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行政の規制権限不作為と司法統制に関する日仏比較法研究

すなわち、フランス行政判例においては、アスベスト訴訟に見られるように、予防原則により、リスクを管理する行政の義務の射程を、その調査義務を厳しく認めることによって拡大してきたのだが、わが国の権限不作為を理由とする国家賠償請求訴訟においても、全く同じではないものの(フランスでは予防原則はわが国と異なり憲法上の効果を有する)、行政の調査義務の内容が大きな役割を果たしているという点である。すなわち、リスク管理をするための行政の権限不作為に関しては、このよう調査義義務を、何を根拠として行政機関に課すのか、また、その具体的な内容はどの範囲なのかという点が重要と考えられるということである。もちろん上記のような点は、国家賠償請求訴訟に関する判例の研究から得られた知見であり、行政訴訟に関しては、次年度の研究において扱うこととしたい。本年度の研究対象であった、リスク回避のために授権されている行政権限の不作為に関するわが国の判例理論については、国家賠償請求に関する判例を中心に研究を行った結果、以下のような点が明らかになった。すなわち、法令上の規制権限の不作為を問題にする場合、当該権限の行使が義務付けられているかという点だけではなく、むしろ、その前段階での義務違反、具体的には、リスクの回避を行う上で前提となる、調査や情報収集や情報提供の義務が大きな意味を有することである。このような情報収集や情報提供の義務は、行政が権限行使を行う前の段階での義務であり、わが国でもフランスでも、国家賠償請求訴訟においては最も重要な争点とされる。わが国では、このような情報収集や情報提供の義務は、法令上規定がないか行政に広範な裁量を認めていることから、近時の下級審判決によく見られるように、「条理上の義務」としている事例が少なくない。もちろん、「条理上の義務」であっても行政の不作為を司法的に統制することは可能であるが、わが国では、当該義務の具体的な内容等について不明確な点が少なくなく、司法的統制の手段として充分機能し難いと考えられる。本研究で比較の対象としたフランス法では、環境憲章(憲法と同様の効力を有する)における予防原則や、現代国家の特質から、情報収集や情報提供の義務の存在やその具体的な内容を導いているが、わが国でも、情報収集や情報提供の義務の具体化と根拠の明確化が必要と考えられる。
ビタミンKの摂取と納豆関連食品

骨細胞のCa代謝には血液凝固に必要なビタミンK以上の量が要求され,ビタミンK含量の高い納豆の摂取は、骨粗鬆症の予防に有効である事が報告されている。我々は、納豆菌の生産するビタミンKが特異的な糖ペプチド成分(vitamin-K binding factor ; KBF)と結合し、安定なミセルとして可溶化されていることを見いだしており、このKBFの存在がビタミンKの体内への消化吸収を促進しているのではないかと考えている。実際,納豆に含まれるビタミンK2(menaquinone-7;MK-7)は植物由来のビタミンK1よりも吸収率がよく,納豆を同時に摂取したとき,野菜中のビタミンK1の吸収も促進されることを観察した。そこで本年度は、腸管上皮培養細胞Caco-2を用いてビタミンK1、ビタミンK2におけるKBFの細胞膜透過促進効果を検討した。ビタミンK(VK1,MK-7),トリグリセリド(TG),タウロコール酸ナトリウムおよびKBFをミセル形成のため超音波処理したものを試料とした。培養したCaco-2細胞に、試料を添加して、添加直後と4時間後におけるビタミンKの透過率を測定した。はじめに,KBFを添加せずMK-7に100μM,200μMのTGを添加したミセルを試料として用いた場合、透過率はそれぞれ2.5%,7.3%となった。この試料に0.5μg/mlのKBFを添加した結果、透過率は,TG 100μM,200μMでそれぞれ8.9%,8.8%、と上昇し,適当な濃度のTGの添加によりKBFのMK-7細胞透過促進効果が見られた。つぎに,ビタミンK1にTG 100μM,200μM添加したとき,それぞれ10.1%,5.4%となり,この試料にKBFを添加したものではそれぞれ5.8%,6.0%となった。ビタミンK1ではMK-7で観察されたKBFによる細胞透過促進効果はみられず,ヒト経口摂取の場合と異なる結果が得られた。骨細胞のカルシウム代謝にビタミンKが関与しており、骨粗鬆症の予防には血液凝固に必要なビタミンK以上の量が必要である。そのためビタミンK含量の高い納豆の摂取は、骨粗鬆症の予防に有効である事が報告されている。我々は、納豆菌の生産するビタミンKが特異的な糖ペプチド成分(vitamin-K binding factor ; KBF)と結合し、安定なミセルとして可溶化されていることを見いだしており、このKBFの存在がビタミンKの体内への消化吸収を促進しているのではないかと考えて実験を開始した。培養細胞を使ったこれまでの実験ではKBFによるビタミンK2の膜透過量が数倍度増加した。そこで本年度は、吸収促進剤として知られるパルミトイルカルニチン(PCC)やキラヤサポニン(QS)を用いて比較、検討した。【方法】培養した腸管上皮細胞であるCaco-2細胞に、ビタミンKとKBFなどの膜透過促進剤を添加して、添加直後と4時間後におけるビタミンKの透過量を測定した。【結果】ビタミンK2のみを添加した場合には4時間後の膜透過率が4%であった。KBF、脱脂KBF、PCCをそれぞれ添加した場合には、9.5%、6.6%、14.5%に上昇し、いずれにおいても促進効果がみられた。しかし、QSでは2.2%に低下しており、阻害効果がみられた。KBFとPCCを同時に添加した場合には8.3%であり、PCCのみを添加した場合よりも低下した。また、KBFとQSを同時に添加した場合には、9.2%であり、QSのみの添加より上昇した。この結果、KBFに対してPCCは阻害的に働き、QSは影響を与えないと考えられる。脱脂KBFとPCCやQSを同時に添加した場合にも同様の傾向がみられた。今後は、試料の濃度や調整法を検討する必要がある。

この試料に0.5μg/mlのKBFを添加した結果、透過率は,TG 100μM,200μMでそれぞれ8.9%,8.8%、と上昇し,適当な濃度のTGの添加によりKBFのMK-7細胞透過促進効果が見られた。つぎに,ビタミンK1にTG 100μM,200μM添加したとき,それぞれ10.1%,5.4%となり,この試料にKBFを添加したものではそれぞれ5.8%,6.0%となった。ビタミンK1ではMK-7で観察されたKBFによる細胞透過促進効果はみられず,ヒト経口摂取の場合と異なる結果が得られた。
幅広いバクテリア種で汎用性のあるゲノム編集技術の開発

