hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In-organelle NMRによるミトコンドリア内蛋白質の動態解析

ミトコンドリア移行配列(MTS)を付加した蛋白質を,(1) Sf9内で安定同位体(13C/15N)標識培地中で発現させ,その後ミトコンドリアに移行させる方法,(2)大腸菌内発現系で安定同位体標識させ,単離精製後にヒト培養細胞に導入し,その後ミトコンドリアに移行させる方法,の2つについては手法としてほぼ確立することに成功した.この結果,当初の計画書に記載した,マトリックス環境の物理的性質の解析,マトリックス環境が蛋白質のコンフォメーションやダイナミクスに与える影響の解析が可能になり,H28年度後半から実際に助走的研究を開始している.以上のように,本研究で目的としたin-organelle NMRの手法的基盤を確立させることができたこと,これを基に応用研究が進展しつつあること,また核内蛋白質を標的とした新しい展開の研究も進行していることから,おおむね順調に進展していると考えられる.本研究では,in-cell NMR法を真核細胞のオルガネラ内にある蛋白質の解析法として発展させることを目指した.オルガネラとしては,細胞質と特に異なる環境を保持し,単離方法も確立されているミトコンドリアを主として用いた.蛋白質のオルガネラにおける機能発現のメカニズムは解析すべき重要な生命現象の一つである.一方で各オルガネラ内の物理化学的環境は充分に解明されていない.したがって,本研究の成果は,オルガネラにおける蛋白質の構造・活性相関を解析するためのブレークスルーになる可能性がある.H29年度は,これまでの開発研究を継続し,NMR解析のモデル試料として多用されるGB1と,原核細胞や真核細胞のin-cell NMR研究で実績があるTTHA1718にミトコンドリア移行シグナル(MTS)を付加したものを用い,in-mitochondria NMR手法の完成を目指した.HeLa.S3細胞をホスト細胞として用い,電気穿孔法を用いて細胞質に導入した結果,細胞全体を試料とした際には,立体構造を保持した状態と部分変性が推定される状態が混在したスペクトルが観測された.その後,ミトコンドリア画分を単離しin-mitochondria NMRを測定した結果,良好なNMRスペクトルの観測に初めて成功した.この結果からは,正しい立体構造の形成が示唆された一方,希薄溶液状態や細胞質内のスペクトルと有意な差が得られたことは非常に興味深い.ミトコンドリア・マトリクスが蛋白質動態に与える影響を観測している可能性があり,さらなる解析が大いに期待される.H29年度は上記の結果に加えて,ミトコンドリア内蛋白質の解析に資する,ベイズ推定を用いた蛋白質の立体構造計算法の確立に成功したほか,核移行シグナルを付加した試料をヒト培養細胞に導入して観測するin-nuclei NMR測定についても一定の成果を得た.真核細胞のオルガネラにおける蛋白質動態は解析すべき重要な生命現象の一つである.本研究では,in-cell NMRを,オルガネラ(特にミトコンドリア)内にある蛋白質に応用することで解析を試みた.ミトコンドリア移行シグナルを付加したモデル蛋白質を,電気穿孔法でヒト培養細胞に導入し,その後ミトコンドリアを単離することで.良好なin-mitochondria NMRの観測に成功した.
原子間力顕微鏡による生きている肺癌細胞表面微細構造の経時観察及び遊走能との関係

生きている状態の癌細胞の表面を原子間力顕微鏡で二千倍から一万倍の倍率で観察することに成功した。5分間トリプシン処理を行い細胞表面の微絨毛を剥離し,粘着剤にてコーティングしたスライドガラス上で肺癌細胞培養株A549を24時間培養した上で,原子間力顕微鏡にて細胞表面を観察した。二千倍での観察では細胞表面に稜上の隆起が存在した。この隆起は,細胞中心部から外縁に向かって放射状に拡がるものと外縁にそって同心円上にあるものの二種類が存在した。原子間力顕微鏡で観察した同一細胞をパラホルムアルデヒドで固定し,アクチンファイバーとチュプリンを蛍光二重染色したところ,放射線状に拡がる隆起と一致してアクチンが染色された。また,同心円上の隆起は,アクチンの他に一部チュブリンが染色された。以上の観察より,これらの隆起はアクチンやチュブリンからなる細胞骨格繊維をみていることが証明された。これらの隆起は,走査型電子顕微鏡では観察できず,原子間力顕微鏡の探子が細胞表面の構造を認識するときに細胞膜を僅かに圧迫するため,細胞膜直下にある細胞骨格繊維を稜上の隆起として認識していると思われた。また,一万倍での細胞表面の経時観察ではこれらの隆起が上下運動をしていることが観察され,細胞骨格は固定されたものではなく,流動していることがわかった。さらに,A549より遊走能の低いPC3でも,同様の観察を行ったが,原子間力顕微鏡で観察できた細胞表面の微細構造には遊走能の違いによる違いを認めなかった。生きている状態の癌細胞の表面を原子間力顕微鏡で約1万倍の倍率で観察することに成功した。しかし、原子間力顕微鏡は細胞表面を鋭い探針でさわるため、細胞に対し僅かではあるが力学的な力が働く。それにより細胞が試料台より剥離してしまうことがしばしば生じた。そのため、細胞と試料台の固着性を高める必要が生じた。種々の検討の結果、スライドガラス上にコラーゲンゲルやセルタッチを塗布した上で細胞を培養させると試料台との固着性がかなりよくなる一方、細胞の増殖には影響をほとんど与えないことがわかった。現在は、この方法にて肺癌細胞の表面微細構造を観察している。また、癌細胞表面には予想以上に微絨毛が存在していて、これが原子間力顕微鏡での微細な観察の妨げになっていた。そのため、トリプシン処理を5分以上行い細胞を剥離した上で、スライドガラス上に播種して24時間培養した後で観察を行えば、スライドガラスへの細胞の固着が良好であり、細胞表面に微絨毛も少ない状態を得られることがわかった。現在のところ、細胞膜直下にあるアクチンストレスファイバーを原子間力顕微鏡で確認できている。また、細胞骨格の免疫染色との対比により、アクチン以外のチュブリンと思われる細胞骨格繊維も認めている。これらの細胞骨格は、時間とともにゆっくりと上下に動いていると思われる現象を観察したが、その真偽について検討しているところである。また、さらに高倍率での観察を目指している。
骨粗鬆症性軟骨下脆弱性骨折による関節破壊のメカニズムの解析

