hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RNAポリメラーゼが生み出すゲノムトポロジー変化の直接可視化

ゲノムトポロジーはDNA結合タンパク質が生み出すトポロジカルストレスによって動的に変化するが、その結果生まれるトポロジー変化を直接可視化する技術は存在しない。本研究では、従来のトポロジカルストレスの研究に用いられてきた生化学的手法と1分子計測技術を組み合わせることで、任意のゲノム領域のゲノムトポロジーを可視化する技術を開発することを目的とする。開発した技術は、大腸菌のlacオペロン上でRNAポリメラーゼによって生み出されるトポロジカルストレスの動的変化の解析に用いる。本年度は、ゲノム上のトポロジカルストレスのアンサンブル平均の解析を行った過去の報告を参考に、lacオペロンの環状化と抽出を行うため、Cre-loxP部位特異的組換え反応に必要なゲノム編集を行い、lacオペロンの上流と下流の位置にloxP配列を導入した大腸菌株を作成した。1分子計測に関しては、抽出されたゲノムをDNA-PAINT法と高速AFMを用いて観察するため、観察条件の検討を行った。DNA-PAINT法では観察分子の密度と必要な分解能に応じて、最適な撮影条件を決める必要がある。そのため、転写開始反応速度を任意に制御できるin vitro転写を利用し、細胞内で予想される転写開始反応速度に最適な撮影条件を検討した。また高速AFM観察では、一定の温度で観察が行えるよう顕微鏡の改良を行い、同様に、撮影条件の検討を行った。以上の撮影条件の検討は、転写反応速度に関わる変数(RNAポリメラーゼの濃度など)を既知の値に設定できるin vitro転写系とは異なり、様々な制御因子により転写反応速度が動的に変化する細胞内のトポロジカルストレスの解析を行う上で、重要な基礎データとなる。DNA-PAINT法に関しては、取得画像の解析法を改良し、ノンパラメトリックベイズモデルを用いた推定法を利用することで、位置決め精度の向上を行った。本年度は、lacオペロンの環状化と抽出に用いる大腸菌株の作成を完了した。また、本研究で用いる1分子計測系の構築を完了した。細胞内のトポロジカルストレスを解析する前段階として、in vitro転写を利用し、DNA-PAINT法、高速AFMの両方において撮影条件の最適化を行った。またDNA-PAINT法では、画像解析アルゴリズムの改良などにより、効率的かつ高精度な超解像画像の取得が可能となった。DNA-PAINT法を用いる観察と解析の効率化は、本研究以外においても有益であることから、大きな成果といえる。次年度は、本年度で得た予備実験の結果をもとに、in vitro転写中のRNAポリメラーゼが生み出すトポロジカルストレスの直接可視化と解析を行う。その後、細胞内での解析を行う予定だが、in vitro転写系を用いたトポロジカルストレスの動的変化を詳細に解析し、その段階で論文として発表することも検討する。
七員環構造を鍵とする高歪化合物の創出と特異な構造に基づく応答機能

本研究に先立って見出した1.8Åを超えるC-C単結合(超結合)は,その極限状態ゆえに弱いエネルギーでも伸縮することが明らかとなっている。そこで,七員環構造を鍵とするその分子構造に着目し,『A.電子的特性がC-C単結合長に与える影響の解明』,『B.光-熱定量的異性化に基づく酸化特性のON/OFFスイッチング』,『C.熱/溶媒/機械刺激応答系の創出:ヘテロ原子への展開』の三つの課題に取り組む計画である。本研究は,基礎研究と応用研究の双方に寄与すべく,緻密にデザインされた高歪化合物により実現されるものである。
血管系の細胞による酸化ストレス応答-ストレスタンパク質の機能とCO/NOシグナル伝達系の関与-

血管関連の細胞および組織について酸化ストレス応答を調べ、以下の結果をえた。1.マクロファージは体内において血漿リポタンパク(LDL)の酸化に関与する細胞の候補の一つと考えられている。LDLの酸化には鉄イオンの還元がリンクする可能性が高いが、平常のマクロファージにはそのような還元能力はなく、細菌内毒素で刺激されると獲得することが示された。2.血管平滑筋細胞は酸化LDLを取り込み酸化ストレス応答を示すが、ビタミンCがこの応答を効率的に抑制することがわかった。3.ヒトの動脈硬化病変部において、ヘムオキシゲナーゼ1が発現していることを示唆するデータを得た。特に、その部位のマクロファージに高発現しているらしい。4.シスチントランスポーターのクローニングに成功した。このトランスポーターは4F2hcという既知のタンパク質とxCTと名付けた新規のタンパク質からなるヘテロダイマー型であることが明らかになった。このトランスポーターはグルタチオン量の維持に重要で、酸化ストレス耐性に関与する。xCTの遺伝子構造を解明したところ親電子物質により転写誘導を引き起こす領域がみつかり、転写因子Nrf2による制御が明らかになった。5.ペルオキシレドキシンIについても酸化ストレスによる誘導の一部はシスチントランスポーターの場合と似たような転写制御機構があることが明らかになった。血管を構成する細胞である内皮細胞や平滑筋細胞、およびそれらと密接に関連するマクロファージについて、酸化ストレスを負荷したときの細胞の応答を調べ、以下のような結果を得た。1)血管平滑筋細胞に酸化した低密度リポタンパクを加えると、細胞には直接活性酸素にさらされた時のような酸化ストレス応答が起こる。この応答が抗酸化作用を持つビタミンCにより抑制されることがわかった。酸化低密度リポタンパクによる血管平滑筋細胞の変化は動脈硬化の引き金とも考えられており、臨床医学的立場からも興味深い知見と思われる。2)マクロファージは体内において低密度リポタンパクの酸化に関与する細胞の候補の一つと考えられている。低密度リポタンパクの酸化には鉄などの遷移金属イオンの還元が重要であるが、平常のマクロファージは、そのような作用をする可能性は低く、細菌内毒素などで刺激されたマクロファージでは可能性が高いことを明らかにした。3)マクロファージにおいて、酸化ストレスで誘導される新しいタンパク質を分子クローニングにより同定した。この結果は現在投稿中である。血管関連の細胞および組織について、酸化ストレス応答を調べ、以下のような結果をえた。1)マクロファージにおいて、酸化ストレスで活性が誘導されるシスチントランスポーターについて、アフリカツメガエル卵を用いた発現クローニング法により、このトランスポーターの分子クローニングに成功した。その結果、シスチントランスポーターは2種類のタンパク質よりなり、一つは4F2hcとして、リンパ球活性化に伴い出現する表面抗原として知られていたものであり、もう一つは新規のタンパク質であることが明らかとなった。xCTと名付けられたこのタンパク質は8個の膜貫通領域をもつ疎水度の高いタンパク質であった。2)マウスxCTの遺伝子構造を調べたところ、xCT遺伝子は12個のエキソンからなり、転写開始点の5'上流域には親電子薬応答領域と推定される部位があり、この領域を介して酸化ストレスに応答していることが示唆された。3)動脈硬化病変部の血管組織におけるストレスタンパク質の発現を患者およびモデルウサギについて調べた。代表的なストレスタンパク質であるヘムオキシゲナーゼ1は正常血管にはほとんど検出されなかったが、硬化病変部で誘導されていることが認められた。さらに詳細な解析から、病変部のマクロファージに特に強く出現していることが判明した。1)前年マクロファージにおいて酸化ストレスで誘導されるストレスタンパク質としてクローニングに成功したシスチントランスポーターについて、さらに研究を進めた。このトランスポーターの主成分であるxCTタンパク質の遺伝子は、マクロファージを細菌リポ多糖で刺激することにより強く転写促進がおこり、さらに、この転写促進は酸素濃度に依存することが示された。シスチントランスポーターの活性が高まると、細胞内グルタチオン量が増え、酸化ストレス耐性が高まるので、この応答は酸化ストレスに対する適応現象と考えられる。2)マウスでの情報を基にヒトのxCT遺伝子を明らかにした。この遺伝子は新規のものであり、マウスと同じく12個のエキソンからなることがわかった。

