hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子発現スイッチ機構を持つ遺伝子治療用ベクターの開発

肝細胞癌、特に播種性および転移性肝癌の特異的遺伝子治療をめざしたアデノウイルスベクターの開発を行った。まず特異的プロモーターの発現特異性を厳密に発揮させる方法を検討し、プロモーターの上流にSV40由来のpolyA付加配列を配置することが効果的であるとの結果を得た。次に、部位特異的組換え酵素Creを肝癌に働くα-フェトプロテイン(AFP)プロモーターの支配下に、核移行シグナルを付加したCre遺伝子を発現するアデノウイルスである。次にCre酵素により、強力なCAGプロモーターから目的遺伝子(今回はLacZ遺伝子)を発現する「発現標的ウイルス」を作製した。このウイルスは、CAGプロモーター下流のLacZ遺伝子との間にポリA付加シグナルを含むスタッファー配列を介在させてある。このスタッファー配列の両側にあるCre認識配列(IoxP配列)によりCre存在下ではスタッファーが除去され、CAGプロモーターからの強力な発現がオンになる。この二種類のウイルスを同時に肝癌由来HepG2細胞へ感染させると、AFPプロモーターから直接発現させた場合と比較して、約50倍の発現増強がみられた。この際非癌細胞株では発現がほとんどみられず、プロモーターの特異性は保たれていた。またム-ドマウスにヒト由来肝癌細胞HuH7を接種し、播種性肝癌細胞の10-15%に特異的なLacZ遺伝子の発現を認め、正常肝細胞では全く発現を認めなかった。以上より本法は全身的あるいは臓器全体への投与により、播種性および転移性肝癌の将来の遺伝子治療法となる可能性を持っていると考えられた。部位特異的組換え酵素Creは標的配列である34塩基対のloxp配列を認識しloxp間のDNA配列を環状に切り出す作用を持つ。このCreを発現する組換えアデノウイルスを「分子のスイッチ」として用いることにより、遺伝子発現を特異的にONあるいはOFFにすることが可能である。本年度の研究では、肝癌特異的に発現するα-fetoprotein(AFP)プロモーターを用いてこのCre酵素を肝癌特異的に発現する組換えアデノウイルスを作製した。従来このプロモーターからの発現は肝癌特異的というメリットはあるが、発現が弱いのが欠点であった。そこでこの肝癌特異的Cre発現ウイルスを用いて、このプロモーターより500倍強力なCAGプロモーターから目的遺伝子の発現がONにできる制御ユニットを登載したアデノウイルスと同時感染を行う系を開発した。この方法で肝癌由来HepG2細胞では本来のAFPプロモーターに比較して約50倍高い発現量が観察された。またAFPを産生していないHeLa細胞においてはその発現量はHepG2細胞での1/200以下であり、発現特異性は極めてよく維持されていた。さらにこの強力かつ特異的は発現はヌードマウスを用いた実験的肝癌モデルにおいても同様に観察された。本法は特異的な肝癌の遺伝子治療法の開発にに有用と考えられ、特に自殺遺伝子療法と組み合わせることにより、播種性の肝癌や遠隔転移などで正常組織を傷つけずに肝癌細胞を特異的に死滅させる方法に道を開く可能性がある。播種性および転移性肝癌の特異的遺伝子治療をめざしたアデノウイルスベクターの開発を行った。まず部位特異的組換え醗酵Creを肝癌特異的に発現させる「制御ウイルス」を作製した。このウイルスは肝細胞特異的に働くα-フェトプロテイン(AFP)プロモーターの支配下に、核移行シグナルを付加したCre遺伝子を発現するアデノウイスルである。このスタッファー配列の両側にあるCre認識

配列(lox配列)によりCre存在下ではスタッファーが除去され、CAGプロモーターからの強力な発現がオンになる。この二種類のウイルスを同時に肝癌由来HepG2細胞へ感染させると、AFPプロモーターから直接発現させた場合に比較して、約50倍の発現増強がみられた。この際非癌細胞株では発現がほとんどみられず、プロモーターの特異性は保たれていた。またヌードマウスにヒト由来肝癌細胞HuH7を接種し、播種性肝癌モデルを作製して二重感染法によりウイルスを経静脈的に播種すると、播種性肝癌細胞の10-15%に特異的なLacZ遺伝子の発現を認め、正常肝細胞では全く発現を認めなかった。アデノウイルスベクターをマウスに投与する時静脈注入法を用いると、その発現はほとんど肝細胞に特異的に起こることから、本法は全身的あるいは臓器全体への投与により、播種性および転移性肝癌の将来の遺伝子治療法となる可能性を持っていると考えられた。
細菌進化の最適変異率の理論予測と実験検証

本研究は細菌の最適な突然変異率が決まる仕組みを、実験進化とモデルとの比較を通して明らかにするものである。まず、大腸菌の変異率を様々に操作し、実験進化を行って変異率と進化速度の関係を示す。その実験結果を数理モデルと比較し、変異率と進化速度との関係を決定するメカニズムを解明する。
ヒト脳よりのプロスタグランジンE合成酵素の精製とそれに対する抗体の作製

ヒト脳可溶性画分よりプロスタグラジンE(PGE)合成酵素を精製し、これに対する抗体を作製した。この抗体を用いてPGE合成酵素のサビユニット機構を解析し、ヒト脳切片でPGE合成酵素の免疫組織化学を行った。以下各々について詳述する。1.前年度の研究で確立した方法に従い、ヒト脳可溶性画分より2種類のPGE合成酵素(以下ピーク1及びピーク2酵素と称す)を精製し、それぞれを抗原としてウサギを免疫した。34回のブースター注射ののち、各々の酵素に対する抗血精を得た。2.得られた抗ピーク1及び抗ピーク2のポリクローナル抗体を用い、ピーク1及びピーク2酵素の異同及び各々のサブユニット構造を解析した。この2つの酵素はいづれも2量体であり、ピーク1は24.5Kと25Kの2つのサブユニット、ピーク2は25Kの見かけ上単一のサブユニットの2量体である。また、両酵素はPGE合成酵素活性のほかにグルタチオントランスフェラーゼ活性をもつなどの共通性がある。上記抗体を用いたイムノタイトレーションでは、抗体過剰域で抗ピーク1抗体はピーク1及びピーク2酵素に同程度結合した。しかし、抗ピーク2抗体は、ピーク1にはピーク2の半量しか結合しなかった。この結果は、ピーク1と2の25Kサブユニットが共通の抗原性をもつこと、ピーク1の他の24.5Kサブユニットはこれとは異なることを示唆するものと考えられる。3.上記の2つの抗体を用いて、手術時に得たヒト大脳皮質切片において免疫組織化学を行った。その結果、抗ピーク1抗体によって神経細胞が強陽性となった。また、アストログリア細胞にも陽性所見がみられた。一方、抗ピーク2抗体によっては、神経細胞にのみ陽性所見がみられた。
アポトーシス制御因子Bcl-2ファミリーの高次構造の解明

