hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リボソームRNA成熟制御を介した核による葉緑体機能発現調節機構の解明

昨年までに単離したシロイヌナズナ葉緑体RNase E候補遺伝子破壊株について、詳細な解析を行った。これまでに、Rubiscoラージサブユニットをコードする葉緑体rbcL遺伝子をプローブとして行ったノザン解析の結果、野生株では、rbcL mRNAに相当する単一のバンドのみが検出されるのに対し、破壊株では、それに加え約8kbと約5kbの2本の高分子転写産物の蓄積が検出されていた。そこで、rbcLの下流に存在する5つの遺伝子に対してもノザン解析を行い、高分子RNAの解明を行った結果、約8kbの断片は解析に用いた6つの遺伝子全長、約5kbの断片はrbcLの下流2遺伝子までの転写産物であることが明らかとなった。一方、RNase E破壊株は、非常に深刻な生育阻害および光合成活性の低下を示すが、これらの表現型がRNase E遺伝子破壊に由来するかを確認するため、cDNAを高発現プロモーター支配下のもと破壊株に導入する相補実験を行った。RNase E遺伝子のcDNAは、データベース上に5ユ末端の異なる3種が登録されており、これら3種の導入を行った。その結果、最も長いcDNAを用いた場合にのみ表現型の回復が認められたが、そのレベルは野生株までは達しなかった。また、rbcLの高分子RNA蓄積も相補株で認められた。遺伝学的には遺伝子破壊と表現型との相関を確認しているため、この結果は導入遺伝子の構築ミスの可能性も考えられるが、RNase Eには、最長のcDNAから発現し破壊株の表現型の一部に寄与する分子と、葉緑体に移行しrbcLのプロセッシングに寄与する分子の少なくとも2分子が存在する可能性を示唆していた。2627-2株(葉緑体RNase R変異株)の葉緑体タンパク質の標識実験を行い、2627-2株では野生株と比較して葉緑体リボソームの翻訳活性が低下していることを明らかとした。また、葉緑体RNase Rの細胞内移行シグナルとGFPとの融合タンパクの一過的発現解析を行い、この酵素が葉緑体に局在することを確認した。葉緑体RNase RにHis Tagを付加したタンパクを大腸菌内で大量発現・精製を行い、抗体作製及び酵素活性の測定を試み、抗体については十分な力価が得られた。活性測定に関しては、現在粗精製タンパクによる活性測定系の確立を試みている。2.葉緑体RNaseホモログ破壊株の単離大腸菌及びラン藻のRNaseとの比較から、シロイヌナズナの葉緑体RNaseの候補遺伝子7種を選定した。これらの遺伝子のT-DNA挿入破壊株の種子をSALK INSTITUTEから得て、遺伝子破壊株の確立を行った。その結果、葉緑体で機能することが示唆される葉の退色を示したRNase E、PNPase及びRNase R破壊株を同定した。なお、今回単離したRNase R破壊株は、これまで解析を行ってきた2627-2株と同一の遺伝子破壊であったが、2627-2株と異なり遺伝子内部へのT-DNAの挿入が認められたため、この株も解析に用いた。これらについて、葉緑体RNAの蓄積量及びプロセッシングを解析した結果、RNase E破壊株では、Rubisco LサブユニットをコードするrbcL mRNAのプロセッシング異常が認められた。また、PNPase破壊株では、多くのRNAにおいて野生株より200-300塩基程度サイズの大きな分子の蓄積が認められ、3'末端のプロセッシングに異常があることが示唆された。RNase R破壊株については、2627-2株よりも深刻なrRNA量の減少が認められた。これまでにシロイヌナズナ葉緑体RNase R破壊株の解析を行い、この酵素が葉緑体リボソームRNAのプロセッシングに関与することを明らかとした。そこで本酵素のRNase活性を評価するため、大腸菌タンパク質発現系を用いたタンパク質の精製並びに酵素活性の測定を行った。葉緑体へのターゲット配列を除いた成熟タンパク質にHisタグもしくはGSTタグを付与したものを大腸菌内で発現し、どちらのタグを付与したものにおいても比較的少量であるが可溶性タンパクとして発現していることを確認し、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。そこで、この精製タンパクを用いて、反応条件、基質特異性等の検討を行った。2.葉緑体RNaseホモログ破壊株の解析昨年、新たに葉緑体RNase破壊株を2種単離した。これらはRNase E及びPNPase破壊株であり、どちらの破壊株も葉色の淡化と、葉緑体におけるRNA代謝の異常が認められた。今回、これらのRNaseの葉緑体機能に対する影響を解析するため、クロロフィル蛍光による遺伝子破壊株の光合成活性の評価を行った。その結果、RNase E破壊株においては、著しい光合成活性の低下が認められ、また、PNPase破壊株においては、葉の退色を示している領域において光合成活性が低下していることが明らかとなった。一方、大腸菌においては、RNase RとPNPaseは共に主要なエキソ型RNaseとしてその機能を相補していることが知られている。そこで、葉緑体におけるそれらの関係性を明らかとするため、これら2種のダブルミュータントを作成した。

これまでに、Rubiscoラージサブユニットをコードする葉緑体rbcL遺伝子をプローブとして行ったノザン解析の結果、野生株では、rbcL mRNAに相当する単一のバンドのみが検出されるのに対し、破壊株では、それに加え約8kbと約5kbの2本の高分子転写産物の蓄積が検出されていた。そこで、rbcLの下流に存在する5つの遺伝子に対してもノザン解析を行い、高分子RNAの解明を行った結果、約8kbの断片は解析に用いた6つの遺伝子全長、約5kbの断片はrbcLの下流2遺伝子までの転写産物であることが明らかとなった。一方、RNase E破壊株は、非常に深刻な生育阻害および光合成活性の低下を示すが、これらの表現型がRNase E遺伝子破壊に由来するかを確認するため、cDNAを高発現プロモーター支配下のもと破壊株に導入する相補実験を行った。RNase E遺伝子のcDNAは、データベース上に5ユ末端の異なる3種が登録されており、これら3種の導入を行った。その結果、最も長いcDNAを用いた場合にのみ表現型の回復が認められたが、そのレベルは野生株までは達しなかった。また、rbcLの高分子RNA蓄積も相補株で認められた。遺伝学的には遺伝子破壊と表現型との相関を確認しているため、この結果は導入遺伝子の構築ミスの可能性も考えられるが、RNase Eには、最長のcDNAから発現し破壊株の表現型の一部に寄与する分子と、葉緑体に移行しrbcLのプロセッシングに寄与する分子の少なくとも2分子が存在する可能性を示唆していた。
糖鎖結合による生体機能分子の高活性化

