hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎不全におけるレニンーアンジオテンシン系とRhoの病態生理的役割

マウスを用いた実験的腎不全モデルを作成して、レニンーアンジオテンシン系および関連因子の病態生理学的役割の解明を行った。Cisplatin投与により、血中BUN、クレアチニン値などの生化学的指標、腎組織切片の病理学的指標から尿細管壊死を中心とした腎不全を確認した。この時、腎組織のCOX-2、TGF-βなどの炎症性因子のmRNAレベルの上昇が見られるとともに、Rhoの活性化が観察され、その役割が注目された。本研究はレニン-アンジオテンシン系および関連因子の腎不全における病態生理学的役割の解明を通して、将来の腎不全治療薬・予防薬の開発に向けた基礎研究を目的としている。初年度の本年度は、主に腎不全モデル動物を用いた病態因子の検出を目的とし、マウスを用いた腎不全モデルの基礎的病態の把握と、それに関連して変動する病態因子の測定を行った。腎不全モデルとしては、尿細管間質性腎炎を引き起こすcisplatinの腹腔内投与を行った。cisplatin投与前および投与後3日、7日、14日目にマウス用メタボリックケージにて24時間尿を採取し、採尿直後にpentbarbital麻酔下にて速やかに採血および腎組織の摘出を行った。組織標本は、適宜分割後に液体窒素により急速冷凍し、腎組織切片作成および腎組織中mRNAおよび各種タンパク質抽出に用いた。血中BUN濃度はcisplatin投与3日後に一番高値を示し、尿量の減少とともに、cisplatinによる急性腎不全の病態を呈していた。血中クレアチニン濃度やクレアチニンクリアランス値、尿中タンパク量には血中BUN濃度ほどの変化は観察されなかった。Cisplatin投与3日後の腎組織切片像は、ヘマトキシリン-エオジン染色では、尿細管への浸潤細胞数の増加が観察され、今後、ED-1抗体による免疫染色により、その細胞種を同定して行く。また、Masson trichrome染色や組織サンプル中のコラーゲンmRNA量の変動から急性腎不全後の間質線維化を数量化していく段階である。これらの典型的病態と、Rho、Rhoキナーゼ系、レニン-アンジオテンシン系の特異的遮断薬や関連因子の変動の測定とを組み合わせることにより、腎不全におけるレニン-アンジオテンシン系の役割が明確になると期待される。本研究はレニンーアンジオテンシン系および関連因子の腎不全における病態生理学的役割の解明を通して、将来の腎不全治療薬・予防薬の開発に向けた基礎研究を目的としている。本年度は、昨年度の結果を受けて主にマウスを用いた腎不全モデルの基礎的病態の把握と、それに関連して変動する病態因子の測定を行った。血中BUN濃度と血中クレアチニン濃度はcisplatin投与3日後に一番高値を示し、クレアチニンクリアランス値、尿量の減少とともに、cisplatinによる急性腎不全の病態を呈していた。Cisplatin投与3日後の腎組織切片像は、ヘマトキシリン-エオジン染色では、尿細管への浸潤細胞数の増加が観察された。リアルタイムPCR測定により、COX-2、TGF-βの発現亢進が観察された。また、Rho binding domainを融合させたglutathione-S-transferaseを用いた免疫沈降物のWestern blottingにより、cisplatinによるRhoの活性化が観察された。レニンーアンジオテンシン系の活性化はG_<12/13>タンパク質を介してRho、Rhoキナーゼ系を活性化するため、レニンーアンジオテンシン系の特異的遮断薬が腎不全に対する保護効果を示している一因としてのRhoの役割の解明がますます重要になると考えられる。
遷延性術後痛における炎症細胞浸潤の解析

本研究は、凍結による筋挫傷によって局所に炎症を引き起こし、その治癒過程において炎症細胞の浸潤量を解析する。さらに、痛みの遷延を行動学的研究および免疫組織学的研究で示し、遷延性術後痛の動物モデルを確立し、ヒトにおける遷延性術後痛を発症させないための、新たな予防的治療法の開発を目指す。以前に作成したふたつの傷害モデル、すなわち足底筋切開モデル(切開群)ならびに、凍結筋障害モデル(凍結群)を用いて研究を継続した。行動学的評価については、本年度におこなった追加実験と統計学的再検討の結果、凍結群は切開群に比べ、自発痛関連行動については手術から3-7日目、機械性痛覚過敏については手術から5-8日目において、有意な増大を認め、凍結モデルの痛みの遷延が確認された。また、脊髄におけるマイクログリアの発現を評価するため、足底の支配領域である脊髄L4-5を採取し、マイクログリアに特異的に発現しているカルシウム結合タンパク質であるIbaー1を用いて染色した。手術4日後、7日後のラット脊髄において、非術側に対する術側のマイクログリア発現が増加していることが確認された。これも、2017年度におこなった統計検討によって、有意差が示された。また、障害足の足底筋HE染色について、組織の炎症細胞浸潤を定量評価し、凍結モデルにおける炎症の増強を示した。2018年度は、脊髄における痛み関連分子であるc-fosの染色をおこなったが、行動研究での疼痛の遷延、マイクログリアの発現との相関が示せなかった。同時にデータの整理、学術論文の作成をおこなっており、2019年度中に英文雑誌への投稿をおこなう予定である。遷延性術後痛のメカニズムを解明するために,組織の慢性炎症がと急性痛から慢性痛への移行の関係に着目した.本研究は,凍結による筋挫傷によって局所に炎症を引き起こし,その治癒過程において炎症細胞の浸潤量を解析する.さらに,痛みの遷延を免疫組織学的研究で示し,遷延性術後痛モデルを確立することで,遷延性術後痛を発症させないための,新たな予防的治療法の開発を目指す.全身麻酔下に,Brennanら(Pain,1996)の方法に従いラットの足底筋切開モデル(筋切開モデル)ならびに,-190°Cの液体窒素によって冷却された金属を足底筋につけ凍結させた凍結筋挫傷モデル(凍結モデル)を作成した.モデル作成前および作成後に,経時的に痛みの行動学的評価をおこなった.自発痛関連行動については,Xuら(Anesthesiology,2010)に従い,Cumulative Pain Scoreを記録した.また痛覚過敏・アロディニアの測定は機械刺激(von Feryフィラメント)および熱性刺激(輻射熱刺激装置)によって計測した.自発痛関連行動,機械性痛覚過敏については手術から3-5日後において凍結モデルが筋切開モデルに比べ有意に増大し,凍結モデルの痛みの遷延が確認された.また,免疫組織学的研究は脊髄におけるミクログリアの発現を評価するため,マクロファージ/ミクログリアに特異的に発現しているカルシウム結合タンパク質であるIba-1を染色した.手術4日後,7日後のラット脊髄において健側に対する術側のミクログリア発現が増加していることが確認された.今後,結果の再現性および統計学的検討をおこなう予定である.さらに,フローサイトメトリーによって,手術後の足底筋における炎症細胞の浸潤量を評価する予定である.当初予定していた行動学的検討は,統計学的処理も含めほぼ終了している.免疫学的検討も,ミクログリアによる評価をすでに開始しており,予備データの段階ではあるが,筋切開モデルに比較して凍結モデルで痛みの遷延を示すことができている.さらに,炎症細胞浸潤の解析にはフローサイトメトリーを用いる方法が確立しており,当教室でも実際に使用されている.遷延性術後痛のメカニズムを解明するために、組織の慢性炎症と急性痛から慢性痛への移行の関係に着目した。さらに、痛みの遷延を免疫組織学的研究で示し、遷延性術後痛モデルを確立することで、遷延性術後痛を発症させないための、新たな予防的治療法の開発を目指す。全身麻酔下に、ラットの足底筋切開モデル(筋切開モデル)ならびに、-190°Cの液体窒素を用いて足底筋を凍結させた凍結筋損傷モデル(凍結モデル)を作成した。昨年度までの行動学的評価によって、自発痛関連行動ならびに痛覚過敏について、手術から3ー5日後において凍結モデルが筋切開モデルに比べ有意に増大し、凍結モデルの痛みの遷延が確認された。また、脊髄におけるミクログリアの発現を評価するため、足底の支配領域である脊髄L4-5を、Ibaー1を用いて染色した。手術4日後、7日後のラット脊髄において非術側に対する術側のミクログリア発現が増加していることが確認された。今回あらたに、損傷を受けた足底筋を採取し、HE染色をおこない、組織の炎症細胞浸潤を評価した。凍結群において、損傷部位付近への強い炎症細胞浸潤がみられた。また、フローサイトメトリーによって、手術後の足底筋における炎症細胞を分離し、その浸潤量や細胞種類を検討した。手術後4日目において、凍結群でCD11陽性細胞数が増加しており、好中球などの炎症細胞が多く浸潤していることが示された。

