hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エキマレーザー屈折矯正手術の基礎的研究:角膜強度及び光学的特性の変化予測

本研究では、屈折矯正手術による角膜形状変化とその光学的特性を評価する方法を確立し、それらを予測することができるコンピュータシミュレーションシステムを開発し、より安全で効果的な屈折矯正手術の開発に貢献することを目指し研究を行った。主たる成果は以下のとおりである。1.角膜形状解析による視機能のシミュレーション角膜形状を解析し、角膜形状の定量的指数を算出することによって、視力やコントラスト感度など視機能を予測する回帰式を示した。2.バイオメカニクスと角膜形状、視機能の関係角膜放射状切開術後の視力の日内変動と角膜形状変化の関係を明らかにし、コンタクトレンズによる低酸素負荷によって視力の日内変動を最小限にできることを示した。また、豚眼における強膜短縮術のモデルを作成し、手術の角膜形状への影響を示した。3.屈折矯正手術における矯正効果に関与する要因の検討乱視矯正手術に対し術前のパラメータによる多変量解析を施行し、被手術眼の形状や軸ずれによって手術の施行される部位が異なると結果は異なることを示した。また、対象となる角膜が年齢および性差によりことなった形状を有することを示した。4.波面センサーによる眼球光学系の光学的特性の評価眼球光学系の特性を、不正乱視を含めて評価するために波面センサーを開発し、LASIKにおける矯正量と高次収差の関連、涙液の影響、水晶体の核硬化、調節の影響、円錐角膜における特徴を明らかにした。屈折矯正手術による角膜の光学的特性を知るために、角膜形状異常、特に角膜不正乱視が矯正視力に及ぼす影響を調べた。正常者および円錐角膜を対象として、ビデオケラトスコープを用いて角膜形状解析を施行し、得られた屈折力分布のデータから角膜不正乱視の定量的指数として、SRI(Surface Regularity Index)および、PCA(Predicted Corneal Acuity)を算出し、矯正視力との相関を調べた。その結果SRIおよびPCAは、矯正視力と有意に相関することが判明し、角膜不正乱視の影響によって低下した矯正視力は、角膜形状解析を行えば予測できた。また、測定に用いた装置が異なり、かつ、SRIとSAIでは、その指数の算出アルゴリズムが異なるにも関わらず、両者間にも高い相関関係があった。ただし、SRIでは、円錐角膜より正常で精度が高く、逆にPCAでは正常より円錐角膜で精度が高く、正常にも角膜不正乱視症例でも高い相関を有する定量的指数の開発が必要と考えられた。そのため、次年度には角膜不正乱視を波面収差として計算して定量化するプロジェクトをすすめることとし、さらに視機能評価法として、現在一般的に用いられている高コントラスト視力検査に加え、低コントラスト視力検査や縞指標コントラスト検査、文字コントラスト検査も併用し、角膜形状変化と視機能の関係を一層明らかにする予定である。加えて、有限要素法に関しても、今年度中にヒト眼球のモデル化を完成させ、動物にエキシマレーザーを実際に照射する実験との比較検討を施行する予定である。前年度の結果で、角膜形状解析より高コントラスト視力検査における矯正視力を予測することが可能であることが判明した。これを受け、今年度は視機能評価法をさらに詳細に解析するため、低コントラスト視力検査や縞指標コントラスト検査、文字コントラスト検査も併用し、角膜形状変化と視機能の関係を一層明らかにすることを試みた。対象を円錐角膜と正常眼とし、角膜形状異常と文字コントラスト感度は相関し、コントラスト感度が他の臨床検査によって予測可能であることを、初めて示した。また、円錐角膜と正常眼の角膜形状を、スリットスキャンニング式角膜形状解析装置にて解析し、前面及び後面の角膜不正乱視をフーリエ展開を用いて、その成分ごとに解析した結果、非対称成分の増加が特徴的であり、また後面の変化が予想以上であることが判明した。さらに角膜放射状切開術後の症例における、視力の日内変動と角膜形状の関係について調査を行い、角膜の酸素分圧により、屈折が日内変動することを示し、その治療として、高含水ソフトコンタクトレンズ装用で軽い虚血の負荷をかけることにより、視力の日内変動を最小限にすることが可能であることが示された。

以上の結果より、屈折矯正手術による不正乱視を、屈折において光学的に意味のある定量的解析を施行する必要があることが示唆された。そこで、屈折における不正成分の測定と解析が可能な波面センサーを用いて、角膜形状異常眼としての円錐角膜や屈折矯正手術症例を精査することとした。そこで得られた波面形状をZernike多項式を用いて展開し、眼球光学系としての不正乱視成分を高次収差として解析することをさらに推進することとした。加えて、有限要素法に関しても、今年度中にヒト眼球のモデル化を完成させ、動物にエキシマレーザーを実際に照射する実験との比較検討を施行する予定である。今年度の研究としては、まず実験的に、眼科手術が角膜形状および不正乱視に及ぼす影響に関して研究した。豚眼を使用し、3つの条件で強膜短縮術を施行した場合の正乱視と不正乱視の発生状況を、角膜形状解析を施行して調べた。その結果強膜短縮の経線方向、緯線方向のどちらを拡大させても正乱視は増強し、不正乱視は乱視軸が曲線化するパターンを示すことが判明した。臨床における屈折矯正手術の効果予測として、白内障術後の乱視矯正手術に対し多変量解析を施行した。術前の乱視量に関わらず同一術式を施行した場合の乱視矯正効果を調べたところ、使用した7変数のうち、術前の乱視度数と手術の乱視矯正効果の軸ずれが、手術効果に影響していた。すなはち、同一術式を施行した場合でも、被手術眼の形状や手術の施行される部位が異なると結果は異なってしまうこと、逆にこれらを考慮すれば手術の精度が向上することが示唆された。このように、術前の角膜形状のばらつきを調査することが、屈折矯正手術の効果予測に重要であることが示唆されたため、年齢および性差が角膜形状に及ぼす影響を調べた。すると、高齢者においては女性より男性は角膜形状が扁平であり、興味あることにそれは垂直方向で著明で、加齢による倒乱視化は、男性につよく発生する可能性が強いと考えられた。また、角膜不正乱視も高齢者ほど増加するが、性差はないこと、若年者にはこれらについて性差がないことが判明した。これら角膜形状解析に加え、屈折における不正乱視に対して波面センサーを用いて高次波面収差として解析することとし、われわれが共同開発した波面センサーを用いた波面収差解析の手法を紹介した。次年度は、この装置を用いて正常眼や屈折矯正手術前後について詳細な検討を行い、屈折矯正手術による光学的特性の変化予測をさらに詳細に検討する予定である。今年度の研究としては、我々が共同開発した波面センサーを用いて高次収差の測定を継続して行った。まず、白内障症例を対象として測定をした結果では、正常者に比べ、白内障症例では高次収差が増加していることを見出した、しかも、皮質白内障ではコマ収差が、核白内障では球面収差が増加しており、白内障のタイプが異なると、生じる不正乱視の性状が異なっていることを示した。従来白内障は、散乱と透過率の低下によって視力が低下すると考えられていたが、水晶体に起因する不正乱視もその原因のひとつであることが示唆され、水晶体不正乱視という概念を示し、それは波面センサーと角膜形状解析を組み合わせることによって評価できるとことを示した。
表面エネルギーを利用した液滴分離表面の作製と評価

