hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ユニバーサルＴＤＭとグローバルメタボロミクスによる高精度薬物治療管理法

モデル薬物としてフェニトインを用い、同位体ピークの強度をプロットして直線性を調べたところ、1万倍以上では飽和が認められ、各同位体の直線の傾きも異なることが判った。そこで、内標準物質を用いてピーク面積比をプロットしたところ、直線の範囲は10万倍まで拡がり、傾きもほぼ等しくなった。しかしながら、ピーク強度の飽和はイオン化の飽和によることが示唆され、同位体ピークを用いても、定量範囲は10万倍程度が限界であることが判った。以上の結果をもとに、がん化学療法レジメンに用いる全薬物および代謝物の一斉分析法を構築した。前年度の結果から、直線性の飽和にはイオン化の飽和が関与していることが示唆された。そこで、まず200 pg/mL200 μg/mLの範囲でフェニトインの希釈系列を調製し、直線性を調べた。SRMのトランジションには、m/z 251→m/z 102、m/z 252→m/z 102、m/z 252→m/z 103、m/z 253→m/z 102、m/z 253→m/z 103、m/z 253→m/z 104を用い、各トランジションにおけるピーク面積比をプロットした。このときのプロトン付加分子の強度を比較すると、m/z 251を100としたときの相対強度は、それぞれm/z 252が16.9、m/z 253が1.67であった。しかしながら、200 pg/mL20 μg/mLの範囲ではいずれもR2=0.999以上の良好な直線性を示したものの、その10倍ではいずれのトランジションでも飽和した。以上の結果から、同位体ピークを用いて広範な直線性を確保することは難しく、ユニバーサルTDMを達成するには、別の手段が必要であることが判明した。次に、がん化学療法レジメンで用いられる薬物の一斉分析法の構築を試みた。モデルとして用いたレジメンでは、抗がん薬であるシスプラチンの血中濃度が0.25 μg/mL程度になるが、併用されるアプレピタント、グラニセトロン、メトクロプラミド、デキサメタゾン、フロセミドがそれぞれ0.033 μg/mL、0.250 ng/mL、3500 ng/mL、0.25 μg/mL、0.15 μg/mLと予想され、物性も大きく異なる。誘導体化、ポジネガスイッチングを駆使して分析法を検討し、すべての薬物の同時分析に成功した。しかしながら、イオン化の飽和と思われる現象により、分析法の信頼性を確保できていない。現在、分析条件の最適化により、課題の解決を試みている。モデル薬物としてフェニトインを用い、注入量0.1pg1μgの10000000倍の範囲で直線性を調べた。ESI法を用い、Q1-scanモードでフローインジェクション分析したところ、[M+H]+に相当するm/z251において、10pg10ngの1000倍の範囲で直線性が確保されたものの、それ以上ではピーク強度の飽和が認められた。同位体ピークであるm/z252の場合は、10pg100ngの10000倍の範囲で直線性が認められたものの、それ以上では同様に飽和することが判明した。また、+2、+3の同位体の場合は明らかに直線の傾きも異なり、ピーク強度の飽和にはイオン化の飽和が影響している可能性が考えられた。そこで次に、ISとしてN-desalkylflurazepamを用いてピーク面積比をプロットした。その結果、先と同様にピーク強度に飽和が認められるものの、同時にイオン化されるISにも飽和が認められるために直線性を確保できる範囲が広くなり、m/z252では10pgから100ngの10000の範囲をカバーでき、m/z253やm/z254では1μgまでカバーできる可能性が示唆され、しかもそれらの直線の傾きがほぼ等しくなることが判明した。このことから、同位体を用いた直線を複数組み合わせることで、極めて広範な濃度域をカバーできる可能性が示唆された。また、オンラインで除タンパク可能な前処理カラムを組み込み、物性の大きく異なる化合物を一斉に分析可能なカラムスイッチングシステムを用い、グローバルメタボロミクスの測定系を構築した。これまでの検討からMass++やMass Bankを組み合わせることにより定量と定性が可能であるうえ、多変量解析により群特異的なマーカー分子を抽出可能であることが明らかとなった。ピーク強度の飽和現象が、イオン化によるものか、あるいは検出によるものかを判断するため、分析ごとの同位体比率を精査したことから、当初の予定よりも時間を要した。

また、当初、プロトン化分子に加えて+1および+2の同位体ピークを用いて100万倍の直線性を確保することを考えていたが、モデル化合物による検討ではそれらの同位体に加えて+3、+4まで用いるとより広範囲をカバーできることが示唆されたことから、解析がより複雑化し、多種類の化合物を用いた検証実験に至らなかった。一方、グローバルメタボロミクスの系を構築するうえで、量的変動を把握することが不可欠であり、当初予定になかった各種ソフトウエアの評価を実施したために進捗が遅れた。これまでの検討から、フローインジェクション分析ではバックグラウンドとの分離が不十分であることから、直線性の評価が困難となる場合があった。そのためカラム分離が必要となるが、その場合はISとして安定同位元素標識体を用いなければならない。そこで、当初は100種程度の薬物を用いることを計画していたが、数を絞ってアイデアの検証を加速する。また、これまでに構築したシステムにヒト血液あるいは尿試料を注入し、精密質量分析の可能なイオントラップ-TOF型のマシンを用いて分析してメタボロームインデックスを作成する。健常人と患者検体の分析結果を比較し、副作用関連マーカー候補分子を見出し、ユニバーサルTDMとグローバルメタボロミクスを組み合わせた薬物治療管理法を構築する。該当なし
宿主誘導抵抗性反応における植物病原菌のサリチル酸分解NahG様遺伝子の機能解明

