hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
繊毛内部のキラリティが作られるメカニズム

本研究は、繊毛運動に必要な構造であるダイニン腕の組み立て、繊毛への運搬の分子機構解明を目的としている。当研究室において作製したPcdrp (Primary Ciliary Dyskinesia Related Protein)ホモノックアウトマウスは繊毛内部構造のダイニン腕の著しい減少を示し、繊毛運動が無くなる。今年度は、得られたPcdrp結合蛋白質の中からMyh10、Myh11がPcdrpに結合していることをウエスタンブロッティングで確認した。さらにPcdrpホモノックアウトマウスでダイニン腕複合体の組み立てが正常に行われているのかどうかを確認した。精巣特異的にCre酵素を発現するNanos3+/Creを用いて、精巣特異的Pcdrpノックアウトマウスを作製し解析に用いた。その結果、精巣特異的Pcdrpノックアウトマウスでは精子運動が無くなるにも関わらず、ダイニン腕の中間鎖であるIC1とIC2の組み立ては野生型と同様に正常である事が確認できた。Pcdrp結合蛋白質であるミオシンはアクチンを足場として移動するモーター蛋白質である事が知られている。PcdrpがMyh10、Myh11と結合し、ダイニン腕複合体の構成因子であるIC1とIC2の組み立てが精巣特異的Pcdrpノックアウトマウスで正常であった事から、Pcdrpはダイニン腕複合体形成後、細胞質から繊毛へダイニン腕を運搬する過程において役割を果たしている可能性が示唆された。現在Myh10、Myh11ノックアウトマウスをCRISPR/CASシステムを用いて作製しており、各ノックアウトマウスのノード、気管、精子運動を確認するために準備を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。近年、繊毛運動の異常が先天性水頭症、男性不妊、内臓臓器の左右非対称性の異常を引き起こし、ヒト遺伝病(繊毛症)の原因となる事が報告されている。繊毛症の原因遺伝子の一つとしてゼブラフィッシュから単離されたPcdrp (Primary Ciliary Dyskinesia Related Protein)に着目し研究を進めている。当研究室において、Pcdrp遺伝子のコーディング領域を欠損したノックアウトマウスを作成した。Pcdrpホモノックアウトマウスは繊毛内部構造のダイニン腕の著しい減少を示し、繊毛運動が全くみられなかった。その結果繊毛症と呼ばれる内蔵臓器の左右非対称性の異常、水頭症が引き起こされる事が明らかになった。さらにPcdrp::Venus BACトランスジェニックマウスを作製しPcdrpの局在を解析した。その結果、Pcdrpは運動性繊毛を持つ組織、マウス8日胚ノード、気管、精巣で確認でき、その局在は運動性繊毛を有する細胞に限局して細胞質内全体でdot状に局在した。このことから、Pcdrpは細胞質内でのダイニン腕の組み立て、運搬に機能している可能性が考えられた。さらにPcdrpのダイニン腕に対する詳細な機能を明らかにするためにPcdrp::Venus BACトランスジェニックマウスと、野生型の精巣に対してGFP抗体とPcdrp抗体を用いて免疫沈降を行った。それぞれのサンプルについて質量分析計を用いた溶液ショットガン解析により、Pcdrp結合蛋白質を得た。Pcdrp、Pcdrp結合蛋白質、ダイニン腕同士の関係性については、今後のさらなる研究が必要である。運動性繊毛が全く動かなくなるというPcdrpノックアウトマウスの表現型を確定でき、Pcdrpの細胞内局在が運動性繊毛をもつ組織の細胞質全体である事を明らかにできた。さらにPcdrpの結合蛋白質候補も得られたのでおおむね順調に進展しているといえる。

得られたPcdrp結合蛋白質候補からどの蛋白質がPcdrpと結合し、ダイニン腕の複合体形成、繊毛までの運搬に関連するのかを今後解析する予定である。具体的にはショットガン解析から得られた結合蛋白質候補についてウエスタンブロッティングによりその結合を確認する。さらにPcdrp結合蛋白質はダイニン腕と結合するのか、Pcdrpノックアウトマウスでその結合に変化はあるのか、Pcdrpノックアウトマウスでダイニン腕複合体の組み立ては正常に行われているのかどうかを確認する。さらにPcdrp結合蛋白質ノックアウトマウスを作製しPcdrpノックアウトマウスと同様に繊毛運動が無くなる表現型を示すのか確認する。26年度が最終年度であるため、記入しない。
生体磁気計測システムを用いた虚血心筋の局在に関する基礎的研究

1.本研究では、磁場の接線方向の心磁計測を行なった。2.この測定結果をもとに、心起電力の二次元ベクトル表示法(ベクトルアローマップ)を作成し、(1)健常者6例(2)心疾患を有する38症例、うち関心根治手術例17例を対象に、術前術後の心磁図の変化を検討した。3.これにより、以下の結果を得た。(1)良好な心磁が測定でき、等磁図およびベクトルアローマップが得られた。(2)心磁図で、心電図のP波、QRS波とそれに続くT波に対応する波形が得られ、QRS部分から得られたベクトルアローマップは、心室脱分極の局在、起電力の方向と強さ、およびその経時変化を示した。(3)肥大心の術前術後のベクトアローマップで、手術によって、ベクトルの方向の変化と、その局在の特性が示された。(4)虚血心で、心筋虚血部位に対応して、起電力ベクトルの乱れを認めた。4.以上から、以下の結論を得た。(1)接線方向成分の心磁測定は、心臓外科領域において起電力変化の局在診断に有用性が高いと考えられた。この研究により、心臓外科領域への心磁計測の有用性と限界が明らかにされた。
電位依存性一過性Kチャネルのアラキドン酸感受性と遺伝子解析

