hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎ウイルス複製におけるRNAヘリカーゼの役割

1.C型肝炎ウイルス(HCV)遺伝子3'末端の2次構造解析。患者血清よりクローニングしたHCVの3'末端RNA(約250b)に対し、塩基配列あるいは、構造特異的なRNA分解酵素(RNaseT1,RNaseV1等)を用いて2次構造をマッピングした。同領域はステム及びループよりなる特徴的な2次構造とポリU鎖が存在していた。2.HCV遺伝子がコードするヘリカーゼ様蛋白質NS3のRNA結合活性の解析。NS3蛋白質を大腸菌内で産生させ、部分精製した。この分画をポリUセファロースと混合し、適当な塩濃度の緩衝液中にて洗浄する事で、NS3蛋白質のRNA結合能を検出する系を確立した。また同蛋白質分画をNS3蛋白質に対して過剰のポリA,U,C及びG鎖と前処理することで結合の特異性を検討した。その結果ポリU鎖で特に結合が阻害された。さらに、NS3蛋白質の欠失変異体を作成し、RNA鎖との結合に必要な領域を検討した。高率のよい結合にはRNAヘリカーゼドメイン全体が必要であった。これらは、NS3蛋白質がポリU鎖結合能を有し、HCV遺伝子の3'末端に結合することを示唆している。3.動物培養細胞株でのHCV遺伝子複製関連蛋白質発現系の確立。HCV遺伝子がコードするNS5b蛋白質中には、RNA依存性RNA合成酵素に特徴的なモチーフが存在している。NS5b遺伝子を組込んだワクシニアウイルスを構築し、動物培養細胞での効率のよい発現系を確立した。NS5bに対する特異的な抗体で細胞を染色することにより、本蛋白質は細胞質全体に存在することが明らかとなった。このことは、HCV RNAの複製が核ではなく細胞質内で行われることを示唆している。4.以上、ウイルス遺伝子複製関連蛋白質の大腸菌及び動物細胞内での発現系を構築することが出来た。現在精製蛋白質を用いた試験管内複製系の確立を試みている。
摩擦攪拌プロセスを用いたナノ超硬合金皮膜の創製

溶射超硬合金皮膜に摩擦攪拌プロセス(FSP)を施し、クラック等が存在しない良好な改質領域を得ることに成功した。溶射後に存在していたポアがFSPによって消失し、ツールの攪拌効果によるWC粒子の再配列及び破砕されたCr3C2粒子の分散が観察された。WC-CrC-Ni皮膜のNi結合相及びWC-Co皮膜のCo結合相の結晶粒はFSPによって200nmにまで微細化された。また、FSPによって硬質粒子を含有する各種金属材料の母材結晶粒をナノサイズ化することにも成功した。高速フレーム溶射を用い、SKD61の板材表面に厚さ約300μmの超硬合金皮膜(WC-CrC-Ni及びWC-Co)を形成した。原料粉末としては、ガスアトマイズ法で製造された平均粒径40μmのWC-20mass%CrC-7mass%Ni造粒焼結粉末およびWC-12mass%Co造粒焼結粉末を用いた。WC-CrC-Ni皮膜の断面観察を行ったところ、巨視的には、クラック・剥離等が存在しない良好な皮膜が形成されていたが、皮膜内部には多数の欠陥が確認された。当該溶射超硬合金皮膜に対し、高速回転させた超硬合金製のツールを圧入し、50 mm/minの速度で移動させることでFSPを施した。FSPを施した領域は金属光沢を呈しており、FSPに特有の筋状のツールマークが形成されていた。また、FSP領域にクラック等は観察されず、良好な表面形状を有していた。FSP前後におけるWC-CrC-Ni皮膜のTEM観察を行ったところ、溶射後の状態で存在していたポアがFSPによって消失していることが確認された。加えて、ツールの攪拌効果によるWC粒子の再配列、金属結合相の微細化および部分的に破砕されたCr3C2粒子の分散が観察された。WC-Co皮膜のCoの結晶粒はFSPによって大幅に微細化されており、200nmのナノ組織となっていた。FSPによる結晶粒微細化の効果については多数の報告が存在するが、通常のFSPで得られる結晶粒は数μm程度である。溶射超硬合金皮膜へのFSPで200nmの微細な結晶粒を有する金属結合相が得られた理由としては、FSP中に導入される歪量が、WC粒子の存在によって大きくなったことが考えられる。また、ツールによって破砕されたWCおよびCr3C2の微細な破片が金属結合相中に分散し、いわゆるピン止め効果によって結晶粒成長を抑制した可能性もある。昨年度までに、摩擦攪拌プロセスを用いて溶射超硬合金皮膜をナノ組織化し得ることを明らかにした。当該ナノ組織化は、溶射超硬合金皮膜中に大量に存在する硬質粒子(WC粒子)によって摩擦攪拌プロセス中に金属結合層に導入されるひずみが増大すること、及び、ツールによって破砕された微細な硬質粒子が金属結合層の結晶粒成長を抑制することによって形成されると考えられる。当該組織微細化メカニズムを他の金属材料にも拡大適用するため、硬質粒子を有する種々の材料に対して摩擦攪拌プロセス施し、詳細な組織観察等を行った。加えて、摩擦攪拌プロセス中に硬質粒子を材料に分散複合化する手法についても検討した。例えば、レーザクラッディングを用いて形成したCo基合金肉盛層に対して摩擦攪拌プロセスを施し、摩擦攪拌プロセス前の炭化物サイズがプロセス後の組織と硬度に及す影響について詳細に検討したところ、摩擦攪拌プロセス前における硬質粒子の粒径が最終的に得られる組織のサイズに大きく影響することが明らかとなった。炭化物サイズが約710 μmであるTIG肉盛Co基合金肉盛層及び炭化物サイズが約200300 nmであるレーザクラッディングCo基合金層に摩擦攪拌プロセスを施した結果、摩擦攪拌プロセス後の母材結晶粒径はそれぞれ約500700 nm及び約150250 nmとなった。なお、XRD測定の結果、両被膜の構成相に関する差異は認められなかった。摩擦攪拌プロセス前の溶射超硬合金被膜には欠陥が散見されるのに対し、摩擦攪拌プロセス後の溶射超硬合金被膜においてはほとんど欠陥が確認されなかった。摩擦攪拌プロセス中の塑性流動により、欠陥が消失したものと考えられる。また、SEM-EDXマッピングにより溶射超硬合金被膜/基材(SKD11)の界面近傍における元素分布を観察したところ、摩擦攪拌プロセス後のサンプルでは、SKD11基材に含まれるFeの溶射超硬合金被膜への拡散が確認された。当該結果は、摩擦攪拌プロセスが基材と溶射超硬合金被膜との密着性向上に資することを示唆している。

