hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インフルエンザウイルスの宿主免疫応答制御機構の解明

インフルエンザウィルスは毎年の様に流行を起こしている。豚由来の新型インフルエンザウィルスが世界中で大流行を起こしたが、鳥由来のウイルス株から新たに発生する可能性も依然として存在しており、公衆衛生上重要な問題となっている。血清中にはインフルエンザウィルス感染を阻害する分子が存在するということが以前より知られていたが、その詳細な分子機構については不明である。我々は、インフルエンザウィルスのHemagglutinin(HA)に結合するヒト血清中の分子について解析することにより、Hemopexin(HPX)を同定した。実際、HAのトランスフェクタントにHPXは特異的に結合した。さらに、インフルエンザウィルス感染時にHPXを加えると、HPXはインフルエンザウィルス(H1N1 New Caledonia/20/99株、H3N2 Panama/2007/99株)の感染を顕著に阻害した。一方、HPXは新型インフルエンザウィルス(H1N1pdm)や鳥インフルエンザウィルス(H5N3)のHAには結合せず、感染も阻害しなかった。また、HPXをシアリダーゼによって処理すると、これらの結合や阻害は認められくなった。他のシアル酸含有血清タンパクではこのような結合、阻害は認められなかったことから、HPX特有のシアル酸の結合あるいは立体構造が予想される。HPXは血清や気道粘液中に含まれている炎症の急性期タンパクであり、血清中のヘム鉄の除去が主要な機能と考えられている分子である。以上より、HPXのインフルエンザウィルス感染阻害能は、抗体非依存性のインフルエンザウィルス防御機構として重要な機能を担っていると考えられる。また、新型インフルエンザウィルスには効果がないことから、HAとHPXとの結合性の有無がインフルエンザウィルス感染時の病態と関連している可能性が考えられた。インフルエンザウイルスに感染した細胞が、ペア型免疫レセプター分子PILRの抑制型であるPILRαに認識されなくなるという現象のメカニズムについて解析を行なった。その結果、PILRαのリガンド認識にもインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)と同様にシアル酸が重要であることが明らかになった。さらにHAとPILRは互いに競合して結合を阻害することが明らかとなり、HAとPILRαは一部に共通のリガンドを有しており、感染細胞上でHAがPILRαリガンドと結合することによってPILRαのリガンド認識が低下していることが考えられた。リガンドが共通であるということは、PILRの細胞膜外領域とIgG-Fcの融合リコンビナント蛋白を培地に予め添加しておくと、インフルエンザウイルスの感染を阻害できることからも裏付けられた。ところが、マウスPILRのリガンドであるmCD99をBaF/3細胞に導入したところインフルエンザウイルスの結合能はほとんど変化せず、にもかかわらず感染率はむしろ低下することが観察された。インフルエンザウイルスが細胞内に侵入するためには他の因子も必要であると考え、目下探索中である。また、HAとPILRが競合するという現象について、in vivoにおける影響を評価するため、PILRノックアウトマウスを用いて解析を行なった。すると、PILRノックアウトマウスではインフルエンザウイルス感染時における体重減少の遷延化が認められた。これは症状の重篤化を反映していると考えられ、そのメカニズムについても現在解析を行なっている。近年では日本でも鳥インフルエンザウイルスの発生が毎年のように起こっており、鳥インフルエンザウイルスと人のインフルエンザウイルスの両方の形質を持つというパンデミックウイルスの出現が危惧されている。また、治療薬であるタミフルに耐性を持つインフルエンザウイルスも報告されており、その割合は今後さらに拡大していくと考えられる。大流行を防ぐため、新たな制御法の開発が重要な課題となっている。インフルエンザウイルスの膜表面分子であるヘマグルチニン(HA)はシアル酸に結合することが知られているが、実際にはある程度の特異性を有している。我々は血清中からHAに結合するものを探索し、ヘモペキシンという分子を見いだした。ヘモペキシンは肝臓で合成される急性期タンパクでヘムに対して最も高い結合能があり、炎症や傷害等によって組織から放出されたヘムの除去、回収に関わっている。ヘモペキシンは予想通りシアル酸に富んだ分子であったが、同じようにシアル酸を多く含む血清中の他の分子と比べてもHAに対して高い親和性を示した。その差異についてはいまだ不明であるがさらに解析を進めていく予定である。ヘモペキシンはインフルエンザウイルスの赤血球凝集試験において凝集を阻害し、培養細胞にインフルエンザウイルスを感染させる際に添加することで感染を阻害することができた。今後その詳しい作用機序やインフルエンザウイルスに対する生体防御における役割について明らかにしていきたい。

他のシアル酸含有血清タンパクではこのような結合、阻害は認められなかったことから、HPX特有のシアル酸の結合あるいは立体構造が予想される。HPXは血清や気道粘液中に含まれている炎症の急性期タンパクであり、血清中のヘム鉄の除去が主要な機能と考えられている分子である。以上より、HPXのインフルエンザウィルス感染阻害能は、抗体非依存性のインフルエンザウィルス防御機構として重要な機能を担っていると考えられる。また、新型インフルエンザウィルスには効果がないことから、HAとHPXとの結合性の有無がインフルエンザウィルス感染時の病態と関連している可能性が考えられた。
オルグネラ表層におけるタンパク質の構造認識と膜透過機能

葉緑体タンパク質において、行き先を指定するシグナル(葉緑体指向シグナル)は、前駆体のアミノ末端に付加された延長ペプチド(トランジットペプチド)に書き込まれていると考えられるが、その具体的な内容は不明である。そこで本研究では、葉緑体のチラコイドのタンパク質であるプラストシアニンのトランジットペプチドの葉緑体指向シグナルを含む1ー43残基のペプチド(PC(1ー43))を新たに化学合成し、その構造と物理的性質を庁べた。PC(1ー43)の円二色性(CD)スペクトルをとったところ、水溶液中では特定の二次構造はとっていないが、SDSやリゾレシチンなどのリン脂質アナログのミセルが存在すると20ー30%のヘリックス構造が誘起されることがわかった。またPC(1ー43)はミトコンドリアタンパク質や分泌タンパク質の延長ペプチドとは異なり、リン脂質のリポソ-ムに結合できず、またリポソ-ムを壊す能力もなかった。ところで実際のプラストシアニンのトランジットペプチドにおいて、葉緑体指向シグナル部分(1ー43残基)の後にはチラコイドへの仕分けシグナル部分(44ー66残基)が続いている。この44ー66残基は疎水的なアミノ酸残基に富んでおり、生体膜への親和性が高いことが期待される。このことを考慮すると、プラストシアニンの葉緑体への局在化は次のようなメカニズムによると考えられる。まずトランジェトペプチドの44ー66残基の疎水性アミノ酸残基の働きによって、細胞内の(様々な)生体膜に運ばれる。次に、生体膜の疎水的環境で1ー43残基に誘起されるヘリックス構造(の上に表示される特定のモチ-フ)が、葉緑体表層の受容体によって認識され、厳密な選別が行なわれる。一次構造が報告されている159のトランジットペプチドについて、ヘリックス構造をとったときに表示されうるモチ-フを検索し、その候補を見いだした。
3次元細胞モデルを使って生体のキラリティーの由来を明らかにする

