hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
技術知識の普及-専有のマネジメントの研究:知識ネットワークによる構造的アプローチ

そのなかで統計的な妥当性の確認も進めつつ、主として以下の点を明らかにした。(1)移動体通信分野を中心に、高い知識の密度を保持している企業の必須特許が、他企業の独自特許からの引用を集め、技術のスピルオーバーに結びついていることを明らかにした。この結果とともに文献と主要企業へのインタビュー成果を検討し、企業は、自社の事業を超えるシステム開発を通じて実装に不可欠な知識や技術を蓄積することで、他企業からの引用を集める効果的なイノベーションを生み出し、産業や技術をコントロールできる可能性があることを示した。また、(2)必須特許の引用の検討を通じて、主要企業が、当初は先進的な企業の必須特許の引用によって新たな技術を獲得して知識を構築し、その後に自社の必須特許を自己引用することで、知識を強化してきたことを示し、経験に応じて知識の獲得や強化のモードが異なってくることを明らかにした。以上の成果は、標準化により技術情報が公開されスピルオーバーしている状況であっても、企業は、知識を自己強化することによって知識の専有性を高めつつ、そうした知識にもとづくイノベーションを通じて、産業や技術をコントロールできることを示唆している。平成29年度には、さらに、(3)車載制御に関わる通信と関連技術についての特許データを検討し、複数の技術分野間にわたる技術のネットワークにおいて、中心的なポジションを築いている企業が存在すること、またそうした企業は産業や技術の発達とともに、自社の既存知識にもとづきながら、関連する新たな技術を獲得することで、知識を構築していることも、暫定的に確認した。本課題は、国際標準化により企業間で技術の移転・共有が進むなかで、いかに企業が独自の専有性の高い知識を構築し、優位を築くことができるのかを検討した。標準の技術規格書や、それに関連して企業の権利を守るはずの標準必須特許は、公開され広く活用される。だが、複数の技術を統合して実装やイノベーションに結びつけるシステム知識は、そうではない。システム知識は、企業別に規格書と必須特許との関係からなる知識のネットワークとしてとらえられる。この観点から、本課題では、多くの引用を集めて技術の実装や進歩に影響を与えている企業は、自社技術を公開しながらも、独自のシステム知識を自己強化的に構築していることを明らかにした。今後は、先行研究やデータの整理、調査によるデータの確認・追加収集、データベースの分析をさらに進め、それらの成果にもとづき、国際標準化による技術の普及下での、企業における知識の普及-専有の効果的なマネジメントの戦略を提示することを試みる。より具体的には、データ分析を試行しながら、より的を絞った文献レビューを行い、理論的な枠組みを検討する。こうした枠組みにもとづき、調査や分析の精緻化を図り、とくに標準化や必須特許化がなされていない、企業独自の事業に関わる知識やその知財・標準との関係への理解を深めることで、企業固有の知識のあり方を解明することを目指す。また、成果については、学会・研究会やワーキングペーパーによる発表を進めるとともに、書籍出版や国内外の論文への投稿をより積極的に行っていく。また、国内外で投稿中の関連論文が複数存在するため、刊行を目指す。
子宮頸癌で低下する新規癌抑制分子Crystallinに対する分子標的治療の開発

子宮頸癌の癌抑制分子Crystallin(CRYAB)の機能を解析するために、CRYAB高発現細胞株を作成し、1細胞増殖能2細胞遊走能3マトリックスメタロプロテアーゼ分泌能、4細胞浸潤能、5抗癌剤のシスプラチン感受性に対する影響の検討を行ったが、いずれにおいてもCRYABの高発現状態では、有意な関連を見出せなかった。摘出子宮の病理組織検体を用いてのCRYABによる免疫組織染色では、前癌状態であるCIN1,2,3では陽性となったが、IB1期の浸潤癌では陰性となった。まとめとしては、子宮頸部扁平上皮癌の発癌過程においてCRYABの発現減弱は認めたが、その機序は明らかとならなかった。目的:我々はこれまでに子宮頸部扁平上皮癌組織において、癌で発現が減弱する蛋白としてCrystallin (CRYAB)を同定した。さらに免疫組織染色で前癌状態から癌化へ向かう過程で、CRYABの発現が低下して行くことを見出しており、これらのことから癌抑制分子である可能性を考えている。そこでまずCRYABのin vitroにおける機能解析を行うこととした。方法:子宮頸部扁平上皮細胞癌細胞株SKG-II細胞に、CRYABのcDNAを組み込んだプラスミドを導入し、高発現細胞株を作成した。機能解析として1MTTアッセイによる細胞増殖能の評価、2スクラッチアッセイによる細胞遊走能の評価、3ゼラチンザイモグラフィーによるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)分泌能の評価、4インベージョンアッセイによる細胞浸潤能の評価、5スフェロイド形成能の評価、を行った。結果:1増殖能はMock、高発現細胞3株を用いて、培養3日目、5日目のMTT吸光度を測定した結果は、上記の細胞間での増殖能の差は認めなかった。2遊走能はプレートにスクラッチでできた間隙の距離を、24時間培養後に計測し、Mock、高発現細胞3株の間で、有意な差は認めなかった。3Mock、高発現細胞3株の培養3日目の培養上清を回収し、ゼラチンザイモグラフィーに供し、proMMP-2、MMP-2の発現量を比較したが、特に差異を認めなかった。4浸潤能はMock、高発現細胞3株を用いて、マトリゲルコーティングのチャンバーを通過した細胞の割合を24時間後に計測したが、各細胞間で有意な差は認めなかった。5スフェロイド形成能はスフェロイド形成用の培地で3日間培養した後に、形成率=スフェロイド数/全細胞数として計算した。高発現細胞3株はいずれもMockと比して有意にスフェロイド形成能が低下していた。実験手技はこれまでの経験から既に確立しているが、結果が予想に反したものが出ている。我々の仮説ではCRYABは癌抑制分子として働いており、高発現の状態では悪性度の低下、すなわち増殖能、遊走能、浸潤能などは全て減弱することを予想していたが、結果はいずれもコントロールに比して、何も差が無いという結果である。唯一スフェロイド形成能はCRYAB高発現細胞株で低下しており、予想と合致した結果となった。我々はこれまでに子宮頸部扁平上皮癌組織において、癌で発現が減弱する蛋白としてCrystallin (CRYAB)を同定し、プレリミナリーな研究からこれが癌抑制分子である可能性を考えている。そこでまず子宮頸部扁平上皮細胞癌細胞株SKG-IIを用いて、CRYAB高発現細胞株を作成し、in vitroにおける機能解析を行った。機能解析として1.細胞増殖能、2.細胞遊走能、3.マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)分泌能、4.細胞浸潤能、5.スフェロイド形成能の評価を行った。その結果は1、2、3、4のいずれにおいても、CRYABの高発現状態は、有意な関連を見出せなかった。5に関しては、CRYABの発現は有意にスフェロイド形成能が低下させていた。以上を昨年報告した。その後のさらにin vitroの機能解析を進め、6.抗癌剤シスプラチン感受性に関する検討として、培養液中にシスプラチンを添加し、24時間、72時間、120時間後の生存細胞数をMTTアッセイにより検討した。その結果はCRYAB高発現細胞ではコントロールと比して有意な差を認めなかった。そこで新たに細胞株への遺伝子導入、安定細胞株の樹立から行い、再度in vitroの機能解析を行ってみたが、結果は初回の研究の結果と同様に、1.細胞増殖能、2.細胞遊走能、3.proMMP-2、MMP-2の発現量、4.浸潤能において、いずれもネガティブな結果であった。また、プレリミナリーな検討として、摘出子宮の病理組織検体を用いて、CRYABによる免疫組織染色を行った。前癌状態であるCIN1、CIN2、CIN3、浸潤癌である子宮頸癌1B1期のそれぞれ3例ずつを対象に行ったが、CINでは陽性となったが、浸潤癌では陰性となり、これは予想と合致したものであった。臨床検体を用いた免疫組織染色の検討では、やはり子宮頚癌で発現が減弱していることは確認できた。しかしその作用機序としてin vitroの検討では増殖、遊走、浸潤などの因子の関与は見られず、細胞株を新たに作成し直した検討でも同様の結果で、当初の予想とは反する結果となった。

