hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大脳聴覚野における音順序学習のコリン作動性システム依存的メカニズム

ドーパミン受容体の非特異的阻害剤であるクロルプロマジン投与で水舐め行動と音順序弁別成績が抑制された。D1受容体阻害剤であるSCH23390投与では水舐め行動が抑制され、D2受容体阻害剤であるハロペリドールで音順序弁別が抑制された。これらよりD1受容体は水舐め行動の発現に、D2受容体は音順序弁別学習に関与することが示唆された。我々はこれまで音の順序の学習・記憶のメカニズムを明らかにするため、ラットの聴覚野スライス標本による研究をしてきた。聴覚野の二カ所を時間差をつけてテタヌス刺激すると、シナプス増強が刺激順序依存的に起こり、この順序依存性はムスカリン受容体に依存する。我々は順序依存的シナプス増強が音の順序学習の基礎となっていると仮説を立て、本研究では音順序弁別学習に聴覚野のムスカリン受容体、コリン作動性入力が関与するか検討し、以下の結果を得た。1ラットに二つの音の順序を弁別学習させるシステムを開発した。2ムスカリン受容体拮抗薬であるアトロピンの腹腔内投与により音順序弁別学習は抑制されたが、血液脳関門不透過性のメチルアトロピンは効果がなかった。一度上昇した順序弁別成績にはアトロピンの効果はなかった。これらより中枢のムスカリン受容体が音順序弁別学習の獲得過程に関与することが判った。3コリン作動性ニューロンに免疫毒性をもつ192IgG-saporinを聴覚野に投与すると、音順序弁別学習は抑制されたが、二音弁別には効果がなかった。4シナプス増強の順序依存性はリノピルジン(認知促進剤)をアトロピンと同時投与すると回復する。192IgG-saporinを聴覚野投与したラットにリノピルジンを投与すると順序弁別学習の成績は回復した。これらより音順序弁別学習は聴覚野のコリン作動性入力、およびムスカリン受容体に依存していることが分かった。また、スライス実験と弁別実験の結果が良く対応していることから、聴覚野シナプス増強の順序依存性が音順序弁別学習のメカニズムとして働いていると考えられる。我々の弁別テストでは水を報酬としているが、最近、音順序弁別学習が聴覚野へのドーパミン入力にも依存することが分かった。聴覚野のコリン作動性入力とドーパミン入力の両者の働きにより音順序弁別学習が獲得されると考えられる。
ヒラメ変態時の左右非対称性発現に関する内分泌学的研究

異体類の種苗生産において、白化・黒化および逆位など変態期の左右非対称性に関する形態異常が問題になっている。そのため逆位個体など「結果として」の形態異常に関する報告は多く見られるが、異常の「発現の機構」にせまる試みはなされていない。そこで、ヒラメ変態期の眼の移動に関係した硬組織の形成過程を詳細に明らかにし、眼の移動を細胞レベルで論ずる基盤とすることを目的とした。ヒラメ変態期には甲状腺ホルモンによって眼の移動が促進されることが知られているが、具体的にどの骨のどの方向への成長が調節されているかは明らかではない。そこで甲状腺ホルモンのT4(100ng/ml)あるいは、甲状腺ホルモンの合成阻害剤であるチオウレア(30ug/ml)に様々な段階でヒラメ仔稚魚を浸漬した。チオウレアへの浸漬によって変態は全般的に遅延するが、特にPseudomesial Barという眼の移動に不可欠とされる硬骨の骨化が見られた。他の骨要素や体色等にも浸漬するステージによって遅延の有無が観察され、組織毎に甲状腺ホルモン感受性が異なることが明らかとなった。また、T4に浸漬した群では、仔魚に特有な形質である伸長鰭条はどのステージからの浸漬によっても短縮が促進されたが、眼の移動についてはステージ特異的な促進効果が観察された。これらのことは発達に自動的にリンクしておこる変化とは別に、甲状腺ホルモンサージによってのみ促進される機構があることを示唆する。すなわち、種苗生産過程で起こる形態異常の原因として、発達過程の適切なタイミングで甲状腺ホルモンサージが起こっていない可能性がある。また、ヒラメ変態期仔魚の伸長鰭条の培養系を参考にして、硬組織を含む眼の周囲全体の組織培養系の確立を試みたが、本年度は培養自身に失敗したため、この点では結果は得られなかった。ヒラメの変態期におこる眼の移動のメカニズム、および左右非対称性の発現過程を明らかにするため、変態時期におこる硬組織の形成過程を詳細に明らかにし、眼の移動を細胞レベルで論ずる基盤とすることを目的とした。また、コルチゾルの役割についての基礎的な知見の収集を試みた。1)樹脂包埋切片の導入による頭部骨格形成過程の観察樹脂包埋による非脱灰薄切切片の作成と硝酸銀染色によって、ヒラメ変態期の頭部骨形成過程の観察を行った。その結果、異体類に特徴的な硬骨であるpseudomesial barの形成が、眼の移動の中心と推測された。また、これまで記載されていなかった一対の袋状の構造物が見つかり、retrorbital vesicleと名付けた。この構造物は眼の移動する右側にあるものが有意に大きく、また時期的にも眼の移動と同時に膨張していたことから、眼を積極的に押しやっている可能性が示唆された。2)変態期ヒラメのコルチゾル-ACTH系ヒラメ仔魚を、コルチゾルの合成阻害剤のメチラポン溶液(5mg/ml)中で飼育したところ、仔魚期に特徴的な形質である伸長鰭条が殆ど発達しなかった。このことはコルチゾルがヒラメ変態およびそれ以前の形態変化に関与していることを強く示唆する。しかしメチラポンとコルチゾルの同時投与群でも同様の形態が見られたため、メチラポンの毒性によって伸長鰭条の形成不全が起こった可能性は否定できない。免疫染色法を用いて発生に伴うACTHおよびMSHの産生開始時期を検討したところ、卵黄吸収が完了したステージAにおいて、両ホルモンとも既に免疫陽性細胞の存在が確認された。これらは、体内コルチゾル濃度の上昇が始まるよりもはるか以前である。変態が始まるステージGになると、脳下垂体の体積が増加するに従ってこれらのホルモン産生細胞の体積比は減少した。

また、ヒラメ変態期仔魚の伸長鰭条の培養系を参考にして、硬組織を含む眼の周囲全体の組織培養系の確立を試みたが、本年度は培養自身に失敗したため、この点では結果は得られなかった。
新規IgM受容体Fcα/μ受容体の濾胞樹状細胞における機能解析

