hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウシ卵管上皮を構成する分泌細胞の多様性とその分化能

卵管上皮は配偶子・初期胚の輸送を促す繊毛細胞と、初期胚発生に必要な物質を分泌する分泌細胞(非繊毛細胞)から構成され、両細胞の割合は発情周期を通じて変化する。申請者らは、繊毛細胞数が増加するにもかかわらず増殖するのは非繊毛細胞のみであることを明らかにしており、非繊毛細胞が繊毛細胞へと分化することを示唆してきた。卵管と同様に繊毛・非繊毛細胞を有する気管においては、非繊毛細胞には複数のタイプが存在し、その一部の細胞が繊毛細胞に分化することが報告されている。しかし、これまでに卵管において複数の非繊毛細胞の存在は報告がなく、繊毛細胞への分化過程も定かでない。本研究では、卵管上皮細胞の詳細なキャラクタリゼーションを行うことにより、ウシ卵管における非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路を検討した。全ての卵管上皮細胞はPAX8かFOXJ1を発現し、共発現する細胞は存在しなかったが、FOXJ1+細胞中にはAc tubulin+細胞とAc tubulin-細胞が存在した。また非繊毛細胞中にはMYB+/PAX8+またはMYB+/FOXJ1+細胞が存在し、MYB+/Ki67+細胞は認められなかった。Ki67+, MYB+およびFOXJ1+細胞数は卵胞期に増加したため、この時期に細胞増殖と繊毛形成が同時に進行することが示唆された。以上より、卵管上皮細胞は形態学的には繊毛細胞と非繊毛細胞に大別されるが、免疫組織学上非繊毛細胞は複数存在し、ウシ卵管上皮においても非繊毛細胞から繊毛細胞への段階的な分化経路が存在することが示された。繊毛・分泌細胞マーカーならびに、繊毛形成関連因子を用いた、卵管上皮細胞のキャラクタリゼーションを行うことにより、以下のことが明らかとなった。全ての卵管上皮細胞はPAX8かFOXJ1を発現し、共発現する細胞は存在しなかったが、FOXJ1+細胞中にはAc tubulin+細胞とAc tubulin-細胞が存在すること。このことから、非繊毛細胞中にはPAX8+細胞とFOXJ1+/Ac tubulin-細胞が存在することが明らかとなった。Ki67+, MYB+およびFOXJ1+細胞数は卵胞期に増加すること。このことから、卵胞期に細胞増殖と繊毛形成が同時に進行することが示唆された。上記の結果のように当初の計画どおり、ウシ卵管上皮構成細胞のキャラクタリゼーションが完了し、非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路の予測も進んでいることから、おおむね順調に進展していると判断する。これまでの研究から、ウシ卵管上皮には複数の非繊毛細胞が存在すること、並びに卵管上皮構成細胞は、発情周期に合わせて変化することを明らかにしている。さらに、非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路も推測できている。そこで本研究では、非繊毛細胞の繊毛細胞への分化能の検討を培養細胞を用いて行い、実際に予測通りの分化経路を辿っているのかを検討する。ウシ卵管上皮より単離した細胞をAir-liquid interfaceculture法を用いて培養し、これまでの結果より明らかとなった分化経路が実際に生じるかを検討する。繊毛細胞への分化の証明は、免疫細胞染色によるacetylated-α-tubulinタンパク質発現および、走査型顕微鏡での繊毛形成により行う。またこれまでの結果より、細胞分化には生理環境(内分泌および局所因子)が影響していることが考えれられる。そのため、本研究では各発情周期の卵管液およびステロイドホルモンを添加することで生体内を再現し、分化能の検討を行う。

以上より、卵管上皮細胞は形態学的には繊毛細胞と非繊毛細胞に大別されるが、免疫組織学上非繊毛細胞は複数存在し、ウシ卵管上皮においても非繊毛細胞から繊毛細胞への段階的な分化経路が存在することが示された。繊毛・分泌細胞マーカーならびに、繊毛形成関連因子を用いた、卵管上皮細胞のキャラクタリゼーションを行うことにより、以下のことが明らかとなった。全ての卵管上皮細胞はPAX8かFOXJ1を発現し、共発現する細胞は存在しなかったが、FOXJ1+細胞中にはAc tubulin+細胞とAc tubulin-細胞が存在すること。このことから、非繊毛細胞中にはPAX8+細胞とFOXJ1+/Ac tubulin-細胞が存在することが明らかとなった。また非繊毛細胞中にはMYB+/PAX8+またはMYB+/FOXJ1+細胞が存在し、MYB+/Ki67+細胞は認められなかった。Ki67+, MYB+およびFOXJ1+細胞数は卵胞期に増加すること。このことから、卵胞期に細胞増殖と繊毛形成が同時に進行することが示唆された。上記の結果のように当初の計画どおり、ウシ卵管上皮構成細胞のキャラクタリゼーションが完了し、非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路の予測も進んでいることから、おおむね順調に進展していると判断する。これまでの研究から、ウシ卵管上皮には複数の非繊毛細胞が存在すること、並びに卵管上皮構成細胞は、発情周期に合わせて変化することを明らかにしている。さらに、非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路も推測できている。そこで本研究では、非繊毛細胞の繊毛細胞への分化能の検討を培養細胞を用いて行い、実際に予測通りの分化経路を辿っているのかを検討する。ウシ卵管上皮より単離した細胞をAir-liquid interfaceculture法を用いて培養し、これまでの結果より明らかとなった分化経路が実際に生じるかを検討する。繊毛細胞への分化の証明は、免疫細胞染色によるacetylated-α-tubulinタンパク質発現および、走査型顕微鏡での繊毛形成により行う。またこれまでの結果より、細胞分化には生理環境(内分泌および局所因子)が影響していることが考えれられる。そのため、本研究では各発情周期の卵管液およびステロイドホルモンを添加することで生体内を再現し、分化能の検討を行う。
筋シナジー解析に基づくヒト随意運動の多様性と巧みさに関する研究

