hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝類洞様基質下肝細胞培養法による肝機能発現Unitの作製とその臨床応用に関する研究

成熟肝細胞は腹腔内移植HXA内で長期生着は得られなかったが、胎児肝組織を用いた実験においては移植1ヵ月目にHXA内に肝細胞の組織塊が得られた。この肝組織は細胞障害もなく、また分裂、増殖能を有することも確認された。したがって、さらに長期の生体内培養を続けることにより、さらに大きな肝組織塊を内包したHXAが得られると考えられた。しかし肝細胞とHXA腔壁との接着性がなく、かつHXAの気孔率が低いため、相対的な肝組織量が少ない、腔径が広く、肝細胞索構造の構築が不十分であった。これら腔内に微小血管が増生してくることが理想的ではあったが、残念ながら観察されなかった。今後、類同様基質としてはたしてHXAが最適か等、これまで試みられているマイクロキャリア、コラーゲン膜等を含め再度検討すべき課題と考えられた。今回の研究で、小さな肝組織を多数包含した肝機能発現UNITの可能性が確認されたことは今後、肝細胞増殖因子等の投与などのmodificationを加えることによりさらに発展させ得るものと考えられた。肝不全LECラットへの移植実験はこれら基礎的実験をさらに行った上で試みる予定で、現在LECラットへの肝細胞移植の実験に着手した。本研究の目的は肝類洞をモジュールした細胞外基質(ハイドロキシアパタイト,SE)を用い、分離肝細胞を培養長期維持し、肝小様構造に類似した肝機能発現unitを作製することである。細胞外基質は30100μmの多孔性で、肝類洞構造に類似し、しかも組織親和性も高い。平成4年度までの研究経過は以下のごとくである。I.生着状態. 1.成熟肝細胞:分離した肝細胞を本unitにシーディングして、同系ラット腹腔大網内に移植した。光顕(HE,PAS)、電顕的に移植後1ヵ日目までの生着を確認した。しかし増殖傾向は認められなかった。2.胎児肝細胞:同様に胎生1820日の胎児肝を細切、unitにシーディングし、腹腔内に移植した。移植後6週までの生着を確認した。細胆管の増生も観察された。II.移植部位の検討実験1、1,2で作成したunitを腎被膜下に移植したが、移植1ヵ月目では生着細胞が認められなかった。III.SE基質に関しての研究ハイドロキシアパタイトの気孔率と気孔径と肝細胞の生着状態との関連:気孔径90μm、200μm、気孔率70%の2種類のSEを用いたが、生着状態に変化は認められなかったが、細胞増殖が認められなかった理由として1)炎症系細胞の増殖2)肝細胞とSE基質との接着状態の不良の2つが考えられた以上の結果より1)厳密な滅菌下で、pre-icubation後に移植する.2)SE基質のコラーゲンでのコーティングを行ない研究を継続する。さらに、1)肝不全動物に対する治療効果. 2)SE基質培養肝細胞UNITの長期保存. 3)LEC自然肝炎、肝癌発生ラットにおけるSE基質培養細胞unit移植によるその抑制効果について検討する予定である。平成5年度は前年度の研究の継続と、HXA内肝細胞の増殖状態も検索を行った。成熟肝細胞は腹腔内移植HXA内で長期生着は得られなかったため、胎児肝組織にを用いた実験系で検索した。胎児肝組織は移植1カ月目においても腹腔のHXA内に生着する。この肝組織は細胞障害もなく、またBrdU,PCNA単クローン抗体を用いた検索で、これら肝組織は分裂、増殖能を有することも確認された。したがって、長期の生体内培養を続けることにより、さらに大きな肝組織塊を内包したHXAが得られると考えられた。また胎児肝細胞より肝細胞のみならず、胆管細胞への分化も起こり、如何にこの胆管細胞の増生を抑えるかが今後の問題点である。

また今後、類同様基質としてはたしてHXAが最適か等、これまで試みられているマイクロキャリア、コラーゲン膜等を含め再度検討すべき課題と考えられた。
アドレナリンβ2受容体機能異常からみた慢性筋痛の病態解明に関する分子生物学的研究

全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症(FMS)患者のβ_2アドレナリン受容体機能評価を末梢血由来リンパ球細胞上に存在するβ_2受容体を用いて,情報伝達の際に産生されるcAMPを機能性マーカーとして,正常被験者のそれと比較した.被験者はFMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と筋痛,関節疾患,頭痛等を認めない無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)である.各被験者から20mlの静脈血を採取し,比重遠心法を用いて単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,燐酸緩衝液のみを加えた安静時ベースラインと燐酸緩衝液で10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβアドレナリン受容体刺激薬(Isoproterenol, IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:p=0.520).一方,10^<-3>M IP刺激後のcAMP量は,安静状態に比較して両群とも有意に増加した(無症状群:p=0.012,FMS群:p<0.001).FMS群において単核球におけるβ2受容体の刺激に対する反応が抑制されているという事実は,FMSの病態に全身性のβ_2受容体機能の脱感作が関与している可能性を示唆する重要な所見と思われた.一方で,FMSとの病態メカニズムの差異が論争されている慢性局所性筋痛症患者におけるβ_2アドレナリン受容体機能評価を,慢性筋痛者11名,正常被験者21名を対象に5段階(10^<-3>10^<-73>M)のIP濃度を用いて前述の手法に従って行った.その結果,単核球が産生するcAMP濃度はIP刺激濃度依存性に増大した.しかしながら,その刺激濃度依存性に増大するcAMP濃度変化は両群間において有意な差は見られなかった.本結果は,局所性慢性筋痛者の病態においては,全身性のβ_2アドレナリン受容体機能異常の関与は認められないこと,換言すれば,線維性筋痛症と局所性慢性筋痛症の病態が異なることを示す重要な所見であると考えられた.全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症(FMS)患者のβ_2アドレナリン受容体機能評価を末梢血由来リンパ球細胞上に存在するβ_2受容体を用いて,情報伝達の際に産生されるcAMPを機能性マーカーとして,正常被験者のそれと比較した.被験者はFMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と筋痛,関節疾患,頭痛等を認めない無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)である.各被験者から20mlの静脈血を採取し,比重遠心法を用いて単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,燐酸緩衝液のみを加えた安静時ベースラインと燐酸緩衝液で10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβアドレナリン受容体刺激薬(Isoproterenol, IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:p=0.520).一方,10^<-3>M IP刺激後のcAMP量は,安静状態に比較して両群とも有意に増加した(無症状群:p=0.012,FMS群:p<0.001).FMS群において単核球におけるβ2受容体の刺激に対する反応が抑制されているという事実は,FMSの病態に全身性のβ_2受容体機能の脱感作が関与している可能性を示唆する重要な所見と思われた.一方で,FMSとの病態メカニズムの差異が論争されている慢性局所性筋痛症患者におけるβ_2アドレナリン受容体機能評価を,慢性筋痛者11名,正常被験者21名を対象に5段階(10^<-3>10^<-73>M)のIP濃度を用いて前述の手法に従って行った.

