hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
いじめ観の変容を目指した総合的な学習の時間と特別活動のクロスカリキュラムの開発

【研究の目的】本研究はいじめ観の変容を目的とした総合的な学習の時間と特別活動のクロスカリキュラムを開発し,その効果の検証をすることを目的とする。【研究方法】大阪府下の小学校における5年生105名に対して,「これまで知らなかった自分自身を発見する活動」を行い,その事前事後で「いじめ」に対する考え方(いじめ観)を尋ねる質問紙,「自尊感情」を尋ねる質問調査を行い,取り組みの効果について検証した。この効果に基づいて,「これまで知らなかった自分自身を発見する活動」の取り組みについて,「総合的な学習の時間」及び「特別活動」における学習指導要領上の目的や活動内容をふまえて,それぞれの時間におけるクロスカリキュラムを構築する。【研究成果】「自分自身を発見する活動」については,学習指導要領の「総合的な学習の時間」の章で示されている「探究的な学習の過程」をふまえ,子どもたち自身がどのような学習を行えば「これまで知らなかった自分自身を発見する」ことができるかと考えていくという流れで学習展開を進めた。子どもたちからは,「自分自身のことを知るためにはやはりお互いのことを知らなければならない」という意見が出たため,学習指導要領「特別活動」の章で示されている「望ましい人間形成」の視点をふまえて,グループ単位で自己紹介やお互いのインタビューなどの学習を進めていった。また取り組みの前後にそれぞれ「自己紹介ポスター」を書くことで,取り組み後にどれだけ新しい視点で「自己紹介」ができるようになったかについて比較を行った。この結果,取り組み後において「いじめ」に関してより鋭敏な感覚を持ち,「自尊感情」についても高まりが見られた。これを受け「自分自身を発見する活動」について,「自分と友達について知る」活動を「総合的な学習の時間」及び「特別活動」の各カリキュラムの中に,「クロスカリキュラム」として位置づけることができた。
地域の多元的社会構造が地域の問題の処理過程に上える影響の総合分析

本研究でわれわれが直接に問題にしたのは、地域社会の近代化と伝統の関係である。これまで、近代化は、どの地域社会においても共通にみられる普追的過程とみなされてきた。そして、伝統とは、地域社会ごとに多様な結果をとるにせよ、全体としては伝統主義として、近代の合理主義の対極にあるものとみなされきた。本研究では、このようなステレオタイプ化された理解が否定され、地域社会の伝統と近代化を理解するのに有効な新しい視点が確立された。ここで、近代化を資本主義化の過程としてとらえると、当然のことながら、合理的な金儲けが問題になる。わが国では、資本主義的生産様式は、国民の主体的意欲と無関係に、外から必然的に持ちこれたという大前提があり、国民は知らないうちに、いわゆる「歴史の必然」に尊かれて、不可避的に資本主義を選択したという非料学的信念がある。したがって、政府が外国から機械を購入し、工場を建てさえすれば、資本主義は自動的に確立すると根拠もなく想定されたのである。だが、日本の資本主義も、たとえそれが西欧型の個人主義的原理のうちにたつものではないにせよ、資本主義であるかぎり、金儲けが不可欠の前提である。したがって、富国強兵をめざし、採算を度外視して経営された官営工場をこの範疇にいれるのは不可能であろう。こうして、きわめて安い、木とブリキを主とした器械、安い労仂力、安価なまゆ、安定した外国市場とあいまって、製糸業において「下から」資本主義化がおこなわれたのである。そして、このような資本主義変化をささえたエトスは、いうまでもなく、プロテスタンティズムではなかった。それはまた、天皇制として制度化された国家神道ではなく、強いていえば「民間神道」であり、この地方でいえば、諏訪大社の神、御左口神信仰だったのである。本年度は静岡県下田市、長野県岡谷市、千葉県山武郡横芝町の三地域における、地域社会構造の持続性と変化について、実証的な研究をおこなった。とくに、日本社会全体における伝統と近代化が、それぞれの地方において、具体的にどのようにあらわれたかを検討した。これまで、近代化は、普遍的な合理化の過程としてとらえられ、近代化がすすめばすすむほど、地域社会の固有の伝統は消滅するものとみなされていた。日本では、近代化は具体的には西欧化の過程にほかならなかったのである。だが、地域社会を詳細に調査すれば、このような一般的図式は地域のレベルでは成立していないことが分かるのである。地域においては生活の持続、統合がめざされているのであり、近代化は伝統の存続の手段にすぎないのである。この点を、岡谷市の製糸業についてみれば、幕末の開国以降、輸出品として生糸がつくられるようになり、製糸業における「下から」の資本主義化がみられた。しかし、そのときでも、製糸業はなによりもまず家業としておこなわれ、片倉製糸のように大きくなっても、片倉同族団の仕事としておこなわれたのである。労働者と資本家は、敵対するものとしてあるのではなく、労働協業集団のなかのオヤ・コ、オヤカタ・コカタの内係として、すなわち、指導者と従者の内係としてあったのである。そして、日本では、このような生活における共同は文化的伝統として存続していき、いわゆる近代化によっては決して解体しないものなのである。このことは、諏訪地方で部落が諏訪大社のお祭りの基本単位として今なお生きていることによっても示される。また、日本では、諏訪地方に限らず、一般に、基は家の基であり、この家を基本単位として同族団が形成されているのである。

本研究でわれわれが直接に問題にしたのは、地域社会の近代化と伝統の関係である。そして、主に調査をおこなった地域は、静岡県の下田市と、長野県岡谷市および諏訪市である。これまで、近代化の過程は、地域社会の住民が主体的に選択した道というより、中央政府と国家によって「上から」強要された道とみなされ、したがって地域社会の伝統と相反するものとみなされてきた。だが、地域社会を具体的に調査研究すると、いわゆる近代化といわれる過程は、地域の特殊な条件のもとで、人びとが主体的に選択したものであり、伝統の再構成に他ならないことがわかる。たとえば、下田の人びとは、タウンゼント・ハリスが通訳のヒュ-スケンをつれただけで、戦艦も軍隊もなく、平和的に交渉にあたった態度を通じて、新たな国際感覚を身につけていくが、それは、この地方の村落の無家格型の伝統文化と無件係ではなかったのである。同じことは、諏訪地方の近代化についてもいえる。諏訪地方は、富岡製糸所のような官営工場の設置による「上から」の近代化に対抗して、独自の安価な機械の発明、養蚕事業の改良などを通じて、「下から」近代化が進行した地域であるが、ここでも、近代化は、諏訪大社の御柱祭りを中心とする、この地方の宗教的伝統と対立するものではなかったのである。日本における近代化の、西欧社会にみられない特徴は、共同体が最終的に解体せず、労働力の自由な売り手である労働者が存在しないなかで、金もうけを目的とする企業が発達していったことにある。このことは、脱工業化社会、ポストモダンの到来という新しい時代のなかで、日本に有利な条件となっている。この意味でも、諏訪大社信仰を中心とする諏訪地方の文化統合は、体系的な検討に価するといえるのである。
腫瘍抗原の分子免疫学的研究

