hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺疾患時における肺血管内皮細胞および体内活性物質代謝の変化に関する研究

肺疾患の際に肺血管内皮細胞がもつオータコイド代謝の機能がどのように変化して、いかなる二次的病態を引き起こすかを主にモノクロタリンで実験的に肺動脈炎を起こしたラットで検討した。ラットにモノクロタリンを一回皮下注射すると、35週後に肺動脈内皮を中心に傷害が認められた。外因性オータコイドに対する血圧反応から、アンギオテンシンの変換やブラジキニンの分解は肺傷害で影響を受けにくいのに対して、プロスタグランジン(PG)の代謝は抑制されることが示された。モノクロタリンを投与したラットから摘出した肺動脈標本の薬物反応性を検討すると、アンギオテンシンの変換は血管内皮の傷害で影響を受けず、これはアンギオテンシン変換酵素が内皮以外にも存在するためであると考えられた。一方、血管内皮からの内皮由来血管弛緩因子(EDRF)の遊離はモノクロタリン投与や機械的内皮除去で抑制されたので、肺疾患の際にはEDRF産生低下により肺高血圧などを招き、肺疾患自体が悪化する可能性が示唆された。また、【PGF_(2α)】による収縮は内皮傷害で増強され、これは内皮細胞でのPG分解抑制によることが示された。従って、肺疾患時には肺でのPG分解が低下して、PGが動脈系に流出して、血行動態や水・電解質代謝が変化する可能性が示唆された。以上、ラットより得られた血管内皮に関連する機能はウシやイヌの肺動脈でも同じように認められたので、ラットの病態モデルでの結果はこれら動物にも外挿できると考えられ、今後人医および獣医臨床においてこれら知見に基づいて新しい治療方法が考慮されるべきであると考えられる。
詳細な未来のイメージ構築におけるメカニズムの解明

人間は,自分の身に将来起こると思われる出来事について自己を投影し,その出来事を今まさに体験しているかのようにイメージすることができる。このような能力は,エピソード的未来思考(episodic future thinking;以下,未来思考)と呼ばれている。これまでの未来思考研究からは,未来の出来事についてのイメージを構築する際,過去のエピソード記憶に蓄えられた詳細情報を検索し,検索した情報を柔軟に統合するというシステムの存在が示されてきた。しかしながら,その検索が如何にして行われているのか,意味記憶といったエピソード記憶以外の記憶情報がどのように未来思考に貢献しているのかは明らかではなかった。そこで,本年度はそれら2点に関する研究を重点的に行なった。まず,検索に関わる現象として予定の自発的想起である展望記憶に着目し,未来思考中にも自発的に必要な情報の活性化が生じている可能性について検討した。現在,予定に関する情報の自発的な活性化を示す結果が部分的に得られているが,安定した結果ではないため,課題や刺激を修正し,次の実験準備を進めている。また,前年度から引き続き,意味記憶の役割を明らかにするために,計算機モデルを用いた研究を実施した。本年度は,モデルのトレーニングに用いたトレーニングセットの内容とパラメータの見直しによって,行動データの再現の再現精度を向上させた。このデータについては,国際誌で発表するために論文を執筆中である。さらに,より現実的な場面を想定した研究として,未来思考が記憶テスト成績に与える影響について検討する実験を実施した。その結果,学習場面を事前にイメージすることで,テスト時に虚記憶が生じることがわかった。これは,イメージをすることのデメリットを示す結果であり,未来思考研究の現実場面への応用を考える上で重要な示唆を与えるものと言える。26年度が最終年度であるため、記入しない。このような能力は,エピソード的未来思考(以下,未来思考)と呼ばれる。未来の出来事についてのイメージを構築する際には,過去のエピソード記憶に蓄えられた詳細情報を検索し,検索した情報を柔軟に統合するというシステムが想定されている。近年,未来思考において中央実行系が情報を統合する際に重要な役割を担っている可能性が指摘されている。しかし,未来思考におけるその役割は未確認であった。そこで,二重課題により中央実行系の働きを阻害し,詳細情報の統合を妨害することで,構築される未来のイメージの詳細さの低下がみられるのかを検討した。私の本年度の計画は,未来のイメージの詳細さが低下する原因を探ることであった。この研究は,用いた課題は計画と異なるものの,同じ目的に沿ったものである。実験は具体的には以下のように実施された。未来思考時に負荷を与える第二課題として,中央実行系のみに負荷をかけることができるキー押し課題が用いられた。実験の結果,未来の出来事をイメージすることで,その詳細さに関わらず近い過去概念が活性化しており,どちらの群の参加者も過去の詳細情報にアクセス出来ていたことを反映していた。また,未来方向の単語については,負荷の小さかった場合は近い距離を表す単語への反応が速く,近い距離概念が活性化していたが,負荷の大きかった場合は未来方向の遠近で差がなく,特定の距離概の念活性化は見られなかった。これは,中央実行系への負荷の増加により,検索は出来ていても,詳細なイメージ構築が出来なくなっていたことを示していた。これらの結果から,詳細な未来のイメージを構築するためには,情報を統合する際の中央実行系の働きが重要であることが明らかになった。これは,これまで想定されていながら,実証はされていなかった未来思考における中央実行系の役割と統合プロセスの重要性を確認したものであり,理論的意義がある。これまでの未来思考研究から,意味記憶の重要性が示唆されていたものの,それが如何にして未来思考に貢献しているのかは,記述的にしか示されていなかった。本年度は,その問題に対して,計算論モデルを用いた研究を実施した。そして,意味認知症の未来思考をモデルによって再現することに成功した。その結果として,未来思考能力の背景には系列的なイベント予測能力が存在することを新たに発見し,意味記憶がイメージされるイベントの文脈維持に寄与しているということを確認した。また,未来思考は将来に備えることを可能にする能力であり,人間が日常生活を営む上で欠かせない能力である。そこで,実験室ではなく,より実際的な場面における未来思考と将来の目標との関連についても研究を実施した。具体的には,ある授業の受講者を参加者として,実際に学期末に実施されるテストを目標として,目標と未来のイメージの詳細さについて調査を行った。その結果,テストまでの時間的距離が「主観的に」近いと感じている場合にのみ,重要性とイメージの詳細さに正の相関関係があることが明らかになった。また,重要性が低い場合には,詳細さがより低下するような変化が確認され,重要でないものについては曖昧にしか考えられないことが明らかになった。このことは実際の距離を操作したとしてもそれを参加者がどう捉えるかによって十分な操作の効果が得られない可能性があることを意味している。

