hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸癌転移制御におけるケモカイン・ジグナル阻害の臨床応用へ向けた展開

1)については、ヒト大腸癌細胞株にmiRNA法を用いて1CXCR3単独ノックダウン、2CXCR4単独ノックダウン、3CXCR3/CXCR4ダブルノックダウンの3種類の細胞株を樹立してマウスモデルで検討したところ、CXCR3およびCXCR4いずれのノックダウンでも転移抑制効果が確認された。また実際のヒト検体の解析でも進行度が進むにつれCXCR3およびCXCR4とも癌細胞での発現が増加することを明らかにした。この結果は論文として発表した(Murakami et al.Int J Cancer.2013)。さらに間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)と癌との相互作用について、CXCR3、CXCR4、CCR5のシグナルが関与していることも明らかとなり、これについては解析中である。2)については、ヒト大腸癌細胞株を使用し癌抑制遺伝子SMAD4が欠損するとケモカインCCL15の発現が上昇する分子機序を明らかにし、さらにヒト大腸癌肝転移においてもマウスモデルと同じく転移巣周囲ではCCR1陽性骨髄球が多く集族しCCL15陽性転移巣では再発リスクが有意に高いことを確認した。この結果は論文として発表した(Itatani et al.Gastroenterology.2013)。さらに大腸癌原発巣の解析でもSMAD4欠損とCCL15発現とは有意な逆相関性をもっており、腫瘍浸潤先端にはCCR1陽性のMDSC(Myeloid-derived suppressor cells)が集族すること、CCL15発現と患者予後には相関性があること、が明らかとなり、更なる解析を進めている。京都大学医学研究科消化管外科ホームページ消化器外科当初の予定通りにおおむね実験計画は進んでおり、現在までに得られた実験結果は学会発表のみならず論文発表することができたから。当初の予定通りにおおむね実験計画は進んでおり、テーマの1つであるCXCR3とCXCR4の研究に関しては論文発表することができたから。またもう一つのテーマであるCCR1の研究に関しても、現在論文投稿中である。大腸癌に発現するCXCR3およびCXCR4についてはmiRNA法を用いて発現を抑制した細胞株を使用してマウス動物実験で転移が抑制することが示せた。今後はさらに臨床応用の可能性を検討するためCXCR3阻害剤、CXCR4阻害剤を使用して検討を進める予定である。骨髄球に発現するCCR1については今後はCCR1阻害剤を使用した動物実験を進めるとともに、CCR1陽性骨髄球の役割についてはヒト臨床検体を使用して大腸癌原発巣や大腸癌肺転移巣についてもこれらの実験結果が応用可能かどうか、さらに詳細な検討をしていく予定である。CXCR3は乳癌でも転移に関与している事が複数のグループにより報告されており、大腸癌以外の癌種においても転移に関与している可能性があるので、他の癌腫においても検討を進める価値があると思われる。またCXCR3やCXCR4の阻害剤をつかったマウスモデルの転移抑制効果についての検討は臨床応用を考える上では重要であると思われ、今後も検討を進める。CCR1陽性骨髄球の研究に関しては、肝転移巣ばかりでなく原発巣でも癌浸潤に関与していることが予想され、原発巣での臨床検体をもちいた解析も重要であると思われる。
樹幹へのミネラルの取り込みと移動経路のクライオＳＥＭ／ＥＤＸを用いた直接的解明（国際共同研究強化）

樹幹の放射方向のミネラル移動は樹木の成長に欠かせない重要な機能である。この移動に放射柔細胞のミネラル輸送機能が寄与すると考えられているが、この輸送機能のメカニズムは解明されていない。本研究では樹幹放射方向のミネラル移動実態の解明のため、トレーサーとして安定同位体セシウムを樹幹に注入して凍結固定したスギ樹幹におけるセシウムの放射方向分布をヨーロッパシンクロトロンの放射光クライオマイクロ蛍光X線分析装置で解析した。凍結試料の解析の結果、セシウムが放射柔細胞内腔と細胞壁および仮道管の細胞壁に分布することを明らかにした。内定年度:2015樹木は、多年に渡り健全な成長を続け大径になるための戦略として、根から吸収したミネラルを師部や辺材の生活細胞に取り込み樹体内に蓄積するとともに、当年までに取り込んだ成分を木部に蓄積し翌年以降にも利用する機能を持つ。この機能に木部柔細胞が深く関わると考えられている。本研究の基課題(H25-27年度科研費)では、樹幹放射方向のミネラルの移動経路が主として放射柔細胞であることを実験的に明らかにした。一方で、ミネラルの移動に関与する放射柔細胞の微細構造は明らかにできておらず、また師部から木部への移動の経路の実態も解明に至っていない。そこで本研究では、師部と木部のミネラルの移動の実態を可視化技術によって解明することを目的とする。本年度は、ヨーロッパシンクロトロン(ESRF)・ID21ビームラインのマイクロ蛍光X線分析装置を用いて樹木のミネラル移動の可視化手法の開発を行った。この装置は凍結試料の測定が可能なため、水を含んだ状態の樹木のミネラル分布解析が期待できる。装置を使用するためには、ESRFへ課題提案を行い採択される必要がある。そのため、まず、共同研究者のJyske博士(フィンランド・Luke)とともにESRF・ID21ビームラインの使用計画を立て、課題を申請した。その結果、提案課題が採択されたため、続いてビームラインの担当研究者と実験の詳細について打ち合わせを行った。ESRFでの実験には、安定同位体セシウムを立木の幹に注入し、立木凍結法で採取したスギを試料として用いた。凍結を維持した状態で解析するための試料の前処理方法や測定条件を検討して解析を行った結果、基課題で解析できなかった低濃度の試料においても、注入したセシウムのマッピングに成功した。現在、ヘルシンキ大学工学部のグループが開発した画像処理技術を用いて詳細な解析を行っている。課題遂行上重要な実験であるヨーロッパシンクロトロンにおけるマイクロ蛍光エックス線分析装置を使用するためにはヨーロッパシンクロトロンへの課題の申請と採択が必要である。共同研究者のJyske博士とともに申請した課題が採択され、当初の計画通りに実験を行うことができた。また画像処理が専門のヘルシンキ大学工学部のグループと共同研究を開始し、得られた結果の解析も順調に進んでいる。師部と木部のミネラルの移動の実態を可視化技術によって解明するため、ヨーロッパシンクロトロン(ESRF)ID21ビームラインにおけるマイクロ蛍光エックス線装置を用いて凍結試料における元素マッピング手法の検討を行った。共同研究者のフィンランド天然資源研究所のJyske博士らとともに昨年度に測定したデータの解析を行い、高感度の元素マッピングデータを得ることが出来た。次に、アールト大学ナノ顕微鏡センターのクライオTEM/EDXを用いた解析を試みた。凍結試料から凍結準超薄切片を作成し凍結を維持したままTEM/EDX解析が可能であることを示した。このことから本手法が凍結試料を用いたミネラル移動解析研究の新たな手法として有効であることを明らかにした。また、ヘルシンキ大学のマイクロCT分析装置を用いた3次元可視化解析を試みた。本装置は凍結試料用の試料ホルダーを付属していないが短時間の測定の場合は凍結維持が可能である。しかしながら測定中の試料の温度上昇に伴う振動等のため、本課題で求める凍結試料の解析には適応不可能なことを明らかにした。本科研費では、基課題で解明できていない師部と木部のミネラル移動の実態を可視化技術によって解明することが目的であった。検討した可視化手法にはいずれも凍結樹木試料を用いた報告例がなかったため本課題は解析手法の開発が中心となったが、当初計画で予定していたESRFの装置では期待したマッピング像を得ることが出来たほか、クライオTEM/EDXを用いた新たな解析手法の可能性を示すことができ、国際共同研究により研究を進展させることができたと考える。2018年度からも国際共同研究を続け研究の発展につなげたい。ヨーロッパシンクロトロンID21ビームラインのマイクロ蛍光エックス線分析で得られたデータについて、ヘルシンキ大学工学部のグループが開発した画像解析手法を用いてミネラルの詳細な局在解析を行う。さらに、ヨーロッパシンクロトロンに継続実験課題を申請し、今年度に検討した条件を用いてさらに解析を行い、ミネラル移動を三次元的に解析する方法を検討する予定である。樹木細胞学
低次元射影的アノソフ力学系の大域的構造の分類