その結果,単核球が産生するcAMP濃度はIP刺激濃度依存性に増大した.しかしながら,その刺激濃度依存性に増大するcAMP濃度変化は両群間において有意な差は見られなかった.本結果は,局所性慢性筋痛者の病態においては,全身性のβ_2アドレナリン受容体機能異常の関与は認められないこと,換言すれば,線維性筋痛症と局所性慢性筋痛症の病態が異なることを示す重要な所見であると考えられた.全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症患者のβ_2アドレナリン受容体機能の評価のため,末梢血由来リンパ球細胞上に存在するβ_2受容体を用いて,情報伝達の際に産性されるcAMPを機能性マーカーとして,enzymeimmunoassay法により測定し,年齢,性別をマッチングさせた正常被験者のそれと比較した.被験者はリウマチ専門医によりFMSと診断され,American College of Rheumatology(1990)の診断基準を満たすFMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と筋痛,関節疾患,頭痛等を認めない無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)である.各被験者からは,橈側皮静脈より20mlの静脈血を採取し,比重遠心法を用いて単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,燐酸緩衝液のみを加えた安静時ベースラインと燐酸緩衝液で10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβアドレナリン受容体刺激薬(Isoproterenol,IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:p=0.520).一方,10^<-3>M IP刺激後のcAMP量は,安静状態に比較して両群とも有意に増加した(無症状群:p=0.012,FMS群:p<0.001).FMS群において単核球におけるβ2受容体の刺激に対する反応が抑制されているという事実は,慢性筋痛の病態にβ_2受容体機能の脱感作が関与している可能性を示唆する重要な所見と思われた.全身の多部位に慢性筋痛を訴える線維性筋痛症(FMS)患者のβ_2アドレナリン受容体機能評価のため,末梢血由来リンパ球細胞上に存在するβ_2受容体を用いて,情報伝達の際に産生されるcAMPを機能性マーカーとして,enzymeimmunoassay法により測定し,年齢,性別をマッチングさせた正常被験者のそれと比較した.被験者はリウマチ専門医によりFMSと診断され,American College of Rheumatology(1990)の診断基準を満たすFMS群(女性8名,平均年齢44.3歳)と筋痛,関節疾患,頭痛等を認めない無症状群(女性9名,平均年齢35.8歳)である.各被験者からは,橈側皮静脈より20mlの静脈血を採取し,比重遠心法を用いて単核球を分離した.分離した単核球は10^6個ずつ分注し,燐酸緩衝液のみを加えた安静時べースラインと燐酸緩衝液で10^<-3>,10^<-5>Mに希釈したβアドレナリン受容体刺激薬(Isoproterenol, IP)を5分間作用させた低・高濃度IP刺激後の3条件のcAMP量を測定した。その結果,低濃度である10^<-5>MIP作用後のcAMP量は,無症状群では有意な増加を示したが,FMS群では変化がみられなかった(無症状群:p<0.001,FMS群:p=0.520).一方,10^<-3>MIP刺激後のcAMP量は,安静状態に比較して両群とも有意に増加した(無症状群:p=0.012, FMS群:p<0.001).FMS群において単核球におけるβ2受容体の刺激に対する反応が抑制されているという事実は,FMSの病態に全身性のβ_2受容体機能の脱感作が関与している可能性を示唆する重要な所見と思われた.一方で,FMSとの病態メカニズムの差異が論争されている慢性局所性筋痛症患者におけるβ_2アドレナリン受容体機能評価を,慢性筋痛者11名,正常被験者21名を対象に5段階(10^<-3>10^<-7>M)のIP濃度を用いて前述の手法に従って行った.その結果,単核球が産生するcAMP濃度はIP刺激濃度依存性に増大した.しかしながら,その刺激濃度依存性に増大するcAMP濃度変化は両群間において有意な差は見られなかった.本結果は,局所性慢性筋痛者の病態においては,全身性のβ_2アドレナリン受容体機能異常の関与は認められないこと,換言すれば,線維性筋痛症と局所性慢性筋痛症の病態が異なることを示す重要な所見であると考えられた.
IVa族およびVa族元素の組合わせによる安全性の高い生体用金属材料の合金設計

