hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高機能抗体創製を指向する分子連結技術の開発

本研究では,ヘテロ4量体を形成する短鎖ペプチドを利用することによって,微生物発現系により,がん細胞を標的とする二重特異性抗体の調製を試みた結果,2種の標的分子に対して同時に結合する組換え抗体を作製することができた.また,標的がん細胞に対する傷害性を評価したところ,市販の抗体医薬品と同等のがん細胞傷害性を有することがわかった.以上の結果から,本研究で構築した手法は,高機能抗体を安価に作製するために役立つと期待できる.本研究では、生命分子の特異的分子認識反応と高い安定性を有する共有結合反応を組み合わせることによって、特異的かつ堅牢なタンパク質連結技術を開発することを目指している。本年度は以下の研究成果を得た。(1)ジスルフィド結合を導入した抗体酵素複合体の評価:上皮増殖因子受容体(EGFR)を標的とするラマ抗体可変領域とRNA分解酵素に対して、ヘテロ4量体を形成する2種のペプチドを各々融合することにより作製した抗体酵素複合体について、安定化を図るためにジスルフィド結合の導入を試みた。2種のペプチドに対して、システイン残基を各々変異導入した結果、電気泳動法によりジスルフィド結合の形成を確認できた。作製した複合体について、酵素活性およびEGFR陽性細胞への結合活性を評価したところ、ジスルフィド結合の導入によって、酵素活性に変化は見られなかったが、標的細胞への結合力は向上したことから、複合体の安定化が機能向上に繋がることが分かった。(2)二重特異性抗体の作製:(1)で作製した2種の変異導入ペプチドを用いて、二重特異性抗体の作製を試みた。具体的には、ペプチドの会合を利用することによって、CD16特異的抗体可変領域とEGFR特異的抗体可変領域を連結した。作製した組換え抗体について、フローサイトメトリーにより抗原陽性細胞に対する結合活性を評価したところ、CD16およびEGFR陽性細胞への結合を各々確認することができたことから、二重特異性を有することが分かった。現在、がん細胞に対する傷害活性の評価を進めている。本研究では、生体分子の持つ優れた分子認識能を利用することによって、特異的かつ堅牢なタンパク質連結技術を開発することを目的としている。本年度は、ジスルフィド結合の導入により安定化したヘテロ4量体形成ペプチド複合体を利用することによって、上皮増殖因子受容体(EGFR)およびCD16に結合する二重特異性抗体を調製し、その機能評価を進めた。まず、フローサイトメトリーおよび表面プラズモン共鳴法により抗原結合性を評価したところ、二重特異性抗体は、2種の標的抗原に対して同時に結合できることがわかった。また、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いて、二重特異性抗体の会合状態を調べた結果、2つの抗体可変領域を連結している2種のヘテロ4量体形成ペプチドは、ヘテロおよびホモの組み合わせでジスルフィド結合を形成していたことから、作製した二重特異性抗体には、2種の異なる会合状態が存在すると考えた。さらに、CD16陽性のエフェクター細胞の存在下で、EGFR陽性のがん細胞に対する傷害性を評価したところ、二重特異性抗体は、市販抗体医薬に匹敵するがん細胞傷害性を示すことが明らかとなった。以上の結果から、本研究で提案するヘテロ4量体形成ペプチド複合体を利用したタンパク質連結法は、高機能組換え抗体の開発において有用であると考えている。現在、本手法の汎用性および優位性を検証するために、新たな組換え抗体の作製を進めている。本研究では、生体分子の特異的相互作用を利用することによって、抗体高機能化を指向する分子連結技術を開発することを目的としている。本年度は、前年度までに構築したヘテロ四量体を形成する二種の短鎖ペプチドの会合を利用したタンパク質連結法について、汎用性の検討を中心に進めた。具体的には、単一抗原の異なる二つのエピトープを標的とする二重パラトープ抗体を作製し、その機能を解析した。まず、がん細胞に高発現する上皮増殖因子受容体に特異的な二種の抗体可変領域に対して、二種の会合ペプチドを各々融合し、大腸菌で共発現させることによって、二重パラトープ抗体を調製した。また、同様の手法を用いて、単一パラトープ抗体を調製し、比較した。ゲルろ過および質量分析を用いて組換え抗体を分析した結果、二重パラトープ抗体および単一パラトープ抗体は、四量体として存在し、主にヘテロ鎖間でジスルフィド結合を形成していることがわかった。表面プラズモン共鳴法により速度論的解析を行ったところ、二重パラトープ抗体の標的抗原に対する結合速度は、単一パラトープ抗体に比べて僅かに遅かったが、解離速度に違いは見られなかった。一方、抗原陽性細胞への結合をフローサイトメトリーにより比較した結果、二重パラトープ抗体では、単一パラトープ抗体に比べて、僅かに大きなピークシフトを観測したことから、二重パラトープ抗体は細胞表面の標的受容体に対して、効果的に作用し得ることが示唆された。以上の結果から、本研究で構築したヘテロ四量体形成ペプチドを利用したタンパク質連結法は、抗体高機能化において汎用的かつ有用性の高い手法であると考えている。今後、本手法の更なる高度化を進め、革新的な抗体医薬創出に向けて展開したい。本研究では,ヘテロ4量体を形成する短鎖ペプチドを利用することによって,微生物発現系により,がん細胞を標的とする二重特異性抗体の調製を試みた結果,2種の標的分子に対して同時に結合する組換え抗体を作製することができた.

また,標的がん細胞に対する傷害性を評価したところ,市販の抗体医薬品と同等のがん細胞傷害性を有することがわかった.以上の結果から,本研究で構築した手法は,高機能抗体を安価に作製するために役立つと期待できる.本研究で開発したタンパク質連結法を用いて、高機能抗体の作製に成功したと考えているが、二重特異性抗体の調製および評価において、当初計画より多くの研究期間を要したことから、タンパク質連結法に関する汎用性の検討が遅れているため。タンパク質工学当初計画よりやや遅れているため、新たな組換え抗体について、迅速に調製・評価を行う。また、進捗状況を勘案しながら、作製する組換え抗体の種類を絞り込む必要性について検討する。抗体酵素複合体の調製系を確立する際に、当初計画より多くの研究期間を必要としたため。当初計画よりやや遅れているため、本年度に作製した組換え抗体について、迅速に調製・評価を行う。一方で、進捗状況を勘案しながら、評価項目を絞り込む必要性についても検討する。
津波被災地をフィールドとした下肢静脈エコー所見と止血機能検査の研究