本研究は、表面エネルギー差を利用した撥水性パターン表面による液滴分離機能の創製を目的としている。2種類の撥水性分子膜をライン状に形成させた表面上に水を滴下し、傾斜させると、ラインに対し平行と垂直方向とでは水滴の転落挙動は異なることが分かった。このような組成、つまり表面エネルギーの差による異方的な転落挙動と、質量に比例した重力による転落を組み合わせることで、サイズ、比重、組成による液滴の分離を目指している。今年度は、フォトリソグラフィー技術を利用して、シリコンウエハ上にパターン膜を作製した。フッ素またはアルキル表面官能基をもつシラン系カップリング剤を用いて、CVD法により平滑な自己組織化単分子膜を合成した。さらに、パターンの付いたフォトマスクを通して真空紫外線を単分子膜に照射させて、分解・除去し、その部分だけに別の単分子膜を堆積させ、2種類の単分子膜によるパターン表面を作製することができた。傾斜させたパターン表面上の水滴の転落挙動を高速度カメラで観察し、転落速度・加速度の異方性を調べた。ラインを横切るように水滴を転落させると、水滴の転落はラインの境界で抑制され、転落速度は小さくなった。また、ラインの幅と水滴の大きさによって、その抑制度合いは異なることが分かってきた。今後、さらに、液滴分離機能表面の設計のために、単分子膜の種類、パターン幅、パターン表面傾斜角度やパターン傾斜角などを変えて、液滴の転落挙動を観察・解析し、その結果を元に液滴分離表面を作製する。
LPS識別におけるMD-2分子の機能解析

グラム陰性菌の細胞壁構成成分であるLPS(lipopolysaccharide)は、あらゆる細胞に強い活性化を誘導し、臨床的にもしばしば致死的なショックを起こしエンドトキシンともよばれている。生体がどうやってLPSを認識するのかはこれまで不明であった。我々はMD-2分子を同定し、TLR (Toll-like receptor)4/MD-2複合体がLPS認識応答に必須であることをこれまで報告してきた。細胞株を用いた結果からMD-2がTLR4によるLPS認識に必須の分子である事を示してきたが、このMD-2の重要性を正常免疫細胞、個体レベルで検討する為にMD-2KOマウスを作製した。MD-2が欠損したB細胞、マクロファージ、樹状細胞いずれもLPSに低応答性を示した。またエンドトキシンショックに対して抵抗性を示しSalmonella typhimurium感染に感受性が高かった。これらの結果からMD-2が個体レベルでもLPS応答に必須の分子である事が明らかとなった。MD-2のLPS応答における役割としてまず、TLR4の細胞内局在の制御があげられる。胎児由来線維芽細胞にTLR4を発現させ、その局在を調べたところMD-2の存在によってTLR4の局在が大きく変化する事を最近見出した。MD-2がないとTLR4はゴルジ体に停滞し、細胞表面への発現が認められなかった。またMD-2はTLR4の局在ばかりでなくLPS認識そのものにも関与していると我々は考えている。LPS生合成前駆体であるlipidIVaは、マウスTLR4/MD-2にはアゴニスト、ヒトTLR4/MD-2にはアンタゴニストとして作用する。マウスTLR4/ヒトMD-2キメラ発現細胞には、lipidIVaはアンタゴニストとして作用した。このようにMD-2がマウスTLR4の特異性を制御することから、LPS認識・シグナル伝達にMD-2が直接関わることが明らかとなった。我々は1999年にMD-2分子を発見し、グラム陰性菌菌体成分であるLPSの認識・応答に関わることを明らかにしてきた。MD-2の病原体認識における役割を分子レベルで明らかにしていくことで、宿主側の感染防御機構を利用する新たな治療法の開発につながるのではないかと考えている。(1)MD-2に対するモノクローナル抗体の確立stable transfectantや精製したMD-2を用いてラットに免疫し、ラット抗マウスMD-2抗体の作製を試みている。現在LPS認識に影響を与える可能性のあるものがいくつかとれてきており、さらに解析を進めている。免疫源にMD-2 fusion proteinを用いたり、ヒトMD-2に対する抗体の作製も進めている。(2)MD-2会合分子の同定stable transfectantやマウスcell lineと(1)でできた抗体を用いた免疫沈降法により、MD-2会合分子の同定・アミノ酸配列の解析を進めている。これによりMD-2の新たな機能解析にもつながっていくと思われる。またMD-2fusion proteinを用いて、MD-2と直接結合する分子の同定も試みている。(3)MD-2の精製、およびそれを用いた機能的解析精製したMD-2やfusion proteinを用いて、MD-2会合分子であるTLR4の細胞表面への発現やLPS認識コントロールに関する解析を進めている。TLR4によるLPS認識に関してMD-2が重要な役割をしていることを、ヒト・マウスキメラ発現細胞とlipidIVaとを用いて証明した(2001, Internal. immunol.)さらに我々はMD-2ノックアウトマウスの作製も成功しており、このマウスを用いて生体内での機能解析も進めていく。

LPS認識応答は多くの分子が関わる複雑な機構であることが分かってきた。MD-2分子を足がかりに今後もこの全容を解明していきたい。グラム陰性菌の細胞壁構成成分であるLPS(lipopolysaccharide)は、あらゆる細胞に強い活性化を誘導し、臨床的にもしばしば致死的なショックを起こしエンドトキシンともよばれている。生体がどうやってLPSを認識するのかはこれまで不明であった。我々はMD-2分子を同定し、TLR(Toll-like receptor)4/MD-2複合体がLPS認識応答に必須であることをこれまで報告してきた。細胞株を用いた結果からMD-2がTLR4によるLPS認識に必須の分子である事を示してきたが、このMD2の重要性を正常免疫細胞、個体レベルで検討する為にMD-2KOマウスを作製した。MD-2が欠損したB細胞、マクロファージ、樹状細胞いずれもLPSに低応答性を示した。またエンドトキシンショックに対して抵抗性を示しSalmonella typhimurium感染に感受性が高かった。これらの結果からMD-2が個体レベルでもLPS応答に必須の分子である事が明らかとなった。MD-2のLPS応答における役割としてまず、TLR4の細胞内局在の制御があげられる。胎児由来線維芽細胞にTLR4を発現させ、その局在を調べたところMD-2の存在によってTLR4の局在が大きく変化する事を最近見出した。MD-2がないとTLR4はゴルジ体に停滞し、細胞表面への発現が認められなかった。またMD-2はTLR4の局在ばかりでなくLPS認識そのものにも関与していると我々は考えている。LPS生合成前駆体であるlipidIVaは、マウスTLR4/MD-2にはアゴニスト、ヒトTLR4/MD-2にはアンタゴニストとして作用する。マウスTLR4/ヒトMD-2キメラ発現細胞には、lipidIVaはアンタゴニストとして作用した。このようにMD-2がマウスTLR4の特異性を制御することから、LPS認識・シグナル伝達にMD-2が直接関わることが明らかとなった。
虚血時初代網膜神経節細胞へのエリスロポエチンによる保護効果および小胞体ストレス

