hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物による土壌中のケイ酸溶出機構の解明

ケイ酸はイネ科作物の耐乾性を高める効果をもつ.本研究では,土壌ケイ酸を溶出させる植物の機能を利用して,経済的に施肥が困難な地域でも土壌ケイ酸濃度を高め,作物の耐乾性を向上させる方法論を確立することを目的とした.20種程度の植物を水耕栽培し,その水耕液の土壌ケイ酸溶出特性を調査した初年度の研究では,ケイ酸溶出量が植物種に関わらず,水耕液(根圏)のpHの低さに依存することを見出し,同様の傾向を土耕栽培でも認めた.またイネ科植物では根圏pHに関わらず土壌溶液中ケイ酸濃度が低かったことから,根圏pHを低下させるがケイ酸を吸収しない植物の利用が有用であると考えられた.また,各植物種の個根のプロトン放出量と水耕液pH低下程度には相関が認められず,ケイ酸溶出程度には根量が影響を及ぼすと考えられた.二年度目には,各種植物と混作した場合に陸稲のケイ酸濃度がどのような影響を受けるかを調査した.その際,混作植物との水分競合により陸稲のケイ酸吸収が影響を受ける可能性が考えられたため,別途,陸稲を異なるケイ酸施肥量と灌水量の組み合わせ下で栽培し,そのケイ酸吸収に対する土壌水分量の影響を調査・理論化するための実験を行った.年度途中での移動に伴って研究が中断したことにより,いずれの実験でも陸稲のケイ酸濃度の分析を完了できず,混作や土壌水分量が陸稲のケイ酸濃度に及ぼす影響を明らかにするに至らなかった.しかし土壌水分量の低下に伴ってケイ酸施肥量が陸稲のクチクラ蒸散に及ぼす影響が大きくなる傾向が得られたことから,混作の影響を検討する際には,混作植物との水分競合の程度に注意を払う必要があることが示唆された.なお,両実験とも陸稲地上部は採取済みであり,今後ケイ酸濃度に関する分析を行いたい.ケイ酸はイネ科作物の耐乾性を高める効果を有する.本研究では,植物がもつ土壌ケイ酸を溶出させる機能を利用して,経済的にケイ酸施肥が困難な途上地域でも土壌ケイ酸濃度を高く維持し,作物の耐乾性を高めるための方法論を確立することを目的とした.初年度はまず,20種程度の植物群を一定期間ポット栽培した後に水耕栽培に移行し,その栽培後の水耕液を砂丘砂土および水田土壌と混合した際の土壌ケイ酸溶出量を指標として,各植物種の土壌ケイ酸溶出能力を評価した.その結果,供試植物内には顕著なケイ酸溶出能力を示すものは認められなかった.一方で,土壌からのケイ酸溶出量は植物種に関わらず,主に水耕液のpHの低さに依存していた.また,上記の試験に供試した植物種の幾つかについてポット栽培時に土壌溶液を分析した結果,イネ科植物以外では土壌溶液中ケイ酸濃度は土壌溶液pHと負の相関を示した.イネ科植物では,pHに関わらず土壌溶液中ケイ酸濃度が低下した.以上から,土壌溶液中ケイ酸濃度を高めるには,根圏pHを低下させるがケイ酸を吸収しない植物の利用が有用であると考えられた.次に,一定期間水耕栽培した各植物種の根を採取してpH指示薬を含む寒天培地に移し,色の変化を画像解析して根のプロトン放出量を評価した.その結果,個根のプロトン放出量には作物種間で有意な差異が認められたが,個根のプロトン放出量と前述した水耕液のpH低下程度およびケイ酸溶出程度との間には相関関係が認められなかった.根系全体のプロトン放出量については実験系の不備により適切に評価を行えなかったため,次年度において実験系に改良を加え,根系全体のプロトン放出能力と根圏pH調整能力およびケイ酸溶出程度との関連性を検討することとした.ケイ酸はイネ科作物の耐乾性を高める効果をもつ.本研究では,土壌ケイ酸を溶出させる植物の機能を利用して,経済的に施肥が困難な地域でも土壌ケイ酸濃度を高め,作物の耐乾性を向上させる方法論を確立することを目的とした.20種程度の植物を水耕栽培し,その水耕液の土壌ケイ酸溶出特性を調査した初年度の研究では,ケイ酸溶出量が植物種に関わらず,水耕液(根圏)のpHの低さに依存することを見出し,同様の傾向を土耕栽培でも認めた.またイネ科植物では根圏pHに関わらず土壌溶液中ケイ酸濃度が低かったことから,根圏pHを低下させるがケイ酸を吸収しない植物の利用が有用であると考えられた.また,各植物種の個根のプロトン放出量と水耕液pH低下程度には相関が認められず,ケイ酸溶出程度には根量が影響を及ぼすと考えられた.二年度目には,各種植物と混作した場合に陸稲のケイ酸濃度がどのような影響を受けるかを調査した.その際,混作植物との水分競合により陸稲のケイ酸吸収が影響を受ける可能性が考えられたため,別途,陸稲を異なるケイ酸施肥量と灌水量の組み合わせ下で栽培し,そのケイ酸吸収に対する土壌水分量の影響を調査・理論化するための実験を行った.年度途中での移動に伴って研究が中断したことにより,いずれの実験でも陸稲のケイ酸濃度の分析を完了できず,混作や土壌水分量が陸稲のケイ酸濃度に及ぼす影響を明らかにするに至らなかった.しかし土壌水分量の低下に伴ってケイ酸施肥量が陸稲のクチクラ蒸散に及ぼす影響が大きくなる傾向が得られたことから,混作の影響を検討する際には,混作植物との水分競合の程度に注意を払う必要があることが示唆された.
バセドウ病における新規エピトープ認識機構に基づく抗原特異的免疫制御に関する研究

