hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫の生存環境温度受容から休眠誘導に繋がる脳内分子ネットワークの解明

2つのサブテーマを遂行した。(A)カイコ卵における温度センサー相同体遺伝子のクローニングと機能解析。(B)休眠ホルモン産生細胞群と脳を巡る神経ネットワークの解析。(A)昨年度は,5つのカイコの温度センサータンパク質(ThemloTRPチャンネル)相同体遺伝子群の部分配列を決定した。本年度はまず,cDNAの全長配列を決定し,発現動態を詳細に調査した。これらのcDNAはいずれもキイロショウジョウバエのものと相同性が高く,機能ドメインも保存されており,カイコにおける温度センサータンパク質をコードしていると考えられた。さらに,いずれの遺伝子も様々な発育時期の様々な組織・器官で発現しており,血球細胞でも高い発現が認められた。これらの結果から,ThermoTRPは変温動物である昆虫の内部組織の急激な温度変化に伴う温度ストレスに対応するために,血球細胞をはじめとする内部組織で発現し,即時的なストレス応答に関与すると推測した。この仮説を検証するために,培養細胞系を用いた活性化温度閾値の測定や遺伝子発現抑制による温度応答性への影響を調査する準備を進めた。さらに,休眠誘導と覚醒への関与を調査している。(B)昨年度までに,休眠ホルモン(DH)の放出抑制に関わると推測される脳内細胞を同定した。本年度はまず,この細胞でアポトーシス誘導タンパク質(Reaper)を発現させ,DH分泌器官である食道下神経節(SG)でのDH蓄積量に及ぼす影響を調査し,休眠性に及ぼす影響を再調査した。その結果,Reaper発現により,DH量の減少が観察され,非休眠卵産生性に条件付けた個体が休眠卵を産出した。さらに,この細胞の神経投射パターンとDH放出抑制に関わると思われるGABAレセプターの局在性を調査した結果,DHの放出器官である側心体においてDH産生細胞の神経軸索末端と重なり合っていた。今後,DH放出抑制細胞で発現するホルモンの休眠誘導における機能解析と,この細胞と日長や温度情報の受容との関連を調査する予定である。3つのサブテーマに分けて研究を遂行している。(A)カイコ卵における温度レセプターの同定と機能解析。(B)休眠ホルモン産生細胞群と脳を巡る神経ネットワークの解明と脳内細胞と休眠誘導との関連の解明。(C)バキュロウイルス(AcNPV)遺伝子導入ベクターを利用した休眠誘導関連遺伝子の網羅的スクリーニング。(A)温度センサータンパク質(ThermoTRPチャンネル)遺伝子の内、TRPA1、TRPM、painlessの3種類のカイコのホモログcDNAの全長のクローニングに成功した。いずれのcDNAもキイロショウジョウバエのものと相同性が高かった。RT-PCRにより、胚発育期での遺伝子発現を確認した。昆虫培養細胞(SF9)系での温度センサーの機能解析を行うため、発現ベクターを構築し、エクオリンcDNAとの共導入を行っている。(B)アポトーシス誘導タンパク質(Reaper)を特定の脳内細胞で発現させるため、DH-PBAN、PTTH、Bombyxin、EH、PTSP、period、Boceropsin、Corazoninの遺伝子上流域をクローニングした。これらのプロモーター領域と、レポーター遺伝子としてEGFP cDNAを利用したAcNPV遺伝子導入法により、各産生細胞でのEGFPの発現を確認した。さらに、各プロモーター領域の下流にreaper cDNAを繋いだコンストラクトをもつ組み換えAcNPVを作製した。(C)2化性の18系統から、スクリーニングに利用できる系統を1つ選抜した。休眠ホルモンの遺伝子発現のオン/オフを決定する転写調節因子の候補であるBmPitxの発現抑制型組み換えAcNPVを作製し、休眠タイプの蛹に注射したところ、非休眠卵と、着色非休眠卵の産出が観察された。現在、DH-PBAN遺伝子の発現抑制型組み換えAcNPVを作製している。昨年に引き続き、3つのサブテーマに分けて研究を遂行した。(A)カイコ卵における温度センサーの同定と機能解析。(B)休眠ホルモン産生細胞群と脳を巡る神経ネットワーグの解析。(C)休眠誘導関連遺伝子のスクリーニング。(A)昨年クローニングした温度センサータンパク質(ThermoTRPチャンネル)遺伝子のTRPA1、TRPM、painlessの3種類のカイコのホモログcDNAに加え、新たにTRPA2(Pyrexia)およびTRPA3のクローニングに成功した。いずれのcDNAもキイロショウジョウバエのものと相同性が高く機能ドメインも保存されていた。胚発育期および幼虫・蛹での遺伝子発現を解析し、いずれの遺伝子も様々な発育時期の様々な組織・器官で発現していることを確認した。また、昆虫培養細胞(SF9)系での温度センサーの機能解析を行うため、発現ベクターを構築し、化学発光による検出を行っている。(B)アポトーシス誘導タンパク質(Reaper)を特定の脳内細胞で発現させるため、様々な遺伝子の各プロモーター領域の下流にreaper cDNAを繋いだコンストラクトをもつ組み換えAcNPVを作製し、休眠性および非休眠性の蛹に注射し、次世代卵の休眠性を観察した。その結果、休眠性の変換が観察されるコンストラクトが見つかった。現在、piggyBAC形質転換カイコを利用して、結果の確認と休眠ホルモン放出制御細胞の同定を試みている。(C)3種類のイオン透過型GABAレセプターサブユニットとGABAトランスポーターのcDNAをクローニングにした。

これらの遺伝子とThermoTRP遺伝子群の発現抑制による休眠誘導への影響を調査するため組換えAcNPVおよび形質転換カイコを作製中である。2つのサブテーマを遂行した。(A)カイコ卵における温度センサー相同体遺伝子のクローニングと機能解析。(B)休眠ホルモン産生細胞群と脳を巡る神経ネットワークの解析。(A)昨年度は,5つのカイコの温度センサータンパク質(ThemloTRPチャンネル)相同体遺伝子群の部分配列を決定した。本年度はまず,cDNAの全長配列を決定し,発現動態を詳細に調査した。これらのcDNAはいずれもキイロショウジョウバエのものと相同性が高く,機能ドメインも保存されており,カイコにおける温度センサータンパク質をコードしていると考えられた。さらに,いずれの遺伝子も様々な発育時期の様々な組織・器官で発現しており,血球細胞でも高い発現が認められた。これらの結果から,ThermoTRPは変温動物である昆虫の内部組織の急激な温度変化に伴う温度ストレスに対応するために,血球細胞をはじめとする内部組織で発現し,即時的なストレス応答に関与すると推測した。この仮説を検証するために,培養細胞系を用いた活性化温度閾値の測定や遺伝子発現抑制による温度応答性への影響を調査する準備を進めた。さらに,休眠誘導と覚醒への関与を調査している。(B)昨年度までに,休眠ホルモン(DH)の放出抑制に関わると推測される脳内細胞を同定した。本年度はまず,この細胞でアポトーシス誘導タンパク質(Reaper)を発現させ,DH分泌器官である食道下神経節(SG)でのDH蓄積量に及ぼす影響を調査し,休眠性に及ぼす影響を再調査した。その結果,Reaper発現により,DH量の減少が観察され,非休眠卵産生性に条件付けた個体が休眠卵を産出した。さらに,この細胞の神経投射パターンとDH放出抑制に関わると思われるGABAレセプターの局在性を調査した結果,DHの放出器官である側心体においてDH産生細胞の神経軸索末端と重なり合っていた。今後,DH放出抑制細胞で発現するホルモンの休眠誘導における機能解析と,この細胞と日長や温度情報の受容との関連を調査する予定である。
動脈硬化と関連した生活習慣病予防における飲酒の是非に関する研究

