hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リソソームアミノ酸輸送体Spns1によるmTORC1およびオートファジー制御

近年、オートファジーは急速に研究が進んでいるが、その収束過程については未だ不明な点が多い。オートファジーによって生じた自己消化産物は各種トランスポーターを介してオートリソソームから細胞質に供給され、最終的に細胞の生存・維持に寄与する。リソソームに局在する12回膜貫通型MFSトランスポーターであるSpns1は、その輸送基質は未同定ではあるものの、飢餓誘導オートファジー後のmTORC1再活性化に必要であることが報告されており、オートファジーの収束過程に重要な働きを持つと考えられる。本課題ではSpns1の輸送基質の同定を試み、生体内での機能や病態への関与について解析を進めた。本研究はオートファジー収束過程の理解の一助になると考えられる。まず、肝臓特異的Spns1ノックアウトマウスを作成したところ、肝臓の肥大が確認され、血液成分の解析から肝臓の炎症が示唆された。この肝臓の電顕像では異常なリソソーム構造体が認められた。HEK293やMEFにおいて、Spns1はリソソームマーカー(LAMP1やCathepsin)と共局在したことから、Spns1欠損がリソソームないしオートリソソームの機能不全を引き起こし、肝臓に炎症が起きたことが示唆された。肝臓特異的Spns1ノックアウトマウスの全肝臓ないし肝臓のリソソーム分画では、Spns1の輸送基質が蓄積している可能性があるため、メタボローム解析等を進めており、一部の代謝産物の蓄積傾向が見出された。この解析で得られたSpns1輸送基質の候補の幾つかについて、Spns1安定発現HEK293株由来の精製Spns1を用いて、in vitroプロテオリポソームアッセイを行った。予備実験として、一部の代謝産物とSons1の相互作用を確認することができたが、現在輸送能の有無を確認中である。当初実験計画のマウスはすでに樹立し、解析を始めており、個体レベルの表現型や細胞レベルの異常もある程度確認できている。in vitro実験系で輸送基質の道程を試みているが、現時点ではまだ同定を終えていない。今後も解析を進めていく予定である。組織特異的Spns1ノックアウトマウスの解析から、いくつかの代謝産物のリソソーム分画への蓄積が確認できたので、Spns1がこれをリソソームから細胞質への輸送をできるかをin vitroのアッセイ系でひきつづき検証する。輸送基質を同定したのち、その輸送基質の再添加実験でSpns1欠損表現型をレスキューできるか調べる。オートファジーによって生じた自己消化産物はオートリソソームから各種トランスポーターを介して細胞質に供給され、細胞の生存・維持に寄与する。オートファジーの研究は近年急速に進んでいるものの、その収束過程については未だよくわかっていない。本課題ではSpns1の輸送基質の同定を試み、生体内での機能や病態への関与について解析を進める。まず、肝臓特異的Spns1ノックアウトマウスを作成したところ、肝臓の肥大が確認でき、血液成分の解析から肝臓の炎症が示唆され、この肝臓の電顕像では異常なリソソーム構造体が認められた。また、Spns1を安定発現させたHEK293株からSpns1を精製し、これをin vitroで脂質と混和してSpns1プロテオリポソームを再構成する実験も進めており、一部の代謝産物とSons1の相互作用を確認した。このような代謝産物をSpns1が輸送できるのか解析中である。in vitro実験系について今後解析を進めていく予定である。

HEK293やMEFにおいて、Spns1はリソソームマーカー(LAMP1やCathepsin)と共局在したことから、Spns1欠損がリソソームないしオートリソソームの機能不全を引き起こし、肝臓に炎症が起きたことが示唆された。肝臓特異的Spns1ノックアウトマウスの全肝臓ないし肝臓のリソソーム分画では、Spns1の輸送基質が蓄積している可能性があるため、メタボローム解析等を進めており、一部の代謝産物の蓄積傾向が見出された。この解析で得られたSpns1輸送基質の候補の幾つかについて、Spns1安定発現HEK293株由来の精製Spns1を用いて、in vitroプロテオリポソームアッセイを行った。予備実験として、一部の代謝産物とSons1の相互作用を確認することができたが、現在輸送能の有無を確認中である。当初実験計画のマウスはすでに樹立し、解析を始めており、個体レベルの表現型や細胞レベルの異常もある程度確認できている。in vitro実験系で輸送基質の道程を試みているが、現時点ではまだ同定を終えていない。今後も解析を進めていく予定である。組織特異的Spns1ノックアウトマウスの解析から、いくつかの代謝産物のリソソーム分画への蓄積が確認できたので、Spns1がこれをリソソームから細胞質への輸送をできるかをin vitroのアッセイ系で検証する。輸送基質を同定したのち、その輸送基質の再添加実験でSpns1欠損表現型をレスキューできるか調べる。組織特異的Spns1ノックアウトマウスの解析から、いくつかの代謝産物のリソソーム分画への蓄積が確認できたので、Spns1がこれをリソソームから細胞質への輸送をできるかをin vitroのアッセイ系でひきつづき検証する。
樹冠動態を考慮した幹形状の形成過程の解明と葉量推定への応用