平成28年9月に開催された国際疼痛学会(IASP)で本研究の途中結果を示し、他の研究者と論議を交わした。今後は不足している実験の追加、データのまとめ、論文作成を進め、学術雑誌への投稿をする予定である。当初予定していた行動学的検討は、統計学的処理も含めほぼ終了している。免疫組織学的検討も、凍結群において、脊髄のミクログリアの発現が遷延していることが遷延していることが示され、統計学的優位差も示された。さらに、当教室においてこれまでも使用されてきたフローサイトメトリーを用いた、筋への炎症細胞浸潤評価もおおむね完了しており、追加実験をおこなって統計処理を施行するのみである。また、国際学会において発表をおこない、研究データを公表済みである。本研究は、凍結による筋挫傷によって局所に炎症を引き起こし、その治癒過程において炎症細胞の浸潤量を解析する。さらに、痛みの遷延を行動学的研究および免疫組織学的研究で示し、遷延性術後痛の動物モデルを確立し、ヒトにおける遷延性術後痛を発症させないための、新たな予防的治療法の開発を目指す。以前に作成したふたつの傷害モデル、すなわち足底筋切開モデル(切開群)ならびに、凍結筋障害モデル(凍結群)を用いて研究を継続した。行動学的評価については、本年度におこなった追加実験と統計学的再検討の結果、凍結群は切開群に比べ、自発痛関連行動については手術から3-7日目、機械性痛覚過敏については手術から5-8日目において、有意な増大を認め、凍結モデルの痛みの遷延が確認された。また、脊髄におけるミクログリアの発現を評価するため、足底の支配領域である脊髄L4-5を採取し、ミクログリアに特異的に発現しているカルシウム結合タンパク質であるIbaー1を用いて染色した。手術4日後、7日後のラット脊髄において、非術側に対する術側のミクログリア発現が増加していることが確認された。これも、本年度におこなった統計検討によって、有意差が示された。前年度におこなった、障害足の足底筋HE染色について、組織の炎症細胞浸潤を定量評価した。今後は、痛み関連分子であるc-fosの染色や、データの整理、学術論文への投稿をおこなっていく予定である。当初予定していた行動学的研究に関して、追加実験をおこなう必要が生じたが、ほぼ終了した。免疫組織学的研究も、切開群に比べて凍結群において、脊髄のミクログリア発現の増加が遷延することが示され、統計学的優位差も示されている。さらに、当教室においてこれまでも使用されてきたフローサイトメトリーを用いた、筋への炎症細胞浸潤の評価もおおむね完了している。今後は学術論文への投稿を予定している。
全身性腫瘍免疫能獲得に及ぼすケモカイン遺伝子導入の波及効果

腫瘍退縮においてTリンパ球、NK細胞を初めとする免疫細胞は重要な働きをしている。我々はケモカインの中でもメモリーTリンパ球の遊走因子であるmacrophage inflammatory protein-1a(MIP-1a)と、マクロファージの前駆細胞である単球へ作用するmonocyte chemottactic protein-1(MCP-1)に着目した。すでに、これらの遺伝子を導入した癌細胞を用いてマウスに移植後の癌増殖に影響が生じ、特にヒトMIP-1aでは約30%のマウスで癌の生着が拒絶され、アポトーシス様の細胞融解がおこっていることを報告している。今回、我々はMCAF/MCP-1の遺伝子を導入したColon26clone20結腸癌細胞(以下、C20)を用いて、宿主免疫反応への影響を検討するとともに、免疫反応調節薬(BRM)を併用して、制癌治療方法の可能性を検討した。癌細胞を移植された動物にインドメタシンとBRMを併用投与したところ、腫瘍を拒絶するマウスが増加し、顕著な抗腫瘍効果が得られた。この効果はT細胞とB細胞を持たないSCIDマウスでは認められなかった。さらに、腫瘍を拒絶したマウスに親株を再移植したところ、殆どのマウスが移植細胞を拒絶し、腫瘍免疫が得られていることが確認された。MCAF/MCP-1遺伝子導入癌細胞を移植したマウスではインドメタシンとBRM併用による抗腫瘍効果は弱められる傾向があった。以上のことから、担癌宿主の免疫を低下させるような腫瘍に関してはMCAF/MCP-1が腫瘍へのマクロファージ浸潤を促すが充分なマクロファージの活性化を起こさないこと、および、マクロファージを調節する薬物との併用により抗腫瘍効果が得られる可能性があることが示さた。我々はケモカインの中でもメモリーTリンパ球の遊走因子であるmacrophage inflammatoryprotein-1a(MIP-1a)と、マクロファージの前騙細胞である半球へ作用するmonocytechemottactic protein-1(MCP-1)に着目した。今回は、MCP-1の腫瘍に対する効果および、in vitroでの発現量と腫瘍内マクロファージの浸潤度を検討するため、MCP-1遺伝子をColon26 clone20結腸癌細胞に導入し、マウスに移植した。そして、マクロファージの活性を十分にするための実験を併せて行った。MCP-1を遺伝子導入することでin vitroでの細胞性質に変化はみられなかった.MCP-1発現量の高いものほど腫瘍部位へマクロファージが浸潤していた。しかしながら、5日目前後をピークとし、マクロファージ浸潤が全ての細胞で、減少しており、この原因として血中にMCP-1が放出されているため、腫瘍局所との濃度勾配が低下し、マクロファージが腫瘍内の浸潤できないことが考えられた。LPSによりマクロファージを活性化させたところ、MCP-1遺伝子導入細胞で抗腫瘍効果が認められた。以上のことから、担癌宿主の免疫を低下させるような腫瘍に関してはMCP-1だけでは効果は得られず、マクロファージを調節する薬物との併用により抗腫瘍効果が得られる可能性があることが示された。

