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高等教育におけるカリキュラムの国際化に関する調査研究

・国際関係・国際問題を内容とする科目群・既存科目の内容の国際的比較の視点と方法の導入による拡張・国際的専門職資格取得のためのカリキュラム・異文化間コミュニケーション技能獲得のためのカリキュラム・学際的地域研究・広域研究・二重学位取得プログラム・外国研修を必修とするカリキュラム・留学生受入れのための特別プログラム(3)OECD及びNuffic側分担各1名を九州大学に招き、上記の調査結果について日本側各研究分担者発表会を兼ねた国際共同セミナーを開催。(4)調査研究成果の国際比較分析・整理、並びに1995年11月パリOECD本部で開催予定のOECD/CERI国際協同研究集会に提出する研究成果報告のまとめ方について協議するため、日本側分担者2名がオランダNuffic及びOECDを訪問。3.調査研究結果の要点(抄)日蘭両国の大学に関する事例研究調査から、両国において多様なプログラムの開発が目立ち、とくにわが国の場合、仮説的類型のほとんどすべてをカバーする事例がが見出された。カリキュラムの国際化は、主に自国民学生対象のものと留学生対象のものとに大別される。前者については、異文化間のコミュニケーション技能の獲得をめざすプログラムから、世界労働市場をにらんだ国際的に通用する専門職資格の取得を助けるプログラムに至るまで、多様なケースが見出された。そうした国際化されたカリキュラムの開発には、外国の有力大学との国際的協力関係を活用しようとする傾向が認められた。また後者については、近年、両国に共通する特色として、国際語(英語)による留学生プログラム開発が漸増していることが特筆される。
磁場を利用した光反応の促進に関する研究

一見磁石に応答しない物質や現象・反応も実際は変化している。磁場効果(MFE)は均一系反応で高い再現性や理論が知られるが、界面を伴う不均一系、特に光触媒反応では報告すら限定的である。本研究ではZnO、TiO2粉末に磁場中で紫外光を照射し、色素溶液脱色反応を用いてMFE関与パラメタを検討した。そして誤差2%の高い再現性と、磁場強度、溶液濃度、溶存酸素濃度、ガス吸着等粉末表面状態の影響を確認した。これより、固-液界面では静電ポテンシャル勾配により有効磁気力が酸素に生じ、短範囲拡散・磁気対流を誘発してMFEを発現するという現象論的OANS(表面近傍酸素流動加速)モデルを提唱し、その妥当性を示した。不確定要素の多い光触媒磁場効果(MFE)を再現性よく得られることがまず最も大切であったが、その点、[再現性の高いMFE」については、確認が得られ、次のステップへと進んでいる。これは、MFEの温度擾乱に対する綿密な制御が一つの鍵であったが、それについて様々な工夫により細心の注意を払った循環冷却システムを組むことでMFE制御に成功し、ほぼ連続的に光触媒色素分解が磁場影響下で測定できるようになり、この新しいシステムを利用してMFEの温度依存について重要な知見が得られつつある。また磁場の大きさによる光触媒の変化や溶存酸素の影響についても、少しずつデータがそろいつつある。一方、スピントラップ剤を用いたラジカルの同定については、ESR測定も含めて、まだその方法を確立したとは言いがたく、溶液中の各活性酸素などMFEに影響を与える可能性が高い要因物質を定量的に検出するため、捕捉剤の更なる検討とも関連させて、今後も技術等の習熟と研鑽が必要である。また、酸素の三重項状態と励起一重項状態との判別を化学発光検出によって行う予定であったが、補助金の減額や光学システム設計の問題等もあり、それ以外の磁場依存や酸素濃度依存、温度制御、被分解物質によるMFEの変化、などに現在重きを置いている。これらを総合すると、当初の実施計画から遅れはあるものの、方向を少し転換したこともあり、研究は比較的順調に進んでおり、興味深い結果が得られつつある段階である。なお、今年8月末にはアメリカで開催される環境触媒の国際学会(ICEC2014)にて、これらの内容を基本とした光触媒磁場効果に関する基調講演を行うことになっている。不均一系光触媒反応の磁場効果(MFE)は報告数が限定的で機構が未解明のうえ、多くはTiO2である。我々のグループは平成25年度まで、ZnO光触媒によるメチレンブルー水溶液分解を調査し,MFEは溶液静置時間、溶液濃度、溶存酸素(DO)濃度と状態、磁場強度に依存する事を明らかにした。平成26年度は、MFEの温度依存性の他、ZnO表面状態(特にガス吸着)の影響を調べ、磁気吸着の関与が示唆された。さらに申請者らの提唱するOANSモデル、つまり不均一系の特徴である界面近傍では表面欠陥や分子吸着・濃度勾配等によりミクロな静電ポテンシャル擾乱が存在し、ヘルムホルツ層のような超短範囲の空間に磁束密度変化が生じ、常磁性DOが正味の力を受けMFEを発現する、というモデルの妥当性を検討した。DOはKinetic力(摩擦DragとForm Drag)を通して溶液流動(磁気対流)やミクロな拡散にも影響を与えうる。光触媒等電点と分子・イオン吸着は表面ポテンシャルに影響するが、DOは磁気吸着発現にも寄与しうる。一方、酸化還元電位の関係から光触媒反応にDOが直接関与しないAg+還元のMFE調査も行った。その結果、銀還元率は磁場強度に対して曲線状に変化し、磁場中では平板状銀析出が見られ、所謂MHD効果が示唆された。ところが、硝酸銀溶液中のDO濃度によってMFEは明瞭に変化するため、MHD効果に対するDO影響も示唆される。これまで得られた結果は、複数の効果・機構の関与が示唆されるものの、OANSモデルと整合する。基本的なMFE原理の解明は、光反応の向上だけでなく医学等他分野への応用も考えられ、科学や社会の発展に貢献できるものと考える。[基調講演:第8回国際環境触媒学会(ICEC2014:米国NC州で8月開催)。Catalysis Today論文誌へ投稿(in press)](他2編論文執筆中)最終年度は主にデータ整理と解析、学会発表と講演、科学雑誌への投稿等、社会還元に注力した[招待講演1件、口頭発表2件、学術誌掲載・受理各1件]。再現性の高い成果に基づく理論が存在する均一系反応の磁場効果(MFE)に対し、不均一系、特に光触媒反応MFEは報告例も少ない。本研究ではZnOとチタニアへのUV照射によりメチレンブルー(MB)溶液脱色反応を行い、直接・間接MFEに関与する様々なパラメタを検討した。1.再現性:反応セル温度制御や吸光度in-situ測定等により、7種類の実験条件(粉末のガス吸着・分散性、MB溶液の濃度・静置時間・温度・溶存酸素[DO]濃度、光強度)を制御し、各4回試行MFE値の誤差2%以内収束に成功した。2.磁場強度依存性:MFE絶対値は上に凸の曲線を示す(00.7T)。MFEの正負は粉末へのガス吸着(CO2、水分子)で変化し、表面近傍静電ポテンシャルが重要である。3.MB溶液濃度:0.010.03