低次元射影的アノソフ力学系の大域的構造に関して次の結果が得られた。2次元射影的アノソフ微分同相写像前年度の段階では射影的アノソフ微分同相写像に付随する空間のホモトピー型を不変量としていたために、ある種のコンパクト性が条件としてはずせなかったが、本年度には、この空間のコンパクト台特異コホモロジー群はコンパクト性を仮定しなくともPA-isotopyについて不変であることを示すことができた。この修正を行った論文を現在投稿準備中である。また、この2次元射影的アノソフ力学系の不変量の研究に関する講演を、10月末に京都大学数理解析研究所で行われた研究集会「低次元トポロジーと接触幾何学」において行った。3次元射形的アノソフ流上に挙げた、本年度に得られた2次元射影的アノソフ力学系のより適用範囲の広い不変量は、3次元射影的アノソフ流の不変量としても適切と思われ、その方向で研究を進めた。しかし、コホモロジー群の不変性を示すためのホモトピーの構成にいくらかの困難が生じることがわかり、本年度はこの困難の克服までには至らなかった。低次元射影的アノソフ力学系の大域的構造に関して次の結果が得られた.また,考えている射影的アノソフ力学系が恒等写像とホモトピックな時にはgenericに力学系がモース・スメール系になることを利用して,うまく力学系を変形することで標準的な射影的アノソフ力学系になるであろうことが,ほぼ解明された.この結果に関しては現在論文執筆中である.3次元射影的アノソフ流3次元射影的アノソフ流に対して2次元の場合と同様の構成を行なう際の障害についての知見が得られた.その結果,2次元のように幾何学的対象を構成することは難しいが,ホモロジー群としての不変量を構成することはいくつかの状況証拠から可能であると思われる.この研究は現在も継続中である.低次元射影的アノソフ力学系の大域的構造に関して次の結果が得られた。
動的キラルルイス酸錯体の構造制御に基づく環状アミン類の選択的不斉アルキル化

平成16年度に引き続いて、1)動的キラル銅錯体を触媒とするピペリジン環への不斉アルキル化および2)動的キラル銅錯体を触媒とするジオール不斉認識を行い、1)、2)とも従来よりも高い不斉収率を得る条件を見出した。1)に関しては、キラルビスオキサゾリン(L^*)触媒、Cu(II>触媒の存在下に、マロン酸ジアルキルエステル(Nu)をN-保護-β,γ-不飽和-α-メトキシピペリジン(S)に反応させると、L^*、Cu(II)、Nuの3者からなる動的錯体が生成し、これがSに作用してアシルイミニウムイオン中間体が生じ、このイオンに動的錯体が攻撃して不斉炭素間結合形成が起こった。この不斉炭素間結合反応において、0°CでN-保護基をp-メトキシベンゾイル基にしたSに対してマロン酸ジp-ClPhエステルをNuに用いると97%ee、S構造でα位に炭素間結合が選択的に起こることを見出した。さらに、生成物とL^*の絶対構造に基づいて反応機構も提唱した。2)に関しては、L^*、Cu(II)の存在下に、環状meso-1,2-ジオールにフェニルイソシアナートを反応させると、L^*、Cu(II)、1,2-ジオールの3者からなる動的錯体にフェニルイソシアナートが反応して1,2-ジオールのモノカルバモイル化が効率的に起こり、且つ、生成物はキラル化合物であった。この不斉モノベンゾイル化は既に見出していた同様の不斉モノベンゾイル化と同等あるいはそれ以上の高い不斉収率であった。例えば、-40°Cでcis-1,2-シクロペンタンジオー及びcis-1,2-シクロヘキサンジオールでは86%ee、cis-1,2-シクロオクタンジオールでは93%eeであった。ラセミジオールの動力学的光学不斉分割も同様のモノカルバモイル化反応により達成されたが、その%eeは不斉非対称化におけるものよりも若干低かった。動的キラル銅錯体を触媒として1)ピペリジン環への不斉アルキル化および2)ジオール不斉認識を行い、1)、2)とも高い不斉収率を得る条件を見出した。1)に関しては、平成15年度に引き続いて、以下の研究を行った。即ち、キラルビスオキサゾリン(L^*)、Cu(II)の存在下に、求核剤(Nu)としてマロン酸ジアルキルエステルを、N-保護ピペリジンの電極酸化によって得られるN-保護-β,γ-不飽和-α-メトキシピペリジン(S)に反応させると、先ず、L^*、Cu(II)、Nuの3者からなる動的錯体が生成し、この条件でSから生じるアシルイミニウムイオン中間体に動的錯体が攻撃して不斉炭素間結合形成が起こることは15年度に見出している。この不斉炭素間結合反応において、N-保護基をp-メトキシベンゾイル基にしたSに対してマロン酸メチルフェニルエステルをNuに用いると81%eeの効率で、Sのα位に炭素間結合が選択的に起こることを見出した。2)に関しては、L^*、Cu(II)の存在下に、meso-1,2-ジオールに塩化ベンゾイルを反応させると、L^*、Cu(II)、1,2-ジオールの3者からなる動的錯体に塩化ベンゾイルが不斉ベンゾイル化し、meso-1,2-ジオールを不斉非対称化できることは既に見出していた。しかし、この反応においては、meso-1,2-ジオールの種類により、分子内アシル移動によるラセミ化が起こるために低い不斉収率しか得られない場合が多くあった。平成16年において、分子内アシル移動が起こらない反応系を開拓した。それは、塩化ベンゾイルの代わりにフェニルイソシアナートを用いたフェニルカルバモイル化である。例えば、cis-1,2-シクロペンタンジオールでは0%eeであったベンゾイル化が、フェニルカルバモイル化にすると66%eeに改善された。2)に関しては、L^*、Cu(II)の存在下に、環状meso-1,2-ジオールにフェニルイソシアナートを反応させると、L^

