hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
λμ計算の表示的意味論に関する研究

本結果の副産物として,ミュウオペレータは無限に続くラムダ抽象として解釈可能であることが明らかになった。(2)ラムダミュウ計算の継続的な意味論は,CPS変換の像に対するScott流の直接的な意味論と模倣関係にある:再帰的な領域方程式D×D=D=[D→D]を満たす任意の領域Dより,ラムダミュウ計算の継続的意味論を与えた。次に,ラムダミュゥ計算からラムダ計算への構文的な変換であるCPS変換を定義した。そして,その像に対する所謂Scott流の直接的な意味論と,前述の継続的な意味論との間には完備半順序集合(CPO)上の形式的な模倣関係が定義可能であることが示された。なお,以上の二つの結果は,学術論文によりそれぞれ公表されている。直観主義論理と型付きλ計算との対応関係は,カリー・ハワードの同型対応として知られている.λμ計算とは,この対応関係を古典論理まで拡張することによりM.Parigotによって導入された論理体系である.λμ計算はλ計算の自然な拡張となっており,計算モデルとしてそれ自体興味深い体系となっている.本研究では,表示的な意味論の観点から,外延的なタイプフリーλμ計算が固有にもっている計算の構造やその性質をλ計算との比較において解明をして,次の結果が得られた.(1)継続の概念に基づくλμ計算の表示的意味論:完備半順序集合で,D×D=D=[D→D]を満たす領域Dより,継続の概念に基づくλμ計算のモデルを与えた.この解釈では,継続をDXDの要素として,λμ式を[D×D→D]である連続関数と定義している.従って,外延的なタイプフリーλμ式の意味は,継続を引数にとる連続関数となっている.一方,Cモノイドは,上記領域方程式を満たすカルテシアン閉カテゴリにおける対象Dのエンドモルフィズムとなっている.よってλμ式の意味は,同時に,Cモノイドでも与えられることが明らかになった.(2)外延的なタイプフリーλμ計算から全射的な組を持つλ計算への全単射的CPS-変換:まず,外延的なλμ計算から全射的な組を持つλ計算への健全なCPS変換を定義した.次に,CPS変換の像で,簡約規則の下で閉じているλ式の集合を生成するために,文脈自由文法を与えた.この形式文法に基づき,λμ計算への逆変換を定義することができた.これにより,上で与えたCPS変換の完全性を示すことができた.さらに,このCPS変換は,λμ式の集合と簡約規則の下で閉じているλ式の集合間の全単射を形成していた.なお,以上の成果は学術論文でそれぞれ公表されている.直観主義論理と型付きラムダ計算との対応関係は,カリー・ハワードの同型対応として古くから知られている.λμ計算とは,この対応関係を古典論理にまで拡張することによりM.Parigotが導入した論理体系である.λμ計算はλ計算の自然な拡張となっており,計算モデルとしてそれ自体興味深い体系となっている.平成14年度,15年度における研究成果として,(1)タイプフリーλμ計算及び単純型付きλμ計算からλ計算へのCPS変換(2)継続の概念に基づくλμ計算の表示的意味論及びCモノイド(3)CPS変換と表示的意味論との完備半順序集合上の模倣関係などについて明らかにしてきた.これらの成果を発展させるために,本研究では多相型λ計算を対象として,次の結果が得られた.
重イオンビーム核融合における均一爆縮に対する理論的研究

[要旨]慣性核融合において最も重要な点は、球状燃料ペレットが如何に効率良く高い均一性を持って爆縮するかであり、これが将来へ向けての高利得シナリオの成否の鍵を握っている.この均一爆縮を達成するため、これまで様々な照射系の設計がなされてきた.例えば、激光XII号(阪大、12ビーム)オメガ(ロチェスター、24ビーム)ノバ(リバモア、10ビーム)等が現在稼働中の大型システムであるが、他の計画中の設計を含め、全てその設計思想は同じである.即ち、同一エネルギーを持つビームを球面上にできるだけ一様に散らばるように配置するものである.しかし、こうした設計は正多面体や結晶構造をベースとしたものであり、レーザーと物質の相互作用あるいは爆縮物理を無視したもので、論理的設計とは言い難い.これに対し、本研究発表では新たに同軸多円錐照射系を提唱する.この照射系では、ビームはいくつかのグループに分割され、同じグループのビームはリング状に配置される.この方法のユニークな点は、これまでの照射角度のみの最適化に対し、各ビームに異なるエネルギーを持たせることにより空間(角度)とエネルギーの2元空間における最適条件を計算することにある.これにより、照射系の設計と建設(コスト)が格段に簡単化されることになる.また、詳細な数値シミュレーションにより、この同軸円錐照射系では従来設計より少ないビーム数でもより均一な燃料球の爆縮が可能であることが確認された.更に特筆すべき点として、本研究成果はレーザーのみならず重イオンビーム等の粒子ドライバーに対しても、また直接照射方式のみならず一旦ビームエネルギーをX線に変換して使うX線駆動方式に対しても有効である.[要旨]慣性核融合において最も重要な点は、球状燃料ペレットが如何に効率良く高い均一性を持って爆縮するかであり、これが将来へ向けての高利得シナリオの成否の鍵を握っている.この均一爆縮を達成するため、これまで様々な照射系の設計がなされてきた.例えば、激光XII号(阪大、12ビーム)オメガ(ロチェスター、24ビーム)ノバ(リバモア、10ビーム)等が現在稼働中の大型システムであるが、他の計画中の設計を含め、全てその設計思想は同じである.即ち、同一エネルギーを持つビームを球面上にできるだけ一様に散らばるように配置するものである.しかし、こうした設計は正多面体や結晶構造をベースとしたものであり、レーザーと物質の相互作用あるいは爆縮物理を無視したもので、論理的設計とは言い難い.これに対し、本研究発表では新たに同軸多円錐照射系を提唱する.この照射系では、ビームはいくつかのグループに分割され、同じグループのビームはリング状に配置される.この方法のユニークな点は、これまでの照射角度のみの最適化に対し、各ビームに異なるエネルギーを持たせることにより空間(角度)とエネルギーの2元空間における最適条件を計算することにある.これにより、照射系の設計と建設(コスト)が格段に簡単化されることになる.また、詳細な数値シミュレーションにより、この同軸円錐照射系では従来設計より少ないビーム数でもより均一な燃料球の爆縮が可能であることが確認された.更に特筆すべき点として、本研究成果はレーザーのみならず重イオンビーム等の粒子ドライバーに対しても、また直接照射方式のみならず一旦ビームエネルギーをX線に変換して使うX線駆動方式に対しても有効である.
X線多層膜非球面レプリカ反射鏡の開発と表面のナノ構造解析