我々は子宮頸部扁平上皮癌組織の網羅的なプロテオーム解析を行い、正常組織に比して癌で発現が減弱する蛋白としてCrystallin (CRYAB)を同定した。子宮頸部上皮病変におけるCRYABの発現を免疫組織染色で検討したところ、正常子宮頸部扁平上皮では、強く発現しているが、癌化に向かう過程であるCIN 1, 2の初期段階で既に発現は減弱、CIN 3で発現は完全に消失していた。この所見からこれが癌抑制分子である可能性を考えた。まず子宮頸部扁平上皮細胞癌細胞株SKG-IIを用いて、CRYAB高発現細胞株を作成し、in vitroにおける機能解析として、1細胞増殖能2細胞遊走能3マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)分泌能、4細胞浸潤能、5スフェロイド形成能の評価、6抗癌剤のシスプラチン感受性に対する影響の検討を行った。その結果は1、2、3、4、6のいずれにおいても、CRYABの高発現状態は、有意な関連を見出せなかった。5に関しては、CRYABの発現は有意にスフェロイド形成能が低下させていた。そこで新たなCRYABの高発現細胞株を作成し、再度in vitroの機能解析を行ってみたが、結果は初回の研究の結果と同様に、1細胞増殖能、2細胞遊走能、3proMMP-2、MMP-2の発現量、4浸潤能において、いずれもネガティブな結果であった。摘出子宮の病理組織検体を用いてのCRYABによる免疫組織染色を行った。前癌状態であるCIN1、CIN2、CIN3、浸潤癌である子宮頸癌1B1期のそれぞれ3例ずつを対象に行ったが、CINでは陽性となったが、浸潤癌では陰性となった。本研究の結果としては、臨床検体における免疫組織学的検討では、子宮頸部扁平上皮癌の発癌過程においてCRYABの発現減弱は認めたが、in vitroの解析では、その作用機序は明らかとならなかった。子宮頸癌の癌抑制分子Crystallin(CRYAB)の機能を解析するために、CRYAB高発現細胞株を作成し、1細胞増殖能2細胞遊走能3マトリックスメタロプロテアーゼ分泌能、4細胞浸潤能、5抗癌剤のシスプラチン感受性に対する影響の検討を行ったが、いずれにおいてもCRYABの高発現状態では、有意な関連を見出せなかった。摘出子宮の病理組織検体を用いてのCRYABによる免疫組織染色では、前癌状態であるCIN1,2,3では陽性となったが、IB1期の浸潤癌では陰性となった。まとめとしては、子宮頸部扁平上皮癌の発癌過程においてCRYABの発現減弱は認めたが、その機序は明らかとならなかった。これまでの検討でポジティブデータとして結果が得られたのは、CRYABの高発現細胞で、その形成能が低下するという結果のみである。スフェロイド形成は癌幹細胞で形成能が増強することが知られており、CRYABが癌幹細胞の性質に関わること、また発現増強によりスフェロイド形成能が低下することは、癌抑制分子としての機能を有することを示唆するものであると考える。今後は細胞株の遺伝子導入を含めて、安定細胞株の樹立から再度施行し、また発現抑制細胞株を樹立し、更なる検討に供する。癌細胞の機能解析に関する実験は再施行することとし、さらに癌幹細胞の性質に関する研究(癌幹細胞マーカーを用いた免疫染色やフローサイトメトリー)を検討したい。これまでの検討で組織検体を用いた免疫染色の検討では、発現減弱という予想通りの結果が得られ、CRYABの機能が注目される所である。
アロマテラピーへの活用を目指したユズ種子オイルの機能性評価

申請者らは、ユズ種子オイルのキャリアオイルへの活用を目的として、理化学的特徴や皮膚への安全性、およびヒト皮膚の保湿効果等を明らかにしてきた。本研究では、ユズ種子オイルのさらなる安全性、付加価値を明らかにすることを目的として研究を行った。まず、フロクマリン類の新規分析法を確立し、ユズ種子オイルに光毒性をもつフロクマリン類が存在しないことを明らかにした。次に、ユズ種子オイルがメラニン生成酵素であるチロシナーゼを阻害すること、また、マウスB16メラノーマ細胞のメラニン生成を阻害することを明らかにした。以上、本研究は、ユズ種子オイルの安全性と新しい機能的存在を明らかにした。申請者らは、未利用資源であるユズ種子からオイルを調製し、このユズ種子オイルのキャリアオイル(マッサージトリートメントオイル)への活用を目的として、理化学的特徴や皮膚への安全性、およびヒト皮膚の保湿効果等を明らかにしてきた。本研究では、ユズ種子オイルのさらなる優位性、付加価値を明らかにすることを目的として、研究を行った。ユズ種子オイルから、我々が開発した新規DMSO抽出法を用いて、DMSO可溶性抽出液を調製し、各種試験に供試した。まず、メラニン生成酵素であるチロシナーゼの活性を濃度依存的に阻害すること、また、細胞レベルの検証実験として、マウスB16メラノーマ細胞のメラニン生成量を阻害することを明らかにした。このことから、ユズ種子オイルがメラニン生成を抑制することが期待された。さらには、予備試験において、グラム陽性菌に対して、増殖抑制効果を示すことを明らかにした。これまでユズ種子オイルに関する機能性研究はほとんどされていない。次年度実施する抗菌性や抗酸化性等の機能性に関する情報を補完することにより、ユズ種子オイルのキャリアオイルとしての可能性、ひいては優位性や付加価値を見出すことができると考えられる。まず、メラニン生成酵素であるチロシナーゼの活性を濃度依存的に阻害すること、また、細胞レベルの検証実験として、マウスB16メラノーマ細胞のメラニン生成を阻害することを明らかにした。また、ユズ種子オイルはグラム陽性細菌の増殖を抑制することが明らかとなった。このことから、ユズ種子オイルの抗菌作用が期待された。一方で、ユズ種子オイルの抗酸化活性(スーパーオキシドアニオンおよびDPPHラジカル消去活性)やヒト新生児包皮繊維芽細胞を用いた細胞増殖試験を行ったところ、試験条件下では抗酸化活性や繊維芽細胞増殖促進作用はみられなかった。これまでユズ種子オイルに関する機能性研究はほとんどされていなかった。今回の研究により、ユズ種子オイルがもついくつかの機能性を解明することができた。今後さらなる解析により、ユズ種子オイルのキャリアオイルとしての可能性、ひいては優位性や付加価値を見出すことができると考えられる。当初の研究計画通り、ユズ種子オイルからの試料調製、チロシナーゼ阻害試験、メラニン生成に関するマウス細胞実験を実施した。さらに、その他の機能性(抗菌性など)に関する予備試験も終えている。以上のように、研究予定通り進捗していることから、「おおむね順調に進展している」と判断した。食品科学次年度は当初の研究計画通り、ユズ種子オイルの機能性のスクリーニングを行う。具体的な測定予定項目を以下に示す。1.抗菌活性試験2.抗酸化試験3.コラーゲン分解酵素阻害試験4.繊維芽細胞の増殖促進とコラーゲン産生試験
北部北太平洋に生息する海鳥類の栄養生態学的解明