細胞が集まって器官の形がきまる。研究目的はいくつかの器官のキラル構造を、数理的細胞モデルを使って解明することである。トリやマウス初期胚の心臓形成時にはへリックスループ形成が見られる。これを研究対象とした。はじめは直線状のチューブであった心臓が(1)チューブの腹側で細胞増殖が頻繁に起こり、チューブが「く」の字型に屈曲することと(2)構成要素である細胞がキラルな行動、すなわち分裂時に2娘細胞が互いに逆時計回りに回転移動することでへリックスが形成されることがわかった。心臓のキラリティー発生の問題は、キラルな細胞行動が細胞自体のキラルな性質によるのか、それとも体内の非対称構造によるのかに絞られた。生物の形はおもに遺伝子がきめていると考えられているが、遺伝子から形への道筋がわかり始めた。この道筋では細胞の自己構築を記述する「細胞モデル」が必須の役割を果たす。また、複雑な形態形成は「逐次的自己構築」を考えることで理解することができる。研究の目的は、細胞モデルをつかった研究方法を完備するためにいくつかの新たな手法をつくることと、これらを使っていまだに不思議と感じられる形態形成である「生体のキラリティーの由来」を明らかにすることである。これまで細胞モデルとしては、2次元平面上での多角形の集まりを記述するvertex dynamics (細胞頂点の運動学)および3次元空間での多面体の集まりを記述するvertex dynamicsをつくって使用してきた。今回、多角形の集まりでできた面が3次元空間で自由に変形する細胞シートモデルをつくった。これは3次元多面体モデルに比べて計算量が少なくてすみ、しかも直感的に把握しやすいものである。多細胞動物の形態が上皮シートとよばれる曲面の閉じた袋が基本であることとあいまって使いでのある有力なモデルである。この細胞シートモデルに細胞分裂を導入し、時間と共に細胞数が増加するシステムを作ることができた。またこれまで制約された条件下で行っていたチューブのねじれを、この細胞シートモデルでシミュレーションすることにより、ねじれのメカニズムをより具体的に検討することができるようになった。また、複雑な形態形成は「逐次的自己築」を考えることで理解することができる。前回、多角形の集まりでできた面が3次元空間で自由に変形する細胞シートモデルをつくった。この細胞シートモデルに細胞分裂を導入し、時間と共に細胞数が増加するシステムを作ることはできているが、今回は細胞分裂を行う細胞と行わない細胞を区別し、行う細胞には細胞分裂の方向を、各々の細胞がもつpolarityに従ってきまるようにした。これによりはじめには単純な円柱であったものが、ねじれながら膨らみができるようになった。この形を心臓発生の初期にチューブがループを形成する現象に対応させるよう試みている。生物の形はおもに遺伝子がきめていると考えられている。遺伝子から形への道筋がわかり始めた。/これまで細胞モデルとしては、2次元平面での多角形の集まりを記述するvertex dynamics (細胞頂点の運動学)および3次元空間での多面体の集まりを記述するvertex dynamicsをつくって使用してきた。2次元での数理モデルは、異なった細胞同士が同じ細胞同士よりも強く結合するという、nectin2およびnectin3が絡んだ細胞接着機構が存在するのだが、これの実証のために2次元細胞モデルをつかった研究を論文として公表した。/さらに、多角形の集まりでできた面が3次元空間で自由に変形する細胞シートモデルをつくった。この細胞シートモデルに細胞分裂を導入し、細胞分裂を行う細胞と行わない細胞を区別し、行う細胞には細胞分裂の方向を、各々の細胞がもつpolarityに従ってきまるようにした。これによりはじめには単純な円柱であったものが、膨らみながらねじれができるようになっていた。/今回は、このねじれを実際の心臓の発生と対応するようにできた。すなわち、細胞分裂を行う細胞と行わない細胞は、心臓チューブを形成する左および右の側板中胚葉の遺伝子発現の差異によるとした。また細胞分裂や配置の方向についてのキラリティーを導入した。これにより実際の心臓のねじれと同じものができた。こうして心臓モデルは実験により検証できるモデルになった。

心臓発生初期に見られるループ形成は複雑で、機構の解明は難しい問題だと考えてきたが、これを物理学があつかう座屈現象(限られた空間内で棒が伸張するとき、たわまざるをえない)ととらえ、細胞分裂に局在があることとキラルな細胞配置を考えれば思いのほか単純に理解できた。しかもこれは遺伝子発現と対応可能であることが分かった。いまからすべきことは実験的事実との対応づけである。このために実験でどの様なことを調べればよいかは、モデルを使ったコンピュータ・シミュレーションの結果が示してくれる。生物の不思議な現象を、実験でなく理論が先導して解明するというまれな研究例になると考えている。生物の形はおもに遺伝子がきめていると考えられているが、数年前にその具体的な道筋の一つを明らかにすることができた。この道筋では細胞の自己構築を記述する「細胞モデル」が必須の役割を果たす。申請した計画の研究目的は細胞モデルを使って、いまだに不思議と感じられる生体のキラリティーを明らかにすることである。不思議な現象として、細胞でできたチューブがらせん状のねじれを形成することがある。哺乳類や鳥類の心臓形成初期にみられるこの現象を説明することをこころみた。心臓の場合ねじれは左ねじ方向である。これを説明するのに2つの要因を考えた。一つはチューブ側面が不均一に成長することで、チューブ縦割りの半分は他よりも大きく成長すると考えた。もう一つの要因は、チューブを構成している細胞は大まかにはチューブの長軸方向に分裂するのだが、その分裂の方向がやや左に(チューブ表面に垂線を考えると、この垂線を軸として反時計回りに)片寄っているとする要因である。この2要因により上下端を固定したチューブは左巻きらせんにねじれた(細胞頂点モデルを使ってのコンピュータ・シミュレーションによる)。第一の要因はすでにこれまでの実験で確認されており、我々もマウス初期胚の心臓で確認した。第二の要因は、これまでに知られていないことで、我々はマウス初期胚E8.25後の心臓をライブで観察することで、分裂方向の偏りを確認することができた。このようにして初期胚心臓の左ねじれは、構成細胞のキラルな性質に帰着させることができた。細胞が集まって器官の形がきまる。研究目的はいくつかの器官のキラル構造を、数理的細胞モデルを使って解明することである。トリやマウス初期胚の心臓形成時にはへリックスループ形成が見られる。これを研究対象とした。はじめは直線状のチューブであった心臓が(1)チューブの腹側で細胞増殖が頻繁に起こり、チューブが「く」の字型に屈曲することと(2)構成要素である細胞がキラルな行動、すなわち分裂時に2娘細胞が互いに逆時計回りに回転移動することでへリックスが形成されることがわかった。心臓のキラリティー発生の問題は、キラルな細胞行動が細胞自体のキラルな性質によるのか、それとも体内の非対称構造によるのかに絞られた。
マウス造血幹細胞におけるアポトーシス制御機構の解析

