hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多臓器不全治療を目的とする次世代型アルブミン―チオレドキシン融合体の設計と評価

2)HSA-Trx融合体は、インフルエンザ誘発のBALF中好中球数の上昇及び酸化ストレス(肺組織8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン、ニトロチロシン、血中ヒドロペルオキシド量)の誘導を抑制したものの、BALF中肺胞マクロファージ数の上昇及びインターフェロン産生、肺組織iNOSの発現には影響を与えなかった。3)インフルエンザ感染治療の標準薬であるタミフルと肺障害抑制効果を比較検討したところ、ほぼ同程度の肺障害抑制効果を示した。加えて、HSA-Trx融合体のBALFへの移行性が上昇していることが判明した。これらの結果から、HSA-Trx融合体はTrxの血中滞留性と発症部位である間質への移行性を向上させる結果、インフルエンザ誘発急性障害に対し抑制効果を示すことが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。薬物動態学、DDS26年度が最終年度であるため、記入しない。全てが当初の予定通りに進んでいる。特に、In vitro実験より、本融合体活性を十分に保持していることが確認でき、次年度への検討課題に順調に取り組めることを確認した。病態モデルの作成に予想以上に時間を要し、当初の多臓器不全モデルを用いてのアルブミンーチオレドキシン融合体の評価を行うことができなかった。しかし、多臓器不全モデルでの作成にも目途がついた。今年度はこれらの動物モデルでの評価を行うととともに、安全性評価についても検討する。前年度の成果に基づき、In vivoでの体内動態や病態モデルを作成して治療効果を調べる。多臓器不全モデルでの作成にも目途がついたので、これらの動物を使った融合体評価を行うとともに、安全性評価についても検討を行う。24年度は、目的はある程度達成したが、研究室で在庫している試薬等を有効利用できたため、残金が発生した。この残金は、既存のNPLCに蛍光検出器を取り付けるために使用する予定である。
小児ARDSに対する一酸化窒素吸入療法の排ガス交換効果と長期追跡調査に関する研究

小児ARDSに対してNO吸入療法が酸素化を改善させるのか、改善させるならば酸素化に最も適した濃度はいくらか、1ppm以下の超低濃度でも酸素化の改善がみられるのか、動脈血炭酸ガス分圧に影響を与えるか、について検討した。対象は、modified ARDS score(Paulson,1995)>3.0の基準を満たした小児患者の内、従来の人工呼吸管理では酸素化の改善がみられず、親から文書による同意を得た上でNO吸入療法を施行した7例。NOは800ppmを含む窒素ボンベから供給し、化学発光測定装置を用いて人工呼吸器回路内のNOの濃度を測定した。16ppmの吸入でP/F(PaO2/FiO2)比が10mmHg以上上昇したものを有効とし、有効例には28ppmで継続して開始翌日より0、0.13、0.25、0.5、1、2、4、8、16ppmとNO濃度を変えた時の動脈血酸素分圧及び動脈血炭酸ガス分圧の変化を測定した。いずれの症例も16ppmの吸入でP/F比が10mmHg以上上昇し、NO吸入療法は有効と判定した。2ppm以上のNO濃度において、P/F比、及び肺胞と動脈血の酸素分圧の差が、NO非吸入時と比較して有意に改善した。炭酸ガス排泄能もNO濃度依存性に改善している傾向があった。NOと酸素と反応して発生する二酸化窒素は、NO16ppmの吸入濃度でのみ0.1ppm以上検出された。P/F比の改善率について検討したところ、吸入前のP/F比と有意に相関がみられ、換気血流不均衡の改善の機序から考えると、正常の換気を保つ肺胞が多いほうがNO吸入療法が有効であることを示唆している。小児におけるNO吸入療法の安全性では、呼吸機能、神経学的発達、発育の経過においてNO吸入療法によると思われる問題は現時点では認められなかった。NO吸入療法が小児ARDSの生存率を改善させうるかどうかは、今後の検討課題として残された。NOと酸素と反応して発生する二酸化窒素は、m16ppmの吸入濃度でのみ0.1ppm以上検出された。さらに、P/F比の改善率について検討したところ、吸入前のP/F比と有意に相関がみられ、換気血流不均衡の改善の機序から考えると、正常の換気を保つ肺胞が多いほうがNO吸入療法が有効であることを示唆している。

P/F比の改善率について検討したところ、吸入前のP/F比と有意に相関がみられ、換気血流不均衡の改善の機序から考えると、正常の換気を保つ肺胞が多いほうがNO吸入療法が有効であることを示唆している。小児におけるNO吸入療法の安全性では、呼吸機能、神経学的発達、発育の経過においてNO吸入療法によると思われる問題は現時点では認められなかった。NO吸入療法が小児ARDSの生存率を改善させうるかどうかは、今後の検討課題として残された。
極低温流体中での空洞の発生機構と気泡力学に関する研究

既設のクライオスタット内部の実験容器中に満たされた,大気圧下で沸点近傍にある液体窒素中にルビーレーザをフォーカスさせ,単一気泡を生成させた。低温液体中に球状気泡を発生させるためには光エネルギーの適切な制御が必要である。ここでは2段式のレンズアレイを用いて環状ビームを作り,これを凸レンズで集光させることにより優れた球状気泡の生成に成功した。こうして得られる球状気泡と光エネルギーとの関係を周囲圧力をパラメータとして実験的に調べた。その結果,気泡の生成エネルギーは準静的な相変化を仮定して予測される値よりはるかに大きく,気泡の生成に対してレーザ・フォーカスの際のプラズマ生成が関与していることが示唆された。また,発泡のしきい値は本実験範囲の加圧の程度(ΔP=19.698.1kPa)では圧力依存性が少ないことが明らかとなった。液体窒素中での気泡の膨張過程は液体慣性が支配的な運動であり,これに対して気泡の崩壊過程では気泡内部蒸気の振舞いおよび気・液界面での相変化などの熱的影響のために気泡の運動は遅れる傾向を示した。気泡は最大半径の約4割程度まで収縮してリバウンドし,その際液中に衝撃波を放射した。さらに気泡リバウンドの直後,気泡界面はTaylor不安定と熱不安定の重畳作用のために著しく乱れ,気泡表面はやがて分裂する傾向を示した。このような気泡表面形状の不安定挙動は沸点近傍の水中における気泡の場合にも観察され,気泡運動に及ぼす熱的効果の顕著な現れであると考えられる。また,熱力学的パラメータの導入によって液体窒素中および水中の気泡の運動に及ぼす熱的影響並びに液体慣性の影響が評価された。以上の結果は,平成6年4月に東京で開催される第2回キャビテーションに関する国際シンポジウムで発表予定である。既設のクライオスタット内に組み込まれたキャビテーション気泡発生用の実験容器を用いて、液体窒素中でのレーザビームの諸特性(エネルギー吸収、集光特性、屈析率など)を調べ、単一レーザ・ビームの光エネルギーの制御方法の検討を行った。その結果、絞りと遮光板の組み合わせを用いる二重レンズ・アレイの利用によって、適切な光エネルギーの制御が可能となり、単一ビームの集光による球状気泡の生成に成功した。液体窒素中に生成された半径1mm程度の気泡はほぼ球状に成長し、最大に達した後、その運動は崩壊過程へと移行する。本実験で得られた気泡は、既存の研究によって得られたそれと比較して格段と球状性が高められたものとなっている。したがって、極低温場での気泡運動を明らかにするうえで適切な実験モデルが得られたことになる。高速度写真を詳細に解析すると、気泡の膨張過程は液体慣性支配型のそれより加速度運動が僅か鈍化したものとなっていることが明らかとなったが、これは熱的影響のためであると考えられる。この熱的作用は、気泡の崩壊過程において次第に支配的な影響を及ぼすようになり、その結果、気泡の運動周期の明白な遅れが認められるようになる。気泡は最大半径の4割程度まで収縮してリバウンドしている。さらに、崩壊末期に急速に発達するTaylor型不安定に熱不安定が重畳するため、リバウンド過程の気泡界面は著しく乱れ、気泡表面はやがて分裂することが観察された。このような熱依存性の強い気泡挙動は、沸点近傍の水中における気泡挙動と非常に類似していることが明らかとなった。以上の成果は、本年度の日本機械学会流体工学部門講演会で発表予定である。大気圧下で沸点近傍にある液体窒素中にルビーレーザをフォーカスさせ,単一気泡を生成させた。

