hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グルコシルトランスフェラーゼの活性を阻害するペプチドの解析

本研究は、齲蝕細菌Streptococcus mutans(S.mutans)の増殖と同菌が分泌するグルカン合成酵素(グルコシルトランスフェラーゼ、GTF)の活性を特異的に阻害するペプチド性阻害剤の開発を目的とする。S.mutansのGTFの3種類のアイソザイムの中で、特に非水溶性グルカン合成酵素(GTF-I)が病原因子として重要であることが明かとなっており、まずGTF-Iを標的として、その一次構造由来ペプチド(GTFペプチド)が酵素活性に与える影響について検討した。GTF-I蛋白質の調整、及び精製は、前年度確立した方法に従って行った。また、19残基のGTFペプチドはF-moc法により合成した。GTFペプチドがGTF-Iの活性に与える影響をF-kit(ベーリンガー)を用いて測定したところ、新たに、スクラーゼの活性中心に相当するペプチドが酵素活性を阻害することを見い出した。昨年度阻害効果を明らかにしたペプチド1176-1194と同様に、精製したGTF-Iに対しても阻害効果を有し、酵素活性に対して特異的なものだと考えられた。このペプチドはGTF-Iのスクラーゼ活性とトランスフェラーゼ活性の両方を阻害した。ペプチド1176-1194とGTF-Iとの相互作用について解析するため、両者の結合をIASYSを用いて解析したところ、ペプチドとGTF-Iは2相性の結合をすることが明かとなった。さらに、ペプチド1176-1194の配列の中で阻害に必須の領域を明らかにするため、10、13、16残基の部分ペプチドを合成し、それらのGTF-Iに対する阻害活性を検討したところ、13残基以下のペプチドには阻害活がないことが明かとなった。S.mutansのGTFの3種類のアイソザイムの中で、特に非水溶性グルカン合成酵素(GTF-1)が病原因子として重要であることが明かとなっており、GTF-Iの一次構造由来ペプチドによる酵素活性の阻害について検討した。GTF-I蛋白質は、gtfB遺伝子を高発現させたS.milleri、KSB8株、またはS.mutans、MT8148株より菌体付着型の酵素を超音波処理により回収し、粗酵素標品とした。さらに、阻害剤の特異性を検討するため、陰イオンカラム、ゲルろ過カラム、クロマトフォーカシングシステムを用いたGTF-I蛋白質の精製法を確立した。GTF-Iの一次構造中、機能的に特に重要だと思われる部位を選び、19残基のペプチド(GTFペプチド)をF-moc法により合成した。これらのうち、22種類のペプチドの酵素活性に与える影響を調べたところ、1176-1194のアミノ酸配列に相当するペプチドが酵素活性を阻害した。この阻害効果は、精製したGTF-Iに対しても認められ、酵素活性に対して特異的なものであると考えられた。阻害はGTF活性のうち、主にトランスフェラーゼ活性に対するものであった。また、50%阻害に必要な濃度は約3マイクロモルであった。ペプチド合成後の脱保護と精製は常法に従い行ったが、この過程で用いる溶媒がペプチドの阻害活性に対して与える影響を検討したところ、酢酸、アンモニアを溶媒としたものと比較して、トリフルオロ酢酸に溶解したペプチドの方が阻害活性が高かった。
多重活性化中間体の発生と多量化を鍵とする機能性有機元素化合物の開発

ボリル基を有するシクロプロペン誘導体の合成例はない。これは適当なボリルアニオン種が知られていなかったためである。本研究では宮浦らが開発した求核性を有するボリル銅を用いて、ボリルシクロプロペンの合成に初めて成功した。得られた化合物は空気や水に安定な白色結晶である。現在、ピナコレート部分をハロゲンに変換し、還元反応を検討中である。また、ゲルミルシクロプロペンはトリフェニルゲルミル誘導体が知られているのみであり、その反応性についてはほとんど知られていない。ここでは(アニシルジクロロゲルミル)シクロプロペンの還元を検討した。この化合物を還流ベンゼン中、ヒドロシラン存在下でカリウムと反応させることによりシクロプロピルゲルミレンの捕捉生成物が得られることが分かった。シクロプロペニル置換カルベンやシリレンは低温で環拡大し、シクロブタジエンやシラシクロブタジエンに異性化することが知られており、今回分かったゲルミレンとの反応性の差異は14族元素二価化学種の反応性の観点から興味深い。ケイ素数6個程度までの短鎖オリゴシランとは異なり、ケイ素数78個以上の長鎖オリゴシランは高分子量ポリシランと同様、主鎖上の一次元励起子に由来する鋭い吸収および発光を示すことが知られている。ここではジメチルアミノフェニル基やチオアニシル基などヘテロ原子を導入したオクタシランやデカシランを合成し、その物性を母体のペルメチルオリゴシランと比較検討した。発光スペクトルを測定したところ、ベンゼン環を通して窒素や硫黄がオリゴシランと共役するヘテロ原子置換長鎖オリゴシランは極性溶媒中で顕著な二重蛍光を示すことが分かった。アリールジシランの二重蛍光は芳香族置換基をアクセプター、ジシラン側をドナーとする電荷移動状態からの発光であるとされているが、今回の化合物では逆方向の電荷移動が起こっている可能性がある。本研究において我々は多重活性化中間体の考えを応用し、高い反応性を有する炭素の二価化学種(カルベン)と、同じく高反応性のスズ二価化学種(スタンニレン)とが隣接した中間体1の発生に成功した。これは炭素-スズ三重結合化学種と見なすことが出来る。始めに立体保護を受けたスタンニレンにシリルジアゾメチル基を導入した前駆体化合物アリール(シリルジアゾメチル)スタンニレン(2, ArSn-C(N_2)-SiR_3)を合成した。前駆体2は対応するクロロアリールスタンニレンとジアゾメチルリチウムの反応で得られる。ここでアリール基としては高い立体保護効果が期待出来る2, 6-ビス(1, 3, 5-トリイソプロピルフェニル)フェニル基を採用した。またシリル基としてはトリメチルシリル基およびトリイソプロピルシリル基を使用した。(これ以降、トリメチルシリル基を使用した場合は化合物番号にaを、またトリイソプロピルシリル基の場合はbを付して略称する。)ベンゼン中での2aの光分解により、予期せぬ生成物としてスタンニル基が置換したスタンニレン3が赤色結晶として高収率で得られた。ジアゾメタン2aの光分解により、期待通りスタンナアセチレン1aが発生したと推定される。しかし、1aはカルベンとしてのキャラクターを強く残しており、非常に反応性が高い。このため、分子内で挿入反応をおこした後で二量化が起こり、さらに複雑な分子内転位反応により最終的にスタンニルスタンニレン3を与えたものと推定される。一方、2bの光分解ではこのような二量化は起こらず、イソプロピル基のC-H結合にカルベンが挿入した生成物を与えた。このように非常に高反応性を有する中間体においても若干の置換基の違いにより反応経路が著しく変わることを明らかにした。

