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不純物揺らぎによる特性ばらつきを抑えたデルタドープ型MOSデバイスに関する研究

VLSIデバイスは性能向上のため急速に微細化しているが,微細化が進むと各種ばらつきが特性に大きく影響を及ぼすようになる.特に,チャネル中の不純物数の統計的な揺らぎは本質的な問題である.これは,サイズが全く同じデバイスであっても,デバイス中に存在する不純物の数は一定ではなく,統計的にばらつくという問題である.この不純物数の揺らぎがそのままデバイスの特性ばらつきとなり,将来のVLSIデバイスの限界を決める要因になりうる.本研究では,不純物揺らぎによる特性ばらつきを抑制する方法として,デルタドープ型MOSデバイスを提案した.このデバイスは,チャネル部分が高不純物濃度の下層と低濃度の上層の2層で構成されている.まず,2次元デバイスシミュレーションを用いてデルタドープMOSデバイスと従来の均一チャネルドープMOSデバイスの設計を行い,しきい値電圧および短チャネル効果の比較を行った.その結果,デルタドープMOSデバイスの方が短チャネル効果に強く,またしきい値電圧を低く設定できることが明らかとなった.次に,両デバイスについて,統計的不純物揺らぎによるしきい値電圧ばらつきの大きさを定量的に求め,両者の比較を行った.その結果,デルタドープMOSデバイスの方が不純物揺らぎの効果を格段に抑制できることを明らかにした.即ち,デルタドープMOSデバイスは,短チャネル効果を抑えつつしかも不純物揺らぎを抑えることができ,将来のサブ0.1μm世代の有望なVLSIデバイスデバイスであることを明らかにした.VLSIデバイスは性能向上のため急速に微細化しているが,微細化が進むと各種ばらつきが特性に大きく影響を及ぼすようになる.特に,チャネル中の不純物数の統計的な揺らぎは本質的な問題である.これは,サイズが全く同じデバイスであっても,デバイス中に存在する不純物の数は一定ではなく,統計的にばらつくという問題である.この不純物数の揺らぎがそのままデバイスの特性ばらつきとなり,将来のVLSIデバイスの限界を決める要因になりうる.本研究では,不純物揺らぎによる特性ばらつきを抑制する方法として,デルタドープ型MOSデバイスを提案した.このデバイスは,チャネル部分が高不純物濃度の下層と低濃度の上層の2層で構成されている.まず,2次元デバイスシミュレーションを用いてデルタドープMOSデバイスと従来の均一チャネルドープMOSデバイスの設計を行い,しきい値電圧および短チャネル効果の比較を行った.その結果,デルタドープMOSデバイスの方が短チャネル効果に強く,またしきい値電圧を低く設定できることが明らかとなった.次に,両デバイスについて,統計的不純物揺らぎによるしきい値電圧ばらつきの大きさを定量的に求め,両者の比較を行った.その結果,デルタドープMOSデバイスの方が不純物揺らぎの効果を格段に抑制できることを明らかにした.即ち,デルタドープMOSデバイスは,短チャネル効果を抑えつつしかも不純物揺らぎを抑えることができ,将来のサブ0.1μm世代の有望なVLSIデバイスデバイスであることを明らかにした.
非裁量的な蛍光顕微鏡画像定量解析法の開発

生命現象を研究する上で、実験や観察の結果を定量化することは不可欠である。従来、実験結果の定量化には操作する人、つまり術者の裁量が入るため、全く同じ結果であっても異なる術者が定量化すると得られる数値が違ってくる。そこで、機械学習を利用した定量化法を開発し、そのプロトタイプを蛍光顕微鏡画像の定量化に適用した。画像を一定の大きさの矩形タイルに分割し、それぞれのタイルの輝度値の分布を中央値と四分位範囲の2つの要約統計量で表現した。この統計量を用いて機械学習を行い、タイルをパターン毎にクラス分類した。観察目的に合致するクラスのタイルのみを対象に数値データを取得し、術者の裁量に拠らない定量化を実現した。術者のバイアスや裁量に依存することなく、最小限の画像処理パラメータの設定で蛍光顕微鏡画像を定量解析する方法を開発した。具体的には、蛍光顕微鏡画像を一定の大きさのマス目(以下gridと呼ぶ)で区切り、それぞれのgridを構成する画素の蛍光強度の要約統計量(中央値など)を計算する。この要約統計量がgridを表現する数値であり、画像定量の基本データとした。次に、細胞核に一致するgridのみを要約統計量の組み合わせを利用して分類するアルゴリズムを開発し、細胞核に存在する分子の定量に成功した。また、gridの要約統計量からgridをクラス分類するアルゴリズムの改良ではgridの画像内での位置情報を利用し、ノイズやアーチファクトに属するgridを効率良く、かつ非裁量的に排除する仕組みを開発した。GBIQの開発は、多数の蛍光顕微鏡画像を非裁量的、自動的に処理・数値化し、バイオイメージインフォマティクスの推進に必要な表現型の定量化に大きく資するものである。今後は、更にインテリジェントなgrid割り当てやクラス分類のアルゴリズムを実装し、より高精度に画像を定量化する方法の開発を目指す。平成28年度の研究計画では、1)計測解析ソフトウェアを研究者コミュニティに提供すると同時に、リファレンスとなる文献を発表し、2) giridの要約統計量を用い、画像の内容を特徴量に基づいてクラス分類するアルゴリズムを改良することを目標とおいた。1)に関しては、開発したソフトウェアGBIQ (Grid Based Image Quantification)のソースコードをgithubに公開し、広く研究者に利用できるようにした。また、GBIQの理論的詳細を学術雑誌に発表し、GBIQを利用して研究を遂行する際のリファレンスを提供した。2)に関しては、gridの要約統計量にプラスして、gridの位置情報を利用するクラス分類のアルゴリズムを開発した。このアルゴリズムは混合正規分布のパラメータ推定を基本としている点ではプロトタイプと変わらないが、位置情報の追加によって、偽陽性のgridを効果的、かつ非裁量的に排除することに成功した。以上の研究進捗状況より、本研究課題は概ね研究計画通りに進展していると判断した。次に、細胞核に一致するgridのみを要約統計量の組み合わせを利用して分類する機械学習のアルゴリズムを開発し、細胞核に存在する分子の定量に成功した。生物試料の調製日時が異なると、利用する試薬のロットや染色手技・条件のばらつき、個体差などの要因により、同じ生命現象を観察しても染色性やバックグラウンドなどの出方が異なる。このように染色結果にばらつきのある生物試料をまとめて定量化することは難しく、術者の定性的観察による結果の解釈・記述を行うしかなかった。そこで、GBIQの方法で定量化した異なる生物試料の複数の結果を統合し、ベイズモデルによって染色性のばらつきやバックグラウンドノイズ、個体差をモデル化した。その結果、GBIQによる複数の定量結果を非裁量的に処理し、定性的観察に頼らない定量的な結果の記述や解釈が可能となった。引き続きGBIQの改良を継続する。特に組織切片の蛍光顕微鏡画像の計測・解析を効率よく行えるような改良を重点的に検討し、cell segmentationではほぼ不可能であった組織切片のハイスループットデータ処理を行えるアルゴリズムを開発する。また、前年度で検討したクラス分類のアルゴリズムを応用し、蛍光顕微鏡画像へのgridの割り振りをadaptiveかつdynamicに行う前処理法を検討する。もしこの方法が成功すれば、本法の信頼性・頑健性は更に高まると期待される。発生生物学あまりました。USBストレージを購入。
敗戦後の日本映画における女性の「貧困」と「堕落」の表象

