hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜神経節細胞の軸索切断によるサブタイプ選択的死の分子機構の解明-遺伝子治療を目指した基礎研究-

哺乳類の網膜神経節細胞は、軸索切断すると細胞体も逆行性変性する。しかし、生存する細胞も僅かであるが存在する。ネコやラットを用いた我々の研究により、細胞は神経節細胞のすべてのサブタイプで均等に生き残るのではなく、一部のサブタイプに偏っていることが明らかになっている。私達はこの事実に着目し、神経節細胞のサブタイプ間で発現パターンに違いがある分子群について、特に変性や再生に深く関わっていると想定されている神経栄養因子とその受容体ファミリーに着目して研究を進めている。BDNFの受容体であるfull length TrkB、truncated TrkB、p75NTRについて、それらの特異的なcDNA断片をラット脳からRT-PCRで単離した。それぞれのプローブが他の分子に交差反応しないことをNorthern Blottingで確認した後、それらをtemplateとしてDigoxigenin-labeled cRNAprobeを作成した。ラットとネコの網膜切片についてin situ hybridizationを行ったところ、これら3つのプローブについて神経節細胞層と内顆粒層に陽性のシグナルが同定できた。神経節細胞のシグナルについて詳細に観察すると、p75NTRについては、明らかに神経節細胞と考えられる細胞のうち、陽性シグナルを示す細胞と示さない細胞が見いだされた。一方、truncatedとfull length TrkBについては神経節細胞層にdiffuseにシグナルが見いだされ、我々が得た標本の中ではシグナル陰性の神経節細胞は観察されなかった。以上の結果より、ラット、ネコの神経節細胞については、p75NTRとTrkBの両方を発現する細胞と、TrkBのみしか発現しない細胞とに分かれていることが強く示唆された。このことは神経栄養因子に対する反応性の違いを説明するものと推測された。これら神経栄養因子受容体の発現パターンの違いと、眼球内にBDNFを注入した時の細胞による効果の違い、及び逆行性変性から免れて生き残るサブタイプ、軸索再生を起こすサブタイプとの関連について今後重点時に研究を進めていく予定である。
遺伝子解析研究に対する一般住民の意識および研究参加への同意の背景要因に関する研究

ヒトを対象とした種々の遺伝子解析研究の実施にあたっては、インフォームドコンセントに基づく対象者からの協力が不可欠であるが、わが国における一般住民が遺伝子解析研究に対してどの様な意識を持っているかは明らかにされていない。本研究では以下の項目に関する検討を行った。(1)中年以降の一般住民が、遺伝子解析研究に対してどの様な認識を持ち、またその様な研究の必要性を感じているか?(2)遺伝子解析研究への協力の可否を決定するにあたって、どの程度までの説明を求めているか?(3)一般住民の中でどれ位の割合が遺伝子解析研究に協力する意志があるか?(4)遺伝子解析研究への協力の意志がある者に、一定の人口統計学的特徴(性・年齢・職業など)があるか?(5)遺伝子解析研究への協力の意志がある者と意志がない者の間に、生活習慣(飲酒・喫煙など)に差があるか?平成13年末日の時点で年齢が4079歳の男性1000名、女性1000名を、佐賀市の住民基本台帳より無作為抽出した。平成14年3月に調査票を郵送し、調査への協力を依頼した結果、1338名(男667名、女671名)の協力が得られた(有効回答率69%)。主な結果を以下に示す。遺伝子解析研究の重要性を感じている者は80%であった。研究への協力にあたって説明してほしい項目では、病気と遺伝子の関連、研究の目的、自分が選ばれた理由、個人情報の保護、遺伝子解析結果の通知などの頻度が高く、「あまり詳しい説明は必要ない」と回答した者は約15%であった。明確な同意を得ていない保存検体の使用については、「改めて同意が得られたもののみ使用してよい」と回答したものが約6割であった。遺伝子解析研究に協力する意志のある者は51%であり、男性、専門的・技術的・管理的職業、飲酒者に協力意志が高い傾向があった。(1)中年以降の一般住民が、遺伝子解析研究に対してどの様な認識を持ち、またその様な研究の必要性を感じているか?(2)遺伝子解析研究への協力の可否を決定するにあたって、どの程度までの説明を求めているか?(3)一般住民の中でどれ位の割合が遺伝子解析研究に協力する意志があるか?(4)遺伝子解析研究への協力の意志がある者に、一定の人口統計学的特徴(性・年齢・職業など)があるか?(5)遺伝子解析研究への協力の意志がある者と意志がない者の間に、生活習慣(飲酒・喫煙など)に差があるか?本年度は、まず自記式調査票の開発を行った。なお、調査票の作成にあたっては、遺伝子解析研究の関連省庁(厚生労働省、文部科学省、経済産業省)において作成された倫理指針を参考とし、また遺伝子解析を問題とした新聞記事を許可を得て一部引用した。次に、専任の調査員が佐賀市の住民基本台帳を閲覧し、平成13年末日の時点で年齢が40歳以上80歳未満の男性1000名、女性1000名を無作為抽出した。この情報に基づいて、平成14年3月に郵送による調査を実施した。

本報告書作成時点では、調査票を回収している段階であり、今後返答のない対象者で電話帳に記載されている者は、電話による督促を行う予定である。この作業を継続し、データ入力および解析は次年度に行う予定である。今回の研究費は、研究補助員に対する謝金、調査票の作成および印刷費、郵送料などに充当した。ヒトを対象とした種々の遺伝子解析研究の実施にあたっては、インフォームドコンセントに基づく対象者からの協力が不可欠であるが、わが国における一般住民が遺伝子解析研究に対してどの様な意識を持っているかは明らかにされていない。本研究では以下の項目に関する検討を行った。(1)中年以降の一般住民が、遺伝子解析研究に対してどの様な認識を持ち、またその様な研究の必要性を感じているか?(2)遺伝子解析研究への協力の可否を決定するにあたって、どの程度までの説明を求めているか?(3)一般住民の中でどれ位の割合が遺伝子解析研究に協力する意志があるか?(4)遺伝子解析研究への協力の意志がある者に、一定の人口統計学的特徴(性・年齢・職業など)があるか?(5)遺伝子解析研究への協力の意志がある者と意志がない者の間に、生活習慣(飲酒・喫煙など)に差があるか?平成13年末日の時点で年齢が4079歳の男性1000名、女性1000名を、佐賀市の住民基本台帳より無作為抽出した。平成14年3月に調査票を郵送し、調査への協力を依頼した結果、1338名(男667名,女671名)の協力が得られた(有効回答率69%)。主な結果を以下に示す。遺伝子解析研究の重要性を感じている者は80%であった。研究への協力にあたって説明してほしい項目では、病気と遺伝子の関連、研究の目的、自分が選ばれた理由、個人情報の保護、遺伝子解析結果の通知などの頻度が高く、「あまり詳しい説明は必要ない」と回答した者は約15%であった。明確な同意を得ていない保存検体の使用については、「改めて同意が得られたもののみ使用してよい」と回答したものが約6割であった。遺伝子解析研究に協力する意志のある者は51%であり、男性、専門的・技術的・管理的職業、飲酒者に協力意志が高い傾向があった。
レーザー冷却の物理と応用(総括班)