アルミニウム合金を超精密ダイヤモンド切削後に無電解ニッケル膜を成膜し、これを再度非球面に超精密ダイヤモンド切削し、表面粗さを向上させるため研磨して金型とし、その表面に金を成膜し、それに内面加工した反射鏡基板をエポキシ樹脂で接着し、加熱・養生後に冷水に漬けて、離型することにより内径10mm以下で形状誤差±72nm、表面粗さ1nm RaのX線レプリカ集光鏡を製作し、結像分解能50nm以下のX線顕微鏡を完成させた。ガラス円筒にPt/C多層膜を成膜し、その上に1/3円状のアルミニウムフォイルをエポキシ樹脂で接着し、真空中で加熱・養生後に、引き剥がすことによりX線レプリカ反射鏡を製作し、X線望遠鏡に組立て、気球に搭載し、アメリカで硬X線領域の天体観測を行った。無電解ニッケル平面金型をフロート・ポリシングし、それに各種Pt/C多層膜を成膜し、ガラス基板をエポキシ樹脂で接着し、離型することでPt/C多層膜レプリカ反射鏡を作成した。無電解ニッケルの表面粗さ0.14nm rmsに対し、剥離したPt/C多層膜レプリカ反射鏡の表面粗さ0.16nm rmsが得られ、完全な転写性を有することを確認した。シリコン単結晶表面にPt/C多層膜を成膜し、超高圧透過型電子顕微鏡により断面観察した結果、Cはアモルファス構造を呈し、Ptは配行した多結晶構造であり、これが界面粗さを規定している。また、Pt/Cの周期長が3nmを切ると、界面の粗さが顕著になり、要求されるX線反射特性が得られず、周期長が短い場合はMo/Siの多層膜が有利であることを見出した。直径70mmの無電解ニッケル金型を製作し、この表面にTi膜を成膜後、Pt/C多層膜を成膜し、内面加工した鋼製反射鏡基板をエポキシ樹脂で接着し、真空中で加熱・養生後に冷水に漬けて、離型することにより、円筒内面にPt/C多層膜がある硬X線用多層膜レプリカ反射鏡が製作することに成功した。1962年に打ち上げたX線天文ロケットで、宇宙X線源が初めて観測されて以来、X線天文学が発達したが、21世紀は観測波長が軟X線から硬X線へと変化する。従来のX線望遠鏡は、表面すれすれに入射したX線が円筒内面で全反射する現象を利用し、軟X線を集光・結像するもので、反射面にはAuもしくはIrがコートされていた。より波長の短い透過力め高い硬X線を検出して新しい天文物理学を確立するため、名古屋大学では、重元素Ptと軽元素Cを一定の厚さで交互に、超平滑な基板上に周期長を可変にして多数積層した準周期的な層状構造を持ち、X線を分光・集光・結像させる多層膜スーパーミラーを開発した。この場合、2種類の物質の界面粗さを小さくすることが高い反射率を得るために重要であり、高い結像性能と広い有効反射面積を得るためには高精度なX線多層膜非球面レプリカ反射鏡が必要である。超精密非球面加工装置による無電解ニッケル非球面金型の超精密ダイヤモンド切削を行うと共に、超高精度三次元形状計測器により非球面形状の測定を行った結果、形状精度200nmの非球面金型が得られた。

無電解ニッケルの平面研磨では0.1nm rms台の表面粗さが得られ、これにPt-C多層膜を成膜し、離型した結果、離型したPt/C多層膜の表面粗さは0.1nm rms台であった。しかし、離型作業そのものは極めて困難な工程であり、今後の更なる研究が必要である。非球面金型からの基板の離型を試みた結果、金を離型剤に使用することにより離型が容易になることが確かめられた。また、Pt/C多層膜を離型するためのレプリカ反射鏡製作用真空加熱・冷却システムの設計および構成要素の購入を行い、今後は組立、改良を行い、X線多層膜非球面レプリカ反射鏡を作成する。シリコン単結晶研磨面へのPt/C多層膜の成膜条件の最適化を図ると共に、多層膜のナノ構造を超高圧透過電子顕微鏡並びに走査型プローブ顕微鏡で観察した。本研究では、硬X線用多重薄板多層膜レプリカX線望遠鏡を製作するための基盤技術としての無電解ニッケル製超精密非球面金型の超精密ダイヤモンド切削と研磨、非球面金型の超精密形状計測法の検討、Pt/C多層膜の成膜技術の確立、レプリカ製作技術の検討、多層膜のナノ構造解析と多層膜の設計、レプリカ多層膜の表面のナノ構造解析を行った。超精密加工と機上での形状計測を繰り返すことにより、放物面と双曲面からなる無電解ニッケル製非球面金型を形状精度100nm代の加工を実現した。その金型表面に重元素Ptと軽元素Cを一定の厚さで交互に、多数積層した準周期的な層状構造を持ち、X線を分光・集光・結像させる多層膜を名古屋大学並びに宇宙航空研究開発機構宇宙科学研究本部で成膜した。その離型に関しては、金型とPt/Cとの離型性を良くする方法を検討し、界面にTi膜をコーティングする方法を開発し、平面・円錐面では硬X線領域で使用できる滑らかなPt/C多層膜レプリカ反射鏡を製作できた。直径100mmの放物面・双曲面からなる非球面金型からのPt/C多層膜の離型は、多層膜と基板との接着強度がTiと無電解ニッケルとの界面強度より低く、成功に至らなかった。イオンビームスパッタ法によりフロートガラス基板上に周期長を4nmから1.5nm、積層数10層のPt/C多層膜を成膜し、X線反射率を測定すると共に、多層膜のナノ構造を超高圧透過電子顕微鏡(HVTEM)観察した。その結果、Pt/C多層膜の微細構造は、Pt層が面心立方構造の多結晶膜で、(111)面に配向する繊維配向膜で、C層が非晶質膜であり、その界面は物質同士の拡散がなく、理想的な積層になっていること、周期長が短くなると、Pt膜の配向性が崩れ、島状の成長が顕著となり、界面の粗さが悪化すると共にPt密度が低下し、X線の反射率が大幅に低下することを明らかにした。アルミニウム合金を超精密ダイヤモンド切削後に無電解ニッケル膜を成膜し、これを再度非球面に超精密ダイヤモンド切削し、表面粗さを向上させるため研磨して金型とし、その表面に金を成膜後に内面加工した反射鏡基板をエポキシ樹脂で接着し、加熱・養生後に冷水に漬けて、離型することにより内径10mm以下で形状誤差±72nm、表面粗さ1nm RaのX線レプリカ集光鏡を製作し、結像分解能50nm以下のX線顕微鏡を完成させた。ガラス円筒にPt/C多層膜を成膜し、その上に1/3円状のアルミニウムフォイルをエポキシ樹脂で接着し、真空中で加熱・養生後に、引き剥がすことによりX線レプリカ反射鏡を製作し、X線望遠鏡に組立て、気球に搭載し、アメリカで硬X線領域の天体観測を行った。無電解ニッケル平面母型をフロート・ポリシングし、それに各種Pt/C多層膜を成膜し、ガラス基板をエポキシ樹脂で接着し、離型することでPt/C多層膜レプリカ反射鏡を作成した。無電解ニッケルの表面粗さ0.14nm rmsに対し、剥離したPt/C多層膜レプリカ反射鏡の表面粗さ0.16nm rmsが得られ、完全な転写性を有することを確認した。シリコン単結晶表面にPt/C多層膜を成膜し、超高圧透過型電子顕微鏡により断面観察した結果、Cはアモルファス構造を呈し、Ptは配行した多結晶構造であり、これが界面粗さを規定している。
新規合成タンパク質局在化の可視化による筋原線維形成の観察

