hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結晶構造から解き明かす光合成の光捕集・光電変換とキノン輸送の分子機構

本研究では、先に決定した紅色光合成細菌由来の光捕集反応中心超分子複合体LH1-RCの結晶構造(Nature 508, 228; 2014)に基づいて、(1)光捕集複合体の吸収挙動と構造安定性を制御する構造要因の特定、(2)キノン輸送機構の解明、(3)反応中心複合体の構造と特性の再検証、(4)膜リン脂質と複合体との間に存在する特異的な相互作用の解明を目的とする。さらに、(5)より高分解能での結晶構造解析を目指す。2017年度に行った上記計画の項目(1)、(2)と(3)に関連するキメラ型光捕集反応中心複合体LH1-RCの作製、特性評価と構造解析に続き、2018年度は項目(4)と(5)に取り組み、大きな進展があった。5種類の紅色硫黄及び非硫黄細菌の光合成膜中に含まれるリン脂質の組成および単離精製された光捕集反応中心複合体LH1-RCに結合しているリン脂質を31P-NMRと誘導結合プラズマ蛍光発光(ICP-AES)測定によって同定し、リン脂質組成と菌体の生育条件や膜タンパク質の性質との関連性を調べた。ほとんどの光合成細菌から精製されたLH1-RCにはカルジオリピン(CL)が主成分であることが判明され、膜中でマイナー成分のCLがLH1-RCに特異的に強く結合していることが示唆された。一方、好熱性光合成細菌Tch. tepidumから単離されたLH1-RCについてさらに高分解能での結晶構造解析に成功した。前述リン脂質の結果はこのLH1-RCの高分解能構造からも確認され、CLがLH1-RC複合体の機能発現と構造安定性に大きな役割を果たしていることがわかった。これらの成果はNature誌(Nature 556, 209; 2018)と国際学術誌(Biochim. Biophys. Acta-Bioenergetics 1860, 461; 2019)に掲載された。本補助金を受ける前から通常の菌体培養から色素タンパク質複合体の精製、リン脂質の特性評価までの手法が確立され、各種予備実験などを行ってきたため、本研究課題をスムーズに進行させることができた。3年目の2018年度は性質が少しずつ異なる5の種類の光合成細菌から膜及びLH1-RCのリン脂質分析を手がけたため、結果の再現性確認に長い時間がかかったことはあったが、研究協力者たちとの努力によって14年の歳月をかけて取り組んできた広範な光合成細菌における膜組成とリン脂質分布ならびに単離された光合成複合体に特異的に結合しているリン脂質の定量評価を行うことができた。また、この成果を速やかに学会発表と国際学術論文誌を通して社会に発信することができた。以上のことを総合的に判断した結果、上記の評価とした。これまでの成果を踏まえ、今後低温電子顕微鏡(Cryo-EM)による光合成細菌のLH1-RC複合体の構造解析を計画してる。近年急速な発展を見せているクライオ電子顕微鏡による単粒子解析は、タンパク質の構造解析において不可欠な手法になりつつある。この手法の利点として、結晶化の必要がなく(構造決定にかかる時間が短い)、少量の試料(数十μg程度)で可能、サイズの大きいタンパク質複合体を得意とすることなどが挙げられる。古くから電子顕微鏡は細胞、組織、巨大な複合体など様々な生体物質の形状観察に利用されてきたが、最近この分野の高分解能化は主に試料調製法の確立、高性能カメラの開発と画像処理技術の進歩によって実現されている。2019年度では、まず数種類の紅色細菌のLH1-RC複合体について、測定条件のスクリーニングを行い、高分解能の構造解析を目指す。一方、極限環境下に生息する光合成細菌のLH1-RC複合体の単離精製と特性評価を行う予定である。その多くは特異な生化学的性質と分光学的挙動を示すことが知られ、その構造的要因を特定することにより、これらの微生物の生存戦略の一端を明らかにすることが期待できる。本年度は当初の実施計画に沿って、好熱性光合成細菌Tch. tepidum由来のLH1-RC複合体を単離精製する段階から、Ca2+と同族のMg2+、Sr2+、Ba2+やCa2+と同じイオン半径をもつCd2+、荷電数は異なるがほぼ同じイオン半径をもつDy3+を添加し、Ca2+との置換反応を行った。置換されたLH1複合体の近赤外吸収極大はいずれもCa2+のものに比べ、約25nmブルーシフトした。これらの金属置換LH1-RCの内、Sr-LH1-RCとBa-LH1-RCから比較的良質な結晶が得られたため、X線構造解析を行った。予想に反して、LH1中におけるSrとBaの結合部位はCaのものと異なっていたことが判明した。

Caの場合LH1-αとβ鎖で構成された二重リングの間にCaイオンが均等に位置し、リンカーとして両リングを架橋して強固な二重リングネットワークを形成しているのに対して、SrとBaの場合内側のαリングのみが架橋され、一重のリング構造を形成していることを突き止めた。この特異な構造によって色素の配向性に変化が生じ、吸収極大がブルーシフトするとともにLH1-RC全体の熱安定性の低下を引き起こしていると考えられる。これらの成果は学会および国際学術誌にて発表した。本補助金を受ける前から菌体の培養から色素タンパク質複合体の精製、特性評価まで各種予備実験などを行っていたため、本研究課題をスムーズに開始させることができた。期間中、良質な結晶が得られない状態が長く続いたことやX線回折データの解析に予想より時間がかかったことはあったが、協力研究者たちとの努力によって長い年月をかけて取り組んできた金属置換LH1-RCの結晶構造を決定することができた。また、その成果を速やかに学会発表と国際学術論文誌を通して社会に発信することができた。以上のことを総合的に判断した結果、上記の評価とした。本研究では、先に決定した紅色光合成細菌由来の光捕集反応中心超分子複合体LH1-RCの結晶構造(Nature 508, 228; 2014)に基づいて、(1)光捕集複合体の吸収挙動と構造安定性を制御する構造要因の特定、(2)キノン輸送機構の解明、(3)反応中心複合体の構造と特性の再検証、(4)膜リン脂質と複合体との間に存在する特異的な相互作用の解明を目的とする。さらに、(5)より高分解能での結晶構造解析を目指す。本年度は上記計画の項目(1)、(2)と(3)に関連して、キメラ型光捕集反応中心複合体LH1-RCの作製、特性評価と構造解析に取り組んだ。常温菌では、LH1の近赤外領域における吸収極大(Qy遷移)が880nmに位置するのに対して、本研究で用いる好熱性光合成細菌Tch. tepidum由来のLH1は約35nmも長い915nmに吸収極大をもっている。これらの挙動にカルシウムイオン(Ca2+)が深く関わっていることがわかっている。そこで、結晶構造から推測されたCa配位アミノ酸残基の役割と寄与の度合いを調べるために遺伝子工学的手法により変異を導入し、改変することによってQy遷移がどのような挙動を示すのかを検証するとともに、各種変異体の特性評価と構造解析を行った。その結果、LH1α鎖における49位のアミノ酸残基Asp49がLH1の分光学的挙動に重要な役割を果たすことが判明した。一方、LH1α鎖中の50位AsnがCa2+配位に関与しないことがわかった。これらの結果は最近高分解能の結晶構造解析(Nature 556, 209; 2018)によって実証され、米国科学アカデミー紀要に掲載された(Proc. Natl Acad. Sci. USA 114, 10906; 2017)。本補助金を受ける前から通常の菌体培養から色素タンパク質複合体の精製、特性評価まで各種予備実験などを行っていたため、本研究課題をスムーズに開始させることができた。二年目の今年は遺伝子組換えを施した変異株の生育速度が予想より遅かったことやアミノ酸変異をもつキメラ型複合体の単離精製に長い時間がかかったことはあったが、連携・協力研究者たちとの努力によって長い年月をかけて取り組んできたハイブリッド型LH1-RCの作製と各種生化学・分光学的特性評価を行うことができた。また、この成果を速やかに学会発表と国際学術論文誌を通して社会に発信することができた。
事象関連電位による脳認知機能の研究

