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中学校アクティブ・ラーニングにおける「対話的実践」の可能性と課題

今年度は、第一に、フランスのフレネ中等教育実験クラスの視察を行った。視察した一つは,世界で最初のフレネ中等教育実験学校CLEFである。10周年を記念し大会を開催したため,それに参加した。CLEFの教師とOG・OB,在校生と保護者,卒業生とその保護者,ICEM(現代学校運動協働研究所)のメンバーやCLEFとフレネ教育を支えてきた研究者が集い,講演やシンポジウムなどが3日間にわたり開催され,それらに参加しCLEFの実践と意義・成果について振り返った。加えて,今年度を総括する職員会議(評価と課題,改善方向などを検討)を参観した。プロジェクトの期間(2週間)が短すぎるため3週間にすることが議論されていたが,議論を通してプロジェクトの意味や役割が確認・際再検討されていた。3週間プロジェクトは,生徒の若者会議(クラス代表により構成)で審議され,今年度実施された。これらに参加し,CLEF10年の歩みと現状,成果と課題について検討が可能になった。もう一つは,CLEFで教えていた地歴の教師エレーヌ・カサビアンカ氏がロンシャン中学校(マルセイユ)に戻り,同僚とプロジェクト・チームを組み,一昨年始めたフレネ実験クラスを参観した。カサビアンカ氏の地歴を中心に、数学・仏語・英語の授業を参観した。また,フレネクラスの教師,在校生と保護者たちの聞き取りを行った。CLEFと違い、生徒や保護者が希望してフレネクラスに入るのではなく,8クラスのなかの1クラスがフレネ教育を実施する。生徒と保護者に事前説明会で説明するされるしくみになっており,CLEFとはフレネクラスの設定方法や実施方法が異なっていた。第二に,日本のオルタナティブ教育の視察・検討を行った。山田は愛知教育大学附属岡崎中学校の授業を参観し記録を撮り,授業者と研究協議を行った。共同研究者の瓦林は箕面こどもの森学園中等部の視察し情報収集した。昨年度は,中等のフレネ実験クラスを実施しているCLEFとロンシャン中学校、並びに日本の中学校の視察を行ったが、例えば注目している地歴のエレーヌ・カサビアンカ氏の授業については、年々進化・発展しているとともに、ロンシャン中学校とCLEFでは背景事情、地域や学校の方針などに異なる部分があるため、授業記録の整理と分析に時間がかかっている。これらについて今年度進めて、日本におけるオルタナティブ・スクールとの比較に入る必要がある。今年度も中等のフレネ実験クラスを実施しているCLEFとロンシャン中学校において,フレネクラスを視察し,授業やアトリエ,プロジェクトの参観や,生徒・卒業生とその保護者の聞き取り調査を実施する予定である。昨年度のデータとともに,エレーヌ・カサブランカ氏の地歴の授業などを中心にフレネ教育実践の意味を整理するとともに,日本におけるオルタナティブ・スクールとの比較に入る予定である。今年度は、以下を中心に行った。一つは、世界で最初のフレネ中等教育実験学校であるCLEFの実践について実践記録や文献から,授業を通して生徒を知/文化の制作者・表現者=「主体」にするしくみを検討した。CLEFでは,生徒が生活の中で得た興味や関心から出発し,教科で学ぶことと自分が考えることを結びつけるようにしくみがつくられている。仏語、英語、地理歴史、数学、技術、美術、情報科学の教師たちが協力し合い、生徒一人ひとりの個別学習と教科学習がつながるように教育課程をつくり、日々の授業をつくっている。近年,その根幹にある主体的で協働的な学びを組織する教育哲学として“ビヤンヴェイヤンス"が注目されている。二つ目に,大正自由教育運動の流れを組み,70年以上に渡り生活教育を実践してきた愛知教育大学附属岡崎中学校の授業を参観・記録・分析した。ここでは,中学校の全教科の授業を「問題解決的過程」で展開することにより,教科学習のなかで生徒が生活の中で得た興味や関心から出発して,教科で学ぶことと自分が考えることを結びつけ,かつ一人ひとりの個別学習がつながるしくみがつくられている。よって,CLEFと愛知教育大学附属中学校のしくみと構造は異なっているが,カリキュラム・マネジメントにおける共通点がみられる。三つ目に,オルタナティブ教育がヨーロッパでどのように展開されているのか,そのなかにあってフレネ教育はどのように捉えられ展開されているのか,視察した。視察先は,「教育の自由」を実現する教育制度によりオルタナティブ教育が積極的に展開されているオランダと,ナショナル・カリキュラムの改訂により子どもによる教科横断的なテーマ学習が重視されることになったフィンランドである。オランダでは,フレネ教育とイエナ・プランを実践している学校を視察し、両者を取り入れた実践づくりを試みている実践研究組織を取材した。昨年度は,CLEFと日本の中学校の比較研究を進めるための前段階として,それぞれの実践的取り組みの整理を行い,フレネ教育というオルタナティブ教育がどのようにヨーロッパで評価されているのか,比較研究の前段階としての取り組みについては着手したものの,前段階に留まったといえる。比較分析を行うためには,さらにCLEFと愛知教育大学附属岡崎中学校の実践検討を深める必要がある。そのためには,CLEFと愛知教育大学附属岡崎中学校の視察,特に教師,保護者,生徒,卒業生などの聴き取り調査が必要である。現在,フレネ教育の中等実験クラスがマルセイユ(フランス)にも誕生しているが,現地視察の資金と時間に限りがあり,着手できなかった。加えて,日本におけるオルタナティブ・スクールの視察と動向把握も実現できていない。これらを今年度に実施していく必要がある。

