hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小加速度計とＳＤメモリー携帯記録装置による歯科切削時の振動被爆・筋電図解析

切削時の振動は,被切削物によって振動暴露の周波数が異なり,それぞれに特徴があることを解明した.手指の受ける振動強度について,歯科技工切削時の振動加速度は,筆記時の20倍程度であることが分かった.周波数分析の結果,特に低周波成分が身体に伝搬することが判明した.さらに,切削器具の回転数とは異なる200-400Hzに振動伝搬性があることが分かり,身体への為害性防止には低周波数帯域に加えこの周波数帯域に対する配慮も必要であることが分かった.周波数成分分析によって,昨年度収集した2軸加速度計による記録を分析し,被切削物によって振動暴露の周波数に特徴があることを解明した.平成25年8月にタイ・バンコクで開催された第二回国際歯科研究学会アジア太平洋部会においてここまでの研究成果を発表した.周波数特性を改善し1kHzまでの計測を可能とした3軸加速度センサを用いて,技工用エンジンにて,石膏,プラスチックを選択し,切削作業時の加速度を27名の被験者について記録した.同時にエンジン空転時の振動も記録した.一方,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを用いたSDメモリー対応の携帯型記録装置に,筋電図同時測定機能を加えた.既存の2軸加速度センサー部を3軸加速度センサとし,周波数特性を改善し1kHz程度までの計測を可能とした.一方マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを利用した,SDメモリー対応の携帯型記録装置を完成した.さらに,既存の計算機に取りこむプログラムを作成し,データを計算機に取り込み可能にした.2軸加速度センサーを用いて,切削対象として,石膏,プラスチックを選択し,切削作業時の加速度を記録し,振動暴露の面から生理学的影響のを検討し,日常的な動作に比較して20倍程度の影響を受けていることを明らかにした.周波数特性を改善し1kHzまでの計測を可能とした3軸加速度センサを用いて,技工用エンジンにて,石膏,プラスチックを選択し,切削作業時の加速度を記録した.同時にエンジン空転時の振動も記録した.また,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを用いたSDメモリー対応の携帯型記録装置に,筋電図同時測定機能を加えた.上記,記録の周波数成分分析によって,被切削物によって振動暴露の周波数が異なり,それぞれに特徴があることを解明し,平成26年6月に南アフリカ・ケープタウンで開催された第92回国際歯科研究学会においてここまでの研究成果を発表した.周波数特性を改善し1kHzまでの計測を可能とした3軸加速度センサを用いて,技工用エンジンにて,石膏,プラスチックを選択し,切削作業時の加速度を記録した.同時にエンジン空転時の振動も記録した.また,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを用いたSDメモリー対応の携帯型記録装置に,筋電図同時測定機能を加えた.上記,記録の周波数成分分析によって,被切削物によって振動暴露の周波数が異なり,それぞれに特徴があることを解明した.周波数成分中、特に低周波線分が身体に伝搬することが判明し,その周波数帯域の振動が身体に悪影響を与える可能性を発見した.さらに,ここまでの振動解析の研究成果に加えて,加速度計による生体計測の端緒として,咀嚼運動の加速度計による様相解析を試み,その結果を顎口腔機能学会の発行する書籍に掲載した.切削時の振動は,被切削物によって振動暴露の周波数が異なり,それぞれに特徴があることを解明した.手指の受ける振動強度について,歯科技工切削時の振動加速度は,筆記時の20倍程度であることが分かった.周波数分析の結果,特に低周波成分が身体に伝搬することが判明した.さらに,切削器具の回転数とは異なる200-400Hzに振動伝搬性があることが分かり,身体への為害性防止には低周波数帯域に加えこの周波数帯域に対する配慮も必要であることが分かった.3軸加速度計はアナログ出力のものであり,今までの2軸デジタル出力のセンサと比較して,ノイズの問題と,携帯性に問題があったが,ノイズを回避して,多くの被験者で計測しデータを蓄積できた.記録側では,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを利用したSDメモリー対応の携帯型記録装置に筋電図計測機能を追加できた.上記3軸加速度センサにより取得したデータを周波数分析し,その結果を国際学会で発表することが出来た.歯科補綴学技工用エンジンに関して,3軸加速度計の振動特性を抽出し,現在までに完成している非携帯型の計測系を用いて,スペクトルアナライザーにより,歯科技工用ハンドピース,歯科治療用タービン,超音波スケーラーそれぞれの動作時の振動の周波数ピーク分布を精査し,周波数領域における特徴を抽出する.ここまでの結果を踏まえ,筋電図と加速度同時測定で勤労時の長時間記録を行う.歯科技工士,歯科医師,歯科衛生士それぞれの労働条件で半日から全日の測定を行い振動暴露状態と筋活動量を解析する.この結果を解析し,手腕振動症候群や感覚異常などの原因と考えられる作業あるいは作業方法を検索し,対策を考案する.その結果を平成28年3月アメリカ合衆国ロサンゼルスにおいて開催される国際歯科研究学会アメリカ部会で発表する.3軸加速度計はアナログ出力のものであり,ノイズの問題と,携帯性に問題があるが,多くの被験者で計測しデータを蓄積できた.一方これとは別に記録側では,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを利用したSDメモリー対応の携帯型記録装置に筋電図計測機能を追加できた.さらに,2軸加速度センサーによるデータ収集結果をまとめ,国際学会で発表することが出来た.3軸のスペクトル解析の面では若干予定より遅れているが,2軸の面では計画通りの進展である.第一の目標である.既存の2軸加速度

