hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋生物毒の薬理学的研究

著者らは、毒性の最も強い海洋毒マイトトキシン(MTX)が興奮性細胞において電位非依存性カルシウムチャンネルを活性化することを世界に先がけて明らかにした。本研究では、非興奮性細胞であるウサギ血小板およびヒトアストロサイトーマ細胞を用いて、MTXの作用をさらに詳細に検討した。MTXは、外液カルシウム依存的な非血小板凝集作用を示すが、この作用は電位非依存性カルシウムの活性化を介すること、ホスホリパーゼC (PLC)の活性化と関連を有することを明らかにした。また、アストロサイトーマにおいてもMTXはPLCを活性化するが、この作用にはチロシンキナーゼが関与しており、細胞内へのカルシウム流入と異なる重要な機構が介在していることが明らかとなった。これらの結果は、非興奮性細胞においてもMTXの結合部位が存在することを示しており、その分子的実態の解明が望まれる。渦鞭毛藻の新規有毒成分ズ-ザンテラトキシン(ZT-A)は、外液カルシウム依存性の血小板凝集作用を示す点はMTXと類似している。しかし、ZT-Aがアラキドン酸カスケードを活性化してTXA_2の生成を促進させることにより、凝集を起こす点は、MTXと大きく異なっている。これらのZT-Aの作用を分子レベルで詳細に解析を行なったところ、ZT-Aによりmitogen-activated protein kinese (MAPK)が活性化され、42kDaの蛋白質がリン酸化されてホスホリパーゼA_2の活性化、TXA_2の遊離の促進が起こることが明らかとなった。ZT-Aはイオン動態の制御機構を解明するtoolとして有用であると思われる。ホヤの成分ユ-ジストミン類は、筋小胞体からカルシウム遊離を引き起こすが、これらの化合物の構造活性相関を明らかにした。さらにその結合部位の生化学的性質を検討し、これらの化合物が、カルシウム動態の研究に有用な試薬であることを明らかにした。1.マイトトキシン(MTX)の作用を非興奮性細胞であるウサギ血小板を用いて検討した.MTXは用量依存的かつ外液カルシウム依存的に血小板凝集,ATP放出並びに形態変化を引き起こした.この作用は電位依存性カルシウムチャネル阻害薬であるベラパミル,ニフェジピンによって阻害されなかったが,プロカインは凝集速度を低下させた.また走査型電子顕微鏡でMTXによる血小板活性化時の形態を観察したところ,血小板に存在するトロンボキサンA2受容体を刺激した活性化時に見られるものとはその形態を異にしていた.一方,ヒトアストロサイトーマ細胞を用いてMTXによるホスホリパーゼC活性化を検討した.MTXはホスホリパーゼCを極めて強く活性化し,受容体刺激による活性化の3倍以上の効力を示した.MTXによるホスホリパーゼC活性化は外液カルシウムに依存しており,また受容体作動性カルシウムチャネル遮断薬のSK&F96365によって抑制を受けた.これらの結果は,非興奮性細胞においてもMTXが作用を示す様なカルシウムチャネルが存在することを示しており,その実態の解明が望まれる.2.ズーザンテラトキシンB(ZT-B)の作用をウサギ大動脈平滑筋を用いて検討した.ZT-Bは用量依存的かつ外液カルシウム依存的に平滑筋を強く収縮させた.しかし,その作用はMTXとは異なり,ベラパミルやニフェジピンによって一部抑制を受けた.従って,ZT-Bの作用発現には電位依存性カルシウムチャネルを介したカルシウム流入が関与していることが示された.またZT-Bにより細胞内ナトリウムの増加とカリウムの減少が起きた.

この変化がZT-Bによる平滑筋収縮に果たす役割は明らかではないが,ZT-Bの作用がNa/K-ATPase阻害剤であるウアバインによって増強されることを考え併せると,これらイオンの変化がZT-Bの作用発現に何らかの寄与を持つものと思われる.今後細胞内カチオンと収縮力の同時測定を用いて更に検討を加える予定である.3.ユージストミン類は海産動物ホヤから単離したカルボリン骨格を持つ一連の化合物であるが,抗腫瘍及び抗ウイルス活性を示した.現在その作用と構造活性との相関について解析を行なっている.マイトトキシン(MTX)の作用を非興奮性細胞であるウサギ血小板およびヒトアストロサイトーマを用いて検討した。MTXの作用の特徴は外液カルシウム依存的であることであり,カルシウムチャネルの開口とともに,ホスホリパーゼC(PLC)の活性化をもたらした。ヒトアストロサイトーマ細胞を用いて.MTXによるPLC活性化機構を詳細に検討した。MTXによるPLC活性化は受容体刺激による活性化の3倍以上の効力を示し,MTXはPLCの極めて強い活性化薬といえる。一方,MTXによるPLC活性化は細胞内カルシウムキレーターであるBAPTAによって影響を受けず,細胞内へのカルシウム流入とは別の経路で起こることが明らかになった。さらに,チロシンキナーゼ阻害薬であるゲニステインによって抑制されることから,PLC活性化にはチロシンキナーゼの介在が想定される。以上の結果は非興奮性細胞でもMTXの結合部位が存在することを示しており,その実態の解明が望まれる。ユ-ジストミン類は海産動物ホヤから単離したカルボリン骨格を持つ一連の化合物であるが,カフェイン様の小胞体からのカルシウム遊離を引き起こす。このユ-ジストミンをリ-ド化合物として合成されたメチルベッドおよびその類縁体がカルシウム遊離を修飾するとともに生体のいくつかの臓器に結合活性を持つことが明らかになった。ズ-ザンテラトキシンA(ZT-A)は血管収縮を引き起こす海洋微生物由来の活性物質であるが,その血小板機能に対する作用を検討した。ZT-Aは強力に血小板凝集を惹起したが,その凝集は外液カルシウム依存的でありMTXと類似した。しかし,シクロオキシゲナーゼ阻害薬のインドメタシンあるいはトロンボキサンA_2(TXA_2)受容体阻害薬であるSQ29548によってZT-Aによる凝集は強く阻害され,ZT-Aはアラキドン酸カスケードを活性化する結果TXA_2の生成を介して血小板凝集を惹起していることが明らかになった。ZT-Aによるアラキドン酸カスケード活性化機構について現在検討中であり,チロシンキナーゼおよびマップキナーゼの介在が想定される。海洋微生物由来の新規活性物質であるズ-ザンテラトキシンA(ZT-A)の血小板機能に対する作用を検討した。ZT-Aは強力に血小板凝集を惹起したが,その凝集は外液カルシウム依存的でありマイトトキシンと類似した。しかし、シクロオキシゲナーゼ阻害薬のインドメタシンあるいはトロンボキサンA_2(TXA_2)受容体阻害薬であるSQ29548によって、MTXの凝集は抑制されないのに対して、ZT-Aによる凝集は強く阻害され,ZT-Aはアラキドン酸カスケードを活性化する結果TXA_2の生成を介して血小板凝集を惹起していることが明らかになった。
レプトンの世代混合と質量行列の系統的研究