【目的】濾胞樹状細胞(FDC)は、脾臓及びリンパ節の胚中心に局在し、樹状突起を伸ばし、3次元の網状組織を形成している。また補体レセプターやFcγRIIbを介して抗原を細胞表面上に長期間保持して、B細胞へ効率的に提示することによって、胚中心形成、クラススイッチ、メモリーB細胞の分化、体細胞突然変異による抗体の親和性成熟に重要な役割を果たしている。当研究室はIgM及びIgAに対する新規Fc受容体であるFcα/μ受容体(Fcα/μR)を同定し、Fcα/μRに対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による発現解析の結果、Fcα/μRがFDCに高発現していることを見いだした。本研究は、FDCにおけるFcα/μRの機能を明らかにすることを目的とする。【結果】collagenase処理を施した抗原未感作マウス由来脾細胞よりCD45陰性FDC-M2陽性細胞分画を同定し、さらにFACSAriaを用いて単離することに成功した。さらにTNFα及びLTβRアゴニスト抗体存在下で7日間の培養後、免疫染色を施したところ、細胞がネットワークを形成している様子が観察され、in vivoにおけるFDCの構造的特性が再現された。B細胞との共培養により、陰性対象群に比較し、B細胞の生存率の亢進、LPS刺激応答性のB細胞の増殖の亢進が確認された。これらの結果より、申請者のマウスから単離したCD45陰性FDC-M2陽性細胞はFDCであることが確かめられた。申請者は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、これらのFDCを観察して、Fcα/μRが細胞内、とりわけ小胞体やゴルジ体に発現している事、またLPSによるTLR4刺激を行うことにより、Fcα/μRが細胞膜上に発現する事を見出した。また、Fcα/μR欠損マウスおよび野生型マウス由来FDCに、IgM免疫複合体をふりかけたところ、野生型マウス由来FDCは細胞内に抗原を取り込んだにもかかわらず、Fcα/μR欠損マウス由来FDCは取り込まなかった。よって、FDC上のFcα/μRは、通常細胞膜上に補足される抗原抗体複合体をIgM抗体存在下でFcα/μRを介して細胞内に取り込むことを明らかにした。【結果】FDC上のFcα/μRの機能をin vivoで解析することを目的に放射線照射したFcα/μRノックアウトマウス及び野生型マウスへ野生型マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラマウスを作製した。FDCは放射線抵抗性であることから、これらの骨髄キメラマウスは血球細胞上にFcα/μRが発現し、FDCを含む非血球細胞上にもFcα/μRが発現したマウス(FDC^<WT>)もしくは消失したマウス(FDC^<KO>)となる。これらのマウスに対し、TNP-Ficollを尾部静脈より投与し、免疫組織染色法にてFDC上の抗原捕捉量を観察したところ、投与12時間及び24時間後には、FDC^<KO>マウスのFDC上での抗原捕捉の亢進が確認された。よってFcα/μRはFDCにおける抗原捕捉を負に制御している可能性が示唆された。また、collagenase処理して調整した脾臓細胞を各種細胞表面抗原に対する抗体を用いて染色し、フローサイトメトリー法によって詳細な解析を行った結果、CD45^-、VCAM-1^+、FDC-M2^+のFDC分画を単離することに成功した。

さらにTNFα及びLTβRアゴニスト抗体存在下で7日間の培養後、免疫染色を施したところ、細胞がネットワークを形成している様子が観察され、in vivoにおけるFDCの構造的特性が再現された。B細胞との共培養により、陰性対象群に比較し、B細胞の生存率の亢進、LPS刺激応答性のB細胞の増殖の亢進が確認された。これらの結果より、申請者のマウスから単離したCD45陰性FDC-M2陽性細胞はFDCであることが確かめられた。現在報告されている単離法が抗原感作後のリンパ節における活性化したFDC(FDC-M1陽性細胞)を標的に行われていることを考えると、申請者の開発した抗原未感作マウス脾臓からの単離法は、質、数ともに実験を行うにあたり、非常に優れたものであると考えられる。【目的】濾胞樹状細胞(FDC)は、脾臓及びリンパ節の胚中心に局在し、樹状突起を伸ばし、3次元の網状組織を形成している。また補体レセプターやFcγRIIbを介して抗原を細胞表面上に長期間保持して、B細胞へ効率的に提示することによって、胚中心形成、クラススイッチ、メモリーB細胞の分化、体細胞突然変異による抗体の親和性成熟に重要な役割を果たしている。当研究室はIgM及びIgAに対する新規Fc受容体であるFcα/μ受容体(Fcα/μR)を同定し、Fcα/μRに対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による発現解析の結果、Fcα/μRがFDCに高発現していることを見いだした。本研究は、FDCにおけるFcα/μRの機能を明らかにすることを目的とする。【結果】collagenase処理を施した抗原未感作マウス由来脾細胞よりCD45陰性FDC-M2陽性細胞分画を同定し、さらにFACSAriaを用いて単離することに成功した。申請者は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、これらのFDCを観察して、Fcα/μRが細胞内、とりわけ小胞体やゴルジ体に発現している事、またLPSによるTLR4刺激を行うことにより、Fcα/μRが細胞膜上に発現する事を見出した。また、Fcα/μR欠損マウスおよび野生型マウス由来FDCに、IgM免疫複合体をふりかけたところ、野生型マウス由来FDCは細胞内に抗原を取り込んだにもかかわらず、Fcα/μR欠損マウス由来FDCは取り込まなかった。よって、FDC上のFcα/μRは、通常細胞膜上に補足される抗原抗体複合体をIgM抗体存在下でFcα/μRを介して細胞内に取り込むことを明らかにした。
プロラクチンによる両生類精原細胞のアポトーシス誘起機構

我々は、プロラクチン(PRL)によるイモリ精原細胞のアポトーシス誘起機構について研究した。本研究は、以下のことを明らかにした。(1)精母細胞ステージのイモリにヒツジPRLを投与すると、精母細胞に分化する直前の精原細胞がアポトーシスを起こした。ブタFSHの同時投与はアポトーシスを回避した。精巣断片の器官培養の結果より、PRLは精巣に直接作用して精原細胞のアポトーシスを誘導する。(2)イモリを低温に移すと、血中PRL濃度が34倍上昇し、精原細胞にアポトーシスが誘導された。これはイモリPRLの抗体によって抑制された。イモリでは、春はPRLの血中濃度が低いため精母細胞は形成されるが、秋口に気温が低下すると血中濃度が上がるため精原細胞はアポトーシスを起こし精母細胞が形成されなくなると考えられる。(3)CHXもPRL同様に精原細胞にアポトーシスを誘導する。カスパーゼの広い阻害剤であるzVAD-fmkはPRLとCHX両方のアポトーシスを阻害した。カスパーゼ3の広い阻害剤3のイモリホモログの遺伝子をクローニングした。ノーザンブロットの結果よりカスパーゼ3のmRNAは精原細胞のステージに強く発現していた。一方、Ac-VAD-CHOやAc-DEVD-CHOは効果がなかった。これらの結果、精原細胞のアポトーシスには未知のカスパーゼが関与していると考えられる。(4)精巣の器官培養において、精原細胞はFSHがなくても6回の体細胞分裂まで進行するが、その後のアポトーシスによって精母細胞に分化できないことがわかった。つまり精原細胞が6回の分裂を完了した時点にチェックポイントが存在し、FSHがなければアポトーシスを起こすが、ある場合は7回目の分裂を行い減数分裂を開始すると考えられる。(1)イモリFSH受容体cDNAのクローニング:イモリFSH受容体の細胞外領域のcDNA断片をRT-PCR法によりクローニングした。さらに、イモリ精巣のcDNAライブラリーより全長のcDNAをクローニングした。イモリFSH受容体は696アミノ酸残基からなり、哺乳類のFSH受容体と約70%の相同性が見られた。ノーザンブロット解析の結果、約6.5kbの単一の転写産物が精巣で検出された。単離した精原細胞および体細胞(殆どがセルトリ細胞)から調製したmRNAを鋳型にRT-PCRを行ったところ、体細胞のみに単一のバンドが得られた。このことから、イモリ精巣においてFSHRmRNAはセルトリ細胞のみに発現していることが示唆された。(2)イモリ・プロラクチン受容体cDNAのクローニング:イモリ腎臓のcDNAを鋳型としたRT-PCRによりプロラクチン受容体遺伝子の断片をクローニングした。さらにcDNAライブラリーのスクリーニング及び3′RACE法により全長の遺伝子をクローニングした。イモリプロラクチン受容体遺伝子は626アミノ酸残基からなり、哺乳類のそれと49-52%の相同性が見られた。ノーザン解析の結果、脳と腎臓に強い発現が見られた。RT-PCR解析の結果、精巣、卵巣、肝臓にも発現が確認された。(3)イモリ・プロラクチン抗体投与による精原細胞のアポトーシス抑制:イモリを低温に置いたときに起こる精原細胞のアポトーシスが、下垂体からのプロラクチン分泌増加によるものかどうかを調べるため、イモリ・プロラクチン抗体を低温下でイモリ体腔へ投与したところ、少なくとも3日間は精原細胞のアポトーシスがほぼ完全に抑制された。

