hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIF-1αを分子標的とした新たな白血病治療法の開発

2.活性酸素除去剤のHIF-1αの発現および白血病細胞増殖に及ぼす影響上記の解析結果を踏まえ、ROS除去剤によりHIF-1αの発現を抑制することができるかについて検討を進めた。ROS除去剤としては、ポリフェノール類の一つであるレスベラトロールを用いた。レスベラトロールにより、HIF-1αの発現は完全に阻害され、またTPO依存性の増殖も抑制された。本年度は、白血病細胞におけるHIF-1αの安定化機構および、flavonoid類がHIF-1の発現レベルに及ぼす影響について研究を進め、以下の事項を明らかにした。1.血病糸胞におけるHIF-1αの-現には糖代謝の活性化が必要である。昨年度の研究により、ヒト白血病細胞株におけるHIF-1αの安定化にはミトコンドリア由来の活性酸素(ROS)が重要であることを明にしたが、さらにミトコンドリアからのROS産生メカニズムについて探求した。特に、ミトコンドリアでのROS産生は糖代謝およびそれと連動する酸化的リン酸化と密接に関わるため、まず糖代謝の阻害剤である2-deoxyglucoseを用い、HIF-1αの発現が変化するかを調べた。その結果、2-deocyglucoseによりHIF-1αの発現は著明に抑制されることが分かった。さらに、glucose transporter蛋白の機能を抑制した場合にも、HIF-1αの発現は抑制された。培養液中のグルコース濃度を低下させることによっても、HIF-1αレベルは低下した。以上の結果より、白血病細胞におけるHIF-1αの発現上昇には、糖代謝の活性化が必要であると考えられた。2.flavonoidによるHIF-1αの発現レベル制御
神経細胞における動的な生化学情報処理機構の解明

脳機能を理解するためには、複雑な脳の中での神経活動とそれによって活性化される生化学反応を計測し、演算を理解する必要がある。神経細胞での生化学演算を計測するために、本研究では非常にダイナミックレンジを改善した新型のCa2+依存的酵素に対するプローブを開発した。そして、これらのプローブを用いて、Ca2+依存的リン酸化酵素(CaMKII)と脱リン酸化酵素(カルシニューリン)の活性化の時空間的プロファイルを生きた神経細胞の樹状突起およびシナプスにおいて計測し、全く異なることが明らかになった。この成果は、神経細胞における生化学演算機構の一端を明らかにし、高次脳機能の理解につながるものと考えられる。本研究26年度は、申請時の計画通り、【1Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】、【2複数シナプス刺激法の開発】、【3単一シナプス体積縮退誘導プロトコールの確立】、の3点に関して研究を行い、以下の結果を得た。まず、【1Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】に関しては、新規蛍光タンパク質を用いてCaMKIIα及びβの高輝度改良型プローブを開発した。これらのプローブが実際にレポーターとして機能することを確認するため、蛍光プレートリーダーもしくは神経細胞にて応答性を確認した。また、Ca2+依存的酵素であるカルシニューリンに関して、三次元結晶構造とバイオインフォマティクスを利用して、新たな改良型プローブの設計・作成とスクリーニングを行い、神経細胞においてこれまでのものよりも大きな変化率を示す非常に高性能の新型プローブの開発に成功した。次に、【2複数シナプス刺激法の開発】に関しては、パイロット実験によりこれまで使用してきたdFOMA法顕微鏡セットアップのソフトウェアの制御では正確なタイミングで多点を刺激することが困難であることが判明したため、外部電気回路からガルバノミラーの位置を制御できるように改変し、多点を正確なタイミングで刺激する方法原理を確立した。【3単一シナプス体積縮退誘導プロトコールの確立】に関しては、先行知見に基づきグルタミン酸アンケイジングによる低頻度刺激の条件検討を行ったが、現在までのところシナプス体積縮退を引き起こす条件を見出すことはできていない。以上、総じて予定通り計画した研究の実施を行い、特にCa2+依存的酵素の活性化プローブの開発については予想以上の良い結果を得た。平成27年度は、26年度に引き続き、Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発、神経細胞シナプス刺激に関する研究を行った。【Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】Ca2+依存的脱リン酸化酵素であるカルシニューリンに関して、26年度に新規に開発した高性能の活性化プローブを元に、蛍光タンパク質の挿入位置やリンカー配列などを調整し、蛍光プレートリーダーでのスクリーニングを行い、さらなる改良を行った。その結果、神経細胞において、より高い変化率を示すインディケーターを開発することに成功した。また、in vitroでプローブ性能の評価をおこなうために、HEK293T細胞を用いたタンパク質発現系を利用して、FRETプローブを精製する系の条件検討を行った。小スケールのパイロット実験において、発現・精製条件の最適化を行い、今後行うプローブ性能の評価のための基盤を構築した。【神経細胞シナプス刺激】単一・複数シナプス刺激を行う際に、入力のあったシナプスをCa2+濃度上昇を指標に同定する目的で、Ca2+インディケーターとCa2+依存的酵素プローブを同時に可視化する手法を開発した。平成2627年度に開発したカルシニューリン活性化プローブ、もしくはCaMKII活性化プローブを、赤色Ca2+インディケーターであるR-CaMP2と同時にイメージングすることに成功した。また、予備検討において、グルタミン酸光融解法を用いた単一シナプス刺激に対する活性化に対するカルシニューリンおよびCaMKIIの活性化プロファイルの違いを見出している。また、TTX存在下において、シナプスにおける局所的なCa2+濃度上昇とカルシニューリンの活性化を計測することに成功した。平成27年度は、カルシニューリン活性化プローブのさらなる高性能化に成功し、このプロープの精製標本を調整するためのタンパク質発現系の条件を最適化した。この成果により、本研究の根幹をなすCa2+依存的酵素の活性化を測定するためのプローブのデザインや開発は一段落し、今後はこのプローブを元にした樹状突起・シナプスでの活性測定や開発したプローブの評価をメインに研究を進める段階に入っている。よって、昨年度より一段階進んでおり、非常に順調に研究が進んでいると考えられる。また、この高性能化によって、神経細胞のシナプス・樹状突起においてCa2+依存的酵素群(CaMKIIおよびカルシニューリン)の活性化の可視化に成功した。また、単一シナプス刺激を用いた予備検討では、両者の活性化プロファイルの違いを見出した。これは、本研究の目的である、Ca2+依存的酵素の生化学的演算機構を検証する上で、非常に重要な知見となる。よって、Ca2+依存的酵素の活性化イメージングは非常に順調に進んでいると考えられる。一方で、当初目標にしていたシナプス体積の縮退を誘導する方法の確立にはこれまでのところ至っていないが、本研究の主目的であるシナプス・樹状突起における生化学演算過程の解明という点に照らし合わせると、シナプス体積の増大を誘導するプロトコールでも十分解明可能であると考えられるので、今後は体積増大プロトコール(シナプス構造的長期増強プロトコール)を用いて研究を進めてゆく。

平成28年度は、平成2627年度に開発したCa2+依存的酵素の活性化プローブを用いて、シナプス・樹状突起におけるCa2+依存的酵素の生化学演算過程の解析を行った。【Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】新規開発したカルシニューリン活性化プローブをHEK293T細胞に発現させ、プローブタンパク質を粗精製し、in vitroでの蛍光プレートリーダーを用いたFRET測定を行った。このFRETプローブ計測において、カルモジュリン阻害剤を用いた薬理学的実験を行い、カルシニューリン活性化プローブとして用いることができることを確認した。また、シナプスおよび神経細胞内での複数の細胞内シグナルを同時にFRETプローブにより可視化するために、新規蛍光タンパク質を利用したCa2+依存的酵素活性化プローブの開発を行った。【神経細胞シナプス刺激】グルタミン酸アンケイジングによる単一シナプス刺激を用いて、神経可塑性を誘導した際のCaMKIIおよびカルシニューリンの活性の時間的・空間的プロファイルを定量的に計測し、そのプロファイルの違いを明らかにした。また、dFOMA法(dual FRET with Optical MAnipulation)を用いて同一細胞・同一シナプスにおけるCaMKIIとカルシニューリンの活性化の違いの比較を行った。これらの成果より、CaMKIIとカルシニューリンのシナプス・樹状突起における生化学演算過程をこれまでにない時空間解像度で明らかにした。