hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎臓病におけるビオチン・エピジェネティックスを指向したＮＭＲメタボロミクス研究

腎臓病患者の血中のビオチン(ビタミンH)濃度を測定したところ、健常者より高値であることを見出した。腎臓機能の低下した患者はビオチンだけでなくその代謝物を尿に排泄できずに血中に蓄積していることを意味している。この代謝物はビタミンとしての活性がないだけでなく、元のビオチンの活性を妨げることが言われている。腎臓病患者にとって慢性的な代謝物の蓄積は、病態を進行させるなど深刻な影響を与える。そこで活性のある元のビオチンと活性のなくなったビオチン代謝物を区別して測定する方法を開発した。さらにNMR(磁気共鳴)法を用いて慢性患者に特有の代謝を解明することにより、治療への道を拓きたい。25年度研究成果:「意義・重要性」血中のビオチン類をアビジン拮抗法によるELISA測定を行ったところ、末期腎臓病患者の血中にはビオチン類が健常者に比べて異常蓄積していることを発見した。腎機能の全廃した患者がビオチンだけでなくビオチンの代謝物も体内に蓄制させ、代謝物が活性のあるビオチンを抑制していることが示唆された。ビオチンの代謝における意義だけでなく、腎機能が減弱すると蓄積し始めた代謝物が活性ビオチンを阻害し、腎臓病の増悪因子となること、慢性的な代謝物の蓄積がエピジェネティクスな影響を持つ可能性があることが考えられた。「成果」上記ELISA法は未変化体ビオチンのみならず、ビオチン代謝物も含めてビオチン骨格のある化合物全体を定量している。そこで、代謝物と未変化体を区別するべくLC/MS測定系の構築を試みた。まず透析患者の血漿において未変化体ビオチンを同定と定量する系を確立した。LC/MS測定値とELISA測定値との差が代謝物の量であるため、これを評価した結果、透析患者は健常より蓄積し、痙攣など合併症のある患者にも相関を認めた。さらに当学のナノテク支援センターにおいて、ビオチン代謝物であるビスノルビオチン、ビオチンスルフォン、ビオチンスルフォキシドを新規に合成した。これらの3代謝物についてはLCMS測定計を構築中である。患者血漿中に蓄積した代謝物の同定できればさらに腎障害との関連を追及できる。新規尿毒素として確立することが可能となるであろう。NMRプロファイリングとの関係は当初の計画に照らして不十分であったが、他の測定系を確立することビオチンメタボロミクスとしての知見が得られ、難分解性ビタミンの慢性腎臓病におけるエピジェネティックな影響を初めて示唆した。24年度研究成果:「意義・重要性」我々はメタボロミクスによって、末期腎不全患者の血中にビオチンおよびその代謝物が異常蓄積していることを発見した。ビオチンはエネルギー・糖・脂質代謝反応の補酵素であるが、糖・脂質代謝異常を基礎にもつ腎臓患者にとって慢性的な高濃度のビオチン代謝物の蓄積は、エピジェネティクな変化をもたらすことが予想される。水溶性ビタミンであるビオチンの代謝・動態と慢性疾患との関係を解明するために、本研究では慢性腎臓病におけるビオチン・エピジェネティクスを指向し、その基盤となるNMRメタボロミクス法を新規に開発することを目的とした。「成果」透析合併症である痙攣の緩和を目的としてビオチンを投与したところ、著効を見た。ビオチンはTCA回路入り口に位置する補酵素であり、エネルギー代謝の偏りを是正する役割が示唆される。血漿中のビオチンをELISA法にて定量したところ、透析患者はビオチンが蓄積していることが判明した。腎機能の全廃した患者がビオチンだけでなくその代謝物も体内に蓄制させ、代謝物が活性のあるビオチンを抑制していることが示唆された。ELISA測定によるビオチンが残尿のある患者には少ない事も発見した。このことは腎機能とビオチン蓄積の関係があることが示唆している。ビオチン代謝に関連する情報を抽出するNMR法を開発することを試みた。今年度は特に糖代謝について実績があった。つまり1HNMRスペクトル解析において原疾患によって乳酸、ピルビン酸、ケトン体および糖原性アミノ酸のプロファイルが異なることを発見した。ビオチンエピジェネティクスとの関連をさらに追求する。・透析患者の合併症にビオチンが著効をみたことは、患者がエネルギー代謝の異常を抱えていることを意味した。ビオチンはTCA回路の入り口の補酵素として働いている。一方でエライザ法でビオチン類が患者に蓄積している事を発見している、これは未変化体ビオチンだけでなくビオチン代謝物がエライザ法でも同じく検出され、代謝物の蓄積が問題となることが示唆された。蓄積量と腎機能の関係も判明し、新たなビオチン代謝と腎不全の進行度の関連が浮かび上がった。・ビオチンを服用した患者に、糖代謝異常を持つ糖尿病者に関連の代謝物プロファイルの変化を認め、ビオチンが糖代謝にも深く関連することを示唆した。

・NMRスペクトルによる定量分析で、乳酸、アラニンなど主要な代謝物プロファイルの違いを明らかにした。慢性的にビオチンとその代謝物に曝されていることでエピジェネティックな変化をもたらすことが予想されるので、今後はさらに代謝物プロファイリングをNMRで行う事でこれを検討する。透析歴とビオチン類の蓄積の関係を明らかにし、ビオチンの腎症への役割を考察する。これまで水溶性ビタミンとして毒性を疑われなかったビオチンであるが、難分解性構造をもつことから新たな代謝的意味あいがあることを、我々の研究によって提起出来ると思われる。未変化体ビオチンとビオチン代謝物を区別して同定定量することで、いすれが腎症の増悪因子として役割を持つか明確にしたい。新規尿毒素としてビオチンが働くか否かについて確証を得ることを目的とする。新規尿毒素であればクレアチニンに代わるマーカーとして有効である可能性も考えられる。・腎機能とビオチン代謝物蓄積の関係があることが示唆されたので、LC/MSなどの測定法で分子種同定と定量をすることでこれを解明したい。透析治療前後の血漿で測定し、廃液においても行う。廃液は除タンパク処理をしたものと同等であるので、むしろ良い結果が期待される。・エネルギー代謝を抽出するNMR法を開発したい。31P NMR測定によってATP/AMP比を検出する。廃液において観察することで廃液中にATPなどの排出を確認したい。透析廃液中のATPは今まで観測されたことはない。・ビオチンを服用する患者の糖・脂質パラメータを追跡することでビオチンの糖・脂質代謝への効果を調べる。
スキージャンプ台実験と3次元粒子流モデル開発による雪崩流動機構の解明