低温液体中に球状気泡を発生させるためには,光エネルギーの適切な制御が必要である。ここでは,2段式のレンズアレイを用いて環状ビームを作り,これを凸レンズで集光させることにより優れた球状気泡の生成に成功した。こうして得られる球状気泡と光エネルギーとの関係を周囲圧力をパラメータとして実験的に調べた。その結果,発泡のしきい値は本実験範囲の加圧の程度(ΔP=19.698.1kPa)では圧力依存性が少ないこと,また,常温水中との比較では水中の方がより少ないエネルギーで発泡するが,発泡の生成エネルギーは準静的な相変化を仮定して予測される値よりはるかに大きく,気泡の生成に対してレーザ・フォーカスの際のプラズマ生成が関与していることが示唆された。液体窒素中での気泡の運動は圧力の増大と共に液体慣性がより現れることになるが,その程度は液温が低いほど著しいこと,また,運動周期は圧力の増加に伴い短かくなり,その依存性を表す指数は(-0.54)と液体慣性が支配的な場合の(-0.5)に近い値であった。液体窒素中の気泡が発する衝撃波の光学的観察と圧力測定並びに気泡リバウンドの際に増幅される気泡界面の不安定の発生状況が光学的に明らかにされた。さらに,熱力学的パラメータの導入によって,本実験値が既存の液体窒素中の気泡のデータおよび水中の気泡のデータと比較検討され,各種液体中での気泡運動に及ぼす熱的影響及び液体慣性の影響が評価された。以上の成果は,平成6年4月に東京で開催される第2回キャビテーションに関する国際シンポジウムで発表予定である。
肝再生促進メカニズムに関与する細胞周期関連分子の基礎的検討およびその臨床応用

細胞周期関連分子であるp27Kip1は肝に強い発現を認め、そのノックアウト(KO)マウスでは、肝を含めた各臓器の肥大化を起こす。この結果を肝再生医療に用いるため、肝癌細胞株、ならびにp27Kip1のKOマウス肝臓に対しコラゲナーゼ処理を行い得られた初代培養肝細胞を用い、細胞増殖に影響を与えた促進分子ならびに抑制分子を検討した。その結果、エストロゲン関連因子などが抽出されたが期間内に責任分子の特定には至らなかった。肝癌細胞株ならびにコラゲナーゼ処理により得られたマウス初代培養細胞をもちい、E2の投与を行い、その増殖速度の変化と発現分子の変化をp27Kip1のKOマウスより調整した培養肝細胞と比較検討することにより、最も細胞増殖に影響を与えた促進分子ならびに抑制分子を特定し、それらの分子の発現を効率的に調整する方法を樹立する目的で研究を行った。しかし前実験として行ったE2投与群とコントロール群での培養細胞の増殖速度に優位な差を得ることができずにp27Kip1のKOマウスより調整した培養肝細胞と比較検討することまで到達できなかった。現在はこれらの原因についてE2投与のタイミング、投与濃度の再検討を行い調整中である。次に以前我々はマウス胎生期の肝において胎生13.5-17.5日に最もp27Kip1が発現していることを以前報告しているが(Anat Embryol 2001)、その結果を基に胎生13.5日以降の胎児肝細胞から抽出したサンプル、およびCC14を用いた肝障害前後のモデルマウスの肝組織より抽出したサンプルを用いてcDNA arrayにてトランスクリプトーム解析を行い、細胞周期関連分子発現の違いの有無を比較検討することより肝再生につながる責任分子の同定を試みた。現在これについては多数の遺伝子発現パターンが異なっていることを確認し、候補遺伝子の絞り込みを行っている状況である。これらから責任分子を絞り込むことが可能であれば肝再生への道筋をつける一歩となると考えられる。肝癌細胞株ならびにコラゲナーゼ処理で得られたマウス初代培養細胞を用い、E2の投与を行ない、その増殖速度と発現分子の変化をp27Kip1のKOマウスより調整した培養肝細胞と比較検討することにより、最も細胞増殖に影響を与えた促進分子ならびに抑制分子を特定し、それらの分子の発現を効率的に調整する方法を樹立する目的で研究を行った。しかし前実験として行なったE2投与群とコントロール群での培養細胞の増殖速度に有意な差を得る事が出来ずに、p27Kip1のKOマウスより調整した培養肝細胞と比較検討することまで到達出来なかった。現在はこれらの原因についてE2の投与のタイミング、投与濃度の再検討を行い調整中である。次に、以前我々はマウス胎生期の肝において胎生13.5-17.5日に最もp27Kip1が発現している事を報告したが(Anat Embryol 2001)、その結果を基に胎生13.5日以降の胎児肝細胞から抽出したサンプル、およびCCl4を用いた肝障害前後のモデルマウスの肝組織より抽出したサンプルを用いて、cDNA arrayにてトランスクリプトーム解析を行い、細胞周期関連分子の発現の違いの有無を比較検討することより肝再生につながる責任分子の同定を試みた。現在これについては多数の遺伝子発現パターンが異なっている事を確認し、候補遺伝子の絞り込みを行なっている状況である。これらから責任分子を絞り込む事が可能であれば、肝再生への道筋をつける一歩となると考えられる。肝癌細胞株、ならびにp27Kip1のKOマウス肝臓に対しコラゲナーゼ処理を行い得られた初代培養肝細胞を用い、E2の投与下において、その増殖速度の変化と発現分子の変化を野生型と比較検討することにより、最も細胞増殖に影響を与えた促進分子ならびに抑制分子を特定し、それらの分子の発現を効率的に調整する方法を樹立することを目標として研究を行った。まず、E2投与群とコントロール群での初代培養肝細胞の増殖速度の比較では、有意差は得られなかった。また、p27Kip1のKOマウスより調整した初代培養肝細胞は、細胞の状態が不安定で比較検討するまで至らなかった。さらに肝癌細胞株にsiRNAを用いてp27Kip1を低下させ、E2刺激の有無での比較検討を行い得られた結果を初代培養細胞の系に還元することを試みたが、これも同様に細胞が不安定であり明確な結果は得られなかった。並行して、マウス胎生期肝において最もp27Kip1が発現している胎生13.5日の胎児肝細胞、およびCC14を用いた肝障害前後のモデルマウスの肝組織よりmRNAを抽出し、cDNA arrayにてトランスクリプトーム解析を行い、細胞周期関連分子発現の違いの有無を比較検討することより肝再生につながる責任分子の同定を試みた。結果、多数の遺伝子発現パターンが異なっており、責任分子を絞り込むことが可能であれば肝再生への道筋をつける一歩となると考えた。