本研究では,生体安全性の高い生体用合金の開発を主たる目的として,Ti-Zr基合金の合金開発を行い,Ti-Zr-Nb三元合金系で高強度合金と低弾性率合金の開発を行った.前者では,Ti-Zr二元合金(両元素の原子比を1:1に固定)に比較的少量のNbを添加した合金に適当な熱処理を加えることによって,高強度合金化することができることを見出した.後者では,同じ二元合金に比較的高濃度のNbを添加し,β型低弾性率合金化することができることを見出した.いずれの合金も既存の生体用チタン合金の力学的性質に比べて,実用化の可能性が高い諸特性を有していることを見出した.また,合金開発と平行して,引張強さだけでなく,ねじり強さを評価し,さらには組合せ(引張+ねじり)応力下での試験を行い,開発合金や既存の生体用チタン合金の評価を行った.さらに,これらの合金を引張疲労試験,ねじり疲労試験,組合せ応力疲労試験に供し,各疲労試験での疲労特性を評価するとともに,引張疲労寿命から,ねじり疲労寿命や組合せ応力疲労寿命を予測する可能性を検討し,提案した.具体的にはミゼス型の相当応力をバスキン則によって整理し,これに試験片の寸法効果を導入することによって適切な世寿命予測ができることを報告した.本研究では,生体安全性の高い生体用合金の開発を主たる目的として,Ti-Zr基合金の合金開発を行い,Ti-Zr-Nb三元合金系で高強度合金と低弾性率合金の開発を行った.前者では,Ti-Zr二元合金(両元素の原子比を1:1に固定)に比較的少量のNbを添加した合金に適当な熱処理を加えることによって,高強度合金化することができることを見出した.後者では,同じ二元合金に比較的高濃度のNbを添加し,β型低弾性率合金化することができることを見出した.いずれの合金も既存の生体用チタン合金の力学的性質に比べて,実用化の可能性が高い諸特性を有していることを見出した.また,合金開発と平行して,引張強さだけでなく,ねじり強さを評価し,さらには組合せ(引張+ねじり)応力下での試験を行い,開発合金や既存の生体用チタン合金の評価を行った.さらに,これらの合金を引張疲労試験,ねじり疲労試験,組合せ応力疲労試験に供し,各疲労試験での疲労特性を評価するとともに,引張疲労寿命から,ねじり疲労寿命や組合せ応力疲労寿命を予測する可能性を検討し,提案した.具体的にはミゼス型の相当応力をバスキン則によって整理し,これに試験片の寸法効果を導入することによって適切な世寿命予測ができることを報告した.(1)合金の作製および組織学的検討まず,IVa族およびVa族元素を組み合わせ合金を件製した,光学顕微鏡観察による金属組織学的検討,ならびに硬さ試験による力学的基礎データを収集した.その結果,タンタルを高濃度に舎む合金は,合金密度が高く,また融点も高温度になることから,一般的なチタン合金の溶解法である現有設備であるアルゴンアーク式溶解炉での試料作成が困難であることをみいだした.以上の結果をもとにして合金設計をチタン,ジルコニウム,ニオブを中心として進めることに方針を定めた.(2)多軸応力試験機の導入と応力の組合わせの検討本研究計画の初年度であるため,多軸応力試験機の発注,据付けに長期間を要し,搬入,据付け,引き渡しは1月半ばになった.直ちに試運転を始めるとともに,各種試験条件の検討設定を行った.すなわち,引張方向および捻り方向に対する応力レベルの設定,捻り角度の設定,それぞれの応力の位相の取り方を解析した.2月末日で試験片の外注加工も終え,3月より試験を開始している.次年度の本格的な試験開始に備え,データ解析法の検討も進めている.(3)平成11年度以降は,平成10年度の研究を引継ぐとともに,合金の熱処理による力学的性質の改善,合金の生物学的安全性評価を進める予定である.(1)引張試験の実施と力学的性質の評価研究計画初年度に主要設備である多軸応用試験機を導入した後,試験条件の設定、試験機作動プログラムの作成を経て、本年度から本格的な試験を始めた.複数の生体用チタン合金を用い,精密鋳造材と鍛造→機械加工材の二種類の試験片を用意した.多軸応用試験に先立って,新しく導入したビデオ式非接触型伸び計の有用性を確認する試験を行い,同伸び計のひずみと試験機アクチュエータのひずみを比較することにより,引張試験初期でのグリップ/試験片間のすべりと,引張試験後期での絞りの発生を捉えることができた.これらの成果はすでに学会での講演で報告し,原著論文としても公表している.(2)多軸応力試験の実施と複合応力下での力学的性質の解析引張応力とねじり応力の組合せを変化させて多軸応力試験を行い,得られたデータを複合応力理論に基づく降伏条件を利用して解析し,単純応力試験の結果から多軸応力試験の結果を予測できる可能性を見いだした.この成果に関しては平成12年度第一四半期中に開催される国内学会ならびに国際会議で報告することになっている.(3)今後の計画平成13年度以降は,これまでの研究を引継ぐとともに,SUS316Lなどの生体用合金も試験に供する.これまでの結果とあわせ,複合応力理論に基づくデータ解析を進める.研究計画初年度末に導入し,昨年度から行っている引張+ねじり組合せ応力試験を実験条件を広げて行った.

また,昨年度で十分試験できなかった比較材料のデータを収集した.これまでに得られた成果をもとに,力学的特性の解析法を検討した.具体的には昨年度中に一部行っているvon Misesの条件を展開し,新たな解析法を独自に検討した.昨年度まで行ってきた引張+ねじり組合せ応力試験のほかに,繰返し引張+繰返しねじり組合せ応力を負荷した組合せ応力疲労試験を行った.この部分の研究では初年度にあたったため,実験条件の設定からはじめ,開発合金の基礎的特性の評価を行った.今日考案されているさまざまな医療デバイスの抱える材料学的な問題を引き続き検討した.例えば,スクリュー型補助心臓の場合,軸受けの構造や材料選定をどうするか,またそこでの耐摩耗性をどう評価するべきかなどの問題があることがわかっており,これら医療デバイスの材料学的問題の情報を収集した.この情報は次年度以降の実験計画に反映することとした.上述の成果を,国内外の会議で報告した.とくに組合せ応力疲労試験にかんしては,その席上,有効なディスカッションが行われ,来年度行う評価・解析方法に関する有効な指針が得られた.また,一部の成果は,学術論文として公表している.本研究では,生体安全性の高い生体用合金の開発を主たる目的として,Ti-Zr基合金の合金開発を行い,Ti-Zr-Nb三元合金系で高強度合金と低弾性率合金の開発を行った.前者では,Ti-Zr二元合金(両元素の原子比を1:1に固定)に比較的少量のNbを添加した合金に適当な熱処理を加えることによって,高強度合金化することができることを見出した.後者では,同じ二元合金に比較的高濃度のNbを添加し,β型低弾性率合金化することができることを見出したいずれの合金も既存の生体用チタン合金の力学的性質に比べて,実用化の可能性が高い諸特性を有していることを見出した.また,合金開発と平行して,引張強さだけでなく,ねじり強さを評価し,さらには組合せ(引張+ねじり)応力下での試験を行い,開発合金や既存の生体用チタン合金の評価を行った.さらに,これらの合金を引張疲労試験,ねじり疲労試験,組合せ応力疲労試験に供し,各疲労試験での疲労特性を評価するとともに,引張疲労寿命から,ねじり疲労寿命や組合せ応力疲労寿命を予測する可能性を検討し,提案した.具体的にはミゼス型の相当応力をバスキン則によって整理し,これに試験片の寸法効果を導入することによって適切な世寿命予測ができることを報告した.
ゲノム編集技術を利用した極限的乾燥耐性遺伝子の同定と機能解析

