hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CCDイオンイメージセンサを用いたチャネルタンパク質スクリーニングアレイの開発

チャネルタンパク質は細胞内外での物質・情報のやり取りに直接関わる膜タンパク質であり、創薬ターゲットとしても重要視されている。本研究課題では特定のカチオンに選択的に応答する半導体イオンイメージセンサ(CCD-IIS)を、チャネルタンパク質の活性計測へ応用するための要素技術を開発することを目的とした。CCD-IIS上に人工細胞膜モデル系である脂質二重膜を作製し、その構造と物性を評価した。脂質二重膜形成前後でのイオン応答を計測し、センサ上に形成された脂質膜にイオン遮蔽効果があることを示した。チャネルタンパク質は創薬ターゲットとして主要な位置を占める膜タンパク質であり、チャネルタンパク質に対する薬剤スクリーニング手法が待望されている。本課題では特定のカチオンに選択的に応答するCCDイオンイメージングセンサ(CCD-IIS)上をチャネルタンパク質応答計測へ応用するための要素技術の開発を目的とする。本課題で用いるCCD-IISはイオノフォアを混ぜたポリビニルクロライド(PVC)膜によって被覆している。平成26年度は、安定かつ欠陥の少ない支持脂質二重膜(SLB)をCCD-IIS上に作製するための技術を確立した。球殻上の脂質二重膜である脂質ベシクルを用いてSLBを形成するベシクル融合法によってCCD-IIS形成を行い、蛍光顕微鏡および原子間力顕微鏡(AFM)観察を行った。蛍光顕微鏡による100 μmオーダーの視野範囲での観察では均一な輝度を持つSLBが形成されたことが確認できた。しかし、AFMを用いた1 μmオーダーの視野範囲での観察では、SLBに直径数十nm程度の欠陥が存在していることが確認された。また、fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)法によるSLBの流動性計測を行ったところ、標準試料であるSiO2/Si基板上のSLBと比較して、PVC膜上のSLBは拡散係数が小さく、また流動性成分が小さいことが明らかになった。PVC膜自体の詳細なAFM観察から、PVC膜は組成成分が均一に混合しておらず、その表面上では主に親水性領域が占める中に数十数百nmの疎水性領域が混在していることを見出した。そこで、巨大単層膜ベシクル(GUV)の展開によるSLB形成を試みた。Electroformation法によって形成したGUVを用いてSLB形成を行うことで、欠陥がほとんど存在しなくなり、またFRAP計測での拡散係数と流動性成分が大幅に改善した。創薬ターゲットの中の主要な膜タンパク質の1つであるイオンチャネルに対して効果的な薬剤スクリーング手法を開発するための要素技術開発のために、CCDイオンイメージングセンサ(CCD-IIS)上への人工脂質二重膜形成とイオン応答計測を行った。平成26年度はCCD-IIS表面の微細構造観察と、その結果をふまえての平面脂質二重膜の形成方法の最適化を行い、概ね順調に推移した。平成27年度はこれらの結果に基づいて、K+イオン感応膜としてイオノフォア含有PVC膜で被覆したCCD-IIS素子上で、K+濃度の異なる緩衝液を交換して時間応答を調べることにより、平面脂質膜によるイオン遮蔽効果を検証した。平面脂質二重膜形成前のCCD-IIS上では性能通りの時間応答が得られ、溶液交換開始後5秒以内に濃度変化が完了した。ベシクル融合法による平面脂質二重膜形成後は、多くの画素において溶液交換から濃度変化に遅延が見られ、半減期で約10秒、90%以上の濃度変化到達までに30秒程度を要した。画素上を被覆した脂質二重膜によるイオン遮蔽が起きていることが示唆された。一方、平面脂質二重膜による被覆が確認された画素については、同じK+濃度でも被覆前と比べてCCD-IISの出力電位が低下した。センサ面直上に絶縁膜の層が形成されたことによりセンシングエリア直下の電気容量が低下したことによると考えられる。画素間で濃度変化に対する時間応答および脂質膜形成による出力電位低下のばらつきが大きかった事から、多くの画素を高絶縁性の脂質二重膜で被覆するために、GUV形成の効率化およびフィルタリングによるサイズ選別を行った。本研究課題によってCCD-IIS上への人工脂質二重膜形成およびイオン応答計測に関しての基盤となる基本技術と計測手法を開発することができた。これまでにPVC膜上でSLBを作製した例は無かったため、平成26年度はPVC膜上でのベシクル融合法によるSLB形成について、実験条件の最適化と原子間力顕微鏡(AFM)および蛍光顕微鏡観察によるSLBの構造観察・物性計測を行うことを予定していた。通常のベシクル融合法ではSLBに欠陥が生じたものの、SLB形成方法をGUV展開法に変更することでSLBの構造および物性を改善た。標準試料であるSiO2/Si上に近いSLBをPVC膜上に形成することができ、当初の予定を達成できたと言える。また、基板として実際のCCD-IIS素子を用いたSLB形成も行い、こちらも実験条件を確立した。

SLBの有無によるイオン応答製の差を調べるための溶液循環用のセットアップもCCD-IIS計測装置周辺に設置して試験運転を行い、順調に稼働した。界面物理化学CCD-IISでは、溶液中のカチオン濃度によってイオノフォアが捕らえるカチオン量を表面ポテンシャルの変化として検出している。溶液とPVC膜が平衡状態に達することが原則であるため、ナノギャップ内での濃度上昇(OPEN時)、分子拡散による濃度減少(CLOSE時)にどの程度追随できるかは、PVC膜内のイオン拡散速度や膜厚に依存する可能性がある。H27年度は、SLBを形成した担持CCD-IIS素子上での溶液交換における時間応答を確認し、必要に応じてPVC膜の膜厚、イオノフォア濃度、可塑剤との配合比などを改善する。SLBによるイオン遮蔽効果が確認できた後に、イオンチャネルとして働くペプチドであるグラミシジンを加えて、CCD-IISによるチャネル応答計測の測定原理を確立する。グラミシジンは構造が単純なため失活しにくく取り扱いと脂質膜中への包埋操作(再構成)が用意で、チャネル電流計測系における測定システムの実証のために広く用いられている。K+やNa+について、シングルチャネルの電流値(=イオン流量)やOPEN/CLOSE頻度、これらの印加電位およびイオン濃度への依存性が明らかにされている。この情報をもとに、SLB/CCD-IIS系においてイオン流による濃度変化がどの程度の強度・時定数のポテンシャル変化の情報として得られるかを実測し、SLBおよびPVC膜の作製法などの実験条件や、データの取得・解析方法も含めて測定手法を確立する。また、16K画素を持つCCD-IISから独立に得られる16K本のデータから統計的にデータを抽出するための解析プログラムを作成する。
公的医療保険を持続可能にする消費者教育の構築－医療面からの消費者市民社会の実現－