実際に複数個の候補遺伝子を選出し解析を行ったが、期間内に責任遺伝子に到達することができなかった。肝再生、細胞周期、消化器病学当初予想していた初代培養細胞における実験で、予想に反してE2投与による細胞増殖促進効果が明確には得られなかった。そのために、まず肝癌細胞株を用いてE2刺激の有無での比較検討を行っている。この系で細胞増殖に影響を与える分子を同定し、初代培養細胞の系でも実現可能な実験系に還元する。当初予定していた初代培養細胞における実験で、予想に反してE2投与による細胞増殖促進効果が明確には得られなかったため、次への研究進行が停止している状態である。現在再度実験のやり直しを行なっており、これにより効果が得られないと判断された場合は本研究の方向性の見直しを行なう予定である。・今後の推進方策E2投与による細胞増殖促進効果が初代培養細胞においては明確には得られなかったため、再度実験系を検討し、その結果により本研究の方向性の見直しを行う可能性もある。・次年度の研究費の使用計画G0期で停止させた培養細胞において、miR221,222のsiRNAでp21Kip1の発現を上昇させる、あるいはE2投与やp21Kip1に対するsiRNAを用いてp27Kip1を低下させることにより、その発現制御による肝再生促進を目指した臨床応用への可能性を探る。この系が上手くいかない際には予定していたp27Kip1 KOマウスより調整した初代培養肝細胞、もしくは培養肝由来細胞株に対してCRISPR/Cas9を用いてgenome改変を試みる。その結果よりp21Kip1の発現制御を介して肝細胞増殖をより効率的に行うことが確認できれば、肝再生により関与する候補責任分子についての更なる絞り込みを行う。さらにヒトへの応用を視野に入れ、これら関連分子の発現制御により同様の効果が得られるかをマウスモデルについて検討する。E2投与による細胞増殖促進効果が明確には得られなかったため、再度実験のやり直しを行ない、その結果により本研究の方向性の見直しを行なう可能性がある。G0期で停止させた培養細胞において、miR221、222のsiRNAでp27Kip1の発現を上昇させる、あるいはE2投与でp27Kip1の発現を低下させることにより、その発現制御による肝再生促進を目指した臨床応用への可能性を探る。その結果よりp27Kip1の発現制御を介して肝細胞増殖をより効率的に行うことが確認できれば、肝再生により関与する候補遺責任分子についての絞り込みを行なう。さらにヒトへの応用を視野に入れ、これら関連分子の発現制御により同様の効果が得られるかをマウスモデルにおいて検討する。
神経細胞およびグリア細胞の変性におけるApaf1依存性アポトーシスの解析

Apaf1は、ミトコンドリア依存性アポトーシスにおいてカスパーゼ9を活性化するアダプター分子である。Apaf1欠損細胞はさまざまなアポトーシス誘導刺激に抵抗性を示し、またApaf1欠損マウスは脳の発生過程におけるアポトーシスの著しい減少のため神経細胞の蓄積により胎生期に死亡する。Apaf1欠損、および野生型胎仔より神経上皮細胞を得て、これらを分散培養し、これらに1)成長因子除去2)紫外線照射によりアポトーシスを誘導したところ、成長因子除去では、野生型細胞ではアポトーシスが誘導され、Apaf1欠損細胞では、アポトーシスは認められなかった。このことは、Apaf1が神経細胞の成長過程における(成長因子欠乏などにより引き起こされる)細胞死に重要な役割を果たしていることを示していると考えられた。一方、紫外線照射においては、予期に反してApaf1欠損細胞でも野生型と同様に細胞死が認められた。Apaf1を欠損する胎生幹細胞や胸腺細胞は紫外線照射に対して抵抗性を示すことから、神経細胞とそれ以外の細胞とで、紫外線照射により引き起こされるアポトーシスの誘導機構が異なる可能性が考えられた。今後抗がん剤によるアポトーシス誘導や、polyQ(ポリグルタミン)発現による細胞死に関しても検討し、神経上皮細胞の分化・細胞死の機構を解析していく予定である。
亜急性硬化性全脳炎(SSPE)ウイルスの持続感染機構

SSPEウイルスの持続感染モデルとして欠損性ウイルス産生を特徴とするYamagataー1株感染Vero細胞についてウイルスクロ-ンの分離を試みた。その結果、遊離ウイルスの産生が見られないYAクロ-ンと遊離ウイルスの産生が見られるYFクロ-ンの2種が得られた。これら2クロ-ンについて単クロ-ン抗体による構成蛋白エピト-プの解析を行なったところ、両者間に差は見られなかった。両クロ-ンともに血球吸着活性を示し、H蛋白が正常な機能を有することが示唆された。Western blotにより構成蛋白産生量を比較したところ、YAクロ-ンでM蛋白の産生がYFクロ-ンよりも低いことが明らかとなった。一方、P+M dicistronic mRNAとM mononocistronic RNAの比を求めた結果、YAクロ-ンの方が約2倍の高値を示した。P遺伝子とM遺伝子の解析を行なった結果、両クロ-ン間でP遺伝子には差は認められず、またPとM遺伝子間のintercistronic配列にも差は見られなかった。しかし、M遺伝子では7か所にpoint mutationが見出され、いずれもTーCまたはAーGの置換であった。open reading frameでの終止コドンはYAでは1083ー1085であったのに対して、YFクロ-ンでは1068ー070であった。その結果、YFクロ-ンで産生されるM蛋白は5アミノ酸小さいことが推測された。以上の結果、P+M dicistronic mRNAの過剰な産生がYAクロ-ンにおけるM蛋白の産生低下をもたらし、遊離ウイルス産生の欠損の原因になっていることが推測された。
Siva-1 を介するリンパ球のアポトーシス誘導機構の解明