本研究では、ヒト随意運動において中枢神経系が選択した運動解を身体協応の観点から解析することで、冗長筋骨格系におけるヒトの運動制御・運動学習の解明を試みた。「筋シナジー抽出/予測/解析技術」を運動解析ツールとして用い、筋レベルにおける身体協応の機能を解明し、これに基づく身体運動制御モデルを構築した。また、提案手法を用いて、冗長自由度を有する筋骨格構造体の運動制御法を確立した。【研究の目的】本研究の目的は、ヒト随意運動において中枢神経系が選択した運動解を身体協応(シナジー)の観点から解析することで、冗長筋骨格系におけるヒトの運動制御を解明することである。ここでは、申請者らの有する筋シナジー抽出/予測技術を解析ツールとして用い、筋レベルにおける身体協応の2つの機能(1)パターン共有機能(筋群が互いに協調し同パターンを共有する機能)、(2)誤差補償機能(筋群が互いの誤差を補償し全体を安定化させる機能)を解明し、これに基づく身体運動制御モデルを構築する。また、提案手法を用いて、運動多様性を有する巧みな運動を筋骨格ロボットに実現させることで、その有用性を実証する。本研究は、運動生理学における未解決問題(Bernstein問題)へのチャレンジである。【研究の成果】本年度は、シナジーが持つ「パターン共有機能」(筋群が互いに協調し同パターンを共有する機能)に焦点を当て、その機能解明へ向けて研究を遂行した。具体的には、ヒト随意運動において中枢神経系から筋群へ送られる運動指令(筋電信号)を申請者らの有する「筋シナジー抽出/予測技術」(特許番号第5158824号)を用いて解析することで、筋群協調と生成運動の関係を明らかにした。本課題では、提案するシナジー制御モデルの汎化に焦点を置き、上肢および下肢の様々な運動タスクにおいて、仮説を裏付ける実証実験を行ないモデルの妥当性を検証している。これらの成果は、学術論文誌(3件)および国内外の学会発表(22件)の形でまとめられている。本年度は、シナジーが持つ「誤差補償機能」(筋群が互いの誤差を補償し全体を安定化させる機能)に焦点を当て、その機能解明へ向けて研究を遂行した。具体的には、申請者らの有する「筋シナジー抽出/予測技術」(WO/2011/030781, P5158824)を用いて、様々な環境下におけるヒト随意運動の筋協調解析を行い、運動多様性の観点からヒトの運動制御、運動適応、運動学習のモデル化を行った。また、筋骨格ロボットに提案モデルを実装することで仮説の検証を行った。これらの成果は、学術論文誌(3件)、学会発表(9件)及び特許出願(1件)にまとめられた。また現在、国際会議へ論文(5件)を投稿中である。本研究は、ヒト随意運動において中枢神経系が選択する運動解を身体協応(シナジー)の観点から解析することで、冗長筋骨格系におけるヒトの運動制御の解明を試みるものである。ここでは、シナジーの概念が持つ2つの機能(1パターン共有機能[多数の構成要素を協調させてパターンを共有する機能]、2誤差補償機能[構成要素の相補的な補償効果により全体を安定化する機能])に着目し、個別にアプローチを行う。本年度は、特に、冗長解における選択の自由、「運動多様性」が洗練されるメカニズムの解明に向けて研究を行った。1.運動学習と運動多様性の関係未習熟運動は練習を重ねることによってその技能を向上させることができる。ここでは、健常者の上肢運動を対象に、運動学習過程における筋シナジーの運動多様性を解析することで、その柔軟な適応能力を定量評価し、運動学習と運動多様性の関係を明らかにした。筋シナジー、手先平衡点軌道、手先剛性の3つの運動指標が互いに関係しながら、運動技能が熟達していくことの実験検証に成功している。2.運動再学習と運動多様性の関係運動麻痺は訓練(リハビリテーション)を重ねることによって失われた機能を回復することができる。ここでは、麻痺者の上肢運動を対象に、運動の再学習過程における筋シナジーの運動多様性を解析することで、その柔軟な修復能力を定量評価し、運動再学習と運動多様性の関係を明らかにした。2.5ヶ月のリハビリテーションによって、筋シナジー及び手先剛性の2つの運動指標で回復が見られ、手先平衡点軌道においても完全ではないものの大幅な運動改善が認められた。上記の結果は、シナジーの概念が運動の評価や診断、さらには運動の支援や訓練に有用であることを示している。これらの成果は、学術論文誌(3件)、学会発表(13件)及び特許出願(2件)としてまとめられた。現在のところ、研究を遂行する上で大きな問題を生じていないため。最終年度となる2015年は、上記アプローチに則してこれまでの研究課題をまとめるとともに、各アプローチを超えて互いの成果を繋ぐことで、筋シナジーに基づく冗長筋骨格系の運動制御の体系化を図った。また、提案手法の有用性を示す例として、次の2つの応用を試みた。1.シナジー

制御に基づくヒト運動技能の筋骨格ロボットへの移植健常者の随意運動時(ペダリング運動)の筋活動からシナジーを抽出し、ヒトを模擬した筋骨格ロボットへ実装することで、ヒトと同様な滑らかな運動の再現に成功した。2.シナジー診断に基づく運動学習支援システムの構築脳卒中患者の随意運動時(リーチング運動)の筋活動からシナジーを抽出し、その診断結果に基づき、運動改善へ向けたロボット介入を行う運動学習支援システムを開発した。本システムでは、筋シナジーと密接な関係を持つ手先剛性や平衡点軌道もディスプレイ表示され、患者の視覚フィードバックも利用した運動訓練が可能である。これらの成果は、学術論文誌(2件)、学会発表(10件)、書籍(1件)としてまとめられている。また、関連技術について米国特許(1件)を取得した。本研究では、ヒト随意運動において中枢神経系が選択した運動解を身体協応の観点から解析することで、冗長筋骨格系におけるヒトの運動制御・運動学習の解明を試みた。「筋シナジー抽出/予測/解析技術」を運動解析ツールとして用い、筋レベルにおける身体協応の機能を解明し、これに基づく身体運動制御モデルを構築した。また、提案手法を用いて、冗長自由度を有する筋骨格構造体の運動制御法を確立した。本年度までに得られた成果に基づき、来年度も計画どおり研究を進めていく予定である。最終年度は、個別成果をまとめ、提案概念の体系化を図る。27年度が最終年度であるため、記入しない。ロボット工学現在のところ、研究を遂行する上で大きな問題を生じていないため。現在のところ、研究を遂行する上で大きな問題を生じていないため。運動制御/適応/学習の機序の解明に向けて研究を遂行するにあたり、計測システムの充実よりも、仮説を裏付けるエビデンスの獲得を優先すべきと判断したため。(小課題の順番の入れ替え)27年度が最終年度であるため、記入しない。順番を入れ替えた課題を遂行するために、次年度に既存システムの拡張を図る。本年度で得られた成果を元に、来年度も計画どおり研究を進めていく予定である。特に、シナジーが持つ「誤差補償機能」のより深い理解へ向け、研究を深化させていきたいと考える。今後、シナジー解析を進めていく上で、筋電計測の更なる多チャンネル化が必要である。そこで、多チャンネルテレメータシステムを追加購入し、既存運動計測システムの拡張を図る。研究遂行の過程で、筋電計測の更なる多チャンネル化よりも、運動制御、運動適応、運動学習のモデル化を優先した方が良いと判断したため。(小課題の順番の入れ替え)多チャンネルテレメータシステムを追加購入し、既存運動計測システムの拡張を図る。
都市生活・行政へのかかわり方の研究