わが国では,消費者基本法および消費者教育推進法の施行を基盤に,消費者は自らの利益のために自立し自らの選択と行動が社会に与える影響を考慮して公正で持続可能な社会の確立に貢献するとともに,消費者市民社会の形成に参画することが求められている。ところで近年,日本の医療保険制度の持続可能性に疑念が生じている。人口構造の高齢化の進展や医療技術・機器・薬品の高度化に加えて,国民の医療消費者としての行動が国民医療費を増大させており保険財政のひっ迫を招いている原因の一つになっていると指摘されている。わが国の医療保険制度は,医療消費者がいつでも必要な時に希望する医療機関で比較的安価な自己負担によって受診することができることから,高い国際的評価を受けてきた。しかし,近年ではそれがかえって災いし,国民が自己の健康管理を怠り,軽度な傷病でも大病院での受診を選択し,定期検診を受けずに重症化し高度な医療が必要になってから受診する傾向が見られ,医療費増大に寄与していると批判されている。このままでは,医療保険制度の持続可能性は損なわれることになる懸念がある。一方,2000年から国がスタートし150を超える関連民間団体が関わる「21世紀における国民健康づくり運動(健康日本21)」が推進され,さらに2013年からは「同(第二次)」が発足して方針や理念,目標が全面改正された上で,生活習慣病の課題解決のための健康指標基本データが示されつつある。本研究では,一人当たり医療費や健康寿命に関して,都道府県および市町村ごとの公的データの分析を行った。加えて「健康日本21(第二次)」の報告(案)の分析を行って日本国内における特色ある地域を選定する過程にある。今年度の研究は,一人当たり医療費や健康寿命に関して,都道府県および市町村ごとの公的データの分析に加えて「健康日本21(第二次)」の報告の検討を行った上で,日本国内における特色ある地域を選定し現地に赴き調査を実施する予定であった。しかし,2013年に立ち上がった「健康日本21(第二次)」の中間評価報告が2018年半ばに「案」の段階のみ公表された。このため,この報告の分析を踏まえて行うはずであった調査地域の選定が大幅に遅れ,今年度は調査実施するには至らなかった。その分の研究がやや遅れている。今後は,今年度に実施できなかった日本国内の特色ある地域での実態調査を実施・分析し,公表された公的データの分析結果と共に,国民全体の健康寿命を延ばし豊かな人生の実現に貢献するとともに公的医療保険制度を持続可能にする消費者行動と消費者教育について,消費者市民社会の観点も踏まえて考察する。わが国では、消費者基本法や消費者教育推進法の施行を基盤に、消費者は自らの利益のために自立し自らの選択と行動が社会に与える影響を考慮して公正で持続可能な社会の確立に貢献し消費者市民社会の形成に参画することが求められている。ところで、近年、国民の医療消費者としての行動についての問題点が指摘されている。わが国の医療保険制度は、各医療消費者がいつでも好きな時にどこでも希望する医療機関で安価な自己負担によって受診することが可能であり、それが利点であるとの国際的評価を受けてきた。しかし、近年ではそれがかえって災いし、医療消費者は、自己の健康管理を怠り、軽度な身体不調でも大病院を受診し、定期検診を受けず疾病が重症化してから受診しようとする傾向にある。その行動が、国民医療費を膨張させ、公的医療保険の財政悪化を招く一因となっているとの評価が為されるようになった。消費者教育は、悪徳商法から身を守る方法ばかりでなく、適切な健康管理や検診・受診行動によって国民の医療サービスを保障している公的医療保険を持続可能にするための教育も重要であり、その開発が本研究の目的である。家政学にとって、この研究目的を果たすことが急務の課題であるといえる。平成29年度は、医療保険制度、社会保障制度、医療経済学、保険学、医薬品、セルフメディケーション、健康などに関する国内外の文献や資料を収集・分析し、医学者や保健学者に必要な専門知識やアドバイスを受けた。また、一人当たり医療費は、日本国内でも市町村や都道府県によって格差が大きいが、地方自治体ごとに医療環境や住民の疾病状況、受診行動、健康維持行動、自治体の健康維持・増進のための取り組みが異なる。その実態について分析し、自治体ごとの特徴を分析し検討した。当初の予定では、一人当たり医療費が高い自治体と低い自治体を選び、住民の健康維持・増進のための自治体の取り組みや医療環境、住民の疾病状況、受診行動、健康維持行動等について、行政機関や医療機関等の資料を収集しインタビュー調査を実施する予定であった。しかし、自治体ごとの実態についての文献や資料による分析に手間と時間がとられ、インタビュー調査を実施するに至っていない。

しかし,近年ではそれがかえって災いし,国民が自己の健康管理を怠り,軽度な傷病でも大病院での受診を選択し,定期検診を受けずに重症化し高度な医療が必要になってから受診する傾向が見られ,医療費増大に寄与していると批判されている。このままでは,医療保険制度の持続可能性は損なわれることになる懸念がある。一方,2000年から国がスタートし150を超える関連民間団体が関わる「21世紀における国民健康づくり運動(健康日本21)」が推進され,さらに2013年からは「同(第二次)」が発足して方針や理念,目標が全面改正された上で,生活習慣病の課題解決のための健康指標基本データが示されつつある。本研究では,一人当たり医療費や健康寿命に関して,都道府県および市町村ごとの公的データの分析を行った。加えて「健康日本21(第二次)」の報告(案)の分析を行って日本国内における特色ある地域を選定する過程にある。今年度の研究は,一人当たり医療費や健康寿命に関して,都道府県および市町村ごとの公的データの分析に加えて「健康日本21(第二次)」の報告の検討を行った上で,日本国内における特色ある地域を選定し現地に赴き調査を実施する予定であった。しかし,2013年に立ち上がった「健康日本21(第二次)」の中間評価報告が2018年半ばに「案」の段階のみ公表された。このため,この報告の分析を踏まえて行うはずであった調査地域の選定が大幅に遅れ,今年度は調査実施するには至らなかった。その分の研究がやや遅れている。平成30年度からは、各自治体の特徴について焦点を絞って検討し直し、インタビュー調査の地点を選んで実施する。さらに、協力が得られる高齢者、中年者、若年者が集まる施設や団体において、日頃の健康維持・増進行動、定期検診の受診行動、医療機関での受診行動、セルフメディケーションなどについてのアンケート調査を実施し分析する。行政機関や医療機関でのインタビュー調査と高齢者、中年者、若年者へのアンケート調査を比較し、問題点を抽出する。さらに、問題解決のための消費者教育の内容について検討する。以上について報告書を作成する。今後は,今年度に実施できなかった日本国内の特色ある地域での実態調査を実施・分析し,公表された公的データの分析結果と共に,国民全体の健康寿命を延ばし豊かな人生の実現に貢献するとともに公的医療保険制度を持続可能にする消費者行動と消費者教育について,消費者市民社会の観点も踏まえて考察する。研究計画時には、当該年度に1人当たり医療費が低い自治体と高い自治体のそれぞれいくつかにおいてインタビュー調査を実施する予定であった。しかし、自治体ごとの実態についての文献や資料による分析に手間と時間がとられ、インタビュー調査を実施するに至らなかったため、特に旅費、人件費・謝金、その他の支出が無いまたは少なくなり、次年度使用額が生じた。次年度には1人当たり医療費が低い自治体と高い自治体のそれぞれいくつかにおいてインタビュー調査を実施するため、当該年度における次年度使用額を使用する予定である。今年度は,公的データが期待していたようには入手できず,その分析結果に基づい実施する予定であった特色ある地域における調査実施ができなかったため,今年度の支出が予定通りに行かなかった。
金属板材スプリングバックの精密計測と高精度曲げ加工システムの開発