温和な条件でタンパク質にオリゴ糖鎖を結合させる反応をまず調べた。還元剤のNaBH3 CNを用い37°C数時間でタンパク質のモデル化合物であるボリリジンおよびポリアルギニンの側鎖アミノ基に、糖残基数27のマルトオリゴ糖を結合させ得る反応を見出した。糖鎖結合ポリリジンおよびポリアルギニン13CNMRスペクトルにおいて、新規に糖成分の吸収および末端アミノ基の隣の炭素吸収が、未反応物のそれより数ppm離れて現れるので、それを定量した。10当量のマルトース(2糖)やマルトペンタオースをオリゴ糖として用い、8590%の糖鎖置換率が得られる条件を見出した。次に、天然の酵素へ適用した。aldolase,lactate dehydrogenase,6-phosphogluconic dehydrogenase,cholinesterase,およびphosphatase alkaline(アルカリフォスファターゼ)に充分量のマルトースを還元アミノ化反応で結合させた。aldolase(9%)を除いた他の4つの酵素は、マルトース結合反応後の活性低下が少なく、元の活性の5890%を保持していた。アルカリフォスファターゼにつき、マルトースおよびマルトヘプタオース(7糖)を結合させて、酵素活性を評価した。糖鎖の結合により酵素活性は低下したが、10日120日間経過の酵素活性は糖鎖結合により大幅に保持されることがわかった。60°C熱処理の影響を調べたところ、糖鎖結合物は60120分後の残存活性がやや高かった。アルカリフォスファターゼについては、糖鎖長の長いマルトヘキサオース結合物の方が、トリオースやペンタオースよりも60分後まで保持された活性値が高かった。糖鎖の結果、長さ、置換度の影響をさらに調べる予定である。また、糖鎖によってタンパク質が受ける影響を解明するため、硫酸化カードラン、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどの糖鎖と、ポリリジン、リジン・アルギニンコポリマーなどのモデルタンパクとの相互作用を、高分解能NMRを用いて調べた。糖の硫酸基とペプチド鎖のアミノ基との間で起こる強い相互作用が、NMRの吸収の顕著な変化として初めて捉えられた。還元剤のNaBH_3CNを用い37°C数時間でタンパク質のモデル化合物であるポリリジンおよびポリアルギニンの側鎖アミノ基に、糖残基数27のマルトオリゴ糖を結合させ得る反応を見出した。糖鎖結合ポリリジンおよびポリアルギニンの^<13>CNMRスペクトルにおいて、新規に糖成分の吸収および末端アミノ基の隣の炭素吸収が、未反応物のそれより数ppm離れて現れるので、それを定量した。

aldolase(9%)を除いた他の4つの酵素は、マルトース結合反応後の活性低下が少なく、元の活性の5890%を保持していた。アルカリフォスファターゼにつき、マルトースおよびマルトヘプタオース(7糖)を結合させて、酵素活性を評価した。糖鎖の結合により酵素活性は低下したが、10日120日間経過後の酵素活性は糖鎖結合により大幅に保持されることが分った。60°C熱処理の影響を調べたところ、糖鎖結合物は60120分後の残存活性がやや高かった。アルカリフォスファターゼについては、糖鎖長の長いマルトヘキサオース結合物の方が、トリオースやペンタオースよりも60分後まで保持された活性値が高かった。糖鎖の種類、長さ、置換度の影響をさらに調べる予定である。温和な条件でタンパク質にオリゴ糖鎖を結合させる反応をまず調べた。還元剤のNaBH_3CNを用い37°C数時間でタンパク質のモデル化合物であるポリリジンおよびポリアルギニンの側鎖アミノ基に、糖残基数27のマルトオリゴ糖を結合させ得る反応を見出した。糖鎖結合ポリリジンおよびポリアルキニンの_<13>CNMRスペクトルにおいて、新規に糖成分の吸収および末端アミノ基の隣の炭素吸収が、未反応物のそれより数ppm離れて現れるので、それを定量した。10当量のマルトース(2糖)やマルトペンタオースをオリゴ糖として用い、8590%の糖鎖置換率が得られる条件を見出した。次に、天然の酵素へ適用した。aldolase,1actate dehydrogenase,6-phosphogluconic dehydrogenase,cholinesterase,およびphosphatase alkaline(アルカリフォスファターゼ)に充分量のマルトースを還元アミノ化反応で結合させた。アルカリフォスファターゼにつき、マルトースおびマルトヘプタオース(7糖)を結合させて、酵素活性を評価した。アルカリフォスファターゼについては、糖鎖長の長いマルトヘキサオ一ス結合物の方が、トリオースやペンタオースよりも60分後まで保持された活性値が高かった。また、糖鎖によってタンパク質が受ける影響を解明するため、硫酸化カードラン、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどの糖鎖と、ポリリジン、リジン・アルギニンコポリマーなどのモデルタンパクとの相互作用を、高分解能NMRを用いて調べた。糖の硫酸基とペプチド鎖のアミノ基との間で起こる強い相互作用が、NMRの吸収の顕著な変化として初めて捉えられた。
超高周波超音波イメージング用配向制御圧電結晶膜トランスデューサの開発

