hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体中の欠陥ダイナミクスと劣化機構を発現する新しい分子計算モデリング

本研究では,従来の分子動力学法の時間スケールでは追従できなかった,ゆっくりとした原子空孔拡散現象を解明可能とするレアイベント計算技術を開発した.開発した技術を固体酸化物形燃料電池の劣化現象と深く関連する電解質材料の自己拡散現象に展開し,電池の作動温度でのカチオン拡散の活性化パラメータの導出に成功した.また,得られた活性化パラメータをKinetic Monte Carlo法の入力値に用いることで,電解質中におけるカチオンの自己拡散係数を予測し,その妥当性を示した.本年度は、前年度開発した、時間スケールの加速化を実現する分子動力学手法をより複雑な系へと展開した。まず、これまで金属バルク内での空孔拡散に限定していた現象を、bcc鉄結晶粒界での空孔拡散問題へと適用し、自己拡散係数を材料の融点の半分程度での温度領域において算出することを可能にした。得られた結果を、別途、反応経路法から導出した値と比較したところ、非常によい一致を示し本手法の妥当性が明らかになった。つづいて、固体酸化物形燃料電池材料への適用も実施した。具体的には、電池性能の劣化に関連する電解質材料イットリア安定化ジルコニウムの陽イオンの自己拡散係数を算出した。本手法を用いることで、電池作動温度での自己拡散係数導出が可能とし、実験値とよい一致を示した。また、活性化エネルギーの配置によるばらつきの効果と、活性化エネルギーの温度依存性が自己拡散係数に与える影響が大きいことを明らかにした。また、反応経路解析法と熱力学積分法とを組み合わせた、より簡便に活性化自由エネルギー障壁を取得できる新しい位相空間サンプリング手法の開発にも着手した。まずは、固体の塑性挙動の重要プロセスである転位生成過程と空孔拡散現象に適用した。結果、活性化自由エネルギーを異なる応力状態で算出し、活性化振動エントロピーの算出を可能にした。また、活性化振動エントロピーが材料のせん断定数の温度依存性に相関があること、活性化エンタルピーとエントロピーの間に、Meyer-Neldel則と呼ばれる比例関係が成立することを見出した。昨年度、本研究内において提案したレアイベント技術を固体酸化物形燃料電池材料へと展開した。具体的には電池性能の劣化に関連する電解質材料イットリア安定化ジルコニウム(YSZ)の陽イオンの自己拡散解析に着手し、本手法を用いることで、電池作動温度での活性化エネルギーの導出に成功した。本年度は、昨年度の解析で得られた活性化エネルギーデータを入力とするカイネティックモンテカルロ計算を開発した。本計算モデルでは、活性化エネルギーの高いカチオン拡散のみを考慮し、活性化エネルギーの低い酸素拡散の効果は無視した。また原子配置による活性化エネルギーのばらつきの効果と、活性化エネルギーの温度依存性も含めることで、自己拡散係数の予測を実現し、実験値との一致を示した。特に、活性化エネルギーの温度依存性の効果が自己拡散係数の予測に与える影響が非常に大きいことを明らかにした。また、バルクだけでなく表面近傍での拡散にも拡張した。またレアイベント技術とカイネティックモンテカルロ法を組み合わせた手法によって、従来の分子動力学法では予測できなかった長時間スケールの原子拡散現象の予測が可能となることを示した。また本研究内容で国内招待講演と海外発表を行い、本研究内容の重要性を対外的に示した。本手法は固体内欠陥のダイナミクスを明らかにする上で優れた手法であると考えられ、今後、拡散過程だけでなく相変態現象などへと展開できるものと考えられる。本研究では,従来の分子動力学法の時間スケールでは追従できなかった,ゆっくりとした原子空孔拡散現象を解明可能とするレアイベント計算技術を開発した.開発した技術を固体酸化物形燃料電池の劣化現象と深く関連する電解質材料の自己拡散現象に展開し,電池の作動温度でのカチオン拡散の活性化パラメータの導出に成功した.また,得られた活性化パラメータをKinetic Monte Carlo法の入力値に用いることで,電解質中におけるカチオンの自己拡散係数を予測し,その妥当性を示した.初年度は,これまでに開発したHyperdynamicsベースの加速化分子動力学法の高精度を図った。Hyperdynamics法は,元のポテンシャル曲面上に,幾何学変数で記述した正のバイアスポテンシャルを足し合わせることでダイナミクスの加速化を可能とするため、幾何学変数は発生させたい現象に依存する。そこでまず、固体材料の力学的振る舞いと深く関連した基本プロセスである原子空孔拡散の熱活性化挙動を把握するため、原子間距離に基づくバイアスポテンシャル構築法を確立した。本手法をfcc金属の空孔ジャンプに適用し、加速化分子動力学法を用いることで,原子空孔のジャンプ頻度と活性化パラメータを定量的に算出した.同時に、活性化パラメータの温度・応力依存性を明らかにし、従来の活性化エントロピーの力学ベースのモデルに異方性の影響を導入し,その妥当性を示した.また本手法により、固体酸化物型燃料電池(SOFC)の燃料極でのNi拡散について、作動温度環境下での情報を得ることが可能となった。つづいて、分子計算の加速化の概念を、固体酸化物形燃料電池(SOFC)の長時間経時劣化課題にも適用を行った。劣化課題として,イットリア安定化ジルコニア(YSZ)電解質の作動中におけるアニオン・カチオン拡散を対象とした。加速化手法をカチオン空孔のジャンプ機構へと適用し,SOFC実験プロセス温度での活性化パラメータの導出を可能にした.特に、カチオン拡散は,高温でもゆっくりとした時間スケールで進行するエネルギ障壁の高い現象であるため,本手法により速度論情報が獲得できることは非常に有効であると考えられる。本年度は予定通り、前年度に開発した加速化