本研究は、太陽ニュートリノ実験、大気ニュートリノ実験、加速器ニュートリノ実験、原子炉ニュートリノ実験のデータを検討し、レプトンの世代混合を質量行列のモデルで系統的に研究するものであった。このテーマに関して、以下のような研究成果が得られた。1.超対称性標準モデルでは、繰り込み群によってニュートリノのフレーバー混合がGUTスケールからEWスケールの間でかなり大きく変化する。たとえば、GUTスケールで第2世代と第3世代の混合角がsinθ【greater than or equal】0.27であるならば、繰り込みの効果によって、大気ニュートリノの異常を説明できる混合角の大きさがEWス2.ニュートリノの質量に階層性があると仮定した場合、大気ニュートリノ異常の実験とLSNDにおける実験結果を同時に説明することができる質量行列のモデルは、CHORUS/NOMADでのニュートリノ振動は観測されないことを予言する。すなわち、CEORUS/NOMAD実験でニュートリノ振動が観測された場合、大気ニュートリノ異常の実験またはLSNDにおける実験結果のいずれかが間違いであることが判明する。3.ニュートリノの質量を説明するZeeモデルは、大気ニュートリノ異常とLSNDの実験を再現する。その時、CHORUS/NOMAD実験でのニュートリノ振動は小さくて観測できない。このモデルにsterileニュートリノν_sを加えることにより、太陽ニュートリノ問題が解決できる。4.ニュートリノ振動におけるCP対称性の破れは、Long Baselineの実験で観測される可能性がある。この場合、地球の物質効果が重要になるが、第3世代と第2世代のニュートリノの質量が1eV程度であればその効果は小さい。しかし、第2世代のニュートリノの質量が0.1eV程度であるならば、この効果は大きくなりCP対称性の破れの実験に深刻な影響をおよぼす。クォーク質量行列を一般的な形で、KM行列のUnitarity三角形にやきなおし、実験的比較が可能であるようにした。この研究は、レプトンの質量行列に転用できると考えられる。さらに、くりこみ群によるGVTスケールからEWスケールまでのレプトン混合の変化を定量的に調べ、Flavor Mixingが大きくなる条件を解明した。現在、加速器や原子炉の実験データを整理し、将来、実験で、flavor Mixingがどのように決定されるかを、検討中である。とりわけ、日本の実験グループが参加しているCERNのCHORVSの実験結果がニュートリノの質量行列の形を決めるのに重要な役割を果たすことを明らかにしつつある。ひきつづき、この問題は検討される。これまでSee-Sawメカニズムの研究が中心であったが、一方、See-Sawメカニズムによらずに、ニュートリノ質量を導く、Zee-Modelを検討中である。特に、加速器、原子炉の実験と大気ニュートリノ、太陽ニュートリノの実験を統一的に理解できるモデルとして、Zee-Modelに焦点をあてている。この研究は、トリエステのSmirnov博士と共同のものであり、近いうち成果を公表する予定である。さらに大気ニュートリノ、太陽ニュートリノ問題の検討を続けている。

すなわち、CHORUS/NOMAD実験でニュートリノ振動が観測された場合、大気ニュートリノ異常の実験またはLSNDにおける実験結果のいずれかが間違いであることが判明する。3.ニュートリノの質量を説明するZeeモデルは、大気ニュートリノ異常とLSNDの実験を再現する。その時、CHORUS/NOMAD実験でのニュートリノ振動は小さくて観測できない。このモデルにsterileニュートリノv_3を加えることにより、太陽ニュートリノ問題が解決できる。4.ニュートリノ振動におけるCP対称性の破れは、Long Baselineの実験で観測される可能性がある。この場合、地球の物質効果が重要になるが、第3世代と第2世代のニュートリノの質量が1eV程度であればその効果は小さい。しかし、第2世代のニュートリノの質量が0.1eV程度であるならば、この効果は大きくなりCP対称性の破れの実験に深刻な影響をおよぼす。
フローサイトメトリーを用いた肝臓における幹細胞の特性解析

本研究は、慢性肝炎など肝疾患に対する再生医学の医療としての実現を目標として、組織幹細胞を安全かつ簡便に分離・操作する新技術を確立するとともに、幹細胞の分化・増殖機構の分子基盤を解明し、人為的な再生制御を可能とする新規医療技術の開発に向けた基礎的検討を試みるものである。すなわち、単離した肝細胞集団の中から、極少数しか存在しない組織幹細胞を、FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により純化・回収し、幹細胞のより高度な操作技術(自己複製による培養系における増幅、可塑性の制御等)の確立や幹細胞の分化・増殖機構の解明を行う。本年度は、特に成体肝臓における肝幹細胞の同定・分離と特性解析を月的とした研究を行った。まず、受け入れ先研究室における先行研究で明らかとなっているマウス胎児肝臓中の肝幹細胞に関する知見を基盤として、ラット胎児肝臓における肝幹細胞の分離を試みた。その結果、ラット胎児肝臓における非血球画分中のICAM-1^+RT1A^<low/->細胞に、高い増殖能・多分化能・組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞が限定的かつ高頻度に存在することが判明した。そこで、幹細胞が活性化されていると考えられる肝障害ラットの肝臓を対象として、同様の細胞が存在するのか否かを解析した。すなわち、AAF(acetylaminofluorene)投与と肝切除を行った肝障害ラットモデルの肝臓を解析したところ、ラット胎児肝臓と同様にICAM-1^+RT1A^<low/->細胞が存在することが判明した。このICAM-1^+RT1A^<low/->細胞の80%以上が、マウス胎児肝臓中の肝幹細胞のマーカーであるc-Metを発現していた。また、FACSで分離したICAM-1^+RT1A^<low/->細胞を対象としたRT-PCRによる解析結果より、この細胞画分にAFP,c-Met、c-Kit,albuminなど肝前駆細胞で発現している複数の遺伝子が強く発現していることが確認された。来年度の研究では、AAF(acetylaminofluorene)投与と肝切除を行った肝障害ラットモデルの肝臓から、FACSにより分離したICAM-1^+RT1A^<low/->細胞を用いて生体への細胞移植実験を行い、in vivoにおける組織再構築能や多分化能などを解析することにより、成体肝臓における肝幹細胞が同定されることが期待される。これらの研究により、成体肝臓と胎仔肝臓における肝幹細胞の関連性が明らかにできるものと考えられる。
新規シグナル分子8-ニトロ-cGMPの骨リモデリングとその破綻における機能の解明

