hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家蚕觸角の神経発生に関する研究

1.カイコ幼虫の成虫觸角原基が、変態期間を経て成虫觸角となる過程およびその間の神経細胞の発生について、種々の方法により研究した。2.幼虫觸角には、計13個の感覚子に52個の感覚神経細胞が分布し、それらの軸索は2本の神経索となって脳へ向かっている。3.幼虫期の原基は多列上皮構造であるが、前蛹期に反転して袋状の蛹觸角となる。蛹化直後の觸角上皮は単層構造となり,その中に成虫神経細胞がすでに分化しはじめている。しかし軸索はまだ伸びていない。4.蛹化12時間目ごろから成虫触角の形態形成運動が開始され、これに伴って成虫神経細胞も軸索を伸ばして2本の神経索に合流する。このころ幼虫神経細胞は退化消失してしまうので、幼虫と成虫の各神経細胞の交代がおこる。タバコスズメガで見られた「蛹神経細胞」は存在しない。5.幼虫の原基を摘出し、これを他固体幼虫を宿主として移植した。発育時期の異なる宿主に移植された場合,原基は移植時の発育程度にかかわらず、ほぼ宿主の体内環境に従って発育・変態を行った。6.幼虫の原基を摘出し、これを種々の濃度のβ-エクジソンを加えたGrace培養液で組織培養した。少なくとも蛹化初期の状態までは原基を培養下で発育変態させることが可能であり、そのための好適エクジソン濃度はほぼ生体血液内濃度に近い値であった。成虫触角も培養下でほぼ形成されたが、クチクルは形成されず神経細胞も確かめられなかった。7.摘出した原基を細断または酵素処理して組織を分解し、これを培養して細胞培養下での細胞系の確立と神経細胞の分化とを試みた。種々の培養液のうちMGM448液が最も好結果を得た。細胞の増殖形態は4種類見られたが、継代による細胞系の確立はまだ成功していない。しかし分散して増殖した細胞群の中から、明らかな神経細胞が分化して来たので、培養下での神経細胞分化は成功したと考えられる。1.触角の神経発生の基礎的データを得る目的で、5ーブロモー2′ージオキシウリジンの核内とりこみを検出する細胞化学的手法により、幼虫頭部内に存在する成虫触角原基細胞の増殖分化過程を調べた。原基細胞は幼虫期に盛んに増殖するが、これはほとんど分化を伴わず、ほぼ均質な細胞の増加に留っている。原基組織は多列上皮構造で、その表面にのみ分裂像が見られるので、脊椎動物胚の神経管と同様な機構により細胞増殖を行うと思われる。蛹化前に増殖は停止し、代って原基組織構成細胞の「並べ変え」によって原基表面積が急激に増大し、蛹触角が形成される。神経細胞の質的な分化はこれにひきつづいておこる。すなわち蛹化前後を界として、細胞の増殖過程と分化過程の切り替えが生じる。2.幼虫の触角原基を摘出し、これを細断して組織片とするか又は酵素処理により組織を解離して、原基細胞のin vitroでの培養を行った。培養液はGrace液やMGM448液などを用いた。

培養期間は10ケ月以上に及んだ。組織片や細胞塊から出発した流出細胞は、種々の形式により増殖・組織化した。これらの細胞は袋状や扁平な組織を形成したり、または分散したままで増殖した。その中には数種の細胞があり、その1つからは培養中に明らかに神経細胞と思われるものが分化して来たので、この細胞は神経芽細胞と考えられた。神経細胞は多極性の長い突起を生じ、その形を変化させながら1ケ月以上生存した。生体の触角原基は変態時に多数の神経細胞を分化させるが、この過程が培養条件下でも再現しうることが明らかになった。由来の確実な原基組織から培養下で神経細胞を得た研究例は、まだ報告がない。上記のように、原基細胞は培養下である程度増殖したが、まだ細胞系として確立されるには至っていないので、今後の研究はこれを目標としたい。さらに、培養状態での神経細胞分化の好適条件をも追及する予定である。1.觸角原基細胞由来の細胞系確立に関しては、従来の方法でほゞ、適当であることが判明したが、なおひきつづき改善に努めている。2.5令5日目の幼虫から摘出した觸角原基を、発育時期の種々異なった幼虫体内に移植し、宿主幼虫が蛹または成虫に変態した後に取り出してその発育程度を檢当した。その結果、原基の発育変態はほゞ一義的に宿主体内のホルモン環境に依存しておこるものであることがわかった。3.5令5日目の觸角原基を取り出して器官培養し、これに変態ホルモンを与えて、培養下で変態をおこさせる好適ホルモン条件を探った。主としてβーエクジソンの培養下原基に対する作用を調べ、幼虫から蛹への初期変態をおこさせるに適当なエクジソン濃度は、約1μg/mlであることが認められた。これは生体血液内のホルモン濃度にほゞ見合う値であった。また、同一濃度のエクジソンを与えても、それが変態開始への「方向づけ」に効果を現すまでの時間は、実際に変態の可視的形態変化がおこるのに要する時間の約2分の1であることがわかった。さらに変態が進み、蛹化から成虫化へ向うための好適条件は、510μgという高濃度のエクジソンを短時間与えることであり、長時間与えるとかえって悪影響があらわれた。このような高濃度は生体ではありえないことなので、この点に関してはなお今後の檢討を要する。4.ショウジョウバエ等で発見された、混虫ニュ-ロン特有の抗原物質(抗HRP抗体)が成虫觸角ニュ-ロンの発生・分化に際して出現するであろうとの予想の下に、これを細胞化学的方法(Jan 5,1982)によって檢出を試みた。しかし、蛹化直後の成虫ニュ-ロン発生初期には同物質がほとんど檢出できず、蛹後期の完成された成虫ニュ-ロンに至って確実に檢出された。神経発生過程の追跡という点では、通常のメチレブル-生体染色の方がより適当であろうと考えられた。
単純ヘルペスウイルス再活性化による顔面神経麻痺モデルに関する基礎研究

近年諸家の報告により、ベル麻痺(特発性顔面神経麻痺)の病因として顔面神経節に潜伏感染した単純ヘルペスウイルス1型(以下HSV-1)の再活性化が強く関与していることが有力視されている。申請者らは既にHSV-1初感染顔面神経麻痺モデルの作製に成功しており、同モデルにて再活性化の必要条件である潜伏感染も共生培養法にて証明している。今回、よりベル麻痺発症に類似したHSV-1再活性化による顔面神経麻痺モデルの作製を試みた。実験方法はBalb/cマウスの一側耳介にHSV-1を接種し、初感染による一側性一過性顔面神経麻痺を発症させた。麻痺治癒後、潜伏感染の成立した2から4カ月経過したマウスに対して、抗T細胞抗体(抗TCR抗体、抗CD3ε抗体)を用いた選択的細胞性免疫抑制と神経終末である耳介擦過による局所刺激を併用しHSV-1再活性化を誘発した。以後、連日マウスの全身状態と髭・鼻翼の動き、また瞬目反射にて顔面神経機能を詳細に観察した。免疫抑制後翌日から全てのマウスに立毛と活動性に低下が出現した。免疫抑制後7から14日目に約28%のマウスに顔面神経麻痺が出現し、麻痺は約14日間持続した。初感染麻痺モデルと比較すると麻痺程度は軽度であった。免疫蛍光法にて麻痺側脳幹顔面神経下行脚と運動核にHSV-1抗原を同定し、病理組織学的には脳幹顔面神経下行脚から膝部に炎症細胞の浸潤を、また脳幹運動核にHSV-1の炎症に特異的とされる核内封入体を認めた。これらのことからHSV-1再活性化による麻痺と考えられた。
インジウム・セレン多結晶薄膜の構造制御と薄膜太陽電池への応用

