hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管径調節関連遺伝子多型からみた慢性筋痛の分子遺伝学的検討

全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症(FMS)患者のβ_2アドレナリン受容体(β_2AR)機能評価のため,末梢血由来単核球細胞上に存在するβ_2ARを用い,情報伝達の際に産生されるcAMPを機能性マーカーとして,ELISA法により測定し,年齢,性別をマッチングさせた正常被験者のそれと比較した.FMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)から静脈血を採取し,単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,安静時ベースラインと10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβAR刺激薬(Isoproterenol, IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:P=0.520).FMS群において単核球におけるβ_2ARの刺激に対する反応が抑制されているという事実は,FMSの病態に全身性のβ_2AR機能の脱感作が関与する可能性を示唆する重要な所見と思われた.一方で,FMSとの病態メカニズムの差異が論争されている慢性局所性筋痛症のβ_2AR機能評価を,慢性筋痛者11名,正常被験者21名を対象にして前述の手法に従って行った.その結果,単核球が産生するcAMP濃度はIP刺激濃度依存性に増大したが,その濃度変化量は両群間に有意な差が見られなかった.本結果は,局所性慢性筋痛症の病態には,全身性のβ_2AR機能異常の関与は認められないこと,換言すれば,線維性筋痛症と局所性慢性筋痛症の病態が異なることを示す重要な所見であると考えられた.遺伝子多型の解析については「岡山大学歯学部ヒトゲノム・遺伝子研究倫理審査委員会」より患者の遺伝子解析について承認を得た後,本学歯学部附属病院顎関節症・口腔顔面痛み外来を受診した患者のなかで,本研究計画の被験者選択基準に合致し,研究の参加に同意の得られた者より,末梢血3mlを供与してもらい,サンプル数を増加させ,解析を進めている.本研究は,生涯有病者率が70%以上と非常に高く,特に中高齢者の生活の質に大きく関わる疾病である慢性筋痛の病態を,筋組織内の血管拡張因子であるβ_2アドレナリン受容体ならびに末梢における血管収縮因子であるとともに中枢における疼痛感受性をコントロールすると考えられている5HTTについて,分子遺伝学的観点から検討を行うものである.研究の進行に際して,まず,「岡山大学歯学部ヒトゲノム・遺伝子研究倫理審査委員会」に患者の遺伝子解析に関する実験計画を提出し,承認を得た.研究実施の承認後,本学歯学部附属病院第一補綴科ならびに顎関節症・口腔顔面痛み外来を受診した患者のなかで,本研究計画の被験者選択基準に合致し,研究の参加に同意の得られた者より,末梢血3mlを供与してもらい,サンプル数を増加させているところである.実験手技的には,末梢血リンパ球よりDNAを抽出後,設計したプライマーを用いたβ_2アドレナリン受容体遺伝子の増幅と制限酵素を用いた多型部位の標識について,また5HTTに関しては,同様にgenomic PCR法を用いてlong allele(L)とshort allele(S)の存在から,LL, LS, SSに分類することに成功している。すなわち,実験方法は確立し,サンプル数の増加により,研究結果を導き出せることが明らかとなっている.全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症(FMS)患者のβ_2アドレナリン受容体(β_2AR)機能評価のため,末梢血由来単核球細胞上に存在するβ_2ARを用い,情報伝達の際に産生されるcAMPを機能性マーカーとして,ELISA法により測定し,年齢,性別をマッチングさせた正常被験者のそれと比較した.FMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)から静脈血を採取し,単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,安静時ベースラインと10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβAR刺激薬(Isoproterenol, IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:P=0.520).FMS群において単核球におけるβ_2ARの刺激に対する反応が抑制されているという事実は,FMSの病態に全身性のβ_2AR機能の脱感作が関与する可能性を示唆する重要な所見と思われた.一方で,FMSとの病態メカニズムの差異が論争されている慢性局所性筋痛症のβ_2AR機能評価を,慢性筋痛者11名,正常被験者21名を対象にして前述の手法に従って行った.

その結果,単核球が産生するcAMP濃度はIP刺激濃度依存性に増大したが,その濃度変化量は両群間に有意な差が見られなかった.本結果は,局所性慢性筋痛症の病態には,全身性のβ_2AR機能異常の関与は認められないこと,換言すれば,線維性筋痛症と局所性慢性筋痛症の病態が異なることを示す重要な所見であると考えられた.遺伝子多型の解析については「岡山大学歯学部ヒトゲノム・遺伝子研究倫理審査委員会」より患者の遺伝子解析について承認を得た後,本学歯学部附属病院顎関節症・口腔顔面痛み外来を受診した患者のなかで,本研究計画の被験者選択基準に合致し,研究の参加に同意の得られた者より,末梢血3mlを供与してもらい,サンプル数を増加させ,解析を進めている.
言葉の連想過程を用いた聴覚障害児の語彙獲得に関する研究

1目的本研究では、生徒が現在身につけている理解言語をまず最大限に使う(思考する)ことから出発し、次の点を研究の目的としたい。(1)1つの言葉からどんな言葉を連想するかといった連想活動を繰り返し行うことで、生徒自身が持っている普段使わない言葉を最大限引き出すこと。(2)連想活動の中で、語彙カードやパソコン、プロジェクター等の視覚的教材・教具を活用し視覚的に語彙をとらえさせることで自分の知っている全体的な語彙の量に気づかせ、新しい語彙獲得の意欲化を図ること。(3)他の生徒が連想した言葉を見ることで新たな語彙の獲得と定着を図ること。2方法中学部の3名の生徒を対象に次のような方法で行った。(1)キーワードとなる言葉を一つ示し、その単語から連想できる言葉をいくつか連想させ、さらにそれぞれの連想した言葉についてさらに連想させ、1つの言葉から樹枝のように言葉を5分間でできるだけ多く連想させていく。(2)連想した言葉を互いに見せ合い、自分の知らない言葉をチェックし、相手にその言葉の意味を問うことで、新しい言葉の獲得を図るようにする。3研究成果・語彙を連想する時間を5分間と決めたが、回数を重ねる度に連想できる語彙の数が増加してきた。このことは、普段の生活の中で使わない言葉であっても、一つの言葉を深く思考することで関連する既習語彙を引き出す事ができたと考えられる。・連想した語彙を品詞分類すると、圧倒的に名詞が多く、他の品詞の量が少ない。これは普段の会話の中で使用されている品詞の量の割合に近い傾向がみられた。・聴力障害が軽い生徒は、一つのカテゴリの中の言葉を連続して連想することが多いが、聴力障害の重い生徒2名については、同じカテゴリーの言葉を連続して連想することが苦手であることが分かった。
アクティブセンシングに基づくロボットによる高度な紙操作に関する研究

