hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南極半島域の温暖化がペンギン類の採餌行動に及ぼす影響に関する研究

本研究課題は、温暖化の著しい南極半島域に生息するペンギン類に着目し、その行動パターンと周囲の海洋環境データを結びつけて解析することにより、グローバルな海洋環境変動に対する高次捕食者の応答過程を解明することを目的としている。2009年度は、2006/2007年に実施した、南極半島域に生息する2種のペンギン類の行動調査結果を論文にまとめ、改訂を重ねて英文雑誌(Marine Biology)で発表したほか、2009年7月に札幌で行われた国際学会で口頭発表した。2009年12月から2010年2月にかけては、同じく南極半島域のフィールドを訪れ、新たにペンギン類の行動データを取得してきた。このフィールド調査では、ペンギンに装着した各種の小型機器類(GPS、デジタルカメラ、3軸の加速度計等)を用いて、ペンギンの潜った地点やその深さ、ペンギンの餌であるナンキョクオキアミの水中での鮮明な画像、ペンギンの餌獲り行動に関係すると考えられる頭部の細かい動きなど、新規性の高い十分な量のデータを収集してくることができた。またペンギンの営巣数や繁殖成績など、今期のペンギンの繁殖状況の指標となる基礎データも取得した。今後、これらのデータを詳しく解析し、ペンギンの行動圏におけるナンキョクオキアミの分布状況や、微細なスケールで観測したペンギンの捕食行動についての論文を執筆する予定であるほか、2006-2007年シーズンと2009-2010年シーズンのペンギンの採餌行動・繁殖状況の違いと、衛星リモートセンシングによって得られる各年の海表面水温・一次生産量等の海洋環境状況の違いがどうリンクしているかを解析して、論文にまとめる予定である。本研究課題は、温暖化の著しい南極半島域に生息するペンギン類に着目し、その行動パターンと周囲の海洋環境データを結びつけて解析することにより、グローバルな海洋環境変動に対する高次捕食者の応答過程を推定することを目的としている。本研究では、同所的に生息する2種のペンギン、ヒゲペンギンとジェンツーペンギンをとりあげ、その採餌行動の違いを詳しく調べた。ペンギンの行動は、詳しい位置を測るGPS-深度ロガー、水中の画像を撮るカメラロガー等をペンギンに取り付けることによって調べた。その結果、ヒゲペンギンは深い海域の海表面近くの層へ潜水して採餌する一方,ジェンツーペンギンは浅い海域の海底近くへ潜水して採餌するという違いがあることがわかった。また実際にジェンツーペンギンが海底上でナンキョクオキアミを追って捕食する場面がしばしば画像に写っていた(Takahashi et al.2008)。南極半島周辺では,ヒゲペンギン・ジェンツーペンギン共に,ナンキョクオキアミを主な餌としている。しかし当地域ではヒゲペンギンの個体数は減少傾向にある一方,ジェンツーペンギンの個体数は増加もしくは安定傾向にあることが,近年の研究によって明らかになってきている。このようなペンギン種毎の個体数変化傾向の違いと,本研究で明らかとなった採餌行動の違いとを考えると,近年顕著な南極半島域の温暖化は,海洋の表層と底層の,ナンキョクオキアミを鍵種とした生態系に違った形で作用しており,その結果として両種は採餌行動・繁殖成績の面で異なる影響を受けているのかもしれない。これらの研究結果については,国際英文誌に投稿し,査読を受けて現在改訂中である(Kokubun et al.revised,Marine Biology)。また国内外の学会において発表を行い、さらに博士論文を執筆して学位審査に望み、2009年3月に学位を取得した。
炎症性マクロファージ様細胞を標的とした新規放射性分子プローブの開発研究

炎症性組織のマクロファージ様細胞に発現しているプリン受容体(P2Y6サブタイプ)を標的とした放射性分子プローブの開発と、これを用いた炎症性病変の定量的評価を目指した。P2Y6受容体リガンドであるUDPのuridine骨格C5位に放射性ヨウ素を導入した化合物:[125I]5-I-UDPの合成を試みた。テレピン油の皮下投与により作製した炎症誘発モデルマウスを用いた検討では、[125I]5-I-UDPは静脈内投与の30分後、炎症部位において健常部位よりも1.6倍の高い放射能集積を認めた。一方、合成収率や純度を高めるための検討は継続する必要がある。炎症性組織に集積したマクロファージ様細胞は、プリン受容体(P2Y6サブタイプ)を高密度に発現することが報告されている。本研究の目的は、P2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブを開発し、新たな観点から炎症性疾患の病態解明に向けたアプローチを試みることにある。平成27年度は、目的とするプローブの母体化合物および放射性同位元素による標識に向けた非放射性化合物の合成につき、反応条件検討を実施した。P2Y6受容体のアゴニストであるuridine diphosphate(UDP)の構造活性相関に関する考察から、受容体親和性が保存されるuridine骨格C5位に放射性ヨウ素を導入した化合物([125I]5-I-UDP)の合成を目標とした。そこで、基盤技術として連携研究者の大倉が開発したN-iodosuccinimide(NIS)を用いる求電子置換反応に基づきuridineから5-iodouridineを合成後、リン酸基を伸長する経路について検討し、反応の進行を確認した。UDPは分子内にリン酸基を有することからヨウ素カチオンによるヨウ素化が効率的に進行しないと推察されたため、上記のような段階的反応による標識法を考案したが、これは放射性ヌクレオチド化合物の合成において有用なデータと考えられる。炎症性組織におけるマクロファージ様細胞に発現し、phagocytosisへの関与が示唆されているP2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブ:[125I]5-I-UDPの開発を目指し、合成に関する検討を行った。まず、直接的にUDPのuridine骨格C5位へヨウ素を導入することを試みた。すなわち、UDP二ナトリウムを出発原料とし、アセトニトリル、アセトンあるいはIonic Liquid中、種々の条件下で非放射性NISを作用させたが、反応は進行しなかった。ヌクレオチドであるuridineに対しては対応するヨウ素体が得られたことから、これは解離して負電荷を帯びたリン酸基の影響により、ヨウ素カチオンの求電子的置換に至らなかったためと考えられた。そこで、まず5-iodouridineを作製後、そのC5'位の水酸基にリン酸基を伸長させることにより5-I-UDPを合成する反応経路について検討した。実際の放射性ヨウ素を用いた標識を考慮し、NCS/NaIを混合したIonic Liquidにuridineを作用させた。さらに、反応混合液中にリン酸化試薬を順次添加することで、トレーサー量の5-I-UDPの生成を質量分析にて確認した。本化合物の精製に関しては、親水性化合物に対して高い保持能が期待される逆相系HPLCカラムを用いた分離条件を検討中である。以上、非放射性化合物の合成について一定の成果は得られたものの、放射性分子プローブの合成は達成できなかったため、評価は「やや遅れている」とした。なお、作製した[125I]5-I-UDPは担癌動物を用いて腫瘍関連マクロファージへの集積性を確認する予定であるが、そのための複数の細胞(ヒト上皮様細胞癌由来細胞株A431、ヒト肺腺癌細胞株H1975等)は継代培養し、動物への接種が可能なだけの数量を既に確保した。炎症性組織に集積したマクロファージ様細胞には、プリン受容体(P2Y6サブタイプ)が高密度に発現することが報告されている。本研究の目的は、P2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブを開発し、新たな視点に基づく炎症性疾患の病態解明を試みることにある。平成28年度は、目的とするプローブの母体化合物を複数候補として検討するとともに、それらの放射性同位元素による標識に向けた非放射性化合物の合成を進めた。P2Y6受容体のアゴニストとして、uridine diphosphate(UDP)が報告されている。そこで、まずUDPを母核とすることを考え、受容体親和性が保存されるuridine骨格C5位に放射性ヨウ素を導入した化合物([125I]5-I-UDP)の合成を試みた。すなわち、N-iodosuccinimide(NIS)を用いる求電子置換反応に基づいたuridineから5-iodouridineの合成に続き、リン酸基を伸長する経路を定量的に検討した。しかし、本反応は全4工程にわたる反応収率が低く、反応時間も精製を含めて数時間を要したことから、さらなる条件検討が必要であると考えられた。一方、P2Y6受容体に親和性を有する化合物としてUDPとは全く構造の異なるthiourea誘導体も存在することから、平成28年度は、これらの化合物に対する放射性ヨウ素、あるいは適当な配位子を介した放射性金属核種の導入の可能性を探索し、その分子設計を行った。今後は、まずUDP誘導体に関しては研究実施施設における[125I]NISの合成系を確立させ、[125I]5-I-UDPの高収率合成を達成する。