欠損性ウルツ鉱構造を有するγ-In_2Se_3は、禁制帯幅1.9eVの直接遷移型半導体であり、タンデム型太陽電池のトップセル用材料として適している。本研究では、In_2Se_3多結晶薄膜の構造制御を行い、評価を行った。また、In_2Se_3多結晶薄膜太陽電池の試作を目指して、p形層としてp-ZnTeを提案し、ZnTe多結晶薄膜の製膜条件の最適化、伝導度制御等を行った。まず、フォトルミネッセンス(PL)法によりIn_2Se_3多結晶薄膜の光学的特性の評価を行った。基板温度500°C、VI/III比4で作製したα相をほとんど含まないγ-In_2Se_3多結晶薄膜の5.7KにおけるPLスペクトルを測定したところ、波長860nm付近および940nm付近をピークとするブロードな発光が観測された。これらの発光の起源を検討するために、測定温度依存性を検討した。860nm付近のピークの活性化エネルギーを見積もったところ、91.6meVとなった。また、940nm付近のピークについては2つの活性化エネルギーがあるとすると温度依存性がうまくフィッティングでき、活性化エネルギーを見積もったところ、5.31meV、35.0meVとなった。また、真空蒸着法によりCuをドープしたZnTe多結晶薄膜の作製を試みた。900°C960°CでCuドーピングした膜の表面は平坦であるが、1000°Cでは表面が荒れてしまうことがわかった。Cuの加熱温度を1000°CまであげるとCuが過剰にドープされ、ZnTe以外の物質Cu_4Te_3、Cu_<1.50>Zn_<0.3>Te、Cu_2Teが形成されることがわかった。また、Cuの加熱温度を変化させることにより導電率を制御でき、960°Cで約10^<-2>S/cmと低抵抗な薄膜が得られた。申請者はこれまでに、MBE法によりγ-In_2Se_3多結晶薄膜の作製を試みてきたが、作製した膜にはα-In_2Se_3(禁制帯幅1.4eV)がかなり含まれていた。本研究では、製膜条件の制御によりIn_2Se_3多結晶薄膜の構造制御を行い、電気的・光学的特性の評価を行った。In_2Se_3多結晶薄膜は、製膜温度を400°Cまたは500°Cとし、VI/III比は160の範囲で変化させた。X線回折測定の結果よりVI/III比が10以上と大きいときには、γ-In_2Se_3とα-In_2Se_3両方の回折ピークが観測されているが、VI/III比を4以下と小さくすることにより、α相をほとんど含まないγ-In_2Se_3多結晶薄膜が得られていることがわかった。しかし、VI/III比を1とさらに小さくすると、組成比が1:1の層状構造を有するInSeが形成されることがわかった。また、電気的特性の評価を行ったところ、γ-In_2Se_3多結晶薄膜が得られているVI/III比4では暗導電率が10^<-9>S/cm程度と非常に高抵抗であることがわかった。一方、VI/III比を40以上に大きくすると暗導電率は増加した。これは層状構造を有するα-In_2Se_3の含有量が増加したためと考えられる。これに対して、VI/III比を1と減少させた場合には層状構造を有するInSeが形成されるが、暗導電率は10^<-5>S/cm程度に増加した。また、VI/III比4でAM1.5,100mW/cm^2のソーラーシミュレータ光を照射したときの光導電率が10^<-5>S/cm程度であり、光感度(σ_<photo>/σ_<dark>)が4桁程度と大きな値が得られた。

また、真空蒸着法によりCuをドープしたZnTe多結晶薄膜の作製を試みた。900°C960°CでCuドーピングした膜の表面は平坦であるが、1000°Cでは表面が荒れてしまうことがわかった。Cuの加熱温度を1000°CまであげるとCuが過剰にドープされ、ZnTe以外の物質Cu_4Te_3、Cu_<1.50>Zn_<0.3>Te、Cu_2Teが形成されることがわかった。また、Cuの加熱温度を変化させることにより導電率を制御でき、960°Cで約10^<-2>S/cmと低抵抗な薄膜が得られた。
In vivo機能ゲノミクススクリーニングによる卵巣がん腹膜播種メカニズムの解明