プラスミドフリーなゲノム改変手法の基礎的基盤を確率した。具体的には、レプリコンを有さず、相同組み換えのためのRed recombinaseと、Red recombinaseを一過的に高発現するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する環状DNAを作製した。この環状DNAを大腸菌にエレクトロポレーションで導入し、同時に大腸菌の染色体の特定の座位と相補的な配列を有するGFP遺伝子(PCRで増幅)も導入し、GFP由来の緑色蛍光を発する大腸菌の作製を試みた。しかし、組み換え効率が極端に悪いため、明確な緑色蛍光を発するコロニーが得られなかった(全体のコロニーの数が多すぎ、かつ擬陽性らしきものが多い)。よって、何かしらの菌株の選別を行う仕組みを併せて用いる必要があることが明らかとなった。一方、T7発現系の高発現の仕組みを利用した構成型T7高発現系を開発した。本発現系が機能することを確認するために、GFP発現菌株、LacZ発現菌株、およびアミノ酸合成に関わる複数遺伝子を発現する菌株に組み込み、それぞれの菌株で本発現系が機能するかどうかを確かめた。リポーターアッセイやリアルタイムPCRを用いた実験で、目的遺伝子が構成的に高発現していることが確認された。これにより、遺伝子発現誘導剤を用いなくても目的遺伝子を高発現することが可能となり、本研究での一過的なRed recombinaseの高発現に非常に役立つと考えられた。論文作成のためのデータ収集を行う必要があったために、研究の進行がやや遅れた。また、新たな課題(遺伝子の導入確率が低い)が発生したため、その解決手段を検討する必要が生じた。期間を延長し、当初予定していた最終年度の内容を行う。遺伝子導入効率が低いために、何かしらの手段で菌株を選別する必要があるが、薬剤耐性遺伝子を用いることで、菌株の選別を行う手段を検討する。本年度は、来年度以降の研究を進めるためのプラスミド等の構築を行った。具体的には、Red recombinaseのシステムおよびT7RNAポリメラーゼの発現系に加えて、1CRISPR-Cas9のシステム2高発現プロモーターに連結したGFP3高発現プロモーターに連結したRFP、が必要となるために、これらを作製して機能を確認することを目指した。はじめに、大腸菌の染色体を改変するためのCRISPR-Cas9のシステム(プラスミド)を構築し、本システムを用いて大腸菌の染色体に薬剤耐性遺伝子を導入できることを確認した。さらに、Cas9の発現を制御するプロモーターを変更することで、より効率的にシステムを働かせることを目指した。一方、lacUV5などのいくつかの一般的なプロモーターを用いてGFPやRFPの発現を試みたが、染色体に1コピー導入した場合には有意な蛍光発色が見られなかった。、そこで、GFPおよびRFPを高活性な構成型のプロモーター(P3-BCD2)に連結して染色体に導入するためのプラスミドを構築した。P3-BCD2プロモーターを用いてこれらの遺伝子を発現させた場合には、1コピーのみの導入でも、RFPやGFPの高発現によって菌株がピンク色および(UV照射下で)緑色になることを確認した。来年度以降、Red recombinaseとT7システム、またはCas9とT7システムを組み合わせた環状DNAを用いて、作製したGFPやRFP遺伝子を大腸菌の染色体に効率よく導入するための検討を行う。プラスミドや環状DNAの作製に際して、今後の研究展開を見据えてラボ内で新たな手法を取り入れる(Gibsonリアクション、より簡便に環状DNAを作製できる)こととしたために、その導入に際して時間を要した。しかしながら、来年度以降はこの手法を用いることで、極めて効率的に研究を推進することが可能となった。本年度は遺伝子を大腸菌に導入して蛍光を発するための環状DNAのもととなるプラスミドを作製した。すなわち、遺伝子発現を増幅するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を構成性のプロモーターに連結し、一方、大腸菌用にコドンを最適化したGFP遺伝子をT7RNAプロモーターに連結して、これらを1つのプラスミド上に配置した。このプラスミドで大腸菌を形質転換することで、誘導剤を添加しなくても大腸菌が緑色蛍光を発することを確認した。また、このプラスミドを適切な制限酵素で処理してセルフライゲーションすることで、T7RNAポリメラーゼ遺伝子とGFP遺伝子のみからなる非プラスミド型の環状DNAを作製した(プラスミド上の複製起点と薬剤耐性遺伝子を除いたもの)。この非環状型DNAを用いて大腸菌が蛍光を発するかどうか現在確認している途中である。さらにGFP遺伝子をλファージの組み換え酵素であるRed recombinaseに変更するためのプライマー、およびT7RNAポリメラーゼ遺伝子の発現に関する構成性プロモーターの種類を変更するためのプライマーなどを設計した。これらのプライマーを用いて、次年度で相同組換えのための非環状型DNAを作製する。構成的に発現するT7RNAポリメラーゼ遺伝子とT7RNAプロモーターにより高発現するGFPを同時にコードするプラスミドを作製する際に、形質転換体がなかなか得られずに実験が遅れた。最終的に低コピーのプラスミドを用いることで問題を解決した。・T7RNAポリメラーゼ/T7プロモーター(T7発現系)を利用することで、低活性なプロモーターを用いた発現系を、超高発現な系へと変更できることを実証した。

