hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質ラフトを標的とする膜孔形成毒素のオリゴマー分子集合化と膜挿入機構

自然界に幅広く存在している膜孔形成毒素は標的細胞膜へと結合した後、オリゴマー化し、細胞膜へと挿入される。その結果として細胞膜傷害を引き起こし、細胞死を導いている。本研究では細胞膜傷害において必須な反応である毒素の分子集合化と膜挿入機構の解明を目的とし、膜孔形成毒素の1つであるパラスポリン2を用いて解析を行っている。昨年度の研究により、パラスポリン2はSDS耐性オリゴマーとSDSやプロテアーゼによって解離、分解してしまうタンパク質が含まれた巨大複合体Assembly Iを形成することが明らかとなった。今年度は、Assembly Iに含まれているタンパク質の解析を行った。PS2Assembly Iに含まれているタンパク質の1つは、PS2高感受性細胞であるHepG2細胞において発見された機能未知タンパク質Hep27であった。そこで、Hep27のPS2作用機構における役割を明らかとするためにHep27の解析を行った。Hep27の発現をいくつかの細胞で確認したところ、Hep27発現とPS2感受性の間に相関関係はなく、HepG2細胞に特異的に発現していた。また、HepG2細胞におけるHep27発現抑制によってPS2作用に影響があらわれるかを検討した。その結果、Hep27発現抑制により、PS2感受性、PS2の細胞膜への結合、PS2のオリゴマー化、PS2 Assembly I形成に大きな影響はあらわれなかった。これらのことから、Hep27はPS2の作用機構に大きな影響を与えない、PS2Assembly Iに結合しているタンパク質であることが示唆された。一方で、Hep27の発現が大幅に抑制されたHepG2細胞は著しい細胞増殖抑制が観察された。このことから、Hep27はHepG2細胞の成長に関わるタンパク質であることが示唆された。膜孔形成毒素は自然界に幅広く存在している毒素タンパク質である。膜孔形成毒素は標的細胞膜へと結合した後、オリゴマー化し、細胞膜へと挿入される。その結果として細胞膜傷害を引き起こすと考えられている。これまでの研究により、パラスポリン2はこれまで考えられていたより巨大な複合体(Assembly I)を形成することが明らかとなった。今年度は他の毒素におけるAssembly I形成の解析、パラスポリン2のAssembly I形成条件の解析、およびAssembly I構成因子同定に向けた解析を行った。解析の結果、エロリジン、イプシロン毒素においてもAssembly Iの形成が確認され、膜孔形成毒素は細胞膜に挿入された巨大複合体を形成することが示唆された。パラスポリン2 Assembly Iの形成条件を調査したところ、生体膜と温度が必要であることが分かった。また、低温で生体膜とパラスポリン2を作用させるとAssembly Iより小さな複合体(Assembly II)を形成することが明らかとなった。パラスポリン2のAssembly Iに対し、各種生体分子の分解酵素を作用させたところ、プロテアーゼに耐性な成分とプロテアーゼにより分離・分解されてしまう成分で構成されていることが示唆された。パラスポリン2 Assembly Iを構成するタンパク質を明らかとするため、Assembly Iの精製を試みた。パラスポリン2のC末端にヒスチジンタグを付加し、ヒスチジンタグに対する免疫沈降法を行った。精製されたタンパク質をSDS-PAGE並びに銀染色で解析したところ、SDS耐性オリゴマーのほかに25kDa付近に細胞由来と考えられるタンパク質のバンドが検出された。
流体指内部のテクスチャ構造による把持性能の向上とそのメカニズムの解明

本研究では,流体層と剛体層から成る二層構造流体指内部にテクスチャ構造を付すことで流体指のさらなる把持性能の向上を目指して研究をおこなっている.どのようなテクスチャ構造がどのように把持性能の向上に効果があるかを明らかにし,タスクに応じた最適な二層構造流体指の設計へと応用することを目的としている.平成30年度の成果としては,指で物体を把持したときの力を計測するための装置を開発し,テクスチャの効果を検証するため,いくつかの基本的なテクスチャパターンを付した指での把持実験の準備を行った.具体的には,把持耐力という把持の基本的な評価指標がテクスチャによってどのように変化するのかについて検証を行ってみることにした.この力を計測するためには,把持力と指と物体との間の接線力を同時に計測する必要があり,把持力と接線力を計測するための力センサを組み込んだ小型の把持耐力計測装置を開発した.開発時の問題点として,把持実験をするときに指と把持物体にコンプライアンス要素が少ない状況で位置制御型のロボットを用いてしまうと,細かく把持耐力を計測することができない.そこで開発した装置には内部にコンプライアンス要素を内蔵しつつその機構の摩擦の影響を計測値が受けないように構造を設計してあり,細かく把持耐力を計測することが可能となっている.開発した装置を用いてテクスチャ構造の効果を検証する把持実験を行うために,いくつかの基本的なテクスチャパターンの指を設計・製作し準備した.一方で,装置の開発や実験の準備に手間取ってしまいテクスチャ構造を有した指による把持実験までは行えていない.当初の計画では,平成30年度に力の計測装置の開発を行いテクスチャ構造が把持性能に与える効果を検証するための実験を行う予定であった.このうち,計測装置の開発を行い,基本的なパターンのテクスチャ構造を有した指を準備することはできたが,装置の開発と準備に手間取ってしまい把持実験の実施にまで至っていない.しかし,実験の準備は終えある程度の目処はたっているため,進捗については,やや遅れている状況であると判断した.今後は,基本的なパターンのテクスチャ構造の把持性能に与える影響について実験により検証と解析を行い,テクスチャ構造が把持に与える効果の力学的なメカニズムを明らかにする.その後,明らかにしたメカニズムを基にして最適な設計方法の提案を行っていきたい.ただし,進捗に応じて,把持性能の指標を把持耐力などに絞って解析をすすめていきたいと考えている.本研究では,流体層と剛体層から成る二層構造流体指内部にテクスチャ構造を付すことで流体指のさらなる把持性能の向上を目指して研究をおこなっている.どのようなテクスチャ構造がどのように把持性能の向上に効果があるかを明らかにし,タスクに応じた最適な二層構造流体指の設計へと応用することを目的としている.平成30年度の成果としては,指で物体を把持したときの力を計測するための装置を開発し,テクスチャの効果を検証するため,いくつかの基本的なテクスチャパターンを付した指での把持実験の準備を行った.具体的には,把持耐力という把持の基本的な評価指標がテクスチャによってどのように変化するのかについて検証を行ってみることにした.この力を計測するためには,把持力と指と物体との間の接線力を同時に計測する必要があり,把持力と接線力を計測するための力センサを組み込んだ小型の把持耐力計測装置を開発した.開発時の問題点として,把持実験をするときに指と把持物体にコンプライアンス要素が少ない状況で位置制御型のロボットを用いてしまうと,細かく把持耐力を計測することができない.そこで開発した装置には内部にコンプライアンス要素を内蔵しつつその機構の摩擦の影響を計測値が受けないように構造を設計してあり,細かく把持耐力を計測することが可能となっている.開発した装置を用いてテクスチャ構造の効果を検証する把持実験を行うために,いくつかの基本的なテクスチャパターンの指を設計・製作し準備した.一方で,装置の開発や実験の準備に手間取ってしまいテクスチャ構造を有した指による把持実験までは行えていない.当初の計画では,平成30年度に力の計測装置の開発を行いテクスチャ構造が把持性能に与える効果を検証するための実験を行う予定であった.このうち,計測装置の開発を行い,基本的なパターンのテクスチャ構造を有した指を準備することはできたが,装置の開発と準備に手間取ってしまい把持実験の実施にまで至っていない.しかし,実験の準備は終えある程度の目処はたっているため,進捗については,やや遅れている状況であると判断した.今後は,基本的なパターンのテクスチャ構造の把持性能に与える影響について実験により検証と解析を行い,テクスチャ構造が把持に与える効果の力学的なメカニズムを明らかにする.その後,明らかにしたメカニズムを基にして最適な設計方法の提案を行っていきたい.ただし,進捗に応じて,把持性能の指標を把持耐力などに絞って解析をすすめていきたいと考えている.旅費の経費が想定より少なくなったため端数が余った.学会発表の旅費に充当する予定である.
ストロボ環境電子顕微鏡による触媒ナノ反応場の直視解析