摩擦攪拌プロセス前における溶射超硬合金被膜の硬度は約1250 HV程度であり、欠陥が存在する領域では1000 HVを下回る硬度となっている。これに対し、摩擦攪拌プロセス後では硬度が大幅に向上し、1900 HV前後の領域が広範囲に確認された。溶射超硬合金皮膜へのFSPにより、超硬合金相の金属結合相がナノ組織化されることを確認できたため。本年度は溶射超硬合金皮膜への摩擦攪拌プロセスを成功させること、及び摩擦攪拌プロセスを施した皮膜の組織、硬度等を調査することが主な目的であった。これに対し、種々の摩擦攪拌プロセス条件(ツール荷重、ツール回転速度、ツール移動速度等)を検討することで良好な塑性流動領域(改質領域)を得ることに成功している。また、改質領域の金属結合相はナノ組織化され、大幅に硬度が上昇していることを確認した。以上より、本年度の研究はおおむね順調に進展したと思われる。平成23、24年度で得た結果を基に、金属結合相の種類が異なる超硬合金についても同様の検討を行い、金属結合相を有する種々の硬質材料に対して普遍的に適用可能な改質技術を確立する。また、金属結合相の差異(結晶構造、変態の有無、積層欠陥エネルギー等)が再結晶粒径に及ぼす影響を、摩擦攪拌プロセスによって導入する歪、入熱及び冷却速度の観点から整理する。これらを系統的にまとめ、超硬合金の組成及び組織を自由に制御し、従来の超硬合金の特性を大幅に凌駕する新規ナノ超硬合金の創製を目指す。1.種々の組織を有する超硬合金の機械的特性の評価WC粒径、Co量及びCo結晶粒径が異なる種々の溶射超硬合金皮膜について、主に下記の特性評価を行う。ビッカース硬度測定:自動ビッカース硬度計を用い、皮膜の硬度マッピングを得る。破壊靭性値(IF法):50kgfでビッカース圧子を圧入した際に発生するクラック長から破壊靭性値を評価する。摩耗試験:大越式摩耗試験機を用い、S45C等に対する皮膜の耐摩耗性を評価する。2.機械的特性に対する超硬合金組織の最適化1.で得た結果と超硬合金組織の関係をまとめ、超硬合金の機械的特性の向上に資する組織設計の指針を得る。また、当該結果を基に摩擦攪拌プロセス条件等を最適化し、理想的なWC粒径、Co量及びCo結晶粒径を有する超硬合金皮膜を創製する。主として、FSP用の超硬合金製ツール及び種々の溶射超硬合金皮膜が形成された金属基材の購入に使用する。主に摩擦攪拌用ツール及び供試材である溶射超硬合金皮膜付きSKD61板を購入する。
公立学校インターナショナルクラス設置に伴う外国籍生徒対応型英語教育システムの構築

本研究初年度の平成19年度は、EIAL用の教材再編や適切な英語教育手法開発に総力を結集し、フィンランドにおける実地調査から得た知見等も盛り込み浜松市立高校インターナショナルクラスに場を借り、新たな授業展開を模索したが期待した成果を得るには至らなかった。そこで、最終年度となる本年度は、再度クラスルームディスコースの徹底分析や「埋め込み図形テスト(embedded figures test)」による生徒の認知スタイル測定を行ったところ、外国籍生徒は日本人生徒比べフィールド依存性が高く、日本人生徒を対象としたユニ・ラテラルな授業展開との間に齟齬を生じていたことが判明した。この問題を解決すべく、GDM(Graded Direct Method)による教師主導型学習と生徒の主体的参加を促す「英語疑問解消FORUM」とを組み合わせた授業展開を提案するに至った。この結果、生徒の言語使用が増加し、一定の成果を挙げるに至った。しかし、更なる課題として、他国籍環境ゆえにpeer pressureから発言を躊躇するケースが散見されたり、特定の国籍生徒に発言が偏る傾向が見られ、結果的には、授業内容未消化の一原因となった。そこで山下・前野は、LMS(Learning Management System:学習管理システム)のSNS機能を用いたウェブ学習コミュニティの形成を中京女子大学において試行しその経過分析を行った結果、多国籍生徒からなる学習集団にとってデジタルコミュニティ形成が有効に作用することが解明された。また、山下・淺間は12月にシンガポール国立大学で開催されたCLaSIC(Centre for Language Studies International Conference)2008へ参加し、ウェブ学習と教室における対面授業とを有機的に連携させたBlended Learningの可能性を探った。平成19年度は、2カ年にわたる研究の初年度となることから、まずは研究の手始めとして公立学校インターナショナルクラスの実態解明をするために、全国でも初の導入校となった浜松市立高等学校において授業視察を実施するとともに、あわせて授業担当者や英語科主任、運営責任者たる校長からのヒアリングをも実施し問題点の洗い出しを行った。また並行して、本研究は未だ国内にあっては未開拓分野であることから、種々の参考事例を渉猟すべく文献探索研究に従事した。加えて、海外での先行事例と具体的な展開研究への示唆を得るために、研究代表者である山下巖および研究分担者である淺間正通の2名は、フィンランド・タンペレ市にあるアムリ総合学校を視察し、教育制度設計、カリキュラム、使用教材、英語教授法等に関して、当該校学校長と英語教員へのインタビューを敢行した。本視察により、我が国の英語教育においては、異文化理解の基底をなす生活体験や現実感覚に依拠した実践的思考力や読解リテラシーの酒養と英語学習との有機的リンクを視野に入れた学校カリキュラム整備の遅れへの全般的対応が、急務となっていることが判明した。これらの課題に関しては、我が国におけるスキル訓練偏重の英語教育を改めて見直し、グローバルな言語文化意識先鋭化の視点から具体的学習方略を改めて模索するとともに、次年度はその解明に向けて研究を深化させてゆきたい。またそれと並行して、国際補助語としての英語教育を正しく円滑に推進できるシステムの開発に従事してゆきたい。
リコンフィギュラブル微小流路によるモバイル細胞・細胞塊長期培養システム