バセドウ病(GD)は臨床的に最も高頻度に起こる臓器特異的自己免疫疾患である。しかし、その発症機構は未だ解明されていない上に、治療法によっては死亡例もあるため、改善すべき点が多い。したがって、1940年代より新規治療法の開発が喫緊の課題である。申請者は、GDにおけるTSH受容体(TSHR)抗原とHLA-DR結合モチーフを解明し、新規免疫寛容誘導ペプチドを開発した(2006 JCEM, 2009 Thyroid, 2010 JCEM, 2013 Endocrinology, 2016 Frontier Endocrinology)。本研究の目的は、その知見を基盤として、1) GDにおける胸腺やHLA分子の役割と甲状腺自己抗原に着目し、新たなエピトープ認識機構を明らかにすること、2)抗原特異的免疫制御による治療法開発を段階に分けて行うことである。平成30年度の研究としては、まず上記1)に関して、GDにおけるHLA分子と甲状腺自己抗原の役割について検討を行った。その方法としては、ヒトHLAトランスジェニックマウスを用いて、甲状腺自己抗原提示形式を評価した。甲状腺自己抗原としては、ヒトTSHRあるいはヒトサイログロブリン(Tg)を同マウスに免疫して甲状腺機能、甲状腺自己抗体、脾細胞のFACS解析と甲状腺自己抗原への反応性試験、および甲状腺組織の評価を行った。その結果、甲状腺自己抗原の違いによって、甲状腺免疫機構の変化の可能性が示唆された。さらに、2) GDに対する抗原特異的免疫抑制治療として、先述の新規免疫寛容誘導ペプチドによる治療の容量、接種間隔等の調整等によって、治療の最適化を行っている。平成30年度の研究としては、GDの危険因子であるHLA-DR3とヒトTSHR抗原に関する最も重要なエピトープ:hTSHR37(78-94)を始めとしてhTSHR132-150等の複数の免疫原性hTSHRペプチドの作用の検討を行った。まず、TSHR細胞外ドメインをコードしたアデノウイルス(Ad-TSHR289)を作成し、HLA-DR3トランスジェニックマウスに接種することでHLA-DR3トランスジェニックGDモデルを誘導した。さらに治療としての前述の新規免疫寛容誘導ペプチドをHLA-DR3トランスジェニックGDマウスに用いて、臨床応用を視野に入れ中枢性及び末梢性に免疫寛容を誘導する可能性を検討した。続いて、平成30年度はTSHR抗原特異的制御性T細胞のクローン化を進めた。また、ヒトTgをTSHRと同時に接種する際に甲状腺免疫機構が増強される可能性が示唆された。上記の方法を応用して、日本人GDに多いHLA-DR8/14、DP5やB35/46に関する同様の研究計画を樹立した。以上により、おおむね順調に研究が進展していると考えられる。平成30年度までに得られた上述の結果を基にして、平成31年度は、GDの臨床応用への展開を進めつつ、3年間における本研究において得られた結果をとりまとめる。さらに、今後は変異TSHRペプチド治療と免疫調節性ペプチド:Treg誘導ペプチド[Blood 2008:112:3303]を用い、in vivoにおいて効率的なTreg誘導を行なうことによって、TSHR特異的Tregの効果が増強されることに期待が持たれる。今後もGDに関する分子免疫学的手法を中心としたTSHR抗原の解析および甲状腺自己抗原を中心とした基礎的研究の確立と臨床応用への展開が円滑に進行されると考えられる。本計画はGDに関する世界最先端の研究の一つであり、従来の知見を生かしつつ独創的な着想に基づく画期的な実験結果が得られ始めている。本研究計画による連続的治療戦略は中枢性並びに末梢性免疫抑制を組み合わせており、全身的免疫異常を制御できる。また、治療が困難であり時に致死的でさえあるGDの加療において長期的かつ根本的な治癒をもたらす可能性がある。なお、感染症や悪性腫瘍の発生の副作用に関しては当治療法の濃度・時期等の調整により予防することが可能である。また、本治療法の確立が難治性自己免疫疾患に関する治療法の発展につながると思われる。なお、欧米ではSLE、多発性硬化症等の自己免疫疾患に対するペプチド治療が行われており、GDに関してもペプチド治療の報告がされ始めているが本邦では皆無である。申請者はこれまで、GDにおけるTSH受容体(TSHR)抗原とHLA-DR結合モチーフの関連を解明し、新規免疫寛容誘導ペプチドを開発した(2006 JCEM, 2009 Thyroid, 2010 JCEM, 2013 Endocrinology, 2016 Frontier Endocrinology)。本研究の目的は、その知見を基盤として、1)GDにおける胸腺やHLA分子の役割と甲状腺自己抗原に着目し、新たなエピトープ認識機構を明らかにすること、2)抗原特異的免疫制御による治療法開発を段階に分けて行うことである。研究方法は、以下の5点に大別して遂行した。まず1)数種類の甲状腺自己抗原に関して胸腺の役割がGDの病態に及ぼす影響を明らかにする。次に2)雌あるいは雄マウスについて検討を行い、女性ホルモン、男性ホルモンや性差によるGD悪化の有無を明らかにする。さらに、3)甲状腺自己抗原のGDへの病態への関与をエピトープ相互作用において明らかにする。

次に、4)治療として新規免疫寛容誘導ペプチドによる治療に加えて、TSHR特異的制御性T細胞の増殖誘導をin vitroにおいて行い、5)GDマウスにその制御性T細胞を注入し免疫原性Tリンパ球に対して末梢性免疫抑制誘導を行なう予定とした。研究初年度である2017年は、まず上記1)の数種類の甲状腺自己抗原に関する胸腺の役割がGDの病態に及ぼす影響を検討した。ヒトHLA化マウスを用いて、甲状腺自己抗原であるTSHRあるいはサイログロブリンの免疫を行い、2)雌雄マウスにおける検討と3)エピトープ相互作用の結果、GDの悪化する条件を検討している。今後4)5)の実験へ進む予定である。平成29年度の研究としては、GDの危険因子であるHLA-DR3とTSH受容体(TSHR)抗原に関する最も重要なエピトープ:hTSHR37(78-94)を始めとしてhTSHR132-150等の複数の免疫原性hTSHRペプチドの作用を既知のエピトープ認識機構において検討を行った。まず、TSHR細胞外ドメインをコードしたアデノウイルス(Ad-TSHR289)を作成し、HLA-DR3トランスジェニックマウスに接種することでHLA-DR3トランスジェニックGDモデルを誘導した。さらに治療としての前述の新規免疫寛容誘導ペプチドをHLA-DR3トランスジェニックGDマウスに用いて、臨床応用を視野に入れ中枢性及び末梢性に免疫寛容を誘導する可能性を検討した。また、TSHR抗原特異的制御性T細胞のクローン化に着手した。また、GDにおける新たなエピトープ認識機構の研究においては、GDにおける甲状腺自己抗原(TSHR,Tg,TPO)のHLA分子上抗原提示形式を、HLA-classI/Tc及びHLA-classII/Thの関連にて、上述のヒト免疫システム類似のHLA-トランスジェニックマウスを用い検討を行った。今後は、日本人GDに多いHLA-DR8/14、DP5やB35/46の関与を同様に検討し明らかにする。バセドウ病(GD)は臨床的に最も高頻度に起こる臓器特異的自己免疫疾患である。しかし、その発症機構は未だ解明されていない上に、治療法によっては死亡例もあるため、改善すべき点が多い。したがって、1940年代より新規治療法の開発が喫緊の課題である。申請者は、GDにおけるTSH受容体(TSHR)抗原とHLA-DR結合モチーフを解明し、新規免疫寛容誘導ペプチドを開発した(2006 JCEM, 2009 Thyroid, 2010 JCEM, 2013 Endocrinology, 2016 Frontier Endocrinology)。本研究の目的は、その知見を基盤として、1) GDにおける胸腺やHLA分子の役割と甲状腺自己抗原に着目し、新たなエピトープ認識機構を明らかにすること、2)抗原特異的免疫制御による治療法開発を段階に分けて行うことである。平成30年度の研究としては、まず上記1)に関して、GDにおけるHLA分子と甲状腺自己抗原の役割について検討を行った。その方法としては、ヒトHLAトランスジェニックマウスを用いて、甲状腺自己抗原提示形式を評価した。
細胞機能制御のためのマイクロ細胞加振デバイスの開発