視察した一つは,世界で最初のフレネ中等教育実験学校CLEFである。10周年を記念し大会を開催したため,それに参加した。CLEFの教師とOG・OB,在校生と保護者,卒業生とその保護者,ICEM(現代学校運動協働研究所)のメンバーやCLEFとフレネ教育を支えてきた研究者が集い,講演やシンポジウムなどが3日間にわたり開催され,それらに参加しCLEFの実践と意義・成果について振り返った。加えて,今年度を総括する職員会議(評価と課題,改善方向などを検討)を参観した。プロジェクトの期間(2週間)が短すぎるため3週間にすることが議論されていたが,議論を通してプロジェクトの意味や役割が確認・際再検討されていた。3週間プロジェクトは,生徒の若者会議(クラス代表により構成)で審議され,今年度実施された。これらに参加し,CLEF10年の歩みと現状,成果と課題について検討が可能になった。もう一つは,CLEFで教えていた地歴の教師エレーヌ・カサビアンカ氏がロンシャン中学校(マルセイユ)に戻り,同僚とプロジェクト・チームを組み,一昨年始めたフレネ実験クラスを参観した。カサビアンカ氏の地歴を中心に、数学・仏語・英語の授業を参観した。また,フレネクラスの教師,在校生と保護者たちの聞き取りを行った。CLEFと違い、生徒や保護者が希望してフレネクラスに入るのではなく,8クラスのなかの1クラスがフレネ教育を実施する。生徒と保護者に事前説明会で説明するされるしくみになっており,CLEFとはフレネクラスの設定方法や実施方法が異なっていた。第二に,日本のオルタナティブ教育の視察・検討を行った。山田は愛知教育大学附属岡崎中学校の授業を参観し記録を撮り,授業者と研究協議を行った。共同研究者の瓦林は箕面こどもの森学園中等部の視察し情報収集した。昨年度は,中等のフレネ実験クラスを実施しているCLEFとロンシャン中学校、並びに日本の中学校の視察を行ったが、例えば注目している地歴のエレーヌ・カサビアンカ氏の授業については、年々進化・発展しているとともに、ロンシャン中学校とCLEFでは背景事情、地域や学校の方針などに異なる部分があるため、授業記録の整理と分析に時間がかかっている。これらについて今年度進めて、日本におけるオルタナティブ・スクールとの比較に入る必要がある。フレネ教育の中等実験学校であるCLEFと「生活教育」を実践してきた愛知教育大学附属岡崎中学校では,生徒の生活のなかの興味・関心から始めて個別学習と教科学習がつながるように教育課程がつくられている。両者の詳しい構造は異なっているものの、そこには共通の理念がある。このしくみにおける,教師と生徒たちの協働を引き出す対話的実践の役割や意味,可能性とそれを引き出すしくみについて整理する必要がある。そのために,今年度は,下記を実施する。第一に,「両者の対話的実践」の特徴両者の比較を踏み込んで行うため,教員,保護者,生徒,卒業生,実験学校の存続・維持に関わる視学官などにインタビュー調査を行う。第二に,フレネの中等実験クラスがマルセイユの公立中学校内にもつくられている。
血管内皮幹細胞の同定および血管新生の新規分子機構の解明と眼疾患治療への応用

糖尿病網膜症や加齢黄斑変性症などの眼疾患は中途失明に関わる重篤な疾患であり、その発症および進行には虚血や病的血管新生が密接に関連することが知られている。本研究では、既存血管に存在し血管新生に中心的な役割を果たす特殊な血管内皮細胞を同定することにより血管新生を制御する新規治療法の開発を目指した。具体的には、フローサイトメトリーおよび蛍光標識モノクローナル抗体を用いてマウス血管内皮細胞の約13%を占める潜在的増殖活性を有する特殊な血管内皮細胞を同定した。またこのような細胞が特異的な遺伝子を発現し、生体内において血管新生に貢献することをトランスジェニックマウスを用いて解析した。糖尿病網膜症や加齢黄斑変性症などの眼疾患や悪性腫瘍は中途失明や生命に関わる重篤な疾患であり、その発症および進行には虚血および病的血管新生が密接に関連することが知られている。本研究では、既存血管に存在して血管新生に中心的な役割を果たす特殊な血管内皮細胞を同定し、血管新生との関連を解明することにより血管新生を制御する新規治療法の開発を目指すことを目的としている。我々は、FACSおよび蛍光標識モノクローナル抗体を用いた精度の高い血管内皮細胞単離法を確立し、さらにDNA結合性色素Hoechstを用いたSide population(SP)法を行い、血管新生の際に中心的な役割を果たす潜在的増殖活性の高い血管内皮細胞として血管内皮SP細胞を同定してきた。(EMBO J 2013, IOVS 2013)。血管内皮SP細胞は既存血管中の血管内皮細胞の約13%で存在し、低酸素刺激でその割合および増殖活性が増加し機能的血管を構築することがわかった。さらに、平成26年度の研究では、DNAマイクロアレイを用いてマウス生体より回収した血管内皮SP細胞および血管内皮MP細胞(SP細胞以外の大部分)の遺伝子発現プロファイルを網羅的に3回にわたって解析した。その結果、血管内皮SP細胞とMP細胞はともに血管内皮細胞マーカーであるVEカドヘリンやCD31を高発現していたが、遺伝子プロファイルが全体として著しく異なることが判明した。これらの遺伝子群のなかで血管内皮SP細胞で特異的に発現する遺伝子群を絞り込み、最終的に血管内皮SP細胞で最も特異的に発現する分子を同定することができた。さらにこの特異的な分子陽性の血管内皮細胞をFACSを用いて単離することができた。また、特異的な分子陽性の血管内皮細胞が、Vitro上で潜在的増殖活性を示す特殊な血管内皮細胞であることを確認した。糖尿病網膜症や加齢黄斑変性などの眼疾患や悪性腫瘍は中途失明や生命に関わる重篤な疾患であり、その発症および進行には虚血および病的血管新生が密接に関連することが知られている。我々は、FACSおよび蛍光標識モノクローナル抗体を用いた精度の高い血管内皮細胞単離法を確立し、さらにDNA結合性色素Hoechstを用いたSide population (SP)法を行い、血管新生の際に中心的な役割を果たす潜在的増殖活性の高い血管内皮細胞として血管内皮SP細胞を同定してきた(EMBO J 2012, IOVS 2013)。平成26年度の研究ではDNAマイクロアレイを用いてマウス生体より回収した血管内皮SP細胞および血管内皮MP細胞(SP細胞以外の大部分)の遺伝子発現プロファイルを解析し、血管内皮SP細胞で最も特異的に発現し、潜在的増殖能力に相関する遺伝子Xを同定した。平成27年度の研究では、血管内皮SP細胞が生体内で実際に存在し、血管新生に貢献するかを検証するため、遺伝子Xに変異型Estrogen受容体融合蛋白(CreERT2)を発現したBAC(大腸菌人工染色体)トランスジェニックマウスを作製し解析した。血管内皮SP細胞に特異的に発現する遺伝子群のマイクロアレイ解析を計画通り行い、候補遺伝子を絞り込み、最終的に特異的な遺伝子を同定した。モノクローナル抗体を作製しFACSにおいてCD31陽性CD45陰性の血管内皮細胞分画に特異的分子陽性の分画が存在することを確認し、その分画を培養することにより、潜在的増殖活性を有する血管内皮細胞が存在することを証明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。血管新生今後、血管内皮SP細胞が生体内で実際に存在し、血管新生に貢献するかにつき検証する。マウス生体内で、特異的な遺伝子を発現する血管内皮細胞のみを蛍光タンパク質で標識する。

方法として、Inducible Cre/loxPシステムを用いた細胞系譜解析(genetic lineage tracing)を行う。マイクロアレイにより同定した特異的遺伝子座位にCreを発現したマウスを作製し、このマウスと2つのloxP配列を有しEGFPをCre切断依存的に発現するレポーターマウスを交配する。Creを発現したマウスは、変異型Estrogen受容体融合蛋白(CreERT2)によりタモキシフェン誘導性にCre recombinase活性を導くことができるようにすることで、in vivoにおいて血管内皮SP細胞特異的分子をEGFPで標識することが可能となる。タモキシフェン投与によりEGFPで標識された血管内皮細胞が生体内で実際に存在するか、存在した場合生体内の血管のどのような部位にどのような細胞と隣接して存在するかなどにつき詳細に検討する。さらに網膜や脈絡膜血管新生における血管内SP細胞の役割についても検討を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。
中国の地方政府による低炭素発展政策の実効性と地域間格差是正への効果

