hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アフリカにおける集団簡易減酒プログラムの開発と長期的効果の検証

本研究は、個人対象簡易減酒プログラムの質的評価結果をふまえて、集団を対象とした簡易減酒プログラムを地域住民(当事者)と共に開発し、その中長期的評価を検証することを目的に計画した。今年度は、昨年度実施した聞き取り調査の分析と、それを踏まえて、集団簡易減酒プログラムを作ること、及びその実施であった。聞き取りの内容を分析したところ、プログラムの効力が中長期的に継続するためには、環境や、経済的な問題が大きいこと、一時的な減酒につながっても、継続するためには、その後の当事者のおかれる環境が大きく影響しているということがわかった。また、調査対象者の、ハイリスク飲酒者の中には、生活のために自らもしくは家族が酒を醸造し、販売しているという状況にある人が複数存在し、その収入によって生活が成り立っている状況のため、単に一般的な減酒プログラムを実施することで、効果を得ることは、非常に難しいということがわかった。これらの地域及び、対象者の特性を踏まえた、効果的な介入プログラムの開発について、地域住民の声を反映させていくことに、非常に時間を要した。また、生活のために、違法酒を醸造、販売している状況にあり、本来であれば、それに変わる経済活動を考えプログラムに組みこむことが本当の意味での持続可能なプログラムになるのではないかと考えられたが、今回の介入プログラムでは、就職支援や就職に繋がる技術の習得支援など、違法醸造酒の販売に変わる経済活動のために支援をプログラムに組むことは、難しいという判断になった。しかしながら、今後考えていかなければならない重要な課題であると考える。第一段階で実施した聞き取り調査の分析から、違法アルコールを醸造、販売する住民の背景や、飲酒にいたる背景、減酒や断酒に至ってからの対象者を取り巻く環境が明らかになり、第二段階の、そのことを考慮する減酒プログラムの開発に時間を要したため、今年度実施予定であった、第三段階であった介入調査が、予定通りできなかったため。当初は、平成30年度に実施予定であった、第3段階にあたる介入調査を実施する。本研究は、第一段階として個人対象簡易減酒プログラムの質的評価の実施、第二段階としてその結果を踏まえて、集団を対象とした簡易減酒プログラムを地域住民とともに開発し、その中長期的効果について検証することを目的とし、研究を計画した。質的評価は、第二段階の集団を対象にした簡易減酒プログラムの開発にあたり、非常に重要であり、前回の研究で実施した地域の飲酒特性、及び文化的背景を考慮してさらに地域で持続可能な減酒プログラムとして発展させるために有益な情報となる。研究開始初年度は、研究の第一段階として、これまで実施してきた個人を対象にした減酒プログラムを質的に評価するため、プログラムに参加していた調査対象と、実際に介入者として参加者に簡易介入を実施したコミュニティーヘルスワーカー(CHW)に対しては、インタビューを、プログラムに参加した地域住民にたいしては、フォーカスグループディスカッション(FGD)を実施した。FGDは、1介入後の評価にて減酒に成功した参加者2介入後の評価にて変化がなかった又は、飲酒量の増加した参加者のグループに分かれて実施した。実際に、プログラムに関わったCHWからは、プログラムに介入者として関わって思ったこと、困難だと感じた点、成功したと感じた点、介入者として感じたこと、改善点などについて有益な情報をえることができた。現在、入力したデータをもとに、それぞれ主題分析と内容分析を行っている。引き続き分析と取りまとめ、内容を反映させた集団を対象にして簡易減酒プログラムの開発を進める予定である。データに関しては、収集できているが現在分析途中であるため。質的調査の分析完了し、その結果を元に集団簡易減酒プログラムの最終的なプログラムを計画、実施する予定である。

当初は、平成30年度に実施予定であった、第3段階にあたる介入調査を実施する。両替の際、為替の関係で、端数が残ったため。本来であれば、対象者のリクルート、ベースライン調査、介入を実施する予定であったが、予定が次年度実施に遅れたため。
光反応性マトリックスによる幹細胞凝集体に対する光形態制御技術の開発

本研究の目的は、細胞同士が“つく"・“はなれる"という細胞機能(細胞結合)を光加工する技術を確立することである。このため、本研究では、研究項目1光反応性マトリックスの合成、および研究項目2上皮ー間葉相互作用による光形態制御について検討する。平成30年度は、研究項目1に対して、メタクリレート基を導入したゼラチンなど、異なる光反応性マトリックスを合成し、その光反応性について検討した。その結果、紫外線照射により反応性を示すことがわかった。また、平成29年度に検討した磁性ナノ粒子を含有したハイドロゲルを用いたサンドイッチ培養法に対して、磁性ナノ粒子の磁気特性ならびに磁性ナノ粒子を安定にハイドロゲル内に固定化する方法について検討した。磁性ナノ粒子の表面をカルボキシ基を有する高分子で被覆後、ハイドロゲル内のアミノ基と共有結合を形成させることによって、磁性ナノ粒子をハイドロゲル内に固定化することができた。一方、研究項目2に対して、平成29年度と同様にイヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)を用いたサンドイッチ培養の検討に加えて、マウス小腸上皮由来の未分化細胞を用いた、腸オルガノイド培養系の確立を行った。この未分化細胞から細胞凝集体を形成させ、コラーゲンゲル内で培養することにより、腸オルガノイドが形成されることを確認することができた。以上により、マウスの胎児から細胞を都度単離する必要がなく、細胞凝集体から管腔状のオルガノイドを形成させる実験系を準備することができた。平成29年度に京都大学より異動し、研究環境の整備に時間を要したため少し計画が遅れていたが、マウスの胎児の細胞に代えて、マウス小腸上皮由来の未分化細胞を用いることによって、研究をより簡便に進めることができるようになった。このため、計画通り研究が遂行できる見込みであると判断している。光反応性マトリックスの合成を推進する。すなわち、細胞接着に関係する分子、形態形成に関するカドヘリンなどの高機能性をもつマトリックス分子に対して光反応性を付与する。得られた光反応性マトリックスを用いることによって、MDCK細胞あるいは小腸上皮由来の未分化細胞からなる立体組織の形態形成制御について検討する。これにより、研究目的の達成を目指す。平成29年度では、研究項目1について、コラーゲンをトランスグルタミナーゼを用いて架橋したハイドロゲルを作製した。得られたコラーゲンゲルについて、レオメーターを用いてハイドロゲルの動的粘弾性を評価した。想定したとおり、架橋度を変化させることによって、硬さの異なるハイドロゲルを得ることができた。光反応性マトリックスについては、反応条件などを検討しているところである。一方、研究項目2について、上皮細胞として株化されたイヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)を用いて、得られたコラーゲンゲル、あるいはコラーゲンを固定化したポリアクリルアミドハイドロゲル上で上皮細胞を培養できることを確認した。さらに、コラーゲンゲルを用いて、MDCK細胞をサンドイッチ培養することによって、MDCK細胞の形態が変化し、管腔状の細胞体を形成することを確認した。また、サンドイッチ培養を維持するために必要となる重りの代替法として、磁性ナノ粒子を含有したハイドロゲルを用いることにより、磁力によりサンドイッチ培養を可能とする技術を開発した。一方、上皮ー間葉相互作用を誘導するために、マウス胎児の皮膚からディスパーゼを用いて、上皮細胞、ならびに間葉系細胞を単離した。平成29年度に京都大学から東北大学へ異動となり、研究環境の整備に時間を要したため。

