hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト疾患モデルとしてのメダカ突然変異体の解析

我々は心臓、血球、血管、骨、ヒレ形成、ヒレ再生に異常のあるメダカ突然変異体を53種類、系統として確立し、特に表現型の興味深いものから順に原因遺伝子の同定を試みている。その結果、ポジショナルクローニングと核酸塩基配列の決定によって、10種類の変異体の原因遺伝子について、その変異部位が確定した。その中で、ヒレ形成変異体ufiの原因遺伝子はHoxb8であり、魚における初めてのHoxfamilyの変異体である。Hoxb8が細胞の移動と骨芽細胞分化の制御に関与し、それが異常になるとヒレが萎縮する。また心筋形態異常を示す変異体sdcの原因遺伝子はfilamin Cであった。この変異体は心室の心筋の一部が欠損する異常を示し、これに関与するfilamin Cは心筋・骨格筋の形成に機能する細胞内蛋白であり、アクチン重合を制御している。骨形成においては、椎骨がジグザグに変形する突然変異体の原因遺伝子は、体節形成の必須遺伝子、Notch1であった。この結果は、椎骨の形態は初期の体節パターンが基盤になっていることが明らかになった。さらに、メダカにおいて初めて破骨細胞が見出され、特に咽頭歯においては多核破骨細胞が存在し、骨吸収している像が観察された。このことから、メダカにおいても骨リモデリングの存在が明らかになった。血管形成において、器官形成の基盤となるメダカ血管発生のアトラスが完成した。この結果、メダカはゼブラフィッシュに比べて、哺乳類に近い血管発生様式を持つことが明らかになった。突然変異体スクリーニングの結果、現在までに収集した突然変異体として、心臓・血管系の異常を示すものが59系統、血球異常9系統、骨のパターン形成異常19系統、鰭の異常25系統、尾鰭の再生異常16系統などがあり、特にゼブラフィッシュでは全く単離されていない椎骨形成不全や、発生は正常でヒレ再生のみ異常な変異体の単離に成功している。突然変異体の中には、ヒトの先天的疾患と対応する表現型のものが多数含まれ、さらに原因遺伝子がヒト遺伝病と同じものとして、ヘモグロビン合成の酵素であるALAD遺伝子の同定とそのメダカ変異体whoの確立に成功しており、ヒトのポリフィリン血症の原因遺伝子と同じことから、メダカ突然変異体が疾患モデルとしても有用であることが実証されている。このように得られた器官形成突然変異体166種類から、特に重要な20種類については原因遺伝子の同定を行い、心臓・血管、ヒレ形成、骨に関わるメダカ突然変異体からポジショナルクローニングにより6つの原因遺伝子のクローニングに成功している。その多くがそれぞれの器官形成に関して新規の遺伝子であり、新しいメカニズムの発見が期待される。特にヒレの伸張にかかわる遺伝子としてHoxb8が同定され、Hoxb8がWnt5aを制御することによりヒレを構成する細胞の移動がおこり、その結果ヒレの伸張と鰭条形成がもたされることが明らかになった。この結果はHoxb8による付属肢形成の分子メカニズムを示した初めての知見である。また、血管システムや骨のパターン形成の解析のため、これらの器官特異的にGFPを発現するトランスジェニックメダカを作成することに成功している。このような総合的な解析にはメダカ各器官の組織学的解析、発生生物学的検討が必要だが、我々は各メダカ器官固有の遺伝子の収集に努め、その発現解析を行うとともに発生過程における組織学解析を進めている。その中で、ヒレ形成変異体ufiの原因遺伝子はHoxb8であり、魚における初めてのHox familyの変異体である。

Hoxb8が細胞の移動と骨芽細胞分化の制御に関与し、それが異常になるとヒレが萎縮する。また心筋形態異常を示す変異体sdcの原因遺伝子はfilamin Cであった。この変異体は心室の心筋の一部が欠損する異常を示し、これに関与するfilamin Cは心筋・骨格筋の形成に機能する細胞内蛋白であり、アクチン重合を制御している。骨形成においては、椎骨がジグザグに変形する突然変異体の原因遺伝子は、体節形成の必須遺伝子、Notch 1であった。この結果は、椎骨の形態は初期の体節パターンが基盤になっていることが明らかになった。さらに、メダカにおいて初めて破骨細胞が見出され、特に咽頭歯においては多核破骨細胞が存在し、骨吸収している像が観察された。このことから、メダカにおいても骨リモデリングの存在が明らかになった。血管形成において、器官形成の基盤となるメダカ血管発生のアトラスが完成した。この結果、メダカはゼブラフィッシュに比べて、哺乳類に近い血管発生様式を持つことが明らかになった。
骨芽細胞の増殖と分化の制御

本研究においてはBMPの制御のメカニズムを明らかにする目的でBMPと結合しその機能をシグナルの上で制御する分子についての検討を行った。Zinc Fingerタンパクのp130Casの結合分子としてクローニングされたCIZは強制発現することにより骨芽細胞(MC3T3E1)の分化の促進することが知られているBMPのアルカリフォスフォターゼ発現亢進に対する作用を抑制した。さらにI型コラーゲンの遺伝子発現についてもBMPの促進作用がCIZの強制発現により処置された。また、骨芽細胞に特異的に発現する分子であるオステオカルシンの遺伝子発現について検討したところ、CIZはBMPによるオステオカルシンの遺伝子発現亢進促進に対する機能を抑制した。以上の結果からさらに上位の転写因子に関する作用が考えられたため、BMPのCbfa1に対する作用を検討した結果Cbfa1の発現促進に対するBMPの作用をCIZが著明に抑制した。次にそのシグナルメカニズムを検討するためにBMPの下流にあるSmadのレスポンスエレメントを持つリポーターを用いてルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、BMPはルシフェラーゼ活性を高め、さらにSmad1およびSmad5はこのレスポンスエレメント(GCCG×6)の活性を促進した。一方CIZの存在下ではBMPによるルシフェラーゼ活性促進作用が抑制され、さらにまたSmad1およびSmad5によるルシフェラーゼ活性促進効果に対してもCIZの強制発現がこれを抑制することからCIZの作用点はBMP作用の中で転写制御におけるSmadの役割をブロックすることにあると考えられた。さらに生理的な作用におけるBMPとCIZの関連を明らかにするために骨芽細胞様細胞を石灰化する条件で21日間に渡り培養した。この際、CIZが強制発現していない場合にはベーターグリセロリン酸とアスコルビン酸の存在下で石灰化がアリザリンレッド陽性の赤色の沈着物として多数観察されたのに対し、CIZを強制発現した骨芽細胞(MC3T3E1細胞)においてはその石灰化が著明に抑制された。以上の観察からBMPのシグナリングに際してCIZ蛋白が細胞内におけるそのシグナル抑止分子として機能することが明らかとなった。
細胞機能制御と構築