動脈硬化症の進展におよぼす飲酒の影響について、飲酒を含む生活習慣に関するアンケート調査を産業従事者対象に実施した。さらに動脈硬化の危険因子として重要である2型糖尿病患者を対象に同様の調査を行った。アンケート調査と健診結果について統計手法を用いて解析し、飲酒の程度およびアルコール感受性の相違が種々の動脈硬化症のリスク要因にいかに影響をおよぼすかについて検討した。顔面紅潮、皮膚紅潮、動悸の3項目からなるアンケート調査の結果からアルコール感受性を判定した。産業従事者を対象とした調査ではアルコール感受性の強い(すなわちお酒に弱い)群の多量飲酒者(一日平均エタノール30g以上)の収縮期および拡張期血圧は、同群の軽度飲酒者(一日平均エタノール30g未満)および非飲酒者に比べ有意に高かった。一方、アルコール感受性の弱い(すなわちお酒に強い)群の多量飲酒者の収縮期および拡張期血圧は、同群の軽度飲酒者および非飲酒者と比べ差はなかった。アルコール感受性の強い群では飲酒量と血圧との間に有意な相関を認めたが、アルコール感受性の弱い群では有意な相関を認めなかった。飲酒量と血圧との関連性におよぼすアルコール感受性の影響について、上記と同様の結果が2型糖尿病を対象にした調査からも得られた。さらに、血中中性脂肪、HDLコレステロール値、大動脈脈波速度におよぼす飲酒の影響についてはアルコール感受性による差はなく、いずれの群でも多量飲酒者においては軽度飲酒者および非飲酒者に比べ有意に高かった。既報ではALDH2の多型は飲酒と血圧との関連性に影響を及ぼさないことが、一致して報告されているが、本研究では血圧と飲酒との関連性が飲酒時の症状から判定したアルコール感受性の影響を受け易く、アルコール感受性が高い人が飲酒することにより高血圧を惹起しやすくなることをはじめて証明した。動脈硬化症の進展におよぼす飲酒の影響を検討する目的で、産業従事者を対象に飲酒を含む生活習慣に関するアンケート調査を実施した。このアンケート調査と定期健康診断の結果を統計手法を用いて解析し、飲酒の程度およびALDHの多型の相違がさまざざまな動脈硬化症のリスク要因にいかに影響をおよぼすかについて検討した。尚、本年度はALDH2の多型については3項目からなるアンケート調査の結果から判定した。既報によるとこのアンケート法により90%の精度によりALDH2の多型の判定が可能であるという。軽度の飲酒者(一日平均エタノール30g未満)では非飲酒者に比べ血圧および血中HDLコレステロールは高値を示し、LDLコレステロールは低値を示したが、両群間で血中中性脂肪には有意差を認めなかった。一方、多量飲酒者(一日平均エタノール30g以上)では非飲酒者および軽度飲酒者に比べて血圧、血中HDLコレステロール、中性脂肪は高値を示し、LDLコレステロールは低値を示した。尚、BMI、血糖値は飲酒の影響を受けなかった。次に、上記の飲酒による影響をALDH2のタイプ別(1*1、1*2、2*2)に比較した。軽度飲酒の血圧、血中HDLコレステロールおよびLDLコレステロールにおよぼす影響にはALDH活性型群と不活性型(ヘテロ)群との間に有意な差は認められなかった。また、ALDH不活性型(ホモ)では飲酒量が極端に少なく、飲酒による動脈硬化のリスク要因への影響は観察されなかった。以上より、飲酒は主に血圧および血中脂質に影響をおよぼすことにより動脈硬化の進展を修飾すると考えられるが、その影響は主に実際の飲酒量により左右され、ALDH2の多型によっては変化しない可能性が示唆された。さらにこの結果は飲酒の血圧および血中脂質におよばす影響にはアルデヒドよりもエタノール自体の生理作用が重要である可能性を示唆している。

動脈硬化症の進展に及ぼす飲酒の影響について、昨年度に実施した産業従事者を対象者とした飲酒を含む生活習慣に関するアンケート調査を、対象者を増やして実施した。さらに動脈硬化の危険因子として重要である2型糖尿病患者を対象に同様の調査を行った。アンケート調査と健診結果について統計手法を用いて解析し、飲酒の程度およびアルコール感受性の相違が種々の動脈硬化症のリスク要因にいかに影響を及ぼすについて検討した。顔面紅潮、皮膚紅潮、動悸の3項目からなるアンケート調査の結果からアルコール感受性を判定した。産業従事者を対象とした調査ではアルコール感受性の強い(すなわちお酒に弱い)群の多量飲酒者(一日平均エタノール30g以上)の収縮期および拡張期血圧は、同群の軽度飲酒者(一日平均エタノール30g未満)および非飲酒者に比べ有意に高かった。一方、アルコール感受性の弱い(すなわちお酒に強い)群の多量飲酒者の収縮期および拡張期血圧は、同群の軽度飲酒者および非飲酒者と比べ差はなかった。アルコール感受性の強い群では飲酒量と血圧との間に有意な相関を認めたが、アルコール感受性の弱い群では有意な相関を認めなかった。飲酒量と血圧との関連性におよぼすアルコール感受性の影響について、上記と同様の結果が2型糖尿病を対象にした調査からも得られた。さらに、血中中性脂肪、HDLコレステロール値、大動脈脈波速度におよぼす飲酒の影響についてはアルコール感受性による差はなく、いずれの群でも多量飲酒者においては軽度飲酒者および非飲酒者に比べ有意に高かった。既報ではALDH2の多型は飲酒と血圧との関連性に影響を及ぼさないことが、一致して報告されているが、本研究では血圧と飲酒との関連性が飲酒時の症状から判定したアルコール感受性の影響を受け易く、アルコール感受性が高い人が飲酒することにより高血圧を惹起しやすくなることをはじめて証明した。
早期リウマチ患者に対する関節超音波検査を併用したリハビリテーションの効果の検討