新規に合成されたタンパク質は局在化されることによってはじめて機能を発揮することができる。骨格筋が太く強くなるためには既存の筋原線維へ新規に収縮フィラメントが追加(筋原線維形成)される必要があるが、近年筋原線維形成に関わるタンパク質が運動や加齢によって変化することが報告されている。本研究では新規に合成されたタンパク質の局在化観察手法を確立し、これまで測定することができなかった新規合成タンパク質の筋原線維形成動態の可視化を試みる。筋原線維形成の亢進は筋力増加を伴った筋肥大に必須であり、新規技術の確立のみならず、骨格筋量・機能調節研究にブレークスルーを起こす評価指標になる可能性がある。
ストップトフローによる浮遊赤血球の高速形状変化の顕微観察

外部刺激による細胞の形状変化の動的情報を得るため溶液内の高速反応の研究法の代表ともいえるストップトフロー法の応用を試み、混合・停止系の不感時間は11.3ミリ秒、リザーバーにある反応溶液A,Bはあらかじめ循環水によって温度37°Cに制御、混合器容量が10.5μl、観測セルの光路長0.2mm、容量8μlで、プレパラート全体が37°Cの循環水で温度制御された光学顕微鏡の恒温ステージにマウントされた装置を開発し、光散乱あるいは吸光度変化は赤血球の形状変化を反映し、形状変化の間接的検出法として利用できることを明らかにし、形状変化の動的研究の道を開いた。また形状変化の直接観察のため通常のCCDカメラと高速ビデオカメラを用いて録画し、ビデオ画像をパソコンに取り込み、画像処理により赤血球の断面積の経時変化を解析した。一方、薬物添加による赤血球の形状変化について、特に陰イオン性の界面活性剤で、エキノサイト型誘起物質であるアルキル硫酸ナトリウムと赤血球との相互作用について、結合等温曲線測定をはじめ、顕微鏡観察、光散乱あるいは吸光度(濁度)測定を行い、各種物理量と赤血球の形状変化との相関を調べてきた。その結果、界面活性剤の赤血球膜への結合は大きく分けてバンド3を代表とする膜蛋白質への疎水的結合と隣脂質部分への協同的結合の2種類に分類できる事を明らかにした。さらに新しく2ミリ秒間隔で画像が取り込める高速ビデオを導入することによりこれまで確認されていなかった速い時間領域(30ミリ秒以内)に形状がすでに変化していることを明らかにした。これらの成果は赤血球のみならず広く細胞の形状変化の時間分割に関する研究に対して基本的かつ重要な情報を提供するものであり、当初の目的を達成することが出来た。一般に、外部刺激による細胞の変化を顕微鏡観察する際に、細胞をプレパラートに固定する場合が多い。しかし薬物添加による細胞の変化を観測する場合には必ずしも良い方法とは言えない。特に細胞で起こる変化が高速であれば、薬物添加の最中に細胞の変化が進行するし、また柔らかな細胞であれば、薬物添加時の液流圧により細胞の歪みを生ずることもある。我々は、これまで薬物添加による赤血球の形状変化について、光散乱あるいは濁度検出ストップトフローを用いて形状変化のダイナミックスを観測し、その機構解明を試みてきた。赤血球は両親媒性物質(陰イオン性界面活性剤)の添加により、約20分にわたる複数の過程を経てエキノサイト形(金平糖形)に変化する。混合後1秒以降の遅い過程については写真撮影等により形状変化の定量的評価も行ってきた。しかも1秒以内にも複数の動的過程の存在する事がわかったものの、その速い過程については赤血球のどんな形状変化が起こっているか不明のままであった。そこで溶液内の高速反応の研究法の代表ともいえるストップトフロー法の応用を試み、混合・停止系の不感時間は11.3ミリ秒、リザーバーにある反応溶液A,Bはあらかじめ循環水によって温度37°Cに制御、混合器容量が10.5μl、観測セルの光路長0.2mm、容量8μlで、プレパラート全体が37°Cの循環水で温度制御された光学顕微鏡の恒温ステージにマウントされた装置を開発した。観測は通常のCCDカメラ(画素数38万、30画像/秒)と高速カメラ(Nac HSV-200、走査線262.5本、200画像/秒)を用いて録画し、ビデオ画像をパソコン(Power Mac)に取り込み、機能豊富なフリーソフトであるNIHImageを用いて画像処理を行うことにより赤血球の断面積の経時変化を解析している。我々は、これまで薬物添加による赤血球の形状変化について、特に陰イオン性の界面活性剤で、エキノサイト型誘起物質であるアルキル硫酸ナトリウムと赤血球との相互作用について、結合等温曲線測定をはじめ、顕微鏡観察、光散乱あるいは吸光度(濁度)測定を行い、各種物理量と赤血球の形状変化との相関を調べてきた。その結果、界面活性剤の赤血球膜への結合は大きく分けてバンド3を代表とする膜蛋白質への疎水的結合と隣脂質部分への協同的結合の2種類に分類できる事を明らかにし、さらに光散乱あるいは吸光度変化は赤血球の形状変化を反映し、形状変化の直積的検出法として利用できることを明らかにし、形状変化の動的研究の道を開いた。この成果に基づいて濁度および散乱光検出ストップトフロー法を利用し、各種アルキル硫酸ナトリウムによる赤血球のエキノサイト化への動的過程の観測をした。その結果、生理条件では赤血球は薬物との混合後、0.1秒から2030分の間に少なくとも4つの過程を経て最終的なエキノサイト型に至る事を明らかにし、形状変化動的モデルを提唱した。この結果は形状変化の高速顕微鏡観察に当たっての重要な指針をあたえる大きな成果であり、論文として発表した。この成果をふまえて、本申請課題の最終年度での完遂を目指して顕微鏡観察の動的実験を展開している。

外部刺激による細胞の形状変化の動的情報を得るため溶液内の高速反応の研究法の代表ともいえるストップトフロー法の応用を試み、混合・停止系の不感時間は11.3ミリ秒、リザーバーにある反応溶液A,Bはあらかじめ循環水によって温度37°Cに制御、混合器容量が10.5μl、観測セルの光路長0.2mm、容量8μlで、プレパラート全体が37°Cの循環水で温度制御された光学顕微鏡の恒温ステージにマウントされた装置を開発し、光散乱あるいは吸光度変化は赤血球の形状変化を反映し、形状変化の間接的検出法として利用できることを明らかにし、形状変化の動的研究の道を開いた。また形状変化の直接観察のため通常のCCDカメラと高速ビデオカメラを用いて録画し、ビデオ画像をパソコンに取り込み、画像処理により赤血球の断面積の経時変化を解析した。一方、薬物添加による赤血球の形状変化について、特に陰イオン性の界面活性剤で、エキノサイト型誘起物質であるアルキル硫酸ナトリウムと赤血球との相互作用について、結合等温曲線測定をはじめ、顕微鏡観察、光散乱あるいは吸光度(濁度)測定を行い、各種物理量と赤血球の形状変化との相関を調べてきた。その結果、界面活性剤の赤血球膜への結合は大きく分けてバンド3を代表とする膜蛋白質への疎水的結合と隣脂質部分への協同的結合の2種類に分類できる事を明らかにした。さらに新しく2ミリ秒間隔で画像が取り込める高速ビデオを導入することによりこれまで確認されていなかった速い時間領域(30ミリ秒以内)に形状がすでに変化していることを明らかにした。これらの成果は赤血球のみならず広く細胞の形状変化の時間分割に関する研究に対して基本的かつ重要な情報を提供するものであり、当初の目的を達成することが出来た。
子宮内膜症由来不死化細胞への性ホルモン受容体の遺伝子導入による病態解析