mmol/Lの範囲では低濃度ほどMFEは顕著に発現し、関与ラジカルや化学種の拡散律速が示唆された。4.DO濃度:低濃度(DO0.5mg/L)でMFEは消失し、濃度増加に伴い負のMFEが顕著になる。5.光触媒や被分解物質の種類によるMFE変化は、固-液界面ポテンシャル変化と関連する。光触媒MFEでは表面近傍短範囲拡散が重要であり、静電ポテンシャルとDOの影響が強く示唆された。これらより、界面近傍ポテンシャル勾配により磁場が有効な力をDOに及ぼし、磁気対流やミクロな磁気拡散を誘発してMFE現象が発現する、という現象論的OANSモデル(表面近傍酸素流動加速モデル)を提唱して妥当性を示し、さらなる機構解明への足懸りとした。これらの成果は環境汚染物質の高効率除去や太陽電池電極反応への応用とも関連するほか、溶液中酸素挙動の磁場制御は医学的応用も考えられる。一見磁石に応答しない物質や現象・反応も実際は変化している。磁場効果(MFE)は均一系反応で高い再現性や理論が知られるが、界面を伴う不均一系、特に光触媒反応では報告すら限定的である。本研究ではZnO、TiO2粉末に磁場中で紫外光を照射し、色素溶液脱色反応を用いてMFE関与パラメタを検討した。そして誤差2%の高い再現性と、磁場強度、溶液濃度、溶存酸素濃度、ガス吸着等粉末表面状態の影響を確認した。これより、固-液界面では静電ポテンシャル勾配により有効磁気力が酸素に生じ、短範囲拡散・磁気対流を誘発してMFEを発現するという現象論的OANS(表面近傍酸素流動加速)モデルを提唱し、その妥当性を示した。平成26年度は、不均一系光触媒反応における磁場効果(MFE)研究の飛躍の年であったと言えるかもしれない。平成25年度までは、所属大学の耐震工事や新築工事による2度の立ち退き避難等のため、研究遅延が存在したが、その後は順調に研究が進展した。研究方針を少し変更し、MFEの機構解明に焦点を絞り、その影響因子の一つである溶存酸素(DO)を精力的に調査したのが功を奏したものと思われる。不均一系反応には界面が存在し、数少ない過去の論文においてもいかに再現性の高いMFEを得るのが難しいか理解できる。同じTiO2を用いても全く異なるMFEも報告されている。本研究では磁場印加、LED照射、反応温度制御とMFEその場観察が同時に行えるシステムを設計し、誤差2%以内という高い再現性のMFEを達成出来た。これにより純粋なMFEを抽出し、複雑な多くの影響因子を一つずつ整理できる素地が整いつつある。その中で最も大きな発見・貢献は、不均一系光触媒反応では界面近傍DOがMFEに大きな影響を及ぼし、それを上記OANSモデルとして提唱できた事である、と考えている。京都で開催された国際触媒学会TOCAT7(2014年6月)では海外研究者から共同研究申入れがあり(後述)、8月に米国(Asheville、NC州)で開催された第8回国際環境触媒学会(ICEC2014)においては基調講演を仰せつかる栄に浴した。さらに11月には第9回日本磁気科学会における講演、今年3月には応用物理学会および電気化学会においても講演を行った。また、Catalysis Today誌へ論文投稿(in press)も行った。(他2編論文執筆中)以上を踏まえると、少なくともこの1年間の研究は順調といえる。本プロジェクトを俯瞰的に眺めても、興味深い研究成果が得られており、研究進展は順調であると考える。
超微量酵素反応解析法の開発

酵素の反応速度や基質親和性の評価、あるいは、至適反応条件の検討のためには、一連の酵素-基質混合試料を分析する必要があり、操作が繁雑であるとともに解析に要する試料量が多いという問題点がある。そこで、キャピラリー電気泳動を用いて酵素反応を簡便に解析できる超微量分析法の開発を試みた。モデル酵素-基質として、β-galactosidaseとo-nitrophenyl-β-galactosideを使用した。内径75μm、長さ50cmの溶融シリカキャピラリー先端付近に28%ケイ酸カリウム水溶液を導入後、高温度のニクロム線にキャピラリーの一部分を瞬間的に接触させることにより、キャピラリー内部フリッツを作成することに成功した。次に、基質や反応生成物(o-nitrophenol)の吸着を防ぐためにキャピラリー内表面並びにフリッツをリニアなポリアクリルアミドでコーティングした後、酵素固定化用リガンドであるトレシル基を結合した樹脂に酵素を反応させ、得られた酵素固定化樹脂をキャピラリー先端に長さ2mm程度になるように充填した。泳動緩衝液であるMOPS緩衝液(pH7.5)を満たした後、2.520mMの基質溶液を5秒間吸引して30秒間酵素反応させた後、電気泳動を開始した。基質は電気的に中性なので泳動されないが、反応生成物は負電荷を有するので正極側に移動して、そのピークが検出された。即ち、キャピラリー内部で酵素反応を行うとともに生成物を検出することに成功した。基質濃度の逆数をx軸に、生成物のピーク面積の逆数をy軸にプロットすると、直線関係(R>0.98)が得られ、その傾きをy切片で割ることにより、ミハエリス定数を評価できた。今回使用した酵素固定化充填剤量は極微量(<1μg)であり、基質溶液の吸入量も超微量(<10nL)であった。
表情・動作から利用者の意図・感情を理解するヒューマンインタフェースの構築