我々はケモカインの中でもメモリーTリンパ球の遊走因子であるmacrophage inflammatory protein-1a(MIP-1a)と、マクロファージの前駆細胞である単球へ作用するmonocyte chemottactic protein-1(MCP-1)に着目した。すでに、これらの遺伝子を導入した癌細胞を用いてマウスに移植後の癌増殖に影響が生じ、特にヒトMIP-1aでは約30%のマウスで癌の生着が拒絶され、アポトーシス様の細胞融解がおこっていることを報告している。今回、我々はMCAF/MCP-1の遺伝子を導入したColon26clone20結腸癌細胞(以下、C20)を用いて、宿主免疫反応への影響を検討するとともに、免疫反応調節薬(BRM)を併用して、制癌治療方法の可能性を検討した。癌細胞を移植された動物にインドメタシンとBRMを併用投与したところ、腫瘍を拒絶するマウスが増加し、顕著な抗腫瘍効果が得られた。この効果はT細胞とB細胞を持たないSCIDマウスでは認められなかった。さらに、腫瘍を拒絶したマウスに親株を再移植したところ、殆どのマウスが移植細胞を拒絶し、腫瘍免疫が得られていることが確認された。MCAF/MCP-1遺伝子導入癌細胞を移植したマウスではインドメタシンとBRM併用による抗腫瘍効果は弱められる傾向があった。以上のことから、担癌宿主の免疫を低下させるような腫瘍に関してはMCAF/MCP-1が腫瘍へのマクロファージ浸潤を促すが充分なマクロファージの活性化を起こさないこと、および、マクロファージを調節する薬物との併用により抗腫瘍効果が得られる可能性があることが示された。
CATV既設地域における住民の情報行動に関する調査研究ー滋賀県水口町及び奈良県生駒市周辺地域の場合ー

本研究は、CATV既設地域における住民の情報行動に関する2年計画の調査研究であるが、前年度の滋賀県甲賀郡水口町に続いて今年度は奈良県生駒市をその調査対象地とした。今年度も、先ず、その地域特性あるいはコミュニケ-ション・情報行動などに関わる文献資料などの収集に努め、さらに、この研究の基本調査である住民に対する大量調査を実施するため、何回か現地視察を行なうと共に、市役所などの機関を訪問し調査実施の協力を依頼した。それと平行して調査票の作成や印刷、その他の準備を行ないつつ調査員の確保とその訓練を行なった。その後、8月には調査員と共に現地におよそ1週間滞在し、調査票の配布と回収の作業を実施した。10月には、調査票の整理とそのコ-ディングやカ-ド・パンチの作業にかかり、平成3年1月に入ってその計算機処理を行なった。平成3年2月からそのデ-タについて検討を開始したが、目下前回の現地調査の資料等を加えて全体的な検討を行なっているところである。部分的には今後も資料の補充や現地訪問の必要性があると考えている。今年度の基本調査の結果を概観すれば、今回の調査対象地域は大都市に隣接する典型的なベッド・タウンで、被調査者の情報行動にみる限り、各種のメディア接触も活発で情報の利用やニ-ズが相当に高いことを見て取ることができるようである。昨年度、設備備品として導入したパ-ソナル・コンピュ-タは機動性がある、こうしたフィ-ルド調査を伴う研究にはやはり有効であった。本研究は、CATV既設地域における住民の情報行動に関する2年計画の調査研究であるが、今年度は滋賀県甲賀郡水口町を調査対象地として選定した。平成元年度当初から、先ず、地域的コミュニケ-ション・情報行動などに関する文献の収集を実施し、次いでその地域特性に関わる文献・資料・統計の収集に努めた。さらに、この研究の基本調査である住民に対する大量調査を実施するため、何回かの現地視察を行なうと共に、町役場などの機関を訪問し調査実施の協力を依頼した。9月には、調査票の整理とそのコ-ディングやカ-ド・パンチの作業にかかり、12月に入ってその計算機処理を行なった。平成2年1月からそのデ-タについての検討を開始したが、目下補完調査の資料等を加えて全体的な検討を行なっているところであるが、部分的には今後も多少資料の補充や現地訪問の必要性があると考えている。基本調査の結果を概観する限り、大都市通勤圏化してきているとはいえ、被調査者の情報行動にみる限り、傾向としてはやはり地方小都市ないし農村的性格を見て取ることができるようである。ただ、町全体を対象地とした基本調査では被調査者が町全域に分散することとなり、調査実施上の困難があったことは、次年度の調査設計上考慮すべき点である。また、対象地についてはその性格を把握するのに重要な近年の文献が少ないことも一つの問題である。設備備品として申請したパ-ソナル・コンピュ-タは機動性があり、こうしたフィ-ルド調査を伴う研究には必須のものであると痛感した。今年度も、先ず、地域およびコミニュケ-ション・情報行動などに関わる文献の収集を実施し、次いでその地域特性に関わる資料などの収集に努めた。さらに、この研究の基本調査である住民に対する大量調査を実施するため、何回か現地視察を行なうと共に、市役所などの機関を訪問し調査実施の協力を依頼した。それと平行して調査票の作成や印刷、その他の準備を行ないつつ調査員の確保とその訓練を行った。

その後、8月には調査員と共に現地におよそ1週間滞在し、調査票の配布と回収の作業を実施した。10月には、調査票の整理とそのコ-ディングやカ-ド・パンチの作業にかかり、平成3年1月に入ってその計算機処理を行なった。平成3年2月からそのデ-タについて検討を開始したが、目下前回の現地調査の資料等を加えて全体的な検討を行なっているところである。部分的には今後も資料の補充や現地訪問の必要性があると考えている。今年度の基本調査の結果を概観すれば、今回の調査対象地域は大都市に隣接する典型的なベッド・タウンで、被調査者の情報行動にみる限り、各種のメディア接触も活発で情報の利用やニ-ズが相当に高いことを見て取ることができるようである。ただ、昨年度は、被調査者が調査対象地域全体に分散し、調査実施上の困難があったため、今年度はその点に留意して、市内の幾つかの地域を選定して調査を実施した。昨年度、設備備品として導入したパ-ソナル・コンピュ-タは機動性があり、こうしたフィ-ルド調査を伴う研究にはやはり有効であった。ただ、この地域でも対象地の性格を把握するのに必要な近年の文献が非常に少ないことが一つの問題であることを記しておきたい。
ブリリアントブルー花色植物と新規レポーター遺伝子の開発