さらに新たに検討を開始した化合物も評価に加え、P2Y6受容体発現細胞を用いたin vitro実験およびモデル動物を用いたex vivo実験を実施し、炎症性組織の評価に関する知見を得る計画である。P2Y6プリン受容体は炎症性組織に集積するマクロファージ様細胞においてphagocytosisへの関与が報告されている。そこで、本受容体を標的とした炎症性病変の診断に資する新規放射性分子プローブの創製を検討した。まず、平成27年度から継続し、uridine誘導体である[125I]5-I-UDPについては、分子内にリン酸基を有するUDP二ナトリウムを出発原料に用いた場合、ヨウ素カチオンによる求電子置換反応が効率的に進行しないという知見を確認した。その上で、直接的にUDPのuridine骨格C5位へヨウ素を導入して5-iodouridineを作製し、さらにそのC5'位の水酸基にリン酸基を伸長させるという5-I-UDPの合成経路を検討した。N-chlorosuccinimide(NCS)/NaIを混合したIonic Liquid中でuridineを作用させ、反応混合液中にリン酸化試薬を順次添加するという方法を試みたが、逆相系HPLCによる精製を含めた合成時間が約4時間であり、収量も低かったため、現在、リン酸伸長に関する試薬の選択を含めた条件の最適化を行っている。さらに、isothiocyanatophenyl基を有するthiourea誘導体に対しても、ヨウ素導入や金属核種とのキレート形成を達成するための分子設計ならびに合成を開始した。一方、プローブの評価(腫瘍関連マクロファージを対象とする)に用いるための腫瘍細胞については平成27年度の癌細胞株に加えてヒト前立腺癌由来細胞株LNCaPやヒトグリオーマ由来細胞株U87細胞を培養し、細胞膜画分の調製法と担癌モデル作製手技を修得した。以上、複数の化合物の合成につき一定の成果は得られたものの、in vitro、ex vivo系での評価は充分に達成できなかったため、評価は「やや遅れている」とした。炎症性組織において貪食能を獲得したマクロファージ様の細胞では、細胞膜表面にプリン受容体(P2Y6サブタイプ)が高発現している。当該研究で、研究代表者はP2Y6受容体を標的とした新規放射性分子プローブの開発と、炎症性疾患の病態解明に向けたアプローチを試みた。最終年度である平成29年度は、目的とする放射性分子プローブの標識合成と、炎症モデル動物を用いた評価を行った。P2Y6受容体のアゴニストであるuridine diphosphate(UDP)の構造活性相関に関する考察に基づき、受容体親和性が保存されると予想したuridine骨格C5位に放射性ヨウ素を導入した。まず、I-125標識N-iodosuccinimide([125I]NIS)を用いる求電子置換反応によりuridineから[125I]5-iodouridineを合成し、さらにリン酸基を伸長させるという合成経路を選択した。固相抽出法による精製後に目的化合物([125I]5-I-UDP)を得た。一方、モデル動物としてはテレピン油の皮下投与により炎症誘発マウスを作製し、組織にP2Y6受容体が発現していることを免疫組織化学染色で確認した。モデルマウスに[125I]
血管新生に着目した虚血性疾患の新規治療法開発

本研究では、急性肺障害におけるL-PGDSの役割とその機構の検討を目的として、研究を行った。塩酸投与による誤嚥性急性肺障害モデルで、野生型マウス群に呼吸機能低下が認められた。一方、L-PGDSまたはH-PGDSの遺伝子欠損マウス群では両系統ともに悪化した。急性肺障害の病態(浮腫形成・好中球浸潤)を定量的に評価したところ、両方が認められた野生型に比べ、L-PGDS欠損群では浮腫形成のみ悪化し、H-PGDS欠損群では好中球浸潤のみが悪化した。肺組織の免疫染色において、L-PGDSは上皮細胞と内皮細胞に強く発現が認められたが、H-PGDSは血球細胞に強い発現が観察された。上皮内皮細胞由来L-PGDSの重要性を検討するため、放射線照射による骨髄細胞の死滅と移植によりキメラマウスを作成した。このマウスに塩酸を処置したところ、WTマウスにL-PGDS欠損骨髄を移植しても出血の範囲・酸素飽和度・浮腫形成の指標である肺水分含有量が悪化せず、L-PGDS欠損マウスにWT骨髄を移植しても諸症状の改善が見られなかった。L-PGDS由来PGD2が浮腫形成を抑制していた結果から、血管透過性亢進におけるPGD2シグナルを検討した。塩酸処置の肺において静脈内投与した青色素の漏出が観察され、血管透過性の上昇を示したが、L-PGDSの欠損はそれを悪化させた。さらに、PGD2の受容体の一つであるDP受容体の作動薬を前処置すると、その悪化した漏出を有意に抑えた。以上の研究によりL-PGDSは急性肺障害を改善することが明らかになった。その中で、塩酸処置により上皮内皮細胞で発現したL-PGDSはPGD2産生を介してDP受容体依存的な浮腫形成抑制を引き起こすことがわかった。本研究により急性肺障害におけるL-PGDSの役割とその病態形成メカニズムを明らかにすることができたため。また、L-PGDSが肺組織での炎症において、血管の透過性を抑制することで炎症を抑制させるという新しい発見を行うことができたため。今後とも引き続き様々な疾患における血管に着目し、その病態における役割を明らかにするとともに、血管を標的とした新たな治療因子を探索していきたい。
良質な社会資本の実現を目指した日本版PFIの評価と改善に関する研究