我々は被災地環境がエコー所見に及ぼす影響を評価するため,津波被災地において深部静脈血栓症(DVT)検出を目的とした下肢静脈エコーと止血機能検査を実施した.期間中の被検者のDVT検出率は年毎に上昇した(発災後2-5年).ヒラメ静脈拡張所見はDVT検出とDVT持続の独立した危険因子であった.DVT持続群は消失群やDVT陰性群と比較してD-dimer値が有意に高値であった.被検者の脂質異常症有病率は年毎に増加し,最終年ではDVT陽性群でprothrombin activator inhibitor-1の有意な上昇を認めた.以上より環境がもたらす被災生活の変化はエコー所見に影響を及ぼした可能性がある.本研究は,震災被災地において深部静脈血栓症(deep vein thrombus:以下DVT)の検出を目的とした下肢静脈エコーと血液凝固線溶機能検査を実施し,被災環境がエコー所見に及ぼす影響を検討する.平成25年度は前年に引き続き,9月14日-15日に宮城県亘理郡(亘理町,山元町)の仮設住宅団地9か所で検診を希望する被災者230名(男性57名,女性173名,年齢72.1±10.0歳)を対象に実施した.背景因子は高血圧59.6%,糖尿病16.1%,脂質異常症48.0%で,脂質異常症は24年度(29.6%)と比較して有意に増加していた.DVTは5.7%(13名)に認め,24年度(4.2%)よりやや増加していた.新鮮血栓はなかった.D-dimer値は希望者57名で測定,1.0μg/ml以上の高値例は5.2%(3例)で,24年度(15.1%)より著しく減少していた.一方,NT proBNP値は希望者37名に実施,125pg/ml以上の高値例は48.6%(18例)で,24年度(44.1%)とほぼ同率であった.2年連続で検診を実施できた仮設団地7か所を比較すると,24年度はすべての団地からDVTが検出(4.7-11.8%,1-3例)されたのに対し,25年度は中山熊野堂(15.2%,7例)と公共ゾーン(6例,10.5%)の2ヵ所から集中的に検出された.2ヵ所の仮設団地は比較的規模が大きく,世帯数が多い傾向にあった.歩行回数と受診回数の変化は24年度と同様であった.本年度の町別のDVT検出率は山元町(7.2%)が亘理町(4.5%)より高かった.平成25年度に本研究と同様の検診を実施した他地区と比較すると,岩手県大槌町(11.0%),釜石市(9.5%),陸前高田市(8.4%)など三陸海岸沿岸部より検出率は低値であったが,福島県南相馬市(4.8%)とはほぼ同率であった.本研究は,震災被災地において深部静脈血栓症(deep vein thrombus:以下DVT)の検出を目的とした下肢静脈エコー検査(lower limb ultrasonography:以下LUS)と血液凝固線溶機能検査を実施し,被災環境がLUS所見と凝固線溶機能に及ぼす影響を検討する.平成24年度は,9月15日及び16日に宮城県亘理郡亘理町並びに山元町の仮設住宅団地9か所において,検診を希望する被災者354名(男性78名,女性276名,70.7±10.1歳)を対象にLUSを実施した.背景因子は高血圧54.7%,糖尿病14.0%,高脂血症29.6%であった.DVTは15例(4.2%)に認め,うち新鮮血栓(充満血栓)は1例であった.血液凝固線溶機能検査では,静脈拡張所見(直径>9mm)を有する被災者93名を対象にコバスh232(ラテックス凝集反応)を用いてD-dimerを測定したところ,D-dimer 1.0μg/ml以上を示した被災者は14例(15.1%)であった.平成24年4月に本研究と同様の手法で実施された岩手県大槌町(182名),釜石市(183名),陸前高田市(400名)の検診では,DVT検出率はそれぞれ8.8%,6.6%,6.8%であった.本研究のDVT検出率は亘理町(157名)が5.1%,山元町(199名)が3.6%であり,いずれも三陸海岸沿いの被災地の検出率を下回った.なお亘理郡のDVT検診では,震災後に10分以上の歩行回数が減少した受診者が64.0%に達していた.また震災後に通院回数が減少した受診者はJR常磐線が途絶している山元町に多く,特に周辺家屋の少ない山間部の仮設住宅地(中山地区)に多かった.以上の結果は,平成25年1月17日に開催された第18回日本集団災害医学会学術集会(兵庫県神戸市)において発表(口演)した.本研究は,震災被災地において深部静脈血栓症(deep vein thrombus:以下DVT)の検出を目的とした下肢静脈エコーと血液凝固線溶機能検査を実施し,被災環境がエコー所見に及ぼす影響を検討する.

平成26年度は過去2年に引き続き,11月1日-2日に宮城県亘理郡(亘理町,山元町)の仮設住宅地6ヶ所と保健センター1ヶ所で,検診を希望する被災者300名(男性63名,女性237名,年齢72.0±7.9歳)を対象に実施した.背景因子は高血圧54.8%,糖尿病14.0%,脂質異常症55.3%で,脂質異常症は24年度(29.6%),25年度(47.8%)と比較して有意に増加していた(p<0.0001).DVTは10.0%(30名)に認め,24年度(4.2%),25年度(8.3%)より有意に増加していた(p<0.05).D-dimer値は希望者95名で測定,1.0μg/ml以上の高値例は4.2%(4例)で,24年度(15.1%),25年度(5.2%)より減少していた.一方,NT proBNP値は希望者91名に実施,125pg/ml以上の高値例は49.5%(45例)で,24年度(44.1%),25年度(48.6%)とほぼ同率であった.本年度の町別のDVT検出率は亘理町(13.8%)と山元町(8.8%)より高かった.平成25年度に本研究と同様の検診を実施した他地区と比較すると,岩手県大槌町(13.1%),釜石市(12.3%),陸前高田市(10.5%)であり,平成24年は三陸沿岸地区より低かったが,本年度はほぼ同等となった.上記の点を日本集団災害学会や日本栓子検出と治療学会,日本脳卒中学会で発表した.一方,過去2年の検診結果を静脈拡張所見の有無で比較すると,拡張群ではDVTの存在と心疾患の既往歴が有意に多かった.下肢静脈の拡張所見はDVTや心疾患の予測因子になる可能性が示唆された.本研究は震災被災地において深部静脈血栓症(Deep vein thrombus:以下DVT)の検出を目的とした下肢静脈エコーと血液凝固線溶機能検査を実施し,被災環境がエコー所見に及ぼす影響を検討する.平成27年度は過去3年に引き続き,10月10日と11日に宮城県亘理郡(亘理町,山元町)の仮設住宅並びに在宅被災者247名(男性69名,女性178名,年齢69.8±11.3歳)を対象に検査を実施した.背景因子は高血圧48.6%,糖尿病15.8%,脂質異常症49.8%で,脂質異常症は24年度(29.6%)と比較し25年度(47.8%),26年度(55.3%)と同様高い検出率を示していた.DVTは27名(11.0%)で,24年度(4.5%),25年度(8.3%),26年度(10.3%)と右肩上がりの上昇は継続していた.凝固線溶機能では過去3年に引き続きD-dimerとPAI-1を任意で計測した(113名).このうちD-dimerはDVTなし群(0.39±0.43ng/dl),新鮮DVT群(0.54±0.50ng/dl),陳旧性DVT群(0.47±0.58ng/dl)とも有意差はなかったが,PAI-1はDVTなし群(23.2±11.7ng/dl)に対し,新鮮DVT群(30.0±29.5ng/dl),陳旧性DVT群(35.3±39.1ng/dl)で上昇傾向を認めた.上記の点を日本集団災害学会や日本栓子検出と治療学会で発表した.また被災地でのDVT検出に下腿静脈の拡張所見が関与することを下記の医学雑誌に報告した.前田文江,山村修ほか,被災地検診活動から得られたヒラメ静脈径拡張の関連因子について,医学検査65(1),p25-31, 2016本研究は被災地環境が下肢静脈エコー所見に及ぼす影響やDVT予防を目的とした保健活動の介入根拠となる指標を求める点にある.平成27年度も過去3年に引き続き亘理,山元両町でDVT検診を実施し,2日間で250名弱の被災者データを得た.被災地は仮設住宅段階から災害復興住宅段階へと移行しているが,DVT検出率は依然,高い数値を保っていることを報告した.また脂質異常症の増加とDVT検出率の上昇をつなげる因子として,脂質由来の線溶因子であるPAI-1を測定し,DVT陽性群で上昇傾向にあることを見出したことは予想外の結果であった.以上より,概ね順調に進展していると判断した.本研究は津波被災地において深部静脈血栓症(deep vein thrombus:DVT)の検出を目的とした下肢静脈エコーと血液凝固線溶機能検査を実施し,被災地環境が下肢静脈エコー所見に及ぼす影響を検討した.
ウミユリ類の再生における神経の役割の分子機構の解明