関節リウマチ患者の関節エコー所見における滑膜病変の程度と機能障害の関連性について明らかにすることを目的とし,外来通院中の患者30名の手指を対象に滑膜肥厚(GS)及び血流シグナル(PD)を段階別に分け,疼痛(VAS),握力,ピンチ力,関節可動域(TAM)を測定し相関分析を行った.その結果,GSは疼痛,握力,ピンチ力,関節可動域と負の相関があったが,PDは有意な相関はなかった.GSについて滑膜肥厚の程度の悪化に伴い消炎後も炎症細胞が蓄積され,器質的変化により手指の機能障害を呈すると考えられた.本研究により関連性が明らかとなり,障害予防や機能改善に向けた局所的評価の一助として有用と示唆された.関節リウマチの臨床的寛解に至った患者に対し、早期リハビリテーションを行う際に関節超音波検査を併用することで、疾患活動性を従来よりコントロールが可能となり、上肢機能の維持、改善において、リハビリテーション効果が高いことを検証することした。当研究の重要な設備としていた超音波装置であるが、設置場所の再検討のため、当初、予定していた血流シグナル評価及び一部研究計画の修正が必要となった。修正内容として、当センターに設置された従来の超音波装置を使用することとした。昨年度の関節超音波検査に関する研修会は参加できなかったため、今年度に参加し、医師、検査技師とともに検査手技のスキルアップを図る。これにより、再現性を高め、検者間信頼性を高める。上記の理由により、介入期間を延期し、今年度より実施しリハビリテーション効果について検証する。また、腫脹、圧痛は軽減したが、画像による炎症は残存する乖離例に対して、関節超音波検査を用いた視覚的フィードバックが過活動を抑制し、予後良好となるか検証する。関節リウマチの臨床的寛解に至った患者に対し、早期リハビリテーションを行う際に関節超音波検査を併用することで、疾患活動性がコントロールされ、上肢機能の維持、改善において、従来より、リハビリテーション効果が高いことを検証することとした。現在までに、腫脹、圧痛は軽減したが、画像による炎症は残存する乖離例を対象に研究をすすめているが、当初の計画より対象数が少なく、コントロール不良な症例は薬物療法により、リハビリテーション介入に満たないものが多い。しかし、臨床所見と画像所見との乖離は予後不良の因子になり得ると報告され、関節超音波検査の補助診断やコメディカルにおける患者との病状把握にはかかせないツールとなっている。今後も介入期間を延長した上で、検証を重ねていく。当初の計画にあった、超音波診断装置とは異なるタイプの装置を使用することとなったため。また、関節超音波検査に関する研修会への参加が遅れたため。関節リウマチ(以下RA)では関節超音波検査(以下US)が簡便な滑膜病変の評価に役立っている.一方,滑膜病変による手指機能障害では関節可動域制限,疼痛による筋出力の低下を招くことから,滑膜病変と関節機能障害は関連性があると考えられるが,USを局所的評価に用いた研究は多く散見されない.よって,本研究はUSの滑膜病変と手指機能障害との関連性について明らかにすることとした.対象は当センターに外来通院中のRA患者30名480指(母指は除外)とした.本研究は対象者に同意を得た上で実施した.方法はUSにおいて日本リウマチ学会が推奨する撮像に準じ,25指のMCP背側を観察した.HITACHI社製「Avius」及び科研費により設置した「Noblus」リニア型プローブ(10MHz)を使用し,滑膜肥厚(以下GS)及び血流シグナル(以下PD)を4段階でスコアリングした.機能評価において手指の疼痛(以下VAS),握力,ピンチ力,関節可動域(以下TAM)を測定した.統計学的処理にはSpearman's順位相関係数検定を用いて,GS,PDスコアにおける各項目との相関を分析した(p<0.05).その結果,GSはVASと負の弱い相関(rs =-0.37,p=0.04),握力と負の相関(rs=-0.47,p=0.01),ピンチ力と負の相関(rs=-0.49,p=0.009),TAMと負の相関(rs=-0.55,p=0.003)があった.PDは手指機能と有意な相関はなかった.考察として,GSでは消炎後も炎症細胞が蓄積され,器質的変化により機能障害を呈すると考えられた.PDでは機能障害には関連せず,関節滑膜以外の腱鞘炎など他の要因が推察された.本研究により,RA患者の滑膜病変の程度と手指機能障害には負の相関があり,関連性が明らかとなった.USは障害予防や機能改善に向けた局所的評価の一助として有用と示唆された.関節リウマチ患者の関節エコー所見における滑膜病変の程度と機能障害の関連性について明らかにすることを目的とし,外来通院中の患者30名の手指を対象に滑膜肥厚(GS)及び血流シグナル(PD)を段階別に分け,疼痛(VAS),握力,ピンチ力,関節可動域(TAM)を測定し相関分析を行った.その結果,GSは疼痛,握力,ピンチ力,関節可動域と負の相関があったが,PDは有意な相関はなかった.GSについて滑膜肥厚の程度の悪化に伴い消炎後も炎症細胞が蓄積され,器質的変化により手指の機能障害を呈すると考えられた.

本研究により関連性が明らかとなり,障害予防や機能改善に向けた局所的評価の一助として有用と示唆された.予定していた血流シグナル評価及び一部研究計画の修正が必要となり、当センターに設置された従来の超音波装置を使用することとしたため。また、昨年度の関節超音波検査に関する研修会は参加できなかったため。今年度の上半期までに対象数を増やし、加えて検査の撮像方法、評価方法、プログラム実施の標準化を目指す。課題として、患者負担を考慮し評価時間の短縮およびフォローアップを図る。作業療法今年度、上半期までに研修会への参加および上肢機能評価の介入前、介入後1ヶ月を実施し、関節超音波検査の撮像方法、評価方法の標準化を目指す。課題として、患者負担を考慮し評価時間を45分から30分に短縮できるよう、手技のスキルアップが必要である。昨年度に購入予定であった装置の納品が遅れたため。前年度に購入予定であった超音波診断装置はオプションを含めると助成金を大きく上回り、また、購入後の装置の設置場所の再検討により、購入を取りやめたため。平成28年度に研究データを集計する統計ソフトを新たに購入するため。次年度の使用計画について、当初、リハビリセンターに設置予定であった超音波診断装置の機種を変更し、評価の対象数を確保する予定である。
エ-テル型ホスファチジルエタノ-ルアミンによる生体過酸化反応の抑制