アポトーシス制御因子Bcl-xの高次構造を解明する目的でラットBcl-xを大腸菌で大量に発現させ、蛋白質として均一になるまで精製した。T7プロモーター下流にラットBcl-xcDNAを接続しlacプロモーター下流に接続したT7RNAポリメラーゼ遺伝子を発現させBcl-xを大量に発現させた。精製は、DEセルロースカラム、hydrophobicカラム、分子ふるいカラム、MonoQカラムによって精製した。MonoQカラムでは精製されたBcl-xは2本のバンドを示した。それぞれのバンドを示す蛋白質を均一に精製し結晶化した。そしてX線結晶解析を行ない、ついに立体構造を明らかにすることに成功した。基本的には、変性ヒトBcl-xを再生させて得た試料を用いて解析したFesikらの結果と同一であったがBcl-2ファミリー間でダイマーを形成するのに必要な領域BH2ドメインに違いがあった。Bcl-xの2本のバンドはAsn-Glyの配列のAsn残基の脱アミドによって生じることが判明した。Bcl-xにはAsn-Glyの配列が3箇所あり、少なくとも一箇所はBH2ドメインに存在するAsn-Gly配列は脱アミド化されていない。FesikらはBH2ドメインのAsn-Gly-Glyの配列は異常な構造をとっていると記載あれているが、私たちの決定した構造では特に異常な構造はとっていない。彼等の試料は変性再生の過程をへて精製されたので、BH2領域の脱アミドが生じた可能性が高い。したがって、解析に要した時間はかかったが、正確な立体構造を提出することができた可能性が高い。ついで、アポトーシスを促進するBaxの致死領域を決定した。この領域ではマウス細胞にアポトーシスを誘導した。また、アポトーシス誘導活性をもつ最小構造ではBcl-2によってアポトーシスの抑制が見られないことから、Bax自身にアポトーシス誘導活性があることが推定された。
パルボウイルスによる宿主遺伝子のエピジェネティクス

パルボウイルス群には各種動物に感染する固有のパルボウイルスが存在し、各ウイルスは胎児死亡、肝炎、造血障害、関節炎等の共通した病態を引き起こし、自己免疫病との関連も示唆されている。また、多くのパルボウイルスでin vivoおよびin vitroでの抗腫瘍活性が報告されているが、そのメカニズムは不明である。昨年度までに、パルボウイルスの抗腫瘍活性や病態形成に重要な役割を持つと考えられる非構造タンパク(NS)が宿主遺伝子のヒストンをアセチル化することにより、様々な形質の変化を誘導する可能性を示した。本年度は、パルボウイルス感染により形質の変化を生じたC58(NT) D/R細胞と親株であるC58(NT)D細胞において、DNAのメチル化の差異をRLGS法によりゲノムワイドに検索し、両細胞間で発現量の異なる2つの遺伝子を同定した。そのひとつである骨形成に関わる遺伝子について、上流域のCpG islandのメチル化状態を、Bisulfite Sequencing法により検討した。その結果、その遺伝子はC58(NT) D/R細胞において高度にメチル化され、発現抑制も確認された。この遺伝子産物は、骨形成因子BMPファミリーのBMP2,BMP4,BMP6等の機能を阻害することが報告されており、BMPのアンタゴニストとして作用すると考えられている。パルボウイルスNSによる宿主遺伝子のメチル化が、BMP/Smad経路の活性化状態を修飾し、腫瘍形成能に変化を誘導する可能性が示唆された。パルボウイルスは、胎児死亡、肝炎、造血障害、関節炎等を引き起こし、自己免疫病との関連も示唆されている。また、抗腫瘍活性が知られ、これらの病態や抗腫瘍活性とウイルス初期タンパクであるNSの関連が疑われているが、病態発現や抗腫瘍活性のメカニズムは未解明である。著者は、独自に分離した新規パルボウイルスがTリンパ腫細胞C58(NT)Dに感染した後、耐過細胞C58(NT)D/Rが出現すること、耐過細胞は、細胞接着性の亢進、アポトーシス抵抗性の獲得、造腫瘍性の低下などの形質変化を生じ、CNTFRαの発現亢進が見られた。また、その形質はウイルス消失後も子孫細胞に伝達した。そこで、NSにより宿主遺伝子がエピジェネティックな発現修飾を受けるとの仮説をたて、この証明のため、C58(NT)DをDNAメチル化阻害薬及びヒストン脱アセチル化阻害薬で処理した後、CNTFRαの発現を解析した。その結果、C58(NT)D細胞において濃度依存的にCNTFRαの発現が誘導され、CNTFRαの発現がDNAのメチル化やピストンのアセチル化により制御されていることが示唆された。さらに、NSを発現させたC58(NT)D及びC58(NT)D/RにおいてCNTFRα遺伝子のヒストンH3領域がアセチル化されていることをクロマチン免疫沈降法により確認した。本研究は、パルボウイルスNSが宿主遺伝子のヒストンをアセチル化することにより、様々な形質の変化を誘導することを初めて明確にし、このメカニズムが本ウイルスの多様な病原性や抗腫瘍性に関与することを示唆した。また、ウイルス因子が宿主遺伝子に対しエピジェネティックな修飾を行うことを示した報告はこれまでになく、ウイルスと宿主の相互関係を解釈する上で、新たな視点を提供するものである。
近接場マルチプローブ分光の基盤技術開発

