浸潤との相関を解析した。今回我々は血管内皮細胞では低酸素状態に陥ると転写因子cAMP response element binding protein(CREB)のリン酸化が促進されるという報告に着目した。ヒト下垂体腺腫細胞HP-75を低酸素状態(1%)で培養するとWestern blottingではCREB蛋白の発現には有意な変化はみられなかったものの、リン酸化CREBは低酸素状態で明らかに発現が増加していた。下垂体腺腫55例の症例でCREBおよびリン酸化CREBに対するmonoclonal抗体を用いて蛍光免疫染色を行い検討した。いずれも両者とも腫瘍血管以外の腫瘍細胞に強く発現していたが、下垂体腺腫各subtype間に発現の有意差はなかったが、浸潤のgrade(Knosp grading)の高いものほど同時に腫瘍サイズの大きなものほどリン酸化CREBの発現のみは有意に上昇していた。同じ傾向が症例ごとのCREBリン酸化率にも認められた。従ってリン酸化CREBは低酸素マーカーと考えられ、浸潤傾向の強い腺腫ほど強く発現し、或いは腫瘍サイズに相関して発現していた。下垂体腺腫の腫瘍浸潤および腫瘍の増大の背景として組織酸素分圧の低下が存在することが明らかとなった。しかしながら腫瘍浸潤に中心的な役割を果たすcell adhesion moleculeやmetalloprpteinaseまたは低酸素関連転写因子hypoxia inducible factorとCREBリン酸化とのsignaling pathwayとの関連はいまだ報告がなく次年度の研究テーマとして検討する予定である。従来の下垂体腫瘍の研究は、細胞内あるいは細胞間の下垂体ホルモンに関連したシグナル伝達機構を考える傾向が強かった。しかし、生体内には細胞以外の主要な固形成分として、細胞外マトリックス(ECM)が存在する。ECMの分解を司る酵素群としてマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)ファミリーがあり、現在20種以上のメンバーが知られている。近年、この分野における研究の突破口として期待される膜結合型の新規MMP阻害因子RECKという分子が発見された。この分子は従来知られていた分泌型のMMP及びMMP阻害因子(TIMPファミリー)とは違って細胞表面に結合しているため細胞の挙動制御に直接関わる可能性が高く、世界的に注目されている。しかしながら下垂体腺腫における動態はいまだに報告がなされていない。今回我々は細胞レベルでのRECKの発現によるMMP分泌、細胞浸潤の変化といった点から実験を行ったので報告する。ヒト非機能性下垂体腺腫細胞HP-75を対照として、HP-75にRECKfull length mRNAをtransfectして強制発現させたもの、RECKをターゲットとしたsiRNAでgene silencingした細胞を作成し、RT-PCR, Western blottingで発現の変化を確認した。zymography, reverse zymographyでMMP, TIMPの分泌の変化を解析し、3-D invasi on assayを行った。さらにこれらの細胞からmRNAを抽出し、cDNA microarrayを行い、シグナル伝達機構におけるRECKの果たす機能について網羅的に解析した。下垂体腫瘍細胞にはRECKが発現し、細胞浸潤を抑制していた。下垂体腺腫の増殖における血管新生の意義に関しての検討は散見されるものの、そのメカニズムにおいて未だ定見を得られていない。今年度、骨髄から血管内皮前駆細胞を腫瘍局所に呼び寄せるhomingeffectを有するchemokineであるstromal cell-derived factor(SDF)-1に着目し、下垂体腺腫における血管新生の機序に関して、SDF-1の発現と微小血管密度の関係を検討した。結果として、下垂体腺腫細胞にもSDF-1が発現しており、従来検討されたVEGFによる組織に既存の血管内皮細胞による血管構築とは別個に、SDF-1のhoming effectによって骨髄から血管内皮前駆細胞を誘導する機序が存在し、下垂体腺腫の血管新生に密接に関わっている事が示唆された。
植物群落における構成個体のメカニズムの解析II.構成個体の受光エネルギー量および林内土壌の無機栄養分量分布とその季節変化

平成3年度に引き続き200m^2の永久枠内の生育個体の積算受光エネルギー量を測定した。本年度はさらに過去に用いてきた468nmに吸収のピークをもつPAN以外に、590nmに吸収ピークをもつDIAZO-BLUEフィルムを用いて予備的な積算受光エネルギー量の測定と生育個体のない小区(50×50cm)の中央部で地表面付近の日射エネルギー量(PAN)の測定も行った。本年度春の時点で、枠内には708個体生育していたが、フィルムが装着できたのは659個体で、他は樹高が高すぎて装着できないか、葉がなく受光エネルギー量の測定から除外された昨年冬から今冬までの間の枯死数は87個体で、そのうち菌による枯死は約26%であった。その結果、生個体の積算受光エネルギー量の日平均は0.466MJ/m^2で、枯死個体のそれは0.434MJであった。この差が統計的に有意な差とはいえず昨年度まで得た結果とは必ずしも一致しなかった。それは日平均の積算エネルギー量が平成2年度が0.575(腐朽菌以外の原因での枯死)、生個体のそれは0.666と平成3年度はそれぞれ0.552と0.717MJであったのに対して本年度の値はそれらより大きく下廻った。その原因については明らかではないが、各個体の受光エネルギー量の経年変化をみると、このような年もあると考えることができる。また、地表面付近の日射エネルギー量を測定したが、生育個体の受光量のほぼ80%のエネルギーが地表面に到達していることが明らかになった。しかし、林内の日射エネルギー量の絶対量が少ないので、生育個体の成長は著しく抑えられている。予備的により長波長域に吸収のピークのあるジアゾ色素を使った実験では、2枚のフィルムを並べて装着したが、個体によって、あるいは場合によってその退色度にかなりの差があり、フィルム間の差をPANの退色度/DIAZO-BLUEの退色度の比で表わすと、0.7451.352の間にあった。それは林全体で考えることには多くの問題があることを意味する。
