hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大メコン圏における中国の「一帯一路」構想の実態と影響に関する比較事例分析

本研究は、東南アジア諸国の中でも特に「親中国」であるとされるカンボジアとラオス、「対中強硬国」とみなされるベトナムの3ヵ国に焦点をあてる。そして、1中国が「一帯一路」構想にもとづき、3ヵ国においてインフラ整備、貿易、金融、人材育成の分野でどのような活動を行ってきたのか、2中国の進出は3ヵ国でどのような影響(弊害と成果)を生んでいるのか、33ヵ国での対中認識はどのように変化しており、その変化の要因は何なのか、43ヵ国における中国の対外進出の成否を分ける要因は何なのかを分析する。
中規模無限基数上の不変な構造

公理的集合論の研究において,アレフ数2以上の無限基数のもつ組合せ的性質は,それ以下の無限基数に比べて解明されていない点が多い.本研究では,アレフ数2以上の無限基数のうち比較的小さいものたちのもつ組合せ的性質の,いろいろな強制拡大の下での不変性を詳しく調べた.その結果,強制公理と呼ばれる集合論のよく知られた一連の公理たちが,どのような種類の半順序集合による強制拡大によってどの程度保存されるかという問題を中心に,いくつかの重要な知見を得ることができた.研究代表者は,以前の研究で,現行の集合論を強化する公理の一つとして有力視されている固有強制法公理(PFA)を,それによる強制法で保存する半順序集合のクラスとして,作戦的閉,および*戦術的閉な半順序集合のクラスを見いだしてきた.また,それぞれのクラスに対するアレフ2レベルのマーティン型公理に対し,それらと同値な組合せ論的構造を特定し,それぞれCP, SCP-と名付けてその性質を調べてきた.このうちSCP-は可算集合の列の長さω2の列で「包含関係について単調増加連続な長さω1の列」を豊富にふくむものの存在という形で述べられるが,これについて(a)「」部分に「それらの総和が順序数となる」ことをさらに要請, (b)「包含関係」を「終拡大」に置き換える,という二種類の自然な拡張を考えることができ,これらをそれぞれSCP-f, SCP-eと名付けた.本年度の研究ではこれらの拡張の性質を調べることを主に行い,次の成果を得た.(2)SCP-eはSCP-fより真に強く, PFAと両立しない.しかし, PFAの下でSCP-eを自然な仕方で強制すると, PFAの帰結であるω2アロンシャイン木の非存在は保たれ,従ってスクエア原理は成立しない.このうち, (2)は以前より共同研究を行っているドイツのケーニヒ博士を秋に約3週間招いて行った共同研究の成果である.研究開始前には代表者はSCP-eはスクエア原理と同値であると予想していたので,この結果は意外であると同時に, *戦術的閉をさらに拡張した半順序集合のクラスや,それが保存する強制公理について新たな自然な概念の抽出の可能性を示唆するものである.研究代表者は,過去の研究で,固有強制公理(PFA)をそれによる強制法で保存するような半順序のクラスの探索を行ってきた.これまでに見つけたそのような半順序のクラスとしては次の二つが代表的である:(a)作戦的閉:長さ(ω1+1)のバナッハ・マズア型ゲームにおいて後手が各手番でそれまでの棋譜のブール下限値と今何手目かの情報のみに依存する必勝法をもつ.(b)*戦術的閉:先手が各手番で半順序の元ではなく可算部分集合を選ぶバナッハ・マズア型ゲームの変種を考え,このゲームで後手が各手番において先手がそれまでに選んだ集合全部の和にのみ依存する必勝法をもつ.これら二つのクラスについては一方が他方を包含するか否かが不明であった.これに関し,本年度の研究で次のことが明らかになった.(1) PFAとは異なる有名な強制公理であるω1閉な半順序に対する強マーティン公理(ここでは公理Sと表す)の下では,いかなる*戦術的閉な半順序による強制法によっても, ω2上の関数でCPと呼ばれる性質をもつものを付加できない.一方,作戦的閉な半順序による強制法でCP性をもつ関数を付加することは可能である.(2)同じく公理Sの下では,いかなる作戦的閉な半順序による強制法によっても,弱SCP列と呼ばれるω2の部分集合列を付加できない.一方, *戦術的閉な半順序による強制法で弱SCP列を付加することは可能である.従って(a), (b)は(少なくとも十分強い強制公理の下では)互いを包含しないことがわかった.なお(1)では酒井(連携研究者)による弱いスクエア原理とチャン予想の無矛盾性の証明にヒントを得ている一方,(2)ではヴェリコビッチにより導入されたω2の部分集合に関するゲームが証明の鍵になっており,公理Sの帰結群に二つの全く異なる組合せ論的構造が関与していることが示唆される.研究の目的に述べたテーマのうち, (A)「強制公理を保存する半順序集合のクラスの研究」に関しては,前年度までの研究で得られていた,固有強制公理(PFA)を保存する半順序集合の2つのクラス(作戦的閉と*戦術的閉)が互いに他方を含まないことの証明を再検討して簡略化を行い,これらの成果を論文としてまとめ,査読誌に投稿した.さらに,前年度にケーニヒとの共同研究で得た結果である, SCP-e列と呼ばれる組合せ的命題を強制法により自然に付加することによる強制公理の部分的な保存について,同様の結果をより広い強制法のクラスに拡張するための着想を得,現在詳細を検討している.一方,テーマ(B)「位相空間の諸性質の強制法のもとでの保存についての研究」に関連して, T1分離公理をみたすコンパクト空間で,固有性をもつ半順序集合による強制拡大で実数が付加されている任意のものにおいて,コンパクト性よりはるかに弱い性質であるメタコンパクト性さえもが失われるような例を見つけた.