脳機能を理解するためには、複雑な脳の中での神経活動とそれによって活性化される生化学反応を計測し、演算を理解する必要がある。神経細胞での生化学演算を計測するために、本研究では非常にダイナミックレンジを改善した新型のCa2+依存的酵素に対するプローブを開発した。そして、これらのプローブを用いて、Ca2+依存的リン酸化酵素(CaMKII)と脱リン酸化酵素(カルシニューリン)の活性化の時空間的プロファイルを生きた神経細胞の樹状突起およびシナプスにおいて計測し、全く異なることが明らかになった。この成果は、神経細胞における生化学演算機構の一端を明らかにし、高次脳機能の理解につながるものと考えられる。「研究実績の概要」で述べた実施計画13の3点に関しては、それぞれ当初予定した実験の実施は完了しており、また成果としてはそれぞれ到達度合いが異なっているが、平均するとおおむね順調に進展していると言えると考えられる。特に【1Ca2+依存的酵素の活性化プローブの開発】においては、カルシニューリンの変化率の大きなプローブの作製に成功しており、これは本研究の目的である生化学演算機構の解明のみならず、さまざまな分野に応用が可能な非常に大きな成果であるといえる。また、CaMKIIプローブに関しても、従来よりも明るいプローブに加えて緑色単色のプローブの開発に成功しており、これは他のプローブと組み合わせた多重計測を可能にする新たな原理となるため、生化学的な演算過程を理解する上で非常に重要な成果であると考えられる。【2複数シナプス刺激法の開発】に関しては、計画通りの研究を遂行し、その中で機器間でのタイミングの非同期という当初予期していなかった問題が発生したが、これにたいしては回避する方策を見出すことができた。
広汎性発達障害における情動機能の発達と障害

広汎性発達障害における情動機能の発達を促進する支援方法として心理劇に着目し、(1)数量的データによる検討、(2)発達段階による検討、(3)事例的検討の3つの視点から検討を行った。その結果、(1)広汎性発達障害の特定の表情とディレクターの特定の支援に関連があるのではなく、対象者の個別性に応じてディレクターが支援の在り方を変えていること、(2)児童と青年の間には情動表出の在り方に違いが見られ、それは心理劇の構造と生活体験及び療育経験の違いによるものであること、(3)情動語の理解や使用に困難を示す事例については、情動の類似性についてディレクターが理解を促すことが有効であることの3点が示された。1.研究の目的広汎性発達障害とは、対人的相互反応の発達に重症で広汎な障害があり、言語的または非言語的なコミュニケーション能力の障害や常同的な行動・興味・活動の存在を伴うものである。本研究では、広汎性発達障害における非言語的コミュニケーションに注目し、情動表出を促進する支援について検討した。2.調査協力機関及び調査協力者F県児童デイサービスAセンターで療育活動(心理劇)に参加している広汎性発達障害児、F県知的障害者更生施設で療育活動に参加している広汎性発達障害者に調査協力を依頼した。3.観察場面と観察場所広汎性発達障害児については、心理劇場面を2台(固定・可動)のデジタルビデオカメラにて記録した。4.結果と考察今年度は、蓄積されたビデオ記録の中から広汎性発達障害児2名(A男、B子)を対象に広汎性発達障害における情動表出を促進する支援について時系列分析による予備的な検討を行った。対象児及びディレクターについて個別に行動カテゴリーを作成した。行動カテゴリーは、広汎性発達障害児について「表情」、「動作」、「発語」の3種類、ディレクターについて、「動作」、「発語」の2種類とした。対象児の表情と対象児における各カテゴリーの同時生起については、A男において「大きな身体の動き」とともに「ポジティブな表情」が観察された。さらに、B子において「ディレクターの言葉に相槌を打つ動作」や「ディレクターに向かって身を乗りだす動作」とともに「ポジティブな表情」が観察された。さらに、対象児の表情とディレクターにおける各行動カテゴリーの同時生起について、ディレクターによる「対象児の言葉の繰り返し」及び「身体接触による注意喚起」と広汎性発達障害児の「ポジティブな表情」が同時に観察された。以上の結果から、ディレクターの行動が広汎性発達障害児の情動表出を促進することが示され、心理劇が支援法として有効であることが示された。研究の概要(1)広汎性発達障害の情動表出と情動理解の促進を目指した支援として心理劇に着目した。対象児の特徴に応じた支援の在り方について考察し、広汎性発達障害児のポジティブな情動表出と、心理劇のディレクターの行動及び発語の関連について検討した。