緑内障の発症に神経栄養因子由来の生存シグナルの欠乏や小胞体ストレスに由来する網膜神経節細胞のアポトーシスが関与している可能性が考えられているので、その分子メカニズムを解明するとともに、エリスロポエチン(Epo)によるアポトーシスの保護作用を検討した。材料として新生ラットの網膜より分離した神経節初代培養細胞を用い、網膜神経節細胞を90%以上の純度で100万個程度分離できる実験系を確立した。この細胞にEpoレセプターが虚血時、非虚血時ともに発現することをRT-PCR法および2重免疫染色法(Thy-1.1抗体およびEpoR抗体)で確認した。Epoは、グルタミン酸または一酸化窒素(NO)誘導性のアポトーシスから網膜神経節細胞を保護することをXTT法で示した。その分子メカニズムを解明するため定量的real time PCF法でBcl-2ファミリーの発現を評価したところ、NOによる毒性において網膜神経節細胞ではBcl-2の発現が低下していたが、Epoはその発現抑制を改善することが明らかとなった。一方、EpoはBDNFと異なり、神経栄養因子としての機能を有さないことがXTT法で明らかとなった。BDNFはサイトカイン欠乏によるBimの発現誘導を抑制したが、Epoは抑制しなかった。この点が両サイトカインの神経栄養因子としての機能の有無に関係する可能性があることが示唆された。以上より我々は、Epoが初代培養網膜神経節細胞においてストレス誘導性のアポトーシスを抑制する機能を有していることを明らかにした。
Ｌｅｖｙ過程の変動理論の発展と応用への展開

両側にジャンプを持つLevy過程に対する配当問題についていくつかの進展があった.Jose-Luis Perez氏(CIMAT),山崎和俊氏(関西大学)および矢野孝次氏(京都大学)とともに,指数分布のジャンプを持つLevy過程に対するPoisson的配当の研究を行い,いくつかの結果を得た.単独で,両側にジャンプを持つ一般のLevy過程に対する,資本注入を含んだ最適配当問題についても研究を行い,いくつかの結果を得た.この結果については論文を準備中である.正のジャンプを持たないMarkov加法過程に関する研究についてもいくつかの進展があった. 8月から9月にかけてメキシコのCIMATに滞在し, Jose-Luis Perez氏(CIMAT)およびJuan-Carlos Pardo氏(CIMAT)とともに,正のジャンプを持たないMarkov加法過程の周遊測度の性質とその応用に関する研究を行った.この際Victor Rivero氏(CIMAT)とも周遊理論に関する議論を行い, Markov加法過程の周遊理論に関する多くの知識を得ることができた.また, Jose-Luis Perez氏およびXiang Yu氏(Hong Kong Polytechnic University)とともに,正のジャンプを持たないMarkov加法過程に対する最適配当問題の研究を行った.この結果については論文にまとめ,現在投稿中である.矢野孝次氏およびVictor Rivero氏とともに, Markov過程の不変測度への収束の速さに関する研究も行った.技術的に困難ががあるとされてきた,両側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題に対して,経路解析による新しい方法を用いることにより反射--反射戦略の最適性を証明できた.これは既存の,片側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題の結果も包括する,非常に興味深い結果であった.また,指数分布のジャンプを持つLevy過程に対するPoisson的配当について研究することで,計算結果だけではなく,指数分布のジャンプを持つLevy過程の周遊測度に関する性質もいくつか得ることができた.Markov加法過程に関しては今後の研究に非常に有用だと期待される,周遊測度とスケール行列の興味深い等式を得ることができた.また一般の正のジャンプを持たないMarkov加法過程に関する最適配当問題は,研究開始時点で先行研究が確認できなかったが,関数の反復合成とその収束性を利用することにより,屈折戦略の最適性の証明に成功した.Markov過程の不変測度への収束の速さの評価に関しては,Markov過程の抽象さがゆえに困難に思われたが,周遊測度と局所時間の理論を利用することにより,問題を非常に具体的な形に落とし込むことができた.両側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題の研究を大幅に進展させたいと考えている.特に,屈折--反射戦略の最適性,完全単調なLevy密度を持つ場合における屈折戦略の最適性を行いたい.そのためには経路解析の技術の発展や,指数分布のジャンプを持つLevy過程による近似の方法の発展が必要だと予測される.また, Markov加法過程に関するパリジャン破産の研究を行いたい.このためには,集合に関する周遊測度の性質をより深く研究する必要がある.近年盛んにおこなわれている, Markov加法過程のWiener--Hopf分解が役に立つのではないかと予測される.Markov過程の不変測度への収束の速さの評価に関しては緩変動の理論を用いることにより,研究を先に進めていきたい.両側にジャンプを持つLevy過程に対する配当問題についていくつかの進展があった.Jose-Luis Perez氏(CIMAT),山崎和俊氏(関西大学)および矢野孝次氏(京都大学)とともに,指数分布のジャンプを持つLevy過程に対するPoisson的配当の研究を行い,いくつかの結果を得た.単独で,両側にジャンプを持つ一般のLevy過程に対する,資本注入を含んだ最適配当問題についても研究を行い,いくつかの結果を得た.この結果については論文を準備中である.正のジャンプを持たないMarkov加法過程に関する研究についてもいくつかの進展があった. 8月から9月にかけてメキシコのCIMATに滞在し, Jose-Luis Perez氏(CIMAT)およびJuan-Carlos Pardo氏(CIMAT)とともに,正のジャンプを持たないMarkov加法過程の周遊測度の性質とその応用に関する研究を行った.この際Victor Rivero氏(CIMAT)とも周遊理論に関する議論を行い, Markov加法過程の周遊理論に関する多くの知識を得ることができた.また, Jose-Luis Perez氏およびXiang Yu氏(Hong Kong Polytechnic University)とともに,正のジャンプを持たないMarkov加法過程に対する最適配当問題の研究を行った.この結果については論文にまとめ,現在投稿中である.矢野孝次氏およびVictor Rivero氏とともに, Markov過程の不変測度への収束の速さに関する研究も行った.技術的に困難ががあるとされてきた,両側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題に対して,経路解析による新しい方法を用いることにより反射--反射戦略の最適性を証明できた.これは既存の,片側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題の結果も包括する,非常に興味深い結果であった.また,指数分布のジャンプを持つLevy過程に対するPoisson的配当について研究することで,計算結果だけではなく,指数分布のジャンプを持つLevy過程の周遊測度に関する性質もいくつか得ることができた.Markov加法過程に関しては今後の研究に非常に有用だと期待される,周遊測度とスケール行列の興味深い等式を得ることができた.また一般の正のジャンプを持たないMarkov加法過程に関する最適配当問題は,研究開始時点で先行研究が確認できなかったが,関数の反復合成とその収束性を利用することにより,屈折戦略の最適性の証明に成功した.