平成22年度は,小型のリコンフィギュラブル微小流路とその制御系(平成21年度に作成)を用いて以下の実験を行い,当該流路の有用性を検証した.1バルブ・ポンプ性能の検証製作した流路により,完全に液を遮断でき,さらに蠕動ポンプと同様の原理で送流が可能であるかどうかを検証した.その結果,ピンの変位による微小流体の遮断(バルブ)は,流れの漏れは起こさない程度に可能であることがわかった.また,色素で標識した高粘度のハイドロゲルを蠕動運動により送流(ポンプ)する方式で流れを評価した結果,流路の壁面の変位が忠実に流れに変換されていることが確認された.2細胞懸濁液の濃縮実験薄い懸濁液でも,ウェルやシリンジを使わずに流路内に導入できることを示した.当初は,懸濁液を流路の片側の蠕動運動で急速に吸入し,もう片側にノズル・ディフューザ構造をつくることで流れを減衰させることを検討したが,特にノズル・ディフューザーザ構造をつくらずとも,流路の幅の変化(流体抵抗の変化)とその変化速度の調節だけでローカルな流速が変化し,細胞の沈降を促進したり抑止することが可能であった.3細胞の培養・継代実験本デバイスを細胞に培養するにあたって,培地が流路壁面の間隙を伝わって外部に漏れ出るルートを閉塞しないと,細胞培養に必要な浸透圧が得られないことが判明した.閉塞の方法については,現在,検討を終え予備実験中であるが,今後の課題である.平成20年度までに,微細なピンを用いてリコンフィギュラブルな微小流路を考案,試作した.適切なピンのハンドリングのアルゴリズムを構成することにより,気泡も含めた非液体をもハンドリングできることがわかった.しかし,計画時に想定しなかった問題として,ピンの駆動系の実装が想定よりもはるかに大型になり,細胞培養を伴わない基礎的な実験はともかく,細胞をインキュベートできる系への組み入れの難易度が高く,生体医工学・ライフサイエンスへの貢献ができるという実質的な成果への段取りをつけにくいという問題に直面した.そこで,以下の2面から,この問題の解決を試みた.1.直接のピン操作を必要としないリコンフィギュラブル微小流路の検討2.既存のCO2インキュベータに組み入れることのできるピン駆動系の作成1に関しては,市販のローテータを用いてチップ全体に慣性力を与えることで,流路をポンプできるような構成を目標とした.まず,各種条件下でピンを駆動させられる力の測定を行い,ピンの駆動力は,ピン表面にかかるメニスカスの長さ,次いでピン上下の壁の間隔の2要素でほぼ決まることを確認した.これに基づき,外部からピンを直接動かす必要のないチップのプロトタイピングを行った.2に関しては,平成21年度に作成したXYZ3軸のアクチュエータのうち,もっとも小型で十分な性能を確認できたZ軸部分のアクチュエータ(超音波アクチュエータ)と同様の原理を,XY2軸にも適用したアクチュエータを新たに作成した.結論として,この2つの試みは,ともに成功の見込みがあるものと判断したため,来年度は,この双方の試みを並行して継続することとしたい.平成22年度は,小型のリコンフィギュラブル微小流路とその制御系(平成21年度に作成)を用いて以下の実験を行い,当該流路の有用性を検証した.1バルブ・ポンプ性能の検証製作した流路により,完全に液を遮断でき,さらに蠕動ポンプと同様の原理で送流が可能であるかどうかを検証した.その結果,ピンの変位による微小流体の遮断(バルブ)は,流れの漏れは起こさない程度に可能であることがわかった.また,色素で標識した高粘度のハイドロゲルを蠕動運動により送流(ポンプ)する方式で流れを評価した結果,流路の壁面の変位が忠実に流れに変換されていることが確認された.2細胞懸濁液の濃縮実験薄い懸濁液でも,ウェルやシリンジを使わずに流路内に導入できることを示した.当初は,懸濁液を流路の片側の蠕動運動で急速に吸入し,もう片側にノズル・ディフューザ構造をつくることで流れを減衰させることを検討したが,特にノズル・ディフューザーザ構造をつくらずとも,流路の幅の変化(流体抵抗の変化)とその変化速度の調節だけでローカルな流速が変化し,細胞の沈降を促進したり抑止することが可能であった.3細胞の培養・継代実験本デバイスを細胞に培養するにあたって,培地が流路壁面の間隙を伝わって外部に漏れ出るルートを閉塞しないと,細胞培養に必要な浸透圧が得られないことが判明した.閉塞の方法については,現在,検討を終え予備実験中であるが,今後の課題である.
中等後教育から職業へのトランジションに関する比較研究:日本とアメリカ

この研究は、大学、短大、専門学校などの中等後教育機関の新規卒業者がどのような社会的、制度的プロセスを経て就職しているのかを、日米の2カ国について比較検討することを目的とした。日本については、新規大卒者の就職状況および、就職にいたるプロセスを調べるために、昨年度に実施した、全国10大学の、経済、経営学系の4年生約1000人を対象とした質問紙調査結果の分析を行った。分析の結果、いわゆる入試難易度によって、就職の時期、就職先企業規模、就職活動において、大きな違いがあることが判明した。また、出身階層が就職先企業規模に及ぼす影響についても検討を行ったが、親が大企業の管理職以上である場合に、子どもも大企業に入るチャンスが大きくなることがわかった。今年度は、日本については、新規大卒者の就職状況および、就職にいたるプロセスを調べるために、全国10大学の、経済、経営学系の4年生約1000人を対象とした質問紙調査を実施した。この調査では、「買い手」市場」と呼ばれた1994年卒の大卒市場において、就職予定者たちが、大学の就職部や先輩後輩関係をどのように利用しているのかを明らかにすることをめざした。現在、集められたデータの分析途上である。また、アメリカについては、日本と比較を行うために文献研究を進めた。とくに、経済系の大学院の卒業者が、プレイスメント・オフィスをどのように利用して、求職行動を行っているのかについて、文献研究を進めた。以上の成果をもとに、今後論文としてまとめていく予定である。日本については、新規大卒者の就職および、就職にいたるプロセスを調べるために、昨年度に実施した、全国10大学の、経済、経営学系の4年生約1000人を対象とした質問紙調査結果の分析を行った。また、出身階層が就職先企業規模に及ぼす影響についても検討を行ったが、親の大企業の管理職以上である場合に、子どもも大企業に入るチャンスが大きくなることがわかった。これらの結果については、日本教育社会学にて発表を行うと同時に、広島大学大学教育研究センターの高等教育叢書としてまとめた。また、アメリカについては、日本と比較を行うために文献研究をもとに理論的な検討を行った。とくに、大学をはじめとする教育機関と企業との結びつきに関して、制度的ネットワーク理論を展開した。この結果については、アメリカの社会学関係のジャーナル(Research in Social Stratification and Mobility)に投稿し、1995年中に掲載されることが決まっている。
網膜ミクログリアによるT細胞アポトーシスの機序解明とぶどう膜炎治療