高解像度の医療用超音波画像診断を実現するために、圧電結晶膜を用いて高周波圧電トランスデューサの作製を行う新しい手法を提案した。スパッタリング法と水熱合成法を組み合わせ、圧電性を向上させるために圧電結晶膜の配向制御を行い、コンパクト化と高周波数化も実現した。本研究の目的は、『配向制御された高性能圧電薄膜』をマトリクス状に配列させることで、高性能な医療用超音波プローブを実現することである。超音波トランスデューサ材料には、電気機械結合係数が優れるKNbO_3を用い、基板上に形成されたKNbO_3圧電膜を用いることをコンセプトの基本とした。研究開発の手順として、(1)良好なKNbO_3圧電製膜方法の確立、(2)製膜されたKNbO_3圧電膜の材料特性および超音波トランスデューサの評価、(3)評価結果を元にしたアレイ化の設計、(4 )KNhO_3圧電膜のアレイ化、(5)アレイ電極からの制御基板への配線、と5つのパートに分けた。現在は(3)から(4)のパートへ移行する段階である。製膜手法に関しては、バッファ層及び電極の作製にはスパッタリング法を用い、KNbO_3膜の製膜には水熱合成法を用いた。スパッタリング法、水熱合成法ともに、電極のパターニングおよび圧電膜のパターニングが可能な製膜技術であることから、トランスデューサのアレイ化が期待される。そこで、製膜されたKNbO_3圧電膜の材料特性および超音波トランスデューサの評価を行った。材料定数の測定は、電気特性、圧電特性の測定および等価回路を用いたフィッティングにより求めた。次に、材料定数を基にKNbO_3圧電膜のアレイ化に関するシミュレーションを行った。超音波イメージングにおいて、高分解能化を図るためには広帯域化、高周波が重要であるが、広帯域化については、水熱法で製膜したKNbO_3圧電膜は密度が低く、音速も低いことから生体や高分子材料と音響インピーダンスマッチングに優れることから、広帯域化が期待できることが分かった。製膜されたKNbO_3圧電膜の材料特性および超音波トランスデューサの評価に関しては、実際に良好な圧電性が得られ、また実験により90MHz以上での高周波帯において超音波の送受信が可能であることが確認された。今後は、幅15μm、ピッチ間隔15μmで下部電極が1次元配列された基板を用い、電極上に厚み15μmのKNbO_3圧電膜を製膜し、下部電極と直交させた形状で幅15μmの上部電極を形成しマトリクスアレイを作製する予定である。高性能な医用超音波画像診断に向けて、超音波プローブのコンパクト化と高周波数化が課題となっている。そこで本研究においては配向制御された圧電性結晶膜の厚膜を用いて、巨大圧電特性を積極的に利用した高感度な送受波感度を有する超音波トンランスデューサを開発することを目的とした。配向制御された圧電結晶膜の製膜においては、下部電極と圧電結晶の核形成にはスパッタリング法を用い、圧電結晶の成長には水熱合成法を用いるといったオリジナルな手法を提案を行い、導電性酸化物であるSrRuO_3(SRO)を製膜し下部電極とし、SRO上に圧電結晶であるKNbO_3(KNO)を製膜した。またKNOの表面にPtを製膜することで上部電極とした。KNOは比誘電率が他の無機系圧電結晶に比べて低いことから、高周波における超音波の受信感度の向上が期待される。そこで本手法により製膜された結晶膜の材料定数を測定し、得られた結果を基に、超高周波超音波トランスデューサの設計を行った。測定した比誘電率および圧電d_<33>定数,圧電g_<31>定数,はそれぞれ約500,80pm/V,8mVm/Nと圧電結晶として良好な結果が得られた。次に、超音波の送波感度、受波感度について基礎動作特性の評価を行ったところ、中心周波数100MHzにおいて、S/N比40dBで超音波の送受信が可能であることが分かった。画像用の超音波トランスデューサとして期待できることから、今後はMEMS技術等を用いて圧電結晶のアレイ化、配線、マッチング層の作成を行い、より実用的な超音波トランスデューサの開発を目指す。
がん特別研究の総括

本年度の総括班の成果は以下の如くである。1.平成5年度成立の229班(がん特1・71班、がん特2・158班)および若い研究者104名の運営と総括を行なった。2.年3回総括班会議を開き研究班の計画・運営・評価を行なった。3.特別委員会4、検討班2を計画し、これを運営した。4.班長会議(第1回平成5年6月7日、第2回平成6年2月4日)を行ない、がん研究の新しい方向、研究者の要望等につき討議した。5.がん特別研究の成果を発表し討議する公開シンポジウムを、第1回目を平成5年6月7日、第2回目を平成6年2月3・4日の両日東京において開催した。また、ミニシンポジウムを平成5年10月30日三重県津市で開催した。6.研究技術交換等のための研究者の国内派遣3名を実施した。7.年度初めに「平成5年度文部省がん特別研究組織」を、年度末には「文部省がん特別研究報告集録」を編集、印刷し、全班員に配布した。8.「がん特ニュース」を年3回、別冊2回全班員、関係者に配布し、研究連絡伝達を密にした。9.「コホート研究による発がん要因の評価に関する研究」の研究を行った。
L-arginineの糸球体硬化に対する逆説的用量依存性効果の機序解明

一酸化窒素(NO)は進行性腎機能低下の主因である糸球体硬化抑制に重要な役割を果たしていると推測されている。しかしNOの産生基質であるL-アルギニン(L-arg)の、種々の腎疾患モデルにおける腎機能、血圧、糸球体硬化に対する効果は、報告者により異なっており定見がない。L-argの効果が一定しないのは腎疾患モデルやL-argの投与量が報告者により異なっているためと考え、糸球体硬化モデルである516腎摘ラットを用いL-arg非投与群(ARG(-)群)、ARG0.2g/kg/day投与群(0.2gARG群)、1g/kg/day投与群(1gARG群)、2.0g/kg/day投与群(2gARG群)の4群に分け、腎機能、糸球体組織およびL-arg-NO代謝に対する効果を検討した。腎機能、尿蛋白および糸球体硬化指数(SI)、間質線維化比率(%INT)はARG(-)群に比し、0.2gARG群でのみ改善が認められ、他の群では変化がないか増悪が認められた。L-arg-NO代謝においては一日尿中NO代謝物排泄量(NOX)及び一日尿中cGMP排泄量(cGMP)は0.2gARG群でのみARG(-)群に比し有意な増加を認めた。腎不全患者の循環器系異常への関与が示唆されている内因性NO合成酵素(NOS)阻害物質である血中asymmetrica1 dimethy1arginine(ADMA)濃度はARG(-)群に比し、0.2gARG群でのみ有意な低下を認めた。血中及び尿中L-argは0.2gARG群においてはARG(-)群に比し有意差は無かったが、1gARG群、2gARG群では有意な増加を認めた。そしてNOXとGSI、%INTおよびADMAとの間に各々有意な負の相関関係を認めたが、血中および尿中L-argとは有意な相関関係は認めなかった。以上から、糸球体硬化モデルである5/6腎摘ラットにおいて、低用量L-arg投与は尿蛋白、腎機能、糸球体硬化、間質の線維化を改善させるが、高用量L-arg投与では逆に悪化させることを明らかとした。またこれらの改善効果はL-argからのNO産生量と関連しているが、NO産生量は必ずしもL-arg投与量と正相関しているわけではなく、ADMAなどにより修飾されると考えられた。一酸化窒素(NO)は内皮依存性血管拡張因子として発見されたが、単に血圧調節のみならず腎血行動態にも重要な働きをしているとされている。そこで、本研究では糸球体硬化モデルである5/6腎摘ラットにおいて、糸球体硬化を調節する因子としてのNOを検討する目的で、モデル動物にNOの先駆体であるL-arginine(L-ARG)の種々の用量を摂取させた検討を行った。