これは,メタコンパクト性がコーエン実数の付加によって保たれるか?という岩佐の問いに対する否定的解答であると同時に, T2分離公理をみたすパラコンパクト(これはメタコンパクト性よりはやや強い性質である)空間であればコーエン実数の付加によってその性質が保たれるというGrumberg-Junqueira-Tallの結果とも好対照をなし,同結果においてT2分離公理が本質的な役割を果たしていたことを明らかにするものである.この結果により,岩佐の問題については, T2分離公理をみたすメタコンパクト空間の保存性が,より核心的な問題であることが浮き彫りとなり,この問題がこのテーマにおける今後の研究課題となる.研究の目的に述べたテーマのうち, (A)「強制公理を保存する半順序集合のクラスの研究」に関しては,前年度までにケーニヒとの共同研究で得られていた, SCP-e列と呼ばれる組合せ的命題を付加する自然な強制法が固有強制法公理(PFA)の帰結であるω2アロンシャイン木の非存在を保存する,という結果を拡張して,**戦術的閉と呼ぶ性質を持つ任意の半順序集合による強制法で同様の結果が得られであろうとの着想を得た.この証明が完成すれば,このタイプの強制法で強制できる様々な組み合わせ論的命題とω2アロンシャイン木の非存在の無矛盾性が示せることになり,無限組み合わせ論において多くの新たな知見をもたらすことが期待できる.また,前年度末に海外誌に投稿した,固有強制公理(PFA)を保存する半順序集合の2つのクラス(作戦的閉と*戦術的閉)の相互比較についての論文について,修正を条件として採録とする査読の報告を受け,現在修正作業中である.一方,テーマ(B)「位相空間の諸性質の強制法のもとでの保存についての研究」に関連し, T2分離公理をみたすメタコンパクト空間が,コーエン実数の付加によってメタコンパクト性を保存されるかという問題について研究を行い,この問題自体の解決には至らなかったものの, T1分離公理をみたすコンパクト空間で,コーエン実数の付加によりメタコンパクト性を失うものの例で,昨年度に発見したものとは本質的に異なるものを見つけることができた.この発見は,より難しいT2の例を探るための手がかりにもなると思われる.補助事業期間延長承認申請書で述べた代表者の私的状況のため研究に十分な時間を割くことができず,今年度中に研究を終えることができなかった.そのような中でもテーマ(A)「強制公理を保存する半順序集合のクラスの研究」においては従前の成果の拡張の見通しが立ち,研究終結に向けての展望が概ね見えてきている.テーマ(B)「位相空間の諸性質の強制法のもとでの保存についての研究」においても若干の進展が見られており,今後の研究の方向性も定まってきている.このように,時間的にいくらか遅れはあるものの,研究は概ね期待した水準の成果に向けて進展していると考える.研究の目的に述べたテーマのうち, (A)「強制公理を保存する半順序集合のクラスの研究」については,平成28年度には,海外誌に投稿していた下記の成果(1)についての論文について,査読報告に基づいて証明の軽微な誤り等を修正して再投稿し,採録決定に至った.研究期間を通しての成果は次のようにまとめられる.(1)半順序集合の「作戦的閉性」と「*戦術的閉性」とはいずれも長さ(ω1+1)のバナッハ・マズアゲームにおいて後手が必勝法を持つという「(ω1+1)戦略的閉性」を強めた概念である.以前の研究で,この二つのいずれかの性質を持つ半順序集合による強制はよく知られた強制公理の一つである固有強制公理(PFA)を保存することがわかっていたが,より強い強制公理,例えばマーティンの極大公理(MM)の下では,作戦的閉な半順序集合による強制で保存されるが*
ダイズ生育初期の湿害発生時におけるタンパク質群による制御機構解明

ダイズの収量の不安定要因である湿害を解決するために、ダイズの生育初期における湿害発生機構を、プロテオーム解析技術を用いてタンパク質レベルから包括的に解析した。ダイズ出芽期の冠水ストレスにより、根端部分は顕著に傷害を受け、細胞壁、細胞膜、ミトコンドリア等に存在する多数のタンパク質群が変動した。特に、湿害によるリグニン化の抑制やエネルギー代謝効率の低下等の改善が重要であることを示唆した。ダイズ生育初期における湿害発生機構を、未知の湿害発生機構も視野に入れて、タンパク質レベルから包括的に解析し、タンパク質間相互作用解析により湿害発生ネットワークを明らかにする。そのために、ダイズの初期生育時において湿害発生により変動するタンパク質群を包括的に解析する。さらに、突然変異ダイズを用いて冠水抵抗性を指標として選抜し、検出されたタンパク質あるいは遺伝子の発現を解析する。このことより、ダイズの出芽期の湿害発生機構を明らかにする。将来的にダイズの湿害を回避することにつながり、生産性の安定・向上に貢献する。ダイズ生育初期における湿害発生機構を、未知の湿害発生機構の存在も視野に入れて、タンパク質レベルから包括的に解析し、タンパク質間相互作用解析により湿害発生ネットワークを明らかにする。本年度は、ダイズ出芽後の冠水ストレスに対する細胞内小器官に存在するタンパク質群の変動をプロテオミクス法で解析した。1.ダイズ播種後2日目で冠水処理し、2日目に生育の抑制された根のタンパク質を用いてプロテオーム解析を行った結果、208個中44個のタンパク質が顕著に増減した。2.Peking、エンレイ、タマホマレ、Williams82、サチユタカ、ナカセンナリに関してプロテオーム解析を行った結果、44個のうち10個のタンパク質が、品種間に関係なく変動した。3.10個のタンパク質のうち、湿害で顕著に発現量の減少するタンパク質を質量分析計で解析した結果、細胞質型アスコルベートパーオキシダーゼ2(cAPX2)であった。4.ダイズAPXは2種類存在し、その相同性は95%であり、イネやアラビドプシスでは、ストレスで増加することが報告されている。5.APXは冠水ストレスにより、ノーザンブロットを用いての転写レベルでも顕著に減少し、酵素活性測定により活性レベルでも顕著に減少していた。今後、細胞膜に対する湿害の影響を解析すると同時に、既に検出されたタンパク質・遺伝子に関しては器官特異性や細胞内局在等を解析し機能を明らかにする。本年度は、細胞膜に対する湿害の影響を解析すると同時に、すでに検出されたタンパク質・遺伝子に関しては器官特異性や細胞内局在等を解析し機能を明らかにした。2.一方、前年度検出した細胞質型ascolbate peroxydaseについては、抗体を調整しウエスタンブロットを行い、組織特異性なく存在し冠水ストレスで発現が顕著に抑制されることを証明した。さらにリアルタイムPCRにより、RNAレベルでもタンパク質レベルと同様な傾向を示していることを明らかにした。今後、さらに上流の細胞壁に対する湿害の影響も含めて、ダイズ出芽期の湿害応答時のネットワーク機構を解明する。ダイズ生育初期における湿害発生機構を、未知の湿害発生機構の存在も視野に入れて、タンパク質レベルから包括的に解析し、タンパク質問相互作用解析により湿害発生ネットワークを明らかにする。本年度は、細胞壁に対する湿害の影響を解析すると同時に、冠水処理早期におけるタンパク質群の発現レベルの変動およびリン酸化タンパク質群のリン酸化レベルの変動を解析する。1、CyDye蛍光色素を用いた二次元電気泳動解析により検出された12時間の冠水処理により顕著に発現変動したタンパク質スポット17個のうち7個が増加、10個が減少であった。これらを同定したところ解糖に関わるタンパク質の増加、また二次代謝に関わるタンパク質が減少しており、冠水後早期において既にこれらの代謝系が制御を受けていることが示唆された。2、Pro-Qダイアモンド染色によりリン酸化タンパク質スポットを検出し、12時間の冠水処理により顕著にリン酸化レベルの変動していたタンパク質スポット16個を検出した。これらのうち3個がリン酸化レベルの上昇、13個が減少であった。質量分析計による同定の結果、病害・防御に関わるタンパク質のリン酸化、またタンパク質合成やタンパク質の修復に関わるタンパク質の脱リン酸化が冠水ストレスにより起こり、これらの機能がタンパク質リン酸化を介して制御されていることが示唆された。冠水処理12時間後の早期において解糖、二次代謝がタンパク質の発現レベルで調節されており、さらに病害・防御反応、タンパク質合成およびタンパク質の修復がタンパク質リン酸化を介して制御されることが示唆された。一方、細胞壁タンパク質のプロテオーム解析により、湿害はリグニン合成やリグニン化を抑制していることも明らかになった。

