hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハイパースペクトルカメラによる遺伝子組み換え成功判別法の開発

本研究の目的は、ハイパースペクトルカメラを用いて遺伝子組換え体の選抜システムを開発することである。本研究では、薬剤耐性マーカー遺伝子が生態系に悪影響を与える問題に着目し、植物由来である硝酸還元酵素遺伝子(NR遺伝子)の使用を提案する。NR遺伝子をマーカー遺伝子として使用した場合、野生株よりも硝酸イオン濃度が低くなると予想される。この硝酸イオン濃度差を捉えるため、ハイパースペクトルカメラを用いたカルスの硝酸イオン濃度推定システムを開発し、遺伝子組換え成功株の判別精度を評価した。解析の結果、カルスの硝酸イオン濃度を推定する検量線の推定精度は、評価用データ相関係数0. 7363となった。パーティクルガンによる遺伝子組換え体の作出を試みたが、遺伝子組換えの条件が適切ではなかったためNR遺伝子導入株を作出することはできなかった。そこで、硝酸イオン濃度の低濃度サンプル(961. 0mg/L以下)と高濃度サンプル(961. 0mg/L以上)の判別精度を評価した結果、検量線によるイオン濃度推定値を用いた判別では85. 0%、PLS-DA(Partial Least Square-Discriminant Analysis)による判別では87. 4%の精度で判別することができた。★カルスの硝酸濃度分布画像合成アルゴリズム開発本年度は分光画像処理システムを構築し、カルスの硝酸濃度分布画像合成アルゴリズムを開発した。ハイパースペクトルカメラ(デルフトハイテック社製V10、波長範囲400nm1000nm、波長分解能9nm、水平画素数1280画素)を固定し、単焦点レンズ(COSMICAR製,焦点距離8mm,f値1.4)、光源装置(Newport Corporation製,Oriel Quartz Tungsten Halogen Research Sources model 66499, 250 W QTH lamp model 6334)、単軸ロボット(YAMAHA製,T-4)を組み合わせたハイパースペクトルイメージングシステムを構築した。神戸大学農学研究科植物栄養学研究室所有のホウレンソウカルスを使用した。カルスをシャーレ内の寒天培地(MS培地)上で培養して作出した。このときMS培地の硝酸濃度を変化させ、最終的に154個のカルスを用意した。カルスは未分化細胞の塊であり、培地から栄養素を吸収する。このとき細胞間隙に多量の養液を保持している。本研究では細胞中の硝酸濃度を測定する必要があるため吸引濾過により細胞間隙水をカルスから除去した。カルスをハイパースペクトルイメージングシステムによって撮影し、画像中カルス領域の平均スペクトルを取得した。撮影後サンプルを煮沸し抽出液からRQ-flex法によりカルス毎の硝酸イオン濃度実測値を取得した。解析の結果、409nmから994nmのスペクトルを使用した場合に検量線作成用データの実測値と推定値との寄与率が0.7499、評価用データの相関係数が0.6499となった。組換え成功判別のためには今年度得られた検量線では精度が低いため、計測法に改善が必要である。来年度に非破壊硝酸イオン濃度計測法を確立し、実際に組換えカルスを作出して開発手法の評価を行う。本研究で使用したホウレンソウ培養細胞は、ホウレンソウ(Spinacia oleracea L.,cv.Orai)の下胚軸から誘導された野生株の培養細胞である。サンプルは、24時間連続照射で温度は25°C、光量子束密度はおよそ220μmoI m^<-2>s^<-1>の条件に保ったグロースチャンバー(グロースチャンバーMLR-350、Sanyo株式会社)内で培養した。培養にはMS (Murashige-Skoog)寒天培地を用いた。本研究で使用したハイパースペクトルカメラはV10(デルフトハイテック社製、波長分解能9nm、測定波長域は400nmから1000nm、ダイナミックレンジ8bit)である。レンズは単焦点レンズ(COSMICAR製、焦点距離8mm、f値1.4)を使用した。ハイパースペクトルイメージングシステムは、ハイパースペクトルカメラと光源装置(Newport Stratford社製、Oriel quartz tungsten halogen research sources 66499、250W QTH lamp 6334)、単軸ロボット(T4、ヤマハ発動機社製)で構成した。

硝酸イオン濃度を10段階に設定(496mg/Lから4960mg/L)したMS培地を用意し、それぞれの培地に継代してから、2週間から3週間培養したカルスをサンプルとして用いた。培地から取り出したサンプルは黒色ろ紙の上に置き、5秒間の吸引ろ過、10秒間の吸引ろ過をしながらの洗浄処理、最後に20秒間の吸引ろ過を施してから、ハイパースペクトルカメラでの撮影を行った。撮影後に硝酸イオン濃度実測値をRQ-flex法を用いて測定した。得られた吸光スペクトルと硝酸イオン濃度から硝酸イオン濃度推定の検量線を作成したサンプルの濃度レンジ、ハイパースペクトル画像に対する画像処理方法、スペクトルの前処理などを検討した結果、取得したハイパースペクトル画像にビニング処理を施して取得された526nmから877nmの波長の吸光スペクトルに対し、前処理としてMSCを適用し、PLS (Partial least squares)法によって導出された検量線の硝酸イオン濃度推定精度が最高(評価用データ相関係数が0.7363)となった。NR遺伝子の導入には、パーティクルガン(Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System (Bio Rad))を用いた。遺伝子組換えの条件が適切ではなかったためNR遺伝子導入株を作出することはできなかった。そこで、硝酸イオン濃度の低濃度サンプル(961.0mg/L以下)と高濃度サンプル(961.0mg/L以上)の判別精度を評価した結果、検量線によるイオン濃度推定値を用いた判別では85.0%、PLS-DA (Partial Least Square-Discriminant Analysis)による判別では87.4%の精度で判別することができた。野生株の硝酸イオン濃度が961.0mg/L以上となる培地上においてNR遺伝子導入株の硝酸イオン濃度が961.0mg/L以下であれば、本研究で開発したシステムを用いることで、約80%の精度で遺伝子組換え体を判別することが出来る。
フォトトロピンを介した核光定位運動の生理学的意義及び三次元ライブセルイメージング