Markov過程の不変測度への収束の速さの評価に関しては,Markov過程の抽象さがゆえに困難に思われたが,周遊測度と局所時間の理論を利用することにより,問題を非常に具体的な形に落とし込むことができた.両側にジャンプを持つLevy過程に関する最適配当問題の研究を大幅に進展させたいと考えている.特に,屈折--反射戦略の最適性,完全単調なLevy密度を持つ場合における屈折戦略の最適性を行いたい.そのためには経路解析の技術の発展や,指数分布のジャンプを持つLevy過程による近似の方法の発展が必要だと予測される.また, Markov加法過程に関するパリジャン破産の研究を行いたい.このためには,集合に関する周遊測度の性質をより深く研究する必要がある.近年盛んにおこなわれている, Markov加法過程のWiener--Hopf分解が役に立つのではないかと予測される.Markov過程の不変測度への収束の速さの評価に関しては緩変動の理論を用いることにより,研究を先に進めていきたい.
高濃度リン酸アンモニウム溶液中におけるD体アミノ酸に対する酵素活性の出現

平成68年度の研究期間に、リン酸水素二アンモニウム存在下におけるトリプトファナーゼのD-トリプトファン分解経路を動力学的解析により明らかにし,酵素におけるD体アミノ酸の排除機構を検討した。その結果、新らたに得られた知見等を以下に示す。1.リン酸水素二アンモニウム飽和濃度が50%以下のとき,リン酸水素二アンモニウムはトリプトファナーゼを活性化するが、それを越えると阻害した。2.動力学的解析による本反応経路を解明することができた。すなわち,トリプトファナーゼはD-トリプトファンとリン酸水素二アンモニウムに迅速平衡でランダム結合し,トリプトファナーゼ・リン酸水素二アンモニウム・D-トリプトファンの三者複合体を形成したのちD-トリプトファンの分解に至った。3.リン酸水素二アンモニウム非存在下でも,D-トリプトファンはトリプトファナーゼに結合した。さらに,リン酸水素二アンモニウム存在下では,その濃度上昇とともにD-トリプトファンの阻害作用は,競争阻害型から中間型を経て非競争阻害型に変化した。4.3の結果は,トリプトファナーゼの活性部位内にはD-トリプトファンとの結合部位と触媒部位が別々に存在することを示した。さらに,リン酸水素二アンモニウム濃度が50%飽和のとき,D-トリプトファンの結合部位はL-トリプトファンのそれと独立的に振舞う可能性のあることを示唆した。これまでの研究で得られた成果を論文にまとめた。平成6年度は研究の初年度にあたるので、トリプトファナーゼがD-トリプトファンに対して活性を示す系を探すための予備的段階と位置づけた。以下の13に本年度の研究概要を述べる。1.市販のトリプトファナーゼは不純タンパク質が非常に多いので、あらかじめ不純物を取り除いておく必要がある。当初は、カラムクロマトグラフィー法で精製を試みたが成功しなかった。次に、バイオラッド社のロトフォアシステムを用いて等電点電気泳動法でこの不純タンパク質を取り除くことを試みた。試行錯誤ののち最終的にはSDSゲル電気泳動法でタンパク標品を泳動させると、ほとんどシングルバンドになるところまで精製することができた。こうして得られたトリプトファナーゼ標品は市販の酵素と比べて3.4倍の比活性の上昇がみられた。以後、すべての実験にはこの精製酵素標品を用いることにした。2.トリプトファナーゼとD-トリプトファンの反応が可能な系を種々検討した。その結果、高濃度のリン酸水素2アンモニウム溶液中で反応することが分かった。反応条件は、100%飽和濃度のリン酸水素2アンモニウム溶液をBritton-Robinson緩衝液で希釈し,1050%の所定飽和濃度に調製し、基質としてD-トリプトファンを加え37°Cでトリプトファナーゼと反応させた。活性測定は,反応生成物をエールリッヒ試薬で赤色に呈色させ,λ=570nmの吸光度を測定することによって算出した。3.D-トリプトファンが高濃度のリン酸水素2アンモニウム溶液中でラセミ化するのかどうか検討するために光学異性体分割用カラムであるクラウンパックを用いて分析を行った。その結果、ラセミ化の可能性はないことが分かった。平成7年度の研究目的は、リン酸水素2アンモニウム存在下におけるトリプトファナーゼのD-トリプトファン分解経路を動力学的解析により明らかにすることであった。そのため、キネティックスを行い反応初速度の測定結果をラインウェーバー・バ-クプロットであらわし検討した。その結果、平成7年度に行った研究によって得られた新たな知見は以下の通りである。1.低濃度のリン酸水素2アンモニウムはトリプトファナーゼを活性化するが、過剰量のリン酸水素2アンモニウムはトリプトファナーゼに阻害作用を及ぼした。2.トリプトファナーゼはD-トリプトファンまたはリン酸水素2アンモニウムと迅速平衡でランダム結合したのち、トリプトファナーゼ・リン酸水素2アンモニウム・D-トリプトファンの3者複合体を経てD-トリプトファンを分解した。

3.リン酸水素2アンモニウムが存在しなくても、トリプトファナーゼはD-トリプトファンに結合することができた。4.3の結果は、酵素における光学異性体に対する分別機能を検討する上で,基質の結合と分解を区別して考える必要があることを示した。5.動力学的解析による本反応の経路を解明することができた。6.化学進化過程でL-アミノ酸を選択した原因を検討する際にリン酸水素2アンモニウムの役割の重要性を示すことができた。平成8年度は,反応阻害剤を用いてトリプトファナーゼによるD-トリプトファン分解反応速度論的に解析し,酵素におけるアミノ酸のL体とD体の識別機構を検討した。その結果,新たに得られた知見等を次の16に示す。1.リン酸水素二アンモニウム無存在下のL-トリプトファン分解反応で,D-トリプトファンはトリプトファナーゼに対して競争阻害剤として働いた。2.トリプトファナーゼに対するD-トリプトファンの阻害作用は,リン酸水素二アンモニウム濃度の上昇と共に競争阻害型から中間型を経て非競争阻害型に変化した。3.リン酸水素二アンモニウム存在下で,D-トリプトファンのアナローグとしてインドールピルビン酸を阻害剤として用いたとき,2と同様の結果を得た。しかし,ピルビン酸を阻害剤として用いても競争阻害しか見られなかった。4.1,2の結果は,トリプトファナーゼの活性部位内にはD-トリプトファンとの結合部位と触媒部位が別々に存在することを示した。さらに,リン酸水素二アンモニウムは濃度が50%のとき,D-トリプトファンの結合部位はL-トリプトファンのそれと独立的に振舞う可能性のあることを示唆した。これまでの研究で得られた新しい知見は,アミノ酸のL体とD体の認識機構の解明に向けて将来展望を開くものとして意義深い。6.これまでの研究で得られた成果を論文にまとめた。
活性水素発生能および捕捉能を有する二重修飾膜電極によるCO_2電気化学的還元