人間から人工環境へのコミュニケーションは、キーボードやポインティングデバイスを中心に今日まで行われてきた。本課題では、人間の顔および全身から表出されるその人独自の表情・動作を解析・識別し人間の意志・感情を理解するシステムの構築を目的に研究を進めてきた。その過程で、つぎの成果が得られた。1.人物動画像3次元計測装置の設計・製作ビデオカメラ・プロジェクタ光源・スリット光源・ビデオキャプチャーカードおよびワークステーションを組み合わせて、時間変化する表情・動作から3次元情報を計測する装置を設計・製作した。2/15秒の動きに追随できる方式を考案し、人間の自然な動作を解析できる装置を開発した。2.人物検出システムが利用者の存在を認識するために人物検出について考察をおこない、エッジベクトルとエッジの信頼度を用いた移動物体の検出法、およびカラーインデクシング法を用いた人物検出法を開発した。3.表情追跡・認識時間的に連続した動画像フレーム間での顔面の動きの追跡と、表情の時間変化から動きの特徴パラメータの抽出を行う手法を開発した。この時、各筋肉の骨格や皮膚への付着位置・筋繊維の方向などの解剖学的な知識を利用し、顔面の自然な動きに適応できる画像処理手法を開発した。4.動作追跡対象物を人間が指示する場合に大きな役割を果たす腕・指に注目し、ステレオ法による腕の動作の3次元空間での追跡手法の開発、画像中の手領域から指領域を抽出しどの指が伸びているのかを認識する手法を開発した。1.試作システム全体の設計人物動画像の入力から表情・動作解析を行って人物の意図・感情を認識するシステムに必要な機能について考察し、システムの基本設計を行った。2.人物動画像3次元計測装置の設計・製作ビデオカメラ・プロジェクタ光源・スリット光源を組み合わせて、時間変化する表情・動作から3次元情報を計測する装置の設計・製作を行った。そして、カラー光源を使用することによって、これまでに開発したシステムに比較して5割高速の動きに追随でき、より自然な動作を解析できる方式を新たに開発した。(3)解剖学的知識を用いた表情追跡と動作追跡時間的に連続した動画像フレーム間での顔面および人体各部の動きの追跡と、表情・動作の時間変化から動きの特徴パラメータの抽出を行う手法を開発した。この時、各筋肉の骨格や皮膚への付着位置・筋繊維の方向などの解剖学的な知識を利用し、顔面や人体の自然な動きに適応できる画像処理手法を開発した。人とコンピュータがフェースツーフェースでコミュニケーションがおこなえる自然なヒューマンインタフェースの実現を目指し、利用者の動作から感性情報を抽出するための動作解析手法について考察し、解析手法の開発と評価実験をおこなった。1.動作解析手法の開発両眼ステレオカメラを用いて手の平の追跡を行い、3次元空間上での手の軌跡を求める手法を開発した。追跡精度の向上・計算量削減のために、幾何学的拘束・肌色領域抽出・エピポーラ拘束を用いて、探索範囲を限定する手法を開発した。2.3次元空間での位置予測を用いた追跡手法の開発従来法のように画像上で探索範囲を決定してから特徴点対応付けを行うのではなく、対応付けをおこなう点を3次元空間上で決定し、その点を画像平面上に投影することによって、より正確な3次元軌跡を検出することが可能となった。3.個人差や曖昧性の計測利用者のもつ感性の偏りを把握できるシステムを開発するために、利用者の意図と動作の偏りについて、位置指示動作を対象に実験をおこなった。4.動作解析実験通常のコンピュータ利用環境での適用を考慮した実験環境下で、開発した手法の評価実験をおこなった。人とコンピュータがフェースツーフェースでコミュニケーションがおこなえる自然なヒューマンインタフェースの実現を目指し、利用者の動作から感性情報を抽出するための動作解析手法について考察し、つぎの各手法の開発をおこなった。1.エッジベクトルとエッジの信頼度を用いた移動物体の検出固定カメラによって撮影された連続画像から、背景画像を利用することで移動物体領域を抽出できるが、撮影環境の明るさが変化したときには正確に領域を抽出できないことがある。

本手法では、明るさの変化による誤検出を抑制するために、エッジ検出結果をもとに、明るさの変化に不変な特徴量であるエッジの信頼度と、エッジベクトルから、入力画像と背景画像とのエッジ類似度を算出し、類似度の低いエッジ点を移動物体のエッジとして抽出し、移動物体の検出を行った。2.指示動作認識のための指領域解析各種の対象にたいして指示する場合に大きな役割を果たす指に注目し、画像中の手領域から指領域を抽出し、どの指が伸びているのかを認識する手法を考案した。本手法では、画像から指の太さ・位置・方向を抽出し、指示の種類を識別した。また、手の方向と大きさを正規化することによって、手の方向やカメラからの距離に依存しない識別が可能になった。3.カラーインデクシング法を用いた人物検出カラーヒストグラムの変化を利用して、人物領域を検出する手法を提案した。色彩の一致度が高い領域を対象物として検出する従来の手法とは逆に、背景画像をモデルとして、カラーヒストグラム上で一致度の低い領域を検出することで人物領域を検出した。また、ヒストグラム上での変化量を画素ごとに算出することによって、カラーインデクシングによる検出誤差を減少できることを示した。
アミノペプチダーゼを介したベーチェット病発症機構の解明と治療基盤の構築