本研究は、ゲノム編集によるPv11細胞の乾燥耐性能力の機能破綻を指標として、ネムリユスリカの乾燥無代謝休眠に決定的な役割を果たしていると考えられる遺伝子ネットワークを明らかにすることを目的とした。手始めに、ターゲットとなる遺伝子の情報を得るために、ネムリユスリカのゲノムを解析した。ネムリユスリカのゲノムには、約200万カ所の潜在的なCRISPR/Cas9のターゲットが存在する事がわかった。また、独自の遺伝子発現系を構築することで、Pv11細胞で駆動するCRISPRシステムを確立させた。このCRISPRシステムを利用した、乾燥耐性をもたらす責任遺伝子の大規模スクリーニングが可能となった。本研究の目的は、ネムリユスリカの乾燥無代謝休眠に決定的な役割を果たしていると考えられる原因遺伝子を含めた遺伝子ネットワークを同定した上で、その分子的背景を利用した乾燥感受性細胞の乾燥保存法の確立を目指すことにある。具体的には、人工的に作製した塩基配列認識型ヌクレアーゼを用いてゲノム上の標的遺伝子破壊やレポーター遺伝子の挿入などを可能にする技術である「ゲノム編集」を利用して、ネムリユスリカ培養細胞の乾燥耐性能を破壊することで、乾燥無代謝休眠の原因遺伝子を特定する。当初、ゲノム編集技術としてTALENを利用する予定であったが、ネムリユスリカ培養細胞(Pv11細胞)での発現が認められず、よりシステムが簡易なCRISPR/Casに変更する決断を行った。CRISPR/Casシステムは人工的に設計したDNAを細胞に導入し、任意のタンパク質(Cas9)やRNA(guide RNA)を作らせることで作動するシステムである。元来原核生物で作動する生体防御システムを応用しているため、実験対象となる生物種のCodon usageやプロモーターを考慮したシステムの構築が必要となる。まず、ネムリユスリカのCodon usageに合わせたCas9をコードする人工遺伝子の構築を行った。さらに、Cas9とguide RNAを発現させるためのタンパク質発現プロモーター(Pol II)領域と、RNA発現プロモーター(Pol III)領域をネムリユスリカゲノムから単離した。これらプロモーターを用いた結果、Pv11細胞でCas9タンパク質とguideRNAの発現に成功した。この成果を踏まえ、一つのベクターでCas9とguideRNAを同時に発現可能なネムリユスリカ用All-in-OneCRISPRベクターの構築も行った。ネムリユスリカPv11細胞でのゲノム編集技術を開発している。Cas9-RFP陽性細胞がわずかながら単離できたが、in-delを捉えるまでは至っていない。理由として考えられるのは、ネムリユスリカが極めて高いATリッチなcodon usageをもつ遺伝子構造を持つことが原因と思われる。そこで、GC含量が高めな一般に真核生物用に最適されたCas9遺伝子ではなく、ATリッチなバクテリア用のCas9遺伝子を用いたCRISPRシステムを試作中である。発現ベクターとして用いているpol II及びpol IIIタイプのプロモーターは、ネムリユスリカゲノムに由来し、その機能を確認済みで有る。(カイコやショウジョウバエのプロモーターは機能しない)従って、Cas9の発現不良は転写ではなく、やはり翻訳効率の低さが原因であろう。世界で唯一ネムリユスリカを扱っているラボが我々であるため、他者の研究成果を宛にできない弊害がある。非モデル生物ならではの問題で有り、ある意味想定内であるが、早急に解決したい。わずかながらの陽性細胞をセルソーターで分取することには成功しているので、この細胞がCas9安定発現細胞として樹立可能か、現在でも培養を継続中である。この細胞樹立は、今後のネムリユスリカのゲノム編集技術開発のブレークスルーとなると期待している。ネムリユスリカで作動するゲノム編集技術開発を目的とした課題である。これまでの研究で、Cas9タンパク質の発現が極めて少ないことが、実験上のボトルネックになっていた。ネムリユスリカ培養細胞Pv11のトランスクリプトーム解析を行った結果、Pv.00443遺伝子が最も発現量が高いことを見いだした。Pv.00443遺伝子の5'上流1.3kbをプロモーターとする発現ベクターを構築し、Cas9遺伝子を組み込み、Pv11細胞に遺伝子導入したところ、効率良く発現することが明らかとなった。ガイドRNA発現の効率あげると期待されるPvU6b snRNA遺伝子のpol III型プロモーターもクローニング出来た。今後、ネムリユスリカ用にカスタマイズしたCRISPRシステムを用いて、Pv11細胞及びネムリユスリカ幼虫のゲノム編集を進めていき、28年度中に完成させたい。未だCRISPRシステムが構築できてない点は憂慮される。ただ、Cas9タンパク質の発現系がようやく構築できたことから、次年度でのシステム構築はかなりの確度で期待できる。本研究は、乾燥耐性の分子機構を解明するために、ネムリユスリカの培養細胞であるPv11で作動可能なゲノム編集技術を開発することを第一目標とした。昨年度までは、Pv11細胞でのCas9タンパク質の発現がほとんど認められなかった。これは市販されている昆虫用発現ベクターがチョウ目昆虫に感染するウィルスに由来するプロモーターを利用しているため、ハエ目昆虫であるネムリユスリカで十分に機能していないためであると考えた。そこで、今年度は、Pv11細胞で機能しうる発現ベクターの構築から行うことにした。トランスクリプトーム解析から乾燥誘導性の遺伝子(PvGapdh)を同定し、そのプロモーターを組み込んだ発現ベクターを独自に構築した。