本研究では,圧電駆動型マイクロ細胞加振デバイスの作製プロセスの検討を行い,駆動性能の評価を行い,有用性を示した.さらに,細胞を高効率にSiNダイアフラム上にトラップするために誘電泳動を利用した細胞配列についての検討を行い,細胞を配置可能であることを示した.また,細胞の増殖・分化などの細胞活動に必要な基盤となることから,細胞への加振の効果検証の基礎として,REF(ラット線維芽)細胞を用いた基板の表面材料への接着性の評価を行った結果,基板表面材料に依存した接着を示すことがわかった.本研究では,圧電駆動型マイクロ細胞加振デバイスの作製プロセスの検討を行い,駆動性能の評価を行い,有用性を示した.さらに,細胞を高効率にSiNダイアフラム上にトラップするために誘電泳動を利用した細胞配列についての検討を行い,細胞を配置可能であることを示した.また,細胞の増殖・分化などの細胞活動に必要な基盤となることから,細胞への加振の効果検証の基礎として,REF(ラット線維芽)細胞を用いた基板の表面材料への接着性の評価を行った結果,基板表面材料に依存した接着を示すことがわかった.本研究では,細胞へのナノメートルオーダの微小な機械的振動刺激が増殖や分化といった細胞機能の制御に有効であるとの知見がえられていることから,細胞への微小な機械的振動刺激を実現するための圧電アクチュエータを搭載した細胞機能制御のためのマイクロ細胞加振デバイスの開発を目的とする.本デバイスは細胞への機械的振動刺激を付与するための複数のダイアフラム構造を有しており,細胞への振幅や周波数といった振動条件を網羅的に解析することを可能とし,安全な細胞機能制御技術の確立を目指すものである.得られた成果は以下のとおりである.(1)マイクロ細胞加振デバイスの開発について,Siの深堀りエッチング(DRIE)を用いたダイアフラム構造および駆動部となるPZTアクチュエータの形成プロセスについて検討を行い,提案するデバイスにおいて細胞を加振するための構造が実現可能であることを示した.(2)細胞への微小な機械的振動刺激を実現するため,PZTアクチュエータを形成したダイアフラム上に細胞を配列する方法について検討を行い,誘電泳動を利用することで高効率な細胞配列を実現可能であることを示した.本研究では,細胞へのナノメートルオーダの微小な機械的振動刺激が増殖や分化といった細胞機能の制御に有効であるとの知見がえられていることから,細胞への微小な機械的振動刺激を実現するための圧電アクチュエータを搭載した細胞機能制御のためのマイクロ細胞加振デバイスの開発を目的とする.本デバイスは細胞への機械的振動刺激を付与するための複数のダイアフラム構造を有しており,細胞への振幅や周波数といった振動条件を網羅的に解析することを可能とし,安全な細胞機能制御技術の確立を目指すものである.得られた成果は以下のとおりである.(1)マイクロ細胞加振デバイスの開発について,Siの深堀りエッチング(DRIE)を用いたダイアフラム構造および駆動部となるPZTアクチュエータの形成プロセスについて最適化を行い,ナノメートルオーダの機械的振動刺激を付与可能であることを示した.(2)細胞の接着は,細胞の増殖・分化などの細胞活動に必要な基盤となることから,細胞への加振の効果検証の基礎として,REF(ラット線維芽)細胞を用いた基板の表面材料への接着性の評価を行った.結果,細胞接着は,表面材料が細胞接着に影響を及ぼすことを示した.本研究の当初計画においては,マイクロ細胞加振デバイスの開発および細胞を用いた加振実験による検証実験を行うことを計画した.今年度,細胞実験においてキーデバイスとなるマイクロ細胞加振デバイスの開発を行い,Siの深堀りエッチング(DRIE)を用いたダイアフラム構造の形成プロセスおよび駆動部となるPZTアクチュエータの形成プロセスについて検討を行い,細胞を加振するためのデバイスが実現可能であることを示した.また,デバイスの駆動実験を行い,ダイアフラムの振動特性を評価した結果,細胞実験に適用可能であることがわかった.さらに,細胞実験の中で細胞のデバイス上の位置を制御する方法として,当初計画では支柱構造を一体化して支柱間に細胞を捕獲することで配列することを計画したが,電気的な制御方式による細胞配列を検討し,高効率に細胞をデバイス上に配列できたことから,当初のデバイス構造とは異なるが細胞配列を実現できることを示し,マイクロ細胞加振デバイスの開発が行えた.概ね当初の研究計画内容に沿って進行しているが,実際の細胞加振実験への適用が行えていない.これは次年度の計画でもあるため,次年度において,デバイス作製プロセスの更なる最適化と実際の細胞実験への適用を検討する.平成26年度では引き続き,PZTアクチュエータの駆動特性の改善などを含めたデバイス作製プロセスの更なる最適化の検討を行うと共に,実際の細胞を用いて振動条件や細胞種間での機械的振動刺激の効果の違いを網羅的に解析を行うための加振実験を計画する.用いる細胞としては,先行研究で用いられているヒト末梢血単核球(PBMC),正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などや間葉系肝細胞(MSC細胞)を用いた研究では,骨,筋肉のみならず神経細胞への分化誘導の報告がなされていることから,これらの細胞を用いた機械的振動刺激が増殖や分化といった細胞機能へ及ぼす影響について調査を行うことを計画する.研究の計画当初は,顕微鏡培養装置の購入を計画していたが,実際に開発したデバイスのパッケージング部分までを含めて検討した結果,当該装置ではサイズが不十分であることが分かったため,今年度の導入を見合わせた.