実質的な今年度の研究に取組もうとした段階の7月初句、文部省特殊法人たる日本学術振興会より、「南米地域研究連絡センタ-(当時の仮線)の初代センタ-長として就任方に要請があり、本案件に関する研究は中断せざるを得なくなった。研究方担者の清水透氏にも、この旨を伝え了承されている。従って以下の10・キ-ワ-ド、裏面II・研究発表の欄の記述はしない。(以上)実質的な今年度の研究に取組もうとした段階の7月初句、文部省特殊法人たる日本学術振興会より、「南米地域研究連絡センタ-(当時の仮線)の初代センタ-長として就任方に要請があり、本案件に関する研究は中断せざるを得なくなった。(以上)
医療事故防止のための電子カルテのシステム監査手法に関する実証的研究

全国の大学病院を始めとして、すでに多くの医療機関において電子カルテの本格的運用が始まっている。一般に医療機器は第3者機関の監査等の下に、厳格にその品質がコントロールされている。しかしながら、電子カルテなどの医療情報システムの安全性・信頼性についてはその開発者に任せられており、現在のところ、客観的な評価や監査は行われていないという重大な問題がある。そこで、本研究では、1)電子カルテのシステム障害事例を収集、分析する、2)電子カルテに関連した診療行為のインシデント、アクシデントを収集し、その原因を分析する、3)これらのリスク分析に基づき、安全性・信頼性を高めるための電子カルテに対する要求モデルを構築する、4)要求モデルに基づき、実際の電子カルテを評価するためのテストケースを作成し、電子カルテの安全性・信頼性をチェックする診断ツールを作成する、ことを通して、電子カルテのシステム監査手法を確立する目標としている。本研究は下記のとおり、事例の収集、分析、モデルの構築、監査手法の構築の順に行った。1)電子カルテのシステム障害事例の収集、およびそのリスク分析2)電子カルテに関連した診療行為のインシデント、アクシデントの収集、およびそのリスク分析3)リスク分析に基づく、電子カルテの安全性・信頼性の自動診断ツールの作成上記の4項目のうち、平成16年度には、1、および2の事例の収集、分析、および3の安全性・信頼性要求モデルの構築を行った。平成17年度は、平成16年度に構築した要求モデルに基づいて、神戸大学病院の病院情報管理システムを実例として、電子カルテの安全性・信頼性の自動診断ツールのプロトタイプをMicrosoft. Net Visual Studio 2005 C#を用いて作成し、試用し、その有用性を確認した。本研究は、1)電子カルテのシステム障害事例の収集、およびそのリスク分析、2)電子カルテに関連した診療行為のインシデント、アクシデントの収集、およびそのリスク分析、3)リスク分析に基づく、電子カルテに対する安全性・信頼性要求モデルの構築、4)要求モデルに基づく、電子カルテの安全性・信頼性に関する監査チェックシートおよびテストケースの作成、5)電子カルテの安全性・信頼性の自動診断ツールの作成、という手順で行っており、本年度は、1、および2の事例の収集、分析、および3の安全性・信頼性要求モデルの構築を行った。電子カルテのシステム障害事例の収集では、神戸大学病院の電子カルテシステムのログを全てCD, DVDなどのWrite-Onceのメディアに書き出し、障害発生時にはその発生前に遡りリスク分析が可能なシステムを構築した。平成16年9月より12月末までの障害事例は154件であった。これらの事例を原因別に詳細に分析すると同時に、その障害によって影響を受けた診療行為、受ける可能性のあった診療行為、影響の規模(関連する患者数)、影響の危険度(医療事故に繋がる可能性)など、の情報を収集した。これらの情報は、ログのように自動的には収集できず、人手を介して行った。このリスク分析の結果、電子カルテのシステム障害によって、投薬に関連したインシデント7例、注射に関連したインシデント3例、処置に関連したインシデント0例、検査に関連したインシデント12例、などを認めた。これらは、エラーのまま処理が進んでいたとすれば非常に重大な医療事故を引き起こす可能性があったが、全て人手によって引き継いで処理されたため、医療事故とはならなかった。情報システムだけではなく、ヒューマンシステムとの連結によってシステムが滞りなく運用されていることが確認されたが、一方で、内在するリスクについて定量的分析結果を得た。

そこで、本研究では、1)電子カルテのシステム障害事例を収集、分析する、2)電子カルテに関連した診療行為のインシデント、アクシデントを収集し、その原因を分析する、3)これらのリスク分析に基づき、安全性・信頼性を高めるための電子カルテに対する要求モデルを構築する、4)要求モデルに基づき、実際の電子カルテを評価するためのチェックシートおよびテストケースを作成する、5)電子カルテの安全性・信頼性をチェックする診断ツールを作成する、ことを通して、電子カルテのシステム監査手法を確立する目標としている。本研究は下記のとおり、事例の収集、分析、モデルの構築、監査手法の構築の順に行った。1)電子カルテのシステム障害事例の収集、およびそのリスク分析2)電子カルテに関連した診療行為のインシデント、アクシデントの収集、およびそのリスク分析3)リスク分析に基づく、電子カルテに対する安全性・信頼性要求モデルの構築4)要求モデルに基づく、電子カルテの安全性・信頼性に関する監査チェックシート、テストケースの作成5)電子カルテの安全性・信頼性の自動診断ツールの作成上記の5項目のうち、平成16年度には、1、および2の事例の収集、分析、および3の安全性・信頼性要求モデルの構築を行った。本年度は、平成16年度に構築した要求モデルに基づいて、神戸大学病院の病院情報管理システムを実例として、電子カルテの安全性・信頼性に関する監査チェックシートおよびテストケースを作成した。また、電子カルテの安全性・信頼性の自動診断ツールのプロトタイプをMicrosoft.Net Visual Studio 2005 C#を用いて作成し、試用し、その有用性を確認した。
新しい心臓核医学計測および三次元処理解析システムの開発

