hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
microRNAによる癌リプログラミング治療の臨床応用

大腸癌細胞株HT29にmiRNA302s,369sを過剰発現させるとES細胞様の細胞塊を形成し、増殖能低下、抗癌剤感受性改善を認めた。また遺伝子発現解析では癌関連遺伝子CDK2,CMYCの発現低下、分化関連遺伝子MUC2,VILLINの発現変化を認めた。これらはエピゲノム関連遺伝子AOF1,MECP1/2の発現低下を伴う、グローバルな脱メチル化を認めた。IN VIVO実験ではこれらのmiRNAs投与群では抗腫瘍増殖効果を認め、細胞実験と同様の遺伝子発現変化を認め、ヒストン修飾の変化を伴っていた。miRNA302s、369sによるエピゲノム変化を伴う“癌リプログラミング"の有用性を示した。microRNA302,369を用いた大腸癌癌細胞におけるリプログラミングによる新規癌治療法の探索をH25年度に続き、H26年度も継続した。H25年度に得られた実験結果からは、ES細胞、iPS細胞に特異的に高発現しているmicroRNA302,369を大腸癌癌細胞株に導入することでin vitroの実験においてまずは間葉上皮転換が誘導され、ES細胞やiPS細胞のような非常に速いturn overを示す細胞群とは違ってG1arrestを示すslow cell cycleとなり、約1週間のmicroRNA導入期間中にリプログラミングを受けない細胞群はapoptosisをうける、そして続く約3週間のES細胞培地で培養することで異なる分化能を示すES細胞コロニー様細胞に変化することがわかった。これらの実験結果を受け、MET,cell cycle, apoptosisにおける導入microRNAの作用機序の解明をすすめた。METに関してはmicroRNA302および369両者ともにEカドヘリンの発現させ、特にmicroRNAはEMT modulatorの一つであるZeb1の翻訳抑制効果を認めた。Cell cycleにおける検討ではmicroRNA302はG1→S期におけるCDK2の翻訳抑制効果をルシフェラーゼアッセイで確認できた。Apoptosisにおける検討ではmicroRNA302が抗アポトーシスを示すMcl-1の翻訳抑制効果を認めた。以上のin vitroの検討に加え、ディープシークエンスによりmicroRNA302がグローバルな脱メチル化を引き起こすことがわかった。上記のような、MET誘導、slow cell cycle、apoptosis誘導、エピゲノム変化によりin vitroにおける癌悪性度の低下をmicroRNA全身投与によるxenograft tumorモデルでの抗癌治療効果を検討し、microRNA投与群のxenograftsにおいて分化度の変化を認め、増殖抑制効果も見られた。以上よりES細胞、iPS細胞に特異的に高発現しているmicroRNA302および369により、MET誘導、slow cell cycle、apoptosis誘導、エピゲノムの変化を経て、癌悪性度の低下につながることが示された。今研究の内容は現在PLOSONE投稿中である。消化器外科iPC cellsの作成にはN-TERA2と同等レベルのmiR302sの発現維持が必要であるとされる。当科で研究開発している炭酸アパタイトは既存のlipofection法と比較して、蛍光ラベルしたsiRNAを用いた解析からより多量のsiRNAをより短時間で取り込ませることができることが分かっている。炭酸アパタイトは従来のtransfection法と比較して細胞毒性が少なくより効率的にmicroRNAのtransfectionが可能である。またin vitroの解析において、DLD-1は3胚葉分化可能な細胞DLD-1-iPC cellsにreprogram可能であったが、iPC cells作成過程でmiR302s,369sの有する様々な効果を認めた。miR302sをある一定のレベルで発現することでHT29,DLD-1は上皮間葉転換(EMT)の抑制、apoptosisの導入のphenotypeを示した。これらは癌の治療の観点から非常に重要な点であり、癌リプログラミングはEMT抑制、apoptosis誘導、iPC cellsへの変化の3つの経路で癌の悪性度の低下を示した。qRT-PCR法、Western blotting法による検討の結果、miR302sはEMTのkey regulatorであるTGF-beta receptor II、apoptosisのkey regulatorであるMcl-1翻訳抑制を、369sはEMTのkey regulatorであるZeb1の翻訳抑制を示すことがわかった。しかしながら癌リプログラミングによる癌悪性度の低下の機序は未だ不明な部分が多いが、注目すべきことに癌遺伝子であるc-mycがmicroRNAによるリプログラミングの過程で低下することがわかった。またin vivoでの解析でmiR投与群はKi67 indexの低下、apoptosisの誘導に加え、分化度の変化を認めた。具体的にはHE染色で元来中分化型腺癌組織を形成するHT29細胞がmiR投与群で腺腔形成の乏しい低分化へshiftしていることがわかった。miR投与群でのH3K4メチル化の亢進を認め、miR投与によりepigeneticsの変化を引き起こした可能性がある。

iPC cellsの作成にはN-TERA2と同等レベルのmiR302sの発現維持が必要であるとされる。当科で研究開発している炭酸アパタイトは既存のlipofection法と比較して、細胞障害性が低く蛍光ラベルしたsiRNAを用いた解析からより多量のsiRNAをより短時間で取り込ませることができることが分かっている。またin vitroの解析において、DLD-1は3胚葉分化可能な細胞DLD-1-iPC cellsにreprogram可能であったが、iPC cells作成過程でmiR302s,369sの有する様々な効果を認めた。miR302sをある一定のレベルで発現することでHT29,DLD-1は上皮間葉転換(EMT)の抑制、apoptosisの導入の癌治療効果を示した。これらは癌の治療の観点から非常に重要な点であり、癌リプログラミングはEMT抑制、apoptosis誘導、iPC cellsへの変化の3つの経路で癌の悪性度の低下を示した。qRT-PCR法、Western blotting法による検討の結果、miR302sはEMTのkey regulatorであるTGF-beta receptor II、apoptosisのkey regulatorであるMcl-1翻訳抑制を、369sはEMTのkey regulatorであるZeb1の翻訳抑制を示すことがわかった(Luciferaseアッセイは未).しかしながら癌リプログラミングによる癌悪性度の低下の機序は未だ不明な部分が多いが、注目すべきことに癌遺伝子であるc-mycがmicroRNAによるリプログラミングの過程で低下することがわかった。またin vivoでの解析でmiR投与群はKi67 indexの低下、apoptosisの誘導に加え、分化度の変化を認めた。具体的にはHE染色で元来中分化型腺癌組織を形成するHT29細胞がmiR投与群で腺腔形成の乏しい低分化へshiftしていること,Alcian blue染色での粘液産生低下、CK20免疫染色の発現の低下である。またこれらの背景にepigeneticsの変化が考えられ、実際H3K4のメチル化は亢進していた。今年度に必要な物品を全て購入したため。来年度に必要な物品を購入するため。
資源真核生物の有用遺伝子の解析と利用