網膜可溶性抗原(S抗原)のペプチド合成を行った。ルイス系ラット(体重1501759)の雌の足蹠に、ペプチドを接種した。免疫接種後10日目から前眼部炎症による両眼の角膜毛様充血をみた。眼球摘出後、網膜の凍結切片を作成した。接種後11日目から網膜内に炎症細胞の浸潤をみるようになった。接種後15日目以降になると、視細胞層は消失して、網膜構造が崩壊して後部ぶどう膜炎の発症が確認できた。正常網膜の凍結切片を作成して、galectin-9抗体による免疫染色では、網膜に陽性細胞をみなかったが、実験的ぶどう膜炎の網膜では、galectin-9抗体陽性が網膜色素上皮細胞(RPE)、内網状層にみた。内網状層の陽性細胞は、局在部位から網膜ミクログリアと思われた。さらにRPEの細胞ラインであるARPE-19 and hTERTを培養させた。それらの細胞は、galectin-1抗体に陽性であった。RPEを活性化したT細胞と共存させて培養すると、T細胞にアポトーシスを生じた。また、ルイス系ラット(生後23日)の前眼部組織、水晶体、硝子体を切除して、RPEを除いて網膜を剥離した。網膜細胞間を分離させて、網膜細胞をDMEM-FBS培養液に95%air-5%CO_2下で入れ、浮遊した細胞を除去して,接着した細胞のみを1ng/ml murine granulocytemacrophage(GM)-CSF(Sigma)を含有したDMEM-FBS培養液中で培養した。培養後10日後から浮遊してきた細胞を分離して、CD11b抗体(OX42)による免疫染色を行うと陽性であったことから、網膜ミクロクリアと同定し、培養系実験を確立させた。今回の研究結果から、実験的ぶどう膜炎の発症経過に網膜ミクログリアとRPEがガレクチン糖鎖ファミリーを介してT細胞に働きかけていることが示唆された。
酸化ストレス応答因子「チオレドキシン」の薬剤性急性腎障害早期診断マーカーへの展開

急性腎障害(AKI)は慢性腎臓病や心血管疾患のリスクを増大させ、生命予後に重大な影響を与える。現在、AKIの診断には血清クレアチニン(SCr)が用いられているが、SCrは腎障害後に蓄積する因子であるため、急性期の傷害を鋭敏に診断することは困難である。そのため、早期診断のための有能なバイオマーカーの確立が切望されている。AKI発症の約30%は薬剤(シスプラチン、抗菌薬、鎮痛薬など)を原因とするが、近年、その発症機序に活性酸素種と抗酸化因子のバランスの破綻、いわゆる「酸化ストレス」による腎臓への傷害の関与が明らかとなった。この酸化ストレス時に発現が上昇する因子の一つに生体内抗酸化タンパク質であるチオレドキシン(Trx)がある。そこで本研究では、薬剤性AKIの早期診断マーカーとしてのTrxの有効性を評価する目的で、シスプラチン腎症を対象として、投与時のTrx発現量の推移に関する検討を行った。マウスを用いてシスプラチンを腹腔内投与後、経時的に採血及び蓄尿を行い、既存の腎障害マーカーの変動を確認したところ、投与34日後において顕著な上昇が認められた。一方、尿中Trx発現量の経時推移を評価したところ、腎障害マーカーが変動しない投与1日後における上昇傾向が明らかとなり、その後は低下する傾向が示された。現在、上記の誘導傾向をもとに、シスプラチン使用患者における有用性評価を行うための準備段階であり、シスプラチン使用患者におけるAKIの重症度と早期のTrx発現量の関係性の解明及び各ステージのCut-off値の算出を行う予定である。
バレット食道腺癌におけるアンジオテンシンⅡ受容体拮抗薬の抗腫瘍効果の基礎的研究

アンジオテンシン受容体拮抗薬であるテルミサルタンは広く処方されている高血圧症の治療薬である。本研究ではテルミサルタンの食道腺癌に対する抗腫瘍効果を証明し、その作用機構と関連するマイクロRNAの同定を行った。In vitroとIn vivoの実験において、テルミサルタンは食道腺癌細胞株の細胞および腫瘍増殖を時間・濃度依存的に抑制していた。またテルミサルタンは細胞周期関連蛋白CyclinEなどの低下により細胞周期停止と腫瘍増殖抑制効果を誘導する。さらなる抗腫瘍作用のメカニズムとして、AMPKαのリン酸化亢進によるmTORの抑制、miR-301a-3pの発現が低下が抗腫瘍作用に関与すると考えられた。近年アンギオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)が種々の固形癌に対して抗腫瘍作用を持つことが報告されている。今回、我々はテルミサルタンのバレット食道および食道腺癌に対する抗腫瘍作用を培養細胞株、実験モデル動物を用いて検討し、関連するmicroRNA(miRNA)を網羅的に解析した。食道腺癌株として、OE19,OE33,SK-GT4,の3種類を使用した。テルミサルタン投与による細胞増殖の評価を細胞増殖アッセイで、種々の細胞周期関連分子動態はWestern Blottingで検討した。またテルミサルタン投与により、誘導されうるmiRNAsをアレイを用いて網羅的に検討した。In vivoの系ではOE19食道腺癌細胞株をヌードマウスに皮下移植し、テルミサルタンがin vivoにおいても増殖抑制するかを検討し、関連するmiRNAsについてもin vitro同様に検討した。細胞増殖アッセイにおいて、4種類のARBsのうちテルミサルタンは全ての食道腺癌株の増殖を抑制していた。In vivoの系においても、テルミサルタンにより食道腺癌細胞の増殖を抑制していた。テルミサルタンは非投与群と比較し,CyclinD1,CyclinEの発現が抑制し、食道腺癌細胞株を細胞周期停止に導いていた。さらにテルミサルタン投与によりAMPKα活性化とその下流のmTOR/p70S6K経路の抑制がみられていた。よってテルミサルタンの抗腫瘍作用の新たな機序としてAMPKαの活性化とmTOR/p70S6K経路の抑制が主要な経路として考えられた。またTelmisartan投与により30種類のmiRNAの発現動態が有意に変化し、様々な癌関連のmiRNAの変化も認められた。本研究の研究結果は研究論文として英文科学雑誌に受理されているため。本研究は、アンジオテンシン受容体拮抗薬テルミサルタンの食道腺癌に対する抗腫瘍効果のメカニズムと新しい機構に関連するマイクロRNAを網羅的に解析し、in vivoを含めたテルミサルタンの抗腫瘍作用機構について検討した。4種類のARB(テルミサルタン,イルベサルタン,バルサルタン,ロサルタン)、3種類の食道腺癌細胞株(OE19,OE33,SK-GT4)に対して細胞増殖アッセイを行い、テルミサルタンのみ濃度・時間依存的に抗腫瘍効果を示していた。またin vivoの実験系では、テルミサルタンにより皮下移植された腫瘍組織の増殖において抗腫瘍作用を発揮することが示唆された。テルミサルタンは食道癌細胞のG1サイクリンに関連する細胞周期タンパクを抑制することで抗腫瘍作用を発揮していた。そのメカニズムとして、AMPKαのリン酸化亢進によるmTORの抑制、その下流に位置する細胞周期関連蛋白の低下することを確認した。またAMPKα上流のLKB-1のリン酸化と、下流のmTOR,p70S6Kのリン酸化抑制がみられ、腫瘍増殖抑制効果に関与するものと考えられた。癌細胞抑制に関連するマイクロRNAをアレイチップを用いて網羅的解析をおこなったところ、テルミサルタン投与群とコントロール群で異なるクラスターを形成しており、なかでもテルミサルタンによりmiR-301a-3pの発現が低下し、AMPKαのリン酸化に関与すると考えられた。これらの結果より、テルミサルタンは食道腺癌に対して抗腫瘍効果が期待される薬剤であることを証明した。今後、食道扁平上皮癌が胃癌などその他の癌種に対しても同様な抗腫瘍効果があるかどうかを進めている。また、細胞周期関連蛋白など低下と細胞周期停止につながる更なるメカニズムの検討を進めている。腫瘍学
受動喫煙のストレス評価を唾液中カテコールアミン代謝物等で行う研究