3)in situハイブリダイゼーション法によりxCTの発現部位を脳を中心に調べた。その結果、脳と血管の間で物質交換が活発と思われる部位での発現が認められた。4)血管平滑筋細胞における酸化LDLによるヘムオキシゲナーゼやxCTなどのストレスタンパク質の誘導は転写因子Nrf2を介していることがわかった。
MALTリンパ腫関連遺伝子異常の分子病理学的研究

胃MALTリンパ腫を慢性炎症関連群と非関連群に分類し,免疫グロブリンVH遺伝子を解析したところ,前者ではVH23,VH30が多くの症例で選択されていたが,後者では特徴的なVH遺伝子は認められなかった.この結果はそれぞれの群が異なるB細胞から発生すること,そして前者から後者への移行が稀であることを示唆している(Mod Pathol 2007).胸腺MALTリンパ腫は自己免疫疾患と特に関連が深い腫瘍である.この腫瘍においてVH遺伝子を解析したところ,胃MALTリンパ腫慢性炎症関連群と同様,VH23,VH30が多くの症例で選択されていた(J Pathol 2006).これらの結果から,慢性炎症と関連が深いMALTリンパ腫は特徴的なVH遺伝子を選択しており,慢性炎症関連群と非関連群は分子生物学的にも異なる腫瘍群であることが示された.p16遺伝子不活化はリンパ腫進展に関与すると考えられている.肺MALTリンパ腫において解析したところ,腫瘍診断時,すでに多数の腫瘍でp16遺伝子が不活化しており,API2-MALT1キメラ遺伝子や臨床病理学的因子との関運も認めなかった.以上より肺MALTリンパ腫ではp16遺伝子不活化は鵬進展より腫瘍発生に関与していることが示唆された(Mod Pathol 2005).肺MALTリンパ腫ではAPI2-MALT1キメラ遺伝子陽性率が50%以上と特に高い.細胞診標本を用いたキメラ遺伝子検出(multiplex RT-PCR法)について検討したところ,BAL,痰,胸水などの検体を用いて高精度にキメラ遺伝子が検出可能であり,遺伝子診断として有用であると考えられた(Int J Hematol 2005).このほか,MALTリンパ腫の遺伝子異常とその臨床病理学的意義について総説を発表した(Pathol Int In press).また自然寛解を示した口腔MALTリンパ腫の一例(Pathol Int 2006),胃MALTリンパ腫除菌治療後に大細胞性リンパ腫の発生を認めた症例(Am J Gastroenterol 2006)を報告した.胃MALTリンパ腫を慢性炎症関連群と非関連群に分類し,免疫グロブリンVH遺伝子を解析したところ,前者ではVH23,VH30が多くの症例で選択されていたが,後者では特徴的なVH遺伝子は認められなかった.この結果はそれぞれの群が異なるB細胞から発生すること,そして前者から後者への移行が稀であることを示唆している(Mod Pathol 2007).胸腺MALTリンパ腫は自己免疫疾患と特に関連が深い腫瘍である.この腫瘍においてVH遺伝子を解析したところ,胃MALTリンパ腫慢性炎症関連群と同様,VH23,VH30が多くの症例で選択されていた(J Pathol 2006).これらの結果から,慢性炎症と関連が深いMALTリンパ腫は特徴的なVH遺伝子を選択しており,慢性炎症関連群と非関連群は分子生物学的にも異なる腫瘍群であることが示された.p16遺伝子不活化はリンパ腫進展に関与すると考えられている.肺MALTリンパ腫において解析したところ,腫瘍診断時,すでに多数の腫瘍でp16遺伝子が不活化しており,API2-MALT1キメラ遺伝子や臨床病理学的因子との関運も認めなかった.以上より肺MALTリンパ腫ではp16遺伝子不活化は鵬進展より腫瘍発生に関与していることが示唆された(Mod Pathol 2005).肺MALTリンパ腫ではAPI2-MALT1キメラ遺伝子陽性率が50%以上と特に高い.細胞診標本を用いたキメラ遺伝子検出(multiplex RT-PCR法)について検討したところ,BAL,痰,胸水などの検体を用いて高精度にキメラ遺伝子が検出可能であり,遺伝子診断として有用であると考えられた(Int J Hematol 2005).このほか,MALTリンパ腫の遺伝子異常とその臨床病理学的意義について総説を発表した(Pathol Int In press).また自然寛解を示した口腔MALTリンパ腫の一例(Pathol Int 2006),胃MALTリンパ腫除菌治療後に大細胞性リンパ腫の発生を認めた症例(Am J Gastroenterol 2006)を報告した.2.肺MALTリンパ腫では診断時にすでに多くの症例で細胞周期調節遺伝子p16の異常が認められ,この異常が早期事象のひとつであることを明らかにした(Takino H, Inagaki H, et al. Mod Pathol 2005).5.アポトーシス抑制に関与するBCL2遺伝子のエクストラシグナルをFISH法を用いて検索したところ,びまん性大細胞性Bリンパ腫において,この異常が非濾胞中心タイプと関連することを明らかにした(Kusumoto S, Inagaki H, et al. Am J Surg Pathol 2005).6.B細胞性腫瘍において癌原遺伝子MUM1がケモカインMIGと関連し,腫瘍の進展に関与することを明らかにした(Uranishi M, Inagaki H, et al. Leukemia2005).1.胸腺MALTリンパ腫は臨床病理学的に特異な腫瘍である.この腫瘍を免疫グロブリン遺伝子の観点から解析したところ,特徴的なVH遺伝子断片の選択性,低い体細胞変異が明らかとなった.この結果は,胸腺MALTリンパ腫が遺伝子学的にも特異な腫瘍であることを示唆している(JPatho12006).2.胃MALTリンパ腫を除菌反応性とAPI2-MALT1キメラ遺伝子から3群に分類し,それぞれの群の免疫グロブリン遺伝子の特徴を明らかにした.