近年の中国では,GDPあたりの省エネルギーとエネルギー源の転換が徐々に進みつつあり,全体としてCO2排出量はピークに近づきつつある.ただし,こうした省エネルギーやエネルギー転換の状況には,省・自治区・直轄市レベルでかなりの地域差が見られ,経済構造の転換と環境対策が進んだ地域とそれらが遅れている地域との格差は縮まっていない.他方で,環境関連投資を増やすことが地方政府指導者の昇進につながっていることが統計データから示され,部分的ではあるが,「一票否決制」が地方政府の環境政策を推進するのに効果があるといえる.1)研究項目Aの「一票否決制の執行状況の解明」に関しては、中国の地方政府指導者の交代状況を把握するために、2000年から現在までの各省・市・自治区及び省都都市の主要指導者(共産党書記と省長・市長)の在任状況に関する情報を収集した。また、地方政府指導者の交代は環境指標の達成状況によるものか、それとも他の原因によるものなのかを把握するために、彼らの個人属性(学歴、年齢、在職期間、出身地、性別、民族など)に関する情報も収集した。2)研究項目Bの「経済成長とエネルギー消費に関する地域別構造分析と政策改革」に関しては、エネルギーを投入要素とする集計的生産関数の推計を行っている先行研究を収集し、CES生産関数やトランスログ生産関数を用いた最近の研究を中心に、どのような推計モデルがどのような研究目的で用いられているかなどについて検討した。また、特に中国を対象としたそれらの研究において、どのようなデータが用いられているかも検討した上で、必要な統計データの収集を行った。3)このほか、中国の地方政府の環境・気候変動と開発衝動をめぐる新たな政治経済分析に関する文献調査、および中国の地方政府における低炭素都市建設の進展に関する文献調査を行った。4)これら研究に関連して、「中国における経済成長方式の転換とその可能性」と題する研究報告を中国経済研究会で行い(劉)、国際的な合意や資金が中国の気候変動政策の展開に及ぼした内容について、国際開発学会全国大会で研究報告を行った(森)。1)研究項目Aの「一票一決制の執行状況の解明」については、平成25年度に収集した各省・市・自治区・省都都市における主要指導者(共産党書記と省長・市長)の在任状況および個人属性(学歴・年齢・在職期間・出身地・性別・民族など)に関するデータを整理し、分析を進めた。2)研究項目Bの「経済成長とエネルギー消費に関する地域別構造分析と政策改革」については、平成25年度に収集した地域別年次別の経済データとエネルギーデータを整理し、分析を進めた。あわせて、計量モデルに関する先行研究の収集と分析を行った。3)このほか引き続き、中国の地方政府の環境・気候変動と開発衝動をめぐる政治経済分析に関する文献調査、および中国の地方政府における低炭素都市建設の進展に関する文献調査を行った。4)これら研究に関連して、平成27年2月に、科学研究費補助金研究プロジェクト『中国の地方政府における環境ガバナンスと環境紛争解決機能の向上に関する研究』(代表:北川秀樹龍谷大学教授)との共催により、「中国の環境ガバナンスに関する研究会」を開催した。北京大学法学院の汪勁教授を講師に迎え、「中国の2014年環境保護法改正と執行への影響」と題する報告の後、両科研プロジェクトメンバー等による討論を行った。1)研究項目(A)の「一票一決制の執行状況の解明」については、すでに収集した各省・市・自治区・省都都市における主要指導者(共産党書記と省長・市長)の在任状況および個人属性(学歴・年齢・在職期間・出身地・性別・民族など)に関するデータについて整理と分析を進めた。2)研究項目(B)の「経済成長とエネルギー消費に関する地域別構造分析」については、すでに収集した地域別年次別の経済データとエネルギーデータを整理し、分析を進めた。3)このほか引き続き、中国の地方政府の環境・気候変動と開発衝動をめぐる政治経済に関する文献調査、および低炭素都市建設の進展に関する文献調査を行った。4)これら研究に関連して、包茂紅・北京大学歴史学部教授・京都大学東南アジア研究所客員教授を迎えて、中国の水汚染ガバナンスに関する研究会を開催した。研究会では、実験的な地域環境ガバナンスの構築として、排出削減と汚染防止の目標の執行状況の社会への公開と市民の監督、及び幹部の実績評価基準としての「一票否決制」が規定されたこと、そしてそれが排出抑制に効果をもたらしたことが紹介された。5)これら研究のために収集した資料や情報をふまえ、中国の環境問題の現状について中国経済経営学会大会シンポジウム報告を行い、中国農村の環境問題および日本の環境協力について論文を発表した(竹歳)。また、東アジアの環境問題や環境政策の動向について国際ワークショップで報告を行い、論文を発表した(森)。勤務先の移動や業務多忙などのため、必要な研究時間を確保することができず、データの分析等が当初の予定に比べて遅れている。また、現地調査の日程調整もうまくいかずこの部分も先伸ばしになっている。こうした理由により研究期間を1年間延長することにした。1)研究項目(A)の「一票一決制の執行状況の解明」については、すでに収集した各省・自治区・省都都市における主要指導者(共産党書記と省長・市長)の在任状況および個人属性(学歴・年齢・在職期間・出身地・性別・民族など)に関するデータについて整理と分析を進めた。分析により、単位GDP当たりのエネルギー消費は地方指導者の昇進には有効ではないが、環境関連の投資は条件付きで有効に作用しているなどの結果を得られた。それらの内容は論文にまとめ、現在投稿中である。2)研究項目(B)の「経済成長とエネルギー