今回、LPS投与したマウス血中のERAP1量、一酸化窒素(NO)量、肝臓のiNOS発現量の経時変化を測定した。その結果、ERAP1量は、LPS投与前にはほとんど認められなかったが、投与後12時間から24時間で分泌量が最大に達した。この分泌ERAP1は48時間後も十分量血中に存在した。NOも12時間後には最大を示したが、24時間後には通常レベルまで減弱した。興味深いことに、ERAP1遺伝子欠損マウスのNO量は、LPS投与12時間後では野生型マウスの半分程度を示したが、投与前および投与24時間後では野生型マウスと同程度を示した。肝臓iNOSの発現も血中NOと同様の挙動を示したが、ERAP1遺伝子欠損による影響は全く認められなかった。したがって、ERAP1はiNOS発現が亢進されている状況で、iNOSの発現には影響を及ぼさずにNO合成に寄与することが分かった。これは、先に報告したERAP1がNOの原料(遊離Arg)を産生するという結果と矛盾しない。すなわち、細胞外EARP1は、感染時特異的な炎症増悪へ寄与することが明らかになった。以上の結果を、論文として報告した。最近、分泌ERAP1に関して海外のいくつかの研究グループが、NK細胞やT細胞、樹状細胞の活性化に関与することを報告した。また、興味深いことに、ERAP1遺伝子上のベーチェット病感受性SNPが、この免疫担当細胞の賦活化に影響を及ぼすことも報告された。ベーチェット病は、細菌感染を契機とした持続的な炎症が原因であるという仮説(分子擬態説)が唱えられている。これらの知見を考慮すると、感染とともに分泌されたERAP1は、マクロファージによるNO産生への寄与に加えて、他の免疫担当細胞を活性化することで炎症反応を惹起し、ベーチェット病などの炎症性自己免疫疾患の発症や増悪を誘導すると考えられる。ベーチェット病は、外皮や神経、血管において慢性再発性の炎症を引き起こす疾患であり、自己免疫疾患の一つとして数えられる。発症機構に関しては明らかになっていないが細菌感染が発症のトリガーとなる可能性が示されている。また最近、ERAP1遺伝子の非同義置換型一塩基多型が発症のキーになることが示唆されている。そこで、本研究ではERAP1の細菌感染性炎症への寄与について明らかにした。具体的にはERAP1遺伝子欠損マウス腹腔に大腸菌由来リポ多糖(LPS)を投与し、12時間後の血中一酸化窒素(NO)濃度を測定した。その結果、ERAP1遺伝子欠損は血中NO濃度を40%程度低下させた。この結果はERAP1機能不全が炎症に影響を及ぼすことを示している。また、今回、LPS刺激に伴ってマクロファージから細胞外に分泌されたERAP1が分泌小胞エキソソームと相互作用し、本細胞に対してパラクリン/オートクリン作用によって活性化を誘導することを見出した。すなわち、ERAP1による炎症亢進にはERAP1結合性エキソソームが関与している可能性が考えられた。興味深いことに本エキソソームにはMHCクラスI分子がLPS未投与時に得られるエキソソームに比べて高い濃度で含有されていたことから、抗原提示への影響にも関与することが考えられた。また、ERAP1遺伝子のベーチェット病感受性HLA提示抗原への寄与を調べるために、CRISPR-CAS9システムを利用し、ERAP1遺伝子欠損RAW264.7細胞を作製した。今回、ERAP1が炎症惹起に関与することを明らかにした。この炎症にはERAP1のほかERAP1と相互作用するエキソソームが関与しうる。本エキソソームにはMHCクラスI分子がLPS未投与時に比べて豊富に含まれていることも明らかになっている。ERAP1依存性炎症とHLAクラスI抗原提示との相関や炎症の持続性について明らかにする必要があるが、慢性炎症性疾患であるベーチェット病の病因解明の一助となりうる知見が得られた。これまでにLPS投与によってブドウ膜炎を発症させたマウスでは、血中にERAP1が分泌されることを見出した。また、このERAP1分泌は、炎症メディエーターである一酸化窒素(NO)の原料である遊離Argを産生することを見出した。さらに、マウス腹腔内マクロファージやマクロファージ細胞株を用いたin vitro解析において、LPS刺激によって分泌されたERAP1が分泌小胞エキソソームと結合し、マクロファージの貪食活性を亢進することも既に見出している。今回、ERAP1結合エキソソームのNO合成に及ぼす影響について検討した。その結果、ERAP1結合エキソソームのマクロファージへの単独処理ではNO合成が誘導されなかったが、本エキソソームは微量のIFN-beta(10 IU/mL)共存化で非常に強いNO産生活性を示した。このNO合成亢進メカニズムを明らかにするために、ERAP1エキソソーム構成成分解析や阻害剤を用いた研究を行ったところ、本エキソソームにはTNF-alpha、IFN-gammaが含有されており、IFN-betaを含めた3者が協調的に作用することでマクロファージのiNOS発現を引き起こすことが明らかになった。さらに、エキソソーム中のERAP1がペプチドの分解を介して遊離Argを産生し、マクロファージにNOの原料として提供することを見出した。

以上の結果は、ERAP1結合エキソソームがNO産生装置として機能し、微弱な感染シグナルを受け取って炎症を誘発することを示唆している。尚、これらの結果は、昨年度論文として報告した。これまでの2年間の解析結果から、細胞外へと分泌されたERAP1が炎症反応を亢進することが示されている。ベーチェット病の炎症にはERAP1の分泌が関与する可能性が考えられた。ベーチェット病発症におけるERAP1の関与を明らかにする目的で本研究計画は実施されている。これまでの研究の結果、ERAP1が一酸化窒素の合成を促進することで炎症を惹起することが分かった。また、炎症性サイトカインと協調してマクロファージを活性化し、炎症を増悪させる可能性も示された。これらの機能はいずれもベーチェット病の発症や増悪に関与しうる。一方で、ERAP1エキソソームの抗原提示やt細胞などその他免疫担当細胞への関与についてはまだ明らかではない。また、ERAP1 SNPのベーチェット病への関与についても明らかにしていかなければならない。今回、LPS投与したマウス血中のERAP1量、一酸化窒素(NO)量、肝臓のiNOS発現量の経時変化を測定した。その結果、ERAP1量は、LPS投与前にはほとんど認められなかったが、投与後12時間から24時間で分泌量が最大に達した。この分泌ERAP1は48時間後も十分量血中に存在した。NOも12時間後には最大を示したが、24時間後には通常レベルまで減弱した。興味深いことに、ERAP1遺伝子欠損マウスのNO量は、LPS投与12時間後では野生型マウスの半分程度を示したが、投与前および投与24時間後では野生型マウスと同程度を示した。肝臓iNOSの発現も血中NOと同様の挙動を示したが、ERAP1遺伝子欠損による影響は全く認められなかった。したがって、ERAP1はiNOS発現が亢進されている状況で、iNOSの発現には影響を及ぼさずにNO合成に寄与することが分かった。これは、先に報告したERAP1がNOの原料(遊離Arg)を産生するという結果と矛盾しない。すなわち、細胞外EARP1は、感染時特異的な炎症増悪へ寄与することが明らかになった。以上の結果を、論文として報告した。最近、分泌ERAP1に関して海外のいくつかの研究グループが、NK細胞やT細胞、樹状細胞の活性化に関与することを報告した。また、興味深いことに、ERAP1遺伝子上のベーチェット病感受性SNPが、この免疫担当細胞の賦活化に影響を及ぼすことも報告された。ベーチェット病は、細菌感染を契機とした持続的な炎症が原因であるという仮説(分子擬態説)が唱えられている。これらの知見を考慮すると、感染とともに分泌されたERAP1は、マクロファージによるNO産生への寄与に加えて、他の免疫担当細胞を活性化することで炎症反応を惹起し、ベーチェット病などの炎症性自己免疫疾患の発症や増悪を誘導すると考えられる。光受容体間レチノイド結合蛋白を投与したブドウ膜炎発症マウスをベーチェット病モデルとし、ERAP1遺伝子欠損による炎症への影響を血中のNO濃度を指標に解析する。
ポリアミンモジュロンによる細胞増殖と生存率の調節