アリールジシランの二重蛍光は芳香族置換基をアクセプター、ジシラン側をドナーとする電荷移動状態からの発光であるとされているが、今回の化合物では逆方向の電荷移動が起こっている可能性がある。
渦鞭毛藻類の眼点の構造と形成過程の解析:細胞内共生期限の観点から

昨年度の研究で明らかとなったように渦鞭毛藻類のうちで,黄金色藻類(おそらく珪藻類)を細胞内共生藻に含むものは6種が知られる(このうち4種類は申請者が新たに確認した).これら6種は共通する特徴として,1)類似の共生藻をもつ,2)同じタイプの眼点をもつ,が挙げられる.この6種の渦鞭毛藻に見られる眼点は,渦鞭毛藻類全体を通してこの6種類でのみ見られる,特徴的なものである.この眼点は3重膜に囲まれることから,最も一般的に見られる葉緑体の中に眼点が存在するタイプの葉緑体部分が消失することにより形成されたとの仮説が出されていた.しかしながら,この眼点の複製様式や葉緑体(眼点)DNAの存在に関しては知られていなかった.本研究でこれらについて検討したところ、眼点は複製に先立ち指状の突起を形成すること,眼点の後端がちぎれ,それが元の眼点の近傍に位置するように移動すること,細胞内で形成された脂質顆粒がそのちぎれた部分に集合し新たな眼点を形成することが明らかとなった.このようにこのタイプの眼点は,分裂と新生の両要素によって複製されるという極めて珍しい複製様式をもつことが明らかとなった.また,DAPIの蛍光染色による眼点中のオルガネラDNAの検出は2種についておこなったが,DNAと断定できる蛍光は検出されなかった.また,今回の重要な成果として,上述のDinothrix paradoxaにおいては,細胞内共生体は存在するものの,他の5種類と異なって共生基の核が消失している進化段階にあることを明らかにしたことが挙げられる。このことは,同じ系統に属すると考えられる渦鞭毛藻類の内で,オルガネラの獲得に向けてさらに一歩先の進化段階へ達したものをわれわれが研究材料として手に入れたことになるからである.昨年度の研究で明らかとなったように渦鞭毛藻類のうちで,黄金色藻類(おそらく珪藻類)を細胞内共生藻に含むものは6種が知られる(このうち4種類は申請者が新たに確認した).これら6種は共通する特徴として,1)類似の共生藻をもつ,2)同じタイプの眼点をもつ,が挙げられる.この6種の渦鞭毛藻に見られる眼点は,渦鞭毛藻類全体を通してこの6種類でのみ見られる,特徴的なものである.この眼点は3重膜に囲まれることから,最も一般的に見られる葉緑体の中に眼点が存在するタイプの葉緑体部分が消失することにより形成されたとの仮説が出されていた.しかしながら,この眼点の複製様式や葉緑体(眼点)DNAの存在に関しては知られていなかった.本研究でこれらについて検討したところ、眼点は複製に先立ち指状の突起を形成すること,眼点の後端がちぎれ,それが元の眼点の近傍に位置するように移動すること,細胞内で形成された脂質顆粒がそのちぎれた部分に集合し新たな眼点を形成することが明らかとなった.このようにこのタイプの眼点は,分裂と新生の両要素によって複製されるという極めて珍しい複製様式をもつことが明らかとなった.また,DAPIの蛍光染色による眼点中のオルガネラDNAの検出は2種についておこなったが,DNAと断定できる蛍光は検出されなかった.また,今回の重要な成果として,上述のDinothrix paradoxaにおいては,細胞内共生体は存在するものの,他の5種類と異なって共生基の核が消失している進化段階にあることを明らかにしたことが挙げられる。このことは,同じ系統に属すると考えられる渦鞭毛藻類の内で,オルガネラの獲得に向けてさらに一歩先の進化段階へ達したものをわれわれが研究材料として手に入れたことになるからである.本研究における第一の目的である渦鞭毛藻類の培養株の確立に関しては,静岡県浜名湖,瀬戸内海,房総半島,三浦半島などで採集をおこない,眼点を有するScrippsiella hexapraecingula,Scrippsiella gregaria,Gymnodinium pyrenoidosumなど,および非眼点性の渦鞭毛藻類Alexandrium hiranoi,Amphidinium spp.および未記載の渦鞭毛藻1種の培養株を確立することに成功した。この未記載の一種は新属・新種であることが明らかとなりAmphidiniella sedentaria Horiguchiとして公表した。第二の目的である眼点の微細構造の解析に関してはS.praecingulaにおいては葉緑体の中に脂質顆粒が存在するタイプであり,脂質顆粒は2層構造となっていることが明らかとなった。このようなタイプの眼点は他の植物群では緑藻でのみ知られるもので,渦鞭毛藻の葉緑体ならびに眼点の起源を考える上で興味深い。また,渦鞭毛藻のうちで眼点が「葉緑体の中に赤い顆粒が存在する」タイプのものをもつ種類は今の所,例外無く光合成色素としてクロロフィルa+cとペリディニンをもつらしいことが明らかとなってきた。一方,黄金色藻を内部共生体にもつ渦鞭毛藻類は6種類が知られる(そのうち4種類は申請者が発見した)がこれらは例外無く,3重膜に囲まれた多層の脂質顆粒から成るタイプの眼点をもち、しかもその眼点は葉緑体とは離れて渦鞭毛藻の細胞質に存在することを明らかにした。この6種類は形態的にはかなり異なっており,現在では異なる分類群に分類されるが,この眼点と内部共生体という独立した要素がこれら6種類で共通しているということは,これらが単系統性である可能性も示唆しており,この点に関する検証が今後の課題である。

昨年度の研究で明らかとなったように渦鞭毛藻類のうちで,黄金色藻類(おそらく珪藻類)を細胞内共生藻に含むものは6種が知られる(このうち4種類は申請著が新たに確認した).これら6種は共通する特徴として,1)類似の共生藻をもつ,2)同じタイプの眼点をもつ,が挙げられる.この6種の渦鞭毛藻に見られる眼点は,渦鞭毛藻類全体を通してこの6種類でのみ見られる,特徴的なものである.この眼点は3重膜に囲まれることから,最も一般的に見られる葉緑体の中に眼点が存在するタイプの葉緑体部分が消失することにより形成されたとの仮説が出されていた.しかしながら,この眼点の複製様式や葉緑体(眼点)DNAの存在に関しては知られていなかった.本研究でこれらについて検討したところ,眼点は複製に先立ち脂状の後端がちぎれ,それが元の眼点の近傍に位置するように移動すること,細胞内で形成された脂質顆粒がそのちぎれた部分に集合し新たな眼点を形成することが明らかとなった.このようにこのタイプの眼点は,分裂と新生の両要素によって複製されるという極めて珍しい複製様式をもつことが明らかとなった.また,DAPIの蛍光染色による眼点中のオルガネラDNAの検出は2種についておこなったが,DNAと断定できる蛍光は検出されなかった.また,今回の重要な成果として,上述のDinothrix paradoxaにおいては,細胞内共生体は存在するものの,他の5種類と異なって共生藻の核が消失している進化段階にあることを明らかにしたことが挙げられる.このことは,同じ系統に属すると考えられる渦鞭毛藻類の内で,オルガネラの獲得に向けてさらに一歩先の進化段階へ達したものをわれわれが研究材料として手に入れたことになるからである.
角層水分量に着目した電場による経皮吸収促進メカニズムの解明研究