大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折の予後を規定する因子を検討した結果、女性の場合は圧潰の進行する症例が有意に多いこともわかり、本骨折の予後に性差があることが判明した。さらに、本骨折の予後予測因子として、MRIにおけるT1強調像でのバンド像が重要であり、これは骨折線を反映しているため、バンド像の長さ、すなわち骨折線に長さと臼蓋荷重部に対する割合が独立因子として予後に関与していることを世界で初めて証明した。骨粗鬆症脆弱性骨折の代表的疾患である大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折(SIF)と、最も鑑別を要する疾患である特発性大腿骨頭壊死症との鑑別ポイントについて検討した。その結果、臨床的背景とMRIにおけるバンド像の形態が有用であることが分かった。臨床的背景では、脆弱性骨折は高齢女性に多く、骨粗鬆症や肥満傾向を有する場合が多いのに対し、大腿頭壊死症の場合は、20-40才台に好発し、ステロイド服用歴やアルコール多飲歴を有する場合が多い。両側発生例は、脆弱性骨折の場合は稀であるが、骨頭壊死症では約50-70%に認められる。レントゲンで大腿骨頭に圧潰を認めた場合、年齢が65歳以上の女性で、ステロイド歴、アルコール歴がない場合は、まず本骨折を考慮する必要がある。次に、鑑別に際し有用と考えられたのがMRI所見である。大腿骨頭壊死症においてもMRIのT1強調像でのバンド像は特徴的な所見であるが、その形態が鑑別の参考になる。脆弱性骨折におけるバンドは、骨折線を反映しているため、不規則で蛇行しており中枢側に凸で軟骨面に平行な形態をとることが多く、またバンドは骨頭の途中までしか及んでいないこともある。一方、骨壊死の場合はバンド像が壊死層の周囲に形成された修復反応層を反映している。そのため、末梢側に凸の形態をとることが多く、比較的滑らかな線を示すことが多い。さらに、造影MRIを行った場合、骨壊死ではバンド像よりも中枢部は壊死に陥っているため造影されないが、脆弱性骨折の場合は早期であれば造影され得ることも鑑別の一助となることがわかった。骨粗鬆症脆弱性骨折の代表疾患である大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折の画像的所見を用いて予後規定因子を検討した。【研究の目的】大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折(以下SIF)は、骨粗鬆症を有する高齢者に発生するとされている。SIFは、同様の保存療法を行っても、骨頭圧潰が進行して関節破壊を来たし手術療法が必要になる症例もあれば、圧潰が進行せず治癒する症例もある。MRIにおけるバンド像の形態を解析して、予後を予測する因子について検討した。【方法と結果】対象はSIFと診断した29例29股。年齢は16から88歳であった。X線にて骨頭圧潰が進行して手術を必要とした群を圧潰進行群、進行せずに治癒した群を圧潰非進行群とした。バンドの長さ、バンドの厚み、骨頭の荷重部の長さ、荷重部骨頭の長さに対するバンドの長さの比(バンド比)を検討した。X線にて29例中14例で圧潰の進行(圧潰進行群)を認め、15例では進行していなかった(圧潰非進行群)。バンドの長さは圧潰進行群が平均20.5 mm、圧潰非進行群が平均13.2mmで、進行群で有意に長かった。バンド長のカットオフ値は20.2 mmであった。バンドの厚みと荷重部の骨頭径は両群で有意差を認めなかった。バンド比は進行群が平均57.7%、非進行群が平均38.2%で、進行群で有意に大きかった。バンド比のカットオフ値は57.9%であった。骨粗鬆症に伴って発生する代表的な関節内骨折であるSIFについて、その骨折線の長さと荷重部に対する割合が、重要な予後を左右する因子であることが判明した。本骨折の予後予測因子を画像上明らかにできたことは、臨床現場における関節破壊の進行予測、ひいてはその予防法開発に向けたに重要な知見を得ることができた。骨粗鬆症軟骨下脆弱性骨折では、骨折線の広がりと荷重部に占める割合が、関節破壊の原因の一つであることを提唱した。具体的には、骨粗鬆症性軟骨下脆弱性骨折の代表的疾患である大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折のうち、一部は保存療法で治癒する症例がある一方、急速に関節破壊を来す症例があることがわかっている。

そこで、その予後を規定する因子を、画像所見に基づいてそれぞれの群で比較検討した結果、本骨折の予後予測因子として、MRIにおけるT1強調像でのバンド像が重要であり、これは骨折線を反映しているため、バンド像の長さ、すなわち骨折線に長さと臼蓋荷重部に対する割合が独立因子として予後に関与していることを世界で初めて証明した。さらに、男性と女性の間で本骨折の予後に有意差があることも報告した。男性の場合は、骨粗鬆症の程度が軽度であり、良好な予後と早期の回復が期待できることがわかった。また、各種股関節疾患における関節液の分析も行った。特発性大腿骨頭壊死症(ION)、臼蓋形成不全に続発した変形性股関節症(OA)、急速破壊型股関節症(RDC)の関節液中における骨代謝マーカー(BAP、TRACP-5b)、軟骨代謝マーカー(MMP-3、ケラタン硫酸)を比較検討した。ION群は他疾患と比較して、BAP、MMP-3、ケラタン硫酸が有意に高値であった。RDC群は他疾患と比較してTRACP-5bが有意に高値であったが、OA群はいずれもが低値であった。以上より、関節液中骨代謝、軟骨代謝マーカーの違いが、各疾患の関節症進行の病態を表す一つの指標である可能性が示唆された。整形外科学骨粗鬆症に伴って発生する代表的な関節内骨折である大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折(SIF)について、その骨折線の長さと荷重部に対する割合が、重要な予後を左右する因子であることを既に明らかにしており、今回、重要な鑑別疾患である大腿骨頭壊死症との鑑別点も明らかにすることができた。骨粗鬆症に伴って発生する関節内骨折の代表的疾患である、大腿骨頭軟骨下脆弱性骨折の臨床的特徴を明らかにすることが出来た。さらに、本骨折の予後を規定する因子を世界で初めてMRIに基づき明らかにできた。これらの因子は、本骨折の診断のみならず予後予測に重要な知見となると考える。今回明らかにした大腿骨頭壊死症との鑑別点に加えて、大腿骨頭壊死症との予後の違いを、関節液における骨性マーカーおよび軟骨マーカーなどの観点から検討を加える。そして、これまで明らかにしたMRI画像所見に加えて、摘出骨頭の病理所見や関節液の解析などをあわた検討を加え、最終的に、骨粗鬆症治療薬などの各種薬剤により、関節破壊の予防法の構築を目指したい。今回明らかにしたMRI画像所見に加えて、摘出骨頭の病理所見や関節液の解析などもあわせたさらに詳細で多角的な予後予測因子を解明したい。最終的には、骨粗鬆症治療薬などの各種薬剤により、関節破壊の予防法の構築を目指したい。本年度は、画像解析による研究を主体として行い、実験にかかる費用が少なく、加えて学会参加にかかる費用も予想よりも低額で済んだため、翌年度への繰り越しとした。関節液分析を行い、さらに成果の国内、国外発表を行う。特に、国外における研究成果の普及に努めたい。概ね、物品費:20%、旅費:60%、その他:20%、の予定である。
部位特異的抗体によるヒト脂肪細胞糖輸送担体の構造と機能の関連についての解析

