hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規軟骨分化誘導因子ZSCANCの機能解析

SOX6およびII型コラーゲンの転写開始点近傍にZSCANCの応答領域が存在することが明らかとなり、その範囲を50bp以内に絞りこんだ。またII型コラーゲン以外にもアグリカンなどの軟骨基質分子、さらにX型コラーゲン、VEGFAなどの後期分化において重要な役割を果たす分子のプロモーターを活性化することも明らかになった。またSOX6およびII型コラーゲンのプロモーター活性化においてはC/EBP・やGATA5が、X型コラーゲンについてはZIC3が、それぞれZSCANと協調的に作用することも明らかとなり、様々な転写因子と協調することによって多彩な標的分子を転写誘導する可能性が示唆された。既にII型コラーゲン誘導能が明らかになっている共役転写因子C/EBP・やGATA5について、脱分化軟骨細胞にレトロウィルスによる遺伝子導入後アルシアンブルーおよびALP染色にて検討をしたところ、ZSCANCはC/EBP・やGATA5による軟骨細胞の細分化誘導能を増強することが明らかになった。未分化軟骨細胞ATDC5に同様の遺伝子導入を行って検討したところ、軟骨基質誘導能のみならず、肥大分化促進能も有することが明らかとなった。レトロウィルスベクターを用いてZSCANCのsiRNAをATDC5に安定導入し、インスリン刺激で軟骨分化誘導させた後にアルシアンブルーおよびALP染色にて検討をしたところ、基質産生、肥大分化がともに抑制されることも明らかとなった。以上よりZSCANCは様々なパートナー分子と協調的に働いて軟骨分化の各段階を制御することが予測される。ZSCANCのin vivoの機能を検証するため、遺伝子ターゲティングベクターを用いてノックアウトマウスを作成し、解析を行っている。ZSCANCによる転写活性化領域はSOX6及びII型コラーゲンの近位プロモーター内に存在することが明らかになったが、結合モチーフの同定にはいたらなかった。GFP融合蛋白を用いた系でZSCANCは核移行シグナル依存性に核に局在すること、またGAL4のDNA結合ドメインとの融合蛋白を用いたルシフェラーゼ・レポーターアッセイを用いた系でN末端側に転写活性化ドメインが存在することが明らかになった。ZSCANCの共役転写因子のうちGATA5はSOX6の近位プロモーター内のエンハンサー配列CES6に結合することで協調作用を示すことが分かった。SOX6やII型コラーゲンプロモーターによるルシフェラーゼアッセイによる解析でZSCANCはPTHrP-Gs-PKAシグナル、BMP-TAK1-p38MAPKシグナルと協調的に作用し転写を活性化することが明らかになった。レトロウィルスベクター及びレンチウィルスを用いたRNAiの系によりZSCANCを恒常的にノックダウンしたATDC5を作成した。免疫染色ではZSCANCは未分化軟骨細胞から後期肥大軟骨細胞まで発生肢の軟骨細胞に一様に発現し、その発現パターンは共役転写因子であるC/EBPbやGATA5と一致していた。一方、成体の臓器・組織別の発現ではいずれの組織でも発現は弱く、発生時に重要な役割を果たす転写因子であると考えられた。ZSCANCのin vivoの機能を検証するため、遺伝子ターゲティングベクターを作成した。
日英バイリンガル園児のメタ言語能力発達段階解明fNIRS研究

本研究では、日英バイリンガルを対象に、メタ言語能力発達に関して、日本語モノリンガルと比較するのに、認知的葛藤タスク遂行時にFp1(前額部左脳)とFp2(同右脳)での脳賦活様態データも同時に収集した。日英バイリンガル幼稚園在園の日英バイリンガル2ー6歳児に加えて、統制群として国内在住の日本語モノリンガル2ー6歳児の104名からデータ収集を行った。年齢・識字率・バイリンガル園在園期間によるバイリンガル度を勘案して、モノリンガルとバイリンガルを年齢別に厳格に抽出して分析を行った。incongruent条件下での認知的葛藤タスク遂行時の行動データに関しては、2歳時にモノリンガルが優り、3歳以降6歳時までバイリンガル・モノリンガル間に差がないことが判明した。ただし、これら2タスク遂行時における脳賦活様態を精査したところ、左脳ではバイリンガルの優位性が4歳位までは顕著であった(右脳では5歳時のみ)。つまり認知的葛藤タスク遂行時のバイリンガル児の優位性は、言語間距離の遠い日英バイリンガル対象実験においても、4歳までのFp1と5歳時のFp2に見いだせた。これはBialystok et al. (2004)のバイリンガル優位説を支持するものであるが、一方でモノリンガルの優位性を示すPalmer (1972)やモノリンガル・バイリンガル間に差はないとするHilchey & Klein (2011)も支持する結果となった。今後の方針は、モノリンガルとバイリンガルを厳格な基準でマッチングすると、104名の園児からのデータが僅か18名にまで絞られてしまった今回の経験を生かして、比較対照できる被験者母数を増やすことが第一である。また、本研究を通して、僅か数人であるが2歳時より縦断的に5歳時までデータ収集を行えたので、個人差の激しいこの年齢層の貴重なデータとして横断データと比較検討したい。バイリンガル児の認知的発達は、小学校中学年位まではモノリンガル児よりも早いとの報告がある。これらの研究はアルファベット言語間バイリンガル(例えば英語とフランス語等)を対象としたものが大半であり、言語間距離の遠い言語(アルファベット言語と中国語のような表象言語等)を操るバイリンガル児対象の研究は非常に少ない。そこでこの研究は日英バイリンガル園児(26才)を対象に、これまでの研究報告の敷衍性を探ることにした。初年度はシンガポールのこのはな幼稚園(日英バイリンガル幼稚園)に通うバイリンガル園児から横断データを収集した。加えて、昨年の予備実験に参加した2才児からは2年目(3才児時)のデータも収集した。2人一組で2チームでデータ収集に当たったので、ほぼ当初の計画通りの人数からのデータ収集が行えた。サイモンタスクやストループタスク等認知的葛藤タスク以外に、日本語と英語の語彙テストも実施した。語彙タスク以外の遂行時には前頭葉前額部(Fp1とFp2)にpocketNIRSを装着して血流(Oxy, Deoxy, Total-Hb)も130 msecおきに測定した。年齢群比較が行えるように、下作業として、各園児の言語歴整理、各タスクの行動データ、fNIRS(機能的近赤外分光法)データの標準化作業を2017年度前半度で終えられるように作業中である。対象園の都合でデータ収集が年度末の3月となったが、ほぼ計画通りに進めることができた。3年間の縦断・横断研究で所期の目的を完遂する為のデータは初年度収集できたが、実際に子供達に接しているとバイリンガル度に疑問に感じる事もあり、次年度以降は保護者からの家庭内言語使用様態の詳細なデータを入手することにした。データ収集困難な幼稚園児対象であるので捨てデータが沢山出たが、二人一組の2チームでデータ収集に当たれたので、ほぼ当初の計画通りの人数からデータ収集が行えた。また、対象園の都合でデータ収集が年度末の3月となったが、下分析作業もほぼ計画通りに進めることができている。そこでこの研究は日英バイリンガル園児(26才)を対象に、これまでの研究報告の敷衍性を探ることにた。2年目も同様のデータ収集を継続した。タスクとしては、サイモンタスクやストループタスク等認知的葛藤タスク以外に、日本語と英語の語彙テストも実施した。語彙タスク以外の遂行時には前頭葉前額部(Fp1とFp2)にpocketNIRSを装着して血流(Oxy, Deoxy, Total-Hb)も測定した。年齢群比較が行えるように、下作業として、各園児の言語歴整理、各タスクの行動データ、fNIRS(機能的近赤外分光法)データの標準化作業を2017年度前半度で終えた。

