hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生組織移植におけるマクロファージ・ポラリゼーションの解析と再生医療への応用

遺伝子発現の検討から、ホスト由来細胞は移植後7日から11日前後で増加することが示され、M2マクロファージは、指標として使用した各因子の発現パターンの違いからから、少なくとも2つのタイプがあることが推察された。サイトカインアレイにおいても、M2マクロファージ関連因子は移植後1週で上昇した後、2週で低下、さらに3週で上昇する傾向を示したことから、その多様性が示唆された。再生医療平成25年度に予定していた1)マクロファージ・ポラリゼーションが再生軟骨移植に及ぼす効果の検証、2)マクロファージ機能不全誘導薬を用いたマクロファージサブクラスの機能評価に関して検討を行い、有意義な知見が得られた。順調に研究が進捗していると考えている。平成24年度に予定していた1)マウス再生軟骨モデルにおけるM1/M2マクロファージの局在同定2)軟骨細胞とM1/M2マクロファージの共培養系における軟骨細胞の生存性の検証3)マクロファージサブクラスと軟骨細胞分化との相関解析に関して検討を行い、有意義な結果が得られたため、順調に進捗していると考えている。昨年度までの検討で、再生軟骨組織に認められるマクロファージにサブクラスがあること、マクロファージのサブクラスにより軟骨細胞の分化度に違いが出ること、移植後早期はM1傾向のマクロファージが優位であり、その局在を抑制することにより、軟骨成熟を促進できる可能性があることなどが示唆された。本年度は、マクロファージ機能不全薬の投与時期の違いにより誘導される組織成熟の違いについて、マウス再生軟骨同系移植モデルを用いて、更に詳細な検討をおこなっていく予定である。具体的には、マクロファージ機能不全を一時的に誘導するclodronateliposomeを腹腔投与する際、投与時期や期間を細かくきざみ、機能不全を誘導する時期を調整する。継時的に摘出した再生軟骨組織の組織学的、免疫組織化学的、生化学的解析を行い、各サブクラスのマクロファージが再生軟骨移植において及ぼす効果を検討する予定である。ついで、再生軟骨医療におけるマクロファージ・ポラリゼーション制御の応用を検討する。M2マクロファージへの変換を誘導する因子として報告されているIL-4などのリコンビナント蛋白を、再生軟骨の足場素材に混和、もしくは結合させ、ポラリゼーションの制御を検討する。昨年度までの検討で、再生軟骨組織に認められるマクロファージにサブクラスがあること、またそのサブクラスに応じて軟骨細胞の分化度に違いが出ることが示唆された。本年度は、マウス再生軟骨同系移植モデルを用いて、更に詳細な検討をおこなっていく予定である。具体的には、マクロファージ・ポラリゼーションが再生軟骨移植に及ぼす効果の検証を行うため、M1傾向を示すことが報告されているC57BL/6JマウスとM2傾向を示すことが報告されているBalb/cマウスを用いてそれぞれ再生軟骨同系移植を行う。移植後継時的に再生軟骨組織を摘出し、組織学的観察(HE染色、トルイジンブルー染色)、免疫組織化学的観察(I,II,X型コラーゲン,アグリカン、F4/80、IL-6, IL-10, Arginase Iなど)により、マクロファージの特性が再生軟骨組織の成熟に及ぼす効果を検証する。次いで、マクロファージ機能不全誘導薬を用いた機能評価を行う。
革新航空エンジンに向けたウェーブロータ要素の作動域限界と最適制御

本研究では,特に小型ジェットエンジンへの搭載を想定したマイクロウェーブロータに関する研究を行った.数値解析においては,給排気ポートまで含めた大規模解析を行い,ロータ流路内部の圧力波伝播だけでなく,給排気ポート内部の非定常性や迎角の有無による状態量の変化など,定常-非定常変換デバイスとしての特性を重視した議論を行った.実験においてはプロトタイプ実験機の作動試験を行い,特に小型の場合に問題となる漏れ流れの抑制及び供給ガスの温度比をパラメタとした作動特性と内部流動を議論した.本研究では,特に小型ジェットエンジンへの搭載を想定したマイクロウェーブロータに関する研究を行った.数値解析においては,給排気ポートまで含めた大規模解析を行い,ロータ流路内部の圧力波伝播だけでなく,給排気ポート内部の非定常性や迎角の有無による状態量の変化など,定常-非定常変換デバイスとしての特性を重視した議論を行った.実験においてはプロトタイプ実験機の作動試験を行い,特に小型の場合に問題となる漏れ流れの抑制及び供給ガスの温度比をパラメタとした作動特性と内部流動を議論した.本研究で対象とするマイクロウェーブロータにおいて,漏れ流れの影響が重大であることは,これまでの実験研究及びパラメタ解析によって分かっている.これに対する解決策のひとつとして,アブレイダブル素材をケーシングに施して,ロータとケーシングを直接接触させつつ運転するという方法について実験検討を行った.最初に,樹脂系の素材であるフルオロシントを用いて運転試験を実施したが,摩擦熱によって素材が破損する結果となり,ウェーブロータに適用するには不適切であることが判明した.そこで,最終的な目標としている温度比を与えた条件下での実験をも踏まえて,予想される温度範囲で使用可能な素材として,CoNiCrAIY-boron nitride/polyesterの粉末を選択し,これをケーシングにプラズマコーティングするという方法を採用し,これを用いた運転試験を行った.その結果,クリアランスの大きさを0-30μm以内に抑えることができ,漏れ流れ流量を24%から5%(流入流量比)に低減することに成功した。また,試験実施後のコーティング部分の状態も良好であり,実際のウェーブロータの運転においても有望な素材であることが確認された.一方,マイクロウエーブロータの性能と作動範囲の予測に欠かせない流動シミュレーションでは,ポート内部まで含めた2次元数値解析モデルを構築中である。ロータとの相対運動を扱う際の課題として,流動場が非定常であるためにポート領域とセル領域の接続部の流東境界条件にとりわけ注意を要し,漏れ流れの物理的モデルや計算格子分布の妥当性などが指摘されるため,これらの問題について,数値計算プログラムの検証を目指し,理論解と実験結果との詳細比較をしつつある段階である。数値シミュレーションにおいては,ロータセル及び給排気ポート全体を解析するための2次元解析モデルを構築し,これを用いた全体流動シミュレーションを行った.特に,回転するロータセルに対する給排気ポートの相対迎角の影響に着目し,入口及び出口迎角が内部流動構造と全体の性能に与える影響について議論した.その結果,出口よりも入ロポート迎角の影響が大きいことが分かり,ロータのトルクや各ポートの流量,ポート内部圧力と流量の安定性にその影響が現れることが分かった.また,ロータセル内部の圧力波伝播構造にも違いが現れる場合があることも明らかとなった.一方,マイクロウェーブロータ作動実験においては,作動状態を設計点に近づけるために,供給する流体に温度比を与えることを目標とした.従来の翼列機械と同様,圧力比と温度比をそろえ,修正流量や修正回転数を導入することによって,ウェーブロータの作動状態を議論することが可能であることから,圧力比だけでなく温度比も実験パラメタとすることが,ウェーブロータの作動試験には必要である.そこで,設計点における温度比を達成するために,高温側の加熱だけでなく低温側を冷却することによって,目標温度比を達成することを目指した.まず低温側については,液体窒素を用いた低温ガス供給装置を考案し,これを用いた実験を行った.その結果,目標である200Kの低温窒素の供給に成功し,これを用いた場合の作動状態の変化や音速の低下による衝撃波伝播速度の変動などについて議論した.さらに,高温側に電熱ヒーターを用いた実験を行い,高温流体を用いた作動試験を行うことにも成功した.
自然集合体に基づくペルム紀‐三畳紀コノドントの分類,進化,古生態

