hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
圧負荷が血管壁の細胞を増殖させる機序と病態生理学的意義 -ヒト血管由来の細胞における検討-

(1)短時間の圧負荷がDNA合成や細胞増殖に影響を与えるかどうかを確認した。ラットの胸部大動脈由来の培養血管平滑筋細胞に圧力負荷装置を用いて5-60分の圧力負荷をかけ、Incubatorに細胞を戻した。24時間後にDNA合成は[3H]thymidineの取り込みで、48時間後に細胞増殖はCLONTECHのAbacus^<TM>Cell Proliferation Kitを用いて測定した。結果は5分の圧負荷で[3H]thymidineの取り込みは増加し、30分で約40%の増加と効果はほぼプラトーになった。細胞数も30分の圧負荷により約15%であるが有意に増加した。(2)圧負荷がDNA合成を増加させる機序同細胞を用いて拮抗薬(H-7)の効果を検討することにより少なくともProtein Kinase Cが圧負荷による[3H]thymidineの取り込みの増加に関与していることがわかった。現在、他の細胞内情報伝達系も関与しているか検討中である。ラットのメサンギウム細胞を用いた予備実験では圧負荷によりIP3の産生が増加した。(3)圧負荷の成長因子や血管作動性物質の発現に対する影響RT-PCRによりmRNAの発現を検討したところ、圧負荷により培養血管平滑筋細胞のPDGF-A,PDGF-B,basic FGFの発現が増加する傾向があった。Adrenomedullinの発現は30分の圧負荷により減少し、24時間後圧負荷の効果は消失していた。今後その機序について検討を加える予定である。
ヒト発がんに於けるオカダ酸発がんプロモーション機構の研究

オカダ酸と同様にプロテインホスファターゼ1と2Aの抑制を示すものをオカダ酸クラス化合物と呼ぶが、これらは新しい発癌プロモーション機構を示す発癌プロモーターである。オカダ酸クラス化合物は、いろいろな臓器の発がんを促進した。本年度は、ミクロチスチンによる肝プロモーション機構をヒト肝プロモーションのモデルと考え、研究を行った。DENでイニシェートしたF344雄ラットに、ミクロチスチン(25μg/kg)を週に2回、i.p.で12週間投与したところ、ミクロチスチンは再生肝処置なしで、強力な肝発癌プロモーション活性を誘導することが証明された。また、ミクロチスチンと同様、アオコに含まれるノジュラリンは、5個のアミノ酸からなる環状構造を持つが、この肝発癌プロモーション活性は、ミクロチスチンのそれより強力であり、現在見出された肝発癌プロモーターの中で最強のものと考えられる。ミクロチスチンやノジュラリンを初代培養肝細胞に処理すると、いろいろな蛋白質がリン酸化を受けていた。特に強くリン酸化された2つの蛋白質について、55kDaの蛋白質はサイトケラチン8であり、49kDaの蛋白質はサイトケラチン18であることを証明した。次に、再生肝の細胞核では、オカダ酸の濃度に依存して、Rbとp53のリン酸化は亢進した。更に、ヒト繊維芽細胞でオカダ酸処理によるRb及びp53のリン酸化は増加した。これより、オカダ酸はがん抑制遺伝子産物のリン酸化亢進を誘導していると考えられる。さらに、がん細胞はプロテインホスファターゼが抑制された状況下にあると考えられたが、NIH3T3と形質変換細胞であるF25細胞とでは、プロテインホスファターゼ1と2Aの活性に全く差は認められなかった。これらの活性阻害は、in vitroのレベルで反映できるほど大きいものではないと考えられる。今後、オカダ酸機構のヒト発がんへの応用という考えで研究を進める計画である。
玄武岩の斑晶のホウ素とリチウム同位体比:南九州マントル・ウェッジの不均質性の解明

岩石からのホウ素の効率的な分離のため、「マイクロ昇華法」の適用を試み、ほぼ100%の回収率が得られる条件を確定した。斑晶の微小領域のサンプル採取法としてマイクロミルを使用した。作業中にホウ素のブランク値の増大がみられ、満足できるサンプルの回収方法を確立できなかった。標準岩石を分析し分析精度の評価を行ったが、推奨値と一致した値とならず、さらなる改良の必要がある。現時点では天然試料に適応できない岩石からのホウ素の効率的な分離のため、「マイクロ昇華法」の適用を試み、ほぼ100%の回収率が得られる条件を確定した。現時点では天然試料に適応できない本年度は岩石中のホウ素(B)の定量と分離、および同位体比の分析に関わる実験を行った。1) Bの分離に関する実験:同位体分析のためには,Bをサンプルから高純度で分離する必要がある。本研究では,従来の研究に比べて,より簡便な分離方法の検討を行った。あわせて、極微量のホウ素を扱うのに必要な分析実験雰囲気(フィルター類など)や使用試薬からのBのブランクを軽減するための工夫を行った。サンプルを酸分解後、通常のイオン交換カラム分離を行わずに、マイクロ昇華法を用いて他元素からBを高純度で分離することができた。回収率も95%以上である。2)ケイ酸塩標準岩石について、ICP-MSを用いてBおよびHFS元素(Nb,Ta,Zr,Hf)の定量分析を行い、推奨値や参考値と概ね5%以下の精度で一致する結果が得られ、定量に関しては分析手法を確立できた。3)微量Bの同位体比分析:当研究室に設置されている表面電離型質量分析計(TIMS)を使用して,Bの同位体比を測定する技術を検討した。同位体比をBO_2^-として測定するNegative-TIMS法(N-TIMS)を適用した。ホウ素を除去した海水をイオン化促進剤として使用し5ngのホウ素の同位体比を±1‰の精度で測定することに成功した。本年度は岩石中(岩石薄片中)の微小領域のサンプル採取法の開発,ホウ素の効率的分離方法の開発,および極微量サンプルでの同位体比測定の技術開発を行った。1)本研究では,岩石中から目的の鉱物だけを効率よく採取する必要がある。このため,マイクロメートル単位で制御できるサンプルステージを備えた全自動マイクロミル装置を利用した。これを火山岩の班晶(かんらん石や普通輝石)へ適用し,微小領域のサンプルの採取技術に成功した。マイクロドリルによってできた粉末を効率よく回収するのに,特殊な吸引装置の導入を検討中である。2)微量試料からのホウ素の効率的な分離技術を検討した。マイクロ昇華法を用いることにより,試薬や実験室雰囲気からのホウ素汚染をかなり抑えられることを確認した。3)極微量のホウ素で同位体比の分析をできるように分析方法の検討を行った。100200pgの極微量のホウ素を効率よく分析できそうなトータル・エバポレーション法を検討した。まだ試験段階であるが,スタンダードに関しては再現性のよいデータが得られた。本研究では,1)マグマの分化初期に形成された斑晶(カンラン石と単斜輝石)中の微量なホウ素(B)とリチウム(Li)同位体比を精度よく分析するための技術開発を行い,2)この手法を南九州に産する比較的未分化な玄武岩の斑晶に適用して,マントル・ウェッジの不均質性を解明(「沈み込み成分」の特定と定量化)することを目的とする。本年度はケイ酸塩(火山岩)と炭酸塩(サンゴ骨格試料)から,ホウ素を効率的に分離する技術(マイクロ昇華法)の開発を中心に行った。マイクロ昇華には,三角錐型のテフロン製密閉容器を用いた。100%近い回収率を得るために,昇華温度や昇華時間などの条件を変えて実験を行った。ケイ酸塩岩石には玄武岩(JB-1,JB-2,JB-3),安山岩(JA-1,JA-2,IA-3),流紋岩(JR-1,JR-2)などの標準岩石を,炭酸塩ではJCp-1サンゴ標準試料を用いた。まず,ICP-MSを用いたホウ素の定量分析では,推奨値とほぼ一致する定量結果が得られた。ホウ素の分離実験では,塩酸溶液を用い,100°Cで10時間程度の昇華を行うことで,両タイプの試料(一部の岩石を除く)から,高純度でホウ素の分離に成功し,回収率も100%近い結果が得られた。本法は従来の多段階のカラム分離を必要とせず,ブランク値を抑え分離時間も短縮され,操作も簡便であることから,画期的な方法である。来年度は本方法で分離したホウ素の同位体比分析を行い,再現性と正確度のチェックを行い,実際のサンプルに応用できるようにする予定である。予定していた表面電離型質量分析計(TIMS)にかわり、H23年度末に本研究室に導入されたマルチコレクターICP質量分析計(MC-ICP-MS)を用いて、ホウ素同位体比の分析を行った。