放線菌BPSAタンパク質は、グルタミンを基質とし単独で青色色素であるindigoidineを生産する。ただし、その活性化にはPPTaseによる修飾が必要である。放線菌のゲノムは極端にGCリッチであり、コドン使用頻度に大きな偏りがあることから、コドンをシロイヌナズナの使用頻度に合わせて改変した人工遺伝子を作成、大腸菌に両遺伝子を導入した結果、大腸菌は青色呈色を示した。次に、この改変型遺伝子を植物体に形質転換したが、幼苗の胚軸や花弁ともに青色呈色は確認されなかった。これらのタンパク質が植物体内で作用するには、コドン使用頻度以外の要素の改善が必要と考えらた。放線菌Streptomyces lavendulaeのnon-ribosomalpeptide synthetaseのひとつであるBPSAタンパク質は、グルタミンを基質とし単独で青色色素であるindigoidineを生産する。しかしながら、その活性化にはphosphopantethein transferase(PPTase:ホスホパンテテン転移酵素)による修飾(セリン基へのホスホパンテテン付加)が必要である。したがって、植物体でindigoidineを生産させるには放線菌のPPTase(SVP)遺伝子も同時に導入する必要がある。まず放線菌のBPSAとSVPをCaMV35Sプロモーターでドライブすることにより高発現させるコンストラクトを作成し、シロイヌナズナに形質転換した。しかし、幼苗、花ともに青色呈色は見られなかった。放線菌のゲノムは極端にGCリッチであり、コドン使用頻度に大きな偏りがあることから、シロイヌナズナではmRNAが発現してもタンパク質が効率的に翻訳されない可能性が考えられた。そこでコドンをシロイヌナズナの使用頻度に合わせて改変した人工遺伝子を作成した。まず、大腸菌にコドン使用頻度を改善した両遺伝子を導入したところ、大腸菌は青色呈色を示したことから、改変型BPSAとSVPは正常に機能することが示された。次に、この改変型遺伝子をCaMV35Sプロモーターでドライブしたキメラ遺伝子を植物体に形質転換した。しかしながら、幼苗の胚軸および花弁では青色呈色は確認されなかった。花弁特異的プロモーターを用いても同様であった。さらに、それぞれに葉緑体移行シグナルを付加し、葉緑体にターゲットされた形で発現させたが、やはり青色呈色は見られなかった。これらのタンパク質が植物体内で作用するには、コドン使用頻度の違い以外の要素の改善が必要と考えられた。まず、この改変型BPSAとPPTaseが青色色素を合成する能力があることを確かめるため、大腸菌に両遺伝子を導入し、IPTG誘導的に発現させた。その結果、大腸菌は青色呈色を示したことから、改変型BPSAとSVPは正常に機能することが示された。現在のところ幼苗(胚軸など)での青色呈色は確認できておらず、今後、花等での呈色を確認する。また、CaMV35Sプロモーター以外のプロモーターによりドライブさせたコンストラクトとその形質転換体も作成した。予定した実験は計画通り進んでいるが、植物体内での青色色素の生産は認められていない。これまで作成した形質転換体の表現型・導入遺伝子の発現を確認する。また花弁特異的なプロモーターによりドライブしたコンストラクトを作成するとともに、プラスチドなど基質であるグルタミンが存在するオルガネラへターゲットさせるコンストラクトなどを作成し、形質転換を行うなど、複数の方法で問題の克服を試みる。

分子生物学的実験を中心とした研究を進めることから、消耗品費として1,940,456円(内訳:分子生物学用試薬1,140,456円、プライマー・その他試薬600,000円、ガラス・プラスチック類200,000円)、またDNAシーケンス(その他)に300,000円を使用する予定である。
水素プラズマアークを利用したチタン融体からの酸素除去：300ppmへの挑戦

チタンの用途開拓を阻む原因がその高コストにあることは広く共有されている。不純物元素として酸素を多く含有する市中のチタンスクラップやB級スポンジチタンをチタン部材の溶解原料として利用できればチタンの低コスト化のために有効である。そこで、チタン部材製造に必須の溶解プロセスへの酸素除去機能付与を目的として、チタン融体の水素プラズマ溶解に関する研究を行った。平成30年度の進捗は以下のとおりである。(1)チタン融体の熱流動解析:プラズマアーク溶解における融体撹拌状況と融体温度分布の把握を目的に計算を行った。ソフトとしてはFluent(V19.2)を使用し、チタン融体質量を250gおよび500g、融体表面に対しての入熱を均一および不均一とした条件で、溶融域、融体の温度分布、チタン融体の流れを明らかにした。(2)融体撹拌の検討:(1)の結果から溶解条件がチタン融体の流れには影響しないこと、撹拌は十分に行われていることが明らかになったので、本年度は融体撹拌の検討は行わなかった。(3)水素プラズマアーク溶解(第1段プロセス)における水素濃度測定: 2018年度の主な検討課題である。まず、2017年度までは半定量方法であった水素濃度測定を定量方法に変更して、より正確なチタン融体中の水素濃度を定量できるようにした。その後、初期酸素濃度、プラズマ中の水素分圧、プラズマガス流量、溶解時間、プラズマ電流、冷却方法がチタン融体中の水素濃度に及ぼす影響を明らかにした。これらの結果を基礎として、脱酸剤として機能する融体中水素濃度を最適化(最大化)する第1段プロセス条件を確立することができた。(4)チタンインゴット中の酸素定量分析に関する検討:EPMAを使用した方法でチタン中の酸素濃度が0.2mass%以上であれば定量分析が可能であることが分かった。(イ)「(1)チタン融体の熱流動解析」および「(2)融体撹拌の検討」に関しては、2018年度に十分な成果が得られたと考えている。チタン融体の表面温度や融体の流れ、加えてそれらの及ぼすプラズマ溶解条件の影響が明らかになったことで、プラズマ溶解条件設定や酸素・水素分析位置に関する知見が得られた。(ロ)「(3)水素プラズマアーク溶解(第1段プロセス)における水素濃度測定」に関しても十分な成果が得られている。初期酸素濃度と水素濃度に関しての知見は水素プラズマ溶解の可能性とともに限界に関しても示唆しており、従来報告されているチタンおよびチタン酸化物の水素プラズマ溶解を統一的に説明できるものと評価している。第2段プロセスでのチタン融体からの酸素除去は物質収支に支配されるので、第1段プロセスで十分な水素をチタン融体中に導入することが必要である。チタン融体中の水素濃度と水素プラズマ溶解条件の関係を調査したことで、初期酸素濃度が一定の条件下ではプラズマガス中の水素分圧がチタン融体中の水素濃度に最も大きな影響を及ぼすことを明らかにした。これらの知見により次年度以降の第1段プロセス条件を設定することができた。(ハ)挑戦的なテーマでありながら、論文をMetallurgical and Materials Transactions Bに投稿し受理された。1年目にして大きな成果をあげることができた。(ニ)従来の酸素分析は不活性ガス融解-赤外吸収法を用いていたが、広い領域を分析するのは膨大な時間と手間が必要で現実的に不可能であった。EPMA分析直前に表面処理を行うことで、酸素濃度の下限値に限度はあるもののEPMAを基礎とした分析手法を確立できたことは大きな進捗である。以上より、当初の計画に加えて(ハ)および(ニ)の進捗があったことから当初の計画以上の進展と判断した。2019年度は最終年度であり、当初目的に設定した「(4)アルゴンプラズマアーク溶解(第2段プロセス)における脱酸レベルの把握」および「(5)酸素除去機構および最適プロセスの提案」に注力する。「(4)アルゴンプラズマアーク溶解(第2段プロセス)における脱酸レベルの把握」に関しては、2018年度に確立した最適第1段プロセス条件を使用した「水素プラズマアーク溶解とそれに続くアルゴンプラズマアーク溶解からなる二段階法」を用いた酸素除去を検討する。第2段プロセスの溶解時間、プラズマガス流量、プラズマ出力、プラズマトーチ-融体表面間距離などの溶解パラメータが脱酸レベルに及ぼす影響を検討する。加えて、初期酸素濃度が脱酸レベルに及ぼす影響を明らかにする。チタン融体表層域の酸素濃度の低下に着目するのは当然であるが、融体中の酸素濃度分布も把握しながら研究を進める。それらを通して、脱酸レベルのみではなく脱酸領域までを考慮したプロセス設計を行いたいと考えている。最終的な目的として設定した「(5)酸素除去機構および最適プロセスの提案」に関しては(イ)酸素除去の熱力学的考察は現在も進めており、極めて新規性の高い脱酸原理を提案することになるので脱酸機能の図的表現方法まで含めて検討する、(ロ)300mass ppmの脱酸レベルを可能とするプロセス条件を提案する。加えて、産業界との連絡を密にしながら工業的に必要な脱酸レベルを達成するためのプロセスも検討する。上記データを中心とした論文の投稿や学会発表などの活動に加えて知財化も積極的に推進する予定である。