皮膚角層の構造と機能の関係性の解明を目的とし、本研究では、様々な水分含有量にある角層の溶液吸収特性を解析し、さらに、様々な水分量にある角層に電気的刺激を加えた際の構造変化、およびその結果として生じる溶液吸収促進効果を明らかにする。申請者が開発した試料保持装置と、SPring-8の高強度X線ビームを用いることで、角層由来のX線回折光の時間変化を高感度に解析し、角層の溶液吸収特性とその環境要因との関係性を広範囲に調べる。本研究より得られた実用的な角層構造の測定法や、外部刺激と溶液吸収の関係性に関する知見は、塗り薬等の外皮用薬の開発及びその適用方法の開発に活用することが可能である。
大江健三郎の小説を通じた戦後研究

平成21年度は、「言葉を奪われた動物-大江健三郎「飼育」をめぐる江藤・三島の批評の問題点」を、日本文学協会第29回研究発表大会(2009年7月19日、於静岡大学)において口頭発表した。また、「小説は宗教に何を語りかけるのか-村上春樹と大江健三郎の差異」を『1Q84スタディーズBOOK2』(小森陽一編、若草書房、2010年1月)に掲載した。前者は、前年度発表の「動物とファシズム-大江健三郎「奇妙な仕事」論」の論点を継承し、動物として差別的に扱われる黒人兵に注目することで、当時の批評言説の陥穽を指摘したものである。具体的に言えば、江藤淳と三島由紀夫に表われた当時の批評言説の二類型(動物を克服されるべき自然の象徴と見る近代主義的視野、動物を「存在の連続性」という原初的次元を開示する存在者と見る反近代主義的視野)を検討し、両者がともに動物=黒人兵を自分たちの言説に都合の良い他者として扱っていること、そのために「飼育」の重要な描写を見逃していることを論じた。なお、本発表は、『日本文学』2010年6月号に論文として掲載予定である。後者は、村上春樹の『1Q84』と大江健三郎の『宙返り』、『取り替え子(チェンジリング)』の比較を行なったものである。そこで明らかになったのは、村上と大江の近年の小説は、「言葉に翻訳不可能なもの」をめぐっている点で共通性を持つということ、しかし、村上はそれを中心化=超越化し、「実体としての固有性」を称揚するのに対して、大江はそれを他者たちによる「取り替え」の連鎖のなかに置き、「関係としての固有性」を重視しているということだった。平成20年度は、「動物とファシズム-大江健三郎「奇妙な仕事」論」(『日本近代文学』、第79集、2008年11月)と「書評原宏之著『言語態分析-コミュニケーショシ的思考の転換』」(『言語態』、第8号、2008年7月)の二本の論文を公刊した。前者は、従来の大江の初期小説研究に欠如していた動物の主題への観点を導入し、サルトルに代表される実存主義=ヒューマニズムの側面とは別に、ガスカールの動物小説から継承した人間性=主体性への疑念という側面が大江の初期小説に孕まれていたことを明らかにしたものである。この観点から出発すれば、「飼育」、「人間の羊」などの作品でも新たな読みを提示できると考えられ、現在学会発表、投稿論文を準備中である。後者は、『言語態』編集部からの依頼による書評である。原宏之氏は、東京大学言語清報科学専攻の出身であり、このたびその研究成果を一冊にまとめ、博士論文として提出された。本書評を執筆する過程で、フーコー『知の考古学』における言説分析の方法に関する知見を深めることができた。この知見を基盤としつつ、現在、大江の小説と同時代の諸言説が結び合う関係性を記述する可能性を探っている。この方向でも、次年度何らかの成果を発表したいと考えている。
無機/炭素層間化合物の合成とキャラクタリゼ-ション

本研究では3種の層状無機化合物(MoO_3,WOP_2O_7,Ti_2O_5)の層間にフェナントロリンを挿入した層間化合物を合成し,その炭素化により無機/炭素層間化合物を誘導することを試みた。さらに得られた層間化合物のキャラクタリゼ-ションも目的にした。その結果つぎのような結論を得ることができた。1.理想的構造をもった目的の無機/炭素層間化合物を得るには至らなかった。しかし,不完全な状態の炭素層が挿入された無機/炭素層間化合物を合成することができた。まだキャラクタリゼ-ションは行っていない。2.実験目的を完遂できなかった最大の理由は,層間のフェナントロリンが充分に炭素化する前に無機層が反応,変化してしまったことにある。今後はさらに耐熱性の高い無機層状化合物を使用するか,できるだけ低い温度で炭素化を促進する方法を導入することが必要である。3.無機/有機層状複合体の還元反応は,通常の無機/カ-ボンブラック混合物に比べて数100°Cも低温から開始した。4.無機/有機層状複合体の熱処理過程は,無機/カ-ボンブラック混合物と基本的には同じである。従って,一部の例外を除いて熱処理によって析出する結晶相は,両試料との同じである。5.無機/有機層状複合体は,通常の無機/カ-ボンブラック混合物に比べて,高温処理後も出発原料の結晶形態をそのまま残しやすい。従ってこうした複合体を使用により,炭化物単結晶を合成しうる可能性が示唆された。無機/炭素層間化合物を合成するためには、無機/有機層間化合物を合成し、その炭素化挙動を解明しておくことが必要である。本年度はMoO_3層間にフェナントロリンを挿入した、MoO_3/フェナントロリン層間化合物(MFと略)の炭素化挙動を、MoO_3/カ-ボンブラック混合物(MCと略)のそれと比較しながら検討し、つぎの知見を得た。1.MoO_3は800°Cで溶融するが、MC中のMoO_3は、400°Cまではそのままで、550°CでMoO_2に還元され、1000°Cでも溶融することなく、その状態が保持される。2.MFは550°CでMoO_2になり、そのまま700°Cでも存在する。しかし、1000°CでMoO_2へと還元される。この550°Cという温度は層間のフェナントロリンを炭素化して、MoO_3/炭素層間化合物に変換するには低すぎる。従って、MoO_3/炭素層間化合物の合成は不可能である。しかし1、2で述べたように、MFは、従来研究されてきたMoO_3/炭素混合物とは著しく異なった挙動をとる。700°C処理後のMFとMCは、共に炭素含有量約3%を含むMoO_2として存在する。しかし、さらに高温での処理で、MC中のCはCO_2として発生するが、MF中ではMoと反応してMo_2Cを生成する。これは、(i)MFから生じるMoO_2の結晶性がMCからのものに比べて低い、(ii)フェナントロリンから生じる炭素質は、カ-ボンブラックに比べて著しく微小で、反応性が高い。(iii)MCに比べて、MFから生じたMoO_2/炭素混合物では、両成分が非常にファインな、また緻密な接触状態にある。などの理由による。本年度は、申請した計画通り、さらに広範な層間化合物の炭素化挙動について検討を行う予定である。本年度は2種の無機/有機層状複合体の熱分解挙動について検討した。