生体内で抗酸化作用発現が期待されているプラズマロ-ゼン型リン脂質の肝細胞における合成と分泌、それらに影響する食品成分ならびに過酸化反応抑制効果の検討を行った。ラットの初代培養肝細胞はコラゲナ-ゼ潅流法で調整した.肝細胞をコラ-ゲンコ-トしたプラスチックシャ-レに接着後、〔^<14>C〕エタノ-ルアミンを含むWE培地で24時間培養し、経時的に細胞と培養液を集めた。総脂質を抽出後、2次限薄層クロマトグラフィ-によってホスファチジルエタノ-ルアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)、アルケニル型のPCとPEをそれぞれ分画し、放射能活性を測定した。細胞内と培養液中のPCとPEへの〔^<14>C〕エタノ-ルアミンの取り込みはほぼ24時間直線的に進行した。一方、アルケニ-ル型リン脂質の場合は肝細胞への取り込みは分泌型と比較してごく僅かであった.PC、PEと異なり分泌型アルケニルPC、PEへの取り込みはほぼ6時間まで直線的に進行したが、以後顕著な増加は認められなかった.また、アルケニルPCの分泌はごく僅かであった.次にアルケニル型PEの分泌を促進する食品成分について検討し、醗酵乳成分が増加させることを見いだした.この醗酵乳はin vitroで鉄の存在下で低密度リポタンパク質の過酸化反応を抑制することも見いだしている.この活性成分が脂溶性であるので現在追究中である。なお、これらリン脂質の代謝については特殊なラットで検討し既に報告し.醗酵乳成分の効果は投稿準備中である。
ヒト胎児・新生児脳障害における可塑性の出現機構に関する研究

われわれの研究は、動物脳においてのみ行われてきた胎児・新生児脳での可塑性の出現をヒト脳においても出現する事実と、そのメカニズムを明らかにすることを目的としてきた。これまで片麻痺患者について検討を行ってきたが、今年度は、両側性脳性まひ(痙性およびアテトーゼ型)での運動機構を検討した。重度の障害部では下肢の運動野が上肢運動野に近い位置に移動すること、また、軽症病巣側の運動野が両側を支配する傾向にあることを推測した(Maegaki Y etal.Pediatr Res 1999;45:559-567)。なお、これらに関連する基礎的研究として、結節性硬化症(TS)の血管線維腫から分離された細胞株の外界刺激からの感受性が健常細胞に比して低く、外界刺激からの可塑性には細胞の健常性が条件であること(Toyoshima M et al.Brain Dev 1999;21:184-191)、未熟児アテトーゼ型脳性まひでの瞬目反射回復曲線の興奮性が高いこと(Maeoka Y et al.Electromyogr clin Neurophysiol 1999;39:79-85)、頭痛患者の脳波コヒーレンスや(Koeda T et al.Headache1999;39:280-286)、片側性小舞踏病での神経生理学的機序(Maegaki Y etal.Neuropediatr 2000;31:70-74)などからは左右脳半球の分離性に問題があることなどを明らかにした。胎児・新生児期に生じた脳障害児の機能回復のメカニズムについて、経頭蓋磁気刺激を用いた運動系の評価を通して検討を行った。先天性片まひでは、健側大脳半球を刺激すると、まひ側上肢からも誘発筋電図が導出され、健側脳からの可塑性のあることが明らかにされた。短拇指外転筋と上腕二頭筋では、前者は受傷早期群から認められ、後者は受傷時期の遅い群にも認められた。前者のメイカニズムは健側皮質脊髄路ニューロンからの軸索側枝が考えられ、後者のメカニズムはそれとは異なった機序が考えられた(Neuropediatrics1997;28:168-74..Eur J Paediatr Neurol 1997;2:79-84.)。先天性脳障害児の末梢血リンパ球の免疫学的な分析からは、明らかにγδT細胞系の異常を示す症例が多かった。しかし、その内容と臨床的な神経症状や周産期の内容との間には明らかな相関は認められなかった。また、先天性脳障害児の脳髄液の神経成長因子を測定したが、可塑性を考察させる結果は得られなかった(Brain,Behavior and Immunity1997;11:157-166.Neuropediatr1997;28:268-271.)。なお、未熟児脳障害の視覚障害からの構成失行の病巣について検討し、これらの可塑性の生じにくい病態を検討した(Acta Paediatrica 1997;86:1068-1073.)。胎児・新生児期に生じた脳障害の機能回復のメカニズムについて、径頭蓋磁気刺激を用いた運動系の評価を通して検討を行った。先天性の片まひでは、健側大脳半球を刺激すると、健側大脳は両側の動きを支配しており、明らかな可塑性が認められた。この現象は程度の差はあれ、脳障害を受けた年齢が幼いほどつよく認められ、可塑性は受傷時年齢の若さに比例して生じることが明らかになった。

この現象は下降路のみでなく、感覚路での求心系にも認められた。このメカニズムは、健側皮質脊髄路ニューロンからの軸策側枝などが考えられたが、受傷時の年齢や障害の内容により異なった可塑性の出現が考えられた。この可塑性に関与する免疫系細胞では、γδT細胞系での異常を示す症例が多かったが、この病態との関連についてはまだ不明である。一方、軸索の成長と髄鞘化、シナプスの形成、シナプス結合の除去などでの基礎的研究を結節性硬化症などでの培養細菌をサンプルにして行っている。ここでもまだ有意の結果は得られていない。われわれの研究は、動物脳においてのみ行われてきた胎児・新生児脳での可塑性の出現をヒト脳においても出現する事実と、そのメカニズムを明らかにすることを目的としている。これまで片麻痺患者について検討を行ったきたが、今年度は、両側性脳性まひ(痙性およびアテトーゼ型)についても検討を広げた。すなはち、脳の運動機構では、重度の障害部では下肢の運動野が上肢運動野に近い位置に移動すること、また、軽症病巣側の運動野が両側を支配する傾向にあることを報告した(Maegaki Y etal.Pediatr Res 1999;45:559-567)。また、これらに関連する基礎的研究として、結節性硬化症(TS)の血管線維腫から分離された細胞株の外界刺激からの感受性が健常細胞に比して低く、外界刺激からの可塑性には細胞の健常性が条件であること(Toyoshima M et al.Brain Dev 1999;21:184-191)、未熟児アテトーゼ型脳性まひでの瞬目反射回復曲線の興奮性(Maeoka Y et al.Electromyogr clin Neurophysiol 1999;39:79-85)が高いこと、頭痛患者の脳波コヒーレンスが左右半球間で高いこと(Koeda T et al.Headache 1999;39:280-286)、片側性小舞踏病での神経生理学的機序には左右脳の機能分離に障害のあること(Maegaki Y et al.Neuropediatr 2000;31:70-74)などの報告を行った。
動脈硬化症初期段階における血管内膜内在性樹状細胞の役割

