hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床への応用を目指した活性中心指向型プラスミン阻害剤の設計

昨年度,ミクロプラスミン(microPlm,プラスミンの活性中心領域)と我々所有のPlm阻害剤YO-2 (IC50 = 0.53 microM)の共結晶構造を解析した結果,酵素ー阻害剤の相互作用様式が明らかになった.本年度は,これら情報とYO-2の構造をもとに,以下の新規化合物を合成し、Plm阻害活性の評価を行った.1)環状Plm阻害剤のデザイン:カルボキシ末端のオクチル基はmicroPlmのS2'サブサイトと相互作用しておらず,酵素との結合に寄与していないことが分かった.そこでこの部分を環状化してS'ポケットとの相互作用を増強することを試みた.不飽和結合を有する20員環化合物がもっとも強力にPlmを阻害した(1, IC50 = 3.68 microM). 20及び18員環状化合物(1, 2)は,対応する鎖状化合物の約5倍強力にPlmを阻害した.2)イミダゾール骨格を有する阻害剤のデザイン:S'サブサイトにおける相互作用を付加する目的で,オクチル残基の代わりにイミダゾール基(ベンゾイミダゾール型)を導入した.合成した化合物中,化合物3は最も強くPlmを阻害した(IC50 = 21.5 microM).合成したすべての化合物は、測定溶媒に対してよく溶解し,溶解性の改善には有用であった.3)阻害剤中のアミノ基を回避する試み:S1サブサイトとアミノ基の相互作用は重要であるが,アベイラビリティ改善の観点からは回避したほうが好ましい.アミノ基に替わる残基として1クロル基を有するニコチン酸,あるいは2二環性複素環を導入し, Plm阻害活性を検討した.これら化合物中,二環性複素環構造を有する化合物4は,弱いながらPlmを阻害した(IC50 = 27.6 microM).プラスミン(PL)はトリプシン様酵素であり、血栓除去に関わるほかに炎症を促進するサイトカインを活性化すると考えられている。我々は共同研究により、PL阻害剤であるYO-2が急性移植片対宿主疾患(GVHD)モデルマウスや潰瘍性大腸炎モデルマウスにおいて、生存率を顕著に改善することを明らかにしてきた。今年度はYO-2を基盤構造として、さらに阻害活性を向上させることを目的として、YO-2分子中のピコリル基の置換と、オクチルアミド基のイミダゾール基への置換を行った。i)ピコリル基の置換:ピコリル基のピリジン環の塩基性の効果を確認するために、ピリジン環をベンゼン環に置換して4位及び3位にカルボキシ、エステル、アミド基を導入した。これら置換により阻害効果の大きな増強がみられなかったことから、ピリジン環の疎水性が相互作用に効果的であることが示唆された。【Tsuda et al, 34th European Peptide Symposium (2016)】ii)イミダゾール基の導入:近年、イミダゾール基を有する第XI因子阻害剤が報告された。第XI因子はPLと同様にトリプシン様酵素であるが、作用は異なり血栓形成に関わっている。報告された第XI因子阻害剤は、YO-2と同じくトラネキサム酸(Tra)を有し、さらにPhe分子を含んでいることから、イミダゾール基を有するPL阻害剤の合成を着想した。得られた化合物は772-2.17 microMの範囲のIC50値を示した。H-Tra- Tyr(OPic)-Imi-X (X = Ph)はこのシリーズ中、最も強い阻害活性を示した(IC50 = 2.17 microM)。【Tsuda et al, The 53rd Japanese Peptide Symposium (2016)】従来の阻害効果を大きく凌駕する化合物を得ることは出来なかった。しかし、P2およびP1'残渣の構造について以下のように有用な情報を得ることができた。・ピコリル基の置換により、ピコリル基の効果はピリジン環の塩基性に由来するのではなく環構造の疎水性によるものであることが示された。このことはS2ポケットにおいて疎水性相互作用が重要であることを示しており、今後のP2残基の分子設計の指針となる。・新規にイミダゾール基を導入したところ、化合物の溶解性を改善することができた。疎水性に富んだP2残基との組み合わせにより、物性に優れた化合物を生む可能性を示した。さらに、凝固線溶系因子は免疫系を過剰に活性化させることが示唆されてきた。マクロファージ活性化症候群(MAS)は、免疫の過剰な活性化により引き起こされるサイトカイン・ストームと多臓器で起こる機能障害が特徴であり、重篤な病状である。このような病状では凝固線溶系に異常がみられることは知られていたが、線溶系の主要酵素であるPlmの役割は不明であった。今回MASモデルマウスを作製し、このモデルではPlm活性が異常亢進しており、免疫系の過剰な活性化に凝固線溶系因子が関わっていることを示した。さらに、Plm阻害剤でPlmを抑制するとMASによる死亡率を低下できることを示した【Hiroshi Shimazu, Yuko Tsuda, Koichi Hattori, et. al. blood, 2017, 130, 59-72】。Plmは線溶系の主要な酵素で、血栓除去に関わっていることはよく知られている。そればかりでなく、Plmは腫瘍の形成および免疫系の亢進に関わっていることが示唆されてきた。