平成29年度に京都大学より異動し、研究環境の整備に時間を要したため少し計画が遅れていたが、マウスの胎児の細胞に代えて、マウス小腸上皮由来の未分化細胞を用いることによって、研究をより簡便に進めることができるようになった。このため、計画通り研究が遂行できる見込みであると判断している。光反応性マトリックスの合成について、研究進捗に若干の遅れが生じているため、平成30年度には、光反応性マトリックスに関する研究を重点的に推進する。また、より研究を推進するために、対象を毛組織に限定せず、かつマウスから単離する繁雑な作業を必要とする上皮ー間葉系細胞の組み合わせに加えて、MDCK細胞や腸上皮細胞など、実験が容易な様々な株化された上皮細胞を用いて研究を行う。光反応性マトリックスの合成を推進する。すなわち、細胞接着に関係する分子、形態形成に関するカドヘリンなどの高機能性をもつマトリックス分子に対して光反応性を付与する。得られた光反応性マトリックスを用いることによって、MDCK細胞あるいは小腸上皮由来の未分化細胞からなる立体組織の形態形成制御について検討する。これにより、研究目的の達成を目指す。
日本産タナイス目甲殻類のモノグラフを作成及びタナイス類の環境指標生物としての評価

日本産タナイス目甲殻類の分類学的研究を行い、モノグラフを作成すること及びタナイス類の環境指標生物としての利用の可能性を調査することが本研究課題の目的であった。日本近海のタナイス類の研究は遅れており、まずは分類学的研究を行うことが急務であった。昨年度に引き続いて、分類学的研究の成果をモノグラフシリーズの第3号と4号として出版した。これらの中で日本近海の深海域から21種を新種として記載を行い、5種を再記載した他、沖縄県阿嘉島の浅海域から2種を新種として記載した。また、阿嘉島臨海研究所を拠点にタナイス類の環境指標生物としての利用の可能性について研究を行った。水深約6メートルの砂地に無生物状態の砂を入れたセディメントトレイトラップを7週間設置して、トラップ内の砂にどのような種がどれだけの数移植するか調査した。同時に比較のためにトラップ設置場所周辺のかく乱されたエリアや自然状態のかく乱されていないエリアのタナイス類の種組成、種数についても調査した。その結果、住管を作らないタナイス(Parapseudes arenamans)と住管を作るタナイス(Paranesotanais longicephalus)が採集され、前者の方が後者よりも群集の再形成速度が速いことが示唆された。しかし、Parapseudes arenamansは群集再形成をはじめたばかりであり、本実験で設定した7週間は短すぎることが判明した。本研究の目的は2つある。1つは分類学的研究の遅れているタナイス目甲殻類の日本産モノグラフを作成すること、2つ目はタナイス類が環境指標生物となりうるかについて研究を行うことである。これまでに広島大学附属練習船豊潮丸の調査航海により集められた主に浅海域のタナイス目の分類学的研究を行った。さらに豊潮丸に2度乗船して自ら採集を行った。採集はソリネット、ドレッジ、ビームトロールによる底質サンプルの採取により行った。主に船上で実体顕微鏡を使ってタナイス目の拾い出しを行った後、70%から80%のエチルアルコールで脱水固定を行い、そのままエチルアルコール中に保存した。これまでに収集した標本と今回の採集調査によって新たに得た標本を実体顕微鏡下で鋭く尖らせた針を用いて解剖し、付属肢のプレパラート標本を作成して形態の詳細な観察を行った。描画装置を用いて図の作成を行い、記載論文2編を完成させた。その結果、アプセウデス亜目Apseudomorphaの2新種及びタナイス亜目Tanaidomorphaの7新種を日本近海より新たに報告した他、これまでに日本沿岸から知られていた種について再検討を行った。今回新種として記載した種は次の通りである:Holomachus toyoshious, Longipedis fragilis, Tumidochelia knighti, Mesotanaisbirdi, Leptognathia bamberi, Typhlotanais magdalensis, T.ohtsukae, Tanaella kommritzia, Chauliopleona hansknechti (Larsen & Shimomura 2006,2007)。また、タナイス目の環境指標生物としての評価を行うための実験準備を行った。実験は19年度に座間味村の阿嘉島臨海研究所で行う予定である。実験用の特殊なトラップの製作を行った。
硝酸還元酵素系遺伝子群を協同的に転写制御するDNA結合蛋白質:NarL・Fnr

大腸菌のような通性嫌気性菌では,嫌気条件になると嫌気呼吸系がその末端還元酵素に対する基質の酸化還元レベルの高い方から順次誘導される.まず,最初に誘導される硝酸呼吸系の遺伝子群(<nar>___ー全オペロン)のうち,硝酸輸送タンパク質と硝酸還元酵素系をそれぞれコ-ドしている<nark>___ーと<narCHJI>___ーの両オペロンの発現は,酸素欠乏に対応するFnrと,硝酸イオンの対する二成分制御系(NarXーL)のNarLの二つのDNA結合性制御タンパク質の活性型によって制御される.前者の制御タンパク質は両オペロンのプロモ-タ-の上流の特異的制御領域:嫌気ボックス(TTGATーATCAA),一方後者の制御タンパク質は同じく上流の特異的制御領域:硝酸ボックス(TACTCCTTAー)に結合する.これらの両制御タンパク質の認識するそれぞれの制御領域の構造特性,それら両制御領域によって認識される両制御タンパク質の構造特性,さらに両遺伝子の発現制御における両制御タンパク質の協同的な作用機構などを究明する目的で本公募研究はスタ-トした.申請初年度(平成2年)に計画した研究はほぼ順調に進行してきており,pT7プラスミドを用いてNarLとFnrの両制御タンパク質の各々の大量調製系を確立し,それら制御タンパク質の精製方法を種々検討してきた.現在,それら両制御タンパク質に対するDNA結合実験と抗体作製を行っている.また,硝酸イオンに対する二成分制御系でのセンサ-タンパク質(NarX)の自己リン酸化反応と制御タンパク質(NarL)へのリン酸基転移反応がオ-トラジオグラフィ-により確認された.さらに,NarLへのリン酸基転移に伴ってリン酸化される残基がアスパラギン酸残基であることを^<31>PーNMRで確認できた.従来,非常に困難な問題とされていた二成分制御系の制御タンパク質のリン酸化部位の同定が,この方法によって比較的簡単にできるようになった.大腸菌のような通性嫌気性菌では,嫌気条件になると嫌気呼吸系がその末端還元酵素に対する基質の酸化還元レベルの高い方から順次誘導される.まず,最初に誘導される硝酸呼吸系の遺伝子群(<nar>___ー全オペロン)のうち,硝酸輸送タンパク質と硝酸還元酵素系をそれぞれコ-ドしている<nark>___ーと<narCHJI>___ーの両オペロンの発現は,酸素欠乏に対応するFnrと,硝酸イオンの対する二成分制御系(NarXーL)のNarLの二つのDNA結合性制御タンパク質の活性型によって制御される.前者の制御タンパク質は両オペロンのプロモ-タ-の上流の特異的制御領域:嫌気ボックス(TTGATーATCAA),一方後者の制御タンパク質は同じく上流の特異的制御領域:硝酸ボックス(TACTCCTTAー)に結合する.これらの両制御タンパク質の認識するそれぞれの制御領域の構造特性,それら両制御領域によって認識される両制御タンパク質の構造特性,さらに両遺伝子の発現制御における両制御タンパク質の協同的な作用機構などを究明する目的で本公募研究はスタ-トした.申請初年度(平成2年)に計画した研究はほぼ順調に進行してきており,pT7プラスミドを用いてNarLとFnrの両制御タンパク質の各々の大量調製系を確立し,それら制御タンパク質の精製方法を種々検討してきた.現在,それら両制御タンパク質に対するDNA結合実験と抗体作製を行っている.また,硝酸イオンに対する二成分制御系でのセンサ-タンパク質(NarX)の自己リン酸化反応と制御タンパク質(NarL)へのリン酸基転移反応がオ-トラジオグラフィ-により確認された.さらに,NarLへのリン酸基転移に伴ってリン酸化される残基がアスパラギン酸残基であることを^<31>PーNMRで確認できた.従来,非常に困難な問題とされていた二成分制御系の制御タンパク質のリン酸化部位の同定が,この方法によって比較的簡単にできるようになった.
環境負荷を低減できるエココンクリートの開発