CO_2の転換方法として,電気化学的,光化学的あるいは高温触媒プロセスが提案されているが,そのプロセスに必要なエネルギー,還元剤,生成物の付加価値などを考慮する常温・常圧で進行する電気化学方法が最も有力である。しかし,この方法の欠点は大きな過電圧を必要とすることと反応速度が遅いことである。この点を克服する鍵は電極触媒の開発にある。本研究では,この目的に沿った電極触媒系を開発するために,異なる機能を有する膜を二重に修飾した電極あるいはその膜に金属錯体または活性配位子を固定した電極を用いてCO_2の接触電気化学的還元を試みた。電極系は,不活性金属/第1膜/第2膜(金属錯体または配位子を包含)/溶液から成る。第1膜は,プロトンを容易に還元し(水素過電圧が小さく),活性な水素原子を発生するプルッシアンブルー(PB)やモリブデンブルー(MB)である。第2膜は,CO_2捕捉あるいはCO_2拡散の可能な導電性高分子膜,ポリメチルピロール(PPy),ポリアニリン(PAn)などである。第2膜には,金属錯体や配位子を取り込ませ,その機能を一層高めた。PPy/MB/Pt電極を用いてCO_2を長時間電解還元したところ,還元生成物としてメタノール,エタノール,乳酸,アセトアルデヒド,アセトンがえられた。特に,乳酸の選択性が大きく,80%以上であった。CO_2還元の電流効率は最高で約40%であった。還元生成物は主として溶液と修飾膜中から検出された。反応後の修飾膜のFTIRスペクトルを測定したところ,-CHO,-COOH,-CHOH,-CO-,-OH,の存在が確認され,CO_2の還元生成物や反応中間体の膜への吸着が認められた。還元生成物の収率と選択率は修飾膜と膜に固定された金属錯体や配分子の種類に大きく依存した。還元機構としては,活性水素によるCO_2の段階的水素化が提案された。
アバヤーカラグプタ著作の新出梵文資料校訂を通したインド仏教の学知形成様態の解明

本研究課題は、近年中国よりサンスクリット・チベット語バイリンガル写本の影印版が出版された、後期インド密教の重要文献であるアバヤーカラグプタ作『アームナーヤマンジャリー』第5-8章のサンスクリットテクスト校訂出版を主要な目的とする。2018年度は、『アームナーヤマンジャリー』第5-8章のTEIガイドライン準拠XMLデータ化を終え、このデータに基づいて同第5,6章の校訂テクストのドラフト版を作成した。2018年9月には、海外研究協力者の出席を得て上記校訂テクストを用いた5日間のワークショップを人文情報学研究所および大正大学綜合仏教研究所にて開催した。当該ワークショップには、本研究課題関係者に加えて、同文献に関心をもつ多数の研究者の参加を得、テクスト校訂および読解に関する問題点を集中的に議論し、校訂テクストの改善に資する知見を多く得ることができた。なお、2019年度においては、研究代表者および研究分担者がドイツ・ハンブルク大学の研究協力者のもとを訪ね、同地にてテクスト読解のワークショップを開催する。また、テクスト校訂と並行して、アバヤーカラグプタが同文献を著すにあたり参照したと考えられる文献を精査し、その成果の一部を論文として公開した。更に、研究分担者の2名は、アバヤーカラグプタの顕教分野における主要著作『ムニマタアランカーラ』およびアバヤーカラグプタの系譜に連なる学僧ラトナラクシタの著作の校訂研究を行ったほか、後期インド密教の重要聖典である『サルヴァブッダサマーヨーガ』の和訳研究において『アームナーヤマンジャリー』より得られる知見を活用しその成果を公表した。以上の業績は、新出資料である『アームナーヤマンジャリー』の内容を解明するにとどまらず、より広範な文脈においてアバヤーカラグプタがインド仏教史上において占める位置を解明することに資する重要な意義をもつと考えられる。本研究課題において校訂予定の『アームナーヤマンジャリー』第5-8章のうち、分量的に二分の一強にあたる第5,6の2章について基礎的なテクスト校訂およびその内容検討を2018年度中に終えることができた。また、当該文献校訂のための基礎作業の重要な一部である、引用・パラレル文献調査も一通り完了し、その成果を論文として公表することができたほか、アバヤーカラグプタの他著作および彼に連なる学僧の著作の検討も並行して進めることができた。以上から、本研究課題は当初の予定どおり進捗しているものと考えられる。2019年度以降も同様に、『アームナーヤマンジャリー』テクスト校訂を軸として、同書著作の背景および後代への影響の解明を進めてゆく。2019年度は、同書第7,8章の基礎校訂本を作成し、海外研究協力者を含めた研究体制のなかでテクスト校訂の問題点を洗い出し、校訂本の改善を図る。2019年度は、ドイツ・ハンブルク大学において海外研究協力者とともにテクスト読解のワークショップを開催する。2020年度においては、海外研究協力者を招聘、あるいは研究代表者・分担者が海外研究協力者を訪問するかたちで同様のワークショップを開催し、それまでに準備した基礎校訂テクストを再度検討、最終的な校訂テクストの完成を目指す。

また、当該文献校訂のための基礎作業の重要な一部である、引用・パラレル文献調査も一通り完了し、その成果を論文として公表することができたほか、アバヤーカラグプタの他著作および彼に連なる学僧の著作の検討も並行して進めることができた。以上から、本研究課題は当初の予定どおり進捗しているものと考えられる。2019年度以降も同様に、『アームナーヤマンジャリー』テクスト校訂を軸として、同書著作の背景および後代への影響の解明を進めてゆく。2019年度は、同書第7,8章の基礎校訂本を作成し、海外研究協力者を含めた研究体制のなかでテクスト校訂の問題点を洗い出し、校訂本の改善を図る。2019年度は、ドイツ・ハンブルク大学において海外研究協力者とともにテクスト読解のワークショップを開催する。2020年度においては、海外研究協力者を招聘、あるいは研究代表者・分担者が海外研究協力者を訪問するかたちで同様のワークショップを開催し、それまでに準備した基礎校訂テクストを再度検討、最終的な校訂テクストの完成を目指す。研究分担者1名(加納)が、当初予定の出張を中止したことと予定の物品・書籍を購入しなかったことにより同分担者に次年度使用額が発生した。これと2019年度請求分を合算した額653,241円(2019年度分分担470,000+次年度使用額183,241)は、同分担者において、旅費および物品費として使用する。そのおおよその内訳は、海外旅費350,000円、国内旅費150,000円、物品費153,241円とする。
東京女子高等師範学校保育実習科における昭和初期の保育者養成－現存資料からの検討