本研究課題では一貫して,運動プログラミング過程の神経機序を探ってきた。2013年度では以下の研究活動を行った。運動プログラミングの様相をとらえるために,反応生成に関連する2変数(反応複雑性と反応持続性)を直交させる操作を行い,反応時間と事象関連電位のなかでも偏側性準備電位に着目した実験を遂行してきた。被験者28名のデータを論文に纏め,精神生理学領域で権威のあるPsychophysiology誌に投稿した。エディタ他, 2名の査読者からは,非常にポジティヴな評価を受け,現在,修正論文の作成中にある。そのため,当該論文は今後受理されるものと信じている。昨夏以来,一般運動プログラムに適用する動作パラメータの脳内処理を明らかにするため,フォースキーによるオリジナルの課題を用いて,データ収集に邁進してきた。これまでにない研究手法を採用していることから,非常にインパクトのある研究成果となるものと考えている。研究成果は17th World Congress of Psychophysiologyで報告する予定であり,論文化も同時進行している。さらに,複雑な力量パターンを出力した後の動作表象の残存についても検証した。その結果,反応プログラムに基づいて動作を完遂した後も,動作表象の反芻が一次運動野で生じることが示された。本結果は,解析終了次第,論文化する予定である。(抄録なし)平成24年度では,要因加算法(additive factor method : AFM)を適用することで,情報処理過程の運動プログラム段階の振る舞いを検証した.AFMロジックに基づき実験では,反応系列の複雑性(response sequence complexity)と,運動持続時間(movement duration)という2つの運動関連パラメータを直交させて操作させた.その結果,反応時間には各変数の主効果が認められたものの,交互作用はなかった.さらに偏側性準備電位(lateralized readiness potential : LRP)を測定した結果,反応選択段階までの処理時間を反映する刺激提示からLRP出現時点までのインターバルに変化はなかった.しかしながら,運動プログラミング処理を反映するLRP出現時点から反応時点までのインターバルには両変数の効果を認めた.これらの結果は,両パラメータは運動プログラミングに関与しているものの,それぞれ独立した段階で処理されていることを示唆している.さらに,一般運動プログラム(generalized motor program : GMP)に適用する動作パラメータが修正される際の脳内処理を検証するために,標的強度出力課題を用いることを着想した.課題はフォースキーを鋭く押すことで,予め決められた標的強度値を出力することであった.そこで平成24年度後半では,実験に必要となるフォースキーシステムの作成を試みた.スチール板にストレインゲージを貼付し,左右いずれの手指による力量発揮曲線も記録できるようにした.データがまだ少ないため現在も実験を継続している.平成24年度における研究成果の一部は,第30回日本生理心理学会(北海道大学)及び第52回アメリカ精神生理学会(New Orleans)で発表した.現在はすべてのデータ解析を終え,論文に纏めているところである.本研究課題では一貫して,運動プログラミング過程の神経機序を探ってきた。2012年度では2つの実験計画を実施してきた.先ず,2012年4月から5月にかけて第1実験を行った.なお,実験1の結果の一部は,第30回日本生理心理学会(北海道大学)及び第52回アメリカ精神生理学会(New Orleans)で発表した.その結果,ほぼ最終版の論文を仕上げることができ,間もなく国際誌に投稿する状況にある.第2実験では,実験計画はすでに早稲田大学倫理委員会より実施承認を得ている(2012年9月).しかしながら,実験に必要となるフォースキーの作成とその制御プログラムの準備に予想以上の時間を費やしてきた.現在,制御プログラムも完成し,予備実験を経て,本実験を開始する状況にある.2013年度では,単一課題条件と複数課題条件を2実験で比較することで,GMP構築過程とパラメータ修正過程の神経メカニズムを探る.実験1では,標的強度値は,例えば,課題条件間で10N(1Nは約98g)出力を共通の標的とするが,複数課題条件ではそれ以外に,4Nや16Nの標的強度値を設定する.実際に使用する標的強度値は,参加者の指に負担がかからない範囲で設定する.

実験2では,単一課題条件と複数課題条件ともに共通した標的強度値出力課題を行う(例えば10N出力課題).単一課題条件ではこの課題を繰り返すが,複数課題条件では,標的出力課題後に異質の動作(例えばボール投げ)を行う.(抄録なし)
静脈麻酔薬および吸入麻酔薬による中枢の酸化ストレス抑制効果の検討

