hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
O-15酸素PETを用いた腫瘍内酸素代謝のイメージングと定量評価

ラット腫瘍モデルを用いて、腫瘍内低酸素領域をFMISO-PETを用いて同定し、O-15ガス定常吸入法による血流と酸素消費量の定量計測を行った。その結果、腫瘍内における低酸素領域では血流の有意な低下、血管の拡張を認めたが、酸素代謝は血流に対して維持されていることがわかった。すなわち、低酸素領域には酸素代謝の保たれた活動性の高い細胞が存在することが明らかになった。これにより、化学療法や放射線治療においては低酸素領域に効率的に血流を増やしていく必要性が示唆された。【目的】O15標識ガス定常吸入法を用いて担癌ラットの腫瘍血流量(TBF)、腫瘍酸素消費量(TMRO2)、腫瘍酸素摂取率(OEF)の定量評価を行う。【方法】麻酔下のRGC6腫瘍担癌ラット3匹(276-291g)に動脈ラインを確保し、気管切開を行った。O15ガス供給装置からのルートを人工呼吸器に接続し、O15-CO2とO15-O2の安定した換気を行い、定常吸入法による腫瘍血流・酸素代謝のPET定量計測を行った。定常状態の確認後、入力関数として動脈採血を行い、全血・血漿のRIカウントを測定した。PET画像にて腫瘍全体と腫瘍辺縁部に関心領域を設定して、定量値を比較した。【結果】O15-CO2ガス、O15-O2ガスはいずれも吸入開始10分後に腫瘍のカウントは定常状態に達していた。腫瘍の定量値は以下の通りであった(TBF, 15.4 ±3.5 and 23.5 ±6.2 mL/100ml/min (p<0.05); TMRO2, 0.79 ±0.15 and 1.06 ±0.18 mL/100ml/min (p<0.05); and OEF, 32.8 ±9.1 and 28.4 ±8.1 % (p<0.05)。腫瘍辺縁部では酸素代謝に比較して、血流が豊富であることがわかった。今後、腫瘍内の低酸素領域をF-MISO製剤にて同定を行い、比較を行う予定である。FMISO-SUVと腫瘍内血流・酸素代謝・酸素摂取率・血管床をボクセルごとにプロットした結果、腫瘍内における低酸素領域では血流の有意な低下、血管の拡張を認めたが、酸素代謝は血流に対して維持されていることがわかった。核医学平成25年度の研究計画に記載されている通り、担癌モデルの作成を行い、実際にO-15ガスPETによる定量撮像を行った。腫瘍細胞の培養については、安定して再現性のある状態で担癌モデルの作成が可能であり、O-15ガスPETを行うための気管切開、動脈採血といった手技も安定して行うことができる状況である。F-18 FMISOによる低酸素領域のPETイメージングとO-15ガスPETを同一個体で続けて行う。すなわち、FMISO-PET画像にて腫瘍内の低酸素領域を同定し、O-15ガスPET機能画像と比較することで、低酸素領域における酸素消費量が明らかになる。これにより、腫瘍内に低酸素状態が生じる機序の解明につながると考えられる。平成25年度は腫瘍におけるO-15ガスPET実験の安定化を優先したため、免疫染色やその他の実験を次年度に行う必要が生じたため。F-MISO-PETとO-15ガスPETの比較を行い、さらに低酸素免疫染色(hypoxyprobe)による切片上での低酸素領域の評価を追加し、論文化する計画である。
医療系大学におけるESP導入期の専門語彙テストの開発と妥当性の検証

本研究は,医療系大学において語学教員が担当することが多い導入期の医療英語に関する科目において,英語の医療語彙がどの程度身についているかを客観的に測定するためのテストを開発することで,医療系大学の初期ESP(English for Specific Purposes)教育に貢献しようとするものである。大学低学年時は未だ専門教育が進んでいないため,専門的な知識を前提としない一般向けの医療系テキストが教材として相応しいとの判断から,独自に開発した一般患者教育向けの英文コーパスから抽出した語(句)を利用して日英,英日,空所補充,リスニングのテスト項目を作成し,出題形式およびESP語彙テストとしての妥当性を検討してきた。研究開始時から2年間は,放射線科学を専攻する学生を対象にしていたが,昨年度から医学科の学生を対象とすることになった。これまでに開発したテスト項目が専攻が異なる学生に対しても利用可能かどうかを判断するため,本年度は医学部の1年生を対象にテストを実施し,概ね放射線科学専攻の学生と同様の結果が得られた。本年度は,独自に編纂した患者教育向けテキストの英文コーパスの分析によって選定した語および句を用いて60項目の問題を作成し,「医学英語」を受講している大学1年生88名に対し,2回の試行テストを授業支援システムMoodleを利用してオンラインで行った。また,この授業に関しては,授業設計および教材開発の効果について,インプットとアウトプットの語彙に焦点をあてて分析した論文をまとめた。試行したテスト形式はいずれも多肢選択で(1)英語を見て相当する日本語を選ぶもの,(2)日本語を見て相当する英語を選ぶもの,(3)文中の空所を補充する語を選ぶもの,(4)英語を聞いて相当する日本語を選ぶもの,の4種類である。このうち,(3)の空所補充問題の文はコーパスから抜き出した実例を用いた。また,(4)のリスニング問題については,Moodle上での音声再生回数を制御することができなかったため,出題方法に課題が残った。2回目の試行テストについて,古典的テスト理論を用いて項目困難度,項目弁別力指数,実質選択指数に着目した分析,およびラッシュモデリングを用いてそれぞれの項目困難度とモデルフィットに着目した分析を行った。テスト全体の信頼性係数は低くはなかったが,個々の項目を細かく分析していくと,カタカナ語の影響で項目困難度が低くなっている問題や,選択肢がうまく機能していない問題など,改訂すべき点が明らかになった。それと同時に,学術語や接頭辞・接尾辞の指導など,今後の指導に取り入れるべき示唆が得られた。リスニングテストの形式について,当初は2,3種類の形式を試すつもりでいたが,1種類にとどまってしまっている。理由としては,リスニングテストの形式に関する先行事例の研究が遅れていることと,プラットフォームとして利用したMoodle上での音声制御に関わる課題が明らかになったからである。医療の国際化とチーム医療の普及により,医師だけでなく看護師や薬剤師など,他の様々な医療職にとっても英語のニーズが高まっている。特に英語医療語彙の習得が医療系大学でのESP(English for Specific Purposes)教育では重要な柱となりえる。本研究は,語学教員が担当することが多い,導入期の医療英語に関する科目において,医療語彙がどの程度身についているかを客観的に測定するためのテストをリスニングも含めて開発することで,医療系大学の導入期のESP教育に貢献しようとするものである。昨年度は,独自に開発した患者教育向けの英文コーパスから頻度,分布度,特徴度を基準として抽出した語句を対象に,日英,英日,空所補充から成る多肢選択型の語彙テストを開発し,パイロットテストを実施した。本年度は,当該テスト用にリスニング項目を追加作成し,医学英語を学ぶ放射線技術学専攻の大学1年生にパイロットテストを行った。出題形式は日本語選択型と英語選型の二種類を採用した。結果として,テスト形式は英語選択型のほうが難易度が高いことが確認されたが,これら二つの形式はタスクが似通っていたため,他の形式も検討する必要性が示唆された。個別の項目については,古典的項目分析とラッシュモデリングによる分析によって再検討が必要な項目が明らかになった。さらに,他のテスト結果との相関を見ることでESP語彙テストの妥当性を検討した。語彙のリスニングテストに関する日本人大学生を対象にした先行研究を参考にして,リスニングテストのタスクデザインを再考する必要が生じた。また,高校教科書のテキストデータ収集に手間取り,高校までの既習語彙とESP専門語彙とのギャップに関する分析が遅れている。本研究は,医療系大学において語学教員が担当することが多い導入期の医療英語に関する科目において,英語の医療語彙がどの程度身についているかを客観的に測定するためのテストをリスニングも含めて開発することで,医療系大学の初期ESP(English for Specific Purposes)教育に貢献しようとするものである。過去2年間にわたり,独自に開発した一般患者教育向けの英文コーパスから抽出した語(句)を利用して日英,英日,空所補充,リスニングのテスト項目を作成し,診療放射線技師養成大学で学ぶ大学1年生を対象にパイロットテストを行い,出題形式およびESP語彙テストとしての妥当性を検討してきた。日本語での解剖学の試験結果と,一般英語のプレースメントテスト結果,および英語医療語彙テスト結果の相関を見ると,解剖学とプレースメントテストには有意な相関は見られなかったが,解剖学と英語医療語彙テスト(特に空所補充問題)とは有意な相関が見られた。