最近バイオテクノロジーが急速に発展し,各種遺伝子の単離,構造解析および人工操作による利用が脚光をあびている.しかし,資源動植物の遺伝子,特にその利用の面から重視すべき遺伝子についての研究は極めて不十分である.そこで,わが国のこうした研究の現状を調査し,その調査結果を参考にしつつ,今後のわが国におけるこうした研究の進め方および組織化について協議した.その結果,資源動物を対象とする研究グループと資源植物を対象とするグループにわかれて研究を推進すベきとの結論に達した.そして,資源動物に関しては,有用物質生産に関与する酵素の遺伝子に着目し,こうした遺伝子にクローニング,構造解析および利用を集中的に研究するグループの組織化が必要であるとの結論に達した.一方資源植物に関しては,その有用遺伝子全般にわたって広い研究グループの組織化をはかるのではなく,いくつかの分野にわかれて組織化する必要があるとの結論に達した.そして,光合成に関与する有用遺伝子,生殖に関与する有用遺伝子およびシンク・ソース機能に関連する有用遺伝子を研究する3つのグループを組織化することになった.このうち,光合成に関与する有用遺伝子研究グループと生殖に関与する有用遺伝子を研究グループは,それぞれ詳細な研究計画および研究組織を検討し,昭和64年度発足の重点領域研究に応募申請した.一方,シンク・ソース機能に関連する有用遺伝子を研究するグループは,更に今後詳細な調査と検討が必要であるとの考えから,昭和63年度の総合研究Bに申請することにした.なお,こうした検討の間に,植物のカタラーゼ,ペルオキシダーゼ,貯蔵タンパク質などの遺伝子や葉緑体とミトコンドリアの遺伝子系について,その利用に関する予備的実験を並行して行い,これらの遺伝子の利用についてある程度の目安を得た.最近バイオテクノロジーが急速に発展し,各種遺伝子の単離,構造解析および人工操作による利用が脚光をあびている.しかし,資源動植物の遺伝子,特にその利用の面から重視すべき遺伝子についての研究は極めて不十分である.そこで,わが国のこうした研究の現状を調査し,その調査結果を参考にしつつ,今後のわが国におけるこうした研究の進め方および組織化について協議した.その結果,資源動物を対象とする研究グループと資源植物を対象とするグループにわかれて研究を推進すベきとの結論に達した.そして,資源動物に関しては,有用物質生産に関与する酵素の遺伝子に着目し,こうした遺伝子にクローニング,構造解析および利用を集中的に研究するグループの組織化が必要であるとの結論に達した.一方資源植物に関しては,その有用遺伝子全般にわたって広い研究グループの組織化をはかるのではなく,いくつかの分野にわかれて組織化する必要があるとの結論に達した.そして,光合成に関与する有用遺伝子,生殖に関与する有用遺伝子およびシンク・ソース機能に関連する有用遺伝子を研究する3つのグループを組織化することになった.このうち,光合成に関与する有用遺伝子研究グループと生殖に関与する有用遺伝子を研究グループは,それぞれ詳細な研究計画および研究組織を検討し,昭和64年度発足の重点領域研究に応募申請した.一方,シンク・ソース機能に関連する有用遺伝子を研究するグループは,更に今後詳細な調査と検討が必要であるとの考えから,昭和63年度の総合研究Bに申請することにした.なお,こうした検討の間に,植物のカタラーゼ,ペルオキシダーゼ,貯蔵タンパク質などの遺伝子や葉緑体とミトコンドリアの遺伝子系について,その利用に関する予備的実験を並行して行い,これらの遺伝子の利用についてある程度の目安を得た.
メタン分子の識別・捕捉と選択的酸化分子触媒創製への挑戦

金属酵素メタンモノオキシゲナーゼに見られるような、メタンを含む炭化水素類の選択的で触媒的な酸化反応は化学における未解決の大きな課題である。この様な酵素においては反応活性点近傍に基質認識/取り込み部位を有しており、反応に必要な一定時間反応点近傍に基質が存在していることである。この様な分子認識は、基質と生成物の識別にも重要である。しかし、反応活性部位をもつ小アルカン分子の認識を可能とする分子(触媒)はこれまで研究例が乏しい。そこで、本研究では小アルカン分子の取り込みのために適切な空間を提供するキャビタンドを、潜在的に触媒活性を付与できるポルフィリンに共有結合で固定した`キャビタンド-ポルフィリン(CP)'を合成した。分子に一定の自由度を与えるようエーテル結合を用い、結合位置に注意した。CPはクロロホルムなどの溶媒を取り込むことなく合成でき、メタン、エタン、エチレン、アセチレン、シクロプロパンを可逆的に取り込み、^1H NMRのタイムスケールでは自由な交換をしないことが明らかとなった。その会合定数(K_<11>,M^<-1>,25°C)は、メタン(81),エタン(9.4),アセチレン(130),エチレン(49),シクロプロパン(9.6)と決定された。更に、熱力学的パラメーターより、メタンの場合ΔG^0=-10.9kJmol^<-1>,ΔH^0=-33kJmol^<-1>,ΔS^0=-75JK^<-1>mol^<-1>となり、メタン取り込みによるエンタルピー利得を負のエントロピーで補償している系であると結論づた。これにより、メタンなどの小アルカン分子を触媒活性近傍に可約的に取り込む系を実現した。メタンに代表される小アルカン分子の認識・捕捉・選択的反応は有機化学領域において未解決の課題である。とりわけこれら分子の選択的酸化反応は、カスケード反応のために選択的にアルコールへの変換は困難とされている。この分子設計においては小アルカン分子を取り込み、一定時間その取り込み部位に存在させるためには疎水性空間と狭溢なポータルを兼ね備えており、しかも取り込んだ分子が外部の分子と交換できる程度の分子の揺らぎを持つ必要がある。そこで、これらの要請を満たす分子としてキャビタンドを用い、これを潜在的な反応部位であるポルフィリンに架橋結合させた「キャビタンドポルフィリン(CP)」を設計し、合成した。このCPの亜鉛錯体はX線単結晶構造解析よりvan der Waals半径を考慮すると83Å^3の空間を有しており、メタン(26Å^3),エタン(42Å^3)等の取り込みが十分可能であることが明らかとなった。次に、重クロロホルム中においてこれら小アルカン分子の取り込みの^1H NMRにより観測したところ、溶媒分子の取り込みは起こらず、選択的にアルカン分子1分子のみがキャビティー中に取り込まれ、ポルフィリンとキャビタントの芳香環の磁気異方性効果により大きく高磁場シフトすることが明らかになった。またこの方法によりメタン、エタン、アセチレン、エチレン、シクロプロパンは取り込みが起こるが、プロパン(59Å^3)は全く取り込まれないことが明らかとなり、明瞭な分子識別能を有することを立証した。更に、窒素ガスの吹き込みにより容易に取り込まれたアルカン分子は交換することから、ゲスト分子はキャビティー内へ可逆的に取り込まれていることも立証できた。このようにメタンの様な小アルカン分子1分子の可逆的識別が行える例は無く、世界初の例である。この結果により、小アルカン分子の選択的反応への関門が克服できた。これらの結果は、Angew.Chem.に投稿中である。
骨内環境再現システムを利用した骨粗鬆症治療モデルの開発

