hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテインキナーゼC群およびその優性抑制変異体群の作用機構の解析

nPKCδのキナーゼノックアウト型の点変異体が、nPKCδを介するTRE活性化能を特異的に抑制することを見いだした。この抑制効果が活性型nPKCδに対しても見られ事は、この抑制作用がPKCの標的蛋白質の競合に起因することを示唆している。すなわちnPKCδはそれに結合する蛋白質を介してTREを活性化している可能性が考えられた。一方、PKCの基質蛋白質であるMARCKSと種々のPKC分子種との試験管内でのリン酸化反応の速度論的な解析から、MARCKS蛋白質はいくつかのPKC分子種に極めて強い相互作用を示し、そのリン酸化の効率が極めて低いことを見いだした。実際、MARCKSはPKCのいくつかの分子種に試験管内で結合することも見いだした。以上の事実はPKCとその生理的な基質蛋白質との結合を利用して未知の基質蛋白質(標的)を単離、同定することが化能であることを示唆している。そこで、精製した組換え型nPKCδを放射標識し、これをプローブとしてcDNA発現ライブラリーをスクリーニングした。約20個のPKC結合蛋白質候補のcDNAを得、この中にはMARCKSが含まれていたが、それ以外は全て新規の蛋白質であった。得られた結合蛋白質を大腸菌で発現させ、種々のPKC分子種に対する結合を解析すると、多くの蛋白は多かれ少なかれ複数のPKC分子種に結合するが、その度合が分子種により大きく異なることが明かとなった。PKCの具体的な作用を知る為にはその直接の標的蛋白質を同定することが必須である。PKCは試験管内で種々の蛋白質をリン酸化することが示されているが、その生理的な意義は多くの場合不明である。PKC結合蛋白質に注目した解析は、この様な状況を打開するための一つの有力な方法であると考えている。今回得られた結合蛋白質の生理機能を一つ一つ調べる事により、今後この分野に大きな進展の見られる事が期待される。特に、TRE転写活性化能、DNA合成促進能、抑制能、細胞死抑制能、更に細胞骨格制御等について、上述の新規蛋白質の作用を検討する事を予定している。昨年見いだしたPKCの優性抑制変異体に加え、本年はまずPKCdeltaの活性型変異体を作成した。これらを用いて、PKC経路とrasを介する経路との相互関係を分子生物学的に調べることが始めて可能となった。PKCの変異体と活性型ras及び優性抑制型のras等を用いて、TPA→PKC→TRE(TPA応答性因子)へのシグナル経路におけるrasの作用を種々の角度から検討した。その結果PKCを介するシグナル経路においてrasは必須であるが、それだけでは充分ではないことが明かとなった。すなわち、TPA→PKC→ras→TREという経路が存在すること。さらに、これとは独立にTPA→PKC→?→TREという経路が存在することが明かとなった。ここに至ってPKCからrasに至る経路に介在する分子を同定することが大きな問題となってきた。クローン化された種々の組換え蛋白を用いた解析から、おそらくras自身はPKCと結合もしないし、PKCによって影響を受けないことが明かとなり、現在rasの活性を制御する種々の蛋白についてPKCとの関わりを解析中である。

一方、PKCの未知の下流因子、すなわち基質蛋白質を見いだす目的で、PKCの優性抑制変異体に直接結合する細胞蛋白質の直接クローニンングを開始した。
消化器癌の発育進展に及ぼす抗酸化酵素(SOD)の役割と抗癌剤効果予測に関する研究

【消化器癌組織におけるSOD発現の臨床病理学的特徴】1)大腸癌24例の組織中のSOD活性をNBT還元法で測定した。癌組織のSOD活性は正常粘膜より明らかに高い値を示し、さらにリンパ節転移陽性例やStage III-IVの進行大腸癌では有意に上昇していた。したがって、大腸癌の発育進展に癌組織の産生するSODが関与している可能性が示唆され2)胃癌61例の免疫組織学的検討を行った結果、MnSODの染色性が低下している腫瘍は、浸潤型、未分化型が有意に多かった。大腸癌54例のiNOSに対する免疫染色を行い臨床病理学的に検討したところ、iNOS陽性例ではリンパ節転移が有意に多く病期の進行した例が多い傾向がみられた。また、右側結腸症例では左側症例より有意に陽性率が高かった。【消化器癌の進展制御に及ぼす抗酸化物質の臨床的意義】胃癌大腸癌症例の末梢血中の各種抗酸化物質の測定を行った。癌患者の血中SODは正常より高い傾向が見られたが、血中カタラーゼは低値であった。各種ビタミンなどの抗酸化物質も含めて、さらに検討を続ける予定である。【目的】消化器癌患者の血中SOD活性測定の臨床的意義を検討した。【対象と方法】消化器癌患者61例(胃癌34例、大腸癌27例)から手術や化学療法などの影響を除くため未治療初診時の末梢血を採取した。血中SOD活性をNBT還元法にて測定し、臨床病理学的因子及び予後との関連を検討した。【結果】胃癌、大腸癌症例の平均SOD活性は各々15.9±2.6%、17.0±2.9%であり、いずれも健常人より高値を示した(正常値2.711.2%)。胃癌患者のSOD活性を宿主側因子の面から分析すると、70歳以上では14.5±3.0%と70歳未満の16.6±7.3%より有意に低値であった(p<0.01)。腫瘍側因子に関しては、StageIV、3・4型の浸潤型、肝転移陽性例、n3,4転移陽性例でSOD活性が高い傾向にあったが、明らかな有意差はなかった。一方、大腸癌ではSOD活性と臨床病理学的因子との関連はみられなかった。次に、胃癌患者のSOD活性を年令と進行度の両面から分析すると、広範転移したStageIV症例の場合、70歳以上の高齢者のSOD活性は17.8±2.6%と70歳未満の13.7±2.1%に比して有意に低いという特徴が認められた(p<0.05)。さらにStageIV胃癌(根治度C)の予後を分析すると、SOD高値群(≧18%)では7例中5例(71%)が6ヶ月以上と比較的長期生存したが、低値群(<18%)では8例中6例(75%)が3ヶ月以内に死亡した。SOD低値群の平均生存期間は3.4ヶ月であり、高値群の9.7ヶ月より有意に不良であった(p<0.05)。【考察・まとめ】広範に転移したStageIV胃癌において70歳以上の高齢者にみられた末梢血SOD活性の低下は宿主の癌に対する脆弱性を反映し、このような高齢者では癌がさらに発育進展し、生存期間の短縮を惹起するものと推測された。
脳内ミクログリアによるシナプス制御機構と慢性疼痛