冬季は、札幌の宮の森ジャンプ競技場の助走路に幅0.8m、深さ0.3m、長さ70mの走路を作り、あらかじめ粒子化した雪(最大300kg)を流下させ、加速に伴う流動化、雪煙の発生から停止、堆積に至るまでの過程を連続的にビデオカメラで測定した。また黒部峡谷で展開している観測システム(衝撃圧、静圧変動、風圧、地震動)と同様のものを走路上に構築したほか、底面にドラッグメータを設置して応力の測定が行われた。一方、ピンポンなだれ実験はランディングバーンの頂部に大型の箱を設置し、そこから最大35万個のピンポン球を一気に放出する形で行われた。流れ全体の挙動と形態変化に加えて、個々の粒子の速度や密度分布構造を詳細に測定するため、K点より10m下流の位置に観測タワーを6基設置し、8台のビデオカメラによる撮影など、各種の測定を実施した。その結果、3次元粒子流モデルの構築に不可欠な速度や密度分布構造が測定されたほか、雪崩などの大規模崩壊現象に共通するクリア-な頭部と尾部構造などの形態的特徴やその形成過程、さらには一定の波長を持った内部波動の存在が確認された。上記の作業と併行して、過去2年間に実施したピンポン流の測定結果をもとに、空気抵抗の効果を考慮した30万個までの挙動解析が可能な3次元粒子流モデルを開発した。そして、このモデルを用いて、ノルウェー、黒部峡谷という異なった地形条件(前者は広大な山腹、後者は拘束された谷)を流れ下る雪崩の運動を再現し、観測結果と比較検討を行った。平成7年11月に、荒井山(35m級)と宮の森(ノーマルヒル・70m級)のスキー競技用ジャンプ台において、2個から最大30万個までのピンポン球を一気に流下させ、その挙動と形態変化等をビデオに収録した。これまでの画像解析の結果からは、流れの速度が粒子数とともに増加するという流れのサイズ依存性などが明らかになった。また雪崩等の大規模崩壊現象に共通して見られる、頭部と尾部の形成という形態的特徴の再現も確認され、模擬実験による雪崩流動機構の研究を進める上で、ピンポン球が最適な物質であることが確認された。本結果をもとに、現在3次元粒状体流れの数値モデルを開発中である。積雪期には、同じジャンプ台の助走路を雪崩斜面として用いて実際に雪のブロックもしくはあらかじめ細かく砕いた雪を最大300kg流下させる実験を行った。雪の加速に伴う破壊、流動化、粒子化、雪煙の発生そして停止、堆積に至るまでを連続的にビデオカメラで撮影した。また黒部峡谷で自然雪崩を対象に展開している観測システム(荷重変換器、風圧計、気圧計等)と同様のものを走路上に構築し測定を行った。現在、荷重変換器のデータと静圧変動の値から、内部速度構造を求めるための解析を進めている。超音波風向風速計の出力からは、雪の流れにより誘起される空気の流れの乱流構造(流れ型雪崩から煙り型雪崩に遷移するうえで重要な因子となると考えられる)も求められた。今冬の多雪にともない数多くの観測に成功した黒部峡谷における実際の大規模な雪崩データと比較検討を行っており、雪崩の流動特性に関わる理解が深まると期待される。昨年度の予備実験に引き続き、平成8年8月、宮の森(ノーマルヒル・70m級)のスキー競技用ジャンプ台において、2個から最大30万個までのピンポン球を一気に流下させ、ビデオによる挙動と形態変化の観測、ならびに流れのもたらす衝撃圧、静圧変化等を測定した。流れの先端速度は粒子数とともに対数的に増加し、30万個の場合はピンポン球一個の終端速度より1.5倍大きい15m/sに達した。こうした速度のサイズ依存性は、次元解析から理論的にもとめた値と定量的に良く一致した。現在、個々の粒子の運動状態および静圧変動から求められた空気の速度を解析・検討の上、2次元粒状体流れの数値モデルの結果との比較を行うとともに、3次元モデルへの拡張をめざしている。積雪期(平成9年3月)には、同じジャンプ台を雪崩斜面として用いて、あらかじめ細かく砕いた雪を最大約400kg流下させる実験を行った。そして雪の加速に伴う破壊、流動化、粒子化、雪煙の発生そして停止、堆積に至るまでを連続的にビデオカメラで撮影した。本実験については現在はまだ解析を開始した段階であるが、昨年度3月の2次元的予備実験からは、荷重変換器のデータと静圧変動の値を用いて、雪と空気の内部速度構造を独立に求めることに成功している。また、昨冬は黒部峡谷において最大速度が70m/s以上に達する大規模な雪崩観測にも成功し、その内部構造が初めて明らかになった。現在、ピンポン流、雪の流下実験、さらには自然雪崩に共通してあらわれた特徴的構造(高さと長さの比がおよそ1対10)を中心に雪崩の流動特性の解明を進めている。

また黒部峡谷で展開している観測システム(衝撃圧、静圧変動、風圧、地震動)と同様のものを走路上に構築したほか、底面にドラッグメータを設置して応力の測定が行われた。一方、ピンポンなだれ実験はランディングバーンの頂部に大型の箱を設置し、そこから最大35万個のピンポン球を一気に放出する形で行われた。流れ全体の挙動と形態変化に加えて、個々の粒子の速度や密度分布構造を詳細に測定するため、K点より10m下流の位置に観測タワーを6基設置し、8台のビデオカメラによる撮影など、各種の測定を実施した。その結果、3次元粒子流モデルの構築に不可欠な速度や密度分布構造が測定されたほか、雪崩などの大規模崩壊現象に共通するクリア-な頭部と尾部構造などの形態的特徴やその形成過程、さらには一定の波長を持った内部波動の存在が確認された。上記の作業と併行して、過去2年間に実施したピンポン流の測定結果をもとに、空気抵抗の効果を考慮した30万個までの挙動解析が可能な3次元粒子流モデルを開発した。そして、このモデルを用いて、ノルウェー、黒部峡谷という異なった地形条件(前者は広大な山腹、後者は拘束された谷)を流れ下る雪崩の運動を再現し、観測結果と比較検討を行った。
中性B中間子のη'η'Ks崩壊の探索とCP非保存現象の研究