TIMS法に比べ、分析にかかる手間と時間の短縮化、および分析に必要とされるサンプル量の最小化が見込めるからである。炭酸塩標準物質(JCp-1)に対して、昨年度までに開発したマイクロ昇華法を適用してホウ素の分離を行い、MC-ICP-MSで測定した。平均値(d11B=24.5)は文献値と一致したが、繰り返し再現性が少し悪い。pHの復元で必要とされる精度にするために、分析方法の改良が必要である。火成岩標準試料(JB-2)についてマイクロ昇華法でホウ素の分離を行い、高回収率を得た。分離したホウ素はd11Bで9.19.5となり、文献値(d11B=7)に比べてやや高い値となった。同位体分別の原因がどこにあるのか、昇華条件の再検討も含めて、分析の最適化を図る必要がある。レーザーアブレーション-MC-ICP-MS法を適用する実験も行った。これが確立されれば、従来のマイクロミルでの微小領域サンプル採取作業が省略され、懸案であった作業時のブランクの大幅な軽減も期待できる。今回はマトリックスが単純な炭酸塩試料を用いた。JCp-1のプレス・ペレットをスタンダードとして、現世と化石サンゴの分析を試みた。復元されたpHは8.79.0であり予想されるpHの値(8.1)よりも少し高い値であった。レーザー照射条件やサンプル表面の前処理の検討が必要である。以上のように、精度の高い信頼性のあるデータを得るための技術開発に時間を費やしが、炭酸塩についてはほぼ満足できる技術開発が終了している。火成岩についての技術開発は最終的な段階にある。本研究では当初の目的である天然試料への応用までは研究が進展できなかった。分離技術の開発に時間がかかり,測定技術の開発まで行えなかった。最適な昇華条件を決定するための予備実験が多く,これに時間を費やした。未だデータ取得の技術開発段階にあり,実際の天然サンプルへの応用がまだできていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度末にマルチコレクターICP質量分析計(MC-ICP-MS)が本研究室に導入された。当初予定していた表面電離型質量分析計に代わって,この質量分析計を用いて同位体比を測定する技術開発も行う。
アルトラサウンドによるビジュアルフィードバック効果の検証

本研究では、日本人英語学習者が対面するトラブル音学習の問題に対処するため、英語スピーキングの教育現場で最も指導が難しいと言われる発音,中でも指導支援が困難とされる,聴覚上類似している子音や母音の調音の対立を取り上げ,日本語母語話者に特有のトラブル音を改善するため,モデルや自分の調音動作の観察学習の効果の検証を行う,などの目標を掲げた。日本語母語話者の英語トラブル音はピッチ幅の狭さにも現れており、1年目はピッチ幅を分析のターゲットにし、音響特徴に似せた表象的動作(ボクシングのジェスチャー)の観察学習およびミラーリングによるトラブル音改善の効果を検証した。観察学習あり(実験群)・なし(比較群)のグループに分け,音声摸倣のプレテスト,ポストテストを行なったところ,実験群の特に男性グループにピッチ幅の増加が見られた。成果は,International Symposium on Applied Phonetics (2018)で発表済みである。アルトラサウンドによる実験を行う為の1年目の最大の課題は,言語分析に適するアルトラサウンドの選択であったが,スペクトログラフと舌の動態が同時表示されるマイクロアルトラサウンドシステムおよびアルトラサウンドトランスデューサー(Articulate Instruments Ltd.)を選択した。実験に向けて,録音室を設置,プレテスト及びポストテストで使用する日本人が苦手な子音や母音を含む刺激語リストを作成した。アルトラサウンドの選択や入手に時間を要したので、入手までの間、トラブル音の分析ターゲットを、アルトラサウンド無しでできるものへと変更した。聴覚刺激だけではなく視覚刺激が,調音という発話に伴う口内動作を助長する,という仮説を前提としている為,音響特徴を真似た・誇張した手の動作などでも,調音に影響があるのかを検証するため,関連した発話実験を行なった。2018年度に計画していたアルトラサウンドによる実験を2019年度に行う予定であるが,学生のアルバイトを雇用し,スピードアップを測る。次年度使用額が生じたのは,アルトラサウンドの納期が遅れたためである。それゆえ次年度の支出となる。また,International Congress of Phonetic Sciencesで発表が予定されている。
放射光蛍光X線CTによる生体内微量元素分布イメージングの実用化に関する研究

放射光X線の特性を利用して、生体内の特定物質分布を描出する蛍光X線CTシステムの実用化を目指し、ヒト頭部程度の大試料に適用するための最適撮像システムを開発している。その目標は、ヒト脳内に分布する数μg/mlの微量なヨウ素を臨床機能画像化装置PETで実現している空間分解能2mmよりも高い空間分解能で描出することである。平成13年度に、シミュレーションおよび基礎実験によって、大量の散乱X線を低減できれば目標達成が可能であることを明らかとした。本年度は、散乱X線低減手法として、フィルタ法とコリメータ法を検討し、コリメータを用いたポイントスキャン方式が有効であることが分かり、大試料のための最適撮像システム構成を提示することができた。さらに、画像理解のための大試料での画像統合表示の有用性も確認できた。1.フィルタ法による散乱X線低減最適なフィルタ用元素を実験的に選択した.すなわち,セシウムでフィルタを設計すると、検出効率を2.2倍改善することができた。しかし、フィルタ元素自身からの励起蛍光X線が大量に検出器に混入したため、検出器に入る蛍光X線光子の占有率はわずか1.56%であり、目標とする数μg/mlの微量濃度の検出は実現できなかった。2.コリメータによる散乱X線低減とポイントスキャン方式撮像細長いコリメータで散乱X線の混入を抑えて蛍光X線を検出しながら走査観測するポイントスキャン方式を検討した。試作撮像システムにおいて,空間分解能2mmで、脳ファントム内に分布する500μg/mlのヨウ素を描出することに成功した。さらに検出器開口縦幅を拡げ,複数検出器を利用することなどで、数μg/mlの目標濃度検出に近づけられることが分かった。なお、画像再構成の際の光路に沿った吸収補正の有効性も確認した。また、撮像時間は被射体の両側に検出素子を複数配列する構成によって約11分で撮像可能と見積もられ、この方式は推定被曝線量も従来のX線CTの1/50と実用的である。3.機能情報と形態情報の統合機能情報を充分に理解するには形態情報を加味した読影が不可欠である。ここに考えている大試料においても,形態画像として蛍光X線画像と同時に得られるコンプトン散乱X線によるCT画像を利用することが実際的であり、これによる画像統合の有用性を脳ファントム撮像例で実験的に示した。なお,このとき2で示した補正には両者のデータの融合が不可欠であった。
ブラ-マン種♂×黒毛和種・日本短角種・ホルスタイン種♀のF_1の発育能力と産肉能力-ブラ-マン種遺伝子の有用性の検証-