その結果,胃MALTリンパ腫は体細胞変異率が高いこと,ongoing変異の頻度は低いこと,除菌反応群は特徴的なVH遺伝子断片を有することを明らかにしたModPathol2007).4.MALTリンパ腫の類縁腫瘍である節性辺縁帯B細胞性リンパ腫について,本邦症例と欧米症例を臨床病理学的に検討したところ,本邦症例では比較的良好な臨床経過をたどることが明らかとなった.また大細胞成分の有無が予後に影響を与える因子であった(Cancer Sci 2007).5.MALTリンパ腫の分子生物学的および臨床病理学的解明はこの10年で大きく進んだ.その進歩について総説にまとめた(Pathollht, inpress).
未成年期に被災した阪神淡路大震災被災者の睡眠健康についての疫学的研究

第三年度は、第二年度に阪神淡路大震災未成年期被災者を対象に行った生活改善を目的としたリーフレットを用いた介入フィールド実験や、フィリピンのビコール地方において行ったインタビューによる質問紙調査の成果をまとめ、各種学会等で発表後、関連雑誌に投稿した。第一年度の調査結果から、食事や光環境など、生活リズムと環境を整える取組が未成年期被災者の心的外傷度の軽減に効果的である可能性が高いことが考えられた。そこで、第二年度に、生活改善を目的としたリーフレット『「早ね、早起き、朝ごはん」3つのお得ー被災者の皆さんへのメッセージー』を作成し、睡眠日誌と共に阪神淡路大震災未成年期被災者である研究協力者(96名)に配布し、生活改善介入フィールド実験を実施した。その結果、今なおPTSD症状が残る未成年期被災者に対して、リーフレットを用いた介入がPTSD症状の緩和に効果的である可能性が示唆された。(1)また、心的外傷後ストレス障害と睡眠健康、食習慣の関係をより幅広く探る目的で、フィリピンのビコール地方において行ったインタビューによる質問紙調査(2006年11月発生の地滑り災害被災者88名を対象)の結果、被災者のPTSD症状は,朝食時にタンパク質を多く摂取している程軽度であり,朝食内容充実によるPTSD症状緩和の可能性を示した。(2)本研究の2つ目、3つ目の目的「1年目の疫学研究の結果を基礎とし、被災看の生活リズムと睡眠習慣を改善させる方策を提案すること」「その方策の効果を介入フィールド実験により検証すること」に関して、生活改善リーフレットを作成し、介入フィールド実験を実施するにいたり、その成果はNatural Science (Vol. 6, P. 338-P. 350, 2014)に掲載された。また4つの国内学会、1つの国際学会で研究成果を発表した。今なおPTSD症状が残る未成年期被災者に対して、リーフレットを用いた介入がPTSD症状の緩和に効果的である可能性が示唆されたことから、特定非営利活動法人阪神高齢者・障害者支援ネットワーク理事長の黒田裕子氏と連携し、東日本大震災被災者の健康増進の為の基礎・介入研究の実現に力を注ぎたい。また、より確かな効果検証のため、フィリピン・ビコール地方の地滑り災害被災者を対象に、フィールド介入調査を実施出来ればと考えている。それにより、心的外傷後ストレス障害と睡眠健康、食習慣の関係把握に貢献できる。初年度は阪神淡路大震災被災者の睡眠習慣、睡眠の質、そして朝型夜型度と心的外傷後ストレス障害(以下PTSD : Posttaumatic stress disorder)の関係を見るための質問紙調査の実施と、今回のプロジェクトの基礎研究にあたる、健常者対象介入実験研究の、結果のまとめ、および成果発表を中心に取り組んだ。作成した質問紙は、生年月、性別、身長と体重(Body Mass Index : BMI算出が目的)の基本項目と、睡眠習慣に関する質問として、平日の就床時刻や起床時刻、睡眠の質に関する質問として、入眠潜時、入眠困難度、熟睡度、目覚めの気分を聞く項目、Torsvall and Akerstedt(1980)版の簡易型朝型夜型質問紙、PTSDの診断基準である再体験、回避、覚醒亢進を測定する尺度である改定出来事インパクト尺度(飛鳥井,1999)で構成され、全部で35項目から成った。特定非営利活動法人阪神高齢者・障害者支援ネットワーク理事長の黒田裕子氏の協力を得て、817名に質問紙を配布し、572名から回答を得た(未成年期に被災した協力者353名に配布、352名から回答)。被災者は非被災者に比較して、早寝で睡眠時間が長い傾向が見られたのに、PTSD値は高かった。高いストレスを相殺する、ホメオスタシスとしての補償反応としてこの長時間睡眠は理解できる。また、被災者群のみを見ると、PTSD値が高いほど、夜型で睡眠時間が短く、睡眠の質も悪かった。この結果は大変意義深い。基礎研究で明らかとなった「朝食でのタンパク質摂取とその後の太陽光曝露、オレンジ色の夜間照明で朝型化を導く」ことを、阪神淡路大震災被災者に適応可能だからだ。朝型化を通してPTSD症状の緩和が望めることがこれで明白となった。最大限の倫理的配慮の上で行われた、当該年度質問紙結果は、来年度の介入研究に直接つながり、被災後17年経過後もなおPTSDに苦しむ方々の福音となることを目指す。また、本研究の基礎研究部分を二つの国際学会で発表したが、学会期間中に今後の研究の推進に対する貴重なアドバイスを様々な方々より頂けたことを付記する。第二年度は、第一年度の調査の結果に基づき、阪神・淡路大震災被災者を対象に、生活改善を目的としたリーフレットを作成し、そのリーフレットを用いた3週間に渡る介入フィールド実験を実施した。第一年度において、兵庫県内の大学生275名(男性93名、女性173名、不明9名)を対象に行った質問紙調査の結果、改定出来事インパクト尺度の得点(以下IES-R得点)が高い者、すなわち、心的外傷度の高い者は低い者よりも有意に睡眠の質(Monroeの睡眠の質、主観的睡眠の質)が悪いことが示された。また、朝型であるほど睡眠の質がよくなるという相関関係が見られ、朝型の生活をすることは質の良い睡眠の獲得に効果的であり、そのことを通じて心的外傷度の軽減に役立ちうることが示された。