平成7年度および8年度において放射状左室長軸断層像の開発と心エコー図と心筋SPECTの同時評価の手法の開発を目的に以下の検討を行って成果を得た。1.放射状左室長軸断層像の開発(1)各左室短軸像を作成の後各データに対して左室中心軸位置を原点とする極座標識変換を行い、極座標データから左室中心軸の周りに頭角度で放射状に位置する長軸断層像を再構成する手法を開発した。(2)上記方法を用い心筋局所部位で心筋血流(^<201>T1)あるいは代謝機能(^<123>1-BMIPP)の評価を行い、両者の解離つき虚血心、肥大心で検討した。(3)特に新しい心筋血流製剤である(^<99m>Tc-tetrofosmin、^<99m>-sestamibiを用いて心拍同期心筋SPECTを施行、同時に左室両軸断層像を再構成し、左心機能および壁運動の3次元的評価を行った。2.心エコー図と心筋SPECTの同時評価(1)心エコー図の入射点にポイントソース(テクネチウム)を置き、心エコー図はこの点よりできるだけ正確な長軸像を得る。次いで、長軸像を再構成し、心エコー図と心筋SPECT拡大率を調製して画像を重合させることに成功した。(2)上記手法の妥当性につき心臓ファントムで検討し、かつ虚血性心疾患にて本法の有用性すなわち心筋壁厚と灌流状態の同時評価につき有用性を確認した。平成7年度においては放射状左室長軸断層像の開発と心エコー図と心筋SPECTの同時評価の手法の開発を目的に以下の検討を行いつつある。1.放射状左室長軸断層像の開発(1)各左室短軸像を作成の後各データに対して左室中心軸位置を原点とする極座標変換を行い、極座標データから左室中心軸の周りに等角度で放射状に位置する長軸断層像を再構成する手法を開発した。(2)上記方法を用い心筋局所部位で心筋血流(^<201>Tl)あるいは代謝機能(^<123>I-BMIPP)を評価を行い、両者の解離につき虚血心、肥大心で検討している。(3)とくに新しい心筋血流製剤である^<99>m Tc-tetrofosmin、^<99>m Tc-sestamibiを用いて心拍同期心筋SPECTを施行、同時に左室長軸断層像を再構成し、左心機能の評価を行いつつある。次いで、長軸像を再構成し心エコー図と心筋SPECT拡大率を調整して画像を重合させる。(2)上記手法の妥当性につき心臓ファントムで検討し、かつ虚血性心疾患にて本法の有用性すなわち心筋壁厚と灌流状態につき検討している。(2)上記方法を用い心筋局所部位で心筋血流(^<201>T1)あるいは代謝機能(^<123>I-BMIPP)の評価を行い、両者の解離つき虚血心、肥大心で検討した。(3)特に新しい心筋血流製剤である^<99m>Tc-tetrofosmin、^<99m>-sestamibiを用いて心拍同期心筋SPECTを施行、同時に左室両軸断層像を再構成し、左心機能および壁運動の3次元的評価を行った。2.心エコー図と心筋SPECTの同時評価

(1)心エコー図の入射点にポイントソース(テクネチウム)を置き、心エコー図はこの点よりできるだけ正確な長軸像を得る。次いで、長軸像を最構成し、心エコー図と心筋SPECT拡大率を調整して画像を重合させることに成功した。(2)上記手法の妥当性につき心臓ファントムで検討し、かつ虚血性心疾患にて本法の有用性すなわち心筋壁厚と灌流状態の同時評価につき有用性を確認した。
歴史人口学における人口指標算出およびグラフィック化のためのプログラム開発

1.目的徳川期の宗門改帳は諸外国には存在しない貴重な人口資料であり,日本の歴史人口学には不可欠なものである。しかし,宗門改帳の整理および各種人口指標の算出には多大の労力と時間を必要とする。このような現状に鑑み,本研究は,1)宗門改帳のデータ入力方法の統一化を行い,2)それから各種の人口指標を算出し,3)それを2次元あるいは3次元空間に表現するという3つの目的を持つ。2.調査結果上の3つの目的のうち、本年度は,1)宗門改帳のデータ入力方法,2)どのような人口指標をグラフィック化すれば有効かという2点を中心に調査した。(1)データ入力の方法本年度は3種類(小野方式,川口方式,速水・木下方式)の入力方法を調査した。これらの方法はそれぞれ特徴を持つが,今後,国際日本文化研究センターの小野芳彦氏による方式に集約されていくものと予想される。小野方式では入力エラーを極力少なくするよう様々な工夫がなされ,また人口と世帯に関する情報を同時に入力できるなどの利点を備えている。(2)人口指標のグラフィック化ここでは山形県天童市内の旧山家村の宗門改帳を使い,いくつかの人口指標をグラフィック化し,その有効性を検討した。人口の年齢構成は単純な指標ではあるが,それが3次元に表現されると非常に有用であることが分かった。なぜなら,それから年齢構成だけではなく,史料の信憑性,人口移動や出生についても推察できるからである。今年度の調査を踏まえ,来年度は出生率や死亡率の3次元表現を試み,その有用性を検討したい。
シトクロムP450新規発現法による殺虫剤解毒代謝反応の解明

強力なピレスロイド抵抗性系統であるネッタイイエカ(Culex pipiens quinquefasciatus)のシトクロムP450をバキュロウイスルを用いたウイルスディスプレイ法での発現を試みた。シトクロムP450の配列はクローニングが困難であったが、最終的に、ウイルス作成用のプラスミドを作成した。バキュロウイルスにトランスフェクションして発現させたものの、十分な発現量が得られなかった。必要量を発現のためには、今後の更なる研究が必要であった。ネッタイイエカ(Culex pipiens quinquefasciatus)JPal-per系統の幼虫はピレスロイド系殺虫剤に対して強力な抵抗性系統である。実験室内における淘汰を経て,ピレスロイド系殺虫剤ペルメトリンに対して2500倍の抵抗性(室内感受性系統比)を示している。殺虫剤の抵抗性をもたらす原因はいくつか考えられるが、その中で主要なものは殺虫剤の作用点の変異と解毒代謝である。これまでの成果から解毒代謝に関与する酵素はシトクロムP450であり、このJPal-per系統において複数のP450分子種の関与が示唆されている。P450遺伝子は個体あたり約100種類存在するといわれているが、その中から発現する対象をCyp9m10の他、Cyp4H34、Cyp6Z10の三つとした。発現用バキュロウイルス作成の最初の段階として、これらの遺伝子を配列をJPal-per系統の幼虫から抽出したRNAを逆転写してcDNAを合成した後、PCRを行い大腸菌プラスミドに導入することによりクローニングを試みた。しかし、TOPOイソメラーゼを利用したTAクローニング法では形質転換効率が低いもしくはプラスミドへの導入方向が逆にしか入らない等のため形質転換体が効率良く作成できなかった。そこで、TypeIIs制限酵素を利用するFASTR(fully automated single-tube recombination)およびGibson assembly法を用いて導入の効率化を図った。P450遺伝子は個体あたり約100種類存在するといわれているが、これまでの研究成果から発現する対象をCyp9m10の他、Cyp4H34、Cyp6Z10の三つとし、継続して発現を試みた。配列がクローニングに用いる大腸菌に対して何らかの毒性があるため、通常の方法ではクローニングできなかった。そのためFASTR(fully automated single-tube recombination)およびGibson assembly法を用いて導入の効率化を図った結果、クローニングに成功した。現在、昆虫細胞における発現を継続して試みている。前年度に引き続き、発現ベクターの構築およびウイルスの作成と発現実験を行った。標的としているシトクロムP450は、単体では作用せず補酵素としてP450レダクターゼが必要となる。ネッタイイエカからTotal RNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成した。これを配列確認用のプラスミドに挿入し、大腸菌によるクローニングの後、常法により塩基配列の確認を行い、正常なアミノ酸をコードしているものを選抜した。前年にクローニングしたシトクロムP450の分子種および今年度クローニングしたシトクロムP450レダクターゼを発現バキュロウイルス作成用のプラスミドベクター(Invitrogen社(現Thermo Fisher Scientific社)、pFastBac Dual)にGibson Assembly法を用いて挿入した。プラスミドを大腸菌DH5αを用いてクローニング後、挿入した配列が確認されたコロニーを選抜して液体培養し、ウイルス作成用のプラスミドを得た。このプラスミドを発現用ウイルス作成用の大腸菌菌株であるDH10Bacに形質転換した後、挿入した配列を含むbacmid DNAをPCRにより確認した。Bacmid DNAが確認されたコロニーを液体培養した後、The PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kitを用いて、bacmid DNAを精製した。10% FBSを含むGrace培地で培養したSf9細胞に、作成したbacmid DNAをトランスフェクション試薬(Cellfectin)と共に加え、形質転換した後、72時間培養した。培養液を1000xgの遠心で分画し、その上清を100,000xgで遠心して沈殿を回収し細胞外発芽バキュロウイルスを得た。沈殿を0.5%tween20/PBS溶液懸濁した後、超音波処理を行った後、100,000xgで遠心して、沈殿をTris-HCl緩衝液に懸濁し酵素標品とした。

