hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜内切断プロテアーゼRsePの選択的基質切断機構と新規細胞機能

大腸菌RsePは、S2Pファミリーに属する膜内切断プロテアーゼであり、大腸菌σE経路表層ストレス応答における膜越えたシグナル伝達やシグナルペプチドの分解除去等により、細胞表層機能の維持に必須の役割を果たす。本研究では、細胞質側に存在するMRE β-loop領域とC1N領域が基質と直接相互作用し、ペリプラズム側にPDZドメインによるサイズ排除フィルターとともに選択的な基質認識に重要な働きを素子とを明らかにした古細菌S2Pホモログの結晶構造には、進化的に保存された、細胞質側領域から膜ドメイン内部に挿入するβヘアピン様ループ構造(MRE β-loop: membrane reentrant β-loop)が存在しており、RsePも相同な領域を持つ。変異解析の結果RseP MRE β-loopのいくつかの変異は、基質特異的な切断阻害を示し、この領域が選択的基質切断に関わることが示唆された。また、共免疫沈降実験やクロスリンク実験の結果、ループ領域が基質の膜貫通領域と直接相互作用することが強く示唆された。さらに、基質膜貫通領域のヘリックス構造を不安定化させる変異により、RsePのループ領域の変異体による基質切断がアリル特異的に回復した。これらの結果等を踏まえ、「MRE β-loopは、基質の膜貫通領域とβストランド付加機構により特異的に相互作用することで切断を受にくいαヘリックス構造から伸びたβストランド構造への変化を促し、RseP活性部位へと提示する」とのモデルを提唱した。MRE β-loopの機能は、PDZフィルターに加えて第二の基質選別チェックポイントとして働くものと考えている。本年度の研究で、RsePのβループ領域が基質の特異的認識と切断に直接関わる事、特に基質膜タンパク質の構造変化を誘起することなど、新規の発見を含め進展があり、国際学術誌に成果を発表した。従って、概ね順調に研究が進展しているものと考える。大腸菌のS2PホモログであるRsePは、1回膜貫通型アンチσE因子RseAの膜内切断を通してσE経路表層ストレス応答に関わる。σE経路においては、まず表層ストレスを感知した内膜プロテアーゼDegSがRseAをペリプラズムドメインで切断し、続いてRsePがDegSによる切断で生じた「RseA分解中間体」を膜内部で切断することで、最終的に転写因子σEが活性化する。我々は以前に「RsePのペリプラズム領域に存在するPDZドメインが、大きなペリプラズムドメインを持つ基質の切断を立体障害によって防ぐサイズ排除フィルターとして働く」というモデルを提唱した。一方で我々は、ペリプラズムドメインが小さいにもかかわらずRsePによる切断を受けない膜タンパク質が存在することも見出しており、RsePにはサイズ排除フィルター以外にも基質を選別する機構が備わっていることが推測されていた。我々は、RsePのC1領域にあるMRE β-loopと名付けた領域が、β-ストランド付加機構で基質TMと特異的に相互作用することで切断を受けにくいα-ヘリックス構造から伸びたβ-ストランド構造への変化を促し、RseP活性部位へと提示する」というモデルを提唱した。本年度は、さらに解析を進め、RsePのMRE β-loopに隣接する領域には、mjS2Pにはない挿入配列が存在すること、この領域がgroup Iサブファミリーに属するバクテリアのS2Pホモログおいて保存されていることを見出した。この領域がRsePのC1ループ内のN末端側領域に存在することからC1Nと命名し、その機能を解析した。その結果、C1Nが、1) MRE β-loopが正常な機能や構造を取ることをサポートし、一方、2)C1N領域内部のGFGモチーフ領域でMRE β-loopとは別に基質と相互作用する、という2つの役割を果たしている事を示した。本研究では、C1N領域が、MRE β-loopと機能的相互作用を持つ一方、保存されたGFGモチーフ領域でMRE β-loopとは独立に基質と相互作用しうること等を示した。これらのことから、基質はまずC1Nと相互作用し、その後MRE β-loopへと移行して切断を受ける可能性を示した。この成果はRseP、ひいてはS2Pプロテアーゼによる特異的な基質認識・切断機構の理解に大きく資するもので、膜内切断プロテアーゼ機能の理解に貢献するものである。このため、本研究課題は概ね順調に進展しているものと判断する。膜内切断プロテアーゼS2Pの大腸菌におけるホモログであるRsePは、表層ストレス応答制御や内膜の品質管理に関わる。我々は以前、RsePの基質選別機構に関して、i) RsePのペリプラズム領域に存在するPDZドメインが、大きなペリプラズムドメインを持つ膜タンパク質の切断を立体障害により防ぐ(size-exclusion filter)、ii) PDZを通過する基質候補タンパク質の中でも、RsePの膜内挿入ループ領域(MRE β-loop)によって構造変化を受けうるもののみがRsePに切断される、というモデルを提唱した。しかしながら、このモデルで基質選別を完全に説明できるのかは不明であった。我々は、MRE β-loopに隣接する領域のアミノ酸配列が保存されていることを見出し、C1Nと名付けた。膜不透過性チオール基修飾試薬AMSによるCys残基の修飾を指標とした解析から、MRE β-loopとC1Nが共に部分的に膜ドメイン内部に挿入していることが示唆された。C1Nの中でも特に保存性が高いGFGモチーフ周辺に高次構造を不安定化するアミノ酸置換

変異を導入することでRsePの機能が低下したことから、C1Nの高次構造が重要であるものと考えられた。タンパク質架橋実験の結果から、C1NのGFGモチーフ内の残基が、MRE β-loopとは独立に基質と相互作用しうることが示唆された。以上の結果等から、C1Nは、「MRE β-loopが正常な機能や構造を取ることをサポートする」「MRE β-loopとは別に基質と相互作用する」という2つの役割を果たし、RsePの基質認識に寄与していると考えられる。大腸菌RsePは、S2Pファミリーに属する膜内切断プロテアーゼであり、大腸菌σE経路表層ストレス応答における膜越えたシグナル伝達やシグナルペプチドの分解除去等により、細胞表層機能の維持に必須の役割を果たす。本研究では、細胞質側に存在するMRE β-loop領域とC1N領域が基質と直接相互作用し、ペリプラズム側にPDZドメインによるサイズ排除フィルターとともに選択的な基質認識に重要な働きを素子とを明らかにした本研究で計画した新規基質の探索についてもこれまでに予備的に候補を得ている。本年度は、RseP機能解析とともに、基質の探索とその切断の生理的意義の解析を進めたい。29年度は、RsePによる基質切断機構の解析をさらに進める。さらに、新たな基質候補としてこれまでに見出していた低分子膜タンパク質の切断とその意義についての研究を進め、RsePの細胞機能の解明をめざしたい。また、共同研究によりRsePの構造を明らかにし、構造・機能相関の理解に努めたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
『源氏物語』古注釈の展開と平安文学の受容に関する基礎的研究