なお,今年度は,デバイス開発およびHeLa細胞を用いた細胞配列実験を中心に実施したため,導入遅れによる問題は生じていない.当初予定していた顕微鏡培養装置の変わりに部品単位で購入して構築することで同様の機能を持たせることを検討する.消耗品費としては,マイクロ細胞加振デバイスの作製に必要となるシリコンウェハ,フォトマスク,半導体プロセス用のガス・薬品類の購入を行うことを計画している.旅費等については,平成26年度は,国内旅費として,成果発表(国内会議×1回)および本研究に関連するシンポジウム・研究会への参加(東京日帰り×3回)を計画している.さらに,海外旅費(国際会議×1回)および学会誌への研究成果投稿料(×1回)を計画し,本研究課題でえられた成果を広く世に公開する.また,研究内容と研究成果を広く一般にも公開するために,ホームページの更新や研究成果広報用パンフレット作成を行うなどによって,その成果を発信することも計画している.
地理的因子が局地風系に与える影響の研究

日本において局地風系を構成する最も重要な要素に海陸風が挙げられる。日本における海陸風の研究は一地域に限った研究が多く、全国の海陸風を同一の基準で俯瞰することができなかった。この点から、研究代表者は第一に日本全国の海陸風を同時に扱った解析を試み、海陸風の地域性を論じることが可能な結果を得た。例えば、北海道から東海にかけての太平洋岸で梅雨の影響のため6・7月に出現頻度が小さくなるが、北海道の西岸では梅雨の影響は認められず、年間を通して6月が出現頻度の最も大きくなる月であることが判明した。さらに、以上の研究を発展させ、全国21地点における海水面温度の情報を取り入れ海陸風との関係を調べた。データの精度・代表性の問題もあり、海陸風理論通りの結果は導くことができなかったが、海水面温度、陸上気温、海風出現頻度との三者は密接に関係していることがわかった。局地風系の研究対象のうち、まだ研究が不十分な静穏状態についての解析を風データの信頼できる関東地方においておこなった。その結果、3時は7月において静穏率が40%と最も大きくなること、15時は年間を通して10%以下でかつ出現頻度の季節差が小さいことがわかった。また、日変化を調べたところ、夜間において1月は静穏率が時刻によりあまり変化しないのに対し、8月は明け方まで増加し続けるという興味深い事実が明らかになった。静穏状態の出現とも密接に関係する夜間の接地逆転層の微細構造をライダーによって観測することを試みた。その結果、逆転層が発達している場合ほど(安定度が大きい場合ほど)エアロゾル濃度の上下方向の密度勾配が大きいことが観測された。本研究の目的は、(1)日変化する風系がその成因となる地理的条件の地域差によって受ける影響を明らかにすること、(2)局地風系をその分布や日変化と関係づけて日本全国にわたり系統的にまとめることである。本年は、まずこれまでもっとも詳しい研究をしてある中部地方について、季節別に海陸風の吹き出し、吹き終りの時刻、最盛期の風向、風速の分布図を作成し、海面温度との関係を調べて、有意なとりまとめをした。また中部日本の他、北海道と西南日本をとり上げて、アメダスおよびその他の関連資料を収集し、全く同じ方法で整理した。局地風系の日変化に伴う局地風の立体構造の変化と地上風系との関連を解明するため、レ-ザ-レ-ダ-を用いた観察を実施する予定であったが、研究分担者が病気のため、次年度に繰越した。その代り、次年度実施する予定であった大阪周辺や山陰地方について、資料の収集を行った。全国規模の研究としては、総観規模の気圧傾度が海陸風に及ぼす影響の統計解析を229地点で実施した。全地点の海風の風向には地域差が見られ、興味深い。また気圧傾度と各地点の毎時の風から、各地の海陸風の最大風速成分の関係をグラフに画くと、気圧傾度が海高陸低の場合は海風が強まり、陸風は弱くなる(気圧傾度0.5mb/100kmのとき陸風成分はなくなる。一方、気圧傾度が陸高海低の場合は海風は気圧傾向が-0.7mb/100km以下で存在しなくなる。しかし前者の場合、海陸風成分の日変化の振幅はほぼ一定であるのに対し、後者の場合は気圧傾度が-1.3mb/100kmを境にして昼夜の位相が逆転する)。日本において局地風系を構成する最も重要な要素に海陸風が挙げられる.日本における海陸風の研究は一地域に限った研究が多く,全国の海陸風を同一の基準で俯瞰することができなかった.

この点から,研究代表者は第一に日本全国の海陸風を同時に扱った解析を試み,海陸風の地域性を論じることが可能な結果を得た.例えば,北海道から東海にかけての太平洋岸で梅雨の影響のため6・7月に出現頻度が小さくなるが,北海道の西岸では梅雨の影響は認められず,年間を通して6月が出現頻度の最も大きくなる月であることが判明した.さらに,以上の研究を発展させ,全国21地点における海水面温度の情報を取り入れ海陸風との関係を調べた.データの精度・代表性の問題もあり,海陸風理論通りの結果は導くことができなかったが,海水面温度,陸上気温,海風出現頻度との三者は密接に関係していることがわかった.局地風系の研究対象のうち,まだ研究が不十分な静穏状態についての解析を風データの信頼できる関東地方においておこなった.その結果,3時は7月において静穏率が40%と最も大きくなること,15時は年間を通して10%以下でかつ出現頻度の季節差が小さいことがわかった.また,日変化を調べたところ,夜間において1月は静穏率が時刻によりあまり変化しないのに対し,8月は明け方まで増加し続けるという興味深い事実が明らかになった.静穏状態の出現とも密接に関係する夜間の接地逆転層の微細構造をライダーによって観測することを試みた.その結果,逆転層が発達している場合ほど(安定度が大きい場合ほど)エアロゾル濃度の上下方向の密度勾配が大きいことが観測された.
ポリマーの反応性を考慮した非ニュートンリミングおよびコーティング流れの解析的研究

