hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
弾性波シミュレーションを組込んだ次世代型コンクリート非破壊欠陥探査システムの開発

本研究では,供用中のコンクリート構造物での弾性波挙動を弾性波シミュレーションにより予めシミュレートし,内部欠陥を現地で適確に評価することが可能な計測条件を事前に決定するための【次世代型コンクリート非破壊欠陥探査システム】を提案した。提案したシステムの妥当性を検証するため,削孔による探査結果との比較を行った結果,両者は概ね一致した。したがって,本システムは,実構造物の欠陥探査に対して有効であることが明らかとなった。本研究は,弾性波シミュレーション解析(FEM解析)により欠陥を適確に探査することが可能な入力方法,受信方法および周波数分析手法について把握した上で,解析結果(理論値)と測定結果(実測値)をパターン認識などにより比較することで,現地でリアルタイムに欠陥を探査することが可能な【次世代型の非破壊欠陥探査システム】を開発することが目的である。本年度は,システムを開発する上でベースとなるFEM解析および周波数分析手法に関する基礎的な検討を行なった。以下に得られた成果の概略を示す。(1)FEM解析によるグラウトト未充填箇所の探査に関する検討供試体や計測条件を基に設定した解析モデルにおいて3次元動磁場解析および3次元衝撃応答解析を行い,得られた解析結果と供試体実験の結果とを比較することによりモデルの妥当性の検証を行なった。さらに,解析を活用することにより,供試体実験の結果に基づき提案した手法の検証も併せて行なった。その結果,グラウト未充填および充填の有無を電磁パルス発信-弾性波受信による方法(電磁パルス法)により評価する場合は,最大振幅値が有効な評価パラメータであることを明らかにした。(2)周波数分析手法の改善による弾性波の多重反射成分の抽出に関する検討入力する弾性波の上限周波数が版厚共振周波数よりも大きくなる条件を満たすにも関わらず版厚共振によるピーク(多重反射成分)が確認できないケースに対して,受信波形を離散ウェーブレット変換により周波数帯域ごとに分解した。得られた波形に対して自己相関係数を算出し,相関係数が極大値を示す時刻から版厚の推定(多重反射成分の抽出)を試みた結果,推定版厚と実際の版厚はおおむね一致することを明らかにした。本研究は,1.実験で用いた供試体および計測条件を基に設定したモデルを対象に,動磁場・弾性波動連成解析を行い,電磁パルス法によるPCグラウト充填評価手法の有効性を検討した。続いて,2.提案した評価手法の実構造物への適用性についての検討も試みた。以下に得られた成果の概要をそれぞれ示す。1.動磁場・弾性波動連成解析によるPCグラウト充填評価手法の有効性の検討設定した解析モデルに対して,まず,動磁場解析により供試体内部で弾性波の発生源となり得る磁性体を特定し,その磁性体に作用する電磁力分布を算出した。続いて,動磁場解析により得られた電磁力の値を衝撃応答解析における衝撃荷重値として入力することにより,供試体内部での弾性波伝搬挙動を再現し,PCグラウト充填評価指標としての最大振幅値の有効性について検討した。動磁場解析の結果,コンクリート内部で弾性波の発生源となり得る磁性体は,主に鋼製シースであることが明らかとなった。また,動磁場解析で得られた電磁力を衝撃応答解析における衝撃荷重として鋼製シースに与えた結果,電磁パルス法により得られる弾性波の最大振幅値は,PCグラウト充填評価指標として有効であることを把握した。2.電磁パルス法によるPCグラウト充填評価手法の実構造物への適用性実構造物としてPC橋梁の横締めを対象として電磁パルス法を適用し,得られた最大振幅値からグラウト充填状況の評価を試みた。電磁パルス法による推定結果と,削孔により把握した実際のグラウト充填の有無は,概ね一致する結果であった。また,グラウト未充填箇所にグラウトを再充填した後,電磁パルス法による計測を行い,グラウト再充填の良否への本手法の適用性についての検討も併せて行った。その結果,グラウト再充填前後の最大振幅値を比較することにより,グラウトが適切に再充填されているかの良否を評価できることが明らかとなった。
癌細胞におけるSTAT3の活性化機構と共役因子の同定

細胞増殖因子の受容体の多くは細胞内ドメインにチロシンキナーゼを内在しているかもしくは造血因子やサイトカインの受容体のようにJAK型チロシンキナーゼが非共有結合によって会合している。慢性骨髄性白血病の原因遺伝子Bcr-Ablから明らかなようにチロシンキナーゼの恒常的活性化は腫瘍や白血病の発生、悪性化に密接に関連している。STATファミリー分子はサイトカインシグナル伝達系において重要な因子である。特に、STAT3は多くのヒトの癌及び形質転換した細胞株で活性化が見られることから腫瘍形成に関与すると考えられている。しかし、恒常的に活性化された変異型のSTAT3 (STAT3C)はv-srcほど強い細胞の形質転換能力を有していないことが、軟寒天コロニー形成実験から分かっていた。そこで、STAT3Cと協調して細胞の形質転換を誘導する腫瘍化因子を探すために、HeLaのレトロcDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、MITFがSTAT3Cと協調してNIH3T3細胞の足場非依存的な細胞増殖を誘導することが明らかとなった。MITFはbHLH-LZ構造を取り、メラノサイトの発生や黒色化に働く重要な転写因子である。次に、マイクロアレイ解析及びノーザンブロッティングより、STAT3CとMITFとを共発現することによって原ガン遺伝子であるc-fosの転写レベルが上がることが分かった。更にプロモーター解析及びChIPアッセイにより、STAT3とMITFがそれぞれc-fosのプロモーター領域内のSIE配列及びE-boxに結合することが明らかとなった。また、ドミナントネガティブAP-1をレトロウイルスで導入するとSTAT3CとMITFとを共発現したNIH3T3細胞の形質転換が抑制されたことから、STAT3CとMITFは協調的にc-fosの発現を高めてその結果細胞の形質転換を誘導することが示唆された。STATファミリー分子はサイトカインシグナル伝達系において重要な転写因子である。特にSTAT3は多くのヒトの癌及び形質転換した細胞株において活性化が見られることから腫瘍形成に関与すると考えられている。しかし、恒常的に活性化された変異型のSTAT3 (STAT3C)はv-srcほど強い細胞の形質転換能力を特たないことが軟寒天コロニー形成実験から分かっていた。