本研究の研究期間全体を通じては、(1)間葉系幹細胞のなかでも骨系細胞へ誘導しやすい細胞は、CD34+,c-Kit+,Sca1+細胞であること。(2)間葉系幹細胞のスキャホールドとしては、1200°Cで焼成したβ-TCPに直径300 μmの貫通孔を付与したものが有効であること。(3)これに間葉系幹細胞を含む骨由来細胞を貫通孔に入れ込み移植体とした「骨内環境再現システム」を用いた実験より、骨粗鬆症とその治療薬によりT細胞が影響をうけており、特にγδT細胞が影響をうけていること、そしてそこにはWnt10bが影響している可能性があること。などを解明した。平成25年度の研究実施計画に従い、間葉系幹細胞移植用のスキャホールドとして「βTCPの構造・性状の検討」を行った。300μmの貫通孔は100, 500, 1000μmの貫通孔に比較して幹細胞が効率的に入り込むことが確認できた。またSEMによる表面性状の解析より、1200°C付近までは焼成温度の上昇にしたがいTCP表面の陥凹が次第に大きくなるが、1200°C以上で焼成したTCPでは表面の陥凹がすくなくなり平滑となるため移植細胞の付着が起こりにくくなることが確認された。さらに焼成したTCPのX線回折パターンの解析より、1200°C以上で焼成したTCPにはαTCPが混入することが確認された。マウスでの移植実験では、αTCPは生体内へ移植した際に溶出しやすく、さらにこのため異物反応が惹起され移植用のスキャホールドとしては不適切であることが判明した。これらの結果から、βTCPスキャホールドは断面がハニカム型で直径300 μmの貫通孔を付与することが有効であることがわかった。さらにβTCPの焼成温度は、1200°Cが適切であることがわかった。また本年度の「骨内循環再現システム内での細胞間相互作用の確認」では、マウス皮下への間葉系幹細胞の移植実験中に、マウス血液中のT細胞とB細胞の割合が変動することを見つけた。などを解明した。平成24年度研究計画にしたがい、骨内膜細胞および脂肪由来細胞を採取し、培養ののち、フローサイトメトリーにて表面膜抗原の解析を解析した。さらに申請者らが開発した貫通孔をもつハニカムβ-TCPを用いて骨内微小環境を再現し、間葉系幹細胞をこのハニカムβ-TCPへ填入しマウスへの移植実験をおこなった。具体的には、骨内膜細胞および脂肪由来細胞からCD34+,c-Kit+,Sca1+細胞をcell sorting systemにより分取しさらに得られた細胞のCD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD117の発現を確認した。その後、造血幹細胞としてCD3e, CD11b, CD45R/B220, Ly-76, Gr-1の発現を確認した。計画にしたがい、骨系前駆細胞への分化を確認しさらに当初に予定に追加して脂肪細胞への分化を確認した。骨髄から採取した細胞、皮質骨から採取した細胞、脂肪から採取した細胞を比較した。表面膜抗原の発現のしかたについては、われわれがこれまで行ってきた方法である、CD3e-, CD11b-, CD45R/B220-, Ly-76-, Gr-1-の細胞を、basic-FGFを添加したMEM培地で継代したものでは細胞の由来にかかわらず、CD34, c-Kit, Sca1, CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD117発現に相違がなかった。一方移植実験ではハニカムβ-TCPの300μmの貫通孔のサイズでは、間葉系幹細胞が貫通孔にうまく入り込まず細胞の填入に問題があることがわかった。顆粒状態のβ-TCPを用いた、移植実験では間葉系幹細胞が顆粒の間にうまく入り込み、骨形成量の比較では圧倒的に顆粒状β-TCPの方が有利であった。平成26年度研究計画に従い、マウス骨系前駆細胞へ誘導した細胞をβ-TCP内に混和し作成した「骨内環境再現システム」を正常マウスおよびOVX(卵巣摘出)骨粗鬆症マウスの生体内に移植し、「骨内環境再現システム」がそれぞれのマウスに与える影響を検討した。移植をうけたマウスから末梢血および脾臓細胞を回収しCD45, CD3e, CD19, CD49b, CD11c, CD4 ,CD8aについて解析した結果からは、「骨内環境再現システム」および骨粗鬆症治療薬テリパラチドはT細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞の分画に影響をあたえないことがわかった。。

しかしながら骨粗鬆症治療薬であるリゼドロネートは末梢血中のT細胞を増加させ、B細胞を減少させることがわかった。マウス血清中のサイトカイン解析からは「骨内環境再現システム」の移植は、G-CSFを増加させることがわかった。一方リゼドロネートの投与によっても、G-CSFが増加するが炎症性サイトカインであるIL-1a、IL-6、IL-7が減少すること、テリパラチドの投与により同様にG-CSFが増加するが、IL-1a、IL-6、IL-7が増加することが確認された。本研究の研究期間全体を通じては、(1)間葉系幹細胞のなかでも骨系細胞へ誘導しやすい細胞は、CD34+,c-Kit+,Sca1+細胞であること。(2)間葉系幹細胞のスキャホールドとしては、1200°Cで焼成したβ-TCPに直径300 μmの貫通孔を付与したものが有効であること。(3)これに間葉系幹細胞を含む骨系細胞を貫通孔に入れ込み移植体とした「骨内環境再現システム」を用いた実験より、骨粗鬆症とその治療薬によりT細胞が影響をうけており、特にγδT細胞が影響をうけていること、そしてそこにはWnt10bが影響している可能性があること。などを解明した。外科系歯学平成24年度には、(1)骨内膜細胞の採取および細胞膜抗原精査、(2)骨系前駆細胞への誘導、(3)骨系前駆細胞への分化、を予定していた。これらについては、計画通り順調に達成することができていた。平成25年度には、予定していた(1)βTCPの構造・性状の検討、を順調にすませ、研究成果はJournal of biomedical materials research Aに掲載された。本年度のもう一点の予定であった、(2)骨内循環再現システム内での細胞間相互作用の確認、ではそこから波及して間葉系幹細胞の移植や、骨粗鬆症治療薬の投与により、免疫系とくにリンパ球に直接的な影響を与えていることを発見した当初の予定では平成24年度には、(1)骨内膜細胞の採取および細胞膜抗原精査、(2)骨系前駆細胞への誘導、(3)骨系前駆細胞への分化、を予定していた。実験計画の概要でも述べたようにこれらについては、本年度の計画通り順調に達成することができた。そこで当初の予定では平成25年度の計画に含まれる(4)β-TCPの構造、性状の検討および(5)「骨内環境再現システム」内での細胞間相互作用の確認を先取りしておこなった。(今後の推進方策)以前より骨系疾患と、免疫との関連はさまざまな場面で議論されているが、今回われわれが発見した骨粗鬆症治療薬による、リンパ球への直接的な影響は新しい発見と思われる。平成26年度はこの点にも配慮した研究を進める。具体的には、平成26年度実施予定の骨粗鬆症病態解明に関連して、間葉系幹細胞や骨粗鬆症治療薬が、造血幹細胞、リンパ球の分化へあたえる影響に着目して研究を進める。文献的検索より、貫通孔の直径は300μmが最も適切であると予想した。実際に行ったフレッシュな細胞を用いておこなった予備実験でも、直径は300μmが最も適切であった。しかしながら、今回のように増殖させるために、継代培養した細胞ではフレッシュな細胞に比較して、細胞の形状および性状に変化があり直径300μmでは小さすぎて貫通孔に入り込めないことが多かった。対策としては1000μmの貫通孔を持つハニカムβ-TCPを新規に作成すること、および顆粒状のβ-TCPをスキャホールドとして、新規の移植実験を計画している。さらに、新しい方法として、間葉系幹細胞の抗原性が低い事を利用して、血流を使った全身投与による移植実験を行う事とする。研究費は80%程度を、試薬、プラスチック器具、実験動物などの消耗品の購入にあてる。
解剖学的知識を用いた人物識別によるマンマシンインターフェースの向上