低線量照射における放射線超感受性を用いた低侵襲がん治療戦略の開発-膠芽腫での検討

前年度に続いて、低線量反復照射を1膠芽腫細胞系(全細胞周期)2G2-M期同調に施行し、生存率、細胞周期、DNA損傷について解析した。本年度は生存率の差が最も顕著である照射間隔0分(単回照射)と30分間隔による低線量反復照射(20cG×10回)に条件を絞りこみ、照射後の細胞周期の変化について前年度より照射後の時間経過を詳細に追跡した。生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色によりDNA量を測定するほか、M期を特定できるヒストンH3抗体染色を追加し。フローサイトメトリーを用いて測定した。前年度は細胞周期に明らかな差を観察できなかったが、時間スケールを増加することでG2/M期の増加が観察された。これは、単回照射と低線量反復照射いずれでも観察され、複数の膠芽腫細胞系(U251、LN428、LN229)でも同様の反応があることが確認された。引き続いて、細胞同調(G2-M期)について本年度もシェイクオフ法を継続した。前項と同様に生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色、ヒストンH3抗体染色を用い、フローサイトメトリーを用いて測定した。トリパンブルー染色、細胞周期解析ともに死細胞の混在が多い結果であった。十分な細胞数を安定して得ること、G2/M期、M期分画が安定して増加することのいずれも困難であった。DNA損傷と修復については、前年度に引き続きγH2AX抗体を用いて、免疫染色で蛍光を観察した。単回照射、低線量反復照射ともに、照射後早期から蛍光の観察が可能であり、経時的に減少した。通常の細胞周期にある培養細胞に対する低線量反復照射とその細胞応答のうち、照射に対する生存率の差が細胞周期にあるという仮説に基づき、本年度は測定ポイントを増やして再度実験を行った。この結果としてG2/M期の細胞分画が明らかに増加しているタイムポイントを見いだすことができた。前年度は見いだせなかった点であり、重要な発見と考えている。解析した細胞数、生存率の差に有意差は指摘できなかったが、今回の線量2Gyでは、殺細胞効果は限定的であり、以前に行った解析でアポトーシス分画の増加が軽度であったことと矛盾しない。シェイクオフ法によるG2/M期の細胞回収についても、前年度に引き続き行った。シェイクオフ法は細胞毒性が低いため、本研究で応用可能か優先して検討したためである。今回の培養細胞ではトリパンブルー染色に加えて、フローサイトメトリー法による解析も追加したが、いずれも死細胞の混在が多い結果となり、本方法での分画割合の増加を安定して得ることは難しいと判断した。DNA損傷と修復については、タイムポイントを追加して検討を進める必要がある。本年度は、前年度の実験結果を検討して、追加修正を行ったため、進捗状況としては当初の予定より遅れている。しかしながら、細胞応答においては、前年度見出せなかった所見を見出しており、G2/M期の細胞回収においては、別の手法を講じる方針を確定することができたため、全体として確実に進捗しており、一定の結果を得ることができたと考えている。1)全細胞周期の細胞に低線量反復照射を行い回収し、DNA損傷、アポトーシス分画といった細胞死について時間経過を増加したうえで再度詳細に検討する。G2/M期の細胞の同調を目的に、ノコダゾールなどの細胞周期をブロックする薬剤を併用して細胞回収を行い、ノコダゾールなど使用する薬剤の毒性についても調べる。回収した細胞をフローサイトメトリー法で測定し、細胞周期の分画を測定する。効果的なG2/M期の細胞回収方法を確立する。2)放射線超感受性の機序解明として細胞周期関連因子、DNA損傷応答関連因子に絞り込み解析を行う。タンパク解析としてウェスタンブロッティングを行い、関連が示唆された場合、さらに遺伝子解析としてPCRを行う予定である。進捗状況に応じてマイクロアレイを用いた網羅的解析を行い、低線量放射線超感受性に関与している遺伝子候補を探索する。関連する遺伝子を見出することができたら、阻害剤と低線量照射との併用を行い、細胞応答を測定することで、有効な放射線増感剤を見出す。3)臨床応用における有効性を検討する目的で実験動物(マウス)を用いたin vivoでの検討を行う。膠芽腫細胞系をヌードマウス大腿皮下に移植し、腫瘍を形成させる。コントロール、通常線量(2Gy)照射、低線量反復放射線照射、低線量反復照射と細胞同調薬剤投与併用による処置を行い腫瘍増殖率、生存期間を測定する。動物実験では、細胞周期・DNA損傷に加え、低線量反復照射が腫瘍微小環境に与える影響を調べるため、低酸素マーカー(HIF-1α)、血管内皮マーカー(CD34)の発現についても検討する。複数の膠芽腫細胞系(U251、LN428)に対して、照射間隔(0-30分)を変じて低線量反復照射(20cG×10回)を行い、細胞応答(生存率、細胞周期、DNA損傷、アポトーシス分画等)を測定した。生存率はコロニー形成法とトリパンブルー染色法にて測定した。細胞周期、アポトーシス分画はフローサイトメトリーを用いて測定した。Annexin V抗体/ヨウ化プロピジウムを用いて、アポトーシスの初期段階についても検出をおこなった。DNA損傷については、γH2AX抗体を用いて、免疫染色で蛍光を観察した。鏡見によりアポトーシス以外の細胞死(細胞老化、分裂期細胞死)についても確認をおこなった。