本研究は、(a)『源氏物語』古注釈書(特に未翻刻のもの)についての調査・翻刻、(b)近現代の平安文学受容に関する新たな視座からの研究、以上の二点を柱としている。2018年度において、(a)については全体の四分の一の翻刻を終えた『長珊聞書』(陽明文庫蔵、全53冊、約3100丁)の校正作業を順次すすめており、翌年度の翻刻書公刊の見通しが立ちつつある。また、研究分担者と研究協力者が主要メンバーとなっている古注釈の研究会では、未翻刻の内閣文庫蔵三冊本『紫明抄』を対象に選び、共同で翻刻と注記内容の検討をすすめている。上記(b)に関しては、かつて国際シンポジウムで発表した町田康の翻訳作品「末摘花」に関する研究論文が刊行された。また、物語叙述に関する根源的な見直し作業をふまえた論考として、2017年10月の中古文学会秋季大会のシンポジウムで報告した内容を論文化するとともに、物語叙述のあり方という点でも注目される『篁物語』の再評価をもくろみ、あらたな論文を執筆した。加えて、明治期前半における平安文学の受容に関する研究として、『国文学全史平安朝篇』で知られる藤岡作太郎に注目してきたが、2018年7月には石川県金沢市で藤岡の蔵書(李花亭文庫)を調査する機会を得た。さらに、その藤岡よりも三歳年長で、国文学というアカデミズムの確立に関わった芳賀矢一に関する問題もとりあげ、二篇の論考にまとめた。そのうちの一篇は、甚野尚志・河野貴美子の両氏と共に編集した近代日本の人文学の形成に関する論文集に収載した(あと一篇は近刊の予定)。『長珊聞書』(約3100丁)については、二段組みで四分冊に及ぶ大部の翻刻書となる予定であるが、その第一分冊の校正が進みつつあり、いよいよ公刊の見通しが立ってきた。一方、翻訳と翻案についてとりあげた論文が刊行されるとともに、その研究をきっかけにしてあらためてとりくんでいる『源氏物語』の物語叙述に関する研究に関しても進展があり、論文一篇が刊行されている。あわせて『篁物語』の叙述に関する論文もまとめた。また、明治期の国文学黎明期に関しては、論考二篇をまとめることができたほか、特に藤岡作太郎については、蔵書の調査を実施するなど、さまざまな角度から検討を加えつつある。なお、当初の計画に組んでいた論集『平安文学の古注釈と受容』の続刊については、2017年度の実施状況報告にも記したとおり、論集の企画から編集に関わる多大な労力を払うことがかなり困難であるため、引き続きこの論集によらない方法で成果発信を行っている。以上をもって、全体の進捗状況の区分としては(2)に相当すると判断する。『長珊聞書』の翻刻については、第一分冊の校正を綿密に行っているさなかであり、2019年度内の刊行をめざしたい。一方で、ひきつづき古注釈の研究会(原則として毎月一回実施)では、三冊本『紫明抄』の翻刻、内容の検討を続ける予定である。翻訳・翻案に関しては、研究協力者からの企画提供により、2019年の内に海外から有力な研究者を招聘し、このテーマに関する学術集会の開催をする予定である。一方、物語叙述についての検討は今後も重ねてゆくつもりである。これまでに十篇程度の論考を発表しており、遠からぬうちに研究書としてまとめることも視野に入れている。2019年度中の刊行は無理だが、2020年度中にまとめられるだけの準備を重ねたい。また、明治期の受容に関しては、特に藤岡作太郎についての研究書をまとめ、遅くとも2020年度前半までには刊行にいたるよう努める。本研究においては、(a)『源氏物語』古注釈書のうち、未翻刻のもの、もしくは新たな翻刻が必要と考えられるものについての調査と翻刻、(b)近現代の平安文学受容に関する新たな視座からの研究、以上の二つが大きな柱である。あわせて、平安時代に成立した文学のさまざまな受容全般をも研究対象としている。平成28年度において、上記(a)については、『長珊聞書』(陽明文庫蔵、全53冊)のうちの約4分の1に相当する部分の翻刻原稿のチェック作業を進め、組版に入稿する準備がおおよそ整った(入稿前の最終チェックが必要な部分が若干残されている)。一方で、5名の研究分担者、2名の研究協力者、および早稲田大学大学院文学研究科の大学院生たちを主たるメンバーとする古注釈の研究会では、未だに翻刻さえなされていない中書本系統『河海抄』の「桐壺」巻を対象とし、その翻刻と注記内容の検討を進めた。上記(b)に関しては、『源氏物語九つの変奏』(新潮文庫)に収められた町田康の作品「末摘花」について、独自の検討を試みた。光源氏の一人称叙述に変換された町田作品は、関西弁混じりのユニークな現代語が炸裂しており、一見すると原作からの逸脱が甚だしいようにみえるが、実は「翻案」というより「翻訳」と見なすべき内実をそなえている。それだけでなく、町田作品からは、『源氏物語』の「人称」の欠落した叙述にも親近する面が析出されてくる。この町田作品についての分析結果は、当該年度末にパリで開催された国際シンポジウムで報告した。

そのほか、当該年度中の関連する研究として、グローバル化が求められる時代の中で「越境」と「交流」をキーワードとして日本古典文学の研究を拓くことを提案した論考、『源氏物語』の「語り」に関する従来の研究の相対化をめざした論考、『堤中納言物語』「花桜折る少将」の切り詰められた叙述を評価する論考などを公にした。全3100丁に及ぶ大部の『長珊聞書』については、初の翻刻ということで公刊に向けてできる限り慎重に原稿のチェックを重ねてきた。平成28年度中に第一分冊に相当する分量(全体の4分の1程度)の翻刻原稿がほぼ完成に近づいてきているので、平成29年度前半ですべてを入稿し、ゲラの校正を進めてゆく見通しが立ってきた。また、現代における斬新な古典翻訳の一例といえる作家・町田康による「末摘花」の研究を進め、国際シンポジウムでその成果を報告することができた。予定通りの進展といえる。一方で、論集『平安文学の古注釈と受容』の刊行に向けた準備も当該年度の計画に入れていた。翻刻の掲載に関しては既に翻刻原稿がおよそ整っているので準備が済んでいる。論考の掲載に関しては、なお具体的な企画をまとめる作業を継続中である。以上のように、全体としてはおおよそ予定していたとおりに進展しており、一部、次年度にまたがる部分があるという状況である。本研究は、(a)『源氏物語』古注釈書(特に未翻刻のもの)についての調査・翻刻、(b)近現代の平安文学受容に関する新たな視座からの研究、以上の二点を柱としている。平成29年度、上記(a)については、『長珊聞書』(陽明文庫蔵、全53冊、約3100丁)の4分の1に相当する部分の翻刻、ならびにそのチェック作業がすべておわり、順次組版がなされ、一部の校正も進められた。また、研究分担者と研究協力者が主要メンバーとなっている古注釈の研究会では、未翻刻の中書本系統『河海抄』(「桐壺」巻)の検討を進めてきたが、それにつづけて、同じく未翻刻の内閣文庫蔵三冊本『紫明抄』を対象に選び、共同で翻刻と注記内容の検討を開始した。上記(b)に関しては、前年度末に国際シンポジウムで発表した町田康の翻訳作品「末摘花」に関する研究を論文化した。また、この町田作品における光源氏の一人称叙述に関する検討をきっかけとして、あらためて『源氏物語』の原文における叙述に関して根源的に見直す必要があることを痛感したため、『源氏物語』の物語叙述、特に「人称」と「語り」について、従来の拙論をふまえながらも、新たな視座から研究にとりくんだ。また、それと併行して、物語叙述のあり方という点でも注目されるべき『篁物語』の再評価をもくろみ、論文を執筆した。加えて、明治期前半における平安文学の受容についての研究にとりくみはじめた。具体的には、「国文学」という学問の黎明期における平安文学のとらえ方に注目し、芳賀矢一・藤岡作太郎などのキーパーソンの発言、あるいはまたアカデミズムとの関係などについて調査・検討を開始した。さらに、キャリア初期研究者が世界各地から集結し、早稲田大学で開催された国際研究集会において、平安文学などの受容に関する研究発表が複数組まれていたことから、これを賛助した。『長珊聞書』(約3100丁)については、初めての翻刻ゆえ、これまで原稿のチェックにかなりの時間をかけてきたが、全体の4分の1に相当する第1分冊の部分についてはすべて入稿し、ゲラの校正も進みつつあるので、刊行への道筋が見えてきた。一方、前年度末に発表した町田康「末摘花」に関する考察の論文化は、年度内に終えている(平成30年に刊行予定)。
弦理論の幾何学とスペクトル理論