*、Cu(II)、1,2-ジオールの3者からなる動的錯体にフェニルイソシアナートが反応して1,2-ジオールのモノカルバモイル化が効率的に起こり、且つ、生成物はキラル化合物であった。この不斉モノベンゾイル化は既に見出していた同様の不斉モノベンゾイル化と同等あるいはそれ以上の高い不斉収率であった。例えば、-40°Cでcis-1,2-シクロペンタンジオー及びcis-1,2-シクロヘキサンジオールでは86%ee、cis-1,2-シクロオクタンジオールでは93%eeであった。ラセミジオールの動力学的光学不斉分割も同様のモノカルバモイル化反応により達成されたが、その%eeは不斉非対称化におけるものよりも若干低かった。
保型形式と整数論

プリンストン大学志村五郎教授による本質的結果の1つである“The special Jalues of Zeta Functions arsociated with Hilbert modular forms,Duke Math,J.45(1978)に従って,1.2つのHilbert modular formsに対して定まるL-serierの特殊値を具体的に求める,2.この値に関してHilbert modular formsのFourier係数によって有理数体上に生成される有限次代数拡大体いわゆるHecke体の判別式及びこの判別式が与えるmodular formsの間の合同式の関係についての神秘的事実を発表すること.この1,2を,論文として“Hilbert modular L-values and discriminant of Hecke′s fields"Mem.Inst.Sci.& Eng.,Ritsumeikan Univ.,53(1994),112.に発表した.これは研究分担者の1人である石井秀則氏との共著である.本研究においては,2.にのべた合同式に力点をおいたため、上のL-valuesの分母について特に注目したが、将来の問題として当然その分子の持つ数論性が追求されなければならない,これは非常に重要な点であろう.さらに,上述のHecke体の判別式は,実は1変数のHauptおよびNeben型尖点形式に付随するsymmetric sguare L-seriesの問題としている尖点形式の重さにおける値と関連するという,カリフオルニア大学肥田晴三教授の発見があり,上の論文とは別に,近い将来これらを総合して論文として発表する予定がある。
国民健康保険制度の都道府県単位化に関する研究

保険財政共同安定化事業の対象医療費を1円以上とする国民健康保険の財政運営の都道府県単位化が与える影響についてシミュレーションを行った。分析の結果,財政運営の都道府県単位化によって被保険者の保険料(税)負担の格差はおおむね縮小し,政策目的のひとつである保険料の平準化は実現するが,県によっては共同安定化事業拠出金の按分方法によって保険料の平準化が実現しない可能性があることが明らかになった。本研究は国民健康保険(以下,国保)の都道府県単位化のシミュレーションを行い,制度変更の意義と限界を明らかにすることを目的とした。この目的を達成するため,本研究は次の3つの分析・調査を行った。(1)市町村国保の現状分析を行い,制度変更が何を解決するのかを明らかにする。/(2)インタビュー調査を行い,文献やデータでは明らかにならない点を明らかにする。/(3)国保の都道府県単位化のシミュレーション分析を行い,政策の評価を行う。最終年度は,(3)「都道府県単位化のシミュレーション分析」について行った。具体的には,A県(県名を非公表とすることを条件としてデータが提供された),千葉県,三重県,大阪府,広島県,B県(同),C県(同)の公表データおよび提供データを用いて,現在は対象医療費が30万円以上である保険財政共同安定化事業(保険者からの拠出金を原資とする)の対象医療費を1円以上とすることによる国保の都道府県単位化についてシミュレーションを行った。その結果,都道府県単位化によって被保険者の保険料負担の格差はおおむね縮小し,政策目的のひとつである保険料の平準化は実現するが,保険財政共同安定化事業拠出金の按分方法によっては非都市的な地域において拡大する可能性があることが明らかになった。都道府県単位化のシミュレーションを行うことによって,保険料の地域間格差に対する制度変更の影響を具体的に見ることができた。研究費申請時点においては,都道府県単位化は将来的に進められる制度変更であったが,研究期間中に厚生労働省から2015年度から国保の都道府県単位化を実施する方針が示されたため,本研究から得られる政策的インプリケーションは極めて大きくなった。現時点でも審議会等の資料でシミュレーションを行っているものは見当たらず,国保の都道府県単位化に関する先駆的な研究となったといえるであろう。本研究は国民健康保険(以下,国保)の都道府県単位化のシミュレーションを行い,制度変更の意義と限界を明らかにするものである。この目的を達成するため,本研究は次の3つの分析・調査を行うこととしている。(2)インタビュー調査を行い,文献やデータでは明らかにならない点を明らかにする。(3)国保の都道府県単位化のシミュレーション分析を行い,政策の評価を行う。今年度は,(1)および(2)の全て,(3)の準備について行うことを予定していた。(1)については保険財政共同安定化事業を中心に現状分析を行った。また,(2)については空知中部,大雪地区,後志の三広域連合(北海道),御坊市と,介護保険を広域連合で運営している福岡県の広域連合と沖縄県の広域連合の担当者に対してインタビュー調査を行うことができた。その中で都道府県単位化が保険財政共同安定化事業の対象医療費拡大によって行われるものであることを理解した。そして,保険財政共同安定化事業の対象医療費の拡大(これを1円以上とすると財政運営は都道府県単位化する)について検討を行っている佐賀県,青森県,長野県の担当者に対してインタビュー調査を行った。(3)についてはインタビュー調査で得た知見を踏まえて準備を行った上で,ある県の市町村について実際にシミュレーションを行うことができた。(1)については,保険財政共同安定化事業を中心に現状分析を行うことができたが,保険料(税)の収納率の問題について十分に検討を行うことができなかった。国保の都道府県単位化の課題のひとつである統一保険料の設定について検討するためには,収納率と保険料(税)の水準に関する現状分析は不可欠であり,次年度行うべき課題として残されている。(2)については,広域連合で国保を運営している団体を先進事例として位置づけ,インタビュー調査を行った。保険料格差の大きさから統一的保険料を設定せず,複数段階の地域別保険料を設定して保険料徴収を行っている団体の運営の状況や,広域的運営から脱退する自治体の行動要因などについて伺った。計画当初に予定していた内容についてはすべて行うことができた。さらに,保険財政共同安定化事業の対象医療費の拡大について検討を行っている佐賀県,青森県,長野県の担当者に対してインタビュー調査を行い,研究に必要な都道府県単位化の制度設計に関する具体的なイメージを得ることができた。(3)については,計画当初では準備のみを行うつもりであったが,インタビュー調査で得た知見を踏まえて準備を行った上で,ある県の市町村について実際にシミュレーションを行うことができた。具体的には保険財政共同安定化事業の対象医療費を1円以上に引き下げた場合の国保特別会計に与える影響と単一のモデル家計における保険料(税)負担の変化について,定量的に明らかにすることができた。