1)研究の経緯と方法:1970年代半ば以降、船舶の石油海上流出事故が日本沿岸・沖合域で多発するながで、事故に巻き込まれる海鳥の大量死が発生している。本研究では1986年島根沖の重油流出事故で大量死したウトウCerorhinca monocerataの胃・腸内容物のガスクロ分析実験を行い、その結果、彼らの死因が従来新聞等で報道されているように石油の取り込みによる中毒死ではないことが判明した。そのため、過去に他種の海鳥の栄養生態学的解析を行った経験(Oka&Maruyama 1985,岡1986,Oka 1989)に基づいて、ウトウの栄養蓄積と消耗過程を分析し、彼らの死因を明かにし、種としての栄養生態学的特質を解明した。剖検と実験に供したウトウは、島根県沖石油流出事故による石油汚染死鳥、関東沿岸斃死鳥、北海道他羅網死鳥と北海道産雛である。主な分析部位及び項目は次のとうりである:体重と体乾重率・脂質含有率、脚・胸筋重量と乾重率・脂質含有率、皮下、腹腔内脂肪、腕骨・脚骨骨髄内脂質含有率、肝臓重量と脂質含有率、尾腺重量と脂質含有率。脂質抽出はエタノ-ル・ベンゼン(1:1)溶媒を用い、ソクスレ-法で行った。2)得られた知見:石油汚染死個体は、すべての部位・項目で、いずれも極度な貧栄養状態にあり、関東沿岸での非人為衰弱死個体と同値であった。一方、漁網溺死個体では、各値は概ね高かったが、骨重量と筋肉重量の体全体に占める割合がとりわけ大きく、体脂質蓄積率・絶対量は低値にあった。これらの値が油汚染死鳥のみならず健康鳥でも低水準だったのは、本種が、1)潜水飛翔時の水圧に抵抗するためと、重い翼荷重のため空中飛翔時に強大な飛翔筋肉が必要とされ、筋肉重量が全体として増大し、その結果、他生活型の同体重海鳥(岡1986)より脂質蓄積の相対量と絶対量を下げる、2)大型な胸骨による腹腔(脂質主要蓄積部位)容積規制、3)長距離渡りをしない、4)潜水能力が優れ、餌の追跡・捕獲が容易、という生活特質をもつことが理由に挙げられる。そのため彼らは、通常、脂質蓄積を抑制した栄養状態で生活していると考えられ、これらの要因が、ウトウの栄養生態を規定し、昨今多発する石油流出事故で油汚染されると、短期間のうちに貧栄養による衰弱死に至るものと結論付けられる。また本種の雛でも、他生活型海鳥類の雛(岡1986)のそれに比較し脂質蓄積量が著しく少なかった。この傾向は、若齢期のみならず、巣立ち期にも顕著にみられた。巣立ち時の本部位は、〓蹠骨長を除いた全ての値で、成鳥比の1570%減と小さかった。雛の脂質蓄積量が少ないのは、親鳥の給餌物が低脂質性であること、また、体部位が成鳥と比べ概ね小さかったのは、彼らの潜水索餌力が優れているか、巣立ち後も親鳥の養育投資が継続されるかのどちらかであることによる、と考えられる。1.研究の経緯と方法:1970年代半ば以降、船舶の石油海上流出事故が日本沿岸・沖合域で多発するなかで、事故に巻き込まれる海鳥の大量死が発生している。本研究では1986年島根沖の重油流失事故で大量死したウトウの胃・腸内容物のガスクロ分析実験を行い、その結果、彼らの死因が従来新聞等で報道されているように石油の取り込みによる中毒死ではないことが判明した。そのため。、過去に他種の海鳥の栄養生態学的解析を行った経験に基づいて、ウトウの栄養蓄積と消耗過程を分析し、彼らの死因を明かし、種としての栄養生態学的特質を解明した。剖検と実験に供したウトウは、島根県沖石油流出事故による石油汚染死鳥、関東沿岸斃死鳥、北海道他羅網死鳥である。主な分析部位及び項目は次のとうりである:体重と体乾重率・脂質含有率、脚・胸筋重量と乾重率・脂質含有率、皮下、腹くう内脂肪、腕骨・脚骨骨髄内脂質含有率、肝臓重量と脂質含有率、尾腺重量と脂質含有率。2.得られた知見:石油汚染死個体は、すべての部位・項目で、いずれも極度な貧栄養状態にあり、関東沿岸での非人為衰弱死個体と同値であった。一方、漁網溺死個体では、各値は概ね高かった。しかし溺死個体でも、骨重量と筋肉重量の体全体に占める割合が高く、その一方で、体脂質蓄積率・絶対量が低値にあった。鳥類の体脂質の主要積部位は皮下と腹くうであるが、これらの値が健康鳥であった溺死個体でも低水準だったのは、1)潜水飛翔時の水圧に抵抗するためと、重い翼荷重のため空中飛翔時に強大な筋肉が必要とされ、筋肉重量が全体として増大し、その結果他生活型の同体重海鳥より脂質蓄積の相対量と絶対量を下げる、2)大型な胸骨による腹くう容積規制、3)長距離渡りをしない、3)潜水能力が優れ、餌の追跡・捕獲が容易、であることが挙げられる。そのため脂質蓄積を抑えた栄養状態で通常生活していると考えられ、この要因がウトウの栄養生態を規定し、昨今多発する石油流出事故で油汚染されると、短期間のうちに貧栄養による衰弱死に至ることが結論付けられた。