骨は、破骨細胞による吸収と骨芽細胞による形成からなるリモデリングを繰り返すことによって、形態と強度を維持している。また、骨細胞が骨吸収と骨形成を制御する細胞であると認識されるようになってきた。骨吸収と骨形成のバランスが崩れると、骨量の減少あるいは増加が起こる。前者の代表的な例として骨粗鬆症、後者のそれとして大理石骨病などがあげられる。一酸化窒素(NO)や活性酸素種(ROS)が骨吸収と骨形成を制御するとういう報告は多い。我々は、一酸化窒素(NO)と活性酸素種(ROS)の共通した下流シグナル分子として同定された、8-ニトロ-cGMPによる骨吸収と骨形成の制御について解析することにした。本年度はまず、破骨細胞分化過程における8-nitro-cGMPの生成および破骨細胞分化に対する8-nitro-cGMPの影響について検討した。破骨細胞分化はNO、ROSおよび活性窒素種によって分化が促進されるという報告が多い。今回の解析では、破骨細胞前駆細胞であるマウス骨髄マクロファージおよび破骨細胞で8-nitro-cGMPの生成が確認され、炎症性サイトカインはその生成を促進した。また、外来性の8-nitro-cGMPは骨髄マクロファージからRANKL依存的な破骨細胞への分化を促進した。一方、ニトロ下されていないcGMPにはそのような活性は認められなかった。続いて、骨細胞様細胞株Ocy454細胞における8-nitro-cGMPの生成を解析した。炎症性サイトカインによる8-nitro-cGMP生成の亢進は認められなかったが、副甲状腺ホルモンおよびプロスタグランジンE2によって8-nitro-cGMPの生成が促進することが明らかになった。破骨細胞および骨細胞で8-nitro-cGMPの生成を確認できた。8-nitro-cGMPは破骨細胞分化を促進することを見出した。破骨細胞前駆細胞および破骨細胞で、炎症性サイトカインが8-nitro-cGMPの生成を促進したことから、炎症性の骨破壊の一部を8-nitro-cGMPで説明できる可能性が示唆された。また、骨細胞での8-nitro-cGMPの生成が確認できたことから、研究の発展が期待される。主に、骨形成を担う骨芽細胞における8-nitro-cGMPの生成と機能を解析する予定である。8-nitro-cGMPの消去系の主要な酵素であるcysteinepersulfide synthetase遺伝子欠損マウスの使用が平成31年度から可能になることから、そのマウス由来の骨構成細胞を用いた実験を行うための費用を繰越す。
iNKT細胞のリプログラミングと膵臓癌免疫療法への応用

多くのがん患者では、iNKT細胞数の減少や機能低下が観察されており、これを回復する方法の開発に期待が寄せられている。私達はiNKT細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)まで初期化した後に、IL-2/15を用いて再分化を誘導する方法を開発した。再生iNKT細胞は、α-ガラクトシルセラミドを認識して増殖応答とIFN-γ産生を示し、樹状細胞の活性化を介して細胞傷害性T細胞の増殖を誘導した。一方、再生iNKT細胞は、がん細胞に対してNKG2DとDNAM-1依存性の直接傷害活性を示した。以上より、再生iNKT細胞は、膵臓癌に対して効果的な免疫療法を提供するプラットフォームとなる可能性がある。健常人末梢血単核球(PBMC)をα-GalCer刺激してヒトインバリアントNKT(iNKT)細胞の増殖を誘導した。9-11日後、α-GalCer負荷PBMCで再刺激して、さらに10-12日後Vα24+6B11+CD4+iNKT細胞とVα24+6B11+CD4-iNKT細胞の2つのサブセットを高速自動セルソーター使用して分離した。これらを再刺激する際にリプログラミング因子(Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)を導入してiNKT細胞に由来する人工多能性幹細胞(iPSC)を樹立した。Vα24+6B11+CD4+iNKT細胞株とVα24+6B11+CD4-iNKT細胞株では、iPSC誘導効率が著しく異なっていた。安定して樹立されたiNKT由来iPSCをC3H10T1/2フィーダー細胞の上でVEGF存在下7日間培養後、SCFとFlt3Lを添加して造血分化を誘導した。7日後、OP9-DL1上でIL-7とFlt3Lを添加してT細胞への分化を誘導した。この細胞はT細胞様の形態、および表面マーカー発現を有していたが、その後の刺激で充分な増殖が得られなかった。現在、より成熟したiNKT細胞の分化誘導法を検討中である。ヒトインバリアントNKT細胞に山中4因子を導入して人工多能性幹細胞を樹立した。これから造血分化を誘導した後、OP9-DLL1上でT細胞分化を誘導した。分化最終段階でIL-2とIL-15を加えることで、a-GalCerに高度の反応性を示すT細胞を得ることができた。この細胞は、CD1d拘束性にa-GalCerを認識して増殖応答を示すとともにIFN-gを産生した。樹状細胞(DC)との共培養では、a-GalCer依存性にDCの成熟とIL-12産生を促進した。このDCにがん抗原ペプチドを負荷して、CD8+T細胞を共培養すると、がん抗原特異的CD8T細胞の増殖を得ることができた。一方、この再生iNKT細胞は、NKG2D、DNAM-1を発現して、K562とU937に強力な細胞傷害活性を示した。詳細な解析により、DNAM-1依存性の傷害活性は、再生iNKT細胞におけるTIGIT欠損によるものであることが分かった。以上より、再生iNKT細胞は、細胞アジュバント効果を発揮するとともに、強力なNK活性を示すことが明らかとなった。再生iNKT細胞の分化に成功して機能解析が進んだ。ヒトインバリアントNKT(iNKT)細胞にリプログラミングファクター(Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)を導入して人工多能性幹細胞(iPSC)を樹立した。ヒトiNKT細胞には、CD4+CD8-(CD4+)とCD4-CD8-(DN)の2つの代表的なサブセットが存在するが、CD4サブセットから効率良くiPSCが作製できた。従来の方法により、NKT-iPSCからT細胞への再分化を試みたが、得られたT細胞はTCR刺激に対して低反応性の不良なものであった。分化の最終段階でIL-2とIL-15を組み合わせて添加したところ、CD1d拘束性にα-GalCerを認識して高度のT細胞応答を示すT細胞様の細胞を得ることができた。再分化したiNKT細胞(iPSC-iNKT細胞)は、T細胞受容体刺激あり・なしの両方において、元のiNKT細胞と類似の遺伝子発現パターンを示したが、特にTh1サイトカインであるIFN-γの産生が高く、Th2サイトカインであるIL-4の産生が低い傾向を示した。また、iPSC-iNKT細胞はα-GalCer負荷樹状細胞(DC)の成熟と活性化を誘導し、これを介して、がん抗原ペプチド特異的CD8陽性T細胞のプライミングを促進した。一方、このiPSC-iNKT細胞はNKG2DおよびDNAM-1を介して、in vitroで白血病細胞株(K562)を傷害した。以上より、再生iNKT細胞は、強力なNK活性によって抗腫瘍効果を発揮することが明らかとなり、MICA/B, ULBP1-4, PVR, Nectin-2を発現する膵癌を排除する細胞製剤としての有用性が示唆された。

