hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトパピローマウイルスの増殖期における相同組換えを利用したDNA複製機構の解明

パピローマウイルスのE1のタンパク質量が調節されていることが、潜伏・増殖期の両方において重要である。本研究では、16型ヒトパピローマウイルスのE1とG2/Mチェックポイントタンパク質であるWee1は細胞内で結合することを示した。また、様々なヒト細胞からWee1をノックダウンすると、強制発現させたE1のタンパク質量が低下した。逆にWee1を過剰発現させると、E1のタンパク質量が増加した。HPV16ゲノムを維持するW12細胞よりWee1をノックダウンするとHPV16 DNAのコピー数が低下した。これらのことは、E1はWee1により安定化されて、HPVゲノムの維持を正しく行うことを示唆している。ヒトパピローマウイルス(HPV)のゲノムは環状二本鎖DNAである。ウイルスは上皮の基底細胞に侵入し、一過性にウイルスゲノムが増加する。そして、細胞の分裂とともに娘細胞に分配され、維持される。宿主細胞が分化を開始すると、ウイルスは増殖へとむかう。その過程で維持複製から増殖複製へと切り替わるとその効率は劇的に上昇する。増殖複製ではタンデムにつながったゲノムが検出される。この多量体DNAを1単位に切断する際、HPVは相同組換え反応を利用すると考えている。そこで、相同組換え因子の増殖複製での関与を調べた。そして、相同組換え因子Rad51がHPV増殖複製に関与することを示唆する結果を得た。16型HPVゲノムを維持する子宮頸部病変由来W12細胞より、Rad51をsiRNAによりノックダウンし、細胞をカルシウム添加により分化させた。細胞から環状DNAを抽出し、RT-PCRによりHPV DNAのコピー数を定量した。コピー数は未分化の細胞ではコントロールと同等であったが、分化細胞ではRad51ノックダウンにより、コントロールの37%に減少していた。このことは相同組換え反応が増殖複製に関与することを示唆している。HPV増殖複製に必須なHPV E1 DNAヘリカーゼをSf9細胞で発現させ、精製した。また、HPV E1と結合し、E1のタンパク質安定性に関わるチェックポイント因子であるWee1をSf9細胞で発現させ、精製した。E1の発現が細胞の数多くのタンパク質量を変化させることを見いだしている。ゲノムのDNA複製装置が損傷DNAに遭遇した場合、複製装置のPCNA(増殖細胞核抗原)のK164がユビキチン化される。モノユビキチン化された場合には損傷乗り越え複製DNAポリメラーゼがリクルートされ、損傷DNAに対してDNA合成が行われる。ポリユビキチン化された場合には相同組換え反応により損傷のないDNAを鋳型にDNA合成が行われる。HPV DNAの増殖複製においてもユビキチンを介して組換え反応を利用するようなメカニズムがあるのではないかと考えた。HPV DNAの複製に必須のHPV E1ヘリカーゼはユビキチン化され、HPV DNA複製に影響を与える。HPVのユビキチンリガーゼを探索する目的で様々なユビキチンリガーゼをノックダウンし、細胞内でのHPV複製効率を測定した。また、PCNAのユビキチン化酵素であるRad18を精製し、HPVタンパク質との相互作用を検討中である。Wee1ノックダウンによりE1のタンパク質量が減少する。このことから、Wee1はE1と結合し安定化すると考えていた。しかし、Wee1ノックダウンによりE1を分解するタンパク質複合体であるAPCを活性化することがわかった。このことから、Wee1ノックダウンによる効果がE1との結合がなくなったことによるものか、単にAPCによる分解が促進したものか区別ができなくなった。また、E1とWee1の精製タンパク質同士の結合は検出できるものの、細胞内での結合が検出できない。HPV E1タンパク質はDNAヘリカーゼであり、増殖複製に必須である。これまでにWee1タンパク質をノックダウンするとE1タンパク質の量が減少すること、また、Wee1はE1と結合することを示した。これらのことから、Wee1はE1と結合し、安定化すると考えていた。しかし、2015年、マウスにおいてWee1をノックダウンすると、E1タンパク質のE3ユビキチンリガーゼであるAPC複合体が活性化するという報告があった。つまり、Wee1タンパク質のノックダウンによるE1タンパク質の減少に、APC複合体の活性化が寄与している可能性がある。そこで、Wee1に加えて、APC複合体のコアタンパク質であるCdc27をノックダウンしたところ、それでもE1タンパク質の量が減少した。このことから、APC複合体の活性化が寄与している割合は少ない、またはcdc27ノックダウンによりさらに未知のHPV E1のE3ユビキチンリガーゼが活性化されると考えられる。出産による中断をしたためヒトパピローマウイルス(HPV)は約8 kbpの環状DNAをゲノムとしてもつ。ウイルスDNAの複製には、ウイルスゲノムがコードするDNAヘリカーゼであるE1と、ウイルスDNAの複製起点に結合するE2、宿主細胞の複製因子が必要である。

現在170種類以上のHPVの型が報告されているが、日本では16型HPVが最も多く子宮頸がんから検出されることから、HPV16の複製機構について解析を行っている。ウシパピローマウイルスE1はAnaphase-promoting Complex (APC)によりユビキチン化され、分解誘導されることが示唆されている。ヒト胎児腎293細胞よりAPCのサブユニットであるcdc27をノックダウンし、HPV16 E1を強制発現させたところ、E1のタンパク質レベルが上昇した。また、HPV16 E1のC末端に位置するAPC認識配列は3ヶ所存在し、それぞれをアラニンに置換したE1タンパク質についても同様に解析した。E1(R619A/L622A)やE1(R537A/L540A)のタンパク質レベルはcdc27ノックダウンにより増加したが、E1(K628A/E629A)のタンパク質レベルはcdc27をノックダウンしても変化がなかった。これらのことから、HPV16 E1もK628/E629を介してAPCにより制御を受けている可能性がある。K628/E629はDNAヘリカーゼドメインにあることから、E1のDNA複製活性がAPCによる制御に影響を与えるか検討が必要である。パピローマウイルスのE1のタンパク質量が調節されていることが、潜伏・増殖期の両方において重要である。本研究では、16型ヒトパピローマウイルスのE1とG2/Mチェックポイントタンパク質であるWee1は細胞内で結合することを示した。また、様々なヒト細胞からWee1をノックダウンすると、強制発現させたE1のタンパク質量が低下した。逆にWee1を過剰発現させると、E1のタンパク質量が増加した。HPV16ゲノムを維持するW12細胞よりWee1をノックダウンするとHPV16 DNAのコピー数が低下した。これらのことは、E1はWee1により安定化されて、HPVゲノムの維持を正しく行うことを示唆している。大学へ異動したことにより、各種安全講習の受講、資格の取得等に時間がかかり実験のスタートが遅れた。また。実験設備へ慣れるのに時間を要した。新たにE1ユビキチン化酵素を検索することにした。新たにHPV E1のE3ユビキチンリガーゼを検索する。また、Wee1とE1の結合の意義を解明するため、Wee1とE1の結合部位を明らかにする。さらに、結合を欠質させたWee1変異体またはE1変異体をW12細胞で発現させ、HPV DNAの複製効率を測定する。他の相同組換え因子RAD52、RAD54などをノックダウンし、W12細胞分化後にHPVのコピー数が減少するか検討する。タンデムにつながったHPVゲノムを切断する活性を分化したW12細胞抽出液より検出する。また、HPV DNA複製因子であるHPV E1の発現により数多くの細胞タンパク質量が変化するという結果を得ているが、相同組換え因子の量の変化についても検討する。学会に出席しなかった。出産により研究を中断したため。研究機関の異動により研究があまり進まなかった。物品費としてsiRNAの購入に充てる。
正標数の代数幾何と符号・暗号理論の研究