特定領域研究"レーザー冷却の物理と応用(総括班)"は各研究分担者の個々の研究を謝整することよりも、本邦における原子光学関係の研究全体の発展を支援するための活動に主眼をおいた。この特定領域研究期間中に5回の研究会を開催したが、第2回以降はすべてこの目的にそって、国内すべての研究者に公開し、かつ国際標準を満たすワークショップを企画、実行してきた。いずれの会議も約100名の参加があり、本邦でレーザー冷却関係の実験とボーズ凝縮関係の理論を研究している主要な研究者は常に出席していた。また、約半数は大学院学生であった。第4回以外の3回は国外から15-20名の参加を得た。国外招待者は、もちろん、本領域研究メンバーの研究推進に対する戦略上の観点から選んだが、全員世界の原子光学分野をリードしている研究グループのメンバーであった。研究発表、討論がすべて英語で行われたことは一部学生にとっては苦痛であったと思われるが、この研究会が国内関係者を大部分集めた研究会であること、若い研究者いとって非常によい情報交換の場になったことから、良い選択であったと考えている。第2、3回研究会の内容(講演の発表スライド、ポスターを集めたもの)はhttp://atom.ils.uec.ac.jpで、第5回研究会の内容はhttp://www-lab15.kuee.kyoto-u.ac.jp/1c/で公開している。また、今後も何らかの方法で同様なワークショップが定期的に開ければ研究の発展に非常によい効果をもたらせることが確認された。総括班はそれ自身で研究を行うものではないので、メンバー(評価委員を除く)の研究実績についてはA01からA04班までの各報告書を参照されたい。本年度の総括班の主な活動は当"レーザー冷却"領域研究者の研究計画策定に資するのを目的にして2回の研究会を開いたことである。第1回研究会は9月27日に盛岡地域交流センター・マリオスで行った。(この期間、盛岡大学で物理学会講演会が開催されていたので、メンバーの旅費負担を軽減することができた。)12人の領域研究メンバー全員がこれまでの研究の経過と今後の計画について発表を行った。第2回研究会は葉山の湘南国際村センターにおいて2月4,5日全員泊まり込みで開催した。この研究会の目的はメンバーの研究遂行に関するより具体的な点検を行うこと、メンバー以外の国内研究者との意見交換をすること、本プロジェクトの国際レベルでのチェックにあった。また、メンバーの関心がボーズ凝縮に集まっていたのでボーズ凝縮関係の研究を中心テーマとした。これらの目的達成のため、国内の中性原子レーザー冷却に関与している研究者ほぼ全員に参加を求めた。また、現在国際的に最も活発にボーズ凝縮関係の研究が行われているMITのKetterle教授、JILAのCornel教授、NISTのPhillips博士のグループから各1名、ヘリウムの研究を行っているHogervorst教授、リチウムのボーズ凝縮のHulet教授の参加を得て研究討論を行った。上記2回の研究会の記録(全発表のOHPのコピー、と評価委員の評価)は当"レーザー冷却"研究グループのホームページ(http://atom.ils.uec.ac.jp)に掲載し、自由に閲覧できるようにする予定である。(第1回研究会に関してはすでに掲載済み)総括班の主な仕事は研究会と勉強会を開催することで、4つの計画研究班の研究成果の発表、評価、科学、技術上の討論を通じて各研究者の研究推進の支援をすることである。本年度も昨年度と同様な研究会を1月8-10日に開催した。原則3日間泊まり込みの参加を求め、公開で外国からの参加者12名(大部分招待者)、4人の評価委員を含めて90人強の参加があった。

当特定領域研究研究分担者全員を含め、国内のレーザー冷却、原子ボーズ凝縮に関わる研究者の大部分が参加し、有益な討論を行った。また、国外参加者は研究遂行上の戦略的見地から招待者を選んだ。研究会のプログラムおよびポスター発表を含む全講演のトランスペアレンシーは今までの研究会と同様、領域研究のためのホームページhttp://atom.ils.uec.ac.jpに掲載予定である。(一部の講演はすでに公開している。)また、東京地区(今まではすべて東京大学駒場キャンパス)で定期的に勉強会を開いている。これも公開である。(連絡先:久我隆弘kuga@phys.c.u-tokyo.ac.jp)いままでの話題は以下の通りである。第1回上田正仁教授(東京工大)"ボーズ凝縮体におけるYrast line"5月24日第2回中川賢一助教授(電通大レーザー)"原子干渉計を用いた基礎物理定数の精密測定"6月21日第3回米谷民明教授(東大総合文化)"量子重力とは何か"10月27日第5回鳥居寛之(東大総合文化)"反陽子原子の精密分光が拓く反物質科学"2月2日総括班の仕事は各計画研究斑の間の交流促進と研究会の開催である。本年度も9月に日本物理学会秋の分科会後援会に引き続いて、淡路島福良において3日間の泊まり込み研究会を開催した。今回は特定領域研究が始まってすでに2年を経過しているので、現在、各研究グループが行っている研究について詳細で建設的な議論が活発に行われた。もちろん、前回までと同様、国内の関連研究者全員解放された研究会で、東京から遠方であるにもかかわらず約80名、本邦における原子冷却関係者がほとんど出席した。プログラムおよび内容については我々のURLを参照されたい。このほか、東京において下記に記した定期的な講演会(勉強会)を行った。2月2日(金)鳥居寛之(東大総合文化)"反陽子原子の精密分光が拓く(ひらく)反物質科学"5月25日(金)杉山和彦(京大工)"モードロックレーザによる光周波数計測"7月27日(金)清水祐公子(JST)"高フィネス微小共振器内の少数冷却原子による光パルスの"スーパー"/サブルミナル伝播"今年度、総括班の外的な活動は1月7日から9日の3日間、淡路島で開催した国際研究集会The 5^<th> laser cooling workshopに中心をおいた。われわれはすでに第1年度、第2年度に同様な研究会を開催しているが、前者がこれから重点領域研究を始めるにあったって、各研究分担者の戦略を定めるのが第一の目的であったのに対して、今回は、我々が過去3年間努力してきたレーザー冷却に関連した研究成果の国際的評価を受けることが最も大きな目的であった。また、研究期間中に科研費以外の研究費で研究を続けた国内研究者との研究上、および研究協力に関する討論、研究メンバーの今後の方向を決めるための助力となることも目的とした。結果は、これらの目的に対して十分な成果を上げることができたと考える。まず、国外からは、現在、世界で最も先進的な研究を行っている研究室(グループ)の多くから代表者が参加し、合計15名が研究発表、討論を行った。(米国7,ドイツ、オーストリア、フランス各2,デンマーク、イタリア各1名)。
偏光赤外・近赤外分光イメージング法による高分子材料中の異方性の可視化解析