酵素標品のCO差スペクトルを確認したが、活性体に見られる450nmの吸収極大および失活した酵素に見られる420nm共にはっきりと確認できなかったため、今後の発現条件および酵素標品の回収法の更なる検討が必要である。強力なピレスロイド抵抗性系統であるネッタイイエカ(Culex pipiens quinquefasciatus)のシトクロムP450をバキュロウイスルを用いたウイルスディスプレイ法での発現を試みた。シトクロムP450の配列はクローニングが困難であったが、最終的に、ウイルス作成用のプラスミドを作成した。バキュロウイルスにトランスフェクションして発現させたものの、十分な発現量が得られなかった。必要量を発現のためには、今後の更なる研究が必要であった。クローニングに難航したが、おおむね研究計画の通りに研究を進めている。衛生害虫研究計画の通りに進める。おおむね研究計画の通りに研究を進めている。年度末納品等にかかる支払いが平成27年4月1日以降となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成26年度分についてはほぼ使用済みである。研究計画の通りに進める。上記のとおり。研究費は概ね予定通りに執行された。年度末の精算時に必要となる銀行振り込み手数料等の支払いのため残した。物品費(消耗品)を購入する。主に細胞培養のための培地を購入予定である。
外国語における語彙的誤出力の要因とその予防策―母語の多義性の観点から

本研究では、日本語母語話者が英語学習の過程で産出するエラーの要因を言語学的観点から分析し、その予防策を検討した。本研究では、収集したデータに基づき、とくに3つのケースを試行的に取り上げた。複数形態素-sのエラーは各言語における名詞の種類に対する関心度の違い、助動詞couldのエラーは「できた」の多義性の認識不足と英語への翻訳曖昧性、思考表現I thinkのエラーは個人的見解の表明方法に関する各言語圏での価値観の違いにそれぞれ起因する。結果として、外国語運用において形態素、語、文、文を超える階層まで母語知識が介在し得ることを指摘し、エラーの予防策のひとつとして母語知識の活性化が必要だと論じた。本研究の目的は、英語のエラー要因を日本語の意味(概念)構造の観点から分析し、その予防策を探究することにある。平成27年度はエラー収集・分類、エラー要因分析、エラー予防の指導法の考案・検証というサイクルの構築に注力した。結果として、サイクルの構築に寄与し得る2つのモデルケースを得た。ひとつは「できた」の英語翻訳に関するケースである。「可能」の意味を持つ「できた」は、「潜在可能」なら“could"、「実現可能」なら“was able to"に翻訳される。しかし、分析対象の大学生は「可能」の種類に関わらず“could"を用いる傾向にあった。これは、「できた」が単一形式で「潜在可能」と「実現可能」の意味を持ち、各々が“could"と“was able to"という別形式に対応すること、そして「できた」=“could"という機械的置換が定着していることに起因する。そこで、先述の「可能」の意味的な違いを同学生に教示したところ、“could"と“was able to"の使い分けに改善が認められた。ここから、日本語の意識を活性化させることで英語のエラーを予防することができる可能性を見出した。もうひとつは「と思う」の英語翻訳に関するケースである。分析対象の大学生が記述した英語を観察すると、“I think I will go ..."や“I think I want to go ..."などのように、意味的に冗長な“I think"が見受けられる。これは、「と思う」と“I think"で付加の義務性/随意性に違いがあることに起因しており、各言語における文の容認度に差を生み出す。また、英米文化圏と日本文化圏では好ましいとされる思考表明方法に違いがあり、それが各言語における文の容認度の差につながることもある。ここから、英語のエラー要因は言語レベルから文化レベルまで広範にわたるという実態を突き止めた。本研究の進捗はやや遅れている。原因は2つある。ひとつの原因は、データの収集・分類がスムーズに進まなかったことにある。英語のエラーは多様性に富み、分析対象が豊かであるため、今後の研究の推進に期待を持つことはできる。しかし、同時に、その多様性がデータの「まとまり」を捕捉することを妨げており、「まとまり」と呼ぶことができるデータを収集・分類するまでにかなりの時間を要した。平成27年度で扱ったケースが「できた(could)」と「と思う(I think)」の2つに留まったのは、そのためである。もうひとつ原因は、指導法の考案・検証のハードルが想定以上に高かったことにある。英語のエラーが生じる要因は、たとえば「できた(could)」のケースのように、言語学および第二言語習得論に帰せられる場合もあれば、「と思う(I think)」のケースのように、異文化理解に帰せられる場合もある。とくに後者のケースは言語レベルを超えた指導が必要になるという点で、指導法を考案・検証するまでの道のりが険しいと予測される。また、前者のケースのような言語レベルの指導であっても、たとえば実験参加者の能力や人数を均等にするために周到な設計・準備が必要となり、所属機関内で検証条件を整えるためにかなりのリソースが割かれた。そのため、研究発表・論文執筆等を年度後半に先延ばしせざるを得なかった。以上の状況から、平成27年度は本研究の目的であるエラー収集・分類、エラー要因分析、エラー予防の指導法の考案・検証というサイクルの構築に寄与し得る研究を着実に遂行することはできたものの、進捗は想定よりも遅れている。本研究の目的は、外国語学習者(とくに英語を学習する日本人大学生)が産出するエラーを、おもに英語学と日本語学の観点から分析し、その予防策を探究することにある。本研究は1エラーの収集・分類、2エラーの要因分析、3エラー予防の指導法の考案・検証というサイクルの構築を目標としているが、平成28年度の研究はとくに2に注力した。というのも、少なくとも言語学的観点からすれば、エラーの要因は当初の想定よりも根が深く、複雑に入り組んでいるということが判明したからである。平成28年度ではまず、前年度の研究で問題提起した“I think"に関するエラーを詳細に分析した。結果として、「と思う」から“I think"への翻訳に容認度の差が見受けられることから「と思う」には翻訳曖昧性の問題が関与すること、「と思う」の付加条件は複雑だが母語ゆえに意識されにくいこと、「と思う」と“I think"は用法が近似しつつも付加条件に違いが認められること、そしてそこに思考表明方法に関する日英の価値観の違いが絡み合いエラーに至ることを明らかにした。次に、平成28年度では新たに、複数形態素“-s"に関するエラーに分析の手を広げた。