申請者は手術時に脳内でおこる酸化ストレスへの麻酔薬の影響を研究するため、まずその実験モデルの確立を目指した。申請者は実験的にラットを脱血し、低血圧を1時間維持した後、正常血圧に戻す出血性ショックモデルを作成し、そのラットの脳における酸化ストレスの状態を調べた。その結果、脳内にヘムオキシゲナーゼ-1と呼ばれる酸化ストレスにより特異的に誘発される酵素の発現を見いだした。すなわち本実験モデルは手術時の脳における酸化ストレスモデルとなることが判明した。本研究課題の平成20年度の研究実施計画は, (1)周術期脳酸化ストレスモデルの確立を目的に,ペントバルビタール麻酔下にラット出血性ショックモデル(ショックモデル)を作製し,中枢におけるHeme oxygenase-1(HO-1)の発現を, real-time PCR法を用いて検討すること,(2)ケタミン,プロポフォールを用いた麻酔下にショックモデルを作製し,中枢におけるHO-1の発現を麻酔薬間で比較検討することにより,静脈麻酔薬における抗酸化作用の違いを明らかにすることである。申請者は雄性SDラット(8週齢)を用い,ペントバルビタール麻酔下に大腿動脈にカテーテルを挿入,平均血圧30mmHgとなるまで脱血を行いショック状態とし, 1時間後脱血した血液を返血し蘇生を行うショックモデルを作製した。蘇生開始から1日後, 3日後および7日後にラット犠死させ脳の摘出をおこない,大脳皮質・海馬・視床下部の標本を採取し, real-time PCR法にてHO-1 mRNAの発現を検討した。その結果, 3日後, 7日後の大脳皮質および海馬においてHO-1 mRNAの発現が認められた。これらショックモデルおける中枢での病態をさらに検討するため、大脳皮質および海馬において,炎症性サイトカインであるinterleukin-1 β(IL-1 β), IL-6 mRNA,およびinductible nitric oxide synthase(iNOS)mRNAの発現をreal-time PCRで検討した。その結果、ショック7日後の海馬においてiNOS mRNAの優位な発現を認めた。このことは、出血性ショックは中枢において炎症反応によらず,何らかの機能障害を引き起こしている可能性を示唆するものであった。また,ケタミン,プロポフォールを用いた麻酔下に作成したショックモデルについても中枢での酸化ストレスを検討中である。本研究課題の平成21年度の研究実施計画は,(1)周術期脳酸化ストレスモデルの確立を目的にラット出血性ショックモデルにおける中枢の変化を観察し,その病態をさらに検討すること,(2)ケタミン,プロポフォール等のペントバルビタール以外の麻酔薬を用いた麻酔下にラット出血性ショックモデルを作製し,中枢におけるHO-1の発現等を麻酔薬間で比較検討することにより静脈麻酔薬の抗酸化作用の違いを検討することである。申請者は昨年同様,雄性SDラット(8週齢)を用い,ペントバルビタール麻酔下に大腿動脈にカテーテルを挿入,平均血圧30mmHgとなるまで脱血を行いショック状態とし,1時間後脱血した血液を返血し蘇生を行うショックモデルを作製した。蘇生開始から3日後および7日後にラット犠死させ脳の摘出をおこない,大脳皮質・海馬・視床下部の標本を採取し,real-time PCR法にてアセチルコリンレセプターのムスカリン型レセプターであるM1,M2,M4およびニコチン型レセプターであるα3レセプターの発現を調べた。その結果,ショック3日後の大脳皮質,ショック7日後の海馬においてM4レセプターの増加が認められた。このことは,出血性ショックにより何らかの中枢機能の変化が引き起こされている可能性を示唆するものであった。また,ケタミン,プロポフォールを用いた麻酔下に作成した出血性ショックモデルについても中枢での酸化ストレス変化を引き続き検討中である。
プリメタゾアモデルの拡充による動物多細胞性進化の機構解明

1.ゲノム編集法の確立単細胞ホロゾアでゲノム編集法を確立することは、本研究課題でもっとも重要な目標である。クレオリマックス細胞やカプサスポラ細胞で実際にゲノム編集を起すことには成功していないが、その実現に向けた重要な研究成果が得られた。まず、single strand annealing assay(SSA)法により、カプサスポラ細胞内でDNAの切断が意図したとおりに起きることを確認した。すなわち、zincfinger nuclease(ZFN)タンパク質、TALENタンパク質双方が、カプサスポラ細胞内で標的配列を特異的に切断すること、そしてその後DNAが相同性組み換えを利用して修復されることを確認した。クレオリマックス細胞においても同様の結果が得られた。更にクレオリマックス細胞においては、強い相同性組み換え能の存在を示す証拠が得られた。これを利用して、簡便な遺伝子ノックイン法を確立できる可能性がある。2.単細胞ホロゾアが持つ「多細胞的な」遺伝子の機能解析遺伝子機能解析の基盤となるゲノム配列をリシーケンスし、品質の高いゲノム配列を作出し論文に出版することができた。カプサスポラの持つラミニン遺伝子の機能解析については、予定通り抗体の作成を終え、現在タンパク質レベルの機能解析を行っている。また、カプサスポラの持つNotch遺伝子については、動物のNotch遺伝子とよく似た分子機能を発見することができた。さらに、細胞の置かれた環境によって特異的に発現する遺伝子(これらは多細胞性進化と関連している可能性がある)のスクリーニングを行い、予測した通り、いくつかの「多細胞的な」遺伝子は環境の変化に応じて働き方を変えているという結果が得られた。これらの結果は、単細胞ホロゾアの持つ「多細胞的な」遺伝子が、危機的な環境をやり過ごすための危機避難機構に関わっているのではないか、という仮説に合致するものである。1.ゲノム・トランスクリプトーム情報整備計画通りクレオリマックス、アベオフォルマ、コラロキトリウムのゲノム決定を行うことができた。それに加え、イクチオスポレア綱に属するピルムとスフェロフォルマのゲノム決定も行うことができた。既に作出が完了している各種トランスクリプトームデータと合わせ、論文の執筆を行った(スペインRuiz-Trillo博士との共同研究)。2.動物多細胞化遺伝子の機能解析最も困難と思われたコラロキトリウムへの遺伝子導入実験に成功した。現時点では導入効率は非常に低く、「たまたま」入ったようなレベルではあるが、重要な第一歩であることは間違いなく、今後この効率を上げていくよう実験を続ける。各遺伝子の機能解析については、計画通りカプサスポラのNotch様遺伝子、チロシンキナーゼSrcの過剰発現表現型の解析に加え、NotchのリガンドであるDeltaや、数種類の細胞外マトリクス様遺伝子の解析も行うことができた。また、ライブマーカーコンストラクトについては、予定通り核、小胞体、ミトコンドリア、アクチン繊維、微小管へのマーカーを整備することができた。2年目以降の計画ではあるが、TALEN法によるゲノム編集にも着手することができた(広島大学との共同研究)。まだゲノムの改変には成功していないものの、対象のモデル生物にTALEN法を適用する際にはいくつか注意すべき点があることがわかり、それらに対応した条件設定や技術開発を行うことができた。ほぼ計画通りの成果を挙げられたことに加え、ゲノム解読や遺伝子機能解析については計画した以上の解析を進めることができた。特にコラロキトリウムへの遺伝子導入実験については、相当困難であると考えていたが、学生の頑張りにより遺伝子を導入することができた。1.ゲノム編集法確立今のところゲノム編集実験においてポジティブな結果は得られていない。現在、その原因を突き止める実験を行っている。TALEN法がうまく動かない場合、大きく分けて2つの問題点が考えられる。まず1TALENタンパク質が標的部位を認識していない、もしくは認識しても切断していないこと、もう一つは2切断は起きていても、その修復の際にホモロガスリコンビネーションや不完全な修復(これによって遺伝子の機能が失われる)が起きていないことである。まずは2の要因について、新たなアプローチを行った。すなわち、TALENとは異なる、実績のある別のゲノム編集法(ZFN)を適用することで、ホモロガスリコンビネーションが起こると蛍光を発する仕組みを細胞に導入し、こうしたDNA修復の仕組みが単細胞ホロゾアに備わっていることを確認しようとしている。2.単細胞ホロゾアが持つ「多細胞的な」遺伝子の機能解析予定通り、単細胞ホロゾアの一種であるクレオリマックスが持つSrc遺伝子の制御の仕組みの一端を解明し、論文に発表することができた。また、カプサスポラが持つ細胞外マトリクス様遺伝子の機能解析については、主な遺伝子について過剰発現実験が終了し、現在は抗体作成実験に移っている。更にカプサスポラのNotch様遺伝子に関しては、truncated(短縮形)タンパク質発現実験を精力的に行った結果、その分子機能について非常に興味深い結果が得られ始めている。最大の目標であったゲノム編集法の確立にはまだ成功していないが、このような壁は、科学研究にはつきものであり、織り込み済みである。一方で、問題点を一つ一つ洗い出すための実験を新たに始めることができており、ゲノム編集法の確立へ向け確実に前進している。また、こうした試行錯誤からまた新しい知見が得られる可能性もある。一方、既存の技術(遺伝子過剰発現法)を利用した、単細胞ホロゾアの「多細胞的」遺伝子群の機能解析については、予定通り進めることができた。

