hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物起源プロテア-ゼインヒビタ-をモデルとした新規インヒビタ-の設計、合成

体および(3S、4S)体をL-Lys誘導体を出発原料とし5段階反応とシリカゲルカラムクロマトにより単離、調製した。key化合物となる1誘導体の量的合成ルートを種々検討の結果、Boc-L-Lys(z)OMeのLiBH_4によるアルコール体への変換、続くSwern酸化によるアルデヒド体経由のルートが最も有効があった。一方、ノナペプチド(2)を調製のためのペプチドフラグメントの合成を完了した。興味あることに、1の一方のジアステレオマー(3S、4S)体のみが弱いながらTsinを阻害し、阻害能発現に立体構造的因子の重要性が示唆された2.他の物起源プロテアーゼインヒビターンヒビターB-III第1阻害部位を含むBBI型ノナペブチド(3)とB-III型ウンデカペプチド(4)をデザイン、合成。興味あることに、3はTsinのみ、4はTsinとCsinをそれぞれ阻害し、4がB-IIIの最小性発現ユニットであることも明らかにした。3.立体制約性アミノ酸含有Csin阻害ペプチド:一連のCsin阻害ジペプチド類のデザイン、合成を開始した。これら合成ペプチドやその中間体の単離精製分画物(有機酸含有)の低温濃縮には、耐蝕仕様の凍結乾燥装置が極めて有用であった。プロテア-ゼインヒビタ-は生体内プロテア-ゼの制御因子として極めて重要である。そのなか植物起源Bowman-Birkインヒビタ-(BBI)はトリプシン(Tsin)およびキモトリプシン(Csin)を同時に阻害する。そこで、BBIの各阻害部位を含む最小活性発現ユニットに着目し、その阻害部位を酵素親和性を保持、分解不能なジペプチドisostereに置換したペプチドを設計、合成し、その阻害能検討より、より強力で新規なプロテア-ゼ阻害ペプチドの探索、開発を目的とする。1.BBI Tsin阻害部位変換Csin阻害ペプチド:BBIのTsin阻害部位(Lys-Ser)をCsinに特異性の高いTyr-Serとしたノナペプチド(1__)を母体とし、そのscissileペプチド結合をスタチン型ジペプチドisostereに置換したノナペプチドアナロ-グ(2__)を合成目的物とした。(1)ジペプチドisoslere(3__):key化合物となる(3S、4S)および(3R、4S)の3__の調製は、昨年度見い出した有効ル-トによった。(2)ノナペプチド合成:1__および3__を導入した(3S、4S)と(3R、4S)の2__の調製は、液相法によった。(3)合成ペプチドのCsin阻害活性:阻害能を検討の結果、一方のジアステレオマ-3__を含む(3S、4S)ー2__のみがCsinを弱いながら阻害した。これは阻害能発現に立体構造的因子の重要性を示す。さらに母体1__は既知BBI関連ペプチドのうち最強の阻害能(Ki10^<-7>M)を示した。2.立体制約性アミノ酸含有Csin阻害ペプチドの設計、合成:立体制約性デヒドロおよびメタノアミノ酸を含む一連のジペプチドを合成、Csin阻害能、コンホメ-ション解析を行った。
タイ汽水産エビ養殖における疫学および池環境調査-疾病回避型養殖法の開発に向けて

タイで深刻な2種類のエビウイルス性疾病には地域的な発生傾向があり、発生時期も種類によって特徴があった。飼育水からの両ウイルス感染は起こりにくく、養殖池の主要な動植物ベントスにもイエローヘッドウイルス(YHV)は検出されなかった。YHVで死亡したエビ体内のYHV活性は1日後激減した。集約養殖されたウシエビおよびバナメイエビには薬剤耐性菌が検出され、汎用されるオキシテトラサイクリン耐性菌比率は養殖池間で大きく異なり、薬剤投与量を表していると推定された。タイ中部地域における疫学調査タイにおける汽水産エビの疾病の現状を把握するために、バンコク近郊のエビ養殖場にて養殖池の維持形態および疾病の状況について聞き取り調査を行った。タイ中部地方ではウシエビ養殖は皆無になってしまっているため、中南米産のバナメイエビを養殖している業者から聞き取り調査を行った。バンコク、サムサコン、サムプラカン、チャチェンサオ、パトンタニ県にある養殖場14か所にて行った。集約的養殖場6か所、半集約的養殖場が8か所であった。調査を行ったすべての半集約的養殖場は、種苗を入れるが投餌を行わない形態であった。集約半集約に関わらず疾病の経験は在るところが多く、集約的養殖場3件のみ疾病の経験がないという返答だった。疾病の時期は暑気(4月5月)が3件、雨季(10月11月)が5件、時期は不定期が3件と、環境の変動の大きい時期に疾病を受けやすいという結果となった。養殖池底泥細菌相調査エビ養殖池底泥試料の強熱減量(乾燥土壌1gあたりの有機物含量)は、集約養殖池および粗放養殖池で大きな差がなく、8.5%前後の値を示した。熱帯では有機物の分解が早いため、給餌を行わない粗放池と給餌している集約池で有機物量において大きな相違がないことを示している。底泥試料中の生菌数は、集約養殖池が多く、粗放池ではその5分の1程度であった。給餌量に応じて生菌数は変化すると考えられる。土壌微生物群集の炭素源利用能の特性を利用したBIOLOGによる測定では、粗放池では細菌の多様性が高かったが、集約池では利用しやすい炭素源のみを利用する細菌が多く、難分解性の炭素源を分解する菌は乏しいという結果となった。エビに付着する病原微生物量と環境との関係集約池と半集約池の間に薬剤非感受性菌の出現率について明確な差は見られなかったが、高度耐性菌の出現率が前者で高い可能性が示唆された。併せて行った聞き取り調査の結果から、非感受性菌の出現率には養殖池の使用年数が関連していることが示唆された。タイ南部・東部地域における疫学調査および環境要因との関係解明タイ南部では20年以上前から疾病の被害があるが、5年ほど前に当該地域で疾病が大発生し多くの養殖業者がエビ養殖を辞めた後、疾病が起こらなくなりた。40pptを越える高塩分環境下でもYHVD疾病は発生し、雨期乾期に問わず起こることから、YHVDの発生の季節性に関しては明確ではなかった。疾病の被害が少ない地域であると考えられてきたタイ東部においても、WSSDの発生が多く、その多くは冬季であった。WSSVの発生には季節性が強く、気温や水温低下の時期とよく一致していた。さらにこの時期は渡り鳥の数などが多い時期でもあり、それらの鳥類が病原ウィルスを運ぶ可能性があると推察された。疾病には地域性、季節性があることが徐々に明らかとなってきた。養殖池臨地調査富栄養化の進行した底泥では95種類の炭素源基質を資化する菌数に対して増殖速度の高い菌の割合が低下する傾向が認められ、増殖速度の高い菌の割合という指標がエビ養殖池の底泥の健全性を示す指標候補として使用できる可能性が示唆された。一方、エビ集約養殖池9カ所、半集約養殖池3カ所から採取した養殖エビ類について、抗生物質耐性菌(オキシテトラサイクリン:OTC)の分布を検討した結果、耐性菌が一般細菌数に占める割合(%)は、集約養殖池では0.01から52.1%、半集約養殖池では0.2から8%と養殖池間で大きく異なっていた。分離した耐性菌の多くはAeromonas属で、分類学的に食中毒性のグループと区別できなかった。OTCが水産養殖で汎用される薬剤であることを考えると、耐性菌比率が養殖池間で大きく異なっていることは(最大6,000倍以上の差)、各養殖池における投薬頻度や残留薬剤量の違いを間接的に表していると推察された。タイにおいて最も深刻な2種類のウイルス性疾病にはある程度地域的な発生傾向があり,ホワイトスポット病(WSD)は東部を中心に中部・南部でまれに発生するのに対し,YHDは中部・南部で猛威を振るうが東部にはほとんど発生しないことが聞き取り調査により示された。