この研究は、受動喫煙のストレス評価を唾液中カテコールアミン代謝物等で行うことを目的とした。非喫煙者の受動喫煙の有無をアンケートで調査して、ニコチンの代謝物であるコチニン濃度を唾液試料から測定した。また、ストレス負荷を加えたときの唾液中コルチゾールとカテコールアミン代謝物のMHPGで挙動をみた。その結果、受動喫煙がある者において、負荷後に有意にMHPGが上昇した。従って、ストレス評価を唾液中MHPGの挙動で捉える可能性を示唆できた。本研究の目的は、受動喫煙のストレス評価を唾液中カテコールアミン代謝物等で行い、受動喫煙の健康影響を客観的データとして表し、受動喫煙防止の教育を含めた取組をさらに積極的に推進することである!測定代謝物は、ドパミンの代謝産物である3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)と最終代謝産物のホモバニリン酸(HVA)及びノルアドレナリンの代謝産物であるバニリルマンデル酸(VMA)と3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルエチレングリコール(MHPG)の4種類である。今年度は、唾液中カテコールアミン代謝物測定の確立を目標に研究を進めた。測定は高速液体クロマトグラフィーの3カラムスイッチングシステムを用い、その分析条件を検討した。その結果、使用する3種類のカラム、移動相組成、移動相の流速や検出蛍光波長を決定した。このシステムでは、唾液の前処理、濃縮、分析が一連の流れの中で行える利点があり、前処理カラムを使用することにより、タンパク質等の夾雑物は5分以内に除去され、5.5分以後に4種の目的物質が検出された。保持時間はVMA,DOPAC,MHPG,HVAの順番でそれぞれの物質のピークが現れ、約40分間で測定が終了した。さらに、唾液に4種類の標準物質を添加した添加回収試験も良好な結果であった。従って、今回の測定システムで4種類の唾液中カテコールアミン代謝物等の測定が可能であったので、次年度以後、これらの物質のサーカデアンリズム等の検討を行い、唾液のサンプリング等のタイミングを含めた測定系の確立とストレス負荷時のカテコールアミン代謝物等の挙動の研究を進める。本研究の目的は、受動喫煙のストレス評価を唾液中カテコールアミン代謝物等で行い、受動喫煙の健康影響を客観的データとして表し、受動喫煙防止の教育を含めた取組をさらに積極的に推進することである。測定代謝物は、ドパミンの代謝産物である3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)と最終代謝産物のホモバニリン酸(HVA)及びノルアドレナリンの代謝産物であるバニリルマンデル酸(VMA)と3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルエチレングリコール(MHPG)の4種類である。今年度は、昨年度にほぼ確立した高速液体クロマトグラフィーによる分析手法(研究協力者、平田紀美子)を用いて非喫煙者の唾液中カテコールアミン代謝物のサーカデアンリズム等を見るため、被験者を募集して、経時的に唾液採取を行った。さらに採取した唾液は、pH測定、ストレス評価でよく用いられている唾液中コルチゾール濃度測定及び、非喫煙者であっても、受動喫煙の可能性があるために、唾液中コチニン測定も合わせて行い、VMAやMHPGなどの変動への影響も検討することとした。今回は33名(男性11名、女性22名)の被験者を募集できた。経時的な唾液採取は、午前中3回、午後3回の計6回の唾液採取を行った。唾液採取は唾液吸収体(サリソフト[○!R])を一定時間口腔内に入れ、それに吸収させ採取し、遠心分離後に試料唾液とした。測定法を含めて今回の一部は、学会報告ができた。今後は、サーカデアンリズムを見るには、被験者数が少なかったので、さらに被験者を追加することと、喫煙者が禁煙をした時の唾液中VMA、MHPG等の挙動を見ることである。また、唾液中クロモグラニンAの測定も試みた。さらにストレス評価法において、よく研究されているコルチゾールの挙動もみた。コルチゾールは視床下部-下垂体-副腎(HPA系)に関わるステロイドホルモンである。今回は昨年に引き続き、サーカデアンリズムを見るために協力者を募集し、非喫煙者19名(男性6名、女性13名)、喫煙者6名(男性のみ)の被験者を募集できた。喫煙者に対しては、唾液採取当日より前の13日間の禁煙及び禁煙期間中の朝夜の唾液採取、唾液採取当日経時的な唾液採取及びたばこ1本の喫煙後の唾液採取を行い喫煙の影響をみた。

経時的な唾液採取は、午前中6回、午後3回の計9回の唾液採取を行った。唾液採取は唾液吸収体(サリソフト[○!R])を一定時間口腔内に入れ、それに吸収させ採取し、遠心分離後に試料唾液とした。喫煙者のコルチゾールは、喫煙直後には喫煙前に比べて低値を示した。クロモグラニンAは唾液採取方法の違いにより、その値に違いが見られ再検討が必要であった。ドパミン代謝物の測定は現在測定中である。また、非喫煙者への受動喫煙調査で1週間当たりのばく露:日数と受動喫煙の嫌悪感についての関係は、受動喫煙がほぼ毎日ある非喫煙者の嫌悪感は、週に1、2回程度の受動喫煙がある非喫煙者に比べて小さく、受動喫煙への抵抗感があまりないことがわかった。本研究の目的は、受動喫煙のストレス評価を唾液中カテコールアミン代謝物等で行い、受動喫煙の健康影響を客観的データとして表し、受動喫煙防止の教育を含めた取組をさらに積極的に推進することである。今回は、喫煙者と非喫煙者で受動喫煙がある者及び受動喫煙がない者に軽いストレス負荷をかけて、負荷前、負荷中及び負荷終了後に経時的に唾液を採取し、その時の各指標の経時的な変動から軽い負荷に及ぼす受動喫煙の影響をみた。さらにアンケート調査等から受動喫煙の有無による喫煙、タバコに関する考え方の違いをみた。参加者は男女合わせて51名である。解析対象者は、非喫煙者の女性38名(19.8±2.1歳)(平均値±標準偏差)である。負荷は、内田クレペリン検査用紙を用いた加算作業である。加算作業は15分実施、5分休憩、15分実施した(1回目の加算作業)。30分の休憩後に、再び同様の加算作業を繰り返した(2回目の加算作業)。唾液採取は、1回目の加算作業前、終了直後、2回目の加算作業前、終了直後、30分後の合計5回行った。加算作業のタイムスケジュールは、加算作業結果の数量的評価を行うために、定められた方法に従った。唾液採取は唾液吸収体(サリソフト)を一定時間口腔内に入れ、それに吸収させ採取し、遠心分離後に試料唾液とした。唾液の測定項目は、採取唾液量、pH、コチニン濃度、コルチゾール濃度である。唾液中コチニン濃度(ng/mL)は、受動喫煙の有り群が0.33±0.18(N=23)、無い群は0.17±0.15(N=15)と有意差(p<0.05)がみられた。一方、コルチゾールは両群間に有意差はなかった。さらに加濃式社会的ニコチン依存度調査も両群間に有意差はなく、合計得点も両群共に10点以下だった。喫煙、タバコに対する嫌悪感についての調査は、受動喫煙の有無に係わらず、否定的な意見が多かった。当初の計画通り、非喫煙者の唾液中測定物質のサーカデアンリズムをみるための想定人数の協力者数が得られた。ドパミンの代謝産物等の測定は、機器の不具合等で測定が遅れているが、コルチゾールは今後の実験をする上での結果が得られた。クロモグラニンAは唾液採取方法の違いによる測定値の変動がみられたため、それを解決する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。ドパミンなどの脳内報酬系の物質の変動から受動喫煙の影響をみるために、喫煙者、非喫煙者で受動喫煙がある者及び受動喫煙がない者に軽いストレス負荷をかけて、その時の経時的な変動から受動喫煙の影響を洞察する。
希土類化合物における価数相転移現象の研究