(1)田中は、非糖質の炭素源にて培養した酵母に発現するペルオキシソ-ム(POS)内の多段階共役複合酵素系の特異的集積化機能を分子レベルで解明し、人工オルガネラ構築のための基礎を得ようと試みた。まず、POS局在酵素の代表としてイソクエン酸リア-ゼを大量に発現させる系を確立し、その系を酵母内に導入してPOSを発達させることに成功した。その結果、局在酵素の集積化機能は分子内のアミノ酸配列そのものの中にあり、かつ、POSの発達と酵素分子の発現が調和していることがオルガネラ機能発揮に必要であることが判明した。(2)林利彦は、細胞外マトリックス(ECM)の細胞機能調節作用をコラ-ゲン(Col)により検討し、Colゲルが培養線維芽細胞の形態、アクチンフィラメントの配列、細胞増殖調節、細胞遊走刺激などに関係することを見出し、また、血管基底膜結合性Colの新種を発見・解析した。(3)林正男は、大量精製に成功したビトロネクチン(VN)の細胞接着性たんぱくとしての分子機能を解析し、生物種による差異と特性を明らかにし、VNと細胞毒物質、抗がん剤などの複合体を創製して細胞へ効果的作用を与える分子設計を検討した。(4)井街は長期間生体内で血液と触れた人工心臓材料表面への血漿たんぱく吸着の状態を免疫学的標識法などを用いて検討し、抗血栓性材料へのたんぱく吸着の要因を解析した。(5)桜井は、人工材料による接触血小板活性化のメカニズムを、細胞内Ca^<+2>の動態を手がかりとして解析し、疎水性表面および親水性表面による作用の違いを明確にした。また、ミクロドメイン構造をもつ材料による血小板活性化抑制について検討し、理想的な抗血栓性材料表面の分子設計の指針を得た。以上生物系と合成系ECMの細胞機能制御と機能構築について、学際的・集学的な研究成果が得られた。
バルクナノメタルにおける力学特性の解明と変形理論構築

結晶粒径が1ミクロン以下のバルクナノメタルは,結晶粒径が10ミクロン以上の通常の金属に比べて強度が高いのみならず,靭性,破壊,疲労挙動などに特異な力学特性を示す.これらバルクナノメタルが示す力学特性について詳細に調査し,変形・破壊機構を実験的,理論的に考察した.その結果,転位の発生と運動に及ぼす結晶粒界の影響が,力学特性に対して本質的な役割を果たしていることが明らかになった.さらに,バルクナノメタルの内部組織を種々の手法を用いて調べ,変形中の超微細粒銅の転位密度変化のその場測定など,多くの新しい実験結果を世界に向けて発信することができた.結晶粒径が1ミクロン以下のバルクナノメタルは,結晶粒径が10ミクロン以上の通常の金属に比べて強度が高いのみならず,靭性,破壊,疲労挙動などに特異な力学特性を示す.これらバルクナノメタルが示す力学特性について詳細に調査し,変形・破壊機構を実験的,理論的に考察した.その結果,転位の発生と運動に及ぼす結晶粒界の影響が,力学特性に対して本質的な役割を果たしていることが明らかになった.さらに,バルクナノメタルの内部組織を種々の手法を用いて調べ,変形中の超微細粒銅の転位密度変化のその場測定など,多くの新しい実験結果を世界に向けて発信することができた.研究代表者と分担者がそれぞれの研究を独自に行いつつ,相互の連携を密にとりながら力学特性に関する種々の系統的な基礎データを蓄積し,バルクナノメタルの変形機構の解明と変形理論の構築を目指した.先ず,バルクナノメタル試料(Cu,Alなど)やその他の試料を用い,適切な熱処理も加えて,種々の方位差,粒径,転位密度の分布を持つ材料の引張変形挙動を系統的に明らかにした.また,変形した試料の内部組織と力学特性の関係を調べた.さらに,上記バルクナノメタル試料と超微細粒の低炭鋼を用いて破壊靭性試験を行い,延性,靭性の温度依存性を調べた.上記バルクナノメタル試料及び合金試料については,繰り返し変形試験(低サイクル試験)及び疲労試験(高サイクル試験)も行い,変形挙動と組織との関係を調べた.超微細粒材における,疲労試験時のせん断帯の形成や結晶粒の粗大化,さらには疲労軟化現象などについて考察した.上記バルクナノメタル試料の引張(圧縮)変形中,その場中性子散乱実験(Bragg回折と小角散乱)も試験温度を変化させて行った.一般に,バルクナノメタル試料では,結晶粒が超微細なため変形中の組織発達過程を追うことは困難であるが,中性子散乱実験という特長ある実験手法を用いることで,変形中の内部応力の発生,転位密度の変化などをin-situで明らかにできた.純金属及び合金のバルクナノメタルの力学特性と変形機構について考察した,実験的には,種々の温度やひずみ速度による引張試験,疲労試験,破壊試験などを系統的に遂行するとともに,変形中のその場観察も行って,変形による内部組織の発達過程を調べた.超微細粒Alに繰返し変形を加えることで形成された転位組織の安定性を,その後の引張変形に伴う転位組織の変化から議論した.また,Co-Fe粒子が分散したCu合金超微細粒組織の焼鈍に伴う変化を調べ,転位上に析出した粒子が超微細結晶粒組織の熱的安定性向上に寄与することを見出した.超微細粒電解析出鉄における特異な塑性変形機構を集合組織,結晶粒径,粒界性格,転位運動(転位密度変化),粒応力,水素挙動に関する実験結果から総合的に考察した.ECAP加工により形成されたナノ双晶を有するステンレス鋼では500°Cの焼鈍までは加工時の硬さを保つことを示し,ナノ双晶構造から構成される微細結晶粒材料の特異性を明らかにした.微細結晶粒組織を持つ鋼を試料とした実験を行い,バルクナノメタルにおける低温脆性向上の原因が,転位源として働き得る粒界の増加によって説明できることを示した.さらに,繰返しチャンネルダイ圧縮接合を考案し,この超強加工プロセスにより厚肉角棒材の結晶粒超微細化と高強度化が実現可能であることを実証した.上記のような多面的かつ系統的な実験によって明らかになった力学特性及び得られたデータを相互に比較検討し,普遍性や特殊性を念頭に置いて,実験結果の総合的な整理を行った.各種純金属および合金のバルクナノメタルの力学特性と変形機構の解明を目的に研究を継続し,多くの成果を得た.実験としては,各種力学試験(引張圧縮試験,疲労試験,破壊試験,クリープ試験)を行い,電子顕微鏡観察,X線回折,中性子回折,熱分析,電気抵抗測定などの手法による材料組織の評価に加えて,各種その場測定も行った.バルクナノメタルにおけるホール・ペッチ関係と熱活性化過程に関して,粒界で生成した転位の粒内への張り出し過程と熱活性化depinning過程を考慮したモデルを用ることで,バルクナノメタル特有の特異現象を含めて,熱活性化変形過程をかなり定量的に説明することができた.また,銅合金において適切なサイズと分布の粒子を析出させることで,熱的安定性を向上させることが可能であることを見出した.さらに,結晶粒の初期方位がバルクナノメタル作製時の変形におよぼす影響を明らかにするために,単結晶を用い組織形成過程を詳細に調査し,3段階の組織変化が起こることを明らかにした.