造血幹細胞の分化・増殖過程におけるc-Fosの発現とその機能を明らかにするために、発現誘導型c-Fosトランスジェニックマウス(Mx-c-fosマウス)とc-Fos欠損マウスから分離した造血幹細胞分画用いて以下の研究成果を得た。1) FACSにより分離した造血幹細胞分画は、SCF,IL-3,IL-6等のサイト力イン添加により一過性にc-fosを発現した。2) Mx-c-fosマウスから分離した造血幹細胞は、c-Fosを持続発現させるとサイトカイン添加による増殖もストロマ細胞上での増殖が抑制されたが、c-Fosの発現消失後には増殖を開始した。BrdU染色やFACSによる細胞周期解析結果から、c-Fos持続発現によっても造血幹細胞はアポトーシスには陥らず、増殖刺激後も造血幹細胞は静止期(GO期)に留まることが示唆された。3)造血幹細胞より分化した造血前駆細胞では、c-Fos持続発現による分化・増殖抑制は認められなかった。4) c-Fos欠損マウスの造血幹細胞は、サイトカイン刺激・ストロマ細胞依存性増殖のいずれにも異常は認められなかった。造血幹細胞は定常状態ではそのほとんどが静止期にあり、一部の造血幹細胞のみが造血に関与している。種々の刺激により造血幹細胞に一過性に発現誘導されるc-Fosにより、造血幹細胞が静止期に留まるか増殖を開始するかを決定する因子であることを明らかにした。様々な感染症において生体内でIFN-γが産生され、iNOSの誘導によりNO産生される。以上の結果から、敗血症やウィルス感染後にしばしばみられる造血抑制や再生不良性貧血の病態に造血幹細胞自身やストロマ細胞により産生されるNOが密接に関わっていると考えられた。NO産生制御は、これらの疾患の治療に有効であると考えられることから、現在in vivoにおけるNO誘導性造血抑制とその治療について検討中である。
ミラー対称性の数学的構造の研究

「ミラー対称性の数学的構造に関する研究」のため、本年度は「グロモフ-ウィッテン不変量の理論」の「連接層のモジュライ空間」による記述および「原始形式の理論」、「小平-スペンサー重力場の理論」による数学的に厳密なB模型の構成、の研究を行なってきた。とくに弦双対性における「Dブレーン」の観点に注目することにより、次のような成果・知見を得た。1導来圏の対象に対する安定性の定義がダグラス達によって試みられているが、彼らの「定義」は一般的には自己引用の危険性があり不満足である。しかし物理的議論を用いれば巨大体積極限においては通常の連接層に対する安定性に帰着されうること、また、以前我々が(安定な連接層によって)数学的に定式化した「BPS不変量」は、導来圏の対象から再定義できる可能性があることが判明した。これはドゥブロビン・ギーベンタールによる半単純量子コホモロジーの再構成定理のカラビ・ヤウ多様体に対する類似を与えるため、今後非常に重要な研究対象となると考えている。2物理学者ゴパクマー-ヴァファによる「グロモフーウイッテン不変量」と「BPS不変量」の等価性に関する予想に対して、知られているほとんどの具体例において数学的に厳密な証明を与えた。3閉じたB型位相的弦理論は、「半無限次元偏極ホッジ構造の変形」および「原始形式の理論」を用いて定式化され、その相関関数の母函数は佐藤グラスマン多様体のタウ函数として記述されるべきであるという方針が得られた。これはウィッテン-コンセビッチによる結果が、ミラー対称性のアイデアとともに高次元の場合陶然に拡張されることを示唆する。非自明な具体例を計算することが今後の課題となっている。「ミラー対称性の数学的構造に関する研究」のため、本年度は「グロモフーウィッテン不変量の理論」の「連接層のモジュライ空間」による記述、を中心に研究を行なってきた。「グロモフーウィッテン不変量の理論」は、閉じたリーマン面から滑らかな多様体への正則写像を数える理論である。「グロモフーウィッテン不変量」の母関数を作り、その構造を解明することが目的である。本研究では、一般の3次元カラビ・ヤウ多様体に対し上記のことについて考察してきた。本年度は、弦双対性における「Dブレーン」の観点から連接層のモジュライ空間の解析し、次のような成果を得た。1「1粒子BPS状態の空間」の数学的定式化を行った。2「安定な連接層のモジュライ空間」の交叉コホモロジー環上に、可換な2つのレフシェッツ作用があることの証明。その結果「BPS不変量」が数学的に定義可能であることを示した。3物理学者ゴパクマー-ヴァファによる予想に対し、いくつかの例で数学的に厳密な証明を与えた。これらの結果から、「正則写像の数」と連接層のモジュライ理論という全く異なる数学が密接に関係していることがわかる。また「BPS状態の空間」の解析の際に、「ポアンカレ多項式の繰り込み」の現象を発見した。このことを数学的に理解することはまだできていないが、「モジュラー不変性」に関して非常に重要な役割を果たすと考えており、現在研究中である。これらの背景に存在する「BPS状態」および「超弦理論の双対性」の「数学的構造」の解明を進めているところである。
がん染色体不安定性の要因としての中心体サイクル制御機構異常に関する研究