免疫系によって認識されるがん抗原の性状および腫瘍化に関連する遺伝子を解析し、次の結果を得た。1.正常と同一の一次構造を持つGM3ガングリオシドであつてもある特定のGM3密度において、T細胞や抗体が認識できるメラノ-マ抗原性を獲得できることをGM3-リポソ-ムを人工抗原として用い証明し、がん抗原に新しい概念を導入した。GM3密度を上昇させる物質として24KdのGM3結合蛋白を同定した。2.蛋白性メラノ-マ抗原遺伝子をクロ-ン化し、塩素配列を決定したところ、内在性レトロウイルスのenv.遺伝子産物であることが判明した。この遺伝子発現は正常組織では全く見られず、腫瘍化に伴って発現するものと考えることができた。この遺伝子をL細胞に導入発現させることでメラノ-マ抗原性が出現するところから、この分子が抗原発現に重要な役割を担っていることが判明した。上記1.2.の結果を考え合わせる自己に内在する分子ががん抗原の活性化等に伴って持続的に発現し、それが免疫系によつて認識されるがん抗原分子として働くものと考えられた。3.腫瘍化、増殖に関連する遺伝子のcDNAクロ-ンを単離し、塩素配列を決定した。M末側にTFIII-A、Kruppel等に見られるZn finger構造を有し、実際DNAに結合する活性を有する全く新しい遺伝子であることが判明した。ノザンブロット解析ではほとんどの腫瘍細胞株においてこのmRNAは出現するが、正常組織では未熟精子母細胞、脳、副腎以外での発現は認められなかった。脳では胎児脳で最も強く発現し、成熟するにつれて発現が低下する。このことから、この遺伝子はDNA結合活性をもつ蛋白であり、転写制御/細胞増殖/組織発生過程に重要な働きを持つものと考えられた。
地方都市の道路交通施設容量、交通公害、住民意識、より見た自動車交通の適正限界評価

2ケ年間にわたる研究成果の概要は次のとうりである。1.街路交通に対する住民の迷惑・危険意識沿道住民のアンケート結果より、騒音や振動に関する迷惑意識は4車線道路以上で大きく、特に歩道設置の有無、交通量や混雑度、大型車混入率によって左右されることが判った。また幅員の狭い道路では危険識が強く、歩道と交通量の寄与度は特に大である。2.狭い地区におけるOD分布交通量の測定都市の狭い地区でこれに関連したOD交通量の分布パターンを調べるにはプレートナンバー法がかなり有効であり、ODパターンのみでなく、走行経路や交差点交通についても十分な精度で分析、予測することが可能である。3.都心部における駐車実態地方都心部の駐車場利用は週日による変動が大きく、佐賀市の調査結果によると休日以外は40%程度の利用率で、半数以上の駐車スペースが通勤用に使われており、駐車時間や歩行距離についても有用な調査結果が得られた。4.駐車場配置に関するコンピュータシミュレーション都心部駐車場配置の効率性と影響度を評価するためのシミュレーションプログラムを開発し、佐賀市都心部の実際のデータに適用してその有用性を確かめることができた。5.地方都市自動車交通の適正限界について地方都市交通の適正限界を規定するには、住民の迷惑・危険意識の許容限界を定めることによって各リンクの環境容量を設定し、予め実測した当該地区のODパターンと街路網の構成から、各リンクの交通量をこの範囲内に抑えるための規制措置、特に都心部における駐車場の規模と配置を再検討する必要がある。1.研究準備としての調査について(1)北部九州圏のいくつかの都市について都市形態の特性、ODパターンや道路網の特性について調査分析し、それぞれの都市形態に応ずる道路及び交通条件の特徴と問題点を明確にした。(2)道路沿線住民の被害意識については、佐賀市の道路網の中から30路線区間を選び、各50世帯(合計1500世帯)を抽出してそれぞれアンケート調査を行った。(3)佐賀市の都心部について駐車場の配置、規模及び駐車特性(駐車時間,駐車目的,歩行距離)を調査し、都心部駐車の実態に関して貴重な資料が得られた。2.調査結果にもとづく分析について(1)以上の調査の結果から道路沿線住民のめいわく意識といろいろな道路、交通条件の間に正準相関分析の手法によってかなり有意な相関式を求めることができた。これによって住民のめいわく意識に対してある許容水準を設定すれば、これから交通量の許容値(環境容量)を推定できることが判った。(2)都市内の自動車交通に一定のODパターンを先験的に与えた場合、総走行時間を最小にするという目的の外に各リンクの通過交通量ができるだけこの環境容量を逸脱しないというもう一つの目的を設定し、これにいわゆるゴールプログラミングや多目的計画の手法を適用する方法を開発した。3.今後の研究計画について今後は佐賀市の都心部に焦点を絞って自動車交通の適正限界を明確にするため、駐車場の能力と限界、土地利用(特に住宅地の配置)、交通規制のあり方とその影響等について研究を発展させる予定である。1.追加調査北部九州の各候補都市及び佐賀市について次のような追加調査を実施し,昨年度の調査結果と併せて集計整理するとともに,データベースとして構築した.自動車交通に対する住民の迷惑意識及びその地区の住み易さや便利さ等に関する調査,特に典型的な住宅地における生活道路に対する住民の評価及びそれら道路網の物理的特性の調査.また佐賀市都心部の駐車場における駐車目的,駐車時間,歩行距離等の実態調査及び都心部街路歩行者(来街者)約500名に対し,自動車交通量,駐輪,駐車に関する迷惑意識の調査.2.分析検討(1)調査結果より駐車需要曲線,目的別駐車時間分布を特定し,いろいろな駐車スペースを仮定してモンテカルロシミュレーションを行い,駐車場利用率と需要との関係を示すことができた.(2)住宅地の道路網形態や道路密度,あるいは通過交通,道路構造等の条件と住民の被害意識に関して相関分析を行い,有意な回帰式を求めた.(3)アンケートの結果から道路歩行者の心理的要素と道路交通条件に関する相関関係を特定することができた.