文書により同意を得た患者の手術検体から得た卵巣チョコレート嚢胞壁から間質細胞を分離し、レンチウイルスベクターシステムにてCDK4/TERTまたは、TERTのみを遺伝子導入して安定的に継代可能な不死化細胞株を樹立した。この細胞株にMPAを投与し、細胞増殖を確認したところ、内膜症組織に特有の有為な細胞増殖抑制効果を確認した。以上より、子宮内膜症病巣由来の不死化子宮内膜間質細胞株を樹立し、以前より作成している不死化上皮細胞とともに子宮内膜症の病態を解明する培養実験系を確立した。平成28年度は不死化子宮内膜間質細胞株の樹立、不死化細胞への各種性ステロイドホルモン受容体の遺伝子導入、遺伝子導入上皮および間質細胞に対する性ステロイドホルモン作用の解析を行なうことを計画した。上皮細胞マーカーとしてサイトケラチンを、間質細胞マーカーとしてCD10をRT-PCRおよび免疫細胞染色にて確認したところ、どちらの不死化細胞株も間質由来であることを確認した。次に子宮内膜症の進展発育に大きな影響を与える性ステロイドホルモンの受容体を解析した。RT-PCRおよびWestern blotによる解析ではEstrogen receptor (ER)α、Progesterone receptor (PR)B陽性であったが、PRAの発現は認められなかった。この細胞株にプロゲスチン製剤であるMPAを投与し、細胞増殖を確認したところ、内膜症組織に特有の有為な細胞増殖抑制効果を確認した。次に不死化細胞への各種性ステロイドホルモン受容体の遺伝子導入だが、不死化上皮細胞にERα、PRA、PRB、不死化間質細胞にERαを導入した。今後、これらの細胞に対する性ステロイドホルモン作用の解析を行う予定である。まず、子宮内膜症病巣由来の不死化子宮内膜間質細胞株の樹立はできた。ここまでは順調に進んでいる。次に不死化細胞への各種ステロイドホルモン受容体の遺伝子導入だが、ここで遺伝子導入が予想よりもスムーズに導入できていないため、当初の計画よりもやや遅れている状況である。不死化子宮内膜間質細胞株の樹立、不死化細胞への各種性ステロイドホルモン受容体の遺伝子導入、遺伝子導入上皮および間質細胞に対する性ステロイドホルモン作用の解析と発現変化する遺伝子群のスクリーニングを行なうことを計画した。RT-PCRおよびWestern blotによる性ステロイドホルモンの受容体の解析ではEstrogen receptor (ER)α、Progesterone receptor (PR)B陽性であったが、PRAの発現は認められなかった。また、不死化上皮細胞にERα、PRA、PRB、不死化間質細胞にERαが導入できた。不死化上皮細胞にPRA、PRBを導入しMPAによる細胞増殖能を確認したところ、MPA2nMでは、PRAの遺伝子導入した細胞株のみに有意な細胞増殖抑制効果を確認し、子宮内膜症由来の不死化細胞株は、プロゲスチンによる増殖抑制メカニズムが正常子宮内膜上皮細胞と違う可能性が示唆された。子宮内膜症病巣由来の不死化子宮内膜間質細胞株は、ERβの発現がWestern blotにて確認できなかった。そこで、ERβ強制発現株を作成しようと試みたが、作成した細胞株はERβの発現が弱かった。この理由として、発現効率が悪い等が考えられる。そこで、遺伝子導入効率をあげるために、今までは、リポフェクション法によるtransfectionをしていたので、electroporation法による導入を行うことを今後、考えている。また、不死化

上皮細胞にERα、PRA、PRBは導入でき、不死化間質細胞にERαは導入できている。そこで、今後、これらの細胞に対する各種ステロイドホルモン作用の解析、遺伝子導入上皮および間質細胞で発現変化する遺伝子群のスクリーニング、不死化上皮と間質細胞および不死化間質細胞とHUVECの共培養系を用いた解析、合成ステロイド剤の作用の解析をする。さらに上記の検討で得られた知見に関して子宮内膜症検体を用いて確認し、子宮内膜症の病態に対応した個別的かつ効果的な治療法開発の可能性を検討する予定である。産婦人科学会参加を予想よりはしなかったため、次年度使用額が生じたものと思われる。抗体等の、物品に使う予定。
ショウジョウバエ試験管内再構成系による組換え修復機構に関する研究

再構成クロマチン上での相同的組換え相同的組換えのなかで重要な過程である相同的対合と鎖交換過程を高感度で検出する試験管内反応系を構築し、再構成クロマチンレベルでの解析を行った。その結果クロマチン構造が相同的組換えに段階的に抑制として働くこと、クロマチンレベルの制御が相同的組換えの進行に重要であることが示唆された。ショウジョウバエ相同的対合タンパクDMRと核内構造相同的対合を行う候補のショウジョウバエDMR蛋白質は発生過程を通じて存在するが初期胚、卵巣により多く存在し、精製したDMR蛋白質はDNA結合性、ATP分解活性などを示した。また、DMRタンパクの核内構造やクロマチンとの相互作用について解析をした。これによりDMRタンパクは減数分裂期およびそれ以外の細胞周期でもDNA代謝などに機能していると推測された。ショウジョウバエ相同的組換え関連タンパクDQ1ショウジョウバエよりRecQホモログDQ1を同定した。DQ1タンパクは新しいサブファミリーに属するものであり、発生過程を通じて存在し、とりわけ初期胚および卵において高い発現がみられた。特に生殖幹細胞に局在がみられ、このことから第一減数分裂前期の相同的組換えへの関与が期待された。相同的組換えタンパク複合体と細胞機能ネットワークDMRタンパクと特異的相互作用を行う新規の細胞機能に必須タンパクを見いだした。このことから新たな組換え修復からのネットワークが示唆された。また、DMRおよびDQ1の発生過程での挙動は類似しており、少なくとも初期胚では両タンパクが複合体を形成していることが示唆された。これらのことから生物個体のなかでどのように修復や組換えが機能しているかが興味が持たれた。ヒトをはじめとする動物での組換え機構は、放射線等からの防御修復機構として、生殖細胞系列での遺伝情報伝達として、真核生物特有の核内構造やクロマチン構造のもとで機能していると予想される。本研究ではショウジョウバエ初期胚による試験管内核/染色体再構成系を裸のDNAと細胞(核)の間を埋める試験管内反応系として構築し、真核生物の核の中にある構造と核の中で行われる機能一組換え修復機構と制御一の関係を解き明かすことを目的としている。まずショウジョウバエ初期胚から抽出液を調整条件を検討し、これを用いてクロマチンを再構成した。再構成クロマチン上での相同的組換え反応の開始,進行はどのような相同的組換え酵素や蛋白によって可能となるのか?という点について、ショウジョウバエ細胞抽出液を用いて、生化学的に解析するとともに、分子生物学的に生物種差を越えて保存されると期待されるアミノ酸配列相同性を利用した解析を試みている。再構成クロマチンが相同的組換え反応の素過程である相同的対合や鎖交換にどう影響するかをみた結果、クロマチン構造が相同的組換えに段階的に抑制として働くことが明らかとなり、クロマチンレベルの制御が相同的組換えの進行に重要であることが示唆された。相同的組換え活性の高い材料からの抽出液画分による再構成クロマチンでの相同的組換えを試みているが、現在までのところまだ反応を進行させる条件を見いだすまでに至っていない。なおも現在、活性の発現、濃縮を試みている。また我々がみいだした染色体脱凝縮に関わるタンパクが染色体構造をときほぐして相同的組換えに活性なクロマチン構造を誘起する可能性についても検討したが、現時点では顕著な変化を与えることはない。これらのことはクロマチン構造により遺伝情報がより安定に保持されていくことを反映しているのかもしれない。再構成