早期不活性化A型Kチャネルは興奮性細胞において活動電位の発生タイミング調節、発生頻度調節、早期再分極形成などの重要な役割を演じている。ラット各種平滑筋細胞に発現しているA型Kチャネルは主にKv4.3であり、特に既知の脳由来Kv4.3(Kv4.3M)のC末端領域に19アミノ酸が挿入された新規遺伝子多形(Kv4.3L)が主要であること、心筋ンのA型KチャネルはKv4.2と4.3の混合であるが、そのKv4.3もKv4.3Lが主要であることが示された。また、脳においてはKv4.3MmRNAが圧倒的に高発現であるが、海馬にはKv4.3Lが高発現していることが明らかとなった。さらに電気生理学的にクローンKチャネル電流とA型K電流を比較するため、HEK293細胞に形質導入し、その巨視的電流を測定した。ラット精管平滑筋細胞からA型K電流を記録し、クローンKv4.2,4.3M,4.3L電流と定量的に比較検討した。その結果、これらのクローンKチャネル電流は精管A型電流と類似したキネティクスを示したが、活性化・不活性化電位や不活性化からの回復の時間依存性などの細部では有意に異なっていた。特に不活性化からの回復は精管A型K電流において明らかに早かった。アラキドン酸に対する感受性には両者で差が見られなかった。キネティクスの違いは細胞骨格とKチャネルの関係が平滑筋細胞と強発現HEK細胞で異なるためでないことが示唆された。βサブユニットあるいは細胞内制御因子の存在を考えるべきであると思われる。Kv4.3MとKv4.3L電流の間には、少なくともホールセルクランプ法で観察する限り、電気生理学的に明かな差はなかったため、Kv4.3LのC末端細胞内領域の末端167アミノ酸を除去した変異体を作成したが、不活性化からの回復は若干遅延したもののそれ以外のキネティクスは変化しなかった。早期不活性化A型Kチャネルは興奮性細胞において活動電位の発生タイミング調節、発生頻度調節、早期再分極相形成などの重要な役割を演じている。ラット各種平滑筋細胞に発現しているA型Kチャネルは主にKv4.3であり、特に既知の脳由来Kv4.3(Kv4.3M)のC末端領域に19アミノ酸が挿入された新規遺伝子多形(Kv4.3L)が主要であることが強く示唆された。さらに心筋のA型KチャネルはKv4.2と4.3の混合であるが、そのKv4.3もKv4.3Lが主要であることが示唆された。また、脳においてはKv4.3M mRNAが圧倒的に高発現であるが、海馬にはKv4.3Lが高発現していることがあきらかとなった。さらに電気生理学的にクローンKチャネル電流とA型K電流を比較するため、HEK293細胞にKv4.2,4.3Mまたは4.3Lを形質導入し、その電流をホールセルクランプ法により測定した。ラット輸精管からの平滑筋細胞からA型K電流を記録し、クローンKv4.2,4.3M,4.3L電流と定量的に比較検討した。その結果、これらのクローンKチャネル電流は輸精管平滑筋A型電流と類似したキネティクスを示したが、活性化・不活性化電位や不活性化からの回復の時間依存性などの細部では有意に異なっていた。

特に不活性化からの回復はA型K電流において明らかに早かった。4-アミノピリジンに対する感受性もクローンKチャネル電流とA型電流では異なっていたが、アラキドン酸に対する感受性には差が見られなかった。上記のキネティクスの違いは細胞骨格とKチャネルの関係が平滑筋細胞とKチャネルクローンを強発現させたHEK細胞で異なることに由来するものではないという示唆を与える結果が得られた。βサブユニットあるいは細胞内制御因子の存在を考えるべきであると思われる。なお、Kv4.3M2:Kv4.3L電流の間には、少なくともホールセルクランプ法で観察する限り、電気生理学的に明かな差はなかった。早期不活性化A型Kチャネルは興奮性細胞において活動電位の発生タイミング調節、発生頻度調節、早期再分極相形成などの重要な役割を演じている。ラット各種平滑筋細胞に発現しているA型Kチャネルは主にKv4.3であり、特に既知の脳由来Kv4.3(Kv4.3M)のC末端領域に19アミノ酸が挿入された新規遺伝子多形(Kv4.3L)が主要であること、心筋のA型KチャネルはKv4.2と4.3の混合であるが、そのKv4.3もKv4.3Lが主要であることが示された。また、脳においてはKv4.3M mRNAが圧倒的に高発現であるが、海馬にはKv4.3Lが高発現していることが明かとなった。さらに電気生理学的にクローンKチャネル電流とA型K電流を比較するため、HEK293細胞に形質導入し、その巨視的電流を測定した。ラット精管平滑筋細胞からA型K電流を記録し、クローンKv4.2,4.3M,4.3L電流と定量的に比較検討した。その結果、これらのクローンKチャネル電流は精管A型電流と類似したキネティクスを示したが、活性化・不活性化電位や不活性化からの回復の時間依存性などの細部では有意に異なっていた。特に不活性化からの回復は精管A型K電流において明らかに早かった。アラキドン酸に対する感受性には両者で差が見られなかった。キネティクスの違いは細胞骨格とKチャネルの関係が平滑筋細胞と強発現HEK細胞で異なるためではないことが示唆された。Kv4.3MとKv4.3L電流の間には、少なくともホールセルクランプ法で観察する限り、電気生理学的に明かな差はなかったため、Kv4.3LのC末端細胞内領域の末端167アミノ酸を除去した変異体を作成したが、不活性化からの回復は若干遅延したもののそれ以外のキネティクスは変化しなかった。
オノマトペを用いた共感覚的表現処理の神経基盤の解明

本年度は脳機能計測実験に用いる刺激語の選定を実施した。本研究計画は、多感覚統合処理時の脳内基盤を検討するために、当初は視覚、聴覚、触覚、味覚、嗅覚の5感全てに関するオノマトペを用いる予定であった。しかし、先行文献を調べると味覚については日本語オノマトペでは食感など口内感覚を示すものが多く、「甘い」、「苦い」という形容詞のような味覚そのものを直接的に表現するオノマトペが少ないことがわかった。同様に、嗅覚についても日本語オノマトペでは、「臭い」という形容詞のような嗅覚そのものを直接的に表現するオノマトペが少ないことがわかった。このため、味覚と嗅覚については本研究の対象から除外した。残りの視覚、聴覚、触覚の3つの感覚に対して、共感覚表現を調べた先行研究を基にしてそれぞれの感覚と関連する計34種のオノマトペを選定した。しかし、内訳が視覚10種、聴覚8種に対し、触覚16種と感覚間で偏りが生じているため、単語親密度などを参考に視覚、聴覚についての追加の候補語を選定している。また、当初はオノマトペについてのみを刺激に用いる予定であったが、右半球でも処理が行われるオノマトペと、左半球で優位に処理が行われる形容詞でも差が認められる可能性が考えられる。このため、形容詞についても視覚、聴覚、触覚の3つの感覚と関連する語を、オノマトペと同数になるよう選定して、共感覚表現時の脳内処理にオノマトペと形容詞で差異が認められるかも検討する。感覚を表現するオノマトペはあるものの、感覚ごとに数の偏りが見られ刺激語の選定に時間がかかっているため。感覚ごとの数の偏りがなくなるように刺激語の選定し、刺激作成が終了次第、脳機能計測を開始する。本年度は刺激語選定に時間が生じたため、実験を開始することができなかったため被験者への謝金や実験に関する消耗品、データ解析のためのソフトなどの購入を行わなかったので次年度使用額が生じた。刺激を作成次第、実験を実施するため、実験実施にかかる上記の費用に使用する。
キイロショウジョウバエを用いた脳の高次視覚中枢における神経回路構造の体系的解析