細胞周期については照射間隔の変化による明らかな分画の差は検出できなかった。コントロールとして用いた10Gy単回照射ではG2/M期分画とsubG1分画の増加を確認することができた。アポトーシス分画の検出では、同様に照射間隔の変化による分画の差はわずかであり、10Gy照射48時間後に測定した群でアポトーシス分画の増加を確認することができた。引き続いて、G2-M期への同調をシェイクオフ法で行った。フラスコシェイカーを用いて培養液中に浮遊した細胞を鏡見し形態を観察したのち回収した。Hoechst33342で核を染色し観察した。トリパンブルー染色法では浮遊液中にG2-M細胞と死細胞片が混在するため可及的に緩衝液で洗浄した。T75フラスコを3本用いたが回収率としては予測していたほど高くなく、十分な細胞数を回収できなかった。全細胞周期における細胞応答(生存率、細胞周期、DNA損傷、アポトーシス分画等)の測定はこれまでも経験しており、比較的予定通り進行することができた。投与間隔による細胞周期、アポトーシス分画の差はわずかであったが、G2/M期の細胞分画がもともと小さいため、強度が低い侵襲である低線量照射による変化はわずかであることが予測されることから、これらの結果については、予想通りであった。そこでG2/M期の細胞をシェイクオフ法で集めることを試みたが、培養液中に浮遊させ、状態の良い浮遊液を得ることに苦慮しており、時間を要している。細胞をコンフルエントにすることなく、多くの細胞を回収することが容易ではないためである。シェイクオフ法は細胞へのダメージが少なく、G2/M期の細胞を集めることができれば低線量反復照射の放射線感受性を純粋に評価することができるが、単回のシェイクオフ法では限界とも考えられる。全体として、全細胞周期の細胞を用いた低線量反復照射による細胞応答測定は予定通り遂行できたが、侵襲の小さいシェイクオフ法による細胞回収に苦慮しており、初年度はG2/M期細胞の効率的な回収法の確立を目標としていたため、進捗状況としては若干の遅れをみている。前年度に続いて、低線量反復照射を1膠芽腫細胞系(全細胞周期)2G2-M期同調に施行し、生存率、細胞周期、DNA損傷について解析した。本年度は生存率の差が最も顕著である照射間隔0分(単回照射)と30分間隔による低線量反復照射(20cG×10回)に条件を絞りこみ、照射後の細胞周期の変化について前年度より照射後の時間経過を詳細に追跡した。生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色によりDNA量を測定するほか、M期を特定できるヒストンH3抗体染色を追加し。フローサイトメトリーを用いて測定した。前年度は細胞周期に明らかな差を観察できなかったが、時間スケールを増加することでG2/M期の増加が観察された。これは、単回照射と低線量反復照射いずれでも観察され、複数の膠芽腫細胞系(U251、LN428、LN229)でも同様の反応があることが確認された。引き続いて、細胞同調(G2-M期)について本年度もシェイクオフ法を継続した。前項と同様に生存率はトリパンブルー染色法、細胞周期はPI染色、ヒストンH3抗体染色を用い、フローサイトメトリーを用いて測定した。トリパンブルー染色、細胞周期解析ともに死細胞の混在が多い結果であった。
膜透過反応における分泌型タンパク質とSecAとの相互作用の分子機構

1)Sec因子に依存して膜透過される分泌型タンパク質proOmpAを材料として、分子内にループ構造を持つ変異人工タンパク質を系統的に作製した。ループ構造形成による膜透過の停止の様子をin vitro系で解析した結果、得られる中間体は、アミノ末端からループまでの距離に対応して段階的に変化するのではなく、ある一定の間隔で不連続的に変化することが明らかとなった。このことは、前駆体タンパク質の膜透過が、約30アミノ酸残基単位でステップワイズに進行していることを示唆している。更に、前述の変異分泌型タンパク質のin vitro膜透過実験を、精製Sec因子を組み込んだ再構成膜を用いて行ったところ、膜透過活性発現に不可欠な3つの因子(SecA,E,Y)のみでこのステップワイズなパターンが再現出来ることを見いだした。また、他の実験より、SecAは分泌型タンパク質シグナルペプチド内の疎水領域を認識し得ることも明らかにした。これらの知見は、分泌型タンパク質は、SecAにより認識され、この因子のダイナミックな動きと連動してステップワイズに膜透過が進行している可能性を示している。2)SecAは、大腸菌膜透過反応に不可欠なATPaseである。この因子のATP加水分解の触媒残基の同定を目的として、他のATPaseとの一次構造比較から触媒残基と予想される133番目のAspをAsnに改変した変異型SecA(D133N)を作製、その酵素化学的解析、in vitro膜透過実験を行った。D133Nは、膜透過反応と共役したATPase活性が著しく低下していると同時に膜透過活性を完全に失っていたが、ATPの結合能力に変化は見られなかった。一方、SecAと相互作用する各因子に対する親和性は野生型と同程度であった。以上のことより、133番目のAsp残基が、膜透過と共役したATP加水分解の触媒残基として機能していることが明らかとなった。
マウス腎移植モデルによる抗体関連型拒絶反応と抗CD20モノクローナル