従来からの予備的検討と同様に、少量のL-ARG(0.2g/kg BW/日)を投与したほうが大量のL-ARG(2.0g/kgBW/日)を投与したものより尿中NO代謝物、cGMP排泄量が多く、また糸球体硬化の程度、蛋白尿も軽いことが確認された。また、間質障害を間質繊維化面積により計測した検討でも同様の結果であり、NO産生が大であるほど糸球体硬化のみならず間質繊維化をも予防していることが示唆された。そこで、in situ hybridizationによりNO産生酵素(NOS)の発現を検討した。ecNOSおよびnNOSを画像解析装置で測定すると、糸球体内に絞った発現量では少量のL-ARG投与群のほうが大量L-ARG投与群に比して約2倍程度の発現量の増加が認められられた。NOSの発現量の増加がNOS蛋白およびNO産生増加に結びついている可能性が示唆された。現在、少量および大量のL-ARGを投与した条件でのL-ARGの代謝を検討するため、血清濃度のみならず臓器内代謝物濃度を検討中である。特に、NOSを阻害する作用のあるN^G,N^G,dimethyl L-arginineの濃度を検討したが両群間では有意な差を認めなかった。次年度では肝ほかの代謝を確認するとともに、in situ hybridizationによるecNOSおよびnNOS発現の検討を定量化する。一酸化窒素(NO)は進行性腎機能低下の主因である糸球体硬化抑制に重要な役割を果たしていると推測されている。しかしNOの産生基質であるL一アルギニン(L-arg)の、種々の腎疾患モデルにおける腎機能、血圧、糸球体硬化に対する効果は、報告者により異なっており定見がない。L-argの効果が一定しないのは腎疾患モデルやL-argの投与量が報告者により異なっているためと考え、糸球体硬化モデルである516腎摘ラットを用いL-arg非投与群(ARG(-)群)、ARG 0.2g/kg/day投与群(0.2gARG群)、1g/kg/day投与群(1gARG群)、2.0g/kg/day投与群(2gARG群)の4群に分け、腎機能、糸球体組織およびL-arg-NO代謝に対する効果を検討した。腎機能、尿蛋白および糸球体硬化指数(SI)、間質線維化比率(%INT)はARG(-)群に比し、○.2gARG群でのみ改善が認められ、他の群では変化がないか増悪が認められた。L-arg-NO代謝においては一日尿中NO代謝物排泄量(NOX)及び一日尿中cGMP排泄量(cGMP)は0.2gARG群でのみARG(-)群に比し有意な増加を認めた。腎不全患者の循環器系異常への関与が示唆されている内因性NO合成酵素(NOS)阻害物質である血中asymmetricaldimethyl arginine(ADMA)濃度はARG(-)群に比し、0.2gARG群でのみ有意な低下を認めた。血中及び尿中L-argは0.2gARG群においてはARG(-)群に比し有意差は無かったが、1gARG群、2gARG群では有意な増加を認めた。そしてNOXとGSI、%INTおよびADMAとの間に各々有意な負の相関関係を認めたが、血中および尿中L-argとは有意な相関関係は認めなかった。以上から、糸球体硬化モデルである5/6腎摘ラットにおいて、低用量L-arg投与は尿蛋白、腎機能、糸球体硬化、間質の線維化を改善させるが、高用量L-arg投与では逆に悪化させることを明らかとした。またこれらの改善効果はL-argからのNO産生量と関連しているが、NO産生量は必ずしもL-arg投与量と正相関しているわけではなく、ADMAなどにより修飾されると考えられた。
CYP2D6遺伝子多型別トラマドール光学異性体血中濃度推移と効果に関する研究

トラマドール(TR)代謝に関連するCYP2D6遺伝子多型別にTR血中濃度測定し、その血中濃度推移および副作用発現状況を調査した。その結果、CYP2D6遺伝子に変異を有し、CYP2D6代謝活性能力低下群では、変異のない通常代謝能力群に比較するとTR血中濃度が高く推移することを見出した。副作用の評価項目として抽出した頭痛、嘔気や嘔吐は、TR投与開始7日間では、CYP2D6代謝活性能力低下群での発現頻度は通常能力群より有意に高かった。TR服用の際には、CYP2D6遺伝子多型を考慮することによって、より効果的かつ安全ながん緩和ケアを提供できると考えられる。(1) TRおよびM1の光学異性体血中濃度測定TRおよびM1の光学異性体血中濃度測定は,Chystilらの報告をもとに改変し,薬学部共通機器センター,LC-MS/MS(液体クロマトグラフ-質量分析装置)を活用し,TRおよび活性代謝体M1の光学異性体測定方法を開発する.この方法を用いて臨床サンプルの測定を行った.加えて,TR内容液剤投与患者でみられた血中TR濃度が低い件について検討を行った.TR内用液剤での分解について検討を行った,(+)-TRの光分解は,UV-A(315-400nm)照射では認められなかった.UV-C(200-280nm)照射による光分解が最も進行し,8時間照射後の(+)-TR残存率は約22%であった.UV-C照射時の光分解は1次反応式に従い,分解速度定数は0.195であった.UV-B(280-315nm)における光分解も1次反応式に従い,分解速度定数は0.037であった.UV-BおよびUV-Cにおける(+)-TRと(-)-TRの残存率の間には有意差が認めらなかった.室内散光下で保管したTR内用液剤中のTRの残存率は,7および14日目において,ともに約92%であった.室温,室内散光下で14日間の処方が可能であると考える.光分解,特にUV-AおよびUV-B曝露でTR分解が促進しすることを明らかにした.(2) CYP2D6遺伝子多型の判定方法の確立CYP2D6遺伝子多型のうち*1 (野生型),*5 (完全欠損), *10 (C100T,酵素活性を減弱させる対立遺伝子) ,およびUM (ultra rapid metabolizer;一定の繰り返し配列による酵素活性を増幅させる複製遺伝子を持つ)についても検出する方法を確立した.トラマドール(TR)は紫外線により分解し,その光分解は1次反応に従うことが報告されている.太陽光に含まれる紫外線は,波長域315-380 nmの長波長紫外線(UV-A) ,波長域280-315 nmの中波長紫外線(UV-B) ,波長域100-280 nmの短波長紫外線(UV-C)に大別される.TR液剤の光による分解に関しては,いまだ十分に検討されておらず,その光分解特性を分析し,臨床現場におけるTR液剤の光安定性を評価することは重要である.本研究では水溶液中TRの光分解特性を調査するために,TR液剤にUV-A, UV-BおよびUV-C照射を行い,TR液剤中(±)-TRの光分解挙動をそれぞれの波長において比較した.さらに,TR液剤が臨床現場で光に対して安定かどうかを評価するため,臨床現場を想定した保管条件のもとTR液剤光安定性実験を行った.UV-A,B,C照射におけるTR光学異性体の分解に差異は認めなかった.また,UV-AおよびUV-B照射では分解はほとんど認めず,TRは水溶液化しても臨床上,使用できることを明らかにした.TRは鎮痛効果に個人差があることが臨床上問題となっている.TRはラセミ体であり,μオピオイド受容体への結合だけでなく,それぞれの光学異性体が異なる作用機序を持つこと,TRの代謝は薬物代謝酵素CYP2D6の影響されることが主要因と考えられる.TRを投与している患者を対象にTR服用後に経時的に血中濃度を測定したところ,CYP2D6遺伝子多型別に異なるpharmcokineticパラメーターを認めた.すなわち,CYP2D6*1*4およびCYP2D6*10*10はその野生型に対しTRのAUCおよびトラフ血球濃度が高くなっていることを見出した.トラマドール(TR)代謝に関連するCYP2D6遺伝子多型別にTR血中濃度測定し、その血中濃度推移および副作用発現状況を調査した。水溶液中トラマドールの光分解特性を調査するために,トラマドール水溶液にUV-A, UV-BおよびUV-C照射を行い,水溶液中(±)-トラマドールの光分解挙動をそれぞれの波長において比較した.さらに,TR液剤が臨床現場で光に対して安定かどうかを評価するため,臨床現場を想定した保管条件のもとTR液剤光安定性実験を行った.UV-A,B,C照射におけるTR光学異性体の分解に差異は認めなかった.