本研究では,ロボットによる高度な紙の操作を実現することを目指した.具体的な課題として,紙操作の記述手法の開発,紙の状態をセンシングする技術,および紙を適切に扱うためのロボットハンドの開発を行った.記述手法の開発では,従来研究で提案した折り紙公理に基づき折り操作を記述する手法を拡張し,高度な紙操作に対応可能にした.センシングについては,紙に力を加えるなどしながら能動的に紙の状態を取得するアクティブセンシング技術を開発した.同時に,高度な紙作業に適したロボットハンドを開発した.これらの技術を総合することにより,最終的に袋折りや中割り折りといった高度な紙折り作業に成功した.高度な紙折り作業を行うには,紙の状態とそこへ施す操作を適切に記述することが必要となる.そのため,これまでに筆者らが提案していた折り紙公理に基づく記述方法を見直し,従来対応していなかった視覚フィードバックを利用しやすい記述へと拡張した.具体的な拡張部分は,紙上に座標系を設定する方法をきちんと定義したこと,および操作前後で保持されるべき点や線の情報を詳細に検討して折り紙状態構造体と折り紙操作構造体の二つのデータ構造を定義したことである.この新しいデータ構造を用いて,従来研究で実現していた紙折り操作ではあるが,まず谷折り操作を実装した.その結果,視覚フィードバックを有効に使えるようになったことにより,従来のものよりも精度よい谷折りを実現した.次に,人間の折り紙作業を認識し,上記の記述方法により作業を記録するシステムを構築した.ここではカメラ画像を入力として用い,折り操作前後の画像からどのような折り操作が行われたのかを推定できるようにした.折り紙公理に基づく作業記述が本手法の特徴でもあるため,たんに折り線の位置を推定するのではなく,「どの点をどの線に重ねるように折った」というような,適用公理やそのパラメタまで推定できるようにシステムを構築した.このように,視覚フィードバックを踏まえた作業記述方法を構築し,折り操作の過程を認識できるようになったことで,ロボットによる高度な紙操作手法の研究へとつながる基盤部分が完成したといえる.当初の予定では,紙の合わせ目に指を差し込むなど,ロボットによる作業の構築を最初に行うはずであった.しかし,研究を進めるうちに,従来の紙の状態記述方法では本研究で扱うような複雑な状況を扱うには十分でないことが明らかになったため,次年度以降に計画していた折り紙小売に基づく作業認識および折り操作シミュレーターの開発を先に行うことにした.また,新たに拡張した操作記述方法により谷折りを実現して,より精度の良い折りが実現できることを確認した.このように,視覚フィードバックを踏まえた作業記述方法を構築し,折り操作の過程を認識できるようになったことで,ロボットによる高度な紙操作手法の研究へとつながる基盤部分が完成したといえる.その意味で,当初の計画とは実施順序に変更の必要が生じたものの,研究全体としての進捗は概ね順調であるといえる.本研究では,従来のロボットでは操作が難しかった紙に対して,能動的に紙の状態をセンシングして扱うための「アクティブセンシング」という概念を提案し,ロボットによる高度な紙の扱いを可能にすることを目指している.本年度は,アクティブセンシングに関する手法の開発に特に焦点を当てて研究を行い,結果として,目標に掲げた3種類の折り操作の一つである「袋折り」に成功した.アクティブセンシングに関する手法としては,まず視覚フィードバックを用いながら徐々に二つの頂点位置を合わせる「位置合わせ」の手法を開発した.これによって,特に頂点どうしの重ね合わせで記述される公理2に基づく折り作業を精度よく実行することが可能になった.次に折り紙をずらすことによって紙と紙の隙間を広げる「ずらし動作」の手法を開発した.これによって,従来は位置の正確な認識すら難しかった紙の隙間に対して,効果的に位置を認識して指を挿入することが可能になった.また,紙操作に関する新たな手法として,あらかじめ紙にクセをつけてそのあとの操作を実行しやすくするための「クセづけ」を開発した.紙の操作においては,折りそのものは単純であっても,紙の座屈等の予測不能な紙のふるまいにより操作が成功しない場合がしばしば起こりうる.クセづけによって紙の変化する方向を強制的に決めてしまうことによって,そのような操作の成功率が格段に向上する.これらの結果を要素技術として利用することによって,ロボットによる袋折り作業が実現した.平成27年度は,視覚フィードバックの導入および紙操作の認識に関する研究を行い,本研究の目指す高度な紙操作の研究を行うための基礎的な技術の開発を行った.本年度はその結果を踏まえ,本格的にアクティブセンシングの手法および新たな紙操作の手法について研究を行った.具体的には,アクティブセンシングの手法として,視覚フィードバックに基づく反復操作により徐々に二つの頂点位置を合わせてゆく「位置合わせ」と,紙をずらすことにより紙の隙間広げて安定した認識・操作を実現する「ずらし動作」を開発した.また紙操作の手法として,あらかじめ紙にクセをつけて変化する方向を強制的に決めてしまうことによって紙の予測不能な変化を抑制する「クセづけ」を開発した.これらを要素技術として用いることによって,「袋折り」を実現した.これは本研究で目標としてあげていた3種類の折り操作の一つであり,研究は概ね順調に進展していると評価できる.本研究では,ロボットによる柔軟物操作の研究の一環として高度な紙の操作を実現することを目指し,単純な折り線付け(谷折り)のみでは達成できない「袋折り」などの実現を目的にした.具体的な課題として,紙の状態をセンシングする技術,紙を適切に扱うためのロボットハンドの開発,および紙操作を公理に基づき記述可能なシミュレーターの開発を行った.