研究代表者は,岡本龍明(NTT)を客員教授に迎え連携併任講座「符号暗号」をオーガナイズし,標題の研究をおこなった.Aを正標数の代数的閉体k上のアーベル曲面とし,Φ_AをAの形式的Brauer群,hをΦ_Aの高さとする.よく知られているように1【less than or equal】h【less than or equal】2またはh=∞である.Z_1をd閉1形式としCをZ_1で定義されたCartier作用素とする.層Z_iをKer dC^<i-1>として帰納的に定義する.Mをレベルl(l【greater than or equal】3)構造を持つ主偏極アーベル曲面のモジュライ空間,π:A→Mをその普遍族とする.υ=π_*Ω<2【chemical formula】/M>とおけば,これはMのChow群の元を与える.M^<(h)>={A∈M|height Φ_A【greater than or equal】h}とおく.このとき,M=M^<(1)>⊃M^<(2)>⊃M^<(∞)>となる.x∈Mを(A,D,σ)に対応する点とし,Im H^1(A,Z_h)を自然な単射Z_h→Ω<1【chemical formula】>から誘導された準同型写像H^1(A,Z_h)→H^1(A,Ω^1_X)の像とする.これらの記号の下に,Φ_Aの高さh<∞のとき,Im H^1(A,Z_h)=7-hが成立する.M^<(h)>のxにおける接空間は{Im H^1(A,Z_h)}∩D^⊥⊂H^1(A,Ω<1【chemical formula】>)と同型であることが示せる.とくに,M^<(h)>の次元は,dim M^<(h)>=20-hとなり,Chow群CHl^1_Q(M)におけるM^<(2)>の類は(p-1)υで与えられる.最後の部分は結果としては知られていたが,我々は新しい枠組みでの定式化をおこなった.この枠組みにおいてはM^<(∞)>にスキームの構造を自然に入れることができ,そのスキームがnon-reducedな構造を持つがわかる.また,岡本龍明は,量子計算機の利用を前提とした「量子公開鍵暗号」という新しい暗号の概念を提案した.将来量子計算機が実現されれば,現在使われている公開鍵暗号のほとんどは解読される.この問題を解決することは応用上重要であり,岡本の提案はNP困難問題である部分和問題に基づき代数的整数論を用いて,その具体的な構成を行うものである.研究代表者は,正標数におけるカラビ・ヤウ多様体の構造の研究を主に行った.本年度も,連携併任講座「符号・暗号」を主催し,企業の研究者との情報交換、討論の場とした.また,2002年2月14日-16日に「代数幾何の広がり研究集会」を開催し,符号暗号理論を含む代数幾何の研究成果に関する総括,討論を行った.本年度の研究成果については,この研究集会でも発表したが,主なものは次のとおりである.Xを正標数の代数的閉体k上のn次元非特異完備代数多様体,H_<dR>(X)をXのde Rhamコホモロジー群とする.H_<dR>(X)はHodge filtration H_<dR>=F_0⊃F_1⊃【triple bond】⊃F_nを持つ.また,H_<dR>(X)上にはFrobenius写像Fが作用する.このとき、a(X) =max{i | F^*H_<dR>(X)⊂F_i}によってa-numberを定義する.この数は,アーベル多様体に対してはF. Oortが定義したa-numberと一致することがまず示せる.また,Frobenius写像がF_1上は零写像になることから,Hodge-to de Rhamスペクトル列がE_1-levelで退化するときには,F^*は写像H^n(X, O_x)=F_0/F_1→H_<dR>(X)を引き起こす.従って,a(X)=max{i |F^*H^n(X, O_x)⊂F_i}となり,いろいろな代数多様体に対し計算可能となる.ここでは,Fermat型のカラビ・ヤウ多様体,P^3の中の5次超曲面に対して,具体的な計算結果を与えた.a-numberはArtin-Mazur形式群の高さhとも関係がある.我々はカラビ・ヤウ多様体の構造を調べることを1つの目的にしているが,この場合には,a=0であることとh=1は同値であり,a【greater than or equal】2ならばh=∞となることが示せた.また,rigidなカラビ・ヤウ多様体の場合,hは1か∞の値しかとれないことも示せた.以上の主要結果はvan der Geerとの共著論文として発表予定である.研究代表者は,本年度も引き続き正標数におけるカラビ・ヤウ多様体の構造の研究を主に行った.また,本年度も連携客員講座「符号・暗号」を主催し,企業の研究者との情報交換,討論の場とした.

2003年1月17日1月19日には「第5回代数幾何・数論及び符号・暗号研究集会」を開催し,研究成果に関する総括,討論を行った.正標数の代数的閉体k上定義された3次元以上のカラビ・ヤウ多様体Xのde Rhamコホモロジー群をH^2_<dR>(X),ネロン・セヴィリ群をNS(X)とする.このとき,次のような結果をえた.2次元の場合には,この写像はかならずしも単射にならず,このことからK3クリスタル理論が生じる.この定理は,3次元以上の場含には状況が異なることを示している.また,同じ仮定の下に準同型写像NS(X)/pNS(X)【cross product】_<Fp>k--H^1(X,Ω^1_X)も単射であることが示せ,この系として,ピカール数ρがρ【less than or equal】dim_kH^1(Ω^1_x)をみたすことがわかる.また,rigidなカラビ・ヤウ多様体の場合,Artin-Nazur形式群の高さhは1か∞の値しかとれないことを示し,アーベル多様体の商空間として得られるカラビ・ヤウ多様体など、いくつかのカラビ・ヤウ多様体に対しhを具体的に計算した.このほかにも,カラビ・ヤウ多様体上のイリュージー層のコホモロジー群の様々な性質を明らかにすることができた.カラビ・ヤウ多様体に関するこれらの結果については,G. van der Geerとの共著論文を準備中である.
関節リウマチにおける両手ＭＲＩ撮像法の改良および非造影ＭＲＩの臨床的有用性の研究

