hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小学校における学級経営支援・評価システムの構築に関する開発的研究

また分担者小島は本研究の知見を学部の教育実習に還元し、さらに分担者松岡は学級経営の妨げになりがちな非行の問題について論を深めるなど、当初の見込みより広範囲に亘る研究枠組みとなった。こうした研究テーマの展開という点においても、十分に意義深い研究となったと考える。
熱帯域の大規模降水システムに伴う水循環の解明に関する研究

本研究では階層化した熱帯の大規模降水システムの組織化機構において水循環および放射の果たす役割を定量化することを目的とする。H8年度は、衛星観測による雲データと一次元放射モデルとを用い、大規模雲活動が大気上端や地上の放射フラックスおよび大気加熱におよぼす効果を計算する手法を開発した。さらに、実際のデータを用いて様々なタイプの雲の消長と放射効果への影響を調べた。また、西太平洋暖水域や東太平洋偏東風域のように、大規模場状況が異なる場合を比較し、大規模場と雲システムの放射効果との関係を調べた。放射計算に当たって、雲データはISCCP D1の15種類の各雲型についての光学的厚さ・雲頂温度・雲量を用いた。大気プロファイルは、ECMWFの格子点データの気温・高度・相対湿度を用いた。放射モデルは中島(東大CCSR)他によるfatar5bを用い、短波放射は0.2-4μm、長波放射は4-100μmで積分した。季節内振動に伴う大規模雲システムが西大西洋域から東太平洋域を東進した1990年3月について計算し、西太平洋暖水域(2.5N-2.5S,150-160E)、東大西洋偏東風域(Eq-5S,100-90W)の2領域での毎日の大気上端・地表の雲の放射強制および、放射による大気加熱を解析した。その結果、大気上端での雲の放射強制の時系列における雲型別の寄与が定量化された。西太平洋での平均的加熱のほとんどは薄い巻雲が、東太平洋の平均的冷却は定住する低層雲が担っており、深い対流活動に伴う厚い上層雲は、大きな振幅を持つが短波・長波でほぼ相殺して中立であった。また、雲の鉛直大気加熱への寄与の解析から大気の安定度に対する雲の時間変化の効果を明らかにした。
翻訳後修飾としてのチロシン-O-硫酸化とその機能(タンパク質チロシン硫酸転移酵素の遺伝子工学への応用)

タンパク質の生合成は、DNAの遺伝情報に基づき転写されたm-RNAがリボゾームでポリペプチド鎖に翻訳され、そのポリペプチド鎖が小胞体やゴルジ体で様々な修飾をうけることによって完成する。翻訳後修飾としては、ポリペプチド鎖の切断、リン酸化、硫酸化、メチル化、アセチル化、ADP-リボシル化、アシル化、糖鎖付加、ジスルフィド架橋などがある。これらの中でも、癌化とリン酸化とは極めて重要な関係がある。近年、リン酸化と分子的に非常に類似した硫酸によるタンパク質のチロシン残基の修飾が見つかり注目されている。硫酸化チロシンタンパク質の硫酸供与体は活性硫酸PAPSすなわち3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸である。それは細胞質可溶性画分で生合成され、そしてゴルジ体に入りタンパク質チロシン硫酸転移酵素(TPST)により硫酸化に使われる。翻訳後修飾としてのチロシン硫酸化の生体内での機能はまだ完全に明らかになっていないが、タンパク質の生理活性調節、機能の多様化、タンパク質分解酵素に対する安定性への寄与、そして選別輸送を含めた分泌のためのシグナルの可能性が考えられる。近年、遺伝子工学の発展に伴い組み換えタンパク質の医薬、研究用試薬への利用が考えられている。しかし、大腸菌や酵母を用いて遺伝子の発現を行った場合、得られたタンパク質が翻訳後修飾をなされていないことにより、その機能を有していない場合があり、問題にされている。チロシン硫酸化もこのような修飾の一つである。そこで今回、65個のアミノ酸からなる血液凝固阻害剤ヒルジンをモデルタンパク質として、上記酵素を用いて天然型ヒルジンの作製を試みた。その結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功し、天然型ヒルジンを得た。これらのことより、組み換えタンパク質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTPSTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。生体内において硫酸化は、多くの外因性や内因性の化合物の代謝や、タンパク質のチロシン残基や糖鎖の翻訳後修飾として重要な役割を演じている。これらの硫酸化は異なる硫酸転移酵素により活性硫酸(PAPS)から基質のOH基への硫酸基を転移することにより行われる。種々の硫酸転移酵素は細胞質と膜の両画分に局在し、タンパク質チロシン硫酸化に関与する酵素(TPST)は、ゴルジ体の膜に結合する膜内在性糖タンパク質である。今回牛肝臓ミクロゾ-ム画分およびゴルジ体に存在する硫酸転移酵素の諸性質の検討と遺伝子工学の産物すなわちリコンビナントタンパク質の効率良いチロシン硫酸化を目的として研究を行った。また、硫酸化チロシン蛋白質をモデルとした11種類の基質オリゴペプチドおよびそれらの硫酸体の合成、構造同定を行った。その結果、牛肝臓のゴルジ体から調製したTPSTはZーGluーTyrやBocーC CKー8などの数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時、Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTPSTの基質の認識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。またチロシンのC端アミノ酸の疎水性の強さは、TPSTの基質認識にほとんど影響しなかった。その結果、基質ペプチドとしては、BocーAspーTyrーValが最も適していることが明らかとなった。牛血清中の硫酸化チロシン結合性タンパク質(TSBP)を反応混液に加えることにより、Km値が1/10に減少した。ヒル(Leech)

由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的にE.coliや酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。TPSTによる硫酸化を試みた結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功した。これらのことより、リコンビナントタンパク質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTPSTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。生体内において硫酸化は、多くの外因性や内因性の化合物の代謝や、タンパク質のチロシン残基や糖鎖の翻訳後修師飾として重要な役割を演じている。これらの硫酸化は異なる硫酸転移酵素により活性硫酸3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸(PAPS)から基質のOH基へ硫酸基を転移することにより行われる。種々の硫酸転移酵素は細胞質と膜の両面分に局在し、タンパク質チロシン硫酸化に関与する転移酵素(TPST)は、ゴルジ体の膜に結合する膜内在性糖タンパク質である。今回、牛肝臓ミクロゾーム画分およびゴルジ体に存在する硫酸転移酵素の諸性質の検討と遺伝子工学の産物すなわちリコンビナントタンパク質の効率良いチロシン硫酸化を目的として研究を行った。その結果、牛肝臓のゴルジ体から調製したTPSTはZ-Glu-TyrやBoc-Cck-8など数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTSPTの基質の認識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。またチロシンのC端のアミノ酸の疎水性の強さは、TPSTの基質認識にほとんど影響しなかった。また牛血清中の硫酸化チロシンに親和性をもつ蛋白質を反応混液に加えることにより、Km値が1/10に減少した。ヒル由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的に酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。
新卒看護師のノンテクニカルスキルの構造化