(1)腕の再生中のニッポンウミシダ個体における神経節特異的に発現する遺伝子を特定化する目的で、腕を切断してから1時間後、5時間後、1日後、再生芽が形成され始める3日後、神経索が再生芽に入り込む1週間後の個体と、無処理の個体の神経節からRNAを抽出した。これらをプローブにウミシダの神経節のマイクロアレイを用いて、スクリーニングすることを試みた。高品質のRNAを得ることはできたが、残念なことに、神戸理化学研究所のマイクロアレイ解析機器の不具合が続き、遺伝子の特定化はできなかった。萌芽研究の研究期間は終了したが、機器の機能を回復させ、引き続きスクリーニングを継続する予定である。(2)腕の再生過程においても、再生芽に神経索が進入すると分節構造が形成されることを確認した。神経索からのシグナルの標的となるウミシダ腕の再生過程における分節機構を解析する目的で、脊椎動物の体節形成に関わるNotchおよびHes遺伝子のウミシダ相同遺伝子OjNotch,0jHesを単離し、in situ hybridizationによる発現解析を行った。その結果、再生腕の歩帯溝および体腔壁で両遺伝子の発現が見られたほか、後期再生腕の反口側組織において、OjHesの縞上の発現が見られた。縞の間隔は分節の幅と対応することから、分節形成にOjHesが関わることが示唆された。一方、正常な腕の形成では、OjHesの縞上の発現が見られないことから、比較的長時間かけて形成される分節構造にはOjHesは関わらず、何らかの別の機構により、分節単位が形成されることが示唆された。今後は、再生における神経節・神経索からのシグナルによる、OjHes等の標的遺伝子の発現調節機構を解析する予定である。これらをプローブにウミシダの神経節のマイクロアレイを用いて、スクリーニングすることを試みたが、高品質のRNAを抽出することに多大な時間がかかるとともに、神戸理化学研究所の機器にトラブルが生じたため、昨年度は遺伝子の特定化はできなかった。したがって、今年度も再生時に神経節で特異的に発現する遺伝子の特定化を継続することになった。一方、(2)実験動物として安定的に確保するための飼育技術の開発は順調に進み、卵から性成熟に至るまで、隔離施設内で多数の個体を得られるようになった。また、(3)形態的解析により、初期の再生芽の未分化細胞の集団から、骨片の形成、再生芽への神経の進入と靭帯の形成、筋肉の形成という過程を経て腕の分節構造が分化することが明らかになった。(4)脊椎動物の分節形成に重要な役割を果たすNotchとhairyホモログをニッポンウミシダからクローニングし、in situhybridizationにより再生芽における発現パターンを解析したところ、Notchは腕の先端の未分化な細胞集団の領域で発現し、その発現境界は、未分化細胞集団と分節形成が起こっている領域との境界にほぼ一致することが明らかになった。これにより、棘皮動物の分節形成においても、脊椎動物と同様の分子メカニズムが用いられていることが強く示唆され、新口動物における分節形成の分子機構は保存されている可能性を示すことができた。Hairyについては解析中である。
神経麻痺性角膜症の病態解明と治療法の開発

臨床的に難治の遷延性角膜上皮欠損の多くの症例は角膜知覚が著しく低下した症例であり,角膜上皮の創傷治癒過程における知覚神経系の役割の重要性が示唆されている。本研究では,角膜上皮に対するsubstance PとIGF-1の相乗作用の作用機序を明らかにし,臨床的に現在の医学知識では難治である神経麻痺性角膜症の病態解明と新しい治療法の開発を目的とした。平成9年度および10年度で下記について明らかとなった。2. IGF-1と相乗作用を示すsubstance Pの最小必須アミノ酸配列はC末端の4個のアミノ酸(FGLM)であることを,in vitroの角膜上皮伸長モデルおよびin vivo角膜上皮剥離モデルで明らかにした。3. Substance PあるいはFGLMおよびIGF-1を角膜上皮細胞に処理することにより,フィブロネクチン受容体(インテグリンα5β1)のタンパク質およびmRNAの発現を亢進させることが明らかとなった。また,substance PとIGF-1を角膜上皮細胞に処理することにより,細胞接着に関与するfocal adhesionkinaseおよびpaxillinのリン酸化が活性化されることが明らかとなった。4. Substance PとIGF-1の点眼療法およびFGLMとIGF-1の点眼療法が神経麻痺性角膜症の症例に対して有効であることが明らかとなった。本研究は,角膜上皮に対するsubstance PとIGF-1の相乗作用の作用機序を明らかにし、臨床的に現在の医学知識では難治である神経麻痺性角膜症の病態解明と新しい治療法の開発を目的とする。本年度は,下記について明らかとなった。1)角膜器官培養系を用いて,培養液中にPKC,PKA,PKGを促進あるいは阻害する薬剤を添加してsubstance PとIGF-1により促進された家兎角膜上皮の伸長を検討したところ,PKCシグナル伝達系が主として関与していることが明らかとなった。2)substance PおよびIGF-1によりをヒト不死化角膜上皮細胞におけるintegrin α5,β1に対するのmRNA発現が促進した。3)substance Pを構成する11個のアミノ酸配列をもとにした各種のペプチドを家兎角膜組織培養系に添加しIGF-1との相乗作用を示す最小必須配列を検索したところ,substance PのC端の4個のアミノ酸配列(F-G-L-M)がIGF-1との相乗作用を示す最少必要アミノ酸配列であることが明らかとなった。5)substance PおよびIGF-1の添加によるMAP kinaseの変化は認めなかったが,focal adhesion kinase(FAK)のリン酸化が促進された。1. IGF-1と相乗作用を示すSubstance PのC末端の4個のアミノ酸配列(FGLM)は,in vivoウサギ角膜上皮剥離モデルにおいて,それ単独では効果を示さないが,IGF-1と組み合わせて点眼することにより,角膜上皮創傷治癒を促進させることが明らかとなった。2. FGLMおよびIGF-1を角膜上皮細胞に処理することにより,フィブロネクチン・マトリックスへの接着性が亢進し,さらにフィブロネクチン受容体(インテグリンα5β1)のタンパク質およびmRNAの発現を亢進させることが明らかとなった。3.学内IRBの承認を得て,FGLMおよびIGF-1を神経麻痺性角膜症の症例に対して治療,点眼することにより,遷延性角膜上皮欠損が治癒した。

