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OSASの多様性に対応した個別化治療の構築―薬物療法の可能性の探索―

閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)の標準的治療法は持続陽圧呼吸(CPAP)療法であるが、CPAPをうまく使用できない患者は少なからず存在する。しかしCPAPの代替的・補助的な治療法は未だ確立されていない。OSASに対する薬物療法の有効性は現在では懐疑的であるわけだが、今回の我々の研究で、ある特定の薬剤に効果を示すことが予想される症例を選定したうえで投与すれば、十分にその効果と有用性が得られることを示唆する結果を得ることができた。閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)の標準的治療法は経鼻的持続陽圧呼吸(CPAP)療法である。CPAPの有効性および生命予後改善効果は明らかにされているものの、CPAPを拒否したり継続できない患者が少なからず存在する。しかしながらCPAPの代替的あるいは補助的な治療戦略は未だ確立されていない。このような背景のもと、OSASのphenotypeを反映する覚醒時安静呼吸不規則性を指標に個々の呼吸調節特性を見極め、薬剤が有効であると予測できる患者に限定して薬剤を投与することで、現在OSASの治療法として実地臨床でほぼ用いられることのない薬物療法の有用性を明らかにすることが本研究の目的である。本年度は呼吸安定化作用をもつ炭酸脱水酵素阻害薬(アセタゾラミド)、およびセロトニン1A受容体作動薬(クエン酸タンドスピロン)の急性期効果の検討を行った。対象症例は覚醒時安静呼吸が不規則であり、かつ診断的終夜睡眠ポリグラフ検査(PSG)でCPAP療法の適応と診断されたOSAS患者のうちCPAP不耐患者とした。現時点で解析終了症例は2例であり、アセタゾラミド投与症例、クエン酸タンドスピロン投与症例それぞれ1例である。アセタゾラミド投与症例では250mgを入眠1時間前に投与してPSGを行ったところ、覚醒時安静呼吸不規則性は顕著に改善し、かつ無呼吸低呼吸指数(AHI)は65%低下しCPAPの保険適応であるAHI 20を下回ったため、CPAPを中止してアセタゾラミドを継続投与中である。クエン酸タンドスピロン投与症例では10mgを入眠1時間前に投与してPSGを行ったところ、覚醒時安静呼吸不規則性は改善したが、AHIは不変であった。そのためクエン酸タンドスピロンにCPAPアドヒアランス改善効果があるか否かを検討するためにCPAPに併行して継続投与中である。現在継続して症例を集積しているところである。閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)の標準的治療法は経鼻的持続陽圧呼吸(CPAP)療法であるが、CPAPを拒否したり継続できない患者が少なからず存在する。このような背景のもと、呼吸安定化作用をもつ薬剤が有効であると予測できる患者に対して、実地臨床で用いられることが殆どないOSASに対する薬物療法の有用性を明らかにすることが本研究の目的である。対象は、覚醒時安静呼吸が不規則であり、終夜睡眠ポリグラフ検査(PSG)でCPAP療法の適応と診断されたOSASのうちCPAP不耐患者とした。炭酸脱水酵素阻害薬(アセタゾラミド)およびセロトニン1A受容体作動薬(クエン酸タンドスピロン)の急性期および慢性期効果の検討を行った。現時点での解析終了症例は6例(投与薬剤の内訳:アセタゾラミド5例、クエン酸タンドスピロン1例)である。薬剤単回投与下でPSG(急性期効果評価)を行ったところ、覚醒時安静呼吸不規則性はアセタゾラミド投与群では5例中4例で、1例のクエン酸タンドスピロンクエン投与症例で改善を示した。アセタゾラミド投与症例中1例は無呼吸低呼吸指数(AHI)がCPAPの保険適応であるAHI 20を下回るまで改善したためCPAPを中止。その改善効果は3ヶ月後も維持していることをPSGで確認した。AHIが20を下回るまで改善しなかった症例のうち4例に対してCPAPと当該薬剤を3ヶ月間継続併用したところ、全例でCPAP使用状況は改善傾向を示した。さらにOSASに有効な新たな薬剤を探索するなかで、脳波覚醒閾値を上昇させる薬剤が有効であると予測できる症例を識別する手法として、覚醒から入眠に伴う換気量低下の度合いにおける個人差が有用である可能性を示すことができた(J Clin Sleep Med 2015, in press)。OSASの標準的治療法はCPAPであるが、CPAPを拒否あるいは継続できない患者が少なからず存在する。炭酸脱水酵素阻害薬(ACZ)およびセロトニン1A受容体作動薬(クエン酸タンドスピロン)の急性期および慢性期効果の検討を行った。症例は7例で、投与薬剤の内訳はACZ 6例、クエン酸タンドスピロン1例である。

薬剤単回投与下でPSG(急性期効果評価)を行ったところ、覚醒時安静呼吸不規則性はACZ投与群では5例中4例で、1例のクエン酸タンドスピロンクエン投与症例で改善を示した。ACZ投与症例5例中4例で平均37%の無呼吸低呼吸指数(AHI)の改善を得たが、1例ではAHIの改善を認めなかった。またACZ投与群でCPAPを中止できた症例は2例で、ACZ中止4ヶ月後のPSG(慢性期効果評価)ではAHIの改善が維持されていた。CPAPを中止できなかった症例ではCPAPとACZを併用して加療継続を行ったが、全例でCPAPアドヒアランス(使用頻度と一晩あたりの使用時間)の改善を認めた。クエン酸タンドスピロンクエン投与症例では、単回投与ではAHIに改善を認めなかったが、CPAPと併用したところ、CPAPアドヒアランスは著明に改善を示した。以上から、症例は少ないものの、OSAS、とりわけ覚醒時呼吸不規則性を呈するOSASでは呼吸安定化作用をもつ薬剤が有効であり、またCPAPアドヒアランスを改善させる可能性が示された。閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)の標準的治療法は持続陽圧呼吸(CPAP)療法であるが、CPAPをうまく使用できない患者は少なからず存在する。しかしCPAPの代替的・補助的な治療法は未だ確立されていない。OSASに対する薬物療法の有効性は現在では懐疑的であるわけだが、今回の我々の研究で、ある特定の薬剤に効果を示すことが予想される症例を選定したうえで投与すれば、十分にその効果と有用性が得られることを示唆する結果を得ることができた。本研究について、奈良県立医科大学医の倫理委員会での承認を得ることに時間を要したこともあり、解析終了症例は6例にとどまっているものの、着実に臨床研究登録症例を増やしており、さらに平成26年度は慢性期効果を検討することもできている。またOSASに対する薬物療法の有効性を予測する新たな指標についての原著論文もアクセプトされており、進捗としてはおおむね順調であると考えている。呼吸器病学さらに登録症例を集積し、それぞれの薬剤の急性期および慢性期効果の検討を継続していく予定である。また症例の蓄積を待って原著論文を作製する予定である。本研究について、奈良県立医科大学医の倫理委員会での承認を得ることに時間を要したこともあり、解析終了症例は2例にとどまっている。しかしながら、平成25年度には炭酸脱水酵素阻害薬(アセタゾラミド)、平成26年度にはセロトニン1A受容体作動薬(クエン酸タンドスピロン)の急性期効果を検討する予定であったものを、併行して2薬剤の検討を行っているため、平成26年度も含めての進捗としてはおおむね順調であると考えている。本研究について、奈良県立医科大学医の倫理委員会での承認を得ることに時間を要したこともあり、解析終了症例は6例にとどまっている。また本邦の高血圧治療ガイドラインに従って治療を行っても降圧効果が十分でない高血圧合併OSAS症例に対してクエン酸タンドスピロンの投与を行っているため、該当症例が少なく、クエン酸タンドスピロン購入にかかる費用および本臨床研究参加者に対する謝金(薬剤の評価目的の睡眠検査にかかる費用の一部を還付)が予算を下回ったため。さらに登録症例を集積し、それぞれの薬剤の急性期効果の検討を継続していく予定である。急性期効果の結果次第で、当該薬剤を単独投与あるいはCPAPに併用する症例に分けて、3ヶ月間の薬剤の慢性期効果およびCPAPアドヒアランス改善効果についての検討を引き続いて行う予定である。本研究は臨床介入試験であるため、臨床研究賠償責任保険に加入し、薬剤に起因した健康被害の発生に備えている。そのため継続して保険加入にかかる費用が発生する。
勾配流による結び目のエネルギーの解析