赤外/近赤外分光イメージング測定において,偏光板の挿入枚数・方向を変更することで,複屈折性を有する試料を測定した際のNIR領域の透過光強度が大きく変化することがわかった.この透過光強度の波長依存性は,試料の厚さと複屈折の積であるリタデーションの値と遅相軸方向に関する関数として理論的に記述できることを示した.また,吸収バンドの影響を除去することで,実測値からリタデーション値を定量的に取得することに成功した.NIR領域から試料の複屈折情報を,IR領域から試料の化学情報を同時に取得し,二次元分布化することで,複屈折性を有する試料内のモルフォロジーを同時に2つの視点から可視化することに成功した.近赤外光は,化学構造に対応した吸収特性を示すという赤外光の特性と,高分子材料への透過性が高いという可視光の特性とを併せ持つ.よって,従来の赤外分光法では難しかった,数mm程度の厚みを有する成形体内の構造評価への応用が期待できる.本研究では近赤外光の特性を利用した高分子成形体中の異方性の可視化手法として,(1)吸収二色性と,(2)複屈折を利用する2通りの手法について検討を行った.本年度は,まずリタデーション既知の位相差フィルムの偏光近赤外分光測定を行い,近赤外複屈折の検出可能性を検討した.2枚の偏光板を用いて直交ニコル位で顕微近赤外/赤外分光測定を行った結果,1.5 2.5μmの波長範囲で,透過光強度の波長依存性が確認された.また,偏光子の軸方向とフィルムの軸方向が平行な場合は光が透過せず,45度の角をなす場合は光強度が最大となることから,透過光強度変化は近赤外複屈折によるものであることが確かめられた.次に,厚さ2mmのポリ乳酸射出成形品内の流動分布の可視化を試みた.ゲート近傍の不均一な流動状態を示す領域について,近赤外二色性と近赤外複屈折のイメージング測定を行ったところ,二色性はほぼ検出できなかったが,スペクトルのベースライン変動から,試料の流動状態の鋭敏な可視化に成功した.これは試料表面近傍の一部の層のみがせん断により強く分子配向しているためと考えられる.このような試料の場合は流動性の評価に近赤外複屈折の利用が有効であることを示した.また,微小領域における温度勾配下での高分子結晶化解析に向けて,チップ型マイクロヒーター上のPPおよびPBTの顕微近赤外分光測定を試みた.各高分子について冷却条件による結晶性の違いを近赤外スペクトルから検出可能であることを確かめた.一方で反射光学系を採用する必要があるため,偏光解析のためには偏光子配置の再検討が必要なことが明らかとなった.当初の予定通り,配向性の試料の近赤外スペクトルに現れるベースライン変化が,複屈折に由来することを確かめた.一方で可視領域でのリタデーション値から予測されるベースライン変化は実測値と定性的に一致したものの,それらの間の差異については今後の検討が必要である.次年度前期に複屈折の波長分散を考慮し,検討を行う予定である.また本年度中にマイクロヒーターの作成を行う予定であったが,研究室に導入された別装置用のチップ型マイクロヒーターが使用できることとなったため,予定を繰り上げ,顕微近赤外分光測定に適切なサンプルサイズの検討,結晶化条件を変化させた際の近赤外スペクトルの変化を調べた.またホットステージに急速冷却のための冷却管と,マイクロヒーター通電用のコネクタの増設を行ったため,次年度はマイクロヒーターとホットステージを組み合わせた測定を行う予定である.本研究では,偏光近赤外分光スペクトルデータに含まれる化学情報と,光学異方性を表す物性値である複屈折の情報を分離し,数mm程度の厚みを有する高分子成形体へ応用可能な可視化分析法の検討を行った.本年度は,近赤外吸収スペクトル内での透過光強度(ベースライン)変化を用いた複屈折の定量的評価手法の確立に取り組んだ.同一の1λ位相差フィルムを積層し,リタデーションを約550約2750 nmの範囲で変化させた試料を作成した.偏光板2枚で試料を挟む光学系で測定した近赤外吸収スペクトル(S-p2)と,偏光板1枚のみの光学系で測定したスペクトル(S-p1)の比を計算した.S-p2とS-p1の比スペクトルからは,非常に強い吸収バンド以外のほとんどの吸収バンドが除去され,試料のリタデーションに依存した,透過光強度の三角関数的な湾曲を抽出できた.比スペクトルに対して,透過光強度とリタデーション,波長の関係を記述した式を最小二乗フィッティングすることで,試料のリタデーションを計算した.得られたリタデーションが積層枚数に対して良好な線形関係を示したことから,本手法の妥当性が確認された.本手法を,ポリ乳酸球晶の可視化に応用し,球晶内のリタデーション分布を可視化することができた.また得られたリタデーション分布は吸収の二色性から得られた配向関数分布よりハイコントラストであった.これは本手法がリタデーションの変化に非常に鋭敏であることに由来していると考えられる.一方で,偏光板1枚,2枚の2つの光学系に対して,それぞれイメージング測定を行うため,当初の想定より,測定に時間がかかってしまい,結晶化過程の解析を行うことはできなかった.

また,リタデーションの値が小さい場合には感度が低く,偏光子特性の除去がより重要であることもわかった.吸収を持たない位相差板の使用などが,今後の改善点として考えられる.赤外/近赤外分光イメージング測定において,偏光板の挿入枚数・方向を変更することで,複屈折性を有する試料を測定した際のNIR領域の透過光強度が大きく変化することがわかった.この透過光強度の波長依存性は,試料の厚さと複屈折の積であるリタデーションの値と遅相軸方向に関する関数として理論的に記述できることを示した.また,吸収バンドの影響を除去することで,実測値からリタデーション値を定量的に取得することに成功した.NIR領域から試料の複屈折情報を,IR領域から試料の化学情報を同時に取得し,二次元分布化することで,複屈折性を有する試料内のモルフォロジーを同時に2つの視点から可視化することに成功した.次年度はまず下記の2点に取り組む予定である.(1)近赤外スペクトル内でのベースライン(透過光強度)変化を用いた複屈折の定量評価法の開発(2)高分子結晶化過程における顕微近赤外分光イメージング測定(1)では,近赤外複屈折に由来すると思われるスペクトルベースライン変化について,近赤外波長域までの複屈折の波長分散を考慮して,理論的な裏付けを試みる.これを行うことにより,実際の高分子成形体中に生じる複屈折性分布の定量的なイメージングが可能になる.また,同一試料内での異方性を定量的な二次元画像として評価が可能になった場合,別波長帯に現れる近赤外吸収二次元画像との相関を調べ,各化学種の寄与の推定も試みる予定である.(2)では,マイクロヒーターとホットステージを組み合わせ,顕微鏡下で試料の局所高速昇温・冷却を試みる.さらに顕微近赤外分光イメージングと合わせて,局所加熱により生じる温度勾配下での結晶化状態の評価を試みる.高分子材料の分析光学系再設計に必要な物品を購入するためには不足していたため,次年度予算と併せて購入するため.次年度予算と併せて,偏光子を固定するホルダーなど,光学系に必要な物品の購入に使用する予定である.
感染防御、炎症誘導に関わるマクロファージの活性制御機構