本研究は近年注目されているPFI事業に焦点をあて、日英両国のPFI事業制度と運用状況に対して、PFIの関連組織のヒアリング調査と具体的なPFI事業に対してケーススタディーを行った。本研究の結果、PFI事業の制度設計上の背景の違い、特にプロセスの各段階におけるチェック機能と補助金等の交付、PFI事業プロセスにおける官民一体の支援組織(PUKや4PS)の存在、CABE等の建築デザインの質を確保するための支援組織の存在などが確認できた。今年度は、日本国内において、施設型ごとのPFI制度の運用のされ方とPFIで建設された施設の実地調査(簡易POE(Post Occupancy Evaluation))を行った。柳澤を中心とする教育施設班、岡本を中心とする医療施設班、石井を中心とする福祉施設班、そして小野田・坂口を中心とする制度班が連携を取りつつ作業を行った。特に、制度という出発点において、すでに施設型ごとに問題構造は大きく異なっていることが確認された。なかでも特徴的な作り込みがなされているのが福祉施設であった。この施設型は、法律で社会福祉法人等に運営が限定されていることや収入が介護保険中心となるといった特殊性があるが、PFIによって計画できるビルディングタイプが、事実上「新型ケアハウス」という種類に限定されていること、さらにその作り込みが、助成を活用して自治体が施設を買い取る変則的BTOとなっており、事業規模が小さいため自治体が雇うことが困難となるコンサルタントを代替するため、新たに計画マニュアルが作成されているといった極めて特殊な進化を遂げていることなどが明らかとなった。これらは、教育施設が比較的普通の作り込みで建てられているのとは対照的であった。簡易POEでの判断ではあるが、今回調査対象としたPFI物件が、建築の質において具体的に劣っているということは確認できなかったが、その一方で、学校に関してはPFIで建てられた校舎は、比較的余裕ある面積配分がなされており、それがあまり使われていないという性向が共通することも把握した。これらは、見かけ上のVFMを大きくするために事業規模をふくらませる一方、運営に関するつくりこみが必ずしも十分ではないことが背景にあるとも推察できる。このように初年度では、部分的ではあるがPFIという仕組みが、実際の建築の内容に影響を与えていることを把握した。次年度では、英国調査と並行して、これら国内の状況を精査することを通じてPFIの運用に潜む問題点を明らかにしていく。本年度は主に二つの調査研究を行った。第一に昨年度行った日本国内のPFI事業のスキーム及び実施状況に関する調査結果の整理及び補足調査の実施である。施設種の違いにより事業の実施状況が異なること。発注者である自治体の経験や能力により、事業立案、審査体制、事業スキームやプロセスに課題が生じやすいことなどを把握した。PFI事業による施設の整備水準を高めるためには、企画立案の支援体制、VFMの算出根拠の明確化、有効なガイドラインの整備等が重要であることを明らかにしつつある。また研究成果の一部は、平成20年9月に行われた日本建築学会大会の学術講演によって発表している。第二にPFI事業の先進国である英国を対称に、PFI事業プロセス、事業実施の支援体制、実際の整備事例の把握を目的として、研究代表者及び研究分担者全員による現地調査を行った。事前に文献資料並びに英国の状況に詳しい有識者からヒアリングを行い基本的な課題を整理した上で、平成20年9月下旬から10月上旬までの約二週間渡英し調査を実施した。調査対象はPFI事業により建設された病院、学校、福祉施設の視察及びPFI事業の支援組織であるPUK, 4Ps、PFI事業に関わった設計事務所、建設会社、コンサルタント事務所等計10カ所。それぞれの調査先に対して資料入手、ヒアリング調査、施設見学、利用状況調査等を行った。実際の整備事例では、日本のPFI事業の整備内容との比較を視野に入れ、専門的な見地からの調査項日に基づき調査を実施した。また公共建築のデザインを担保する役割を担うCABE等には別途追加調査等を行うことで、より詳細な状況把握につとめた。これらの調査結果を研究代表者並びに各研究分担者により整理分析を行い、現在の英国のPFI事業の全体像と各実施段階における重要なポイントについて把握した。本研究は近年注目されているPFI事業に焦点をあて、先行して導入し成果を上げている英国との比較調査を通して、我が国における良質な社会資本実現のための発注システムの課題と具体的な在り方を提案するものである。実際の調査は、日英両国のPFI事業の制度と運用状況に対して、PFIに関連する公的組織、自治体、事業者(設計者、建設会社)及び関連の有識者へのヒアリング調査と公的資料の分析を行った。次に具体的なPFI事業により整備された公共施設(教育、医療、福祉)の両国の比較と簡易的な利用状況把握調査、更に日英の図書館PFI事業をケーススタディーとして、事業プロセス及び整備運用状況を詳細に把握した。

本研究の結果、我が国のPFI事業の課題として、自治体における専門的な発注能力の不足、個々の設置法との整合性、VFM算定根拠の曖昧さ、BTOを主体とした運用状況などがその要因として明らかとなった。他方英国に関する比較研究において、PFI事業の制度設計上の背景の違い、特にプロセスの各段階(ゲートウェィ)におけるチェック機能と補助金等の交付、PFI事業プロセスにおける官民一体の支援組織(PUKや4PS)の存在、CABE等の建築デザインの質を確保するための支援組織の存在などが確認できた。日英の図書館PFI事業におけるケーススタディーでは、両事業とも一定の建築的な水準を確保されているものの、日本の場合初期のPFI事業であり自治体も意欲的に取り組んでいたこと、発注者、事業者の関係者の協力により具体化したのに対して、英国の場合は計画・立案に対する長期間の事業検討、建築・エネルギー性能等の評価基準の明確化、優先交渉権者決定後の詳細な契約の策定とリスクの明確化などがその要因として指摘できる。具体的な建築の質とサービスの確保が実現している背景には、事業制度全般に関わる思想の違いが存在しそれらを把握した上で、我が国のPFI事業の改善が望まれる。
キチン添加土壌で増加するキチン非分解微生物の生態的意義の解明