本年度は,テストの対象者を医学部低学年生(1・2年次)に絞り,これまでに蓄積されていたデータを分析して全体的な英語力の見直しを行うことで,開発する語彙テストの難易度を調整するための参考資料を得るにとどまった。本年度の調査結果を踏まえ,次年度は,これまでよりも難易度の高い項目を英語医療語彙テストに加えて,当初の目的であるパラレルテストの作成に取り組む予定である。研究代表者の異動に伴い,英語医療語彙テストの実施対象が変わったため,対象コーパスの見直しとテスト項目作成をやり直す必要が生じた。本研究は,医療系大学において語学教員が担当することが多い導入期の医療英語に関する科目において,英語の医療語彙がどの程度身についているかを客観的に測定するためのテストを開発することで,医療系大学の初期ESP(English for Specific Purposes)教育に貢献しようとするものである。大学低学年時は未だ専門教育が進んでいないため,専門的な知識を前提としない一般向けの医療系テキストが教材として相応しいとの判断から,独自に開発した一般患者教育向けの英文コーパスから抽出した語(句)を利用して日英,英日,空所補充,リスニングのテスト項目を作成し,出題形式およびESP語彙テストとしての妥当性を検討してきた。研究開始時から2年間は,放射線科学を専攻する学生を対象にしていたが,昨年度から医学科の学生を対象とすることになった。これまでに開発したテスト項目が専攻が異なる学生に対しても利用可能かどうかを判断するため,本年度は医学部の1年生を対象にテストを実施し,概ね放射線科学専攻の学生と同様の結果が得られた。ESPにおける語彙テストにリスニングを導入する点は本研究の特色でもあるため,オンライン上での音声制御の課題を克服するため,専門家の助けを得る予定である。その後,リスニング問題については再度パイロットテストを実施する。来年度は,項目数を増やし複数のテストの等化と結果分析を進めるために,ESP語彙テストの開発経験がある専門家を研究分担者として一名増員する。高校教科書のテキストデータについては入手の目途が立ったため,遅れてはいるが来年度遂行できる予定である。コーパス研究に基づいた医学生向けの英語語彙リストはこれまでに数種類が開発されているため,それを利用した作問をすることによって効率化を図る。研究分担者の海外出張旅費が予定よりも安くできたための残金である。研究代表者の所属変更が年度途中にあったため,予定していた海外での研究発表を取りやめたため。研究代表者の所属変更により,研究計画を見直す必要が生じたため,研究期間を延長した。作問補助のための謝金,および国内外の学会での成果発表のための旅費の使用が予定されている。残金は,今後の出張旅費に組み込んで使用する予定である。作問と分析を担当する研究分担者を追加する予定であるので,分担者用の旅費に充てる。
平面磁路積層形パラメトリックモータの発振確立機構に関する研究