分子動力学コードを比較的単純なバルク系での空孔拡散問題から、より不均質で複雑な金属結晶粒界での空孔拡散問題へと展開できたこと、ならびに固体酸化物形燃料電池の陽イオン拡散問題へと発展させることができたことから順調に進展しているといえる。また、より簡便な位相空間サンプリング法の開発にも着手し、空孔拡散と転位生成という二つの現象に関する活性化自由エネルギーについて、より深い洞察を得ることができており、当初の目的は達成しているといえる。本年度新たに開発した原子間距離で加速化するハイパーダイナミクス手法によって、原子空孔拡散現象について、実験での応力・温度スケールでの挙動の解明を達成することができた。また、当初の予定では、固体酸化物型燃料電池の陽イオン拡散の問題への適用は次年度の検討項目としていたが、陽イオン空孔の移動自由エネルギー算出への適用可能性も示唆できた。さらに、次年度検討予定である、より複雑な粒界拡散問題にもすでに検討を着手できており、研究はおおむね順調に進展しているといってよい。本年度までに開発した新しいスキームを用いて、金属・セラミクスを対象に、バルク・粒界の自己拡散係数を直接導出することが可能なったが、その妥当性を検討するには、別途反応経路解析から得られた活性化エネルギーデータを入力とするカイネティックモンテカルロ計算が必要である。今後は本検証を考察に含めて、海外雑誌等への投稿を実施する。次年度は、本年度開発した手法をより複雑で現実的な現象へと展開する。具体的には、1.これまでバルク内での空孔拡散に限定していた現象を、表面・粒界での空孔拡散問題に適用すること、2.不純物原子の拡散問題への適用を行う。結果の妥当性検証には、FCC金属粒界を対象とし、別途、反応経路法とカイネティックモンテカルロ法から導出した粒界拡散係数との比較を実施予定でいる。つづいて、固体酸化物形燃料電池に用いられるセラミクス材料への展開も図る。特に、陽イオンの表面・界面への析出現象が電池性能の劣化要因であることから、本研究では、析出現象の速度論的情報の取得を試み、析出駆動力を考察する.また、上記加速化シミュレーションは複雑な手続きが必要となるため、より普及した手法(反応経路解析法と分子動力学法)から、より簡便に活性化自由エネルギ障壁を取得できるシミュレーター開発にも着手する。次年度は、固体の塑性挙動の重要プロセスである転位生成過程に適用を行い、塑性挙動の温度依存性検討を予定している。開発手法の妥当性を考察するため、最終的にはモンテカルロ解析を含めた結果を次年度には国内外発表・論文投稿することとし、未使用額はその経費に当てることとする。次年度は研究最終年度であるため、研究費を成果の対外発表に主に使用する。旅費については,国内への研究旅費・成果発表(次年度3回)に加え,本分野における世界的研究者が集う国際会議(Multiscale Materials Modeling2012とMRS-Meeting2012Fall)への発表参加に伴う海外渡航費用を計上する。また、海外雑誌への論文投稿に伴う費用も計上する。
間葉系細胞移植による新規根管治療技術の開発

今日の歯内療法においても根尖孔の骨性瘢痕治癒を積極的に図る方法は未だに確立されていない。一方で,歯科領域において間葉系細胞移植による硬組織再生医療が可能となりつつあり,また,マウスの歯の再生技術も報告され,歯の各構造における発生機構に基づいた歯科再生医療技術の開発なされている。本研究では歯の発生機構の解析による歯髄,歯周組織の再生療法を利用した根尖孔の骨性瘢痕治癒の基礎的検討を試みた。19年度の研究の結果,in vivoにおいてマウス間葉系細胞由来の歯乳頭細胞中には,象牙質特異的遺伝子Dentin sialoprotein(DSP)発現を有する象牙芽細胞前駆体が存在し,さらに,basicfibroblast growthfactor(bFGF)を添加することによりDSPの発現が増強したことから,bFGFは象牙芽細胞分化誘導因子であることを報告した。また,歯根膜前駆体細胞が存在する歯小嚢細胞から,腱/靭帯形成関連遺伝子が高発現し,歯根膜様構造物を形成する単細胞クローンの採取に成功した。さらに,腱/靭帯マーカー遺伝子であるScleraxis(Scx)が成熟した歯根膜のみに発現することを確認し,過剰発現させた同細胞とフィブリン塊を免疫不全マウスに皮下移植すると石灰化物形成能力が抑制され,規則正しい細胞配列を示す歯根膜様構造物の形成が観察されたことから,Scxは石灰化抑制を介して歯根膜内の区画維持に働く可能性が示唆された。以上の研究成果から,根尖部に象牙芽細胞前駆体細胞,セメント芽細胞および歯根膜前駆体細胞を誘導することができる可能性が強く示唆され,根尖の骨性瘢痕治癒を積極的に促す治療法開発の端緒となすことができた。今日の歯内治療法は、根管内洗浄技術や根管充填法の改善により予知性の高い治療を施すことが可能となったが、根尖歯周組織の積極的な癒痕治癒を図る治療法は未だ確立されていない。一方で、問葉系細胞移植による硬組織の再生医療は歯科保存領域でも可能になりつつある。そこで本研究では、根管治療の確実性を高め、さらにその適応を拡げるため、問葉系細胞移植治療による新たな根管治療技術の開発を試みた。18年度の研究の結果、マウス間葉系細胞由来の歯小嚢細胞は、in vitroにおいて石灰化物形成能と骨形成関連遺伝子の発現を有しており、硬組織形成能を有することが示唆された。さらに同細胞をハイドロキシアパタイトと混和培養後、免疫不全マウスの皮下に移植したところ、セメント質様構造物の形成が観察されたことから、同細胞の3次元培養法にほぼ満足行く結果が得られた。近年、歯科予防への関心が高まり、MI(Minimal Intervention)の概念による健全歯質を可能な限り残した修復処置が実践されているが、広範囲にわたる露髄を伴うケースでは抜髄処置に至ってしまうのが現状である。一方、研究分担者の齋藤らが報告したごとく、マウスの歯の再生技術も報告されており、歯の各構成における発生機構に基づいた歯科再生技術の開発が必要となる。そこで今後は、間葉系細胞移植による新たな根管治療技術の開発のみならず、象牙質を中心とした歯髄発生機構の解析により歯髄再生療法の基礎的検討が必要であると考えられる。
新規シグナル経路GLI1-CXCR4による肉腫悪性形質制御メカニズムの解析