ポーラスコンクリートは,その特徴である多孔性によって種々の優れた特性を有している。吸音機能もその1つであり,近年では吸音機能に関する研究も次第に活発に行われてきており,本研究では,これまで道路交通騒音の低減が可能なポーラスコンクリートの開発を目的の1つとして,インピーダンス管による垂直入射吸音率のデータの収集や吸音壁の等価騒音レベル低減効果に関して,実験的な研究を行ってきている。ポーラスコンクリート壁を作製するにあたって用いた火山性軽量骨材のぼら,石灰石およびフェロニッケルスラグ(以下,FNSと記述)の3種類の骨材ならびに2種類の目標空隙率20%と30%が騒音低減効果に及ぼす影響を検討した。騒音低減効果の検討にあたっては,普通騒音計を用いて得られた1002000Hzの範囲の各1/3オクターブバンドの周波数の等価騒音レベルを用いている。また,壁供試体から抜き取った直径約100mmのコアに対して,インピーダンス管による垂直入射吸音率も測定し,吸音壁から得られた等価騒音レベルとの関連についても検討を加えている。得られた結果を要約すると以下のとおりである。(1)使用骨材別にみると,FNSを用いた壁の騒音低減効果が最も高くなった。これは粒径が他の骨材よりも小さいために空隙径が小さくなり,実際の空隙率も他の骨材の場合より低めになった影響と思われる。(2)FNSを用いた場合,特に1000HZ以上の周波数に対して,回折行路差の影響を上回る騒音低減が生じていることからも,FNSの吸音効果が高いといえる。(3)ぼらおよび石灰石を用いた壁の騒音低減効果がFNSほど大きくないのは,これらの壁の内部空隙を音が透過する影響によるものと考えられる。(4)ぼらおよび石灰石を用いた場合の垂直入射吸音率は,500Hz近傍で第1の吸音ピークが生じているが,この周波数域での壁の等価騒音レベルの低減量がそれほど大きくないことからも,壁内部の空隙を音が透過する影響があると考えられる。(5)同一骨材を使用した壁の空隙率の影響をみると,空隙率が小さい方が等価騒音レベルの減量は幾分大きくなる傾向が認められた。ポーラスコンクリートは種々の優れた機能を有している。その1つである吸音機能に着目し、近年ますます深刻化してきている道路周辺の騒音問題への対応に関する研究が活発になされ、ポーラスコンクリートの吸音特性も次第に明らかになってきているが、十分には解明されてはいない。そこで平成14年度では、南九州に広く分布する火山性軽量骨材で多孔質のぼらおよび石灰石を用いて作製したポーラスコンクリート供試体を2層構造とした場合において、1)同一空隙率や異なった空隙率を組み合わせたとき、2)同じ厚さや異なった厚さを組み合わせた場合で、重ね合わせた供試体間の空気層の厚さを変化させたときに、管内法によって得られた垂直入射吸音率について検討した。ついで、1層のポーラスコンクリート供試体に対して垂直入射吸音率を測定し、高い吸音率を示した供試体に対して、残響室吸音率測定法および斜入射吸音率測定法を用いて吸音率を求めて検討を加えた。