消費に関する地域別構造分析」については、すでに収集した地域別年次別の経済データとエネルギーデータを整理し、分析を進めた。これに関しては、この分野に詳しい中国の研究者にコメントを求め、分析の方向性についてディスカッションを行った。このディスカッションを通じて、エネルギーデータに関する分析上の問題点も明らかになった。3)このほか引き続き、中国の地方政府の環境・気候変動と開発衝動をめぐる政治経済に関する文献調査および低炭素都市建設の進展に関する文献調査を行った。これらの成果の一部を盛り込んで、竹歳(2016)では中国の環境政策の課題について言及したほか、現在竹歳が分担執筆中の図書では、環境・気候変動政策の内容やCO2排出構造について述べている。また、森(2017)では、中国の気候変動政策によるカーボンリーケージの問題に焦点をあて、その抑制策について述べている。近年の中国では,GDPあたりの省エネルギーとエネルギー源の転換が徐々に進みつつあり,全体としてCO2排出量はピークに近づきつつある.ただし,こうした省エネルギーやエネルギー転換の状況には,省・自治区・直轄市レベルでかなりの地域差が見られ,経済構造の転換と環境対策が進んだ地域とそれらが遅れている地域との格差は縮まっていない.他方で,環境関連投資を増やすことが地方政府指導者の昇進につながっていることが統計データから示され,部分的ではあるが,「一票否決制」が地方政府の環境政策を推進するのに効果があるといえる.データの整理・分析に時間がかかったため、当初想定していた達成度に比べやや遅れている。現在行っている分析をスピードアップしつつ引き続き進めていく。次年度は延長した研究期間の最終年度にあたるので、論文にまとめて発表することにも注力していく。環境政策論,経済発展論,農業経済学現在行っている分析を、スピードアップしつつ引き続き進めていく。次年度は計画の最終年度にあたるので、論文にまとめて発表することにも注力していく。当初の研究計画に沿い、各研究項目について本格的な分析のための準備作業を行うことができた。研究計画を大きく変更させる障害なども現段階ではなく、順調に進んでいる。ただし、現地調査やモデル推計などの本格的な分析作業は26年度以降に実施する。現地調査を行うことができなかったため、旅費の使用が少なかった。また、研究の進捗が遅れているため、人件費の使用も少なかった。当年度はデータ分析を中心に研究を進めたため、実地調査や研究発表のための旅費などの支出が少なくなった。旅費を使用して、現地調査あるいは研究協力者との研究会を行う。また、研究のとりまとめに向けて、人件費などを使用する。これまでの準備作業をもとにして、26年度には本格的な分析作業を行う。研究項目Aについては、地方指導者の業績となっている環境指標や経済指標を収集し、分析を進める。研究項目Bについては、収集した統計データの加工とモデルの推計を進める。また、これらに関する情報収集と、各地方政府の低炭素都市建設に関する実態調査のため、現地調査も予定する。
食嗜好性に関与する味細胞-味神経間における味質特異的情報ライン形成のメカニズム

食物の味の情報は味細胞で受容され、味神経を経て、脳へと伝えられる。しかし、その味情報が味細胞から味神経へどのようなメカニズムで伝達されているのかについては、まだ多くが不明である。昨年度は、GABA_AやGABA_B受容体サブユニット、GABA応答を制御する2種類のC1^-トランスポーター(KCC2、NKCC1)が味細胞に発現すること、GABA基底外側膜側への投与により、発火頻度が増加する細胞と減少する細胞が存在し、甘味応答が増加する細胞や、苦味応答が減少する細胞が存在することを明らかとしている。本年度は、II型細胞、III型細胞をGFPにて蛍光標識させた遺伝子改変マウス(II型: T1R3-、TRPM5-、Gustducin-GFP、III型:GAD67-GFP)を用い、解析を行った。その結果、GABAやGABA_A受容体アゴニストムシモールの投与により、II型細胞で生じる甘味応答は増大し、苦味応答は減少し、GABAやGABA_B受容体アゴニストバクロフェンの投与によりIII型細胞の酸味応答は減少した。また、GABAやムシモールの投与により、甘味応答が増大したII型細胞をsingle cell RT-PCRした結果、半数でNKCC1が検出された。さらに、免疫染色の結果、茸状乳頭と有郭乳頭のII型細胞及びIII型細胞の一部でNKCC1及びKCC2が検出され、特にKCC2は茸状乳頭では主にGAD67-GFP発現細胞と共発現し、ごく一部のTRPM5-GFP発現細胞で共発現するが、有郭乳頭ではTRPM5-GFP発現細胞の半数で共発現していた。さらに、GABAイメージング解析の結果、high K^+刺激やクエン酸刺激により味細胞からのGABAの放出が観察された。以上の結果から、GABAは味細胞から放出され、II型及びIII型細胞において味覚修飾に関与する可能性が示唆された。味覚の受容・情報伝達機構を明らかにするには、味細胞レベルでの味情報伝達機構や、味細胞から味神経への伝達機構を解明することが必要である。近年、味細胞の一部には、神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸(GABA)、その合成酵素(GAD-67)、トランスポーター(GAT)や受容体を発現することが報告された。また、GABA投与によりCl^-電流が増加する細胞も存在することが示唆されている。これらは、GABAが味蕾内での情報伝達、特に細胞間コミュニケーションに関与する可能性を示唆する。しかし、その詳細はまだ全く不明である。そこで本研究では、GABAの味蕾内での作用メカニズムを明らかにるため、RT-PCR法を用いて、マウス味細胞におけるGAD-67、GABA_A及びGABA_B受容体サブユニットの発現様式を調べた。また、ルーズパッチ法を用いて味細胞の活動電位を記録し、GABA投与後の変化を解析した。その結果、GABA_A及びGABA_B受容体サブユニットが検出された。GABAの投与により、発火頻度が増加する細胞と減少する細胞が存在し、甘味応答が増加する細胞や、苦味応答が減少する細胞も存在した。さらに、RT-PCRの結果からGABA応答を制御する2種類のCl^-トランスポーター(KCC2、NKCC1)の発現が認められた。これらの結果から、GABAが味細胞の興奮性に何らかの影響を与え、味細胞レベルでの味覚情報の修飾に関与することが示唆された。甘味抑制物質Gurmarin感受性(GS)神経や非感受性(GI)神経が存在することが明らかとなっているが、味細胞での存在はまだ明らかではない。そこで次に本研究では、T1R3-GFPマウスを用いて甘味受容体発現細胞におけるGurmarinの感受性を解析している。その結果T1R3-GFP発現細胞の中にGSとGIの経路が存在する結果がでてきているが、現在も解析中である。

さらに、GABAイメージング解析の結果、high K^+刺激やクエン酸刺激により味細胞からのGABAの放出が観察された。以上の結果から、GABAは味細胞から放出され、II型及びIII型細胞において味覚修飾に関与する可能性が示唆された。
環境共生長寿命住宅の実現へ向けたバイオアコースティクスの利用