1)研究の経緯と方法:1970年代半ば以降、船舶の石油海上流出事故が日本沿岸・沖合域で多発するながで、事故に巻き込まれる海鳥の大量死が発生している。本研究では1986年島根沖の重油流出事故で大量死したウトウCerorhinca monocerataの胃・腸内容物のガスクロ分析実験を行い、その結果、彼らの死因が従来新聞等で報道されているように石油の取り込みによる中毒死ではないことが判明した。そのため、過去に他種の海鳥の栄養生態学的解析を行った経験(Oka&Maruyama 1985,岡1986,Oka 1989)に基づいて、ウトウの栄養蓄積と消耗過程を分析し、彼らの死因を明かにし、種としての栄養生態学的特質を解明した。剖検と実験に供したウトウは、島根県沖石油流出事故による石油汚染死鳥、関東沿岸斃死鳥、北海道他羅網死鳥と北海道産雛である。主な分析部位及び項目は次のとうりである:体重と体乾重率・脂質含有率、脚・胸筋重量と乾重率・脂質含有率、皮下、腹腔内脂肪、腕骨・脚骨骨髄内脂質含有率、肝臓重量と脂質含有率、尾腺重量と脂質含有率。脂質抽出はエタノ-ル・ベンゼン(1:1)溶媒を用い、ソクスレ-法で行った。2)得られた知見:石油汚染死個体は、すべての部位・項目で、いずれも極度な貧栄養状態にあり、関東沿岸での非人為衰弱死個体と同値であった。一方、漁網溺死個体では、各値は概ね高かったが、骨重量と筋肉重量の体全体に占める割合がとりわけ大きく、体脂質蓄積率・絶対量は低値にあった。これらの値が油汚染死鳥のみならず健康鳥でも低水準だったのは、本種が、1)潜水飛翔時の水圧に抵抗するためと、重い翼荷重のため空中飛翔時に強大な飛翔筋肉が必要とされ、筋肉重量が全体として増大し、その結果、他生活型の同体重海鳥(岡1986)より脂質蓄積の相対量と絶対量を下げる、2)大型な胸骨による腹腔(脂質主要蓄積部位)容積規制、3)長距離渡りをしない、4)潜水能力が優れ、餌の追跡・捕獲が容易、という生活特質をもつことが理由に挙げられる。そのため彼らは、通常、脂質蓄積を抑制した栄養状態で生活していると考えられ、これらの要因が、ウトウの栄養生態を規定し、昨今多発する石油流出事故で油汚染されると、短期間のうちに貧栄養による衰弱死に至るものと結論付けられる。また本種の雛でも、他生活型海鳥類の雛(岡1986)のそれに比較し脂質蓄積量が著しく少なかった。この傾向は、若齢期のみならず、巣立ち期にも顕著にみられた。巣立ち時の本部位は、〓蹠骨長を除いた全ての値で、成鳥比の1570%減と小さかった。雛の脂質蓄積量が少ないのは、親鳥の給餌物が低脂質性であること、また、体部位が成鳥と比べ概ね小さかったのは、彼らの潜水索餌力が優れているか、巣立ち後も親鳥の養育投資が継続されるかのどちらかであることによる、と考えられる。1)研究目的:潜水適応型鳥類雛の多くは在巣日数が比較的短期であることが知られている(Johnsgard 1987)が、彼らの在巣期の成長過程は、外部形態の伸長を除き不明な点が多い。在巣期の雛の栄養蓄積は、特に筋肉量、脂質蓄積量の多少により、雛の巣立ち後の生残、生活様式に一定の制限を与えると考えられる。本研究ではウトウの雛の成長を分析し、潜水適応種雛の成長の特質を明らかにした。2)供試材・方法:北海道沿岸島嶼産のウトウ雛計19羽を、Watanuki(1987)の簡便的日齢査定資料から5日齢毎の区分し、孵化から巣立ちまでの外部形態と、そのうち9羽はさらに体内栄養蓄積部位の成長による変化を分析した。外部形態の測定部位は嘴蜂長、〓蹠骨長、翼・尾長、体重、体内測定部位は胸筋(大胸筋・小胸筋)生重・脂質含率、大腿骨及び脛骨筋生重・脂質含率、肝臓生重・脂質含率、体脂質含率、胃内容物、尾腺生重である。脂質抽出には、ホモゲナイズした各25gの生試料をエタノ-ル・ベンゼン(1:1)溶媒で、ソクスレ-抽出器を用い15時間還流し測定した。
ナトリウム利尿ペプチド受容体優性阻害型アイソフォームの病態生理的意義の検討

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)は、膜型グアニル酸シクラーゼ(GC)-Bを受容体として、動脈硬化病変の抑制や内軟骨骨化の促進に関与することが知られている。我々は既に、マウスにおいて単一のGC-B遺伝子から、選択的スプライシングによりGC-B1、GC-B2(CNP結合によるGC活性化に重要な第9エクソン部分を欠失)、GC-B3(細胞外ドメインのみ)の3つのアイソフォームが生じ、GC-B2とGC-B3が優性阻害型アイソフォームとして働くことを明らかにしていた。本研究では、マウス成長板軟骨にはGC-B1のみが発現していることが明らかになり、我々が作製したCNPあるいはGC-Bのノックアウトマウスの主たる表現型が、GC-B発現レベルが必ずしも高くない成長板軟骨での内軟骨骨化の障害による、脊椎と四肢骨の伸長障害であった理由と考えられた。次に、ヒト心室から抽出したRNAを用いた逆転写PCR法にて、ヒトにおいてもGC-B2が発現していることを確認し、フレームの一致した終止コドンを有する第8イントロンが転写され、GC-B3様であるが膜貫通部位の直後で終止する、新たなGC-Bアイソフォームの存在が示唆された。ヒト遠位中間肢異形成症Maroteaux型の原因となるGC-B変異の1つにQ500X変異が報告されているが、今回存在が示唆されたアイソフォームはこの変異体と同様なGC-B分子を生じるため、今後、このアイソフォームの機能を検討する予定である。一方、GC-B2特異的な配列の10アミノ酸からなるペプチドを抗原として用い、家兎を免疫して抗血清を調整したが、マウス組織抽出物を用いたウェスタンブロット解析では、GC-B2を検出することはできなかった。より特異性の高い、抗GC-B2あるいは抗GC-B3抗体の調整が必要と考えられた。C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)は、血管内皮や軟骨細胞から分泌され、血管平滑筋細胞や軟骨細胞に発現する、膜型グアニル酸シクラーゼ(GC)であるGC-Bを受容体として、動脈硬化病変の抑制や内軟骨骨化の促進に関与することが知られている。我々は既に、マウスにおいて単一のGC-B遺伝子から、選択的スプライシングによりGC-B1、GC-B2(CNP結合によるGC活性化に重要な第9エクソン部分を欠失)、GC-B3(細胞外ドメインのみ)の3つのアイソフォームが生じ、GC-B1がCNPの結合により細胞内cGNP濃度を上昇させるのに対して、GC-B2とGC-B3が優性阻害型アイソフォームとして働くことを明らかにしていた。本年度、各アイソフォームを個別に検出する逆転写PCR法を用いた検討にて、マウスにおいてGC-Bの3つのアイソフォームの遺伝子発現は、ほぼすべての臓器で認められるが、成長板軟骨にはGC-B1のみが発現していることが明らかとなった。この所見は、我々が作製したCNPあるいはGC-Bのノックアウトマウスの主たる表現型が、成長板軟骨でのGC-B発現レベルが必ずしも高くないにも関わらず、成長板軟骨での内軟骨骨化の障害による、脊椎と四肢骨の伸長障害であったことの1つの説明となる。次に、ヒト心室から抽出したRNAを用いた逆転写PCR法にて、ヒトにおいてもGC-B2が発現していることを確認した。また、GC-B各アイソフォームの培養細胞あるいは組織における発現を蛋白レベルで検討することを目的として、まず、GC-B2特異的な配列の10アミノ酸からなるペプチドを抗原として用い、家兎を免疫して抗血清を調整した。GC-B1、GC-B2、GC-B3を発現させたNIH-3T3細胞を用いた検討にて、今回調整した抗血清がGC-B2を特異的に認識することが確認された。