B中間子のb→sqq遷移モードの一つであるB0→η'η'KS崩壊を研究し、人工ニューラルネットワークを用いた多変量解析を導入する事でシグナルを残したまま膨大な背景事象を効率良く排除する手法を確立した。また同じくb→sqq遷移モードの一つであるB0→f0(980)(→π+π-)KS崩壊のCP非対称度パラメータを、当時の世界最高精度で測定すると共にモンテカルロシミュレータを改良し干渉効果の定量的な見積もりを行った。計画初年度である本年においては、まず背景事象を理解しCP非対称度測定に最適な再構成パラメータを求めるために、大統計量のモンテカルロシミュレーション事象を生成すると共に実データの背景事象領域を抽出し、解析を行った。その結果シグナル領域にピークを持つ様なB中間子由来の背景事象はほぼ無視できるが、軽いクォークジェットやB中間子の崩壊トラックが乱数的に組み合わされる偶然背景事象の寄与が支配的である事を確認した。主な寄与はη'→ργモードにおけるρ中間子の広い崩壊幅によるものであり、最も大きなシグナル数と背景事象数をもたらす(ργ)(ργ)モードを用いるとCP非対称度測定における統計有意度が減少する事が判明した。これは当該モードを省き、更にKEKB加速器による順調に蓄積されているデータ量によって改善が見込まれる。また、上記の様に今年度においては本解析モードのデータ蓄積量が十分では無い事から、予備測定として解析モード同様b→<sqq>^^^-遷移が支配的であり、三体崩壊であるB^0→π^+π^-崩壊におけるCP非対称度測定を行った。この崩壊モードは本解析において解析の各段階が正しく進められている事を確認する為のコントロールサンプルとしても必要である。約5.35億個のB中間子対生成事象から再構成された377個のπ^+π^-K_sシグナル事象を用い、f_0(980)中間子の不変質量領域においてB^0→f_0(980)(→π^+π^-)K_sのCP非対称度パラメータとしてS=0.18±0.23(統計)±0.11(系統)、A=-0.15±0.15(統計)±0.07(系統)を得た。ここでSはB中間子混合に誘起される間接的なCPの破れ、Aは直接的なCPの破れを表す。これはこの終状態としては世界最高精度の測定であり、いずれの結果も過去の測定及び標準理論との有意な差異は見られない。この結果は国際会議ICHEP2006において発表された他、プレプリントサーバーにhcp-ex O609006として公表され、間もなくPhysical ReviewLetters紙に投稿される予定である。また、本測定においては模擬実験(モンテカルロシミュレーション)やコントロールサンプルを用いた分解関数やCP非対称度測定の線形応答性の妥当性の検証及び系統誤差の把握が重要である。B中間子の三体崩壊においては、中間状態に異なるCP固有値を持つ共鳴状態を含む場合、干渉効果により各成分の崩壊幅が変化し、測定されるCP非対称度に影響を及ぼす事が分かっている。本測定においてもこの効果を考慮した系統誤差を見積もる為、これまで研究グループで用いていたモンテカルロ(MC)シミュレータでは扱えなかった、共鳴状態の干渉による、時間に依存したCP非対称度変化を扱う事のできるようシミュレータを改良した。このシミュレータを用いて大量のMC事象を生成し、特にπ^+π^-K_sを用い、シミュレータの動作を検証した。π^+π_-不変質量を適切な幅で区切り、特定の中間状態の支配的な領域を切りだした時に、予測通りのCP符号が得られる事を検出器シミュレーションを通す前及び後で確認した。また適切なパラメータを与えた場合、このMCシミュレーションにより得られるπ^+π_-不変質量分布は共鳴状態を仮定しない測定結果より、よく実験データを再現する事も確認した。これにより、三体崩壊における共鳴状態の干渉効果による影響を、本測定のみならず、より一般的な場合において見積もる事が可能となった。本研究の主測定モードであるB^0→η'η'K_s崩壊は未発見であるが、その崩壊分岐比を1×10^<-5>と仮定した場合、2008年までに蓄積された約6.57億個のBB中間子対生成事象からは1066個生成されると期待される。しかし実際に再構成可能な事象はこのうち数%である上、背景事象を考慮した事象選択を行う必要がある。前年度までの解析より本測定モードにおける主要な背景事象は偶然背景事象によるものである事が解っている為、実データで運動学的にシグナルを含まない領域を背景事象領域と定義し、その量と性質を調べた。B^0→η'η'K_s崩壊のサブ崩壊モード(γγ)(γγ)が最も高い統計有意度を示し、(3π)(γγ)及び(3π)(3π)モードがそれに続く事がわかった。

しかしこれらのモードにより期待される統計量は当初予定されていた(ργ)を含む3×3の組み合わせのうち15%に過ぎず、従来と同様の事象選択を行った場合期待される事象数は約3個となり、崩壊分岐比の上限まで考慮したとしても事象の発見及びCP非対称度測定には不十分である。したがって、本測定においてはpγモードを特に改善する事が必須である事が判明した。(ργ)(ργ)モードにおいて従来と同様にFisher Discriminantを用いた事象選択を行った場合、期待される事象数は約8個、背景事象数は3800に及ぶ。従来はこのような複雑な崩壊トポロジーを持つ事象の再構成、改善は困難だったが、pの偏極度分布など本モード特有の力学的変数を新たに用いたり、人工的ニューラルネットワークを利用した多変量解析を行い、変数間の相関を考慮したりする事で効果的なシグナル選別を行った。最適化の結果、シグナル13事象に対し背景事象1200とシグナル数を増やしながらSIN比が5倍向上する著しい改善を見た。これにより10本以上に及ぶ荷電及び中性粒子より構成される事象を、多変量解析を用いて再構成する方法を確立した。しかし背景事象の多さから本解析は現状の統計量ではCP非対称度測定には不十分である事も又判明した。
ツメガエル卵片を用いた遺伝子機能の新しい解析法による体軸形成機構の解明

動物の初期発生は、様々な遺伝子の産物が、遺伝子発現に関して、相互に複雑な制御をかけることによって進行する。遺伝子の働きは、mRNAの胚への注入によって調べることができるが、注入される胚での遺伝子発現がバックグラウンドとして存在するので、評価がむずかしかった。私達はゼノパスの卵片という、バックグラウンドの遺伝子発現がほとんどない実験系を開発し、これを使って研究を進めている。これまでに明らかになったのは次のようなことである。1.原腸陥入する卵片の細胞質を注入することにより、表皮にしかならない卵片にVeg-T mRNAが導入できた。細胞質注入胚では原腸陥入が引き起こされ、内胚葉マーカー、中胚葉マーカーが発現したが、背側・神経マーカーは発現しなかった。背側デターミナントを代替する因子であるXwnt-8 mRNAを表皮にしかならない卵片に注入しても背側・神経マーカーは発現しなかったが、Xwnt-8 mRNAを原腸陥入する卵片の細胞質、またはVeg-T mRNAとともに注入することで、背側の遺伝子発現が起こり、また、目や筋肉を含む体軸構造が形成された。これは、背側形成に、二つの因子の共働が必要であることを示す、発生生物学にとってきわめて重要な結果である。この結果は現在論文投稿準備中である。2.両生類のオーガナイザーはそのままでは表皮にしかならない細胞群に対して作用させたときに、前方の神経構造のみを作る。一方、反応系が、腹側の内・中胚葉を含むときには後方の神経構造も作る。このことは、オーガナイザーと外胚葉には後方を作る活性がなく、腹側の内・中胚葉に、オーガナイザーと共働して後方をつくる活性があることを示唆している。オーガナイザーとともに胚の様々な領域を移植する実験により、後方化活性は胚の植物半球全体に存在することが示された(Fujii et al.,Dev.Biol.)。これまでに、PBEでは内中胚葉を指定するデターミナントであると考えられているVeg-Tが発現しておらず(GNEでは発現している)ことをin situ hybridizationにより確かめた。さらに、PBEにGNEの細胞質を注入することによりVeg-TmRNAが導入されることをin situ hybridizationで確認した。この細胞質注入胚では原腸陥入、Xbraの発現が起こった。Veg-TmRNAの注入でも同様に原腸陥入、Xbraの発現が起こった。この結果は、特定の細胞質の注入によって特定のmRNAが実際に移動したことを示す最初の例である。Veg-TmRNAの存在の有無と、原腸陥入、Xbra発現の有無がよく一致したので、Veg-TmRNAはこれらのプロセスに必須の因子であることが示された。