昨年度までに、冠水処理下のダイズにおける細胞膜と細胞壁のタンパク質群の変動を明らかにし、本年度は、ミトコンドリアタンパク質の変動を解析した。さらに。冠水抵抗性突然変異ダイズを用いて、プロテオーム解析を行なった。(1)γ線照射突然変異ダイズ用いてダイズ出芽期の冠水抵抗性試験を継続し、M4世代において、冠水抵抗性を示す耐湿性ダイズ3系統を選抜した。いずれも冠水ストレスによる根の傷害を克服する能力が強いことを明らかにした。(2)冠水抵抗性突然変異ダイズにおいて二次元電気泳動を基盤にしたプロテオーム解析を行った。系統1に関しては野生株と比較してアルコール脱水素酵素が顕著に増加していることを明らかにした。系統2については野生株と比較して、冠水条件下で変動するタンパク質群が顕著に減少していることを明らかにした。(3)冠水条件下で変動するミトコンドリアタンパク質のプロテオーム解析を行った結果、クエン酸回路および電子伝達系の複合体IとIIは活性化するが、複合体III、IV、Vを阻害されATP産生を抑制することにより、エネルギー代謝効率は低下することを証明した。
咀嚼運動に係わる諸器官の協調メカニズムに関する臨床的研究

咀嚼運動を遂行する咬合、顎関節、咀嚼筋の各器官それぞれについて、以下の研究を行った。1.咬合に関しては、120名の歯列模型と顎運動記録を採得し、模型による咬合分析ならびに咀嚼運動記録の分析を行った。その結果、下顎の行う運動の中でも機能的に最も重要な咀嚼運動に、歯列不正や歯の欠損のような各種の咬合の異常がそれぞれ特徴を持って現れていた。特に、臼歯部交叉咬合、骨格性反対咬合の矯正治療症例、非作業側咬合干渉については、特徴的な異常運動パタ-ンが見られた。2.顎関節に関しては、175名の咀嚼運動時の下顎頭運動記録を含む下顎運動記録と顎関節同時多層断層X線撮影を行い、咀嚼運動と顎関節の正常異常の関連、特に咀嚼スピ-ドを検討した。その結果、下顎頭運動の異常が咀嚼運動経路および咀嚼スピ-ドに反映されていた。3.咀嚼筋に関しては、顎口腔機能異常者約30名について、咬筋、側頭筋前・後部、顎二腹筋前腹の咀嚼時筋電図を採取、分析した。咀嚼運動と筋活性との関連に顎口腔機能異常による特徴的な影響が現れていた。上記の分析結果等を基に咀嚼運動時の協調メカニズムを検討するため、顎口腔機能異常者146名の咬合状態と顎関節同時多層断層X線写真とを検討し、下顎頭の萎縮と下顎第1大臼歯の欠損との関連を認めた。また、咬合異常の一つである臼歯部反対咬合を有する被験者の顎運動及び咀嚼筋筋電図を採取し、咬合異常と咀嚼筋筋活性の様相と関連を研究している。今後、顎口腔機能異常の診断および処置方針を与えるソフトウェアを開発する計画である。本補助金により購入したパーソナル・コンピュータ及びハードディスク・システムによりデータの集積を行っている.昭和62年度の研究計画に含まれる正常者についての咬合分析,顎間接に関する分析,咀嚼金に関する分布のうち1.咬合に関して,本学学生を中心に約100名の歯列模型及び顎運動記録を採得し,模型による咬合分析ならびに顎運動記録(限界運動,咀嚼運動)のコンピュータによる解析を行っている.咀嚼運動時の顎運動分析プログラムは,第8回顎関節研究会(昭和62年7月,新潟)でその一部を発表した. (研究分担者瑞森,西尾)2.顎関節に関して同じく約50名について顎関節同時多総断層X線撮影を行い,形態及び顆頭の位置について分析を行っている.なお,第8回顎関節研究会(昭和62年7月新潟)で,顆頭の発育不全についての発表を行っている.(研究分担者丸山)3.咀嚼筋に関して,同じく約50名について咬筋,側頭筋前腹,後腹,顎二腹筋の咀嚼時筋電図を採取し,コンピュータ分析を行っている.咀嚼運動筋電図の自動分析プログラムを第78回日本補給歯科学会(昭和62年10月,東京)において発表した. (研究分担者高島)以降,昭和63年度には異常者についの分析を行い,咬合,顎関節,咀嚼筋の各要素における正常像,異常像を把握する.さらに,昭和64年度には上式の分析結果から,顎口腔機能異常の診断および処置方針を与えるソフトウァアを開発する計画である.咀嚼運動を遂行する咬合、顎関節、咀嚼筋の各器官それぞれについて、以下の研究を行った。