20年にわたり詳細に行なわれたヒノキ群落内全樹木の幹形状および樹高等の調査記録から、幹形の形成とともに個体の樹冠がどのように発達するかを解析した。優占個体では樹齢とともに樹冠長が長くなり葉量も増加したが、被圧個体では樹冠の枯れ上がりによって枯死に至るまで葉量が減少した。この樹冠枯れ上がりの長期過程の個体間の違いが幹の形の個体間差の原因となることを解明した。この詳細な調査記録により、幹バイオマス成長速度や群落の葉量(LAI)の年年変動を規定する気象要因を特定することも可能となった。平成25年度当初は、幹の長さと幹断面積との関係を表すTTモデルの成立理由を明らかにすることを第一目標としていた。しかし、平成24年度に発表・出版したTree Physiology論文内容の発展として、個体の葉量・幹乾重と群落全体の葉量・幹バイオマスとの関連との解析を行うなかで、同論文発表時に公開したヒノキ林の20年調査データを用いることで林冠閉鎖後に群落LAI (葉面積指数)がほぼ一定に保たれるメカニズムを明らかにできることを着想した。このメカニズム解明は本調査データを用いることによって初めて可能となるものであるが、データを公開してしまったためこのメカニズム解析が競争的環境にさらされることとなってしまった。一方、この新規解析を行うことは、TTモデルの成立理由の説明を堅固にするという本研究課題の目的に沿うものであることから、当初の解析順序を変更し、上述の解析を最優先させることとした。この際、既存の森林調査データを用いて個体の幹乾重および個体葉面積を推定する式を新たに導出し、個体ベースデータから群落全体にスケールアップする手法によって群落の幹バイオマスと葉面積指数の長期変動との関係を明らかにすることができた。さらに、20年間のヒノキ林調査と同時期に記録された近隣の気象測候所およびアメダスデータからヒノキ林調査地の過去の気象を推定する作業を行った。これにより、調査地の幹バイオマスやLAIの長期変動と気象要因との関係を明らかにすることができた。これらの一次解析結果は、日本植物学会第77回大会および第61回日本生態学会大会において発表した。現在この内容を論文化し投稿する準備を進めている。なお、上述のTree Physiology論文は、2013年4月以降、同誌ホームページ上に毎月発表される"Most-read Articles"50位以内に毎月ランクインしている(2013年10月2014年2月号(最新発表)までは常に5位以内)。平成24年度の目的は、生物学的要因として樹冠動態を取り入れることによって幹形状の形成過程を解明することにあった。連携研究者(龍谷大学宮浦富保教授)が保有するヒノキ(Chamaecyparis obtusa)同齢林の樹齢21ー40年の期間の全個体(142個体)の非破壊的調査データを用い、群落の発達とともに各個体の幹がどのように太るのかについて、線形混合モデル等を使用した解析を行なった。どの個体でも、樹冠下(胸高から樹冠基部まで)では、幹の上側ほど直径成長速度ΔDが胸高直径成長速度ΔDBHよりやや大きくなる傾向があった。しかし同一個体内のΔDの変異は個体間のΔDBHの差異と比べると小さかった。一方、幹断面積の成長速度ΔAはΔDのほかに幹直径Dにも関係するので、優占個体では胸高に近いほど、被圧個体では逆に樹冠基部に近いほど、樹冠下のΔAが大きかった。これに対し、樹冠内ではどの個体でもΔDがΔDBHより大きく、ΔDBHが0に近い被圧個体でも樹冠内のΔDは正の値を示した。優占個体では成長とともに樹冠が長くなり、個体葉量の指標となる樹冠基部の幹直径DCBは大きくなった。しかし、被圧個体では樹高成長より樹冠基部上昇速度のほうが速いために樹冠は短くなりDCBは小さくなった。すなわち、葉のある部分(樹冠内)では幹は順調に太る一方、樹冠下の幹の太りは個体葉量の長期変化パターンに左右されていた。このような樹冠の上と下との直径成長の違いの程度は、被圧個体ほど大きく異なっていた。これらの現象を説明する生理的なメカニズムを、葉の更新の必要性の観点とそれにかかわる既知の生理的メカニズムとの関連で示唆した。以上の内容はTree Physiology誌にOpen Access論文として掲載されたほか、付録および調査データも同誌の論文URLから公開し、フリーで利用可能としている。前年度に引き続き、ヒノキ林長期調査データに基づく解析を行った。とくに、ヒノキ林調査地の幹バイオマスおよび森林全体の葉量(葉面積指数LAI)の長期変動が、年変動する気象要因のうち何の影響を最も受けているかを詳細に調べた。その結果、ある年の幹バイオマスの増加速度とその年のLAIにはそれぞれ別の気象要因が影響していること、その気象要因とLAIとの関係性にはヒノキが常緑樹であることも関係していると考えられること、を見いだした。これらの解析結果をまとめた論文の原稿をほぼ完成させ、本年度末の時点で投稿間近の状態となった。これらの結果は、本研究課題の目的である樹形のTTモデルの成立理由解析において、個体の幹の長さと幹断面積との関係を個体の幹乾重および葉量との関係に発展させたものと位置づけられる。また、前年度の研究実績概要で報告したとおり、本研究課題の遂行のなかで、樹木が成長してもTTモデルが成立し続ける生物的メカニズムを説明する仮説が生まれた。

この仮説の検証の一部として、樹木の枝や葉芽の生死などに関する野外調査や解剖学的観察を、北海道大学の大学院生とともに北海道大学研究林のアカエゾマツ人工林で行った。その一次解析の結果からは、上述の仮説と矛盾しない結果が得られた。さらにまた、枝内の芽の生死を制御する細胞生理学的知見や測定からもこの仮説を支持できるかどうかを検討するため、資料収集および専門家との情報交換を行った。前年度に引き続きヒノキ人工林個体群の長期非破壊的調査データを用いた解析を行なった。今年度は森林の葉面積指数(LAI)の年々変動解析結果を可能な限り統計的に信頼できるものとするため、非破壊的調査データから個体葉面積や幹乾重を推定するためのアロメトリー関係を再吟味した。それによる幹バイオマスやLAIの年変動の全体的な傾向は前年度までの結果と同じであり、前年度までの解析の結果が統計的な理由で見かけ上生じたものではないことが確かめられた。さらに今年度の解析から、全個体数のうち葉量が前年より減る個体数の割合が年により2050%の間で変動し、その割合が毎年のLAIの年変動(ΔLAI)の大きさに反映されることがわかった。また、幹バイオマス成長速度(dΔBs)の年変動が初夏の降水量と有意な相関をもつことを前年度までに明らかにしたが、先行研究では降水量よりもポテンシャル蒸発量が成長に関わる要因としてしばしば用いられる。そこで、過去の気象データから月ごとのポテンシャル蒸発量を推定した。その結果、本研究を行った森林では比較的多雨であるため、ポテンシャル蒸発量はLAIの年変動や幹の成長に影響していないことがわかった。また、樹木が成長してもTTモデルが成立し続ける生物的メカニズムを説明する仮説を検証するための野外調査も引き続き行なった。本年度はアカエゾマツ二次枝(一次枝上の枝)の当年生シュートを調査対象とした。その結果、一次枝と二次枝とでは当年生シュートの生産に関わる要因が同じとは限らないことが判明し、その違いを説明する仮説を立てた。なお、本課題の成果としてTree Physiology誌に発表した論文(Sumida et al. (2013))は、同誌HP上に毎月発表される"Most-read Articles"において、2013年6月から2016年3月まで35ヶ月連続で上位20位以内にランクされており、2015年11月には1位を記録した。20年にわたり詳細に行なわれたヒノキ群落内全樹木の幹形状および樹高等の調査記録から、幹形の形成とともに個体の樹冠がどのように発達するかを解析した。優占個体では樹齢とともに樹冠長が長くなり葉量も増加したが、被圧個体では樹冠の枯れ上がりによって枯死に至るまで葉量が減少した。この樹冠枯れ上がりの長期過程の個体間の違いが幹の形の個体間差の原因となることを解明した。この詳細な調査記録により、幹バイオマス成長速度や群落の葉量(LAI)の年年変動を規定する気象要因を特定することも可能となった。本年度も前年度と同様に、研究当初に予定していた計画の進行順序を変更して、Tree Physiology論文(本課題平成24年度成果)を発端として新規に派生したヒノキ林のLAIや幹バイオマス増加速度の長期パターンと気象要因との関連についての解析を最優先させた。この解析については比較的順調に進み、日本植物学会第78回大会(明治大学、川崎市)において成果の一部を発表し、これに関する論文
植物二次代謝産物トランスポーターの構造と機能