クロマチン相同な塩基配列の間でのヘテロ二本鎖の形成(相同的対合)と塩基対の水素結合交換をともなうヘテロ二本鎖の伸長(鎖交換)は相同的組換えのなかで重要な過程である。クロマチンレベルでどのように相同的対合や鎖交換が進行するかについて試験管内での解析を行った。その結果クロマチン構造が相同的組換えに段階的に抑制として働くこと、クロマチンレベルの制御が相同的組換えの進行に重要であることが示唆された。DMR蛋白質DMRはRecAやRAD51に相同性をもつショウジョウバエの遺伝子で第3染色体99Dにマップされるが、この領域に減数分裂や体細胞分裂の変異株は報告されていない。大腸菌内でのDMR蛋白質の大量発現し、DMR蛋白質を精製解析するとともに、抗原として抗体を作製した。この抗体を用いてDMR蛋白質のショウジョウバエ発生分化過程における分布などについて解析したところ、成虫にも存在するが初期胚、卵巣により多く存在した。またDMR蛋白質はDNA結合性を示した。従ってショウジョウバエDMR蛋白質は減数分裂期およびそれ以外の細胞周期でもDNA代謝などに機能していると推測された。RecOホモログ最近、ヒトではATPaseQ1/RecQLに加えブルーム症候群原因遺伝子産物BLMRecQおよびヴェルナ-症候群原因遺伝子産物WRNRecQと3種のRecQホモログの報告がされた。一方、出芽酵母ではRecQホモログSGSがTop3とだけでなく、TopIIとも作用することで修復や組換えばかりでなく分配にも関与することが明らかになりつつある。われわれはPCRにより、ショウジョウバエ染色体DNAより特異的に増幅される断片を得た。これをプローブとしてショウジョウバエgenomic libraryおよびcDNA libraryから複数の陽性クローンを分離した。それらの陽性クローンの塩基配列を決定した結果、ショウジョウバエにおけるRecQホモログであることが判明した。ショウジョウバエ相同的対合タンパクDMRと核内構造核内で相同組換えに関与するタンパクとしてショウジョウバエDMRタンパクの発生分化過程における発現、局在、試験管内での活性および核内構造やクロマチンとの相互作用について解析を進めた。これによりDMRタンパクは減数分裂期およびそれ以外の細胞周期でもDNA代謝などに機能していると推測された。ショウジョウバエ相同的組換え関連タンパクDQ1ショウジョウバエより同定したRecQホモログDQ1はアミノ酸配列解析の結果、現在ヒトで報告されている3種のRecQホモログ(ATPaseQ1/RecQL、ブルーム症候群原因遺伝子産物BLMRecQおよびヴェルナ-症候群原因遺伝子産物WRNRecQ)とは異なる新しいサブファミリーに属するもので、その遺伝子産物が同定された初めての例であった。このDQ1タンパクのショウジョウバエ発生分化過程における発現、局在について解析を進めた。その結果DQ1タンパクは発生過程を通じて存在し、とりわけ初期胚および卵において高い発現がみられた。特に生殖幹細胞に局在がみられ、このことから第一減数分裂前期の相同的組換えの関与が期待された。相同的組換えタンパク複合体と細胞機能ネットワーク正確でかつ迅速な細胞増殖が行われる初期胚ではDMRタンパクと特異的相互作用を行うタンパクを見いだすことができた。
スーパーコンティニューム光を用いた「高分解能生体光イメージング顕微鏡」の開発