特に、クレオリマックスで今回発表することのできたSrc遺伝子の機能解析は、単細胞ホロゾアの遺伝子を直接その細胞で解析した世界初の例となった。カプサスポラにおける細胞外マトリクス様遺伝子の過剰発現実験に関しては、どの遺伝子の過剰発現についても全く表現型を変えることがない、という意外な結果が得られている。このことは、こうした細胞外マトリクス様遺伝子が、好適環境にあるアメーバステージでは全く何の機能も発揮しないことを示唆している。現在、そのことこそが実は多細胞性進化の謎を解く鍵の本質なのではないかという予想をもとに様々な仮説を立てて、それを証明するための抗体実験に移行中である。1.ゲノム編集法の確立単細胞ホロゾアでゲノム編集法を確立することは、本研究課題でもっとも重要な目標である。クレオリマックス細胞やカプサスポラ細胞で実際にゲノム編集を起すことには成功していないが、その実現に向けた重要な研究成果が得られた。まず、single strand annealing assay(SSA)法により、カプサスポラ細胞内でDNAの切断が意図したとおりに起きることを確認した。すなわち、zincfinger nuclease(ZFN)タンパク質、TALENタンパク質双方が、カプサスポラ細胞内で標的配列を特異的に切断すること、そしてその後DNAが相同性組み換えを利用して修復されることを確認した。クレオリマックス細胞においても同様の結果が得られた。更にクレオリマックス細胞においては、強い相同性組み換え能の存在を示す証拠が得られた。これを利用して、簡便な遺伝子ノックイン法を確立できる可能性がある。2.単細胞ホロゾアが持つ「多細胞的な」遺伝子の機能解析遺伝子機能解析の基盤となるゲノム配列をリシーケンスし、品質の高いゲノム配列を作出し論文に出版することができた。カプサスポラの持つラミニン遺伝子の機能解析については、予定通り抗体の作成を終え、現在タンパク質レベルの機能解析を行っている。また、カプサスポラの持つNotch遺伝子については、動物のNotch遺伝子とよく似た分子機能を発見することができた。さらに、細胞の置かれた環境によって特異的に発現する遺伝子(これらは多細胞性進化と関連している可能性がある)のスクリーニングを行い、予測した通り、いくつかの「多細胞的な」遺伝子は環境の変化に応じて働き方を変えているという結果が得られた。これらの結果は、単細胞ホロゾアの持つ「多細胞的な」遺伝子が、危機的な環境をやり過ごすための危機避難機構に関わっているのではないか、という仮説に合致するものである。カプサスポラについては大きな問題はないものの、もう一方のモデル生物クレオリマックスへの遺伝子導入効率の悪さが、計画を進めるうえでの大きな障壁となっている。解決策としては、新しいエレクトロポレーター(NEPA21)の導入を考えている。
記録型紀行文にみる化政文化の精神性

本研究では、鈴木牧之『秋山記行』や渡辺崋山『毛武游記』『訪〓録』の紀行作品を、執筆された時代(文化・文政期)の社会背景を踏まえ分析するなかで、自らの文化圏内における僻地を実証的・考証的な姿勢でとらえて著された記録型紀行文の成立を明らかにすることを目的とした。特に『秋山記行』の分析に関しては、紀行文の舞台となった地域の調査を実施して、歴史的資料(地方文書等の文献資料、石像物・伝承などの民俗事象、村落景観の復元古地図など)の収集を行った。これらの資料を通して、十八世紀後半から十九世紀初頭における当該地域の社会構造を明らかにした上で、作品に込められた問題関心を当時筆者が抱いた精神として浮かび上がらせる方法をとった。この結果、地域が抱える社会問題の解決策を確立するために、地域社会の現状を分析する態度および理想社会への追究が、直載な記録に基づく実証的な紀行文の成立を促すに至った歴史的過程を究明することができた。同時にこの精神性は、庶民が他地域の文化と日常的に接するようになり、自らの生い育った土地に改めて目を向けて、客観的・相対的に捉える視座を持つようになった時代状況と重ね合わせることで、化政文化の全般的特徴を産み落とす母胎として位置づけ普遍化することができた。さらに、この分析成果を、新潟県南魚沼市立鈴木牧之記念館の刊行するリーフレット(『なんちゃら秋山記行』)の作成編集に加わる中で反映させ、学校教育や生涯学習へ利用できるような試みを行った。これにより現在の画一化されつつある社会・文化状況のなかで、紀行文の舞台となった地域住民たちが、それらの作品を通じて日常性のなかに埋没している歴史認識を深め、身近な地域文化を見つめ直すことで生活の場に育まれた文化の共有、ひいては地域文化の振興につなげることが可能となった。
計算論モデルと統計モデルの統合による行動データからの心的過程解明のための基盤構築