ヒト肝癌細胞糖輸送担体蛋白のアミノ酸配列のN末端に近い15個のアミノ酸VHRYGESILPTTLTTより成るショートペプチド(ペプチドNと呼ぶ),ほぼ中央部の12個のアミノ酸LINRNEENRAKSより成るペプチド(ペプチドM),およびC末端に近い14個のアミノ酸GFRQGGASQSDKTPより成るペプチドCを化学的に合成した。これをKeyhole limpet hemocyaninに結合させた後、家兎に免疫したところ、ELISAにて各々のショートペプチドに対する抗体の産生が認められた。そこでショートペプチドをアガロースに結合させ、このアフィニティカラムを用いて抗血清より抗体を精製した(各々抗体N,抗体M,抗体Cとする)。ヒト赤血球の糖輸送担体をトリチウム標識サイトカラシンBにてフォトアフィニティ標識した後、トライトンX-100にて可溶化し、抗体と孵置後プロティンA-セファロースを用いて免疫沈降を行ったところ、抗体MおよびCは10μg/mlの濃度でヒト赤血球糖輸送担体蛋白を80%以上免疫沈降した。抗体Nも免疫沈降したが、その力価は抗体MおよびCに比較して弱かった。又、抗体MおよびCはニトロセルロース紙にブロットしたヒト赤血球糖輸送担体蛋白を認識した。興味あることに、抗体MおよびCは、ラット脳の糖輸送担体蛋白を免疫沈降およびブロッティング法にて認識したのに対し、インスリンに反応するラット脂肪細胞の糖輸送担体はいずれの方法にても認識しなかった。これは脂肪細胞の糖輸送担体蛋白がヒト赤血球やラット脳の糖輸送担体蛋白とは免疫学的に必ずしも類似していない可能性を示唆している。また抗体Mは250μg/mlの濃度でヒト赤血球糖輸送担体に対するサイトカラシンBによる標識を強く抑制したのに対し、抗体Cではその抑制は軽度にとどまり、グルコースと競合するサイトカラシンBの結合部位がヒト赤血球糖輸送担体のほぼ中央部を含む可能性を示唆した。
医療依存度の高い在宅療養患者の介護負担感尺度の開発

本研究は在宅療養において医療依存度の高い患者を対象に,病状やADL,治療や看護,療養環境,社会資源,社会保障などが家族介護者に与える影響を包括的に評価するための介護負担感尺度を開発することが目的である.今年度は昨年行った山形県内の訪問看護ステーションの事業所管理者と訪問看護師,訪問看護利用者を対象とした在宅療養の実態調査をもとに分析を行った.山形県の訪問看護利用者の調査結果の分析から,利用者は後期高齢者で全面介助を要する寝たきりが多く,日常生活的援助が多く求められ,利用サービスについては医師の受診で訪問診療,主治医は医院かクリニックに月1回の受診,訪問看護以外のサービスでは訪問介護が最も多く利用されていた.訪問看護は週1回,30分1時間の利用で,最も多く行われるのは病状観察であった.医師や福祉・保健との連携に関してはほとんど良好な評価で,利用者の療養上の最も多い問題・課題は「患者・家族との関係性」であった.以上述べたのは訪問看護の対象となる平均的な利用者像であるが,利用者の特性や障害・疾病において医療依存度の高い対象者は少なくなく,支援体制内容や訪問看護の状況,療養上の問題はいずれも多種多様で幅広いために,訪問看護だけでは解決しがたい多問題を抱える利用者もいた.また,利用者満足度について実態を把握し,これらの利用者満足度と利用者の特性との関連を検討したところ,全体として利用者満足度はいずれも非常に高いが,利用者満足度を低くすることに関連する要因としては,訪問看護の担当体制,ケアプランの適切さ,多問題を抱える利用者が考えられた.利用者が求める多種多様なニーズに対応する在宅支援体制,訪問看護サービスが必要なことが示唆されたが,特に医療依存度の高い在宅療養者に焦点を当てた利用者と家族の負担感のアセスメントの必要性は高い.介護負担の構成要素を抽出した尺度の検討を引き続き行う.医療費削減政策である平均在院日数の短縮の必要性から,病院医療から在宅医療への方向転換が求められている.患者と家族が望む医療が提供される在宅療養が可能となるためには,地域での医療連携などにおいて,特に人工呼吸器や経管栄養などの高度な医療処置を必要とする医療依存度の高い患者へのサポートシステムの充実を図る必要性は高い.そこで本研究では在宅療養において医療依存度の高い患者を対象に,病状やADL,治療や看護,療養環境,社会資源,社会保障などが家族介護者に与える影響を包括的に評価するための介護負担感尺度を開発することが目的である.初年度である今年度は,医療依存度の高い患者を代表する疾患として筋萎縮性側策硬化症(ALS)患者を対象とし,在宅療養中のALS患者の支援と,入院中で在宅療養へ移行するALS患者の退院調製の支援を通し,病院医療と在宅医療のさまざまな段階における患者と介護者が抱える医療や看護,介護の課題や問題点の分析を行った.そして訪問看護ステーションや患者会の視点からの在宅療養における介護負担感についての情報収集を行い,介護負担感に関連する構成要素の探索を行った.これらの成果を踏まえ,まもなく山形県内の訪問看護ステーションの事業所管理者と訪問看護師を対象とした在宅療養患者の看護内容に関する調査を行う予定である.そのため山形県との協働のもと,現場との調査に関する調製と計画の段階である.その結果と既存の尺度の質問項目を含めて,質問項目の検討を行う.本研究は在宅療養において医療依存度の高い患者を対象に,病状やADL,治療や看護,療養環境,社会資源,社会保障などが家族介護者に与える影響を包括的に評価するための介護負担感尺度を開発することが目的である.今年度は山形県内の訪問看護ステーションの事業所管理者と訪問看護師,訪問看護利用者を対象とした在宅療養患者の看護内容に関する調査を行った.事業管理者31名,訪問看護師203名,利用者1,384名から回収が得られた.事業所は開設してからの期間は平均7.3年,開設主体は医療法人が最も多く,職員数は平均9.0人で,リハビリ職のいる事業所,事務職がいる事業所は半数に満たなかった.訪問看護師は平均40.7歳,平均訪問看護歴4.4年,常勤が71.4%,1月あたりの訪問看護担当者数は平均30.4人であった.研修の受講経験は82.3%があり,これから受けたい研修があるものは92.1%で,ターミナルケアや呼吸管理などについてであった.訪問看護利用者は平均79.9歳で,主病名は脳血管疾患が48.8%と最も多く,日常生活自立度ではランクC,要介護認定では要介護5が最も多かった.1週間あたりの訪問看護の平均回数は1.6回であった.看護内容の実施頻度では「毎回行なう」のが「病状観察」94.2%で最も多く,次いで「リハビリテーション」47.5%となっており,一方「ほとんど行なわない」で多かったのが「腹膜還流」,「導尿」,「透析」であった.看護内容の実施上の困難の程度では「とても感じる」の割合が最も高かったのが「ターミナルケア」32.0%,ついで「透析」28.6%,「腹膜灌流」21.1%,「問題行動のケア」20.0%であった.実施頻度は少ないが困難を感じることの多い看護内容であった.

