hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鳥インフルエンザ後の学校動物飼育の実態調査および子どもの心理的発達への飼育の効果

全国調査:鳥インフルエンザ後の学校での飼育状況を全国的に調査するため、2018年10月まで全都道府県における架電聞き取り調査を行った。調査項目は、屋外/屋内飼育についての飼育の有無、動物種と数、世話をしている児童、教材としての動物の有無等であった。その結果、屋内・外で動物を飼っている学校、生物を飼っていない学校、屋外飼育を行っている学校、屋内飼育を行っている学校の回答数等が明らかになった。また、全国小学校理科教育研究協議会を通して行った動物飼育を行っている小学校へのアンケート回答590件もデータを整理し終わり、現在分析中。継続調査:愛知県、新潟市、西東京市、福岡県、神戸市、奈良市の49校に行った第1回目アンケート調査(2017年12月2018年3月)のデータ約5,300件を集計・分析。また2018年9月には各小学校に、学年ごとの結果をフィードバックした。2018年12月2019年2月に、第1回目に調査協力を得た小学校49校に第2回目調査を行った。事前に電話で調査の依頼を行い、各校の状況を鑑みつつ、学年飼育校23校(対象児童約1,700名)、委員会飼育校19校(同約2,500名)、飼育なし校8校(同約1,100名)にアンケートを送付、3月現在47校より回答を得た。意義および重要性全国調査は、鳥インフルエンザ発生以後初となる全国規模での調査となる。特に無作為抽出による全都道府県約2,000校への電話調査はわが国の学校動物飼育の現状を明確化しうる貴重なデータとなる。また継続調査は,「学校での動物飼育が子どもの心理的発達に与える影響」に関する、多地域・大規模研究となった。第1回目に続き第2回目調査を実施し得たことで、飼育をしている児童、飼育はしていないが学校に動物がいる児童、飼育動物がいない学校の児童を高学年/低学年別を継時的に比較する貴重なデータが得られた。全国調査:架電による聞き取り調査は、当初平成28年8月より2018年7月までの期間での調査を計画していた。しかし、件数の多さ等により、3ヶ月遅れの2018年10月データ採集が終了した。また、架電調査を補完するために、動物飼育を行っている小学校へのアンケート調査も当初の研究計画より新たに追加して実施したため、さらなる集計・分析作業を要することとなった。ただし、データの集計・分析・取りまとめ・公表は今年度中に終了する予定。継続調査:第2回継続調査を平成30年2月より行う予定であったが、学年飼育の終了が平成30年12月であることを受けて、第2回調査を平成30年12月より開始した。また、第2回調査の回答は平成30年度内に回収し終える予定であったが、一部の小学校で諸般の事情により回答が遅れ、最終的にすべての回答が得られたのは平成31年4月であった。飼育終了後における動物飼育の心理的効果を測定するためには第2回調査から数か月の経過が必要であること、調査対象となる小学校の都合等を勘案し、第3回調査を平成31年9月に現在予定している。また、調査対象の小学生人数を当初、約1,000名と想定していたが、多くの小学校より協力をいただいた結果、想定の5倍以上の約5,300名より協力を得ることとなった。このため、データの入力・分析、各校へのフィードバックにも想定以上の時間を必要としている。全国調査:架電調査および動物飼育を行っている小学校へのアンケート調査のデータ集計、分析を行う。分析結果を取りまとめて、平成31年9月に行われる全国学校飼育動物研究大会等にてその概要を報告する。継続調査:第2回調査のデータ入力作業は平成31年5月中に完了する予定。分析を行うとともに、各校への第2回フィードバックを7月までに行う。また、第3回調査を平成31年9月に行い、年内にデータの回収・入力、各校への第3回フィードバックを行う。調査に使用した尺度に関する論文の執筆・投稿、計3回の継続調査の継時データの分析・公表を年度内に予定している。本研究の目的は,1小学校での動物飼育についての全国調査による,学校動物飼育の現状と課題の解明,2学校動物の飼育方法の違いと教育的効果との関係についての,心理的発達を指標としての縦断的な調査であった。2017年5・7月の研究運営会議を経て,以下の調査を行った。1全国調査:全国小学校理科教育研究協議会を通し,動物飼育を行っている小学校1,700校へのアンケート調査を依頼。平成30年5月の時点で,FAXにより477件Webにより屋内飼育57件、屋外飼育85件の回答を得た。また電話調査では,全国約20,580校の10分の1にあたる2,000校の小学校を無作為抽出し,電話により動物飼育の有無,飼育種,動物の世話等を調査。2継続調査:愛知県、西東京市、福岡県、神戸市、奈良市の49小学校に第1回調査を実施。学年飼育校23校(対象児童約1,700名)に2017年12月にアンケートを送付。また委員会飼育校19校(同約2,500名),飼育なし校8校(同約1,100名)に2018年3月にアンケートを送付。

意義および重要性全国調査は,鳥インフルエンザ発生以後初となる全国規模での調査となる。特に無作為抽出による全都道府県約2,000校への電話調査はわが国の学校動物飼育の現状を明確化しうる貴重なデータとなる。また継続調査は,多くの獣医師・心理学研究者・小学校の協力を得て「学校での動物飼育が子どもの心理的発達に与える影響」に関する,わが国初の地域を跨いでの大規模研究となった。また,飼育をしている児童,飼育はしていないが学校に動物がいる児童,飼育動物がいない学校の児童を高学年/低学年別に比較する本研究は,先行研究には見られない独自性と複雑性を有する。実行可能性の高い研究計画を立案し,第1回目の調査を実施し得たことは,第2回・第3回と続く調査研究貫徹のための礎を築き得た点において重要である。全国調査:計画は「全国各地の約1000校を抽出し飼育動物の現状と課題について質問紙調査」であった。しかし当初想定していた2つの実施手段,すなわち行政への依頼(日本獣医師会の協力を得て都道府県の家畜伝染病予防法の調査データを取得),教育委員会を通じての依頼(市町村の教育委員会への協力を依頼→承諾を得た市町村教育委員会には,質問紙調査を行う小学校の選定を依頼→選定された小学校に調査依頼)は実行がかなわなかった。そこで,無作為抽出による全都道府県約2,000校への電話調査により,当初予定していた動物飼育の実態(飼育の有無,飼育動物種など)を実施。また,全国小学校理科教育研究協議会を通しての飼育実施校への調査により,当初予定していたアンケート調査(飼育担当の教職員・児童について,飼育上の課題・問題点,飼育の利点・欠点,動物の病気・死亡時の対応,獣医師との連携等)を遂行。継続調査:当初の計画は,これまでに調査協力実績のある小学校約15校に対し継続調査を依頼することであった。調査においては,第1回第3回までの継続調査であるため各調査回の各児童の回答が照合できるよう出席番号を記すなど,学校との信頼関係を築くことが調査成立の鍵であった。しかるに本研究では,各地方獣医師会の協力により想定を超える49校約5,000名以上の児童の協力を得ることができた。また当初は第4学年の児童のみへの調査を想定していたが,低学年への調査の協力もいただき,結果的に学年飼育校,委員会飼育校,動物飼育なし校とも,第4学年および低学年における調査を行うことができた。第1回目調査の回収も順調で,想定した回収率が望みうる。継続調査が成り立つためには、平成29年度中の第1回調査は必須である。また全国調査も研究計画上平成29年度中に着手する必要があった。その点においても本研究はおおむね順調に進展しているといえる。全国調査:鳥インフルエンザ後の学校での飼育状況を全国的に調査するため、2018年10月まで全都道府県における架電聞き取り調査を行った。調査項目は、屋外/屋内飼育についての飼育の有無、動物種と数、世話をしている児童、教材としての動物の有無等であった。その結果、屋内・外で動物を飼っている学校、生物を飼っていない学校、屋外飼育を行っている学校、屋内飼育を行っている学校の回答数等が明らかになった。また、全国小学校理科教育研究協議会を通して行った動物飼育を行っている小学校へのアンケート回答590件もデータを整理し終わり、現在分析中。継続調査:愛知県、新潟市、西東京市、福岡県、神戸市、奈良市の49校に行った第1回目アンケート調査(2017年12月2018年3月)のデータ約5,300件を集計・分析。また2018年9月には各小学校に、学年ごとの結果をフィードバックした。2018年12月2019年2月に、第1回目に調査協力を得た小学校49校に第2回目調査を行った。
タンパク質の揺らぎ及び溶媒効果を考慮した分子動力学計算の薬剤設計への応用