疾病の発生時期は地域を問わずそれぞれのウイルス病に特徴があり,WSDが低温期から乾季に(2-5月),YHDが雨季の終焉から乾季(10-4月)に発生しやすい傾向にあった。室内実験の結果では,飼育水からの両ウイルス感染は起こりにくく、疾病が発生している養殖池に生息する主要な動植物ベントスにイエローヘッドウイルス(YHV)は検出されなかった。YGDによって死亡したエビ体内のYHV活性は24時間で極端に下がるという結果も得た。上記を総合的に考察した結果,タイ国内で発生している主要ウイルス疾病は地域的にある程度限定された状態で伝播し,疾病を媒介するのは飼育水や池内主要動植物以外の「何者か」すなわち東部と南部を頻繁に行き来するほど長距離を移動しないものである可能性が高いことが示唆された。一方、タイで集約的養殖されたウシエビおよびバナメイエビに付着した薬剤耐性菌の分布実態を調査したところ、いずれにも薬剤耐性菌が検出され、多剤耐性菌もみられることが明らかとなった。水産養殖で汎用される薬剤であるオキシテトラサイクリン耐性菌の一般細菌数に対する各池の比率の範囲はバナメイエビが0.3-52.1%、ウシエビが0.008-22.3%であり、オキシテトラサイクリン耐性菌比率は養殖池間で大きく異なった。これは養殖池への投与薬剤量の差を表していると推定できる。代表的な菌株に対して抗生剤の最小発育阻害濃度を測定したところ、いずれの菌株もオキシテトラサイクリンに対して高い耐性を示し、単離されたオキシテトラサイクリン耐性菌株の約8割が多剤耐性を持っていた。
神経細胞分化に関わる膜貫通型分子の遺伝子クローニングとその発現細胞の同定

神経細胞分化の分子機構は、様々な視点で研究されている。特に、転写調節、RNA転写制御、翻訳後調節や選択的スプライシングによる分化の分子機構の解析は、極めて急速に進展している。一方、中枢神経系において、神経幹細胞分化時期の異なる細胞集団をpositive選択によって単離可能な細胞膜表面抗原の解析については、極めて不十分である。細胞膜表面抗原は、(1)外部シグナルの細胞内への伝達、細胞と細胞および細胞と細胞外マトリックスとの相互作用などの機能を有することと、(2)細胞表面マーカーとして特定の細胞集団の同定に有効であり、さらにその抗原に対する特異的抗体を作製することによって、その抗体を用いて抗原陽性細胞をFACSソート等により生細胞として単離することが可能である。そこで本研究は、神経細胞分化に伴って特異的に発現する細胞膜表面抗原の網羅的な解析とその抗原の機能的解析をP19EC細胞を用いて行った。その結果、RA(+)4細胞に特異的に発現する2つの抗原(分子量約90kDaのRANDAM-1と分子量約40kDaのRANDAM-2)のを特異的に認識するmAb(SKY-1とSKY-2)を得ることに成功した。SKY-1 mAbはRANDAM-1の糖鎖領域を、SKY-2 mAbはRANDAM-2のポリペプチド領域をそれぞれ特異的に認識していた。その詳細な解析から、RANDAM-1は未分化な神経系細胞に、またRANDAM-2は神経細胞系譜に分化する細胞に発現していることが分かった。次に、それぞれの分子の構造と機能について明らかにしていくために、それぞれの抗原の遺伝子クローニングを試みた。SKY-2 mAbを用いたRANDAM-2 cDNAの発現クローニングを行った。その結果、RANDAM-2は、その塩基配列と予想アミノ酸配列から、Schollら(1999)によって報告されたPA.2.26antigen(腫瘍化したケラチノサイトに特異的に発現するシアロムチン様I型糖蛋白質)と完全に一致する分子であった。ホモロジー解析から、RANDAM-2は、マウスのgp38やOTS-8、ラットのE11やpodoplaninならびにイヌのgp40と極めて高いホモノロジーを有していることも判明した。しかしながら、これらの分子の生理的機能については、未だ不明である。RANDAM-2 mRNAは、胎生6.0(E6.0)日で発現が認められ、その領域は中枢神経系に限局していた。RANDAM-2/PA.2.26antigenの神経系における発現時期や、発現領域に関する解析は、本研究が最初である。また、RANDAM-2のneurotransmitter phenotypeの解析から、RANDAM-2陽性神経細胞は、主にグルタミン酸作動性神経細胞であることを明らかにした。以上の結果から、RANDAM-2は、グルタミン酸作動性神経細胞へと分化する細胞系譜に恒常的に発現するI型細胞膜抗原であると結論された。RANDAM-2の神経細胞分化における生理的機能やRANDAM-2陽性未分化神経細胞の単離とその細胞生物学的性状に関する解析については、今後の研究課題であると考えている。