東北大学農学部附属農場において、オ-ストラリアより輸入したブラ-マン種(22)の精液の人工授精により、黒毛和種とのF_1(2B)、日本短角種とのF_1(2N)、ホルスタイン種とのF_1(2H)合計25頭を生産した。1.F_1子牛の発育:生時体重にヘテロ-シスが表われ、純粋種に比し、2B113%、2N137%、ZH125%となった。妊娠期間は57日延長した。18カ月齢体重もF_1群が約50kg上回った。2.粗飼料の利用性と基礎代謝量:12カ月齢と2BとBBの去勢牛を用い、低質チモシ-乾草単一給与下で粗飼料の利用性を比較した。摂取量に差はなかったが、中性デタ-ジェント繊維、乾物および酸性デタ-ジェント繊維の消化率が2Bで優れていた。また、呼吸数、呼気量、心拍数を調べ、2BがBBに比し、基礎代謝量が低いことを明らかとした。3.放牧行動及び放牧地での増体量:夏の日中純粋種は殆ど採食しないがF_1群はよく採食すること、1日の歩行距離が1.41.9倍になること、採食草種数が多いこと、採食量が多いばかりでなく、採食量当たりの増体効率がよいことが示唆された。1720カ月齢去勢牛BB8頭と2B4頭(ともに338kg)の放牧地の145日間の増体は2B93kg、BB37kgであった。4.放牧病に対する抵抗性:小型ピロプラズマに対して、F_1群が抵抗性があり、またノサシバエ、イエバエの1年間の寄生個体数も少ない。5.去勢牛の肥育成績:F_1群の肥育仕上げ日数はNNに比して50日、BBに比して90日短かかった。F_1群は皮下脂肪厚が薄いが、ロ-ス芯面積・歩留が若干低かった。内モモ肉の官能試験の結果はF_1はBBに比し、風味は劣るが、大衆肉としては充分通用する。体脂肪の構成脂肪酸および分子量分布の解析からF_1にはブラ-マン種の遺伝的特性が発現していた。6.ブラ-マン種の基礎代謝の低さ、粗飼料の利用性、優れた放牧適性は日本種にはない極めて注目すべき遺伝的特性で有用と考えられた。1.雑種牛生産育成状況:昭和60年11月61年4月出生で現存の【F_1】は、黒毛との【F_1】(BB)9頭(♀4♂5)短角との【F_1】(BN)8頭(♀2♂3♂3)ホルスと【F_1】(BH)4頭(♀2♂2)の合計21頭である。なお、BHは61年5月と62年3月に各1頭が出生した。また62年7月までに2頭が出生する予定。2.【F_1】雑種の発育状況

上記の21頭の【F_1】について、付属農場の夏山冬里方式の管理に従い、昭和61年5月末より11月中旬まで山の放牧場で育成、以後下牧させ、舍飼に入った。昭和62年3月18日(15.6ケ月齢)の去勢牛(♂)の発育は、BB5頭,BN2頭,BH2頭の順に体重293kg,337kg,371kgであった。父牛が同一であるので、子の発育の差は母品種の大小によると考えられる。なお、【F_1】の毛色については母品種の毛色の影響が強く発現した。3.放牧地での行動と抗病性(1)採食行動:雑種は活発で集合性が強いこと、8月の盛夏通常農場ではみられない日中の採食行動がみられた。(2)抗病性:血中のヘマトクリット値の推移よりピロプラズマに抵抗性があること。血中の補体価も高いことから疾病抵抗性が高いことが示唆された。4.粗飼料の利用性61年10月24日より12月24日まで、チモシー乾草単-給与条件を主として、BB4,BN3,BH2および黒毛純粋4の合計13頭の去勢牛を用いて調査した。採食量は体重当たりで比較してもBHがBBより多かった。現在消化率について分析中で4月上旬までに終了する予定である。5.呼吸試験上記の群で比較すると、黒毛とBBとでは【F_1】のBBが呼吸数,呼気量とも有意に少なく、かつ基礎代謝も低いことが示唆された。6.血液型と核型の分析17座位の血液型分析を母子20組で行い、ブラーマン種がトランスフェリンにおいて日本の品種にはないNとPをもつこと、また核型においてもブラーマン種のY染色体が次中部着糸型で明らかにtauruo系品種と異なることを確認した。1.雑種牛の育成飼養状況:黒毛和種とのF_1(ZB)9頭(♀4♂5),日本短角種とのF_1(ZN)8頭(♀2♂6),ホルスタインとのF_1(ZH)8頭(♀4♂4)の合計25頭について夏山冬里の付属農場の飼養条件で育成・肥育実施中.2.ZB9,ZN7,ZH4頭と黒毛和種(BB)57頭,日本短角種(NN)28頭の成長を比較した.月齢が進むにつれてF_1の成長が有意によくなり,18カ月齢での最少二乗平均値はZH378,ZH370,ZB302,BB255,NN306kgであった.3.ZH2,ZH2,ZB4頭の去勢F_1牛8頭とその対照としてのBB去勢牛5頭を巾20mの禁牧区を隔てて互に行動が影響されないようにして野草地での放牧行動を調査した.(1)採食草種:F_1群は草木類27,木本類13種を採食したのに対し,BB群はそれぞれ18種と10種と少なかった.(2)採食数/分と歩行数/分:F_1群は40と6.9に対し,BB群は26と0.9であり,F_1群はよく歩き,よく食べることが明らかとなった.(3)夏季の日中はBostaurus系品種は採食をしないがF_1群は採食することが確認された.(4)日増体量:145日間の増体量はF_1群の72kgに対し,BB群は0.27kgに過ぎず,F_1が優れていた.(5)マダ=寄生数とノイエバエ,ノイエサシバエの攻票に対する抵抗性:F_1群は6月と7月の調査では明らかに被害が少ないが,9月と10月では逆となった.4.粗飼料の利用性:ナモシー乾草單ー給与条件下でZB4,ZN3,ZH2と対照のBB4頭の去勢牛で消化率を比較したところNDF消化率でF_1が良かった.5.F_1で検出されたBostaurus系品種とは異なるブラーマン由来の染色体の動態を明らかにするために,染色体を構成しているDNAについて各種制限酵素による切断パターンを比較したがBB染色体との差は検出できなかった.6.本年度実施中であるが,結果が63年度になるものとして,(1)昨年10月からのF_1去勢牛とBB去勢牛の肥育成績産用能力の比較(2)F_1雌牛の産子成績と産子の発育性の比較がある.1.雑種中の産肉性:2B(ブラーマン×黒毛和種のF_1)5頭、2N(ブラーマン芽日本短角種のF_1)6頭、2H(ブラーマン×ホルスタイン種のF_1)2頭および対照のBB(黒毛和種)12頭,NN(日本短角種)10頭について、昭和62年11月より単飼で粗飼料飽食・濃厚器料多給の肥育を行い昭和63年6月より10月にかけて逐次屠殺した。
再生不良性貧血の病態に関する研究