1.背景、目的筆者らは、市販モータにはない多くの特長を有し、市販モータと同等の出力、効率を有する平面磁路積層形パラメトリックモータの研究、開発を進めている。現在、低速回転領域でパラメトリック発振が不安定となる場合があること、またそのため設計法の確立が困難である等の問題が存在している。本研究の目的は、この問題解決のために、パラメトリック発振の確立機構を明らかにすることである。2.研究によって得られた新たな知見平成10年度は、固定子材質、寸法、形状と発振の安定性とモータ特性について種々の検討を行ったが、固定子の内側環状磁路を非対称とすれば、パラメトリック発振が安定化され、モータの出力、効率が大幅に向上することが明らかになった。平成11年度は、この成果を踏まえ、その非対称性を内外環状磁路に持たせた場合の発振安定性、モータ特性の関係について検討を行った。その結果、内側環状磁路非対称性は、出力、効率に大きな影響を及ぼし、外側環状磁路非対称性は、発振を安定化し、発振安定性に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。平成12年度は、この固定子磁路非対称性を磁極の配置、すなわち、磁極間角度を通常の90度より増やした場合の、発振安定性、モータ特性の関係について検討を行った。その結果、磁極間角度を増加させることにより、これまでに現れていた不安定動作の一つである、正転・逆転動作領域が減少し、最終的には消滅することが分かった。また安定領域が大幅に拡大し、発振の安定化に伴い、出力、効率が大幅に向上した。磁極間角度の最適値は、通常の90度より、10度15度増やした場合である。1.背景、目的筆者らは、市販モータにはない多くの特長を有し、市販モータと同等の出力、効率を有し、かつ生産ラインの新設が不要の、平面磁路積層形パラメトリックモータの作製に成功した。しかし、低速回転領域でパラメトリック発振が不安定となる場合があること、またそのため設計法の確立が困難である等の問題がある。本研究の目的は、上記問題解決のために、固定子材質、寸法、形状とパラメトリック発振安定性との関係について検討を行い、パラメトリック発振の確立機構を明らかにすることである。2.本年の研究によって得られた新たな知見(1)材質に関して固定子に方向性ケイ素鋼板を用い、磁化容易軸を磁極に平行とした場合は発振が不安定になり、磁極に対して45゚とした場合は安定となること。また、固定子に無方向性ケイ素鋼板を用いた場合は、上記前者の場合よりは安定となるが全体的に不安定となる。発振安定化には形状の変更が必要と考えられる。(2)寸法に関して発振現象に影響を及ぼす内側環状磁路幅の異なる3台のモータについて実験を行った結果、発振安定とする最適寸法が得られた。出力、効率向上のためには幅の更なる増大が必要である。また外側環状磁路幅を8.7%増大したモータについて実験を行った結果、安定性に大きな変化はなく、効率が8%向上した。(3)形状に関して固定子内磁束動作の測定結果から、内側環状磁路が非対称のモータについて実験を行った。発振安定性、出力、効率が大幅に向上した。また4極構造の場合にも発振は生じ、多極機の可能性も確認した。(4)理論的な裏付け固定子のみの磁気回路から非線形微分方程式を導出し、固定子形状寸法が変化した場合の発振安定性を定性的に解明した。今後、回転子を含んだ負荷印加時の微分方程式を導出し、安定性の解明を行う。

1.背景、目的筆者らは、市販モータにはない多くの特長を有し、市販モータと同等の出力、効率を有する平面磁路積層形パラメトリックモータの研究、開発を進めている。現在、低速回転領域でパラメトリック発振が不安定となる場合があること、またそのため設計法の確立が困難である等の問題が存在している。本研究の目的は、この問題解決のために、パラメトリック発振の確立機構を明らかにすることである。昨年度、固定子内磁束動作の測定結果から、固定子の内側環状磁路を非対称としてモータを作製すれば、パラメトリック発振が安定化され、モータの出力、効率が大幅に向上することが明らかになった。今年度は、この成果を踏まえ、その非対称性の度合いと、発振安定性、モータ特性の関係について検討を行った。また、非対称性を外側環状磁路に持たせた場合、更には、内側、外側の両方に非対称性を持たせた場合についても同様の検討を行った。2.本年の研究によって得られた新たな知見(1)内側環状磁路非対称の場合発振は安定化されるが、急峻な確立は起こらない。出力、効率に大きな影響を及ぼし、非対称性の度合いが大きい程、それらの値は大きくなる。(2)外側環状磁路非対称の場合発振はかなり安定化され、急峻に確立する。出力、効率にはほとんど影響を与えない。発振の安定化に最も有効と考えられる。(3)内外共通磁路非対称の場合上記、両者の特性を併せ持つ特性が得られる。(4)理論的な裏付け非対称固定子の磁気回路から非線形微分方程式を導出し、非対称固定子が発振の安定性に及ぼす影響を定性的に解明した。非対称固定子の発振安定化の主な理由は、励磁側磁束の共振側への流入による。一昨年度、固定子の内側環状磁路を非対称とすれば、パラメトリック発振が安定化され、モータの出力、効率が大幅に向上することが明らかになった。昨年度は、この成果を踏まえ、その非対称性を内外環状磁路に持たせた場合の発振安定性、モータ特性の関係について検討を行い、発振の安定化方法、モータの出力、効率の向上方法を明らかにした。本年度は、この固定子磁路非対称性を磁極の配置、すなわち、磁極間角度を通常の90度より増やした場合の、発振安定性、モータ特性の関係について検討を行った。2.本年の研究によって得られた新たな知見(1)磁極間角度を増加させることにより、これまでに現れていた不安定動作の一つである、正転・逆転動作領域が減少し、最終的には消滅した。また安定領域が大幅に拡大した。また発振の安定化に伴い、出力、効率が大幅に向上した。(2)磁極間角度を通常の90度より、10度15度とした場合、発振は最も安定となり、モータの出力、効率も最も良好となった。(3)単相励磁入力・三相パラメトリックモータの可能性を明確にした。
位相フィードバックを用いたロボットの適応的運動軌道生成

本論文では,入力信号から位相情報を抽出し,ロボットマニピュレータの運動軌道にフィードバックすることで様々な周期運動の位相および周波数を入力信号に対して同期させる手法を提案した.また,フーリエ級数近似式による運動軌道の多項式表現により任意の周期運動軌道の実現も可能とした.ロボットマニピュレータを用いた実験により,ステレオカメラシステムにより計測した人間の周期運動と同期した運動軌道の生成を確認した本論文では,入力信号から位相情報を抽出し,ロボットマニピュレータの運動軌道にフィードバックすることで様々な周期運動の位相および周波数を入力信号に対して同期させる手法を提案した.また,フーリエ級数近似式による運動軌道の多項式表現により任意の周期運動軌道の実現も可能とした.ロボットマニピュレータを用いた実験により,ステレオカメラシステムにより計測した人間の周期運動と同期した運動軌道の生成を確認した近年,一般家庭向けのロボットが発売されるなど,ロボットの活用公野が広がりつつある.そのため,これまで産業用ロボットが行ってきたような定常的な環境下での作業だけではなく,その時々の変化する外部環境に適応しつつ作業を行う能力をロボットが持つ事が求められている.そこで,本研究では,新たに位相フィードバックによるロボットの適応的な運動軌道生成手法の提案を行った.本年度は.これまで製作してきたシミュレーションシステムの拡充を行い,ステレオカメラシステムを用いたオンライン3次元位置計測システムを位相フイードバックを用いた適応的運動軌道生成システムに加える作業を行った.本提案手法の有効性を確認するため.人間の周期的な腕振り運動を上記のシステムを用いて計測を行い,ロボットシステムが,その運動に位相同期をかけることができるかどうかを確認する実験を行った.人間が運動途中で,運動の位相を変化しても,ロボットは1,2振りの間に追従する事が可能である事を確認した.これらの評価結果をまとめて,日本ロボット学会誌に投稿を行った.また,新たに上記手法に加えて,ウェーブレット変換を用いる事により,人間の運動から代表的な運動周期を取り出し.任意の人間の運動周期,位相に同期する事のできる手法を開発した.実機のロボットシステムを用いて,運動の周期.位相を変化させる人間の運動に追従して,同期する事が可能な事を確認した.この成果は,第25回日本ロボット学会学術講演会にて発表を行った.近年,一般家庭向けのロボットが発売されるなど,ロボットの活用分野が広がりつつある,そのため,これまで産業用ロボットが行ってきたような定常的な環境下での作業だけではなく,その時々の変化する外部環境に適応しつつ作業を行う能力をロボットが持つ事が求められている.そこで,本研究では,新たに位相フィードバックによるロボットの適応的な運動軌道生成手法の提案を行った.本年度は,昨年度開発した位相フィードバック手法の能力を確認するため様々な条件可での位相,周期の同期性能の確認を行った.また,複数の周期の運動が合成された運動から,特定の周期のみを抜き出し,それに同期するための手法の開発を行った.ここまでの成果は,2008年度目本機械学会ロボティクスメカトロニクス講演会にて発表を行った.また,手法として安定した性能を発揮できることを確認できたので,Journaul of Robotics & Mechatoronicsに投稿を行い,採録されることが決定した.さらに,視覚による観測においては遮蔽が常に問題となる.本手法のロバスト性能を活用して,視覚情報の入力が遮蔽によって一時的に途絶えても周期的な運動を乱さずに行うことのできるゲインコントロール手法を開発,提案を行った.この内容は,2009年度日本機械学会ロボティクスメカトロニクス講演会にて発表予定である.
ヌードマウス可移植性甲状腺未分化癌を用いた血管新生阻害剤の局注効果に関する検討