近年,行動データの分析において,その背後にある心的過程・計算過程を表現した計算論モデルが用いられるようになっている。計算論モデルには少数のパラメータで行動の特徴を記述し,心的過程を推定できるという利点がある。しかしながら現状では,そのパラメータがどのような行動の特徴を反映しているか理解されないまま使われることが多く,分析結果が反映するものと研究者の主張に解離が生じている可能性がある。一方,行動データ分析には回帰モデル等の統計モデルも用いられており,そのような伝統的分析手法には行動の統計構造が理解しやすいという利点がある。本研究では,計算論モデルと統計モデルの関係を明らかにすることで,計算論モデルが表現する行動の特徴の理解を促し,両手法の長所を活かした統合的な枠組みを提案することを目的とした。初年度では,代表的な計算論モデルである強化学習モデルに関し,よく用いられている2種類のモデル(一回当たりの価値の更新の程度を決める学習率パラメータが結果に応じて変化するモデル,モデルベース強化学習)に関して回帰モデルとの対応関係を検討し,モデルの誤設定がパラメータの推定に系統的なバイアスを与えることを明らかにした。いずれも実際の行動データの解析や計算機シミュレーションをもとに,既存の研究がその誤設定による影響を受けている可能性があることを示した。この結果は,計算論モデリングの方法論を精緻化するのみならず,精神疾患や行動との関係について議論した過去の研究の解釈についても見直しを迫るものである。初年度の目的であった代表的な計算論モデルと統計モデルの関係の検討について,二種類のモデルに関して成果をまとめることができたといえる。次年度以降は対象とするモデルの種類を拡大ながら,実験課題のデザインも精査し,行動データの特徴をとらえるための統合的な枠組みを検討・構築していく予定である。クラウドソーシングを利用ことなどにより予定額より少ない額で実験が実施できたため,余った経費を次年度の実験に使用することとした。
レーザーリソグラフィを用いたマイクロ・ナノ流体システムの作製

マイクロ・ナノバイオセンサは高感度・低侵襲・高速検出ができ,細胞組織工学や医療診断技術の分野へ開発されている.本研究では,ナノ流路の新たな製造技術を開発するトップダウンアプローチと自己組織化を用いてナノセンサを作製するボトムアップアプローチを模索した.2光子レーザーリソグラフィーを用い,マイクロ流路内部にナノ流路の描画ができた.ボトムアップアプローチでポリマーナノ粒子とボロン酸グルコースセンサの重合に成功し,生体内血糖濃度範囲でグルコース応答性を示すことを明らかにした.このナノ蛍光グルコースセンサは今後細胞内部に取り込まれ,細胞・組織のメカニズムの解明に応用展開可能だと期待できる.マイクロ・ナノバイオセンサは高感度・低侵襲・高速検出ができ,細胞組織工学や医療診断技術の分野へ開発されている.本研究では,ナノ流路の新たな製造技術を開発するトップダウンアプローチと自己組織化を用いてナノセンサを作製するボトムアップアプローチを模索した.2光子レーザーリソグラフィーを用い,マイクロ流路内部にナノ流路の描画ができた.ボトムアップアプローチでポリマーナノ粒子とボロン酸グルコースセンサの重合に成功し,生体内血糖濃度範囲でグルコース応答性を示すことを明らかにした.このナノ蛍光グルコースセンサは今後細胞内部に取り込まれ,細胞・組織のメカニズムの解明に応用展開可能だと期待できる.本研究の初年度(H25)目標は,マイクロチャンネル内部でのナノチャンネル組み込みの2光子レーザー描画手法の確立である.i)マイクロチャンネルの作製のため,ガラス基板上にマイクロチャンネルがパターンされているガラス及びpolydimethylsiloxane (PDMS)をボンディングしてマイクロ流体システムを作製した.レーザーリソグラフィー装置は基板の下からレーザーを走査するため,マイクロ流体システムは約150um厚のカーバーガラス上で作製した.下の基板の同じ材料でマイクロチャンネルを作製すると液体に対する摩擦などが等しくなるため望ましいが,ガラスエッチングのプロセスに時間がかかる,かつ基板間接合が弱い問題があった.一方,PDMSをマイクロチャンネルのパターンとして使用するとモールディング手法で簡単にマイクロチャンネルのパターンができ,かつ下のガラス基板とPDMSが加熱することだけで簡単にボンディングができ,プロセスが容易になった.ii)ナノチャンネルの組み込みのため,作製したガラスーPDMSマイクロ流体システムの内部にフォトレジスト(IP-L)を充填し,ナノチャンネルを描画した.次にデベロッパーをマイクロチャンネルの内部に流してナノチャンネルの構築を行ったが,PDMSがデベロッパーを吸収してフォトレジストを溶かしたデベロッパーをマイクロチャンネルから取り出すとこができなかった.上記の問題を改善するため,申請書の次年度(H26)の計画2ー3)のとおり,異なった材料で構成することを検討している.まず,マイクロ流体システムの作製に広く使われているネガティブフォトレジスト(SU8)を用いてマイクロチャンネルを作製した.次に,SU8マイクロチャンネルと密着できるフォトレジスト(Ormocomp)を用いて,ナノチャンネルの作製条件を検討している.本研究の最終年度(H26)の目標は, 2光子レーザーリソグラフィーを用いて,ナノチャンネルをマイクロ流体システムに組み込む手法を提案し,医療や細胞工学などの応用分野への貢献が期待できるナノパーティクルを作製することを目的とした.i)マイクロ・ナノ流体システムの材料の検討:マイクロ流路の内部へのナノ流路の組み込みを容易にするため,ネガ型フォトレジスト(SU8)でオープンマイクロ流路を作り,レーザーリソグラフィーを用いて異なるフォトレジスト(ormocomp)でナノ流路を作製したが,マイクロ・ナノ流体システムのカバーレイヤーとのボンディングが弱い問題があった.ii)T字型マイクロ・ナノデバイスを利用したナノパーティクルの作製:T字型マイクロ流体システムの内部でナノ流路を描画することには成功したが,ナノパーティクルの作製には至ってなかった.その原因としては,ナノパーティクルを作製に必要な圧力をマイクロ・ナノ流体システムが耐えられないと考え,ナノパーティクルを作製するボトムアップアプローチを行った.Urethane acrylate nonionomer (UAN)をcrosslinkingさせ,40200 nmの大きさのナノパーティクル(PUAN)を作製できる.そのPUANに蛍光グルコースセンサ(Shibata, Heo et al., PNAS, 2010)をつけ,ナノグルコースセンサを作製する手法を検討し,ナノグルコースセンサの作製に成功した.iii)細胞工学への応用展開:ii)で得られたナノグルコースセンサのグルコース応答性をin vitro評価を行った.その結果,0500 mg/dLのグルコース濃度に応答性があることを確かめた.また,作製されたナノセンサの大きさは径100-200nmであり,細胞内部に入り込まれてグルコース濃度の測定することができると考える.従って,本研究の最終目的である細胞工学へ応用展開ができるナノグルコースセンサの作製に至っていると考える.本研究の初年度(H25)目標は,マイクロチャンネル内部でのナノチャンネル組み込みの2光子レーザー描画手法の確立である.具合的な実験目標は,i)ガラス,またはPDMSを用いてマイクロチャンネルの作製,ii)2光子レーザーリソグラフィーを用いたマイクロチャンネル内部でのナノチャンネルの作製,iii)マイクロチャンネルの表面処理及び流路の内部圧力の検討である.上記の申請書の実験計画とおり検討を行ったが,マイクロチャンネルの内部にナノチャンネルの作製が容易にできなかった.マイクロチャンネルの内部でデベロッパーを流してナノチャンネルの構築を行う方法はPDMSが有機溶媒を吸収するため,ナノチャンネルの組み込みには適してないと確認した.また,ナノチャンネルに残りのフォトレジストを溶かしたデベロッパーを流すことは高圧力を必要であり,簡単にナノチャンネルの構築が可能な新しい作製方法を探す必要がある.