本研究は、敗戦直後の日本で同時期に多数製作された「娼婦」がヒロインの映画=<パンパン映画>と「母」がヒロインの映画=<母もの映画>における同時代的表象を明らかにすることを目的としている。1研究対象となるフィルム、シナリオ、関連する映画文献の調査について主として、(1)早稲田大学演劇博物館、東京国立近代美術館フィルムセンター、松竹大谷図書館、京都文化博物館、京都府立総合資料館でおこない、(2)占領期ないし検閲関係の資料については主として早稲田大学中央図書館、国立国会図書館、アメリカ議会図書館、メリーランド大学において調査した。また、(3)東京国立近代美術館フィルムセンターにおいてフィルム試写をおこない、本研究に関連する分野の研究者との意見交換をおこなった。(4)以上をふまえ、テクスト分析および歴史的・理論的考察をおこなった。2研究の途中経過として、「廃嘘の<娼婦>と<母>--占領期からポスト占領期の日本映画における女たち」(国際日本文化研究センターシンポジウム「1950年代日本映画における戦前・戦中との連続性・非連続性」於国際日本文化研究センター)というテーマで研究発表をおこなった。また、同時代の映画以外のメディアにおける女性表象との関連についても考察し、「基地をめぐるジェンダー表象:幻灯と映画を中心に」(上映と研究報告会「《幻灯》に見る戦後社会運動--基地と原爆--」於早稲田大学)というテーマで研究発表をおこなった。また、銃後の女性の理想像を描いた映画について分析した論文「『ハナコサン』(1943年、マキノ正博)の両義性:「明朗」な戦争プロパガンダ映画」が刊行予定である(『美学』第63巻1号、2012年6月)。3以上をふまえた研究成果を、2012年度中に論文「占領期の日本映画における堕落した女」の表象」(仮)として発表する予定である。
Cold Collision電子分光法の確立

平成18年度に製作した、超低エネルギー電子ビーム生成装置を用いて、実際に超低エネルギー電子衝突実験をKEK-PF(高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光科学研究センター)での共同利用実験として行い、新たに開発した実験手法の検証を行った。平成18年度の開発で製作した、「しきい光電子」を電子源とする電子ビーム生成装置に電子衝突用セルを備え付け、透過減衰法による電子-原子・分子衝突全断面積測定を行った。低エネルギーから比較的高いエネルギー(16eV)まで電子ビームを制御できること、全断面積が正しく得られることについて、測定結果と既存のデータと比較することで確認した。この結果、低エネルギーから比較的高いエネルギー(16eV)まで、装置が動作することが確かめられた。さらに、これまで、その存在は明らかであったが、全断面積値が報告されていなかった、共鳴に起因する構造について、その断面積の測定に成功した。また、この共鳴による構造を利用して、生成した電子ビームのエネルギー分解能を見積もる手法を確立した。以上のことから、新しい手法による超低エネルギー電子ビーム生成法の確立に成功し、Cold Collision電子分光法の基礎技術の一つを確立した。また、本研究で開発した手法は、これまで、専有の放射光ビームラインを有する世界で唯一のグループでしか行えなかった実験を、より一般的な設備で行うことを可能とする技術である。本研究はCold Collisionと呼ばれるミリeV領域での超低エネルギー電子衝突における電子分光法の基礎を確立することを目的とする。従来型の実験手法では全く不可能であった超低エネルギーの電子ビーム生成技術と超低エネルギー電子のエネルギー分析システムの開発が主要な課題であり、本研究では放射光を利用することで技術的困難さを克服する。このCold Collision電子分光法が確立されることにより、量子効果が明確に現れ、かつ有限多体系であることに起因する未知の現象が観測されることが期待される。平成18年度では、主に超低エネルギー電子ビームの生成法の開発を行った。(1)高感度・高エネルギー分解能を原理的に達成することが可能な「しきい光電子分光法」を応用した、独自の手法を用いた超低エネルギー電子ビーム発生装置を設計・製作した。(2)実験を行う高エネルギー加速器研究機構・物質構造科学研究所・放射光科学研究施設(KEK-PF)のビームラインBL-20Aについて、光学系の調整を行い高分解能の単色紫外線の供給を可能とした。(3)既存の真空装置の真空排気系を増強し、製作した超低エネルギー電子ビーム発生装置を設置し、アライメント等の調整を行った。(4)製作した超低エネルギー電子ビーム発生装置とビームラインとのマッチングを行い、ビームライン・テストを行い、電子ビーム生成を確認した。平成19年度では、超低エネルギー電子ビームの生成装置を用いて、実際に超低エネルギー電子衝突実験をKEK-PFで行った。前年度に製作した装置に、電子エネルギー制御用の電子レンズシステムおよび衝突セルを取りつけ、透過減衰法による電子衝突全断面積測定を試行した。過去に全断面積の測定例があるXeを標的とした実験により、製作・開発した装置の特性を把握するとともに、エネルギー分解能等の評価方法を確立することにも成功した。さらに、これまで実験的に直接観測することが出来なかった、Xeの電子衝突全断面積に現れるFeshbach共鳴による構造を測定することに成功し、その絶対値を求めることに成功した。これらのことから、本研究により、新しい実験手法に基づいたCold Collision電子分光法の基礎的な基盤技術の開発することが出来た。
カドミウム・亜鉛調整精製飼料によるラット免疫担当器官の変化