本研究では、ガス中反応を可視化する「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を新規開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することを目指した。装置開発では、ストロボ化は技術的・予算的に困難な点が認められたため見送ったが、ガス同入出用の同軸管型試料ホルダを新開発し、ガスの混合供給システムを完成させた。また、それを用いた金ナノ触媒の観察では、プロピレンの選択酸化に注目し、触媒反応で生じるプロピレンオキサイドを電子顕微鏡像として直接捉えることで反応場を可視化し、反応サイトが界面周囲であることを明らかにすることができた。本研究の目的は、電子線照射の影響が除去可能な「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を新規開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することである。本年度は、金ナノ触媒の反応場特定を目指して、プロピレンの選択酸化反応のガス中電子顕微鏡その場観察を試みた。本触媒では特定のヘテロ構造(金とアナターゼ構造の酸化チタン)を作ることで、プロピレンと酸素の反応でプロピレン・オキサイドを一段合成する事が可能である。このプロピレン・オキサイドはポリウレタンの原料で、工業的にも重要な合成反応のひとつであり、本触媒反応の解析は学術的のみならず産業的にも意義が深いと言える。プロピレン・オキサイドは蒸気圧が比較的低く、室温・大気圧下では液体であることに我々は注目した。液体の場合、ガス分子よりも密度が高いため、電子顕微鏡内でも容易に像コントラストが得られる。これを利用し、電子顕微鏡内で上記反応のその場観察を行いプロピレン・オキサイドの生成を動的に捉えることが出来れば、反応が起こっている場を特定できるはずだと考えた。これを実現するため、大気圧までの触媒反応ガスを導入できる環境セル電子顕微鏡を改良し、複数のガス種を混合導入できるシステム、および反応後ガスの質量分析が出来るシステムを追加導入した。本装置を用いて実験を行った結果、約0.5気圧のプロピレンおよび酸素混合ガス雰囲気下において、金ナノ粒子と担体である酸化チタン(アナターゼ構造)の接合界面周囲に、反応生成物(プロピレンオキサイドと考えられる)が発生する様子をリアルタイムで観察する事に成功した。これにより、金/担体の接合界面こそが本触媒の反応場であることが明らかとなった。本研究の目的は、ガス中反応を可視化する「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することである。本年度は、要素技術開発を中心に研究を実施した。具体的な項目は以下の通りである。1)ガス液雰囲気下における結像シミュレータの開発。2)ホローコーン照明TEM法の適用条件の検討。3)加速電圧の大きなTEM(300kV ←従来は200kV)への適用改良。1)は、各種ガス液条件下に於いて得られるであろうTEM像の分解能を解析することで、要求分解能を満たすための実験条件を事前検討することを目的とした。試料周囲の電子線の伝搬はマルチスライス法で計算し、結像系での影響はフリーウェアのソフト(E. J. Kirkland image)を用いて解析した。それにより、ガス分子(液体分子)量とTEM像分解能との関係を明らかにした。2)は、ガス液環境下観察において分解能を劣化させる主要因と考えられる色収差を低減する方法として、ホローコーン照明法と呼ばれる手法の適用検討を行った。本研究では、結像シミュレーションを行うことで、同手法を適用する際に要求される装置条件を明らかにした。その結果、これまで観察に用いてきたTEM装置の場合、熱電子放出電子銃を用いているため、その効果は大きくないことが分かった。本手法を実施するには電界放出電子銃を搭載したTEMを用いることが重要であり、次年度での実施を検討することとした。3)では、従前の装置よりも高分解能・高SN比の像を得るために、加速電圧の大きなTEM(300kV;日立ハイテク製H9500 ←従前は200kV-TEM)を用いて、金ナノ触媒のプロピレン酸化反応その場観察を行うべく、装置の適用改良を行った。特に、試料ホルダをガス導入・高分解能観察対応に改造を行い、次年度からの観察が可能な状況を整えた。本研究の目的は、ガス中反応を可視化する「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を新規開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することである。本年度は、これまでの成果をまとめながら、外部発表などに注力した。1)金ナノ触媒のナノ反応場可視化による反応サイトの特定。2)ガス液雰囲気下における結像シミュレータの改良1)は、特異な触媒作用を示す金ナノ触媒の活性サイトを解明するため、新規な反応可視化法を独自に開発して得られた成果である。我々は、金ナノ粒子触媒が活性を示す多くの反応のうち、プロピレンの選択酸化に注目した。この反応で生成されるのがプロピレンオキサイドという物質で、工業的にも種々化成品の原料として使われるなど重要な材料である。この物質の蒸気圧は、室温で0.5気圧程度と比較的低い。このため、周囲の圧力をその程度の値にすることで、発生したプロピレンオキサイドが液体として触媒表面に留まるため、電子顕微鏡で観察することで可視化できるものと考えた。