Tyk2はIFNαによるB細胞増殖抑制作用に必須の物質である。私は、アポトーシス誘導蛋白であるSiva-1が細胞内でTyk2と会合し、Tyk2によりSiva-1がリン酸化されることを見出した。Ba/F3細胞(マウスproB細胞)では、Siva-1がTyk2と会合することにより細胞のアポトーシスが増加したことから、Siva-1はTyk2と複合体を形成してリンパ球のアポトーシスシグナルを担っている可能性が考えられた。1.インターフェロン(IFN)αの抗腫瘍効果のシグナル伝達機構(1) IFNα刺激によるp53発現の亢進が、Siva-1蛋白の発現量を調節しているかStat1欠損マウス由来の細胞におけるSiva-1の発現量およびIFNα刺激時のSiva-1の発現量の増加を野生型マウス由来の細胞と比較した。(2) Siva-1はIFNαによる細胞増殖抑制作用を担うTyk2の下流分子であるか細胞内でTyk2とSiva-1はSiva-1のN末で会合し、Tyk2によりリン酸化されることを見出した。これらの結果は生化学的にSiva-1がTyk2の基質であることを示しており、機能的にも細胞増殖抑制のシグナル伝達に重要である可能性が考えられた。そこで、マウスのproB細胞であるBaF3細胞を用いて、野生型Tyk2を恒常的発現させた細胞(BaF3/Tyk2WT)にSiva-1を導入したところ、通常のBaF3細胞(BaF3/parent)にSiva-1を導入した場合と較べて生じるアポトーシスの割合が約2倍に増加することが分かった。活性型Tyk2を発現させた細胞(BaF/TykV678F)にSiva-1を導入した場合も生じるアポトーシスの割合はBaF3/Tyk2WT細胞の場合と変わらないことから、Tyk2がSiva-1をリン酸化することがアポトーシス作用の増強に重要なのではなく、Tyk2とSiva-1が会合することが重要であることが考えられた。現在再現性を確認するとともに、Tyk2との会合部分を欠損させたSiva-1を用いた場合を確認中である。2. 14番染色体転座を有する悪性リンパ腫の発症・病態にSiva-1が関与しているかSiva-1は第14番染色体上に位置することから、第14番染色体転座をもつ悪性リンパ腫の発症にSiva-1が関与する可能性を考えた。インフォームドコンセントを得た症例を収集した。1.インターフェロン(IFN)αによる抗腫瘍効果のシグナル伝達機構の解明IFNαによる抗腫瘍作用のシグナル伝達経路はTyk2依存性であるが、その下流は不明である。私は、アポトーシス誘導蛋白であるSiva-1が、細胞内でTyk2と会合することを見出した。会合部位はSiva-1のN末であった。また、Tyk2によりSiva-1の53番と162番のチロシンがリン酸化されることを明らかにした。細胞を直接IFNαで刺激したときにSiva-1のリン酸化が生じるかどうかは、現在確認中である。次に、Tyk2とSiva-1の相互作用が細胞増殖抑制作用にどのような機能的役割をもつかを検討した。マウスのproB細胞であるBaF3細胞を用いて、野生型Tyk2を恒常的発現させた細胞(BaF3/Tyk2WT)にSiva-1を導入したところ、通常のBaF3細胞(BaF3/parent)にSiva-1を導入した場合と較べて生じるアポトーシスの割合が約2倍に増加した。Tyk2との会合部位(N末)を削除した変異Siva-1をBaF3/Tyk2細胞に導入してもアポトーシスの割合は増加しないことから、Siva-1がTyk2と会合することによってSiva-1のアポトーシス誘導能が亢進すると考えられた。現在この現象を生体内で確認する目的で、野生型マウス由来の細胞およびTyk2欠損マウス由来の細胞それぞれにSiva-1を導入し、生じるアポトーシスの割合を比較する実験を行っている。2. 14番染色体転座を有する悪性リンパ腫の発症・病態にSiva-1が関与しているかSiva-1遺伝子は第14番染色体上に位置することから、第14番染色体転座をもつ悪性リンパ腫の発症にSiva-1が関与する可能性を考えた。腫瘍細胞より蛋白を抽出し、Siva-1の発現量を正常細胞と比較する実験を現在行っている。
悪性グリオーマの病態解明と新しい治療戦略