従って,オープンマイクロチャンネル構造を作製してその上にナノチャンネルを構成し,得られた構造の上にカーバーを接合すると上記の課題を解決できると考える.従って,申請書の次年度計画であるマイクロチャンネルとナノチャンネルをそれぞれ異なった材料で構成する方向に変え,SU8マイクロチャンネルの作製及びOrmocompナノチャンネルのレーザーリソグラフィー条件を検討しているところである.その結果を基づき,今後の研究では,オープンマイクロチャンネルにナノチャンネルを組み込み,その上にシラン化したPDMSカーバーをボンディングすることでマイクロ・ナノ流体システムを作製する.従って,申請書に書いてある初年度研究計画内容は全て検討を行い,その問題点を解決するために次年度研究内容を検討していることで,研究計画とおり順調に進展していると考える.今後の研究は,マイクロ・ナノ流体システムを作製し,そのシステムを利用して微小液敵やエマルジョンを作製することを目的とする.具合的には,i)マイクロ・ナノ流体システムの材料の検討する,ii)T字型マイクロ・ナノデバイス作製し,そのデバイスを用いて,直径数百nm数百umの液敵を作製する,iii)細胞工学への応用展開を検討することを目的とする.1マイクロ・ナノ流体システムの材料の検討(申請書の研究計画の平成26年度2ー3):マイクロチャンネルの内部へのナノチャンネルの組み込みを容易にするため,フォトレジスト(SU8)でオープンマイクロチャンネルをガラス基板上で作製し,レーザーリソグラフィーを用いて異なるフォトレジスト(Ormocomp)のナノチャンネルを描画する.そのオープンマイクロ・ナノ流体システム上にシラン化したPDMSをボンディングすることでカーバーし,複数の材料を利用してマイクロチャンネル内部でのナノチャンネル組み込みの作製方法を検討する.2T字型マイクロ・ナノデバイスを利用した微小液敵の作製(申請書の研究計画の平成26年度2ー1&2):1の作製方法を用いてT字型マイクロデバイスを作製し,レーザーリソグラフィーを用いてマイクロチャンネルの分岐部あるいは連続相チャンネルへのナノチャンネルの組み込みを行う.次に,このデバイスを用いて微小液敵を作製し,得られた液敵の大きさを測定し,評価実験を行い,デバイスデザインを最適化する.3細胞工学への応用展開(申請書の研究計画の平成26年度2ー4):本研究では,2で作製されたT字型デバイスにグルコースセンサの溶液を流し,グルコースセンサのドロップレットを作製して数μm数百nmサイズのグルコースセンサの作製可能性を検討する.現在,株式会社テルモとの物質提供契約を結び,グルコースセンサを確保しているところである.初年度(H26)には製作プロセスを検討する段階であり,流体制御・細胞培養実験は次年度に行う.
MRSAとE.coliの混合感染の遺伝子解析によるMOFの初期予防と治療の基礎検討

マウスMRSA内因性敗血症モデルを作成した。腸内細菌叢を乱す目的で、第1日よりampicillin(ABPC)を皮内投与したマウスに、臨床分離株であるMRSA strain 334を1回10^9cfu/mouseで実験開始から連続3日間経口投与。Bacterial translocationを起こさせる目的で、第1日・第4日・第7日cyclophosphamide250mg/kgを腹腔内投与。MRSA敗血症重症化の菌側因子としてTSST-1の関与を検討した。本モデルに、抗TSST-1モノクローナル抗体を、菌の経口投与後に皮下投与した群と、生理食塩水を投与した群について比較検討した。有意差は認められなかったが、抗TSST-1モノクローナル抗体投与群で生存率を高める傾向がある結果を認めた。次にMRSA敗血症重症化の宿側因子として、IL-1およびIFN-γの関与を検討した。MRSA内因性敗血症の実験プロトコールをWTマウス、IL-1を欠損したマウス、IFN-γを欠損した3群に対して施行し、比較検討した。80%以上生存したWT群に対し、IL-1欠損マウスでは全例死亡し、死亡直前の肝、脾、腸間膜リンパ節、腎の各臓器内のMRSA菌数においてもIL-1欠損マウスで有意に高値であり、IL-1が欠損することで有意にMRSA内因性敗血症が重症化した。また、IFN-γ欠損したマウスにおいては、有意な差はなかったが、IFN-γが欠損することで生存率が低くなる傾向が認められた。従来当科で用いてきた術後MRSA感染に関する動物実験モデルは、開腹術後の感染モデルであり、今回の研究目的である、異なる病原因子をもつMRSAの菌株間における毒性の強さを検討するためには、比較的簡便で宿主側因子の影響の少ない新たなモデルが必要と考えた。そこで、初年度に当たる今年度は、MRSAによる致死的な内因性感染マウスモデルを作成した。そして、異なる病原因子を持つ数種のMRSA臨床分離株を本モデルに用い、生存率、血液・各臓器内・便中の菌数および菌種、血清および肝ホモジネート上清中のサイトカイン値の測定を行った。その結果、死亡前の重篤な状態のマウスにおいて、各臓器からMRSAが培養され、本モデルではMRSAによる内因性敗血症、多臓器不全が生じていると考えられた。また、異なる病原因子を持つMRSA菌株間で生存率に差が有ることを認めた。これらのMRSAにおいては、エンテロトキシンおよびTSST-1の産生性に差を認めた。また、本モデルにおいて、使用する抗菌薬の種類を変更することで生存率に差が生じること、またその際にMRSA、E.coli、その他の菌種の臓器内菌数に差が有ることを確認した。今後は、今回用いたMRSA株から、前述した病原因子の遺伝子欠損株を作成し、生存率、臓器内菌数などについて検討を行う予定である。前年度までに、マウスMRSA内因性敗血症モデルを作成した。本モデルの概要は以下の通り。マウスはbalb/cマウス、メス・8週齢を使用。本マウスに臨床分離株であるMRSA strain334を1回10^9cfu/mouseで実験開始から連続4日間経口投与。Bacterial translocationを起こさせる目的で、第1日・第4日・第7日にCyclophosphamide 250mg/kgを腹腔内投与。また、腸内細菌叢をかく乱する目的で、第1日よりCeftazidime 40mg/kgを皮内投与した。本モデルでは第8日ごろよりマウスの死亡が確認され、最終的なマウスの死亡率はおよそ2045%であった。