顔面筋に基づく顔構成要素モデルを用いた表情の認識手法を開発し,表情の時間的変化の認識について研究した.顔モデルは,眉・目・口それぞれの顔構成要素の可変モデルから成る.各モデルは数個の制御点と顔面筋の収縮方向のベクトルで構成される.制御点の移動方向は顔面筋が収縮する方向と一致しているため,モデルの変形は実際の顔構成要素と同じ変形規則を持つ.顔動画像にモデルをマッチングさせることで,顔構成要素の動きの追跡ができ,顔面筋の収縮度が求められる.得られた収縮度を要素とする表情パターンと,あらかじめ決定されている表情標準パターンとを比較することで各表情の表出度が得られる.表情表出度は,顔に表れている表情の明瞭さを示しており,値の大小から表情を識別する.また,表情表出度の時間的変移から表情の発生・持続・終了を検出できる.実際の顔動画像に対して実験を行った結果,顔構成要素の動きを正確に検出できた.表情表出度から4種の表情について87%の認識率を得た.また,表情表出度の増減から表情の発生と終了を検出できることを示した.このような表情の発生過程の検出は,コンピュータとの対話や作業において,どのようなことを行った時に人の表情が変化したかを機械が理解するために重要であり、マンマシンインターフェースの向上に寄与するものである.顔面筋に基づく顔構成要素モデルを用いた表情の認識手法を開発し,表情の時間的変化の認識について研究した.顔モデルは,眉・目・口それぞれの顔構成要素の可変モデルから成る.各モデルは数個の制御点と顔面筋の収縮方向のベクトルで構成される.制御点の移動方向は顔面筋が収縮する方向と一致しているため,モデルの変形は実際の顔構成要素と同じ変形規則を持つ.顔動画像にモデルをマッチングさせることで,顔構成要素の動きの追跡ができ,顔面筋の収縮度が求められる.得られた収縮度を要素とする表情パターンと,あらかじめ決定されている表情標準パターンとを比較することで各表情の表出度が得られる.表情表出度は,顔に表れている表情の明瞭さを示しており,値の大小から表情を識別する.また,表情表出度の時間的変移から表情の発生・持続・終了を検出できる.実際の顔動画像に対して実験を行った結果,顔構成要素の動きを正確に検出できた.表情表出度から4種の表情について87%の認識率を得た.また,表情表出度の増減から表情の発生と終了を検出できることを示した.このような表情の発生過程の検出は,コンピュータとの対話や作業において,どのようなことを行った時に人の表情が変化したかを機械が理解するために重要であり、マンマシンインターフェースの向上に寄与するものである.1.顔面立体形状測定手法の開発と装置の設計・製作二つの光源と一つのスリット光源を用い、それらの光源を高速に切り換えることによって、動いている立体の形状を実時間で計測できる手法を開発した。さらに開発した手法に基づく顔面動画像入力装置を設計・製作した。その成果は電子情報通信学会論文誌E80-D,8,1997などで発表した。2.顔面構成要素の追跡手法の開発動画像上での顔構成要素(眉・目・口)の動きを、解剖学的な知識を導入して追跡する手法を開発した。顔構成要素の動きの方向と範囲は、骨格と顔面筋肉によって制約されている。この制約を利用し、顔の構造に合わせた2段階処理を行うことにより構成要素に動きを求めることができた。その成果は電子情報通信学会論文誌vol.J80-D-II,no.8,1997などで発表した。3.表情変化の追跡手法の開発人の表情変化に伴う顔構成要素の動きを追跡するために、眉と口の構成要素モデルを開発した。モデルを顔面筋の動きに基づき作成することによって、モデルの変形に規則性をもたせることができ、顔構成要素の動きの効率よく追跡することが可能になった。その成果は電子情報通信学会論文誌vol.J81-D-II,no.1,1998などで発表した。顔面筋に基づく顔構成要素モデルを用いた表情の認識手法を開発し,表情の時間的変化の認識について研究した.顔モデルは,眉・目・口それぞれの顔構成要素の可変モデルから成る.各モデルは数個の制御点と顔面筋の収縮方向のベクトルで構成される.制御点の移動方向は顔面筋が収縮する方向と一致しているため,モデルの変形は実際の顔構成要素と同じ変形規則を持つ.顔動画像にモデルをマッチングさせることで,顔構成要素の動きの追跡ができ,顔面筋の収縮度が求められる.得られた収縮度を要素とする表情パターンと,あらかじめ決定されている表情標準パターンとを比較することで各表情の表出度が得られる.表情表出度は,顔に表れている表情の明瞭さを示しており,値の大小から表情を識別する.また,表情表出度の時間的変移から表情の発生・持続・終了を検出できる.実際の顔動画像に対して実験を行った結果,顔構成要素の動きを正確に検出できた.表情表出度から4種の表情について87%の認識率を得た.また,表情表出度の増減から表情の発生と終了を検出できることを示した.このような表情の発生過程の検出は,コンピュータとの対話や作業において,どのようなことを行った時に人の表情が変化したかを機械が理解するために重要であり、マンマシンインターフェースの向上に寄与するものである.
粘菌細胞の分化に関する分子生物学的研究