背側デターミナントを代替する因子であるXwnt-8 mRNAを表皮にしかならない卵片に注入しても背側・神経マーカーは発現しなかったが、Xwnt-8 mRNAを原腸陥入する卵片の細胞質、またはVeg-T mRNAとともに注入することで、背側の遺伝子発現が起こり、また、目や筋肉を含む体軸構造が形成された。これは、背側形成に、二つの因子の共働が必要であることを示す、発生生物学にとってきわめて重要な結果である。この結果は現在論文投稿準備中である。2.両生類のオーガナイザーはそのままでは表皮にしかならない細胞群に対して作用させたときに、前方の神経構造のみを作る。一方、反応系が、腹側の内・中胚葉を含むときには後方の神経構造も作る。このことは、オーガナイザーと外胚葉には後方を作る活性がなく、腹側の内・中胚葉に、オーガナイザーと共働して後方をつくる活性があることを示唆している。オーガナイザーとともに胚の様々な領域を移植する実験により、後方化活性は胚の植物半球全体に存在することが示された(Fujii et al., Dev.Biol.)。
反対色細胞を基盤とする色覚生成機構の解明

動物は少数の異なる分光感度を持つ光受容体の組み合わせによって、光の波長の違いを色の違いとして識別することができる。色覚生成のためには、異なる光受容細胞からの情報を比較する反対色細胞の存在が重要である。しかし、反対色応答形成の神経基盤や反対色細胞からの情報が統合される神経機構はよくわかっていない。本研究では、視覚情報処理経路において、脊椎動物と多くの機能構造的共通性を持つショウジョウバエを用い、色覚生成機構の神経基盤を解明することを目的とする。特に、反対色応答を示すニューロンを回路の中で同定し、それらの細胞が反対色応答を生成する神経メカニズムと反対色細胞からの情報がその後どのように統合されていくかを明らかにすることを目指す。2018年度はin vivoホールセルパッチクランプ法を用い、初期視覚中枢から高次視覚領域のニューロンを対象に、300nm-650nmの光刺激に対する波長応答特性を計測した。多くのニューロンは広帯域の波長の光に興奮性の応答を示し、サルやミツバチなどで見つかっている典型的な反対色応答を示すニューロンや狭領域の波長に応答を示すニューロンの存在は確認できなかった。また、パッチクランプ法での計測の難しい視髄の2次ニューロンからカルシウムイメージング法の確立を試み、自発活動および光刺激に対する応答の計測に一部成功している。さらに、熱忌避による色識別の連合学習系を用い、野生型を用いて6種類の異なる波長のLEDの組み合わせに対する色識別能を評価し、光受容体の変異体を用いて各光受容体の色識別への寄与について調べた。代表者はこれまでに、300-650nmまでの波長の光刺激を25nmステップで与える視覚刺激系の確立とショウジョウバエ視覚系におけるin vivoホールセルパッチクランプ法の適用を行ってきた。本研究では、最初に反対色細胞の候補である視髄の2次ニューロンを対象に計測を試みた。しかし、細胞体サイズの小ささから安定的な計測系の確立に至っていない。そこで次に、細胞体サイズのもう少し大きい初期視覚中枢から高次視覚領域のニューロンを対象に、ある程度ランダムに標的細胞を定め、波長応答特性の計測を行った。現在までに40個ほどのニューロンの計測に成功し、光刺激に対するON応答、OFF応答の違いからいくつかの応答パターンに分類した。多くのニューロンは広帯域の波長の光に興奮性の応答を示し、反対色応答を示すニューロンや狭領域の波長に特異的に応答を示すニューロンは見つかっていない。また、視髄のニューロンの応答計測に対する相互補完的なアプローチとして、時間分解能は低いものの空間分解能は高く、技術的にも少し易しいカルシウムイメージング法の確立を行っている。確率は低いものの、自発活動および光刺激に対する応答の計測に成功しており、より安定的な計測系に改良を進めている。また、同定したニューロンが色覚に重要であるかを評価するために、色識別の行動実験による検証が必要である。2018年度はこれまでの研究で確立してきた色識別の熱忌避連合学習系を用い、野生型を用いて6種類の異なる波長のLEDの組み合わせに対する色識別能を調べた。さらに、その結果を光受容体空間における各光刺激波長間の距離と比較して評価した。また、光受容体の変異体を用いて各光受容体の色識別への寄与について調べた。本研究の現在の課題は波長応答特性を計測したニューロンの同定である。現状の方法はある程度ランダムに標的細胞を定め、記録後の細胞内染色によってニューロンの同定を試みている。形態が染色できた場合、分枝領域や形態の特徴から、過去の知見やデータベースを参照し、ニューロンを同定することができる。しかし、現状では形態染色に成功する確率があまり高くない。染色条件の改良や技術的な熟練によって精度を改善する必要がある。また、特異的な神経群を遺伝学的手法でGFPなどを発現させ標的細胞とした場合に、計測の成功率が低いという問題もある。標的の数が少ない場合に、それらを確実に露出し、良好な計測対象とする技術の改善が必要である。カルシウムイメージングの確立にむけては、安定的な計測を実現するために、応答のみられる適切な条件を確立することが課題である。また、動きに対する補正や刺激タイミングに対する蛍光強度変化を正確に評価できる解析プログラムの作成を進めている。