不純物元素として酸素を多く含有する市中のチタンスクラップやB級スポンジチタンをチタン部材の溶解原料として利用できればチタンの低コスト化のために有効である。そこで、チタン部材製造に必須の溶解プロセスへの酸素除去機能付与を目的として、チタン融体の水素プラズマ溶解に関する研究を行った。平成30年度の進捗は以下のとおりである。(1)チタン融体の熱流動解析:プラズマアーク溶解における融体撹拌状況と融体温度分布の把握を目的に計算を行った。ソフトとしてはFluent(V19.2)を使用し、チタン融体質量を250gおよび500g、融体表面に対しての入熱を均一および不均一とした条件で、溶融域、融体の温度分布、チタン融体の流れを明らかにした。(2)融体撹拌の検討:(1)の結果から溶解条件がチタン融体の流れには影響しないこと、撹拌は十分に行われていることが明らかになったので、本年度は融体撹拌の検討は行わなかった。(3)水素プラズマアーク溶解(第1段プロセス)における水素濃度測定: 2018年度の主な検討課題である。まず、2017年度までは半定量方法であった水素濃度測定を定量方法に変更して、より正確なチタン融体中の水素濃度を定量できるようにした。その後、初期酸素濃度、プラズマ中の水素分圧、プラズマガス流量、溶解時間、プラズマ電流、冷却方法がチタン融体中の水素濃度に及ぼす影響を明らかにした。これらの結果を基礎として、脱酸剤として機能する融体中水素濃度を最適化(最大化)する第1段プロセス条件を確立することができた。(4)チタンインゴット中の酸素定量分析に関する検討:EPMAを使用した方法でチタン中の酸素濃度が0.2mass%以上であれば定量分析が可能であることが分かった。(イ)「(1)チタン融体の熱流動解析」および「(2)融体撹拌の検討」に関しては、2018年度に十分な成果が得られたと考えている。チタン融体の表面温度や融体の流れ、加えてそれらの及ぼすプラズマ溶解条件の影響が明らかになったことで、プラズマ溶解条件設定や酸素・水素分析位置に関する知見が得られた。(ロ)「(3)水素プラズマアーク溶解(第1段プロセス)における水素濃度測定」に関しても十分な成果が得られている。初期酸素濃度と水素濃度に関しての知見は水素プラズマ溶解の可能性とともに限界に関しても示唆しており、従来報告されているチタンおよびチタン酸化物の水素プラズマ溶解を統一的に説明できるものと評価している。第2段プロセスでのチタン融体からの酸素除去は物質収支に支配されるので、第1段プロセスで十分な水素をチタン融体中に導入することが必要である。チタン融体中の水素濃度と水素プラズマ溶解条件の関係を調査したことで、初期酸素濃度が一定の条件下ではプラズマガス中の水素分圧がチタン融体中の水素濃度に最も大きな影響を及ぼすことを明らかにした。これらの知見により次年度以降の第1段プロセス条件を設定することができた。(ハ)挑戦的なテーマでありながら、論文をMetallurgical and Materials Transactions Bに投稿し受理された。1年目にして大きな成果をあげることができた。(ニ)従来の酸素分析は不活性ガス融解-赤外吸収法を用いていたが、広い領域を分析するのは膨大な時間と手間が必要で現実的に不可能であった。
減数分裂の成り立ちと本質の理解～ミジンコの単為発生卵の形成機構解析から迫る～