具体的には、構成的プロモーターであるTyrRプロモーターのみを使用した場合と比較して、T7発現系を介した場合では、100倍以上高い構成的高発現系を構築できることを実験的に証明した(この特性を生かしたプラスミドフリーな組み換え系を構築する)。・Red recombinaseのシステムを用いたプラスミドフリーな組換え系の構築と比較するために、CRISPR/Cas9のシステムを用いたプラスミドフリー系の構築を試みた。GFPを構成的に高発現する大腸菌を作製し、CRISPR/Cas9の系を用いてGFPに由来する蛍光を発しない大腸菌をどのような効率で作製できるか検討した。しかしながら、抗生物質耐性でスクリーニングするRed recombinaseの系に比べて、特別な選択圧をかけないCRISPR/Cas9の系では、目的菌株の取得効率は極めて低かった(現在、さらに効率を上げるための検討を行っている)。・Red recombinaseのプラスミドフリーな組換え系を大腸菌以外に適用するために、T7RP遺伝子のプロモーター領域を任意に設計できるようなシステムへと改変した。具体的には、非プラスミド型の環状DNA上のT7RP遺伝子の上流に、PCR増幅した任意のDNA配列をGibson assemblyなどで挿入できるようにした。これにより、遺伝子組み換えの対象となるバクテリアに併せて、T7RP遺伝子を発現するためのプロモーターを最適化できるようになった。現在、このプロモーター領域を種々改良し、大腸菌以外の菌株に対する染色体への遺伝子導入を検討している。CRISPR/Cas9の実験系が思ったよりも機能しなかったため、研究に若干の遅れが生じた。プラスミドフリーなゲノム改変手法の基礎的基盤を確率した。具体的には、レプリコンを有さず、相同組み換えのためのRed recombinaseと、Red recombinaseを一過的に高発現するためのT7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する環状DNAを作製した。この環状DNAを大腸菌にエレクトロポレーションで導入し、同時に大腸菌の染色体の特定の座位と相補的な配列を有するGFP遺伝子(PCRで増幅)も導入し、GFP由来の緑色蛍光を発する大腸菌の作製を試みた。しかし、組み換え効率が極端に悪いため、明確な緑色蛍光を発するコロニーが得られなかった(全体のコロニーの数が多すぎ、かつ擬陽性らしきものが多い)。よって、何かしらの菌株の選別を行う仕組みを併せて用いる必要があることが明らかとなった。一方、T7発現系の高発現の仕組みを利用した構成型T7高発現系を開発した。本発現系が機能することを確認するために、GFP発現菌株、LacZ発現菌株、およびアミノ酸合成に関わる複数遺伝子を発現する菌株に組み込み、それぞれの菌株で本発現系が機能するかどうかを確かめた。リポーターアッセイやリアルタイムPCRを用いた実験で、目的遺伝子が構成的に高発現していることが確認された。これにより、遺伝子発現誘導剤を用いなくても目的遺伝子を高発現することが可能となり、本研究での一過的なRed recombinaseの高発現に非常に役立つと考えられた。
胎盤構築過程におけるウシ内在性レトロウイルスの貢献

本研究の目的は、ウシ胎盤で機能する内在性レトロウイルスを同定することである。昨年度までに、代表者らが同定したウシ内在性レトロウイルスK1(BERV-K1)のエンベロープ(Env)が胎盤の栄養膜二核細胞で特異的に発現していること、ならびにBERV-K1 Envがin vitroの解析で、ウシ子宮内膜細胞に対して高い細胞融合活性を示すことを明らかとした。このことから、BERV-K1 Envはウシの胎盤に特徴的な組織像である三核細胞の形成に中心的な役割を担っていると考えられた。本年度の計画は、ウシ子宮内膜細胞上で発現しているBERV-K1 Envの受容体を同定することとしたが、まだ特定には至っていない。しかしながら、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞に結合することが確認できたことから、当該組織の細胞がBERV-K1 Envの受容体を発現していることが強く示唆された。さらに詳細な解析を行った結果、BERV-K1はウシFAT2遺伝子のイントロン18に挿入されていることが明らかとなった。そこで、様々な動物のFAT2遺伝子におけるBERV-K1の有無をゲノムPCRによって解析したところ、ウシ科の中でもバリ牛、スイギュウ、シタツンガなどウシ亜科に属する動物のみがBERV-K1を有していることが明らかとなった。また、これらのBERV-K1は家畜ウシと同様にEnvのみが保存され、それらは高い細胞融合活性を示したことから、BERV-K1 Envはウシ亜科動物の進化の過程で積極的に保存され、これらの胎盤の発達に大きく寄与してきたものと考えられる。ウシFAT2遺伝子に関する解析を行ったところ、BERV-K1と同様に胎盤で特異的に発現していたことから、BERV-K1はFAT2遺伝子の発現機構を利用することで胎盤特異的に発現するようになったことが示唆された。本年度当初に予定していたBERV-K1 Env受容体の同定に関しては、実験系の確立が遅れているため進展に乏しいが、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞に対して有意に結合能を示したことから、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞表面に発現する受容体と結合し、細胞融合を引き起こすことで三核細胞を形成することが示唆された。また、ウシにおけるBERV-K1のin vivoノックダウン実験は、実験施設の確保ができず滞っている。しかしながら、BERV-K1はスイギュウやシタツンガなど他のウシ亜科に属する近縁種にも同様に挿入されていること、さらにはそれらのEnvが細胞融合活性を有していたことなどを鑑みるに、BERV-K1は進化の過程で積極的に保存され、胎盤形成という生理機能の発展に大いに貢献してきたことが強く示唆された。以上のことから、本研究の目的の達成度はおおむね順調に進展していると考えられる。現在のところBERV-K1 Envの予想される機能としては、その高い細胞融合活性を利用した三核細胞の形成であるが、in vivoにおける機能は証明されていない。そこで、目的タンパクの翻訳を阻害するモルフォリノアンチセンスオリゴによってBERV-K1 Envの機能を抑制し、着床期やその後の胎盤形成に与える影響を調べる。さらに、BERV-K1が胎盤で特異的に発現する機構の詳細を明らかにするために、BERV-K1のプロモーター解析やエピジェネティック修飾による転写制御などを中心に解析を進めていく。申請者が同定した、胎盤で発現していたウシ内在性レトロウイルス(BERV)-K1、および-K2のエンベロープ遺伝子(env)が、ウシ胎盤形成過程において重要な栄養膜細胞と子宮内膜細胞との融合に関わるか否かを調べることを目的とした。FLAGタグを付けた各エンベロープタンパク(Env)発現プラスミドを構築し、Cos-7細胞に導入し、envのタンパク産生能をウエスタンブロット法により確認したところ、両Envともに前駆体タンパクを確認した。また、細胞融合に必須であるTM EnvはBERV-K1のみに確認できた。各Env発現細胞と子宮内膜細胞との細胞融合活性をルシフェラーゼアッセイ法により確認したところ、BERV-K1が高い活性を示したのに対し、BERV-K2の活性は低い値であった。リアルタイムRT-PCR法により、ウシ体組織における各env mRNAの発現量を確認したところ、BERV-K1 envは胎盤で特異的に多く発現していたのに対し、BERV-K2 envはほとんど発現していなかった。さらに、in situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いて、胎盤における各envを発現する細胞を確認したところ、BERV-K1 envは栄養膜二核細胞(BNC)特異的に発現していたのに対し、BERV-K2 envの発現は確認できなかった。また、申請者が作製した抗BERV-K1 Envポリクローナル抗体を用いて、胎盤の免疫組織化学染色を行ったところ、ISH法の結果と同様にBERV-K1 EnvがBNC特異的に発現していることを見出した。以上より、BERV-K1 EnvがBNCと子宮内膜細胞との融合において、中心的な役割を担うことが強く示唆された。