3年間の縦断・横断研究で所期の目的を完遂する為のデータは初年度に続き2年目も収集できたが、実際に子供達に接しているとバイリンガル度に疑問に感じる事もあり、最終年度には保護者からの家庭内言語使用様態の詳細なデータを入手する必要がある。対象早期バイリンガル児の保護者の転勤による、継続データ収集の不可ケース数が事前予測よりも多かった部分を除き、縦断・横断データ収集は概ね計画通りに2年度も行えた。2年前に2才児であった子供達を縦断的に追う部分が主であり、4才児となりかなりデータ収集にも慣れ、質の高いデータ収集ができた。また、横断データとして、今年の2才児クラスよりデータ収集を行ったが、例年に比べて泣いたり、fNIRS装着を嫌がる子どもが少なく順調にデータ収集を進めることができた。年長者の語彙力が増え閾値を超えて次のステージにまたがり時間がかかるのは予想できたが、予想外に時間がかかったのは、明らかに語意がわかっていないのに当てずっぽうで正解を重ねて運良く閾値を超え、次のステージに進む子どもが続出した為である。行動データ的には仕方ないが、明らかに当てずっぽうと分かるケースでは、行動記録にその旨注釈を入れておく必要性を感じた。本研究では、日英バイリンガルを対象に、メタ言語能力発達に関して、日本語モノリンガルと比較するのに、認知的葛藤タスク遂行時にFp1(前額部左脳)とFp2(同右脳)での脳賦活様態データも同時に収集した。日英バイリンガル幼稚園在園の日英バイリンガル2ー6歳児に加えて、統制群として国内在住の日本語モノリンガル2ー6歳児の104名からデータ収集を行った。年齢・識字率・バイリンガル園在園期間によるバイリンガル度を勘案して、モノリンガルとバイリンガルを年齢別に厳格に抽出して分析を行った。incongruent条件下での認知的葛藤タスク遂行時の行動データに関しては、2歳時にモノリンガルが優り、3歳以降6歳時までバイリンガル・モノリンガル間に差がないことが判明した。ただし、これら2タスク遂行時における脳賦活様態を精査したところ、左脳ではバイリンガルの優位性が4歳位までは顕著であった(右脳では5歳時のみ)。つまり認知的葛藤タスク遂行時のバイリンガル児の優位性は、言語間距離の遠い日英バイリンガル対象実験においても、4歳までのFp1と5歳時のFp2に見いだせた。これはBialystok et al. (2004)のバイリンガル優位説を支持するものであるが、一方でモノリンガルの優位性を示すPalmer (1972)やモノリンガル・バイリンガル間に差はないとするHilchey & Klein (2011)も支持する結果となった。今後の方針は、モノリンガルとバイリンガルを厳格な基準でマッチングすると、104名の園児からのデータが僅か18名にまで絞られてしまった今回の経験を生かして、比較対照できる被験者母数を増やすことが第一である。また、本研究を通して、僅か数人であるが2歳時より縦断的に5歳時までデータ収集を行えたので、個人差の激しいこの年齢層の貴重なデータとして横断データと比較検討したい。初年度に収集したデータの下分析が完了した段階で、年齢群ごとの平均値を出し、横断研究として年齢間にどのような差があるのかを探る。初年度データ収集できた園児から2年目縦断データ収集を行う。同時に統制群としての日本人モノリンガル園児からのデータ収集も行う。初年度データの下分析を通して不具合が露見した場合は、使用タスクを適切に改訂して実施する。
落語の談話構造的研究：「間」と「音調」

研究成果として、和文論文四本と英文論文五本を発表した。いずれも大学紀要または学会誌である。2011年三本、2012年二本、2013年三本、2014年一本という内訳である。また海外学会での口頭発表は四回、行った。2012年と2013年に各二回という内訳である。内容は、英語や日本語の冗句あるいは落語で語られる小咄や本題を音響分析したものである。研究二年目として、談話構造としての落語を言語学的に継続的に分析した。落語においては、小咄の音響分析に特に重点を置いた。この結果を英語と対照させるため、英語ジョークを対象とした音響分析も平行して行った。成果として、以下のように論文二本公刊と学会発表四回を挙げておく。角岡賢一「上方落語演題の意味的分類」『龍谷大学国際センター研究年報』第二十二号、49-69ページ。2013年3月。期間内に公表した業績のうちから、以下の四点を挙げておく。いずれも大学(研究所)の紀要に掲載された分である。掲載順は最新のものからである。海外学会での発表等は別掲とする。「落語「くっしゃみ講釈」における話芸語り口の音響分析」龍谷紀要第35巻第二号、pp. 21-47 2014年3月発行「上方落語演題の意味的分類」「龍谷大学国際センター研究年報」第二十二巻pp. 49-69 2013年3月発行研究成果として、和文論文四本と英文論文五本を発表した。当初の計画に沿って、対象とする落語や小咄、英語ジョークなどの音響分析を進めている。一年で複数本という論文刊行や年間複数回という学会発表は、量的に満足のできる実績を上げていると考えている。過去二年間で取り纏めると、紀要や研究所年報で刊行された論文は四本、海外学会での発表は四回である。他方では、分析の対象とする小咄や落語類の数が多いので、優先順位を付けて取り組む必要がある。研究計画で予定していたとおり、初年度は音響分析を中心として進めている。初年度に研究課題に即して公刊した論文は三本であり、ほぼ計画に沿って研究が進められていると考える。海外学会発表も、一回行った。これもほぼ当初の計画通りである。引き続いて落語や小咄、英語ジョークの音響分析を進める。今年は、英語ジョークの一形態としてスタンダップ・コメディーを取り上げる予定である。これは日本の漫談に近い話芸で、一人の演者が壇上でジョークを連ねていく。これまでに分析してきた英語ジョークの朗読と大きく異なるのは、舞台上あるいはテレビカメラを前にして演者が聴衆に語りかけるという点にある。その意味では、落語と共通する側面があると言えよう。研究成果の公表は、論文刊行と学会での口頭発表を中心に考えている。これまでの実績からは、紀要等への論文掲載は年間二本または三本、学会での発表は二回または三回を予定する。紀要等の単発論文では、ページ数の制限から小咄を三本か四本対象にするのが上限である。著書であれば、最大限十倍程度のページ数を前提とすることができる。刊行した論文が十本ほどに達した時点で、著書として成果を纏める予定である。二年目は、日本語の落語や小咄の音源を収集して音響分析を継続する。音源は、量的な面も考慮するー今まで以上に、多種の落語や小咄から音源を収集する方が望ましい。音響分析ソフトウェアの精度向上も課題の一つである。現在使用中のソフトウェアは、分析精度が不十分である可能性が考えられる。より精度の高い分析を行うため、新たなソフトウェアを使用することも模索してみたい。また費用面で許容される範囲内で、学会発表を通じて国内外研究者との交流を図りたい。最新の知見を取り入れ、本課題研究をより意義のあるものにするために、機会を多く作っていきたい。研究は三年目の最終年度であるので、相対的に論文公刊や学会発表に比重を移してゆくこととする。そのために英語で論文を執筆した際の英文校閲に要する費用、学会に出張するための旅費を支出する予定である。他方では、資料図書費を含む物品費や消耗品は最小限度に押さえる予定である。次年度は初年度より研究費補助額が減るので、より有意義に予算を立てる。学会発表等で国内研究者との交流を図るため、一定程度の旅費を確保する。海外学会への旅費については、当初より今回の科学研究費補助金で支出する予定ではなかったので、個人研究費などで手当てするものとする。備品は、研究書など資料購入を中心とする。
細胞内の化学反応を可視化する超高感度ラマン散乱増強微粒子の創製