1.アブシジン酸輸送を司るトランスポーターに関する研究アブシジン酸は重要な植物ホルモンの一種であり、abiotic stress response, seed maturationなど広範な生理機能を制御している。アブシジン酸はvascular tissueで生合成され他の組織に輸送されることがわかっているが、その機構はわかっていなかった。今回、理研の篠崎教授と黒森研究員との共同研究として、アラビドプシスのABCtransporterの一種AtABCG25がATP依存的にアブシジン酸を輸送することを見いだした。初めてのアブシジン酸トランスポーターの発見であり、一月中にPNASで公表された。2.アラビドプシスPHP4ファミリーの機能解析PHP4は動物のSLC17ファミリーに近縁のトランスポーターファミリーであり、リン酸を輸送することが知られている。我々はSLC17ファミリーもリン酸を輸送するが、この活性は人工産物であり、生理的には種々の神経伝達物質の小胞型トランスポーターあるいはアニオン性薬物の尿中排出を司るトランスポーターであることを示してきた。この結果を考慮すると、PHP4におけるリン酸輸送活性も人工産物であり、真の活性は不明のままである可能性があった。このことを追求するために、理研よりアラビドプシスのPHP4ファミリーcDNAsを提供いただき、発現系を構築した。現在、精製トランスポーターの輸送活性を測定中である。植物における情報伝達物質のトランスポーターである証拠が得られつつある。植物とヒトのトランスポーターの精製・再構成系を確立した。この技術を用いて以下の成果を得た。1、タバコ葉よりジャスモン酸たより発現が誘導される遺伝子を単離、そのうち一種を昆虫細胞内で大量発現させ、精製再構成により輸送機能を測定した。予想通り、このトランスポーターは有機カチオンや両親媒性イオンを輸送した。しかも、タバコの液胞に局在しており、ニコチンの濃縮に関与する証拠を得た。この成果は京大矢崎研究室との共同研究として2009年度2月のPNASに公表した。2、ヒトとラットのSLC17A9に分類されるトランスポーターが長年探し求められていたvesicular ATP transporter(VNUT)であることを証明した。この成果は2008年のPNASに公表した。3、ヒトとラットのSLC17A5に分類されるトランスポーターが長年探し求められていたvesicular aspartatetransporter(VEAT)であることを証明した。4、大腸菌を用いたヒトトランスポーターの機能的大量発現系を構築した。5、VNUTの植物ホモログのcDNAをクローン化し、その発現系を構築している。近い将来、このトランスポーターの機能を解明できると考えている。特に、成果3は、植物におけるATPによるシグナル伝達という新しい分野を開拓するための重要である。また、成果4は植物のトランスポーターを解析するための画期的ブレークスルー技術である。
海洋表層の短時間変動が大気に与える影響の解明

日本周辺の北西太平洋を対象に、短時間スケールの海洋表層の変動とそれが大気に与える影響を調べた。人工衛星データの解析から、海面水温急低下を伴う表層クロロフィル濃度の急増加現象は、低気圧が通過することの多い縁辺海や沖縄や本州の南方、及び黒潮・親潮続流域周辺で発生しやすいことが明らかになった。また大気海洋結合領域モデルを用いた数値実験を行い、海面水温の日変化が梅雨期の降水量や台風の強度に影響を与え得ることが示された。潮汐以外の短時間スケールの海洋表層の現象として「晴天時の日射加熱による昇温」及び「気象擾乱通過に伴う鉛直混合による水温やクロロフィル濃度等の変化」が挙げられる。本研究は亜熱帯中緯度の海域を対象に、これらの短周期海洋変動が大気場に与える影響を明らかにすることを目的とする。本年度は、このような短時間スケールの海洋表層の変動現象をより正確に数値モデルで再現できるように海面境界部分のスキームの改良を行った。具体的には、海面から数m深のごく浅いところに形成される日水温躍層の形成を表現できるスキームのプログラムを作成し、これを海洋モデルに組み入れた。これにより、鉛直解像度の比較的粗い従来の海洋モデルでも浅い日水温躍層の形成を表現できるようになった。このスキームを組み入れた大気海洋結合モデルを用いて、2004年の梅雨期を対象に東シナ海海域における降水の日変化に対する海面水温日変化の影響を調査する簡単なモデル実験を行った。レーダーアメダスによる観測では九州地方の降水は午前と午後にピークを持つが、海面水温の日変化を考慮しない場合にはモデルの降水は午後にしかピークを持たなかった。これに対し、日変化を考慮した場合には午前にもピークが現れた。この結果は研究分担者と共同で日本気象学会において発表した。また、海面水温や海色等の衛星観測データを収集・解析し、5日程度の短い期間で発生する急激な変動現象の検出を行った。5日間で3°Cを超える急激な海面水温低下現象は黄海、日本海、オホーツク海、本州東方の混合水域、及び沖縄南方の海域で発生する頻度が高い。これは主に気象擾乱の通過に伴って起こっており、クロロフィルa濃度の大きな変化を伴うこともあることが分かった。太平洋の亜熱帯から中緯度の海域を対象に、1日から数日程度の短時間スケールの海洋変動が大気場に与える影響を明らかにすることが本研究の目的である。本年度は引き続きクロロフィル濃度及び海面水温の衛星観測データの解析を進め、大気擾乱の通過に伴う短期的なクロロフィルa濃度の増加現象に関する研究を行った。その結果、急激な海面水温低下を伴うクロロフィルa濃度増加は熱帯低気圧や温帯低気圧の通り道にあたる沖縄や本州の南方、及び黒潮・親潮続流域周辺で発生しやすいことが明らかとなった。一年を通しての総クロロフィルa濃度増加量のうち、低気圧通過に起因すると考えられるものの割合は大半の海域では5%以下であるが、縁辺海や黒潮・親潮続流域では部分的に数10%に達する海域もあった。台風など発達した低気圧の通過は時間的には数日程度と短いが、海洋生物生産や大気海洋間の気体交換に大きな影響を与え得ることが過去の研究でも示されている。本研究ではそのような低気圧の影響について特に注目すべき海域が明確に示された。また、大気海洋結合モデルを用いた数値実験も並行して進めた。西日本とその周辺海域を含む領域で梅雨期を対象に、海面水温の日変動を再現する場合としない場合で大気場に違いが生じ得るかどうかを調べた。その結果、両者の間で海上風や降水量に差が生じていることを確認した。詳細はまだ調査中であるが、晴天域での海面水温の大きな日変化が直上の海上風速に変化を生じさせ、それが降雨域に伝播し降水量に影響した可能性があることがわかった。本年度は更に台風シミュレーションで海面水温日変動を再現する実験も開始した。本年度は昨年度までに行った表層クロロフィル濃度及び海面水温(SST)の衛星観測データ解析結果を論文にまとめて査読付論文誌に投稿し、更に国際学会において成果発表を行った。この研究により日本周辺海域で大気擾乱の通過によりクロロフィル濃度がどの程度急変するかについて知見を得た。これを踏まえてクロロフィル濃度に対するSST日変動の感度を簡単な数値実験により評価したが、SSTの違いは予想したよりかなり小さいものであった。また、大気海洋結合モデルを用いた数値実験も引き続き実施した。本年度は2005年の台風Hai-Tangを対象に、SST日変化が台風強度予測に与える影響を調査した。その結果、SSTの日変化を考慮すると考慮しない場合に比べて中心気圧に小さいながらも差が生じ得ることが分かった。SST日昇温は台風の進行方向前面で明瞭になる。つまり進行方向前面におけるSSTの差が大気下層の温度や水蒸気量に違いを生じさせ、それが台風の発達に影響したと考えられる。