本研究は,大変形後の弾性係数やスプリングバック特性を高精度に計測評価するために,レーザー干渉測長計を導入して塑性変形に伴う弾性係数の変化を精密に測定するシステムを開発した.弾性変形領域と塑性変形領域を統一した形で,応力とひずみを測定することにより,高精度かつ安定した弾性係数の測定が可能となった.また,ホール素子を利用した応力測定磁気センサの開発を行い,曲げ変形中における応力分布の測定を行った.塑性変形前後の弾性係数を測定した結果,塑性変形に伴い,弾性係数が20%ほど減少することが分かった.塑性ひずみの増加に伴うヤング率の減少をモデル化し,曲げ加工プロセスシミュレーションのスプリングバックを予測する構成式に適用し,スプリングバック予測を行った.実験値と比較した結果,曲げ角度に関して,従来より高い予測精度が得られた.塑性変形が進行することに伴う弾性係数の低下現象のメカニズムを把握するために,変形による金属板材の内部でのマイクロ的な材料特性の変化等について計測・評価した.変形前と後の金属板材断面の結晶組織観察を行い,曲げ変形による結晶組織の変化を画像処理によって定量的に評価した.ナノインデンテーションを用いて結晶粒内での材料特性(ヤング率,硬さ)の分布を測定し,変形によるマイクロな材料特性の変化を評価した.塑性変形に伴い,結晶粒界付近において,弾性係数が局部的に低下することが分かった.この局部的な弾性係数の低下は全体のスプリングバック量の変化に大きく影響を及ぼすものと考えられる.実機用金型を用いた曲げ加工に対応して,より加工条件の厳しい金型に対して有限要素法による解析を行い,シミュレーションデータベースの構築及び適応フィルターの設計を行って,実験との比較評価を行った.実機での実験データを用いて評価を行った結果,実験室レベルと同様に高精度な加工精度を得ることができた.本研究は,大変形後の弾性係数やスプリングバック特性を高精度に計測評価するために,レーザー干渉測長計を導入して塑性変形に伴う弾性係数の変化を精密に測定するシステムを開発した.弾性変形領域と塑性変形領域を統一した形で,応力とひずみを測定することにより,高精度かつ安定した弾性係数の測定が可能となった.また,ホール素子を利用した応力測定磁気センサの開発を行い,曲げ変形中における応力分布の測定を行った.塑性変形前後の弾性係数を測定した結果,塑性変形に伴い,弾性係数が20%ほど減少することが分かった.塑性ひずみの増加に伴うヤング率の減少をモデル化し,曲げ加工プロセスシミュレーションのスプリングバックを予測する構成式に適用し,スプリングバック予測を行った.実験値と比較した結果,曲げ角度に関して,従来より高い予測精度が得られた.塑性変形が進行することに伴う弾性係数の低下現象のメカニズムを把握するために,変形による金属板材の内部でのマイクロ的な材料特性の変化等について計測・評価した.変形前と後の金属板材断面の結晶組織観察を行い,曲げ変形による結晶組織の変化を画像処理によって定量的に評価した.ナノインデンテーションを用いて結晶粒内での材料特性(ヤング率,硬さ)の分布を測定し,変形によるマイクロな材料特性の変化を評価した.塑性変形に伴い,結晶粒界付近において,弾性係数が局部的に低下することが分かった.この局部的な弾性係数の低下は全体のスプリングバック量の変化に大きく影響を及ぼすものと考えられる.実機用金型を用いた曲げ加工に対応して,より加工条件の厳しい金型に対して有限要素法による解析を行い,シミュレーションデータベースの構築及び適応フィルターの設計を行って,実験との比較評価を行った.実機での実験データを用いて評価を行った結果,実験室レベルと同様に高精度な加工精度を得ることができた.今年度は,レーザー干渉測長計を導入した塑性変形に伴う弾性係数の変化を精密測定システムを開発し,弾性変形領域と塑性変形領域を統一した形で,応力とひずみの測定が可能となり,高精度かつ安定したヤング率の測定が可能となった.また,ホール素子を利用した応力測定磁気センサの開発を行い,曲げ変形中における応力分布の測定を行った.さらに,実機で用いられる金型を用いた曲げ加工に対応して,有限要素法による解析と旨シミュレーションデータベースの構築及び適応フィルターの設計を行い,実験との比較評価を行った.具体的な研究成果は以下に示す.a)開発した精密ヤング率測定システムを用いて,塑性変形前後ヤング率を測定した.その結果,塑性変形に伴い,ヤング率が20%ほど減少することが分かった.ヤング率の塑性歪みに伴う変化をシミュレーションに適用し,スプリングバックをより高精度に予測できると考えられる.b)開発した応力測定センサーを用いて,塑性変形時の応力及びその分布を測定した.その結果,応力と試験片の通磁率との間に相関があり,磁気センサの応力測定の可能性を示した.現在,応力分布の測定を試みている段階である.塑性変形に伴うヤング率の変化と曲げ変形中の応力分布を測定することによって,スプリングバックのリアルタイム計測と高精度評価が可能となる.c)実機で使用されているより加工条件の厳しい金型に対して,加工シミュレーションを行い,加工制御用のデータベースと制御システムの構築を行った.実機での実験データを用いて評価を行った結果,実験室レベルと同様に高精度な加工精度を得ることができた.今年度は,より高い加工精度のニーズに対して,材料変形特性の高精度計測・評価方法の確立とシミュレーションの改良を行った.まず,昨年度開発したレーザー干渉測長計を導入した引張試験で得られた測定した塑性変形に伴う弾性係数の変化に対して,曲げ実験及びシミュレーションによって,その信頼性について評価した.