再生不良性貧血(再不貧)の病態を明らかにする目的にて、骨髄造血前駆細胞(BFV-E,CFV-E,CFV-GM),骨髄Fibroblastコロニ-(CFV-F)形成能,Fibroblast monolayerの造血前駆細胞支持能,Fibroblast培養上清(FCM)の造血前駆細胞におよぼす影響,骨髄中のTリンパ球と造血前駆細胞の相互作用につき検討した。1.骨髄造血前駆細胞は、BFV-E,CFV-E,CFV-GMとも診断時には著減しており、末梢血液所見が寛解に至っても、造血前駆細胞はかなり減少しており、本症における造血幹細胞の障害はかなり長期にわたって持続するものと思われた。3.骨髄Fibroblast monolayerの造血前駆細胞支持能は、再不貧骨髄由来と正常骨髄由来のmonolayerにおいて差は認めず、培養開始後8週まで浮遊細胞中にCFV-GMを認めた。4.FCMの造血前駆細胞におよぼす影響については、再不貧および正常骨髄由来のFCMにおいて差を認めず、いずれも分子量50,000以上の分画においてCFV-GMコロニー形成を増強する因子の存在を認めた。5.Magnetic Microspheresとモノクロナール抗体を用いて、2例において骨髄中Tリンパ球除去前後のCFV-GMコロニー形成能を比較したがいずれもコロニー形成は認めず、再不貧患児骨髄中の造血抑制Tリンパ球を検出することはできなかった。本研究では、再不貧の成因は末梢血液所見が改善した後にも幹細胞の減少が持続している例が多く、その中の一例で再発を認めたことより造血幹細胞自体の障害が最も大きいと考えられた。
肝細胞の発生・増殖・分化の分子機構

肝芽細胞(肝臓幹細胞)は肝細胞と胆管上皮細胞に分化する細胞であるが、その実体は十分に理解されていない。我々はEGFリピートを持つ膜タンパク質Dlk/Pref1が肝芽細胞に発現しており、Dlk陽性細胞はin vitroで肝細胞と胆管上皮細胞へと分化することを示してきた。Notch2が肝芽細胞で発現し、門脈周辺の細胞がNotchのリガンドであるJagged1を発現していることを見いだした。さらに分離したDlk陽性細胞にNotchの活性化型を発現すると、肝細胞への分化が抑制され胆管上皮への分化が促進された。これらの結果は肝内胆管の形成に異常を示すAlagille症候群の原因遺伝子がJagged1であるという結果とよく一致しており、Notchのシグナルが肝芽細胞の分化の方向性を決定する上で重要であると考えられる。Dlk陽性細胞を胎児肝臓から分離してラミニンでコートしたプレートで培養すると長期間培養可能な細胞が再現よく得られた。この細胞は培養条件により肝細胞、胆管上皮細胞あるいは膵臓細胞に分化することから、多能性の内肺葉系前駆細胞であると考えらる。Dlkの発現は肝臓の分化が進むに連れて減少し成体肝臓では全く認められない。重篤な肝障害により出現するoval細胞は肝細胞と胆管上皮細胞に分化し得る成体肝臓の幹細胞であると考えられているが、この細胞におけるDlkの発現をラットの肝障害モデルにて検討した。Dlkはoval細胞の一部で発現しており、肝芽細胞とoval細胞との類似性が示されたが、oval細胞が均一な細胞集団ではないことも明らかとなった。我々はすでにマウス胎生肝臓細胞の培養系を確率して、未分化肝細胞がIL-6ファミリーのOncostatin M(OSM)により分化が誘導されアミノ酸代謝や糖代謝などに関与する様々な酵素の発現することを示してきた。マウスの個体発生に必須のjmjやC/EBPa遺伝子の欠損マウスにこのシステムを応用して、それらが肝細胞分化に必須であることを示した。また、胎児肝臓のDlk陽性細胞が肝細胞と胆管上皮細胞に分化する能力を備えた肝芽細胞(肝幹細胞)であることをすでに示したが、Dlk陽性細胞にはNotch2が発現すること、そのリガンドであるJagged1が門脈域にのみ発現すること、さらにDlk陽性細胞にNotchの活性化型である細胞内ドメインを発現すると肝細胞分化が抑制されて胆管上皮細胞の分化が促進されることから、Notchが肝芽細胞の分化に重要であることを明らかにした。また、成体肝臓が重度の傷害を受けたときに出現する肝幹細胞と考えられるオーバル細胞の遺伝子解析を行い、胎生期の肝芽細胞との比較を進めている。肝臓分化に関する分子生物学的研究が血液・免疫系の研究に比べて進んでいるとはいいがたい。その理由の一つに肝臓の細胞を分離/同定に利用可能な抗体が少ないことがある。そこで、マウスの胎生肝臓細胞に対するモノクローナル抗体を多数作製し、抗原の同定を行うとともに抗原分子の発現解析を進めている。すでに肝類洞内皮細胞を分離する抗体などが得られており、純化した細胞集団を使った遺伝子発現解析等を進めている。我々は発生直後のマウス胎児肝臓に細胞膜抗原Dlk/Pref1が発現しており、これに対する抗体を使ってDlk陽性細胞を分離し、それが肝細胞と胆管上皮細胞に分化する肝芽細胞であることを示してきた。この肝芽細胞はNotch2を発現していること、門脈周辺の細胞がJagged-1を発現していること、さらに分離したDlk陽性細胞に活性化型Notchを発現すると肝細胞への分化が抑制されて胆管上皮細胞への分化が促進されることを示した。これらの結果は、肝内胆管形成異常を示すAlagille Syndromeの原因遺伝子がJagged1であることとも一致しており、Notchが肝芽細胞の分化に重要てあることを示している。