マウス並体接合モデル大腿動脈において高脂肪食摂取によって血管内膜に接着した白血球が内皮下浸潤に至る過程をin vivoイメージングシステムを使って観察することを試みた。血管内膜での白血球集積は観察されたが、接着から浸潤の過程は確認できなかった。従って血管内膜に接着した白血球は内皮下に浸潤せず、内膜中に集積する白血球は内在する白血球の増加によるものである可能性が示唆された。また、白血球接着を抑制すると内膜に集積する白血球増加が減少することから接着する白血球が内在性白血球の増加に関与することが推察された。動脈硬化症は脂質などにより血管壁が障害され、傷害部位に白血球が遊走・接着する血管炎症反応によって発症・進行する。さらに接着した白血球は血管内皮下へ浸潤し、増悪すると考えられている。これまでの培養細胞を使った研究では主に単球が血管内皮へ遊走・接着し、接着現象を経て内皮下へ遊走することや肥満した脂肪組織、移植後の肝臓、腎臓などの細動静脈における末梢血白血球の組織浸潤について報告されているが、大血管、特に動脈において血管内皮に接着した白血球が内皮下へ浸潤する過程は生体下では捉えられておらず、接着した白血球が内皮下へ浸潤するかどうか定かではない。一方で動脈硬化症が進行して形成された動脈硬化巣では血管壁に常在するマクロファージの増加が報告されている。従って集積している白血球は接着した白血球の内皮下遊走のみではなく血管内膜に常在する白血球の増殖によるものである可能性が考えられる。血管炎症反応に伴う大血管の血管内膜への白血球浸潤について、常在する白血球増殖の関与があるのかどうかマウス大腿動脈にて検証する。高脂肪食による血管内膜での白血球集積は常在白血球の増殖によるものか、白血球接着を介した内皮下浸潤によるものなのか、検討するために顆粒球特異的にeGFPが発現するマウスであるLysozymeM-eGFPマウスと野生型マウスの並体接合を行った。並体接合によってeGFP陽性白血球を野生型マウスに循環させて野生型マウスの血管内膜にeGFP陽性白血球が存在した場合には循環白血球が内皮への接着を介して浸潤していると考えられる。一方、陽性細胞が存在しなかった場合には接着を介さず、常在白血球の増殖によることが示唆される。In vivoイメージングを使って野生型マウスの白血球内皮下浸潤を観察したが、eGFP陽性白血球はみられなかった。LysozymeM-eGFPマウスと野生型マウスの並体接合法を確立した。しかしながら、成功率が低いため更なる工夫が必要と思われる。また、並体接合後の野生型マウスの大腿動脈ではeGFP陽性白血球は観察されなかったが、さらに実験を積み重ねて再現性を確認する必要性がある。動脈硬化症は脂質などにより血管壁が傷害され、生涯部位に白血球が遊走・接着する血管炎症反応によって発症・進行する。これまでの培養細胞を使った研究では主に単球が血管内皮へ遊走・接着し、接着現象を経て内皮下へ浸潤することや肥満した脂肪組織、移植後の肝臓、腎臓などの細動静脈における末梢血白血球の組織浸潤について報告されているが、大血管、特に動脈において血管内皮に接着した白血球が内皮下へ浸潤する過程は生体下捉えられておらず、接着した白血球が内皮下へ浸潤するかどうか定かではない。顆粒球特異的にeGFPが発現する遺伝子改変マウス(LysM-eGFP)と野生型マウスの並体接合を行い、高脂肪食を与えて大腿動脈において接着したeGFP陽性白血球の内皮下浸潤をin vivoイメージングを用いて観察した。観察は野生型マウスの大腿動脈で行い、観察部位にeGFP陽性白血球がみられれば接着を介した内皮下浸潤が起こったと考えられる。観察した結果、野生型マウスの大腿動脈ではeGFP陽性白血球がみられなかったことから内皮に集積する白血球は常在する白血球増加によるものであることが考えられた。また、高脂肪食摂取により血管内膜に集積する白血球分画の同定を行うために、大腿動脈を採取してコラゲナーゼ処理を行った単一細胞についてフローサイトメトリーを行った。これらの白血球はCD11b+, CD11c+, MHCclassII+, CCR2+, F4/80-, Ly6G-, CD40+, CD80+, CD86+である可能性が高いことがわかった。

並体接合法の成功率が低いため、成功率を上げるために更なる工夫が必要と思われる。また、並体接合後の野生型マウスの大腿動脈ではeGFP陽性白血球は観察されなかったが、さらに実験を積み重ねて再現性を確認する必要性がある。接着から浸潤への移行があるかどうかについて、並体接合後の野生型マウスの大腿動脈を酵素処理により単一細胞懸濁液にしてフローサイトメトリーでeGFPの陽性率を検討すれば更なる確証が得られると考えられる。医学購入予定の消耗品に対して当該年度の残額を超えていたため、次年度交付金と合わせて次年度に購入することとした。当該年度購入予定であった消耗品の購入に充てる。
神経内分泌腫瘍におけるPHLDA3のがん抑制機構の解明

神経内分泌腫瘍(neuroendocrine tumor; NET)は神経内分泌細胞に由来する腫瘍である。神経内分泌細胞は全身の所臓器に分布することがわかっているが、各臓器に発症するNETは希少がんであり、その解析や治療方法の確立が遅れている。本研究の目的は、ヒトNETの症例解析とモデルマウスの作製・解析を通じてNETの本態を解明することである。本研究室ではこれまでに代表的ながん抑制因子p53の標的遺伝子としてPHLDA3を同定し、がん抑制的な働きをしていることを明らかにしてきた(Cell, 2009)。同時に、膵臓と肺のNETにおいてPHLDA3遺伝子部位での高頻度なヘテロ接合性の喪失(LOH)が観測されることを報告してきた(Cell 2009, PNAS 2014)。膵臓と肺のNETに共通してPHLDA3遺伝子に異常が頻発していたことから、全身で発症するNETにも共通してPHLDA3の遺伝子異常が観察できると予想し、膵臓、下垂体、大腸、甲状腺、副甲状腺などのNET検体を収集・解析を行なった。さらに、PHLDA3遺伝子ノックアウトマウスを元に作製したNETモデルマウスを解析することで組織を超えたNET共通のがん抑制メカニズムの解明を行なった。その結果、PHLDA3欠損によりNET発症と悪性化が促進される結果が得られた。また一方で、PHLDA3のファミリー遺伝子であるPHLDA1の機能解析を行なったところ、PHLDA3と同様にAktの競合阻害による増殖抑制能を示すことが明らかになり、まとめた結果をもとに論文を執筆した(Cancer Science, 2018)。PHLDAファミリー遺伝子のNET発症への貢献を明らかにしたことから、NET研究のさらなる発展に繋がると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。膵臓と肺のNETに共通してPHLDA3遺伝子に異常が頻発していたことから、全身で発症するNETにも共通してPHLDA3の遺伝子異常が観察できると予想し、様々な臓器で発症したヒトNET検体を収集・解析することを計画した。さらに、PHLDA3遺伝子ノックアウトマウスを元に作製したNETモデルマウスを解析することで組織を超えたNET共通のがん抑制メカニズムを明らかにする。本研究によってPHLDA3遺伝子の異常がNET発症と関連付けられることが明らかになれば、希少がんであるNETの発症メカニズムの解明と、その治療・診断方法の開発に繋がることが期待できる。予定しているヒトNET臨床サンプルを用いたゲノム解析と、NETモデルマウスを用いた解析は順調に進んでいる。また、論文発表も順調に行なっており、現在投稿中の論文もある。本研究では、臨床医との緊密な連携のもと集めた詳細な臨床情報の付帯したヒトNET臨床サンプルを用いたゲノム解析と、NETモデルマウスを用いた解析を行い、希少がんであるNETの本態を解明する。今後以下の研究をさらに進める。