マウスモデルによる腎臓移植後の生着期間の観察、拒絶移植片の病理学的解析および抗CD20モノクローナル抗体および抗TNFα抗体の投与による生着期間の延長を確認し投与方法や投与後の抗ドナー抗体の経時的変化を観察することにより効果的な使用方法と免疫細胞の浸潤等やB細胞による液性拒絶以外の抗原提示細胞能力の減弱による移植片の拒絶および生着延長効果の解析を行うことを目的として移植モデルの手術手技確立をおこなっている。実験の基本モデルの手術手技はマウスの左腎臓を大動脈とともにen-blockに摘出し、レシピエントの左腎摘出後に腹部大動脈と下大静脈に吻合をおこない1週間後に対側腎の摘出をおこない生存を確認することで生着とし、A/Jマウス(H-2a)からC57BL/6(H-2b)マウスへのMHC Full-Mismatchの腎移植をおこなう。A/JマウスからC57BL/6/CCR5-/-マウスへの腎移植をおこない抗体関連型拒絶が腎移植モデルでの確認ができないようであれば心臓移植モデルへの変更を考慮するとしていたが、腎臓の移植手技が安定しておらず手技の確立を目指したが手技の安定には一定の手術を定期的に行う必要があるが、手術に費やせる時間が難しく手技が安定しなかった。心臓移植、皮膚移植等で代替も可能と考えるがすでにおこなわれている研究でもあり、可能なかぎり腎臓移植での研究継続をおこないたいと考える。現在は定期的にマウス心臓移植のモデルを作成しているが同種心移植での生着率が不良であり薬物投与をおこなえる状況になっておらず大幅に実験が遅れている状況であり定期的な手術施行を行っている。1)移植モデルの手技確立実験の基本モデルの手術手技の確立に難渋しており心臓移植モデルへの変更を考慮している。心臓移植モデルでは移植した心臓の拍動により生着を確認している。2)A/JマウスからC57BL/6マウスへのフルミスマッチ心臓移植では7日前後で拒絶させることが確認できている。3)引き続き腎移植モデルの手技確立へ手技の習熟もおこなっている。A/JマウスからC57BL/6/CCR5-/-マウスへの腎移植モデルの作成手技が安定せずに臨床業務等により進行が遅れている。血管吻合部の血流が安定せずに移植した腎臓が正常に機能していない状況が認められる。心臓移植については安定して可能であるが腎移植と心臓移植を平行しておこなっている。手技が安定し生着率が問題なければ病理、フローサイトなどの手技に移行する予定である。腎臓移植後の生着期間の観察、拒絶移植片の病理学的解析および抗CD20モノクローナル抗体および抗TNFα抗体の投与による生着期間の延長を確認し投与方法や投与後の抗ドナー抗体の経時的変化を観察することにより効果的な使用方法と免疫細胞の浸潤等やB細胞による液性拒絶以外の抗原提示細胞能力の減弱による移植片の拒絶および生着延長効果の解析を行うことを目的として移植モデルの手術手技確立をおこなった。実験の基本モデルの手術手技はマウスの左腎臓を大動脈とともにen-blockに摘出し、レシピエントの左腎摘出後に腹部大動脈と下大静脈に吻合をおこない1週間後に対側腎の摘出をおこない生存を確認することで生着とするとしていたが腎臓の移植手技が安定しておらずマウスの体側腎摘出後の死亡が継続したため手技を心臓移植に変更している。マウスの皮膚移植をおこない拒絶の有無を確認した。皮膚移植に関しては手技は安定している。今後は心臓移植の手技安定を目指しマウスの移植手技の修練中である。マウスの腎臓移植モデルの手術手技確立が遅れている。血管吻合部からの出血、静脈吻合の狭窄、尿管吻合の狭窄による水腎症などが解決していない。心臓移植手技に変更して確立を目指しているが心臓移植手技の確立も移植数の少なさから安定したモデル作成に至っていない。現在までに約1000例のマウス腎移植を施行しており2つの同種腎移植術では腎臓は100日以上にわたり生着することを確認している。A/JマウスからC57BL/6/CCR5-/-マウスへの腎移植をおこない抗体関連型拒絶が腎移植モデルでの確認ができないようであれば心臓移植モデルへの変更を考慮するとしていたが、腎臓の移植手技が安定しておらず手技の確立を目指しているものの、心臓移植、腎臓移植ともに現在手技安定を目指している。手技の安定には一定の手術を定期的に行う必要があるが、手術に費やせる時間が難しく手技が安定していない。

心臓移植、皮膚移植等で代替も可能と考えるがすでにおこなわれている研究でもあり、可能なかぎり腎臓移植での研究継続をおこないたいと考える。代替案としてマウスの皮膚移植をおこない拒絶の有無、免疫寛容やAccomodationの確認、検討するなど、皮膚移植に関しての手技は安定している。移植の手技安定を目指しマウスの移植手技の修練中である。マウスの腎臓移植モデルの手術手技確立が遅れている。血管吻合部からの出血、静脈吻合の狭窄、尿管吻合の狭窄による水腎症などが解決していない。心臓移植手技に変更して確立を目指しているが心臓移植手技の確立も移植数の少なさから安定したモデル作成に至っていない。マウスモデルによる腎臓移植後の生着期間の観察、拒絶移植片の病理学的解析および抗CD20モノクローナル抗体および抗TNFα抗体の投与による生着期間の延長を確認し投与方法や投与後の抗ドナー抗体の経時的変化を観察することにより効果的な使用方法と免疫細胞の浸潤等やB細胞による液性拒絶以外の抗原提示細胞能力の減弱による移植片の拒絶および生着延長効果の解析を行うことを目的として移植モデルの手術手技確立をおこなっている。実験の基本モデルの手術手技はマウスの左腎臓を大動脈とともにen-blockに摘出し、レシピエントの左腎摘出後に腹部大動脈と下大静脈に吻合をおこない1週間後に対側腎の摘出をおこない生存を確認することで生着とし、A/Jマウス(H-2a)からC57BL/6(H-2b)マウスへのMHC Full-Mismatchの腎移植をおこなう。A/JマウスからC57BL/6/CCR5-/-マウスへの腎移植をおこない抗体関連型拒絶が腎移植モデルでの確認ができないようであれば心臓移植モデルへの変更を考慮するとしていたが、腎臓の移植手技が安定しておらず手技の確立を目指したが手技の安定には一定の手術を定期的に行う必要があるが、手術に費やせる時間が難しく手技が安定しなかった。現在は定期的にマウス心臓移植のモデルを作成しているが同種心移植での生着率が不良であり薬物投与をおこなえる状況になっておらず大幅に実験が遅れている状況であり定期的な手術施行を行っている。