環境共生住宅の長寿命化実現への障害として,日本で特に被害の大きいイエシロアリ(Coptotermes formosanus)を対象に,振動・音響信号の木材への付加と摂食活性に関する基礎的な実験を行った。その結果,木材へ付加された振動・音響信号の量および周波数特性によりイエシロアリの摂食活性が変化することを示した。また,特に振動・音響信号の量とイエシロアリの摂食活性に相関が認められた。本研究は、日本における代表的な木材劣化生物である地下シロアリを対象に「振動・音響信号による地下シロアリの摂食活性の変化の検討」「地下シロアリの摂食活性を制御する振動・音響信号の開発」の2つの検討を行い、環境への影響が少ない振動・音響信号を用いた木材劣化の防止、ひいては環境共生長寿命住宅の実現を目指す。本年度は研究実施計画にも記載した2項目に対し、それぞれ以下の成果が得られた。1.木材に付加する振動・音響信号の種類とイエシロアリの摂食活性との関係の検討:前年度研究の結果、木材に振動を付加した場合、付加する信号の量が大きいほど摂食活性が低下する傾向が見られた。本年度は、引き続き前年度に構築した実験環境において、付加する信号の周波数特性に関する検討を行ったが、これまで以上に摂食活性が低下する信号は得られなかった。2.イエシロアリの摂食活性を制御する振動・音響信号の普遍性検討:前年度までは、本実験に京都大学生存圏研究所コロニーBのイエシロアリを使用していた。本年度は実験の普遍性検証のため、同研究所のコロニーCおよび鹿児島県の松林で採取された野生のイエシロアリを対象に、木材への振動・音響信号の付加によるイエシロアリの摂食活性の変化に関する検討を行った。その結果、京都大学生存圏研究所のコロニーCのイエシロアリでは、これまでの実験結果同様、木材への信号の付加により摂食活性が低下した。一方、鹿児島県の松林で採取された野生のイエシロアリでは、木材への信号の付加により摂食活性に明確な変化が見られなかった。ただし、本年度の実験は冬季に行われ、振動・音響信号を付加しない木材への摂食量がこれまでより少なかった。野生のシロアリは季節により摂食量が変化するため、今後さらなる検討を行う必要がある。本年度は研究実施計画に記載した4項目に対し、それぞれ以下の成果が得られた。1.実験環境の構築:研究連携者および京都大学生存圏研究所の協力を仰ぎながら、イエシロアリの摂食活性が高く、かつ振動・音響信号の付加が可能な実験環境を構築した。2.実験環境に関する検証:1.で構築した実験環境を検証するため、イエシロアリの生存実験を行った結果、実験開始後2週間の生存率が80%以上であった。3.摂食活動で発生する振動・音響信号の収集・分析:長さの異なる4種のスギ材中におけるイエシロアリの摂食活動で生じる振動・音響信号の収集に成功した。得られた信号に,短時間FFTを施し,周波数特性の時間変化を観察した。その結果、それぞれの材で複数のピーク周波数が見られ、この周波数を乾材シロアリに対する先行研究結果と比較したところ、イエシロアリの結果は乾材シロアリの結果に比べ、材のサイズによる変化の割合が小さかった。4.木材に付加する振動・音響信号の種類とイエシロアリの摂食活性との関係の検討:上記1.で構築された実験環境において、3.で採取された信号とピンクノイズを木材に付加し、2週間の摂食量を比較した。その結果、ピンクノイズを使用した場合に、2つの材の摂食量に有意差が生じた。さらに、それぞれの信号の量を変化させたところ、付加する信号の量が大きいほど摂食活性が低下する傾向が見られた。本研究は、日本における代表的な木材劣化生物である地下シロアリを対象に「振動・音響信号による地下シロアリの摂食活性の変化の検討」「地下シロアリの摂食活性を制御する振動・音響信号の開発」の2つを実施し、環境への影響が少ない振動・音響信号を用いた木材劣化の防止、ひいては環境共生長寿命住宅の実現を目指した。昨年度までの検討結果、木材に振動を付加した場合、付加する信号の量が大きいほどイエシロアリの摂食活性が低下する傾向が見られたが、摂食活性と信号の周波数特性に関しては有為な関係が見られなかった。また、京都大学生存圏研究所に飼育されているイエシロアリと鹿児島県の松林で採取された野生のイエシロアリでは、木材への信号の付加による摂食活性の変化に差が見られた。本年度は最終年度として、まず、前年度までに構築した実験環境について、イエシロアリが摂食する木材への振動・音響信号の付加装置の検討を行った。その結果、昨年度までに比べ低周波数域で1020 dB程度のSN比改善を達成した。

続いて、木材に付加する振動・音響信号の種類とイエシロアリの摂食活性との関係の検討として、前年度までの振動・音響信号に対し、狭帯域な中心周波数1000 Hzの1/3オクターブバンドノイズを、京都大学生存圏研究所で飼育されているイエシロアリが摂食する木材へ付加した実験を行った。また、信号の量に関する検討として、加振面の振動加速度レベルが約30dB異なる2種の信号を用い、それぞれの信号で18回の繰返し実験を実施した。その結果、広帯域信号を付加した場合と同様、付加する信号の量が大きいと摂食活性が低下する傾向が確認された。一方、振動・音響信号の量が同じ場合、昨年度までの広帯域信号をイエシロアリが摂食する木材へ付加した場合に比べ、狭帯域信号を付加した場合、摂食量が半分以下となった。建築環境・設備研究代表者と研究分担者間の連絡もきちんとなされており、研究連携者との連携および研究協力者の協力も予定通り得られ、研究実施計画に記載した項目が順調に実施できたため。本研究では、環境負荷の少ない木造住宅の長寿命化を目指し、日本における代表的な木材劣化生物である地下シロアリを対象に、振動・音響信号を用いた木材劣化の防止手法の開発を目的としている。平成24年度は、まず、実験を行うための環境の構築として、振動・音響信号の付加が可能で、2週間後の生存率80%以上の実験環境の構築を行った。続いて、地下シロアリが感知可能な振動・音響振動の目安をえるために、地下シロアリが木材を摂食する際に発生する信号の採取に成功した。さらに、地下シロアリが摂食する木材に付加する振動・音響信号の種類および量を変化させて実験を行ったところ、地下シロアリの摂食活性が低下する場合が見られた。来年度以降は、構築された実験環境をもとに、地下シロアリの摂食活性が低下する場合について、その条件や普遍性を明らかにする。以上、平成24年度の研究実施計画に記載された内容が実施できており、次年度以降の実施計画内容も実施可能となっているため、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。野生のシロアリを用いた実験結果については、早急に研究協力者の京都大学生存圏研究所吉村教授と、これまでの実験結果との比較方法および本年度の実験手法について議論する。最終年度として、本年度までの研究の継続および追加として以下の研究を予定している。・摂食活動以外の振動・音響信号の収集・分析:兵アリから危険を知らせる際に発生されると考えられている振動・音響信号等、地下シロアリの挙動と関連すると考えられる、摂食活動以外の振動・音響信号の収集・分析を試みる。・振動・音響信号の発生手法と地下シロアリの摂食活性との関係の検討:前項の成果とあわせ、木材への振動・音響信号の付加方法に関し、3種以上試行し、地下シロアリの摂食活性の変化を観察する。その結果より、環境への影響やコスト面も考慮に入れ、最も効果的な信号の付与手法を提案する。また、必要に応じて研究テーマの取捨選択を行う。具体的には、木材に付加する振動・音響信号の種類とイエシロアリの摂食活性との関係の検討および、地下シロアリの摂食活性を制御する振動・音響信号の開発を優先的に実施する予定である。平成24年度の成果を踏まえ、以下の計画で研究を実施する予定である。
ヘリコバクター・ピロリ菌感染を契機とした胃発癌分子機構の解明