平成9年度および10年度に得た研究成績をもとに,今後更にsubstance PあるいはFGLMとIGF-1の角膜上皮創傷治癒促進作用の機序を細胞内シグナル伝達系の関与を中心に解析を進めることが薬効薬理および遷延性角膜上皮欠損の病態の解明に役立つと考える。一方,臨床的にもこの新規の治療法の有用性を確立するための多数例での臨床試験が必要である。
クラスター効果を利用した抗インフルエンザ薬の開発

A型インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるHAは3量体を形成することで非常に強く標的細胞に結合する(クラスター効果).本研究では,このクラスター効果に基づく高親和性結合を阻害する阻害剤を開発するための新しい方法,多価型ペプチドライブラリー法を用いて, HA3量体に特異的かつ高親和性に結合するペプチドモチーフを同定した。本モチーフを有する化合物は,ウイルス粒子の標的細胞への侵入を強力に阻害するペプチド性阻害剤として期待される.A型インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるHAは3量体を形成することで非常に強く標的細胞に結合する(クラスター効果).本研究では,このクラスター効果に基づく高親和性結合を阻害する阻害剤を開発するための新しい方法,多価型ペプチドライブラリー法を用いて, HA3量体に特異的かつ高親和性に結合するペプチドモチーフを同定した。本モチーフを有する化合物は,ウイルス粒子の標的細胞への侵入を強力に阻害するペプチド性阻害剤として期待される.A型インフルエンザウイルスのHAは標的細胞上に存在するシアル酸を受容体として認識、結合し、ウイルスの細胞内への侵入に中心的な役割を果たしている。本研究では、我々が独自に開発したマルチバレントペプチドライブラリー法を用いて、HA3量体に特異的かつ高親和性に結合し、ウイルス粒子の標的細胞への侵入を強力に阻害するペプチド性阻害剤を開発することを目的とする。1,野生型HAならびにシアル酸結合部位に変異を有するHAの大量調製HAのシアル酸結合サイトに特異的に結合するペプチドモチーフを決定するために、ライブラリーのスクリーニングは、野生型HAカラムならびにシアル酸結合サイトに変異を有するHA(L194A)カラムの2種を用いて行う。本年度は、バキュロウイルス発現系を用いて、C末端にHis-tagを有する野生型HAならびにL194Aを大量に調製し、L194Aでは赤血球凝集活性が完全に消失していることを確認した。これらHAを用い、アフィニティーカラムを作成した。2,HAに対して最適化したマルチバレントペプチドライブラリーの作成本研究では、HA3量体とシアル酸との結合にはクラスター効果が存在することに着目し、ペプチドライブラリー自体を多価にしたマルチバレントペプチドライブラリーを作成する。本年度は、末端のライブラリー部と核構造を結ぶスペーサー長が異なる一連のマルチバレントペプチドライブラリーを作成し、野生型HAに対する結合活性を比較し、最終的にHAに対して最適化したマルチバレントペプチドライブラリーの構造を決定した。現在、得られたマルチバレントペプチドライブラリーを1次ライブラリーとして、1で得られた野生型HAならびにL194Aアフィニティーカラムを用いたスクリーニングを進めている。本検討により、HAのシアル酸結合部位への結合に中心的な役割を果たすと考えられるアミノ酸が同定されるものと考えられ、このアミノ酸をlocking Positionとして導入し、HAに対してさらに結合親和性に優れたた2次ライブラリーが作成できると期待される。1)2次ライブラリーの作成前年度までの成果をもとに同定した、HAに最適化したマルチバレントペプチドライブラリー(1次ライブラリー)を用い、野生型HAカラムならびにシアル酸結合サイトに変異を有するH:A(L194A)カラムの2種を用いてスクリーニングを行った。本検討により結合に中心的な役割を果たすと考えられるアミノ酸として、Arg、Lys、Valを同定することができた。これらのアミノ酸をlockingpositionとして導入した2次ライブラリー、すなわちXXX-Arg-XXX,XXX・Lys-XXX,XXX・Val-XXX)を4個持ち、HAに対してより結合親和性に優れた2次ライブラリーを合成した。2)HAシアル酸結合部位特異的結合モチーフの同定本2次ライブラリーのスクリーニングは、同様に野生型HAカラムならびにH:A(L194A)カラムの2種を用いて行った。野生型HAカラムを用いて得られた結合モチーフから、ミュータントHAカラムを用いて得られた結合モチーフを差し引くことにより、HAのシアル酸結合サイトに特異的に結合するペプチドモチーフを決定することができた。1.ペプチド性HA阻害剤の活性評価(1)生化学的検討2年目の成果により決定した2種のHA結合モチーフを、1年目で決定したHAに結合するための多価型ペプチドライブラリーの最適核構造と全く同じ核構造に組み込み、4価のペプチド性HA阻害剤を化学合成した。これら2種の新規HA阻害剤(RVとKRと呼ぶ)のHA結合活性について、ビアコアを用いた結合速度解析を行い、結合定数を算出した。その結果、RV,KRともにsubmicroMオーダーの非常に強い結合活性を示すこと、さらにRVについては、シアル酸結合サイトに変異を有するHAミュータント(L194A)に対しては結合定数が数倍に増加したことから、シアル酸結合サイトに特異的に結合していると考えられる。HAによるRBCの凝集活性に対するRV,KRの阻害効果を検討したところ、RV,KRは単独でRBCに結合する活性を有していたため、活性評価には至っていない。そこで、実際のウイルス増殖に対する効果を検討することとした。(2)インフルエンザウイルスに対する阻害活性の検討MDCK細胞を用いて、実際の臨床分離H1N1インフルエンザウイルスの増殖活性を測定する系の確立を試みた。これまでにMDCKでの増殖培養における、ウイルスのタイター、寒天培地中のトリプシン濃度、等の最適化を行い、再現性よくインフルエンザウイルスの増殖活性を測定する系を確立することができた。現在本系を用いて得られたペプチド性HA阻害剤RV,KRの活性評価を行っている。
安全かつ強固な新しい腰仙椎固定術式の開発と難治性強度脊柱変形への学際的挑戦