2A/JマウスからC57BL/6/CCR5-/-マウスへの腎移植をおこない抗体関連型拒絶の確認を早急に行う。2)抗体関連型拒絶モデルにおける病理組織学的検討抗体関連型拒絶モデルにおける移植腎ではBanff分類に基づき間質、糸球体、傍糸球体微小血管、尿細管などの障害およびC4d蛍光抗体免疫染色による抗体関連型拒絶反応の確認をおこなう。またフローサイトメーターにより細胞浸潤程度(拒絶の程度)を細胞数/重量で定量化を行うものとする。3)抗CD20モノクローナル抗体、抗TNFα抗体の投与による生着率の延長の確認抗体関連型拒絶マウスにおいて抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)、抗TNFα抗体(infliximab)の至適投与量の確認をおこない生着率の延長に寄与する確認をおこなう。研究計画に沿って、実験に取り組むことに率先する。手術手技の安定化を目指し手術数の増加を目指す。安定した手技が確立した場合は抗CD20モノクローナル抗体、抗TNFα抗体投与後に生着率が向上することが確認された後、レシピエントの検体腎臓の病理学的な検討、単体での投与による病理学的変化の確認にそれぞれでの血液中のDSAの変化の確認をおこなう。
中国土壌の重金属汚染調査と農作物への影響評価

2017年度に構築したオールインジェクション分析装置を稼働させるため、2018年5月に協力研究員の和田博士と当研究室の博士後期課程学生と共に渡中した。現地では多数の土壌試料を取り扱う必要があったため、日本で作製した1流路システムを改造して、4検体の同時分析が可能な4流路システムを構築した。この装置を用いて、カドミウムで汚染されている江蘇省の水田の土壌について詳細な化学形態分析を行い、米のカドミウム濃度との相関について考察した。その結果、フラクション1のカドミウム濃度とコメのカドミウム濃度との間には正の相関が見られ、土壌中のカドミウムの内、溶出しやすいカドミウムが主としてコメに取り込まれていることが明らかとなった。また、この土壌に当研究室で開発したバーク醗酵材料(FBA)を添加したところ、FBAの添加割合に比例して、コメのカドミウム濃度は減少し、FBAがコメへのカドミウム取込抑制剤として有効に機能していることが確認できた。一方、無錫の水銀で汚染されている水田について調査を行うため、9月に連携研究員の富山大学丸茂教授を訪問し、分析方法について打合せを行った。この結果を受けて11月に丸茂教授と共に渡中し、現地を視察すると共に、過般型蛍光X線分析装置にて、土壌の水銀濃度分布を確認した。また、オールインジェクション分析装置を用いて、土壌の重金属の化学形態別分析を行った。その結果、水銀は水田に広く分布していることが確認され、その化学形態は主としてフラクション4とフラクション5であり、土壌中の水銀はカドミウムと比較して溶出しにくい化学形態で存在していることが明らかとなった。4試料を同時に分析可能な4流路型オールインジェクション分析装置では、カラムに市販の容器とフィルター(Spelco社製Empty Rezorianチューブキット57609-U)が、ポンプに市販の4流路ペリスタルティックポンプが使用可能であることが判明した。これにより、比較的安価に多くの試料を同時に分析できることが可能となり、中国現地での調査が大きく進展する見通しとなった。また、重金属で汚染されている地域については、共同研究先の中国企業を通して、カドミウムに汚染されている江蘇省の水田で詳細な実験を行うことができ、実際の水田における土壌カドミウムの化学形態とコメのカドミウム濃度の相関性及びFBAのカコメへのドミウム取り込み抑制効果を確認することができた。これにより、土壌のカドミウムの化学形態と米への移行メカニズムについての研究では、実際の水田を使った実験を行うことができ、当初の予定通り重要な知見が得られている。来年度も継続してこのフィールドに於いて実験を行うと共に、更に水銀で汚染されている無錫の水田での実験も可能であることから、今後も順調に調査が行えるものと期待できる。さらに分析方法やデータの解析については、蛍光X線分析に精通している富山大学の丸茂教授と共同研究者である高知大学森教授と連携が取れており、成果の発表に向けて準備を進めているところである。以上の状況から、これまでのところ本研究は順調に進んでいると言える。水銀で汚染されている無錫の水田での実験の遂行と来年度本格的な実験を行う予定である南京の水田の視察を行うため、2019年5月に和田博士及び当研究室の博士後期課程学生と渡中する。分析については中国靖江市の分析センターにて、4流路計のオールインジェクション分析装置を使った土壌重金属の化学形態別分析とコメの重金属濃度の測定を引き続き行う。また、南京の水田ではカドミウムに汚染されていることが報告されているため、視察の際に土壌試料を持ち帰り、土壌カドミウム含有量の測定を行う。2019年9月と2020年3月に再度渡中し、無錫の水田においてFBAを散布し、コメへの水銀取り込み抑制機能の検討を行うと共に、オールインジェクション装置を用いて、水銀で汚染されている水田の土壌について詳細な化学形態分析を行い、コメの水銀濃度との相関について考察する。さらに、南京のカドミウムで汚染されている水田について、土壌分析の計画を立てると共に、米の栽培に関する打ち合わせを行う。これらの結果を基に、2020年度に調査を行う土壌の選定を行うと共に得られた成果を国内外の学会や専門誌に発表する。2020年度以降につては、さらに汚染が深刻な地域に関して同様の調査を行うと共に、これらの地域で農作物への重金属の取り込みを抑制する方法について提案する。前期は土壌試料充填カラムの作製を行うと共に化学形態別分析が可能なオールインジェクション分析システムを構築した。土壌充填カラムには市販されている複数のカラムで検討した後、得られた結果を基に使用するカラムの形状を決定した。このカラムを装着したオールインジェクション分析法において1試料充填量、2流速、3循環時間、4注入試薬について検討し、最適条件を決定した。本システムの有効性を確認するため、土壌標準試料を用いてバッチ法で得られる結果と比較した。後期は、オールインジェクション法を用いてヒ素に汚染されている土壌の形態別分析を実施し、バッチ法との比較から、土壌の形態別分析システムとしての本分析法の有用性を確認した。また、平成29年9月と平成30年3月に大学院生と共に上海市と靖江市を訪問し、共同研究先機関である中国企業と実験計画の打合せを行うと共に、江蘇省の汚染地帯の土壌を採取して靖江市の分析センターに於いて分析を行った。