昨年度までに、代表者らが同定したウシ内在性レトロウイルスK1(BERV-K1)のエンベロープ(Env)が胎盤の栄養膜二核細胞で特異的に発現していること、ならびにBERV-K1 Envがin vitroの解析で、ウシ子宮内膜細胞に対して高い細胞融合活性を示すことを明らかとした。このことから、BERV-K1 Envはウシの胎盤に特徴的な組織像である三核細胞の形成に中心的な役割を担っていると考えられた。本年度の計画は、ウシ子宮内膜細胞上で発現しているBERV-K1 Envの受容体を同定することとしたが、まだ特定には至っていない。しかしながら、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞に結合することが確認できたことから、当該組織の細胞がBERV-K1 Envの受容体を発現していることが強く示唆された。さらに詳細な解析を行った結果、BERV-K1はウシFAT2遺伝子のイントロン18に挿入されていることが明らかとなった。そこで、様々な動物のFAT2遺伝子におけるBERV-K1の有無をゲノムPCRによって解析したところ、ウシ科の中でもバリ牛、スイギュウ、シタツンガなどウシ亜科に属する動物のみがBERV-K1を有していることが明らかとなった。また、これらのBERV-K1は家畜ウシと同様にEnvのみが保存され、それらは高い細胞融合活性を示したことから、BERV-K1 Envはウシ亜科動物の進化の過程で積極的に保存され、これらの胎盤の発達に大きく寄与してきたものと考えられる。ウシFAT2遺伝子に関する解析を行ったところ、BERV-K1と同様に胎盤で特異的に発現していたことから、BERV-K1はFAT2遺伝子の発現機構を利用することで胎盤特異的に発現するようになったことが示唆された。本年度当初に予定していたBERV-K1 Env受容体の同定に関しては、実験系の確立が遅れているため進展に乏しいが、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞に対して有意に結合能を示したことから、BERV-K1Envがウシ子宮内膜細胞表面に発現する受容体と結合し、細胞融合を引き起こすことで三核細胞を形成することが示唆された。また、ウシにおけるBERV-K1のin vivoノックダウン実験は、実験施設の確保ができず滞っている。しかしながら、BERV-K1はスイギュウやシタツンガなど他のウシ亜科に属する近縁種にも同様に挿入されていること、さらにはそれらのEnvが細胞融合活性を有していたことなどを鑑みるに、BERV-K1は進化の過程で積極的に保存され、胎盤形成という生理機能の発展に大いに貢献してきたことが強く示唆された。以上のことから、本研究の目的の達成度はおおむね順調に進展していると考えられる。現在のところBERV-K1 Envの予想される機能としては、その高い細胞融合活性を利用した三核細胞の形成であるが、in vivoにおける機能は証明されていない。そこで、目的タンパクの翻訳を阻害するモルフォリノアンチセンスオリゴによってBERV-K1 Envの機能を抑制し、着床期やその後の胎盤形成に与える影響を調べる。さらに、BERV-K1が胎盤で特異的に発現する機構の詳細を明らかにするために、BERV-K1のプロモーター解析やエピジェネティック修飾による転写制御などを中心に解析を進めていく。
口腔癌に対する変異型IkBα遺伝子導入による抗腫瘍効果発現機構

1.ヒト頭頸部癌細胞株と正常ヒト口腔粘膜上皮細胞及び唾液腺細胞における転写因子NFκB活性を検索したところ、頭頸部癌細胞株においては正常細胞に比較して著しい活性の増強が認められた。そしてこの活性の増強は、IκB kinase活性の上昇に起因していることを明らかにした(Cancer Lett,171:165-172,2001)。2.口腔癌細胞株に変異型IκBαcDNAを遺伝子導入した細胞クローンを樹立した。これらの細胞クローンにおいては、ヌードマウス背部皮下での造腫瘍性の低下が認められ、これは、NFκBによって発現調節をうけている血管新生因子(IL-8,VEGF)の産生低下によることを明らかにした(日本口腔組織培養学会,10:45-54,2001)。4.セファランチンはヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるNFκB活性を抑制することにより、MMP-9産生を低下させることを明らかにした(Arthritis Rheum,46:1585-1594,2002)。5.ヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるアポトーシスからの回避機構として、TNF-αによる抗アポトーシス蛋白であるTRAF-1の誘導が重要であることを明らかにした(Exp Cell Res,276:111-119,2002)。6.シスプラチンの口腔癌細胞に対する殺細胞効果はミトコンドリアの経路を介して、cytochrome cの遊離を増強させることによりアポトーシスを誘導することを明らかにした(Oral Oncol, in press)。1.7種類のヒト頭頸部癌細胞株と7種類の正常ヒト口腔粘膜上皮細胞及び唾液腺細胞における転写因子NFкB活性を検索したところ、頭頸部癌細胞株においては正常口腔粘膜上皮細胞及び唾液腺細胞に比較して著しい活性の増強が認められた。そしてこの活性の増強は、IкB kinase活性の上昇に起因していることを明らかにした(Cancer Lett,171:165-172,2001)。2.口腔癌細胞株(B88)に変異型IкBαcDNAを遺伝子導入した細胞クローンを樹立した(B88cl-1,B88cl-2,B88cl-3)。これらの細胞クローンにおいては、ヌードマウス背部皮下での造腫瘍性の低下が認められ、これは、NFкBによって発現調節をうけている血管新生因子(IL-8,VEGF)の産生低下によることを明らかにした(投稿中)。4.アルカロイド製剤であるセファランチンはヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるNFкB活性を抑制することにより、MMP-9産生を低下させることを明らかにした(Arthritis Rheum, in press)。5.ヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるアポトーシスからの回避機構として、TNF-αによる抗アポトーシス蛋白であるTRAF-1の誘導が重要であることを明らかにした(Exp Cell Res, submitted for publication)。

4.セファランチンはヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるNFκB活性を抑制することにより、MMP-9産生を低下させることを明らかにした(Arthritis Rheum,46:1585-1594,2002)。5.ヒト唾液腺細胞において、TNF-αによって誘導されるアポトーシスからの回避機構として、TNF-αによる抗アポトーシス蛋白であるTRAF-1の誘導が重要であることを明らかにした(Exp Cell Res,276:111-119,2002)。6.シスプラチンの口腔癌細胞に対する殺細胞効果はミトコンドリアの経路を介して、cytochrome cの遊離を増強させることによりアポトーシスを誘導することを明らかにした(Oral Oncol, in press)。
高齢者のうつ状態に於ける抗うつ薬の血中濃度と臨床効果の解析