台風予測においては比較的小さなSSTの変動も重要であることを示唆する結果となった。また引き続き、西日本とその周辺海域を含む領域での梅雨期の事例を対象とした実験も並行して進めた。数値モデルで表現された大気場の違いが比較的小さなSST日昇温に起因する有意なものであるかどうかを確かめるため、本年度はSSTの場にランダム誤差を付加した実験を実施した。この結果については21年度以降も解析を進めている。
アンチセンス法を用いたオリゴデンドロサイト機能抑制による中枢神経移植効果の改善

脳卒中モデルとして、ラットの脳内出血モデルを作成し検討したところ、遅発性の出血と同側の黒質の変性が生じmicrogliaが集ることが分かった。また、このmicrogliaはMAPkinaseの一つであるp38の燐酸化が亢進していることがわかり、第77回日本生理学会、第23回日本神経科学大会および第12回神経損傷の基礎シンポジュウムに発表した。神経幹細胞はラットの胎生14日のmedialおよびlateralganglionic eminencesより分離・調整することができた。この細胞にbFGFを添加するとEGFを添加した際より大きなneurosphereをつくることがわかり、これにより移植細胞を調整することができた。この神経幹細胞および胎仔線条体細胞を脳出血モデルラットにcell suspension法で移植した。両者とも移植片でNeuN陽性細胞、Neurofilament陽性繊維が観察され、synaptophysin陽性のvesicleが観察された。しかしながら神経幹細胞の移植片は、胎仔線条体細胞より全体に粗で周囲の反応性のastrocyteも多数みられた。このasrocyteは移植細胞がasrocyteへ分化した可能性も伺われた。以上の結果を平成13年6月9日に大阪で行われる第16回神経組織の成長・再生・移植研究会に発表する予定である。残念ながら研究報告提出期限までに、移植による機能回復の有無の検討およびオリゴデンドロサイトに対するアンチセンスの作成までには至らなかったが、引き続き研究を続け成果を発表する予定である。本研究では移植を受ける宿主のモデルとして、脳梗塞、脳出血および脳外傷モデルを用いる予定であるが、平成11年度の研究は主に宿主tのモデルの検討を行なった。脳出血モデルはcollagenase注入による線条体出血モデルの作成を試み再現性のあるモデルができるようになった。出血後の変化について病理学的には主に免疫染色を用いて、すなわちGFAPやOX41に対する抗体を用いて宿主での反応を検討した。この結果、移植予定部位である線条体のみならず遠隔部である黒質でもgliosisがおきることを確認しこの結果の一部を日本脳出血学会において発表した。脳梗塞モデルは塞栓子を用いた中大脳動脈閉塞モデルを作成し経時的にやはり免疫染色を用いてGFAP陽性のastrocyteの梗塞巣辺縁での浸潤を観察し得た。また、Blood-brain barrier(BBB)のdisruptionについて検討を加え水チャンネルであるaquqporin-4の変化についても観察しこの結果の一部を第11回国際脳浮腫および細胞障害メカニズムシンポジウムにおいて発表した。脳外傷は大脳皮質にcryogenic injuryを作成した。病理組織学的にやはり損傷部位でのBBBのdisruptionやastrocyteの浸潤について検討中である。来年度(平成12年度)に、これらの宿主モデルでの変化が中枢神経移植効果にどのように関るかを検討を加える予定である。移植細胞としては、当初胎児神経細胞を使用するつもりであったが、neural stem cellの抽出に成功したのでこれを移植細胞として用いる予定である。
原子核乾板による一次宇宙線中の反陽子観測

本年度は、カナダにおいて、気球による宇宙線中の反陽子の観測を行うべく、準備を進めてきたが、カナダにおいては、気球実験は中止されたままであり、アメリカの国立科学気球施設(NSBF)が行うカナダにおける気球飛揚計画も1987年以降に延期されたため、観測実験を実施することはできなかった。アメリカの気球実験再開とともに、いつでも反陽子観測実験が行えるよう待機している状態であるが、本年度は、そのため、以下の準備作業を進めてきた。1.カナダでの気球実験は、ヒッチハイクの形をとることになるので、昨年度購入した気球は、カナダで使用する予定がなくなったので、日本に輸送し、文部省宇宙科学研究所に保管をお願いした。2.原子核乳剤の厚膜塗布のため補助装置を作成し、厚膜塗布のテスト実験を行い、安定した乾板作成方法を調べた。3.上記乾板のテスト現像をくり返し、最適な現像方法について調べた。4.気球実験に用いる観測装置(回転装置つき乾板収納器)及びそのための補助装置(乾板用パンチャー等)を設計し、作成した。又その動作実験テストを行った。5.反陽子イベント検出のため、加速器による反陽子イベントを調べ、プリンスアルバート・スタック中の反陽子イベント候補の検出方法及び、その記録方法について検討を行った。6.上記の原子核乾板中での反陽子イベント候補の効率良い検出方法を検討し、VTR,精密座標測定器及び計算機との連動を、ハード及びソフトの面からテストを行い、イベント解折方法の準備を行った。
新しい疾患概念「心ファブリー病」の遺伝子異常と発症機序の解明