しかし病態モデル動物を使ってPlmの役割を検討する試みはなされていなかった。本研究においては、病態モデルマウスを作製した。病態モデルマウスとPlm阻害剤を使用して、病態下のPlmの役割の一部を解明することができた。1)Plm阻害剤は多発性骨髄腫モデルマウスにおいてPlmを抑制することはできたが、多発性骨髄腫の進展を抑えることはできなかった。従って、Plmが多発性骨髄腫の進展に直接関わっているとは言えないことが示された。2)マクロファージ活性化症候群(MAS)モデルマウスではPlm活性が異常亢進しており、免疫系の過剰な活性化にPlmが関わっていることを示した。酵素ー阻害剤の相互作用様式が明らかになったことにより、それを基に新規阻害剤の分子設計を進めることができる。したがって今後の進展は加速することが期待される。昨年度,ミクロプラスミン(microPlm,プラスミンの活性中心領域)と我々所有のPlm阻害剤YO-2 (IC50 = 0.53 microM)の共結晶構造を解析した結果,酵素ー阻害剤の相互作用様式が明らかになった.本年度は,これら情報とYO-2の構造をもとに,以下の新規化合物を合成し、Plm阻害活性の評価を行った.1)環状Plm阻害剤のデザイン:カルボキシ末端のオクチル基はmicroPlmのS2'サブサイトと相互作用しておらず,酵素との結合に寄与していないことが分かった.そこでこの部分を環状化してS'ポケットとの相互作用を増強することを試みた.不飽和結合を有する20員環化合物がもっとも強力にPlmを阻害した(1, IC50 = 3.68 microM). 20及び18員環状化合物(1, 2)は,対応する鎖状化合物の約5倍強力にPlmを阻害した.2)イミダゾール骨格を有する阻害剤のデザイン:S'サブサイトにおける相互作用を付加する目的で,オクチル残基の代わりにイミダゾール基(ベンゾイミダゾール型)を導入した.合成した化合物中,化合物3は最も強くPlmを阻害した(IC50 = 21.5 microM).合成したすべての化合物は、測定溶媒に対してよく溶解し,溶解性の改善には有用であった.3)阻害剤中のアミノ基を回避する試み:S1サブサイトとアミノ基の相互作用は重要であるが,アベイラビリティ改善の観点からは回避したほうが好ましい.アミノ基に替わる残基として1クロル基を有するニコチン酸,あるいは2二環性複素環を導入し, Plm阻害活性を検討した.これら化合物中,二環性複素環構造を有する化合物4は,弱いながらPlmを阻害した(IC50 = 27.6 microM).以下の指針で分子設計を継続する。・P2残基を疎水性に富んだ分子で伸張し(脂肪族でも芳香族でもよい)、P1'位にイミダゾール基を持つ化合物を合成する。・P2およびP1'残基を伸張し、環化する。・P1残渣の修飾を行なう。それと同時に、PL-阻害剤複合体のX-線構造解析をすすめ(共同研究)、PL阻害剤を使ってPLの炎症時の役割を明らかにする(共同研究)。・P1'残基を疎水性に富んだ分子で伸張する(脂肪族でも芳香族でもよい)。・P1残渣の修飾およびP1残渣のつなぎの部分の化学修飾を行う。
レインガーデンの設計・管理指針の提案と先進的都市緑化戦略の策定に関する研究

緑地の減少により地中への雨水浸透量が減少し,下水管渠への依存度が増加した。近年,その下水管渠の処理容量を上回るゲリラ豪雨の増加により、都市型洪水が深刻化している。欧米ではレインガーデンと下水管渠を複合させた雨水処理システムが主流化されているが,わが国では調査・研究が不足しており,社会実装化に向けての準備が整っていない。本研究は,実験ヤードのレインガーデンでのモニタリング調査より表面流水抑制量を把握した。また,ヒアリング調査により,レインガーデンの設計及び維持管理に関する留意点を整理した。本研究成果は,わが国でレインガーデンの社会実装化を進めていく上での基礎資料として活用されることが期待される。今日、我が国ではレインガーデン導入の必要性が議論され始めている。しかしながらレインガーデン関連の調査・研究はほとんど行われておらず、導入のための準備が整っていない。こうしたことから、海外で利用されているレインガーデンの事例調査を行い、設計上の留意点や管理上の課題を整理する必要がある。加えて、レインガーデンのようなグリーンインフラ(緑の構造物)は、気候・風土の影響を受ける可能性があるため、海外事例をそのまま輸入することはリスクが高い。実際にレインガーデンを建設してモニタリング調査を行い、我が国の気候・風土に適した形にアレンジしなければならない。本年度の事例調査として、グリーンインフラの政策を進める先進都市として国際的に認知されているアメリカのオレゴン州ポートランドと、ポートランドとは気候・風土が全く異なるフロリダ州ゲインズビルを訪問し、既に利用されているレインガーデンの構造や植栽されている植物について調査した。また、レインガーデンの設計者や管理者に対して、設計上の留意点、管理上の課題、施工費、維持管理費、レインガーデンのメリット・デメリットについてヒアリング調査を行った。一方、モニタリング調査の準備として、国立大学法人九州工業大学先端グリーンキャンパスプロジェクトの実験ヤードにレインガーデンを建設した。そして、平成27年度に行うレインガーデンの雨水吸収能力実証実験に向けての予備実験を行い、改良を加え、レインガーデンの施工前と施工後植生調査を行った。さらに、国際学会1件(口頭発表)、国際シンポジウム1件(基調講演)、国内学会1件(ポスター発表)、和文雑誌1本、英文書籍1冊で本研究について発表するとともに、国内外の研究者や技術者と情報交換を行った。本年度は、レインガーデンをはじめとするグリーンインフラ(緑の構造物)に関する研究で多くの実績を持つコペンハーゲン大学のMarina Bergen Jensen教授の研究室を訪問した。そして、同研究室がコペンハーゲンにおいて展開しているレインガーデンを用いた都市型洪水緩和に向けた実践的な取り組みについての調査を実施した。同時に、同教授が担当する「Urban Ecosystems」を受講し、レインガーデンの設計・配置計画手法などを学んだ。それらの結果と昨年度実施したアメリカオレゴン州ポートランドとフロリダ州ゲインズビルでの事例調査結果を比較することによって、気候・風土が異なっても共通するレインガーデンの構造的特徴を把握した。これらの知見は、研究発表に加えて造園業者や行政担当者を対象としたレインガーデンに関する技術セミナーなどで情報発信する際にも活用する予定である。一方、九州工業大学戸畑キャンパスに昨年度建設したレインガーデンにデジタル水位計(MODEL-4800 S&DL mini、応用地質株式会社製)を取り付け、レインガーデンの雨水吸収能力を評価するための検証実験を実施し、その実験データを解析した。上述した事例調査と検証実験に関しては、次年度初頭に英文ジャーナルに学術論文として投稿するための準備がほぼ完了した。また、昨年度の研究成果を国内学会2件と和文雑誌1本で発表した。