深部脳神経刺激を施行したパーキンソン脊柱変形患者の、脊柱変形手術の術後成績に関して前向きに研究を行い、上位胸椎から腰仙骨まで固定を行うと、腰痛が非常によく軽減することが明らかとなり、また、従来の報告と異なり術後2年の時点まで再手術やインストルメントの破綻は生じなかった。従来パーキンソン脊柱変形に対して、手術治療は行うべきではないとの意見も多いが、今回の成果はこれらを克服しうる内容であると考えられた。また、解剖学的試験から仙骨前面での神経根損傷や大血管損傷に関する検討を行い、不適切なスクリュー設置は神経損傷、大血管損傷の可能性があることを明らかとした。パーキンソン脊柱変形手術に対する、広範囲固定術を行いその中期成績が明らかとなった。非常に疼痛軽減効果が高いばかりでなく、従来報告されているような手術合併症も少ない結果であった。従来、パーキンソン脊柱変形手術は非常に合併症が多く手術はむしろ禁忌と主張している報告もある。しかしながら、それら報告の多くは近年急速に進歩した、spino-pelvic parameterを全く考慮していないばかりでなく、短い固定範囲にとどめた手術方法が選択されているものが多い。我々はspino-pelvic harmonizationを目指すとともに重心の前倒れに伴う後弯変形防止のため、基本的にTh3ー仙腸骨固定を施行した。その結果中期成績として合併症なく経過した。これらから、パーキンソン脊柱変形は全身性疾患で徐々に脊柱後弯が進行するため、短い固定範囲では固定上位での脊柱変形がさらに進行すること、かつspino-pelvic parameterを考慮しないと、それらの調和がとれていない場合に、固定範囲内あるいは固定範囲外のどこかで調和をとる代償機構が働くことが通常よりも大きく、従来報告のような手術方式では、インストルメントバックアウトや上位端での骨折などいわゆるproximal junctional failureが多い原因であろうことを推察した。臨床研究としては名古屋市立大学病院脳神経外科にて深部脳神経刺激療法をおこなったパーキンソン患者のうち、脊柱変形が進行して強度腰背部痛を来した患者群に対して胸腰仙椎固定術を施行した。これら患者群では上位胸椎から仙骨固定を行うとインストルメントが破綻する事なく、良好な固定が維持されていたが、1例腰仙椎固定を施行しなかった症例に置いてはインストルメントがバックアウトした。仙腸骨まで固定アンカーを延ばして再手術を行いその後の経過は良好である。強度腰痛を訴え、坐位バランスも不良かつ坐位でも疼痛が認められた患者が、坐位での疼痛が軽減するのみならず歩行時の腰痛も軽減し、歩行能力も改善した。安易にshort fusionを行うべきではなく、胸椎、仙腸骨まで含めた矯正固定が必要であることを明らかとした。パーキンソン脊柱変形に対するDBS治療後の脊柱変形矯正術は、従来報告されているようなインストルメント破綻の危険や矯正損失も少ない事を明らかとした。基礎的研究としては安全な腰仙椎固定のための、仙骨前面の解剖に関して、3次元造影CTを用いて、特に腸骨動静脈とスクリューの位置関係に関して詳細に検討を加えるためにCTデータを蓄積し安全なスクリュー経路と腸骨動静脈との位置関係に関して一定のデータを得ているがさらに詳細な検討を加えるためにデータを集積中である。また、同様に腰仙腸骨固定術後の仙腸関節の生体力学的動態に関する基礎的データを集積中である。パーキンソン脊柱変形に対する変形矯正固定術の手術後成績に関して、非常に疼痛が改善し、疼痛改善状態が術後2年にわたり持続されることを明らかとした。また、従来パーキンソン脊柱変形手術は、固定上位での更なる急激な変形の悪化、術後インストルメント破綻、術後隣接椎間障害などの合併症が多く、手術は禁忌とする意見もあったが、その原因として従来の報告ではshort fusionからlong fusionまで混在しておりその固定範囲など手術適応が曖昧であったことがあげられる。我々は、パーキンソン脊柱変形患者に対する手術成績を検討し、上位胸椎から仙腸骨まで固定することで、術後2年時インストルメントの破綻症例が皆無であったこと、すなわち、パーキンソン脊柱変形に対する固定術はlong fusionを行うことで、手術成績に一定の効果がもたらされることを初めて報告した。さらなる長期成績を検討してゆく必要がある。また、生体力学試験、解剖学的研究においては仙骨前面における仙骨神経、腰神経根とスクリュー刺入位置に関する新たな知見をもたらし、スクリュー刺入位置が適切でないと神経根損傷が生じうる可能性を明らかとした。具体的には仙骨前面を貫通するスクリューが外側方向に触れすぎた場合には第5腰神経根損傷が生じる可能性があることを明らかとした。また、成人脊柱変形手術における腰仙椎固定の成績を明らかとし、さらに、成人脊柱変形手術の低侵襲化をもたらすために、側方固定術の意義と有用性、問題点に関して検討を行い、側方固定術は明らかに出血量が軽減できることを報告した。

脊椎脊椎外科学パーキンソン脊柱変形手術の中期成績が明らかとなってきた。パーキンソン脊柱変形に対する固定術の腰痛軽減効果を明らかとした有限要素解析法を用いて仙腸関節椎固定術の3次元的動態解析を行う。また、CTデータから骨密度を測定する方法(Zink et al 1997; Eur Radiol)に準じて骨密度を測定し、仙骨の骨密度の3次元分布を明らかにする。加えて、スクリュー引き抜き強度と骨密度との相関関係を明らかにする。引き続き、パーキンソン脊椎変形患者に対する矯正固定術積み重ねてゆき、臨床的有用性を明らかにしていく。有限要素解析法を用いて仙腸関節及び腰仙椎固定術の3次元的動態解析を行う。また、CTデータから骨密度を測定する方法(Zink et al 1997; Eur Radiol)に準じて骨密度を計測し、仙骨の骨密度の3次元分布を明らかにする。引き続き、パーキンソン脊柱変形患者に対する矯正固定術積み重ねてゆき臨床的有用性を明らかにしてゆく実験の進捗状況はおおむね順調であるが、実験計画全体から翌年度に行うこととなった実験が生じたため。CT画像解析、スクリュー強度解析などに使用する。解剖屍体を用いたスクリュー刺入経路の解析のために、スクリュー等の手術機械及び器具購入、画像解析、英語論文校閲および学会出張旅費に充当する
マクロファージのTNF-α及びケモカイン遺伝子の発現を抑制する寄生虫因子の研究