昨年度の結果を踏まえて研究を行った。その流れは次のようである。(1)ドッキングソフトウェアによりタンパク質-薬剤複合体を作成する。(2)作成した複合体に対し分子動力学シミュレーションを行う。(3)分子動力学シミュレーションから得られた構造トラジェクトリーを利用しMM-PB/SA計算を行い薬剤の結合自由エネルギー予測をする。また、エントロピー項の計算は分子動力学シミュレーションから得られた構造トラジェクトリーについて主成分解析を行うことで求める。本年度は、(2)-(3)の過程を全自動化するプログラムを作成し、MDGRAPE-3を利用し1複合体に対し2時間程で計算できることに成功した。また、分子動力学シミュレーションを行う際、構造予測の精度を向上させるため、1薬剤に対しドッキングソフトから複数の複合体構造を得て、更に、これらの中から適切で代表的な構造を抽出し分子動力学シミュレーションを行った。TRYPSIN等のタンパク質を使って計算した結果、計算から得られた結合自由エネルギー値と実験値間で比較的良い相関が得られた。また、この手法ではエントロピー項を考慮しない方がより良い相関が得られたことから、エントロピー項の求め方には改善が必要であることがわかった。現段階で、本研究の目的は概ね達成できたと思われる。今後は、計算パラメータの最適化、その他のタンパク質に適応し調査を行い、より更に高精度に結合自由エネルギー予測できる手法へと発展させていきたいと考えている。(1)実験的に構造と結合自由エネルギーが決定されているタンパク質-薬剤複合体について、分子動力学シミュレーションにより自由エネルギーを求めることを試みた。ここでは、タンパク質と薬剤が正しい結合様式で結合している場合に、どのような計算手法が効果的であるかを検討するため様々な計算条件で計算を試みた。研究の結果、多様な薬剤をスクリーニングするという本研究も目的から、MM-PB/SA法による計算が最も効果的であると判断した。この際、タンパク質の薬剤結合部位だけを溶媒で覆い計算する場合とタンパク質全体を溶媒で覆い計算する場合とで比較したが大きな精度の違いがないことがわかった。このため、計算コストの点からタンパク質の薬剤結合部位だけを溶媒で覆い計算する手法が適切だと判断した。薬剤の計算パラメータについてはまだ検討中であるが、これまでの結果からは第一原理量子化学計算によるパラメータと半経験的な量子化学計算によるパラメータとで大きな違いがないように思われるため後者が適切ではないかと考えている。(2)次の段階の研究目的は、既存のドッキングソフトウェアを使いタンパク質-薬剤複合体を作成し上記の方法を用い結合自由エネルギーを求めることである。分子動力学計算による構造精密化のため、1つの薬剤に対しドッキングソフトから複数の複合体構造を抽出し、更に、これらの中から適切で代表的な構造を抽出し分子動力学シミュレーションに適応することを考えている。現在は、これらを自動化するためのプログラム作成中である。
単純ヘルペスウイルスの感染不均一性を司る要因解明

単純ヘルペスウイルス(HSV)を培養細胞に感染させる際細胞毎の感染の不均一性が認められる。この現象は細胞側の遺伝子発現の不均一性が影響していることが考えられるが、HSV感染の不均一性に関与する宿主因子は明らかになっていない。本研究はHSV感染細胞のシングルセルRNA-seqとその後のバイオインフォマティクス解析により感染の不均一性を司る宿主因子の候補を選定し、CRISPR-Cas9によって候補遺伝子のノックアウト細胞を作製する。作製したノックアウト細胞にHSVを感染させ、感染の不均一性を評価する事により、HSV感染の不均一性を司る宿主因子を同定する事を目的とする。
アストロサイト機能の部位特異性と神経機能調節