現地の農産物として、カドミウムに汚染されている水田で栽培された米と小麦を入手して分析を行った。さらに、カドミウムに汚染されている水田にゼオライトと有機物系土壌改良材を添加して、米と小麦へのカドミウムの吸収抑制効果を検証した。その結果、土壌改良材の添加により、土壌におけるカドミウムの化学形態が難溶態へと変化し、米と小麦のカドミウム含有量が減少することを明らかにした。これらの成果は、平成30年4月22日に群馬大学の桐生キャンパスで開催した「日中環境創生シンポジウム」において、共同研究者の森教授(現在高知大学)及び連携研究者の丸茂教授(富山大学)とともに報告し、来日した中国の関係者(曹教授(上海交通大学)、常総経理(上海シェンロン環境修復技術有限公司)、羅博士(上海環境工程設計科学研究院))とのディスカッションを通して、今後の方針について協議した。土壌カラムを装着したオールインジェクション分析装置では、カラムに市販の容器とフィルター(Spelco社製Empty Rezorianチューブキット57609-U)が使用可能であることが判明した。これにより、比較的安価に多くの試料を同時に分析できることが可能となり、中国現地での調査が大きく進展する見通しとなった。また、重金属で汚染されている地域については、共同研究先の中国企業を通して、カドミウムに汚染されている江蘇省の水田で実験ができることとなった。これにより、土壌のカドミウムの化学形態と米への移行メカニズムについての研究では、今年度既にいくつかの分析データが取得できたことから、当初の予定よりも早く重要な知見が得られている。来年度も継続してこのフィールドに於いて実験が可能であることから、今後も順調に調査が行えるものと期待できる。さらに分析方法やデータの解析については、上海交通大学の曹教授および仇博士とのディスカッションを通して情報交換ができおり、中国研究者との協力関係も良好な状態を維持できている。また、平成29年度の研究成果について、平成30年4月22日に開催した「日中環境創生シンポジウム」において、日本側の共同研究者・連携研究者と中国側の研究者が一堂に会して議論することで、今後の研究についての方向性を確認することができた。以上の状況から、これまでのところ本研究は順調に進んでいると言える。2017年度に構築したオールインジェクション分析装置を稼働させるため、2018年5月に協力研究員の和田博士と当研究室の博士後期課程学生と共に渡中した。現地では多数の土壌試料を取り扱う必要があったため、日本で作製した1流路システムを改造して、4検体の同時分析が可能な4流路システムを構築した。この装置を用いて、カドミウムで汚染されている江蘇省の水田の土壌について詳細な化学形態分析を行い、米のカドミウム濃度との相関について考察した。その結果、フラクション1のカドミウム濃度とコメのカドミウム濃度との間には正の相関が見られ、土壌中のカドミウムの内、溶出しやすいカドミウムが主としてコメに取り込まれていることが明らかとなった。また、この土壌に当研究室で開発したバーク醗酵材料(FBA)を添加したところ、FBAの添加割合に比例して、コメのカドミウム濃度は減少し、FBAがコメへのカドミウム取込抑制剤として有効に機能していることが確認できた。一方、無錫の水銀で汚染されている水田について調査を行うため、9月に連携研究員の富山大学丸茂教授を訪問し、分析方法について打合せを行った。
近代日本における長期軍備拡張計画が及ぼした政治経済的影響に関する研究

本年度の研究は、まず昨年度おこなった艦船外国発注とそれに関連する技術導入の過程についての研究作業を完結させるため、論文「1883年度以降の軍備拡張計画に基づく日本海軍の艦船輸入について(下)」(『人文社会科学論叢』第5号、2018年8月)を取りまとめて公表した。それと並行して、『社会経済史学』編集委員会より千田武志著『呉海軍工廠の形成』(錦正社、2018年)の書評を依頼され、執筆した。既に原稿は提出済である。2019年度中に掲載される予定という連絡を受けているが、その巻号は未定である。同書と本研究とは、視角や方法においてかなりの違いがあるものの、その対象領域は重複するところがかなりあり、とくに同書の丹念な史資料収集に基づく実証分析はとても参考になった。同書の指摘によって、鹿児島県立図書館に赴いて収集した川村純義の追懐談は、同書の主張とは異なり、むしろ本研究の従来の主張を補強することになったと考えている。その他に、この書評を執筆することによって、本研究の重要課題や論点を再確認できるというメリットもあった。また、本年度は軍拡計画の中断期(1889ー95年)における国内・国外の艦船建造構想とその実施過程を検討することによって、日清戦争後の拡大された軍拡計画と最初の軍拡計画の相違と関連を考察することができた。この作業はまだ完結しておらず、期間中に成果を公表することができなかったが、著作として刊行することを目指している。本年度の研究成果については、「1883年長期軍備拡張計画の成立をめぐって」(『人文社会科学論叢』第2号、2017年2月)を発表した。