マクロファージをLPSまたはIFN-γ刺激で刺激すると、IP-10ケモカインが発現するが、これらのIP-10の遺伝子発現をマンソン裂頭条虫擬充尾虫の排泄・分泌物質(ES)は抑制した。しかし、IRF-1の発現は抑制されなかった。IP-10はLPS刺激ではTLR4の細胞質領域が会合するMyD88非依存性経路でIFN-βの産生を介して発現するが、ESはIFN-βの発現を抑制するだけでなく、IFN-β刺激によるIP-10遺伝子の発現も抑制することがRT-PCRで認められた。そして、Western blotでLPS刺激による3時間後のSTAT1 Tyr701のリン酸化はESによって阻害された。一方、IFN-γ刺激によるSTAT1 Tyr701のリン酸化はESによって阻害されなかった。ゲルシフトアッセイでIFN-γ,IFN-β刺激によるSTAT1のDNA結合活性を検討したが抑制されておらず、IFN-β刺激によるISGF3のDNA結合活性も抑制されていなかった。また、NF-κBの核移行も抑制されなかった。そこで、IP-10のIFN-γ,LPSによる最小応答領域である-243プロモーター・エンハンサー領域を組み込んだレポーター遺伝子を作成し、luciferase assayによってESの影響を検討したところ、いずれの刺激による活性化も抑制された。これらの結果は、ESによるIP-10の遺伝子発現抑制の機序が、STAT1、NF-κBのDNA結合活性を抑制するのではなく、IP-10プロモーターの構成的な転写活性の抑制によるものである可能性が示唆された。また、ESはLPS, IFN-γ,CpG-DNAのいずれの刺激によるiNOSの遺伝子発現も抑制し,nitrite産生も抑制した。しかし,IFN-γ刺激群では,MHC-II及びCIITAの遺伝子発現がES添加によって上昇した。マンソン裂頭条虫擬充尾虫の排泄・分泌物質(ES)がLPSで活性化したマクロファージのTNF-α遺伝子発現を抑制する機序について検討した。gel shift assayでは、LPS刺激によるNF-кB核への移行は、ESによって抑制されていなかった。そこで、MAP kinaseのリン酸化に対するESの影響をマクロファージ細胞株RAW264.7を用いて検討した。マクロファージはp38 MAP kinaseのinhibitorであるSB203580またはextracellular signal regulated kinase(ERK)inhibitorであるPD98059の1時間の前処置によってLPS刺激によるp38 MAPKおよびERKのリン酸化の抑制が認められるとともに、TNF-αの遺伝子発現の抑制が認め与れた。次にマクロファージにESを添加しWestern blotを行うと、ESによってp38 MAPKおよびERKのリン酸化の抑制が観察された。次に、マクロファージ細胞株RAW264.7のLPS応答性形態変化に於けるMAPKの約割およびESの影響について検討した。RAW264.7細胞にSB203580及びPD98059を添加し、1時間後にLPSを加えて24時間培養したところ、LPS応答性の細胞の形態変化はほぼ完全に阻害された。また、ES添加によってもLPS応答性の細胞の形態変化が阻害された。ESによるpreincubation時に同時にpuromycinを加えて蛋白合成を阻害しても、LPS応答性の細胞変化に対するESの阻害作用が持続した。

それゆえ、ESによるマクロファージのLPS応答性の形態変化の抑制は、新たな蛋白の育成を介さずに、ERKおよびp38 MAPKのリン酸化が抑制されるためと推祭され、TNF-αの遺伝子発現抑制因子と同一の因子である可能性が示唆された。次に、マクロファージにおいて。MyD88非依存性経路で活性化するIP-10ケモカインの遺伝子発現の抑制について検討した。マウス腹腔マクロファージと擬充尾虫を前培養後、LPSを添加するとマクロファージのIP-10遺伝子の発現は前培養の時間依存的に抑制された。LPS、IFN-γ,IFN-βのいずれの刺激によって誘導されたIP-10もESによって抑制されることが、Northern blotまたはRT-PCRで明らかになった。また、LPSやIFN-γ刺激によるIP-10の遺伝子発現はp38 MAPK阻害剤(SB208530)やERK阻害剤(PD98059)で抑制された。しかし、IRF-1はESやMAPK阻害剤で抑制されず、IP-10遺伝子に特異的な抑制と考えられた。LPSによるIP-10の抑制は、IFN-βの発現が抑制され、そのためにSTAT1 Y701のリン酸化が抑制されるためと考えられた。IFN-γとLPS共刺激によるIP-10の発現については、STAT1 Y701もSer727もESによってそのリン酸化は抑制されず、またゲルシフトアッセイでもSTAT-1やISGR3の核への移行は抑制されていなかった。今後p300などのcoactivatorやTATA boxに結合する基本転写因子群などの抑制機序との関連を検討したい。マクロファージをLPSまたはIFN-γ刺激で刺激すると、IP-10ケモカインが発現するが、これらのIP-10の遺伝子発現をマンソン裂頭条虫擬充尾虫の排泄・分泌物質(ES)は抑制した。しかし、IRF-1の発現は抑制されなかった。IP-10はLPS刺激ではTLR4の細胞質領域が会合するMyD88非依存性経路でIFN-βの産生を介して発現するが、ESはIFN-βの発現を抑制するだけでなく、IFN-β刺激によるIP-10遺伝子の発現も抑制することがRT-PCRで認められた。そして、Western blotでLPS刺激による3時間後のSTAT1 Tyr701のリン酸化はESによって阻害された。一方、IFN-γ刺激によるSTAT1 Tyr701のリン酸化はESによって阻害されなかった。ゲルシフトアッセイでIFN-γ,IFN-β刺激によるSTAT1のDNA結合活性を検討したが抑制されておらず、IFN-β刺激によるISGF3のDNA結合活性も抑制されていなかった。また、NF-κBの核移行も抑制されなかった。そこで、IP-10のIFN-γ,LPSによる最小応答領域である-243プロモーター・エンハンサー領域を組み込んだレポーター遺伝子を作成し、luciferase assayによってESの影響を検討したところ、いずれの刺激による活性化も抑制された。これらの結果は、ESによるIP-10の遺伝子発現抑制の機序が、STAT1、NF-κBのDNA結合活性を抑制するのではなく、IP-10プロモーターの構成的な転写活性の抑制によるものである可能性が示唆された。
陽電子大量生産方式の開発