サリチル酸は、病害抵抗性誘導のメッセンジャー分子となっているが、植物病原菌を含め多くの糸状菌がサリチル酸分解NhaG様遺伝子をもっていた。本遺伝子の機能を解析するために、アカパンカビのNcNahG遺伝子の破壊株を作出し、サルチル酸およびその誘導体に対する感受性を比較したが、野生株と顕著な差が認められなかった。サルチル酸誘導体SHAMがシアン耐性呼吸の阻害剤であることから、農業用殺菌剤アゾキシストロビン(QoI剤)で誘導されるシアン耐性呼吸に対する影響を調べたが、野生株と破壊株間に顕著な差は認められなかった。また、イネいもち病菌のNahG様遺伝子は、EST解析から感染器官である付着器で発現していることが示唆された。そこで、NahGプロモーター-GFP遺伝子をもつイネいもち病菌の形質転換体を作成し、NahG遺伝子発現を共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。その結果、GFP蛍光は付着器のみでなく菌糸にも認められた。だたし、その蛍光は対照としてもちいたIMRプロモーターGFPと比較して明らかに弱く、遺伝子の発現量は低いと推定された。さらに、イネいもち病菌のNahG遺伝子のcDNAを大腸菌で大量発現させたが、可溶化が困難で充分の酵素を調整できなかった。尿素処理により一部可溶化した酵素溶液を使用してサルチル酸からカテコールへの変換活性を調べたが活性を検出できなかった。以上の結果から、糸状菌のNahG様遺伝子産物は、糸状菌には一般に存在することから、芳香族化合物を資化する活性をもつと推定されるが、サルチル酸を基質とする可能性は低いと考えられた。本研究において糸状菌がもつNahG様遺伝子の機能を特定することはできなかったが、研究過程でサルチル酸がその誘導体SHAMと同様にシアン耐性呼吸の阻害活性を有していることが明らかになり、植物の抵抗性誘導とシアン耐性呼吸との関連が示唆された。サリチル酸は、病害抵抗性誘導のメッセンジャー分子となっていることが判明しており、細菌由来のサリチル酸分解NahG遺伝子を植物に導入すると、病害感染による抵抗性反応が消失する。このNahG遺伝子は特定の細菌のみがもつと思われていたが、糸状菌のゲノム情報から、植物病原菌であるイネいもち病菌やフザリウム病菌をはじめとする糸状菌にNahG様遺伝子が複数存在することが判明した。糸状菌のもつNahG様遺伝子の機能解析と植物病原性との関連を解析するため、NahG様遺伝子がゲノム上に1種類と思われるアカパンカビを用いて、NcNahG遺伝子の破壊株をRIP法により作出した。得られたNcNahG破壊株は、NahG遺伝子上流に終止コドン変異を含め多数の変異が存在したことから、null株であると推定された。NcNahG破壊株は、菌糸生育や形態形成に異常は認められず、サリチル酸に対する感受性も野生株を同等であった。イネいもち病菌には、2種類のNahG様遺伝子が存在したが、そのうちの1種類が感染器官である付着器で発現している可能性がEST解析から示唆されている。そこで、イネいもち病菌の2種類のMgNahG1およびMgNahG2遺伝子の発現解析をおこなうため、プロモーターに蛍光蛋白質GFP遺伝子を融合したキメラ遺伝子を作成した。作成したNahGプロモーター-GFP遺伝子をイネいもち病菌に形質転換し、形質転換体を単離した。また、MgNahG遺伝子産物の生化学的な解析をおこなうために、cDNAをクローン化し、大腸菌の発現ベクターを作成した。形質転換大腸菌は、MgNahG産物を生産していることを確認した。今後この形質転換体を用いて、糸状菌のNahG遺伝子の機能を解明する。

本研究において糸状菌がもつNahG様遺伝子の機能を特定することはできなかったが、研究過程でサルチル酸がその誘導体SHAMと同様にシアン耐性呼吸の阻害活性を有していることが明らかになり、植物の抵抗性誘導とシアン耐性呼吸との関連が示唆された。
Reverse geneticsを用いたニパウイルスの病原性発現機構の解析

我々はニパウイルスの強力な解析手段となるreverse genetics系を世界に先駆けて開発し、現在でも遺伝子改変ニパウイルスを作出できるのは世界で我々のみである。本研究は、この技術を用いてニパウイルスの病原性発現機序を解析することを大きな目標とし、本年度は主に病原性に最も関与することが疑われている3種類のアクセサリー蛋白に注目して、それらの病原性への関与の機序の解析を行なった。3種のアクセサリー蛋白について、in vitroでIFN応答の阻害作用を持つことをリポーターアッセイによって確認した。そこで昨年度、reverse geneticsによって作出したそれぞれのアクセサリー蛋白を欠損する組換えニパウイルスを細胞および動物に感染させて、病原性への影響およびIFN応答性への影響を解析した。その結果、IFN応答性への影響が減少する傾向が認められアクセサリー蛋白によっては感染細胞中でも作用を及ぼしている可能性が示唆された。そこでこれらウイルスをそれぞれハムスターに感染させて病原性への関与を、臨床症状、生死、病理学的解析により検索したところ、2種類のアクセサリー蛋白欠損ウイルスで病原性の著しい減弱が認められた。現在詳細な機序を解析中である。本研究成果はニパウイルスの病原性に関与するウイルス蛋白を動物実験で証明する初めての成果となると考えられる。ニパウイルスはヒト高い致死率を示す新興感染症であり、現在でもインド、バングラデシュなどで、流行を起こしている。我々は、このニパウイルスのreverse genetics系の開発に着手し、世界に書きがけて確立に成功した。(PNAS,2006)。平成19年度は、ニパウイルスのアクセサリー蛋白の病原性発現への関与とその機能に着目し、研究を行った。ニパウイルスのアクセサリー蛋白はin vitroの細胞発現系実験で、IFN応答経路の阻害能を持つことが示されている。そこで、我々の開発したreverse genetics系を用いて、3種のアクセサリー蛋白(V、C、W蛋白)を単独、あるいは組み合わせて欠損させた組換えウイルス7種を作製した。これらアクセサリー蛋白は全てP遺伝子から作られるため、P遺伝子にそれぞれ改変を加え、これをinfectious cloneに挿入し、reverse genetics法により感染性ウイルスを回収した。得られた組換えウイルスのvero細胞での増殖を比較した結果、W蛋白を欠損させたウイルスは親株と同様に増殖するが、CまたはV蛋白を欠損させたウイルスの増殖は、親株より抑えられており、この2つの蛋白は、invitroでのウイルス増殖に影響を与えることが明らかになった。現在、これら組換えウイルスの病原性を、ハムスターを用いた感染実験により解析中である。これらの実験のうち、遺伝子組換え操作は日本で行ない、感染性ウイルスを扱う研究は、フランスINSERMのBSL4施設内で行なった。
損失回避性と社会的比較が節電行動に与える影響の違い：ランダム化比較試験による検証