これまでに、病原体構成成分を認識するToll-like receptor(TLR)ファミリーがマクロファージの異常活性化による慢性腸炎の発症のトリガーとなることを明らかにした。さらに、正常マウスの大腸粘膜固有層マクロファージは、TLR刺激依存性の炎症性サイトカインの産生を認めないが、慢性腸炎を発症するIL-10ノックアウトマウス由来の細胞は有意に産生することを見出した。そこで正常マウスとIL-10ノックアウトマウスの大腸粘膜固有層マクロファージ間で遣伝子発現の差をDNAマイクロアレイで解析した。その結果、IκBファミリーに属するBcl-3,IκBNSが正常大腸粘膜固有層マクロファージに特異的に発現していることを見出した。Bcl-3,IκBNSをマクロファージに発現させると、LPS刺激依存性のTNF-α,IL-6産生がそれぞれ特異的に減少していた。そこで、IκBNSノックアウトマウスを作製したところ、マクロファージ、樹状細胞では、TLR刺激により誘導される遺伝子の中で、IL-6などのNF-κB依存性に3時間以降に遅れて誘導されてくる遺伝子の発現が有意に上昇していた。またTLR刺激によるNF-κBの活性が遷延化し、刺激後3時間でもまだNF-κBの活性が残存していた。さらに個体レベルでも、LPS投与によるエンドトキシンショックに対する感受性が高くなり、またDSS投与による腸管炎症に対する感受性も高くなっていた。このように、IκBNSノックアウトマウスでは、NF-κBの活性の遷延化、あるサブセットのNF-κB標的遺伝子の過剰発現、そして個体レベルでは炎症反応に対する感受性の充進が見られた。この結果から、IκBNSが自然免疫系の活性をNF-κBの活性制御により負に制御し、個体レベルで炎症反応を抑制していることが明らかになった。これまでにSTAT3をマクロファージで特異的に欠失させたマウスを作製し、STAT3がマクロファージでのIL-10シグナルに必須であり、マクロファージの機能抑制、さらには生体レベルで慢性炎症の抑制に必須であることを明らかにした。そして、病原体構成成分を認識するToll-like receptor(TLR)ファミリーが、STAT3非存在下でマクロファージの異常活性化による慢性腸炎の発症のトリガーとなることを、TLR4/STAT3二重変異マウスの解析により明らかにした。さらに、IL-10刺激によりマクロファージで誘導されるBcl-3が、TLR刺激依存性のTNF-α産生を特異的に抑制していることを明らかにした。今年度は、大腸粘膜固有層に存在するマクロファージの機能を解析した。その結果、正常マウスの大腸粘膜固有層マクロファージは、TLR刺激依存性の炎症性サイトカインの産生が認められないが、慢性腸炎を発症するIL-10ノックアウトマウスやSTAT3変異マウス由来の細胞はTLR刺激依存性に炎症性サイトカインを産生した。そこで正常マウスとIL-10ノックアウトマウスの大腸粘膜固有層マクロファージ間でTLR応答性が異なる分子機構を解析するため、両者間で遺伝子発現の差をDNAマイクロアレイで解析した。その結果、Bcl-3と同じIκBファミリーに属するIκBNSがBcl-3とともに正常大腸粘膜固有層マクロファージに特異的に発現していることを見出した。IκBNSをマクロファージに発現させると、LPS刺激依存性のIL-6産生が特異的に減少していた。さらにIκBNSを発現した細胞では、NF-κBのDNA結合能に障害が認められた。さらに、IκBNSはIL-6プロモーターにp50NF-κBサブユニットと共に恒常的に会合していることがクロマチン免疫沈降法の解析から明らかになった。さらに、RNAiによるIκBNSのノックダウンマクロファージでは、LPS刺激依存性のIL-6産生が特異的に増加していた。以上の結果から、正常大腸粘膜固有層マクロファージに恒常的に発現しているIκBNSがマクロファージ系細胞において、IL-6産生の抑制に特異的に関与していることが明らかになった。

このように、IκBNSノックアウトマウスでは、NF-κBの活性の遷延化、あるサブセットのNF-κB標的遺伝子の過剰発現、そして個体レベルでは炎症反応に対する感受性の充進が見られた。この結果から、IκBNSが自然免疫系の活性をNF-κBの活性制御により負に制御し、個体レベルで炎症反応を抑制していることが明らかになった。
精巣ライディッヒ細胞における胎仔期分化記憶保持の分子基盤解明

精巣ライディッヒ細胞は男性ホルモンを産生する細胞であり、胎仔期と成獣期では機能が大きく異なる。我々は最近、胎仔期に出現したライディッヒ細胞がいったん脱分化し、出生後に機能の異なる成獣型ライディッヒ細胞へ再分化することを明らかにした。またこの過程で、胎仔型ライディッヒ細胞において活性化されたNr5a1遺伝子の発現制御領域(エンハンサー)がエピジェネティック修飾を受けることにより、エンハンサー活性化の記憶(胎仔期の分化記憶)が出生後も保持されると考えられた。本研究では、エンハンサーに結合する転写因子の同定と機能解析を通じて、ライディッヒ細胞における胎仔期分化記憶保持の分子機構を解明する。
粉体の数値解析の実用化のための基礎研究