管内法による垂直入射吸音率測定法によって、2層構造としたポーラスコンクリート供試体の使用骨材の種類や空隙率、供試体厚さ、供試体間の空気層厚さが吸音率に及ぼす影響を調べた結果、4001000Hzでの吸音面積率は、ぼらを用いれば石灰石の場合よりも大きくなること、音源に直接面する前面供試体の空隙率が増大すれば吸音面積率も大となること、供試体厚さについては後面供試体の影響が大である、供試体間の空気層が厚くなれば吸音面積率が小さくなることなどが確かめられた。また1層構造の供試体の場合、残響室法による吸音率は垂直入射法の結果と大差はないが、斜め入射法による吸音率は残響室法より小さくなることなどが確かめられた。高い空隙率を有し、内部表面積が大きなポーラスコンクリートの吸音性状は近年の研究成果によって次第に明らかになってきてはいるが、いまだ十分とは言いがたい。そこで本研究では、粗骨材に石灰石および火山性軽量骨材のぼらをもちいて作製したポーラスコンクリートの吸音特性に関して、まず管内法垂直入射吸音率測定法によって、供試体表面に設けた凹凸の影響および供試体の乾湿状態の影響を実験的に検討した。その結果、平滑な表面よりも凹凸のある場合は吸音特性が向上することおよび供試体が乾燥状態にあれば湿潤状態の場合よりも吸音率が高くなることが確認された。次いで、実際面への適用を念頭において作製したポーラスコンクリート製吸音壁について、固定点音源から発生する騒音の吸収性状を検討したところ、吸音壁を設置することによって最大15dB程度の騒音低減効果があることや、500Hz以下の周波数に対してはあまり騒音レベルの低減効果はなかったものの、500Hz以上の周波数域では大きな低減効果があることが確認された。また、吸音壁が高く、騒音の計測高さが低い場合ほど騒音低減効果が大きいが、吸音壁の長さは吸音壁の高さほどには効果的ではないこともあきらかになった。さらに、日本道路公団の遮音壁設計要領を用いて、音源から騒音計測点までの回折行路差による騒音低減量を求めたところ、最も大きな差でも4dB程度であり、遮音壁と吸音壁との機能的な相違はあるものの、実験結果は設計要領による計算結果と比較的良く合致することが認められた。ポーラスコンクリートは,その特徴である多孔性によって種々の優れた特性を有している。吸音機能もその1つであり,近年では吸音機能に関する研究も次第に活発に行われてきており,本研究では,これまで道路交通騒音の低減が可能なポーラスコンクリートの開発を目的の1つとして,インピーダンス管による垂直入射吸音率のデータの収集や吸音壁の等価騒音レベル低減効果に関して,実験的な研究を行ってきている。本年度は,この研究の一環として,ポーラスコンクリート壁を作製するにあたって用いた火山性軽量骨材のぼら,石灰石およびフェロニッケルスラグ(以下,FNSと記述)の3種類の骨材ならびに2種類の目標空隙率20%と30%が騒音低減効果に及ぼす影響を検討した。騒音低減効果の検討にあたっては,普通騒音計を用いて得られた1002000Hzの範囲の各1/3オクターブバンドの周波数の等価騒音レベルを用いている。また,壁供試体から抜き取った直径約100mmのコアに対して,インピーダンス管による垂直入射吸音率も測定し,吸音壁から得られた等価騒音レベルとの関連についても検討を加えている。得られた結果を要約すると以下のとおりである。(1)使用骨材別にみると,FNSを用いた壁の騒音低減効果が最も高くなった。これは粒径が他の骨材よりも小さいために空隙径が小さくなり,実際の空隙率も他の骨材の場合より低めになった影響と思われる。
トランスジェニックマウスを用いたポリオウイルス感染防御機構の解析

経口免疫により賦与されるポリオウイルスに対する,粘膜免疫応答の成立機序について解析する事を目的として研究を行った。実験には,ポリオウイルスレセプター遺伝子を導入したトランスジェニック(PVR-Tg)マウスを用いた。PVR-T_1gマウスは,ポリオウイルスの経口感染が成立し難かった。原因としてはポリオウイルスレセプターのマウス腸管における発現が著しく弱いことが考えられた。そこで,PVR-Tgマウスの腸管で訓化を試み,I型の強毒株であるMahoney株に由来するMN341株を得た。MN341株は経口感染の後,体内伝播がみられ,脳内で増殖しPVR-Tgマウスを致死させ,LD50は10^<4.5>PFU/mouseであった。LP50値から,経口免疫ウイルス量を10^4PFU/mouse,攻撃ウイルス量は10^6PFU/mouseとし以下の実験を行った。一回のみ経口免疫を行ったPVR-Tgマウス群は,免疫7日後の攻撃ウイルス量による感染に対し100%の生存率を示した。二回または三回経口免疫群においても同様の成績が得られた。経口免疫を行ったPVR-Tgマウスは,ウイルスの体内伝播が阻止されていた。また非免疫と経口免疫PVR-Tgマウスに,攻撃ウイルス量を感染させ腸管局所におけるリンパ球のサイトカインmRNAの発現を比較したところ,経口免疫マウスでは,IL4,IL-5ならびにIL-6の発現が認められた。さらに経口免疫を行ったPVR-Tgマウスの血中ならびに糞便中の抗体を測定した結果,血中ではIgGおよびIgM,糞便中にはIgAおよびIgGクラスの特異抗体と中和抗体の上昇が認められた。以上の結果より,ポリオウイルスの経口感染に対する感染防御は,経口免疫により誘導されるIgAを主体とする腸管局所での粘膜免疫応答の誘導が重要であることが示唆された。経口感染の代表であるポリオウイルス感染症は、従来では秀れたモデル動物がなくその発症ならびに予防効果の機序に関する報告は少ない。近年ポリオウイルスレセプターを発現するトランスジェニックマウス(PVR-Tgマウス)が開発されこれらの問題を解明する有用なモル動物であると考えられている。本年度は、ポリオウイルスの経口感染に対する初期防御機序の解析ならびに経口生ワクチンの予防効果を検討し以下の知見を得た。初期感染防御では、抗CD8モノクローナル抗体処理PVR-Tgマウスでポリオウイルスの体内増殖がみられ致死的経過をみた。これらの結果からCD8^+細胞が重要な役割りを演ずるとの結論を得た。一方、生ワクチンの効果は、強毒株の致死量以下の感染あるいはワクチン株であるSabinI株の経口免疫によった。その結果、SabinI株では2回以上の経口免疫により、強毒株では1回の免疫でも充分な、強毒株に対する防御効果を認めた。これらのデーターは、ポリオウイルスに対する防御機構の解析と経口生ワクチンの作用機序が解明できると考えられる。経口免疫により賦与されるポリオウイルスに対する,粘膜免疫応答の成立機序について解析した.実験には、ポリオウイルスレセプター導入トランスジェニック(PVR-Tg)マウスを用いた.ポリオウイルスとしては,I型強毒株のMahoney株に由来するPVR-Tgマウス腸管で訓化したMN341株を用いた。MN341株は経口感染の後,体内伝幡がみられ脳内で増殖しPVR-Tgマウスを致死させ,LD_<50>は10^<4.5>

pfu/mouseであった。この結果から、経口免疫ウイルス量としては10^4pfu/mouse,攻撃ウイルス量は10^6pfu/mouseとし以下の実験を行った。一回の経口免疫を行ったPVR-Tgマウス群は,免疫後7日目の攻撃ウイルス量による感染に対しても100%の生存率を示し,経口免疫二回,三回群においても同様の成績が得られた。経口免疫を行ったPVR-Tgマウスでは,ウイルスの体内伝幡が阻止されていた.また,非免疫と経口免疫PVR-Tgマウスに,攻撃ウイルス量を感染させ腸管局所のリンパ球のサイトカインmRNAの発現を比較したところ,生存する経口免疫マウスでは,IL-4,IL-5ならびにIL-6の発現が認められた.さらに経口免疫を行ったPVR-Tgマウス血中ならびに糞便中の抗体を測定した結果,血中ではIgG,IgM,糞便中にはIgA,IgGクラスの特異抗体と中和抗体の上昇が認められた.以上の結果より,ポリオウイルスの経口感染に対する感染防御には経口免疫により誘導されるIgAを主体とする腸管局所での粘膜免疫応答の誘導が重要であることが示唆された.
黒潮影響域におけるウニと海中林の相互関係に関する生態学的研究