今年度は,メビウス・エネルギーの離散化について, Salzburg大学のSimon Blatt氏,埼玉大学の長澤壯之氏と取り組んだ.エネルギーの離散化とは多角形に対するエネルギーのことである.離散化エネルギーの勾配流は連立の常微分方程式になる.これは元のエネルギーの勾配流を空間方向に離散化したものになっているはずで,数値実験を行うときに有効と考えられ,これが離散化を考える動機の一つである.メビウス・エネルギーの離散エネルギーは少なくとも2種が知られている.Kim-Kusnerの離散エネルギーとSimonによる最小距離エネルギーである.これらのエネルギーは,メビウス・エネルギーの名前の由来であるメビウス不変性という性質を失っている.ここでは,メビウス不変性という構造を保ったまま離散化が可能かを考え, 2種の離散化を得た.一つは,共形角をメビウス不変を保ったまま離散化することで離散エネルギーを定義した.これは多角形の頂点数を増やしていくとメビウス・エネルギーにΓ-収束することも示された.他方は,石関-長澤の分解を離散化する方法で別の離散エネルギーを定義した.これらは,石関-長澤の分解による分解エネルギーを解析することで得られたものである.エネルギー密度はメビウス不変性を持たないが,その積分値がメビウス不変性になる.ここでは,分解エネルギー密度に積分値が0になるような適当な量を加えることでメビウス不変なエネルギー密度になることが分かった.これ自身は興味深いものと思われる.こうして書き直された分解エネルギーを離散化することで,石関-長澤の分解のメビウス不変離散版を構成した.これらの成果は,共同研究者により,複数の研究集会と日本数学会で発表された.また, 2つの論文として纏め,学術誌に投稿中である.年次計画として予定していた研究内容とは多少異なるものの、関連する内容の研究を遂行し、論文投稿も行った。Simon Blatt氏を訪問し、最新の研究内容に関してセミナーや議論を行った。1, 2年目の年次計画と多少異なるものの、進捗状況に合わせ適宜順番を入れ替えることで、効率良く進められるよう、調整しながら研究を進める。また、前年度同様、当研究課題遂行にあたり有力な助言者であるSimon Blatt氏の訪問も再び実現し、最終年度に目的が達成できるよう研究を進めていく。メビウス・エネルギーはO'Haraエネルギーの一つである。今年度の研究は、石関-長澤の分解(Kodai Math. (2014), J. Knot Thoery of Ramifications (2016))が、O'Haraエネルギーに対しても成り立つかどうかを調べたものである。メビウス・エネルギー以外のエネルギーは一般にメビウス・不変性を持たない。従って、余弦公式に相当するものは知られていない。しかし、メビウス・エネルギーの分解は、余弦公式を経由せずに示せたうえ、分解が「曲がり具合」と「ねじれ具合」を測るというメビウス・不変性以外の幾何学的性質を持つため、O'Haraエネルギーでも同種の分解が成り立つと考えるのは自然である。実際、O'Haraの(α,1)-エネルギーについて、2≦α< 3の場合に同様の分解が成り立つことが示された。但し、分解の第3項は絶対定数でなく長さのみで決まる定数となる。α= 2の場合はエネルギーがスケール不変になるため、これが長さにも依らない定数となり、絶対定数になるという構造が明らかになった。O'Hara (1994)によれば、α≧2はエネルギーが自斥性を持つための条件であり、α< 3は任意の滑らかな自己交叉を持たない閉曲線に対してエネルギーが有限になるための条件である。従って、2≦α< 3は、(α,1)-エネルギーが結び目のエネルギーとして機能する場合と言える。更に、O'Haraエネルギーのべき乗を単調増加関数に置き換えたエネルギー(一般化されたO'Haraエネルギー)についても適当な条件下で分解定理が成り立つことが示された。これは、長澤壯之(埼玉大学)との共同研究による成果で、共同研究者により、国内外の複数の研究集会と日本数学会で成果発表された。また、論文として纏め、学術誌に投稿中である。年次計画として予定していた研究内容とは異なるものの、関連する内容の研究をほぼ遂行でき、論文投稿も行った。また、本研究課題の遂行にあたり有力な助言者であるVon der Mosel氏を訪問し、研究集会への参加および研究連絡を行った。今年度は,メビウス・エネルギーの離散化について, Salzburg大学のSimon Blatt氏,埼玉大学の長澤壯之氏と取り組んだ.エネルギーの離散化とは多角形に対するエネルギーのことである.離散化エネルギーの勾配流は連立の常微分方程式になる.これは元のエネルギーの勾配流を空間方向に離散化したものになっているはずで,数値実験を行うときに有効と考えられ,これが離散化を考える動機の一つである.メビウス・エネルギーの離散エネルギーは少なくとも2種が知られている.Kim-Kusnerの離散エネルギーとSimonによる最小距離エネルギーである.これらのエネルギーは,メビウス・エネルギーの名前の由来であるメビウス不変性という性質を失っている.ここでは,メビウス不変性という構造を保ったまま離散化が可能かを考え, 2種の離散化を得た.一つは,共形角をメビウス不変を保ったまま離散化することで離散エネルギーを定義した.これは多角形の頂点数を増やしていくとメビウス・エネルギーにΓ-収束することも示された.他方は,石関-長澤の分解を離散化する方法で別の離散エネルギーを定義した.これらは,石関-長澤の分解による分解エネルギーを解析することで得られたものである.エネルギー密度はメビウス不変性を持たないが,その積分値がメビウス不変性になる.