本研究班において、アストロサイトの部位特異性をになう機能分子(アストロサイトの膜表面のレセプター、トランスポーター、チャネル、ポンプ、細胞接着因子類、神経栄養因子など)の同定を行うことを目的に研究を進めた。1)アストロサイトが産生する神経栄養因子の部位特異性の検索。アストロサイトが産生する神経栄養因子の遺伝子発現量が部位により異なるかどうかを検討した。方法としては、胎生18日のラット胎児より、部位別(大脳皮質、海馬、嗅脳、小脳、脊髄)にアストロサイトを初代培養し、RNAを抽出し、northern blotにて解析した。その結果、GMFBは、どの部位でもほぼ同じ発現量があり、部位による差はなかった。GMFGは、小脳、脊髄で多く発現しており、海馬で少ない傾向が観察された。また、LC1は、海馬、大脳皮質、小脳で多く、嗅脳、脊髄で発現が少なかった。2)Atras Arrayによるアストロサイト部位特異性の解析。胎生1819日ラット胎児より、大脳皮質、海馬、小脳を分取し、アストロサイトの初代培養を行なった。これら細胞よりRNAを抽出し、Clontech社のAtlas 1.2 Rat Arraysによる解析を行った。その結果、大脳皮質アストロサイトと海馬アストロサイトを比較した場合、11種類の遺伝子の発現に発現量の差が認められ、そのうち、7種類が皮質に多く、4種類が海馬に多く発現していた。大脳皮質アストロサイトと小脳アストロサイトを比較した場合、9種類の遺伝子に発現量の差が認められ、そのうち5種類が大脳皮質に多く、4種類が小脳に多く発現していた。次に、上記の解析で発現に差が見られた遺伝子のうち、Id-2、HSP27、LC1についてRT-PCR法を用いて確認した。PCR productを半定量的に検討した結果、Atras Arrayの結果とほぼ一致した結果が得られた。【研究目的】中枢神経系においてアストロサイトは、ニューロン機能の発現や維持に重要な役割を果たしている。アストロサイトとの共培養下にあるニューロンには、自発的で周期的な細胞内カルシウムイオン濃度の変動が認められ、シナプス形成の進行とともに、多数のニューロンのカルシウムイオン濃度変動が同期するようになる。一般的には、その濃度変動の頻度は活動しているシナプス数と相関すると考えられている。そこで、本年度は「研究計画」の実施の基礎となるニューロン・アスト口サイト共培養系を用いて、両細胞の細胞間交通にあずかるギャップジャンクション(GJ)に注目し、その阻害に基づくシナプス機能の変化を観察することより、アストロサイトの神経伝達に果たす役割を検討した。【研究方法および結果】実験には、GJ阻害剤としてオクタノール、ハロセン、リンダンを用い、GJ阻害効果は「Scrape-load anddye transfer法」で確認した。また細胞内カルシウムイオン濃度の変動は蛍光指示薬(Fura2-AM)を共培養系に投与したのち蛍光カルシウムモニタリングシステムを用いて観察した。オクタノール、ハロセンは、ニューロンのカルシウムイオン濃度変動の振幅を濃度依存的に低下させた。この2つの薬剤はGJ阻害作用のほかに、イノシトール3リン酸(IP3)に依存した小胞体(ER)からのカルシウムイオン放出を抑制する作用も併せもつことから、対照として、GJ阻害作用をもたずIP3合成を阻害するU-73122を用いたところ、オクタノールやハロセンと同様に濃度依存的な振幅の低下が見られた。また、IP3合成を促進するリンダンは逆に振幅を上昇させた。

一方、活動しているシナプス数を反映する細胞内カルシウムイオン濃度変動の頻度については、オクタノール、ハロセンが濃度依存的に頻度を低下させたが、GJ阻害作用をもたないU-73122は無効であった。以上の実験より、アストロサイト間あるいはニューロン・アストロサイト間に存在するGJを阻害すると、ニューロン内カルシウムイオン濃度変動の頻度は著しく低下し、さらに、その濃度変動の振幅にはIP3が関与することがわかった。この実験系を用いてアストロサイト機能の部位特異性を次年度以降に検討する予定である。平成11年度は、ラットの脳の部位別にアストロサイトを初代培養し、アストロサイト産生性の神経栄養因子(GMF-γ、LC1)の発現に部位特異性があるかどうか検討した。胎生18日ラット胎児より、大脳皮質、海馬、嗅脳、小脳、脊髄を分取し、中西らの方法に従い、アストロサイトの初代培養を行ない、GMF-γとLC1の発現はノーザンブロット法を用いた。各遺伝子の発現量の比較は、メンブレンごとに18srRNAで補正後、大脳皮質の発現量を100として表わした。フイルムを観察した印象と著しく異なるメンブレンNO.4の嗅脳のみを除き、得られたデータをStarView J4.01の分散分析を利用して解析した。その結果、アストロサイトにおけるGMF-γの発現量は小脳で多く、小脳と海馬では有意な差があることが観察された(p<0.05)。また小脳と大脳皮質と比較しても小脳でGMF-γの発現量が大きい傾向が観察された(但し、p<0.1で有意差はなし)。他の部位間では統計的に有意な差は観察されなかった。LC1については、小脳で発現が多く、脊髄、嗅脳で少ない傾向が観察された。統計上、小脳と脊髄、小脳と嗅脳の間で有意差があった。さらに現在、アストロサイト内での遺伝子発現の変化を捉えるため、部位別に培養したアストロサイトからmRNAを抽出し、SAGE(Serial Analysis Gene Expression)による解析を行っている。これによりアストロサイトの脳内部位特異的な遺伝子発現を捉えることが出来ると思われる。胎生1819日ラット胎児より、大脳皮質、海馬、小脳を分取し、中西らの方法に従い、アストロサイトの初代培養を行なった。組織の大きさが著しく異なる為、大脳皮質はおよそ1匹分を、海馬は10匹分、小脳は10匹分をそれぞれ25cm2フラスコ1個に播種した。それぞれの細胞は75cm2フラスコに1回継代を行なった。培地は初代培養時にはDMEM(20%FCS)を用い、その後はDMEM(10%FCS)を使用した。培地交換は3日おきに行った。Confluentになった時点で、PBS(-)で洗った後、セルスクレーパーで回収し、直ちに-80°Cで保存した。Clontech社のAtlas 1.2 Rat Arraysによる解析を行った。その結果、大脳皮質アストロサイトと海馬アストロサイトを比較した場合、11種類の遺伝子の発現に発現量の差が認められ、そのうち、7種類が皮質に多く、4種類が海馬に多く発現していた。大脳皮質アストロサイトと小脳アストロサイトを比較した場合、9種類の遺伝子に発現量の差が認められ、そのうち5種類が大脳皮質に多く、4種類が小脳に多く発現していた。
HP1BP3が形成するクロマチン高次基盤構造の立体構造解明