甲状腺未分化癌は、分化癌と比較して経過が極めて急速で、従来の治療法では十分な効果が得られないまま、短期間のうちに死の転帰をとっている。これらの状況を打開するために我々は、より効果的な治療体型の確立を目指し、臨床ならびに実験的立場より検討を重ねている。近年、腫瘍増殖に関してはtumor angiogenesisに関連する研究が急速に進展し増殖因子を含め多方面からの検索が展開され、特に血管新生阻害による抗腫瘍効果は新たな方法として注目されている。本研究では現在行われている集学的治療効果をさらに向上させる目的で当大学で樹立したヌードマウス可移植性ヒト甲状腺未分化癌を用い、最近注目されている血管新生阻害剤TNP-470(武田薬品工業より供与)の局注による腫瘍増殖抑制効果を検討した。さらに増殖抑制機序の解析を免疫組織化学的手法により解析した。平成5年度および平成6年度に行った腫瘍増殖抑制効果試験では、TNP-470腫瘍内投与および腫瘍周囲投与において著明な効果が認められた。また、平成7年度に施行したFactor XIIIによる免疫組織化学的検討ではTNP-470投与群は有意な腫瘍血管数の減少が認められ、増殖抑制機序は血管新生の阻害によることが確認された。以上よりヌードマウス可移植性ヒト甲状腺未分化癌に対する抗腫瘍効果が認められ、臨床応用、ことに局所治療においての有用性が示唆された。血管新生阻害剤(TNP470)の抗腫瘍効果について,平成5年度は以下の投与方法により検討した。1.腹腔内投与法:TNP50mg/kgを移植腫瘍生着確認後,4日毎に計6回,腹腔内に注入し,経日的に腫瘍増殖度(腫瘍重量として算出)の変化ならびに実験最終段階における病理形態学的所見をcontrol群と比較検討した。その結果,腹腔内投与群ならびに対照群はともに類似の増殖曲線を示し,本剤の腹腔内投与では,腫瘍増殖抑制効果は全く認められなかった。2.腫瘍内注入法:TNPの投与濃度を、体重Kg当り5mg,10mg,20mg,50mgの4群とし,腫瘍内に注入後control群と比較した。なお投与間隔や評価法は1と同じである。その結果,20mgでは対照群に比べ軽度の抗腫瘍効果が認められ,さらに50mgでは著しい増殖抑制効果を認め(P<0.01),移植した腫瘍部位は瘢痕様の変化を示し,病理組織学的にも同様の所見が観察された。3.腫瘍周囲局注法:次に、TNP50mg/kgを生着腫瘍辺縁より数mm離して(TNPの腫瘍細胞への直接効果を防止する目的で),数個所に局注を行い,対照群と比較した。なお効果判定法は1,2と同様である。その結果,本投与法の場合も,局注後,経過日数を追うごとにTNP群に有意の腫瘍増殖抑制効果を認めた。以上,当刻年度は,血管新生阻害剤TNP470の腫瘍内および腫瘍周囲の局所注入において明らかな抗腫瘍効果が確認された。前年度に報告したごとく,血管新生阻害剤(TNP470)のヌードマウス可移植性ヒト甲状腺未分化癌に対する局注効果の検討より,本剤は明らかな腫瘍増殖抑制効果を有することが確認された。当該年度では,次の抗腫瘍効果の基礎実験として,腫瘍の移植部位とは関係のない遠隔部位の皮下にTNPを投与して増殖抑制効果の有無を検討した。しかし,control群と比較しても有意の抑制効果は認められなかった。更に別の基礎的検討として,腫瘍部へのTNP局注により増殖抑制効果を認めた切除材料を用い,抗腫瘍作用の機序に関し病理組織学的ならびに免疫組織学的手法により検索を行った。病理組織学的検討では,腫瘍細胞の著明な破壊(壊死)像と残存癌細胞周辺への著しい結合織の増生が観察された。一方,血管新生阻害作用を形態学的に証明する目的で,抗下FGF抗体やFactorVIIIを用い血管内皮細胞のABC法による免疫染色を行った。

しかし,パラフィン包埋切片ではいずれの場合も血管内皮が全く染色されず,方法論的に改善する必要が確認され、現在検討を行っている(例;電子レンジによる加熱処理)。このため,コンピューター処理による血管構築解析も未実施の状態であり,次年度に継続予定である。最終年度の本年は課題であった血管新生阻害剤TNP-470の抗腫瘍効果の機序に関し免疫組織学的検討を行った。抗腫瘍効果が確認された(1)TNP腫瘍内投与群,(2)TNP腫瘍周囲投与群と(3)無処置についてパラフィン包埋切片を作製1factorVIII抗体を用い免疫染色を行い、評価は光顕にて各標本3視野の単位面積あたりの腫瘍辺縁部の血管数を数え(血管数/mm^2)平均化した。腫瘍内血管はfactorVIII陽性であり、腫瘍辺縁部に強い陽性所見を認めた。(1)TNP腫瘍内投与群7.8±2.9に対し対照群(アラビアゴム投与)27.0±6.3,(2)TNP腫瘍周囲投与群9.7±2.6に対し対照群21.1±5.1,(3)無処置群30.8±6.9であり,TNP投与群は有意に血管数が少なかった。以上の結果よりTNPの腫瘍増殖抑制効果は血管新生阻害によることが確認された。
イソアミラーゼの立体構造と反応機構解析の研究