本研究は在宅療養において医療依存度の高い患者を対象に,病状やADL,治療や看護,療養環境,社会資源,社会保障などが家族介護者に与える影響を包括的に評価するための介護負担感尺度を開発することが目的である.今年度は昨年行った山形県内の訪問看護ステーションの事業所管理者と訪問看護師,訪問看護利用者を対象とした在宅療養の実態調査をもとに分析を行った.山形県の訪問看護利用者の調査結果の分析から,利用者は後期高齢者で全面介助を要する寝たきりが多く,日常生活的援助が多く求められ,利用サービスについては医師の受診で訪問診療,主治医は医院かクリニックに月1回の受診,訪問看護以外のサービスでは訪問介護が最も多く利用されていた.訪問看護は週1回,30分1時間の利用で,最も多く行われるのは病状観察であった.医師や福祉・保健との連携に関してはほとんど良好な評価で,利用者の療養上の最も多い問題・課題は「患者・家族との関係性」であった.以上述べたのは訪問看護の対象となる平均的な利用者像であるが,利用者の特性や障害・疾病において医療依存度の高い対象者は少なくなく,支援体制内容や訪問看護の状況,療養上の問題はいずれも多種多様で幅広いために,訪問看護だけでは解決しがたい多問題を抱える利用者もいた.また,利用者満足度について実態を把握し,これらの利用者満足度と利用者の特性との関連を検討したところ,全体として利用者満足度はいずれも非常に高いが,利用者満足度を低くすることに関連する要因としては,訪問看護の担当体制,ケアプランの適切さ,多問題を抱える利用者が考えられた.利用者が求める多種多様なニーズに対応する在宅支援体制,訪問看護サービスが必要なことが示唆されたが,特に医療依存度の高い在宅療養者に焦点を当てた利用者と家族の負担感のアセスメントの必要性は高い.介護負担の構成要素を抽出した尺度の検討を引き続き行う.
条件付き相互情報量規範適応量子化に基づく信号処理設計と深層学習を用いた無線通信

本研究では,無線通信路に適した適応量子化及び量子化情報に基づく信号処理設計と,深層学習に基づくパラメータ最適化・入力推定を用いた超大容量・超低遅延・超低消費電力無線通信の実現を目指す.具体的には,まず統計的性質が異なる種々の状態を取る未知の無線通信路に対する条件付き相互情報量規範の適応量子化法について検討する.次に,量子化情報に基づく通信路推定・誤り訂正復号器等の各種信号処理設計について検討する.また,深層学習を用いた無線通信システムの各パラメータ最適化・入力推定について研究する.本研究では,無線通信路に適した適応量子化及び量子化情報に基づく信号処理設計と,深層学習に基づくパラメータ最適化・入力推定を用いた超大容量・超低遅延・超低消費電力無線通信の実現を目指す.具体的には,まず統計的性質が異なる種々の状態を取る未知の無線通信路に対する条件付き相互情報量規範の適応量子化法について検討する.次に,量子化情報に基づく通信路推定・誤り訂正復号器等の各種信号処理設計について検討する.また,深層学習を用いた無線通信システムの各パラメータ最適化・入力推定について研究する.
消化器癌に対する分子標的光免疫治療Photoimmunotherapy

光感受性物質を結合させた抗体を癌細胞に結合させ近赤外光照射により癌細胞を殺傷するPhotoimmunotherapy(PIT)が新たな癌治療として期待されている。HER2標的治療をモデルとして標的抗原陰性癌にもPITを適応すべく、HER2を発現するアデノウイルスベクターを併用し、HER2陰性癌における抗HER2 PITを試みた。ウイルスによりHER2陽性化させた陰性胃癌細胞株にPITは特異的細胞死を誘導し、さらにHER2陰性胃癌腹膜播種マウスにおいてもウイルスとPITの併用は腹膜播種の抑制と生存期間延長を示した。ウイルス遺伝子導入の併用はPITを抗原陰性癌にも有効とし、適応拡大が可能となる。抗癌剤である抗体医薬品をドラッグデリバリーシステムとして利用し、光感受性物質を特定の抗原を発現する癌細胞へ運び近赤外線照射により殺細胞効果を発揮する近赤外光線免疫療法、Photoimmunotherapy(以下PIT)が最近報告されたが、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入技術を応用して、抗原陰性細胞へも標的抗原を強制発現させることで、その適応を拡大する試みが本研究の目的である。まず、抗体医薬品としてTrastuzumabに光感受性物質IR700を結合させたTra-IR700の作成を行った。当初収量が少なかったTra-IR700は作成する工程の改善により、最終収量を増加させることに成功した。HER2陰性MDA-MB-231乳癌細胞へHER2の細胞外ドメイン蛋白を発現させるAd-HER2-ECDを感染させ、HER2蛋白質が発現されることを、フローサイトメトリー、蛍光免疫染色、並びにウエスタンブロットで確認した。HER2陰性の胃癌細胞のMKN-45細胞においても同様にAd-HER2-ECD HER2蛋白質の導入が可能であることを確認した。近赤外線照射の照射システムの構築と、光エネルギーのVitroでの各種Dishでの測定法を確立し、PITの実験系が一定の条件で繰り返し有効に作動させることに成功した。HER2陰性胃癌、乳癌細胞にはTra-IR700を用いたPITは殺細胞効果を示すことなく、HER2陽性癌細胞にのみ効果を発揮することを確認した。抗体薬をドラッグデリバリーとして用い、光感受性物質を特定の抗原を発現している癌細胞へ運んで近赤外線照射によって殺細胞効果を発揮するPhotoimmunotherapy(以下PIT)に関する研究を行った。HER2陰性の胃癌細胞にHER2発現アデノウイルスベクターAd/HER2-ECDによるHER2遺伝子の発現を行い、HER2蛋白質の発現がWestern Blotting, Flow cytometry,免疫染色にて確認された。平成25年度に設定した条件で、上記においてHER2遺伝子導入が成功した細胞を用いて、PITの効果を観察した。trasutuzumab-IR700を培養液に加え、近赤外線を照射し、細胞の形態を経時的に観察したところ、細胞の膨化、細胞増殖の停止が確認され、Propidium iodideによる細胞膜破壊による細胞死を確認した。さらに細胞死をXTT assayで比較したところ、治療群で有意に抗腫瘍効果が見られた。HER2陰性乳癌細胞MDA-MB231を用いて、同所性腫瘍モデル、背部皮下腫瘍を作製を試みたが、成功しなかった。この時点で乳癌細胞を用いたモデルでのin vivo実験は断念し、乳癌細胞におけるin vitroの実験結果に関して論文作成を行った。MKN45胃癌細胞を用いて腹膜播種モデルを作製を試み、腹腔内で胃癌を生着させることに成功した。腹膜播種モデルにおいてはAd/HER2-ECD, trastuzumabーIR700腹腔内に投与することで、胃癌細胞に遺伝子導入でき、かつtrastuzumabーIR700が結合することが蛍光免疫染色で確認された。癌を特異的に攻撃する分子標的治療は標的抗原を有する癌に対して有効性とされているが、胃癌においては有効な標的抗原が少なく、またその標的抗原の発現が不均一であることが治療の大きな障壁となっている。HER2細胞外ドメインのみを発現する遺伝子改変アデノウイルスベクター(以下Ad/HER2-ECD)は細胞の悪性度を上昇させることなく、HER2陰性癌細胞の陽性化が可能である。またHER2標的抗癌剤であるTrastuzumabに光感受性物質IR700を結合させたTrastuzumab-IR700(以下、Tra-IR700)はHER2陽性癌細胞に結合し近赤外線を照射されることで、高い殺傷能力を示す。本研究では、この二つの技術の併用により、胃癌において最も多い転移様式の一つで、予後不良とされる腹膜播種に対する治療への応用を試みた。まず、Ad/HER2-ECDによりHER2陽性化させた陰性胃癌細胞株にTra-IR700を投与し、近赤外光を照射することで、特異的に細胞死を誘導することを確認した。またHER2陽性細胞と陰性細胞が混在するheterogeneityな環境においてもHER2陰性癌細胞を陽性化し、細胞死を誘導した。さらに、HER2陰性胃癌腹膜播種マウスモデルにおいて、Ad/HER2-ECDとTra-IR700の腹腔内投与と体腔外からの近赤外光照射による腹膜播種の増殖抑制効果と生存延長効果を確認した。遺伝子導入技術の応用と分子標的光免疫療法の併用は、標的抗原のない癌細胞や不均一な癌細胞に対しても適応できる可能性が示された。さまざまな癌細胞にも幅広く応用可能と考えられ、新たな癌治療戦略の一つになることが期待される。