本研究の目的は弦理論におけるカラビ・ヤウ多様体の幾何学と量子可積分系・2次元電子系におけるスペクトル理論を結びつけ、弦理論の非摂動的側面の理解を深めることである。本年度は主に以下の2点についての研究を行った:(1)Hofsdater模型におけるインスタントン効果と弦理論との関係、(2)弦理論を用いた楕円型Ruijsenaars-Schneider模型の厳密量子化条件の予想。まず(1)においては、2次元格子上の電子模型としてよく知られているHofsdater模型について、そのスペクトルの解析的構造を詳しく調べた。弱磁場ではエネルギーはランダウ準位を形成し、磁束に関して摂動的に展開することができる。この摂動展開は発散級数であり、しかもボレル総和法の意味で総和不可能である。その帰結としてスペクトルは磁束に関して非摂動的補正を受ける。これは量子力学的には、ポテンシャルをすり抜けるインスタントン効果である。まず経路積分の観点からインスタントン補正の具体形を導いた。驚くべきことにこの補正はトーリック・カラビ・ヤウ多様体上の位相的弦理論の自由エネルギーと正確に一致することが確かめられた。位相的弦理論の自由エネルギーは正則アノマリー方程式によって極めて系統的に計算できるので、この関係は実用上有用である。(2)では楕円型Ruijsenaars-Schneider模型のスペクトル問題について取り組んだ。可積分系の文脈において、この模型のエネルギー固有値を決定する完全な量子化条件は知られていなかった。この研究では5次元超対称ゲージ理論との関係に着目し、固有値を決める完全な方程式を予想することに成功した。その結果ゲージ理論における電磁双対性(S双対性)の構造が量子化条件においてもあらわに見えることがわかった。本年度実施した研究はいずれも弦理論とスペクトル理論との関係を明らかにしたものであり、本研究の課題に直接関係した成果であった。特にHofstadter模型における量子力学的インスタントン効果が位相的弦理論の自由エネルギーと正確に一致するという発見は、当初想定していなかった成果であり、発見したときは共同研究者と共に驚愕した。よって現時点では予想以上の成果が出ていると言える。次年度以降は蜂の巣格子上の電子模型に応用することに主眼をおいて研究を進める。まずこの電子模型に対応するカラビ・ヤウ多様体を同定し、Hofstadter模型と同様に位相的弦理論との関係を詳細に解析する。余裕があれば楕円型Ruijsenaars-Schneider模型の固有関数の構成も並行して進める予定である。国内学会の参加費が別の財源より支出出来たため、国内旅費が当初の予定より少なくなった。次年度の旅費で使用する予定である。
報酬の獲得と罰の回避を目的とするヒトの欺瞞行動の神経基盤の研究

本研究では機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて、報酬の獲得と罰の回避を目的とした欺瞞行動の神経基盤を検討した。行動データの解析からは、二種類の嘘をつく割合に大きな個人差があることが明らかとなった。脳機能画像データの解析からは、二種類の嘘の背景にある神経基盤が、部分的に異なっていることが示唆された。本研究の成果は、社会生活における人間の意思決定のメカニズムを明らかにするための、一助となると考えられる。今年度の研究では、報酬の獲得と罰の回避を目的として、被験者が自発的に嘘をつくことが可能な認知課題を作成した。具体的には、「ズル」をすることで金銭的な報酬を獲得、もしくは金銭的な罰を回避することが可能となる実験パラダイムである。今年度は予備実験の結果に基づき実験条件の細部を決定し、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)の実験データ取得を開始している。これまで得られたデータからは大きな個人差があることが明らかとなった。すなわち、高い確率で「ズル」をして嘘をつく不正直な被験者から、全く嘘をつかない正直な被験者まで、多様なデータが得られている。データ解析の際には、こうした個人差を反映した神経基盤と、個人差には依存しない普遍的なプロセスの神経基盤を特定する必要があると考えられる。来年度は引き続き実験データの取得を継続し、十分な数の被験者からのデータを確保する予定である。報酬獲得と罰回避を目的とする嘘に関して、行動データと脳機能画像データの解析を進めることで、欺瞞行動を動機づける神経基盤の一端を明らかにできればと考えている。本研究では、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて、報酬の獲得と罰の回避を目的とした欺瞞行動の神経基盤にアプローチしている。具体的には、「ズル」をすることで金銭的な報酬を獲得、もしくは金銭的な罰を回避できる課題を用いて、嘘をつく割合を定量的に評価し、その意思決定の際の神経活動を測定している。今年度の研究では、昨年から開始したデータ取得が終了し、基本的なデータ解析も概ね完了した。行動データの解析からは、報酬を獲得するための嘘と、罰を回避するための嘘をつく割合はそれぞれ、大きな個人差が存在することが明らかとなった。また、二種類の嘘をつく行為の神経基盤に、差異が存在する可能性も明らかとなった。同様に、二種類の嘘をつくことを制御して正直に振る舞う行為の神経基盤にも、差異が存在する可能性が明らかとなった。なお、先行研究でも用いられている手法として(Greene & Paxton, 2009; Abe & Greene 2014)、嘘をつく割合に応じてグループ分けを行い、画像データを解析する手法が報告されている。本研究のデータについても、上記の手法を用いて追加の解析を行う予定である。したがって本研究で得られたデータについては、研究期間終了後も引き続き、上記の手法を含めたデータ解析を行い、得られた成果を学会・研究会等で報告する。最終的な研究成果については、海外の学術雑誌で報告する予定である。認知神経科学本年度の研究は、概ね当初の実施計画に基づいて進めることができた。データ取得も順調に進んでおり、滞りなく来年度の研究に着手できると考えられる。今年度はデータ取得が完了次第、速やかに解析に着手する。得られた成果については、学会発表及び論文発表を積極的に進めていく。本年度得られた研究成果については、学会発表等を行うための十分なデータ解析までは進めていないため、学会参加のための旅費の支出が生じなかった。また、物品についても現在までの進捗では支出を必要としなかったため、次年度使用額が生じることとなった。次年度の研究においては、実験参加者手配に伴う人材派遣会社への支払いを中心に、消耗品購入や学会参加のための旅費に使用する予定である。
食の安全確保のためのフードシステムにおける生産・供給主体の行動経済学的研究