我々のグループの先行研究に於いて、大気圧までのガス雰囲気下で材料を直接観察出来る環境セル電子顕微鏡システムを作り上げており、上述のオリジナルのアイデアを実現することが出来た。観察の結果、金と担体(酸化チタン)との接合界面周囲にプロピレンオキサイドと考えられるコントラストが生じるのを捉えることに成功した。この結果から、反応サイトが界面周囲であることを明らかにすることができた。本研究成果で、受賞3件、プレス発表1件など外部から高い評価を得ることが出来た。2)について、昨年度から進めている各種ガス液雰囲気下での電子顕微鏡像シミュレータ開発を鋭意進めた。特に、ガス液分子の運動の影響を取り入れ、かつ短時間で計算が実施できる新たなシミュレーション法を開発することに成功した。本研究では、ガス中反応を可視化する「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を新規開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することを目指した。装置開発では、ストロボ化は技術的・予算的に困難な点が認められたため見送ったが、ガス同入出用の同軸管型試料ホルダを新開発し、ガスの混合供給システムを完成させた。また、それを用いた金ナノ触媒の観察では、プロピレンの選択酸化に注目し、触媒反応で生じるプロピレンオキサイドを電子顕微鏡像として直接捉えることで反応場を可視化し、反応サイトが界面周囲であることを明らかにすることができた。上述の通り、本研究の目的は、電子線照射の影響が除去可能な「ストロボ環境電子顕微鏡システム」を開発し、金ナノ粒子触媒の「ナノ反応場」を直視解析・特定することである。これまでに本研究の主目的である"金ナノ粒子触媒のナノ反応場"を特定することに成功しており、研究全体での目的は達せられていると考えている。一方で、これまで観察された像の分解能・SN比は良いとは言いがたい。その点を改善するための各種手法の検討を本年度に実施し、上述の通り成果を得ている。これに基づいて次年度以降の装置開発・触媒その場観察につなげることで、さらなる飛躍が期待できる。以上のことから、研究計画全体としては順調に進展していると考えている。電子顕微鏡学、応用物理学本研究の当初目的については、前述の通り、ほぼ達成できている。次年度以降は、本年度の検討結果で得られた成果に基づき、各種装置開発・応用研究を推進する予定である。具体的には、ホローコーン照明TEM法での像観察、および300kV-TEMでのガス中反応その場観察である。また次年度は、本研究の最終年度であるため、成果発表および論文投稿にも力を入れ、得られた成果を世に出すことにも注力する。このうち、観察時の電子線照射の影響をなくすためのストロボ観察システムについては、現在のところ概念設計の段階で実機の作製には至っていない。しかし、主眼である金ナノ粒子触媒のナノ反応場の直視解析については、非常に重要な知見を得ることに成功しており、その目的を達している。装置開発についても、H26年度開始時に製作に着手することが可能であり、当初予定とは順序が変わっているものの研究計画全体としては順調に進展していると考えている。本年度に購入した消耗品の一部が、当初予定していた価格より安価に入手できたため。
非線形放物型方程式のアトラクターの研究

研究目的にかかげた目標に関する次の幾つかの興味ある成果が得られた。(1)我々の先行研究によって、p-Laplacianを主要項に持つ準線形放物型方程式u_t=△_p u+uに対する初期値境界値問題に対して、全ての解軌道を引き付ける「大域アトラクター」が、L^2で構成され、さらにそれが無限次元を持つ事実が知られていたが、これはかなり特殊な状況であり、非線形楕円型方程式に関するLyusternik-Scnirelman理論からも、その無限次元性は導出できるという難点があった。uをαu-b(x)|u|^q uとしても、大域アトラクターの存在とその無限次元性が導かれることが示された。これは、より一般的な非線形項f(x, u)に対しても、同様な結果が成立することを示唆する、重要な発見である。(2)多孔質媒質中を流れる流体(溶媒)の速度及び温度と流体中の溶質の濃度の振舞いを記述する、2または3次元有界領域におけるBrin kman-Forchheimer方程式の時間大域解の存在と一意性が、H^1に属する初期値に対して、示された。これによって、この方程式に対する、大域アトラクターの構成の出発点がクリアーされたことになる。また、よく知られているように、3次元空間におけるナビエ・ストークス方程式の一意的時間大域解の存在問題が未解決大問題である事実と比較すると、非常に興味深い知見を与えている。研究日的にかかげた目標に関する次の幾つかの興味ある成果が得られた。(i)報告者たちの最近の研究により、p-Laplacianを主要項に持つ準線形放物型方程式に対する初期値境界値問題に対して全ての解軌道を引き付ける「大域アトラクター」が、L2で構成され、さらにそれが無限次元となるための十分条件が与えられている。このような新奇な現象は、準線形放物型方程式に特有のものと思われる。さらに、主要項にp-LaplacianとLaplacianを含む、ある種の特殊な準線形放物型方程式に対して、あるクラスに属する初期値から出発する解軌道を、時間に関して指数的に引き寄せる、有限フラクタル次元を持つ「指数アトラクター」の存在が示された。この結果から特に、大域アトラクターのフラクタル次元が有限であることが導かれる。すなわちこれらの知見は、半線形放物型方程式に対する場合とはことなり、準線形放物型方程式に対しては、大域アトラクターの有限次元性と無限次元性とを支配する何らかの構造が内包されていることを示唆しており、今後の極めて重要な研究課題を提示している。(ii)必ずしも有界でない一般領域における、多項式型非線形摂動項をもつporous medium方程式の弱解の存在と一意性が示された。有界領域、全空間においてもこのような事実は知られていなかった。一般領域における準線形放物型方程式に対する大域アトラクターの研究は皆無であり、この方面の研究を開拓する第一歩として意義あるものである。研究目的にかかげた目標に関する次の幾つかの興味ある成果が得られた.(i)未知関数の時間に関する微分のべき乗の非線形項と未知関数自身のべき乗の非線形項を含む二重非線形放物型方程式に対する指数アトラクターを構成した.この種の二重非線形放物型方程式に対して、従来の研究では,弱解の存在は知られていたものの、解の一意性が保証されるような高い正則性を有する解の存在は知られていなかった.このため、指数アトラクターのみならず大域アトラクターに対しても、その存在を議論するための基本的情報が全く欠如していた.このような状況下で、一気に指数アトラクターの構成にまでたどり着いた意義は極めて大きいといえる.アトラクターの存在を示す過程で、この種の二重非線形放物型方程式が、放物型方程式の際立った性質のひとつである、正則化現象(smoothing efect)(初期殖の正則性が悪くても、解の正則性が瞬時に改善する現象)を有していることも示されている点で,新たな知見を与えている.(ii)我々の従来の研究によって,p-Laplacianを主要項に持つ準線形放物型方程式に対する初期値境界値問題に対して,全ての解軌道を引き付ける「大域アトラクター」が、L2で構成され、さらにそれが無限次元となるための非線形項f(u)に対する十分条件(f(u)=u u:十分小)が与えられていたが,これはかなり特殊な状況であった.より一般的な非線形項f(x、u)に対しても、同様な結果が成立することを示唆する、いくつかの具体例が発見された.研究目的にかかげた目標に関する次の幾つかの興味ある成果が得られた。