本研究では、看護実践において必要となるノンテクニカルスキル(状況認識、意思決定、コミュニケーション、チームワーク、自己管理)を育む教育プログラムの開発を目指し、看護師がどのようにして「ノンテクニカルスキル」を獲得していくのか、新卒から卒後3年目までの経過を経時的に追うことでその構成要素を明らかにし、「ノンテクニカルスキル」を構造化することを目的とした。2018年度は、研究に着手するにあたり、ノンテクニカルスキルに関する文献レビューを行った。国内、また医療分野以外にも目を向け文献レビューを行うことで既存のエビデンスを整理した。文献レビューの過程を以下に示す。1.分析および結果「ノンテクニカルスキル」をキーワードとして、「医学中央雑誌Web」と「科学技術情報発信・流通総合システム(J-STAGE)」にて文献検索を行った。文献の選定基準を設定し検索を行った後に、タイトルレビュー、アブストラクトレビュー、アーティクルレビューにより、対象となる文献を選定した。結果は、医中誌では240件が、J-STAGEでは85件がそれぞれ抽出され、そのうち41件を分析対象とした。41件の内訳は、研究論文が10件、総説・解説が31件であり、研究論文は方法別に、質問紙調査が7件、事例分析が3件、尺度開発が1件であった。研究論文は11件と少数であり、扱われているノンテクニカルスキルの要素についても著者によって様々であり、用語の定義も統一されたものではなかった。また、医療職やその他の職業における現任教育の取り組みは散見されたが、看護基礎教育での導入はほとんどみあたらなかった。2.考察今後の課題として、ノンテクニカルスキルの概念の明確化が必須であり、さらには学生のノンテクニカルスキルを育む新たな教育手法の開発および評価に関する研究の必要性が示唆された。本調査(参加観察・インタビュー)にあたり、ノンテクにカルスキルの概念に関する検討から進めており、その分析に時間を要している。概念分析は本研究の基盤となるものであり、丁寧に進めていく必要がある。文献レビューの結果から、看護におけるノンテクニカルスキルの概念について明確化が必須であることが明らかとなったこと、さらには、看護基礎教育における導入が見当たらないことから、まず「ノンテクニカルスキル」の概念分析を進めていく。次に、学生のノンテクニカルスキルを育む新たな教育手法の開発および評価に関する研究に取り組み、最終的には新卒看護師を対象にノンテクニカルスキルに関する調査(インタビュー・参加観察)を行い、看護基礎教育と現任教育をつなぐ教育プログラムの開発を目指す。2019年度は、1「ノンテクニカルスキル」の概念分析、2学生を対象とした「ノンテクニカルスキル」を育む教育プログラムの開発に着手する。1「ノンテクニカルスキル」の概念分析:国外文献の分析をとおして、概念を抽出する。また、抽出された概念や理論との関係性を検討する。2「ノンテクニカルスキル」を育む教育プログラムの開発:概念分析に基づき、ノンテクニカルスキルの要素を取り入れた教育を導入し、教育の効果を評価していく。

1「ノンテクニカルスキル」の概念分析:国外文献の分析をとおして、概念を抽出する。また、抽出された概念や理論との関係性を検討する。2「ノンテクニカルスキル」を育む教育プログラムの開発:概念分析に基づき、ノンテクニカルスキルの要素を取り入れた教育を導入し、教育の効果を評価していく。2018年度は、人件費・謝金において支払いが生じなかったため、当該年度所要額との間に差が生じた。2019年度は、分析のプロセスで内容分析を行う予定であり、研究協力者への十分な謝金を確保する必要がある。予定されている物品費や旅費等の支出に加え、人件費や謝金についても計画的に執行していく。
ウエアラブルメディアによる長期間体験映像記録と自動的な要約の生成

「極めて長期間の個人体験映像をそのまま記録したい」というのが本研究の動機である。カメラやコンピュータの小型化が進み、ウエアラブルコンピュータといった究極の個人情報処理環境も出現している。また、記録装置の高密度化、小型化もすすみ、大量の情報を蓄積できるようになってきている。いずれは小型カメラをつけ、見たままの映像をその人の視点から記録し長期間に渡って記録し続けることのできる環境が整うことであろう。映像のデータ量は70年分の映像を記録したとしても圧縮レートが64kbps(TV電話品質)で11テラバイト、4Mbps(放送TV品質)でその64倍にすぎない。この量はまちがいなく近い将来、個人で所有できるデータ量となる。ただし、記録できたとしてもその人にとって必要なところだけを絵日記のように抽出し、再生するにはどうすればよいのかという問題が大きな処理課題として残る。本研究では、この課題への取り組みを行う。なお、このように人生まるまる要約するようなメディアをライフメディアと称したい。今年度の成果を以下に記す。・ウエアラブルイメージングシステムの構築カメラ映像、GPS、脳波情報、加速度センサなどウエアラブル機器をまとめたプラットホームを構築した。・各種センサ情報を用いた体験映像のインデキシング比較的長時間の映像データに対して、GPS,動きセンサ、加速度センサなどの情報を用いてユーザの振る舞いを推定し、体験映像へのインデキシングを行った。歩いている、とまっているなどのイベントを検出し、ビューワ上で一覧することができる。これまでに続けてきた脳波情報も者種センサデータと合わせて構築したシステムでは一括して記録することが出来る。・映像と音響情報による個人視点映像の構造化個人視点映像は、だらだらと連続的に続く映像であり、これを何らかの処理単位へと分割し、ショットを構成したい。映像の客観的な特徴量を用いた分割手法を検討した。映像のデータ量は70年分の映像を記録したとしても圧縮レートが64kbps(TV電話品質)で11テラバイト、4Mbps(放送TV晶質)でその64倍にすぎない。・個人視点映像敢得のためのウエアラブル撮像機器の構築カメラ映像、GPS、脳波情報、加速度センサなどウエアラブル機籍をまとめたプラットホームを構築した。・生理情報を用いた体験映像の格付け手法の確立比較的長時間の映像データに対して、生理情報、具体的には、先行してすすめている脳波情報を用いることによる興味の度合の評価を行い要約のための手法を確立した。イベントヘの人の脳波の反応は一般的な傾向があり、その傾向を利用した格付け手法を構築した。
活性炭吸着制癌剤臨床応用のための基礎研究