ミクログリア特異的IRF8欠損マウスでは、社会的認識能が選択的に低下していることが認められた。また、正常では脳内の定位置で細胞突起を動かしているミクログリアが、IRF8欠損マウスでは細胞体ごと脳内を移動していることを見出した。また、時期特異的・ミクログリア特異的IRF8欠損マウスでも、同様の突起形成異常と形態変化が再現されることを見出し、IRF8がミクログリアの形態の維持に関与する転写因子であることを明らかにした。ミクログリアの形態・機能異常が脳の回路形成に影響を及ぼして高次機能の発現に混乱をもたらし、ミクログリアの正常な活動が脳の回路形成や高次機能の維持にも寄与すると考えられた。慢性疼痛には「情動」も大きく影響し,痛みを慢性化する重要な要因として情動系脳領域の発達障害が挙げられている。本研究では,発達障害モデル動物の中枢内ミクログリアの異常を捉え,その異常がもたらすシナプスの形成・維持・剪定における変化,さらに疼痛を慢性化へ導くメカニズムを明らかにすることを目的とする。ミクログリアの突起運動および細胞貪食など,発達期シナプスリモデリングに重要と予想される機能について,発達期での特徴を捉えるために,ミクログリア特異的に緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するマウスと神経細胞特異的に黄色蛍光タンパク質(eYFP)を発現するマウスを交配し、ミクログリアと神経細胞を同時に可視化したマウスを作製した。このマウスの主に体性感覚を司る大脳皮質領域において、蛍光タンパク質を基に細胞形態を観察したところ神経細胞の樹状突起に形成されるスパインと呼ばれる神経同士の情報伝達部位にミクログリアの細胞突起が接触している箇所が複数認められた。さらに二光子励起顕微鏡を用いて,この領域を少なくとも7日間生体イメージングする手法をほぼ確立した。また、ミクログリアの細胞運動を制御するために、細胞骨格制御タンパク質の一種であるrac1の不活性化改変体をドキシサイクリン誘導性にミクログリア内で発現する遺伝子配列を設計し、この配列を受精卵に注入することで遺伝子導入が確認されたマウスを3系統取得した。一方で、ウイルスベクターを用いた手法においても同様の遺伝子をミクログリア内に発現可能であることを確認した。発達障害モデルとして,幼弱期隔離マウスを作成し,末梢神経切断による神経障害性疼痛の発症を観察したところ、隔離マウスで疼痛レベルが増悪することを確認した。シナプスリモデリングに重要とされるミクログリアの形態変化、突起運動などを観察可能な遺伝子改変マウス(CX3CR1-GFP)と、神経細胞の樹状突起上のスパイン構造を観察可能な遺伝子改変マウス(Thy1-YFPH)の両表現型を持つ遺伝子改変マウスを作製し、神経障害性疼痛モデルマウスにおいて、体性感覚野の同一個体の同一のミクログリアにつき神経傷害前の23日間と神経傷害後の7日間、継続的に観察し、神経傷害後にミクログリアの移動能が亢進傾向にあることを明らかにした。また、ミクログリアの活性化応答・運動機能の発現に関与するIRF8を時期特異的・ミクログリア特異的にノックダウンする遺伝子改変マウス(floxed-IRF8, CX3CR1-creER)、ならびにミクログリアの貪食能に関与するP2Y6受容体欠損マウスのミクログリアを可視化した遺伝子改変マウス(P2Y6KO, CX3CR1-GFP)をそれぞれ作成し、IRF8およびP2Y6の機能解析を開始した。一方で、脊髄実質のイメージングを可能にするチャンバーを設計・構築し、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてアストロサイトの細胞内カルシウム応答をライブイメージングする系を構築した。これを用いて、脊髄後角1,2層のアストロサイトは末梢一次求心性神経からの各種侵害刺激に応答すること、さらに、この伝達系にTRPV1陽性神経、ならびにIP3受容体IP3R2が関与することを世界で初めて明らかにした。加えて、発達障害モデルとして、胎児期バルプロ酸暴露モデル、胎児期母体炎症モデルを作成し、幼弱期隔離マウスでは疼痛レベルの増悪を、バルプロ酸暴露モデルでは神経障害性疼痛の維持期に疼痛の減弱が見られることを確認した。シナプスリモデリングに重要とされるミクログリアの形態変化、突起運動などを観察可能な遺伝子改変マウス(CX3CR1-GFP)と、神経細胞の樹状突起上のスパイン構造を観察可能な遺伝子改変マウス(Thy1-YFPH)の両表現型を持つ遺伝子改変マウスとミクログリアの成熟、活性化応答、運動機能の発現に関与するIRF8遺伝子のノックアウトマウスを交配し、神経障害性疼痛モデルマウスにおいて、体性感覚野の同一個体の同一のミクログリアにつき神経傷害前の23日間と神経傷害後の7日間、継続的に観察したところ、神経傷害前後に関わらず、ミクログリアの移動能が大きく亢進していることを明らかにした。疼痛病態そのものはノックアウト動物において抑制されていた。IRF8ノックアウトマウスの社会性に関し、3チャンバーテストを用いて評価したところ、一部のパラメーターに有意な変化を見出しており、ミクログリアの成熟異常が脳の高次機能に影響を及ぼしていることが示唆された。そこで時期特異的・ミクログリア特異的にIRF8をノックダウンするコンディショナルノックアウトマウス(floxed-IRF8, CX3CR1-creER)を作成し、コンベンショナルIRF8ノックアウトマウスで見られるミクログリアの突起形成異常と同様の形態変化が、出生後5週目以降の成熟したミクログリアのIRF8をノックダウンすることによっても再現することを見出した。