pPGKと命名したこのベクターを用いる事で、Pv11細胞にGFPを安定的に発現させることが可能となった。この安定発現細胞をPv11-KHと命名した。このGFP発現をマーカーに、遺伝子ノックダウン及びノックアウトの実験系構築を進めた。GFP遺伝子に対するsiRNAをPv11-KH細胞に導入すると、極めて効率良くノックダウンができた。具体的には、タンパク質レベルで7.5%程度までGFPの発現量を低下させることに成功した。発現ベクターの構築は、Pv11細胞でのCas9タンパク質の発現も可能にした。Cas9を発現させたPv11-KH細胞に、GFP遺伝子をターゲットとしたガイドRNAを導入すると、GFPの発現を消失させることができた。蛍光を消失した細胞を集めてGFP遺伝子の配列を確認したところ、その遺伝子に欠失・挿入変異が生じていた。以上のことから、ネムリユスリカに特化したCRISPR/Casシステムが確立できたと結論づけた。今後は、CRISPR及びRNAiシステムを利用し、乾燥耐性をもたらす責任遺伝子の大規模スクリーニングを展開していく予定ある。本研究は、ゲノム編集によるPv11細胞の乾燥耐性能力の機能破綻を指標として、ネムリユスリカの乾燥無代謝休眠に決定的な役割を果たしていると考えられる遺伝子ネットワークを明らかにすることを目的とした。手始めに、ターゲットとなる遺伝子の情報を得るために、ネムリユスリカのゲノムを解析した。ネムリユスリカのゲノムには、約200万カ所の潜在的なCRISPR/Cas9のターゲットが存在する事がわかった。また、独自の遺伝子発現系を構築することで、Pv11細胞で駆動するCRISPRシステムを確立させた。このCRISPRシステムを利用した、乾燥耐性をもたらす責任遺伝子の大規模スクリーニングが可能となった。実績概要に記載したように、実際のin-del変異を捉えるに至っていない。非モデル生物でのゲノム編集技術確立には、困難な問題に直面することは想定済みだが、計画を遂行するためには早々に実験系の確立を急がなければならない。Cas9ヌクレアーゼやガイドRNAの発現は確認できているので、後はそれらの発現効率を上げることが課題である事を理解して、実験を進めている。Cas9発現ベクターの導入と、ガイドRNA発現システム及びRNAのダイレクト導入の双方を試すことで、ネムリユスリカ用のCRISPRシステムを構築させる。構築できた場合は、ゲノム計画の結果明らかとなった乾燥耐性関連遺伝子の機能破壊及び機能抑制を行って、これら遺伝子機能と乾燥耐性との因果関係を明らかにしたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫分子生物学・生化学Pv11細胞での遺伝子発現効率を上げるようなネムリユスリカ内在性の強力なプロモーターを選抜し、発現ベクターを構築する。また、幼虫個体での異所的発現を用いたゲノム編集技術の確立も目指す。
フッ素洗口後におけるプラーク中ミネラル分布の解析

プラークに歯を再石灰化する際にフッ素やミネラルを供給するリザーバーとしての働きがあることが報告されプラークの再石灰化能に関する働きが注目されている。また,プラークに対し均一にフッ素をリザーブさせるにはフッ素洗口が有効であると考えられる。そこで本研究では,フッ素洗口後におけるフッ素が唾液クリアランスの異なる部位のプラークに対しどのような濃度分布で存在するかを明らかにする。平成16年度では,唾液クリアランスの調査研究を行った。上顎の側切歯と第一大臼歯の唇側面を対象に,225ppmF洗口液20mlを用いて30秒間洗口を行ない10分後の残留フッ素濃度を測定した。残留フッ素濃度は第一大臼歯部で有意(p<0.01)に低く,両部位において唾液クリアランスに違いが認められた。平成17年度では,フッ素洗口後のプラーク中のミネラル分布の調査研究を行った。16年度と同じく上顎の側切歯と第一大臼歯の唇側面を対象に調査した。同部位にプラーク堆積装置を装着し得られたプラークからフッ素とカルシウム,リンを層別に測定した。フッ素洗口前のプラーク中のフッ素濃度は,前,臼歯部ともに全層にわたりきわめて低くフラットな分布を示した。一方,洗口後では,表層から内層にわたって著しい上昇を示した。前歯部,臼歯部の分布を比較すると,唾液に最もさらされる1層(表層)からの7暦(内層)目まで第一大臼歯部が有意(p<0.050.01)に低い結果を示した。カルシウムとリン濃度は,洗口前後の前歯部,大臼歯部とで特に有意な差は認められなかった。本研究からは,フッ素洗口後のプラーク中フッ素も唾液クリアランスの影響を受けることが示唆された。しかし,カルシウムおよびリンの濃度分布では,統計学的有意な差は認められなかった。近年,プラークには歯を再石灰化する際にフッ素やミネラルを供給するリザーバーとしての働きがあることが報告されプラークの再石灰化能に関する働きが注目されている。プラークを完全に除去することは困難であるため残存したプラークがリザーバーになるのが望ましくプラークに対して均一にフッ素をリザーブさせるにはフッ素洗口が有効であると考えられる。しかし,洗口後のフッ素の動向は唾液の流れに影響をうけると思われる。そこで,洗口後におけるフッ素が唾液クリアランスの異なる部位に堆積したプラーク中に対しどのような濃度分布で存在するかを明らかにする。平成16年度では,プラークの分析前にフッ素洗口条件を規定化する調査を行った。1.唾液クリアランス時間の検討成人ボランティア2名を対象に225ppmF洗口液20mlを用いて30秒間洗口を行い,洗口前,洗口後5分,10分,15分,20分,30分後の唾液を上顎側切歯と第一大臼歯から採取し,残留フッ素濃度を測定した。[結果]10分後が最も上顎側切歯と第一大臼歯において差が出たため唾液クリアランスの判定時間とした。2.唾液分泌量および唾液クリアランスの測定調査に対し同意の得られたボランティア成人男性(2023歳)10名に対し調査を行った。まず,3分間の唾液分泌量の測定。次に225ppmF洗口液20mlを用いて30秒間洗口し10分後の上顎側切歯と第一大臼歯の唾液を採取し唾液クリアランスを測定した。[結果]唾液分泌量は平均3.1ml/3minであった。

フッ素洗口後の残留フッ素濃度は側切歯部で平均25.99ppm,第一大臼歯部で平均12.03ppmであった。残留フッ素濃度は第一大臼歯部で有意(p<0.01)に低く,両部位の唾液クリアランスに差が認められた。次年度はフッ素洗口後におけるプラーク中のフッ素およびカルシウム,リンの測定を行っていく予定である。近年,プラークには歯を再石灰化する際にフッ素やミネラルを供給するリザーバーとしての働きがあることが報告されプラークの再石灰化能に関する働きが注目されている。しかし,フッ素洗口後のフッ素の動向は唾液の流れに影響をうけると思われる。そこで,フッ素洗口後におけるフッ素が唾液クリアランスの異なる部位のプラークに対しどのような濃度分布で存在するかを明らかにする。平成17年度では,フッ素洗口後のプラーク中ミネラル分布の分析調査を行った。1.フッ素洗口後のプラーク中のミネラル分布の分析調査に対し同意の得られたボランティア成人男性(2023歳)8名に対し調査を行った。各被験者の,上顎左右側の側切歯と第一大臼歯の頬側面にプラーク堆積装置を接着した。1週間後,先ず右側にある2個の装置を口腔内から撤去し,得られたプラークを対照群とした。次に0.05%NaF洗口液20mlにて唾液クリアランス測定と同じ条件にて30秒間洗口した。10分後左側の2個の装置を撤去し実験群とした。プラーク資料は凍結乾燥を行い層別分画(68層)とした。そして各層ごとにフッ素,カルシウム,リン濃度を測定した。[結果]フッ素洗口前のプラーク中のフッ素濃度は,前,臼歯部ともに全層にわたりきわめて低くフラットな分布を示した。一方,洗口後では,表層から内層にわたって著しい上昇を示した。前歯部,臼歯部の分布を比較すると,唾液に最もさらされる1層(表層)からの7層(内層)目まで第一大臼歯部が有意(p<0.050.01)に低い結果を示した。カルシウムとリン濃度は,洗口前後の前歯部,大臼歯部とで特に有意な差は認められなかった。上記の結果よりフッ素洗口後のプラーク中フッ素も唾液クリアランスの影響を受けることが示唆された。カルシウムおよびリンの濃度分布では,統計学的有意な差は認められなかった。
栄養処理による食肉の呈味制御：遺伝子及びメタボローム解析と代謝調節による高品質化