また、咬合異常の一つである臼歯部反対咬合を有する被験者の顎運動及び咀嚼筋筋電図を採取し、咬合異常と咀嚼筋筋活性の様相と関連を研究している。今後、顎口腔機能異常の診断および処置方針を与えるソフトウェアを開発する計画である。咀嚼運動を遂行する咬合、顎関節、咀嚼筋の各器官それぞれについて、以上の分析を行った。1.咬合に関しては、120名の歯列模型と顎運動記録を採得し、模型による咬合分析ならびに咀嚼運動記録のコンビュータによる解析を行った。その結果、下顎の行う運動の中でも機能的に最も重要な咀嚼運動に、歯列不正や歯の欠損のような咬合の異常がそれぞれ特徴を持って現れていた。2.顎関節に関しては、175名の咀嚼運動時の下顎頭運動記録を含む下顎運動記録と顎関節同時多層断層X線撮影を行い、咀嚼運動と顎関節の正常異常の関連を検討した。その結果、下顎頭運動の異常が咀嚼運動に反映されていた。3.咀嚼筋に関しては、顎口腔機能異常者約30名について、咬筋、側頭筋前・後部、顎二腹筋前腹の咀嚼時筋電図を採取し、コンピュータ分析を行っている。顎口腔機能正常者については、咀嚼時の咀嚼筋活動をコンピュータ分析している。以降、平成元年度には、上記の分析結果等を基に咀嚼運動時の咬合、顎関節、咀嚼筋の協調メカニズムを検討し、顎口腔機能異常の診断および処置方針を与えるソフトウェアを開発する計画である。咀嚼運動を遂行する咬合、顎関節、咀嚼筋の各器官それぞれについて、以下の分析を行った。1.咬合に関しては、120名の歯列模型と顎運動記録を採得し、模型による咬合分析ならびに硬軟食品の咀嚼運動記録のコンピュ-タによる解析を行った。その結果、下顎の行う運動の中でも機能的に最も重要な咀嚼運動に、歯列不正や歯の欠損のような各種の咬合の異常がそれぞれ特徴を持って現れていた。特に、臼歯部交叉咬合、骨格性反対咬合の矯正治療例、非作業側咬合千渉については、特徴的な異常運動パタ-ンが見られた。2.顎関節に関しては、175名の咀嚼運動時の下顎頭運動記録を含む下顎運動記録と顎関節同時多層断層X線撮影を行い、咀嚼運動と顎関節の正常異常の関連、特に咀嚼スピ-ドを検討した。その結果、下顎頭運動の異常が咀嚼運動経路および咀嚼スピ-ドに反映されていた。3.咀嚼筋に関しては、顎口腔機能異常者約30名について、咬筋、側頭筋前・後部、顎二腹筋前腹の咀嚼時筋電図を採取し、コンピュ-タ分析を行った。顎口腔機能正常者については、咀嚼時の咀嚼筋活動をコンピュ-タ分析した。上記の分析結果等を基に咀嚼運動時の協調メカニズムを検討するため、顎口腔機能異常者146名の咬合状態と顎関節同時多層断層X線写真とを検討し、下顎頭の萎縮と下顎第1大臼歯の欠損との関連を認めた。また、咬合異常の一つである臼歯部反対咬合を有する被験者の顎運動及び咀嚼筋筋電図を採取し、咬合異常と咀嚼筋筋活性の様相との関連を研究している。
神経回路形成におけるAMPA型受容体チャネル活性調節機構の解析

Stargazin(γ-2)はStargazer(stg)ミュータントマウスの原因遺伝子であり、カルシウムチャネルγサブユニットの一員であると考えられている。一方stgマウスの小脳顆粒細胞ではAMPA型受容体を介する応答が消失していることから、γ-2はAMPS型受容体の細胞表面発現やシナプスへのターゲティングに関与することが示唆されてきた。本研究ではstargazin分子群のAMPS型受容体チャネル活性調節に果たす役割を明らかにするために、HEK293細胞とXenopus oocytesを用いた実験系でStargazin(γ-2)とそのファミリーがAMPA型受容体活性に及ぼす効果を検証した。その結果、これらの分子がAMPA型受容体のグルタミン酸に対する電流応答を著しく増加させることを見いだした。ビオチン標識により細胞膜表面に発現するAMPA型受容体と電流応答の相関性を調べたが、γ-2共発現による応答の増加はAMPS型受容体の細胞表面発現の増加だけでは説明できなかった。またグルタミン酸濃度に対する応答性を調べた結果、γ-2の共発現はGluRα1ホモメリックチャネルのHill係数を増大させ、グルタミン酸に対する親和性を強めたことから、これらの分子間に正の協同性が存在することが示された。これらの結果はγ-2がAMPS型受容体の構成成分である可能性を示唆する(Yamazaki, M. et al.(2004)Neuroscience Research 50,369-374)。さらにγサブユニットファミリーのうち、γ-2、γ-3、γ-4、γ-7、γ-8はAMPA型受容体の活性を増加させ、γ-5は活性を抑制する。これらの分子の発現分布はAMPA型受容体の存在する脳組織内に相互保完的に発現していることも明らかになった。以上の結果よりγサブユニットファミリーは生体内のAMPA型受容体の活性調節因子であると考えた。
蛍光挿入型ｓｉＲＮＡアナログを用いたＲＮＡ干渉の作動機構の解明