エリスおよびベキ乗則流体のリミング流れに関する流出条件を導出した。流出条件を満足することで、定常状態での溶解の存在を証明することができた。これらの条件より想定されるリミング流れの範囲内において、フィルムの厚さは継続的な溶解を可能にし、それは臨界前および臨界状態での流れ則を用いた予備値と一致することを示した。また、臨界状態での流れ則において、不連続な溶解挙動が予測された。エリスおよびベキ乗則流体における衝撃位置と高さに関する検討をするにあたり、定常状態理論は有効であることが示された。ベキ乗則モデルについて、流れのフィルム厚さに関する定常状態方程式の理論的解の導出に成功し、エリスモデルについて演算処理を実行した。このモデルについて解析的な漸近解が陽な形式で得られ、演算処理の結果と比較することができた。これらの解より、コーティング流れの正確なシミュレーションを行うためのエリスおよびベキ乗則の方程式におけるパラメーター値を最適化することが可能になり、流れが超臨界状態にある時に起こる定常水位急上昇の大きさと位置について、種々の流れパラメーターにおける解も決定できた。これにより、異なる多因子の溶解のための、エリスおよびベキ論の流動学的モデルの較正を呈示した。上述した方程式の高次近似解析のための数値的アルゴリズムを導出した。高次数における流れの安定性についてのより詳細な判定法を定め、主な次数方程式から導出される結果と比較した。長波理論の枠組みにおいて、二軸回転シリンダー上の非ニュートン流れについてのリミング流れの数学的3Dモデルを導出した。3D支配方程式の安定性解析を実施し、流れの安定性に対する二軸回転成型の影響を解析した。さらに、フィルムの一様性に対する微小重力の影響を明らかにした。スケール解析に基づく計算手法を用いることにより、ポリマーコーティングプロセスの主な特徴を示す指数や無次元量を求めた。現実のポリマー流れに関するこれまでの実験事実に基づき、プロセスの漸近的数学モデルを確立し、立証した。流れの多くの領域で、一般化されたニュートン・モデルと合致するせん断応力およびせん断速度と関連する関数により一般構成法則を呈示した。この場合、リミング流れについての流出条件が導き出される。本条件で想定される範囲内において、フィルムの厚さは継続的な溶解を可能にし、それは臨界前および臨界状態での流れ則を用いた予測値と一致する。臨界域において、溶解は上昇するシリンダーの壁面上において生じることが証明された。超臨界流れにおいて、不連続の溶解は可能であり、水位急上昇も起こり得る。衝撃位置と高さを研究するにあたり、定常状態理論は有効であることが示された。非ニュートン・モデルのリミング流れを説明するのにキャロー・安田モデルを用いることが最適であることがいわれている。しかしながら、当該モデルは構成方程式中でいくつかのパラメーター値に非物理的な結果を導く可能性がある。この溶解に基づき、コーティング流れについての正しいシミュレーションのためのキャロー・安田方程式に用いられるべき最適なパラメーター値は決定され、定常状態での継続的溶解を許容する基準が定義され、さらに流れが超臨界状態にあるときに起こる定常水位急上昇の大きさと位置が異なる流れパラメーターについて推定することが可能となった。
地域社会における異質性受容に関する社会学的研究

山形県戸沢村には、「後継者対策」(「嫁不足問題」の解決策)として1989年に村行政主導の「国際結婚」が始まって以来、中国・韓国・フィリピン出身の女性が30余名暮らしている。それ以来、この20年間の同村の」「国際結婚」やそれに伴う多文化主義的政策が注目されているが、この地域には昭和初期からのキリスト教徒の受入れ等「異質なる者」を受け入れてきた歴史がある。今日の異質性受容はこのような歴史的文脈で考えられることが重要である。1.「住民」の多様性の検討山形県戸沢村における住民の多様性/複数性についての整理を開始した。山村と位置づけられる当該地域は必ずしも閉鎖的な社会ではなく、外部社会からの様々な援助・補助を受け入れながら存続してきたといえる。昭和初期からの地域づくりの歴史をもつ村のキリスト教徒たちと、平成元年からの「村の国際結婚」によりやってきた外国人妻たちに着目して「住民」の再検討をした。2.当該地域のキリスト教徒の調査当該地域の「住民」の多様性を考察する際に重要な集団として位置づけられるのが、村のキリスト教徒たちである。昭和5年の当該地域におけるキリスト教開伝以来、彼らは様々な社会運動を展開して地域づくりを試みてきた。そして地域の宗教的マイノリティである彼らは賀川豊彦の思想を取り入れて長い間地域づくりをすすめてきたことが明らかになった。彼らのナラティヴ資料はある程度収集できたが、これと賀川の思想をより厳密に照らし合わせて分析することが課題として残されている。3.農村伝道の調査および昭和初期からの当該地域におけるキリスト教徒の役割の分析キリスト教徒への聞き取りによるナラティヴ資料をデータとして、「よそもの」、「マージナルマン」、「知識人」などの概念を道具として社会変動期における個人の役割の分析も開始した。今後は日本の農村伝道一般に関する史資料も用い、当該地域のみならずより広いコンテクストの中で、この当該地域におけるキリスト教徒の役割を考察する予定である。4.「公共性」の分析枠組みの検討社会科学において近年盛んに議論されている「公共性」概念が本研究において分析枠組み足り得るのか、検討を開始した。1.「住民」の多様性の検討山形県戸沢村における住民の多様性/複数性についての整理をした。昭和初期からの地域づくりの歴史をもつ村のキリスト教徒たちと、平成元年からの「村の国際結婚」によりやってきた外国人妻たちに着目して「住民」概念を再検討した。今後は日本の農村伝道一般に関する史資料も用い、当該地域のみならずより広いコンテクストの中で、この当該地域におけるキリスト教徒の役割をさらに考察する必要がある。4.「多文化主義」概念の分析枠組みとしての検討社会科学において近年盛んに議論されている「多文化主義」概念が本研究において分析枠組み足り得るのか検討した。1.マイノリティ住民の整理・検討山形県戸沢村における住民の多様性/複数性についての整理をした。昭和初期からの地域づくりの歴史をもつ村のキリスト教徒たちと、平成元年からの「村の国際結婚」によりやってきた外国人妻たちに着目して「住民」概念を再検討し、「地域づくり」における彼らの役割を分析した。
高分子ナノコンポジット材料の電気的特性発現機構の解明

本研究ではまず、高分子絶縁材料中の電荷移動特性を評価すべく、高分子結晶領域および、アモルファス領域における電荷移動度を量子化学計算、分子動力学計算、KMCシミュレーション(および、高分子鎖の統計的な性質)をあわせることで、経験的なパラメータを用いること無く評価する方法を提案した。ポリエチレン(PE)材料に関して、結晶、非晶領域における電荷移動度を評価した結果、PEのアモルファス領域における正孔移動度がPEの結晶領域におけるそれと比べて5桁程度小さくなる原因は主に、PE鎖の持続長が短いため電荷局在化領域が短くなり、電荷と分子鎖の構造変化の相互作用が大きくなること、構造の乱れによる電荷局在状態のエネルギーのバラツキによってエネルギー的に不利なホッピングがマクロな移動度を支配することなどによることを明らかにした。なお、高分子材料の非晶領域における電荷移動度を評価するにあたって計算量の異なる複数のモデル化方法を提案しており、それぞれのモデル化方法によって得られた電荷輸送特性が良好に一致することも確認している。さらに、高分子ナノコンポジット材料の特性予測に関しては、広義のコンポジット材料として分子(ハロゲン)を添加した系に関して分子添加による移動度の増加要因が電荷局在領域間の相互作用が分子の添加によって大きくなるためであると明らかにしている。これは、これまでのモデルでは定性的にも予測できなかったことで、交付申請書に示した目的である「高分子ナノコンポジット材料の特異な電気特性の発現要因を明らかにする」にかなうものである。もちろん、今後は異なる種類の添加物についても同様の検討を進める必要がある。29年度が最終年度であるため、記入しない。
視床下部のオレキシン系がインスリン抵抗性を防御する機構の解明