ポリスチレンとアミン末端ポリブタジエンからなるコア-シェル型ポリマーブレンド微粒子を独自の微粒子作製法である自己組織化析出(Self-ORganized Precipitation, SORP)法により作製した。得られた微粒子の表面電位はアミン基により正に帯電していることから、負に帯電した金ナノコロイド粒子と混合することで、金ナノ粒子がシェルに高密度に充填された有機-無機コンポジット微粒子が得られることを見いだした。本微粒子が近赤外光励起によりラマン散乱シグナルを増強できることを証明し、ポリマー被覆した磁性ナノ粒子を導入することで磁場応答性を付与することに成功した。今年度は金ナノ粒子ーポリマーコンポジット微粒子の作製とその機能評価を行った。末端アミン基を持つポリブタジエンとポリスチレンからなるコアーシェル型微粒子を自己組織化析出法により作製し、金ナノ粒子分散液を加えることで、シェルに金ナノ粒子が密に詰まった微粒子を得た。金ナノ粒子のプラズモン吸収はもともと520nm付近に存在しているが、シェルに高密度に配列することにより、金ナノ粒子間のプラズモン共鳴がカップリングしたことで、近赤外領域まで吸収波長がレッドシフトした。このコンポジット微粒子にパラメルカプトフェノールを吸着させ、785nmの波長で励起した表面増強ラマンスペクトルを測定したところ、高感度に検出できることが明らかとなった。比較として用いたポリマー粒子や金ナノ粒子単独ではスペクトルが確認できない濃度であったことから、近赤外領域に吸収を持つことと、表面増強効果が効果的にラマンシグナルを増強した物と考えられる。さらに、コアに磁性ナノ粒子を導入したコンポジット微粒子の作製にも着手し、磁場応答性を持つコンポジット微粒子の作製にも成功した。末端官能基化したポリマーのテトラヒドロフラン溶液にシリカナノ粒子などの表面負電荷を持つナノ粒子の水分散液を加え、テトラヒドロフランを蒸発除去する事により、シリカナノ粒子と末端官能基化ポリマーのコンポジット微粒子が自発的に形成されることを明らかとした。さらに、末端官能基化ポリマーの分子量やポリマー種に依って、シリカナノ粒子の配列や存在部位が変化する事を明らかとした。具体的には、分子量の低いアミン末端官能基化ポリブタジエンを用いた場合、シリカ粒子はポリマー微粒子マトリクス中に包埋された構造となるのに対し、分子量の大きいアミン末端官能基化ポリブタジエンを用いた場合、シリカナノ粒子は粒子表面に偏析し、その結果、ナノ粒子が表面で最密充填した構造となることを明らかとした。アミン末端官能基化ポリスチレンを用いた場合も同様に表面にナノ粒子の偏析が見られたことから、この結果はポリマーの流動性に依存する減少であると考えられる。さらに、この知見はシリカ粒子に限らず、無機のナノ粒子をポリマー微粒子表面に高密度配列させることにつながる重要な発見である。また、従来のヘテロ凝集と異なり、ポリマー溶液から微粒子を作製させる際に同時にコンポジット化が行われるため、粒子表面の電荷を気にする必要は無く、また、溶液状態で麻座合わせるだけであるため、非常に簡便に高密度にナノ粒子が表面で配列したコンポジット微粒子を作製する手法を提供することになり、今後のプラズモン増強粒子の開発に重要な知見を得た。コンポジット微粒子の作製については予定を上回る速度で進行しており、順調に進捗している一方、細胞培養に関しては、研究代表者が組織を異動したため、培養設備の引き継ぎおよび異動に伴う実験の停止があり、進捗が若干遅れている。しかし、新年度からも継続して研究が行えるため、ほぼ順調に進捗していると言える。今年度は微粒子の内部相分離構造の制御と細胞培養系への展開を検討した。微粒子の内部相分離構造制御に関しては、ポリ(スチレン-ブロック-イソプレン)からなる微粒子を自己組織化析出法を用いて調整し、四酸化オスミウムによりポリイソプレン相を染色した後、透過型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡で観察トモグラフィー、走査型透過電子顕微鏡などにより構造の観察を行ったところ、サブミクロンサイズの微粒子は粒子サイズによってバルクとは全く異なる相分離構造を形成する事を見いだした。この相分離構造の妥当性を検討するため、セルダイナミクスシミュレーションを行い、実験を再現する結果が得られることを見いだし、論文に報告した。さらに、より多様な構造制御因子を明らかとするために、Cahn-Hilliard方程式を用いた3次元シミュレーションを行い、一軸ラメラ構造から突起状のミクロ相分離構造まで、多様な相分離構造を粒子内に形成できる事を明らかとした。細胞培養系への展開のために、細胞培養および将来的に移植医療への展開を考え、細胞培養基材として有用なハニカム多孔体を生分解性のポリ乳酸から作製した。ポリ乳酸は耐熱性が100°C以下であり、細胞培養系に必要なオートクレーブ滅菌を行う事が難しい。そこで、ポリ(L-乳酸)とポリ(D-乳酸)の混合溶液からハニカム多孔体を作製することにより、150°C程度まで構造を保持できるハニカム多孔体を作製することに成功した。