特に紙は薄く,折り重なっている場合もあり,一般に状態のセンシングが難しいため,紙に力を加えるなどしながら能動的に紙の状態を取得するアクティブセンシング技術を開発した.本研究で開発した手法として,頂点合わせ操作,ずらし操作,クセ付け操作,光源変化による折り線検出があげられる.これらのアクティブセンシング技術を含め,対象とする折り作業に必要となる個々の紙操作を実現するため,必要な機能を抽出し,特に指先形状や材質,自由度を工夫したロボットハンドを開発した.さらに,高度な紙操作のためには,どのような操作によりどのような折り目がつくのかをシミュレート可能なシミュレーターが必要となる.本研究では折り紙公理と呼ばれる数学理論をもとにして紙の状態および操作を記述しているが,その記述に基づいて折りをシミュレートできるシミュレーターを開発した.このシミュレーターを利用することにより,人間が実際に紙を折った画像のみから,公理に基づき折り作業を抽象的認識することが可能となり,折り作業の見まね学習の可能性が開けた.これらの技術を総合することにより,最終的に袋折りや中割り折りといった高度な紙折り作業をロボットにより実行させることに成功した.本研究では,ロボットによる高度な紙の操作を実現することを目指した.具体的な課題として,紙操作の記述手法の開発,紙の状態をセンシングする技術,および紙を適切に扱うためのロボットハンドの開発を行った.記述手法の開発では,従来研究で提案した折り紙公理に基づき折り操作を記述する手法を拡張し,高度な紙操作に対応可能にした.センシングについては,紙に力を加えるなどしながら能動的に紙の状態を取得するアクティブセンシング技術を開発した.同時に,高度な紙作業に適したロボットハンドを開発した.これらの技術を総合することにより,最終的に袋折りや中割り折りといった高度な紙折り作業に成功した.今後は,ロボットによる高度な紙操作(紙の隙間への指の挿入など)の実現を目指し研究を進める.それと同時に,これまでの研究によって,ある操作の成功率を高めるためには,それ以前の操作が精度よく行われていることが重要であることが分かってきた.そのため,視覚フィードバックを生かした反復的な方法により,谷折りの精度をさらに向上する手法の構築も行う予定である.平成29年度は,残る目標である「中割り折り」と「かぶせ折り」の実現を目指す.そのためには,すでに存在する折り目と逆方向に折る操作や折り目をいちど広げる操作など,これまでの方法では対応できない操作が必要となる.それらに必要な紙の認識・操作手法の開発を行う.ロボット工学当初の予定では,紙の合わせ目に指を差し込むなど,ロボットによる作業の構築を最初に行うはずであった.しかし,研究を進めるうちに,従来の紙の状態記述方法では本研究で扱うような複雑な状況を扱うには十分でないことが明らかになったため,次年度以降に計画していた折り紙小売に基づく作業認識および折り操作シミュレーターの開発を先に行うことにした.
顕微注入法を用いない全卵ゲノム編集方法の開発

ゲノム編集技術は、その正確かつ簡便に狙った遺伝子領域を改変できるという特性から、基礎生物学から、医学、創薬学、農林水産学などの応用分野まで幅広く利用されている技術である。動物にゲノム編集を施す場合、通常、受精卵にゲノム編集ツールを顕微注入法により導入するという方法を用いる。しかしながら、多くの養殖魚の場合、計画的に、かつ、親魚にダメージを与えないで受精卵を得られる魚種は限られており、このことが水産業への当該技術の適用の大きな障害となっている。そこで本研究では、受精卵に顕微注入せずに魚類でゲノム編集個体を作出する方法の開発を目指す。魚類をはじめとする卵性生物では、卵巣以外の組織で卵黄タンパク質を生成し、血流を介して卵に蓄積する。この輸送システムに着目した。つまり、肝臓などでゲノム編集ツールを生成し、それを卵に送り込みゲノム編集を施すというアイデアである。上記のアイデアを実現するために、平成30年度は、メダカを用いて、ビテロゲニンAタンパク質と融合した緑色蛍光タンパク質とルシフェラーぜタンパク質が肝臓から卵に輸送されるか否かを検討した。具体的には、女性ホルモンで発現を誘導するコリオゲニンH遺伝子のプロモーターにビテロゲニンA:ルシフェラーゼ:緑色蛍光タンパク質遺伝子を連結したプラスミドをメダカ受精卵に顕微注入法にり導入した。これらを成魚まで育成し、交配により次世代(F1世代)を作出した。まず、F1世代の受精卵を各F0ペアーから40粒採取し、ルシフェラーゼ遺伝子を検出するプライマーを用いてPCRを行った。これまでのところ、約10ペアーをスクリーニングし、上記プラスミドを有するF1を産卵するペアーを1組得た。これまでに、メダカにおいて、ビテロゲニンBタンパク質のN末端の300アミノ酸を用いることにより、低分子のタンパク質(緑色蛍光タンパク質)を効率的に肝臓から卵に輸送できることを示してきた。しかしながら、同配列では、より高分子のタンパク質(ルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質)では、その輸送効率が大変低いことが判明した。そこで、平成30年度は、ビテロゲニンの異なる分子種であるビテロゲニンAの有効性を検討することとした。また、ビテロゲニンAの部分アミノ酸配列を検討するのではなく、全長配列を用いることとした。その効果を試すためのプラスミドは、全長で10kbpを超えるものであり、作製が困難と思われたが、作製に成功した。また、同プラスミドを有する遺伝子導入メダカの作出を試みた結果、これまでに導入プラスミドを有する次世代を産出する親魚を1組獲得することに成功した。このように、複数の候補配列を検討するための基盤が構築され始め、研究は、おおむね順調に進行していると考えている。ます、平成30年度に作出した、ビテロゲニンA-ルシフェラーゼ-緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するF1個体を用いて、エストロゲン処理により、発現を誘導し、卵へのタンパク質の蓄積を蛍光顕微鏡による蛍光の観察、および、ルミのメーターによる発光の観察を行う。加えて、養殖魚への応用を見据えて、マダイのビテロゲニン遺伝子の単離とメダカをはじめとする他の魚種との相同性を検討する。また、引き続き、魚類細胞のカプセル化条件検討を行う。マイクロインジェクション法を用いないで、迅速にゲノム編集を行う方法の開発を目指している。その方法の1つとして、魚類で一般に見られる、肝臓から卵への卵黄タンパク質ビテロゲニンの輸送システムの利用を考えた。まず、メダカのビテロゲニン遺伝子をin silicoで単離し、既報の他魚種のビテロゲニンタンパク質と比較した、その結果複数の魚類で共通のシグナル配列が翻訳産物の5'側に存在することを見出し、その領域を含む約900塩基に着目した。この900塩基の下流に、緑色蛍光タンパク質遺伝子を連結したものを、エストロゲンの刺激により肝臓で遺伝子発現を誘導するコリオゲニンHプロモーターの下流に配置した人工遺伝子をメダカ受精卵に導入した。この第1世代(遺伝子導入を行なった個体)において、肝臓で発現された緑色蛍光タンパク質が卵に移行していることが確認された。つまり、卵には遺伝子は導入されていないが、タンパク質は肝臓から輸送され、緑色蛍光タンパク質が蓄積されていた。このように、ビテロゲニン遺伝子から単離した約900塩基には、肝臓から卵にタンパク質を輸送する能力があることが明らかとなった。また、メダカ成魚のあらゆる組織に簡便に遺伝子を導入するシステムを開発するために、脂質に目的の遺伝子を付着させたリポソームの使用を試みた。その結果、リポソームを用いて組織に遺伝子導入を行った場合、用いない場合に比べて、広範囲に遺伝子導入が起こり、また、その遺伝子の発現期間も長くなることがわかった。肝臓から卵に輸送するシグナルの特定ができた。