癌化学療法を効果的に行うためには、癌細胞にだけ選択的に毒性を示し正常細胞には毒性を示さない薬剤の出現が理想である。しかし、現時点ではこのような薬剤はないので、既存の抗癌剤の剤型を工夫して出来るだけ抗癌の癌選択性を高める工夫がなされている。本研究では活性炭というこれまでにない全く新しい抗癌剤の剤型を開発し、本剤が癌のリンパ節転移を播種性転移に極めて有効性が高いことを基礎的ならびに臨床的にも明らかにすることが出来た。微粒子活性炭は多量の抗癌剤を吸着することが出来る。また、吸着された抗癌剤は活性炭周囲の薬物濃度が低下したとき活性炭から離脱される。しかも、微粒子活性炭を組織内に投与すると血管系からは吸収されずリンパ系から吸収され投与した所属リンパ管、リンパ節は黒染される。これらの微粒子活性炭の性質を利用して、活性炭に抗癌剤を吸着し(活性炭吸着抗癌剤)これを癌性胸・腹膜炎の治療およびリンパ節転移の治療に応用した。試験的に癌性腹膜炎のモデルに活性炭吸着マイトマイシンCを投与したところ、マイトマイシンは長時間高濃度を示し、通常のマイトマイシン腹腔内投与より著しい効果を示した。これを臨床的にも癌性胸腹膜炎に74例の患者に応用し、61%の有効率であった。さらに微粒子活性炭のもう一つの特性であるリンパ指向性を利用して、胃癌、大腸癌、乳癌のリンパ節転移の治療に応用した。活性炭吸着マイトマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシンなどを組織内に注入すると、速やかにリンパ管、リンパ節は黒染され外科的郭清の指標として有用性が高いと同時に、郭清の困難な遠位リンパ節には高濃度の抗癌剤が分布するので、リンパ節転移の化学療法としても極めて有効である。すでに本剤を臨床的に100例以上の患者に応用し、良好な結果が得られている。微粒子活性炭に抗癌剤を吸着させ、活性炭を抗癌剤のキャリアーやリザーバーとして使用するために、基礎的に検討を重ね臨床にも応用してきた。従来開発してきたマイトマイシン吸着活性炭は、癌性腹膜炎やリンパ節転移に対して用いられ、それぞれ成果を挙げている。特に癌性腹膜炎に対する効果には著しいものがあり、切除不能であった胃癌がMMC活性炭を投与後切除可能になった例が認められた。また、いったん癌性腹膜炎として重篤な状態で入院した患者が、本法施行後退院可能となり、通常の社会生活に復帰した例も数例に認められた。以上のような臨床成果の他に、本年度はアドリアマイシン吸着活性炭の基礎的な検討を進めた。癌の種類によってはMMCが必ずしも効果を示すわけではなく、そのような場合に他の種類の抗癌剤を吸着させた活性炭が必要になってくる。アドリアマイシンは乳癌などに広く用いられている薬剤であるので、乳癌のリンパ節転移や癌性胸腹膜炎に対して使用するためアドリアマイシン吸着活性炭を開発した。その結果アドリアマイシンは活性炭に大量に吸着され、徐々に活性を保持したまま遊離してくることが分った。ただMMCの場合と違い不可逆的に活性炭に吸着される割合がやや高く、更に活性炭の種類の検討などが必要と考えられた。また、本年度は動脈内投与による塞栓化学療法に応用するため、サイズのやや大きな活性炭を開発した。
減数分裂中期特異的アポトーシスを導く因子の解明

精巣内アポトーシスの意義を解明する目的で、減数分裂M期特異的に細胞死の出現するMRLマウスを解析した。本年度はその特徴をさらに検討した。精子形成過程における減数分裂M期は一般的にMIとMIIに区別されるが、多くのアポトーシス像はMI期に集中していた。電顕観察により、減数分裂の紡錘糸形成後に細胞変性が開始しアポトーシスの過程を辿ることが見いだされた。このことから、MI期の細胞死が紡錘糸形成チェックポイント作動の結果として惹起される可能性が示された。次にMRLマウス精子形成チェックポイントの特徴をさらに検討するため、腹腔内停留精巣術を施しC57BL/6マウスのそれと比較した。その結果、術後2週までにC57BL/6の精巣重量はほぼ半減したのに対し、MRLマウスのそれは術後3週においてもコントロールの70%前後で推移した。形態学的にはMRLマウスで多くの精祖細胞が残存していた。さらに、生後発達過程の検討から、MRLマウス精巣では一時期卵細胞の形成されていることが明らかとなった。これらのことから、MRLマウス精祖細胞が熱耐性で、減数分裂中期チェックポイント完成前は卵細胞へと分化し、チェックポイント完成後は精母細胞のアポトーシス像として観察されるものと考えられた。この熱耐性精祖細胞に特異的に発現してくる遺伝子を同定するため、MRLマウスとC57BL/6マウス精巣cDNAを用いてdifferential display法を行ったところ、いくつかの既知ならびに未知遺伝子クローンを検出することに成功した。以上の所見から、MRL系統のマウスは減数分裂MI期特異的にアポトーシスが出現し、精祖細胞の分化過程に何らかの変異の存在することが伺えた。今後精祖細胞を詳細に解析することで新たな精子形成チェックポイントを提唱できる有用なモデルとしてMRLマウスを検討していきたい。アポトーシスは、形態学的には細胞萎縮、核濃縮、核分断化を特徴とし、細胞死機構の解明に重要な位置を占める。精巣内の減数分裂は種の保存に欠くことのできない生物現象であり、その間の細胞死は多くの因子によって制御されていると考えられる。我々はマウス精巣内のアポトーシスをTUNEL法ならびにDNAラダー検出法で観察したところ、MRL系統のマウスにおいて無視できないほどの陽性像を検出した。材料としてマウス10系統を使用した。C57BL/6,C57BL/10,CBA/J,DBA2,C3H/He,SL,BALB/c,NJLにおいてTUNEL陽性細胞の出現する精細管は約10%前後であったのに対し、MRL^<+/+>,MRL^<lp/lp>では、約35%であった。1精細管中に出現する陽性細胞数は前者で1-2個、MRL系統では6-7個で、20個以上出現する精細管も約5%存在した。HE染色との連続切片観察の結果、陽性細胞はステージ12のM期精母細胞に一致していた。ステージ12に出現するM期の死細胞数は、MRL^<+/+>でC57BL/6の約25倍であった。さらに、MRL^<+/+>精巣では明らかなDNAラダーが検出された。電顕的に、MRL^<+/+>ではM期精母細胞の特徴的な細胞死が多数観察された。以上の所見から、MRL系統のマウスは他系統のマウスに比較して減数分裂中期特異的にアポトーシスの出現することが伺えた。減数分裂中期特異的に細胞死が出現する意義は現在のところ不明であるが、精子形成過程にみられるチェックポイントの一つを解明する有用なモデルと考えられる。以上の所見から、MRL系統のマウスは減数分裂MI期

