hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子欠損マウスを用いた発癌物質の検出・評価システム

本研究では突然変異の制御機構に基づいて、発癌の制御に関わると考えられる2つのDNA修復系を欠くマウスをつくり、それを用いて発癌剤の高感度な検出系を確立した。これによってこれまで経験的に進められてきた発癌性の評価に学問的基盤を与え、充実した検査体制を築くための有用なシステムを提供することができた。さらにこの実験系は生体のもつ発癌を抑制する機構を明らかにする上で有用と考えられる。DNA修復酵素(0^6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ)を欠くMGMT欠損マウスはアルキル化作用をもつ化学物質の発癌性を検出する上で有用なことがわかったが、何分その高い致死性のため投与できるアルキル化剤の量が限られる。アルキル化剤によってひき起こされるアポトーシスにはミスマッチ修復系が関わると考えられるので、MGMT欠損に加えてミスマッチ修復遺伝子の1つであるMLH1を欠くマウスを作成して検討した。その結果MGMT^<-/->MLH1^<-/->マウスはMNUの致死効果に対して野生型マウスと同じレベルの抵抗性を示した。そのようなマウスに30mg/kgのMNUを投与して発癌性を調べたところ、77%に胸腺腫が生じた。この条件下では野生型マウスには全く腫瘍は生じなかったので、二重欠損マウスはアルキル化剤の腫瘍誘起効果に対してきわめて高感受性となることが明かとなった。この場合の問題点の1つはMGMT^<-/->MLH1^<-/->マウスは正常の状態でも比較的高い頻度でも腫瘍を生じることであった。この問題を解決するためMGMT^<-/->MLH1^<+/->マウスを作製して検討したところこのマウスのMNUに対するLD_<50>は120mg/kgでホモ欠損のマウス(MGMT^<-/->MGMT^<-/->)比べて若干低かったが、30mg/kg投与の発癌実験を支障なく実施することができた。MGMT^<-/->MLH1^<+/->マウスではPBS投与では腫瘍を全く生じず、30mg/kgのMNU投与によって40%の固体に胸腺リンパ腫を生じた。これによって比較的高濃度のアルキル化物質を投与してもマウスの生存を損なうことなく、その発癌性をきわめて鋭敏に検出できる系を確立することができた。化学物質が生体に作用して癌をひき起こす場合、先ずその物質がDNAに結合してその塩基を修飾しその結果塩基対合に異常をきたすことが必要と考えられる。生体にはこれを防ぐために、修飾をうけた塩基を認識し、それを排除してもとの状態に修復する機構が存在する。この修飾機構は動物の種類はもとより組織や細胞によっても異なっており、化学物質の発癌性はこの過程によって著しく左右される。化学物質の発癌性を評価するにあたってはDNA修復活性を念頭に入れることが重要であり、発癌性を敏感に検出するためには修復能を欠くモデル動物を用いた実験系を確立することが必要である。

そのような見地から、我々はアルキル化剤による発癌性において主要な役割を演じると考えられるO^6-メチルグアニンを認識して修復する酵素(O^6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ)の遺伝子(MGMT)を欠くマウスを遺伝子ターゲティングの手法を用いて作出した。MGMT^<-/->マウスは正常マウスより若干小さいが正常に成長し、増殖した。このマウスにアルキル化剤(メチルニトロソウレア)を投与したところきわめて高い感受性を示し、MGMT^<+/+>のLD_<50>が240mg/kgであったのに対しMGMT^<-/->マウスのLD_<50>はその1/10以下の19.5mg/kgであった。致死量以下のメチルニトロソウレア(2.5mg/kg)の投与によってMGMT^<-/->マウスは正常マウスに比べ、より高い率で胸腺や肺に腫瘍が発生した。同様な傾向は環境発癌物質の一つの考えられるジメチルニトロサミンの投与によっても観察された。メチルトランスフェラーゼ欠損マウスではアルキル化剤の投与によって増殖の盛んな細胞が障害を受け、その結果血球系・免疫系の細胞を供給する骨髄の幹細胞や腸官上皮の細胞が著しく減少する。致死効果が高いと発癌性を検討することがむつかしくなるので両者を分離する実験系についても検討を行っている。多細胞生物においては突然変異をひき起こすようなDNAの傷を持つ細胞をみつけ出して排除することが必要であり、アポトーシスはそのための機構として働いていると考えられる。アルキル化剤によってできるO^6-メチルグアニンのような微少なDNAの傷の場合、それ自体ではアポトーシスを起こすシグナルとなり得ないが、それが未成熟ミスマッチ修復を起こし、それが結果的にアポトーシスをひき起こすと考えられる。本研究ではDNA修復酵素をコードする遺伝子MGMTとミスマッチ修復の初期過程に関与する酵素の遺伝子MLH1をともに欠損するマウスを作出することによってそれが個体レベルで起ることを示すことができた。MGMT^<-/->MLH1^<-/->マウスの場合と同じくMGMT^<-/->MLH1^<+/->のマウスにおいてもアルキノ化剤の致死性に関して野生型マウスに近い抵抗性を示すという結果が得られた。このことはミスマッチ修復遺伝子がヘテロで欠損しても発がん剤に対する感受性において影響がでることを示しており、化学物質の発がん性を評価する上で重要な知見と考えられる。MTH1遺伝子は酵素ラジカルによって生じるDNA前駆物質の酸化体8-オキソdGTPを分解する酵素をコードしており、この遺伝子の欠損は自然突然変異率の上昇をきたすことが微生物の系で明らかにされている。この遺伝子をマウスからクローニングし、それを用いてMTH1遺伝子欠損マウスを作製した。このマウスは生後1年半で胃がんを生じることが明らかになったので、胃がん発生のモデル系として有用なのではないかと検討を進めている。本研究では突然変異の制御機構に基づいて、発癌の制御に関わると考えられる2つのDNA修復系を欠くマウスをつくり、それを用いて発癌剤の高感度な検出系を確立した。これによってこれまで経験的に進められてきた発癌性の評価に学問的基盤を与え、充実した検査体制を築くための有用なシステムを提供することができた。さらにこの実験系は生体のもつ発癌を抑制する機構を明らかにする上で有用と考えられる。
リンパ節転移陰性乳がんにおける分子生物学的予後因子