魚類をはじめとする卵性生物では、卵巣以外の組織で卵黄タンパク質を生成し、血流を介して卵に蓄積する。この輸送システムに着目した。つまり、肝臓などでゲノム編集ツールを生成し、それを卵に送り込みゲノム編集を施すというアイデアである。上記のアイデアを実現するために、平成30年度は、メダカを用いて、ビテロゲニンAタンパク質と融合した緑色蛍光タンパク質とルシフェラーぜタンパク質が肝臓から卵に輸送されるか否かを検討した。具体的には、女性ホルモンで発現を誘導するコリオゲニンH遺伝子のプロモーターにビテロゲニンA:ルシフェラーゼ:緑色蛍光タンパク質遺伝子を連結したプラスミドをメダカ受精卵に顕微注入法にり導入した。これらを成魚まで育成し、交配により次世代(F1世代)を作出した。まず、F1世代の受精卵を各F0ペアーから40粒採取し、ルシフェラーゼ遺伝子を検出するプライマーを用いてPCRを行った。これまでのところ、約10ペアーをスクリーニングし、上記プラスミドを有するF1を産卵するペアーを1組得た。これまでに、メダカにおいて、ビテロゲニンBタンパク質のN末端の300アミノ酸を用いることにより、低分子のタンパク質(緑色蛍光タンパク質)を効率的に肝臓から卵に輸送できることを示してきた。しかしながら、同配列では、より高分子のタンパク質(ルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質)では、その輸送効率が大変低いことが判明した。そこで、平成30年度は、ビテロゲニンの異なる分子種であるビテロゲニンAの有効性を検討することとした。また、ビテロゲニンAの部分アミノ酸配列を検討するのではなく、全長配列を用いることとした。その効果を試すためのプラスミドは、全長で10kbpを超えるものであり、作製が困難と思われたが、作製に成功した。また、同プラスミドを有する遺伝子導入メダカの作出を試みた結果、これまでに導入プラスミドを有する次世代を産出する親魚を1組獲得することに成功した。このように、複数の候補配列を検討するための基盤が構築され始め、研究は、おおむね順調に進行していると考えている。今後は、肝臓以外で発現させたタンパク質を卵に輸送するシステムの開発を行う。また、成魚の組織に効率的に遺伝子を導入する方法の開発を行う。ます、平成30年度に作出した、ビテロゲニンA-ルシフェラーゼ-緑色蛍光タンパク質遺伝子を有するF1個体を用いて、エストロゲン処理により、発現を誘導し、卵へのタンパク質の蓄積を蛍光顕微鏡による蛍光の観察、および、ルミのメーターによる発光の観察を行う。加えて、養殖魚への応用を見据えて、マダイのビテロゲニン遺伝子の単離とメダカをはじめとする他の魚種との相同性を検討する。また、引き続き、魚類細胞のカプセル化条件検討を行う。
サイトカインコーディングとマイクロ粒子センサアレイによるがんの可視化

本研究は,300種以上が発見されているサイトカインと呼ばれる一群の情報伝達物質のコード情報と経時的な変化を測定し,早期のがん部位を可視化することを目的とした。本年度は,サイトカイン・センサアレイの製作,ケースコントロールスタディ,及び体内ネットワークモデルによるがん部位の可視化に取り組んだ。1.サイトカイン・センサアレイの製作光開裂性マイクロ粒子の開発を行い,シグナル増幅法の増幅特性を検証した。マイクロ粒子センサアレイの基本要素技術の構築により,同一検体から複数のサイトカインを同時分析するセンサアレイを実現するめどをつけた。2.ケースコントロールスタディ肺がんに続き,大腸がんに着目してケースコントロールスタディ(各群80名)を実施し,27項目のサイトカイン群を血液検体から同時分析した。サイトカインの分析には,初年度に購入した磁気ビーズ法を用いたマルチ分析システムを用いた。その結果,13種類のサイトカインで大腸がん患者と健常者に有意差が観察された(p < 0.05)。3.体内ネットワークモデルによるがん部位の可視化大腸がんとサイトカイン群との関連性を検証するために,(1) Mann-Whitney検定,(2)ロジスティック回帰分析および(3) Receiver Operating Characteristic(ROC)解析を行った。その結果,大腸がんにおいても部位特異的なサイトカインによるロジスティックモデルが構築された。以上により,肺がんや大腸がんに特異的なサイトカインの組み合わせを発掘し,そのセンサアレイ開発のめどをつけるとともに,これらがんマーカーががんの存在とその進行度に応じて変化する可能性があることを示すことができた。また,本年度の成果は,米国科学雑誌「PLOS ONE」など国内外の雑誌論文5編,学会発表5件,著書1編等で報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,抗体修飾した抗原内包型の光開裂性マイクロ粒子の開発と,シグナル増幅法の基礎研究を行うために,下記の3課題に取り組んだ。1.光開裂性マイクロ粒子の作成1)骨格層,2)脂質二重膜,3)外殻層からなる直径2ミクロンほどのマイクロ粒子を試作した。外殻層に光触媒であるTiO2を用いることで光開裂性を付与し,メチレンブルーの分解スピードから光触媒活性を評価して光開裂性を実証し,所望の結果を得た。本年度は,進歩性・新規性の担保に注力し,光開裂性マイクロカプセルの特許出願を優先した。2.シグナル増幅法の基本特性の測定光開裂性マイクロ粒子の作成に手間取ったため,本取り組みはやや遅れている。抗体密度の最適化に関しては,抗体固定化効率を自己組織化単分子膜のプローブ分子のアルキル鎖長で調整できるところまでを実験的に示した。応答時間,シグナル増幅率については,検証を続けている。3.サイトカインセンサの開発アルカリフォスファターゼ標識抗サイトカイン抗体(コンジュゲート)を有機合成して,競合法と発光基質を用いたイムノアッセイー光検出系を設計・試作した。光電子増倍管を用いた検出機構も試作し,サイトカインセンサの性能評価を実施できる状況になった。一方で,被測定物質の同定にも着手し,ケースコントロールスタディの予備実験を開始した。その結果をもとに,肺がんリスク状態の評価方法,進行度合いの評価方法に関する特許出願を行った。また,本年度の成果は,国内外の雑誌論文5編,学会発表5件,著書1編等で報告した。申請時に計画した本年度実施すべき3つの課題のうち,光開裂性マイクロ粒子の作成を完了するとともに,特許出願した。残り2つの課題である「サイトカイン・コーディングに基づくがん部位に関する体内ネットワークのモデル化」と「サイトカイン・センサアレイによるがん部位の可視化」のうち,体内ネットワークのモデル化についても着手している。このように,本年度の課題についてはやや遅れている部分もあるが半ば以上を完了することで目標達成のめどをつけた。また,次年度の課題についても先行して着手している。