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)は、血管内皮や軟骨細胞から分泌され、血管平滑筋細胞や軟骨細胞に発現する、膜型グアニル酸シクラーゼ(GC)であるGC-Bを受容体として、動脈硬化病変の抑制や内軟骨骨化の促進に関与することが知られている。昨年度、ヒト心室から抽出したRNAから合成したcDNAを鋳型とし、第811エクソンを増幅するプライマーを用いたPCRにて、ヒトにおいても第9エクソンを欠くGC-B2が発現していることを確認した。同じPCRでGC-B1よりも0.6kb長いバンドが認められていたため、サブクローニングして塩基配列を検討したところ、フレームの一致した終止コドンを有する第8イントロンが転写されていて、細胞外領域のみから成るGC-B3様であるが、膜貫通部位の直後で終止する新たなGC-Bアイソフォームの存在が示唆された。ヒトの遠位中間肢異形成症Maruteaux型の原因となるGC-B変異の1つにQ500X変異が報告されているが、今回存在が示唆されたアイソフォームはこの変異体と同様なGC-B分子を生じるため、今後、このアイソフォームの機能を検討する予定である。一方、昨年度、GC-B各アイソフォームの培養細胞あるいは組織における発現を蛋白レベルで検討することを目的として、GC-B2を特異的に認識するウサギ抗血清を作成したが、マウス組織抽出物を用いたウェスタンブロット解析では、GC-B2を検出することはできなかった。より特異性の高い、抗GC-B2あるいは抗GC-B3抗体の調整が必要と考えられた。
高効率な強相関電子酸化物NaCo2O4熱電変換材料の基礎物性測定と製造法の検討

熱電変換材料に求められる性質は、大きいSeebeck係数と大きい電気伝導率、小さい熱伝導率である。異常に大きいSeebeck係数と電気伝導率に比較して異常に小さい熱伝導率を持つNaCo2O4は熱電変換材料として極めて優れた特性を有しているが、この高効率性は単結晶の特定の方向でみで実現されており、作成の困難さ、コストなどあらゆる面で多結晶体での高効率化が望まれている。これまで多くの研究者によってNaCo2O4多結晶の高効率化が研究されているが、最大で単結晶の性能の50%程度で、通常1020%にとどまっている。本研究では種々の方法(固相反応法、プラズマ焼結法、溶融法、大気中加圧法、ホットプレス法など)で多結晶NaCo2O4の熱電特性の高効率化を試みた。熱電材料の高効率化には異種相や空洞などの欠陥の混在を皆無とし、結晶粒界の弱結合を無くすことで電気伝導度の増大が先ず重要である。本研究ではプラズマ焼結法、ホットプレス法で緻密化を試みたが、粉末の焼結と同時に反応ガスが生成し、緻密化しにくいこと、これらの方法では試料が還元雰囲気となり、原材料が反応してNaCo2O4を生成するためには酸素を必要とすることなどの理由から、緻密で高効率な焼結体の作成は困難であった。このため、酸素の供給が可能な大気中加圧法を考案し、極めて緻密な焼結体の作成に成功した。しかしながら、この焼結体の熱電特性は粉末焼結法で得られたものに比べて、1020%程度、性能が向上するに過ぎなかった。加熱中のNaの飛散が原因と考えられ、加熱中、Na2CO3やNaCo2O4と同じ組成を持つ粉末を周辺に添加して解決を試みた。試料の緻密化は可能となるものの性能の向上は認められない。逆に、Naの供給過剰となっている可能性がある。今後、この点の確認、Na濃度の適切な制御を行い、高性能化を試みる。一方、溶融法では種々の問題を克服して、局所的にではあるが緻密で結晶粒が特定の方向に配向した組織が得られた。更なる検討を行う予定である。熱電変換材料の性能は、しばしば、出力因子(power factor)S^2σ,性能指数(figure of merit)Z=S^2σ/κ,および無次元性能指数(dimensionless figure of merit)ZTで評価される。Sが大きく、導電率が大きく、熱伝導率の小さいもの、大きな温度差が得られる材料ほど性能がよいことになる。しかしながら、S、σ、κは全て、キャリア濃度の関数であり、従来の材料では独立に制御できない。強相関電子酸化物は従来のバンド理論では説明できない種々な特異な物性(超伝導、高誘電率、巨大磁気抵抗など)を示すことが知られており、学術的にもこれまでの常識では考えられない特性を持った物質が存在する可能性が高く、近年、特に注目されている。熱電特性に限るなら、異常に大きいSee beck係数と高導電率に比較して異常に小さい熱伝導率を持つ。