ヒト胃発癌過程において、ヘリコバクター・ピロリ菌感染を契機とした慢性胃炎を背景として種々の癌関連遺伝子に異常が生成されるが、その機序は不明であった。ヒトに生理的に備わっている遺伝子編集酵素Activation-Induced Cytidine Deaminase(AID)が、ヘリコバクター・ピロリ菌感染を契機として胃上皮に異常発現し、さらにAIDの異常発現の結果、種々の癌関連遺伝子異常を引き起こすことを明らかにし、胃発癌過程における遺伝子異常生成にAIDが重要な役割を果たしている可能性を示した。1.ゲノムアナライザーを用いた、AID発現により胃上皮にもたらされる遺伝子異常の全体像の探求;AIDを過剰発現する胃上皮細胞において、既知のすべての遺伝子DNAの塩基配列と染色体異常について解析を行い、胃上皮におけるAIDの持続発現の結果生じる遺伝子異常生成・蓄積の全体像を明らかにする。薬剤誘導により活性化AIDを過剰発現する胃上皮培養細胞株を樹立、またAID Tgマウスの胃組織から胃上皮細胞の初代培養を樹立し、AID過剰発現下の胃上皮細胞における体細胞変異の全体像をゲノムアナライザーを用いて検討する。また、野生型マウスにHP菌を経口感染させることにより、胃上皮細胞に内在性AIDが発現誘導され、遺伝子変異生成に寄与しうるかどうかの検討を行う。AID過剰発現下の胃上皮培養細胞およびAID Tgマウスの胃から経時的にDNAを抽出する。遺伝子変異の解析については、次世代ゲノムアナライザーを用いることにより、体細胞変異を網羅的に解析することが可能となる。野生型マウスにHP菌を経口感染させる。感染後、経時的に胃上皮から核酸を抽出し、内在性AID転写産物の発現を定量評価すると同時に、全癌関連遺伝子の変異生成の有無をゲノムアナライザーを用いて網羅的に検討したところ、癌関連遺伝子に変異を認めた。一方、AID KOマウスにHP株を感染させても遺伝子変異を認めなかった。すなわち、HP菌感染した胃上皮細胞における遺伝子変異生成が、AID依存性に引き起こされることが示唆された。2.胃発癌過程におけるAIDの役割についての胃癌モデルマウスを用いた検討;さまざまな胃癌モデルマウスとAID KOマウスをかけあわせ、胃癌発生の頻度について検討し、胃発癌過程におけるAIDの重要性を明らかにすることを目的とする。現在、マウスの準備中である。1)活性化AIDを過剰発現する胃上皮培養細胞株の樹立およびAIDトランスジェニック(Tg)マウスから胃上皮を採取し、AID過剰発現下の胃上皮細胞における体細胞変異の全体像をゲノムアナライザーを用いて検討する。また、野生型マウスにヘリコバクター・ピロリ(HP)菌を経口感染させると、胃上皮細胞に内在性AIDが発現誘導され、遺伝子変異生成の有無をゲノムアナライザーを用いて網羅的に検討したところ、癌関連遺伝子に変異を認めた。一方、AIDノックアウト(KO)マウスにHP菌を感染させても遺伝子変異を認めなかった。2)AID過剰発現下の胃上皮細胞における遺伝子DNAコピー数の変化および染色体異常(転座、欠失など)の有無につき、CGHアレイ法による解析を行ったところ、癌関連遺伝子に欠失を認めた。引き続き、CGHアレイ法により同定された染色体欠失想定部位に対し、Fluorescent in situ hybridization (FISH)法を施行したところ、染色体欠失が生じたことが確認された。また、野生型マウスにHP菌を感染させることにより、胃上皮細胞に内在性AIDが発現誘導され、癌関連遺伝子DNAコピー数の減少を認めた。一方、AID KOマウスにHP株を感染させても癌関連遺伝子DNAコピー数の減少を認めなかった。1),2)の結果から、胃上皮におけるAID異常発現により、遺伝子異常生成がAID依存性に引き起こされることが示唆された。
糖尿病心におけるレニンーアンジオテンシン系の細胞内直接作用についての研究

正常及び糖尿病(DM)ラットの灌流心における虚血障害および虚血領域の非分泌型レニン、プロレニン受容体の発現とミトコンドリア機能を検討した。結果、糖尿病心において非分泌型レニンが、虚血中にミトコンドリア内に発現し、膜電位の脱分極の予防により、虚血障害への耐性に関与することが明らかになった。さらに、冠動脈疾患を有する糖尿病症例における直接的レニン阻害薬の脂質代謝とサイトカインへの効果を検討した。血漿レニン活性と血圧は低下したが、脂質とサイトカインに変化はなく、糖尿病症例におけるレニン阻害薬の上乗せ効果は否定された。正常ラットの灌流心における直接的レニン阻害薬の虚血/再灌流障害に対する保護効果の検討5-8週齢のSDラットより心臓を摘出し、Langendorff装置に装着して、酸素化されたKrebs液で灌流する。電極にて250小分で電気刺激し、圧トランスデューサを用いて左室発生圧と左室拡張終期圧を、血流計を用いて冠血流量を測定する。虚血/再灌流は、摘出心の灌流を30分間完全に停止し(全虚血)、その後再開して40分間観察する(再灌流)。Langendorff灌流した正常心に、aliskiren、candesartan,spironolactoneを灌流して直接効果を調べる。また、虚血/再灌流を行い、左室圧および高エネルギーリン酸化合物の回復に及ぼすaliskiren、candesartan,eplerenoneの効果を検討する。現在、虚血/再灌流前後の心筋において、細胞質、ミトコンドリア分画ともに、レニンの発現をWestern blotにて確認している。今後、上記薬剤の虚血/再灌流障害に対する保護効果を検討する予定である。冠動脈病変を有する糖尿病症例における直接的レニン阻害薬の動脈硬化進展抑制効果外来通院中の安定した糖尿病を有する冠動脈疾患症例をレニン阻害薬のaliskiren投与群と非投与群に無作為に分ける。Aliskirenは、150mg錠1錠を1日1回経口で内服する。その他の治療薬は継続投与とする。評価項目は、A.血圧、脈拍数、B.脂質(過酸化脂質)、サイトカイン:LDL-c,HDL-c,TG,Apo蛋白,Lp(a),MDA-LDLコレステロール値,adiponectin,leptin,IL-6など。C.心血管合併症:死亡、狭心症小心不全による入院、PCI/CABGの有無である。現在約50名が試験にエントリーされて、外来経過観察中である。正常及び糖尿病ラットの灌流心における虚血障害と虚血領域のレニン、プロレニン受容体量の検討冠動脈病変を有する糖尿病症例における直接的renin阻害薬の脂質代謝およびサイトカインへの効果【方法】外来通院中の安定した糖尿病を有する冠動脈疾患症例30例を対象とする。患者は全てangiotensin II受容体拮抗薬(ARB)を服用しておりrenin阻害薬のaliskiren(150mg/日)の血圧、脂質、サイトカインに対する上乗せ効果を検討する。【結果】血漿renin活性は低下し、収縮期、拡張期血圧がともに有意に低下したが、心拍数は変化しなかった。LDL-c,HDL-c,TG,MDA-LDLコレステロール,Apo蛋白など脂質に変化になかった。また、adiponectine, hsCRP, MCP-1, p-selectinなどサイトカインにも変化はなかった。今後は、症例を増加し、ARBからaliskirenへの変更による効果も検討する。正常及び糖尿病ラットの灌流心における虚血障害と虚血領域のレニン、プロレニン受容体量、細胞内ミトコンドリア機能の検討【方法】Wistar rat (非DM)及びGoto-Kakizaki rat (DM)より心臓を摘出し、Langendorff装置に装着して灌流する。250/分で電気刺激し左室発生圧と左室拡張終期圧を測定する。虚血は、摘出心の前下行枝の灌流を90分間完全に停止させて作成する。組織中のrenin、angiotensin II(ATII)、prorenin、prorenin受容体は、免疫染色、Western blottingにて測定する。また、レニンを灌流した心筋の単離細胞と単離ミトコンドリアでミトコンドリア膜電位を測定する。【結果】虚血後の左室発生圧の低下と拡張終期圧の上昇は、DM群において非DM群より軽度であった。また、梗塞範囲もDM群で小さかった。Aliskirenは、DM群において心機能を低下させ、梗塞サイズを増大させた。一方、valsartanはこれらに影響しなかった。DM群では、Western blottingと免疫染色の両方の評価で、虚血領域のrenin発現が増加していた。また、ATIIの発現も軽度増加していた。非DM群ではこれらの増加はなかった。