食肉のおいしさは,味,香り,色,食感等の様々な要素によって形成されるが,特に「呈味」に着目した。食肉の主要な呈味成分は筋肉遊離Gluであり,Glu量の調節は食肉の呈味に影響する。執筆者らの検討から,リジン(Lys)、イソロイシンまたはバリンを添加した飼料の短期給与により,筋肉遊離Glu量が有意に増加することが示された。一方,低Lys飼料を給与した場合にも,筋肉遊離Glu量が有意に増加し,食肉のうま味及び総合的な味強度が向上することが示された。また機能性成分への影響も見られた。そこでメタボローム及び遺伝子発現解析を用いて,代謝物質の変動を解析し、メカニズムをそれぞれ検討した。食肉の高品質化の中で呈味の向上に対する期待は大きいが、有効な情報は極めて不足している。申請者は飼料栄養素による食肉の高品質化を検討し、短期の特定アミノ酸量の調節による筋肉遊離グルタミン酸(Glu)量の増加と食味の向上の可能性を得た。この新たな制御技術は食肉の高付加価値化に有効であるが、筋肉特異的な現象であることが判明し、代謝メカニズムの解明が技術の応用やさらなる食肉高品質化に有効である。そこで次の検討を行った。1)飼料Lys量をNRC要求量の0.9、1.0、1.5Xに設定した飼料を10日間給与し、筋肉試料を得た。メタボローム解析から、Lys0.9Xでは筋肉の遊離Lys量が減少し、一方、Gluを含む多数の遊離アミノ酸が増加、また複数の有機酸及び核酸関連物質が増加した。Lys1.5Xでは筋肉の遊離Lys及びGluのみが増加した。Lys1.5Xでは筋肉のLKR発現が増加したが0.9Xでは変化が見られず、両者のGlu増加機構は異なると推察された。2)ピペコリン酸添加試料を給与し、ピペコリン酸系Lys異化関連物質を解析した結果、ピペコリン酸経路は関与するがGlu増加の主経路ではないと推察された。3)食餌性Lysレベルによる筋肉の機能性物質イミダゾールジペプチド(IDP)量への影響を検討した。その結果、低Lys飼料では筋肉IDP総量への影響は認められないものの、複数の機能性が報告されてきたカルノシン量に減少が示された。4)Lys0.9X飼料の10日間給与で筋肉遊離Gluの増加と食味の向上が得られた一方で、飼育成績が低下し、産肉量への影響が生じた。そこで検討を行った結果、3ないし6日間のLys0.9X飼料給与では産肉量を低下させずに、10日間と同様の食味向上効果が得られることを見出した。このときカルノシン量への影響は認められなかった。アミノ酸代謝と各種解析手法によりこれらの成果を得た。良質タンパク質の供給源である食肉は、量的・効率的生産が求められる一方、TPPへの対応等も加わり高品質化が求められている。高品質化の中で呈味の向上に対する期待は大きいが、有効な情報は極めて不足してきた。申請者は飼料栄養素による高品質化を検討し、短期の特定アミノ酸量の調節による筋肉遊離グルタミン酸(Glu)量の増加と食味の向上の可能性を得た。この新たな栄養制御手法をさらなる高品質化に繋げるため、遺伝子発現、メタボローム等の解析により調節機構の詳細を明らかにし、食肉の価値向上を追求した。1)飼料Lys量をNRC要求量の0.9、1.0、1.5Xに設定した飼料を10日間給与した筋肉試料のメタボローム解析から、低及び高Lys飼料により筋肉遊離Glu量は増加、低LysではGlu以外の遊離アミノ酸、有機酸の一部が増加した。筋肉LKR発現の解析からLys異化がGlu増加に関与すると推定したが、0.9XではLKRに変化が見られなかった。そこで筋肉タンパク質合成及び分解に関する主要酵素の遺伝子発現解析の結果、分解系のみが増加し、これがGlu及び他の遊離アミノ酸等の増加に関与したと推定した。2)低Lys飼料の10日間の給与で1)の効果が得られるものの増体量は減少した。経時的検討から短期間給与で増体に影響なく呈味物質が増加することを得た。3)高タンパク質飼料においてLysのみを要求量レベルとする相対的低リジンバランス条件により、10日間の給与で増体に影響させず呈味成分の増加が得られることを得た。4)機能性物質イミダゾールジペプチドの代謝においてCarのメチル化に関与するMetの影響を検討した結果、高Met飼料において筋肉Ans量の増加が示された。代謝酵素の遺伝子発現に影響は認められなかった。アミノ酸代謝に基づく解析により上記の成果が見出された。概要に示したように、各アミノ酸を特定レベルに設定した飼料を調製し、想定した効果を有するモデルを用いて、メタボロミクス、遺伝子発現解析等により比較解析を行い、代謝調節機構を検討し、多くの成果を得た。また各種解析手法を用いて生産性と食味を考慮した検討を行い、飼料アミノ酸についてより適切な条件を提案した。また当初計画以外のアミノ酸について新たな機能を見いだすことができた。良質タンパク質の供給源である食肉は、量的・効率的生産が重視される一方、国際的には食肉の高品質化が求められている。