Pseudomonasイソアミラーゼの酵素単独構造を2.2Å分解能で解析し発表した。また本酵素はマルトテトラオース、マルトトリオースによって競争阻害されることが知られているので、マルトテトラオースを使って基質アナログとの複合体結晶の調製を試みた。ネィティブ結晶を10mMのマルトテトラオース液に5時間浸漬したものを試料としてX線回折実験に供した。X線回折実験はSPring-8兵庫県ビームライン(BL24XU)で行った。複合体の解析はネィティブ結晶の解析で得られたモデルを用いて分子置換法により行った。分子置換法によって得られた解に基づいて差フーリエ合成を行い、電子密度に対Gグルコース残基の位置の検索を行った。グルコース残基及び水分子の検索と構造精密化を繰り返し、最終的に活性クレフト近傍に合計4個のグルコース残基の位置を見いだした。グルコース残基4個と水分子526個を含んだ1.8Å分解能での構造精密化の結果、結晶学的R値は20.1%、Rfree値は26.3%になった。見いだされたグルコース残基の中で最も還元末端側に存在するものはTyr250とスタッキング相互作用する位置にあり、他のα-アミラーゼファミリー酵素におけるサブサイト-1に相当している。また、他のグルコース残基もそれぞれサブサイト-2-4に相当していることが確認できた。一方、+1位に相当するグルコース残基は電子密度上から確認することはできなかった。α-1,4-グルコシド結合を加水分解するタイプのα-アミラーゼファミリー酵素の基質あるいは基質アナログとの複合体との構造比較から、Leu376とGlc(+1)の04との間で立体障害が生じ、α-1,4-グルコシド結合を加水分解する基質結合様式をとることが困難であることが推測された。このことからLeu376がイソアミラーゼの基質特異性を決定を左右する残基であると推測している。Pseudomonasイソアミラーゼについて、既に得ていたnative構造の精密化を行い、プロテインデータバンク(PDB)に登録した(登録コード1BF2)。また、FlavobacteriumイソアミラーゼについてプログラムMODELLERを使ったホモロジーモデリング法により構造予測を行い、活性中心付近の立体構造の保存性について検討を加えた。さらに、共結晶化法および浸漬法で基質アナログとPseudomonasイソアミラーゼの複合体結晶の調製を試みた。種々の条件を検索した結果、6-0-α-グルコシル-β-シクロデキストリンを基質アナログとして用いた浸漬法で酵素-基質アナログ複合体結晶の調製に成功した。Pseudomonasイソアミラーゼのnaitive結晶を50mMの6-0-α-グルコシル-β-シクロデキストリン液に15時間浸漬したものを試料としてX線回折実験に供した。X線回折実験はSPring-8の兵庫県ビームライン(BL24XU)を用いて行った。位相決定はnativeイソアミラーゼの座標を用いた分子置換法で行った。分子置換法で得られた解に基づいて差フーリエ合成を行い、電子密度に対して基質アナログ分子の位置を検索した。その結果、ドメインA中央部の活性クレフトに比較的大きな電子密度の固まりを見いだすことができた。とりわけTyr250の近傍にGlc残基とフィットする電子密度の固まりを見いだした。この位置にβ-シクロデキストリンの分子モデルのGlc残基の一つを重ね合わせることで初期モデルを構築した。

この初期モデルに対してプログラムX-PLORを使ったシミュレーティド・アニーリング法にり2.2A分解能での構造精密化を試みたところR-値は20.2%となったが、シクロデキストリン環の一部がはっきり見えていないため、複合体結晶の調製とX線回折実験に関して条件を再検討する必要がある。Pseudomonasイソアミラーゼはマルトテトラオース、マルトトリオースによって競争阻害されることが知られているので、マルトテトラオースを使って基質アナログとの複合体結晶の調製を試みた。ネィティブ結晶を10mMのマルトテトラオース液に5時間浸漬したものを試料としてX線回析実験に供した。X線回析実験はSPring-8兵庫県ビームライン(BL24XU)で行った。複合体の解析はネィティブ結晶の解析で得られたモデルを用いて分子置換法により行った。分子置換法によって得られた解に基づいて差フーリエ合成を行い、電子密度に対してグルコース残基の位置の検索を行った。グルコース残基及び水分子の検索と構造精密化を繰り返し、最終的に活性クレフト近傍に合計4個のグルコース残基の位置を見いだした。グルコース残基4個と水分子526個を含んだ1.8・分解能での構造精密化の結果、結晶学的R値は20.1%、R free値は26.3%になった。見いだされたグルコース残基の中で最も還元末端側に存在するものはTyr250とスタッキング相互作用する位置にあり、他のα-アミラーゼファミリー酵素におけるサブサイト-1に相当している。また、他のグルコース残基もそれぞれサブサイト-2-4に相当していることが確認できた。一方、+1位に相当するグルコース残基は電子密度上から確認することはできなかった。α-1,4-グルコシド結合を加水分解するタイプのα-アミラーゼファミリー酵素の基質あるいは基質アナログとの複合体との構造比較から、Leu376とGlc(+1)の04との間で立体障害が生じ、α-1,4-グルコシド結合を加水分解する基質結合様式をとることが困難であることが推測された。このことからLeu376がイソアミラーゼの基質特異性を決定を左右する残基であると推測できる。ネィティブ結晶を10mMのマルトテトラオース液に5時間浸漬したものを試料としてX線回折実験に供した。X線回折実験はSPring-8兵庫県ビームライン(BL24XU)で行った。分子置換法によって得られた解に基づいて差フーリエ合成を行い、電子密度に対Gグルコース残基の位置の検索を行った。グルコース残基4個と水分子526個を含んだ1.8Å分解能での構造精密化の結果、結晶学的R値は20.1%、Rfree値は26.3%になった。
変異型γδ型TCRのX線結晶解析構造と抗原認識能との相関解析