特異的にアポトーシスが出現し、精祖細胞の分化過程に何らかの変異の存在することが伺えた。今後精祖細胞を詳細に解析することで新たな精子形成チェックポイントを提唱できる有用なモデルとしてMRLマウスを検討していきたい。
ジベレリン生合成系酵素遺伝子を利用した樹木の成長制御に関する研究

セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)は活性型ジベレリン(GA)のうち、GA_1、GA_3、GA_4を保持し、このうちGA_3が地上部のバイオマス生産を極端に促進した。このポプラから、GA生合成の鍵酵素であるGA20参加酵素、GA3β水酸化酵素及び活性型GAを不活性化する7種類のGA2β水酸化酵素の遺伝子(PnGA2ox1PnGA2ox7)を単離した。ポプラ挿し木をGA処理(GA_3:0,15,45,150μM)し、GA20酸化酵素遺伝子、GA3β水酸化酵素遺伝子、7種類のGA2β水酸化酵素遺伝子の発現量の変化を、GA処理の前後で比較した。GA20酸化酵素遺伝子、GA3β水酸化酵素遺伝子の発現はGA処理にフィードバック的に阻害された。一方、GAβ水酸化酵素遺伝子のうち、葉と茎で発現するPnGA2ox1、PnGA2ox3、PnGA2ox6、葉で特異的に発現するPnGA2ox2、茎で特異的に発現するPnGA2ox4、PnGA2ox7の発現はいずれもGA処理により上昇したが、葉でのみ発現するPnGA2ox5の発現量は変化しなかった。こうして結果は、GA処理により、葉や茎で活性型GAであるGA_3含量が極端に増加したことで説明できる。また、除草剤ビアラホスや抗生物質ハイグロマイシンを用いた効率の良い組換えポプラの作出技術も確立した。さらに、GA20酸化酵素遺伝子やGAのシグナル伝達に関与する3量体Gタンパク質の遺伝子を過剰発現させた組換えポプラを作出し、ゲノムDNA上に組換え遺伝子の存在を確認した。現在、これら組換えポプラの成長特性を閉鎖系温室で解析している。本研究によりGA20酸化酵素遺伝子やGA3β水酸化酵素遺伝子の過剰発現、ないしはGA2β水酸化酵素遺伝子の発現の抑制により、樹木の成長を向上できる可能性が示唆された。セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)及びギンドロ(P. alba)の2種類のポプラから、草本植物等の既知の遺伝子情報に基づき、複数のジベレリン生合成系酵素遺伝子を単離した。ジベレリン20酸化酵素はジベレリン生合成のキー酵素といわれており、その遺伝子はポプラゲノム中に複数個存在した。これらが対立遺伝子であるのか、別の遺伝子座に存在するのかは解析中である。また、ジベレリン3β水酸化酵素、ジベレリン2β水酸化酵素、コパリル二リン酸合成酵素、カウレン合成酵素等ジベレリン生合成系酵素の候補遺伝子の単離にも成功しており、これら遺伝子の全塩基配列の決定を進めている。一方、組換えギンドロの作出技術を確立した。この方法では、選抜マーカー遺伝子にフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar)遺伝子を用い、選抜薬剤として除草剤ビアラホスを直接使用した。これは、木本植物の形質転換において除草剤を選抜薬剤に用いた最初の例である。このシステムでは、エスケープ個体やキメラ個体は全く出現しなかった。これまで、ポプラではカナマイシン選抜など比較的選択圧の低い抗生物質が用いられ、エスケープ個体やキメラ個体が出現し、効率的な解析の大きな妨げとなっていた。しかし、ポプラでも選択圧が高いビアラホス選抜が可能となり、効率良く組換えポプラの作出が図れ、組換えポプラを用いた遺伝子機能の解析が大きく前進するものと期待できる。

なお、セイヨウハコヤナギの遺伝子組換えにも同様の選抜が実施できるよう詳細な条件検討を行っている。セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)及びギンドロ(P.alba)の2種類のポプラから、二オキソグルタル酸依存型モノオキシゲナーゼファミリーに属するジベレリン生合成系酵素遺伝子、ジベレリン20酸化酵素、ジベレリン3β水酸化酵素及びジベレリン2β水酸化酵素の候補遺伝子の単離に成功した。特に、セイヨウハコヤナギから単離した1種類のジベレリン20酸化酵素、1種類のジベレリン3β水酸化酵素及び4種類のジベレリン2β水酸化酵素について配列を決定した。また、ジベレリン20酸化酵素、ジベレリンシグナルを伝達する3量体Gタンパク質αサブユニットをコードする遺伝子(RGA)及びそれに恒常的活性型変異を導入した変異RGAのいずれかを過剰発現するセイヨウハコヤナギの組換え体の作出に成功した。これらの組換え遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター下流にタバコモザイクウイルス183kDタンパク質の5'側非翻訳領域(Ω配列)を連結した強力なプロモーターにより制御されている。一方、選抜マーカー遺伝子にハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ(hpt)遺伝子を用い、選抜薬剤としてハイグロマイシンを使用した効率の良いセイヨウハコヤナギ組換え実験系を確立した。この系では、エスケープ個体やキメラ個体は全く出現せず、組換えカルスの出現頻度はビアラフォス選抜に比べ10倍以上だった。これにより、遺伝子機能解析に用いるセイヨウハコヤナギ組換え体を容易に作出できると期待できる。セイヨウハコヤナギ(Populus nigra)から、活性型のジベレリン(GA)を不活性化するGA2β水酸化酵素の候補遺伝子(PnGA2ox4PnGA2ox7)を新たに4種類単離し、全塩基配列を決定した。セイヨウハコヤナギ挿し木をGA処理(GA_3:0,15,45,150μM)し、GA20酸化酵素遺伝子、GA3β水酸化酵素遺伝子、7種類のGA2β水酸化酵素遺伝子(PnGA2ox1PnGA2ox7)の発現量の変化を、GA処理の前後で比較した。GA20酸化酵素遺伝子、GA3β水酸化酵素遺伝子の発現はGA処理によりフィードバック的に阻害された。一方、GA2β水酸化酵素遺伝子のうち、葉と茎で発現するPnGa2ox1、PnGA2ox3、PnGa2ox6、葉で特異的に発現するPnGa2ox2、茎で特異的に発現するPnGa2ox4、PnGA2ox7の発現はいずれもGA処理により上昇したが、葉でのみ発現するPnGA2ox5の発現量は変化しなかった。こうした結果は、GA処理により、葉や茎で活性型GAであるGA_3含量が極端に増加したことで説明できる。なお、GA生合成の早い段階で、前述のものと異なるファミリーに属するGA2β水酸化酵素遺伝子を4種類単離し、全塩基配列を決定した。ゲノムDNAの解析では、このファミリーのGA2β水酸化酵素遺伝子が他に2種類存在することが明らかになった。さらに、GA20酸化酵素やGAのシグナル伝達に関与する3量体Gタンパク質を過剰発現させた組換えポプラを作出し、ゲノムDNA上に組換え遺伝子の存在を確認した。現在、これら組換えポプラの成長特性を閉鎖系温室で解析している。本研究により、GA20酸化酵素遺伝子やGA3β水酸化酵素遺伝子の過剰発現、ないしはGA2β水酸化酵素遺伝子の発現の抑制により、樹木の成長を向上できる可能性が示唆された。
HIV-1におけるDNAワクチン開発の基礎的研究