今後国内では電力料金低下による節電行動の緩みが予想される。地球温暖化抑制への個人の節電行動の重要性は、より一層高まる。これまで、個人の「節電意識・行動・効果プロセス」に係る新たなモデルの構築と検証を行い、損失回避性と社会的比較要因の影響を明らかにしてきた。近年、ランダム化比較試験(RCT)による社会実験が海外を中心に実施され、節電分野でも高い成果をあげている。ただ、節電の意識と行動に影響を与えるメカニズムは明らかにされていない。本研究では、「節電意識・行動・効果プロセス」と「RCT社会実験」を組みあわせた全く新しい研究を行い、損失回避性情報と社会的比較情報が、節電行動に与える影響の違い(プロセス、結果)を検証する。そして、節電行動促進に向けたインセンティブ情報の望ましい表現・提供方法を示す。具体的には、節電行動の規定要因のうち、村上(2016)で示した「個人便益の可視化と実感」と「身近な他者との関わりに基づく知識・情報の補完と同調、競争」を踏まえ、損失回避性と社会的比較に対応する情報を複数設定してRCT社会実験を行い、これら情報が節電行動に与える影響の違い(意思決定プロセス、結果)を比較検証する。本年度は、「社会的比較の比較対象の違いによる節電行動への影響力の違い」を明らかにするため、他者比較に係る4つの異なる提供情報間での節電行動意欲、および意思決定要因の影響の違いをRCT社会実験により明らかにした。今夏の節電行動の実施状況と意思決定要因の把握、そしてRCTに係る情報提供に基づく来夏の節電行動意欲に係るデータを把握した。そして異なる提供情報間での水準の異同およびその影響要因についての分析、考察を進めた。研究実施計画どおりに進展している。研究実施計画に沿って進めていく。本年度は、「節電効果の表現の違いによる節電行動への影響力の違い」を明らかにするため、損失回避性および他者比較に係る3つの異なる提供情報間での節電行動・効果、および意思決定要因の影響の違いをRCT社会実験により明らかにした。社会実験は調査会社の登録モニターに対し、Webを通じて行った。節電行動前のRCTに係る情報提供等(7月中旬)と、節電行動結果の把握等(9月中旬)を目的に、同一被験者に2回ずつ実施し、そのデータを接合し、分析、考察を進めた。

研究者本人が作業を行った部分で、人件費・謝金が当初計画より抑えられたため次年度使用額が生じた。この次年度使用額は、翌年度の作業における人件費・謝金に充当させる。予定していたデータ入力等の人件費・謝金に関して、研究者本人が実施したため次年度使用額が生じた。次年度のデータ入力等において使用する。
日和見感染性真菌カンジダグラブラータの侵襲感染メカニズムの解明

我々は、東北大学倉田研究室と共同研究を行い、カンジダ・グラブラータの網羅的組換え体ライブラリーの中から、ショウジョウバエの殺傷力を大きく低下させた菌株をスクリーニングした。その中から10菌株について着目し、カイコ幼虫を用いた感染実験を進めたところ、特に殺傷力が低下したA,B各遺伝子欠損した2株を特定することができた。A遺伝子がコードするタンパク質は細胞膜上に局在し、特殊な膜構造維持に必要な因子であり、血清中の成分を同化するために必要な遺伝子であるということが示唆された。現在我々は、それらの結果をまとめ、論文投稿準備中である。また、B遺伝子については、病原性との関わりを解析する予定である。本年度はカンジダ・グラブラータ全遺伝子組換え体ライブラリーの中から菌株の生育速度が野生株と比較して30%以内の変化しか見られない比較的に生育状態の良い一遺伝子欠損菌株を選抜し実験に用いた。先ず、1種類の遺伝子欠損株の菌体ペレットを20匹のショウジョウバエに対して体液中に接種した。これを2,000種類の遺伝子欠損菌株を40,000匹のショウジョウバエに対して行った。その後、ショウジョウバエの生存数を毎日カウントし、これを7日間継続することによりショウジョウバエの生存率が25%以下に達するまでの日数を求めた。ショウジョウバエの生存率が25%以下に達するまでの日数が短かった200菌株、ならびにショウジョウバエの生存率が高く維持された上位200菌株について同様の感染実験を2回繰り返し行った。以上の結果に基づきショウジョウバエの生存率が25%以下に達するまでの日数が短かった菌株すなわち殺傷力が上昇した菌株30菌株が得られた。またショウジョウバエの生存率が高く維持された菌株すなわち殺傷力が低下した菌株が60菌株得られた。殺傷力が上昇した菌株については、ショウジョウバエが体液中でカンジダ・グラブラータを認識する際に必要な分子の欠損もしくは変異が生じたためにショウジョウバエの免疫システムが作動しないか遅延が生じたためにショウジョウバエの生存率が低下したと考えられ、ショウジョウバエの未知のレセプターの発見が期待できる。一方、殺傷力が低下しショウジョウバエの生存率が上昇した菌株については、カンジダ・グラブラータの病原性に関与する分子の欠損もしくは変異が生じたために殺傷力が低下したと考えられる。今後これらの遺伝子の機能解析を進めることにより、カンジダ・グラブラータの病原性について理解を深めることが期待できる。病原性カンジダは、主に腸管粘膜に常在する真菌であり、健常者には罹患しないが、免疫力の低下した高齢者、エイズ患者、抗がん治療患者、臓器移植患者等の易感染患者に対して重篤な全身感染を起こす。細菌類を含む全血流感染症原因菌のうちカンジダは第4位、全体の7-8%を占め、致死率20-50%に達し、国内で約200人/年の死亡数が報告されている。これまでに東北大学倉田研究室との共同研究により、カンジダ・グラブラータ全遺伝子組換え体ライブラリーの中から菌株の培地上での生育速度が野生株と比較して30%以内の変化しか見られない比較的に生育状態の良い2,000遺伝子の欠損菌株を、合計70,000匹のショウジョウバエに対して感染実験を行った。その結果、殺傷力が上昇した菌株30菌株、またショウジョウバエの生存率が高く維持された菌株すなわち殺傷力が低下した菌株が60菌株得られた。これらの菌株について更に詳細且つ高精度な解析を行うために、カイコ幼虫を用いた感染実験を進めている。また、マウスを用いたカンジダ・グラブラータ口腔感染実験を実施したところ、胃部への定着が確認された。そこで、胃酸への寛容性を想定し、酸耐性に関わる遺伝子を検索した結果、酸耐性を示唆する転写制御因子が見つかった。そこで、本遺伝子の欠損株を用いて感染実験を実施したところ、胃部への定着が減少しため、カンジダ・グラブラータの腸管定着に必要な因子であることが明らかになった。次に本遺伝子の制御下にある遺伝子を同定するためにRNA-seqを行ない、複数の遺伝子が見出され、これらの遺伝子群について、遺伝子欠損株を用いてマウスの感染実験を進め胃部からの感染経路について研究を進めている。本研究の重要課題である血流感染因子、ならびに腸管粘膜への定着因子について各々スクリーニング成功した。深在性カンジダ症は、免疫抑制剤、抗癌剤、加齢、AIDS等により免疫力が低下し、易感染状態になった患者に対して肝臓や腎臓などに重篤な日和見感染症を発症する。死亡者数はカンジダ感染症だけでも年間40万人に及ぶ。国内においても、カンジダ血症患者数は1万人、死亡者数は1,000-5,000人/年と推定され、生存者の予後も不良である。血流感染菌(細菌感染も含む)のうちカンジダは第4位(9%)に位置し、死亡率は20-50%に達し、血流感染がカンジダ侵襲感染において最も重要な要因であると考えられる。我々は、東北大学倉田研究室と共同研究を行い、カンジダ・グラブラータ全遺伝子組換え体ライブラリーの中から培地上での生育状態が良好にも関わらず、ショウジョウバエの殺傷力を大きく低下させた菌株をスクリーニングした。