(1)ヒトNET臨床サンプルを用いたゲノム解析膵臓・下垂体・甲状腺・副甲状腺・大腸のNETサンプルをすでに収集済みである。本研究では、これらのサンプルのゲノム解析を行う。さらにはゲノム異常と患者予後・治療薬奏功の関連の解析を行う。(2)動物モデルを用いた解析これまでに構築したPHLDA3遺伝子を欠損した膵NET・下垂体NETのモデルマウスの解析を行う。特にPHLDA3遺伝子異常とNETの悪性度との関連を重点的に解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
長崎原爆に応答した英米文学者に関する基礎的研究

平成30(2018)年度は、2018年9月と2019年3月に長崎市を訪問し、長崎大学(中央図書館、経済学部分館)において、長崎経済専門学校時代から新制長崎大学経済学部で活躍した英文学者の伊東勇太郎(1889年1980年)の足跡について調査をおこなった。伊東はシェイクスピア研究者であるが、大学での授業では19世紀の小説や詩(ディケンズやワーズワースなど)について講義をしたこと、漢籍についての該博な知識を披露していたことなどが、同窓会誌『瓊林』(けいりん)に掲載された卒業生たちの文章から確認できた。重要なのは、伊東が長崎原爆について少なくとも2回応答していたことへの言及が、調べた限りでの卒業生の文章にはなかったことである。伊東は1945年12月、『長崎新聞』の編集部に請われてアーネスト・ロブソンというアメリカ人軍属の詩を英訳して新聞に掲載した。また、1955年、旧・長崎医科大学正門跡の門柱碑文の英訳を手がけている。ところがこれらについて、同僚の教員の言及はあるが、卒業生たちの言及がないのである。卒業生たちが作り上げた、西洋東洋の文学に詳しい温厚な知識人という伊東のイメージを相対化し、アメリカ軍による原子爆弾の投下という日米双方にとってトラウマに直面した知識人としての営為をさらに明らかにすることで、現代における英米文学研究の意義を再考する必要があることをあらためて確認できた。なお、同窓会誌『瓊林』などを調査することで、伊東の若い同僚であったフランス文学者、引田稔(1915年1987年)が、1973年のフランスによる南太平洋ムルロア環礁での核実験に明確な反対の立場をとり、主要新聞『ル・モンド』などの関連記事を分析していたことを知ることとなった。これは研究当初想定していなかった発見であったが、その意義について研究論文を執筆した。2018年9月と2019年3月の長崎市における資料調査の結果、英文学者の伊東勇太郎についての文章を、同窓会誌『瓊林』掲載分については、ほぼ全て確認することができた。長崎のローカルメディア、例えば『長崎新聞』などに伊東が寄稿していることもわかった。さらに、1949年に広島市を訪問、原爆被災者への追悼と復興を願って詩を書いたイギリスの詩人Edmund Blundenが長崎市を訪問した際に伊東も応対していたことがわかった。2回の調査の副次的な成果として、フランス核実験に反対したフランス文学者の引田稔の文章を発見し、その意義を論文として発表することができた。ただし、当初目論んでいた長崎大学のアメリカ文学者、藤井昌子(長崎原爆については、長崎女子師範学校があった大村市で間接的にその被害を見聞している)については、1955年に開催されたアメリカ人のノーベル賞作家ウィリアム・フォークナーのセミナー(通称「長野セミナー」)に参加したことが明らかになったことがわかったが、それ以上に新たな資料を発見することができなかった。伊東が寄稿した『長崎新聞』などの地元メディアについての調査は、こうしたローカルメディアの電子媒体が整備されていないため、伊東の長崎原爆との関わりをさらに詳しく調査するためには、調査対象とする時期とキーワードを厳選することが必要である。また、英国の詩人エドマンド・ブランデン(広島市を訪問した際に広島原爆犠牲者の追悼と復興を願う詩を書いている)が長崎訪問時に講演をおこなった際、伊東が応答していることについてもさらに調査する必要がある。伊東については、平成31年度の調査研究成果の報告として、令和元年度(2019年度)中に論文を執筆する予定である。なお、藤井については、長崎大学や長崎市内の図書館での調査では今後の研究の方向性を見いだすことができなかった。藤井についての研究を推進するのはひとまず保留して、伊東について集中的に研究することも検討する必要がある。

なお、同窓会誌『瓊林』などを調査することで、伊東の若い同僚であったフランス文学者、引田稔(1915年1987年)が、1973年のフランスによる南太平洋ムルロア環礁での核実験に明確な反対の立場をとり、主要新聞『ル・モンド』などの関連記事を分析していたことを知ることとなった。これは研究当初想定していなかった発見であったが、その意義について研究論文を執筆した。2018年9月と2019年3月の長崎市における資料調査の結果、英文学者の伊東勇太郎についての文章を、同窓会誌『瓊林』掲載分については、ほぼ全て確認することができた。長崎のローカルメディア、例えば『長崎新聞』などに伊東が寄稿していることもわかった。さらに、1949年に広島市を訪問、原爆被災者への追悼と復興を願って詩を書いたイギリスの詩人Edmund Blundenが長崎市を訪問した際に伊東も応対していたことがわかった。2回の調査の副次的な成果として、フランス核実験に反対したフランス文学者の引田稔の文章を発見し、その意義を論文として発表することができた。ただし、当初目論んでいた長崎大学のアメリカ文学者、藤井昌子(長崎原爆については、長崎女子師範学校があった大村市で間接的にその被害を見聞している)については、1955年に開催されたアメリカ人のノーベル賞作家ウィリアム・フォークナーのセミナー(通称「長野セミナー」)に参加したことが明らかになったことがわかったが、それ以上に新たな資料を発見することができなかった。伊東が寄稿した『長崎新聞』などの地元メディアについての調査は、こうしたローカルメディアの電子媒体が整備されていないため、伊東の長崎原爆との関わりをさらに詳しく調査するためには、調査対象とする時期とキーワードを厳選することが必要である。また、英国の詩人エドマンド・ブランデン(広島市を訪問した際に広島原爆犠牲者の追悼と復興を願う詩を書いている)が長崎訪問時に講演をおこなった際、伊東が応答していることについてもさらに調査する必要がある。伊東については、平成31年度の調査研究成果の報告として、令和元年度(2019年度)中に論文を執筆する予定である。なお、藤井については、長崎大学や長崎市内の図書館での調査では今後の研究の方向性を見いだすことができなかった。藤井についての研究を推進するのはひとまず保留して、伊東について集中的に研究することも検討する必要がある。
画像による光学解析に基づく材質特性の物理的再現