このことから、イモリが低温にさらされると、血中のプロラクチン濃度が上昇し精原細胞にアポトーシスを起こすことが示唆された。我々は、ヒツジプロラクチンをイモリ腹腔に注射すると、第一精母細胞に分化する直前の精原細胞が細胞死を起こし、FSHによってレスキューされることを見いだした。本研究は、プロラクチン受容体がどの細胞に存在するのか、FSHの作用とプロラクチンの作用はどうして拮抗するのか、プロラクチンによってどうして減数分裂開始直前の精原細胞だけがアポトーシスを起こすのか、プロラクチンによる精原細胞のアポトーシスの生理的意義は何か、を明らかにすることを目的とする。本年度は、次のことを明らかにした。(1)低温下での精原細胞のアポトーシス:低温下にイモリを置くと精原細胞が死ぬ理由を調べるために、イモリを22°C8°Cで飼育し、血中のプロラクチン濃度を測定したところ、8°Cや12°Cでは22°Cや18°Cに比べて約3倍高いことが明らかになった。また、8°Cにおいてイモリプロラクチン抗体を注射したところ3日間は精原細胞のアポトーシスを回避した。この結果、低温下で精原細胞が死ぬのは、イモリ下垂体から血中へのプロラクチンの分泌量が増すためであることを証明した。(2)イモリプロラクチン受容体遺伝子の発現:クローニングしたプロラクチン受容体遺伝子全長をCOS細胞に発現させるとその膜分画にプロラクチンが結合することから、機能的受容体であることを証明した。イモリプロラクチン受容体遺伝子の精巣における発現をRT-PCRで調べたところ、ステージ特異性は見られなかった。また、同遺伝子の発現はセルトリ細胞の方が高いものの生殖細胞でも発現が見られた。(1)プロラクチンとシクロヘキシミドによる精原細胞のアポトーシスにはカスパーゼが関与するシクロヘキシミドもプロラクチン同様に6回目の分裂を終えた精原細胞にアポトーシスを誘導する。カスパーゼの広い阻害剤である。zVAD-fmkはプロラクチンとシクロヘキシミド両方のアポトーシスを阻害した。一方、ICE阻害剤である。Ac-YVAD-CHOやcaspase-3阻害剤であるAc-DEVD-CHOは効果がなかった。これらの結果、6回目の分裂を終えた精原細胞のアポトーシスには未知のカスパーゼが関与していると考えられる。(2)精原細胞のアポトーシスと減数分裂開始のチェックポイント器官培養で、FSHがない場合、精原細胞は第一精母細胞に分化できない。これは6回の体細胞分裂完了まで進行するものの、その後のアポトーシスによって精母細胞に分化できないことがわかった。つまり、精原細胞が6回の分裂を完了した時点にチェックポイントが存在し、FSHがなければアポトーシスを起こすが、ある場合は7回目の分裂を行い減数分裂を開始すると考えられる。タンパク質合成阻害剤であるcycloheximideによっても6回の分裂後にアポトーシスが起こるので、FSHの影響によってセルトリ細胞で合成されるタンパク質が精原細胞のアポトーシスを回避するものと考えられる。
バングラデシュ産淡水フグの毒について一未知の猛毒クルペオトキシンおよびアオブダイ毒の解明に関連して

本年度は、まず、新たにバングラデシュで採取した淡水フグ数十検体につき毒性を調査したが、アオブタイ毒類似の遅延性毒はほとんど検出されなかった。そこで当初の計画を変更し、宮崎県で発生したアオブダイ中毒様食中毒について疫学調査を行ったところ、以下のような中毒の概要が明らかとなった。2003年2月20日、宮崎県延岡市沖の島浦島で釣り上げられた"ハコフグ"を男性2名が喫食し、このうち筋肉と肝臓の大部分を食べた1名が、11時間の潜伏時間を経て、横紋筋融解症、ミオグロビン尿症、CPK値の急激な上昇を呈して中毒した。これら諸症状の回復には数週間を要した。喫食者の証言によれば、問題の"ハコフグ"は皮膚に六角形の紋様がみられ、前額部に"ツノ"があったという。ハコフグOstracion cubicusにそのような"ツノ"はなく、従って、原因魚はハコフグに類似しているが、これとは異なるハコフグ科魚類であると推察された。次いで、中毒患者の発症2日目の血清(CPK値80,500 IU/I)につき、既報の方法に基づいて溶血活性試験を行ったところ、濃度50μl血清/mlで抗パリトキシン(PTX)抗体により抑制される遅延性の溶血活性を示したことから、原因物質をアオブダイ毒と同様のPTX類縁体と推定した。一方、酵素免疫学的手法を用い、フグにおけるフグ毒テトロドトキソン(TTX)の組織内微細分布ないし細胞内超微細分布に検討を加えたところ、TTXの分布は魚種により異なり、ナシフグでは皮膚の腺組織や卵母細胞内の卵黄胞、卵黄球なド、オキナワフグでは皮膚の分泌細胞や卵巣内の結合組織、卵母細胞核などに毒の分布が認められること、ミドリフグにおいては、TTXは皮の未分化基底細胞と分泌細胞に見られるが、さらに微視的には基底細胞中のリソゾームに局在すること、などか明らかとなった。本年度は、まず、バングラデシュ産淡水フグから既に得ている粗毒につき、効率の良い大量精製法を確立する目的で、予備的に二、三のカラムクロマトグラフィーを試みた。しかしながら、いずれの場合も生物活性を有する画分を十分量回収することができなかったため、同毒と性状が非常によく似ているアオブダイ毒に関連して、以下のような研究を行った。まず、藻食性のアオブダイが海藻とともに多量に混食している可能性の高いOstreopsis属渦鞭毛藻につき、産生する毒の生化学的性状を調べてアオブダイ毒と比較した。徳島県沿岸で採取したOstreopsis sp.の培養藻体(4 x 10^5 cells)から抽出後、溶媒分画に付して得た粗毒をマウスに投与したところ、1.0 x 10^<-4> MU/cellの遅延性致死活性を示した。この毒は、アオブダイ毒同様、マウスに対して血清クレアチンホスホキナーゼ(CPK)上昇活性を、マウスもしくはヒト赤血球に対して抗パリトキシン(PTX)抗体およびウアバインで抑制される遅延性溶血活性を示すことから、いずれもPTXもしくはその類縁体であることが強く示唆され、したがって、アオブダイは有毒渦鞭毛藻Ostreopsissp.を生物起源として毒化するとものと推察された。一方、最近西日本で発生したハタ科魚類による中毒に関して、中毒検体を用い、同様に毒の性状を調べたところ、遅延性致死活性ならびに抗PTX抗体およびウワバインで抑制される遅延性溶血活性を確認することができた。患者には共通してアオブダイ中毒に特有の横紋筋融解症、ミオグロビン尿症、血清CPK値の急激な上昇がみられたことなどから、アオブダイ中毒同様、本中毒の原因物質もPTXもしくはその類縁体であると推定された。この他、酵素免疫学的手法により、数種のフグにおけるフグ毒テトロドトキシンの組織内微細分布を明らかにした。