バルクナノメタルのリューダース変形の発現条件を調べ,部分焼入れ処理を行うことによってナノベイナイト変形が促進されることを明らかにした.ステンレス鋼のバルクナノメタルの低サイクル疲労試験においては,応力振幅の増加と初期の軟化率の低減に成功した.バルクナノメタルと加工材の脆性ー延性遷移挙動の違いに関して検討を行った.Ti添加極低炭素IF鋼を用いて,特異な不連続降伏および異常ホール・ペッチ強化は,組織中に存在する転位源が不活性化されているために生じる現象であることを見出すと共に,超微細粒鋼の降伏挙動におよぼすナノ析出物の影響を明らかにした.以上のように,幅広い領域で系統的に実験を行うことにより力学特性に関する新たなデータを取得した.また,実験結果を基に理論的な考察を行い,バルクナノメタルの変形挙動とその機構を総合的に議論した.本研究では,バルクナノメタルで特徴的な力学特性とその支配因子,すなわち,強度とその温度・ひずみ速度・結晶粒径依存性,じん性,降伏点現象,疲労軟化現象,転位組織,転位密度解析を解明することで,力学物性を説明する変形機構理論の構築を目的としている.このため,実験的研究として,引張(圧縮)試験,疲労試験,破壊試験,クリープ試験などの各種の力学試験と,透過型および走査型の電子顕微鏡による観察,X線回折,中性子回折,熱分析電気抵抗測定などの転位組織,材料組織の評価を行い,従来には示されていない新しい成果を発表してきた.特に平成26年度においては,超微細粒材料に特異の力学特性(熱活性化過程,リューダース変形,等)の調査と原因追及,クリープ変形機構の考察,鉄及び鉄合金における降伏応力の温度依存性と加工軟化・固溶軟化,破壊の熱活性化過程と延性ー脆性遷移,疲労・繰り返し変形の組織依存性,析出粒子と強度や組織の安定性の関係,超微細粒組織材料の変形中の転位密度変化のin-situ測定を実施した.また,バルクナノ結晶材の粒界や転位に関する内部組織の定量化とキャラクタリゼーションや組織の熱安定性の研究でも顕著な成果をあげた.そして,これらの実験で得られた成果を基に,転位論,速度論,破壊力学,マイクロメカニックスを駆使して,バルクナノメタルの力学特性についての理論的な解析を行った.以上を要するに本研究では,変形中に形成される内部組織と力学特性の関係を明らかにすることによって,バルクナノメタルの力学特性の解明と変形理論の構築を行った.平成24年度は,バルクナノメタルにおける塑性変形・破壊挙動解明のための各種力学試験,疲労と破壊に関する系統的な研究,多様な手法での組織観察を継続,発展させて行った.研究体制としては研究代表者と5名の研究分担者さらに2名の連携研究者が参加し,バルクナノメタルの力学物性と組織変化に関連した事項を定量的に評価,解明した.得られた成果の具体的な例を以下に示す.(1)超微細結晶粒(UFG)Alにおける疲労転位組織の引張変形に対する安定性について考察した.UFG-Alと粗大結晶粒(CG)を持つAlに繰り返し変形を行い,それらの中に疲労変形組織を形成させた.これら二種類のAl疲労材に引張変形を加えると,CG-Alの疲労組織が引張変形後も安定に存在し続けたのに対し,UFG-Al疲労組織は引張変形後には消失することがわかった.(2) Cu基UFG合金における微小析出粒子による超微細結晶粒の組織安定化について考察した.平均粒径16nmのbcc Co-Fe微小析出粒子が分散したCu基合金にECAP加工を加え,微小粒子が分散したUFG組織を作製した.UFG組織は一般に熱的に不安定とされる.しかし,微小な析出粒子の分散が,UFG組織の熱的安定性を大きく向上させることがわかった.
カルシウム依存性に起こる細胞内ホスファチジルセリンの分布変化

私達は新規に確立したホスファチジルセリン(PS)可視化法により、PSが小胞体膜の細胞質側に豊富に存在すること、細胞質Ca2+の上昇により小胞体膜内腔側にPSが出現し、同時に核膜PSが著しく増加すること等、新しい知見を得ました。本計画ではこれらをさらに発展させ、Ca2+依存的に細胞内PS分布が変化する分子機構、そしてその生物学的役割について研究します。さらに細胞内PS分布と疾病との関係を明らかにします。
低頻度疲労の発生メカニズムとその対処法

前年度,回復早期段階における低頻度疲労の原因は,筋小胞体のCa2+放出機能の低下にあることを明らかにした.そこで,本年度は,低頻度疲労に伴う筋小胞体のCa2+放出機能の低下のメカニズムを筋小胞体からのCa2+漏出に着目して検討する(研究A)とともに,活性酸素種に着目して低頻度疲労の対処法(研究B)を検討した.研究Aでは何も処置していないラットを用いて,研究Bではラットを2群に分け,片方の群には収縮を負荷する1時間前に生理食塩水を腹腔内投与し,もう一方の群には同様のタイミングで抗酸化剤(EUK-134)を投与した.どちらの実験においても前年度と同様のモデルを用いて,低頻度疲労を誘起した.ラットの片脚の腓腹筋に収縮を負荷し,収縮終了30分後において筋を摘出し,スキンドファイバーを用いた解析に供した.研究Aの結果,安静脚と比較し刺激脚では,1)筋小胞体に含まれるCa2+含有量が低下すること,2)筋小胞体からのCa2+漏出量が増加すること,3)ジヒドロピリジン(DHPR)からリアノジン受容体へのシグナルを高めると,両脚のCa2+漏出量は同等となることが明らかとなった.これらの結果は,低頻度疲労に伴う筋小胞体Ca2+放出機能低下の原因の一つは,筋小胞体のCa2+含有量の低下にあり,それはDHPRからのシグナルが高まることに起因することを示す.研究Bの結果,1) EUK-134を投与したとしても低頻度疲労の程度は変わらないこと,2) EUK-134投与群では筋小胞体Ca2+放出機能の低下が軽減されること,3)非投与群では筋原線維のCa2+感受性が増加するが,EUK-134投与群ではその効果がなくなることが明らかとなった.これらの結果は,抗酸化剤を投与したとしても低頻度疲労が軽減されないこと,それは抗酸化によるプラスの効果とマイナスの効果が相殺するためであることが示された.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,低頻度疲労の発生メカニズムおよびその対処法を明らかにすることであり,本年度は,1)筋小胞体Ca2+放出機能(以下,Ca2+放出機能と表記)の低下が低頻度疲労の原因となるのか,2)もしそうであるとすれば,そのメカニズムは何かについて検討した.実験にはラットを用い,ラットの腓腹筋に対して,張力が初期値の50%に低下するまで収縮を負荷した.収縮終了直後,0.5時間後,2時間後,6時間後,12時間後において腓腹筋を摘出し,スキンドファイバーを作製した.なお,収縮を負荷していない筋をコントロールとして使用した.スキンドファイバーを用いて,横行小管の興奮性(Na+-K+-ATPaseの機能),脱分極誘因性張力(ジヒドロピリジン受容体から開始されるCa2+放出機能),カフェイン感受性(筋小胞体Ca2+放出チャネルから開始されるCa2+放出機能)について検討し,以下の結果を得た.1)横行小管の興奮性は,コントロールと比較し,収縮終了0.5時間後において低下した.2)脱分極誘因性張力は,コントロールと比較し,収縮終了直後から2時間後において著しく低下し,6時間後においてわずかに低下した.3)カフェイン感受性は,コントロールと比較し,収縮終了0.5時間および2時間後において低下した.上記の結果は,回復早期段階において,Ca2+放出機能の低下が低頻度疲労の主な原因となることを示す.Ca2+放出機能の低下は,1) Na+-K+-ATPaseの機能低下,2)ジヒドロピリジンの機能低下,3)ジヒドロピリジン受容体から筋小胞体Ca2+放出チャネルへの情報伝達不全,4)筋小胞体Ca2+放出チャネルの機能低下のいずれかによって生じる.本研究の結果は,2)と3)のいずれか一方あるいは両方が収縮後すぐに生じ,その後の安静期間において,1)および4)が生じることを示唆する.当初は,スキンドファイバーを用いた解析だけでなく,免疫沈降法を用いてタンパク修飾についても検討する予定であった.しかしながら,抗原抗体反応において非特異的なタンパク質と抗体が反応するなど種々の問題が生じ,解析結果を得られなかった.それでも,スキンドファイバーを用いた解析によって,当初の目的であった「どのタンパク質がCa2+放出機能の低下に寄与するか」を明らかにできた.これらのことから,おおむね順調であると判断した.前年度,回復早期段階における低頻度疲労の原因は,筋小胞体のCa2+放出機能の低下にあることを明らかにした.そこで,本年度は,低頻度疲労に伴う筋小胞体のCa2+放出機能の低下のメカニズムを筋小胞体からのCa2+漏出に着目して検討する(研究A)とともに,活性酸素種に着目して低頻度疲労の対処法(研究B)を検討した.研究Aでは何も処置していないラットを用いて,研究Bではラットを2群に分け,片方の群には収縮を負荷する1時間前に生理食塩水を腹腔内投与し,もう一方の群には同様のタイミングで抗酸化剤(EUK-134)を投与した.どちらの実験においても前年度と同様のモデルを用いて,低頻度疲労を誘起した.