近年、医工連携の促進に伴い工学分野の医療診断技術への進出による研究活動が盛んに行われている.その中でも広帯域光源の安定駆動に伴う「光」を用いた低侵襲-医療診断技術による研究分野の拡充が注目されている.そこで本研究では、フォトニック結晶ファイバと超短光パルス光源を併用することで得られる超広帯域光源(スーパーコンティニューム[SC]光源)を生体光イメージング顕微鏡への応用及び、その可能性について検討を行った.その際、被測定対象として「蛍光染色されたヒト乳がん細胞」を用い、更にSC光源と蛍光顕微鏡を組合わせたシステム構築を行った.最後に既存の蛍光顕微鏡との比較検証を行い、その性能評価を行った.平成25年度の研究成果は、構造特性の異なる数種類のフォトニック結晶ファイバ(PCF)の伝送特性を実測(PetermannIIと自己位相変調法)と数値解析(有限差分法)を用いて双方評価を行った.その結果、複雑な構造特性を有するPCFの伝送特性(電磁界分布)の評価に成功し、構造特性と伝送特性の相関性に関して示した.また非線形シュレディンガー方程式を用いた数値解析のプログラムをMatlabを用いて新たに作成を行い、それを用いて上記のPCFに短光パルスを入射した場合の広帯域光源(SC光源)応答に関するシミュレーションを行った.その結果、各種構造特性の異なるPCFにおけるSC光源発生に関する数値解析に成功した.さらに上記のPCFのうち、ファイバー長が500メートル(ゲルマニウム添加コアPCF)と1000メートル(純石英コアPCF)に関しては、非線形定数(n2/Aeff)非線形屈折率(n2)と波長分散(D)の評価に成功した.平成25年度の研究成果より得られた意義としては、複雑な構造のPCFの光伝送特性の研究報告として、実測と数値解析の双方向評価に成功と、その一部の非線形定数と非線形屈折率の実測に成功したことである.また本研究によって、国際電気通信連合(ITU-T)の基準測定法を用いたPCFの伝送特性(電磁界分布)を明確化する事が出来た.これによって新たにPCFの構造設計を行う場合に、これらのPCFの伝送特性(電磁界分布)の把握を容易に行うことができることは、本研究によって明らかにした重要点である.近年、医工連携の促進に伴い工学分野の医療診断技術への進出による研究活動が盛んに行われている.その中でも広帯域光源の安定駆動に伴う「光」を用いた低侵襲-医療診断技術による研究分野の拡充が注目されている.そこで本研究では、フォトニック結晶ファイバと超短光パルス光源を併用することで得られる超広帯域光源(スーパーコンティニューム[SC]光源)を生体光イメージング顕微鏡への応用及び、その可能性について検討を行った.その際、被測定対象として「蛍光染色されたヒト乳がん細胞」を用い、更にSC光源と蛍光顕微鏡を組合わせたシステム構築を行った.最後に既存の蛍光顕微鏡との比較検証を行い、その性能評価を行った.研究目的である高効率スーパーコンティニューム(SC)光発生と条件について検討するため、実測評価と数値解析を用いて電磁界分布を解析し、またSC光源の発生に関する応答特性の検証を行った。具体的には、構造の異なる数種類のフォトニック結晶ファイバ(PCF)を実際に準備し、それらの非線形定数、実効断面積(モードフィールド径)に関する実測評価を行った。また上記の検証を行うために有限差分法(FDM)による電磁界分布解析を行い、実測結果/数値解析による双方向評価を行うことで良い結果を得る事ができたため、学術論文誌への投稿(採録)を行った。前年度の後半より「非線形シュレディンガー方程式」を用いた解析ソフトを作成することで、短光パルスレーザー光を各種構造の異なるPCFへ入射した場合の応答特性の検証を行った。ここでは、短光パルス光の特性(波長、パルス幅や、繰返し周波数)と各種PCFへの相関性について検討を行うことで、応答特性であるSC光源発生条件についての数値解析を行っている。平成24年度後半には、光学部品メーカの協力のもとで実証検証によるSC光発生実験に(一部)成功/光学軸の試作を行った。そこで琉球大学においては、詳細な検証を行うため、数値解析によって得られたSC光源発生条件などを実験で確認するために、研究協力者(琉球大学理学部)と共に、実際にフェムト秒レーザー光源を各種PCFに入射させる光学軸(システム)を再構築し、平成25年度の早期に、SC光源発生に関する評価実験を行う。この様に申請時の研究計画とリンクした研究計画を進めています。本申請における研究成果は,次世代光ファイバとして注目されているフォトニック結晶光ファイバ(PCF)の光伝送特性(波長分散特性、電磁界分布、非線形光学特性)を数値解析(有限要素(FEM)法)と,実測(位相シフト法,ファーフィールドスキャン法,自己位相変調法)による双方向評価を行うことで,様々な構造特性を有するPCFの伝送特性評価を明確にし,その結果を用いることでPCF構造特性と光伝送特性の相関性の検証を行った.さらに非線形シュレディンガー方程式のソフトウェア開発も併せて行った.これによりPCFに超短(フェムト秒)光パルス光源を入射することで得られる超広帯域(スーパーコンティニューム:SC)光源の数値解析検証も行った.以上より得られたPCFの構造特性-光伝送特性の相関性を明らかにすることで,様々な複雑な構造のPCFでもその伝送特性の一般解が把握でき,かつ様々なPCFに対するSC光源発生効率の一般解を示した.更にSC光源を用いた生体光イメージング顕微鏡への応用への検証を行った.

本研究により得られたSC光源は400nm-2200nm(帯域1800nm)の超広帯域光源の特性を有しており,そのSC光源を分光光源として任意の波長を抽出する光学系(同軸落射型-生体顕微鏡)を試作した.研究協力者より提供された測定資料は,蛍光分子を含んだ「ヒト肺腺ガン細胞」と「ヒト乳ガン細胞」を用いた.また本研究で試作した「SC光源を用いた同軸落射型-生体顕微鏡」の性能評価を行うため,市販されている「蛍光顕微鏡」2機種(光源タイプが,ハロゲンとメタルハライド)との同一サンプル比較を行い,その結果をImageJソフトウェアを用いて検証を行った.その結果,評価項目に優劣は有るが,本研究で試作を行った生体顕微鏡が良い結果を示した.SC光源は「高コヒーレント・高指向性・超広帯域」特性が性能向上の要因だと確認できた.光計測工学フォトニック結晶ファイバ(PCF)の構造特性と伝送特性(電磁界分布)の相関性に関して示すことができ、また非線形シュレディンガー方程式を用いた超広帯域(SC)光源の応答に関して、シュミレーションを用いて示すことができた.しかし、実際にPCFに短光パルス(fs:フェムト秒)を入射させ、実測とシュミレーションとの比較検討には至っていない。これには、短光パルス光源を保有する研究協力者との調整が若干遅れており、その調整を急ぐ必要がある.またSC光源を顕微鏡への応用も遅れており、これらの2つの要素の再検討を急ぐ必要がある.PCFに関して試作品を無償(一部有償)提供して頂き、そのPCFを本研究グループ独自の評価技術(実測と数値解析)により、より詳細かつ貴重な基礎データを早期に得る事ができた。そこで双方向評価による貴重な結果を、学術論文誌への投稿(採録)を行うことができた。さらに「非線形シュレディンガー方程式」を用いたSC光源発生に関する数値解析ソフトも早期に構築することができたため、「入射光(パルス幅、光強度)とPCF構造パラメータ」の相関に関しても容易に解析ができる環境を得る事ができた。また研究協力者(琉球大学理学部)の配慮も非常に大きく作用しており、フェムト秒ファイバーレーザを無償で使用する研究環境を得る事ができ、実際にSC光源発生に関する実験に取り組んでいる状況です。さらに本年度(平成25年度以降)に行うSC光源の応用に関する研究に関しても、研究協力者(琉球大学熱帯生物圏研究所)とも研究計画/対象に関しての技術協力/相談を定期的に行い、その研究環境も整いつつあります。最優先事項として、研究協力者と、短光パルス光源の調整を行う.もう1つの案として、SC光源を別手法により発生に成功した研究協力者が別に居るため、彼らとの再度調整を行うことで、SC光源の一時貸与を検討する.また上記のSC光源を用いて、生細胞顕微鏡との融合について再度検討を行う.本年度(平成25年度)には、実際にSC光源を発生させ、その安定度や、帯域幅などの評価を行う。その際に、分光器や光強度計などは、申請者(琉球大学工学部)で保有した計測器を用いる。またSC光源の応用に関して、赤外帯域を有効活用した「低侵襲・高分解能」に対象物(細胞・ミジンコなどを検討中)を解析するシステムの構築を行う。その際、光学部品(光フィルター、レンズや、光学軸)などの技術的な相談は、申請者が共同研究をした経験より(株)オプトクエスト社を予定している。
消化管陰窩におけるケモカイン分泌上皮の局在と食餌成分による調節機構