岐阜県舟伏山地域に分布する黒色粘土岩層から前期三畳紀Induanの最前期を示すHindeodus parvusおよびHindeodus typicalisの自然集合体が得られた。これらの集合体にもとづきHindeodus属コノドントの器官復元を行ったところ、これらの器官は合計13個のエレメントから構成されることが明らかとなった。また堆積課程の考察から、これらのコノドントは遠洋・深海域の海底面近くに生息し、死後直接堆積物中に埋没したことが明らかになった。栃木県秋山川上流地域における研究では、前期三畳紀Olenekianのコノドントエレメントが密集したコノドント集積層が発見された。コノドントの古生態および岩相解析にもとづく考察から、前期三畳紀の遠洋域では貧酸素状態が生じ、しばしば深海あるいは中層まで発達していたことが結論づけられた。本研究では、ジュラ紀付加体中に含まれる珪質粘土岩からコノドント自然集合体を発見・記載し、後期ペルム紀から前期三畳紀コノドントの系統、分類、進化および古生態を解明することを目的としている。本年度は、当初予定していた栃木県足尾山地の秋山川上流地域の試料に加え、新たな情報にもとづいてカナダ西部のブリティッシュコロンビア州カシェクリークおよび岐阜県舟伏山地域から採取された試料について研究を行った。これまでのところ得られている結果は以下のとおりである。1、栃木県秋山川上流地域に分布する珪質粘土岩層からコノドントエレメントの密集層を発見し、その地史学的・堆積学的意義について考察した。2、カナダ・カシェクリークに分布する珪質頁岩層から三畳紀コノドントを発見した。しかしながら、上記栃木県およびカナダの試料について自然集合体の発見には至らなかった。3、岐阜県舟伏山地域の黒色粘土岩層から最前期三畳紀を示すHindeodus parvusを含むコノドントの自然集合体が得られた。これらの集合体にもとづき、Hindeodus属コノドントのアパレイタスの復元を行った。Hindeodus属はペルム紀-三畳紀境界を決定するためのもっとも代表的な示準化石であり、自然集合体は世界でも初めての発見である。この研究成果は22年6月の日本古生物学会で発表する。22年度はこれらの標本の記載を進め、最前期三畳紀コノドントの分類、系統と古生態に関する考察を行う予定である。平成21年度は当初予定していた栃木県足尾山地の秋山川上流地域の試料に加え、カナダ西部のブリティッシュコロンビア州カシェクリークおよび岐阜県舟伏山地域から採取された試料について研究を行った。また平成22年度は引き続き舟伏山地域の試料採取を行い、また茨城県八溝山地においても野外調査を行った。以上の調査地域のうち岐阜県舟伏山地域と栃木県秋山川地域に分布する粘土岩から保存良好なコノドント化石を得ることができた。舟伏山地域からは最前期三畳紀を示すコノドント自然集合体が産出した。これらの集合体はHindeodus parvusおよびHindeodus typicalisに同定される。特に前者はペルム紀/三畳紀境界を定義することから層序学的に重要な種である。集合体にもとづき復元された硬組織器官は、M、S0S3、P1およびP2エレメントを含む13エレメントで構成される。栃木県秋山川地域からはコノドントエレメントの集積層を発見した。集積層には前期三畳紀の後期を示すNeostrachanognathus tahoensisが含まれる。岩相学的な考察にもとづき、コノドント集積層は海山のような地形的高まりからしばしば堆積物の流入する遠洋・深海域で形成されたことが明らかになった。また同時代の粘土岩を産する他地域との比較から、ペルム紀/三畳紀境界の後、前期三畳紀の間に遠洋・深海域では海洋貧酸素状態がしばしば発生し、そのような水塊が時には中層まで発達していたことが示された。
血清マイクロRNAを用いたANCA関連血管炎における新規バイオマーカーの開発

次に、活動性症例および寛解症例での検討を行ったところmiR-5571は活動性による差を認めなかったがmiR-200cは活動性症例と比較し寛解例で有意な低下を認めた。さらに、疾患分類や臓器障害、治療反応性など層別の解析を加えたがこれらの臨床的パラメータによる明らかな差異は認めなかった。ANCA関連血管炎(AAV)患者の治療開始前および健常人でのmiR-5571・miR-200cをリアルタイムPCR法で測定し,AAV患者で発現が亢進していることを確認した。次に、活動性のAAV患者におけるmiR-5571・miR-200cと患者背景(疾患分類,重症度,臓器別BVAS(バーミンガム血管炎活動性スコア),CRP, MPO-ANCA, PR3-ANCA,血清クレアチニン,白血球数, IgG,KL-6)との関連を単回帰あるいは重回帰分析を用いて個別のパラメータとの関連を検討した。現在、活動性症例の追加、および寛解症例での検討を行っており、活動性によるmiR-5571・miR-200c推移の検討を予定している。併せて全身性エリテマトーデス(SLE)患者10名,急性細菌感染症患者10名の血清の収集も継続中で今後疾患特異性についても検討予定である。来年度以降は上記の検討に加えてIn vitroにおけるmiR-200c, miR-5571の機能解析やIn vivoでのmiR-200c, miR-5571の検討を予定している。疾患特異性を確認するための全身性エリテマトーデス患者,急性細菌感染症患者の検体数が不足したため。ANCA関連血管炎(AAV)患者の治療開始前および健常人でのmiR-5571・miR-200cをリアルタイムPCR法で測定し,健常人と比較しAAV患者で発現が亢進していることを確認した。次に、対象症例を追加し、活動性症例および寛解症例でのこれらの比較検討を行ったところ,miR-5571は活動性による差を認めなかったが、miR-200cは活動性症例と比較し寛解例で有意な低下を認めた。以上のことからmiR-5571は特に疾患特異的な診断マーカーとしての可能性が示唆され、またmiR-200cは活動性のマーカーとなることが示唆された。今後疾患特異性についても検討を行い、in vitroにおけるmiR-200cの機能解析やin vivoでのmiR-200cの検討を予定している。当初、疾患活動性マーカーとして2つのmicroRNAを想定していたが、miR-5571は診断マーカーとして、miR-200cは疾患活動性のマーカーとして有用である可能性が示唆される結果が得られたため、それぞれをさらに検証する必要が出てきた。臨床検体を収集するために他診療科にも協力を依頼する。疾患特異性が確認できればmiR-5571については活動性マーカーではなく診断マーカーとしての意義を検討する。
ゲーム構造と社会的選好及びリスク選好の内生性－理論・実験分析