本研究では、高悪性度軟部肉腫のひとつである滑膜肉腫の発生・進展におけるヘッジホッグ系転写因子GLI1の重要性を、滑膜肉腫培養細胞株を用いたin vitroの実験系、およびマウス肺転移モデルを用いて解析し、GLI1が新規標的遺伝子CXCR4を介して、滑膜肉腫細胞の増殖や、浸潤遊走能、肺転移巣の形成を亢進させることを実験的に証明した。また、ヒト正常間葉系細胞を用いてGLI1、SYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子群を同定し、これらの滑膜肉腫診断における病理組織学的診断マーカーとしての有用性を検討したが、有用な遺伝子の同定には至らなかった。滑膜肉腫細胞株SW982にレンチウイルスを用いて、GLI1およびLacZを導入し、これらの遺伝子を安定発現するSW982細胞を樹立した。遺伝子安定発現細胞株を用いて、qRT-PCR解析およびWestern blottingを行い、GLI1がCXCL12-CXCR4シグナルの構成因子であるCXCR4, CXCR7, LCP1の発現を誘導することを明らかにした。次いで、CXCR4のプロモーター配列を用いてレポーターアッセイを行い、プロモーター領域内のGLI1結合配列(GBS)を明らかにするとともに、クロマチン免疫沈降法を用いてGLI1がGBSに結合していることを証明した。また、GLI1を発現したSW982細胞株は、CXCL12に対する化学走化性が亢進していることを、boyden chamber法を用いて明らかにした。一方で、GLI1はSW982細胞株の細胞分裂能を亢進させることも明らかにした。以上より、ヘッジホッグシグナル系転写因子GLI1は、滑膜肉腫細胞において、その細胞分裂能やCXCL12-CXCR4シグナル依存的な化学走化性を制御することで、その悪性形質を制御している可能性を明らかにした。昨年度に樹立したGLI1及びLacZ導入滑膜肉腫細胞株SW982を、免疫不全マウス尾静脈より注射し、肺転移能を比較したところ、GLI1遺伝子導入株で肺転移能の亢進を観察した。ヘッジホッグシグナル経路が、滑膜肉腫細胞のin vitroにおける遊走能のみならず、生体内での肺転移巣の形成をも亢進させることを、実験的に証明した。一方で、ヒト正常間葉系幹細胞に、GLI1および、滑膜肉腫細胞にて観察されるSYT-SSX1融合遺伝子を導入し、cDNAマイクロアレイを用いて、発現遺伝子の変化を網羅的に解析し、これらGLI1および融合遺伝子の下流に存在する遺伝子群を同定した。今後は同定された遺伝子(群)を介した滑膜肉腫の発生、進展メカニズムの解析を進めるとともに、滑膜肉腫の診断に有用な免疫組織学的マーカーの検討も行っていく予定である。レンチウイルスを用いた遺伝子安定発現細胞株の樹立と、それら細胞株を用いたGLI1の機能解析および、ヒト正常間葉系幹細胞株におけるGLI1, SYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子群解析、同定が円滑に行われたため、順調に実験計画を遂行できている。現在までに、GLI1、およびLacZ遺伝子導入滑膜肉腫細胞株SW982を樹立し、in vitroにおける遊走能のみならず、免疫不全マウス尾静脈へ腫瘍細胞を投与する肺転移モデルにおいて、GLI1が滑膜肉腫細胞株の悪性能を制御していることを実験的に証明した。一方で、ヒト正常間葉系細胞株におけるGLI1、およびSYT-SSX1融合遺伝子の転写標的遺伝子をcDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析し、標的候補遺伝子群を同定した。平成29年度は、一年間の研究期間の延長が認められたため、GLI1の薬剤耐性能に及ぼす影響を分子生物学的に検討しつつ、組織学的診断マーカーの同定を引き続き行っていく予定である。2015年6月までは、遺伝子安定発現細胞株の樹立、ヒト正常間葉系幹細胞株におけるGLI1、SYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子解析等の分子生物学的研究が順調に遂行できていたが、2015年7月より、2016年9月まで、米国National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI)への留学に伴い、分子生物学的実験を行うことができなかった。NCIにおいては、滑膜肉腫組織を用いた免疫組織学的解析を行うも、現在までに有用な免疫組織学的診断マーカーの同定を行うことができなかった。前年度までに、GLI1、およびその対照としてLacZ遺伝子を安定導入した滑膜肉腫細胞株SW982を樹立し、in vitroにおける浸潤・遊走能を検討することで、GLI1がこれらの悪性能を制御している可能性を明らかにした。また、同細胞株を免疫不全マウス尾静脈より注射し、肺における転移性病変の形成能を比較したところ、GLI1遺伝子導入株において肺転移病巣が増加しており、ヘッジホッグシグナル経路が、生体内における転移巣の形成を亢進させることを実験的に証明した。一方で、滑膜肉腫の発生・進展メカニズムの解析を目的として、滑膜肉腫細胞株、およびヒト正常間葉系細胞におけるGLI1、およびSYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子群をcDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析し、CXCR4を含む転写標的候補遺伝子群を同定した。

National Institutes of Health/National Cancer Institute (NIH/NCI)との共同研究として、GLI1、およびSYT-SSX1融合遺伝子の転写標的候補遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し、滑膜肉腫組織を含む紡錘形細胞肉腫を免疫組織学的に解析、滑膜肉腫の診断に有用な組織学的診断マーカーの同定を試みたが、同腫瘍に特異的な発現を示すタンパク質の同定には至らなかった。今後も、GLI1-CXCR4シグナル経路の治療標的としての可能性や、滑膜肉腫の病理組織学的診断マーカーの解析・同定を継続していく予定である。本研究では、高悪性度軟部肉腫のひとつである滑膜肉腫の発生・進展におけるヘッジホッグ系転写因子GLI1の重要性を、滑膜肉腫培養細胞株を用いたin vitroの実験系、およびマウス肺転移モデルを用いて解析し、GLI1が新規標的遺伝子CXCR4を介して、滑膜肉腫細胞の増殖や、浸潤遊走能、肺転移巣の形成を亢進させることを実験的に証明した。また、ヒト正常間葉系細胞を用いてGLI1、SYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子群を同定し、これらの滑膜肉腫診断における病理組織学的診断マーカーとしての有用性を検討したが、有用な遺伝子の同定には至らなかった。当初の研究計画では、滑膜肉腫細胞株SW982とユーイング肉腫細胞株RD-ESにGLI1ER融合遺伝子を安定発現させ、β-estradiolを用いて標的遺伝子発現を誘導し、転写因子GLI1の標的遺伝子同定および機能解析を行う予定であった。しかしながら、対照群においてβ-estradiolによる副反応が観察されたことから、レンチウイルスを用いた遺伝子安定発現法に変更したところ、SW982細胞に関しては安定発現株を樹立することができ、GLI1による明瞭な遺伝子発現誘導が観察された。また、細胞分裂能やCXCL12に対する化学走化性も効果的に評価することが可能となり、本研究計画を順調に進めることが可能となった。網羅的遺伝子発現解析によって同定された、GLI1およびSYT-SSX1融合遺伝子の標的遺伝子(群)を解析し、これらが滑膜肉腫の発生、進展に関与する分子病理学的なメカニズムを同定することを試みる。また、滑膜肉腫の診断に有用な免疫組織学的マーカーの同定を目的として、滑膜肉腫をはじめとする複数の軟部腫瘍組織を免疫組織学的に解析する予定である。2016年10月の帰国後より、分子生物学的解析を再開している。平成29年度は、実験計画の延長が承認されたため、分子生物学的研究を継続つつ、免疫組織学的検索に関してはNCIとの共同研究として、本研究計画を継続的に遂行していく予定である。病理学今後は、当初の研究計画通りに、LacZ, GLI1安定発現滑膜肉腫細胞株を用いて、GLI1が腫瘍細胞の薬剤耐性能を制御するかを検討する。また、これらの細胞株における発現遺伝子を網羅的に解析し、細胞分裂能、薬剤耐性能に関連した遺伝子群、シグナル経路の同定を目指す。一方で、EWS-FLI1, SYT-SSX1, PAX3-FKHRといった軟部腫瘍発生に重要だと考えられる融合遺伝子をヒト間葉系幹細胞株に導入し、各融合遺伝子によって発現制御がなされる遺伝子群を同定することで、腫瘍発生に重要なシグナル経路、メカニズムを明らかにすることを試みる。比較的速やかに、無駄なく実験計画を遂行することができ、試薬やプラスチック製品などの消耗品費が抑えられた点があげられる。比較的速やかに実験計画を遂行することができ、試薬やプラスチック製品など消耗品の消費が比較的少量で済んだ点、およびcDNAアレイを用いた網羅的遺伝子解析が、次年度に持ち越されたため。cDNA
急性心筋虚血における細胞障害度の新しい測定法の開発