これまで乏しい知見しかなかったショウジョウバエの高次視覚中枢の内部について個々の神経回路要素の位置を特定するため、シナプスや神経線維全体を染める抗体を用い、視覚中枢内部の局所的特徴を解析した。この結果、シナプスが球状に密集した「島」状の領域を多数同定した。これらの構造は嗅覚系一次中枢である触角葉に見られる糸球体構造と非常に類似していたので、視覚糸球体と名付けた。さらに、低次視覚中枢である触角葉と高次視覚中枢とを結ぶ視覚投射神経をラベルするGAL4エンハンサートラップ系統を用い、これらが投射する標的領域を、高次視覚中枢の内部の形態的ランドマークに従って詳細にマップした。また、出力シナプスの位置のみを特異的にラベルする手法を用いて、同定した個々の神経種について、情報が伝わる向きを解析した。この結果、低次中枢から高次中枢へ情報を伝える求心性の神経は、「コラム型」もしくは「接線型」の2種類の投射様式を示していた。「コラム型」求心性神経の末端は、全て同定された糸球体の位置と一致し、少なくとも糸球体の過半数はコラム型求心性神経の末端によって形成されていることが分かった。一方、接線型求心性神経の末端は糸球体には投射せず、それ以外の領域に拡散して投射していた。また、コラム型は経路ごとに異なる位置に投射するのに対し、接線型は複数の経路が同じ位置に重複投射していた。一方、高次中枢から低次中枢へ情報伝える遠心性神経は、すべて接線型であった。これら接線型遠心性神経の中で糸球体に投射するものはなく、また、コラム型/接線型の求心性神経の投射と重複する位置に投射するものもほとんどなかった。従って、高次視覚中枢から低次視覚中枢への情報は、低次視覚中枢から情報を受け取った高次脳領域から直接フィードバックされるのではなく、いったんさらに別の視覚中枢へ送られた情報が間接的にフィードバックされるか、嗅覚など他の感覚情報の情報が別の脳領域で統合されたものが低次視覚中枢に伝達されている可能性が高いことが示唆された。これまで曖昧な知見しかなかった前部視覚中枢の内部について個々の神経回路要素の位置を特定するため、まず、シナプスや神経線維全体を染める抗体nc82を用い、前部視覚中枢内部の細かな局所的特徴を細かく把握した。この結果、前部視覚中枢の内部を貫く神経線維の束を6種類、シナプスが球状に密集した「島」状の領域を11ケ所同定した。これら線維束やシナプス密集領域の位置には個体差がほとんど見られなかった。また、グリア細胞の突起をラベルして解析したところ、これら線維束やシナプス密集領域は周囲を特徴的にグリアで囲まれていた。とくにシナプス密集領域の構造は、触角葉で見られる糸球体構造と非常に類似していたので、これらを糸球体と名付けた。次に、視覚・嗅覚・聴覚系の投射神経をラベルするGAL4エンハンサートラップ系統を用い、これらが投射する標的領域を、上記のランドマークを用いて基本台帳地図上に詳細にマップした。この結果、視覚中枢からの「コラム型」投射神経の末端は、全て同定された糸球体の位置と一致し、少なくとも糸球体の過半数は、コラム型投射神経によって形成されていることが分かった。一方、接線型投射神経の末端は糸球体には投射せず、それ以外の領域に拡散して投射していた。

コラム型は経路ごとに異なる位置に投射するのに対し、接線型は複数の経路が同じ位置に重複投射していた。一方、触角葉からの嗅覚系投射神経の末端は、視覚系の神経が投射する領域とは離れた場所に集中していた。聴覚系の投射も、前部視覚中枢下部の、別の場所に投射していた。従って視覚・嗅覚・聴覚系の情報は、どれも前部視覚中枢には送られるが、その中の別々の領域に分かれて伝えられることが分かった。これは、一見大きな境界が見られない前部視覚中枢下部が、入力する情報という点では少なくとも3つの大きなゾーンに分かれていることを示唆している。また、異種の情報の統合は、投射神経同士が直接行うのではなく、投射神経から情報を受ける介在神経のレベルではじめて生じることが示唆された。高次視覚中枢への投射の全貌を把握するため,前部視覚中枢に続いて後部視覚中枢の構造も解析し,両者を比較した。前部視覚中枢は一次視覚中枢の中のlobula領域からの投射を受けているのに対し,後部視覚中枢はlobula plate領域からの投射およびlobulaとlobula plate両方の領域からの投射を受けていた。また,前部視覚中枢と同様に,後部視覚中枢にも視覚だけでなく嗅覚系からの神経投射を発見した。ただし嗅覚系低次中枢からの投射経路は,前部視覚中枢と後部視覚中枢では大きく異なっていた。前部視覚中枢と後部視覚中枢は一見すると一体化した構造であるため,その境界は従来はっきりと規定されていなかった。しかし,上記のように両者では投射する視覚神経の経路が異なることから,視覚中枢内の糸球体の分布を,各糸球体が由来する低次中枢の領域ごとにマップすることによって,その境界線として,両中枢の位置関係を精密に規定した。昨年度の研究で,聴覚感覚器の神経が前部視覚中枢に投射することを発見したが,さらに聴覚一次中枢からの介在神経も,同じ領域に投射することを見出した。ただし,嗅覚系の場合は投射領域が視覚系の投射とかなり入り組んだ関係にあるのに比べ,聴覚系の投射領域は視覚中枢の下部に限られ,他とは明確に独立していた。他の解剖学的特徴とも合わせ,この部分は,前部視覚中枢でなく別個の領域として定義し直すことにした。以上の研究で,昆虫の代表的高次視覚中枢とその内部の構造を,初めて明確に示すことができた。
ヘルマンスキー・パドラック症候群合併例からの統合失調症脆弱性決定遺伝子の探索研究