本研究では、心理学等を用いた実証的な行動経済学の視点から次の諸点を明かにした。第1に、畑作農家の施肥行動、耕畜連携による飼料受委託生産における農家行動、酪農家の公共牧場の利用行動について、これら行動を規定する要因などを明かにした。第2に、施設栽培農家の心理や新技術導入行動、フードシステムにおける生産・供給主体である、日本とベトナムの酪農家の性格と家畜衛生管理行動、また酪農家の主観的割引率と家畜衛生管理行動の評価を行った。最後に、酪農家の経営行動と六次産業への展開、また、濃厚飼料の給与及び貯蔵飼料品質と乳牛の健康との関係について、食の安全性確保の観点から技術的条件を明かにした。平成21年度は、行動経済学理論に基づいた農家行動に関する整理、インターネットによる国内農家の家畜衛生管理に関する調査を実施し、海外調査地をエジプトとして、調査のための事前打ち合わせを行った。インターネット調査の結果は次の通りで、酪農家の家畜衛生に対する行動モデル構築のための有益な成果を得ることができた。特定地域の酪農家の調査を実施する前に、国内の酪農家を対象にインターネット調査を試みた。農家数は3戸で、地域別では北海道が44%と最も多く、続いて中部地方17%、東北地方14%で、四国地方は0%であった。サンプルが地域の特性を強く受けている可能性が高く、単純な比較には無理があるが、1次接近としてデータの分析を行った。調査結果の概要では、情報を入手している農家ほど乳房炎の発生数は低い傾向を示すが、情報の入手の程度が低くなるほど乳房炎の発生の分散が多いくなる傾向がみられた。同様に、飼養衛生管理の実施程度と乳房炎の発生数との関係についてと、適切な搾乳手順の実施程度と乳房炎の発生数の関係についても同様な傾向が確認された。つまり、情報の入手の程度が低い農家、飼養衛生管理の実施程度が低い農家、適切な搾乳手順の実施の程度の低い農家においても、乳房炎の発生数が低い農家が一定程度あり、農家に対する衛生対策の指導の難しさの一端を知ることができた。衛生情報の入手程度、入手した情報の吟味の程度、飼養衛生管理基準の順守程度、適切な搾乳手順の順守程度の関係をみると、衛生情報の入手程度が高くても、情報の吟味がなされていない農家では、飼養衛生管理基準の順守程度との関係がみられず、入手した情報の吟味の程度の高い農家において、飼養衛生管理基準の順守程度の高さ、適切な搾乳手順の順守程度も高さに影響を与えていることが確認され、入手情報の吟味が重要なキーワードとなっていることが確認された。平成22年度における行動経済学の研究では、社会心理学及び性格心理学との関連とその応用の可能性について検討を行った。社会心理学では人間の行動を科学的に統一的に理解する理論として、また性格心理学では個人の行動の特性を分類把握する理論として応用できる可能性を探った。また、平成22年度における実態調査では、酪農生産における家畜衛生管理行動について、2重プロセス理論に基づいたアンケートを作成し調査を行った。2重プロセス理論とは、人の情報処理過程においては、分析型プロセスと直感型プロセスとがあり、それぞれの型で情報処理プロセスに違いがあるというものである。家畜衛生管理において、分析的プロセスを採用する農家では、リスク認知に対する理解が深く、より長期的な視点で管理行動がとられるものと推察された。具体的には、北海道の酪農地帯の町を選定し、酪農家にアンケート調査を行い、45戸の酪農家より回収が得られた。その結果、(1)分析型得点が高いほうがリスク認知や衛生管理基準順守程度が高い傾向がある、(2)直感型得点より分析型得点の高い農家のほうが体細胞数が少なくなる傾向がある、(3)衛生管理行動と畜産収入との関連は明確ではない、ことなどが明らかとなった。また、同様のアンケート調査を途上国であるベトナムにおいても実施したが、その結果の集計及び解析は現在作業を進めているところである。本アンケート調査は、調査年の状況が調査結果に反映される可能性があることから、パネルデータとして蓄積する必要があると認識している。さらに、先進国の乳衛生管理の実態について、生乳の生産割当制を実施しているカナダについて、その制度的な内容の調査も実施した。農家をはじめとする食料の生産・供給主体は、多様な作物や技術から自らが望ましいと判断する作物や技術を選択し生産・供給を行っている。この選択する作物や技術の違いによって経営成果が異なり、リスクの水準も異なってくる。選択における望ましさには、個人の性格が反映されると仮定して平成23年度も研究を行った。実施した研究は、まず、平成22年度に北海道のA町で行った農家の家畜衛生管理行動の調査を、同様の調査内容で海外において実施した。