したがって,達成率を定量的に示すとすれば,(1)が50%程度,(2)が100%,(3)が100%より大であると言える。当該年度の分析・調査に基づき,保険財政共同安定化事業を1円以上とした場合の影響と,統一保険料の設定について検証可能な形でシミュレーションの前提を構築し,複数の県の市町村について検証を行う。国保の都道府県単位化による家計負担の変化や,そのことによって予想される収納率の変化がどの程度になるのかを明らかにすることが中心的課題となる。シミュレーションの方法としては,モデルケースをいくつか作成して市町村国保における家計負担を算出した上で,これが都道府県単位化にどのように変化するのかを検証する形になる。実際の所得分布や世帯構成を踏まえた上で,モデルケースを設定することになる。シミュレーションを行う際に必要となるデータは,保険財政共同安定化事業を1円以上とした場合の医療費(保険財政共同安定化交付金)と,保険財政共同安定化拠出金のデータであるが,都道府県によってはこれらのデータを提供してくれないというところもいくつか出てくるものと考えられる。データ入手可能な自治体のみでシミュレーションを行い,そこからのみ結論を得ることは避けるべきことである。本来であれば,すべての市町村に関して分析を行うべきであるので,極力データの提供をお願いしたい。データの提供がなされない場合の対応は今後の研究を推進する上で大きな課題として存在している。なお,2015年度から厚生労働省は国保の都道府県単位化を実施する方針を示しているが,審議会等の資料でシミュレーションを行っているものは見当たらない。したがって,本研究から得られる政策インプリケーションは極めて重要なものになると言える。研究の進捗状況を踏まえ,次年度は下記のような形で研究費を使用する。引き続き現状分析を行うため,物品費を10万円(地方財政論・社会保障論関係図書費として5万円,ソフトウェア購入費として5万円)計上する。保険財政共同安定化事業を1円以上とした場合の影響と,統一保険料の設定について検証可能な形でシミュレーションの前提を構築し,複数の県の市町村について検証を行う。これに必要なデータを入手するため,当該年度にシミュレーションを行った以外の46都道府県からの紙データでの提供に備え,データ入力委託費20万円を計上する。また,データを提供していただくに当たって直接お話を伺う場合に備え,旅費10万円を計上する。専門的知識の提供と資料整理に対する謝金として10万円計上する。複写費として5万円計上する。そして,研究実績の公表のため,報告書印刷費として5万円を計上する。
in vivo異所発現スクリーニングによる神経細胞死実行機構の解析

昨年度までの研究結果から、ショウジョウバエTNFが誘導する細胞死においては、その下流でTNFレセプターであるWengenによってシグナルが細胞内に伝えられ、さらにjunN-terminal kinase (JNK)経路の活性化を介して最終的に細胞死が誘導されることを遺伝学的に証明してきた。今年度は、さらにEigerによって誘導される細胞死を抑制する変異体系統について詳細な解析を行った結果、ミトコンドリアのエネルギー産生に関連する遺伝子の発現を抑制することでこの細胞死が顕著に抑制できることが明らかとなった。これまで細胞死におけるミトコンドリアの関与については、ストレス刺激時にチトクロムcが細胞質に放出され、アポトソームと呼ばれる複合体を形成することでカスパーゼを活性化し細胞死を誘導すると言うメカニズムが広く知られていたが、本研究から、チトクロムcの放出以外にもミトコンドリアのエネルギー代謝そのものが細胞死の制御に関わっていることが強く示唆される。細胞にエネルギー代謝の基質の1つであるピルビン酸を添加すると過剰なエネルギー産生を伴って細胞死が誘導されるとの報告もあることから、本研究結果は細胞死におけるミトコンドリアの新たな機能を示す始めての生体レベルでの解析である。研究については論文としてまとめられる形になっているため、現在国際雑誌に論文を投稿中である。研究代表者はショウジョウバエを用いてgene search(GS)システムにより神経細胞死実行因子のスクリーニングを行った。本システムは転写因子GAL4の標的配列であるUAS配列をP-element内部に有するベクターをゲノム中にランダムに挿入した系統(GS系統)を用い、GAL4依存的に任意の遺伝子を強制発現させるシステムである。本研究では複眼特異的なGMRプロモーターでGAL4をドライブし、複眼の表現型を指標にスクリーニングを行った。約5000のGS系統について解析を行い、複眼が縮小する6系統を得た。そのうち一系統の責任遺伝子はショウジョウバエTNF superfamily分子をコードすることが分かり、この分子をEigerと命名した。eigerはショウジョウバエの発生過程で神経系に発現しており、eigerにより誘導される神経細胞死ではJNK経路の活性化を伴った。現在、Eigerの下流シグナル分子を明らかにする目的で染色体欠失系統を用いたスクリーニングを行っている。Eigerを複眼特異的に過剰発現する系統と一連の染色体欠失系統とを交配し、Eigerによる複眼の縮小を抑制する系統をスクリーニングし、現在までに20の抑制系統を得た。解析の結果、一系統の欠失領域内にショウジョウバエTNF receptor superfamily分子をコードする遺伝子が含まれることが明らかとなり、この分子をWengenと命名した。Eigerによる複眼の縮小はWengenのRNAiにより抑制されること及びin vitroにおいてEigerとWengenはTNF及びTNF receptorのhomology domainを介して結合することから、WengenはEigerのレセプター機能分子であると考えられる。今後はWengenの生理機能の解析を進めると共にスクリーニングにより得られた分子についても機能解析を進めていく。in vivo異所発現スクリーニングによる神経細胞死実行機構の解析を行う目的で、ショウジョウバエTNF superfamily ligandであるEigerの下流分子の網羅的探索を行った。ショウジョウバエ複眼特異的にEigerを過剰発現させると、過剰な細胞死を伴った複眼サイズの縮小が観察される。このトランスジェニックショウジョウバエと、一連の染色体欠失系統とを交配し、F1世代でEigerによる複眼サイズの縮小を抑制する系統をスクリーニングした(1次スクリーニング)。1次スクリーニングで得られた染色体欠失領域内に、Eigerの下流分子をコードする遺伝子が含まれていると考えられる。その原因遺伝子領域を狭めるために、1次スクリーニングで得られた領域と欠失領域が部分的に重複している複数の欠失系統を用いて2次スクリーニングを行った。2次スクリーニングで得られた染色体領域内に存在する遺伝子の単一変異体系統とEigerとの遺伝学的相互作用を調べることで最終的に複数の下流分子候補を得た。現在までに複数の分子に関して解析を行っており、それらの1つに関しては、さらに詳細な機能解析及び生理機能の解析を行う目的で、遺伝学的な解析と併行して現在機能欠失型変異体ショウジョウバエの作製を試みている。この分子はショウジョウバエのすべての発生過程、及び成体で発現が認められており、また申請者によって、Eigerと直接結合することが確認されている分子であるため、Eigerのシグナル伝達機構を理解する上で重要な役割を担っていると考えられる。また、他の下流候補分子として、ミトコンドリアを介するエネルギー代謝に関わる複数の分子を得ており、Eigerシグナルとの関係、及び生体内での機能について遺伝学的及び生化学的解析を進めている。