本研究プロジェクトによって、近接場マルチプローブ分光技術、すなわち、光ファイバー先端に設けた微小開口から試料の微少領域を光励起し、数100 nm程度離れた場所からの光信号を別の微小開口プローブを用いて分光する技術の開発に成功した。これによって、半導体ナノ構造など光材料におけるキャリア・エキシトン・プラズモンなどの素励起の時間的・空間的な再結合ダイナミクスを可視化でき、光物性評価のための新しいツールが開発された。本研究は,微細加工された材料やデバイスそして生体細胞などの各部位へ近接場領域で光アクセス可能なマルチプローブヘッドを開発し,生成された励起子やキャリアの再結合によって生じるルミネッセンスなど,光ダイナミクスを測定するための基盤技術を開拓することを目的としている。平成21年度は,2ファイバー方式による近接場光学顕微鏡(D-SNOM)において,各ファイバーと試料表面間の距離や両ファイバー間の距離を独立して検出・制御する手法として2バンド変調法を開発し,装置の基本原理を特許出願した。また,緑色発光InGaN単一量子井戸において,イルミネーション(I)プローブによって光励起によって生成したキャリア・励起子が,異なる場所で発光していることを,コレクション(C)プローブによる分光測定により実証した。次に,光ファイバコアの径をいかに小さくできるか,また隣り合うファイバー間をどこまで接近させられるかについて,Maxwell方程式の有限差分時間領域(Finite Difference Time Domain : FDTD)計算による構造最適化を行うとともに,AuとAlの二段階蒸着と押し付けプロセスによって,表面が比較的平坦で耐剥離性に優れた微小開口作製プロセスを開拓した。さらに,短波長での分光技術の開発のために,チタンサファイア再生増幅装置と非線形光学システムを用いて,深紫外域短パルスレーザ装置を構築し,高品質AlリッチAlGaN/AlN量子井戸における,励起子の多体効果や電子正孔プラズマの輻射再結合ダイナミクスの測定に成功した。これらの成果は,速報として平成22年春季応用物理学会において報告した。マルチプローブ近接場光学顕微鏡のプロトタイプとして,2本のプローブを用いて,一方のプローブで試料を光励起し,もう一方のプローブでその周囲を走査し,発光を集光するデュアルプローブ近接場光学顕微鏡(DSNOM)を開発してきた.この方法では,検出プローブの開口直下のキャリアの発光(I_D)が検出できるため,開口外へ拡散した全てのキャリアの発光(I_<out>)を各局所領域の発光の総和,I_<out>=ΣI_Dと表すことができる.その結果,これまで空間平均になっていたIモードの発光(I_I)を,I_I=I_<I-C>+I_<out>=I_<I-C>+ΣI_Dと,さらに分解して表すことができる.したがって,プローブを通して局所的に励起されたキャリアが,周囲のポテンシャル分布の影響を受けて拡散していく過程を観測することができる.本年度は,緑色発光InGaN SQWのキャリア拡散過程の可視化に成功した.I-Cモードで発光強度が強い領域でキャリアの長距離拡散を観測し,また,その様な領域は,ポテンシャルバリヤによって囲まれていた.この結果から,ポテンシャル揺らぎは,キャリアの局在,アンチローカライズと作用するだけでなく,非発光中心へのキャリア拡散を効果的に抑制していることが判明した.さらに,強光励起時にキャリアオーバーフローによってこの抑制効果が働かなくなることも明らかにされ,発光ダイオードの高電流動作時の効率低下(Droop現象)機構の解明に大きなヒントを与えている.このように,我々の開発したDSNOM技術は,局所領域のポテンシャルプロファイルと,キャリアの拡散および再結合過程の関係を詳細に調べることができるため,フォトニクス材料,とくに量子ドットなどの不均一系材料でも有用な評価手法になると考えている.光材料中のキャリア・励起子・プラズモンなどの素励起状態の時間空間ダイナミクスを可視化するために、一方のファイバープローブ(Iプローブ)で光励起を行い、もう一方のファイバー(Cプローブ)で光測定を行うデュアルプローブ近接場光学顕微鏡(Dual probe scanning near-field optical microscope : DSNOM)の開発を推進している。DSNOM測定において最も重要な技術は、ファイバー間の距離(d)と各ファイバーと試料の間の距離(h)を独立して制御することにある。そのため、両ファイバーに取り付けたチューニングフォークの共振周波数(32.7kHz)とは別に、Cプローブに周波数(100Hz)で変調振動を加え、両プローブに発生したシア・フォースを検出する手法(Dual band mdulation : DBM)を考案・実証した。このような発想は従来ないものであり、特許出願(特願2011-519892、PCT出願中)とともに装置の構成やファイバー構造・近接技術の詳細について、Review of Scientific Instrumentationにフルペーパーとして投稿中である。さらに,Ag薄膜およびAg細線(幅3.4μm)における表面プラズモンポラリトン(Surface plasmon polariton : SPP)伝搬をDSNOMによって可視化した。

薄膜の場合にはSPPが同心円状に広がって伝搬しているのに対し、細線の場合には,干渉縞が形成されており、伝搬距離が長くなっている。これは、細線端でSPPが反射し,もとの波と干渉したためだと考えられ、SPPの波としてのコヒーレンスが顕在化している例として興味深い(Applied Surface Science印刷中)。近接場光学顕微鏡(SNOM)や共焦点顕微鏡によるフォトルミネッセンス(PL)マッピングにより,極性面上の緑色発光InGaN量子井戸(QW)の光物性を評価した。測定試料としては,(1)緑色レーザダイオード(LD)と同様の成長条件でGaNバルク基板上に作製したInGaN QWと(2)従来の成長条件でサファイア基板上に作製したInGaN QWである。PLピークエネルギーの励起エネルギー密度依存性や温度依存性の解析から,(1)の試料では,σ=20-25meVと,(2)の試料のσ値(約100meV)よりも大幅に抑えられていることが分かった。また,(1)では,数100nmスケールでの発光空間分布が均一化するとともに,波長分布幅2nm((2)の波長分布幅は20nm)と,大幅に抑えられていることが示された(Appl. Phys. Exp. 6, 111002 (2013).)。また,極性面上への緑色LDの光利得スペクトルを,縦モード解析(ハッキ・パオリ法)によって評価した。その結果,内部ロスが10cm-1と従来の値の半分以下に低減しており低閾値化の大きな要因となっていること,光閉じ込め係数Γ=0.006と紫色青色LD(Γ=0.016-0.03)と比較して大幅に小さく,微分モード利得が小さいことが,高出力化に不利な要因となっていることが明らかにされた。また,光利得のフィッティングの際に用いられた,ポテンシャル揺らぎの指標σgが,σg=95meVとσ=20-25meVと比較して大きく,PL弱励起によって評価された裾準位のポテンシャル揺らぎσと,高密度に注入されたキャリアが状態密度にある程度フィリングされた際に生じるポテンシャル揺らぎσgは異なっており,前者は局所的な局在を,後者はもう少し大きな空間階層で生じるポテンシャル揺らぎを,反映していることが定量的に示された(Appl. Phys. Exp. 6, 122704 (2013).)。昨年度は,2探針ファイバープローブタイプの近接場光学顕微鏡(DSNOM)において,光学シミュレーション(FDTD法)による光ファイバー構造の最適化や同期2バンド変調法(Synchronous-DBM)法による2ファイバー間の精密距離制御など,装置開発に関して,論文の発表(Rev. Sci. Instrum., 83, 083709/1-11, (2012).)を行った.また,(1)温度ドリフト抑制のため温度環境を±0.1°Cとするためのブース設置,(2)チューニングフォークへの反共振補償回路の実装,(3)静電容量センサーを用いたピエゾ素子の位置制御・精度の向上などにより,装置の性能と安定性を高めることに成功した.
抗ヒスタミン薬を応用した新しい抗ブラキシズム療法の確立