さらに,塑性変形が進行することに伴い,ヤング率が低下していく現象のメカニズムを把握するために,変形による金属板材の内部でのマイクロ的な材料特性の変化等について計測・評価した.マイクロ的な機械特性をマクロ変形特性との相関を評価し,マクロな変形をより高精度にシミュレートすることを目的とした.具体的な研究成果は以下に示す.a)塑性変形に伴い,ヤング率が減少する傾向をモデル化し,プロセスシミュレーションのスプリングバック予測する構成式に適用し,スプリングバックの予測を行い,実験値と比較した結果,曲げ角度に関して,従来の計算より高い予測精度が得られた.b)変形前と後の金属板材断面の結晶組織観察を行い,曲げ変形による結晶組織の変化を画像処理によって定量的に評価した.その結果,変形によって個々の結晶粒は大きく変形し,ひずみが大きい表層部では大きなダメージが観察された.また,結晶粒の変形を定量評価したところ,ひずみ量との相関があることが分った.c)ナノインデンテーションを用いて結晶粒内での材料特性(ヤング率,硬さ)の分布を測定し,変形によるマイクロな材料特性の変化を評価した.塑性変形に伴い,ヤング率が低下していく現象のメカニズムを把握することによって,マクロな変形をより高精度に予測可能と考えられる.今年度は,塑性変形に伴うヤング率低下のメカニズムを把握するために,塑性変形に伴う金属板材の内部でのマイクロ的な機械特性の変化をナノインデンテーション試験を行うことによって,計測評価した.マイクロ的な機械特性をマクロ変形特性との相関を評価し,マクロな変形をより高精度にシミュレートし,それを反映した高精度曲げ加工制御システムの構築を行うことを目的とした.具体的な研究成果は以下に示す.a)塑性変形による材料の結晶構造の変化を精密光学測定装置を用いて測定を行った.板材の曲げ実験を行い,試験片断面を顕微鏡観察し,画像処理で結晶粒の変形を評価した結果,最大約60%の結晶粒径の変化があり,ボイドの発生も確認された.b)塑性変形による材料特性の変化をさらに微視的な観点で計測評価するため,一つの結晶粒の粒界付近及び内部に対してナノインデンテーション試験で微小領域でも材料特性測定を行った.10%程度の塑性歪みを負荷した材料に対して,任意に選んだ結晶の粒界面付近での弾性係数を測定した.その結果,粒界に近づくにつれて,弾性係数が低下する傾向が見られた.これは粒界に堆積した転移が弾性変形範囲内でも移動する可動転位の存在によるものと考えられる.塑性歪みの増加に伴い,可動転位が増加するため,マクロ的に測定したヤング率が低下するものと推定できる.c)塑性変形後の材料を用いて,弾性範囲のみの引張試験を行った.その際,可動転位の影響を確認するために,可動転位を固着するような特殊な熱処理を行った試験片についても,試験を行った.その結果,熱処理を行った試験片とそうでない試験片の弾性係数が大きく異なり,可動転位による影響が明らかになった.d)ヤング率の塑性歪みに伴う変化をシミュレーションに取入れ,実機で使用されている金型と曲げ加工条件で曲げシミュレーションを行った.
近世期私塾の人間形成ー松下村塾生92名の追跡調査を中心に

本年度研究テ-マに関して得られた知見は以下のとおりである。1.ほとんど無名の市井人として生きた30名全体の32.6%のうち、故郷に帰った者が10名いるが、家業を継いだのは医者4名、僧侶1名、作陶家1名。他は小学校長、村議などで終わった。もと士族の多くは、県の下級官吏や教員の職についたが、志を得ず、北海道へ移住した佐々木兄弟のように、県外へ脱出したものも少なくない。2.消息不明のリストから外された多くは、維新前後に養子縁組や改名の事実が判明した人びとであり、また早い時期に死没したものも若干いる。3.墓碑、過去帳の追跡により直系子孫の生存が2件確認されたが、僧観界の場合は自筆の史料を入手した。4.政治的反乱、刑罰関係の史料から、従前隠匿されていた情報の判明したものが2名いる。5.長崎や大村益次郎塾などで蘭学を学び、海外留学を希望したものが多数いる。松浦のアメリカ行は挫折したが、伊藤ら12名の場合は実現した。選抜から漏れた福原ら4名を合わせると、計17名、実に全体の18.5%に達する。工学方面に進んだものが多く、帰国後も技術系官僚の道を選んだのは、実利・実用を重んじたかつての塾風のゆえだろうか。6.成功者といわれる人びとは、討幕運動の中から浮上した政治的覚派に属したが、多くは軽輩であり、家格の高い中士以上の人びとは早晩脱落した。7.教職の経験者は8名程度しか確認できないが、東京職工学校長正木退蔵のように、志願者に勉学の目的を尋ね、また師弟の会食を日常比するなど、往昔の塾風をそのまま踏襲したものもいる。8.政界や官界への進出がめざましいが、伊藤、山県らのような閣僚経験のある6名、県知事クラスの4名を含め、旧師の意志をどれだけ継承したかというと、甚だ疑わしい。松陰の期待した人民の友たる経世家に程遠い圧政者に属する人びとが多く、世俗的意味での政的人間=政治家や官僚という範畴にとどまった。
有機媒体中における新しい分子集合系の創製とその機能化

本研究では、有機溶媒中で新たな分子集合組織を形成するために,種々の界面活性剤分子を合成し,これらの分子の作り出す集合組織の反応場および分離場としての機能化に焦点を絞り研究を展開した。具体的に得られた研究成果は,以下の通りである.1.有機媒体中に自発的に形成される分子集合体の一種である逆ミセルは、生体高分子であるタンパク質の抽出操作を可能にした。分子集合組織のタンパク質の抽出の観点から重要なことは,全く同様な逆ミセルの挙動を示した界面活性剤分子が非常に異なるタンパク質の抽出挙動を示す点である.つまりこのことは同一の親水基を有する界面活性剤においても,逆ミセル形成能とタンパク質の抽出能が一義的に相関できないことを示している.また,疎水基の微妙な構造の変化やバランス,界面活性剤の分子の大きさや形がタンパク質の抽出と密接な関係があることが示された.2.逆ミセル溶液をナノ構造を有する新たなバイオリアクターと考え、これまでにない新しい"液状固定化酵素"という概念を提案した。すなわち、逆ミセルに固定化した酵素を水相中に投入し、水相中のアミノ酸の選択的加水分解反応に応用した。逆ミセル中に固定化された酵素は、個々隔離されて存在するために、耐熱性長期安定性に優れた生体触媒としての特性を示した。3.凝集タンパク質の再生を目的として、逆ミセルを利用した新しいリフォルディング技術を開発した。モデルタンパク質として、RNase Aを取り上げ、尿素で変性させたタンパク質を高効率で再生することに成功した。新しく開発した界面活性剤ジオレイルリン酸(DOLPAと略記)を用いることによって、これまでとは性質の大きとく異なる逆ミセルを構築することが出来た。本年度具体的に得られた成果は以下の通りである。2種類の界面活性剤AOTおよびDOLPAを適当な割合で混合することによって、水溶液中から、活性なタンパク質を特異的に抽出できることが明かとなった。AOTとDOLPAを、モル比で8:2に混合した逆ミセルは、活性なタンパク質α-キモトリプシンを効率よく抽出するが、上記溶液を高温で煮沸し、熱失活したタンパク質はほとんど抽出されなかった。また活性タンパク質の認識能の程度は、混合モル比およびその濃度に大きく依存した。2.逆ミセルを用いたナノ構造バイオリアクターの構築DOLPAによって形成された逆ミセルは、従来の逆ミセルに比較して、極めて高い孤立性を有することが明かとなった。この特性は有機媒体中に酵素を安定に保持するためのマトリックスとして非常に有用な性質となる。α-キモトリプシンを有機相デカン中に取り込んだ逆ミセル溶液を、アミノ酸分解のバイオリアクターとして用いることができた。酵素を含んだ逆ミセル溶液は、光学活性を有するアミノ酸の一方のみを効率よく触媒した。この溶液は、5回の繰り返し使用においてもまったく活性の低下が見られず、高性能のバイオリアクターとなった本研究では、新しく開発した界面活性剤ジオレイルリン酸(DOLPA)およびAOTとの混合逆ミセルからなる有機媒体中での分子集合組織の反応場および分離場としての機能化に焦点を絞り研究を展開した.有機媒体中に自発的に形成される分子集合体の一種である逆ミセルは、生体高分子であるタンパク質の抽出操作を可能にした.逆ミセルを形成する代表的な界面活性剤としては,AOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)が挙げられるが、本研究で開発したDOLPAは,従来抽出が困難であった分子量5万以上のタンパク質の有機相中への可溶化を可能にした。また、有機媒体中での分子集合系の反応場としての利用も特殊環境下における生体触媒の活性発現という観点から最近注目されている。本研究では、逆ミセル溶液をナノ構造を有する新たなバイオリアクターと考え、これまでにない新しい"液状固定化酵素"という概念を提案した。