ヘルマンスキー・パドラック症候群(HPS)と精神病性障害との集積家族における解析から、HPS4遺伝子にナンセンス変異を見出した。この遺伝子変異が、当該家族におけるHPSの原因と考えられた。この遺伝子が統合失調症にも関与するかを検討するため、統合失調症患者422名、健常対照者578名を対象に、DNA多型をベースにした患者-対照研究を行い、イントロンに存在する一塩基多型(SNP)の対立遺伝子(アリル)頻度が有意に健常対照者に高いことを見出した。また、一部の対象者に対して、認知機能検査(BACS-J)を行い、当該アリルを有する群において、患者、健常者ともワーキングメモリが高いことが示された。以上より、このアリルが病態に対して何らか保護的に作用している可能性が考えられ、HPS4遺伝子が統合失調症の病態に関与していることが示唆された。我々は、常染色体劣性遺伝形式を取る稀な遺伝性疾患ヘルマンスキー・パドラック症候群と精神疾患である統合失調症との合併例のDNA解析を行った。その結果、ヘルマンスキー・パドラック症候群を引き起こしている可能性が高い、ホモのナンセンス変異をある遺伝子上に発見した。また、同疾患の罹患同胞についても、全く同一の変異を確認した。この変異により、遺伝子産物(タンパク質)が短くなり、重要な機能を失うために、疾患が引き起こされることが想定される。この知見は、本家系のみならず、同疾患に苦しむ方々を救う端緒となりうる重要なものであると考えられる。また、我々はこの遺伝子変異が、本症例の統合失調症発症にも関与しているのではないかとの仮説を持っている。今後は、この遺伝子と精神疾患との関連を見出していくこととなる。そのため、「(1)統合失調症との関連解析」と「(2)タンパク機能解析」が大きな軸となる。現在、当大学倫理委員会にて承認を得た計画に則り、書面による同意を得た上で採取した患者・健常者のDNAサンプルを用いて、当該遺伝子領域のリシークエンシング、-塩基多型(SNP)タイピングを行っている。サンプル数を増やして、患者短対照研究を行う予定である。また、当該遺伝子のcDNAを哺乳類細胞発現プラスミドにつないでクローニングを行った。これを哺乳類細胞にトランスフェクションし、細胞内での局在、機能について調べている。これらの研究を通して、統合失調症をはじめとした精神疾患の病態により迫ることができると考えられる。我々は稀な遺伝性疾患であるヘルマンスキー・パドラック症候群(HPS)と精神疾患を合併している自験家系を糸口にして、統合失調症とHPSの病態に共通の機序を持つ関連遺伝子を患者対照研究において解析を進めている。平成21年度は、この自験家系の構成員全員から同意を得て採血し、この家系のHPSの原因となる遺伝子の変異を同定した。この遺伝子変異を持つHPS罹患患者に統合失調症が合併したという報告はこれまでになく、論文作成を鋭意進めている。これと並行して行っている一般の統合失調症患者と健常対照者(それぞれ約300名程度ずつ)の比較研究でも、この当該遺伝子上の一塩基多型(SNP)の頻度に有意な差を見出した。このSNPの生物学的意義を見出すため、追加実験を組みながら、この成果も論文作成を鋭意進めている。当該遺伝子の機能解析の第一歩として、当該遺伝子(正常型とおよびHPSでみられる変異型)のopenreading frameをクローニングして、緑色蛍光タンパク(GFP)遺伝子と融合させた。これを神経芽細胞株SH-SY5Yに導入して、融合蛋白が発する蛍光を観察することによって、突起伸長等の神経ネットワークが形成される過程にこの変異遺伝子がどのような影響を与えるかを解析している。当該遺伝子の機能変化が神経系の発達や機能にどのような影響を与えるかを明らかにすることにより、統合失調症の成因ひいては脳機能そのものについても、新しい知見が得ることが期待される。平成21年度までに、この自験家系の構成員全員から同意を得て採血し、この家系のHPSの原因となる遺伝子の変異を同定した。HPS関連遺伝子の中には、統合失調症を始めとした精神疾患との関連が示唆されるHPS7(=dysbindin)も存在し、これら遺伝子群と精神疾患との関連について注目が集まっている。平成22年度は、書面による同意を得た一般の統合失調症患者約420名と健常対照者約580名の末梢血DNA用い、関連解析を行った。

その結果、当該遺伝子上の一塩基多型(SNP)の頻度に有意な差を見出した。ここまでの結果については、北米神経科学大会等で示説を行った。また、このSNPの生物学的意義を見出すため、Brief Assessment of Cognition in Schizophrenia(BACS)成績と多型、mRNA発現量と多型との関連について検討を行った。ここまでの結果について、現在論文化を進めている。当該遺伝子の機能解析の第一歩として、当該遺伝子(正常型とおよびHPSでみられる変異型)のopenreading frameを、単体および緑色蛍光タンパク(GFP)等のタグを融合させた形で発現できるようクローニングを行い、細胞内動態等について検討を進めている。また、当該タンパクのbindingpartnerを明らかにするため、イースト・ツーハイブリッド法による解析も進めている。当該遺伝子の機能変化が神経系の発達や機能にどのような影響を与えるかを明らかにすることにより、統合失調症の成因ひいては脳機能そのものについても、新しい知見を得ることが期待される。
熱帯熱マラリアワクチン抗原 SERA5 タンパク質の立体構造解析

マラリアワクチン候補抗原SE36は、マラリア流行地域であるウガンダにおける臨床試験でワクチンの安全性と発症防御効果が示されたが、抗原タンパク質の立体構造や物理化学的性質は明らかにされていない。本研究では、SE36抗原の防御エピトープ領域が特定の立体構造を持たない天然変性領域であることを明らかにするとともに、立体構造解析に適した安定な立体構造を有するSE36変異体の構築に成功した。熱帯熱マラリアに対するワクチンとして開発されているSE36は、120kDaからなるSERA5と呼ばれるタンパク質のN末端ドメインに由来する。SERA5については、どのような機能や立体構造を有するのかなど不明な点が多く残されており、本研究ではSERA5、特にSE36に相当する領域についての物理化学的性質や高次構造情報を明らかにすることで、SE36ワクチンの品質の管理と評価、また効率的なワクチンの生産と改良に繋がる基盤を築くことを目的としている。今年度は、SERA5を構成するドメインのうち、SE36に相当する47kDaドメインと、47kDaドメインとジスルフィド結合で繋がっている18kDaドメインに重点をおき、酵母および大腸菌を用いて、その領域の組換えタンパク質の発現を試みた。酵母における発現系では、さまざまな配列や組合せを試したにもかかわらず、目的タンパク質の発現は確認できなかった。一方、大腸菌では、封入体になってしまうものの、47kDaドメインや47、18kDaを繋いだコンストラクトの発現が確認された。それらの封入体からのリフォールディングを行った結果、単量体として存在するものが得られたが、円二色性(CD)や示差走査熱量計(DSC)により測定したところ、有意な二次構造が存在するものの、協同的な熱変性を示さず、有意な三次構造が形成されていないことが示唆された。しかし、47kDaドメインから低複雑度領域を除いたコンストラクトのうち、C末端領域が短くなったものについては封入体にならず、また精製中の性状が非常によかったため、^<15>N標識体を発現させたところ、核磁気共鳴(NMR)で有意な立体構造をもつと思われるスペクトルが得られ、またCD、DSCにおいても協同的な熱変性を示した。来年度は、このコンストラクトをベースに、詳細な構造解析を行うことを目指そうと考えている。熱帯熱マラリアに対するワクチン候補として、現在、ウガンダで臨床試験が行われているSE36は、120kDaからなるSERA5と呼ばれるタンパク質のN末端ドメインに由来する。本研究ではSERA5、特にSE36に相当する領域についての物理化学的性質や高次構造情報を明らかにすることで、SE36ワクチンの品質の管理と評価、また効率的なワクチンの生産と改良に繋がる基盤を築くことを目的としている。昨年度までの研究において、構造物性解析に適した高純度、高品質のタンパク質を得るための条件検討および物性測定を繰り返してきた。その結果、SE36およびその由来となったSERA5タンパク質の発現、精製における、発現領域、発現系、精製方法の好ましい組み合わせが明らかになってきた。しかし、必ず発現、精製がうまくいき、再現性が高い状態であるかと言うと、特に、安定同位体標識を行うための合成培地における発現においては、まだ満足のいくレベルとは言えないのが現状である。具体的には、熱帯熱マラリア原虫においても株によってバリエーションの多い低複雑度領域を除いたSE36コンストラクトを大腸菌で発現させ、そのC末端領域が大腸菌内で切断されたものの性状が良好であったため、C末端が同じものだけが確実に得られるように、あらかじめ切断が予想される付近にストップコドンを導入した新しいコンストラクトを作製したが、繰り返しさまざまな条件での発現、精製を試したものの、良好なNMRスペクトルが得られるには至らなかった。精製タンパク質の濃度や純度は吸光度や電気泳動で確認しているので、NMRで観測できない会合体を形成している可能性が考えられる。そこに至るまでの過程で、その都度、物理化学的解析手法によって、その構造物性を解析しており、SE36のもつ性状についての理解は確実に深まってきている。WHOによると、2010年における熱帯、亜熱帯地域でのマラリアによる死者は66万人、感染者は2億1900万人と推定されており、効果的なマラリアワクチンの実用化が期待されている。現在、我々のグループで開発しているSE36は、ウガンダにおける第Ib相臨床試験において発症防御効果が示され、実用化が期待されるワクチン候補抗原である。SE36は、120 kDaからなるSERA5と呼ばれるタンパク質のN末端ドメインに由来する。本研究ではSERA5、特にSE36に相当する領域についての物理化学的性質や高次構造情報を明らかにすることで、SE36ワクチンの品質の管理と評価、また効率的なワクチンの生産と改良に繋がる基盤を築くことを目的としてきた。本研究では、構造物性解析に適した高純度、高品質のタンパク質を得るための条件検討および物性測定を繰り返し行い、その結果、SE36のC末端側を短くしたものが、SE36領域のコア構造として安定に存在しうることを明らかにした。