3.結論及び評価都市住民の自動車交通に対する被害(迷惑)意識は交通量や車道構造のみでなく,通過交通の比率,歩道の有無,道路密度等に関係が深く,道路網形態やこれら交通条件の定量化によって意識の程度を数値的に表現することが可能である.一方都心部駐車場についてはその利用率と駐車需要を規定することによって必要な駐車スペースを確定できるし,また上記の研究成果をより現実的なものに修正すれば住民意識に関する特定のレベルを基準として道路網や駐車場の将来計画を立案,評価できるであろう.
病／障害者の地域生活・移行支援に関わる制度・組織・人材のあり方についての研究

ハンセン病患者・精神障害者・水俣病被害者の置かれた状況と彼らに対する支援が如何に実施されてきたのかを調査した。隔離はハンセン病患者に対してなされ現在では否定されている。支援は支援対象者を限定し行われる。その支援対象者を限定し一所に集めることは部分的ではあれ隔離ではないのか。他方、水俣病被害者の多くの人たちは水俣病患者として国から認定されずにいる。それらの人たちは公的な支援を受けることが少なかったが支援者は存在した。そして支援者は地域で住む被害者の人と同じ地域で住み、その場で支援を行った。個人の生活に合わせた支援を行うことを支援の基本とするなら、それを可能とする裏付けを付けることが重要だろう。25年度の計画とした、三つの事象(精神障害者における病と障害の問題、水俣病患者の病者としての主張、ハンセン病患者の社会的排除による障害)のうち、精神障害に関するものと水俣病患者についての調査をおこなった。「水俣病患者の病者としての主張」に関する調査として水俣市社会福祉協議会、水俣病患者に対して支援を行っている団体・個人に対して聞き取りを行った。そこで患者個々の事情を熟知し長期的かつ継続的に支援を行っている人たちの存在を知る。ここで重要なことはシステム・仕組みとしての「支援」のもと集まった専門家というより、支援を行っている人たちによってシステムが利用/創造されている点であった。他方、「精神障害者における病と障害の問題」に関する調査は計画書に記したように社会福祉法人心生会の協力を得て、当該法人に勤務する精神保健福祉士にインタビューを実施した。これまでの入院治療中心から地域生活支援へケアの方向性を政策として変化させてきたわけだが、実際の地域生活を支援する中で国等が考える方法では不具合が出ていることが分かった。これらの調査から、地域生活支援を行う上で「様々な機関が提供するサービスを組み合わせること」の有益さと不具合について考察する視点を得た。今後も調査を継続し、得た知見をまとめたうえで、平成27年1月に開催予定である第10回水俣病事件研究交流集会で発表する。「ハンセン病患者の社会的排除」に関する調査は研究協力者を得ることで平成26年度より本格的に調査を行う予定である。平成26年度計画における調査は次のとおりである。群馬県前橋市にある「社会福祉法人フランシスコの町あかつきの村」に於いて「精神障害における病と障害の関係」に関する聞き取りを行った。その際、社会的包摂という概念自体は否定しないが地域社会から排除された人たちを、一時的ではあるにせよ守る場とそこで活動する支援者の必要性を知った。「水俣病患者の病者としての主張」に関しては熊本学園大学水俣学研究センターが開催する「水俣学若手研究セミナー」に参加し知見を広げた。水俣病被害者の多くは町で暮らす。この点において「あかつきの村」の生活様式と異なる。しかし、様々な不都合があり、その不都合さが人とのつながりに関わるものであることは同質である。その不都合さの解消は福祉サービス・制度ではなく、それらを創造し活用する支援者の「よりそい」を基盤とした活動であった。これら平成26年度の調査から得た知見は、「よりそい」というキーワードのもと第10回水俣病事件研究交流集会で発表した。「ハンセン病患者の社会的排除」に関する調査は、国立療養所の看護師等に「療養所の生活は排斥であるのか」という視座の元、聞き取りを行う。精神障害領域に関する調査は群馬県前橋市にある「あかつきの村」で実施した。当該調査にて共生のあり方に関する課題が明確になりつつある。それは水俣市における水俣病患者への支援を行う人たちの実践と共通するところでもある。それはソーシャルインクルージョンと「福祉的支援」がいかに関係しているかという視点でもある。ソーシャルインクルージョンを共生と共生社会の実現に向けての試みと同義とするなら、それらの対立概念は社会的排除となりえるだろう。しかし、福祉の実践には施設における支援という形がある。入所施設の「隔離」という側面は否定できず、その点が批判されるが入所で生きられる生命や生活もありえることが「あかつきの村」における調査で明らかになった。他方、地域で暮らしながら放置される人たちが存在することも水俣における調査で知ることができた。国立ハンセン病患者に関する調査は国立栗生楽泉園で実施した。この調査では「隔離」された人々が、長年量要所で暮らしたため地域社会に出ることが困難になっていることを知ることとなった。そして施設での生活を充実させることで彼らの生活の質を上げるという試みがなされ手いることもわかった。これらの調査結果から、「入所施設」の生活の質を上げることは「隔離」批判に対することになっているのか。また、精神障害者や水俣病患者、国立療養所で暮らす人たちに対し「福祉」という仕組みができた/できること、また阻害してきたことは何かについて分析を平成28年度に行う。国立ハンセン病療養所調査にかかる研究協力者の業務が多忙であったため、調査が大幅に遅れた。その結果、調査結果の分析検討と研究全体の結果分析に遅れが生じている。病/障害者の地域生活・移行支援に際し、差別・偏見に如何に抗するのかが大きな問題であることは自明のことであろう。しかし、本研究ではこの点を強く確認することができた。そして差別に晒され更なる困難さを抱える人たちへ寄り添うことで支える人たちの取り組みをみた。「寄り添い」は社会福祉では頻回に使われる言葉である。

しかしどのようなことをいうのかは、実践で示すほかはない。ただ、本研究で困難さを抱える人たちに寄り添う支援者たちは施設に集める(入所・通所利用)のではなく、彼らの生活の場に足を運ぶ、あるいは共に暮らすことで支えようとしていた。ハンセン病患者たちは病を理由に一所に集められ隔離された。その政策に対する反省弁を国は述べる。精神障害者は病の治療を目的に病院に入院する。ただ、長期間の入院により地域移行が難しい人が多くいる。水俣病被害者の多くは国が患者と認めず、支援者とともにその被害を訴え続ける。一所に人を集め(入所・通所利用)支援を行うことは人的・経済的側面の上では効率的であろう。水俣病被害者の支援を続けた医師の原田正純は「公害のあるところに差別がおこるのではない。差別があるところに公害がおこる」と言った。原田の指摘は施設型支援にも援用できると考える。つまり、一所に人を集める支援は差別を増幅させる可能性があり、その差別は新たな困難さを引き起こす支援を行い同時に差別に抗する取り組みを行う施設が新たな差別を惹起する機関となっていないか。本研究で成果が指摘したいことの一つがこの点である。ではどうすれば良いか。個人の生活に合わせることを支援の基本とするなら、一所に人を集める支援は基本から外れていることを認識したうえで、個人で住むことを保証し必要な支援をその人たちの生活の場で行う。それを可能にする人員と財政的裏付けつけることを保証していく。これらの重要性を改めて強く指摘したい。ハンセン病患者・精神障害者・水俣病被害者の置かれた状況と彼らに対する支援が如何に実施されてきたのかを調査した。隔離はハンセン病患者に対してなされ現在では否定されている。支援は支援対象者を限定し行われる。その支援対象者を限定し一所に集めることは部分的ではあれ隔離ではないのか。他方、水俣病被害者の多くの人たちは水俣病患者として国から認定されずにいる。それらの人たちは公的な支援を受けることが少なかったが支援者は存在した。そして支援者は地域で住む被害者の人と同じ地域で住み、その場で支援を行った。個人の生活に合わせた支援を行うことを支援の基本とするなら、それを可能とする裏付けを付けることが重要だろう。「精神障害における病と障害の関係」及び「水俣病患者の病者としての主張」に関しては、当初計画の通り調査を行っている。しかし、「ハンセン病患者の社会的排除」に関する調査は研究への協力者を得ることはできたが、当該協力者が多忙により調査実施に至ることができなかった。ただ、調査先の選定や調査における視座に関する打ち合わせは行っているため、本年度は「ハンセン病患者の社会的排除」に関する調査を実施し研究のまとめを行うことが可能であると考える。群馬県前橋市にある「あかつきの村」における精神障害領域に関する調査と水俣市での調査、国立栗生楽泉園における調査の結果を分析する。それは「入所施設」の生活の質を上げることは「隔離」批判に対することになっているのか。
湖岸・河岸帯植物群落の水質浄化機能とその保全・復元技術に関する研究