心臓には大量のFABPが存在し、細胞内可溶分画のFABPは分子量が小さく、約14Kdであった。FABPが心筋細胞分画に存在し、低分子量であることに注目し、心筋細胞障害時に、細胞外へ流出すると考え、流出FABP量と細胞障害度に相関がないか検討した。低酸素下にて心筋細胞の死亡率は4時間で20ー30%、6時間で50%に達した。細胞外に流出するCPKは60mmの細胞培養液4.5mlを500μlに濃縮しなければ検出できなかった。FABPは培養液を濃縮せずに十分検出可能であった。FABPの細胞外への流出は20ー30分頃から検出できた。その流出パタ-ンは図1の細胞障害のパタ-ンと類似してした。低酸素時細胞外へ流出してくるFABPが細胞質FABPであることを確認するために、培養液をSephadex G100,DE52カラムを用い精製したところ、心筋細胞質より精製したFABPと比較した。ゲルろ過し溶出分画の脂肪酸結合能をみると、ボイドの位置と、後に溶出される低分子量の位置に活性ピ-クがみられた。前者は混入アルブミンによるものと思われた。後者をFABP画分としてプ-ルした。ゲルろ過によって得られた画分を、DEAEーセルロ-スクロマトグラマフィ-にかけると、Nacl 0.18Mに相当する緩衝液濃度の位置に脂肪酸結合能の高いピ-クが得られた。培養液に流出したFABPの精製パタ-ンは細胞質より精製した物と一致した。FABPの細胞外への流出機構、すなわち心筋障害のメカニズムを検討するための心筋保護剤としてα,βーblockade,Caーantagononist,PGI_2を投与したところ、FABPの細胞外への流出はβーblockade,Caーantagononist,PG精剤で抑制でき、またtrypanblueによる細胞死亡率もこれらの薬剤にて低下した。以上より、細胞外へ流出するFABPは細胞障害のマ-カ-として使用可能と考えられた。〈研究目的〉FABPはすでにラット心筋にて精製可能であり、現在ヒト心筋にて精製中である。心筋FABPは他の臓器由来のFABPとはアミノ酸配列に相違があり、免疫学的にも特異性が見られる。また心筋細胞質FABPの分子量は14,000、形質膜FABPは60,000と分子量に大きな差があり、それぞれ免疫学的にも特異的である。これらの特異的抗体を用いれば急性心筋梗塞患者に応用することは不可能ではない。CPK・ミオシン軽鎖アイソザイム等は、細胞膜が完全破壊されなければ測定不可能であるが、細胞膜FABPは軽度の膜障害にても血中へ流出することが予想される。細胞膜FABPはCPK・ミオシンと比較すると分子量が小さく細胞膜FABP同様に軽度の膜障害にても血中へ流出すると考える。また測定法も簡便であるため容易に測定可能である。実験動物による成績より、心筋細胞障害を判定し、PTCA、PTCR等の冠動脈再建術を行ない、実際応用が可能と考えられる。〈研究成果〉1.ラット心筋細胞を培養し、低酸素化にてインキュベーションし、細胞障害を作成すると、FABPが遊離してくることが判明した。

2.低酸素下に遊離するFABPはCa^<2+>拮抗薬にて、抑制された。心臓には大量のFABPが存在し、細胞内可溶分画のFABPは分子量が小さく、約14kgであった。FABPが心筋細胞分画に存在し低分子量であることに注目し、心筋細胞障害時に、細胞外へ流出すると考え、流出FABP量と細胞障害度に相関がないか検討した。低酸素下にて心筋細胞の死亡率は4時間で20-30%、6時間で50%に達した。細胞外に流出するCPKは60mmの細胞培養液4.5mlを500μlに濃縮しなければ検出できなかった。FABPは培養液を濃縮せずに十分検出可能であった。FABPの細胞外への流出は20-30分頃から検出できた。その流出パタ-ンは細胞障害のパタ-ンと類似していた。低酸時、細胞外へ流出してくるFABPが細胞質FABPであることを確認するために、培養液をSephadex G-100、DE52カラムを用い精製したところ、心筋細胞質より精製したFABPと比較した。ゲルろ過し溶出分画の脂肪酸結合能をみると、ボイドの位置と後に溶出される低分子量の位置に活性ピ-クがみられた。前者は混入アルブミンによるものと思われた。後者をFABP画分としてプ-ルした。ゲルろ過によって得られた画分をDEAE-セルロ-スクロマトグラフィ-にかけると、Nacl0.18Mに相当する緩衝液濃度の位置に脂肪酸結合能の高いピ-クが得られた。培養液に流出したFABPの精製パタ-ンは細胞質より精製したものと一致した。FABPの細胞外への流出機構、すなわち心筋障害のメカニズムを検討するため心筋保護剤としてα、βblockade、Ca-antagonist、PGI^2を投与したところ、FABPの細胞外への流出はβblockade、Ca-antagonist、PG製剤で抑制でき、またtrypanblueによる細胞死亡率もこれらの薬剤にて低下した。以上より、細胞外へ流出するFABPは細胞障害のマ-カ-として使用可能と考えられた。
子宮内膜癌におけるエストロゲン合成酵素の発現・制御の解析