糖代謝調節に関わる末梢組織でのインスリン作用は視床下部性制御を受けているが、その詳細は不明である。そこで生体のエネルギーバランス調節に関与する視床下部ペプチドのオレキシンに注目し、糖代謝調節機構における役割を検討した。その結果、オレキシン欠損マウスでは加齢に伴い、視床下部および末梢組織のインスリン作用が破綻し、耐糖能異常およびインスリン抵抗性が惹起されることを見出した。従ってオレキシンは、インスリン感受性の調節に必須な脳と末梢組織の臓器連関を統合する役割を果たしており、加齢に伴うインスリン抵抗性の増大に対する防御因子であると考えられる。視床下部には血糖センサーとして機能するオレキシンニューロンが存在し、摂食行動、覚醒レベルおよび生体のエネルギーバランスを調節しており、全身の糖代謝調節機構の統括因子である可能性が高い。そこでオレキシン欠損(KO)マウスを用いて、脳と末梢組織との臓器連関を介したインスリン作用の調節機構におけるオレキシンの役割を検討した。雄性オレキシンKOマウスは9ヶ月齢まで加齢すると、正常体重であるにも関わらず、耐糖能異常、インスリン感受性の低下に加え、高インスリン血症を示した。2および9ヶ月齢のKOマウスにインスリンを末梢および中枢投与すると、視床下部でのシグナルはインスリン受容体、Akt/プロテインキナーゼBおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK3β)において減弱した。浸透圧ポンプを用いてKOマウスの脳室内にオレキシンを2週間連続投与したがシグナルの異常は改善されず、より長期的なオレキシン欠損の影響であることが示された。一方、末梢組織では加齢したKOマウスにおいてのみAkt/GSK3βシグナルに異常が認められた。雌性KOマウスは同様のインスリンシグナルの異常を示したが、加齢に伴い肥満となり、高インスリン血症に加え高レプチン血症を呈した。しかも、高脂肪食負荷により雌性KOマウスのみ肥満し、著しい耐糖能異常およびインスリン抵抗性を示した。このように、長期間に及ぶオレキシンの欠損は視床下部でのインスリン作用不全を引き起こし、さらに末梢組織のインスリン抵抗性を増大させた。従って、オレキシンは、インスリン作用を調節するための脳と末梢組織の臓器連関における統合中枢としての役割を果たしており、加齢依存的なインスリン抵抗性に対する防御因子であると考えられる。視床下部のインスリン作用は末梢組織のインスリン感受性を増大させ、糖代謝を促進する役割を果たしている。本研究では前年度、視床下部ペプチドのオレキシンの欠損により視床下部におけるインスリン作用が破綻し、加齢に伴い糖代謝に異常が生じることを見出した。特に雌性オレキシン欠損マウスでは糖代謝異常が顕著であり、血清インスリン濃度およびレプチン濃度の上昇が認められた。そこで、これらの異常の発症メカニズムを明らかにするため、9ヵ月齢の雌性オレキシン欠損マウスの腹腔内にレプチンを投与し、細胞内シグナルを解析した結果、肝臓におけるSTAT3リン酸化の減弱が認められた。従ってオレキシン欠損に伴うレプチン感受性の低下が、肝臓でのインスリン感受性の低下を誘発することが示唆された。さらに、加齢したオレキシン欠損マウスの肝臓における遺伝子発現をGeneChipを用いて網羅的に解析した結果、糖新生に関わるFoxa2やグリコーゲン合成・分解に必須なglycogenin、glycogen debranching enzymeの発現量に異常が認められた。またインスリンシグナルに関わるインスリン受容体、インスリン受容体基質およびprotein kinase Cζの発現量にも低下傾向が見られた。その他、炎症や脂質代謝に関わる遺伝子群にも著明な異常を認めた。以上の結果から、慢性的なオレキシンの欠乏は、視床下部と肝臓の臓器連関による血糖調節を破綻させ、耐糖能異常を惹起すると考えられる。このように視床下部のオレキシン神経系は加齢依存的なインスリンおよびレプチン抵抗性の増大を防御することにより、糖代謝調節に重要な肝機能の維持に寄与していると考えられる。
手軽さを追求した携帯情報端末向け動画の製作・配信システムの構築