さらに、熱忌避による色識別の連合学習系を用い、野生型を用いて6種類の異なる波長のLEDの組み合わせに対する色識別能を評価し、光受容体の変異体を用いて各光受容体の色識別への寄与について調べた。代表者はこれまでに、300-650nmまでの波長の光刺激を25nmステップで与える視覚刺激系の確立とショウジョウバエ視覚系におけるin vivoホールセルパッチクランプ法の適用を行ってきた。本研究では、最初に反対色細胞の候補である視髄の2次ニューロンを対象に計測を試みた。しかし、細胞体サイズの小ささから安定的な計測系の確立に至っていない。そこで次に、細胞体サイズのもう少し大きい初期視覚中枢から高次視覚領域のニューロンを対象に、ある程度ランダムに標的細胞を定め、波長応答特性の計測を行った。現在までに40個ほどのニューロンの計測に成功し、光刺激に対するON応答、OFF応答の違いからいくつかの応答パターンに分類した。多くのニューロンは広帯域の波長の光に興奮性の応答を示し、反対色応答を示すニューロンや狭領域の波長に特異的に応答を示すニューロンは見つかっていない。また、視髄のニューロンの応答計測に対する相互補完的なアプローチとして、時間分解能は低いものの空間分解能は高く、技術的にも少し易しいカルシウムイメージング法の確立を行っている。確率は低いものの、自発活動および光刺激に対する応答の計測に成功しており、より安定的な計測系に改良を進めている。また、同定したニューロンが色覚に重要であるかを評価するために、色識別の行動実験による検証が必要である。2018年度はこれまでの研究で確立してきた色識別の熱忌避連合学習系を用い、野生型を用いて6種類の異なる波長のLEDの組み合わせに対する色識別能を調べた。さらに、その結果を光受容体空間における各光刺激波長間の距離と比較して評価した。また、光受容体の変異体を用いて各光受容体の色識別への寄与について調べた。本研究の現在の課題は波長応答特性を計測したニューロンの同定である。現状の方法はある程度ランダムに標的細胞を定め、記録後の細胞内染色によってニューロンの同定を試みている。形態が染色できた場合、分枝領域や形態の特徴から、過去の知見やデータベースを参照し、ニューロンを同定することができる。しかし、現状では形態染色に成功する確率があまり高くない。染色条件の改良や技術的な熟練によって精度を改善する必要がある。また、特異的な神経群を遺伝学的手法でGFPなどを発現させ標的細胞とした場合に、計測の成功率が低いという問題もある。標的の数が少ない場合に、それらを確実に露出し、良好な計測対象とする技術の改善が必要である。カルシウムイメージングの確立にむけては、安定的な計測を実現するために、応答のみられる適切な条件を確立することが課題である。また、動きに対する補正や刺激タイミングに対する蛍光強度変化を正確に評価できる解析プログラムの作成を進めている。今年度の消耗品の購入に使用予定であった10万円を、次年度に使用できる額が少ないことから、次年度の消耗品費および旅費のための予算として繰り越した。
巨核球・血小板分化における転写因子ＨＥＳ１が担う制御機構の解明

巨核球・血小板分化制御機構の詳細を明らかにし、Notch-Hesシグナル制御による分化制御が可能か否か明らかにするために、最も巨核球分化に重要であると考えられているサイトカイン、TPOのレセプターであるc-mplの欠損マウスを用いて、実験を行った。c-mpl欠損マウスでは我々が同定した巨核球前駆細胞分画CD34+GPIba+細胞(34a-MKP)の頻度、造血幹細胞分画は激減していた一方、従来考えられてきた赤血球・巨核球共通前駆細胞(MEP)分画の頻度には著変を認めなかった。一方、細胞周期特異的抗癌剤である5-FUや抗血小板抗体投与によって作成した実験的血小板減少モデルの骨髄を詳細に解析すると、MEP分画の著増が認められた。この事は血小板需要が高まった時の血小板供給にはc-Mpl/TPO非依存的な制御機構が関与している事を示唆していると考えた。また、MEP分画をはじめ、骨髄前駆細胞にはNotch2が発現している事をRT-PCR法、フローサイトメトリーで確認した。その下流シグナル分子であるHes1の発現もMEP分画,34a-MKPで比較的高い発現を示している事から、血小板需要に応じた血小板供給にはNotch-Hesシグナルが役割を担っている可能性が考えられた。また、Notch分子のリガンドであるDeltaは骨髄内免疫染色で観察するとDelta1は骨芽細胞近傍に、Delta4は血管内皮を中心とした血管近くに局在していた。Delta4発現細胞近傍に34a-MKPは有意に局在している事からもDelta4-Notch-Hes経路が役割を担っている事が考えられた。さらにc-Mpl欠損マウスにDelta4の阻害抗体を投与すると更なる血小板減少が認められた。現在、c-Mpl/TPO非依存的血小板産生機構の意義とDelta-Notch-Hesシグナルの関係性ついて更なる研究を行っている。
ピナコールの炭素一炭素結合切断による金属ケチルラジカル錯体の合成と反応

金属ビス(トリメチルシリル)アミド(MN(SiMe_3)_2,M=Li,Na,K)を脱プロトン化剤として用い1,2-ビス(ビフェニル-2,2′-ジイル)エタン-1,2-ジオールとの反応により対応するケチルラジカル錯体を単離し、その構造をX線構造解析により明らかにした。これらの錯体の構造は金属の種類や配位子の添加量に依存する。リチウムの場合は二量体[Li(μ_2-ketyl)(HMPA)_2]_2、カリウムの場合は四量体[K(μ_3-ketyl)(HMPA)]_4[μ_2-THF]のみが単離されたが、ナトリウムの場合は一当量のHMPAを添加すると四量体[Na(μ_3-ketyl)(HMPA)]_4のみが生成し、二当量のHMPAを添加すると二量体[Na(μ_2-ketyl)(HMPA)_2]_2のみが得られた。ケチルラジカルが二量体以上の集合体として存在することが以前にESRなどの研究によって示唆されたことがあるが、それを単離して構造を決めたのは今回が初めてである。また、本研究はピナコールの炭素-炭素結合の切断によるケチルラジカル錯体の合成を実現した初めての例でもある。その他、カルシウムやサマリウム金属とフルオレノンの反応により初めてのマルチ(ケチル)錯体を単離しその構造を明らかにした。
地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収プロセスの開発