RNA干渉(RNAi)は20塩基対程度の短い二重鎖RNA(siRNA)により誘導され、その塩基配列に相補的な遺伝子の発現を抑制するシステムである。本研究ではsiRNAの細胞内動態やタンパク質との相互作用解析を行うためにsiRNAを蛍光基やクロスリンク基で化学修飾し、分析ツールとして利用可能なsiRNAのデザイン開発を行った。まず、化学修飾によって、RNAi活性の向上および副作用の抑制を両立するsiRNAの設計を見いだした。このデザインを応用して蛍光基及び消光剤を導入したsiRNAを合成することで、実際に、RNAiの活性本体であるmature RISCの選択的な可視化に成功した。RNAiは2本鎖RNAにより誘導され、その塩基配列に相補的な遺伝子の発現を抑制するシステムである。本研究では、RNAiを作動する因子siRNAに対し機能性分子を修飾した分子ツールを開発している。これを利用し、RNAi関連タンパク質とsiRNAとの相互作用を解析し、RNAiシステムの作動メカニズムを解明することを目指している。昨年度合成に成功した光クロスリンク基であるジアジリンのD-threoninol誘導体のアミダイトモノマーを用い、RNAに導入し光架橋性を解析した。その結果、このジアジリンは相補鎖RNAと鎖間でクロスリンクしてしまうことがわかった。このことから、本ジアジリンは目的タンパク質との架橋効率が低いことが疑われたため、ジアジリン化合物の再設計を行った。光反応性部位を二重鎖の外に位置させることを狙い、新たなジアジリン化合物の合成を行った。反応性を解析したところ、期待通り相補鎖に対する架橋性は観測されなかった。そこで、この新規ジアジリンをpre-miRNAに導入し、RNAi関連タンパク質であるDicerとのクロスリンクを試みた。その際にpre-miRNA全長の固相合成が困難であったため、天然RNA鎖とジアジリンとペリレンを導入したRNA鎖をあらかじめ合成し、これらを酵素によるライゲーションを行うことで目的のpre-miRNAの調製に成功した。得られたpre-miRNAに対するDicerの反応性は天然型のpre-miRNAと同程度であったことからクロスリンク導入型のpre-miRNAはDicerにより認識されていることが明らかとなった。そこで実際に光照射を行いpre-miRNAとDicerのクロスリンクを試みた。SDS-PAGEによる解析を行ったところ、Dicer/pre-miRNA複合体の形成によるバンドシフトが観測された。以上のようにRNA結合タンパク質を検出するための適切な光クロスリンク基の設計に成功し、RNAi関連タンパク質であるDicerとの結合を捉えることができた。RNA干渉(RNAi)は2本鎖RNAにより誘導され、その塩基配列に相補的な遺伝子の発現を抑制するシステムである。本研究では、解析ツールとなる機能性分子を修飾したsiRNAを作出し、これを利用してRNAiマシーナリーを構成する一連のタンパク質によるRNAiシステムの作動メカニズムを解明することを目的とした。H24年度は、機能性分子を修飾することにより、分子ツールとして用いるsiRNAの開発に注力した。特に、蛍光基修飾型およびクロスリンク基挿入型のsiRNAをデザインし、siRNAの細胞内動態のモニタリングやタンパク質との相互作用解析を行うための基盤を整えた。そのために、各種機能性化合物を合成し、siRNA配列内の適切な挿入位置の検討を行った。合成したsiRNAの評価をルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて解析したところ、RNAi活性の向上及びOff-target効果の抑制を両立することが可能な修飾siRNAを得ることに成功した。機能性siRNAのなかでも消光剤ー蛍光剤の対で修飾を施したsiRNAを用いることでsiRNAの細胞内モニタリングを試みた。消光剤ー蛍光基のペアを配列内部に導入したsiRNAを用いることで、細胞内でRISCに取り込まれたsiRNAを可視化することに成功した。RNAi機構を解明するために、分子ツールとなる機能性siRNAの合成に成功したのみならず、これを用いたイメージング解析によりRISCを選択的にモニタリングすることに成功した。H25年度は、クロスリンク基挿入型のsiRNAをもちいて、RNAi関連タンパク質との相互作用の詳細を解明することを計画している。具体的にはH24年度に開発した光架橋性の分子を導入したsiRNAの設計の最適化を行い、RNAi関連タンパク質であるDicerおよびAGO2との相互作用解析に用いる。そのためには各タンパク質のリコンビナント体を得る必要がある。これらのタンパク質の大量発現系を構築し、得られたタンパク質とsiRNAの複合体形成に伴い光架橋することで、タンパク質上のsiRNA結合部位のマッピングを行う。また、哺乳細胞ではRNAi機構が複雑化していることも明らかとなっており、超分子複合体が新規タンパク質によって機能調整されている可能性がある。そこで、未知タンパク質を捕捉するためのクロスリンク基を挿入したsiRNA分子をプローブとして、哺乳細胞の抽出液とのプルダウン解析を行い、質量分析法と組み合わせてsiRNA

分子と結合するタンパク質複合体の構成因子を同定することを試みる。さらに、蛍光基を挿入したsiRNA分子を用いてRNAiにかかわるRNA結合タンパク質との相互作用解析を実施する予定である。以上の手法を駆使することにより、RNAiマシーナリーを構成するタンパク質がどのように連携して一連の反応をRNAに仕掛けているのか、その作動機構の実体を解明する。H24年度の研究は名古屋大学に設置されている共有設備の顕微鏡を用いてイメージング解析を行うことができたため、顕微鏡のセットアップにかかる費用を節約することができた。H25年度の研究計画では、蛍光挿入型siRNAを用いた解析をさらに発展させる予定であり、これに伴い細胞内イメージング用蛍光顕微鏡の消耗品の一部を補充する必要がある。そのための費用を予定し繰越額とした。
高い雑音下での単語認識のための実時間読唇システムの構成に関する研究

ロボット技術が進展するにつれ,これまでのようにあらかじめ定められた作業行程のみを機械が単独に繰り返し行うのではなく,人の指示を受けながら人が行う作業を補助する働きをするものが大変有効であることが認識されつつある.このような際の人とロボットが行う情報交換の手段にはいくつかの方法が考えられるが,そのなかでも言葉を利用することは,人にとって特に訓練を行わなくてもよいことや,特別な道具を利用しなくてもよいことなどの点から大変有効な手段であることがわかる.この点音声認識に関する研究は,従来から各所で盛んに行われているが,ロボットの利用を必要とする場面のように周囲の雑音が大変大きい環境では,十分に音声を認識できないという基本的な問題がいまだに解決できていない.本研究計画では,このような高雑音環境下での単語認識を実現する1つの手段として,視覚情報である唇の動きを実時間で取り込みながらそれを認識することにより,人が発する単語の認識を行うことを考える,これは人がいわゆる「読唇」によって,ある程度言葉を理解できることを考えれば実現性のある方法といえる.この方法によると周囲の雑音に影響されない単語認識システムを構築することができるだけでなく,先に述べたような人にとって特別な訓練や道具を必要としない柔軟なヒューマン・マシンインターフェイスを実現することができる.本研究計画期間内には,上で述べた唇の動きから単語を認識するシステムを構築する.初年度は,人の発話中の顔画像を実時間で取り込み,それから唇の動きを抽出する手法について検討し,そのハードウエア化を試みた.開発を試みたハードウエアはFPGAと呼ばれる内部構造を自由に設計できる集積回路を中心に,プリント基板上に実現するものとした.FPGA中には動的輪郭モデルとよばれる,画像の輪郭を高速に抽出することができる回路を実現し,その結果現状では試作ではあるが画像1枚あたり平均で3ミリ秒で処理することができた.これは日本で標準のNTSCと呼ばれるビデオ信号の規格で定められるフレーム間の間隔が33ミリ秒であることを考えると,大変高速であり実時間処理ができることが実証された.2年目は初年度の研究結果に基づき,高い雑音下でも正確に人の発話を検出できるよう,唇の動きの変化を捉えることによる発話区間の自動抽出手法について検討した.続いて,発話中の唇の動きを表現する各種のパラメータについて考察を加えた後,それを用いた認識手法を確立し,最後にこれらの技術を総合して実時間読唇システムの構築を試みた.その結果,特定の話者ではあるが,目的とする読唇システムを構築できた.今後は本研究成果をもとに,より実環境に近い環境で利用できるシステムの開発が望まれる.ロボット技術が進展するにつれ,これまでのようにあらかじめ定められた作業行程のみを機械が単独に繰り返し行うのではなく,人の指示を受けながら人が行う作業を補助する働きをするものが大変有効であることが認識されつつある.このような際の人とロボットが行う情報交換の手段にはいくつかの方法が考えられるが,そのなかでも言葉を利用することは,人にとって特に訓練を行わなくてもよいことや,特別な道具を利用しなくてもよいことなどの点から大変有効な手段であることがわかる.この点音声認識に関する研究は,従来から各所で盛んに行われているが,ロボットの利用を必要とする場面のように周囲の雑音が大変大きい環境では,十分に音声を認識できないという基本的な問題がいまだに解決できていない.本研究計画では,このような高雑音環境下での単語認識を実現する1つの手段として,視覚情報である唇の動きを実時間で取り込みながらそれを認識することにより,人が発する単語の認識を行うことを考える,これは人がいわゆる「読唇」によって,ある程度言葉を理解できることを考えれば実現性のある方法といえる.この方法によると周囲の雑音に影響されない単語認識システムを構築することができるだけでなく,先に述べたような人にとって特別な訓練や道具を必要としない柔軟なヒューマン・マシンインターフェイスを実現することができる.本研究計画期間内には,上で述べた唇の動きから単語を認識するシステムを構築する.初年度は,人の発話中の顔画像を実時間で取り込み,それから唇の動きを抽出する手法について検討し,そのハードウエア化を試みた.開発を試みたハードウエアはFPGAと呼ばれる内部構造を自由に設計できる集積回路を中心に,プリント基板上に実現するものとした.FPGA中には動的輪郭モデルとよばれる,画像の輪郭を高速に抽出することができる回路を実現し,その結果現状では試作ではあるが画像1枚あたり平均で3ミリ秒で処理することができた.これは日本で標準のNTSCと呼ばれるビデオ信号の規格で定められるフレーム間の間隔が33ミリ秒であることを考えると,大変高速であり実時間処理ができることが実証された.2年目は初年度の研究結果に基づき,高い雑音下でも正確に人の発話を検出できるよう,唇の動きの変化を捉えることによる発話区間の自動抽出手法について検討した.続いて,発話中の唇の動きを表現する各種のパラメータについて考察を加えた後,それを用いた認識手法を確立し,最後にこれらの技術を総合して実時間読唇システムの構築を試みた.その結果,特定の話者ではあるが,目的とする読唇システムを構築できた.今後は本研究成果をもとに,より実環境に近い環境で利用できるシステムの開発が望まれる.ロボット技術が進展するにつれ,これまでのようにあらかじめ定められた作業行程のみを機械が単独に繰り返し行うのではなく,人の指示を受けながら人が行う作業を補助する働きをするものが大変有効であることが認識されつつある.