(2)多孔質媒質中を流れる流体(溶媒)の速度及び温度と流体中の溶質の濃度の振舞いを記述する、2または3次元有界領域におけるBrin kman-Forchheimer方程式の時間大域解の存在と一意性が、H^1に属する初期値に対して、示された。これによって、この方程式に対する、大域アトラクターの構成の出発点がクリアーされたことになる。また、よく知られているように、3次元空間におけるナビエ・ストークス方程式の一意的時間大域解の存在問題が未解決大問題である事実と比較すると、非常に興味深い知見を与えている。
クリティカルケアで急性死別を経験した遺族の複雑性悲嘆へのリスク評価尺度の開発

クリティカルケア領域で急性死別を経験した遺族の悲嘆に影響する要因の構造を明らかにすることを目的に,クリティカルケアで死亡した患者の遺族70名を対象に質問紙調査を実施した.結果,遺族の悲嘆反応に最も関連していたのは「ストレス認知」であり,死別の悲しみが強いほど,死別に後悔があるほど高まった.また,ストレス認知は,死別を受容できるほど,死を安らかであったと思うほど緩和された(p<. 05. 01).クリティカルケア領域で急性死別を経験した遺族の悲嘆に影響する要因の構造を明らかにすることを目的に,クリティカルケアで死亡した患者の遺族70名を対象に質問紙調査を実施した.結果,遺族の悲嘆反応に最も関連していたのは「ストレス認知」であり,死別の悲しみが強いほど,死別に後悔があるほど高まった.また,ストレス認知は,死別を受容できるほど,死を安らかであったと思うほど緩和された(p<. 05. 01).平成21年4月から5月に、遺族研究に関する文献検討を実施した。その結果、わが国のクリティカルケアにおける遺族研究では、遺族へのお悔やみ状の配布や個別面談など各施設の取組が実践報告されるようにはなったものの、その報告数は少なく、ほぼ手つかずのテーマであることが明らかになった。わが国のクリティカルケア以外の領域における遺族研究では、遺族の悲嘆反応の特徴について明らかにしたものや、悲嘆反応に影響する要因の検討、癌により家族員を失った遺族の悲嘆反応の終結時期等に関する調査が行われていた。また、国外では、悲嘆反応の緩和や、複雑性悲嘆の治療に関する介入研究が積極的に検証されていることを確認した。本研究では、クリティカルケアで死別体験をした遺族に活用できる複雑性悲嘆へのリスク評価尺度の開発を目的としていたが、文献検討の結果、その前段階として、クリティカルケアで予期していない死別を体験した遺族の悲嘆反応の特徴および悲嘆反応に影響する要因について明らかにする必要性を見出すことができた。そこで、救急部または救命救急センターを有する2施設の救急領域および集中治療領域で予期していない死別を体験した遺族を対象に、質問紙を用いた聞き取り調査を実施することを計画し、6月にデータ収集施設の倫理審査委員会に申請した。調査内容は、急性死別に対するストレス度、死別関連および非死別関連ストレッサーの有無と程度、ソーシャルサポート、ストレスに対する対処機制、出来事に対する知覚等とした。倫理審査委員会から承認の得られた9月よりデータ収集を開始し、3月までに53名のデータ収集を実施した。来年度は、対象者数が70名に達するまでデータ収集を継続し、遺族の悲嘆反応の特徴および悲嘆反応に影響する要因の構造を共分散構造分析により明らかにすることとする。その結果を受け、リスク評価尺度の開発に向けた質問項目案の策定を目指したい。本年度は主に、クリティカルケアで急性死別を経験した遺族への聞き取り調査およびデータ分析を中心に行った。これまでに目標症例数である70例に達しデータ収集は終了した。データ収集を行った76名のうち6名はすでに複雑性悲嘆を発症しており質問紙への回答が困難であったため70例を分析対象とした。対象者の背景は、女性が47名(67.1%)、続柄は配偶者が半数を占めていた。45名(64.3%)は無職であった。死別後平均経過日数は382.1日であった。分析の結果、遺族全体の悲嘆反応としては思慕と空虚が最も得点が高く、次いで鬱的な不調であった。死別後1年以上を経過した群は1年未満の群に比べ有意に悲嘆反応が緩和していることが明らかになった。遺族の悲嘆反応に影響する要因には、性別、死別後経過日数、死別に対する認識、サポートの程度、対処機制があった。構造分析の結果、遺族の悲嘆反応に最も影響する要因は、死別に対する認識であることを見出した。死別に対する主観的悲しみの程度が大きいほど、死別に対する後悔や心残りがあるほど悲嘆反応は強くなる傾向にあることがわかった。データ収集および分析の過程において、中間報告として結果を日本看護科学学科に発表した。最終年度である来年度は、遺族の悲嘆反応に影響する要因について探索的に分析を行い、これまでの結果の信頼性を検証し、さらに研究成果を関連学会の学術集会および論文投稿として公表することが課題である。また、研究成果をもとに文献検討を加え、複雑性悲嘆のリスクを評定する評価尺度の開発を目指したい。本年度は、本研究の最終年度であり、これまでに得られた研究結果を見直し、結果の信頼性を確認することおよび研究成果の公表、論文投稿(英文誌)を主な目的とした。まず、探索的データ解析ソフトであるStat Flexを用いてデータを分析した結果、遺族の悲嘆反応に最も影響する要因は、死別に対する認識であり、死を安らかであったと思えるほど、死別に対して後悔がないほど、死を現実の出来事として受容できているほど悲嘆反応は緩和されることが明らかになった。このことから本研究の研究結果について信頼性を確認することができた。その後、研究結果を、関連学会での成果公表および、英文誌(Nursing and Health Science)に投稿を行った。英文誌には12月に受理され、平成24年度6月号に掲載される予定である。次に、クリティカルケアにおける終末期患者の家族ケアに関する研究会に参加し、家族ケアの動向について学ぶとともに、参加者にインタビューを行い、終末期ケアの現状、課題等の把握を行った。