本モデルでは死亡直前の重篤な状態では肝、脾、腸間膜リンパ節、肺、腎の各臓器からMRSAが検出され、血液からも検出された。本年度は本モデルを用い、使用する抗生物質の種類による死亡率の差について検討した。当初使用したCeftazidime(CAZ)40mg/kgをampicillin(ABPC)40mg/kgに変更して実験したところ、ABPC群では死亡率がおよそ60100%とCAZ群に比べ有意に上昇した。ABPC群の臓器内菌数の検討では、MRSAの生菌数は両群で差は見られなかったが、ABPC群で大腸菌の陽性率が有意に高く、また血清エンドトキシン量は後者で有意に上昇していた。このことから、MRSA内因性敗血症において、本症が重篤化する因子のひとつとして大腸菌の関与が考えられた。今後は本モデルを用い、本症重篤化の因子を宿主側、菌側から検討する予定である。マウスMRSA内因性敗血症モデルを作成した。マウスはbalb/cマウス、メス・8週齢を使用。本マウスに臨床分離株であるMRSA strain 334を1回10^9cfu/mouseで実験開始から連続4日間経口投与。Bacterial translocationを起こさせる目的で、第1日・第4日・第7日にCyclophosphamide 250mg/kgを腹腔内投与。また、腸内細菌叢を乱す目的で、第1日よりCeftazidime (CAZ)、およびampicillin (ABPC)を皮内投与した2群について比較検討した。最終的なマウスの生存率はCAZ投与群で100%、ABPC投与群で40%であった。死亡直前の肝、脾、腸間膜リンパ節、肺、腎の各臓器からMRSAが検出され、血液からも検出された。また、E.coliも血液および各臓器から検出されたが、CAZ投与群よりもABPC投与群で菌量、検出頻度ともに有意に高値であり、血清エンドトキシン濃度もABPC群でCAZ群に比べ有意に高かった。MRSA敗血症においてE.coli感染の併存またはエンドトキシンが重症化に関与すると考えられた。さらに本モデルを用いて、MRSA敗血症重症化の菌側因子について検討した。実験で使用したMRSA strain 334は、TSST-1を産生するため、抗TSST-1モノクローナル抗体を菌の経口投与後に、皮下投与した群と、生理食塩水を投与した群について比較検討した。有意差は認められなかったが、抗TSST-1モノクローナル抗体投与群で生存率を高める傾向がある結果を認めた。腸内細菌叢を乱す目的で、第1日よりampicillin(ABPC)を皮内投与したマウスに、臨床分離株であるMRSA strain 334を1回10^9cfu/mouseで実験開始から連続3日間経口投与。Bacterial translocationを起こさせる目的で、第1日・第4日・第7日cyclophosphamide250mg/kgを腹腔内投与。MRSA敗血症重症化の菌側因子としてTSST-1の関与を検討した。本モデルに、抗TSST-1モノクローナル抗体を、菌の経口投与後に皮下投与した群と、生理食塩水を投与した群について比較検討した。
迅速プロテオミクス分析のための並列化CE-MSシステムの開発

ペプチドを効率的に濃縮する手法として、large-volume sample stacking法とtransient isotachophoresis法を融合したところ、分離能をそこなうことなく最大1000倍程度の高感度化を実現した。また並列化CE-MSについては500nL/min以下と流量が少なければ少ないほど高密度な並列化が容易になることが示唆されたため、低流量を実現可能なシースレス型のCE-MSシステム構築した。内径5μmのキャピラリーを壁厚5μm程度までフッ酸でエッチングすることで、約250 pL/minの超低流量で良好なESIシグナルを得ることに成功した。イオンソースと質量分析計(MS)の結合条件について基礎検討を行った。石英キャピラリーをCO2レーザーで引き延ばすことでnanoESIエミッターを作成し,エレクトロスプレーイオン化法(ESI)を用いてウシ血清アルブミン(BSA)のトリプシン消化物ペプチドを試料としてシグナルをモニタリングした。nanoESIエミッターはマグネット固定型XYZステージでMS本体に固定し,シリンジポンプを利用して流量や電圧などを最適化して分析を行ったところ, 50 zmol程度のBSAトリプシン消化物を検出することに成功した。続いて並列化CE-MS条件についてソースとMS装置との1距離, 2角度, 3流速, 4溶媒の種類, 5試料などのパラメーターを最適化した結果,流量500 nL/min以下程度で感度を低下させずに試料を検出できることが示唆された。また,質量分析計の無償貸与を受けることで,共用のMSが使用されている際にも実験を遂行できる環境を整備した。続いて濃縮条件を最適化するために,自動CE装置を利用してBSAトリプシン消化物分析を行った。感度の低いUV検出を利用しても1ppm程度の試料を検出することができた。このシステムにおいて今後pH,イオン強度,電気伝導度,キャピラリーのコーティング法,インレットとアウトレットの緩衝液の組み合わせなどについて最適化を機械的に進められる研究環境を整備した。まず昨年度整備したCE-UV分析条件において、申請者がノウハウを持つlarge-volume sample stacking (LVSS)法(Anal. Chem. 2010, 82, 6504)とDynamic pH junction法(Anal. Chem. 2000, 72, 1242)を組み合わせた新規濃縮法について検討した。結論として、様々なpH、電気伝導度条件の泳動液・試料マトリクスを試用したが、100倍以上の良好なペプチド濃縮を実現することはできなかった。そこで、既にペプチド分析で実績のあるtransient isotachophoresis法(Electrophoresis, 2008, 29, 1565)に注目し、LVSSと融合を試みたところ、分離能をそこなうことなく最大1000倍程度の高感度化を実現できることがわかった。また高塩濃度の試料マトリクスを許容できるため、強陽イオン交換クロマトグラフィーによる試料前処理との相性も良いことが示唆された。本法では分析開始時にキャピラリーのMS側末端部へ液滴を付着させることで通常のCEと同様に濃縮が可能であり、アミノ酸・ペプチド・糖鎖・核酸・タンパク質などの分析に利用できることを確認した。CE-MSについては昨年度に引き続き、並列化に最適なエレクトロスプレーイオン化(ESI)の最適化を行った。昨年度の研究により、流量が少なければ少ないほど高密度な並列化が容易になることが示唆されたため、低流量を実現可能なシースレス型のCE-MSシステム構築した。内径5 μmのキャピラリーを壁厚5 μm程度までフッ酸でエッチングすることで、約250 pL/minの超低流量で良好なESIシグナルを得ることに成功した。またシースレス型CEに三連四重極型の質量分析計を接続し、MS/MS分析を行うことでモデル試料であるAngiotensin IIの500 pMの検出を実現した。昨年度の研究室移転により研究遅延の影響で、本年度は新ESIシステムの並列化にまで至らなかったが、今後本研究コンセプトの実用化に向けてさらに研究を推進する予定である。2014年度9月開始の研究であるが, 2015年2,3月の研究室の大規模移転に伴い,実験可能な期間が大幅に減少してしまったため。27年度が最終年度であるため、記入しない。分析化学試料濃縮法の最適化を中心に実験進捗が予定より遅れているが,人員拡充や装置導入などの研究体制の整備は順調に進捗している。2015年度はこの新体制の下, 2014年度に完了できなかった課題も合わせて推進する。具体的にはまずCE-MS分析の前の1次元目の分離の最適化を行う。逆相カラムを用いて一次元目の分離・脱塩を行い,試料濃縮法によってペプチドを濃縮して高感度なCE-MS分析を行う。