本微粒子が近赤外光励起によりラマン散乱シグナルを増強できることを証明し、ポリマー被覆した磁性ナノ粒子を導入することで磁場応答性を付与することに成功した。計画通りコンポジット微粒子の作製に成功しており、おおむね順調に研究は進展している。コンポジット微粒子の粒径制御と培養細胞への導入およびラマン散乱測定を着実に遂行する。28年度が最終年度であるため、記入しない。高分子化学磁性ナノ粒子を導入したコンポジット微粒子の表面増強ラマン散乱特性評価を行い、細胞導入に向けた基礎的な検討を行う。特に磁性によって粒子の分散、移動、集積をコントロールし、それによりラマン散乱スペクトルがどのような影響を受けるかについて検討を行う。昨年度は異動のため細胞培養を一時中断したこと、微粒子の構造制御に大きな進捗があったため、本研究項目に集中したことなどから、次年度以降に細胞培養実験を集中的に行うため次年度使用額が生じた。今年度購入予定の少額試薬の購入を次年度購入に変更したため。生じた次年度使用額を利用して、現在進捗が進んでいる微粒子を細胞に導入する実験を今後2年間で集中的に行う。上記の様に少額の変更であるため、ほぼ計画通り予算の使用を行う。
強磁場下非中性プラズマを用いた多粒子系の緩和過程に関する制御実験

磁化された純電子プラズマの集団的相互作用は渦運動とみなすことができる.紐状の鋭い密度分布(clumps)が対称性の高い配列に至る現象は「渦結晶」の名前で秩序の自己形成過程の代表として注目を受けている.しかし,どのような物理過程によって実現するのかは理解されていない.本研究においてはこれを渦糸の合体あるいは近接分離の分岐過程として捉え,初期分布を精密に制御しつつ緩和過程を細密に観測することにより,渦相互作用の間に背景の低密度の電子分布の中に形成される希薄な溝構造が合体を妨げる働きをすることを指摘した.(Soga, Phys.Plasmas2003)その一方で背景分布はclumpsの運動を規制してclumps間の配位が対称的となる位置にclumpsを導くことを実験的に示した.(Sanpei, Phys.Rev.2003)更にこの孤立した多粒子系に対して外部から回転偏波した波動によりトルクを与えた場合のプラズマの応答について詳細な実験と解析を行い,プラズマの密度分布と境界条件を満たす固有モードが,プラズマとの整合条件をある幅のなかで満たしながら,密度分布を圧縮することを観測した.(Soga, JPFRSERIES6(2004))この成果は外場との相互作用の中に生じる新しい緩和過程として,更なる展開が期待される.本物理課題を平衡分布形成と平衡間の遷移の研究まで展開するために,最大2.2Tの強磁場でプラズマを保持する実験装置を建設した.併行して強磁場下で鮮明な密度分布計測を行うために,明るくかつ歪みの小さい画像伝送用光学系を開発し,従来よりもはるかに微細に構造化した渦分布の計測に成功した.(Aoki, JJAP投稿2004)この計測技術を渦運動の特性と結びつけて磁気軸とトラップ軸とを高い精度で軸合わせする手法を開発し,本装置の調整に適用した.(Aoki, JJAP投稿2004)更に以上の成果を基礎に得た画像データに,新しく開発した高速ポテンシャル計算法(Kiwamoto, Phys.Plasmas投稿2004)を適用して,強磁場の下放物線状の真空ポテンシャルの中で,純電子群は回転楕円体状のPenning分布に近い平衡状態に緩和することを導出した.以上の成果はこれまでの研究水準を大きく高めると同時に,今後の実験研究が飛躍的に展開するための基礎を固めるものである.磁化された純電子プラズマの集団的相互作用は渦運動とみなすことができる.紐状の鋭い密度分布(clumps)が対称性の高い配列に至る現象は「渦結晶」の名前で秩序の自己形成過程の代表として注目を受けている.しかし,どのような物理過程によって実現するのかは理解されていない.本研究においてはこれを渦糸の合体あるいは近接分離の分岐過程として捉え,初期分布を精密に制御しつつ緩和過程を細密に観測することにより,渦相互作用の間に背景の低密度の電子分布の中に形成される希薄な溝構造が合体を妨げる働きをすることを指摘した.(Soga, Phys.Plasmas2003)その一方で背景分布はclumpsの運動を規制してclumps間の配位が対称的となる位置にclumpsを導くことを実験的に示した.(Sanpei, Phys.Rev.2003)更にこの孤立した多粒子系に対して外部から回転偏波した波動によりトルクを与えた場合のプラズマの応答について詳細な実験と解析を行い,プラズマの密度分布と境界条件を満たす固有モードが,プラズマとの整合条件をある幅のなかで満たしながら,密度分布を圧縮することを観測した.(Soga, JPFRSERIES6(2004))この成果は外場との相互作用の中に生じる新しい緩和過程として,更なる展開が期待される.本物理課題を平衡分布形成と平衡間の遷移の研究まで展開するために,最大2.2Tの強磁場でプラズマを保持する実験装置を建設した.併行して強磁場下で鮮明な密度分布計測を行うために,明るくかつ歪みの小さい画像伝送用光学系を開発し,従来よりもはるかに微細に構造化した渦分布の計測に成功した.(Aoki, JJAP投稿2004)この計測技術を渦運動の特性と結びつけて磁気軸とトラップ軸とを高い精度で軸合わせする手法を開発し,本装置の調整に適用した.(Aoki, JJAP投稿2004)更に以上の成果を基礎に得た画像データに,新しく開発した高速ポテンシャル計算法(Kiwamoto, Phys.Plasmas投稿2004)を適用して,強磁場の下放物線状の真空ポテンシャルの中で,純電子群は回転楕円体状のPenning分布に近い平衡状態に緩和することを導出した.以上の成果はこれまでの研究水準を大きく高めると同時に,今後の実験研究が飛躍的に展開するための基礎を固めるものである.一様磁場と電位障壁で捕捉された純電子プラズマが磁場方向に一様に分布して案内中心近似が成り立つならば,磁場と自己電場に直交して流れる電子の運動は巨視的には二次元の理想流体と等価であり,渦度が電子密度に流れ関数が等電位面に対応する.このような磁化プラズマを作り,渦相互作用による緩和過程を二次元画像としてとらえ,電磁気学を適用して定量的に解析を進めることが本年度の第1の課題である.この展開と併行して最大2.2Tの強磁場の中での実験に向けての整備が第2の課題である.第1の課題については次のような成果が得られた.