本研究では、ミジンコの単為発生卵形成でみられる「減数しない減数分裂」が、減数分裂をどのように改変させたものなのかを明らかにすることを目的に、次の2点から研究を進めてきた。まず1点目は、ゲノム編集基盤を確立することで、1分裂装置の構成因子を蛍光タンパク質により可視化することで染色体の動態を詳細に解析する、2分裂時の染色体構築や分離/分配に関わる因子のノックアウト/ノックインにより機能解析を行うことを目指した。ゲノム編集基盤については、TALENとCRISPR/Cas9では利用できる派生技術が異なるため、TALENに続きCRISPR/Cas9によるノックアウト法も確立した(Hiruta et al., 2018)。さらに、両手法を用いたノックイン法とそれに続く時期/組織特異的な遺伝子発現制御法の確立を進めており、現状と課題について日本動物学会大会で報告した。残念なことに北海道胆振東部地震による停電によって、冷蔵冷凍品がすべて室温まで上昇し、合成したmRNAなどの試薬は使用に不適切な状態になった。そのため実験の再開に時間を要したことから、レポーターミジンコの作出および分裂を制御する因子の機能解析は引き続き実験中である。2点目は、単為発生卵形成時の分裂を人為的に制御することを目指し、Mos-MAPK経路に着目して研究を進めた。リン酸化MAPK抗体を用いた免疫染色により、各分裂過程におけるMAPKの活性化状態を解析し、第1減数分裂に相当する時期でのみ活性化することが明らかになった。さらにMEK阻害剤のU0126処理により、Mos-MAPK経路の不活性化が認められたので詳細を解析中である。単為生殖種は、卵形成に必須である減数分裂機構を獲得してからそれぞれの分類群において独立に単為発生機構を獲得している。本研究では、その単為発生機構を「体細胞分裂から減数分裂への進化に至る疑似的な中間段階」とみなすことで、単為発生機構の研究から減数分裂の成立過程と本質に迫ることを目指している。今回研究対象とするミジンコの単為発生卵形成でみられる「減数しない減数分裂」の過程が減数分裂をどのように改変させたものなのかを明らかにする事を目的に、次の2点からアプローチを行った。まず1点目は、ミジンコの単為発生卵が形成される過程の分裂装置の動態を詳細に解析するために、分裂装置を構成する標的タンパク質の下流にEGFPを挿入したレポーターミジンコの作出を目指した。標的染色体領域への正確な遺伝子挿入が可能なシステムであるTAL-PITCh法を用いたが、導入するドナーベクター内のカセットの種類や濃度などの条件検討に時間を要した。これらをゲノム編集学会にて報告し、得られた有益な情報を参考にミジンコでノックイン法が機能するよう、ドナーとしてPCR産物を用いるなど代替法も取り入れながら問題解決に取り組んでいる。2点目は、卵形成時の分裂の制御を目指して、脊椎および無脊椎動物においてその関与が報告されているMos-MAPK経路に着目した。すでにミジンコにおいてもMAPKの活性化/不活性化が分裂の停止/進行へ関与することを示唆する予備実験結果が得られている。そこで、Mos-MAPK経路の阻害剤処理により、人為的に分裂が制御できるか実験した。その結果、阻害剤はミジンコにも効果的であることが示唆されたが、安定的な結果を得るに至っていない。現在、阻害剤処理の濃度や時間などの条件検討と共に、リン酸化MAPK抗体を用いた免疫染色により各分裂過程でのMAPKの活性化状態の詳細な解析を進めている。以下2点の理由で進捗がやや遅れている。1点目は、所属機関の変更による使用実験機器の移送に伴い実験を一部停止したため。2点目は、単為発生機構の解析方法として、卵形成時の分裂に関わるタンパク質を蛍光標識した個体を作出する予定であったが、そのノックイン法の確立に課題が生じ、解決のための時間を要しているため。本研究では、ミジンコの単為発生卵形成でみられる減数分裂を一部改変した機構について、どの過程をどのように改変させたものなのかを明らかにすることを目的に研究を進めている。昨年度より、ミジンコの単為発生卵が形成される過程の分裂装置の動態を詳細に解析するために、分裂装置を構成する標的タンパク質の下流に蛍光タンパク質を挿入したレポーターミジンコの作出を目指してきた。標的染色体領域への正確な遺伝子挿入が可能なシステムであるTAL-PITCh法の条件検討に時間を要していたため、CRIS-PITCh法も視野に入れて、CRISPR/Cas9を用いた実験系の確立を並行して実施したところ、ノックアウト法が機能したので国際誌に投稿し、受理された(Hiruta et al., in press)。引き続き、ノックイン(TAL-PITChおよびCRIS-PITCh)法が機能するか検証を行っているところである。また、昨年度に引き続き単為発生卵が形成される際の減数分裂細胞周期の制御について、Mos-MAPK経路に着目した解析を進めた。リン酸化MAPK抗体による卵の免疫染色により第1減数分裂に相当する時期でMAPKが活性化し、前後の時期に相当する卵核胞崩壊期と第2減数分裂に相当する時期では活性化は見られなかった。これは、MAPKの活性化により第1減数分裂の停止が引き起こされ、不活性化により細胞周期が再開する機構の関与を示唆するものである。さらに、Mos-MAPK経路の阻害剤処理により、人為的な分裂の制御を試みているところである。

所属機関の異動により、研究遂行に必須の実験機器のうち代替品のない機器のリース契約開始が7月になったことに伴い実験の再開まで時間を要したため。本研究では、ミジンコの単為発生卵形成でみられる「減数しない減数分裂」が、減数分裂をどのように改変させたものなのかを明らかにすることを目的に、次の2点から研究を進めてきた。まず1点目は、ゲノム編集基盤を確立することで、1分裂装置の構成因子を蛍光タンパク質により可視化することで染色体の動態を詳細に解析する、2分裂時の染色体構築や分離/分配に関わる因子のノックアウト/ノックインにより機能解析を行うことを目指した。ゲノム編集基盤については、TALENとCRISPR/Cas9では利用できる派生技術が異なるため、TALENに続きCRISPR/Cas9によるノックアウト法も確立した(Hiruta et al., 2018)。さらに、両手法を用いたノックイン法とそれに続く時期/組織特異的な遺伝子発現制御法の確立を進めており、現状と課題について日本動物学会大会で報告した。残念なことに北海道胆振東部地震による停電によって、冷蔵冷凍品がすべて室温まで上昇し、合成したmRNAなどの試薬は使用に不適切な状態になった。そのため実験の再開に時間を要したことから、レポーターミジンコの作出および分裂を制御する因子の機能解析は引き続き実験中である。2点目は、単為発生卵形成時の分裂を人為的に制御することを目指し、Mos-MAPK経路に着目して研究を進めた。リン酸化MAPK抗体を用いた免疫染色により、各分裂過程におけるMAPKの活性化状態を解析し、第1減数分裂に相当する時期でのみ活性化することが明らかになった。さらにMEK阻害剤のU0126処理により、Mos-MAPK経路の不活性化が認められたので詳細を解析中である。ノックイン法については、現状で考え得る解決方法に取り組んでいるところである。さらに、解決しない場合も想定して、TALENだけではなくCRISPR/Cas9を利用したノックイン法にも並行して取り組む予定である。本研究の要となる蛍光タンパク質をノックインしたレポーターミジンコの作出を早急に行っていく。なお、ミジンコのノックイン法の確立は報告されていないので、方法論を国際誌に投稿する。そして解析に足る個体が作出され次第、単為生殖機構の詳細な解析を進めていく予定である。また、並行してMos-MAPK経路の阻害および活性化によって、人為的に単為発生機構を制御することで、その詳細な機構を明らかにしていく。所属機関の変更および実験計画の遅れにより、当初の使用計画から変更が生じたため。(理由)所属機関の異動により、1)研究遂行に必須の実験機器のうち代替品のない機器のリース料が発生したため、および2)実験計画の遅れにより、当初の使用計画から変更が生じたため。(使用計画)まず、研究遂行に必須の実験機器についてのリース費用に充当する。さらに、ノックイン法に必要なゲノム編集用の試薬・消耗品へ充当する。その後は、単為生殖様式の分子メカニズム解析に必要な試薬、消耗品、飼育器具に充当する。また、成果報告のための学会参加や論文校正および投稿費用にも支出する予定である。
フランス「公共経済学」の成立-フランス古典派の展開と公共性