1.ポリアミンにより翻訳レベルで合成促進を受ける更なる蛋白質を探索したところ、rRNA合成、ある種のtRNA合成及びエネルギー産生に関与する3種のmRNAの合成を促進する転写因子FisとFe輸送蛋白質mRNAの合成を促進する転写因子FecI (σ^<18>)がポリアミンにより合成促進を受けることが明らかとなった。Fis及びFecI mRNAは蛋白質合成開始に重要なShine-Dalgarno (SD)、配列が明瞭でなく、SD配列をmRNA中に人為的に作ると、ポリアミン非存在下での蛋白質合成能が上昇し、ポリアミンによる促進が認められなくなった。2.大腸菌の終結因子RF2のmRNAは26番目に終止コドンが存在し、+1 frameshiftによりRF2が合成される。このframeshiftに対するポリアミンの効果を検討したところ、RF2 mRNAに対するRF2の量が少ない時、すなわち対数増殖初期にポリアミンがこの+1 frameshiftを促進することが明らかとなった。ポリアミンの促進はdecoding siteで起こることが示唆された。3.ポリアミンにより翻訳レベルで合成促進を受ける遺伝子群をポリアミンモジュロンと命名し、これまでにoppA、cya、rpoS、fis、fecIの5種を同定した。これら遺伝子群のポリアミンによる発現促進により、どの程度の数のmRNAの転写が促進されるかをDNAマイクロアレイで検討したところ、約300種のmRNAの転写がポリアミンにより促進を受けることが明らかとなった。このうち、約60種のmRNAの転写が上記5種のモジュロンにより発現調節を受けていた。現在、新しいポリアミンモジュロンを探索中である。
疾病発症を担う分子経路を標的とした魚病防除法の開発-過剰な免疫反応を抑える

我々はマサバおよびゴマサバを飼育する中で、高水温期の細菌感染症による斃死率が各魚種で異なることを見出した。本研究では、マサバーゴマサバ表皮における種間で比較が可能なトランスクリプトーム解析の基盤構築を試みた。3ヶ月齢マサバおよびゴマサバの表皮サンプルをRNA-seqに供し、71,072のマサバコンティグ、52,530のゴマサバコンティグを取得した。さらに、両種のコンティグ配列をreciprocal best matchに供し、両種オーソログとして13,875コンティグを得た。このリストを用いて遺伝子発現解析を行い、両種間で発現量に差のあった遺伝子リストには免疫関連のパスウェイ等が確認された。サバ類は、我が国の重要な水産資源であり、最近では養殖対象魚としても注目されている。しかし、サバ養殖では高水温期において細菌感染症が多発し、斃死率が上昇することが大きな問題となる。我々は、マサバでは斃死率の高い高水温期において、近縁種であるゴマサバの斃死率がマサバの斃死率と比べ低くなることを見出しており、この様な表現型の差を生み出す分子基盤を、近縁種間の遺伝子発現パターンの差異を指標に解析することは、ミュータントの作出等が困難な海産魚において、重要なアプローチとなる。そこで、本研究では、次世代シークエンサーを用いた大規模なトランスクリプトーム解析を実施する。平成26年度は、低水温および高水温飼育の2試験区を設定し、それぞれマサバ、ゴマサバおよびゴマサバxマサバ雑種を同一水槽内で飼育する、飼育試験を実施し、4ヶ月齢における各種サバの死亡率を調査した。その結果、20°Cで飼育した低水温区でのマサバ、ゴマサバおよびゴマサバxマサバ雑種の死亡率は、それぞれ76.9%、87.5%、100%であったのに対し、水温25°Cの高水温区では44%、100%、100%であった。このことからあらためてゴマサバが高水温期における生残性が高いことが示され、さらに雑種もゴマサバ同様に生存することが明らかとなった。また、本飼育試験の供試魚をサンプルを用いて、ゴマサバ、マサバの表皮で発現する転写産物のde novo assemblyを行った。各魚種あたり3個体を用いて、魚種あたり160Mリードを用いたde novo assemblyの結果、275,714のコンティグが得られ、サバ類のシークエンス解析の基盤として利用が可能となった。さらに、雑種を含めた3種の各水温における表皮サンプルのRNA-seqを行い、両種サバのde novo assemblyデータを基にトランスクリプトーム解析を実施している。本研究室ではマサバおよびゴマサバを飼育するなかで、高水温期の細菌感染症による斃死率が各魚種で異なることを見出した。3ヶ月齢のマサバおよびゴマサバを供試魚として飼育実験を行った。飼育開始から1ヶ月後両種の表皮サンプルをRNA-seqに供した。得られた結果からTrinityおよびTransDecoderを用いて、71,072のマサバコンティグ、52,530のゴマサバコンティグを取得した得られた両種のコンティグ配列およびクロマグロ推定遺伝子をblastプログラムによるreciprocal best matchに供した結果、マサバおよびゴマサバ間で推定されたオーソログとして13,875コンティグ、マサバとクロマグロ間のオーソログとして748コンティグ、ゴマサバとマグロ間のオーソログとして1,652コンティグが得られた。この両種コンティグをヒト、マウスのデータベースに対し相同性検索をおこなった結果、約9割の遺伝子に相同性があった。また、これらオーソログ遺伝子keggパスウェイと対応させたところ、両種とも約1万のkeggパスウェイの情報を付与することができた。オーソログ遺伝子の推定を試みた。さらに、このオーソログ遺伝子に対しblastプログラムによる注釈付けをおこなったうえおよびkeggパスウェイ情報についても付与した。このコンティグを用いて遺伝子発現解析を実施したところ、マサバ、ゴマサバ間で発現量に差のあった遺伝子リストには免疫関連のパスウェイが確認された。今後は、マサバおよびゴマサバを用いた水温別の飼育試験を行い、本研究で作成した種間統一リファレンス配列を利用して、トランスクリプトーム解析を行い、高水温期の斃死率の種間差を規定する分子機構を解明することを目指す。

本研究における最重要事項は、各魚種を同時に用いる飼育試験であるが、平成26年度中に飼育試験を実施し、順調にサンプリングすることができた。さらに、非モデル動物であるサバでは、ゲノムあるいは転写産物の塩基配列情報の蓄積が乏しく、網羅的な遺伝子発現解析が困難であった。本研究において実施した、ゴマサバおよびマサバ各魚種あたり160Mリードを用いたde novo assemblyの結果、275,714のコンティグが得られ、サバ類のシークエンス解析の基盤として利用が可能となった。このような情報を用いて、現在網羅的な遺伝子発現パターンの解析を実施中である。さらに、平成26年度の飼育試験では、ゴマサバxマサバの作出に成功し、マサバおよびゴマサバと同一の飼育環境下で飼育試験を実施した。飼育試験の結果、この雑種も、ゴマサバ同様に高水温に対し、抵抗性を示した。このような雑種で示された高水温への耐性を規定する分子基盤を、ゴマサバに見られる抵抗性の分子基盤と比較することは興味深く、本研究に新しい視点を加えるうえで重要な情報となることが期待される。魚類病態生理平成26年度に実施した飼育試験に基づく、網羅的な遺伝子発現解析の結果をもとに、モデル生物のパスウェイマップ等の情報を利用し、高水温環境下での斃死を増加させる要因となるシグナル伝達経路の同定を試みる。本研究において、マサバ、ゴマサバの2種間における抗病性の差を規定するシグナル伝達経路が特定できれば、そのシグナル伝達経路を特異的に阻害あるいは亢進する化合物により、当該シグナル伝達経路を制御可能となることが期待される。すなわち、高水温期のゴマサバでみられる抗病性を担う分子機構を、マサバ魚体内で人為的に再現することが最終的な目的となる。この方法が確立されれば、シグナル伝達経路の阻害あるいは亢進剤の投与によりマサバが高水温に強くなり、斃死率が低下することが期待される。さらに、平成26年度に実施することができなかった、高水温期の斃死に対する給餌制限の影響を見る飼育試験を実施する。この飼育試験により得られるサンプルを用いて、トランスクリプトーム解析を実施することで、魚種、水温、給餌条件といった高水温期の斃死率に関わる因子を複合的に理解可能になることが期待される。次世代シークエンサーを用いたRNA-seqについて、他大学の共同利用による受託解析を依頼しているが、サンプル調整の遅れと先方の受け入れ状況により、一部の解析を平成26年度中に実勢できなかったため。平成26年度に実施できなかった解析を順次、実施する。
子宮内環境の悪化に起因する成長後の各種疾患発症機序の解析とその予防法の開発