ベンゾピレン代謝産物B[a]PDEは、中心体過剰複製誘導を介した染色体不安定性誘導により、肺がんに関わっていることを明らかにした。大腸がんにおいて、染色体分離に関わるhSgo1遺伝子の発現が低下しており、これにより、中心体過剰複製、染色体不安定性が見られることを明らかにした。がん抑制遺伝子p53が転写活性非依存的中心体複製制御活性を有することを明らかにした。がん抑制遺伝子NORE1Aの中心体制御能を明らかにした。1.多くのがんでの不活化が示されているp53は、これまでに、p21によるCDK2/サイクリンEの活性調節を介した転写活性依存的中心体複製制御活性は知られていたが、転写活性非依存的な役割については、分かっていなかった。そこで、p53-/-マウス胎児線維芽細胞に細胞周期停止薬剤ミモシンを投与した中心体過剰複製アッセイにおいて、転写活性(+)中心体結合能(-)のp53変異体、転写活性(-)中心体結合能(+)のp53変異体、転写活性(-)中心体結合能(-)のp53変異体、および野性型p53の発現プラスミドを各々発現させ、中心体過剰複製をどの程度抑制できるかについて検討した。そして、その結果として、p53が転写活性非依存的中心体複製制御活性を有するという知見を得た。2.中心体サイクルにおいて重要な役割を果たすヌクレオフォスミンが、K230、K263においてSUMO化されることを明らかにした。そして、このヌクレオフォスミンのSUMO化が、ヌクレオフォスミンの細胞内局在、中心体複製、細胞増殖能、細胞生存活性を制御していることを明らかにした。3.細胞分裂期の紡錘体上に局在することが知られているEML4蛋白質が、ヒト非小細胞肺がんにおいて、2.6%(2/77例)の頻度で、チロシンキナーゼ活性を有するALKと融合蛋白質を形成していることを明らかにした。血液系腫瘍の一部で認められるNPM-、TPM3-、CLTC-、ATIC-、TFG-ALK融合遺伝子は、77例の非小細胞肺がんには、認められなかった。これらのことから、一部の非小細胞肺がん発生へのEML4-ALKの関与が示唆された。4.中心体局在配列発現ベクターとその変異体発現ベクターを構築した。1.ベンゾピレン代謝産物B[a]PDEは、喫煙者肺がんにおいて、がん抑制遺伝子p53の体細胞変異誘導の原因の一つと考えられている。私達は、B[a]PDEの肺がんへの更なる関与の可能性を考え、p53欠損肺がん細胞株H1299を用いて、中心体数、染色体数への影響を検討した。H1299にB[a]PDEを処理すると、S期停止が起こり、中心体過剰複製が誘導された。また、トランスリージョンDNAポリメラーゼPOLKを過剰発現させると、B[a]PDE誘発中心体過剰複製が抑制された。B[a]PDE処理後数日後に染色体FISH解析を行うと、中心体過剰複製誘導を介したと考えられる染色体不安定性誘導が認められた。さらに、原発性肺がん検体での解析で、p53が変異している場合に、B[a]PDE蓄積と中心体過剰複製との間に関連性が認められた。以上のことから、B[a]PDEは、これまで報告されている遺伝子突然変異誘導のみならず、中心体過剰複製誘導を介した染色体不安定性誘導により、肺がんに関わっていることが示唆された。2.正確な染色体分離が行われる上で重要な役割を果たす分子として同定されたヒトシュゴシン(hSgol)の大腸がんにおける関与を検討し、次の結果を得た。1)原発性大腸がん患者の腫瘍部のhSgolの発現はmRNAおよび蛋白質レベルで低下していた。2)hSgolのmRNA発現レベルの低い大腸がんは左側大腸に局在し、染色体FISH解析での観察で染色体数の変化に富んでいた。3)大腸がん細胞株HCT116におけるhsgolの発現をsiRNA法で低下させたところ、G2/M期停止、中心体過剰複製、染色体不安定性が誘導された。以上のことは消化器がんにおけるhSgolの変化とその関与についての初めての報告である。3.中心体局在配列の安定発現株、および、その変異体安定発現株を樹立した。1.がん抑制遺伝子NORE1Aは、核細胞質シャトル蛋白質であり、その一部は中心体に局在するが、その中心体上NORE1Aの役割は解明されていなかった。そこで、中心体制御、染色体数制御の点から、NORE1Aの機能解明を試みた。p53欠損肺がん細胞株H1299に、DNA合成阻害剤hydroxyurea(HU)を処理すると、3個以上の中心体を有する細胞の割合が増加し、中心体過剰複製が生じることが蛍光免疫染色法で示された。

NORE1Aを外来性に発現させると、その割合は部分的に抑制された。核外移行シグナル(NES)変異体は、中心体に局在せず、また、HU誘発中心体過剰複製の抑制活性を示さなかった。FISH解析で染色体2番と16番の染色体数を計測すると、HU処理によってみられる染色体数異常を、野性型NORE1Aは部分的に抑制したが、NES変異型は抑制しなかった。これらのことから、NORE1Aは、HU誘発中心体過剰複製の抑制活性、および、中心体過剰複製を介すると考えられるHU誘発染色体不安定性の抑制活性を有することが示唆された。さらに、非小細胞肺がんにおけるNORE1Aの発現を定量的PCR法で調べたところ、細胞株で100%(12/12)、原発性がん検体で49%(25/51)がmRNAレベルでの低発現を示し、NORE1A発現低下は非小細胞肺がんにおける頻度の高い遺伝子異常の一つであることが示唆された。2.細胞分裂期の紡錘体上に局在するEML4蛋白質の、ALKとの融合蛋白質の存在を、302例の原発性非小細胞肺がん検体で、免疫染色法を利用して検討した。そして、10例でEML4-ALK mRNAの存在を明らかにした。1例は、EML4のエクソン14が、ALKのエクソン20の53番目の塩基に、2塩基を介してつながる新規の型を有していた。ALK融合蛋白質探索における免疫染色法の有用性を示すことができた。
レゾナンスバイオ国際活動支援