フランスの古典経済学はケネーの経済学を中心に把握されてきたし、チュルゴの経済学にその発展と継承を見るのが通例である。しかし、フランス経済学にはグルネ・サークルに代表されるもう一つの系譜があり、それはチュルゴの王政改革の実践以降、独自の経済学を成立させるのであって、これをフランス「公共経済学」と呼ぶことができる。チュルゴ改革は、「憲政」の樹立を掲げたが、これに照応する経済社会像を描くべく、1780年代に、コンドルセ、レドレル、シエースなどが、「公共経済学」を構想した。彼らは、アダム・スミスの『国富論』特にその分業論を摂取し、これを基礎の生産の科学としての経済学を構想し、さらにこれを、公共圏と近代国家の導出の論理構想に結び付けようとした。彼らの理論は、フランス革命期初期のコンドルセとシエースの政治理論の土台として機能し、続く総裁政府期において、レドレルやデスチュット・ド・トラッシなどのいわゆるイデオローグの理論的中核を構成し、この時期のかれらによる近代的改革のヴィジョンと実践を支えた。さらに、この「公共経済学」は、セー経済学の成立にも寄与し、ナポレオン帝政期と復古王政期の自由主義的改革理論として機能し、19世紀フランス自由主義の経済思想の母胎という意義も担ったと考えられる。以上のように、フランス古典経済学の展開過程の中に、「公共経済学」の成立と展開を読み取り、これを、むしろ古典経済学のフランス的展開の独自性を示すものとして、明示したのが、本研究の成果と考える。本研究は、チュルゴ改革期以降のコンドルセ、革命期初期のシエース、総裁政府期以降のレドレルを中心に、個別分析を行い、以上のように「公共経済学」の系譜を明らかとしたが、それぞれの個別分析についても先駆的研究となったと考える。アベ・シエースの経済理論の分析をおこなった。シエースに『著作集』、特にシエースの『政治論集』を中心に、革命前夜から革命期のシエースの経済理論を取り出す作業をおこなった。これまで重農主義からの影響を中心に研究されてきたシエースの経済理論は、むしろエコノミストさらにはイギリス経済学の影響を極めて大きく受けていることが明らかとなってきた。本研究のもう一人の中心的対象であるレドレルと同じく、革命以前に、シエースはアダム・スミス『国富論』の経済学の研究をおこない、重農主義ではなく、スミスの経済社会像を政治論の基礎に据えようとしていた。特にスミス分業論はシエースの注意をひいており、彼は、コンドルセとともに、分業論を社会政治論の基本概念に取り入れようとしていた。スミス分業論のフランスへの導入は重農主義者ジェルマン・ギャルニエによってなされたという通説を修正することができると思われる。本年度は体調不良でシエースについてのパリでの資料収集ができなかったが、シエース経済理論の基本的な分析は終えることができたので、次年度に資料収集により補足研究を追加したい。今年度の分析の限りでもシエースの理論から公共経済学とよぶべき潮流の存在を明らかにできると思われる。次年度はレドレルとコンドルセの分析を加えこの潮流を確定できるようにしたい。レドレルの経済理論の分析をおこなった。レドレルの主要著作、特に、動産と不動産の対抗を基準とする経済理論を中心に、革命前夜から革命期のレドレルの経済理論を取り出す作業をおこなった。これまで重農主義との対抗という観点を中心に研究されてきたレドレルの経済理論を、エコノミストさらにはイギリス経済学の影響に引きつけて再構成した。

本研究のもう一人の中心的対象であり昨年検討したシエースと同じく、革命以前に、レドレルも、アダム・スミス『国富論』の経済学の研究をおこない、重農主義ではなく、スミスの経済社会像を基礎に近代的政治論を組み立てようとしていた。スミス分業論にはシエースやコンドルセほど注意を引いていないが、レドレルは資本と労働の関係について、シエースやコンドルセにみられない執着し検討を繰り返している。スミスのフランスへの導入が、幅広い層によって、多様な論点においてなされたという状況が明らかとなったと思われる。本年度もパリでの資料収集ができなかったが、シエースとレドレルの経済理論の基本的な分析は終えることができたので、次年度に資料収集により補足研究を追加したい。今年度の分析でもフランス公共経済学とよぶべき潮流の存在を一層明らかにできたと思われる。次年度は、コンドルセの分析を加えこの潮流を確定し、研究の総括をおこないたい。残存課題を消化し、研究全体の総括を行った。フランスの古典経済学はケネーの経済学を中心に把握されてきたし、チュルゴの経済学にその発展と継承を見るのが通例である。しかし、フランス経済学にはグルネ・サークルに代表されるもう一つの系譜があり、それはチュルゴの王政改革の実践以降、独自の経済学を成立させるのであって、これをフランス「公共経済学」と呼ぶことができる。チュルゴ改革は、「憲政」の樹立を掲げたが、これに照応する経済社会像を描くべく、1780年代に、コンドルセ、レドレル、シエースなどが、「公共経済学」を構想した。彼らは、アダム・スミスの『国富論』特にその分業論を摂取し、これを基礎の生産の科学としての経済学を構想し、さらにこれを、公共圏と近代国家の導出の論理構想に結び付けようとした。彼らの理論は、フランス革命期初期のコンドルセとシエースの政治理論の土台として機能し、続く総裁政府期において、レドレルやデスチュット・ド・トラッシなどのいわゆるイデオローグの理論的中核を構成し、この時期のかれらによる近代的改革のヴィジョンと実践を支えた。さらに、この「公共経済学」は、セー経済学の成立にも寄与し、ナポレオン帝政期と復古王政期の自由主義的改革理論として機能し、19世紀フランス自由主義の経済思想の母胎という意義も担ったと考えられる。以上のように、フランス古典経済学の展開過程の中に、「公共経済学」の成立と展開を読み取り、これを、むしろ古典経済学のフランス的展開の独自性を示すものとして、明示したのが、本研究の成果と考える。本研究は、チュルゴ改革期以降のコンドルセ、革命期初期のシエース、総裁政府期以降のレドレルを中心に、個別分析を行い、以上のように「公共経済学」の系譜を明らかとしたが、それぞれの個別分析についても先駆的研究となったと考える。
患者由来iPS細胞の腎分化系を用いたARPKDの病態モデル作製