希土類元素は通常3価だが、Ceは4価、Sm, Eu, Tm, Ybは2価のものが存在する。物質中では両者はしばしば混在し、温度や圧力によって価数相転移を示す物質もある。中でもYbInCu4は構造不変のままTV40 KでYb価数z=3 (高温相)から、z=2.9 (低温相)に1次相転移する。系を特徴付ける近藤温度は高温相でTK25 K、低温相でTK400 Kであり、Yb 4f状態は高温側で局在的、低温側で遍歴的である。本研究では、Inを他の元素で置換したYbXCu4単結晶を育成し、光電子分光実験により電子状態を明らかにし、それらの比較からYbInCu4の示す価数相転移の機構を構築することを目的とする。これまで、Inを周期表の両隣の元素であるCd、Snで置換したYbCdCu4、YbSnCu4の単結晶育成に成功し、硬X線(hn=6 keV)光電子分光実験から、YbInCu4でCuサイト上の伝導電子数が最も多く、Cuサイトから他のサイト(ここではYb)に電荷が移動しやすくなっていることが価数相転移と関連していることが分かった。一方、最近合成された新規近藤格子系YbNi3X9 (X=Al, Ga)は、X=AlはTK3 K、X=GaはTK600 Kであり、前者がYbInCu4の高温相、後者が低温相に対応する。この系について同様な実験を実施し、光電子スペクトルに類似の変化を見いだした。比較により、伝導電子がYbサイトに移動することで価数相転移が起こり、伝導電子状態密度(DOS)中のフェルミ準位(EF)が移動し、EF上のDOSが増えたために低温相で近藤温度が上昇すると考えられる。YbInCu4は構造不変のままTV40 KでYb価数z=3 (高温相)から、z=2.9 (低温相)に1次相転移する。本研究では、Inを他の元素で置換したYbXCu4単結晶を育成し、光電子分光実験により電子状態を明らかにし、それらの比較からYbInCu4の示す価数相転移の機構を構築することを目的とした。Inを周期表の両隣の元素であるCd、Snで置換したYbCdCu4、YbSnCu4の単結晶育成に成功し、硬X線(hn=6 keV)光電子分光実験から、YbInCu4でCuサイト上の伝導電子数が最も多く、Cuサイトから他のサイト(ここではYb)に電荷が移動しやすくなっていることが価数相転移と関連していることが分かった。このモデルを確かめるために、YbNiX3 (X=Si, Ge)に対して測定を行った。X=SiがYbInCu4の高温相、X=Geが低温相に対応し、全く同様の振る舞いが観測され、モデルを指示する結果が得られた。Inを周期表の両隣の元素であるCd、Snで置換したYbCdCu4、YbSnCu4の単結晶育成に成功し、硬X線(hn=6 keV)を用いたCu 2p光電子分光および極紫外光(hn=10 eV)を用いた近藤ピークの観測を行った。Cu 2p内殻はYbInCu4で最も結合エネルギーが高い(単純なケミカルトレンドには従わない)。このことはYbInCu4でCuサイト上の伝導電子数が最も多いことを示唆しており、YbInCu4ではCuサイトから他のサイト(ここではYb)に電荷が移動しやすくなっていることが価数相転移と関連していると考えている。

Yb価数はYbSnCu4が最も揺動しており、近藤ピークも最も鋭く観測された。また、新規近藤格子系YbNi3X9 (X=Al, Ga)に対して同様の実験を実施した。X=AlはTK3 K、X=GaはTK600 Kであり、前者がYbInCu4の高温相、後者が低温相に対応する。YbInCu4での降温は、YbNi3X9でXをGaからAlへのに置換する事に対応しており、実際光電子スペクトルにも類似の変化がみられることが分かった。当初の計画どおり、YbCdCu4、YbSnCu4の単結晶に成功し、硬X線(hn=6 keV)および極紫外(hn=10 eV)光電子分光実験を実施した。また新規近藤格子系YbNi3X9(X=Al,Ga)に対しても同様な測定を行い、光電子スペクトルが、YbInCu4の価数相転移と類似の振る舞いを示す事から、本研究の目的に適した系であることを新たに見いだした。YbXCu4の実験結果と比較することで、YbInCu4の価数相転移機構に関して研究実績の概要で述べたモデルを構築した。また、YbNi3Ga9に対して角度分解光電子実験を実施し、Yb 4f-伝導電子混成状態の観測にも成功している。さらにInを、周期律表でInの左上にあるZnと右隣にあるSnで置換したYbZn0.5Sn0.5Cu4単結晶(伝導電子数がYbInCu4と同じになる)に対して測定を行ったところ、急激な価数相転移は起こさないが、100 K以下でYb価数が急激に減少することも見いだした。以上からおおむね順調に進展していると自己評価している。当初の計画どおり、YbCdCu4、YbSnCu4の単結晶に成功した。硬X線(hn=6 keV)を用いたCu 2p内殻光電子分光および極紫外光(hn=10 eV)を用いた近藤ピークの観測により、研究実績の概要で述べた結果を得た。また新規近藤格子系YbNi3X9 (X=Al, Ga)に対し、同様な測定を行ったところ、YbInCu4の価数相転移と類似の振る舞いを示す事から、本研究の目的に適した系であることを新たに見いだした。X=AlがYbInCu4の高温相、X=Gaが低温相に相当し、YbInCu4で温度を下げる事が、YbNi3X9でXをAlからGaに置換することに相当する。この系を本研究の対象に含める事で、YbInCu4の価数相転移機構の理解が深まることが期待される。また、YbInCu4とYbCdCu4との混晶であるYbIn1-xCdxCu4 (x=0.05-0.85)の結晶育成を試み、いずれも劈開面を有する単結晶を得るのに成功している。今年度は、YbInCu4単結晶に対する角度分解光電子分光を中心に研究をすすめる。これまでは角度積分モードで光電子分光実験を実施してきた。角度分解測定を行うことで、価数相転移前後におけるバンド構造の変化(特にフェルミ準位近傍)や、低温相におけるYb 4f-伝導電子混成状態を詳細に明らかにし、YbInCu4の価数相転移機構についてさらに考察を行う。また新規近藤格子系YbNi3X9(X=Al,Ga)がYbInCu4の価数相転移機構の解明に適した系であると考えられるため、引き続きこの系に対しても角度分解光電子分光実験を行い、YbInCu4との実験結果の比較から、価数相転移機構に関する知見を得る。新規近藤格子系YbNi3X9 (X=Al, Ga)がYbInCu4の価数相転移機構の解明に適した系であると考えられるため、引き続きこの系に対して硬X線および極紫外光電子分光を行う。特に両者の混晶系に対して測定を行い、置換によってどのように電子状態が変化していくのかを調べ、YbInCu4の電子状態の温度変化と比較する。
レトロ配向性オピオイドアンタゴニストペプチドに関する研究