すなわち、逆ミセルに固定化した酵素を水相中に投入し、水相中のアミノ酸の選択的加水分解反応に応用した。逆ミセル中に固定化された酵素は、個々融離されて存在するために、耐熱性長期安定性に優れた生体触媒としての特性を示した。さらに、近年の遺伝子工学の発展によって、大量にタンパク質を生産させることができるようになってきた。しかしながら、細胞内に蓄積されたタンパク質は、lnclusion bodyと呼ばれる不活性な凝集体をしばしば形成することが知られている。本研究では、この凝集タンパク質の再生を目的として、逆ミセルを利用した新しいリフォルディング技術を開発した。モデルタンパク質として、RNase Aを取り上げ、尿素で変性させたタンパク質を高効率で再生することに成功した。
免疫老化と幹細胞制御機構変容との連関解明

加齢に伴う造血幹細胞でのANGPTL2発現上昇の意義を検討する目的で、Angptl2 KOマウス由来のLSK細胞を用いて競合的連続骨髄移植実験を行ったところ、野生型マウスに比べAngptl2 KOマウスの造血幹細胞が高い骨髄再構築能を示すことを見出した。ANGPTL2は加齢に伴い造血幹細胞からSASP因子として分泌され、オートクリンまたはパラクリン的に造血幹細胞の老化を促進することで、自己複製能の低下に寄与している可能性が示唆された。ANGPTL2受容体は、我々が同定したインテグリンα5β1以外に、我々以外のグループからLILRB2が同定され、その下流シグナルが造血幹細胞や白血病幹細胞の分化制御、幹細胞性維持に関わることが報告された。LILRB2のマウスホモログPirBは、造血幹細胞に高発現していることが報告されていたが、我々が検討したところ造血幹細胞ではなくlineage marker陽性細胞で豊富に発現しているという結果を得ている。また、PirB KOマウス由来のLSK細胞を用いた競合的骨髄移植実験では、野生型マウスとPirB KOマウス由来造血幹細胞の骨髄再構築能に差を認めないことから、PirB以外の受容体を介したANGPTL2シグナルが造血幹細胞の老化形質促進に関わっている可能性が考えられた。さらに、CD34ーLSK細胞では、PirBの発現は認めないが、我々がANGPTL2受容体の1つとして同定しているα5およびβ1インテグリンの発現が認められることから、α5β1インテグリンを介したANGPTL2シグナルが、造血幹細胞の老化形質促進に関わっている可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度では、造血幹細胞ニッチにおいてANGPTL2およびANGPTL2受容体を発現する責任細胞の同定を行うため、野生型マウスの骨髄よりセルソーターを用いて分取した各種細胞を用いてリアルタイムPCR解析を行った。その結果、ANGPTL2はlineage marker陽性細胞に比べ造血幹細胞において豊富に発現していることが明らかとなった。さらに、造血幹細胞におけるANGPTL2発現レベルは、造血幹細胞の加齢マーカー遺伝子同様に加齢に伴い上昇することが明らかとなった。一方、ANGPTL2の受容体として造血幹細胞に発現していることが報告されていたPirBの発現は、lineage marker陽性細胞で豊富に発現していることが確認された。ANGPTL2シグナルを介した造血幹細胞の維持・分化制御機構を解析する目的で、Angptl2 KOマウスおよび造血幹細胞や血管内皮細胞においてANGPTL2を高発現するAngptl2 Tgマウス(Tie2-Angptl2 Tg)由来造血幹細胞をフローサイトメトリーにて解析した。その結果、Angptl2 KOマウスでは造血幹細胞数が野生型マウスに比べて有意に多いこと、逆にTie2-Angptl2 Tgマウスでは造血幹細胞数が少ない傾向が認められた。そこで、Angptl2 KOマウスおよびTie2-Angptl2 Tgマウス由来の造血幹細胞を用いてコロニーアッセイを行った。その結果、コロニーアッセイではいずれのマウスにおいても野生型マウス由来造血幹細胞と比べて、コロニーの形成数、コロニーサイズ、コロニー構成細胞種に差を認めなかった。以上より、造血幹細胞と幹細胞ニッチを構成する細胞間のANGPTL2シグナルが造血幹細胞数の制御に関わっている可能性が示唆された。また、骨髄内に存在するCD4+メモリーT細胞のなかでもPD-1陽性のCD4+メモリーT細胞がANGPTL2を高発現することを見出しており、ANGPTL2シグナルを介したCD4+メモリーT細胞による造血幹細胞制御機構が存在する可能性も考えられる。当初の計画通り、造血幹細胞ニッチにおいてANGPTL2が造血幹細胞やPD-1+ CD4+メモリーT細胞において高発現していること、一方、ANGPTL2受容体の1つであるPirBはlineage marker陽性細胞に豊富に発現していることを明らかにした。さらに、ANGPTL2シグナルを介した造血幹細胞の維持・分化制御機構造血幹細胞におけるANGPTL2発現は他の造血幹細胞老化マーカー遺伝子同様に加齢に伴い上昇することや、Angptl2 KOマウスやTgマウスを用いた解析から、ANGPTL2シグナルを介した造血幹細胞の維持・分化制御機構として、ANGPTL2シグナル亢進が造血幹細胞数を負に制御している可能性が示唆された。また、平成27年度では、免疫老化関連疾患の発症・進展におけるANGPTL2シグナルの意義解明研究において平成28年度以降使用するSpa-1とAngptl2の二重欠損マウスの作製を終了している。以上のことから、本研究は当初の計画通りに進展していると考えられる。ANGPTL