本研究の目的は,行動経済学分野で注目されている社会的選好モデルを視野に,自他が戦略的に意思決定を行うゲーム状況で,そこで起こりうる結果の可能性を人々がどのように推定し,それがプレイの選択にどのようにつながるのかを,戦略性が生むリスクに対する個人のリスク姿勢の観点から解析することを目的とする。本研究では,(1)ゲーム構造と相互性発動の関係と(2)ゲーム構造とリスク・不確実性選択の関係の2点を再検討し,戦略的関係とリスク・不確実性選好,さらに社会的選好との相互作用について新たな知見を得ようとするものである。(1)については主にH28年度に実験を実施し,利害が対立するゲームでも,「意図」を顕示できる手続きがゲーム内にあれば,協調がより達成され効率的結果がより得られやすくなることを示し,H30年度中にかけてワーキングペーパーにまとめ,学術雑誌に投稿中である。H30年度の作業は主に(2)であった。まず,ゲームを伴わない状況において,所得分配に関する社会的選好とリスク選好を,リスク選択行動の測定を介して両者を分離する方法を提案し,その実験上の有効性を示した。その成果は現在投稿準備中である。H30年度はさらに,複数種類のゲームを用意し,直接のプレイヤーでない立場の被験者にゲームにおける選択の可能性を推定してもらい,その推定値のリスク・不確実性選好上の特性を特定すると共に,複数解を備えるゲームにおいてどの解に向けて参加者の志向性が協調を生み,それが逆に可能性の推定値を左右するかを検討するための実験をデザインし,予備実験を実施した。なお,岡野芳隆・舛田武仁の両氏を研究協力者として擁し,共同研究を実施している。リスク姿勢については,その研究成果の一部がMasuda-Lee (2019),協調ゲームについてはAoyagi-Nishimura-Okano, 2019に反映されている。計画通り,これまで得た知見をまとめて雑誌へ投稿するに至っている。一方,リスクが存在する場合の理論分析では,戦略的要素を含まない枠組みにおけるリスク選好と社会的選好との分離手法を開発するに至っており,知見をまとめる作業へ移行している。ゲーム的要素を含む状況での,リスク・不確実性選好と社会的選好を含む戦略性に関する実験デザインを構築し,予備実験を実施するところまで至っており,それら暫定的知見を各所で報告するに至っている。今後は,次の3点について研究を進めていく予定である。(1)ゲーム要素を含む場合に,リスク選好と社会的選好を分離する手法を適用し,戦略性が生むリスクや不確実性とリスク選好と社会的選好との相互作用に関する実験を実施していき,知見をまとめる。(2)ゲームが内生する不確実性が,客観(主観)確率で構成される「リスク」ではなく,確率的に把握されない「曖昧性」として認識される場合について,H30年度に構築した実験デザインと予備実験で得た知見に基づき,本実験を実施する。(3)ゲームにおける選択の可能性に関する推定値と,リスク・不確実性の推定値に関する選好の特性との関係を代表する測度を開発し,実験データ分析につなげる。本研究の目的は,戦略的選択過程から顕示される「意図」に着目し,(1)ゲーム構造と相互性発動の関係と(2)ゲーム構造とリスク選択の関係の2点を再検討することにある。このうち,H28年度の研究作業の中心を(1)の前者とした。まず,分析対象を複数協調均衡を持つ「協調ゲーム(Coordination Game)」とし,一方の均衡が他の均衡より効率的であるような2つの均衡を持つ2x2ゲームを2種類用意した。一方のゲームでは効率的均衡が他の均衡をパレート支配する利害共通型,他のゲームは利害対立型とし,これをゲーム構造の違いと位置づけた。本研究では,効率的均衡が常に他の均衡をリスク支配するように設定し,先行研究の主なターゲットであったパレート支配基準対リスク支配基準という均衡選択分析と差別化できるように配慮した。さらに,2人のプレーヤーの利得の間に常に一方向の有意な利得差があるように設定し,利得差から生じる「意図」の役割が際立つようにした。また,協調ゲームを行って利得が確定した後,そうしたければ相手に自らの利得の一部を譲渡できる段階を加えたゲームも構築し,協調ゲームを介して推定した相手の「意図」に反応できる場を用意し,相互性の発動を観察できるようにした。上記のデザインに基づいて,実験を実施した。その結果,利得譲渡機会なしでは,利害共通ゲームにおいてより効率的均衡が達成されることを確認したが,利得譲渡機会ありでは譲渡行為が有意に観察され,社会的選好の発動が確認された。利得譲渡行為に伴って効率的均衡達成度の上昇が見られたのは,当初予想した利害共通ゲームではなく,利害対立ゲームであることを特定し,これにより社会的選好の中でも「意図」の役割が利害対立ゲームにおいて特に顕在化したことを観察した。この結果は,ワーキングペーパーとしてまとめてある。申請時の計画では,研究初年度の中心課題を社会的選好抽出実験研究においてあった。H28年度には,その計画に沿って「研究実績の概要」の項にあるように,研究を行った。そこでは,当初の計画通り,(i)ゲーム的状況の有無の比較,(ii)ゲームの利得構造の対称・非対称の比較,(iii)