このような際の人とロボットが行う情報交換の手段にはいくつかの方法が考えられるが,そのなかでも言葉を利用することは,人にとって特に訓練を行わなくてもよいことや,特別な道具を利用しなくてもよいことなどの点から大変有効な手段であることがわかる.この点音声認識に関する研究は,従来から各所で盛んに行われているが,ロボットの利用を必要とする場面のように周囲の雑音が大変大きい環境では,十分に音声を認識できないという基本的な問題がいまだに解決できていない.本研究計画では,このような高雑音環境下での単語認識を実現する1つの手段として,視覚情報である唇の動きを実時間で取り込みながらそれを認識することにより,人が発する単語の認識を行うことを考える.これは人がいわゆる「読唇」によって,ある程度言葉を理解できることを考えれば実現性のある方法といえる.この方法によると周囲の雑音に影響されない単語認識システムを構築することができるだけでなく,先に述べたような人にとって特別な訓練や道具を必要としない柔軟なヒューマン・マシンインターフェイスを実現することができる.本研究計画期間内には,上で述べた唇の動きから単語を認識するシステムを構築する.そのために初年度にあたる今年度は,人の発話中の顔画像を実時間で取り込み,それから唇の動きを抽出する手法について検討し,そのハードウエア化を試みた.開発を試みたハードウエアはFPGAと呼ばれる内部構造を自由に設計できる集積回路を中心に,プリント基板上に実現するものとした.FPGA中には動的輪郭モデルとよばれる,画像の輪郭を高速に抽出することができる回路を実現し,その結果現状では試作ではあるが画像1枚あたり平均で3ミリ秒で処理することができた.これは日本で標準のNTSCと呼ばれるビデオ信号の規格で定められるフレーム間の間隔が33ミリ秒であることを考えると,大変高速であり実時間処理ができることが実証された.来年度はこの方法を利用して,高い雑音下でも正確に人の発話を検出できるよう,唇の動きの変化を捉えることによる発話区間の自動抽出手法について検討する.続いて,発話中の唇の動きを表現する各種のパラメータについて考察を加えた後,それを用いた認識手法を確立し,最後にこれらの技術を総合して実時間読唇システムを構築する.ロボット技術が進展するにつれ,これまでのようにあらかじめ定められた作業行程のみを機械が単独に繰り返し行うのではなく,人の指示を受けながら人が行う作業を補助する働きをするものが大変有効であることが認識されつつある.このような際の人とロボットが行う情報交換の手段にはいくつかの方法が考えられるが,そのなかでも言葉を利用することは,人にとって特に訓練を行わなくてもよいことや,特別な道具を利用しなくてもよいことなどの点から大変有効な手段であることがわかる.この点音声認識に関する研究は,従来から各所で盛んに行われているが,ロボットの利用を必要とする場面のように周囲の雑音が大変大きい環境では,十分に音声を認識できないという基本的な問題がいまだに解決できていない.
固相抽出-LC/MS法を用いた溶存有機物(DOM)の新規解析手法