一方で、2光子励起顕微鏡を用いて脊髄実質の神経細胞の細胞内カルシウム動態をイメージングしたところ、脊髄後角表層の神経細胞が侵害刺激に対して応答し、前部帯状回の電気刺激によって侵害刺激に対する応答性が増強されることを見出した。ミクログリア特異的に遺伝子改変を行う新たなツールとしてCX3CR1-creERマウスとミクログリアの機能に関連する遺伝子(IRF8、Mafb)のFloxedマウスを用いた実験を開始しており。Mafbに関連した実験では予想通り、神経障害性疼痛の抑制が観察された。タモキシフェン投与によるコンディショナルIRF8ノックアウトマウスにおいても、過去の結果と一致して、神経障害性疼痛が抑制されている。これまでIRF8はミクログリアの胎生期における分化・成熟過程に関わる転写因子と認識されており、コンベンショナルなIRF8ノックアウトマウスでみられる細胞突起形成異常は胎生期のミクログリアの分化異常が成熟動物まで引き継がれたものと考えていたが、また、成熟後のミクログリアにおけるIRF8の発現は低レベルであり、何らかの活性化時にその発現が再度誘導されると考えられたが、5,6週齢以降にIRF8をノックアウトすることによっても形態変化が引き起こされることが明らかになり、ミクログリアの正常時に機能維持にもIRF8が関与するという新規の概念への手がかりを得たと考えられる。作成したIRF8コンディショナルノックアウトマウスは、タモキシフェンの投与により時期特異的なミクログリアの細胞形態異常を誘導することが可能であることから、発達・成長の特定の段階を選択してミクログリアの機能異常を誘導する手段を手に入れたと考えられる。今後この実験系を用いて生体の発達段階・成熟段階におけるミクログリアの意義を検討し、脳の高次機能への影響を観察する。IRF8ノックアウトマウス、タモキシフェン投与で誘導されるIRF8コンディショナルノックアウトマウスを用い、ミクログリアの正常な発生発達過程を阻害することで、動物の社会性行動試験に影響が現れることを明らかにした。その中で、シナプスリモデリングに重要とされるミクログリアの形態変化、突起運動などを観察可能な遺伝子改変マウス(CX3CR1-GFP)と、神経細胞の樹状突起上のスパイン構造を観察可能な遺伝子改変マウス(Thy1-YFPH)の両表現型を持つ遺伝子改変マウス、さらにミクログリアの成熟、活性化応答、運動機能の発現に関与するIRF8遺伝子のノックアウトマウスを交配し、体性感覚野の同一個体の同一のミクログリアにつき4日間の細胞体局在について2光子励起顕微鏡を用いて継続的に観察したところ、野生型マウスでは脳内の定位置にとどまって、細胞突起を動かしているミクログリアが、IRF8を欠損することで細胞体ごと脳内を移動していることを見出した。IRF8欠損マウスのミクログリアは突起構造と分枝構造の減少が顕著であり、時期特異的・ミクログリア特異的なIRF8コンディショナルノックアウトマウス(floxed-IRF8, CX3CR1-creER)を用いた解析からは、同様の突起形成異常と形態変化が、出生後5週目以降の成熟したミクログリアでのIRF8ノックダウン誘導によっても再現することを見出した。
Haーrasによって誘導されるエンハンサー結合因子の遺伝子クローニングと機能解析

我々は、先にポリオーマウイルスエンハンサー中のAエレメントに結合する細胞性因子PEBP2を同定し、その分子的性状がHaーrasによるトランスフォーメーションに際して劇的に変化することを見いだした。そこで本研究ではPEBP2の機能と役割をさらに追究するために本因子の分子的特性解析とcDNAクローニングを次の如く進めた。まずトランスフォーム細胞をヌードマウスに移植して作らせた癌組織を出発材料とし、DNAアフィニティークロマトグラフィーを主体とする方法によりPEBP2の精製を行った。数百匹分の材料を処理することにより、総計数十マイクログラムの純化標品を得ることが出来た。これを用いてアミノ酸配列の決定を行い2ー3の部分配列を得た。この情報を基に現在cDNAクローニングを遂行中である。他方、分子的解析の結果、PEBP3は(i)2種類のサブユニットalphaとbeta(分子量30ー35Kおよび20ー25K)からなるヘテロダイマーである、(ii)alphaとbetaは共にDNA結合活性を持ち、しかもその認識配列は全く同等である。(iii)PEBP2は全体として2価のDNA結合能を持ち、DNAにループ構造を形成させる働きがあるなど種々の特徴的性質を持つことが判った。これらの知見に加えて,PEBP3はポリオーマウイルスエンハンサー上の中心的機能領域であるAおよびBエレメントの双方にほぼ同じ強さで特異的に結合することが見いだされ、同因子がポリオーマウイルスの転写・複製の制御にとって従来予想された以上に重要な役割を果している可能性が示唆された。さらに細胞遺伝子上での役割に関する有力な手がかりとして、発癌遺伝子cーmycの上流域に存在するDNA複製開始信号配列にPEBP3が結合することが見いだされた。
浮体式洋上を目指した超大型風車の提案とその動解析

風車回転翼のピッチ制御による浮体式洋上風車のネガティブダンピングを抑制するための制御を提案し,実験と数値解析によって評価を行った.従来の回転数一定化を目指すピッチ制御によってネガティブダンピングが発生することを確認しつつ,この振動増幅現象を浮体の姿勢安定化制御を組み合わせるRTS制御によって,出力を保ちながら抑制することが可能であることを示した.回転数一定化制御の評価により,ネガティブダンピングが起きる状態でのスラストの分布を示し,RTS制御のその分布とは明確な差があること,定常風・規則波における解析により,RTS制御がネガティブダンピングを発生させにくい制御となっていることを明らかにした.風車回転翼のピッチ制御による浮体式洋上風車のネガティブダンピングを抑制するための制御を提案し,実験と数値解析によって評価を行った.従来の回転数一定化を目指すピッチ制御によってネガティブダンピングが発生することを確認しつつ,この振動増幅現象を浮体の姿勢安定化制御を組み合わせるRTS制御によって,出力を保ちながら抑制することが可能であることを示した.回転数一定化制御の評価により,ネガティブダンピングが起きる状態でのスラストの分布を示し,RTS制御のその分布とは明確な差があること,定常風・規則波における解析により,RTS制御がネガティブダンピングを発生させにくい制御となっていることを明らかにした.ブレードピッチ制御可能な大型風車を模した模型を用いて、海上技術安全研究所・変動風水洞を利用して風洞試験を実施した。風洞試験においては、風速を変化させて風車の発電量やスラスト等の基本特性を把握すると共に、強制動揺装置を組み合わせて波浪中浮体動揺を模した動揺下での風車特性も計測した。続いて、風洞試験に供した風車模型と水槽試験用の浮体模型を組み合わせて、海上技術安全研究所・海洋構造物試験水槽を利用して、水槽試験を実施した。水槽試験においては、波浪によって浮体を動揺させ、ブレードピッチ制御を行った状態での浮体および風車の全体挙動を計測し、ネガティブダンピングの発生状況を調べると共に、ブレードピッチ制御の制御パラメータを変化させて、制御パラメータが全体挙動に及ぼす影響を調査した。一方、舞鶴高専では、最初に造波水槽の改良を行った。波高計の設置と造波装置の改良により再現性の高い波を発生可能となった。この水槽により、係留方法による動揺特性の変化について実験を行った。ピッチ制御機構を有する小型風車模型の設計と製作も同時に進行させており、24年度には実験を開始する。風洞の計測区画で動揺を模擬する実験を行い発電量の変化に関するデータを取得した。また、数値計算により動揺の特性を明らかにする目的で実際の寸法を持った浮体式洋上風車を3次元CADでモデリングし、海流や風により風車が受ける抗力や部材が受ける応力について計算を行った。これらの研究をもとに、ネガティブダンピングを再現するシミュレーションツールを開発した。米国再生可能エネルギー研究所の風車解析ツールFASTと、動解析ツールMATLABを組み合わせたシステムを構築した。次年度以降、これらの成果を利用し、現象の発生条件、その防止策について研究を進める。風車回転翼のピッチ制御によって発生する浮体式洋上風車のネガティブダンピングを抑制するための新しい制御を提案し,実験と数値解析によってこの制御の評価を行った.模型風車の実験結果より,従来のピッチ制御である回転数一定化制御を適用した際に減衰係数が低下し,ネガティブダンピングが発生することをはじめに示した.つづいてこのピッチ角を変更することによる浮体の姿勢安定化制御において,制御入力をタワー角速度とし姿勢が安定化できることを明らかにした.また,数値解析モデルについて実験結果と比較し検証を行った.これにより模型試験結果と数値解析の結果は高い一致を示し,解析の妥当性を示した.従来のピッチ制御によってネガティブダンピングが発生することを確認しつつ,この振動増幅現象を浮体の姿勢安定化制御を組み合わせるRTS制御によって,出力を保ちながら抑制することが可能であることが示された.結果として,それぞれ最大でタワーの疲労荷重を50%,翼根荷重を15%程度低減することが可能となる.ただし,これらの疲労荷重は二つの基礎となる制御の依存関係にあり,姿勢安定化制御のパラメータをタワーおよび翼の設計に合わせて最適化することで適切な設計が可能となる.回転数一定化制御およびRTS制御について風速に対するスラストを比較し,ネガティブダンピングの評価を行った.回転数一定化制御の評価により,ネガティブダンピングが起きる状態でのスラストの分布を示し,RTS制御の分布に明確な差があることを示した.また,定常風・規則波における解析により,RTS制御がネガティブダンピングを発生させにくい制御となっていることが示された.一方,RTS制御においてタワー荷重は大きく低減される一方,翼の荷重については増大するケースも考えられる.翼を独立に変化させる独立ピッチ制御によって翼荷重の低減が期待され,さらなる研究の深化が求められる。日本における将来の再生可能エネルギーの中心的存在となりえる浮体式洋上風車を安全に運転し、その普及を支えるための制御法の基礎研究を実施している。つまり、浮体の搖動と、定格風速以上で行われる風車回転翼のピッチ制御が連成し、ネガティブダンピング現象を引き起こす可能性があるため、風車出力を落とさずに安定に運転する方法を探求する。海上技術安全研究所・海洋構造物試験水槽を利用して実施した、ブレードピッチ制御可能な大型風車と浮体模型の組み合わせによる水槽試験の結果を基に、波浪による浮体動揺下でブレードピッチ制御を行った状態での、浮体および風車の全体挙動およびブレードピッチ制御パラメータが全体挙動に及ぼす影響を、数値モデリング手法を援用して調査した。