臨床的に早期の乳がん症例の中から再発・死亡する可能性の高い症例を選び出すための客観的指標を見いだす目的で、過去に当施設で外科切除されたリンパ節転移陰性(n0)かつ腫瘍径5cm以下の症例で2年以内に再発し最終的に乳がんの転移で死亡した32症例と、これらの各症例と年齢・腫瘍径が一致し、かつ10年以上健在した122症例を選び出し、これらの症例に対して組織学的所見の検索ならびにp53蛋白の核内蓄積、c-erbB-2蛋白の過剰発現、カテプシンDの発現低下に関する免疫組織化学的検索を行った。再発群と非再発群の間で最も差があったのは組織学的異型度であり、前者では59%(19例)が最も異型度の高いGrade3の症例であったのに対し、後者ではGrade3は7%(9例)のみであった。またp53の核染色性も両群間で有意な差を示し、再発群では41%(13例)に陽性であったが、非再発群の陽性律は16%(20例)にとどまった。c-erbB-2の頻度は両群間で有意な差はなく、カテプシンDの発現低下も再発群でより高頻度であったが顕著な差ではなかった。多変量解析により各因子の中で独立した最も強力な再発危険因子は組織学的異型度で、Grade3の群はより異型の乏しいGrade1や2の群の約60倍の2年以内再発危険率を示した。p53の核染色性も再発危険因子として約2倍の危険率を示した。p53の核染色性は高い組織学的異型度とも関連した。以上の結果から、予後不良のn0乳がん症例の選別に組織学的異型度だけでなく、p53の核染色性も有用であることが示唆された。今後プロスペクティブな検討も併用し、今回の研究成果を確認した後、実際の診療への応用を目指す予定である。
物性を指標としたシロイヌナズナのゲノム機能解析

シロイヌナズナのゲノム機能を網羅的に解析するために、効率的な物性測定手法と試料調製方法について検討した。試料としては、播種後数日で得られる胚軸が有効であることがわかったが、他の植物試料と比べて非常に小さくて力学的強度が低く、現有の引っ張り試験機では物性の正確な測定が困難であった。そこで、荷重計測精度が高い新鋭万能試験機を導入して、安定した結果が得られる測定条件を決定した。また、従来独立に用いられてきた荷重-伸び解析法と応力緩和法とを、同一試料に連続的に適用するプログラムとインターフェイスを開発し、効率的な測定を可能にした。さらに、試料を効率よく調製するために、芽ばえの最適な生育条件について検討した。これらにより、物性を指標としてシロイヌナズナのゲノム機能を網羅的に解析するための基本的な条件を確立できた。本研究で確立した物性測定条件を、細胞壁、細胞膜、並びに表層微小管の構造、代謝、あるいは機能に変異を生じたシロイヌナズナ系統の胚軸の物性解析に適用し、その有効性を検証した。様々な変異体のうち、XTHノックアウト変異体及びZIMの過剰発現体では、胚軸の成長速度の変化やキシログルカンのレベル、分子サイズ、及び代謝回転の程度と見合う細胞壁物性の変化が検出された。また、α-及びβ-チューブリン変異体、微小管結合タンパク質(morl、spr1、spr2、MAP65、カタニン)変異体、hmg変異体などでは、胚軸の伸長成長が様々な程度に抑制され、細胞列のねじれや肥大成長の促進が認められたが、成長パターンの変化の程度に応じて細胞壁伸展性の低下が起きていることが確認された。このように、本研究で確立した測定方法がシロイヌナズナ胚軸の物性の網羅的な解析に非常有効であることが示された。シロイヌナズナのゲノム機能解析に必要な胚軸の物性測定のための手法と条件について検討した。まず、現有の引っ張り試験機(TENSILON RTM-25)を用いて荷重-伸び解析法と応力緩和法による物性解析を試みた。しかし、シロイヌナズナ胚軸は他の植物試料に比べて非常に小さくて力学的強度が低く、通常の解析の数十分の1に相当する0.5g程度の荷重を用いて測定する必要があった。そのため、機械的なノイズや操作上のばらつきに起因する測定誤差が大きく、遺伝子機能の網羅的な解析のための条件となる少ない試料数での正確な測定は困難であることがわかった。そこで、現有機器の使用はあきらめ、本補助金とは別の予算を確保して、荷重計測精度が高い新鋭万能試験機(TENSILON RTE-1210)を新たに導入した。これにより、従来の測定方法と条件を適用した場合でも、測定に必要な試料数を半分以下に減らすことが可能になった。引っ張り速度や試料固定条件、あるいはクランプの選択などを通して、さらに少ない試料で安定した結果が得られるように引き続き検討している。荷重-伸び解析法と応力緩和法は植物細胞壁物性の測定によく使われる方法であるが、従来は別々の試料について2つの方法を適用していた。網羅的な解析において植物試料を効率よく使用するため、同じ試料に両方法を連続的に適用するプログラムとインターフェイスを開発し、新規導入した試験機に適用した。その結果、30秒間という短時間の測定により、同一試料から、全コンプライアンス、粘性率、弾性率、最小緩和時間、応力緩和速度などの多くのパラメータを得ることが可能になった。測定プログラムはまだ完全ではなく、引き続き改良を続けているが、これを用いることにより物性によるシロイヌナズナのゲノム機能解析の見通しが立ったと言える。

昨年度に新規導入した万能引っ張り試験機を用いて、シロイヌナズナ胚軸の物性を安定的に測定できる条件を探索した。シロイヌナズナ胚軸は、他の植物試料に比べて非常に小さく力学的強度も低いが、メタノール固定時間を十分に取り、引っ張り速度を下げ、市販品の代わりに微小クリップを加工したクランプを用いることによって、誤差の少ない測定が可能になった。また、昨年度開発した荷重-伸び解析法と応力緩和法を連続的に適用するプログラムとインターフェイスを改良して、操作性を向上させた。以上のハードウェアとソフトウェアの組み合わせによって、多数のシロイヌナズナ胚軸の物性を測定する基本的な条件がほぼ確立できた。このような測定手法を適用して、細胞壁及び表層微小管の構造、構築、代謝、並びに機能に関わるいくつかのシロイヌナズナ変異体の胚軸の物性を、予備的に解析した。双子葉植物の物性の決定において重要な働きをしているエンド型キシログルカン転移/加水分解酵素(XTH)に関する変異体のうち、XTH31とXTH32のT-DNA挿入ノックアウト変異体及び両者の二重変異体では、胚軸の物性が野生型のそれとほぼ同程度であり、明瞭な違いが認められなかった。これに対して、XTH33の過剰発現体では、細胞壁伸展性の増加並びに細胞壁強度の低下が見いだされた。このような変異体の物性は、胚軸の成長速度の変化やキシログルカンのレベル、分子サイズ、及び代謝回転の程度とよく合致していた。ほぼ同様の結果が、表層微小管構造を破壊したシロイヌナズナ胚軸でも認められた。これらの結果より、本研究において開発した測定方法がシロイヌナズナの物性の網羅的な解析に有効であることが示された。物性を指標として、シロイヌナズナのゲノム機能を網羅的に解析するため、試料の効率的な調製方法について検討した。シロイヌナズナ芽ばえの生育条件(光、温度、重力方向)及び齢を変えて各々の物性を測定した結果、網羅的な解析に最適かつ効率的な条件を見いだした。また、実験毎の生育速度の違いによる影響を最小限にするためには、芽ばえの齢と各パラメータの間の関係に基づいて測定値を補正するのが有効であることがわかった。物性の網羅的解析に使用するハードウェアとソフトウェアについては、昨年度までの研究で基本的な条件を定めていたが、本年度はさらに細部に修正を加え、最終的な測定方法を確立した。この方法を、細胞壁、細胞膜、並びに表層微小管の構造、代謝、あるいは機能に変異を生じたシロイヌナズナ系統の胚軸の物性解析に適用した。様々な変異体のうち、ジンクフィンガー型転写因子ZIMの過剰発現体の胚軸伸長は、赤色光下で顕著に促進された。この時、細胞壁伸展性が有意に増加しており、成長速度との間に高い相関が見られた。一方、α-及びβ-チューブリン変異体、並びに微小管結合タンパク質(mor1、spr1、spr2、MAP65、カタニン)変異体では、胚軸の伸長成長が様々な程度に抑制され、細胞列のねじれや肥大成長の促進が認められた。これらの変異体では、伸長成長抑制の程度に応じて細胞壁伸展性の低下が起きていることが確かめられた。同様の結果が、細胞膜の構築に異常があるhmg変異体でも認められた。このように、本研究で確立した測定方法がシロイヌナズナ胚軸の物性の網羅的な解析に有効であることが明らかになった。
新規バイオ―マーカーを用いた食物アレルギーの個別化オーダーメイド治療の開発