ヒト遺伝子を標的としたshRNAライブラリーを安定発現するヒト卵巣癌細胞株を作成した。この細胞株を用いて、発現抑制によりanoikis耐性に関与する遺伝子の同定に成功し、そのひとつ、ABHD2について、機能実験を行い、シスプラチン耐性との関連を見出した。また、発現抑制によりHoechst 33342の高い排出能をもつSide Population細胞が増加する遺伝子を同定した。この遺伝子について、発現抑制株はスフィア形成能などの幹細胞形質を獲得していることを機能実験で示した。レンチウイルスベクターに組み込まれた、マウス遺伝子をターゲットとしたshRNAライブラリーを293FT細胞に感染させることで、レンチウイルスを産生させた。このレンチウイルスをマウス卵巣がん細胞株へ感染させることにより、安定した遺伝子導入を行った。この細胞株を同系マウスの腹腔内に接種してできた腹膜播種腫瘍を回収したが、腹膜播種組織内の腫瘍細胞をソーティングしてクローニングしたところ、shRNA配列が含まれていなかった。現在、各工程の問題を検証中であると同時に、他のマウス卵巣がん細胞株でも同様の実験を行っている途中である。一方で、ヒト遺伝子をターゲットとしたshRNAライブラリーを安定発現するヒト卵巣がん細胞株を複数作成することができたので、これらの細胞株をヌードマウスに投与して、腫瘍細胞を回収し、同様のクローニングを試みる予定である。また、shRNAを遺伝子導入したヒト卵巣がん細胞株を用いて、発現抑制によりanoikis耐性に関与する遺伝子の同定に成功し、そのひとつ、ABHD2について、機能実験を行い、シスプラチン耐性との関連を見出し、論文として報告した。また、同様の手法でヒト卵巣がん細胞株を用いて、発現抑制によりHoechst 33342の高い排出能をもつSide Population細胞が増加する6つの遺伝子を同定した。Side Population細胞は癌幹細胞の形質の一つと考えられている。これらの遺伝子について、それぞれshRNAにより発現抑制株を作成し、コントロール株と比較して幹細胞形質を獲得しているかどうか、機能実験を行っている。shRNAライブラリーを導入したマウス卵巣癌細胞株のin vivoでの増殖・回収に成功していないため。レンチウイルスベクターに組み込まれたshRNAライブラリーをマウス卵巣癌細胞株であるHM-1およびID8に添加したところ、安定したマーカー発現を得た。こうして得たshRNAライブラリー導入マウス卵巣癌細胞株をそれぞれ同系の免疫正常マウスに腹腔内接種して腫瘍形成を観察した。HM-1では腫瘍が回収できたものの、回収した腫瘍内のHM-1細胞にshRNA配列が入っていなかった。ID8では腹膜播種腫瘍が形成されず、腫瘍の回収ができなかった。遺伝子導入したマウス卵巣癌細胞株は何らかの理由(免疫により排除されるなど)で、腫瘍形成できなかったと考えられる。そこで、次に、同様の手法で、レンチウイルスベクターに組み込まれたヒト遺伝子を標的としたshRNAライブラリーをヒト卵巣癌細胞株に安定導入した。すると、発現抑制によりHoechst 33342の高い排出能をもつSide Population細胞が増加する6つの遺伝子を同定した。これらの遺伝子について、それぞれshRNAにより発現抑制株を作成し、コントロール株と比較して幹細胞形質を獲得しているかどうか、機能実験を行ったところ、スフィア形成能や、単細胞クローン形成能、マウスにおける腫瘍形成能、抗がん剤耐性といった悪性形質がいずれも上昇していることを見出した。さらに、これらの悪性形質獲得は、Hedgehog経路の活性化を通じてもたらされることを示した。実験工程を再度検証し、引き続きマウス卵巣癌細胞株を用いたshRNAライブラリーの安定した導入をめざす。一方で、マウス卵巣癌細胞株を用いた実験が不成功である場合、すでに樹立しているヒト卵巣癌細胞株を用いて、in vivoスクリーニングを含めた予定の実験を推進していく。また、shRNAライブラリースクリーニングによりside populationを増やす、すなわち癌幹細胞化に関与する遺伝子を同定したため、これらの遺伝子の機能実験を推進する。産婦人科マウス卵巣がん細胞株のin vivoで形成した腫瘍を回収したところ、期待したshRNAが導入されていなかったことから、工程を再検証中である。このため次のshRNAのセカンドライブラリー作成に進むことができなかったため、予定通り計画が進行していない。工程を検証し、in vivo機能スクリーニングに成功すれば、セカンドライブラリー作成およびshRNAによる機能の検証実験に進む予定である。その際必要な試薬などの消耗品に使用する予定である。
心臓内に流入する神経堤細胞の正体の解明～多分化能と可塑性はどこまで保持されるか

本研究において我々は、マウスと鳥類胚を用いた発生学的実験により、従来「心臓神経堤細胞」として知られていた後耳胞領域より頭側の(前耳胞)頭部神経堤細胞が心臓内に遊走し、冠動脈平滑筋を始め、半月弁や心筋層内の間葉細胞に分化することを見出した。さらに単一細胞の遺伝子発現解析により、心臓内に流入する神経堤細胞の一群にはc-Kitなど幹細胞マーカーを発現する細胞群が含まれ、神経堤幹細胞としての多分化能をもつ細胞が心臓内においても保持されている可能性が示された。神経堤細胞を標識するWnt1-Cre;R26Rマウスにおける心臓内の神経堤由来細胞の分布と神経堤のウズラ-ニワトリキメラ移植の結果を比較し、従来心臓神経堤細胞として知られていた後耳胞領域の神経堤に加えて、主に頭部骨格を形成する前耳胞領域の神経堤細胞も心臓内に遊走し、半月弁(大動脈弁及び肺動脈弁)を形成する間葉細胞に異なる分布パターンで寄与すること、心基部領域へは前耳胞神経堤細胞の寄与が大きく、冠動脈起始部から中隔枝にかけての平滑筋細胞に分化することを明らかにした。さらに、前耳胞神経堤と後耳胞神経堤(心臓神経堤)それぞれの除去実験によって、弁形成や冠動脈形成に異なる異常が生じ、神経堤細胞の起源によって心臓形成に対して異なる役割を果たしていることが示唆された。また、マウス-ニワトリ胚間の頭部神経堤キメラ移植を行い、ウズラ-ニワトリキメラ移植同様の遊走パターンが得られた。しかし、遊走細胞数が少なく、単一細胞の遺伝子発現解析に供するには宿主由来の細胞数に対する比率が低すぎて効率が悪いと判断されたため、効率改善方法の検討とともに、Wnt1-Cre;R26Rマウス心臓からの神経堤由来細胞の単離と解析を試みることとした。一方、神経堤細胞の冠動脈平滑筋細胞への分化と冠動脈形成にエンドセリンシグナルが関与していることをマウス及び鳥類胚における阻害実験で明らかにしてきたが、その過程でエンドセリンシグナル阻害がマウスでは鼓膜の消失、ニワトリでは鼓膜の重複が起こすことを見出た。この結果を倉谷滋博士(理研)らとの共同研究によって発展させ、脊椎動物の進化の過程で鼓膜がマウスと鳥類・爬虫類とで独立に獲得されたという進化生物学上の仮説を実験発生学的に実証することが出来、その成果をNature Communications誌に報告した。神経堤細胞はニューロンやグリア細胞からメラノサイト、頭部の骨軟骨細胞に至るまで多彩な分化能をもつ幹細胞群である。心大血管系においても後耳胞領域の心臓神経堤細胞と呼ばれる細胞群が大血管の平滑筋や隔壁形成に寄与し、その発生異常は総動脈幹や大血管転位などの病態に関与する。最近我々は、心臓神経堤細胞よりも頭側にあり、第1,2鰓弓に遊走して頭部骨格の形成に中心的役割を果たす頭部神経堤細胞が心臓内にも流入し、一部は冠動脈近位部の平滑筋細胞に分化することを見出した。本研究においてはさらに、この心臓内に流入する神経堤細胞についてニワトリ胚とマウス胚を用いて研究を進めた。ニワトリ胚における蛍光ラベルとWnt1-Creマウスによる神経堤細胞の追跡により、前耳胞神経堤細胞は後耳胞神経堤細胞(心臓神経堤細胞)に先んじて心流出路内を遊走し、心基部に集簇しながら冠動脈平滑筋の他に半月弁、乳頭筋、心外膜などに分布することが明らかになった。Wnt1-Cre; ROSA-EYFPマウスによるソーティングとFluidigm C1による単一細胞遺伝子解析により、心臓内に流入する神経堤細胞は血管平滑筋の他に特徴的な遺伝子発現パターンを示す亜群に分けられ、そのうちの一部はc-Kitなどの幹細胞マーカーを発現することが明らかになった。このc-Kitなどを発現する一群は神経堤細胞がもつ多分化能と可塑性を保持している可能性があり、従来報告されている心臓幹細胞との関連や病態生理的役割の解明が今後の課題と考えられた。マウスと鳥類胚を用いた双方向的な実験、即ち神経堤細胞を標識するWnt1-Cre;R26Rマウスにおける心臓内の神経堤由来細胞の分布解析と神経堤のウズラ-ニワトリキメラ移植あるいはニワトリ胚における神経堤除去の実験から、心臓に流入する神経堤細胞の分布とその起源による違い、頭部神経堤細胞の冠動脈平滑筋細胞や半月弁間葉細胞への分化を明らかにした点で、本研究の目標の1つ「頭部神経堤細胞は心臓内に流入した後、どのような細胞に分化するのか?」の解明を一歩進め、さらにマウス-ニワトリ胚間の頭部神経堤キメラ移植実験を確立することができたが、遺伝子発現解析には量的な問題があり、方法論の改良とマウスにおける別種の実験を試みるなど、目標達成にはまだ十分ではない点も残った。