最終年度では、安定かつ大量に発現することのできるC末端の位置と発現条件をさらに検討し、効率的に発現できるC末端の詳細な位置、発現誘導温度、大腸菌株の組み合わせを見出だした。これまでのSE36では、その精製の過程で変性処理を行っており、可溶性かつ単量体として精製することが困難であったが、本研究ではそれを可能にした。今後は、本研究で確立した方法でSE36領域のタンパク質を作製、精製し、引き続きその立体構造解析を試みるとともに、変性過程を経ずに作製されたSE36抗原を用いて、立体構造の違いによる抗原性や抗体による認識の違いを明らかにしていきたいと考えている。初年度の結果に基づいて、よりうまくいくと思われた方向性で新たなコンストラクトを作製し、その発現、精製を試みていたが、繰り返し条件検討を行った結果、吸光度や電気泳動では判断できないレベルで、構造解析に適した純度を達成することが困難なことが明らかになったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、引き続き、立体構造解析に耐えうる高純度、高品質のタンパク質を得るためのさらなる条件検討を行いつつ、これまでに得られた各コンストラクトの構造物性の情報をもとに、その方向性を発展させたいと考えている。具体的には、超遠心分析による自己会合状態や、分光器や熱量計を用いた熱力学的安定性の解析など、多角的かつ詳細な構造物性解析を積み重ね、直接的な立体構造解析が困難な場合には、SE36およびSERA5の構造物性についての研究として成果をまとめたいと考えている。
水性シダ植物デンジソウの水上葉形成における遺伝子発現機構の解明

デンジソウ(Marsilea quadrifolia L.)は、周りの水位が低いときは地上葉を形成するが、水位が高くなると短期間で葉柄を伸ばして水上葉(浮き葉)を形成する。本研究では、デンジソウの水上葉形成時において見られる急激な葉柄伸長に注目し、この生命現象における遺伝子発現機構を明らかにすることを目的とした。特に、細胞成長のキーとなる膜タンパク質のアクアポリンに焦点をあて、未知であるデンジソウのアクアポリン遺伝子の同定と、個体周囲の水位が高くなることでそれらの発現量に違いが生じるかどうかについて調査を行った。デンジソウの葉柄組織からmRNAを抽出し、RT-PCR法にてアクアポリンの発現を確認した。その後、cDNAサンプルのシークエンスを行い、アクアポリン遺伝子の同定を行った。次に、デンジソウ株を水没させた時にそれらの発現量が変わるかどうかについて調べた。転写量の違いについては、RT-PCR法後に行った電気泳動のバンド濃度により確認し、翻訳量の違いについては、ウエスタンブロット法により確認した。実験の結果、デンジソウ株は水に浸されると、アクアポリン遺伝子の転写量及び翻訳量の両方とも増加することが確認できた。これらの実験結果より、デンジソウは水に浸された場合、アクアポリン遺伝子の発現量を増加させることで、急激な葉柄伸長を促していることが示唆された。本研究により、研究例の乏しいシダ植物のアクアポリンについての知見を増やすことが出来た。さらに本研究成果は、高校現場での教科指導に役立てることも出来る内容で、教育的意義も大いに有すると考えている。
In vivoイメージングによる疼痛維持機構におけるプロスタノイドの役割の可視化