(2)「気持ちの理解」をテーマとした心理劇の事例を報告し、情動表出と情動理解の促進における心理劇適用の意義と課題について考察した。結果(1)広汎性発達障害の表情は、ポジティブ、ネガティブ、ニュートラルに分類した。ディレクターの支援については、動作(指示・介入、促し、見守り)と発語(注意喚起、指示・介入、繰り返し、質問確認、傾聴)に分類した。両者の関連について分析した結果、広汎性発達障害の特定の表情とディレクターの特定の支援に関連があるのではなく、対象者の個別性に応じてディレクターが支援の在り方を変えていることが示された。また、対象者における表情表出の特徴を考慮して、情動表出や情動理解の側面を支援していく必要があることが示された。(2)情動表出の促進を支援するにあたっては、対象者の日常生活に関連の深い場面に焦点化することが有効であることが示された。情動語の理解と使用については、対象者の個人差が見られ、特定の情動を特定の場面と結び付けて理解している事例や、情動の類似性について理解していない事例が見られた。これらの点については今後の課題であるが、ディレクターが対象者の発言を言い換えることや、類似した情動語を使用することで、情動表出及び情動理解を促すことが期待される。
薬用食品からの脂肪蓄積抑制および脂肪代謝促進作用成分の探索

伝統・伝承薬物として薬用に供される一方で,食材としてあるいは料理の香味付けやスパイスなどの食用としても用いられる薬用食品素材について,脂肪蓄積抑制作用および脂肪代謝促進作用成分の探索を実施することを目的とする.その結果,キク科植物の西洋ハーブであるデイジーフラワーやタイ産ムクロジから中性脂質吸収抑制サポニンおよびベンケイソウ科植物である垂盆草からHepG2細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用メガスチグマン化合物などを見い出した.伝統・伝承薬物として薬用に供される一方で,食材としてあるいは料理の香味付けやスパイスなどの食用としても用いられる薬用食品素材について,脂肪蓄積抑制作用および脂肪代謝促進作用成分の探索を実施することを目的とする.その結果,キク科植物の西洋ハーブであるデイジーフラワーやタイ産ムクロジから中性脂質吸収抑制サポニンおよびベンケイソウ科植物である垂盆草からHepG2細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用メガスチグマン化合物などを見い出した.近年,いわゆる生活習慣病が一個人に複数集積する状態である"メタボリックシンドローム"が,動脈硬化性疾患発症の背景として重要であることが明らかとなっている.本症候群は単に多数の因子が偶然集積したものではなく,その上流に内臓脂肪の蓄積が成因基盤として存在していることが知られている.我が国においても生活習慣の欧米化が進み,いわゆる生活習慣病の病態を呈する人口が増加しており,この背景には過食および過剰な脂肪摂取,運動不足やストレスなどが要因の肥満症(脂肪組織の蓄積)があることは明白である.また,これら生活習慣病の境界域の状態においても,それらの病態が重積すると,あたかもドミノ倒しのように症状や各種合併症の進展および併発が促される.本研究では,伝統・伝承薬物として薬用に供される一方で,食材としてあるいは料理の香味付けやスパイスなどの食用としても用いられる薬用食品素材について,マウス初代培養肝細胞およびヒト肝がん由来HepG2細胞を用いた細胞内の中性脂肪蓄積量(あるいは残存量)を指標とした評価系を用いた広範なスクリーニング試験をおこない,脂肪蓄積抑制作用および脂肪代謝促進作用成分の探索を実施することを目的とする.今年度は,中性脂肪吸収作用および脂肪蓄積抑制作用シーズの探索に焦点を絞り, i).キク科植物の西洋ハーブであるデイジーフラワーやタイ産ムクロジから中性脂質吸収抑制サポニン, ii).ベンケイソウ科植物である垂盆草からHepG2細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用メガスチグマン化合物およびiii).アディポサイトカインのひとつであるTNF-αに対する感受性を低減する低分子化合物をタイ人参,ザクロ花およびエバーラスティングフラワーなどから見い出した.近年,いわゆる生活習慣病が一個人に複数集積する状態である"メタボリックシンドローム"が,動脈硬化性疾患発症の背景として重要であることが明らかとなっている.本症候群は単に多数の因子が偶然集積したものではなく,その上流に内臓脂肪の蓄積が成因基盤として存在していることが知られている.