1883年度以降実施された長期軍備拡張計画の成立過程について、従来の外交史的研究と国内政治・財政史的研究成果を批判的に検討するとともに、新たな史資料に基づいた論点を提起したものである。本論考は、1882年の朝鮮における壬午事変が日本と清国との外交的・軍事的緊張関係を惹起し、日本政府をして軍備拡張計画を策定させることになったという通説的把握について、事変への日本政府の対処動向を整理し、それが軍拡へと繋がる根拠に乏しいことをまず明らかにした。しかしながら、軍拡計画が成立したことは間違いなく、それを可能にしたのは政府内における財政・外交政策の絡み合いであったことを主張した。その根拠として、軍拡計画と軍拡財源の構想推移を史料に基づいて分析し、今後の研究の方向性を提示した。次に、以上の論考執筆と並行して、当時の日本政府首脳が「清国の脅威」としてみていた中心的存在である清国艦隊について、近年の中国における研究を主としてフォローした。研究代表者は中国語文献に関する読解力が十分とはいえないので、中国人留学生に助力を仰ぎつつ、検討をおこなった。また、資・史料の実地調査については、国立公文書館・国立国会図書館憲政資料室において、清国艦隊および壬午事変への日本政府の対応に関する史料収集をおこなった。これらは先の論考ですでに一部利用した。予定していた軍拡計画の成立経緯については、前述の論考によってほぼ研究を終了した。軍拡計画の実施過程(18831888年)については以前に発表した成果に追加・修正を加える作業を進めている。軍拡計画成立後の国内への艦船発注・購買過程についても基本的に解明を終えているが、外国発注の分析とそれに関連する技術導入の過程についての検討は進行途中である。この時期に英国を中心にヨーロッパ諸国において艦船に関するアーキテクチュアが大きく変化するとともに、民間企業による艦船生産が進展したという状況変化の把握に努めているためである。他方で、次年度予定であった18831888年についての作業を前倒しして進めており、軍拡計画が成立しなかった経緯および軍拡計画なき部分的軍拡の実施についての解明もほぼ終えたので、当初の予定とは異なる部分があるが、全体的な進行はほぼ順調といえる。本年度の研究は艦船外国発注とそれに関連する技術導入の過程についての検討をおこなうことに重点をおいた。その成果は、研究発表「1883年度以降の軍備拡張計画に基づく日本海軍艦船輸入について」(政治経済学・経済史学会、秋季学術大会、自由論題、於;大阪商業大学、2017年10月20日)と、「1883年度以降の軍備拡張計画に基づく日本海軍の艦船輸入について(上)」(『人文社会科学論叢』第4号、2018年2月)において公表した。なお、上記の論考は完結していないが、(下)の論考執筆はほぼ完了しており、この時期の艦船輸入に関する検討は基本的に終えたと考えている。これらは、1883年度以降の長期軍備拡張計画に基づいて実施された日本海軍の艦船輸入の特徴を考察する前提として、まずは広範な研究文献や資料に依りながら、一方で清国艦隊の状況を分析しつつ、他方で同時期の世界的な艦船技術進展や仕様変化の特徴を検討した。次に、輸入契約書を具体的に分析して発注の特徴を明らかにしたうえで、その建造過程の諸特徴について考察した。その結果、次のような諸点が明らかになった。1)海外からの艦船輸入実績が乏しかった日本海軍は予算が保証されていたにもかかわらず、輸入決定に手間取った。2)輸入決定が遅れた理由は日本側の準備不足という面があったが、ヨーロッパにおける技術革新や艦船アーキテクチャの変化という面も関係していた。

3)これらはその後の艦船輸入に対する重要な経験となるとともに、技術導入の契機にもなったという点で、その後の艦船国産化に大きな意義を有した。軍拡計画の成立経緯については、一昨年度にほぼ研究を終了した。軍拡計画の実施に基づく艦船外国発注とそれに関連する技術導入の過程については、昨年度においてほぼ研究を終了した。これによって、国内艦船生産体制についての制度的変化および技術者・労働者の存在形態の検討が主要課題として残されているが、これらについてはすでに部分的に着手しており、おおむね予定の範囲で推移している。本年度の研究は、まず昨年度おこなった艦船外国発注とそれに関連する技術導入の過程についての研究作業を完結させるため、論文「1883年度以降の軍備拡張計画に基づく日本海軍の艦船輸入について(下)」(『人文社会科学論叢』第5号、2018年8月)を取りまとめて公表した。それと並行して、『社会経済史学』編集委員会より千田武志著『呉海軍工廠の形成』(錦正社、2018年)の書評を依頼され、執筆した。既に原稿は提出済である。2019年度中に掲載される予定という連絡を受けているが、その巻号は未定である。同書と本研究とは、視角や方法においてかなりの違いがあるものの、その対象領域は重複するところがかなりあり、とくに同書の丹念な史資料収集に基づく実証分析はとても参考になった。同書の指摘によって、鹿児島県立図書館に赴いて収集した川村純義の追懐談は、同書の主張とは異なり、むしろ本研究の従来の主張を補強することになったと考えている。その他に、この書評を執筆することによって、本研究の重要課題や論点を再確認できるというメリットもあった。また、本年度は軍拡計画の中断期(1889ー95年)における国内・国外の艦船建造構想とその実施過程を検討することによって、日清戦争後の拡大された軍拡計画と最初の軍拡計画の相違と関連を考察することができた。この作業はまだ完結しておらず、期間中に成果を公表することができなかったが、著作として刊行することを目指している。本年度に引き続いて、次年度は艦船外国発注とそれに関連する技術導入の過程についての検討をすすめて、それとの関連で国内艦船建造過程の分析結果を論考として公表することを予定している。次に、上記の分析を踏まえながら、艦船国内生産体制についての制度的変化および技術者・労働者の存在形態の検討に移る。また、海軍費支出がいかなる経済的波及効果を持ったのかという点の解明にも着手する。最終年度は、1896年度予算と97年度予算の両者で打ち出された新たな日清戦後軍拡計画の全体像を明らかにし、以前の軍拡計画との関連と異同を問うとともに艦船製造技術形成および国内生産体制の到達点を検討する。それらを通じて、長期軍備拡張計画の政治経済的意義を解明するつもりである。今後は軍拡計画の中断期(1889ー95年)における国内・国外の艦船建造構想とその実施過程を検討しつつ、国内艦船生産体制についての制度的変化および技術者・労働者の存在形態、さらにはその後の技術導入過程の特徴について分析する。さらに、それらが日清戦争後の軍拡計画の成立といかに関係したのかという点を中心として総括をおこないたい。