本研究では消化管リンパ球の局在とそれにおよぼす食餌成分の影響についてケモカインの関与を検討した。本研究を通じて明らかになったことは以下の通りである。これまでにもパイエル板を除いたラット小腸粘膜固有層からリンパ球の分離が可能であったが、その分離法を改善することにより回収率を上げる事に成功した。また、その方法を基にしてラット大腸粘膜からのリンパ球分離を可能にした。難消化性糖類は上部消化管で吸収されずに大腸へ流入することで、そこに存在する腸内菌に資化されることを考えれば、大腸粘膜におけるリンパ球分離法の確立は今後の重要な課題を解決するための基盤技術となりうる。食餌成分として甜菜繊維(SBF)を用いた場合、WKAHラット盲腸部位におけるCD8^+上皮間リンパ球(IEL)の頻度を有意に増加させたが、小腸でも同様な現象が観察された。興味深いことに、盲腸に比べ小腸での上昇率の方が極めて高いことが明らかになった。しかし、このSBF摂取による小腸でのCD8^+ IEL増加は、ラットの系統により異なることが示された。DAラットではこのような小腸における増加は全く確認されなかった。このことは遺伝的背景により食餌による消化管粘膜リンパ球局在調節機構が異なることを示している。小腸から機械的に陰窩および絨毛部位を分離し、それぞれRT-PCR解析を行ったところ、この部位間で異なる発現を示すものとしてCCL9及びCCL28を見いだすことが出来た。しかし、SBFによる発現の増強や減弱は見られなかった。これらのことから、消化管絨毛から分泌されるケモカインそのものよりも、リンパ球側のケモカイン受容体発現や上皮における接着分子発現により食餌によるリンパ球分布が調節されている可能性が考えられる。我々の以前の研究で大腸陰窩上皮間または陰窩上皮周囲に存在するリンパ球の局在がCD161とCD8で異なることを明らかにした。そこで、当該リンパ球に存在するケモカインレセプター発現の検討を行うために粘膜上皮間及びその周囲に存在するリンパ球を分離した。文献的に知られている上皮間リンパ球(IEL)及び粘膜固有層内リンパ球(LPL)の分離法を行った後の組織を組織化学的に観察したところ、IEL分離処理を行った後では陰窩周囲に存在するリンパ球は全く採取できず、むしろ文献的にはLPL画分の中に当該リンパ球が存在することができた。分離粘膜リンパ球のフローサイトメトリーを行った結果、生理的状態ではCD161^+細胞の大多数はCD8^-であり、これら二つのポピュレーションは独立であるものが殆どであることを確認した。次に、マウスの配列を元にラットケモカインレセプター発現解析用のPCR用プライマーを設計し、当該リンパ球における発現の有無を解析したところ、CCR2、CXCR4、CCR5、CCR9、CX3CR1は分離された粘膜リンパ球でも発現が確認できた。一方、ラット小腸粘膜から絨毛画分と陰窩画分を分離してケモカインリガンドの発現を調べたところ、一部のケモカインリガンドでは絨毛-陰窩間での発現が異なることが明らかになった。これは消化管上皮でも、微少な範囲でケモカインリガンドの発現が異なり、それが結果としてリンパ球のフェノタイプによる局在の原因となることを示唆している。現在、粘膜上皮側でのケモカインリガンドの発現と粘膜リンパ球でのケモカインレセプターの発現を詳細に検討中である。昨年度は、当該リンパ球に存在するケモカイン受容体発現の検討を行うために粘膜上皮間及びその周囲に存在するリンパ球分離法を確立したので、今年度は粘膜固有層リンパ球(LPL)におけるケモカイン受容体の発現を検討した。上皮間リンパ球(IEL)は殆どがCD8+なので、IELに移行途中の段階と考えられるLPLをCD8+とCD8-画分に分画した。これらの細胞間で発現の異なるケモカイン受容体を検討したところ、XCR1とCCR10はどちらもCD8+LPLでは発現が見られるのに対しCD8-LPLでは発現が見られなかった。これらに対応するリガンドがCD8+リンパ球の上皮への誘導に関与する可能性が示唆された。そこで、消化管上皮で分化領域と増殖領域が比較的明確な小腸を用いて、機械的に分離した絨毛及び陰窩画分でのケモカインリガンドの発現をRT-PCRを用いて解析した。絨毛-陰窩における発現検討ではCCL9とCCL28が共に陰窩内での発現が高い事を明らかにした。これらの結果から、静的な状態で増殖上皮と分化上皮が発現するケモカインのパターンが異なると考えることは必ずしも得策でないように思われる。消化管は比較的上皮細胞のターンオーバーが早い臓器として知られているので、増殖域上部で発現するケモカインに誘引されて上皮に接したCD8+リンパ球が接着分子などを介して分化上皮へ移行する可能性が考えられる。

また、その方法を基にしてラット大腸粘膜からのリンパ球分離を可能にした。難消化性糖類は上部消化管で吸収されずに大腸へ流入することで、そこに存在する腸内菌に資化されることを考えれば、大腸粘膜におけるリンパ球分離法の確立は今後の重要な課題を解決するための基盤技術となりうる。食餌成分として甜菜繊維(SBF)を用いた場合、WKAHラット盲腸部位におけるCD8^+上皮間リンパ球(IEL)の頻度を有意に増加させたが、小腸でも同様な現象が観察された。興味深いことに、盲腸に比べ小腸での上昇率の方が極めて高いことが明らかになった。しかし、このSBF摂取による小腸でのCD8^+ IEL増加は、ラットの系統により異なることが示された。DAラットではこのような小腸における増加は全く確認されなかった。このことは遺伝的背景により食餌による消化管粘膜リンパ球局在調節機構が異なることを示している。小腸から機械的に陰窩および絨毛部位を分離し、それぞれRT-PCR解析を行ったところ、この部位間で異なる発現を示すものとしてCCL9及びCCL28を見いだすことが出来た。しかし、SBFによる発現の増強や減弱は見られなかった。これらのことから、消化管絨毛から分泌されるケモカインそのものよりも、リンパ球側のケモカイン受容体発現や上皮における接着分子発現により食餌によるリンパ球分布が調節されている可能性が考えられる。
血中循環腫瘍細胞をターゲットとするリキッドバイオプシーで拓く高速癌診断システム