また,UV-AおよびUV-B照射では分解はほとんど認めず,TRは水溶液化しても臨床上,使用できることを明らかにした.また,これらの内容は論文化した.トラマドールを投与している患者を対象に,トラマドール服用後に経時的に血中濃度を測定したところ,CYP2D6遺伝子多型別に異なるpharmcokineticパラメーターを認めた.すなわち,CYP2D6*1*4およびCYP2D6*10*10はその野生型に対しトラマドールのAUCおよびトラフ血球濃度が高くなっていることを見出した.臨床薬学引き続き臨床医と連携し,患者データの積み重ねをしていく.加えて,CYP2D6遺伝子多型別にトラマドール血中濃度と鎮痛効果および有害事象として頭痛および嘔気の発生頻度を調査する予定である.今年度は11月に開催される医療薬学会に成果発表を予定している.トラマドール血中濃度測定できた患者は10例,CYP2D6遺伝子多型についてもこれまでの報告同様の頻度である.トラマドール処方医とコンタクトも取れており,今後のサンプルの確保(30例程度)できている.懸念されたトラマドールの光分解についても,原因を解明できたことから,順調に進行していると判断した.引き続き臨床医と連携をとり,患者データを積み重ねていく.トラマドール血中濃度推移について,pharmacokinetics(PK)パラメーターを解析していく.
新規7/5縮環骨格構築法の開発とdehydrozaluzanin C の全合成

α-メチレン-γ-ブチロラクトン構造を含む天然物は数多く存在し、抗腫瘍活性、抗炎症活性、抗HIV活性を示すことから、それらの量的供給が望まれる。本研究では、Rh触媒を用いたカルベンのトランス選択的なC-H挿入反応、続くPetersonオレフィン化によりトランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトンの新規構築法を開発することができた。本構築法を用いて、(-)-xanthatinの全合成および(+)-8-epi-xanthatinの形式合成を達成することができた。平成25年度は、セスキテルペノイドであるdehydrozaluzanin Cに見られる5/7/5縮環構造を2つの部分に分け、1) 5/7シス縮環構造の構築および2) 7/5トランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトン構造の新規構築法の検討を開始した。1)では、キラルな7員環エノンに対しアルケニル基の1,4付加を検討したところ、アルケニル銅試薬を用いると1,4付加が立体選択的に進行した。その後の5/7シス縮環形成の際に、望みのシス縮環体からトランス縮環体に異性化することが分かった。得られた5/7トランス縮環体から、抗癌活性を示すenglerin Aの中間体へと導いた。平成26年度は5/7シス縮環体の選択的な合成を検討し、dehydrozaluzanin Cの合成研究に取り組む予定である。2)で述べた7/5トランス縮環構造は、ロジウム試薬を用いたジアゾエステルのC-H挿入により構築できると考えた。モデル基質としてシクロヘキサノールから調製できるジアゾエステルを用いて検討を行った。溶媒、ロジウム試薬のリガンド、基質の置換基について検討した結果、トランス選択的なC-H挿入が進行し、6/5トランス縮環体の構築に成功した。更に1工程をかけて、6/5トランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトン構造の新規構築法を達成することができた。同様に、シクロヘプタノールから7/5トランス縮環体への変換も良好に進行した。今後は基質の適用範囲を検討していく予定である。縮環型のα-メチレン-γ-ブチロラクトン構造を含む天然物は数多く存在し、抗腫瘍活性、抗炎症活性、抗HIV活性を示すことから、それらの量的供給が望まれる。本研究では、1)キラルな7員環エノンへの立体選択的な1,4-付加および環化、2) Rh触媒を用いたジアゾエステルのメチレンへのC-H挿入によるトランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトンの新規構築法を検討した。2)では溶媒、Rh試薬のリガンド、基質の置換基について検討した結果、シリル基の置換したジアゾエステルからのトランス選択的なC-H挿入によりトランス縮環体を構築した。続くオレフィン化によって、6/5, 7/5, 8/5トランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトンの効率的構築法を開発した。本構築法を用いて、グアイアン骨格を有するdehydrozaluzanin Cの合成研究に取り組んだが、1)の7/5シス縮環体への変換が選択的に進行しなかった。そこで、キサンタン骨格を持つxanthatinの合成研究を開始し、2)の構築法を鍵としたxanthatinの全合成、8-epi-xanthatinの形式合成を達成した。26年度が最終年度であるため、記入しない。有機合成化学26年度が最終年度であるため、記入しない。1)で述べたように、5/7縮環体形成条件の際、望みのシス縮環体からトランス縮環体に異性化することから、dehydrozaluzanin Cに含まれる7/5シス縮環体の選択的合成は達成できていない。しかしながら、2)において、7/5トランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトン構造の新規構築法を開発したことにより、2)の骨格を有するセスキテルペノイド類の合成研究に応用可能となった。全体として、おおむね順調に進展していると判断した。平成26年度は、7/5トランス縮環α-メチレン-γ-ブチロラクトン構造を有するセスキテルペノイド類の合成を試みる。引き続きdehydrozaluzanin Cの合成研究を行うとともに、キサンタノライド型テルペノイドであるキサンタチンの合成に向けた検討も試みる。
自己集合性ペプチドを用いた硝子体再建術