食物アレルギー(FA)の原因食物を定期的に摂取し、症状誘発閾値の上昇を目指す「経口免疫療法」の有効性が報告されている。しかし、客観的指標が無いことが課題である。申請者らは、FAの発症時に、肥満細胞から産生されるプロスタグランジンD2の最終代謝産物である尿中PGDMが上昇すること、更に症状誘発を予測するカットオフ値を報告した(Inagaki S.JACl.2018)。本マーカーは、診断・治療の指標として応用できる可能性がある。本研究では、免疫療法中の患者を対象に、定期的に尿中PGDMwpモニタリングしながら適切な摂取量を決定し、安全かつ有効なオーダーメイドの経口免疫療法の開発を目指す。
不均質異方性大規模ボクセルモデル内低周波電磁界の数値計算法に関する研究

不均質な異方性を有する大規模ボクセルモデル内の低周波電磁界解析手法として、ボクセルモデル用静的モーメント法を開発した。解析解との比較などを通じ妥当性検証にも成功した。提案法はボクセルモデル用間接境界要素法との併用が可能で、両手法共に高速多重極法と高速フーリエ変換とを用いて、高速大容量計算に向く計算法として整備した。人頭部の磁気共鳴画像と拡散テンソル画像から形状情報と導電率テンソル情報を抽出してボクセルモデルを作成した。このモデルを用い、外部磁界印加時の誘導電流・電界を計算し、妥当な結果を得た。約2億未知数の異方性頭部モデルを、PCを用いて約83分で求解でき、本手法の高速大容量性能が示された。人体詳細モデルや実規模電気機器モデルなどの、導電率・誘電率に不均質な異方性を有する大規模ボクセルモデル内の低周波電磁界の数値解析手法について、高精度・高速・大容量化を図り、計算法の高度化を目指してきた。平成25年度の主要な成果は以下の通り。1 DTI画像より不均質な異方性導電率を有する(比較的簡易な)頭部モデルを作成し、電界計算に成功した。2ボクセルモデル解析に固有の階段形状近似誤差が発生しない例題を用い、間接境界要素法の妥当性検証を実施した。検証手順は以下の通り。(1)解析式が存在する直方体導体内の誘導電界につき、異方性対応の間接境界要素法による計算電界と、異方性対応の直接境界要素法による計算電界と、解析式による真値の3者が一致することを確認した。(2)続けて、解析式が存在しない複数の直方体をつないだ形状の導体内の誘導電界について、直接境界要素法による計算電界と、間接境界要素法による計算電界とが一致することを確認した。この手順により、解析解が存在せず、階段形状近似誤差も発生しないという条件での、間接境界要素法の妥当性検証に成功した。3間接境界要素法の連立一次方程式の反復解法について、正則化手法の改良を行い収束性の安定性向上に成功した。例えば耳朶のような複雑形状部分をボクセルによってモデル化すると、電気的に孤立したボクセルクラスターが作られることがあり、これが反復解法の収束性に悪影響を与えることがあることを確認した。さらに対策手法を考案し、有効性の検証にも成功した。4等方媒質を対象としたボクセルモデル解析についても計算の大規模化を進め、パーソナルコンピュータ上で6千万境界要素・22億ボクセルの実用解析に成功した。なお実用モデルを用いたものではないが1億境界要素の解析にも成功し、大規模計算の実行に関して多くの知見を得た。平成26年度の主要な成果は以下の通り。1ボクセルモデル解析用の高速多重極法の近傍場計算につきFFTを用いた高速化に成功した。等方性組織からなる人体モデルでの表面電荷法の高速化率は最大数10%に留まったが、直方体モデルでの異方性を考慮したモーメント法による計算では、高速化率は通常のFMMによる計算の290%にまで改善された。また全域をFFTで計算する手法と比較して、メモリ使用量は28%となり、使用メモリ容量の削減に成功した。さらに全域をFFTで計算する手法と比較して、使用配列個別のサイズが大幅に小さくなったため、並列化の際の粒度を小さくすることが容易となり、コード並列化の柔軟性が大幅に向上した。2等方媒質を対象としたボクセルモデル解析についても計算の高速化を進め、パーソナルコンピュータ上で6千万境界要素・22億ボクセルの人体全身解剖モデル解析に関し、GPUの使用によって反復解法の収束に必要な演算時間を約20分にまで短縮した。その後、CPUを使用した計算コードの高速化を再度検討し、CPUの使用によって反復解法の収束に必要な演算時間を約60分にまで短縮した。また、人体解剖モデルを例として、解析可能な要素数は現行機材(PC)によってCPU版・GPU版ともに約1億と見積もられ、さらに今後新規に(1カードあたり12GBのメモリを有する)新鋭のGPUを使用できれば、PC1台で約2億になると見積もられた。3 3次元FFT計算による相互作用計算を1次元FFTに置き換える手法についても検討し、計算可能であることを検証したが、速度性能の向上には結びつかなかった。導電率・誘電率に不均質な異方性を有する大規模ボクセルモデル内の低周波電磁界の数値解析手法について、高精度・高速・大容量化を図り、計算法の高度化を目指してきた。平成27年度の主要な成果は以下の通り。1.面要素片側の物理量のみで表現される境界条件式を用いる境界要素(片側面要素)の概念を明確化し、面要素を用いるモーメント法と6面要素を用いるモーメント法とを、どちらも片側面要素に基づいて統一的に表現できることを示した。これにより、これら2種のモーメント法を併用する際の要素定義規則を、4項目にまで簡潔化できた。また、6面要素を用いるモーメント法は境界要素法の一種であるが、体積要素をエミュレートする要素であることが明確になり、概念整理が進み見通しが大変よくなった。