一方、酵素免疫学的手法を用い、フグにおけるフグ毒テトロドトキソン(TTX)の組織内微細分布ないし細胞内超微細分布に検討を加えたところ、TTXの分布は魚種により異なり、ナシフグでは皮膚の腺組織や卵母細胞内の卵黄胞、卵黄球なド、オキナワフグでは皮膚の分泌細胞や卵巣内の結合組織、卵母細胞核などに毒の分布が認められること、ミドリフグにおいては、TTXは皮の未分化基底細胞と分泌細胞に見られるが、さらに微視的には基底細胞中のリソゾームに局在すること、などか明らかとなった。
低エネルギー電子照射による半導体ナノ結晶の形成

化合物半導体GaSb(アンチモン化ガリウム)、InSb(アンチモン化インジウム)単結晶に低エネルギー(125 keV)の電子を100°C以上で照射したとき、内部に結晶方位のそろったナノサイズの微結晶が形成されることを新しく見出ている(Nitta et al., Philo. Mag. Lett., 2011)。このナノ結晶の形成メカニズムの解明が本研究の主たる目的である。そのために、GaSb、InSbに電子照射およびそれに加えてイオン照射を行い、その照射挙動についての知見を得た。化合物半導体GaSb(アンチモン化ガリウム)、InSb(アンチモン化インジウム)単結晶に低エネルギー(125 keV)の電子線を100°C以上で照射したとき、内部に結晶方位のそろったナノサイズの微結晶が形成されることを新しく見出ている(N. Nitta et al., Philosophical Magazine Letters 91 (2011))。このナノ結晶の形成メカニズムの解明および他の系の探索が本研究の目的である。加えて半導体中のナノ結晶は、バルクとは異なるエネルギー準位を持ち、新しい発光特性を示すことが期待されるが、現在のところナノ結晶のサイズ制御はできていない。本研究では、発生するナノ結晶のサイズと電子線照射条件との関係を調べ、サイズ制御方法を検討する。さらにその発光特性について調べ、新しい光デバイス創製をめざす。平成25年度は、GaSb、InSbに対して他の粒子線(イオンビーム)を照射した場合の効果を調べた。GaSb、InSbに集束イオンビームを用い、照射量、加速電圧、照射温度、照射材料の形状を変化させ照射実験を行った。イオン照射した表面に多孔質構造の形成を確認した。照射量が多く、加速電圧、照射温度が高く、薄膜よりバルク試料ほど表面に大きなサイズの多孔質構造が形成された。化合物半導体GaSb(アンチモン化ガリウム)、InSb(アンチモン化インジウム)単結晶に低エネルギー(125 keV)の電子線を100°C以上で照射したとき、内部に結晶方位のそろったナノサイズの微結晶が形成されることを新しく見出ている(N. Nitta et al., Philo. Mag. Lett. 91 (2011))。平成25年度は、電子線照射量と温度を変化させ実験を行った。加えてGaSb、InSb以外の他の系にナノ結晶が発現しないか確かめるために、種々の化合物半導体および元素半導体に対して照射実験を行った。GaSb、InSbでは、ナノ結晶は照射時間が長いほど、また照射温度が高いほど、大きさと密度が増加した。これはナノ結晶形成が原子のすべりによる部分転位の導入によって引き起こされるため、試料内に蓄積される応力が大きくなる照射時間の増加と、すべり運動の速度が速い高温の方が変形量が大きいためと考えられる。一方、Si、Ge、GaP、InPでは照射前後でナノ結晶の形成は確認されなかった。前年度、電子照射するときに使用する電子顕微鏡の真空度が高い(10-5Pa程度)とナノ結晶が形成されないことが判明している。高知工科大学では高真空の電子顕微鏡しか保有しておらず、平成26年度は25年度と同様、電子照射の代わりにInSbに対してイオンビーム照射実験を行った。InSbに集束イオンビームを用い、周期的な構造を作製後(トップダウン)、イオン照射を行い(ボトムアップ)形成されるナノ構造について調べた。ナノ構造の深さ方向への成長には、イオンビームのフラックスを小さくすることが有効であることを明らかにした。

材料工学電子照射するときに使用する電子顕微鏡の真空度が高い(10-5Pa程度)とナノ結晶が形成されないことが判明した。高知工科大学では高真空の電子顕微鏡しか保有しておらず、平成25年度は電子照射の代わりにGaSb、InSbに対してイオン照射実験を行った。予定していた照射条件(加速電圧、照射量、流束、温度の4種類)のうち、照射量と温度の2種類について実験が終了した。GaSb、InSb以外の他の系では、Si、Ge、GaP、InPについて確認が終了している。試料形状(バルク、薄膜、微粒子)を変化させた実験と、イオン照射で異常な挙動を示しているAlSbへの照射は行うことができなかった。平成26年度は、他大学にて、低真空での電子照射実験を行うとともに、平成25年度に引き続きイオン照射実験を行う予定である。それによりGaSb、InSbにおける粒子線照射効果を明らかにし、ナノ結晶形成メカニズムの解明に新たな知見を加える。平成25年度は、電子の加速電圧、流束の違いによる変化を観察する。特に超高圧電子顕微鏡によって、高エネルギー電子照射を行い、低エネルギー電子照射結果と比較を行う。加えて、ナノ結晶が、照射時の真空度の違いによって、GaSb、InSbでも形成されないことが今年度判明ている。そこで照射時の真空を変化させ実験を行う。形成されたナノ結晶の発光特性に関して、各サイズの試料においてフォトルミネッセンス測定を行なう。試料の購入数が少なかったため。成果発表において、国際学会に参加しなかったため。試料を購入予定。成果発表において、国際学会に参加予定(2015年3月TMS2015@Frolida)。化合物半導体単結晶基板電子顕微鏡フィルム写真現像用薬剤大阪大学超高圧電子顕微鏡センターでの実験研究成果発表(日本金属学会(春・秋))
子どもの運動学習に関する脳神経科学的バイオマーカーの探索