従来の第二言語習得研究で“-s"は比較的早い段階で習得されると言われてきたが、分析対象の大学生が記述した英語では“three school"や“many user"など“-s"の欠落が珍しくない。これは、日本語の複数性を表す文法的手続きが名詞の種類に依拠し随意的であるのに対し、英語では、その手続きがもっぱら名詞の可算性に依拠し義務的であるからであり、その違いがエラーにつながっている可能性を明らかにした。以上の分析から、本研究は無意識的な母語知識が形態素(-s)から語(could)、文、そして文を超える階層(I think)にまで根を張り、外国語のエラーを引き起こしている可能性を明らかにした。本研究の進捗はやや遅れている。というのも、「研究実績の概要」で述べたように、“I think"と複数形態素“-s"のエラー分析に当初の想定よりも多くの時間を要したからである。詳述すると、平成27年度で扱った“could"のエラーは、翻訳対応関係にある「できた」との意味的差異を主な要因とするため、概ね意味レベルで捉えることができる問題と言える。そのため、エラー分析から予防策の考案・検証への移行は円滑であった。これに対して、平成28年度で扱った“I think"や複数形態素“-s"のエラーは一筋縄ではいかない。“I think"のエラーは、意味レベルだけで捉えることが困難な問題である。“I think"のエラーには翻訳対応関係にある「と思う」との付加条件の違いと、思考表明方法に関する日英の価値観の違いが関与する。こうした言外の要因は意味レベルの要因に比べて複雑に入り組んでおり、相応して解明に時間を要した。また、複数形態素“-s"のエラーは、日本語ではその付加が随意的であり、随意性のレベルも異なるため、その仕組みを解明するまでに想定外の時間を要した。また、これらのエラーは、その要因の複雑さに相応して、予防策の考案・検証にも多くの時間を要すると予測される。以上の状況から、“could"のエラー分析に要した時間を根拠に“I think"と複数形態素“-s"のエラー分析に要する時間を確保したものの、それらの要因が想定以上に複雑であったため、確保した時間に分析が割り込む形となり、進捗の遅れにつながったと考えられる。したがって、本研究の目標である1エラーの収集・分類、2エラーの要因分析、3エラー予防の指導法の考案・検証というサイクルの構築の観点からすれば、1と2については一定の進捗が認められるものの、平成28年度はとくに2に多くの時間を要したため、結果として3の進捗が遅れることになった。本研究では、外国語学習者(とくに英語を学習する日本人大学生)が産出するエラーをおもに英語学と日本語学の両面から分析し、その予防策を探究してきた。平成27年度および平成28年度の研究で、エラーの要因が想定していた以上に根深く、複雑に入り組んでいることが明らかになったため、本来の目標であった1エラーの収集・分類、2エラーの要因分析、3エラー予防の指導法の考案・検証というサイクルの構築に先立ち、1と2に注力すべきとの判断に至った。これにあたり、平成29年度ではとくに以下の2つの取り組みに注力した。まず、前年度までの研究をここで一度、俯瞰的に振り返ることで、エラーの分類に基づく研究のロードマップの構築を試みた。
大脳メタ記憶神経回路の解明：光遺伝学による内省の因果的制御

第1に、まず、サルに遂行可能なメタ記憶課題(確信度判定課題:自分の記憶がどの程度正しいか、に関する自己の確信の程度を問うメタ認知課題。非言語的報告が可能)を開発してメタ記憶がヒト固有の能力ではないことを実証した。そして、fMRI法と薬理学的な大脳局所不活性化法を用いて、記憶内容そのものの処理と独立したメタ記憶中枢が大脳前頭葉(9野)に存在することを発見した。ソクラテスの唱えた「無知の知」に代表されるような、自分自身が経験したことのない出来事に対してメタ認知評価を行う心のはたらき(メタ記憶機能の中でも特に高度な心的機能と考えられる)について、このメタ記憶課題を用いて、サルが未経験の出来事に対して確信度判断を行いうることを実証し、大脳皮質前頭葉のうちでも最前方に位置する前頭極(10野)が、未経験の出来事への確信度判断の生成に因果的に寄与していることを発見した。第2に、目にした物体を見慣れているか否かという主観的判断がどのようにして大脳側頭葉の神経回路によって計算されるかを、レーザー光照射により側頭葉嗅周野記憶細胞の活動を選択的に活性化する光遺伝学的方法を用いることによって明らかにした。嗅周野ニューロンの活動が増加して“記憶にある"という情報の総和がある一定の閾値を超えることで『なじみ深い』という印象が生成される、との親近性/新奇性判断の神経情報処理モデルを導いた。更に、複数脳領域からの同時神経活動計測によって領野間のシグナル伝達回路とそれがtarget領域内の神経情報処理に与えるインパクトを明らかにした。第1のサルを被験者としたメタ記憶大脳神経回路解析については、進化的に最も新しい大脳領域である前頭極に「無知の知」に特化した神経基盤が存在することを明らかにしたことは予想以上の進捗であった(Miyamoto et al., Neuron 97, 980-989, 2018)。第2の記憶実行システム回路解析についても、上記のように大きな進捗があった(Tamura et al., Science 357, 687-692, 2017)。サルを被験者とした認知課題において、光遺伝学的方法によって行動上の大きな変容をもたらすことに成功したこの成果は、世界をリードする先進的なものであり、予想以上の進捗であると評価できる。これらの成果をまとめた総説を準備中である(Miyashita, Nature Rev. Neurosci., in revision, 2019)。第一に、サルを被験者とした大脳記憶大域神経回路解析を進める。ことに従来計測されていなかった報酬獲得時におけるメタ記憶信号の解析を進める。この試みにおいては、報酬信号自体との分離が克服すべき課題となっている。また、複数脳領域からの同時神経活動計測を推進して、論文発表までもっていきたい。更に、光遺伝学的実験に関して抑制性介入の基礎実験を引き続き追及する。バイラスによって導入された光遺伝学素子ArchTによる抑制作用における赤色シフト刺激の有効性確立を目指す。594nmレーザー光が、大脳皮質内のHb/HbO2による減衰を受けにくいことを立証したい。第二に、サルを用いた実験の成果をヒト被験者を対象とした更に複雑な認知課題に拡張するプロジェクトを昨年度に引き続き進める。ヒトを被験者とする場合は介入実験手法として磁気刺激法が有効であるので、この実験システムの有効性を確立された行動パラダイムで確認するとともに、臨床データにタグ付けされた被験者群で解析を行い、ヒト脳高次機能の個人特性の身体的起源を追求したい。