一方では、本研究の実験から派生した成果が、心臓発生と起源を共有する頭部発生において、鼓膜の起源に関する進化生物学の仮説を実験発生学的に実証する実験に発展させることが出来、予想外の展開を見せた大きな成果となった。これらを総合的に考えると、研究の進展は順調であると考えて良いのではないかと思われる。発生学・循環器内科学・血管生物学頭部神経堤由来細胞の遺伝子発現プロファイリングとin vitroおよびin vivoでの細胞分化と動態の解析を中心とする。遺伝子発現プロファイリングについては、Wnt1-Cre;R26Rマウスにおける心臓内の神経堤由来細胞の単離とC1(Fluidigm社)による単一細胞解析を中心に行うが、最近連携研究者の和田はC1により単離された細胞のRNA-seq解析を軌道に乗せており、発現遺伝子の網羅的解析により神経堤由来細胞の特徴づけやマーカー遺伝子の探索を推進しようと考えている。細胞分化と動態の解析では、in vitro実験では予定通りフィーダー細胞等を用いた培養系で分化誘導実験を行うが、in vivoに関してはマウス-ニワトリ胚間の頭部神経堤キメラ移植の効率改善とともに、ウズラ-ニワトリキメラ移植を並行して行うことによって、心筋傷害などの病態モデルにおいて、頭部神経堤由来細胞がどのような動態を示し、どのような細胞に分化するかを解析する。以上のように、当初の申請計画の大筋に従いながら、方法論としてより進んだものは積極的に取り入れるとともに、改善を要する点については検討を重ねながら、並行して次善の策となる実験を進め、目標を達成させる。頭部神経堤由来細胞の遺伝子発現プロファイリングを実施するにあたっては、心臓内の神経堤由来細胞の単離とC1(Fluidigm社)による単一細胞解析を中心に行うが、マウス-ニワトリ胚間の頭部神経堤キメラ移植においては解析に十分な比率の細胞が得られないと判断し、神経堤細胞を標識するWnt1-Cre;R26Rマウスにおける心臓内の神経堤由来細胞の単離を並行して行うこととした。このため、C1(Fluidigm社)による単一細胞解析に用いる費用(1検体につき約20万円)、マウスの維持および細胞単離のための試薬等が必要となり、次年度に繰り越すこととした。概算:260万円分子生物学用試薬(120万円(C1(Fluidigm社)による単一細胞解析費用を含む))、細胞培養試薬・消耗品(20万円)、マウス・床敷等購入(30万円)、マウス飼育委託費(90万円)
DNA損傷修復過程で生じるヒストンタンパク質立体構造変化の放射光分光による追跡

円二色性スペクトル測定により、DNA損傷に伴って、ヒストンH2A-H2Bはα-ヘリックス構造が増加するのに対し、H3-H4では逆に、α-ヘリックス構造が減少することを明らかにした。H2A-H2B、H3-H4に生じる構造変化が異なることから、それぞれ異なる構造変化機構が関与していることが示唆された。さらに、DNA損傷に伴って生じる「異常な」構造は、少なくとも24時間にわたって保たれ続ける事が明らかとなった。ヒストンの構造変化は、DNA損傷応答、例えば、DNA損傷修復機構、において、何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。ヒストンタンパク質は、DNA損傷修復過程で重要な役割を果たすことが知られている。DNA損傷に伴うヒストンの構造変化を調査するために、平成27年度は、X線を照射してDNAを損傷させたヒトがん細胞(HeLa細胞)から、ヒストンタンパク質H2A-H2Bを抽出し、円二色性スペクトル測定によりその二次構造の分析を行った。その結果、非照射細胞から抽出した場合に比べて、H2A-H2Bのα-へリックス(らせん)構造の割合が増加していることを発見した。H2A-H2Bに直接X線を照射した場合には、逆に、α-へリックス構造の減少が見られた。これらのことから、X線照射細胞から抽出したH2A-H2Bで見られた構造変化は、X線照射によって生じる直接、間接効果によってH2A-H2Bがダメージを受けたためではなく、DNA損傷応答の結果、生じたものであると結論した。また、X線照射後、ヒストン抽出を行うまでの時間を30分から24時間まで変化させても、H2A-H2Bはα-へリックスが増加した「異常な」構造のまま細胞中に存在することを確認した。H2A-H2Bを「異常な」構造に変化させるメカニズム、あるいは、その役割は現時点で明らかになっていないが、放射線被ばくによる生命の危機を避けるための機能の一部になっているのではないかと考えられる。平成27年度の成果として、査読付き論文1報が既に掲載されている。その続報の査読が現在行われており、近日中に掲載されるものと期待される。既に掲載された論文に関しては、プレスリリースを行い、日刊工業新聞に掲載された。加えて、本研究のように放射線生物学研究に円二色性スペクトル測定を利用するための解説記事(査読付き)を執筆した。また、国際学会において、1件の招待講演と、1件のポスター発表を行った。ポスター発表に関して、Young Investigator Awardを受賞した。平成27年度の実施計画を概ね完了することができた。また、現在査読中で掲載に至っていない論文が残っているものの、日刊工業新聞での記事の掲載、国際学会における招待講演、Young Investigator Awardの受賞など、期待以上の成果を上げることができた。ヒストンは細胞内でDNAが巻き付いているタンパク質で、DNA損傷修復過程で重要な役割を果たすことが知られている。DNA損傷細胞におけるヒストンの構造を調査するために、平成28年度は、X線を照射してDNAを損傷させたヒトがん細胞(HeLa細胞)からヒストンH3-H4を抽出し、放射光円二色性スペクトル測定によりその二次構造の分析を行った。その結果、照射細胞由来のH3-H4では非照射細胞から抽出した場合に比べてα-ヘリックス(らせん)構造の割合が減少し、β-ストランド(直鎖)構造の割合は逆に増加していることを発見した。これとは対照的に、H3-H4と同様にDNAが巻き付いているタンパク質であるヒストンH2A-H2Bの場合には、細胞へのX線照射によりα-ヘリックス構造の割合が増加し、β-ストランド構造の割合は減少した(平成27年度実施)。これらの結果から、(1)細胞にはDNA損傷に伴って、ヒストンの構造を変化させる機能が備わっていること、(2) H2A-H2BとH3-H4では異なる構造変化が生じることが明らかになった。H2A-H2BとH3-H4で異なる構造変化が観測されたことから、異なる機構が働いて構造変化が生じているものと考えられる。ヒストンの構造変化が果たす役割の解明は分子生物学的手法などを用いた新たな研究の展開が必要であるが、構造変化したヒストンがDNA修復タンパク質が損傷個所を見分ける目印となっている可能性が考えられる。平成28年度の成果として、査読付き論文2報、解説記事1報が出版された。また、4件の学会発表を行い、内1件で若手優秀講演賞を受賞した。平成28年度は、H2A-H2Bと共にヌクレオソームを構成するヒストンタンパク質H3-H4に関して同様の実験を行う予定である。また、薬剤等の添加により酵素の機能を制御した細胞からH2A-H2Bを抽出、円二色性スペクトル測定を行うことで、「異常な」構造が形成されるメカニズムの調査を行う。