結果、クリティカルケアにおいては、終末期の判断が難しく、予後が不確かな中で、救命のための医療と終末期ケアを同時に行わなければならない現状に医療者自身もジレンマを感じていること、その中で十分な家族ケアが行えていないという認識をもっていることがわかった。また、家族ケアに関する課題では、死別への受容が困難な家族への介入、、家族ニーズが不明確であること、意思決定支援などがあがった。今後はこれらの結果をもとに、終末期ケアの質を評価するための指標を確立していく必要があるとわかった。
電場とナノ流動場を利用した，カーボンナノチューブの繊維化と電極への応用

カーボンナノチューブ(CNT)のような一次元ナノ材料は流動場,電場,磁場などの外場中で高い配向性を示すことが知られている.電界紡糸法は,高電場下において形成される帯電した微細な流動場(ジェット)を利用したナノファイバー作製法である.電界紡糸法により電場とナノ流動場という2つの外場を利用して高濃度CNT分散液を紡糸することによって,高い配向性を持つ高密度CNTファイバーの作製が可能になる.本研究では,電界紡糸法を用いてCNTを高密度かつ高配向な状態で含み,電気伝導性,熱伝導性,機械特性に優れた高機能CNTファイバーの作製を行う.繊維内でのCNT配向性および密着性の制御因子を明らかにし,1,000S/cm以上の電気伝導性の達成を目的とする.さらに,作製したCNTファイバーを利用した蓄電デバイスを作製・評価し、電池およびキャパシタ電極応用への指針を示す.本年度の研究では,CNTに代わり新たにグラフェンナノリボン(GNR)を用いた.GNRはCNT同様,1次元(リボン形状)の高結晶カーボンナノ材料であるため,電界紡糸プロセスにおけるファイバー内での配向が期待できる.さらに,リボン形状であるため,内部に空間を有するチューブ状のCNTよりも,フィラーとして少ない添加量での機能発現が期待される.本研究では,このようなGNRを用いたカーボンコンポジットナノファイバーの作製について検討を行った。作製したGNR/カーボンコンポジットナノファイバーは高機械特性(引張強度<400MPa),電気特性(電気伝導度<170S/cm)を示し,新たなカーボンコンポジット材料の作製プロセスとしての指針を示すことに成功した(現在,ACS Nanoへ投稿中).カーボンナノチューブ(CNT)のような一次元ナノ材料は流動場,電場,磁場などの外場中で高い配向性を示すことが知られている.電界紡糸法は,高電場下において形成される帯電した微細な流動場(ジェット)を利用したナノファイバー作製法である.電界紡糸法により電場とナノ流動場という2つの外場を利用して高濃度CNT分散液を紡糸することによって,高い配向性を持つ高密度CNTファイバーの作製が可能になる.本研究では,電界紡糸法を用いてCNTを高密度かつ高配向な状態で含み,電気伝導性,熱伝導性,機械特性に優れた高機能CNTファイバーの作製を行う.繊維内でのCNT配向性および密着性の制御因子を明らかにし,1,000S/cm以上の電気伝導性の達成を目的とする.さらに,作製したCNTファイバーを利用した蓄電デバイスを作製・評価し、電池およびキャパシタ電極応用への指針を示す.本年度の研究では,CNTに代わり新たにグラフェンナノリボン(GNR)を用いた.GNRはCNT同様,1次元(リボン形状)の高結晶カーボンナノ材料であるため,電界紡糸プロセスにおけるファイバー内での配向が期待できる.さらに,リボン形状であるため,内部に空間を有するチューブ状のCNTよりも,フィラーとして少ない添加量での機能発現が期待される.本研究では,このようなGNRを用いたカーボンコンポジットナノファイバーの作製について検討を行った。作製したGNR/カーボンコンポジットナノファイバーは高機械特性(引張強度<400MPa),電気特性(電気伝導度<170S/cm)を示し,新たなカーボンコンポジット材料の作製プロセスとしての指針を示すことに成功した(現在,ACS Nanoへ投稿中).
家族性及び同胞癌症例ゲノム解析による遺伝性癌原因遺伝子の同定とその応用