本プロジェクトは、バイオイメージングを中心に据えた学際的かつ国際的な共同研究の推進を行う。今年度は、若手研究者が国際舞台において活躍する機会を得るため、シンポジウムとワークショップを開催した。本会議は若手研究者が企画から運営までを行った。・「若手研究者のための国際バイオイメージング会議」科研費新学術領域「ResonanceBio」(共鳴誘導で革新するバイオイメージング)(代表・宮脇敦史)の若手研究者が中心になり、沖縄科学技術大学院大学(OIST)の協力を得て、Bioimagingに関する会議を開催した。国際色豊かなOISTや台湾Academia Sinicaの若手研究者たちとの交流を通して国際感覚を養うとともに、現行プロジェクトおよび将来の研究に資する関係構築を行った。上記に加え、第2回国際連携企画技術講習会を開催し、Dr. Bi-Chang Chen(台湾中央研究院)を講師として招聘した。さらに、講習会後に、東京大学で「Light Sheet顕微鏡を用いた研究」について講演会を開催し、イメージング技術の意見交換を行った。<若手育成・共催・連携推進>計画班根本班の若手研究者がオーガナイザーを務め、「若手研究者のための国際バイオイメージング会議」を開催した。新学術領域「先端バイオイメージング支援プラットフォーム」との共同国際シンポジウムとワークショップを開催し、連携推進を強化した。Dr. Bi-Chang ChenによるLight Sheet顕微鏡の講習会(@愛媛大)とForum(@東大)を開催し、台湾中央研究院との協力体制も継続している。<情報発信>若手の会開催にあたって本領域のウェブサイトを活用し、領域活動の発信を積極的に行った。バイオイメージングの先端を行く研究者約10名を招聘し、10月に国際シンポジウム(@東京理科大)を開催する。本会議は、統括班と連携して行う。国内外の若手研究者達の意見交換の場を設けるため、3月に国際シンポジウム(@熱海)を行った。海外で活躍する若手研究者2名、Dr. Nam Young Kang (National University of Singapore)、Dr. Evan Miller (UC Berkeley)を招待した。Dr. Kangからは、組織幹細胞を蛍光化合物で特異的に標識する技術、Dr. Millerからは、膜電位を高感度、低侵襲的に可視化する技術について講演をしてもらった。国内からは各計画班の若手研究員が研究成果について発表を行った。宮脇班はレチノイン酸プローブの技術について、神谷班は超解像イメージングのための技術について、根本班はレーザー光技術を用いた新規バイオイメージング技術と偏光(偏向)レーザービームを用いたイメージングにおける解像度向上技術について、横田班はクラウド型情報処理システム技術とX線、ニュートロン、近赤外線によるCTイメージング技術について、今村班はがん転移研究のがんモデルメダカの開発とイメージング応用について、曽我班はSBWにおけるバイオフォトにクス技術について講演した。海外からの招待講演者からは多くの質問や意見があり、活発な議論の場になった。講演会と平行し、ポスター発表も行った。口頭発表をしなかった研究者も、活発に互いに議論し合い、今後の研究に資する情報交換を行うことができた。技術講習のワークショップ等で必要なiQIM-SPF-P2解析システムを導入した。2017年2月18日(土)に、自然科学研究機構・自然科学研究機構基礎生物学研究所(岡崎市)にて、若手研究者ワークショップを開催した。国内外の15名の若手が講演を行い、参加者は30名程度であった。2017年2月19(日)-20日(月)にはThe 1st ABiS Symposium Towards the Future of Advanced Bioimaging for Life Sciencesとの共催シンポジウムを自然科学研究機構岡崎コンファレンスセンターで行った。台湾中央研究所應用科學研究中心Research FellowのPEILINGCHEN博士と韓国慶煕大学Assistant professorのSUN KWANG KIM博士を招聘し、シンポジウムで講演をしてもらった。"neuropathic pain"や“light-sheet microscopy"など、当領域研究者の興味と重なる題材が多かった。シンポジウムには100名程度の参加者があった。英語での発表と討論、および海外研究者との交流は、若手研究者には貴重な研鑽の場となった。2017年2月21日(火)に愛媛大学医学部において国際連携企画技術講習会を開催し、本邦の若手研究者と海外研究者の技術交流を推進した。<若手育成>若手研究者ワークショップと国際連携企画技術講習会を英語で開催した。ワークショップには約30名が参加し、活発な意見交換が行われた。国際連携企画技術講習会では、The 1st ABiS Symposiumで招聘したPeiling Chen博士とSun Kwang Kim博士が講師となり、実際に顕微鏡を使いながら講義を行った。若手研究者と海外研究者の技術交流を推進した。2017年の秋には台湾Academia Sinicaと合同で若手研究者による国際会議を企画しており、当領域の若手研究者が中心となって準備を進めている。<連携推進>ヨーロッパにおけるイメージング研究の第一人者であるEMBLのJan Ellenberg博士を理化学研究所に招聘し、講演会を行った。参加者は約80名であった。光-電子顕微鏡を用いたシステムバイオロジーの最先端について話し、参加者と意見交換を行った。Ellenberg博士は欧州におけるバイオイメージング連携を展開する中心人物であるので、当領域のパートナーとして連携を進めていく予定である。ELLENBERG博士と宮脇は2017年10月に、EMBLにて国際シンポジウム"Seeing is believing"を主催する予定である。レゾナンスバイオからはゲストスピーカー2名と計画班長を含む25名が参加した。

ゲストスピーカーには、外観検査アルゴリズムコンテスト2016でレゾンナスバイオ賞を受賞したみずほ情報総研株式会社橋本大樹氏が含まれた。4DCellからは中野明彦代表(理研)を含む25名が参加。台湾側からはLattice Light-Sheet Microscopyの開発に携わったDr. Bi-Chang Chenをはじめ、50名以上が参加した。全体の参加者は約100名であった。ポスター会場や食堂では、分子をデザインする研究者と光をコントロールする研究者を含む集団が多く形成され、活発な意見交換が行われた。会議後も、様々なレベルで交流が継続しており、より本格的な国際連携が期待される。<若手育成・共催・連携推進>2017年度においては、若手研究者が中心になり、国際連携の推進を行った。実際に、台湾Academi Sinicaで開催した日台合同若手の会以降、3グループ間の交流が行われている。本会議に参加したAcademia SinicaのDr. Bi-Chang ChenとDr. Peillin Chenは、2018年夏以降に来日し、本領域主催で顕微鏡講習会を行う予定である。本領域はまた2018年秋に、沖縄大学院大学で国際若手の会を開催し、若手研究者の育成と国際連携の推進を図る。<情報発信>台湾若手の会開催にあたって、本領域のウェブサイトを活用した。本領域のコンセプトおよび成果を広く海外に知ってもらうために、英文サイトを充実させた。本プロジェクトは、バイオイメージングを中心に据えた学際的かつ国際的な共同研究の推進を行う。今年度は、若手研究者が国際舞台において活躍する機会を得るため、シンポジウムとワークショップを開催した。本会議は若手研究者が企画から運営までを行った。・「若手研究者のための国際バイオイメージング会議」科研費新学術領域「ResonanceBio」(共鳴誘導で革新するバイオイメージング)(代表・宮脇敦史)の若手研究者が中心になり、沖縄科学技術大学院大学(OIST)の協力を得て、Bioimagingに関する会議を開催した。国際色豊かなOISTや台湾Academia Sinicaの若手研究者たちとの交流を通して国際感覚を養うとともに、現行プロジェクトおよび将来の研究に資する関係構築を行った。上記に加え、第2回国際連携企画技術講習会を開催し、Dr. Bi-Chang Chen(台湾中央研究院)を講師として招聘した。さらに、講習会後に、東京大学で「Light Sheet顕微鏡を用いた研究」について講演会を開催し、イメージング技術の意見交換を行った。
シバヤギ脳内のケトン体感知システムにおけるモノカルボン酸輸送担体の機能解析