これと同時に、DNA損傷修復過程などで生じることが知られている被修飾ヒストンなどを合成し、その構造を調査、比較することで、「異常な」構造形成の原因を探る。放射線生物学平成27年度は、実験試料作製に用いる試薬等の購入費用に予算の大半を割く計画であった。当初の想定よりも実験が順調に進んだため、結果として、試料作製の機会が減り、その購入費用が余ることとなった。研究代表者の研究機関移動に伴い、現在必要な実験機器の一部が不足している。したがって、平成28年度に繰り越す当該費用をこれらの購入費用として用いる予定である。また、平成28年度分の助成金は、平成27年度と同様に、試料の作製のための試薬購入費用、成果発表のための旅費、論文投稿費用、オープンアクセスの費用として使用する予定である。
新規ハイブリッド型ポリケタイド合成酵素Steelyの構造と機能に関する研究

土壌微生物である細胞性粘菌で初めて発見された新規ハイブリッド型ポリケタイド合成酵素(PKS)のSteelyは今まで別個と考えられていたI型PKSとIII型PKSが融合したものである。本研究ではどのように2つの酵素が協調して働くのか、どのような産物を与えるのか、その産物はどのような生物学的機能をもつのかを調べた。研究代表者によって細胞性粘菌で初めて発見された、新規ポリケタイド合成酵素SteelyはI型酵素のチオエステレースドメインがIII型酵素に置き換わると言う特徴的な構造を持つものであった。本研究では別個の酵素と考えられていたI型酵素とIII型酵素が、どうのように融合し、協調的に働いているのかを明らかにする目的で、精製SteelyB酵素を用いたin vitroでの酵素活性再構成実験を行った。endogenousな遺伝子にタグを挿入し融合タンパク質を発現させるノックイン株を用いて実験を行った。まずタグを使ってSteelyB酵素を精製した。一緒にいくつかのタンパク質もpull downされたので、これらをマススペクトルで分析したが、ほとんどがアクチン、ミオシンなどの構造タンパク質であり、Steely酵素の活性に関与するものではないと判断された。そこで、このpull down画分を用いてスターター基質、伸長物質を与えてin vitro再構成実験を行った。その結果、pull downサンプルは予想通り最終産物であるDIF-1のポリケタイド骨格を作り出した。スターター基質としてヘキサノイル-CoAを用いた場合だけでなく、アセチル-CoAをスターター基質とし、伸長物質としてマロニル-CoAを用いた場合でもポリケタイド骨格が出来た事から、このポリケタイド骨格はI型酵素からIII型酵素へ産物が直接受け渡されている事が強く示唆された。このようなin vitroでの酵素活性の直接的な証明はこれまでに報告がなく、Steely酵素の作用機構の理解にとって重要なステップとなったと考えている。SteelyB酵素が作るDIF-1以外の産物については、その生化学的性質を明らかにしたので、現在精製に向けて、大量培養を行って出発物質を集めている段階にある。申請者は細胞性粘菌の新規ハイブリッド型ポリケタイド合成酵素Steely酵素が分化誘導分子DIF-1を合成することを明らかにした。このSteely酵素はI型脂肪酸合成酵素(FAS)のチオエステラーゼドメインがIII型ポリケタイド合成酵素(PKS)に置き換わると言う特異な構造を持つ酵素であった。この構造はいわば天然のドメイン交換によるものと考えられる。そこで本研究はコンビナトリアル生合成への応用を視野に入れ、別個の酵素と考えられていたI型FASとIII型PKSが構造上どのように融合し、協調して機能しているのか、どのようにして異なるいくつかの産物を作り出しているのかを明らかにする事を目指している。21年度の研究ではSteelyB酵素のI型FASとIII型PKSの間でどのように産物が受け渡しされるのか、そのメカニズムの解明を中心に研究を進めた。昨年度の実験ではタグをつけたSteelyB酵素をそのタグをもとに精製し、in vitroで基質を与えてDIF-1のポリケタイド骨格を作るかどうかを検証した。その結果、他のタンパク質の介在無しにSteelyB酵素は単独でDIF-1のポリケタイド骨格を作った。この結果アシルキャリアプロテイン(ACP)ドメインが仲介していると言う考えを支持するものであった。また、SteelyB酵素の発生後期のDIF-1以外の産物はIII型PKSの部分が切り離されて単独でphloroglucinolをつくり、これを基本骨格としている事が推定された。このような酵素はこれまでに報告がなく、細胞性粘菌のような微生物が数少ない酵素で最大限の多様な産物を作り出そうとするシステムと理解され、新規酵素の創成に応用できると考えている。細胞性粘菌の新規ハイブリッド型ポリケタイド合成酵素Steely酵素は1型脂肪酸合成酵素(FAS)のチオエステラーゼドメインがIII型ポリケタイド合成酵素(PKS)に置き換わると言う特異な構造を持つ酵素である。そこで本研究ではコンビナトリアル生合成への応用を視野に入れ、新規ハイブリッド型PKSであるSteely酵素の構造、作用機構、産物の関係を調べた。本年度はこれまであまり解析がなされていなかったSteelyA酵素を中心に解析を進めた。SteelyA酵素をコードするstlA遺伝子を欠損した遺伝子破壊株を用いて、SteelyA酵素のin vivo産物の構造解析を行い、SteelyA酵素がその産物のひとつとして4-methyl-5-pentylbenzene-1,3-diol(MPBD)の合成を司っている事を明らかにした。さらにこの欠損株は胞子細胞の成熟ができず、胞子塊が不完全な細胞からなるという欠損がある事、この胞子形成の欠損が外から200nMのMPBDを与える事によって回復する事を明らかにした。これまでの研究から、細胞性粘菌でみられる2つのハイブリッド型PKSの産物がそれぞれ柄細胞分化誘導分子DIF-1と胞子細胞の成熟を誘導するMPBDである事を明らかにする事ができた。
微小トンネル接合における散逸効果の研究