1.グリオーマにおける血管新生とその調節:グリオーマにおける血管新生にVEGFが重要であり、このVEGFの活性化にグリオーマ細胞由来のMCP-1により浸潤したマクロファージを介した機序とグリオーマ由来のプロトロンビンから変換したトロンビンを介した機序があることを明らかにした。さらに壊死組織に存在するドコサヘキサエンサンが浸潤したマクロファージの抗腫瘍効果を抑制することにより、グリオーマが免疫反応から回避していることがわかった。2.グリオーマの浸潤機序とその調節:Integrin-linked kinase(ILK)は腫瘍細胞の増殖・浸潤に関与する分子である。グリオーマ細胞ではILKの発現と活性が増加し、とくにPTEN遺伝子欠損細胞に高い活性を示した。この細胞にPTEN遺伝子を導入するとアポトシース活性が上昇し、さらに増殖関連シグナルが抑制された。このことからILKがPTEN遺伝子欠損グリオーマ細胞の増殖に重要な役割を演じていると思われ、ILK抑制剤であるCOX-2抑制剤によりPTEN遺伝子欠損グリオーマ細胞の増殖が抑制されることを明らかにした。また、スタチンのひとっであるシンバスタチンが細胞接着に関わる分子であるFocal Adhesion Kinaseのリン酸化を抑制することで、グリオーマ細胞の浸潤能を抑制することを明かにした。3.悪性グリオーマ予後と遺伝子異常:EGF-R遺伝子変異、p16遺伝子のホモ接合体欠失の有無が、それぞれ悪性グリオーマの予後と関連していることを明らかにした。4.NF1遺伝子の産物であるneurofibrominの新しい機能として神経細胞への分化誘導であることを見出し、NF1におけるneurofibrominの欠失がNF1患者の学習記憶能力の障害に関係していると思われる。本年度の研究実績1.悪性グリオーマの浸潤性および血管新生についての分子機構について検討した。その結果、血液の凝固に重要な役割を果たすトロンビンの前駆物質がグリオーマ局所に存在し、なんらかの刺激により生じたトロンビンがグリオーマ細胞に存在するトロンビン受容体を介してグリオーマ細胞からの血管新生因子Vascular endothelial growthfactor(VEGF)の産生を促すことを明らかにした。また高脂血症の治療薬であるスタチンの一つであるセルバスタチンがグリオーマ細胞の浸潤能を抑制することを見いだし、その機序としてグリオーマ細胞に存在するfocal adhesion kinaseのリン酸化を抑制することを明らかにした。2.悪性グリオーマ局所へのマクロファージの浸潤にMCP-1が関与していることをこれまでに明らかにしたが、今回リンパ球の浸潤に関わるケモカインの関与について検討した結果、リンパ球遊走因子であるLARCがグリオーマ細胞から産生され、CD8-,CD4-,CD45RO-陽性リンパ球に浸潤関与していることを明らかにした。3.悪性グリオーマにおいて癌抑制遺伝子であるp53やp16の変異が知られている。今回、これらの遺伝子異常の悪性グリオーマにおける臨床的意義について検討した。その結果、悪性度の違いによりp53の遺伝子変異の部位が異なること、変異の有無は膠芽腫において予後には関連がないが、p16遺伝子の変異は膠芽腫においては予後不良因子であることを明らかにした。1.膠芽腫で高頻度に認められる癌遺伝子EGFR増幅、癌抑制遺伝子p53変異の予後的価値を検討した。p53遺伝子変異はyeast functional assay、EGFR遺伝子増幅はsouthern blotting、EGFR蛋白発現は免疫染色で評価した。p53変異は予後因子とならなかったが、EGFR増幅は生存期間の独立予後不良因子であった。また遺伝子増幅が確認された変異型EGFR過剰発現例は最も予後不良であった。

2.神経線維腫症I型(NF1)は高頻度にグリオーマを合併する。このNF1患者に見られる学習・記憶障害の発生はNF1遺伝子産物NeurofibrominによるRasの制御が破綻することで生じていることを細胞形態学的に証明し、その制御のメカニズムにNF1遺伝子のalternative splicing機構が関与していることと、さらにはそのalternative splicingにはRasの活性上昇が引き金となっているということを分子生物学的・生化学的に証明した。3.一酸化酸化窒素(NO)が腫瘍の病態に関わっていることが知られているが、その産生機序は明らかでない。今回酸化産物を生体内マイクロダイアリシス法にて測定した。その結果、グリオーマで正常の2倍のNOが産生され、その産生に組織内に浸潤したカルシウム非依存性NO合成酵素を介したNO産生機構が関わっていることを明らかにした。4.c-kit蛋白は脳や睾丸組織など正常組織に発現し、細胞の分化に重要な役割を果す膜蛋白であり、腫瘍細胞において発現が亢進している。今回、頭蓋内胚芽腫において睾丸胚芽腫と同様に腫瘍細胞の膜特異的に発現しており、また可溶性kit値が頭蓋内胚芽腫の髄液にて他の胚細胞腫に比較して特異的に上昇しており、診断や治療成績の判定に有用であることを明らかにした。1.Integrin-linked kinase (ILK)は腫瘍細胞の悪性化に関与する分子であるが、グリオーマ細胞でILKの発現と活性が増加し、とくに癌抑制遺伝子の一つであるPTEN遺伝子発現のない細胞に高い活性を示すことを明らかにした。この細胞にPTEN遺伝子を導入するとアポトシース活性が上昇し、さらにILKの局在が変化し、PKB/Akt kinase活性が抑制された。このことからILKがPTEN遺伝子欠損グリオーマ細胞の増殖に重要な役割を演じていると思われることから、ILK抑制剤であるCOX-2抑制剤NS-398によりPTEN遺伝子欠損グリオーマ細胞の増殖が抑制されることを明らかにした。2.壊死組織の存在とマクロファージの浸潤は膠芽腫における組織学的特徴の一つであるが、この壊死組織内に遊離ドコサヘキサエンサン(DHA)が存在することを明らかにした。しかもDHAによりマクロファージの抗腫瘍活性が抑制され、アポトーシスに陥ることを明らかにした。このことからグリオーマ局所の壊死組織に含まれるDHAが局所浸潤したマクロファージによる腫瘍免疫からグリオーマ細胞を回避させていると思われる。3.ヒト胚細胞腫においてc-kit分子が発現し、特に胚芽腫成分において特異的に発現していることを見出し、さらにその可溶型分子(膜貫通ドメインにて分解され産生される)s-kitが髄液中に存在し、その濃度が臨床経過と相関することを見出した。
ヒト鼻粘膜におけるp63を介した新規抗原・感染防御機構の解明