種子植物であるシロイヌナズナの葉の細胞核は青色光に依存した定位運動を示す(Iwabuchi et al., 2007).しかし,この運動の仕組みは未解明である.本年度は,核光定運動の仕組みについて研究を行った.細胞骨格阻害剤を用いた実験から,核光定運動はアクチン細胞骨格に依存することが明らかになった.間接蛍光抗体法によりアクチンを可視化したところ,細胞の長軸方向に沿って配向した太いアクチン繊維と核とがインタラクトしており,このアクチン繊維の構築が青色光照射前後で変わることがわかった.核光定位運動は青色光受容体フォトトロピン2により制御され,この受容体が欠損した変異体では青色光に依存したアクチン繊維の構築変化が見られないことから,核光定位運動はフォトトロピン2に依存したアクチン繊維の構築変化を介して起こると考察した(Iwabuchi et al., 2010).これまでの研究においては,核とアクチンを可視化するために細胞を固定する必要があった.しかしながら,この手法では生きた細胞の中で核やアクチンがどのような挙動を示すのか明らかにすることができない.そこで,核の運動をリアルタイムで観察するための実験系の確立を試みた.核を緑色蛍光タンパク質GFPで可視化した形質転換体(Histone2B-GFP)とアクチン繊維を赤色蛍光タンパク質tdTomatoで可視化した形質転換体(tdTomato-ABD2)を入手し,これらを掛け合わせることにより,核とアクチン繊維を同時可視化したシロイヌナズナ形質転換体を作製した.この形質転換体においても核光定位運動が正常に誘導されることを確認した.この形質転換体を用いることにより,核光定位運動におけるアクチン繊維の役割が明らかになると期待している.高等植物であるシロイヌナズナの葉では、細胞核が青色光に依存して細胞内で位置を変えるという現象が見られる。これは核光定位運動と呼ばれる。私はこの運動を発見し、関与する光受容体は青色光受容体フォトトロピン2であること、運動の制御にアクチン細胞骨格が関与することなどを明らかにした。しかし、核光定位運動の生理学的意義は未解明である。核光定位運動は強い青色光によって特異的に誘導されること、核はまるで光を避けるかのように入射光に対して平行な面に定位することから、この運動は過剰光が引き起すDNA損傷に対する防御応答の一つと考えられる。この可能性を検証するため、葉に強い青色光を照射した時に核のDNAが傷つくか調べた。DNA損傷をリアルタイム定量PCR法により定量化したところ、青色光照射時間に依存してDNAに傷ができることが明らかになった。紫外線照射によりDNAが損傷するということは知られているが、可視光である青色光によりDNAが傷つくということは植物においては知られていなかった。DNA上に傷ができると複製や転写が阻害され、結果的に細胞分裂の停止やmRNA量の低下などが起きる。核は青色光によるDNA損傷を回避する為に細胞内で存在場所を変えるのであれば、この運動の重要性は言うまでもないだろう。今後は、核が青色光に応答しない変異体を用いて解析を行い、核の位置とDNA損傷との関係を明らかにする。種子植物であるシロイヌナズナの葉の細胞核は青色光に依存した定位運動を示す(Iwabuchi et al., 2007).しかし,この運動の仕組みは未解明である.本年度は,核光定運動の仕組みについて研究を行った.細胞骨格阻害剤を用いた実験から,核光定運動はアクチン細胞骨格に依存することが明らかになった.間接蛍光抗体法によりアクチンを可視化したところ,細胞の長軸方向に沿って配向した太いアクチン繊維と核とがインタラクトしており,このアクチン繊維の構築が青色光照射前後で変わることがわかった.核光定位運動は青色光受容体フォトトロピン2により制御され,この受容体が欠損した変異体では青色光に依存したアクチン繊維の構築変化が見られないことから,核光定位運動はフォトトロピン2に依存したアクチン繊維の構築変化を介して起こると考察した(Iwabuchi et al., 2010).これまでの研究においては,核とアクチンを可視化するために細胞を固定する必要があった.しかしながら,この手法では生きた細胞の中で核やアクチンがどのような挙動を示すのか明らかにすることができない.そこで,核の運動をリアルタイムで観察するための実験系の確立を試みた.核を緑色蛍光タンパク質GFPで可視化した形質転換体(Histone2B-GFP)とアクチン繊維を赤色蛍光タンパク質tdTomatoで可視化した形質転換体(tdTomato-ABD2)を入手し,これらを掛け合わせることにより,核とアクチン繊維を同時可視化したシロイヌナズナ形質転換体を作製した.この形質転換体においても核光定位運動が正常に誘導されることを確認した.この形質転換体を用いることにより,核光定位運動におけるアクチン繊維の役割が明らかになると期待している.
レーザを利用した同位体レベルでの単一原子分析装置の開発