ヒトγδ型T細胞は、結核菌、マラリア原虫、大腸菌O157など病原性微生物の産生するピロリン酸モノエステル系化合物、プロテウスなど病原性細菌の産生するアルキルアミン系化合物、高カルシウム血症などの治療薬として知られる窒素含有型ビスホスホン酸系化合物などを認識して、様々なエフェクター作用を呈する。一般に、αβ型T細胞はMHCに拘束されたペプチド性抗原をαβ型T細胞受容体で認識するが、γδ型T細胞はMHC非依存的に非ペプチド性抗原を認識するため、その詳細な認識機構はほとんど明らかにされていない。今回、γδ型T細胞受容体にアラニン置換の点変異を行い、T細胞受容体陰性のJurkat細胞をトランスフォームし、変異γδ型T細胞受容体を発現する種々のJurkat細胞を樹立し、その反応性を詳細に解析した。また、それら変異型γδ型T細胞受容体を大腸菌で発現させ、結晶化を行うことにより、X線結晶構造解析のための準備を行った。変異実験に関しては、γK109、δR51、δL97をアラニン置換することにより、全ての非ペプチド性抗原に対する認識能が消失した。このことより、機能的にはこの3つのアミノ酸残基が非ペプチド性抗原認識に重要な役割を果たしていることが明らかになった。また、γδ型T細胞受容体の結晶解析に関しては、γ鎖およびδ鎖を大腸菌で発現させ、それぞれの封入体を精製し、アルギニンベースの緩衝液でリフォールドした。さらに、PEGベースの緩衝液中で結晶化を行い、X線結晶解析のための準備を整えた。今後、機能と構造の相関関係を明らかにすることにより、γδ型T細胞による非ペプチド性抗原認識能を明らかにする予定である。本年度は、まずγδ型T細胞受容体遺伝子に点変異を導入した。さらに、それらをJurkat細胞に導入し、IL-2の産生を指標にして抗原認識能におよぼす影響について検討した。また、可溶型T細胞受容体の産生に関しては大腸菌での発現系を確立した。点変異導入に関しては、γδ型T細胞の割合の多い健常成人末梢血においてもっとも出現頻度の高いγ鎖およびδ鎖を選択し、そのぞれのcDNAをpEF-BOS発現ベクターに組み込んだ。そして、変異導入キットを用い定法により、γK108、γK109、δR51、δL97にアラニン置換あるいはセリン置換を行い、γK108A、γK109A、δR51A、δL97A、δ97Sを得た。さらに、それらを対となる野性型γ鎖あるいはδ鎖と組み合わせ、pST-NeoBマーカー遺伝子とともにTCRβ鎖欠損型Jurkat細胞にエレクトロポレーション法により導入した。細胞はGeneticinにより選択し、CD3からのシグナル伝達を確認後、ピロリン酸モノエステル、アルキルアミン、窒素含有型ビスホスフォネートによる刺激を行い、反応性をIL-2産生を指標にして行った。その結果、γK108A、δR51A、δL97A、δ97Sにおいて反応性の消失が観察された。このことから、非ペプチド性抗原の認識においては少なくともγK108、δR51、δL97の3つのアミノ酸残基が関わっていることが示唆された。次に、可溶型T細胞受容体の調製に関しては、γ鎖およびδ鎖のcDNAをpLM1発現ベクターに組み込み、RBSを適宜変換後さらにレアーコドンを大腸菌型に変換し、約200mg/1の収率で両鎖をインクルージョンボディーとして産生する系を確立した。また、T細胞受容体のリフォールディングに関して、アルギニンベースの緩衝液でpH8.0が至適条件であることを確認した。
4次元多様体の同相群・微分同相群と族のゲージ理論

4次元多様体の同相群と微分同相群との間の差を調べることを研究目標とする.研究手法は,理論物理に由来するゲージ理論から現れる偏微分方程式の連続族を考えることである.従来のゲージ理論は,4次元多様体の位相構造と可微分構造との間の差を見出す上で主要な道具であった.一方,数学的対象が与えられたときに,その自己同型群の研究は基本的である.本研究では,4次元多様体の位相多様体としての自己同型群と,可微分多様体としての自己同型群との間の違いを引き出すことを目指す.具体的応用としては,位相的な4次元多様体バンドルであって,滑らかなファイバー束の構造を持ち得ないものを,系統的に構成することができると見込まれる.4次元多様体の同相群と微分同相群との間の差を調べることを研究目標とする.研究手法は,理論物理に由来するゲージ理論から現れる偏微分方程式の連続族を考えることである.従来のゲージ理論は,4次元多様体の位相構造と可微分構造との間の差を見出す上で主要な道具であった.一方,数学的対象が与えられたときに,その自己同型群の研究は基本的である.本研究では,4次元多様体の位相多様体としての自己同型群と,可微分多様体としての自己同型群との間の違いを引き出すことを目指す.具体的応用としては,位相的な4次元多様体バンドルであって,滑らかなファイバー束の構造を持ち得ないものを,系統的に構成することができると見込まれる.
紫外共鳴ラマン分光法を用いた生細胞中タンパク質の選択的観測法の開発