センサー部を3軸加速度センサとし,周波数特性を改善し1kHz程度までの計測可能とすることが出来たことが大な進展である.ただし3軸加速度計はアナログ出力のものであり,ノイズの問題と,携帯性に問題が残った.一方これとは別に記録側では,マイクロコンピュータとADコンバータを内蔵したICチップを利用したSDメモリー対応の携帯型記録装置を完成した.さらに,記録速度と記憶容量を有効に生かすため,非アスキーの形式でセクターごとに保存された機械語形式のデータを,既存の計算機に取りこむプログラムを作成し,データを計算機に取り込み可能にすることが出来た.一方,データ収集,解析の面では2軸加速度センサーによるデータ収集を行い,切削対象として,石膏,プラスチックを選択し,切削作業時の加速度を記録し,振動暴露の面から生理学的影響のを検討し,日常的な動作に比較して20倍程度の強い衝撃の影響を受けていることを明らかにし,雑誌に発表することが出来た.3軸のスペクトル解析の面では若干予定より遅れているが,2軸の面で計画より早く発表に至った.技工用エンジンに関して,3軸加速度計の振動特性を抽出し,その結果を平成26年6月南アフリカケープタウンで開催される国際歯科研究学会で発表する.現在までに完成している非携帯型の計測系を用いて,スペクトルアナライザーにより,歯科技工用ハンドピース,歯科治療用タービン,超音波スケーラーそれぞれの動作時の振動の周波数ピーク分布を精査し,周波数領域における特徴を抽出する.筋電図と加速度同時測定のための測定筋(貼付部位と貼付筋数)と加速度ベクトル方向(加速度測定方向)を決定し,4チャネルの測定を計画する.4チャネルで不足の場合は記録装置を増加して2台とし8チャネルまで対応する予定である.つづいて,設定項目に従って筋電図同時記録を行い加速度計のみの測定結果と比較し,電極貼付部位,加速度計測方向の適性度を検討し,必要な場合は変更を加える.このときの測定には大学院生に補助してもらう.各項目の測定条件が確立した時点で長時間記録に移る.歯科技工士,歯科医師,歯科衛生士それぞれの労働条件で半日から全日の測定を行い振動暴露状態と筋活動量を解析する.この結果を解析し,手腕振動症候群や感覚異常などの原因と考えられる作業あるいは作業方法を検索し,対策を考案する.現在までに完成している非携帯型の計測系を用いて,スペクトルアナライザーにより,歯科技工用ハンドピース,歯科治療用タービン,超音波スケーラーそれぞれの動作時の振動の周波数ピーク分布を精査し,周波数領域における特徴を抽出する.技工用エンジンに関して,携帯型加速度計測システムによる短時間の計測を行う.これにより,当該項目の振動特性を抽出する.これとは別に筋電図電極及びアンプを作成し携帯型記録装置で同時使用可能にする.平成25年8月タイ・バンコクで開催される国際歯科研究学会アジア太平洋部会で発表する.この段階で筋電図と加速度同時測定のための測定筋(貼付部位と貼付筋数)と加速度ベクトル方向(加速度測定方向)を決定し,4チャンネルの測定を計画する.
ドラム型遠心力載荷装置を用いた河川堤防の安定に関する研究

本研究は、長大な上構造物のモデル化に適するドラム型遠心力載荷装置を我国で初めて試作し、その実験手法を確立するとともに、河川堤防の破壊現象を模型実験によって再現し、堤防の破壊メカニズムを明らかにせんとして行われたものである。本研究の成果は、次の4点に要約される。1.我国で初めてドラム型遠心力載荷装置を試作し、昭和62年2月末現在まで1071時間の安全運転の実積を作り、土質工学分野における新しい実験手法として確立させた。本装置の諸元は、ドラム直径が0.8m,幅0.3m,深さ0.1mで、最大遠心力加速度は150gである。プロトタイプに換算すると、長さ377m,幅45m,深さ15mの地盤のモデル化が可能である。2.ドラム内部に正規圧密粘土地盤、締め固め粘性土地盤の作成方法を確立し、土壌造物と相対速度をもつ水流の発生方法を開発した。3.河川堤防の洪水時の破壊現象を再現させることに成功した。観察された破壊は次の通りである。洪水流の水位上昇に伴い、堤外法面に洗掘が生じ、その箇所から、ハイドラウリックフラクチャーにより堤内にパイプ流が発生し、堤内法面から漏水が開始する。堤内法面からの土粒子の流亡に伴いパイプは、漸次その径を拡大していく。堤体を構成する土の強度が大きいと、パイプの径は拡大しても、堤防全体は安定しているが漏水量は急増する。土の強度が弱いと、パイプの径がある大きさで天端が安定を失い破堤へとつながる。土が粘着力を有しない砂質土である場合、パイプはセルフヒーリングにより閉塞されて拡大せず、堤内法面からの土の流亡が拡大していく形式となる。洗掘の開始点としては、河川工作物と堤防の接合点,堤防の土性の変化点となる。
細胞内情報伝達に関与する微小細胞膜領域の形成機構の解明

現在、種々の細胞内情報伝達関連分子が、細胞膜や細胞内小器官膜上の特定微小領域に局在化して情報伝達の場を形成することが、細胞内情報伝達系の機能遂行に重要であることが明らかになっている。このうち、細胞増殖等の重要な細胞機能に関与しているGPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系では、ラフトと呼ばれる徴小細胞膜領域に一群の関連情報伝達分子が局在化することが明らかになっている。このことから、ラフトの形成機構を明らかにすることが、GPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系の分子メカニズムの解明につながると考えられている。最近、このラフト形成に普遍的膜融合装置であるSNARE系が関与していることが明らかになりつつある。しかし、ラフト形成におけるSNARE系の作用機構と活性制御機構については不明な点が多い。そこで、本研究では、ラフト形成に関与している可能性が高いSNARE系構成因子であるシンタキシン-3に結合する新たな蛋白分子の同定を試み、p270とp80の新たなシンタキシン結合蛋白質を同定することに成功した。このうち、p270は、細胞膜直下の主要細胞骨格構成因子であるα-Fodrinであった。α-Fodrinは、シンタキシン結合蛋白質であるMunc18やSNAP-25と競合的にシンタキシンに結合してSNARE複合体形成を制御している可能性が示唆された。一方、p80は、546個のアミノ酸からなる分子量61,890の新規蛋白分子であった。そこで、私共は、この新規シンタキシン結合蛋白質をTaxilinと命名した。Taxilinは、C末端側に長いコイルド-コイル領域を有しており、ほとんどの組織に発現していた。Taxilinは、シンタキシン-3以外にシンタキシン-1とシンタキシン-4にも結合した。本研究から、α-FodrinやTaxilinが、シンタキシン-3との結合を介してラフト形成に関与している可能性が出てきた。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成することができた。現在、細胞膜受容体を介する細胞内情報伝達系において、細胞膜受容体やその関連情報伝達因子の特定微小細胞膜領域への局在化が、それらの分子を介する情報伝達に重要であることが明らかになりつつある。特に、細胞増殖等に関与しているGPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系では、その細胞内情報伝達に関与する蛋白分子が微小細胞膜領域に局在化してラフトを形成するが、このラフト形成がGPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系の機能発現に重要であることが明らかになっている。最近、このラフト形成に、普遍的膜融合装置であるSNARE系等によって制御されている細胞内小胞輸送が関与していることが明らかになりつつある。しかし、ラフト形成における細胞内小胞輸送の制御機構の分子メカニズムについては不明な点が多い。そこで、本研究では、ラフト形成に関与している可能性が高いSNARE系構成因子であるシンタキシン-3に結合する新たな蛋白分子の同定を試み、p80とp270の二つの新たなシンタキシン-3結合蛋白質を同定することに成功した。このうち、p270は、細胞膜直下の主要細胞骨格構成因子であるα-フォドリンであった。