本研究は、地熱水や温泉水から溶存元素であるリチウムとホウ素のレアメタル2元素を同時に、かつ、高選択的に分離濃縮できる吸着分離剤と分離回収プロセスを開発することを目的として、(1)無機系イオン形状記憶型吸着剤および吸着剤の造粒手法の開発、(2)吸着平衡と速度の測定と吸着機構の解明、(3)カラム法による模擬地熱水からのリチウムとホウ素の分離回収実験、(4)地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収の基礎実験、および、(5)地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収プロセスの実証試験を実施した。本研究は地熱水や温泉水から、溶存元素であるリチウムとホウ素のレアメタル2元素を同時に、かつ、高選択的に分離濃縮できる吸着分離剤と分離回収プロセスを開発することを目的としている。本年度は、基盤的研究として以下の研究を行った。(1)無機系イオン形状記憶型吸着剤の開発地熱水中に共存するナトリウムやカリウム、シリカ、ヒ素などに対する吸着剤のリチウムとホウ素の吸着選択性を明らかにした。(2)吸着平衡と速度の測定と吸着機構の解明ターゲット金属の吸着速度に関する実験を行い、吸着速度のpH、金属イオン濃度、吸着剤量および温度の依存性を明らかにした。(3)新規吸着剤の造粒手法の開発(1)および(2)で開発した新規吸着剤の造粒方法の開発を行った。特に、地熱水を現場で直接処理する場合には、80100□といった高温での操作が必要であるため、高温に耐えうる無機系バインダーを用いた造粒吸着剤の結晶構造に与える温度の影響を明らかにした。(4)カラム法による模擬地熱水からのリチウムとホウ素の吸着溶離実験(3)で開発した粒状吸着剤をカラムに詰め、(2)と同様の条件下でカラム吸着溶離実験を行い、地熱水中に共存する成分に対する吸着選択性および操作温度の影響を明らかにした。また、吸着溶離試験後の吸着剤の結晶構造を測定し、吸着剤の構造安定性、耐久性の確認と共にバインダーの地熱水への耐久性と耐熱性についても評価を行った。本研究は地熱水や温泉水から、溶存元素であるリチウムとホウ素のレアメタル2元素を同時に、かつ、高選択的に分離濃縮できる吸着分離剤と分離回収プロセスを開発することを目的として、(1)リチウムとホウ素を選択的に吸着分離できる吸着剤の開発、(2)地熱水からのリチウムとホウ素の吸着分離の基礎データの取得と最適化、(3)高温での操作が可能な吸着剤の新規造粒手法の開発、(4)地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収の基礎実験および実証試験について系統的研究を行っている。本年度は、応用的および実証的研究として、以下の研究を行った。1.地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収の基礎実験平成2324年度の結果を基に、自作の吸着カラムとペリスタリックポンプなどと組み合わせて「レアメタル2元素同時分離回収ミニプラント」を設計・製作した。これを用いて、模擬地熱水をリチウム吸着カラムとホウ素吸着カラムを直列に並べた吸着カラムモジュールへ供給して、リチウムとホウ素の破過挙動、およびこれらの金属を負荷した吸着カラムからの溶離挙動を明らかにした。また、溶離時はカラムを並列に使用し、それぞれのイオンを別々に溶離する方式を採用し、連続式吸着溶離実験より、ターゲット金属/共存金属の選択性や吸脱着速度の温度依存性などを明らかにした。2.実地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収プロセスの実証試験長期間(1ヶ月)に亘る実地熱水からのリチウムとホウ素の選択的分離回収の実証試験を、レアメタル2元素同時分離回収ミニプラントを用いて行い、吸着カラムモジュールの選択的分離特性の変化及び長期間の耐久性について評価した。本年度は、応用的研究として以下の研究を行った。(1)カラム法による模擬地熱水からのリチウムとホウ素の分離回収実験平成23年度の研究で開発した吸着剤を充填したカラムを用いて、模擬地熱水を用いたリチウムとホウ素の分離回収を個別に行った。模擬地熱水中の共存イオンの阻害を抑制しながら、各々の金属を高選択的に分離回収できるよう、供給液速度、吸着後のカラム洗浄(スクラビング)、溶離についての条件の探索を行った。(2)地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収の基礎実験自作の吸着カラムとペリスタリックポンプなどと組み合わせて「地熱水からのレアメタル2元素同時分離回収ミニプラント」を設計・製作した。これを用いて、模擬地熱水からのリチウムとホウ素の吸脱着挙動、共存元素からの分離挙動に対する実験条件(地熱水のpH、温度、流量、溶離液の濃度など)の影響について明らかにした。

具体的には、模擬地熱水をリチウム吸着カラムとホウ素吸着カラムを直列に並べた吸着カラムモジュールへ供給して、リチウムとホウ素の破過挙動、およびこれらの金属を負荷した吸着カラムからの溶離挙動を明らかにした。溶離時はカラムを並列に使用し、それぞれのイオンを別々に溶離する方式を採用した。この連続式吸着溶離実験より、ターゲット金属/共存金属の選択性や吸脱着速度の温度依存性などを明らかにした。本研究は3年計画であり、初年度の基盤的研究、2年度の応用的研究および3年度の実証研究を予定している。平成23年度は吸着剤の開発や吸着特性および高温に耐える造粒法の開発など、ほぼ基盤的研究は完了することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は平成23年度に開発した吸着剤を充填したカラムを用いて実際の地熱水からのリチウムやホウ素の回収の実験とその評価を行うなど、ほぼ応用的研究は完了することができた。平成24年度は、平成23年度に開発した吸着剤を用いて、サンプリングした地熱水からリチウムとホウ素の同時回収に関する実験室規模の研究を行い、操作上の問題点等を明らかにしていき、プロセスの最適化を行う。平成25年度は、平成24年度に引き継ぎカラム分離実験を行うが、リチウムとホウ素の吸着分離の繰り返し実験を行い、吸着剤の安定性や耐久性などについて評価するとともに、地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収プロセスを提案する予定である。平成25年度は、平成24年度に引き継ぎ、サンプリングした地熱水からカラム分離実験を行うが、リチウムとホウ素の吸着分離の繰り返し実験を行い、吸着剤の安定性や耐久性などについて評価するとともに、地熱水からのリチウムとホウ素の同時分離回収プロセスを提案する予定である。
遺伝子発現の可視化と細胞分画による網膜幹細胞の同定と細胞分化系譜の決定