黒潮影響域で,バフンウニとムラサキウニの摂食圧がアラメ海中林の形成に及ぼす影響と季節的な海中林との関係を明らかにするために,和歌山県日ノ御崎沿岸の実験区において調べた。実験区におけるバフンウニとムラサキウニの密度は,5月から7月にかけて,淡水の過度の流入に起因した大量へい死により著しく低下した。大量へい死後,実験区にアラメの幼体が入植し,水温が平年よりも極めて高く推移したにもかかわらず,今まで潮間帯にのみ認められたアラメ群落が水深1mまで分布を拡大した。しかし,それ以深2mまでの有節サンゴモ群落においては,幼体は認められたが,成体に至らずに消失した。いずれのウニも殻径18mm以上で成熟した。バフンウニは成熟から産卵にいたる秋季から春季に,深所の有節サンゴモ群落から浅所の海中林形成域へと明瞭な深浅移動が認められた。バフンウニとムラサキウニの成長および生殖巣の発達が,生息する場所の海藻遷移の進行系列を反映するか否かを明らかにするため,7月に,和歌山県美浜町沿岸の水深2.0mと5.3mにおける小型海藻群落,御坊市沿岸のヒバマタ目褐藻群落とカジメ群落で調べた。小型海藻群落は2地点とも小形多年生海藻が優占し,現存量は0.6kg/m^2以下であった。ヒバマタ目褐藻群落の現存量はジョロモクが71%を占めて1.6kg/m^2,カジメ群落ではカジメが87%を占めて6.6kg/m^2と著しく高かった。バフンウニの1m^2当たりの密度は,浅所の小形海藻群落で10個体,ムラサキウニはヒバマタ目褐藻群落で18.7個体と高かった。両種の生殖巣指数は,ヒバマタ目褐藻群落が他の群落よりも高かった。バフンウニの成長は,ヒバマタ目褐藻群落とカジメ群落が小型海藻群落よりも速かった。しかし,ムラサキウニの成長はヒバマタ目褐藻群落が他の群落よりも速く,カジメ群落に対しても有意な差が認められた。極相をなすカジメとヒバマタ目褐藻群落とでウニ2種の成長に相違が認められたが,それらは途中相をなす小形海藻群落より明らかに成長が速く,生殖巣が量的に発達し,遷移の進行系列を基本的に反映すると結論された。ムラサキウニとバフンウニが同所的に分布する仕組みと海中林との相互関係を明らかにするために,和歌山県美浜町日ノ御崎沿岸の海図0mより潮下帯にかけて海底に固定した杭に沿って沖出し20mのラインを張り,ラインを中心に幅2m,合計40m^2の永久トランセクトを実験区とした。隔月毎に1m×1mの方形枠(合計40枠)を置き,枠内に生息するムラサキウニとバフンウニを採集して殻径を測定し,再び元の場所に放流した。

また,水深別に50×50cmの方形枠を置いて海藻を採集するとともに,枠毎のアラメの密度を記録した。大型多年生褐藻のアラメ群落は潮間帯にのみ形成され,幼体の出現は認められなかった。また,1月には,潮間帯で大型多年生褐藻ネジモクが約500g/m^2生育した。潮下帯はピリヒバやフサカニノテなどの紅藻有節サシゴモが優占した。出現したバフンウニは9月に殻径1214mmの前年に発生したほぼ単一の年級群から構成された。その密度は,9月から3月にかけて,いずれも40個体/m^2と著しく高く,秋季から春季にかけて,深所の有節サンゴモ群落から浅所のアラメ海中林形成域への明瞭な移動が認められた。この時期は,生殖巣指数(生殖巣重量×100/体重)がピークに達してから急激に下降する成熟期から産卵期に相当すると判断される。ムラサキウニは9月に殻径1620mmの満2歳群が優占し,11月には殻径10mm前後の前年の発生群も認められた。その密度は潮間帯を除いてバフンウニよりも低く,ほぼ10個体/m^2以下で推移し,密度に顕著な季節変化は認められなかった。また,生殖巣指数は5以下で極めて低く推移した。和歌山県日ノ御崎沿岸の40m^2の実験区で,前年度に引き続いてバフンウニとムラサキウニの鉛直分布と生殖巣の発達を植生と対応させて季節的に調べた。実験区におけるウニ2種は,淡水が過度に流入して塩分が21psuへと低下した6月に大量に死亡し,密度は著しく低下した。ウニの大量死亡後,アラメの幼体が入植し,生育に不適な水温が高い温暖な海況条件であったにも関わらず,今まで潮間帯にのみ認められたアラメが水深1mまで分布を拡大した。しかし,それ以深2mまでの有節サンゴモ群落においては,幼体は認められたが,成体には至らずに消失した。深所の海中林の形成はウニの摂食圧以外の要因で阻害されると判断された。組織学的な観察により,バフンウニの生殖巣はアラメ海中林において7月から10月の回復期を経て,12月から1月の成長期から成熟後期,そして3月の放出期へと移行した。ムラサキウニの生殖巣はアラメ海中林において5月から7月に回復期あるいは成長期から成熟後期あるいは放出期へと至り,10月には一部回復期の個体も認められて以後3月まで回復期が持続した。有節サンゴモ群落においては,両種の成熟への進行はアラメ海中林に比べて若干遅かった。いずれの種も殻径18mm以上のサイズで性成熟することが明らかになった。また,バフンウニが有節サンゴモ群落からアラメ海中林形成域へと深浅移動する秋季から春季は成熟から産卵にいたる時期であることが明らかになった。和歌山県西岸において,バフンウニとムラサキウニの成長および生殖巣の発達が,生息する場所の海藻遷移の進行系列を反映するか否かを明らかにするために研究を行った。7月に,和歌山県美浜町沿岸の水深2.0mと5.3mにおける小型海藻群落,御坊市沿岸のヒバマタ目褐藻群落とカジメ群落の合計4地点に50cm×50cmの方形枠を3枠置いて生育する海藻を採集し,種別の湿重量を測定して5生活形群(谷口1996)に分類した。同地点で1m×1mの方形枠3枠とその周辺でバフンウニとムラサキウニを各50個体以上採集した。採集したウニの殻径,体重ならびに生殖巣重量を測定し,生殖巣指数(生殖巣重量×100/体重)を求めた。また,加熱した生殖板の輪紋数から年齢を査定し,第5生殖板の最大横幅と各輪紋横幅を計測して年齢と殻径との関係を求めた。小型海藻群落は2地点とも小形多年生海藻が優占し,現存量は0.6kg/m^2以下であった。ヒバマタ目褐藻群落の現存量はジョロモクが71%を占めて1.6kg/m^2,カジメ群落ではカジメが87%を占めて6.6kg/m^2と著しく高かった。バフンウニの1m^2当たりの密度は,浅所の小形海藻群落で10個体,ムラサキウニはヒバマタ目褐藻群落で18.7個体と高かった。両種の生殖巣指数は,ヒバマタ目褐藻群落が他の群落よりも高かった。バフンウニの成長は,ヒバマタ目褐藻群落とカジメ群落が小型海藻群落よりも速かった。
花弁成長機構の解明と切り花品質向上への応用