ラットの片脚の腓腹筋に収縮を負荷し,収縮終了30分後において筋を摘出し,スキンドファイバーを用いた解析に供した.研究Aの結果,安静脚と比較し刺激脚では,1)筋小胞体に含まれるCa2+含有量が低下すること,2)筋小胞体からのCa2+漏出量が増加すること,3)ジヒドロピリジン(DHPR)からリアノジン受容体へのシグナルを高めると,両脚のCa2+漏出量は同等となることが明らかとなった.これらの結果は,低頻度疲労に伴う筋小胞体Ca2+放出機能低下の原因の一つは,筋小胞体のCa2+含有量の低下にあり,それはDHPRからのシグナルが高まることに起因することを示す.研究Bの結果,1) EUK-134を投与したとしても低頻度疲労の程度は変わらないこと,2) EUK-134投与群では筋小胞体Ca2+放出機能の低下が軽減されること,3)非投与群では筋原線維のCa2+感受性が増加するが,EUK-134投与群ではその効果がなくなることが明らかとなった.これらの結果は,抗酸化剤を投与したとしても低頻度疲労が軽減されないこと,それは抗酸化によるプラスの効果とマイナスの効果が相殺するためであることが示された.平成29年度は,当初の計画と同様,抗酸化剤の投与が低頻度疲労を軽減するかについて検討する.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
Y染色体微細加工と顕微発現プロファイリングを用いた植物性決定遺伝子の完全解明

雌雄異株植物ヒロハノマンテマに重イオンビームを照射し、両性花変異体17株、無性花変異体10株を得た。次世代シーケンサー解析によりY染色体連鎖DNA断片を1741同定し、その中から両性花変異体、無性花変異体でそれぞれ共通して欠失する断片を特定、性決定遺伝子の座乗領域を絞り込んだ。また、レーザーマイクロダイセクションの実験系を確立、現在、性決定遺伝子が働くステージにおける発現アレイ解析を進めている。雌雄異株植物ヒロハノマンテマのY染色体には、雄蕊伸長促進機能領域(SPF)と雌蕊抑制機能領域(GSF)が存在する。これらに座乗する性決定遺伝子の同定を目指し、以下の課題を遂行した。1.理研リングサイクロトロンで加速したCビーム20Gyをヒロハノマンテマの花粉に照射し、後代種子を1000粒獲た。スクリーニングの結果、SPFを欠失する無性花を2株、GSFを欠失する両性花を1株を新たに得て、合計で無性花11株、両性花13株となった。2.ヒロハノマンテマのオス株由来のBACライブラリー(平均インサートサイズ105 kb、130,000クローン)の構築をゲノム支援の協力により完成させた。3.X染色体特異的遺伝子SlWUS1を同定した。近縁種におけるSlWUS1のゲノムシーケンスを比較解析した結果、ヒロハノマンテマのY染色体は、常染色体から進化する際にSlWUS1周辺領域を失ったことを明らかにした。4.本課題では、SPF近傍のゲノム配列の獲得に集中する予定であったが、BACライブラリーの完成が予定よりも遅れたため、SPFとGSFの両方をターゲットとし、近傍マーカーの獲得を優先した。英国エジンバラ大とオックスフォード大との共同研究により、オス株とメス株のゲノムDNA、及び雌雄のつぼみ由来のcDNAを次世代シーケンサーで解析した。オスの蕾のみで発現する遺伝子+オスのゲノムだけに存在するDNA断片を収集し、Y染色体由来と考えられる1741のDNA断片を得た。この1741断片について、Y染色体欠失・性転換変異体群における欠失の有無を調べた。両性花変異体で共通して欠失する断片は得られなかったことから、既に同定済みのMK17というマーカーがGSFに最近傍であると考えられる。無性花変異体では3つの断片が共通して欠失していた。これらの断片をSPFの最近傍マーカーとして同定した。雌雄異株植物ヒロハノマンテマの性は、哺乳類と同じXY型の性染色体で雌雄が決まる。Y染色体には3つの雄性決定機能領域が予測されており、(1)雌蕊発達抑制機能領域(GSF)、(2)雄蕊伸長促進機能領域(SPF)、(3)葯成熟促進機能領域(MFF)と呼ばれる。これらの性決定遺伝子の同定に向けて、申請者はこれまで、理化学研究所のリングサイクロトロンで加速した重イオンビームをヒロハノマンテマに照射し、(1)を欠失する両性花、(2)を欠失する無性花、(3)を欠失する雄蕊葯不全花の変異体ラインからなる「Y染色体欠失・性転換変異体ライブラリ」を整備してきた。また、Y染色体STSマーカーを用いて無性花変異体6個体の欠失領域を調査し、6個体すべてで欠失する領域を求めることで、SPF雄性決定遺伝子がScQ14とSmixy6という2つのマーカー間に存在することを明らかにしている。Y染色体欠失・性転換変異体ライブラリを拡充するため、炭素イオンビームを花粉に最適線量(20Gy)で照射し、人工受粉して後代種子を得、1000個体を圃場で栽培して選抜を行った。現在スクリーニングを進めている。SPF性決定候補領域のゲノム配列を解読するため、雄のヒロハノマンテマ由来のBACライブラリー(平均インサートサイズ115 kb、130,000クローン)の構築をゲノム支援に依頼し、現在までに平均インサートサイズ105 kb、46,000クローンからなるパーシャルBACライブラリーの構築を完了した。また、SPF性決定候補領域に含まれるBACクローンを2つ同定し、合計218 kbをシーケンスし、新規Y染色体座乗遺伝子を3つを同定した。解析の課程で、X染色体特異的遺伝子1つを同定した。現在、これらの遺伝子について無性花変異体での欠失および野生型雄個体での発現解析を進めている。Y染色体欠失・性転換変異体ライブラリの拡充は予定の規模で行っており、順調に進んでいる。一方、SPF性決定遺伝子領域のBACコンティグはいまだ作製途上にある。ゲノム支援によるBACライブラリの構築が遅れており、ヒロハノマンテマ全ゲノムを網羅するBACライブラリが未だ完成していないため、BACクローンのスクリーニングが予定通りには進まなかった。