また、子宮内膜癌組織と正常子宮内膜組織のホモジネートに3^H-E1を添加して産生される3^H-E2および3^H-E2を添加して産生される3^H-E1をHPLCおよび再結晶法により分離・精製して測定した(17β-HSDの活性の測定)。結果は還元型17β-HSDの活性(E1からE2への転換)および酸化型17β-HSDの活性(E2からE1への転換)ともに子宮内膜癌組織と正常子宮内膜組織とで差を認めなかった。また上記とは別に、HDAC阻害剤の乳癌細胞のアロマターゼ発現に及ぼす影響についても検討を行った。SK-BR3乳癌細胞では、PMAによりアロマターゼ活性が亢進する。このPMAによるアロマターゼ活性の誘導はTSA, MS275,apicidineにより抑制され、CBHAおよびsodium butylateにより逆に促進された。一方MCF-7およびT-47細胞ではSK-BR3と異なり、TSAはPMAによるアロマターゼ活性の誘導を促進した。いずれのHDAC阻害剤も、胎盤ミクロソームを酵素源としたin vitroの測定系でアロマターゼ活性の阻害効果を示さなかったことから、アロマターゼの活性阻害剤としての作用はないと考えられた。したがって、HDAC阻害剤はアロマターゼの転写または蛋白合成に影響を及ぼすことでアロマターゼ活性を調節していると考えられた。また、HDAC阻害剤のアロマターゼ活性に及ぼす効果は、細胞種およびHDAC阻害剤ごとに大きく異なっていた。
霊長類頭頂連合野における三次元空間視覚から運動空間構成に関与する神経回路

当該研究において以下の3点を明らかにした。1)外側頭頂間溝野はV3A野から投射を受け、前頭頂間溝野へ投射する。3)VP野とV3A野およびV2野との線維連絡ニホンザルの頭頂間溝外側野は頭頂間溝の外側壁に在在し、視覚空間認識と運動空間溝築とに関係している。当該研究において、頭頂間溝外側野の後部から、三次元コンピュータグラフィックイメージに反応する神経活動を電気生理学的に記録した。さらに、神経トレーサーを外側頭頂間溝野に微量投与して、外側頭頂間溝野はV3A野から視覚性の投射を受けること、さらに外側頭頂間溝野が前頭頂間溝野へ投射することを明らかにした。前頭頂間溝野は運動前野へ投射することが報告されているので、外側頭頂間溝野から前頭頂間溝野への投射が、運動空間構築に関与している可能性がある。V3A野は視覚皮質および視覚連合野皮質のほとんどと線維連絡を持っていた。またVP野はV3A野との双方向性の連絡の他に、V2野のチトクローム染色で染め分けられる全ての構造から投射を受けていた。後頭頂葉視覚連合野皮質は視覚皮質背側路の一部で、空間と物体の三次元視覚認識において重要である。外側頭頂間溝野(LIP野)の後部の神経細胞は三次元物体に視覚的に反応し、一方前頭頂間溝野(AIP野)はその物体を把握する手の運動に反応する。したがって、LIP野からAIP野への情報伝達すなわち神経線維連絡が存在することが予想されるが、LIP野の神経細胞がAIP野に投射しているか否かについてはこれまでのところ解っていない。申請者はニホンザルで三次元空間視覚から把握運動への情報変換を行っていると考えられる神経連絡について検討した。LIP野から三次元視覚刺激に反応する神経活動を記録した後、その皮質からの順方向および逆方向へ神経線維連絡をトレースする目的で、記録部位に記録用ハミルトンシリンジを用いて同じ視覚刺激を用いた神経細胞活動記録下でWGA-HRPを微量注入した。その結果、LIP野の三次元空間視覚反応部位はV3A野から投射を受けAIP野に投射することが明らかになった。そこで、さらにこの発見を確認する目的で、同じ半球のV3A野に順行性のトレーサーを、AIP野に逆行性のトレーサーを同時に微量注入した。その結果、AIP野に投射するLIP野の神経細胞体の近くにV3A野の神経細胞の軸索終末が発見された。この結果はV3A野からLIP野を経由してAIP野に至る側頭間溝の外側壁皮質の神経結合が把握運動の視覚運動情報変換に重要な役割を果たすことを示唆する。空間と物体の三次元視覚認識において重要な視覚皮質背側路のうち、外側頭頂間溝野(LIP野)の後部の神経細胞はから、三次元物体に視覚的に反応する神経活動を記録し、両方向性の神経トレーサーであるWGA-HRPを微量注入した。その結果、LIP野の三次元空間視覚反応部位は視覚皮質V3A野から投射を受け前頭頂間溝野(AIP野)に投射することを発見した。さらに、V3A野に順行性のトレーサーを、AIP野に逆行性のトレーサーを同時に微量注入した。その結果、AIP野に投射するLIP野の神経細胞体の近くにV3A野の神経細胞の軸索終末を発見した。この結果はV3A野からLIP野を経由してAIP野に至る側頭間溝の外側壁皮質の神経結合が、視覚を基盤とした三次元情報の運動情報への変換に重要な役割を果たすことを示している。同時に、これまで存在しないと考えられてきたLIP野からAIP野への投射を証明したことは意義深い。本研究費を用いて、1)外側頭頂間溝野がV3A野から投射を受け、前頭頂間溝野へ投射すること、2)V3A野の線維連絡の詳細、3)VP野とV3A野およびV2野との線維連絡について研究した。ニホンザル頭頂間溝の外側壁に存在する外側頭頂間溝野は空間の認識と運動空間構成に関与している。

本研究で、この領野の後部からコンピュータグラフィック上の三次元図形に反応する神経細胞を記録し、さらにこの部位が三次視覚皮質複合体のうちV3A野から入力を受け、前頭頂間溝野へ投射することを証明した。前頭頂間溝野から運動前野への投射は良く知られており、これらの神経回路が運動空間の構成に重要な役割を果たしていることが示唆された。この結果は国際的に評価の高いJ Neurosciに掲載された。V3A野は背側視覚皮質路の一部と考えられているが、その線維連絡についてはこれまでほとんど分かっていない。そこで頭頂葉へ多くの線維を送っているV3A野へのトレーサー注入標本を詳しく検討した。その結果、V3A野が同側および対側のV2野の背側部と腹側部の皮質と双方向性の線維連絡を持っていること、同側および対側の他の三次視覚皮質複合体V3野およびVP野と双方向性の線維連絡を持っていること、V3A野がV1野へ投射していることを発見した。さらに驚くべきことには、V2野のチトクロームオキシダーゼ染色陽性構造とV3A投射神経細胞の分布との関係を検討し、背側視覚路へ投射しているチトクロームオキシダーゼ反応陽性の太い帯のみでなく、腹側視覚路へ投射しているチトクロームオキシダーゼ反応陽性の細い帯と帯の間の反応陰性の領域もV3Aに投射していることがわかった。この結果は現在投稿中である。三次視覚複合体の一部であるVP野は、腹側皮質視覚路の一部と考えられているが、その線維連絡についてもこれまであまり理解されていない。そこで、三次元視覚の神経回路をさらに明らかにする目的で、VP野に神経トレーサーを微量注入した。その結果、同側および反対側のV3A野と双方向性に線維連絡を持っていることを証明した。また、V2野の腹側部と双方向性の線維連絡を確認した。VP野に投射するV2の神経細胞も、腹側視覚路へ投射しているチトクロームオキシダーゼ反応陽性の細い帯と帯の間の反応陰性の領域だけでなく、背側視覚路へ投射しているチトクロームオキシダーゼ反応陽性の太い帯もV3Aに投射していることがわかった。この結果も現在投稿中である。
時間と質感の接点-質感によって符号化される多感覚情報の時間ずれについての検討-