生体内微量元素である亜鉛とカドミウムの相互作用による免疫担当器官に対する影響を検索する目的で、雄ラットに6種類のカドミウム・亜鉛調整精製飼料(カドミウムの含量が0.01ppm以下および0.3ppmの2種類にそれぞれ低亜鉛レベル(3ppm)、通常亜鉛レベル(30ppm)、高亜鉛レベル(1000ppm)および市販飼料で離乳直後の3週齢から12カ月間飼育し、次のような結果を得た。1.低亜鉛レベルの飼料で飼育した群では体重の増加抑制傾向がみられたが、最終体重において各群間において有意な変化はみられなかった。2.血清中亜鉛濃度は、飼料への亜鉛添加量に比例して高い値を示したが、低亜鉛レベルの飼料を給与した群と市販飼料を給与した群では有意な差はみられなかった。3.血清中カドミウム濃度は、市販飼料を給与した群と比べ、カドミウム・亜鉛調整精製飼料を給与した群では低い値を示す傾向がみられたが、カドミウムおよび亜鉛の添加量に相関する変化はみられなかった。4.胸線および脾臓重量では各群間に有意な変化はみられなかった。5.胸線および脾臓の組織学的検索においても各群間に形態学的な差異は認められなかった。以上のように、亜鉛とカドミウムの相互作用について、これらの元素の添加量に相関するような変化は何も認められず、この2つの元素の相互作用は確認できなかった。また、本試験では亜鉛の欠乏量として飼料への添加量を3ppmとした。しかしながら、低亜鉛飼料を給与した群の血清中亜鉛濃度は市販飼料とほぼ同等の値であり、さらに、成長の抑制、脱毛や皮膚炎といった欠乏症はみられておらず、重篤な亜鉛欠乏状態を引き起こしていないと考えられた。このことが、今回検索した胸線および脾臓に対して何ら組織学的な影響がみられなかった原因であると考える。現在、文献的には亜鉛欠乏状態を引き起こす条件(飼料中亜鉛濃度3ppm)で飼育したのにもかかわらず、亜鉛欠乏モデルを作出できなかったのかについて検索中である。
マウス由来膜タンパク質ＴＲＩＣチャネルのＸ線結晶構造解析

Tricチャネルは、小胞体からのカルシウム放出の制御機構の一旦を担っており、近年見つかった新しいタイプの3量体型陽イオンチャネルであるということからも大変興味深い。本研究では、構造学的観点からカルシウムシグナル制御機構を明らかにするために、昆虫細胞と大腸菌を用いたTricチャネルの大量調整法の確立、精製、結晶化、X線回折実験を行った。様々な種のTricを調製することに成功し、結晶化を行ったところ、クラミドモナスとバクテリア2種由来のTricで結晶化に成功した。特にバクテリア由来のSSOではより大きな結晶が得られ、最高分解能7.5Åの回折斑点を得た。小胞体からのカルシウム放出は筋収縮やホルモン分泌等の多くの重要な生理機能の調節に関与する。カルシウムは主に小胞体内膜に存在する2つのカルシウムチャネルにより放出されるが、近年、Tricと呼ばれるチャネルが2つのカルシウムチャネルと連動して、カルシウム放出機構を制御していることが明らかとなった。本申請ではTricA及びTricBを対象とし、昆虫細胞を用いたチャネルタンパク質の大量調整法の確立、X線結晶構造解析法による立体構造決定を行うことで、構造学的観点から、カルシウムシグナル制御機構の解明を行うことを目的としている。平成25年度は、様々な生物種のTricホモログの結晶化と、結晶の改善を目指したサンプルの調製に主眼をおいて研究を行った。マウス由来のTricA及びTricBは不安定で結晶が得られなかった事から、ゼブラフィッシュ、クラミドモナス、最近発見されたバクテリア由来のTricホモログをクローニングし、昆虫細胞と大腸菌にて大量発現、精製、結晶化スクリーニングを行ったところ、Sulfolobus solfataricus由来のTricチャネルで結晶化に成功した。クラミドモナス由来Tricでも結晶が得られたが、構造解析には適さない結晶であることが明らかとなった。更にバクテリア由来のTricに対し界面活性剤の最適化を行ったところ、DM及び新しい界面活性剤として注目されているNG322で結晶がより改善する事が明らかとなった。また、タグの切断、アミノ酸配列の長さの切り詰めを行ったところ、より大きな結晶が得られた。現在、脱水等により分解能向上を試みている。今後、結晶が得られ次第X線回折実験を行う予定である。平成24年度は、立体構造解析により適したサンプルを調製することに主眼をおいて研究を行った。研究開始時にマウス由来のTricA、TricBの全長及びC末端側を削ったコンストラクトを作製し、昆虫細胞を用いて大量発現することに成功していたが、様々な界面活性剤を検討した結果、不安定なタンパク質で構造解析に適したサンプルでないことが明らかとなった。そこで、ホモログタンパク質に着目し、ゼブラフィッシュ、クラミドモナス、バクテリア由来のTricAをクローニングし、昆虫細胞と大腸菌にて大量発現に成功した。界面活性剤の最適化の結果、近年新しい界面活性剤として注目されているMNG-3で最も安定に保つことができることが明らかとなった。現在、通常の結晶化法に加え、脂質キュービック法も用い、結晶化スクリーニングを行っている。更にアミノ酸配列の長さの切り詰めや変異体の作成、結晶化しやすいタンパク質との融合など多種の発現系を作成し、結晶化に適した安定なコンストラクトの調製を試みている。Tricチャネルの立体構造解析に向けて、サンプルの調製、安定に保つことのできる条件の最適化が順調に進行した。結晶構造解析に適したTricAサンプルを用い、より良質な結晶を作製し、大型放射光施設にてX線回折実験を行う。該当なし
ライソゾーム逸脱型BCG-Tokyo新規ワクチン開発と免疫学的評価