1.均質な粘菌細胞は集合して組織を形成すると2種類の細胞(予定胞子と予定柄)に分化し、それぞれが子実体の胞子と柄細胞になる。予定細胞の分化に伴って特異的に発現されるmRNAに対するcDNAクローンを単離し、それに対応する数種類の遺伝子をクローン化した。これらの遺伝子のあるものは予定胞子/予定柄分化時にそれぞれの細胞型でのみ転写されるが、あるものは発生の早い時期から発現し、両細胞型で転写される。これらのmRNAがいずれかの細胞型に選択的に蓄積されるのは、片方の細胞型で不安定化するからである。2種類の予定胞子特異的遺伝子の5'上流域を含むDNA断片を用いて粘菌細胞を形質転換させると、導入された遺伝子は発生段階および細胞型特異的に発現する。これらの遺伝子の転写の調節にかかわるDNAの構造の同定とそれに結合する核蛋白質の単離を試みている。粘菌のある野性種に存在するプラスミドの全構造を明らかにし、これを用いてD.discoideum細胞を形質転換させると、その発現が集合期に始まることおよびcAMPによって誘導されることを示した。2.細胞が組織を形成することなく遊離状態のままで分化する条件を見出し、細胞外pHによって胞子と柄細胞への分化を制御できることがわかった。細胞質内Ca^<++>濃度を測定することに成功し、集合期細胞のそれがcAMPの添加によって4倍に増加することを示し、細胞の走化性反応における刺激の伝達にCa^<++>が関与することを示唆した。細胞の接着分子GP80の一部の糖鎖が細胞接着機能を担うことを示唆した。有性生殖過程(マクロシスト形成)では無性生殖過程(子実体形成)とは異なる蛋白質が合成されること、および交配型の細胞表面に存在する糖蛋白質GP138と70が有性的細胞融合にかかわる分子の候補として同定された。1.均質な粘菌細胞は集合して組織を形成すると、2種類の細胞(予定柄および予定胞子)に分化し、それぞれが子実体の柄と胞子群を構成する。田坂・岩渕・竹内は集合後期と子実体形成期細胞のmRNAに対するcDNAライブラリーを作製し、予定柄および予定胞子の分化に伴って特異的に発現されるcDNAクローンを選択した。これを用いて発生過程における特異的mRNAの合成を調べた結果、あるものは集合期以前から存在しその後いずれかの細胞型に局在するものと、当初からいずれかの細胞型に特異的に合成されるものがあることがわかった。現在、これらのcDNAクローンに対応する遺伝子をゲノムライブラリーから単離しつつある。田仲はある野生種に存在するプラスミドの全構造を明らかにし、これを用いて形質転換を試み、シャトルベクターの産生を目差している。岩渕はアクチン遺伝子を用いて、粘菌細胞抽出液による無細胞転写系の確立に努めたが、まだ成功していない。一方、竹内は細胞型特異的な遺伝子発現を制御すると思われるDNA結合性クロマチン蛋白質を分画した結果、予定胞子分化時に出現する蛋白質を得たので、遺伝子による結合特異性を検討している。2.大畠は予定柄の分化に伴って酸性フォスファターゼの特異的アイソザイムが出現し、それが柄細胞分化過程で選択的に細胞外に放出されることを示した。前田靖は成長期終了時の細胞周期と分化傾向の関係を調べ、【G_2】初期と後期の細胞がそれぞれ予定柄と予定胞子に分化することを確認し、それぞれの集合特性の相違を明らかにした。前田ミは予定胞子細胞の脱分化がリソソーム活性の阻害剤で阻害され、その分化が8ブロムcAMPで促進されることを見出した。

柳澤は有性生殖過程であるマクロシスト形成時の蛋白合成パターンを子実体形成時と比較するとともに、細胞融合促進因子を単離精製している。1.粘菌細胞は集合して組織を形成すると2種類の細胞(予定柄および予定胞子)に分化し,それぞれが子実体の柄組織と胞子群を構成する.田坂・岩淵・竹内はこれら予定細胞の分化に伴う遺伝子発現をcDNAクローンを用いて調べた結果,いずれの予定細胞に特異的なmRNAもtip形成期の組織に初めて合成されることを明らかにした.一方,成長期の時期から存在するが,いずれかの予定細胞で特異的に消失するmRNA種が存在することが示された.粘菌のポリペプチド鎖伸長因子(EF2)のcDNAをハムスターのcDNAを用いて単離したが,この遺伝子の発現は後者のタイプに属し,組織形成後は予定胞子のみで発現される.予定胞子に特異的に発現する2種の遺伝子と予定柄に特異的に発現する1種の遺伝子クローンを単離し,それらの構造解析を進めている.また,後者の遺伝子産物の融合蛋白質を大腸菌に合成させ,それに対して特異的に反応する抗体を得た.田仲は野生株から単離されたプラスチッド(pDG1)の全構造を決定するとともに,形質転換ベクターを用いてD.discoideum細胞に導入し,その発現が集合期に始まり,cAMPによって誘導されることを示した.また,この遺伝子の5′上流域にcAMP反応性配列の存在を暗示した.2.柳澤は有性生殖過程であるマクロシスト形成と無性生殖過程の子実体形成における細胞の合成蛋白質を二次元電気泳動で比較し,マクロシスト形成に伴って特異的な蛋白質が合成されることを示した.また,この過程の細胞膜分画に対する抗体のF_<ab>が生殖細胞の融合を特異的に阻害することを明らかにした.落合は粘菌のレクチンであるディスコイディンIおよびIIに対するモノクローナル抗体を得て,これらのレクチンの発生過程における組織内分布の変化を示した.前田靖は細胞サイクルを細胞の選別傾向および集合特性発現の関連を明らかにした.1.粘菌細胞の集合によってつくられる組織には2種類の細胞(予定柄および予定胞子)が分化する。予定胞子細胞に特異的に蓄積するmRNAに対応する遺伝子には予定胞子でのみ転写されるものと予定柄と予定胞子の双方で転写されるものがある。前者は予定胞子分化時に発現を開始し、後者は成長期から発現している。したがって後者のmRNAは予定柄細胞で選択的に分解される結果予定胞子特異的になると結論される。前者の2種類の遺伝子の5′上流域を含むDNA断片を粘菌細胞に形質導入した結果この遺伝子は発生段階および細胞型特異的に発現することがわかった。そのうちの一種は胞子特異抗原である胞子外被蛋白質をコードしている。トポイソメラーゼI活性を示さない突然変異株を単離し、この株の増殖と発生を野生株と比較した結果、この酵素は粘菌細胞の生存には必須ではないが、遺伝子発現の速やかな変化を促進すると思われる。2.細胞外のpHが4-6の範囲では細胞は組織を形成することなく遊離状態で胞子あるいは柄細胞に分化する。pHが低い時には柄細胞の、高い時には胞子の分化が優性である。Ca^<++>感受性の蛍光色素をエレクトロポレーションによって細胞内に導入することによって細胞質内Ca^<++>濃度を測定することができた。この細胞にはcAMPを添加すると、きわめて短時間内に細胞質内Ca^<++>
唾液によるHIV(ヒト免疫不全ウイルス)感染についての基礎的研究