一方、舞鶴高専では,実験模型の製作が完了し、ネガティブダンピング現象を解明するための実験が行われた。現状では、風車模型の回転数が十分でなく翼のスラストではなく風からの抗力で発生するネガティブダンピング現象を明らかにしつつある。これらの研究をもとに、平成23年度に開発したネガティブダンピングを再現するシミュレーションツールの精度向上に係る検討を実施した。風車運動については、アメリカ再生可能エネルギー研究所が研究を進めるFASTコードを利用し、浮体運動にはWASPと呼ばれる動的解析コード、これらを連成するシステムとして、マルチボディ解析のADAMSを効率的に組み褪せたシミュレーション体系を構築した。これらの実験とシミュレーション解析を組み合わせた総合的な研究で、大規模な浮体式洋上風車において発生を恐れるシビア・アクシデントを未然に防ぐ制御法を見出しつつある。実験、解析ともに、ほぼ予定通り進行している。研究の初期段階であるため、まだ、公表論文が少ないことを問題点として認識している。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究の初期段階であるため、講演論文の発表に機会は多数あるものの、まだ、査読論文が少ないことを問題点として認識している。風力エネルギーの国際的シンポジウムとして、EWEA2103(ヨーロッパ風力学会2013)、およびノルウエーにおけるDeep Offshore 2013(大深度洋上風力国際シンポジウム)で、実験・シミュレーション双方の講演発表を行い、世界的な研究者らと議論を深めている。ネガティブ・ダンピングを抑制する方法として、風車回転翼のピッチ制御を、スラストの増減を逆方向にする必要がある。そのとき、定格出力に裕度を持たせる方法と、回転数に裕度を持たせる方法が議論されている。さらに、浮体構造物のダンピングを大きくし、ネガティブダンピングが発生しない方向性をとなるグループもある。これらの議論について、理論、実験、経済性から評価することが求められているため、慎重に研究を進めている。体系的な結論を得たのちに、論文としてまとめる予定である。浮体式洋上風車のさまざまな運転条件に対応した実験を行い、それに対応するシミュレーションを丹念に積み重ね、普遍的な結論を導き出すよう、研究を推進していく。実験においては、誤差の原因となる係留方法について詳細な検討を行い、新しい係留方法で追加実験を行い、精度の向上を図る。また、搭載する小型風車についても、より信頼性の高めたものを利用する。制御法については、前述の方法のみならず、複合的なシステムを含めた信頼性の高い新しい方法の提案を目指して研究を進めていく。
上皮小体癌の臨床病理診断基準の確立と治療法の開発

1.遠隔調査からみた上皮小体癌病理組織診断基準の再検討従来、上皮小体癌の病理組織診断では、核分裂像がもっとも信頼性の高い単一所見であり、それがあれば癌の診断がつくという考えが一般的であった。自験例でもそれを根拠に癌と診断していた例が8例あったが、、本研究では術後長期追跡調査を行なったところ再発は認めなかった。そこで、核分裂像の存在だけでは上皮小体癌の診断を確定できないことが明らかになった。2.上皮小体癌の電顕的検討.再発または転移が起こり診断が確定できた上皮小体癌の詳細な電顕的研究を行ない、(1)好酸性細胞から成る上皮小体癌の存在(2例)を初めて明らかにすることができた-従来は、主細胞から成るという報告しかなかった。、(2)細胞間癒合と細胞質内糸状体の所見を示す例がみつかった3.上皮小体癌DNAヒストグラム解析上皮小体腫瘍のDNAヒストグラム分析が癌の診断の確認およびその予後の予測に役立つかどうか検討することができた。(1)自験例の確実に癌と診断できる例でも原発巣のDNAパターンはすべてdiploidであり、この検査で癌の診断を確認することはできない。(2)再発巣または転移巣の組織がtetrapl-oidであるときには繰り返し再発する危険性が高い。4.再発部位の診断とその治療頸部の局所再発の部位診断には【^(201)Tl】Clシンチグラムが有用であり、肺転移巣の検出にはCT検査が役に立つ。再発例の治療は手術がもっとも有効な方法である。化学療法としてはdacarbazineがわずかながら効果を期待できる薬剤である。
能動変調型・環境TEMによる『純』反応ダイナミクスのオペランド観察技術の開発