HIVのワクチンにはenv,gag,pol等に対する細胞障害性T細胞(CTL)の活性を主とする強い免疫反応の惹起が重要である。今回我々は免疫宿主に強い免疫能の付与を目的に新世代DNAワクチンの開発、検討を今回行った。まず、IL-2、IL-12、GM-CSF等の発現プラスミドをHIVワクチンに挿入することにより、強い免疫応答が得られた。次にHIVのenv,gag,polの感染防御抗原を構成する約15前後のアミノ酸をコードする約1.5KbのDNAをヒト型コドン化した。エピトープをコードしている複数のDNAを直列に繋ぎ、その上流にCMVプロモーターを結合させ、更にカスパーゼやユビキチンなどの遺伝子をも挿入したものも作製した。これらには免疫増強活性が観察された。これらの新世代DNAワクチンの免疫原性及び抗HIV-1活性をHIV-1ワクチニア、キメラウイルスを用いたチャレンジ実験で有効性が認められた。一方、この10数個のエピトープをコードしているDNAをワクチニアウイルスベクターLC16m8に挿入し、追加免疫用のワクチンとして作製し、その免疫原性を現在確かめている。LC16m8株は日本で独自に開発され、副作用が、極めて少なく、有効性が高いワクチンとして臨床試験も行われているものである。それら両方が揃った場合に、新世代DNAをまず免疫し、次にLC16m8株由来ワクチニアウイルスベクターを追加免疫した後、種々の免疫反応を検討し、その有効性を検討していく。
核医学心筋画像と冠動脈造影像の3次元複合表示および解析システムの開発

昨年までは、高価なグラフィックワークステーションやビジュアリゼーションソフトウェアを用いて重ね合わせ及び複合表示システムの試作を行って来た。今年度はこれまで開発して来たシステムの使用経験を積み、有効性を確認すると共に、臨床への応用を念頭にPC上でのシステムの実現を試みた。以下具体的に記す。1. PC上で重ね合わせ及び複合表示システムの試作を行った。この際、臨床で使用することを想走して、安価なシステムを構築するために、フリーソフトウェアを中心とした構成を検討した。実際にはPC-AT互換機上に構築したPC-UNIX(GNU/Linux)+XFree86+MesaGL(OpenGL)という環境を用いた。同システム上で、3次元表示のハードウェアアクセラレーションが可能であることも確認した。また、OpenGLを用いたことにより簡単に他のプラットフォームへの移植が可能であると考えられた。実際、医師の間で評判の高い、マッキトッシュ上でのシステム試作も開始した。2.先のシステムに、SPECTやPETからのディジタルデータ転送が可能であることを確認した。3.昨年度以来開発を続けて来た、ブルズアイマップ上での重ね合わせ表示が臨床上有用であることが確認できた。このため、ブルズアイマップ上での重ね合わせを簡単に実現するための、半自動重ね合わせプログラムとユーザインターフェイスを上記システム上に試作し、アルゴリズムとシステムの有効性を確認した。4.重ね合わせを簡単に実現するためには、造影像上で冠動脈像の抽出が行われていることが望ましい。冠動脈の抽出のために、モルフォロジーフィルタを用いる方法を検討し、有効性を確認した。昨年までに試作して来たシステムの使用経験を積み、有効性を確認すると共に、開発システムの実用化に必要な用件の洗い出しを試みた。また、それに基づいて異なる観点からの2つの試みを同時に行なった。以下具体的に記す。1.今年度新たに1機種のSPECT装置から計算機へディジタルデータを転送方法を確立した。2.システム全体の中で最も効率が悪く、実用化を妨げている冠動脈造影像の3次元再構成の部分について、1)3方向以上の複数撮影像を利用することによる冠動脈の自動3次元再構成法、2)SPECT像から作成した簡易左心室モデルを用い心筋表面を走行するという条件で冠動脈像を再構成する手法、の2点を試みた。第一の方法は詳細な再構成を目指すもので、冠動脈像を事前に抽出した2値化像を用いた場合に比較的良好な結果を得ることができた。計算時間の短縮や冠動脈像の抽出法あるいは、上記手法の多値画像への拡張を引続き検討中である。第二の方法では近似的な再構成を行なうが、同時に重ね合わせを行なうこと、簡単に再構成できるという点が特徴である。いずれの方法についても実用化の可能性が示された。今後目的に応じて使い分けて行く予定である。3.表示方法の検討を行なった。患者などに対する説明に用いるためには、これまでに検討して来た詳細な3次元表示が有効であるが、医師の診断支援には、通常の診断でよく使われている、ブルズアイ表示上へ冠動脈像を重ね合わせることが有用であると考えられた。ブルズアイ表示上への重ね合わせを前提とした場合には、上記の簡単なモデルを利用する方法が有効であると考えられた。以下具体的に記す。
誘因両立的かつ効率的な資源配分ルールの設計に関する理論的研究

(2)Sprumont(1991)によって研究された個人の消費集合が1次元であり、各個人は単峰的選好を持つモデルは、戦略的操作不可能性と効率性及び公平性とが両立可能であるモデルとして知られている。また、このモデルにおいては、Thomson(1994)が明らかにしたところによると、公平、効率的かつ整合性をみたすルールはuniform ruleと呼ばれるルールのみであることが知られている。23年度には、財が分割不可能である場合に上記のような帰結が維持されるのか否かについて研究を行なった。得られた結果は、ルールfが戦略的操作不可能性、効率性及び公平性(ここでは弱意の非羨望性)をみたすならばfはtype-1 uniform ruleとよばれるルールであること、ルールfが整合性、効率性、公平性(ここでは弱意の均等配分下限性)及び資源に関する連続性をみたすならばfはtype-2 uniform ruleとよばれるルールであること、である。以上の結果を"On the problem of fair division of indivisible goodswhen preferences are single-peaked"と題する論文にまとめた。本研究は、戦略的操作不可能性や効率性及び公平性の観点から社会的に望ましい資源配分ルールを特定化する事を目的としている。特に、資源配分ルールに関し、戦略的操作不可能性と効率性とが両立不可能であることを示唆する研究結果を受けてSasaki(2003)が提案した次善的効率性をみたす戦略的操作不可能なルールを設計する事を目標としている。
呼気情報のセンシングとインタフェース応用に関する研究