RANDAM-2 mRNAは、胎生6.0(E6.0)日で発現が認められ、その領域は中枢神経系に限局していた。RANDAM-2/PA.2.26antigenの神経系における発現時期や、発現領域に関する解析は、本研究が最初である。また、RANDAM-2のneurotransmitter phenotypeの解析から、RANDAM-2陽性神経細胞は、主にグルタミン酸作動性神経細胞であることを明らかにした。以上の結果から、RANDAM-2は、グルタミン酸作動性神経細胞へと分化する細胞系譜に恒常的に発現するI型細胞膜抗原であると結論された。RANDAM-2の神経細胞分化における生理的機能やRANDAM-2陽性未分化神経細胞の単離とその細胞生物学的性状に関する解析については、今後の研究課題であると考えている。RANDAM-2は、未分化神経系細胞(神経幹細胞や神経前駆細胞)と一部の神経細胞の膜表面に発現する分子量約40kDaの分子として、この分子を特異的に認識するSKY-2モノクローナル抗体(SKY-2 mAb,ラットIgG)を用いた生化学的葎らびに免疫学的解析により同定された。しかし、その機能については不明である。そこで、RANDAM-2の分子構造と神経細胞分化における機能的役割を明らかにするために、SKY-2 mAbを用いてRANDAM-2cDNAの遺伝子クローニングを行った。幾つかのSKY-2 mAb陽性クローンが得られた。解析したクローンは、インサートサイズが1608bpのcDNAを有していた。シークエンスの結果、このcDNAは、172アミノ酸をコードするORFとAATAAA(poly(A)+から14bp上流で、スットップコドンから192bp下流に位置)を含んでいた。RANDAM-2の塩基配列と予想アミノ酸配列は、Schollら(1999)によって報告されたPA2.26antigen(腫瘍化したケラチノサイトに発現するシアロムチン様1型糖蛋白質)と全く一致した。しかし、PA2.26antigenの中枢神経系における発現や機能に関する報告は、今回が最初である。また、RANDAM-2/PA2.26antigenのホモロジー検索を行ったところ、マウス9P38とOTS-8分子、ラットE11とpodoplanin分子ならびに犬gP40分子に高いホモロジ-(70から80%)のあることが判明した。ただし、これらの分子の生理的機能については、未だ不明である。上記のcDNAがRANDAM-2をコードしていることを立証するため、このcDNAの3'側にFLAGタグを付けて、COS7細胞にRANDAM-2/FLAG融合蛋白質として発現させ、anti-FLAG抗体とSKY-2 mAbを用いたIP/Western blottingを行った。その結果、得られたcDNAは、RANDAM-2をコードしていることが確認できた。得られたRANDAM
アストロサイトによる疼痛ネットワークのスクラップ＆ビルド

脳神経回路のスクラップ&ビルドは「臨界期」に集中するが、種々の脳疾患モデルでは成熟脳でも頻繁に認められる。これらには、グリア細胞「アストロサイト」が中心的な役割を果たす。本研究では、アストロサイト依存的な(1)シナプス新生、及び(2)シナプス除去、の分子メカニズムを、それぞれの候補分子をアストロサイト特異的に欠損した動物を用いて明らかにする。さらに、アストロサイトがこれら方向性が180度異なるイベントをどのように使い分けるのか、その(3)スイッチングメカニズム解明にも挑戦する。本研究により、神経回路スクラップ&ビルドのアストロサイト依存的メカニズムが解明されることが期待される。
単一参照プロセスの検出による関数プログラムの並列実行性能の改善

関数プログラミング言語では,プログラムは決定的であり,制御を陽に指定する必要がない.また割り付けや割り当てはシステム側が指定でき,プログラムの可搬性が保たれる.申請者は,単一参照プロセス(一度しか参照されないプロセス)は,実際には,計算結果をブロードキャストする必要がないため,これを予め検出しておけば,関数プログラムの並列実行性能を改善できることに着目し,抽象解釈によって単一参照プロセスを検出するための算法を提案している.本研究では,まず,既存の計算機や記憶装置を使用して,関数プログラムの分散並列実行に利用できる解析技法である,単一参照プロセス検出のための算法を実現した.さらに,新たに調達したワークステーション上に,広く使用されている関数プログラミング言語Haskellの処理系を実現し,これに従来からある必須性解析や共有解析といった手法に,単一参照プロセスの情報を組合わせて利用できるシステムを開発した.また,並列実行を実現するための相互結合網としてハイパキューブを選び,その通信性能の改善を試みた.以上の内容を各種学会の全国大会,研究会および国際会議で発表した.現在は,今後も引続き発表するべく準備を行っている.また,ベンチマーク用のプログラムを利用して,実現した処理系の性能を評価し,各パラメータを調整中である.関数プログラミング言語では,プログラムは決定的であり,制御を陽に指定する必要がない.また割り付けや割り当てはシステム側が指定でき,プログラムの可搬性が保たれる.研究代表者は,単一参照プロセス(他のプロセスから高々一度しか参照されないプロセス)は,実際には,計算結果をブロードキャストする必要がないため,これを予め検出しておけば,関数プログラムの並列実行性能を改善できることに着目し,抽象解釈によって単一参照プロセスを検出するための算法を提案している.本研究では,まず単純な関数プログラミング言語を定義した.次に,これを処理するシステムをScheme言語を用いて記述し,単一参照プロセスを検出する算法を,逐次型計算モデルによるシミュレータ上に実現した.さらに,これと並行して分散並列計算実験用のシミュレータを構成するため,ハイパキューブ結合網を対象に,経路選択算法と,その耐故障性能の向上をはかった.今後は関数プログラムを分散並列実行する際に,従来からある必須性解析や共有解析といった手法に,単一参照プロセスの情報を組合わせて利用できるシステムを開発し,その性能を評価する予定である.関数プログラミング言語では,プログラムは決定的であり,制御を陽に指定する必要がない.また割り付けや割り当てはシステム側が指定でき,プログラムの可搬性が保たれる.申請者は,単一参照プロセス(一度しか参照されないプロセス)は,実際には,計算結果をブロードキャストする必要がないため,これを予め検出しておけば,関数プログラムの並列実行性能を改善できることに着目し,抽象解釈によって単一参照プロセスを検出するための算法を提案している.本研究では,まず,既存の計算機や記憶装置を使用して,関数プログラムの分散並列実行に利用できる解析技法である,単一参照プロセス検出のための算法を実現した.さらに,新たに調達したワークステーション上に,広く使用されている関数プログラミング言語Haskellの処理系を実現し,これに従来からある必須性解析や共有解析といった手法に,単一参照プロセスの情報を組合わせて利用できるシステムを開発した.また,並列実行を実現するための相互結合網としてハイパキューブを選び,その通信性能の改善を試みた.以上の内容を各種学会の全国大会,研究会および国際会議で発表した.現在は,今後も引続き発表するべく準備を行っている.また,ベンチマーク用のプログラムを利用して,実現した処理系の性能を評価し,各パラメータを調整中である.
微細加工技術により作製したナノ空間におけるタンパク質機能の解明