その中から10菌株について着目し、カイコ幼虫を用いた感染実験を進めたところ、特に殺傷力が低下したA,B各遺伝子欠損した2株を特定することができた。分子系統分類学的に近縁種であるサッカロマイセス・セレビシエでの情報よりA遺伝子がコードするタンパク質は細胞膜上に局在し、特殊な膜構造維持に必要な因子であることが報告されている。カンジダ・グラブラータのA遺伝子欠損株は、富栄養培地での生育状況は野生株と比較して遜色は見られなかった。カンジダ・グラブラータは貧栄養(最少)培地では、生育が大きく低下するが、それに血清を添加すると生育状態が良好となる。しかし、A遺伝子欠損株は、貧栄養培地に血清を添加しても、生育状態は不良のままであった。この結果より、A遺伝子は、血清中の成分を同化するために必要な遺伝子であるということが推測された。現在我々は、その血清中の成分を明らかに、それらの結果をまとめ、論文投稿準備中である。また、B遺伝子については、病原性との関わりを解析する予定である。我々は、東北大学倉田研究室と共同研究を行い、カンジダ・グラブラータの網羅的組換え体ライブラリーの中から、ショウジョウバエの殺傷力を大きく低下させた菌株をスクリーニングした。A遺伝子がコードするタンパク質は細胞膜上に局在し、特殊な膜構造維持に必要な因子であり、血清中の成分を同化するために必要な遺伝子であるということが示唆された。現在我々は、それらの結果をまとめ、論文投稿準備中である。本年度は、遺伝子組換え体ライブラリーの中から、病原性の変化が見られる菌株をスクリーニングすることが課題であった。当初96菌株ずつ混合しマウスに接種した後に次世代シーケンサーを用いてを各菌株の増減を測定する予定であった。実験系を変更し、東北大学倉田教授、倉石助教との共同研究によってショウジョウバエのToll変異体を用いて、菌株を個別に接種し感染実験を進めることができた。これによって、高精度の結果と解析時間を大幅に短縮することができた。スクリーニングされた因子が機能する感染メカニズムを明らかにする。医真菌学ショウジョウバエの殺傷力が、カンジダ・グラブラータ野生株に比べて低下した遺伝子欠損菌株が60株、上昇した株が30株確認された。次年度はこれらの菌株の殺傷力が変化した遺伝子について生理機能などの詳細な解析を行う。共同利用・共同研究等の運営費交付金から追加予算により本科研費の使用を減らすことができた。当初マウスを用いた感染実験を予定していたが、マウスをショウジョウバエに切り替えたために経費を大幅に節約することができた。当初の予定より多くの関連因子が見つかったために研究支援員の雇用及び、マウス感染実験を当初の予定より多く実施する。平成27年度は培養細胞を用いた実験を多数予定しており前年度から繰り越した分を充当する。
徂徠学の地方的展開に関する基礎的研究

本研究は、荻生徂徠の学統の地方的展開とその思想史的意義の解明を目的とした研究であり、その端緒として取り上げたのが福島県伊達郡である。当該地域は、18世紀後半、徂徠学派に属す熊阪台州が地域の知識人層を糾合したところであり、その活動はこの地域のみならず全国的なひろがりを持った。台州のもとに集った知識人は、豪農、医者、僧侶、零細な農民など諸階層を含むもので、徂徠学は彼らの基礎的教養の形成に大きく機能し、彼らの語彙や思想は均質化・共通化し、国内各地とのネットワーク形成も、そうした共通の思想と言語によって確保された。ところが、19世紀になるとこの地域の思想状況には変化が生じ、国学・心学などの徂徠学以外の思想的な要素が入り込むようになった。それまで地域の学問者糾合の靭帯として機能していた徂徠学は、逆に思想状況の分節化を促す触媒の役割を果たしたのである。上に示した本研究担当者の、この地域の思想状況についての俯瞰図をより明晰なものとするのが本研究の目的であり、主に次の諸点を明らかにすべく調査と研究を実施した。(1)熊阪台州の思想的な営みの現れともいえる彼の蔵書(曳尾堂文庫)は幕末に処分され、第二次大戦後さらに散逸したが、その所在はどうなっているのか。(2)処分された曳尾堂文庫の移転先(山形市半沢家)と熊阪家との関係ないしは地域的な交流の有無・文化的な背景はどんなものか。(3)曳尾堂文庫の全容解明は可能か。上記の台州の旧蔵書発見を端緒とした文献調査・実地調査の結果、1)従来知られていなかった曳尾堂文庫の蔵書目録を発見した。2)曳尾堂文庫が売却された時点(幕末・第二次大戦後)は、日本国内の文献が大量に移動(売買)された時期に重なり、半沢家がその結節点のひとつであったことが判明した。3)半沢家は仙台藩藩校の図書も多く購入しそれにより曳尾堂文庫の拡充がなったことが明瞭となった。4)それと関連して、仙台藩旧蔵書(具体的には青柳館文庫)の集積と散逸の過程が明らかになった。本研究は、荻生徂徠の学統の地方的展開とその思想史的意義の解明を目的とした研究であり、その端緒として福島県伊達郡保原町・伊達町・桑折町に居住した知識人たちを取り上げた。当該地域は、徂徠学派に属す熊阪台州が地域の知識人層を糾合したところであり、その活動はこの地域のみならず江戸や京都、名古屋などとの地域的なつながりを持った。一方、台州のもとに集った知識人は、豪農、医者、僧侶、零細な農民など諸階層を含むもので、徂徠学は彼らの基礎的教養の形成に大きく機能した。その結果、彼らの語彙や思想は均質化・共通化し、国内各地とのネットワーク形成も、そうした共通の思想と言語によって確保された。