1.水生植物群落内の付着生物群集をめぐるCNPの動態(渡辺):諏訪湖のエビモ帯および実験室内において付着生物群集の生産に伴うCNPの動態を測定した。湖水中の人工基盤上における夏季の純増加速度は、直線増加期にC;90,N;10,P2.6(mg/m^2・d)で、これまでの春・秋季に比べて1/51/3の低い値であった。諏訪湖の人工基盤上に発達した付着生物群集を用いて室内の人工照明下で測定した水中からのNPの除去速度は、N;46100,P918(mg/m^2・d)であった。これはこれまでに報告されている水生植物による除去速度より低い値である。2.ヒメタニシの糞による植物プランクトンの増殖抑制(鈴木):琵琶湖の沿岸帯に大量に生息するヒメタニシとカワニナの糞による一次生産力(糞中に含まれる植物プランクトンによる)およびNPの吸収を測定した。ヒメタニシの糞の一次生産力はカワニナに比べて約10倍(1日目)から4倍(3日目)高く、また水中のDINおよびPの濃度を低下させた。両種の糞を投入した水中の生産力は逆にカワニナの場合に数倍高かった。3.湖岸・河岸帯植物群落の保全と復元(桜井):この課題については以下のようなさまざまな調査・研究を行なった。(1)霞ケ浦湖岸のヨシ群落を先端部の株化・崩壊現象が広範囲に起きていることを調査し、その原因を考察した。(2)湖岸帯の植生構造と生息するトンボ群集の関係について上田市の溜池群について3年間調査し、多様な生活形からなる群落が多様なトンボ群集の生息の基盤であることを明らかにした。(3)霞ケ浦の裸地化した湖岸においてヨシその他の抽水植物およびヤナギ類を植栽し、沿岸帯植物群落の復元をはかる実験を建設省と協力して実施し、満足すべき結果をえた。しかしこの人工群落は、台風の増水時に流入した木材など粗大浮遊物の高波によるロ-リングのため、壊滅的な損傷を受けた。上記の(1)の原因の一つもこれであり、対策を要する。(4)千曲川中流の戸倉地籍右岸の低水護岸部で、建設省と協力して木工階段護岸と蛇籠護岸にヤナギ類を併用するための基礎試験を実施した。ヤナギは低木性(ネコヤナギ、イヌコリヤナギ)と高木性(タチヤナギ、カワヤナギ)の4種を植栽し、いずれも良好な結果をえた。(5)河岸帯の自然度を類型分けして評価する手法を考案し、上田市内を流れる千曲川およびその支流の14河川の流路延長102kmを対象にして調査してその結果を解析したところ、この方法は有効であることが判明した。

(5)河岸帯の自然度を類型分けして評価する手法を考案し、上田市内を流れる千曲川およびその支流の14河川の流路延長102kmを対象にして調査してその結果を解析したところ、この方法は有効であることが判明した。
アフリカツメガエルSox7の胚発生における役割解明とその標的遺伝子の同定

我々は、平成17年度の研究計画に従って、実験を行ったのでその結果を報告する。アフリカツメガエル受精卵に、Antisense/sense RNAやoligo-DNAをマイクロインジェクションし、XSox7遺伝子の発現調節を試みた。マイクロインジェクションされたツメガエル胚におけるXSox7遺伝子の発現量を調べるために、インジェクションされた初期胚を用いて、ウェスタン分析を行い、発現調節が正確に行われているかどうかを調べている。Antisense/sense RNAやoligo-DNAでうまく発現の制御が出来ない場合には、Morpholino-oligoDNAの使用も予定している。発現量を調べると同時に、インジェクションされた初期胚における、Xcardiac troponine I等の心筋特異的に発現する遺伝子の発現をwhole mount in situ hybridization法により検索している。Xsox7遺伝子の発現は、whole mount in situ hybridization法から、心臓のみならず、頭部や神経系においても強く発現していることから、心臓の形成のみならず、頭部及び神経系の形成に深く関与していると考えられる。よって、我々は、Xsox7遺伝子の胚形成における役割として、心形成にだけ関与するものとは考えず、もっと広く、頭部や神経系の形成に関与する遺伝子の制御も考慮に入れながら研究を進めていく予定である。平成16年度の研究計画調書に記した研究計画に沿って、実験を行った。アフリカツメガエルSox7遺伝子に対してモルフォリーノ・アンチセンスオリゴDNAとセンスRNAを作製し、アフリカツメガエル受精卵にマイクロインジェクションした。モルフォリーノ・アンチセンスオリゴDNAは、従来のアンチセンスオリゴDNAに比較し、生体において安定であるため効率のよい作用効果が得られることが知られているので、この実験ではモルフォリーノ・アンチセンスオリゴDNAを用いた。我々は、モルフォリーノ・アンチセンスオリゴDNAとセンスRNAの作用効果を確認するために、マイクロインジェクションするにあたり各々の濃度を調節し、Sox7の翻訳が濃度に比例して抑制されているかどうかを確認するために、インジェクション後の初期胚を用いて、ウェスタン分析を行った。アンチセンスオリゴDNAとセンスRNAの作用効果を確認した後、Sox7蛋白質発現が調節された胚を用いて、これらの胚の心臓の動きをビデオに収録中である。またビデオ収録と平行して、アフリカツメガエル正常胚とSox7発現調節を行ったツメガエル初期胚を用い、パラフィン切片を作製し、我々が作成した抗ツメガエルSox7ポリクローナル抗体を用いて免疫染色を施した。現在、正常初期胚とSox7発現調節を行ったツメガエル初期胚の心臓におけるSox7の局在を比較すると共に、Purkinje線維の組織学的構築も相互に比較し、Sox7蛋白質の心臓形成に関する役割を調べている。
左室補助人工心臓補助下の大動脈弁逆流が生体に与える影響解明と管理・治療基準の構築