EmergingしたSalmonella Agonaの生物系統地理学的評価

我々は同一食鳥処理場を調査定点とした肉用鶏におけるサルモネラの分布調査を行ってきた。その食鳥処理場では2011年にはSalmonella Infantisが優勢に分離されていたが、2014年にはS. Agonaが優勢に分離されるようになり、S. InfantisからS. Agonaへ血清型シフトを示し、S. Agonaのemergingであることが推察された。この要因を明らかとするために検討を行った。平成30年度は前年度行った次世代シークエンサー(NGS)解析のデータをS. Agonaのcore geneを用いて解析した。その結果、1995年に千葉県で分離された食中毒事例株がemerging株のクローンであることが明らかとなった。この結果はこの菌株がemerging株の祖先である可能性が示され、この菌株が何らかの経路で肉用鶏の農場に侵入した可能性が考えられた。in vitroにおける病原性の差の検討について、S. Agonaの細胞侵入性の検討はGentamycin Protection assayによって行ったが、使用する細胞をマクロファージ由来細胞であるJ774.1株に変更して株間の比較をした。その結果、emerging株は他で分離された菌株よりも細胞侵入性の能力が高いことが示された。さらに、emerging株がマクロファージ由来細胞に細胞死を引き起こすか細胞死検出ELISAキットを用いて検討を行ったところ、一部の菌株はマクロファージ由来細胞に細胞死を引き起こすことが示され、病原性が高いことが明らかとなった。その食鳥処理場では、2011年にはSalmonella Infantisが優勢に分離されていたが、2014年にはS. Agonaが優勢に分離されるようになり、S. Agonaのemergingであることが推察された。このemergingの要因を明らかとするために検討を行った。平成28年度はS. Agona菌株の全国規模での収集、パルスフィールド電気泳動(PFGE)による分子疫学的解析、in vitroにおける病原性差について検討した。S. Agona菌株の全国規模での収集については、全国の衛生研究所、家畜衛生研究所の協力を得て行った。20052015年までにヒト、食品、環境中など様々なものから分離されたS.Agona菌株を約250株収集した。PFGEによる分子疫学的解析については、収集した菌株のDNAを2種類の制限酵素(XbaIおよびBlnI)でそれぞれ処理してPFGEを行った。PFGEデータをクラスター解析してデンドログラムを作成した。さらに、Minimum spanning tree (MST)解析して、各菌株の類似度により被験菌株をgeno-groupに分けて、clonal complex (CC)によりグループ分けを行った。その結果、収集した菌株はXbaIでは4つ、BlnIでは7つのCCが形成された。emerging菌株と同一CCに区分されたものは、XbaIでは9菌株、BlnIでは32菌株であった。in vitroにおける病原性差については、PFGEによる分子疫学的解析においてemerging菌株と同一CCに区分された菌株のうち数菌株を用いてGentamycin Protection Assayを実施した。今後数を増やして結果を比較する予定である。平成28年度は、S.Agona菌株の全国規模での収集、PFGEによる分子疫学的解析まで終了した。この結果をもとに、次世代シークエンサー(NGS)による全ゲノム解析による進化系統群の解明、集団遺伝学的解析によるS.Agonaの進化系統群ごとの多様性の解明、S.Agonaの進化系統群による病原性差の解明を実施する予定にしている。その食鳥処理場では2011年にはSalmonella Infantisが優勢に分離されていたが、2014年にはS. Agonaが優勢に分離されるようになり、S. Agonaのemergingであることが推察された。平成29年度は昨年度行った全国から収集したS. Agonaのパルスフィールド電気泳動(PFGE)による解析結果を受けて、91菌株を選択して次世代シークエンサー(NGS)解析を行い、Minimum spanning tree (MST)解析をした。その結果、S.Agonaの全ゲノムあるいはcore geneのいずれかを選択するかによって解析結果が異なることが分かった。どちらの手法を選択して株間の比較をするか検討中である。in vitroにおける病原性差については、PFGEの解析結果を受けて15菌株を選択し、intestine407細胞を用いたGentamycin Protection assayにより菌株間の比較を行った。その結果、emerging菌株は他で分離された菌株よりも細胞侵入性の能力が高く、病原性が高いことが示された。今後は菌株の数を増やすことと、マクロファージ由来細胞に変えて株間の違いが認められるか検討する予定である。平成29年度は、全国から収集したS.Agona菌株のPFGE結果を受けて、NGS解析を実施した。また、in vitroにおける病原性差の検討についても実施した。