試料濃縮法の最適化においては申請者がノウハウを持つLVSEP法に加え動電過給濃縮法やdynamic pH junction法などのペプチド濃縮法を組み合わせて利用する。最終的に,開発した並列化CE-MSを実際のプロテオミクス分析へ利用する。大腸菌溶解液由来ペプチドを逆相Stage Tipカラムで分画し並列化CE-MSで分析し,従来法の半分以下の分析時間で従来以上のペプチド同定数の実現を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
異質倍数性植物コムギにおけるステロール代謝パスウエイの特性解析

コムギにおけるステロール類のプロファイル(質ならびに量)を改変することにより、コムギに新たな機能性を付与することが期待できる。ところがコムギは異質六倍体であること、形質転換植物の作成が困難であることなどから、コムギにおけるステロール代謝パスウエイに関する知見は皆無に等しかった。本研究によりコムギにおけるステロール代謝パスウエイに係わる推定酵素遺伝子13種を同定した。さらに、機能性ステロールであるスティグマステロール生合成に係わるステロールC-22不飽和化酵素をコードする3種のコムギP450であるCYP710Aサブファミリーを単離し、ゲノムマッピングにより同祖遺伝子TaCYP710A8-A, TaCYP710A8-B, TaCYP710A8-Dを明らかにするとともに、発現解析ならびにシロイヌナズナを用いた機能解析によりその機能差異を明らかにすることができた。コムギESTならびに完全長cDNA情報から、ステロール生合成に関わるアセチルCoAからステロール骨格形成に至る経路の酵素に相当するcDNAを抽出し、これらのcDNAをシロイヌナズナで過剰発現させる。ステロールプロファイル分析による化学的表現型(ケミカルフェノタイプ)を調査し、コムギにおけるステロール生合成遺伝子群の機能を明らかにすること、さらに、コムギにおけるステロール生合成遺伝子群について同祖遺伝子ごとにゲノムマッピングを行うとともにRT-PCR解析、マイクロアレイ解析による遺伝子発現解析の結果とシロイヌナズナを用いた酵素機能解析の結果を統合し、コムギ同祖遺伝子間における遺伝子機能の差異を明らかにするとともに、コムギステロール代謝パスウエイの特性を明らかにすることを目指す。今年度、コムギにけるステロール生合成のうち、シトステロールからスティグマステロールへの変換に係るチトクロームP450モノオキゲナーゼであるCYP701ホモログについての解析を行った。コムギのCYP701ホモログをクローニングし、昆虫細胞/バキュロウイルスの系でタンパク質を発現させた。タンパク質発現は確認できたが、インビトロの活性試験で、シトステロールからスティグマステロールへの変換は見られなかった。次にコムギCYP701ホモログを野生型シロイヌナズナで過剰発現させた。その結果、複数の独立のクローンで、野生型に比ベスティグマステロール含量が増加した予備的結果が得られた。今後、詳細なステロールプロファイリングを行うとともに表現型調査を実施する。今年度、スティグマステロールに関わるP450(CYP710Aサブファミリー)について詳細な解析を行った。コムギ'チャイニーズスプリング(CS)'より3種のCYP710Aサブファミリーをクローニングした。CSのnullisomic-tetrasomic系統を用いて、各遺伝子についてゲノムPCRを行った。その結果、3種の遺伝子はそれぞれ、A, B, Dゲノムに存在することがわかり、TaCYP710A8-A, TaCYP710A8-B, TaCYP710A8-Dと命名した。TaCYP710A8に共通なPCRプライマーでRT-PCRを行った結果、9/13がTaCYP710A8-Aであったことから、コムギCSにおいてTaCYP710A8-Aが優先的に発現していることがわかった。昨年度までに、ステロールC-22不飽和化

酵素遺伝子である3種のコムギP450(CYP710Aサブファミリー)TaCYP710A8-A, TaCYP710A8-B, TaCYP710A8-Dの植物体での機能を調べるために、各遺伝子をシロイヌナズナで高発現させた。その結果、いずれの分子種を過剰発現したものでは、炭素数29のシトステロールのC-22不飽和化されたスティグマステロール含量が10-20倍上昇した。さらにTaCYP710A8-AあるいはTaCYP710A8-Dを高発現したシロイヌナズナのみで24-メチレン-Δ22ステロールレベルが増加した事から、A,Dタイプの分子種は、炭素数28のステロールの不飽和化にも機能することがわかった。以上、コムギにおけるステロール生合成遺伝子において、コムギ同祖遺伝子間における遺伝子機能の差異が明らかとなった。