Cー末端にTyrーOCH_3を有する多数のオピオイドアンタゴニストを得,それらがオピオイドレセプタ-上でオピオイドアゴニストの場合とC末端とN末端を逆方向に配向して結合するというレトロ配向モデルを得た。このモデルに適合するペプチドとしてはcasoxin6(SerーArgーTyrーProーSerーTyrーOCH_3),casoxin5(ArgーTyrーProーSerーTyrーOCH_3),casoxin4(TyrーProーSerーTyrーOCH_3),lactoferroxin A(TyrーLeuーGlyーSerーGlyーTyrーOCH_3),lactoferroxin B(ArgーTyrーTyrーGlyーTyrーOCH_3),lactoferroxin C(LysーTyrーLeuーGlyーProーGlnーTyrーOCH_3),レトロ〔Leu〕エンケファリンメチルエステル(LeuーPheーGlyーTyrーOCH_3),レトロダイノルフィン13メチルエステル(LysーLeuーlysーProーArgーIleーArgーArgーLeuーPheーGlyーGlyーTyrーOCH_3)などがあり,XaーArometicーXbーTyrーXcで表現される。またXaが塩基性残基の場合Kレセプタ-に対する特異性が見られる。このことはオピオイドアゴニストがXaーTyrーXbーArometicーXcの一般式で表現され,Xcが塩基性残基の場合にKーレセプタ-特異性を示すこととT度逆の関係である。これらの事実は上記レトロ配向モデルを支持している。レセプタ-とのこのような結合様式はアゴニスト活性に必要なTyrのアミノ基がレセプタ-上のサイトに配向しないため,結合能のみを持ったアンタゴニストになるものと考えられる。なお,上記レトロ配向モでルに適合しないオピオイドアンタゴニストとして牛乳Kーカゼイン由来のcasoxinC(TyrーIleーProーIleーGlnーTyrーValーLeuーSerーArg)人乳αsiーカゼイン由来のcasoxin D(TyrーValーProーPheーProーProーPhe)を単離した。また化学合成によりTyrーProーPheーProーIleーIleーValを得た。本ペプチドはC末端Valを除去することによりアンタゴニストからアゴニストに変換された。さらに合成によりTyrーProーPheーProーPheを得た。本ペプチドはμータイプオピオイドレセプタ-に対してアゴニスト活性を示すが、δータイプレセプタ-に対してはアンタゴニスト活性を示した。レトロ配向モデルに従って合成したretro-Dynorphin 13

methylesterは強いκレセプタ-選択性を持ったオピオイドアンタゴニストであり、Try-OCH_3をC末端に持ったオピオイドアンタゴニストがレトロモデルに適合する事例が拡大された。牛乳κ-カゼインのペプシン分解物から単離したcasoxin 6(Tyr-Pro-Ser-Tyr-OCH_3)および、これをもとに合成したcasoxin 5(Arg-Tyr-Ser-Pro-Tyr-OCH_3)はμ-およびκ-レセプタ-に対し親和性をもつオピオイドアンタゴニストであるが、casoxin 4(Tyr-Pro-Ser-Tyr-OCH_3)はμ-レセプタ-に対し選択的なオピオイドアンタゴニストである。即ち、これらのオピオイドアンタゴニストではN末端側に存在する塩基性残基がκ-レセプタ-に対する選択性を支配しているが、これはオピオイドアゴニストペプチドにおいてC末端側に存在する塩基性残基がκ-レセプタ-に対する選択性にとって必須な事実と丁度逆の関係である。このことは、Tyr-OCH_3をC末端に持つこれらオピタイドアンタゴニストがオピタイドレセプタ-上でレトロに配向して結合するという我々のモデルの論拠の一つである。κ-カゼインのペプシン-トリプシン分解物から今回単離した新しいオピオイドアンタゴニストcasoxin A(Try-Pro-Ser--TurGly-Leu-Asn-Tyr)はC末端が遊離の場合でもかなり強いオピオイドアンタゴニスト活性を示し、μ-レセプタ-に対し選択的をリガンドであった。κ-カゼインのペプシン分解物から得られたSer-Arg-Casoxin Aもまたμ-レセプタ-に選択的なリガンドであり、casoxin 6のようなκ-レセプタ-選択性は示さなかった。このことは、レトロモデルはcasoxin AおよびSer-Arg-Casoxin Aには適用され得ず、またTyr-Gly-Leu-Asn-Tyr配列の意義はTyr-OCH_3とは異なることを意味している。新しいオピオイドアンタゴニストとして牛乳Kーカゼインのトリプシン消化物からcasoxin C(TyrーIleーProーTleーGlnーTyrーValーLeuーSerーArg)を単離した。本ペプチドはオピオイドアンタゴニスト活性以外に回腸収縮,動脈収縮,およびアンジオテンシン変換酵素阻害活性を示した。本ペプチドの構造活性相関に関する研究からC末端のTyrーValーSerーArg配列がオピオイドアンタゴニストに必須であることが判明した。また人乳α_<s1>ーカゼインのペプシン・キモトリプシン消化物からオピオイドアンタゴニストcasoxin D(TyrーValーProーPheーProーProーPhe)を単離した。本ペプチドも回腸収縮,動脈弛緩活性を併せ持っていた。オピオイドアンタゴニスト活性にはN末端のTyrが必須であった。これらの結果から,casoxin Cおよびcasoxin Dはレトロ配向モデルに従わないオピオイドアンタゴニストといえる。牛乳βーカゼインのC末端ペプチド(GlyーProーPheーProーIleーIleーVal)を一残基置換して得られたTyrーProーPheーProーIleーIleーValはオサピオイドアンタゴニスト活性を示した。一方,C末端Valを削除して得られたTyrーProーPheーProーIleーIleはオピオイドアゴニスト活性を示した。このことはC末端のValの存在によってオピオイドアゴニストからアンタゴニストへの変換が生じることを意味している。
テロメレース遺伝子プロモーター活性を指標とする白血病幹細胞の探索とその性状解析