本研究では小学生の器械体操(マット運動)を対象とし、脳波事象関連電位や誘発電位を「運動学習能力の脳神経科学的バイオマーカー」として捉え、運動パフォーマンスと脳波事象関連電位や誘発電位との関連性(横断的研究)、トレーニングによって生じる運動学習能力の変化と脳神経活動の可塑的変化の関連性(縦断的研究)、運動学習過程で生じる子どもの運動イメージ形成能力に関わる脳血流動態と運動パフォーマンスとの関連を解析する。
グロー放電処理による歯科補綴物の表面処理ならびに表面改質に関する研究

本研究では、被着面に対する表面処理法としてグロー放電処理法をチタン製歯科補綴物に適用するため、温度変化、濡れ性の変化、表面清浄効果、歯科用接着システムにおける接着強さの変化、接着性モノマーの吸着状態から評価した。グロー放電処理には、周波数20kHz、出力電圧6.5kV(max)の高周波・高圧電源を有する、当教室試作のグロー放電処理装置を用い、チャンバー内を0.2Torrまで減圧した後、0.4Torrのアルゴン雰囲気中で、グロー放電処理を一定時間行った。チタン板は、グロー放電処理により約20°C上昇したが、長時間の処理はチタン表層を酸化させた。接触角は未処理の場合の51°から、45分間のグロー放電処理後で9°以下に低下し、短時間で顕著な濡れ性の向上が認められた。グロー放電処理後の細菌培養試験では、グロー放電処理により顕著な付着させた口腔内細菌のコロニー数の顕著な減少が認められた。SEM像において、グロー放電処理後には表層に付着した有機物が消滅し表層の清浄化が認められたが、完全な滅菌はできなかった。4種類中、3種類の硬質レジンシステムで接着強さ増加が見られたが、有意差は認められなかった。接着性の発現には、濡れ性の向上よりもプライマーに含有される機能性モノマーの吸着状態ならびに結合様式が大きな影響を及ぼしたためと考えられた。FT-IR-RAS分析からは、チタン表層に吸着した接着性モノマーに由来するピークがスペクトルに認められたが、吸着レジン量はグロー放電処理と未処理を比べ差は見られなかった。今回の実験から、グロー放電処理は歯科補綴物に対する有効な表面処理法の一つであることが認められたが、グロー放電処理を歯科臨床に応用するためには、さらに試料保持方法、処理条件等に改良の必要性が認められた。グロー放電処理(GDT)は、チタン表層を清浄化ならびに活性化させ、現在の歯科補綴物製作上必要不可欠な技術となっている接着性を向上させる可能性があるため、本研究ではGDTがチタン製歯科補綴物に及ぼす影響について検討した。GDT装置には、周波数20kHz、出力電圧6.5kV(max)の高周波電源を用いた試作装置を用い、0.4Torrのアルゴン雰囲気中でJIS2種チタン板(KS50)にGDTを一定時間施し試験片とした。GDTによるチタン板の温度上昇は、20°C程度であり、チタン製補綴物に対するGDTの影響は小さいと考えられたが、10分以上のGDT処理では表層を黄色化させるため、チタン表層を酸化させる可能性も示唆された。チタンに対する蒸留水の接触角は、未処理の51°から、急激に低下し5分間のGDTで8°になったが、その後の低下は小さかった。細菌培養試験から、GDTによってチタン上に付着した細菌のほとんどを死滅させることが可能であった。また、GDT後のSEM観察から、唾液により表層に付着した汚染物質がほぼ消滅し、清浄化されている像が認められた。接着強さの測定には、4種類の歯科用硬質レジンシステムを用いて行った。GDTにより3種類の硬質レジンシステムでGDT未処理の場合より接着強さの増加を生じたが、有意差は認められなかった。このため今後、接着耐久性や汚染された被着面に対するGDTの影響などについて検討を行う必要があると考えられた。また、各システムが用いる接着性プライマーによってチタンに対する接着強さには大きな差が認められた。現在開発中の直流電源を用いたGDT装置では、放電条件を制御可能になるため、より詳細なGDT条件の検討とともに、被着面に対するエッチング効果ならびに反応性ガスを用いた表面改質がチタン製歯科補綴物の接着性に及ぼす影響等について検討する予定である。

本研究では、被着面に対する表面処理法としてグロー放電処理法をチタン製歯科補綴物に適用するため、温度変化、濡れ性の変化、表面清浄効果、歯科用接着システムにおける接着強さの変化、接着性モノマーの吸着状態から評価した。グロー放電処理には、周波数20kHz、出力電圧6.5kV(max)の高周波・高圧電源を有する、当教室試作のグロー放電処理装置を用い、チャンバー内を0.2 Torrまで減圧した後、0.4 Torrのアルゴン雰囲気中で、グロー放電処理を一定時間行った。チタン板は、グロー放電処理により約20°C上昇したが、長時間の処理はチタン表層を酸化させた。接触角は未処理の場合の51°から、45分間のグロー放電処理後で9°以下に低下し、短時間で顕著な濡れ性の向上が認められた。グロー放電処理後の細菌培養試験では、グロー放電処理により顕著な付着させた口腔内細菌のコロニー数の顕著な減少が認められた。SEM像において、グロー放電処理後には表層に付着した有機物が消滅し表層の清浄化が認められたが、完全な滅菌はできなかった。4種類中、3種類の硬質レジンシステムで接着強さ増加が見られたが、有意差は認められなかった。接着性の発現には、濡れ性の向上よりもプライマーに含有される機能性モノマーの吸着状態ならびに結合様式が大きな影響を及ぼしたためと考えられた。FT-IR-RAS分析からは、チタン表層に吸着した接着性モノマーに由来するピークがスペクトルに認められたが、吸着レジン量はグロー放電処理と未処理を比べ差は見られなかった。今回の実験から、グロー放電処理は歯科補綴物に対する有効な表面処理法の一つであることが認められたが、グロー放電処理を歯科臨床に応用するためには、さらに試料保持方法、処理条件等に改良の必要性が認められた。
新規腎疾患診断法の開発：糸球体上皮細胞傷害機序の解明と尿中バイオマーカーへの応用