低栄養状態にある動物では、低栄養に関する情報が何らかの末梢のシグナルによって脳に伝達され、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)分泌を司る脳内神経機構(GnRHパルスジェネレーター)の活動が抑制される。単胃動物では低栄養時に血糖値が低下すると、脳ではケトン体の利用が増加することから、ケトン体が低栄養を伝達するシグナルの一つと考えられている。しかし、血糖値が常に低値に保たれている反芻動物において同様の機構が存在するのかは明らかでない。脳内へのケトン体輸送はモノカルボン酸輸送担体(MCT)により行われる。本研究の目的は、反芻動物のモデルであるシバヤギにおいて、MCT遺伝子cDNAの同定と、脳における遺伝子発現解析を行い、低栄養シグナルとしてのケトン体の役割および脳内のケトン体感知機構におけるMCT分子の機能を解明することにある。本研究により、以下の成果が得られた。1)成熟雌シバヤギ視床下部より調製した全RNAから作成したcDNAを用いてPCRを行い、シバヤギ1型MCT(MCT1)の全コード領域(1506塩基)を含むcDNA塩基配列を決定した。2)シバヤギMCT1の推定アミノ酸配列は、ウシおよびヒツジのそれらと高い相同性(≧97%)を示し、12カ所に予想される膜貫通領域も保存されていた。3)シバヤギ各種組織の全RNAを用いてRT-PCRを行ったところ、MCT1遺伝子転写物がどの臓器でも確認されたが、臓器間で発現量に差があった。4)シバヤギ脳室内にβ-ヒドロキシ酪酸(80μmol/h、5時間)を投与すると、GnRHパルスジェネレーターの活動が抑制された。このとき,末梢血中のケトン体濃度に変化がなく、脳室内に投与したβ-ヒドロキシ酪酸は脳内でその効果を現すと考えられた。以上の結果より、反芻動物脳内にはMCTを介するケトン体感知システムが存在し、低栄養シグナルとしてのケトン体濃度上昇に関する情報をGnRHパルスジェネレーターに伝達する経路が存在することが示唆された。低栄養状態にある動物では、低栄養に関する情報が何らかの末梢のシグナルによって脳に伝達され、性腺刺激ホルモン分泌を司る脳内神経機構の活動が抑制される。脳内へのケトン体輸送はモノカルボン酸輸送担体(monocarboxylate transporter, MCT)により行われる。本研究の目的は、反芻家畜の実験動物モデルであるシバヤギにおいてMCT遺伝子cDNAの同定と、脳における遺伝子発現の解析を行い、低栄養シグナルとしてのケトン体の役割および脳内のケトン体感知機構におけるMCT分子の機能を解明することにある。本年度は、まず、成熟雌シバヤギ視床下部組織より調製した全RNAから作成したcDNAに対して、他哺乳類の1型MCT(MCT1)と相同性の高い合成プライマーを作成してPCRを行った。また、シバヤギの各種組織の全RNAを用いてRT-PCRを行い、MCT1遺伝子の発現を調べた。その結果、シバヤギMCT1の全コード領域(1506塩基)を含むcDNAの塩基配列を決定した。

推定アミノ酸配列は、ウシおよびヒツジのそれらと高い相同性(≧97%)を示し、12カ所に予想される膜貫通領域も保存されていた。MCT1遺伝子転写物はどの臓器でも確認されたが、臓器間で発現量に差があり、肝臓、筋では肺、腎臓に比べて発現レベルが高いようであった。現在、2型MCT(MCT2)の部分構造も明らかにしており、それらの塩基配列情報を用いてin situ hybridization解析を行い、シバヤギ脳内におけるMCT1およびMCT2 mRNA発現の局在を検討する予定である。低栄養状態にある動物では、低栄養に関する情報が何らかの末梢のシグナルによって脳に伝達され、性腺刺激ホルモン分泌を司る脳内神経機構の活動が抑制される。単胃動物では低栄養時に血糖値が低下すると、脳ではケトン体の利用が増加することから、ケトン体が低栄養を伝達するシグナルを一つと考えられている。しかし、血糖値が常に低値に保たれている反芻動物において同様の機構が存在するのかは明らかでない。脳内へのケトン体輸送はモノカルボン酸輸送担体(monocarboxylate transporter,MCT)により行われる。本研究の目的は、反芻家畜の実験動物モデルであるシバヤギにおいてMCT遺伝子cDNAの同定と、脳における遺伝子発現の解析を行い、低栄養シグナルとしてのケトン体の役割および脳内のケトン体感知機構におけるMCT分子の機能を解明することにある。研究第1年度にシバヤギ1型MCT(MCT1)の全コード領域(1506塩基)を含むcDNAの塩基配列を決定したが、本年度は同様の手法により、シバヤギ2型MCT(MCT2)をコードする遺伝子のcDNA塩基配列の同定を試みた。まず、成熟雌シバヤギ視床下部組織より調製した全DNAを用いてcDNAを作成し、このcDNAを用いて、他哺乳類のMCT2相同性の高い合成プライマーを作成してPCRを行った。その結果、シバヤギMCT2をコードする遺伝子の部分塩基配列を決定したが、今回用いた合成プライマーでは全コード領域を含むcDNAの塩基配列決定には至らなかった。今後は、MCT2の全コード領域の塩基配列の同定を行い、シバヤギ各種組織の全RNAを用いたRT-PCRによりMCI遺伝子発現を調べるとともに、MCT1およびMCT2遺伝子の塩基配列情報を用いてin situ hybridization解析を行い、シバヤギ脳内におけるMCT1およびMCT2 mRNA発現の局在を検討する予定である。低栄養状態にある動物では、低栄養に関する情報が何らかの末梢のシグナルによって脳に伝達され、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)分泌を司る脳内神経機構(GnRHパルスジェネレーター)の活動が抑制される。単胃動物では低栄養時に血糖値が低下すると、脳ではケトン体の利用が増加することから、ケトン体が低栄養を伝達するシグナルの一つと考えられている。脳内へのケトン体輸送はモノカルボン酸輸送担体(monocarboxylate transporter, MCT)により行われる。本研究の最終的な目的は、反芻動物の実験動物モデルであるシバヤギにおいて、MCT遺伝子cDNAの同定と、脳における遺伝子発現の解析を行い、低栄養シグナルとしてのケトン体の役割および脳内のケトン体感知機構におけるMCT分子の機能を解明することにある。
大腸腫瘍の発育進展におけるサイクロオキシゲナーゼ2の役割と阻害剤の作用機序の検討