ところが、寛政改革以後、この地域の思想に変化が生じ、徂徠学以外の様々な思想的な要素が入り込み、前代に地域の学問者糾合の靭帯として機能していた徂徠学は、逆に思想状況の分節化を促す触媒の役割を果たした。上記の本研究担当者の、この地域の思想状況についての俯瞰図をより明晰なものとすることが本研究の目的であった。その目的に沿って平成11年度は、次のような調査と研究の実施した。(1)熊阪台州周辺の学術的な営みについて、福島県立図書館、保原町歴史文化資料館などでの文献調査・実地調査を行った。その結果、この地域の歴史的・文化的な背景、人的交流のネットワークの概要が明らかになりつつある。(2)本年度の研究は、文献調査を中心としたものであり、既知の史料の蒐集と新史料の入手に重きを置き、台州の旧蔵書の発見にこころがけ、図書の流れのいくつかについての知見を得た。そして、その知見に沿って今後の調査の方針を設定した。(3)これに対して、台州門人の冨田以孝の旧蔵書については、子孫の協力のもとに調査がなったことによって、その全容の解明が可能となった。旧蔵書目録の作成はほぼ完了したので、公表を予定している。(4)本研究の意義を高めるため調査対象を拡大し、神奈川県、山口県、京都府等での調査を行い、比較研究の視座を得ようとしたが、調査途上にあり所期の成果は得られていない。今後に期したい。本研究は、荻生徂徠の学統の地方的展開とその思想史的意義の解明を目的とした研究であり、その端緒として取り上げたのが福島県伊達郡である。当該地域は、18世紀後半、徂徠学派に属す熊阪台州が地域の知識人層を糾合したところであり、その活動はこの地域のみならず全国的なひろがりを持った。台州のもとに集った知識人は、豪農、医者、僧侶、零細な農民など諸階層を含むもので、徂徠学は彼らの基礎的教養の形成に大きく機能し、彼らの語彙や思想は均質化・共通化し、国内各地とのネットワーク形成も、そうした共通の思想と言語によって確保された。ところが、19世紀になるとこの地域の思想状況には変化が生じ、国学・心学などの徂徠学以外の思想的な要素が入り込むようになった。それまで地域の学問者糾合の靱帯として機能していた徂徠学は、逆に思想状況の分節化を促す触媒の役割を果たしたのである。上に示した本研究担当者の、この地域の思想状況についての俯瞰図をより明晰なものとするのが本研究の目的であり、平成12年度は、主に次の諸点を明らかにすべく調査と研究を実施した。(1)熊阪台州の思想的な営みの現れともいえる彼の蔵書(曳尾堂文庫)は幕末に処分され、第二次大戦後さらに散逸したが、その所在はどうなっているのか。(2)処分された曳尾堂文庫の移転先(山形市半沢家)と熊阪家との関係ないしは地域的な交流の有無・文化的な背景はどんなものか。(3)曳尾堂文庫の全容解明は可能か。上記の台州の旧蔵書発見を端緒とした文献調査・実地調査の結果、1)従来知られていなかった曳尾堂文庫の蔵書目録を発見した。2)曳尾堂文庫が売却された時点(幕末・第二次大戦後)は、日本国内の文献が大量に移動(売買)された時期に重なり、半沢家がその結節点のひとつであったことが判明した。3)半沢家は仙台藩藩校の図書も多く購入しそれにより曳尾堂文庫の拡充がなったことが明瞭となった。4)それと関連して、仙台藩旧蔵書(具体的には青柳館文庫)の集積と散逸の過程が明らかになった。
転写ネットワークによるリンパ管分化の制御機構

リンパ管は生体内の恒常性の維持など生理的に重要な役割を担っているとともに悪性腫瘍の転移などの病的状態にも関与している。本研究においてはProx1を中心とした転写因子のネットワークによるリンパ管分化の制御機構の包括的な解明を試みた。成果として血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞へと分化する過程でProx1が重要な役割を果たすこと、そしてEts-2とCOUP-TFIIがリンパ管の形成と維持においてProx1と結合することにより、Prox1の機能をそれぞれ正と負の方向に調節していることが示された。リンパ管は血管とともに生体内の恒常性の維持、代謝、免疫応答など生理的に重要な役割を担っているだけでなく、悪性腫瘍の転移などの病的状態にも関与していることが示唆されている。しかし、リンパ管の発生を調節する分子機構には未解明な部分が多い。ホメオボックス転写因子Prox1は脈管系においてはリンパ管内皮細胞に特異的に発現し、そのノックアウトマウスにおいて静脈からのリンパ管の発芽が停止することから、リンパ管発生に必須の転写因子であることが知られている。我々は血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞へと分化する過程でのProx1の機能を解析するために、マウス胚性幹(ES)細胞由来血管細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるProx1の作用を検討した。血管内皮細胞においてProx1を発現させることで、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)-3の発現が亢進し、VEGF-C(VEGFR-3に対するリガンド)に対する走化性が上昇した。次に我々はProx1の転写活性を調節する共役因子を同定するためにyeast two hybrid screeningによりProx1結合因子の同定を試みた。得られた候補因子の一つであるEts-2は血管発生においても重要な役割を果たす転写因子である。また昨年度Prox1がリンパ管分化を制御するにあたって作用している標的遺伝子を同定するためにcDNAマイクロアレイを用いた。比較するサンプルとしてはES細胞由来の血管内皮細胞にProx1を発現させないものと発現させてリンパ管内皮細胞へと分化させたものであり、すでにVEGFR3やpodoplaninなどのリンパ管内皮細胞マーカーの発現が上昇していることが確かめられている。その結果400以上の遺伝子の発現が変化することを見出したリンパ管は血管とともに生体内の恒常性の維持、代謝、免疫応答など生理的に重要な役割を担っているだけでなく、悪性腫瘍の転移などの病的状態にも関与していることが示唆されている。ホメオボックス転写因子Prox1は脈管系においてはリンパ管内皮細胞に特異的に発現しくそのノックアウトマウスにおいて静脈からのリンパ管の発芽が停止することから、リンパ管発生に必須の転写因子であることが知られている。本年度はProx1に結合するリガンド未同定の核内受容体であるCOUP-TFIIのリンパ管新生における役割について検討した。COUP-TFIIは静脈血管内皮細胞において発現するが、リンパ管の発生過程においては静脈の一部においてProx1ホメオボックス転写因子が発現する。Prox1は血管内皮細胞増殖因子受容体3(VEGFR3)などのさまざまなリンパ管内皮細胞(LEC)マーカーの発現を誘導することにより血管内皮細胞(BEC)からLECへの分化を促進する。しかしProx1の転写活性の調節機構については未解明な部分が多い。本研究において我々はCOUP-TFIIがProx1の転写活性を調節することを示した。BECとLECにおいてProx1はcyclinE1とVEGFR3の発現を誘導することにより、細胞増殖とVEGF-Cへの走化性を亢進する。COUP-TFIIの発現によりBECとLECにおいてProx1の作用は阻害されたのに対し、COUP-TFIIの発現を低下させるとProx1の作用はBECでは亢進し、LECでは阻害された。我々はまた内因性のProx1とCOUP-TFIIがリンパ管内皮細胞において結合すること、そしてcyclin E1プロモーター上で複合体を形成することを見出した。以上の結果からCOUP-TFIIがリンパ管の形成と維持においてProx1と結合することにより、Prox1の機能を調節していることが示唆された。
スギ花粉ワクチンの開発