本研究では、東京女子高等師範学校保育実習科における昭和初期の保育者養成を明らかにするために、昭和9年度に在籍した川上須賀子の残した「保育法」「児童心理」「教育」「修身」「遊戯」の講義ノートを現代語に書き下し検討した。既存の倉橋惣三の「保育法」講義録との比較から、川上ノートの講義内容の再現性の高さが明らかになった。「児童心理」講義についての詳細な検討を行った結果、保育者養成は、附属幼稚園に所属して行う実習と並行して行われたこと、講義は倉橋の充実期のものであり、一般的な児童心理学より自我の発達を重視していたことなどが明らかとなった。その成果を『倉橋惣三「児童心理」講義録を読み解く』として出版した。交付決定に関する打ち合わせにおいて、関係者に全体の研究計画について説明を行い、役割分担の確認を行った。また、卓上スキャナを使い、研究補助者と共に、昭和8年に東京女子師範学校保育実習科に在籍した川上氏が残した全資料のデータ化作業を行った。倉橋惣三の「児童心理」講義録については、研究分担者と共に、学内研究助成で行ったの現代語書き下し文についての再検討を行った。書下し文では判読不能な文字等、不明な点が多かったため、確認作業を継続中である。「児童心理」の講義録は、出版可能な原稿作成を目指しているため、印刷物とプロジェクターで投影したパソコン画面を見ながら、一語一語に検討を加え、少しずつ書き改め作業を行っている。完成原稿作成までには、心理学に関する専門的な助言が必要であるため、次年度以降の課題とする。同時に、「保育」講義録の現代語書き下し作業を外部の専門家に委託した。その成果が得られたため、それ以後は「児童心理」の執筆作業を中断し、「川上ノート」の特徴を把握する目的で、既存の出版物『倉橋惣三「保育」講義録』との比較検討を行った。その結果、出版物との差異がいくつか見つかり、川上ノートの特徴の理解に役立ったと同時に、講義内容についても、新たな知見が得られた。並行して、表現領域を専門とする研究分担者は、当時の保育者養成でどのような「遊戯」の授業が行われていたかを明らかにするため、データ化された資料をもとに、演奏と実際の動きを再現し、映像化を試みた。その結果、2曲について、学生による再現を行うことができた。広角での撮影が可能な機器を用いたが、撮影状況に改善の余地があったため、次年度以降はさらに計画的に映像化を進める予定である。「川上ノート」は6科目の講義録と遊戯等の図版から成るが、今年度は主に、前年度に外部の専門家に書下しを依頼し、成果物を得た倉橋惣三の2つの講義録についての検討を継続した。「保育」講義録については、既刊の『倉橋惣三「保育」講義録』と同じ講義を記録したものであったことから、書下し文を検討する会議を重ね、比較研究を行い、研究代表者と研究分担者が論文にまとめ、『淑徳大学研究紀要第50号』誌上で発表した。その後、「児童心理」検討会を再開し、書下し文では不明だった表記や文意について、プロジェクターで投影しながら、一語ずつ検討し、書き改め作業を行った。また、昨年度再現映像化を試みた「遊戯」の図版については、今年度はさらに研究が進展し、研究分担者が遊戯の音楽教育上の効果を明らかにし、海外の学会で発表を行った。さらに年度末には、幼児教育史上、価値があると考えられる倉橋惣三の「児童心理」講義録の公開方法について、研究代表者・研究分担者・連携研究者4名が集まって会議を行い、出版原稿を作成する方向性を確認した。昨年度データ化した「川上ノート」の現代語書下し作業を今年度中に完了することになっていたが、予定通り、その成果物を得ることができた。また、資料の特性を明らかにするための比較研究も、倉橋惣三の「保育」講義録の書下し文を詳細に検討する会議を重ねることにより、年度内に研究成果を論文として発表することができた。また、昨年度映像化を試みた「遊戯」ついても、新たな研究成果が得られている。「児童心理」の公開方法についても研究代表者・研究分担者・連携研究者が集まり、その方向性について合意することができた。本研究の目的は、発見された史料である昭和9年度に東京女子高等師範学校保育実習科に在籍していた川上須賀子が残した講義ノート(川上ノート)から、昭和初期の保育者養成の姿を明らかにすることであった。それらを手に取れるものにし、保育者養成の在り方の探究に寄与することを目指して、史料の現代語への書下しを行い、研究者間で検討した結果、主に2つの成果が得られた。研究成果の中心は、倉橋惣三の保育者養成に関するものである。既刊の『倉橋惣三「保育法」講義録』との比較研究(27年度)から、川上ノートの史料価値を明らかにすることができ、その相違点からは、倉橋の授業スタイルを推察することができた。また、川上ノート特有の記述からは、比喩を交えた思わず聞き入るような授業であったことが理解された。最終年度は、「児童心理」講義録についての詳細な検討を行い、研究分担者・連携研究者と共に現代語書下し文を読み解き、それぞれの専門分野から出版原稿を作成した。その結果、『倉橋惣三「児童心理」講義録を読み解く』との出版が実現し(平成29年6月1日発刊)、当初の目的である、本史料に関心のある人に研究成果を届けるという目的を果たすことができた。