したがって,この調査によって示された時間的距離感とイベントの重要性の交互作用的な関係は,刺激選定や操作方法を決めるといった未来思考研究の課題設定を行う上でも,非常に重要な知見を提供するものである。人間は,自分の身に将来起こると思われる出来事について自己を投影し,その出来事を今まさに体験しているかのようにイメージすることができる。このような能力は,エピソード的未来思考(episodic future thinking;以下,未来思考)と呼ばれている。これまでの未来思考研究からは,未来の出来事についてのイメージを構築する際,過去のエピソード記憶に蓄えられた詳細情報を検索し,検索した情報を柔軟に統合するというシステムの存在が示されてきた。しかしながら,その検索が如何にして行われているのか,意味記憶といったエピソード記憶以外の記憶情報がどのように未来思考に貢献しているのかは明らかではなかった。そこで,本年度はそれら2点に関する研究を重点的に行なった。まず,検索に関わる現象として予定の自発的想起である展望記憶に着目し,未来思考中にも自発的に必要な情報の活性化が生じている可能性について検討した。現在,予定に関する情報の自発的な活性化を示す結果が部分的に得られているが,安定した結果ではないため,課題や刺激を修正し,次の実験準備を進めている。また,前年度から引き続き,意味記憶の役割を明らかにするために,計算機モデルを用いた研究を実施した。本年度は,モデルのトレーニングに用いたトレーニングセットの内容とパラメータの見直しによって,行動データの再現の再現精度を向上させた。このデータについては,国際誌で発表するために論文を執筆中である。さらに,より現実的な場面を想定した研究として,未来思考が記憶テスト成績に与える影響について検討する実験を実施した。その結果,学習場面を事前にイメージすることで,テスト時に虚記憶が生じることがわかった。これは,イメージをすることのデメリットを示す結果であり,未来思考研究の現実場面への応用を考える上で重要な示唆を与えるものと言える。26年度が最終年度であるため、記入しない。計画時点では,イメージとして統合すべき情報間の意味的な関連性を操作することで統合の困難な状況でイメージの詳細さが低下することを示し,統合というプロセスの重要性を間接的に検証しようとしていた。本年度実施した実験は,情報を統合する能力自体を低下させる操作を行うことで,直接的にその重要性を検証できた。したがって,計画時点よりも適切な方法で目的を達成したと言える。未来の出来事のイメージ構築のメカニズムの背景に系列予測能力が存在することと,意味記憶が如何にして未来のイメージ構築に寄与しているのかを明らかにした。さらに,主観的な時間的距離感とイメージの対象となる事象に対する重要性の認識が,イメージの詳細さという現象的側面に影響を及ぼすことを明らかにした。
フォノン-フォノン相互作用に関する研究

本研究では、フェムト秒のパルスX線源をもちいて、結晶中のフォノンを時間分解X線回折法を用いて測定することによって、ラマン散乱や中性子散乱などの非弾性散乱法と異なり、格子のダイナミクスの、より直接的な構造的解釈が可能になった。パルスX線源を新たに改良し、3次元的なフォノンの緩和状態を計測するための手法を考案し、フォノン計測としてのx線回折法の予備実験にも成功した。本年度は、フォノン計測に最適化した極短パルスX線源に特化したシステムの開発を行った。線源の安定性を確保するためのテープターゲットの改良と、その調節機構を含めたチャンバーの設計製作を行った。ターゲットから飛散するデブリの影響を少なくするために、90度の放物面鏡に変更した。チャンバー外部から手動で集光系を操作できるようにし、X線回折象を測定しながら簡便に調整ができるようになった。X線源となる銅テープ部分の送り機構に関しても、ギヤ比によるトルクの増加を行い、従来から問題になっていた長時間計測における送り速度の変化に伴うX線の不安定化を改善した。レーザーシステムは、阪大の10TWフェムト秒レーザーを用いることで、さらに能力の増加を図ることができたが、現在、励起結晶の結露に伴うシステムの修理、調整に予想外の時間がかかっている。調整が終了次第、X線による光学フォノン測定を再開する予定である。今年度で、パルスX線源側の開発は終了したので、来年度はパルスX線と同期した励起光側の改良を予定している。この改良は、本実験計画の根幹をなすフォノン計測を実施しながら行うものであり、パルス列励起に伴うフォノンの増加をX線回折像により測定しながら、最終的にはフォノン-フォノン相互作用における、コヒーレンスの効果を計測する予定である。X線回折像によりフォノンを計測することは、結晶構造と直接結びついた情報が得られ、かつ、理論的に複雑な過程を含まないため、計測信号の解釈がきわめて容易である。したがって、この測定法で測定された信号を示すこと自体にも大きな意義があり、複雑な光励起過程のフォノンのダイナミクス、特にコヒーレンスに関するダイナミクスを直接観測できるものと考えている。本研究目的では、極短パルスレーザーを用いて、物質内部にコヒーレントなフォノンを誘起する。このことによって、物質の熱力学的、光学的、電気的性質をコントロールすることが、究極の目的である。しかし、フォノンのコヒーレンスを測定するうえで、物質の構造やその中でのフォノンのコヒーレンスがどのように振舞うかについての知見はあまり解明されていない。理論的に、結晶構造と、フォノンのダイナミクスは時間分解X線回折法によって測定される。従来、フォノンの測定はラマン散乱法、中性子散乱法などが知られているが、コヒーレントフォノン測定には、結晶構造、やブリルアンゾーン全体を見渡せる測定法が必要で、この意味から、ラマン散乱法は適さない。しかし、現状では中性子散乱法には十分な時間分解能はない。唯一可能な方法が時間分解X線回折法である。この装置開発を行いながら、測定法の最適化によって、コヒーレントフォノンの測定に必要な周波数測定に成功した。コヒーレントフォノンを用いた、非熱力学的構造相転移には至らなかったものの、ダイナミクス測定に不可欠な構造情報を得るため、広角散乱時間分解X線回折法の提案を行うと共に、その予備実験に成功し、空間的なコヒーレントフォノンの描像をとらえることができる可能性を示した。広角散乱時間分解X線回折法は、従来の測定法が、特定の逆格子ベクトル方向に限られていたのに対して、異なるベクトル方向をフェムト秒でとらえることができる、つまり、3次元的にフォノンの振る舞いを測定できる可能性を秘めた手法で、コヒーレントフォノンの異方性を調べることができる。この測定法は、これまでとはまったく違った概念を与えてくれるものであり、今後の展開が期待できる。
肝臓全細胞置換によるヒト化動物モデルの開発