顎関節症患者への抗ヒスタミン薬の治療効果に基づき,筋活動がヒスタミン合成酵素(HDC)の発現を介して,運動機能の維持と痛みにも関与するとの仮説に基づき実験を行った.咀嚼様運動をマウスへと負荷した結果,咬筋でのHDCのmRNA発現と活性が咬筋運動量と相関して上昇した.抗ヒスタミン薬(ピリラミン)投与で咬筋活動量は低下したため,ヒスタミン関連遺伝子欠損マウスを用いて同様に検討を行った.結果,ヒスタミン関連遺伝子欠損マウスでは,咬筋運動量が有意に低下した.以上の結果は,ブラキシズムといった過剰な咬筋活動により生産されるヒスタミンが微小循環を維持する役割を担う反面,遅発性疼痛に関与することを示唆する.顎関節症患者への抗ヒスタミン薬の治療効果に基づき,筋活動がヒスタミン合成酵素(HDC)の発現を介して,運動機能の維持と痛みにも関与するとの仮説に基づき実験を行った.咀嚼様運動をマウスへと負荷した結果,咬筋でのHDCのmRNA発現と活性が咬筋運動量と相関して上昇した.抗ヒスタミン薬(ピリラミン)投与で咬筋活動量は低下したため,ヒスタミン関連遺伝子欠損マウスを用いて同様に検討を行った.結果,ヒスタミン関連遺伝子欠損マウスでは,咬筋運動量が有意に低下した.以上の結果は,ブラキシズムといった過剰な咬筋活動により生産されるヒスタミンが微小循環を維持する役割を担う反面,遅発性疼痛に関与することを示唆する.ブラキシズムは顎関節症の増悪因子であり,筋・筋膜症状を悪化させる.特に睡眠時のブラキシズムへの対応は,臨床的に困難であることが多い.しかしながら,治療法はスプリント装着という対症療法のみであり,他の治療選択肢は見当たらない.申請者らは,顎関節症に伴う筋症状に抗ヒスタミン薬が著効することを示したが,近年,抗ヒスタミン薬に過剰な筋活動を抑制する効果があることも見出した.本研究ではブラキシズム患者への抗ヒスタミン薬の抑制効果を示すことで,対ブラキシズムの新規治療法を確立することを目的として行った.まず、筋活動への影響を確認するため,強制歩行モデルを用いた抗ヒスタミン薬投与に伴う疲労耐性への影響について検討を行った。Balb/c雄性マウス(5-7週齢)にFexofenadine (4mg/kg BW in Saline)を腹腔内投与後に強制歩行を行わせた。その結果、抗ヒスタミン薬を投与された群では有意に早期に歩行を停止し、易疲労性となることが明らかとなった。その起因メカニズムとして、ヒスタミンによる微小循環維持機構の阻害が考えられた。まず、エバンスブルーを用いた血管浸透性の検討を行った。尾静脈より1%エバンスブルー染色液を注入し,摘出した大腿四頭筋に等量のホルムアミドを加え,over nightで組織移行した染色液を抽出し,比色法により筋組織の血管浸透性について評価を行った.しかしながら、それによる有意な差は認められなかった。次に、筋組織内のグリコーゲン量に関しては、抗ヒスタミン薬の投与による有意な減少が認められた。加えて、ヒスタミンにより誘導されるとの報告のある内皮型一酸化窒素合成酵素の発現、および酸化窒素代謝物量が低下していることから、抗ヒスタミン薬が歩行程度の生理的運動において、その筋活動を阻害する可能性が示された。以上の結果は,臨床試験から得られるであろう筋活動の減少と顎関節症状の改善という結果を裏付けるものと考えられる.ブラキシズムは顎関節症の増悪因子であり,筋・筋膜症状を悪化させる.特に睡眠時のブラキシズムへの対応は,臨床的に困難であることが多い.しかしながら,治療法はスプリント装着という対症療法のみであり,他の治療選択肢は見当たらない.申請者らは,顎関節症に伴う筋症状に抗ヒスタミン薬が著効することを示したが,近年,抗ヒスタミン薬に過剰な筋活動を抑制する効果があることも見出した.本研究ではブラキシズム患者への抗ヒスタミン薬の抑制効果を示すことで,対ブラキシズムの新規治療法を確立することを目的として行った.これまで,筋活動への影響を確認するため,マウス咀嚼運動モデルを用いた抗ヒスタミン薬投与に伴う疲労耐性への影響について検討を行い,Fexofenadine(4mg/kgBW in Saline)の腹腔内投与により,有意に咀嚼運動を減少させ,易疲労性となることが明らかとした.その起因メカニズムとして,ヒスタミンによる微小循環維持機構の障害が考えられた.これを本研究の仮説基盤とし,本年度はヒスタミン関連遺伝子(ヒスチジン脱炭酸酵素:HDC,およびヒスタミン受容体1:H1R))欠損マウスにおける咀嚼運動の動態について検討を行った.筋組織内のグリコーゲン量に関しても,上記のマウスでは運動後の有意な減少が認められた.加えて,ヒスタミンにより誘導されるとの報告のある内皮型一酸化窒素合成酵素の発現,および酸化窒素代謝物量が上記のマウスでは低下していることから,抗ヒスタミン薬投与マウスで認められる咀嚼運動減少同様に,咀嚼筋活動を阻害する可能性が示された.以上の結果は,臨床試験から得られると予想される,ブラキシズムに伴う筋活動の減少と顎関節症状の改善という結果を裏付けるものと考えられる.ブラキシズムは顎関節症の増悪因子であり,筋・筋膜症状を悪化させる.