その結果,大腸がんにおいても部位特異的なサイトカインによるロジスティックモデルが構築された。以上により,肺がんや大腸がんに特異的なサイトカインの組み合わせを発掘し,そのセンサアレイ開発のめどをつけるとともに,これらがんマーカーががんの存在とその進行度に応じて変化する可能性があることを示すことができた。また,本年度の成果は,米国科学雑誌「PLOS ONE」など国内外の雑誌論文5編,学会発表5件,著書1編等で報告した。本研究は,300種以上が発見されているサイトカインと呼ばれる一群の情報伝達物質のコード情報と経時的な変化を測定し,早期のがん部位を可視化することを目的とした。本年度は,抗体修飾した抗原内包型の光開裂性マイクロ粒子の開発と,シグナル増幅法の基礎研究を行うために,下記の3課題に取り組んだ。1.サイトカインのコーディングサイトカインとがんの相関性を考察するために,PubMed (国立生物工学情報センター)を用いて1977年から2016年の40年間の英文学術論文を検索した。その文献数などをエビデンスとし,がんとの相関性が期待されるサイトカイン上位10種類,TNF-アルファ(9.8%),IL-6 (6.4%),TGF-ベータ(5.9%),IL-10 (2.5%),IL-4 (2.4%),IL-12 (2.1%),IL-1ベータ(2.1%),IFN-アルファ(2.0%),IL-17A (0.5%),IL-18 (0.5%)を同定した。2.ケースコントロールスタディ肺がん患者のケースコントロールスタディ(各群35名)を実施し,27項目のサイトカイン群を唾液,口腔液,血液の3検体を用いて同時分析した。サイトカインの分析には,前年度に購入した磁気ビーズ法を用いたマルチ分析システムを用いた。その結果,12種類のサイトカインで肺がん患者と健常者に有意差が観察された(p < 0.05)。3.体内ネットワークモデルの構築肺がんとサイトカイン群との関連性を検証するために,(1) Mann-Whitney検定,(2)ロジスティック回帰分析および(3) Receiver Operating Characteristic (ROC)解析を行った。その結果,IL-10 (オッズ比:1.156)とIP-10オッズ比:1.000)によるロジスティックモデルが構築された。また,本年度の成果は,国内外の雑誌論文3編,学会発表6件,著書1編等で報告した。申請時に計画した本年度実施すべき3つの課題のうち,サイトカインのコーディングとケースコントロールスタディを実施した。特に,医工連携してケースコントロールスタディに本格的に取り組むことができたのは,研究進展の大きなドライビングフォースとなった。残りの課題「体内ネットワークモデルの構築」についても実施しており,おおむね完了できた。本研究の核となるのは,サイトカインセンサの開発と臨床研究(ケースコントロールスタディ)である。
歯髄におけるPAR-1活性化カスケードによるCOX-2産生相互ネットワークの解明

本研究の目的は、ヒト歯髄培養細胞におけるカリクレインのPAR-1活性化と、カリクレインとプラスミンおよびブラジキニンとの相互ネットワークを介したCOX-2産生のメカニズムを解明することである。カリクレインは、COX-2 mRNAの発現を濃度-時間依存的に増加させた。カリクレインはCOX-2タンパク質の産生を促進し、この効果はPAR-1阻害剤によって抑制された。プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の探索では、細胞内Ca2+濃度測定ではその効果は確認されなかった。しかし、カリクレインとブラジキニンの刺激は、単独で刺激された場合と比較してCOX-2タンパク質の発現を増強した。本申請の目的は、ヒト歯髄培養細胞においてカリクレインのPAR-1活性化を介したCOX-2産生機序、およびプラスミンやブラジキニンとの相互ネットワークの存在を明らかにすることにある。初年度にはまずカリクレインのCOX-2産生機序を報告済みのプラスミンと比較しながら明らかにする計画であった。具体的には、カリクレイン作用時のCOX-2 mRNA発現(リアルタイムPCR法)、タンパク質発現(Western Blot法)およびNFATc1のDNA結合活性を可視化することを目的としてGel shift assayを行う。また状況によってプラスミンやブラジキニンとの相互作用についても検討を開始する。まずリアルタイムPCR法にてカリクレインはCOX-2mRNAの発現を濃度依存的、時間依存的に上昇させることを確認した。またこれは確認済みであったRT-PCRと同様の結果であった、つぎにウェスタンブロット法にてタンパク質発現についても検討し、カリクレインによるCOX-2タンパク質発現の促進を確認した。またいずれもPAR-1阻害剤により効果は抑制された。さらに培養上清中に放出されるPGE2に関しても同様の傾向があった。上記結果はJ Cell Biochemにて報告した。Gel shift assayに関しては計画とは異なり非アイソトープで行うこととし、現在準備段階にある。同時に、ブラジキニンとの相互作用に関する実験も開始し細胞内カルシウムイオン濃度変化についてデータの収集を行っている。また、カリクレイン同様にPAR-1活性化に関与する可能性のあるセリンプロテアーゼを模索し、Neuropsinがヒト歯髄培養細胞でCOX-2発現に関与する可能性について日本歯科保存学会学術大会にて報告した。初年度の計画の多くは達成されており、計画中に含まれたGel shift assayも準備段階ではあるが進行していること。替わりに相互作用に関するデータの収集を開始できていること、さらにデータの一部で論文投稿が完了していることから、おおむね順調であるといえる。平成28年度の実施計画として、まずgelshift assayによるカリクレインのCOX-2産生シグナルにおける転写因子NFATc1の転写活性についての検索があった。しかしながらデータ収集に難航し、他のNFATサブタイプの動向も合わせて検索中である。また、gelshift以外の転写活性測定キットによる検索も検討中である。そちらは一度傾向の確認は済んでいるが、有意差の得られる状況ではないため、データ数を増やす必要はある。プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の検索では現在のところ細胞内カルシウムイオン濃度([Ca2+]i)の変化について検索しているが、現時点で相乗効果を確認できていない。しかしながら過去の報告ではそれより下流のシグナル伝達における相乗効果が期待できるため、継続してCOX-2産生経路まで検索を行う。また、過去の報告同様に炎症性サイトカインとの相乗効果ではCOX-2 mRNA、タンパク質で確認できたことから、いずれのパターン、シグナル経路で効果が現れるのかを検索中である。また、PGE2量についてもELISA法にて計測を行う予定である。同時に[Ca2+]i動態の変化の由来についての検索も行った。すなわち細胞膜上のカルシウムイオンチャネル阻害剤であるSKF96365の効果を検索した。その結果、小胞体からの放出というよりはむしろ細胞外からの流入によるものが大半である結果を得た。現在は追加として小胞体からのCa2+の放出に関与するIP3産生量の測定をELISA法にて検索を予定している。gelshift assayによるカリクレインのCOX-2産生シグナルにおける転写因子NFATc1の転写活性の検索に難航している。新規にはじめた手技なのでテクニカルエラーであるのか、実際の事象を反映しているのかの判断も思わしくない。シグナル伝達が明確な刺激タンパクを新規購入し、手技の精度の安定化を図る必要があるとも考えられる。また、炎症性サイトカインとの相乗効果による結果は期待できるデータが得られているが、プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる細胞内カルシウムシグナル同士の相乗効果は得られていない。今後PKCシグナルとの相乗効果についても同時に検索して、データの得られるほうで進行する。上記からやや遅れていると判断される。まずカリクレインのCOX-2産生機序を報告済みのプラスミンと比較しながら明らかにすることを計画した。リアルタイムPCR法にてカリクレインはCOX-2mRNAの発現を濃度依存的、時間依存的に上昇させることを確認した。つぎにウェスタンブロット法にてタンパク質発現についても検討し、カリクレインによるCOX-2タンパク質発現の促進を確認した。