ラットおよびマウス肝臓を界面活性剤を含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓の微細形態を保持した[肝臓基質]を作製した。この肝臓基質にiPS細胞由来ヒト肝細胞と肝星細胞株細胞を還流によって移植し、生着させ肝臓基質の再細胞化を行った。その結果、dish上の共培養と比較し有意差を持って「肝臓基質」での培養がALB、CYP3の発現に好影響をもたらすには現時点では至っていない。今後、実質細胞、非実質細胞のバランスの検討あるいはスフェロイド作製後の「肝臓基質」での培養を検討していく予定である。本研究において、ラット肝臓、マウス肝臓を界面活性剤(0.5%SDS)を含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓の微細形態を保持した[肝臓基質]を作製し、この肝臓基質に、iPS細胞由来ヒト肝細胞を還流によって移植し、生着させ肝臓基質を再細胞化することを目標に本年度は、以下の2点について検討を行った。1)[肝細胞基質]作製:ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系(体外循環系)で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5%SDSを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製することができた。2)iPS細胞から肝細胞への分化誘導の効率化:ヒトiPS細胞を、ActivinAを100ng/mlとなるよう添加したRPMI Medium 1690+B27supplement中で、37°C、5%CO2条件下で5日間培養した。次に、20ng/ml BMP4と10ng/ml FGF2を添加したRPMI medium 1690+B27 supplementで37°C、5%CO2、4%O2条件下で5日間培養し、増殖因子を20ng/ml HGFに変更し、引き続き低酸素条件下で5日間培養した。その後、20ng/ml OSMとHCM SingleQuotsを添加したHepatocyte Basal Mediumで37°C、5%CO2条件下で5日間培養することにより、肝細胞へと分化誘導させた。さらに、ウイルスベクターによる遺伝子導入やフィーダー細胞として肝星細胞を利用する等の工夫を加え、効率化を検討した。ウエスタンブロットや免疫組織化学によって、AFPやALBの発現を調べた結果、約50%程度の細胞が肝細胞へと分化誘導させることが可能となっている。本研究において、ラット肝臓、マウス肝臓を界面活性剤(0.5%SDS)を含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓の微細形態を保持した「肝臓基質」を作製し、この肝臓基質にiPS細胞由来ヒト肝細胞を還流によって移植し、生着させ肝臓基質を再細胞化を目標に、以下の2点について検討した。1)「肝細胞基質」作製;ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系(体外循環系)で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5%SDSを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製し、再細胞化には、HepG2とLX2をもちいた。ALBとCYP3の発現から、上皮系細胞単独より間葉系細胞との共培養で良い結果が得られた。本研究において、ラット肝臓、マウス肝臓を界面活性剤(0.5%SDS)を含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓の微細形態を保持した[肝臓基質]を作製し、この肝臓基質にiPS細胞由来ヒト肝細胞還流によって移植し、生着させ肝臓基質の再細胞化を目標に、実験を行った。1)「肝臓基質」作製;ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系(体外循環系)で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5%SDSを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。2)iPS細胞から肝細胞への分化誘導の効率化;ヒトiPS細胞を、ActivinA 100ng/ml添加したRPMI Medium1690+B27supplement中で、37°C、5%CO2、4%O2条件下で5日間培養し、増殖因子を20ng/ml HGFに変更し、引き続き低酸素条件下で5日間培養した。その後、20ng/ml OSMとHCM Single Quotsを添加したHepatocyte Basal Mediumで37°C、5%CO2条件下で5日間培養することにより、肝細胞へと分化誘導させた。さらに、ウイルスベクターによる遺伝子導入、フィーダー細胞としての肝星細胞の利用やGHをもちいることでALBの発現増加がみられた。3)「肝臓基質」再細胞化;「肝臓基質」でのiPS細胞由来肝細胞と星細胞の混合培養を行ったが、ALBとCYP3の発現からは、有意差をもって、肝星細胞の共培養が有効であるという結果には至らなかった。

この肝臓基質にiPS細胞由来ヒト肝細胞と肝星細胞株細胞を還流によって移植し、生着させ肝臓基質の再細胞化を行った。その結果、dish上の共培養と比較し有意差を持って「肝臓基質」での培養がALB、CYP3の発現に好影響をもたらすには現時点では至っていない。今後、実質細胞、非実質細胞のバランスの検討あるいはスフェロイド作製後の「肝臓基質」での培養を検討していく予定である。研究実績の概要で記載したとおり、ラット肝臓、マウス肝臓を用い、ex-vivo閉鎖系(体外循環系)で培養可能となるように動物の門脈と胸部下大静脈にカニュレーションを行い、0.5%SDSを含む溶液で穏やかに還流し、細胞成分を完全に除去し、肝臓裏面の腹部下大静脈を閉鎖した。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製し、再細胞化には、HepG2とLX2をもちいた。ALBとCYP3の発現から、上皮系細胞単独より間葉系細胞との共培養で良い結果が得られた。また、iPS細胞の肝細胞への分化誘導もわずかであるがその効率を上げることができた。肝臓病学肝臓基質へのヒト細胞注入に関しては、iPS細胞由来肝細胞をもちいた実験と、HEPG2, LX2ヒト細胞株をもちいた実験とを同時に進めることとする。これによってex-vivo閉鎖系の肝臓基質を作製することができた。肝臓基質へのヒト細胞注入に関しては、iPS細胞由来肝細胞を使用する当初の予定を進めていく前に、HEPG2,LX2などのヒト細胞株を用いて研究を進めることとする。平成26年度は、肝臓基質へのヒト細胞注入に関してiPS細胞由来肝細胞を使用する当初の予定を進めていく前に、HEPG2,LX2などのヒト細胞株を用いて研究を進める実験を追加することとした。上皮系細胞と肝葉系細胞の相互作用による肝臓機能がどのように変化するのかを調べることに主眼を置いて実験を進める。
直接内部改質が可能な三相流動層溶融炭酸塩型燃料電池の開発

燃料電池は水素やメタンなどの燃料を電気化学的に反応させ直接化学エネルギーを電気エネルギーに変換するため効率が高く、またNOxやSOxなどの大気汚染物質の排出もほとんどないため、次世代の発電システムとして期待されている。しかし電極構造が複雑で実用化は容易ではない。そこで、これまで燃料電池に用いられている平板型ガス電極ではなく、スケールアップが容易な三次元電極を用いた溶融炭酸塩型燃料電池を試作し、その電極特性を調べた。具体的には、直径50mmのアルミナ管三次元電極を製作し、流動電極粒子としてニッケルを、電解質には溶融炭酸塩(Li2CO3:K2CO3=62:38)を、集電体にニッケル板を、対極に白金網を用いて、電気炉で650°Cに加熱し、燃料ガスとして水素80%、CO220%のガスを吹き込み流動層電極および固定層電極を形成させ、ポテンショスタットを用いて定電位電解法で電流電圧曲線を測定し、電極特性を調べた。またメタンを直接導入し、内部改質させて電極特性を調べた。その結果、以下の点が明らかになった。1)固定層(低ガス流速)の場合は、拡散律速であることを示す限界電流が見られ、ガス流速の増大させると分極特性が向上した。2)流動層(高ガス流速)の場合は、ガス流速の影響をあまり見られず、固定層よりも分極特性は良かった。3)メタンを直接水素極に導入すると、メタン改質ガスを導入した場合とほぼ同じ分極特性を示し、電極内部でメタンが改質されていることが明らかになった。以上の知見より、三次元電極を用いた溶融炭酸塩型燃料電池の水素極の電極特性を明らかにし、メタンを直接改質が可能であることを明らかにした。今後、本プロセスの実用化の可能性を追求する計画である。
多能性幹細胞を用いた心筋組織の人工的構築と再生治療法の開発