ゴム材などの弾性体材料の数値解析を行うためには、大変形および非線形を考慮しなければならない。昨年度までの研究では、線形弾性体の構成方程式を用いた解析だった。そこで本研究では、既存の粒子法構造解析手法に非線形構成方程式を導入することで、粒子法に依る大変形・非線形弾性体の数値解析手法の開発を行った。非線形弾性体構成方程式を導入した粒子法構造解析手法の精度検証として、円柱状試験片の一軸引っ張り解析を行った。材料係数の値を変化させながら、引張中の応力ひずみ関係を各モデルによる理論値と比較した。また、疑似非圧縮性を保つためのパラメータの適正な値の範囲を見定めるため、解析中の体積変化率も記録した。いずれの解析でも応力ひずみ関係は理論値とよく一致し、解析を行った範囲ではひずみが約3倍程度まで理論値との一致が見られた。体積変化率も、疑似非圧縮性を保つためのパラメータを適正にとればこれらのひずみの範囲内ではごく小さい変化に収まっていた。また、実在のゴムの挙動と比較するため、非線形弾性体構成方程式に即したゴムの材料係数を同定した。ゴムの一軸引っ張り試験を行い、応力ひずみ関係を取得した。この引っ張り試験結果に最小二乗近似を行う事によって、非線形弾性体構成方程式の材料係数を同定した。この結果を用いた弾性体の一軸引っ張り解析においても、応力ひずみ関係は理論値との良好な一致が見られた。この粒子法による非線形構造解析に、ゴムと壁面との接触を想定したDEMによる接触解析モデルを導入した。モデルの精度検証のため、ゴムブレードとガラス板の接触実験を行い、同条件で行った数値解析結果との比較を行った。非線形弾性体構成方程式を導入したことによるゴム挙動解析の精度向上が望まれたが、線形および非線形構成方程式の結果に有意な差異が見られず、精度の検証を行うためには実験及び数値解析を行う体系の見直しが必要と考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.粒子法を用いた粉体-弾性体連成解析手法の開発薬品錠剤や食品、原子燃料、再処理施設から生じる廃棄体のように、粉末を固めて形状を与えたものを粉末成形体と呼ぶ。成形プロセスの一部である撹拌や輸送のプロセスにおける、粉体と構造物との相互作用の挙動解析を行うために、既存の粉体解析手法と弾性体解析手法を組み合わせることで、粉体-弾性体連成解析手法を開発した(学会発表1,2)。この解析では、矩形容器内に充填した粉体層を、弾性体で構成される撹拌翼によって撹拌するシミュレーションを行い、粉体との接触によって弾性体に働く応力や、粉体層の速度分布、移動量などの情報を取得した。数値解析の精度検証を行うために、実験装置を設計、作成した。今後は実験と同スケールの数値解析を行い、実証実験の結果との比較を行っていく。2.開発した連成解析手法を利用した粉末成形体の衝突シミュレーション1.で開発した連成解析手法を用いて,タブレット形状の粉末成形体を壁面に衝突させるシミュレーションを行った。生産現場において破損率の異なる二つの形状のタブレットを弾性体でモデル化し、粉体解析手法と同様の方法でモデル化した壁面に衝突させることで、形状が破損率に与える影響を評価した。解析の結果、破損率に影響を与えるのは成形後の形状そのものではなく、粉体を圧密して成形する過程に形状による差異が影響することが示唆された。今後は破損率の違いをより深く追及するために、粉末成形過程に注目した解析を行っていく。粉末成形体の成形プロセスには、撹拌や輸送といったプロセスが含まれる。粉体と構造物との相互作用の挙動を解析するために粉体ー弾性体連成形跡手法を昨年度開発した。当該年度は、粉末ー弾性体連成解析手法の実用化に向けて、昨年度は解析手法の確立に主眼を置いたが、当該年度は実験との比較による精度検証を中心に研究を行った。実験では、矩形容器内に充てんした粉体層を、弾性体であるゴムの撹拌翼によって撹拌した。実験の様子はハイスピードカメラを用いて撮影した。その後、撮影した動画からゴムの変位量を取得した。ゴムの変位量は、撮影した動画から複数枚の画像を抜き出し、手作業によって測定した。これは、数百枚から数千枚に及ぶ画像をすべて手作業で処理することは現実的ではなく、また画像処理を自動化するためには数値解析とは別な特殊な技術が必要になるため、今回は十数枚の画像を処理するにとどまった。この変位量という実験データの取得に当たって、数値解析では解析中のすべての情報が数値情報として記録されるため、弾性体の変位の連続的な変化を計測することができた。この点において、数値解析の有用性が確認できた。ただし、実験と数値解析ではゴムの硬度の違いによる変位の差に相関こそ見られたものの変位量の絶対値は一致しなかった。これは、実際のゴムが非線形挙動を見せるのに対し、数値解析に用いた構成方程式が線形弾性体モデルであったためだと考えられる。この実験と数値解析の比較から、本年度の課題として数値解析への非線形弾性体モデル導入の重要性が明らかになった。

そこで本研究では、既存の粒子法構造解析手法に非線形構成方程式を導入することで、粒子法に依る大変形・非線形弾性体の数値解析手法の開発を行った。非線形弾性体構成方程式を導入した粒子法構造解析手法の精度検証として、円柱状試験片の一軸引っ張り解析を行った。材料係数の値を変化させながら、引張中の応力ひずみ関係を各モデルによる理論値と比較した。また、疑似非圧縮性を保つためのパラメータの適正な値の範囲を見定めるため、解析中の体積変化率も記録した。いずれの解析でも応力ひずみ関係は理論値とよく一致し、解析を行った範囲ではひずみが約3倍程度まで理論値との一致が見られた。体積変化率も、疑似非圧縮性を保つためのパラメータを適正にとればこれらのひずみの範囲内ではごく小さい変化に収まっていた。また、実在のゴムの挙動と比較するため、非線形弾性体構成方程式に即したゴムの材料係数を同定した。ゴムの一軸引っ張り試験を行い、応力ひずみ関係を取得した。この引っ張り試験結果に最小二乗近似を行う事によって、非線形弾性体構成方程式の材料係数を同定した。この結果を用いた弾性体の一軸引っ張り解析においても、応力ひずみ関係は理論値との良好な一致が見られた。この粒子法による非線形構造解析に、ゴムと壁面との接触を想定したDEMによる接触解析モデルを導入した。モデルの精度検証のため、ゴムブレードとガラス板の接触実験を行い、同条件で行った数値解析結果との比較を行った。非線形弾性体構成方程式を導入したことによるゴム挙動解析の精度向上が望まれたが、線形および非線形構成方程式の結果に有意な差異が見られず、精度の検証を行うためには実験及び数値解析を行う体系の見直しが必要と考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。粉末成形体の数値解析のための衝突解析手法の基礎を確立した。粉末成形プロセスのひとつである粉末の撹拌を、数値解析を用いて模擬することが可能であることを示した。開発した粒子法による粉体ー弾性体連成解析手法の精度検証を行い、有用性と課題を明確にした。これまでの研究は、線形弾性体を仮定して行ってきたが、実際の成形体の応力ひずみ関係は非線形であることが多く、また変形の度合いが大きい場合は塑性変形を伴うこともある。そのため、今後は応力ひずみ関係に弾性体以外のモデルを組み込めるようにプログラムを改良し、またその解析の精度検証を行う。数値解析へのより実験に即した構成方程式を導入する。実験に用いられている撹拌翼はゴムで構成されているため、非圧縮等方性非線形弾性体構成方程式であるNeo-Hookeanモデルを導入する。一軸引張解析を行い、応力ひずみ関係と非圧縮性を理論値と比較することで、モデルの妥当性を検証する。妥当性を検証した後に、改めて矩形容器内のゴムによる粉体層撹拌解析を行い、実験結果と比較することで、粉体ー弾性体連成解析手法のさらなる精度検証を行う。
家族性高コレステロール血症の残余リスク制圧：HDLを悪玉化させる原因脂質の探索