昨年度作成した組換えBCGの解析を行った。すなわち、昨年度作成した既存のBCGにMycobacterium bovisのAnigen 85B (Ag85)を組み込んだrBCG-Mbov85Bと、これまでに我々が新たに作成したrBCG-Mkan85Bの比較を行い、どちらがより有効なワクチンとなりうるか検討した。rBCG85B-Mkan85Bは既存のBCGにMycobacterium kansasiiのAg85Bを組み込んだものである。まず、組み込んだ遺伝子のシークエンスを解析し、どちらもそれぞれの抗酸菌由来のAg85B遺伝子が組み込まれていることを確認した。次に、タンパク発現をウェスタンブロットで解析した。その結果、rBCG-Mbov85BはBCGに比較して、1.8倍程度の発現量であったのに対し、rBCG-Mkan85Bは9倍程度の発現量を示した。in vivoでの免疫誘導能を解析するために、マウスにrBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bをそれぞれ接種した。免疫したマウスの脾臓細胞を採取し、エピトープペプチドでin vitroで刺激し、種々のサイトカインを産生する細胞をフローサイトメトリーで検出した。その結果、rBCG-Mkan85Bを接種したマウスの方がrBCG-Mbov85Bを接種したマウスよりも、抗原特異的に複数のサイトカインを同時に産生するpolyfunctional CD4陽性ヘルパーT細胞が多く検出された。次にCD8陽性細胞傷害性T細胞の誘導を促すために、rBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bを接種したマウスに、それぞれ対応するDNAワクチン(DNA-Mkan85BもしくはDNA-Mbov85B)を追加接種して免疫誘導能を検討しているところである。本申請の研究の最終的な目的はライソゾームエスケープタイプの組換えBCGの作成と、その抗原特異的免疫誘導能の検討をすることであるが、その前段階の組換えBCGの作成に時間がかかってしまった。その理由として、BCGは遅発育菌であるため、組換えBCGを作成し、実験に必要な量まで増やすのに、時間がかかることが挙げられる。また、ワクチンのスケジュールも追加接種まで含めるとトータルで10週間かかるスケジュールで至適化されたため、1クールの動物実験を終了させるのに約3ヶ月かかるため実験の進行がやや遅れている。次年度はまず、rBCG-Mkan85BとrBCG-Mbov85Bの結核感染防御能の比較をマウスを用いて行う。具体的にはrBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bをマウスに接種し、それぞれに対応するDNAワクチン(DNA-Mkan85BもしくはDNA-Mbov85B)を追加接種する。これらのマウスに結核菌を噴霧感染させ、一定期間後に解剖する。肺や脾臓などの組織内の生菌数を検出し、比較する。また、ライソゾームエスケープタイプのBCGの作成にも着手する。ライソゾームエスケープタイプのBCGが作成できたら、さらにM.kansasii由来のantigen 85B (Ag85B)を組み込み、新たな組換えBCGを作成する。本研究課題ではライソゾーム逸脱型BCG-Tokyoを作成し、これにAg85B抗原遺伝子をさらに組込んで、既存のBCGよりも有効な結核ワクチンを開発することを目的としている。Ag85Bは結核を含む抗酸菌のなかで広く保存されており、抗酸菌の細胞壁の合成に重要な機能を有する分泌タンパクである。これまでに、我々は既存のBCGにMycobacterim kansasiiのAg85Bを組込んだ組換えBCGを作成し、マウスに接種し免疫学的応答などの解析を行い既存のBCGよりも強力に抗原特異的細胞性免疫応答が誘導可能であることを確認済みである。しかし、Mycobacterim kansasiiのAg85Bは結核菌のAg85Bとの相同性が89%であるため、結核菌のAg85Bを組込んだBCGでの検討が必要であると考えた。そこで、本年度はまず結核菌のAg85BをBCG-Tokyoに組込んだ組換えBCGを作成することとした。結核菌とBCG(Mycobacterium bovis BCG)のAg85Bは相同であるため、BCGのAg85Bをコードしたプラスミドを入手して使用した。このプラスミドからAg85Bのコーディング領域を切り出し、抗酸菌のシャトルベクターにライゲーションし新たなプラスミドを作成した。このプラスミドを大腸菌に導入して、大量のプラスミドを得ることができた。さらに、このプラスミドをBCG-Tokyoに導入し新たな組換えBCGを作成した。加えて、免疫のブースターとして使用するために、BCGのAg85BをコードしたプラスミドをDNAワクチンとして新たに作成した。当初の予定では本年度中にライソゾーム逸脱型BCG-TokyoにAg85Bを組込むところまで進める予定であった。しかし、研究を遂行するなかで、我々がこれまで進めてきたMycobacterium kansasii由来のAg85Bを組込んだ組換えBCGに加えて、結核菌(もしくはBCG)由来のAg85Bを組込んだ組換えBCGを作成し、菌株内でのAg85Bの発現を比較して我々が進めているMycobacterium kansasii由来のAg85Bを組込んだ組換えBCGの優位性を示すことを求められた。

さらに、これらの二つの組換えBCGを動物に接種して免疫誘導能や感染防御能を検討することとした。従って、今年度は研究協力者からBCG由来のAg85Bをコードしているプラスミドの分与を受け、BCG由来のAg85Bを組込んだ組換えBCGの作成に取り掛かった。すなわち当初の予定を変更し、やや遅れた進捗状況である。昨年度作成した組換えBCGの解析を行った。すなわち、昨年度作成した既存のBCGにMycobacterium bovisのAnigen 85B (Ag85)を組み込んだrBCG-Mbov85Bと、これまでに我々が新たに作成したrBCG-Mkan85Bの比較を行い、どちらがより有効なワクチンとなりうるか検討した。rBCG85B-Mkan85Bは既存のBCGにMycobacterium kansasiiのAg85Bを組み込んだものである。まず、組み込んだ遺伝子のシークエンスを解析し、どちらもそれぞれの抗酸菌由来のAg85B遺伝子が組み込まれていることを確認した。次に、タンパク発現をウェスタンブロットで解析した。その結果、rBCG-Mbov85BはBCGに比較して、1.8倍程度の発現量であったのに対し、rBCG-Mkan85Bは9倍程度の発現量を示した。in vivoでの免疫誘導能を解析するために、マウスにrBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bをそれぞれ接種した。免疫したマウスの脾臓細胞を採取し、エピトープペプチドでin vitroで刺激し、種々のサイトカインを産生する細胞をフローサイトメトリーで検出した。その結果、rBCG-Mkan85Bを接種したマウスの方がrBCG-Mbov85Bを接種したマウスよりも、抗原特異的に複数のサイトカインを同時に産生するpolyfunctional CD4陽性ヘルパーT細胞が多く検出された。次にCD8陽性細胞傷害性T細胞の誘導を促すために、rBCG-Mkan85BもしくはrBCG-Mbov85Bを接種したマウスに、それぞれ対応するDNAワクチン(DNA-Mkan85BもしくはDNA-Mbov85B)を追加接種して免疫誘導能を検討しているところである。本申請の研究の最終的な目的はライソゾームエスケープタイプの組換えBCGの作成と、その抗原特異的免疫誘導能の検討をすることであるが、その前段階の組換えBCGの作成に時間がかかってしまった。その理由として、BCGは遅発育菌であるため、組換えBCGを作成し、実験に必要な量まで増やすのに、時間がかかることが挙げられる。また、ワクチンのスケジュールも追加接種まで含めるとトータルで10週間かかるスケジュールで至適化されたため、1クールの動物実験を終了させるのに約3ヶ月かかるため実験の進行がやや遅れている。今年度はBCG由来のAg85Bを組込んだ組換えBCGの作成に取り組み、BCGに組み込むことができるシャトルベクターの完成までを見た。次年度はこのシャトルベクターをBCGに組み込みBCG由来のAg85Bを組込んだ組換えBCG(rBCG-BCG85B)の完成を目指す。上記の組換えBCG(rBCG-BCG85B)が完成したのちに、rBCG-BCG85Bとこれまでに作成した組換えBCG(rBCG-Mkan85B)のウェスタンブロッティングを行い、組み込んだAg85Bの発現量を比較する。
ドナー細胞の胸腺内移入による特異的免疫寛容誘導法の開発