近年、この様な強相関電子酸化物NaCo204の単結晶が無次元性能指数ZT>1をクリアしたとの報告が世界に先駆けて日本でなされ、熱電変換材料が太陽電池並に広く普及するための足がかりが出来た。残された間題はNaCo204がP-typeの半導体であり、同様に高性能なn-typeの半導体を作成が必要であること、高温で長時間使用するとNaが飛散してしまい、性能が劣化することが危惧されること、現在、高性能なNaCo204も粉末の焼結体ではなく、単結晶である点であり、単結晶の製造は困難でコストもかかることである。安価で製造が容易でしかも、高温で安定な高性能NaCo204の製造法の開発が他国に先駆けて行われることが望まれる。本研究はNaCo204以外の異種相が混在しないもの、結晶粒をできるだけ大きくし、結晶方位を配向させる技術を開発することを目的とした。これまでにNa_2CO_3とCo_3O_4の粉末をNaとCoのモル比が化学量論組成の1:2となるように混合し、冷間等方圧機を用いて加圧形成し、二段階焼結法を行った。一段階目の焼結は、炭酸ガスの分離を目的とし、二段階目の焼結は、Naの飛散防止や安定した組成を得るために、同組成の混合粉末の中に埋没させて焼結した。また、さらに均一化を促すために三段階目の焼結を行なった。これら単なる焼結法では充分な性能のNaCo204は作成できなかった。原因としてNaCo204以外の相や空洞の存在、粒界に原因があると考えられる。出発粉末、ホットプレス法、一軸加圧法など種々検討を行う必要がある。現在出発粉末を変えることで、異種相の生成が抑制されることが見いだされている。近年、強相関電子酸化物NaCo2O4の単結晶が熱電変換材料の実用化可能なボーダーライン、無次元性能指数ZT>1をクリアしたとの報告がなされた。残された問題はNaCo2O4が高温ぞ長時間使用するとNaが飛散してしまい、性能が劣化することが危倶されること、現在、高性能なNaCo2O4も粉末の焼結体ではなく、単結晶であり、大きな単結晶の製造は困難でコストもかかることである。安価で製造が容易でしかも、高温で安定な高性能NaCo2O4の製造法の開発が望まれる。本研究では通常の固相反応法(粉末焼結法)、ホットプレス法、溶融法、プラズマ焼結法、低荷重下加熱法など種々の方法でNaCo2O4を作成し、得られた試料の組織を検討した。通常の固相反応法では異種相や空洞の存在、結晶の弱結合の問題がクリアできず、単相で級密な試料の作成は困難であった。ホットプレス法では、不活性もしくは還元雰囲気のため焼結の際、充分な酸素を必要とするNaCo2O4の作成には不向きであった。今後、ホットプレス後の加熱法に工夫が必要である。プラズマ焼結法では一部溶融部が形成され配向組織が得られ、高性能NaCo2O4作成の可能性が示唆された。しかしながら、全体的には通常の焼結法を超える性能を持つ試料の作成は困難であった。引き続き、焼成条件の検討が必要である。Na過剰とした粉末をアルミナ坩堝中、1150°Cで加熱した溶融法ではNa過剰な液相が低融点で形成され、この液液相があたかも超流動体のごとく、坩堝の炉壁を這い上がり抜け出すため、坩堝内に残存する固相の濃度はCo過剰となる傾向にある。しかし、本方法が大きな結晶粒のNaCo2O4作成法としては最も可能性が大きい。低荷重加熱法によって緻密で単相からなる焼結体が得られ、熱電性能も現時点では本研究中、最も高性能であった。しかし、結晶粒は数10μm程度で、配向性も期待できない。液相の這い上がり現象を防ぎ、溶融法によるNaCo
浸潤性膵管癌の生物学的悪性度からみた新規臨床病期システムの確立とその治療応用

近年、浸潤性膵管癌に対する化学療法と放射線治療を併用した化学放射線治療(CRT)を先行した手術治療が導入されるようになり、癌遺残のないR0切除率の向上、リンパ節転移陰性化、局所再発率の低下などの点から有効性が示唆されている。しかし、CRT後の再評価にて潜在性遠隔転移が顕在化、あるいは局所進行高度のため非切除となる症例も存在し、かかる症例の予後は有意に不良であり、従来の画像診断に基づいた臨床病期システムや切除可能性分類のみでは予後を層別化することが困難となっている。多くの癌種では、prognostic nutritional index (PNI)などの宿主の炎症/免疫栄養指標が予後因子として報告されているが、膵癌では十分で検討されていない。これらを背景に、CRT先行手術治療プロトコールに登録された浸潤性膵管癌症例を対象として、腫瘍の解剖学的、生物学的因子ならびに膵癌宿主における様々な炎症/免疫栄養指標を含む因子を用いた本治療後の疾患特異的生存期間(DSS)に影響する臨床病理学的因子の解析検討を行った。その結果、CRT後のprognostic nutritional index (post-CRT PNI)が最も有意な予後規定因子(カットオフ値:39)であることを明らかにし、post-CRT PNIは本治療後の予後を規定する重要な宿主因子であることを報告した。また、切除可能境界(BR)膵癌の定義と基準に関する国際コンセンサス2017では、切除可能性分類には腫瘍の解剖学的因子以外に腫瘍生物学的因子と宿主因子も考慮に入れる必要性があることを報告し、CRT先行手術治療プロトコールに登録された307例の膵癌患者を対象に本コンセンサスの妥当性を検証し、その有用性を報告した。今後、さらなる膵癌の生物学的特性に基づいた新規臨床病期システムの開発と治療応用が進行中である。化学放射線治療(CRT)、化学療法に耐性を示す膵癌、治療開始時にすでに潜在性微小遠隔転移を併存する膵癌の臨床病理学的特性の解明については概ね順調に進行しており、研究結果を国内外の学会で発表を行っている。また、CRT先行手術治療プロトコールに登録された浸潤性膵管癌症例を対象として、腫瘍の解剖学的、生物学的因子ならびに膵癌宿主における様々な炎症/免疫栄養指標を含む因子を用いた本治療後の疾患特異的生存期間(DSS)に影響する臨床病理学的因子の解析検討を行った結果、切除可能境界(BR)膵癌の定義と基準に関する国際コンセンサス2017にも提唱したBiological factor(serum CA 19-9 levels and lymph node metastasis)とConditional factor (宿主のperformance status)ならびに膵癌宿主における炎症/免疫栄養指標であるprognostic nutritionalindexの予後規定因子としての有用性を明らかにし、論文報告を行った。CRTが膵癌組織内の免疫抑制細胞と免疫担当細胞に与える影響の解明、超音波内視鏡下穿刺吸引細胞診や審査腹腔鏡下生検、開腹下生検で得られた膵癌細胞、癌間質を用いたCRT不応膵癌、全身遠隔転移型膵癌の生物学的特性の解明について今後、研究を推進する予定である。しかし、一方で、CRT後の再評価にて潜在性遠隔転移が顕在化、あるいは局所進行高度のため非切除となる症例も存在し、かかる症例の予後は有意に不良であり、画像診断に基づいた切除可能性分類別には層別化されなかった。これらを背景に、CRTに耐性または潜在性微小遠隔転移が顕在化したため、非切除となった膵癌の生物学的特性を明らかにするために、CRT先行手術治療プロトコールに登録された浸潤性膵管癌症例の臨床病理学的因子を解析検討を行った。その結果、術前遠隔転移出現のリスク因子解析では、Performance status (PS) 2以上、腫瘍径2cm以上)、治療前NLR (リンパ球好中球比)高値、治療前CA19.9>450ul/dlが有意な術前遠隔転移出現の危険因子であることが判明した。予後因子解析では治療前PS、NLR、BMI、CEA、SMA浸潤が有意な予後規定因子でありこれらの因子からnomogramを作成しscoringするとscore30点以下で最も予後が良好、30-40点、40点以上では順に予後が不良となり層別化された。さらに様々な炎症/免疫栄養指標を検討した結果、CRT後のprognostic nutritional index (PNI)PNIは最も有意な予後規定因子(カットオフ値PNI>42)であることが判明した。以上の結果、膵癌は解剖学的進展度因子だけでなく腫瘍の生物学的因子ならびに宿主因子も重要な予後規定因子であることが明らかになった。