本研究では、ヒトの新規リンカーヒストンタンパク質HP1BP3が形成するクロマチン高次基盤構造の解明を目指した。しかし、HP1BP3タンパク質を構造解析に必要な純度で大量に精製することが困難であった。そこで、分裂酵母におけるHP1BP3の機能性ホモログを選定し、リコンビナントタンパク質として高純度かつ大量に精製した。さらに、分裂酵母の四種類のヒストンを高純度に精製し、分裂酵母ヌクレオソームを試験管内で再構成する系を確立した。これは分裂酵母ヌクレオソームを試験管内再構成した初めての報告例である。さらに、精製したHP1BP3ホモログタンパク質がヌクレオソームに結合することを確認した。真核細胞の核内では、長大なDNAが4種類のコアヒストン(H2A, H2B, H3, H4)二分子ずつから成るヒストン八量体に巻き付いて直径10 nmのヌクレオソーム線維を形成している。遺伝子転写が抑制されているヘテロクロマチン領域においては、このヌクレオソーム線維が規則正しく折り畳まれ、直径30 nmや数十nmの高次の線維構造が形成されているというのが長年信じられてきた定説であった。しかし最新の研究により、核内のクロマチンは長大なヌクレオソーム線維が規則正しく高度に凝縮した線維状の構造体として存在するのではなく、数個から十数個という比較的少数のヌクレオソームから成るいくつかの高次基盤構造の組み合わせで構成されることが示唆されている。高次基盤構造形成においては、H1ファミリーに属するリンカーヒストンが重要な役割を果たすと考えられている。本研究では、ヌクレオソームがリンカーヒストンなどと協同して構築する高次基盤構造の立体構造を明らかにし、転写因子などのクロマチン結合蛋白質が作用するメカニズムを構造生物学的に明らかにすることを目的としている。本年度は、リンカーヒストンHP1BP3のコンストラクト構築および大腸菌発現系による発現および精製の条件検討を行った。さらに、高次基盤構造に作用してクロマチンの構造変換を引き起こすと考えられる転写因子のいくつかをクローニングし、大量発現と高純度での精製が可能な系を確立して、ターゲットとなるヌクレオソームを用いて生化学的解析を行った。全長のリンカーヒストンHP1BP3の大腸菌発現系での大量発現が当初予想していたよりも難しく、さまざまなベクターや大腸菌株を用い、また分子シャペロンや可溶化タグとの融合蛋白質としての発現も試みたものの、構造解析に十分な量での高純度精製には現在までのところ到達していない。しかしながら、標的ヌクレオソームの再構成に成功し、またDNA長の最適化も行った。さらに、数種類の転写因子について大腸菌を用いた発現系の構築を行い、大量精製系の確立に成功した。これらの標的ヌクレオソームと転写因子を用いた生化学的解析を行って、いくつかの重要な知見を得ることができた。真核細胞において、ゲノムDNAは四種類のヒストンからなるヒストン八量体の周囲に巻き付いてヌクレオソーム構造を形成し、コンパクトに折り畳まれた状態で核内に収納されている。ヌクレオソームは、クロマチン結合因子と結合することにより、さらに高次のクロマチン基盤構造を形成する。本研究では、ヌクレオソームとクロマチン結合因子が形成するクロマチン高次基盤構造を明らかにすることを目的としている。本課題申請時は、新規リンカーヒストンタンパク質HP1BP3に着目し、HP1BP3が形成するクロマチン高次基盤構造の解明を目指していた。しかし、HP1BP3タンパク質の性状が悪く、構造解析に必要な量をリコンビナントタンパク質として大腸菌から高純度に精製することが困難であった。そこで、生物種をヒトから分裂酵母に変更することとした。分裂酵母は、単細胞生物でありながら、クロマチン構造やその制御機構の多くがヒトをはじめとする高等真核生物との間で高度に保存されている。しかし、これまでに分裂酵母ヌクレオソームの試験管内再構成に成功した例は報告されていなかった。そこでまず、分裂酵母の4種類のコアヒストンをそれぞれリコンビナントタンパク質として高純度に精製した。精製したヒストンとDNAを高塩濃度条件下で混合し、塩透析法により分裂酵母ヌクレオソームを試験管内で再構成することに成功した(Koyama et al., 2107)。また、分裂酵母におけるHP1BP3の機能性ホモログを選定し、リコンビナントタンパク質として高純度かつ大量に精製した。さらに、精製した分裂酵母のHP1BP3機能性ホモログタンパク質がヌクレオソームに結合することをゲルシフト法により確認した。今後、精製した複合体を用いて立体構造解析を行う予定である。大腸菌発現系用にコドンを最適化した遺伝子配列を用いてHP1BP3の発現検討を行う。また、大腸菌以外の発現系(主に無細胞発現系)を用いることにより、HP1BP3の発現精製を試みる。さらに、さまざまなヌクレオソームの試験

管内再構成もひきつづき行い、HP1BP3とヌクレオソームの複合体(クロマチンの高次基盤構造)を精製して、X線結晶解析やX線小角散乱、クライオ電子顕微鏡による構造生物学的解析を行う。クロマチンの高次基盤構造に対する転写因子の作用機序を解明するために、転写因子とヌクレオソーム(あるいはクロマチン高次基盤構造)を用いた生化学的解析、物理化学的解析および構造生物学的解析をひきつづき行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。クロマチンの構造生物学28年度が最終年度であるため、記入しない。
ゲルマニウムナノ結晶の自己集合化と学習機能擬似ニューロデバイスへの応用

本研究は、シリコン酸化膜(SiO_2)中にナノサイズのゲルマニウム(Ge)微結晶を自己集合化し、それらが作る量子井戸に電子を1個ずつ捕獲させることを目的としている。さらに、ニューラルネットワークの適用学習型電子デバイスとして動作させることについて検討した。SiO_2中のGe結晶は量子ドットを形成しており、0次元の量子閉じ込め効果により可視発光することが報告されている。本研究は、SiO_2を含有した珪素化合物とGeO_2を主成分とした有機金属溶液を混合し、酢酸エチルで希釈した溶液を試料表面にスプレースピン塗布した。焼結のための熱処理を行った結果、800°C以上の温度でGe微結晶が成長していることをラマン分光スペクトルより確認した。また、ラマンピークの半値幅からGe結晶サイズを見積もった結果、平均で3.15.2nmであった。結晶サイズ径は熱処理温度の上昇に伴い増加する傾向が見られた。次にHe-Cdレーザー励起によるフォトルミネッセンス測定を行った結果、量子閉じ込め効果による強い青色発光(波長420nm)が室温で観測された。次にMOS構造を作製し、SiO_2/Ge/SiO_2量子井戸に電子を注入することを試みた。容量-電圧(C-V)測定を行った結果、電子注入後、電子捕獲によるフラットバンド電圧の正方向シフトが確認された。電流-電圧(I-V)特性によるSiO_2中の電気伝導を調べた結果、ステップ状の電流変化および低電圧側からのリーク電流の増加が確認された。二重障壁量子井戸構造を仮定したトンネル伝導計算を行った結果、実験データは量子共鳴トンネル伝導を忠実に再現していることが判明した。今後は、SiO_2中のGe結晶径の制御および深さ方向制御ができるようプロセスの最適化を図る。さらにMOSFET構造でのデバイス動作を確認し、シナプス動作を実現させる。焼結のための熱処理を行った結果、800°C以上の温度でGe微結晶が成長していることをラマン分光スペクトルにより確認した。次にHe-Cdレーザー励起によるフォトルミネッセンス測定を行った結果、量子閉じ込め効果による強い青色発光(波長420nm)が温室で観測された。次にMOS構造を作製し、SiO_2/Ge/SiO_2電子井戸に量子を注入することを試みた。溶液-電圧(C-V)測定を行った結果、電子注入後、電子捕獲によるフラットバンド電圧の正方向シフトが確認された。電流-電圧(I-V)特性によるSiO_2中の電気伝導を調べた結果、ステップ状の電流変化および低電圧側からのリーク電流が確認された。二重障壁量子井戸構造を仮定したトンネル伝導を理論計算を行った結果、実験データは量子共鳴トンネル伝導を忠実に再現していることが判明した。今後は、SiO_2中のGe結晶径の制御および深さ方向制御ができるようなプロセスの最適化を図る。