本年度は、開発しているその場観察技術を用いた応用研究で成果が出た。液中その場観察用の試料ホルダについては、液体をフローしながら観察ができるように改良を実施した。内径150μmのPEEK製チューブを2本、試料ホルダ内に設置し、ホルダ先端の試料搭載部まで液体を導入出できる機構とした。先端部は従来と同様にSiN製の隔膜が窓孔となっているMEMS製チップが2枚搭載可能であり、両MEMSチップ間に試料を挟み、その間隙を上記チューブから導入された液体が流れる機構となっている。それを用いて、金属材料の液中その場観察を実施し、金属の溶解および析出過程の観察に成功した。特に異種金属の生成を確認などの新しい知見を得ている。ただし、電子ビーム照射が反応に影響を及ぼすことも明らかになっており、メカニズム解明には照射電信線の低ドーズ化が鍵となることが明らかになった。また、開発技術の生体試料への展開を検討しており、グラフェン膜2枚により細菌を内包した液体(培養液)のパッキング技術を開発した。、大腸菌の電子顕微鏡挙動観察への可能性を見出すことに成功した。一方で装置開発では、照射電子ビームの変調機構の開発が難しいことが概念設計から明らかとなってきた。単純な直流電圧印加による電子ビームの場合、300kVで加速された電子ビーム軌道を曲げて試料に届かなくする(照射ビームOFF状態)ためには、数kVを平行平板に印加する必要があり、それを高周波変調するためには電源・制御機構などの設計・開発を要する。このため、RFチョッパーの導入など他の方法を用いることも視野に検討を進めている。オペランド観察技術の開発は順調に進捗しており、応用成果も着実に出ている。一方で装置開発では、平行平板電極を用いた照射電子ビームの変調機構の開発が難しいことが概念設計から明らかとなってきた。このため、他の手法の導入検討が必要であると考えている。最終年度と言うこともあり、基本的には応用研究を中心に成果を出すことを想定している。具体的には、液中その場観察技術を用いた、金属材料、生体試料の挙動観察であり、特に後者において、細菌の生きた状態でのベシクル生成などの生命活動を動的に捉えることを目指す予定である。本研究の目的は、『電子顕微鏡その場観察において、これまで原理的に避けられなかった電子線照射の影響を除去し、反応現象そのものによって起こる純粋な変化・挙動を直接に観察できる“能動変調型・環境電子顕微鏡"を新規開発することと、その応用研究』である。これを実現するために、まずは4つの要素技術開発を進める必要があり、初年度はその検討・製作を実施した。具体的には以下の通りである。1電子線をパルス化して試料照射できる“パルス電子銃":電子ビームのON/OFFを切り替えるための偏光器として、電界/磁界を利用した装置の検討を行った。その結果、高加速電圧(300kV)にて高周波変調するためには磁界型を利用する必要があるとの結論を得た。2反応ガスをパルス状に噴射する“パルスガス導入機構":パルス状のガス導入のために高速変調可能なガスバルブの選定を行い、それらを2つ逆方向に並べることで振動をキャンセルする機構を着想し、開発中である。3試料の高速温度変調および液体導入ができる“MEMSチップ試料ホルダ":液中での試料観察を実現するためにMEMSチップ試料ホルダの開発を行った。極薄SiNの観察窓を有する2枚のMEMSチップで液体試料を挟み込むタイプの開発、およびグラフェンを用いた液体パック技術の開発を平行して進めており、いずれも液体を閉じ込めて電子顕微鏡内で観察することに成功している。4上記の各要素と動画撮影用のカメラを制御する“同期制御システム":制御システムベース装置を導入し、立ち上げが完了している。電子線照射と環境変調をそれぞれ制御する機能を有する電子顕微鏡装置を創出するため、初年度は4つの要素技術を開発してベースのTEM装置(日立ハイテクH9500)に組み込む計画であった。それぞれの進捗状況を以下に説明する。1電子線をパルス化して試料照射できる“パルス電子銃":電子顕微鏡の収束絞り部分に偏光板を導入してビームのON/OFFを切り替える。偏光器として電界を利用する場合について検討を進めたが、高加速電圧(300kV)に対応するためには高圧電源を利用する必要があり、それを高周波変調するのは困難である、との結論に達した。そこで磁場を用いた偏光器の検討を進めている。2反応ガスをパルス状に噴射する“パルスガス導入機構":パルス状のガス導入について、高速変調可能なガスバルブの選定を進めている。問題はバルブ開閉に伴う振動の発生であり、それをキャンセルするために2個のバルブを別方向に同時に動作させるシステムを開発中である。3試料の高速温度変調および液体導入ができる“MEMSチップ試料ホルダ":環境変調のMEMSチップ試料ホルダの初段階として、液体中試料の観察が可能な試料ホルダを独自に開発した。極薄SiNの観察窓を有する2枚のMEMSチップで液体試料を挟み込み、それらをOringでシールすることにより電子顕微鏡の真空環境下においても液体が蒸発せず、直接液中試料を観察することが可能となっている。すでにテスト試料での検証を完了している。これに加えて、更なる高分解能観察のために、MEMSチップに代わりグラフェンを用いた液体パック技術の開発を推進しており、コロイド粒子の液中観察に成功している。

4上記の各要素と動画撮影用のカメラを制御する“同期制御システム":制御システムベース装置を導入し、立ち上げが完了している。本年度は、開発しているその場観察技術を用いた応用研究で成果が出た。液中その場観察用の試料ホルダについては、液体をフローしながら観察ができるように改良を実施した。内径150μmのPEEK製チューブを2本、試料ホルダ内に設置し、ホルダ先端の試料搭載部まで液体を導入出できる機構とした。先端部は従来と同様にSiN製の隔膜が窓孔となっているMEMS製チップが2枚搭載可能であり、両MEMSチップ間に試料を挟み、その間隙を上記チューブから導入された液体が流れる機構となっている。それを用いて、金属材料の液中その場観察を実施し、金属の溶解および析出過程の観察に成功した。特に異種金属の生成を確認などの新しい知見を得ている。ただし、電子ビーム照射が反応に影響を及ぼすことも明らかになっており、メカニズム解明には照射電信線の低ドーズ化が鍵となることが明らかになった。また、開発技術の生体試料への展開を検討しており、グラフェン膜2枚により細菌を内包した液体(培養液)のパッキング技術を開発した。、大腸菌の電子顕微鏡挙動観察への可能性を見出すことに成功した。一方で装置開発では、照射電子ビームの変調機構の開発が難しいことが概念設計から明らかとなってきた。単純な直流電圧印加による電子ビームの場合、300kVで加速された電子ビーム軌道を曲げて試料に届かなくする(照射ビームOFF状態)ためには、数kVを平行平板に印加する必要があり、それを高周波変調するためには電源・制御機構などの設計・開発を要する。このため、RFチョッパーの導入など他の方法を用いることも視野に検討を進めている。オペランド観察技術の開発は順調に進捗しており、応用成果も着実に出ている。一方で装置開発では、平行平板電極を用いた照射電子ビームの変調機構の開発が難しいことが概念設計から明らかとなってきた。このため、他の手法の導入検討が必要であると考えている。4つの要素技術のうち、まだ完成していない以下の点について開発を進めつつ、応用研究を実施する。1電子線をパルス化して試料照射できる“パルス電子銃"2反応ガスをパルス状に噴射する“パルスガス導入機構"開発した要素技術を組み合わせ、以下の要領で同期変調しながら像撮影できるように装置全体のシステム化を行う。電子線、ガス(必要ならば試料加熱)、撮像の3つを、各々タイミングをずらしてON/OFFする。一例として、ガス反応により粒径が肥大化する触媒材料を想定した場合、電子線OFF・ガスONの時だけ粒が成長し、その際には電子線の影響を受けていない。一方で電子線ON・ガスOFF時は、粒子に変化がなく定常状態で撮像ON(TEM像記録)となる。この一連の画像を観ると粒子が徐々に肥大化していく様子を動画像として得ることが可能となる。この例は不可逆な構造変化の場合だが、可逆的な反応挙動に適用する場合は各々の変調タイミングをずらすことで変形過程を動的に記録することが出来る。
米国大学における日本語蔵書史の調査、及びその情報の利用、共有化についての研究