本研究では、流域圏における溶存有機物の役割や機能の解明に向け、固相抽出法およびLC/MS法を組み合わせた解析手法の開発を行った。最終的に10種類以上の固相カートリッジを用いて実験的な検討を実施した結果、本研究で開発した固相抽出法では溶存有機物の分画と同時に、共存する無機塩類の除去・有機物の濃縮の効果が期待できるものであった。LCについては、サイズ排除モードによる分離が第一選択であることが明らかとなった本研究では、流域圏における溶存有機物の役割や機能の解明に向け、固相抽出法およびLC/MS法を組み合わせた解析手法の開発を行った。LCについては、サイズ排除モードによる分離が第一選択であることが明らかとなった近年、湖沼等の閉鎖性水域において難分解性有機物の増加・蓄積が報告されるなど、流域圏における有機物の動態や生態系への影響に注目が集まっている。しかし、機器分析により明らかにできる成分は、有機物全体の1020%程度と言われ、有機物の発生源や水環境中における環境動態および機能・役割についてはほとんど明らかにされておらず、湖沼等の有機物に関する基盤情報が欠如している。本研究課題は、流域圏における溶存有機物(dissolved organic matter, DOM)の機能や役割の解明に向け、固相抽出法およびLC/MS法を組み合わせた解析手法の新規開発を行うものである。平成22年度は、研究計画全体を踏まえ、文献考察および固相抽出法について検討を行った。現在のところ、湖沼の有機物を網羅的かつ定量的に解析できる体系的な手法は見当たらない。そのため、先進的な(環境)分析関連雑誌で発表されている文献等を調査した結果、XAD-8分画法をベースにした固相抽出法が本研究課題の目的に適しており、より効率的なメソッドを開発できることが明らかとなった。従来のXAD-8法と比べて簡便で高回収率な手法を確立するために、試料の濃縮・精製において非常に優れた手法であり、かつ操作性、簡便性等の利点を持ち合わせている固相抽出法を採用した。平成22年度は、固相カートリッジの選定から洗浄、コンディショニング、保持・溶出の各操作について検討を実施した。本研究課題では、水環境中の有機物全体を網羅的かつ定量的に検出できる解析・評価手法の新規開発を目指すものであり、固相抽出とLC/MSを組み合わせた新規解析手法により湖沼の有機物研究のさらなる発展に資することが期待できる。近年、湖沼等の閉鎖性水域において難分解性有機物の増加・蓄積が報告されるなど、流域圏における有機物の動態や生態系への影響に注目が集まっている。平成23年度は、研究計画全体を踏まえ、文献考察および固相抽出法について検討を行った。LC/MS等の高度機器分析では、湖水中でDOMと共存する無機成分に妨害されることが多いだけでなく、その影響を定量的に評価することが困難である為に、分析結果の信頼性を低下させると考えられる。複数のイオン交換系固相カートリッジを組み合わせることにより、湖水中から主要な無機イオンを除去できる手法の検討を行った。本法では、主要な陽イオンおよび塩化物イオンについては定量的に除去可能であったが、硫酸イオンについてはその一部しか除去できないことが明らかとなった。したがって、本法は更なる検討・改良が必要なものの非常に簡便に処理できるため、本研究課題の目的に適しておりより効率的な新規メソッドの開発につながることが明らかとなった。本研究課題は、流域圏における溶存有機物(dissolved organic matter、DOM)の機能や役割の解明に向け、固相抽出法およびLC/MS法を組み合わせた解析手法の新規開発を行うものである。平成24年度は、研究計画全体・最終目標および過年度までの成果を踏まえ、固相抽出法の更なる高度化を中心に検討を行った。現在のところ、湖沼有機物を網羅的かつ定量的に解析できる手法は見当たらず、1980年代にUSGSのグループによって開発された非常に煩雑な樹脂分画法(XAD-8法)に替わる固相抽出法の新規開発が重要であることによる。更に、LC/MS法では、試料中に共存する無機塩類の妨害が問題であり、長年にわたって課題として残されてきた。本研究課題で開発した固相抽出法では溶存有機物の分画と同時に、共存する無機塩類の除去・有機物の濃縮の効果が期待できるものであった。

本研究課題では、最終的に10種類以上の固相カートリッジについて、洗浄方法、通水速度、pH調整等の操作条件、更には固相カートリッジの組み合わせについても体系的な実験的検討を行った。本法は、更なる検討・改良が必要なものの、簡便に操作が行えるため、本研究の最終目標に照らして、新規メソッドが開発できたと言える。LCにおける分離モードについては、逆相系、サイズ排除系、HILIC系などの複数のカラムを用いて条件検討を行った結果、サイズ排除系の分離モードが第一選択であることが明らかとなった。本研究課題では、水環境中の溶存有機物全体を網羅的かつ定量的に検出できる解析・評価手法の新規開発を行った。今後は、本法の適用例を増やしてその汎用性を示すとともに、湖沼の有機物研究の発展に資することを目指す。H23年度はLC/MS分析に供するための前処理として、複数のイオン交換系固相カートリッジを組み合わせた脱塩・精製手法を検討・確立した。LC/MS法については様々なカラムを使用して条件検討を実施した。したがって、当初の交付申請書に記載した計画のとおり、おおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、過年度までに検討し確立した手法を組みわせ、実試料として琵琶湖溶存有機物(DOM)に着目して本法を適用する。これにより、本研究課題で開発した新規解析手法の有効性を示すとともに、琵琶湖DOMの発生源や分解挙動等の解明に向けて有機物全体についての質的な(定性的な)基礎情報の収集に精力的に取り組む。さらに、本研究課題で得られた成果を学会等において成果を公表をしていく予定である。
膠原病性肺高血圧症の病態解明-骨髄由来免疫抑制細胞の分化とGATA-2の関与‐