平成29年度までの実施状況を受け、平成30年度は、細菌株のキチン分解能の有無と細菌属および抗菌活性の有無の関係性を知ることを目的として、キチン添加培養畑土壌から分離した細菌株について、細菌属、キチン分解能、および抗菌活性を調べた。その結果は以下のとおりである。(1)キチンを添加して45日間培養した土壌から分離した細菌株78株とキチンを添加せずに同一の土壌を同一期間培養した土壌から分離した細菌株81株について、キチン分解能と抗菌活性の有無を調べたところ、キチン分解活性をもつ細菌株の割合が、キチンを添加した方が添加しなかった場合に比べて10%程度多かったのに対し、抗菌活性陽性の細菌株の割合は両者の間でほとんど変わらなかった。(2)キチンを添加して5日間培養した土壌から分離して簡易同定した78株のうち、半分以上はStreptomyces属であった。その他、510%程度はAgromyces属、Paenibacillus属、Microbacterium属であった。一方、45日間培養した土壌から分離した細菌株のうち簡易同定した72株については、Streptomyces属は5%程度であり、Microbacterium属が約3分の一を占めた。その他、Agromyces属、Lysobacter属、およびBacillus属が510%を占めた。これらの細菌属の割合のうち、Streptomyces属とLysobacter属の占める割合は、土壌抽出DNAのアンプリコン塩基配列の解析結果と同様の傾向を示したが、その他は、大きく異なっていた。(3)キチン添加培養土壌から分離された主要な細菌属のうち、Streptomyces属、Agromyces属、Paenibacillus属、Lysobacter属の分離株のほとんどはキチン分解能を示した。一方、Microbacterium属とBacillus属の分離株の半分以上はキチン分解能を示さなかった。(4)キチン添加培養土壌から分離された主要な細菌属のうち、半分以上の分離株が抗菌活性を示したのはStreptomyces属のみであった。抗菌物質の解析、および、キチン分解細菌とキチン非分解細菌の共存の意義についての解析に遅れがみられる。平成31年度が最終年度であるので、これまでの研究成果を補い、キチン非分解細菌の生態的意義について総合的に考察できるような、実験を実施し成果を得るよう努力する。具体的には、キチン添加培養畑土壌から分離した細菌株において、主要な属で、かつ、キチン分解能を示す株の割合が少なかったMicrobacterium属とBacillus属のキチン非分解株に着目し、その抗菌活性の有無と、キチン分解細菌株の増殖やキチン分解活性の促進効果を調べる。特に、分離した細菌株のうちの一部のキチン分解能をもつものが栄養要求株であることが判明したことに着目し、それらのキチン分解細菌の増殖やキチン分解活性、さらには抗菌活性に対する、キチン非分解細菌株の効果を検証する。畑土壌にキチンを添加すると糸状菌を病原とする植物病害が低減することが知られている。キチン添加によって増加するキチン分解微生物が生産する抗菌物質(キチン分解酵素や抗生物質など)が作用するためと考えられている。本研究では、キチン添加土壌に存在するキチン非分解微生物の生態学的意義を、キチン分解活性と抗菌活性に着目して解明するため、本年度は、以下の(1)(3)を行った。(1)キチンを添加して培養した畑土壌(褐色森林土)から、コロニーの色や形状が異なる細菌株を分離し、キチン,N-アセチルグルコサミン(以下、キチン単糖),およびN,N'-ジアセチルキトビオース(以下、キチン2糖)に対する資化性とキチン分解能を調べた。その結果、キチン添加後の培養時間に伴って、キチン分解細菌数が変化することが分かった。また、キチン分解細菌株と非分解細菌株の一部をリボソームRNA遺伝子の塩基配列情報に基づき簡易同定した結果、キチン添加後の培養時間の長短によって、それぞれの細菌属の構成が異なることが分かった。(2)キチン、キチン単糖、あるいはキチン2糖を添加して培養した土壌からDNAを抽出し、リボソームRNA遺伝子アンプリコン塩基配列解析によって細菌群集構造を比較した。(3)「(1)」で分離・同定したキチン分解および非分解細菌のうち,「(2)」で代表的な属と判断された属の細菌株を対象として、キチン含有寒天培地上で交差培養を行った。その結果、交差部分でキチン溶解斑が増大する組み合わせや、キチン非分解細菌の増殖が促進される組み合わせ、また、互いの増殖を阻害する組み合わせが観察された。申請に書記した計画のうち、「(1)キチン分解微生物とキチン分解中間産物資化微生物の分離と同定」、「(2)リボソームRNA遺伝子アンプリコン塩基配列解析による細菌群集構造の解析」が計画通り実施できた。一方、学内共通機器である質量分析計付ガスクロマトグラフィーの更新時期と重なったため、計画のうちの「(3)キチン添加土壌中の揮発性化合物の同定」をすることができなかった。代わって平成30年度に実施予定であった「キチン分解微生物と非分解微生物の共存下でのキチン分解特性の評価」を行った。これらの状況から、上記のように判断した。平成28年度の研究実績を受け、本年度は以下の(1)(4)を行った。

(1)キチンを添加して培養した畑土壌(褐色森林土)から分離した一般細菌について、キチン分解能を再試験するとともに、植物病原性糸状菌に対する抗菌活性を試験し、それぞれの分離細菌株のキチン分解活性と抗菌活性の有無を判定した。また、キチン添加後の培養日数との関係も解析した。その結果、キチン添加後の培養日数によって、キチン分解能をもつ細菌だけでなく、抗菌活性をもつ細菌の割合も変動することが分かった。また、キチン分解活性はもたないが抗菌活性を有する細菌株の割合も変動した。(2)キチンを添加して培養した畑土壌(褐色森林土)から分離した細菌株のうちの約半数を無作為に選択し、16S rRNA遺伝子の塩基配列情報に基づいて、簡易的に同定作業を行った。同定結果を「(1)」のキチン分解活性と抗菌活性の有無、さらには、平成28年度に得たアンプリコン塩基配列情報による細菌群集構造解析の結果を合わせて分析した。それにより、キチン添加後の培養日数によって変動する主要な細菌属について、キチン分解活性や抗菌活性の有無を推定することができた。(3)平成28年度にキチン分解活性陰性と判断された細菌株のうち、一部のものは特定のアミノ酸を増殖に必要とする栄養要求性を持つことが明らかとなった。また、それらの菌株は、キチン添加によって大きく増加するキチン分解細菌が共存することによっても、増殖が促進されることが分かった。(4)アンプリコン塩基配列による細菌群集構造解析のデータをさらに増やし、属レベルでの個体群の変動を解析したところ、キチン分解活性を有する細菌属によって、個体群増加のタイミングが異なることが明らかとなった。土壌中の細菌の群集構造解析や、細菌株の分離と同定、およびそれらのキチン関連物質の資化性や抗菌活性の有無に関する研究の進捗は概ね順調に進展しているが、土壌の揮発性化合物や抗菌活性をもつ細菌株の抗菌化合物の分析は進展が遅れている。これらの点を鑑み、「やや遅れている」と判断した。平成29年度までの実施状況を受け、平成30年度は、細菌株のキチン分解能の有無と細菌属および抗菌活性の有無の関係性を知ることを目的として、キチン添加培養畑土壌から分離した細菌株について、細菌属、キチン分解能、および抗菌活性を調べた。その結果は以下のとおりである。(1)キチンを添加して45日間培養した土壌から分離した細菌株78株とキチンを添加せずに同一の土壌を同一期間培養した土壌から分離した細菌株81株について、キチン分解能と抗菌活性の有無を調べたところ、キチン分解活性をもつ細菌株の割合が、キチンを添加した方が添加しなかった場合に比べて10%程度多かったのに対し、抗菌活性陽性の細菌株の割合は両者の間でほとんど変わらなかった。(2)キチンを添加して5日間培養した土壌から分離して簡易同定した78株のうち、半分以上はStreptomyces属であった。その他、510%程度はAgromyces属、Paenibacillus属、Microbacterium属であった。一方、45日間培養した土壌から分離した細菌株のうち簡易同定した72株については、Streptomyces属は5%程度であり、Microbacterium属が約3分の一を占めた。その他、Agromyces属、Lysobacter属、およびBacillus属が510%を占めた。
神経細胞死後の二次変性・他細胞障害に至る経路の解明