そこで、生活改善を目的としたリーフレット『「早ね、早起き、朝ごはん」3つのお得一被災者の皆さんへのメッセージー』を作成(和田担当、原田哲夫・黒田裕子監修)し、睡眠日誌と共に研究協力者に配布、生活改善介入フィールド実験を実施した。実験は事前質問紙調査、3週間に渡る睡眠日誌自記取組、事後質問紙調査で構成された。睡眠日誌へは1日の体調、就寝時刻、起床時刻、寝起きの気分、中途覚醒の有無及び回数と、既出リーフレットの内容に沿った5つの取組(1.早朝の太陽光曝露、2.朝食でのタンパク質摂取、3.朝食後の太陽光曝露、4.夜間テレビ視聴の制限、5.夜間の白色光非曝露)の実施状況の21日間毎日自記を依頼した。特定非営利活動法人阪神高齢者・障害者支援ネットワーク理事長の黒田裕子氏の協力のもと、6月、10月、11月において計151名(うち、未成年期に被災した方は96名)の方に研究に協力していただいた。未成年期被災者の結果については現在解析中である。高齢者を対象とした同様の調査では、IES-R得点が取組前から取組後にかけて有意に低くなり(P=0.002)、取組効果が示された(黒田ら、2013)。本結果は原著論文として雑誌に投稿中と共に、2013年10月出版予定の著書「最新臨床睡眠学」中に掲載予定である。第三年度は、第二年度に阪神淡路大震災未成年期被災者を対象に行った生活改善を目的としたリーフレットを用いた介入フィールド実験や、フィリピンのビコール地方において行ったインタビューによる質問紙調査の成果をまとめ、各種学会等で発表後、関連雑誌に投稿した。第一年度の調査結果から、食事や光環境など、生活リズムと環境を整える取組が未成年期被災者の心的外傷度の軽減に効果的である可能性が高いことが考えられた。そこで、第二年度に、生活改善を目的としたリーフレット『「早ね、早起き、朝ごはん」3つのお得ー被災者の皆さんへのメッセージー』を作成し、睡眠日誌と共に阪神淡路大震災未成年期被災者である研究協力者(96名)に配布し、生活改善介入フィールド実験を実施した。その結果、今なおPTSD症状が残る未成年期被災者に対して、リーフレットを用いた介入がPTSD症状の緩和に効果的である可能性が示唆された。(1)また、心的外傷後ストレス障害と睡眠健康、食習慣の関係をより幅広く探る目的で、フィリピンのビコール地方において行ったインタビューによる質問紙調査(2006年11月発生の地滑り災害被災者88名を対象)の結果、被災者のPTSD症状は,朝食時にタンパク質を多く摂取している程軽度であり,朝食内容充実によるPTSD症状緩和の可能性を示した。(2)本研究の1つ目の目的である「被災者の15年以上の時を経ての、その睡眠健康や精神衛生の特徴的な問題を非被災者群と比較することで把握すること」に関して、質問紙調査を実施し、分析を行うことができた。その結果を5月の国内学会で発表することも決定している。また、本研究プロジェクトの基礎部分を2つの国際学会で発表し、関連論文4報が査読付き英文雑誌に掲載された。本研究の2つ目、3つ目の目的「1年目の疫学研究の結果を基礎とし、被災者の生活リズムと睡眠習慣を改善させる方策を提案すること」「その方策の効果を介入フィールド実験により検証すること」に関して、生活改善リーフレットを作成し、介入フィールド実験を実施するにいたった。
MCP-1受容体拮抗遺伝子療法による新しい心臓保存・移植戦略の開発

本研究の目的は心臓保存、移植戦略の改良をめざしたMCP-1受容体拮抗遺伝子療法を確立し、実際に臨床応用可能な基礎研究を実施することである。具体的には1)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により長時間心保存後の虚血再還流障害を軽減しうるかどうか。2)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により心臓移植術で避けることのできない体外循環による侵襲を軽減しうるかどうか。3)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により移植心の炎症性変化、繊維化を軽減し移植後血管障害を抑制しうるかどうかを明らかにすることが目的である。今回我々は、pcDNASプラスミドにMCP-1拮抗遺伝子である7ND遺伝子を組み込み、7NDプラスミドあるいは遺伝子を組み込んでいないプラスミド(対照プラスミド)を実験動物に筋注しウサギ交叉循環摘出還流心モデルを用いて実験を行った。まずは、ヒトMCP-1、7ND遺伝子のウサギ単球への作用確認のため7ND遺伝子導入、非導入のそれぞれのウサギ皮下にMCP-1を注射して単球浸潤の程度を比較検討した。MCP-1による多数の単球浸潤をヒト7ND遺伝子導入により阻害し得た。摘出還流心モデルでは、供血ウサギにあらかじめ7ND遺伝子あるいは、対照遺伝子をエレクトロポレーション法にて導入した。6時間保存した心臓の心機能をこの供血ウサギの血液で還流された摘出心装置で評価した。6時間保存後の心機能は、7NDプラスミド使用群で有意に良好であり、加えて単球由来のサイトカイン(IL-1β,TNF-α)も有意に低下していた。組織では、好中球の心筋組織への浸潤が減少し好中球遊走能を持つ単球由来のサイトカイン減少によるものと推測された。これらより、現在まで虚血再還流障害において殆ど解明されていない単球、MCP-1の役割を明らかにするとともに心臓保存、移植戦略の改良に繋がる可能性が示唆された。今回我々は、pcDNA3プラスミドにMCP-1拮抗遺伝子である7ND遺伝子を組み込み、7NDプラスミドあるいは遺伝子を組み込んでいないプラスミド(対照プラスミド)を実験動物に筋注しウサギ交叉循環摘出還流心モデルを用いて実験を行った。供血ウサギにあらかじめ7NDプラスミドあるいは、対照プラスミドを筋注し、6時間保存した心臓の心機能をこの供血ウサギの血液で還流された摘出心装置で評価した。供血ウサギの血流中には7NDが存在するはずなので、この7NDが摘出心への単球の浸潤を抑制して保存後の虚血再還流障害を軽減し心機能を良好に保ち得るか否かを検討した。

これらより、現在まで虚血再還流障害において殆ど解明されていない単球、MCP-1の役割を明らかにするとともに心臓保存、移植戦略の改良に繋がる可能性が示唆された。本研究の目的は心臓保存、移植戦略の改良をめざしたMCP-1受容体拮抗遺伝子療法を確立し、実際に臨床応用可能な基礎研究を実施することである。具体的には1)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により長時間心保存後の虚血再還流障害を軽減しうるかどうか。2)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により心臓移植術で避けることのできない体外循環による侵襲を軽減しうるかどうか。3)MCP-1受容体拮抗遺伝子療法により移植心の炎症性変化、繊維化を軽減し移植後血管障害を抑制しうるかどうかを明らかにすることが目的である。今回我々は、pcDNA3プラスミドにMCP-1拮抗遺伝子である7ND遺伝子を組み込み、7NDプラスミドあるいは遺伝子を組み込んでいないプラスミド(対照プラスミド)を実験動物に筋注しウサギ交叉循環摘出還流心モデルを用いて実験を行った。まずは、ヒトMCP-1、7ND遺伝子のウサギ単球への作用確認のため7ND遺伝子導入、非導入のそれぞれのウサギ皮下にMCP-1を注射して単球浸潤の程度を比較検討した。MCP-1による多数の単球浸潤をヒト7ND遺伝子導入により阻害し得た。摘出還流心モデルでは、供血ウサギにあらかじめ7ND遺伝子あるいは、対照遺伝子をエレクトロポレーション法にて導入した。6時間保存した心臓の心機能をこの供血ウサギの血液で還流された摘出心装置で評価した。6時間保存後の心機能は、7NDプラスミド使用群で有意に良好であり、加えて単球由来のサイトカイン(IL-1β,TNF-α)も有意に低下していた。組織では、好中球の心筋組織への浸潤が減少し好中球遊走能を持つ単球由来のサイトカイン減少によるものと推測された。
第二言語における流暢さ指標の妥当性検証に関する研究