肥満妊婦では脂肪細胞の肥大化とM1 macrophageの浸潤増加を介したadipokinesの発現が変化し、インスリン抵抗性が増大することが示された。高脂肪食負荷による肥満妊娠マウスモデルでも、同様の変化が内臓脂肪、皮下脂肪両者において生じており、骨格筋におけるGLUT-4遺伝子発現が低下していた。抗酸化物質であるthioredoxin-1過剰発現マウス(Tg)では、胎盤におけるglucocorticoid代謝活性化を介してGLUT-1発現が亢進し、胎仔発育が促進した。このTgマウスは成獣期に膵臓β細胞の機能低下を伴う耐糖能低下を認めた。[目的]高脂肪食摂取による肥満が妊娠母体および胎児におよぼす長期的影響を検討する目的で、肥満妊娠モデルマウスを作成し、酸化ストレスおよび脂肪組織局所炎症の視点から母児の糖代謝調節機序を解析した。[方法]抗酸化系分子の一つであるthioredoxin-1(TRX-1)を全身に過剰発現する遺伝子改変マウス(TRX-Tg)を用いて、胎盤ならびに胎仔におけるTRX発現が胎児発育におよぼす影響を糖代謝関連因子発現の視点から検討した。また、高脂肪食(HFD)摂餌による肥満妊娠マウスモデルを作成し、肥満が、母獣の糖代謝ならびに胎仔発育におよぼす影響を検討した。[結果]TRX-Tgマウス胎仔はWt胎仔に比し有意に重かったが、これには胎盤におけるコルチコステロン代謝の変化を介したGLUT-1発現亢進が関与していると考えられた。また、高脂肪食負荷により、耐糖能が対照ND妊娠群に比し低下し、インスリン抵抗性が有意に高い肥満妊娠モデル(HFD妊娠群)が作成できた。HFD妊娠群の脂肪量は皮下、内臓ともにND妊娠群より有意に多かった。また脂肪細胞は、非妊娠・妊娠時共にHFD群はND群に比し大きく、脂肪細胞当たりのマクロファージ数はHFD群において有意に増加していた。[結論]胎盤の抗酸化機構はGLUT-1発現を介して胎仔発育を調節していることが示された。また、高脂肪食摂取による肥満妊娠では、脂肪組織局所へのmacrophage浸潤の増加を介したadipokines発現変化等によるインスリン抵抗性の充進が内臓脂肪、皮下脂肪両者において生じている可能性が示唆された。次年度はこのマウスモデルを用いて、母児の長期予後についても検討する予定である。[目的]肥満が妊娠母体および胎児におよぼす長期的影響を脂肪組織局所炎症および酸化ストレスの視点から検討した。[方法]倫理委員会承認の下に帝王切開時に皮下及び内臓脂肪を採取しアディポカイン発現及びマクロファージ浸潤度を解析した。また、高脂肪食(HFD)摂餌による肥満妊娠マウスモデルを作成し、肥満が、母獣のならびに新生仔の糖代謝におよぼす影響を検討した。[結果]妊娠中には脂肪細胞の肥大化とM1マクロファージの浸潤の増加を介したTNFα、レジスチン発現の増加とアディポネクチン発現の低下が認められた。肥満妊娠ではそれら変化がさらに増強していた。一方、肥満妊娠マウスモデルでも、ヒトと同様のマクロファージの浸潤やadipokine発現変化が見られ、骨格筋のGLUT4遺伝子発現の低下が認められた。thioredoxin-1(TRX-1)過剰発現マウス(TRX-Tg)胎仔の胎盤では、11βHSD-1活性上昇と11βHSD-2活性低下によりglucocorticoid代謝が活性化し、GLUT-1発現を誘導した。4週齢の体重、摂取カロリー量、空腹時血糖(FBS)、インスリン値および糖負荷試験に有意差を認めなかった。10週齢のFBS、インスリン値はTg群で有意に低かったが、糖負荷試験ではTg群で有意なインスリン分泌の低下および血糖の上昇を認めた(p<0.01)。しかし、インスリン負荷試験では有意差を認めなかった。また、膵臓の形成に関係するとされるPdx-1発現はTgの方がWtに比して有意に低かった。[結論]妊婦特に肥満妊婦に生じるインスリン抵抗性には脂肪細胞の肥大化とM1マクロファージの浸潤増加を介したアディポカインの発現変化が関与する。また、hTRX-1 Tgマウスでは、抗酸化機構が胎盤におけるglucocorticoid代謝活性化を介してGLUT-1発現を亢進し胎仔発育を調節することが示された。Tgマウスでは成獣期に膵臓β細胞の機能低下(インスリン分泌の低下)を伴う耐糖能低下を認めた。
気候変動予測結果を用いた沿岸メガシティにおける海岸災害リスクの変化予測