我々は、加齢が抗うつ薬の血中濃度に与える影響を検討するために、三環系抗うつ薬イミプラミンあるいはクロミプラミンを、2週間以上に亘って定期的に服用している患者に研究の同意を得た後、最終服用後2-3時間に於いて未変化体およびその活性代謝物であるデジプラミン、デスメチルクロミプラミンの血中濃度を測定した。その結果を高齢者群(60歳以上)と対照群(50歳未満)に分け、統計処理を行った。薬物濃度の定量は高速液体クロマトグラフィーを用い、検出は波長210nm紫外部吸収装置で行った。薬物動態の指標としてP-D比(plasma level dose ratio,ng/ml/mg;血漿中濃度を1日投与量で除した値)を用いた。その結果、イミプラミンに関しては、対照群(7人)の場合、その定常状態に於けるP-D比の平均値は、イミプラミン1.43±0.34,デジプラミン0.62±0.22であった。一方、高齢者群(7人)では、そのP-D比の平均値はイミプラミン4.62×0.76,デジプラミン3.02±0.90で、対照群と比較して有意に高値を示した。クロミプラミン投与時に於いても、イミプラミン投与時の場合と同様に、高齢者群が有意に対照群と比較して高いP-D比を示したが、高齢者群の症例数が少なく、今後さらに同様の研究を続ける予定である。また、イミプラミン(30mg/day)を6ヶ月以上に亘って経口投与されている高齢患者2例における血中イミプラミンとデジプラミン濃度を、投与1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月に於いて測定した結果、6ヶ月の長期投与に於いて血中濃度の著しい変動は認められなかった。以上より、60歳以上の高齢者群の場合、比較的少量の抗うつ薬の投与によって、従来報告されている治療有効血中濃度に達することが示唆され、身体的な合併症を認めない高齢者では長期投与による過剰な蓄積は生じ難いことが推測された。
癌特異的蛍光プローブによる頭頸部癌検出法の開発

局所進行頭頸部癌において、粘膜病変の範囲を蛍光プローブによって定性・定量化し、イメージング手法として確立する事目的として、GGTをターゲットとした蛍光プローブを手術切除検体に噴霧し、その蛍光の有無によって各症例におけるGGT発現を評価してきた。それにより、同じ部位でも症例ごとにGGT活性に違いがある事が判明した。また、切除検体より抽出したRNAからの行ったシーケンスによる遺伝子発現定量解析によってGGT1発現の有無にも違いがあり、GGT1発現が亢進している検体においては、PI3K経路の活性化に関連している事が判明した。これらの蛍光特性と遺伝子発現解析におけるGGT1発現、PI3K経路の活性化について、それぞれを結びつけるために培養細胞を用いた蛍光イメージングとGGT1発現の関連性について検証した。検証には6種類の頭頸部癌細胞株および1種類の口腔正常粘膜細胞株を用いた。まず、それぞれの細胞株におけるGGT1発現についてpPCRにより測定した。その結果、細胞株によって比較的明確にGGT1発現の有無が分かれた。次に各細胞株に対して、切除検体の蛍光イメージングの際に用いた蛍光プローブを噴霧し、その蛍光特性について評価した。その結果、pPCRにてGGT1が高発現する細胞株では高い蛍光特性が見られ、逆にGGT1発現の低い細胞核ではほとんど発光が見られなかった。それにより、GGT1の発現が、蛍光特性と一致することが確認された。GGT活性と蛍光特性がほぼ一致することが確認できたが、PI3K経路の活性化や発がんとの関連性など、臨床応用に結び付ける結果には至っていない。今後の予定としては細胞実験における蛍光強度の定量化、免疫染色による蛍光イメージングとGGT1発現の裏付け、蛍光イメージの結果とPI3K経路活性化の関連性について評価していく。最終的には蛍光特性から得られるGGT発現の有無が臨床像とどのように関連するかについて検証することを目標とする。局所進行頭頸部癌において、粘膜病変の範囲を蛍光プローブによって定性・定量化し、イメージング手法として確立する事を目的として、GGTをターゲットとした蛍光プローブであるgGlu-HMRGを使用して手術切除検体に噴霧し、その蛍光量を評価してきた。順調に症例を蓄積し、肉眼的な腫瘍の存在範囲に一致した蛍光を確認する事ができた。すなわち頭頚部癌においてもGGTが発現している事が言える。一方で、すべての症例において蛍光が確認できた訳ではなく、症例ごとにその蛍光特性には違いがあることが判明した。つまり、同部位の病変においてもそのGGT活性には症例ごとに違いがある事がわかった。蛍光特性と臨床的特徴についての関係性についても検討したが、現段階では明らかな傾向が見いだせていない。切除検体よりRNAを抽出し、シーケンスによる遺伝子発現定量を行った結果、GGT1発現が更新しているものとそうでないものが同割合で存在する事が確認できた。更にその発現の有無によって2群にわけたpathway解析において、GGT1発現群ではPI3K経路が更新している事が判明した。GGT1の発現と発がんに何らかの因果関係がある可能性が示唆された。gGlu-HMRGが頭頸部癌のイメージングにおいて有用であることが確認できた。ただし、現段階では定性的な手法としての有用性にとどまっており、定量的な評価方法の確立には至っていない。その他のプローブの有用性についてもまだ検証ができていない。一方で、当初平成30年度に予定していたプローブがターゲットとする遺伝子の発現や、pathway解析についてはすでに取り掛かっており、一部結果も判明してきている。引き続き症例を蓄積し、蛍光プローブによる定量的イメージング手法の確立および他のプローブの有用性の検証を行う。蛍光特性と臨床像との関係性についてもさらに検討していく。GGT活性を免疫染色により評価し、蛍光特性との整合性を確認する。引き続き遺伝子発現およびpathway解析を行っていく。

今後の予定としては細胞実験における蛍光強度の定量化、免疫染色による蛍光イメージングとGGT1発現の裏付け、蛍光イメージの結果とPI3K経路活性化の関連性について評価していく。最終的には蛍光特性から得られるGGT発現の有無が臨床像とどのように関連するかについて検証することを目標とする。購入を予定していた試薬の一部がすでに施設内にあり、それを利用できたことと、当初の予定より学会発表にかかる旅費が少額で済んだため次年度使用額が生じた。今後、遺伝子解析などに費用を要し、試薬の購入や学会発表および論文投稿にも費用が生じる予定である。購入を予定していた試薬の一部が既に施設内にあり、それを利用できたことと、学会発表にかかる旅費が当初予定より少額で済み、論文発表にかかる校正費用を支出していないため次年度使用額が生じた。今後は細胞実験の継続と免疫染色を予定しており、そのための試薬購入に費用が生じる予定である。
ミセル型金属徴粒子の組織構造制御と強〓性体の開発