そのため、本年度に予定していたSPF性決定領域のBACクローンのシーケンス費用を次年度に繰り越すことにした。ゲノム支援によるBACライブラリの完成後、直ちにSPF性決定領域のBACスクリーニングを開始し、BACコンティグを完成させる。完成後はSPF性決定領域のBAC全てを454Titaniumシーケンサーを用いて高速シーケンスを行う。それぞれのコンティグをPCRとサンガー法のシーケンスでつなぎ合わせ、SPF性決定領域のシーケンスを完了する。ゲノム支援によるBACライブラリの完成が間に合わない場合には、以下の方法でSPF性決定領域に存在する遺伝子を網羅的に抽出する。エコタイプが異なる雄雌のヒロハノマンテマを交配し、F1世代を得る。交配親オス、交配親メス、F1世代のオス複数個体、F1世代のメス複数個体のそれぞれの花のつぼみからRNAを抽出し高速シーケンサーを用いてRNAseqを行う。得られた配列情報から各遺伝子のSNPsを検出しその遺伝様式を調べる。XY型性染色体の遺伝様式に合致する遺伝子群を抽出することで、性染色体連鎖遺伝子を特定する。このうちY染色体連鎖遺伝子群の欠失を無性花突然変異体で調査し、SPF性決定領域に存在する遺伝子を絞り込む。SPF性決定領域に座乗する遺伝子群について顕微発現プロファイルを行いSPF性決定遺伝子の同定を目指す。SPF性決定遺伝子領域のBACコンティグが間に合わなかったため、BACクローンのシーケンス費用(1,759,794円)を次年度に繰り越した。この費用は、ゲノム支援によるBACライブラリの完成が間に合えば、次年度の研究費を計画どおりSPF性決定領域のBACのシーケンスに当てる。ゲノム支援によるBACライブラリの完成が間に合わない場合は、繰り越し費用を上記性染色体連鎖遺伝子SNPsマッピングに当てる。次年度の研究経費(1,300,000円)は、上記どちらかのシーケンス解析が終了後、顕微発現プロファイリングに用いる。SPF性決定領域に存在する遺伝子についてタイリングアレイをデザインし、野生型オスと無性花突然変異体のつぼみの発達ステージを追ってSPF性決定領域の全遺伝子のうち、雄蕊の発達時期に特異的に発現する遺伝子を絞り込む。
カーボンナノドットへのヘテロ原子ドープによる高機能化

カーボンナノドット(CND)は有機化合物や炭素材料を原料として、加熱分解法や電解法などの多様な合成方法で得ることができる。CNDについて発光特性などの基礎検討や応用例が報告されているが、CNDの原料および合成方法と得られたCNDの発光特性の関連性について系統的に取り組んだ研究例は少ない。また、CND発光強度は既存の半導体ナノドットなどに比べるとやや劣っており、発光量子収率にして20 %程度である。これに対して、原料として窒素や硫黄を含む有機物から合成された、ヘテロ原子がドープされたCNDでは、発光量子収率が向上することがここ数年の研究から認めラル用になった。そこで、本研究では原料の元素組成と得られたCNDの発光特性の関連性に着目するとともに、窒素や硫黄の代替となるヘテロ原子の探索に取り組んだ。CNDの合成には、原料比の制御が容易であり、反応操作から精製処理まで比較的短時間で対応できる、電気炉加熱分解法とマイクロ波照射法を採用した。CNDの主原料として、高純度の試薬が入手可能であり、その元素組成が明確なグルタミン酸を選択した。これにより、種々の合成原料組成から合成したホウ素をドープしたCNDの吸収および発光スペクトル測定に基づいた発光特性評価に取り組んだ。グルタミン酸を主原料とし、これにドープするホウ素源としてホウ酸またはフェニルボロン酸を選択し、マイクロ波照射法によってカーボンナノドット(CND)を合成した。ホウ酸は一般的な有機化合物に比べて熱分解温度が高いため、従来のCNDの合成で反応容器として用いられてきたテフロン耐圧容器の使用温度(260 °Cで溶解)範囲内でCNDを生成させることができなかった。そのため、ホウ素含有カーボンナノドットの合成では、より反応効率が高く短時間で加熱分解処理が可能なマイクロ波照射法に変更した。原料の合計重量を1 gとして、グルタミン酸とホウ酸の混合比率を変化させた一連の原料からそれぞれCNDをマイクロ波照射によって合成した。得られたホウ素がドープされたCNDの発光強度は(励起波長328 nm,発光波長378 nm)NaCl 0.001-2.5 MおよびpH 4.5-9.5の範囲でほぼ一定を示した。原料中のホウ酸含有率増加に伴い発光量子収率は増大し、原料中のホウ酸含有率50 %で発光量子収率が42 %を示した。一方で、原料中のホウ酸含有率90 %では発光量子収率が3.7 %まで減少した。この結果からホウ素ドープは、CNDの発光量子収率に与える影響として、これまで報告されている窒素および硫黄ドープと同程度の効果が得られることが分かった。本年度グルタミン酸とホウ酸を原料としてマイクロ波照射法によるホウ素ドープCNDの合成法を確立し、原料混合比による発光特性の影響についての指針を得た。しかしながら、ホウ酸の熱分解温度の高さと偏った元素組成のため、より広範な原料組成比や温度条件でのCND合成が難しいことも明らかとなっている。そこで、ホウ素源をフェニルボロン酸にすることで、混合原料中の炭素含有比率について検討するとともに、電気炉加熱分解法を採用することで反応温度と反応時間の影響について取り組む。これと並行して、リンを含有したCNDの合成法の確立と、CNDの発光特性におよぼすヘテロ原子としてのリンの効果について検討する。