2.異方性導電率を含む人体モデルをDTI画像から作製し、モデル内電界・電流密度を計算する場合、実測画像から推定した導電率はボクセル毎に値が異なる。このように、ほとんどあらゆる位置で隣接ボクセルと不連続な導電率を有するモデルで、電界・電流密度を適切に計算できることを、各ボクセルを細分割したモデルの解析により検証した。組織ボクセル数176,673個・未知数606,277個のモデルを基準として、全ボクセルを3×3×3分割(4,770,171ボクセル・15,166,017未知数)、5×5×5分割(22,084,125ボクセル・69,098,725未知数)、7×7×7分割(60,598,839ボクセル・188,296,645未知数)した細分割モデルの解析を行い、電界・電流分布が巨視的に合致していることを示した。3. 2で述べた約2億未知数の頭部モデル計算時間は1台のPCで約5千秒となった。さらに直方体形状の均質異方性媒体の計算においては、約3億未知数のモデル計算時間は1台のPCで約3千秒となった。本手法の大規模高速性能が実証された。不均質な異方性を有する大規模ボクセルモデル内の低周波電磁界解析手法として、ボクセルモデル用静的モーメント法を開発した。解析解との比較などを通じ妥当性検証にも成功した。提案法はボクセルモデル用間接境界要素法との併用が可能で、両手法共に高速多重極法と高速フーリエ変換とを用いて、高速大容量計算に向く計算法として整備した。人頭部の磁気共鳴画像と拡散テンソル画像から形状情報と導電率テンソル情報を抽出してボクセルモデルを作成した。このモデルを用い、外部磁界印加時の誘導電流・電界を計算し、妥当な結果を得た。約2億未知数の異方性頭部モデルを、PCを用いて約83分で求解でき、本手法の高速大容量性能が示された。1提案の異方性解析用ボクセルモデル用モーメント法の計算速度・使用メモリの削減手法として、以下の整備に成功している。(1)異方性媒質解析用のボクセルモデル用モーメント法と、等方性媒質解析用のボクセルモデル用表面電荷法との併用を可能にできたので、異方性組織の空間領域を限定する事で、後者の高速・省メモリ性能が有効利用可能となっている。(2)高速多重極法の近傍場計算へのFFTの導入に成功したことから、異方性媒質解析用のボクセルモデル用モーメント法の計算速度向上と必要メモリ容量削減とに成功した。(3) (1)(2)の整備においては、磁化や電気分極の基本式を元に、面要素の片側の物理量のみで成立する境界条件式(=片側境界条件式)を導入した。面の表裏で1組の片側境界条件式を用いることで、従来の表面電荷法の定式化も、新規の6面要素を用いるモーメント法の定式化も、両者の併用方法の整備も、一貫したスタイルで実現できた。片側境界条件式という考え方は、理論的にも実用的にもたいへん自然で有用なものであり、学術的にも高い価値を有すると考える。2拡散テンソル画像(DTI)から導電率テンソルを推定する手法については、Rullmannの方法が実用性が高いことは確認できたが、導電率テンソル推定精度そのものは十分に高いとは言い難い。一方、DTI撮像可能な0.3T MRI装置が、研究代表者の所属専攻に新規設置されたことから、DTIデータの取得は容易な状況となっている。以上を総括すると、全体としては概ね順調な進展状況であると思われる。
文字認知障害者のセンター試験等の受験を可能にする文字と音声のマルチモーダル問題

不可視2次元コードを活用して、鉛筆をペン型のデジタルオーディオプレーヤに置き換えた、紙筆テスト感覚の文字と音声のマルチモーダル問題を開発した。4次に渡る評価実験の結果、従来の点字問題と拡大文字問題に加えて、この文字と音声のマルチモーダル問題と先行研究の文書構造表音声問題を導入すれば、文字認知に障害を有するすべての受験者のセンター試験等の受験が可能となることが見出された。この新しい2種類の音声問題の導入は国連の障害者の権利条約が求める合理的配慮の遵守を可能にする。また、導入に伴う試験実施主体の過度の負担を防ぐため特別問題一貫作成システムを開発し、大幅なコスト削減を可能とした。最新の見えない2次元コードを活用して鉛筆をペン型のデジタルオーディオプレーヤに置き換えた、紙筆テスト感覚の新しい2種類の音声問題、すなわち文字と音声のマルチモーダル問題と文書構造表音声問題を開発し、実用化を研究している。1音声問題作成システムの開発ー問題冊子の電子データを問題の文書構造に即して区分し、各区分に2次元コードを割り付け重ねて印刷することにより、文字と音声のマルチモーダル問題冊子の効率的作成が可能となった。また、この文書構造だけを記号で表記した問題冊子に2次元コードを割り付け重ねて印刷することにより点字または通常文字の文書構造表音声問題冊子も効率的作成が可能となった。2次元コード開発元の協力を得て必要ソフトウェアを開発した。2音声出題法の開発ー古文や漢文、数式及び英語の発音や綴りに関する問題の音声出題法を研究した。また、図表の音声出題法を開発した。3平成23年度評価実験ー総合試験問題を出題した実験の結果、従来の点字問題と拡大文字または通常文字問題に加えて、この紙筆テスト感覚の新しい2種類の音声問題を実用化すれば、読字障害の発達障害者、中途失明者及び重度の弱視者はもとより文字認知に障害を有するすべての受験者のセンター試験等の受験が可能となることが見出された。実験計画は、3×3のグレコラテン方格である。被験者群は、点字使用高校生15名、弱視高校生9名、読字障害者(多くは高校卒業者) 9名、健常高校生21名。テストメディアは、点字問題、拡大文字問題、マルチモーダル問題、文書構造表音声問題、通常文字問題の5種類のうちから3種類を出題。4特別問題一貫作成システムの開発ー高解像度の点字グラフィックプリンタを購入し、点字問題と点字の文書構造表音声問題を印刷する計画であったが、発売が遅くなったため購入を次年度に見送らざるを得なくなった。不可視2次元コードを活用して、鉛筆をペン型のデジタルオーディオプレーヤに置き換えた紙筆テスト感覚の新しい2種類の音声問題、すなわち、文字と音声のマルチモーダル問題と文書構造表音声問題を開発した。従来の点字問題と拡大文字問題に加えて、この2種類の音声問題を実用化すれば、読字障害を有する発達障害者はもとより文字認知に障害を有するすべての受験者のセンター試験等の受験が可能となることが先行実験により実証された。また、図表を含む6教科の音声出題方法も開発された。1この2種類の音声問題の作成作業を効率化するため一貫作成システムを開発した。原問題の電子データを構文解析し、文書構造に即して問題文を区分し、各区分に2次元コードを割り付け、冊子が印刷される。同時に、音声データも生成される。また、点字問題の作成作業を効率化するため一貫作成システムを開発した。問題文は点字フォーマッタにより、図はユニバーサルデザインの作図ソフトウェアにより点訳される。2これらのシステムにより特別問題の一貫作成が可能となった。各種の特別問題は個々に作成するよりも一貫作成した方が質の向上と作成作業の効率化、セキュリティの向上と大幅なコスト削減が可能となる。原問題の電子データから点字問題一貫作成システムにより点字問題が、ワープロにより拡大文字問題が、音声問題一貫作成システムとワープロによりマルチモーダル問題が、音声問題一貫作成システムと点字問題一貫作成システムにより点字または通常文字の文書構造表音声問題が作成される。3センター試験問題を出題する第4次の評価実験を実施した。4研究成果の民間移転を進めている。紙の教科書にそのまま音声を付けた音声付教科書を開発し、読字障害児や弱視児及び外国人子女等が健常児と机を並べて勉強できるよう提供を開始した。また、ユニバーサルデザインの作図ソフトウェアの製品化を進めている。不可視2次元コードを活用して新しい2種類の音声問題、すなわち文字と音声のマルチモーダル問題と文書構造表音声問題の実用化を図るため、中間年の本年度は次の研究を行った。1音声問題作成支援システムの開発ー文字と音声のマルチモーダル問題を一貫作成するオーサリングシステムを開発した。問題のデータファイルが解析され、文書構造の区分と2次元コードの割り付け及び合成音声作成用データの出力等の一貫作成が可能となった。