専用のソフトウェアを用いた動画変換作業は自由度が高い反面,多岐の変換オプションを有する上に,端末のプラットフォーム別に配信プロトコルを考慮せねばならず,不慣れな利用者にとっては敷居が高い.そこで,これらの作業を簡単かつ効率よく行えるよう,サーバサイドでオートメーション化するシステムが有用であると考えた.本研究は,主要なコンシューマ向け動画サービスと同等の機能を持ち合わせながら,単純な操作により,手軽で容易な動画配信を実現できるシステムの構築と,その有用性に対する検証を目的とする.本システムは,変換作業をWebブラウザで行なえるよう,Webアプリケーションとして実装することとし,サーバサイドのプログラム言語にPHPを用いた.ユーザの直観操作に応えるためこ,JavaScriptおよびHTML5の技術を駆使して汎用性を追求している.サーバ内部での変換処理にはHandBrakeのCLIツールを用い,これをPHPから実行させる.配信はマルチプロトコル対応のストリーミングサーバであるWowzaMediaServerを用い,変換された動画を端末プラットフォームに応じたプロトコルで配信できるように設計した.動画サービスを利用したことのない3人の被験者に,本システムを使用した場合と,デスクトップ型の変換ツールおよびFTPアップロードによる手作業の場合と,YouTubeを用いた場合の3つの手法で作業時間を計測したところ,平均でそれぞれ約18分,約34分,約19分であった.また,実機を用いてのストリーミング再生においては,品質の面で機種の差異が見られ,Android端末では無線LAN環境の依存が高いことが判った.このことから,本システムは,手作業による手法よりも短時間で,かつYouTubeとも遜色ない作業時間を達成でき,十分に実用性のあることが明らかとなった.専用のソフトウェアを用いた動画変換作業は自由度が高い反面,多岐の変換オプションを有する上に,端末のプラットフォーム別に配信プロトコルを考慮せねばならず,不慣れな利用者にとっては敷居が高い.そこで,これらの作業を簡単かつ効率よく行えるよう,サーバサイドでオートメーション化するシステムが有用であると考えた.本研究は,主要なコンシューマ向け動画サービスと同等の機能を持ち合わせながら,単純な操作により,手軽で容易な動画配信を実現できるシステムの構築と,その有用性に対する検証を目的とする.本システムは,変換作業をWebブラウザで行なえるよう,Webアプリケーションとして実装することとし,サーバサイドのプログラム言語にPHPを用いた.ユーザの直観操作に応えるためこ,JavaScriptおよびHTML5の技術を駆使して汎用性を追求している.サーバ内部での変換処理にはHandBrakeのCLIツールを用い,これをPHPから実行させる.配信はマルチプロトコル対応のストリーミングサーバであるWowzaMediaServerを用い,変換された動画を端末プラットフォームに応じたプロトコルで配信できるように設計した.動画サービスを利用したことのない3人の被験者に,本システムを使用した場合と,デスクトップ型の変換ツールおよびFTPアップロードによる手作業の場合と,YouTubeを用いた場合の3つの手法で作業時間を計測したところ,平均でそれぞれ約18分,約34分,約19分であった.また,実機を用いてのストリーミング再生においては,品質の面で機種の差異が見られ,Android端末では無線LAN環境の依存が高いことが判った.このことから,本システムは,手作業による手法よりも短時間で,かつYouTubeとも遜色ない作業時間を達成でき,十分に実用性のあることが明らかとなった.
IL-1非応答性突然変異株の分離とその変異を相補するcDNAのクローニング

IL-1非応答性突然変異株の分離とその変異を相補するcDNAのクローニングのプロジェクトについては、研究計画に従って、変異株の分離のための親株となるIL-1応答性安定細胞株を作成中である。今後、目的のIL-1応答性安定細胞株が樹立されしだい、IL-1非応答性突然変異株の分離とIL-8遺伝子活性化に必須に関与するシグナル伝達因子のcDNAのクローニングを試みる予定である。一方、IL-8やIL-6をはじめとする多くのIL-1誘導性遺伝子の発現制御には、転写因子NFκBの活性化が中心的な役割を果たしているが、我々の研究グループでは、上記のプロジェクト以外に、直接NFκBの活性化に関与するシグナル伝達因子の同定を試みている。NFκBは、未刺激の細胞では阻害因子IκBと複合体を形成して不活性型として細胞質に保持されており、IL-1,TNF等による刺激後、IκBαのリン酸化と分解による不活性化の後、NFκBは核へ移行し、標的遺伝子のプロモーターに結合してその転写を促進することが知られている。しかしIκBαを直接リン酸化するプロテインキナーゼはいまだ確立されていない。また最近、JNK(Jun N-terminal kinase)などの重要なシグナル伝達因子は、基質と会合するプロテインキナーゼとして同定されている。そこで我々はGST-IκBα融合タンパクを用い、GST-IκBαとタンパク因子を会合させたのちin vitro kinase reactionを行う系で解析を行った。その結果、ヒト単球系細胞株THP-1の細胞抽出液中にIκBαに特異的に会合してリン酸化する、IκBα会合キナーゼを同定した(Kuno K.et al.,1995)。また種々のGST-IκBαの部分欠損変異体およびアミノ酸置換体を用いた実験の結果から、IκBα会合キナーゼはIκBαのC末端領域の酸性ドメインと相互作用し、同酸性ドメインのSer/Thr残基をリン酸化することが明らかとなった。さらにIκBαのC末端酸性ドメインに対応するペプチドおよびそのアミノ酸置換体を基質としたin vitro kinase reactionの実験から、Ser-293が会合キナーゼによるIκBαにおける主なリン酸化部位であり、Ser-288とThr-291が弱いリン酸化部位であることが明らかとなった。またIκBα会合キナーゼ活性は、THP-1細胞をLPSで刺激した場合、一過性に増強された。我々の研究室では先にTHP-1細胞抽出液を用いたcell-free系でのLPS刺激によるNFκB活性化assayを開発している(Ishikawa Y.et al.,1995)。IκBα会合キナーゼによるリン酸化部位であるIκBαのC末端酸性ドメインのペプチドは、このcell-free系での実験において、LPSによるNFκB活性化を抑制することがわかった。以上の結果からIκBα会合キナーゼによるIκBαのC末端酸性ドメインのリン酸化が、少なくともcell-free系においてはLPS刺激によるNFκB活性化すなわちIκBαの不活性化に重要であることが示唆された。

またIκBα会合キナーゼ活性は、THP-1細胞をLPSで刺激した場合、一過性に増強された。我々の研究室では先にTHP-1細胞抽出液を用いたcell-free系でのLPS刺激によるNFκB活性化assayを開発している(Ishikawa Y.et al.,1995)。IκBα会合キナーゼによるリン酸化部位であるIκBαのC末端酸性ドメインのペプチドは、このcell-free系での実験において、LPSによるNFκB活性化を抑制することがわかった。以上の結果からIκBα会合キナーゼによるIκBαのC末端酸性ドメインのリン酸化が、少なくともcell-free系においてはLPS刺激によるNFκB活性化すなわちIκBαの不活性化に重要であることが示唆された。
小児固形腫瘍の転移・再発を制御するクローン進化の時空的かつ網羅的ゲノム解析