生細胞の中は、生体分子が細胞体積の2040%をも占める、いわゆる分子クラウディング状態にある。このような直径わずか数十μm程度の空間内に様々な分子が高度に詰め込まれた状態においても、DNAやタンパク質などの生体高分子は、時空間的に高度に連携を取りながらその機能を発現していることは圧巻である。この細胞内システムを人工的なマイクロ・ナノ構造体を取り入れることで模倣して再現できれば、細胞内システムのより深い理解が進むだけでなく、新しい機能を創発できる可能性がある。本研究では、細胞もしくは核やミトコンドリアなどの様々な細胞小器官が有する「空間サイズ」に着目し、精密にサイズが制御されたナノ空間を人工的に作り出し、その中でのタンパク質機能を解析すると同時に、その機能を制御することを目指して行った。今年度は、シリコンマスターからPDMSにマイクロ・ナノチャンバーを転写したものを作製し、β-ガラクトシダーゼの酵素活性測定を行った。その結果、反応容器サイズの縮小に伴って酵素活性が低下する現象が数fLから500fL(直径が数百nmから10μmのチャンバー)程度までの間で広く観察された。このような微小空間においては、酵素分子のマイクロ・ナノチャンバー壁面への吸着の影響が考えられることから、吸着を防止する表面コーティングなどを施して同様の計測を行ったが、特に改善は見られなかったことから、単なる酵素分子の壁面への吸着ではなく、何らかの「サイズ効果」が関与していることを示唆する結果を得た。本年度は、現状の実験系が抱える種々の問題点を解消するための新規極微量チャンバーの試作と評価、さらには酵素分子が基板表面へ吸着するのを防ぐためのコーティング法の検討を行った。具体的には、新規極微量チャンバーの試作と評価に関しては、PDMSシートの柔軟性を利用することで、空気圧を利用して計測対象となる酵素溶液をチャンバーの中に封入できるようなデバイスを試作した。これを用いて蛍光ナノ粒子や酵素溶液の封入を試みたところ、チャンバー外へ溶液が漏れるといったことなく、封入できることが分かった。しかしながら、チャンバーの位置する領域によってかかる空気圧が若干異なるためか、チャンバーの位置によってチャンバーサイズが異なる現象が観察された。今後は、均等な空気圧がかかるように、デバイスの構造を改善する予定である。一方、酵素分子が基板表面へ吸着するのを防ぐためのコーティング法として、Poly (N-hydroxyethyl acrylamide)をガラス基板とチャンバーにダイナミックコーティングした後、酵素活性測定を行ったところ、各サイズのチャンバーにおいて酵素活性の若干の向上は見られたものの、依然としてチャンバーサイズに応じて酵素活性が低下していく傾向が観察された。以上のことを踏まえて、今後はより定量的なデータを取得するためのデバイスの改良と同時に、封入後の酵素分子を再度取り出して酵素活性を測定するなど、空間サイズが酵素活性に与える影響の本質に迫っていく予定である。
トランスポゾンを用いたアクティベーションタギング系の開発と応用

本研究においては、シロイヌナズナの個体レベルでの変異形質の選抜を可能にする新規activationtagging(AT)系を確立し、植物ホルモンのシグナル伝達系の解析に応用することを目的としている。昨年度作成した数種のトランスポゾン型のAT用タギングエレメントのシロイヌナズナにおける転位様式をPCR,サザンブロッティングにより解析した.タバコの場合と異なりシロイヌナズナでは転位の指標となるスペクチノマイシン耐性遺伝子が正常に機能せず、また,ゲノム解析ではsomaticとgerminal転位の区別が明瞭でないため,germinal転位率を算出する事が出来なかった。転位によって生じるemptydonorsiteの検出率が高かったREH-Cと名付けたタグエレメントをその後の研究に使用することに決定し,本エレメントを導入した約2000の形質転換体及びその後代種子を調製した.これらのトランスポゾンの転位により新たな変異を含んでいると考えられる後代種子およびストックセンターより入手可能なT-DNA ATラインを対象に胚軸伸長に関わる変異体のスクリーニングを行った.その結果,通常の栽培条件下で野生型より長い胚軸を有する変異体が1種得られた.形質転換マーカーや形質の遺伝学的解析により,この変異は劣性であり,挿入されたT-DNAによる可能性が高いことが示された.プラスミドレスキューによりT-DNA近傍にゲノムDNAを回収し,シーケンス解析をしたところ,2個以上のT-DNAが複雑な挿入様式で導入されていることが判明した.また,これまでに配列が決定された約600bpの領域には既知の配列との相同性が認められなかった.優性の変異体を得るべく,さらに種々のスクリーニングを継続している.本研究は植物の個体レベルでの変異形質の選抜を可能にする新規アクティベーションタギング(AT)系を確立し、植物ホルモンのシグナル伝達系の解析に応用することを目的としており、本年度はAc/Ds系トランスポゾンを用いたATエレメントを調製し、植物中でのトランスポゾンの転位頻度等、調製したエレメントの性質を明らかにし、タギングを行う上での実用性を検討した。自己安定化型のAc/Ds系トランスポゾンを用いて、新規AT用エレメントを作製した。形質転換、転位、再挿入のマーカー遺伝子を持つ上に、プラスミドレスキューにより、挿入位置近傍のゲノムDNAの回収が可能である。これらをAc/Ds系トランスポゾンが転位しやすいタバコおよび実験植物として数々の利点を有するシロイヌナズナに導入した。形質転換体第一世代におけるソマティック転位および第一世代から第二世代にかけてのジャーミナル転位の有無を解析した。タバコにおいては形質転換第一世代の葉におけるソマティック転位をPCRおよびサザン解析により確認した。また、自家受粉により得られた第二世代のゲノムDNAのPCR解析により、約25から90%の頻度でジャミナール転位が起こっていることが判明した。また、シロイヌナズナにおいても一部の形質転換体でソマティック転位が確認された。これらの結果より、少なくともタギングエレメント内の各ユニットの遺伝子が両植物で機能していることが証明された。現在、シロイヌナズナにおけるジャミナール転位の頻度等を明らかにすべく解析結果を集積している。これらの解析を通して、約700の形質転換体ストックを得たが、その中に花成時期の早まるものや遅くなるもの、また致死的なものなどの変異形質を持つものが観察されている。転位によって生じるemptydonorsiteの検出率が高かったREH-Cと名付けたタグエレメントをその後の研究に使用することに決定し,本エレメントを導入した約2000の形質転換体及びその後代種子を調製した.これらのトランスポゾンの転位により新たな変異を含んでいると考えられる後代種子およびストックセンターより入手可能なT-DNA ATラインを対象に胚軸伸長に関わる変異体のスクリーニングを行った.その結果,通常の栽培条件下で野生型より長い胚軸を有する変異体が1種得られた.形質転換マーカーや形質の遺伝学的解析により,この変異は劣性であり,挿入されたT-DNAによる可能性が高いことが示された.プラスミドレスキューによりT-DNA近傍にゲノムDNAを回収し,シーケンス解析をしたところ,2個以上のT-DNAが複雑な挿入様式で導入されていることが判明した.また,これまでに配列が決定された約600bpの領域には既知の配列との相同性が認められなかった.優性の変異体を得るべく,さらに種々のスクリーニングを継続している.
NAD結合型脱水素酵素の反応機構と利用に関する研究