また、文書構造表音声問題も一貫作成可能となった。オーディオプレーヤの内部プログラムを書き換えることにより、1本のデジタルオーディオプレーヤで音声問題を読みながらリスニングテストが受けられるリスニングテストシステムを開発した。点字問題と点字の文書構造表音声問題を印刷するため、点字教材作図ソフトウェアを開発した。作図言語の採用によりCUIで作図コマンドを入力するエディタウィンドウとマウス等を使用してGUIで描画する描画ウィンドウとが相互に連動したユーザインタフェースを備えたユニバーサルデザインを実現した。2平成24年度評価実験ー高校入試問題を出題した評価実験の結果、この2種類の音声問題は国語・英語・数学・社会・理科の5教科の出題が可能となることが見出された。得点は点字問題、拡大文字問題及び通常文字問題とほぼ同水準であった。また、英語リスニングテストも可能であることも見出された。3特別問題所内一貫作成システムの開発ー音声問題一貫作成オーサリングシステムと点字教材作図システムとを統合して、特別問題の一貫作成が可能となった。各種特別問題は一貫作成した方が問題の質の向上と作成作業の効率化及びセキュリティの向上と大幅なコスト削減が可能となる。2次元コード方式の音声問題の作成法と出題がシステム開発され、評価実験の結果、有用な知見を得た。残念ながら点字グラフィックプリンタの新発売が遅れたため、特別問題一貫作成システムの研究は遅滞した。25年度が最終年度であるため、記入しない。2次元コード音声問題一貫作成オーサリングシステムが開発され、5教科の音声出題が可能となった。特に文字認知障害者用のリスニングテストシステムの開発に成功した。文字認知障害者のセンター試験等の受験を可能にするため、2次元コード方式の2種類の新しい音声問題をさらに研究する。問題作成を効率化するため音声問題一貫作成オーサリングシステムを開発する。初年度の総合試験問題、次年度の高校入試問題に引き続きセンター試験問題を出題する第3次の評価実験により、2次元コード方式の音声問題の総合的評価を行う計画である。また、障害受験者に対する公平な試験を実施するため、試験時間延長率の推定と出題問題量の適正化の研究を進める計画である。
siRNAによる歯周組織再生の試み