これまで、心Fabry病家系内の酵素活性や心臓所見については明らかにされていなかった。そこで、遺伝子異常が異なる心Fabry病3家系について、家系内の患者を遺伝子解析で診断し、その酵素活性と心臓所見について検討した。方法)対象は心Fabry病3家系の男性9名、女性9名の計18名であり、α-galactosidase遺伝子の直接塩基配列決定による遺伝子診断と血漿α-galactosidase活性測定を行った。遺伝子解析で診断されたhemizygote 5名とheterozygote 6名中5名に対して、心エコー図検査を行い、左室肥大の有無を調べた。結果)遺伝子診断にて5名のhemizygoteと6名のheterozygoteが診断された。家系1:exon6にMet296Ileの点変異が同定された。家系2:exon2にGlu66Glnの点変異が同定された。家系3:exon1にAla20Proの点変異を同定された。酵素活性は家系1:血漿α-galactosidase活性は、hemizygoteが0.6 nmoles/hr/ml(正常平均値の7%)と低下していた。heterozygoteの3名は3336%と低値だった。正常だった残りの6名の酵素活性は正常であった。家系2:2名のhemizygoteは31,35%と低値だった。しかし、heterozygoteである3名の娘は酵素活性が正常であった。家系3:2名のhemizygoteは58%と低値だった。5名のhemizygote全員に左室肥大を認めた。5名のheterozygoteでは左室肥大は認めなかった。結論)心Fabry病では遺伝子異常の違いにより酵素活性が異なる。Hemizygoteでは左室肥大を認めたがheterozygoteでは認めなかった。心Fabry病家系はX-linked Hypertrophic Cardiomyopathyを呈する言える。心ファブリー病の発症機序を明らかにするために心臓所見と遺伝子異常を解析した。心ファブリー病の診断は血漿αガラクトシダーゼ活性測定にて行なった。2名(65歳、57歳)の男性ファブリー病(hemizygote)が見出され、症例1の血漿αガラクトシダーゼ活性は正常の8%、症例2は35%であった。遺伝子解析により、症例1ではαガラクトシダーゼ遺伝子のエキソン6のミスセンス変異(M296I)、症例2(57歳)ではエキソン2のミスセンス変異(E66Q)が同定された。症例1と症例2の2家系で遺伝子診断を行い、男性ファブリー病(hemizygote)と女性ファブリー病(heterozygote)と正常者を明らかにすることができた。症例1の家系では3名のheterozygoteの酵素活性は低値を示した。正常男性4名と正常女性2名は正常値を示した。症例2の家系ではhemizygoteの弟は低値を示した。しかしheterozygoteの3名は正常値を示したことより、遺伝子診断が必要であることが明らかになった。この2家系においては、hemizygote3名とも左室肥大を認めた。しかし、heterozygote6名では肥大を認めなかった。

以上の結果より、1)遺伝子異常の違いにより、酵素活性値が異なること、2)heterozygoteでは酵素活性が正常値を示す症例が存在するために、遺伝子診断が有用であること、3)hemizygoteでは左室肥大を認めるが、heterozygoteでは肥大を認めないことが明らかになった。今後も、心Fabry病の表現型(phenotype)と遺伝型(genotype)の関係を明らかにする必要がある。肥大型心筋症例の中からFabry病を見い出すために血漿を用いてα-galactosidase活性測定を行った。その結果、α-galactosidase活性が高度低下を示すFabry病が新たに見つかった。患者の白血球からDNAを抽出し、PCR法にて増幅し、エキソン17の塩基配列を決定した。その結果、α-galactosidase遺伝子に異常が同定された。その遺伝子異常は今まで報告のない新しい点変異でエキソン5のF229LとD231Vであった。それらのFabry病の臨床病態は肥大型心筋症と酷似し、古典的Fabry病に認められる被角血管腫、四肢末端痛、低汗症、角膜混濁などの全身症状を欠く心Fabry病であった。肥大型心筋症の中に診断されていないFabry病が存在することが再度確認できた。心臓障害を明らかにするために、心Fahry病10例で心機能と形態を検討したが、6例(60%)と高率に左室短縮率低下(FS26%以下)を認めた。その6例中2例では後壁基部の非薄化も認められた。冠動脈の狭窄はなく、局所的に障害が強い機序は明らかではないが、対象の肥大型心筋症84例では認められなかったことから、この所見は心Fabry病に特徴的と考えられる。またこれら10例で心筋病理所見を検討した。その結果、心筋横径は2745μmと肥大し、全例に空胞化がみられた。繊維化も全例に認められ、心筋障害を生じていることを示していた。蓄積はトルイジン・ブルー染色と電顕像で評価したが、すべての心筋に認められた。
国際会計基準（IFRS)導入に伴う会計教育カリキュラムの再検討

本年度は、エストニアで行われたヨーロッパ会計学会に出席し、Framework-Based Teachingのワークショップに参加した。そこでの議論は、これまでにIASBによって公表されているケーススタディだけではなく、さらに営業権の評価や外貨換算のような、より応用的な問題をも含むものであった。このワークショップに参加したことによりIFRSの進展とともに推し進められている原理主義の基づく会計基準の展開あるいはそれを可能にする会計学方法論およびその教育方法の問題点を明確にすることができた。それは次の二つの問題である。1.基礎概念の実践適応時の問題;IFRSの最大の特徴である資産概念を中核とした概念規定の方法は、ある意味で平易で理解しやすいが、反面、そこには数多くの解釈を生み出す可能性がある。すなわち、会計学における基礎概念は普遍的であると思われがちであるが、実は社会状況に依存する可能性が少なからず存在する。単純な概念は多様な解釈を生み出す可能性があり、実際の問題を解決しようとする際に、IFRSが想定するように単純な概念が機能するとは考えにくいように思われる。2.取引レベルへの還元;IFRSは資産概念を中心的な視座に据えているが故に、その変化を取引としてどのように理解するかの議論は脆弱である。すなわち、ある変化を会計上の仕訳として認識するためには、取引の相手勘定をどう規定するかといった問題が重要であるが、利益を概念的に明確にしえていないIFRSにおいては、この相手勘定の問題には直接的な回答をもっていない。よって、仕訳を認識するといった議論はIFRSからは導きえない。この点は、複式簿記を会計学教育の基盤とするわが国においては決定的な問題になるであろう。以上のような問題をどのように解決するかによって、今後のIFRS教育は方向性が決定されるように思われる。本研究の具体的な目的は、IASBがそのホームページで公表しているFramework-based Teaching Materialをわが国、会計学教育にどのように活用するかにある。そのために、平成25年度の目標は、これらの教材と従来の会計学教育体系の比較検討を行うことにあった。この検討に際して、現在進行しているフレームワークそのものの改訂作業を考慮しなければならない。すなわち、どのような改訂が予定され、それがIASBの提唱する教育方法にどのような影響を見定めることは本研究の重要なトピックであるといえよう。今回の改訂はある意味、その他の包括利益概念の明晰化による当期純利益の復活にある。このことは、従来の包括利益概念を中核としたフレームワークの方向性の修正を意味するものとして理解することができる。これまでの包括利益を中核とするフレームワークの理論体系は、資産負債アプローチを基礎とするものであり、現在、公表されているIASBのマテリアルに鮮明に反映されている。すなわち、現在のマテリアルにおいて初級者を対象に提供されている、いわゆるOpen Safariのケーススタディは、資産とは何かが中心的なテーマであり、それはまさにこの資産負債アプローチに従った教材ということができる。しかし、この資産負債アプローチこそが、日本人の多くが把握しづらい考え方であり、これこそがわが国の会計学の教育体系とIASBが想定するそれとの差異を生み出しているものと言えるであろう。よって、本年度は、この資産負債アプローチをその源流までさかのぼって意味内容を明らかにし、さらにIFRSにおいても現在、議論の対象となっていることを明らかにした。その成果は、『會計』第184巻第4号に、「IFRSと資産負債アプローチ」として発表した。