緑内障は中枢神経系の障害であり、神経細胞保護がその障害を治療していく上での重大な課題である。我々は2013年に脳梗塞が全身諸臓器に悪影響を与える事を示唆した(Stroke, 2013)。本研究ではin vitro脳梗塞モデルを用い、他細胞を傷害する可能性のある液性因子と思われる物質を同定し、中枢神経系疾患の新しい治療薬を開発することを目的とした。残念ながら、有効な液性因子の同定には至らず、障害を受けた神経細胞から液性因子が放出されるという仮説は覆された。むしろ、液性因子によるものではなく、細胞間インタラクティブである可能性が高いと結論付けた。今後も更なる追加検討が必要と考えられる。平成26年度は培養実験を主とし、ラット大脳皮質・網膜細胞を用いた組織培養法を確立する予定であり、これまでに20バイアル以上のラット大脳皮質細胞の組織培養を行った。次にこれらの細胞を疑似的な虚血状態、すなわちin vitroの脳梗塞モデルである、OGD (Oxygen Glucose. Deprivation)モデルを作製した。今年度は本モデルの作製に主に時間を費やしたが、細胞死もしくは酸欠状態による細胞障害の程度にばらつきがあり、いわゆるモデルの安定性にかけたため、このモデル作成方法の確立に難渋している。次年度以降もまず培養モデルの確立をさせたうえで、次のステップである、培養上清の同定に進行する予定である。緑内障は中枢神経系の障害であり、中枢神経細胞保護・二次変性予防・他細胞への悪影響の回避が中枢神経障害を治療していく上での重大な研究課題である。我々はこれまでに、脳梗塞組織が全身の諸臓器に悪影響を与える可能性があることを示唆した(H Ishikawa et al. Stroke, 2013)。中枢神経細胞が障害を受けると、隣接した細胞のみならず、全身にも波及し他の細胞を傷害する。本研究では、培養中枢神経を用いたin vitro脳梗塞モデルを用い、他細胞への障害を誘発する液性因子と思われる物質を同定し、将来的にはその阻害剤を開発することによって緑内障・脳梗塞をはじめとした中枢神経系疾患の新しい治療薬を開発することを目的とする。平成27年度は前年度に引き続き培養実験を主とし、ラット大脳皮質・網膜細胞を用いた組織培養用を確立した。これまでに約40バイアルのラット大脳皮質細胞の組織培養を行い、in vitro脳梗塞モデルであるOxygen Glucose Deprivation (OGD)モデルの条件設定を行った。多数の培養実験を繰り返し、ようやく安定した細胞死を得ることができ(モデルの安定化)、培養上清特定実験という次の段階に進行した。この上清内にあるタンパク特定において、コントロール群とOGD群を比較したところ残念ながらタンパク量そのものの差は認められず、OGD群に有意に認められる液性因子の同定は不可能であった。この結果は逆に、細胞虚血状態において、その生存反応に呼応するメカニズムは細胞から細胞外への液性因子の放出ではなく、細胞間インタラクティブである可能性が高いということを示唆する。培養上清の解析に当初の予定よりやや遅れたものの開始し、その結果は上記のとおりである。液性因子そのものより細胞間インタラクティブの関与が、虚血細胞の生存反応に重要である旨が示唆された。我々はこれまでに、脳梗塞組織が全身の諸臓器に悪影響を与える可能性があることを示唆した(Ishikawa H, et al. Stroke, 2013)。中枢神経細胞が障害を受けると、隣接した細胞のみならず、全身にもその影響が波及し、他細胞を傷害する。本研究では、培養中枢神経を用いたin vitro脳梗塞モデルを用い、他細胞への障害を誘発する液性因子と思われる物質を同定し、将来的にはその阻害剤を開発することによって緑内障・脳梗塞を始めとした中枢神経系疾患の新しい治療薬を開発することを目的とした。平成28年度は引き続き培養実験を主に行い、ラット大脳皮質・網膜細胞を用いた組織培養法を継続して行った。さらにin vitro脳梗塞モデルであるOxygen Glucose Deprivation(OGD)モデルを作製し、平成27年度には解明できなかった培養上清内の液性因子特定を更に行った。しかしながら、昨年度と同様に新規の液性因子の特定は不可能であり、細胞虚血状態における生存反応に呼応するメカニズムは液性因子による可能性は低く、細胞間インタラクティブである可能性が高いと結論づけた。前記にもあるように、培養モデル作成がいまだに安定しておらず、次のステップである培養上清の解析にたどり着けていない。

目的は神経保護作用のある培養上清の液性因子同定であったが、液性因子そのものが証明できないという結果であり、これらの細胞ストレス環境下における細胞の挙動は、細胞間インタラクティブなど直接相互作用を介しているものと思われる。抜本的に実験計画を今後変えていく必要性があり、細胞表面の膜蛋白の解析が主となると思われる。いずれにしても、これらを遂行していく上において、同予算、期間内での完遂は困難であり、別課題研究として応募予定である。眼科学本研究の基礎実験である培養モデルの確立は最重要事項であり、平成27年度早期にこれを確立していくことを目指す。当初、動物を購入する予定であったが、初代培養細胞ラット・マウス神経細胞CX(R)大脳皮質(胎生17日)を購入する必要が生じその差額が次年度使用額として残ったため。購入した細胞で、次年度は実験を進める。
自治体合併の経済学的検討：平成の大合併のインパクト分析