さらにMOSFET構造でのデバイス動作を確認し、シナプス動作を再現させる。本研究は、シリコン酸化膜(SiO_2)中にナノサイズのゲルマニウム(Ge)微結晶を自己集合化し、それらが作る量子井戸に電子を1個ずつ捕獲させることを目的としている。さらに、ニューラルネットワークの適用学習型電子デバイスとして動作させることについて検討した。SiO_2中のGe結晶は量子ドットを形成しており、0次元の量子閉じ込め効果により可視発光することが報告されている。本研究は、SiO_2を含有した珪素化合物とGeO_2を主成分とした有機金属溶液を混合し、酢酸エチルで希釈した溶液を試料表面にスプレースピン塗布した。焼結のための熱処理を行った結果、800°C以上の温度でGe微結晶が成長していることをラマン分光スペクトルより確認した。また、ラマンピークの半値幅からGe結晶サイズを見積もつた結果、平均で3.15.2nmであった。結晶サイズ径は熱処理温度の上昇に伴い増加する傾向が見られた。次にHe-Cdレーザー励起によるフォトルミネッセンス測定を行った結果、量子閉じ込め効果による強い青色発光(波長420nm)が室温で観測された。次にMOS構造を作製し、SiO_2/Ge/SiO_2量子井戸に電子を注入することを試みた。容量-電圧(C-V)測定を行った結果、電子注入後、電子捕獲によるフラットバンド電圧の正方向シフトが確認された。電流-電圧(I-V)特性によるSiO_2中の電気伝導を調べた結果、ステップ状の電流変化および低電圧側からのリーク電流の増加が確認された。二重障壁量子井戸構造を仮定したトンネル伝導計算を行った結果、実験データは量子共鳴トンネル伝導を忠実に再現していることが判明した。今後は、SiO_2中のGe結晶径の制御および深さ方向制御ができるようプロセスの最適化を図る。さらにMOSFET構造でのデバイス動作を確認し、シナプス動作を実現させる。
新規ヒストンシャペロンGRWD1のp53抑制と発がんへの関与

GRWD1はDNA複製だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられる新規ヒストンシャペロンである。このGRWD1の結合候補因子として、核小体因子RPL11を同定した。RPL11は、低用量アクチノマイシンD処理や低栄養状態時に核小体が崩壊すると核へ放出され、ユビキチンリガーゼMDM2の酸性ドメイン近傍に結合することでその機能を抑制し、腫瘍抑制因子p53の安定化を誘導することが知られている。解析の結果、GRWD1はRPL11とMDM2の結合を競合的に阻害し、核小体ストレス時のp53誘導に抑制的に働き、その結果、発がんに関与することを発見した。我々は、DNA複製開始制御に重要なCdt1の新規結合タンパク質としてGRWD1を同定し、このGRWD1がヒストンシャペロンとして、複製ヘリカーゼMCM2-7のクロマチン装着を促進することを明らかにしてきた。GRWD1の更なる機能解明を目的に、マススペクトロメトリー解析により結合因子を網羅的に探索した。その結果、転写因子Purαを同定した。このPurαとGRWD1との関連を明らかにすることが本研究の目的である。これまでの研究によって得られたデータから、GRWD1はPurαと協調して、がん抑制因子p53の転写活性化能を抑制的に制御していると考えられた。そこで本年度は、GRWD1のがん化への寄与を調べるため、GRWD1とがん遺伝子であるHPV16 (ヒトパピローマウイルス)のE7、活性型KRas (KRasG12V)を安定発現させた正常線維芽細胞を樹立し、軟寒天培地を用いたコロニー形成試験を行った。その結果、E7、KRas G12V、GRWD1発現はE7、KRasのみの発現よりも細胞の足場非依存性増殖を促進することが明らかになった。また、これらの細胞を用いてヌードマウスにおける腫瘍形成試験を行ったところ、GRWD1 (およびE7、KRas G12V)発現細胞では腫瘍形成能を示した。さらに、PrognoScanと呼ばれるがん患者の予後と遺伝子発現の関連を示すデータベースから、GRWD1が過剰発現しているがん患者の予後が悪いことが示唆された。以上のことから、GRWD1はp53を制御する新たながん遺伝子として機能することが示唆された。この機能の少なくとも一部は、GRWD1とPurαとの結合を介したp53転写活性化能の抑制によるものだと考えられるが、他の経路が関与している可能性についても今後検討していきたい。軟寒天培地を用いたコロニー形成試験およびヌードマウスを用いた腫瘍形成試験から、GRWD1の過剰発現ががん化の一因となることを示唆する結果が得られた。このことは、種々のがん細胞でGRWD1が過剰発現していること、さらには、GRWD1の過剰発現が予後不良因子の一つであるという、PrognoScanのデータと一致しており、大変興味深い結果だと言える。GRWD1とPurαによるp53転写活性化能の抑制が、がん化能の一端を担っていると考えているが、他の経路も関与している可能性については今後の検討課題である。また、当初の計画では、本年度はChIP-qPCR assayにより、GRWD1およびPurαがp53標的因子のプロモーターに結合するか、その結合がp53依存的なのかなどを調べる予定であった。しかし抗体の特異性に問題が生じたため、特異的抗体の作製を再度行った。具体的な検証については次年度行う予定である。このGRWD1の結合因子として、核小体因子RPL11を同定した。RPL11は、低用量アクチノマイシンD処理や低栄養状態時に核小体が崩壊すると核へ放出され、ユビキチンリガーゼMDM2に結合することでその機能を抑制し、腫瘍抑制因子p53の安定化を誘導することが知られている。解析の結果、GRWD1はRPL11と直接結合することで、RPL11-MDM2結合を競合的に阻害し、核小体ストレス時のp53誘導に抑制的に働き、その結果、発がんに関与することを発見した。これらの知見と一致して、GRWD1の過剰発現はp53が野生型のグリオーマ患者において予後不良と強く相関していたが、変異p53を持つ同患者では、そのような相関は認められなかった。加えて、以下に示すようにGRWD1がp53と結合し、その結果、p53の転写活性化能を抑制している可能性も見出した。まずHCT116細胞においてGRWD1を発現抑制した後、ブレオマイシン処理によってDNAに損傷を与えた。その結果、GRWD1発現抑制細胞では、コントロールと比較してp53標的因子の一つであるp21の発現量の上昇がタンパク質レベルおよびmRNAレベルで観察された。さらに、p21遺伝子のプロモーター領域を組み込んだレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイによって、GRWD1がp53による転写活性化に抑制的に作用することが示唆された。また、ChIP-qPCR法により、GRWD1がp21プロモーターに結合していることも示唆された。今後は、GRWD1がp21プロモーター上でどのようにp53転写活性化能を抑制しているのかをChIP-qPCR法などによって解析する予定である。GRWD