微小ジョセフソン接合では位相のトンネルに付随するエネルギー散逸が重要である。散逸が大きくなるにつれ、トンネルレートのの抑圧は増大し、ジョセフソン接合は、散逸に依存した超伝導・絶縁体転移を示す。エネルギー散逸の代表例は、オーミックなシャント抵抗である。このエネルギー散逸のシャント抵抗の制御による超伝導・絶縁体転移に関して報告した。これとは異なるエネルギー散逸としてトンネル抵抗(サブギャップ抵抗)と呼ばれるトンネルに伴う抵抗である。トンネル抵抗では電荷が離散的に変化するのに対し、オーミックシャント抵抗では電荷が連続的に変化するという違いがある。我々は、二軸回転の斜め蒸着法と、プラズマ酸化を組み合わせることにより、トンネル抵抗の制御をした試料の作成に成功した。試料の構造はアルミニウムで形成される微小ジョセフソン接合近傍に、常伝導金属であるクロムのトンネル接合を付加した複合単一接合であり、外部環境の影響からこの接合を孤立させるために、同一基板上て複合接合のごく近傍に細長いクロム線で形成される高抵抗のリード線を形成しこれを介して測定を行った。アルミニウムのジョセフソン接合の常伝導時の接合抵抗を、量子抵抗(約6キロオーム)よりも充分高くし、外づけの常伝導接合のトンネル抵抗によりトンネル的エネルギー散逸を3キロオーム前後に調節した試料で、超伝導・絶縁体転移を観測するのに成功した。
ドパミン作動性ニューロンに影響を及ぼす脳内神経ペプチドの動態に関する研究

精神分裂病の原因として、いわゆる「ドパミン過剰仮説」があることは周知の事実である。実際、夛くの抗精神病薬が抗ドパミン作用を示すなど、その根拠は依然有力であるが、それのみでは説明できない面も夛く、疾患の本態は依然不明といわざるを得ない。他方、近年になって夛くの神経ペプチドが発見され、アミンとの関連も種々論義されている。本研究では、ドパミン・ニューロンとペプチドとの機能連関を明らかにする目的で実験を行い、以下の結果を得た。1)代表的抗精神病薬であるハロペリドールの慢性投与を、ミニポンプによる慢性投与と腹腔内注射による間歇投与に分けて検討したところ、血中ラット・プロラクチン値は間歇投与では上昇反応が維持されるのに対し、持続投与では急速に上昇反応は消失し、逆に分泌抑制がみられた。従って下垂体プロラクチン分泌系では耐性の発現がありうるわけで、投与法の違いが効果発現に影響することが示された。2)他方脳内コレシストキニン量はいずれの投与法でも増加し、線条体・前脳部辺縁系で特に顕著でその効果も長く持続した。3)次に6-ハイドロキシドパミンの脳室内投与によって前シナプス性にカテコラミン神経終末を破壊して、ペプチドに与える影響を検討した。脳内コレシストキニンとソマトスタチン量は同処置によってともに増加し、特に中脳,線条体,前頭皮質,辺縁系などドパミン線維の分布する領域に顕著であった。従って、両ペプチドはドパミンによって抑制性の支配を受けていることが考えられた。また、しばしば言及されるドパミンとコレシストキニンの共存ニューロンの存在は、かなり分布が限定されているように思われる結果であった。以上より、ドパミン性ニューロンと密接に関連するペプチドの存在が明確に示されたが、今後はペプチド性ニューロンに対するドパミンの作用機序について、遺伝子レベルの解析などを含め、より詳細に検討していくことが必要と思われる。
都市労働市場におけるジョブ・サーチ理論のミクロ実証分析:タイの経験

ネットワークを介して求人・求職双方の情報が完全であるような非市場的取引から、規模が大きく匿名性のある市場取引へと移行するタイミングに焦点を当て、タイの個票データを利用し、労働移動に関する重要な仮説への統計的推測を行った。特に都市・開発経済学の成果を取り入れながら、求職・求人行動を分析の中心に据え、これら異なる分野を統一的に研究した。分野横断的な研究によって、従来の労働経済の実証研究と比較して、新しい知見を得た。平成18年度は、タイ統計局が公開しているThailand Labor Force Surveyの個票を利用し、綿密な実証分析の蓄積が望まれていた、発展途上国経済の労働移動に関する様々な仮説への統計的推測とその吟味を行った。特に都市・開発経済学の理論・実証結果を取り入れながら、マイクロレベルの求職・求人行動を分析の中心に据え、これら異なる分野を統一的に研究した。分野横断的な研究によって、従来の労働経済の実証研究と比較して、新しい知見を得て、それらは雑誌論文1点にまとめられる。平成18年度は主に「大都市に労働移動することで労働者の生産性が高まる」という移住学習仮説について、タイ労働力調査の個票を用いて検証した。地域間労働移動における「自己選抜効果」と「移住学習効果」を識別した結果として、潜在的に生産性の高い労働者が大都市に向かって移動を行い、ジョブ・マッチングが悪く生産性の低い労働者は退出し、ジョブ・マッチングが良く生産性の高い労働者は長期間にわたって大都市に生き残る、という自然淘汰機能が働いていることを実証的に明らかにした。さらに、質の高いジョブ・マッチングを得た移住者は、大都市に長期間滞在することによって賃金が上昇する一方で、農村に新たに移住し、長期間滞在したとしても、賃金上昇は大都市よりも小さく、「移住学習効果」は大都市の方が大きいことも明らかになった。公刊された雑誌論文以外にも、本年度は、1997年に突然発生したタイ金融危機によって、タイ国内労働市場がどのように変貌したかを吟味する実証研究および市場を介さないジョブ・ネットワークが地域に粘着的であり、求職方法選択にとって重要であることを精査する実証研究も行った。現在投稿中であり、審査を経て今後専門雑誌において公刊されることが期待されている。失業の要因として、景気循環的要因や哀退地域(産業)から成長地域(産業)への労働移動、および情報の偏在に伴う一時的な摩擦に加え、労働市場を構成する求人企業と求職者の特性・戦略的行動から生じる構造的要因の重要性が高まっている。同時に、ジョブ・マッチングの質を高めるために必要とされる政策プログラムの内容も変わりつつある。最近の研究によって、ジョブ・マッチングの質は求人方法と求職方法によって大きく異なり、市場取引だけでなく、私的仲介者を通じた非市場的取引がマッチヒグの質改善において大きな役割を果たす可能性が示唆されている。労働市場における摩擦の程度、摩擦の発生要因、摩擦の費用などに関する統計的推測を深めることで、公共職業紹介制度の整備が進まない発展途上国への政策的含意を導出する。その際、特に労働者と企業がどのような経路を介して、お互いに探索し、円滑な取引を進めているか、ジョブ・サーチ理論を用いて、都市労働市場構造を深く理解し、マイクロデータによる実証研究を行う。平成19年度は研究の最終年度ということで、第一年目、第二年目の研究で見いだした研究分野全体の特徴、残る問題点を吟味し、空間ジョブ・サーチ理論の開発をさらに推進する。そこで、ジョブ・マッチングの質と私的なジョブ・ネットワークの関係を描写する理論モデルを作成する。特にネットワークを介して求人・求職双方の情報が完全であるような非市場的取引から、規模が大きく匿名性のある市場取引へと移行するタイミングに焦点を当てて、理論モデルを構築する。この部分は理論的にも不明確であるため、国内外への研究出張をつうじて近隣諸分野の専門化とのディースカッション集中的に行う。この間の研究経費は、理論モデルを構築し、実証研究を行うまでの図書資料購入、国内外の研究集会出張にあてられる。そこで得られた議論にもとづき、研究をまとめてゆく。失業の要因として、景気循環的要因や衰退地域(産業)から成長地域(産業)への労働移動、および情報の偏在に伴う一時的な摩擦に加え、労働市場を構成する求人企業と求職者の特性・戦略的行動から生じる構造的要因の重要性が高まっている。最近の研究によって、ジョブ・マッチングの質は求人方法と求職方法によって大きく異なり、市場取引だけでなく、私的仲介者を通じた非市場的取引がマッチングの質改善において大きな役割を果たす可能性が示唆されている。労働市場における摩擦の程度、摩擦の発生要因、摩擦の費用などに関する統計的推測を深めることで、公共職業紹介制度の整備が進まない発展途上国への政策的含意を導出した。特に平成20年度は、第一年目、第二年目の研究で見いだした研究分野全体の特徴、残る問題点を吟味し、空間ジョブ・サーチ理論の開発をさらに推進した。新しい成果として、都市化とジョブ・サーチを理解する新しい視点として都市における企業規模の決定要因に注目し、実証研究を行った。