神経障害性疼痛の特徴の一つは、触覚刺激が痛覚として知覚されることである。この変調を来す可塑性機構を脊髄ニューロンの刺激-応答地図の中で形態学的、機能的変化として可視化を行った。長時間にわたり、連続的に形態変化を追跡すると共に、それに伴うカルシウム動態変化を記録し、形態と機能の連関の解析を試みた。自発呼吸下の個体のin vivo標本において2光子顕微鏡を用いて複数の脊髄後角ニューロンの細胞内カルシウムイメージングを行った。皮膚への機械的な刺激に反応して細胞内カルシウム濃度増加するニューロンの中にPGE2によってその反応が記録した。そのニューロンは脊髄後角表層に存在した。我々は、in utero遺伝子導入法による脊髄神経回路蛍光可視化可能なマウス作製法を確立し、自発呼吸下の個体のin vivo標本において2光子顕微鏡を用いて複数の脊髄後角ニューロンの細胞内Ca2+イメージングを行い、皮膚感覚刺激に応答するニューロンの3次元刺激ー応答地図を作製することに成功した。この新技術を用いることにより、神経障害性疼痛に関わる感覚情報伝達神経回路網を構成するニューロンの形態学的変化とその活動変化を同時に高空間・高時間分解能で可視化が可能となった。遺伝的プローブを用いることで目的ニューロン群におけるイメージングが初めて可能となり、脊髄を摘出すること無く観察を可能とした。プロスタグランジン(PG)E2は疼痛修飾物質として、痛覚のグルタミン酸作動性興奮伝達を促進し、グリシン作動性抑制伝達を減弱して、痛みの中枢性感作に関与していると考えられている。疼痛モデルにおいて疼痛維持の可塑性形成に関与するニューロンの形態学的変化と機能的変化にPGE2がどのように関わるかを解明することを目的としている。神経障害性疼痛の発生機序に大きな役割を担うと考えられる脊髄後角内の神経可塑性を伴う感覚情報伝達系の機能異常に焦点を絞り、興奮性と抑制性介在ニューロンを選択的にイメージングして刺激ー応答地図を作成し、同定したニューロンでPGE2の作用機序を受容体サブタイプレベルで解析を行っている。これらは、神経障害性疼痛に対して選択的PGE2受容体サブタイプ拮抗薬の臨床応用につながる糸口につなげる努力をしている。標的ニューロン特異的に蛍光タンパク質を発現するマウスの製ニューロン特異的なプロモーター遺伝子を用いて細胞特異的に発現する蛍光タンパク(YCnano50)遺伝子を脊髄にin utero遺伝子導入法により導入し、脊髄腰膨大部後角ニューロン特異的にCa2+イメージングが可能となった。急性スライス標本を用いたニューロンへのPGE2の効果の解析Fura2-AMなどのCa2+プローブ試薬の複数のニューロンへの選択的な負荷は困難だったので、ニューロン特異的に発現する遺伝的プローブによってPGE2受容体サブタイプの脊髄後角ニューロンにおける役割を検討している。PGE2は疼痛修飾物質として、痛覚のグルタミン酸作動性興奮伝達を促進し、グリシン作動性抑制伝達を減弱して、痛みの中枢性感作に関与していると考えられている。PGE2の4種類の受容体サブタイプはGタンパク質共役型受容体で、いままで神経障害性疼痛において一次求心性感覚神経のEP1、EP3受容体やグリシン作動性抑制ニューロンのEP2受容体による修飾が関与されているとされているが、実際にその過程を経時的に記録することは出来ていなかった。現在、脊髄後角ニューロン特異的、脊髄後角抑制性ニューロン特異的にCa2+プローブを発現したマウスでEP受容体サブタイプの作動薬や拮抗薬を用いてそのものの効果およびグルタミン酸により引き起こされた神経活動に対する修飾作用を検討している。我々は、in utero遺伝子導入法による脊髄神経回路蛍光可視化可能なマウス作製法を確立し、自発呼吸下の個体のin vivo標本において2光子顕微鏡を用いて複数の脊髄後角ニューロンの細胞内Ca2+イメージングを行い、皮膚感覚刺激に応答するニューロンの3次元刺激-応答地図を作製することに成功した。遺伝的プローブを用いることで目的ニューロン群におけるイメージングが初めて可能となり、脊髄を摘出すること無く観察を可能としたので、生体脊髄で同定したニューロンレベルでのPGE2の役割を解明することは神経障害性疼痛発症維持の可塑性形成機構解明の一助となる。いままで神経障害性疼痛において一次求心性感覚神経のEP1、EP3受容体やグリシン作動性抑制ニューロンのEP2受容体による修飾が関与されているとされているが、実際にその過程を経時的に個体レベルで記録することは出来ていない。in vivo標本を用いて皮膚への機械的な刺激に反応して細胞内Ca2+濃度増加するニューロンの中にPGE2によってその反応が記録された。PGE2が痛覚過敏をひきおこすことを行動実験により我々の研究グループが既に報告しているが、その痛覚過敏行動を引き起こすニューロンの活動を今回記録することができた。疼痛モデル動物脊髄ニューロンネットワークの可塑性機構の可視化神経障害性疼痛の特徴の一つは、触覚刺激が痛覚として知覚されることである。

この変調を来す可塑性機構を脊髄ニューロンの刺激-応答地図の中で形態学的、機能的変化として可視化を行っている。長時間にわたり、連続的に形態変化を追跡すると共に、それに伴うCa2+動態変化を記録し、形態と機能の連関の解析を試みている。PGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬を用いてどのような修飾変化が起こるかを観察記録し、EP受容体の役割を詳細に検討するために、in vivo標本で行う前に急性スライス標本により単純な実験系でPGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬の効果を検証した結果、EP2受容体サブタイプに的をしぼりin vivo標本での効果を検証することを予定している。脊髄ニューロン棘突起における局所刺激応答に対するPGE2の効果我々はEP3受容体サブタイプのシグナル下流にニューロン構造タンパク質が存在することを示唆した。そこで、脊髄ニューロンのシナプスを形成する棘突起にグルタミン酸等のケージド試薬を局所投与し、オプトジェネティクスによる選択的な刺激を与え、その反応に対するPGE2の役割を検討することを計画したが、多光子励起顕微鏡の特性上観察するためのレーザー波長でオプトジェネティクスによる刺激も引き起こしてしまい、選択的な刺激を与えることが困難であることが判明した。この不具合を解消する方法を検討している。脊髄腰膨大部におけるPGE2の局在の定量解析質量顕微鏡は質量分析を2次元的に行うことを可能とし、今までの生化学的手法と異なりPGE2の脊髄腰膨大部での局所的な2次元分布の定量解析を可能とする。しかしながら、PGE2の定量のためには既知のマトリクスではうまく検出できず、現在最適なマトリクスやそのコーティング法を検討している。疼痛モデル動物脊髄ニューロンネットワークの可塑性機構の可視化神経障害性疼痛の特徴の一つは、触覚刺激が痛覚として知覚されることである。この変調を来す可塑性機構を脊髄ニューロンの刺激-応答地図の中で形態学的、機能的変化として可視化を行った。長時間にわたり、連続的に形態変化を追跡すると共に、それに伴うCa2+動態変化を記録し、形態と機能の連関の解析を試みた。我々は、in utero遺伝子導入法による脊髄神経回路蛍光可視化可能なマウス作製法を確立し、自発呼吸下の個体のin vivo標本において2光子顕微鏡を用いて複数の脊髄後角ニューロンの細胞内Ca2+イメージングを行った。プロスタグランジン(PG)E2は疼痛修飾物質として、痛覚のグルタミン酸作動性興奮伝達を促進し、グリシン作動性抑制伝達を減弱して、痛みの中枢性感作に関与していると考えられている。皮膚への機械的な刺激に反応して細胞内Ca2+濃度増加するニューロンの中にPGE2によってその反応が記録された。そのニューロンは脊髄後角表層に存在した。PGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬を用いてどのような修飾変化が起こるかを観察記録し、EP受容体の役割を詳細に検討するために、in vivo標本で行う前に急性スライス標本により単純な実験系でPGE2受容体サブタイプの作動薬、遮断薬の効果を検証した結果、EP2受容体サブタイプを介して皮膚への機械刺激を増大反応や減少反応が記録された。さらなる解析により、その細胞のサブタイプが決定されることが期待された。
キシャヤスデ個体群の動態と成長に関する基礎的研究