ゲームの利得構造が対立的・非対立的の比較の3つの対照実験のデザインを構築し,その予備実験と本実験を実施したものであり,順調に研究は進行している。本研究の目的は,行動経済学分野で注目されている社会的選好モデルを視野に,自他が戦略的に意思決定を行うゲーム状況で,ゲームが内生するリスクに対する個人のリスク姿勢の観点から解析することを目的とする。Chew-Nishimura(2015)は,リスクの内生性が個人のリスク態度自体に影響を及ぼすことを発見した。リスク選好と社会的選好の相互作用についての先行研究例は極めて乏しく,定説は確立されていない。本研究では,(1)ゲーム構造と相互性発動の関係と(2)ゲーム構造とリスク選択の関係の2点を再検討し,リスク選好と社会的選好の相互作用について新たな知見を得ることが目的である。(1)については主にH28年度に実験を実施し,利害が共通するゲームではなく,利害が対立するゲームで,「意図」を顕示できる手続きがゲーム内にあれば,協調がより達成され効率的結果がより得られやすくなることを示し,社会的選好の中でも他者に対する「意図」の役割の重要度を示し,H28年度からH29年度中に渡ってワーキングペーパーにまとめ,学術雑誌に投稿中である。H29年度の作業は主に(2)について行った。まず,ゲームを伴わない状況において,所得分配に関する社会的選好とリスク選好を,リスク選択行動の測定上どのように分離するかに関する研究を行い,Schur-Concavityを領した分離方法を提案するに至った。また,分離方法に即して,自他の所得が確率的に変動するリスクを生成して,実験を行い,実験結果について提案した分離方法を適用し,分離可能性を示した。この結果を,第21回実験社会科学カンファレンス及び,東大社会心理学研究室セミナーで報告した。年度当初には,リスクが存在しない場合で,利害が対立するゲームとそうでないゲームの実験を実施するところまでの計画であったが,実施を完了し知見をまとめて雑誌へ投稿まで至っている。一方,リスクが存在する場合の理論分析に着手し,その第1段階である,リスク選好と社会的選好との分離手法を開発するに至った。ゲーム的要素を含まない状況での,リスク選好と社会的選好に関する予備実験及び本実験も実施し,分離手法が有効であることを確認できたと共に,その分離手法の下でのみ知りうる新たな知見を得ることができた。それら暫定的知見を各所で報告するに至っている。本研究の目的は,行動経済学分野で注目されている社会的選好モデルを視野に,自他が戦略的に意思決定を行うゲーム状況で,そこで起こりうる結果の可能性を人々がどのように推定し,それがプレイの選択にどのようにつながるのかを,戦略性が生むリスクに対する個人のリスク姿勢の観点から解析することを目的とする。本研究では,(1)ゲーム構造と相互性発動の関係と(2)ゲーム構造とリスク・不確実性選択の関係の2点を再検討し,戦略的関係とリスク・不確実性選好,さらに社会的選好との相互作用について新たな知見を得ようとするものである。(1)については主にH28年度に実験を実施し,利害が対立するゲームでも,「意図」を顕示できる手続きがゲーム内にあれば,協調がより達成され効率的結果がより得られやすくなることを示し,H30年度中にかけてワーキングペーパーにまとめ,学術雑誌に投稿中である。H30年度の作業は主に(2)であった。
神経突起の形成過程における選択的蛋白分解の基質蛋白質群の精製と同定

1.精製方法の決定。大量調製が容易なK562細胞を用い、ユビキチン(Ub)化蛋白質の精製法を検討した。その結果、第一段階は抗Ub抗体FK2をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーに決定した。その際、抗体固定化ゲル1mlに約0.2mgUb当量が吸着し、溶出には3.5M MgCl_2が優れると判明した。この精製標品は、次にSuperdex75のゲル濾過で分画し、30kDaを境とした"高分子量"と"低分子量"のUb化蛋白質画分が得られた。前者は主にマルチUb化蛋白質からなる。後者はUbとチオエステル結合体したUb結合酵素(E2)も含み、E2精製にも有用と判明した。2.神経突起形成時に特徴的なUb化蛋白質の検出。PC12h細胞を神経成長因子(NGF)存在下で一週間培養した際に出現または増加するUb化蛋白質をFK2抗体による免疫沈降/SDS-PAGEで解析し、前者に3種類(18,19,36-kDa)、後者に6種類(20,23,26,51,68,93-kDa)の候補を見出した。3.PC12h細胞のUb化蛋白質の精製。NGFで処理したPC12h細胞(2_x10^9個)の細胞質抽出液をFK2固定化カラムで精製しUb化蛋白質画分0.56mgを得た後、ゲル濾過で高分子量および低分子量の同蛋白質画分を獲得した。現在、後者の成分をSDS-PAGEで分離し、順次その限定分解産物のアミノ酸配列の同定を進めている。26-kDaバンドに関してはUb部分配列2種類と未知蛋白の部分配列5種類の結果を得た。4.抗Ub化タグペプチドに対する抗体作成。標的蛋白の同定に不可欠なUb化タグペプチドに対するモノクローナル抗体の作成は、抗原溶解性の問題から困難を極めたが、ペプチドの設計を改良し樹立に成功した。今後この抗体を用いて高分子量Ub化蛋白質の分析を行う計画である。1.精製方法の決定。本年度は材料調製と精製方法に関する条件設定を行った。各種条件下で培養したPC12h細胞のマルチュビキチン鎖を特異的ELISAで定量したところ、神経成長因子を1週間作用させて突起形成を誘導すると、マルチュビキチン鎖量が約3倍増加した。また、細胞回収前にプロテアソーム阻害剤MG132を培地に添加すると、その濃度と感作時間に比例してマルチュビキチン鎖量が増加した。その際、過剰感作による細胞傷害性も認めたため、最適な条件を検討し、濃度2μM、感作2時間と決定した。これにより、1mg蛋白あたりマルチュビキチン鎖150ng(MUCRP1換算)が得られる。出発材料のマルチュビキチン鎖は50μg以上確保したいため、蛋白300mg相当、即ち55cm^2培養皿約200枚分の細胞調製を決定した。精製方法の検討には、大量調製が容易なK562白血病細胞を用い、MG132感作と熱ショック負荷の前処理後、抽出液を調製した。精製第一段階には、結合型ユビキチンに高親和性を示すFK2抗体をSepharoseに固定したカラムを用いた。

約300mg蛋白を含む抽出液を同カラムに展開し、吸着成分を高濃度の塩で溶出したところ、蛋白量は0.6%まで減少したがマルチュビキチン鎖は100%回収され、優れた精製効率を得た。次に、これをゲル濾過し、SDS-PAGEでスメアなバンドを示す30kDa以上の成分と複数の明確なバンドを与える30kDa以下の成分を得た。その後の蛋白・免疫化学的検討から、前者の主成分はマルチュビキチン化蛋白と同定され、目的に適う精製標品が得られた。一方、後者には、ユビキチン単多量体に加え、複数のユビキチン結合酵素(E2)およびそれらとユビキチンのチオエステル結合体が同定された。こうしたE2の精製・同定は過去に例が無く、本方法の優れた特質が見出された。PC12h細胞のE2の同定も目標に加え検討を進める。1.精製方法の決定。大量調製が容易なK562細胞を用い、ユビキチン(Ub)化蛋白質の精製法を検討した。その結果、第一段階は抗Ub抗体FK2をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーに決定した。その際、抗体固定化ゲル1mlに約0.2mg Ub当量が吸着し、溶出には3.5M MgCl_2が優れると判明した。この精製標品は、次にSuperdex75のゲル濾過で分画し、30kDaを境とした"高分子量"と"低分子量"のUb化蛋白質画分が得られた。前者は主にマルチUb化蛋白質からなる。後者はUbとチオエステル結合体したUb結合酵素(E2)も含み、E2精製にも有用と判明した。2.神経突起形成時に特徴的なUb化蛋白質の検出。PC12h細胞を神経成長因子(NGF)存在下で1週間培養した際に出現または増加するUb化蛋白質をFK2抗体による免疫沈降/SDS-PAGEで解析し、前者に3種類(18,19,36-kDa)、後者に6種類(20,23,26,51,68,93-kDa)の候補を見出した。3.PC12h細胞のUb化蛋白質の精製。NGFで処理したPC12h細胞(2x10^9個)の細胞質抽出液をFK2固定化カラムで精製しUb化蛋白質画分0.56mgを得た後、ゲル濾過で高分子量および低分子量の同蛋白質画分を獲得した。現在、後者の成分をSDS-PAGEで分離し、順次その限定分解産物のアミノ酸配列の同定を進めている。26-kDaバンドに関してはUb部分配列2種類と未知蛋白の部分配列5種類の結果を得た。4.抗Ub化タグペプチドに対する抗体作成。標的蛋白の同定に不可欠なUb化タグペプチドに対するモノクローナル抗体の作成は、抗原溶解性の問題から困難を極めたが、ペプチドの設計を改良し樹立に成功した。今後この抗体を用いて高分子量Ub化蛋白質の分析を行う計画である。
大学生のチャレンジ精神を醸成する学内起業による自律型ロボット教材の開発・製作