MTP超微粒子の成長過程における、構造、組成、結合状態体及び磁化過程等を「その場観察」することのできる超高真空槽装置を作製した。更に、RHEEDと結合させた新しい二結晶X線分光器を開発した。これにより、Si(111)上のFe薄膜から放射された特性X線FeKα1を測定し、6.0 eVの高分解能が得られた。これらの装置により、MgO(001)上のFe、Nd、Fe-Nd合金の成長過程の構造を調べ、これに対応した磁化測定も行った。RHEED解析により、Nd薄膜はバルクのABAC型hcp構造ではなく、fcc構造が成長することを初めて見出した。AuとNaClを交互に蒸着し、これをチオール(メルカプトプロピオン酸)水溶液中に溶解させて「Au-MTPナノミセル」を作製した。チオールの最適の濃度を調べた結果、1.0×10^<-3>mol/lであることを明らかにした。この条件で作製したAu-MTPナノミセルの電子顕微像には6角形状のネットワークが観察されたが、これらの粒子同士の間隙は約12Åであり、チオール分子の長さのほぼ2倍であるこを実証した。希ガス中で金属を蒸発させて超微粒子を凝縮させ、これを更に異なる金属蒸気と混合させて表面上にグラニュラー磁性体を作製する方法を開発した。この方法により、Fe/Ag系のFe微粒子のグラニュラー磁性体を作製し、その磁気的性質を調べた結果、微粒子(クラスター)間の磁気的相互作用が強く働いており磁気的な性質を支配していることを明らかにした。単結晶Rh(001)表面にFe薄膜を成長させるとfcc構造のFe薄膜が成長する。この成長過程の構造を低速電子回折(LEED)により詳しく解析した。その結果、Feは3原子層目まではfcc構造であるが、4層目以上では格子間隔が急激に減少し本来のbcc構造へと相転移することを見出した。AuとNaClを交互に蒸着し、NaCl中に埋め込まれたAu微粒子を作成した。これをチオール(メルカプトプロピオン酸)水溶液中に溶解させてチオール分子で表面が覆われたAu微粒子である「Au-MTPナノミセル」を作製した。これを乾燥させ電子顕微鏡で観察した。その結果、Au-MTPナノミセルの形状はほぼ球状で、その粒径の平均の直径は7.9nm、標準偏差3.3nmであった。粒径が揃っている場所ではAu-MTPナノミセルは二次元的に配列した六角形状の最密構造を取ることを見い出した。さらに粒径が良く揃ったMTPナノミセルを作成したり、修飾分子の官能基などを適切に選択すれば、二次元的及び三次元的な規則配列構造を持ったクラスターや組織体を作製することが可能であり、新しい材料が創生される可能性が高まった。次に、ガスフロースパッタリング法により、粒径が数nmの大きさのFeやCo超微粒子がAg薄膜中に分散したグラニュラー磁性体薄膜を作製し、その磁気的性質を詳細に調べた。その結果、磁性粒子間の相互作用を考慮した磁性秩序が観測され、金属磁性体粒子系において磁気的相互作用を制御できることを初めて可能にした。さらに、Ni(100)表面にfcc構造のCoおよびFe薄膜を作製し、この表面上におけるエチレンの吸着状態とその水素化反応を調べた。

エチレン分子の吸着エネルギーはNi<Co<Feの順に増加し、水素化反応の中間体であるエチル基の生成に必要な活性化エネルギーが増大し、水素化反応速度の減少をもたらすことを明かにした。上記研究を遂行すると同時に、強磁界中で金属薄膜を作製することのできる装置、及び反射高速電子回折(RHEED)と組み合わせた高分解能X線分光器の開発も行った。高磁界(1T)中においてMTP超微粒子や超薄膜を成長させることのできる超高真空槽を設計・作製し、これに反射高速電子回折(RHEED)、精密X線分光器、スクイド磁力計などを結合させ、MTP超微粒子の成長過程、構造変化、組成変化及び磁化過程の「その場観察」をすることのできる装置を完成させた。RHEEDと結合させた新しい二結晶X線分光器を作製したが、Si上のFe薄膜の特性X線FeKαにに対して6.0eVの高分解能が得られた。これにより、RHEED-高分解能TRAXS法は表面・薄膜研究の研究に有力な新しい方法となることを実証した。これらの装置により、MgO上のFe.Nd、Fe-Nd合金について詳しい構造を調べ、それに対応させて磁化測定も行った。特に、Nd薄膜ではバルクのABAC型hcp構造ではなく、fcc構造が成長することを始めて見出した。またFe-Nd合金薄膜ではbcc型の構造を基本とした1次元的な原子配列構造になることを見出した。また、塩化金酸のクエン酸還元法において、添加するNaの量をクエン酸当量の1/3程度に減らすと殆どがMTP微粒子となることも見出した。表面上にグラニュラー磁性体を作製する方法として、希ガス中で金属を蒸発させて超微粒子を凝縮させた後に更に異なる金属蒸気と混合させて堆積させる方法を開発した。この方法により、Ag中に分散したFe微粒子のグラニュラー磁性体を作製した。その磁気的性質は、粒子間の磁気的相互作用より支配されることを解明し、磁性材料に関する有用な新しい知見を得た。単結晶Rh(001)表面に成長したfccのFe薄膜の構造を低速電子回折(LEED)により解析した。その結果、Feは3原子層目まではRhと同じ格子間隔に膨張しfcc構造となるが、4層目以上では格子間隔が減少し本来のbcc構造へと相変化することを解明した。
軟骨を利用した新しい外耳道作成術の研究