1.ホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)の精製と性質.Pseudomonas putida F61よりFDMを大量にしかも結晶状に単離する方法を確立した.本酵素の分子量は18万で, 4つの同一分子量サブユニットから成り,サブユニットあたり1分子のNAD(H)と2原子の亜鉛を含んでいた.2.FDMの反応機構,結晶酵素標品を用いた酵素反応速度論の検討より,本酵素とNAD(H)との結合は非共有結合的ではあるものの極めて強く,外から加えたNAD(H)およびそのアナログとは交換しない.またアルデヒドの不均化では,酸化と還元のどちらの側からも反応が開始し,酵素に結合した補酵素はNAD:NADHの比が1:1に近ずいた.本酵素の基質特異性および各々の基質に対する親和力は,半反応(酸化反応)だけで見るかぎり,従来のNAD関与のアルコール脱水素酵素と類似であるが,反応全体で考えると,アルコール:アルデヒド酸化還元酵素(EC1.1.99.X)と分類される新型酵素である.3.FDMの固定化とメタノールからのギ酸生成. FDMはウレタンプレポリマーで包摂固定化することによって安定性が向上した.また,メタノール資化性酵母Hanse polymorphaのアルコールオキシダーゼとカタラーゼとを同時に固定化することによってメタノールからギ酸への変換に利用できた.さらに, P.putideとH.polymorphaの菌体を固定化することによって触媒能の安定性えを著しく向上させることができた.この生体触媒系はC1からC4の一級アルコルから相当する酸への変換に利用できる.4.NAD結合型ギ酸脱水素酵素の利用.ギ酸脱水素酵素に化学的手法でスペーサーを介してNADを結合させたものは,各種の脱水素酵素と共役し,その結合した. NADを共通の補酵素として利用した.そのうちロイシン脱水素酵素の場合は,ギ酸, 2-オキソイソカプロン酸,アンモニア,ギ酸から定量的にロイシンを合成することができた.1.ホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)の精製と性質.Pseudomonas putida F61よりFDMを大量にしかも結晶状に単離する方法を確立した.本酵素の分子量は18万で, 4つの同一分子量サブユニットから成り,サブユニットあたり1分子のNAD(H)と2原子の亜鉛を含んでいた.2.FDMの反応機構,結晶酵素標品を用いた酵素反応速度論の検討より,本酵素とNAD(H)との結合は非共有結合的ではあるものの極めて強く,外から加えたNAD(H)およびそのアナログとは交換しない.またアルデヒドの不均化では,酸化と還元のどちらの側からも反応が開始し,酵素に結合した補酵素はNAD:NADHの比が1:1に近ずいた.本酵素の基質特異性および各々の基質に対する親和力は,半反応(酸化反応)だけで見るかぎり,従来のNAD関与のアルコール脱水素酵素と類似であるが,反応全体で考えると,アルコール:アルデヒド酸化還元酵素(EC1.1.99.X)と分類される新型酵素である.3.FDMの固定化とメタノールからのギ酸生成. FDMはウレタンプレポリマーで包摂固定化することによって安定性が向上した.また,メタノール資化性酵母Hanse polymorphaのアルコールオキシダーゼとカタラーゼとを同時に固定化することによってメタノールからギ酸への変換に利用できた.さらに, P.putideとH.polymorphaの菌体を固定化することによって触媒能の安定性えを著しく向上させることができた.この生体触媒系はC1からC4の一級アルコルから相当する酸への変換に利用できる.4.NAD結合型ギ酸脱水素酵素の利用.ギ酸脱水素酵素に化学的手法でスペーサーを介してNADを結合させたものは,各種の脱水素酵素と共役し,その結合した. NADを共通の補酵素として利用した.そのうちロイシン脱水素酵素の場合は,ギ酸, 2-オキソイソカプロン酸,アンモニア,ギ酸から定量的にロイシンを合成することができた.1.Pseudomonas putidaの固定化菌体を用いるクロス不均化反応。菌体の固定化はウレタンプレポリマー法およびポリアクリルアミド法などの包摂法を適用し、固定化法の良否はホルムアルデヒド不均化活性で判定した。菌体を固定化しないものにくらべ、反応速度は2/3程度に減ずるが、両固定化法ともに活性は1ケ月間安定に保持された。また菌体反応と同様にホルムアルデヒドと各種アルデヒド間でクロス不均化反応がほゞ理論収率で起ったが、アクロレインの場合には、マトリックスからの菌体の漏出が認められた。2.電解酸化によるアルコールからアルデヒドの生成。結晶状に精製したホルムアルデヒドジスムターゼをグラスカーボン電極に付着固定化し、酵素中に含まれる補酵素NADHを電気化学的に酸化再生してアルコールの酸化を行った。サイクリックボルタモグラフィーでは、NADHの酸化に相当する600mVでの電流値の増加を伴う特徴的な波形を描いた。また0.3Mブタノールを基質とし、900mV,1時間の通電で30mMのブチルアルデヒドが生成した。これらのことによって、不均化反応がNAD(H)の酸化還元によることが証明できた。3.NAD結合型脱水素酵素の調製。乳酸,ギ酸,グルコース各脱水素酵素に【N^6】-

〔N-(6-aminohexyl)carbamoyl methyl〕NADを結合させ、これと第2のNAD関与脱水素酵素との間で、NADを外部から添加せずに、2種の酸化還元反応を同時に行うことができた。NAD結合ギ酸脱水素酵素では、遊離の酵素にくらべて比活性が約20%上昇した。NAD結合量はサブユニットあたり0.2モルであった。この修飾酵素は乳酸,アラニン,リンゴ酸,ロイシン脱水素酵素と共役した。すなわち、ギ酸の酸化に伴って生ずる酵素と結合したまゝのNADHが第2の酵素の還元反応に利用されるものである。2-オキソイソカプロン酸を還元するロイシン脱水素酵素とのカップリングによって、10時間で50mMのロイシンが定量的に生成した。
ゼラチン-GPSMを用いた新しい脳梗塞再生治療