そこで、STAT3Cと協調して細胞の形質転換を誘導する腫瘍化因子を検索するために、HeLaのレトロcDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、STAT3Cと協調してNIH3T3細胞の足場非依存性細胞増殖を誘導する遺伝子として、メラノサイトの発生や黒色化に働く重要な転写因子であるMITFを見出した。STAT3とMITFの標的遺伝子をマイクロアレイ解析によって検索したところ、STAT3CとMITFとの共発現によってc-fosの転写が促進されることが分かった。更に、プロモーター解析およびChIPアッセイによりSTAT3とMITFがそれぞれc-fos遺伝子のプロモーター領域に結合して協調的に活性化することを確認した。また、ドミナントネガティブAP-1をレトロウイルスで導入するとSTAT3CとMITFとを共発現させたNIH3T3細胞の形質転換能が抑制されたことから、STAT3とMITFは協調的にc-fosの発現を高めて、その結果細胞の形質転換を誘導することが示された。
セルフエッチングシステムのエナメル質に対する臨床的接着耐久性

鶴見大学歯学部臨床予備実習時に,接着性レジンの学生相互実習で行われた修復の術直後および1年後に得られた臨床成績調査票,口腔内写真およびレプリカ模型から,以下の項目について調査,観察および測定を行った.1.臨床成績調査票のまとめ近年開発され臨床で使用され始めているワンステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の辺縁部着色,辺縁適合性,二次齲蝕,歯髄反応などのエナメル質窩縁部における評価項目について,臨床成績調査票から集計し,口腔内写真の評価も加えて各修復物の臨床経過をまとめた.また,ワンステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の臨床経過と比較するため,ツーステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の臨床経過についてもまとめた.2.エナメル質マージン部の形態学的変化の観察採得したレプリカ模型をSEM観察し,修復物周囲のエナメル質マージン部の形態学的変化の観察を詳細に行った3.エナメル質マージン部の形態学的変化の測定ワンステップセルフエッチングシステムやツーステップセルフエッチングシステムを使用した接着性レジン修復物のエナメル質マージン部の形態学的変化を,高精度形状測定変位計LE(キーエンス)を使用して計測を試みた.修復直後と1年後のレプリカ模型を比較し,エナメル質マージン部の経時的摩耗量について定量的測定を行ったが,修復直後と1年後のレプリカ模型の完全に同一部位の測定が,レプリカの測定台設置時のズレ,測定方向,角度またはレプリカの精度などから困難であり,今後のさらなる検討が必要と考えられた.以上の研究結果から,ワンステップセルフエッチングシステムとツーステップセルフエッチングシステムのエナメル質に対する接着について研究を行い,セルフエッチングシステムのエナメル質に対する臨床的接着性について検討し,発表を行った.鶴見大学歯学部臨床予備実習時に,接着性レジンの学生相互実習で行われた修復の術直後および1年後に関して得られた臨床成績調査票,口腔内写真そしてレプリカ模型を資料として使用し,研究を行うため,以下の項目について調査,測定を行った.1.臨床成績調査票のまとめセルフエッチングシステムを使用して修復されたレジン修復物のエナメル質窩縁部に関する評価項目である辺縁部着色,辺縁適合性,二次齲蝕,歯髄反応などについて,臨床成績調査票から集計し,口腔内写真の評価も加えて各修復物の臨床経過をまとめた.また,セルフエッチングシステムを使用して修復されたレジン修復物の臨床経過と比較するため,トータルエッチングシステムを使用して修復されたレジン修復物の臨床経過もまとめた.2.エナメル質マージン部分の形態学的変化の測定セルフエッチングシステムやトータルエッチングシステムを使用した接着性レジン修復物のエナメル質マージン部分の形態学的変化が,レプリカ模型から観察できるため,高精度形状測定変位計LE(キーエンス)により計測を試みた.今後,修復直後のレプリカ模型と1年後のレプリカ模型を比較し,エナメル質マージン部の経時的摩耗量について定量的測定を行い,高精度形状測定変位計LEのオーバーラップ機能(波形比較解析機能)でマスターサンプルの基準波形をメモリーさせ,取り込んだ形状波形データと重ね合わせて,基準との差異,ずれ量などの比較・測定を行う予定.鶴見大学歯学部臨床予備実習時に,接着性レジンの学生相互実習で行われた修復の術直後および1年後に得られた臨床成績調査票,口腔内写真およびレプリカ模型から,以下の項目について調査,観察および測定を行った.1.臨床成績調査票のまとめ近年開発され臨床で使用され始めているワンステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の辺縁部着色,辺縁適合性,二次齲蝕,歯髄反応などのエナメル質窩縁部における評価項目について,臨床成績調査票から集計し,口腔内写真の評価も加えて各修復物の臨床経過をまとめた.また,ワンステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の臨床経過と比較するため,ツーステップセルフエッチングシステムを使用して修復したレジン修復物の臨床経過についてもまとめた.2.エナメル質マージン部の形態学的変化の観察採得したレプリカ模型をSEM観察し,修復物周囲のエナメル質マージン部の形態学的変化の観察を詳細に行った3.エナメル質マージン部の形態学的変化の測定ワンステップセルフエッチングシステムやツーステップセルフエッチングシステムを使用した接着性レジン修復物のエナメル質マージン部の形態学的変化を,高精度形状測定変位計LE(キーエンス)を使用して計測を試みた.修復直後と1年後のレプリカ模型を比較し,エナメル質マージン部の経時的摩耗量について定量的測定を行ったが,修復直後と1年後のレプリカ模型の完全に同一部位の測定が,レプリカの測定台設置時のズレ,測定方向,角度またはレプリカの精度などから困難であり,今後のさらなる検討が必要と考えられた.以上の研究結果から,ワンステップセルフエッチングシステムとツーステップセルフエッチングシステムのエナメル質に対する接着について研究を行い,セルフエッチングシステムのエナメル質に対する臨床的接着性について検討し,発表を行った.