当初の研究計画としては、単純にIASBの公表しているTeaching Materialをわが国にどのように移植させるかが、当面の目的であったが、図らずもIASBがそのFrameworkの改訂作業を進め、これまでの理論体系を見直す作業に入ったために、本研究も必然的にその改訂作業の影響を受けることになり、当初の研究目的を敷衍化し、Frameworkの基本的理論構造の見直しを考察に対象に入れざるを得なくなった。このことは、単にわが国におけるIFRSの教育体系を考察することから、IFRSそのもののわが国における意義をも考察対象とすることを意味している。周知のように、わが国のIFRSを巡る状況は不透明さを増している。金融庁による強制適用の見通しが立たない反面、商社や製薬会社などの大手企業はこぞって任意適用を進めているというアンビバレントな状況にある。このような中において、IFRSの理論体系の基礎に位置づけられている資産負債アプローチの意義を考察することはわが国におけるIFRSの意味を問い直すだけでなく、IFRSの理論基盤の脆弱性を指摘し、その補強を行う意味においても有意義なものであると言える。このような研究の発展は当初は想定しなかったとはいえ、本研究の本来の目的をより深化させ、促進させるものと確信している。現在、研究しているIFRSにおける資産負債アプローチの変容と、教育マテリアルの開発問題を結びつけて議論を行い、その成果をヨーロッパの学会において次年度発表する予定である。そのために、本年度は5月末に開催されるヨーロッパ会計学会に出席し、自らの研究課題を他の研究者がどのように現段階で議論しているかを確認したい。この視察を得て、次年度の研究発表に備える予定である。研究の具体的な進め方としては、IFRSにおける資産負債アプローチとIASBの公表しているTeaching Materialとの理論的関係性を文献研究によって解明し、さらに今年度授業で、実際にこの教材を使用し、学生からのフィードバックなどを通じて、現在のIASBの教育マテリアルの問題点を明らかにしたいと考えている。これらの教育上の効果と理論上の接合を図ることが本年度の目標である。当初想定したよりも、3042円支出が少なかった。この主たる原因は、旅費の見積もり違いである。消耗品費で使用する予定である。
人工甘味料摂取が気管支喘息に与える影響

現代の食生活において、世界的な肥満の増加と健康意識の高まりから、カロリー摂取量を抑制する目的でゼロカロリーの人工甘味料が広く用いられている。一方で、カロリーを抑制するために用いているにも関わらず、人工甘味料摂取が逆に肥満や2型糖尿病のリスクを上げることが報告されており、その健康への影響が注目されている。本研究の喘息モデルマウスでは容量依存性にアスパルテーム投与でアレルギー性気道炎症の亢進を認めていた。今回の研究により、人工甘味料:アスパルテームは既存の気管支喘息のアレルギー性気道炎症を増悪させるだけでなく、それ自体が気道炎症惹起のリスクになると考えられた。最も汎用されている代表的な人工甘味料であるアスパルテームを投与したマウス気管支喘息モデルを作成した。我々の既報に沿ったマウス喘息モデルに、アレルギー性気道炎症作成過程でのアスパルテーム投与を行った。投与量はアスパルテームが代謝されてフェニルケトンになることを利用して算出した。成人の体重を約60Kgとして、市販されている人工甘味料を含む清涼飲料水の中で、最もアスパルテーム含有量が多い商品を、1日に1,000mL飲むことに相当する量をマウス体重に換算して算出し予備実験を行った。投与経路としては予備実験を経て、最終的に蒸留水に溶かしての経口投与とした。作成された人工甘味料投与喘息モデルは、通常の気管支喘息モデルに比べて、組織学的にかなり高度の好酸球性気道炎症を呈していることが確認された。これまでのところ投与そのものによると思われる死亡につながるような事象は確認されず生育状況も順調であり、投与量は妥当であると考えている。今後はさらにnを増やし、実験結果の再現性も含めて検討を進めていく。その後アスパルテームの投与量の増減を行い、量依存性の有無を確認する。その後、平成26年度以降に予定していた喘息モデル成立後のアスパルテーム投与についての検討を行っていく予定になっている。本研究は所謂“ゼロカロリー"の人工甘味料が気管支喘息の好酸球性気道炎症に与える影響を検討し、人工甘味料を摂取する食生活が気管支喘息に与える影響の検討を目的としている。肥満は気管支喘息の発症・増悪のリスク因子であることは知られている。一方、本来カロリー制限(ダイエット)を目的としているはずの人工甘味料が逆に肥満を助長しているとの報告が近年注目を集めている。肥満の助長のみならず、2型糖尿病や脳卒中等の様々な疾患のリスクを上昇させる報告もあり、人工甘味料そのものの健康への悪影響が懸念されるようになってきている。しかし気管支喘息のような呼吸器疾患に人工甘味料が与える影響のけんとうはこれまでなされていない。今回我々は、最も汎用されている人工甘味料:アスパルテームを用いて、ダニ抗原で作成したマウス気管支喘息モデルの好酸球性気道炎症への影響を検討した。アスパルテームは気管支喘息モデルマウスの好酸球性気道炎症を用量依存性に組織学的に増悪させていた。肺内のサイトカイン産生はアスパルテーム投与によりTh2優位となっていた。しかし血清IgE値には強く影響を与えていなかった。また、喘息モデルではないプラセボ投与のマウスに対して、高容量のアスパルテームを投与すると気道の炎症性変化を生じていた。以上のことより、アスパルテームは気管支喘息の好酸球性気道炎症を増悪させる。また、アスパルテームは高容量であれば、アスパルテーム自体が気道炎症を惹起している可能性が示唆された。健康意識の高まりから、ゼロカロリーの人工甘味料は現代の食品に広く用いられている。しかしその一方で、人工甘味料が肥満や2型糖尿病のリスクを上げることが近年報告され、その健康への影響が注目されている。代表的な人工甘味料:アスパルテームは、ヒト体内で代謝されるとアセトアルデヒドを生じる。我々はこれまでにアセトアルデヒドが気管支喘息の気道炎症を増悪させることを報告している。以上のことより、人工甘味料が気管支喘息を増悪させる可能性があると考えられる。そこで本研究は、人工甘味料が喘息の気道炎症に与える影響を喘息モデルマウスを用いて検討することを目的とした。我々の既報に沿って雌性BALB/cマウスを用いたダニアレルゲン感作による気管支喘息モデルマウスを作製し、アスパルテーム投与群とプラセボ群とを比較した。さらにその用量依存性の有無についても検討を行った。プラセボに比べ、アスパルテームを投与された喘息マウスではアレルギー性気道炎症の亢進を認めていた。組織学的所見より、高用量のアスパルテームは、それ自体が気道への炎症細胞浸潤を増強させることが示唆された。また高用量投与が肺に与える影響にはサイトカイン特異性があることが示唆された。研究代表者が、他県で独居している父親の入院介護のために2015年10月から2016年1月の間、週末の不在が多く、動物実験を行うことがスケジュール上困難となった。動物実験は3週間通してのモデル作成であり、週末にも連続の投薬を余儀なくされる。上記事情のため、予定していた動物実験進行に遅れが生じた。先進国における肥満の増加と健康意識の高まりから、カロリー摂取量を抑える目的でゼロカロリーの人工甘味料は現代社会において食品や薬品にも広く用いられている。一方、カロリー制限目的のはずにも関わらず、人工甘味料が肥満や2型糖尿病のリスクを上げることが近年報告されており、その健康への影響が注目されている。