前年度までの研究で、新規生体素材「ゼラチンーGMSM」の埋入により、血管内皮、アストロサイト、ミクロダリアが素材内に新生していることが確認された。その一方、神経細胞の新生は認められなかった。このことは、現方法のままでは神経細胞を有する正常脳の組織再生が不可能であることを示している。この点については、(1)生体素材に間題があった、(2)添加した成長因子(bFGFおよびEGF)が不適切であった、等の可能性が考えられる。その結果、血管内皮、アストロサイト、ミクロダリアの新生は認めた。一部はBrdU取り込みを認め、物理的に脳の変形を生じて侵入した組織ではないことが分かった。その一方、やはり本方法でも神経細胞の新生は認められなかった。神経新生を生じさせるためには、さらにより最適な成長因子cocktailの作成などを開発していく必要がある。コントロール群では新しい組織は認められなかったが、担体埋入群では担体周囲の孔内へ組織の侵入が認められ、主に脳梁周囲に形成されていた。担体内組織の体積は、含浸したbFGFとEGFの用量依存性に増加し、また、脳欠損30日後に担体埋入群は、欠損直後に埋入群より担体内組織の形成は少なかった。担体内組織内にNAGO陽性細胞、GFAP陽性細胞、Iba1陽性細胞が認められ、特にGFAP陽性細胞が多く認められた。3種類の細胞はどの実験群においても担体内組織で同様の分布であった。しかし、神経細胞はどの群においても認められなかった。また、BrdU陽性細胞も脳欠損直後に担体を埋入した群においてbFGFとEGFの用量依存性に増加した。ゼラチン-GPSMは中枢神経系の損傷部位に対して生体親和性を持ち、bFGFとEGFの併用により、脳組織再構築の有用な足場として機能する可能性があることを示した。
コヒーシンアセチル化酵素による転写調節機構の解明

コヒーシンアセチル化酵素ESCO2が、DNA複製前にMCMと直接結合することにより染色体にリクルートされ、安定化すること、複製終了後、VPRBP-CUL4及びAPCユビキチンリガーゼを介したプロテアソーム経路により完全に分解されることに関しての成果をまとめCurrent Biology誌にて報告した。その研究をさらに進め、ESCO2がCDKによりリン酸化される部位を同定し、このリン酸化はMCMとの結合には影響なく、非リン酸化型ESCO2のタンパクは不安定な傾向を、リン酸化型は安定的な傾向を示し、リン酸化がESCO2のタンパク制御に寄与することを明らかにした。In vitro転写反応系を用いてタンパクの動態を解析した結果、コヒーシンローダーは、アクチベータGAL4VP16に依存してメディエーターを含む転写開始前複合体に会合し、転写が活性化され、伸長反応が進行するとその複合体から乖離した。この動態は、TP53やVDRアクチベータドメインでも見られた一方で、ERでは見られなかった。また、コヒーシンローダーの会合反応はAFF4を含むSECと競合的に起こる可能性が示唆される結果が得られた。さらに、培養細胞をCDK9阻害剤で処理すると、転写伸長への移行が抑制される転写の一時停止状態になるが、このとき、エンハンサー領域やプロモーター領域に局在するコヒーシンローダーの増加とその結合量の増加が観察され、in vitroと同様の結果が得られた。このことからコヒーシンローダーは、SECが働く前に転写活性化の領域にリクルートされ、その後CDK9活性化に伴い、活性が抑制されることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。コヒーシンアセチル化酵素の一つであるEsco2がどのような因子と結合するかについて、質量分析装置により網羅的に解析した。クロマチンに結合するEsco2は、Mcmの構成因子すべてと、それに加えスコアが低いもののGINS、Cdc45との結合が見えた。一方で、可溶性のEsco2(クロマチン非結合分画)では、いまのところ興味深い結合因子を捉えることが出来なかった。さらに、ChIP-seq解析からも、Esco2の局在動態は、S期進行に伴った複製Mcmの局在と強い相関が見られた。また、Esco2は、DNA複製前やG1期後期抑制剤ミモシン添加時にも、クロマチンへの結合が見られた。ヒト培養細胞では、Mcmの結合は分裂後、G1初期よりDNAに結合する。加えて、Mcmとの結合できないEsco2変異型やMcmのノックダウンによりEsco2そのものが不安定化する。以上のことは、Esco2の活性発揮には、Mcmとの結合が必須である事を示唆している。一方で、Esco2は、DNA複製後、特に分裂期にはEsco2が消失する。この消失は、複製終了後、Mcmの機能停止、クロマチンからの乖離と共に積極的に分解されていると思われ、実際、この分解にはCul4ユビキチンリガーゼ複合体により引き起こされることを示した。さらに、Cul4リガーゼの基質認識因子は、非常に多くの因子が存在することが、その中の一つ少なくともVPRBPがEsco2の分解を誘導する事を示した。Escoの精製タンパク、in vitroのアッセイ系が順調に調製でき、また、in vivoからEscoの相互作用因子の同定実験の確立できた。エンハンサー(5xGAL4UAS)及びプロモーターを持つDNAを利用したin vitro転写反応系では、コヒーシンローダーNipbl-Mau2は、アクチベーターに依存し転写開始前複合体と共にDNAに結合する。この結合には転写に必要なCDKの活性は必要とせず、エンハンサーとプロモーター間の距離が500bpまでは離れていても変化は見られなかった。コヒーシンローダーは、エンハンサーのみに依存しDNAに会合すること、in vitroで形成した複合体からの精製でメディエーター複合体のkinase moduleと強い相互作用が見られた。コヒーシンローダーは、mediator複合体を介してPIC複合体形成制御に関わり、その後に続くRNApol2の活性の厳密な制御に関わる可能性を示した。コヒーシンのアセチル化酵素の一つESCO2は、MCMと相互作用し、安定化する。この相互作用に、CDC7やCDK2の活性は必要なく、複製開始前にすでにクロマチンに結合したMCMにESCO2は結合し、安定化することが新たに分かった。反対にDNA複製後のMCMから乖離したEsco2は、Cul4-VPRBPユビキチン経路により分解される。実際、ESCO2とVPRBPの相互作用が見られ、G2期とCUL4ノックダウン下ではその結合量の増加が見られた。さらに、Cul4の分解を抑制すると、G1期に持ち越されたEsco2がAPC経路により分解される事が明らかとなった。In vitro転写系から精製し、質量分析装置により網羅的に解析する手法を確立できた。またEsco2の精製から相互作用の同定とその制御機構の新たな知見を得る事に成功し、論文投稿まで進める事が出来た。また、この成果は、新たなコヒーシンアセチル化制御メカニズムの解明へ切り込む一歩となり、次の研究の展開が期待できるものであった。