本研究では自治体合併の影響を把握するため、合併が水道事業の生産性、住宅地地価の2つの指標に対してどのような影響を与えているかを定量的に分析した。また、自治体自体が合併に対してどのような評価をしているかについて、アンケートを用いて分析した。分析の結果、合併は水道事業のような自治体運営を改善しているものの、地域コミュニティの希薄化や文化衰退など、住民にとってはマイナスの影響をもたらしている可能性が示された。したがって、合併の際には、自治体運営だけではなく、住民にとってもメリットとなるような保管的な政策が必要となる。本研究は国内で行われた『平成の大合併』に対して、経済学的な視点から定量的評価を試みる。この合併は世界的にも類を見ない規模のものであり、そのために費やされた行政費用は少なくはない。それにもかかわらず、経済学的な視点でこの合併の評価を行なっている研究はほとんどない。そこで、平成25年度は経済分析に先立ち、本研究に関連するデータの収集を試みた。具体的には、自治体の社会・経済・地形データおよび自治体の選挙データである。そのうち、総務省データベースよりこれまでの自治体合併データを入手した。また、自治体データとしては全国市町村のものを社会人口統計体系より収集した。合併の評価項目として第一に公益水道事業を想定し、水道事業のデータを地方公営企業年鑑より収集した。詳細な分析は平成26年度に行う予定であるが、簡易な分析を行ったところ、自治体合併を行った自治体はそうではない自治体に比べて水道事業の効率性が改善したことが確認された。したがって、規模の経済を享受することができるという自治体合併のメリットが確認されたといえる。さらに、平成26年度は合併に対する住民の評価を把握するために選挙分析を想定している。つまり、合併に賛成・反対した立候補者の得票率(当選確率)を分析することで、間接的に住民の合併に対する評価を抽出するのである。そこで、平成25年度は自治体の首長(市区町村長)の選挙データも併せて収集している。ただし、選挙データについてはデータベースが作成されておらず、地方新聞を手動チェックしつつ入手するために、投入できる人的資本の制約もあり、本年度は群馬県内の自治体選挙情報のみを収集している。本研究は自治体合併に対して、複数の視点からその影響を定量的に評価することを試みる。平成26年度は平成25年度に収集したデータを用いて、自治体合併によって水道事業体の運営の効率性が改善したかどうかを分析した。分析の結果、合併を経験した自治体は、そうではない自治体に比べ、水道事業の効率性が約1%高いことが示された。したがって、自治体の合併を水道という一つの財で評価した場合、1%ではあるものの、効率性改善に寄与したといえる。そして、この1%改善を温室効果ガスに換算したところ、2004年から2011年までの8年間で、合計19.6万t-CO2の削減に相当することがわかった。そのため、合併によって、温室効果ガスの削減ももたらされたといえる。また、平成25年度に引き続き、自治体別の選挙データおよび、地価データの収集も行い、データベースの作成も行った。本研究は自治体合併による影響についての多面的な視点で評価を試みた。2015年度は主に2つの分析を行った。1つは24年度までに作成した自治体データベースを用いて、地域犯罪と温室効果ガスを評価項目として分析を試みた。ただし、ここでの分析は自治体合併の影響の前に、自治体間での地域犯罪や温室効果ガスの排出量に差があるかどうか、そして、それらをどのようにすれば低下させることができるのかに着目した。その結果、経済成長にって地域犯罪は、自治体独自の都市計画によって温室効果ガスは削減させることができることが示された。2つは全市町村を対象に、2015年11月にアンケート調査を実施した。そこでは、自治体合併についての各自治体の見解や評価を含めて、自治体の財務・環境等の多岐にわたる質問を実施した。2016年4月時点において、668の自治体から回答を得ることができた。2015年11月に実施した自治体アンケート調査を実施したものの、当初1カ月の回収期間を想定していたものが、複数の自治体からの要請もあり回収が大幅に遅れてしまっている。そのため、アンケート調査の入力および分析作業に遅れがある。2016年度では、2015年度に実施した自治体アンケート調査の精査を行い、各自治体が自治体合併にどのようなメリット・デメリットを感じているかを把握した。アンケート調査は1741全自治体(市区町村)を対象とし実施し、そのうち約38%の668自治体から回答を得ることができた。668自治体のうち、過去の合併経験のある自治体は約32%であり、その大半が合併特例法(旧法)の適応を受け合併をしていることがわかった。合併特例法(新法)あるいは新・旧両方の適応を受け合併をした自治体は38自治体であった。合併を経験した257自治体に対し、合併によるメリット(複数項目)について、5段階スケール(1:効果は小さい、5:効果が大きい)で回答してもらった。

最も効果が大きいと回答のあった項目は「議会議員数の削減」(平均4.51)、「職員数の削減」(平均4.44)となっており、多くの自治体で合併は人件費の削減に寄与したといえる。逆に、「住民の自治体行政に関する関心向上」や「住民の利便性向上」については平均で3ポイント程度となっており、メリットが相対的に小さいといえる。自治体が考える合併のデメリットについても6段階スケール(1:デメリットが小さい、6:デメリットが大きい)で同様に質問をし、「地域コミュニティにおける連帯感の希薄化」(平均3.60)、「地域文化・伝統の継承の衰退」(平均3.64)と、地域コミュニティや文化に対してデメリットが大きいということが明らかになった。一方で、「中心部と周辺地の間の住民満足度の隔たり」(平均2.74)はデメリット項目の中で最もポイントが低かったことから、相対的にデメリットが小さいことが示された。本研究では自治体合併の影響を把握するため、合併が水道事業の生産性、住宅地地価の2つの指標に対してどのような影響を与えているかを定量的に分析した。また、自治体自体が合併に対してどのような評価をしているかについて、アンケートを用いて分析した。分析の結果、合併は水道事業のような自治体運営を改善しているものの、地域コミュニティの希薄化や文化衰退など、住民にとってはマイナスの影響をもたらしている可能性が示された。したがって、合併の際には、自治体運営だけではなく、住民にとってもメリットとなるような保管的な政策が必要となる。平成26年度は、水道事業についての合併の影響を分析し、その論文を執筆した。論文は国内査読付き雑誌に掲載されている。また、平成26年度中に収集予定であったデータも全ては入手することができていないが、おおむね予定通り収集が完了し、分析可能なデータベース化をおおむね作成できた。そのため、本研究の達成度は概ね順調に進展していると判断する。2016年度は前年度に実施した自治体アンケート調査の入力業務および分析作業を中心に進める。前半は自治体向けの報告書の作成を行い、後半は、論文を執筆しつつ、学会等での研究報告を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。環境経済学今後は、自治体合併の影響を評価するために水道事業以外の分野、犯罪や、土地、選挙等のデータベースの分析を試みる。そして、平成27年度中に、これらの分析を完了し、論文の投稿を試みる。平成25年度中に収集予定であったデータについては一部入手することができていないが、おおむね予定通り収集が完了し、分析可能なデータベース化を行うことができている。そして、同年度中に分析を開始することができていることから、達成度は概ね順調に進展していると判断する。2015年11月に実施した自治体アンケート調査を実施したものの、当初1カ月の回収期間を想定していたものが、複数の自治体からの要請もあり回収が大幅に遅れてしまっている。そのため、アンケート調査の入力および分析作業に遅れがある。平成27年度の研究費は概ね予定通り執行している。ただし、投稿した論文を英語雑誌ではなく、日本語雑誌にしたため、英文校閲費を使用していなかった。そのため、繰越金が生じている。
新規癌抑制遺伝子PP6機能不全による発癌機構、PP6を標的とする治療開発の可能性