レーザアブレーションにより発生するCaイオンを線形四重極型のイオントラップにより捕獲し,基底状態4^2S_<1/2>から励起状態4^2P_<1/2>への遷移に共鴫する波長397mmとリポンプのための866nmのレーザ光を照射することによりレーザ冷却を行った.さらに3波長(397,866,850nm)のレーザ光を用いて量子跳躍実験を行うことで,蛍光を通して単一カルシウムイオンの観測に成功した。これを利用して捕獲イオン数を明らかにするとともに,真空度とバックグランドガスとの衝突によるイオン捕獲寿命との関係を明らかにした.さらにトラップ電極に印加するrf電圧振幅およびDC電圧を調整することにより任意の同位体のみをトラップし,それを光学的な手法により確認することに成功した.この結果から,トラップポテンシャルを用いて質量分解を行い,さらにレーザにより元素/同位体分解が可能であることが示された.これにより質量分析では避けることができない同重体干渉を,レーザ冷却法と組み合わせることで,単一イオンレベルで解決できることが実験的に明らかにするごとができた.同位体レベルでの単一イオン計測を達成することができ,基礎技術の確立ができたと言える.また必要となる要素技術も明らかとなった.さらに同位体比の測定に必要となる知見も得られつつあることから,我々の提案しているイオントラップ・レーザ冷却法を用いた極微量同位体分析の実現可能性を大きく押し広げるものである.レーザアブレーションにより発生するCaイオンを線形四重極型のイオントラップにより捕獲し,基底状態4^2S_<1/2>から励起状態4^2P_<1/2>への遷移に共鴫する波長397mmとリポンプのための866nmのレーザ光を照射することによりレーザ冷却を行った.さらに3波長(397,866,850nm)のレーザ光を用いて量子跳躍実験を行うことで,蛍光を通して単一カルシウムイオンの観測に成功した。これを利用して捕獲イオン数を明らかにするとともに,真空度とバックグランドガスとの衝突によるイオン捕獲寿命との関係を明らかにした.さらにトラップ電極に印加するrf電圧振幅およびDC電圧を調整することにより任意の同位体のみをトラップし,それを光学的な手法により確認することに成功した.この結果から,トラップポテンシャルを用いて質量分解を行い,さらにレーザにより元素/同位体分解が可能であることが示された.これにより質量分析では避けることができない同重体干渉を,レーザ冷却法と組み合わせることで,単一イオンレベルで解決できることが実験的に明らかにするごとができた.同位体レベルでの単一イオン計測を達成することができ,基礎技術の確立ができたと言える.また必要となる要素技術も明らかとなった.さらに同位体比の測定に必要となる知見も得られつつあることから,我々の提案しているイオントラップ・レーザ冷却法を用いた極微量同位体分析の実現可能性を大きく押し広げるものである.アブレーションレーザにより発生するCaイオンを線形四重極型のイオントラップにより捕獲した.電極パラメータに対するトラップ効率をチャンネルトロンにより測定しq=0.5付近で最大になることを確認するとともに,数値シミュレーションを行いその結果と比較を行った.さらにトラップされたイオンに基底状態4 ^2S_<1/2>から励起状態4 ^2P_<1/2>への遷移に共鳴する波長397nmのレーザ光を照射することによりレーザ冷却をおこなった.このレーザ光は,日亜化学製の半導体レーザと回折格子による共振器を組み合わせた自作レーザシステムより得た.またCaイオンの電子配置において励起状態は準安定状態3^2D_<3/2>へ緩和することから,866nmの半導体レーザにより励起状態へ再励起している.この2波長をトラップされたイオンに照射することによりレーザ冷却を行った.その結果,397nmレーザ光周波数に対する蛍光強度スペクトルが非対称になることを確認した.これは共鳴波長の長波長側から冷却が進み,蛍光量が増大するとともにイオンが結晶化している様子を示している.さらに共鳴波長を通過するとイオンが加熱され急激に蛍光量が減少している.このスペクトルより,イオンが31mKまで冷却されていることがわかった.さらに,イオンが結晶化することから,ICCDにより画像を取得することでイオン数を計数することも試みた.これは少数イオンの計数を行うためである.その結果,ポテンシャルやレーザは長によるイオン雲の形状の変化を観測することに成功した.3波長(397,866,850nm)のレーザ光を用いて量子跳躍実験を行い,単一カルシウムイオンの観測に成功した.具体的には以下の通りである.前年度の実験によりレーザアブレーションにより発生したカルシウムイオンを四重極電極によりトラップし,2波長のレーザ光(397,866nm)によりレーザ冷却の確認(光電子増倍管による蛍光測定)および冷却されたイオン雲の可視化(ICCDによる撮影)が可能になっている.単一イオン観測に向けて,まずアブレーションレーザ強度および初期トラップ電圧の最適化を行い,捕獲イオン数との関係を実験的に調べた.これにより少数イオンの捕獲が可能になった.また冷却レーザ光の波長安定化の精度を上げることにより高効率のレーザ冷却が可能となった.

さらにイオンからの蛍光を光電子増倍管により観測するための光学系を再度精査しバックグランドを取り除くなど高度化を行った.以上により少数イオンの高効率検出システムを確立することができた.さらに観測されているイオン数を確定するために量子跳躍実験を行った.これはトラップされたイオンをレーザ光(850nm)により準安定状態に遷移させることで,蛍光(397nm)のオン・オフを行うものである.この実験によりトラップされているイオンが,独立に蛍光をオン・オフすることから,トラップイオン数を蛍光により確認することができる.これを利用して捕獲イオン数を明らかにするとともに,真空度とバックグランドガスとの衝突によるイオン捕獲寿命との関係を明らかにした.トラップ電極に印加するrf電圧振幅およびDC電圧を調整することにより任意の同位体のみをトラップし,それを光学的な手法により確認することに成功した,具体的には以下の通りである。レーザアブレーションにより発生させたカルシウムイオンを四重極型トラップにより,直接トラップする。この際,複数のカルシウム同位体がトラップされることになるが,電極に印加するrf電場の電圧を増加させて行くにつれて,軽いカルシウム同位体から順に排除できることを実験的に確認した。またDC電圧を印加していくにつれて,rf電圧に応じて軽いあるいは重い同位体から順に排除できること実験的に明らかにした。これらの実験は,イオンをレーザ冷却することで同位体シフトをレーザで分解することが可能となっている。そこでトラップイオンの同位体判別はレーザ冷却後にレーザ周波数を着目同位体の共鳴周波数に合わせた際のレーザ誘起蛍光により確認した。これらを組み合わせることで任意の単一同位体のみをトラップすることが可能になる。この結果を,SIMIONを用いた数値計算とも比較した。この数値計算は単一イオンに対する数値計算がメインであるが,同様の傾向を示しており実験結果が少量イオンを対象にしていることから考慮して,合理的な結果を得ることができた。本研究により,単一イオンの検出および同位体イオン操作が可能となり,極微量同位体分析を行うための基本的な操作法を確立したと言える。
コホモトピー群の幾何学的性質をもつ元の研究

Kahn-Priddy写像【λ_(2n)】:【L(^(2n)_P)】→【S^0】のホモトピー類を同じ記号【λ_(2n)】で表す。【λ'_(2n)】=【λ'_(2n)】【L^(2n-1)】とする。交付申請書でも述べたように、これらの元の位数を決定できた。すなわち、n=s(p-1)+r,0≦r<p-1のとき#【λ_(2n)】=【P^s】で、#【λ'_(2n)】=【P^s】はr>0のとき成りたち、r=0のときは#【λ'_(2n)】=【P^(s-1)】又は【P^s】となる。この「または」は結局【P^s】となるが、この証明が一番苦労した点である。P=2のときは近く出版される論文"Acharacterization of the Kahn-Priddy map"で述べた結果を一層精密にできた。以上のことをまとめて、ある数学雑誌に投稿した。まだ受理されるかどうかは未定だが、近いうちに受理されることを確信している。この論文が受理され次第、これに関連するもう一つの論文の投稿も計画している。研究分担者の研究実績について述べると、西川はHopf代数の構造論的側面の研究で、阿部は、微分位相幾何学的側面の研究で、また、二宮は、群の表現論的側面からの研究で、それぞれ成果をあげることができた。可知は研究代表者と専門が近い関係から、日常的に極めて有意義な討論の相手となった。
ネットワークの耐故障性に関するグラフ構造的性質の解明と改善アルゴリズムの設計