ここでは,分解エネルギー密度に積分値が0になるような適当な量を加えることでメビウス不変なエネルギー密度になることが分かった.これ自身は興味深いものと思われる.こうして書き直された分解エネルギーを離散化することで,石関-長澤の分解のメビウス不変離散版を構成した.これらの成果は,共同研究者により,複数の研究集会と日本数学会で発表された.また, 2つの論文として纏め,学術誌に投稿中である.年次計画として予定していた研究内容とは多少異なるものの、関連する内容の研究を遂行し、論文投稿も行った。Simon Blatt氏を訪問し、最新の研究内容に関してセミナーや議論を行った。1年目に行う予定だった研究内容を引き続き2年目にも行う。2年目に行う予定だった研究内容は、1年目に得た成果から同時進行で行うことが可能である。1, 2年目の年次計画と多少異なるものの、進捗状況に合わせ適宜順番を入れ替えることで、効率良く進められるよう、調整しながら研究を進める。また、前年度同様、当研究課題遂行にあたり有力な助言者であるSimon Blatt氏の訪問も再び実現し、最終年度に目的が達成できるよう研究を進めていく。
エネルギー転送回路を用いた超伝導発電機用励磁電源システムの検討

本年度は、提案した超伝導発電機の発電機端に系統安定化用の小型のSMESを設置し,この貯蔵装置からエネルギー転送装置を介して発電機の超伝導界磁巻線を励磁するシステムについて、1.エネルギー転送回路について詳しい解析を行い、SMESから界磁巻線へエネルギーが転送され励磁が可能であることを確認し、その特性を解析した。この時界磁巻線にかかる電圧のリプルを低減する制御アルゴリズムを提案して、その有効性を計算機シミュレーションで確認した。2.超電導発電機の界磁巻線の仕様、要求される速応励磁制御のパターン(励磁速度、励磁電圧、励磁電流)を基にして、励磁電源としての転送回路の設計SMESの設計の方法を検討した。3.この制御アルゴリズムを基に、提案した超電導マグネットとエネルギー転送回路を用いた励磁電源を持つ速応励磁型超電導発電機が送電線を介して無限大母線につながれている一機無限大母線系統に対してモデルを構築し,計算機シミュレーションコードを作成した。これは,変換器の転流動作、高調波の影響まで模擬し,従来の励磁電源との比較を行えるものである。また、発電機の系統事故時の速応励磁制御を模擬するため,詳細な過渡状態を表現できるモデルとしている。4.このシミュレーションコードを用いて,貯蔵用マグネットからのエネルギー転送による発電機の励磁制御動作の確認をおこなった。詳しい解析検討は今後の課題である。
オルトキノンメチドアナログを活用した縮合多環式複素環化合物の合成

本研究は、高反応活性なオルトキノンメチドアナログの穏和な発生法と立体選択的な分子内付加反応を活用して、含酸素、含窒素および含硫黄系の縮合複素環化合物の新しい合成法を確立することが目的である。(1)オルトキノンメチドのチオアナログを発生させることができれば、B環にSを含む多環式化合物が得られると期待される。そこで、チオサリチルアルデヒド誘導体を合成して、不飽和アルコールとの反応を検討した。初めにMOMエーテル保護体を用いて反応を行ったところ、目的化合物の合成に成功したが、立体特異性が発現しなかった。そこでTHPエーテル保護体を合成し、三フッ化ホウ素エーテル錯体を触媒として反応を行ったところ、良好な収率で、しかも立体特異的に二置換の三環式化合物を合成することに成功した。(2)次に、B環にO,C環にSとOを含む多元素多環式化合物の合成について検討した。即ち、5-メチル-3-チア-4-ヘキセノールを合成してサリチルアルデヒドとの反応を検討したところ、通常の反応条件では三環式化合物は低収率で、二環式化合物が副生した。そこで、オルトギ酸エステルを用いず、ルイス酸を用いたところ、目的の三環式化合物を高収率で得ることに成功した。さらに、アルコールとしてシクロヘキサン環構造を持たせた化合物を用いたところ、良好な収率で四環式化合物を合成することができた。(3)生理活性天然物Stachybotrinのような酸素と窒素を含有する三環式化合物の合成について検討した。初めにMannich反応を用いて含窒素ヘテロ環を構築し、次にグリシジルフェノール体を合成して、酸触媒で環化を行うと、目的とする含酸素ヘテロ環を構築できた。本研究は、高反応活性なオルトキノンメチドアナログの穏和な発生法と立体選択的な分子内付加反応を活用して、含酸素系および含硫黄系の縮合複素環化合物の新しい合成法を確立することが目的である。(1)オルトキノンメチドのチオアナログは今まで合成に使われた報告がない。これを発生させることができれば、B環にSを含む多環式化合物が得られると期待される。そこで、チオールサリチルアルデヒドを合成して、不飽和アルコールとの反応を検討した。酸化の副反応を防止するためにチオールサリチルアルデヒドMOMエーテルを用いて反応を行ったところ、。目的化合物の合成に成功した。しかし通常の条件下では立体特異性がなく、中間体としてオルトキノンメチドチオンアナログが生成したかどうか疑問がある。そこで予め両者を穏和な条件で反応させてアセタールとした後、加熱条件で環化を行うと、立体特異的に目的生成物が得られた。(2)B環にO,C環にSを含む四環式化合物の合成について検討した。2-プレニルシクロヘキサンチオールを合成し、サリチルアルデヒドとの反応を検討したところ、対応するシクロヘキサノールに比べて反応は低温で速やかに進行し、目的の四環式化合物を合成することに成功した。(3)次に、B環にO,C環にSとOを含む多元素多環式化合物の合成について検討した。
マルチスペクトルマシンビジョンを中核としたほ場環境センサによるPFシステムの開発