関節リウマチ(RA)における非造影MRIは滑膜炎に伴う骨変化(骨髄浮腫と骨浸食)の診断において造影MRIと同等の診断能を有する。ACR/EULAR(米国および欧州リウマチ学会)から提唱されている2010年分類基準に手関節非造影MRIにおける骨髄浮腫を加えることで,早期診断の感度向上が得られた。また,初回MRIで骨髄浮腫を認めたRA症例における治療1年後の骨髄浮腫の有無が骨関節破壊のコントロールに重要であることが示された。非造影MRIは低磁場の装置でも評価可能で,医療コストの削減の面からも有用である。本研究で示された非造影MRIの特徴を生かすことで,効率的な臨床応用が広がることが期待される。前年度までの研究で早期関節リウマチ(RA)症例の両手MRIについて,造影MRIを基準とした時の非造影MRIの診断能を評価し,滑膜炎の評価は不十分であるが,骨変化の評価は非造影MRIでも十分可能であることが示された。MRIにおける骨変化は骨髄の炎症性変化(骨炎)を反映しており,RAにおける活動性に相関し,予後予測の重要な因子であることがわかってきている。すなわち,非造影MRIでも骨炎に注目することにより,RAの活動性評価と予後判定が可能である。しかしながら,きわめて早期のいわゆる診断未確定関節炎(ndifferntiated arthritis, UA)における,MRIの位置付けは明確にされていない。非造影MRIの臨床的役割を,1)早期診断,2)早期治療効果判定との関連について評価を行った。1)早期診断;早期関節炎200名について,ACR/EULARの2010 RA分類基準に非造影MRIで認められる骨変化(骨髄浮腫)を加えることによる診断能の違いを評価した。非造影MRIの所見を加えることで,感度59.8→74.4%,特異度80.7→90.4%,診断確度68.5→84.0%と有意に向上した。2)早期治療との関連:MRIにおける骨髄浮腫陽性および自己抗体(RA因子または抗CCP抗体)陽性の早期関節炎13例について,DMARDsおよびMTXによる治療を行い,6ヶ月毎に手関節のX線所見および非造影MRIにおける骨髄浮腫の変化(RAMRISスコア)を前向きに観察した。12ヶ月でX線スコアの進行がなかったものは9例で,このうち8例では骨髄浮腫スコアが33%以下に減少していた。これに対して,X線スコアの進行した4例では骨髄浮腫スコアの減少が見られなかった。前年度までの研究で早期関節リウマチ(RA)症例の両手MRIについて,非造影MRIの診断能,早期診断および治療における意義について検討してきた。今年度はさらに以下の事項を検討した。1)前年度の早期診断における検討の見直し:164例の関節炎疑いの患者について2010年のACR/EULARによるRA分類基準を適用した場合のRAの診断能、非造影MRIで認められる骨髄浮腫を加えることによる診断能の違いを評価した。RAの最終的な診断は、リウマチ専門医の判断により発症後1年以内にDMARDsを使用した症例をRAとした。この結果、ACR/EULAR分類基準による診断能は感度62.4%,特異度83.1%,正確度71.3%であった。これに非造影MRIにおける骨髄浮腫の所見を加えた場合,すなわち前者が陰性であっても,骨髄浮腫が陽性であればRAと診断した場合は感度79.6%,特異度76.1%,正確度78.0%となった。MRIにおける骨髄浮腫を追加することにより,ACR/EULAR分類基準でRAと診断できなかった35例のうち,16例をRAと診断することができた。2)治療効果達成判定における骨髄浮腫の意義:初回のMRIで骨髄浮腫を認めたRA22症例のうち,治療1年後に骨髄浮腫スコアが67%以上減少した症例15例とそうでなかった7例に分け,その後(少なくとも2年)の手関節のX線写真におけるスコア(modified Sharp-Genant score)の変化を検討した。初回のX線スコアは両者に有意差がなかったが, X線スコアの進行があったものが,前者で13.3%,後者で85.7%と有意差を認めた。すなわち治療1年後の骨髄浮腫のコントロールが骨破壊の進行予後に重要であることが示唆された。(1) 51例の早期関節リウマチ症例(発症から5ヶ月以内)の両手MRI(左右各15部位)について,造影MRIを基準とした時の非造影MRIの診断能を比較した。

また滑膜炎の滑動性の指標である滑膜の造影効果の速度(e-rate)と診断能の比較も行った。非造影MRIの診断能は滑膜炎に関しては感度77.8%,特異度49.7%,正診率65.3%,骨変化に関しては感度80.7%,特異度99.4%,正診率97.9%であった。非造影MRIにおける滑膜炎の偽陽性の原因として,軽度の滑膜炎と関節液・関節軟骨との区別が困難な点が挙げられる。また偽陰性の関節はe-rateが有意に低く,滑膜炎の活動性が低いことが偽陰性の要因と考えられた。骨変化の評価は非造影MRIでも十分可能であることが示された。(2)非造影MRIにかわる滑膜炎の評価法として,動脈血スピンラベル法(Arterial spin labeling, ASL)の応用を考案した。これは動脈血に磁気的なラベルをつけることで,ダイナミック造影MRIと同様の血流情報を得る方法で,非造影MRIを用いて脳血流評価を行う方法として注目されている。しかし,中枢神経以外の適応はほとんど報告されていない。ASLを造影MRIの代用として使用可能かどうかを検討するため,ボランティアによる撮像を行い,撮像条件の設定を行った。手根関節からMP関節をカバーする範囲(撮像視野18cm)で4mm厚の横断像を撮像した(撮像時間約5分)。動脈ラベル負荷後の遅延時間(1,2,3秒)を変化させることで,手の筋肉の信号が変化することがわかり,筋血流を反映していた信号が得られることを確認した。今後はこの方法を臨床例に用い,滑膜炎の評価を造影MRIと比較する予定である。1) ACR/EULARの2010 RA分類基準に非造影MRIでにおける骨変化(骨髄浮腫)を加えることで,早期RAの診断能が有意に向上することが明らかとなった。早期治療における治療との関連についても,骨髄浮腫が治療効果判定と予後予測に有用であることが示唆されたが,前向きに評価できた症例が13例と少ないこと,観察期間が1年に限られていることが限界としてあげられる。今後は後ろ向きの症例も含めて,症例数を増やす必要がある。2)動脈血スピンラベル法(Arterial spin labeling, ASL)における滑膜の血流評価ついては,臨床例における検討を行っているが,画像ノイズが多く,造影MRIとの比較がうまく行えなかった。非造影MRIの診断能の評価は達成したが,非造影MRIにおける滑膜炎の評価法における新たな撮像法考案に予想以上の時間をとった。ASLによる滑膜血流評価のめどがついたばかりで,臨床例による検討がまだ十分でない。早期RAの臨床的有用性を明確にすること,これにより早期RAの診断および治療方針において非造影MRIが標準的な検査になりうることを明らかにする。経過観察症例だけでは症例数に限界があり,過去の症例を後ろ向きに分析し症例を増やしているところである。ASLは画像ノイズが多く,分析が困難であった。ソフトウェアの更新を行い,適切な撮像条件を再度検討したい。本年度の研究でASLの撮像条件を決定できたので,引き続き臨床例を用いた研究を行う。まず,診断の確定した関節リウマチ症例について,ダイナミック造影MRIとASLの両者を行い,ASLによる滑膜炎の血流評価の可能性について研究を行い,非造影MRIによる滑膜炎の活動性評価が臨床的に応用可能かどうかを検討する。
非光合成生物の光適応進化の全容解明