胎児肝臓から分離したDlk陽性細胞集団からラミニンでコートしたプレートで長期培養可能な細胞が再現性よく出現し、この細胞は肝細胞と胆管上皮細胞への分化能をもつことから、内胚葉系の幹細胞である可能性が示唆された。Dlkは肝分化とともに発現が低下して成体肝臓では全く発現が認められないが、成体肝臓に重篤な障害が生じた場合に門脈周辺に出現するオーバル細胞は成体肝臓の幹細胞と考えられており、Dlkが発現する可能性が考えられた。この可能性をラット肝障害モデルで検証し、オーバル細胞の一部にのみその発現を認めた。この結果はオーバル細胞が均一な細胞集団ではないこと示しており、現在オーバル細胞の分離と遺伝子解析など、さらにこの細胞の性状の解析を行っている
米国IT多国籍企業のインターネットを利用した特許ポートフォリオ戦略の研究

今年度の研究により、これまでの米国多国籍企業のインターネットを利用した特許ポートフォリオ戦略の研究に加えて、新たに日本多国籍企業の同戦略との比較分析の研究を行うことができた。また、これまでの米国多国籍企業の研究では、主に文献資料や理論面での考察が主だったものであったが、今年度は日本多国籍企業62社に対してアンケート調査を行い、そうした実証研究分析の成果を加えることが可能となった。とくに、アンケート調査の成果は、これまでの理論研究との比較分析の観点から、『小樽商科大学・商学討究』の第53巻第4号に、「日本多国籍企業の技術戦略進化とその問題点(上)-アンケート調査による日米比較分析を基に」としてまとめている。今年度の研究成果としては、アンケート調査に関する論文の後半部分について記していないが、同じく『小樽商科大学・商学討究』の第54巻第1号に、「日本多国籍企業の技術戦略進化とその問題点(下)-アンケート調査による日米比較分析を基に」を掲載予定である。そして、今回の若手研究(B)での研究補助で蓄積した論文等をまとめ、2003年度中にその総合的な内容を博士論文として提出する予定である。博士論文の内容は、第1部として文献研究、第2部として理論研究、第3部として実証研究を予定し、その各部分に今回の科研費補助によって執筆した論文(レフリー論文1本、学会論文集論文1本、大学紀要3本[今回、研究成果に記していないものも含む])を組み込む予定である。今年度は、「米国IT多国籍企業のインターネットを利用した特許ポートフォリオ戦略の研究」の前半部として、主に理論的研究に重点を置き考察を行ってきた。とくに文献研究の中から、以下のような事実を新たに発見することができた。すなわち、米国企業の多国籍化が始まった1960年代から、IT革命が本格化する1990年代前半にかけては、米国多国籍企業の技術戦略は技術開発戦略と技術管理戦略の交互台頭の動きを示しており、これは内部経営資源の範囲内で技術戦略進化を進めてきたことを意味している(=内的成長下での技術戦略進化)。一方、1990年代後半以降の米国多国籍企業の技術戦略は、技術開発戦略と技術管理戦略がそれぞれ独自の進化を遂げつつあり、これは外部経営資源の活用により限られた内部経営資源の制約が外されたことによるものと考えられる(=外的成長下での技術戦略進化)。そして、本研究のテーマである、インターネットを利用した特許ポートフォリオ戦略とは、こうした外的成長下での米国IT多国籍企業の代表的な技術管理戦略として、理論的に位置付けられることが明らかにされた。本年度は、こうした研究成果をまとめた論文を大学紀要に掲載し、この他にも学会大会において同研究成果の報告を行っている。1.「米国多国籍企業の技術戦略サイクル・モデル」日本経営学会・第75回大会自由論題、桃山学院大学、2001年9月6日9日。2.「多国籍企業の技術戦略サイクル・モデル-第二次世界大戦後の米国多国籍企業による技術戦略の進化過程」国際ビジネス研究学会・第8回全国大会自由論題、パルセいいざか(福島大学)、2001年10月20日21日。次年度は、こうした理論的含意を持って、主にアンケート調査といった実証研究を中心に、より具体的に米国IT多国籍企業のインターネットを利用した特許ポートフォリオ戦略の実態について、考察を進めることとしたい。
学習者参加型授業を促進する教員の学習支援スキル育成カリキュラムの開発

本研究において得られた結果として、教員研修では、(1)多くの学校においては、一斉授業型になじみ、たとえ、学習者参加型の教員研修で体験的に学んでも、現場では、多様な指導法が実践できる状況にはない。(2)教員は多忙なため時間がなく、なかなか積極的に、手間のかかるグループワークなどの学習者参加型の授業を構築できない。(3)教員自身、モデルカリキュラムから実際の実施カリキュラムへの応用が難しいことから、現場でそのまま利用できる実践的なカリキュラムが必要と考えられるが、むしろ、教員自身の応用力を鍛える必要がある。(4)教員の学習支援スキル育成には、本研究で作成した継続的な体験型研修カリキュラムの必要性が大きい。大学での教員養成に関しては、(1)学生は、自らが学ぶ姿勢が弱く「受け身」が染みついている。(2)「教わる」から「学ぶ」への意識転換がなかなか困難である。(3)考える力、応用する力、議論して意見などをまとめる力などの評価が難しいことから、共有された学習成果の活用方法、学習者参加型の指導手法、評価の方法の開発が必要である。これらのことが示唆された。1目的本研究は、教員のスキルとして「教えるスキル」に加え、学習者参加型の授業には必須となる「学習支援スキル」が身につけられる教員研修・養成カリキュラムを期間内に開発することを目的としている。そして、教員研修・養成カリキュラムの実施により、従来型の「教える」ことから「学習を支援する」ことへの教育観の転換に寄与することである。2方法(1)これまでの研究成果を教員研修・養成の視点で整理・検討すでに、平成15年度、16年度の2年間にわたる研究の結果、収集データや成果が蓄積されているので、研究分担者で、教員研修・養成カリキュラム作成の視点で整理し検討したのち、研究者会議を開き協議した。また、これまでの研究に加わった現職の教員の協力をも得ることができた。(2)教員の学習支援能力の現状分析と教員研修・養成カリキュラムの検討実態把握:「総合的な学習の時間」を含む教科学習全般のなかで教員が行っている学習者参加型の授業や教員が持っている学習支援能力についてアンケート調査を実施して現状分析をした。(3)能力開発手法の検討学習支援のための能力(問題設定能力、問題解決力、学び方・ものの考え方、主体的な態度、創造的な態度、協同・協働する態度など)の育成手法を、実際の教員研修の中で検討した。3結果アンケート調査結果、たとえば、自ら課題を見付、問題を解決する力を育てるには、「コミュニケーション」「褒める、受け入れる」など、児童・生徒との肯定的なコミュニケーションが重要であるなどの示唆が得られた。すべての調査項目に関する結果の考察は、冊子「平成19年度科学研究費補助金(基盤研究(C))中間報告」(130p)にまとめた。また、本研究のテーマを遂行するにあたり、文部科学省が三重県教育委員会と連携して開催している講座『平成19年度「総合的な学習の時間」コーディネーター養成講座』(平成19年8月28日(火)と平成19年10月4日(木)の2回)と協働して研究した。教員研修の結果、たとえば、コーディネーターとして身につける必要のある資質については、「状況把握力・分析力・洞察力」「情報収集・発信力」「調整力」「リーダーシップ」「知識・技能」「企画力」「意欲・好奇心など」に分類できた。この他の結果・考察も上述の「中間報告」にまとめた。1目的本研究は、「総合的な学習の時間」などを通し、教員のスキルとして「教えるスキル」に加え、学習者参加型の授業には必須となる「学習支援スキル」が身につけられる教員研修・養成カリキュラムを期間内に開発することを目的としている。そして、教員研修・養成カリキュラムの開発・実施により、従来型の「教える」ことから「学習を支援する」ことへの教育観の転換に寄与することである。(2)教員の学習支援能力の現状分析と教員研修・養成カリキュラムの検討