研究の目的:未分化間葉系幹細胞(MSCs)は組織再生で移植組織や器官として分化することが可能であり,骨芽細胞から骨へ分化させることもできる.S100A4遺伝子はS100カルシウム結合蛋白に属しており,MSCsでの骨芽細胞遺伝子発現を抑制し骨芽細胞分化を調整している.また,RNAiは遺伝子特異的な翻訳後のサイレンシングであり,遺伝子サイレンシングとして強力なツールとなり得る.そこで我々はヒトMSCsにおいて,S100A4遺伝子をRNAiにて発現阻害し骨芽細胞へ分化させることを試みた.さらに,MSCsでのS100A4遺伝子の発現阻害による影響を,マイクロアレイを用いて観察した.研究実施計画と成果:ヒトMSCを培養し,S100A4 siRNAを細胞内に導入した.Real time PCRを行い,S100A4遺伝子の発現を定量的に観察した.同様にReal-time PCR microarray analysisでは84の骨形成遺伝子発現を分析した.また,Western blotによりS100A4遺伝子の蛋白レベルの発現を観察した.S100A4siRNA導入3,7,14,21日後,すべての濃度でコントロールと比較して,S100A4遺伝子発現が抑制された.Western blotではS100A4siRNA導入7,14,21日後でS100A4遺伝子蛋白発現が抑制されていた.遺伝子導入3日後では37の遺伝子が,コントロールと比較して2倍以上あるいは,0.5倍以下の発現変化がみられた.導入7,14,21日後ではそれぞれ29,4,10の遺伝子が変化した.本研究では,MSCsのS100A4遺伝子発現抑制により,多数の骨関連遺伝子発現が上昇した.今回用いたアプローチと適切な遺伝子デリバリーシステムを開発することによって,1つの有効なティッシュエンジニアリングの手法として応用可能になるものと考えている.最近になって,歯根膜細胞のS100A4遺伝子をsiRNAを用いてサイレンシングすると,骨転写因子であるcbfa1の発現が上昇することが報告された.すなわち,S100A4遺伝子は骨芽細胞において骨分化を抑制する遺伝子の可能性がある.これら背景を踏まえて,成長因子を使わずに未分化間葉系幹細胞の改良,すなわち,そのS100A4遺伝子のサイレンシングで,より効果的に骨芽細胞に分化させ,再生培養骨を形成することを目的とする.ヒトの未分化間葉系幹細胞(MSCs)は高い増殖と様々な系統に分化することができるばかりか,無機質化を阻害する性質がある.一方,S100A4遺伝子はS100カルシウム結合蛋白に属しており,無機質化を阻害する働きがある.したがってS100A4遺伝子の阻害によってMSCsの骨形成分化能を高めることが期待できる.そこで,今回の研究では,化学修飾されサイレンシング作用がより長く持続するsiRNA (siSTABLE(R))をMSCsに導入することにより骨形成関連遺伝子とアルカリフォスファターゼ(ALPL),タイプ1コラーゲン(COL1),オステオカルシン(BGLAP)の蛋白レベルの挙動を調べた.siRNAによってS100A4遺伝子を阻害すると多数の骨形成関連遺伝子発現は上昇したが,ALPL, COL1, BGLAP発現は上昇しなかった.本研究結果から,siSTABLE(R)を用いS100A4遺伝子をサイレンシングすることにより,S100A4遺伝子が21日間,蛋白発現が7, 14, 21日間にわたって抑制された.今回の実験では多数の骨関連遺伝子発現が上昇し,ヒトのMSCsの分化能力を高める1つの方法を我々は提案した.今回用いたアプローチと適切な遺伝子デリバリーシステムを開発することによって,1つの有効なティッシュエンジニアリングの手法として応用可能になるものと考えている.研究の目的:未分化間葉系幹細胞(MSCs)は組織再生で移植組織や器官として分化することが可能であり,骨芽細胞から骨へ分化させることもできる.S100A4遺伝子はS100カルシウム結合蛋白に属しており,MSCsでの骨芽細胞遺伝子発現を抑制し骨芽細胞分化を調整している.また,RNAiは遺伝子特異的な翻訳後のサイレンシングであり,遺伝子サイレンシングとして強力なツールとなり得る.そこで我々はヒトMSCsにおいて,S100A4遺伝子をRNAiにて発現阻害し骨芽細胞へ分化させることを試みた.さらに,MSCsでのS100A4遺伝子の発現阻害による影響を,マイクロアレイを用いて観察した.研究実施計画と成果:ヒトMSCを培養し,S100A4 siRNAを細胞内に導入した.Real time PCRを行い,S100A4遺伝子の発現を定量的に観察した.同様にReal-time PCR microarray analysisでは84の骨形成遺伝子発現を分析した.また,Western blotによりS100A4遺伝子の蛋白レベルの発現を観察した.S100A4siRNA導入3,7,14,21日後,すべての濃度でコントロールと比較して,S100A4遺伝子発現が抑制された.Western blotではS100A4siRNA導入7,14,21日後でS100A4遺伝子蛋白発現が抑制されていた.遺伝子導入3日後では37の遺伝子が,コントロールと比較して2倍以上あるいは,0.5倍以下の発現変化がみられた.導入7,14,21日後ではそれぞれ29,4,10の遺伝子が変化した.本研究では,MSCsのS100A4遺伝子発現抑制により,多数の骨関連遺伝子発現が上昇した.今回用いたアプローチと適切な遺伝子デリバリーシステムを開発することによって,1つの有効なティッシュエンジニアリングの手法として応用可能になるものと考えている.
細胞外シグナルによる遺伝子発現の制御機構

遺伝子発現制御におけるRasの作用機構の解析を行い以下の結果を得た。(1)RasによるMAPキナーゼの活性化機構私共はツメガエル卵の細胞質画分からRas依存性にMAPキナーゼ・キナーゼを活性化するのに必要な蛋白質因子(REKS)を部分精製している。昨年度は、REKSがRas依存性にMAPキナーゼ・キナーゼをリン酸化して活性化するプロテインキナーゼであることを明らかにした。また、RasがREKSと複合体を形成することから、REKSはRasの直接のターゲットであると考えている。最近、Rasがc-RAS-1と結合することが報告されているが、REKSがc-Raf-1でないことを確認している。本年度は、ツメガエル卵の細胞質画分からREKSを高度に精製した。また、REKSが牛大脳細胞質画分にも存在することを明らかにし、これを均一蛋白質にまで精製した。ツメガエル卵と牛大脳から精製されたREKSは、ともに分子量約10万のプロテインキナーゼであり、自己リン酸化能を示した。一方、Cキナーゼやホスホリパーゼの制御因子として知られる14-3-3がRasと共同してREKSを活性化することも明らかにした。(2)新しいRasの標的蛋白質の同定Rasの標的蛋白質はGTP結合型のRasに特異的に結合してGDP結合型のRasには結合しないと考えられる。そこで、GTP結合型のRasをマトリックスに固定化してアフィニティカラムクロマトグラフィーを行い、Rasの標的蛋白質の同定を試みた。その結果、牛大脳からGTP-Rasに結合する分子量約19万の蛋白質(p190)を分離精製できた。この蛋白質はGDP結合型のRasには結合せず、標的蛋白質結合領域に変異を導入したGTP結合型のRasにも結合しなかった。したがって、この蛋白質はRasの標的蛋白質のひとつであると考えられる。以上本年度の研究計画はほぼ達成することができたと考えられている。
FGF受容体の多様性と脳内での生理的役割の解明

これまでの結果をまとめると,FGFR-1は脳内の広い領域の神経細胞に発現していた。また,FGFR-2とFGFR-3はそれぞれ,脳内ではオリゴデンドロサイト,アストロサイトに特異的に発現していた。一方,FGFR-4は視床上部の内側手網核のコリン作動性ニューロンでのみ発現していた。これらの実験結果は,脳内で発現している4種類のFGF受容体はいずれも,それぞれ独自の生理的役割を果たしていることを示唆している。我々は,FGF受容体の脳内発現を調べるとともに,現在知られている9種類のFGFの内,aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5,FGF-6,FGF-9の9種類のFGF cDNAを単離し,それらの脳内発現をin situ hybridization法により調べた。FGF-4,FGF-6は脳内では発現は確認されなかったが,aFGF,bFGF,FGF-9は脳内で強い発現が,FGF-5は非常に弱いながら発現が観察された。aFGFの発現は中脳,脳幹の特定の神経核の神経細胞に局在していた。また,bFGFの発現は海馬のCA領域,海馬痕跡,灰白層などの神経細胞に強く発現するとともに,グリア細胞にも弱い発現が観察された。一方,FGF-9は脳内の広い領域の神経細胞に発現が見られた。これらのことより,FGFとFGF受容体は構造的に類似した多数のメンバーからなるが,いずれも脳内ではその発現領域,発現細胞は異なることが明らかになった。神経細胞,グリア細胞はなんらかのFGFとFGF受容体を発現しており,FGFの作用はニューロンとニューロンの相互作用,ニューロンとグリアの相互作用,グリアとグリアの相互作用の3種類が考えられ,特定のニューロン,グリア細胞における分化,生存維持にはそれぞれ,特定のFGFとFGF受容体の組み合わせによってその作用を発揮していると考えられる。各FGF受容体タンパク質特異的抗体の作成1.各FGF受容体に特異的なペプチドを化学合成した。2.合成ペプチドを高分子のキャリヤ-に結合させ,ウザキに免疫し,特異的抗血清を得た。3.得られた抗体の特異性をWestern analysisにより調べ,各抗体はそれぞれ特異的な受容体蛋白質を認識していることを明らかにした。各FGF受容体遺伝子発現の脳細胞特異性1.グリア細胞で発現していることが明らかになっているFGFR-2,FGFR-3について,グリア細胞特異的マーカー染色体とIn situ hybridization法の組み合わせにより,発現しているグリア細胞の種類を同定し,FGFR-2はオリゴデンドロサイト,FGFR-3はアストロサイトに特異的に発現していることが明らかになった。2.神経細胞に特異的に発現しているFGFR-4について,コリン作動性神経細胞マーカーである,コリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現との比較により,FGFR-4遺伝子は内側手鋼核の発現しているコリン作動性神経細胞に特異的発現していることを明らかにした。これまでの結果をまとめると,PGFR-1は脳内の広い領域の神経細胞に発現していた。一方,FGFR-4は視床上部の内側手網核のコリン作動性ニユーロンでのみ発現していた。