葉緑体の主機能は光合成だと一般に認識される。しかしながら,二次的に光合成能を消失した生物は真核生物全般に認められ,それらは概して非光合成葉緑体を維持している。それらの非光合成葉緑体は系統によって認識される機能にはばらつきがあり,非光合成葉緑体機能の“一般則"は不明瞭である。本研究では,非光合成のクリプト生物が独立に何度も光合成機能を失っていることに注目し,それらの比較ゲノム解析から光合成消失進化における一般則の解明を目指す。さらに一部の非光合成クリプト生物では光合成色素とは異なる光吸収物質をもつことに着目し,従来全く議論されてこなかった非光合成葉緑体特有の新規な機能の解明を目指してきた。初年度に非光合成クリプト生物の2株について基礎的なゲノムデータ及びトランスクリプトームデータを取得し,質の良い一次データの取得した。今年度はそれらのアセンブリと評価を終了し,予備的なアノテーションを行った。大まかな比較解析から、非光合成の生物は光合成種に比べて葉緑体ゲノムにコードされるタンパク質の数は減少しているものの,核ゲノムを含む全体としての遺伝情報は増加していることが明らかになった。また,非光合成葉緑体ゲノムの比較からこれまで知られていなかった光合成機能消失に伴うゲノム構造の変化と,近縁種でも独立の進化であれば残存する光合成関連遺伝子が異なることを見出し現在論文として投稿準備中である。さらに栄養状態・光状態の異なる培養株のトランスクリプトームの一次データの取得を今年度行い,ゲノム情報のアノテーションとともに解析を行った。ゲノム情報そのものは大まかなアノテーションは終了しているものの,比較ゲノムを行う前により精査なアノテーションの必要がある。トランスクリプトームの比較解析とともに次年度以降も行っていく。初年度にゲノムシーケンスの高精度DNAが必要量用意できなかったため、研究費の繰越を行った。2019年度にはゲノムシーケンスを行うことができたが、ゲノムデータの構築が遅れたため、予定より若干進歩が遅れている。また、対象生物のゲノムサイズが予想を大きく超えて巨大だったためにゲノムのアセンブリとその評価に予定より遅れが生じた。しかし、他の実験系については大きな遅延はない。研究計画通り、本研究で主な対象としているCryptomonasのアノテーションの精査を含むゲノム解析・葉緑体局在タンパク質の予測を行う。またそれらのデータを下地とした光応答トランスクリプトーム解析を引き続き行う。更に、すでにゲノム情報が公開されている光合成種、および葉緑体を完全に持っていない種との種間比較ゲノム解析を行っていく。光合成が葉緑体の主機能であると一般に認識される一方,マラリア原虫,寄生性植物,ミドリムシの一部など,二次的に光合成能を消失した生物は真核生物全般に認められ,それらは概して非光合成葉緑体を維持している。また、それら非光合成葉緑体は系統によって認識される機能にはばらつきがあり,非光合成葉緑体の“一般則"は不明瞭である。さらに一部の非光合成クリプト生物では光合成色素とは異なる光吸収物質をもつことに着目し,従来全く議論されてこなかった非光合成葉緑体特有の新規な機能の解明を目指す。初年度は非光合成クリプト

生物の2株について基礎的なゲノムデータ及びトランスクリプトームデータを取得した。ゲノムデータはPacBio,Illuminaに加えNanoporeのような新規テクノロジーを積極的に活用し,質の良いゲノムデータの作成を目指した。様々なアセンブル手法を試し,それらの比較から最適な構築法及びパラメーターを模索し、次年度以降で解析予定のドラフト・ゲノムデータを構築した。トランスクリプトームはストランド・スペシフィックライブラリーを作成し,遺伝子カタログを作製するとともに,ゲノム上の遺伝子予測を容易にするように工夫した。これらのデータを用い遺伝子予測やアノテーションを行う。また,非光合成の生物がどのような光応答を行うか,もし特異的な反応をするとすればどのような光吸収物質が関与しているか調べるために,7つの単色光源を搭載した特殊光源人工気象機を導入し,実験を行った。PacBioによる長鎖シーケンス用のDNAには非常に高い精製度が大量に要求されるが、初年度には必要量の高精度DNAが用意できなかったため、研究費の繰越を行った。2019年度に高精製度のDNAが要求されるが比較的DNA量が少量で実地できるNanoporeシーケンサーによりゲノムデータを得た。これらにより予想していた量のゲノムデータが得られたが、ゲノムデータの構築が遅れたため、予定より若干進歩が遅れている。それ以外の進行スケジュールには遅延ない。研究計画通り、本研究で主な対象としているCryptomonasのアノテーションの精査を含むゲノム解析・葉緑体局在タンパク質の予測を行う。またそれらのデータを下地とした光応答トランスクリプトーム解析を引き続き行う。更に、すでにゲノム情報が公開されている光合成種、および葉緑体を完全に持っていない種との種間比較ゲノム解析を行っていく。基礎データの取得が概ね終了したことから、予定通り高精度のゲノムアノテーションを行う。また、光応答実験の下地も整ったことからゲノムデータを合わせた比較解析を開始する。研究計画に大幅な変更はない。
高等学校化学における旋光性を理解させる教材の開発