心筋細胞の発生は、発生初期の胚に存在する心臓発生領域において多段階的で複雑な遺伝子発現に基づいて分化が進行することが知られている。周囲の内/外胚葉から分泌される細胞増殖因子の刺激により間葉系細胞において転写因子活性を生じる。しかし幹細胞が心臓中胚葉発生プロセスに入る分子機構は不明である。我々は心臓中胚葉分化を選択的に誘導し決定する機構を「心臓中胚葉発生の初期プライミング因子」と名づけて探索を開始し、現在までに合計6個の初期プライミング因子の単離同定に成功した。現在Crossveinless-2 (Cv2)に注目し解析を進めている。マウス胚を用いてwhole mount in situ hybridization法によりCv2と他の分化関連因子の発現パターンとの比較を行っている。Cv2と同様の生物学的特徴をもつタンパク質にNogginがあげられる。Cv2とNogginのin vivoでの発生時期における発現局在様式に関して検討したが、Cv2のみが発生初期過程の心臓発生領域に発現していた。mRNAレベルでの検討も行ったが、先の結果と同様に、Nogginの発現は心臓発生領域には発現を得られなかった。Cv2は発生初期過程の心臓発生領域に発現し、幹細胞の心臓中胚葉誘導と心筋分化を促進するメインプレイヤーである可能性が示された。一方、Cv2遺伝子変異マウスでは仔の成長遅延が示されている。Cv2-Blue miceの初期胚モデルを確立、変異形式による胚発生早期への影響(心血管系への影響)を観察。このモデルを用いて初期心臓にCV2が発現する事を発見した(投稿準備中)。詳細な発現経過の解析、発現細胞種類の同定進めると共に、心臓形成時期での他の因子との相互関係を引き続き探索している。我々は心臓中胚葉分化を選択的に誘導し決定する機構を「心臓中胚葉発生の初期プライミング因子」と名づけて探索を開始。合計6個の初期プライミング因子の単離同定に成功した。現在Crossveinless-2(Cv2)に注目し解析を進めている。Cv2とNogginのin vivoでの発生時期における発現局在様式に関しては、Cv2のみが発生初期過程の心臓発生領域に発現した。mRNAレベルでの検討結果と同様、Nogginの発現は心臓発生領域には発現を得られなかった。Cv2は発生初期過程の心臓発生領域に発現し、幹細胞の心臓中胚葉誘導と心筋分化を促進するメインプレイヤーであることが示された。また発現局在を明らかにするため、Cv2-Blue miceを用いた胚発生早期におけるCv2の発現場所を探索するモデルを開発した。このモデルを用いて初期心臓にCV2が発現する事を発見した。現在詳細な発現経過の解析とともに、発現細胞種類の同定を行っている。

現在Crossveinless-2(Cv2)に注目し解析を進めている。マウス胚を用いてwhole mount in situ hybridization法によりCv2と他の分化関連因子の発現パターンとの比較を行っている。Cv2と同様の生物学的特徴をもつタンパク質にNogginがあげられる。Cv2とNogglnのin vivoでの発生時期における発現局在様式に関して検討したが、Cv2のみが発生初期過程の心臓発生領域に発現していた。mRNAレベルでの検討も行ったが、先の結果と同様に、Nogginの発現は心臓発生領域には発現を得られなかった。Cv2は発生初期過程の心臓発生領域に発現し、幹細胞の心臓中胚葉誘導と心筋分化を促進するメインプレイヤーである可能性が示された。一方、Cv2遺伝子変異マウスでは仔の成長遅延が示されている。Cv2-Blue miceの変異形式による胚発生早期への影響(心血管系への影響)を観察中である。このモデルを用いて初期心臓にCV2が発現する事を発見した。詳細な発現経過の解析、発現細胞種類の同定進めると共に、心臓形成時期での他の因子との関係を探索している。心筋細胞の発生は、発生初期の胚に存在する心臓発生領域において多段階的で複雑な遺伝子発現に基づいて分化が進行することが知られている。周囲の内/外胚葉から分泌される細胞増殖因子の刺激により間葉系細胞において転写因子活性を生じる。しかし幹細胞が心臓中胚葉発生プロセスに入る分子機構は不明である。我々は心臓中胚葉分化を選択的に誘導し決定する機構を「心臓中胚葉発生の初期プライミング因子」と名づけて探索を開始し、現在までに合計6個の初期プライミング因子の単離同定に成功した。現在Crossveinless-2 (Cv2)に注目し解析を進めている。Cv2とNogginのin vivoでの発生時期における発現局在様式に関して検討したが、Cv2のみが発生初期過程の心臓発生領域に発現していた。Cv2-Blue miceの初期胚モデルを確立、変異形式による胚発生早期への影響(心血管系への影響)を観察。このモデルを用いて初期心臓にCV2が発現する事を発見した(投稿準備中)。詳細な発現経過の解析、発現細胞種類の同定進めると共に、心臓形成時期での他の因子との相互関係を引き続き探索している。現行解析を行っている因子以外の因子に関しての解析が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ハイパー・スペクトルイメージングによる種子の生理的変化の可視化