左室補助人工心臓(LVAD)補助中の大動脈弁逆流が生体に与え得る影響について、昨年に引き続き、大動物を用いて評価した。昨年度投稿していた大動脈弁逆流の進行が血行動態および心筋酸素代謝に与える影響については、Journal of Artificial Organs (2018) 21(3):265-270に正式に掲載された。今後はこれらの研究成果をもとに、臨床におけるLVAD補助中の大動脈弁逆流治療基準の構築や、また近年トピックとなりつつあるLVAD補助中の右心不全併発時の大動脈弁逆流について、より詳細な検討を重ねる予定である。左室補助人工心臓補助下の大動脈弁逆流について、調節可能で再現性の比較的高い大動物モデルが確立できたことを背景に、大動脈弁逆流の進行や、左室補助人工心臓送血管の角度が生体に与える影響など、関連する重要な要因について評価することが可能であった。研究成果の一部を論文として発表した。引き続き、確立した大動物モデルを用いて、関連する血行動態変化に対する評価を続けるとともに、得られた成果より導き出される臨床における治療基準の構築に対しても、より詳細な検討を重ねていく予定である。左室補助人工心臓補助中の大動脈弁逆流が生体に与え得る影響について、大動物を用いて評価した。まず大動脈弁逆流の進行を模擬する大動物モデルを構築した。大動脈弁位に挿入した下大静脈フィルターの開放度を変えることにより、大動脈弁逆流の進行を模擬することに成功した。当モデルを用いて、左室補助人工心臓補助下の大動脈弁逆流が進行した際の血行動態および心筋酸素代謝変化について考察した。大動脈弁逆流が進行した際の心負担が左室補助人工心臓の補助効果を上回った時に、左心系の急激な圧上昇が見られ、また心筋酸素代謝も悪化し得ることを発見した。この変化は左室補助人工心臓から駆出された血液が左心室に戻るrecirculationの割合が40%を超える辺りで確認された。臨床における左室補助人工心臓補助中の大動脈弁逆流進行に対しての治療介入については未だ明確な基準がなく、症例ごとによる詳細な検討が必要だが、この左心系の圧変化は大動脈弁に対する治療介入を検討する際の一つのサインとして有用である可能性があると考察した。本研究成果はJournal of Artificial Organsに投稿され、現在online first articleとして閲覧可能である(Iizuka, K., Nishinaka, T., Naito, N. et al. J Artif Organs (2018). https://doi.org/10.1007/s10047-018-1027-4)。今後はこの研究成果をもとに、左室補助人工心臓の駆動条件やグラフトの位置など、補助側の要因が大動脈弁逆流に与え得る影響について、より詳細な検討を重ねる予定である。左室補助人工心臓補助下の大動脈弁逆流について、調節可能で再現性の比較的高い大動物モデルを確立できた。当モデルにより、大動脈弁逆流進行が血行動態および心筋酸素代謝に与える影響について、評価することが可能であった。引き続き、確立した大動物モデルを用いて、血行動態変化に対する評価を続けてゆく。今後は左室補助人工心臓の駆動条件やグラフトの位置など、補助側の要因が大動脈弁逆流に与え得る影響について、より詳細な検討を重ねる予定である。支出端数として生じた43925円を次年度に繰り越す。引き続き、大動物モデルを用いた手術関連器具、学会発表旅費、論文投稿費用、データ保存・解析関連およびその他消耗品などに使用予定。購入予定であった手術器具の一部について、無償貸与にて使用することができた。合わせて支出端数として生じた226,220円を次年度に繰り越す。
マイクロチャネル乳化法によるエマルションおよびダブルエマルションの連続生産

連続相を流通させることが可能なクロスフロー型のマイクロチャネル基板を設計し、マイクロチャネル乳化法を行うことによって、単分散O/W(Oil in Water)エマルションの作製の連続化に成功した。マイクロチャネルの構造が異なる基板を用いることによって、生成するエマルションの平均液滴径を1152μmの範囲で変化させることができた。また、連続相流量を1.4x10^<-2>2.4ml/minと流量を100倍以上に変化させても、20μm前後の液滴を生成する基板を用いた場合は、液滴径に大きな変化はなかった。界面活性剤濃度によって油水間の界面張力が変化するが、これに比例して液滴生成圧力が変化することが分かった。また、界面活性剤濃度や操作圧力は、検討を行った範囲では液滴径に影響を及ぼさず、単分散エマルションが広い範囲で生成することが分かった。マイクロチャネル表面をシランカップラー試薬で疎水化することによって、W/O(Water in Oil)エマルションの作製を行った。疎水化の程度は、油相中の基板に対する水の接触角を測定することにより評価した。油相として、ヘキサン、デカン、およびオレイン酸を使用したが、接触角は修飾に用いたシランカップラー試薬の種類だけでなく、油相の種類によっても変化した。W/Oエマルションが生成する条件は、全ての場合において、水の接触角が110度を越える場合であることが分かった。その際、生成するエマルションの液滴径は、水相と油相の粘度の比や界面活性剤の種類によって±10%の範囲で変化した。以上、エマルションの連続生産技術とW/Oエマルションの作製技術を融合させることによって、W/O/W、あるいはO/W/Oといったダブルエマルションの連続生産が可能であると考えられる。本年度は、連続相を流通させることが可能なクロスフロー型のマイクロチャネル基板を設計・作製した。クロスフロー型マイクロチャネル基板には、孔が2つあけられており、孔の間には連続相が流れるための流路が設けられている。流路の壁面には、マイクロチャネルが作製されており、そこから分散相が送り出されて液滴が生成する。従って、一方の孔から供給された連続相は、もう一方の孔からエマルションとして回収される。一連のプロセスは顕微ビデオシステムによって、観察・制御される。今回は、分散相としてトリオレイン、連続相としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液を用い、O/Wエマルションを作製した。このクロスフロー型マイクロチャネル基板を用いて単分散エマルションの連続生産を行った。マイクロチャネルの構造が異なる基板を用いることによって、生成するエマルションの滴径が1152μmの範囲で変化した。いずれの場合も、液滴径分布はシャープであり、幾何標準偏差は1.03と単分散性を示す値となった。連続相流量が液滴径に及ぼす影響についても検討したが、20μm前後の液滴を生成する基板を用いた場合は、1.4x10^<-2>2.4ml/minと流量を100倍以上に変化させても、液滴径に大きな変化はなかった。界面活性剤として用いたSDSの濃度が液滴生成圧力に及ぼす影響について検討を行ったところ、SDS濃度によって変化する油水間の界面張力に比例して液滴生成圧力が変化することが分かった。また、SDS濃度や操作圧力は、液滴径に影響を及ぼさず、単分散エマルションが広い範囲で生成することが分かった。
テラヘルツ・ファブリペロー・ジョセフソンレーザー