高等学校の化学では、光学異性体は不斉炭素原子と対称性という理論から教えているに留まり、生徒が目で確認できる教材・実験は教科書・参考書にほとんど掲載されていない。これは、元素分析等が高等学校では無理で、違う物質であることを生徒は理解しても、同じ分子式をもつ物質であることが理解できないからである。私は、水晶を使い対称な構造を持つ左右1対の物質の存在とその区別の仕方としての旋光性を生徒に理解させ、パスツールにより発見された酒石酸塩の実験を通して不斉炭素原子を生徒に説明しようと考えた。自然界に存在する水晶は形が不鮮明なものが多いため、日本電波工業KKに依頼して、長さ8cmの左右1組の水晶を作成して頂いた。これにより左右対称な物質の存在を肉眼ではっきりと確認できた。左右水晶の旋光性は、きらりビュアを用いて生徒に視覚的に理解させることができた。色や渦巻きが生徒の関心を引いた。水晶の旋光性の説明についてはウェブサイト等を活用した。酒石酸ナトリウムアンモニウムの結晶の作成は先に報告した方法^<1)>によったが、夜間の温度降下を利用して1晩で20m、23g程度の色・形の良い結晶が容易に得られる条件がわかった。DL体飽和水溶液からL体、D体の結晶を分離晶出させる原因として溶解度を疑い、差があるというデータも得たが、エナンチオマーに差はないという定説に反することやpHにより変動することから結論を得ていない。DL体溶液からの分離晶出をビデオ撮影したところ、結晶が動き回ることが観測された。結晶の大きさは変化せず、対流によるものと思われるが興味深い結果である。酒石酸ナトリウムアンモニウム水溶液を手製の旋光計に2本並べて同時に見ることで、1本で見たときの2倍の視覚効果をあげ、旋光度の差をよりはっきり生徒に確認させることができた。水晶と違い溶液が旋光性を示すことから、不斉炭素原子の存在を生徒に理解させることができた。眼で見てわかる操作的段階から、抽象的段階へ生徒の思考を誘導することもできた。1)村田吉彦、化学と教育、55、348 (2007)高等学校の化学では、光学異性体は不斉炭素原子と対称性という理論から教えているに留まり、生徒が目で確認できる教材・実験は教科書・参考書にほとんど掲載されていない。1)村田吉彦、化学と教育、55、348 (2007)
炎症時のインターフェロンγによるシトクロムb558重鎖遺伝子発現誘導機構の解析

1.前単球細胞におけるIFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構の解析。(1)IFN-γによるCYBB転誘導現象においてPU.1が量的または質的変化することによって-53PU.1への結合が増大することを明らかにした。(2)本誘導機構に-53PU.1非依存性の機構が存在し、その機構に-100GAS/-88ISRE機構が関与することを明らかにした(3)IRF-1過剰発現と発現抑制実験により、IRF-1の本誘導機構における重要性をより確かにした。(4)ICSBPは定常状態でも発現しておりその量は本誘導に十分である可能性を示唆した。(5)本誘導機構にアデノウイルスE1a蛋白質により活性阻害をうける転写コアクチベーターが関与していることを示した。(6)PU.1,は定常・IFN-γ誘導共に関与しており、IRF-1は後者のみに関わるというこれまでの私たちの考えを、in vivoにおけるCYBBプロモーターへのこれら因子の結合を示すことにより確かなものにした。2.マクロファージにおけるIFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構の解析。U937細胞をPMAで分化させたマクロファージにおけるIFN-γによるCYBB転写誘導においてもCYBB遺伝子の-115塩基から+12塩基の部位が関与していることを示唆した。未分化U937細胞並びにマクロファージ分化型U937細胞共にcAMP、プロシタグランジンE2がIFN-γによるCYBB転写誘導に相加的に作用することが示された。4.樹状細胞の分化におけるIRF-4の役割の解析。本研究に関連して樹状細胞におけるCYBB遺伝子発現機構を解析した結果、IRF-4がCD11c高発現CD8陰性の樹状細胞の分化に重要であることが世界で初めて見出された。A.前単球細胞におけるIFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構の解明。(1).IRF-1の関与に関する検討:U937細胞とCYBB遺伝子+12から-115塩基を持つレポータープラスミド(p-115/+12)を用いIRF-1過剰発現並びにIRF-1発現抑制実験を行ったところ前者ではIFN-γによるP-115/+12の発現誘導が促進され、後者では抑制されたことから、IRF-1の本誘導機構への関与がさらに確かになった。(2).ICSBP過剰発現法を行ったところ、やはりIFN-γによるp-115/+12の発現誘導が促進されたことから、ICSBPの本誘導機構への関与がより強く示唆された。(3).アデノウイルスE1a蛋白質発現によるCBP/p300活性の特異的抑制並びにp300の過剰発現の影響を調べた結果、共に大きな影響が無かったことから、P300の本誘導への関与は少ないと考えられた。(4).クロマチン免疫沈降法により、in vivoにおけるIRF-1,PU.1,ICSBP,p300のCYBB遺伝子上流への結合を解析したところ、PU.1はIFN-γ刺激の有無にかかわらず結合が認められ、IRF-1はIFN-γ刺激後にのみ結合が認められた。これらの結果よりPU.1,は定常・IFN-γ誘導共に関与しており、IRF-1は後者のみに関わるというこれまでの私たちの考えが支持された。一方、ICSBP,p300は刺激の有無にかかわらず上記部位への結合が認められず、それらの本誘導機構に関して再考する必要性が示唆された。B.マクロファージにおけるIFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構の解明

U937細胞をPMAで1日処理しその後2日間PMAなしの状態で培養することにより形成したマクロファージとp-115/+12を用い一過性発現法を行ったところ分化させてないU937細胞にくらべやや活性が低いもののIFN-γによる誘導が認められことから、本分化マクロファージが今後解析に有用であると考えられた。未分化U937細胞並びにマクロファージ分化型U937細胞とp-267/+12を用いcAMP、プロシタグランジンE2の本IFN-γ誘導に及ぼす影響をしらべたところ、両者ともIFN-γに相加的に作用することが示された。A.前単球細胞におけるIFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構の解明。(1)U937細胞とCYBB遺伝子+12から-115塩基を持つレポータープラスミド(p-115/+12)を用いIRF-8過剰発現を行ったところ、p-115/+12の発現が約2倍促進されたことから、IRF-8のCYBB遺伝子定常発現への関与が示唆された。また、IRF-2過剰発現を行ったところ単独では顕著な効果は認められ無かったが、IRF-8によるp-115/+12の発現誘導を増強したことから、IRF-2とIRF-8とのCYBB遺伝子定常発現における協調機構の存在が示唆された。一方、IRF-1は本協調機構をむしろ阻害したことから、IFN-γによるCYBB遺伝子転写促進機構が単なるCYBB定常発現機構の修飾では無い事が示唆された。(2)U937細胞よりより単球に分化しているTHP-1細胞とp-115/+12を用いIFN-γによるCYBB遺伝子転写誘導実験を行ったところ、顕著な誘導が認められなかったことから、両細胞のIFN-γによる誘導機構が異なる事が示唆された。U937細胞をフォルボールエステル(PMA)を用いた2種類の方法でマクロファージに又ビタミンD3(VD3)+レチノイン酸(RA)を用いた方法で単球に分化させた細胞を用い、LPS刺激に対する反応性をTNF-α、IL1-β、IL-10,IL-12,およびIL-8の産生量から調べたところ,未刺激細胞とVD3+RA誘導型単球は、ほぼ同様の低い反応性を示したが、いずれのPMA誘導型マクロファージは高い反応性示した。この結果はIFN-γによるCYBB遺伝子発現誘導に影響をおよぼす因子がマクロファージと単球では大きく異なることを示す。サイバーグリーン法によるCYBB mRNA定量法を確立し、レポーター遺伝子導入実験等において実際の内在性CYBB mRNAの誘導状態も同時にモニターできるようになった。D.IRF-4の樹状細胞の分化に重要であることの発見。本研究に関連して樹状細胞におけるCYBB遺伝子発現機構解析したところ、IRF-4がGM-CSFによる樹状細胞の分化に重要であることが見出された。
戦前における公立大学の成立・展開過程に関する実証的研究