眼の大部分を占める硝子体は、網膜を押し付けて網膜の剥離を防止する機能(タンポナーデ機能)や、眼内に薬剤が注入された際にその薬剤を眼内に長く滞留させ徐放する機能(徐放機能)などを持っている。その硝子体は、網膜剥離治療の際に除去されることがしばしばある。その際、タンポナーデ機能の回復を図るための硝子体代替物が眼内に注入される。しかし、それらの使用に伴い、術後の長期間のうつ伏せ姿勢強要や合併症などの問題がある。また、この硝子体代替物には、徐放機能は考えられていない。加齢黄斑変性症などの治療法として硝子体内薬剤投与が支流となっている現在、徐放機能も非常に重要な機能となっている。そこで、自己集合性ペプチドゲルというユニークな特徴を持つゲルに着目し、我々はその両方の機能を有する新規の硝子体代替物の検討を行った。ウサギ網膜剥離モデルに対して、自己集合性ペプチドゲルを眼内に注入し、そのタンポナーデ機能を評価した。術後3か月間において、網膜の再剥離は見られず、網膜を押し付けて機能が有することが示された。また、その注入のおける合併症なども見られなかった。さらに、サル網膜剥離モデルに対してもウサギ同様に実施し、同様な結果が得られた。次に、自己集合性ペプチドゲルに加齢黄斑変性症に対する治療薬であるルセンティスを内包し、そのゲルからのルセンティスの徐放量をin vitroで定量を行い、その徐放機能を評価した。結果は、1か月でルセンティスがおよそ内包量の50%徐放された。また、ウサギ眼にアバスチンを内包したゲルを注入し、in vivoでの徐放機能も評価した。結果は、注入3か月後において、アバスチン単独で注入した群に対して、有意に眼内残存量が多いことが示され、in vivoにおいてもその除票機能が確認された。申請時に、初年度はタンポナーデ機能とin vivoでの徐放機能評価をおこなうとしており、その評価を概ね完了しているため。また、追加として大動物においてもそのタンポナーデ機能を評価することができたため。本年度の結果をもとに、より長期的にタンポナーデ、徐放機能の評価を行う。また、カニクイザルを用いた薬剤徐放効果評価の基準となる、ゲルを使用しない対照試験を実施する。
ゲノムデータに対して有効性が高い多重検定法の開発

P値を推定する際に,標本数の少なさをカバーするために,他の遺伝子のデータを加えることがしばしば行われている.しかしながら,その妥当性は,必ずしも検証されていなかった.本申請研究では,その妥当性が保証されるP値推定の条件を数理的に整理できた.その条件のもとでの最適な検定も導出できた.数値実験でも実データ解析でも,劇的に優れていることが検証できた.平均の同等性だけでなく分散の同等性についても検討した.P値を推定する際に,標本数の少なさをカバーするために,他の遺伝子のデータを加えることがしばしば行われている.しかしながら,その妥当性は,必ずしも検証されていなかった.本申請研究では,その妥当性が保証されるP値推定の条件を数理的に整理できた.その条件のもとでの最適な検定も導出できた.数値実験でも実データ解析でも,劇的に優れていることが検証できた.平均の同等性だけでなく分散の同等性についても検討した.【研究の目的】ゲノムデータにおいては,繰り返し実験の回数(n)よりも説明変数の数(p:たとえば遺伝子数)が圧倒的に多い場合,いわゆる「n<<p」問題への対処を,統計科学に強く要請している.この問題においては,古典的な統計科学の手法を,簡単には援用できない.そこで,遺伝子発現データにおける遺伝子発現差解析においては,ある遺伝子の遺伝子発現差を検出するのに,他の遺伝子のデータを援用するという試みがアドホックに提案されている.本申請研究では,アドホックにではなく,他の遺伝子のデータを「うまく」援用できるための本質的な条件は何であるかを適切に捉え,このタイプの研究に統一的な観点を与えたい.そして,そのような条件の下で,どのような検定が最適であるかを考えたい.【研究の成果】本年度は平均の同等性検定を対象にした.データの背後にある分布が対称な場合には,本研究申請の前に結果を得ていた.ある種のクラスでは,ある検定統計量が最適であると分かっていた.本年度は,データの背後にある分布が対称でなくても,二つの母集団において,ある種の同一性を持つクラスでは,ある検定統計量が最適であると分かった.後者の検定統計量は前者の検定統計量よりも自由度が一つ小さかった.結果として,後者の新しい検定統計量に基づくと,検出力もより高く,P値推定という意味でも安定性がより高い,という性質が期待された.その性質を数値実験で確認した.論文をまとめて投稿した.これまでに,通常に行われる平均の同等性検定に関しては,様々な結果を得られた.他の遺伝子のデータをうまく援用してP値を妥当に推定するための条件を数理的に整理できた.その条件のもとでの最適な検定も導出できた.過去の議論はすべてアドホックであったので,この成果は非常に有意義であった.この分野に完全に新しい枠組みを提示できた.その検定方法は,過去にアドホックに提案されている検定よりも,ある意味で検出力が高いことも証明できた.数値実験でも,P値推定としての安定性と,検出力の大きさが,過去の手法に比べて,単に優れているというレベルではなく,劇的に優れていることが検証できた.実際のデータ解析でも導出した手法の優位性は明らかとなった.ここまでは非常にうまく行った.その話の延長として分散の同等性検定に関してもチャレンジしている.分散の検定は,平均の検定のように理論がきれいに進まないことが多く,非常にチャレンジングであると考えている.その話題に対処しようと思った動機は遺伝研究所から分散の同等性に関連した話題を持ち込まれたからである.難しい問題にチャレンジしようとするモチベーションが高い.他の遺伝子のデータをうまく援用してP値を妥当に推定できる検定統計量については幾つか思い付いた.その方法の妥当性もある程度は確認できた.しかし,それを統一的に扱うという問題が,なかなかきれいにクリアできていない.この問題を次年度も引き続いてあらためてトライしたいと考えている.遺伝研究所から,きちんとしたデータも頂いたので,そのデータを解析しつつ,新しい方向性をも模索した.これまでに,通常に行われる平均の同等性検定に関しては,様々な結果を得られた.他の遺伝子のデータをうまく援用してP値を妥当に推定するための条件を数理的に整理できた.その条件のもとでの最適な検定も導出できた.過去の議論はすべてアドホックであったので,この成果は非常に有意義であった.この分野に完全に新しい枠組みを提示できた.その検定方法は,過去にアドホックに提案されている検定よりも,ある意味で検出力が高いことも証明できた.数値実験でも,P値推定としての安定性と,検出力の大きさが,過去の手法に比べて,単に優れているというレベルではなく,劇的に優れていることが検証できた.実際のデータ解析でも導出した手法の優位性は明らかとなった.ここまでは非常にうまく行った.その話の延長として分散の同等性検定に関してもチャレンジした.分散の検定は,平均の検定のように理論がきれいに進まないことが多く,非常にチャレンジングであると考えている.その話題に対処しようと思った動機は遺伝研究所から分散の同等性に関連した話題を持ち込まれたからである.難しい問題にチャレンジしようとするモチベーションが高い.他の遺伝子のデータをうまく援用してP値を妥当に推定できる検定統計量については幾つか思い付いた.その方法の妥当性もある程度は確認できた.さらに統一的に扱うという問題をトライしていた.ある程度のクラスの中では統一的に扱うことは可能となった.