現在までのところ,標記の無機/炭素層間化合物の合成には至っていないが,合成のための基本的知見,さらにはこの種の複合体の熱分解挙動の特異性を明らかにすることができた.1.WOP_2O_7/フェナントロリン複合体: WOP_2O_7をNa_2 S_2 O_4で還元して層間にNa^+を導入,ついでC_<12>H_8N_2(phenと略)で置換した.分析の結果(WOP_2O_7)^<ー0.7>/0.5phen^<ー0.7>・0.2H^+が得られた.比較試料として上述の複合体試料と同じ炭素含有量になるようにWOP_2O_7/カ-ボンブラック混合試料を調整した.両者を不活性雰囲気中で2400°C以下の各温度で熱処理した.複合体は通常の混合物に比べて,反応開始温度が200°Cも低温側にずれ,そのために結晶相の析出温度も低温側にずれること,また高温処理後に析出するWCの形態が原料複合体結晶の履歴を残しやすいことが明らかになった.2.Ti_2 O_5/フェナントロリン複合体: K_2Ti_2 O_5中のKを陽イオン交換によりphenで置換した層状複合体を作成した.これと炭素含有量が等しくなるようにH_2Ti_2 O_5/カ-ボンブラック混合試料を調整し,2400°C以下の不活性雰囲気中で熱処理した.ここでも基本的には1の場合と同じ現象が観察されたが,2400°C処理後に生成したTiC結晶はほとんど原料の針状結晶の形態を保持した.以上の結果,複合体の反応開始温度が低温側にずれるので,それ以下の温度で長期間,それも挿入炭素量の不足を補うためにカ-ボンブラックに埋め込むなどで完全な還元性雰囲気のもとで熱処理すれば無機/炭素層間化合物の合成は可能であろう.またこうした複合体を利用して炭化物単結晶を合成する可能性を示唆された.
防風通聖散およびその生薬成分の肝脂肪化抑制機構の研究

我々は漢方薬・防風通聖散(TJ-62)および大柴胡湯(TJ-8)の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠乏性脂肪性肝炎・肝硬変モデルを用いて実験を行なった。防風通聖散投与群および大柴胡湯投与群は肝線維化を有意に改善した。肝星細胞の活性化を有意に抑制した。また肝発癌については前癌性病変のマーカーであるGSTP蛋白の発現が、防風通聖散投与群と大柴胡湯投与群では有意に抑制した。これらの漢方薬での結果を2008年11月米国、サンフランシスコで開催された第95回アメリカ肝臓病学会でそれぞれ発表した。われわれは近年肥満改善薬として使用されている防風通聖散(TJ-62)が肝脂肪化抑制作用を有するかについて検討した。実験1.コリン欠乏食(CDAA)誘発脂肪肝ラットモデルをもちいて防風通聖散の効果を検討した。急性期のモデルとしてCDAA投与開始1週問目、2週間目、慢性期のモデルとして3ケ月目のサンプルを抽出した。防風通聖散投与群と非投与群をコントロールとして比較検討した。以下これまでに得られた結果を示す。1、血清学的検討では急性期1週目2週目ではALT、総胆汁酸がコントロールと比し有意に低下していた。また血漿中の総コレステロール、リン脂質、中性脂肪は有意に減少した。慢性期においてはALT、総胆汁酸、アルカリフォスファターゼ、コリンエステラーゼが有意に低下していた。2、組織学的検討では2週間では、コントロール群において殆どの個体が、細胞質全体を占めるほど大型な脂肪滴が認められる肝細胞脂肪化がびまん性に認められた。炎症性細胞浸潤、肝細胞の単細胞壊死も認められたが、1週間に比べ肝細胞の脂肪化が著しかった。防風通聖散投与群において脂肪化の改善が認められた。肝組織内の総コレステロール、リン脂質、総胆汁酸、中性脂肪濃度が有意に防風通聖散投与群では低下した。3ケ月目ではコントロール群では肝線維化率が上昇していたが、防風通聖散群では有意に低下が認められた。以上の結果より、in vivoにおいて防風通聖散は肝脂肪化を抑制し、肝線維化を抑制することが分かった。現在メダカを用いた防風通聖散通の個々の生薬を用いた肝脂肪化抑制作用にいてサンプリングを行なっている。これまで非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対して様々な治療が試みられているが十分な効果は上げていない。我々は漢方薬・防風通聖散(TJ-62)の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠乏性脂肪性肝炎・肝硬変モデルを用いて実験を行なった。肝線維化はアザン染色・シリウスレッド染色で評価し防風通聖散投与群は肝線維化を有意に改善した。肝線維化の中心的役割を示す肝星細胞の活性化をαSMA、TGF-βの免疫染色を用いて検討し有意に活性化を抑制していることを認めた。また肝発癌については前癌性病変のマーカーであるGSTP蛋白の発現について免疫染色にて評価し、防風通聖散投与群では有意に肝発癌を抑制した。また体重、血清蛋白質、血清ビリルビン値、肝線維化マーカーである血清ヒアルロン値も投与群で有意に改善した。遺伝子レベルにおいても線維化マーカーであるコラーゲンI、TGF-βのmRNAの発現も投与群において有意に抑制されていた。また8種類の生薬からなる大柴胡湯(TJ-8)についても同様の実験を行い、肝線維化及び肝発癌抑制効果を有意に持つことを実証した。以上の2つの漢方薬での結果を2008年11月米国、サンフランシスコで開催された第95回アメリカ肝臓病学会でそれぞれ発表した。漢方薬を使ったこの結果は代替医療の研究が進んだ米国でも注目されている。現在各生薬レベルでの肝線維化効果を検討するため、メダカを用いた脂肪肝・肝線維化モデルにおいて個々の生薬の作用機序について検討中である。
血清p53蛋白濃度と高濃度石綿曝露歴の関連性に対する分子疫学的研究