1 COX-2蛋白はヒト大腸腺腫症のモデルであるAPCノックアウトマウスの腸粘膜表層の間質に誘導され、血管新生を促すことが知られているが、その担当細胞は同定されていない。今回の研究では免疫組織学的分析にて、APCノックアウトマウスのポリープ近傍の腸粘膜表層の間質でCOX-2蛋白を発現している細胞は線維芽細胞と内皮細胞であること、マクロファージや白血球にはCOX-2蛋白が発現していないことを明らかにした。(Cancer Research 62:6846-6849,2002)2大腸癌の発生や進展にCOX-2蛋白が関与していることが示されている。APCノックアウトマウスの実験ではポリープの発生にCOX-2蛋白が関与していることが明らかにされ、また、NSAIDsやCOX-2蛋白阻害剤が大腸癌の発生率や死亡率を低下させることが報告されている。散発性大腸腺腫95病変を対象とし、腺腫の病理組織学的所見とCOX-2蛋白の免疫染色を比較検討した。正常大腸粘膜上皮にはCOX-2蛋白は発現せず、腫瘍上皮、間質細胞に発現を認めた。COX-2蛋白の発現は単変量解析では腺腫異型度と大きさに有意な相関をみたが、多変量解析では異型度とのみに有意な相関を認めた。(Dis Colon Rectum 46:786-792,2003)3 COX-2蛋白と腺腫異型度との相関を認めたが、さらに細胞増殖能との関係を検討した。散発性大腸腺腫95病変を対象とし、COX-2蛋白の発現なし、低発現、高発現の腺腫で比較すると、Ki67 labelingindexはそれぞれの群間で有意差があり、COX-2蛋白の発現と細胞増殖能は相関した。(Jpn J Clin Oncol 33:631-635,2003)5家族性大腸腺腫症21例を対象としてCOX-2阻害剤の直腸腺腫に対する効果を二重盲検法にて検討した。9ケ月間の投与にて、COX-2阻害剤投与群ではプラセボ投与群よりポリープの大きさと数が有意に減少した。しかし、投与終了後3ヶ月目ではその差はなくなった。(Clin Cancer Res 315:4756-4760,2003)1 COX-2蛋白はヒト大腸腺腫症のモデルであるAPCノックアウトマウスの腸粘膜表層の間質に誘導され、血管新生を促すことが知られているが、その担当細胞は同定されていない。(Clin Cancer Res 315:4756-4760,2003)大腸発癌におけるサイクロオキシゲナーゼ(COX)-2の役割を明らかにするために,臨床材料を用いてCOX-2発現を検討すると共に,COX-2選択的抑制剤の大腸癌に対する効果を検討しているが,今年度は以下のような結果を得ている.1.孤発性大腸腺腫におけるCOX-2発現内視鏡的ポリペクトミーにより得られた58個の腺腫および外科的切除により得られた5個の腺腫,計63個を対象とした.手術または内視鏡検査時に得られた47検体の正常大腸粘膜を対照とした.ポリープからmRNAを抽出し,RT-PCR法によりCOX-2発現を検討した.

ポリープの最大径により,small:φ≦6mm,medium:6mm<φ≦12mm,large:φ<12mmの3群に分けた.COX-1に対するCOX-2の比をCOX-2 indexとすると,正常大腸粘膜0.3±0.1,腺腫1.7±0.2で,COX-2 indexは有意に腺腫で増加していた.大きさ別のCOX-2 indexは,small群1.1±0.1,medium群1.7±0.3,large:2.5±0.5で,発現は有意に大きさに関連していたが,存在部位,異型度,肉眼型とは関係していなかった.2.実験動物を用いたCOX-2選択的阻害剤の効果ヒト大腸癌細胞KM12SMをヌードマウスに皮下移植後,対照,スリンダック30mg/kg,COX-2阻害剤10mg/kg,30mg/kg投与の4群に分け,4週間の処置後に犠死させ腫瘍重量を測定した.スリンダック投与群の重量は34±5.6mgで対照群の43±7.0mgに比べ腫瘍生育を抑制する傾向がみられた(p=0.12).一方,COX-2阻害剤(30mg/kg)投与群の腫瘍重量は31±5.1mgで,対照群に比べ有意に低かった(p<0.05).COX-2選択的阻害剤群は用量依存性に腫瘍の生育を抑制した.ヒト大腸菌臨床検体を用いてCOX-2発現と臨床病理学的因子との関連性を検討し,大腸癌発育進展におけるサイクロオキシゲナーゼ(COX)-2の役割を明らかにしている.1.大腸癌肝転移巣におけるCOX-2 mRNA発現大腸癌肝転移(HM)15例,大腸癌(CC)108例,非癌部肝組織(NH)12例,大腸粘膜(NH)98例を対象とした.RT-PCR法によりCOX-2発現を検討し,COX-2のCOX-1に対する比(COX-2 index)を算出した.HM, CC, NH, NCのCOX-2 indexはそれぞれ1.9±0.2, 1.7±0.1, 1.6±0.2, 0.9±0.1(mean±SE)で,NCは他の3群と比べ有意に低かったが,HM, CC, NHの間には差を認めなかった.肝転移を伴う大腸癌と,伴わない大腸癌のCOX-2 indexはそれぞれ2.0±0.3, 1.7±0.1であり,差を認めなかった.肝転移巣ではCOX-2 indexが原発巣および非癌部肝組織より高くなく,肝転移を伴う大腸癌と伴わない大腸癌でCOX-2 indexの有意差がないことから,大腸癌肝転移ではCOX-2発現の関与は少ないことが示唆された.2.大腸癌におけるCOX-2 mRNA発現と深達度の関係m癌を除く大腸癌92例を対象とした.上記と同様な方法でCOX-2 indexを求め,深達度との関係を検討した.COX-2 indexが2以上の症例を高発現群,2未満を低発現群とした.両群間で深達度に差を認めなかった.腫瘍径を大(7.5cm以上),中(4cm以上7.5cm未満),小(4cm未満)に分けて検討すると,小と中では高発現群と低発現群の間に深達度の差は認めなかったが,大では高発現群で有意に深達度が深かった.腫瘍径の大きい大腸癌では,COX-2 mRNAの発現が深達度の増大に関与している可能性が示唆された.1 COX-2と大腸発癌・成長の関係:散在性大腸腺腫63個からmRNAを抽出し、RTPCRによりCOX-2のmRNAを取り出し検討した。全例でCOX-2のmRNAが検出された。COX-2mRNAをCOX-1mRNAの比で半定量し手の検討では、COX-2mRNAの発現量は腺腫の大きさと相関したが(P=0.019)、部位、形態、異型度とは相関しなかった(Eur J Cancer2001;37:1469-1474)。さらに散在性大腸腺腫95個をCOX-2抗体で免疫染色にてCOX-2発現を検討した。
術後痛対策におけるニューロステロイドの可能性