2つめは、昭和初期の保育者養成における「遊戯」の内容を明らかにできたことである。最終年度には、学会発表においてその史料価値と内容の詳細を明らかにし、現存する楽譜の調査等も行い、その教育的意義を検討した。また、文字とイラストのデータ化を行い、冊子を作成した。さらに現代語書き下しを行ったので、今後公開方法を検討したい。その他の成果として、他教科「教育」「修身」についても、書下し文をデータ化できたことがある。これらの成果物をどのように還元していくかが未定であるが、本史料の存在を示せたことで、今後の幼児教育史研究において活かされる可能性を残した。本研究では、東京女子高等師範学校保育実習科における昭和初期の保育者養成を明らかにするために、昭和9年度に在籍した川上須賀子の残した「保育法」「児童心理」「教育」「修身」「遊戯」の講義ノートを現代語に書き下し検討した。既存の倉橋惣三の「保育法」講義録との比較から、川上ノートの講義内容の再現性の高さが明らかになった。「児童心理」講義についての詳細な検討を行った結果、保育者養成は、附属幼稚園に所属して行う実習と並行して行われたこと、講義は倉橋の充実期のものであり、一般的な児童心理学より自我の発達を重視していたことなどが明らかとなった。その成果を『倉橋惣三「児童心理」講義録を読み解く』として出版した。全資料のデータ化が完了し、現代語への書下し、その検討会の開催、映像化の試行等、26年度に計画した作業と会議は実施することができた。倉橋惣三の「児童心理」講義録の出版原稿を作成する。それぞれの研究者が専門領域をいかした分担執筆を行い、そのなかで、当初から本研究の課題でもある「昭和初期の東京女子高等師範学校保育実習科における保育者養成の姿にも迫っていく。また、最終年度であることから、これまでの研究成果に関して、研究代表者と分担者が学会において発表する。現代語書き下しを行った資料については、詳細にわたる検討がなされていない「修身」「教育」講義録についても、資料として閲覧できるような公開方法を模索する。幼児教育学造形教育学研究はおおむね順調に進んでいるが、「児童心理」の書下し文を公開できる状態に書き改める作業に、予想以上の時間がかかっている。計画では28年度末に完成予定であるが、その実現が課題となっている。どんな完成原稿を目指すか等、方向性を定めるために、専門家を交えた検討会を開催する必要がある。また、引き続き、残された資料の現代語書下し作業を外部の専門家に依頼する。成果報告が1件の学会発表と紀要論文であったため、旅費の支出が予想より少なかった。また、資料検討会議を主に学内研究室で行ったため、経費がかからなかった。専門的知識の供与に対する謝礼は、依頼時期が遅れたため、次年度に必要となる予定である。「保育」講義ノートの現代語書下し作業依頼時に、学内研究助成時の「児童心理」講義ノートのページあたりの文字数で見積もって依頼したが、ページあたりの文字数が少なく、結果的に「その他」の支出が予想より少なくなってしまった。また、作業が短時間で終了したため、人件費が少なく、用品の代金についても、計画時より低かった。原稿作成のための会議費、原稿執筆に必要な図書費、専門的知識の供与を伴う原稿執筆に対する謝礼、書下し文を成果物として公開するための資料作成費用(印刷費含む)、学会での成果発表のための旅費、研究に必要な消耗品などの物品費として使用する計画である。
流体包有物を用いた変成岩上昇速度計の構築

昨年度から引き続き,流体包有物の化学組成をより正確に推定するために,集束イオンビーム(focused ion beam: FIB)を活用した分析手法の開発・改良を行った.Yoshidaet al. (2018)で公表した結果では,包有物の凍結分析に当たって装置内部の幾何学的な問題が発生していたが,本年度それを解決すべく,試料の分析前準備に顕微掘削サンプリング法を導入した.FIBによる顕微掘削サンプリングは透過電子顕微鏡観察などと組み合わせて広く使われている手法であるが,本研究ではこの手法をクライオFIBの前準備に活用した.新しく開発した手法を適用した結果として,分析の際の幾何学的な問題は解消され,エネルギー分散型のX線化学組成分析における妨害元素の影響はほぼ無くなったと言える.一方で,X線散乱のモンテカルロシミュレーションを行った結果,微小すぎる包有物の分析には,固相分析と同様に分析エネルギーを下げる等の工夫が必要であることも示唆された.これらの成果は東北大学で開催された国際シンポジウムWater Dynamics 16や,日本鉱物科学会の年会で公表し,会議参加者と議論を行った.本年度,流体包有物の分析に用いる集束イオンビーム(FIB)の故障が相次ぎ,分析のための十分な時間が取れなかったため,研究期間の延長申請を行った.限られた時間の中での実験・分析ではあったが,クライオFIB分析に対して顕微掘削サンプリングを組み合わせる手法に関しては,現段階までで確立した手法論で概ね問題ないと言える.本研究で確立した手法は,微小包有物の化学組成を可能な限り定量的に分析する手法として,また記載岩石学と密に連携可能な「顕微」分析手法であるため,従来分析が困難であった変成岩中の流体包有物に対して強力なツールとなり得る.それらを踏まえて現在論文投稿の準備中である.クライオFIBと顕微掘削サンプリングを組み合わせた分析手法に関する論文の投稿準備,および実際に確立した手法を天然試料に適用する研究を実施する.昨年度までにスロヴェニアのポホリエ山地,キルギスタンのマクバル岩体などで変成岩試料の採取を行っており,これらの記載岩石学的な研究を進めているところである.本研究で確立した手法を,天然の流体包有物に適用していき,100km以深から深部岩石が上昇してくる際の流体活動について,どのような化学組成の流体が関与しているかを記載する.2016年度は流体包有物の密度による温度圧力計を較正する為に,モデルの精密化と,天然に産する流体包有物の記載手法の改良を行った.流体包有物の密度と岩石の温度圧力史を関連づけたモデルを構築するにあたり,本年度はザクロ石の化学組成変化から温度圧力史を復元する手法の開発と習熟に取り組んだ.天然試料に適用するに当たっての必要なデータの取得も行ったので,今後はこれらの適用と成果公表を行う予定である.一方で,天然に産する流体包有物の記載についても研究を進行させている.本年度は夏にキルギスタンの野外調査を行い,冷たい沈み込み帯で形成された超高圧変成岩試料を採取した.採取した試料中に記載研究に適した流体包有物を発見したため,この試料の記載を進める上で必要となった流体包有物記載手法の改良を実施した.従来の組織観察・融点測定・常温ラマン等の分析手法に加えて,本年度は流体包有物を凍結させた状態での分析(ラマン分光など)にスポットを当てた.結果,常温下の観察・分析では不十分だったデータを補う記載を行うことが出来たため,2017年度の学会発表を予定しているとともに,現在論文を投稿準備中である.また,天然試料の記載の一環として和歌山県・毛原層群に産する変成岩の変成温度見積もりを行った.本地域は従来の研究手法では温度見積もりに困難が伴う変成条件が予想されており,近年発達してきたラマン分光による温度解析手法を適用し,変成温度の地域的な差異を精密に解析した.本成果は論文として公表・印刷済みである.研究計画では流体包有物の密度保存過程のモデル化を本年度の当初目標としていたが,モデル化に当たって克服すべき課題が数点見えてきたところで,課題克服に向けて数理的アプローチを模索している最中である.数理アプローチの模索の最中に,副産物として地下深部流体の化学組成の多変量解析・変成岩の全岩化学組成の多変量解析についてまとまった成果を得ることが出来たため,これらの内容は学会発表を行うとともに,現在論文投稿準備中である.一方で,天然試料の記載研究は,現地側共同研究者の都合がついたためキルギスタンの野外調査を実施することが出来た.従来保有していた研究試料に加えて複数の研究試料を採取することが出来,地理的にもこれまでの研究地域を相補する形での調査を行うことが出来た.採取した試料からは今後の研究目的に適う流体包有物を見いだすことが出来たため,現在記載手法の改良とともに記載岩石学的な研究を進行中である.それらに加えて,和歌山県・毛原層群に産する変成岩の変成温度見積もりを実施し,当該研究地域が従来考えられていた説のうち,三波川変成帯の南方延長ではなく,隣接する御荷鉾帯の東方延長である考えを支持する結果を得,論文として成果公表に至った.以上の成果より,当初目標として初年度と次年度以降の予定の多少の前後はあるものの,本研究の今年度の進捗状況は概ね順調であると言える.本年度は流体包有物の化学組成をより正確に推定するための分析手法開発・改良を行った.