得られたホウ素がドープされたCNDの発光強度は(励起波長328 nm,発光波長378 nm)NaCl 0.001-2.5 MおよびpH 4.5-9.5の範囲でほぼ一定を示した。原料中のホウ酸含有率増加に伴い発光量子収率は増大し、原料中のホウ酸含有率50 %で発光量子収率が42 %を示した。一方で、原料中のホウ酸含有率90 %では発光量子収率が3.7 %まで減少した。この結果からホウ素ドープは、CNDの発光量子収率に与える影響として、これまで報告されている窒素および硫黄ドープと同程度の効果が得られることが分かった。本年度グルタミン酸とホウ酸を原料としてマイクロ波照射法によるホウ素ドープCNDの合成法を確立し、原料混合比による発光特性の影響についての指針を得た。しかしながら、ホウ酸の熱分解温度の高さと偏った元素組成のため、より広範な原料組成比や温度条件でのCND合成が難しいことも明らかとなっている。そこで、ホウ素源をフェニルボロン酸にすることで、混合原料中の炭素含有比率について検討するとともに、電気炉加熱分解法を採用することで反応温度と反応時間の影響について取り組む。これと並行して、リンを含有したCNDの合成法の確立と、CNDの発光特性におよぼすヘテロ原子としてのリンの効果について検討する。【次年度使用額が生じた理由】CNDの合成に使用するテフロン容器、遠心ろ過デバイス、スペクトル測定に使用する石英キュベットなどの消耗品が、想定していたよりも更新間隔が長かったため、消耗品購入のための物品費が抑えられたため、残額を次年度使用額とした。【使用計画】過度の消耗品在庫を所持することを避け、研究進捗状況と照らし合わせて適切な数量を購入する。研究の進行によって必要に応じた新たな物品の購入が発生することも考慮しつつ研究費を執行する。
「食への援助」に関わる安全確保のための看護師の判断視点と臨床経験年数の関連

看護師の「食べることへの援助」の実践内容と判断視点は臨床経験年数により異なるかを明らかにするため、経験年数が3年、5年、10年、20年を有する看護師に調査を行った。誤嚥・窒息の回避が安全確保には重要と認識しており、嚥下状態、意識状態、食事形態・食事内容等の観察、誤嚥リスクのアセスメント、姿勢の保持や医師や栄養士との連携を図る等の実践が共通であった。臨床経験年数の増加は担う役割の拡大と実践への意識を変化させ、実践する援助行為の必要性を自ら考察するようになることが本調査によって明らかとなり、食べることへの援助の実践や安全確保への判断視点の拡大には、役割負荷が転換期となっていることが示唆された。看護師は患者の「食べること」に対し安全を前提とし、その上で患者の食べることへの満足を支える援助を「食への援助」と捉えている。食べることは個人的な経験により培われ、食行動の多くに影響する。また、看護師の援助実践も臨床での経験を重ねることで変化する。このことから、看護師の「食への援助」の実践はこれらの経験によって変化することが考えられる。本研究では「食への援助」の実践において、看護師が行っているさまざまな判断を安全確保に焦点化して明らかにすることを目的とした。これを臨床経験年数による比較を行い、臨床経験年数による判断内容や視点の違いを分析する。得られた結果は「食への援助」をより安全に実践していくために、これまでは個人の経験によって培われたであろうものを早期に習得するための看護基礎教育や現任教育の方法を検討するのに有意義である。さらに、ケアの質向上に寄与することが期待される。平成25年度は新たな協力施設の開拓のため、各病院の看護部に依頼を行った。臨床経験年数20年を有する対象者の確保が他の対象群よりも遅れており、強化が必要である。そのため現在は協力施設の地域や規模など、看護師の年齢構成等を考慮して調整している。また、これまでのデータを振り返り、インタビューガイドでは実践している安全な「食の援助」をより具体的にできるように修正した。また、これまでの経験と現在の実践の繋がりが明確になるよう質問の順番を検討した。看護師は患者の「食べること」(広義の食事)において安全を前提とし、その上で患者の食べることへの満足を支える援助を「食への援助」と捉えている。平成24年度は質問項目を吟味し、インタビューガイドを作成した。質問項目は、研究者の行った先行研究のうち、安全のカテゴリを形成した内容をもとに、これまでの看護実践経験の内容が現在の実践や安全確保への判断等に影響したかを捉えられるよう考査し、安全確保のための着眼点、現在の実践に至る経緯、安全な「食への援助」を提供するために必要なこと等で構成した。インタビューに加え、対象者の援助実践に影響があると思われる臨床経験年数、勤務している病棟および勤務経験のある病棟、看護基礎教育課程、取得資格等を確認する質問紙を作成した。インタビューは新たに開拓し協力の得られた2施設にて、1臨床経験年数3年を有するもの、2同5年を有するもの、3同10年を有するもの、4同20年を有するものの各群に実施した。現在は逐語録の作成を行っている。経験年数が20年の群は他の群よりも対象の確保ができにくかった。このことから、看護師の「食への援助」の実践は臨床での経験によって変化することが考えられる。これを臨床経験年数ごとに比較を行い、臨床経験年数による判断内容や視点の違いを分析する。結果は「食への援助」がより安全に提供されるために、これまでは個人の経験によって培われたものを早期に習得して実践することができるよう、看護基礎教育や現任教育の方法を検討するのに意義がある。平成26年度は予定していたデータのうち、臨床経験年数20年を有する対象者の確保ができなかった。そのため協力施設の規模等、対象施設を調整したが、未だ十分でない。看護師は患者の「食べること」について安全を前提としており、その上で患者の満足を支える援助を目指している。