その他に、北九州国際会議場にて開催された「都市と自然の共生シンポジウム」に出席し、中央大学の鷲谷いづみ教授と九州工業大学の伊東啓太郎准教授による基調講演から、今後我が国において期待されるレインガーデンなどのグリーンインフラの役割についての最新情報を収集した。本研究の2本柱である「海外におけるレインガーデンの先進事例調査」と「実験ヤードに建設したレインガーデンのモニタリング調査」に関しては、計画通りに進展している。また、昨年度やや遅れの見られたGISによる実験ヤード周辺の不透水層(コンクリートやアスファルトなど雨水が地下に浸透しない表面)の変遷状況の把握については、遅れを解消することができた。最終年度は、当初の研究計画通り、研究期間全体を通じて実施した研究の成果を、国内外の研究者や技術者、行政職員に向けて積極的に情報発信した。加えて、平成28年6月に本研究で得られた知見を基盤に新たに研究計画を立て、国土交通省国土政策局平成28年度国土政策関係研究支援事業に応募し、採択された。本研究ではGISを用いて広島市デルタ市街地におけるレインガーデンの建設適地について分析し、その表面流水抑制効果を経済ベースで評価した。そして、平成29年3月研究成果報告会にて「地理空間情報を活用した都市域における人と自然の共生モデル構築に関する研究-レインガーデンの最適配置計画を基軸として-」を発表し、報告書を提出した。今後、研究対象地を広島市デルタ市街地から瀬戸内ブロックに拡大し、水循環基本法の観点から雨水処理について検討する予定である。

本研究成果は,わが国でレインガーデンの社会実装化を進めていく上での基礎資料として活用されることが期待される。本研究の2本柱である「海外におけるレインガーデンの事例調査」と「国内におけるレインガーデンのモニタリング調査」に関しては、計画以上に進展している。その一方、本年度内での完了を予定していたGISを用いた実験ヤード(九州工業大学戸畑キャンパス)周辺の1960年代、1980年代、2000年代における不透水層(コンクリートやアスファルトなど雨水が浸透しない表面)の変遷状況の把握において、若干の遅れが見られる。ただし、この遅れはクリティカルパスではなく、平成27年度上半期までに解消を図ることができれると考えられる。次年度は、本研究の最終年度にあたるため、学術論文や学会発表などの情報発信に重点を置く。具体的には、英文ジャーナルに2本投稿することに加えて、国際学会で1回、国内学会で2回発表する予定としている。また、本研究によりこれまで得られた知見をもとに、GISを用いて広島市内(研究代表者の現在の勤務地)におけるレインガーデンの建設候補地を提案し、その候補地にレインガーデンを建設した場合に想定される雨水浸透量をシミュレートする。土木工学残りの2年間は、当初の研究計画に従って本研究を円滑に推進していく。具体的には、以下のとおりである。平成27年度は、平成26年度に訪問できなかった欧州にて、レインガーデンの事例調査を行う。訪問する都市については、現在、調整中である。また、平成26年度に実験ヤードに建設したレインガーデンで植生調査を行うとともに、レインガーデンの機能性・耐久性を評価する。さらに、GISを用いて不透水層の変遷状況を把握し、北九州市戸畑区及びその周辺の雨水吸収能力を評価する。平成28年度は、実験ヤードのレインガーデンで平成27年度と同様のモニタリング調査を継続して行う。そして、本研究で行った調査結果をもとに、日本の都市環境に適した生態系サービスの修復を目的としたレインガーデンの設計・管理指針を提案する。また、レインガーデンと屋上緑化を組み合わせた継続的かつ先進的な都市緑化戦略を策定する。
サルモネラ菌の細胞内増殖に関わる病原性因子の機能解析と新規薬物療法への展開

Salmonella enterica serovar Typhimuriumの染色体上に存在するSalmonella Pathogenicity Island 2の領域内に同定した新規病原性因子,SpiCはマクロファージ(Mφ)の殺菌能に対する抵抗性やマウスに対する全身感染の成立に関与していること,さらに,サルモネラ感染によりMφ内で変化する宿主因子の網羅的な解析をcDNAアレイ等の方法により行った結果,SpiCがサイトカイン抑制因子3(SOCS-3)などの遺伝子発現の増強に関与していることをこれまで明らかにしてきた.本研究の目的は,これらのファクターの発現の意義およびSpiCによる発現増強のメカニズムを解明することであり,各年度の研究実施計画に基づいて研究を行った結果,以下の新たな知見を得ることができた.1.SOCS-3の発現は,STAT1およびSTAT3のリン酸化を阻害することにより,IL-6およびIFN_κ-B刺激による活性を抑制した.2.SpiC依存的なSOCS-3の発現は,MAPキナーゼおよびNFκ-Bシグナル伝達経路が関与していた.3.培養上清を用いたプロテオーム解析により,SpiCは鞭毛繊維の構成蛋白であるフラジェリン(FliC)の発現に関与していた.4.SpiCは転写レベルでfliC遺伝子の発現に関与していた.5.電子顕微鏡観察を行った結果,spiC欠損変異株では極度に鞭毛の減少が見られた.6.fliC遺伝子欠損変異株を作製して,サルモネラ感染MφのSOCS-3の発現を調べた結果,その減少が見られた.7.精製FliCをMφの培養液中に添加,さらにfliC遺伝子をクローニングしたpcDNA3.1ベクターをMφにトランスフェクションした結果,SOCS-3発現の増加が見られた.以上の結果から,SpiCはフラジェリンの発現に関与することにより,MφからのSOCS-3などの発現に関与し,さらにこれらのファクターの発現はサルモネラの病原性に重要な役割をしていることが明らかとなった.Salmonella enterica serovar Typhimuriumの染色体上に存在するSalmonella Pathogenicity Island 2の領域内に同定した新規病原性因子,SpiCはマクロファージ(Mφ)の殺菌能に対する抵抗性やマウスに対する全身感染の成立に関与していること,さらに,サルモネラ感染によりMφ内で変化する宿主因子の網羅的な解析をcDNAアレイ等の方法により行った結果,SpiCがサイトカイン抑制因子3(SOCS-3)などの遺伝子発現の増強に関与していることをこれまで明らかにしてきた.