再生iNKT細胞は、α-ガラクトシルセラミドを認識して増殖応答とIFN-γ産生を示し、樹状細胞の活性化を介して細胞傷害性T細胞の増殖を誘導した。一方、再生iNKT細胞は、がん細胞に対してNKG2DとDNAM-1依存性の直接傷害活性を示した。以上より、再生iNKT細胞は、膵臓癌に対して効果的な免疫療法を提供するプラットフォームとなる可能性がある。ヒトNKT細胞には2つの代表的なサブセットが存在するが、それぞれの間でiPSC誘導効率が著しく異なることがわかった。TCR刺激に対する反応性が低かったがiPSCからiNKT細胞様細胞への分化誘導はできたため、おおむね順調と考えられる。詳細な機能の解析を進めるとともに、免疫不全マウスを用いたin vivo抗腫瘍効果を検討する。腫瘍免疫学より成熟したiNKT細胞を誘導するためのサイトカイン候補が分かりつつある。これらを用いて、より生理的に近いiNKT細胞の誘導を行う予定である。
ATP合成酵素の回転モーター制御の分子機構

生体分子モーターの作動機構を明らかにするために、駆動機構の解明と制御機構の解明は車の両輪である。分子モーターの制御とは、モーター分子の原子レベルでの動きの制御である。本研究では、これを理解するために、回転軸(γサブユニット)側からの研究と、外的要因の研究を同時平行して実施した。(1)γサブユニットの構造変化による回転制御を1分子レベルで解析し、正確な角度解析により軸受け側のβサブユニットの構造と停止位置の対応付けを行った。また、磁気ピンセット技術を用いて、停止と回転に要する力を実測した。さらに、制御時に起こる構造変化を立体構造レベルで解明し、制御と構造の関連付けを行なった。(2)内在性阻害因子であるεサブユニットの機能を、阻害にかかる力の測定と分子構造の変化の両面から検証した。さらに内在性阻害因子の構造変化と膜ポテンシャルの関連付けを目指した。(3)細胞内におけるATP合成量と分子レベルでのATP合成酵素の活性変化の対応付けを行うことにより、回転調節の生理的な重要性について考察した。これを理解するために、回転軸(・サブユニット)側からの研究と、外的要因の研究を同時平行して実施する。特に、(1)・サブユニットの構造変化による回転制御を1分子レベルで解析し、正確な角度解析により軸受け側の・サブユニットの構造と停止位置の対応付けを行う。また、磁気ピンセット技術を用いて、停止と回転に要する力を実測する。さらに、制御時に起こる構造変化を立体構造レベルで解明し、制御と構造の関連付けを行なう。(2)内在性阻害因子である・サブユニットの機能を、阻害にかかる力の測定と分子構造の変化の両面から検証する。さらに内在性阻害因子の構造変化と膜ポテンシャルの関連付けを行う。(3)外来因子によるATP合成酵素の再活性化の分子機構を調べることで、回転調節の分子機構を明らかにする。1.γの回転制御機構γサブユニットの調節領域に存在するジチオールの酸化によって、回転の停止頻度が著しく増加する。この回転制御の分子機構を調べることを目的として、本年度は、安定にステップの観察が可能な複合体を構築した。また、γサブユニットの回転は、葉緑体型酵素の特異的な阻害剤であるテントキシンによって阻害される。この阻害の分子機構を解析するため、ステップの観察を行い、停止ステップを確定することに成功した。2.内在性阻害因子による制御内在性阻害因子であるεサブユニットは、葉緑体型ATP合成酵素ではほぼ完全に酵素の回転を停止するが細菌型ATP合成酵素ではその阻害効果が一過的である。この両者の違いを、阻害にかかる力の測定と分子構造の変化の両面から検証するため、磁気ピンセットの整備を行い、力測定の予備実験を行った。また、εサブユニットの分子構造の変化を明らかにするため、大阪大学・八木宏昌助手が中心になってNMRによる構造解析を行った。3.εサブユニットへのATPの結合εサブユニットがγ・ε複合体でもATPを結合する性質を持つことを明らかにした。4.シアノバクテリアATP合成酵素の形質転換シアノバクテリアATP合成酵素サブユニットの形質転換を行い、回転実験試料の準備を行った。植物型ATP合成酵素のγサブユニットの酸化還元制御による回転調節機構の詳細を明らかにするために、シアノ、バクテリアATP合成酵素に変異導入し、回転と停止の詳細(特に停止位置の解明)を一分子レベルで明らかにすること、および磁気ピンセットを用いて停止のからの回復について解析した。また、植物のATP合成酵素に特異的に働くテントキシンによる阻害と活性促進についても、一分子レベルで詳細な解析を行い、酵素のどのような変化が活性変化に影響するのかを明らかにした細菌型ATP合成酵素を用いた回転1分子観察実験では、阻害状態がはっきりと見られなかった。一方、生化学的な解析から、細菌型である好熱菌ATP合成酵素では、阻害型から活性型への転換が起こると、構造変化を起こしたεサブユニットへATPの結合が起こり、これにより阻害型への再転換が起こりにくくなっている事が明らかになった。このことが、植物型と比較して細菌型ではεサブユニットの阻害効果が弱い事の一因と考えられる。

この知見をふまえ、細菌型ATP合成酵素の阻害状態をより詳細に解析するために、ATP結合能を持たず、阻害効果の強い変異体εサブユニットを用いた回転1分子解析に着手した。植物型および細菌型のεサブユニットの機能の違いを明らかにするため、シアノバクテリア由来のεサブユニットおよびその一部を植物型にしたものについて、NMRによる溶液構造の解析を行った。植物型ATP合成酵素のγサブユニットの酸化還元制御による回転調節機構の詳細を明らかにするために、シアノバクテリアATP合成酵素に変異導入し、回転と停止の詳細(特に停止位置の解明)を一分子レベルで詳細に調べた。その結果、酸化状態ではいわゆる「ADP阻害」と言われている80度の停止位置での停止頻度が増加し、停止時間も長くなることがわかった(発表準備中)。一方、植物型ATP合成酵素のγサブユニットに特徴的な挿入配列の役割を明らかにするため、この配列を削除した変異体の詳細な解析を行った。1分子観察の結果から、この挿入配列がADP阻害の誘導に重要な役割を果たしていることおよび挿入配列を欠損したシアノバクテリアの生理レベルでの解析から、ADP阻害が暗所での細胞内のATPレベルの維持に直接的な役割を持っていることを明らかにした(投稿論文執筆中)。葉緑体型ATP合成酵素の特異的阻害剤であるテントキシンによる回転阻害の解析によってADP遊離段階が阻害されることを明らかにした。シアノバクテリアATP合成酵素のεサブユニットおよびC末端側ヘリックス部分を植物由来のものに置換したキメラサブユニットについてNMRによる溶液構造の解析を行い、両者のヘリックス部分の長さあるいは二本のヘリックスをつなぐループ部分の長さがバクテリア由来のものと著しく異なることを明らかにした(論文投稿中、PDBコード2RQ6および2RQ7)。植物型ATP合成酵素のγサブユニットの回転調節機構の詳細を明らかにするために、シアノバクテリアATP合成酵素のADP阻害とε阻害の力学的な強さの違いを磁気ピンセットを用いて1分子レベルで計測した。その結果、ε阻害はADP阻害に比べて2倍程度強固にγの回転を止めていることが明らかになり、両者は関係はあるものの別個の阻害であることが明らかになった(論文投稿中)。また、葉緑体型ATP合成酵素のγサブユニットに特徴的な挿入配列の役割を明らかにするため、この配列を削除した変異体の詳細な解析を行った。1分子観察の結果から、この挿入配列がADP阻害の誘導に重要な役割を果たしていることおよび挿入配列を欠損したシアノバクテリアの生理レベルでの解析から、ADP阻害が暗所での細胞内のATPレベルの維持に直接的な役割を持っていることを明らかにした(論文投稿中)。さらに、葉緑体型ATP合成酵素のεサブユニットの機能を明らかにするために、C末端ヘリックス部分を削除した変異体を持ったシアノバクテリアを作出し、その生理・生化学的な解析を行った。興味深いことに、C末端を欠いたεを持つチラコイド膜は、プロトン勾配の形成に異常を来すことが明らかになった(論文執筆中)。ATP結合能を持たず、阻害効果の強い変異体ε
唾液腺腫瘍での細胞接着分子発現の変化が多彩な形態形成や生物学的態度に与える影響