近年、浸潤性膵管癌に対する化学療法と放射線治療を併用した化学放射線治療(CRT)を先行した手術治療が導入されるようになり、癌遺残のないR0切除率の向上、リンパ節転移陰性化、局所再発率の低下などの点から有効性が示唆されている。しかし、CRT後の再評価にて潜在性遠隔転移が顕在化、あるいは局所進行高度のため非切除となる症例も存在し、かかる症例の予後は有意に不良であり、従来の画像診断に基づいた臨床病期システムや切除可能性分類のみでは予後を層別化することが困難となっている。多くの癌種では、prognostic nutritional index (PNI)などの宿主の炎症/免疫栄養指標が予後因子として報告されているが、膵癌では十分で検討されていない。これらを背景に、CRT先行手術治療プロトコールに登録された浸潤性膵管癌症例を対象として、腫瘍の解剖学的、生物学的因子ならびに膵癌宿主における様々な炎症/免疫栄養指標を含む因子を用いた本治療後の疾患特異的生存期間(DSS)に影響する臨床病理学的因子の解析検討を行った。その結果、CRT後のprognostic nutritional index (post-CRT PNI)が最も有意な予後規定因子(カットオフ値:39)であることを明らかにし、post-CRT PNIは本治療後の予後を規定する重要な宿主因子であることを報告した。また、切除可能境界(BR)膵癌の定義と基準に関する国際コンセンサス2017では、切除可能性分類には腫瘍の解剖学的因子以外に腫瘍生物学的因子と宿主因子も考慮に入れる必要性があることを報告し、CRT先行手術治療プロトコールに登録された307例の膵癌患者を対象に本コンセンサスの妥当性を検証し、その有用性を報告した。今後、さらなる膵癌の生物学的特性に基づいた新規臨床病期システムの開発と治療応用が進行中である。化学放射線治療(CRT)、化学療法に耐性を示す膵癌、治療開始時にすでに潜在性微小遠隔転移を併存する膵癌の臨床病理学的特性の解明については概ね順調に進行しており、研究結果を国内外の学会で発表を行っている。また、CRT先行手術治療プロトコールに登録された浸潤性膵管癌症例を対象として、腫瘍の解剖学的、生物学的因子ならびに膵癌宿主における様々な炎症/免疫栄養指標を含む因子を用いた本治療後の疾患特異的生存期間(DSS)に影響する臨床病理学的因子の解析検討を行った結果、切除可能境界(BR)膵癌の定義と基準に関する国際コンセンサス2017にも提唱したBiological factor(serum CA 19-9 levels and lymph node metastasis)とConditional factor (宿主のperformance status)ならびに膵癌宿主における炎症/免疫栄養指標であるprognostic nutritionalindexの予後規定因子としての有用性を明らかにし、論文報告を行った。CRTが膵癌組織内の免疫抑制細胞と免疫担当細胞に与える影響の解明、超音波内視鏡下穿刺吸引細胞診や審査腹腔鏡下生検、開腹下生検で得られた膵癌細胞、癌間質を用いたCRT不応膵癌、全身遠隔転移型膵癌の生物学的特性の解明について今後、研究を推進する予定である。
モンゴル産白亜紀の恐竜卵化石の微細構造の研究とそれに基づく分類

目的:モンゴル国ゴビ砂漠に分布する白亜系から採集された恐竜の卵殻化石の内部微細構造を観察し、その分類学的位置を同定すること。方法:採集した卵殻化石標本の薄片(プレパラート)を製作し、それを偏光顕微鏡で観察した。また、卵殻の外部、内部表面、破断面を実体顕微鏡で観察し、顕微鏡写真を撮影して、そのデータに基づき記載した。さらに、従来報告されているモンゴルおよび中国産の恐竜卵殻化石と比較し、モンゴルの卵殻化石標本の分類学的所属を同定した。成果:従来モンゴルの中生界から発見されていなかった新しい種類の卵化石の存在を明らかにした。それは、ゴビ砂漠東部、バインシレ産地に露出する部白亜系下部から発見されたものである。その新発見の卵化石は、中国の下部白亜系および上部白亜系から発見されているDictyoolithus属に同定された。しかし、卵殻の内部の多層構造およびサイズにおいて中国産のものとは区別され、新種である可能性が高い。詳細に卵殻の内部構造を薄片において観察したところ、従来の記載ではその種類の分類群の特徴を説明するのは不十分であることが判明した。新しい形質(特徴)を認めることができた。この成果は、2011年1月、高知大学で開催された日本古生物学会第160回例会で口頭発表した。それをもとに、現在、海外の学術雑誌に投稿するべく論文を執筆中である。また、同産地からさらにもう1種類新しい分類群を発見した。この標本については、東京学芸大学佐藤環准教授の卒論生2名の研究テーマとして提供した。その成果は、今年の6月の日本古生物学会総会で発表予定である。さらに、モンゴル卵殻標本を、岡山理科大学西戸教授の卒論生の研究テーマ(微細構造についてのカソードルミネッセンス分析)として提供し、その内部構造を元にした分類手法を指導した。内部構造において、結晶構造の変化および軽元素の濃集を発見した。この研究テーマについては研究代表者と大学との共同研究として継続していく予定である。
癌原性口腔細菌によるヒト上皮AID発現誘導とp53遺伝子変異の解析