複雑さ・正確さ・流暢さの指標(CAF指標)は発話能力を客観的・量的に測る指標として第二言語習得や言語テストの分野で広く応用されている。流暢さに関しては解釈や測定方法が研究者によって非常に多様であるが、指標の特徴を検証したものは少ない。そこで本研究では先行研究で用いられている多様な流暢さの指標を整理し、3つのタイプ(言い直し等の非流暢さ、速さ、ポーズ頻度)について日本語学習者の発話データを用いて構成概念妥当性の検証を行った。その結果、非流暢さの指標は複雑さ・正確さとは異なる傾向が得られた。さらに、非流暢さとポーズ頻度の相関関係が認められないことから同じ構成概念を示すとは言えないことが示唆された。本研究課題について、ここ数年で先行研究が増え、明らかにすべき点とその手法について再検討する必要があったため第二言語習得研究、評価研究、コーパス分析の手法などを中心に研究動向をまとめ、本研究の研究課題(1)「流暢さ」の複数のタイプの測定方法が同一の構成概念を測っていると言えるか、(2)「流暢さ」が「構文的複雑さ」「正確さ」と異なる構成概念を測っていると言えるか、の2つの課題を明らかにするための調査実施に向けて準備を進めた。本研究の研究課題(1)「流暢さ」の複数のタイプの測定方法が同一の構成概念を測っていると言えるか、(2)「流暢さ」が「構文的複雑さ」「正確さ」と異なる構成概念を測っていると言えるか、の2点を明らかにするために、日本語学習者を対象とした調査を計画・実施した。また、調査で得られた学習者の発話データの文字化作業と、その文字化データをコーディングするためのルールの検討を進めた。今後の研究や教育における指標の実用化を目指すためにも、作業者やデータによる誤差の削減と対策は重要である。そのため、コーディング・ルールの検討においては、実際の作業者との議論や、日本語以外の指標研究も含めた先行研究の見直しを行った。日本語学習者を対象に実施した調査で得られた学習者の発話データの文字化作業、流暢さ指標の検証に向けたコーディング・ルールの検討、指標の妥当性検証のための準備を進めた。特に、コーディング・ルールは今後研究や教育現場への応用を提案する際に重要であるため、昨年度試験的に分析したデータに加え、異なる発話タスクで抽出したデータでの分析を行い、できるだけ評価者によるずれがないよう検討を行った。また、近年注目されている学習者の発話や作文を対象としたコーパス研究やコンピューターを利用した自動採点・評価に関する研究等を概観し、これらの研究分野においても学習者の言語運用データを扱う際に何をどのように観察・数値化するかが極めて重要な観点であることが分かった。そのため、改めて本研究課題のニーズや応用可能性について検討し、学会での発表等を通して日本語教育関係者との意見交換を行った。今後は流暢さ指標の構成概念妥当性の検証に向けて分析を進めるとともに、研究や教育現場で応用するための提案を行っていく予定である。申請時から現在の所属に移動になったことで初年度に大幅な遅れがあったことが主な理由であるが、その分平成26年度は遅れている調査を着実に進めるよう努めた。ただ、調査を行うにあたり現在の所属機関であるICUの研究倫理委員会での調査計画の審査を受ける必要があったため、申請準備と審査結果を受けての修正や準備に時間を要した。加えて、調査直前に調査協力校のアメリカ、カリフォルニア大学サンタバーバラ校の付近で起きた銃乱射事件の影響による協力者の辞退などもあり、データ数の点で課題が残っている。日本語教育不足分のデータ収集と、収集したデータの文字化作業、及びコーディング作業と信頼性の検証を進め、研究結果を発表していく準備を進めたい。検証した指標の実用化に向け、第二言語習得研究や外国語教育現場での応用についての検討も行いたいと考えている。申請時所属していた国立国語研究所から所属先が変わったことで予定通りのスケジュールで調査を進めることができなかった。特に平成25年度は夏期集中コースの担当もあり研究のためのまとまった時間を取ることができなかったため、予定していた発話データ収集のための調査の実施とその後のデータの文字化及びコーディング作業を昨年度中に実施できなかった。しかし今年度は夏期講習の代替休暇があるのでその期間を利用して調査・分析を進めていく予定である。本研究課題の申請時から所属が変わり、初年度は現在の所属機関での業務や勤務時間内に予定していた研究計画を進めることができなかった。そのため、平成26年度には、初年度計画していた海外調査の準備・実施を含め、発話データの文字化作業、コーディング・ルールの検討作業を進めた。

ただ、所属機関が変わったことによる研究倫理委員会での審査申請の手続きや、海外調査の直前に起きた銃乱射事件による調査協力者数への影響などもあり、予定していたデータを収集し分析するまでには至らなかった。したがって、追加調査を含めたデータ分析のために延長を申請し、教育・研究現場での実用化に向けて研究課題の検証と公表を進めていきたいと考えている。5月2日に本学の研究倫理委員会から調査計画が承認されたので、5月下旬から国内外での調査を開始する。対象は日本語を第二言語・外国語として学んでいる学習者100名を予定しており、調査後はデータの文字化及びコーディング作業を行い、統計分析を行う。研究結果は外国語教育や日本語教育に関する学会等で発表できるよう準備する。調査、発話データの文字化作業、コーディング作業、関連学会での発表の経費に充てたい。研究初年度に所属研究機関が変わり、研究以外の用務が非常に多忙となってしまったため、予定していた発話データ収集等の調査等を初年度中に行えなかったため未使用額が生じた。今年度の当初配分額と合わせ、初年度中に行えなかった海外での発話データ収集等の調査旅費・謝金およびコーディング作業補助等に使用する予定である。
小、中、高、大の一貫する英語コミュニケーション能力の到達基準の策定とその検証