ある意味での最強力検定も導出できた.しかし,平均の同等性検定のように,非常に汎用的なクラスにまで広げられなかったのが残念であった.分散の同等性検定に関しては,遺伝学研究所のデータを具体的に解析して,その結果に関して議論も行った.平均の同等性に関する部分については当初の予想以上にきれいな成果が得られた.これは特筆に値する.ただし,次の目的とした分散の同等性の検定に関しては,大きな進展はない.これは研究計画時からチャレンジングな問題として認識しており現状での停滞は予想したことである.今年度は試行錯誤の段階であり,それによって見えたものをどこまで整理できるかが,最終年度の課題である.24年度が最終年度であるため、記入しない。分散の同等性の検定は通常の設定でも難しい.他の遺伝子のデータを援用するという枠組みをどのような統一的観点から扱うかである.現在までは,平均の同等性の検定と同一の観点から考えていたが,今後は違う観点の模索も行いたい.さらに,検定としての良さに関しても,平均と違って,一様最強力不偏検定ではなく,局所最強力検定などの違う観点も考慮に入れたい.24年度が最終年度であるため、記入しない。
免疫複合体病におけるB細胞の役割の解明と治療応用

(背景)制御性B細胞の免疫複合体病における役割を制御性B細胞を持たないCD19ノックアウトマウス(KO)にアルサス反応を惹起することにより検討する。(方法)腹腔逆アルサス反応を野生型マウスおよびCD19KOに惹起する。(結果)腹腔アルサス反応における白血球浸潤はCD19KOで有意に増加していた。またそれに伴い腹腔回収液中のIL-6濃度は上昇する一方、IL-10濃度は低下していた。(結論)制御性B細胞は腹腔アルサス反応における白血球浸潤を抑制するとともに、IL-6を抑制し免疫複合体病の制御を担っている可能性がある。(背景と目的)B細胞の免疫複合体病における役割を、IL-10産生制御性B細胞が欠如したCD19ノックアウトマウスに免疫複合体病のモデルであるアルサス反応を誘導することによって解析を行っている。(方法)野生型マウスおよびCD19ノックアウトマウスにニワトリ卵白アルブミンに対するウサギIgG型抗体および陰性コントロールとして精製ウサギIgGを、マウスの背部皮膚に皮内注射する。その直後に抗原であるニワトリ卵白アルブミンをマウス尾静脈から静注し、皮膚にて免疫複合体を形成させ炎症を惹起させた。1)皮膚浮腫の測定:浮腫を測定するため抗原であるニワトリ卵白アルブミンには0.2% Evans blueを添加しておき、抗体および抗原投与4時間後、マウスの背部のEvans blueで青染された皮膚を測定することによって皮膚浮腫を定量化した。2)皮膚出血の測定:抗体および抗原投与8時間後、マウスの背部皮膚の出血を測定することによって皮膚出血を定量化した。(結果)野生型マウスおよびCD19ノックアウトマウスで皮膚アルサス反応の程度に有意な差は見られなかった。今後は腹腔アルサス反応において両群で違いがあるかどうかを検討する。(背景と目的)B細胞の免疫複合体病における役割を、IL-10産生B細胞を持たないCD19ノックアウトマウスに免疫複合体病のモデルであるアルサス反応を惹起することにより検討を行う。(方法)1皮膚逆アルサス反応ニワトリ卵白アルブミンに対するウサギIgG型抗体および陰性コントロールとして精製ウサギIgGを、マウスの背部皮膚に皮内注射する。その直後に抗原であるニワトリ卵白アルブミンをマウス尾静脈から静注し、皮膚にて免疫複合体を形成させ炎症を惹起させる。2腹腔逆アルサス反応ニワトリ卵白アルブミンに対するウサギIgG型抗体および陰性コントロールとして精製ウサギIgGを腹腔内注射する。その直後に抗原であるニワトリ卵白アルブミンを尾静脈から静注し、腹腔内にて免疫複合体を形成させ炎症を惹起させる。アルサス反応誘導前、誘導後の腹腔回収液におけるサイトカインをELISAて定量的に測定する。サイトカインとしては、1アルサス反応に関与していると考えられるIL-6など、2逆にアルサス反応を抑制すると考えられるIL-10を測定する。(結果)野生型マウスおよびCD19ノックアウトマウスで皮膚アルサス反応の程度に有意な差はみられなかったが、腹腔アルサス反応における白血球浸潤はCD19ノックアウトマウスで有意に増加していた。またそれに伴い腹腔回収液中のインターロイキン6値は上昇し、逆にインターロイキン10値は減少していた。研究計画時より皮膚アルサス反応におけるIL-10産生制御性B細胞の役割は限定的であると推測していた。皮膚科今後腹腔アルサス反応でIL-10産生制御性B細胞の関与があるかどうかを検討する。本研究では、皮膚アルサス反応および腹腔アルサス反応の2つの反応により、免疫複合体病におけるB細胞およびIL-10産生制御性B細胞の役割を評価するのがテーマである。初年度では主に皮膚アルサス反応の評価を行った。次年度は残る腹腔アルサス反応を行う必要がある。1)腹腔逆アルサス反応の誘導:ニワトリ卵白アルブミンに対するウサギIgG型抗体(2 mg/ml;Sigma社)および陰性コントロールとして精製ウサギIgGを腹腔内注射する。その直後に抗原であるニワトリ卵白アルブミン(を尾静脈から静注し、腹腔内にて免疫複合体を形成させ炎症を惹起させる。抗体および抗原投与4時間後、8時間後に腹腔中に含まれる好中球、肥満細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B-1a細胞、B-1b細胞、B-2細胞(をフローサイトメーターを用いて評価する。2)腹腔回収液中のサイトカイン濃度の評価:アルサス反応誘導前、誘導後の腹腔回収液におけるサイトカイン蛋白をELISA法にて定量的に測定する。
平安期漢詩文における和化漢語生成の原理に関する研究