特に睡眠時のブラキシズムへの対応は,臨床的に困難であることが多い.しかしながら,治療法はスプリント装着という対症療法のみであり,他の治療選択肢は見当たらない.申請者らは,顎関節症に伴う筋症状に抗ヒスタミン薬が著効することを示したが,近年,抗ヒスタミン薬に過剰な筋活動を抑制する効果があることも見出した.本研究ではブラキシズム患者への抗ヒスタミン薬の抑制効果を示すことで,対ブラキシズムの新規治療法を確立することを目的として行った.前年度,筋活動への影響を確認するため,強制歩行モデルを用いた抗ヒスタミン薬投与に伴う疲労耐性への影響について検討を行い,Fexofenadine(4mg/kgBW in Saline)の腹腔内投与により,有意に早期に歩行を停止し,易疲労性となることが明らかとした.その起因メカニズムとして,ヒスタミンによる微小循環維持機構の障害が考えられた.これを本研究の仮説基盤とし,本年度は咀嚼運動における影響について検討を行った.マウスを円筒形の筒に閉じ込め,筒前にプラスチック板を装着すると,自発的な咀嚼様運動が観察される.抗ヒスタミン薬投与により咀嚼様運動の活動量が有意な減少を示した.エバンスブルーを用いた血管浸透性による筋組織の血管浸透性について検討を行ったが,有意な差は認められなかった.次に,筋組織内のグリコーゲン量に関しては,抗ヒスタミン薬の投与による有意な減少が認められた.加えて,ヒスタミンにより誘導されるとの報告のある内皮型一酸化窒素合成酵素の発現,および酸化窒素代謝物量が低下していることから,抗ヒスタミン薬がマウスで認められる咀嚼様運動において,その筋活動を阻害する可能性が示された.これらは,臨床試験から得られた,顎関節症状の改善という結果を裏付けるものと考えられる.ブラキシズム(Brx)は顎関節症の増悪因子であり,筋・筋膜症状を悪化させる.特に睡眠時のBrxへの対応は,臨床的に困難であることが多い.しかしながら,治療法はスプリント装着という対症療法のみであり,他の治療選択肢は見当たらない.申請者らは,顎関節症に伴う筋症状に抗ヒスタミン薬が著効することを示したが,近年,抗ヒスタミン薬に過剰な筋活動を抑制する効果があることも見出した.本研究ではBrx患者への抗ヒスタミン薬の抑制効果を示すことで,対Brxの新規治療法を確立することを目的として行った.前年度までに、組織内で産生されるヒスタミンの筋活動への影響を確認するため,強制歩行モデル,およびマウス咀嚼運動モデルを用いた抗ヒスタミン薬投与に伴う疲労耐性への影響について検討を行い,Fexofenadine(4mg/kgBW in Saline)の腹腔内投与により,有意に早期に筋活動を停止することが示されている.また同様に,ヒスタミン関連遺伝子(ヒスチジン脱炭酸酵素:HDC,)欠損マウスにおいても,強制歩行および咀嚼運動の両方で易疲労性が示された.その起因メカニズムとして,IL-1-ヒスタミン誘導系による微小循環維持機構の障害が考えられた.これを本研究の仮説基盤とし、本年度は咀嚼運動における影響について検討を行った。筋組織内のグリコーゲン量に関しても,抗ヒスタミン薬の投与による有意な減少が認められた.加えて,ヒスタミンにより誘導される内皮型一酸化窒素合成酵素の発現,および酸化窒素代謝物量が低下し,外的なIL-1投与(iv. 200pg/ml)による回復が確認されたことから,抗ヒスタミン薬がマウスで認められる咀嚼様運動において,その筋活動を阻害する可能性が示された.以上の結果は,臨床試験から得られるであろうブラキシズムに伴う筋活動の減少と顎関節症状の改善という結果を裏付けるものと考えられる.26年度が最終年度であるため、記入しない。
Wnt/β-Cateninシグナルを介したCD4T細胞自己応答性の制御

本年度の一連の研究で、CD4T細胞ではTGFb/IL-6刺激によってb-cateninシグナルが活性化することを見出した。TGFb/IL-6はTh17細胞分化に必要なサイトカインであることから、Th細胞サブセット間でのb-cateninシグナルの標的分子の発現を検討したところ、Th17細胞においてその発現が最も高く、次いでiTreg細胞で高いことが分かった。さらに、活性化b-cateninをTh2細胞に強制発現することで、Th17細胞分化のマスター転写因子であるRORaとRORgtの発現が誘導されることが明らかとなった。これらの結果は、Th17細胞分化にb-cateninシグナルが非常に重要な役割を担っている可能性を示唆している。T細胞において、b-cateninは転写因子Tcf7やLef1と結合してその作用を発揮すると考えられている。そこで、ドミナントネガティブTcf7をTh17細胞分化条件下のCD4T細胞に導入し、Tcf7/Lef1/b-catenin複合体のTh17細胞分化における役割の検討を行ったが、驚いたことにTh17細胞分化およびRORa/RORgtの発現は、ドミナントネガティブTcf7の導入では抑制されなかった。さらに、siRNAでTcf7をノックダウンしてTh17細胞分化に対する影響を解析したが、それでも抑制作用は認められなかった。以上の結果から、Th17細胞にはTcf7/Lef1以外にもb-cateninと結合して転写を活性化できる転写因子が存在すると考え、現在その分子を検索中である。Wnt/β-cateninシグナル伝達経路は進化上広く保存されており、発生や形態形成など多くの生命現象で重要な役割を果たしているとともに、癌をはじめとした様々な疾患の発症に深く関わっている。しかし、免疫細胞においてWnt/β-cateninシグナルは、T細胞やB細胞の初期分化に関与することが分かってはいるが、末梢T細胞における役割や免疫疾患発症への関与についてはほとんど解析がなされてない。そこで本年は、末梢T細胞応答性の制御におけるWnt/β-cateninシグナルの役割について解析を行った。まず、ヘルパーT(Th)細胞サブセット(Th1, Th2, Th17, iTreg)間におけるβ-cateninシグナル活性化状態の違いについてβ-cateninシグナル標的分子の発現を指標に検討を行い、β-cateninシグナルが、Th17細胞で特異的に活性化してる可能性を見いだした。現在、入手したWnt/β-cateninシグナルレポータートランスジェニックマウスを用いて、Th17細胞特異的β-cateninシグナルの活性化を確認している。また、β-cateninシグナルの活性化因子のWnt(Wnt1, Wnt3a, Wnt4)がTh17細胞で高発現していることが分かった。Th17細胞は、炎症性疾患の発症に関与するThサブセットであることから、Wnt/β-cateninシグナル活性化が炎症反応に何らかの役割を担っている可能性が示唆された。これらの新知見は、炎症疾患発症の分子機構を理解し、新しい治療法を考える上で極めて有用である。
次世代シークエンサーを用いた骨髄腫におけるnon-coding RNAの役割解析