小学校から大学までの一貫する英語コミュニケーション能力の到達基準として、世界的に影響を及ぼしつつあるCEFRに準拠し、かつ日本の英語教育環境に適用する新しい基準CEFR-Jを提案した。英語を使って「できる」という具体的なことばの機能を中心にしたcan doリストからなり、そのレベル別のcan doリストの順序を科学的な調査方法で妥当性検証した結果を公開している。かつ、このCEFR-Jを活用するための基礎資料(語彙表や包括的なcan doリストのデータベース)なども同時に公開するべく整備をしている。本研究は、日本における小学校大学・一般を含む「英語教育到達指標の新基準」の提案とその内容の実証的調査・検証を行うものである。その具体化と内容の精査を行うため以下の研究計画を実施する。(a)本科研の前身である小池生夫氏を代表とした基盤研究(A)で、小、中、高、大の各レベルでさまざまな資料を調査収集してきた。それらの資料の分析に基づいてCEFR-J(検証版)を提案する。(b)CEFR-Jの妥当性を多面的に検証する。またその検証方法自体を整理し提案する。(c)CEFR-Jを検証して改訂版を作成しつつ,具体的な実施のための方策と実施に必要な基礎資料を作成・公開する(d)CEFR-Jを具体的に学校で運用してもらって実施上のさまざまな課題を浮き彫りにし,それらへの対処法を検討する。平成20年度は以下のような目的を設定して、研究計画を実施した:1.研究チームの編成と具体的な連携方法の調整2.前年までの「小池科研」の資料の活用方法の議論を深める3. CEFR-J(試案)の改良点を議論し、プロトタイプ作成方法を議論初年度は、前年度までに行ってきた「小池科研」において大枠を作成したCEFR-J(試案)をもとに、より具体的で綿密な到達指標の作成を実行に移すための体制作りと資料関連の勉強会を中心に行った。すでに、関連資料として収集したCouncil of Europe, EU, FinlandなどからのCEFRに関する資料、および主要ヨーロッパ各国、アジア各国の到達度指標に関する資料(学習指導要領、最もよく利用されている教科書のデータベース)などを基礎とし、さらに最近の第2言語習得研究分野からのCEFR批判の論文などを吟味しつつ、どのようにCEFR-Jに英語の語彙や構造を当てはめていくか、またそれをどのように検証するか、といった具体的プロセスを検討し、プロトタイプ版を2009年7月までに作成することで合意し、作業を小中高大セクションに分けて行った。研究計画2年目は、小中高大の一貫した英語到達基準の策定に向けて以下のような研究を実施した。1)CEFRを基準にして日本に導入した場合の具体的なdescriptorの仕様の検討と策定2)海外調査(グラーツ、フィンランド、台湾、香港、スペイン、英国)特に、1)に関しては、当初予想していた日本独自の到達指標の策定の方向を改め、この数年で応酬で圧倒的に影響力を増大しているCEFRの大枠を堅持しつつ、いかに日本の学校教育、特に小学校からの導入および中高大と適切な連携ができるかを勘案しながら、日本の学校教育における評価枠の可能性を探りつつ、検証版の作成を行った。これをもとに3-4年目に実証的なデータをとりながら、改訂版をもって一応のCEFR-J(仮称)の提案とする予定である。また2)に関しては、3-4年目の検証方法に関して、さまざまな方法論や実際の検証事例の収集を行った。CEFR-Jについて、教員によるアンケート、descriptorの並べ替え実験、実際の学習者のパフォーマンスとの関係、学習者コーパスによる裏付け、などの具体的検証方法の資料を収集した。平成22年度は以下のような手順で研究を進めた。小中高大の到達指標としてCEFRをベースとした日本の英語教育の文脈に即した参照枠としてCEFR-Jの検証用ヴァージョンを作成した。(2)検証作業の具体化(5-10月)研究グループごとに担当を決め,以下のような検証方法の提案および実施計画を練った:これによりデスクリプタの配列の妥当性検証を行うWeb版の作成を年度内に終了,実施は最終年度c)CEFR-J5技能のデスクリプタに関して自己評価と実際のスキルの相関を検証研究デザインを年度内にほぼ固める,実施は最終年度d)学校パイロットCEFR-Jを実際に小中高大の各レベルで学校に下ろしパイロット的に利用してもらう,大学レベルで年度内に実施開始,小中高は最終年度(3)ベータ版の公開(9月)(2)の部分的な調査結果を利用してアルファ版の内容をいくつかの方法で文言の修正や統一を図り,ベータ版として公開。(4)中間報告書の作成と公開(9月)研究前半の2年半の成果を中間報告書の形でまとめて公開した。これにベータ版も含めている。(5)成果発表(8-12月)中間報告を兼ねて,全国英語教育学会,BAAL(英国応用言語学会),EuroSLA,等の国内外での学会発表を行った。

またその成果が認められて,2011年度のALTEという欧州中心の外国語評価関連の国際学会に基調講演を行う予定である。最終年度にあたる今年度は、欧州言語共通参照枠(CEFR)の日本に適用したCEFR-Jの検証作業を中心に研究を行った。検証作業の柱は、小中高大の英語教員約150名を対象に行ったディスクリプタ並べ替え調査、および中高大5,468名(中学1,685名、高校2,538名、大学1,245名)の英語学習者に対するCEFR-Jベースの「can do調査」とその結果の項目応答理論による分析である。これらの2つの検証作業の結果、CEFR-Jβ版をさらに改善し、能力記述文の順序に関する補正を行った結果、CEFR-J Version1として2012年3月に正式公開をした。これらの検証作業と並行して、can do調査の妥当性を調査するため「できると思っていることと実際にできるのか」の差を見るための実験をCEFR-J主要5技能に関して実施した。その結果、can do調査の妥当性が確認される結果が出た一方で、can doからタスク作成のプロセスで教員側にタスク・イメージの揺れが大きい項目や、生徒の側のイメージが教員のイメージとずれているような事例が観察された。これらを踏まえた、より具体的なcan doディスクリプタの内容を示すexemplarの重要性が指摘された。また規模は小さかったが、大学、中学、小学校における学校活用パイロットも実施した。CEFR-J Version1の公開にあわせて、付属する活用資料の作成も行った。CEFR-Jのレベルごとの学習語彙を示す"CEFR-J Wordlist"およびCEFR-Jを活用するための「Can doリストデータベース」である。これら補足資料を含めた一般公開のための専用のwebサイト(http://www.cefr-j.org)を立ち上げ、かつ、文科省の後援を得てブリティッシュ・カウンシルと共催で3月9,10日に「新しい英語能力到達度指標CEFR-J公開シンポジウム」と題して明治大学を会場に最終報告会を開催、約200名の参加者を得て盛会のうちに終わった。
ジチオナイト錯体分子による機能性フォトクロミック単結晶の創製