長野県茅野市蓼料山山麓の隣接する二つのカラマツ、ミズナラ林で、過去大発生が記録されているキシャヤスデ個体群の動態と成長に関して基礎的な研究を行った。多くの大発生を起しているキシャヤスデは単一世代のみの生息が多い。しかし本研究の調査地では連続した二世代のキシャヤスデが生息していることが観察された。キシャヤスデの大発生にはこの単一世代個体群の維持ということが関連しているものと考え、他の大発生地にない生息状況を示すこの調査地を選び、大発生と単一世代の関係を考察しようとした。しかし研究を継続してゆくうちに、二世代のうちの一つの個体群の密度が著しく減少し、ついには追跡不可能となり二世代の個体群の動態の研究はうち切らざるを得なくなった。この後若干研究方針を変更し、尾発生とカラマツ林との関係を個体群動態から研究を行った。この結果、キシャヤスデの大発生にはカラマツ林とそれに接する広葉樹林または草原という、カラマツ林とそれに接する他の性質の異った立地状況が関連していることが推察された。1つは大発生時の群遊行動は8令成体が、より良質のエサを求めたカラマツ林から他の場所へ移動することであろうと認識された。それにもかかわらずキシャヤスデの大発生がカラマツ林近くから起るのは、その後の産卵の捕食との関係で、カラマツ林の存在が重要な意味を持つことが示唆された。また大発生の機構を考えるために、キシャヤスデの4令以上の呼吸速度を測定し、大発生時の8令は温度条件にたいして他の令と異った温度特性を持っていることが明らかになった。基礎的な資料として1985年7月から1987年7月まで調査地の土壌温度を測定し、ほぼ1年間の有効な資料を得た。この資料は現在解析中で、また時期を改ためて発表する予定である。62年度は本研究研の最終年度にあたり,データの不充分な箇所の補足するための3回の現地調査と,データ整理を主に行った.代表者の所属機関が62年4月から変ったため,研究環境や時間が整わず(62年新設のため)データ整理のための時間が約4ケ月程度遅れることとなった.得られたデータは,〈1〉調査地のミズナラ林,カラマツ林の60年夏から62年夏までの気温,湿度,地表および地中温度の完成されたデータ,〈2〉キシャヤスデ個体群(60年61年は2世代, 61年以降は1世代)の個体数の動態と成長に関するデータ,〈3〉ミズナラ,カラマツ林におけるキシャヤスデの卵および幼虫の捕食者と考えられる捕食性大形土壌動物の個体数に関するデータの3種類である.長野県茅野市蓼料山山麓の隣接する二つのカラマツ、ミズナラ林で、過去大発生が記録されているキシャヤスデ個体群の動態と成長に関して基礎的な研究を行った。
顎関節障害の病態進展メカニズムの解明に向けた大規模MRIデータの縦断的解析

subchondral cystは変形性顎関節症の一つに含まれ,画像検査において診断すべき異常所見である.しかし,subchondral cystに関する報告は十分ではなく,その原因および病態は未だ明らかになっていない.そこで本年度は下顎頭のSubchondral cystの経時的変化を調査するための縦断研究を実施した.まず予備調査としてSubchondral cystが下顎頭に認められる患者43名の初診時のMRデータの読影および解析を行った.MR所見において,subchondral cystの大きさ,矢状面および冠状面におけるSubchondral cystの位置,下顎頭皮質骨外側からsubchondral cystまでの距離,関節円板の位置異常について調査したところ,Subchondral cystは負荷が加わりやすい下顎頭の前方および上方に位置する傾向があり,また,下顎頭皮質骨辺縁に近接して存在しているものが多いことが判明した.さらに,Subchondral cystを有する顎関節のほとんどの関節円板に位置異常が認められたことなどから,下顎頭に加わる力学的負荷により引き起こされる骨のリモデリングによってSubchondral cystが生じる可能性が示唆された.さらに,患者43名のうち縦断研究への協力に同意された27名のMR検査を実施した.2回目のMR検査は初診時より少なくとも3年が経過していた.初診時と比較して,Subchondral cystが消失しているもの,拡大しているもの,縮小しているもの,別の場所に新たなcystが形成されているもの等様々な様相を示した.下顎頭の形態はほとんど変化が認められないものや,大きく骨が吸収・添加しているケースが認められた.現在詳しい解析を進めている.初診時にsubchondral cystを有していた26名の被験者のMR検査を予定どおり実施した.現在MRデータを読影している段階であるが,今後順調に統計解析が進んでいくことが予想される. 2019年度に実施予定の関節円板側方転位に縦断的調査についても,すでに被験者の抽出は完了しており,研究依頼を開始する準備は整っている.放射線科との連携も十分に図れており,意見交換を行う会議を不定期に開催している.初診時に得られたsubchondral cystのMRデータと2018年度に得られたMRデータを比較し,subchondral cystの変化に影響を与える因子について探索する.また,下顎頭の骨変化については3次元レベルでの解析を進める予定である.さらに,先行研究より獲得した関節円板側方転位を有する被験者に対し,調査への参加を依頼し,参加に同意された患者のMRを撮像することにより,関節円板側方転位の経時的変化を評価する.質問票や臨床検査により得られた情報とMRデータを合わせて解析を行い,変化に影響を与える因子について明らかにする.日本補綴歯科学会,日本顎関節学会やInternational College of Prosthodontistsなどで研究成果を発表し,今後の方向性を検討する必要があると考える.Subchondral cystのErosionへの変化および関節円板側方転位が前方転位に変化する頻度とその原因を縦断研究により探索することを目的として調査を開始した.Subchondral cystの既往がある患者を25名抽出していたが,その対象となる患者群が比較的高齢であることから調査への参加率が低くなることが推測された.被験者数をさらに獲得するため,新たに蓄積された来院患者のMRを読影したところ, Subchondral cystが下顎頭に認められる患者を合計45名抽出することができた.さらに各下顎頭におけるSubchondral cystの数および大きさについても記録し,その分布を明らかにした.また学術大会や論文等から得られた知見から,関節円板の評価方法を改善する必要があるとの判断に至り,現在まで蓄積されたおよそ800名のMRデータを再度読影を行った.各患者ごとにおよそ1020分間費やし,関節円板の状態,下顎頭骨変化の状態,Joint effusion像をより詳細に評価を行った.関節円板の評価方法で今までと異なる点は,顎関節を3次元的に評価している点である.新しい評価方法により関節円板の位置異常には様々なバリエーションが存在することが判明し,それぞれの位置異常についてその分布も明らかにした.新しい評価方法によりJoint effusionと関節円板の位置,動態および下顎頭骨変化との関連について調査を実施した結果,joint effusionの大きさは,関節円板の位置異常ではなく,下顎頭の骨変化の有無に影響を受けることが明らかとなった.約800名のMRデータを再読影・再評価していたため,研究計画に若干の遅れが出たが,その代わりに十分なサンプルとベースデータをを獲得することができた.それにより今後予定している被験者を招集しての調査は,順調に進行していくことが予想される.subchondral cystは変形性顎関節症の一つに含まれ,画像検査において診断すべき異常所見である.しかし,subchondral cystに関する報告は十分ではなく,その原因および病態は未だ明らかになっていない.そこで本年度は下顎頭のSubchondral cystの経時的変化を調査するための縦断研究を実施した.まず予備調査としてSubchondral cystが下顎頭に認められる患者43名の初診時のMRデータの読影および解析を行った.MR所見において,subchondral cystの大きさ,矢状面および冠状面におけるSubchondral cystの位置,下顎頭皮質骨外側からsubchondral cystまでの距離,関節円板の位置異常について調査したところ,Subchondral cystは負荷が加わりやすい下顎頭の前方および上方に位置する傾向があり,また,下顎頭皮質骨辺縁に近接して存在しているものが多いことが判明した.