従来、平安時代の日本漢詩文の言語は、概ね中国漢文に準拠すると説かれてきたが、語彙の面に注目してみると、中国の漢文には認めがたい、日本独特の意味・用法で用いられている漢語(和化漢語)の少なからず存することに気付かれる。しかしながら、認定の方法に困難を伴うこともあって、その実態調査は、十分に行われていないのが実状である。本研究は、平安時代の漢詩文における和化漢語の認定方法を検討した上で、その量的構造を解明し、さらに一々の和化漢語の生成過程を追求することにより、漢語の、わが国における意味変化の要因・類型といった原理的な問題にまで迫ることを目的として出発した。具体的には、次のような成果が得られた。以下、箇条的に示すこととする。1,平安時代の漢詩文のうち、表白文・願文について、京都の古寺院(仁和寺、高山寺など)、金沢文庫、東京大学国語研究室の未公表の文献資料の調査、蒐集を行い、パーソナルコンピュータによって文献学的な基礎データの整理を行った。2,『本朝文粋』所収の願文の漢語索引を作成した。3,特に、願文について、そこに使用されている漢語の性格が、身分差、法会の種類、文章構成などによって異なっているとの見通しを得て、その構想を示した。4,願文中に用いられる「松」のイメージが、中国古典の用法と本邦のそれとの双方を受容しているらしいことを明らかにした。(2・3の成果については、国語語彙史研究会および鎌倉時代語研究会にて口頭発表を行った。)今後は、表白文・願文にとどまらず、広く漢詩文全体を対象に、漢語の性格(和化、和製の漢語を中心に)の解明に努め、加えて、後世の文章への影響についても考察したいと思う。
細胞外ドメインシェディングによるシグナル伝達制御の病態における意義

膜タンパク質の細胞外ドメインが、膜近傍のタンパク質分解により切断される現象を細胞外ドメインシェディング(以下シェディング)という。シェディングは膜タンパク質の機能変換や多機能化を介してシグナル伝達制御を担う重要な翻訳後修飾である。我々は、ナルディライジン(NRDc)がシェディングの活性化因子であることを明らかにしてきた。またNRDc欠損マウスは、複数の炎症疾患モデルで炎症抵抗性を呈し、同分子が炎症性疾患で重要な役割をもつことが示唆された。シェディング増強活性は細胞外における機能だが、NRDcはシグナルペプチドを有さない可溶型酵素で、その分泌機構は不明である。これまでシグナルペプチドのないタンパク質が、特異的な翻訳後修飾に依存して分泌されることが報告されており、NRDの分泌機構の解明がシェディング活性化機能の解明につながることが期待される。本申請においては、1)個体レベルにおけるシェディング制御の意義、2)NRDcの分泌における翻訳後修飾の意義、の解明を目的にして実験を行い、その結果以下を明らかにすることができた。1)炎症性腸疾患モデルマウスの病変部位あるいは血清の検討から、NRDc欠損マウスの炎症抵抗性が、NRDc欠損によるTNFalphaのシェディングの低下、およびその下流であるIL-6の分泌の低下によるものであることが示唆された。2)NRDcの分泌が自身のリン酸化で制御されている可能性が示唆され、インビトロキナーゼアッセイを用いて検証したところ、NRDc自身が特定のキナーゼでリン酸化されることがわかった。さらに質量分析による解析の結果、NRDcには少なくとも10カ所以上のリン酸化部位があることがわかった。それらのリン酸化部位の変異体NRDcを用いた解析から、NRDcの分泌は少なくとも部分的に自身のリン酸化に依存していることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。細胞外ドメインシェディングは膜タンパク質の機能変換や多機能化を介してシグナル伝達制御を担う重要な翻訳後修飾である。我々は、ナルディライジン(NRDc)が、シェディングの活性化因子であることを明らかにしてきた。NRDc欠損マウスは、複数の炎症疾患モデルで炎症抵抗性を呈し、同分子が炎症性疾患で重要な役割をもつことが示唆された。これまでシグナルペプチドのないタンパク質分泌が翻訳後修飾に依存することが報告されている。NRDc分泌は、炎症性サイトカインなどで誘導されることがわかっており、分泌機構解明が、シェディング活性化機能の解明につながることは明らかである。本申請においては、1)個体レベルにおけるシェディング制御の意義、2)NRDcの分泌における翻訳後修飾の意義、の解明を目的にした。平成23年度には以下を明らかにすることができた。2)NRDcの分泌がPKAによるリン酸化で制御されている可能性が示唆され、インビトロキナーゼアッセイを用いて検証したところ、NRDc自身がPKAでリン酸化されることがわかった。さらに、インビトロキナーゼアッセイと質量分析による解析の結果、NRDcには少なくとも10カ所以上のリン酸化部位があること、それらのリン酸化がPKAによって誘導されている可能性があることが明らかになった。

申請時の平成23年度の計画欄に記した内容について、プロジェクト1の炎症性腸疾患モデルの解析は順調に進んでいるが、メタボリックシンドロームモデルの白色脂肪組織の解析はやや遅れている。一方プロジェクト2)については、NRDcのリン酸化部位同定に成功するなど、おおむね順調に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、プロジェクト1)TNFalpha、IL-6の下流シグナリングを組織レベルで検討し、培養細胞を用いてTNFalphaシェディング、IL-6分泌におけるNRDcの役割をさらに明らかにする。また、IL-6あるいはTNFalphaの投与あるいは、そのトランスジーンの発現によって、個体レベルにおけるNRDc欠損マウスの炎症抵抗性がリバースされるかどうかを検討する。プロジェクト2)平成23年度に同定したリン酸化部位の変異体を作製し、NRDc分泌に重要な働きをする部位が存在するかどうかを確かめる。並行して、細胞質NRDcと分泌NRDc(培地中)を、それぞれ免疫沈降法などを用いて精製し、さらに質量分析を行い翻訳後修飾プロフィールを解析する。