1)正常(肥厚性鼻炎),および慢性副鼻腔炎患者より採取したヒト鼻粘膜組織と鼻茸組織に対し免疫染色を行ったところ,p53がん抑制遺伝子ファミリーに属する転写因子p63,およびそのisoformの一つである⊿Np63が,慢性副鼻腔炎患者で発現増加しているのを認めた.またp63の調節に関わるヒストン脱アセチルか酵素(HDAC)のうちHDAC-1およびHDAC-6の発現も慢性副鼻腔炎患者で増加していた.上皮バリアを担う細胞間接着装置-タイト結合を構成するタンパク質claudin-1とclaudin-4の発現は慢性副鼻腔炎患者で低下した.2)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞において,p63および⊿Np63をノックダウンさせたところ,蛋白レベルでclaudin-1とclaudin-4の発現増加と認めた.claudin-1,4の発現に関連する転写因子SP1の発現も増加した.TER実験で上皮バリア機能亢進,脂質アナログを用いたフェンス機能実験では機能亢進がみられた.走査電子顕微鏡では,細胞表面で線毛様構造の増加を認めた.3)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞へRSVを感染させると,免疫染色およびウェスタンブロットにてp63発現低下,claudin-4,occludin発現増加を認めた.4)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に対しNF-kBのinhibitor(クルクミン)全HDACに対するinhibitor(TSA)HDAC-1,6の各inhibitor,p38MAPKのinhibitor(SB230580)を処置したところ,免疫染色,ウェスタンブロットにてp63の発現抑制,claudin-4,occludinの発現が亢進し,TER実験にて上皮バリア機能が亢進していた.以上から,p63はヒト鼻粘膜上皮バリアにおいて,負の調節機構に関連し,p63を抑制することにより感染,抗原防御に有利に作用する可能性が示唆された.平成30年度に実施する実験においては,ほぼ終了し有意義な結果を見出すことができた.正常ヒト鼻粘膜上皮細胞の恒常性,特に細胞間接着装置の負の発現調節に転写因子p63が関連していることが確認された.p63は,細胞外基質やギャップ結合を介した細胞間コミュニケーションにも関連していることが考えられている.またp63は,多細胞生物における後天的な遺伝子発現制御を調節するHDACのinhibitorにより発現抑制することが認められた.Rho kinase inhibitorであるY27632は,reprograming cultureにおいて重要な因子であり,気道上皮細胞においてprogenitor clone formationを亢進するとされる.Y27632をヒト鼻粘膜上皮細胞に対し長期間処置し,DNA aray解析したところ,p63の発現が増加するとともに,ギャップ結合分子,薬物代謝酵素,多様な代謝ネットワークの制御因子であるKLF familyの一部の発現亢進,タイト結合分子の発現低下を認めた.今後,これらの詳細な調節システムを解明するとともに,ヒト鼻粘膜におけるp63の役割を明らかとしたい.1)正常(肥厚性鼻炎),および慢性副鼻腔炎患者より採取したヒト鼻粘膜組織と鼻茸組織に対し免疫染色を行ったところ,p53がん抑制遺伝子ファミリーに属する転写因子p63,およびそのisoformの一つである⊿Np63が,慢性副鼻腔炎患者で発現増加しているのを認めた.またp63の調節に関わるヒストン脱アセチルか酵素(HDAC)のうちHDAC-1およびHDAC-6の発現も慢性副鼻腔炎患者で増加していた.上皮バリアを担う細胞間接着装置-タイト結合を構成するタンパク質claudin-1とclaudin-4の発現は慢性副鼻腔炎患者で低下した.2)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞において,p63および⊿Np63をノックダウンさせたところ,蛋白レベルでclaudin-1とclaudin-4の発現増加と認めた.claudin-1,4の発現に関連する転写因子SP1の発現も増加した.TER実験で上皮バリア機能亢進,脂質アナログを用いたフェンス機能実験では機能亢進がみられた.走査電子顕微鏡では,細胞表面で線毛様構造の増加を認めた.3)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞へRSVを感染させると,免疫染色およびウェスタンブロットにてp63発現低下,claudin-4,occludin発現増加を認めた.4)正常ヒト鼻粘膜上皮細胞に対しNF-kBのinhibitor(クルクミン)全HDACに対するinhibitor(TSA)HDAC-1,6の各inhibitor,p38MAPKのinhibitor(SB230580)を処置したところ,免疫染色,ウェスタンブロットにてp63の発現抑制,claudin-4,occludinの発現が亢進し,TER実験にて上皮バリア機能が亢進していた.以上から,p63はヒト鼻粘膜上皮バリアにおいて,負の調節機構に関連し,p63を抑制することにより感染,抗原防御に有利に作用する可能性が示唆された.平成30年度に実施する実験においては,ほぼ終了し有意義な結果を見出すことができた.正常ヒト鼻粘膜上皮細胞の恒常性,特に細胞間接着装置の負の発現調節に転写因子p63が関連していることが確認された.p63は,細胞外基質やギャップ結合を介した細胞間コミュニケーションにも関連していることが考えられている.またp63は,多細胞生物における後天的な遺伝子発現制御を調節するHDACのinhibitorにより発現抑制することが認められた.

Rho kinase inhibitorであるY27632は,reprograming cultureにおいて重要な因子であり,気道上皮細胞においてprogenitor clone formationを亢進するとされる.Y27632をヒト鼻粘膜上皮細胞に対し長期間処置し,DNA aray解析したところ,p63の発現が増加するとともに,ギャップ結合分子,薬物代謝酵素,多様な代謝ネットワークの制御因子であるKLF familyの一部の発現亢進,タイト結合分子の発現低下を認めた.今後,これらの詳細な調節システムを解明するとともに,ヒト鼻粘膜におけるp63の役割を明らかとしたい.実験に使用する薬液の消費個数が予定より少なかったため。次年度の実験において,材料となるヒト鼻粘膜上皮細胞のサンプリング,培養を強化する予定であり,培養液等にあてる予定である。
標準治療抵抗性口腔扁平上皮癌における癌間質細胞を標的とした新規治療法の開発

セツキシマブは頭頸部がんに適応となっている分子標的薬で、切除不能口腔癌の標準治療として用いられている。しかし、著効例においてもある時期に抵抗性を獲得すると考えられ、腫瘍の根治は困難であることから、これらを補完できる治療法の開発が望まれる。われわれはこれまでに、セツキシマブ耐性腫瘍において上皮間葉転換(EMT)マーカーであるCD44vが高発現していることを解明してきた。そこで本研究では、セツキシマブ耐性口腔扁平上皮癌の癌間質・間葉系細胞に着目し、CD44vと新規間質マーカーの発現プロファイルの構築による個別化治療を目的とする。本年度は、昨年度までに同定した上皮マーカー:CD326 (Epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)と、間葉マーカー:CD140a (Platelet-Derived Growth Factor Receptor alpha; PDGFRα)を用いて、未分化なセツキシマブ耐性SCC細胞の解析を実施した。コラゲナーゼ処理後フローサイトメーターを用いて細胞表面マーカーの解析を実施した結果、EpCAM陽性細胞、およびPDGFRα陽性細胞中のいずれにおいてもEGFR陽性細胞が存在したが、それらはそれぞれ10%台の陽性率であった。過去の報告では頭頸部扁平上皮癌におけるEGFR陽性率は80-90%とされており、本結果はセツキシマブ耐性の性質を保持した何かしらの腫瘍関連細胞、特に異常増殖能を示す幹細胞性質を強く保持している細胞が存在する可能性が考えられた。EpCAM陽性細胞/PDGFRα陽性細胞いずれにもがん幹細胞マーカーCD44vが存在したことも我々の仮説を強く支持した。そこで本研究では、セツキシマブ耐性口腔扁平上皮癌の癌間質・間葉系細胞に着目し、新たな治療標的の探索や特異的分子標的治療薬開発を目的とする。分子マーカーの測定は進行しているが、n数が不足している。Western blottingの条件検討にもやや時間を要している。EpCAM陽性細胞/PDGFRα陽性細胞のいずれにおいてもがん幹細胞マーカーCD44vが存在したこともわれわれの仮説を強く支持した。どのようにn数を増やすかは課題ではあるものの、概ね順調に進展している。