気象研究所の超高解像度全球気候モデルGCMの2次元気象場データを用いて、直接高潮シミュレーションをした。熱帯低気圧の存在期間の海面気圧および海上風を駆動力として与えた。高潮計算に用いた台風は北西太平洋領域を通過したものとした。台風ごとの最大高潮偏差の計算結果を極大値資料とし、極値統計解析を行った。将来気候下における100年に1度の高潮が現在気候に比べて増大すること、台風強度変化によって一様に増大するのではなく、エリア依存性があることを明らかにした。さらに、高潮モデル自体が内包する不確実性を減らすのに必要な要件を整理することができた。非構造格子モデルには,ADCIRC (ADvanced CIRCulation model)を用いた.伊勢湾台風を対象に,構造格子モデルと非構造格子モデルの計算を行い,結果を比較した.全体的に,最大潮位偏差はADCIRCの方が,値が小さくなる傾向にあり,特に,三河湾において顕著な差がみられた.外洋を含めた計算領域の設定をうまくできなかったことが要因の一つと考えられる.高潮モデル自体の不確実性を調べるため,高潮モデルの風速に対する海面抵抗係数を変えたアンサンブル実験を行った.格子解像度や計算格子,ラディエーションストレス,入力気象場,海面抵抗係数による高潮偏差に及ぼす不確実性を評価したところ,海面抵抗係数と気象場が高潮偏差に及ぼす影響が大きいことがわかった.当初,RCMによるアンサンブル計算を行い,高潮予測値の不確実性を評価することも目的のひとつとしていたが,スペクトルナッジングをする元データとして用いるアンサンブルランがなされたGCMの解像度が60kmであり,台風の再現性がよくなかったので,良好な結果が得られなかった.本研究では,全球気候モデルGCMによる気候変動予測実験結果を外力として,東アジア沿岸を対象に高潮の直接計算を行い,海岸災害リスクの将来変化を定量的に評価することを目的としていたが,2年間の研究期間全体を通じて,将来気候下における100年に1度の高潮が現在気候に比べて増大すること,台風強度変化によって一様に増大するのではなく,エリア依存性があることを明らかにした.さらに,高潮モデル自体が内包する不確実性を減らすのに必要な要件を整理することができた.気象研究所の超高解像度全球気候モデルGCMの2次元気象場データを用いて、直接高潮シミュレーションをした。高潮モデルには、Kimら(2008,2010)による潮汐・高潮・波浪の相互作用を考慮した双方向結合モデルSuWATを用いた。本研究では、計算コスト軽減のため波浪計算は行わず、非線形長波モデルを基礎式とした高潮計算モジュールのみを用いた。北西太平洋及び日本沿岸を解析対象とし、3階層のネスティングスキームを適用した。高潮計算に用いた台風は北西太平洋領域を通過したものとし、それらの個数は、現在気候で190、将来気候で127であった。極値の分布関数にはグンベル分布を用い、プロッティング・ポジション公式にはGringorten公式を用いた。再現期間は、GCMのデータ期間の25年と、50年および100年とした。瀬戸内海領域では、現在気候においては、周防灘における高潮偏差の再現確率値が最も大きく、燧灘および播磨灘の小豆島以西においても大きい。将来気候では、周防灘での再現確率値が、現在気候に比べて大きく増大する。また、燧灘では将来予測値は現在気候よりも小さくなったが、反対に、安芸灘および斎灘では大きくなった。関東東海領域の現在気候では、東京湾で最も大きく、次いで、伊勢湾西部および三河湾で大きくなった。将来気候では、東京湾における将来変化よりも、伊勢湾、三河湾での増大傾向が顕著であった。現在気候で推算された房総半島東海岸や伊豆諸島周辺海域のピークは将来気候では現れず、遠州灘や熊野灘において大きくなった。このように将来気候における高潮偏差は、台風強度変化によって一様に増大するのではなく、台風のコースに応じて強い海域依存性があることを明らかにした。気象研究所の超高解像度

全球気候モデルGCMの2次元気象場データを用いて、直接高潮シミュレーションをした。熱帯低気圧の存在期間の海面気圧および海上風を駆動力として与えた。高潮計算に用いた台風は北西太平洋領域を通過したものとした。台風ごとの最大高潮偏差の計算結果を極大値資料とし、極値統計解析を行った。将来気候下における100年に1度の高潮が現在気候に比べて増大すること、台風強度変化によって一様に増大するのではなく、エリア依存性があることを明らかにした。さらに、高潮モデル自体が内包する不確実性を減らすのに必要な要件を整理することができた。初年度には,全球気候モデル出力結果を用いた直接高潮シミュレーション,メソ気象モデルによるアンサンブルダウンスケール実験,非構造格子高潮モデルの開発を行う計画であった。全球気候モデル結果を入力条件とした直接高潮計算については,GCMの出力結果のうち,海面更正気圧と海上風を用いて,直接高潮計算を実施した。また,高潮計算を実施する前に,現在気候実験の気圧および海上風について,沖合での観測値と比較することで,GCMのバイアス評価をし,その再現性が十分にあることを確認した。直接高潮計算結果については,高潮の現在予測結果と将来予測結果が得られ,本研究の主たる目標の6割以上は達成できたと考えている。メソ気象モデルによるアンサンブル・ダウンスケール実験については,計算負荷が予想以上に高く,計算を継続中である。非構造格子高潮・波浪モデルの開発については,高潮モデルのみでの計算はできるようになった。伊勢湾台風を対象に再現計算を行ったが,直交格子モデルよりも過小評価になる結果が得られており,モデルの有用性が見い出せていない。引き続きモデルの開発,改良を行っていく予定である。複数の領域気候モデルRCMによる気候変動実験結果を用いて,アンサンブル高潮計算を行い,推算値のゆらぎ幅,すなわち高潮の将来変化予測の不確実性を評価する。高潮モデル自体の不確実性を調べるため,高潮モデルの風速に対する海面抵抗係数を変えたアンサンブル実験も行う。さらに,台風経路の不確実性を評価するため,経路や進行方向,進行速度を変えた実験も行い,高潮予測に内在する予測不確実性を示す。非構造格子高潮モデルについては,波浪モデルとのカップリングを試み,実用性を考慮して評価する。消耗品としては,RCMデータを保存するためのRAID NASの購入を考えている.また,プログラミングソフト等のライセンス料を計上している。旅費としては,国内外の学会に出席し資料収集をすると共に,研究成果を積極的に発表する。国際会議参加費および旅費などを見込んでいる。人件費・謝金としては,データ整理やバックアップに関して大学院生に補助を依頼することを考えている。また,英語論文の校閲費を計上している。その他経費として,印刷複写費,論文投稿料等を見込んでいる。
乾燥無代謝休眠覚醒過程に特異的な生体分子修復系の分子背景の解明