遺伝学的に証明された家族性高コレステロール血症患者のうち、若年性ASCVD患者12名と冠動脈疾患未発症者17名のHDL分画(血漿をPEG沈殿して得た)を共同研究先(九州大学・生体防御医学研究所)に送付し、超臨界流体クロマトグラフィ・質量分析法(SFC/MC)によりHDL分画中のリン脂質について脂肪酸側鎖の違いまで含めて測定を依頼した。測定結果について、搬出能および冠動脈疾患との関連を検討し、ASCVD患者でその血中濃度が高く、かつ搬出能と負の関連を示すHDL分画中の悪玉脂質を探索した。合計215種類の脂質を定量できた。すべての測定できたリン脂質が患者のHDL-C濃度と正に関連してしまうため、各脂質クラスの総量に対する比率をパラメーターとして採用した。搬出能およびASCVDの有無との関連を検討したところ、概してphosphatidylcholine (PC)やphosphatidylethanolamine (PE)、sphingomyelin (SM)やcholesterylester (CE)は搬出能と正に関連し、ASCVD患者でその血中濃度が低い、いわゆる「善玉脂質」と考えられた。逆に、Lyso-PCおよびLyso-PEは搬出能と負に関連し、ASCVD患者でその血中濃度が高い、いわゆる「悪玉脂質」と考えられた。phosphatidylinositolやCeramides、diacylglycerol、triacylglycerolは一定の傾向を示さなかった。興味深いことに、多くが善玉脂質であるPCとPEのうち、「PC 18:0-20:4/Total PC」および「PE 18:0-20:4/Total PE」は、搬出能と負に関連し、ASCVD患者でその血中濃度が高いため「悪玉脂質」である可能性が示唆された。家族性高コレステロール血症患者の血漿からHDL分画を得、リピドミクス解析により、HDL機能と負に関連し、ASCVD患者で濃度が高い「HDLを悪玉化させる候補脂質」を複数同定できた。おおむね研究計画書通りに進んでいる。平成30年度の成果から、ホスフォリパーゼA2(PLA2)などによりリン脂質のsn-2位のアラキドン酸が切断され、その代謝産物(エイコサノイド等)が搬出能低下を介して動脈硬化プラーク形成進展に寄与している可能性が考えられる。したがって、アラキドン酸カスケードの下流の酵素や脂質メディエーターおよびその受容体、またPCやPEにアラキドン酸を導入する酵素なども創薬ターゲットとして有望かもしれない。今後は上記HDL分画の脂質メディエーター(アラキドン酸カスケードの下流に位置する物質など)の測定、アラキドン酸やその下流の脂質メディエーターとコレステロール搬出反応との関連を探る細胞実験などを進めていく。また脂肪酸を細胞内外で運搬する脂肪酸結合タンパクやその阻害剤などを用いた実験も進めていきたい。

今後は上記HDL分画の脂質メディエーター(アラキドン酸カスケードの下流に位置する物質など)の測定、アラキドン酸やその下流の脂質メディエーターとコレステロール搬出反応との関連を探る細胞実験などを進めていく。また脂肪酸を細胞内外で運搬する脂肪酸結合タンパクやその阻害剤などを用いた実験も進めていきたい。国際学会の旅費について、他の研究費で賄ったため。
胎児MRI画像の多次元定量解析に関する研究

近年の超音波診断機器と内視鏡の発達に伴い、医用工学機器が医療の現場に浸透し始めて久しい。その一方で、子宮内の胎児に対し手術をし、出生以後の治療ではどうしても治癒しないほど重篤な疾患を治療する胎児外科は、昨今その必要性が説かれ始めたばかりである。胎児外科を飛躍的に前進させる当該研家への取り組みはわが国の急務課題であり、本研究はその課題にまさしく取り組むものである。以上の背景のもとに本研究では胎児MRI画像の定量的画像解析を中心軸として、関連する診断・治療デバイスの開発を行った。MRI画像の定量的画像解析では、まず機能MRIにおける脳活動部位の探知を行う画像処理法を応用して、「心電同期を必要としない流れの可視化PC-MRA撮影法」の開発を行った。この手法は、通常の流れの可視化MRIで必要となる心電同期が胎児では困難である事をふまえて、心電同期を行わずに流れMRI撮影を行う方法である。この研究については、一定の成果を得て、無心体胎児の臍帯血流の診断に臨床応用する事ができた。この成果についてはPediatric Radiology誌に投稿し、条件付き採択の判定を受けている。次にMR対応超音波プローブによる胎児心拍同期を用いたPC-MRA法についても開発を行った。この手法は先に述べた通常の流れの可視化MRIで心電同期を行わないアプローチをとったのに対して、心電計測を行わずに心拍同期を行おうとするアプローチであった。このアプローチを実現するため、新たにMRI対応の胎児用心拍測定装置を開発した。定量的評価実験、ボランティア実験を介して「MR対応超音波プローブによる胎児心拍同期を用いたPC-MRA法」が「心電同期を必要としない流れの可視化PC-MRA撮影法」より優れる事が判明した。今後は両者のアプローチについて精査して臨床応用の可能性をさらに拡げたい。胎児水頭症は脳脊髄液(Cerebrospinal fluid ; CSF)が脳室やその他の頭蓋内腔に過剰に貯留し,これらの腔が拡大した状態である.そのため,CSF循環路の閉塞部位を同定することが胎児水頭症診断には非常に重要である.しかしながら,出生後のヒトのCSF循環動態の評価はPC-MRA法により確立しているにも関わらず,胎児のCSF循環動態の評価に関する研究は統計的画像処理にとどまっているのが現状である,PC-MRAには心拍同期が必要であり,通常は心電が主に用いられているが,胎児の心電取得は難しい事に加え,超音波装置のMR対応性が報告されている\cite{Azuma}こともあり,超音波ドップラによる同期が有効であると考えられる.そこで本研究では,MR内で使用可能な超音波ドップラ装置を製作し,超音波ドップラ波形から心拍同期を行う新しい胎児PC-MRA(Phase Contrast Magnetic Resonance Angiography)法を開発し,そのPC-MRA法の評価・検証を行った.PC-MRA法とは,流れの位相ごとのMRA画像を撮影する手法であるが,撮影にあたって,一心拍毎に位相エンコードステップを変化させていき,時相毎の画像を取得していく.その,心拍同期を得る方法として通常は心電が用いられているのだが,本システムではMR対応の超音波ドップラにより,胎児の心拍波形から心拍同期信号を作り出す事で,PC-MRA法による撮影を行った.MR装置は日立メディコ社製MRH-500 0.5Tを用いた.MR対応超音波装置のMR対応性をS/N比により評価した.撮影はSE(Spin Echo)法とGFE(Gradient Fieid Echo)法でそれぞれTR/TE/FOV:300ms/30ms/250mm,解像度は$256\times256$で行った、ボランティア6名(成人男性2223歳)の超音波ドップラ波形を用いて,心拍同期の生成アルゴリズムの精度評価を行った.ファントムのみを撮影した場合に対して,MR対応超音波装置を入れて撮影したところ,SE法の場合S/N比が3.8%減少し,GFE法の場合5.8%減少した,パラメータの調整を最適化した場合には,被験者6名に対して偏差1.6%以内の精度で心拍を検出できた.胎児中脳水道の流れを模擬したファントム実験においては,流量が0.1mlの場合,同期なしによる撮影では検出できなかった流れ部分が検出出来,輝度値の増加量は71%であった.MR対応超音波ドップラ装置による胎児心拍同期を用いてPC-MRA法のシステム開発を行った.開発したMR対応超音波ドップラ装置を用いて撮影したMRI画像のS/N比はたかだか5.9\%程度しか減少しなかった.また,心拍ドップラ波形から同期信号を自動生成するアルゴリズムを開発し,偏差1.6%以内の精度で心拍を検出できた.胎児中脳水道の流れを模擬したファントム実験においては,流量が0.1mlの場合,同期なしによる撮影では検出できなかった流れ部分が検出出来,輝度値の増加量は71%であった.近年の超音波診断機器と内視鏡の発達に伴い、医用工学機器が医療の現場に浸透し始めて久しい。