1はDNA複製だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられる新規ヒストンシャペロンである。このGRWD1の結合候補因子として、核小体因子RPL11を同定した。RPL11は、低用量アクチノマイシンD処理や低栄養状態時に核小体が崩壊すると核へ放出され、ユビキチンリガーゼMDM2の酸性ドメイン近傍に結合することでその機能を抑制し、腫瘍抑制因子p53の安定化を誘導することが知られている。解析の結果、GRWD1はRPL11とMDM2の結合を競合的に阻害し、核小体ストレス時のp53誘導に抑制的に働き、その結果、発がんに関与することを発見した。GRWD1、Purαおよびp53の結合様式をChIP-qPCR法を用いて解析する。具体的には、新たに精製した抗GRWD1抗体を用いて、GRWD1およびPurαがp53標的因子のプロモーターに結合するのか、その結合がp53依存的かを調べる。さらに、p53の標的プロモーターへの結合はGRWD1依存的なのかを調べるため、GRWD1に対するsiRNAを用いたChIP assayも行う。あるいは、ブレオマイシン処理等によってしてDNA損傷を与えp53を活性化させた細胞を用いて、上記結合が変化するのかも調べる。また、FLAGタグ付きのGRWD1を発現させた細胞を用いて抗FLAG抗体を使用したChIP assayも行い、結合様式とその依存性を詳細に解析したい。分子生物学上述したように、これまで使用していた抗GRWD1抗体の特異性に問題が生じたため、新たに抗GRWD1抗体の精製を行った。そのため、その後の解析の一部が次年度にずれ込んだ。上述した今後の研究方針に従い、平成28年度の研究費と併せ、研究の邁進のために適切に執行していきたい。
細胞特異的なβバレル膜孔形成タンパク質性ナノツール設計の分子・構造基盤の確立

黄色ブドウ球菌のβバレル膜孔形成毒素の分子機構を追求した。細胞特異性では、2成分性γヘモリジンのHlg2成分、LukEDのLukE成分が膜孔形成時に標的細胞と接する4つのループ構造のうち、loop4が赤血球認識に重要であり、loop1と2が補助的に働くことを見出した。γヘモリジンのprestem解放には、LukFでprestemを保持に関わるcap領域のAspと、膜孔形成で隣接するHlg2cap部位の塩基性アミノ酸との相互作用が関わることを見出した。さらにstemの膜挿入に関わる残基の探索のため、αヘモリジンのcapとstemにCysを導入しprestem解放を調節できる評価系を構築した。本研究では黄色ブドウ球菌の産生する二成分性β-PFT(Hlg/Luk)を用い、毒素の自律的細胞膜挿入βバレル形成機構を解明し、任意の生体膜上にナノサイズ膜孔を形成するタンパク質の分子設計を行うための分子基盤を確立する。そのために、1)prestemが2段階に伸展し、βバレル膜孔が形成するために必須な因子の探索として1)a.bの2項目、2)としてダイマー、オリゴマー形成とprestemのリリースに関わる因子の探索として2)a-cの3項目、3)各成分の標的細胞膜認識に関わる毒素側因子の探索として1項目の実験を設定した。実験1)では、αヘモリジンを用い、1)a実験の要となるβバレルを形成するステムドメインのリリースに関わる因子と、伸長後に膜貫入に関する因子の効果について、別々に見ることが出来るシステムを開発した。実験2)では、2)b実験として、Hlg2およびLukFを用い、それぞれ膜孔構造からステムリリースに関わると考えられる残基の変異体を作成した。Hlg2について変異により溶血活性を失った2つの残基がそれぞれステムリリースに関与すると推定された。一方LukFでは予想される残基の変異は溶血活性に影響しなかった。以上(1,2)の結果より、βーバレル型膜孔の形成に関与する残基の候補が複数見いだされた。実験3)では、Hlg2を含む複数の二成分性β-PFTのS型成分とHlg/Lukの赤血球認識S型成分であるHlg2成分の推定細胞認識部位を置換し、赤血球結合に対する影響を解析した。ヒト赤血球を認識しうる2種類のS型成分では、赤血球認識に関与するループの位置は同一であったが、認識に関わるアミノ酸の配列はそれぞれ固有であった。その成果の一部は、第90回日本細菌学会総会(平成29年3月、仙台)で発表した。研究科の移転による実験に支障を来す期間が予想以上に長く(約二か月)なったため、下記のように若干の遅れが見られる。しかし、本研究の計画の遂行にあたっての大きな障害は生じていないため、29年度中に一定の成果を上げることができると確信する。実験1)ではa, bの二段階のうち、αヘモリジンでβバレル伸展と膜貫通に関わる因子の働きを見分けるシステイン二重変異体を確立できた。これを活用し、実験1aの実験を早急に進める必要がある。実験2では2)bを中心に進め、Hlg2で2つの残基を見いだしたことで、βバレルステムのリリースのスイッチとなる残基が明らかになった一方、LukFではの残基の変異は溶血活性に影響しなかったことは予想外であったが、逆にこれが2つの成分が連携してβバレルを形成するために必要な性質である可能性が考えられる。概ね予定通りに進んでいるが、引き続き引っ越しで手をつけられなかった、実験2)a, cに着手する必要がある。実験3)では、複数のS型成分の赤血球細胞膜認識に関わる最も重要なループの位置が共通であることを見いだしたが、その部位のアミノ酸配列は共通ではなく、それぞれの毒素に固有の配列が必要であった。これはそれぞれの成分が認識する標的細胞レセプターが異なる可能性、複数のループが共同して認識している可能性などを示唆するものであり、更なる解析を進める必要がある。本研究では黄色ブドウ球菌の2成分性βバレル膜孔形成毒素が備えている、リング状前駆体形成、prestemのリリース、βバレルの二段階伸展と細胞膜への挿入からなる細胞特異的膜孔形成能力の分子機構を追求した。【S型成分の標的細胞膜認識に関わる分子内因子の同定】γヘモリジンのHlg2成分、LukEDのLukE成分が膜孔形成時に標的細胞と接する4つのループ構造に注目した。これらを赤血球を認識できないロイコシジンLukS-PVのの該当部位と置換した変異体の解析から、いずれの成分でもLoop4が赤血球認識に重要で、Loop1と2がそれを補助することを明らかにした。この成果はJ. Biochemistryに報告した。【モノマーでのprestemの保持および標的膜上でのリリースに関わる分子内因子の解析】γヘモリジンのLukF及びHlg2成分において、stemのTyr(実験1のαヘモリジンY118の相当)との水素結合によってprestemを保持するcap領域のAsp残基に注目した。これらのAspは膜孔形成時には隣接する成分のcap部位の塩基性アミノ酸とイオン結合を形成する。そこでこれら塩基性アミノ酸の変異体を解析した結果、Hlg2成分のK15及びR16がLukF成分のprestemリリースに関与することを明らかにした。この成果は学会で発表するとともにToxiconに投稿し、現在査読結果を受け追加実験を行い、改定稿を作成中である。