1.正常唾液腺では、E-cadherin,α,β-catenin,CD44v6,v9のいずれもが実質細胞の細胞膜に明瞭に発現されていた。一方、腫瘍組織では、腫瘍性筋上皮細胞の関与のないWarthin腫瘍、粘表皮癌では強い発現が見られたのに対して、PAでは間葉様組織への化生を伴う前に、すでに腫瘍性筋上皮細胞間の接着分子発現が減弱していることが明らかとなった。ACCでは、E-cadherin,β-cateninとも細胞膜上での発現が不規則で弱く、一方、β-cateninの核内蓄積が認められた。このことから、ACCでは、腫瘍発生にβ-cateninの異常発現が関わることが示唆された。ACCでは、CD44v6,v9の発現低下もみられたが、転移能との間に関連性は認められなかった。3.ACCの細胞外基質内にはMMP-2,-9が含まれており、基底膜の破壊、浸潤ならびに転移に関わると考えられた。4.PAと腺房細胞癌より分離した腫瘍細胞にhTERTを導入し、継続して増殖可能な細胞株の樹立に成功した。PA細胞は、分泌上皮性マーカーと筋上皮性マーカーをともに発現し、PLAG1の発現も確認できた。一方、腺房細胞癌よりの細胞株は、分泌上皮性マーカーのみを発現していた。両細胞株を用い、細胞形質を比較することにより、唾液腺腫瘍での細胞分化、腫瘍性筋上皮による特異な形態形成をin vitroで調べることが可能となり、現在、増殖因子刺激に対する反応性と細胞接着性の変化ならびに基質産生能を検討中である。科学研究費補助金の交付が約半年遅れたため、成果を発表するまでには至っていないが、主に正常唾液腺ならびに各種唾液腺腫瘍組織、多形性腺腫の培養細胞を用い、以下の成果を得た。1.免疫染色により各種細胞接着分子の発現を調べた結果、正常唾液腺では、E-cadherin,β-catenin, CD44v9のいずれも導管上皮細胞、腺房細胞の細胞膜に明瞭に発現され、これらが細胞間の接着に関わっていることが明らかになった。一方、腫瘍組織では、腫瘍型により発現程度が異なり、腫瘍性筋上皮細胞の関与のないWarthin腫瘍、粘表皮癌では強い発現が見られたのに対して、多形性腺腫では充実性増殖部でも発現の低下が見られ、間葉様組織への化生を伴う前に、すでに腫瘍性筋上皮細胞間の接着性が減弱していることが示唆された。2.腺様嚢胞癌では、上記の細胞接着分子の発現程度と転移の有無との間に関連性は認められず、転移には脈管侵襲性などに影響を与える他の因子の関与が大きいことが示唆された。3.増殖因子に対するレセプターの発現は、正常組織よりも腫瘍で亢進していることが確認され、基質産生との関連性を検討中である。4.2つの多形性腺腫より分離した腫瘍細胞にhTERTを導入し、継続的に増殖可能な細胞の樹立に成功した。これらの細胞は、まだヘテロな状態ではあるが、分泌上皮と腫瘍性筋上皮への異なった分化を示す細胞を含むことを確認しており、これを用いて細胞接着分子の発現と基質産生との関連性を調べるモデルになると期待される。昨年度に引き続き、正常唾液腺ならびに唾液腺腫瘍(多形性腺腫、腺様嚢胞癌など)組織、あるいはそれからの培養細胞を用いて実験を行い、以下の成果を得た。1.腺様嚢胞癌の組織を用いて検討した結果、腫瘍細胞が胞巣内外に産生し、特徴的な組織構築に強く関わっている豊富な粘液様基質内には、グリコサミノグリカンに加えて、matrix metaloproteinase (MMP)-9が豊富に含まれていることが明らかとなった。このことは、腺様嚢胞癌が正常で存在する間質を分解し、浸潤する性格と密に関係していると見なされた。

現在、培養細胞株を用いて、検討を行っている。一方、多形性腺腫の細胞外基質内のMMPはごく少量で、両腫瘍型が産生する細胞外基質には、大きな違いがあることが明らかとなった。2.多形性腺腫の上皮細胞にhTERTを導入し、現在まで継続して増殖を続けている細胞を用い、細胞接着分子の発現と基質形成との関連について検討を行ったが、confluentなり、細胞同士が密に接しても細胞接着分子(CD44v9,E-cadherin,β-catenin)の発現は弱く、不均一であった。また、RT-PCR、western blottingでこれらの細胞によるaggrecanやtype II collagenの産生について検討したが、今のところ、産生を示す所見は得られていない。軟骨への分化に関連する遺伝子を導入することを検討中である。3.扁平上皮癌の手術に際して切除された正常顎下腺より得られた培養細胞についても、細胞接着分子の発現について検討し、これらは細胞膜にCD44v9,E-cadherin,β-cateninを明瞭に発現し、さらに、培養を続けることにより一部の細胞は腺管を形成することを確認した。基質産生についても検討を行いつつある。
ＡＭＰＫに着目した涙液分泌機構の解明とその制御