本研究の目的は佳子からの累積的ば曝露を有する石綿作業者の血清p53蛋白(p53がん抑制遺伝子産生物)について、喫煙、肺機能、胸部X線所見等、交絡要因を考慮しながら曝露との関連を調べることである。対象は500人超の石綿など鉱物繊維取扱者のコホートから抽出された120名で、インフォームドコンセントを得た後、1997,1998,1999年にELISA法で血清中p53蛋白(各pan-p53, mutant-p-53)を測定した。加えて尿中8-ハイドロキシデオキシグアノシンを酸化的損傷の指標として測定した。血清pan-p53の平均は50-75pg/mで、正の方向に歪んだ分布をしていた。3年度間の値は有意な正相関を示した。同様の傾向がmutant-p53においても認められた。興味深い結果の一つは、pan-p53が高値を示すものは一秒量(FEV1)の減少が加速する傾向にあったことである。対象者を四分すると、最も高値を示すもののFEV1減少の平均は148ml/年で、他の3グループ(-34,-33,-40ml/年)より喫煙や石綿曝露を補正してもなお有意に大きな減少であった。このことは、一秒量減少の加速とp53遺伝子の活性亢進が、感受性を共有する関係にある可能性を示唆するものである。石綿曝露と血清p53蛋白の詳細な解析は現在なお実行中である。本年度は、1985年より観察を行っている職域コホートの継続調査を行った.測定項目は、以下に示す通りである。1)末梢血中p53蛋白:Mutant-p53蛋白(変異蛋白の一種:PAb240抗体で検出)の測定3)肺機能測定4)呼吸器症状、生活習慣等の質問票調査5)業務歴調査尿中8ohdGの平均レベルは、有意ではないが曝露群の方が高い傾向を示した。じん肺所見の有無別では、じん肺有群に高値(有:22.6+/-25.6,無:16.8+/-17.1ng/mgCRE)を示した。また%FVC79以下のものに高値を示す傾向(79%以下:22.1+/-20.7.80%以上:16.3+/-17.8ng/mgCRE)があった。血清p53蛋白については、曝露群に高値を示すものが多かった。2年間の経年変化をみると、初年度の血清P53蛋白の絶対値が高いものが増加の程度が大きいという興味深い傾向が見られた。また、過去10年間のデータをもとにFVCの低下を傾きとして算出してみると、肺機能的に感受性が高いと思われる傾きが大きい群で、血清P53蛋白が高値を示す傾向があった。尿中8ohdGの高低で2群に分け、血清5p53蛋白との関係についてみたが明らかな関係は認められなかった。本研究からは、アスベスト曝露によって、尿中8ohdGと血清53蛋白ともに変化することが示唆されるが、その有効性を判断するには、さらに追跡調査が必要であると思われた。今後、白血球中の8ohdGやその修復酵素の発現量および多型についても考慮し、追跡調査していく予定である.本年度は、1985年より継続して観測を行っている職域のコホートに対して、昨年度に引き続き野外調査を実施し210名から有効な結果を得た。調査項目は以下の項目である。(1)血清中p53蛋白、Mutant-p53蛋白の測定(2)血清中抗p53蛋白抗体の検出(3)尿中8-hy-droxy-2'deoxyguanosine(8OHdG)の測定(4)白血球中80HdGの測定

(5)肺機能測定(スパイロメトリー、最大努力性呼出曲線)(6)呼吸器症状・生活習慣等の質問票調査(7)業務歴調査このうち(2)(4)は今年度新たに追加した測定項目である。p53蛋白(pg/ml)の測定は、ELISA(PAb1801抗体で検出)キットで行い、8OHdG(nmol/mmolCRE)は、ELISA(8OHdG特異的モノクローナル抗体N45.1で検出)で測定した。肺機能はローリングシール型スパイロメータを用い、呼吸器症状、業務歴等は標準化質問票および面接によって調査した。最後の調査が平成12年2月であったため、まだ最終的な解析を行っている途中であるが、現時点までの予備的な解析で、血清中p53蛋白、Mutant-p53蛋白、尿中、白血球中8OHdGには大きな個人間変動が認められた。また昨年度の値との間には、相関係数0.30.4程度の軽度の、しかし有意な相関が認められた。現在、質問票で得られた現病歴、既往歴、また持続性のせき・たんなどの慢性呼吸器症状やその他の自覚症状、喫煙等の生活習慣関連要因、および肺機能との関連性を検討しているが、肺機能加齢低下の加速と血清中p53蛋白、尿中8OHdG値の間に有意な関連が認められており、石綿曝露と個体の感受性という観点から興味深い結果である。石綿累積曝露との関連は、これらを加味した上で、また昨年度の測定対象者の結果とあわせて、解析の詳細を研究成果報告書にまとめる。
溶液核磁気共鳴法による光合成色素膜蛋白質複合体の構造と機能解析