網膜亜集団と遺伝子発現の関係を検討するため最も未分化なSSEA-1陽性プロジェニター細胞、次の発生ステージであるc-kit陽性プロジェニター細胞、いずれも陰性の細胞、の3つの集団について精製した後RNAを抽出しcDNAとして増幅をかけてからDNAchipでの解析をおこない、それぞれの遺伝子発現の包括的なパターンを得た。10個以上のこれらの集団での発現パターンが明らかである遺伝子について検討するといずれも予想どおりの発現パターンを示しており、増幅の過程が良好に行われている事が章かであったので、この結果をもとに、網膜亜集団と遺伝子発現の関係についての解析を開始した。一方で、CD138,CD73は本研究の初年度に行ったCD抗原の網膜における発現のスクリーニングで興味深い発現パターンを示すものとして解析の候補としてあがってきたのでその後の解析を行った。それぞれの空間的発現パターンを免疫染色により様々な発生段階のマウス網膜について解析し、さらにセルソーターで陽性細胞、陰性細胞に分画し、in vitroの解析系によりそれらの細胞集団の増殖能、分化能を検討した。その結果、CD138は顆粒を持たない毛様体細胞に特異的に発現しよいマーカーとなると同時に、また毛様体前駆細胞としての運命決定が網膜発生のかなり初期に行われることを明らかにした。最も未分化な網膜はこのマーカーと、網膜プロジェニター細胞のマーカーの両者を発現しており、まだいずれの運命決定も行なわれていない事が示唆された。一方CD73は視細胞前駆細胞のマーカーであることが明らかになり、この細胞を用いた細胞移植による細胞移植に道を拓いた。事実、マウス胎児網膜体外培養系へCD73陽性細胞を移植すると視細胞への効率のよい分化が観察されたが、in vivoでの眼への移植は効率が悪く、この技術の改善が今後の課題となった。研究計画に従ってBACシステムを用い計画されていた分子のうちChx-10,Lhx-2,glutamine synthetaseについてプロモーター部分を含むBACを入手し、組み換えによりEGFP/creを組み替えたコンストラクトを作製した。トランスジェニックマウスの作製にはいり、生まれたF1についてスクリーニングを行っている。また平行して、これらの遺伝子を含む様々な遺伝子について発現パターンの検討、siRNAによる遺伝子機能消失の実験、過剰発現による機能の検討を行った。siRNAについてはレトロウイルスで単離網膜に導入する系を樹立した。一方で迅速な機能解析のスクリーニング系としてゼブラフィッシュを導入し、モルフォリーノを用いて機能解析を行った。ゼブラフィッシュで網膜発生での役割が示唆された遺伝子についてさらにマウスの系で解析をおこなった結果、膜蛋白質を主体に、網膜発生の増殖、分化に影響を及ぼす複数の因子を同定した。これらの因子については来年度計画されている網膜亜集団の分離による網膜の発生過程の研究につなげる。またWnt, Shh, Notch, FGF/NGF, NF-kBのシグナル経路について、網膜発生過程での活性化状況をそれぞれの標的配列にEGFPをつないだコンストラクトを作製し、網膜体外培養系に導入することで検討している。シグナルによる先に同定した因子群の制御を軸に次年度は網膜発生過程度多次元的に解析する計画でいる。その際用いることを計画しているdsRedマウスに関しては網膜の各発生段階での発現を検討し、次年度の実験に使用できることを確認した。

10個以上のこれらの集団での発現パターンがあきらかである遺伝子について検討するといずれも予想どうりの発現パターンを示しており、増幅の過程が良好に行われている事が章かであったので、この結果をもとに、網膜亜集団と遺伝子発現の関係についての解析を開始した。一方で、CD138,CD73は本研究の初年度に行ったCD抗原の網膜における発現のスクリーニングで興味深い発現パターンを示すものとして解析の候補としてあがってきたのでその後の解析を行った。それぞれの空間的発現パターンを免疫染色により様々な発生段階のマウス網膜について解析し、さらにセルソーターで陽性細胞、陰性細胞に分画し、in vitroの解析系によりそれらの細胞集団の増殖能、分化能を検討した。その結果、CD138は顆粒をもたない毛様体細胞に特異的に発現しよいマーカーとなると同時に、また毛様体前駆細胞としての運命決定が網膜発生のかなり初期に行われることをあきらかにした。最も未分化な網膜はこのマーカーと、網膜プロジェニター細胞のマーカーの両者を発現しており、まだいずれの運命決定も行なわれていない事が示唆された。一方CD73は視細胞前駆細胞のマーカーであることが明らかになり、この細胞を用いた細胞移植による細胞移植に道をひらいた。事実、マウス胎児網膜体外培養系へCD73陽性細胞を移植すると視細胞への効率のよい分化が観察されたが、in vivoでの眼への移植は効率が悪く、この技術の改善が今後の課題となった。
ヒト配偶子受精カルシウム反応の受精能評価法への応用に関する研究

第1に、これまで行ってきた、ヒロ卵における受精時細胞内カルシウム増加反応(受精カルシウム反応)の解析を進めた。方法としては、体外受精・胚移植にて未受精に終わった卵と夫精子とを、患者夫婦の同意を得た後に材料として用い、卵の透明帯を酵素処理にて除去した後に、カルシウム結合制御蛍光色素であるFura 2をAM体の形で卵内に取り込ませ、特定波長をもった異なる2種類の紫外線を照射し、励起される蛍光の強度の比の変化から細胞内カルシウム濃度の変化を観察した。この方法により受精カルシウム反応の出現と、事前に行った体外受精・胚移植における受精率との間に相関が認められるか否かを検討した。体外受精・胚移植における受精率を、未受精群(A群)・受精率の低い群(B群)・受精率の高い群(C群)の3群に分類し、それぞれの群における受精カルシウム反応の出現率をみると、A群では出現率は低く、逆にC群では高く、B群では両者の中間の値をとった。すなわち、受精カルシウム反応の出現率と体外受精・胚移植における受精率とには相関が認められた。体外受精・胚移植における受精率は、精子受精能により規定されるところが大きく、従って受精カルシウム反応は精子受精能の新しい評価法となると考えられた。第2に、別な精子受精能の評価法として、精子のアクリジン・オレンジ染色法の検討を行った。その結果、本法による染色パターンと、体外受精・胚移植における受精率との間に相関が認められた。従って本法も精子受精能評価法として有用であると判断された。以上2つの方法を採用することにより、精子受精能評価がより正確に行えるようになうと期待される。
量子集合論の研究と量子論的様相解釈への応用

量子力学の様相解釈では,所与の状態のもとで同時に所有値を持つと考えられる物理量の集合のうち極大なものを極大存在可能部分環(maximal beable subalgebra)と呼んで,その特徴付けが重要な研究課題とされている。一方,量子集合論では,いくつかの量子集合が所与の状態で可換であることを意味する述語が定義され,ZFCの移行原理では,ZFCの任意の定理の自由変数に量子集合の名前を代入した論理式の真理値は,それらの量子集合がすべて可換であるという論理式の真理値以上であることが示される。本課題では,所与の状態のもとで,ある量子実数の集合が可換であることと,対応する物理量の集合がその状態に対する一つの極大存在可能部分環に属することが同等である事を証明した。このことから,物理量の集合が所与の状態の一つの極大存在可能部分環に属する事と対応する量子実数を定項とするZFCの任意の定理がその状態で成立することが同等であることが示される。様相解釈では,極大存在可能部分環に属する物理量は,その値を決定する隠れた変数が存在すると解釈される。隠れた変数の存在を特徴付ける条件として,従来,Bellの不等式などが提唱されてきたが,本研究では,上述の成果から,隠れた変数の存在を「定項の集合がZFC集合論の任意の定理を満たす」という論理学的条件で特徴付けることができる。1.古典論理結合子の量子論的拡張:古典論理における論理結合子を完備オーソモデュラー束に基づく量子論理に拡張する方法の一般理論を構築した。量子論理において含意などの論理結合子をどう定義するかについては未解決問題とされているが,この理論により含意結合子の候補の広いクラス(一般含意結合子)について統一的な扱いを可能にした。2.量子集合論における移行原理:ブール代数値モデルの構成法と同様の方法で完備オーソモデュラー束に替えて量子集合の普遍類を構成し,完備オーソモデュラー束の一般含意結合子の場合に対して,非有界量化記号を含む一般の論理式で表されるZFC集合論の定理をどう変形したら量子集合論で成立するかを示す移行原理を証明した。これによって,量子集合論における移行原理について完全に一般的な結果を確立した。3.量子集合論における実数の構成:量子論理がフォン・ノイマン代数の射影束の場合,一般含意結合子に対して,量子集合論内部の実数(量子実数)を有理数の切断によって定義し,量子実数の全体がフォン・ノイマン代数にアフィリエイトする自己共役作用素に一対一に対応することを示した。このことにより,一般含意結合子に対して,含意結合子の選択によらずに,量子実数が代数的場の量子論における物理量の概念と同等であることが示された。4.量子集合論における実数論:実数の順序関係について研究した。すべての一般含意結合子に対して,量子実数の等号関係は同等であるが、一方、順序関係については、含意接続詞によって異なる関係が得られることがわかる。とりわけ、順序関係から可換性が導かれ、様相解釈における所有値の大小関係と同等になる順序関係を導く一般含意結合子が、ただ一つ存在することがわかった。今後、異なる一般含意結合子を用いて異なる量子集合論を展開することは、どのような物理的解釈に対応しているのかを研究する計画である。
アロディニア発症の分子機構とその治療薬の開発に関する研究