本研究はマシンビジョンで検出できる様々な情報の中でもとりわけ重要なものの一つである作物生育情報を検出することを目的とし,具体的には葉色測定による作物のクロロフィル濃度の推定,植被率算出による作物物理量の推定を行なった。開発したセンシングシステムを産業用無人ヘリコプタに搭載して,グランドベースセンシングよりも飛躍的に高効率なリモートセンシング法を考案した。リアルタイムビジョンシステムの開発リアルタイムでセンシングを可能にする作物生育診断システムを構築した。マシンビジョンとしてDuncan Tec製MS2100を供試した。葉色予備実験や屋外での圃場実験を通してMS2100を用いた作物生育情報の検出手法を考案した。取得できた作物生育情報は葉色値LCI,植被率VCRであり,特にVCRに関して高いセンシング精度が見られた。この2情報を用いて実生長量指数RGIIという空間に存在するクロロフィルの絶対量を推定する指標を導入し,収量調査の結果と比較した。RGIIと収量である雌穂正味重量との相関はR^2=0.684となり,7月末の段階で収量を予測することができた。ヘリコプタをプラットフォームにしたセンシングシステム無人ヘリコプタに搭載されたイメージングセンサMS2100から画像を取得し,GISでマッピングできるシステムを開発した。機体のロール角,ピッチ角,ヨー角の計測には,供試ヘリコプタに内蔵されている慣性センサを用いた。ポジショニングセンサとしてRTK-GPSを採用し,画像取得のためにイメージングセンサを機体下に搭載した。ヘリコプタの姿勢変化に伴い,画像に外部歪が生じるが,3次元の回転変換及び地表面への透視変換による座標変換を行うことで解決できる。画像データを座標変換し,マッピング精度を評価した。変換誤差は29cm以内であった。これは作物情報をセンシングする上で十分な測位精度と判断できる。1)画像データからの生育情報の抽出と記号化雑草認識・作物成長情報画像データを実空間に変換することにより,作物の個体レベルの成長度合に関する情報を取得した.近赤外画像を情報圧縮して作物(大豆)の個体レベルの高さ・幅といったサイズを推定する手法をニューラルネットワークを用いて開発した.800nmの近赤外フィルタを通して取得された画像データを情報圧縮して植生(作物・雑草)密度として記述し,ファジィ推論によって雑草認識を施す.画像中から雑草領域を除去した後,9入力2出力のニューラルネットワークに入力して,作物の高さ・幅を推定する.検証用データに対して0.85程度のr^2が得られた.さらに市販のGISソフトウェアを使用して,作物の生育マップの作成を行った.住抱栄養情報作物の栄養状態は可視領域の分光反射特性を用いて認識できる.今年度は作物の窒素ストレスを検出する方法を検討した.すでに窒素ストレス診断用センサとしてミノルタ(株)製のSpadmeterがある.このSPAD値をマシンビジョンによって推定するために,コーンを対象に窒素ストレスの異なる観測プロットを設定して葉の分光反射特性とSPAD値の関係を調べた.窒素ストレスを検出するスペクトルセンサの場合,光波長550nmの葉身反射率を測定する必要がある.開発したSPAD推定アルゴリズムによって推定値とSPAD値の間に0.90のr^2が得られ,作物の窒素ストレス検出法として十分な計測原理を確立した.2)マルチスペクトルセンサの基本設計以上の知見を元にマルチスペクトルセンサの基本設計を行なった.160万画素のデジタルカメラを供試して,緑色と赤色領域の550,650nm,近赤外領域の800nmの干渉フィルタを装備する.さらに太陽光の変化を補償するために,イルミネーションセンサを装着して,画像データの正規化を行なう.

次年度以降試作システムについて実験を開始する.本研究はトラクタに搭載できる程度に小型で,作物の窒素栄養ストレスが検出できるマシンビジョンセンサの開発を目的としている.屋外環境下で使用するセンサの開発は,どの波長領域の光エネルギを測定するかという点,また光源変化による誤差をどのように補正するかが重要な問題となる.今年度はマシンビジョンを用いて作物葉面からの太陽光反射率を測定し,作物体の栄養状態の推定を行った.その際,作物体の栄養状態を表現する指標としてディジタル葉緑素計(SPADメータ)の指示値であるSPAD値を採用した.今年度得られた成果をまとめると以下の通りである.1.分光測色計によって葉面反射率を測定することにより,SPAD値を精度良く推定することができた.G,R分光の反射率を用いることによって,高精度にSPAD値が推定可能であることから,マシンビジョンに装備する光学バンドパスフィルタの波長帯をG,R付近に決定した.2.トウモロコシ,小麦いずれの作物においても,NIR画像の土壌領域と植物領域で輝度値に明らかな違いが存在した.輝度の高い領域を作物体として認識して二値画像を作成し,土壌領域の除去を行なった.3.トウモロコシ,小麦の2作物においてマシンビジョンによるSPAD値推定を行なった.4.屋外条件に対して二つの異なる補正法を用い,それぞれの評価を行なった.一つは光源に起因するデータのぱらつきを近赤外900nm付近のスペクトル画像との比を求めることにより補正する方法である.もう一方は光強度が測定できる光量センサを用いて太陽の日射量を測定して補正を行い,葉面反射率をより正確に測定した.5.異なる天候(照度)条件において,マシンビジョンを用いて160×100mの大規模ほ場の窒素ストレスマップを作成した.本研究はトラクタに搭載できる程度に小型で,作物の窒素栄養ストレスが検出できるマシンビジョンセンサの開発を目的としている.屋外環境下で使用するセンサの開発は,どの波長領域の光エネルギを測定するかという点,また光源変化による誤差をどのように補正するかが重要な問題となる.今年度はマシンビジョンを用いた植物の生育情報を検出できるNIR領域の波長を含むマルチスペクトルビジョンセンサを開発し,作物,土壌,雑草を識別する波形解析を行い,有効な認識アルゴリズム,モデル化手法を開発した。2.トウモロコシについて窒素基肥を0,5,10,18kg/10aに調整・設定した試験圃場を用意して,画像データから生育情報の抽出と記号化手法を検討した.試作センサのReferencedataに高精度ビジョンセンサによる画像,SPAD値,Chlorophyll-aの液クロ分析値を採用し,ハードウェア・ソフトウェアの両面から作物生育センサを評価した.3.最後に試作したセンシングシステムを用いて,圃場レベルでの窒素ストレスマップをGISによって作成し,試作センシングシステムの有効性を検証した.
義歯床下粘膜の負担圧に関する研究

義歯床下組織に加わる負担圧分布を測定するために、微少静電容量型圧力センサーを応用し、その有用性と精度について検討を加え、十分満足のいく精度で圧力分布の測定が可能であり、義歯床下組織に加わる負担圧の測定に有用であるという結論を得た。そこで、この圧力センサーを用い、上顎全部床義歯ならびに支持組織を想定したシミュレーターを作製し、咬合力の作用点、臼歯人工歯の頬舌的配列位置、義歯床口蓋の材質の違いが負担圧分布に与える影響について検討を加えたところ、以下の結果を得た。1)支持骨骨面上の負担圧量は、荷重点の位置の変化にともなって著しく変化した。2)臼歯人工歯を頬側寄りに排列した場合は、口蓋部での圧負担域が広がり、口蓋全体での負担圧量が大きくなった。3)臼歯人工歯を舌側寄りに排列した場合には、口蓋部での圧負担域が広がり、口蓋全体での負担圧量が増加したが、最大負担圧量は小さくなった。4)金属床義歯とレジン床義歯を比較した場合、口蓋部での圧負担域が、特に大臼歯部口蓋斜面部の圧負担域が広まった。また、最大負担圧も減少した。しかし、歯槽頂付近を荷重した場合には、口蓋部での圧負担域は広く、平衡側の口蓋部にも圧負担部位が認められた。以上、床下組織の保護という立場から、臼歯人工歯は、頬側寄りに配列することは好ましくなく、多少、頬舌側に排列位置をずらさなければならない場合には、金属床を用いた方が、負担圧を均等に分散させるのに適していることが明らかとなった。今後は、これらの結果を参考に効果的な負担圧の分散方法について検討を加えていく予定である。義歯床下粘膜に加わる負担圧に影響を及ぼす因子を解明するためにシミュレーター上で負担圧を測定することとし,今年度は,その第一段階として,62年度科学研究費補助金により購入した圧力分布測定システム(SPECTROMASTER 7001)と現有のパーソナルコンピューターを用いて,静電容量型圧力センサの較正試験を行い,センサの有用性について検討を加えたところ,以下の結果が得られた.1)圧力分布測定システムの圧力センサは,従来の感圧導電性ゴムを用いた圧力センサよりも直線性が高く(相関係数0.995),圧力測定に適している事が判明した.2)実験測定値は12kg/cmD12D2と小さく,利用する圧力センサには低圧高感度が要求されるため,電極層間にはさむ弾性ゴム材は分解能,精度の点で既製のゴムよりはむしろ硬度の低いウレタンが適している.3)荷重を0から2Kg/cm^2まで増加させたあと,減少させるという荷重サイクルを加えた場合,その増減過程において出力電圧値は一致せず,ヒステリシスが認められた.その最大値は圧力値に換算して50g/cm^2であった.また,無荷重時の出力電圧値は0とならず,負の値を示し,クリープが認められた.しかし,その値は小さく,補正は可能であった.以上の実験結果より,今回改良を加えた圧力センサの誤差範囲は,最大±5%F.S.であり,従来から使用されているダイヤフラム型圧力センサと比べれば精度的(同様の実験結果から誤差は±1%F.S.)には多少おちるものの,センサの密度を細かくでき,かつ,煩雑な配線を簡略化できることなどの利点があり,定性的ならびに多数点での圧力測定には適した圧力センサであると考えられる.義歯床下組織に加わる負担圧分布を測定するために、微少静電容量型圧力センサーを応用し、上顎全部床義歯ならびに支持組織を想定したシミュレーターを作製した。