本研究の目的は、独自に発見したフォトクロミック分子「ロジウムジチオナイト錯体[(Cp^RRh)_2(μ-CH_2)_2(μ-O_2SSO_2)](1^R)(Cp^R=η^5-C_5Me_4R, R=Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, etc.)」を用いた機能性フォトクロミック単結晶の構築である。平成22年度は、昨年度に続き下記3つの現象の分子レベルでの解明・理解に努め、次の成果を得た。1.結晶内で連動する分子構造変化(R=n-Propyl):熱による戻りの反応のダイナミクスを検討し、熱反応過程においても光反応と同様な結晶内共同現象を観測した。2.フォトクロミック反応に誘起される表面ナノ構造変化と結晶相転移(R=Ethyl):同一結晶で観測される独立した2つの現象を、光照射強度によって制御可能であることを見いだした。3.光誘起結晶形状変化(R=Ethyl, n-Butyl, n-Pentyl):針状結晶の屈曲現象と配位子のアルキル鎖長との相関を調べ、「長鎖アルキル基による結晶への柔軟性の付与」が光誘起形状変化の発現において重要な役割を担っていることを明らかにした。本研究を通して得られた知見は、いずれもフォトクロミック単結晶の新機能の創出に繋がるものである。本年度得られた成果は、PACIFICHEM 2010を含めた学会、討論会で発表した(国際会議3件、国内2件:内2件は招待講演)。また、上記成果およびその遂行に伴い派生した成果を、3報の学術論文としてまとめた。本研究の目的は、独自に発見したフォトクロミック分子「ロジウムジチオナイト錯体[(Cp^RRh)_2(μ-CH_2)_2(μ-O_2SSO_2)](1^R)(CP^R=η^5-C_5Me_4R, R=Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, etc.)」を用いた機能性フォトクロミック単結晶の構築である。平成21年度は、昨年までに見出した3つの現象の分子レベルでの解明・理解に努め、フォトクロミック単結晶の新機能の創出に繋がる次の結果を得た。(1)時間分割X線回折実験によって、結晶内の2つの分子構造変化を追跡し、「フォトクロミック反応によって雪崩式に誘起されるアルキル鎖のコンフォメーション変化(結晶内協同現象)」を発見した(R=n-Propyl)。(2)同一サンプルを用いたAFMおよび単結晶X線回折の実験より、「結晶表面で観察されるナノ構造変化」と「結晶全体としての現象である相転移」が、それぞれ独立に発現することを突止めた(R=Ethyl)。さらに、(3)針状結晶が光源から遠ざかる方向に屈曲する「光誘起結晶形状変化」の作用機構を明らかにした(R=n-Butyl):分子構造の変化が結晶の長軸方向への部分的な伸張を誘起し、結晶の屈曲へと繋がる。本年度得られた成果は、18^<th>ISPPCC (Inter International Symposium on the Photochemistry and Photophysics of Coordination Compounds)を含めた学会、討論会で発表した(国際会議4件、国内3件:内1件は学生講演賞を受賞)。また、得られた成果の一部を、2報の学術論文および1件の図書(1章を執筆)としてまとめるとともに、1件の特許出願を行った。
藍色細菌時計遺伝子ホモローグの真核主物での探索

藍色細菌に最も近い真核細胞である原始紅藻や、原始緑藻で、単細胞性藍色細菌Synechococcussp.strain PCC 7942の生物時計遺伝子クラスターkaiABC(Ishiura et al.1998.投稿中)の真核生物遺伝子ホモログを探索した。1)^<32>Pで標識したkaiCをプローブに用いてゲノムDNAのサ-ザンブロッティング解析を行い、原始紅藻Cyanidioscyzon merolaeで有意と思われるハイブリダイザーションバンドが見つかった。2)CyanidioscyzonmerolaeのゲノムDNAライブラリーをプラークハイブリダイザーションでスクリーニングし、有意と思われるクローンを分離した。このクローンのゲノムDNAインサートをサブクローニングして塩基配列を決定したところ、3つの領域で翻訳したアミノ酸配列がかなり似ていた。現在、このクローンに対応するcDNAをクローニングして解析しようとしている。本物のホモローグかどうか、今後の解析が待たれる。
毛様動脈血管平滑筋に対するプロスタグランディン製剤の効果についての薬理学的研究

プロスタグランディン製剤は眼圧下降剤として最も使用頻度の高い緑内障治療薬である。その血流に対する影響を薬理学的に検討した。この薬剤は点眼でも眼血流に影響することをレーザースペックル法で確認した。また、in vitroで血管弛緩作用を持っていることが明らかとなった。この弛緩作用はFP受容体ノックアウトマウスでも観察された。従ってこの薬剤がFP受容体を介さない機序で血管弛緩作用を持っていることが明らかとなった。抗緑内障治療薬の血管拡張作用を薬理学的に検討するために、ウサギ、ラットおよびマウス摘出毛様動脈に対するプロスタグランディン製剤(PG製剤)の効果を検討した。顕微鏡下で摘出眼球より毛様動脈を分離し、myographシステムに装着し、ウサギ、ラットにおいては当尺性収縮記録法によって、種々の薬物の効果を検討した。また、マウスでは同じ薬物の血管細胞内のCa濃度に及ぼす影響をFluorophotometryをもちいて検討した。高血圧ラットを用いた実験では、正常ラットに比べて高血圧ラットの弛緩が弱い傾向があり、その機序として内皮由来のEDHF(Endothelium derived hyperpolarizing factor)の減少によると考えられた。タフルプロスト、トラバプロスト、ラタノプロストは高カリウム溶液で収縮させたウサギ毛様動脈を濃度依存性に弛緩させた。この弛緩はPGE2やPGI2による弛緩効果よりも強いものであった。この弛緩機序の一部は容量性Caチャネルの抑制によると考えられた。今回検討を行った3種類のプロスタグランディン製剤の血管弛緩機序は共通しており、β遮断剤と異なり血管弛緩作用は共通性があると考えられた。また、プロスタグランデン受容体ノックアウトマウスを用いて、これらの薬剤の血管弛緩機序をさらに詳しく検討する実験を進めており、血管弛緩がこれらの受容体を介さない作用機序を持っていることを見出した。多くの抗緑内障がウサギ毛様動脈に対して弛緩効果を持っており、これがin vivoでこれらの薬剤が眼循環に効果を持つ説明になると思われた。緑内障のriskfactorの最も重要なものは眼圧であるが、正常眼圧緑内障のような症例には眼循環も重要な要素と思われる。抗緑内用薬の眼循環に対する効果の研究はこの意味から臨床上も重要である。臨床で使用されているPG製剤であるタフルプロスト、トラバプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロストは高カリウム溶液で収縮させたウサギ毛様動脈を濃度依存性に弛緩させた。しかしPGF2α自体による弛緩効果はほとんど認められなかった。プロスタグランデン受容体ノックアウトマウスを用いて、これらの薬剤の血管弛緩機序をさらに詳しく検討し、FP、EP受容体KOマウスにおいてもこれらのPG製剤が弛緩作用を持つことを見いだした。従ってPG製剤による血管弛緩がこれらの受容体を介さない作用機序を持っていると考えられた。抗緑内障治療薬の血管拡張作用を薬理学的に検討するために、ウサギおよびマウス摘出毛様動脈に対するプロスタグランディン(PG)製剤の効果を検討した。顕微鏡下で摘出眼球より毛様動脈を分離し、Myographシステムに装着し、ウサギにおいては当尺性収縮記録法によって種々の薬物の効果を検討した。また、マウスでは同じ薬物の血管細胞内のCa濃度に及ぼす影響をFluorophotometryを用いて検討した。ウノプロストン、タフルプロスト、トラバプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、PGF2αは高カリウム溶液で収縮させたウサギ毛様動脈を濃度依存性に弛緩させた。ビマトプロスト、PGF2αは、それぞれ他のPG製剤と比較して有意に弛緩率が低く、眼圧下降効果とは異なる結果であった。PG受容体であるFP受容体ノックアウトマウスを用いてこれらの薬剤の血管弛緩機序をさらに詳しく検討したところ、FP受容体ノックアウトマウスでもこれらの薬剤による血管弛緩が認められた。