具体的にはベトナムのフエ市にあるフン・トラ地区で、調査結果の集計・分析については、調査の準備や調整等で時間を要したことから、平成24年度に行う予定である。また、農家の作付の選択行動について、畑作農家のデントコーンの受託生産の行動について調査分析を行った。北海道の畑地型畜産地域では、畑作農家のデントコーン受託生産が、新たな自給飼料供給源として注目されている。畑作農家が受託するデントコーン生産については、黄熟するに伴う栄養価と重量のトレードオフを厳密に評価することが困難なことから、面積あたり一律の単価で精算をおこなう場合がある。この仕組みについては畑作農家で評価が分かれ、自らの経営努力が直接的に評価されることを望む畑作農家にあっては重量や栄養価をふまえた出来高精算方式を望み、畑作収入の安定性を望む農家にあっては面積あたり精算方式を評価している。これらの傾向は、デントコーン受託生産以外でも、価格変動の少ない畑作4品の生産が主なのか、変動の大きい食用バレイショが主なのかなど、作付の実態にも表れている。その背景としてはそれぞれの畑作農家の性格が反映されていると考えられ、安定志向のリスクaverterなのか、変動は大きくとも長期的に平均収益が高い作付構成を選択するリスクloverなのかが、作付行動および、デントコーン生産方式の評価を左右しているものと考えられた。食の安全確保のためにはフードシステムの展開方向について明らかにする必要があることから、酪農の展開方向の重要な六次産業化の展開について分析を行った。その結果、「レストラン」、「ジェラート・アイス・ソフトの製造」、その後「洋菓子・ヨーグルトの製造」が容易な展開方向であることが確認された。一方、牛乳製造への展開は比較的困難で、チーズ・バターについては展開が困難である事が確認された。家畜衛生管理行動には継続的な実施が求められるが、個別の畜産農家の経営視点や特性の違いにより差異が見られる。そこで、酪農家の搾乳衛生管理行動に、情報処理過程で分析型と直観型が存在するとされる二重プロセス理論と時間的視点を把握するための主観的割引率をあてはめて分析を行った。その結果、分析型に比べて直観型情報処理過程を優先的に採用している方が近視眼的な酪農家であり、搾乳衛生管理の実施得点が低いことなどが明らかとなった。ベトナム・ハノイ近郊の酪農家を対象に酪農家の性格と衛生管理技術の対応について分析を行った。性格は「外向性」、「協調性」などの5項目に係る質問項目を設定し、衛生管理については「搾乳前の手指の消毒」などの18項目について調査項目を設定し、共分散構造分析を行った。その結果、「プレディッピング」と「搾乳前の手指の消毒」、「ポストディッピング」の三つの指標について性格の差異による対応の違いが確認された。生産者心理と新技術導入との因果構造について施設野菜農家を対象に共分散構造分析(SEM)によって分析した。その結果、「リスク認知」はポストハーベスト技術と殺虫剤低減技術の導入、「積極性」は土壌消毒低減技術と化学肥料低減技術の導入の影響を与えることなど、施設栽培野菜農家が新技術導入にいたるまでには、「積極性」、「規模」、「リスク認知」を中心とした様々な生産者心理が関係している事が明らかになった。
医療者―患者コミュニケーションにおける程度用語の理解に関する基礎的研究

従来から、医療者と患者の間で問題が発生する場合の一因として会話中の用語の意味合いの違いが指摘されてきた。しかし、実は一般の患者にとってはるかに重要性の高い、「少しお酒を控える」「もう少し運動をする」といった場合の、「少し」や「もう少し」といった副詞の程度に関する研究は全く行われていない。そこで、本研究では、医師、看護婦、患者を対象に、医療場面で頻出する、程度に関する用語の解釈のズレを定量的に評価した。本年度は、福岡市内の医師、医療職者(看護士、薬剤師)、および一般市民(非医療職者)を対象に、質問紙法による調査を実施し、医療場面でよく使われる程度を表す用語(主に副詞、動詞および形容詞)の解釈のズレを定量的に評価した。その結果、以下の知見が得られた。(1)医師、医療職者(看護士、薬剤師)、一般市民の職種間で解釈に差が見られる程度表現は「ずいぶん前から異常が見られた」「たまには運動する」「たくさんの薬」「ご飯の量を増やす」「治る確率」であった。(2)対象者の年齢によって解釈に差が見られる程度表現は「夜更かし(時刻)」「たまには・・してもいい」「お酒を少々飲む」「少し運動を増やす」であった。(3)対象者の性別によって解釈に差が見られる程度表現は「もう少しお待ちください」「治る確率」であった。以上から、対象者の職種、年齢、性別によって、同一用語の理解や解釈に関し、差異が存することが明らかになった。医療者-患者間コミュニケーションで誤解や行き違いを防ぐため、形容表現のかわりに具体的な数値を用いたり、言い換え表現を多用することの必要性が示唆された。
遺伝子発現を介さないエクジソンの分子作用機構

エクジソンは核受容体に結合し遺伝子発現を調節することにより、その作用を示すとされてきた。一方、核受容体を介さないであろう作用も知られており、この作用から細胞膜に組み込まれた膜受容体の存在が示唆されてきた。カイコガを用いた薬理学的実験結果から、この膜受容体はGタンパク質共役受容体の一であることが示唆され、その下流には、小胞体から放出されるCa^<2+>をセカンドメッセンジャーとして、カスパーゼ系を活性化し、細胞死に至ることが示された。また、エクジソンによるカイコガ絹糸腺細胞死は、絹糸腺内に存在するグルコースオキシダーゼにより生成する過酸化水素の調節下にあることを明らかにした。カイコガ幼虫前部絹糸腺は、20-hydroxyecdysone(20E)のgenomic及びnongenomic作用により、細胞死が完了する。また、吐糸期前日までの前部絹糸腺は細胞死抑制因子を分泌し、早期の細胞死を抑制している。本年度は、抑制因子の精製を行い、同定することに成功した。5齢摂食期の前部絹糸腺を培養した培養液を回収し、これを培養上清として用い、20Eを加えてV7幼虫の前部絹糸腺を培養すると、V7の前部絹糸腺の予定細胞死は起こらなかった。そこで、この予定細胞死抑制因子の特性を調べるためにCMに熱処理、タンパク質分解酵素処理、有機溶媒処理を行ったところタンパク性の物質と非タンパク性の物質の両者が細胞死抑制活性をもつことが示唆された。細胞死抑制活性をもつタンパク性の物質に着目し、特性を調べた。この物質は60°Cの熱処理、タンパク質分解酵素であるトリプシンやプロテイナーゼKによる処理、30%メタノール処理で活性を失い、ゲルろ過クロマトグラフィーによる推定分子量では約440KDa669KDaを示した。30kDa限外濾過、Mono Qカラム、Superdex 200によるゲル濾過後、6%SDS-PAGEにより約80kDaのバンドを得、MALDI-TOF MS分析を行った。得られた配列は、グルコース酸化酵素のアミノ酸配列と部分的に一致した。カビのグルコース酸化酵素標品を用いて、前部絹糸腺の予定細胞死の抑制活性を調べたところ、活性を有していた。したがって、タンパク性の細胞死抑制因子の一つは、グルコース酸化酵素であることが示唆された。今後、大量発現系により、カイコガ・グルコース酸化酵素標品を得、予定細胞死の抑制活性を検討する。一方、吐糸期前日までの前部絹糸腺は細胞死抑制因子を分泌し、早期の細胞死を抑制している。昨年度までの研究では、タンパク性と非タンパク性物質の両者が細胞死抑制活性をもつことを示し、タンパク性のものがグルコース酸化酵素(GOD)であることを示唆してきた。本年度は、細胞死抑制因子の実体を明らかにしその作用機構に迫った。コウジカビGOD標品を用いた実験、また、GODの基質であるグルコースを除いた培養液を用いた実験などから、細胞死抑制因子はGODであり、GODの反応産物である過酸化水素が直接細胞死を抑制していることを示した。絹糸腺や繭でのGODの活性染色等から、GODが吐糸期に絹糸と共に前部絹糸腺より繭の表層に吐き捨てられることをあきらかにした。したがって、前部絹糸腺は、抑制因子であるGODを喪失し、体内エクジステロイド濃度が上昇することにより細胞死が進行し、絹糸腺の崩壊が生じることが示唆された。これまで吐糸のための単なる管と考えられていた前部絹糸腺がGODを保持することで細胞死を自己制御している可能性、吐糸行動が環境適応のために繭を作るだけではなく、前部絹糸腺という幼虫特異的組織を予定細胞死により速やかに崩壊・除去するためにも重要な行動である可能性が示された。この研究成果は、論文掲載雑誌(FEBS Journal)で高く評価され、表紙に絹糸腺や繭でのGODの活性染色結果が掲載された。20-ヒドロキシエクジソン(20E)作用のうち、genomic作用は18時間以内に完了するが、nongenomic作用は72時間にわたり作動し、この間シグナル伝達系が順次活性化され細胞死の完了に必要な因子の活性化が完了する。因子を同定した結果、glucose oxidase (GOD)であった(昨年度の研究成果)。GODは絹糸腺細胞によりつくられ、内腔内に分泌されるものと示唆される。