Prorenin受容体の発現は両群で差はなかった。電子顕微鏡の検討では、reninの発現は、単離心筋細胞内に認められ、特にミトコンドリアに優位に存在した。スキンド細胞と単離ミトコンドリアをreninへ暴露すると、ミトコンドリア膜電位は脱分極し、この効果はaliskirenで消失した。【結論】糖尿病心においては、虚血中、心筋のミトコンドリアに優位に存在する非分泌性のreninが増加する。このreninは、ミトコンドリアの膜電位の脱分極を予防することにより、虚血障害への耐性に関与する。基礎研究において、Langendorff灌流装置を用いた研究で心機能評価は行えている。また、免疫染色、western blottingによる評価も行えている。臨床研究では、血圧、心拍数の変化、脂質、サイトカインの変化につき評価を終えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。基礎研究では、虚血/再灌流モデルで同様の実験を行うこと、renin阻害薬の効果を試みることが必要で、現在の実験装置でさらなる検討を進めていく。臨床研究では、aliskirenのARBからの切り替えの効果の検討、および心、血管事故の有無など予後調査を進めていく。
皮膚悪性リンパ腫の診断と治療のための研究、特に腫瘍免疫との関連における解析

前回までの研究にて菌状息肉症が末梢T細胞性リンパ腫であり、その腫瘍細胞はヘルパ-T細胞の中の、マウスにおけるTh2細胞、あるいは人でのSanderらの言う"いわゆるmemory T cell"に相当する細胞であることを示してきた。本年度は、更にこの腫瘍細胞が細胞間接着因子として、LFAー1、CD29、VLA4αなどを発現し、リンパ節のホ-ミングレセプタ-と考えられているLeu8や、ICAM1を発現しないことを、免疫組織化学的に示した。このことは、一般的には菌状息肉症がその末期に至るまで皮膚病変が主体であり、内臓には腫瘤等の病変が少ないことを説明するのに不都合な所見ではなかった。また炎症性皮膚疾患において、浸潤細胞のこれら細胞接着因子(LFAー1、CD29、VLAα、ICAM1等)発現はすべての細胞に渡ることなく、浸潤細胞は様々な表面形質持った細胞よりなりたっていた。菌状息肉症細胞における細胞間接着因子の発現様式は、菌状息肉症細胞の皮膚親和性を示すものと考えられた。次に、菌状息肉症浸潤細胞の癌遺伝子産物cーmyc蛋白の発現、DNA polymeraseーα、Kiー67、CD71などの発現を免疫組織化学にて検討したところ、これら抗原の発現が菌状息肉症の病期、CTCLの病期分類ではなく、International Working Formulation(IWF)における悪性リンパ腫の組織分類に、より相関していることが明かとなった。また、末梢血液リンパ球サブセット・各種抗原やマイトジェンに対する反応性と予後の関係を検討したところ、CD3、CD4陽性細胞が正常に保たれているほど予後が良いことが明かとなり、免疫機構の保持、IWF分類が菌状息肉症を考える上でも重要であった。即ち、菌状息肉症を含む皮膚悪性リンパ腫を考えるに当り、菌状息肉症では皮膚に親和性が強いという特徴はあるが、予後・悪性度を考える限りは、他の悪性リンパ腫と際だって異なる性状を示すものではなく、化学療法の効果が悪い点は、腫瘍細胞の性状というよりも、化学療法剤の皮膚への移行などの因子を考えるべきと思われた。(1)マウスB細胞株ORAに対する抗腫瘍活性発現機序の検討を、BALB/Cマウスを用いて行なった。ORAを8-MOPとUVA照射処置を行ない、BALB/Cマウス背部に皮下注射し、1ケ月後に無処置ORAを背部に皮下注射してその腫瘤の発育を経時的に検討した。8-MOP+UVA処置ORAの前感作を行なったマウスでは、皮下注射により接種したORAの脱落が著明であった。そこで、このBALB/Cマウスの抗ORA抗腫瘍活性について、in vitroの系で検討中である。また、in vivoの系においても、この抗腫瘍活性を阻害する因子についても検討してゆく予定である。(2)皮膚、リンパ節、末梢血液より得られたリンパ球よりDNAを取り出し、サザンブロット法によりT細胞受容体の単クローン性再構成について検討した。菌状息肉症腫瘤期、扁平浸潤期の皮膚、リンパ節では、再構成が認められたが、紅斑期では現在まで再構成が認められていないが、検討中である。ATLでは、皮膚、末梢血液ともに再構成バンドが認められた。菌状息肉症末梢血については、ILー2とともに培養し、その培養細胞についても検討する予定である。