この研究では、1920年代の京都府立医科大学を主要な事例として取り上げ、とくに公立大学への府(県)費補充金の制度的基盤とその展開について一次資料をもとに考察を進めてきた。それは専門学校、府当局、府会、文部省による昇格をめぐる議論のなかでもっとも重大な論点となったのがその支出であったからである。考察によって得られた新たな知見は以下のように整理される。1.大学設立認可内規(1919年)の存在と内容(1)従来の研究では、文部省の大学設立認可内規は1925年のものが明らかにされていたが、新たに、1919年のものを確認した。(2)これにより私学の基本財産については「六箇年以内」の供託が明記されていたことが判明した。2.公立大学府(県)費補充金の制度的基盤(1)文部省が京都府立医科大学への府費補充を要請した直接的契機は、収入増加を図るための附属病院経営への傾注よりも、大学の本質的機能である研究を公立大学に求める「姿勢」にあった。(2)府費補充の制度的基盤は上記の「姿勢」に媒介された大学設立認可内規にあり、実際に京都府立医科大学に対して府費補充金が支出されていた。(3)しかし、京都府立医科大学への府費補充金は1916(大正15)年度予算では削除されるが、これは府会騒動を契機とした、知事による指揮要請に対応した府の予算への、内務大臣、大蔵大臣、文部大臣による指揮によるものであった。(4)このような公立大学への府(県)費補充の脆弱性は、その支出そのものを明記していない大学設立認可内規の不十分さに起因するものであった。
球状糖質両親媒性分子の創成と超構造制御

球状素構造による超構造構築の新概念に基づき、球状両親媒性分子の創成、ブロック型球状分子の合成法の開拓、そして球状分子の組織化による全く新しい超構造の創出を目的に研究を進めた。本年度はまず、球状素構造モデルとしてポリ(アミドアミン)デンドリマ-の球状表面を糖質で覆った球状糖質高分子を合成し、SugarBallと名付けて発表した。Sugar Ballとタンパク質であるレクチンとの相互作用を濁度測定、ゲル内二重拡散法、赤血球凝集阻害試験などの方法により調べたところ、特異的な分子認識を示すことが明らかになり、球状糖質高分子とタンパク質との会合体形成を確認した。次に、デンドリマ-を希薄溶液中で半球表面のみを疎水基で化学修飾する全く新しい手法により球状両親媒性分子の合成に成功した。ポリ(アミドアミン)デンドリマ-を非極性溶媒(ジエチルエーテル)中でガラス面に吸着させ、溶媒側の半球表面のアミノ基だけをフェニルイソシアナ-トで選択的に置換した。この方法は、球状両親媒性分子を簡便に合成する画期的な方法であると考えている。精密な両親媒性球状分子を合成する目的で、デンドリマ-合成におけるDivergent法とConvergent法とをともに用いた新手法を開発した。マルトース誘導体が置換した親水性半球ブロックとフタルイミド基で疎水化した半球ブロックとをDivergent法により合成し、これらを核の部分で連結し、球状糖質両親媒性分子Half Sugar Ballを合成した。親水性の糖質半球ブロックはタンパク質であるコンカナバリンAレクチンと相互作用して分子集合体を形成することが、紫外線分光器を用いた濁度測定により明らかになった。今後は、本年度に合成した球状両親媒性分子を用いて自己組織化による超構造の構築を行い、形態を解明する。
薄型CCDバーテックス測定器の開発研究

20μm厚さのCCDの平坦性について研究した。このCCDは素子としての稼働はするが中央部が60μm程度大きくへこんでいることがわかった。さらに大面積にすると歪が大きくなり、何らかの保持機構が不可欠であることがわかったので、新しい構造について検討した。また、CCDを用いたバーテックス測定器の概念設計をし、b/cクォークの同定の効率やバックグランドの量について検討した。トポロジカルバーテックス法とMassTag法を用いると標準の測定器パラメータではbクォークの同定は純度95%で効率50%、cクォークについては純度55%で効率27%になった。一方、CCDを5層、厚さを約1/3にし、ビームパイプの半径を半分の1cmにした場合にはbクォークについては純度50%で効率が60%に、cクォークは純度65%、効率40%程度になった。一方CCDの使用に際して問題になるバックグランドの量は標準測定器の場合、10年間の運転で電子が10^<12>e/cm^2、中性子は10^9n/cm^2程度になる。MPPモードを使い室温に近い温度での駆動が可能な浜松フォトにクス社製のCCDの場合、このレベルの放射線の照射を受けるとFlat Band Voltage shiftは1V程度、VCTIは2x10^<-4>程度に低下する。これはぎりぎり許容範囲ではあるが、さらに放射線耐性のさらに大きな素子の開発が望まれる。また、測定器のソレノイド磁場を2テスラから3テスラに上げバックグランドを抑えることにより、ビームパイプ半径を標準ものより小さくすることを検討したが、バックグランドが急激に増加するために、半径1.5cm程度が限界であることがわかった。薄型CCDバーテックス測定器を安定に支持するために従来より半径を小さくする可能性について研究した。測定器のソレノイド磁場を2テスラから3テスラにあげるとバーテックス領域に入射するバックグランド粒子の回転半径が小さくなるので測定器を衝突点に近づけることができる。詳細なシュミレーションにより、20%程度近づけても2テスラの場合と同程度のバックグランドヒット数にできること、また、測定器のサポートシステムの振動解析を行ったところ数ナノ程度以下には十分押さえられること等が分かった。バーテックス測定器に用いるCCD素子本体に関しては1cm幅、5cm長の素子に4個所の読み出し口をつけて高速読み出しすることを検討中である。素子本体の厚さとしては20μm厚のものは可能である。またバーテックス測定器近辺で予想される放射線量は10年間の運転で電子が10^<12>e/cm^2,中性子が10^9n/cm^2程度であるが、放射線耐性の測定の結果、従来の手法により作成したCCDでもこの程度の放射線量に耐えられることがわかった。一方、20μm厚だとたわみが100μmのオーダーになるので、ベリリウムで数μm以下に抑えることを検討している。薄型CCDの平面位置の一様性をレーザーにより測定した。300μm厚の基板を持つS5466CCDの場合には振幅が15μmの正弦波形の非一様性が見られた。一方、20μm厚のS7170CCDの場合には全面にわたって振幅が60μm以上の大きな歪みが生じていた。さらに大面積を持つ試作CCDでは肉眼ではっきりとわかる大きな歪みを生じており、20μm厚さでは十分な例えベリリウム基板などにより保持するにしても位置の一様性を保つことは難しいと考えた。一方、薄型CCDの物理研究に対する効果は関してシミュレーションで研究を行った。