神経因性疼痛の新しい治療法,治療薬の開発を目的に,脊髄グリシン神経に焦点をあて研究を行った.前年度までに,グリシントランスポーター(GlyTs)阻害薬が異なった神経因性疼痛モデルにおいて等しく抗アロディニア作用,抗痛覚過敏作用を有するだけでなく,急性炎症モデルでも鎮痛効果を現すことを見い出した.さらに,GlyT阻害薬を用いた解析から神経損傷後初期にはグリシン神経の本来の抑制性機能が消失し,むしろ興奮に転じることが疼痛発症の基礎をなすことを示唆してきた.GlyTlKoマウスでは運動神経麻痺が,GlyT2 Koマウスではシナプス小胞のグリシンの涸渇がおこり,びっくり病の表現型が現れることが報告された,これらの説に従えば,GlyTs阻害薬は鎮痛作用を発現するというアイディアには至らない.今年度はGlyTs阻害薬の鎮痛薬としての有用性とこれら矛盾点について検討した.GlyT1阻害薬の鎮痛作用には潜時を必要とした.この潜時はNMDA受容体阻害薬により消失し,グリシンによるNMDA受容体の活性化によることを明らかにした.GlyT2阻害薬の長期間反復投与や脊髄GlyT2ノックダウンでもグリシンの涸渇は起こらず,GlyT2がクリアランスにも機能することを明らかにした.GlyT2阻害薬の長期間持続投与およびGlyT2ノックダウンでもびっくり病様表現型は出現せず,運動の協調性,平衡感覚など運動機能にも変化も観られず,知覚神経のGlyT2阻害薬感受性は運動神経のそれよりも3,000倍も感受性が高いことが明らかになった.以上のことが,これまでの定説に逆らってGlyT阻害薬が運動機能に影響を及ぼすことなく強力な疼痛制御作用を発現する理由と考えられる.特異的GlyTs阻害薬の開発は痛覚伝達の抑制系を強化することで,原因の異なる広範な疼痛患者に対しても有効な治療戦略として期待される.アロディニアallodyniaは本来痛みを伝えない非侵害性の刺激によっても痛みを生じ,神経因性疼痛neuropathic painの主症状として知られる.アロディニアは抜歯,抜髄他外科的処置時の神経損傷や慢性炎症時に生じる長期間持続する痛みの成因となる.アロディニアは難治性で,非ステロイド性抗炎症薬を含む従来の鎮痛薬は有効でない.アロディニアの発症の分子機構は解明されておらず,口腔領域,全身において共通の重要な研究課題である.本研究は,各種神経損傷モデルを用いて,グリシン受容体機能,活性化ミクログリアの係わり,更に,グリシントランスポーター阻害作用を有する薬物に抗アロディニア作用を明らかにし,新規抗アロディニア作用薬,鎮痛薬の開発を目指して企画した.1.マウス坐骨神経部分結紮神経障害モデルを作成した.本モデルにおいて,グリシントランスポーター(GlyT)およびグリシン受容体(GlyR)の発現はウエスタンブロッテイングにおいて変化は見られなかった.活性化ミクログリア(OX-42)は術後3日および5日以降に,2相性に増加していた.2.GlyT1選択的阻害薬,ORG25935,sarcosineの脊髄腔内投与および静脈内投与は,投与後約2時間の潜時の後72-96時間持続する,極めて長時間抗アロディア作用を示した.NMDA受容体グリシン結合部位阻害薬DCK,L-701324は潜時を消失させ,持続時間をさらに延長した.3.Glyt2選択低阻害薬ORG25543,ALX1393は潜時の無い,長時間持続性の抗アロディニ作用を示した.4.これら薬物の静脈内投与による抗アロディニア作用は,グリシン受容体拮抗薬ストリキニーネの脊髄腔内投与により,あるいはGlyRα3siRNAの脊髄腔内投与によりGlyRα3 knockdownすることにより拮抗された.以上,脊髄グリシン神経はGlyRα3を介してアロディニアを制御しており,GlyTs阻害薬はシナプス間隙のグリシン濃度を高めて長時間持続する抗アロディニア作用を発現することが明らかとなった.次年度以降,脊髄GlyTsを標的とした神経因性疼痛の制御機構解明と新規治療薬開発のために研究を発展させたい.アロディニアallodyniaは,本来痛みを伝えない非侵害性の刺激によっても痛みを生じ,神経因性疼痛neuropathic painの主症状として知られている.アロディニアは抜歯,抜髄他外科的処置時の神経損傷や慢性炎症時に生じる長期間持続する痛みの成因となる.アロディニアは難治性で,非ステロイド性抗炎症薬を含む従来の鎮痛薬は有効ではない.アロディニア発症の分子機構は解明されておらず,口腔領域,全身において共通の重要な研究課題である,本研究は,各種神経損傷モデルを用いて,グリシン受容体機能,活性化ミクログリアの係わり,更に,グリシントランスポーター阻害作用を有する薬物の抗アロディニア作用を明らかにし,新規抗アロディニア作用薬,鎮痛薬の開発を目指して企画した.1.マウス坐骨神経部分結紮神経障害モデルにおいて,神経損傷後3日目までで認められる疼痛はグリシン受容体α3をsiRNAを用いてknockdoumすることにより抑制された。しかしながら,神経損傷後4日目以降で認められる疼痛ではグリシンシグナルを賦活化することにより抑制された.2.同モデルにおいて,神経細胞内からクロライドイオンを細胞外に汲み出す蛋白質であるKCC2の発現が神経結紮6時間後から減少していた.この減少は,術後4日目までに回復していた.