【βバレル膜孔が形成するために必須な分子内因子の探索】近縁の1成分性膜孔毒素タンパク質であるαヘモリジンを用いた。stem領域に変異を入れるとprestemの保持に影響が出た。そこでcapドメインとstemにCysを導入してprestemの開放を調節できる評価系を構築した。この評価系を用い、膜孔形成に影響するstem領域の残基を絞り込んだ。詳細は現在解析中である。黄色ブドウ球菌のβバレル膜孔形成毒素の分子機構を追求した。細胞特異性では、2成分性γヘモリジンのHlg2成分、LukEDのLukE成分が膜孔形成時に標的細胞と接する4つのループ構造のうち、loop4が赤血球認識に重要であり、loop1と2が補助的に働くことを見出した。γヘモリジンのprestem解放には、LukFでprestemを保持に関わるcap領域のAspと、膜孔形成で隣接するHlg2cap部位の塩基性アミノ酸との相互作用が関わることを見出した。さらにstemの膜挿入に関わる残基の探索のため、αヘモリジンのcapとstemにCysを導入しprestem解放を調節できる評価系を構築した。実験1)aでは得られたαヘモリジンのシステイン二重変異体を活用し、βバレルの膜貫入に必須と考えられる残基を種々のアミノ酸に変換した変異体を作成して赤血球崩壊、および膜孔形成への影響を解析することをαヘモリジンで先行して行う。その結果を受け、実験1)で予定していたγヘモリジン各成分での解析を予定通り進める。実験2)bで得られた活性を失った2つHlg2変異体の解析を進めるとともに、実験1)aにおけるのαヘモリジンのステム貫入とステムリリースの影響を分地した解析を参考にしながら、実験2a)のprestam安定性の解析を進める。一方、2)bで活性に影響を示さなかったLukF変異体については、実験2)3のダイマー・リング状構造の形成に関与する残基の解析と合わせ、この変異が溶血活性に影響しなかった理由を解明する。また、実験3)のS型成分の標的細胞膜認識に関わる毒素側因子の探索では、複数のS型成分の赤血球結合において最も重要なループを毒素間で入れ替えた変異体をもとに、標的細胞と接触するその他のループ部位の細胞認識に対する協同的機能を解析する。さらにヒトリンパ球型レセプターを組み込んだマウス細胞を使用できるめどがついたので、赤血球認識との関連を調査し、S型成分の細胞認識に関わるアミノ酸残基の同定する。黄色ブドウ球菌で知られている複数の二成分性毒素はお互いのS型-F型成分を入れ替えても活性を示すが、遺伝子が遺伝子的にオペロンを形成している「本来の二成分」のペアでで最も高くなる。すなわち、細胞特異的な活性には、S-F成分間の相性も影響する。そこで、実験1)におけるテム形成に関与する変異、実験2)における二成分間のリング形成に関わる変異の情報をもとに構築した各種変異体の組み合わせによる赤血球崩壊活性を指標にして、実験3)の成果と合わせて、「本来の二成分」が最も強い毒素活性を示す機構を解明する。分子生物学・細菌学平成28年度秋から29年度春にかけ、研究科の移転があり、約二ヶ月実験がストップした。新規備品購入は移転後の機器は位置をにらみながら行うことになった。
バイオ化学ICを基盤とする次世代医療ナノデバイス群の開発

生化学分野における多種多用な合成と分析を全工程マイクロ領域で行うことができる新概念デバイス「バイオ化学ICチップ」の多様化とバイオ応用を目的とし、チップ素材から細胞チップへの適用まで、組織的な研究開発を行った。2001年に世界初の無細胞タンパク合成用化学ICチップを、当初の蛍の発光酵素ルシファラーゼから、バイオマーカとして有名なGFP(緑色蛍光蛋白)の長時間連続合成系まで発展させた。これにより、我々の「無細胞蛋白合成用化学ICチップ群」の有効性と汎用性が実証された。「細胞内蔵型バイオ化学IC」の基盤技術として、細胞適合性を有する光硬化樹脂の探索と、表面修飾、表面構造、マイクロ構造製作法等を研究し、所定の時間細胞が培養可能な条件を見出した。一般に光硬化樹脂は開始剤の毒性が細胞に悪影響を与えるため、このような基礎研究が不可欠となる。各種マイクロ光造形法の中で、化学ICのハイブリッド構造の製作に不可欠な自由液面方式のマイクロ光造形法を、10ミクロン以下の加工分解能を達成することにも成功した。液状樹脂をならすスキージの角度と素材を最適化した。その結果、マイクロ流路径を10ミクロン以下にするだけでなく、細胞接着面の平坦性の改善にも大きく貢献した。顕微鏡下における細胞操作を高度化するため、独自開発の高速2光子ナノ光造形法で作製した可動機構を持つナノマシンをレーザトラッピングで遠隔駆動する「光駆動ナノマシン」を提案・開発した。数ミクロンのナノピンセット、並進回転が可能なナノニードル、細胞膜の力学特性を計測するナノムーバー、10ミクロン長の3自由度光駆動ナノマニピュレータ等を作製し、有効性を実証した。さらに将来、化学ICを体内に埋め込み薬物や抗がん剤などを放出するための基礎研究としてポリ乳酸など生分解性樹脂を用いた3次元マイクロ造形法を考案、開発した。本装置の分解能は50ミクロンであるが、従来のような毒性溶媒を一切用いないため、細胞培養も可能であることが実証された。初年度では、生田らが独自に提案開発してきた化学ICチップのマイクロリアクタ内でさまざまな細胞が安定に培養できるバイオ化学ICの基盤技術を構築するため、主として下記の研究を行った。1.マイクロ光造形法で使用する光硬化樹脂の細胞毒性の調査エポキシ系、ウレタン系など、マイクロ光造形法に適した光硬化樹脂で細胞培養皿を製作し、その中でPC12など数種類の細胞培養試験を行った。その結果、硬化後の洗浄を十分に行っただけでは、細胞の長期安定培養は困難であることが再確認された。理由としては、硬化の開始剤の溶出や、硬化表面の状態、親水性の制御、樹脂の電気的極性などの因子が考えられる。2.適合性を満たす表面修飾法の検討硬化後の樹脂表面に各種コーティングを施し、細胞適合性を改善する手法の開発を行った。SiO_2コーティングなどに代表される化学的手法と、表面構造の形状など物理的手法の両者に関し、その効果を実験的定量的に調査し、最低1週間は安定に培養可能な条件を明確化した。3.無細胞蛋白合成チップの機能拡張昨年までは、蛍の発光酵素ルシファラーゼを無細胞的に合成する化学ICチップ群の開発と検証実験に成功しているが、本年度は、より汎用性の高いGFPなどマーカ蛋白の無細胞合成に成功した。さらに外部ポンプ方式ではなく、ポンプチップを内蔵したマイクロ合成系を完成し、化学ICチップ群だけで無細胞蛋白合成系が構築できることを実証した。4.光駆動マイクロマシンの高度化