本研究は、慢性腎臓病(CKD)の主因となる慢性糸球体腎炎におけるポドサイトの傷害メカニズムを解明し、傷害マーカーの同定・尿中検出法の確立によって、「CKDの早期診断法の開発および有効な新規治療法につながるシーズを提供する」ことを目的としている。これまでの研究により、1慢性糸球体腎炎におけるポドサイト傷害の分子形態学的変化、2自己免疫疾患、およびそれに続発する慢性糸球体腎炎の病態における、第一染色体テロメア領域に存在する遺伝子座の関与、3CKD、特に慢性糸球体腎炎におけるポドサイト細胞傷害へのTLR8シグナル活性化の関与、4イヌの腎臓における糸球体、特にポドサイト特異的なTLR8の発現と、糸球体傷害時における発現増加を明らかとしてきた。本年度は、新たなポドサイト傷害仮説としての「インフラマソームとポドサイト傷害との関連」について解析を行った。慢性糸球体腎炎モデルマウス(BXSB/MpJ-Yaaマウス)の分離糸球体において、インフラマソーム関連因子は高発現を示し、ウエスタンブロットによる蛋白発現解析の結果、これらが活性化していることが明らかとなった。また、これらの因子の糸球体内mRNA発現量はポドサイト傷害スコアと強い正の相関を示し、その蛋白局在はポドサイト領域に限局した。これらの結果から、慢性糸球体腎炎において、インフラマソームの活性化がポドサイトの病理学的プロセスに関与する可能性が示唆された。これらの成果は、「CKDの制御」という本研究の最終目標につながりうる新知見であり、ポドサイトをターゲットとした創薬研究に向けた重要なアカデミックエビデンスとなる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、腎疾患、特に近年問題となっている慢性腎臓病(CKD)の主因となる慢性糸球体腎炎におけるポドサイトの傷害メカニズムを解明し、新たな傷害マーカーを同定することにより、「CKDの早期診断法の開発および有効な新規治療法につながるシーズを提供する」ことを目的とする。本年度はまず、自己免疫性糸球体腎炎モデルであるBXSB/MpJ-Yaaマウスを用いて、ポドサイトの分子病態の精査と、分離糸球体を用いた網羅的遺伝子発現解析によるポドサイト傷害マーカーの選抜を行い、以下のことを明らかとした。1BXSB/MpJ-Yaaは免疫複合体の沈着を伴う膜性増殖性糸球体腎炎を発症していた。また、本マウス糸球体では糸球体包内壁の上皮細胞(ポドサイト)の足突起の癒合・消失、スリット膜部の不明瞭化が認められた。さらに、糸球体におけるポドサイト機能因子の発現減少が認められ、その発現レベルは糸球体機能障害スコアと有意な相関を示した。2BXSB/MpJ-Yaaマウス発症初期個体の分離糸球体を用いた網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、TLRファミリー、およびその下流因子である炎症性サイトカインの発現上昇が認められた。107倍の顕著な高発現を示したTLR8の腎臓内局在を免疫組織化学法およびin situハイブリダイゼーション法により解析したところ、ポドサイトに強く局在した。さらに、ポドサイト株を用いて病態モデル血清でTLR8を刺激したところ、非感染性炎症が誘導された。以上より、これまで明らかでなかった自己免疫性糸球体腎炎におけるポドサイト傷害の実態、またその病理学的プロセスにToll-like receptorファミリーを介したシグナルが関与することを明らかとした。今後は病態モデルおよび培養細胞を用いた本病理学的メカニズムの全貌解明と、臨床サンプルを用いた外挿検証を行っていく。2014年度は、前年度に引き続き慢性糸球体腎炎モデルマウスにおけるポドサイト傷害の分子病理を精査と臨床サンプルの解析を行い、以下の成果を得た。1慢性糸球体腎炎モデルマウスであるBXSB/MpJ-Yaaマウスにおいて、Toll-like receptor(TLR)ファミリー、特にTLR8がポドサイトに高発現することを明らかとした。また、その他の慢性糸球体腎炎モデルマウスにおいても、糸球体においてTLR8が高発現していることを見出した。さらに、これら慢性糸球体腎炎モデルマウスにおいて、血清および糸球体中のTLR8の内因性リガンド、また尿中のTlr8 mRNAが高レベルに検出されることを明らかとした。2臨床サンプル(イヌ)の解析の結果、健常イヌの腎臓において、Tlr8 mRNAが検出された。抗TLR8抗体を用いた免疫染色の結果、健常イヌの腎臓において、免疫陽性反応は足細胞領域に限局した。慢性腎臓病と診断されたイヌの腎臓では、糸球体肥大、糸球体総核数の増加、メサンギウム基質の増生、および糸球体基底膜の肥厚が認められ、明瞭な糸球体腎炎像を呈した。本症例において、TLR8陽性反応は足細胞領域に局在し、その陽性強度は健常イヌのそれに比べて強かった。以上のことから、イヌの腎臓においてTLR8は糸球体、特に足細胞特異的に発現し、その発現は糸球体傷害時に増加する可能性が示された。以上より、TLR8は慢性糸球体腎炎におけるポドサイト傷害の早期診断ならびに治療法の開発に有用な標的分子になる可能性が示された。今後、さらなる基礎研究と臨床サンプルの解析を行い、人獣共通疾患としての慢性腎臓病制圧のための適切な方法論確立を目指す。

本研究は、慢性腎臓病(CKD)の主因となる慢性糸球体腎炎におけるポドサイトの傷害メカニズムを解明し、傷害マーカーの同定・尿中検出法の確立によって、「CKDの早期診断法の開発および有効な新規治療法につながるシーズを提供する」ことを目的としている。これまでの研究により、1慢性糸球体腎炎におけるポドサイト傷害の分子形態学的変化、2自己免疫疾患、およびそれに続発する慢性糸球体腎炎の病態における、第一染色体テロメア領域に存在する遺伝子座の関与、3CKD、特に慢性糸球体腎炎におけるポドサイト細胞傷害へのTLR8シグナル活性化の関与、4イヌの腎臓における糸球体、特にポドサイト特異的なTLR8の発現と、糸球体傷害時における発現増加を明らかとしてきた。本年度は、新たなポドサイト傷害仮説としての「インフラマソームとポドサイト傷害との関連」について解析を行った。慢性糸球体腎炎モデルマウス(BXSB/MpJ-Yaaマウス)の分離糸球体において、インフラマソーム関連因子は高発現を示し、ウエスタンブロットによる蛋白発現解析の結果、これらが活性化していることが明らかとなった。また、これらの因子の糸球体内mRNA発現量はポドサイト傷害スコアと強い正の相関を示し、その蛋白局在はポドサイト領域に限局した。これらの結果から、慢性糸球体腎炎において、インフラマソームの活性化がポドサイトの病理学的プロセスに関与する可能性が示唆された。これらの成果は、「CKDの制御」という本研究の最終目標につながりうる新知見であり、ポドサイトをターゲットとした創薬研究に向けた重要なアカデミックエビデンスとなる。本年度の成果により、Toll-like receptor(TLR)ファミリー、特にTLR8を介したシグナル活性化がポドサイトの病理学的プロセスに関与することを明らかとし、TLR8が慢性腎臓病の新たな診断ならびに治療法開発の標的分子となる可能性を示した。これらの成果は、「慢性腎臓病の制御」という本研究の最終目標につながりうる新知見であり、学術論文として海外学術雑誌において発表したほか、国内外の学術集会で報告し、最優秀口演賞を受賞するなど高い評価を得た。27年度が最終年度であるため、記入しない。「TLR8の下流因子である炎症性サイトカインとポドサイト傷害との関連」についてより詳細に明らかにするため、さらなる基礎研究、またヒトを含めた臨床サンプルの解析を行い、TLR8シグナルおよびその下流因子を介したポドサイト傷害の診断・治療法開発に向けてのアカデミックエビデンスを得ていく。本年度の主目標は、慢性糸球体腎炎におけるポドサイトの分子病態の精査と、分離糸球体を用いた網羅的遺伝子発現解析によるポドサイト傷害マーカーの選抜であったが、病態モデルを用いた解析により、超微形態学的および分子生物学的変化を伴うポドサイト傷害と、Toll-like receptorファミリーが関与する病理学的プロセスを明らかにし、本目標を達成できた。加えて、臨床サンプルの解析にも着手済みであり、イヌ・ネコ・ヒトにおける本病態の臨床的エビデンスが既に得られはじめており、今後さらなる進展が期待される。臨床サンプルの解析から、TLR発現動態の動物種差などの臨床応用上の問題点が明らかとなった。今後は、実験動物および培養細胞を用いたさらなる病理発生機構の解明に加えて、動物種差にフォーカスした臨床獣医学・医学への外挿検証を行っていく。
強磁場中コロイドプロセスによる高配向セラミックス作製に関する研究