血清中におけるインフルエンザウイルス亜型間交叉反応性中和抗体の検出法の確立

本研究では、これまでの研究によって得られたインフルエンザ中和抗体を利用し、様々なタイプのインフルエンザウイルスに幅広く交差反応する抗体を血清中から検出する方法を検討している。昨年度よりA型インフルエンザグループ1に属するウイルス株に対し幅広く中和能を持つ抗体を検出することを目標とし、競合ELISAにより検討している。2009年パンデミックワクチン接種前後のヒト血清のウイルス株への結合活性を指標に、グループ1ウイルス株中和抗体存在下における活性減少での検出を目指していたが、ワクチン接種後の血清においても、大きな活性減少は見られなかった。そこで、方法論を再考し、血清共存下におけるグループ1中和抗体の結合活性減少率を検討することとした。その際、検出に使用する中和抗体をビオチン化して、ストレプトアビジン-HRPでの検出系を構築し、ワクチン株に対する結合活性を検討したところ、結合活性の検出が可能であった。そこでワクチン株濃度、ビオチン化抗体、およびストレプトアビジン-HRPの濃度を検討し、ビオチン化していない中和抗体共存下におけるビオチン化抗体の活性を検出したところ、十分な結合活性の減少が検出できた。その条件下で、ワクチン接種前後の血清を50倍、200倍希釈濃度で共存させたところ、ワクチン接種後の血清共存下では、血清濃度依存的に中和抗体結合活性が減少した。さらに、同一ドナーによる季節性ワクチン接種前後の血清を用いた場合でも同様の良好な結果が得られた。本検出法では、グループ1ウイルス株を幅広く、さらに将来にわたって中和可能な抗体の血清中における存在を確認できる。季節性ウイルス株であるA型H1N1型は、将来パンデミックが予想されているH5N1型もグループ1ウイルスに属しており、予防対策として有用である。昨年度の条件検討の結果をもとにさらに実験を進めていたが、研究の進行に伴い、当初考えていた方法では目的の達成は無理だと判断し、今年度は方法論の再考とその検証を最初からやり直す必要が生じた。そのため、方法論再考後は比較的順調に進んだものの、初年度終了予定の研究計画が本年度全般にわたりずれ込み、研究の遅れにつながった。本年度では、A型インフルエンザグループ1に属するウイルスを幅広く中和する血清中の抗体検出が可能となった。今後は季節性ウイルスであるH3N2型が含まれているA型グループ2に属するウイルスとB型ウイルスをそれぞれ幅広く中和する抗体の検出法の確立が課題となる。当初計画していた方法論では検出が難しい場合が想定され、また、検出に使用する抗体の性質を考慮した方法論が必要である。どのような抗体の組み合わせで最終的に検出を行うかがカギとなっており、その条件検討を中心に行い、検出法に結び付ける予定である。本研究では、我々がこれまでに単離してきた交差反応性抗体の性質を利用し、様々なタイプのインフルエンザウイルスに幅広く交差反応する抗体を血清中から検出する方法を検討する。本年度は、A型インフルエンザウイルスグループ1のウイルス株を対象とし、ELISAでの実験系を構築するために、抗原(ウイルスワクチン液)の固相化濃度と、使用する血清及び2次抗体の希釈濃度及びブロッキング剤の検討を行った。使用した血清は、同一ドナーからのインフルエンザワクチン接種前後に採取しており、段階希釈した抗原それぞれに対しタイトレーションカーブを描くことで評価を行った。その結果、バックグラウンドが出にくいスキムミルクをブロッキング剤として使用することを決定し、かつ、ワクチン接種前後の両血清の活性が1.0-2.0の間に収まる範囲内での抗原濃度及び血清希釈濃度を複数点候補として決定した。さらに、2次抗体の希釈濃度を決定するため段階希釈を行い、ワクチン接種前後での活性の差が検出可能な範囲内での2点の希釈倍率を決定するとともに、最終的に抗原濃度及び血清希釈濃度もそれぞれ2点決定した。過去に単離した交差反応性抗体共存下での血清のワクチン株への結合活性減少を検出することを目的としていることから、予備実験で決定した条件で交差反応性抗体を添加したところ、活性の減少が検出できた。しかしながら、再現性を得るまでには至っておらず、さらなる条件検討が必要である。インフルエンザウイルスに対する中和抗体は流行株にのみ効果があると考えられがちであるが、グループ1に属する複数の亜型ウイルスに幅広く交差反応する中和抗体が人の体内に存在することは、世界的にも多くの報告がなされている。そのような抗体を血清中から検出する方法は非常に有用であり、安定した再現性をいかに取るか、また、別の角度からも検出する方法を考慮する必要がある。血清中の抗体検出法をELISA法で検討するにあたり、使用する抗原の濃度、血清希釈倍率、2次抗体の選定及びその希釈倍率の評価に時間を要した。血清はH1N1インフルエンザワクチン(2009年パンデミック株)接種前後に採取したものを両方とも評価し、ワクチン接種前後における結合活性の差(倍率)が毎回ほぼ同じでかつ安定して検出できる条件を設定する必要があると考え、この条件を整えるのに時間を要した。そこで、方法論を再考し、血清共存下におけるグループ

1中和抗体の結合活性減少率を検討することとした。その際、検出に使用する中和抗体をビオチン化して、ストレプトアビジン-HRPでの検出系を構築し、ワクチン株に対する結合活性を検討したところ、結合活性の検出が可能であった。そこでワクチン株濃度、ビオチン化抗体、およびストレプトアビジン-HRPの濃度を検討し、ビオチン化していない中和抗体共存下におけるビオチン化抗体の活性を検出したところ、十分な結合活性の減少が検出できた。その条件下で、ワクチン接種前後の血清を50倍、200倍希釈濃度で共存させたところ、ワクチン接種後の血清共存下では、血清濃度依存的に中和抗体結合活性が減少した。さらに、同一ドナーによる季節性ワクチン接種前後の血清を用いた場合でも同様の良好な結果が得られた。本検出法では、グループ1ウイルス株を幅広く、さらに将来にわたって中和可能な抗体の血清中における存在を確認できる。季節性ウイルス株であるA型H1N1型は、将来パンデミックが予想されているH5N1型もグループ1ウイルスに属しており、予防対策として有用である。昨年度の条件検討の結果をもとにさらに実験を進めていたが、研究の進行に伴い、当初考えていた方法では目的の達成は無理だと判断し、今年度は方法論の再考とその検証を最初からやり直す必要が生じた。そのため、方法論再考後は比較的順調に進んだものの、初年度終了予定の研究計画が本年度全般にわたりずれ込み、研究の遅れにつながった。我々が単離した、グループ1の複数のウイルス株に対する交差反応性抗体共存下での結合活性の低下をどのように検出するかが大きな課題である。競合ELISAの系での検討を進めていくにあたり、抗原濃度、血清濃度、2次抗体濃度、競合抗体濃度を、再現が取れるように設定することが重要な点で、それを詰めていく必要がある。一方で、血清中には、中和活性がある抗ヘマグルチニン(HA)抗体だけではなく、他のインフルエンザウイルスタンパクに対する抗体も存在しており、ウイルスワクチン液を抗原に使用したときにはHA以外にも反応するという問題点が生じる。これを回避するために、抗原としてリコンビナントHAを使用して血清中の抗HA抗体のみを検出する系を構築する方法も検討する必要があると考える。また、競合ELISAの系だけでなく、サンドイッチELISAなどの系を利用して、別の検出法につなげることができるかどうかの検討を試みる。本年度では、A型インフルエンザグループ1に属するウイルスを幅広く中和する血清中の抗体検出が可能となった。今後は季節性ウイルスであるH3N2型が含まれているA型グループ2に属するウイルスとB型ウイルスをそれぞれ幅広く中和する抗体の検出法の確立が課題となる。当初計画していた方法論では検出が難しい場合が想定され、また、検出に使用する抗体の性質を考慮した方法論が必要である。どのような抗体の組み合わせで最終的に検出を行うかがカギとなっており、その条件検討を中心に行い、検出法に結び付ける予定である。
GABA作働性介在ニューロンの大脳皮質の局所回路における役割