多発性骨髄腫(MM)前がん病変MGUS、難治性骨髄外形質細胞腫(EMM)を対象に、non coding RNAが疾患進行にどのように関わるのかを次世代シークエンサーRNA-seqで解析した。その結果MALAT1とNEAT1がMMとEMMでMGUSより高発現しており、特にMALAT1はEMMでMMより数千倍も高発現していた。MM細胞株でMALAT1をノックダウンしたが、細胞増殖、細胞運動遺伝子発現には変化は認められなかった。MALAT1、NEAT1発現量はボルテゾミブとドキソルビシンにより増加した。薬剤ストレスによって誘導されたMALAT1やNEAT1がEMM形成に関わることが示唆された。【目的】long non-coding RNA(lncRNA)は数百から数十万塩基にも及ぶ、タンパク質をコードしないRNAで、クロマチン制御、転写制御、核内構造体タンパク質輸送などに関与することが明らかにされつつある。本研究ではこの2つのlncRNAの多発性骨髄腫における発現を比較検討した。【方法】多発性骨髄腫由来の細胞株(9株)および、同意を得て採取したMM患者71名、MGUS患者27名、正常対照として顕微鏡的に異常がないと判断された悪性リンパ腫患者11名の骨髄由来の単核球(CD138陽性細胞)を用いてRNAを抽出し、qPCRにてANRILとMALAT1の発現量の定量を行った。【結果】細胞株においてANRILはKMS18、OPM2、KMM1で、MALAT1はKMS12BM、OPM2、KMS12PEで高発現であった。また、ANRILは正常形質細胞には全く発現しておらず、発現量の平均値を比較するとMM患者群(5.351±25.117)がMGUS患者群(0.432±1.861)と正常対照群に対し、有意に高値(ともにp≦0.001)を示した。MALAT1の発現量の平均値は、MM患者群(12.333±17.251)がMGUS患者群(6.128±10.816)と正常対照群(1.909±1.571)に対し有意に高値(p=0.002、p=0.015)を示した。【結論】患者群で比較した結果より、この2種のlncRNAは多発性骨髄腫において高発現していること、またMGUSよりもMMでより高発現であったことからMMの進行に関与することが示唆された。現在次世代シークエンサーIllumina-Nextseq500を用いて、網羅的RNA発現解析を施行中である。我々はMALAT1がMMにおいてMGUSおよび正常の形質細胞(PC)より高発現すること、一例の髄外形質細胞腫(EMD)でさらに高発現すること、しかしMM細胞株におけるMALAT1ノックダウン(KD)は細胞増殖には影響しないことを報告した。MM患者の生存期間は新規薬剤などにより延長してきているが、その晩期に発生する難治性EMDと治療薬との関連も示唆されている。そこで今回、さらに5例のEMDにおけるMALAT1発現、予後との関連、MM細胞株における抗腫瘍薬のMALAT1発現への影響、MALAT1によって制御される遺伝子などを検討した。対象はMM患者112名、MGUS患者48名、正常対照19名のCD138陽性細胞、EMD 5名、MM細胞株。RQ-PCRにてMALAT1発現を定量した。MM細胞株にボルテゾミブ(Bor)、ドキソルビシン(Dox)を投与しMALAT1発現を、さらにMALAT1をKDし細胞運動性遺伝子などを検討した。EMDにおけるMALAT1は、MMの骨髄内PCと比較し、有意に高発現だった(p<0.001)。またEMDとの関連が示唆され予後不良の染色体異常t(4;14), del(17p)をもつMMにおいて、MALAT1は有意に高発現であった(p=0.049、p=0.03)。MALAT1高発現患者のOSおよびPFSは短い傾向が見られた。MM細胞株にBor、Dox投与により、MM細胞株のMALAT1発現は増加した。MALAT1KDでは今回検討した細胞運動性遺伝子に変化は見られなかった。さらに次世代シークエンサーを使用し、MALAT1のシークエンスおよびそれ以外のlong non-coding RNA発現の検討し、多くの未知、既知のlong non-coding RNAを発見した。上記のような結果を得られているが、次世代シークエンサーの結果が膨大であるためその解釈に手間取っている。多発性骨髄腫およびその前がん病変であるMonoclonal Gammopahty of Undetermined Significance (MGUS)、さらに骨髄外形質細胞腫を対象に、long non coding RNAがその病態進行にどのように関わるかについて検討を行った。3名の急性白血病寛解期の患者(コントロール)、10名の多発性骨髄腫、8名のMGUSの患者骨髄からCD138抗体と磁気ビーズを用いて形質細胞を純化しRNAを抽出した。5名の骨髄外形質細胞腫から採取した形質細胞からもRNAを採取し、Illumina Next-seqを使って、long non coding RNAも含んだ全トランスクリプトーム解析を行った。その結果、既知のLong non coding RNAとしてMALAT1/NEAT2およびNEAT1が、多発性骨髄腫および髄外形質細胞腫で高発現していることが判明した。

これを定量PCR法にて確認したところ、同じ結果であり特に髄外形質細胞腫検体では同一患者より採取したこつずい形質細胞よりも数千倍高値であることが判明した。次に骨髄腫細胞におけるMALAT1の機能を知るため、single strand antisense RNA LNA GapmeR用いて、骨髄腫細胞株のMALAT1発現を低下させたが、細胞増殖や既報にあった細胞運動性遺伝子の発現には差は認められなかった。患者骨髄検体のMALAT1はHSP90の発現量と正相関し、細胞株においてはプロテアソーム阻害薬ボルテゾミブやドキソルビシンといった骨髄腫治療に用いられる薬剤投与でその発現は著しく増加した。髄外形質細胞腫は骨髄腫治療の後期に出現することが多い治療抵抗性の腫瘍であり、薬剤投与のストレスによって誘導されたMALAT1がその形成に関わることが示唆された。多発性骨髄腫(MM)前がん病変MGUS、難治性骨髄外形質細胞腫(EMM)を対象に、non coding RNAが疾患進行にどのように関わるのかを次世代シークエンサーRNA-seqで解析した。その結果MALAT1とNEAT1がMMとEMMでMGUSより高発現しており、特にMALAT1はEMMでMMより数千倍も高発現していた。MM細胞株でMALAT1をノックダウンしたが、細胞増殖、細胞運動遺伝子発現には変化は認められなかった。MALAT1、NEAT1発現量はボルテゾミブとドキソルビシンにより増加した。薬剤ストレスによって誘導されたMALAT1やNEAT1がEMM形成に関わることが示唆された。次世代シークエンサーによる網羅的RNA発現解析は、当初当大学に導入済みであったIon Protonを使用して施行予定で、実際数例のサンプルについては、解析を開始していた。しかし本年1月から、より高性能なIllumina社の次世代シークエンサーNextSeq500が導入されたことから、本年の解析をこちらのプラットホームに移行した。そのため若干作業が遅れたが、RQ-PCR法や遺伝子導入による作業は概ね予定通り進捗しているため、やや遅れているとした。血液内科学血液検査学引き続き、骨髄検体を収集し、次世代シークエンサーによる解析を進める。また形質細胞腫など骨髄外のサンプルや、治療経過中のサンプルについても検討を行う予定である。可能であれば内外の研究者を連携を図って研究のスピードアップを図りたい。旅費として計上していた50,000円を、学内業務により出張の日程が確保できなかったため当該年度では使用せず、次年度に繰り越しとなった。次年度あるいは、次次年度において、血液学会において成果発表と情報収集の目的で使用予定
将来のCP対称性の測定に向けた新しいビーム強度測定器の開発