2は加齢に伴い造血幹細胞からSASP因子として分泌され、オートクリンまたはパラクリン的に造血幹細胞の老化を促進することで、自己複製能の低下に寄与している可能性が示唆された。ANGPTL2受容体は、我々が同定したインテグリンα5β1以外に、我々以外のグループからLILRB2が同定され、その下流シグナルが造血幹細胞や白血病幹細胞の分化制御、幹細胞性維持に関わることが報告された。LILRB2のマウスホモログPirBは、造血幹細胞に高発現していることが報告されていたが、我々が検討したところ造血幹細胞ではなくlineage marker陽性細胞で豊富に発現しているという結果を得ている。また、PirB KOマウス由来のLSK細胞を用いた競合的骨髄移植実験では、野生型マウスとPirB KOマウス由来造血幹細胞の骨髄再構築能に差を認めないことから、PirB以外の受容体を介したANGPTL2シグナルが造血幹細胞の老化形質促進に関わっている可能性が考えられた。さらに、CD34ーLSK細胞では、PirBの発現は認めないが、我々がANGPTL2受容体の1つとして同定しているα5およびβ1インテグリンの発現が認められることから、α5β1インテグリンを介したANGPTL2シグナルが、造血幹細胞の老化形質促進に関わっている可能性が示唆された。平成28年度では、Angptl2 KOマウスやTgマウス、PirB KOマウス由来造血幹細胞を用いて競合的骨髄再構築実験を行い、各マウス系統由来造血幹細胞の長期的骨髄再構築能を評価することで、ANGPTL2シグナルを介した造血幹細胞の維持・分化制御機構の解析を進める。また、若齢および高齢のAngptl2 KOマウスやTgマウス由来造血幹細胞における造血幹細胞老化マーカー遺伝子の発現、造血幹細胞による骨髄再建能を解析し、ANGPTL2シグナルと造血幹細胞老化との関連を検討する。さらに、Spa-1とAngptl2の二重欠損マウスにおける白血病の発症率や病態の重症度を解析することで、白血病の病態発症・進展におけるANGPTL2シグナルの意義を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
元素偏析を利用したβ型チタン合金のヘテロ構造制御と高靭性化

本研究ではβ型Ti-Mo系合金を対象に、渦状偏析組織(VGS組織)のようなMoの元素偏析に起因するヘテロ構造が材料の靭性に及ぼす影響を検討することを目的とし、合わせて延性や靭性といった機械的性質や変形機構に偏析組織が及ぼす影響を基礎的に理解する実験を行った。本研究期間内では偏析組織に沿って硬質第二相であるω相を析出させることでシャルピー衝撃吸収エネルギーが上昇すること、引張延性とシャルピー衝撃吸収エネルギーとで偏析組織がより効果を発揮する温度が異なること、破壊靭性試験においても偏析組織によるω相のヘテロ分散によって室温での破壊靭性値が向上すること、などの成果が得られた。本研究はベータ型Ti-Mo系合金をメインターゲットとし、Moの元素偏析を逆に利用して非常に微細かつ複雑な渦状ハイブリッド組織(Van Gogh's Sky (VGS)組織)の作り込みを行い、Ti-Mo系合金の靭性に及ぼすVGS組織の影響を把握し、靭性向上の可能性を見極めるとともに靭性の発現機構の解明を目指すものである。本年度は主に以下のような成果が得られた。(1) Ti-12Mo(mass%)合金中のMoの偏析が材料の機械的性質や変形挙動・変形組織に及ぼす影響の基礎的な理解を目的に、板圧延によって製造した、Moが層状に偏析した材料から板状引張試験片を作成し、引張変形後の組織観察等を行った。Mo濃度の異なる領域で双晶による変形から変態誘起塑性(マルテンサイト変態)による変形へと連続的に変化する様子が走査型電子顕微鏡(SEM)における組成像(BEI)や方位像(OIM)によって観察され、Mo偏析による変形制御の可能性が示唆された。(2) Ti-12Mo合金中のMoの偏析によるVGS組織がシャルピー衝撃吸収エネルギーに及ぼす影響を調査した。250°Cで時効処理を行いVGS組織に沿ってオメガ相(硬質第二相)をヘテロ析出させた材料と、偏析がなくオメガ相が均一に析出した材料との比較では、室温での試験ではシャルピー衝撃吸収エネルギーに大きな差がなかったのに対し、200°CではVGS組織の衝撃吸収エネルギーが大きく増加し、VGS組織による靭性向上の可能性が示唆された。本材料では室温での引張試験においてVGS組織による延性の向上が確認されており、今後延性向上の発現温度とシャルピー衝撃吸収エネルギー向上の発現温度との違いについてくわしく考察していく必要がある。(1)昨年度の研究でTi-12Mo(mass%)合金時効材(硬質第二相であるオメガ相を析出させた材料)のシャルピー衝撃吸収エネルギーに及ぼすVGS偏析組織の影響が大きかった200°Cにおいて引張試験を行った結果、偏析組織を有しオメガ相が不均一に析出した材料の方が偏析組織を持たずオメガ相が均一に析出した材料と比較して同等の引張強さと大きな破断伸びを示したが、その差は室温での結果と比較して非常に小さくなり、シャルピー衝撃試験と真逆の傾向を示した。変形速度の差(シャルピー衝撃試験の方が変形速度が大きい)が関係している可能性がある。(2)Ti-12Mo(mass%)合金時効材について室温で破壊靭性試験を行い、破壊靭性値を測定した。サイズの小さい試験片しか準備できなかったこともあり、特に偏析組織を有する材料において平面ひずみ破壊靭性値(KIC)の条件を満たしておらず、破壊靭性値(KQ)としての測定となったが、偏析組織を有する材料の方が偏析組織を有しない材料より1.5倍程度高い破壊靭性値を示した。本材料はベータ相とオメガ相の二相組織であるが、オメガ相は通常チタン合金に出現するアルファ相とはき裂発生、進展に及ぼす影響が異なり、あまり影響しないのではないかと予測していたため、新たな知見となった。シャルピー衝撃吸収エネルギーに加え、破壊靭性値もVGS偏析組織によって向上することが確認できたことは、研究の方向性が正しいことを示していると考える。また室温引張延性も含めたVGS偏析組織による向上傾向の違いは変形速度の影響が大きい可能性を示唆しており、最終年度の研究の進め方がよりはっきりしたものと考える。以上の通り、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。最終年度である本年度は主に以下のような成果が得られた。(1)Ti-12Mo(mass%)合金時効材(硬質第二相であるオメガ相を析出させた材料)について偏析組織による延性、靭性発現機構を検討する一助として、ナノインデンテーション試験による局所力学応答の測定を行った。