鼓室形成術の発展に伴い中耳疾患に対する手術成績は著しく向上したが、技術的に単純と思われる外耳道閉鎖症の手術成績は今なお概して不良である。せっかく外耳道を造設しても、骨削開面からの肉芽増生や形成鼓膜の浅在化、移植皮膚の感染などのため、やがて外耳道の再閉鎖が始まり、一旦改善した聴力は次第に悪化することが多い。一方、軟骨は栄養状態が悪い環境下でも生着し、感染にも強いことから移植材料として最適の素材と考えられる。そこで我々は外耳道を軟骨で補強することにより、術後の肉芽増殖や鼓膜浅在化が防止できるのではないかと着想し以下の研究を行った。基礎研究にはモルモットを用いて実験を行った。耳後部に切開を加えて耳胞を開放、外部から中耳骨胞に至る「穴」を形成した。その後、A群では反体側の耳介から軟骨を軟骨膜とともに採取してリング状とし、上記の造設した穴に縫合して外耳道を形成した。B群では軟骨の代わりに筋膜を、C群では表皮を、それぞれ造設した穴に縫合して外耳道を形成した。術後は定期的に観察し、4週後に組織を採取、外耳道の形態と外耳道周囲の組織学的変化を検討した。その結果、外耳道を軟骨で形成することにより肉芽の増殖が阻止できることを明らかにした。一方、B群やC群では高頻度で肉芽の増殖が生じ、外耳道は狭窄傾向を示した。この結果を活用し、実際の症例において軟骨を用いた外耳道造設術を施行した。症例は11歳の男児で、左側小耳症と外耳道閉鎖症の合併例である。外耳道造設術は耳介形成術と同時に行なった。軟骨カッターを用いて肋軟骨を厚さ0.2-0.3mmの板状に切断し、これをトリミングして外耳道の骨削開面に貼り付けたところ、術後、肉芽増殖はおこらず外耳道の形態は安定していた。本法は外耳道閉鎖症の新しい術式として有望であると結論した。先天性外耳道閉鎖症の治療法として外耳道造成術が広く行われているが、現在のところ手術成績は概して不良である。治療成績を向上するには従来の発想とは異なった新しい手法による治療法の開発が望まれる。我々はリング状に形成した軟骨で外耳道を造成することにより、治療成績不良の主因である術後の肉芽増殖や鼓膜浅在化が防止できるのではないかと着想した。本年度の研究では実験動物において、軟骨により形成した外耳道が安定して生者し狭窄が生じないか否かを検討した。実験動物にはモルモットを用いた。ネンブタールを投与して動物を麻酔し、固定台に腹臥位にして固定した。局所麻酔後、耳後部に切開を加えて筋層を剥離しドリルで耳胞を開放することにより、体外部から中耳骨胞に至る「穴」を形成した。A群では反体側の耳介から軟骨膜を付けて軟骨を採取してリング状とし、上記の造設した穴に縫合して外耳道を形成した。この際、軟骨リングの先端には、あらかじめ筋膜を縫合しておき鼓膜を模擬した。B群では軟骨の代わりに筋膜を、C群では表皮を、造設した穴にそれぞれ縫合して外耳道を形成し、さらに深部に筋膜を張ることで鼓膜形成を模擬した。その後、B群およびC群では増設した外耳道にシリコンチューブを留置した。このチューブは2週間後に抜去した。その結果、8週後、全例で移植片は生着していた。この際、A群では明確な「穴」の形成がみられたが、B群およびC群では穴の形状は維持されているものの内腔はA群と比べて狭く、狭窄傾向がみられた。今後、さらに長期間の観察を行い、形成した管の内腔変化をみることで、外耳道形態の安定性を探索する予定である。

症例は11歳の男児で、左側小耳症と外耳道閉鎖症の合併例である。外耳道造設術は耳介形成術と同時に行なった。軟骨カッターを用いて肋軟骨を厚さ0.2-0.3mmの板状に切断し、これをトリミングして外耳道の骨削開面に貼り付けたところ、術後、肉芽増殖はおこらず外耳道の形態は安定していた。本法は外耳道閉鎖症の新しい術式として有望であると結論した。
森林生態系における有機酸の動態とその土壌中アルミニウムの無毒化機構

本研究の目的は、森林生態系内に存在する有機酸の中で、ヒノキ樹幹流に含まれる有機酸および樹木根から分泌される有機酸に焦点を当て、特にアルミニウムの無毒化という観点から、有機酸が森林生態系で果たす役割を解明することである。ヒノキの降雨初期の樹幹流は1降雨の樹幹流に比べ、pHが低く、EC、無機イオン濃度、TOC濃度が高い傾向が見られた。無機イオンのみを測定した際のイオンバランスの崩れは、初期樹幹流の方が大きく、洗脱される物質の中に有機陰イオンを生じる物質が存在することが示唆された。実際に低分子有機酸を測定した結果では、針葉樹の樹幹流にも広葉樹の樹幹流にも、一般的に有機酸と呼ばれている低分子の有機酸はほとんど存在しないことが明らかになった。イオンバランスが崩れる原因は、例えば樹皮成分で水溶性であるフェノール性成分などの、高分子有機陰イオンではないかと示唆された。また、H2O2処理とHPLCによるグラジェント溶離により、樹幹流中には多種多様な有機成分が存在することが明らかになった。今回、樹幹流中の有機成分の金属キレート能力は評価することはできなかったが、樹皮成分として含まれるフェノール性成分などの高分子有機酸が存在することが示唆されたため、樹幹流中のキレート能は期待できるものと考えられる。次にクヌギ苗を用いたポット実験において、Al処理した全ての区でコントロール区と比べ水耕溶液中のTOC濃度が低くなることが示された。Al処理開始後60日でコントロール区、P欠区、Ca欠区ではほぼ同じ値だったことから、養分欠乏の影響ではなく、Alによって有機物分泌が抑えられたと考えられる。また、HPLCを用いた有機酸分析では32分のピークが全てのAl処理区で小さく、5mMAlを培養液中に添加したときクヌギはクエン酸、リンゴ酸のピークがみられた。これらから、クヌギ根から分泌される有機酸にはAlによって32分の有機酸の様に抑制されるものと、クエン酸とリンゴ酸の様に促進されるものがあることが明らかとなった。森林生態系には様々な種類の有機酸が存在し、生態系内の物質循環や植物生理において重要な役割を果たしている。森林生態系の有機酸の起源は大きく二つに分けることができる。植物や動物の遺骸の分解過程において生成したり、樹体から溶出したりする生物起源のものと、大気汚染物質のオゾンや過酸化水素のような酸化性ガスと、生物起源あるいは人為起源の有機性ガスとの反応で生成すると考えられる人為起源のものとである。有機酸の森林生態系における動態は、土壌中の有機物分解過程で生成する腐植酸を代表的物質として取り扱われていることが多く、低分子有機酸を含む様々な有機酸の組成や量、生成メカニズムなどはまだよく把握されていない。本年度は、樹木根から分泌される有機酸と樹幹から溶脱してくる有機酸について研究をおこなった。樹木根から分泌される有機酸については、クヌギを用いた水耕栽培により、Al処理、Ca欠乏、P欠乏等のストレスが根からの有機酸分泌にどのような影響を与えるかを調べた。その結果、有機酸分泌に影響を与える因子は、Ca欠乏やP欠乏ではなく、Alの絶対濃度であることが示唆された。また、Alの存在によって分泌が抑制される有機酸(αケトグルタル酸)と、分泌が促進される有機酸(リンゴ酸、クエン酸)があることがわかった。