代表的な人工甘味料であるアスパルテームは、ヒト体内で代謝されるとアセトアルデヒドを生じる。我々はこれまでにアセトアルデヒドが気管支喘息の好酸球性気道炎症を増悪させることを報告している。以上のことより、人工甘味料が気管支喘息を増悪させる可能性があると考えられた。雌性BALB/cマウスを用いてダニアレルゲン感作による気管支喘息モデルマウスを作製し、プラセボ群とアスパルテーム投与群とを一日投与量を変えた群で比較した。組織学的検査、気管支肺胞洗浄液(BALF)所見、BALF中サイトカインを測定したところ、プラセボに比べ、アスパルテームを投与された喘息マウスでは、容量依存性にアレルギー性気道炎症の亢進を認めていた。さらに、高用量のアスパルテームは、それ自体が気道への炎症細胞浸潤を増強させることが示唆された。このことにより、高容量ではベースに好酸球性気道炎症(気管支喘息)がなくても、アスパルテーム自体が気道への炎症細胞浸潤を増強させる可能性が示唆された。本研究より人工甘味料:アスパルテームは、気管支喘息のアレルギー性気道炎症を容量依存性に増悪させ、それ自体が好酸球性気道炎症発症のリスクとなると考えられた。現代の食生活において、世界的な肥満の増加と健康意識の高まりから、カロリー摂取量を抑制する目的でゼロカロリーの人工甘味料が広く用いられている。一方で、カロリーを抑制するために用いているにも関わらず、人工甘味料摂取が逆に肥満や2型糖尿病のリスクを上げることが報告されており、その健康への影響が注目されている。本研究の喘息モデルマウスでは容量依存性にアスパルテーム投与でアレルギー性気道炎症の亢進を認めていた。今回の研究により、人工甘味料:アスパルテームは既存の気管支喘息のアレルギー性気道炎症を増悪させるだけでなく、それ自体が気道炎症惹起のリスクになると考えられた。実験はほぼ予定通りに進行し、定期的な学会発表もできている。今後は追加実験と論文執筆にうつる予定。上記事情により予定よりやや遅れたものの、年度が変わってから学会発表も予定通り進行できている。数度の追加実験を以て実験は終了できる見込みであり、その後は論文執筆の予定である。呼吸器学今後は気道炎症形成過程での投与が与える影響を、これまでの既存の炎症への投与と比較検討していく。人工甘味料(アスパルテーム)の投与量の設定と、投与経路の模索に時間を要したが、喘息モデル自体は既に我々が確立していたものであり、決定後は大きな問題なく実験を遂行することができたため。研究代表者が、他県に在住している父親の病気療養介護のために、週末不在にすることが2015年末から2016年にかけて続いた。動物実験は3週間連続してのモデル作成であり、週末も投薬が必要となり、実験遂行が困難であた時期があったため。予定していた学会参加を次年度の学会へ持ち越したこと等で予定金額よりも少なくなった。遅れていた分の追加実験を施行する。成果について学会発表、論文執筆を遂行していく。アスパルテーム投与で確認された好酸球性気道炎症について、投与量の増減を行い、量依存性の有無を確認する。
高原子価16族元素中間体を経由するカルコゲノカルボン酸誘導体の新合成法開発

トリフロロ酢酸存在下、アルキニルセレノアテテート(1)とチオールから新基化合物であるセレノンチオールエステル(2)を合成単離し、その性状を明らかにした。得られた化合物(2)青紫色の液体で、水や熱に対しては比較的安定であるが、酸素に対しては不安定である。化合物(2)のセレノカルボニル基に基づく、n-π遷移は置換基(R^2)が嵩高くなるに従い、即ちエチル、イソプロピル、t-ブチルの順に長波長シフトする。また、セレニウムのケミカルシフトもその順章高滋場シフトする。逆に、その炭素のケミカルシフトはその順で低滋場シフトをする。この結果は、セレノカルボニルカーボンとセレニウムのケミカルシフトがn-π遷移と間与していることを示している。2は第1及び第2アミンと容易に反応し、相当するセレノアミドを高収率で与えた。2を-20°Cでリチウムジイシプロピルアミンで処理するとエンセレノラート(3)を生成する。3はハロゲン化アルキル、アシルクロリドなどの求電子試薬で容易にトラップされ、他の方法では得ることが難しいケラン-Se,S-アセタールを定量的に与える。アリルブロミドでトラップされたアセタールは[3,3]-シグマトロピー転位し、新しいセレノンチオールエステルを生成する。また、3はメチルビニルケトンと容易に反応し、Michael付加物を生成した。2をメタクロロ過安息香酸で酸化するとビスセレノンチオールエステルとジセレニドを生成した。【chemical formula】トリフロロ酢酸存在下、アルキニルセレノアテテート(1)とチオールから新基化合物であるセレノンチオールエステル(2)を合成単離し、その性状を明らかにした。【chemical formula】
HVEMを標的とした自己免疫疾患に対する新規治療法の開発