MRI画像の定量的画像解析では、まず機能MRIにおける脳活動部位の探知を行う画像処理法を応用して、「心電同期を必要としない流れの可視化PC-MRA撮影法」の開発を行った。この手法は、通常の流れの可視化MRIで必要となる心電同期が胎児では困難である事をふまえて、心電同期を行わずに流れMRI撮影を行う方法である。この研究については、一定の成果を得て、無心体胎児の臍帯血流の診断に臨床応用する事ができた。この成果についてはPediatric Radiology誌に投稿し、条件付き採択の判定を受けている。次にMR対応超音波プローブによる胎児心拍同期を用いたPC-MRA法についても開発を行った。この手法は先に述べた通常の流れの可視化MRIで心電同期を行わないアプローチをとったのに対して、心電計測を行わずに心拍同期を行おうとするアプローチであった。このアプローチを実現するため、新たにMRI対応の胎児用心拍測定装置を開発した。定量的評価実験、ボランティア実験を介して「MR対応超音波プローブによる胎児心拍同期を用いたPC-MRA法」が「心電同期を必要としない流れの可視化PC-MRA撮影法」より優れる事が判明した。今後は両者のアプローチについて精査して臨床応用の可能性をさらに拡げたい。
湿式研削における焼け発生予測の研究

本研究では、まず、湿式研削における焼け発生条件を明確にするために、焼入れたSKD11材を各種条件で研削した場合の接触孤内最高温度θmaxと研削焼け発生の有無との関係を中心に調べ、次の結果を得た。1.下向き研削での焼けは、湿式,乾式および研削盤の作動条件にかかわらず、θmaxが約400°Cで発生する。乾式と湿式の焼け発生温度が同程度になるのは、湿式でもθmaxが400°C程度になると、接触孤内の研削液が膜沸騰状態になり、接触孤内およびその近傍での熱伝達率が乾式と差がなくなるためと考えられる。2.上向き湿式研削での焼け発生θmaxは、下向きの場合よりも高く、約500°Cとなる。これは、上向き研削の場合には、研削液供給ノズルが、研削査後の高温度の工作物表面に研削液を最適に供給し得る位置にあり、工作物表面の酸化防止効果が下向き研削の場合よりも大きくなるためと考えられる。3.湿式よりも乾式研削の方が小さな除去速度、発生熱量で焼けが発生する。これは、完全な膜沸騰状態範囲と考えられる焼け発生温度になるための発生研削熱量が、乾式よりも湿式の方が大きくなることを意味する。これらの結果から、湿式研削の焼けを予測するには、湿式研削温度を数式化し、その式から上述の焼け発生温度となる条件を求めれば良いことがわかった。そこで、J.C Jaegerの移動熱源理論を応用した数式を考え、実験結果と比較したところ、未膜沸騰状態の範囲では、その研削条件での乾式の場合の熱流入割合がわかれば、研削条件と発発生熱量によって温式のθmaxが計算し得ることがわかった。末膜沸騰領域はθmaxが120°Cまでであるので、正確な予測をするには不十分であるが、θmaxが120°Cを越えると、温度上昇が急激になることや、安全側に立った焼け予測ということを考えると、この式は比較的有用となる可能性がある。
エピゲノム制御の観点から心不全病態分子基盤解明に挑む

遺伝子トラップ法を用いて同定された胎児期心臓で高発現するcardiac specific long non-coding RNA X(CSLR-X)について心不全病態における分子機能解明を行った。心筋細胞由来CSLR-Xの機能解析のため心筋特異的CSLR-X過剰発現、心筋特異的CSLR-X欠損マウスを作製し解析を行い、心組織及び心機能に関して明らかな表現型を認めなかった。またCSLR-Xと複合体を構成する構成因子探索のため全身性強制発現CSLR-X Tg、CSLR-X KO、野生型マウスの心組織を用いてproteome解析を行い、複数の候補タンパクを同定した。循環器病態学
網羅的同定を目指した変形性膝関節症感受性遺伝子の解明

変形性関節症の感受性遺伝子の同定のため、EPAS1とMMP13を候補遺伝子として関連解析を行った。板橋と美山の二つのコホートから患者475名、対照563名を選択し、解析方法はRFLP法とTaqMan法を用いた。EPAS1のrs1703192とMMP13のrs2252070の二つのSNPで関連があった。板橋コホートでは、rs1703192がアレルモデル(χ2検定p=0. 018)と劣性モデル(p=0. 031).で関連があり、二つのコホートを併せて解析すると、rs1703192では、アレルモデル(p=0. 013)と劣性モデル(p=0. 018)で、rs2252070では、劣性モデル(p=0. 039)で関連があった。変形性膝関節症は、関節軟骨の変性と骨棘形成に特徴づけられる関節疾患で、加齢によりその発症率は上昇する。わが国では65歳以上の高齢者の22%が変形性膝関節症に罹患していると考えられ、高齢社会の進展と相まってその患者数は増加の一途をたどっている。しかしながら発症原因は未だ解明されておらず、根本治療もないのが現状である。環境要因と遺伝的素因が組み合わさって発症する多因子性疾患と考えられており、この疾患の遺伝的素因を解明するため、3,040名の参加者から構成される住民コホートから採取した検体を用いて主に血縁者を対象とした遺伝子解析を行った。この住民コホートは、地域特性の異なる都市部・農村・漁村の3つの地域から構成されており、ここから141例を抽出した。これら対象者のゲノムを血液より抽出、90万箇所のSNP(一塩基多型)及びほぼ同数箇所のCNV(コピー数多型)に対応するマーカーが搭載されているDNAチップGenome-Wide Human SNP Array 6.0(Affymetrix社)を用いたジェノタイピングを実施、本年2月に終了した。対象141検体のうちCall rate 97%以上の結果が得られたものは127検体であり、タイピング成功率は90%であった。このデータをアレル頻度、Hardy-Weinberg平衡、SNP Call rate等でフィルタリング後、対照群600例と比較するゲノムワイド関連解析のための統計学的解析を現在実施中である。本年度は、ここから抽出されたSNPを異なったサンプルセットを用いて、当教室で開発した新規ジェノタイピング法DigiTag2によるreplication studyを実施し感受性多型を同定する。変形性膝関節症は、関節軟骨の変性と骨棘形成に特徴づけられる関節疾患で、わが国では65歳以上の高齢者の22%が変形性膝関節症に罹患していると考えられ、高齢社会の進展と相まってその患者数は増加の一途をたどっている。本疾患は環境要因と遺伝的素因が組み合わさって発症する多因子性疾患と考えられており、この疾患の遺伝的素因を解明するため、3,040名の参加者から構成される住民コホートから採取した検体を用いて主に血縁者を対象とした遺伝子解析を行った。ここから141例を抽出した。90万箇所のSNP(-塩基多型)及びほぼ同数箇所のCNV(コピー数多型)に対応するマーカーが搭載されているDNAチップGenome-Wide Human SNP Anay 6.0 (Affy metrix社)を用いたジェノタイピングを昨年度終了した。このデータをアレル頻度、Hardy-Weinberg平衡、SNP Call rate等でフィルタリング後、対照群600例と比較するゲノムワイド関連解析を行った。ここから抽出されたSNPを異なったサンプルセットを用いて、当教室で開発した新規ジェノタイピング法DigiTag2によるreplication studyを実施し感受性多型を同定し、候補遺伝子領域を確認、高密度タイピングを実施中である。