皮質のニューロンは、興奮性アミノ酸を伝達物質とする投射型の錐体細胞と、GABAを伝達物質とする抑制性の介在ニューロンである非錐体細胞の二つにわけられる。錐体細胞に比べて、抑制性である非錐体細胞の方は非常に多様な形をしたサブグループから構成されており、様々な皮質機能に関わると考えられる。前頭皮質のGABA作働性介在ニューロンを調べた結果、生理的・形態的・化学的性質の異なるいくつかのグループに分けられることがわかった。つまり、大脳皮質の中に複数のGABA作働性システムが組み込まれていると考えた。しかし、最近の他の研究室によって、発火パターン、シナプス伝達ダイナミックス、チャネル・ペプチドなどのmRNA発現、形態の解析から、数百種類の介在細胞が皮質内に存在しているという考え方が提唱されている。本質はどうであるのかを議論するために、形態的・生理的性質をある程度定量化して解析する必要があると考え、軸索分枝パターンや終末ブトンの軸索上・空間分布のニューロルシーダによる定量化を行った。これらの定量的パラメーターで、細胞群をクラスター解析すると、それぞれのクラスターが発火様式や物質発現パターンと相関することを証明できた。また、皮質GABA細胞は、細胞内通電に対する発火様式が多様であることが知られているが、皮質が同期的な活動をしている時にどのようにスパイクを出すかは殆ど調べられていない。脳切片標本でNMDA受容体を活性化させて0.1ヘルツと10ヘルツの興奮性電位のリズムをおこし、その時の非錐体細胞の発火様式を調べ、サブタイプごとに比較した。その結果、皮質に引き起こされた特定の周期的活動時に非錐体細胞のそれぞれのサブタイプでは異なる発火様式を示した。今後は、各グループのシナプス結合パターンや生理的特性を調べていくことで、各グループの機能的意義を検討していきたい。私たちは皮質内抑制を担うGABA作働性細胞が、生理的・形態的性質が異なる複数のグループからできていることをこれまでに明らかにしてきた。今年度は、皮質電気活動が緩徐振動や、てんかん様発作の時期における抑制性細胞サブタイプの活動を調べることで、サブタイプの機能的役割分担の理解に役立つデータを集めた。大脳皮質のスライス標本で、細胞外マグネシウムを減らしてNMDA受容体を活性化させ、自発活動を引き起こした。外液のマグネシウムをなくして数分すると、0.1ヘルツ位のゆっくりとした周期で、自発的な脱分極(depolarization shift)が見られるようになった。さらに10分から15分くらいすると、もっと強い同期的興奮(long burst)がおきた。Long burstの最初の部分は、最も強い興奮で、高頻度発火した。Long burstの開始から数秒後、10から6ヘルツの周期的な変動(fast run)がみられた。これらの同期的活動における、皮質ニューロンの膜電位変動や発火様式を定量的に調べ、記録した細胞は、細胞内通電にたいする発火パターンや、細胞内染色・免疫組織化学で形態や発現物質を調べることで、どの皮質ニューロングループに属するかを同定した。その結果、FS細胞が、各時期で最も高頻度発火し、Long burstの最初では、400Hz位まで発火頻度を上昇させた。ソマトスタチン細胞、VIP細胞、大型CCK細胞の発火パターンは、FS細胞とは異なるものであった。大脳皮質ニューロンの発火様式は、興奮性入力の強度・時間パターンだけでなく、化学的・形態的性質の異なるサブタイプに依存して動的に変わることが明らかになった。
組織再生スケールアップを目指した生体内血管網構築法の開発

細胞は培養環境中に合目的な因子を放出する.その因子を含む骨髄間葉系幹細胞および歯髄幹細胞の培養上清を組織欠損モデル,臓器障害モデルに適用すると,それぞれ組織再生,障害軽減に有効であり,それには血管網構築が先行することを示した.培養環境を酸素濃度1%などの過酷な条件設定をすると,培養細胞における血管新生に関連する遺伝子発現,その培養上清中のタンパク質が増し,管腔形成能,細胞遊走能はいずれも高くなり,血管網構築に有効であった.培養上清中の主な因子を組み合わせたもの,培養上清中からそれらを除いたものを適用することにより,その因子の有効性を示した.本研究は組織再生に有効な血管網構築法の端緒を開いた.本研究の全体構想は,幹細胞培養上清の調製法と適用法を工夫することにより,区域欠損部に血管網構築を誘導し,骨再建など大規模組織再生を可能にすることを目指すものであり,その目的は血管系を誘導するのに最適な幹細胞培養上清を得るための培養条件と,生体内で実際に血管系を誘導するのに最適な上清の投与方法を求めることであった.本年度の研究は幹細胞培養上清の調製条件と成分分析を中心に推進した.いままでにわれわれが標準にしていた培養上清の調製法は培養細胞が70-80%コンフルエントになった時点で無血清培地に交換し24時間後に回収する方法であり,細胞成分は遠心分離にて除去していた.この方法では細胞が分泌する成分のみではなく細胞を構成している成分も残ることが明らかになり問題であった.これはフィルターでろ過することによって解決し,培養上清中の細胞が真に分泌した成分の詳細な分析が可能になった.ついで細胞種について検討した.骨髄間質細胞と脱落乳歯幹細胞の培養上清を質量分析機にて解析したところ,コラーゲン,デコリン,フィブロネクチンなどの細胞接着に寄与するタンパク質が多量に含まれていることが明らかになった.これらは数千種類におよび,骨髄間質細胞と脱落乳歯幹細胞の両者に共通するものが多かったが,異なるものも少なくなく,それらを特定した.また血管形成に関与するタンパク質についてはVEGFが含まれていたもののAngiopoietinはなかった.細胞増殖アッセイにより両者の培養上清に含まれている成分の細胞増殖能におよぼす影響を比較した.培養上清は両者とも細胞増殖能を高めたが両者間に差は認められなかった.現在までの研究結果から培養上清の調製方法はほぼ確立したと考えている.細胞種についてはさらにヒト由来不死化臍帯静脈血管内皮細胞を検討対象に加えることとする.また培養上清投与方法,濃度についても検討を進める.本研究の全体構想は幹細胞培養上清の調製法と適用法を工夫することにより,区域欠損のような組織欠損部に血管網構築を誘導し,骨再建など大規模組織再生を可能にすることを目指すものであり,その目的は血管系を誘導するのに最適な幹細胞培養上清を得るための培養条件と,生体内で実際に血管系を誘導するのに最適な培養上清の投与方法を求めることであった.本年度の研究は培養条件の検討と適応となる組織欠損の探索を中心に推進した.培養環境を酸素濃度21%の標準に対して1%を低酸素条件として設定し,それぞれの環境下で歯髄幹細胞を培養した.培養細胞に発現するVEGF-A,ANG-2などの血管新生に関連する遺伝子,培養上清中のそれらのタンパク量,管腔形成能,細胞遊走能はいずれも標準よりも低酸素条件で有意に高かった.また培養上清を生体内の組織欠損部に適用することにより,複数の骨欠損モデルのみならず末梢神経の区域欠損モデルにおいても組織再生が促されることがわかった.その効果は骨においては標準よりも低酸素条件で有意に高かった.その過程は培養上清に含まれる血管形成に関係する因子が組織欠損部で作用し,血管網が構築されるところから始まることを示した.低酸素濃度の培養環境下におかれた細胞は酸素供給を欲し環境改善のために血管形成を促す因子を放出する.その因子を利用して組織を形成する細胞のライフラインである血管網を整備することは効率的な組織再生のための有効な方策であると考える.前年度は幹細胞培養上清の調製条件の検討と成分分析を中心に推進し,培養上清中の細胞分泌成分を精製する方法を絞り込み,その成分を骨髄間葉系幹細胞と歯髄幹細胞について質量分析法により詳細に調べることができた.本年度は培養条件の検討と適応となる組織欠損の探索を中心に推進した.培養環境を酸素濃度21%の標準に対して1%を低酸素条件として設定し,それぞれの環境下で培養した歯髄幹細胞の血管新生に関連する遺伝子発現およびその培養上清中のタンパク量,培養上清による管腔形成および細胞遊走能について調べた結果,いずれも標準よりも低酸素条件で有意に高いことがわかった.また培養上清を生体内の組織欠損部に適用することにより,複数の骨欠損モデルのみならず末梢神経の区域欠損モデルにおいても組織再生が促されること,その効果は骨においては標準よりも低酸素条件で有意に高かったこと,その過程は培養上清に含まれる血管形成に関係する因子が組織欠損部で作用し,血管網が構築されるところから始まることなどを示せた.本研究の全体構想は幹細胞培養上清の調製法と適用法を工夫することにより,区域欠損のような組織欠損部に血管網構築を誘導し,骨再建など大規模組織再生を可能にすることを目指すものであり,その構想を具現化するための目論見のとおりに概ね研究が遂行できている.