唾液によるHIV(ヒト免疫不全ウイルス)感染の可能性を検証するために、HIV感染者から全唾液を採取しnested-PCR法を用いてHIVプロウイルスDNAの検出を試みた。さらに、感染性については唾液中の血液の混入を調べる必要があるが、ヘモグロビン量を測定することにより評価した。その結果、CD4陽性リンパ球数が500/μ1以上の患者の唾液中からはHIVプロウイルスDNAは検出されなかったが、ほぼAIDS関連症候群にあたるCD4陽性リンパ球数500/μ1未満の200/μ1以上の患者の唾液の57%からHIVプロウイルスDNAが検出された。AIDS状態に相当するCD4陽性リンパ球数が200/μ1未満の患者から採取した唾液からは検出されなかった。HIVプロウイルスDNAが検出された全ての唾液検体からは血液の混入が認められた。すなわち、唾液自体による感染の危険性は否定的であるが、微量ながら血液が混入している唾液によってはHIV感染が成立する可能性があると考えられた。さらに今後はより厳密な検討のために唾液中のHIV-RNAの測定も必要と思われた。次に唾液によるHIV感染の危険性を修飾すると考えられる口腔内の局所免疫能を検討するために、唾液中の分泌型免疫グロブリンAを定量した。その結果、CD4陽性リンパ球数が200/μ1未満の患者において唾液中の分泌型免疫グロブリンAの濃度が低下する傾向が示された。これはHIV関連口腔症状の発現にも関与していると推測された。HIV(ヒト免疫不全ウイルス)感染者の血液を健常人の唾液にて濃度勾配を持たせ、希釈することにより,検体モデルを作成した。そしてこの検体を血液に準じたPCR法にかけることによりHIVのDNAすなわちプロウイルスの検出を試みた。その結果、本法により唾液中よりプロウイルスの検出が可能であることが示された。現在はHIV感染者から採取した唾液をPCRにて解析しつつあり、無症候性キャリヤ-ではプロウイルスの検出は低いものの、HIV感染者が進行した被験者の唾液中には、プロウイルスが存在することが証明された。唾液によるHIV感染の可能性を判断するためには、唾液自体に含まれるウイルスを中和する物質の存在についての検討も必要と考えられる。そこで唾液中に含まれる分泌型IgA量の測定をELISA法により行った。その結果、無症候性キャリヤ-ではHIV非感染者とはy445有意差はみられなかったが、CD4陽性リンパ球数が200/μ1未満に減少した。いわゆるAIDS患者では唾液中の分泌型IgA濃度が顕著に低下していることが明らかとなった。以上の研究より、HIV感染者の中でもAIDS状態の患者では、唾液自体が感染の媒体となりうることが示唆された。しかしながら、対象症例が少なく、また血友病患者を対象としているため自然出血による影響も考えられる。また。血液中のウイルス量との比較により現実的に唾液が感染源となるのか検討が必要であると考えられた。名古屋大学医学部附属病院歯科口腔外科に通医しているHIV感染者対して口腔症状の発現について調査するとともに、全唾液を採取してnested-PCRによりHIVプロウイルスDNAの検出を試みた。なお、対照として非感染者からも同様に唾液を採取した。その結果、CD4陽性リンパ球数が500/mm^3以上および200/mm^3未満のHIV感染者から採取した唾液からはプロウイルスDNAは検出されなかった。しかしながら、CD4陽性リンパ球数が500mm^3未満200/mm^3以上の群の57%からプロウイルスDNAが検出された。また、唾液中の血液の混入を潜血用試験紙を用いて調べた結果ではヘモグロビンが2.5mg/dl以上混入していた検体において高率でプロウイルスが検出された。しかしヘモグロビンの混入がそれ以下の唾液からはプロウイルスDNAは検出されなかった。

観察期間中、HIV関連口腔症状は口腔カンジダ症がわずかにみられたに過ぎなくプロウイルスDNAの検出との関係はないと思われた。現在、さらにHIV-RNA検出をPCRを用いて試みている。
明朝の官印制度の研究

本研究は、中国王朝の官印制度の集大成といえる清朝の官印制度の特徴を解明した成果をふまえて、時代を遡って,各王朝の官印制度の変遷とその特徴を明らかにしようとする研究課題の一環として、清朝の前王朝である明朝の官印制度を明らかにすることを目的とした。具体的には、明朝の官制の変遷を確認し、その中での官印の種類と発給、特に明朝においてはじめて採用された、印背の刻字と「関防」印の出現について、それぞれの背景を考察することに注意した。その結果、(1)印背の刻字として、これまでの「製造年月」、「製造部署名」に加えて、前代の遼・金・元朝の民族文字印(契丹文印、女真文印、パスパ文印)に刻されていた民族文印文の漢訳文が、漢文印である明朝の官印にも踏襲されて、印面の印文と同じ文が印背にも刻されたこと、(2)同じ刻字でも、印側に製造番号といえる「編号」がはじめて刻された。それによって王朝の官印管理体制がいっそう完備されたものになったことが判明した。(3)明朝に出現した長方形の「関防」印について、これまで通説のようにいわれていた洪武帝時代(1368-1398)ではなく、当初は宣徳帝時代(1425-1435),に内府で一部の宦官に給付され、のちに正統帝時代(1435-1449)に一般官員に発給されたことが史料的に確認することができた。さらに、(4)遼東都指揮使司の各種官印を整理し分析することで、支配体制の中での官印の機能、運用の具体像を素描できた。かくして、官印に係わる罰則規定をふくめた明朝の官印制度の全体像を、各種の官印の印影を提示して明らかにし、明朝の官印制度がほぼそのまま清朝のそれに継承されたことを確認できた。本研究は、明朝の官印制度を中国政治史、官印制度史の中に位置づけようとするものである。本年度の課題は、明朝政治史・中国官印制度に係わる史料文献の収集を行うとともに、明朝に至る官印制度の流れを考察することを主眼とした。(1)関係史料文献の収集においては、官印制度の密接不可分の関係にあると考える、符節の考察を行った。戦国から漢代において、「符」の役割は官印を補完するものといえる。『周礼』『史記』等の文献にいう「符節」は一個のものではなく、「符」「節」はそれぞれ由来を異にする別個のものであると、考える。符は割り符として、その持参者の身分を保証するものであったが、節は保持者の権威を証明するものであった。それ故に節は漢代から南北朝時代に「使節」として権限を表示したのである。その時代の符の実物として、わが国で唯一その存在が知られる大原美術館所蔵の「銅虎符」を実見し、近年多量に出土する木符との類似性を確認した。また、節の権威性については、明朝における鉄券に反映されていることが推測される。すなわち、皇帝権を表象するものは官印だけでなく、古代から続く節にもみることができる。ただし、その適用範囲は時代とともに限定され、明朝においては皇帝の私的な、または皇城という狭いものになってきたと想定される。