『ホヤ喘息』や『ダニアレルギー』の治療用抗原に関して蓄積してきた知見を基にスギ花粉症治療薬の研究を行った。まず、スギ花粉蛋白質の抽出法の検討を行った。NaHCO_3抽出(CJP-N)ではF画分にCryj1、J画分にCryj2の溶出がみられ、Crij1とCryj2の精製に適していたがPBS抽出(CJP-P)ではよりアルカリ性の弱い画分に様々にアルカリ性度の異なるCryj1,Cryj2、その分解物及び主要抗原以外の抗原の溶出がみられた。次にスギ花粉中のCryj1,Cryj2以外の抗原の存在と、アレルゲンとしての寄与を検討した。CJP-PのSDS-PAGEブロット後のIgE染色では分子量の異なる10個のバンドがみられ、これらは全てCryj1,Cryj2とは異なっていた。Cryj1,Cryj2はSDSで変性を受けてIgEと全く反応しなかった。患者血清を主要抗原で中和後、患者IgEと反応した抗原量を見積った。実験は15人のスギ花粉症患者血清すべてで、主要抗原以外の抗原と反応した。反応は患者による個人差があった。これらの結果を基に、減感作治療用抗原の検索を行い、アレルゲン性が強く、抗体IgGを作る能力が高く、粘膜反応性(結膜反応)をもたず、分子量が1万から10万の間にある抗原、CJP-PのC画分がノミネートされた。この画分は主要画分を含んでいない。今後、主要画分との混合などを検討して、さらに有用なワクチン開発の工夫が必要である。一連の抗原検索中に、イオン交換で分画したCJP-P画分のSDS-PAGE後の、蛋白質のN-末端側のシークエンスを分析した結果、Cryj1のN末端側の分解物(p15)とC末端側の分解物(p29)を発見し、p29が発症抗原である可能性を示唆した。今回我々はスギ花粉ワクチン用抗原を得るために様々な検索を行い、ノミネートされた蛋白質は出てきたがまだ特定するには至っていない。今後、これらの蛋白質の中からさらに効果的なワクチンを開発する方向に向けて研究していく予定である。1,花粉蛋白質抽出法の検討:種々の抽出液を検討した結果、中性のPBSにより既報の方法より約10倍量の蛋白質が得られ、また、花粉の膨潤が微弱で糖鎖性不純物の溶出が顕著に抑制されることがわかった。本方法による遠心分離後の上清中蛋白質の、硫安沈澱・脱塩濃縮・凍結乾燥処理した試料(CJP)を用い、花粉症患者12名に皮内(20万倍希釈)及び結膜反応(1万倍希釈)を行ったところ、活性がみられた。2,粗スギ抗原ウサギ抗血清の作製3,ゲルクロマトグラフィーによる分画:CJPに対しSuperdex G-75でゲルクロマトグラフィーを行った。溶出のUV280nmモニターの結果から、4つのピーク(VV側からCJP-1、CJP-2、CJP-3、CJP-4)が得られた。患者血清1gEとの反応、及び皮内・結膜反応は共にCJP-3で最も高く、CJP-1は反応しなった。

糖はCJP-2に大部分溶出した。CJP-3には分子量80KD12KDのものが含まれていたが、従来から主抗原といわれている蛋白質もこの画分に含まれている可能性がある。SDS-PAGE後、蛋白質染色した結果、この画分には少なくとも14本のバンドが確認され、主抗原の他にも多くの蛋白質が含まれることが明らかとなった。さらにこの画分を精製して発症抗原、及びそれと交叉反応する治療用抗原を開発していく予定である。4,アレルゲン産生遺伝子の分子遺伝学的検討:花粉細胞からのゲノムDNAを単離、また花粉形成時期を追って全RNAを単離し、cDNA調整の初期段階にある。『ホヤ喘息』や『ダニアレルギー』の治療用抗原に関して蓄積してきた知見を基に、スギ花粉症治療薬の研究を行った。まず、スギ花粉蛋白質の抽出法の検討を行った。NaHCO_3抽出(CJP-N)では、F画分にCryj1、J画分にCryj2の溶出がみられ、Crij1とCryj2の精製に適していたが、PBS抽出(CJP-P)ではよりアルカリ性の弱い画分に様々にアルカリ性度の異なるCryj1、Cryj2、その分解物、及び主要抗原以外の抗原の溶出がみられた。次に、スギ花粉中のCryj1、Cryj2以外の抗原の存在と、アレルゲンとしての寄与を検討した。CJP-PのSDS-PAGEブロット後のIgE染色では分子量の異なる10個のバンドがみられ、これらは全てCryj1、Cryj2とは異なっていた。Cryj1、Cryj2はSDSで変性を受けてIgEと全く反応しなかった。患者血清を主要抗原で中和後、患者IgEと反応した抗原量を見積った。実験は15人のスギ花粉症患者血清すべてで、主要抗原以外の抗原と反応した。反応は患者による個人差があった。これらの結果を基に、減感作治療用抗原の検索を行い、アレルゲン性が強く、抗体IgGを作る能力が高く、粘膜反応性(結膜反応)をもたず、分子量が1万から10万の間にある抗原、CJP-PのC画分がノミネートされた。この画分は主要画分を含んでいない。今後、主要画分との混合などを検討して、さらに有用なワクチン開発の工夫が必要である。一連の抗原検索中に、イオン交換で分画したCJP-P画分のSDS-PAGE後の、蛋白質のN-末端側のシークエンスを分析した結果、Cryj1のN末端側の分解物(p15)とC末端側の分解物(p29)を発見し、p29が発症抗原である可能性を示唆した。今回我々はスギ花粉ワクチン用抗原を得るために様々な検索を行い、ノミネートされた蛋白質は出てきたがまだ特定するには至っていない。今後、これらの蛋白質の中からさらに効果的なワクチンを開発する方向に向けて研究していく予定である。
口腔顔面領域のガン性疼痛におけるエンドセリンの役割とその治療法