実態把握:「総合的な学習の時間」を含む教科学習全般のなかで教員が行っている学習者参加型の授業や教員が持っている学習支援能力についてアンケート調査を実施し現状を分析し、結果を冊子「平成19-20年度科学研究費補助金(基盤研究(C))中間報告」(127p)にまとめた。(3)能力開発手法の検討学習支援のための能力(問題設定能力、問題解決力、学び方・ものの考え方、主体的な態度、創造的な態度、協同・協働する態度など)の育成手法を、2年間にわたる実際の教員研修および本学の教職課程に関わる授業の中で検討した。3結果アンケート調査結果、たとえば、自ら課題を見付け、問題を解決する力を育てるには、「コミュニケーション」「褒める、受け入れる」など、児童・生徒との肯定的なコミュニケーションが重要であるなどが示唆された。すべての調査項目に関する結果の考察は、冊子「平成19-20年度科学研究費補助金(基盤研究(C))最終報告」(180p)にまとめた。また、本研究のテーマを遂行するにあたり、文部科学省が三重県教育委員会と連携して開催している講座『平成19年度および20年度「総合的な学習の時間」コーディネーター養成講座』と協働して研究した。教員研修の結果、コーディネーターとして身につける必要のある資質については、「状況把握力・分析力・洞察力」「情報収集・発信力」「調整力」「リーダーシップ」「知識・技能」「企画力」「意欲・好奇心など」に分類できた。この他の結果・考察も上述の最終報告書にまとめた。
立体構造と生物活性発現の関連性の解明を目指したレパジン類の網羅的な短段階合成

平成28年度はレパジンBの全合成経路確立を目指し検討を行った。先ず鍵となるハロアミノ化反応前駆体として、ジエンを含む側鎖ユニットを有する基質の合成を行った。その結果、出発物質から8工程にてハロアミノ化反応前駆体を合成した。続いて鍵となるハロアミノ化反応を行った。モデル基質での予備検討で見出した最適条件を適用したところ、低収率に留まるものの立体選択的に環化体を得ることに成功した。得られたオクタヒドロインドールの塩基性条件下のヒドロキシ基の導入を伴う環拡大反応は反応の位置選択性に問題を残すものの、位置異性体混合物として目的物を得ることに成功した。最後にアミノ基のパラメトキシベンジル基の除去を試みた。定法に従い酸化的な除去、および酸性条件下の除去を試みたがいずれの場合も基質の損壊を招くのみでレパジンBを得るには至らなかった。パラメトキシベンジル基よりも容易に除去可能なベンジル系保護基を用いて検討したが、脱保護は困難であった。以上の結果を受け、2級アミンに対する求電子的ハロアミノ化反応を適用した合成経路は断念せざるを得なかった。しかし、レパジンB保護体の合成を10段階で行うことができたので、不活性化基をアミンに対して導入せずにアミノ基の反応性を生かして複雑なアルカロイドを短段階合成する、というコンセプトを提示することはできたものと考えている。また、本研究で得た知見を生かした新たな合成戦略に従ってレパジンBの形式全合成を達成した。すなわち環化反応で確認した課題点を解決すべく、銅触媒を用いた分子内環化反応を適用した。その結果、市販品から10工程にてAmatらが報告しているレパジンB合成中間体(Chem. Eur. J., 2015, 21, 12804)を得ることに成功した。当初想定していた合成戦略に基づくレパジンBの短段階合成は頓挫したが、市販品から10段階で天然物保護体を得ることに成功した。また、この研究で得られた知見を生かし、新たな手法によりレパジンBの形式全合成を達成することができた。本手法はレパジン類の他の誘導体合成にも適用可能である。以上の理由により全体としては概ね順調に進展したと言える。確立した分子内アミノ環化反応を適用し、他の類縁体の合成に取り組む。研究成果の論文化に伴う諸経費として使用する。また、消耗品の購入に充てる。当初購入を予定していた分取クロマトグラフィーを導入しなかったため。購入を見据えデモ機を暫定的に導入したが、検討の結果本実験機器を利用せずとも問題なく研究を遂行できると判断した。
マイクロ穿刺デバイスによる3次元細胞注入システムの実現