励起・蛍光マトリックス(Excitation Emission Matrix:EEM)は、励起波長、蛍光波長、蛍光強度の3軸からなる等高線状のグラフで、成分に固有のパターンを示す。EEMは古典絵画おける染料同定や水質検査における汚染物質同定などに利用されているが、種子およびその成長等の生理変化に応用した研究はほとんど無い。そこで本研究では、発芽中の種子の各部位でEEMを計測・解析することにより、種子の内部構造あるいは成分分布の可視化を目的とした計測技術の開発を行った。分光照明部・分光観察部・マイクロスライサ部から構成される「3次元スペクトルイメージングシステム」を構築した。分光照明部は2001,000nmの範囲で試料を照明し、分光観察部は4001,100nmの範囲で試料断面を撮影する。また、マイクロスライサ部はミクロン単位で試料を繰り返し切削する。本システムを用いることにより、試料の各部位におけるEEMを取得でき、部位別のEEMパターンを解析することにより、試料中の内部構造・成分分布を可視化する事が可能となった。本システムを用い、大豆試料を計測した結果、アリューロン層、胚および葉脈状の構造を可視化することに成功した。また、ダイズの吸水過程の可視化も試み、これは1484nmにおける2次微分スペクトルイメージングによりきれいにその浸透の様子を観察することが可能なった。本手法は、種子の生理的変化の可視化ばかりでなく、食品中の成分分布の可視化等にも応用可能と思われる。種子発芽時の種子内成分分布状態やそれに関連する形態生理的な生命現象を解明するための準備段階として,多次元スペクトル(ハイパー・スペクトル)イメージングの要素技術開発と装置構築を目指した.同時に,ダイズ種子が発芽するための前提条件となる吸水過程の諸現象を把握するため,構築した装置を適用して吸水過程におけるダイズ種子切断面のスペクトルイメージングを行った.(1)ハイパースペクトルイメージング技術の開発および装置構築蛍光指紋解析のための試料・成分の固有スペクトル同定や特性を計測するため,波長走査が可能な液晶チューナブルフィルタと近赤外線領域でも高感度CCDカメラを組み合わせて顕微鏡に取り付け,同時に照明光源として近赤外領域も利用可能な光源も利用してスペクトルイメージングシステムを構築した.このイメージングシステムを冷却試料固定式の実体スライス装置(クリオ型自動ミクロトーム)に取り付けて,冷凍試料の切断面が観察可能となるようにした.(2)吸水過程におけるダイズ種子切断面のスペクトルイメージングダイズ種子を蒸留水に浸漬し,吸水経過時間ごとの切断面を観察することによって切断面上での吸水部位の識別を試みた.吸水開始から0,1,2,24時間経過した4条件のダイズ試料を液体窒素で急速冷凍し切断用試料とした.冷凍された試料は実体スライス装置にセットし適度な切断面を得られるまで切削した.切断面は主に近赤外領域(900nm-1100nm)において2nm幅で波長走査・画像化し,得られた画像データの解析によって氷結部位の可視化を試みた.なお本報告書の段階では,氷結した部位を試料の吸水部位とみなして実験を進めた.これらの実験・解析の結果,吸光度を二次微分して画像化すれば960nm付近の波長域で吸水した部位と吸水していない部位の識別が可能になるものと考えられた.今後,より詳細な解析を検討中である.種子発芽時の種子内成分分布状態やそれに関連する形態生理的な生命現象を解明するため,多次元スペクトル(ハイパー・スペクトル)イメージング装置を構築した.同時に,構築した装置を適用してソバ種子が含有する機能性成分の局在状態を可視化した.(1)ハイパースペクトルイメージング装置の構築照明波長可変の分光照明装置,冷却CCDカメラ,透過波長可変の液晶チューナブルフィルタを計測部,冷却試料固定式の実体スライス装置を試料操作部とするハイパースペクトルイメージングシステムを構築した.これにより冷凍試料の切断面ごとに励起蛍光マトリックス(Excitation-Emission Matrix : EEM)を計測することが可能となった.

なお,計測部の照明光源として近赤外領域も観察可能な光源を組み込んだ.本装置の構築により,様々な波長条件でEEMを取得し,画素間のEEMパターンの比較によって特定物質の有無やその位置を明らかにすることが可能となった.(2)ダッタンソバ種子切断面のハイパースペクトルイメージングダッタンソバ種子の切断面を励起波長350670nm,蛍光波長400720nm,波長間隔10nmで撮影して蛍光画像の各画素におけるEEMを算出し,それらに主成分分析を適用して各画素のEEMパターンの違いを3次元の座標空間上に投影した.次に,蛍光画像の各画素を割り当てられた色に彩色することによりEEMパターンの違いを可視化し,試料・成分の固有スペクトル同定や特性を計測した.その結果,胚乳,子葉,種皮,果皮などの部位が明確に識別可能であった.これは各部位の構成成分が特有のEEMパターンを持っていることを反映しているためと考えられた.今後は活性酸素消去を持つ色素を特定した上でそれらのEEMパターンの測定・解析を検討している.照明光の波長が可変な分光照明装置と、近赤外領域の画像を撮影可能な近赤外カメラを組合せ、近赤外領域の任意の波長における分光画像を取得可能なシステムを構築した。本システムを用いて水滴及び氷粒の分光画像を、1,300-1,600nmの範囲で、10nmおきに撮影した。同じ条件で標準白色板の分光画像も撮影した。吸光度の定義に従い、得られた分光画像より水及び氷の可視吸光スペクトルを算出したところ、1,450nm付近にある水の吸収帯が、氷においては1,500nm付近にシフトすることが明らかとなった。次に、供試材料として大豆種子を用意し、0,20,40,60分間純水に浸漬した後、水分移動を止めるため、液体窒素に浸して急速凍結した。凍結した大豆種子を、試料の1ミクロン単位での押し上げと試料上端部の切削を繰り返して試料断面を連続的に露出させる「マイクロスライサ」にセットし、半分に切断した。次に、上記のシステムを用いて、切断面の1,500nmにおける分光画像を撮影した。さらに、撮影した画像の各画素の輝度値を吸光度に変換し、吸光度の小さい部分は青、大きい部分は赤となるよう、吸光度の大小に応じて各画素を彩色した。その結果、吸水時間が増加するに従い、種子の外縁部および胚軸の周辺部から胚乳の中心部に向けて吸光度の高い部分が広がる様子が観察された。このような吸光度の分布は吸水過程における水分の動きと一致していると考えられ、本手法により大豆種子内の水分分布が可視化できることが示唆された。試料を連続的に切削し、様々な深さにおける断面を露出させるマイクロスライサ部、照明波長可変の分光照明部、及び任意の波長で試料の露出断面を観察可能な分光イメージング部よりなる「3次元スぺクトルイメージングシステム」を用い、米国産春小麦のEEMを計測した。具体的には、小麦種子をマイクロスライサにより切削して中央部断面を露出させ、その蛍光画像を、励起波長350670nm、蛍光波長400720nm、波長間隔10nmにて、計561枚撮影した。
星・惑星系形成過程における揮発性物質の組成、同位体比、気相・固相分配