α-フォドリンは、シンタキシン結合蛋白質であるMunc18やSNAP-25と競合的にシンタキシンに結合し、SNARE複合体形成を制御している可能性が示唆された。さらに、シンタキシンは、細胞膜直下でF-アクチンとメッシュワークを形成しているα-フォドリンとのみ結合する可能性が出てきた。α-フォドリンは、細胞膜直下でF-アクチンと結合してメッシュワークを形成しており、細胞の形態維持に関与しているが、本研究から、α-フォドリンが、SNARE系を介して細胞内小胞輸送を制御し、微小細胞膜膜領域であるラフトの形成にも関与している可能性が出てきた。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成することができた。現在、種々の細胞内情報伝達系において、情報伝達関連分子が細胞膜や細胞内小器官膜上の特定微小領域に局在化して情報伝達の場を形成することが、おのおのの細胞内情報伝達系機能遂行に重要であることが明らかになっている。このうち、細胞増殖等の重要な細胞機能に関与しているGPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系では、ラフトと呼ばれる微小細胞膜領域に一群の関運情報伝達分子が局在化することが明らかになっている。このことから、GPIアンカー蛋白質を介した細胞内情報伝達系の分子メカニズムを解明する上で、ラフトの形成機構を明らかにすることが重要であると考えられている。最近、このラフト形成に普遍的膜融合装置であるSNARE系の作用機構と活性制御機構については不明な点が多い。そこで、本年度の研究では、昨年度に引き続いてラフト形成に関与している可能性が高いSNARE系構成因子であるシンタキシン-3に結合する新たな蛋白分子の同定を試み、新規シンタキシン-3結合蛋白質としてTaxilinを発見することに成功した。Taxilinは、546個のアミノ酸からなる分子量61,890の蛋白分子で、c末端側に長いコイルド-コイル領域を有していた。現在、シンタキシンには、シンタキシン-3以外に約16種類のアイソフォームが存在するが、このうち、Taxilinは、シンタキシン-3以外にシンタキシン-1とシンタキシン-4にも結合した。しかし、シンタキシン-7やシンタキシン-8には結合しなかった。Taxilinは、ほとんどの組織に発現していたが、おのおのの組織におけるTaxilinの生理機能に関しては未だ明らかではない。しかし少なくとも、neuroendocrine様細胞においては、TaxilinはCa^<2+>依存性の分泌反応に関与している可能性が高い。今後、Ca^<2+>依存性の分泌反応におけるTaxilinの作用機構を解明すると共に、ラフト形成におけるTaxilinの機能と作用機構について解析を進めていく予定である。
インテグリン由来シグナル伝達機構の解析

CD29/VLAインテグリンは細胞外基質蛋白の受容体であるが,接着分子としての役割のみならずシグナル伝達にも関わり、癌細胞増殖、癌転移などの機能にも重要である。我々はCD29/VLAのリガンドの結合によりpp105、pp125FAK、PLCγ、パキシリン、MAPキナーゼなどの蛋白がチロシンリン酸化されること、pp125FAKはパキシリンに直接結合し、パキシリンへの結合能力とpp125FAKの接着斑局在能力とが一致することを明らかにしてきた。pp105はpp125FAKとは明らかに異なる蛋白でありながら、CD29/VLA刺激後のチロシンリン酸化のkineticsは全く同じ態度をとっているが、このpp105の構造については明らかでなかった。今回我々はpp105のcDNAクローニングに成功し、p130Cas関連蛋白であることを同定した。pp105はリンパ系細胞に主として発現され、一方p130Casは非血液系細胞に主として発現される。これらの所見より我々はpp105をCas-L(リンパ球型Cas)と名付けた。Cas-LはCD29/VLA刺激依存性にFAK-C末端部分に直接会合し、チロシンリン酸化されたCas-LはCrk、Nck及びSHPTP2のSH2ドメインに結合する。上記の結果よりCD29/VLAインテグリン由来チロシンリン酸化の新しい構成分子が明らかにされ、Crk、Nck、SHPTP2がCD29/VLA由来シグナル伝達経路の下流に位置していることが示唆された。CD29/VLAを介するシグナル伝達機構をさらに解析していくことは癌細胞増殖、転移のメカニズムの解明のみならず細胞内情報伝達機構の解明のためにも重要である。
有限群の作用付き曲線及びある種の被覆のモジュライの研究とその応用