3次元細胞注入システムで使用する穿刺深さ計測方法として,インピーダンス値をもとに穿刺深さを計測する3種類の方法,針・板電極法,二針電極法,MEMS電極法を考案した.針・板電極法は穿刺針とステンレス板対極電極を用いる方法,二針電極法は2本の穿刺針を用いる方法,MEMS電極法はMEMS技術を用いて複数の電極を1本の針上に形成した穿刺針を用いる方法である.MEMS電極は市販の注射針(27G,直径0.04mm,長さ15mm)の円筒面上に,絶縁層となるネガ型の感光性ポリイミドをフォトリソグラフィによって形成し,さらに,2層目の電極となる白金薄膜をリフトオフ法によってパターニングした.濃度6.5%のゼラチン試料を用いて,評価実験を行ったところ,全ての穿刺深さ計測法で5%以内の誤差で穿刺深さが数10μmの単位で計測可能であることを確認した.加えて.位置決め精度10μm,分解能1μmのマイクロ穿刺針駆動系および細胞注入精度0.125μlの細胞注入システムも開発した.以上の研究により,スキャッフォルドなどの目標生体組織に対してマイクロメートルオーダーの穿刺深さ精度で針を挿入し,遺伝子キャリア細胞を高精度で注入するシステムが開発できた.一方,組織内細胞インジェクションについて,脱細胞化生体組織を用いて検討を行った.組織外部から細胞を播種した場合、組織内に空隙が多数存在する場合でも内部への細胞の浸潤はおこらなかった.そこで注射器を用いて手動で注入したところ、組織内部に生着した.このことから、厚みのある組織(大血管、心筋など)に細胞を植え込む場合には注入法が有効であることが分かった.さらに,注入する針の表面を生体適合化する技術として,ハイドロキシアパタイトナノ粒子の固定化について検討を行い,様々なナノ粒子と固定化法についての有用なデータを得た.3次元細胞注入システムで使用する穿刺深さ計測方法として,穿刺深さ穿刺針を針電極として用いて,針電極と板電極間のインピーダンス値をもとに穿刺深さを計測する方法を考案した.20mm×20mm×2mmの濃度20%のゼラチン,20mm×20mm×6mmの豚の心筋を用いて,本法の基礎的評価実験を行った.試料を35mm角のステンレス板対極電極上に置き,マイクロメータに取り付けた32Gのステンレス針を試料の中心に対して垂直に穿刺した.穿刺針を100μmごとに下降させた時と,最下点から100μmごとに上昇させたときのインピーダンス計測を行い計測精度,再現性を評価した.インピーダンス計測は,定電流計測を採用し,測定電流値0.3mA(rms),測定周波数100Hzとした.ゼラチンでは0mmから2mmの穿刺深さの変化に対して,インピーダンス値は,10000Ωから6000Ωに,豚の心筋でも,0mmから6mmの穿刺深さの変化に対して,インピーダンス値は,1100Ωから600Ωに非線形に変化した。穿刺針の上昇,下降時に若干の差があるヒステリシス特性と,施行回による差を認めたが,安定的な,穿刺深さに対するインピーダンス変化の関係を確認し,本法を用いた穿刺深さ計測の可能性を確認した.同時に.マイクロ穿刺駆動系も考案し,ボールネジ直結型パルスモータを採用することにより,位置決め精度10μm,分解能1μmの穿刺針移動機構を開発した.細胞注入方式に関しては,穿刺針先端部にカッターブレイドをマイクロマシン(MEMS)技術を形成,回転動作により細胞注入スペースを確保する方法の考案を行った.そのほか,MEMS技術による針表面上へのマイクロ計測電極製作方法の確立,マイクロ電極間の短絡防止の表面ナノ改質技術の検討を行った.3次元細胞注入システムで使用する穿刺深さ計測方法として,インピーダンス値をもとに穿刺深さを計測する3種類の方法,針・板電極法,二針電極法,MEMS電極法を考案した.針・板電極法は穿刺針とステンレス板対極電極を用いる方法,二針電極法は2本の穿刺針を用いる方法,MEMS電極法はMEMS技術を用いて複数の電極を1本の針上に形成した穿刺針を用いる方法である.MEMS電極は市販の注射針(27G,直径0.04mm,長さ15mm)の円筒面上に,絶縁層となるネガ型の感光性ポリイミドをフォトリソグラフィによって形成し,さらに,2層目の電極となる白金薄膜をリフトオフ法によってパターニングした.濃度6.5%のゼラチン試料を用いて,評価実験を行ったところ,全ての穿刺深さ計測法で5%以内の誤差で穿刺深さが数10μmの単位で計測可能であることを確認した.加えて.位置決め精度10μm,分解能1μmのマイクロ穿刺針駆動系および細胞注入精度0.125μlの細胞注入システムも開発した.以上の研究により,スキャッフォルドなどの目標生体組織に対してマイクロメートルオーダーの穿刺深さ精度で針を挿入し,遺伝子キャリア細胞を高精度で注入するシステムが開発できた.一方,組織内細胞インジェクションについて,脱細胞化生体組織を用いて検討を行った.組織外部から細胞を播種した場合、組織内に空隙が多数存在する場合でも内部への細胞の浸潤はおこらなかった.そこで注射器を用いて手動で注入したところ、組織内部に生着した.

このことから、厚みのある組織(大血管、心筋など)に細胞を植え込む場合には注入法が有効であることが分かった.さらに,注入する針の表面を生体適合化する技術として,ハイドロキシアパタイトナノ粒子の固定化について検討を行い,様々なナノ粒子と固定化法についての有用なデータを得た.
ω-3系脂肪酸の発癌、転移抑制メカニズムの解析

【目的】癌の集学的治療において栄養管理は欠かせないものとなったが、長期遠隔成績の改善とは結びついていない。しかし、最近の臨床栄養学の進歩は、担癌生体における個々の脂肪酸やアミノ酸の作用についての解析を進めると共に投与する栄養因子の組成も自由に組み替えることを容易にした。ω3系多価不飽和脂肪酸は細胞膜構成の変化を介する種々の疾患予防効果によって注目されるようになってきた。そこで小児悪性固形腫瘍のなかでも最も頻度が高く、進行癌症例の予後が極めて不良である神経芽腫を対象としてω3系脂肪酸の腫瘍増殖、転移に及ぼす効果について検討を行った。【方法ならびに結果】1) A/Jマウスに普通食、高ω3系脂肪酸食を与え、マウス神経芽腫C-1300を尾静脈より注入し、liver colony assayを用いて転移の抑制効果を判定した。肝転移結節数、肝湿重量/体重比、肝組織像よりω3系脂肪酸による転移抑制効果を認めた。3)ω3系脂肪酸投与によりPGF2の産生が抑制されたことからcyclo-oxygenase inhibiterを投与し、転移抑制効果を観察し、肝転移の抑制と生存率の高値を認めた。【考案】生体の細胞膜はリン脂質よりなり、摂取脂肪酸のパターンは細胞膜の脂肪酸構成に反映される。ω3系脂肪酸が膜に取り込まれる結果、エイコサノイドのタイプは2シリーズから3シリーズに変わる。さらに膜の安定性、流動性、膜に関連する酵素、レセプター、糖鎖にも影響を及ぼす。これらが各種効果につながると考えられる。腫瘍増殖抑制、担癌生体の免疫抑制防止、血管新生抑制、抗血栓作用による着床防止等多くの段階に作用する。ω3系脂肪酸の作用は多岐にわたり、さらに解析が進むなら有効な抗癌療法として期待される。小児悪性腫瘍の集学的治療においても栄養管理は欠かせなくなっている。そして最近は、栄養状態を維持、改善するだけでなく、栄養素の配合を変化させることにより腫瘍増殖を抑える試みも行われるようになってきた。ω3素多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸(EPA)が、動脈硬化抑止効果を頂点に、膜構成の変化を介する種々の疾患予防効果によって注目されはじめ、癌治療への応用も考慮されるようになってきた。生体の細胞膜はリン脂質より成っており、摂取脂肪酸のパターンは細胞膜の脂肪酸構成に反映される。膜リン脂質にとり込まれたω3系脂肪酸はアラキドン酸の膜リン脂質からの遊離を抑制し、産生されるエイコサノイドのタイプを変化させる。さらに膜表面のレセプターの感受性にも影響を及ぼす。ω3系脂肪酸投与によって膜リン脂質の構成が変ることは生体の機能を変化させ、癌増殖抑制、転移抑制へと働くことが期待できる。そこで、われわれはマウス神経芽腫を用い、ω3系脂肪酸の転移抑制効果を検討した。マウス胃内のそれぞれ、生食、大豆油、EPA、ドコサヘキサエン酸を連日2週間投与した4群を作製し、マウス神経芽腫C-1300を尾静脈より注入し、更に2週間後、犠死し、liver colony assayにて判定した。EPA投与群は他の3群に比し、肝転移結節数が少なく、肝湿重量/体重比も低値であった。血漿総脂質酸構成においてリノール酸、アラキドン酸の低下をEPAの増加を認めた。現在、アラキドン酸カスケードのω3系脂肪酸投与による変化をみるためプロスタグランジンの測定、ならびにtransforming growthfactorの測定を行なっているところである。【目的】前年度、マウス神経芽腫の肝転移モデルを用いてω3系脂肪酸の肝転移抑制効果について報告した。今回、その作用機序を検討する目的で以下の実験を行った。【方法】