II型糖尿病モデルマウスにおいて、持続運動により涙液分泌量低下を抑制できることを発見した。またAMPK活性化剤を投与によっても、同様に涙液分泌低下を抑制できることがわかった。また、涙液中の酸化ストレスマーカーについても、運動介入により減少することがわかった。これらの結果より、運動およびAMPK活性化剤の投与はII型糖尿病モデルマウスにおいて糖代謝のみならず、涙液分泌に対しても有効であることが示された。AMPKは細胞の中でのエネルギーの消費をコントロールしているだけでなく、体全体のエネルギーバランスの調整のために非常に大きな役割を果たしていると考えられる。ドライアイの病態を細胞の代謝機構の変化、エネルギー産生の変化により活性酸素の上昇、涙液分泌の低下がもたらされているのではないかと考えた。さらにはAMPKが直接的に涙液分泌に関与する可能性もあると考えた。このAMPKの涙腺における役割を明らかにするために、本年度は、AMPK活性化剤であるAICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside)投与による涙液分泌変化の解析をおこなった。涙液分泌量を綿糸法(30秒)を用いて測定した。正常マウス(C57BL/6)において、AICARの単回腹腔内投与により、投与後4時間および6時間で有意に涙液量が増加するという結果が得られた。AICAR投与量を各種変更したが、125mg/kgまたは250mg/kg量で最も安全かつ顕著な影響がみられた。このため、次に、同容量で、5日間の連続投与を行ったところ、AICAR腹腔内投与5日目の涙液量はコントロール群およびAICAR投与前の値と比べて、有意に増加する結果が得られた。さらに涙液量が減少することが明らかになっている糖尿病モデル(db/db)を用いて同様のAICAR5日間連続投与を行ったところ、涙液分泌量が増加することを確認した。このAMPKの涙腺における役割を明らかにするために、まず、AMPKの活性を上げることで知られている「運動」介入を行い、涙腺機能維持に効果があると仮説をたて実験を行うことにした。また、以前に長期の高脂肪食負荷で涙液分泌が低下する結果を得たため、雄のC57BL/6マウスを購入し、通常食群、高脂肪食負荷(60%ラード)群、高脂肪食+運動負荷群の3群にわけ飼育実験を開始し、8週目で解剖をおこなった。1週毎に体重測定、負荷開始1週ごとに涙液分泌量を綿糸法(30秒)を用いて測定した。運動介入を行った群で、高脂肪食負荷による涙腺機能低下を抑制できることがわかった。しかしながら、組織染色では運動群で炎症細胞浸潤の軽微が認められるようであったがはっきりしなかった。さらに糖尿病モデル(dbdb)を用いて同様の運動介入を行い、涙液分泌量維持ができることを確認した。AMPKを中心とした関連する分子の発現変化をreal-time PCR、western blottingを用いてmRNAおよびタンパク質レベルで解析した。しかし、どちらのモデルにおいても現在のところ、筋肉ではAMPKの活性化が確認できたが涙腺組織では確認できていない。AMPKは細胞の中でのエネルギーの消費をコントロールしているだけでなく体全体のエネルギーバランスの調整のために大きな役割を果たしていると考えられる。このAMPKの涙腺における役割を明らかにするために初年度はC57BL/6マウスおよびII型糖尿病モデルマウス(db/db)を用いてAMPK活性化をもたらす8週間の「運動介入」を行い、全身性変化および涙液分泌量の変化を検討した。次に、2年目ではAMPK活性化剤のAICAR投与実験を行い、涙液分泌との関連を検討した。最終年度では、1,2年目で得られた結果である、db/dbマウスでの涙液分泌低下が運動で抑制されること、AICAR投与で涙液分泌が保持されることを追試し確認した。また、初年度では検討できていなかったdb/dbマウスでの運動による耐糖能変化、呼吸商評価を検討し、運動により、血糖値および耐糖能が改善傾向を認めることを示した。これらより、II型糖尿病マウスにおいて涙液分泌量の減少が生じ、8週間の運動負荷により運動群では体重増加の抑制および糖代謝の改善が認められたこと、涙液分泌量は対照群に比べ運動群では有意に増加し、涙液中の酸化ストレスマーカーにおいても減少傾向が認められることが明らかにになった。

これらの結果より、運動およびAMPK活性化剤の投与はII型糖尿病モデルマウスにおいて糖代謝のみならず、涙液分泌に対しても有効であることが示された。眼表面仮説を裏付ける現象は結果として得ることができたが、そのメカニズムについては解明が進められていない。疾病モデルにおける運動介入により涙腺機能維持ができることを証明できた。初年度の動物実験結果と2年時の動物実験結果をあわせて、共通のメカニズムがあるかどうかを探る。AMPKの活性化剤や阻害剤など種々の試薬を用いて涙液分泌の増減およびその遺伝子変化を探っていく予定である。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入にあてる予定である。消耗品購入にあてる予定である。
遺伝要因と環境要因による急性心筋梗塞発症、進展、再発リスクの臨床的・基礎的検討