我々は,FGF受容体の脳内発現を調べるとともに,現在知られている9種類のFGFの内,aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5,FGF-6,FGF-9の6種類のFGF cDNAを単離し,それらの脳内発現をin situhybridization法により調べた。FGF-4,FGF-6は脳内では発現は確認されなったが,aFGF,bFGF,FGF-9は脳内で強い発現が,FGF-5は非常に弱いながら発現が観察された。aFGFの発現は中脳,脳幹の特定の神経核の神経細胞に局在していた。また,bFGFの発現は海馬のCA領域,海馬痕跡,灰白層などの神経細胞に強く発現するとともに,グリア細胞にも弱い発現が観察された。一方,FGF-9は脳内の広い領域の神経細胞に発現が見られた。これらのことより,FGFとFGF受容体は構造的に類似した多数のメンバーからなるが,いずれも脳内ではその発現領域,発現細胞は異なることが明らかになった。神経細胞,グリア細胞はなんらかのFGFとFGF受容体を発現しており,FGFの作用はニューロンとニューロンの相互作用,ニューロンとグリアの相互作用,グリアとグリアの相互作用の3種類が考えられ,特定のニューロン,グリア細胞における分化,生存維持にはそれぞれ,特定のFGFのFGF受容体の組み合わせによってその作用を発揮していると考えられる。
「問題飲酒」の民族誌－オーストラリアの飲酒の法的規制とアボリジニの動態から－

本研究の目的は、オーストラリアの飲酒の法的規制とアボリジニの動態を通じて、北部準州におけるアボリジニたちの「問題飲酒」の実相を解明することである。平成27年度は、現地調査を通して、「白人」に対してこれまで一枚岩的に認識されることの多かった「アボリジニ」の中に立ち現れるさまざまな人間関係を、酒をめぐるやりとりやトラブルに着目しながら検討した。具体的には、2015年78月、2016年3月に北部準州第二の都市アリススプリングスと郊外のアボリジニコミュニティ・イマンパにおいて、酒がらみのトラブルをよく起こす「トラブルメーカー」と呼ばれる人々と行動をともにし、彼らが酒を手に入れる過程で周囲の人々といかなる人間関係を結んでいくかを観察した。これらの現地調査を通じて、厳しい飲酒規制のもとでも、周囲の人々と連携しながら規制をすりぬけ酒を入手する人々や、酒の分配をめぐって激しく衝突する人々の関係性、トラブルメーカーを強く非難しながらも家族としてのつながりを保とうとする人々の動きを把握することができた。グローバル化にともない大きな変化を強いられてきた先住民社会では様々な問題が表面化しているが、これらの知見をもとにして、問題に対峙する先住民たちの生活実践を明らかにする研究を推進することが期待できる。平成27年度は、これまでの研究成果を2015年5月、日本文化人類学会で口頭発表した。また、分担執筆者として『単配列思考の人類学』(白川千尋、石森大知、久保忠行編、風響社)に寄稿した。27年度が最終年度であるため、記入しない。そこで2014年度は現地調査に入り、酒をめぐる人々のやりとりを観察することで、これまで一枚岩的に認識されることの多かった「アボリジニ」の中にいかなる社会関係が形成されているかを検討した。現地調査は2014年6月9月、2015年1月4月に北部準州で実施した。調査中は主に地方都市アリススプリングスと郊外にあるアボリジニコミュニティ・イマンパに滞在した。研究実施計画では、地方都市テナントクリークの病院や断酒施設での調査を予定していたが、現地人の仲介によりイマンパコミュニティでの調査許可を得られたため、急遽、調査地を変更した。調査地では、主に酒飲みのアボリジニ女性数名に同行し、彼女たちがいかに飲酒規制をかいくぐり酒を手に入れるか、どのように飲酒するか、いかなるトラブルを起こすかなどを観察した。また、彼女たちのライフヒストリーや飲酒規制への意見について聞き取りをおこなった。さらに、彼女たちに対する家族、医療従事者、NGO団体職員の関わりや反応を観察した。これらの成果は、同行者の許可を得た上で、観察記録、画像、映像として集積した。この現地調査により、アボリジニ社会内部には、酒に酩酊してトラブルを起こす者とそうしたトラブルに悩まされる者が存在し、両者が緊張関係にあることが明らかになった。これらの成果により、「アボリジニ」が「問題飲酒」への対応について、必ずしも一枚岩でないことが示された。また、酒がらみのトラブルを前にして立ち現れるアボリジニたちの緊張関係を解明することは、これまで自明視されてきた「アボリジニ」と「白人」という二項対立だけでは捉えきれない、「アボリジニ」内部の複雑な社会関係を読み解く糸口となる可能性がある点で意義深い。申請者は、2014年6月からオーストラリア北部準州において現地調査を開始した。調査を開始して間もなく、アリススプリングス市内で偶然知り合ったアボリジニ小集団との関係からその出身のイマンパコミュニティを訪問することができ、当該コミュニティでの調査許可を得ることができた。

その後、申請者はアボリジニたちと生活をともにしながら、イマンパコミュニティとアリススプリングスを往復し、「飲酒」をめぐる様々なやりとりを表だっては語ることのできない側面も含めて詳細に観察した。これらの経験とそれにもとづく資料は本研究の根幹に関わる部分であり、アボリジニたちの社会関係や文化的概念を読み解くための非常に貴重な資料である。困難が予想されていた調査許可を得たという手続き面での成果もあり、資料収集の進捗という側面からも2014年度は期待以上の研究の進展があったと評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度は、2014年度と同様にオーストラリア北部準州のイマンパコミュニティおよび地方都市アリススプリングスにおいて現地調査を実施する。ただし、次回の調査では、主な対象者を酒飲みのアボリジニたちではなく、酒がらみのトラブルに巻き込まれる側、酒飲みたちを批判する側にいる人々とする。現地調査後は、酒飲みのアボリジニと彼らを批判する側のアボリジニ、それぞれの民族誌データを照らし合わせ、両側から「問題飲酒とは何か」を検討する。これにより「アボリジニ」内部に複数の立場や意見がうまれる要因を明らかにし、一枚岩的に捉えられがちな「先住民」の中に働いているはずの微細なポリティクスの解明を目指す。
分子遺伝子学的診断に基づいた口腔癌に対する個別化免疫化学療法の開発