当初の目標は、星・惑星系形成時における星間物質の進化について(1)同位体比異常の獲得と喪失(2)円盤形成時の衝撃波化学(3)円盤氷線近傍の化学を明らかにすることであった。(1)については分子の重水素比について分子雲形成時から原始惑星系円盤まで包括的にモデルを構築できた。(2)については氷が昇華するための密度と衝撃波速度の条件を明らかにした。(3)については一酸化炭素の氷線に付随するN2H+などの存在度変化を数値解および解析解で明らかにした。水の氷線近傍においてガス-ダストの速度差によって生じる元素組成の変化については指導学生の修士論文で調べたが、今後さらに研究を進め論文にまとめる必要がある。(1)昨年度の業績報告時に投稿中であった2件の研究(11次元輻射流体星形成コアモデルにおける大型有機分子、炭素鎖分子、重水素比の時間進化の研究、23次元輻射流体シミュレーションに基づいたfirst core形成時の分子組成空間分布の研究)が学術雑誌に掲載された。また。これらの研究をさらに発展させるため、ダスト表面反応の修正法(昨年度の報告書「今後の推進方策」参照)を計算コードに組み込み、現在、米国の研究協力者と結果を比較し、テスト計算を行っている。(2)野辺山電波観測所で行われている星形成領域の輝線サーベイで検出されたPN分子について、その生成過程を衝撃波化学モデルを用いて調べた。PN以外のP分子が検出されなかったことから、衝撃波によって脱離したP原子またはPH3とN原子の反応によってPNが生成されたことが分かった。この結果は学術雑誌に掲載された。(3)地球の海水の重水素比(HDO/H2O10{-4})や太陽系始原天体である彗星の重水素比は、太陽系近傍の元素のD/H比(10{-5})よりも1ケタ程度高いことが知られている。一方近年、原始星コアでHDO/H2O比が観測され、原始星コアでは10{-2}程度の高い値であるが分かってきた。この高いD/H比をもつ水が原始惑星系円盤内でどのように進化するかを探るべく、乱流拡散のある原始惑星系円盤中での化学組成進化を数値計算で調べた。その結果、原始星コアから持ち込まれた水は円盤表面での光解離で壊され、半径20AU程度の領域では10{-4}程度の重水素比をもつ水が再形成される可能性があることが分かった。この結果は学会などで発表し、現在、学術論文にまとめている。(4)原始惑星系円盤のスノーライン近傍において、酸素/炭素比が変動した場合に分子組成がどのように変化するかをX線および紫外線の効果を考慮して調べた。(1)ALMAでの若い低質量星L1527のまわりに形成中の原始惑星系円盤が観測されつつある。特にSO輝線では円盤への降着衝撃波が捉えられた可能性がある。昨年度までに行った星形成コアの分子組成進化のモデルをもとに、L1527のSO輝線観測の理論的裏付けを行った。さらに、コアから円盤への降着衝撃波によってSO分子がダスト表面から脱離し得るかを一次元衝撃波モデルによって定量的に調べた。この結果は現在学術雑誌に投稿中である。(2)昨年の業績報告時に執筆中であった、原始惑星系円盤における水の存在度および重水素進化の研究が学術雑誌に掲載された。また、その研究の続きとして、円盤内での炭素、窒素系分子の進化についても数値計算および計算結果の解析を行った。ダスト温度の高い領域では、水と同様にメタノールもダスト表面での再生成の効率が悪いため、円盤表面での光解離によって減少していくことが分かった。メタノールよりも大きな有機分子は、乱流のない場合は円盤中心面で、乱流のある場合は円盤表面付近で生成されやすいことが分かった。また、COやN2が、化学反応でより昇華しにくい分子に変わりダスト表面に吸着することで、その存在度が減少していく時間スケールを解析的に導出した。これらの結果は現在学術雑誌に投稿し、査読コメントに基づいて現在修正を行っている。(3)分子雲およびHI雲での星間衝撃波において、星間ガスが熱的に不安定な状態を経るか、また、不安定性による擾乱の成長度を調べた。その結果、分子ガスでも熱的不安定性は生じるが、擾乱はガスが低密度で衝突速度が大きいほど成長率が大きいことを明らかにした。この結果は学術論文に掲載された。(4)低質量星形成過程における星間分子の組成進化およびその理論モデルについてのレビュー論文を執筆した。(1)1次元輻射流体計算による星形成コアモデルに基づいて、大型有機分子や炭素鎖分子、およびこれらの重水素比の時間進化を調べた。得られた結果は以下の通りである。(i)大型有機分子、炭素鎖分子ともに原始星コアの進化が進むにつれて増加することが分かった。(ii)低温な高密度コア時代に生成された分子の高い重水素比は、その後原始星周囲で大型有機分子などが生成される際に娘分子に引き継がれることを示した。(iii)ダスト表面におけるCH3OHとD原子の交換、引き抜き反応はD原子を多く消費し、ほかの有機分子の存在度や重水素比にも大きく影響を与えることを示した。(iv)中心星に落下する流体素片は、ダスト表面反応による有機分子生成が活発になる数10Kの温度領域を比較的短時間で通過してしまう。

これに対して、円盤内では流体素片がより長い時間数10Kの領域に留まれる可能性があり、CH3OCH3などがエンベロープよりも形成しやすいことを示した。(2)3次元RMHDシミュレーションに基づいてfirst core形成時の分子組成空間分布を求めた。分子の組成分布はほぼ温度分布で決まること、現在Class I天体で検出されているHot Corino分子がfirst coreの段階でも存在することを示した。上記の2件の結果は学術論文としてまとめ、The Astrophysical Journal誌に投稿中である。(3)野辺山電波観測所で行われている星形成領域の分子輝線観測プロジェクトにも参加し、観測結果とモデルの比較等を行っている。1円盤形成時における揮発性分子の挙動:円盤形成中の天体L1527の観測チームに参加し、観測された分子がエンベロープや形成中の円盤でどのように存在度変動するかについて主に理論的見地から議論した。降着衝撃波におけるSO等揮発性分子の昇華条件をまとめた論文が学術雑誌に掲載された。2原始惑星系円盤におけるイオン分子存在度:原始惑星系円盤において主要なイオン分子(HCO+, N2H+, H3+)の存在度を数値計算で求め、さらにこれを解析して解析解を導出した。このうちN2H+は最近の観測でCO snow lineの指標になる可能性が観測で示されているが、本研究で得られた解析解はN2H+がCO昇華温度近傍で増加することを明快に示す。また円盤内でのイオン化率(宇宙線によるイオン化の有無など)によってN2H+が1ー2桁変動することも示した。この結果は学術雑誌に投稿し、現在、査読コメントに基づいて改定中である。3星間雲、原始惑星系円盤における重水素濃縮:分子雲や円盤外縁部の低温下での化学反応では、分子の重水素比(XD/XH)が元素の同位体比(D/H 10-5)よりも高くなることが知られている。近年、この同位体分別に水素のオルソ/パラ比も重要な役割を示すことが指摘された。このオルソ/パラ比を反応ネットワークモデルに取り込み、円盤での重水素比の変化を計算した。また、水氷については分子雲形成時にすでに多く生成されるため、その重水素比については、分子雲形成段階からモデルに取り入れることが重要であるという結論を得た。これらの結果は現在論文にまとめている段階である。4円盤観測と理論モデル:ハーバード大学のKarin Oberg助教が率いる円盤の電波輝線観測プロジェクトに参加し、3の数値計算で得られた分子組成や重水素比を観測結果と比較している。1分子雲は低温であるため、そこで形成される分子はH3+などの発熱交換反応によって重水素濃縮を起こす。つまり、分子の重水素比(DX/HX)は宇宙元素存在度(D/H=1.5×10{-5})よりも高くなる。実際、分子雲コアにおいては多くの分子がDX/HX10{-2}程度の高い重水素比を示す。一方星間氷の水についてはHDO氷が検出されておらず、HDO/H2O比の上限値は10{-3}程度である。さらに最近、星間氷が昇華していると考えられる原始星コア中心の観測でもHDO/H2O10{-3}が得られた。水の重水素比は地球の海水(HDO/H2O10{-4})の起源を探る上でも重要なパラメータである。なぜ分子雲では、水はほかの分子と比べて重水素濃縮度が低いのだろうか?
コーパス利用による日常会話の文法・語法の研究