1.計測システム:乾燥空気中で様々なガスをppbレベルで検出可能な重量検知型水晶振動子(QCR)式ガスセンサを用いて呼気ガス計測システムを設計した.共振周波数9MHzの温度依存性の小さいATカットQCRの両面に感応膜として高周波スパッタリング法によりプラズマ有機薄膜を堆積させたトランスデューサを発振用回路と周波数変化計測用回路,マルチポートインタフェースを持つ集積回路ボード上に8個アレイ状に装着することで呼気ガスセンサモジュールを構成した.呼気ガス測定系は,被験者が呼気を吹き込むサンプルラインと,大気をベースとして取り込むリファレンスラインで構成されており,ガスラインの流量は流量調整器によって制御される.2.心理推定(1)被験者にイメージングにより快,不快の感情を想起してもらい,その感情状態における呼気を収集した.快,不快,及び感情無しの3感情状態を対象として学習機械による認識システムを構築した.センサ応答波形からパルス幅と振幅を抽出して特徴ベクトルを構成して学習機械の入力とした.実験の結果,サポートベクトルマシンにより83.3%,ニューラルネットワークにより75%の認識率が得られ,呼気ガスからの感情識別の可能性を示した.(2)物理的な刺激として市販の洗口液を使用し,被験者20名より洗口液の使用前後での呼気を収集し,さらに多面的感情状態尺度により洗口液使用前後での感情評価を行った.その結果,洗口液使用後は正の感情が喚起されていることから,快適(洗口液使用後)と普通(洗口液使用前)の2感情状態を対象としてニューラルネットワークによる認識システムを構築した.ガスセンサの応答波形で構成したデータマトリクスについて主成分分析を行って特徴ベクトルを抽出し,ニューラルネットワークへの入力とした.実験の結果,47.5%の認識率が得られ,呼気ガスからの感情識別の可能性を示した.1.計測システム:乾燥空気中で様々なガスをppbレベルで検出可能な重量検知型水晶振動子(QCR)式ガスセンサを用いて呼気ガス計測システムを設計した.共振周波数9MHzの温度依存性の小さいATカットQCRの両面に感応膜として高周波スパッタリング法によりプラズマ有機薄膜を堆積させたトランスデューサを発振用回路と周波数変化計測用回路,マルチポートインタフェースを持つ集積回路ボード上に8個アレイ状に装着することで呼気ガスセンサモジュールを構成した.呼気ガス測定系は,被験者が呼気を吹き込むサンプルラインと,大気をベースとして取り込むリファレンスラインで構成されており,ガスラインの流量は流量調整器によって制御される.2.心理推定(1)被験者にイメージングにより快,不快の感情を想起してもらい,その感情状態における呼気を収集した.快,不快,及び感情無しの3感情状態を対象として学習機械による認識システムを構築した.センサ応答波形からパルス幅と振幅を抽出して特徴ベクトルを構成して学習機械の入力とした.実験の結果,サポートベクトルマシンにより83.3%,ニューラルネットワークにより75%の認識率が得られ,呼気ガスからの感情識別の可能性を示した.(2)物理的な刺激として市販の洗口液を使用し,被験者20名より洗口液の使用前後での呼気を収集し,さらに多面的感情状態尺度により洗口液使用前後での感情評価を行った.その結果,洗口液使用後は正の感情が喚起されていることから,快適(洗口液使用後)と普通(洗口液使用前)の2感情状態を対象としてニューラルネットワークによる認識システムを構築した.ガスセンサの応答波形で構成したデータマトリクスについて主成分分析を行って特徴ベクトルを抽出し,ニューラルネットワークへの入力とした.実験の結果,47.5%の認識率が得られ,呼気ガスからの感情識別の可能性を示した.本年度は,呼気情報インタフェースを構成するための基礎データを収集する計測システムの構築と,その基本性能に関する検討を行った.(1)計測システム乾燥空気中で様々なガスをppbレベルで検出可能な重量検知型の水晶振動子(QCR)式ガスセンサを使用し,室内空間に存在する揮発性有機化学物質が室内大気室に及ぼす影響を計測するシステムの構成を参考に呼気ガス計測システムを設計した.振周波数9MHzの温度依存性の小さいATカットQCRの両面に感応膜として高周波スパッタリング法によりプラズマ有機薄膜を堆積させたものをトランスデューサとし,このQCRセンサを発振用回路と周波数変化計測用回路,マルチポートインタフェースを持つ集積回路ボード上に8個アレイ状に装着することで呼気ガスセンサモジュールを構成した.呼気ガスの測定系は,被験者が呼気を吹き込むサンプルラインと,大気をベースガスとして取り込むリファレンスラインの2つのガスラインで構成されており,ガスラインの流量は流量調整器によって制御される構成とした.(2)呼気計測実験設計した計測システムを用いて,健常な被験者により呼気ガスを導入した時の各センサの応答について検討した.呼気が導入されるといずれのセンサも一旦周波数変化量が減少して極小値を取った後,増加に転じてベースライン付近に漸近する応答を示す傾向が観測された.センサの応答波形形状は呼気の吹き込みの強さに依存せず,極小値のピークが吹き込みの強さに依存することも確認された.極性ガスに感度の高いセンサ群のピークが大きく,これは呼気ガス中の水蒸気成分に反応していることが示されることから,設計した測定システムにおいてガスライン中の除湿が必要であることを示唆している.