食べることは個人的な経験によって培われ、その経験は食に関連した多くの行動に影響している。「食への援助」は看護師の臨床経験や人生経験に伴い変化すると予測される。本研究では看護師の「食への援助」に関わる思考過程のうち、安全に関連する事柄を経験年数で比較することで、実践に至る経緯と実践を支持する背景の違い、経験に伴い思考が変化する理由を明らかにする。平成27年度は不足していた対象者(特に臨床経験10年および20年を有する対象者)への調査を実施したうえで、経験年数ごとの分析を行った。結果、看護師は食べることへの安全確保には「誤嚥や窒息の回避が重要」と捉えていた。実践内容は意識状態の確認、嚥下状況や食事形態・食事内容等の観察、誤嚥リスクのアセスメント、誤嚥回避に望ましい姿勢の保持、医師や管理栄養士との連携を図る等であった。これらは全ての経験年数に共通していた。実践する理由は、臨床経験3年の看護師は自発的な思考よりも周囲(先輩の指導や病棟での決まり等)の実践状況が動機になっており、臨床経験5年の看護師は看護チーム内でリーダー役割をとる等、自身が担う役割が変化したことで視野が広がり、援助行為の目的や実践の必要性を考えるようになったためであった。また、臨床経験10年および20年の看護師では異動や転職等がこれまでの自身の経験や実践を振り返る機会となり、安全の重要性を再認識したことにあった。実践の背景には「過去の自分の援助行動に対する何らかの後悔」が存在していることが共通していた。食べることへの安全を確保した援助の実践と経験年数による思考の変化には、「自身が担う役割の変化」と「現場での経験(個人の経験と先輩等から伝えられる他者の経験)の積み重ね」が影響していることが示唆された。看護師の「食べることへの援助」の実践内容と判断視点は臨床経験年数により異なるかを明らかにするため、経験年数が3年、5年、10年、20年を有する看護師に調査を行った。誤嚥・窒息の回避が安全確保には重要と認識しており、嚥下状態、意識状態、食事形態・食事内容等の観察、誤嚥リスクのアセスメント、姿勢の保持や医師や栄養士との連携を図る等の実践が共通であった。臨床経験年数の増加は担う役割の拡大と実践への意識を変化させ、実践する援助行為の必要性を自ら考察するようになることが本調査によって明らかとなり、食べることへの援助の実践や安全確保への判断視点の拡大には、役割負荷が転換期となっていることが示唆された。本研究の目的は「食への援助」の実践について安全確保に焦点をあて、それが臨床経験年数によって違いがあるかを明らかにすることである。そのため、対象者を臨床経験年数ごとに確保し、対象ごとの分析結果をもとにした経験年数による安全確保のための視点とその特性を抽出することと、各群を比較することにより、臨床経験年数による「食への援助」の実践における安全確保への視点や判断基準の差を検討する。臨床での経験内容が現在の実践や安全確保への判断視点等に影響しているか、これまでの経験が基盤となっているかを経験年数別に比較して明らかにすることが本研究の目的であるが、主として臨床経験年数20年を有する対象者についてのインタビューが滞っている。看護学臨床での経験内容が現在の実践や安全確保への判断視点等に影響しているかを明らかにする、方法としては臨床経験年数別に比較するが、本研究の目的に影響しない範囲で(経験年数による区分が不明瞭にならない範囲で)対象者の経験年数に若干の幅をもたせ、データを補充する予定である。
成長軟骨細胞の分化に及ぼす各種ホルモンならびに化学物質の効果に関する研究

Invivoの実験系で,これまでに明らかにされていない成長軟骨細胞の分化に及ぼす各種ホルモンと化学物質の影響を,当教室で開発したEHDP(HEBP)くる病ラット成長軟骨の観察を通して明らかにしようとした。その結果を日本整形外科学会,日本骨代謝学会,西日本整形災害外科学会等で発表したが,未発表の内容も含めて概要は以下の通りである。(1)EHDPくる病モデル成長軟骨板における,成長軟骨細胞の分化を甲状腺ホルモン(Triiodothyronine)が促進することを発見したが,これは我々が以前に発表したカルシトニンによる成長軟骨細胞分化促進効果とはその促進機構が異なることが実験的に明らかにされた。機構の詳細については不明であるが,甲状腺ホルモン投与の場合は,血清アルカリフォスファタ-ゼ活性の著しい上昇を示すこと,カルシトニンの場合はそれほどの上昇を示さないことである。又両ホルモンの併用投与により相乗効果がみられることも機構の相違を示している。カルシウム結抗薬の1つであるdiltiazemを併用することにより,カルシトニンの場合はその効果発現が抑制されたが,甲状腺ホルモンの場合は効果発現に変動がみられなかった。(2)以前よりカルシトニンと異なり,低分子の化学物質であるイミダゾ-ルやThiopheneー2ーcarboxylic acidが,カルシトニンと類似した様式で成長軟骨板の石灰化を促進することを報告してきたが,本年度の実験の結果,これら2種の化学物質と甲状腺ホルモンの併用投与によって成長軟骨板の石灰化促進効果に,相乗作用がみられることを明らかにした。
マイクロカンチレバーを用いた微量生体金属タンパク質のテラヘルツESR分光

マイクロリットルオーダーの微量な金属タンパク質試料に対するテラヘルツ電子スピン共鳴(ESR)分光法の開発を行った。新たに専用のプローブホルダー、電磁波導波管等の設計および製作を行い、装置系を構築した。ESR信号を力で検出するためのプローブとしてカンチレバーを採用した。また磁場発生機構として最大磁場15Tの超伝導磁石、テラヘルツ光源として後進行波管を採用した。測定感度評価を実施した所、10Tを超える強磁場領域では測定不能となる結果が得られた。そこで、カンチレバーの代わりに、メンブレンと呼ばれるトランポリン型の力検出デバイスを新たに採用した。そして力検出デバイスの変更に伴い以下のような装置の設計変更を加えた。まず電磁界解析シミュレータを用いて最適な形状を計算した上で溶液試料用のセルを設計および自作した。また最適な磁場勾配発生用磁気チップの選定および磁気チップと溶液セルの距離を計算し、プローブホルダー全体の再設計および製作を行った。改良された装置の評価として、DPPH粉末試料に対してESR測定を実施した。その結果、10Tを超える領域における信号雑音比はカンチレバーを使用した場合と比べて100倍以上向上した。測定感度は10^12spins/Gaussという高い感度が得られた。開発した装置を実際の二種類の溶液試料へと応用した。一つ目はヘムタンパク質のモデル物質であるヘミンクロライドの溶液(50mM、2マイクロリットル)に適用し、約0.4THzまでの多周波数においてESR信号を観測することに成功した。二つ目は実際のヘムタンパク質であるアコメトミオグロビンの溶液(8.8mM、10マイクロリットル)に適用し、同様にテラヘルツ領域においてESR信号を観測することに成功した。さらに本装置の動作信頼性を検証するため、ESRシミュレーションとの比較を行い、良い一致を得ることができた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
空気動ジグの選炭能力に最適な脈動波形の効果とその実用化に関する研究