(1) 2連結グラフのデカルト積には2本の完全独立全域木が存在することを証明した.また,反復ラインダイグラフの(h, k)-支配数を決定した.(2)耐故障ゴシップグラフの最小サイズの上下界を改善した.(3)木のL(2, 1)-ラベリング数を計算する線形時間アルゴリズムを設計した.また,木の(p, q)-全ラベリング数のタイトな上下界,最大次数が3と4のときの外平面グラフの(2, 1)-全ラベリング数のタイトな上界を与えた.(4)極大外平面グラフのキューナンバーを計算する線形時間アルゴリズムを設計した.(1) 2連結グラフのデカルト積には2本の完全独立全域木が存在することを証明した.また,反復ラインダイグラフの(h, k)-支配数を決定した.(2)耐故障ゴシップグラフの最小サイズの上下界を改善した.(3)木のL(2, 1)-ラベリング数を計算する線形時間アルゴリズムを設計した.また,木の(p, q)-全ラベリング数のタイトな上下界,最大次数が3と4のときの外平面グラフの(2, 1)-全ラベリング数のタイトな上界を与えた.(4)極大外平面グラフのキューナンバーを計算する線形時間アルゴリズムを設計した.●完全独立全域木はネットワークの耐故障性を考慮した通信問題に応用をもつことが知られている.本研究では,2次元トーラスネットワークに2本の完全独立全域木が存在することを構成的に証明した.さらにこの結果をグラフのデカルト積の観点かち一般化することを試み,単サイクルグラフとサイクルのデカルト積における2本の完全独立全域木の存在,任意の2連結グラフのデカルト積における2本の完全独立全域木の存在をそれぞれ構成的に証明することができた.今後は次元が3以上の高次元のトーラスネットワークにおける3本以上の完全独立全域木の存在性および構成法について考察を進める予定である.●完全独立全域木は,互いに共通要素をもたない複数の連結支配集合と見做すことができ,連結支配集合という概念と関連している.連結支配集合は耐故障性を考慮したネットワーク上の資源配置問題や無線通信ネットワークめバックボーンに応用をもつことが知られている.連結支配集合をより一般化したものとしてダイグラフにおける連結k-組双支配集合という概念があり,これまでにde Bruijnダイグラフ,Kautzダイグラフに関して調べられていた.de Bruijnダイグラフ,Kautzダイグラフは反復ラインダイグラフの特殊なクラスである.本研究では,反復ラインダイグラフにおける高連結k-組双支配集合の最小濃度を決定し,既知のde Bruijn及びKautzダイグラフの結果を一般化することができた.●L(2, 1)-ラベリングでは,外平面グラフの部分クラスである木に関して,これまでに知られていたL(2, 1)-ラベリングナンバーを求めるアルゴリズムの時間計算量をさらに改善し,線形時間で求めることができることを示した.・完全独立全域木はネットワークの耐故障性を考慮した通信問題に応用をもつことが知られており,前年度に任意の2運結グラフのデカル積における2本の完全独立全域木の存在を構成的に証明した。本年度は,あるグラフGにk本の完全独立全域木が存在するとき,どのようなグラフと直積をと,その直積グラフにk+1本の完全独立全域木を構成できるかについて考察した.そしで,自由頂点という定義を導入し,自由頂点に関するある条件を満たすならば,あるcirculant graphとの直積をとることにより,k+1本の完全独立全域木を構成できることが分かった.特にこの結果から,5次元以上の3進超立方体における3本の完全独立全域木が存在性が系として得られる・辺素なラベル増加パスは耐故障性を考慮したgossiping問題に応用をもつことが知られている.本年度は,Haddad,Rovy,and Schafferの辺素なラベル増加パスの構成法をより精密に解析することにより,彼らの上界結果(頂点数が2のべき乗のとき及び一般の場合の両方)を改善することができた.また,recursive circulantと呼ばれるグラフに類似したグラフの構造的性質を調べることにより,Hou and Shigenoの上界結果も改善することができた.さらに,Berman and Paulの情報散布数の結果を利用することにより,Hou and Shigenoの下界を頂点数nが5以上のときに,Beman and Paulの下界をk(故障回数の上限)がn/2よりも大きいときに,それぞれ改善する下界を示すことができた.・L(p,q)-ラベリングは周波数割り当て問題に応用をもっており,(p,q)-全ラベリングはL(p,q)-ラベリングに類似した概念である.本研究では,最大次数Δが3と4のときも外平面グラフの(2,1)-全ラベリングナンバーが高々Δ+2であることを示した.また,木の(p,q)-全ラベリングナンバーのタイトな上下界を与えた.グラフのキューレイアウトは頂点の順序付けと辺のキューへの割り当て,ただし同一キューに割り当てられた辺は入れ子にならない,により定義され,グラフGのキューレイアウトに必要なキューの最小数をGのキューナンバーという.グラフのキューレイアウトは耐故障性を考慮した計算やグラフの3次元描画に応用をもつことが知られており,これまでに様々なグラフのクラスに対してキューナンバーの上界が調べられている.

特に,平面グラフのキューナンバーの上界が定数で抑えられるかどうかはキューレイアウトに関する最も有名な未解決問題であり,2010年のFOCS(理論計算機科学分野における最も権威のある国際会議の一つ)で0(log^4 n)の上界の結果が報告されている.また,アルゴリズム的な観点からは,キューナンバーが1のグラフの認識問題はNP完全であること,平面グラフのキューナンバーを計算する問題はNP困難であることが知られている.本研究では,極大外平面グラフという,平面グラフの部分クラスに限定した場合には,キューナンバーの計算が線形時間で可能であることを示した.すなわち,極大外平面グラフのキューナンバーを計算する線形時間アルゴリズムを設計した.これまでにグラフクラスに対するキューナンバーを計算する多項式時間アルゴリズムは著者の知る限り,示されておらず,極大外平面グラフという制約の強いクラスではあるが,線形時間でキューナンバーが計算できるということを示したことは意義のあることと考えられる.また,本研究で設計した線形時間アルゴリズムの中心となる部分は,有限オートマトンで記述でき非常にシンプルである.
活性酸素消去能に優れる白金ナノ粒子のＤＤＳ開発と転移性肝癌治療への応用