よく知られているように,単連結な位相空間に群が離散的かつ自由に作用しているとき,その群は商空間の基本群と同型である.また,位相空間が二つの然るべき部分空間の和空間ならば,もとの空間の基本群は部分空間の基本群のアマルガム和で表される.つまり,この状況下では,位相空間を通して群の構造ををその部分群を用いて記述できる.さらに,セールは,彼の著書の中で,作用する位相空間が樹木と呼ばれる単連結なグラフの場合に,組合せ的な考察によって固定部分群が非自明な場合にも上記のようなことが言える,すなわち,商グラフの基本群と固定部分群を用いてもとの群が記述できることを明らかにした.従って,群構造を知るには,それを樹木に作用させその商グラフと固定部分群を調べることが有効である.そこで,本研究員はこれに関し今年度は以下のような研究を行なった.非特異射影多様体Sとその豊富な因子をとり,その上の点を一つ固定する.構造層のその点での茎をRとおくと,階数2の再帰的R-加群の適当な同値類全体は,自然に樹木をなすことがわかる.一方,もとの多様体から豊富な因子を取り除いて得られるアフィン多様体の座標環をAとおくと,A上の一般線型群等Gがその樹木に作用し,その商グラフはS上の階数2の再帰的加群層やその初等変換とに密接な関連があることがわかる.つまり,射影多様体上の加群を調べることによってGの構造が原理的には記述できるのである.一般に,構造を実際に記述するのは易しくないが,射影空間の場合,豊富な因子として超平面をとれば計算可能である.また,現在考察中であるが,二次超曲面をとった場合にも何らかの形で記述できそうである.本年度は,研究課題である有限群の作用付き曲線及びある種の被覆のモジュライの研究とその応用を扱った.具体的には,考える有限群は位数2でそれによる商が射影直線になるような場合,すなわち超楕円曲線の場合を扱った.実際にこれについて得た結果を説明したい.安定超楕円曲線のモジュライ空間には,ホッジ類やあるタイプごとに定まる境界類などの標準的に与えられる因子類が存在するが,標数が0の場合にはそれらの間にCornalba-Harrisの等式と呼ばれる関係式が存在することが知られている.それの証明では,適当な群作用を除いて,超楕円曲線は本質的には射影曲線上の幾つかの点の集合に対応させられることが効いていた.この関係式は,正標数であってもそれが2でなければ成立することまではわかっていた.しかし標数が2のときには,ワイルドな分岐のせいでそのような対応はつかないので,わからなかった.そこで,私はこれを標数が2のときにも成立することを証明し,論文作成を行った.証明方法は標数が0の場合と同じ方法はとれないが,有理整数環上で安定超楕円曲線のモジュライを考察し標数0での結果を標数が2の場合に還元することによって証明した.(ここで重要なのは,Maugeaisによる,安定超楕円曲線は等標数でのスムージングが可能であるという結果であった.)この結果の簡単な帰結として,例えば完備な曲線上の滑らかな超楕円曲線の族は必ず局所自明になってしまうことがわかることを注意しておく.安定超楕円曲線のモジュライ空間には,ホッジ類やあるタイプごとに定まる境界類などの標準的に与えられる因子類が存在するが,標数が0の場合にはそれらの間にCornalba-Harrisの等式と呼ばれる関係式が存在することが知られている.それの証明では,適当な群作用を除いて,超楕円曲線は本質的には射影曲線上の幾つかの点の集合に対応させられることが効いていた.この関係式は,正標数であってもそれが2でなければ成立することまではわかっていた.しかし標数が2のときには,ワイルドな分岐のせいでそのような対応はつかないので,わからなかった.そこで,私はこれを標数が2のときにも成立することを証明し,論文作成を行った,証明の本質的な部分は昨年度の成果であるが,論文投稿中に,査読者の指摘により一部証明に使う代数スタックの一般論について加筆し,本年度正式に掲載が決定した.これは,本年度における実績の主要なひとつである.本年度は,これとは別の話題として,二変数多項式環上のある線型群の構造について研究した.これは,樹木と呼ばれる単連結な組み合わせ論的グラフに群を作用させたとき,その商グラフの構造がわかれば元の群の構造が記述できるという原理を,然るべき状況下で応用したものである.ここでは,算術的な群の構造と,射影曲面上の階数2のベクトル束のある同値類の集合との間に関連があり,それが興味深く面白い点である.これについては現在投稿準備中である.よく知られているように,単連結な位相空間に群が離散的かつ自由に作用しているとき,その群は商空間の基本群と同型である.また,位相空間が二つの然るべき部分空間の和空間ならば,もとの空間の基本群は部分空間の基本群のアマルガム和で表される.つまり,この状況下では,位相空間を通して群の構造ををその部分群を用いて記述できる.さらに,セールは,彼の著書の中で,作用する位相空間が樹木と呼ばれる単連結なグラフの場合に,組合せ的な考察によって固定部分群が非自明な場合にも上記のようなことが言える,すなわち,商グラフの基本群と固定部分群を用いてもとの群が記述できることを明らかにした.

従って,群構造を知るには,それを樹木に作用させその商グラフと固定部分群を調べることが有効である.そこで,本研究員はこれに関し今年度は以下のような研究を行なった.非特異射影多様体Sとその豊富な因子をとり,その上の点を一つ固定する.構造層のその点での茎をRとおくと,階数2の再帰的R-加群の適当な同値類全体は,自然に樹木をなすことがわかる.一方,もとの多様体から豊富な因子を取り除いて得られるアフィン多様体の座標環をAとおくと,A上の一般線型群等Gがその樹木に作用し,その商グラフはS上の階数2の再帰的加群層やその初等変換とに密接な関連があることがわかる.つまり,射影多様体上の加群を調べることによってGの構造が原理的には記述できるのである.一般に,構造を実際に記述するのは易しくないが,射影空間の場合,豊富な因子として超平面をとれば計算可能である.また,現在考察中であるが,二次超曲面をとった場合にも何らかの形で記述できそうである.
転写因子LMO1が制御するmicroRNAの同定による神経芽腫治療標的分子の探索

先行研究において、LMO1遺伝子のコピー数の増加は予後の悪い高リスク群症例に多く見られ、同遺伝子がコードする転写調節因子LMO1は神経芽腫細胞の細胞増殖を促進する機能を持つがん遺伝子であることが明らかになっている。LMO1発現抑制下での神経芽腫培養細胞の遺伝子発現解析及びmicroRNAを疑似した合成RNA (microRNA mimic)の神経芽腫培養細胞への導入実験の結果から、LMO1は細胞増殖抑制機能を持つmicroRNAの発現を間接的に抑制することにより、がん促進的に機能することが示唆された。先行研究で実施したクロマチン免疫沈降ーDNAシークエンシングにより、神経芽腫細胞SK-N-SHのゲノム上にLMO1の結合領域候補が相当数同定されていたが、本研究における解析の結果、その中に近傍にmicroRNA遺伝子が存在する結合領域候補が5か所あった。SK-N-SH細胞にLMO1発現抑制用のshRNAを導入し発現解析を行ったところ、これら5か所の近傍にあるmicroRNAのうち、一つのmicroRNA(hsa-miR-Xとしておく)の発現量が低下していたことから、このmicroRNAはLMO1により直接的に発現制御を受けることが示唆された。しかしながら、SK-N-SHにおいてhsa-miR-Xの発現を抑制しても細胞増殖速度には変化が見られなかったことから、このmicroRNAは少なくともLMO1の細胞増殖促進機能を媒介するものではない可能性が高いと判断された。また、前述のLMO1発現抑制下でのSK-N-SH細胞の発現解析により、LMO1の結合領域にはないが発現が抑制されているmicroRNAが複数同定された。これらは間接的にLMO1による発現制御を受けているものと推測された。しかしながら、26年度の研究において、これら5か所の近傍にあるmicroRNAの中にはLMO1の細胞増殖促進機能を媒介するものはないとの結論に達した。そこで、LMO1発現抑制下でのSK-N-SH細胞のマイクロアレイ遺伝子発現解析により、LMO1の結合領域には存在していないが他の何らかの遺伝子を介して間接的にLMO1による発現抑制を受けているmicroRNAが複数同定されたことから、27年度はこれらのmicroRNAについて解析を行った。マイクロアレイ発現解析の結果をさらに定量PCRにより確認した結果、18個のmicroRNAについて間接的にLMO1による発現抑制を受けているとの結論を得た。これらのmicroRNAを疑似した合成RNA (microRNA mimic)を神経芽腫培養細胞に導入したところ、hsa-miR-34a-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-20b-5p及びhsa-miR-409-3pが細胞増殖を抑制することがわかった。以上の結果より、がん促進的遺伝子の発現を正に制御することに加えて、細胞増殖抑制機能を持つこれらのmicroRNAの発現を負に制御することにより、LMO1はがん促進的に機能する可能性が示唆された。当研究課題の遂行は当初予想していたより困難を極め、1年の研究期間内に十分な成果を出せず、研究補助事業期間の延長を申請するにいたった。分子腫瘍学hsa-miR-XはSK-N-SHにおいてがん抑制的に機能する遺伝子の機能を抑制していると考えられることからこれらの遺伝子を同定する。また、前述のLMO1発現抑制下でのSK-N-SH細胞の発現解析により、がん促進的転写調節因子LMO1の働きにより間接的に発現が抑制されているmicroRNAが複数同定されており、この中にはがん抑制的機能を持つものが含まれていると期待される。がん抑制的機能を持つmicroRNAを同定し、さらにそれらが機能を抑制する遺伝子(がん促進的機能を持つことが期待される)を同定することにより、神経芽腫細胞で機能するがん促進的分子経路を明らかにし、その中に新規治療標的分子を探索する。転写因子LMO1が発現を制御するmicroRNAの同定が予想よりも難航したため、研究の進捗が予定より遅れている。