その研究をさらに進め、ESCO2がCDKによりリン酸化される部位を同定し、このリン酸化はMCMとの結合には影響なく、非リン酸化型ESCO2のタンパクは不安定な傾向を、リン酸化型は安定的な傾向を示し、リン酸化がESCO2のタンパク制御に寄与することを明らかにした。In vitro転写反応系を用いてタンパクの動態を解析した結果、コヒーシンローダーは、アクチベータGAL4VP16に依存してメディエーターを含む転写開始前複合体に会合し、転写が活性化され、伸長反応が進行するとその複合体から乖離した。この動態は、TP53やVDRアクチベータドメインでも見られた一方で、ERでは見られなかった。また、コヒーシンローダーの会合反応はAFF4を含むSECと競合的に起こる可能性が示唆される結果が得られた。さらに、培養細胞をCDK9阻害剤で処理すると、転写伸長への移行が抑制される転写の一時停止状態になるが、このとき、エンハンサー領域やプロモーター領域に局在するコヒーシンローダーの増加とその結合量の増加が観察され、in vitroと同様の結果が得られた。このことからコヒーシンローダーは、SECが働く前に転写活性化の領域にリクルートされ、その後CDK9活性化に伴い、活性が抑制されることが示唆された。Esco2に関しては、これまでの結果についてより詳細に解析をつめる。また、新たな条件下での相互因子の同定を行う。Esco1に関して、in vitro系に組み込み、相互作用因子の同定、コヒーシンのアセチル化機構の解析を行う。In vitro系を用いたタンパク質精製を利用し、転写制御におけるタンパク質のネットワークを明らかにする。また、Esco1とEsco2に関しては細胞レベルで細胞周期同調及び転写阻害の系で新たな因子の精製、またEscoノックダウン下でのコヒーシン、ローダー及びCTCFに結合する相互作用因子の探索を行う。また、これまでの成果を踏まえEsco2のMCM非結合変異、分解抑制変異など、制御に必要なドメインを同定する。以上の研究により新たに同定されたタンパク質について、コヒーシン(アセチル化)局在、転写活性、染色体構造に対しての影響を検証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
BCL6とAP-1遺伝子群による血球分化と機能制御

1.赤芽球系分化におけるBCL6の役割:マウス赤芽球においては、好塩基性赤芽球(TER119^<high>CD71^<high>)においてBCL6 mRNAが強く発現しており、BCL6欠損マウス新生仔においては、脾臓中の好塩基性赤芽球数と網状赤血球数が優位に減少していたことから、赤芽球の細胞分裂が盛んな好塩基性赤芽球段階においてBCL6が必要であることを示した。また、赤芽球においては、ABCG-2が強発現していることを見出した。今後、BCL6がABCG-2の発現を制御している可能性について研究を進めていく予定である。2.樹状細胞におけるBCL6の役割:BCL6欠損マウスでは、脾臓中の樹状細胞の数が著しく減少していた。樹状細胞のうちCD8陽性樹状細胞が特異的に欠損していた。CD8陽性樹状細胞は、抗原提示機能以外にIL-12産生を通して免疫系を制御していることが知られており、BCL6はCD8陽性樹状細胞の分化に重要な役割を果たしていることが示唆された。3.体細胞突然変異におけるADAR1の役割とBCL6による制御:BCL6欠損マウス由来のIgG1陽性B細胞の体細胞突然変異の頻度は、野生型マウスと比べて亢進し、BCL6欠損マウス由来B細胞では、アデノシンデアミナーゼ活性を持つRNA修飾酵素ADAR1の発現が亢進していた。更に、ADAR1のプロモーター解析により、ADAR1がBCL6の標的遺伝子のひとつであることが判明した。ADAR1は、胚中心B細胞においてAdenineからGuanineへの体細胞突然変異に関係しており、その機能はBCL6により制御されていることが示唆された。5.c-Fos欠損マウス脾臓における造血ニッチの解析:c-Fos欠損マウスは、破骨細胞の欠損により骨大理石病になるため、脾臓において髄外造血を行う。骨髄では、未分化な造血幹細胞は骨芽細胞と接してニッチを形成しているが、脾臓では骨芽細胞は存在しない。また、未分化な造血幹細胞の周囲に巨核球様細胞が多数存在し、これらの細胞が造血幹細胞の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。BCL6遺伝子群とAP-1遺伝子群とは、共に細胞刺激時のごく初期に広範に発現する前初期遺伝子群(Immediate early genes)であり、細胞の分化・増殖・アポトーシス・癌化に極めて重要な働きをする転写因子群であり、実際、これらの遺伝子の異常は様々な細胞系譜において異常を起こすことが知られている。本研究では、造血系におけるBCL6・AP-1遺伝子群の機能とその破綻による腫瘍化及びBCL6・AP-1遺伝子群クロストークを明らかにすることを目的に研究を行っている。平成18年度は、特に樹状細胞分化におけるBCL6の役割について検討した。その結果、BCL6欠損マウスの脾臓においては、形質細胞性樹状細胞は正常であるが、CD11c陽性の樹状細胞が減少していることを見出した。

その原因は、CD8陽性樹状細胞が欠失しているためであった。BCL6欠損マウスとGFPトランスジェニックマウスを交配して、BCL6欠損GFPトランスジェニックマウスを作製した。本マウスの造血幹細胞を正常マウスに移植し、GFPの発現を指標に造血幹細胞から樹状細胞への分化をみたところ、CD8陽性樹状細胞が分化してこなかったことから、樹状細胞分化異常がBCL6欠損による内在的なものであり、BCL6はCD8陽性樹状細胞に必須の因子であることが判明した。1.赤芽球系分化におけるBCL6の役割:マウス赤芽球においては、好塩基性赤芽球(TER119^<high>CD71^<high>)においてBCL6 mRNAが強く発現しており、BCL6欠損マウス新生仔においては、脾臓中の好塩基性赤芽球数と網状赤血球数が優位に減少していたことから、赤芽球の細胞分裂が盛んな好塩基性赤芽球段階においてBCL6が必要であることを示した。また、赤芽球においては、ABCG-2が強発現していることを見出した。今後、BCL6がABCG-2の発現を制御している可能性について研究を進めていく予定である。2.体細胞突然変異におけるADAR1の役割とBCL6による制御:BCL6欠損マウス由来のIgG1陽性B細胞の体細胞突然変異の頻度は、野生型マウスと比べて亢進し、BCL6欠損マウス由来B細胞では、アデノシンデアミナーゼ活性を持つRNA修飾酵素ADAR1の発現が亢進していた。更に、ADAR1のプロモーター解析により、ADAR1がBCL6の標的遺伝子のひとつであることが判明した。ADAR1は、胚中心B細胞においてAdenineからGuanineへの体細胞突然変異に関係し、その機能はBCL6により制御されていることが示唆された。4.c-Fos欠損マウス脾臓における造血ニッチの解析:c-Fos欠損マウスは、破骨細胞の欠損により骨大理石病になるため、脾臓において髄外造血を行う。骨髄では、未分化な造血幹細胞は骨芽細胞と接してニッチを形成しているが、脾臓では骨芽細胞は存在しない。また、未分化な造血幹細胞の周囲に巨核球様細胞が多数存在し、これらの細胞が造血幹細胞の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。
トランスクリプトームの網羅的解析によるクロマツのマツ材線虫病抵抗性要因の解明