一方,疎水性のガスに感度が高いセンサ群の応答を分析することで呼気ガス成分の性質について分析・判別できる可能性があることも示された.本年度は,被験者に対して心理・物理実験を行った状況において呼気ガス計測システムを用いて呼気を収集し,呼気ガスから心理状態を推定する手法について検討した.1.イメージングにより喚起される感情の認識被験者にイメージングによって快および不快の感情を想起してもらい,その感情状態における呼気を収集する実験を行った.快,不快,及び感情無しの3感情状態を対象として学習機械による認識システムを構築した.ガスセンサの応答波形からパルス幅と振幅を抽出して特徴ベクトルを構成して学習機械の入力とした。実験の結果,サポートベクトルマシンにより最大83.3%,ニューラルネットワークにより75%の認識率が得られ,呼気ガスから感情状態を識別する手法の可能性を示した.2.物理刺激により喚起される感情の認識物理的な刺激として市販の洗口液(デンタルリンス)を使用して被験者20名より洗口液の使用前後での呼気を収集し,さらに多面的感情状態尺度により洗口液使用前後での感情評価実験を行った.その結果,洗口液使用後は正の感情が喚起されていることから,快適(洗口液使用後)と普通(洗口液使用前)の2感情状態を対象としてニューラルネットワークによる認識システムを構築した.ガスセンサの応答波形で構成したデータマトリクスについて主成分分析を行って特徴ベクトルを抽出し,ニューラルネットワークへの入力とした.実験の結果,47.5%の認識率が得られ,呼気ガスから感情状態を識別する手法の可能性を示した.
モモ果実における渋味の発生要因及び渋味物質生成機構の解明

モモ果実における渋味の発生要因を明らかにするため、13園の`白桃'成熟果実についてフェノール含量を比較した。フェノール含量は、同一園での樹体間や果実間よりも果樹園間で大きく異なり、最も多い園では最も少ない園の約3倍であった。しかし、果実のフェノール含量と生産地、樹齢、果実重、糖含量などとの間には関係がみられなかった。果実のフェノール含量と土壌pHとの間には関係がなかったが、土壌ECはフェノール含量の多い園で僅かに高い傾向であった。`白桃'果実のフェノール含量が園によって異なる背景を検討した。フェノール含量は、各園とも果実発育第2期にピークに達し、その後は成熟期に向けて減少したが、成熟時のフェノール含量が多い園ほど第2期の含量も多かった。果実のフェノール含量と新梢生長からみた樹勢の強弱および土壌水分含量との間に関係がなかった。フェノール生合成のキー酵素とされているPAL(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)の活性は、果実発育第1期に高く、しかもフェノール含量が多い園ほど高かった。しかし、フェノール代謝に関与するとされているN、Mn、CuおよびBの果実中の含量とPAL活性との間には明確な関係がみられなかった。12品種の成熟果実についてフェノール含量を比較したところ、箕島白桃とゴールデンピーチで最も多く、大久保、白桃などがこれに次ぎ、川中島白桃やネクタリンで少なかった。フェノールの分子量は、果実発育第1期に大きく、第2期に低下し、第3期に再び大きくなる傾向であったが、ネクタリンでは成熟期でも小さいままであった。HPLC解析の結果、いずれの品種でも6つ以上のフェノール性物質が検出され、そのうち同定できたカテキンとクロロゲン酸は、ほとんどの品種で硬核期まではクロロゲン酸よりもカテキンが多かったが、成熟期にはクロロゲン酸が多かった。モモ果実に於ける渋味の発生要因を明らかにするために、成熟期の白桃果実におけるフェノール含量の果樹園間での差異を調査するとともに、園によってフェノール含量に違いが生じる背景を検討した。すなわち、岡山県内4地区から13の白桃栽培園を選び、各園につき同じ樹齢のものを3樹ずつ選定し、各々の個体から収穫した4果についてフェノール含量を測定した。同時に、新梢長を調査するとともに、葉と土壌を採取し、乾燥後発光ダイオードを使って果実とともに微量要素を中心とした無機成分の分析を行った。その結果、果実のフェノール含量は、同一園内での樹体間や同一樹内での果実間による差は小さかったが、栽培園間では大きく異なり、最も多い園のフェノール含量は最も少ない園の約3倍であった。しかし、果実におけるこのようなフェノール含量の園地間差異と生産地、樹齢、傾斜地であるか水田跡地であるかといった園地の形態、収穫日、果実重、新梢長からみた樹勢の強弱などとの間には明確な関係が認められなかった。果実の糖含量の園地間差は小さかった。土壌のpHと果実のフェノール含量との間には関係がみられなかったが、ECと窒素含量はフェノール含量の多い園で僅かに高い傾向であった。フェノールの代謝に関与するとされている無機成分のうち、葉と果実中の窒素(N)とマンガン(Mn)についてはフェノール含量との間に明確な関係が認められなかったが、ホウ素(B)と銅(Cu)については果実のフェノール含量が多い園で僅かに少ない傾向であった。モモ果実における渋味の発生用を明らかにするために、`白桃'果実のフェノール含量が栽培園によって異なる背景を検討した。

すなわち、前年度の調査で成熟果実のフェノール含量が多かった2園(K,T)と少なかった2園(I,S)の各々3樹から経時的に果実を採取し、フェノール含量を測定した。また果実発育期間中、新梢長と土壌水分含量を調査するとともに、葉と土壌を採取し、果実とともに微量要素を中心とした無機成分、ならびに土壌のpHとECを測定した。成熟果実のフェノール含量は、昨年度と同様に同一園内での樹体間や同一樹内での果実間よりも栽培園によって大きく異なり、K園で最も多かったが、T園については他の2園(I,S)と大差ないことから、果実のフェノール含量は園によって異なるものの年によってもかなり変動することが明らかとなった。フェノール含量は、いずれの園のいずれの樹体とも果実発育第2期にピークに達し、その後は成熟期まで減少し続けたが、成熟期のフェノール含量が多い園ほど第2期の含量も多かった。果実のフェノール含量と新梢生長からみた樹勢の強弱および土壌の水分含量との間には明確な関係が認められなかったが、果実の糖含量はフェノール含量の多い園で高かった。I園では発育期間を通して土壌のpHとECが低かったが、果実のフェノール含量との関係は明確でなかった。また、フェノールの代謝に関与するとされている無機成分のうち、特異的にI園だけで果実と葉のマンガン(Mn)が多かった。モモ果実における渋味物質の化学的特性を明らかにするため、果実の発育期間を通してフェノール含量およびフェノールの組成や分子量分布を調査した。12品種の成熟果実についてフェノール含量を比較したところ、箕島白桃とゴールデンピーチで著しく多く、大久保、白桃、白鳳などがこれに次ぎ、紅鳳、川中島白桃およびネクタリンのヒラツカレッドとファンタジアで少なかった。フェノール含量は、いずれの品種とも果実発育初期に少なく、硬核期に急増してピークに達し、その後は成熟期に向けて減少し続けた。ゲル濾過法でフェノールの分子量分布(40フラクション)をみたところ、分子量は果実発育初期に大きく、硬核期に低下し、成熟期に再び大きくなる傾向であったが、ネクタリンでは成熟期にも小さいままであった。成熟果実では、1623番目のフラクションに最大ピークがみられたが、フェノール含量の多い品種と少ない品種との間に大きな違いはなく、また大久保とネクタリンでは比較的遅いフラクションにピークがみられた。HPLC解析の結果、いずれの品種でも6つ以上のフェノール性物質が検出された。そのうち同定できたカテキンとクロロゲン酸の果実発育に伴う変化の様相は、フェノール含量の場合とほぼ同じであったが、硬核期まではクロロゲン酸よりもカテキンが多かったのに対し、成熟期には白桃と瀬戸内白桃を除き、カテキンよりもクロロゲン酸が多かった。ファンタジアでは、カテキン、クロロゲン酸ともに硬核期に著しく増力汀し、フェノール含量の少ない成熟期にも両者ともに多いままであった。
生体外細胞操作と細胞群組織化による複合ハイブリッド腎糸球体ユニットの構築