家族性が疑われる肺癌、胃癌、肉腫症例を収集し、エキソーム解析を行った。肺癌症例で検出したCHEK2変異は肺以外の臓器にも癌を発症した多発性肺癌症例の原因異常であると結論付けた。他の症例では原因となる異常は見つかっていない。一方、血液中に微量に存在する癌由来遺伝子変異をdeep sequencingで高感度に検出する方法を開発した。また、分子バーコード技術を用いて、高精度に塩基配列を決定し、DNA分子を絶対定量する方法を開発した。様々な疾患に対する個別化医療の実現と普及には病因の特定とそれに続く発症・進行機序の理解や診断・治療法の開発が必須である。本研究では臨床所見に基づいて収集された特徴ある遺伝性癌症例の全エキソーム解析を行うことによりその発癌原因遺伝子異常を同定し、それを起点にした癌診断法の開発や発症・進行機序の理解を深めることを目指す。平成25年度は臨床的に特徴のある遺伝性癌症例の収集とその一部の症例の全エキソーム解析を主に行った。収集している胃癌2家系を解析した。1家系は若年発症患者を有し、患者の両親の両家系に胃癌患者が1人または複数人発症していた。この家系からは患者本人とその両親を、もう一方は家系内に複数の胃癌患者を有していたが、患者本人のみをエキソーム解析した(シーケンス読み取り深度は平均92倍)。シーケンスリード数を使ったエキソン領域の染色体数異常解析では両家系に異常は検出されなかった。ヒト多型データベースに無いアミノ酸変化を伴う変異は各人約300個ずつ検出された。親子を解析した胃癌家系には常染色体劣性遺伝形式に従う変異が6遺伝子上に検出されたが、癌関連遺伝子として知られているものではなかった。もう1家系の胃癌患者にも癌と強い関連のある異常は見つかっていない。肉腫を発症している家系症例からは血液試料を収集し、DNAを抽出した。また、1症例については肉腫組織も収集した。エキソーム解析と並行して、癌バイオマーカー開発に必要な、血液中や癌組織中に微量に含まれる癌細胞由来の変異DNA配列を高精度で検出する方法の開発を開始した。本研究では臨床所見に基づいて収集された特徴ある遺伝性癌症例のゲノム解析を行うことによりその発癌原因遺伝子異常を同定し、それを起点にした癌診断法の開発や発症・進行機序の理解を深めることを目指している。平成26年度は下記の3点を行った。1.遺伝性が疑われるが詳しい家系情報を得ることができない場合、実験的に血縁症例間の遺伝的な関係の程度をゲノム中のホモ接合領域の探索から知ることができる。最近イタリアのグループによりエキソームシーケンスデータのみを使いホモ接合領域を検出する方法(H3M2法)が開発されたので、我々の症例を使ってその方法の有用性の確認と解析フローの構築を行った。2.これまでに家系内で複数人肉腫を有する症例を2家系収集した。そのうち1家系の母子症例のエキソームを行った。シーケンスリード数を使ったエキソン領域のコピー数解析では疾患の原因と疑われるような異常は検出されなかった。母子で共通かつ、ヒト多型データベースに無いアミノ酸変化を伴う変異は301個検出された。そのうちの18個は体細胞変異データベースCOSMICに登録されているものであった。3.症例のゲノム解析と並行して、癌バイオマーカー開発に必要な、血液中や癌組織中に微量に含まれる癌細胞由来の変異DNA配列を高精度で検出する方法の開発を昨年に引き続き行った。次世代シーケンサーを使った解析では、その高い読み取りエラー率による偽陽性が微量変異検出の障害になっていた。そこで、バーコード配列タグを使ったDNA分子高精度シーケンシングによる癌患者血漿DNA中の突然変異検出システムを開発した。この方法は偽陽性を抑え、血中微量突然変異の絶対定量的なde novo検出を可能にする。昨年に引き続き、収集した家族性癌が疑われる家系症例(昨年にエキソームシーケンスデータを産出した胃癌2家系、肉腫1家系)の解析を行った。これまでのところ原因と疑われるような異常を検出することが出来なかったが、今後も最新の変異データベースや新しい解析手法を利用した解析を続けていくつもりである。症例のゲノム解析と並行して、癌バイオマーカー開発に必要な、血液中や癌組織中に微量に含まれる癌細胞由来の変異DNA配列を高精度に検出する方法の開発を引き続き行った。昨年開発した方法では、バーコード配列タグを利用し、DNA分子高精度塩基配列決定及び絶対定量ができるので、本年度は、肺癌患者の血中遊離DNAを抽出・使用し、KRAS遺伝子変異の検出にその方法を応用した。高精度な配列決定ができるが、読み取りエラーを完全に無くすことはできない。それで、解析したDNA分子数と塩基配列情報を使い、エラーと真の変異を統計学的手法により区別する変異判定法を考案して変異の検出に用いた。肺癌患者では、EGFR遺伝子変異とKRAS遺伝子変異は相互排他的にみられることが知られているが、そのことと矛盾なく、EGFR遺伝子変異を持たない患者でのみKRAS変異が検出された。また、肺癌患者では通常突然変異が検出されないCTNNB1遺伝子の解析では、アミノ酸を変える変異は検出されなかった。これらの結果から、独自に開発した方法では、事前に癌組織中の変異の情報を知ることなく、癌患者の血中から癌組織の体細胞変異を検出できることを確認した。

今後は、高精度塩基配列決定及び絶対定量の機能を保持したまま、解析領域を拡大する方向に技術を改良していく予定である。家族性が疑われる肺癌、胃癌、肉腫症例を収集し、エキソーム解析を行った。肺癌症例で検出したCHEK2変異は肺以外の臓器にも癌を発症した多発性肺癌症例の原因異常であると結論付けた。他の症例では原因となる異常は見つかっていない。一方、血液中に微量に存在する癌由来遺伝子変異をdeep sequencingで高感度に検出する方法を開発した。また、分子バーコード技術を用いて、高精度に塩基配列を決定し、DNA分子を絶対定量する方法を開発した。肉腫症例のエキソーム解析では発癌の原因として強く疑われるような配列異常が見つからなかった。また、全ゲノムシーケンス解析を予定していたが、使用機器メーカーからの試薬及び消耗品開発が予定を大幅に遅れているため、実行できなかった。ゲノム科学未解析の症例についてエキソームシーケンスを行う。全ゲノムシーケンスについては、使用機器で解析環境が整い次第行う。発癌原因候補異常の絞り込みには、大規模癌ゲノム研究(国際癌ゲノムコンソーシウムなど)から公開されつつある情報の利用や、配列機能予測法による解析を行う。また、癌バイオマーカー開発に必要な高精度微量変異検出法の開発を推進する。特に多領域同時解析を可能にするように改良する。胃癌症例のエキソーム解析では発癌の原因として強く疑われるような配列異常が見つからなかった。肉腫症例については、非タンパク質コード領域の情報も得るために全ゲノムシーケンスで解析することにしたので、エキソーム解析を行わなかった。エキソン以外の配列構造異常を検出するために全ゲノムシーケンスを行う。発癌原因候補異常の絞り込みには、大規模癌ゲノム研究(国際癌ゲノムコンソーシウムなど)から公開されつつある情報も利用する。
紀伊半島における漁村・漁民の歴史的・総合的研究

本研究は、歴史学・地理学・社会学・経済学などによって、紀伊半島における漁村社会の歴史的特質及び現状を関連させて総合的に分析を行うことを目的とし、次のような具体的な課題を設定した。1.紀伊半島の漁村地域の古代から近代に至る漁業の発展過程を明らかにし、漁村社会の特質とその近代的展開を解明する。2.昭和40年代以降、急速に変貌を遂げつつある紀伊半島の漁村の現状を漁業経済・漁村の社会構造の諸視角から分析する。3.諸外国・他地域の漁業・漁村問題の分析を加えることによって、紀伊半島の漁村社会の発展の方向を模索する。1の〈漁業史〕に関しては学外の研究協力者の参加も得て、二・三の新しい知見を加えることができた。近世期の捕鯨やあしか漁が大いに発展し、漁村社会の構成にまで影響を及ぼしたこと、カキ・ノリ養殖業が和歌浦湾でかなり盛んであったこと、また、近代においては沿岸漁業が優勢で大型漁船による漁業は余り発展しなかったことなどが明らかにできた。2については、漁村地域のわらべ歌の分析から1980年代末でも、まだ伝統的文化が根強く残っていることを明らかにしたが、漁業経済や漁村社会の変貌についての分析はできなかった。また、前近代における紀伊半島の漁村構造の先進性についてはかなり明らかにできたが、現状分析と発展方向の模索は今後の課題として残った。本研究は2か年継続で研究計画を立てており、本年度は主として研究対象に関係する資料の収集と情報の収攬に力点を置き、各研究グル-プ毎に調査を実施した。歴史分析グル-プでは、水産資料館に旧蔵されていた文書史料の複写とその整理を行ない、紀州藩領域での漁村構造や藩の漁業政策の検討にはいりつつある。また、近代の漁業資本の個別事例を明らかにするため、水産資料館に架蔵の鈴木家文書の整理に着手した。さらに、紀北漁村の歴史的分析を企てるため、本学所蔵文書の整理と解読作業をも試みた。現状分析グル-プでは、他府県地域との比較を企てるため、主要漁業府県や中央官庁での資料収集と情報確得に努めるとともに、紀伊半島地域内での漁業形態の特色をつかむため、同地域内での資料収集も企て、新聞資料の収集と記事索引作成にあたった。比較理論グル-プは、外国における漁業政策や漁村構造の特色を明らかにし、若干の理論的整理を企てることに主眼を置いて、主として文献資料の検索と収集に努めた。本年度は資料収集に主力を置いたため、まだ具体的な研究成果を生みだすまでに至っていないが、今春以降、紀伊半島地域の二、三の特色ある漁村地域に焦点を絞って、地域研究に取り組み、歴史研究と現状分析との総合化に努めることを目ざしている。また、研究分担者以外にも当該研究分野に造詣深い研究者にも参加を求めていくことも計画している。1紀伊半島の漁村地域の古代から近代に至る漁業の発展過程を明らかにし、漁村社会の特質とその近代的展開を解明する。2昭和40年代以降、急速に変貌を遂げつつある紀伊半島の漁村の現状を漁業経済・漁村の社会構造の諸視角から分析する。3諸外国・他地域の漁業・漁村問題の分析を加えることによって、紀伊半島の漁村社会の発展の方向を模索する。1の〈漁業史〉に関しては学外の研究協力者の参加も得て、二・三の新しい知見を加えることができた。