本研究の目的は、J-PARCで行われているニュートリノ振動実験(T2K実験)を発展させた将来の実験での「ニュートリノでの粒子・反粒子対称性(CP対称性)の破れ」の発見感度の向上である。本研究では、将来のCP対称性の破れの測定実験に向けて、新しいビーム強度測定器の開発を行い、T2K実験でニュートリノ(反ニュートリノ)ビーム中の反ニュートリノ(ニュートリノ)の割合を間接的に測定して、これまでのハドロン生成分布の測定結果と合わせてニュートリノや反ニュートリノビームの組成の違いを小さな不定性で求める事で目的の達成を目指す。今年度は、これまでの測定から得られたニュートリノや反ニュートリノの親粒子(ハドロン)の生成分布を用いて、ニュートリノ・反ニュートリノの生成シミュレーションを行い、ビーム中のニュートリノや反ニュートリノ成分の割合を実験データに基づいて見積もった。本研究課題で開発する測定器は、ニュートリノ生成の際に同時に生成される正電荷ミューオンと、反ニュートリノ生成の際に生成される負電荷ミューオンの収量の差を測定する。この収量やミューオン以外の粒子の収量についても、実験データに基づいて詳細な見積もり評価を行った。今後は、ビームラインへの設置を進めて、ニュートリノビーム、反ニュートリノビームでの測定を行い、ハドロン生成分布に基づく見積もりとの比較を行い、理解を進めていく。本研究の目的は、T2K実験(当該領域:A04)を発展させた将来の実験において、「ニュートリノでの粒子・反粒子対称性(CP対称性)の破れ」の発見感度の向上である。今年度は、まずモンテカルロ法を用いたニュートリノビームのシミュレーションをもちいて、測定器を置く位置での荷電粒子の数や種類の割合などを見積もった。その結果、検出器の置く位置によって、検出器よりビーム上流位置の物質とビームとの相互作用からのδ電子の寄与が大きい事が分かった。このスタディをもとに検出器の位置の最適化を行い、δ電子の影響を小さく抑え、検出器の設計検討を行った。検出器を設置する場所は、大強度ニュートリノビームラインのミューオンピットと呼ばれるビームライン下流に位置するところであり、運転中は強い放射線環境となる。そのため、コネクタやケーブルを耐放射線のものを使用した。測定装置の製作のあと、ビームラインへの設置、測定を行う予定であったが、実験を考えていたニュートリノビームラインの機器故障により測定が行えなかった。一方で、使用を考えているニュートリノビームラインのニュートリノビーム生成についての研究をすすめて、ビーム生成の理解を深めた。この結果は、研究発表の論文にまとめて発表している。
鎖状芳香族化合物のNADPH機能に類似した2電子移動光還元触媒作用

概要1.パラテルフェニルの水還元水素発生に対する光増感作用と塩効果パラテルフェニル(TP)は電子供与体であるトリエチルアミン(TEA)と電子メディエーターである貴金属コロイドの存在下に紫外線を照射すると,水の水素分子への還元反応を引き起こす光増感剤として機能する。この反応系では,TPの一重項励起状態がTEAに還元的に消光されて生じるアニオンラジカル(TP・-)が重要な反応活性種である。TP・-は電子移動と競争的にプロトン化を受けて徐々に触媒活性を失うが,その寿命を延ばすことで光触媒活性の向上を図れると考え,各種の塩を添加し光増感水還元反応を行った。臭化テトラオクチルアンモニウムの添加により水素の生成量は格段に向上し,TPの分解は大きく抑制され,光照射3時間後のターンオーバー数は,7倍にも増大した。TP・-の減衰速度は塩の添加により効果的に抑制され,長寿命化することが判明した。2.部分フッ素化パラテルフェニルの水分子1電子酸化反応に対する光増感作用TPの全ての水素をフッ素で置換したペルフルオロ体は,光照射下,電子受容体の酸素を過酸化水素へと還元しつつ,水をヒドロキシルラジカルへと酸化できる。そこで,種々の部分フッ素化パラテルフェニルを合成し,それらの光化学的光物理的物性の変化を明らかにすると共に,光増感活性の制御を試みた。フッ素原子の置換数の増加に伴い,吸収,および蛍光の短波長シフトが見られた。各PTPのサイクリックボルタモグラムを測定した結果、フッ素化の度合いの増加に伴い大きく正側にシフトした。フッ素化の度合いの異なるパラテルフェニルを用いることで,光物性,酸化電位を段階的に変化させることができ,光増感作用を制御することに成功した。
時系列仮想衛星画像の構築とそれによる森林景観動態把握の手法開発