本研究では、米国内には数多く存在する日本語図書館について、その歴史を明らかにした。蔵書の歴史情報は、その蔵書を利用、活用する場合の重要情報であるが、これまで系統的な研究は存在しなかった。本研究は、それら歴史を明らかにするとともに、その歴史に関係する文献、文書を、米国内の各地図書館で収集するとともに、それらの整理、保存、公開につとめた。また、こうした研究、調査の重要性について認知度を高めた。本研究は、米国内における日本語蔵書の形成、及びその変化について歴史的に解明することを目的とする。また、それとあわせて、蔵書形成、変化の歴史を明らかにする資料の収集、整備、保存と公開、共有を促進する。本研究は、海外の日本語図書の蔵書の歴史を調査し、関連史料を収集、整理、提供することを目的としている。本年度は、海外での調査として、ミシガン大学、コロンビア大学、イエール大学、カリフォルニア大学(バークレー)、カリフォルニア大学(ロサンゼルス)の日本語蔵書史に関する追加調査を行った。特にこれまでの調査で十分ではなかった、写真史料に重点をおいた資料状況を調査した。日本国内の調査では、占領期にミシガン大学が岡山に設置した日本研究所についての史料調査を岡山で、同じく占領期に日本語収集にあたっていたカリフォルニア大学(バークレー)の調査員に関する史料を小樽商科大学で収集した。また、国内の関連史料の収集、整理を進めた。これらの史料をもとに、現段階までの調査内容を研究報告書としてまとめ、2月に出版社より刊行した。また、この成果を国内、海外の研究機関に送り、今後の調査への連携、協力体制を整えることとした。そして、こうした研究の進展状況を含め、調査プロジェクトのホームページを通して情報公開に努めた。本調査は、(1)蔵書史資料の所在情報目録の作成、(2)資料内容についての分析、報告、(3)周辺資料の収集と情報収集、(4)主要情報のデジタル化と基礎情報の提供、(5)米国内での追加調査、及び調整作業、研究報告を主要な柱として活動している。(1)の蔵書史史料の所在情報に関しては、昨年度末に所在情報も含めて刊行した著書をもとに、関係機関からの情報収集を進めた。(2)の資料の内容の分析については、メリーランド大学の蔵書史史料、及び米議会図書館の蔵書史史料の分析、追加調査を行い、一部は論として公表した。(3)周辺資料の収集と情報収集では、日本語蔵書史に深いかかわりのある書籍取り扱い業者を中心として資料収集を行い、バーモント州のチャールズ・タトル出版や日本の丸善、紀伊国屋等からの資料収集を行った。(4)については、こうした蔵書史資料の情報の長期的な基礎情報を提供するための研究会「リテラシー史研究会」をたちあげ、会誌を発行し、インターネットを通して研究協力者を得つつ、より広範な情報提供が可能な環境を整えることができた。また、日本国内で行われた二つの国際学会において調査に基づいた報告を行い、情報の発信、公表につとめた。(5)の米国内での追加調査については、オハイオ州立大学の日本語蔵書史を現地で調査し、関係資料を収集できた。また、米議会図書館についても追加調査を行った。そして、米国の日本語蔵書史との関係を検討するために、カナダのブリティッシュ・コロンビア大学の日本語蔵書史調査を行って、資料収集につとめた。本研究の目的は、米国における日本語蔵書の形成について明らかにし、あわせて、関運する資料を整理、公開してゆくことにある。こうした海外における日本語蔵書形成についての研究は、各研究領域にわたる広い関心を引く領域にもかかわらず、いまだ十分な研究がなされておらず、その情報の共有が急務である。こうした関心を高めるための活動として、アトランタで行われた北米日本研究資料調整協議会(NCC,The North American Coordinating Council on Japanese Library Resources)で報告を行い、本研究の重要性を述べるとともに、蔵書形成にかかわる資料の保存と利用の意義について報告を行った。また、あわせて米国内の各地図書館の関係者からの情報収集を行った。また、米国内の追加調査として、日米間の図書流通の歴史に戦後深くかかわったタトル出版における書店史料の調査を行い、同社所蔵の数多くの資料を収集することができた。国内では、書籍の日米交流という観点から、角田柳作についての調査、報告や、米国内における占領期の被接収文献についての調査報告を行い、論文として公開を進めてきた。また、図書、書籍の流通という観点からの問題意識を高めることをねらいとして、地域の読書史、蔵書史と関係づけながら、研究報告や論文の公開を進めた。同時に、これらの問題意識を共有する研究者とともに、研究会、および論文集の発行を行った。本研究の目的は、米国における日本語蔵書の形成について明らかにし、あわせて、関連する資料を整理、公開してゆくことにある。本年度の活動は、米国図書館におけるグーグル・ライブラリ・プロジェクトを含めた蔵書デジタル化の状況について調査を行い、米国内の日本語蔵書への影響、さらにはそれによる日本の図書館、出版状況への影響関係について調査した。こうしたデジタル化プロジェクトが、日本語蔵書史や読書環境に大きな変化をもたらしつつあり、国内外の関心も高いためである。