PP6触媒サブユニット(Ppp6c)遺伝欠損アレルを作製し、Ppp6cヌルマウスが胎生致死であることを証明した。次に皮膚特異的にPpp6cを欠損させるシステムを作製し、Ppp6c欠損がマウスDMBA発がんにおいて強力な腫瘍プロモーション作用を持つことを証明した。組織学的な解析によりPpp6cの機能が欠損した皮膚では、DMBA投与48時間後、表皮の肥厚、真皮への細胞浸潤、皮下組織への細胞浸潤が見られ、増殖と炎症の病変が認められた。その原因の1つとして、Ppp6c機能欠損ケラチノサイトにおいて、TNF-α-やIL-1βによるNFkBシグナルの活性化が著しく増強される分子機構の存在を明らかにした。申請者らは、PP6の発がんへの関与を明らかにする目的で、PP6と結合するタンパクのスクリーニングを行い、中心体のタンパク、CP110を同定した。そこでPP6のノックダウンを行い、中心体の数や分離異常が起こることを確認したことから、PP6は中心体の機能制御に必須であり、おそらく、がん抑制遺伝子として働く可能性を考えた。そこで、がん抑制遺伝子として働くか否かを検証するため、皮膚の2段階発がん実験を行い、PP6の機能が欠失している皮膚では、DMBA誘導発がんに対する感受性が亢進している事を明らかとした。また、その機能を明らかにする過程で、PP6の活性を欠損している組織においては、NFkBシグナルが増強していることが明らかとなった。しかし、その基質タンパクは現在のところ不明である。また、DMBA以外の環境変異物質による発がん性にたいしても、PP6の欠損は感受性が亢進するのか否かが重要な課題となった。サイトケラチン14プロモーターにより、扁平上皮の基底層においてCREーTAMが発現するマウスと、floxed-Ppp6cゲノムをもつマウスを掛け合わせて、タモキシフェンを腹腔内投与することにより、皮膚、舌、咽頭、食道で高頻度にPpp6cの遺伝子が欠損するシステムを作製した。このシステムで、まず環境変異源物質であるし紫外線による皮膚発がん実験を行った。その結果、BL6の背景をもつマウスにおいても、PP6の活性が減少したマウス皮膚において、紫外線照射は、強く腫瘍を発生させることが分かった。この場合の腫瘍は扁平上皮であることから、単なる腫瘍化ではなく悪性化になっていることが明らかとなり、Ppp6cのがん抑制遺伝子としての重要性が再確認された。プロテインホスファターゼ6型(PP6)の発がんへの関与を明らかにする目的で、PP6と結合するタンパクのスクリーニングを行い、中心体のタンパク、CP110を同定した。そこでPP6の触媒サブユニット(Ppp6c)のノックダウンを行い、中心体の数や分離異常が起こることを確認したことから、PP6は中心体の機能制御に必須であり、おそらく、がん抑制遺伝子として働く可能性を考えた。そこで、がん抑制遺伝子として働くか否かを検証するため、サイトケラチン14プロモーター(CK14)により、扁平上皮の基底層においてCRE-TAMが発現するマウスと、floxed-Ppp6cを持つマウスを掛け合わせて、CK14-CRE-TAM:Ppp6cflox/floxマウスを作成した。本マウスを用いて皮膚の2段階発がん実験を行い、PP6の機能が欠失している皮膚では、DMBA誘導発がんに対する感受性が亢進している事を明らかとした。そのメカニズム解明を行い、PP6活性を欠損している組織においては、NFkBシグナルが増強していることが明らかとなった。次に紫外線による発がんにおけるPP6の機能を解析した。その結果、紫外線照射により、Ppp6c欠損皮膚では腫瘍発生が著しく亢進することが分かった。そのメカニズム解明を行い、Ppp6c欠損皮膚に対して紫外線照射を行うと、正常皮膚に比べて、細胞死が著しく亢進していることとが分かった。また、形成された扁平上皮癌において、γH2AX陽性細胞、p53陽性細胞が増加していることが確認され、DNA修復の傷害と代償性の過形成が、腫瘍形成の原因の1つである事が示された。Ppp6cflox/flox;K14-CreTAM; LSL K-rasG12Dマウスを用いて、K-rasG12D発現による、K14ケラチン発現細胞(皮膚表皮、口腔粘膜、食道の重層扁平上皮の基底層の細胞)における、PP6の欠損と変異K-rasの相乗効果を詳細に検討する。プライマリーのPP6欠損細胞を用いてDMBA、電離放射線、UV、ブレオマイシン、カンプトテシン、に対する影響を以下で調べる。1細胞生存2γH2AXのリン酸化状態3DNA損傷(コメットアッセイ)4DNA-PK活性化(RPA32のリン酸化)医歯薬学
近代における和歌山県民家の特徴と変遷史についての基礎的研究

和歌山県域には今も数多くの伝統的な民家が残され、これまでに奈良文化財研究所や千森督子、神吉紀代子らが、県域民家の調査研究を行ってきている。しかしながらこれらは近世民家の捕捉や、現状の景観的調査が中心で、近代の民家についての史的研究は十分と言えず、未調査の空白地域も相当に多かった。本研究はこの状況に鑑みて、いまだ十分な調査が行われていない和歌山県域の近代の民家について、現存するものを大観し、その中から、時代的、地域的特性が良く現れていると考えられる6件の民家について、建築史学の調査方法に則り、調査を行った。まず始めに県域をなるべく全域的に網羅すべく、可能な限り、近代民家の所在確認調査を行った。これにより和歌山県南部では、新宮市域を中心に近代の民家、洋風住宅が多数残されていることが判明し、洋風の影響を受けた伝統的民家の所在も確認出来た。その他海南市下津では、当地名産のミカンを遅らせて出荷させるためのミカン蔵の存在を発見出来た。また紀の川市域では遥か遠方の兵庫県豊岡市から、戦後まもなくに移築された民家があることが判明した。所在確認調査により抽出しえた民家について、調査協力者等の協力を得て、建物調査を実施した。調査許諾の得られた6件の家について実測調査を行い、写真撮影や資料収集を行った。また対象民家の所有者からの聞き取り調査も実施し、建物の復原的検討を行い、建物の変遷や地域的特徴を把握した。これらの作業を元に、和歌山県域における地域性と変遷についての検討と、位置づけを行った。調査対象は6件のみであるので、きわめて基礎的な研究資料となるが、研究成果は日本建築学会で発表していく予定である。
現代中国における司法の性格および位置づけに関する研究-「厳打」を素材として-