これまで細胞死におけるミトコンドリアの関与については、ストレス刺激時にチトクロムcが細胞質に放出され、アポトソームと呼ばれる複合体を形成することでカスパーゼを活性化し細胞死を誘導すると言うメカニズムが広く知られていたが、本研究から、チトクロムcの放出以外にもミトコンドリアのエネルギー代謝そのものが細胞死の制御に関わっていることが強く示唆される。細胞にエネルギー代謝の基質の1つであるピルビン酸を添加すると過剰なエネルギー産生を伴って細胞死が誘導されるとの報告もあることから、本研究結果は細胞死におけるミトコンドリアの新たな機能を示す始めての生体レベルでの解析である。研究については論文としてまとめられる形になっているため、現在国際雑誌に論文を投稿中である。
オリゴデンドロサイト関連遺伝子発現制御に着目した初期精神病状態介入法の開発

本研究では、『核内受容体がオリゴデンドロサイト関連遺伝子群の挙動を制御することにより統合失調症の病態に関与する』との仮説に基づき解析を行った。OLP6細胞株(未分化オリゴデンドロサイト系細胞)を用いた解析から、核内受容体RXR ligand添加によりオリゴデンドロサイト関連遺伝子群の発現が変動することを見いだした。また、野生型マウスに対するRXR agonist経口事前投与により、幻覚惹起物質として知られるMK-801に対する感受性が減弱することを見いだした。また、ヒトの毛根細胞を用いた解析から、統合失調症群では対照群と比較してRXRA遺伝子の発現が低下していることを明らかにした。研究の目的:統合失調症は一旦発症すると完治が困難であるため、発症機序解明と発症予防法開発が疾患研究にとって重要な目標と言える。統合失調症の原因については、種々の状況証拠からオリゴデンドロサイトやその前駆細胞の機能低下が病態形成に関与する可能性が想定されているが、決定的な発症機序解明には至っていない。本研究では、オリゴデンドロサイトを起点として統合失調症発症機序の少なくともその一端を解明し、また、難治として知られる統合失調症に対して発症予防法開発のパラダイムの手がかりを得ることを目的として解析を行う。研究成果の内容:OLP6細胞株(未分化オリゴデンドロサイト系細胞)に対する核内受容体RXRのパンアゴニストBexaroteneの添加実験を行い、Bexaroteneを添加した細胞ではオリゴデンドロサイト関連遺伝子群(Olig2, Cldn11, Mal, Mbp-long)の発現が上昇することを見出した。また、Bexaroteneを長期連続投与したマウスの前頭前野では、オリゴデンドロサイト関連遺伝子であるOlig2遺伝子の発現が上昇することを見出した。これらの結果は、核内受容体がオリゴデンドロサイト関連遺伝子群の発現を上位で制御する可能性を示唆している。意義・重要性:本研究により、統合失調症関連遺伝子として知られるオリゴデンドロサイト系遺伝子群の発現に核内受容体制御が重要であることが示された。この結果は、核内受容体を中心とした全く新しい統合失調症病態メカニズムの検討につながるため、統合失調症研究を大きく進歩させる可能性がある。平成27年度は、予定通りOLP6細胞株を用いた核内受容体リガンド添加実験を実行した。遺伝子導入実験、レポータージーンアッセイについても同時に進行したが、結果を得るには至らなかったため、概ね順調に進展している、と評価するに留めた。研究目的:種々の状況証拠からオリゴデンドロサイトやその前駆細胞の機能低下が統合失調症の病態形成に関与する可能性が想定されているが、決定的な発症機序解明には至っていない。本研究では、「オリゴデンドロサイト関連遺伝子の発現を脂質関連の核内受容体(転写因子)が上位で制御する可能性」に着目して解析を行った。平成28年度の研究実績:(1) OLP6細胞株(オリゴデンドロサイト系細胞)に対してRXRパンアンタゴニストHX531の添加実験を行った結果、HX531を添加した細胞ではオリゴデンドロサイト系遺伝子Cldn11, Mbpの発現が低下することを見出した。(2)培養細胞の系でオリゴデンドロサイト系遺伝子の発現を負に制御すると判断されたRXRパンアンタゴニストHX531を野生型マウスに腹腔内投与し、精神疾患関連行動試験を行ったところ、HX531投与マウスではY迷路試験、オープンフィールド試験に行動変化が認められた。(3)毛根細胞を用いた診断技術を開発する目的で、健常者および統合失調症患者の毛根細胞を用いて遺伝子発現解析を行った結果、統合失調症の毛根細胞において一部の核内受容体遺伝子の発現低下が認められること、核内受容体遺伝子の発現がオリゴデンドロサイト系遺伝子の発現と正相関すること、を見出した。意義・重要性:本研究により、(1)統合失調症関連遺伝子として知られるオリゴデンドロサイト関連遺伝子の発現を脂質関連の核内受容体(転写因子)が上位で制御する可能性、(2)核内受容体/オリゴデンドロサイトのパスウェイが統合失調症の病態生理と関連する可能性、が示された。この結果は、核内受容体を中心とした全く新しい統合失調症病態メカニズムの検討につながるため、統合失調症研究を大きく進展させる可能性がある。平成28年度は、培養細胞を用いて核内受容体によるオリゴデンドロサイト系遺伝子発現制御機構の検証を行った。また、核内受容体の機能低下と統合失調症発症脆弱性との因果関係を個体レベルで明らかにするため、薬理学的動物モデル(核内受容体アンタゴニスト投与マウス)を用いて、精神疾患関連行動試験を行った。さらに、バイオマーカーを開発する目的で、健常者および統合失調症患者から採取した毛根細胞を用いて核内受容体遺伝子およびオリゴデンドロサイト系遺伝子の遺伝子発現解析を行った。ヒト生体試料を用いた解析は、当初の予定にはなかったが、統合失調症の病態生理と核内受容体/オリゴデンドロサイトのパスウェイを検証するために必要な項目であると考え、解析を実施することにした。その他の実験は、当初予定していた項目である。よって、概ね順調に進展していると判断した。OLP6細胞株(未分化オリゴデンドロサイト系細胞)を用いた解析から、核内受容体RXR ligand添加によりオリゴデンドロサイト