さらに培養上清中に放出されるPGE2に関しても同様の傾向があった。また、シグナル伝達過程でcalcineurinを介することが示唆された。Gel shift assayに関してはデータ収集に難航し、転写活性測定キットによる検索で転写活性促進を確認した。プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の検索では細胞内カルシウムイオン濃度([Ca2+]i)の変化について相乗効果を確認できなかった。しかしそれは過去の炎症性サトカインとブラジキニンの報告と同様である。COX-2タンパク質発現で、カリクレインとブラジキニンでそれぞれ単独作用に比べ増強することは確認した。しかしながら相乗効果という観点からすると弱く、相加、もしくは一方にマスクされている状況であることが示唆された。同時にカリクレインによる[Ca2+]i動態の変化の由来についての検索も行った。すなわち細胞膜上のカルシウムイオンチャネル阻害剤であるSKF96365の効果を検索した。その結果、小胞体からの放出というよりはむしろ細胞外からの流入によるものが大半である結果を得た。本研究の目的は、ヒト歯髄培養細胞におけるカリクレインのPAR-1活性化と、カリクレインとプラスミンおよびブラジキニンとの相互ネットワークを介したCOX-2産生のメカニズムを解明することである。カリクレインは、COX-2 mRNAの発現を濃度-時間依存的に増加させた。カリクレインはCOX-2タンパク質の産生を促進し、この効果はPAR-1阻害剤によって抑制された。プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の探索では、細胞内Ca2+濃度測定ではその効果は確認されなかった。しかし、カリクレインとブラジキニンの刺激は、単独で刺激された場合と比較してCOX-2タンパク質の発現を増強した。研究計画どおり、プラスミン・カリクレイン・ブラジキニンによる相互作用の可能性の検索および[Ca2+]iの上昇機構の詳細な検索を行う。特に[Ca2+]iの上昇機構の検索に関しては過去にプラスミンとCa2+-ATPase阻害剤であるThapsigargin存在下での検討を行い要領を得ている。今回は細胞膜カルシウムイオンチャネルの阻害剤の効果を検討を行う。また細胞内カルシウムイオンの標的タンパクであるPKCの動態は非常に重要であると考えられる。calcineurin-NFATシグナルだけでなくPKC活性化についても同時に検索を行ったほうが効率的であり、進行状況によってはPKC動態やPMAにより活性化することによる相乗効果の検討への変更を考える。gelshift assayによる検索だけでなく、転写活性測定キットを用いた検索も再検討する。
高階の帰納的関数の研究

1.(K,【less than or equal】)の部分順序集合としてどのようとなものが許されるかという問題に関して、濃度が連続体の濃度2^<κo>以下のいかなる型の順序構造も可能であるとこが比較的容易に分かる。連続体仮説を仮定するとき、このような順序構造はすべて(K,【less than or equal】)において一様に定義可能であることを示した。すなわち有限個のパラメ-タ-(実際には8個)を変化させることにより、濃度が2^<xo>以下のすべての順序構造を一つの定義式を用いて(K,【.ltireq.】)の中で表現することができ2.濃度2^<χo>の順序集合を適当にとって、実数全体のなす集合2^<χo>をその演算を含めたコ-ドすることができる。したがって、連続体仮説を仮定するとき、実数の理論は本質的に(K,【less than or equal】)の理論の中に埋め込まれる。3.連続体仮説を仮定するとき、濃度が2^<χo>以下のイデアルに対して、その完全対(exact pair)が存在する。したがって、Kの濃度2^<χo>以下の部分集合は2個の型の2の対象によりコ-ドできる。これを用いて、(V_<w+2>,【element】)の理論を(K,【less than or equal】)の理論に埋め込むことができる。この結果は本質的に連続体仮説を用いており、連続体仮説を用いない証明を見出すことは今後の研究課題である。4.K-{Φ}に極小元が存在するか否かという問題に関しては最終的な結論を得るに到らなかった。無限ゲ-ムに関するΔ^1_2-決定性公理を仮定すれば、ΦのsuperjumpΦ^′がK-{Φ}の極小元であることが示される。1方、V=Lを仮定するとき、Φ^′は極小でないことが既に知られているので、Φ^′がK-{Φ}の極小元であるという主張はZFCと独立な命題となる。しかしV=Lの仮定のもとで、K-{Φ}の極小元が存在するか否かは依然として未解決である。
準安定凝縮相の作り分けに用いる"高品質中性フリーラジカルビーム"の生成技術の改良