マウスに無脂肪食を1週間摂取させた後、普通食投与群、低脂肪食投与群、高ω3系脂肪酸食投与群の3群を作製した。それぞれ2週間、摂取させた後、腹腔マクロファージ、脾マクロファージを採取し、LPSで刺激し、培養液上清中のprostaglandin E2(PGE2),transforming growth factor β(TGFβ)を測定した。【結果】低脂肪食投与群は普通食投与群に比べ、PGE2,TGFβともにその産生量が高値であった。高ω3系脂肪酸食投与群は普通食投与群に比べ、PGE2の産生は抑制されたが、TGFβの産生は抑制されなかった。【考案】ω3系脂肪酸によるPGE2産生抑制は、ω3系脂肪酸が細胞膜リン脂質に取り込まれ、アラキドン酸からの2シリーズ産生からω3系脂肪酸による3シリーズへ変化したことによると考えられる。PGE2は免疫系細胞に対し、種々の抑制効果を持っており、ω3系脂肪酸によるPGE2産生抑制は、転移抑制と関連があると思われた。TGFβは従来、創傷治癒との関連で注目されてきたが、最近、免疫抑制効果も明らかとなった。今回の実験ではTGFβの産生は抑制されなかったが、TGFβは、細胞増殖を抑制することも明らかとなっており、アポトーシスとの関連性も指摘されていることから今後も癌増殖抑制、転移抑制の面から検討を行っていく必要があると思われた。【方法】1)cyclo-oxygenase inhibiterであるIndomethacinがPGE_2産生を抑制する事を確認した後、マウス神経芽腫C-1300細胞注入1日前より連続5日間Indomethacinを皮下注したI群、細胞注入後6日目より皮下注したII群、Indomethacinを投与しなかった群を対照群とした3群を作成した。。2)通常の飼料を摂取させた群とω3系脂肪酸を多く含む飼料を摂取させた群を作成し、腹腔マクロファージを採取しprocoagulant activityを測定した。【結果】1)I、II群は肝転移が抑制され、生存率も対照群に比し有意に高かった。I、II群間ではI群がII群より高い傾向にあり、I群で長期生存したものに下肢骨への転移を認めた。以上より、ω3系脂肪酸のマウス神経芽腫肝転移抑制の機序にはPGE_2産生低下による免疫系への関与とprocoagulant activity低下による凝固系の抑制が関与していることが示唆された。
扁桃体中心核におけるシナプス可塑性の可視化とその生理的意義

痛みなどの無条件刺激と条件刺激との連合学習には、扁桃体基底外側核が連合の座とされてきた。一方、侵害受容信号は橋の腕傍核(lPB)から扁桃体外包中心核(CeC)に直接入力する。すなわち、CeCはlPBからの直接経路と、高次処理された間接経路との連合の座と捉えられる。我々は、直接経路・間接経路が情動学習依存的にシナプス増強を示すことを見出した。また、lPBの抑制は恐怖記憶の形成を顕著に減弱させた。さらに、lPBにチャネルロドプシンを発現させ投射先であるCeCを光刺激すると、人工的な恐怖記憶を作ることに成功した。以上の結果から、直接経路は忌避信号として機能することが示唆された。情動は、認知・意欲などの発現に深く関与すると共に、危険な場所や刺激を学習することで、個体の生存維持に重要な役割を担う。痛みなどの無条件刺激(US)と条件刺激(CS)との連合学習である情動学習のひとつ、恐怖条件付けには、扁桃体外側核が責任領域として注目されてきた。一方、痛みは扁桃体外包中心核(CeC)に直接入力することが知られ、CeCもCS-US連合の場と捉えられる。我々は今まで、CeCシナプスが慢性痛成立後および情動学習依存的に顕著なシナプス増強を示すことを報告してきた。そこで本研究ではCeCを負情動連合の座と捉え、CeC可塑性制御の分子機構とその生理的役割を明らかにすることを目的としている。当該年度の研究実績としては、CeCに直接痛みシグナルを入力する中継核である腕傍核を薬理学的に可逆的に抑制すると、情動記憶の形成が有意に減弱することを見出した。これは、腕傍核という原始感覚中継核が恐怖記憶形成などの高次脳機能制御に積極的に関与するという初めての報告である。一方、腕傍核の活動抑制により、熱性、機械性疼痛閾値およびUS侵害受容刺激に対する閾値には顕著な変化が見られなかった。これらの結果は、腕傍核の活動が、情動記憶の獲得に関与することを示唆するものである。さらにその異常は、心的外傷後ストレス症候群(PTSD)などにも直結し、現代のストレス社会において最重要課題のひとつである。情動の座である扁桃体は、痛みなどの無条件刺激(US)と条件刺激(CS)との連合学習である恐怖条件付けにおいて中心的役割りを担う。特に、扁桃体外包中心核(CeC)には痛み信号が直接入力することが知られ、我々は今まで慢性痛成立後や恐怖記憶形成後にCeCシナプス可塑性が誘導されることを報告してきた。そこで、本年度は、痛みの中継核である橋の腕傍核-CeCシナプスに着目し、恐怖記憶形成においてこの経路が必要かつ十分であることを見出した。痛みなどの無条件刺激(US)と条件刺激(CS)との連合学習である恐怖条件付けには、扁桃体外側核が責任領域として世界中で研究が進められてきた。しかしながら近年、それまで扁桃体の単なる出力系と捉えられてきた中心核が、外側中心核(CeL)外包中心核(CeC)および内側中心核(CeM)の亜核より構成され、抑制・脱抑制による統合処理を担うことが示された。さらに、痛み信号は橋にある腕傍核からCeCに直接入力することも知られ、CeCもCS-US連合の場と捉えられる。そこで、本研究ではCeCを新たな連合の座と捉え、情動学習における生理的役割を神経回路から行動制御レベルまで一貫して解明することを目的とする。具体的には、情動依存的学習後にCeCのシナプス可塑性が誘導されていることを見出した。また、このシナプス可塑性が連合依存的に誘導され、プレシナプスからの小胞放出確率の亢進を伴うことも見出している。今後、痛みを手がかりとした情動依存的記憶制御の神経回路機構を明らかにしてゆく。慢性痛成立後にCeCのシナプス増強が報告されているが、我々は恐怖記憶成立後にCeCの顕著なシナプス増強を見出した。このシナプス増強は連合学習依存的であり、さらに、扁桃体外側核・基底外側核を介した間接経路、および腕傍核からの直接経路どちらにもシナプス増強が見出された。このシナプス増強にはプレシナプスからの神経伝達物質放出確率の増大を伴うことが明らかとなった。さらに、このシナプス増強には痛みペプチドであるCGRPが関与することが示された。一方、個体レベルでの解析では、直接経路の起始核である腕傍核の抑制により、情動記憶の形成に障害が出ることも見出した。これらの結果は、従来着目されてきた視床・皮質を介した経路による恐怖記憶制御に加えて、新たに腕傍核からの直接経路が恐怖記憶に関与することを示すものである。情動記憶は個体の生存に重要な鍵として機能する。痛みなどの無条件刺激(US)と音や空間などの条件刺激(CS)との連合学習である恐怖条件付けには、扁桃体外側核がその責任領域として長年研究が進んできた。一方、USとして用いられる痛みシグナルは、腕傍核(PB)から扁桃体外包中心核(CeC)に直接入力することが知られ、CeCもCS-US連合の場として捉えられる。