タンパク質の構造に基づいて作用機構を理解するには、精製したタンパク質だけではなく、生きた細胞中にあるタンパク質を対象とした研究が必要である。本研究課題では、生きた細胞中にあるタンパク質のラマンスペクトルを、高感度かつ選択的に観測可能とする計測手法を開発した。この方法を用いて、生細胞中に含まれるタンパク質の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定し、過剰発現したタンパク質の種類やその発現量依存性を調べた。1.高い生産効率をもつベクターを活用した培養細胞の調製生細胞中のタンパク質の濃度を上げることができれば、そのスペクトルを観測しやすくなる。コールドショック遺伝子を利用しタンパク質発現システムを用いることによって、宿主細胞由来タンパク質の合成を抑制し、目的タンパク質のみを高効率で得ることを試みた。しかし、効率の大幅な向上はみられず、大腸菌におけるクローニングおよび組換えタンパク質発現用として広く用いられているpETベクターの方が有利であると判断されたので、これを用いて生細胞の紫外共鳴ラマンスペクトル測定を行うことにした。2.生細胞の紫外共鳴ラマンスペクトル測定:発現量依存性プラスミドによって発現したタンパク質が紫外共鳴ラマンスペクトルに観測されているかどうかを調べるために、発現誘導後の大腸菌のスペクトルを観測した。発現誘導後、1時間おきに紫外共鳴ラマンスペクトルを測定したところ、ラマンバンドの相対強度に変化が観測された。これは、プラスミドによって大腸菌内で目的タンパク質が発現し、大腸菌自体の核DNAによって発現したタンパク質との相対強度が変化したためだと考えられる。3.生細胞の紫外共鳴ラマンスペクトル測定:発現タンパク質依存性プラスミドに導入する外来遺伝子を変え、大腸菌中で過剰発現するタンパク質を変化させた。具体的には、ミオグロビン、イエロープロテイン、緑色蛍光タンパク質(GFP)の3種類を試した。これらが発現した大腸菌の紫外共鳴ラマンスペクトルを比較したところ、ラマンバンドの相対強度に違いが観測された。これは、大腸菌試料の紫外共鳴ラマンスペクトルに外来遺伝子由来のタンパク質の寄与が含まれていることを示している。以上の確認実験から、生細胞中に含まれるタンパク質の紫外共鳴ラマンスペクトル測定法の基礎を作ることができた。1.高粘性の懸濁試料用のプローシステムの開発ラマン散乱の励起に用いる紫外光はタンパク質試料に損傷を起こしやすい。そのため、測定試料はフローさせ、常にフレッシュな試料に紫外光が当たるようにする必要がある。そこで、粘性の高い試料溶液であっても安定な液膜ができるよう、ノズルの内径や断面の形状を最適化した。2.迷光低減のためのフィルター分光器の高性能化高濃度の懸濁細胞溶液は紫外光の波長レベルで不均一性が存在する。このような試料ではレーリー散乱光が強く、低振動数領域のスペクトル測定が困難である。低振動数領域のスペクトルにはタンパク質の構造解析に重要なラマンバンドが多く観測されるため、その測定は必須である。そこで迷光をできるだけ抑え、かつ高感度の測定ができるよう、現有のフィルター分光器を改良した。また、主分光器内にも細かく仕切りを設けることで、低迷光で低振動数領域の測定が培養細胞に対して行えるようにした。3.高い生産効率をもつベクターを活用した培養細胞の調製生細胞中のタンパク質の濃度を上げることができれば、そのスペクトルを観測しやすくなる。現段階では、効率の大幅な向上にはまだ至っていないが、培養条件の検討を引き続き行っている。上記、1および2の達成によって、観測システムの性能は当初計画していたレベルに達したといえる。今後は、細胞内における目的タンパク質の濃度を上げることによって、生細胞中でのタンパク質の共鳴ラマンスペクトル測定を目指す。今年度の主な目標としていた観測システムの高性能化は、試料部と検出部ともに達成できた。そのおかげで生細胞の測定は再現性良く行えるようになった。観測システムの性能は当初目標としていたレベルに達したので、今後は細胞内における目的タンパク質の濃度を上げることによって、生細胞中でのタンパク質の反応観測を目指す。研究計画の変更あるいは研究を遂行する上での問題点は特にない。生細胞中タンパク質観測の検証実験平成23年度に整備した測定系を用いて、生きた細胞中のタンパク質の紫外共鳴ラマンスペクトル測定を行う。まず、目的タンパク質が観測されているかどうかを検証するために、以下の2つの実験を行う。(a)細胞中で発現させるタンパク質の種類を変え、観測される紫外共鳴ラマンスペクトルがそれに応じて変化するかを調べる(b)細胞中で発現させるタンパク質の量を変え、観測される紫外共鳴ラマンスペクトルの強度がそれに応じて変化するかを調べるこれらの検証実験により、目的タンパク質が観測されていることが確認されれば、次に生細胞のスペクトルと細胞から単離・精製したタンパク質のスペクトルとを比較する。スペクトルの違いをもとに、細胞内の環境がタンパク質の構造、タンパク質間相互作用、動態にどのような影響を与えているかを明らかにする。
在宅看護における感染予防システムに関する研究

在宅生活高齢者や在宅療養者の中に、易感染性者が増加している。本研究では、1)MRSAをマーカーとして、在宅感染源の所在追求およびその感染経路と環境分散に関して細菌学的調査、2)在宅感染予防看護法、3)在宅看護における感染予防システムを米国の訪問看護実態と比較し、研究した。その結果、次のことを得た。1)在宅療養者におけるMRSA感染源は院内感染に由来している。2)在宅感染源からの環境分散は感染部位に接するシ-ツや下着、手指などの汚染を介して、扉ハンドルや洗面所の窓のひき手、床などに拡大していた。また、入浴介助装置にも拡大が認められた。3)手指汚染は洗浄と消毒薬の塗布により、病床周囲の環境汚染は一般的に用いられる消毒薬の塗布やぬぐい去りにより除去されていたが、入浴介助装置である療養者を浴槽内で支えるネットの汚染は通常行われている方法では除去困難であった。4)米国訪問看護会社の実例調査では、(1)感染予防は医療機関内と同様な基準で行われている、(2)感染症の診断の有無に関わらず感染予防を徹底している、(3)感染予防用消毒器材(例:消毒物品キットや消毒薬剤浸染綿棒キット)を工夫、開発している、(4)感染予防マニュアルが作られている、(5)感染予防システムは医療保障制度や労働安全施策と連動している。以上のことから、我が国の在宅看護においても感染予防の徹底を図るシステムが必要であり、本研究に関連しては筋・神経疾患の在宅看護マニュアルに感染予防項目をおいた。【研究課題】現在、MRSAを筆頭にする感染症が大きな課題となっている。近年、在宅療養患者に医療依存度が高く、易感染状態にある患者が増加していることによって、高の課題は医療機関内だけではなくなっている。そこで、在宅患者の実態を調査し、課題解決のための感染予防システム(案)の作成を目的とする。今年度は(1)細菌学的検索を中心とする実態調査、(2)全国の訪問看護婦44名から使用器具の消毒に関する調査、(3)米国の訪問看護会社の感染予防対策の資料入手を行った。今回は(1)に関して報告する。【研究方法】医療依存度が高い在宅神経系疾患患者12例における患者の創部、在宅で用いている器材および病床の環境に関して、MRSAを中心とする細菌学的検索を行った。【結果と考察】(1)入院歴が長い患者では、感染巣で検出される細菌は院内感染源を反映していた。(2)特に気管切開蒼や尿道口等で検出されるMRSA、緑膿菌等の感染は、気管では分泌物を増し気道確保を妨げ、吸引回数の増加をもたらし、また、尿路感染の原因となり、患者と介護者の負担を増加させていた。(3)患者がもつ感染源は器材や介護者を介して、再度患者に戻り得る感染サイクルを形成しており、処置に用いる器材と処置後器材の適切な消毒や滅菌法の強化が必要と考えられた。(4)感染源の存在の有無を確認することは、介護者教育においても、また、感染の拡大を防止する上でも不可欠なことであり、定期的な細菌検索が望ましいと考えられた。【まとめ】(1)今回の成績では、患者の感染源は在宅環境自身よりも病院内感染の持ち帰りによるものであり、この定着が在宅感染患者の実態と推測された。(2)在宅で用いられる器具器材の消毒は感染経路を絶つ上で重要である。在宅療養者に関する看護サービス上の感染予防に関して細菌学的検査を行い、感染予防対策を検討する。在宅看護対象者23名の細菌学的検査により、1)在宅患者から院内感染由来と推測されるMRSAが検出された。2)MRSAは退院時申し送られていない部位でも発見された。3)院内感染の既往は申し送られていない事例もあった。4)在宅患者の予防的細菌学検査は極めて困難が多い。5)滅菌器具や消毒薬の供給体制がない。