我が国においても生活習慣の欧米化が進み,いわゆる生活習慣病の病態を呈する人口が増加しており,この背景には過食および過剰な脂肪摂取,運動不足やストレスなどが要因の肥満症(脂肪組織の蓄積)があることは明白である.本研究では,伝統・伝承薬物として薬用に供される一方で,食材としてあるいは料理の香味付けやスパイスなどの食用としても用いられる薬用食品素材について,マウス初代培養肝細胞およびヒト肝がん由来HepG2細胞を用いた細胞内の中性脂肪蓄積量(あるいは残存量)を指標とした評価系を用いた広範なスクリーニング試験をおこない,脂肪蓄積抑制作用および脂肪代謝促進作用成分の探索を実施することを目的とする.最終年度である今年度は,昨年度に見い出した中性脂肪吸収作用および脂肪蓄積抑制作用シーズについて,以下の研究成果を報告した.i).タイ産ムクロジから中性脂質吸収抑制サポニン,ii).ベンケイソウ科植物である垂盆草からHepG2細胞を用いた脂肪蓄積抑制作用メガスチグマン化合物,iii).西洋ハーブのエバーラスティングフラワーや香辛料であるコショウ科植物Piperchabaから,アディポサイトカインのひとつであるTNF・αに対する感受性を低減する低分子化合物を見い出した.本研究により見い出された低分子化合物が,内臓脂肪蓄積に起因するメタボリックシンドロームの改善作用を有する医薬シーズとして期待できるとともに,これら薬用食品素材が予防的見地から有用な機能性食品の開発につながる成果であると考える.
環境教育における木質バイオマスを題材とした教材の開発とその学習効果

勤務校の農場ビニルハウス内に設置されたペレットストーブに使用できる燃料を、"おがくず"を利用して作成する体験的授業を行うことで、木質バイオマス由来のエネルギーの存在を意識させ、その学習効果を検証した。勤務校森林科学科第3学年の専門科目である「課題研究」において、1、2学期間を"おがくず"燃料における長さの適性と水分量の適性について調査を行った。その結果、長さは3センチさが適正であった。次に、乾燥時に個体として残る成型率を調査した結果、おがくず:水目1:1.25の水分量が適正であった。次に、この燃料を用いて燃焼性調査とストーブへの適性を、自作燃料と市販のペレットを使った燃焼比較試験を実施することで調査した。その結果、市販ペレットの燃焼性が良く、その違いは両者の密度の違いによると考察された。次に、研究のはじめと終わりに質問紙形式のアンケート調査と概念地図を描かせる時間を設け、木質バイオマスに関する生徒の意識の違いを調査した。その結果、エネルギーに関するキーワードの個数とキーワードの関連語句数が有意に増加した。このことより、生徒の木質バイオマスに対する意識が高まることで、より環境に対する認識を高める効果があったと考察できた。エネルギーは、目に見えにくく、実感や納得を伴って理解することが困難であるが、この研究では、「体験→指摘→分析→概念化」の循環型体験学習理論を適用した。すなわち、「目標と課題の設定→燃料作成(体験)→様々な工夫(指摘)→課題解決(分析)→まとめる(概念化〉→燃料適性試験(体験)」のプロセスを経る指導を行い、循環的体験学習を実践した。その結果、"実感と納得を伴った理解"ができる教材づくりを実施し、学習効果を上げることができた。しかしながら、燃料性は市販ペレットと比較すると低く、密度を上げることが今後の課題として残った。
企業の社会的健全性を促進するコーポレート・ガバナンス機能の解明

本研究課題は、企業の社会的責任、という近年その重要性が注目されている問題について、会社法制という視点からのアプローチを試みるというものであった。企業をとりまく利害関係者の中で、企業が社会的責任を果たすべき対象として今回焦点を当てたのは企業の労働力を担う従業員である。具体的なアプローチの手法としては、会社との関係で従業員にもたらされた損害に対しては会社だけでなく役員にも責任を負わせることで、健全な企業運営を担うことに対する経営者の責任意識を高めることにつながることが期待できると考えられる。21年度に予定していた調査内容は以下のとおりである。一.株主アクティビズム型ガバナンス・システムの調査(株主提案権制度およびその他の株主権の利用に基づくもの)二.社会的配慮を欠いた企業経営に関する役員責任のあり方の解明(会社法上の責任問題として)今年度前半は比較法的な検討にあて、ドイツを調査対象に設定した。まず一.については、現時ではまだアメリカの活況が注目されている段階であり、その議論は萌芽的である印象を受けた。