S. anginosusによる口腔癌発症機序の解明を目的として,口腔扁平上皮癌組織への本菌の感染率およびAID発現誘導,また培養細胞でのS. anginosus由来生理活性物質SAA刺激によるAID発現誘導ならびにp53遺伝子変異について検討した.その結果,口腔癌組織においてS. anginosus感染とAID発現に有意な関連性が認められ,また,SAA刺激で培養上皮細胞にNF-kBの活性化が関与するAID遺伝子およびタンパク質の発現誘導が認められた.さらに,SAA刺激したヒト正常歯肉上皮細胞のp53遺伝子配列の一部に変異が認められた.B細胞の遺伝子に変異を誘導する酵素AIDは通常B細胞でしか働かないといわれているが,近年,Helicobacter pylori感染マウスの胃粘膜上皮細胞等で過剰発現していることが明らかとなり,感染による発癌にAIDの異所性発現が関与していることが示唆されている.今年度,本研究においては,S. anginosusの口腔癌発症機序の解明を目的として,癌組織への本菌の感染,AID発現,さらに株化上皮細胞へのS. anginosus菌体および菌由来生理活性物質によるAID発現誘導,および細胞内シグナル伝達系について検討した.その結果,1.口腔癌組織におけるAID遺伝子発現については,癌組織からRNAを抽出し,逆転写反応,およびサイバーグリーンを用いたリアルタイムPCRを実施してAID遺伝子の発現を定量化した.正常組織にくらべ口腔癌組織でAID遺伝子の発現が高い傾向が認められた.さらに,癌組織から50%の頻度でS. anginosusゲノムDNAが検出された.また,ヒト咽頭上皮細胞株(HEp-2),ヒト舌癌由来株化上皮細胞(DOK)を用いてS. anginosus菌体,あるいは生理活性物質である本菌由来抗原SAAで刺激した際の細胞内のAID遺伝子の発現量を検討した.対照に比べ菌体およびSAA刺激により,細胞内のAID遺伝子の発現誘導が認められた.2.培養細胞を用いた細胞内シグナル伝達系の解析では,マクロファージ様細胞株(RAW細胞),ヒト咽頭上皮細胞株(HEp-2),ヒト舌癌由来株化上皮細胞(DOK)を用いて,S. anginosus菌体あるいはSAAで刺激した際の細胞内シグナル伝達系について検討した.NF-κBの活性化(IκBαの分解)をSDS-PAGE後にウエスタンブロッティングで解析したところ,RAW細胞では菌体およびSAA刺激でNF-κBの活性化が認められた.これらの成績から,口腔癌においてもAID遺伝子の異所性発現が亢進し,S. anginosusは口腔粘膜上皮細胞を含む,種々の上皮細胞に対してAID遺伝子発現を誘導する可能性が示唆された.S. anginosusの口腔癌発症機序の解明を目的として,癌組織への本菌の感染,AID発現,さらに株化上皮細胞に加え正常歯肉上皮細胞へのS. anginosus菌体および菌由来生理活性物質SAAによるAID発現誘導,および細胞内シグナル伝達系について詳細に検討した.また,S. anginosusの重要なビルレンスファクターと考えられるSAAの遺伝子同定を行った.その結果,1.これまで明らかにして来た株化上皮細胞同様,正常ヒト歯肉上皮細胞でも対照に比べ菌体およびSAA刺激により,細胞内のAID遺伝子の発現誘導が認められた.2.培養細胞を用いた細胞内シグナル伝達系の解析では,ヒト舌癌由来株化上皮細胞(DOK)および正常ヒト歯肉上皮細胞を用いて, S. anginosus菌体あるいはSAAで刺激した際の細胞内シグナル伝達系については前年度の系(NF-κBの活性化についてIκBαの分解をSDS-PAGE後にウエスタンブロッティング解析)ではうまく検出できなかったので,今年度はデュアルルシフェラーゼアッセイにより検討した.ウエスタンブロットに比べ高感度なためNF-κBの活性化を菌体およびSAA刺激でいずれの細胞でも認めることができた.3.S. anginosus菌由来抗原であるSAAの遺伝子のクローニング解析は,SAAを二次元電気泳動後,目的スポットのアミノ酸配列をLS/MSにより決定し,S. anginosusゲノムDNAの情報をもとに同定した.これらの成績から,口腔癌においてもAID遺伝子の異所性発現が亢進し,S. anginosusは口腔粘膜株化上皮細胞を含む正常歯肉上皮細胞でも,AID遺伝子発現を誘導すること明らかにした.また,S. anginosusによる上皮細胞からのAID発現誘導が細胞内シグナル伝達系のNF-kBを経由していることを解明した.S. anginosusの口腔癌発症機序の解明を目的として,S. anginosus菌由来生理活性物質であるSAAによる歯肉上皮細胞からの長期刺激によるAIDタンパク質発現,およびS. anginosus菌由来生理活性物質であるSAA遺伝子のクローニングデータをもとにSAAの組替えタンパク質の発現について検討した.その結果ヒト歯肉上皮細胞をSAAで刺激72時間後まで認められなかったAIDタンパク質は,2週間から4週間持続的に刺激することで発現誘導が認められた.すなわち,歯肉上皮細胞に対するAID遺伝子発現はコントロールの2倍程度で,短期のSAA刺激ではタンパク質の発現は非常に弱いと考えられる.しかし,長期にわたる刺激ではAIDタンパク質の発現が誘導されることが明らかとなった.さらに,S. anginosus菌由来生理活性物質SAAの組替えタンパク質の発現については, pGEXベクターGST融合蛋白質あるいはHisタグタンパク質の両タンパク質の発現系を用いて検討した.

その結果,pGEXベクターにSAA遺伝子を組み込みGSTおよびHisタグリコンビナントSAA(rSAA)を発現することができた.この際,ホストにclean coliを用いることにより発現タンパク質サンプル中に大腸菌由来LPSの持ち込みを排除した.次にこの精製rSAAを用いて,これまで行って来たネイティブSAA(nSAA)によるマクロファージ刺激による一酸化窒素(NO)産生ならびにiNOS遺伝子誘導について検討した.nSAA同様rSAAでもマウス腹腔マクロファージおよびマクロファージ様細胞株J774に対してNO誘導活性が認められた.以上の成績より, S. anginosusはその生理活性物質SAAによりAID異所性発現誘導による上皮細胞への変異誘導およびNO産生などの炎症応答を惹起し,S. anginosusの口腔癌発症機序に深く関与していることが示唆された.S. anginosusによる口腔癌発症機序の解明を目的として,口腔扁平上皮癌組織への本菌の感染率およびAID発現誘導,また培養細胞でのS. anginosus由来生理活性物質SAA刺激によるAID発現誘導ならびにp53遺伝子変異について検討した.その結果,口腔癌組織においてS. anginosus感染とAID発現に有意な関連性が認められ,また,SAA刺激で培養上皮細胞にNF-kBの活性化が関与するAID遺伝子およびタンパク質の発現誘導が認められた.さらに,SAA刺激したヒト正常歯肉上皮細胞のp53遺伝子配列の一部に変異が認められた.26年度は,前年度からの継続課題として,癌組織からのAID遺伝子発現およびS. anginosus感染の検出について検体数をさらに増やし検討した.その結果,対象口腔癌組織は10例増えて22例となり,それら組織をRNeasy kitを用いてRNAを抽出後,逆転写,リアルタイムPCRを実施しAID遺伝子の発現量を,また,DNAを精製しS. anginosus特異的プライマーで本菌の感染を検討した.例数が増したことにより, S. anginosus感染とAID発現に前年度より高い有意な関連性が認められた.また,前年度は株化培養上皮細胞におけるS. anginosus菌体および菌由来抗原(SAA)によるAID遺伝子の発現について検討したが,今年度は,初代培養口腔上皮細胞についても定量PCRで検討した.その結果,株化上皮細胞同様,歯肉上皮細胞でもAID遺伝子の発現誘導が認められ,正常歯肉上皮細胞でも株化細胞同様の応答性を示すことが明らかとなった.また,細胞内シグナル伝達系の解析をNF-kBについて,化学発光を利用したデュアルルシフェラーゼアッセイにより高感度での解析を行った.その結果,株化上皮細胞,正常歯肉上皮細胞ともS. anginosus菌体および菌由来抗原(SAA)により,NF-kBの活性化が認められた.また,NF-kB阻害剤添加により,AID遺伝子の発現誘導が有意に抑制されたことから,S. anginosus菌体および菌由来抗原(SAA)によるAID遺伝子の発現誘導にNF-kBの活性化が関与していることを明らかにした.