本研究では、転移性肝癌の進展及び病態に活性酸素種が深く関与している点に着目し、触媒反応を利用して様々な種類の活性酸素種を持続的に消去可能な白金ナノ粒子を用いることで転移性肝癌が効率よく抑制可能であることを示した。すなわち、活性酸素消去能に優れる白金ナノ粒子を開発することに成功し、マウスにおけるその肝臓選択的な体内動態、肝転移抑制効果ならびに安全性を明らかにした。また、白金ナノ粒子による肝転移抑制効果には活性酸素消去による接着因子の抑制が一部関与している可能性が示された。以上のように転移性肝癌治療における白金ナノ粒子の有用性を明らかにした。本研究は、癌転移の病態の進展に活性酸素種が関与している点に着目し、活性酸素消去能と体内動態特性に優れた白金ナノ粒子を利用した転移性肝癌治療システムを開発することにより肝転移治療の改善と癌患者のコンプライアンス・QOLの向上を目指すものである。初年度の平成24年度では、物性が異なる種々の白金ナノ粒子を作製し、それらの優れた活性酸素消去能及びマウスにおける肝臓非実質細胞(クッパー細胞、肝臓血管内皮細胞)選択的な体内動態特性を明らかにした。平成25年度では、活性酸素消去能に優れる白金ナノ粒子の肝臓選択的な体内動態特性を活かして肝転移モデルマウスに対する治療効果について検討した。肝転移モデルマウスはホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を安定発現させたColon26/Luc細胞をマウスの門脈内に接種することにより作製した。Colon26/Luc細胞を接種した当日及び3日目において白金ナノ粒子を静脈内投与しその後の癌増殖をin vivoイメージングおよびルミノメーターを用いて評価したところ、肝臓における癌増殖は白金ナノ粒子の静脈内投与により顕著に抑制されることが示された。肝転移をはじめとする癌転移ではその病態に活性酸素が関与することが報告されている。したがって、白金ナノ粒子による肝転移抑制機構には、活性酸素消去能に優れる白金ナノ粒子が肝臓クッパー細胞などから産生される活性酸素を効率よく消去することによる癌細胞の接着および浸潤の抑制が関与しているものと推察される。以上、活性酸素消去能に優れる白金ナノ粒子による肝転移治療の可能性を示した。平成24年度では、物性が異なる種々の白金ナノ粒子を作製し、それらの活性酸素消去効果及びマウスにおける体内動態特性を評価した。すなわち、白金ナノ粒子は塩化白金イオンを還元剤と反応させることにより作製した。反応比率を調整することにより粒子径の大きい白金ナノ粒子(large Pt-NP)、粒子径の小さい白金ナノ粒子(small Pt-NP)の2種類のPt-NPを作製した。作製したPt-NPはいずれも活性酸素種である過酸化水素、スーパーオキサイドアニオン及びヒドロキシラジカルに対し、顕著な消去効果を示すことが明らかとなった。マウス静脈内投与後の各種Pt-NPの体内動態をICP-MSを用いて評価したところ、Pt-NPはいずれも急速に血中から消失し肝臓中に移行することが明らかとなった。特に粒子径の大きいlarge Pt-NPは効率よく肝臓に取り込まれた。Pt-NP静脈内投与後の肝臓を摘出し、肝臓内分布を詳細に評価したところ、Pt-NPはクッパー細胞や血管内皮細胞などの肝臓非実質細胞に主に分布していることが示された。肝転移の病態の進展にはクッパー細胞等からの活性酸素種の産生が寄与していることから、Pt-NPは肝転移治療に有利な体内動態特性を示すことが明らかとなった。以上、活性酸素能と体内動態特性に優れた白金ナノ粒子を作製することに成功した。本研究は、癌転移の病態の進展に活性酸素種が関与している点に着目し、活性酸素消去能と体内動態特性に優れた白金ナノ粒子を利用した転移性肝癌治療システムを開発することを目的とする。平成25年度までに、優れた活性酸素消去能を有する白金ナノ粒子の開発に成功し、その肝臓選択的な体内動態特性ならびに肝転移モデルマウスにおける治療効果について明らかにした。平成26年度では、白金ナノ粒子による肝転移抑制機構を明らかにすることを目的として、マウス大動脈血管内皮細胞において過酸化水素により誘導される接着分子(ICAM及びVCAM)の発現に及ぼす白金ナノ粒子の影響をリアルタイムPCR法により評価した。その結果、過酸化水素により誘導される接着分子の発現が白金ナノ粒子の添加により抑制されたこと、マウスを用いたin vivo実験においても同様の結果が得られたことから、白金ナノ粒子による肝転移抑制機構には活性酸素種消去を介した接着分子の抑制が寄与している可能性が示された。以上のことから、肝転移治療における白金ナノ粒子の有用性が実証された。

そこで次に白金ナノ粒子の腎臓における安全性を腎臓組織切片を観察することで評価した。白金製剤であるシスプラチンを対照として投与した群では、腎臓において炎症性細胞の浸潤が認められ、腎障害が惹起されていることが確認された。一方、白金ナノ粒子投与群では、ほぼ正常な腎細胞が観察された。さらに、白金ナノ粒子投与時の全身毒性を評価する目的で、経日的に体重を測定したところ、シスプラチン投与群では体重減少が確認された。一方、白金ナノ粒子投与群では、体重増加が認められ、シスプラチン投与時のような食欲不振・悪心・嘔吐等の胃腸障害による全身毒性を惹起しにくいことが示された。以上より白金ナノ粒子はシスプラチンと比較して安全性の高い製剤であると考えられた。医歯薬学平成25年度では、活性酸素消去能に優れ肝指向性を示す白金ナノ粒子による肝転移抑制の可能性を明らかにすることを目標としていた。これまでに、作製した白金ナノ粒子を静脈内投与することによりマウスの肝転移が顕著に抑制されることを明らかにしており、おおむね順調に進展していると考えている。平成24年度では、物性が異なる種々の白金ナノ粒子を作製し、それらの活性酸素消去効果及びマウスにおける体内動態特性に応じて白金ナノ粒子の物性を最適化することを目標としていた。これまでに、作製した白金ナノ粒子が各種活性酸素種を効率よく消去すること、マウス静脈内投与後の体内動態評価において標的部位である肝臓に急速に移行することを明らかにしており、おおむね順調に進展していると考えている。平成25年度までに、活性酸素消去能および肝臓指向性に優れた白金ナノ粒子を作製することに成功し、肝転移モデルマウスにおける転移抑制効果を明らかにした。そこで平成26年度では、白金ナノ粒子による肝転移抑制機構及び安全性について評価する。すなわち、癌の転移では、活性酸素により発現が亢進するICAM, VCAMなどの接着因子が癌の接着に関与していることが報告されていることから、白金ナノ粒子のこれら接着因子や他の癌転移関連因子の発現への影響についてリアルタイムPCRなどを用いて評価する。安全性評価においては、白金ナノ粒子の肝臓移行後の排泄過程や連続投与後の毒性を体重変化、内臓機能の観点から評価する。以上のように白金ナノ粒子による治療効果、治療機構及び安全性を系統的に評価することで、有効性と安全性のバランスに優れた白金ナノ粒子による肝転移治療法を構築したいと考えている。平成24年度では、活性酸素消去能および肝臓指向性に優れた白金ナノ粒子を作製することに成功した。そこで平成25年度以降では、白金ナノ粒子の転移性肝癌における有効性と安全性を評価する。すなわち、肝転移抑制効果は遺伝子導入で細胞標識した癌細胞を用いてin vivo imagingにより評価を行う。具体的には、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドDNAを導入することによりルシフェラーゼ安定発現細胞株を作製し、その細胞をマウスに門脈内投与することにより肝転移モデルマウスを作製する。当該マウスを用いて白金ナノ粒子静脈内投与後の肝転移抑制効果を評価する。
自閉症者における情報源記憶と伝達先記憶についての研究