光感受性物質を結合させた抗体を癌細胞に結合させ近赤外光照射により癌細胞を殺傷するPhotoimmunotherapy(PIT)が新たな癌治療として期待されている。HER2標的治療をモデルとして標的抗原陰性癌にもPITを適応すべく、HER2を発現するアデノウイルスベクターを併用し、HER2陰性癌における抗HER2 PITを試みた。ウイルスによりHER2陽性化させた陰性胃癌細胞株にPITは特異的細胞死を誘導し、さらにHER2陰性胃癌腹膜播種マウスにおいてもウイルスとPITの併用は腹膜播種の抑制と生存期間延長を示した。ウイルス遺伝子導入の併用はPITを抗原陰性癌にも有効とし、適応拡大が可能となる。in vitroの実験系については、確立され、Ad-HER2-ECDによる遺伝子発現とそれに対するPITにより殺細胞効果が、再現性を持って乳癌、胃癌細胞で確認され、当初の予定通りに研究成果が得られている。乳癌細胞において、皮下腫瘍モデル、同所性移植モデルの作製を何度か試みたが、腫瘍の生着は不安定で、乳癌に関してはIn vivoでの検証実験を断念せざるを得なかった。in vitroの実験までで、Proof of conceptの結果は得られたとして論文作成できたことについて、概ね順調な進展と考える。胃癌の移植モデルが完成できたことも順調な進展であった。in vitroの結果については確認が得られたので、胃癌細胞についてもデータの再現性を確認する。また胃癌のマウス移植モデルを用いたPITの抗腫瘍効果については至適条件を確定させ、その抗腫瘍効果とその再現性を確認する。胃癌のHER2発現とtrastuzumabを用いたPITの実験結果については、一定の結論が得られた時点で論文を作成する。平成25年度に計画していた内容については、上記の実績概要のとおりで、trastuzumabとIR700の結合物を作製、近赤外線照射装置を用いて光照射の実験ができるシステムの構築、アデノウイルスベクターの感染実験など、実験遂行のための基盤が確認できた状況でいる。まずは細胞株を用いた実験系が確立できたことで初年度の目的はおおむね達成出きている。実験に使用する試薬等の経費は、実験条件によって多少左右され、学会参加等の旅費の費用も医局、個人の負担分によって左右される。予算の範囲内に収めため、結果的に次年度使用額が生じた。ひきつづき、胃癌細胞株を用いたin vitroでの実験データを蓄積し、アデノウイルスベクターによるHER2の細胞外蛋白発現とPITの有効性を確認していく。マウスでHER2陰性の担癌モデルを作製し、そのモデルにおいても、HER2-ECDの強制発現によりPITが有効に作用するかどうか、検証実験を行っていく。今後行う実験においても再現性の繰り返し回数等によって、使用額は左右される。最終年度となるため、予算の範囲内で収まる様に努力する。実験に使用する化合物(Trastuzumab-IR700等)や装置には自作のものも含んでおり、その収量や品質によって、実験における材料の経費が多少左右される。比較的順調に材料の準備ができたことで、経費が軽減されたため。
細胞モデルを用いたミオシン１分子計測の試み：より生体に近い状態での解析を目指して