(3)菌状息肉症患者末梢血液リンパ球の腫瘍性T細胞株に対するキラー活性、NK活性、LAK活性を検討した。患者リンパ球を1週間、IL-2とともに、培養することにより、明らかにキラー活性の増強が認められた。しかし、腫瘍性T細胞株であるHUT78、HUT102に対するキラー活性は明確でなかった。また、患者末梢血リンパ球の培養株に対するMLTRにおいても、HUT78、HUT102に対する反応は低かった。(4)菌状息肉症をはじめとするCTCLはヘルパーT細胞性リンパ腫であるが、同じヘルパーT細胞リンパ腫であるATLとの間に表面膜形質に差異があるかの検討を行なった。CDu29、CD45R、CD7、CD25など発現に特異のある抗原が多数認められた。反応性疾患についても検討中。マウスの免疫系の研究よりマウスでは、末梢helperT細胞は少なくとも2つの亜群よりなることが知られている。IL-2反応性であり、IL-2,IFN-γなどの産生に関わるT_<h1>、IL-4反応性であり、IL-4、IL-5などを産生し、IgE抗体産生、遅延型過敏反応をおこすT_<h2>である。人に於いても、マウスと同様の亜群が存在すると考えられており、Sander等はこれをnaiveT細胞、memoryT細胞とし、同系列の異なる分化段階にある末梢helperT細胞であると提唱した。皮膚は、直接外的環境と接する場の1つであり、そこにはLuger TA等が示すように、角化細胞、Th-1陽性樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞等の表皮内細胞、真皮内諸細胞を交えた繊細な免疫ネットワ-クが形成されている。皮膚T細胞性リンパ腫においては長期間に渡り皮膚を主たる病変部位としている。このような性質も、皮膚免疫機構と大きく関わりをもっており、腫瘍細胞が正常細胞の機能を表現しているほど、この皮膚免疫機構からの制約を受けていると考えられる。そこで、このT細胞のT細胞分化過程での位置付けについて、免疫組織化学、DNA解析等により検討してきた。すなわち、homing receptor、分化抗原、機能性抗原などの膜表面形質についての免疫組織化学、臨床症状、臨床検査成績(皮膚向性、組織及び末梢血液好酸球、組織形質細胞増多)より、皮膚T細胞性リンパ腫のほとんどを占める菌状息肉症では、その腫瘍細胞はマウスのT_<h2>、人のmemoryT細胞の性質を示した。そこで、次にT_<h2>の阻害因子であるIFN-γの腫瘍細胞に対する増殖抑制効果について検討した。皮膚T細胞性リンパ腫患者より得られた、皮膚浸潤細胞をin vitroにて組織培養し、その増殖に対するIFN-γの増殖抑制効果についての検討を行った。その結果、組織中に好酸球、形質細胞の浸潤が著名に認められる症例では強い抑制効果が認められた。すなわち、T_<h2>の機能が強く認められた症例では抑制効果も顕著であった。前回までの研究にて菌状息肉症が末梢T細胞性リンパ腫であり、その腫瘍細胞はヘルパ-T細胞の中の、マウスにおけるTh2細胞、あるいは人でのSanderらの言う“いわゆるmemory T cell"に相当する細胞であることを示してきた。本年度は、更にこの腫瘍細胞が細胞間接着因子として、LFAー1、CD29、VLA4αなどを発現し、リンパ節のホ-ミングレセプタ-と考えられているLeu8や、ICAM1を発現しないことを、免疫組織化学的に示した。
膜型増殖因子のER/核膜オートトランスロケーション分子機構解明とがん特性診断応用

膜型細胞増殖因子proHB-EGFやproAREGは,正常細胞では細胞膜に局在するが、悪性度の高いがん細胞には、直接ER/核膜に移行する(これをオートトランスロケーションと呼ぶ)例があり、有意な抗がん剤抵抗性を示す。本研究では、proAREGのER/核膜オートトランスロケーションと抗がん剤抵抗性獲得をin vivo解析により、実証した。また、その分子機構の一端として、C-末端ペプチドの切断を提唱し、責任プロテアーゼの探索を行った。本研究は、抗がん剤感受性診断法開発に向けて、有用性とその意義を示した。Heparin-binding EGF-like growthfactor(HB-EGF)やamphiregulin(AREG)は,正常細胞では適切な制御下において、その細胞内局在を細胞膜からER/核膜へと逆行的に変える。一方,悪性度の高い培養がん細胞株で、新規合成されたHB-EGFやAREGが細胞膜に運ばれず、直接ER/核膜に移行する(これをオートトランスロケーションと呼ぶ)例があり、こうした例においては、有意な抗がん剤抵抗性を示すことをこれまでに明らかにしてきた。以上の私どもの研究成果に基づき、本研究では、膜型増殖因子HB-EGFとAREGのER/核膜オートトランスロケーション分子機構の解明と、HB-EGF/AREG発現ヒトがんの抗がん剤感受性診断法の開発・応用を目的とする。本年度、コムギ胚芽インビトロ蛋白質合成システムとリポソームを組み合わせて作製したインビトロ膜蛋白質再構成システムを用いて、ヒトゲノム情報より抽出した約500種の膜型プロテアーゼリコンビナント蛋白質の作製を試みた。その結果、約300種の合成をSDS-PAGEにより確認した。残り約200種については、用いたcDNAの塩基配列を確認しており、さらに合成を進めているところである。合成を確認した約300種の膜型プロテアーゼについては、基質にα2-マクログロブリンを基質として、酵素活性を確認しているところである。活性を確認次第、これを用いて、FITC蛍光標識HB-EGFおよびAREGのC-末端合成ペプチド(それぞれ24、30残基)を基質とし、キャピラリー電気泳動法と蛍光検出器を組み合わせた測定装置(キャリパー)により、分離・定量することで、C-末端切断プロテアーゼの探索・同定をすすめる。Heparin-binding EGF-like growthfactor (HB-EGF)やamphiregulin (AREG)は,正常細胞では適切な制御下において、その細胞内局在を細胞膜からER/核膜へと逆行的に変える。一方,悪性度の高い培養がん細胞株で、新規合成されたHB-EGFやAREGが細胞膜に運ばれず、直接ER/核膜に移行する(これをオートトランスロケーションと呼ぶ)例があり、こうした例においては、有意な抗がん剤抵抗性を示すことを、培養細胞系を用いてこれまでに明らかにしてきた。以上の私どもの研究成果に基づき、本研究では、膜型増殖因子HB-EGFとAREGのER/核膜オートトランスロケーションのin vivo解析、その分子機構の解明、ならびに、HB-EGFやAREG発現ヒトがんの抗がん剤感受性診断法の開発・応用を目的とした。本年度は、昨年度にコムギ胚芽インビトロ膜蛋白質再構成システムを用いて作成した、約100種の膜型プロテアーゼリコンビナント蛋白質のHB-EGFおよびAREGのC-末端ドメイン切断活性を、質量分析系を用いて測定するマルチプルリアクションモニタリング(MRM)システムを構築し、このシステムを用いて活性測定を開始した。また、本年度は、膜型増殖因AREGのER/核膜オートトランスロケーションのin vivo解析を、腫瘍移植マウスモデル、および、ヒト胃がん手術後のがん組織免疫染色により行った。その結果、膜型増殖因AREGのER/核膜オートトランスロケーション誘導を施した腫瘍移植マウスモデルにおいて、統計的有為差をもって、化学療法薬剤に対して抵抗性を示した。また、ヒト胃がん手術後のがん組織切片を、AREGの細胞内ドメインに対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、AREG陽性検体とAREG陰性検体との間に、化学療法薬剤感受性の統計的有為差は見出せなかったが、生存日数に統計的有為差が認められた。以上の事から、本研究のヒトがんの抗がん剤感受性診断法開発に向けての有用性と意義が、強く示唆された。