本研究は空気動ジグの選炭能力に最適な脈動効果を理論と実験の両面から解析し、実用化のための具体的な指針を提供することを目的としている。この目的を達成する為にベッド内粒子の分離成層と脈動との関係の問題に的を絞って実験と理論解析を行った。先ず、最適と言われる台形波を含めて種々の波形を発生できる連続選別型の小形ジグと模擬試料として比重の異なる直径6mmの樹脂球を試作し、各粒子の各位置における時々刻々の運動、分離成層の経過、処理量と分離成層度との関係などについて調べた。一方、理論解析では脈動の波形、振動数、波高、ベッド厚、網下給水量、投入後の粒子配分などの諸条件下における各粒子の浮上から再着床までの時々刻々の運動を計算し、粒子の分離成層の経過を予知する数学モデルを提案した。この数学モデルによる計算結果は実験結果とよく一致している。本研究の成果を要約すると(1)空気動ジグの分離成層過程を詳細かつかなり精度よく予知できる数学モデルを提案した。このモデルは脈動の波形や振動数など諸パラメーターの効果の定量的な検討が可能なだけでなく、パソコンを用いて選別の詳細な経過を具体的に可視化して示すことができる。(2)脈動の波形は波高、振動数と同様選別成績にかなりの効果を持つ。中でも台形波形は従来の正弦波に近い波形に比し、数割程度は処理能力が高い。(3)脈動の波高、振動数、ベッド厚にも波形同様最適値が存在する。この最適値は原炭性状にも存在する。昭和59年度に試作した実験機を大幅に改良した。波高の均一化をはかるため網下に20枚のガイドベーンを設置し、床網も抵抗の少ないバースクリーン型に代えた。また、給炭部および硬抜部にはスターホイールを採用し、給炭量および硬抜量の安定化とその調節を容易にした。その結果、実験の再現性と能率が大きく改善され、信頼性のあるデータを得ることができるようになった。この実験装置を用いて3種類の比重の異なる直径6mmの樹脂球の試料で選別実験を行ない、選別に最適といわれる台形波状の脈動の効果について調べた。また、与えられた脈動からベッドの時々刻々の空隙率を算出し、ジグ内の選別の経過を予知する数学モデルの提案も行なった。その結果、次のような結論を得た。(1)現用の実機の正弦波に近い脈動を与えた場合に比し、台形波状の脈動を与えた場合はかなりの選別成績の向上が期待できる。本研究の実験では同じ分離精度であれば、台形波脈動を与えた場合処理量が5割程度向上する。(2)台形波脈動が優れている原因はベッド下面に発生する大きなほぐれがより早く生じ、浮遊時間も長いため、より上方まで大きくほぐれることによる。この効果はベッド厚を適度にとった場合より顕著である。(3)本研究の数学モデルは実験結果を良く説明できる。ほぐれが大きい場合に処理量をやや過大に評価する傾向があるが、ジグ選別過程の予知にかなり役立つものと思われる。

一方、理論解析では脈動の波形、振動数、波高、ベッド厚、網下給水量、投入後の粒子配分などの諸条件下における各粒子の浮上から再着床までの時々刻々の運動を計算し、粒子の分離成層の経過を予知する数学モデルを提案した。この数学モデルによる計算結果は実験結果とよく一致している。」本研究の成果を要約すると(1)空気動ジグの分離成層過程を詳細かつかなり精度よく予知できる数学モデルを提案した。このモデルは脈動の波形や振動数など諸パラメーターの効果の定量的な検討が可能なだけでなく、パソコンを用いて選別の詳細な経過を具体的に可視化して示すことができる。」(2)脈動の波形は波高、振動数と同様選別成績にかなりの効果を持つ。中でも台形波形は従来の正弦波に比し、数割程度は処理能力が高い。(3)脈動の波高、振動数、ベッド厚にも波形同様最適値が存在する。この最適値は原炭性状にも存在する。
歯周炎における新規病態因子の分子制御機構に関する研究

我々はバクテリアγ-GTP(bGGT)が破骨細胞形成を刺激することを見出した。本研究ではbGGTによる破骨細胞分化誘導の分子機構について検討した。バクテリア由来分子には細胞膜上のToll-like receptor (TLR) familyが関与することから、複数のTLRsに共通するアダプター分子MyD88のKOマウス骨髄マクロファージ(BMM)を用いた実験を行った。その結果、MyD88欠損BMMからは破骨細胞は誘導されなかった。さらに、TLR4欠損BMMでも同様の結果が得られた。またbGGTはLPSと同じように細胞内シグナル伝達を行うことが確認された。これらの結果から、bGGTはTLR4を介して破骨細胞形成を刺激していることが示された。我々は、細菌の産生するγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)が破骨細胞分化を誘導することを見出した。GGTは歯垢を形成する細菌の多くが産生しており、歯周炎における病態因子として作用する可能性がある。我々は、これまでの研究から、GGTはサイトカインの様に標的細胞の細胞膜分子と結合して、破骨細胞分化を誘導すると考え、ある細胞膜分子群を候補とした作業仮説を立てた。これを実証するため、これらの膜蛋白分子を欠損するマウスを入手し、それぞれのマウス骨髄から破骨細胞前駆細胞を調製してGGTで刺激した。その結果、候補分子群のひとつの欠損マウスから調整した破骨細胞前駆細胞では、GGTによる破骨細胞誘導が低下した。このことから、この分子がGGTによる破骨細胞形成に関与していることが示唆された。現在、このマウスの歯肉溝に直接GGTを投与した顎骨の組織標本を作製中であり、近々in vivoにおける結果が得られるものと期待している。破骨細胞前駆細胞として用いられる株細胞、RAW264.7細胞でもGGTによる破骨細胞形成が生じることを確認した。そこで、同細胞を用い、GGTによる破骨細胞分化の情報伝達経路について解析した。その結果、破骨細胞の分化に関与する重要分子、すなわちERK、JNK、p38などのリン酸化が確認され、IkBaのリン酸化も等しく確認された。これらのことから、GGTは破骨細胞分化因子RANKLと同じ情報伝達経路を活性化していることが明らかになった。これらの分子は今回の受容体候補分子の下流に存在することが知られている。一方、P.gingivalisのゲノム情報からのGGT遺伝子の特定については、本年度内に成果をうることができなかった。今後さらに検討を続ける予定である。我々は細菌の生命維持に重要なグルタミル代謝酵素のひとつであるγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)が破骨細胞誘導活性因子であることを見出した。このことは、細菌GGTが歯周炎における歯槽骨破壊の病態因子となる可能性を示唆している。昨年度までの研究から、細菌GGTはサイトカイン様に破骨細胞前駆細胞の細胞膜分子を刺激して破骨細胞分化を誘導していることが示されている。当該年度はさらに研究を進め、GGTの破骨細胞誘導を仲介する細胞膜上の候補分子の特定に成功した。この分子の欠損マウスから調整した破骨細胞前駆細胞は、GGTで刺激しても破骨細胞形成が起こらない。HEK293細胞にこの受容体分子の遺伝子を導入し強制発現させ、蛍光化したGGTを反応させたところ細胞表面の蛍光反応が確認された。一方、未導入のHEK293細胞では蛍光反応はまったく観察されなかった。さらに、この細胞ではNFκBのルシフェラーゼ反応が観察された。すでにGGTで刺激されたRAW264.7細胞では、破骨細胞分化のシグナル伝達経路におけるERK、JNK、p38などのリン酸化に加え、IκBのリン酸化も等しく確認されている。これらの反応は、この受容体分子の下流に存在すること、RAW264.7細胞もこの受容体分子を発現していることなどから、この分子がGGTの破骨細胞分化誘導の標的あると考えられた。そこで、一分子間相互作用などの実験を行った。しかしながら、この分子とGGTが直接接合する証拠はまだ得られていない。このことから、GGTとこの分子の間にはさらに仲介分子が存在するのかもしれない。最終年度は、この点に焦点を当てた解析を進める必要があると考えられた。細菌の産生するγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)に酵素活性非依存性の破骨細胞誘導活性を見出した。歯周炎の原因菌とされる種々の細菌の培養上清にはGGTが検出される。