アクチン繊維は細胞内で種々のアクチン結合蛋白質と結合し、多様な高次構造を形成している。これらの高次構造上でのミオシンとの相互作用様式を探るために、脱膜モデルによるアクチンレール構築を試みた。神経細胞を培養したガラス基板を利用してフローチェンバーを作成し、ファロトキシン存在化で高濃度界面活性剤処理をして脱膜後、チェンバー内の溶液を数度入れかえてもアクチン構造が破壊されない事を確認した。蛍光標識ミオシンを外部から導入したところ、アクチン繊維への結合が確認できた。この系はアクチンの脱重合を阻害しながら脱膜しただけであり、生体に近いミオシン滑り運動解析に有望な系が確立できたとものと思われる。モータータンパク質ミオシンは、アクチン繊維をレールとして滑り運動を行い、細胞における主要な力発生原となっている。アクチン繊維は細胞内で種々のアクチン結合タンパク質と結合し、ストレスファイバー、接着班、フィロポディア、ラメリポディア等、さまざまな高次構造複合体を取る。我々は高次構造に含まれる精製蛋白質の再構成系を用いて、アクチン結合タンパク質がミオシン滑り運動に影響を及ぼす事を報告してきた。本研究では、アクチン高次複合体の単離及び細胞モデルを利用して、再構成系よりも生体に近い系を確立しようとするものである。昨年度は、界面活性剤処理、ファロトキシンによるアクチン安定化、低速遠心法を用いて、培養神経細胞Ng108-15細胞からフィロポディア様構造の単離に成功した。本年度は、これを基板上に保持してミオシンの滑り運動解析を試みるとともに、細胞モデルに適した条件の探索を実施し、以下の結果を得た。カラス基盤を通常のよりはるかに高い濃度(1-2%)のニトロセルロースでコーティングし、フローチェンバーを作成して単離したフィロポディア様構造を流し込むことで、液の入れ換えに耐えられる安定した保持に成功した。この上にミオシンをまぶした蛍光ビーズを流したが、結合するビーズの数が少なく、滑り運動は観察されなかった。原因が精製フィロポディア様構造側にあるかどうかも含め、現在、ビーズ処理条件、フィロポディアのさらなる純化、in vitoro motility assay系でのフィロポディア様構造滑り運動解析を試みているところである。モータータンパク質ミオシンはアクチン繊維をレールとして滑り運動を行い,細胞における主要な力発生原となっている。アクチン繊維は細胞内で種々のアクチン結合タンパク質と結合し、ストレスファイバー、接着版、フィロポディア、ラメリポディア等、さまざまな高次構造複合体を取る。我々は高次構造精製蛋白質の再構成系を用いて、アクチン結合タンパク質がミオシン滑り運動に影響を及ぼす事を報告してきた。本研究では、アクチン高次複合体の単離及び細胞モデルを利用して、再構成系よりもより生体に近い系を確立し、ミオシンの滑り運動解析を目指す。これにより、種々のアクチン形態によるミオシン運動制御機構を1分子レベルで解明しようとするものである。本年度は培養細胞Ng108-15からのアクチン高次構造複合体の単離、及びそのミオシンレール系の開発を行い、以下の結果を得た。Ng108-15細胞を種々の界面活性剤で処理後、ローダミンファロイジンでアクチン構造を安定化させ、細胞をかき集めてマイルドに破砕した。遠心操作により核画分を取り除き、さらに遠心操作によりアクチン束を分離した。このアクチン束を蛍光顕微鏡で観察したところ、界面活性剤としてTriton-X100、Teen-20、NP-40を用いたものが、形態、サイズともにフィロポディアに極めて似通っていた。アクチンレールとして使用できるという感触が得られたので、これらの画分をニトロセルロースコートしたフローチェンバーに流し込み、ガラス上にアクチン束の固定を試みているが、ガラスへの結合が不安定で、まだ成功していない。現在、固定条件・方法を変えて試しているところである。モータータンパク質ミオシンは、アクチン繊維をレールとして滑り運動を行い、細胞における主要な力発生源となっている。アクチン繊維は細胞内で種々のアクチン結合蛋白質と結合し、ストレスファイバー、接着斑、膜裏打ち、フィロポディア、ラメリポディア等、さまざまな高次構造複合体を取る。我々は高次構造に含まれる生成タンパク質の再構成系を用いて、アクチン結合蛋白質がミオシン滑り運動に影響を及ぼす事を報告してきた。本研究では、(1)アクチン高次複合体の単離、及び(2)細胞モデルを利用して、再構成系よりも生体に近い系を確立しようとするものである。(1)界面活性剤処理、ファロトキシンによるアクチン安定化、細胞破砕と低速遠心法を用いて、神経細胞からフィロポディア様構造の単離を行った。高濃度ニトロセルロースでこの構造物を基板上に固定し蛍光標識

ビーズミオシンを種々の条件で作用させたが、ビーズが構造物に結合せず、滑り運動は観察できなかった。またミオシンを基板上に固定したフローチェンバーにおいても、構造物は滑り運動を示さなかった。アクチンとミオシンの結合を阻害する因子が結合している可能性があり、この単離法は滑り運動解析系には適さないものと思われる。(2)カバーグラス上の神経細胞を用いてフローチェンバーを作成し、ファロトキシン存在下、高濃度界面活性剤処理をして脱膜後、アクチン構造を顕微鏡観察したところ、アクチン細胞骨格が保持されていた。さらに、チェンバー内溶液を数回入れかえた後も、アクチン構造が壊れない事が確認できた。このチェンバーに蛍光標識ミオシンを導入したところ、アクチン繊維への結合が観察された。この系はアクチンの脱重合を阻害しながら脱膜しただけなので、生体に近いミオシン滑り運動解析に有望だと思われる。医歯薬学昨年度本学に赴任したばかりで、実験室の立ち上げにかなりの時間を費やしてしまった。また、他業務との関連で継続した実験時間の調整が難しく、特に共同研究先である長岡技術科学大学へのサンプル持ち込み、および1分子解析実験の実施が数えるほどしかできなかった。本年度に群馬県立県民健康科学大学に赴任したため、研究室の引越や整備に時間を取られてしまい、実験を実施する時間が予定より大幅に少なくなってしまった。さらに、実験に使用する培養細胞のトラブルで、細胞の再樹立に時間を要してしまった。以上の理由により、いまだアクチンレール系の確立にいたっておらず、計画は遅れている。以下(1)(2)により単離フィロポディア様構造が1分子解析系として利用できるか結論を出すとともに、(3)で脱膜モデルの確立を目指す。(1)ミオシンをコートしたいわゆるin vitoro motility系での、フィロポディア様構造の滑り運動を解析する。(2)ミオシン1分子滑り運動観察:蛍光ビーズ、Qドット、Cy3で標識したミオシンの解析を行う。(3)脱膜モデル:今年度いろいろトライした活性剤では脱膜は成功しているが、チェンバーにして液を流すと基盤から細胞骨格が遊離していった。そこで、いったん遊離した細胞(断片)につき、ニトロセルロース膜あるいは抗アクチン抗体を使用して再接着を試みる。(1)他のアクチン複合体単離:マウス繊維芽細胞から、低調液と界面活性剤を利用したKatohらの方法でストレスファイバーの単離を試みる。(2)アクチン複合体の基盤への固定:再構成系のアクチン束固定は昨年度の方法で成功しているので、ニトロセルロース濃度をいろいろ変えて固定を試みる。アクチン束を直接固定できない場合は、アクチン抗体かNEM処理ミオシンを基板上に固定し、2段階での固定を試みる。(3)ミオシン1分子滑り運動観察:以上の系を用いて、Qドット、Cy3で蛍光標識したミオシンの1分子解析を行う。なお、1分子解析を旧所属先である群馬大学で共同研究者中村(群馬大学)とともに行う予定であったが、諸般の事情(旧研究室への新教授赴任)で実施不能となった。そこで、新しい共同研究者として本多(長岡技術科学大学)を加え、1分子計測を担当してもらうこととなった。
好脂質性皮膚常在真菌Malassezia furfurが産生するアレルゲンの分析