本研究課題において、Bi2212固有ジョセフソン接合を利用したテラヘルツ帯レーザーの実現に向けて、以下のようなブレークスルーがあった。【1】テラヘルツ電磁波放射の"高バイアス条件":ギャップ電圧をほぼ保ちながら電流がゼロに近づくバイアス領域での一桁強い放射を観測。【2】"HOT SPOT"の出現:接合中心部が超伝導遷移温度以上に加熱する現象を観測。【3】周波数可変性の発見:"HOT SPOT"の加熱により共鳴箱である超伝導体の実効サイズが変化して共鳴周波数が350 750GHzまで53%変化する現象を発見。【4】放射波の狭線幅23MHz :"HOT SPOT"の加熱により接合間を抵抗でシャントしたのと同じ効果が生じ、接合間の結合が強まり、コヒーレンスが格段に向上。以上のように、この3年間で固有ジョセフソン接合を利用したテラヘルツ帯発振素子の特性は格段に進歩させると同時に、今後さらに強度・可変周波数特性・狭線幅といった特性を向上させていくために必要な発見を次々に行った。我々の発見した、固有ジョセフソン接合巨大スタックからのテラヘルツ放射新条件において、結晶内での電磁波励起パターンを低温レーザー顕微鏡で観測することに成功し、PRL誌に発表した。平成21年度は、この新条件において、励起電磁波パターンと放射されるテラヘルツ波の強度・スペクトラムを同一の結晶において観測することに成功し、目下、第2報としてPRL誌に投稿中である。そこで明らかとなったのは、結晶内での電磁波が形成する定在波の様式が従来の報告と90°異なることである。テラヘルツ発振機構の白紙からの見直しが必要であることが裏付けられた。さらに、結晶中心付近に現れる"HOT-SPOT"、即ち超伝導遷移温度以上に発熱している部分がバイアス電流に依存して大きさを変え、それに伴い定在波パターンの形が変わることで発振周波数が変化することが見いだされた。この発見は、発振メカニズムの解明に肉薄する貴重な知見であるとともに、この素子がデザインを変えることなく、周波数可変の発振器として利用できることを示したもので、応用上重要な知見である。さらにファブリペロー共鳴箱を搭載して、強度の向上を図っている。固有ジョセブソン接合からのTHz放射メカニズム解明と、THz放射出力アップを目指して、研究代表者が発明した両面加工法により様々な形状の接合スタックを単結晶チップに集積し、THz放射出力・周波数の評価を行った。さらに研究代表者は、チュービンゲン大学に滞在し、日独共同で低温走査型レーザー顕微鏡を用いたテラヘルツ励起パターン(定在波パターン)の観測を行った。接合スタックの形状が接合面内を伝搬する電磁波に対する空洞共振器として働き、この共振周波数が、接合電圧で決まるジョセブソン周波数に一致するときにTHz外部放射が得られる。研究代表者が発見した高バイアス条件においては、接合内に加熱領域(T>Tc)が生じるとともに、40%を超える放射THz周波数可変性が観測された。加熱領域の出現により空洞共振器の実効サイズが接合の非加熱領域(T<Tc)となることから、共振器の長さが変化し共振周波数が変化することが解った。バイアス電流と熱浴の温度を制御することにより、放射周波数の広範囲な制御が可能となった。固有ジョセフソン接合を利用したテラヘルツ帯レーザーの実現に向けて、我々はテラヘルツ電磁波放射の"高バイアス条件"(ギャップ電圧をほぼ保ちながら電流がゼロに近づくバイアス領域)、"HOT SPOT"の出現(接合中心部が超伝導遷移温度以上に加熱する現象)、周波数可変性の発見(加熱により共鳴箱である超伝導体の実効サイズが変化する現象)を報告してきた。本年度は本研究課題の最終年度である。東日本大震災の影響を乗り越え、以下にあげる成果を挙げた。自作の低温走査型レーザー顕微鏡を完成させた。この顕微鏡の小型化を図ることにより、既存のテラヘルツ発振実験用のクライオスタットに装着することに成功した。これにより、従来のテラヘルツ光外部放射の強度・分光分析と同時に、接合内部でのテラヘルツ共鳴励起モードの観測が可能となった。ロシア科学アカデミーのコテルニコフ電波・電子工学研究所との共同研究で、我々の固有ジョセフソン接合テラヘルツ発振素子からのテラヘルツ放射電磁波の周波数線幅の測定を行った。測定に用いたのは、共同研究者の開発した金属窒化物超伝導体ジョセフソン接合Nb/A1N/NbNから構成される、平面アンテナ・SISミキサー・ジョセフソン接合局部発振素子の集積デバイスである。

従来の発振条件、即ち、固有ジョセフソン接合列の電流-電圧特性における電圧状態へのスイッチ後、ギャップ電圧をほぼ保ちながら電流がゼロに近づき、やがて電圧が減少し始める条件(低電流バイアス条件、所謂、subgap conductance領域)では、周波数線幅が500MHzより小さくなることはなかった。一方、我々が見出した"高バイアス電流条件"では、周波数線幅が最小で6MHzに達した。その原因は、HOT SPOTの生成により接合列が常伝導抵抗体で結合され、各接合の位相が整合して線幅が鋭くなったものと解釈できる。
多層エピ成長による結晶配向転換を用いたＣМОＳプロセスの革新