中性フリーラジカルの高純度かつ運動量の揃った定常フラックスビームの高効率生成法として研究代表者が提案し実験実績を挙げてきたPDECB法およびPDINIB法について,素過程の理論設計と精密実験に基づいて,生成可能な中性フリーラジカル種の多様化および生成効率とビーム制御性の一層の向上を達成した.具体的には,以下の1.と2.の取り組みを並行して進め成果を得た.1.希薄磁性半導体(Ga,Cr)Nの母材となるIII族窒化物半導体GaNの極低欠陥密度薄膜の低温エピタキシャル成長に利用する高品質中性フリーラジカルビームをPDECB法により生成する技術の更なる高効率化を達成した.具体的には,PDECB原料分子の光ラジカル解離機構についての理論と実験の両面からの検討をもとに,(CH_3)_2GaN_3等の有機III族azideを原料分子とし(CH_3)_2GaN等の有機III族nitreneビラジカロイドをPDECB法によって生成する際に,光ラジカル解離の量子効率がエンハンスされる条件(熱アシスト,磁場アシスト,原料化学種の電子構造等)を詳細に明らかにした.2.PDECB法を応用したラジカルビームエピタキシー法によるGaN薄膜の低温成長時にPDINIB法により生成した磁性原子Crの中性ビームを照射して希薄磁性半導体(Ga,Cr)Nの高品質エピタキシャル薄膜を成長させる実験の条件出しとして,中性Cr原子が膜中に取り込まれ意図した準安定凝縮相(希薄磁性半導体相)が形成される効率が基板表面に対する中性Cr原子ビームの入射角に応じてどのように変化するか精密に調べることを目標に,RBNR装置試作機において高品質中性Cr原子ビームの生成条件を最適化し運動量の揃った平行ビームを制御性良く生成できるようにした.中性フリーラジカルの高純度かつ運動量の揃った定常フラックスビームの高効率生成法として研究代表者が提案し実験実績を挙げてきたPDECB法およびPDINIB法について,素過程の理論設計と精密実験に基づいて,生成可能な中性フリーラジカル種の多様化および生成効率とビーム制御性の一層の向上を達成した.具体的には,以下の1.と2.の取り組みを並行して進め成果を得た.1.希薄磁性半導体(Ga,Cr)Nの母材となるIII族窒化物半導体GaNの極低欠陥密度薄膜の低温エピタキシャル成長に利用する高品質中性フリーラジカルビームをPDECB法により生成する技術の更なる高効率化を達成した.具体的には,PDECB原料分子の光ラジカル解離機構についての理論と実験の両面からの検討をもとに,(CH_3)_2GaN_3等の有機III族azideを原料分子とし(CH_3)_2GaN等の有機III族nitreneビラジカロイドをPDECB法によって生成する際に,光ラジカル解離の量子効率がエンハンスされる条件(熱アシスト,磁場アシスト,原料化学種の電子構造等)を詳細に明らかにした.2.PDECB法を応用したラジカルビームエピタキシー法によるGaN薄膜の低温成長時にPDINIB法により生成した磁性原子Crの中性ビームを照射して希薄磁性半導体(Ga,Cr)Nの高品質エピタキシャル薄膜を成長させる実験の条件出しとして,中性Cr原子が膜中に取り込まれ意図した準安定凝縮相(希薄磁性半導体相)が形成される効率が基板表面に対する中性Cr原子ビームの入射角に応じてどのように変化するか精密に調べることを目標に,RBNR装置試作機において高品質中性Cr原子ビームの生成条件を最適化し運動量の揃った平行ビームを制御性良く生成できるようにした.交付申請書の研究実施計画に沿って,以下の1.2.を並行して進めた.1.中性フリーラジカルの高純度かつ運動量の揃った定常フラックスビームの高効率生成法として研究代表者が提案し実験成果を挙げてきたPDECB法およびPDINIB法について,本研究では,まず,素過程の理論設計と精密実験に基づいて,生成できるフリーラジカル種の更なる多様化および効率と制御性の更なる向上を図った.2.さらに,PDECB法およびPDINIB法により,中性フリーラジカルの表面反応選択性を利用して作り分けることのできる様々な準安定凝縮相薄膜について,応用分野を拡げるための多面的な検討を行なった.とくに,平成18年度の研究により新たに見出した応用分野として,NEMS(Nano-ElectroMechanical System)に用いる所望のエネルギー散逸特性を有する人工材料の設計法として研究代表者が提案したPhonon-Band Engineering手法について,高品質中性フリーラジカルビームを利用して実現される無欠陥のラテラル歪超格子から成る弾性接触動摩擦系をモデルに採り,確立を目指した.具体的には,Phonon-Band Engineering手法の開発の一環として,系統的な非平衡分子動力学シミュレーションによる理論解析に基づいて"ナノ動摩擦法則(メゾスコピック系における弾性接触条件下での動摩擦法則)の解明"および"フォノン物性に基づくナノ動摩擦法則の原子論的由来の解明"に取り組み,様々な新たな知見を得た.さらに,この成果を踏まえて,高品質中性フリーラジカルビームを利用して実現される無欠陥のラテラル歪人工超格子から成る弾性接触動摩擦系をモデルに採り,この人工超格子の材料設計にPhonon-Band Engineering手法を活用するための基礎研究を行なった.交付申請書の研究実施計画に沿って,以下の1.2.を並行して進めた.

1.中性フリーラジカルの高純度かつ運動量の揃った定常フラックスビームの高効率生成法として研究代表者が提案し実験成果を挙げてきたPDECB法およびPDINIB法について,平成19年度は,素過程の理論設計と精密実験に基づいて,生成できるフリーラジカル種の更なる多様化および効率と制御性の更なる向上を進めた.2.さらに,PDECB法およびPDINIB法により,中性フリーラジカルの表面反応選択性を利用して作り分けることのできる様々な準安定凝縮相薄膜について,応用分野を拡げるための多面的な検討も進めた.とくに,本研究により新たに見出した応用分野として,NEMS(Nano-ElectroMechanicalSystem)に用いる所望のエネルギー散逸特性を有する人工材料の設計法として研究代表者が提案したPhonon-Band Engineering手法について,高品質中性フリーラジカルビームを利用して実現される無欠陥のラテラル歪超格子から成る弾性接触動摩擦系をモデルに採り,確立を目指した.具体的には,Phonon-Band Engineering手法の開発の一環として,"ナノ動摩擦法則(メゾスコピック系における弾性接触条件下での動摩擦法則)の解明"および"フォノン物性に基づくナノ動摩擦法則の原子論的由来の解明"に取り組み,平成19年度も,様々な新たな知見を得た.さらに,これらの成果を踏まえて,高品質中性フリーラジカルビームを利用して実現される無欠陥のラテラル歪人工超格子から成る弾性接触動摩擦系をモデルに採り,この人工超格子の材料設計にPhonon-Band Engineering手法を活用するための基礎研究を進展させた.
光合成炭素代謝の統御に関与するプロテインキナーゼの探索とシグナル伝達の分子機構