M.furfurの粗抗原をIgE-immunoblotで分析すると、多数のアレルゲン成分が検出される。今年度はその中で、分子量が20,000付近の成分の分析を実施した。2種類のM.furfurアレルゲン,MF1,MF2の精製とその性質M.furfur TIMM2782株の菌体破砕抽出液の硫安50-90%飽和で沈殿する画分(P2)を出発原料として、陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、メタルキレートクロマトグラフィを組み合わせることによってMF1MF2と名付けた2種類のアレルゲンを単離した。MF1,MF2のSDS-PAGEにおける分子量は、還元条件下ではそれぞれ21,000、20,000非還元条件下ではいずれも40,000であり、両者はいずれもS-S結合を介したホモダイマーであると推定された。また、等電点はMF1が4.7、MF2が4.8であった。MF1のN末端アミノ酸配列は28残基まで明らかになったが、既知タンパク質の配列との相同性は見い出されなかった。一方、MF2のN末端アミノ酸配列は分析不能で、N末端がブロックされているものと考えられた。MF1,MF2のアレルゲン活性MF1,MF2のアレルゲン活性は、RASTによるIgE抗体の測定、および末梢血白血球からのヒスタミン遊離試験によって調べた。RASTにおいては、M.furfur粗抗原に対するIgE抗体が陽性(>0.7PRU/ml)の30例のアレルギー患者のうち、MF1に陽性は20例(66.7%)、MF2に陽性は19例(63.3%)であった。一方、ヒスタミン遊離試験は22例の患者で実施した。遊離曲線に用量依存性があり、かつ最大遊離率が20%以上を示した例を陽性とすると、P2画分に対して陽性の14例のうち、MF1に対しては8例(57.1%)、MF2に対しては7例(50%)が陽性であった。まとめM.furfur菌体破砕抽出液から分子量が約40,000の2種類のアレルゲン、MF1,MF2を単離、精製した。RAST、ヒスタミン遊離試験の結果から、両者はともにM.furfurの主要なアレルゲンであると考えられた。
骨および軟組織付着を目指した凹凸微細表面を有するレーザ加工ジルコニアインプラント

本研究は,オッセオインテグレーションの早期獲得,長期間安定し機能するジルコニアインプラント開発を目指し,微細加工が可能なナノ秒パルスレーザによってジルコニア表面に凹凸構造を創成し骨および軟組織付着性について検討を行ってきた.2018年度の研究実績について報告する.ナノ秒パルスレーザ加工に伴い生じたジルコニアの結晶構造の変化による影響を明らかにするため,レーザ照射後のイットリア安定型正方晶部分安定化ジルコニア(Y-TZP)およびセリア安定型正方晶部分安定化ジルコニア(Ce-TZP)表面に対しX線回折法(XRD)による表面分析を行った.レーザ照射前の機械加工や研磨時に由来する単斜晶へ変態したジルコニアが,ナノ秒パルスレーザの照射自体により母材と同様の正方晶に回復することが分かった.これはブラスト法等の従来の機械加工による表面改質法と比較し,正方晶を維持し機械的強度が担保できる点でジルコニア表面への処理として本レーザ加工が有用であることが示された.Ce-TZP表面へのレーザ照射によって黒変が認められた.この黒変したCe-TZPに対し,EDXおよびX線光電子分光法(XPS)による分析を行った結果,ジルコニア内の酸素の欠損およびジルコニウムイオンの還元が確認された.このことから電気炉内で1,000°C,15分間留置後炉冷を行うことにより,白色へ色調回復できることが明らかになった.ジルコニアなどセラミックス表面への有機物の接着を検討するため,シランカップリング剤を試作し,その化学的影響について検討した.またインプラントを見据えた各種歯科材料へのタンパク質吸着についてもQCM法を用い検討を行った.これらの結果は,2017年度の実績とともに統括し,各関連学会の学術講演会にて発表を行った.またこの成果を研究論文としてまとめ,機関雑誌に投稿,掲載を果たした.本研究は,長期持続可能なジルコニアインプラントの開発のため,微細な加工が可能なナノ秒パルスレーザによりジルコニア表面に凹凸構造を付与し,骨適合性と軟組織接着性について検証を行っている.現在までに以下のように実績を得たので報告する.イットリア3mol%添加正方晶部分安定化ジルコニア多結晶体(Y-TZP)および30vol%アルミナ含有セリア10mol%添加正方晶部分安定化ジルコニア多結晶体(Ce-TZP)の研磨した平板試料(3×2mm、厚さ1mm)を用意した.パルス幅3 nsのNd:YAGレーザのスポットを30μm×60μmのトップハット形状に整形し,波長1064nm,出力150μmJ/pulse,周波数50Hz,送り速度7μm /s,大気雰囲気で基材に対し垂直にレーザ照射を行うことによって,深さ30μm,幅30μmの規則的な凹凸形状が作製できた.EDX分析ではレーザ照射後は酸素原子数濃度が減少していたが,Ce-TZPの方がY-TZPに比べてより大きな減少を示していることがわかった.レーザ照射後のCe-TZPの表面ゼータ電位は80%低下していた.Wistarラット大腿骨にインプイラントを埋入した.コントロールは,SLA処理とした.術後2,3週目に蛍光ラベリングを行い,4週で試料を摘出して非脱灰薄切研磨標本を製作した.周囲骨を観察後,骨-インプラント間接触率(BIC)および新生骨量(BM)を算出した.結果,laser/Y-TZPがSLA/Y-TZPおよびSLA/ Ce-TZPに比較して,有意に高いBICが得られた.CLSM像ではインプラント体凹凸部に垂直的な骨形成が観察された.laser/Ce-TZPでは他の試料よりもBICが有意に低く,レーザ照射により表面の特性が変化した可能性が推察された.BMはすべての試料において有意な差は認められなかった.レーザ照射によりCe-TZP試料表面において黒変が認められた.原因を明らかにするために,エネルギー分散型X線分析(EDX)およびゼータ電位の測定を追加し検討した.その他平成29年度に予定していた実験は実験計画通り遂行できており,さらに当初平成30年度に予定していた動物実験の一部(骨適合性評価)については繰り上げて実施できた.現在までの成果は各関連学会の学術大会にて発表を行った.本研究は,オッセオインテグレーションの早期獲得,長期間安定し機能するジルコニアインプラント開発を目指し,微細加工が可能なナノ秒パルスレーザによってジルコニア表面に凹凸構造を創成し骨および軟組織付着性について検討を行ってきた.2018年度の研究実績について報告する.ナノ秒パルスレーザ加工に伴い生じたジルコニアの結晶構造の変化による影響を明らかにするため,レーザ照射後のイットリア安定型正方晶部分安定化ジルコニア(Y-TZP)およびセリア安定型正方晶部分安定化ジルコニア(Ce-TZP)表面に対しX線回折法(XRD)による表面分析を行った.レーザ照射前の機械加工や研磨時に由来する単斜晶へ変態したジルコニアが,ナノ秒パルスレーザの照射自体により母材と同様の正方晶に回復することが分かった.これはブラスト法等の従来の機械加工による表面改質法と比較し,正方晶を維持し機械的強度が担保できる点でジルコニア表面への処理として本レーザ加工が有用であることが示された.Ce-TZP表面へのレーザ照射によって黒変が認められた.