電子・正孔共に同等の移動度を有するSi(110)面とSi(111)面の組み合わせをSi(110)基板の一部に3C-SiC(111)薄膜を介してSi(111)面を成長させることで実現するアイディアを掲げ、その原理検証に取り組んだ。まず、Si(110)基板上に3C-SiC(111)薄膜が成長する回転エピ成長機構を解明し、これを最適化した。その結果、Si(110)面上に従来法よりX線ロッキング半値幅で23%高品質の3C-SiC(111)結晶薄膜をヘテロエピタキシャル成長することに成功し、同薄膜上に、工業的成膜手法であるLPCVD法を用いてSi(111)薄膜を形成することに成功した。MOSデバイスはこれまでSi(100)基板上に構築されてきた。それはこの面方位においてSi/SiO2の界面準位が最小で、その結果、電子移動度が最大だからである。その一方、Si(100)面の正孔移動度は電子移動度の約30%と低く、このためCMOSではNMOSとPMOSの動作速度を合わせるべく、前者をわざと大きく作っており、そのことがCMOSデバイスの更なるスケーリングを阻む一因となっていた。本研究は、申請者らが構築してきた結晶成長技術の最新の成果を組み合わせ、正孔移動度がSi(100)面に比べて2倍以上も高いSi(110)基板上にSi(111)結晶をエピタキシャル成長させるという、これまでにない発想の革新的CMOS技術を提案し、原理的実証を行うことを目的として研究を行った。初年度である2013年度は、Si(110)基板上に成長させた3C-SiC(111)結晶薄膜の断面TEM観察を行った。その結果、Si(110)基板上3C-SiC(111)回転エピ成長では、回転エピ成長領域以外に僅かながら非回転エピ成長領域が存在し、その境界にドメインバウンダリ(DB)と呼ばれる面欠陥が存在すること、DBはSiC/Si界面の荒れを原因として発生すること、一方、回転3C-SiC(111)領域内にも、互いに双晶関係にある2種類の領域が存在し,その界面にDPBが発生すること、そしてこれら3C-SiC内の構造欠陥は、その上に形成したグラフェン(GOS)に欠陥を発生させることを明らかにした。また、この問題を解決する為、固相による炭化層形成を試み,初の固相炭化層の形成に成功した。さらに、回転3C-SiC(111)基板上にSiエピ成長を試み、Si(110)基板上に3C-SiC(111)薄膜を介してSi(111)薄膜形成が可能であることを見出した。その一方、Si(100)面の正孔移動度は電子移動度の約30%ときわめて低く、このためCMOSではNMOSとPMOSの動作速度を合わせるべく、前者をわざと大きく作っており、そのことがCMOSデバイスの更なるスケーリングを阻む一因となっていた。本研究は、申請者らが構築してきた結晶成長技術の最新の成果を組み合わせ、正孔移動度がSi(100)面に比べて2倍以上も高いSi(110)基板上に3C-SiC(111)極薄膜を介してSi(111)結晶をエピタキシャル成長させるという、これまでにない発想の革新的CMOS技術を提案し、原理検証を行うことを目的として研究を行っている。二年度である2014年度は、SiC結晶上のSiエピタキシャル成長プロセスを確立すべく、工業的製法であるLPCVD装置を用いて予備実験を実施した。シランを原料としてSiならびにSiC基板上へのSiエピタキシャル成長を試みたところ、Si、SiC基板上ともSiのエピタキシャル成長が可能であることがX線ロッキングカーブにより確認された。またSi(110)基板上に3C-SiC(111)配向薄膜が成長する初期過程を高速電子線回折(RHEED)によって「その場」観察することに初めて成功した。その一方、Si(100)面の正孔移動度は電子移動度の約30%の低い値しか示さず、このためCMOSではNMOSとPMOSの動作速度を合せるべく、前者をわざと大きく創っており、そのことがCMOSデバイスの更なるスケーリングを阻む一因となっていた。本研究は、申請者らが構築してきた結晶成長技術の最新の成果を組み合わせ、正孔移動度がSi(100)面に比べ2倍以上も高いSi(110)基板上にSi(111)結晶をエピタキシャル成長させるという、これまでにない発想の革新的CMOS技術を提案し、原理的実証を行うことを目的として研究を行っている。最終年度である2015年度は、前年度に実施した工業的製法であるLPCVD装置を用いてシランを原料とするSiC基板上へのSiエピタキシャル成長を行い、X線回折(XRD)によって3C-SiC(111)/Si(110)上にSi(111)が成長していることを確認した。

またこれと並行して、Si(110)基板上3C-SiC(111)回転エピ機構を、前年度に開発したRHEED法を用いて詳細に解析し、回転エピ成長は、SiC成長前に形成するアモルファス状バッファ層をSiC成長温度に昇温加熱する段階で回転エピ核が発生することによって生じることが明らかになった。この知見を基に従来にない高品質の3C-SiC(111)/Si(110)回転エピ膜の成長に成功した。電子・正孔共に同等の移動度を有するSi(110)面とSi(111)面の組み合わせをSi(110)基板の一部に3C-SiC(111)薄膜を介してSi(111)面を成長させることで実現するアイディアを掲げ、その原理検証に取り組んだ。まず、Si(110)基板上に3C-SiC(111)薄膜が成長する回転エピ成長機構を解明し、これを最適化した。その結果、Si(110)面上に従来法よりX線ロッキング半値幅で23%高品質の3C-SiC(111)結晶薄膜をヘテロエピタキシャル成長することに成功し、同薄膜上に、工業的成膜手法であるLPCVD法を用いてSi(111)薄膜を形成することに成功した。本研究は、(I)Si(110)基板上3C-SiC(111)回転エピ成長を発生させ、(II)この3C-SiC(111)薄膜上にSi(111)薄膜を形成させるものである。本年はこのうち(I)に関し、成長面の結晶方位を高速電子線回折(RHEED)によって「その場」観察することに初めて成功し、この結晶方位回転現象が、SiC成長時ではなく、Si基板上バッファ層(炭化層)形成時に生じることを明らかにした。これは極めて重要な知見である。また(II)に関しては、将来の産業化を見据え、実際の半導体プロセスで用いられると同じLPCVD装置を用いてSiC結晶上のSi薄膜成長を試み、エピタキシャルSi薄膜の成長に成功することができた。これは当該研究が提案する結晶方位回転技術の実用化に大きく資するものである。以上から平成26年度はおおむね順調な進展であると考える。半導体薄膜工学初年度の固相炭化法及びSiC/Si界面平坦化技術の開発、二年度の結晶方位回転過程「その場」観察技術及びSiC結晶上Si薄膜成長技術の開発、を組み合わせ、高品質結晶方位回転Si薄膜の開発を行う。また電気特性評価実験を行い、提案技術の将来性を評価する。当初計画では、本年度、SiC/Si成膜実験を行い、良好な3C-SiC(111)薄膜上Si(111)薄膜形成が成立する最適化条件を探索する予定であった。しかし、Si(110)基板上3C-SiC(111)薄膜上の断面TEM観察の結果、SiC/Si界面構造の荒れに起因する二次元欠陥が存在することが判明したため、不完全な3C-SiC薄膜の上にSi薄膜を形成しても所期の目的を達成することは出来ないと判断、SiC/Si界面の平坦化に取り組んだ。具体的には固相炭素によるSi炭化を検討し、同法によってもSiC/Si界面が形成可能であることを初めて明らかにした。以上の判断より、当初予定だった3C-SiC(111)薄膜上Si(111)薄膜形成の最適化条件探索は行うことが出来なかったが、その代わり、Si(110)基板上3C-SiC(111)薄膜形成の最適化に関する重要な知見と処方箋を得ることが出来た。これは大きな成果である。一方、第二の当初目的である3C-SiCおよびSiエピ薄膜の結晶性評価に関しては、前者に関して詳細な断面TEMを行うことが出来、順調に推移している。よって昨年度の進捗はおおむね順調に推移したと判断される。回転エピ成長機構を解明する成長カイネティクス評価に関し、当初はSiC薄膜を成長させた後にこれを電子顕微鏡(TEM)評価することを予定していた。
心筋筋小胞体Triadinの機能解明とカルセクエストリン遺伝子の構造解析