本研究の全体構想は幹細胞培養上清の調製法と適用法を工夫することにより,区域欠損のような組織欠損部に血管網構築を誘導し,骨再建など大規模組織再生を可能にすることを目指すものであり,その目的は血管系を誘導するのに最適な幹細胞培養上清を得るための培養条件と,生体内で実際に血管系を誘導するのに最適な上清の投与方法を求めることであった.本年度の研究は培養条件の再検討と適応となる組織欠損モデルでの評価を中心に推進した.培養環境を酸素濃度21%の標準に対して1%などの低い酸素濃度,伸展刺激付加条件として設定し,それぞれの環境下で骨髄間葉系幹細胞,歯髄幹細胞を培養した.培養細胞に発現する血管新生に関連する遺伝子,培養上清中のそれらのタンパク質,管腔形成能,細胞遊走能はいずれも標準よりも特に低酸素条件で有意に高かった.また培養上清を生体内の組織欠損部に適用することにより,複数の骨欠損モデルのみならず末梢神経の区域欠損モデルにおいても組織再生が促されることがわかった.その効果は骨においては標準よりも低酸素条件で有意に高かった.その過程は培養上清に含まれる血管形成に関係する因子が組織欠損部で作用し,血管網が構築されるところから始まることを示した.低酸素濃度の培養環境下に置かれた細胞は酸素供給を欲し環境改善のために血管形成を促す因子を放出する.その因子を利用して組織を形成する細胞のライフラインである血管網を整備することは効率的な組織再生のための有効な方策であると考える.細胞は培養環境中に合目的な因子を放出する.その因子を含む骨髄間葉系幹細胞および歯髄幹細胞の培養上清を組織欠損モデル,臓器障害モデルに適用すると,それぞれ組織再生,障害軽減に有効であり,それには血管網構築が先行することを示した.培養環境を酸素濃度1%などの過酷な条件設定をすると,培養細胞における血管新生に関連する遺伝子発現,その培養上清中のタンパク質が増し,管腔形成能,細胞遊走能はいずれも高くなり,血管網構築に有効であった.培養上清中の主な因子を組み合わせたもの,培養上清中からそれらを除いたものを適用することにより,その因子の有効性を示した.本研究は組織再生に有効な血管網構築法の端緒を開いた.本年度の研究は幹細胞培養上清の調製条件と成分分析を中心に推進した.いままでにわれわれが標準にしていた培養上清の調製法は培養細胞が70-80%コンフルエントになった時点で無血清培地に交換し24時間後に回収する方法であり,細胞成分は遠心分離にて除去していた.この方法では細胞が分泌する成分のみではなく細胞を構成している成分も残ることが明らかになり問題であった.これは0.22μmのフィルターでろ過することによって細胞構成成分を除去し解決することができ,ろ過処理が必須であることがわかった.これにより培養上清中の細胞が真に分泌した成分の詳細な分析が可能になった.ついで細胞種について検討した.培養上清調製に用いてきたのは骨髄間質細胞と脱落乳歯幹細胞であった.両者の培養上清を質量分析機にて解析したところ,コラーゲン,デコリン,フィブロネクチンなどの細胞接着に寄与するタンパク質が多量に含まれていることが明らかになった.いままでのELISAによる解析では特定の対象とした数種類のタンパク質が解析できるのみであったが,質量分析法によって網羅的に解析することができた.その中に含まれるタンパク質は数千種類におよび,骨髄間質細胞と脱落乳歯幹細胞の両者に共通するものが多かったが,異なるものも少なくなく,それらを特定した.また本研究の核となる血管形成に関与するタンパク質についてはVEGFが含まれていたもののAngiopoietinはなかった.