本研究の目的は,光学解析手法によって計測された材質特性をデジタルファブリケーション技術で物理的に再現することである.材質が持つ光の反射・散乱・吸収・透過特性を材質特性として,外観の計測と再現を行う.当該年度は,材質特性のモデル化および計測に加えて,材質特性と材料合成の関係性の明確化にも取り組んだ.材質特性の一つである半透明度を対象として,計測と再現を行った.半透明な物体に一点の光を入射すると光が空間的に広がるが,これは点像分布関数によって表現される.本研究では,半透明な層で構成される層状物体全体の半透明度を各層の点像分布関数を用いてモデル化した.ただし,空間領域ではなく,周波数領域において定式化することにより,材質計測および材質合成を効率化した.材質特性再現のためには,使用する材質の種類と現れる材質特性との関係を明らかにする必要がある.そこで,当該モデルを用い,異なる材質が層状になったときの半透明度を合成した.点像分布関数の合成の定式化では畳み込み積分が含まれるが,周波数領域に変換することにより,単純な積として演算できる.最終的に,所望の半透明度に対し,どのような材質で層を構成すればよいかを決定することで,半透明度を再現した.熱溶解積層(FDM)方式3Dプリンタで作製された物体は,フィラメントの積層によって独特な反射特性を示す.ゆえに,積層パターンの変化によって反射特性を操作できる可能性がある.当該年度は,FDM方式3Dプリンタの積層厚さを適宜変更する技術を開発した.当該技術の応用として,3D印刷された物体に対して電子透かしを適用する手法を提案した.当該年度は,材質特性のモデル化および計測に加えて,材質特性と材料合成の関係性の明確化を目標とした.材質特性として,光の反射・散乱・吸収・透過特性を想定しているが,そのうち散乱・吸収特性に関わる物体の半透明度に関して,モデルを構築し,計測と再現を行った.再現するにあたり,半透明度と材料合成の関係性を明確化した.以上のことから,おおむね順調に進展していると言える.半透明度を対象とした試みは前年度から続けているが,3DプリンタとUVプリンタとを組み合わせた新しいデジタルファブリケーションの応用についての検討も進んでおり,一定の進捗があった.また,反射特性の計測として,拡散反射光と鏡面反射光を分離して計測する方法を考えており,プロジェクタ・カメラシステムの活用や偏光カメラの利用を検討した.反射特性の再現に向け,熱溶解積層(FDM)方式の3Dプリンタにおいて,場所ごとにフィラメントの積層厚さを可変できるツールを開発した.当該ツールを用いた新しい試みとして,3Dプリンタにおける電子透かし技術について,検討を行った.反射特性の計測および再現については,次年度以降も研究開発を進めていく.次年度は,計画通り,他の材質特性の計測および材質特性と材料合成の関係性の明確化について取り組む.特に,反射特性の計測と再現に注力する予定である.反射特性の計測には,プロジェクタ・カメラシステムによる空間的な光学特性計測のほか,偏光カメラの利用や,ToF(Time-of-Flight)カメラを用いた時間的な光学特性の計測も活用する.例えば,光沢に影響する鏡面反射は,表面下散乱と比較し,時間的に速い現象である.反射特性の再現には,3Dプリンタによる表面造形,UVプリンタによる透明インク層付加,CNCルータによる表面掘削などを活用することを考えており,最終的には複合的なデジタルファブリケーション技術の創出を計画している.材質特性の再現には,材料および加工の組合せとそのときに現れる材質特性との関係性が重要であるが,現在までは物理に基づくモデルによる表現に着手してきた.次年度は,機械学習に基づく新しいアプローチによって当該関係性を明確にする検討を行う.本研究の目的は,光学解析手法によって計測された材質特性をデジタルファブリケーション技術を用いて物理的に再現することである.材質が持つ光の反射・散乱・吸収・透過特性を材質特性として,外観の計測と再現を行う.初年度は,材質特性のモデル化および計測に取り組んだ.モデル化では,物体の層構造に着目した.人の肌や植物の葉などの自然物は層構造であることが多い.また,3DプリンタやUVプリンタなどのデジタルファブリケーション機器は層構造による加工を行う.したがって,層構造によるモデル化は計測と出力の両方にとって妥当である.材質特性の計測は各要因を個別に表現せず,空間的な関数によって一括して表現する.ある一層に着目し,その層に一点の光が入射することを考えると,層の表面・裏面のそれぞれにおいて光が空間的に広がる.それらを表面・裏面の点像分布関数として表現し,クベルカの層理論によって多層構造をモデル化した.また,プロジェクタ・カメラシステムを構築し,パターン照明投影法によって層構造物体の点像分布関数を計測した.さらに,出力システムについての検討を開始した.UVプリンタはUV硬化インクを用いることによって様々な材質および立体物にインクジェット印刷できる機器である.半透明材質上にUV印刷すると,材質の半透明感が変化する.半透明材料の種類とUV印刷のパラメータの組合せに対する半透明感の関係を明らかにするため,少数のサンプル計測と多層構造モデルを用いてルックアップテーブルを構築した.また,ルックアップテーブルを逆引きすることで所望の半透明感をUV印刷によって再現できることを確認した.計画通り,初年度は主に,材質特性のモデル化および計測について取り組んだ.対象材質の反射・散乱・吸収・透過特性を同時に計測するため,点像分布関数という形で一括して計測するアプローチをとった.

デジタルファブリケーション機器によって加工・造形することが目的であるため,個別の特性を計測する必要はなく,全体としての光学特性が再現できれば良い.表面粗さを考慮できていない点と計測系の移動についてまだ課題はあるが,一括した光学特性の計測は実現できた.また,次年度以降の目標である出力についても検討することができ,順調な進捗であると考えている.一方で,当初計画していた3Dプリンタ用材料の混合が実際には容易ではないことが判明した.低価格帯のほとんどを占める熱熔解積層方式の場合,フィラメント材質の混合比率を空間的に変えることが難しく,一様な材質特性の再現しかできない.インクジェット方式の場合,混合比率を空間的に変えられる機種もあるが,価格は数千万円で容易に購入できない.そこで,インクジェット方式機種を持つ業者に外注する形で研究を進めている.ただし,新たにUVプリンタによる質感制御の可能性を見いだし,実装および評価ができたため,プロジェクトの目的に対する進捗はおおむね順調である.本研究の目的は,光学解析手法によって計測された材質特性をデジタルファブリケーション技術で物理的に再現することである.材質が持つ光の反射・散乱・吸収・透過特性を材質特性として,外観の計測と再現を行う.当該年度は,材質特性のモデル化および計測に加えて,材質特性と材料合成の関係性の明確化にも取り組んだ.材質特性の一つである半透明度を対象として,計測と再現を行った.半透明な物体に一点の光を入射すると光が空間的に広がるが,これは点像分布関数によって表現される.本研究では,半透明な層で構成される層状物体全体の半透明度を各層の点像分布関数を用いてモデル化した.ただし,空間領域ではなく,周波数領域において定式化することにより,材質計測および材質合成を効率化した.材質特性再現のためには,使用する材質の種類と現れる材質特性との関係を明らかにする必要がある.そこで,当該モデルを用い,異なる材質が層状になったときの半透明度を合成した.点像分布関数の合成の定式化では畳み込み積分が含まれるが,周波数領域に変換することにより,単純な積として演算できる.最終的に,所望の半透明度に対し,どのような材質で層を構成すればよいかを決定することで,半透明度を再現した.熱溶解積層(FDM)方式3Dプリンタで作製された物体は,フィラメントの積層によって独特な反射特性を示す.ゆえに,積層パターンの変化によって反射特性を操作できる可能性がある.当該年度は,FDM方式3Dプリンタの積層厚さを適宜変更する技術を開発した.当該技術の応用として,3D印刷された物体に対して電子透かしを適用する手法を提案した.当該年度は,材質特性のモデル化および計測に加えて,材質特性と材料合成の関係性の明確化を目標とした.材質特性として,光の反射・散乱・吸収・透過特性を想定しているが,そのうち散乱・吸収特性に関わる物体の半透明度に関して,モデルを構築し,計測と再現を行った.再現するにあたり,半透明度と材料合成の関係性を明確化した.以上のことから,おおむね順調に進展していると言える.半透明度を対象とした試みは前年度から続けているが,3DプリンタとUVプリンタとを組み合わせた新しいデジタルファブリケーションの応用についての検討も進んでおり,一定の進捗があった.
培養骨芽細胞を用いた新しい顎骨再建法に関する基礎的研究