本研究の目的は、コーパスに基づき、日本語による日常会話の文法,語法の諸側面を明らかにすることである。3年間の成果として、終助詞「ね」「よ」「よね」の機能、格助詞「に」と「を」及び「が」と「を」が交代可能な場合、モダリティー「みたいだ」/「ようだ」、及び受身形、使役形の使用実態などをまとめることができた。アスペクト表現「てしまう」に関しては、文章語と会話における使用の違いを、接続表現「のだから」に関しては学習者の使用実態を明らかにした。更に、共通語による会話に出現する方言、共通語アクセントと方言アクセントの併存状況に関しても、調査することができた。また、新聞において共起する確率の高い、副詞+形容詞(例:はなはだ+心もとない、およそ+縁遠い、誠に+喜ばしい)、動詞のある特定の活用形と共起する確率の高い表現(例:元をただせば、欲を言えば(条件形との共起)、隙を見て、合間を縫って(て形との共起))の考察など、コロケーションに関しても成果をあげることができた。コーパス利用による現代語研究は、まだ緒についたばかりである。特に会話の研究は数が限られている。これは、利用できる会話のコーパスが少ないということでもある。この研究で利用した「名大会話コーパス」を、近い将来、国立国語研究所のサーバーで公開してもらえることになったのも本研究の成果と言えよう。本年度は先ず、コーパスを利用した研究に必要なユニックスの検索技術を身につけるため、姫路獨協大学において9月14日、15日と2日間に渡り、分担者の滝沢を講師としてワークショップを開催した。このワークショップには代表者である大曾の他、分担者の蓮沼、山崎、村中が参加し、それぞれ必要な基礎的検索技術をある程度身につけることができた。また、以前名古屋大学において科学研究費補助金によって収集した100時間の雑談コーパス(名大コーパス)の整備を行った。自然発話の文字化は様々な問題を含むため、上記2に使われている東京外国語大学で開発された文字化のシステムを参考にして更に整備を進め、公開にまで持っていく予定である。必要なコーパスがかなり準備できたので、各自、分担したテーマの下に研究を開始した。来年度ニューヨークで開かれるInternational Conference on Japanese Language Educationに応募したパネルが採択されたので、結果の一部をそこで発表することになっている。来年度は公開を目指して、引き続き名大会話コーパスの整備を行うとともに、入手したコーパスを使って、各自研究を進める予定である。本年度は、昨年入手・整備したコーパスを使って、分担者の専門・興味に応じた研究を行い、その成果を発表する研究会を2回姫路獨協大学で開催する一方、台湾、米国などで発表する機会を得た。研究代表者の大曾は、引き続き会話コーパスの整備にあたり、約60時間分をパデュー大学のサーバーに載せてもらって、コロケーションの検索ができるようにした。大曾はまた、5月に台湾の東呉大学で開かれたシンポジウム「日本語教育文法とコーパス」において、「コーパスに見られる格助詞の運用実態」という題目で発表し、その発表を論文としてまとめ姫路獨協大学外国語学部紀要に掲載した。更に、2月18日に仙台で開かれた国際シンポジウム「日本語研究の現在」に参加し、「コーパス利用による日本語研究:その可能性と限界」という題目で、本年の成果の一部を発表した。研究分担者の蓮沼、山崎、村中は、それぞれ個別に行った研究を「コーパス利用による日常会話の研究」というパネル形式にまとめ、8月5日、6日に米国ニューヨーク市のコロンビア大学で開催された「日本語教育国際研究大会」で発表した。そのパネルセッションで大曾は司会を、滝沢は指定討論者を務めた。3人の発表の題目は、次の通りである。「日本語学習者の会話能力と「のだから」使用の実態」(蓮沼)、「談話における「テシマウ」とその縮約形」(山崎)、「話し相手によるアクセントの切り換えについて」(村中)。

本研究の目的は、コーパスに基づき、日本語による日常会話の文法・語法の諸側面を明らかにすることである。3年間の成果として、終助詞「ね」「よ」「よね」の機能、格助詞「に」と「を」及び「が」と「を」が交代可能な場合、モダリティー「みたいだ」/「ようだ」、及び受身形、使役形の使用実態などをまとぬることができた。アスペクト表現「てしまう」に関しては、文章語と会話における使用の違いを、接続表現「のだから」に関しては学習者の使用実態を明らかにした。更に、共通語による会話に出現する方言、共通語アクセントと方言アクセントの併存状況に関しても、調査することができた。また、新聞において共起する確率の高い、副詞+形容詞(例:はなはだ+心もとない、およそ+縁遠い、誠に+喜ばしい)、動詞のある特定の活用形と共起する確率の高い表現(例:元をただせば、欲を言えば(条件形との共起)、隙を見て、合間を縫って(て形との共起))の考察など、コロケーションに関しても成果をあげることができた。コーパス利用による現代語研究は、まだ緒についたばかりである。特に会話の研究は数が限られている。これは、利用できる会話のコーパスが少ないということでもある。この研究で利用した「名大会話コーパス」を、近い将来、国立国語研究所のサーバーで公開してもらえることになったのも本研究の成果と言えよう。
アトピー性皮膚炎のストレスによる増悪機序の神経内分泌学および免疫学的解析

アトピー性皮膚炎が精神的・肉体的ストレスによって増悪することはよく知られているが、詳細なメカニズムは未だ明らかではない。また近年、ストレスホルモンであるcorticotropin-releasing factor(CRF)およびその受容体が中枢神経系のみならず皮膚にも存在することが報告され、炎症の増悪とCRFとの関係が注目される。そこで我々はラット腹部にハプテンを塗布し感作を成立させ、その後同じハプテンを背部に頻回塗布し、慢性接触皮膚炎を惹起した。このラットに1日1時間の心理ストレスないしフットショックストレスを連日9日間加えた後に皮膚を採取し、アトピー性皮膚炎患者の皮膚の病理組織像に最も近い皮膚組織像を呈するラットをアトピー性皮膚炎のストレス増悪モデル動物として確立した。このラットは血清IgEは高値を示し、ストレス負荷により表皮が肥厚し、また真皮上層の肥満細胞数が有意に増加していた。これに対し正常ラットに連日9日間同様のストレス負荷を行った場合、逆に表皮は非薄化し、真皮上層の肥満細胞数に影響は認められなかった。前者の表皮角化細胞はPCNA陽性細胞数が増加する傾向を示し、後者は減少する傾向を示した。これは正常皮膚と異なり、アトピー性皮膚炎モデル動物ではストレス負荷により真皮上層の肥満細胞数が増加し、表皮角化細胞の増殖亢進が起きると考えられた。臨床の場においてストレスにより種々の皮膚疾患が増悪し、ステロイド治療に抵抗することはしばしば経験される。特にアトピー性皮膚炎が精神的・肉体的ストレスによって増悪することはよく知られているが詳細なメカニズムは未だ明らかではない。近年ストレスホルモンであるcorticotropin-releasingfactor(CRF)およびその受容体が中枢神経系のみならず皮膚にも存在することが報告され、炎症の増悪とCRFとの関係が注目される。現在はCRF受容体タイプ1選択的拮抗剤を外用により表皮に直接投与、あるいは脳室内に投与するための予備実験を行っており、アトピー性皮膚炎の増悪機序におけるCRFの作用がどのサブタイプの受容体を介しているのか明らかにする予定である。
白内障発症過程におけるタンパク質分解の機構とその意義に関する研究