(1)最大19本の渦糸とその間を溝たす背景渦度分布を高い再現性で初期条件として設定し,その緩和過程を細密に追跡し解析した結果,さまざまな結晶構造の形成と転移が確認された.(2)背景渦度分布と渦糸の位置との関係や分布の形状に依存して,緩和の経路が違ったものとなる分岐現象が観測された.(3)渦間相互作用の発展段階で背景渦度の分布にさまざまな形とサイズの空乏域(渦孔)が形成される.それによる遮蔽効果で渦糸間の相互作用が大きく変更され,不揃いな強度の渦糸の配列が対称性を獲得することを実験的に示し,その渦孔の形成時間のパラメタ依存性について経験的な比例則を提案した.第2の課題については強磁場コィルの設計製作を完了し,実験配位に設定した.プラズマ閉込めの真空容器と電極構造の設計は完了し,現在は部品の製作に入っている.全体的に計画は前倒しで進めており,平成14年度夏には初期実験を開始できる態勢に入る.一様磁場と電位障壁で捕捉された純電子プラズマが磁場方向に一様に分布して案内中心近似が成り立つならば,磁場と自己電場に直交して流れる電子の運動は巨視的に見ると二次元の理想流体と等価であり,渦度が電子密度に流れ関数が等電位面に対応する.このような磁化プラズマを作り,渦相互作用による緩和過程を二次元画像としてとらえ,電磁気学を適用して定量的に解析を進めることが本研究課題の目的である.本年度の最大の目標は,最大2.2Tの強磁場下でこのような現象を展開させる装置を完成することである.第2の課題は,この作業と併行して補助装置において純電子プラズマが秩序構造を自己形成する過程の物理的解明を推進することである.第1の課題に関しては,(1)アルミ製の真空容器の中に軸方向に長短32個の円筒電極を数ミクロンの高精度で並べて,様々な電位分布を形成できるプラズマトラップを完成した.(2)5x10^<-9>Torrより低い高真空下において2.2Tで強く磁化された純電子プラズマの形成と良好な閉じ込めを達成した.現在の閉じ込め時間は数秒であり,残留ガスとの衝突で決まっている.これは真空壁のagingにより更に改善できる見通しである.(3)この装置において予備実験として37本の渦糸を初期分布として与えて,緩和過程において様々な渦結晶が自己形成されることを観測した.第2の課題については,(1)渦結晶の単位セルの形成過程の理解が大きく進んだ.(2)渦糸間の相互作用で合体と渦対形成の分岐点において鍵となる渦構造の同定に成功した.本計画の主要課題である強磁場下で閉じ込められたプラズマの生成と制御については,いくつかの問題点を克服しつつ,500秒の閉じ込め時間と渦運動で形成される微細な構造の観測を達成した.具体的には:純電子プラズマを閉じ込めるトラップを組み上げて初期特性を確認するところまでは平成14年度末に到達していた.これを受けて,最大2.2テスラの強磁場中で動的に変化する電子密度分を高い分解能で計測する実験基盤の確立が急務であった.計測と強磁場を両立させるため,高感度CCDカメラを弱磁場位置に移動して,そこまで電子数の2次元分布を輝度分布に変換した画像データを歪み無くかつ明るく伝送する光学系を設計・製作した.この結果,電子密度分布を512x512のピクセルに分解して(実空間分解能0.1mm)10:60000の線形的強度比で鮮明に得ることに成功した.この成果は修士論文としてまとめられ,欧文誌(Rev.Sci.Instrum.)に投稿した.
最大クレンチング時の血流が顔面表面温度に及ぼす影響について

最大クレンチング時の血流による顔面表面温度への影響を明らかにするため、20歳代の正常被験者10名に最大クレンチングを行わせ、側頭筋前部と咬筋中央部の表面温度と表面の血流を計測し、クレンチング前、中、後におけるそれらの変化を調べた。顔面表面温度は、現有の日本電気三栄社製サーモトレーサ6T67を用いて計測し、顔面表面の血流は、今回申請した日本光電社製レーザ血流計ALF21を用いて計測した。記録は、クレンチング前、クレンチング開始10,20、30秒後、クレンチング終了30秒後、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分後に行った。結果は、以下の通りである。1.側頭筋前部、咬筋中央部の顔面表面温度は、最大クレンチング時の側頭筋と咬筋の活動によって上昇し、活動の停止により徐々に下降し、クレンチング前の温度に回復した。2.側頭筋前部、咬筋中央部の顔面表面の血流は、最大クレンチング時の側頭筋と咬筋の活動によって上昇する傾向を示し、活動の停止により徐々に下降し、ほぼクレンチング前の血流に回復した。しかしながら、クレンチング中、特にクレンチング開始20秒後から30秒後にかけて血流が減少する被験者がみられた。また、血流が減少しても顔面表面温度は上昇していた。これらのことから、最大クレンチング時の血流による顔面表面温度への影響は、ポジテブであるものの、筋活動による顔面表面温度への影響よりも少ないと考えられる。
蛍光標識糖鎖ホルモンを利用した機能的受容体の定量法の確立と補充療法の有効性予測