Hypoxia induciblefactor (HIF)は低酸素誘導性の転写因子で、低酸素状態における血管新生や造血の促進、慢性炎症や癌の進展に関与することが知られているが、リンパ球による免疫応答におけるHIFの役割については解明されていない。最近の我々の研究により、免疫細胞に幅広く発現する共シグナル分子のHVEM(Herpes virus entry mediator)がHIFの機能亢進に関与することが判明した。一方でHIFは炎症性のTh17(T helper type 17)細胞の分化・発展に関与することが示されている。そこで本研究では、HVEMがHIFを介してTh17細胞の誘導を促進するという仮説を立て、これを動物モデルを用いて検証する。平成24年度はまずin vitroでHVEMシグナル刺激によってリンパ球がTh17関連サイトカインを産生するかを検討した。マウスから分離したTリンパ球を抗CD3抗体とコントロールIgGあるいはHVEMシグナル刺激抗体(HM3.30)で刺激したところ、コントロール群と比較しHM3.30投与群はIL-17aを含むTh17関連サイトカインの産生が有意に上昇していた。次にHM3.30によるin vivoの効果を検討した。マウスにコントロールIgGまたはHM3.30を200ug腹腔内投与し4日後に脾臓を摘出した。Th17細胞を同定するため脾細胞をPMAとionomycinにて4時間刺激し、flow cytometryにてIL-17aサイトカインの産生を解析すると、コントロール群に比べHM3.30投与群で有意にIL-17a産生細胞の割合が増加していた。現在、再現性を確認すると共にTH17誘導性の疾患であるEAE(experimental autoimmune encephalomyelitis)におけるHM3.30の役割について検討中である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
造精機能調節におけるカルモデュリンおよびカルモデュリン結合蛋白の役割に関する研究

本年度は、本研究の最終年度であり、下記の2つの研究計画を実施するとともに、本研究によって得られた知見をまとめ、各種学術雑誌に発表した。【I】.Carsperminの組識間分布の検討:昨年度、ブタ睾丸中のカルスペルミンに対する特異的抗体を用いたRIA系を確立した。これを用いて、ブタ各組識中の本蛋白の分布を検討した。本カルモデュリン結合蛋白は主として睾丸、精子、中枢神経系に分布した。造精系臓器では本蛋白の殆んどは、105、000g上清に存在したが、中枢神経系では、大脳と小脳皮質に高濃度で、その多くは105.000g顆粒画分に存在した。【II】.Carsperminの組識化学的分布の検討;前述の抗体を用い、Carsperminの免疫組識化学的分布を、ミニピッグで調べた。免疫反応(ペロキシダーゼ法)による染色は、RIAによる結果と良く一致し、睾丸では精子細胞、精子に、中枢神経系では大脳及び小脳灰白質、小悩顆粒層細胞に濃く、その他、各種の神経核の細胞体にも散在性に染色を認めた。一方、白質には全く染色はなく、carsperminは神経細胞に分布することが明らかとなった。【III】.その他:Carsperminの精製法をMethods in Enzymologyに発表した。また、現在までの研究の概要をCell Calciumに発表した。
L型ピルビン酸キナーゼ遺伝子のグルコース応答性転写因子複合体の解明

1.LPK遺伝子の炭水化物応答性転写因子であるChREBPが転写共役因子のPGC-1αとin vitroで結合することを見出し、この結合がChREBPの7-150および659-760領域とPGC-1αの650-797領域の間で起こることを示した。PGC-1αのこの結合はChREBPのLPK遺伝子プロモーターへの結合を阻害し、ChREBPによるLPK遺伝子の転写活性化を抑制した。さらに、この結合は共免疫沈降法により両因子を強制的に発現させた培養細胞中でも起こることを示した。2.肝細胞で発現している転写因子のHexもin vitroでChREBPと結合することが示されたが、強制発現させた培養細胞では認められなかったし、レポーターアッセイでも有意な影響は認められなかった。3.ChREBPの新規結合タンパク質のスクリーニングを2つの方法により行った。1つはGST-ChREBPを作製し、これに結合する特異的なタンパク質を肝臓核抽出物から検索した。もう1つは酵母ツーハイブリドシステムを利用して、肝臓mRNAから検索した。しかしながら、これまでのところ有力な候補となりうるタンパク質の同定には成功していない。4.ラットChREBP遺伝子のプロモーター領域を含む断片をクローニングし、翻訳開始点上流約900bpの配列を明らかにし、複数の転写開始点を同定した。レポーターアッセイにより-163から-32の間に複数の転写制御領域(Sp結合部位、ステロール調節部位、NF-Y結合部位)があることを見出し、それぞれの領域に細胞内でSp1,SREBP1,NF-Yが結合していることを示した。また、Sp1とNF-Yの間、Sp1とSREBP1の間で、それぞれ相乗効果のあることが認められた。したがって、ChREBP遺伝子の転写制御にはこれらの転写因子間の相乗作用が重要であることが明らかになった。1.ChREBPと相互作用するタンパク質の検索ラットのChREBPをグルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、グルタチオンセファロースビーズに結合させた。これにラット肝臓から抽出した核タンパク質を反応させ、よく洗浄後、結合タンパク質を質量分析にて解析した。その結果、いくつかのタンパク質が同定されたが、候補と考えられるようなタンパク質は見当たらなかった。まだ、結合の特異性に問題があり、これを解決することが必要なので、現在、種々の方法を検討中である。2.PGC1ファミリータンパク質の役割の検討ChREBPと相互作用するかもしれない既知の転写共役因子の影響を検討したところ、PGC1ファミリータンパク質がChREBPの作用を抑制することを見出した。現在、その機構を検討中である。3.ラットChREBP遺伝子の転写制御機構の検討ラットChREBP遺伝子のプロモーター領域を含む断片をクローニングし、翻訳開始点上流約900bpの配列を明らかにするとともに、複数の転写開始点を同定した。レポーターアッセイで転写制御領域を調べたところ-163から-32の間に複数の制御領域があることが示唆された。これらの領域はSp結合部位、ステロール調節部位、NF-Y結合部位で、それぞれ細胞内でSp1、SREBP1、NF-Yが結合していることが電気泳動移動度シフトアッセイやクロマチン免疫沈降法で示された。したがって、ChREBP遺伝子の転写制御にはこれらの転写因子の間の相乗作用が重要であることが明らかになった。