FP受容体ノックアウトマウスではPG製剤による眼圧下降効果が消失することが知られており、眼圧下降効果はPG受容体を介するものであると考えられている。しかし今回の実験結果から、同じPG製剤の血管弛緩作用についてはFP受容体を介さない作用機序を持っていると考えられた。すなわち、同じ薬剤でも眼圧下降機序と血管拡張機序は全く異なるものと考えられた。緑内障のriskfactorの最も重要なものは眼圧であるが、正常眼圧緑内障のような症例には眼循環も重要な要素と思われる。抗緑内用薬の眼循環に対する効果の研究はこの意味から臨床上も重要であると考えられた。
金属依存性デアセチラーゼの触媒反応メカニズムの解明と阻害剤の開発

当初平成29年度に終了する予定であったが、D-アミノアシラーゼの発現系についての論文投稿において大幅な追加実験を要求されたため、基質特異性に関する研究が平成30年度にずれ込んだ。対象としたD-アミノアシラーゼは、Thermomicrobium roseum由来Tr_DAACである。Tr_DAACの金属イオン特異性を調べるため、組換え大腸菌内でTr_DAACが取り込んだ金属を変性剤存在下EDTAで除去し、そののちに種々の金属(Cu, Zn, Mn, Co)を含む緩衝液で透析することによりTr_DAACに金属を取り込んだ。その中で最も高活性を示した金属はZnであり、Mn, Coを補因子としてもそれぞれ70%, 30%の活性を示すことが明らかになった。類縁のデアセチラーゼとのホモロジーから、天然で用いている金属補因子はZnであると考えられる。なお、組換え大腸菌の培地に金属を添加してもTr_DAACに金属は取り込まれなかった。次に、基質となるN-アセチル-D-アミノ酸の特異性を調べた。活性の検出は、反応によって遊離する酢酸を酵素法により定量することにより行った。その結果、Tr_DAACの最適な基質はAc-D-Lysであり、Ac-D-Arg, Ac-D-Asnに対しても5570%の活性を示すことが明らかとなった。Gluなどの酸性アミノ酸や疎水性アミノ酸の誘導体に対しては活性を示さなかった。以上により、Tr_DAACの酵素学的性質を明らかにできたとともに、良質の回折をする結晶作製法の指針となる。本研究計画ではN-アセチル基を加水分解する2種類の酵素DacおよびDAAをターゲットとしたものであるが、平成27年度はDacについて研究を進捗させた。Dacは単糖(GlcNAc)と二糖(GlcNAc2)の両方を基質とし、非還元末端のN-アセチル基を加水分解する酵素である。まず、Dacの活性を215nmの吸光度で測定する系を確立し、基質飽和実験と阻害実験を行った。その結果、基質として単糖を用いた場合と二糖を用いた場合で、基質飽和曲線が変わらないということを明らかにした。このことにより、二糖が基質として反応するさいに、還元末端側の糖は酵素と特異的な相互作用をしていないことを示唆された。さらに、単糖アナログMPGによる阻害活性を測定した。その結果、MPGはDacと等モルで不可逆的に酵素阻害を起こすことが明らかになった。Dacと単糖基質の相互作用はDac-MPG複合体の立体構造を結晶解析することにより明らかにした。Dacと二糖基質の相互作用は、Dac-GlcNAc2複合体の分子動力学計算により明らかにした。これらの結果、非還元末端の糖の水酸基が酵素のアミノ酸側鎖によって認識されている様子が高分解能で明らかになった。また、二糖基質の還元末端糖はDacの分子間クレフトにあり、基質飽和曲線からも示唆されるように、酵素との特異的な相互作用はないと結論づけられた。以上とは別に、Dacの結晶内でのパッキングを解析した。その結果、P. furiosus Dacは、カドミウムの有無とセレノメチオニンの有無によりパッキングが変化することが明らかになった。特にカドミウムはN末端残基のセレンと錯体をつくり、その錯体が結晶内コンタクトに寄与していることを明らかにした。申請書の「研究計画・方法」に記述した通りのことがおおむねできている。具体的には、Dac-MPG複合体の高分解能結晶構造解析と酵素学的データ収集ができたため、初年度はおおむね順調に進展したと判断した。N-アセチル基を加水分解する2種類の酵素DacおよびDAAをターゲットとして本研究計画を立てているが、平成28年度はDacについての阻害剤デザインの完成とDAAについての研究の着手が重なるフェーズとなった。Dacに関しては、超好熱性古細菌Pyrococcus horikoshii由来酵素を用い、デザインした阻害剤MPGまたは二糖基質との複合体の構造を、X線結晶解析または分子動力学シミュレーションによって明らかにした。それにより、基質糖の水酸基と3個のアミノ酸側鎖が特異的に水素結合を形成していることが明らかになった。Dacは二糖基質の非還元末端側のN-アセチル基にだけ作用する特異性を有するが、その特異性がこの基質ー酵素相互作用によって明確に説明された。DacはCAZyデータベースのCE-14ファミリーに属するデアセチラーゼである。CE-14デアセチラーゼは酵素により作用する基質は異なるが、。これらのうち立体構造がすでに明らかになっているものを取り出して比較することにより、それらのアミノ酸配列や立体構造は互いに相同ではないが、上記「3個のアミノ酸側鎖」は立体的に保存されていることが明らかとなった。このことから、Dacにおいて明らかにした基質認識機構は、CE-14デアセチラーゼに共通のものであるという可能性が高い。DAAに関しては、超好熱性古細菌Pyrococcus abyssi由来酵素ndaDを用い、構造生物学的研究に着手した。結晶化スクリーニングからndaDの最適結晶化条件を探索し、空間群P21、分解能2.1Åの反射を与える結晶を得た。分子置換法により初期位相を決定し、構造精密化を進めたが、触媒部位の金属を含む部位の電子密度が不明瞭であった。次年度はこの点を改良することが課題である。Dacに関しては【研究実績の概要】の内容で論文発表をした。