本疾患は環境要因と遺伝的素因が組み合わさって発症する多因子性疾患と考えられており、この疾患の遺伝的素因を解明するため、3,040名の参加者から構成される住民コホートから採取した検体を用いて主に血縁者を対象とした遺伝子解析を行った。ここから141例を抽出した。90万箇所のSNP(一塩基多型)及びほぼ同数箇所のCNV(コピー数多型)に対応するマーカーが搭載されているDNAチップGenome-Wide Human SNP Anay 6.0(Affymetrix社)を用いたジェノタイピングを昨年度終了した。対象141検体のうちCall rate97%以上の結果が得られたものは127検体であり、タイピング成功率は90%であった。このデータをアレル頻度、Hardy-Weinberg平衡、SNP Call rate等でフィルタリング後、対照群600例と比較するゲノムワイド関連解析を行った。ここから抽出されたSNPを異なったサンプルセットを用いて、当教室で開発した新規ジェノタイピング法DigiTag2によるreplication studyを実施した。また、候補遺伝子アプローチによる変形性膝関節症感受性遺伝子の同定を行った。
胎児横隔膜ヘルニアにおける肺血管のリモデリング解析と胎児治療モデルの作成

胎児診断の普及と超音波診断技術の普及に伴い、横隔膜ヘルニア(以下CDH)の胎児診断例は増加し、生直後より専門施設でのintensive careが行われている。しかし、現状では胎児診断されたCDHの予後は一般的に不良であり、胎児診断の恩恵を受けていない。この理由として胎児診断のCDH予後不良例の肺は極めて未熟であり、肺低形成および血管平滑筋の肥厚による肺高血圧の2つの重篤な病態を伴っている。近年の分子生物学的研究により、肺血管の発生とremodelingの過程に関わる遺伝子: VEGF, angiopoietin, ephrinが解明され、肺血管形成の過程とこれに関わる遺伝子の発現が分かってきた。更に、肺血管トーヌスを司る遺伝子としてendothelinが関与していることが判明した。nitrofen経口による胎仔CDHモデルラットを用い、胎仔CDHモデルにおける肺血管構築に関わる遺伝子ephrin、肺血管トーヌスをコントロールする遺伝子: endothelinの発現を解析する。更に各antagonistを用いて、出生後の効果的な肺高血圧を予防し、新たなCDH胎児治療が可能か検討を行う。実験法:横隔膜ヘルニアラット(CDHラット)の作製:妊娠(GA)9日のラットにNitrofen 100mg/1ml olive oilを経口投与する。コントロールとして、olive oilのみ経口したものをC群とする。G17、19、21日目に帝王切開にて胎仔を摘出。GA-17、19、21日目の胎仔は、顕微鏡下に横隔膜ヘルニアの有無を確認後、胎仔肺を摘出し、CDHが形成されなかった群:CDH-群、CDHが形成された群:CDH+群に分類する。C群、CDH-群、CDH+群の肺組織からcDNAを作成した。結果考案Ephrin B2は、肺血管構築に早期に関わり、A1は胎生後期に発現し、発現部位では、B2は肺動脈、A1は肺胞上皮に発現すると報告されている。モデルラットの解析では、A1,B2共に発現量の差を、C群、CDH-群、CDH+群のGA17、19、21日目の各肺組織で認めなかったことから、横隔膜ヘルニア、Nitrofenによる影響を共に受けない事が示唆された。これは、ephrin自体が肺組織の基本構造に関与する遺伝子であり、肺低形成や肺血管壁の肥厚に関与していない事が示唆された。【目的】ラットCDHモデルを用いて肺血管形成、トーヌスに関与する遺伝子の発現を解析し、胎児肺動脈壁肥厚の抑制が可能か検討する。【方法2】妊娠ラットにNT投与後、GA1519までPD 100mg/kgを経口投与(PD群)し、対照は生食のみ投与した。この他NTを投与しない群を正常群とした。GA20に肺組織を摘出後、肺動脈壁の肥厚とVEGFの発現量を比較した。【結果2】肺血管壁の肥厚は、対照群に比べPD群で優位に抑制され、正常群に近い状態であった。VEGFの発現量も対照群、正常群に比べPD群で優位に高値であった。【まとめ】CDHにおける肺動脈壁肥厚にはET1、ET receptorの発現量増加が大きく関与していると考えられ、antagonist投与により優位に壁肥厚が抑制されたことから、新たな胎児治療の可能性が示唆された。【方法2】妊娠ラットにNT投与後、GA1519までそれぞれPD50,100mg/kgを経口投与(PD50群、PDIOO群)し、対照は生食のみ投与した。【結果2】肺血管壁の肥厚は、対照群に比べPD50/100群で優位に抑制された。VEGFの発現量も対照群、正常群に比べPD50/100群で優位に高値であった。【まとめ】CDHにおける肺動脈壁肥厚にはETI、ET receptorの発現量増加が大きく関与していると考えられ、antagonist投与により優位に壁肥厚が抑制され、今後他のantagonistによる検討を行う予定である。【結果1】CDH群では対照群と比較し、GA21でangiopoietin-1の発現量が優位に低下していたが、VEGF、angiopoietin-2、ephrinA1,B2、PDGFb、各receptorの発現量は各GAで差を認めなかった。ET1はGA21、ET1 receptorA,BはGA19,21においてCDH群で優位に発現量の増加を認めた。この結果からCDHでは胎児肺動脈壁肥厚にET1が大きく関与していることが考えられ、ET1 receptor antagonist : PD156707(PD),Bosentan,ATZを用いて肺動脈壁厚に及ぼす影響を検討した。【結果2】肺血管壁の肥厚は、対照群に比べPU,Bos,ATZ群で優位に抑制された。VEGFの発現量も対照群、正常群に比べPD,Bos,ATZ群で優位に高値であった。【まとめ】