本試験研究で以下の成果を挙げた。1.LINACによる陽電子の生産効率の向上:X線照射でW内に対創成した陽電子を外部に引き出す以下の2通りの方法を開発して,陽電子発生効率を向上させ実用化した.(1)「多層光子-陽電子変換器」:LINACを用いて発生するX線照射でW内に対創成した陽電子は熱化して表面より放出する。この放出面積を十分広くして収率を挙げ、且つこれを引き出すことが出来る構造の変換器を開発した。種々の性能をもったLINACにも適用できる発生率の算定方法も併せて見いだし、その適用性を確認した。(2)「光子-非熱化陽電子変換器」:W面から熱化しないで放出する陽電子を同時に取り出すことで、陽電子生産率が抜本的に向上することを見いだした。この変換器は構造が簡単で作り易い特長がある。実際の試験では、その発生率は、エネルギーが30MeVと低い0.5A-LINACビームで、2×10^<13>[e^+/s]に達し、時間平均で8×10^9[e^+/s]となる。2.発生した陽電子を再減速するものとして、陽電子の取り扱いに必要な超高真空と適応性がよい、高効率の窒素ガスの氷薄膜を用いる方法を開発した。実験によって、減速効率は陽電子のエネルギーに依存するが、数%以上である。(2)の陽電子流にこの減速法を適用して、エネルギーが6eV以下の陽電子の生産率が時間平均で3×10^7[e^+/s]に達することを示した。3.減速した低速陽電子の蓄積・閉じ込め方法、陽電子のエネルギー依存性の小さい移送用磁場ダクト、陽電子放出W板表面処理法等に関しても開発の成果を挙げた。今後、開発した方式が他の研究者・機関で採用し易くするための報告を順次していく予定である。また、この方式開発を始めた動機であった、陽電子プラズマの形成とその物性に関する研究に、開発した方式を活用していくことにしている。京都大学原子炉実験所線形加速器KURII-LINACの出力電子ビ-ムをTa標的に照射して発生するX線をW-薄膜で構成する「多層光子-陽電子変換器」(Modular Photon-Positron Conveter:MPPC)を透過させる。W内に発生する対創生陽電子は熱化され、表面より低速陽電子として取り出すことが出来る。この際のMPPCを高効率なものにして、大量の低速陽電子を生産する方式を開発するのが本研究の目的である。平成3年度では、試験装置の主要部を設計製作するとともに、その機能をテストし、第一段階としての低速陽電子の発生テストを行った。1.検討・設計・製作:まず、MPPCの最適な構造を決定する手段として計算機コ-ド:EGS4を利用する方法を開発し、低速陽電子の発生率を予想することを可能にした。この方法とMPPC内部の陽電子軌道の詳細な検討から、変換器の効率向上にとって最適な構造決定ができるようになった。テストを目的とした5モジュ-ルからなるMPPCを製作するとともに、試験に必要な構成要素である、低速陽電子移送用磁場ガイドチャンネル(9m長)、真空排気系、計測系を製作・設置した。2.実験テスト結果:

(1)磁場チャンネル終端における低速陽電子流を対消減のX線同時計測法で検出し、全システムを通して低速陽電子が出力端より取り出せていることを確認した。(2)テスト用MPPCからの低速用電子流は、LINACビ-ムパルス中で6×10^<11>[e^+/s]であり、ビ-ムサイクル100ppsでの時間平均は2.4×10^8[e^+/s]である。(3)効率向上に効果があるW薄膜表面を清浄にする方法として、水素ガス高周波放電の適用が有効であることも実験的に確認した。3.次年度には本格的なMPPCを製作して、時間平均発生率を1桁以上あげる予定である。線形電子加速器を用いて発生するX線バーストを大量の低速陽電子に変換する方法を開発することが本研究の目的である。具体的には、加速器には京大・原子炉実験所の30MeV KURRI-LINACを用い、開発対象になる変換方法として「多層光子-陽電子変換器」(MPPC)を採用している。本計画第2年次の平成4年度では、前年度の構成部分の個別テストを踏まえ、加速器→MPPC→陽電子輸送磁場ダクト→蓄積器の全システムを通じての総合的運転を行って、MPPCの機能の総合評価をした。この際、磁場発生用に定電圧/定電流直流電源2台を設置している。得られた結果は以下の通りである。(2)発生率の全システムを考慮した評価を行った。LINACのX線発生からMPPC内の陽電子発生に関しては,モンテ-カルロ法による粒子シミュレーション(EGS4 code)で予測した。MPPC内での陽電子の熱化とその引き出しの機構にはモデル化と軌道計算を適用する。このようにして得られる低速陽電子の全体の収率予測は実験値とよい一致をみた。この開発した評価法はシステムの最適化の検討に有用である。MPPCは熱化陽電子を引き出す方法であるが、非熱化陽電子を引き出す方法(PNTPC)を大量陽電子生産に適用する試みも行った。この方式はMPPCに比べて構造が簡単である。発生率は1X10^<12>[e^+/s]に達した。また、低速陽電子を極低温冷凍器ヘッド上にキセノン固体薄膜で再減速して、更に低速陽電子を作ることも試みた。減速で約10%の効率で温度換算2eVまで減速することが出来た。本試験研究の最終年度であるので、最終まとめのための研究を以下のように行った。X線照射でW内に対創生した陽電子の中で熱化しないで表面より放出する非熱化陽電子も熱化陽電子と同時に引き出すことを試みて、格段に大きな発生率を実現することが可能になった。用いているLINACの電子ビームエネルギーは30MeVと低いけれども、大表面積のW薄板を用いて発生する低速(<3keV)陽電子のビームは、照射時間中での発生率:2X10^<13>[e^+/s]に達した。(ii)非熱化陽電子はエネルギーに広がりがある。これを再減速して低エネルギー陽電子に変換するためには、効率のよい減速器が必要となる。本研究では、低温の金属面に形成されるXe、Ar、N2ガスの氷薄膜を減速材に用いた。減速効率は最大で8%に達し、特にいままで報告されていないN2の氷が有効であることを見いだした。減速材にW結晶を用いる場合等に比して、任意の大表面の減速材が実現出来るわけである。(iii)減速した陽電子を利用するためには、それを蓄積することが必要である。ペニングトラップを用いる方式で、減速した陽電子を閉じ込め、LINACの1ビームパルス当り3X10^5個の陽電子をため込んだ。多パルスの溜込みも試みたが、閉じ込めの時間が10msと短いため、溜込み粒子数の増大は今のところ大きくはない。
写実的な画像合成のための高速なレイトレーシング

コンピュータグラフィックスを用いた写実的な画像の生成は、光の経路をコンピュータ上で追跡することで行われる。光は物体に当たるまでは直線状を進むと仮定すると、この計算では、光源を出た光や他の物体から反射した光が、どの物体のどの位置に当たるかを求める必要がある。この計算はレイトレーシングと呼ばれ、写実的な画像の生成の基本となる計算である。この計算の高速化は写実的な画像の生成の高速化につながり、映画やデザイン産業において有用である。本研究では、レイトレーシングの計算を高速化するための、acceleration data structureという技術について、既存の手法を超えた高速化を目指す。
新たな発がん理論に基づくがん予防食素材のスクリーニングシステムの構築