難治性膵芽腫例から採取したマルチサンプリング検体を用いて、エクソーム解析を行った。肝転移巣検体については、計7か所の部位につき組織を採取し、それぞれのゲノム解析を行った。すべての腫瘍検体ではベータカテニンの変異と11pの片親ダイソミー(UPD)が検出されたが、初発腫瘍と転移、再発腫瘍で重複する遺伝子変異、ゲノム変異は検出されなかった。転移、再発腫瘍では、初発時のmajor cloneに新たな付加異常が加わったクローンが大半を占めていた。従って、膵芽腫の発症にはベータカテニンの変異と11pのUPDが、最も重要な異常であり、その進展には、複数の異なる付加的なイベントが関与する可能性が示唆された。難治性小児がんの新規治療標的を同定するために、次世代シークエンサー、高密度マイクロアレイといった革新的ゲノム解析技術を用いて、小児固形腫瘍の初発、転移、再発腫瘍のクローン進化を細胞レベルで経時的かつ網羅的に解析し、再発や転移を規定する分子病態の解明を試みる。本年度は、ALK変異を有する神経芽腫1例およびDICER1変異を有する甲状腺がん1例の凍結腫瘍検体を用いて、レーザーマイクロデイセクション(LMD)による単一細胞の単離とDNAの増幅を試みた。具体的には、凍結標本よりスタンプ標本を作製し、腫瘍細胞を単一層にスライドグラスに貼り付けら後に、LMDによる切り出しを行った。DNAの増幅には、全ゲノム増幅キットを用いた。増幅したDNAが腫瘍由来か否かを検討するために、それぞれの腫瘍でALK、DICER1の変異部位のサンガーシークエンスを行った。その結果、ALK変異は確認できなかったが、DICER1変異は確認できた。ALK変異が確認できなかった要因として、腫瘍細胞のintra-tumor heterogeneityの存在が示唆された。そこで、神経芽腫の腫瘍検体を用いて、deep sequencingを行い、ALK変異のアレル頻度を確認したところ、20%であった。従って、神経芽腫から分離する単一細胞数を増やして、更なる検証を行う予定である。また、神経芽腫2例における初発、再発腫瘍のエクソーム解析、deep sequencingを行い、クローン進化の評価を行った。その結果、再発腫瘍では、初発時のmajor cloneに新たな付加異常が加わったクローンが大半を占めており、これらの付加的な異常が悪性度を規定している可能性が示唆された。本年度は、再発を繰り返す膵芽腫例の初発、転移巣、再発腫瘍から採取したマルチサンプリング検体を用いて、エクソーム解析、SNPアレイ解析を行った。肝転移巣検体については、計6か所の部位につき組織を採取し、それぞれのゲノム解析を行った。その結果、すべての腫瘍検体ではベータカテニンの変異と11pの片親ダイソミー(UPD)が検出されたが、初発腫瘍と転移、再発腫瘍で重複する遺伝子変異、ゲノム変異は検出されなかった。転移、再発腫瘍に検出された変異の中に有意なドライバー変異は見出されなかったことから、多数の遺伝子変異の蓄積による個々の細胞の生理機能の破綻が、悪性化に関与しているメカニズムが推測された。さらにトランスクリプトーム解析、メチル化解析あるいは全ゲノム解析を行って、クローン進化の病態を解明する必要がある。固形腫瘍における単一細胞からのゲノム抽出は、技術的に困難であり、正確な評価が行えなかったが、単一細胞から100-1000個程度の細胞集団の解析を行う方針としたところ、順調に解析が進展した。また、次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析、deep sequencingによりクローン進化の評価法も確立した。難治性小児がんの代表である神経芽腫500例につき、がん関連遺伝子10個のターゲットシーケンスと高密度SNPアレイ解析を用いて、ゲノムプロファイリングを行った。その結果、神経芽腫は、ゲノム異常の特性により6つのサブグループに分類されることが判明した。これらのサブグループは臨床的特徴とよく相関し、さらに興味深いことに腫瘍の進化の過程を反映していることが明らかとなった。サブグループは以下の通りである。グループA (ALK異常を伴う群)、グループB (他の遺伝子変異を伴う群)、グループC (MYCN増幅を伴う群)、グループD (11q LOHを伴う群)、グループE (少なくとも1か所のゲノムコピー数の変化を伴う群)およびグループF (サイレント群)。グループAからDは予後不良であり、グループE、Fは予後良好であった。サブグループAからEを通じて、最も共通するゲノム異常は、17qの増加であったことから、神経芽腫の発生過程において、17qの増加は最も早期に生じる異常であることが推測できた。また、次に高頻度なゲノム異常は2pの増加であったことから、これは17qの増加に引き続いて生じた異常であり、その後、1p LOHおよび11q LOHが排他的に独立したクローンに生じた可能性が考えられた。

その後、1p LOHをもつクローンにALK変異とMYCN増幅がそれぞれ別々に生じ、異なるサブグループに分化していったものと推測された。グループEでは、hyperploidが高頻度であったことから、同時に染色体の異数分裂が生じた結果、腫瘍化したものと推測された。またグループFにおけるがん化のメカニズムには、生殖系列細胞の異常やエピゲノム異常の関与が考えられた。以上の結果より、大多数のコホートに対するゲノムのプロファイリングは、腫瘍の進化を推測する上でも有用であった。難治性膵芽腫例から採取したマルチサンプリング検体を用いて、エクソーム解析を行った。肝転移巣検体については、計7か所の部位につき組織を採取し、それぞれのゲノム解析を行った。すべての腫瘍検体ではベータカテニンの変異と11pの片親ダイソミー(UPD)が検出されたが、初発腫瘍と転移、再発腫瘍で重複する遺伝子変異、ゲノム変異は検出されなかった。転移、再発腫瘍では、初発時のmajor cloneに新たな付加異常が加わったクローンが大半を占めていた。従って、膵芽腫の発症にはベータカテニンの変異と11pのUPDが、最も重要な異常であり、その進展には、複数の異なる付加的なイベントが関与する可能性が示唆された。白血病細胞などの造血器腫瘍とは異なり、固形腫瘍における単一細胞は困難を極めているが、これまでの解析により神経芽腫と甲状腺がんからの単一細胞の単離、DNAの増幅には成功した。研究の第一段階は、達成した。また、次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析、deep sequencingによりクローン進化の評価法も確立した。さらに症例やがん種を増やして、クローン進化の解明を試みる。さまざまなコンディションの腫瘍検体を解析することにより、安定した手法の確立を目指す。また、抽出したDNAを用いたSNPアレイも行って、ゲノムコピー数の網羅的解析が可能か否かの検証を行う。条件検討により手法を確立し、多数検体の解析が可能なシステムを構築する。また、平行して、初発、転移巣、再発腫瘍のトランスクリプトーム解析、メチル化解析も行い、腫瘍細胞のもつクローンの集団進化のエピゲノム異常の検討も進める。解析腫瘍としては、神経芽腫、肝芽腫、膵芽腫を予定している。28年度が最終年度であるため、記入しない。小児固形腫瘍単一細胞の単離、DNAの増幅には成功したものの、検体によっては、不安定な部分もあり、更なる条件検討が必要である。そこで、さらに症例を増やして、単一細胞の単離を試みる。また、単一細胞シークエンスと平行して、初発、転移巣、再発腫瘍のゲノムワイドな解析を行い、腫瘍細胞のもつクローンの集団進化の検討も進める。また腫瘍内のintra-tumor heterogeneityを解明するために、同一腫瘍の複数個所を切り出して、エクソーム解析、SNPアレイ解析、deep sequencingを行う。