この黒変したCe-TZPに対し,EDXおよびX線光電子分光法(XPS)による分析を行った結果,ジルコニア内の酸素の欠損およびジルコニウムイオンの還元が確認された.このことから電気炉内で1,000°C,15分間留置後炉冷を行うことにより,白色へ色調回復できることが明らかになった.ジルコニアなどセラミックス表面への有機物の接着を検討するため,シランカップリング剤を試作し,その化学的影響について検討した.またインプラントを見据えた各種歯科材料へのタンパク質吸着についてもQCM法を用い検討を行った.これらの結果は,2017年度の実績とともに統括し,各関連学会の学術講演会にて発表を行った.またこの成果を研究論文としてまとめ,機関雑誌に投稿,掲載を果たした.平成29年度に引き続き平成30年度においては,レーザ照射ジルコニアインプラントの軟組織適合性評価を行う.ラット上顎抜歯窩インプラントモデルを検討しているが,埋入にあたり適切な形状・大きさのジルコニアインプラント基材をCAD/CAMで製作し検討を行っている.また,基材へのレーザ照射を行うために,インプラントの回転ジグの導入を検討する予定である.レーザ照射によりジルコニアの結晶相が,正方晶から単斜相や立方晶へ変化している可能性が示唆される.これらの相転移はジルコニアの場合,体積変化を伴うため圧縮応力の残留やクラックの原因になることが危惧される.このことより平成30年度の実験計画として,レーザ照射前後の結晶相をX線回折法(XRD)により測定し,レーザが基材に与える影響について検証することを追加する.また,正方晶への回復を目的として,電気炉内での熱処理(800°C,15分)を検討し,同様にXRDにより分析する.これらの成果は,関連学会における学会発表を予定している.また,平成29年度の研究結果とまとめて海外ジャーナルへの論文投稿を予定している.
細胞死抑制活性強化蛋白質による虚血性心疾患及び薬剤性心筋障害の治療

昨年度までに、心筋梗塞モデルにおいて、心拍動停止直後に細胞死導入法を可能にした細胞死抑制強化蛋白質を心筋内投与することによって、心筋梗塞層の軽減が見られ、さらに心機能の改善傾向が見られたことを報告した。(Arakawa, M, et. al. Life Sci. 2007)今年度は、これらの結果を踏まえて、(1)心筋細胞死抑制効果の機能解析(2)薬剤性心筋障害モデルに対する効果、(3)血管新生への影響について調べた。(1)について、心虚血の際に惹起されるストレスとして、活性酸素による障害が考えられ、ラット心筋細胞H9c2株を用いた培養条件下において、過酸化水素の添加における細胞生存率を調べた。過酸化水素(200nM)において細胞死抑制強化蛋白質(0,0.3,3,30nM)の同時添加において12時間後の細胞死をヘキスト33242とpropidium iodide(PI)で染色し細胞生存率を調べたところ40%の細胞生存率を示したが、細胞死抑制蛋白質(PTD-FNK)を同時添加した場合、72%の細胞生存率に上昇した。このことから、過酸化水素による酸化ストレスによる細胞死を抑制することがわかった。さらに過酸化水素によるアポトーシスを抑制していることが示された。次に、(2)について薬剤性心筋障害モデルとして、アンスラサイクリン系抗がん剤のドキソルビシン(0,0.5,5,50nM)とPTD-FNK(0,0.5,5,50nM)の同時投与24h後において、ドキソルビシン(0.5および5nM)の惹起する細胞死を20%抑制することが示された。現在この細胞死抑制効果の機能解析を行っている。(3)では、In vitroにおけるHUVECを用いた管腔形成下において過酸化水素およびIFN-γの細胞への影響及び管腔形成の影響について引き続き検討している。【目的】本研究は、虚血心再灌流障害モデルや薬剤性心筋障害モデルを作製し、これらのモデルを用いて細胞内導入を可能にした細胞死抑制活性強化蛋白質を投与し、心筋細胞死を抑制する新しい治療法を開発することを目的とする。【結果と考察】本年度は、ラット心摘出虚血再灌流を行い、虚血時間35分、再灌流120分で心筋梗塞部位が47.8%である梗塞モデルを作製した。このモデルを用いて、細胞死抑制活性強化蛋白質に細胞内に導入可能なProtein transduction domain (PTD)を導入した蛋白質の投与法の検討を行った。投与方法は、冠動脈導入と直接心筋投与を行った。その結果、虚血開始直後に、直接心筋投与の方が、虚血35分後に効率よく蛋白質が導入されていることを免疫組織化学的手法により確認した。一方、冠動脈導入では蛋白質の確認ができなかった。この結果から、蛋白質の投与は虚血後、心拍動の停止直後(1分後)と設定し、用いる蛋白質は、生理食塩水で希釈したもの(濃度5,50,500nM、各n=8)を、それぞれマイクロシリンジを用いて左室前壁へ7.5μlを4箇所に投与した。これらの方法より、蛋白質投与群及びVehicle群ともに、35分の虚血・120分の再灌流を行った。実験終了後、各心臓を採取し、2,3,5-triphenyltetrazolium chlolide (TTC)染色によって心筋梗塞領域の定量を行った。その結果、Vehicle群の梗塞率47.8±6.8に対して、蛋白質投与群(50nM)の梗塞率は28.7±3.8%(p<0.05)で、梗塞を有意に抑制した。さらに、心機能の指標の一つである再灌流60分、120分における左室発生圧(LVDP)の回復変化を調べたところ、それぞれ再灌流60分、Vehicle群38.9%に対して、蛋白質投与群(50nM)では59.5%、120分では、Vehicle群32.5%に対して、蛋白質投与群(50nM)では45.6%であり、蛋白質投与群において心機能の回復傾向を認めた。これらの結果を踏まえて、心筋細胞死抑制のメカニズムの追求及び薬剤性心筋障害モデルを作製し、細胞死抑制活性強化蛋白質の効果を検討する予定である。【目的】本研究は、虚血心再灌流モデル及び薬剤性心筋障害モデルを用いて、細胞内導入を可能にした細胞死抑制活性強化蛋白質を投与し、心筋細胞死を抑制する新しい治療法を開発することを目的とする。【結果と考察】昨年度において、ラット心摘出虚血再灌流による心筋梗塞モデルを用いて、細胞内に導入可能なProtein transduction domain (PTD)配列を導入した細胞死抑制活性強化蛋白質を直接心筋投与した結果、虚血35分、再灌流120分におけるVehicle群の梗塞率に対して蛋白質投与群(50nM)の梗塞率が有意に抑制し、さらに左室発生圧(LVDP)の回復が見られた。本年度は、これらの蛋白質を投与することによる心筋細胞死の抑制のメカニズムの解析を行った。これらの解析に用いたサンプルは、蛋白質投与群及び未投与群のラット心臓を凍結サンプル及びホルマリン固定サンプルとした。これらの組織サンプルを用いて、細胞死の指標に対してアポトーシスをterminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine 5-triphosphate nick-end labeling (TUNEL) assay、さらにアポトーシス関連蛋白質の発現・変化の有無をウエスタンブロット法を用いて、解析を行った。