骨芽細胞はわずかな皮質骨、海綿骨細片や骨髄組織からの分離、培養が可能であり、生体より分離した骨芽細胞をin vitroで増殖、分化させた後、これを適切な担体とともに移植し、生体内で骨組織を形成させることができれば、きわめて有用な骨欠損部再建方法の確立に結びつくものと考えられる。本研究は培養骨芽細胞の骨再建材としての可能性を探ることを目的として行われた。前年度の研究結果を踏まえ、in vitroでデキサメサゾンの存在下に培養、増殖させたヒト骨芽細胞をI型アテロコラーゲンの三次元構築体を担体として、SCIDマウスの筋肉内に移植し、経時的に移植体を回収し、組織学的に検討した。その結果、デキサメサゾンで処理したヒト骨芽細胞を移植した場合にのみ良好な骨形成が認められた。さらに、生体内において骨組織を形成した細胞が実際にマウス由来のものではなく、移植されたヒトの骨芽細胞であることを確認するために、ヒトゲノム中に特徴的に存在するalu配列に着目し、これを特異的に認識するプローブを作製し、in situ hybridization法により、骨芽細胞の由来を確認した。この結果、移植体中に新しく形成された骨組織は移植したヒト骨芽細胞により形成されたものであることが明らかとなった。以上の結果より、in vitroで培養、増殖させたヒト骨芽細胞を骨欠損部再建に応用できる可能性が示された。さらにデキサメサゾン処理がヒト骨芽細胞の機能促進や維持に有効であること、またI型アテロコラーゲンの三次元構築体が骨芽細胞の担体としてきわめて有用であることが確かめられた。骨芽細胞はわずかな海綿骨細片や骨髄組織からの単離、培養が可能であり、生体内より分離した骨芽細胞をin vitroで増殖、分化させた後、これを適切な担体とともに移植し、生体内で骨を形成させることができれば、極めて有用な新たな骨再建方法の確立に結びつくと考えられる。本研究は骨芽細胞による生体内での骨形成機構を解明し、培養骨芽細胞の骨再建材としての可能性を探ることを目的とする。本年度は、1.骨芽細胞による顎骨再建の際に不可欠となる担体を開発する目的で、種々の担体内における骨芽細胞の増殖、分化能を検索した。タイプI型コラーゲン、アパタイト、トリカルシウムホスフェイトを担体として骨芽細胞を三次元培養し、細胞数の変化を検索することにより増殖能に対する影響を検討した。さらに骨芽細胞表現形質(アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、タイプI型コラーゲン、BSP)のmRNAの発現をノーザンブロット法およびRT-PCR法により検索することにより細胞分化への影響を検討した。その結果、各材料ともに細胞数、表現形質の発現に対しては有意な影響は与えなかったことから、担体として有用な材料であることが明らかとなった。2.三次元培養下における骨芽細胞の分化促進因子についても検討を行った。三次元培養した骨芽細胞の培地中にステロイドの一種であるデキサメサゾン、血小板由来成長因子(PDGF)を加え、前述の骨芽細胞表現形質のmRNAの発現をRT-PCR法により検索し、さらに石灰化への影響を調べた結果、デキサメサゾン、PDGFはともに骨芽細胞表現形質のmRNAの発現および石灰化を促進したことから、これらは有効な分化促進因子であることが確認された。
ミトコンドリア機能制御の基盤となるミトコンドリアー核ネットワークの包括的解明

心不全の進行抑制や心筋の再生医療においてミトコンドリアの分解、合成、成熟化の制御がとても重要で、ミトコンドリアの機能制御は次世代心不全治療の有望な候補となっている。本研究ではCRISPRスクリーニング、RNAシークエンス、ATACシークエンス、一細胞解析といった最先端の解析方法を用いて、統合解析を行うことによりミトコンドリア制御機構の包括的分子メカニズムの解明に取り組む。
ウシ初乳中の細胞生長因子の精製・構造および機能の解明に関する研究

近年、ヒト、ウシおよびラットの母乳中に表皮生長因子、内皮細胞生長因子、線維穿細胞生長因子、インスリン様生長因子および血小板由来生長因子などが存在し、哺乳動物の正常細胞あるいは形質変換細胞の生長を促進することが報告されている。しかし、これらの構造と分子レベルの機能は不明な点が多い。本研究では量的に入手容易なウシ母乳の細胞生長因子の性状を明らかにするため、ラット由来横紋筋細胞(Lb)およびマウス由来線維穿細胞(BALB/c 3T3)を使用し、ウシ初乳中の細胞生長因子の分離精製およびその同定を行った。1.ウシ初乳中にはLbおよびBALB/c 3T3を増殖する因子が存在した。しかし、これらの活性は出産後の初乳の時間経過と共に著しく減退し、出産後初乳15時間および24時間のものは、6時間初乳の増殖活性のそれぞれ70%および90%減少活性を示した。2.ウシ出産6時間初乳の酸処理遠心上清のSephadex utー100ゲル濾過添出区分について、L6およびBALB/c 3T3増殖活性をしらべたところ、L6増殖活性は分子量70008000の画分に、またBALB/c 3T3増殖活性は分子量1400016000画分に存在した。3.Sephadex utー100のL6増殖活性を有する分子量70008000画分やよびBALB/c 3T3増殖活性を有する分子量1400016000画分の穿電点電気泳動分析の結果、前者はPH9.0に、後者はPH4.5にそれぞれ穿電点を有することが判明した。以上により、ウシ初乳中には少くとも2種類の細胞生長因子が存在することが明らかになった。今後、これらの因子の単一分離、その第一構造を追求する予定である。