ヒトiPS細胞から前方中間中胚葉とウォルフ管(中腎管)の細胞を70%以上の高効率で分化誘導し、さらにゲルの中での三次元培養を行うことで発芽と分岐を示し、尿管芽のマーカー遺伝子であるGATA3, RET, CK19, PAX2, CALB1などを発現する尿管芽様組織を作製する分化誘導法を確立した。さらに、ARPKD患者体細胞から樹立したiPS細胞株を本分化誘導法により尿管芽様組織に分化することにも成功し、現在、健常人由来iPS細胞から作製した尿管芽組織との比較を行い、尿管芽の段階でARPKDに生じる異常の有無と集合管へのさらなる分化誘導を行っている。腎臓に進行性に多数の嚢胞を形成し腎機能不全を引き起こす、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)や常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)などの嚢胞性腎疾患の病態機序の解明や根治的治療薬の開発研究の進展が期待されている。また、難治性疾患の患者体細胞から樹立される疾患特異的iPS細胞を病気で傷害される細胞種に分化誘導することによって病態を再現する疾患モデルを作製する研究が盛んに行われている。本研究では、特にARPKDに着目し、ヒトiPS細胞から同疾患で傷害される腎細胞種である胎生期腎臓の尿管芽細胞とそれより派生する集合管細胞への高効率分化誘導法を確立する。そして、ARPKD患者由来iPS細胞をそれらの傷害腎細胞種へ分化誘導することによって、ARPKDの腎嚢胞形成を再現する新規の疾患モデルの開発を目指す。最終目標として、新規の治療標的分子となりうる病態関連分子の同定や腎嚢胞形成を模倣する培養系を構築することによって、腎嚢胞形成を阻害する治療薬のスクリーニング系開発に繋げる。平成27年度は、前年度までに開発した低効率のヒトiPS細胞から中腎管細胞を経た尿管芽細胞への分化誘導における増殖因子の組み合わせ、濃度、タイミング、処理期間のさらなる検討を行うことで、高効率な尿管芽細胞の分化誘導法を確立し、マウス胎児の後腎間葉との共培養などの機能試験を開始した。ARPKDなどの嚢胞性腎疾患に対する疾患モデル作製のためには、ヒトiPS細胞から中間中胚葉、中腎管を経て尿管芽を選択的に分化誘導することが重要である。申請者らは、本研究開始までに尿管芽細胞を40%程度の効率にて分化誘導する方法を開発していた。その培養法においては、中間中胚葉および尿管芽の前段階である中腎管細胞までは二次元の平面培養であるが、その後に、細胞塊を形成し三次元培養を行うことが必要であるため分化誘導効率が高くなく、その改良により分化誘導効率を向上させることを目標に掲げ研究を実施した。研究開始当初、中腎管から尿管芽細胞への誘導効率を向上させるため、このステップを二次元培養に改良することをさまざまな増殖因子の組み合わせ処理を行って検討したが誘導効率は改善しなかった。そのため、その他の原因を検討したところ、最初の原始線条を誘導するステップにおいて中内胚葉である原始線条に加えて外胚葉の細胞が形成されているためであることが判明した。そして、最初の原始線条を誘導するステップとしてアクチビンとWnt経路の活性化剤であるCHIR99021を用いていたが、外胚葉への誘導を抑えるための増殖因子の組み合わせを複数検討し、外胚葉の混入を減少させる方法を開発したところ尿管芽細胞の誘導効率が80%以上となった。この尿管芽細胞の誘導効率向上に計画以上の時間を要したため、平成27年度のもう一つの研究プロジェクトである集合管細胞のマーカー遺伝子であるAQP2のレポーターヒトiPS細胞株の樹立が遅れた。レポーター細胞株の樹立のためにCRISPR/Cas9システムを用いることに決定後にターゲティング戦略を考案し、ガイドRNAの設計を完了し現在樹立を続けている。本研究では、特にARPKDに焦点を絞り、ヒトiPS細胞から同疾患で傷害される腎細胞種である胎生期腎臓の尿管芽細胞とそれより派生する集合管細胞への高効率分化誘導法を確立する。そして、ARPKD患者由来iPS細胞をそれらの傷害腎細胞種へ分化誘導することによって、ARPKDの腎嚢胞形成を再現する新規疾患モデルの開発を目指す。平成28年度は、前年度までに開発した分化誘導法を用いて尿管芽細胞を作製し、マウス胎仔の後腎間葉や既報を用いてヒトiPS細胞から分化誘導したネフロン前駆細胞の細胞塊との共培養を行ったが、相互に分化を促進する発生学的機能が認められなかった。このため、発生機構をより忠実に再現することを試み、尿管芽を派生させる前方中間中胚葉と中腎管を選択的に分化誘導する方法を確立し、現在、中腎管から尿管芽への分化誘導を行っている。

ARPKDなどの嚢胞性腎疾患に対する疾患モデル作製のためには、ヒトiPS細胞から中間中胚葉、中腎管を経て尿管芽を選択的に分化誘導することが重要である。申請者らは、本研究開始までに尿管芽細胞を40%程度の効率にて分化誘導する方法を開発していた。平成27年度に分化誘導法の改良を行い、尿管芽細胞の誘導効率を80%以上に向上させた。平成28年度には、前年度に開発した方法を用いて尿管芽細胞を作製し、マウス胎仔の後腎間葉や既報を用いてヒトiPS細胞から分化誘導したネフロン前駆細胞の細胞塊との共培養を行ったが、相互に分化を促進する尿管芽としての発生学的機能が認められなかった。そのため、発生機構をより忠実に再現することを試み、FGFおよびTGFbシグナルを調節することで、それぞれ外胚葉と内胚葉細胞への分化を抑制し、さらに側板中胚葉と沿軸中胚葉細胞の混入を抑え、尿管芽を派生させる前方の中間中胚葉を選択的に分化誘導し、そこから中腎管を分化誘導する方法を確立した。そして、現在、中腎管細胞から尿管芽細胞への分化誘導を行っている。上記のとおり尿管芽細胞の誘導法改良に計画以上の時間を要したため、平成27年度から開始している集合管細胞のマーカー遺伝子であるAQP2のレポーターヒトiPS細胞株の樹立に関しては、現在ターゲティングベクターの作製を行っている。腎臓に進行性に多数の嚢胞を形成し腎機能不全を引き起こす、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)や常染色体劣性多発性嚢胞腎(ARPKD)などの嚢胞性腎疾患の病態機序の解明や根治的治療薬の開発研究の進展が期待されている。また、難治性疾患の患者体細胞から樹立される疾患特異的iPS細胞を病気で傷害される細胞種に分化誘導することによって病態を再現する疾患モデルを作製する研究が盛んに行われている。本研究では、特にARPKDに焦点を絞り、ヒトiPS細胞から同疾患で傷害される腎細胞種である胎生期腎臓の尿管芽細胞とそれより派生する集合管細胞への高効率分化誘導法を確立する。そして、ARPKD患者由来iPS細胞をそれらの傷害腎細胞種へ分化誘導することによって、ARPKDの腎嚢胞形成を再現する新規疾患モデルの開発を目指す。最終目標として、新規の治療標的分子となりうる病態関連分子の同定や腎嚢胞形成を模倣する培養系を構築することによって、腎嚢胞形成を阻害する治療薬のスクリーニング系開発に繋げる。平成29年度は、前年度までに開発した分化誘導法を改良し、二次元培養にて前方中間中胚葉とウォルフ管(中腎管)を70%以上の高効率で分化誘導し、さらにゲルの中での三次元培養を行うことで分岐を繰り返し、尿管芽のマーカー遺伝子であるGATA3, RET, CK19, PAX2, CALB1などを発現する組織を作製することに成功し、ヒトiPS細胞から尿管芽組織の分化誘導法を確立し論文発表を行った。さらに、ARPKD患者体細胞から樹立したiPS細胞株を本分化誘導法により尿管芽組織に分化することにも成功し、現在、健常人由来iPS細胞から作製した尿管芽組織との比較を行い、尿管芽の段階でARPKDに生じる異常の有無と集合管へのさらなる分化誘導を行っている。ヒトiPS細胞から前方中間中胚葉とウォルフ管(中腎管)の細胞を70%以上の高効率で分化誘導し、さらにゲルの中での三次元培養を行うことで発芽と分岐を示し、尿管芽のマーカー遺伝子であるGATA3, RET, CK19, PAX2, CALB1などを発現する尿管芽様組織を作製する分化誘導法を確立した。