Non-isotopic ligand binding assay法はligandに蛍光色素を効率よく結合させ、biotin-avidine結合とenergy transferを利用して赤色蛍光を発光させ、その蛍光量から細胞上の受容体数を定量しようとするものである。測定はflow cytometryを使用し、被爆等の問題が少なく、多くの施設で測定しうる方法である。私たちはこれまでligandを中心に本方法を成功させてきた。今回の研究ではNon-isotopic ligand binding assay法をホルモン受容体量の検出に広げ、これまで、RIAが抱える諸問題(被爆、施設の限定、臨床検体では得られにくい一定量以上の細胞数が必要なこと、アイソトープの使用期限など)を解決し、高感度かつ定量的に検出できることを試みた。TSHは標識に重要な糖鎖を保有し、遺伝子組み換えTSHが開発されたため、これを今回のモデルとした。rhTSHは臨床用に発売されているThyrogenを使用した。Kolmogorov-Smirnov解析中に利用されるD valueは蛍光標識TSHが特異的にその受容体に結合していた場合、有意に高値を示す。今回の実験ではD valueの最大値は0. 12と特異的に蛍光標識TSHが受容体に結合していた。臨床検体由来細胞のTSH受容体を高感度かつ定量的に測定するためにはD valueを0. 50以上にまで高める必要があり、今後さらに蛍光標識方法をはじめアッセイ法の改善をしていく必要がある。私達がこれまでに開発してきたnon-isotopic ligand binding assay法はサイトカインやホルモンに蛍光色素を標識し、細胞上の受容体と結合後、その蛍光量から細胞上の受容体数をフローサイトメトリー法にて定量しようよとするものである。本法は、ラジオアイソトープを使用しないため、施設の限定を受けず、再現性があり、煩雑性やコスト面からも優れている。本年度は、糖鎖を有するホルモン受容体の定量的解析法を確立することを目的とし、糖鎖を有するホルモンである甲状腺刺激ホルモン(TSH)とその受容体発現解析への応用を試みた。まず、遺伝子組換え型ヒトTSH(Thyrogen(R))をビオチン標識し、TSH依存性に増殖するTSH受容体発現細胞株であるFRTL-5細胞を用いて発現解析を試みた。TSHを除去した細胞培養液に変更し2472時間培養後、ビオチン標識遺伝子組換え型ヒトTSHと反応させた。その後、ストレプトアビジン標識PC5と反応させ、フローサイトメーターにて蛍光量を測定した。反応の温度、時間、濃度など実験条件を種々に設定して検討したが、TSHのTSH受容体への特異的結合による十分な蛍光強度の増強が見られなかった。このため、ビオチン標識部位、標識効率の向上、検出感度の増高、反応条件等についてさらに検討中である。また、同様な糖鎖を有するホルモンであるFSHについてもその受容体発現解析を適用するため検討を進めている。non-isotopic ligand binding assay法はサイトカインやホルモンに蛍光色素を標識し、細胞上の受容体と結合後、その蛍光量から細胞上の受容体数をフローサイトメトリー法にて定量しようよとするものである。本方法は、ラジオアイソトープを使用しないため、被爆の問題がなく、施設の限定を受けず、再現性があり、煩雑性やコスト面からも優れていると思われる。糖鎖を有するホルモン受容体の定量的解析法を確立することを目的とし、糖鎖を有するホルモンである甲状腺刺激ホルモン(TSH)とその受容体発現解析への応用を引き続き検討した。まず、遺伝子組換え型ヒトTSH(Thyrogen^[○!R])をビオチン標識し、TSH依存性に増殖するTSH受容体発現細胞株であるFRTL-5細胞を用いて発現解析を試みた。TSHを除去した細胞培養液に変更し、培養後、ビオチン標識遺伝子組換え型ヒトTSHと反応させた。昨年に続き、種々の条件を変えて特異性と感度をみたが、十分な蛍光量が得られなかった。このため、ビオチン標識方法に問題があると考え、標識方法を変え、改めて測定系を立て直した。

Thyrogenに関しては非常に高価であり、数メーカーへの資料の提供を依頼するも、成就せず、量的に限られた資料を使用した。新たにビオチン化したTSHに関して、受容体への結合の特異性、感受性を含めて、さらに検討する。サイトカインやホルモンに蛍光色素を標識し、細胞上の受容体と結合後、その蛍光量から細胞上の受容体数をフローサイトメトリー法にて定量しようよとするnon-isotopic ligand binding assay法は、ラジオアイソトープを使用しないため、被爆の問題がなく、施設の限定を受けず、再現性があり、煩雑性やコスト面からも優れている。これまで、G-SCF、Erythropoietin、Thrombopietinなどの糖鎖を保有するサイトカインを蛍光色素でラベルし、flow cytometer上で測定後、得られた標準曲線から、それぞれのサイトカインを定量した。その延長上で糖鎖を有するホルモン受容体の定量的解析法を確立することを目的とし、糖鎖を有するホルモンである甲状腺刺激ホルモン(TSH)とその受容体発現解析への応用を検討した。まず、遺伝子組換え型ヒトTSH (Thyrogen^[○!R])をビオチン標識し、TSH依存性に増殖するTSH受容体発現細胞株であるFRTL-5細胞を用いて発現解析を試みた。数週間のTSHを含んだ培地での培養の後、細胞の生存率等を検討したのち、TSHを除去した培地を変更し、2-5日間、培養後、ビオチン標識遺伝子組換え型ヒトTSHと反応させた。その後、ストレプトアビジン標識PC5と反応させ、フローサイトメーターにて蛍光量を測定した。今回は、蛍光ラベルの効率を上げたほか、インキュベーション時間等の条件を変えて特異性と感度を検討したところ、D valueとして、最大値が0,08と、これまでに比較して、蛍光量が増した。血清を使用した臨床応用では、D value値として、0,50以上必要とされる。ビオチン標識方法をさらに変更する必要があると考え、現在、測定系を立て直している。組み換えTSHであるThyrogenに関しては非常に高価であり、量的に限られた資料を使用した。Thyrogenを新たに購入し、TSHを新たにビオチン化し、さらに感度と特異性の向上を図りたい。
神経幹細胞の栄養因子による神経分化誘導と分化機構の解明による障害脳機能の再建