ニューロステロイドのアロプレグナノロンが術後痛に対してどのような効果を果たすかをBrennanのラット術後痛モデルを用いて調べた。アロプレグナノロン合成酵素阻害薬であるフィナステロイドを投与すると7日後の機械的アロデニアが遷延する傾向にあった。さらに、アロプレグナノロン低用量(0.16mg/kg)と高用量(1.6mg/kg)を投与した場合、低用量で機械刺激に対する閾値が高くなった。これは、アロプレグナノロンが複数のメカニズムで痛覚過敏の形成を抑制することを示唆している。また、インドメタシンやアセトアミノフェン併用で相乗効果の確認はできなかったが、ガバペンチン併用では相加的効果が認められた。目的:現在手術後の疼痛対策については様々な工夫がなされているが、危険な副作用も存在し未だ充分とは言えない現状である。そこで、この分野の裾野を少しでも広げるべくニューロステロイドの鎮痛効果とその補助薬剤の探索を目的とし、今年度はまず小動物において術後疼痛モデルの作成・手技の確立と評価方法の検討を行うこととした。方法:8-9週齢雄のSprague-Dawleyラットを対象とし、Brennanらが発表した足底皮膚切開痛モデルを作成した。具体的にはペントバルビタールかセボフルラン麻酔下に、左後肢の足底部に1cmの長軸方向の切開を加え一度屈筋腱を牽引した後5-0ナイロンでマットレス縫合して急性疼痛モデルを作成した。疼痛評価は、熱刺激とvon Frey filamentsによる機械刺激に対する逃避行動と患肢に対する加重の程度を観察した。結果:術後1日・3日・1週間後に観察を行った結果、Drennanらの実験結果はほぼ追試可能でありモデル作成手技は確立したと判断された。熱刺激は再現性の良いデータが得られたが、それ自体が刺激となることが危惧されたため途中で放棄した。また、より客観的な評価方法として、脊髄後根神経節の神経鞘の変化を観察することができないか今後検討してみることとした。目的:手術後疼痛に対してニューロステロイドの関与の程度を検討する目的で、手術創モデルラットの中枢神経におけるアロプレグナノロンの産生量を免疫組織染色を用いて測定することとした。しかし、定量分析可能なレベルの染色は困難であったため、アロプレグナノロンの合成酵素阻害薬を用いた行動学的な研究に変更した。当初予定していた3α-hydroxysteroid oxido-reductase抑制薬Proveraは、逆にアロプレグナノロンが上昇するという文献もあり、Finasterideを用いることにした。結果:Brennanらの結果および我々の昨年度施行した追試の結果1週間後の機械刺激に対する逃避行動は対照値とほぼ同じ値に回復している。しかし、今回Finasteride投与群では1週間後も機械刺激に対する反応は過敏であり、これはアロプレグナノロンが痛覚過敏の発生を抑制している可能性を示唆している。今後は、Finasteride投与群でのアロプレグナノロンの低下の程度を定性的に確認するとともに、痛覚域値の経時的変化を観察したい。目的:アロプレグナノロンの手術創に対する鎮痛効果を検討するため、Brenannのモデルを作成し、アロプレグナノロン投与群と対照群の比較検討を行った。方法:7週齢雄のSprague-Dawleyラット45匹を対象とし、アロプレグナノロン高用量群(1.6mg/kg)、低用量群(0.16mg/kg)およびコントロール群(溶媒のみ)の3群に分けた。ラットの背部皮下に薬剤を投与し、15分後イソフルラン麻酔下にBrenannのモデル(右足底長軸方向1cmの切開後2回マットレス縫合)を作成した。術前、術後2時間、24時間、48時間、7日後に、右足への荷重の程度(姿勢スコア)、テイルフリックテスト(52°Cのホットバス)、機械的アロデニアの程度(von Frayfilament)を測定した。アロデニアについては、Dixonの簡易式50%反応閾値とup-down methodを繰り返して求めた逃避反応閾値6回の平均値を検討した。結果:手術前後の体重および体重増加率に群間差はなかった。姿勢スコア、テイルフリックテスト、簡易式50%反応閾値はどの時間においても群間差を認めなかった。低用量群の逃避反応閾値6回の平均値は術後2時間と24時間後に、コントロール群に比べて有意に高くなっていた。高用量群では有意差を認めなかった。アロプレグナノロンの手術創に対する鎮痛効果は、用量に比例しないことから単一の機序でないことが示唆された。

また、単独では鎮痛効果が弱い可能性があり、今後は他の補助薬と組み合わせて鎮痛効果が増強されるかについて同様の手法で検討していく予定である。ニューロステロイドであるアロプレグナノロンが術後痛に対してどのような効果を果たすかをBrennanのラット術後痛モデルを用いて調べた。1.術後疼痛モデルにおけるアロプレグナノロンの関与の検討:通常Brennanの手術創モデルでは、7日後の機械的アロデニアはほぼ対照値に回復してくる。しかし、アロプレグナノロンの合成酵素阻害薬であるフィナステロイド投与群では約40%疼痛閾値が低下していた。これは、アロプレグナノロンが術後の痛覚過敏の発生を抑制している可能性を示唆している。2.アロプレグナノロンの手術創に対する鎮痛効果の検討:アロプレグナノロン低用量(0.16mg/kg)と高用量(1.6mg/kg)を投与した場合、低用量群は2と24時間後に有意に機械刺激に対する閾値が高くなっていた。これは、アロプレグナノロンの痛覚過敏抑制のメカニズムが単一ではないことを示唆している。3.アロプレグナノロンと他の鎮痛薬の併用効果に関する検討:アロプレグナノロンとインドメタシン(110mg/kg)の単回投与では効果がなく、持続投与では消化性潰瘍が発生して十分な鎮痛効果は確認できなかった。アロプレグナノロンとアセトアミノフェン(300mg/k/日)併用ではアセトアミノフェン単独群に比較して12と36時間後に有意な閾値の上昇が認められたが、全体的に閾値の低下があり、複数回の薬液経口投与がストレスになったことが推測された。ガバペンチン(100mg/kg)とアロプレグナノロンの併用では、僅かな相加的効果が認められた。上記結果をまとめると、本研究の究極の目的である「術後疼痛対策の裾野を広げる」という目標はほぼ達成され、実施計画内容もほぼ全て遂行された。アロプレグナノロンの鎮痛の程度は予想より軽微であったが、一部の患者で慢性痛に移行してしまう手術後疼痛の解決に向けての貴重な一歩となったと考えられる。我々は平成23年度までに、ニューロステロイドの1種であるアロプレグナノロンがラットの術後痛モデルにおいて疼痛閾値の上昇すなわち鎮痛効果をもたらすことを明らかにした。平成24年度においては、このアロプレグナノロンと現在臨床で使用されている消炎鎮痛薬を併用した場合の鎮痛作用について検討することを目的とした。具体的には、アロプレグナノロン0.16mg/kgの皮下投与とインドメタシン10mg/kg、5mg/kg、1mg/kgの経口投与の併用を試みたが、インドメタシン単回投与では効果がなく、連続投与では消化管潰瘍などの副作用がおこるため充分な効果を確認することはできなかった。そこで、アセトアミノフェン300mg/kg/日の経口投与とアロプレグナノロン0.16mg/kg皮下投与の併用効果を調査した。モデル作成12時間後と36時間後に機械刺激(von Frey filaments)に対する閾値が併用した群ではアセトアミノフェン単独群より高い値を示した。ただしこの結果は、アセトアミノフェンを複数回経口投与するという今回の実験スタイルが動物にとってストレスになり全体的に閾値を低下させた可能性があると推測された。理由は、今年度のデータを昨年度のアロプレグナノロン群及びその対照群のデータと比較すると、疼痛閾値がむしろやや低い傾向を示していたからである。