食肉の高品質化の中で、剪断応力、抗酸化性等とともに呈味の向上に対する期待は大きいが、呈味は評価が難しいのみでなく、飼料栄養を用いた呈味の調節は困難とされてきた。申請者は、短期の飼料の特定アミノ酸量の調節による筋肉遊離グルタミン酸(Glu)量の増加と食味の向上の可能性を得た。この新たな栄養制御手法をさらなる高品質化に繋げるため、遺伝子発現、メタボローム等の解析から調節機構を、また食肉の熟成の影響を検討し、食肉の価値向上を追求した。1)飼料リジン(Lys)量をNRC要求量の低レベルから高レベルまで段階的に設定した飼料を10日間給与した筋肉試料のメタボローム解析から、低及び高Lys飼料のいずれからも筋肉遊離Glu量が増加することを確認した。遺伝子発現解析から、高レベルと低レベルでは調節メカニズムが異なる可能性を得た。2)高タンパク質飼料において熟成後の食肉への影響を検討した。その結果、保存48時間から段階的に検討した各時間において、対照区に比較してLys添加による胸肉で有意にGlu量が増加した。また遊離アミノ酸総量が増加した。さらにドリップロスが有意に低下する結果を得た。これらからLys添加における熟成後の新たな肉質向上の可能性を見出した。4)機能性物質イミダゾールジペプチド(IDP)の代謝において、食餌性の塩基性アミノ酸のLys、または含硫アミノ酸のMetの検討から、筋肉のカルノシン(Car)/アンセリン(Ans)比に変化が生じ、IDP総量は変わらないものの筋肉Ans量の増加が示された。CarとAnsの機能が異なるとする報告に基づくと、飼料栄養により肉質として適切な比率に調節できる可能性が示された。アミノ酸代謝に基づく解析により以上の成果を得た。食肉のおいしさは,味,香り,色,食感等の様々な要素によって形成されるが,特に「呈味」に着目した。食肉の主要な呈味成分は筋肉遊離Gluであり,Glu量の調節は食肉の呈味に影響する。執筆者らの検討から,リジン(Lys)、イソロイシンまたはバリンを添加した飼料の短期給与により,筋肉遊離Glu量が有意に増加することが示された。一方,低Lys飼料を給与した場合にも,筋肉遊離Glu量が有意に増加し,食肉のうま味及び総合的な味強度が向上することが示された。また機能性成分への影響も見られた。そこでメタボローム及び遺伝子発現解析を用いて,代謝物質の変動を解析し、メカニズムをそれぞれ検討した。概要に示した様に、各Lysレベルに設定した飼料を調製し、想定した効果を有するモデル肉試料を作成した。メタボローム解析、遺伝子発現解析等により、各Lysレベルから得た試料の比較解析を行い、代謝調節機構を検討し、成果を得た。また各種解析手法を用いて生産性と食味を考慮した検討を行い、Lysについてより適切な条件を提案した。前年度までの成果を基礎とし、単一の飼料アミノ酸レベルの調節、またアミノ酸バランスの調節、さらには給与期間等の条件を考慮した筋肉グルタミン酸量の制御メカニズムの解明をメタボロミクス及び遺伝子発現解析等を用いて進めるとともに、効率的な食肉の食味向上のための条件を検討する。動物栄養学前年度の成果を基盤に、メタボローム及び遺伝子発現解析等を用いて、飼料アミノ酸レベルの調節及び給与期間等の条件を考慮した筋肉Glu量の増加メカニズムの解明を進めるとともに、食肉の効率的な食味向上のための条件を検討する。該当年度の本研究に関係するメタボローム解析の一部について、関連する筋肉のアミノ酸代謝の解析を目的とした他の研究経費で賄えたことから、次年度の使用額として留保することとした。
条件付き不変性を用いた最適配置問題解法に関する研究

連続型k-システムはシステム内のある一定範囲内で集中して故障(稼働)している場合にシステム故障(稼働)となるようなシステムの総称であり,立体的に配置されたセンサー(例えば衛星)等による監視システムなどの評価に有用である.本研究では、システムの最適設計時に有用な不変性(部品信頼度の大小関係が分かれば最適設計が可能である性質)が、システムの形状や部品信頼度に関して規定の条件が成立すれば、連続型k-システムに対して成立することを示しシステム設計時に有用であることを示した。また、その結果が作業者配置最適問題や最適設備配置計画問題にも適用可能であることを示した。今年度は, k-システムとその一般系となるネットワークシステムの評価技術について従来研究を見直し,3拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の提案として,1a)独立を仮定し限定した条件下であるが,連結型-(r,s)-out-of-(m,n):Fシステムの最適配置の性質に関する定理の導出を行った.そして,1b)それらの定理を利用した,最適配置導出のための分枝限定アルゴリズムの提案を行い,従来アルゴリズムとの比較実験の結果、提案アルゴリズムの有効性を示すことができた。また,1c)最適配置の数理的な導出のための一手段として,連結型-(r,s)-out-of-(m,n):Fシステムの信頼度と構成コンポーネントの信頼度との関係を導く信頼度算出式の導出に取り組んだ.これは2従属な連続型k-システムと拡張連続型k-システムの信頼度算出方法の提案の準備段階となる.更に,大規模システムの評価と最適配置の性質把握のために2)多状態連続型k-システムの最適配置導出に注目し,中規模以上のシステムの準最適配置導出を効率的に行うためのSAアルゴリズムの改善を行い,良好な結果を得た.加えて6多目的ネットワークの最適配置問題の定式化の一環として,3)ネットワークシステムのノードとエッジの連結関係を調査し,全点間信頼度を最大にするために必要とされるノードとエッジの連結の組み合わせを明らかにした.この結果はネットワーク最適設計への適用が期待される.以上の結果を生産管理における作業者配置問題に適用し良好な結果を得た.今年度は、「条件付き不変性の存在条件分析と不変な最適配置の存在の検討」として、多状態及び2次元システム(拡張連続型k-システム)についてコンポーネント信頼度や状態確率,システム形状や故障条件などの条件と最適配置との関係を考察し,不変な最適配置が存在する、コンポーネント信頼度や状態確率の条件を導いた.その条件を利用し、拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の再提案を行ない、数値実験により、その有効性を示した。「多目的ネットワークの最適配置問題の定式化」として、2種類の評価基準(全点間信頼度とコスト)を有するネットワークとして表されたシステム(多目的ネットワークシステム)の最適配置問題を定式化し、そのエッジ数が一定である条件を追加したネットワークの最大の全点間信頼度を解析的に導き、その結果を利用することにより最適配置問題の効率的な解法を提案した。さらに、3種類の評価基準(コスト)を有する多目的ネットワークについては、最適パスが存在する探索空間を効率的に制限する方法を導き、その方法を利用することにより最適パスを効率的に導く方法を提案した。作業者配置最適化問題や最適設備配置計画問題についても同様に効率的な解法を提案してる。今年度の成果により、拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の基本的な考察及びは終了したと考える。特に、システム故障を誘発する故障コンポーネントの領域が、ある領域(事象)を含んでいる場合に、最適配置の必要条件を数理的に導くことに成功した。さらに、上記と同様に最適解の必要条件を導き出すという考えを利用しトポロジーが固定されている場合の多目的ネットワークの最適配置問題についても効率的な解法が提案できたと考える。ここで得られた結果は、トポロジーを設計要素として含んだ多目的ネットワークの最適設計導出への有用な指針となると考えられる。さらに、今年度は作業者配置最適化問題や最適設備配置計画問題の効率的解法も提案したが、これらの問題解法にも最適解が存在する必要条件を導出し、それらを利用している。概ね、当初計画通りであるが、上記の結果は、主に、各コンポーネント(エッジ、ノード)の故障や状態遷移が独立に発生する場合に対応するが、より広い領域で利用可能な統一的最適設計の提案のためにはそれらが従属な場合を考察する必要がある。最終年度では、主に、前年度までに実施した最適配置における不変性の拡張や最適配置の効率的な探索方法の提案結果に基づき、関連問題への適用検討を行った。作業者配置最適問題については、多状態及び2次元システムにおいて提案した条件付き最適配置の考えに基づき、作業者の能力のばらつきが小さい場合に最適な作業者配置の提案、また最適設備配置計画問題については、最適配置の必要条件を導出し、その条件を利用し効率的な最適設備配置計画の導出手順を提案した。本研究全体では、「最適配置における不変性の概念の拡張」として、多状態及び2次元システム(拡張連続型k-システム)についてコンポーネント信頼度や状態確率,システム形状や故障条件などの条件と最適配置との関係を考察し,不変な最適配置が存在する、コンポーネント信頼度や状態確率の条件を導き、従来の不変性の概念を拡張した。