天然に産する流体包有物は,その形成条件・環境により様々な化学組成を取り得るが,その化学組成を測定する手法には未だ限りがある.特に微小包有物に含まれる水流体の溶質を正確に決定する手法は,未だにないと言ってもいい.昨年度より引き続き,キルギスタンで採取した岩石試料に含まれる流体包有物の記載・分析研究を実施した.従来の組織観察・融点測定・常温ラマン等の分析手法に加えて,クライオFIBを用いて凍結させた状態での流体包有物の顕微掘削による露出を行い,走査電子顕微鏡下での化学組成分析を行った結果を,論文としてまとめて投稿し,Yoshida et al. (2018 Geochemical Journal)として出版・印刷された.また,同成果は2017年国際エクロジャイト会議でもポスター発表を行い,会議参加者との議論を行った.この成果では,クライオFIB内部の装置可動範囲等の制約により,流体化学組成の分析は定性的なものにとどまったが,従来の手法では検出の難しかった成分(カリウム)が見られるなど,これまでのは得られていなかった知見を得ると共に,衝突帯に於ける深部流体が普遍的にカリウムを含む可能性を示唆したと言える.更に,クライオFIBを用いた流体包有物の化学分析手法の改良に着手した.Yoshidaet al. (2018)で実施した分析に対して,試料前準備段階を改良することで,流体包有物の定量分析が可能である可能性を見いだし,現在定量性の検証を行っているところである.研究計画では,流体包有物の密度保存過程のモデル構築および天然試料へのモデル適用を本年度の目標としていたが,密度保存過程のモデル化は課題が残っており,解決方法を模索しているところである.天然試料へのモデル適用に先立って,記載研究を推し進める点が順調に進行している.昨年度実施したキルギスタンの野外調査を踏まえて,世界で最も冷たい超高圧変成岩が保持する流体包有物の化学組成を定性的に記載し,論文や国際学会での発表を行うことが出来た.同地域に於ける流体包有物の化学組成報告は初めてであり,この研究をきっかけに冷たい超高圧変成岩の形成過程・上昇過程に於ける流体活動の研究を進行させていきたい.流体包有物の記載を行うに当たって,集束イオンビーム装置を活用出来た点が,従来想定していた以上の成果をもたらしている.流体包有物の化学組成の記載研究には,包有物の小ささが大きな課題であった.微小領域加工技術として発展してきた集束イオンビーム装置はサブミクロン精度での物質加工が可能であり,クライオステージを用いた凍結加工・分析と組み合わせることで従来分析が困難であった微小流体包有物の化学組成を測定可能であることがわかりつつある.本年度は,これまでの知見から予想されていなかった化学組成の流体を見いだしたことを速報的に論文として公表したが,クライオステージと集束イオンビーム装置を用いた流体包有物の分析手法は,引き続き改良と成果公表を行っていく.昨年度から引き続き,流体包有物の化学組成をより正確に推定するために,集束イオンビーム(focused ion beam: FIB)を活用した分析手法の開発・改良を行った.Yoshidaet al. (2018)で公表した結果では,包有物の凍結分析に当たって装置内部の幾何学的な問題が発生していたが,本年度それを解決すべく,試料の分析前準備に顕微掘削サンプリング法を導入した.
ゲノム障壁を支える雌蕊生殖器官形成機構の解析

雌蕊は受粉から受精・胚発生へと到る一連の生殖過程を支える重要な器官である。本研究ではシロイヌナズナにおいてシュート器官の融合・分離と茎頂メリステム形成に働くNAC型転写因子CUC1とCUC2に着目し、生殖を支えるいくつかの重要な構造(胚珠、隔壁、および心皮融合部)の形成メカニズムを明らかにすることを目的とする。平成2223年度において以下の成果を得た。1)CUC1・CUC2の作用機構を明らかにする研究これまでに同定したCUC1・CUC2によって発現が制御される下流遺伝子をcuc1 cuc2二重変異体で強制的に発現させ、変異体の表現型を回復できるかどうかを調べた。その結果、胚発生ではSTM、LAS、BLR、KNAT6の各遺伝子が、CUC1とCUC2の下流で茎頂メリステム形成と子葉分離に中心的な役割を果たすことがわかった。これにより、茎頂分裂組織形成の重要な制御ステップの分子メカニズムが明らかになった。2)雌蕊におけるCUC1・CUC2の発現制御機構の解析CUC1およびCUC2は、発達中の雌蕊向軸側に限定された領域で発現することが分かっていた。そこで、その発現制御機構を明らかにするため、雌蕊形態に異常を示す突然変異体sptおよびcrcにおいて、各遺伝子の発現解析を行った。その結果、いずれの変異体においても、雌蕊の背軸側にCUC1とCUC2の異所的な発現が見られたことから、SPTとCRCがCUCの向軸側特異的な発現に重要な役割を示すことが分かった。さらに、cuc1およびcuc2変異はいずれもspt変異体における心皮の融合不全の表現型が抑制されることから、SPTにおけるCUC遺伝子の発現抑制が、心皮の完全な融合に重要な役割を果たすことも分かった。以上より、心皮融合を制御する遺伝子間相互作用の一端が明らかになった。我々はこれまでに、茎頂分裂組織形成および維持の分子メカニズムについて研究を行い、シロイヌナズナのNAC型転写因子をコードするCUC1およびCUC2遺伝子が、シュート器官の分離と茎頂メリステム形成における主要な調節因子であること明らかにしてきた。そしてその過程でCUC遺伝子が雌蕊発生初期のメリステム様組織である内側隆起の形成を促進し、そこから生じる胚珠、隔壁、および心皮融合部の形成に必須であることを明らかにした。本研究は、CUC遺伝子の内側隆起形成における機能解析を通じて、生殖過程を支える雌蕊生殖器官の形成メカニズムを明らかにすることを目的とする。今年度は、KNOX型転写因子をコードするSTM遺伝子について、cuc1 cuc2二重変異体、CUC1過剰発現体、CUC2過剰発現体における発現を調べたところ、この遺伝子が雌蕊においてもCUC1とCUC2の発現制御を受けていることが明らかになった。またcuc1 cuc2二重変異体の背景でSTM遺伝子を強制的に発現させたところ、雌蕊の表現型が部分的に回復した。以上から、雌蕊形成においてもSTMがCUC1とCUC2の下流で機能することが強く示唆された。また、心皮の融合に異常を示すcrc、sptとcuc1、cuc2との多重変異体の解析から、4遺伝子の相互作用が正常な心皮の発達に重要であることも示した。