肺動脈肺高血圧症(PAH)への転写因子GATA-2の関与,骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)・マクロファージの役割.1)ヒトPAH肺組織ではGATA2+CD68+マクロファージ細胞浸潤が多数集簇. 2)ヒトPAHで末梢血MDSC増加を認めた.3) GATA2-KOマウスを樹立し、PAHを誘導. GATA2-KOでは,WTより右心負荷が低かった.肺動脈リモデリングは有意差はなかった.一方GATA-2 KOで炎症細胞浸潤を多く認めた.これらより,ヒトPAHではGATA2発現上昇,マウスGATA2-KOにて右心負荷が低いことと一致したが,炎症細胞浸潤は相反する結果で検討が必要である.本研究では肺動脈肺高血圧症(PAH)病態解明のため、GATA-2の病態への関与について、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)・単球・マクロファージの役割について研究を進めている。1)転写因子GATA-2の肺組織への分布と発現の程度について:ヒトPAHの肺組織と、正常肺組織をGATA-2で免疫染色して、その分布と発現の程度を比較した。PAH肺組織、肺胞周辺には細胞浸潤が多数集簇し、これらはGATA-2を強く発現した。正常肺組織にも同様な細胞が散見されたがごくわずかであった。これらの細胞をCD68,サイトケラチンで染色し、これらGATA-2発現細胞はCD68陽性のMDSC・単球・マクロファージ系の細胞であることを確認した。3)MDSCはToll様受容体(TLR)を介して活性化することが知られていた。今回、筆者らはMDSCはTLR1/2リガンドによりM2マクロファージへ、TLR7/8リガンドによりM1マクロファージへ分化、活性化することを報告した。(1)CTD-PAHにおける単球・マクロファージ系の役割をみるために、ヒト肺動脈性肺高血圧(PAH)症例で肺移植後の肺組織と、健常な肺組織をGATA2で免疫染色した。どちらの肺組織にもGATA2に染色されるCD68陽性のマクロファージを認めたが、PAH症例の方が、よりGATA2陽性マクロファージが集簇している印象であった。(2)PBMCサブセットについて、PAH症例と健常者を比較検討した。特に、単球系については、CD14, CD16, HLADRで染色し、幼弱な単球、通常の単球、より活性化して、文化した単球について比較検討した。PAH症例の方が、より活性化した単球が多い傾向にあったが、さらにNを増やし、統計解析する予定である。(3)これまでにヒトPAHにおけるGATA2の役割について検討する方向で考えていたが、実際にGATA2がKOされることで、PAHを発症するのか、マウスモデルで検討中である。具体的にはGata2-conditional KOマウス: GATA2flox/flox-ER-Creマウスを用いる。GATA2floxマウスはGATA2のDNA結合に重要なエクソン5の両端にfloxを入れており、そのマウスにER-Creマウスと掛け合わせる。マウスのER-Creは細胞特異的なプロモーターで制御されてなく、エストロゲン(タモキシフェン)投与によりGATA2のエクソン5が欠損することで全身のGATA2の機能欠損を来たす。このマウスを、タモキシフェン投与後にGATA2がKOされていることを確認し、EM染色、HE染色を行った。GATA KOマウスでは、血管系のリモデリングが目立ち、また血管周囲に細胞浸潤が目立つ印象があるが、さらなる詳細な検討が必要である。末梢血PBMCにおいて、十分な細胞数が得られないため、GATA2の強制発現やノックダウンの系を確立するのが難しい。また、ヒトPAH症例数が、少ないために、PBMCを得る機会が少ない。肺動脈肺高血圧症(PAH)病態解明のため、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)・単球・マクロファージの役割と,分化に重要な転写因子GATA-2の役割を研究した.今年度は,GATA2ノックアウト(KO)のPAH発症への関与を探究した.私たちは, GATA2コンディショニングKOマウスを樹立した.GATA2floxマウスはGATA2のDNA結合に重要なエクソン5の両端にfloxを入れ,ER-Creマウスと掛け合わせる. ER-Creは細胞特異的プロモーターで制御されず,タモキシフェン投与によりGATA2のエクソン5が欠損することで全身のGATA2機能欠損を来たす. GATA2-KOとWTマウスを,低酸素状態で飼育しPAHを誘導した.肺動脈リモデリング,炎症細胞浸潤の程度,心重量で右心負荷を評価した.マウスを低酸素室で飼育,タモキシフェンを腹腔内投与しday 20に解析. GATA2-KOマウスでは,WTより右心負荷が低い傾向であった.肺動脈リモデリングはGATA2-KO, WTの両者で認めたが有意差は明らかでなく,一方GATA-2 KOで炎症細胞浸潤を比較的多く認めたが,浸潤細胞の種類や機能について,更に研究が必要となる.GATA2過剰発現系は樹立に至らず,今後の課題となった.またヒト

MDSCや単球のtranscriptをマイクロアレイで定量比較,パスウェイ解析を行ない, GATA-2と関連する遺伝子を推定する予定であった.ヒト単球分画をMACs beadsにより採取し, RNAを保存したが容量が少なく,マイクロアレイを施行できず.今後もさらに検体収集し,精査することが課題となった.膠原病PAHに関して,炎症性機序を病態とするシェーグレン,全身性エリテマトーデスと,線維化を病態とする強皮症に関して,免疫抑制療法の効果を比較検討して学会発表した.肺動脈肺高血圧症(PAH)への転写因子GATA-2の関与,骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)・マクロファージの役割.1)ヒトPAH肺組織ではGATA2+CD68+マクロファージ細胞浸潤が多数集簇. 2)ヒトPAHで末梢血MDSC増加を認めた.3) GATA2-KOマウスを樹立し、PAHを誘導. GATA2-KOでは,WTより右心負荷が低かった.肺動脈リモデリングは有意差はなかった.一方GATA-2 KOで炎症細胞浸潤を多く認めた.これらより,ヒトPAHではGATA2発現上昇,マウスGATA2-KOにて右心負荷が低いことと一致したが,炎症細胞浸潤は相反する結果で検討が必要である.1)転写因子GATA-2の肺組織への分布と発現の程度について:これらGATA-2発現細胞はCD68陽性のMDSC・単球・マクロファージ系の細胞であることを確認した。これらがエンドセリン系の発現に関与している可能性があり、これらの細胞をエンドセリン染色し、細胞の分化の程度や機能についてはさらに検討していく。2)PAH症例における末梢血単核球(PBMC)の各サブセット分画について:MDSC・単球・マクロファージ系の末梢血での割合は、ステロイドや免疫抑制療法により変化する可能性があるが、さらに症例を蓄積して検討する必要がある。3)マイクロアレイによるGATA2とMDSCを分化誘導する遺伝子プロファイリングの解析を進める必要がある。4)末梢血単球・MDSCのGATA-2過剰発現系、GATA-ノックダウン系の樹立を進める必要がある。1)GATA2の強制発現やノックダウンの系を確立するために、ナイーブな単球を得るのが難しいときは、セルラインを用いて代用する予定である。肺高血圧に関連するのは、内皮細胞、血管平滑筋、炎症細胞があり、それぞれのセルラインを用いることを検討する。これらにより、エンドセリンやサイトカインの産生能の変化を確かめる。2)ヒトのPAHにおいて、GATA2の異常とPAHの発現の因果関係を十分に示すのが難しいため、Gata2-conditional KOマウス: GATA2flox/flox-ER-Creマウスを用いた実験も、されに進めていく。低酸素状態で、PAHを誘発し、GATA2 KOと通常のマウスにおいて、PAHの発症の有無を検討する。免疫染色により、血管のリモデリングの程度を確認したり、心臓について右心肥大の有無を確認する。さらには、肺血管周囲に浸潤している細胞の種類を免疫染色で同定する。また、このマウスから、単球を分離し、エンドセリンの産生能などを比較検討することも考えている。膠原病1)転写因子GATA-2の肺組織への分布と発現の程度について:肺組織のGATA-2発現細胞はCD68陽性細胞でありこれらのエンドセリン発現を確認し細胞の分化の程度や機能を検討。3)マイクロアレイによるGATA2と単球を分化誘導する遺伝子プロファイリングの解析:GATA-2の発現や、MDSCの分化誘導に重要と思われる転写因子、サイトカインの候補遺伝子の選別を行なう。