昨年の研究により、recipientにLewis(LEW)、donorにBrown Norway (BN)を用いた心移植モデルにおいて、donorの骨髄細胞を胸腺内移入(ITBMC)するとともに短期間のFK506の併用により心に対してdonor特異的免疫寛容の誘導が示され、また、ITBMCの時期は移植当日が最適であることが示された。今回は移植3週間前にITBMCをすると早期拒絶される原因を研究するために、無処置LEWと早期拒絶群における末梢血リンパ球サブセットの経日的変化をCD8^+CD25^+細胞率で解析したところ、早期拒絶群では移植後1日目にピークを認め、活性化細胞傷害性T細胞により移植心が早期に拒絶されたものと考えられた。モノクローナル抗体OX-27(BNに陽性、LEWに陰性)とOX-3(LEWに陽性、BNに陰性)を用いて免疫組織学的検討をおこなった。移植心が長期生着しているラットは、OX-27陽性細胞がリンパ節、脾臓、骨髄、胸腺および固有心に認められた。また、移植心にはOX-3陽性細胞が認められキメリズムの成立が証明された。また、リンパ節や脾臓のOX-27陽性細胞は経時的に増加し、キメリズム発現と免疫寛容の成立との関連性が示唆された。移植心が長期生着しているLEWの脾細胞をX線照射したLEWに1×10^8個静脈内投与し、BN心を移植した。同様に無処置LEWおよび心移植をおこなわずFK506とITBMCのみおこなったLEWの脾細胞を投与し、BN心を移植した。3群間では生着期間に有意差を認めずsuppressor mechanismがこの免疫寛容の主な機序ではないことが示された。γIL-2を移植心が長期生着しているLEWに1000単位を5日間投与したが拒絶反応は誘発されず、また、リンパ球混合培養試験においても長期生着LEWのBNに対する反応はγIL-2添加によっても増強しなかった。このことより心に対するドナー特異的免疫寛容の主な機序がclonal anergyではなく、clonaldelationであることが示唆された。recipientにLewis(LEW)、donorにBrown Norway(BN)を用い、心移植および皮膚移植モデルで検討を行った。胸腺内移入するdonor細胞は骨髄細胞とし、心移植1×10^8個、皮膚移植5×10^7個を胸腺両葉に注入した。(ITBMC)。FK506,1mg/kgをITBMC当日から隔日投与にて計5回筋注した。心移植は100日以上の長期生着が得られたが、皮膚移植は生着延長効果を認めたものの、長期生着が得られなかった。移植心の長期生着が得られたrecipientにdonorおよびthird partyの皮膚移植を行うとdonorの皮膚の生着延長効果が得られ、third partyの皮膚は生着延長効果はなく、donor特異的な免疫寛容状態であることが示された。ITBMCを行う時期を検討したが、心移植当日が最適であり、移植前3週、4週では逆に移植心は早期に拒絶された。リンパ球混合培養は、100日以上の長期生着したrecipientのリンパ球と対照群として無処置のLEWのリンパ球を反応細胞に、また、donorおよびthird partyの脾細胞を刺激細胞に用いて行った。長期生着したrecipientは、対照群と比較してdonorに対する反応は有意に低値であり、third partyに対する反応はどちらも同様であり有意差を認めなかった。in vitroにおいてもdonor特異的であることが示された。ITBMCと短期間のFK506の併用により心に対してdonor特異的免疫寛容の誘導が示され、また、ITBMCの時期は移植当日が最適であることが示された。

3群間では生着期間に有意差を認めずsuppressor mechanismがこの免疫寛容の主な機序ではないことが示された。γIL-2を移植心が長期生着しているLEWに1000単位を5日間投与したが拒絶反応は誘発されず、また、リンパ球混合培養試験においても長期生着LEWのBNに対する反応はγIL-2添加によっても増強しなかった。このことより心に対するドナー特異的免疫寛容の主な機序がclonal anergyではなく、clonaldelationであることが示唆された。
中枢神経病変を来すリソソーム病治療への多面的アプローチ

リソソーム病はリソソーム内の加水分解酵素の欠失により、未分解の基質がリソソーム内に蓄積することにより細胞障害をおこし、各臓器の障害につながると考えられているが、特に中枢病変における分子メカニズムについては詳細不明である。また中枢神経病変を伴うリソソーム疾患は、酵素補充療法も中枢神経神経病変には効果がないと考えられている。このため、中枢神経病変に対する多面的なアプローチとして下記の方法について実験を行った。1)中枢神経系で欠損酵素を発現させて蓄積物質を除去する;酵母による発現ベクターを構築しその発現を試みたが、効率が低く十分な量が得られなかった。2)スフィンゴリピド合成酵素を抑制し、蓄積する脂質を減少させる;サイクロセリンがクラッベ病の細胞毒性物質サイコシンの合成阻害をすると考えられており、用量依存性などを調べる予定である。3)蓄積物質を分子シャペロンを用いて排泄させる;クラッベ病におけるサポシンAは欠損酵素galactocerebrosidaseの活性化因子と言われているが、基質に結合し分子シャペロンともなりうると考えられるため、まず酵母による大量発現系を構築した。その結果高純度のサポシンAが十分得られ、β-glucosidase, galactocerebrosidaseともに測定系において活性を数倍に増大させることが判明した。In vivoで治療法とならないか検討中である。4)残存酵素活性を上昇させる;上記におけるサポシンAが残存酵素活性を増大させる可能性があり、in vivoで確認中である。5)DNA-RNAオリゴを用いたhomologous recombinationによる治療;当該期間での進行はなかった。6)リソソームへの蓄積から神経細胞死に至るシグナルをブロックする;ファーバー病においてセラミドの蓄積により、NFkB、MCP-1などのサイトカイン、ケモカインの分泌増大が確認され、NFkBのデコイ治療が効果ないか検討中。またクラッベ病におけるサイコシンレセプターは細胞の多角化に関与するとされているため、この抗体により、レセプターの抗体による発現分布の解析、中和抗体としての治療効果につき検討している。リソソーム病はリソソームへの分解されない気質の蓄積により細胞障害を引き起こし、種々の臓器の機能障害を引き起こすと考えられているがその分子メカニズムは不明である。本年度ではクラッベ病の病態解明として、サイコシンの蓄積がどのような細胞の機能異常を来すのかを明らかにするため、1)サイコシンのレセプターと考えられているT cell death associated gene 8 (TDA8)の抗体を用い、サイコシンにてアポトーシスを来すと考えられているマウスのオリゴデンドロ細胞にTDA8が発現しているのかどうか、2)マクロファージ由来の細胞に強制発現させサイコシンによる細胞毒性(細胞分裂障害)を抗体により予防できるのかを明らかとすることを目的とした。1)に関して現在抗体の特異性を検討しその確認を行い、存在の可能性が示唆された。2)に関しTDA8の発現ベクターを構築しその発現程度をマクロファージ由来の培養細胞にて検討している段階である。今後、抗体を用いた毒性阻止試験を行う予定である。サイコシンはスフィンゴリピド活性化蛋白に結合する。このため、スフィンゴリピド活性化蛋白のAドメインのペプチドを作成し、サイコシン毒性の阻止を検討する予定である。特異的なサイコシン毒性のペプチドが同定されればモデルマウスを用いその効果を検討する。