本年度は採用期間の最終年度にあたるため、研究の総括に向けての追加実験、データ解析、学会および学会誌での発表を中心に行った。具体的には以下の4点である。1.昨年度得た抗体を用い、花弁中のエクスパンシンおよびXTHのタンパク質量の変動を調査した。両タンパク質はともに開花前の花弁ではごく微量しか蓄積しないが、開花直前から徐々に増加し始め、開花中に最大量の蓄積が見られた。この傾向はmRNA発現解析の結果と矛盾せず、開花時の花弁成長へのエクスパンシンおよびXTHの関与を強く示唆する重要な結果である。2.トルコギキョウ切り花に成長調節物質の処理を行った。ジャスモン酸メチル処理により、開花が促進され、同時にエクスパンシンおよびXTHのタンパク質量の増加も観察された。これは、エクスパンシンおよびXTHが自然状態での花弁成長のみならず、強制的に誘導された開花においても機能することを示唆しており、開花時の花弁成長におけるエクスパンシンおよびXTHの重要性をより一層示す結果である。3.より直接的に花弁成長への関与を証明するため、トルコギキョウにおいて両遺伝子のノックダウン形質転換体の作出を引き続き行った。現在までに37の系統が得られ、その内の23系統については順調に生育し、開花も確認された。形質転換体において開花速度の変化が確認された。現在は収集したデータの解析を行なっている。4.主要花卉であるバラにおいて効率的な形質転換方法の検討を行い、2種のバラで形質転換による標的遺伝子の発現抑制に成功した。この発現抑制は長期間持続し、標的遺伝子の機能解析に適した手法であることが確かめられた。5.花弁特異的プロモーターの利用については、発現解析により花弁で特異的な発現を示したエクスパンシンの遺伝子配列をもとにプロモーター領域の絞り込みを行っている。本年度は主にエクスパンシン及びXTHの花弁成長への関与の証明に向けての実験を行った。開花中の花弁よりエクスパンシン遺伝子及びXTH遺伝子のクローニングを行ったところ、3種類のエクスパンシン遺伝子と1種類のXTH遺伝子が得られた。これらはいずれも開花中の花弁で特に強く発現した。一般的にエクスパンシン及びXTHは細胞壁の伸展性を上昇させる働きを持つ。そこで、これらが機能するタンパク質であることを確認するために花弁の細胞壁の伸展性を開花ステージごとに測定した。その結果、伸展性は開花が進むに伴い上昇した。この変動はこれらの遺伝子の発現量の変動と一致した。また、これらのタンパク質を大腸菌内で合成しトルコギキョウの開花前の花弁切片に処理したところ細胞壁の伸展性の上昇がみられた。以上のことより、花弁で特異的に発現するエクスパンシン及びXTHは細胞壁の伸展性を上昇させる活性を持っており、その働きによって開花時の花弁の肥大がもたらされることが示唆された。また、このことより、エクスパンシン及びXTHの制御を通した開花速度のコントロールも期待できる。より直接的な証明を行うため、それぞれのエクスバンシン及びXTHについてトルコギキョウでのノックダウン形質転換体を作出している。現在までに合計17系統が得られ、その内の12系統についてはあと数カ月で開花するまでに成長している。これらのノックダウン形質転換体では花弁でのエクスパンシンもしくはXTHの働きが抑えられることで、花弁の細胞壁の伸展性の上昇が緩やかになり、ひいては開花速度の低下が想定される。この現象を捉えることはエクスパンシン及びXTHの制御を通した開花速度のコントロールを目指している本研究において非常に重要な位置を占める。より多くの系統で形態の変化を確認するために、今後も引き続き形質転換の実験を行う。本年度はエクスパンシン及びXTHの花弁成長への関与の証明に向けての実験およびバラへの遺伝子導入の実験を並行して行った。エクスパンシン及びXTHの開花現象への関与をより直接的に証明するために、これまでにクローニングした3種類のエクスパンシン遺伝子と1種類のXTH遺伝子について、それぞれRNAiの手法を用いたトルコギキョウのノックダウン形質転換体の作出を引き続き行った。遺伝的背景が完全には均一ではない園芸作物を用いているため、解析にあたっては十分な系統数を得ることが重要となる。本年度までに合わせて37系統が得られ、そのうちの多くの系統で順調な成育が見られる。また、花芽を付ける系統も着実に増加しており、それらについては順次解析を行っている。本研究は切り花での開花制御が最終目標である。エクスパンシンおよびXTHの抗体を切り花に外部から処理することによって、エクスパンシン及びXTHの制御を通した開花速度のコントロールが可能となることが予想される。そこで、これらのリコンビナントタンパク質をもとに抗体を作製した。現在、抗体精製を行っている段階であり、今後得られた抗体を切り花に対して処理することでその効果の確認を行う。また、本年度はバラへの遺伝子導入も試みた。バラは現状の技術では形質転換が困難であったが、ウイルスを媒介して遺伝子発現を抑制する手法を新たに用いることで、目的遺伝子の発現が抑制された個体を複数得ることに成功した。切り花において卸売数量が多いバラにおいて遺伝子の制御が可能となったことは、分子生物学的知見を切り花の育種に応用する選択肢が増えたことを示し、花卉産業への還元が大きく期待できる。

1.昨年度得た抗体を用い、花弁中のエクスパンシンおよびXTHのタンパク質量の変動を調査した。両タンパク質はともに開花前の花弁ではごく微量しか蓄積しないが、開花直前から徐々に増加し始め、開花中に最大量の蓄積が見られた。この傾向はmRNA発現解析の結果と矛盾せず、開花時の花弁成長へのエクスパンシンおよびXTHの関与を強く示唆する重要な結果である。2.トルコギキョウ切り花に成長調節物質の処理を行った。ジャスモン酸メチル処理により、開花が促進され、同時にエクスパンシンおよびXTHのタンパク質量の増加も観察された。これは、エクスパンシンおよびXTHが自然状態での花弁成長のみならず、強制的に誘導された開花においても機能することを示唆しており、開花時の花弁成長におけるエクスパンシンおよびXTHの重要性をより一層示す結果である。3.より直接的に花弁成長への関与を証明するため、トルコギキョウにおいて両遺伝子のノックダウン形質転換体の作出を引き続き行った。現在までに37の系統が得られ、その内の23系統については順調に生育し、開花も確認された。形質転換体において開花速度の変化が確認された。現在は収集したデータの解析を行なっている。4.主要花卉であるバラにおいて効率的な形質転換方法の検討を行い、2種のバラで形質転換による標的遺伝子の発現抑制に成功した。この発現抑制は長期間持続し、標的遺伝子の機能解析に適した手法であることが確かめられた。5.花弁特異的プロモーターの利用については、発現解析により花弁で特異的な発現を示したエクスパンシンの遺伝子配列をもとにプロモーター領域の絞り込みを行っている。トルコギキョウでの遺伝子導入個体の作出及びバラでの遺伝子導入系の確立には多くの労力と困難が予想されたが、両者において当初の計画以上の早い段階で実験の目処を立てることができたため。平成24年度は本研究の最終年度にあたり、また、各実験において実験材料の目処が立っているため、今後は得られたデータを集約および解析するとともに実験結果を補足する基礎的な実験を複数行うことを計画している。なお、本研究の成果は平成24年度中に複数の雑誌論文及び学会発表を通して発表することを予定している。
頭頸部骨化の鍵となる膜性骨が関与する「筋・腱・骨複合体」の組織構築機序の解明