都市化に伴う企業規模とジョブ・サーチの関係は理論的にも未だ不明確であるため、近隣諸分野の専門化とのディスカッションを集中的に行った。特に実証研究の成果は、社会経済史学会で報告され、発展途上経済における労働市場と産業組織の在り方に新たな視京を持ち込む研究として活発な議論が行われた。そこで得られた議論、一年目、二年目の成果に基づき、研究全体がまとめられた。
多峰性最適化手法を用いた適応的共生モデルの構築とその工学的応用に関する研究

情報理論的クラスタリングの理論的整備を進め,外れ値検出・一クラス分類,一クラスクラスタリング・バブルクラスタリング等の従来手法とマイノリティクラスタリングの理論的統合を実現した.多クラスの教師無し分類問題(文書・画像)に適用し,従来手法を大きく上回る高い適合率と再現率を実現した.この成果を人工知能学会論文誌(Vol22, pp.311-321)および国際会議(ICDMO7:7th International Conference on Data Mining, regular paper, pp.13-22)で発表した.さらに,共クラスタリング・クロスドメイン学習での利用のための拡張を行い,一部の成果を3月に人工知能学会論文誌に投稿したマイノリティクラスタリングに関する新たな知見を基に共進化・ニッチ探索の拡張を行った.共進化における多層ニューラルネットワークの隠れ層における写像の挙動とブースティングへの影響について分析を行い,分類性能の向上を実現した.情報理論的クラスタリングの理論的な進展により、大規模データセット中の特異な情報源およびそこから生成された小さな部分集合を検出するマイノリティクラスタリング手法の理論的な整備が完了した。その結果、教師無し例外検出手法とクラスタリングを統一的に扱うことを可能にする考え方であることが示された。人工データによる実験では数十万件程度のデータから100個のマイノリティの情報源から生成された事例集合を検出し、スケーラビリティの高さが示された。また、文書分類問題と衛星画像分類問題の実世界ベンチマークで検証した結果、従来の教師無し学習手法を大きく上回る分類性能を実現した。この成果はICDM2006(口頭発表採択率10%)にて発表した。情報理論的クラスタリングをベースとしたニッチ探索手法を実装し、進化的なニューラルネットワークアンサンブル設計問題に適用した。アンサンブル設計は異なる分類関数に対応する複数の遺伝集団が協力的な共進化を行うシステムとした実装がよいベンチマーク性能を出すことが確認された。実験のためアンサンブルによる分類ベンチマークを用意し、ブースティングやバギングなどの確率的手法と分類性能を比較した結果アンサンブルの一般化誤差を減少できることが判明した。さらに、分類関数を発見的に追加する共進化システムによりネットワークの数が抑えられることが分かった。この成果はGECCO2007にて発表される。さらに、分類関数の形状を制限して共進化に関する挙動を解析した結果、情報量の大きい分類が早期に獲得されることが分かった。情報理論的クラスタリングの理論的整備を進め,外れ値検出・一クラス分類,一クラスクラスタリング・バブルクラスタリング等の従来手法とマイノリティクラスタリングの理論的統合を実現した.多クラスの教師無し分類問題(文書・画像)に適用し,従来手法を大きく上回る高い適合率と再現率を実現した.この成果を人工知能学会論文誌(Vol22, pp.311-321)および国際会議(ICDMO7:7th International Conference on Data Mining, regular paper, pp.13-22)で発表した.さらに,共クラスタリング・クロスドメイン学習での利用のための拡張を行い,一部の成果を3月に人工知能学会論文誌に投稿したマイノリティクラスタリングに関する新たな知見を基に共進化・ニッチ探索の拡張を行った.共進化における多層ニューラルネットワークの隠れ層における写像の挙動とブースティングへの影響について分析を行い,分類性能の向上を実現した.
自己組織化ポルフィリン・フラーレン超分子の光電荷分離過程の制御