ET-1は口腔粘膜炎症において増加するが,口内炎疼痛に関連するかは不明である。本研究ではET-1の関与を調べるために,酢酸誘発潰瘍性口内炎ラットを用いて検討した。潰瘍部を介した細菌侵入後のET-1産生増加は,ETBを介するプロスタノイド産生によるTRPA1活性化を介した自発痛とETA/ETBを介したTRPA1およびTRPV1活性化が関与する機械的アロディニアを誘発する一方,ET-1非依存性経路を介した機械的アロディニアが生じることが示された。これらの結果から,ボセンタンがエンドセリンシグナル伝達遮断薬として潰瘍性口内炎患者に対する有効な鎮痛薬として期待される。抗癌剤の5-FUの投与後の口内炎増悪モデルラットの病態生理学的状態を評価した。またTRPチャネルの自発痛と機械痛覚過敏への関与と薬物の効果を検討した。5-FUは食欲不振、体重減少、白血球減少を引き起こしたが、健常口腔粘膜における疼痛関連行動には直接影響を及ぼさなかった。5-FU自体は口内炎は引き起こさなかったため、最終投与から2日後に、酢酸処理にて下唇粘膜部に口内炎を誘発した。生食投与群と比較して5-FU投与群では口内炎部への白血球浸潤減少、細菌コロニー数の増加、口内炎の肉眼的な増悪が認められた。また自発痛と口内炎部の機械痛覚過敏は増悪した。抗菌薬にて自発痛と機械痛覚過敏の両方が抑制された。自発痛はCOX阻害薬インドメタシン、TRPV1阻害薬SB-366791により抑制されたが、TRPA1阻害薬HC-030031は無効であった。一方、機械痛覚過敏は、HC-030031により抑制されたが、インドメタシン、SB-366791は無効であった。TRPA1の機械的感作を引き起こす要因を調べるため、細菌毒素のLPS、fMLFを健常粘膜に局所投与したところ、TRPA1を介した機械痛覚過敏を引き起こした。細菌毒素の阻害薬としてLPS阻害薬ポリミキシンB及びfMLF受容体FPR1拮抗薬Boc MLFを5-FU群の口内炎部に局所塗布したところ、機械痛覚過敏は抑制された。さらにポリミキシンBはプロスタグランジンE2産生を抑制し、自発痛も抑制した。またTRPチャネル拮抗薬のルセニウムレッド及びTRPV1/TRPA1チャネルポア通過麻酔薬QX-314の局所塗布は、自発痛と機械痛覚過敏を抑制した。5-FUによる白血球減少が口内炎部位への細菌感染を増加し、COX経路を介した持続的なTRPV1活性による自発痛の増悪と、細菌毒素によるTRPA1機械的感作を介した機械痛覚過敏の増悪をもたらす。以上の結果から、上記の機序とエンドセリンの関連性を追求する必要があるため。口内炎は不良補綴物や食事時の咬傷の原因、抗癌剤の副作用として発症するが、その痛みにより患者のQOLの低下を招く。しかし、口内炎疼痛発症機序については不明な点が多い。本年は、疼痛との関与が報告されているエンドセリン-1(ET-1)と口内炎疼痛との関係を調べるために口内炎モデルラットを用いて実験を行った。前回と同様に酢酸誘発口内炎モデルを作成後、口内炎部組織におけるET-1の発現を免疫組織学的手法とELISAにて解析した。また、好気・嫌気性下にて口内炎部組織の細菌コロニー数を評価した。さらに抗菌薬処置後のET-1濃度の変化と細菌コロニー数の変化を評価した。次に、ET-1受容体(ETA/ETB)拮抗薬を用いて自発ラビング時間(自発痛の指標)および機械逃避閾値(接触痛の指標)を測定することで口内炎疼痛へのET-1の関与を評価した。疼痛評価は、ETA/ETB拮抗薬であるボセンタンの尾静脈投与、ETA拮抗薬のBQ-123またはETB受容体拮抗薬BQ-788の局所塗布の1時間後に行った。酢酸処理2日後において潰瘍を伴う口内炎が発症し明らかな腫脹を認めた。また、潰瘍部位を中心にET-1の発現が認められ、ET-1濃度も2日目をピークに増加していた。口内炎部組織の好気・嫌気性菌はともに増加し、抗菌薬によってET-1濃度、細菌数ともに有意に抑制した。さらに、2日目に認められた自発痛は、ボセンタン投与およびBQ-788塗布後に抑制した。以上の結果より、口内炎部位への細菌感染によりET-1産生が促進し、ETBを介して自発痛が発症し、ETAおよびETBを介して接触痛が引き起こされる可能性が示唆された。これらの結果は、口腔顔面領域のガン性疼痛や抗癌剤による口内炎の複合的な痛みにおける病態解明の一助となることが考えられる。口腔顔面領域のガン性疼痛の病態は複雑であるため、モデルを口内炎に変更して研究を続けている。しかし、ET-1は口内炎にどのように関連しているのかが判明してきており、これらの結果はガン性疼痛におけるET-1とその治療法に有効に生かすことができると考える。口内炎疼痛により会話や食事が困難となり、患者のQOLが低下する。エンドセリン-1(ET-1)は口腔粘膜

炎症において増加するが、口内炎疼痛に関連するかは不明である。本研究では、口内炎疼痛へのET-1の関与を調べるために、酢酸誘発潰瘍性口内炎ラットを用いて行動学的、免疫組織化学的および分子生物学的手法にて検討した。その結果、潰瘍部を介した細菌侵入後にET-1発現量が増加した。自発痛は、ETB受容体を介するプロスタノイド産生によるTRPA1活性化を介して誘発された。また、ETA/ETB受容体を介したTRPA1およびTRPV1活性化が関与する機械的アロディニアを誘発する一方、ET-1非依存性経路を介したアロディニアが生じることが示唆された。ET-1は口腔粘膜炎症において増加するが,口内炎疼痛に関連するかは不明である。本研究ではET-1の関与を調べるために,酢酸誘発潰瘍性口内炎ラットを用いて検討した。潰瘍部を介した細菌侵入後のET-1産生増加は,ETBを介するプロスタノイド産生によるTRPA1活性化を介した自発痛とETA/ETBを介したTRPA1およびTRPV1活性化が関与する機械的アロディニアを誘発する一方,ET-1非依存性経路を介した機械的アロディニアが生じることが示された。これらの結果から,ボセンタンがエンドセリンシグナル伝達遮断薬として潰瘍性口内炎患者に対する有効な鎮痛薬として期待される。口内炎の疼痛発生とエンドセリンの関連性を調査する必要がある。今後は、一般的な口内炎のみならず、難治性の潰瘍性口内炎に対しても研究を展開していく予定である。歯科麻酔学本年度の研究が、昨年度の研究内容と類似していたため、その使用が消耗品に限局していた。次年度は備品等を購入する必要があると考える。次年度は、潰瘍性口内炎ならびに癌性疼痛におけるET-1の役割、ならびにET-1受容体拮抗薬を用いた治療法の検討を行っていくため、大規模な調査になると考えられる。
偽遺伝子挿入による種特異的非コードＲＮＡ獲得に基づく遺伝子スイッチ制御の多様化