マツ材線虫病抵抗性個体の保有する抵抗性要因を明らかにするために,トランスクリプトーム解析によって抵抗性クロマツの線虫に対する反応を明らかにし,抵抗性要因の解明を試み,次の研究成果を得た。1.改良LongSAGE法によるマツ材線虫病抵抗性クロマツのトランスクリプトーム解析抵抗性クロマツの線虫に対する反応を明らかにするために,線虫接種3日後のトランスクリプトーム解析を行った。改良LongSAGE法を用いて4つの発現遺伝子ライブラリー(各約5200タグ)を構築し,ライブラリー間で比較することで発現量の変化した遺伝子を評価した。その結果,抵抗性と非抵抗性クロマツでは線虫に対する反応が異なることが明らかになった。抵抗性クロマツでは,活性酸素の除去が効率よく行われていると推定された。一方,非抵抗性クロマツでは,活性酸素の集積やPRタンパク質の発現などの防御反応が進み,これらの反応によって枯死に至ると推定された。2.SAGEタグ情報を用いたcDNA 3'末端のシークエンスさらに,遺伝子機能が未明の発現遺伝子について,タグ塩基配列をプライマーとしたPCR増幅を行い,cDNAの3'末端のシークエンスを試みた。その結果,遺伝子機能が特定できなかったものについても,いくつかの遺伝子で機能を推定することができた。改良LongSAGE法による分析の結果,異なる発現パターンが観察された5つの遺伝子を対象にqRT-PCR法を行った。その結果,改良LongSAGE法とで同じ結果(発現量の増加・減少)が得られたことから本研究成果の信頼性は高いと考える。マツ材線虫病は、伝播者マツノマダラカミキリによって運ばれるマツノザイセンチュウ(以下、線虫)がマツ樹体内に侵入することによって発病する。マツ材線虫病に対する抵抗性は複数の要因(遺伝子)によって支配されていると推定されている。各抵抗性クロマツクローンの持つ抵抗性要因を明らかにすることは、今後の育種戦略を策定する上でも、また、抵抗性メカニズムの解明のためにも意義のあることである。線虫の増殖抑制は抵抗性要因の一つとして考えられている。そこで今回、抵抗性と非選抜(以下、非抵抗性)個体への線虫接種を行い、6日後に線虫頭数を調査した。その方法として、木材中より線虫DNAの直接抽出法と、Real-time PCR法を用いた線虫頭数の定量法を確立した。これによって、木材から直接、高い精度で線虫の定量を行えるようになった。分析の結果、抵抗性グループと非抵抗性グループ間では線虫増殖に有意差は認められなかった。しかし、線虫増殖は個体間で異なっており、さらに個体と組織(木部と樹皮)間で相互作用があることが明らかになった。抵抗性クローンには、木部のみで線虫増殖が抑制されているもの、樹皮のみで抑制されているもの、または木部と樹皮の両方で抑制されているものの3タイプが存在した。以上より、線虫の増殖を抑制する抵抗性クローンとしないクローンが存在すると推定され、増殖抑制しない抵抗性クローンは他の抵抗性要因を保有していると考えられる。クロマツはマツ材線虫病に対して感受性の高い種であるが,これまでに抵抗性の高い個体が選抜されている。本研究は,その抵抗性個体の保有する抵抗性要因の解明を行うことを目的としている。抵抗性・非抵抗性マツ間で線虫接種後に特異的に発現する遺伝子や,発現量の異なる遺伝子を,トランスクリプトームを網羅的に解析することのできるSAGE法を用いて検出する予定である。本年度は,SAGE法を用いるにあたって,サンプルの準備と一連の実験操作の最適化と改良(後述)を行った。現在,確立した本実験系を用いて分析を進めている。1.マツ当年枝からの良質なRNAの単離:クロマツをはじめとする針葉樹には,フェノール類,テルペノイド,ポリサッカロイドなど多くの二次代謝物が含まれていることと,組織がリグニン化していることからRNAの単離が難しい。いくつかの方法を用いてRNA抽出を行ったところ,ポリサッカロイドやDNAの混入が少なく,劣化も見られない良質なRNAが得られるようになった。2.SMART法を用いたcDNA合成:抽出したマツRNAから良質な二本鎖cDNAが合成されていることを,電気泳動像とシークエンスから確認した。3.SAGE法の簡便化:SAGE法では,ゲルからフラグメントの切り出しを三回行う必要がある。この際,原法ではアクリルアミドゲルを使用していたためにDNA回収率が低く,多量のPCR産物(50ul×300反応)が必要であった。しかし今回,分離能の高い低融解アガロースゲルを使用することで,常法の1/3量のPCR産物(50ul×100反応)で分析が行えるようになり,操作も簡便化された。

一方,非抵抗性クロマツでは,活性酸素の集積やPRタンパク質の発現などの防御反応が進み,これらの反応によって枯死に至ると推定された。2.SAGEタグ情報を用いたcDNA 3'末端のシークエンスさらに,遺伝子機能が未明の発現遺伝子について,タグ塩基配列をプライマーとしたPCR増幅を行い,cDNAの3'末端のシークエンスを試みた。その結果,遺伝子機能が特定できなかったものについても,いくつかの遺伝子で機能を推定することができた。改良LongSAGE法による分析の結果,異なる発現パターンが観察された5つの遺伝子を対象にqRT-PCR法を行った。その結果,改良LongSAGE法とで同じ結果(発現量の増加・減少)が得られたことから本研究成果の信頼性は高いと考える。