リソソーム病はリソソーム内の加水分解酵素の欠失により、未分解の基質がリソソーム内に蓄積することにより細胞障害をおこし、各臓器の障害につながると考えられているが、特に中枢病変における分子メカニズムについては詳細不明である。今年度はリソソーム病のうち、脱髄疾患であるクラッベ病に関して、次の2つの方法による治療法に関する研究をおこなった。1)ガラクトセレブロシダーゼの大量発現系の開発;クラッベ病の欠損酵素のモデルマウスへの投与と、構造解析をめざして、大量発現系の確立をめざした。大腸菌での発現系では、効率も悪く酵素活性が測定できないことが判明した。酵母での発現系をいくつかのベクターをもちいて現在試みている。2)活性化因子サポシンの生物活性の解析;サポシンはいくつかのリソソーム酵素の基質と結合し、酵素と基質が反応しやすくすることによって酵素を活性化するといわれている。またこのタンパク質はいくつかのアイソフオームがあるが、ガラクトセレブロシダーゼの活性化因子はまだはっきり同定されていない。しかしサポシンAは選択的ノックアウトマウスの作出により、クラッベ病の表現型を示すことが示されているため、本酵素の活性化因子の可能性がある。そこでこのたんぱく質の酵母発現系を確立した。今後はガラクトセレブロシダーゼ活性にどのような影響があるか調べ、活性化因子と言えるのか判定する。またこのサポシンAがガラクトセレブロシダーゼのもう一つの基質であり、細胞毒性を持つサイコシンと結合して、分子シャペロンとしての機能を持たないかin vitroの系で確認する予定である。リソソーム病の病態解明として今年度は脱髄疾患であるクラッベ病に関して、次の2つの方法で研究を行った。1)クラッベ病の日本人における遺伝子変異を包括的に解析し、そのスクリーニング法につき確立を目指した。日本人の酵素活性で診断されているが遺伝子変異未解析の症例20例に対して、ゲノムDNAを用いて全エクソンの変異をDHPLC法でスクリーニングする方法を確立した。変異が推定されるエクソンに関して塩基配列決定法で変異を同定し、5つの新規変異を含む20変異を同定している。またヒトのアミノ酸の置換する多型についても新たに同定した。新規変異に関しては発現実験により、酵素活性の変化を解析中である。2)活性化因子サポシンの生物活性の解析;サポシンAは、クラッベ病の欠損酵素ガラクトセレブロシダーゼの活性化因子の可能性がある。500mlの培養液から60mgの蛋白が精製できる効率の良い発現系であることが確認でき、また精製したガラクトセレブロシダーゼを用いてin vitro実験で酵素活性を上昇することも確認した。糖鎖についても解析し、糖鎖の付かないタイプの発現蛋白でも活性があることが確認された。またβ-gulcosidaseの活性を上昇させることも確認できた。
海馬において記憶を制御するニューロステロイド合成系の研究

(1)脳内性ステロイド濃度の性周期変動と雌雄差質量分析器を用いた脳内性ステロイド濃度測定法を確立した。この測定から得られた、女性ホルモンであるエストラジオールがメスではなくオスの海馬でかなり高いという結果はこれまでの常識を覆す発見であるといえる(Higo et al.,Endocrinology2009,Mukai et al.,BBA2010)。上記に加えメスの各性周期におけるテストステロン、エストロン、プロゲステロン濃度も測定が終了しており、特にエストロンとプロゲステロンにおいて明確な性周期変動が観察された。これらの結果を第33回日本神経科学大会でポスター発表し、結果をまとめた論文を投稿中である。(2)生後発達期における脳内ステロイド合成系の動態解析生後1、4、7、10、14日齢、4週齢および12週齢においてステロイド合成酵素群とその受容体を調査対象とし、網羅的発現解析をおこなった。過去には特定の酵素のみ、一部の期間のみを対象にした研究が散見されるのみであったが、すべての性ステロイド合成酵素およびその受容体を発達段階の広い期間で網羅的に調べた本研究は基礎研究として有用性が高い(Kimoto et al.,Endocrinology2010)。(3)脳内コルチコステロイド合成系の研究脳内コルチコステロイド合成系を対象にした研究もおこなった。プロゲステロン→デオキシコルチコステロン→コルチコステロンの合成経路を、発現解析、代謝実験、免疫組織化学およびin situ hybridizationにより調査した。その結果、海馬をはじめとする脳各部位にコルチコステロイド合成酵素が発現しており、実際の代謝能もあることが明らかになった。海馬での合成酵素発現は錐体神経細胞および顆粒神経細胞に局在していた。これらの研究結果をまとめた論文が現在PloS ONEにて審査中である。(1)脳内性ステロイド濃度の性周期変動と雌雄差適切な誘導体化の探索を含む詳細な条件検討を行い、LC-MS/MSを用いた脳内性ステロイド濃度測定法の確立を達成した。本研究で確立した測定法は従来に比べ感度が飛躍的に向上し、定量限界以下であるとされてきた雄ラット血中エストラジオール濃度の測定を可能にした。濃度測定により雌ラットでも血中に比べ海馬内のエストラジオール・テストステロン濃度が有意に高いことがわかり、脳に対する性ステロイドの作用は血中由来ではなく脳内合成系由来のものが中心的な役割を果たすという予想が裏付けられた。また、エストラジオールは各性周期に伴う血中・海馬内濃度の変動が観測された。血中エストラジオール濃度は雌より雄が低かった。一方、雌の海馬内エストラジオール濃度は排卵期で最大の1.7nM、排卵間期で最小の0.5nMであり、雄ラットの約8nMと比べかなり小さいという血中とは逆の傾向が見られた。女性ホルモンであるエストラジオールが雌ではなく雄の海馬でかなり高いという結果はこれまでの常識を覆す発見であるといえる。エストラジオールは神経に対し最も強力な作用を持つステロイドの一つであることを考えあわせると、この海馬内エストラジオール濃度の雌雄差が記憶学習の雌雄差形成に中心的な役割を果たしていることが強く示唆される(以上Higo.Hojo., Endocrinology 2009)。上記に加えテストステロン、エストロン、プロゲステロン濃度も測定が終了し、論文発表予定である。(2)発現解析と代謝実験による脳内ステロイド合成活性の測定法の確立各性ステロイド合成酵素について最近接法による熱力学的計算により至適プライマーを作製、条件検討を行なった。また、代謝実験についても条件検討を行い、測定法を確立した(Higo, Hojo., BBRC 2009)。
界面活性剤ミセル中へのヌクレオチドの分配特性の解明と分離特性の評価