我々は、1)胚性幹(ES)細胞由来神経幹細胞(NSCs)のドパミン(DA)ニューロンへの分化誘導とその分化機構の解明、2)その細胞移植により障害脳機能を再建するための基礎的研究、に取り組み、以下の結果をえた。胚性幹(ES)細胞由来の神経幹細胞からドパミン(DA)ニューロンへより効率的な分化誘導条件を調べるため、まず、A)ES)細胞からDAニューロンへの5段階分化誘導培養法の厳密な培養条件を、免疫染色法およびPCRを用いて再検証した。その後、B)EBs細胞形成期(stage2)の培養細胞濃度および低酸素(3.5%)条件の検討、C)nestin陽性神経幹細胞の増殖段階(stage4)の低酸素条件および分化因子処置の検討、等を行った。その結果stage2における検討から、1)1×10^4/cm^2の細胞密度での培養が神経系およびDA分化効率が最も良いこと、2)低酸素条件では分裂能の低下のため比較的均一な小EBs塊が形成されること、3)stage2以降の低酸素条件培養によりDA分化効率が低下することが明らかになった。またstage4の検討から、4)低酸素条件ではより小さなneurosphereが形成されること、5)DA分化効率が促進されること、さらに6)DA欠如線条体で発現増加しているIL1βの処置によりDA分化が促進されること、また7)DA欠如線条体で発現が一定であるIL1αの処置ではDA分化促進は認められないこと、等が明らかになった。上記の結果は、主にチロシン水酸化酵素(TH)等の免疫染色による細胞カウントによるデータである。しかしwestern blot法ではTH蛋白の発現量は検出レベル以下であるので、ES細胞からDAニューロンへの効率の良い分化誘導と成熟したDA分化には、更なる工夫が必要であると考えられる。胚性幹(ES)細胞由来神経幹細胞からドパミン(DA)ニューロンへの分化は5段階のステップで誘導できる。すなわち、ES細胞の増殖(第一段階)、embryoid bodyの形成期(第2段階)、ネスチン陽性細胞のみの選別(第3段階)、ネスチン陽性神経幹細胞の増殖期(第4段階)、幹細胞から神経への分化(第5段階)である。神経幹細胞から効率良くチロシン水酸化酵素陽性のDAニューロンへ分化誘導させるため、nestin陽性神経幹細胞に対する低酸素条件およびサイトカインの影響を免疫染色法およびウェスターン法を用いて調べた。その結果、1、低酸素条件ではDAへの分化が1.83倍に促進される、2、DA欠如線条体で発現増加しているサイトカインの混合物(LIF, IL-1β,IL-11,GDNF)の処置によりDA分化が2.16倍に促進すること、3、サイトカイン混合物の中でもLIFの作用が最も大きいこと(1.97倍)、4、サイトカイン混合物および低酸素は相加的に作用しないこと、5、サイトカイン混合物および低酸素は神経幹細胞のBrdU取込みを促進すること、等が明らかになった。これによって、再生過程には発現増加するサイトカインや、正常発生を考慮に入れた低酸素条件が、DAニューロンの分化促進に関与することが明らかになった。また、中脳DAニューロンの発生に関与するwnt5a遺伝子のクローニング、PA6細胞へのwnt5a遺伝子導入に成功したが、wnt5a遺伝子導入PA6細胞とES細胞および中脳由来神経幹細胞と共培養によってDAニューロン分化が促進されるという結果は得られなかった。実験系の再考が必要と考えられ、現在検討中である。さらに、G1/S期に作用する細胞周期抑制剤の処置による神経分化の促進を報告したが、その分化促進機構の解析に関しては、cdk5およびp27の相互作用、MAPKシグナルの関与を中心に現在検討している。胚性幹(ES)細胞由来神経幹細胞からドパミン(DA)ニューロンへの分化誘導において、ネスチン陽性神経幹細胞(NSC)へ低酸素条件およびサイトカイン混合物(LIF, IL-1β, IL-11,GDNF)を処置し、免疫染色法等により解析した。その結果、低酸素条件およびサイトカインの混合物の処置によりDA分化は促進されるが、相加的に作用しないことから、共通のシグナルを介するDA分化の促進が考えられた。そのため、hypoxia inducible factor (HIF)-1αに注目し解析を進めた。低酸素およびLIFによりHIF-1α蛋白の増加が確認されたため、アンチセンス法によりHIF-1αを発現抑制させたところ、DAニューロンへの分化誘導が抑制された。すなわち、低酸素およびLIF処置によるNSCからDAニューロンへの分化誘導がHIF-1αを介した機構によることを証明した。一方、中脳由来神経幹細胞(neurosphere)から神経への分化機構に関して、G1/S期に作用する細胞周期抑制剤(deferoxamine : DFO)の処置によるp27^<kip1>を介する神経分化の促進を報告したが、cdk5,p35およびp27^<kip1>の相互作用を各遺伝子発現の時間経過やcdk5抑製剤を用い解析を行った。その結果、cdk5抑製剤(roscorvitin : RS)の処置によりDFOによる神径分化促進作用が消失した。

また、cdk5の局在は主に細胞質に、p27^<kip1>はの局在が主に核に発現することが観察された。この結果から、cdk5はp27^<kip1>の下流のシグナルにおいて神経分化に関与することが示唆された。以上、NSCからニューロン、さらにDAニューロンの分化機構において、p27^<kip1>、cdk5、HIF-1αが関与することが明らかになった。
音声・音楽情報を利用したビデオデータの自動構造化と検索技術研究

本研究では、ビデオ情報の局所的な特徴、大局的な特徴・分類手法を研究・開発し、ビデオデータ内の自動的なセグメンテーションを第1の目的とし、さらに、セグメンテーションされたクリップ(ビデオのあるまとまった部分区間)同士の局所的・大局的類似性等を利用し、ビデオデータの自動的な構造化を目指すものである。本研究においては、まずビデオデータ中の局所的な音響(映像)データの類似性を分析し、局所的特徴と大局的特徴を用いて,音声区間、音楽区間それぞれの自動判定を行う方式の研究を遂行し,同一楽曲内で繰り返される大局的音響特徴と音楽・音声の局所的音響特徴により音声・音楽の自動セグメンテーション方式を開発し,本方式の有効性を検証した。さらに、抽出された音声区間に対して、テキストあるいは音声を用いて検索語を設定することによりビデオ中の音声データの検索を行う手法(音声検索手法)についての研究を推進した。検索する言葉の検索のし易さを手掛かりとして、複数のサブワードを統合した検索手法の研究開発を行った。評価実験を通して、サブワードの自動統合方式としての有効性を検証した。これらの研究成果を国内外の学会で研究発表を行った。今後は、本研究成果の実応用化に向けた調査開発を推進する。本年度(平成18年3月31日)の研究では、まず、音響的な局所的特徴や大局的特徴の研究開発を中心に推進した。音声区間、音楽区間それぞれの判定を行う上で適切な局所的特徴パラメータについて性能比較実験を通して評価し、MFCCおよびクロマベクトル、およびSinusoidal Segmentの利用可能性を確認した。また、これらの局所パラメータを用い、同一楽曲内の同一フレーズや、音声区間内の繰り返される同一言葉等、大局的特徴を抽出する方法としてセグメンタル連続DP法を開発し、その動作を確認するとともに、音声区間と音楽区間のセグメンテーションの自動化を図った。さらに、音声区間が抽出されたものとして、音声区間に対する、音声検索手法についての研究を推進し、新しいサブワードモデルを導入することによって、辞書に依存しない自由な音声検索システムのプロトタイプを実現した。今後は、今年度有効性を確認した音響的な局所的特徴や大局的特徴の抽出方式の深化を目指すと共に、音楽・音声判定方式の高性能化、音声検索の高精度化、および利用者が検索・利用しやすいデータの構造化方式について分析・調査を推進する。この研究のベースとなる音声・音楽等で構成されたビデオデータの整備を行う必要があり、既存のビデオデータ、利用可能なビデオデータの調査、およびビデオデータの構築・公開に関する環境整備について検討していく予定である。本年度(平成19年3月31日)の研究では、まずビデオデータを分析し,昨年度の研究から得られた音響的な局所的特徴と大局的特徴を用いて,音声区間、音楽区間それぞれの自動判定を行う方式の研究を遂行し,同一楽曲内で繰り返される大局的音響特徴と音楽・音声の局所的音響特徴により音声・音楽の自動セグメンテーション方式を開発した。音素よりもさらに細かくした半音素、1/3音素など従来にない新しいサブワードモデルを開発すると共に、サブワード間の音響的な類似度を導入することによって、辞書に依存しない自由かつ高精度な音声検索システムの研究開発を行った。評価実験を通して、新しいサブワードおよびサブワード間音響類似度の有効性を検証し,国内外の学会で研究発表を行った。