それらについての調査報告を米国内の主要研究図書館と交換、共有し、さらにその内容について国内の図書館総合フォーラム「"グーグル文化と日本"研究者、図書館の立場から」において報告、いくつかの論として同テーマについて公開した。また、米国内の日本語図書館、及び大学アーカイブズとの連絡体制を維持し、今後の関係資料の収集、公開体制を整えた。また、図書や資料の所蔵、流通史をとらえるという研究方法について、より高度化、体系化するために、同テーマにそった資料調査、報告をまとめるとともに、図書館と連携した調査、研究体制の構築につとめ、共同して資料整理を進めていくスタッフの教育体制をも整えた。さらに、図書の流通史をとらえるという観点から、地域における図書流通、所蔵に関する調査を進め、報告書としてまとめるとともに、そのデータのデジタル化や資料公開に努めた。また、これら問題意識を共有する研究者とともに、研究会、および論文集の発行を前年度に継続して行った。
DMFCによる環境低負荷型高効率エネルギー変換の新展開

本特定領域研究は、貯蔵や運搬が難しい水素を用いて発電する燃料電池の代わりに、これらが容易なアルコール液体燃料で直接発電する燃料電池の基礎研究を、直接メタノール形燃料電池(DMFC)を中心に行い、その実用化研究を加速することを目的とした。特に、DMFCの実用化を阻んでいる要因を、(1)発電効率が低い、(2)パワーが少ない、(3)高価である、(4)形状が大きい、(5)メタノールに毒性がある、の5点に抽出しまとめた。さらにこれらの問題を解決するための基礎研究を進める方針として、メタノール・クロスオーバーの低減、電極の高性能化および高温運転を可能とする電解質膜材料の開発、白金触媒の使用量低減および非白金系触媒の開発、MEMS燃料電池の開発、人体無害な燃料による燃料電池発電、の5課題を対応させ、課題ごとに具体的な研究テーマを決め実行した。研究の実施体制は総括班の下に、電解質膜材料開発、電極触媒開発、電解質膜電極接合体開発、およびシステム化技術の研究開発の4計画研究班を配置し、各々が強く連携し上記研究テーマを実行した。その結果、(1)については細孔フィリング膜およびシリカ多孔体コンポジット膜を開発し、メタノール・クロスオーバーの低減に成功し、発電効率を高めることができた。(2)については基板も含めた電極構造の最適化を行い、世界最高レベルの出力密度を達成した。また、複合無機化合物膜材料と室温溶融塩膜材料を開発し高温作動を確認した。(3)では酸化物複合触媒を開発し白金使用量を大幅に減らすことに成功した。また、アニオン交換膜形燃料電池を開発し、非白金系触媒を用いて高出力発電を確認した。さらに、電気泳動法による高性能触媒層形成技術を確立し白金使用量の削減を行った。(4)については2種類のMEMS型DMFCを開発し、超小型化への道を開いた。(5)については各種燃料電池についてエタノールを燃料としたときの運転データを集積し、直接形のエタノール燃料電池が可能であることを示した。今年度は本領域の発足年度にあたるので、まず領域全体のこれからの研究方針を明らかにするために、第1回全体会議を平成13年12月21日(金)に開催した。この際、各計画研究班の概要説明ならびに具体的な研究目標の確認も併せて行われ、活発な質疑・応答が交わされた。A01班からは、"新しいイオン伝導性膜の創製"および"膜と電極の界面"という本年度の研究課題に対し、無機・有機材料コンポジット膜の作成方法などについての研究成果が披露された。14年度以降については、無機マトリックス体の大面積化などのテーマが示された。続いてB01班からは(1)DMFC電極特性の把握、(2)高活性電極・スタック構造の設計指針の構築、(3)新規電極構成の提案とその検証、が研究テーマとして掲げられた。さらに今年度の目標として、(1)実験装置の構築と調整、(2)触媒層の調整条件、などが示された。C01班は、DMFCアノード反応場-メソ空間内での3相界面反応-に関し、"細孔構造を精密制御した炭素担体の開発"を目標に掲げ、アルキルアンモニウム類が形成する2次元ヘキサゴナル構造のミセルを利用したメソポーラス炭素の作成法などについて発表があった。

最後にD01班は、当研究班を"DMFCのシステム設計のための物質・材料・MEA開発支援部隊"と位置づけ、研究全体の方向性を示し、燃料電池の最新のトレンドを紹介していくことなどが明らかにされるとともに、本年度の購入備品について報告がなされた。このほか、山崎領域代表から今後の方針として、特許申請手続きに関わる研究補助のためのシステムを整備してゆく旨の発表があった。本年度はこの他にも、情報収集・処理のためのコンピューター機器類の整備をおこない、当領域の研究計画概要をまとめたニュースレター第1号を発行した。今年度は本領域の発足第2年目にあたり、各計画研究班においても設備が整い徐々に興味あるデータが出始めている。総括班としては、全体会議(第3回:平成14年7月2日(火)、第4回:平成14年12月3日(火))および班会議(全体会議と同日)を主催し、各計画研究班員による研究発表をおこない、進捗状況の把握をおこなうとともに、国内外における研究動向について情報の提供をおこなった。これらはオープン形式でおこなわれ、大学のみならず産業界からも多くの参加者を得たことにより、本領域研究に対する関心の大きさを確認できた。さらに、本領域研究に深い関わりをもつ複数の領域外研究者による講演会を実施し、広く意見交換をおこなうことによって、班員の研究意欲の向上をはかるとともに、社会における本領域研究のスタンスの把握に努めた。一方、海外における最新の研究動向調査のため、アメリカ電気化学会秋季大会(平成14年10月20日-25日、ソルトレークシティ)および国際燃料電池学会(平成15年2月19日-22日、ミラノ)に出席した。一方、電気化学会会誌(Electrochemistry Vol.70,No.12)の特集号「携帯機器用小型燃料電池」のゲストエディターとして山崎領域代表が参画し、本領域からも多くの研究者が参加して英文による論文特集号が発刊された。さらに、本年度の研究成果をまとめた「平成14年度成果報告書」を平成15年3月に発行した。この他にも、情報収集・処理のためのコンピューター機器類の整備をおこなった。総括班として主催した会議関係では、最初に平成15年度第1回全体会議を4月17日(木)にすずかけ台セミナープラザで開催した。この会議では、各計画研究班における前年度までの研究の進捗状況を確認するとともに、今年度の具体的な研究達成目標の設定について議論をおこなった。第2回目の全体会議は、(社)化学工学会関東支部との共催により、7月14日(月)に同会群馬大会において公開シンポジウム形式で行った。平均参加者人数約60名を数える盛会となった。一方、9月10日(水)に実施された本領域の中間ヒアリングの結果を受け、ヒヤリングにおいて出されたコメントについて十分に検討した上、12月3日(火)に計画研究班員全員が集まり、総括班・計画研究班会議を開催し、今後の領域全体の研究の方向性や各研究班のテーマ設定について再検討をおこなった。また、領域全体で取り組むべき新たな研究テーマについて集中した議論をおこなった。さらに、本年度の研究成果発表の締めくくりとして第3回公開シンポジウムを平成16年1月24日(土)に開催した。この他にも、情報収集・処理のためのコンピューター機器類の整備をおこない、本特定領域のホームページを開設した。2月には平成15年度の本領域研究の成果概要をまとめたニュースレター第3号(A4版60ページ)を発行した。
小胞体カルシウムポンプの異常にともなうダリエー病発症機構の研究