本研究の目的は,これらのファクターの発現の意義およびSpiCによる発現増強のメカニズムを解明することであり,各年度の研究実施計画に基づいて研究を行った結果,以下の新たな知見を得ることができた.1.SOCS-3の発現は,STAT1およびSTAT3のリン酸化を阻害することにより,IL-6およびIFN_κ-B刺激による活性を抑制した.2.SpiC依存的なSOCS-3の発現は,MAPキナーゼおよびNFκ-Bシグナル伝達経路が関与していた.3.培養上清を用いたプロテオーム解析により,SpiCは鞭毛繊維の構成蛋白であるフラジェリン(FliC)の発現に関与していた.4.SpiCは転写レベルでfliC遺伝子の発現に関与していた.5.電子顕微鏡観察を行った結果,spiC欠損変異株では極度に鞭毛の減少が見られた.6.fliC遺伝子欠損変異株を作製して,サルモネラ感染MφのSOCS-3の発現を調べた結果,その減少が見られた.7.精製FliCをMφの培養液中に添加,さらにfliC遺伝子をクローニングしたpcDNA3.1ベクターをMφにトランスフェクションした結果,SOCS-3発現の増加が見られた.以上の結果から,SpiCはフラジェリンの発現に関与することにより,MφからのSOCS-3などの発現に関与し,さらにこれらのファクターの発現はサルモネラの病原性に重要な役割をしていることが明らかとなった.Salmonella enterica serovar Typhimuriumの染色体上に存在するSalmonella Pathogenicity Island 2の領域内に同定した新規の病原性遺伝子,spiCはマクロファージ(Mφ)の殺菌能に対する抵抗性やマウスに対する全身感染の成立に関与していること,さらに,SpiCの機能を明らかにする目的でサルモネラ感染によりMφ内で変化する宿主因子の網羅的な解析をcDNAアレイ等の方法により行った結果,SpiCがシクロオキシゲナーゼ2(COX-2),インターロイキン-10(IL-10),そしてサイトカイン抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3:SOCS-3)の各遺伝子発現の増強に関与していることを明らかにした.本研究において,これらのファクターの発現の意義およびSpiCによる発現増強のメカニズムを解明するため,平成17年度の研究実施計画に基づいて研究を行った結果,以下の新たな知見を得た.1.サルモネラ感染MφのSpiC依存的なCOX-2およびSOCS-3の発現は,MAPキナーゼおよびNFκ-Bシグナル伝達経路が関与していた.2.IL-10の発現は,COX-2の発現増強により産生されるプロスタグランジンE_2(PGE_2)やPGI_2を介したプロテインキナーゼA(PKA)の活性化が関与していた.3.そのPKAの活性化は,活性酸素の産生を阻害することにより,サルモネラのMφ内増殖に重要な役割をしていた.4.SOCS-3の発現は,STAT1およびSTAT3のリン酸化を阻害することにより,IL-6およびIFN-γ刺激による活性を抑制した.

5.透過型電子顕微鏡観察の結果,SpiCは鞭毛の形成に関与していた.6.SpiCは鞭毛繊維の構成タンパクであるFliCの輸送に関与していた.そして,FliCは上記の遺伝子発現に重要な役割を果たしていた.以上の結果から,SpiCは鞭毛形成に関与することにより種々のファクターの発現に関与し,さらにこれらのファクターの発現はサルモネラの病原性発現に重要な役割を果たしていることが明らかとなった.Salmonella enterica serovar Typhimuriumの染色体上に存在するSalmonella Pathogenicity Island 2の領域内に同定した新規の病原性遺伝子、spiCはマクロファージ(Mφ)の殺菌能に対する抵抗性やマウスに対する全身感染の成立に関与していること、さらに、Spicの機能を明らかにする目的でサルモネラ感染によりMφ内で変化する宿主因子の網羅的な解析をcDNAアレイ等の方法により行った結果、SpiCがシクロオキシゲナーゼ2、インターロイキン10、そしてサイトカイン抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3:SOCS-3)の各遺伝子発現の増強に関与していることを明らかにした。本研究において、これらのファクターの発現の意義およびSpiCによる発現増強のメカニズムを解明するため、平成18年度の研究実施計画に基づいて研究を行った結果、以下の新たな知見を得た。1.プロテオーム解析によるSpiCの機能解析。野生株およびspiC遺伝子欠損変異株の培養上清中に分泌されるタンパク質の解析を2次元電気泳動法で行った結果、spiC欠損変異株において著しく減少するスポットが確認された。そのスポットからタンパク質を抽出してMALDI-TOF MSによる解析を行った結果、鞭毛繊維の構成蛋白であるFliCと同定することができた。2.SpiCのFliCへの関与を詳しく調べるために、FliCに対するペプチド抗体を作製し、菌体あるいは培養上清中から蛋白を抽出してウエスタンブロット解析を行った結果、両画分においてspiC欠損変異株でFliCの減少が見られた。この結果から、SpiCはFliCの発現に関与していることがわかった。3.FliC欠損変異株を作製して、サルモネラ感染Mφの上記ファクターの発現を調べた結果、その減少が見られた。以上の結果から、SpiCは鞭毛形成に関与するFliCの発現に関与し、これによりMφにおける上記ファクターの発現に影響を与え、さらにこれらのファクターの発現はサルモネラの病原性発現に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。Salmonella enterica serovar Typhimuriumの染色体上に存在するSalmonella Pathogenicity Island2の領域内に同定した新規の病原性遺伝子,spiCはマクロファージ(Mφ)の殺菌能に対する抵抗性やマウスに対する全身感染の成立に関与しているが,その機能は明らかでない.