よって、前部絹糸腺の細胞死における20Eの分子作用は、genomic作用、nongenomic作用、それに自己分泌因子による20Eの作用の抑制という、少なくとも3つの異なる系から構成されていることが示された。本研究は、当初想定しなかった因子の同定に進んだが、本年度は、この因子の影響を排除した培養環境下で、前部絹糸腺の20E応答能を再検討し、予定細胞死のコミットメントを誘導する機構について再検証した。すなわち、蛹コミットメントは幼若ホルモンが抑制的に働くが、死のコミットメントにおける幼若ホルモンの関与の有無について検証した。結果、in vitroで培養した5齢2日幼虫、4齢3日にアラタ体を摘出した幼虫の前部絹糸腺の細胞死は進行せず、5齢2日以前の予定細胞死進行は幼若ホルモンにより抑制されていることが示唆された。以上より、細胞死抑制因子の活性が低い時期の前部絹糸腺は幼若ホルモンにより抑制され、死のコミットメントも蛹コミットメント同様、幼若ホルモンにより制御されていることが明らかとなった。
細胞極性形成機構の解明

遊走細胞は高度に極性化した状態の細胞であり、進行方向に対し前後軸を形成する。細胞前方部ではPIP3などのシグナル伝達因子の濃縮や、接着装置のturnoverが認められる。この様に細胞は時間空間的にシグナルを制御することで効率よく細胞遊走を行う。しかし、細胞遊走の詳細な分子機構については未だ不明である。Par3は細胞極性に重要な役割を果たしていることが知られている。最近、Par3が細胞遊走に関与していることが報告されたが、その詳細な分子メカニズムは未だ不明な点が多い。本研究では網羅的プロテオミック解析によりPar3の遊走細胞における機能を解明することを試みた。平成21年度において、我々はPar3とFAK、PI3-kinaseとの結合様式、結合の意義について詳細に解析した。細胞基質間接着、非接着時におけるPar3とFAK、p110(PI3-kinaseの触媒サブユニット)との結合を免疫沈降法により調べたところ、細胞基質間接着時にFAK、p110の共沈が認められた。このことから、Par3-FAK、-p110複合体は細胞基質間接着時依存的に形成されることが示唆された。また、細胞遊走におけるPar3とFAK、p110との結合の意義を調べるため、Boyden-chamber assayを行った。Par3のFAK結合領域であるPar3-PDZ2、-4N2を過剰発現させた細胞はcontrolに比べ細胞遊走が抑制された。一方、Par3のp110結合領域であるPar3-4N1を発現させた細胞はcontrolに比べ細胞遊走が促進された。これらの結果からPar3とFAK、p110との結合が細胞遊走に関与していることが示唆された。本研究によりPar3の細胞遊走における機能の一端が明らかとなった。今後、個体レベルでの解析を行うことでPar3による細胞遊走の制御と疾患との関連性が明らかとなることが期待される。細胞極性はその細胞が生体内で適切な機能を果たすうえで必要不可欠である。しかしながら、細胞極性がどのようにして形成されるかについての詳細なメカニズムについては未だ不明な点が多い。我々は細胞極性に関与する様々なタンパク質の新規結合分子を同定することで細胞極性形成機構を解明しようと試みた。平成20年度において、我々はRhoファミリー低分子量GTPaseの一つであるRhoAの新規結合タンパク質としてsorting nexin17(SNX17)を、PAR-3の新結合タンパク質としてphoshatidyl inositol 3-kinase(PI3K)およびfocal adhesion kinase(FAK)を同定した。RhoAとSNX17、PAR-3とPI3KおよびFAkの結合様式について検討したところ、いずれも細胞内での結合が確認された。さらにPAR-3とPI3KおよびFAKは直接結合することも明らかとなった。RhoAがどのようにして時間空間的な活性制御を受けるかについての詳細なメカニズムについてはよくわかっていない。SNX17は細胞内に膜結合ドメインを有していることから、SNX17はRhoAが活性化される際にRhoAを特定の膜にアンカーする機能をもつ可能性が考えられる。また、PAR-3はPI3KおよびFAKを局所的に活性化させることで細胞極性を制御している可能性が示唆される。PI3KおよびFAKはともにある種のがん細胞においてその活性に常が認められている。本研究によりPI3K、FAKの新たな活性制御機構が明らかとなることが期待され、従って本研究の成果は医学的見地からも非常に重要であると考えられる。今後上記の可能性について細胞生物学的のみならず医学的見地からも詳細に検討する予定である。
入浴関連事故の実態把握および病態，予防に関する研究