質感は空間や時間とともに感覚モダリティをまたぐように存在する。感覚モダリティをまたぐように存在する情報は異なる感覚間をつなぐ重要な手がかりとなるだけでなく、感覚統合の結果としてまた新たな知覚体験を生起させる。本研究はこれまで個別に研究されてきた時間知覚と質感知覚の関係性を多感覚統合の観点から明らかにすることを目的とする。具体的には感覚モダリティをまたがった情報間の時間ずれが、直接同時性や同期性を訊くと識別できない場合であっても、質感知覚として符号化されると識別できる場合について、その符号化のメカニズムや情報処理の階層性を解明することを目指す。今年度は、ダンスの映像とスピーチの映像を使った予備調査を行った。その結果、ダンスの映像については、映像と音声にずれがあることに被験者が気付いていない場合であっても、例えば「(ダンスが)下手である」「ノリが違う」というように、何らかの違和感を検知できていることが示唆された。またスピーチについては、映像と音声がずれたことに明示的に気づかない場合であっても、話者への信頼感や説得力といった項目の評価が下がる場合があることがあることが示された。これらはいずれも予備実験であるため、今後、本格的な実験実施にむけて準備を進めていきたい。そのほかの成果としては、ジャーナル論文2本の掲載が決定した(一本は掲載済、もう一本は印刷中)。また視覚学会の実行委員や座長、多感覚研究会の世話人やセッションの企画、司会などを行った。研究所から大学に異動して1年目であり、実験室の整備等が遅れており、本格的な実験実施には至らなかった。一方で、予備調査については、卒論生やゼミ生の力を借りて、当初の予定を超えて進捗している。トータルとしてはおおむね順調に進捗している。実験室の整備が急務であるが、大学が2021年に移転するため、現状で大幅な整備を行うことができない。現在の環境でできることを着実に地道に行っていきつつ、別の方法で代替できることは代替するなど(例えば一部を実験室実験ではなく質問紙調査にするなど)、柔軟に対応していきたいと考えている。今年度は、自分の動作と感覚フィードバックとの間に遅延を挿入し、被験者に同時性判断と質感判断を同時に行っていただく予備的観察を行った。今回の予備的観察結果を参考にして、今後、質感判断と同時性判断の順番や、一度に訊く質問項目数のボリュームなどを調整していく予定である。所属研究機関において、建物の空調工事で実験室に入室できない時期があったこととやそれにともなう引っ越しがあったこと、不正アクセス対応のためのシステム遮断やネットワーク制限等があり、予備的観察は可能であったが、精密に条件を統制した実験実施を行うことが困難な時期があった。2018年度より、研究所から大学に異動した。初年度のため、倫理申請を新しい所属で出しなおしたり実験室を整備したりといった時間が必要であることが課題である。

一度立ち上げたら、その後はスムーズに進むと思われるので、対応策としては、拙速に立ち上げて後でやり直しになって却って時間をロスするといったことにならないように、必要な時間をかけて実験環境を構築し、その後に着実に成果を上げられるようにしていきたい。実験室の整備が急務であるが、大学が2021年に移転するため、現状で大幅な整備を行うことができない。現在の環境でできることを着実に地道に行っていきつつ、別の方法で代替できることは代替するなど(例えば一部を実験室実験ではなく質問紙調査にするなど)、柔軟に対応していきたいと考えている。所属研究機関における建物の空調工事とそれにともなう引っ越し、また不正アクセス対応のためのシステム遮断やネットワーク制限などにより、今年度は予備的観察にとどまり、本格的な実験実施にまで至らなかった。本来予定していた経費は今年度に繰り越して使用する計画である。研究所から大学へ移動した初年度であったため、実験室などの環境整備が十分にできず、本格的な実験に着手できなかった。その代わりに予備実験を多く行った。そのため使用計画に変更が生じた。今後は、現在の環境でできることを地道に着実に進めるとともに、計画変更が必要な部分については柔軟に対処しながら計画を進めていく予定である。
動作追尾と練習支援記録システムを用いたピアノ演奏基礎能力に関する研究