生体分子を集積化した高性能解析系の開発

マイクロチップや細管という微小領域の一部に生体由来の機能性物質を固定化し、その機能を利用することで優れた解析用素子を作製した。物質の固定には、高含水ゲルやリン脂質と類似した構造を有する高分子を用いた。このように生体内と類似した環境で生体物質を固定化することで、固定化された生体物資はその機能を持続的に発現した。また微小領域に固定化し、繰り返し利用が可能であることから、固定化に必要な生体物質は、汎用されている手法と比較して数100分の1以下と、極めて微量であった。この固定化法を利用してタンパク質の消化酵素であるペプシンを固定化し、タンパク質試料の消化と分離を細管内で行い、生成したペプチド断片をオンラインで質量分析装置に導入し検出することで、タンパク質の同定が行える解析系を構築した。また薬物代謝酵素を含むラット肝臓ミクロソームを固定化した細管に、薬物と代謝阻害薬を同時に注入することで、薬物の阻害活性を簡便に測定できることを明らかとした。またこれら解析法の開発に並行して、より生体物質の固定化に適した高含水ゲルの開発を行った。従来から使用していたアルコキシシランに加えて、天然由来の高分子であるキトサンやゼラチンを添加した高含水ゲルを調製し、固定化した生体物質の安定性を評価した。その結果、微量のゼラチンを添加することで、固定化した血清アルブミンのアミノ酸に対する親和性が増加すること明らかとなり、今後はゼラチンを添加した高含水ゲルを他の生体物質の固定化に利用していく予定である。本年度は、マイクロチップ上でタンパク質の消化反応と分離検出を行った。サンプルリザバー(SR)に高含水ゲルを用いてタンパク質消化酵素であるトリプシンを固定化したプラスチック製マイクロチップ(日立化成)を作製し、アミノ酸誘導体(benzoyl-L-arginine ethylester)、ペプチド([Tyr8]-bradykinin),タンパク質(BODIPY-casein)の分析を行った。試料をマイクロチップ上のSRに載せ、各リザバーに電気を印加すると、試料は電気浸透流と電気移動度により泳動され、トリプシンを含むゲル内を通過した。その過程で各試料はトリプシンによって加水分解され、生成したペプチド断片や未反応の原料は、マイクロチップ上の分離流路で分離検出された。各試料の分離検出は、1-5分程度と極めて短時間で行うことができた。特に、キャピラリー内に固定化したトリプシンでは、加水分解及び分離検出ができなかった、タンパク質試料の分析がマイクロチップを用いることで成功した。また生体物質の固定化に利用していた高含水ゲルの微細構造を、光散乱法や熱分析法によって解析した。その結果、ゲルは約10nmの微細孔を有する約1μmのクラスターの集合体であることが明らかとなった。微細孔の大きさは、固定化した生体物質の大きさより僅かに大きかったことから、生体物質は微細孔内に存在すると予想された。またゲルの調製条件(pH、イオン強度等)が、ゲルや固定化されたタンパク質の性質に大きな影響を与えることが明らかとなった。
神経再生関連分子の機能解析

1. Damage-induced neuronal endopeptidase (DINE)のプロテアーゼ活性評価DINEは胎生期運動ニューロンに豊富に発現する膜一回貫通型のメタロプロテアーゼである。DINE欠損マウス(KO)では、横隔神経の軸索分枝異常により神経筋接合部が形成されず生直後死に至る。DINEの基質は同定されておらず、プロテアーゼとして機能するという証拠は未だ得られていない。そこで本研究ではDINE過剰発現マウス(Tg)を用いたDINE KOのレスキュー実験を行った。胎生期運動ニューロン特異的に野生型DINEまたはプロテアーゼ活性部位を欠失させた変異型DINEを発現するDINE Tgを作製し、KOとの交配を行った。その結果、野生型DINE TgはKOの胎生期運動ニューロン軸索分枝異常をレスキューし、生後生存することができた。一方、変異型DINE Tgとの交配では、KOの表現型がレスキューされず、生直後死亡した。以上のことから、DINEが胎生期運動ニューロンでプロテアーゼとして機能していることが明らかになった。2.シュワン細胞を介したDINEの機能メカニズムDINEの機能メカニズムを検討するために、DINE KOの横隔神経を形態学的に詳細に観察したところ、シュワン細胞の形態に異常が認められた。このことから、軸索に存在するDINEが運動ニューロン-シュワン細胞間相互作用を制御している可能性が考えられた。そこで、胎生期におけるシュワン細胞の分化マーカーの発現を比較したところ、KOで一部の分化マーカーの発現が有意に減少していた。また、運動ニューロンとシュワン細胞の共培養を行うと、軸索に沿って並ぶシュワン細胞の数の割合がKOで有意に減少していた。以上の結果から、DINEによって切断された基質が軸索ーシュワン細胞間相互作用を制御し、適切な軸索分枝が形成される可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。Damage-induced neuronal endopeptidase(DINE)のプロテアーゼ活性と軸索ブランチングとの関連性の評価DINEは、中枢・末梢を問わず損傷神経細胞で発現誘導される膜一回貫通型メタロプロテアーゼである。DINE KOマウスは横隔神経の軸索ブランチング形成異常を起こし生直後死に至るが、この生理現象とDINEのプロテアーゼ活性との関連性を調べるために、DINE KOマウスのレスキュー実験を行う必要があった。そのため、この実験のツールとして必要不可欠なDINEのトランスジェニック(Tg)動物作製に取りかかった。DINEの野生型およびプロテアーゼ活性部位変異型をそれぞれ発現させる二種類のコンストラクトを作製し、BACシステムを用いてTgマウス作製を何度か試みたが全く得られなかった。そのため、BACシステムではなく従来のTg動物作製手法でも試みたところそれぞれ10ライン程度獲得できたので、現在DINEの発現と組織特異性を確認している。DINE結合タンパクの探索レスキュー実験と並行して、DINEの結合タンパクの探索にも取りかかった。DINEの基質はいまだ不明であるため、DINEが機能するために必要な足場タンパクや結合タンパクの同定は今後の基質探索や機能解明に重要な足がかりとなることが期待された。dual membraneシステムを用いたyeast two hybridを行った。酵母でDINEを発現させるコンストラクトを作製し、予備実験によって適切なスクリーニング条件を決定した。マウスadult脳cDNAライブラリーを用いたスクリーニングを行い、二次スクリーニングと配列決定により50個程度のクローンを得た。現在これらの分子についてin situ hybridizationによりDINEとの共局在を確かめているところで、今後免疫沈降によって実際の結合を評価する予定である。