ヘリコバクター・ピロリ菌感染の中でもCagA抗体陽性のピロリ菌が胃癌、急性心筋梗塞の発症に関与しており、本邦ではCagA陽性ピロリ菌の割合が高い。このため、平成30年度はピロリ菌感染の中でも、CagAタンパク質と動脈硬化発症、進展との関係を明らかにするため、CagA抗体染色によるCagAタンパク質分布に着目した。ピロリ菌感染は血液での抗体測定により判断しているが、ヒト組織での染色等による確認はこれまで報告がない。このため、ヒト血管組織、特に動脈硬化病変組織でのヘリコバクター・ピロリ菌産生CagAタンパク質の分布を明らかにし、血管イベントとの直接的な関連を検討した。結果は、CagA陽性患者からの胃粘膜組織を免疫染色したところ、陽性所見が得られ、ポジティブコントロールとした。次に、動脈硬化の一つである腹部大動脈瘤の人工血管置換術時に切除された組織をサンプルとしてCagA陽性の患者と陰性の患者で免疫染色を行った。大動脈の内膜組織にCagA陽性患者では染色され、陰性の患者では染色されなかった。初めてヒト動脈硬化血管におけるCagA抗体陽性が示され、CagAタンパク質と動脈硬化血管との関連性が示唆された。これまで、急性心筋梗塞ではヘリコバクター・ピロリ菌感染+インターロイキン1遺伝子多型保有者が有意に高値であり、喫煙の因子が加わることでST上昇型急性心筋梗塞の頻度が高値であることを示してきたが、平成30年度の実験において、ピロリ菌産生CagAタンパク質が動脈硬化性血管の発生と関連している可能性があることが示された。以上から、遺伝・環境要因からみた動脈硬化性血管疾患の発症・進展・再発リスクを明らかにした。インターロイキン-1β遺伝子多型とピロリ菌の感染は胃での炎症を増悪させることが報告されている。今回、ピロリ菌感染、喫煙の環境因子と炎症に深く関与するインターロイキン-1β(IL-1)遺伝子多型の遺伝因子による、急性冠症候群の発症、心血管イベントリスクを検討した。インターロイキン1(IL-1)遺伝子多型は、IL-1β511 T alleleあるいはIL-1RN*2 allele保有と定義した。1まず急性心筋梗塞82例と対照群82例による症例対照研究では、急性心筋梗塞ではピロリ菌+インターロイキン1遺伝子多型陽性が45%で対照の19%に比し有意に高値であった。急性心筋梗塞、対照群の両群において、ピロリ菌+IL-1遺伝子多型陽性群は、Endo-PATは有意に低値で、高感度CRPは有意に高値であった。2急性冠症候群(ACS)253例の検討では、ヘリコバクター・ピロリ陽性は44.3%、IL-1 beta-511 C/C, C/T, T/Tの比率は、それぞれ30.4%,、45.6%、24.0%だった。また、IL-1RN *2 alleleの頻度は13.7%だった。この急性冠症候群をピロリ陽性かつインターロイキン-1遺伝子多型かつ現在喫煙群(21例)とそれ以外群(232例)に分けて、3年間の心血管イベントを比較すると、3因子陽性群で有意にイベント率が高値であった(Log rank P=0.012)。以上より、ピロリ菌感染とIL-1遺伝子多型に喫煙が加わることで、心血管イベント再発リスクが高値が判明した。3ST上昇型急性心筋梗塞(STEMI)と、それ以外のACSで区別すると、STEMIではピロリ菌+IL-1遺伝子多型の割合が有意に高値であった。さらにその2因子に現在喫煙を加えた3因子の割合は、STEMIの77%にみられた。熊本地震が平成28年4月に発生し、対応に追われたため、研究の進捗状況はやや遅れている。特に、熊本地震後、相次ぐ余震で車中泊が多くみられ、エコノミークラス症候群が社会問題化し、その予防啓発活動に対し、日本循環器学会、日本静脈学会等の学術団体からの支援、地元医療機関、行政(熊本県、熊本市、厚生労働省)との連携で、熊本地震血栓塞栓症予防プロジェクト:Kumamoto Earthquakes thrombosis and Embolism Protection(KEEPプロジェクト)を行った(代表掃本誠治)。熊本県民にとっては、緊喫の問題であったため、こちらが優先されたためやや遅れている。平成29年度は、急性冠症候群で経皮的冠動脈インターベンション(PCI)を施行し成功した中で、同意の得られた患者でヘリコバクター・ピロリの抗体陽性者6名に対し、ヘリコバクター・ピロリ早期除菌群と晩期除菌群に分けて心血管イベント再発の経過をみている。また、アルコール代謝に関与するアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)は日本を含む東アジアの人種ではALDH2遺伝子多型が多くみられ、45%に酵素活性の低下、あるいは欠損があり、白人にはALDH2遺伝子多型がみられないことから人種差が報告されている。急性心筋梗塞のため薬剤溶出性ステント留置術を受けた129例において、心筋障害の指標として血中クレアチンフォスフォキナーゼ(CPK)、血漿B型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)を、左室リモデリングの指標として左室拡張末期径(LVDd)、左室収縮期末期径(LVDs)を心エコーで測定しALDH2遺伝子多型ごとに比較検討を行った。ALDH2酵素活性低下あるいは機能喪失を示すALDH2*2アレル(対立遺伝子)を有する多型は129例中65例(50.4%)にみられ(ALDH2 Variant群)、酵素活性が正常である*1/*

1wildタイプは64例(49.6%)であった。これは、急性心筋梗塞を発症していない一般的な日本人の分布がwildタイプが4045%であることを考えると急性心筋梗塞の発症そのものがALDH2多型を有する人に多いことを示唆している。さらに、max CPKはALDH2 Variant群で有意に高値、血漿BNP濃度はVariant群で急性期と退院時に有意に高値で慢性期は有意差なかった。ALDH2多型保有患者では、急性心筋梗塞後同じように経皮的冠動脈インターベンションを受けても心筋障害が大きいことを示唆している。LVDsはVariant群で急性期に有意に高値だったが退院時、慢性期で有意差なかった。LVDdは各期で有意差を認めなかった。内服加療の影響があり、さらなる検討が必要であることを示した。平成28年熊本地震で1年目に遅れがでたが、2年目は1年目の遅れを取り戻しつつある。臨床的な研究は進行している。ヘリコバクター・ピロリ菌感染の中でもCagA抗体陽性のピロリ菌が胃癌、急性心筋梗塞の発症に関与しており、本邦ではCagA陽性ピロリ菌の割合が高い。このため、平成30年度はピロリ菌感染の中でも、CagAタンパク質と動脈硬化発症、進展との関係を明らかにするため、CagA抗体染色によるCagAタンパク質分布に着目した。ピロリ菌感染は血液での抗体測定により判断しているが、ヒト組織での染色等による確認はこれまで報告がない。このため、ヒト血管組織、特に動脈硬化病変組織でのヘリコバクター・ピロリ菌産生CagAタンパク質の分布を明らかにし、血管イベントとの直接的な関連を検討した。結果は、CagA陽性患者からの胃粘膜組織を免疫染色したところ、陽性所見が得られ、ポジティブコントロールとした。次に、動脈硬化の一つである腹部大動脈瘤の人工血管置換術時に切除された組織をサンプルとしてCagA陽性の患者と陰性の患者で免疫染色を行った。大動脈の内膜組織にCagA陽性患者では染色され、陰性の患者では染色されなかった。初めてヒト動脈硬化血管におけるCagA抗体陽性が示され、CagAタンパク質と動脈硬化血管との関連性が示唆された。これまで、急性心筋梗塞ではヘリコバクター・ピロリ菌感染+インターロイキン1遺伝子多型保有者が有意に高値であり、喫煙の因子が加わることでST上昇型急性心筋梗塞の頻度が高値であることを示してきたが、平成30年度の実験において、ピロリ菌産生CagAタンパク質が動脈硬化性血管の発生と関連している可能性があることが示された。以上から、遺伝・環境要因からみた動脈硬化性血管疾患の発症・進展・再発リスクを明らかにした。ヘリコバクター・ピロリ菌感染が、遺伝要因や喫煙の環境要因と相俟って、急性冠症候群の発症、心血管イベントリスクに、関連している可能性が考えられた。このため、ピロリ除菌の有無による前向き研究を行い、遺伝子多型との関連を解析する。ただ、モニタリングにおいて、一症例あたり、約2万円の費用負担があり、症例数を絞らざるを得ない。ヘリコバクター・ピロリ菌感染の中でも、CagA抗体陽性のピロリ菌が胃癌、急性心筋梗塞の発症に関与していることが報告されている。このため、ピロリ菌感染の中でも、CagA抗体、染色まで行うことは意義のあることである。
地盤・地中鉄筋コンクリート構造系の連成エネルギー吸収