マイクロ・ナノ光造形された透明マイクロ可動機構を、レーザ光で外部からトラップして遠隔駆動する手法を開発してきた。本年度は、バイオ化学ICチップの流路内に回転する攪拌機構を造形し、光駆動方式のマイクロミキシングを実証した。今後は、さらに各種応用に発展予定である。生化学分野における多種多用な合成と分析を全工程マイクロ領域で行うことができる新概念デバイス「バイオ化学ICチップ」の多様化とバイオ応用を目的とし、チップ素材から細胞チップへの適用まで、組織的な研究開発を行った。2001年に世界初の無細胞タンパク合成用化学ICチップを、当初の蛍の発光酵素ルシファラーゼから、バイオマーカとして有名なGFP(緑色蛍光蛋白)の長時間連続合成系まで発展させた。これにより、我々の「無細胞蛋白合成用化学ICチップ群」の有効性と汎用性が実証された。「細胞内蔵型バイオ化学IC」の基盤技術として、細胞適合性を有する光硬化樹脂の探索と、表面修飾、表面構造、マイクロ構造製作法等を研究し、所定の時間細胞が培養可能な条件を見出した。一般に光硬化樹脂は開始剤の毒性が細胞に悪影響を与えるため、このような基礎研究が不可欠となる。各種マイクロ光造形法の中で、化学ICのハイブリッド構造の製作に不可欠な自由液面方式のマイクロ光造形法を、10ミクロン以下の加工分解能を達成することにも成功した。液状樹脂をならすスキージの角度と素材を最適化した。その結果、マイクロ流路径を10ミクロン以下にするだけでなく、細胞接着面の平坦性の改善にも大きく貢献した。顕微鏡下における細胞操作を高度化するため、独自開発の高速2光子ナノ光造形法で作製した可動機構を持つナノマシンをレーザトラッピングで遠隔駆動する「光駆動ナノマシン」を提案・開発した。数ミクロンのナノピンセット、並進回転が可能なナノニードル、細胞膜の力学特性を計測するナノムーバー、10ミクロン長の3自由度光駆動ナノマニピュレータ等を作製し、有効性を実証した。さらに将来、化学ICを体内に埋め込み薬物や抗がん剤などを放出するための基礎研究としてポリ乳酸など生分解性樹脂を用いた3次元マイクロ造形法を考案、開発した。本装置の分解能は50ミクロンであるが、従来のような毒性溶媒を一切用いないため、細胞培養も可能であることが実証された。
顔面神経丘の同定に関する電気生理学的研究

第4脳室底で顔面神経丘の同定を試み、至適刺激方法、更に第4脳室底電気刺激の血圧・脈拍・呼吸に及ぼす影響を検討した。逆行性活動電位による同定では、第4脳室底の直径2mm以内の範囲でのみ、刺激後3msecから始まる振幅が約300μVの多相性の電位変化が眼輪筋から記録でき、この眼輪筋の誘発筋電図は小脳橋角部で頭蓋内顔面神経を切断後は得られなかった。順行生電位による同定では、陽性・陰性の2相性波が、逆行性活動電位が得られたと同じ範囲の刺激でのみ得られた。それぞれのピークは、2.03±0.35msecと3.04±0.16msec(n=5)で、小脳橋角部で左顔面神経を切断後この電位は消失した。電気生理学的に顔面神経丘と同定した部位が顔面神経丘上であることは、組織学的にも確認した。顔面神経丘上で電位を得る上での至適刺激条件は、0.1mA・0.1msecの単極刺激であった。顔面神経丘電気刺激による呼吸・循環への影響に関しては、0.4mA以上の刺激強度で血圧低下が、2.0mA以上の刺激強度で脈拍数低下と呼吸抑制が出現した。これらの呼吸循環へ及ぼす影響は、Atropine(0.01mg/kg)静注後5分で抑制され、その効果は約50分間持続した。以上の結果より、第4脳室底において呼吸循環に影響を及ぼすことなく安定して顔面神経丘を同定することができ、臨床応用も可能と思われた。
新規・生理活性物質レピジモイドの作用機構に関する研究

アブラナ科植物のクレス発芽種子分泌液中から発見された新規・機能性オリゴ糖レピジモイドについて、これまでに植物界における分布、類縁体による構造活性相関、発芽時におけるレピジモイドの分泌パターンが明らかにされてきた。また、レピジモイドの生理作用としては、植物の成長促進(特にケイトウ芽生えの下胚軸伸長)活性、クロロフィルの合成促進作用及びセネッセンスの防止作用が明らかにされている。本研究ではケイトウ以外の植物に対するレピジモイドの作用を調べるため、近年分子生物学のモデル植物として盛んに用いられているシロイヌナズナ(エコタイプ:WS)にレピジモイド処理を行い、顕著な下胚軸の伸長促進および子葉の拡大作用を有することを明らかにした。また、レピジモイドのエコタイプ(7種類)による成長反応(下胚軸の伸長促進作用および子葉面積の拡大作用)の差異を検討した結果、レピジモイド感受性および非感受性のエコタイプが存在することを明らかにした。また、レピジモイドの植物ホルモンとの相互作用を遺伝子レベルで解析するための基礎データを得るべく、既知の植物ホルモンに対するアッセイ系を用いて、詳細な生理作用の検討を行った。アマランサスの種子発芽、アベナ幼葉鞘の伸長、イネ第二葉鞘の伸長、ダイコン下胚軸の伸長、大麦種子中の還元糖生成、アマランサスのベタシアニン合成、大麦葉のクロロフィル合成およびアズキ葉柄エクスプラントの脱離に対する効果を調べたところ、特にサイトカイニンおよびジベレリンのアッセイ系のいくつかにおいて顕著な生理活性を示すことを明らかにした。これらの結果は、今後の遺伝子レベルからのレピジモイドの作用発現機構の解析へのアプローチとなる実験系の確立に大いに貢献するものと期待される。植物由来の新規・機能性オリゴ糖レピジモイドについて、これまでに植物の成長促進(特にケイトウ芽生えの下胚軸伸長)活性、クロロフィルの合成促進作用及びセネッセンス防止作用等、レヒジモイドの多面的な生理活性を明らかにしてきた。本研究ではケイトウ以外の植物に対するレピジモイドの作用を調べるため、近年分子生物学のモデル植物として盛んに用いられているロイヌナズナ(エコタイプ:WS)にレヒジモイド処理を行った。その結果、レヒジモイドはシロイヌナズナに対しても下胚軸の伸長促進作用を示し、更には子葉の拡大作用も有することが明らかになった。また、7種類のエコタイプの異なる野性型シロイヌナズナの成長(下胚軸の伸長促進作用および子葉面積の拡大作用)に対するレヒジモイドの効果を検討した結果、顕著な下胚軸伸長および子葉面積の拡大促進作用を示したエコタイプとしてWS、C24、Canの3種類が確認された。一方、その他のエコタイプ(Columbia、Lansberg、Enkheim、C1-0)では、ほとんど促進作用が認められなかったことからレヒジモイド感受性および非感受性のエコタイプが存在することが明らかになり、今後の遺伝子レベルからのレヒジモイドの作用の解析に用いられる可能性が示唆され、分子レベルでの作用メカニズム解析の有用な材料となるものと期待される。今後はシロイヌナズナを用いてレヒジモイド処理により発現が誘導される遺伝子の同定を行う予定である。