第2の記憶実行システム回路解析についても、上記のように大きな進捗があった(Tamura et al., Science 357, 687-692, 2017)。サルを被験者とした認知課題において、光遺伝学的方法によって行動上の大きな変容をもたらすことに成功したこの成果は、世界をリードする先進的なものであり、予想以上の進捗であると評価できる。これらの成果をまとめた総説を準備中である(Miyashita, Nature Rev. Neurosci., in revision, 2019)。第一に、サルを被験者とした大脳記憶大域神経回路解析を進める。ことに従来計測されていなかった報酬獲得時におけるメタ記憶信号の解析を進める。この試みにおいては、報酬信号自体との分離が克服すべき課題となっている。また、複数脳領域からの同時神経活動計測を推進して、論文発表までもっていきたい。更に、光遺伝学的実験に関して抑制性介入の基礎実験を引き続き追及する。バイラスによって導入された光遺伝学素子ArchTによる抑制作用における赤色シフト刺激の有効性確立を目指す。594nmレーザー光が、大脳皮質内のHb/HbO2による減衰を受けにくいことを立証したい。第二に、サルを用いた実験の成果をヒト被験者を対象とした更に複雑な認知課題に拡張するプロジェクトを昨年度に引き続き進める。ヒトを被験者とする場合は介入実験手法として磁気刺激法が有効であるので、この実験システムの有効性を確立された行動パラダイムで確認するとともに、臨床データにタグ付けされた被験者群で解析を行い、ヒト脳高次機能の個人特性の身体的起源を追求したい。
フイブリノゲン非構造領域とＮ結合糖鎖によるフイブリンゲル形成の制御機構の解明

血液凝固の主要因子であるフィブリノゲンがフィブリンゲルを形成するメカニズムの詳細を明らかにすることを目的として、Bβ鎖N末端領域66残基(BβN)の役割に注目して研究を行った。BβNがフィブリノゲン末端D領域と相互作用することがフィブリン凝集・ゲル化において重要な役割を果たしていること、その中心となるのはBβ44Arg周辺部位の可動性の高い非構造領域、中でもBβ44Argが相互作用に必須の役割を果たしていることがSPR測定により示唆された。N結合複合糖鎖は、BβNのD領域との相互作用に対して阻害的に影響することにより、プロトフィブリルのラテラル集合の抑制因子として作用することが示唆された。本年度は、1Fbg断片試料間の相互作用解析と2変異体試料の調製、を当初計画としていたが、前者に集中して研究を行った。後者については調製プロトコルの最終的確立に向け研究を進めている。Fibrin重合におけるBβ鎖N末端領域の役割を解明するため、遺伝子工学的にBβ鎖N末端領域Fragment(BβN)を作製し、SPRによるBβNの相互作用の検討、ならびに濁度測定を用いたBβNの添加によるFibrin重合過程の特性解析を行った。SPR測定の結果、BβNおよびFragment NDSKとFragment D(Frag-D)が濃度依存的に相互作用すること、E領域の中でも特にβNとFrag-Dとの相互作用が認められ、Fibrin重合におけるBβNとD領域の相互作用の関与が確かめられた。濁度測定の結果、B:b相互作用とは別に、D領域に対するBβNの相互作用がラテラル凝集に関与していることが示された。BβNおよびBβNからFpBを切除したβNの添加により同様の阻害効果が見られ、BβNの中でも特にB knob以外の部位での相互作用が明らかとなった。また、BβNの二量体の(BβN)2、(βN)2の添加効果の解析から、BβNがD領域と直接相互作用していることが示された。以上より、ラテラル凝集におけるBβ鎖N末端領域の相互作用の重要性、ならびにβ鎖N末端領域とD領域との相互作用がFibrin重合に大きく寄与していること、この相互作用がFibrin線維形成の実質的な因子となっていることが示唆された。また、Bβ鎖N末端領域のD領域との相互作用が実現されるためには、Protofibrilの生成によるD領域のコンフォメーション変化が必要であることから、Fibrin重合がProtofibrilの生成・成長とそれに引き続くラテラル凝集という2段階のプロセスで進行することが裏付けられた。本年度の当初計画は、(1)種々の断片試料の調製とインタクトフィブリノゲン(Fbg)との混合系での凝集特性の解析、(2)変異導入部位の探索と変異体試料の調製としていた。(2)の調製については、CHO細胞を用いて作製する予定としていたが、より簡便で効率的な方法としてバキュロウイルスー昆虫細胞発現系を用いた調製を並行して進めることとした。そこで本年度は、変異導入の候補部位の探索・基礎情報の収集を先行させた。そのために、静電相互作用の関与を検討するために、種々の塩濃度条件で、糖鎖切除、シアル酸切除Fbgの凝集特性、シアル酸の添加効果の解析を進めた。その結果、インタクトFbgでは顕著な凝集の抑制・遅延、とりわけラテラル凝集の抑制が起こる高塩濃度下でも、糖鎖・シアル酸の切除は顕著なラテラル凝集の促進をもたらし、プロトフィブリルの成長からラテラル凝集への移行に糖鎖、なかでも末端シアル酸が関与し、調節していることがわかり、糖鎖の関係する部位との相互作用は特異性を持ったものであり、、静電相互作用の寄与はマイナーであることがわかった。シアル酸とそれに続くガラクトースの両方の切除がシアル酸のみの切除と同等の効果を持つことから、糖鎖の特異的な相互作用には糖鎖末端のシアル酸の構造を認識する部分がFbg分子中央部に存在し、ラテラル凝集を担うと予想されるBβ鎖N端部のリリースを制御していることが示唆され、変異導入部位についての重要な情報が得られた。また(1)については、αC鎖断片試料、Bβ鎖N端部断片試料の調製に加えて、Fbg分子中央部を切り出したNDSK断片、N結合糖鎖を含む糖ペプチド断片試料の調製に成功した。特に、Bβ鎖N端部はFbgのD領域と相互作用することがSPR測定で認められ、糖鎖によるラテラル凝集への移行の調節メカニズムについての重要な知見を得ることができた。