このシミュレーターを用いて、咬合力の作用点、臼歯人工歯の頬舌的排列位置、義歯床口蓋の材質の違いが負担圧分布に与える影響について検討を加えたところ、以下の結果を得た。1)支持骨骨面上の負担圧量は、荷重点の位置の変化にともなって著しく変化した。2)臼歯人工歯を頬側寄りに排列した場合は、口蓋部での圧負担域が広がり、口蓋全体での負担圧量が大きくなった。3)臼歯人工歯を舌側寄りに排列した場合には、口蓋部での圧負担域が広がり、口蓋全体での負担圧量が増加したが、最大負担圧量は小さくなった。4)金属床義歯とレジン床義歯を比較した場合、口蓋部での圧負担域が特に大臼歯部口蓋斜面部の圧負担域が広まった。また最大負担圧も減少した。しかし、歯槽項付近を荷重した場合には、口蓋部での圧負担域は広く、平衡側の口蓋部にも圧負担部位が認められた。以上、床下組織の保護という立場から、臼歯人工歯は、頬側寄りに配列することは好ましくなく、多少、頬舌側に排列位置をずらさなければならない場合には、金属床を用いた方が、負担圧を均等に分散させるのに適していることが明らかとなった。今後は、これらの結果を参考に効果的な負担圧の分散方法について検討を加えていく予定である。
tESが投動作パフォーマンスへ与える影響の個人差につながる生理的要因の解明

近年、頭蓋骨上から電気刺激を実施することで脳活動を修飾し、認知機能や運動の制御・学習能力を促進させることが示唆されている。しかし、その効果の表れ方は個人差が大きく、期待した効果を安定して得ることができないことも報告されている。経頭蓋電気刺激の適用には個人差が生じる要因を解明し、脳活動への修飾効果を安定して得る方法を示すことが重要である。本研究では経頭蓋電気刺激の運動パフォーマンスに対する影響の個人差について明らかにすることを目的としている。ダーツ投げによる投動作を運動モデルとして用い、同時に脳波計測を実施することでダーツ投げのパフォーマンスと脳波の関連の確認、および経頭蓋電気刺激をすることでパフォーマンスと脳波の関連がどのように変化するか検討する。研究計画に基づいて初年度は実験環境の構築および投動作と脳波の関連について検討することを目標とした。下記「現在までの進捗状況」に記述する通り、機器のトラブルが発生したため研究の進捗は現在遅れている。初年度は実験環境の構築を実施した。ダーツの投動作を行う際に個人の体格差による標的の変動を除外するために、身長に合わせた標的作成を実施した。また、ダーツ投げ動作の計測を実施するためにOptiTrack社のFlex 3を用いて動作分析を行う環境の構築を完了した。また、ダーツ実施環境および動作計測環境構築後、脳波計不良により実験が一時停止中である。現在メーカーによる修理実施中であり、本年度の7月には脳波計の修理が完了する予定である。修理完了後、迅速に実験が再開できるように、異なる脳波計による脳波計測および取得した脳波の投動作による体動ノイズの除去について現在検討中である。修理が完了次第、メインの脳波計を用いた実験の再開を予定している。投動作による脳波の体動ノイズ除去について確認したのち、経頭蓋電気刺激によるダーツ投げパフォーマンスへの影響の個人差検討を行うための実験を開始する。ダーツ投げのパフォーマンスと脳波との関係を確認したのち、経頭蓋電気刺激(経頭蓋直流電気刺激および経頭蓋交流電気刺激)からダーツ投げパフォーマンスが受ける影響について、脳波と関連してどのような個人差が生じるか検討する。そして、ダーツ投げの訓練を実施することで個人のパフォーマンスの変動と共にダーツ投げ実施時の脳波がどのように変動するか、および経頭蓋電気刺激によるダーツ投げへの影響の出方がどのように変化するか検討する予定である。生体電気現象を計測する機器の調達について、従来予定していた機器ではなくその代替となるメーカーの機器を調達したため、次年度へ繰り越し分が発生した。また、データ計測が遅れているため対象者への計測参加への謝金が次年度へ繰り越された。繰り越し分については対象者への謝金および購入した生体電気現象計測機器の消耗品購入分として使用する。
プロック共重合体のミクロ相分離構造を利用した結晶性高分子材料の透明化