申請者は遺伝性白内障ラットであるSCRの水晶体を用い、白内障の発症とカルパイン依存性タンパク質分解との関連性を解析している。これまでに、1)カルシウム濃度の変動、2)カルパインの動態(活性化等)、3)カルパイン依存性タンパク質分解の生化学的解析、4)カルパインによる限定分解で不溶化するタンパク質の検索、5)α-クリスタリンのシャペロン様活性に及ぼすカルパインの影響、6)カルパイン依存性タンパク質分解の免疫組織化学などの解析から、水晶体の混濁化にはカルパイン依存性のタンパク質分解が深く関わっていることを明らかにしてきた。本年度は、カルパイン阻害剤(カルペプチン)を含む種々の薬剤にについて抗白内障作用を検討した。残念ながら、カルパイン阻害剤は水晶体内部への浸透性に問題があり(水,晶体の構造特性によるものと思われる)、明確な抗白内障効果を見出すことは出来なかった。しかし、誘導型NO合成酵素の阻害剤として知られるアミノグアニジンに強い抗白内障作用がある(経口投与)ことを見出した。しかも予備実験の段階ではあるが、アミノグアニジンを投与した水晶体ではカルパイン依存性のタンパク質分解も抑制を受けることが明らかとなった。現在、アミノグアニジンの作用機作について詳細な解析を進めている。白内障は水晶体が何らかの原因で混濁化し、透明性を失った状態である。我々は水晶体の混濁化原因としてタンパク質分解の亢進に着目し、研究を行っている。これまでに遺伝性白内障ラットであるSCRを用いた解析から、水晶体混濁に伴うα-およびβ-クリスタリンの分解にはカルシウム依存性プロテアーゼであるカルパインが関与することを明らかにしている。そこで本年度は、カルパインによるクリスタリンの分解と水晶体混濁化との関係をより明確にするため、1)α-クリスタリンが有するシャペロン様活性(他のタンパク質の凝集や変性を防ぐ機能)に及ぼすカルパインの影響、2)カルパイン依存性のクリスタリン分解の免疫組織化学的な解析等を行なった。正常の非混濁水晶体から部分精製したα-クリスタリンにカルパインを作用させ、シャペロン様活性の変動を解析した。その結果、α-クリスタリンのシャペロン様活性はカルパインによる限定分解でほぼ消失することが明らかとなった。また、混濁水晶体から調製したα-クリスタリンのシャペロン様活性も有意に低下していることが判明した。カルパインによる限定分解産物のみを認識する特異抗体を用いて免疫組織化学的な解析を行なった結果、カルパインによる限定分解産物は水晶体混濁が発現する部位と全く同じ場所で生ずることが確認された。更にβB1-クリスタリンはカルパインによる切断で可溶性から不溶性に変化することも明らかとなった。以上の結果から、カルパインは水晶体の混濁過程で水晶体タンパク質の不溶化に深く拘わっているものと思われる。
出生時の肺動脈血流量の変化に関する研究

今回の研究の目的は山羊胎仔を用いて子宮内での換気を行ない、出生時のシミュレーションモデルを作成し、肺動脈血流量(PAF)の変化を調べることである。在胎日数138±1日(Term145日)の妊娠山羊6頭を用いた。母獣の麻酔下に胎仔にカニュレーションを行い、肺動脈に超音波血流計のプローブを装着した。まず胎仔3頭を用い100%酸素での子宮内換気実験を行なった。換気条件は35ml×30回/分に設定した。残りの3頭ではPAF増加作用のあるアセチルコリン(Ach)の投与実験を行なった。Achの投与量は2,3,5μgとし、bolusで15分毎に投与した。また一酸化窒素(NO)の阻害剤であるNG-monoethyl-L-arginine(L-NMMA)の前処置によるAchと子宮内換気によるPAFの増加への影響を調べた。100%酸素による子宮内換気で胎仔動脈血pO2は24.4±1.9から164.4±62.3torrに上昇した。この結果PAFは最大98.7±67.4%の増加率を示した。AchによるPAFの増加率は2μgで11.7±6.1%、3μgで14.2±9.0%、5μgで18.2±4.0%と投与量の増大につれて増加率が大きくなった。L-NMMAの前投与によってAchのPAF増加作用は有意に抑制され、5μg投与で1.5±5.0%の増加にとどまった。(t=4.52、p<0.05)またL-NMMA投与後に子宮内換気を行なった所、pO2の増加にも拘わらずPAFの増加は約30分関抑制された。Achと子宮内換気によるPAFの増加がNO阻害剤によって抑制されたことから、出生時のPAFの増加にNOの関与が大きいことが示された。平成5年度はまず研究の基礎的段階を行つた。3頭の山羊新生仔を用いて、肺動脈血流量の基礎値と低酸素状態での変化を調べた。新生仔の肺動脈血流量はpO2が107.9mmHgの時は110.7±1.5ml/minで、低酸素状態にしていくと肺動脈血流量はpO2が69.8mmHgの時135.1±2.2ml/min,34.8mmHgの時138.6±3.0ml/min,25.1mmHgの時127.0±1.8ml/minへと増加した。胎仔の実験は胎仔2頭を用いて行った。1頭は胎仔の状態が不良でpH7.012,pO234.9mmHg,pCO247.2mmHgとアシドーシスの状態であった。この胎仔での肺動脈血流量は251.7±3.9mmHgで子宮内で100%酸素による換気によって胎仔動脈血pO2は23.7mmHgから、51.6mmHgに増加し、肺動脈血流量は251ml/minから223ml/minへと僅かに低下しただけであった。もう1頭の胎仔は良好な状態で動脈血pH7.277,pO227.7mmHg,pCO245.0mmHg,肺動脈血流量は116.4±7.5ml/minであった。