関連遺伝子群の発現が変動することを見いだした。また、野生型マウスに対するRXR agonist経口事前投与により、幻覚惹起物質として知られるMK-801に対する感受性が減弱することを見いだした。また、ヒトの毛根細胞を用いた解析から、統合失調症群では対照群と比較してRXRA遺伝子の発現が低下していることを明らかにした。平成28年度は、核内受容体によるオリゴデンドロサイト系遺伝子発現制御機構を検証するため、OLP6細胞株を用いた遺伝子導入実験、レポータージーンアッセイを予定している。また、マウス個体に対するリガンド投与実験も行い、統合失調症関連行動に対する影響についても調べる予定である。1.最終年度は、統合失調症の病態メカニズムと核内受容体/オリゴデンドロサイトのパスウェイをさらに深く追求するため、遺伝子改変マウスを用いた解析を実施する予定である。既に、CRISPR-Cas9n法によりRxraノックアウトマウス、Pparaノックアウトマウスを作製し、解析の準備を行っている。これらのマウスを用いて、精神疾患関連行動解析を行い、統合失調症様表現型の有無を検証する。さらに、これらのマウスの脳の遺伝子発現解析を行い、オリゴデンドロサイト系遺伝子の発現変動の有無を検証する予定である。2.統合失調症モデル動物に、核内受容体アゴニストを投与して治療効果の有無を検証する。モデルマウスに核内受容体アゴニストを投与し、統合失調症関連の行動変化が改善するか、組織学的異常が改善するか、等を検討する。精神医学平成27年度に行う予定だった培養細胞を用いた解析の一部を平成28年度に繰り越したため、平成28年度にその実験に必要な試薬代を購入したいため。統合失調症モデル動物に投与するための、核内受容体アゴニストを購入する。1)核内受容体アゴニストは価格が高い、2)効果が発現するまで3週間以上かかることが判明した、以上の理由により、試薬購入費が当初の予定より高額となった。培養細胞を用いた解析を行うため、分子細胞生物学的実験・生化学実験・遺伝子発現解析に関連する試薬を購入する統合失調症モデル動物に対して、治療効果の検証のため3週間から1ヶ月程度核内受容体アゴニストを投与する。これらのマウスを用いて、精神疾患関連行動解析を行い、統合失調症様表現型の改善の有無を検証する。
動作制御に占める空間識の研究

1)空間識と動作の係わりの実験化受動的な移動(乗り物)でも、運転者と乗客では、感覚ばかえいでなく動作や平衡維持が大きく異なってくる。これより、脳内の知覚内容が、感覚や動作の内容を決定していると考えられる。今回は回転台を用いたコリオリ刺激実験で、この仮説を起立制御と眼球運動で証明することに成功した。2)回転台の製作回転中に頭部を傾斜すると、奇妙な眼球運動や重心の移動が観察される、従来、これらの現象は複雑に解釈されてきた。今回は、回転台上に重心動揺計を設けて起立させ、同時にCCDビデオ・カメラを装着し、重心移動と眼球運動を経時的に記録した。この結果、コリオリ刺激中、重心と眼球運動を同時に、遮眼と裸眼の条件で記録することが可能となった。これらの記録を分析した結果、眼球も重心も、脳内に想定される外界空間の運動ベクトルを、忠実に反映していることが判明した。3)受動動作と能動動作の制御原理の解明回転中、遮眼であると回転は知覚されないので、脳内の外界空間は静止している。。そこにコリオリ刺激が加わると、脳内の空間はこの入力にベクトル的に占拠され、眼球も重心もこれに伴う。奇妙な眼球運動と重心の移動が起こる(時に転倒する)。一方、回転中裸眼であれば、視覚入力は脳内の外界空間を反対方向に移動させる。ここにコリオリ刺激が加わると、脳内空間も頭部と共に移動するが、前庭入力とベクトル計に加算され、結果的に脳内空間は外界を表現し続ける。つまり、当初の仮説が、実験的に裏付けられた。。1)回転テーブルの作成空間識が眼球運動、身体骨格系に及ぼす影響を同時に調べるため、直径が100cm、高さが31cm、重量が85kgの回転テーブルを作成した。テーブルの回転速度を毎秒7度から127度まで無段階に調節することが可能である。安全を考え、回転テーブルの周囲にド-ナツ状に幅50cmの踊り場を設けた。2)空間識が眼球運動に及ぼす影響の記録回転テーブル上で被験者が頭部を傾斜した時(コリオリ刺激)、誘発される眼球運動を記録するために、赤外線CCDビデオ・カメラを頭部に固定する装置を作成した。本装置により、被験者が速い速度で頭部を移動する際の眼球運動を、確実に記録することが可能になった。3)空間識が起立動作に及ぼす影響の記録回転テーブル上でコリオリ刺激が起立に及ぼす影響を記録するために、重心動揺計をテーブル上に設置し、回転に影響されずに足圧中心を記録できるアタッチメントを開発した。さらに、回転テーブル上にビデオ・カメラを固定し、頭部傾斜中の身体動揺を記録できるよう工夫した。4)健康者における記録上記の装置を用い、健康者数名で最適な回転速度、頭部傾斜方向、傾斜角度を調べた。現在までに、コリオリ刺激で確実に回旋成分の強い眼球運動と重心の移動を、同時に記録することに成功している。これら奇妙な眼球運動と頭部傾斜方向と異なる重心移動は、共に同じ原理で説明可能な事実が判明しつつある。今後は、検定に耐える対象数で定量的に分析し、空間識が動作制御に占める役割を明らかにしてゆく予定である。1)回転テーブルによるコリオリ刺激実験昨年度作製した回転テーブルを用いて、健康者6名に加え、2名の両側前庭機能消失者で、コリオリ刺激実験を行った。回転テーブル上に重心動揺計を置き、被験者を開脚起立させ、一眼にCCDビデオ・カメラを装着し、他眼を遮眼した。