われわれは現時点で報告のある変異のうち、ナンセンス変異以外の点突然変異を有するSERCA2bを51種類全て作成し、これらを内因性SERCA2b活性のないCos1細胞に導入し機能解析を行うシステムを確立した。51種類中、15種類はSERCA2bの発現そのものが低下していた。また21種類はカルシウムポンプ機能と共役するATPase活性が完全に消失していた。さらに残りの8種類はATPase活性はあるもののカルシウムポンプとの間の機能的uncouplingがおきているmutantであった。最後に残った3種類(1274V,L321F,M719I)は、SERCA2bはほぼ正常に発現し、しかも高いカルシウム輸送活性を有していたが、速度論的性質において、それぞれ異なるタイプの異常を示し、1274Vでは正常なカルシウム親和性だが、輸送活性は若干低下し、M719Iではいずれも若干低下していた。さらにL321F変異体はM719Iと同様に細胞質カルシウムに対する親和性が低下していることに加え、小胞体内腔カルシウムによるfeedback inhibitionに対する非感受性を有し、その結果、小胞体内腔カルシウムレベルの異常高値での設定を引き起こすことが明らかとなった。ダリエー病は従来、SERCA2b変異体の極度の発現低下や機能喪失によるhaproinsufficiencyにより発症するものと予測されてきたが、われわれの結果は、ミスセンス変異によっては異なるタイプの速度論的性質の異常により、細胞内カルシウム恒常性の変動が引き起こされることを初めて示したものである。ダリエー病は小胞体カルシウムポンプ遺伝子ATP2A2の変異により発症する角化異常症である。ATP2A2の転写産物であるSERCA2b(sarcoendoplasmic reticulum calcium-ATPase type 2b)はATPを加水分解し、カルシウムを細胞質から小胞体内腔へ輸送する。われわれは強制発現系で得られる変異SERCA2bの蛋白質機能解析を行った。過去にダリエー病患者で報告されているmissense遺伝子変異のcDNA50種類を全て作成し、COS-1細胞に形質導入し小胞体分画を得た。得られたmutantSERCA2bに対し1)発現、2)ATPase活性、3)カルシウム取り込み(ポンプ機能)を検討した。その結果、機能面からみて、変異SERCA2bは多岐にわたっており、単に発現の低下のみがダリエー病発症の原因ではないことが明かとなった。変異SERCA2bの発現レベルはゼロに近いものからwild typeと同様のものまで様々であり、ATPase活性については、発現の程度に拘わらず、活性が失活しているものから活性が高いものまで幅広く分布していた。さらにポンプ機能の解析により、ATPase活性が存在するにも拘わらず、ポンプ機能が低下しているもの、ポンプ機能そのものはwild typeに匹敵するにもかかわらず、back inhibitionの濃度設定が高いため結果的に機能不全に陥っているものが同定された。これらの結果は、ダリエー病におけるSERCA2bを介するカルシウム代謝の異常の多様性を示すと同時に、ダリエー病における遺伝子型、表現型の対応の解析に新しい観点をもたらすものである。われわれは日本人ダリエー病患者の遺伝子解析により、われわれが新規に発見したI274V, L321F, M719Iの3つのミスセンス変異を導入したSERCA2b蛋白をそれぞれCOS-1細胞で発現させ、発現量、細胞内局在、および機能について解析した。その結果、これらの変異SERCA2bはほぼ正常に発現、局在化し、しかも高いカルシウム輸送活性を保持することが明らかとなった。

さらなる解析の結果、これら3種の変異体は速度論的性質においてそれぞれ異なるタイプの異常を示し、I274Vでは正常なカルシウム親和性だが輸送活性は若干低下し、M719Iではいずれも若干低下していた。輸送活性の低下は、細胞質および小胞体内腔におけるカルシウム代謝に対する迅速な対応が不十分であることを意味し、細胞質カルシウムに対する親和性の低下は細胞質カルシウムレベルが異常な高値に設定されてしまうことを意味する。さらにL321F変異体はM719Iと同様に細胞質カルシウムに対する親和性が低下していることに加え、顕著な特異的異常、すなわち小胞体内腔カルシウムによるfeedback inhibitionに対する不感受性を有し、その結果、小胞体内腔カルシウムレベルの異常高値での設定をひきおこすことが明らかとなった。ダリエー病は従来、SERCA2b変異体の極度の発現低下や機能喪失によるhaploinsufficiencyにより発症するものと予想されてきたが、今回の結果は、ミスセンス変異によっては異なるタイプの速度論的性質の異常により、細胞内カルシウムホメオスタシスの変動が引き起されることを初めて示したものである。ダリエー病は小胞体カルシウムポンプ遺伝子ATP2A2の変異により発症する角化異常症である。ATP2A2の転写産物であるSERCA2b(sarcoendoplasmic reticulum calcium-ATPase type 2b)はATPを加水分解し、カルシウムを細胞質から小胞体内腔へ輸送する。われわれは現時点で報告のある変異のうち、ナンセンス変異以外の点突然変異を有するSERCA2bを51種類全て作成した。さらにこれらを内因性SERCA2b活性のないCos1細胞に導入し機能解析を行うシステムを確立した。51種類中、15種類はSERCA2bの発現そのものが低下していた。これはおそらく異常なSERCA2b蛋白が品質管理の過程で分解されてしまい、その結果、これらのグループはSERCA2bについてはstop codonによるナンセンス変異のようにふるまっているものと推定した。残りの31種類のうち21種類はカルシウムポンプ機能と共役するATPase活性が完全に消失していることが明らかとなった。さらに残りの8種類はATPase活性はあるもののカルシウムポンプとの間の機能的uncouplingがおきているmutantであることが明らかとなった。したがってポンプ機能は遂行できず、エネルギーの無駄な消費のみがおこっていることになる。興味深いことにこのタイプのmutantはATPase活性消失型mutantと比べ全体的に症状が強い傾向がみられた。おそらくATPの無駄な消費が、他の細胞機能にも影響を及ぼしているものと推定している。最後の3種類については昨年度の報告書に詳しくまとめており省略する。これらの検索の過程でSERCA2bの異常の部位には、いわゆるhot spotに相当するものはなく、SERCA2bは機能的にあらゆる部位が重要な、極めて分子進化の遅い蛋白であることが明らかとなった。