これまで、色素・膜内蛋白質複合体(LH1)の単離・精製条件の最適化と色素(BChl a)の選択的及び全^<13>C標識を行い、再構成B820サブユニットを作成することに成功した。この過程において、複合体を構成するアポ蛋白質のN末端アミノ酸残基が酸化とメチル化を受けていることを初めて突き止めた。これらの成果は既に国際学術誌に掲載されている。(次頁を参照)これらの成果を踏まえて、再構成色素-膜蛋白質複合体中の主要なアミノ酸残基の挙動を調べるために、次のように^<15>N-と^<13>C-標識ペプチドを作製した。^<15>NH_4Clを含む培地でRs. rubrumを培養し、^<15>N標識のLH1蛋白を得た。同じ手法により、^<13>CH_3COONaまたは、CH_3^<13>COONaを用いて^<13>Cラベルの蛋白質を作製した。溶媒抽出法により、α-及びβ-サブユニットに分離した後、標識されたサブユニットと天然存在比のサブユニット及び色素分子との組み合わせで820nmに吸収ピークをもつ高濃度複合体の再構成を行った。異種核多次元相関パルス法を使って,再構成LH1の窒素、炭素並びに水素核の測定を行った結果、色素の中心金属Mgに配位するヒスチジン残基のイミダゾール側鎖が色素の環電流シフトを受けて、プロトンの化学シフトが高磁場側へ大きく変化したことが判明された。さらに錯形成に深く関わる幾つかのアミノ酸残基の同定を行った。これらの情報は、色素バクテリオクロロフィルと相互作用するベブチド側の側鎖部位を検討する有力の手がかりなる。本補助金の助成により、生理的活性を持つ色素膜蛋白複合体で、初めて色素由来の高分解能^1H-^<13>C相関スペクトルを得ることができ、これを含めた結果が近く国際学術雑誌に公表されることになっている(J. Am. Chem. Soc. 2002, in press)。平成12年度には、まず色素・膜内蛋白質複合体(LH1)の単離・精製条件の最適化と色素(BChl a)の選択的及び全^<13>C標識から着手した。NMRの測定にはこれまで最も高濃度(2mM)で、しかも室温で安定な均一再構成B820サブユニットを作成することに成功した。^<13>C標識した色素を組み込んだ再構成試料と重水素界面活性剤オクチルグルコシド(OG-d)を用いることにより、生理的活性を持つ色素膜蛋白複合体で、初めて色素由来の高分解能^1H-^<13>C相関スペクトルを得ることができた。ここで、観測された幾つかの特徴について述べる。1.色素と膜蛋白質との複合体形成に加え、界面活性剤によるミセル化の影響で、スペクトルの著しい広幅化が^1Hと^<13>Cの両方において見られた。特に、バクテリオクロリン環の運動性が長鎖フィトール基に比べて著しく制限され、ポリペプチド骨格にバクテリオクロリン環が高度に固定されていることが分かった。2.多くのシグナル分裂が観測された。例えば、3^2,12^1とP3aのメチル基プロトンが2本の共鳴シグナルを与え、8^2のメチル基プロトンは4本のシグナルに分裂している。特に、ピロール環IIとIIIに結合する側鎖のプロトンにこのような傾向が強い。これは色素分子のこれらの官能基が二量体サブユニットの中で、わずかに異なる磁気環境中に置かれていることを示唆している。3.複合体中における色素分子の化学シフトが有機溶媒中のものと比較して、大きく変化している。変化の大きい官能基は主にピロール環IVとVに集中し、その中で特に8^2のメチル基プロトンは最高で1.1ppm高磁場側ヘシフトした。これらの変化は主にポリペプチド側鎖及び色素分子同士との相互作用によるもので、色素蛋白複合体を形成する上で重要なアミノ酸残基の特定に有用な原子レベルでの情報を与えるものと考えられる。

異種核多次元相関パルス法を使って,再構成LH1の窒素、炭素並びに水素核の測定を行った結果、色素の中心金属Mgに配位するヒスチジン残基のイミダゾール側鎖が色素の環電流シフトを受けて、プロトンの化学シフトが高磁場側へ大きく変化したことが判明された。さらに錯形成に深く関わる幾つかのアミノ酸残基の同定を行った。これらの情報は、色素バクテリオクロロフィルと相互作用するベブチド側の側鎖部位を検討する有力の手がかりなる。本補助金の助成により、生理的活性を持つ色素膜蛋白複合体で、初めて色素由来の高分解能^1H-^<13>C相関スペクトルを得ることができ、これを含めた結果が近く国際学術雑誌に公表されることになっている(J. Am. Chem. Soc. 2002, in press)。
ヘリコバクター・ピロリ菌感染による胃上皮細胞におけるゲノム異常生成機構の解析

ヒトの発癌過程において種々の遺伝子異常が認められることが知られている。胃癌の多くはヘリコバクター・ピロリ菌(HP菌)感染を契機とした慢性胃炎を背景に発生すると考えられているが、その分子機序は不明のままであった。申請者らは、ヒトに生理的に備わっている遺伝子編集酵素Activation-Induced Cytidine Deaminase(AID)の機能異常が、胃発癌過程にみられる各種遺伝子異常に関与している可能性に着目した。本研究では、HP菌感染を契機とする胃発癌過程におけるゲノム異常生成機構の解明を目的とする。申請者らはすでに、1)HP菌感染を契機に胃上皮においてAIDが異所性に発現する、2)AID発現の結果癌関連遺伝子に点突然変異が誘導される、3)HP菌陽性ヒト胃上皮細胞では高率にAIDが発現していることを明らかにしており、HP菌感染による胃発癌過程における遺伝子変異生成・蓄積へのAIDの関与を示唆する重要な知見であると考えられた。そこで今後の研究をすすめるにあたって以下の内容を計画した。1)マウス胃組織においてAIDの持続的な発現による遺伝子変異生成・蓄積について詳細に検討すること、2)AID異常発現下の胃上皮細胞における染色体異常の有無について検討することである。活性化AIDを過剰発現する胃上皮培養細胞株を樹立し、Comparative genomic hybridization(CGH)microarray法により染色体異常についての解析を行った結果、複数の染色体においてある特定の癌抑制遺伝子領域の欠失が起こっていることが示された。またその遺伝子領域においては、高頻度に遺伝子変異を認めることが示された。本年度においては主に2)についての検討を行った。活性化AIDを過剰発現する胃上皮培養細胞株を樹立し、数Kbの微細ゲノム異常をゲノムワイドに俯瞰的に分析することが可能であるComparative genomichybridization(CGH)microarray法により染色体異常についての解析を行った。結果、複数の染色体においてある特定の遺伝子領域の欠失が起こっていることが示された。
異種移植モデルを用いたダウン症候群関連白血病の病態解析および特異的治療の基盤開発