今年度の研究内容は主に以下の4点である。(1)「現代中国における「司法」の構造-厳打:なぜ刑事裁判が道具となるのか?-」(博士論文・北海道大学・2006年3月24日学位授与)の公表(北大法学論集)。これは本研究課題の核心であり、今年度、(6)(7)を公表し、全7回の連載を終えた。現在、同論文をモノグロフィーとして出版するために、加筆・修正作業を進めている((2)も含めて)。(2)上記論文の補論作成。上記論文は、中国の司法の構造面に重点を置いて、「なぜ刑事裁判が道具となるのか」という点を検討したが、裁判観・理念については十分に検討していなかった。そこでその補論として、そもそも中国では刑事裁判はどうあるべきと考えられているのかを、政策決定者・裁判所幹部の諸言説および政策文書などを素材に、考察した。(3)中国の裁判の際だった特徴である再審制度(裁判監督制度)について、その理念および現在行われている改革の動向・背景・現在地を検討した(比較法学会にて公表)。(4)本研究課題に関係のある中国語論文を邦訳し、公表した。今年度の実績は主に以下の3点である。1、今年度最もエフォートを費やしたのは、本課題の内容を一部とする博士論文「現代中国における「司法」の構造--「厳打」:なぜ中国の刑事裁判は道具となるのか--」の執筆である。同論文は平成17年12月に北海道大学法学研究科に提出した。学位を授与された後、順次、『北大法学論集』誌にて公表する予定である。2、平成17年12月24日から同月28日にかけて、中国・北京に出張し、最高人民法院研究室(胡雲騰副主任)、中国社会科学院法学研究所(劉仁文教授)、天元弁護士事務所の3ヶ所を訪問し、本課題についてヒアリング調査を行った。3、関西大学法学研究所第56回特別研究会にて、「中国刑法における反革命の罪から国家の安全に危害を加える罪への改正の意味--「反革命目的」の削除を手がかりに」を報告した。本報告は同所機関誌『ノモス』第18号に掲載予定である(平成18年6月頃刊行予定)。このほか、来年度以降の中国現地調査の準備として、中国社会科学院法学研究所の渠涛教授、上海の曲弁護士、南京大学法学院の解亘講師と交渉中である。(1)今年度最もエフォートを費やしたのは、本研究課題の核心部分となる「現代中国における「司法」の構造--厳打:なぜ刑事裁判が道具となるのか?--」(博士論文・北海道大学・2006年3月24日学位授与)の公表(北大法学論集にて連載中)、およびそのための準備作業である。全7回の連載のうち、4回まで既刊。(2)6月に中国に出張し、まず南京大学法学院にて孫国祥(南京大学経済刑法研究所所長、法学院教授)、薛剣祥(江蘇省高級人民法院刑事-庭庭長)、尹吉(江蘇省高級人民検察院法律政策研究室主任)等と座談会を行い、量刑、下級裁判所による上級裁判所への照会などの問題についてヒアリングした。また上海では星韵律師事務所の曲立新・弁護士に、とくに裁判の独立について、実務家の実感をヒアリングした。(3)中国の組織犯罪対策について検討を進めた。その成果は『講座人間の安全保障と国際組織犯罪第2巻国際組織犯罪の現段階-世界と日本』(近刊予定)に掲載予定。
鉄輸送体の三者複合体による結晶構造解析と基質認識メカニズムの解明

鉄輸送体の三者複合体の立体構造決定を最終的な目標とし、これまでに以下の手順によって研究を進めた。まず、TTHA1628の発現、精製法の確立を目指し、三者複合体の結晶化に必要な基質結合サブユニットTTHA1628の調製のため、TTHA1628の発現、精製法の確立を行った。TTHA1628はペリプラズム局在タンパク質であるが、タンパク質中にシステイン残基を持たないので、必ずしも酸化的条件下で発現する必要はないと考えられた。そこで、シグナル配列を除去し、細胞内における還元的条件下における発現系、精製法の構築を行った。次に、TTHA1628の鉄結合能の確認を目的とし、精製したTTHA1628について、鉄結合能を確認するため、ICPAESを用いてTTHA1628に選択的に結合している金属元素の同定を行った。その結果、TTHA1628が鉄イオンを選択的に結合していることを実証した。このことから、アミノ酸配列から推定鉄輸送体と注釈がつけられていたTTHA1628-TTHA1629-TTHA1630が、確かに鉄輸送体として働くことを実証した。次に、TTHA1628の構造解析のため、精製したTTHA1628に関して鉄結合型、鉄非結合型の結晶構造を最高分解能1.8オングストロームで決定することに成功した。回折データは、放射光施設であるSPring-8やPF-ARで収集を行った。構造解析の結果、両者の構造において顕著な構造変化は見られなかったが、DLSやSAXSによる解析から、溶液中では異なる構造を取っている可能性が示唆された。またゲル濾過クロマトグラフィーによる解析から鉄結合型は鉄非結合型に比して低分子量側に溶出することが明らかとなった。現在、これらの結果の追試実験を行い、これまでのデータをまとめ、現在、論文執筆、投稿作業を行っている。また、TTHA1628-TTHA1629-TTHA1630三者複合体の結晶構造解析にむけてTTHA1628-TTHA1629-TTHA1630三者複合体に関する更なる高品質の結晶を取得し高分解能の構造を得るため、本年度は、英国オックスフォード大学に海外渡航し最先端の技術取得に励んでいる。本研究では、鉄輸送体の三者複合体による結晶構造解析と基質認識メカニズムの解明を目的としている。既にTTHA1628、TTHA1629の発現、精製系は構築していたが、三者複合体の構造解析に必要なTTHA1628の構造解析については未着手であった。本年度の成果として、TTHA1628の発現、精製法、鉄結合能の確認、および、鉄存在下、非存在下における構造解析を挙げる。また、三者複合体構造解析を見据え、TTHA1628-TTHA1629二者複合体の調製を行った。詳細については以下に記す。TTHA1628の発現、精製法、鉄結合能の確認および構造解析三者複合体の結晶化に必要な基質結合サブユニットTTHA1628の調製のため、TTHA1628の発現、精製法の確立を行った。次に、ICP-AESを用いてTTHA1628に選択的に結合している金属元素の同定を行った。次にTTA1628に関して鉄結合型、鉄非結合型の結晶構造を最高分解能1.8オングストロームで決定することに成功した。両者の構造において顕著な構造変化は見られなかったが、DLSやSAXSによる解析から、溶液中では異なる構造を取っている可能性が示唆され、基質依存的な構造変化の可能性が示唆された。上記の発現法で調製したTTHA1628と既に精製法を確立しているTTHA1629に関して結合能を調べるためSPR法を利用して相互作用解析を行った。その結果、鉄結合型TTHA1628がTTHA1629と解離定数10-20uMオーダーで相互作用する可能性が示唆された。