そして、その条件(条件付き不変性条件)を利用し、拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の提案を行ない、数値実験により、その有効性を示した。また、「多目的ネットワークシステムの最適配置問題の提案と効率的な最適配置探索方法の提案」として、多種類の評価基準を有する多目的ネットワークに対して、最適パスが存在する探索空間を制限し、効率的に最適パスを探索する方法を提案した。作業者配置最適問題や最適設備配置計画問題についても同様に最適解が存在する探索空間を制限することにより、効率的に最適解を探索する方法を提案した。以上のことより,従来不可能であった複雑なシステムについて,従来よりも正確な設計指針の提案が可能になったと考える.更に本研究の結果を作業者配置問題や設備配置問題,ソフト開発資源配分問題に適用し,大規模化と複雑化により評価困難となった実社会のシステムの設計問題に対し,統一的な解法を提供できたと考える。連続型k-システムはシステム内のある一定範囲内で集中して故障(稼働)している場合にシステム故障(稼働)となるようなシステムの総称であり,立体的に配置されたセンサー(例えば衛星)等による監視システムなどの評価に有用である.本研究では、システムの最適設計時に有用な不変性(部品信頼度の大小関係が分かれば最適設計が可能である性質)が、システムの形状や部品信頼度に関して規定の条件が成立すれば、連続型k-システムに対して成立することを示しシステム設計時に有用であることを示した。また、その結果が作業者配置最適問題や最適設備配置計画問題にも適用可能であることを示した。当初の計画に基づき,1国内外の文献調査を進めた.この結果を踏まえ,はじめに3拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の提案として,独立を仮定した拡張連続型k-システムにおいて,最適配置問題の幾つかの解法の基礎研究を進めた.その結果,効率的な最適配置導出手法,並びに構成要素(コンポーネント)の組み合わせと一定の配置位置に特定条件を考慮することで,最適配置となる組み合わせが限定可能であることを導いた.また,6多目的ネットワークの最適配置問題の定式化として,ネットワークシステムの構成要素(ノードやエッジ)の連結の組み合わせを考慮することで,特定条件のもとで全点間信頼度を最大とする最適配置となる組み合わせが限定可能であることを導いた.また,新たな数理解析の検討の結果に基づき,2従属な連続型k-システムと拡張連続型k-システムの信頼度算出方法の提案の準備を行った.現時点で4条件付き不変性の存在条件分析と不変な最適配置の存在については,数値実験を実施中であるが,その結果の考察が不十分であり,未だ明確な条件式導出には至っていないが,最終年度に予定していた本研究の成果の異分野への適用を前倒しして,本年度の結果を,生産管理における作業者(設備)配置問題にすでに適用し良好な結果を得ている.今年度の成果により、多目的ネットワークの最適配置問題解法の基本となる拡張連続型k-システムの効率的な最適配置探索方法の基本的な考察は終了したと考える。しかし、この結果は、各コンポーネント(エッジ、ノード)の故障や状態遷移が独立に発生する場合を主に検討しているが、従属な場合に拡張する必要がある。そのために、従属性の概念の導入及び最適設計のキーワードとなるコンポーネント(エッジ、ノード)の重要度の導入と共に、より広い領域で利用可能な統一的最適設計の提案のために、従属性のある場合の多目的ネットワークの最適配置問題の考察を行なう予定である。
1930年代における輸出統制と中小工業-工業組合と輸出組合を中心に-

平成4年度までの資料収集に基づき、論文「1930年代の羊毛工業と貿易統制」を執筆した。このなかで南アフリカ連邦共和国およびオーストラリアとの通商問題の解決方法として羊毛輸入統制が行われたが、国内の輸出産業と輸入関連産業との利害対立が激化し、1936年末の貿易収支大幅赤字により拡大均衡目的の貿易統制は破綻し、以後日満支ブロック形成、アウタルキー的原料国策が唯一の選択肢となったということを明らかにした。本年度はこの延長上に外務省所轄の通商審議委員会資料、輸出組合資料、各国為替管理・輸入制限関係資料を収集した。その結果、(1)拡大均衡目的の輸出統制が輸入統制を巻き込むなかで国内産業界の利害対立を惹起すること、(2)外務省の国際協調路線が商工省・軍部の原料国策にとってかわられること、(3)輸入関連産業を代表する三井物産安川雄之助の「中国市場確保論」はきわめて早い1934年6月に提唱されたが、これは物産内部の路線対立に敗れた安川が拡大均衡目的の輸出統制を選択した物産主流派に対する警鐘の意味で主張していること、(4)輸出統制と輸入統制をリンクさせようという考え方は1933年頃から見られること、(5)入超国としての日本は複関税制度導入など輸入制限措置を模索するが二国間で見た場合日本側出超のケースが非常に多いという世界市場における日本の特殊事情から見送られ、通商擁護法制定にとどまったこと、などを確認した。これらについては現在、資料整理・解読の段階であり、論文執筆は平成6年度に行う予定である。