本研究では、まず実験に用いる刺激の作成・標準化を行った。さまざまなトリビアを収集し、複数の項目について評定を行った。評定値をもとに、情報源記憶と伝達先記憶の研究に利用可能な刺激リストを作成した。これら刺激リストと有名人の顔写真を組み合わせて刺激とした。健常者を対象として予備実験を行ったところ、情報源記憶と伝達先記憶の成績評価が可能であることが確認された。その後、自閉症者を対象とした研究を開始したが、期間中に十分な数のデータ取得ができなかったため、今後追加のデータ取得を行い、自閉症者の社会性問題にアプローチしたい。今年度の研究では、昨年度までに作成した情報源記憶と伝達先記憶を評価する認知課題を自閉症者を対象として施行した。結果の全般的な傾向としては、当初の仮説を支持する形で、自閉症者における記憶成績の低下が認められた。特に、記憶の再認判断において確信度の判断も同時に行う場合に、実際の記憶成績と確信度が乖離するという特徴的な所見が認められた。この結果は、伝達先記憶や情報源記憶といった対人場面での記憶メカニズムに特異的に生じる現象なのか、あるいは想起が困難な情報全般に対して生じる現象なのか、いくつかの解釈の可能性が想定できる。この問題については、今後の研究において焦点をあてていきたい。なお今年度の研究期間内には、明確な結論を出すための十分なデータを取得することはできなかったる。今後の研究において追加のデータ取得を行い、さらに詳細な解析を進めることで、自閉症者の社会性の障害にアプローチしてきたいと考えている。本年度の研究では、まず実験に用いる刺激の作成・標準化を行った。刺激としてトリビアを収集し、刺激の性質に関する複数の項目について評定を行った。評定値をもとに、情報源記憶と伝達先記憶の実験に利用可能な複数の刺激リストを作成した。これらの刺激リストと、実験参加者にとって未知の男性顔写真・女性顔写真を用いて予備実験を施行したところ、床効果が確認された。未知相貌を用いた課題の難易度が高いと思われたため、実験参加者にとって既知の顔である有名人の顔写真に刺激を変更することとした。有名人の顔写真を収集し、トリビア同様に評定を行い、それぞれの実験課題に利用可能な複数の刺激リストを作成した。上記の有名人の顔写真を用いて、新たに予備実験を行ったところ、自閉症者を対象として情報源記憶と伝達先記憶のパフォーマンスの評価が十分に可能であることが確認された。また、健常対照群における課題成績が、伝達先記憶の先行研究であるGopieら(2009, Psychological Science)のものと同等の成績であることも確認されたため、この課題を本実験で利用する課題とした。現在までに、本実験における健常対照群におけるデータ取得をほぼ終えている。データの詳細については、これから解析を進める予定である。また、自閉症者のデータについても、リクルート手続きを進めており、間もなくデータ取得を開始する準備が整いつつある。本年度の研究では、予備実験の成績をもとに課題条件に若干の修正を加える必要が生じたが、実験に用いる全ての刺激について、評定によって統制された刺激リストの作成が完了した。その後の予備実験の結果も本実験に速やかに移行できる結果が得られたため、実験課題の作成は既に完成している。健常対照群のデータもほぼ取得が終わり、自閉症者を対象としたデータ取得も準備が進んでいるため、今後はデータの取得と解析へと進められる状態にある。当初の予定通り、順調に研究が進展していると言える。平成25年度は、まず自閉症者を対象としたデータの収集を進める。自閉症者における情報源記憶と伝達先記憶に関する実験を施行し、健常対照群と比べ、記憶成績に有意な差が認められるかどうかを調べることが中心となる。研究全体で必要なデータ取得は、可能な限り早めに、今年度の前半を目途に完了する。データ取得後は速やかに解析を進め、自閉症者における情報源記憶と伝達先記憶の障害の有無と、障害があった場合にはその特徴を明らかにする。得られた知見については、学会発表や論文への執筆作業を進める。平成25年度はデータ解析のためのパソコンや、統計検定等に必要となるソフトウェアの購入のために研究費を使用する。また、研究成果についての学会発表、及び情報収集のための旅費として使用する。また、英語論文執筆の際の英文校正費用、論文の投稿・出版にかかわる費用に対して、研究費を使用する。
アシル-ロジウム錯体の反応挙動の解明及びそれを鍵中間体とする新規触媒反応の開拓