心筋の筋小胞体に存在するCa制御蛋白質triadinの機能を解明するため、本研究を行った。triadinはryanodine receptorとcalsequestrinに結合する蛋白として知られているが、その詳しい機能は不明である。我々は、これまでratを用いた実験系を有しているため、まずrat triadin cDNAの抽出から始めた。核酸配列の決定されているrabbit RNAからRT-PCR法によりrabbit cardiac triadinを合成。これをprobeにしてrat heart cDNAlibraryをscreeningし、rat cardiac triadin cDNAを1つ抽出した。このcDNAは3^1末端が欠けていたため、3^1RACE法によりこの遺伝子の3^1側を抽出した。これらcDNAの核酸配列から3つのisoformが存在することが判った。一方、Northern blotでは心室に2つのbandを認めた。高血圧心肥大のモデルとしての圧負荷肥大心では、2つのbandのうち分子量の大きいisoformのみ、mRNAの発現が増加した。心臓内部位発現の検討では、心房において心室のtriadinと分子量の異なる3つのisoformが観察された。発生の経過中のisoform変化を観察したところ、心室はisoform発現に変化はなかった。胎児期の心房は心室と同じisoformを示したが、adult ratの心房は心房特有のisoformに変化していた。心房と心室の心筋細胞では筋小胞体の形態が異なると言われており、triadinのisoformの存在との関連が興味深い。次に、triadin機能の解明について、当初はantisenseを用いてその機能を検討する予定であったが、最近の遺伝子導入技術の進歩からadenovirusを用いた、negative domonant法を計画し、機能および分子構造との関連について実験を試行中である。triadinのgenomeはreverse PCRによりtriadin promoterの抽出を繰り返したが成功しなかった。現在、rat genomic libraryによりtraidinのgenomeを抽出している。(1)圧負荷肥大心におけるtriadinの変化:Rabbitにおける圧負荷肥大心モデル作成の技術的困難からRatを用いた肥大心作成モデルを使用することにした.Ratのtriadin核酸配列は知られていないのでrabbit triadinの3つのisoformに共通な部分の核酸配列からPCRによりrat triadin cDNAを合成した.次に、このcDNAをprobeとしてrat cDNA jibraryをscreeningしたところ、3個のpositive clonesを抽出した(clone1,clone2,clone3).1.1kbのclone1とclone2は核酸配列から同一cDNAであり、rabbit triadin cDNAやヒトtriadin cDNAと高い相同性を有することからrat triadin cDNAと断定した.clone3は2.7kbとclone1に比べ長く、3'側はrabbit tradinと高い相同性を有するが、5'側は長いuntranslatedregionが存在していた.以上より、ratにおいては少なくとも2つのisoformが存在していると考えられた.現在、full-length cDNAを得るために5'RACEおよび3'RACEを実施している.またclone1およびclone3をprobeとしてRNAの発現をNorthern blottingで検討したところ、clone3の発現は強いがcone1の発現はNorthern blottingでは検出できなかった.圧負荷肥大心モデルの検討前にisoformによる発現変化の検討が必要と考え現在検討中である.心筋の筋小胞体に存在するCa制御蛋白質triadinの機能を解明するため、本研究を行った。
赤血球型AMPデアミネース欠損の遺伝子解析

ヒトのAMPデアミネースには基本となる3種類のアイソザイムが存在し、遺伝子AMPD-1は筋型を、AMPD-2は肝型を、そして第3の遺伝子AMPD-3は赤血球型をコードしている。赤血球型酵素の完全欠損例は、我々が世界で最初に健常人中で発見しているが、この研究ではヒト赤血球型AMPデアミネース欠損の遺伝子変異を同定し、変異遺伝子のスクリーニングを行い、遺伝子変異の種類や変異遺伝子の頻度、分布などを明らかにすることを最終目標とし、またこれらの検討を簡便かつ迅速に行うため、AMPD-3の染色体遺伝子の構造の解明を並行してすすめ、以下の成果を得た。1)決定した赤血球型AMPデアミネースcDNAの全塩基配列を基に、完全欠損例2例のBリンパ芽球のmRNAを、RT-PCR法とそれに続くdirect sequencingにより分析し、主たる変異R573Cを同定した。2)日本人の遺伝子スクリーニングがら、同定した変異R573Cが全体の約75%を占めるが、残りの25%は他の変異によると考えられ、12例を分析し9種の変異(600delT,N310K,1320V,M324T,R331C,R402C,Q433X,W445R,P585L)の同定に成功した。3)酵素活性を発現する大腸菌ベクターに主たる変異R573Cを導入し、この変異が酵素欠損の原因であることを確認した。また600delT,M324T,R331Cについても同様の実験で酵素欠損の原因であることを確認した。4)PCR法を駆使し、ゲノムの全エクソン・イントロン接合部の塩基配列を明らかにし、ゲノムからのエクソン部を増幅できるようプライマーをデザインし、今後の変異の同定を容易にした。また、LA-PCR法によりゲノム遺伝子を6つのパートに分けて増幅可能とし、AMPD-3遺伝子のおおよその全長を明らかにし得た。この研究ではヒト赤血球型AMPデアミネース欠損の遺伝子変異を同定し、変異遺伝子のスクリーニングを世界的に行い、遺伝子変異の種類や変異遺伝子の頻度、分布などを明らかにすることを最終目標とし、またこれらの検討を簡便かつ迅速に行うため、AMPD-3の染色体遺伝子の構造の解明に努力しているが、今年度の研究において以下の成果を得た。1.ヒト脾cDNAライブラリーのスクリーニングおよび5′-RACE法により決定した赤血球型AMPデアミネースcDNAの全塩基配列を基に、完全欠損例2例のBリンパ芽球を用いて、RT-PCR法とそれに続くdirect sequencingniにより変異を同定に成功した。完全欠損2例とも翻訳領域の同じ位置(1717番目の塩基)にCからTへの単塩基置換がみつかり、単アミノ酸置換(アルギニン→システイン)が同定された。また、この変異の近辺のgenomic DNAの塩基配列の同定にも成功し、ゲノム遺伝子での分析、スクリーニングか可能となった。2.酵素活性を発現する大腸菌ベクターに同定した変異(C1717T)を導入すると、酵素タンパクの存在はウエスタンブロット法で確認されたが、酵素活性の発現は完全に消失し、この変異が酵素欠損の原因であることが示唆された。3.ゲノムDNAの分析から、完全欠損2例がこの変異のhomozygoteであり、部分欠損2例はheterozygotoであることが明らかになり、同定された変異が全体の変異の大部分を占めあることが予想された。予備スクリーニングから、同定した変異は全体の約75%を占めるが、他の変異遺伝子の存在も示唆された。