白血病においても正常造血と同じく分裂増殖能力の階層性(幹細胞システム)が存在するという知見に基づいて、白血病の根治には白血病幹細胞を標的とする新たな治療戦略が必要であるという認識が広まりつつある。この視点から、白血病幹細胞を生きたまま同定してその生物化学的な性状を解析することが急務である。われわれは、極めて高いテロメレース活性を示す白血病細胞の中に幹細胞が含まれる可能性を想定し、当該細胞を前方視的に同定・分取する方法を考案した。テロメレース活性はその触媒サブユニットである逆転写酵素(hTERT)遺伝子の発現レベルと正の相関を示すため、hTERT遺伝子のプロモーター配列により黄色蛍光タンパク質(YFP)変異体(Venus)を発現する第三世代レンチウイルスベクターを作製した。高力価のVSV-Gシュードタイプ型hTERT-Venusウイルスは、白血病細胞株や患者細胞に対して高い導入効率を示した。そして、フローサイトメトリー上のVenus蛍光強度は内因性テロメレース活性を反映することを確認できた。サイトカイン(+/-)で培養した患者急性骨髄性白血病(AML)細胞のhTERTプロモーター活性(Venus蛍光強度)はほぼ一峰性であり、hTERTの発現は白血病細胞集団において連続的な分布を示すことが示唆された。さらに、蛍光顕微鏡に観察すると一部の細胞は強い蛍光を発しており、テロメレース活性の階層性が示唆された。3例の臍帯血CD34陽性細胞と19例のAMLを対象にhTERTプロモーター活性の測定を行った。前者は、無刺激でのhTERTプロモーター活性が低く、サイトカイン刺激により一様に上昇した。いっぽう、後者のhTERTプロモーター活性は、サイトカイン刺激の有無にかかわらず、患者間で大きな差異を認めた。AML19例のhTERTプロモーター活性の平均値は、サイトカイン(-)では臍帯血CD34陽性細胞の平均値の約2倍であり、サイトカイン(+)では平均値とほぼ同じであった。本研究により、患者白血病細胞のhTERTプロモーター活性を単一細胞レベルでモニターすることが可能となった。そして、白血病細胞集団にはhTERTプロモーター活性の連続的な階層性が存在することが判明した。大部分の症例ではサイトカインに反応してhTERTプロモーター活性が上昇したが、一部の細胞はサイトカイン(-)でも陽性であり、これらの細胞が白血病幹細胞に該当するかどうかが注目される。造血系に代表されるように、成体各組織において幹細胞システムの存在が知られている。近年、腫瘍細胞にも正常組織と同様に分裂増殖能力の階層性(hierarchy)-幹細胞システム-が存在するという知見が注目されており、がんを根治するためには、自己複製能力を有する腫瘍幹細胞を標的とする新たな治療戦略が必要であるという認識が広まりつつある。この視点に立てば、腫瘍幹細胞を生きた状態のまま同定し、その生物化学的な性状を解析することは急務である。われわれは、不均一な腫瘍細胞集団において極めて高いテロメレース活性を示す細胞の中に幹細胞が含まれると想定し、当該細胞を生きたまま(前方視的に)同定・分取する方法を考案した。

テロメレース活性はその触媒サブユニットである逆転写酵素(hTERT)遺伝子の発現レベルと正の相関を示すため、hTERT遺伝子の5'上流域1.2kbをGFP変異体(hrGFP)またはYFP変異体(Venus)遺伝子につなげた発現カセットを含む第三世代レンチウイルスベクターを作製した。最終的に得られた高力価のVSV-Gシュードタイプ型hTERT-hrGFP/Venusウイルスは、培養細胞や患者細胞に対して高い遺伝子導入効率を示した。実際TERT-hrGFPウイルスをCML由来K562細胞とAML-M3由来NB4細胞に感染させ、それぞれimatinibまたはATRAで処理した場合、前者では濃度依存性、後者では時間依存性に増殖抑制とTRAP法で測定したテロメレース活性の低下を認めた。同時に行ったフローサイトメトリーにおいて、hrGFPの蛍光強度はテロメレース活性とほぼ同様の変化を示した。以上より、フローサイトメトリー上の蛍光強度は内因性テロメレース活性を反映することも確認できた。VenusはYFPと比較してタンパク質合成後速やかに蛍光を発し、しかもその強度は20倍高いため、患者検体でもテロメレース活性が高い細胞は蛍光顕微鏡下で可視化することができた。われわれは、これまでに約20例の急性骨髄性白血病(AML)患者由来白血病芽球について上記解析を行い、以下の結果を得ている。(1)患者検体におけるVenus陽性細胞の割合やその平均蛍光強度については症例間の差が大きく、治療抵抗例や再発例は高い傾向が見られた。(2)レポーターウイルス感染前後に添加したCSFによってVenus陽性細胞の割合やその平均蛍光強度が増強する例と変化しない例があり、未分化な形質の芽球(M0やM1)は後者に該当する傾向が見られた。(3)マウス骨髄間質細胞との共培養の結果、敷石状領域を形成する芽球細胞集団の中でもVenus陽性・陰性細胞が混在していることが観察され、白血病幹細胞システムの作業仮説を裏付ける結果が得られた。本研究ではAML患者より採取した白血病細胞一個一個のテロメレース活性を生きた細胞のままで予測するために、レンチウイルスベクターとフローサイトメトリーを用いたhTERTプロモーター活性の測定法を開発した。さらに、この方法により高いテロメレース活性を持つと考えられた白血病細胞の性状や動態の解析を試みた。フローサイトメトリーを用いて測定したhTERTプロモーター活性が、TRAP法で検出した内因性テロメレース活性と相関するかどうか検討し、イマチニブによるK562細胞のアポトーシス誘導系およびATRAによるNB4細胞の分化誘導系において、hTERTプロモーター活性は内因性のテロメレース活性と良く相関した。サイトカイン(+/-)で培養したAML細胞のhTERTプロモーター活性(Venus発現強度)は幅広くほぼ一峰性であり、hTERTの発現は白血病細胞集団において連続的な分布を示すことが示唆された。また、これらのAML細胞においても、hTERTプロモーター活性は内因性テロメレース活性と相関することが示された。