(1)2次元鉄筋コンクリート・地盤相互作用系の非線形解析プログラムの開発を行った。鉄筋コンクリートに対しては、交番繰り返しを考慮できる分散ひびわれモデルと離散ひびわれモデルを、地盤に対しては多重塑性関数法に基づく構成方程式を開発し、任意の交番荷重と地盤拘束度を合理的に解析に反映させる数値計算法を確立した。これは、従来から行われている地盤・構造の等価減衰および等価せん断剛性による簡易定式化とは異なり、材料の履歴特性をすべて任意荷重下に対して定量化する手法によるものである。(2)地中に埋設された鉄筋コンクリートラーメン箱型構造の非線形応答と、周辺地盤の材料非線形性について、既往の実験結果との検証を行い、十分な精度を有することを確認した。(3)地震によって変形した地盤中の大型RCケーソンの非線形応答解析を実施し、エネルギー吸収能、導入せん断力、残留変形と地震以後の機能性保持についてパラメトリックスタディーを実施した。その結果、導入される地震時せん断力は、RC構造の鉄筋比の低下と壁厚の減少に応じて低下することが明示された。これは、鉄筋コンクリートの耐震設計に取り入れられている靭性設計と同様の設計概念で、地中RC構造物の設計を合理化することが可能であることを意味している。また、従来の弾性設計によって算定される導入せん断力は、地盤と構造の非線形性を考慮することにより、およそ半減することが示された。(4)上記の解析法をさらに直接積分型動的解析に組み込み、基盤入力加速度から地中RC構造物の非線形動的応答を解析する一般化プログラムの開発を終了した。
タンパク質の細胞内導入を目的とする細菌毒素を改造したナノマシンの分子設計

コレラ毒素は、毒素活性を持つタンパク質(Aサブユニット)と、細胞表面の毒素受容体(糖資質ガングリオシド)に結合する役割を持つタンパク質(Bサブユニット)の2種類のタンパク質から構成されている。細胞表面のカベオラと言う凹部のガングリオシドに結合した毒素はエンドサイトーシスによって細胞内へと取り込まれてゆく。このBサブユニットが示す毒素受容体との特異的相互作用を利用し、Aサブユニットの代わりに目的のタンパク質をBサブユニットに会合させれば、ガングリオシドに特異的に依存する、目的タンパク質の細胞内導入が行える。1.Bサブユニットとスギ花粉症抗原の融合タンパク質の設計と作製コレラ毒素Bサブユニットとスギ花粉症抗原を結合させたタンパク質遺伝子を設計し、その発現を行った。抗原にはスギ花粉タンパク質であるCry j1のT細胞抗原決定基を数個選択し、そのアミノ酸配列をコードする合成DNAをBサブユニット遺伝子に結合させ、融合タンパク質遺伝子を作製した。遺伝子を大腸菌及び枯草菌の細胞内で発現し、融合タンパク質を得た。(第46回日本生化学会中国・四国支部例会にて発表)2.無細胞タンパク質合成系によるBサブユニットと緑色蛍光タンパク質(GFP)複合体の作製コレラ毒素Bサブユニット遺伝子を用い、無細胞タンパク質合成系でBサブユニットを発現させた。非組換えBサブユニットと同様の5量体でガングリオシドへの結合性を示すBサブユニットが得られた。また、Bサブユニットへの結合に必要なペプチドを付加したGFPをBサブユニットと共に発現させたが、GFPの発現は見られたものの両者の複合体は形成されなかった。複合体の形成には新生タンパク質の折りたたみが関与していることが推測された。コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、ベロ毒素等の細菌毒素は、毒素活性を持つAサブユニットと、細胞表面の毒素受容体(糖脂質であるガングリオシド)に結合する役割を持つBサブユニットの2種のタンパク質から構成されている。細胞表面のカベオラと言う凹部のガングリオシドに結合した毒素は、エンドサイトーシスによって細胞内へと取り込まれてゆく。本研究では、このBサブユニットと毒素受容体との特異的相互作用を利用して、目的のタンパク質を細胞内へ導入するためのタンパク質分子を設計する。15年度は、Bサブユニットとしてコレラ毒素及び大腸菌易熱性毒素のBサブユニットを選び、その遺伝子を大腸菌内で発現させることによって、組換えBサブユニットを得ることに成功した。この組換えBサブユニットとガングリオシドとの相互作用を、ELISA法によって検証中である。また、この組換えBサブユニットに結合させ、細胞内へ導入するタンパク質として、蛍光による検出が容易なタンパク質であるGreen Fluorescence proteinを選択した。現在、Green Fluorescence proteinをBサブユニットと結合できるように、その遺伝子を改変中である。さらにアレルギー症の治療に応用できる可能性のあるタンパク質として、スギ花粉タンパク質中の花粉症の原因となる複数の抗原決定基を選択し、Bサブユニットと融合したタンパク質として発現できるよう、遺伝子を設計した。また、培養細胞系を用いたタンパク質の細胞内導入の追跡のため、蛍光顕微鏡を用いた観察を検討中である。このBサブユニットと毒素受容体との特異的相互作用を利用し、Aサブユニットの代わりに目的のタンパク質をBサブユニットに会合させ、Bサブユニットともに細胞内へ導入するためのタンパク質分子を設計する。コレラ毒素Bサブユニットの調製及び解析を次の通り行った。Bサブユニット遺伝子を発現プラスミドpET28に組み込んだ。次にこのプラスミドで大腸菌を形質転換し、大腸菌培養液に誘導物質であるIPTGを添加することにより、Bサブユニット遺伝子の発現を促した。発現されたBサブユニットはそのN末端にプラスミド由来のHis x 6配列と余分のアミノ酸配列を持つため、天然のBサブユニットよりやや大きい14kDaのタンパク質として得られた。このHis x 6配列がアフィニティカラムへ特異的に結合する性質を利用して組換えBサブユニットを精製した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析で、精製組換えBサブユニットはモノマー以外に5量体までの会合体として存在することが明らかになった。同時にガングリオシドへの結合をELISA法で測定したところ、天然のBサブユニットに比べて弱い結合性を示した。これはN末端に付加されたアミノ酸配列がガングリオシドとの相互作用を阻害しているためと考えられる。現在、His x 6のみをN末端またはC末端に持つBサブユニット、さらにHis x 6を持たず天然のBサブユニットと同一の組換えサブユニットを調製中である。1.B

サブユニットとスギ花粉症抗原の融合タンパク質の設計と作製コレラ毒素Bサブユニットとスギ花粉症抗原を結合させたタンパク質遺伝子を設計し、その発現を行った。抗原にはスギ花粉タンパク質であるCry j1のT細胞抗原決定基を数個選択し、そのアミノ酸配列をコードする合成DNAをBサブユニット遺伝子に結合させ、融合タンパク質遺伝子を作製した。遺伝子を大腸菌及び枯草菌の細胞内で発現し、融合タンパク質を得た。(第46回日本生化学会中国・四国支部例会にて発表)2.無細胞タンパク質合成系によるBサブユニットと緑色蛍光タンパク質(GFP)複合体の作製コレラ毒素Bサブユニット遺伝子を用い、無細胞タンパク質合成系でBサブユニットを発現させた。非組換えBサブユニットと同様の5量体でガングリオシドへの結合性を示すBサブユニットが得られた。また、Bサブユニットへの結合に必要なペプチドを付加したGFPをBサブユニットと共に発現させたが、GFPの発現は見られたものの両者の複合体は形成されなかった。複合体の形成には新生タンパク質の折りたたみが関与していることが推測された。