今後は、ビデオのセグメンテーション技術の深化を目指すため、音楽・音声判定方式の高性能化、音声検索の高精度化、および利用者が検索・利用しやすいデータの構造化方式について分析・調査を推進する。本研究では、ビデオ情報の局所的な特徴、大局的な特徴・分類手法を研究・開発し、ビデオデータ内の自動的なセグメンテーションを第1の目的とし、さらに、セグメンテーションされたクリップ(ビデオのあるまとまった部分区間)同士の局所的・大局的類似性等を利用し、ビデオデータの自動的な構造化を目指すものである。本年度(平成20年3月31日)の研究では、まずビデオデータを分析し,昨年度の研究から得られた音響的な局所的特徴と大局的特徴を用いて,音声区間、音楽区間それぞれの自動判定を行う方式の研究を遂行し,同一楽曲内で繰り返される大局的音響特徴と音楽・音声の局所的音響特徴により音声・音楽の自動セグメンテーション方式を開発し,本方式の有効性を検証した。さらに、抽出された音声区間に対して、テキストあるいは音声を用いて検索語を設定することによりビデオ中の音声データの検索を行う手法(音声検索手法)についての研究を推進した。検索する言葉の検索のし易さを手掛かりとして、複数のサブワードを統合した検索手法の研究開発を行った。評価実験を通して、サブワードの自動統合方式としての有効性を検証した。これらの研究成果を国内外の学会で研究発表を行った。今後は、本研究成果の実応用化に向けた調査開発を推進する。
メチル水銀が示す脳選択的毒性に対するセクレトグロビンの役割

本研究では、メチル水銀曝露したマウスにおいて、脳組織での病理変化が認められる前に、脳特異的にセクレトグロビンSCGB3A1が発現誘導されることを見出した。また、マウス神経前駆細胞を用いた検討により、SCGB3A1が細胞外からの作用によってメチル水銀の毒性を軽減することも明らかとなった。さらに、転写因子NF-κBおよびTCF3がメチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導に関与することも判明した。以上の結果から、NF-κB/TCF3を介したSCGB3A1の発現誘導がメチル水銀毒性に対する生体防御システムとして重要な役割を果たしていると考えられる。メチル水銀は中枢神経に選択毒性を示すが、その毒性発現機構はほとんど明らかにされていない。本申請者は、メチル水銀投与によって脳特異的に上昇する蛋白質としてセクレトグロビン(低分子量の分泌性蛋白質)ファミリーに属するScgb3a1を同定している。本研究では、メチル水銀によるScgb3a1の発現誘導とメチル水銀毒性軽減との関係について培養細胞およびマウスを用いて検討した。メチル水銀によるScgb3a1の発現レベルの上昇はマウス神経前駆細胞(C17.2細胞)でも認められ、同細胞を用いて経時的に検討したところScgb3a1のmRNAレベルの上昇はメチル水銀による細胞死(アポトーシス)が引き起こされるより早い時点で認められた。また、メチル水銀を投与したマウスにおいて免疫組織学的な解析を行ったところ、脳組織での病理変化(神経細胞数の減少)が認められる前に、Scgb3a1の発現レベルの上昇が確認された。このことから、Scgb3a1の発現誘導は、少なくともメチル水銀によって細胞が障害された結果として認められる現象ではなく、メチル水銀曝露に対する細胞応答によるものと考えられる。また、siRNAによってScgb3a1の発現を抑制したところ、C17.2細胞のメチル水銀に対する感受性が上昇した。以上の結果からScgb3a1はメチル水銀曝露に応答して脳特異的に発現誘導される防御因子として働く可能性が考えられる。本申請者はメチル水銀によるSCGB3A1の脳特異的な発現誘導機構およびその毒性学的意義の解明を目指している。前年度までの検討によって、マウス個体レベルにおいて、メチル水銀による細胞死が引き起こされるより早い時点でSCGB3A1 mRNAレベルが脳特異的に上昇することを見出した。本年度は、メチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導が認められたマウス神経前駆細胞(C17.2細胞)を用いて発現誘導機構の解析を行った。これまでにSCGBファミリーの発現誘導にはMAPキナーゼ経路が関与していることが知られているが、本誘導機構にはMAPキナーゼは関与しなかった。本申請者らは転写因子NF-κBがメチル水銀によって活性化されることを明らかにしている。そこでメチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導におけるNF-κBの関与を調べたところ、NF-κBのサブユニットの一つのp65をノックダウンすることによってメチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導が部分的に抑制された。メチル水銀によってNF-κBの核内レベルが上昇し、SCGB3A1プロモーターへの結合量も増加したことから、メチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導にはNF-κBが部分的に関与していると考えられる。また、培地中へのリコンビナントSCGB3A1の添加はメチル水銀毒性に対して軽減効果を示した。したがって、分泌蛋白質であるSCGB3A1は細胞外からの作用によってメチル水銀の毒性を軽減することが示唆された。当該年度の検討により、メチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導に関わる転写因子としてNF-κBを見出すことに成功しており、本研究の目的であるメチル水銀によるSCGB3A1発現誘導機構解明に繋がる有用な知見を得ている。また、細胞外SCGB3A1がメチル水銀毒性を軽減することも見出しており、当初の研究目標達成のため順調に進展していると判断した。本研究では、メチル水銀を投与したマウスの脳特異的に発現誘導される分泌蛋白質セクレトグロビンSCGB3A1に着目し、その発現誘導機構およびメチル水銀毒性との関係について検討した。メチル水銀を投与したマウスにおいて、脳組織での病理変化(神経細胞数の減少)が認められる前にSCGB3A1の発現レベルの上昇が確認された。したがってSCGB3A1の発現誘導はメチル水銀によって細胞が障害された結果として認められる現象ではなく、メチル水銀に対する細胞応答によるものと考えられる。また、siRNAを用いたSCGB3A1の発現抑制によってマウス神経前駆細胞のメチル水銀に対する感受性が上昇し、培地中へのリコンビナントSCGB3A1の添加はメチル水銀毒性に対して軽減効果を示したことから、分泌蛋白質であるSCGB3A1は細胞外からの作用によってメチル水銀の毒性を軽減すると考えられる。また、メチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導に関わる転写誘導機構を解析し、ノックダウンによってメチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導を抑制する転写因子としてNF-κBおよびTCF3を同定した。また、NF-κBとTCF3は同一の経路を介してメチル水銀によるSCGB3A1の発現誘導に関与することも判明した。以上の結果から、NF-κB/TCF3を介したSCGB3A1の発現誘導はメチル水銀毒性に対する生体防御システムとして重要な役割を果たしていると考えられる。本知見は、メチル水銀が示す中枢神経選択的な毒性発現機構の解明に繋がることが期待される。