本年度は、マイクロ加工技術(フォトリソグラフィ)と精密電鋳技術により製作され、流体力によって動的かつ立体的に変形するマイクロフィルタを用いて、液体サンプル中の癌細胞の捕捉評価を実施した。具体的には、癌細胞のみを含む液体サンプルと正常細胞のみを含む液体サンプルを用い、構築したマイクロフィルタでのそれぞれの捕捉効果を評価した。その結果、構築したフィルタを用いることによって、正常細胞に比べて効果的に癌細胞を10倍以上効果的に捕捉することに成功した。また、癌細胞と正常細胞を様々な比率で混合した液体サンプルを用いる実験を行い、癌細胞の捕捉効果や非癌細胞の非特異吸着性について検証した。その結果、正常細胞:癌細胞の割合を9:1で混合した場合でも、正常細胞の非特異的吸着を抑制し、癌細胞を効果的に捕捉できることを実証した。一方で、液体サンプル中に混入した癌細胞数に比べて、捕捉した癌細胞数が少ないことが課題となった。そこで、数値解析ソフトを用いて流量とフィルタの変形量の関係を明らかにし、実験と理論の両面からの検証結果を基にして、さらに効率的に癌細胞を捕捉することができるフィルタを新たに設計・製作した。その結果、捕捉される癌細胞の量を向上させることに成功し、正常細胞:癌細胞の割合を1000:1で混合した場合でも、癌細胞の捕捉を実現することに成功した。一方で、シグナル増幅機構に関して基礎的な検討を実施した。具体的には、蛍光剤を修飾したタグの相補鎖と消光剤修飾トリガーから成る二本鎖複合体を形成し、タグを有するアプタマーを添加した。この結果、鎖交換反応が起こり、トリガーが放出されることを実証し、目的のシグナル増幅機構が実現可能であることを示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、がん細胞に多量に発現していると言われている上皮細胞接着分子(EpCAM)と特異的に結合するEpCAMアプタマーを基板に修飾する方法を確立した。具体的には、めっきにより基板表面に金薄膜を形成し、金表面に金-チオール結合によりポリエチレングリコール誘導体自己組織化単分子膜を形成させた。この末端のヒドロキシル基をDSCにより活性化し、活性化したヒドロキシル基に末端をアミノ化したEpCAMアプタマーを修飾した。製作した基板を用いて、がん細胞の捕捉実験を行った。実験にはCTCと同様に細胞膜上にEpCAMを高発現しているヒト由来のがん細胞とEpCAMの発現がないヒト由来の正常細胞を用いた。その結果、正常細胞に比べて効果的にがん細胞を捕捉することに成功した。また、EpCAMアプタマーの効果を検証するために、EpCAMアプタマーと同じ塩基を持ち、その塩基配列を変えたスクランブルDNAを基板上に修飾し、同様の捕捉実験を行った結果、正常細胞のみならず、がん細胞も捕捉されず、EpCAMアプタマーの塩基配列によって効果的にがん細胞が捕捉されることも確認した。このように、基板上への非特異的吸着が少なく、目的の細胞を特異的に捕捉可能な基板を製作できた。一方、CTCの効率的な捕捉をアシストするためのフィルタの設計を行った。本フィルタは、液体の流れによる力を受けて平面形状から立体形状に弾性変形するフィルタである。本フィルタはフォトリソグラフィと精密電鋳により製作することを想定しており、これらの製作方法に合致する寸法設計や構造設計が重要である。本条件を満たすフィルタ構造を3種類設計し、解析ソフトを用いて流体解析を行ったところ、それぞれ流量に応じて線形的に立体変形することが確認できた。一方で、変形後のフィルタ形状や隙間寸法などの観点で改良すべき新たな設計指針を得ており、新たな設計を開始した。EpCAMアプタマーや非特異的吸着を防ぐためのSAM膜の選定、それらの基板への修飾方法などが概ね完了した。また、それらの溶液濃度や修飾密度などの諸条件に関してもおおむね決定し、安定した修飾と実験が可能になった。また、効率的な捕捉をアシストするためのフィルタについては、流体解析結果のフィードバックにより、改良点や新たな設計指針を得ており、設計を開始している。また、設計の完了後すぐに製作に移れるように、同等寸法のサンプルを用いてフォトリソグラフィや精密電鋳を用いた製作方法やそれらの各種条件を検証済みである。上記のことから、今年度の達成度はおおむね順調であると言える。本年度は、血液中の循環腫瘍細胞(CTC)の捕捉をアシストするための立体変形マイクロフィルタを設計し、実際に製作した。本フィルタはマイクロ加工技術と精密電鋳技術により製作されるものであり、昨年度までに検討した製作のための条件を用いて予定通りに製作することができた。製作した立体変形マイクロフィルタの基本特性評価として、流体を導入した際のフィルタの変形量について実測した結果、流量に応じて変形量を調整できることを実証した。本フィルタに関しては、研究を進めていきながら常に結果をフィードバックすることによって状況に応じた最適設計指針を取得し、改善していく予定である。一方、製作したフィルタにがん細胞に多量に発現していると言われている上皮細胞接着分子(EpCAM)と特異的に結合するEpCAMアプタマーを修飾し、癌細胞の捕捉実験を行った。比較実験として、EpCAMアプタマーの代わりにEpCAM抗体をフィルタに修飾したものや癌細胞の代わりに正常細胞を用いた実験も同時に実施した。

CTCは赤血球や白血球などの血液細胞よりもサイズが大きく歪な形状をしているため、本フィルタを用いることによってCTCに特異的に発現するEpCAMとの特異的捕捉とサイズや形状を指標とした捕捉を同時に行うことができる。実験の結果、構築したフィルタを用いることによって、正常細胞に比べて効果的に癌細胞を捕捉することに成功した。また、EpCAMアプタマーを修飾したフィルタの方がEpCAM抗体を修飾したフィルタよりも10倍以上も効果的に癌細胞を捕捉できることがわかった。一方で、フィルタの部位によって捕捉数が大きく異なることがわかった。これは、流体がフィルタを通過する際の流体力の分布やフィルタの変形量などに依存するものだと考えられる。今後は数値シミュレーションによる検証と実験の結果を総合的に検証し、フィルタの改善を進める予定である。当初の予定通り、癌細胞の捕捉をアシストするための立体変形マイクロフィルタを設計し実際にフィルタの製作が完了した。製作したフィルタの基本特性評価に加え、選定したEpCAMアプタマーや非特異的吸着を防ぐためのSAM膜を修飾し、癌細胞の捕捉実験やフィルタ改善のための検証も進んでおり、次年度への課題も明らかになった。上記の通り計画を着実に実行していることから、今年度の達成度はおおむね順調であると言える。本年度は、マイクロ加工技術(フォトリソグラフィ)と精密電鋳技術により製作され、流体力によって動的かつ立体的に変形するマイクロフィルタを用いて、液体サンプル中の癌細胞の捕捉評価を実施した。具体的には、癌細胞のみを含む液体サンプルと正常細胞のみを含む液体サンプルを用い、構築したマイクロフィルタでのそれぞれの捕捉効果を評価した。その結果、構築したフィルタを用いることによって、正常細胞に比べて効果的に癌細胞を10倍以上効果的に捕捉することに成功した。また、癌細胞と正常細胞を様々な比率で混合した液体サンプルを用いる実験を行い、癌細胞の捕捉効果や非癌細胞の非特異吸着性について検証した。その結果、正常細胞:癌細胞の割合を9:1で混合した場合でも、正常細胞の非特異的吸着を抑制し、癌細胞を効果的に捕捉できることを実証した。一方で、液体サンプル中に混入した癌細胞数に比べて、捕捉した癌細胞数が少ないことが課題となった。そこで、数値解析ソフトを用いて流量とフィルタの変形量の関係を明らかにし、実験と理論の両面からの検証結果を基にして、さらに効率的に癌細胞を捕捉することができるフィルタを新たに設計・製作した。その結果、捕捉される癌細胞の量を向上させることに成功し、正常細胞:癌細胞の割合を1000:1で混合した場合でも、癌細胞の捕捉を実現することに成功した。一方で、シグナル増幅機構に関して基礎的な検討を実施した。具体的には、蛍光剤を修飾したタグの相補鎖と消光剤修飾トリガーから成る二本鎖複合体を形成し、タグを有するアプタマーを添加した。この結果、鎖交換反応が起こり、トリガーが放出されることを実証し、目的のシグナル増幅機構が実現可能であることを示した。効率的なCTCの捕捉をアシストするためのフィルタの設計を完了し、実際に製作する。