非イオン性(Triton)および陰イオン性(SDS)界面活性剤の混合ミセルへの疎水性分子であるフェナントロリン(phen)誘導体および核酸塩基(アデニンおよびAMP)の可溶化現象を電位差滴定法、精密滴定カロリメトリー、分光光度滴定法、密度滴定法、蛍光光度法で調べた。まず界面活性剤を含まない水溶液中で、疎水性分子のプロトン化定数を求め、界面活性剤(Triton)溶液中でのプロトン化定数から化学種の水溶液とミセル間の分配定数を決定した。2,9-ジメチルフェナントロリンの中性分子はphenに比較して、より強く可溶化することが示され、それが可溶化のエンタルピー変化のみに依存し、エントロピーは変化しないことが明らかになった。さらにミセル内部は、より疎水的なコア相(オクチルフェニル基)と親水的な界面相(エチレンオキシド基)の2重構造を形成し、疎水性分子はいずれの相にも可溶化することが示され、各相への移行の熱力学的パラメータが決定された。また、フェナントロリンの蛍光はコア相では完全に消光され、界面相では部分的に消光されることがわかり、界面相での水分子の含有量を見積もる方法論を確立した。一方、カチオン性のHPhen^+およびH(phen)_2^+は全く可溶化しない。同様に、核酸塩基であるアデニンとAMPもTritonミセルには全く可溶化しない。この理由はアデニンの窒素部位の水和が強く、分子の疎水性が低下していること、またAMPでは、燐酸基の水和が強く非イオン性界面活性剤への可溶化が阻害されるものと考えられる。アデニンの混合ミセルへの可溶化をTritonとSDSの割合を変えて調べると、わずかであるが可溶化することが示された。アデニンは非イオン性よりも陰イオン性界面活性剤と相互作用することがわかった。核酸塩基のミセルへの可溶化は水素結合性アダクトを形成させることにより促進するものと考えられ、目下検討中である。界面活性剤ミセルへの種々のアミノ酸やヌクレオチドの分配特性を解明することを目指して、非イオン性界面活性剤ポリオキシエチレンアルキルエーテルを用いて、様々なタイプのアミノ酸、アミノ酸蛍光誘導体およびヌクレオチドのプロトン付加反応を電位差滴定法、精密滴定力ロリメトリー、分光光度滴定法、密度滴定法、蛍光光度法で調べる。アミノ酸やヌクレオチドのミセル内分配位置を明らかにするために、本研究では蛍光スペクトルを用いることを試みた。蛍光特性が水溶液中とミセル中では違いがあることを考えると、ミセル内部が一様でなく、局部構造があれば構造に依存して蛍光特性がちがってくるであろうと考えられた。まず、ヌクレオチドを使うまえに、そのモデル物質であるフェナントロリン(phen)を用いて、蛍光法が使えるかどうか検討した。蛍光スペクトルを定量的に解析できる蛍光スペクトル測定システムを構築し、フェナントロリンの蛍光スペクトルのpH依存性からphenとHphen^+の固有の蛍光スペクトルを得た。界面活性剤Triton溶液中にはphenのみが可溶化され、蛍光スペクトルの界面活性剤濃度依存性から、ミセル中に存在するphenの分配定数と固有スペクトルを決定した。分配定数は別途、ポテンショメトリーで決定した値と同じ値を得、この測定法が使えることがわかった。また、同時に得られたミセル中の固有スペクトルのモル蛍光強度は水溶液中に比べて非常に弱く、ミセル中では強く消光されることがわかった。したがって、フェナントロリンの蛍光スペクトルからミセル構造の非均一性を確認するにはいたらなかった。核酸AMPの場合、酸性溶液中ではミセルとの相互作用は発生せず、pH>9でミセルに取り込まれることが、ポテンショメトリーと蛍光スペクトルから明かになった。AMPの蛍光はフェナントロリンと同様、ミセル中で消光されることがわかった。

この理由はアデニンの窒素部位の水和が強く、分子の疎水性が低下していること、またAMPでは、燐酸基の水和が強く非イオン性界面活性剤への可溶化が阻害されるものと考えられる。アデニンの混合ミセルへの可溶化をTritonとSDSの割合を変えて調べると、わずかであるが可溶化することが示された。アデニンは非イオン性よりも陰イオン性界面活性剤と相互作用することがわかった。核酸塩基のミセルへの可溶化は水素結合性アダクトを形成させることにより促進するものと考えられ、目下検討中である。
軸対称衝突噴流中に形成される拡散火炎の安定機械

拡散火炎の安定機構を解明するために、軸対称衝突噴流場のよどみ流領域と壁噴流領域を利用し、Edge Flameを形成できる新規なバーナシステムを構築した。バーナは、円形ノズル、燃料噴出用の多孔質板を埋め込んだ衝突平板から構成した。そして、多孔質板中央に金属円板を埋め込み燃料噴出の一部を止めることで、本バーナシステムでは対抗流拡散火炎にHoleとしてEdge Flameを形成した。さらに、ノズル直径Dを基準にして多孔質をよどみ流領域に、di>Dの場合Edge Flameを壁噴流領域に形成した。以下に各流れ場で明らかになったEdge Flameの火炎特性を示す。1.よどみ流中にEdge Flameが形成される場合、その火炎の消炎特性は伝播性を有さない純拡散火炎と同様の傾向を示し、如何にしても火炎を安定に形成できない臨界よどみ速度勾配が存在した。これはよどみ流中にEdge Flameが形成された場合、火炎はEdge Flameの反応帯における化学反応速度の有限性に起因して消炎することが明らかとなった。さらに、火炎に形成されるHole直径が増加する場合、その臨界値が減少することが明らかとなった。2.減速流である軸対称壁噴流中にEdge Flameを形成した場合、Edge Flameは空気流速の増加に伴い伝播性を有するTriple Flameへ遷移し消炎することがわかった。そして、Edge FlameからTriple Flameへの遷移過程において、火炎先端領域の発熱量が増加し、火炎位置の決定要因が個体壁面と火炎先端との干渉と言った熱的要因から、Edge Flame(Tripie Flame)が有する伝播速度と未燃混合機流速との釣り合いといった流体力学的な要因へ変化することが分かった。本研究はEdge Flameを有する拡散火炎の安定機構を独自のバーナを用いて実験的に検討している.バーナは上方に円形ノズル,下方に衝突平板を設け軸対称衝突噴流場を形成する.その衝突平板に多孔質板を埋め込み,燃料を噴出することで対向流拡散火炎を形成する.このとき多孔質板に金属円板を埋め込み燃料の噴出を禁じることで,対向流拡散火炎にHole(火炎の無い領域)を形成させEdge Flameを有した拡散火炎として形成する.そして,その金属円板直径を変化させHoleの大きさを変えEgde Flameを衝突噴流場のよどみ流領域または壁噴流領域に形成させ,各々の火炎特性について個別に検討した.1.よどみ流領域にEdge Flameが形成される場合安定限界の測定結果からEdge Flameを有する拡散火炎も純拡散火炎と同様,いくら燃料噴出速度を増加させても火炎を維持できない臨界よどみ速度勾配が存在し,その値はHoleの直径の増加とともに減少することが分かった.火炎位置とトモグラフイー法による温度境界層の可視化の結果から,Holeが大きくなりEdge Flameが形成されてゆくにつれ火炎が衝突平板へ近づき固体壁面への熱損失が増加すること,Edge Flame相互の温度境界層のOverlappingが減少することが分かった.臨界よどみ速度勾配の減少はそれらに基づく火炎温度の低下に起因すると考えられる.熱電対を用いた温度測定の結果も,HoleができEdge Flameが形成されてゆくにつれ火炎温度が低下することを示した.2.壁噴流領域にEdge Flameが形成される場合本研究は拡散火炎の安定性を支配するEdge Flameの火炎特性を独自のバーナを用いて実験的に検討している.バーナは円形ノズル,衝突平板から成り,衝突平板に多孔質板を埋め込み燃料を噴出する事で火炎を形成する.多孔質板中央には金属円板を埋め込み燃料の噴出を一部止めることで,対向流拡散火炎にHoleを形成し,Edge Flameを有した拡散火災として形成する.