LMO1が発現を制御するmicroRNAの中からがん促進的あるいはがん抑制的に機能するものを同定し、それらの関連する分子経路の中に治療標的分子を探索することから、必要な実験・解析の経費として使用する。また、本年4月の小児科学会で成果を一部発表したほか、9月の癌学会、12月の分子生物学会での発表を予定しており、また、学術誌での論文発表も予定していることから、これらの発表の経費として使用する。
新規に作出したc-kit変異マーモセットの表現型解析

本研究はゲノム編集技術CRISPR/Cas9で作出したc-kit遺伝子変異コモンマーモセットの有用性を明らかにすることを目的とする。c-kit遺伝子は造血、生殖機能や毛色に関与し、自然突然変異体も含めて、その変異マーモセットは報告がない。作出したc-kit変異マーモセットは遺伝子変異のほか、毛色異常などc-kit変異マウスと同様の表現型が確認できている。さらに血液解析や、変異体が示すc-kit遺伝子配列の発現ベクターをもちいたリン酸化能解析により、個体の特性を明らかにする。またc-kit変異体細胞由来iPS細胞から始原生殖細胞誘導能を検討し、c-kit変異マーモセットの生殖能を明らかにする。
Rab44による破骨細胞分化制御の分子メカニズムおよび個体レベルでの機能解明

本研究では、骨の吸収を担う破骨細胞の分化をRab44遺伝子がどのように制御するか、詳細な分子メカニズム及び個体レベルでの機能を解明する。本研究代表者らはRab44遺伝子が破骨細胞分化を抑制することを明らかにした。しかし、それ以外の知見についてはまだわかっていない。本研究では、生体内でRab44が破骨細胞分化にどのように働いているのか明らかにするために、Rab44に結合するタンパク質の同定と同遺伝子ノックアウトマウス用いた骨組織の解析を行う。本研究において破骨細胞のユニークな分化制御と極性小胞輸送を解明することで、新しい骨疾患治療や予防研究への進展が期待できる。1.Rab44結合タンパク質の同定Rab44過剰発現細胞を用いてRab44プルダウンアッセイを行い、結合候補分子を質量分析法により同定した。その後、野生型、恒常的活性型(GTP型)、恒常的不活性型(GDP型)のRab44を発現させた細胞でRANKL刺激時、非刺激時での免疫沈降実験を行い、結合タンパク質の差異を検証した。結果、2種類のタンパク質が同定され、それぞれ恒常的活性型、不活性型に特異的に結合することがわかった。このことより、Rab44はGTPaseの活性、不活性により結合タンパク質を切り替えていることが明らかになった。またRANKLでの刺激の有無によって結合が影響を受けることを明らかにした。恒常的活性型ではRANKL刺激により結合候補分子と結合できなくなることがわかった。2.Rab44のカルシウム感受性の解析Rab44遺伝子はカルシウム結合領域であるEFハンドモチーフを持つ。したがって、カルシウム感受性の違いを検討した。カルシウムイオノフォアであるML-SA1刺激による野生型、恒常的活性型、恒常的不活性型Rab44の局在変化を観察した。結果、ML-SA1による局在の変化は観察されなかった。3.Rab44遺伝子欠損マウスの作製および骨組織・骨代謝解析Rab44遺伝子欠損マウスを作製した。遺伝子欠損マウスから骨髄細胞を採取し、破骨細胞へと分化させると、野生型マウスに比べて分化が促進され、破骨細胞数の増加と巨大化が認められた。これはこれまで明らかにしたマウスマクロファージ様細胞RAW-D細胞での実験結果と一致する。本年度は実験計画通り、Rab44結合タンパク質の同定、Rab44のカルシウム感受性の解析、Rab44遺伝子欠損マウスの作製による機能解析を行った。結合タンパク質の実験では、Rab44遺伝子の過剰発現系を用いて、プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質をプロテオーム解析により2つの結合候補分子を同定した。Rab44のカルシウム感受性の解析では、マウスRab44のアイソフォームにEFハンドモチーフを持つものが存在することが明らかになったので、マウス骨髄細胞からEFハンドモチーフを持ったRab44のcDNAを作製した。このcDNAを元にEFハンドを持つRab44過剰発現細胞を作製し、カルシウムイオノフォア刺激による局在変化を検討した。Rab44遺伝子欠損マウスでは、細胞レベルでの解析で破骨細胞の分化促進が起こっていることを示した。以上のことより当初の研究計画通り、研究が進展していると評価できる。1.Rab44結合タンパク質の同定同定された2つの結合タンパクに関して過剰発現細胞を作成し、Rab44と結合するかの確認実験を行う。また、この発現細胞を用いた破骨細胞分化実験を行うことで分化に対する影響を調べる。Rab44はRab45、CRACR2aと同様に高分子Rab GTPaseに分類される。Rab45及びCRACR2aはダイニン、ダイナクチン複合体と結合することによって微小管依存性の輸送を制御していることが明らかになっている。このことから、ダイニン、ダイナクチンと複合体を形成するかのプルダウンアッセイを行う予定である。2.Rab44のカルシウム感受性の解析カルシウムイオノフォアであるML-SA1刺激による野生型、恒常的活性型、恒常的不活性型Rab44の局在の変化は観察されなかった。このため別のカルシウムイオノフォアであるイオノマイシンによる刺激で同様の実験を行い、局在変化をみる。またRab44の局在の変化だけでなく、粒子径の変化や時間依存性の変化が起こっていないかの解析も行なっていく予定である。3.Rab44遺伝子欠損マウスの作製および骨組織・骨代謝解析当初の予定通り、Rab44遺伝子欠損マウスを用いて、個体レベルでの解析を行う。Rab44遺伝子欠損の胎生期マウスあるいは生後数日のマウスの透明骨格標本を作製し、マウス個体レベルでの硬骨形成程度の比較を行う。さらに成長したマウスに対しては大腿骨、椎骨などのX線解析を行い、固定後脱灰パラフィン切片や非脱灰樹脂切片を作製し、HE染色、TRAP染色を行い、骨形成を比較する。また非脱灰樹脂標本を作製し骨組織形態計測を行う。骨量、海綿骨数などの計測にはマイクロCT解析を用いる。