画像の時間的・空間的に一貫した解釈を可能にするために、過去の大量の時系列画像(高密度時系列画像)を用い、任意の日付の画像を仮想的に発生させる手法を開発した。素材となるLandsat画像は米国地質調査所からダウンロードした。地上反射率への変換、雲の除去などの前処理を行った後、画素ごとに、撮影年月日と分光反射率とからなる時系列データを構成した。各画素において、季節変動(フェノロジー)の有無と経年変化(トレンド)の有無により、4つのパターンのモデルを想定し、その中から最も当てはまりの良いものをAICにより選択した。さらに、期間を年ごとに分割して上記の変動・変化を推定し、不連続な変化があればそれを抽出した。その結果、異なる土地被覆により異なる季節変動を示した。落葉広葉樹林では、近赤外域の反射が4月から5月にかけて急激に増加し、9月以降に徐々に減少する。針葉樹人工林では安定した季節変動がみられる。針葉樹人工林で観測期間中に発生した皆伐は、明らかな土地被覆変化として抽出された。可視域では皆伐後に不連続に上昇した後、植栽木などが繁茂して急激に低下する様子が捉えられた。人工物では季節を問わず安定した反射率が観測されたほか、農耕地でも連年の標準的な変動が捉えられた。画素ごとの時間変化を画像に再構成し、任意の時点での仮想的な時系列衛星画像を作成した。雲と大気がなかった場合に上空から見えることが期待される景色である。多くの画像を集積することにより個々の画素の中の雑音が相殺され、森林・非森林を含む植生のフェノロジーが明瞭にあらわされた。本研究の目的は、連続する複数年の衛星画像を集積し、その時系列反射率データから、雲があって実際には観測できなかった地点・時点の反射率を推定し、森林の連続的変化、非連続的変化、フェノロジー成分を抽出する技術を開発して、あたかも任意の日付および地点での森林の状況を観察できるようにすることである。そのために、まず過去から現在に至る複数年かつできるだけ多くの季節にまたがる衛星画像を収集する必要がある。そこで、今年度はその第1年度として、Landsat画像の時系列データベースの構築を行った。研究対象地として関東および東海地方にまたがる地域を選定し、Path 107-108、Row 35-36の4シーンについて、2000年前後から現在に至る画像を選定した。それらの衛星画像は米国地質調査所(USGS)が運営するEarth Explorerからダウンロードした。それらを地理情報システムに読み込み、各画像に対して雲とその影を除去し、暗い植生に基づく広域可変の大気補正を行い、さらにそれらの画像を時系列方向に並べ、衛星画像データベースを構築した。なお、降雪地のデータは地表に植生があっても反射率が大きく変化するため、取り除いた。一方、衛星画像による反射率と現実の森林との関係を与え、また解析結果を検証するために、地上で得られた森林の情報が必要である。そのでデータとして林野庁森林生態系多様性基礎調査より第3次調査のデータを許可を得て移入し、同じく地理情報システムに読み込み解析環境を構築した。本課題採択後に組織間の異動となったため、今年度は研究設備の整備を中心に行った。本研究の目的は、連続する複数年の衛星画像を集積し、その時系列反射データから、雲があって実際には観測できなかった地点・時点の反射率を推定し、森林の連続的変化、非連続的変化、フェノロジー成分を抽出する技術を開発し、あたかも任意の日付および地点での森林の状況を観測できるようにすることである。今年度は、昨年度の画像データベース作成後に、公開されているLandsat画像の仕様が変更となったため、将来の汎用化も見据えて、新たな仕様でのデータ収集を再度行っている。新たな仕様の方が高度な前処理が施されているため、本課題で独自に行っていた前処理のかなりの部分を省略できるようになる。そのためのアルゴリズムの変更を行った。一方、昨年度に構築した画像データベースをもとに、分光反射率の時間的変遷を再構成し、森林の連続的変化(成長、遷移)と非連続的変化(攪乱、土地利用変化)に分解する技術を開発した。公開されているデータの仕様の変更に対応するため、アルゴリズムの変更を加えた。

人工物では季節を問わず安定した反射率が観測されたほか、農耕地でも連年の標準的な変動が捉えられた。画素ごとの時間変化を画像に再構成し、任意の時点での仮想的な時系列衛星画像を作成した。雲と大気がなかった場合に上空から見えることが期待される景色である。多くの画像を集積することにより個々の画素の中の雑音が相殺され、森林・非森林を含む植生のフェノロジーが明瞭にあらわされた。時系列データベースから任意の地点(画素)での分光反射率の時間的変遷を再構成し、森林の連続的変化(成長、遷移)、非連続的変化(攪乱、土地利用変化)、季節変化(フェノロジー)に分解して抽出する技術を開発する。森林生態系多様性基礎調査など既知の森林型・土地被覆情報を参照して、手法適応前後のデータの一貫性の差として評価する。森林の季節変化に分解する手法を開発し、森林生態系多様性基礎調査データと比較して、日本国内のいくつかの地方において森林の時系列変化図を作成し、検証する。端数額であり、執行できなかった。データ保管用等の消耗品を当初予定よりも低価格で購入できた。次年度使用額は翌年度分と合わせてより大面積の衛星画像に対応したデータ保管・処理用消耗品に充当する。消耗品等に充当する。
中国近代農村関係文書の統計的分析

本研究計画は、近代江南の土地関係文書の統計的分析を通じて農村の実態を解明する基礎的データを得ることであり、次の三段階の方法で行った。第一は江南の土地関係文書の内、特に租桟関係簿冊及び魚鱗冊に焦点を当てて、それらの日本の各大学・研究機関における収蔵状況を調査し、マイクロフィルム等で収集することである。調査の結果日本に現在する蘇州を中心とする江南の租桟関係簿冊(308冊)、魚鱗冊(196冊)が確認された。内訳は7機関、22租桟で、租桟関係簿冊は1820代から1930年代初めまでの百年間であり、魚鱗冊は清初から民国初めの約二百年間で、1地方の文書の量としては相当なものといえる。これらの文書各冊について目録を作り、簡単な分類と解説をつけて「日本現存の租桟関係簿冊及び魚鱗冊について-目及び分類」『史流』第33号に公表した。第二はデータのパーソナルコンピューターへの入力であるが、ロータス123を用い、全体の約三分の一の150冊程度の入力が完成した。今後引き続き継続していきたい。第三は入力したデータを用いての分析であるが、太平天国前後の収租状況を分析した「太平天国と蘇州農民」『北海道教育大学紀要』(第一部B)43巻1号と、国会図書館収蔵の呉貽経桟簿冊を基に清末から民国半ばまでの租桟の経営内容を分析した「清末・民国期の江南の租桟経営について-『呉貽経桟』簿冊を基に-」『史流』32号を公表した。データの入力・分析過程において、近代蘇州の1筆当りの小作地面積、1畝当りの小作料額、折価額、減免額等の小作条件、地主と佃戸の分布状況等は各文書や租桟間で相似していることが明らかになり、今後各文書間や他の種類の文書資料(例えば契約文書)・文献資料と対照した総合的な研究の必要がある。三年計画の初年度である本年は、基礎的準備作業の時期と位置づけ、資料の収集と収集した資料のデ-タ-の電算機への入力を実施した。第一の資料の調査収集は、本年度は東京大学東洋文化研究所・国会図書館・東北大学収蔵の租機関係簿冊・魚鱗冊・契約文書等について行い、一部をマイクロフィルムによる複写を行った。この調査収集の過程で、日本の各大学・研究機関に収蔵されている地主関係簿冊・文書資料は、例えばある機関収蔵資料に出てくる租機名が他の機関収蔵資料にも見い出されるほど、かなりの相互関連性をもっており、これらの資料について、従来までの個別資料の実証研究ばかりでなく、統合的な比較研究が必要であることを痛感した。第二の資料デ-タ-の電算機への入力は、新たにパ-ソナルコンピュ-タ-等を購入し、一部研究補助員の力を借りて、租機関係簿冊を中心に約50冊について完了した。デ-タ-の入力においては、簿冊・文書に注記されたメモ書き等をどう扱うかについて一部問題は残るが、数値の計算・分析及び資料の整理・検索については、市販の表計算、デ-タ-ベ-スソフト(今回はロ-タス1、2、3と「The Card3^+」使用)で充分対応できることが分った。