本研究は、ピアノ学習初歩段階での“ピアノ演奏基礎能力"を手の安定性と円滑な運指能力と定義、これを獲得するための基礎練習として、実験者が提案する被験者共通の“共通学習メニュー"と被験者個別の“個別学習メニュー"を被験者6名に提示、打鍵時の“悪癖"の改善を試みた。実験後、ヒートマップに基づく動作追尾等のデータを用いて考察した結果、第1回実験終了後から第2回実験までの“共通学習メニュー"による基礎練習と第2回実験終了後から第3回実験までの“個別学習メニュー"による基礎練習の両者に有効性を確認した。つまり、“悪癖"の改善には“共通学習メニュー"と“個別学習メニュー"を併用した基礎練習が必要である。<研究の具体的内容>本実験の課題曲(ツェルニー30番練習曲集/No.1より第1小節8小節の旋律部分)を用いての予備実験の後、第1回本実験に入った。先ず被験者6名に3年間の研究概要を説明、ピアノ学習歴等のアンケート調査、引き続き課題曲の演奏ビデオを撮影(右手と左手/撮影は正面・左・右の3方向)した。そしてこのビデオ映像から被験者の5指すべての関節および手首の動作分析を三次元化、および打鍵強度と打鍵時間間隔の音響測定分析をヒートマップに基づくグラフで可視化した。次にこれらの可視化されたデータから最も「音の不揃い・歪・ミスタッチ」が顕著に表れている部分を抽出して各被験者の検証個所を特定した。さらにこの抽出した部分に関わる指や関節の打鍵状態が、抽出部分以外との相関関係も重要であると考え、抽出部分に近似した個所をさらに特定し、対象となる指の関節、手首の動作分析を追加した。被験者には第1回本実験(平成27年度)と第2回本実験(平成28年度)のビデオ撮影の間に「演奏基礎能力」を養成する基礎練習を奨励する練習ビデオを作成、このビデオを参照して訓練を行うように指示した。<研究の意義とその重要性>本研究はピアノ学習過程の初歩段階での「演奏基礎能力」獲得におけるピアノ学習者個々の技術的な奏法の課題を見出し、これを克服すための「演奏基礎能力」獲得に有効な練習方法の提案が目的である。平成27年度の第1回本実験での打鍵強度と打鍵時間間隔、および動作追尾分析による被験者データには指の関節や手首の不安定さが現われており、「演奏基礎能力」獲得のための基礎訓練が必要であることがわかった。更に実験を繰り返し、以後どのように改善されていくかというところが本研究の意義であり、「演奏基礎能力」獲得はピアノ学習初心者にとって重要な課題である。予備実験での方法が本実験において支障なく遂行されたため。また、当初の計画では音響測定分析をヒートマップで表す予定であったが、公立はこだて未来大学の竹川佳成研究室の協力によって、ヒートマップをグラフ化することが可能となり、「音の不揃い・歪・ミスタッチ」が顕著に表れている部分を抽出しやすくなったこと。第1回本実験(被験者の実験前の打鍵状況の現状把握)のビデオ撮影終了後、被験者6名に「共通学習メニュー(基礎練習)」による第1期練習期間を設け、約6ヶ月後に第2回本実験を行った。そして実験者が定義した「ピアノ演奏基礎能力」(手の安定性と円滑な運指能力)を動作分析(3次元化)」と「音響測定分析(ヒートマップに基づくグラフ)」の2点で可視化したが、これらのデータのからは6名それぞれの被験者の打鍵状況に明らかな改善は見られなかった。そこで第2回本実験終了後の第2期練習期間において、第1期練習期間と同様の「共通学習メニュー(基礎練習)」を約7ヶ月間継続、そしてこの間を利用して、第2回本実験のデータ分析に基づいて被験者へ被験者6名にそれぞれの打鍵状況の問題点を改善するための「個別学習メニュー(基礎練習)」を実験者が考案、これらを被験者の第2期練習期間終盤の約2ヶ月の基礎練習に加え、「共通学習メニュー(基礎練習)」と「個別学習メニュー(基礎練習)」を約2ヶ月間併用した。その結果、第2回本実験から約9ヶ月後の第3回本実験のビデオ映像では打鍵時の手の安定性が第2回本実験より改善されている傾向が確認された。現在、このビデオ映像をもとに第3回本実験の「音響測定分析(ヒートマップに基づくグラフ)」と「動作分析(3次元化)」の可視化データを作成中である。その後、「共通学習メニュー(基礎練習)」のみより被験者へ被験者6名にそれぞれの打鍵状況の課題に応じた「個別学習メニュー(基礎練習)」を取り入れた併用のほうが「ピアノ演奏基礎能力」(手の安定性と円滑な運指能力)の獲得に効果が見られたことついて、被験者個々の詳細を検証する予定である。被験者6名の5指すべての関節および手首の動作分析の3次元化、および打鍵強度と打鍵時間間隔をヒートマップに基づくグラフ等で可視化しているが、当初はこれらの被験者各々の「音の不揃い・歪・ミスタッチ」が最も顕著に現れているデータ抽出箇所を特定する予定であった。しかし、特定した抽出箇所に近似する部分との相関関係の重要性から、データ抽出部分を当初より広げた。それによってそのデータ収集に時間を要し、第3回本実験が3ヶ月遅れることとなったため。

被験者の実験前の打鍵状況の現状把握のための第1回ビデオ撮影、被験者共通学習メニューによる基礎練習後の第2回ビデオ撮影、被験者の改善点に対応した個別学習メニューによる基礎練習後の第3回ビデオ撮影のすべてを終了した。そして、6名の被験者の打鍵時の手・指・関節の悪癖の改善状況を検証するため、悪癖が見られる被験者個々の抽出点の比較表を作成し、整理した。またこれにあたり、ヒートマップ(グラフ化したものを含む)、動作追尾を基に打鍵時の各指関節と手首の状態をプロットしたボーンスティック、および第1回実験から第3回実験のビデオ撮影の動画から作製した速度調整可能な3視点動画(正面・左・右)同時再生ツール(協力:公立はこだて未来大学竹川研究室)を用いて、より正確な検証を行った。これらのデータを分析した結果、被験者個々に改善状況に差異が見られたものの、悪癖を改善することにより「ピアノ演奏基礎能力」(手の安定性と円滑な運指能力)の獲得に向う傾向を確認した。しかし、6名の被験者個々に改善状況には、年齢と学習経験、打鍵改善への自覚など、アンケートから垣間見ることができる被験者それぞれの特徴とも関連している。被験者に1年3ヶ月という実験期間を用いて悪癖改善のための2つのメニューによる基礎訓練をさせたが、第1回実験終了後から第2回実験までの期間に提示した「共通学習メニュー」(被験者共通)を使った基礎練習に加え、第2回実験終了後から第3回実験までの期間に提示した「個別学習メニュー」(被験者個々の悪癖に対応)を加えることが、悪癖の改善効果には必要であることを確認、これは、ピアノ指導者がピアノ学習者の個々の打鍵状況を十分に把握し、学習者個々に対応する「個別学習メニュー」を考案し、打鍵時における悪癖改善の指導に活用する重要性を裏付けるものである。本研究は、ピアノ学習初歩段階での“ピアノ演奏基礎能力"を手の安定性と円滑な運指能力と定義、これを獲得するための基礎練習として、実験者が提案する被験者共通の“共通学習メニュー"と被験者個別の“個別学習メニュー"を被験者6名に提示、打鍵時の“悪癖"の改善を試みた。実験後、ヒートマップに基づく動作追尾等のデータを用いて考察した結果、第1回実験終了後から第2回実験までの“共通学習メニュー"による基礎練習と第2回実験終了後から第3回実験までの“個別学習メニュー"による基礎練習の両者に有効性を確認した。つまり、“悪癖"の改善には“共通学習メニュー"と“個別学習メニュー"を併用した基礎練習が必要である。今後の計画に変更点はないが、被験者の動作分析の際の計測点(関節)にマークをして正面・左・右の3方向からビデオ撮影を行ったが、指の動きのよって計測点に死角が生じる。動作分析の三次元化は少なくとの2方向からの撮影で可能になるものの、より正確なデータをとるためには、計測点(関節)のマークの方法とビデオ撮影の角度を改善する課題が生じた。ツェルニー30番練習曲第1番(第1小節第8小節の上声部旋律/左・右ともに同旋律)の被験者6名による演奏を対象に、約1年5ヶ月に及ぶ第1回本実験、第2回本実験、第3回本実験を行った。そして、それぞれのビデオ映像をもとに打鍵強度・打鍵時間間隔のヒートマップのグラフ化、及び動作追尾を用いた打鍵状況(演奏時の第1指から第5指および手首の関節指の動作)の可視化データを作成、比較を行った。これらをもとに被験者の「ピアノ演奏基礎能力」(手の安定性と円滑な運指能力)の改善の進捗状況の考察を行う。
臍帯血中ヒトグルココルチコイドレセプターの発現とステロイド抵抗性に関する検討