偏析組織を有しオメガ相が不均一に析出した材料について、局所硬さのみならず局所的なヤング率もオメガ相析出量の増加に伴い増加していること、(2)Moの偏析を利用した金属組織制御の一環として、合金元素としてAlを含むTi-Mo系合金を作製し、アルファ相が析出する温度で熱処理を行い金属組織、機械的性質を調べた。主にMoの偏析に起因してアルファ相が析出する部分と析出しない部分が生じ、さらに析出するアルファ相の形態を同じ材料内で等軸状、針状等に変化させることができた。現時点で熱処理等の条件の最適化ができておらず、引張延性や破壊靭性に格段の向上は見られていないが、偏析組織による新たな組織制御の可能性は見いだされたと考える。研究期間全体では、ある一定の条件の下ではあるがVGS組織等の偏析組織によるTi-Mo系合金の靭性(シャルピー衝撃吸収エネルギー、平面ひずみ破壊靭性値)の向上が達成できたことが成果とできる。今後合金組成や製造プロセスの最適化により、靭性を含む特性のさらなる向上を目指したい。本研究ではβ型Ti-Mo系合金を対象に、渦状偏析組織(VGS組織)のようなMoの元素偏析に起因するヘテロ構造が材料の靭性に及ぼす影響を検討することを目的とし、合わせて延性や靭性といった機械的性質や変形機構に偏析組織が及ぼす影響を基礎的に理解する実験を行った。本研究期間内では偏析組織に沿って硬質第二相であるω相を析出させることでシャルピー衝撃吸収エネルギーが上昇すること、引張延性とシャルピー衝撃吸収エネルギーとで偏析組織がより効果を発揮する温度が異なること、破壊靭性試験においても偏析組織によるω相のヘテロ分散によって室温での破壊靭性値が向上すること、などの成果が得られた。200°Cというやや高い温度ではあるが、VGS組織によるシャルピー衝撃吸収エネルギーの向上が確認できたことは、研究の方向性が正しいことを示している。今後静的破壊靭性試験や引張速度を変えた引張試験を行い、今回の結果と照らし合わせることで靭性におよぼす偏析組織の影響をよりよく理解できると考えられる。また層状偏析を有する板材について検討することで、変形様式に及ぼす偏析組織の影響の基礎的な理解が得られることを示した点も本年度の成果である。以上の通り、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。最終年度は必要に応じて追加のシャルピー衝撃試験、平面ひずみ破壊靭性試験、引張速度を変えた引張試験等を行うと共に、変形中および変形(破壊)後の試験片の組織、破面等を詳細に観察する。またベータ相の安定度の異なる材料(Mo量を変化させた材料、FeやAlを添加した材料)や偏析組織の状態が異なる材料(板圧延材)についても試験を行う。これらの結果を整理し、靭性向上の原因の検討を行い、特性向上の指針となる知見を得る。材料工学次年度以降、研究実施計画に沿ってシャルピー衝撃試験、平面ひずみ破壊靭性試験、引張速度を変えた引張試験等を行い、VGS組織の靭性に及ぼす影響をよりくわしく調べる。特に、シャルピー衝撃吸収エネルギーに大きな影響がでた200°Cでの引張試験等を行い、靭性向上の原因の検討や引張試験等他の試験との比較を行い、特性向上の指針となる知見を得る。対象とする合金については、Mo量を変化させた合金やFeやAlなどの合金元素を添加させた合金等に拡大し、ベータ相の安定度が変形モード(すべり変形、双晶変形、変態誘起塑性)や靭性値などの機械的特性に及ぼす影響を検討する。比較検討のため、鍛造・圧延条件を変え、偏析組織の状態を変えた材料(例えば板圧延によって製造した層状偏析を有する材料)についても調査を行う。
統計的モデリングに基づくチップマルチプロセッサの動的最適化に関する研究

複数のプロセッサコアを1チップに搭載するチップマルチプロセッサ(CMP:chip multiprocessor)の問題である共有リソースの競合を考慮し、動的電源電圧制御(DVFS)手法と併用することによる、動的な低消費電力化手法を提案した。本手法はCMP上での実行をモデル化し数式で表現し、電力を最小化する協調制御を導出した。評価の結果、従来手法と比較し、要求性能を維持しつつ、消費電力を削減可能なことが分かった。本年度はまず、CMPにおいて複数のプロセスを同時に実行した際の性能および振る舞いを計測することを目的として、実プロセッサを用いたプラットフォームを複数種類構築した。また、同様の実験をプロセッサのパラメータ(プロセッサのコア数、キャッシュサイズ、キャッシュやメインメモリのレイテンシなど)を様々に変更した場合や、実プロセッサにすでに実装されているDVFSだけでなく、共有キャッシュのパーティショニングなどの実システムでは使用できないハードウェア制御を適用した場合に行なうために、CMPのプロセッサシミュレータを改造し、評価システムを構築した。これらの環境上で様々なプログラムを同時に実行し、それぞれのプログラムが実行されているプロセッサコアにDVFS制御を適用した際の性能およびシステムのハードウェアカウンタの値を計測した。また、シミュレータ上では上記に加えて様々なパラメータを変化させることによる評価も行なった。これらのデータを基にして、システムのハードウェアカウンタの値と適用するハードウェア制御に対するCMPの性能(トータルスループットやフェアネス)の関係をモデル化することを試みた。このモデル化により、対象とする指標(例えばトータルスループット)をDVFSなどのハードウェア制御で最適化することができるようになった。具体的には、実行時のハードウェアカウンタの値と適用しうるハードウェア制御を、構築したモデルに代入することによって最適な制御(例えば2コアのCMPにおいてコアAの周波数を1段階下げ、コアBの周波数を2段階上げる、など)を導出するものである。本手法により、従来のヒューリスティックな制御に比べて、性能向上を達成できることがわかった。本年度は、チップマルチプロセッサ(CMP)において複数のプロセスを同時に実行した際に共有資源へのアクセスが競合することによる性能およびその振る舞いを計測した。また、プロセッサのパラメータ(プロセッサのコア数、キャッシュサイズ、キャッシュやメインメモリのレイテンシなど)を様々に変更した場合や、実プロセッサにすでに実装されている動的電源電圧制御(DVFS)だけでなく、共有キャッシュのパーティショニングなどの実システムでは使用できないハードウェア制御においても測定した。共有資源の競合の問題は従来より用いられているDVFSによる省電力化の大きな障害となり、特に性能制約を持つアプリケーションでは最適なクロック周波数・電源電圧の値がアプリケーションの性質だけでなく、競合の状況に依存して変動してしまうため、最適化が非常に困難になる。そこで、複数の共有資源へのアクセスを協調制御することで競合の状況を調整し、その上でDVFSによって消費電力を削減する手法を提案した。まず共有資源への協調制御がCMPの消費電力に与える影響を、昨年度から行なっている統計的なモデル化手法から得られた知見を用いて、その実行をモデル化し数式で表わし、電力を最小化する協調制御を導出した。次に、モデルに基づいた協調制御手法を構築し、提案手法を評価した結果、従来の協調制御を用いない場合のDVFS手法に比べて、要求性能を維持しつつ、消費電力を削減可能なことが分かった。なお、本評価は昨年度開発した、CMP上でそれぞれのコアが独立に動的電源電圧制御を適用した際の性能および電力が評価可能なシミュレータを用いて行なった。
小児の口腔アレルギー疾患に関与する口腔レンサ球菌と自然免疫応答の破綻