本課題では、ネムリユスリカの乾燥無代謝休眠の覚醒過程で特異的な修復機構の存在を検討した。マイクロアレイ解析の結果、400個以上の遺伝子が再水和過程で特異的に発現上昇することが分かった。乾燥から再水和に至る過程は著しい酸化ストレスに曝される過程であり、その結果DNAやタンパク質は傷害を受ける。PIMT(proteinL-isoaspartylmethyltransferase)と呼ばれる異性化タンパク質修復酵素やRad51などのDNA修復酵素が再水和過程で発現することで、健常な蘇生が実現できるのであろう。吸水過程のネムリユスリカを用いてcDNAライブラリーを作製し、その配列をデータベース化した。具体的には、乾燥幼虫(吸水0時間)、吸水1時間及び吸水24時間の幼虫を用いた。同時に、発現産物のカタログ化を行う目的で、乾燥過程及び吸水過程などの様々な処理を施した幼虫から抽出したRNAを混合し、平均化ライブラリーを作製した。併せて4つのライブラリーから、各10,000個のコロニーを単離し、5'及び3'末端の塩基配列を決定した。得られたデータセットを、作成済みの乾燥過程ESTデータベースに加えて、再度クラスタリングを行ったところ、70,860クローンのESTが、24,183個のクラスターに集約された。得られたクラスターには、発現頻度が低いと思われる遺伝子群である転写因子やシグナル因子も多く含まれていた。今回作製したデータベースには、DNA修復遺伝子群も含まれていた。例として、塩基除去修復に関連するRad23と二本鎖切断修復に関与するRad51があげられる。これらの遣伝子の発現をReal-Time PCRで定量したところ、Rad23は吸水過程のみならず乾燥過程でも発現が上昇していた。一方、Rad51は吸水過程で顕著に発現が上昇していた。このことから、乾燥過程と吸水過程では、種類の異なるDNA障害が生じており、この障害を修復する機構が作動していることが明らかとなった。この結果は、22年度内に論文化し、詳細を報告予定である。乾燥無代謝の覚醒過程に起こる修復系の分子背景の解明を目的に、乾燥及び再水和過程の網羅的な遺伝子発現解析を行うことにした。昨年度作成したネムリユスリカESTデータベースから独立したクラスターを抽出するために、Blast-xに基づく再クラスタリングを施した。カスタムマイクロアレイを作製するために、得られたクラスターデータを元に、独立した遺伝子をコードするプローブを選抜した。最終的に、16,652個のプローブを選抜し、アジレント社製の4×44kフォーマットのアレイを作製した。その結果、乾燥前に比べて、乾燥後24時間後または48時間後に10倍以上発現上昇する遺伝子は少なくとも825個存在し、1/10以下に発現が減少する遺伝子は少なくとも171個存在することが明らかとなった。一方、乾燥したユスリカに比べて、再水和後24時間後に10倍以上発現が上昇する遺伝子は少なくとも803個存在し、1/10以下に発現が減少する遺伝子は少なくとも217個存在することが明らかとなった。これらの情報に基づき、発現クラスター解析を行っている。再水和過程でのDNA修復糸の検討も進めた。吸水過程は著しい酸化ストレスに曝される過程であり、その結果DNAが損傷受けていた。この損傷に対する修復系や活性酸素の除去系が、再水和に伴って作動することが、乾燥無代謝休眠からの健全な覚醒に重要であることが明らかとなった。同時に、この過程には、HSPも関与していることも明らかになった。以上の本年度までの結果を論文にまとめ、PLoSOneやJBCなどのジャーナルに報告した。ESTデータベースに基づき作成したカスタムマイクロアレイには、約8,000個の独立した遺伝子を検出可能な16,652個のプローブを4x44kフォーマットで載せている。このマイクロアレイとESTデータベースを組み合わせることで、13個の独立した異性化タンパク質修復酵素PIMT.(brotein L-isoaspartyl methyl transferase)遺伝子を見いだした。加えて、ゲノム解析とmRNA-seqから新たに2個のPIMT遺伝子も発見した。PIMTは、老化に伴うタンパク質のアスパラギン残基やアスパラギン酸残基の異性化を防ぐことで、タンパク質の健常性を維持する機能を持った酵素である。PIMTは、微生物から植物・動物まで広く存在しているが、そのコピー数は半数体当たり1つないし2つしか存在しない。15個ものPIMTのパラログを有する生物は、知る限りネムリユスリカのみである。mRNA-seqの結果を踏まえると、1つのパラログを除いて、ほとんどのPIMT遺伝子は乾燥に伴って発現が上昇していた。メタボローム解析の結果、メチル基供与基質であるS-アデノシルメチオニンの濃度が乾燥に伴って減少している事から、PIMTが乾燥過程で活性を発揮している事が示唆された。

これらの結果から、多コピーかつ乾燥誘導性のPIMT遺伝子の発現によって、乾燥によって生じる活性酸素濃度の上昇がもたらす深刻な異性化から、健常性を維持するようにタンパク質を修復することで、anhydrobiosisに至る乾燥過程でも生体内の様々な機能を保持し続けることを可能としていると考えられた。ネムリユスリカは乾燥のみならず再吸水の過程で、多大な活性酸素ストレスを受けている(Gusev, et al. PLoS ONE, 2010)。乾燥状態からの健常な蘇生には、抗酸化経路が重要に介在することが示唆された。すなわち、乾燥ストレスと酸化ストレスの両者によって誘導される遺伝子群は、ネムリユスリカの極限乾燥耐性に深く関与すると予想される。そこで、カスタムメイドしたマイクロアレイ(約8,000個の独立した遺伝子を検出可能な16,652個のプローブを4 x 44kフォーマットのもの)を用い、乾燥と酸化の双方のストレスに応答する遺伝子を探索した。ネムリユスリカ幼虫を乾燥処理及び酸化剤処理した後に全RNAを抽出し、マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行った結果、両方のストレスに応答する155個の遺伝子を選抜した。遺伝子オントロジーで分類すると、代表例としてストレス応答(20遺伝子)、抗酸化(5遺伝子)、タンパク質フォールディング(4遺伝子)、脂質代謝(3遺伝子)、タンパク質分解(3遺伝子)などが含まれていた。具体的には、ストレスタンパク質としてLEAタンパク質や熱ショックタンパク質、抗酸化関連因子としてチオレドキンやスーパーオキシドジスムターゼが挙げられる。上記の傾向は、mRNA-seqを用いた解析でも同様であった。これらの遺伝子は乾燥に伴う酸化ストレスに応答する制御エレメントが共通に存在する事が推察される。ゲノム解析のデータと比較しながら、乾燥応答シグナルの一部としての酸化応答シグナル伝達経路の解析に、これら155個の遺伝子は利用可能であろうと考えている。技術の進歩に伴い、サンガー法のみでは同定しづらかった多コピーの遺伝子を、mRNA-seqにより網羅的に同定できた。機能解析に関しては、既存の方法を踏襲して行うことで、進捗が期待可能である。24年度が最終年度であるため、記入しない。乾燥に伴う酸化ストレスは、タンパク質に対して甚大な傷害をもたらす。本研究により、ネムリユスリカは、PIMTのような修復酵素を転写レベルで大量に発現するのみならず、ゲノム中のコピー数も増やすことで、酸化ストレスに対抗していることが示唆された。今後は、これらの遺伝子の機能を解析することで、PIMTパラログ間の生理学的役割分担と、極限乾燥耐性機構に対するタンパク修復系の寄与を考察していく予定である。