この点については次年度においても継続して調査する予定である。次に、二.については、環境法上の事業者責任概念と会社法上の経営者責任をつなぐ研究が進められていたため、まずはその内容について、翻訳を通じての紹介にあてることとした。著者にも随時確認をとりながら慎重に作業を進めた結果、グループ経営において誰が責任主体となるのか等会社法上の伝統的な問題の多くが、本テーマにおいても共通して生じていることが判明した。さらなる解明は次年度以降の継続課題とする。今年度後半は、国内法制における経営者の責任のあり方に目を向けた。CSR(企業の社会的責任)の対象となる利害関係者は多岐にわたり、画一的な理解になじまない。そこで、わが国のCSR問題において特に大きな位置を占める従業員問題に焦点を当て、民法上の不法行為・債務不履行責任との関係から、会社法上の責任のあり方について調査・検討を行った。暫定的な結論が出た段階で、労働法学者と会社法学者混在の研究会で報告し、双方から受けた指摘を踏まえて最終的な結論に向けての調整を行った。その成果については、次年度初頭に公表することを予定している。本研究課題「企業の社会的健全性を促進するコーポレート・ガバナンス機能の解明」において設定した目的は、会社法制におけるCSR(企業の会社責任)のあり方として、特に株主利益の最大化という会社法上避けて通れない要請との間の調整をどのようにして行うのが、そして役員にはCSRに絡む会社法上の責任が発生しうるのか、という二つの観点からこのテーマに対するアプローチを試み、より実効的な解決の糸口を探ることにあった。平成22年度に策定した研究計画においては、会社法制における企業の社会的責任のあり方に関して、EUレベルの規制動向と日本の現状課題の解明を図ることとしていたが、その際には、EUレベル全体での規制動向に目を向けるだけでなく、EU規制に影響を受けた加盟国の法規則や実務の状況に目を向けることが望ましいと考えた。そこで、EU域内の規制動向の調査にあたっては、実施評画の予定通り、2010年11月に勤務大学の提携校であるフランスのボルドー大学を訪問し、フランスにおける規制および実務の現状のヒアリングを行った。また、国内法上の現状課題の解明に際しては、とくに役員の従業員に対する損害賠償責任に焦点を当て、会社法制と労働法制との交錯領域の一つとして検討を重ねた。そして研究会で得た各方面からの意見をふまえてその成果の一部を公表した(詳細は下記の研究成果を参照)。この問題については、上記比較法的観点からも、さらなる分析の必要性が感じられたため、23年度以降も引き続き検討課題とすることを予定している。この研究課題で設定した目的は、昨今重要性が注目される企業の社会的青任のあり方として、特に株主利益の最大化という会社法上避けて通れない要請との間の調整をどのようにして行うのか、ひいては企業の社会的責任という視点から、会社法上も責任問題が発生しうるのか、という観点からこのテーマに対するアプローチを試み、より実効的な解決の糸口を探ることにあった。平成23年度は、従業員の過労死に対する役員の法的責任を中心的な検討課題とした。この問題は、平成22年度に会社法制と労働法制との交錯領域の一つとして役員の従業員に対する損害賠償責任について行った調査の延長線上にあり、今年度は、22年度に行った全般的な責任問題の中から、とくに会社の安全配慮義務違反がもたらした従業員の過労死に対する会社役員の任務懈怠の問題に焦点を当て、調査・検討を行った。検討内容については、23年11月開催の研究会(商法)および24年3月開催の研究会(労働法)の二回に分け、順次報告を行った。

検討および報告を進める中で、会社による安全配慮義務の履行は役員が果たすべき業務の重要な一部として現実にも従えられつつあることが、近年の裁判例の状況から判明したが、その一方で、この検討課題においては会社法上の伝統的議論の一つである会社法上の役員の個人責任と民法上の不法行為責任の関係の見直しを避けて通ることはできないという結論にも至るととになった。なお、今年度の研究途中において上記の課題、すなわち民法上の不法行為責任の問題について新たに見直す必要性が生じたことにより、それをふまえた成果のとりまとめは今年度中に行うことができなかった。したがって、研究期間(平成21年度平成23年度)経過後も、引き続き同課題の検討に取り組む予定である。
ＭＡＰキナーゼ活性の可視化による植物免疫機構の解明