DINEは、発生期の運動ニューロンで豊富に発現が認められる膜一回貫通型メタロプロテアーゼである。DINEノックアウトマウス(KO)は横隔神経の軸索分枝形成異常により生直後死に至る。DINEはAβ分解酵素であるNeprilysinと同じファミリーを形成するが基質は同定されていない。そのため、まずDINEが生体内でプロテアーゼとして機能するか否かを確かめる必要があった。そこで、DINEトランスジェニックマウス(Tg)を用いたKOのレスキュー実験を行った。発生期脊髄運動ニューロン特異的なHb9プロモーター制御下で野生型DINEまたはプロテアーゼ活性部位変異型DINEを発現する二種類のTgを作製した。これらのTgをKOと交配すると、野生型TgはKOの表現型をレスキューできたが、変異型Tgはレスキューできなかった。この結果から、DINEが生体内でプロテアーゼとして機能することが明らかになった。DINEを介した軸索-シュワン細胞間相互作用DINEがプロテアーゼ活性を有することが示されたことから、DINEによって分解された基質が周囲の環境に作用し、軸索分枝を制御する可能性が考えられた。神経再生過程においては、軸索の伸張やガイダンスにシュワン細胞が大きく関与する。そこで、発生期の軸索分枝の制御に、DINEの基質を介した軸索-シュワン細胞間相互作用が存在すると仮説を立て、DINE KOを用いて胎生期のシュワン細胞の表現型について比較することにした。現在は、シュワン細胞の分化状態及び軸索に対するシュワン細胞のアラインメントについて評価しているところで、KOと野生型々ウスに差があう傾向が得られている。

今後はTgを用いてこれらの現象とプロテアーゼ活性の必要性についても評価する予定である。1. Damage-induced neuronal endopeptidase (DINE)のプロテアーゼ活性評価DINEは胎生期運動ニューロンに豊富に発現する膜一回貫通型のメタロプロテアーゼである。DINE欠損マウス(KO)では、横隔神経の軸索分枝異常により神経筋接合部が形成されず生直後死に至る。DINEの基質は同定されておらず、プロテアーゼとして機能するという証拠は未だ得られていない。そこで本研究ではDINE過剰発現マウス(Tg)を用いたDINE KOのレスキュー実験を行った。胎生期運動ニューロン特異的に野生型DINEまたはプロテアーゼ活性部位を欠失させた変異型DINEを発現するDINE Tgを作製し、KOとの交配を行った。その結果、野生型DINE TgはKOの胎生期運動ニューロン軸索分枝異常をレスキューし、生後生存することができた。一方、変異型DINE Tgとの交配では、KOの表現型がレスキューされず、生直後死亡した。以上のことから、DINEが胎生期運動ニューロンでプロテアーゼとして機能していることが明らかになった。2.シュワン細胞を介したDINEの機能メカニズムDINEの機能メカニズムを検討するために、DINE KOの横隔神経を形態学的に詳細に観察したところ、シュワン細胞の形態に異常が認められた。このことから、軸索に存在するDINEが運動ニューロン-シュワン細胞間相互作用を制御している可能性が考えられた。そこで、胎生期におけるシュワン細胞の分化マーカーの発現を比較したところ、KOで一部の分化マーカーの発現が有意に減少していた。また、運動ニューロンとシュワン細胞の共培養を行うと、軸索に沿って並ぶシュワン細胞の数の割合がKOで有意に減少していた。以上の結果から、DINEによって切断された基質が軸索ーシュワン細胞間相互作用を制御し、適切な軸索分枝が形成される可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。DINE Tgマウス作製において、当初の計画であったBACシステムの利用ではTg動物が得られず、従来通りの手法を用いて現在動物を獲得しつつある。Tg動物の獲得に少々難航したため、当該年度に実施予定であったTg動物のキャラクタライゼーションまで進められなかった。またDINEの結合タンパク探索でもシステムが上手く働くまでに時間を要したため、タンパクの同定までこぎつけることができなかった。当該年度の研究計画に従って、昨年度作製したDINE Tgのキャラクタライゼーションを進め、トランスジーンの十分な発現量と期待通りの組織特異性をそなえた有力なラインの選別を行った。このDINE TgとDINE KOを用いて、DINEが胎生期運動ニューロンにおいてプロテアーゼとして機能することを証明する結果を得ることができた。
同期的コミュニケーション手法による日本語教育支援システムの構築と検証

本研究の目的はPCカメラなどの同期的コミュニケーション手法を使って、インターネット上で日本語学習環境を創設し、遠隔地の学習者が生の日本語に触れ、発話機会を増やすことで、日本語学習、留学へのモティベーションを高めることであった。この目的を達成するために、平成17年度から18年度までの2年間にPCカメラを使った3つのプロジェクトを実施し、以下の成果を収めた。(1)事前調査平成17年度を中心に設備・機器・ソフトウェアなどの研究環境を整備した。具体的には、プロジェクトで使用する設備・ソフトウェアの機能をGunartoが調査し、宇根谷、梅田、佐々木はウィスコンシン大学、オシコシ校で実施されているテレビ会議システムによる遠隔日本語授業を見学し、設備、教材、教授法を調査した。(2)PCカメラを使った日本語教育及び交流の実施平成17年度後半18年度は研究者が所属する立命館アジア太平洋大学とマレーシア、マラヤ大学、オーストラリア、ニューサウズウェルーズ大学、アメリカ、ウィスコンシン大学オシコシ校をオンラインで結び、PCカメラを使って日本語教育や交流授業を実施した。結果として、日程の調整、マイナーな技術的課題、教材開発など今後改善すべき課題は残るが、PCカメラを使った同期的コミュニケーション手法とビデオなどの非同期的手法と組み合わせることで、遠隔地の日本語学習者に生の日本語に触れる機会を提供し、それによって学習への興味を高め、留学へのモティベーション向上に寄与することを確認した。本研究の目的は、日本語予備教育教材「サバイバル日本語」を遠隔地の学習者に公開し、それをより効率的に学習させるために、同期的コミュニケーション手法による日本語学習支援環境を構築することを目指す。1)平成17年度の目標・・・本年度の目標は、ネット授業を実施するために、基盤である主要設備・動作環境を確認し、試験的運用をすることである。さらに、アジア地域の高等教育機関における日本語予備教育へのニーズを調査し、ネット授業のパートナーとして本プロジェクトへの参加を要請することである。2)成果(1)主要設備・動作環境の確認・・・2005年8月アメリカ、ウィスコンシン大学を訪問し、主要設備・動作環境の確認を行った。(2)試験的運用・・・同年11月、テレビ会議システム(Polycom社製)を利用した言語交流を立命館アジア太平洋大学とウィスコンシン大学間で実施し、結果、日米両国間の時差(19時間)のため、教育に利用できる時間帯が制限されるが、教材「サバイバル日本語」へのアクセス、テレビ会議システムを用いた同期的コミュニケーションは問題なくできることを確認した。