本研究において破骨細胞のユニークな分化制御と極性小胞輸送を解明することで、新しい骨疾患治療や予防研究への進展が期待できる。1.Rab44結合タンパク質の同定Rab44過剰発現細胞を用いてRab44プルダウンアッセイを行い、結合候補分子を質量分析法により同定した。その後、野生型、恒常的活性型(GTP型)、恒常的不活性型(GDP型)のRab44を発現させた細胞でRANKL刺激時、非刺激時での免疫沈降実験を行い、結合タンパク質の差異を検証した。結果、2種類のタンパク質が同定され、それぞれ恒常的活性型、不活性型に特異的に結合することがわかった。このことより、Rab44はGTPaseの活性、不活性により結合タンパク質を切り替えていることが明らかになった。またRANKLでの刺激の有無によって結合が影響を受けることを明らかにした。恒常的活性型ではRANKL刺激により結合候補分子と結合できなくなることがわかった。2.Rab44のカルシウム感受性の解析Rab44遺伝子はカルシウム結合領域であるEFハンドモチーフを持つ。したがって、カルシウム感受性の違いを検討した。カルシウムイオノフォアであるML-SA1刺激による野生型、恒常的活性型、恒常的不活性型Rab44の局在変化を観察した。結果、ML-SA1による局在の変化は観察されなかった。3.Rab44遺伝子欠損マウスの作製および骨組織・骨代謝解析Rab44遺伝子欠損マウスを作製した。遺伝子欠損マウスから骨髄細胞を採取し、破骨細胞へと分化させると、野生型マウスに比べて分化が促進され、破骨細胞数の増加と巨大化が認められた。これはこれまで明らかにしたマウスマクロファージ様細胞RAW-D細胞での実験結果と一致する。本年度は実験計画通り、Rab44結合タンパク質の同定、Rab44のカルシウム感受性の解析、Rab44遺伝子欠損マウスの作製による機能解析を行った。結合タンパク質の実験では、Rab44遺伝子の過剰発現系を用いて、プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質をプロテオーム解析により2つの結合候補分子を同定した。Rab44のカルシウム感受性の解析では、マウスRab44のアイソフォームにEFハンドモチーフを持つものが存在することが明らかになったので、マウス骨髄細胞からEFハンドモチーフを持ったRab44のcDNAを作製した。このcDNAを元にEFハンドを持つRab44過剰発現細胞を作製し、カルシウムイオノフォア刺激による局在変化を検討した。Rab44遺伝子欠損マウスでは、細胞レベルでの解析で破骨細胞の分化促進が起こっていることを示した。以上のことより当初の研究計画通り、研究が進展していると評価できる。1.Rab44結合タンパク質の同定同定された2つの結合タンパクに関して過剰発現細胞を作成し、Rab44と結合するかの確認実験を行う。また、この発現細胞を用いた破骨細胞分化実験を行うことで分化に対する影響を調べる。Rab44はRab45、CRACR2aと同様に高分子Rab GTPaseに分類される。Rab45及びCRACR2aはダイニン、ダイナクチン複合体と結合することによって微小管依存性の輸送を制御していることが明らかになっている。
炭酸ガスを用いた経動脈DSAに関する基礎的研究

本研究の第一の目的は、動脈性出血および動静脈シャントの検出法としてCO_2-IADSAが優れている機序として挙げた仮設を、人工血管モデルを用いて実証することである。現在、人工血管内の圧力を制御することには成功しているが、血管外の空間は、DSAの特性上、気体であってはならず、密封され、人工血管との間に隙間がなく、かつ圧力を外部で制御可能な系を作成する必要があるが、現時点では、この条件を満たす理想的はシステムが確立できていない。本研究の第二の目的は、得られたCO_2-IADSAの画像から、シャント量や出血量を、コンピューターを用いて定量化することである。この定量化の第一歩として、DSAにおける血流信号の強度を規定するヨード造影剤、およびCO_2ガスの造影剤の絶対濃度を比較するため、各種濃度のヨード造影剤およびCO_2ガスのX線吸収値をX線CTを用いて測定した。使用機種は、横河メディカルシステム社製Quantexである。CT上、CO_2ガスは、-1000H.U.のX線吸収値を示したのに対し、ヨード造影剤のX線吸収値は、CTの測定範囲限界内で、ヨード含量に正比例し、CO_2ガスに匹敵するX線吸収値を示したのは、約40mgl/mlのヨード含量の造影剤であった。通常の血管造影に使用するヨード造影剤のヨード含量は140mgl/mlないし370mgl/mlであり、これらの造影剤のコントラストと比較すると、CO_2ガスの造影剤としてのコントラストは低く、臨床例で得られたCO_2-IADSAの画像の粒状性がやや劣る理由、即ち、CO_2-IADSAのcontrast to noise ratio(C/N比)がヨード造影剤を用いたIADSAの数分の一であることが立証された。今後、理想的なシステムを確立し、当初の目的を達成していく予定である。
微量有害物質の河川水と底泥の微生物分解に及ぼす共存界面活性剤成分の影響