球面上の重みつき点配置空間の上の複素双曲構造の変形理論の構築

(1)オートマティック群に関するGerstenの問題の研究(研究協力者:田村誠氏、中川義行氏)閉3次元多様体の基本群に対する弱双曲化予想(Perelmanの仕事を認めれば定理)とは基本群は(1)有限群(2)Z+Z(階数2の自由アーベル群)を部分群として含む(3)語双曲群のいずれかになる、というものである。(技術的には有限群は語双曲群だが、ここでは分けて考えた。)この「閉3次元多様体の基本群」を「オートマティック群」に置き換えて同じ現象が起こるかどうかを問うのがGerstenの問題である。この研究では、この問題について考察を行った。群がZ+Zを部分群として含む場合は、Z+Zの格子が群の中にあることになる。本研究では、「n-track」というZ+Zの格子に似ている構造を導入し、オートマティック群が語双曲的でない場合はほとんどいつも、n-trackが群の中に見つかることを示した。さらにオートマティック構造が比較的単純な場合として「prime-starred」というオートマティック構造のクラスを導入し、この場合は、上記Gerstenの問題が(技術的な条件付で)肯定的に解けることを示した。(2)4色問題と球面の分岐被覆に関する研究(研究協力者:Yo'av Rieck氏)平面グラフに関する4色問題は1970年代に計算機を用いた方法で証明されているが、実際に与えられた平面グラフを4彩色するための効果的なアルゴリズムはよく知られていない。本研究では、球面の分岐被覆から定まるデータと遺伝的アルゴリズムを組み合わせた方法を考察し、その効果について検討を行った。(1)1点穴あきトーラスの上の射影構造の研究1点穴あきトーラスの上の射影構造全体の空間は、複素2次元であることが古典的に知られている。この空間の中で、射影構造から定まるPSL(2,C)の部分群が離散的になる領域Kは重要な研究対象となっている。しかし射影構造が与えられたとき、これから定まる群がKに入っているかどうかを判定せよというBersによって1970年代に問われた問題は非常に難しく、これまで部分的な結果しかなされてこなかった。この研究では、計算機を使用した数値計算的な手法により実験的に上記判別問題を解くとともに、射影構造全体である複素2次元内のよく知られた複素1次元スライスについて、Kをコンピュータグラフィックスの画像として図示し、この領域Kの境界がフラクタル性を実験的に確かめた。(2)オートマティック群に関するGerstenの問題の研究閉3次元多様体の基本群に対する弱双曲化予想とは、基本群は(1)有限群(2)階数2の自由アーベル群(Z+Z)を部分群として含む(3)語双曲群のいずれかになる、というものである。この問題を「オートマティック群」に置き換えて同じ現象が起こるかどうかを問うのがGerstenの問題である。さらにオートマティック構造が比較的単純な場合として「n-starred」というオートマティック構造のクラスを導入し、この場合は、上記問題が条件付で肯定的に解けることを示した。
老化促進機構における活性酸素の役割の解明と老化予防への応用

酸化ストレスが老化促進に関与すると考えられているが、その分子機構は未だ明らかではない。前年度は、プロテオミクス解析を行い高酸化ストレス状態にある老化促進モデルマウスSAMP8とコントロールマウスSAMR1においてタンパク質の発現差が認められたスポットを5個、さらに機能プロテオミクス解析により酸化損傷を受けているタンパク質を12個検出した。本年度は、これらのタンパク質の同定を行った結果、発現差が認められたスポットはTubulin β-2C chainと、Mitochondrial inner membrane protein(Mitofilin)であることが解明された。また、SAMP8で酸化損傷が増加したタンパク質は、Mitofilin、Glial fibrillary acidic protein(GEAP)、Actinであった。SAMP8はミトコンドリア異常が指摘されていることから、Mitofilinの発現変化や酸化損傷の増加はSAMP8の学習・記憶障害に関与すると考えられる。さらにSAMP8とは異なる機序で脳機能障害を示すSAMP10とSAMR1を用い、経時的な発現変化を解析した。その結果、SAMP10の病変部位において3ヶ月から8ヶ月でPyridoxal phosphate phosphataseが減少し、α-internexinが増加していることを確認した。これらのタンパク質はSAMP10の加齢に伴う大脳萎縮に関与する可能性がある。また本年度は、酸化ストレスとして虚血負荷を与えたサルの海馬プロテオミクス解析も行った。神経細胞死が認められるCA1領域で約72個のタンパク質の発現量が経時的に有意に変化していた。従って、これらのタンパク質は酸化ストレスによる神経細胞死に重要な働きをしていると考えられるので、脳機能障害との関連について今後さらなる研究を進める。酸化ストレスが老化の促進に重要な役割を果たしていることから、酸化ストレスによる老化の特異的バイオマーカーの決定と、老化促進機構の解明は、老化予防法を確立する上で極めて重要である。本年度は、老化の特異的マーカーを決定する事を目的として、高酸化ストレス状態にある老化促進モデルマウス(SAM)を用いた発現プロテオミクス解析を行った。またタンパク質の酸化的損傷であるカルボニル化に注目し、二次元電気泳動と免疫染色法を組み合わせた機能プロテオミクス解析によりカルボニル化タンパク質を検出した。老年期脳機能障害を示すSAMP8とコントロールマウスSAMR1の海馬からタンパク質を抽出後、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)法にて発現プロテオミクス解析を行った。その結果、約900個のタンパク質スポットを検出し、SAMR1に比べてSAMP8で発現が有意に増加したスポット2個、有意に減少したスポット3個を確認した。さらにSAMP8とは異なる機序で脳機能障害を示す系統SAMP10とSAMR1を用いた比較においても、2つのタンパク質がSAMP8と同様の発現変化を示した。また、カルボニル化タンパク質について個々のタンパクスポットを解析した結果、約70個のカルボニル化タンパク質を検出し、SAMR1に比べてSAMP8で2倍以上の差があるスポットが12個あった。以上の結果からSAMP系とSAMR1に発現差があるタンパク質が確認され、SAMP8とSAMP10で共通の変動を示すタンパク質については、酸化ストレスによる老化のバイオマーカーとして利用できる可能性がある。また、SAMP8でカルボニル化タンパク質が検出されたことから、これらのタンパク質の機能を明らかにすることが老化促進機構の解明につながると考えられる。
経営者業績予想情報の分析と評価に関する実証的研究