本研究は遺伝子操作により、免疫複合体を除去する機能を付加させた腎糸球体細胞を、糸球体基底膜成分に類似す生分解性高分子素材に植え付け、細胞外環境を人工的に設計、構造化し、それらの相互作用を持つ細胞間基質(マトリックス)を用い、機能強化細胞群を取り込むことによって、複合ハイブリッド腎組織を生体外で形成させ、取り扱い易い形状にした人工腎ユニットを構築する研究を行い、将来移植可能な人工腎臓の根幹となすキーテクノロジーを確立することを目的とする。平成10年度は既に、細胞の免疫複合体の除去能及び免疫寛容能を支配する遺伝子を腎糸球体上皮細胞に導入した。また、細胞不死化に効果する遺伝子E6,E7を用い、腎糸球体メサンギウム細胞の不死化を行った。平成11年度は腎糸球体上皮細胞及びメサンギウム細胞の生体外の共培養および細胞間相互作用を検討した。共培養の最適培地のみならず、細胞外マトリクスであるECM(excellular matrix)、コラーゲンゲルも用い、細胞培養の最適条件を検討した。また生体内では、メサンギウム細胞と上皮細胞が基底膜の両側に存在するため、アスコルビン酸添加したコラーゲン溶液中にガーゼを浸漬し、UV照射によりゲルを架橋し、形成したガーゼゲルの両側に二種類の細胞をそれぞれ植え付けて培養した。結果として、ECMは腎糸球体上皮細胞を蜂巣状を引き起こし、メサンギウム細胞の伸縮性を抑制した。一方、コラーゲンゲルは上皮細胞を集落的に増殖させたが、アスコルビン酸をさらに添加すると、両細胞が順調に増殖した。ガーゼゲルの両側に細胞を共培養した結果、上皮細胞がシート様に増殖したが、メサンギウム細胞がガーゼの枝に付着増殖し、さらに凝集した。FDA(生細胞を判定する試薬)とPI(死細胞を判定する試薬)の染色により、細胞の生存が確認された。これらの結果により、ガーゼが栄養分及び酵素などをトランスポートしたことを示唆した。また、ガーゼゲルは細胞共培養の軟足場として使われることが明らかとなった。本研究は遺伝子操作により、免疫複合体を除去する機能を付加させた腎糸球体細胞を、糸球体基底膜成分に類似ず生分解性高分子素材に植え付け、細胞外環境を人工的に設計、構造化し、それらの相互作用を持つ細胞間基質(マトリックス)を用い、機能強化細胞群を取り込むことによって、複合ハイブリッド腎組織を生体外で形成させ、取り扱い安い形状にした人工腎ユニットを構築する研究を行い、将来移植可能な人工腎臓の根幹となすキーテクノロジーを確立することを目的とする。平成10年度の研究実績は以下の通りである細胞の免疫複合体の除去能及び免疫寛容能を支配する遺伝子を腎糸球体上皮細胞に導入した。免疫複合体の除去能(結合及び貧食)を持つ遺伝子、補体C3bレセプターをコードするpCR1をclectroporation法により、腎糸球体上皮細胞に導入した。また、T細胞の免疫応答co-timulatory signalをコードするCTLA4-Igも細胞に導入した。遺伝子の蛋白質への発現はFlowcytometryやWestern blottingにより確認した。2腎糸球体メサンギウム細胞の不死化株の樹立細胞不死化に効果する遺伝子E6,E7(前者は癌制御する因子p53の不活性化遺伝子、後者は細胞周期調整因子であるpRBの不活性化蛋白をコードするヒトパピローマウイルス(HPV16)の遺伝子)を用い、メサンギウム細胞の不死化を行った。蛍光顕微鏡により、メサシギウム細胞特有の伸縮形質を確認した。3腎糸球体

上皮細胞及びメサンギウム細胞の共培養法を開発する生体腎内でのメサンギウム細胞と上皮細胞の生存類似環境を設計するため、生体外の共培養環境をセルデイスク及びシリコンリングを用いた。細胞をセルデイスク上に播種してから、シリコンリングの上下両側に載せて、上皮細胞の特有培地DMEM-F12及びメサシギウム細胞の特有培地MSGMを添加し、37Cの培養法を開発した。平成10年度は既に、細胞の免疫複合体の除去能及び免疫寛容能を支配する遺伝子を腎糸球体上皮細胞に導入した。また、細胞不死化に効果する遺伝子E6,E7を用い、腎糸球体メサンギウム細胞の不死化を行った。平成11年度は腎糸球体上皮細胞及びメサンギウム細胞の生体外の共培養および細胞間相互作用を検討した。共培養の最適培地のみならず、細胞外マトリクスであるECM(excellular matrix)、コラーゲンゲルも用い、細胞培養の最適条件を検討した。また生体内では、メサンギウム細胞と上皮細胞が基底膜の両側に存在するため、アスコルビン酸添加したコラーゲン溶液中にガーゼを浸漬し、UV照射によりゲルを架橋し、形成したガーゼゲルの両側に二種類の細胞をそれぞれ植え付けて培養した。結果として、ECMは腎糸球体上皮細胞を蜂巣状を引き起こし、メサンギウム細胞の伸縮性を抑制した。一方、コラーゲンゲルは上皮細胞を集落的に増殖させたが、アスコルビン酸をさらに添加すると、両細胞が順調に増殖した。ガーゼゲルの両側に細胞を共培養した結果、上皮細胞がシート様に増殖したが、メサンギウム細胞がガーゼの枝に付着増殖し、さらに凝集した。FDA(生細胞を判定する試薬)とPI(死細胞を判定する試薬)の染色により、細胞の生存が確認された。これらの結果により、ガーゼが栄養分及び酸素などをトランスポートしたことを示唆した。また、ガーゼゲルは細胞共培養の軟足場として使われることが明らかとなった。以上の結果を平成11年度の日本生物工学会、日本化学工学会、日本培養組織学会、第5回アジア太平洋生物工学会および第9回欧州バイオテクノロジー学会に発表した。