有機リン酸トリエステル類(Organophoshoric acid triesters: OPEs)は合成樹脂添加剤,可塑剤,溶剤,消泡剤,潤滑添加剤等で広く使用され,環境中に排出されている.これらの中には変異原性を示すものや有機系殺虫剤とほぼ同程度の毒性を示すものもあり,環境への悪影響が危惧されている物質である.本研究ではOPEsの生分解特性に及ぼす合成洗剤LASの一種であるドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(DBS)の影響について報告する。また,界面活性剤の共存下におけるOPEsの液液抽出における溶媒種の影響についても考察をおこなった.以下得られた知見を示す.1.抽出溶媒としてヘキサン,ベンゼン,ジクロロメタンの3種類を用いた.その結果1)界面活性剤としてDBS濃度が10mg/L以下の場合,ジクロロメタンの抽出効率がよい,2)DBS濃度が100mg/Lから1000mg/Lと高くなるとジクロロメタンの抽出効率が悪くなる,3)ベンゼンを用いた場合はDBS濃度の影響を受けにくい,4)TCEPのヘキサン抽出ではDBS濃度が上がるにつれて抽出効率が上昇する,こと等がわかった.2.河川水にTBP, TBXP, TCEPをそれぞれ1mg/L濃度で,かつ,DBSが0,3,10.100mg/Lの共存条件にてOPEsの分解状況をしらべた.得られた知見は1)DBs100mg/L以上の共存では試供したOPEはいずれも分解しなかった,2)TBPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件において濃度の増加とともにその分解開始時間がおくれた,3)TBXPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件においてはその分解に何等影響を受けなかった,4)TCEPについては共存DBS濃度に関係なく全く分解されなかった.このようにOPEsの河川水中での生分解において多量のDBSの共存は分解を阻止し,OPEsの中でも生分解しにくいものはDBSの濃度が上昇すると分解開始におくれが生じる.有機リン酸トリエステル類(Organophoshoric acid triesters: OPEs)は合成樹脂添加剤,可塑剤,溶剤,消泡剤,潤滑添加剤等で広く使用され,環境中に排出されている.これらの中には変異原性を示すものや有機系殺虫剤とほぼ同程度の毒性を示すものもあり,環境への悪影響が危惧されている物質である.本研究ではOPEsの生分解特性に及ぼす合成洗剤LASの一種であるドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(DBS)の影響について報告する。また,界面活性剤の共存下におけるOPEsの液液抽出における溶媒種の影響についても考察をおこなった.以下得られた知見を示す.1.抽出溶媒としてヘキサン,ベンゼン,ジクロロメタンの3種類を用いた.その結果1)界面活性剤としてDBS濃度が10mg/L以下の場合,ジクロロメタンの抽出効率がよい,2)DBS濃度が100mg/Lから1000mg/Lと高くなるとジクロロメタンの抽出効率が悪くなる,3)ベンゼンを用いた場合はDBS濃度の影響を受けにくい,4)TCEPのヘキサン抽出ではDBS濃度が上がるにつれて抽出効率が上昇する,こと等がわかった.2.河川水にTBP, TBXP, TCEPをそれぞれ1mg/L濃度で,かつ,DBSが0,3,10.100mg/Lの共存条件にてOPEsの分解状況をしらべた.得られた知見は1)DBs100mg/L以上の共存では試供したOPEはいずれも分解しなかった,2)TBPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件において濃度の増加とともにその分解開始時間がおくれた,3)TBXPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件においてはその分解に何等影響を受けなかった,4)TCEPについては共存DBS濃度に関係なく全く分解されなかった.このようにOPEsの河川水中での生分解において多量のDBSの共存は分解を阻止し,OPEsの中でも生分解しにくいものはDBSの濃度が上昇すると分解開始におくれが生じる.有機リン酸トリエステル類(Organophosphoric acid triesters:OPE)は合成樹脂添加剤、可塑剤、溶剤、消泡剤、潤滑添加剤等で広く使用され、環境中に排出されている。これらの中には変異原性を示すものや有機りん系殺虫剤とほぼ同程度の毒性を示すものがあり、環境への悪影響が危ぐされている物質である。本研究では有機リン酸トリエステル類の生分解特性に及ぼす共存界面活性剤成分の影響について報告する。実験に供したOPEはTOP(Tris(2-ethyl hexyel)phosphate),TBP(Tributy1 phosphate),TBXP(Tris(2-butoxyethy1)phosphate)およびTCEP(Tris(2-chloroethy1)phosphate)で、生分解の序列はTOP>TBP>TBXP>TCEPである。陰イオン界面活性剤は合成洗剤としてドデシル硫酸ナトリウム、石鹸としてステアリン酸ナトリウムを用いた。ドデシル硫酸ナトリウムは合成洗剤のなかでも分解しやすい界面活性剤である。生分解実験はRiver-die-away法を用いた。以下に得られた知見を示す。1。TOPはドデシル硫酸ナトリウムやステアリン酸ナトリウムの共存下でも分解される。ただし、ドデシル硫酸ナトリウム1000mg/Lの共存下では分解されない。2。TBPはドデシル硫酸ナトリウム100mg/Lの共存下で分解が促進される。3。