回転台を加速した後、一定速度で維持し、被験者に頭部の前屈や後屈、右傾斜や左傾斜を指示した。以下の結果が得られた。健康者では例外なく、重心は前屈で左に、後屈で右に、右傾斜で前方に、左傾斜で後方に移動した。眼球運動は、前屈で反時計方向回旋性(被験者からみて)、後屈で時計方向回旋性、右傾斜で上眼瞼向き垂直性、左傾斜で下眼瞼向き垂直性の、それぞれ眼振を数秒間認めた。重心の移動と眼振の方向は、コリオリで誘発される脳内ベクトルを忠実に反映していた。一方、両側前庭機能消失者では、回転中に頭部を傾斜しても、明らかな重心の移動や眼振は観察されなかった。これらの事実から、コリオリ刺激中の重心の移動は、頭部移動による物理的な結果ではなく、前庭器を介する脳内の環境の変化によるものと、結論された。同時に、一見複雑な眼球運動や重心移動が、極めて単純なベクトルの原理に従っていることが判明した。健康者の裸眼では、同じ頭部傾斜でも、これらの重心の移動や奇妙な眼振は観察されない。この結果は、視覚から空間の移動がベクトルとして脳内に再現され、前庭器からの入力とベクトル的に加算されることで、合理的に説明可能である。2)研究成果の出版現在、研究成果を論文として準備中である。
地方大都市の社会病理に関する総合的研究-北九州のばあい-

都市病理と生活福祉の視点より、北九州市を調査、研究を行ない、とくに昭和38年の旧5市合併以来、また前回調査(昭和62年度文部省科学研究費補助)以後の都市の状況、生活環境の変遷と市民の生活の実態について既存の調査資料、報告書の収集と分析、また総合的研究を以下の項目によって、各研究分担者、研究協力者に行なった。この期間に、基盤産業であった製鉄とその関連産業を主要とする産業構造の変化、それに伴う人口構造の変化、インナーシティの現象等は都市の構造的変化とともに、地域社会の諸機能、家族、教育、福祉、医療等に、また意識構造に変化が見られる。今回の調査が都市病理だけではなく、生活と福祉の分野、さらに生活を含めた社会計画、福祉の分野を含めたのこのためである。研究分野の項目は以下のとおりである。I.都市病理と生活福祉(本調査の概説)、II.基礎構造の問題、1.地域の生活構造、2.人口、3.産業構造と労働問題、4.歴史と文化構造、III.健康問題、1.障害児(者)問題、2.アルコール依存、3.精神障害、4.薬物依存、IV.問題行動、1.犯罪、2.非行、3.自殺、4.売春、5.不登校、登校拒否、V.家族問題、1.老人問題、2.単親家族、3.生活保護・所得保障、4.養護児童、5.離婚、VI.地域環境問題、1.交通、2.住宅と生活環境、VII.電話相談に見る生活問題その他、VIII.人権と差別の問題、IX.社会計画、X.結び。北九州市の都市問題として、基礎構造としての人口、産業、雇用、歴史的背景と文化等は、現代の日本の社会の特性とともに、地域社会としての歴史的、地理的状況と特性も見ることができる。その基礎的構造の作用されながら、生活基盤としての地域・家族の機能の低下をもたらし、生活困難を派生している。しかしその中に新しい公私の取組みも始まっている。研究の第1年目に当たり,研究分担者6名,研究協力者15名の計21名をもって,研究体制を組織した.これにより本研究全体の構成と研究領域の分担を協議した.研究内容の構成は, 1序言(都市病理と生活福祉), 2基礎構造の問題(生態構造,産業と労働,文化と歴史,環境と余暇),3健康問題(障害者,薬物・アルコール依存,精神障害),4問題行動(犯罪,非行,自殺,売春),5家族問題(老人問題,単親家族,生活保護,低所得,養護問題,離婚),6学校問題(不登校,学業不信,学校での問題行動),7地域環境問題(交通,住宅,公害),8電話相談にみる生活問題,9人権と差別の問題, 10社会計画とした.各分担者,協力者は,関係機関,団体と連絡して,既存の文献,調査,統計の資料の収集に当った.なお,研究会において,現在の北九州市を社会学的に考察するための基礎構造としての人口の推移,分布,移動の状況等の分析,歴史的,文化的背景,地理的状況と土地利用の状況,産業立地等について全体研究会を開き,相互に意見の交換を行った.児童・障害児の分野においては,児童相談所の関係者との協議を重ね,現状の分析,要因となる家庭,地域,学校さらに当事者の人格的要因の検討を継続している.基礎構造の分野では,基礎産業とりわけ,製鉄,石炭を主要としてきた本市において,産業構造の変化から,人口の流出,自然増の減少,急速な人口高齢化を呈し,生活環境としての機能の低下は,家族,地域社会,人格と人間関係の側面にも病理現象を生じており,本研究の課題として,都市病理の分析にとどまらず.生活福祉,社会計画の領域に示唆を提供しうる内容も含むことを共通の理解とし,次年度に研究のまとめを完了することにした.都市病理と生活福祉の視点より、北九州市を調査、研究を行ない、とくに昭和38年の旧5市合併以来、また前回調査(昭和62年度文部省科学研究費補助)以後の都市の状況、生活環境の変遷と市民の生活の実態について既存の調査資料、報告書の収集と分析、また総合的研究を以下の項目によって、各研究分担者、研究協力者に行なった。
重度侵襲性歯周炎原因細菌による新規病原機構の解析