小学校高学年から中学生までを対象として,子どもたちが先端技術を直接体験することができる安価な教材を開発した。具体的には,マイクロコントローラを搭載した自律走行型ロボットの標準仕様ともいうべきものを開発した。基礎的なセンサは標準装備,ロボットの機構部分の製作は自由度が大きく,子どもの発想力を生かせる形のものを検討した。開発した教材については教育現場等で実践を行い,その効果について評価を行った。開発した教材はマザーボードを中心に量産化を実現し,学生を中心とした大学内起業を推進した。先端的な科学技術の基礎を子どもたちに教えようとするとき,その技術を取り込んだコンパクトな標準的な教材があれば,指導者の大きな助けとなると期待されることから,本研究では,先端技術を教材化して扱いやすい形で普及することを目的とし,特に,小学校高学年から中学生までを対象として,一貫して先端技術を学べるような,子どもたちが先端技術を直接体験することができる安価な教材の開発・評価・普及とそれを用いた科学技術の啓蒙を目指している。具体的には,マイクロコンピュータを搭載して自動走行する自律型走行ロボット等の製作を通して,小学生の場合には電子回路を組み込んだマザーボードの部分はブラックボックスとして与え,ロボット本体の「デザインと製作」および「プログラミング」を中心に,中学生の場合にはマザーボードの一部製作も含んで,子どもたちの独創性・思考力及び「ものづくり」への興味を育むことを計画している。平成25年度は開発したマイクロコントローラ搭載のマザーボードおよびソフトウェアを用い,自律走行が可能なビークル型ロボットや簡単なパフォーマンスが可能なダンスロボットの製作を通じて,小学校高学年から中学生までの子供たち20名程度に試行的に実践を行った。子供たちからの評価は好ましいものであったが,ロボットのハードウェア製作やプログラミング環境,ソフトウェアの機能等に関していくつかの課題も見つかったため,次年度には改善を行い,学生を中心とした大学内起業の実現を達成できるような教材とする予定である。平成26年度には開発したマイクロコントローラ搭載の自律走行型ロボットおよびソフトウェアを基に改善を行い,教員養成系大学の学部生80名程度に対しても授業の中で試行的に実践を行った。大学生に対しては製作・実践を行った一人あたりの時間は,小中学生に対して行った時間より短いため,単純な比較はできないが,このような体験をしたことがない学生も多かったことから,新鮮な印象を与えたようで学生からの評価は好ましいものであった。平成27年度は最終年度となるため,学生を中心とした大学内起業の実現を達成できるような教材とする予定である。子供たちからの評価は好ましいものであったが,ロボットのハードウェア製作やプログラミング環境,ソフトウェアの機能等に関していくつかの課題も見つかった。平成26年度にはそれらを基に改善を行い,教員養成系大学の学部生80名程度に対しても授業の中で試行的に実践を行ったが,このような体験をしたことがない学生も多かったことから,新鮮な印象を与えたようで学生からの評価は好ましいものであった。平成27年度は最終年度となるため,開発したマザーボードの量産化を実現し,学生を中心とした大学内起業を推進した。

平成25年度は上記のように当初の計画通り,開発したマイクロコントローラ搭載のマザーボードおよびソフトウェアを用い,小学校高学年から中学生までの子供たち20名程度にロボットの製作実践を試行的に行った。その際,ロボットのハードウェア製作やプログラミング環境,ソフトウェアの機能等に関していくつかの課題も見つかったが,改善が可能なものに対しては平成26年度に検討を行い改良した。例えば40名程度の受講者に対して授業実践を行おうとすると,20名程度の場合に比べて受講者の理解度の差がさらに広がることの問題や,マザーボードの動作不良率が同じでも(あらかじめ準備のための部品ハンダ付け等が学生による作業のため数パーセントの動作不良率)不良個体数全体は増加するなど,あらたな課題が出てきたため,多くの受講生の場合でも確実に動作し,授業計画等も含めて理解しやすい教材となるように,作業手順の工夫とチェック体制を見直した。それを基に平成26年度は,教員養成系大学の学部生80名程度に対しても授業の中で試行的に実践を行うこともあり,研究室レベルとしては大量の100個以上のマザーボードを動作不良率をほぼ0で製作し,学内企業の可能性を確認した。平成26年度に見つかった課題を基に教材としての完成度や製作方法などをさらに確実なものとする必要があるが,研究全体の進捗状況という面から判断すると,2年目としては,ほぼ計画通りに進展していると言える。社会科学平成27年度は,最終年度であるためマザーボードの完成度を高め,研究室レベルでの大量製作でも動作不良率が0となるよう安定した製作方法を確立する。具体的にはパターンデザインを変更して,取り付け作業上の確実性・能率性が向上するように素子のレイアウトを工夫する。併せて,基礎的なセンサやモータドライバーはマザーボードに標準装備,オプションのセンサやアクチュエータは拡張基板で供給することとしてあるが,オプション基板の充実を図る。特にオプションのセンサ類については,多様なものが利用可能と考えられるが,小学校で適用可能なもの,中学校で適用可能なもの等,学習レベルに応じて対応可能となるよう弾力的に開発を行ってきたが,これらも安定して製作ができるように工夫を行う。また,ロボットの機構部分の製作はこれまで以上に自由度が大きく,子どもの発想力を生かせる多様な形に改良を行い,走行型ロボットのみでなくパフォーマンスを行うようなロボットまで含んだ全体について研究分担者間で意見交換・検討を行う。完成したロボットの量産に当たって,マザーボード基板など製作を外注依頼するものと,ギアなど汎用の部品を流用するものとに分け,外注するものについては地元企業等の協力参加も含め量産体制の確立を行い,汎用部品については価格も考慮して最終決定を行う。
心血管系動態の高精度計測のための超高速超音波イメージングシステムの開発