入浴中の急死は高齢者で多いが、原因は特定されていないが、大阪市での疫学調査により病態を概ね明らかにできた。浴槽内での死亡事故の発生場所は、自宅が89.4%を占め、公衆浴場が6.6%、ホテル1.3%、老人ホーム0.4%であった。老人ホームでは5年間で8件の浴槽内死亡事故があり、1件の死因は内因性急死で、7件は一人入浴での急死で熱中症を否定できない。42°C以上の湯に全身浴で30分以上浸かると深部体温が3°C上昇して誰もがIII度熱中症になり、意識を失う。深部体温が42°C以上になると心筋が崩壊し高カリウム血症となり心室細動を起こし急死する。今まで不可解とされた解剖所見もこのメカニズムで矛盾なく説明できた。【背景】我が国では高齢者の入浴中の急死や事故が多く、年間約19,000人発生していると推計され、注意が促されるも、未だ減少する兆しが見えない。【目的】入浴中の事故は死に至るものが多いが、その原因は、事故か疾病か依然としてわかっておらず、単純に溺水と判断できる事例が少なく、現状では、根拠をもって死因を決定するのはむつかしい現状にあり、より正確に診断できることは、予防につながり、入浴中の急死の減少につながる。【対象と方法】まず、2013年に大阪市内で発生したすべての入浴中の事故を掌握するため、大阪市消防局より、入浴関連事故での救急搬送データ、熱中症での救急搬送データを入手し、大阪府監察医事務所からは、大阪市内の入浴中の急死症例、熱中症による急死症例を入手した。また、大阪市福祉局介護保険課からは、大阪市内の介護保険事業所等での事故報告集計を入手した。【結果】CPA以外の救急搬送例は33例と少なく、溺水に至らなかった熱中症11名、溺水18名、疾病発症4名であった。一方、浴槽内死亡は423名(男性236名、女性187名平均年齢76.8歳)にみられたが、死因はまちまちであった。介護保険事業所等で年間1844件の事故報告があるが、浴室での事故報告は63件にすぎず、溺水の項目自体がない。救急搬送例および浴槽内死亡例に、介護保険事業者が関与した例はゼロであった。【考察】介護保険事業者にとって入浴時事故防止は最重要事項であり、42°C以下の湯温、20分未満の入浴が守られていることもあり、浴槽内事故がみられておらず、入浴条件を守れば、一般人でも事故に合わない可能性が極めて高い。【結語】死に至ることが多い浴槽内事故の大半は、熱中症などの事故であり、疾病発症は極めて少ないと考える。現在のところ、42°C以上の湯温で30分以上継続して湯に浸かると事故に遭う可能性が高まるようである。入浴関連事故の実態が、介護入浴という側面から、ある程度明らかにすることができたため、概ね順調に伸展していると判断した。【背景】我が国では高齢者で入浴中の急死が多く、年間約19,000人発生していると推計され、現在も増え続けている。入浴中の事故は死に至るものが多いが、その原因は、事故か疾病か依然として不明である。現状では、死因を正確に決定する診断基準がなく、それを探求することが予防にもつながる。【対象と方法】2013年に大阪市内で発生したすべての浴槽内事故について、1救急搬送患者については大阪市消防局から、2死亡例については大阪府監察医事務所から、3介護保険施設等での事故について大阪市福祉局介護保険課からデータを入手し、疫学調査を行った。介護保険の適用のある介護保険施設等では浴槽内事故は皆無で、介護保険の適用のない介護保険施設等では、一人入浴での死亡4名中3名は入浴後30分以上で生存確認。湯温は全て41°C以上であった。【考察】41°C以上の湯での30分以上の全身浴では体温が3°C上昇し、III度熱中症になりうる。介護保険施設等では、このような長湯でない限り、病的な発作はみられない。文献によると、気道確保されたラットの実験では41°C以上の湯の全身浴で全例死亡し、湯温上昇に伴い、死亡までの時間は短縮され、41°Cの湯でも死亡時体温が42.2°Cになるという。よって、入浴中の急死は40°C以上の体温で意識消失し溺れる可能性があり、42°Cを超えると心筋崩壊による高カリウム血症で心室細動が生じ急死すると考えた。このメカニズムで、入浴中急死の法医解剖所見も矛盾なく説明できる。つまるところ、浴槽内事故のほとんどが熱中症で、初めての熱い湯での長風呂が死につながる。比較的少ないデータからの解析ではあるが、入浴中の急死の原因のほとんどが熱中症であることが明らかにすることができ、その成果は、マスコミなどでも取り上げられるようになった。

20112015年の5年間に大阪市内で発生したすべての浴槽内事故につき救急・警察・介護と関わる機関からの協力を得て疫学調査を行った。浴槽内事故で救急搬送され助かった者は188例(男性111名、女性77名平均年齢60.1歳)で、傷病名は熱中症48名、溺水140名。一方、浴槽内事故死亡者は2,063名(男性236名、女性187名平均年齢76.8歳)で、発生場所は自宅1,844名、公衆浴場136名、ホテル27名、老人ホーム24名、共同風呂14名であった。死因は虚血性心疾患807名、溺死341名、高血圧性心疾患296名、脳血管疾患155名、熱中症45名と様々であった。介護保険施設等での入浴介護中の浴槽内事故は5年間に3件しかなく、いずれも意識障害を発症し急死したが、死因は病死で虚血性心疾患、てんかん、大動脈解離であった。老人ホームなどでの浴槽内事故も5年間に6名しかなく、いずれも一人入浴での死亡で、熱中症を否定できなかった。42°C以上の湯に全身浴で浸かり続けると、30分で体温が3°C以上上昇し、誰もがIII度熱中症になりうる。また、気道確保されたラットでも41°C以上の全身浴で全例が死亡し、湯温に反比例して死亡時間が短縮されるとされる。42°C以上の深部体温では、心筋が崩壊し高カリウム血症、心室細動を引き起こす。今まで不可解とされた解剖所見も、熱中症発症のメカニズムで矛盾なく説明できる。介護保険施設等での浴槽内事故は、入浴介護中の稀な致死的な病的発作以外は、老人ホームでの一人入浴中の事故であり、ほぼほぼ熱中症と考えられる。元気な高齢者に多い自宅での事故は、熱中症の可能性がより高まる。41°C以上の湯に30分以上全身浴で浸かり続けると誰もが事故に遭う可能性が高く、めったに救命されることはない。初めての熱い湯での長風呂が死につながりうる。入浴中の急死は高齢者で多いが、原因は特定されていないが、大阪市での疫学調査により病態を概ね明らかにできた。浴槽内での死亡事故の発生場所は、自宅が89.4%を占め、公衆浴場が6.6%、ホテル1.3%、老人ホーム0.4%であった。老人ホームでは5年間で8件の浴槽内死亡事故があり、1件の死因は内因性急死で、7件は一人入浴での急死で熱中症を否定できない。42°C以上の湯に全身浴で30分以上浸かると深部体温が3°C上昇して誰もがIII度熱中症になり、意識を失う。深部体温が42°C以上になると心筋が崩壊し高カリウム血症となり心室細動を起こし急死する。今まで不可解とされた解剖所見もこのメカニズムで矛盾なく説明できた。現在は1年間だけのデータで概要を示しただけに過ぎず、気象データとの関連性、剖検データからの診断根拠、など、現在の研究をより進展させる必要がある。データを増やし、より確固たる証拠を見いだした上で、別の方向からの研究も加え、入浴中の急死の原因が熱中症であることを示すことを証明したい。法医学研究自体は順調に進んでいるが、当初の予定より、学会発表の機会が減り、論文作成が滞ったために、次年度使用額が生じてしまった。当初予定していた、出張計画が行われなかったため。結果として22万円ほどの残金が生じた。学会参加・学会発表を増やし、英語論文を作成する回数を増やすことにより、当初より、使用額を増やす予定であり、それ以外については、当初の使用計画に変わりはない。次年度での、研究出張を増やし、より多くのデータを入手するように努める。
新たなスクリーニング法の開発を目指した胆嚢がん特異蛋白の検索