Aggregatibacter actinomycetemcomitansは侵襲性歯周炎の発症に関与する口腔細菌で、外毒素であるロイコトキシン(LtxA)を産生する。LtxA高生産株(JP2株)により重篤な症状が引き起こされることから、LtxAの性質とその病原性の関連性の解析を行った。これまでに、TLR4欠損マウス由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系でLtxAが破骨細胞の分化に影響することを示してきた。本年度はマウス由来の骨髄マクロファージを調整し、濃度依存的にLtxを添加し破骨細胞への分化を評価した。しかし、本実験系ではマクロファージからの分化が確認できず、逆に細胞数が減少する結果となった。このことからLtxA単独でマクロファージから破骨細胞への分化能がないことが示唆された。また、ロイコトキシンの配列による細胞への影響を評価するために、JP2以外の株からのLtxAの精製を試みた。Y4株からの精度の高いロイコトキシンの精製には成功したが、量が少なく細胞実験には用いられなかった。そこで、異種発現系の構築のためのコンストラクト作成を行っている。一方、LtxAの高次構造解析に向けて、タンパク質の精製を行った。LtxAが3つのドメインからなっているため、ドメイン毎の精製を行うための発現系の構築を行った。昨年度カルシウムが構造安定性に関与することが示されていたので、カルシウム存在下で精製を行った。現在、結晶化条件の検討を行っている。侵襲性歯周炎の発症に関与するAggregatibacter actinomycetemcomitansは、その菌株間で病原性に差異がある。特に、外毒素であるロイコトキシン(LtxA)高生産株(JP2株)により重篤な症状が引き起こされている。そこで、我々はその病原性の違いにLtxAとLPSの性質が関与している仮定し、ロイコトキシン高生産株とそれ以外のserotypeの菌株由来のLtxAおよびLPSを比較解析することで、侵襲性歯周炎の発症機構の解明を目的としている。平成28年度は、「LPSとLtxAの相乗効果の解析」と「LtxAのアミノ酸配列による単球・白血球への影響解析」を目的とした。そこで1「共存培養系を用いたLtxAによる骨吸収活性解析」、2「様々なserotypeからのLtxA精製」、3「LtxAの高次元構造解析」を目標に研究計画を立てた。1LPSの影響を少なくするため、細胞培養系にはTLR4欠損マウス由来の細胞を用いた。TLR4欠損マウス由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系に精製LtxAを添加し、LtxAによる破骨細胞の分化・活性化を評価した。その結果、LtxA濃度依存的な破骨細胞への分化が確認された。このことよりLtxAによる直接的な骨吸収機構の存在が示唆された。2JP2株の培養液上清から、ゲルろ過クロマトグラフィーにて純度の高いLtxAの精製に成功した。しかし、JP2株以外の菌株のLtxA産生量は低く、純度の高い高濃度のタンパク質を精製出来なかった。そこで、現在は異種発現系を用いたタンパク質発現を検討している段階である。3純度の高い精製LtxAを得ることが出来たため、未だ明らかとなっていないLtxAの高次元構造解析を行うことにした。現在は結晶化条件の検討を行っている段階である。平成28年度は、1共存培養系を用いたLtxAによる骨吸収活性解析、2様々なserotypeからのLtxA精製、3LtxAの高次元構造解析を行った。1TLR4欠損マウス由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系に精製LtxAを添加することで、破骨細胞の分化が確認された。しかし、その分化には1μg/mlと高濃度のタンパク質が必要であった。2LtxA高生産株であるJP2株からはゲルろ過クロマトグラフィーを用いることで精製度の高いLtxAを精製することに成功した。しかし、別のserotypeの菌種からのLtxA精製を試みたが、LtxA産生量が少なく容易に精製することが出来なかった。そこで、大腸菌などを宿主にした異種発現系でLtxAの発現させることで、様々なLtxAを精製することにした。現在は異種発現系の確立を行っている状況であり、当初の計画より遅れている。LtxAとその受容体であるLFA-1の相互作用およびLtxAの孔形成機構を解明するためには、その高次元構造の解明が必要と考えた。そこで、2で精製したLtxAを用いてX線構造解析のための、結晶化の条件検討を行った。これまでに約1500条件以上での条件検討を行ったが、結晶を得ることが出来なかった。現在も結晶化の条件検討を行っている状況である。侵襲性歯周炎の発症に関与するAggregatibacter actinomycetemcomitansは、外毒素であるロイコトキシン(LtxA)を産生する。前年度にTLR4欠損マウス

由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系に精製LtxAを添加することで、LtxA濃度依存的な破骨細胞への分化が確認された。そこで、本年度は熱処理LtxAを用いた破骨細胞の分化との比較実験を行った結果、熱処理LtxAによる破骨細胞形成が有為に減少した。このことよりLtxAが破骨細胞への分化に関わることが示唆された。次に、LtxAによる骨髄細胞から破骨細胞への影響を調べるため、TLR4欠損マウス由来の骨髄細胞に精製LtxAを添加し、破骨細胞の分化を評価した。現在は最適な濃度や細胞数などの条件検討を行っている。また、LtxAの作用機序を解析するため、LtxAの高次元構造解析を試みた。昨年に引き続き結晶化の条件検討を行ったが、結晶を得ることが出来なかった。そこで、LtxAの構造安定性を調べた結果、構造安定性にカルシウムが重要であること、精製過程中に自己分解が行われることが判明した。このことにより全長での解析が困難である判断し、ドメイン毎での構造解析を行うことにした。現在は、各ドメインでの発現・精製を行っている最中である。1. TLR4欠損マウス由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系に精製LtxAを添加することで、熱処理LtxAによる破骨細胞分化と比較し、有為に破骨細胞数の増加がみられた。2. LtxAを用いてX線構造解析のための、結晶化の条件検討を行ったが、X線構造解析に使用可能なLtxAの取得には至らなかった。Aggregatibacter actinomycetemcomitansは侵襲性歯周炎の発症に関与する口腔細菌で、外毒素であるロイコトキシン(LtxA)を産生する。LtxA高生産株(JP2株)により重篤な症状が引き起こされることから、LtxAの性質とその病原性の関連性の解析を行った。これまでに、TLR4欠損マウス由来の骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系でLtxAが破骨細胞の分化に影響することを示してきた。本年度はマウス由来の骨髄マクロファージを調整し、濃度依存的にLtxを添加し破骨細胞への分化を評価した。しかし、本実験系ではマクロファージからの分化が確認できず、逆に細胞数が減少する結果となった。このことからLtxA単独でマクロファージから破骨細胞への分化能がないことが示唆された。また、ロイコトキシンの配列による細胞への影響を評価するために、JP2以外の株からのLtxAの精製を試みた。Y4株からの精度の高いロイコトキシンの精製には成功したが、量が少なく細胞実験には用いられなかった。そこで、異種発現系の構築のためのコンストラクト作成を行っている。一方、LtxAの高次構造解析に向けて、タンパク質の精製を行った。LtxAが3つのドメインからなっているため、ドメイン毎の精製を行うための発現系の構築を行った。昨年度カルシウムが構造安定性に関与することが示されていたので、カルシウム存在下で精製を行った。現在、結晶化条件の検討を行っている。当初は、serotypeの異なるLPSを用いた骨吸収の比較解析とLtxAとの相関関係解析を行う予定であったが、精製LtxAを得ることが出来たため、平成29年度に計画していたLtxAによる骨吸収活性解析を前倒しで行った。平成29年度は引き続きLtxAによる骨吸収活性解析とLPSの影響を解析して行く予定である。LtxAのアミノ酸配列による単球・白血球への影響解析については、様々な菌株からのLtxAの精製が困難だったため、大腸菌あるいは枯草菌を宿主にした異種発現系の確立を行う予定である。