循環器系は動的な器官であるため動態計測が必要不可欠である.超音波診断はCT,MRIに比べ時間分解能に優れるため動態計測に適しており,本研究者はこれまでに,超音波診断の長所である時間分解能を,血管系の計測において従来の数十Hzから1 kHz以上に飛躍的に向上させる方法を開発した.本研究では,心臓についても高速超音波イメージングを可能とするための超音波照射方法および受信ビームフォーミング法・超音波断層像構築手法について研究開発するとともに,開発した高速超音波イメージング法を実現するための多チャンネル超音波送受信システムの開発を行った.循環器系は動的な器官であるため動態計測が必要不可欠である.超音波診断はCT,MRIに比べ時間分解能に優れるため動態計測に適しており,本研究者はこれまでに,超音波診断の長所である時間分解能を,血管系の計測において従来の数十Hzから1 kHz以上に飛躍的に向上させる方法を開発した.本研究では,心臓についても高速超音波イメージングを可能とするための超音波照射方法および受信ビームフォーミング法・超音波断層像構築手法について研究開発するとともに,開発した高速超音波イメージング法を実現するための多チャンネル超音波送受信システムの開発を行った.本研究では,心臓の電気的興奮による心筋の収縮の伝播現象などを従来にない高精度で捉えることを目指し,心臓を数百Hzの高時間分解能で超音波イメージングする手法を開発するとともに,そのイメージング手法を実現するシステムを構築する.今年度は(1)心臓の高速超音波イメージング法の開発,および(2)高速イメージングを実現するためのシステムハードウエアの開発を行った.(1)については,心臓のセクタ走査に対応するための拡散ビームについて検討を行い,超音波プローブの素子に印加する信号の遅延時間を制御することで拡散ビームを送信可能であることを理論的,実験的に検証した.実際には,拡散ビームの仮想音源を,超音波プローブ表面から50mm100mm後方に設定することで心臓の高速超音波イメージングに適した拡散ビームを形成することができることを明らかにした.さらに,受信ビームフォーミング法については,送信拡散ビームの偏向による感度分布の変化を平滑化するため,1本の走査線を形成するために複数回の送受信を重ね合わせる手法を開発した.受信ビームフォーミング法を送信拡散ビームと組み合わせて実際に模擬対象物のイメージングを行い,従来法(フレームレート数十Hz)と同様の空間分解能で316Hzという高フレームレートを実現することができた.(2)についても開発を進め,超音波プローブの96素子の励振を同時に制御可能であり,かつ受信した超音波信号を96素子分標本化して保存可能な超音波送受信ユニットを開発した.平成25年度は,前年度までに開発した超音波送受信システムおよび高速超音波イメージング法を用いた生体組織動態計測法の開発および評価実験を行うとともに,ヒトでの非侵襲in vivo計測を行った.高速超音波イメージングシステムを用いて得られる生体組織からの反射・散乱超音波RF (radio frequency)信号をもとに,対象物の変位をトラッキングすることができる手法を開発した.シリコーンゴムを用いた生体模擬ファントムを用いて評価実験を行ったところ,従来のトラッキング手法より高い変位推定精度が得られることを確認した.また,ヒトを対象とした非侵襲in vivo計測により,開発したトラッキング法を用いることで心臓収縮に伴う心筋変位や頸動脈の脈波伝播速度などの計測が行えることを示した.血流動態計測法については,高速超音波イメージングシステムを用いて得られる超音波RF信号について時間方向に高域通過(moving target indicator: MTI)フィルタを適用し,超音波RF信号のフレーム間の相関を評価することにより血球からの微弱な超音波エコーを描出する手法を開発した.血球からの超音波エコーを高時間分解能で描出することで,血流による血球の動きを観察することが可能である.ただ,心臓に関しては,体内深部に存在するため超音波の伝搬減衰が大きく,血球からのエコーを高いSN比で得ることが困難であった.開発した高速超音波イメージング法では,送信ビームを集束させず,球面状に拡散させているため,対象領域(心臓)において超音波音圧が従来の集束ビームに比べ低下してしまう.拡散ビームを用いた場合の超音波出力は,現段階では安全基準を大きく下回っているため,超音波送受信系の出力を向上させ,高速超音波イメージングにおいても十分な超音波音圧を実現するようにすることが今後の課題である.本研究では,心臓の電気的興奮による心筋の収縮の伝播現象などを従来にない高精度で捉えることを目指し,心臓を数百Hzの高時間分解能で超音波イメージングする手法を開発するとともに,そのイメージング手法を実現するシステムを構築する.本年度も引き続き(1)心臓の高速超音波イメージング法の開発,および(2)高速超音波イメージングシステムの開発を行った.(1)については,前年度に送信に用いる球面拡散ビームの最適化を行い,受信において並列ビーム形成を行うことで300 Hz以上の高フレームレート計測が可能であることを示したが,送信に拡散ビームを用いるためサイドローブレベルが上昇し,それによる不要エコーが増加するという問題があった.そこで,超音波プローブ(96素子から構成)で受信した各素子の信号間のコヒーレンスを評価し,それによる重み付けを行うことによりサイドローブレベルを従来法よりも低減できる手法を開発し,従来の超音波断層像と同等の画質を保ちながら高時間分解能化を実現することに成功した.(2)については,前年度に開発した96チャンネル超音波送受信ユニットにより計測される,超音波プローブ各素子で受信された信号の処理を行う信号処理ユニットを開発した.

超音波送受信ユニットと信号処理ユニットを接続して超音波送受信のテストを行い,超音波送受信ユニットで送受信した超音波信号を信号処理ユニットに転送して表示することが可能であることを確認した.本システムに超音波信号処理アルゴリズムを組み込むことで,数Hzから30 Hz程度のフレームレートで断層像をリアルタイム表示しながら,数百Hzの高フレームレートで計測した超音波プローブの各素子で受信した信号をシステムのハードディスクに保存することが可能となる.当初の計画とおり,従来法(数十Hz)よりもはるかに高時間分解能(300Hz以上)の超音波イメージング法を開発することに成功している.また,本イメージング法を実現するためのシステムのハードウエア開発も順調に進んでおり,来年度開発予定の信号処理ユニットの設計について既に検討を始めていることから当初の計画以上に進展していると評価できる.25年度が最終年度であるため、記入しない。心臓について,従来の超音波断層像と同等の画質を保ちながらはるかに高時間分解能を実現するために必要な,球面拡散ビーム使用時のサイドローブなどによる不要エコーを低減する手法を開発することに成功した.また,高速イメージング法を実装するための信号処理ユニットの開発を行い,完成させることができた.完成させた信号処理ユニットは,前年度に構築した超音波送受信ユニットと接続して動作テストを行い,動作確認を行い,問題なく動作することを確認している.このように本年度予定していた高速超音波イメージングシステムのハードウエアの構築を完了させたことから,順調に進展していると言える.今後は,開発した高速超音波イメージング法を実現するためのシステム構築に重点を置く.また,高速イメージング法の画質をさらに向上させるため,サイドローブ低減技術などの研究開発も行う.25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,完成させた高速超音波イメージングシステムハードウエアについて,超音波送信時に超音波プローブに印加する励起信号波形の設定や送受信アンプのゲイン設定など,超音波送受信に関するシステムのパラメータについて最適化を行う.また,完成させた高速超音波イメージングシステムハードウエアにより得られる超音波受信信号から超音波断層像を構築するためにこれまで開発してきた高速超音波イメージング法をシステムに実装するためのアルゴリズムの開発を行う.また,高速超音波イメージングシステムにより高時間分解能で得られる超音波信号に動態計測法を適用し,生体計測における本システムの有用性について検討を行う.
骨組織適合性を持つ有機-無機ハイブリッドナノカプセルの作製と機能化