ドナー・フラーレン結合分子は長寿命電荷分離状態を実現する有用な分子であるが、ほとんどは共有結合により結合したものである。ドナーである亜鉛ポルフィリンにピリジル基を持つ超分子を構築できる。人工光合成を目指した光機能デバイスの構築には、この配位結合等を応用した自己組織化が有用と考えられる。したがって、本研究では自己組織化により構築されたドナー・フラーレン超分子を合成し、その電荷分離過程を明らかにすることを目的とし、以下の研究を行った。1:アクセプターとなるフラーレン誘導体の分子構造の設計電子ドナーとなる亜鉛ポルフィリンに配位しうるフラーレン誘導体としてピリジル基、イミダゾール基を導入した分子を設計し、高い超分子形成定数と電荷分離効率が達成された。2:温度コントロールによる超分子形成定数の最適化低温において超分子の形成定数の向上が実験的に認められたことから、従来では超分子内電荷分離には不適であった配位性の極性溶媒における超分子形成への道が開けた。またこの事は、電子移動速度の温度変化が観測可能であることを示唆しており、電荷移動過程を支配する再配向エネルギー等マーカスパラメータの算出が可能である事が明らかとなった。3:新規超分子系の構築新たな超分子形成形態として、ロタキサン骨格を利用した空間を通じた電子移動の研究も行った。この系では、サイズに応じて励起1重項からの電荷分離が励起3重項からの電荷分離に切り替わる証拠を得た。また、電荷再結合速度は1マイクロ秒にも及び、その温度依存性から、電荷再結合に関するマーカスパラメータの算出に成功した。算出したパラメータは、通常の化学結合を通したパラメータと大幅に異なり、このことから結合を通した電子移動と空間を通した電子移動の比較が可能となった。・亜鉛ポルフィリンに対して、配位能を有するフラーレン誘導体の合成と超分子の形成を確認した。亜鉛ポルフィリンにフラーレンを配位させるためピリジル基等をフラーレンに導入した。合成したフラーレン誘導体の亜鉛ポルフィリンヘの配位は、定常吸収スペクトルの測定にて観測できる吸収帯のシフトで確認した。・亜鉛ポルフィリン・フラーレン超分子の光誘起電荷分離状態を解明した。フェトム秒ならびにナノ秒過渡吸収法を用いて亜鉛ポルフィリン・フラーレン超分子の電荷分離状態を測定した。特に、フラーレンとポルフィリン間の距離および配向で電荷分離速度と電荷分離寿命がどのように変化するかを調べた。・アンテナ部を有するポルフィリン・フラーレン超分子の合成と光誘起電荷分離状態を評価した。アンテナ部としてフリーベースポルフィリンをフラーレン誘導体に導入した。さらに亜鉛ポルフィリンと超分子を形成することにより、高効率電荷分離状態が生成したことを確認した。フリーベースポルフィリンと亜鉛ポルフィリンの励起一重項ダイナミクスは時間分解蛍光スペクトルにより評価した。以上から、ビリジル基を有するフラーレンを用いた自己組織化亜鉛ポルフィリン・フラーレン超分子の形成の確認と、レーザー照射にともない生成した光電荷分離過程の過渡吸収法による観測に成功した。また、アンテナ部を有する超分子では高効率の光電荷分離過程が生成することを時間分解蛍光スペクトルにより確認した。本年度は、とくに超分子形成の最適化をおこない、電荷分離効率の向上を目指した。超分子形成の最適化には、1:アクセプターとなるフラーレン誘導体の分子構造の再設計、2:温度コントロールによる超分子形成定数の最適化を行った。1:アクセプターとなるフラーレン誘導体の分子構造の再設計電子ドナーとなる亜鉛ポルフィリンに配位するフラーレン誘導体に導入されたピリジル基を、イミダゾール基に転換した分子を設計し超分子形成定数の向上が達成された。これを基に、電荷分離効率の向上が達成された。2:温度コントロールによる超分子形成定数の最適化

低温において超分子の形成定数の向上が実験的に認められたことから、従来では超分子内電荷分離には不適であった配位性の極性溶媒における超分子形成への道が開けた。またこの事は、電子移動速度の温度変化が観測可能であることを示唆しており、電荷移動過程を支配する再配向エネルギー等マーカスパラメータの算出が可能である事が明らかとなった。3:その他の試みその他、フラーレン-ポルフィリン間の新たな超分子形成として、ロタキサン骨格を利用した空間を通じた電子移動の研究も行った。ロタキサンを用いた超分子では、サイズに応じて励起1重項からの電荷分離が励起3重項からの電荷分離に切り替わる証拠を得た。また、電荷再結合速度は1マイクロ秒にも及び、その温度依存性から、電荷再結合に関するマーカスパラメータの算出に成功した。算出したパラメータは、通常の化学結合を通したパラメータと大幅に異なり、このことから結合を通した電子移動と空間を通した電子移動の比較が可能となった。
低温ストレス応答におけるｍＲＮＡ合成と分解の協調的制御システム

低温ストレスに応答したmRNA合成と分解による協調的な制御が,mRNA蓄積量の経時変化パターンの形成にどのように関わるのかを明らかにするためには,転写阻害剤とマイクロアレイを組み合わせたmRNA decay arrayを低温処理後経時的に行う必要がある。本年度は最終のマイクロアレイデータを得ることができた。mRNA蓄積量に加えて転写速度(k)とmRNA分解率(λ)も時間の関数であると考えると,mRNA蓄積量(A)の変化は微分方程式dA/dt = k(t)-λ(t) x A(t)で表わされる(t:低温ストレス処理後の時間)。このうち,分解率の変化λ(t)は,低温処理後の各時点において転写阻害剤添加後のmRNA量の経時変化を測定することにより求められる。この際,転写阻害剤を加える前の時点におけるmRNA量は,低温処理後の各時点でのmRNA量の蓄積量A(t)を表すことから,mRNA分解率λ(t)とmRNA蓄積量A(t)の経時変化を同時に測定したことになる。このマイクロアレイのデータをもとに,低温処理後のmRNAの蓄積量および分解率の変化パターンで遺伝子群をクラス分けした。その結果,低温応答に重要な転写因子であるCBFの下流で制御されている遺伝子群は,いずれも低温に応答してmRNAの蓄積量を増加させるが,mRNA分解速度に関しては促進させているクラスと変化しないクラスに分かれることがわかった。さらに,分解速度を促進しているグループの方が,より大きなmRNA蓄積量の増加を示すことが明らかとなった。これら個別の遺伝子に関して,低温処理後のλ(t)およびA(t)の値からkの積分値を近似的に算出した。結果として,CBF下流の遺伝子群のうち,より大きなmRNA量の増加を必要とするものは,その分解速度を促進させることでより迅速で大きなmRNA蓄積量の増加を可能にしていることが示唆された。また,分解を促進するために,その分の転写速度を増加させていることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。移動という逃避手段を持たない植物にとって,急激な環境の変化は大きなストレスであり,随時,適応していかなくてはならない。その中でも低温は,迅速に対応しなくてはならない主要な環境ストレスのひとつである。この手法により低温ストレスによるmRNA分解速度およびmRNA蓄積量の経時変化を同時に測定することができる。研究対象としては代表的なモデル植物であるシロイヌナズナの培養細胞株(T87)を用いた。本年度は,この新規の実験系の確立を目指した様々な予備実験を進めた。今回行ったmRNA decay arrayでは,低温下での60時間におよぶ経時的なサンプリングが必要となり,その間低温条件がきちんと保たれるかどうかが実験成功の鍵となる。予備的な実験を行ったところ,予想していなかったデータが得られ,その要因を様々な方面から検討した。その結果,当初使用を予定していたインキュベータでは,低温条件を長時間一定に保つことが難しいことがわかった。そこで,新しい低温処理法を考案する必要が生じたため予定以上の時間を費やしたが,最終的には信頼性の高いデータを得ることができる実験条件を決定することができた。

新規の実験系の評価において,データに予想していなかった変化が見られ,その原因を追究したところ,使用を予定していたインキュベーターが長時間におよぶ低温ストレス条件を設定するには不適であることがわかった。そのため新たな実験条件の検討および実験条件確認のための予備実験を行う必要が生じたため。確立した実験条件において最終のマイクロアレイデーターを取り,そのデータをもとに遺伝子群のクラスタリング解析を行う。さらに,興味深い変化パターンを示す遺伝子に関しては,数学的なアプローチを用いた個別の解析を進めることによって,mRNA合成と分解の制御がどのように協調してmRNAの蓄積量の変化を決定しているのかを明らかにする。26年度が最終年度であるため、記入しない。