その金属円板直径を,ノズル直径を基準に小さくまたは大きくすることで,Holeの大きさを変えEdge Flameを衝突噴流場のよどみ流領域または壁噴流領域に形成することができる.各々の火炎の特徴として,よどみ流領域ではいかにしても火炎が形成できない消炎限界の臨界値を生じる.他方,壁噴流領域では消炎過程においてEdge FlameからTriple Flameへの遷移が生じることが明らかになった.平成11年度はPIVを用いて流れ場の測定を行った.得られた結果として,よどみ流領域及び壁噴流領域共に火炎が形成されても,Edge Flame近傍及びその上流には,再循環流の様な流れの剥離は形成されていないことがわかった.また,よどみ流に火災が形成される場合,流れは火炎のごく近傍まで火炎の存在による影響を受けず,一般的な対向流拡散火炎と同様,よどみ速度匂配によって流れ場が支配されている.他方,壁噴流領域で火炎が形成された場合,流れ場全体は火炎の存在によって生じる浮力の影響を受け変形する.また,火炎先端がEdge FlameからTriple Flameへと変化するにともない,火炎先端上流の流れが発散することが明らかとなった.
ストレス順応性獲得分子機構の解析

今年度、以下のような具体的研究成果が得られた。1)カイコ幼虫にN-acetyltyrosine(NAT)を1 micromol/larva注射し、4時間後に44度/1時間という致死的熱ストレスを与えた結果、アワヨトウ幼虫同様の生存率の上昇が見られた。したがって、NATはアワヨトウ以外の鱗翅目昆虫にもストレス耐性増強作用を示す事を証明できた。2)西洋ミツバチへの女王蜂からの隔離ストレス、すなわち、巣箱から採取した若いワーカーを小さな虫籠に入れ、NATを含むハチミツ水投与の影響を見た。その結果、0.01-0.1mMのNAT含有ハチミツ水の投与によって有意にストレス耐性が上昇する事を明らかにした。しかし、これ以上、あるいは、これ以下の濃度のNAT含有ハチミツ水によっては、生理的効果が見られなかった。この結果から、膜翅目昆虫であるミツバチに対しては濃度依存的なストレス耐性増強作用を示す事を証明できた。3)予備的に行ったマウスを用いた実験によって、予め1g/kg-weightのNAT水を投与したマウスでは、1時間の強制水泳という強度のストレスによる血中過酸化脂質濃度の上昇を抑える生理的効果がある事が分かった。ただ、同時に測定した血中コルチコステロン濃度には有意な差は見られなかった。従って、ストレス条件を更に検討し、本当にNATは血中コルチコステロン濃度変動には影響しないのかどうかについて明らかにする必要がある。なぜなら、血清中のコルチコステロン、過酸化脂質とも哺乳類において重要なストレス指標となっている為、一方に対してのみ濃度上昇抑制効果を示すというのは、やや矛盾があるように思われるからである。ストレス順応性誘導因子として同定したN-acetyltyrosineは、ストレス負荷を受けたアワヨトウ幼虫では、脳ー神経節から未知活性因子が分泌され、これによって特定の組織から生合成・分泌が誘導されると予想している。一昨年度、脳ー神経節から同定した未知活性因子3-hydroxykynurenineは、今年度の解析結果より、NAT生合成・分泌の上流因子では無いと結論せざるを得ない。なぜなら、脳ー神経節内の3-hydroxykynurenine濃度はストレス依存的上昇を示さない上に、アワヨトウ幼虫への3-hydroxykynurenine注射によって体液中NAT濃度上昇が見られなかったからである。再度精製条件を変えて幼虫脳ー神経節からの活性因子の単離を再度試みている。これとは、別に、進めてきたアワヨトウ以外の動物へのN-acetyltyrosine生理活性についての解析では以下のような成果を得た。まず、西洋ミツバチへの女王蜂からの隔離ストレス、すなわち、巣箱から採取した若いワーカーを虫籠に入れ、N-acetyltyrosineを含むハチミツ水の影響を見た結果、0.01-0.1mMのN-acetyltyrosineの投与によって有意にストレス耐性が上昇する事を明らかにした。さらに、マウスを用いてN-acetyltyrosineの生理活性を測定した。具体的には、1g/kg-weightのN-acetyltyrosineを5日間投与し、6日目に強制水泳・1時間というストレスを与えた後に、血中コルチコステロンと過酸化脂質濃度を測定した。その結果、前者のコルチコステロン濃度にはコントロール値と有意な差は見られなかったものの、過酸化脂質は顕著に減少する事が分かった。従って、N-acetyltyrosineは昆虫のみならず、哺乳類に対してもストレス耐性増強作用がある可能性が示唆された。以下の2種類の研究を並行して進める。1)分泌・作用機構解析研究:今年度は、NAT産生組織の同定に重点を置く。具体的には、ストレス条件下に置かれたアワヨトウ幼虫から脳-神経節、脂肪体、外皮、中腸、後腸、血球などを摘出し、その組織抽出液を調製する。こうした組織抽出液を逆相のHPLC分析を行い、NAT存在の有無を確認する。次に、NAT含有組織とストレス条件下のアワヨトウ幼虫の脳-神経節抽出液共培養し、組織内あるいは培養液中のNAT濃度をHPLC分析する。NATの生理的作用機序の解析については、NATによる抗酸化酵素遺伝子発現上昇活性に着目し、上流の転写調節因子の解析を行う。抗酸化酵素遺伝子発言調節に関与するシグナル伝達経路が報告されているが、その中で最も可能性が高いと予想されるFoxOの関与について、組織免疫染色やリアルタイムPCR法を用いて細胞内分布と遺伝子発現レベル両方向から解析を進める。2)NAT構造解析研究:昨年度、NAT生合成系のキーエンザイムをN-acetyltransferaseと予想し、キイロショウジョウバエの当該酵素候補遺伝子のRNAiによって解析した。その結果、中腸細胞(enteroendocrine cells)におけるノックダウンによってコントロール系統に比べ有意な順応性能の低下が検出できた。しかし、他の組織細胞(真皮細胞や脂肪体細胞)におけるRNAiでは、上記のような結果は得られなかった。従って、今年度は、高温ストレス環境下で中腸enteroendocrine cellsにおいてN-acetyltransferaseの遺伝子発現が上昇するかどうかについて検証を進める。さらに、有機合成によってNATのエステル化合物などを調製し、ストレス耐性誘導能についてアワヨトウ幼虫を用いて分析を進める。ストレス順応性は、数多くの動植物で観察されていることから、恐らく全ての生物が有する生理現象と考えられる。しかし、その誘導に関わる分子機構についてはまだ良く分かっていない。