非タンパク質コードRNA(ncRNA)獲得と機能化が近傍遺伝子の発現スイッチを多様化しうる、という仮説を検証した。ほ乳類5種(チンパンジー・マカクザル・マーモセット・マウス・ラット)の5組織を用いた比較トランスクリプトーム・エピゲノム解析から、pancRNAと命名した遺伝子プロモーター近傍から発現する機能ncRNAの新種を4000以上発見し、遺伝子活性化に働くこと及びそのDNA配列上の特徴を明らかにした。種にしたがった固有のpancRNAレパートリーが存在し、それらが共通して遺伝子活性化機構を駆動することで、種特異的な遺伝子発現制御ネットワークが実現していることが明らかになった。ゲノムへの偽遺伝子挿入パターンは動物種毎に異なっている。本課題では、脳の動物種間多様性成立機構を解き明かすため、偽遺伝子挿入による非タンパク質コードRNA(ncRNA)獲得と機能化が近傍遺伝子の発現スイッチを多様化しうる、という独自の発見の普遍性を検証していく。ncRNAの活性には二本鎖ゲノムからの転写方向が非常に重要である。本年度は、ncRNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、に大きな進展があった。当該課題が文科省新学術領域「ゲノム支援」の支援課題にも選ばれたため、アカゲザル・チンパンジー・マウス・ラットの微量RNAサンプルからイルミナ社HiSeq2000を用いたdirectional RNA_Seq解析を強力に進めた。例えば、マウスとチンパンジー大脳・小脳では、いずれもゲノムの約1%程度しか両鎖からの転写が起こっておらず、二本鎖RNAがシスに形成される確率は低いと考えられた。一方で、タンパク質コード遺伝子の転写開始点近傍では、アンチセンス転写とセンス転写を明確に分ける「スイッチ点」が数千の座位で認められた。head-to-head型プロモーターの9割以上はCpGアイランドを含んでおり、CCGリピートとCGGリピートがそれぞれプロモーター上流と下流に有意に高く存在していた。組織特異的プロモーターncRNA(pancRNA)を持つタンパク質コード遺伝子は、pancRNA発現増大にしたがい協調的に発現を増大させており、一方ハウスキーピング遺伝子には概してpancRNAが欠落していた。このことに一致して、種特異的pancRNAノックダウンにより、直下の組織特異特異的遺伝子発現減少/表現型改変が起こりうることも分かってきたことから、pancRNAを介した共通原理の下で、動物種毎に異なる遺伝子スイッチ修飾が偽遺伝子挿入により生み出されていることが示唆された。本課題では、脳の動物種間多様性成立機構を解き明かすため、非タンパク質コードRNA(ncRNA)獲得と機能化が近傍遺伝子の発現スイッチを多様化しうる、という独自の発見の普遍性を検証していく。昨年度は、ncRNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、に大きな進展があったが、本年度は、その網羅的データから得られた新規の組織特異的プロモーターncRNA(pancRNA)によるエピジェネティック変換解析に大きな進展があった。解析したいずれの遺伝子座においても、pancRNAは直下の遺伝子の活性化に寄与しており、このうち種特異的pancRNAノックダウンについても、直下の組織特異特異的遺伝子発現減少/表現型改変が起こっていた。例えば、SH3 domain-containing RING finger protein 3(SH3RF3)遺伝子については、マウス特異的にpancRNAが存在しており、霊長類にはpancRNAが存在しない。それでもマウス大脳皮質ニューロンにおいて直下の遺伝子活性化に寄与していたことから、pancRNAを介した共通原理の下で、動物種毎に異なる遺伝子スイッチ修飾が種特異的に生み出されていることが示唆された。以上の成果の一部については、BMC Genomics誌に1月に出版報告した。種特異的pancRNAによるエピジェネティック変換が確かに細胞の構成に表現型を生み出すのかについて、現在、10程度のpancRNAのノックダウンの効果をマウス胎児神経幹細胞初代培養系にて検定しており、例えば上記のSH3RF3遺伝子の場合、細胞増殖の抑制によりニューロンの数が減少することを認めている。このように、ncRNA獲得と機能化が近傍遺伝子の発現スイッチを種特異的に適応させた効果について、更に例を増やすことで評価して行く。本課題では、脳の動物種間多様性成立機構を解き明かすため、非タンパク質コードRNA(ncRNA)獲得と機能化が近傍遺伝子の発現スイッチを多様化しうる、という独自の発見の普遍性を検証した。昨年度までに、pancRNAと命名した遺伝子プロモーター近傍から発現するncRNAの新種を1000以上発見し、遺伝子活性化に働くこと及びその配列上の特徴を示し、うち複数の種特異的pancRNAについて機能解析を進めてきていた。今年度は、pancRNA発現の種間多様性を調べるために、哺乳類5種(チンパンジー・マカクザル・マーモセット・マウス・ラット)の5組織を用いた比較トランスクリプトーム解析を実施し、格段に包括度を増すことによる種特異的pancRNAの特徴の抽出と機能性検定を行った。

その結果、pancRNAは発現プロファイルと塩基配列の点で種間多様性が高いということ、及び、数百の生物種特異的pancRNAが確かに存在していることを証明した。また、マウス大脳皮質特異的発現を示すpancRNAの機能解析から、実際に種特異的pancRNAが遺伝子発現制御に寄与し、表現型発現に結びついていることを示した。例えば、大脳においてげっ歯類にのみ認めたSh3rf3とVwa5b2遺伝子のpancRNA(pancSh3rf3、pancVwa5b2)については、pancSh3rf3が神経幹細胞におけるニューロン分化の促進に寄与すること、反対にpancVwa5b2が神経幹細胞におけるニューロン分化の抑制し、またアストロサイト分化の促進にも関与していること、を発見した。以上より、種特異的なpancRNAレパートリーが存在し、それらが哺乳類生物種間で共通の遺伝子発現活性化機構を駆動することで、種特異的な遺伝子発現制御ネットワークを作り出している、という種間多様性発現機構が進化の過程で機能してきたことを提唱する。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。本課題は、[1]DNA脱メチル化における共通原理の推定、[2]RNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、[3]遺伝子操作技術を活用した脳の多様化の実現、の3本柱で成り立っており、このうち、項目[2]が大きく進展したことにより、原理の一般化と動物有用形質賦与への応用への律速段階を乗り越えることが出来た。本課題は、[1]DNA脱メチル化における共通原理の推定、[2]RNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、[3]遺伝子操作技術を活用した脳の多様化の実現、の3本柱で成り立っており、このうち、昨年度に項目[2]が大きく進展したことにより、本年度は項目[3]に集中できたため。[1]DNA脱メチル化における共通原理の推定、[2].,発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、[3]遺伝子操作技術を活用した脳の多様化の実現、のうち、今年度に項目[2]で得られた情報をもとに、項目[1][3]の研究を効率よく推進する。[1]DNA脱メチル化における共通原理の推定、[2]RNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、[3]遺伝子操作技術を活用した脳の多様化の実現、のうち、今年度までに項目[2][3]で得られた情報をもとに、項目[1]の研究と個体でのncRNA機能研究を効率よく推進する。特に、[2]RNA発現を指標とした多様なシスエレメント情報の網羅化、については次年度も大きく発展が期待でき、またデータ量も格段に増えたため、新たにワークステーションを整備する。