このシミュレーションではビームパイプ半径1.0cm,第一層に100μm厚のCCDを半径1.2cmに設置した場合と、ビームパイプ半径2.0cmで第一層に300μm厚のCCDを半径2.0cmに設置した場合について、bクォーク、cクォーク同定の効率と純度をe^+e^-→Z反応を用いて調べた。重いクォークの同定法としては2次および3次の崩壊バーテックスをトポロジカル・バーテックス法で選び出し、中性粒子のエネルギーを補正したバーテックス質量を求める方法を採用した。この方法ではbクォークに対しては約60%の効率と95%以上の純度で同定でき、cクォークに対しては65%程度の純度で30%ないし40%の純度で同定できた。2種類のバーテックス測定器による検出効率の違いはcクォークの場合には10%であったが、これはさらに解析方法を改善して効率が向上することを期待している。CCDの厚さとしては保持機構も含めてシリコン100μm程度にできればバーテックス測定器の必要な性能が満たせることがわかった。
水を溶媒とするアルカロイドの革新的合成法の開発

これまでの有機合成反応は有機溶媒中で行うのが常であった。今回、我々は天然由来の塩基性成分であるアルカロイドが酸性水溶液中で塩を形成するために、水に可溶になる現象に着目した。この現象を利用して生体成分である水中での有機合成反応の開発を行った。結果として、生体内で行われている幾つかの化学反応をフラスコ内で完全水中で行うことに成功し、有用な生物活性天然物の全合成研究へと応用した。開発した合成法はこれまでに報告されている合成法と比べて非常に簡便であり、網羅的に天然物を合成できる上、水溶媒であるために環境に優しい。自然界には数多くの窒素由来の塩基性を示す化合物(アルカロイド)が存在し、その中には有益な生物活性物質を有するものが数多く知られている。これまでのアルカロイドの全合成は、保護基を多用し有機溶媒中で行うのが常であった。本提案では、アルカロイドの塩基性を利用し、通常水には溶解困難なアルカロイドを酸性水溶液中で塩を形成させる事で水に可溶させる。さらに、塩形成を利用して、酸化剤などに対して副反応が懸念される窒素原子の不対電子の保護を水中で行う。まず、本提案を実現ため、トリプトファン由来二量体型ジケトピペラジンアルカロイド類を標的とし、市販のトリプトファン誘導体を基質とした水中二量化反応の開発を行なった。具体的には市販のトリプトファンエチルエステルをメタンスルホン酸水溶液中に溶解させ、一電子酸化剤として酢酸マンガン、三フッ化酸化バナジウム、もしくは五酸化バナジウムを用いて酸化反応を行なった。その結果、それぞれ望む二量化反応が進行し、多様なアルカロイドの骨格を1段階で構築できる事を見出した。続いて、本反応を鍵工程とし、標的とするアルカロイド群の網羅的全合成を行なった。一方で、トリプトファンを基質とするバイオインスパイアード水中プレニル化反応の開発を行なった。先と同様にトリプトファン誘導体を酸性水溶液に溶解させ、生体内でプレニル化剤として機能している事が知られているジメチルアリル2リン酸(DMAPP)を作用させた。その結果、予想通りインドール環がプレニル化された化合物が得られた。この合成手法は1級アミンを保護する事無く、完全水中でアルキル化した初めての例であり、化学的に非常に重要な知見である。一方で、本反応の成功により、自然界では常に行なわれている反応が如何に無駄無く行なわれているかを証明できた。これまでの有機合成反応は有機溶媒中で行うことが常であった。我々が注目したのはアミノ酸の一種であるトリプトファンから派生した二量体型ジケトピペラジンアルカロイド類およびプレニル化インドールアルカロイド類である。二量体型ジケトピペラジンアルカロイド類の合成は、市販のトリプトファンエチルエステルを基質とた酢酸マンガンや酸化バナジウムなど安価な一電子酸化剤を用いた二量化反応により達成された。本反応は酸性水溶液中で行い、基質は完全に水に溶解した状態で進行する。本法を用いて、11種の天然物および誘導体を合成し、生物活性試験によりこれまでに報告例のない生物活性を見出すことに成功した。さらに、プレニルアルコールと硫酸を用いた完全水中インドールプレニル化反応の開発に成功した。本法は完全均一系の水中反応である。これまで、インドールのプレニル化反応には酵素による疎水場が必要であると考えられてきたことから、酵素を用いない水中プレニル化反応は生合成研究(生体内での物質合成研究)としても大きな意味を持つ。以上我々は、生体内で行われている幾つかの化学反応をフラスコ内で完全水中にて行うことに成功し、有用な生物活性天然物の全合成研究へと応用した。開発した合成法はこれまでに報告されている合成法と比べて非常に簡便であり、網羅的に天然物を合成できる上、水溶媒であるために環境にも優しい。有機合成化学本提案の鍵となる水中炭素ー炭素結合反応は達成された。未だ、収率や効率性に問題があるものの最適化に向けて順調に進行している。一点問題であったのは、得られる化合物群が現所属機関で所有している質量分析装置では観測できなかったことである。従って、化合物の構造決定に時間を要した。本問題は来年度低温測定可能な質量分析装置を購入する事で解決できる。鍵となる水中バイオインスパーアード反応の最適化を行う。具体的には添加する酸の種類や温度を検討し、反応の選択性を観測する。

また、反応機構の解析を行なうため痕跡料の生成物まで精査し、水中でどのような反応が起こっているのかを理解する。最適化された反応を用いて、ジケトピペラジンアルカロイド類およびプレニルインドールアルカロイド類の全合成へと展開する。その際、近年、プロセス化学において注目されているマイクロリアクター反応装置およびワンポット反応を利用し、最終的に5工程以下の全合成を目指す。25年度、使用予定であった反応および精製用溶媒、反応試薬、ガラス器具および実験器具に使用した。残額は元々旅費として申請していたが、研究の進展状況により学会発表するに至らなかった。また、論文投稿費として計上していた分も25年度に消化しなかった。研究の進展によって、取り扱う化合物群が温度に非常に不安定であることが明らかとなった。従って25年度の残額と合わせて、化合物保存用の冷蔵庫や、低温で質量分析ができるESI-MSの購入資金の一部に充てる。また、それ以外に学会等で研究成果を発表するための出張旅費として計上する。
実験大腸癌の発癌過程,前癌状態におけるサイトカインの出現および変動についての検討