本研究では、強磁場中でのコロイドプロセスによる配向に関し、理論による予測と実験から詳細に検討し、精密配向化のための要件を体系化することを目的とした。そのために、(1)微粒子の高分散化、(2)強磁場中配向過程の直接観察と理論的検討、(3)形状、サイズと容易軸磁化方向および磁場印加様式(静および動的磁場)の異なる試料の磁場印加方向を変えることによる配向度と配向方向の詳細な検討を行った。c軸が磁化容易軸な粒子として、Al_2O_3、TiO_2を、a,b軸が磁化容易軸の粒子として、HAP(水酸アパタイト)、Si_3N_4を取り上げた。粒子サイズがサブミクロン以上の微粒子分散系では、最も大きなエネルギーは重力である。また、磁化容易軸がc軸かa,b軸かにより、一軸方向に配向させるには、磁場印加方向および回転磁場の選択が重要である。さらに、この知見をMAX相セラミックスに適用し、Nb_4AlC_3およびTi_3SiC_2セラミックスの配向化に成功した。特に、配向性Nb_4AlC_3セラミックスの曲げ強度と破壊靱性は、セラミックス系の報告値との比較において、最も高い強度と靱性を示した。Al2O3、TiO2、HAP、Si3N4の粒状微粒子、棒状(針状粒子)、板状粒子にポリカルボン酸あるいはポリエチレンイミンを適量添加し安定サスペンションを得た。ここで、超音波照射により再分散させた試料の電子顕微鏡写真と粒度分布の関係を検討し、超音波では解砕が十分でない試料については、ビーズミルによる解砕を検討した。その結果、Al2O3、HAP、ZrO2ナノ粒子あるいは強く凝集した粒子は、超音波では解砕が不可能であったが、ジルコニア製ビーズのサイズを50μm15μmとしたビーズミルを行うことにより、一次粒子まで解砕が可能であることを実証した。a,b軸が容易磁化方向であるSi3N4に対して、静磁場と比較し、回転磁場の効果を検討した。静磁場中でのスリップキャスト、反応焼結では、面配向は可能であったが、c面でa,b軸はランダム配向であった。回転磁場の採用により、c軸に-軸配向したβ-Si3N4の作製に成功し、熱伝導度の方位依存性を示した。さらに、パターンの形成に対しては、磁場中でのMIMIC(Micro-Molding in Capillaries)法を試み、TiO2の配向パターンの作製に成功した。一部成形体について、放電焼結(SPS:Spark Plasma Sintering)を試み、成形体より焼結後の配向度は上昇し、高密度の配向焼結体が作製可能であることを実証した。本年の主な対象は、β-Si3N4の一軸配向体作製であり、そのため(1)微粒子の高分散化、(2)出発原料としてのα-Si3N4とβ-Si3N4の違い、(3)形状、サイズと容易軸磁化方向および磁場印加様式(静および動的磁場)の異なる試料の磁場印加方向を変えることによる配向度と配向方向の詳細な検討、(4)焼結助剤による液相焼結過程での相変態と配向の関係の検討、を行った。まず、静的磁場の磁場印加方向を変えることによる配向方向と試料形状、磁化容易軸との関係を明確にした。α-Si3N4およびβ-Si3N4ともに結晶磁気異方性により強磁場中でのコロイドプロセスによる配向が期待できるが、β-Si3N4の方が大きな配向度を示した。

さらに、出発原料のα-Si3N4に5%のβ-Si3N4添加することで、磁場配向したβ-Si3N4がシードの役割をし、液相焼結中に溶解したSi3N4が配向したβ-Si3N4に析出することにより、配向体が得られることが分かった。さらに、回転磁場を取り入れることで、一軸配向β-Si3N4が得られた。このとき、β-Si3N4として、ウィスカーを使用することで、より高配向なβ-Si3N4が得られた。一軸方向に配向したβ-Si3N4は、大きな熱伝導特性の配向依存性を示した。本研究では、強磁場中でのコロイドプロセスによる配向に関し、理論による予測と実験から詳細に検討し、精密配向化のための要件を体系化することを目的とした。そのために、(1)微粒子の高分散化、(2)強磁場中配向過程の直接観察と理論的検討、(3)形状、サイズと容易軸磁化方向および磁場印加様式(静および動的磁場)の異なる試料の磁場印加方向を変えることによる配向度と配向方向の詳細な検討を行った。c軸が磁化容易軸な粒子として、Al203、TiO2を、a,b軸が磁化容易軸の粒子として、HAP(水酸アパタイト)、Si3N4を取り上げた。粒子サイズがサブミクロン以上の微粒子分散系では、最も大きなエネルギーは重力である。また、磁化容易軸がc軸かa,b軸かにより、一軸方向に配向させるには、磁場印加方向および回転磁場の選択が重要である。したがって、粒子の種類、形状、サイズによって、配向度、配向方向は異なり、この体系化を図った。さらに、この知見をMAX相セラミックスに適用し、Nb4AlC3およびTi3SiC2セラミックスの配向化に成功した。ここでは、粉砕、再分散によるMAX相微粒子の分散サスペンションの作製、磁場中スリップキャストによる配向体の作製、パルス通電焼結による配向セラミックスの緻密化を行った。特に、Nb4AlC3においては、力学特性の方位依存性を検討し、曲げ強度はc軸方向への曲げの場合が1184.9±283.3MPaであり、破壊靱性はc軸方向への荷重時の場合が17.9±5.16MPa・m^<1/2>が得られた.c軸方向に曲げるとジグザグ破壊モードが現れ、このジグザグ破壊面は機械エネルギーから転換された表面エネルギーが大きいことを示した.配向性Nb_4AlC_3セラミックスの曲げ強度と破壊靱性は、セラミックス系の報告値との比較において、最も高い強度と靱性を示した。
神経細胞死防止作用をもつプロデテオグリカンの局在と機能に関する研究