さらに,Subchondral cystを有する顎関節のほとんどの関節円板に位置異常が認められたことなどから,下顎頭に加わる力学的負荷により引き起こされる骨のリモデリングによってSubchondral cystが生じる可能性が示唆された.さらに,患者43名のうち縦断研究への協力に同意された27名のMR検査を実施した.2回目のMR検査は初診時より少なくとも3年が経過していた.初診時と比較して,Subchondral cystが消失しているもの,拡大しているもの,縮小しているもの,別の場所に新たなcystが形成されているもの等様々な様相を示した.下顎頭の形態はほとんど変化が認められないものや,大きく骨が吸収・添加しているケースが認められた.現在詳しい解析を進めている.初診時にsubchondral cystを有していた26名の被験者のMR検査を予定どおり実施した.現在MRデータを読影している段階であるが,今後順調に統計解析が進んでいくことが予想される. 2019年度に実施予定の関節円板側方転位に縦断的調査についても,すでに被験者の抽出は完了しており,研究依頼を開始する準備は整っている.放射線科との連携も十分に図れており,意見交換を行う会議を不定期に開催している.初年度に実施した先行研究より獲得したSubchondral cystを有する被験者に対し,調査への参加を依頼し,参加に同意された患者のMRを撮影することにより,Subchondral cystの経時的な変化を評価する.さらに質問票や臨床検査により得られた情報とMRデータを合わせて解析を行い,Subchondral cystの変化に影響を与える因子について明らかにする.関節円板側方転位に関しても縦断的に調査を行い,経時的な変化について調査を行う.Subchondral cystと同様に経時的な変化に影響を与える因子についても探索を行う.また,Joint effusionと関節円板の位置,動態および下顎頭骨変化との関連について,多変量解析による分析を進める.初診時に得られたsubchondral cystのMRデータと2018年度に得られたMRデータを比較し,subchondral cystの変化に影響を与える因子について探索する.また,下顎頭の骨変化については3次元レベルでの解析を進める予定である.さらに,先行研究より獲得した関節円板側方転位を有する被験者に対し,調査への参加を依頼し,参加に同意された患者のMRを撮像することにより,関節円板側方転位の経時的変化を評価する.質問票や臨床検査により得られた情報とMRデータを合わせて解析を行い,変化に影響を与える因子について明らかにする.日本補綴歯科学会,日本顎関節学会やInternational College of Prosthodontistsなどで研究成果を発表し,今後の方向性を検討する必要があると考える.差額は次年度の論文掲載料として使用予定である.最終年度にMRデータの3次元データ解析ソフトの購入を予定しており,そのための予算として次年度に繰り越している.
ニューロペプチドPACAPによる精神機能の調節機構に関する研究

本研究は、ニューロペプチドPACAPの高次脳・精神機能調節を明らかにすることを目的として、PACAP欠損マウスを用いて検討を行い、以下の研究成果を得た。1.PACAP欠損マウスはオープンフィールドにおいて探索的自発運動亢進および異常ジャンプ行動を示す。これら異常行動はドパミンD2受容体遮断薬ハロペリドール、選択的セロトニン取り込み阻害薬(SSRI)によって抑制された。2.好奇的探索行動及び不安関連行動をオープンフィールドにおける中心部の滞在時間、高架式十字迷路、novel object試験、emergence試験によって解析し、本マウスは好奇心が亢進し、不安関連行動が低下していることを明らかにした。3.音刺激驚愕反応プレパルス抑制(PPI)(1)PACAP欠損マウスのPPIは4週齢では野生型と同等であるが、6週齢以降で減弱(障害)することから、ヒト"発達障害仮説"に相似する可能性が示唆された。(2)このPPI低下は、ハロペリドールでは改善されないが、アンフェタミンによって改善された。4.アンフェタミンは、本変異マウスの異常行動も、逆説的に改善することが明らかになった。5.PACAP欠損マウスの海馬切片におけるシナプス伝達長期増強(LTP)について検討した結果、シナプス特異的LTP障害が観察された。さらに、PACAPヘテロ欠損マウスおよびPACAP1型受容体欠損マウスにおけるLTPを、in vivo電気生理学的手法を用いて検討し、遺伝子用量依存的なLTP障害を認めた。6.行動薬理学的解析(水迷路、Y迷路、恐怖条件づけ連合学習試験等)により、記憶形成および保持過程においてPACAPシグナルが果たす役割を明らかにした。以上の各成績により1)PACAP欠損マウスがヒト統合失調症あるいはADHDと類似した病態を呈することが明らかになり、2)PACAPがヒト精神病態発現に関わる因子である可能性が示され、さらに3)本ペプチドの高次脳・精神機能調節機序の一端が解明されたものと考えられる。ニューロペプチドPACAPのin vivo中枢神経機能解析を行う目的で、我々はこれまでに、PACAP欠損マウスなど、3種類の遺伝子改変マウスを作成しており、とくにPACAP欠損マウスは顕著な精神運動機能の異常を示すことを見い出している。本研究は、PACAPによる精神機能の調節機構を明らかにし、PACAPがヒトの統合失調症などの精神病態発現に関わる因子である可能性とその治療に関する基礎的知見を得ることを目的に計画・実施中であり、これまでに以下の研究成果を得た。1 PACAPによる精神運動調節におけるセロトニン神経作用薬の効果についてオープンフィールドで見られるPACAP欠損マウスの探索的自発運動亢進および異常ジャンプ行動は、ドパミンD2受容体遮断薬ハロペリドールとともに選択的セロトニン取り込み阻害薬(SSRI)によって抑制された。2 PCAP欠損マウスの感情障害(好奇心過多・不安感減少)に関する検討好奇的探索行動及び不安関連行動をオープンフィールドにおける中心部の滞在時間、高架式十字迷路試験、novel object試験によって解析し、本マウスは好奇心が亢進し、不安関連行動が低下していることを明らかにした。3 PACAP欠損マウスにおける統合失調症などの関連指標の変化について4 PACAP欠損マウスの異常行動に対する精神刺激薬の逆説的改善作用アンフェタミンが本変異マウスの異常行動を逆説的に改善させることが明らかになった。この結果は本マウスがヒト注意欠陥多動性障害(ADHD)などの病態表現型を持つ可能性を示唆するものと考えられる。