本研究の目的は、当研究室で開発された高い構造安定性を持つベシクル型有機-無機ナノハイブリッド「セラソーム」の骨組織親和性材料としての可能性を明らかにすることである。セラソームはその表層に原子厚みのシリカ骨格を有するため、骨の主要無機成分であるヒドロキシアパタイト(HAp)に対する親和性が高いと期待される。昨年度までに、ヒト体液と同様の無機イオン組成を持つ擬似体液を用いた生体類似環境下でのHApの形成を評価することで、セラソーム表面がHApの不均一核形成および結晶化を誘起することを明らかにしている。今年度は、セラソーム表面でのHAp形成における、表面官能基の効果について詳細な検討を行った。HAp構成元素の一つであるカルシウムイオンを捕捉可能なカルボキシル基を頭部に1個または2個持つ脂質を合成し、それらとセラソーム形成脂質との混合比を変えることでセラソーム表面の官能基組成を変化させ、組成の違いがHAp析出能に与える影響について検討した。その結果、セラソーム表面へのカルボキシル基の提示によりHApの析出が促進されることがわかり、頭部に2個のカルボキシル基を持つ脂質においては1モル%という低含量においても促進効果がみられた。1個のカルボキシル基を持つ脂質においても、膜中の含量が5モル%以上では2個のカルボキシル基を持つ脂質と同様の促進効果を示した。これらの結果から、適切な表面デザインをすることによりセラソーム表層へのHAp析出を制御できることが明らかとなった。本研究で得られた表面がHApで修飾されたセラソームは、骨組織指向性の薬物キャリアや物質保持能を持つ構造安定な人工骨セメントの添加剤などの応用が期待される。本研究で示した表面修飾セラソームの設計概念はHApに限らず他のバイオミネラル析出系にも拡張できると考えられ、今後その実証に向けて更なる検討を進める予定である。当研究室で開発されたベシクル型有機-無機ナノハイブリッド「セラソーム」は、その表層に原子厚みのシリカ骨格を有しており、従来のベシクルと比較してはるかに高い構造安定性を持つナノカプセルである。一方でシリカ表面を持つ材料は骨の主要無機成分であるヒドロキシアパタイトに対する親和性が高いことが知られている。本研究では、表面にシリカ骨格を持つセラソームの骨親和性材料としての有用性を実証することを目的としている。今年度は、セラソーム表面へのヒドロキシアパタイト層の形成について検討を行った。手法としては、ヒトの体液と同様の無機イオン組成を持つ擬似体液を用いた、生体類似環境下でのヒドロキシアパタイト形成プロセスを利用した。セラソームの高い構造安定性を活かし、セラソームを固体基板上に集積化し、その基板を擬似体液に浸漬した。浸漬後の基板表面について走査型電子顕微鏡観察、エネルギー分散型X線分析、X線回折測定などを行うことよりヒドロキシアパタイト形成を評価した。その結果、擬似体液に浸漬することでセラソーム表面にヒドロキシアパタイトの形成が確認され、一週間の浸漬により基板全面をヒドロキシアパタイトの結晶で覆うことが可能であることがわかった。すなわち、セラソーム表面のシリカ骨格は擬似体液からのヒドロキシアパタイトの不均一核形成を誘起することが明らかとなった。さらに、セラソームが脂質の分子集合体である特徴を活かし、セラソーム形成脂質とカルボキシル基を持つ脂質分子とを混合したセラソームを作製し、それらに対するヒドロキシアパタイトの析出について検討を行った。その結果、セラソーム表面にカルボキシル基を提示することにより、ヒドロキシアパタイトの形成が促進されることがわかり、現在さらに詳細な検討を続けている。これらの成果はセラソームの骨親和性ナノカプセルとしての可能性を強く支持するものである。

本研究で示した表面修飾セラソームの設計概念はHApに限らず他のバイオミネラル析出系にも拡張できると考えられ、今後その実証に向けて更なる検討を進める予定である。
燃料作物ジャトロファの安全性評価に基づく抗発がんプロモーション活性物質の取得