2については、漁村地域のわらべ歌の分析から1980年代末でも、まだ伝統的文化が根強く残っていることを明らかにしたが、漁業経済や漁村社会の変貌についての分析はできなかった。また、前近代における紀伊半島の漁村と漁村構造の先進性についてはかなり明らかにできたが、現状分析と発展方向の模索は今後の課題として残った。
水中で有害塩素化合物を無害化する新規コアシェル型グリーン触媒の開発

始めに,ナノメートルサイズの粒子径を持つ白金粒子をアルミナ(酸化アルミニウム)に分散させた触媒を作成する。次に,自己組織化能(分子自身が集まり配列する力)を持つ有機ホスホン酸分子をベースユニットとして結合させる。有機ホスホン酸は反応中で脱離しにくく,反応する分子数を高める。この基礎ユニットへ有機分子第2世代ユニットを結合させると,アルミナの無機核(コア)表面上に有機の殻(シェル)ができ,水中で分子を保つ機能を持たせることができる。この触媒は環境に優しい水という液体中で人体に有害な有機塩素化合物を触媒に集めて無害化するのに適し,自然環境の保全に大きく貢献できる。
"自己体内再生型"結合組織代用血管バイオチューブの抗感染性に関する基礎研究

本研究はバイオチューブに期待される抗感染性を感染実験により実証する事を目的としている.バイオチューブとは非分解性のシリコン等の鋳型を皮下に埋没し生体反応により,鋳型を被包化(カプセル化)する結合組織から得られる管状組織体である.これをバイオチューブグラフトとして血管の移植に用いる.自己組織であるバイオチューブは免疫拒絶反応もなく,鋳型の形状により血管の形状,長さ,直径に至るまで自由に作成可能なオーダーメイド医療である.更に自己組織と癒合し、栄養血管を自ら形成しつつ、個体の成長に伴ってともに成長するという特徴を有する.既存の人工血管は人工物ゆえに抗感染はない.人工物感染はわずかな菌量でも発症し,難治性となることは以前より指摘されている.原因として人工物周囲の死腔の存在や血流の低下,バイオフィルムの形成により,本来備わっている免疫機能を十分に発揮することができず,血管新生もなく抗生剤の到達も困難である.一方バイオチューブは人工物を全く含まず,血管新生をはじめとする組織適合性が高いため抗感染性が期待されていたが,抗感染性を証明する実験は未だ行われていない.バイオチューブの抗感染性を証明するために感染実験を行う.さらに,バイオチューブは移植後数ヶ月以内に生体動脈に酷似した組織再生が誘導されるという特徴が本来備わっている.今後の臨床応用に向けて局所感染により,前述のバイオチューブの特性がどのように変化するかを解析するため研究を進めている.当初はバイオチューブを移植した群と人工血管移植群での比較を行う予定であった.しかし,ラット腹部大動脈は細く移植可能な人工血管が存在せず,血管に人工血管のパッチを当てるようにモデル作製を変更した.また,安定して後腹膜に感染を確立させるための適切な菌量の決定に難渋している.引き続き安定した後腹膜感染の確立に必要な菌液濃度の解析を行う.血液培養,移植片の菌量測定は行なっているが,組織学的評価は行えておらずHE染色・MT染色・EVG染色にてグラフトの縮窄や瘤化・内腔の血栓付着・内膜面積・平滑筋層厚・新外膜厚の測定・内腔/壁厚比の測定・外膜における新生血管数を比較する.免疫染色としてSMemb /SM2/αSMA染色をおこない内皮化の有無,血管形成の有無,平滑筋細胞の分化および活性化の程度を検討する.本研究はバイオチューブに期待される抗感染性を感染実験により実証する事を目的としている.バイオチューブとは非分解性のシリコン等の鋳型を皮下に埋没し生体反応により,鋳型を被包化(カプセル化)する結合組織から得られる管状組織体である.これをバイオチューブグラフトとして血管の移植に用いる.自己組織であるバイオチューブは免疫拒絶反応もなく,鋳型の形状により血管の形状,長さ,直径に至るまで自由に作成可能なオーダーメイド医療である.更に自己組織と癒合し、栄養血管を自ら形成しつつ、個体の成長に伴ってともに成長するという特徴を有する.既存の人工血管は人工物ゆえに抗感染はない.人工物感染はわずかな菌量でも発症し,難治性となることは以前より指摘されている.原因として人工物周囲の死腔の存在や血流の低下,バイオフィルムの形成により,本来備わっている免疫機能を十分に発揮することができず,血管新生もなく抗生剤の到達も困難である.一方バイオチューブは人工物を全く含まず,血管新生をはじめとする組織適合性が高いため抗感染性が期待されていたが,抗感染性を証明する実験は未だ行われていない.バイオチューブの抗感染性を証明するために感染実験を行う.さらに,バイオチューブは移植後数ヶ月以内に生体動脈に酷似した組織再生が誘導されるという特徴が本来備わっている.今後の臨床応用に向けて局所感染により,前述のバイオチューブの特性がどのように変化するかを解析するため研究を進めている.当初はバイオチューブを移植した群と人工血管移植群での比較を行う予定であった.しかし,ラット腹部大動脈は細く移植可能な人工血管が存在せず,血管に人工血管のパッチを当てるようにモデル作製を変更した.また,安定して後腹膜に感染を確立させるための適切な菌量の決定に難渋している.引き続き安定した後腹膜感染の確立に必要な菌液濃度の解析を行う.血液培養,移植片の菌量測定は行なっているが,組織学的評価は行えておらずHE染色・MT染色・EVG染色にてグラフトの縮窄や瘤化・内腔の血栓付着・内膜面積・平滑筋層厚・新外膜厚の測定・内腔/壁厚比の測定・外膜における新生血管数を比較する.免疫染色としてSMemb /SM2/αSMA染色をおこない内皮化の有無,血管形成の有無,平滑筋細胞の分化および活性化の程度を検討する.今年度はモデルの作成ならびに感染確立に必要な菌量の検討が主となり,移植後の評価にまでは至らなかった.次年度には今年度予定していた菌量の決定をした上で感染実験を行い,組織学的評価を実施する.その上で次年度に予定している実験も進めていくため,それらの経費に充てる予定である.
In-organelle NMRによるミトコンドリア内蛋白質の動態解析