EpCAM陽性細胞/PDGFRα陽性細胞いずれにもがん幹細胞マーカーCD44vが存在したことも我々の仮説を強く支持した。今後はフローサイトメーターだけでなく、Western blottingや免疫染色でも発現確認を行う。今後は症例数を増やして、昨年度までに同定した上皮マーカー:CD326 (Epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)と、間葉マーカー:CD140a (Platelet-Derived Growth Factor Receptor alpha; PDGFRα)を用いたセツキシマブ耐性SCC細胞の解析を実施する予定である。また、将来の臨床応用に向けて、腫瘍細胞のヌードマウスへの移植およびin vivoにおける細胞動態の評価、オンコパネルによる解析も予定している。オンコパネルなど比較的高額の外注検査を予定していたが、本年度中に発注に至らなかったため。オンコパネルや腫瘍細胞のヌードマウスへの移植、in vivoにおける細胞動態の評価の実施に高額の費用が必要となるが、研究全体の進捗状況と症例不足から昨年度はまだこれらの実験・検討を行うには時期尚早であった。昨年までに、これらを行う前に必要な他の実験を終えることができたため、今年度はオンコパネルや腫瘍細胞のヌードマウスへの移植などの実施を予定している。上記につき次年度に発注予定である。
固有声(eigenvoice)に基づいた音声合成---多様な声質の実現を目指して---

自動電話番号案内/自動残高照会/電子メール読み上げなどの電話サービス,カーナビゲーションにおける音声インタフェース,パソコンの音声入出力インタフェース,自動翻訳電話,など,音声認識,音声合成の技術を用いた各種システムが実用化の段階に入ろうとしており,その将来への期待が高まっている.ところが,この中で用いられる多くの音声合成システムは,予め定められた話者の声質、および発話スタイル(通常、読み上げ調)でしか音声を合成することができず,人間同士との対話との違和感は大きい.このような現状に鑑み,本研究課題では,新たに提案する「音声合成における固有声」の概念と手法に基づいて多様な話者の声質,発話様式(「嬉しそうに」,「悲しそうに」など)を自在に実現することのできる音声合成システムを構築することを目的とした.まず,固有声計算手法を理論面から整理し,音声合成に適した手法を導出した.次に,多数話者の音声データベースを構築した上で,それに基づき実際に「固有声に基づく音声合成システム」を構築し,固有声重みの設定により多様な声質が得られること,また,基本的な音声品質に劣化がないことを確認した.そして,構築した「固有声に基づく音声合成システム」に関して,各固有声重みと生成される声質との対応について,主観評価実験に基づき,統計的分析を行った.最終的に,分析結果に基づいて,ユーザが好みの声質を表現語(例:男性的で,若々しく,元気な声)により自在に設定することのできる音声合成システムを構築した.自動電話番号案内/自動残高照会/電子メール読み上げなどの電話サービス,カーナビゲーションにおける音声インタフェース,パソコンの音声入出力インタフェース,自動翻訳電話,など,音声認識,音声合成の技術を用いた各種システムが実用化の段階に入ろうとしており,その将来への期待が高まっている.ところが,この中で用いられる多くの音声合成システムは,予め定められた話者の声質、および発話スタイル(通常、読み上げ調)でしか音声を合成することができず,人間同士との対話との違和感は大きい.このような現状に鑑み,本研究課題では,新たに提案する「音声合成における固有声」の概念と手法に基づいて多様な話者の声質,発話様式(「嬉しそうに」,「悲しそうに」など)を自在に実現することのできる音声合成システムを構築することを目的とした.まず,固有声計算手法を理論面から整理し,音声合成に適した手法を導出した.次に,多数話者の音声データベースを構築した上で,それに基づき実際に「固有声に基づく音声合成システム」を構築し,固有声重みの設定により多様な声質が得られること,また,基本的な音声品質に劣化がないことを確認した.そして,構築した「固有声に基づく音声合成システム」に関して,各固有声重みと生成される声質との対応について,主観評価実験に基づき,統計的分析を行った.最終的に,分析結果に基づいて,ユーザが好みの声質を表現語(例:男性的で,若々しく,元気な声)により自在に設定することのできる音声合成システムを構築した.本研究で実現を目指す「固有声に基づいた音声合成システム」は,大きくわけて(1)固有声学習部},(2)声質設定部},(3)音声合成部の3つの部分からなる.「音声合成部」については,これまでに提案した「HMMに基づく音声合成」により実現できるが,「固有声学習部」,「声質設定部」に関しては,以下にあげるいくつかの問題点を解決しなければならない.本年度は主として音声合成における固有声手法の確立を目指し、以下を行った.1.固有声算出のため、特定話者HMMの学習:40名分の特定話者モデルを学習した.2.合成音声の基本品質を向上させるため、コンテキスト依存HMM(トライフォンHMM)の導入を行った.但し、特別な工夫なくコンテキスト依存HMMを導入しただけでは、各特定話者モデルの構造が異なったものとなり、固有声手法を適用することができなくなるため、この問題を解決するための、特定話者モデルのクラスタリング手法を提案した.3.提案した手法により得られた固有声に基づいて音声を合成し,期待通りの動作をするか,また,基本的な音声品質に劣化がないかなどについて確認した.4.受聴試験により、コンテキスト依存HMMを用いることにより、合成音声の品質が大幅に向上することを確認した.5.因子分析に基づいて、各固有声成分がどのような声質の表現語に対応しているかについて、基礎的な検討を行った.隠れマルコフモデル(HMM)に基づく音声合成システムでは,HMMのパラメータを変換することで様々な声質の音声を合成できるという利点がある。本研究では,固有声手法をHMM音声合成システムに適用することにより,多様な声質の合成音声を得ることが出来るシステムを提案しその有効性を示してきた。昨年度までのシステムではtriphoneモデルに固有声手法を適用してきたが,スペクトルのみを扱っていた。本年度は,更に基本周波数をも同時にモデル化するため,多空間分布HMMによって基本周波数をモデル化した。また,不特定話者モデルのクラスタリングの際に,MDL基準を用いた。2種類のモデル生成部を提案し,それぞれについて合成実験を行った。実際に1から3個の固有ベクトルの重みを変更して聴取実験を行った。スペクトル包絡の面では,男性的,女性的な合成音声を,基本周波数の面では,高い,低い合成音声などの声質を持つ音声を容易に合成することが出来た。また,提案法の基になっているHMM音声合成システムの合成音声の品質向上のための検討をも行った。従来のシステムでは,励振源モデルとして有声区間と無声区間でパルス列と白色雑音源を切り換える単純なモデルを用いていたため,合成音声はボコーダ特有の品質であった。