本年度は研究計画期間の最終年度であり、昨年度に大きな進展のあったフィブリノゲン(Fbg)断片試料間の相互作用解析の成果を更に発展させるべく、Fbg Bβ鎖N末端領域(Bβ1-66、BβNと略記)、ならびにN結合糖鎖に着目して研究を進めた。BβN及びN結合糖鎖の役割の解明を目指し、遺伝β子工学的手法を用いてBβN、変異型BβNを調製した。変異の導入については、Bβ42周辺に塩基性アミノ酸が局在していることからR42A、R44Aを考え、コントロールとしてBβ1-30、ならびにK53,54Aを作製することとした。相互作用解析のリガンドとしてはβFbg、Fragment-X、ならびにFragment-Dを用いた。表面プラズモン共鳴測定から解離平衡定数を決定した。その結果、BβN、R42A、K53,54Aの3者ともに上記リガンドと高い強度の相互作用を示すことが確認されたが、Bβ1-30とR44Aではいずれのリガンドとも相互作用が見られなかった。従ってBβNの相互作用にはBβ44R周辺部位の立体構造が重要な役割を果たしていることがわかった。Bβ1-30ではBβ44R周辺領域を欠損しているため、相互作用が現れなかったものと考えられる。Bβ44R周辺部位の2次構造予測から、この付近は構造を持たないことを考えると、Bβ44R周辺部位の可動性の高い非構造領域、その中でもR44が、FbgのD領域との相互作用に必須な役割を果たしていることが示唆された。一方、N結合糖鎖については、Fbg中央部に対応するFragment-NDSKとは相互作用しないが、Fragment-Dとは相互作用することがわかった。これらのことから、N結合糖鎖はBβNのD領域との相互作用を阻害的に影響することによりプロトフィブリルのラテラル凝集の抑制因子として作用することが示唆された。化学当初計画の1に関しては、前年度のSPRによる前実験を再現するだけでなく、より明確な結果が得られたと同時に、その結果と整合する濁度測定の結果も得られ、ラテラル凝集におけるBβ鎖N末端領域の相互作用の重要性、Bβ鎖N末端領域とD領域との相互作用がFibrin重合に大きく寄与していること、そしてこの相互作用がFibrin線維形成の実質的な因子となっていることが分かった。また、Bβ鎖N末端領域とインタクトのFibrinogen分子との混合系では凝集が認められず、Bβ鎖N末端領域のD領域との相互作用が実現されるためには、Protofibrilの生成によりD領域のコンフォメーション変化が惹起される必要があることが示唆された。この結果、Fibrin重合がProtofibrilの生成・成長とそれに引き続くラテラル凝集という2段階のプロセスで進行することが示され、Fibrin重合メカニズムの解明にとって極めて重要な知見が得られ、1の計画は十分に目的を達成できたと考えられる。一方、当初計画の2については、リシルエンドペプチダーゼを用いたN結合糖鎖の単離調製を進めFbg断片試料とのSPRを用いた相互作用解析を行う段階となっており、Fbg重合に果たす糖鎖の役割の解明につながると期待できる。この糖ペプチドフラグメントが非常に吸着しやすいため、精製純度を高め、SPR測定の改良を現在進めている。全長型のFbg試料の調製については、25年度の研究で1のテーマに注力したため少し足踏みしているが、Mimic SF9細胞系での26年度での完了を目指している。以上のことから、当初の計画に対して、おおむね順調に進んでいると判断した。本年度の当初計画は、(1)種々の断片試料の調製とインタクトフィブリノゲン(Fbg)との混合系での凝集特性の解析と(2)変異導入部位の探索と変異体試料の調製を予定していた。(1)のうちのαC鎖
雌性配偶子形成におけるアルギニル化の機能の解明

アルギニル化は、アルギニン転移酵素(ATE1)のはたらきによって、タンパク質にアルギニンがペプチド結合する翻訳後修飾である。Ate1ノックアウトマウスが致死であることから、アルギニル化が個体発生に必須であることは明らかである。また、コンディショナルノックアウトマウスの解析から、正常な生殖能力にアルギニル化が必要であることも示されているが、雌性配偶子の形成におけるアルギニル化の役割についてはこれまでに報告が皆無である。本研究の目的は、細胞骨格タンパク質とそのアルギニル化が減数分裂時の紡錘体形成や染色体分配をどのように制御しているのか、さらにはその他のタンパク質のアルギニル化が配偶子形成にどのように関与しているのかを調べることで、雌性配偶子形成のメカニズムの一端を明らかにし、動物生産や生殖医療に貢献する成果を得ることである。もし減数分裂における主要タンパク質の機能がアルギニル化により制御されているのであれば、アルギニル化を人為的に制御することで雌性配偶子の形成およびその発生能を向上させる可能性を提示することができる。このように、本研究は、これまでにない視点から配偶子形成のメカニズムに迫り、動物生産や生殖医療への貢献を目指すものである。本研究の遂行にあたり、加齢マウス、アルギニン転移酵素ノックアウトマウスおよびコンディショナルノックアウトマウスを使用する必要があるので、平成30年度からそれらの導入を進めている。また、始原生殖細胞からの生殖細胞の体外作製も必要となるので、その実験系の立ち上げも行なっている。加齢マウス卵子においては、免疫染色によるアルギニン転移酵素の発現解析を始めている。平成30年度は、本研究の遂行に必要なマウス系統の導入を進めるとともに、当研究室において確立されていなかった技術である始原生殖細胞からの生殖細胞の体外作製の立ち上げを行なった。この期間は当初から考えられた準備期間であり、平成31年度にはこれらの準備が完了し、予定していた実験を進めることが可能である。加齢マウスについては、解析の一部をスタートさせている。平成31年度は、加齢マウスおよびアルギニン転移酵素ノックアウトマウスを用いて、以下のように研究を進める。加齢マウス卵子および卵巣におけるアルギニン転移酵素の発現を若齢マウスと比較する。また、加齢マウス卵子の体外成熟を試みる。さらには、アルギニン転移酵素を導入することにより加齢マウス卵子の質が向上するかを調べる。アルギニン転移酵素ノックアウトマウス胎子由来の始原生殖細胞を卵子に至るまで体外培養し、その過程における表現型の有無を調べ、表現型がみとめられた場合は、アルギニン転移酵素を導入することによりその表現型がレスキューされるかを調べる。