細胞外マトリックス分子が中枢神経細胞の生存にどう関与するかを解明するため,胎生1819日目のラット脳から調製した初代培養神経細胞を使った研究を行い,以下の知見を得た。1新生児ラット脳から精製したコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPGs)は,用量依存性に大脳皮質及び海馬神経細胞のグルタミン酸による遅発性細胞死を防止した。2遅発生神経細胞死防止作用は,脳に特異的に発現するCSPGのひとつで,受容体型チロジンホスファターゼの細胞外ドメインと相同な分子であることが解明されているフォスファカンの特定コア蛋白領域にあるらしいことが判明した。3これを確認するため,推定されたコア蛋白領域と相同なリコンブナント蛋白を作製してその作用を検討した結果,遅発性神経細胞死防止機能はフィブロネクチンIII型リピートのすぐC末端側に位置するアミノ酸配列中に存在することが明らかになった。4ヘパラン酸プロテオグリカン(HSPGs)を微量測定するため,リポ蛋白リパーゼ(LPL)に対するポリクロナール抗体を利用した酵素免疫学的測定法を開発し,LPL結合性をもつHSPGsを,従来の方法より100倍以上高い感度で測定できることを示した。中枢神経組織の細胞外マトリックスの機能を解明する目的で、グルタミン酸によるラット脳初代培養神経細胞の遅発性細胞死防止作用をもつコンドロチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の同定を進めた結果、以下の成績を得た。1ラット脳可溶性分画から精製したCSPGのグルタミン酸による遅発性神経細胞死防止効果を検討した結果、急性神経細胞死と同様、防止作用がCSPGのコア蛋白にあるらしいことが明らかとなった。2 CSPGコア蛋白を臭化シアンで切断して作製したペプチドの効果とN末端アミノ酸配列を調べた結果、遅発性神経細胞死防止作用をもつペプチドのN末端アミノ酸配列は、受容体型チロジンフォスファターゼの一種で、既にコア蛋白cDNAがクローニングされているフォスファカンの特定領域と一致した。3この特定領域に含まれる3つの親水性領域と相同な合成ペプチドの作用を検討したが、明らかな遅発性神経細胞死防止作用や培養神経細胞の生存促進作用はみられなかった。以上の結果を踏まえ、遅発性神経細胞死防止作用がフォスファカンコア蛋白の特定領域にあると断定するには、この領域と相同なリコンビナント蛋白の作用を検討する必要があると考え、現在その実験を進めている。また、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)の免疫学的微量測定法を開発したほか、CSPGのmRNAおよびDNAレベルでの発現と分布を検討する目的で、ジゴキシゲニン標識RNAおよびPCRプローブを用いた非RI検出の基礎実験を行っている。神経細胞死防止作用をもつプロテオグリカンを同定するため,新生児ラット脳の可溶性画分からコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPGs)を精製して,ラット大脳皮質,海馬初代培養神経細胞のグルタミン酸による遅発性細胞死に対する防止効果を検討し,以下の結果を得た。1,臭化シアンで切断したCSPGsコア蛋白の作用解析から,プロテオグリカン型プロテインチロジンホスファターゼの細胞外ドメインと同じ分子であることが解明されているフォスファカンに遅発性神経細胞死防止機能があるらしいことが判明した。2,これを確認するため,フォスファカンコア蛋白の各領域と相同なリコンビナント蛋白を作製してそれらの作用を解析した結果,フィブロネクチンIII型リピートのC末端側に位置するコア蛋白領域が防止機能をもつことが判明した。しかし,遅発性神経細胞死防止機能がこのコア蛋白領域に特異的かどうかを確認するには至らなかった。フォスファカンの遺伝的てんかんラット脳における発現と分布を検討する準備として,ジゴキシゲニン標識RNAプローブを用いたノーザンブロットとインサイチュハイブリダイゼーションでSDラットにおけるフォスファカンmRNAの検出を試みたが,期待した感度が得られず,アイソ-トプ標識DNAプローブとポリクロナール抗体でmRNA,蛋白レベルの発現を検討中である。ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPGs)については,リポプロテインリパーゼとこれに対するポリクロナール抗体を用いて,ng/m1濃度のHSPGs測定が可能な酵素免疫測定法を開発し,ラット脳HSPGsの測定に応用可能なことを確認したが,神経細胞死との関係,発現と分布については検討できなかった。
酵母を用いたヒトch-TOG相同遺伝子による染色体分配制御の解析

酵母におけるヒトch-TOG相同タンパク質Dis1ならびにMtc1について以下の解析を行なった。まずDis1-GFP融合タンパク質の解析からDis1は分裂期中期から後期にかけての極めて短い時期に動原体に局在することを見出した。さらに解析を進め、Dis1は微小管結合タンパク質であると同時に、分裂期特異的に動原体DNAの中央領域に結合するタンパク質であることが明らかとなった。次に我々はゲノムデータベースを検索し、分裂酵母にもう一つこのファミリーに属するタンパク質Mtc1を同定し、解析を行なった。Mtc1もDis1と同様に微小管と結合することを示し、Mtc1破壊株では許容温度においても細胞質微小管がほとんど消失していることを見出した。一方Dis1については変異株ならびに遺伝子破壊株で間期の細胞質微小管には異常が見られないことから同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子でありながら機能が多様化していると考えられる。これらの遺伝子産物と相互作用する因子の探索を主として行なった。まずDis1を用いて酵母ツー・ハイブリッド法により、Dis1自身とMal3を同定した。EB1,Mal3共に微小管結合活性を持ち、細胞内で微小管と共局在することが知られている。Dis1は自分自身、ならびにMal3と結合することで微小管機能を制御する因子かもしれない。また、Dis1,Mal3共にヒト相同遺伝子とアミノ酸の高度な保存性を保持していることから、この物理的相互作用ならびにそれら複合体の機能も種間を通じて保存された機構によるものかも知れない。本研究の一連の解析の結果により、進化的に高度に保存された分裂酵母の2つの微小管結合タンパク質Dis1,Mtc1は、各々独立した機能制御を受けながら、微小管を介した細胞周期制御、とりわけ分裂期における微小管機能、並びに動原体機能に必須機能を持つことが明らかとなった。酵母におけるヒトch-TOG相同タンパク質DislならびにMtclについて以下の解析を行なった。まずDisl-GFP融合タンパク質をタイムラプス撮影し、Dislの細胞周期における局在変化を生細胞内で解析した。その結果、驚いたことにDislは分裂期中期から後期にかけての極めて短い時期に動原体に局在することを見出した。さらに解析を進め、Dislは微小管結合タンパク質であると同時に、分裂期特異的に動原体DNAの中央領域に結合するタンパク質であることが明らかとなった。次に我々はゲノムデータベースを検索し、分裂酵母にもう一つこのファミリーに属するタンパク質Mtclを同定し、解析を行なった。MtclもDislと同様に微小管と結合することを示し、興味深いことに、Mtcl遺伝子中央部のDislと相同性を示さない領域が結合に必須であることが明らかとなった。Mtcl遺伝子破壊株は生育可能であるが高温感受性を示した。Disl遺伝子破壊株が低温感受性であることと逆の関係にあり、両遺伝子の重破壊株は致死となることから重複した機能を持つと考えられる。Mtcl破壊株では許容温度においても細胞質微小管がほとんど消失しており、細胞の変形が観察された。スピンドル微小管は形成されるが、スピンドルの位置ならびに形態に異常を示すごとから、Mtclは間期、分裂期共に微小管の安定性に寄与していると考えられる。一方Dislについては変異株ならびに遺伝子破壊株で間期の細胞質微小管には異常が見られないことから同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子でありながら機能が多様化していると考えられる。本研究の一連の解析の結果により、進化的に高度に保存された分裂酵母の2つの微小管結合タンパク質Disl, Mtclは、微小管を介した細胞周期制御、とりわけ分裂期における動原体機能に必須機能を持つことが明らかとなった。