研究では,音声符号化手法であるMELPと同様の混合励振源モデルとポストフィルタを導入することにより合成音声の品質向上を検討した。合成音声の聴取実験によれば,品質が大幅に改善できることが確認できた。以上の成果は,電子情報通信学会研究会,日本音響学会秋季発表会,Eurospeech2001において発表を行った。本研究で実現を目指す「固有声に基づいた音声合成システム」は,大きくわけて(1)固有声学習部,(2)声質設定部,(3)音声合成部の3つの部分からなる.「音声合成部」については,これまでに提案した「HMMに基づく音声合成」により実現できる.また,「固有声学習部」に関しては,前年のまでの研究により確立することができた.従って,本年度は,「声質設定部」に関する研究を中心に進めた.経過は,以下のようにまとめられる.1.まず,各固有声がどのような表現語に対応しているかを調べる必要がある.受聴試験に基づく主観評価試験により,第1成分および第2成分は「性別」と「音量」との混合にほぼ対応していることがわかった.但し,第3成分以降の成分は,必ずしも,わかりやすい表現語と一対一対応している訳ではないこともわかった.2.各成分と,代表的な声質に関する表現語との関係を明らかとするため,新たな受聴試験を行った.その結果を統計的に分析することにより,各成分の重みの値と,実現される合成音声の声質との間の関係をモデル化した.3.モデルに基づいて,ユーザーが好みの声質(例:「若々しい女性の声」)を自在に設定できる音声合成システムを構築した.本システムは,以下のURLにおいて,実際に試用することが可能である.http://kt-lab.ics.nitech.acjp./demo/
非Pd系水素透過合金の強加工による組織の異方化と高性能化

bcc構造の(Nb, Ti)相とB2構造のTiNi相からなる複相Nb-TiNi合金の組織を制御し、微細組織と水素透過度の関係ついて調べた。強加工によって作製した異方性合金の板厚方向の水素透過度は、加工率の増加とともにより低温、短時間で回復できる。また、ラメラ組織を有する合金を熱処理すると、塊状組織が形成され水素透過度が低下する。これは、見かけの拡散係数が低下するためである。従って、水素の拡散が容易な組織により、合金の水素透過度を効率的に改善できると考えられる。Nb40Ti30Ni30合金は鋳造状態で塊状の(Nb, Ti)相と共晶{TiNi+(Nb, Ti)}相からなるが、熱処理・加工条件を変えることで、様々なミクロ組織を作製できることが分かった。まず、熱処理を行うことで共晶組織が消失し、TiNi相中に(Nb, Ti)相が分散した組織となる。この場合でも特性悪化や脆化の原因となる脆い金属間化合物相は生成せず、高い水素透過度と耐水素脆化性を示す。圧延率が低い場合は、初晶形状はほとんど変化せず、水素透過度の改善効果も低い。しかし、圧延率が90%を超えると、(Nb, Ti)相が圧延方向に著しく伸展した異方性組織を形成する。(Nb, Ti)相の伸展方向およびそれと垂直方向に水素透過を行ったところ、前者の透過度は鋳造合金の7倍程度に増加するが、後者の透過度は1/10程度に減少する。すなわち、水素の透過方向で70倍程度の差が生じ、水素透過にも異方性が生じることが分かった。いずれの場合も523Kまで破壊することなく水素透過が可能であり、良好な耐水素脆化性を有しているといえる。合金を透過する水素の流束は、(1)水素透過度と(2)膜前後の圧力差とともに増加し、(3)膜厚に反比例する。高い水素透過流束を得るために上記(1)(3)のパラメータを変えて水素透過試験を行ったところ、膜厚100μm、入口側圧力0.9MPa、出口側圧力0.1MPaの条件下で、70cc/cm2/minを超える水素流量が得られることが明らかとなった。この流量は純Pdの4倍以上である。以上より、Nb-TiNi合金の組織制御により、高い水素透過度と耐水素脆化性を両立する合金の作製が可能であり、実用材料への応用が期待される。初晶と共晶からなるNb-TiNi合金を鍛造・圧延により薄膜化すると、水素透過を担う(Nb, Ti)相の水素透過方向の連続性が低下するため、水素透過度が著しく減少する。従って、低下した水素透過度を回復させるプロセスの確立が工業的に重要になる。断面減少率99%以上に加工したNb40Ti30Ni30合金を様々な条件で熱処理したところ、熱処理の温度・時間とともに、加工により形成した異方性組織が崩れ、(Nb, Ti)相の水素透過方向の連続性が回復し、それに付随して水素透過度が加工前と同等の値まで回復することが分かった。その結果、水素透過度の犠牲なしに膜厚を1/70程度にすることができ、水素透過流量が70倍以上向上することが分かった。本複相型水素透過合金は、水素化挙動のことなる2相、すなわちbcc-(Nb, Ti)相とB2-TiNi相から構成されているが、それぞれの単相合金では良好な耐水素脆化性は得られない。本合金の耐水素脆化性の起源を調べるため、bcc単相合金、B2単相合金、bcc+B22相合金の高温高圧水素中での格子定数の変化を調べた。単相合金では、水素化によりbcc相は4%程度格子が膨張するが、B2相の膨張量は1%以下であった。また、水素化後も鋭い回折ピークが観察されることから、均一に膨張が生じていることが分かる。しかし、2相合金では、B2相の膨張量が低下し、かつ多量のひずみが導入されることが分かった。つまり、B2相が自らひずむことでbcc相の格子膨張の影響を緩和し、合金の耐水素脆化性向上に寄与することが分かった。Nb19Ti40Ni41共晶合金を熱処理すると、bcc-(Nb,Ti)相がB2-TiNi相中に析出した2相合金を形成した。この合金中のbcc相およびB2相の組成を決定し、それぞれの単相合金を作製し、高温高圧水素下でX線回折を行った。bcc単相合金を673Kで水素化すると、格子定数が約3.8%膨張した。また、温度の低下とともに増大した。これは、水素吸蔵による格子膨張が熱収縮を上回るためである。

一方、B2-TiNi単相合金を同条件で水素化すると、673Kではほとんど膨張しなかったが、温度の低下とともに格子膨張が観察された。また、ブラッグピークの半価幅は水素化および温度変化によらずほぼ一定であった。bcc+B22相合金を水素化すると、bcc相はbcc単相合金と同じ水素化挙動を示した。従って、bcc相は他相による拘束の影響を受けずに水素化することがわかった。一方、2相合金中のB2相は、単相合金と比較して格子膨張量が小さく、半価幅が大きくなった。これは、bcc相による機械的な拘束を受け、水素吸蔵量が低下したと考えられる。また、bcc相の大きな膨張により、B2相に不均一ひずみが導入されたと考えられる。また、共晶合金を同条件で水素化した場合は、これらがより顕著に観察されることがわかった。Nb-TiNi 2相合金では、拘束によりTiNi相の水素吸蔵量が低下すること、TiNi相がbcc相の膨張を緩和するようにひずむことで、耐水素脆化性が発現していると考えられる。また、両相がより細かく複雑な組織を呈しているほど大きな効果が得られると考えられる。