日本企業が発表する業績予想情報について、2000年代における実態の把握と包括的な評価を行うために、(a)資本市場による情報有用性評価、(b)制度の変化からの影響、(c)情報の頑健性の検討、という3つの研究課題を提示し研究を進めた。(a)ついては、2000年代に経営者予想の実態が大きく変化しているにもかかわらず、資本市場において一定の役割を持つこと、(b)については、会計制度改革のみならずマクロ経済の変動から大きな影響を受ける実態を、また、(c)の課題については、予想誤差を予め織り込んだ投資家行動が予想誤差の変動によるネガティブな影響を緩和していることを示した。平成25年度には、研究代表者と研究分担者が研究課題の基礎となる3つの研究テーマ、(a)資本市場による情報評価に関する研究、(b)会計制度の変化からの影響に関する研究、(c)情報の頑健性の検討に関する研究、を分担して進めた。(a)のテーマについては、先行研究のサーベイを中心に研究を進め、おおむね主要な研究論文の評価と体系化を終えることができた。特に、2005年以降は、業績予想情報の有用性に関する研究から、業績予想誤差の原因に関する研究および予想誤差が与える影響についての研究に論文の関心がシフトしていることを検出した。(b)のテーマについては、業績予測情報の年度別特性の分析と産業間特性の分析を並行して進め、基礎的な分析データをそろえることができた。これらのデータは、2年目の研究の重要な基礎になると期待している。また、(c)のテーマについては、業績予想情報の精度に関する年度別のクロスセクション分析を行い、業績予想情報の精度はビジネス環境の変化に影響を受けやすいものの業績予想情報の精度の低下と有用性の間には優位な因果関係が観察できないことを検証した。2014年度には、研究代表者と研究分担者が研究課題の発展的な研究テーマ、(a)資本市場における予想情報の評価と資本コストの関係に関する研究、(b)会計制度の変化と情報の有用性に関する研究、(c)情報の予想誤差と資本市場の関連に関する研究、を分担して進めた。(a)については、1990年代から2000年代の株式市場データを中心に研究を進め、資本コストの変化に関する分析を終了した。予想誤差が資本コストに与える影響について、先行研究の検証モデルを利用しながら追検証を進めている。(b)のテーマについては、業績予想情報の精度に関する年度別のクロスセクション分析を行い、業績予想情報の精度はビジネス環境の変化に影響を受けやすいものの業績予想情報の精度の低下と有用性の間には優位な因果関係が観察できないことを検証した。(c)のテーマについては、業績予測情報の年度別特性の分析と産業間特性の分析を並行して進め、基礎的な分析データをそろえることができた。研究プロジェクトの進行は、研究課題に関する発展的な以下の3つの研究テーマを設定し、研究代表者と研究分担者が分担して研究を進めるとともに、順次研究成果の発表を行った。3つの研究テーマは、(a)資本市場における予想情報の評価と資本コストの関係に関する研究、(b)会計制度の変化と情報の有用性に関する研究、(c)情報の予想誤差と資本市場の関連に関する研究、である。(a)については、1990年代から2000年代の株式市場データを中心に研究を進め、資本コストの変化に関する分析を行い、学会発表を利用しながら検証プロセスの頑健性を検討しているので、現時点で一定の研究成果は得てはいるものの継続的な分析を必要としている。(b)のテーマについては、業績予想情報の頻度変化と予想誤差に関する年度別のクロスセクション分析を行うとともに、会計制度の経時的な変化に対応させることを試みた。その結果、2000年代前半にに日本における業績予想開示の状況に大きな変化あったこと、また会計制度の変化が業績予想開示の頻度に影響を与えていたことを検証した。これらの成果については、研究代表者と研究分担者が論文として発表している。(c)のテーマについては、価値関連性分析のフレームワークを用いて業績予想情報の有用性を計量化し、年度別特性の分析と産業間特性の分析を並行して進めた。さらに、価値関連性分析に予想誤差に関する変数を加えることによって、予想誤差が情報の有用性に与える影響を観察することを可能にした。これらの研究の成果についても順次学会発表を行っている。株式市場における株価データの分析を基礎とした(a)の研究は、ほぼ予定通りの分析を終え、業績予想の属性の変化との間の相関関係を調査する段階に移ることができた。

(b)の研究については、業績予想情報の精度に関する年度別のクロスセクション分析に基づき、四半期決算の浸透度と予想精度との間に強いかかわりが存在することが裏付けられた。また(c)の研究については、業績予測情報の年度別特性の分析と産業間特性の分析を通じて行ったが、業績予想情報の記述統計的な特性を把握することができたものの、年度別特性や産業間特性を説明する変数の抽出までは分析を進めることができなかった。会計学最終年度である2015年の課題は、3つの視点に分けて進められた第2年度の研究成果をベースに、総合的な研究成果の取りまとめを目指すことにある。特に、2014度に成果が得られた量的な因果関係分析を中心として取りまとめを進めたい。まず、2014度の(a)と(b)の成果に基づき、会計制度の変更と資本市場による情報の有用性評価との複合的な影響関係を検証する研究をおこなう。特に、日本の会計制度に四半期決算が定着したことが業績予想の情報有用性に与えた影響を検出・測定することを中心に、会計制度の違いによる情報モメンタムの存在を仮定して、情報の有用性と頑健性(信頼性)の関係を検証する。また、このような情報モメンタムを通じて業績予想誤差の変動が業績予想情報の有用性や頑健性に影響を及ぼすとの仮説を検証する。これまでの研究では、同一会計期間の業績予想誤差の水準と情報有用性の因果関係分析にとどまったが、期間にずれのある因果関係モデルを構築することによって、過去の業績予想誤差がその後の情報有用性に与える影響の検証へと拡張を試みる。平成25年度には、(a)資本市場による情報評価に関する研究、(b)会計制度の変化からの影響に関する研究、(c)情報の頑健性の検討に関する研究、という3つの研究テーマに分担して取り組んだ。先行研究サーベイを中心とした(a)の研究は、ほぼ予定通りの論文の評価と、論文間の関係付けを終えることができた。これらの先行研究サーベイを通じて、業績予想誤差の変動が情報利用者に与える影響という問題が、先行研究では十分に検討されていない点など、今後の研究の方向性を与えるファインディングを得ることができた。(b)の研究は、業績予測情報の年度別特性の分析と産業間特性の分析を通じて行ったが、業績予想情報の記述統計的な特性を把握することができたものの、年度別特性や産業間特性を説明する変数の抽出までは分析を進めることができなかった。そうした点では、このテーマについての研究はやや遅れ気味であるといえる。(c)の研究については、業績予想誤差と業績予想の情報有用性の関係について統計的に興味深い関係を抽出することができた。この成果については、2013年12月に開かれた国際会議で研究報告を行い、一定の成果を発表することができた。第1に、研究成果の発表場所として予定していた国内学会の大会(2件)を研究代表者の小倉昇と分担者の久持英司が所属する青山学院大学で開催することになったこと、第2に、国際会議における研究発表を予定していたものが準備が間に合わず国際会議への参加を見送ったことの2点の理由により、成果発表のための研究旅費が予定より低い金額の支出に終わった。第2年度である平成26年の課題は、3つの視点ごとに進められた初年度の研究成果をベースに、複数の視点を接合して研究課題の達成を目指すことにある。
線虫の性的成熟に伴う感覚情報処理回路の変化とその分子的制御機構の解析