6)素人である家族が無菌操作を行っている。7)家庭外ケア提供者の出入りが多い。素人が多い。8)患者・家族は感染による発熱や化膿創を有している。9)患者は訪問看護婦やヘルパー派遣、入浴サービス、入院、入所を拒まれるなどの感染疎外に遭遇していることが分かった。つまり、在宅ケアの感染予防課題は1)感染源(1)-4))が不確定、2)感染経路を遮断することが困難(5)-7))、3)感染経路が複雑(6)-8))で感染疎外を生じていることであった。そこで、感染者を疎外しない看護サービス体制をとっている機関の対策を調査し、そのあり方を米国例と比較、検討し、訪問看護婦教育用ビデオ・テープを作成する準備をした。また、日本看護科学学会および日本環境感染学会、難病看護研究会に働きかけ、本課題に関するシンポジュウムを開催してもらい、シンポジストおよび司会者として参加した。在宅看護は医療、保健、福祉制度の改定により、従来よりも易感染性状態の人々を対象にするようになっており、感染予防はますます重要かつ緊急な研究課題になっている。在宅生活高齢者や在宅療養者の中に、易感染性者が増加している。本研究では、、1)MRSAをマーカーとして、在宅感染源の所在追求およびその感染経路と環境分散に関して細菌学的調査、2)在宅感染予防看護法、3)在宅看護における感染予防システムを米国の訪問看護実態と比較し、研究した。その結果、次のことを得た。1)在宅療養者におけるMRSA感染源は院内感染に由来している。2)在宅感染源からの環境分散は感染部位に接するシ-ツや下着、手指などの汚染を介して、扉ハンドルや洗面所の窓のひき手、床などに拡大していた。また、入浴介助装置にも拡大が認められた。3)手指汚染は洗浄と消毒薬の塗布により、病床周囲の環境汚染は一般的に用いられる消毒薬の塗布やぬぐい去りにより除去されていたが、入浴介助装置である療養者を浴槽内で支えるネットの汚染は通常行われている方法では除去困難であった。4)米国訪問看護会社の実例調査では、(1)感染予防は医療機関内と同様な規準で行われている、(2)感染症の診断の有無に関わらず感染予防を徹底している、(3)感染予防用消毒器材(例:消毒物品キットや消毒薬剤浸染綿棒キット)を工夫、開発している、(4)感染予防マニュアルが作られている、(5)感染予防システムは医療保障制度や労働安全施策と連動している。以上のことから、我が国の在宅看護においても感染予防の徹底を図るシステムが必要であり、本研究に関連しては筋・神経疾患の在宅看護マニュアルに感染予防項目をおいた。
遺伝子配列特異的微生物回収技術の開発とそれを用いた廃水処理微生物群集の機能解明

サンプルをフィルトレーションし、CARD-FISH法を適用した後、フィルターを溶解し、配列特異的に微生物を回収する技術の開発を行った。フィルターを溶解する溶媒やその量、微生物群集構造への影響を評価した。また廃水処理プロセスとしてフェノール処理バイオリアクターの微生物群集構造を解析した。主要3グループについてFISHプローブを設計し、それを用いてグラニュール内の空間分布を明らかにした。本研究は、廃水処理複合微生物群集から我々が開発してきたtwo-pass TSA-FISHを用いて特定機能遺伝子配列情報に基づいて微生物を染色し、それらを抗原抗体反応を用いてマグネットビーズにより回収後、DNA抽出・核酸増幅を経てこれら細胞の分子系統および機能を解明するための技術を開発しようとするものである。これまでに分離・培養されていない未知微生物群からの遺伝子資源の回収とコミュニティメカニズムの解明を行うことで、排水処理システムにおける微生物コミュニティ解明のための基盤ツールの提供を目指した。H22年度は、純粋菌株を標的として微生物を検出する際に、tyramide-Fluoresceinを沈着させた。抗Fluorescein抗体を用いて、沈着させたFluoresceinを抗原として標的菌体のみをマグネットビーズに結合させた。マグネットビーズはサイズがいろいろあるが、その内で最適なものを選択することで、分取に成功した。しかしながら標的菌体の集積率はさほど良くなく、非特異的な巻き込みがその原因であると考えられた。それを克服するために、現在洗浄条件などを検討中である。また濃度の薄いサンプルへの適用性およびCARD-FISH法適用の際の細胞壁処理を容易にするために、フィルター上に菌体を補足し、それらにCARD-FISH法を適用後、再度水溶液中に回収する方法についても検討を行った。具体的にはメンブレンを溶媒で溶かすことで溶液中に回収することを試みており、本年度は、メンブレンを溶かす溶媒の種類および直径25mmのメンブレン1枚を完全に溶解させる(目視レベル)のに必要な溶媒の量などについて検討した。H23年度はH22年度に引き続き、マグネットビーズを用いた微生物回収法の開発を行った。集積率が低い原因として、1.5mlチューブで全ての作業を行うため、菌濃度が非常に高くなってしまうこと、また壁面に補足する菌体が集まるときに余剰物を巻き込みやすいことが分かったため、より大きな反応系でマグネットビーズの回収を行う事が適切であるとの結果に至った。また、「メンブレンの溶解は、アガロースで包埋した後に溶解させると、目視レベルでは問題ないが顕微鏡観察するとフロックが形成されていることが明らかになった。これを破砕するために、熱処理などを試みたがうまく行かず、最終的には超音波で破砕することが最も適した方法であることが分かった。この他、回収技術を適用するサンプルの予備的知見として、フェノール廃水を処理するUASBリアクター汚泥中の微生物群集構造を解析し、フェノール分解に関与する微生物群に関する遺伝子レベルでの情報を蓄積した。