ブロック共重合体は、球状、円筒状、ラメラ状の規則的なミクロ相分離構造を発現する。これらの相構造の大きさは数十nmのオーダーであるので、可視光に対して透明である。したがって、結晶相をこれらのミクロ相分離構造内に限定することができれば、結晶性でありながら透明な高分子材料を実現することができることが期待される。結晶性-非晶性ブロック共重合体において、ミクロ相分離構造を有する融体からの結晶化において、非晶性成分がガラス状である場合は、融体のミクロ相分離構造を破壊せずにミクロドメイン内で結晶化することが期待されるが、非晶性成分がゴム状である場合は、破壊される場合と保持される場合とがある。118年度においては、前者であるポリエチレンーポリイソプレンブロック共重合体(PE-PIs)において、ミクロ相分離を破壊せずに結晶化する条件を調査した。19年度においては、後者であるポリエチレンーポリスチレンブロック共重合体およびそのブレンドについて研究した。ラメラ状、シリンダー状ミクロ相分離構造を有する融体から所定の温度に急激にクエンチして等温結晶化させたときの構造変化あるいは形成を、高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーのBL-10Cにて、シンクロトロン放射光による時分割小角X線散乱により観察した。期待通り、融体のミクロ相分離構造を保持したまま結晶化した。一方、シリンダー状ミクロ相分離構造からの結晶化においては、結晶化が生じない場合が認められた。また、光散乱測定により、これら試料の散乱強度を測定することにより、透明性を評価した。18年度においては、前者であるポリエチレン-ポリイソプレンブロック共重合体(PE-PIs)において、ミクロ相分離を破壊せずに結晶化する条件を調査した。ブロック共重合体は、ポリブタジエン-ポリイソプレンブロック共重合体をブタジエン部分のみ選択的に水添することによって得た。PE-Pisブロック共重合体をラメラ状ミクロ相分離構造を有する融体から所定の温度に急激にクエンチして等温結晶化させた。そのときの構造変化あるいは形成を、高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーのBL-10Cにて、シンクロトロン放射光による時分割小角X線散乱により観察した。結晶化温度Tcが高い場合と低い場合において融体のミクロ相分離構造は、結晶化においても保たれたが、その中間の温度においては破壊された。高いTcにおいては結晶化度が小さいために融体の構造が保持され、また、低い温度においては、結晶化速度と構造再編成に必要な分子拡散速度との競争において、結晶化速度が速いためミクロ相分離構造が保たれたものと、結論された。
高校生および勤労者の睡眠不足による過眠に対する午睡導入の実証的研究

昼休みに15分間午睡をすることによってそれ以後の眠気が減少し、午後の授業だけでなく、帰宅後の学習にも集中できた。また、週3回以上実施した者は昼夜のメリハリのある規則正しい生活リズムが確立し、夜の睡眠も深くなった。午睡導入前の3年間と導入後の3年間の大学入試センターの試験成績を比較すると明らかに導入後の試験成績は上昇していた。保健室利用者および1人当たりの平均利用回数を午睡導入前後の3年間で比較すると導入後の3年間で減少していた。近年、日本は「24時間社会」と言われ、大人から子供まで人々の生活は夜型化し、就寝時刻が遅くなり、それに伴い睡眠時間も短縮している。日本人全体の平均睡眠時間は約7時間と言われているが、これは40年前に比べると約1時間減少している。すなわち、現代の日本人の多くが睡眠不足の状態で生活している。睡眠不足は昼間の眠気(過眠)を引き起こし、学生では学習障害や情緒障害を招く。一方、勤労者では交通事故や労働災害の危険が増大するばかりでなく、作業効率の低下やうつ病などの心の病気を招く。そこで学生の過眠の実態を調査し、心身に対する悪影響を明確にし、その上で昼休みの短時間の昼寝(午睡)を導入することによって午睡の効果を明らかにし、実際に過眠を減少させ、学生の学習能率やQOLを高め情緒的安定をはかることを自覚的評価および客観的評価によって実証したい。現在の高校生は睡眠不足や睡眠リズムの乱れが生じ日中の眠気、体調不良や情緒不安定を招き、健康な高校生活を送るのに大きな阻害要因となっていると思われる。このような睡眠不足から生じる日中の眠気の対策として、昼休みに午睡を導入し、日中の眠気や学習効果についての有効性を検討した。明善高校946名(男性476名、女性466名:1年生307名、2年生300名、3年生339名)に対して昼休みの15分間(13時15分13時30分)に午睡を6ヶ月間以上試み、その前後でアンケート調査を行った。午睡を実施した者は542名で、内訳は週3回以上の実施者が204名、週12回実施者が159名、月12回実施者が163名であった。「週3回以上実施」グループは他に比べて早寝、早起きで、睡眠時間、仮眠時間ともに短い傾向にあった。「週3回以上実施グループ」は就寝時刻が一定であり、また休日の起床時刻も平日と同様に一定の割合が高かった。「週3回以上午睡実施グループ」では、午前・午後の眠気を感じることが有意に少なく、午前中および午後ともに頭がすっきりしていた。「週3回以上実施グループ」では学校での授業や自主学習中に集中でき、自宅での勉強中に眠くなることも少なく、さらに成績も向上し、体の調子も良くなった。午睡の効果を実感できた者は76%で、必要だと思った者が83%であった。今回の研究結果より、昼休みに午睡をした者は午後の眠気が軽減し、授業に集中でき、学習効果や体調の維持につながることが示唆され、実施者本人も午睡の効果を強く実感していた。また、週3回以上午睡をした者はそれに加え、昼間の活動性が向上し、夜間の就寝時刻が一定となり、夜間の熟睡感は増し、目覚めも改善し、朝の起床時刻も一定となった。その結果、午前中の眠気も軽減し、1日の規則正しい生活リズムを確立することが可能になると推察される。【目的】医学部の6年生は11月末の卒業試験から国家試験の約2ケ月間は朝からの授業はなく,生活が不規則となり,夜型になりやすい。しかし,国家試験は9時30分から開始されるため夜型のままでは試験当日に実力を充分発揮できない可能性が高い。また,試験前日に不安や緊張のため入眠出来ないことも少なくない。そこで,睡眠覚醒リズムの是正および試験前日の不安、不眠対策の国家試験への影響を検討した。【方法】国家試験1ケ月前に6年生に対して睡眠覚醒リずムを朝型に変えることの重要性を説明し,個人で是正できない場合は精神科外来を受診させた。27名が受診し,生活指導とともに睡眠導入剤あるいは抗不安薬を眠前に投与した。また,試験前日から3日間,6年生が宿泊するホテルに精神科医および内科医が待機宿泊し,対応した。さらに国家試験終了後に,学生に対して試験時の心境や医師の待機に関するアンケート調査を施行した。【結果】27名中19名は,睡眠覚醒リズムが後退していたため就寝前にゾルピデムを毎日服用させ,その結果,約2週間後には睡眠覚醒リズムを前進させることができ,全員試験に合格した。また,試験前日に不安、緊張が強く不眠を来たしやすい8名にはゾルピデムあるいはエチゾラムを前もって投与し,持ち越し効果や健忘などの副作用が出現しないことを確認した上で,試験前日に投与し良眠できた。