C. elegansでは、成長に伴って生殖細胞が増殖すると、嗅覚回路のうちAWA-AIA-AIB神経での匂い応答が変化し、餌の匂いに対する走性行動が亢進する。本研究課題では、生殖細胞の増殖のシグナル、ターゲット回路にそれがどのように作用するのか、回路変化にはどのような分子が働くのか、神経活動イメージングも行いながら回路情報処理の解明をめざす。H30年度は、以下のことを明らかにできた。1.生殖細胞の増殖に伴う走性の亢進を示さない4つの変異体について、匂い刺激時の神経活動をカルシウムイメージングで測定して、回路での情報処理のどこに異常があるのかを調べた。その結果、daf-22、eat-2、gcy-28変異体では、生殖細胞が増殖していないときに本来は見られないはずのAIBの応答が起こることが分かった。2.光作動性陽イオンチャネルをターゲット回路の最下流の介在神経細胞AIBに発現させて人為的に興奮させたところ、生殖細胞の増殖していない虫でも増殖している虫と同様の行動が誘起されたことから、ターゲット回路の下流の出力回路には変化がないことが示唆された。3.H29年度の解析からGCY-28分子が神経軸索のギャップ結合に局在していることが明らかになったため、ギャップ結合のブロッカーとして働くunc-1(dn)遺伝子を細胞特異的に発現させて走性を調べたところ、ターゲット回路のAIA神経、または、AIAとギャップ結合を作るASI神経でのunc-1(dn)発現で、生殖細胞増植に伴う走性の亢進が正常に起きなくなることが分かった。4.3の結果からASI神経がこの機構に重要な役割を果たしていることが示唆されたので、ASI神経で神経活動依存的に発現調節を受けることが知られている遺伝子の発現をgfpで可視化することで、生殖細胞の有無によってASIの活動が変化しているかを調べる測定系を確立した。上記の結果に加えて、以下のように生殖細胞増殖依存的な走性の亢進に働く新たな機能分子を同定できた。5.走性亢進機構におけるギャップ結合の役割を調べる目的で線虫の7つのイネキシン変異体を用いて走性行動の解析を行った。その結果、inx-4遺伝子が生殖細胞増植に伴う走性の亢進に関わっていることが示された。6.ターゲット回路を構成するAIA介在神経がアセチルコリン作動性であること、下流のAIBの応答が抑制性であることから、3つのアセチルコリン作動性Clチャンネルの変異体の走性行動の解析を行った。その結果、acc-3遺伝子が生殖細胞増植に伴う走性の亢進に関わっていることが示された。一方で、どのような生殖細胞の増殖によってどのようなシグナル・生理学的条件の変化が回路の調節を引き起こすのか、トリガーとなる機序の解明が進んでいないので、進捗状況を「概ね順調」とした。上記2の光遺伝学的解析、上記4の活動依存的転写のモニター解析を進めて、生殖細胞の増殖によって回路での情報処理がどのように変化しているのかを明らかにする。さらに、上記1、5、6の解析を進めて、どのような分子が回路のどこで働くことで情報処理の調節が行われるのかを明らかにする。また、これまでの結果からこの制御機構で重要な働きをすることが明らかになってきたASI神経は、様々な分子の転写が活動依存的に制御されていることが知られており、さらに分泌細胞として働いて他の神経細胞の機能に様々な影響を及ぼす細胞である。そのため、今年度はASI細胞を用いてシングルセルRNAseqも試み、生殖細胞増殖下と非増殖下でmRNAの発現パターンがどのように変化するかを調べる。これにより、回路制御に働く新たな分子の探索を行う。最後に今年度は、これらの結果をまとめた論文の発表を目指す。本研究課題は、線虫C. elegansの性的成熟に伴う神経回路の再編の機構を明らかにすることを目的としている。これ以前の解析から、線虫では生殖細胞が増殖して性的な成熟が起こると匂いへの走性行動が変化すること、その機構として嗅覚ニューロンAWAとその下流の介在ニューロンAIAとAIBが構成する神経回路の活動が生殖細胞増殖に依存して亢進することをあきらかにしていた。今回、この回路の再編に関わる分子としてグアニル酸シクラーゼGCY-28を新たに同定した。GCY-28の変異体では、性的成熟に伴う匂いへの行動変化が正常に起きないことが分かった。また、AIA細胞特異的な野生型gcy-28遺伝子の発現で変異体の表現型が少なくとも一部回復した。さらに、gcy-28変異体でAIB神経の活動を測定したところ、生殖細胞の増殖に依存して起こる活動変化が見られず、生殖細胞が欠損していても生殖細胞増殖時と同様の活動を示すことが分かった。これらのことから、回路の再編にはAIA細胞でGCY-28タンパク質が働くことが重要であること、また、生殖細胞が増殖していない時にはGCY-28によってAIB神経の活動が抑制されていることが示唆された。GCY-28は膜貫通型のcGMP合成酵素だが、これがどのように神経活動の抑制に関わっているかはまだ不明である。AIA神経でのGCY-28の局在をGFP融合タンパク質を作製して詳細に調べたところ、軸索上のギャップ結合部位に比較的局在が強く見られた。現在、これを手がかりに回路再編におけるギャップ結合の役割を調べている。

さらに、回路の再編によって回路での情報の流れがどう変化しているかを調べるため、光遺伝学による解析系を現在セットアップしている。チャネルロドプシンなどをこの回路で発現させた遺伝子改変線虫を作製したので、光照射の条件検討を行っている段階である。もともと予定していたのはスクリーニングで得られた正常な行動変化を示さない変異体の原因遺伝子のマッピングであったが、なかなかレスキュー実験が成功せずクローニングが難航している。こちらも引き続き行いながら、既存の変異体の中から回路再編に関わるものを探す手法でGCY-28がこの制御に必要であることを明らかにできたので、全体の進行はおおむね順調とした。また、予想していなかったギャップ結合の関わりが示唆されたのも、今後の解析の手がかりとして重要ではないかと考えている。また、光遺伝学の手法を取り入れた回路機能の解析系を一部は立ち上げることができたので、これからの解析に効力を発することを期待している。C. elegansでは、成長に伴って生殖細胞が増殖すると、嗅覚回路のうちAWA-AIA-AIB神経での匂い応答が変化し、餌の匂いに対する走性行動が亢進する。本研究課題では、生殖細胞の増殖のシグナル、ターゲット回路にそれがどのように作用するのか、回路変化にはどのような分子が働くのか、神経活動イメージングも行いながら回路情報処理の解明をめざす。H30年度は、以下のことを明らかにできた。1.生殖細胞の増殖に伴う走性の亢進を示さない4つの変異体について、匂い刺激時の神経活動をカルシウムイメージングで測定して、回路での情報処理のどこに異常があるのかを調べた。その結果、daf-22、eat-2、gcy-28変異体では、生殖細胞が増殖していないときに本来は見られないはずのAIBの応答が起こることが分かった。2.光作動性陽イオンチャネルをターゲット回路の最下流の介在神経細胞AIBに発現させて人為的に興奮させたところ、生殖細胞の増殖していない虫でも増殖している虫と同様の行動が誘起されたことから、ターゲット回路の下流の出力回路には変化がないことが示唆された。3.H29年度の解析からGCY-28分子が神経軸索のギャップ結合に局在していることが明らかになったため、ギャップ結合のブロッカーとして働くunc-1(dn)遺伝子を細胞特異的に発現させて走性を調べたところ、ターゲット回路のAIA神経、または、AIAとギャップ結合を作るASI神経でのunc-1(dn)発現で、生殖細胞増植に伴う走性の亢進が正常に起きなくなることが分かった。4.3の結果からASI神経がこの機構に重要な役割を果たしていることが示唆されたので、ASI神経で神経活動依存的に発現調節を受けることが知られている遺伝子の発現をgfpで可視化することで、生殖細胞の有無によってASIの活動が変化しているかを調べる測定系を確立した。上記の結果に加えて、以下のように生殖細胞増殖依存的な走性の亢進に働く新たな機能分子を同定できた。5.走性亢進機構におけるギャップ結合の役割を調べる目的で線虫の7つのイネキシン変異体を用いて走性行動の解析を行った。その結果、inx-4遺伝子が生殖細胞増植に伴う走性の亢進に関わっていることが示された。6.ターゲット回路を構成するAIA介在神経がアセチルコリン作動性であること、下流のAIBの応答が抑制性であることから、3つのアセチルコリン作動性Clチャンネルの変異体の走性行動の解析を行った。その結果、acc-3遺伝子が生殖細胞増植に伴う走性の亢進に関わっていることが示された。