(3)ネットワークの構築・・・2005年11月には高麗大学及び済州大学(韓国)、2006年2月には、香港理工大学(香港)、マラヤ大学(マレーシア)、ガジャマダ大学(インドネシア)等の各大学を訪問し、日本語予備教育へのニーズを調査した。その結果、香港理工大学及びマラヤ大学が主要設備やニーズの面から相手機関として望ましいと判断し、パートナー大学として実験授業への参加を要請(交渉中も含む)し、予備教育授業の実施に向けて準備を進めている。<研究の経過>本研究の目的は、インターネットベースのテレビ電話を利用して日本語学習支援環境を構築し、その効果を検証することであった。平成17年度は設備機器及び授業内容の準備、18年度は同期的手法を使った遠隔授業を実施し、その効果を調べた。概略は以下の通りである。期間:3月26日(火)3月30日(土)5日間。午前9時10時(日本時間)場所:アメリカ、ウィスコンシン大学と日本、立命館アジア太平洋大学ソフトウエア:スカイプを使用。対象:日本に興味があり、短期プログラム等で日本に留学しようと思っている初級レベルの日本語学習者教授法:自己学習+PCカメラを使ったチューターによる支援(質問への応答、会話・タスクの相手)教材:日本語予備教育教材(「とびら-サバイバル編-」及び付属のビデオ)(WebCT使用)<到達点>インターネット利用した自己学習方法は、アンケート及びインタビュー調査の結果(学習者8名、チューター8名)の双方からよい評価(5点満点の4点以上)が得られた。ただし、タスク、シラバス、チューターの支援方法等、まだ改善すべき点は多くあるが。

技術面に関しても、設備機器の習熟、技術スタッフの支援体制作り等、改善すべき点はあるが、概ね安定した交信が行われた。結果的に、インターネットを使用した教材の配信等の非同期手法及びPCカメラを使った同期的手法の組み合わせによる日本語予備教育は学生の動機付けを高め、学習効率も高いことがわかった。<今後の研究計画との関連>今回の実験結果から、このような学習方法は、日本語の遠隔予備教育のみならず、プロジェクト調査や相互交流等、教育の国際連携をはかる手段として今後大きな成果を発揮することがわかった。今後は本格的実施に向けて、方法と内容を改善し、データをさらに蓄積しながら、その効果を検証していきたい。
角膜潰瘍の形成機序及びその新規治療薬の開発

角膜潰瘍は,角膜実質を構成するコラーゲンの過剰分解がその本態であると考えられる.組織学的に角膜潰瘍周辺では,角膜実質細胞,活性化した角膜線維芽細胞,浸潤してきた好中球などの炎症細胞が認められる.中でも角膜線維芽細胞がその中心的役割を果たしており、病原体由来のLPS,Poly:IC,Zymosanなどに反応し,種々のサイトカイン,ケモカインおよびコラーゲン分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの発現,分泌を亢進させることを明らかにした.角膜潰瘍は,角膜実質を構成するコラーゲンの過剰分解がその本態であると考えられる.組織学的に角膜潰瘍周辺では,角膜実質細胞,活性化した角膜線維芽細胞,浸潤してきた好中球などの炎症細胞が認められる.中でも角膜線維芽細胞がその中心的役割を果たしており、病原体由来のLPS,Poly:IC,Zymosanなどに反応し,種々のサイトカイン,ケモカインおよびコラーゲン分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの発現,分泌を亢進させることを明らかにした.感染性角膜潰瘍の病態は角膜実質コラーゲン融解である.抗菌薬のみでは,実際に感染初期なら治療が容易であるが,ある程度進行した角膜潰瘍ではすぐには治癒にいたらず,さらに進行することがしばしば臨床の場でみかける.このことは,病原微生物の死滅のみでは,角膜潰瘍の形成および進行は十分に阻害できないことを意味する.そこで,抗菌薬とともに併用可能な角膜潰瘍治療の特異的な薬剤の検索,開発を本研究の目的とする.感染性角膜潰瘍の誘因としては種々の病原微生物が知られている.そこでこれらの外来因子の1つであるウィルスに着目し,ウィルス由来RNAのPoly(I : C)にて角膜実質細胞を刺激することにより,IL-6, IL-8などの種々のサイトカイン,ケモカインの発現,分泌およびICAM-1, VCAM-1などの接着因子の発現が認められた.さらに,Poly(I : C)にて発現の亢進した炎症性サイトカインIL-1β依存性に,蛋白質分解酵素の一つであるMMPsの発現がの亢進した.さらに,炎症性サイトカインIL-1βを用いた三次元角膜実質細胞培養系においてコラーゲン分解促進が認められ,さらにこの実験系にて性ホルモンのコラーゲン分解抑制作用が明らかになった.この作用機序は,いくつかのMMPの発現抑制によることが明らかになってきている.本研究結果は,角膜潰瘍の発症機序の解明に大きく寄与し,薬物開発において新たな標的分子の開発につながると思われる.角膜潰瘍は,角膜実質を構成するコラーゲンの過剰分解がその本態であると考えられる.これまでの組織学的検討から角膜潰瘍周辺に角膜実質細胞,活性化した角膜線維芽細胞,浸潤してきた好中球などの炎症細胞が認められることが明らかとなっている。中でもコラーゲン分解の中心的役割を角膜線維芽細胞がはたいしていると考えられる。感染性角膜潰瘍は臨床上見かける頻度が高く,抗菌薬のみで感染初期なら治癒することが多い。しかしながら,ある程度進行した角膜潰瘍ではすぐには治癒にいたらず,さらに進行することがしばしば臨床の場でみかける.病原微生物の死滅のみでは,角膜潰瘍形成は十分に阻害できないことを意味する。本研究では,角膜潰瘍のメカニズムを明らかにし特異的な角膜潰瘍の治療薬開発を本研究の目的としている。病原体由来のLPS, Poly : IC, Zymosanなどに反応し,種々のサイトカイン,ケモカインおよびコラーゲン分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの発現,分泌を亢進させることを明らかにした。特にLPS, Poly : IC, Zymosanにてヒト角膜線維芽細胞を刺激すると、濃度及び時間依存性に種々のサイトカイン、ケモカインの発現、分泌が亢進した。中でもIL-6, IL-8及びMCP-1の三つが,LPS, Poly : IC, Zymosanで共通に分泌発現が亢進した。LPS及びPoly : ICはICAM-1, VCAM-1の発現を亢進させたが,一方でZymosanはそれらの発現に影響をおよぼさなかった。LPS,及びPoly : ICは,さらにMMP-1,2,3,9の発現分泌を亢進させた。Zymosanは,MMPの発現には影響を及ぼさなかった。本研究結果は,角膜潰瘍の発症機序の解明に大きく寄与し,薬物開発において新たな標的分子の開発につながると思われる。