この8名中7名は合格した。さらに試験前夜に新たに2名が不安,4名が不眠を,試験1日目の夜に2名が不眠を訴えたため,これら合計8名に対してアルプラゾラムあるいはゾルピデムを投与し,症状は改善し全員合格した。一方,学生に対するアンケート調査では医師の待機に関しては約90%が安心できたと答えていた。【結論】試験2週間前からの睡眠覚醒リズムを朝型に是正することや試験前日の不安、緊張に基づく不眠を改善することが学生の実力を充分発揮しうる大きな要因であることが示唆された。【目的】M高校の生徒の平均睡眠時間は5時間45分であり、60%の生徒が十分に睡眠がとれていないと答え、約90%が午後の授業中の我慢できない強い眠気を感じていることが明らかになった。このような高校生の睡眠不足が学習や心身へ悪影響を与えている可能性が推察される。そこで昼休みに午睡(昼寝)を行い、その有効性を検討した。【方法】昼休みに15分間の午睡を施行する前3年間と施行後3年間のM高校の大学入試センター試験成績、保健室利用者数、心の健康相談数、災害発生件数および部活動実績について比較検討した。【結果】大学入試センター試験の平均点は午睡実施後明らかに上昇しており、集中力や意欲の向上が推察された。保健室利用者数および心の健康相談数は実施後減少しており、身体の体調不良や心の悩みの訴えが軽減していた。災害発生件数も実施後減少しており、クラブ活動などにおける不注意なけがや事故が少なくなっていることが推察された。また、部活動実績に関しては県大会ベスト16以上の出場数を比較してみると、実施前の27回に比べ実施後は43回と増加しており、クラブ活動に対しても集中力や意欲が向上している可能性が推察された。【結論】昼休みに15分間の午睡を行うことによって、午後の眠気を軽減させ、集中力や意欲を向上させ、その結果、学習、部活動の成績を上昇させ、また、心身の健康など学校生活を含めた日常生活のQOLの向上につながることが示唆された。【目的】現在の高校生は睡眠不足や睡眠リズムの乱れが生じ日中の眠気、体調不良や情緒不安定を招き、健康な高校生活を送るのに大きな阻害要因となっていると思われる。このような睡眠不足から生じる日中の眠気の対策として、昼休みに午睡を導入し、日中の眠気や学習効果についての有効性を検討した。【方法】M高校946名(男性476名、女性466名:1年生307名、2年生300名、3年生339名)に対して昼休みの15分間(13時15分13時30分)に午睡を6ヶ月間以上試み、その前後でアンケート調査を行った。【結果】昼休みに午睡をした者は午後の眠気が軽減し、授業に集中でき、学習効果や体調の維持につながることが示唆され、実施者本人も午睡の効果を強く実感していた。また、週3回以上午睡をした者はそれに加え、昼間の活動性が向上し、夜間の就寝時刻が一定となり、夜間の熟睡感は増し、目覚めも改善し、朝の起床時刻も一定となった。その結果、午前中の眠気も軽減し、1日の規則正しい生活リズムを確立することが可能になると推察される。【結論】週3回以上の午睡を行うことで、昼夜のメリハリのある規則正しい生活リズムを獲得し、夜間の睡眠時間を延長しなくても睡眠の質を高めることが可能である、という結果は現実的に学校あるいは臨床現場で指導していく中で重要であると思われる.
リアルタイムＰＣＲを用いた糖鎖情報解析法の開発

本研究では、Proximity Ligation Assay(PLA)法を糖鎖情報解析に応用するための基礎検討を行った。糖鎖情報としては、細胞膜糖脂質GM1に特異的に結合するコレラトキシンBサブユニットをプローブとするPLA法により、GM1の集積を数値化し、これを指標として脂質ラフトの形成を評価する系を構築した。さらに、生体内糖鎖構造の変動に伴い発現される抗糖鎖自己抗体(IgM)の網羅的解析を実施するため、2種類のオリゴDNAを、各々、糖鎖還元末端および抗ヒトIgM抗体に結合することで、PLA法によりIgMをサブクラスとする抗糖鎖自己抗体を網羅的検出する系を構築した。本課題研究の最終目標は、細胞膜上における脂質ラフトの形成を数量的解析することである。脂質ラフトは細胞膜上にコレステロールが高密度に局在し、膜の硬さが増すことで流動性が損なわれる構造体である。特に、脂質ラフトには糖脂質であるGM1が集積することが知られており、GM1の集積を脂質ラフト形成のマーカーに利用している。すなわち、細胞膜を固相と考えると、固相表面における目的物質の集積を数値化することが望まれる。平成24年度には、結合組織に固定されているヒアルロン酸を測定対象として測定条件の検討を実施してきた。軟骨組織切片上におけるヒアルロン酸の局在を平成25年度は、脂質ラフトを数値化するための基準となる標準モデルの作成について検討した。原理的には、ラテックスビーズに糖脂質であるGM1を固相化し、ラテックスビーズの表面積とGM1結合量とから集積密度を割り出し、脂質ラフトにおけるGM1集積のモデルとしての可能性について検討した。さらに、ヒト消化管粘膜由来上皮細胞であるCaco-2細胞におけるGM1集積についてProximity Ligation Assayを実施し、GM1固相化ラテックスビーズを基準として数値化を実施し、期待していた結果を得ている。また、従来より報告されているイムノPCR法についてシステムを構築し、イムノPCR法に対するProximity Ligation Assay法の優位性について評価を行った。これにより、超高感度化だけではなく、目的分子の集積に関する位置情報を収得する新たな手法を提示することができた。オリゴDNA結合ヒアルロン酸プローブ(牛軟骨由来)およびオリゴDNA結合シアル酸結合レクチンを用い、各々、磁性ビーズに結合させたヒアルロン酸、Jurkat細胞膜上のタンパク結合シアル酸の検出を行った。いずれも数値化の可能性が認められ、磁性ビーズ上ヒアルロン酸では、濃度依存的な検出が可能であった。細胞膜上には、DNA鎖同様陰イオン性ポリマーである各種グリコサミノグリカンが存在することが予想される。グリコサミノグリカンによるProximity Ligation Assay法への影響を評価するため、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、過硫酸化コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンのリアルタイムPCR検出への影響を検討した。その結果、ヘパリンおよび過度に硫酸化されたコンドロイチン硫酸(2糖あたり硫酸エステル基2個以上)がリアルタイムPCR検出を妨害した。この結果より、本法は、ヘパリン含有肥満細胞や過硫酸化コンドロイチン硫酸含有マクロファージへの応用は困難なものの、標的細胞を上皮系の細胞とすることで、内因性グリコサミノグリカンの影響を受けることなく評価が可能であることが明らかとなった。さらに、2種類のオリゴDNAを溶離液中でProximity Ligation Assay法に供したところ、ある増幅回数を超えるとコントロール値の上昇が認められた。この結果は、わずかではあるが、2種類のオリゴDNA鎖がコネクターDNAによりLigationを受けることが明らかとなった。この結果より、基質に接着した細胞を本法に供する際、Ligationに先立ち、遊離のオリゴDNAを洗浄除去することが望まれた。Proximity Ligation Assay(PLA)法を用いたリアルタイムPCRによる定量分析法を糖鎖情報解析に応用するための開発研究を実施した。PLA法は、異なる2つのマーカーDNAが近接している場合にのみ検出することが可能な空間位置情報解析法である。応用展開として、1細胞膜における糖鎖クラスタリングの相対的評価、2糖鎖自己抗体の網羅的検出、を目標とした。最初に、細胞膜脂質ラフトの形成を数値化するため、脂質ラフトに集積することが知られているガングリオシドGM1に対し特異的親和性を有するコレラトキシンBサブユニットをプローブとした。ビオチン修飾したコレラトキシンBサブユニットを2郡に分け、各々に、アビジンを介してPLAプローブDNA(A)およびPLAプローブDNA(B)を結合させた。これら2種類のマーカーDNAで標識したコレラトキシンBサブユニットを用いることで、GM1のクラスタリングをリアルタイムPCRによるCt値として数値化することを可能とした。