TBXPはドデシル硫酸ナトリウム10mg/Lの共存下で分解が促進されるが、ドデシル硫酸ナトリウム100mg/Lの共存下では生分解性が阻害される可能性がある。5。難分解性のTCEPはドデシル硫酸ナトリウムやステアリン酸ナトリウムの共存下でもほとんど分解されない。このようにOPEの生分解において石鹸成分の影響は大きくないが、ドデシル硫酸ナトリウウムの共存はある小量の共存は分解を促進するが、多量の共存は分解を阻害することがわかった。有機リン酸トリエステル類(Organophosphoric acidtriesters: OPEs)は合成樹脂添加剤,可塑剤,溶剤,消泡剤,潤滑添加剤等で広く使用され,環境中に排出されている.これらの中には変異原性を示すものや有機系殺虫剤とほぼ同程度の毒性を示すものもあり,環境への悪影響が危惧されている物質である.本研究ではOPEsの生分解特性に及ぼす合成洗剤LASの一種であるドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(DBS)の影響について報告する.また,界面活性剤の共存下におけるOPEsの液液抽出における溶媒種の影響についても考察をおこなった。以下得られた知見を示す.1.抽出溶媒としてヘキサン,ベンゼン,ジクロロメタンの3種類を用いた.その結果1)界面活性剤としてDBS濃度が10mg/L以下の場合,ジクロロメタンの抽出効率がよい,2)DBS濃度が100mg/Lから1000mg/Lと高くなるとジクロロメタンの抽出効率が悪くなる,3)ベンゼンを用いた場合はDBS濃度の影響を受けにくい,4)TCEPのヘキサン抽出ではDBS濃度が上がるにつれて抽出効率が上昇する,こと等がわかった.2.河川水にTBP,TBXP,TCEPをそれぞれ1mg/L濃度で,かつ,DBSが0,3,10.100mg/Lの共存条件にてOPEsの分解状況をしらべた.得られた知見は1)DBS100mg/L以上の共存では供試したOPEはいずれも分解しなかった,2)TBPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件において濃度の増加とともにその分解開始時間がおくれた,3)TBXPはDBS濃度が0,3,10mg/Lの条件においてはその分解に何等影響を受けなかった,4)TCEPについては共存DBS濃度に関係なく全く分解されなかった.このようにOPEsの河川水中での生分解において多量のDBSの共存は分解を阻止し,OPEsの中でも生分解しにくいものはDBSの濃度が上昇すると分解開始におくれが生じる.
青枯病菌の宿主域を決定する因子をゲノムの比較により解き明かす

1.タバコに病気を起こして枯らせてしまうOE1-1株とタバコにHRを誘発する株として8266株のドラフトゲノム解析を行った。GMI1000株(タバコに非病原性)に対してBLAST解析を行い、遺伝子配置について調べた。2. GMI1000株で74個あると予想されているエフェクター遺伝子について、ドラフト解析を元にOE1-1株、8266株の両方から抽出を行った。その結果14個のエフェクター遺伝子において、3株間で何らかの違いがみられた。こうしたエフェクターは、病原細菌の分離された地理的な状況を反映している可能性やタバコに対する病原性を支配している可能性がある。また、日本株にのみ見られるエフェクター遺伝子がひとつ存在した。3. 2で抽出された候補遺伝子のうち、2つの遺伝子RSp0914、RSc1356はLRR-GALAfamily type IIIeffector proteinに分類される。青枯病菌において7種類のLRR-GALAfamily type III effector Droteinが知られており、すべてを欠損させた変異株は宿主植物に対する病原性が弱まることが報告されている。そこでまず、これらの7種類のLRR-GALAfamily type III effector protein遺伝子についてOE1-1株と8266株の間での入れ替え実験を行うこととした。そのために、OE1-1株において5それぞれの遺伝子の欠失変異株を作製し、そこにOE1-1株もしくは8266株の対応する遺伝子を染色体上の特定の位置に挿入した株を作製し、タバコに対する病原性を調べるという手法をとった。そのために、まず、それぞれの遣伝子の欠失変異株を作製し、その病原性を調べた。GMI1000株で見られたように、ほとんどすべての1gala遺伝子欠損株は野生株OE1-1株と同等の病原性を示した。今後は、いずれか1種類のgala遺伝子だけが発現する変異株およびすべてのgala遺伝子欠損株を構築し、それら変異株の病原性について明らかにする。4. gala3欠損株はタバコに対して野生株と同等の病原性を示す。エフェクターの入れ替え実験として、この欠損株に8266株のgala3遺伝子を図5の手法を用いて導入した。タバコ葉に接種したところ、OE1-1野生株と同様に病原性を示し、HRは示さなかった。gala3遺伝子は、OE1-1株と8266株の間でよく保存されていることからタバコに対するHR要因とはならないとの予想とよく一致している。タバコに病気を起こして枯らせてしまうOE1-1株とタバコにHRを誘発する株として8266のドラフトゲノム解析を行った。8266株はミヤコグサに対しても病原性を示すことが知られている。そのため、タバコとミヤコグサの両方の宿主域の決定機構が解明できると期待した。いずれのドラフト解析においてもコンティグ数が1000以上ある状況である。各コンティグについてレファレンス株であるGMI1000に対してBLAST解析を行い、遺伝子配置について調べた。当然ながらほぼゲノム全体にわたりシンテニーが確認できた。GMI1000株は3.7Mbの染色体と2.1MBのメガプラスミドの2つのレプリコンを持っていることが知られているが、今回ドラフトゲノム解析を行ったOE1-1株、8266株ともに同様にレプリコンは2つであった。シンテニーを示さない領域はメガプラスミドにより多く見られた。2種類の日本分離株間どうしのシンテニー領域は、GMI1000とOE1-1、GMI1000と8266間におけるシンテニー領域よりも広いことが明らかとなった。すなわち、同じphylotype Iに属するにもかかわらず、南米で分離されたGMI1000株と日本株の間ではdiversityがより高いことが示された。同様のことは、挿入配列についても見いだされた。GMI1000株には16種類のIS配列が確認されている。OE1-1株は解析途中であるが、8266に関してはGMI1000よりもISの挿入部位が少ないことが明らかとなった。これらのことから日本分離株のレファレンス株の完全長配列の必要性が再確認された。現在、フォスミドクローンの末端配列解析を行うクローン数を大幅に増やして、完全長の配列解析を進めている。そこでまず、これらの7種類のLRR-GALA

family type III effector protein遺伝子についてOE1-1株と8266株の間での入れ替え実験を行うこととした。そのために、OE1-1株において5それぞれの遺伝子の欠失変異株を作製し、そこにOE1-1株もしくは8266株の対応する遺伝子を染色体上の特定の位置に挿入した株を作製し、タバコに対する病原性を調べるという手法をとった。そのために、まず、それぞれの遣伝子の欠失変異株を作製し、その病原性を調べた。GMI1000株で見られたように、ほとんどすべての1gala遺伝子欠損株は野生株OE1-1株と同等の病原性を示した。今後は、いずれか1種類のgala遺伝子だけが発現する変異株およびすべてのgala遺伝子欠損株を構築し、それら変異株の病原性について明らかにする。4. gala3欠損株はタバコに対して野生株と同等の病原性を示す。エフェクターの入れ替え実験として、この欠損株に8266株のgala3遺伝子を図5の手法を用いて導入した。タバコ葉に接種したところ、OE1-1野生株と同様に病原性を示し、HRは示さなかった。gala3遺伝子は、OE1-1株と8266株の間でよく保存されていることからタバコに対するHR要因とはならないとの予想とよく一致している。