この分泌が促進される有機酸はNとキレートを形成し、Alを無毒化する作用があることが推察される。樹幹から溶脱する有機酸については、ヒノキの樹幹流中の有機物についてHPLCによる分析をおこttつた。ODSカラムでグラディエント溶離をおこなったが、解離型有機酸と硝酸のピークが重なり、解離している有機酸の定量が困難であり、更なる検討が必要である。本研究の目的は、森林生態系内に存在する有機酸の中で、ヒノキ樹幹流に含まれる有機酸および樹木根から分泌される有機酸に焦点を当て、特にアルミニウムの無毒化という観点から、有機酸が森林生態系で果たす役割を解明することである。ヒノキの降雨初期の樹幹流は1降雨に樹幹流に比べ、pHが低く、EC、無機イオン濃度、TOC濃度が高い傾向が見られた。無機イオンのみを測定した際のイオンバランスの崩れは、初期樹幹流の方が大きく、洗脱される物質の中に有機陰イオンを生じる物質が存在することが示唆された。実際に低分子有機酸を測定した結果では、針葉樹の樹幹流にも広葉樹の樹幹流にも、一般的に有機酸と呼ばれている低分子の有機酸はほとんど存在しないことが明らかになった。イオンバランスが崩れる原因は、例えば樹皮成分で水溶性であるフェノール性成分などの、高分子有機陰イオンではないかと示唆された。また、H2O2処理とHPLCによるグラジェント溶離により、樹幹流中には多種多様な有機成分が存在することが明らかになった。今回、樹幹流中の有機成分の金属キレート能力は評価することはできなかったが、樹皮成分として含まれるフェノール性成分などの高分子有機酸が存在することが示唆されたため、樹幹流中の有機成分のキレート能は期待できるものと考えられる。次にクヌギ苗を用いたポット実験において、Al処理した全ての区でコントロール区と比べ水耕溶液中のTOC濃度が低くなることが示された。Al処理開始後60日でコントロール区、P欠区,Ca欠区でほぼ同じ値だったであったことから、養分欠乏の影響ではなく、Alによって有機物分泌が抑えられたと考えられる。また、HPLCを用いた有機酸分析では32分のピークが全てのAl処理区で小さく、5mM Alを培養液中に添加したときクヌギはクエン酸、リンゴ酸のピークがみられた。これらから、クヌギ根から分泌される有機酸にはAlによって32分の有機酸の様に制御されるものと、クエン酸とリンゴ酸の様に促進されるものがあることが明らかとなった。
初期中皮腫に対する革新的な診断法および治療法の開発

我が国では、今後中皮腫患者の増加が懸念されているにもかかわらず、早期診断法や標準治療法は確立されておらず、有効な診断法および治療法の確立が急務とされている。その手段として5-aminole vulinic acid(ALA)の腫瘍集積性を用いた光線力学診断法(photodynamic diagnosis ; PDD)およびポルフィリンのスクリーニングやクリアランスが新たな診断法となる可能性について検討を試みた。本年度はFisher344雄性ラットによる動物実験を昨年度と継続して実施した。ラットに炭化ケイ素繊維(SiC)5mg/匹を腹腔内投与し、約30週後に投与ラットを解剖して中皮腫の発症を確認した。血液・肝臓・腎臓・脾臓および腹膜を採取した。別群にALA塩酸塩-生理食塩水経口投与群を設定し、4時間後および8時間後、24時間後に中皮腫の発症を調べ、前述群と同様に臓器を採取した。採取した臓器はシュークロースを加えてホモジナイズし、前処理後にHPLC-蛍光検出器を用いて各ポルフィリンの分離定量を行った。その結果、対照群に腹膜中皮腫の発症は無かった(非腫瘍群)が、すべてのSiC投与ラットに腹膜中皮腫が認められた(腫瘍群)。腫瘍群の各臓器中プロトポルフィリン濃度は非腫瘍群よりも高値で、腫瘍発生の腹膜では特に有意な高値であった(p<0.01)。腫瘍群では投与されたALAが代謝され、腹膜においてプロトポルフィリンの有意な高値を認めた(P<0.001)。一方、非腫瘍群ではALAを投与しているにもかかわらず腫瘍群のような臓器中プロトポルフィリン濃度の蓄積を認めず、ALAを投与していない非腫瘍群と比較して有意差はなかった。以上のことから、中皮腫発症ラットでは投与されたALAが腫瘍部に取り込まれ、代謝されてプロトポルフィリンの蓄積が確認された。一方、腫瘍発生の無いラットでは中皮腫発症ラットに比較してALAがポルフィリンに代謝されずに体外へ排出されていくことが明らかになった。以上のことからALAの代謝によるポルフィリン濃度の変化が中皮腫発症の有効な診断の1つになり得ることが推察できた。その手段として5-aminolevulinic acid (ALA)の腫瘍集積性を用いた光線力学診断法(photodynamic diagnosis;PDD)およびポルフィリンのスクリーニングやクリアランスが新たな診断法となる可能性について検討を試みた。本年度は動物実験としてFisher344雄性ラットを用いた。ラットに炭化ケイ素繊維(SiC)5mg/匹を腹腔内投与し、約30週後に投与ラットへALA塩酸塩-生理食塩水を経口投与した。1群は投与4時間後に解剖し、中皮腫の発症と蛍光を調べた。別群はALA投与直後から48時間後までの尿中ポルフィリン濃度測定を行った。対照群として非投与ラットにALA塩酸塩-生理食塩水を経口投与し、1群は蛍光を別群はALA投与直後から48時間後までの尿中ポルフィリン濃度測定を行った。その結果、対照群に腹膜中皮腫の発症は無かった(非腫瘍群)が、すべてのSic投与ラットにおいて腹膜中皮腫が認められた(腫瘍群)。非腫瘍群および腫瘍群にALAを投与し、紫外線を照射した。その結果、非腫瘍群は腸管のみが、腫瘍群では腸管の他に中皮腫での蛍光を確認した。一方、投与されたALAは代謝され、Uroporphyrin, Coproporphyrin1, Coproporphyin3として尿中に排出されたが、腫瘍群は非腫瘍群とクリアランスが異なり、明らかな代謝遅延が確認できた。本年度の研究成果としてまだ試験的ではあったが、ALAを用いたPDDおよび尿中ポルフィリン測定が中皮腫の有効な診断法となる可能性を見出せた。

腫瘍群の各臓器中プロトポルフィリン濃度は非腫瘍群よりも高値で、腫瘍発生の腹膜では特に有意な高値であった(p<0.01)。腫瘍群では投与されたALAが代謝され、腹膜においてプロトポルフィリンの有意な高値を認めた(P<0.001)。一方、非腫瘍群ではALAを投与しているにもかかわらず腫瘍群のような臓器中プロトポルフィリン濃度の蓄積を認めず、ALAを投与していない非腫瘍群と比較して有意差はなかった。以上のことから、中皮腫発症ラットでは投与されたALAが腫瘍部に取り込まれ、代謝されてプロトポルフィリンの蓄積が確認された。一方、腫瘍発生の無いラットでは中皮腫発症ラットに比較してALAがポルフィリンに代謝されずに体外へ排出されていくことが明らかになった。以上のことからALAの代謝によるポルフィリン濃度の変化が中皮腫発症の有効な診断の1つになり得ることが推察できた。