ダウン症候群に起こる一過性異常骨髄増殖症(TAM)と引き続いて起こる白血病(AMKL)は、前白血病状態から白血病への移行過程を観察し得るモデル疾患である。我々は、TAM臨床検体を移植したTAMモデルマウスと、そこから継代が可能であった白血病モデルマウスを確立した。TAMモデルマウスと白血病モデルマウスのそれぞれについて詳細な遺伝学的解析を行ったところ、TAMマウスと白血病マウスでは、DNA修飾因子および遺伝子の発現パターンがそれぞれで異なり、この結果は臨床検体を用いた解析結果と一致した。本モデルを用いた解析により、白血病化に関わる重要な因子が明らかとなった。TAMはダウン症候群の新生児の10%に起こり、新生児期に白血病様の細胞が一過性に増殖する疾患で、多くは自然消褪する。約1020%の症例は、自然消褪した後に急性巨核芽球性白血病(AMKL)を発症する。TAMはダウン症候群に存在する21トリソミーに転写因子GATA-1の異常が加わって発症することが知られており、さらにTAM細胞に何らかの遺伝的異常が加わりAMKLへと進展することが推測されている。本研究では、TAMの異種移植モデルを作製し、白血病発症に重要な因子を特定し、新規治療開発への基盤開発を目指す。1)TAM患者検体の収集およびTAM異種移植モデルの作製全国より新規発生のTAM患者検体を収集し、さらに同意を得られた患者より提供されたTAM細胞(患者末梢血)をNOGマウスへ移植した。現時点で15症例の移植を行い、うち3例で生着を確認している。2)患者検体およびマウス由来検体の遺伝学的解析マウスへ生着した症例について、正常対照細胞、患者TAM/AMKL細胞、およびマウス内TAM由来細胞(一次、二次、三次移植検体)についてDNAを回収し、SNPアレイ解析を行った。生着したTAM 3症例は、基本的に由来患者の遺伝的性質を反映するものであった。引き続き、継代移植が可能であった1症例について、TAM細胞、1代目マウス由来細胞(TAMモデルマウス)、4,5,6代目マウス(白血病モデルマウス)についてエキソーム解析およびDNAメチル化解析を行った。エキソーム解析では、白血病モデルに共通する異常は検出されなかった。DNAメチル化解析では、患者検体であるTAM細胞と1代目マウス(TAMモデル)由来の細胞は同一のカテゴリーに分類され、4,5,6代目マウス(白血病モデルマウス)とは明確に分かれる結果となった。他の研究グループからの報告により、TAMから白血病への進展には、エピジェネティック修飾が関連する可能性が示唆されており、今回観察された事象は、その可能性を支持する結果であると考えられた。約10-20%の症例は、自然消褪したのちに急性巨核芽球性白血病(AMKL)を発症する。TAMはダウン症候群に存在する21トリソミーに転写因子であるGATA1の異常が加わって発症することが知られており、さらにTAM細胞に何らかの遺伝的異常が加わり、AMKLへと進展することが推測されている。本研究では、TAMの異種移植モデルを作製し、白血病発症に重要な因子を特定し、新規治療開発への基盤開発を目標とした。1)TAM患者検体の収集およびTAM異種移植モデルの作製全国より新規発生のTAM患者検体を収集し、さらに同意を得られた患者より提供されたTAM細胞を免疫不全マウスであるNOGマウスへ移植した。合計15例の移植を行った。2)患者検体およびマウス由来検体の遺伝学的解析3症例でマウスへの生着を確認した。うち継代可能であった1症例について、正常対照細胞患者TAM細胞、およびマウス内TAM由来細胞(一次、二次、三次移植検体)について、DNAを回収し、SNPアレイ解析、エキソーム解析、DNAメチル化解析を行った。エキソーム解析では、白血病モデルマウスにおいて共通する新たな異常は検出されなかった。SNPアレイ解析では、マウスモデルにおいて、過去にAMKLにおいて高頻度に指摘されている異常(CTCF欠損)を指摘した。本白血病進展モデルにおけるDNAメチル化解析の結果、患者TAM細胞と1代目マウス(TAMモデル)は同一のカテゴリーに分類された。一方で白血病モデルマウスとした4代目、5代目、6代目マウスでは、TAMモデルと比較して、特徴的なDNAメチル化パターンを示した。さらに遺伝子発現解析ではこのメチル化の異常が巨核球分化を阻害する方向に作用することが示された。以上から、ダウン症のAMKL進展において、DNAメチル化の異常が重要な役割を果たしていることが示された。平成26年度の計画は以下の通りである。

1)TAM患者検体の収集およびTAM異種移植モデルの作製2)患者検体およびマウス由来検体の遺伝学的解析(1エキソーム解析, SNPアレイ解析、2白血病発症に関わる候補遺伝子の抽出、3抽出された遺伝子異常の検証、4患者検体における詳細な検討)3)日常診療における、本実験系の予後因子としての有用性についての検証TAM患者検体の収集および異種移植モデルの作製については、TAM症例が発生した際に検体を収集し、異種移植を順調に行っている。またそれら作製した異種移植モデルマウスより採取した細胞について、エキソーム解析、SNPアレイ解析を行い、解析を行っている。近年、エピジェネティック修飾が、TAMからの白血病進展に関わっている可能性が示唆されているため、作製したモデルマウスにおけるDNAメチル化解析も合わせて行っている。本実験系の予後因子としての有用性の検討については、症例数の蓄積が必要なため、十分な検討が行えていないが、次年度の症例と合わせて検討することを予定している。以上のことから、本研究は概ね当初の予定通りに進行していると考えている。血液腫瘍これまでの研究結果から、移植を行ったTAM症例のうち、免疫不全マウスへ生着する症例はごく少数であることが分かっている。そのため、生着することが可能であった限られた症例について、TAM患者検体、TAMモデルマウス、白血病モデルマウスのそれぞれについて、網羅的な遺伝子解析、エピジェネティクス解析を継続して行っていく。これまでに得られた結果から、白血病モデルでは、DNAのメチル化にTAM細胞とは異なる一定のパターンが観察されることが明らかとなった。このことから今後は遺伝子発現解析を組み合わせて行い、これらエピジェネティック修飾が、どのような遺伝子の発現に関わるかについての検討も行う。これらにより白血病化に関わる因子について、遺伝的、あるいはエピジェネティック修飾について網羅的に解析を行い、白血病(AMKL)発症に真に重要な因子を同定することを目標に研究を進めていく。平成26年度と比較し、平成27年度は遺伝子発現解析などを行っていくため、より多くの使用金額が必要となるため。マウス由来骨髄細胞から、ヒト由来細胞を抽出する目的で使用するビーズ等の購入費用として使用する予定である。
炭酸アパタイト連通多孔体の気孔制御が骨置換速度に及ぼす影響