新しい発がん理論であるがん幹細胞理論に基づいた前立腺がんの一次および二次予防に有効な予防食素材をスクリーニングするシステムの構築を目的とした。新たな三次元培養法とがん幹細胞形成選択培地を用いて、sphere形成能を指標にした前立腺がん幹細胞分離法の構築に成功した。この分離した前立腺がん幹細胞を用いて、すでに前立腺がん予防食素材としての可能性が示されているアナトー由来のトコトリエノール(delta-tocotrienol 90%以上含有)に強力な前立腺がん幹細胞抑制作用があることが示された。以上、本研究を通じて、がん幹細胞理論に基づいた新たな前立腺がん予防食素材のスクリーニング法が構築された.国内外のセルバンクから入手可能な男性ホルモン依存性および非依存性のヒト前立腺癌細胞を購入し、各メーカーの低吸着性細胞培養プレートないしは細胞の吸着性を低下させる試薬(polyHEMA)で前処理をした細胞プレートと癌幹細胞形成選択培地を用いて、sphere形成能を指標に前立腺癌幹細胞の分離を試みた。その結果、ホルモン非依存性前立腺癌細胞(LNCaP)およびホルモン非依存性前立腺癌細胞(PC3)からそれぞれ、sphere形成能が高いクローンの分離に成功した。次に、sphere形成能が高いクローンの中で、癌幹細胞マーカー(CD24, CD44, SOX2, CD133)の発現レベルが高い癌幹細胞が濃縮されているクローンを選択した。この選択したクローンを用いて通常の2次元培養を行った時、何継代で幹細胞性が消失するか検討し、5継代で幹細胞性が消失することが判明した。この結果から以後の検討には、幹細胞分離後4継代目までのクローンを使用することにした。さらに、最終的にsphere形成能が高いクローンの幹細胞性を確認するために、ヌードマウスに移植し、腫瘍形成能を野生株と比較したところ、sphere形成能が高いクローンほど腫瘍形成能が高く、spehere形成能が高いクローンに癌幹細胞が濃縮されていることが確認された。最後に、野生株と幹細胞が濃縮されたクローンの癌幹細胞の形質の最大の特徴である低酸素適応能力を比較したところ、後者の方が高い低酸素適応性を示した。以上、前立腺癌幹細胞を標的にした癌予防・治療に有効なファイトケミカルをスクリーニングする評価系が構築できた。低吸着性細胞培養と癌幹細胞培養用選択培地を組み合わせることで、前立腺癌幹細胞を豊富に含むクローンの分離に成功した。また、このクローンの幹細胞性は複数の癌幹細胞マーカーの高発現、ヌードマウス移植系における高腫瘍形成能、高い低酸素条件適応性から確認された。さらに、男性ホルモン依存性および非依存性の前立腺細胞株から癌幹細胞を濃縮できたことから、この細胞培養系を使って、前立腺癌予防および治療に有効な機能性成分のスクリーニングが可能になると推測された。以上、本年度に計画した幹細胞培養系の確立とその培養系を使ったスクリーニングシステムの構築は達成されたと判断できる。ビタミンE同族体の中で一番抗がん活性が高いdeltaートコトリエノール(T3)を90%以上含んだアナトー由来T3(AT3)を使用して、ホルモン非依存性前立腺癌細胞LNCaPおよびホルモン非依存性前立腺癌細胞PC3から濃縮したがん幹細胞に対する効果を検証した。その結果、AT3処理により前立腺がん幹細胞の低酸素分圧適応が有意に阻害されると同時に、PC3由来のがん幹細胞画分をヌードマウスに移植したモデル実験においても、AT3による造腫瘍形成能の抑制が認められ、in vitro及びin vivoの両方の系において、AT3の優れた前立腺がん幹細胞抑制作用が示された。次にAT3による前立腺がん幹細胞の低酸素適応阻害作用機序の解析を行った。まず、低酸素応答機構の重要な因子であるhypoxia-inducible factors(HIF-1alpha, HIF-2alpha)レベルに対して、AT3は抑制効果を示した。また、HIFsシグナル系の上流に位置し、HIFsを安定化させることが知られている非受容体型キナーゼ(SFKs)の活性化をAT3が抑制することが示され、AT3による前立腺がん幹細胞の低酸素適応阻害作用機序の1つとして、AT3によるSFKs活性化抑制を介したHIFsの不安定化が関与していることが推測された。その推測はSFKs阻害剤(PP2)を使用した研究結果からも裏付けられた。最後に、HIFs特異的な阻害剤を使用して、AT3による前立腺がん幹細胞の低酸素適応阻害作用にHIFsのどちらの分子種が関与しているか検討したところ、HIF-1alphaが関与していることが明らかになった。以上の研究結果をまとめると、本研究を通じて、前立腺がん幹細胞を標的にした前立腺がん予防食素材のスクリーニングシステムが構築できたと結論付ける。以上、本研究を通じて、がん幹細胞理論に基づいた新たな前立腺がん予防食素材のスクリーニング法が構築された.まず、前立腺癌の予防・治療に有効と思われる食機能性素材をデーターベースから絞り込む。その有効性をメタ分析等の統計学的手法で検証し、可能性が高い予防成分をさらに絞り込む。

絞り込まれた成分を用いて、通常の培養系で前立腺癌細胞の増殖抑制効果を検証し、その有効濃度が臨床応用可能な濃度かを確認し、本研究で使用する成分を決定する。前年度に構築された前立腺癌幹細胞系を用いたスクリーニングシステムで特定された成分の前立腺癌予防・治療における可能性を探ると同時に、癌幹細胞を移植したヌードマウス移植モデル系での有効性をその成分の生体内動態等を考慮に入れ、検証する。以上の結果を総合して、本研究を通じて構築されたスクリーニング法が前立腺癌の予防・治療に有効な成分のスクリーニングに適しているか判断する。がん病態制御学
網膜視藍投射形成の分子機構

網膜視藍投射が正確に行われるために、網膜、視藍それぞれが発生の初期に位置特異性を獲得し、それぞれ対応するもの同士でシナプスを形成すると考えられる。一方、網膜耳側の線維は視藍尾側の膜成分に反発される、それにはEphタイプの膜受容体型チロシンキナーゼのリガンド-レセプターのシステムが関与しているらしいことがわかってきた。我々の研究でenが視藍に尾側としての位置特異性を付与することが示されている。本年度は、視藍の吻尾軸に沿った位置特異性獲得過程での遺伝子発現制御のカスゲ-ドと、視藍に発現しているEph型チロシンキナーゼのリガンドであるElf-やRAGSがenの支配下にあるかどうかに焦点を当てて実験を行った。レトロウイルスペクターにen-2を組み込みE2胚で強制発現させると、en-2の異所的発現部位で、Elf-, RAGSの発現が誘導された。enを強制発現させると、耳側網膜線維が視藍に侵入できないことがあるが、これはenによりElf-1やRAGSが誘発されたためだと考える。レトロウイルスによるen-2の強制発現で、間脳部にwnt-1の発現が誘導された。またwnt-1産生細胞を脳胞壁に埋め込むと、間脳の前端で終脳に近いところで、en-2の発現が誘導された。このことはショウジョウバエでのen/wnt-1の相互作用がニワトリ神経系の発生においても保存されていることを示しており興味深い。