ついで、糖鎖還元末端にPLAプローブDNA(A)を結合させ、抗免疫グロブリン抗体にPLAプローブDNA(B)を結合させ、抗糖鎖自己抗体の検出法について検討した。糖鎖へDNAプローブを直接結合させることは、市販のPLAキットでは対応できないため、全てのPLA用試薬を独自に開発した。DNAプローブの5'末端または3'末端に活性型官能基を導入し、糖鎖還元末端へ直接DNAプローブを導入する手法を開発した。また、ビオチニル化した抗免疫グロブリン抗体に対しては、アビジンを介してPLAプローブDNAを結合させた。本手法により、抗糖鎖自己抗体に対して、分子数として定量下限60,000、検出下限6,000を達成することが可能となった。この手法を用いることで、糖鎖のみを替えることで抗糖鎖自己抗体の検出が可能となった。生物分析化学一つの生理現象を数値化し、比較検討するためには、基準となる標準モデルが欠かせない。これまでの研究で、固相表面でのGM1の集積密度と集積量に対するProximity Ligation Assayで得られる数値との間の相関を確立することができた。これにより、単なる数値化から、定量的評価への可能性に道が開けた。本課題研究の最終目標は、細胞膜上における脂質ラフトの形成を数量的解析することである。平成24年度はこの目標達成のための基盤研究を実施することであった。Proximity Ligation Assay法は、タンパク質の定量的評価を目的として、エピトープを異にする2種類のオリゴDNA結合抗体を用いる手法として開発された経緯を有する。これに対し、本課題研究では、タンパク質を認識する抗体の代わりに糖鎖を認識するレクチン様プローブを用い、細胞膜表層糖鎖を定量的評価することが可能であるか否かを明らかにすることを目的としている。本年度は、特に、磁性ビーズに分子量が10kDaから2000kDaと広範囲にわたるヒアルロン酸を固層化したモデル系を調製し、ヒアルロン酸結合プローブを用いたProximity Ligation Assay法の問題点について検討を試みた。その結果、内因性物質による妨害の可能性、より高感度化のための操作法の改良等が明らかとなった。今後の永続的な研究を目的に、市販されているProximity Ligation Assayキットを用いることなく、すべての試薬をオリジナルに設計・合成し、今後の研究がキットの市販状況に左右されることなく実施し得るようにする。平成25年度は、ヒト大腸粘膜上皮樹立細胞株であるCaco-2細胞を用い、細胞膜上脂質ラフト形成の数値化を試みる。プローブとしては、糖脂質GM1に対し特異的に結合するコレラトキシンBユニットを用いる。また、カベオラとの分別識別を目的としてスフィンゴミエリンに対して特異的に結合するライセニンを用いる。我々は、Caco-2細胞が消化管粘膜上皮細胞のM細胞と類似して高分子物質輸送系(Transcytosis)を有していることを明らかにするとともに、この輸送系は細胞膜一電子還元系により調節されている可能性を見出した(未発表データ)。この現象における脂質ラフトの関わりについて検討する。
大腸ACFにおけるK-ras変異の意義と同分子を標的とした大腸癌予防の試み

1.目的種々の癌や前癌病変におけるras遺伝子変異や細胞増殖における活性化rasの関与が報告されている。本研究では、ras蛋白の活性化に必須である翻訳後prenylationを阻害するFarnesyltransferase阻害剤やGaranylgeranyltransferase阻害剤(GGTI)の大腸癌予防薬としての有効性を検討する。2.方法と結果(1)FTIのACF、ポリープに対する抑制効果(2)GGTIのACF、ポリープに対する抑制効果(1)の方法によりラットにDMHを投与し、連日CGTI1030kg/kgを腹腔内投与したところ、8週後のACF数、24週後のポリープ数はいずれも対照群に比べく少ない傾向にあった。(3)FTI及びGGTI併用投与によるACF、ポリープに対する抑制効果(1)の方法によりラットにDMHを投与し、連日FTI276及びGGTIを併用投与したところ、8週後のACF数は有意に減少し、FTI単独投与群、GGTI単独投与群よりも有意に減少した。同様に、24週後のポリープ数もFTI単独投与群、GGTI単独投与群よりも有意に減少した。(4)FTI及びGGTIの毒性に関する検討ラットの化学発癌にけるACF及びポリープの抑制に必要なFTI及びGGTIの投与量では、各臓器に病理組織学的に異常所見を認めなかった。同様に、血液生化学検査でも異常所見を認めなかった。3.結論FTI及びGCTIは、ラット大腸化学発癌におけるACF及びポリープを抑制する効果を有すること、さらに、両者の併用投与の相加効果が認められ、これらの化合物の大腸発癌予防薬としての有用性が示唆された。1.目的ras蛋白の阻害剤であるFarnesyltransferase阻害剤(FTI,各種CAAX analogue)やGeranylgeranyltransefrase阻害剤(GGTI)を用いて、大腸腺腫の前病変であるACF、腺腫及び癌の形成を抑制するかどうかを動物化学発癌モデルを用いて検討した。2.方法と結果(1)ラット大腸発癌モデルとACFにおけるK-ras変異の解析ラットに大腸発癌物質であるDimethyhydralazine(DMH)(15mg/kg×2)を皮下注射し、8週後に屠殺して全大腸をメチレンブルーで染色し、実体顕微鏡下にACFを観察した。ACF組織を切離し、DNAを抽出して2-step PCR法によりK-ras変異の有無を検討したところ、66%に変異が認められた。(2)各種FTI及びGGTIFTIとして、K-ras蛋白C末端のペプチド配列の誘導体CAAX analogueの中で特に変異K-rasに対する抑制効果の高いFTI276を用いた。GGTIとして、GGTI297を用いた。(3)各種FTIのACFに対する抑制効果上記のラット大腸発癌モデルにおいて、各種FTIを連日投与し、8週後にACF数を検討したところ、ACF数は有意に抑制された。FTIをday1-day28に投与した群とday29-day56に投与した群では、後者の方が有意にACF数が抑制された。(4)各種GGTIのACFに対する抑制効果上記のラット大腸発癌モデルにおいて、各種GGTIを連日投与し、8週後にACF数を検討したところ、ACF数は抑制傾向が認められたが、有意差は認められなかった。3.結論変異ras蛋白を阻害するFTIはACFの形成を有意に抑制すること、またGGTIはACFの形成を抑制する傾向を有することが認められ、これらの阻害剤の発癌予防効果が示唆された。本研究では、ras蛋白の活性化に必須である翻訳後prenylationを阻害するFarnesyltransferase阻害剤Geranylgeranyltransferase阻害剤(GGT1)の大腸癌予防薬としての有効性を検討する。2.方法と結果