本研究の目的は、DMHを投与した大腸癌誘発ラットの発癌過程にある大腸組織を用いて、大腸癌好発部位の大腸粘膜を中心に、経時的に組織を採取し、発癌過程および前癌状態におけるサイトカインの動向をin vivoにおいて検討しようとするものである。6週齢雄WistarラットにDMH 25mg/kgを週1回、20週間皮下投与を行った。これまでの発癌実験における大腸癌好発部位(肛門より口側23cm、近位結腸の壁在リンパ節近傍)の大腸粘膜を中心に、DMH投与後10週目より、1週毎に解剖、経時的に組織を採取した。結腸の各目的部位より粘膜を採取、一部はホモジュネートし、ELISA法によりIL1,IL2,IL6,TNFについて測定し、さらに組織学的に抗TNF抗体、抗IL6抗体および抗IL2receptor抗体を用いて酵素抗体法により免疫染色を行い、組織での出現および局在を検討した。結果、肉眼的隆起病変は22週目より出現しはじめた。細胞増殖能はBrdUによる計測では投与前では平均標識率15.5%、12週目が15.8%、16週目で18.8%、20週目で19.5%であり、経時的に増殖能が増加する傾向がみられたが、有意差は見られず、隆起病変出現(腺腫)ににより24.8%高値を呈した。しかしながら、今回の前癌状態から腺腫発生時点においてのサイトカインの検出および組織学的局在の証明は現時点において出来ていない。また、ヒトポリ-プに対しても同様の試みを行ったが、明らかな結果が見出せないでいる。理由としては(1)一連のサイトカインは局所の組織侵襲、すなわち正常細胞が自己逸脱する過程において産生される物質であるために、癌腫を形成していない発癌過程および前癌状態においては出現してこない、(2)血中における広範かつ多彩なネットワークによる相互作用により生体組織の応答を統御しているが、いわゆるレセプターは局所には存在していない、等が考え得る。しかし、癌化した組織においてはTリンパ球が優位となり、その浸潤程度は早期癌であるほど強いとする報告もある。本研究の達成には技術面における検討も重要な課題であり、in vitroに比べ実験過程においても更に習熟することが必要と思われる。今後も引続き、前癌病変および発癌後の腫瘍増殖過程との関係について実験的検討を行っていく。
予測的姿勢制御における大脳小脳連関の解明

本研究は、様々な身体運動及びスポーツにおける動きの基盤となっている予測的姿勢制御に関わる神経機構の本質的な解明をめざしている。この神経機構の構成要素としては、大脳皮質運動関連領域のみならず、小脳ならびに脳幹などがあげられるが、これらがどのように時空間的に連関し、協調的に機能しているのか明らかにする。そこで、本年度はラットが自分の前肢によってレバーを押すことがトリガーとなって、自身が後肢2足により立位姿勢を維持している台が後方に傾斜する姿勢実験パラダイムを構築した。正常無処置のラットは、トレーニングによって傾斜直前に傾斜と逆方向へとCOPを移動させる姿勢の応答を示した。Rose bengalの静脈注射と緑色レーザー光(532 nm)照射によるphotothrombosis法を用いて小脳虫部に脳梗塞を生じた際、また、小脳虫部後葉を吸引除去した際の姿勢制御への影響を調べたところ、小脳傷害前に観察された予測的な姿勢の応答が障害される個体が観察された。ラットを実験モデルとして、後肢2足により立位姿勢を維持している際に、自らの前肢でレバーを押して一定時間後に台が後方に傾斜する実験装置及び一連の馴化・学習課題を構築し、ラットをトレーニングすることでラットが傾斜の開始を予測して傾斜前に姿勢の調節をを行うという行動実験パラダイムを完成した。さらに、健常状態での実験後に小脳虫部に局所的な脳梗塞を作成し、あるいは、吸引除去して傷害すると、姿勢応答における障害を観察することができた。従って、おおむね順調に進展していると言える。観察されたラットの予測的姿勢制御において、小脳虫部における責任領域を同定するため、局所的傷害実験をさらに精細に進めていく。また、現在までの実験においては、特に小脳障害後にラットがその前肢でレバーを保持してしまう行動が多く観察されたため、レバーの操作をなくし、姿勢台の傾斜についての教示方法、すなわち外乱についての情報を視覚情報として呈示する実験系を再構築する予定である。これにより、ラットにかかる外力をすべて計測し、ラットの身体力学モデルとモデル予測制御による制御系からなるシステムモデルを構築し、動力学シミュレーションを行い、実際のラットの姿勢制御応答と比較検証する。硬膜下皮質脳波(Electrocorticogram ; ECoG)を記録するための電極において、一部製造が間に合わず2018年度内に納入されなかったため、当該の予算を次年度の使用額として持ち越した。
オウギガニ科有毒ガニにおける麻ひ性貝毒成分の変換に関する研究

本研究では,スベスベマンジュウガニにgonyautoxin(GTX)を注射もしくは経口投与するとsaxitoxin(STX)群に変換した上で蓄積することを明らかにした。その概要は以下の通りである。注射投与の場合:1995年6月に沖縄県石垣島川平湾内の小島で採集したスベスベマンジュウガニ12個体につき,右鉗脚の腕節と長節の接合部からGTX_<2,3>標品の3%食塩水溶液(5.7μmol/ml)を体重20g当たり0.2ml注射した。3個体は30分以内に直接,残り9個体は27°Cの水槽中で1248時間飼育後,HPLC-蛍光法により右鉗脚と内臓の麻ひ性貝毒(PSP)含有量を調べた。その結果,鉗脚では毒未投与区,注射30分以内,12,24及び48時間後のGTX_<2,3>の平均含有量はそれぞれ0,41.2,1.9,1.6,1.5nmol/gで,12時間以内に投与された毒の大部分が見かけ上消失した。これに対し,同STXの平均含有量は0.7,3.8,3.1,10.6,7.2nmol/gで,注射直後から顕著な増加が見られた。STX群の他の成分については,毒未投与区との有意な差は殆ど見られなかった。内臓でもほぼ同様な結果が得られた。経口投与の場合:同様のスベスベマンジュウガニ12個体を27°Cの水槽に入れ,1日1回,1個体当たり0.2gの有毒餌料(GTX_<1・4>の混合標品をエビすり身に添加し,寒天で固めたもの;毒含有量1.1μmol/g)を投与した。飼育開始後3日毎に3個体ずつ水槽から取り出し,鉗脚と内臓について各PSP成分の含有量を調べたところ,GTX_<1・4>はいずれの個体からも検出されなかった。これに対し,毒未投与区,飼育開始後3,6,9及び12日目におけるSTX群の総含有量は,鉗脚で2.1,18.8,35.1,44.2,31.1nmol/g,内臓で0,43.5,81.0,57.4,31.2nmol/gと,いずれも毒投与により顕著に増加した。蓄積した毒は,鉗脚,内臓ともにSTXとneoSTXが主体で,他の成分については飼育前後ではほとんど差がなかった。飼育9日目までの毒蓄積率は2030%程度と計算された。