炭酸アパタイトは骨リモデリングと調和し、自家骨のように骨に置換する。申請者は炭酸アパタイトの骨への置換を飛躍的に加速するために石膏小球を前駆体とした炭酸アパタイト連通多孔体を調製する方法を確立した。本研究では当該方法を用いて、気孔径を制御し、気孔径が炭酸アパタイト連通多孔体の骨置換速度に及ぼす影響を検討した。日本家兎大腿骨に形成した骨欠損部に異なる気孔径を持つ炭酸アパタイト連通多孔体を埋入し、新生骨の形成を評価した。結果として、ブロック体と比較し、多孔体は早期に埋入部への新生骨の侵入を認めた。また、気孔径が小さいほど早期に新生骨が深部まで侵入しており、多孔体が吸収されていることが判明した申請者らは骨の無機組成が炭酸アパタイトであることに着目し、前駆体を用いた溶解析出反応による炭酸アパタイトの調製法を確立した。炭酸アパタイトは破骨細胞に吸収されるため、海面骨のように連通多孔体化によって骨置換速度の飛躍的加速が期待される。そこで申請者は連通多孔体化のために球体の六方最密充填構造に着目し、球が連結されてできた骨補填材は完全連通気孔をもつ骨補填材となり、また球径を変えることで、球間に形成される気孔径を制御することができると考えた。本研究では気孔径を制御し、気孔径が炭酸アパタイト連通多孔体の骨置換速度に及ぼす影響を検討することを目的とした。球を最密充填するには、形態のそろった球体を作成する必要性があり、申請者は油の中に水滴を落とすと界面張力によりその水滴が球形になる現象を用いたW/Oエマルジョン法で球体を作成した。完全な球体を作成するためにはエマルジョンの中で水相成分が固まる必要性があるため、自己硬化性のある半水石膏をもちいて球形を作成した。当該年度はW/Oエマルジョン法による石膏小球の球径制御が可能かをまず検討した。攪拌速度を変動因子とし、攪拌速度と得られる石膏小球の球径の関係を求めた結果、速度が上昇するにつれて、得られる石膏小球は小さくなることがわかり、1000rpmを超えると、直径1mm球を得ることができなくなることが分かった。また攪拌速度を変えたことによる球形態に違いは見られないことが分かった。次に異なる直径の石膏小球で連通多孔体の作製が可能かを検討した。推定気孔径が400、300、200、100μmになるように小球のサイズを直径1.00-1.18、0.71-0.85、0.50-0.60、0.21-0.30mmに分類し、それぞれ異なる大きさの小球で連通多孔体の作製を行った。結果、それぞれの球径において連通多孔体の作製が可能であることが確認できた。本研究は異なる球径の石膏球から気孔径の異なる石膏連通多孔体を調製し、当該多孔体を前駆体として炭酸アパタイト連通多孔体を調製し、炭酸アパタイト連通多孔体の気孔径が物性に及ぼす影響を検討するとともに、同連通多孔体を実験動物に埋入し、病理組織学的に連通多孔体の気孔径が炭酸アパタイトの骨置換速度に及ぼす影響を解析することである。当該年度は炭酸アパタイト連通多孔体の気孔制御が可能であるかの検討を行った。連通多孔体の気孔径は球径の大きさによって制御でき、また石膏小球から気孔径の異なる石膏連通多孔体を調製し、組成変換させて炭酸アパタイト連通多孔体を調製できることを確認した。実験動物を用いての病理組織学的解析が可能な状態である。申請者らは骨の無機組成が炭酸アパタイトであることに着目し、前駆体を用いた溶解析出反応による炭酸アパタイトの調製法を確立した。前年度において、異なる径をもつ形態のそろった球形を同条件で作製することに成功した。本年度は前年度に作製した小球を用いて連通多孔体を作成し、その物性評価を行った。石膏連通多孔体は半水石膏小球を積層したのち、蒸留水に浸漬し、球体周囲の余剰水を遠心分離機で除去することで、表面張力を利用して石膏球接触部に水を残し、当該水を利用して、硬化反応がすすむことで形成される。小球のサイズを直径1.00-1.18、0.71-0.85、0.50-0.60、0.21-0.30mmに分類し、それぞれ異なる大きさの小球で連通多孔体の作製を行った。

走査型電子顕微鏡による微細構造の観察を行ったところ、最小サイズの0.21-0.30mmを用いた場合、遠心分離低速度時に小球間の気孔が石膏の結晶成長により塞がることが分かった。また、石膏連通多孔体から炭酸アパタイト連通多孔体への組成変換を水熱処理を用いて行った。CHNコーダーによる炭酸基含有量の測定を行ったところ、作製した炭酸アパタイト連通多孔体は骨と同等量の炭酸基量を持つことが分かった。また、万能試験機にて圧縮強度を測定したところ、ハンディングプロパティに問題ない強度を持つことが確認できた。本研究は炭酸アパタイト連通多孔体の気孔径が物性に及ぼす影響を検討するとともに、同連通多孔体を実験動物に埋入し、病理組織学的に連通多孔体の気孔径が炭酸アパタイトの骨置換速度に及ぼす影響を解析することを目的とする。平成28年度においては作製した連通多孔体の物性評価を行ったが、異なる径の小球を同条件で連通多孔体にする方法に関して再検討が必要であり、時間を要した。そのため、当初の予定よりも動物実験の進捗状況が遅れている。申請者らは骨の無機組成が炭酸アパタイトであることに着目し、前駆体を用いた溶解析出反応による炭酸アパタイトの調製法を確立した。炭酸アパタイトは破骨細胞に吸収されるため、海面骨のように連通多孔体化によって骨置換速度の飛躍的加速が期待される。そこで申請者は連通多孔体化のために球体の六方最密充填構造に着目し、球が連結されてできた骨補填材は完全連通気孔をもつ骨補填材となり、また球径を変えることで、球間に形成される気孔径を制御することができると考えた。本研究では気孔径を制御し、気孔径が炭酸アパタイト連通多孔体の骨置換速度に及ぼす影響を検討することを目的とした。前年度までにおいて、異なる径をもつ形態のそろった球形を同条件で作製し、その作製した小球を用いて連通多孔体を作成することに成功したため、本年度は実験動物を用いての組織学的解析を行った。動物実験では日本白色家兎大腿骨に骨欠損を形成し、気孔径の異なる4種類(気孔径100、200、300、400μm)の炭酸アパタイト連通多孔体を、また対照試料として炭酸アパタイトブロックを埋入した。埋入4,8週後に大腿骨及び周囲組織をとりだし、固定を行った。標本はマイクロCTにて硬組織評価を、また一般組織染色(H&E染色)を行い、補填材の吸収程度、新生骨のリモデリングを評価した。結果、炭酸アパタイトブロックでは埋入8週後でも顕著な吸収は見られなかった。一方、炭酸アパタイト連通多孔体では気孔径に関わらず、気孔への組織の介入を認め、また気孔径400μmの炭酸アパタイト連通多孔体では顕著な吸収は見られなかったが、気孔径100μmでは吸収が見られることが分かった。炭酸アパタイトは骨リモデリングと調和し、自家骨のように骨に置換する。申請者は炭酸アパタイトの骨への置換を飛躍的に加速するために石膏小球を前駆体とした炭酸アパタイト連通多孔体を調製する方法を確立した。本研究では当該方法を用いて、気孔径を制御し、気孔径が炭酸アパタイト連通多孔体の骨置換速度に及ぼす影響を検討した。日本家兎大腿骨に形成した骨欠損部に異なる気孔径を持つ炭酸アパタイト連通多孔体を埋入し、新生骨の形成を評価した。結果として、ブロック体と比較し、多孔体は早期に埋入部への新生骨の侵入を認めた。また、気孔径が小さいほど早期に新生骨が深部まで侵入しており、多孔体が吸収されていることが判明した次年度は研究計画の2年目にあたり、1実験試料の追加解析および2動物実験、病理組織標本での検討を行う。昨年度において、粉末X線回折装置および赤外分光分析にて組成分析を行い、目的の試料が作製されていることが確認できたため、今年度は物性についての検討をおう。ピクノメーターを用いての気孔率の測定、走査型電子顕微鏡による微細構造の観察、CHNコーダーによる炭酸アパタイト顆粒の炭酸基含有量の測定を行う。また、動物実験では日本白色家兎の大腿骨に骨欠損を作成し、調製した骨補填材で再建を行う。組織標本は一般組織染色(H&E染色)を行い、補填材の吸収程度、新生骨のリモデリングを評価する。