昨年度に引き続き、Rh錯体触媒を用いて酸塩化物とアルキンをCO加圧下で反応させ、CO挿入を伴う付加反応によって(Z)-4-クロロ-3-ブテン-1-アリール-1,2-ジオンを得る反応について検討した。電子的性質の異なる酸塩化物を用いてそれぞれ反応条件を検討したが、目的化合物の収率は向上せず最大でも20%程度であった。しかし、これらの結果は、アシルロジウム錯体に対するCO挿入によってα-ケトアシルロジウム錯体が生成していることを示唆している。実際、RhCl_2(CO)(PMe_3)_2(COC_6H_4Cl)を加圧COで処理すると、僅かながらα-ケトアシル錯体が生成することを見出した。その際、不均化によって生成したと考えられるベンジルやベンゾフェノン誘導体などの副生を確認している。一方、クロロアセチルクロリドの末端アルキンへの付加反応について継続して検討中、トリクロロアセチルクロリドを用いるとCl-C(O)結合の付加反応ではなく、末端アルキンの塩素付加2量化反応が進行し、(Z,Z)-1,4-ジクロロ-1,3-ブタジエン誘導体が高選択的に得られる事を偶然見出した。トリブロモアセチルブロミドの反応でも対応するジブロモブタジエンが中程度の収率で得られた。Pd錯体触媒と銅塩を用いる不均一系での反応が既に知られているが、今回見出した手法は均一系触媒反応として始めての例である。反応機構について検討する為、RhCl(CO)L_2をCl_3CCOClで処理したところ、trans-RhCl_3(CO)L_2がほぼ定量的に得られ、本錯体とアルキンとの当量反応は目的化合物を与えた。従ってtrans-RhCl_3(CO)L_2が鍵中間体であると考えられるが、現時点では詳細なメカニズムについては不明である。PhCOCOClをロジウム錯体に対して酸化的付加させる手法でα-ケトアシルロジウム錯体PhCOCO-Rhを合成した。本錯体は溶液状態で60°C程度まで安定であるものの、一つ目のカルボニル基が放出されPhCO-Rh錯体となるともはや電子吸引性置換基を有さないため更なる脱カルボニル化が進行した。類似のα-ケトアシルパラジウム錯体では極めて容易に脱カルボニル化が進行する報告があるため、この対比は興味深いものである。また、この錯体種を鍵中間体として、末端アルキンへのダブルカルボニル保持付加反応への展開を試みた。種々のRh錯体や配位子等の検討、あるいは一酸化炭素雰囲気下での反応を試みたが、残念なことに脱カルボニル化が進行し、ダブルカルボニル保持生成物を痕跡量しか得ることができなかった。一方、類似の観点から、クロロアセチルクロリドの各種末端アルキンへの付加反応についても検討したところ、カルボニル保持生成物である1,4-ジクロロ-3-ブテン-2-オン誘導体が良好な収率で得られた。反応生成物は分子内の2つの塩素原子をそれぞれ独立して官能基変換することが可能であることが知られているため、合成中間体として有用である。パラジウムとの対比をより明確にするため、パラジウム錯体触媒を用いた酸塩化物とジシランの反応を検討した。その結果、C_6F_5COClとSi_2Me_6との反応では脱カルボニル化を伴ったC_6F_5SiMe_3がほぼ定量的に得られた。つまり脱カルボニル化が電子吸引性置換基によって促進され、アシルロジウムからのそれと傾向が逆転した。同様にスルホニルパラジウム錯体からの脱スルホニル化もアシルパラジウムからの脱カルボニル化と同じ傾向を示した。得られた結果は今後合成反応を設計する際非常に重要な知見となるものと期待する。昨年度、α-ケトアシル錯体のアルキンへの付加反応は脱カルボニル化が優先的に進行すると報告したが、継続して反応条件の検討を行った結果、α-ケトアシル基の構造を保持した付加反応生成物を満足できる収率で得る事に成功した。また用いるα-ケト酸塩化物の電子的性質がアシルロジウム錯体からの脱カルボニル化に直接関係することを錯体化学的にも確認することができた。加えて、ロジウム錯体触媒を用い、ベンゾイルクロリドと末端アルキンとをCO加圧条件下で反応させると、低収率ながらもCOを取り込みつつ付加反応が進行し、4-クロロ-3-ブテン-1-フェニル-1,2-ジオン骨格を有する化合物が生成する事も見出した。一方、α-ケト酸塩化物を用いたクロスカップリング反応を検討中、無触媒条件でスズ試薬との有機基交換反応が進行し、非対称1,2-ジケトンがほぼ定量的に得られる事を見出した。通常酸塩化物を用いたクロスカップリング反応はPd触媒やルイス酸などの添加を必要とするが、本研究の手法はこれらを必要とせず、簡便で合成化学的価値の高い手法であると考える。またクロロアセチルクロリドの各種末端アルキンへの付加反応について検討した事を前回報告したが、今年度は生成物である1,4-ジクロロ-3-ブテン-2-オンの各種官能基変換反応について探索し、合成中間体としての有用性を示すことができた。さらに、クロロアセチルクロリドのみならず、α-位に様々な官能基を有する酢酸塩化物が末端アルキンにカルボニル保持で付加することも見出しており、現在研究を継続中である。

昨年度に引き続き、Rh錯体触媒を用いて酸塩化物とアルキンをCO加圧下で反応させ、CO挿入を伴う付加反応によって(Z)-4-クロロ-3-ブテン-1-アリール-1,2-ジオンを得る反応について検討した。電子的性質の異なる酸塩化物を用いてそれぞれ反応条件を検討したが、目的化合物の収率は向上せず最大でも20%程度であった。しかし、これらの結果は、アシルロジウム錯体に対するCO挿入によってα-ケトアシルロジウム錯体が生成していることを示唆している。実際、RhCl_2(CO)(PMe_3)_2(COC_6H_4Cl)を加圧COで処理すると、僅かながらα-ケトアシル錯体が生成することを見出した。その際、不均化によって生成したと考えられるベンジルやベンゾフェノン誘導体などの副生を確認している。一方、クロロアセチルクロリドの末端アルキンへの付加反応について継続して検討中、トリクロロアセチルクロリドを用いるとCl-C(O)結合の付加反応ではなく、末端アルキンの塩素付加2量化反応が進行し、(Z,Z)-1,4-ジクロロ-1,3-ブタジエン誘導体が高選択的に得られる事を偶然見出した。トリブロモアセチルブロミドの反応でも対応するジブロモブタジエンが中程度の収率で得られた。Pd錯体触媒と銅塩を用いる不均一系での反応が既に知られているが、今回見出した手法は均一系触媒反応として始めての例である。反応機構について検討する為、RhCl(CO)L_2をCl_3CCOClで処理したところ、trans-RhCl_3(CO)L_2がほぼ定量的に得られ、本錯体とアルキンとの当量反応は目的化合物を与えた。従ってtrans-RhCl_3(CO)L_2が鍵中間体であると考えられるが、現時点では詳細なメカニズムについては不明である。
キラリティー制御された光学活性フェロセン配位子の合成と不斉触媒反応への応用