ナンヨウアブラギリ(Jatropha curcas)はその種子中にバイオディーゼルの生産に適した流動性の高い中性脂質を50%以上含み、次世代のバイオ燃料の原料作物として期待されている熱帯性灌木である。一方本植物は油脂以外に二次代謝産物として発がんプロモーション活性を持つホルボールエステル類を生産する。我々は、本植物の安全性を評価する過程でジャトロファの代謝産物中に,既存の強力な発癌プロモーション活性物質であるPMAの作用を逆に抑制する作用を持つ代謝産物が存在することを示唆する結果を得た。本研究では、この抗発がんプロモーション活性物質の化学的性状および生理活性について知見を得た。中南米原産の落葉低木であるジャトロファ(Jatropha curcas)は,その種子中にバイオディーゼルの生産に適した流動性の高い中性脂質を50%以上含み,病害虫に強く,半乾燥地や貧栄養土壌でも栽培可能であることから,次世代のバイオ燃料としてすでにEUや東南アジア・アフリカなどで,その試験栽培と生産性や経済性の実証研究が開始されている。しかし、本植物は,次世代バイオ燃料植物として多くの利点を有する一方,実用化するにあたっては留意すべき問題点も併せ持っている。すなわち,本植物の種子には油脂以外に,発がんプロモーション活性を有するホルボールエステル類(PEs)を含み、生産者や消費者の健康に与える影響が懸念される点である。申請者はジャトロファの安全な普及に資するため,ホルボールエステル類の毒性の詳細な検討や安全性の評価を行ってきた。この過程でジャトロファの代謝産物中には,強力な発癌プロモーション活性を持つことが知られるPMA(phorbol-12-myristate-13acetate)の作用を逆に抑制する作用を持つ代謝産物が存在することを示唆する結果を得た。本年度はこの作用がジャトロファの産生するどのような代謝産物に起因するのかを調べる目的で,PE類を生産しないジャトロファ無毒株の抽出物を用いたアッセイを行うと共に,活性の標的を探るためのin vitroアッセイ系の構築を試みた。申請者らは,次世代バイオ燃料植物として多くの利点を有するジャトロファ(Jatropha curcas)の安全な普及をめざし,本植物が産生する発がんプロモーション活性物質であるホルボールエステル類(PE類)の毒性の詳細な検討や安全性の評価を行ってきた。この過程で本植物の代謝産物中には,強力な発癌プロモーション活性を持つことが知られるPMAの作用を逆に抑制する作用を持つ代謝産物が存在することを見いだした。昨年度(H26年度)はこの作用が本植物の産生するどのような代謝産物に起因するのかを調べる目的で,PE類を生産しない無毒株の抽出物を用いた活性評価を行った。その結果,無毒株抽出物は,マウス皮膚2段階試験においてPMAによる発がん効果を抑制せず,有毒株抽出物がPMAの作用を有意に抑制することを合わせて考えると,この抑制効果がジャトロファのPE類に起因していることを示唆した。この結果を受けてH27年度は,活性の指標としてマウス皮膚2段階試験と共に頻用されるRaji細胞のEBV-EA(Epstein-Barr virus早期抗原)誘導試験を用いて同様の結果が得られるかを検討した。Raji細胞は,EBVゲノムを保有し,PMAなどの発癌プロモーターで処置することにより,EAが誘導されるため,このEAを間接的蛍光抗体法によって検出することにより活性評価が可能である。一方,本方法は,EA発現細胞を蛍光顕微鏡により観察し,蛍光を発する細胞を計数することによって評価を行うため,計測数に限りがあることや,判断が目視のため,実験者によって結果に差が出てしまうなどの問題がある。そこでまず,EAの間接的蛍光抗体法での検出をフローサイトメトリー(FCM)で行う方法の検討を行った。さらに,別法としてリアルタイムPCRを用いたEAのmRNAの定量解析による活性評価を検討した。まず,EAの間接的蛍光抗体法での検出をフローサイトメトリー(FCM)で行う方法の検討では,ポジティブコントロールとしてPMAを用い,Raji細胞に対して48時間のEA誘導を行ってEA抗体および二次抗体によって蛍光標識した。このときPMAの培養液添加に伴い細胞に形態変化が生じることが観測された。この形態変化はJatropha抽出物を添加したものでも観察された。Raji細胞は浮遊細胞であるが,形態変化したものは接着性を示した。この接着性はFCMにおける計測にも影響し,見かけ上の細胞の大きさが変化するため正確な計測を行うには,剥離処理等の前処理の検討が必要である事が判った。一方,この細胞の形態変化は,発がんプロモーション活性物質の多様な作用の一つと考えられ,形態変化そのものや,これに伴う細胞骨格の変化を捉えた新しい発癌プロモーション活性評価や,化学発癌のメカニズム解明への示唆を与えるものであった。一方,EA関連遺伝子発現のリアルタイムPCRによる定量化を用いた活性評価法の検討では,コンパレイティブCT法によりGAPDHとの相対発現定量の解析を行った。その結果,バックグランドでの発現はほぼ無く,ジャトロファ代謝産物ではPMAの約1/5のEA関連遺伝子(BRLF-1)の発現が見られ,本法は発癌プロモーション活性の定量化に利用可能である事が判った。報告者らは、バイオ燃料原料作物として有望な熱帯植物ジャトロファ(Jatropha curcas)の安全な普及と利用をめざし,本植物が産生するホルボールエステル類の毒性の詳細な検討や安全性の評価を行ってきた。

この過程でジャトロファの代謝産物中には,強力な発癌プロモーション活性を持つことが知られるトウゴマ由来の二次代謝産物であるPMA(phorbol 12- myristate 13-acetate)の作用を逆に抑制する作用を持つものが存在することを見出した。昨年度(H27年度)までに、PE類を生産しないジャトロファ無毒株の抽出物を用いた発癌プロモーション活性評価を、マウス皮膚2段階試験および、ヒトバーキットリンパ腫細胞(Raji細胞)の間接蛍光抗体法を用いたEBV-EA(Epstein-Barr virus早期抗原)誘導試験、さらに、リアルタイムPCRを用いたEAのmRNAの定量解析を用いて検討し、無毒株抽出物は,マウス皮膚2段階試験においてPMAによる発がんプロモーション効果を抑制しないこと、有毒株抽出物がPMAの作用を有意に抑制すること,さらにこの抑制効果がジャトロファの産生するPE類に起因していることを示した。一方、一般に化学発がん過程には多数の因子(タンパク質)が関与していると考えており、これらの因子が作用する各ステップに影響を与える化合物が見つかれば、発がん機構の解明に役立つ分子プローブとなりうるだけでなく、新しい抗がん剤の設計に示唆を与えるものと考えられる。そこで、H28年度は,Jatropha curcasの産生するPE類の生理作用をさらに詳しく検討し、発がんの如何なる過程に本化合物が関与するかを明らかとする目的で、細胞増殖能と細胞形態変化誘導活性を調査し,腫瘍形成の過程と転移浸潤過程に与える影響をそれぞれ独立に評価した。本課題の昨年度までの結果から、Jatropha curcasの産生するPE類(以下JcPEs)は、マウス皮膚に段階発がん試験および、EBV-EA誘導試験において活性を示すものの、その作用はPMAの活性の100分の1程度であること、PMAとJcPEsをこれらの試験に同時に供試することにより、JcPEsはPMAの活性をJcPEs単独投与のレベルまで低下させることが明らかとなった。また、この研究過程でPE類添加に伴い浮遊細胞であるRaji細胞に形態変化が生じ、さらに形態変化したものは接着性を示すことを見出した。細胞の接着性はがんの浸潤過程に関与すると考えられるため、H28年度は、JcPEsおよびPMAの細胞増殖能と細胞形態変化誘導活性を調査することにより,腫瘍形成の過程と転移浸潤過程に与える影響をそれぞれ独立に評価した。試験の結果、細胞増殖活性においてはJcPEsは、供試した濃度範囲(0.00110ppm)でほとんど活性は見られず、かつ1ppmのJcPEsをPMAと同時投与することによりPMAの細胞増殖活性を約5分の1にまで低下させることが明らかとなった。一方、接着細胞への形態変化に関しては、0.0001ppm1ppmの濃度範囲で活性が見られ、これはPMAの活性とほぼ同程度であった。このことから、JcPEsは細胞増殖活性はあまりなく、細胞分化活性が強いことが示唆された。今回得られた知見は、PE類の構造活性相関研究に有用な知見を与えるだけでなく、新しい分子プローブの分子設計にも資するものと期待される。このように本研究は現在のところ順調に推移していると考えている。