福島医大および関連施設で出生した在胎30週未満で出生した41名の児において、グルココルチコイド受容体(GR)の遺伝子多型と周産期予後の関連性を検討した。対象児から、血液を採取し、DNAの抽出した後、4種類のGRの遺伝子多型を調べた。そのうち、3種類は検出されず、BclIのみ検出された。BclIの遺伝子多型の割合は、G/G:33名(以下GG群), G/C:8名(以下GC群)、C/C:0名だった。G/G群とG/C群の2群に分け、様々な周産期因子との関連を調べた。その結果、難治性低血圧、生後48時間以内の塩酸ドパミン最大量、塩酸ドブタミン最大量は、G/C群に比較し有意にG/G群で少なかった。在胎30週未満の早産児において、ハイドロコルチゾン(HDC)を主としたステロイドホルモン投与が低血圧や慢性肺疾患(CLD)に対して行われている。しかし、HDC治療への反応には個人差がある。我々は、グルココルチコイド(GC)受容体の一塩基遺伝子多型(SNP)が早産児の急性期難治性低血圧、CLDに対する影響を調べた。尚、急性期難治性低血圧は、生後48時間において容量負荷、塩酸ドパミン(DOA)5μg/kg/分以上投与にても低血圧が持続し、HDCの反復投与が持続した症例とした。GC受容体には4種類のSNPが知られている。GCの感受性を増加させるSNP2種類(N363S、BclI)、感受性を減弱させるSNP2種類(R23K、GR-9β)である。約200名から血液を採取し、DNAを抽出し、4種類のSNPの頻度をTaqMan法にて解析した。また、急性期難治性低血圧、CLDなどの出生後因子とSNPの関連を調べた。30週未満の児(26例)において遺伝子多型の違いでGG群、GC+CC群の2群に分け、出生後因子との関連を調べた。急性期難治性低血圧、DOA最大量がGG群で有意に少なく(P=0.04、P=0.04)、重症CLDは差を認めなかった。以上から、GCの感受性を増加させるGC受容体のSNPをもつ児においては急性期難治性低血圧になりにくい可能性が示唆された。出生直後にBclIのSNPを調べることでDOA、HDCの投与量を含めた循環管理の指針をたてることができると考えられた。平成22年10月から平成25年3月まで福島県立医大および国立病院機構福島病院で出生した児のうち、220名を対象とした。本研究での血液採取は出生した各病院において、臍帯血もしくは児からの静脈血、動脈血を生後3時間以内に採取した。30週未満で出生の児を、GRの遺伝子多型であるBclIの遺伝子多型であるG/G群とG/C群の2群に分け、様々な周産期因子との関連を調べた。その結果、難治性低血圧、生後48時間以内の塩酸ドパミン(DOA)最大量、塩酸ドブタミン(DOB)最大量は、G/C群に比較し有意にG/G群で有意に少なかった。BclI遺伝子多型はグルココルチコイドのGRに対する感受性を良くすると報告されている。BclIの遺伝子多型であるG/G群では、少量のグルココルチコイド投与でも心筋のカテコラミン受容体が発現しやすく、DOA、DOB最大量が少なく済み、また昇圧しやすいために難治性低血圧が少なかったと考えられた。早産児では出生後早期に低血圧、尿量低下などを主症状とする急性期難治性低血圧(refractory hypotension: RH)という病態がある。ステロイド投与を行うことが多いが、それに対する反応性の差が大きい。本研究は、在胎30週未満出生児のステロイドホルモン、そしてグルココルチコイド受容体(GR)の遺伝子多型(SNP)を調べることで急性期RHの病態を解明することを目的とした。急性期RHではカテコラミン、容量負荷でも低血圧が持続し、ステロイド投与で昇圧することをよく経験する。急性期RHは晩期循環不全(LOC)と同じく相対的副腎不全が原因と推測されている。近年、LOCの原因は、ステロイド代謝に関わる3βーHSD活性が早産児では低く、ストレスに見合ったコルチゾールが産生できないからであるとの報告ある。急性期RHがLOCと同様の原因であるのかを各種ステロイドホルモン測定値から確かめた報告はない。また、RHのステロイド治療に対する反応の差が、グルココルチコイドに対するGRの感受性の違いにあると考えた。

既知のGRのSNPのうち、2種類がグルココルチコイドの感受性が増加するSNPであり、3種類は抵抗性のSNPである。研究計画として、(1)約30名の30週未満の児の臍帯血および日齢7の血清を採取する。その血清からLCMS/MS法にて10種類のステロイドホルモンを測定する。(2)臍帯血からDNAを抽出する。GRのSNPに関して、リアルタイムPCRを使用しTaqMan法でSNPタイピングを行う。30週未満の児だけでなくそれ以外の児(合計約1000名)からもSNPタイピングを行い、一般的なSNPの頻度も調べる。ステロイドホルモンやGRのSNPを測定することで、急性期RHの病態解明、発症の危険性、治療への反応性を事前に知ることが可能となる。新生児一人一人に対応したテーラーメード治療に繋がる。30週未満出生の児が予想よりも少なく、検体数が集まっていない。今年度も目標70検体とし、検体を集める。また、30週未満の児の出生直後の血清を保存しており、10種類のステロイドホルモンをLC-MS/MSで測定し、SNPとの関連を調べる予定であるが、まだ測定に至っていない。血液検体から抽出したDNAをTaqMan法でSNPタイピングする際に、うまく結果が出せず時間を要した。また、ステロイドホルモンのLC-MS/MSでの測定を確立させるのに時間を要している。検体数を増やしたうえで、BclIのSNPと急性期難治性低血圧の関連を調べる。また、LC-MS/MSでのステロイドホルモン測定を進める。SNPタイピング、LC-MS/MSでのステロイドホルモン測定をより確立したものとする。次年度中に測定したデータを解析し、難治性低血圧におけるステロイドホルモン値、グルココルチコイド受容体のSNPの頻度を明らかにする。グルココルチコイド受容体のSNPのに関しては、欧米ではすでに大規模な検索がなされており、頻度が知られている。しかし、日本では成人50人での検索しかなされていない。今回は、約1000人(30週未満の児30人を含む)での検索を行うので、初めて日本人でのグルココルチコイド受容体のSNPの頻度を明らかにする。これらを調べることで、日本からの難治性低血圧、晩期循環不全が多い原因が判明するかもしれない。現在行っているグルココルチコイド受容体のSNPタイピング、LC-MS/MSでのステロイドホルモン測定を行うための試薬、消耗品が次年度も必要である。現在行っている臍帯血を用いたグルココルチコイド受容体のSNPの検索は検体数が多い。DNAの抽出、リアルタイムPCRでのTaqman法を用いたSNPタイピングでのも多くの試薬を購入する予定である。また、ステロイドホルモン測定(10種類同時測定)にLCMS/MSを使用するが、その調整、測定でも多くの試薬を使用する予定である。