C4光合成の律速酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)をとりあげ、1)本酵素の可逆的リン酸化による活性調節の動態の解明、2)このリン酸化に関与するプロテインキナーゼ(PK)の同定とこれに連なるシグナル伝達機構の解明および、3)本酵素遺伝子の発現調節すなわち、転写やmRNAの安定性などの段階における調節機構の解明を目指す。今年度はトウモロコシを材料として1)種々の条件下、すなわち、概日リズム、CO_2濃度、N源の供給量、湿度、低温などがリン酸化に及ぼす影響を調べた。リン酸化PEPCとのみ特異的に反応する抗体を開発したのでこれによる解析を行った。光のみならず、PEPCから生成する代謝産物による補償的フィードバック制御機構の存在が示唆された。2)PEPC-PKの高度精製標品をもちいて、本酵素がチオレドキシン(Trx)を介するRedox制御を受けることを示唆する知見を得た。これは細胞質のPKでTrxによる制御としてははじめてのものである。3)PEPCのリン酸化の促進にはCa^<2+>が必要であることが細胞レベルで示唆されているので、植物特有のCa^<2+>依存性PK(CDPK)に注目してきた。とくに低温で誘導される分子種については、イネを用いて過剰発現形質転換株を作出したところ、顕著に低温および塩ストレス耐性が高まった。4)PEPCのmRNAの安定性が明条件下で高く、暗条件下で低いことをみいだしているが、今回、明暗で活性の変動するRNase分子種を見い出した。
細胞性免疫機構の維持・破綻に関与する低分子量G蛋白質Rit1の機能解析

マクロファージ等の貪食細胞で活発に認められるファゴサイトーシスは、感染性病原体などの外来性異物を認識し、細胞内へ取り込み、分解・処理した後、獲得免疫を誘導する重要なエンドサイトーシス経路である。本研究課題では、ライブセルイメージング局在解析、遺伝子ノックアウト、蛋白質の過剰発現解析などにより、低分子量GTPaseの一つであるRit1が、IgGによりオプソニン化された異物を取り込むFcγレセプター介在性ファゴサイトーシスの重要な制御因子であることを突き止めた。Rit1が貪食過程に関与するという知見は、これまで全く知られていない新規パラダイムである。<多色蛍光ライブセル観察によるRit1と各種貪食マーカーとの時空間的な相関関係の明確化>ファゴゾーム形成時におけるRit1の詳細な細胞内局在は不明である。そこで本年度は、ファゴサイティックカップの形成・閉鎖に重要なPI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3を認識する蛍光プローブ(PLC-PH、Akt-PH)を用いてRit1との多色蛍光ライブセル観察を行った。RAW264マクロファージにYFP-Rit1とCFP-PLC-PHあるいはCFP-Akt-PHを共発現させ、Zymosanの貪食過程を顕微鏡観察したところ、Rit1はこれらのマーカーと極めてよく共局在することが明らかとなった。Rit1のC末端領域はこれまでに、PI(3,4,5)P3と結合することが報告されている。そこで、Rit1の全長リコンビナント蛋白質を作製し、フォスホイノシチドとの直接的な結合について検討した。GST-Rit1とPIP strip membraneを用いてin vitro binding assayを行ったところ、Rit1はPI(3,4,5)P3のみならずPI(4,5)P2と直接結合することが判明した。<活性化型Rit1結合プローブによるRit1活性化状態の追跡>Rit1の活性化型はこれまでにRGL3と結合することが報告されている。そこで、貪食過程におけるRit1の活性化状態を調べる目的でRGL3のGST融合蛋白質を作製した。予備実験として、Rit1のGTP及びGDP結合変異体を発現させたCell Lysateを用いてGST pull down assayを行ったところ、作製したリコンビナントはRit1のGTP結合型に強い親和性を示した。現在、この精製蛋白質を用いて貪食過程におけるRit1の活性化状態を検討中である。Rit1 GTPaseはZymosanの貪食過程においてファゴサイティックカップに集積する。また、Rit1のGDP結合型を過剰発現するとZymosanの取り込みが抑制されることがわかっている。本年度は、この蛋白質のファゴサイトーシス過程における普遍的重要性を確認するために、IgGによりオプソニン化された異物を取り込むFcガンマーレセプター介在性ファゴサイトーシス経路でのRit1の関与の有無について検討を行った。GFP-Rit1をRAW264マクロファージに発現させ、オプソニン化赤血球の取り込みを共焦点顕微鏡でライブセル観察したところ、Zymosanの貪食時と同様にFcガンマーレセプター介在性ファゴサイトーシス過程でもRit1がファゴサイティックカップに集積することが明らかとなった。また、GDP結合型Rit1の過剰発現では、貪食の抑制が確認された。以上の結果は、Rit1 GTPaseがZymosanの貪食に特異的な制御因子ではなく、ファゴサイトーシスの普遍的な調節因子である可能性を示唆するものである。次に、Rit1の蛋白質レベルでの発現について調べるために、Rit1に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。内在性Rit1蛋白質は、RAW264マクロファージ及び骨髄由来マクロファージで同程度の発現レベルを示すことが明らかとなった。この結果を踏まえ、現在、RAW264マクロファージにおいてRit1のノックアウトを行うために、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを立ち上げ、Rit1のノックアウトセルラインの樹立を目指している。Rit1に対する特異的抗体で内在性Rit1蛋白質の発現をマクロファージで検出できたことを踏まえ、本年度はCRISPR/Cas9システムによるRit1 GTPaseのノックアウト(KO)細胞株の樹立を目指した。マウスRit1のORF領域のN末端側にsgRNAターゲット配列を2つデザインし、ピューロマイシン耐性マーカを持つプラスミドpSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459 Addgeneより入手)にターゲット配列をそれぞれ挿入した。これらのプラスミドをRAW264マクロファージに遺伝子導入し、ピューロマイシンの存在下で培養後、限界希釈によりシングルセル由来のコロニーを約200クローン選択した。これらのクローンについてウエスタンブロッティングによるRit1 KO細胞株のスクリーニングを行ったところ、そのうち3クローンがRit1の蛋白発現を消失していることがわかった。次に、樹立したRit1 KO細胞株を用いて、Fcγレセプターを介した貪食ターゲットの取り込みを定量化したところ、いずれの細胞株においても貪食の抑制が認められた。さらに、これらのファゴゾーム形成の抑制がオフターゲット効果によるものか否かについて検討した。Rit1 KO細胞株に野生型のRit1を発現させ、ファゴゾームの形成能が上昇するかどうか調べたところ、野生型Rit1の発現により貪食ターゲットの取り込みが回復することが明らかとなった。以上の結果は、内在性Rit1蛋白質が、マクロファージにおける貪食制御のキーファクターであることを支持するものである。