本研究は、中国王朝の官印制度の集大成といえる清朝の官印制度の特徴を解明した成果をふまえて、時代を遡って、各王朝の官印制度の変遷とその特徴を明らかにしようとする研究課題の一環として、清朝の前王朝である明朝の官印制度を明らかにすることを目的とした。具体的には、明朝の官制の変遷を確認し、その中での官印の種類と発給、特に明朝においてはじめて採用された、印背の刻宇と「関防」印の出現について、それぞれの背景を考察することに注意した。その結果、(1)印背の刻字として、これまでの「製造年月」、「製造部署名」に加えて、前代の元朝のパスパ文官印に見られた印文の漢訳文がそのまま、漢文印である明朝の官印にも踏襲され、印文と同じ文が印背にも刻されたこと、(2)同じ刻字でも、印側に製造番号といえる「編号」がはじめて刻され、それによって王朝の官印管理体制がいっそう完備されたものになったことが判明した。(3)明朝に出現した長方形の「関防」印について、これまで通説のように語られていた洪武帝時代(1368-1398)ではなく、当初は宣徳帝時代(1425-1435)に内府で一部の宙官に給付され、のちに正統帝時代(1435-1449)に一般官員に発給されたことが史料的に確認することができ、さらに遼東都指揮使司の各種官印を整理し分析することで、支配体制の中での官印の機能、運用の具体像を素描できた。かくして、官印に係わる罰則規定をふくめた明朝の官印制度の全体像を、各種の官印印影を提示して明らかにし、明朝の官印制度がほぼそのまま清朝のそれに継承されたことを確認できた。
ＣＣＲ４－ＮＯＴデアデニレース欠損に伴う病態解析と新たな遺伝子発現制御機構

高等生物mRNA代謝に関わるCCR4-NOT複合体について、それを構成する9種のタンパク質を個々に欠損するマウスを作成した。それらが、胚発生、肝・脂肪組織形成、免疫機能、エネルギー代謝などの異常を引き起こすことを見いだして、CCR4-NOT欠損マウスがヒト疾患の病態モデルマウスとなると示唆した。また、mRNA分解のメカニズムを、CCR4-NOT複合体構成成分の構造やmRNAとの会合様式を解析することで追求し、標的mRNAの3'UTR配列にCCR4-NOT複合体の調節成分が会合し、その結果活性成分によりmRNAの脱アデニル化が進み、当該mRNA分解が進むことを示唆する結果を得た。(1)欠損マウス作成:Cnot1,2,10条件的欠損マウス作成のためのキメラマウスを得た。(2)表現系解析:Cnot3^<-1->マウスの胚性致死の原因は細胞増殖機構の異常によるものと考えられる。個体レベルでのこの異常を解明するために、肝臓特異的にCnot3を完全欠損するCnot3(liver-KO)マウスを作成した。当該マウスは出産時から体重が少なく小型であった。Cnot9^<-1->マウスは胎生12.5日で胎児内血管網形成不全で死亡することを明らかにした。血管内皮細胞への分化誘導実験から、Cnot9欠損胚では細胞の分化能や血管網形成能が減弱していることを見出した。(3)遺伝子発現解析:microarrayやRT-PCRにより、野生型に比べCnot3^<-1->マウス白色脂肪組織でホルモン感受性リバーゼ遺伝子(Hsl)の発現が亢進していることを見出し、それが瘠せ形質の一因となっていると推定した。また、microarrayや次世代シーケンサーを用いた解析から、Cnot7欠損精巣組織でFst(follistatin)やAdh1(alcohol dehydrogenese)遺伝子など精子形成に関与する複数の遺伝子の発現上昇を見出した。また、Cnot9欠損10.5日胚組織でRunx1遺伝子など血管網形成関連遺伝子群の顕著な発現変動を見出した。(4)分子機構の解析上記(3)で示した遺伝子の発現変化が当該形質の原因かどうかを遺伝子産物の作用機構の面から検討し、またそれら遺伝子mRNAがCCR4-NOTデアデニレースの標的かどうかをそれぞれのmRNAについてPoly(A)長を測定することで調べている。また、CNOT6L蛋白質とoligo(dA)会合体の共結晶構造を明らかして、CNOT6Lによる脱アデニル化の分子機構を推定した。(1)Cnot1,2,6,10遺伝子欠損マウスの作製を完了し、Cnot1,2,10欠損が胎生致死を誘導すること、つまりこれら遺伝子が発生過程で重要であることを明らかにした。Cnot6欠損マウスは正常に発生し、生後にも顕著な異常はしめさなかった。Cnot1, 3, 8それぞれを肝特異的に、またCnot3を脂肪組織特異的に欠損するマウスを、それらのヘテロ欠損マウスと適当なCreマウスと交配して作成した。AP2-Creマウスとの交配で得られるマウスは出生直後に死亡するが、adiponectin-Creとの交配で得られるマウスは見かけ上正常であった。Cnot1, 3, 8の組織特異的欠損マウスの作成を開始した。(4)Tobの発現をON-OFFしてTNFαmRNAの局在を調べることで、Tobが、mRNA代謝に関わるStress GranuleやP-bodyの形成制御に関わっていることを示唆する結果を得た。(5)CCR4-NOTの構造生物学的解析に向けて、すべての複合体成分について大腸菌や昆虫細胞での発現系を確立した。今年度は以下を推進した。1.これまでにCCR4-NOT複合体構成サブユニット遺伝子ついて欠損マウスを作成・解析し、脱アデニル化活性サブユニットCNOT6, 6L, 7を欠損すマウスは産まれてくるが、CNOT3,CNOT8,CNOT9,CNOT10各サブユニットのヌル欠損マウスについてそれぞれE6.5, E9.5, E10.5, E8.5-E10.5で胚死することを示した。今年度はCNOT1欠損マウスとCNOT2欠損マウスが、それぞれE6.5, E18.5近傍で胚死することを示した(未発表)。2.CNOT1を後期胚肝臓でAlb-Creトランスジェニックマウスを利用して条件的に欠損させ、出生後の発達が遅延することと、肝炎様の症状を発症することを示した。それらマウスの肝臓では、胎児性AFP遺伝子や、細胞周期制御因子の遺伝子発現が増大していた。またCNOT1をAdQ-Creトランスジェニックマウスを利用して脂肪組織で特異的に欠損させた場合は脂肪萎縮症様の症状を示し、発熱能力が低下していた(未発表)。