網羅的分子系統解析による琉球列島の陸上無脊椎動物相成立過程の解明

琉球列島は九州から台湾にかけての島嶼群で、140以上もの島から形成される。琉球列島には数多くの固有動植物が生息し、日本で最も生物種多様性の高い地域となっている。これは、琉球列島の複雑な地史(大陸との陸橋形成に伴う祖先種の移住や海水面の変動による島の分離、融合等)によって固有種形成が促進されたためであると考えられている。琉球列島に生息する陸上動物の分子系統地理学的研究は主に脊椎動物で行われて来た。本研究では、無脊椎動物、特に分散能力が低いと考えられる陸産貝類を中心とする多様な分類群において分子系統地理学的解析を行い、固有動物相の形成過程の構築を試みると共に、各グループの分類学的再検討を行った。その結果、系統分岐のパターンが海峡形成などの地史的イベントに対応すると思われる分類群はむしろ少なく、遺存固有と考えられる分類群が予想以上に多いことが判明した。地域集団間の系統関係は分類群によって大きく異なり、分散や種分化の過程は分類群ごとに異なることが示唆された。また移動能力が低いと考えられてきた陸産貝類においても海上分散が認められ、複数の分類群において人為的な移入が確認された。琉球列島産の固有種の系統分岐は必ずしも生息地の分断の歴史に対応していないため、海峡形成などの地史的年代を分子進化速度の補正に用いる際は慎重に検討することが必要である。また、今回の分子系統解析により多数の隠蔽種が発見され、これまで広域に分布する単一種と思われていたものが実際には種複合体であったことが複数の科において判明した。これら隠蔽種の多くは内部形態で識別できたが、一部の隠蔽種は形態学的には全く識別できなかった。これらの隠蔽種には遺存固有と考えられるものが多く、分布域が著しく限定されているものもあり、早急な保全対策が必要である。本年度は陸産貝類のナンバンマイマイ科、キセルモドキ科、カサマイマイ科の入手できたサンプルを用いて予備的解析を行った。琉球列島に広く分布し、かつ種分化が著しいSatsuma, Yakuena, Videnoida属についてmtDNAの一部の領域の塩基配列をdirect sequenceにより決定し、分子系統解析を行った。その結果、これら3科で共通するパターンとして、1)琉球列島の分類群は本州、九州の分類群とは別の系統となる、2)南琉球の分類群が最初に分岐し、中琉球+北琉球の分類群が単系統群となる、3)沖縄本島および周辺の島の個体群は単系統群となる、という傾向が認められ、これは琉球列島の古地理とよく合致することが分かった。一方、類縁関係が生物地理と一致しない場合が、複数の分類群で認められた。特にキセルモドキ科では、琉球列島の外に分布する種が北+中琉球のクレードに含まれ、これは海流による分散が起きている証拠であると考えられた。今回の分子系統解析によって判明した陸貝の類縁関係は現行の分類と一致しない部分が多く認められた。これは特定の形質の類似性が系統関係を反映していないことを示しており、これらの種については分類学的位置を変更すべきであると考えられる。また、カサマイマイ科では複数の隠蔽種の存在が示唆され、分類を大幅に見直す必要と思われる。上記3科において中琉球+北琉球の分類群が単系統群となるが、いずれの場合も奄美諸島の分類群が古く分岐していることが示唆され、奄美諸島のサンプリングを詳細に行う必要が判明した。そこで、奄美諸島でのサンプリングを実施し、多数の標本を得た。これらのサンプルは現在解析中である。昨年度に引き続き、ナンバンマイマイ科、キセルモドキ科、カサマイマイ科の分子系統解析を台湾産のサンプルを加えて行った。

台湾の固有種の一部は八重山諸島の分類群に近縁であることが示されたが、その一方で琉球列島の分布する種とは直接の類縁関係のないものがあることが明らかになった。特に、オキナワヤマタカマイマイ類は台湾のコシタカマイマイ類に近縁であると考えられていたが、両者はそれぞれ独立に種分化していることが分かった。また、左巻きの種も琉球列島と台湾では独立に進化したことが示唆され、形態から推測された陸貝の分散過程はかならずしも支持されないことが分かった。また、これまで研究がほとんど行われていなかったベッコウマイマイ科についても検討を行った。琉球列島のNipponochlamys属はこれまで1種とされてきたが、内部形態を詳細に比較したところ、多くの隠蔽種の存在が確認された。奄美以南には少なくとも10種があり、同種に分類されていたものの一部は別属に移すべきことが判明した。多くの種は島に固有であり、生物地理の研究に適していると考えられる。これらの分子系統解析は現在進めている。前年度に引き続いて、マイマイ上科、キセルモドキ科、カサマイマイ科、ベッコウマイマイ科の系統解析を進め、キセルガイ科、ヤマタニシ科、ヤマキサゴ科の分類学的再検討、分子系統解析も行った。特に琉球列島の分類群の起源と系統解析の適切な外群を調べるために、台湾、中国南部、ベトナム、マレーシアのサンプルについても比較検討したところ、従来の分類体系とは大きく異なる知見が得られた。例えば、カサマイマイ科の属は長らく琉球列島の固有属と考えられていたが、東南アジア、中国産の別属に分類されていた種が本属の一員であることが判明し、琉球列島の分類群はその系統の末端に位置する一群に過ぎない。また、ベッコウマイマイ科のBekkochlamys属も日本に固有であると考えられていたが、解剖学的特徴を再検討したところ、台湾のPetalochlamys属の一員であり、この広義のPetalochlamysに近縁あるいは同属と思われる分類群が中国や東南アジアに存在することが分かった。Petalochlamys属は台湾での種多様性が著しく高く、その中の複数の系統が琉球列島や日本本土へと進出したことが示唆される。また琉球列島の固有種の関係については新たなサンプルを加えて解析したところ、一部の島の固有の分類群とされていたものは遠く離れた島の集団との遺伝的分化がほとんどなく、きわめて最近に人為的に移入された可能性が高いことも判明した。この分類群については固有種としての位置づけを変更する必要があると考えられる。また、Rathouisiidae科に属するナメクジには多くの未記載種が存在し、琉球列島では地域ごとの固有種になっていることが判明した。これらの一部は外見による識別は困難で、正確な同定をするためには生殖器の形態を見ることが必要である。琉球列島での分化が著しいヤマタニシ属CyclophorusとRathouisiidaeについてmtDNAの分子系統地理学的解析を行った。Cyclophorusでは琉球列島の各地域集団間で明瞭な遺伝的が認められ、少なくとも8つの系統群が識別された。これらの系統群はいずれも分布域が狭い範囲に限定され、他の系統群とは異所的または側所的に分布した。これらの系統群は既知の分類群に合致することが多いが、これまでに別種とされていた集団が他の島の系統群の中に含まれるなど、分類学的な変更が必要となることが分かった。