オルトーシリル封鎖フェロセンをブチルリチウムと反応させると,予想に反してフェロセンのシクロペンタジエニル基と側鎖置換基のフェニル基のオルト位の両方にリチオ化反応が進行することが判明した。中間体はジハロゲン化物として単離され,ハロゲン基をホスフィン基へと変換することでTaniaphos配位子が合成できた。この反応により,従来の高価なハロゲン置換されているフェニル基を用いることなく,この配位子を合成する方法が開発された。この配位子は,例えばロジウムやルテニウム金属錯体が触媒する不斉水素化反応において,有効に作用するキラル配位子であることが報告されている。中間体であるジハロゲン化物のアミノ置換基を,ナトリウムメトキシドと反応させることで,立体反転でメトキシ基に置換させることができた。このように,本反応によりTaniaphos誘導体を簡便に合成できる手法の開発に成功した。中間体のジハロゲン化物を分子内カップリングさせることで,橋かけ構造をとるキラルフェロセンが合成できた。一方,オルトーリン置換フェロセンをブチルリチウムと反応させると,上記の場合と同様にフェロセンのシクロペンタジエニル基と側鎖置換基のフェニル基のオルト位の両方にリチオ化反応が進行し,鉄(III)触媒を加えることで分子内カップリング反応が進行した。これを,オルトーリチオ化しホスフィン配位子へと導くことに成功した。これらは"硬直した"リン-窒素配位子であり,一般的な自由に動ける配位子に比べ構造がきわめて特徴的である。これらをパラジウム錯体が触媒する不斉アリル位アルキル化反応へと応用すると,生成物が最大96%鏡像体過剰率の高い光学収率で得られた。また,アリルアミノ化反応に応用しても,90%鏡像体過剰率で対応する二級アミンが生成し,不斉合成に有効な配位子であることが示された。二価のサマリウム錯体を用いて,オルト-置換ホルミルフェロセンのピナコールカップリング反応の立体化学に関して研究を行った。オルト-置換基としては,配位性の強い,スルポキシド,ホスフィンオキシド,ピリジン,アミノ基および比較的配位性の強くないホスフィン,オキサゾリン基を持つ化合物について検討を行った。反応を理解しやすくするために,用いたオルト置換ホルミルフェロセンの面性不斉はすべて,Spとして考える。二価のサマリウム錯体として,調製が容易でで取り扱いやすいヨウ化サマリウム(II)とサマリウムトリフラート(II)を用い,比較検討を行った。オキサゾリン,ホスフィン置換ホルミルフェロセンのピナコールカップリングは,ヨウ化サマリウム(II)を用いたときは,立体選択性が全く観られず,アルコール炭素の立体化学が(R,R),(S,S),(R,S)の統計的な混合物となった。一方,サマリウムトリフラート(II)を用いたときは,高立体選択的に反応が進行し,(R,R)ピナコールが選択性良く生成した。スルポキシド,ホスフィンオキシド置換ホルミルフェロセンとの反応では,サマリウムトリフラート(II)を用いたときに立体選択性良く反応が進行したが,アルコール炭素の立体化学は(S,S)が主生成物となった。これは,置換基の酸素原子がサマリウムに配位をし,キレーション中間体を経て反応が進行したためと考えられる。ピリジン,アミノ置換ホルミルフェロセンとの反応では,ヨウ化サマリウム(II)とサマリウムトリフラート(II)のどちらを用いても,選択性はほとんど観られなかった。

これら置換基は,サマリウム原子に対して中程度の配位性のため,キレーション構造と非キレーション構造の両方が中間に存在しているためと考えられる。生成した,フェロセニルピナコールをルイス酸触媒の配位子として用いて,各種不斉合成反応へと応用した。イッテルビウム錯体を用いた不斉ディールズ-アルダー反応が高いエナンチオ選択性で進行した。オルトーシリル封鎖フェロセンをブチルリチウムと反応させると,予想に反してフェロセンのシクロペンタジエニル基と側鎖置換基のフェニル基のオルト位の両方にリチオ化反応が進行することが判明した。中間体はジハロゲン化物として単離され,ハロゲン基をボスフィン基へと変換することでTaniaphos配位子が合成できた。この反応により,従来の高価なハロゲン置換されているフェニル基を用いることなく,この配位子を合成する方法が開発された。この配位子は,例えばロジウムやルテニウム金属錯体が触媒する不斉水素化反応において,有効に作用するキラル配位子であることが報告されている。中間体であるジハロゲン化物のアミノ置換基を,ナトリウムメトキシドと反応させることで,立体反転でメトキシ基に置換させることができた。このように,本反応によりTaniaphos誘導体を簡便に合成できる手法の開発に成功した。中間体のジハロゲン化物を分子内カップリングさせることで,橋かけ構造をとるキラルフェロセンが合成できた。一方,オルトーリン置換フェロセンをブチルリチウムと反応させると,上記の揚合と同様にフェロセンのシクロペンタジエニル基と側鎖置換基のフェニル基のオルト位の両方にリチオ化反応が進行し,鉄(III)触媒を加えることで分子内カップリング反応が進行した。これを,オルトーリチオ化しホスフィン配位子へと導くことに成功した。これらは"硬直した"リン-窒素配位子であり,一般的な自由に動ける配位子に比べ構造がきわめて特徴的である。これらをパラジウム錯体が触媒する不斉アリル位アルキル化反応へと応用すると,生成物が最大96%鏡像体過剰率の高い光学収率で得られた。また,アリルアミノ化反応に応用しても,90%鏡像体過剰率で対応する二級アミンが生成し,不斉合成に有効な配位子であることが示された。
砒素によるヒト表皮細胞のサイトカイン産生亢進および増殖促進に関する研究

免疫応答の調節因子であるサイトカインが全身の各種細胞の増殖・分化制御因子としても作用することが知られるに至り、全身の生体機能が統合して研究されるようになってきた。砒素曝露者の皮膚症状として角化症、色素異常、腫瘍発生などが知られている。しかし、それらの発症の過程は殆どわかっていない。そこで申請者は砒素が表皮角化細胞の増殖を基調とする角化症を起こすことに着目し、表皮角化細胞の培養系を用い砒素添加による細胞増殖活性への影響とサイトカイン産生の変化についての研究に着手した。砒素を添加して培養した表皮角化細胞培養上清中の遺伝子産物としてのサイトカインとそれぞれのmRNAの発現、染色体学的観察による細胞増殖活性の両面からの統合的検索をおこなった。その結果、表皮角化細胞自体が産生するGM-CSFおよびTGFalphaが、砒素の添加によって産生量が増大すること、さらにGM-CSFおよびTGFalphaが砒素による細胞増殖亢進に関与していることが判明した。また、砒素添加による培養細胞のディッシュへの強い結合性が観察され、角化症発現のもう一つの要因である角化の貯留とも考えられた。現在、表皮角化細胞にて産生され得るその他のサイトカインであるIL-alpha、IL-6、IL-8やTNFalphaなどの砒素添加による変動、すなわち砒素による角化症でのサイトカイン・ネットワークについて研究を続けている。また培養細胞における接着因子の発現とも結び付けて考えて行く方針である。