癌治療において免疫療法が注目されているが、口腔癌における有用な癌抗原は未だ不明である。また、化学療法との併用が有効であるという報告もあるが、化学的根拠に乏しいのが現状である。我々は口腔癌における有用な癌抗原の特定を行うとともに、近年、注目されている樹状細胞による免疫療法に着目し、各種抗癌剤の免疫細胞への影響についての知見を得た。さらに口腔癌患者血清中における免疫関連サイトカインを検索することにより予後に関連するバイオマーカーを同定した。これらのデータは、口腔癌に対する個別化免疫化学療法の開発につながるものと考えられる。本研究では、従来の治療法では制御困難な口腔癌症例に対する有用な免疫療法を探索した。まず、口腔癌治療に適した免疫アジュバント製剤(非特異的免疫療法)の同定を試みた。レンサ球菌製剤OK-432の活性成分(リポタイコ酸関連分子OK-PSA)はToll-like receptor (TLR) 4/MD-2複合体を介して抗腫瘍免疫活性を発現することが知られている。そこで、ヒト口腔癌細胞に対するOK-PSAの効果につき検索した。最初に、ヒト口腔癌細胞12株を用いてTLR4およびMD-2遺伝子発現をリアルタイム定量化PCR法にて検索した。次に、各癌細胞をOK-PSAで処理し、生細胞数をMTT法、アポトーシスをTUNEL法、Caspases活性をCaspase assaykitにて検索した。その結果、TLR4発現細胞は全株、MD-2発現細胞は5株であった。これらの細胞株においてOK-PSAは増殖抑制効果を示し、さらにCaspase-1および-8を活性化しアポトーシスを誘導した。よって、OK-432はヒト口腔癌細胞に対する直接的な抗腫瘍活性が期待できるため、口腔癌治療に有用な免疫アジュバント製剤であることが示唆された。つづいて、口腔癌免疫治療に有用な癌抗原の同定を試みたところ、ヒト口腔癌細胞株を用いたマイクロアレイ解析にて既知の癌抗原としてWilms tumor 1、Aurora kinase A、Mucin1、Survivinの発現が明らかとなった。また同時に、ヒト口腔癌細胞および口腔癌組織におけるHuman leukocyte antigenの発現を確認した。以上の結果は、口腔癌の治療として特異的および非特異的免疫療法が適用できる可能性を示した。われわれは、特異的癌免疫療法を従来の治療法に加えることにより口腔癌治療成績の飛躍的向上を目指している。本研究では、口腔扁平上皮癌における癌抗原Wilms腫瘍遺伝子WT1の発現と放射線化学療法がその発現に及ぼす影響を検討した。当科にて初回治療を行った30症例の口腔扁平上皮癌組織を対象にWT1 mRNAの発現量を定量化リアルタイムRT-PCR法にて検討した。30例のうち18例(60%)においてWT1 mRNAの発現を認めた。また、4種類の口腔扁平上皮癌細胞株(B88,HSC2,HSC3,HSC4)について同様の手法によりWT1 mRNAの発現を調べたところ2株においてWT1 mRNAの発現を認めた。つづいて、各種抗癌剤処理について検討を行ったところ塩酸ゲムシタビン(GEM)処理群においては4株(100%)すべてにおいて、ドセタキセル処理群においては3株(75%)においてWT1 mRNAの発現上昇を認めた。また、初回治療において根治的放射線照射を行った口腔扁平上皮癌2症例の照射前後における腫瘍組織中のWT1 mRNAの発現を検討した結果、2症例ともにWT1 mRNAの発現上昇を認めた。これらの結果をもとにB88細胞においてさらなる検討をおこなったところ、免疫蛍光抗体法においてGEM処理によりWT1蛋白質の核内から細胞質への移行が認められた。WT1蛋白質は転写因子として核内に局在するが、GEM処理にて細胞質へ移行しプロテアソームによる抗原ペプチド産生が促進される可能性が示唆された。以上の結果より、口腔扁平上皮癌に対するWT1を標的とした特異的癌免疫療法と従来の放射線化学療法との併用の有用性が示唆された。本研究では口腔癌における有用な癌抗原を探索した。ヒト口腔癌細胞株を用いたマイクロアレイ解析にて既知の癌抗原としてWilms tumor 1 (WT1)、Aurora kinase A、Mucin 1 (MUC1)、Survivinの発現が明らかとなった。同時に、ヒト口腔癌細胞および口腔癌組織におけるHuman leukocyte antigenの発現を確認した。WT1およびMUC1は固形癌における有用な癌抗原としてすでに報告されているため、口腔扁平上皮癌組織50検体、ヒト口腔扁平上皮癌細胞5株を対象に定量化リアルタイムRT-PCR法でWT1、MUC1 mRNAの発現を検討し、さらに口腔扁平上皮癌組織14検体、ヒト口腔扁平上皮癌細胞5株を用いてWestern blotting法、免疫組織化学染色法によりMUC1の蛋白質発現を確認した。

口腔扁平上皮癌50検体中1例(2%)にのみWT1 mRNAの発現が認められたが、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株全てにおいてWT1 mRNAの発現は検出されなかった。一方、MUC1 mRNAは口腔扁平上皮癌組織および細胞株全てにおいてその発現が確認されたが、Western blotting法においてはMUC1蛋白質の発現は口腔扁平上皮癌組織14検体中7例(50%)に、免疫組織化学染色法では14検体中11例(78.5%)に認められ、口腔癌における有用な癌抗原としてはMUC1が示唆された。以前より、当教室では口腔癌組織のtotal RNAおよび蛋白質を抽出し、保存しているため研究目的を達成できた。本研究により、口腔扁平上皮癌における癌抗原WT1の発現と放射線化学療法がその発現を増強することが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。特異的癌免疫療法の効果を予測できるバイオマーカーの同定が極めて重要である。血清および末梢血単核球を検体として宿主の免疫状態を把握できるバイオマーカーの網羅的探索を行う。また、WT1特異的な細胞障害性T細胞の誘導を評価できる方法を確立する必要がある。これまでに報告されているテトラマーアッセイおよびエリスポットアッセイ法等により検討を行い、最適な評価法を決定する。