本研究では,口腔内で特に病原性を示すことはないと考えられていたサングイスレンサ球菌,アンギノーサスレンサ球菌の一部に上皮細胞内へ侵入する能力があることを明らかにした.その結果上皮細胞の炎症性サイトカイン産生増強,免疫担当細胞の遊走を促すことが示された.さらに線毛構造をつくるタンパク(pili)の有無がサングイスレンサ球菌の細胞侵入性に大きく影響することがわかった.口腔内に多く存在する一つの菌種でも,piliのほかさまざまな因子の有無によって生体に対する病原性が大きく異なり,その機能によってアレルギー疾患やその他の疾患の原因になっている可能性が示唆された.本研究では,口腔内で特に病原性を示すことはないと考えられていたサングイスレンサ球菌,アンギノーサスレンサ球菌の一部に上皮細胞内へ侵入する能力があることを明らかにした.その結果上皮細胞の炎症性サイトカイン産生増強,免疫担当細胞の遊走を促すことが示された.さらに線毛構造をつくるタンパク(pili)の有無がサングイスレンサ球菌の細胞侵入性に大きく影響することがわかった.口腔内に多く存在する一つの菌種でも,piliのほかさまざまな因子の有無によって生体に対する病原性が大きく異なり,その機能によってアレルギー疾患やその他の疾患の原因になっている可能性が示唆された.一般に宿主上皮細胞では,細菌やウイルスなどの病原体構造物を認識できる生来のレセブター(自然免疫レセプター)を発現しており,炎症やアポトーシスと言った免疫応答を引き起こすことが知うれているが,口腔や咽頭などの上皮細胞は,常に多くの細菌に晒されている環境にあることから,リガンド物質で刺激しても容易には炎症応答は増大せず,他の要因によって炎症を起こしたり,長期にわたる刺激を受けた場合にのみ強い免疫応答を生じると考えられている.本研究では,口腔細菌叢のうち代表的なビリダンスレンサ球菌,齲蝕原性レンサ球菌,化膿レンサ球菌を用い,ヒト由来培養口腔・咽頭上皮細胞に感染させた場合の細菌の動態を観察し,宿主細胞に免疫応答を生じさせうるのか,またはどのような免疫応答が生じるのかについて検討した.研究の遂行にあたり,菌株の上皮細胞への付着・侵入能の測定し,共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内への細菌侵入の観察を行った.さらにリアルタイムPCR法やELISAによる細胞からの炎症性サイトカイン,抗菌物質の発現を解析した.その結果,多上の口腔レンサ球菌は,口腔内においては特に病原性を示さないと考えられてきたが,いくつかの菌種,特にS.sanguinisには細胞への付着・侵入能を有し,強く炎症応答を有する菌株があること,ヒト上皮細胞は自然免疫レセプターに対するリガンド刺激に対し,抗菌物質を産生はするものの炎症応答のような強い免疫応答は起こさないと考えられている.しかし,細胞内に侵入したり,長時間にわたって細胞に付着するような強い刺激があ加わると炎症応答を起こしうること,このような菌が口腔内に大量に存在すると口腔粘膜などに疾患を生じる原因となる可能性があることが明らかとなった.口腔は,齲蝕を発生させるミュータンスレンサ球菌をはじめ600種を超える細菌種が存在するといわれる.そのため,口腔や咽頭粘膜の上皮は常に細菌の存在を認識していると考えられる.しかし口腔や咽頭の上皮細胞は微生物の構成成分を認識できる生来のレセプター(Toll様受容体,Nod様受容体)を発現しているにもかかわらず,これらに対するリガンドによる刺激を加えてもほとんど炎症性サイトカインが産生されない.このため,上皮細胞では通常,口腔内細菌に対してすぐには炎症性応答を起こさない状態に制御されているが,他の要因によってひとたび炎症を起こしたり,リガンドの細胞内外への長時間の定着を許したりした場合にはさらに強い免疫応答を引き起こす原因になると考えられている.本研究では,特に病原性を示すことはないと考えられていたサングイスレンサ球菌の一部にも上皮細胞内へ侵入する能力があって,その結果上皮細胞の炎症性サイトカイン産生増強,免疫担当細胞の遊走を促すことを明らかにした.さらに線毛構造をつくるタンパク(pili)の有無がサングイスレンサ球菌の細胞侵入性に大きく影響することがわかった.口腔内に多く存在する一つの菌種でも,piliのほかさまざまな因子の有無によって生体に対する病原性が大きく異なり,その機能によってアレルギー疾患やその他の疾患の原因になっている可能性が示唆された.ヒトの複雑かつ多彩な口腔内細菌叢を考えたとき,現在でも培養のできない,研究の進んでいない菌種は多く,口腔内・全身疾患の発症に直接的,間接的に関与している菌もまだまだ多いと推察される.
脈絡膜新生血管発生による細胞成長因子の分子生物学的研究

実験動物として成熟有色ラット(Brown-Norway系)を用い、眼底後極部にクリプトンレーザーで、強度光凝固を行い、実験的脈絡膜新生血管を作成した。光凝固後、2時間、2日、7日、2週間、4週間に眼底撮影、蛍光眼底造影を行い、新生血管発生、成長の過程を観察し、4%パラフォルムアルデヒドにて灌流固定を行なったのち、眼球摘出し、5μmの凍結薄切切片を作成した。Basic-FGFのcDNAをBluescriptにサブクローニングし、T3、T7RNAポリメラーゼでcRNAを増幅すると同時にDigoxigenin(DIG)による標識を行ない、anti-sense、senseリボプローブを作成した。組織切片上で標識したリボプローブによるハイブリダイゼーションを行ない、ブローブ結合部を発色させ、b-FGFの発現を観察した。光凝固直後では、凝固部にb-FGF mRANの発現を認めなかったが、3日後、脈絡膜新生血管発生期では、光凝固部の増殖した細胞に著しい発現をみた。1週後、2週後の新生血管の発育成長期では、新生血管の内皮細胞、増殖した網膜色素上皮細胞、線維芽細胞にb-FGFの発現をみた。4週後、脈絡膜新生血管の退縮期には、これらの細胞に発現はみられなかった。このように、脈絡膜新生血管発生からの成長の過程において、b-FGFが関与していることが示された。