顎顔面領域で舌や口腔底部、下顎周囲の腫瘍により下顎骨を切除した症例は、下顎の左右対称性が失われ、機能時にきわめて不安定な運動様相を呈する。現在、切除された下顎骨はチタンプレートと自家骨移植の併用などにより再建手術が行なわれているが、切離した筋と骨の再付着が困難なことから、咀嚼・嚥下障害などの術後合併症に悩む患者が多い。この問題を解決するために、顎顔面領域における筋付着部の再生に向けた、『筋-腱-骨複合体』の発生・組織構築メカニズムの基礎研究を進める必要がある。申請者はこの問題解決に向けて、頭頸部における筋の骨格への付着部位を『筋-腱-骨複合体』として1つの機能的単位として捉え、動力機能を獲得するメカニズムの解明を推進してきた。その結果、膜性骨が関与する特殊な『筋-腱-骨複合体』の組織構築メカニズムを見いだした。本申請により、1)膜性骨近傍に発生する腱芽細胞と筋芽細胞の初期付着機構、2)膜性骨と腱の付着メカニズムを解析し、頭頸部骨化の鍵となる膜性骨と、腱、筋の各コンポーネントがどのように連結して『筋-腱-骨複合体』を組織構築するのかを明らかにする。これにより、間葉系幹細胞から分化した筋、腱、骨が複合組織として再生し、顎骨再建手術により切離した筋付着部を再建できる新たな治療法開発の基盤構築を目指す。初年度において、「筋-腱-骨複合体」は骨化過程に依存して2つの発生過程を辿るのではないかと考え、胎生期マウス(C57BL6J)を経時的に観察した。発生初期において「筋-腱-骨複合体」は、軟骨、膜性骨に関わらず1転写因子であるSox9が陽性の腱・骨前駆細胞群と2筋特異的中間径フィラメントであるDesmin陽性の筋前駆細胞群の2種の細胞が接触することにより開始していた。しかし、胎生期マウスの発達にともない、軟骨と腱の接合部ではSox9が継続して発現するが、膜性骨と腱の接合部ではSox9の発現が減弱していることが明らかになった。膜性骨と腱の接合部ではSox9の発現が減弱したため、「膜性骨型腱-骨付着部の発生にSox9が必要なのか」という疑問が生まれた。これを明らかにするために現在、頭部神経堤細胞(腱と骨の起源)領域のSox9が欠失するマウスを作出中であり、膜性骨型腱-骨付着部におけるSox9の必要性を明らかにする予定である。免疫染色の抗体の検討(予備実験)がスムーズだったことから、抗体の購入本数が少なかった。そのため、本年度は差額が生じた。
光ラジカル化によるヌクレオチド関連酵素の活性機構の解明

結核菌のカタラーゼ-ペロキシダーゼ(KatG)酵素における酵素反応初期過程を時間分解電子スピン共鳴法で室温において観測した。KatG-アントラキノンスルフォン酸イオン(薬物)の複合体において、レーザー光照射による光誘起電子移動反応を観測し、メチオニンカチオンラジカルと電子受容した薬物のアニオンラジカルで構成されるスピン相関ラジカル対をナノ秒領域で観測することに成功した。この薬物はKatGヘムポケット内部に存在し、近傍のヘム、トリプトファン、チロシン残基を介して高速の電荷分離過程が起こっていることが明らかになった。結核菌のカタラーゼーペロキシダーゼ(KatG)酵素における酵素反応初期過程を時間分解電子スピン共鳴法で室温において観測した。KatG-アントラキノンスルフォン酸(薬物)の複合体において,レーザー光照射による光誘起電子移動反応を観測し,メチオニンカチオンラジカルと電子受容した薬物のアニオンラジカルで構成されるスピン相関ラジカル対をナノ秒領域で観測することに成功した。得られた測定結果から,この薬物はKatGヘムポケット内部に存在し,近傍のヘム,トリプトファン,チロシン残基を介して高速の電荷分離過程が起こっていることが示唆された。これまで,77KにおけるKat酵素反応中間体の電子スピン共鳴測定では,ヘム近傍のチロシン残基が酵素反応によってラジカルとなっていることが報告されている。今回の光ラジカル化による時間分解電子スピン共鳴測定の結果から,室温では,酵素反応においてメチオニンが酸化されることを示した。以上のことから,本酵素反応機構を明らかにする上で極めて重要な結果が得られたと考えている。さらに,電子スピン共鳴スペクトルから,メチオニンラジカルにおける立体構造,ラジカル対の相対分子配向,ラジカル間の距離および交換相互作用を決定しヘムポケット内部における薬物分子の位置や電子的相互作用を見積もることに成功した。これらの情報は,酵素によって認識される薬物やアミノ酸の位置や構造,立体配置を決定するために有用である。KatG-アントラキノンスルフォン酸(薬物)の複合体において、レーザー光照射による光誘起電子移動反応を観測し、メチオニンカチオンラジカルと電子受容した薬物のアニオンラジカルで構成されるスピン相関ラジカル対をナノ秒領域で観測することに成功した。得られた測定結果から、この薬物はKatGヘムポケット内部に存在し、近傍のヘム、トリプトファン、チロシン残基を介して高速の電荷分離過程が起こっていることが示唆された。これまで、77KにおけるKat酵素反応中間体の電子スピン共鳴測定では、ヘム近傍のチロシン残基が酵素反応によってラジカルとなっていることが報告されている。今回の光ラジカル化による時間分解電子スピン共鳴測定の結果から、室温では、酵素反応においてメチオニンが酸化されることを示した。以上のことから、本酵素反応機構を明らかにする上で極めて重要な結果が得られたと考えている。さらに、電子スピン共鳴スペクトルから、メチオニンラジカルにおける立体構造、ラジカル対の相対分子配向、ラジカル間の距離および交換相互作用を決定しヘムポケット内部における薬物分子の位置や電子的相互作用を見積もることに成功した。これらの情報は、酵素によって認識される薬物やアミノ酸の位置や構造、立体配置を決定するために有用である。
印欧語史的形態論研究の最前線：動詞語幹形成母音の起源

アナトリア諸語に保存されている古い言語特徴に基づいて、印欧語動詞にみられる語幹形成母音の起源という未解決の問題に対して妥当な歴史的説明を与える。アナトリア以外の語派にみられる語幹形成母音*-e-*-o-の交替は、アナトリア語派が印欧祖語から離脱した後、他の語派がなおひとつの言語共同体としてまとまっていた時期に音変化によってつくられたと考えられる。この見方をより実質的にするために、この音変化が作用した時期および喉音(laryngeal)が隣接母音の音色に変化を与えた時期について詳細な分析を試みる。
本邦におけるデバイスラグの発生要因の探索と審査迅速化対策の効果に関する検討