本研究の目的は、胆嚢がん患者の癌組織中の蛋白質を網羅的に検索し、早期発見用の新規マーカーの開発を目指すことである。胆嚢がん患者のホルマリン固定パラフィン包埋切片から、コントロール群(I群)3、異形成群(II群)6、進行癌群(III群)6の計15試料を作成した。LC/MS/MS法により各群の発現蛋白質を網羅的に検索した。平均蛋白質数は、I群993、II群1,291、III群1,109であり、306、1,148、930が群特異蛋白質であった。胆嚢がんマーカーとすべき候補蛋白質を絞り込み、免疫染色により胆嚢組織での発現を確認した。胆嚢がんマーカーの候補とした蛋白質を用いて、新たな患者での検証が必要である。平成24年度の計画は、チリで採取した胆嚢がん患者の試料中の特異蛋白質の検索を行うことであった。平成23年度に入手したチリ胆嚢がん患者の病理ホルマリン固定パラフィン切片から分担研究者のグループが開発したOSDD (On-site Directed Digestion)法を用いてペプチド試料を作製し、ショットガン分析により正常組織と癌組織に発現する蛋白質を網羅的に解析した。その方法と結果は以下の通りである。胆嚢がん患者のホルマリン固定パラフィンブロックから専用メンブレン上にその切片を作製し、脱パラフィンを行った。PAS染色後、切片上の組織画像をもとに、正常細胞、癌細胞、進行癌細胞の3群に分け、Laser Micro Dissection法により正常細胞群3試料、癌細胞群6試料、進行癌細胞群6試料を切り出した。得られた試料をトリプシン処理し、脱塩した。脱塩後のサンプルを遠心乾燥し、再度溶媒に溶解して濃度測定後、各サンプルを質量分析装置を用いて解析した。測定は1サンプルにつき3回行い、ショットガン分析を用いることでより分離能を上げた。得られた質量データの検索は、ウェブ上で検索可能な蛋白質同定システム"MASCOT"を用いて行った。得られた結果をExcel上で比較し、各群で選別された蛋白質の同定を行い、各群に固有の蛋白質を検出した。その結果、正常細胞群からは平均993個の蛋白質が、癌細胞群からは平均1,291個の蛋白質が、進行癌細胞群からは平均1,105個の蛋白質が検出された。さらに、群間での比較を行い、正常細胞群に固有の蛋白質が306個、癌細胞群に固有の蛋白質が1148個、進行癌細胞群に固有の蛋白質が930個検出された。本研究は、予後が極めて悪い胆嚢がんの予防対策として、本症を早期発見、早期診断するために血液でプレスクリーニングできる新規腫瘍マーカーの開発を目指すことを目的としている。平成25年度には、前年度に遺伝子シンボルの群間比較(コントロール;Group 1,異形成;Group 2,進行癌;Group 3)で得られた結果をもとに抗体リストを作成した。各条件を満たす遺伝子シンボルについて、各試料での出現回数とSIN値の平均値、蛋白質名、胆嚢での発現割合、正常/癌組織での発現等を考慮してリストを作成した。まず、コントロール群のGroup 1には出現せず、癌群のGroup 2とGroup 3のみに出現した遺伝子シンボル391個について抗体リストを作成した。さらに、Group 2のみに出現した遺伝子シンボル506個、Group 3のみに出現した遺伝子シンボル435個について、各々抗体リストを作成した。各サンプルでの出現回数とSIN値が高く、胆嚢での発現割合や癌組織での発現が低いものを候補として絞り込み、8種類の蛋白質を選び出した。そして、これらの抗体を用いて、免疫抗体染色により、胆嚢組織中での発現を確認した。その結果、これまでの報告では胆嚢での発現は認められていないが、免疫抗体染色により染色され、かつ、癌が進行するにつれて良く染まっているものが2つ存在した。これらは、胆嚢がんのマーカーとして使用できる可能性があり、今後、胆嚢がん患者の血清や尿中から検出されるかどうかの検証を行う予定である。これまで胆嚢がん患者の癌細胞に由来する蛋白質を網羅的に解析した例は少なく、また、各グループから1,500種以上の蛋白質を同定した例はない。今後の課題として、候補として絞り込んだ蛋白質がマーカーとして実際に使用可能かどうかの検証を行いたい。平成23年度の計画は、チリで共同研究者と打合せを行った後、試料採取を行うことであった。平成23年8月に、海外共同研究者が勤務するSotero del Rio病院(チリの首都サンチアゴ)を訪問し、研究打ち合わせを行った。

その後、日本(新潟医療福祉大学)およびチリ(Sotero del Rio病院)で倫理委員会の承認を得てから試料の採取を開始した。研究打ち合わせでは、本研究の目的、方法、及び予想される結果についての概要、患者への説明書及び同意書の書式と同意書の取得方法、試料(胆嚢組織、胆汁、血液、尿)の採取法および取扱い法と保存法、チリで採取した試料の日本への運搬方法、各試料からの蛋白質の分離、同定方法、得られた結果の解釈などについて協議し、合意が得られた。試料採取の対象者は、チリ胆嚢がん患者であり、術前に本研究の目的、方法、予想される結果等を患者に説明し、書面によるインフォームドコンセントが得られたものから試料を採取した。平成24年3月末までに4名の患者から試料を採取した。得られた試料は、胆嚢組織は、術後直ちに液体窒素による迅速固定標本を作成、その後ー80°Cのフリーザー中に保存した。胆汁は、胆摘後に採取し、市販チューブに移し、直ちに冷凍保存した。血液は、術前、術後の早朝空腹時に10 ml採取し、30分間室温放置後1500G、10分間遠心し、得られた上清(血清)をチューブに分注した。同様に、尿も術前、術後の早朝空腹時に2030 ml採取した。得られた血清、尿は直ちに冷凍保存した。平成24年度には、癌組織中から特異蛋白質を検出し、胆汁、血清、尿中から検出される蛋白質と比較照合し、オーバーラップする蛋白質をバイオマーカー候補として選抜することを目的としていた。質量分析装置(LC-MS/MS)を用いて、胆嚢がん患者の病理ホルマリン固定パラフィン切片上の正常細胞群、癌細胞群、進行癌細胞群からそれぞれに固有の蛋白質を多数検出することができた。しかし、癌細胞群や進行癌細胞群から特異的に検出された蛋白質が他の生体試料中からも検出されるかどうかの検討はできなかった。さらに、検出された蛋白質をバイオマーカー候補として絞り込むこともできなかった。今後、GO annotation解析や各群に特異的な蛋白質についてProtein ATRASの抗体リストを作成し、データベースに存在する既存抗体を用いた確認を行う予定である。平成23年度には、5例の胆嚢がん患者から試料を採取する予定であったが、平成24年3月末までに4例の患者から試料を採取した。このうち1例はその後の精密検査の結果、胆嚢がんと診断されなかったため、この1例についてはコントロール(正常胆嚢組織)として使用する予定である。23年度中には、目標とした5例の試料を採取できなかったため、引き続き試料の採取を平成24年6月末まで継続し、目標数に達する予定である。当初予定したとおりに研究打ち合わせ、試料の採取などがほぼ達成できたので研究の進捗状況は概ね順調であると考えている。平成25年度は本研究の最終年度に当たることから、各々の細胞群から得られた蛋白質を詳細に検討し、以下の方法でバイオマーカーとなる蛋白質を同定する予定である。蛋白質同定システム"MASCOT"を用いて各群で同定された蛋白質について、DAVID Bioinformatics Resources (ver. 6.7)によりGO annotation解析を行う。各群の蛋白質のIDリストをDAVIDのFunctional Annotation Toolを用いてgene IDリストに変換した後、Anno-tation Summary resultsを表示して、Gene Oncologyの結果をTXT形式で得る。