真核細胞のオルガネラにおける蛋白質動態は解析すべき重要な生命現象の一つである.本研究では,in-cell NMRを,オルガネラ(特にミトコンドリア)内にある蛋白質に応用することで解析を試みた.ミトコンドリア移行シグナルを付加したモデル蛋白質を,電気穿孔法でヒト培養細胞に導入し,その後ミトコンドリアを単離することで.良好なin-mitochondria NMRの観測に成功した.希薄溶液状態と同様の立体構造が形成されていたが,細胞質内のスペクトルとの有意な差も観測され.ミトコンドリア・マトリックスが蛋白質動態に与える影響を反映している可能性がある.本研究の目的は,生体内の蛋白質の解析に対して潜在的なポテンシャルを持つin-cell NMR法を,真核細胞のオルガネラ内にある蛋白質の解析法として発展させることである.対象となるオルガネラとしては,細胞質と特に異なる環境を保持し,その単離方法も確立されているミトコンドリアを用いる.ミトコンドリア内環境が蛋白質の立体構造や動態(フォールディング安定性や高分子複合体との相互作用など)に与える影響を解析する.蛋白質のオルガネラにおける機能発現のメカニズムは解析すべき重要な生命現象の一つである.一方で各オルガネラ内の物理化学的環境は充分に解明されていない.したがって,本研究の成果は,オルガネラにおける蛋白質の構造・活性相関を解析するためのブレークスルーになる可能性がある.本研究ではミトコンドリア・マトリックスに存在する蛋白質を解析候補として取り上げるが,その前段階的研究として,H27年度は,既にin-cell NMR解析で実績がある連鎖球菌protein G B1ドメイン(GB1)および高度好熱菌T.thermophilus HB8 TTHA1718にミトコンドリア移行シグナル(MTS)を付加し,in-mitochondria NMRの手法の確立を試みた.使用するin-cell NMRの系としてはsf9/baculovirusの系とHeLa細胞の系を用いた.このうちHeLa細胞の系では,MTSのついたGB1を,電気穿孔法を用いて細胞質に導入することに成功した.その後移行シグナルが切断されミトコンドリア内に輸送されていることも確認した.連鎖球菌protein G B1ドメイン(GB1)をミトコンドリア・マトリックスに移行させるために,PCRを用いてミトコンドリア移行配列(MTS)を付加したGB1(MTS-GB1)の大腸菌発現用ベクターを作成した.次に15N標識最小培地M9で培養した大腸菌内にMTS-GB1を大量発現させ,大腸菌を破砕後に既報のプロトコルに従って15N標識MTS-GB1を精製した.この試料を電気穿孔法によりHeLa細胞に導入し,2D 1H-15N SOFAST-HMQC測定を行った.続いて,測定に用いた細胞からミトコンドリアを単離し,同様に2D 1H-15N SOFAST-HMQC測定を行った.HeLa細胞に導入したMTS-GB1について2D 1H-15N SOFAST-HMQC測定を行った結果,良好なスペクトルを得た.測定後,ミトコンドリアと細胞質を単離して電気泳動を行った結果,MTS-GB1は移項配列が切除された状態でミトコンドリア内に局在しており,細胞質にはほとんど存在していないことを確認した.MTS-GB1をHeLa細胞に導入したスペクトルとMTSのないGB1を導入したものを比較すると,多くのシグナルが消失・変化していた.このことからGB1はミトコンドリアマトリクス内で細胞質中とは異なる状態をとることが示唆された.このように,H27の研究によって,ヒト培養細胞中で標的蛋白質をミトコンドリア内に移行させ,詳細な動態をin-cell NMRによって観測する手法の確立に成功したと考えられる.従って,研究はおおむね順調に進展していると言える.本研究の目的は,生体内の蛋白質の解析に対して潜在的なポテンシャルを持つin-cell NMR法を,真核細胞のオルガネラ内にある蛋白質の解析法として発展させることである.対象となるオルガネラとしては,細胞質と特に異なる環境を保持し,その単離方法も確立されているミトコンドリアを用いる.ミトコンドリア内環境が蛋白質の立体構造や動態(フォールディング安定性や高分子複合体との相互作用など)に与える影響を解析する.蛋白質のオルガネラにおける機能発現のメカニズムは解析すべき重要な生命現象の一つである.一方で各オルガネラ内の物理化学的環境は充分に解明されていない.したがって,本研究の成果は,オルガネラにおける蛋白質の構造・活性相関を解析するためのブレークスルーになる可能性がある.H28年度は,前年度に引き続き,既にin-cell NMR解析で実績がある連鎖球菌protein G B1ドメイン(GB1)および高度好熱菌T.thermophilus HB8 TTHA1718にミトコンドリア移行シグナル(MTS)を付加したものを用い,in-mitochondria NMRの手法の確立を進めた.使用するin-cell NMRの系としてはsf9/baculovirusの系とHeLa細胞の系を用い,sf9については細胞内の発現量の最適化,HeLa細胞の系では,細胞への導入効率の最適化とミトコンドリア試料の調製法の改良を行った.また,ミトコンドリアに加えて,核内のNMR観測を目指した研究も開始した.核に局在する,RNA結合活性を持つマルチドメイン蛋白質をモデル試料とし,各ドメインにC末端の核移行シグナルを結合させたフラグメントをデザインして,大腸菌を用いた発現系の作成を行った.