「デバイスラグ」とは日本で医療機器の薬事承認が欧米よりも遅れることである。デバイスラグの要因として開発相談・審査体制が不十分であることや審査基準が不明瞭であることが指摘されてきた。このため、医療機器審査の迅速化対策として、開発相談・審査体制の拡充および審査基準の明確化の推進などの対策が導入されてきた。しかし、未だにデバイスラグが改善していない疾患分野が存在する。本研究では、日米間のデバイスラグの発生要因や医療機器審査の迅速化対策の効果を分析する。本研究において、医療機器の早期承認の障害となっている原因を明らかにし、デバイスラグ解消の対策を立案するための基盤となる知見を発信することを目指す。
新たな前立腺癌治療の可能性の探索‐グルココルチコイド受容体発現意義の解明‐

本年度は、ヒト前立腺癌培養細胞株におけるグルココルチコイド(デキサメタゾン)添加による細胞増殖への影響およびGRの発現を検討した。また、ヒト前立腺癌組織(51例)におけるGRの発現状況を免疫組織化学にて評価した。培養細胞実験では、アンドロゲン依存性株LNCaPとアンドロゲン非依存性株DU145を用いた。予備検討でGRのmRNAはLNCaPでは発現しておらず、DU145では発現していることが確認されている。10nM、100nMのデキサメタゾン添加によりDU145の有意な増殖促進が認められ、LNCaPでは有意な差はなかった。GRのmRNA発現はDU145では有意に低下し、タンパクレベルでも顕著に低下した。LNCaPではmRNA発現はわずかに検出される程度で有意差はなく、タンパクは検出自体されなかった。また、デキサメタゾン添加によりLNCaPのARとPSAの発現が上昇した。ヒト前立腺癌組織における免疫組織化学での検討では、正常上皮、癌細胞、周囲間質それぞれにGR発現が認められた。癌細胞でのGR発現をGleason score、pT分類、年齢、PSA、Ki-67それぞれと比較したところ、いずれも有意差は確認されなかった。これらの結果から、グルココルチコイドは、GRを発現している前立腺癌細胞の増殖や遊走に影響を及ぼしており、またそのGR発現はグルココルチコイドによりdown regulationを生じることが考えられた。一方、GRの発現がない前立腺癌細胞でもグルココルチコイドがGR以外の経路でアンドロゲン関連因子の発現に関与している可能性が示唆された。初年度中にヒト組織を用いた検討を行う予定であったが、研究設備の関係上、先に培養細胞を用いた検討を始めた。その後ヒト組織の検討を始めたが、GRの検討までに留まっており、その他の免疫組織化学的検討が遅れている。しかしながら、培養細胞を用いた検討は概ね順調に進められている。ヒト組織の症例数を増やしてGRの免疫組織化学による詳細な解析を継続し、ステロイド合成・代謝関連酵素などの発現程度を確認し、個々のヒト前立腺癌組織の性質を評価する。培養細胞においてはmRNAレベルでステロイド合成・代謝関連酵素の発現程度を確認し、PCRArray解析を行い、必要に応じてバリデーション、タンパク発現を確認する。アンドロゲン依存・非依存性などにも着目しながら、グルココルチコイドと前立腺癌の病態との関連を更に検討し、ヒト前立腺癌組織と培養細胞実験における比較・検討を行い、総合評価を目指す。初年度予定していたPCR Array(QIAGEN)解析が出来なかった。その分を見込んでいた金額を次年度に繰り越す。DU145、LNCaPのデキサメタゾン添加また、ヒト組織のPCR Arrayによる解析検討を行う。
高輝度放射光によるアクチンミオシン三次元分子動態と心筋心室マクロ動態の統合解析

本研究はSpring-8の放射光を用いて、摘出心筋および丸ごとの心臓におけるアクチンとミオシンの相互作用の1心周期内での経時的解析を目的とした。高輝度放射光施設(Super Photon Ring 8 GeV : SPring-8)に既設の装置を使用し、BL45XUにX線エネルギー12.4keV;波長1Aの小角散乱のセットアップを組んだ。X線回折像の記録には、X線イメージインテンシファイアと冷却CCDカメラを用いた。心室の撮影にはBL45XUよりX線エネルギーの高いBL40XUを使用した。カメラ長は3mとし、X線エネルギーは16keVとした。X線強度はフロントエンドスリットの幅により適切な水準に制御した。サルコメア長はレーザ回折サルコメア長計測装置により計測し、アクチン・ミオシンの側方間隔と対比し分子レベルとミクロレベルの統合性を検討した。ラットの右室乳頭筋の摘出潅流標本に放射光を照射して赤道反射を得た。それの(1,0)/(1,1)比からミオシンヘッドのアクチンヘの移動量(クロスブリッジ形成量)を計測した。等尺性収縮および等張性収縮でサルコメア長の変化および後負荷の変化によりアクチン・ミオシン分子間の相互作用がいかに変化するかを明らかにした。また、等容性収縮を行っているランゲンドルフ灌流心の心室壁各部位にX線を照射して、X線回析像を得た。等尺性収縮では心筋長の長いほど、ミオシンヘッドのアクチンヘの移動量は多かったので、クロスブリッジ形成量がStarlingの心臓の法則の分子的基盤であることが明らかなった。等張性収縮でも、発生張力が大きいほどクロスブリッジ形成量が大きかった。しかし、後負荷水準がある量より少ないと等尺性収縮時の同一張力発生時よりミオシンヘッドの移動量が少ないと言う興味ある所見が得られた。一心周期内の等容収縮心における発生圧はミオシンヘッド移動量と同一方向の変化を示した。心室壁への照射による回折像は内壁側、壁中央、外壁側で異なり、丸ごとの心臓における1心周期内の分子配列を解析可能であった。ラットの心臓を摘出してBMD潅流停止心の右室より乳頭筋を単離し、制御装置に保持した。酸素化したタイロード液で灌流し、電気刺激により等尺収縮をさせ、発生張力を計測した。Spring-8のBL45XU放射光により心筋のアクチン・ミオシンに由来する(1,0)と(1,1)の回折像を得た。これと同時に、HeNeレーザを乳頭筋に照射し、サルコメアによる回折像の0次と1次の間隔よりサルコメア長を計測した。静止時のサルコメア長と収縮タンパクの格子間隔の間には、下に凸な放物線状の逆相関関係が認められたが、詳しく調べると体積が完全に一定とはいえず、サルコメア長の増減により格子から水が少量出入りしていることがわかった。等尺収縮時張力の1心周期内変化は、張力発生にミオシンからアクチンへの質量移動が先行し、張力が減少する収縮後半ではその逆に跳梁区減少がアクチンからミオシンへの質量移動に先行した。