3.CNOT6ヌル欠損マウスは見か上正常であるが、高脂肪食依存的肥満には抵抗性である事が分かった。その原因を探る中で、CNOT6L mRNAがFGF21(hepatokine)mRNAの3'UTRにあるAU-rich配列に作用することを見いだした(未発表)。4.CNOT3遺伝子を成体の肝、脂肪組織、胸腺T細胞、脳で条件的に欠失させ、それぞれ肝炎様の症状、脂肪萎縮症、自己免疫疾患、脳発達異常などが誘発されることを見いだした(未発表)。それらの組織でのmRNA発現を調べ、CNOT3欠損は組織毎に異なるmRNA種の発現を増大させていることを見いだした。以上、CCR4-NOT複合体の個々のサブユニットが、組織特異的に標的mRNAを脱アデニル化する仕組みに関わっていることが示唆された。Cnots欠損マウスの病態・生理機能解析と、CCR4-NOTの標的mRNAs認識機構の解析を進めた。(2)上記マウス肝での遺伝子発現のマイクロアレイ解析、RT-PCR解析を行った。liver-Cnot3 KOマウスでは、AFPやH19, IGF2などの胎児肝特異的な遺伝子や代謝関連遺伝子の発現が数倍から数百倍の範囲で増大していた。liver-Cnot8 KOマウスでは野生型に比べ肝臓でエネルギー代謝関連、インシュリンシグナル関連、そしてEGFRの遺伝子発現が上昇数倍から数十倍の範囲で増大していた。(3)上記発現上昇mRNAの半減期やpoly(A)鎖を調べた。肝細胞をアクチノマイシン処理る実験から、CNOT3非存在で発現上昇している多くのmRNAは半減期がコントロールに比べ長いことを確認した。またCNOT8を欠く肝細胞では、IGFBP2やEGFR mRNAのpoly(A)鎖がコントロールに比べ長いことを見出した。(4)X線結晶構造解析に向けて、TagつきCNOT3全長配列、CCR4-NOT複合体の形成に重要と考えられるCNOT2,CNOT3のNOT box配列を調製した。また、PABP-Tob-CNOT7複合体解析に向けて、夫々の蛋白質を調製した。活性サブユニットCNOT6LとCNOT7会合体を結晶化した。また新規CNOT3会合蛋白質としてTAB182やMINKを見出した。(5)培養細胞を増殖因子等で刺激後に不安定化あるいは安定化するmRNA種を探索する実験系を確立した。当初の目標の一つであるCCR4-NOT複合体の構成成分をひとつずつ欠損するマウスの作成を完了し、それらの解剖学的解析が可能となった。CCR4-NOTの標的候補mRNAをいくつかを得、そのうちの相互作用を確認した。CNOT7とpoly(A)の共X線結晶構造解析が進むとともにCCR4-NOT複合体構成全蛋白質の解析の準備が進んだ。25年度が最終年度であるため、記入しない。CCR4-NOT構成成分夫々を欠くマウスラインを得、それら成分を臓器特異的に欠損するマウスラインを自由に作れることになり生理学研究の大々的展開が可能となった。CCR4-NOTの標的候補mRNAを当初の予定通りすでにいくつか得ている。これらの標的mRNAとCCR4-NOTの物理的機能的会合については昨年度に引き続き進展している。蛋白質構造解析も着実に進んでいる。
マルチエージェント方式の適用による広域的負荷周波数制御のインテリジェント化に関する研究

H無限大制御を基本とした低次制御システムを設計するための方式を開発し、PI制御で構成される負荷周波数制御システムの最適設計を可能とするとともにコンピュータネットワークを介した情報伝送に伴う情報伝送遅延時間の影響を受けないロバストな制御システムの設計を可能とした。多地域連系系統を対象としたシミュレーションにより、提案する設計方式により設計された負荷周波数制御システムのロバスト性を明らかにしている。特に、情報伝送時間の遅延による負荷周波数制御性能の劣化を防止できることを明らかにしている。電気二重層キャパシタにより構成される新型電力貯蔵システムとの協調制御方式を提案し比較的小容量の電力貯蔵システムにより負荷周波数制御性能の大幅な改善が可能となることを明らかにしている。さらに、電力自由化後の系統を対象としたマルチエージェント方式の新しい負荷周波数制御方式を提案し、シミュレーションによりそのロバスト性を検証し、提案する制御方式が対象となる電力システムの構成変更、マルチエージェントシステムで特に問題となる情報伝送遅延などに対しても極めて良好な制御性能を維持できることを明らかにしている。Matlab/Simulink環境下で負荷周波数制御のシミュレーションのための実規模系統のモデルを構築するとともに、モデル内に通常のLFC対応発電機以外に電気二重層キャパシタにより構成される小容量新型電力貯蔵システムを付加し本電力貯蔵システムによる負荷周波数制御性能の改善に関する検証を可能とした。コンピュータネットワーク上に負荷周波数制御を対象とした電力システムシミュレータを構築する際の基本となるVPNを用いた情報配信システムの基本部の構成とその動作試験を完了している。新型小容量電力貯蔵システムとLFC対応発電機との協調型負荷周波数制御方式を開発し、電力貯蔵容量と制御性能改善度合いとの関係を明らかにすることで必要となる貯蔵容量の決定法を明らかにしている。コンピュータネットワークを介した情報伝送遅延時間の制御性能に与える影響を明らかにし、伝送遅延による制御性能劣化を防止するための補償方式、伝送遅延が存在する場合の制御システムの設計方式を開発し、シミュレーションによりその有効性を明らかにしている。
トリチウムによるマウス個体での遺伝子突然変異の誘発

マウス毛色変異系を組合せた体細胞突然変異検出法を用い、トリチウム水によるマウス個体レベルでの遺伝子突然変異誘発を試み、トリチウムによるヒトへの遺伝的影響のリスク推定の資料とする。1)突然変異の検出:大阪大学医学部無菌動物室においてPT♀とHT♂を交配し、妊娠10【1/2】日目に、広島大学原医研にてトリチウム水を腹腔内に注射する。生後4週齢で【F_1】マウスを屠殺し、体細胞突然変異と細胞死および奇形を検出する。【F_1】マウス(a/a,b/+,【PC^(ch)】/++,d/+,ln/+,pa/+,pe/+)の毛色は正常では黒色であるが、野生型遺伝子に変異がおこると、その胎児色素芽細胞由来の毛の部分が、茶一灰白色のスポットとなる。変異毛を抜去し、顕微鏡下で観察し、変異遺伝子座を決定する。これまでの研究成果により、倍加線量(33R)、1R、1遺伝子座当りの変異率(2.2×【10^(-7)】)は、精原細胞での突然変異とよく一致している。2)トリチウム水による突然変異の誘発:トリチウム水120uCi/g・体重を妊娠10【1/2】日目に腹腔内注射した8匹のマウスのうち4匹が生仔を分娩した。残り4匹は、妊娠が成立していなかった。現在、24匹のPT-HT【F_1】マウスの観察を終了した。その結果、6匹(25.0%)に体細胞突然変異による毛色スポットが検出された。単純な計算では、今回、用いたトリチウム水120μCi/g・体重は、110radに相当する。X線110R急照射では、218匹中26匹(11.9%)に変異が誘発されており、トリチウム水でも、invivoでの体細胞突然変異は、極めて効率よく検出されることは今回の予備実験よりまちがいない。来年度よりは、長期計画で、量効果曲線を求め、トリチウム水の哺乳動物個体レベルでの遺伝的影響を定量的に解析し、ヒトへのリスク推定の資料を作成したい。