植物独自の免疫システムは、2段階の質的に異なる抵抗反応で構成されるが、共通してMAPKカスケードを介して発揮される。1つのシグナル伝達経路が異なる応答を誘導する要因として、MAPK活性の持続時間の長さや強度の違いが考えられる。病原菌認識後のMAPKの活性動態を調べるには、従来の生化学的解析とは異なり、非破壊的にMAPK活性を評価できる実験系が必要である。本研究では、MAPKの活性動態を可視化するバイオセンサー(MAPKセンサー)を作製し、病原菌が感染した細胞でMAPK活性を時間的・空間的に観察することで、MAPKシグナル伝達機構の分子基盤を構築することを目的とした。本センサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように設計している。FRET強度には、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であり、リン酸化活性に依存して生体内で理想的な配置をとる構造を模索する必要がある。蛍光タンパク質の配向やリンカーの種類を検討し、FRET強度比(ON/OFF)が1.3以上となる実用レベルのセンサーの作製に成功した。また、MAPKセンサーに細胞内局在シグナルを付加し、任意に植物細胞内での局在を調整した。それらセンサーを一過的に発現させたベンサミアナタバコ葉に免疫応答を誘導すると、それぞれの細胞内局在部位においてFRETによる蛍光が観察された。この結果から、作製したMAPKセンサーが、MAPK活性のライブイメージングを可能にする有用なツールであることが示された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本MAPKセンサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように構成されている。FRET強度比(ON/OFF)については、1.3以上であることが実用レベルのセンサーの目安とされる。本研究では1.6のMAPKセンサーが得られていることから、今回作製したMAPKセンサーは植物体内で充分機能するものと判断された。さらに、フォスファターゼに対して感受性であることから、生体内でMAPKの活性減少を反映してFRET蛍光が減衰することも期待される。本MAPKセンサーを一過的に導入したベンサミアナ葉を病原菌由来のエリシタータンパク質で処理したところ、共焦点レーザー顕微鏡下でFRET誘導が確認された。本MAPKセンサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように設計している。昨年度は、センサーに用いるMAPK基質断片の長さを検討し、病害応答性MAPKによる特異的リン酸化を評価することで、MAPKセンサーの最適化を図った。その結果、実用レベルのセンサーの目安であるFRET強度比(ON/OFF)が1.3以上のMAPKセンサーが得られていた。本年度は、得られたMAPKセンサーをベンサミアナタバコに形質転換し、センサー植物の作出に成功した。FRET強度には、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であることが知られており、生体内でより高効率なMAPKセンサーの構築を目指し、蛍光タンパク質に円順列変異を施すことで2つの蛍光標識の配向を調節した。また、ノイズとして検出されるバックグラウンドのFRETを抑える目的で、リンカーの種類と長さの検討も併せて行っている。本年度は、昨年度に作製した実用基準を満たすMAPKセンサーをベンサミアナタバコに形質転換し、センサー植物の作出に成功した。しかしながら、センサー植物の葉組織表面を蛍光顕微鏡で観察したところ、MAPKセンサーは孔辺細胞においてのみ高蓄積おり、その他の表皮細胞において顕著な蓄積は認められなかった。MAPKセンサーには反復配列が含まれているため、植物細胞内のサイレンシング機構の影響を受ける可能性が示唆されている。したがって、本年度、高効率化を図る目的で新たに作製したMAPKセンサーでは、1つの蛍光タンパク質にコドン変異を施すことで、反復配列を回避するよう設計している。

以上の方針によって、生体内で高蓄積・高効率型のMAPKセンサーが得られるものと期待している。植物独自の免疫システムは、2段階の質的に異なる抵抗反応で構成されるが、共通してMAPKカスケードを介して発揮される。1つのシグナル伝達経路が異なる応答を誘導する要因として、MAPK活性の持続時間の長さや強度の違いが考えられる。病原菌認識後のMAPKの活性動態を調べるには、従来の生化学的解析とは異なり、非破壊的にMAPK活性を評価できる実験系が必要である。本研究では、MAPKの活性動態を可視化するバイオセンサー(MAPKセンサー)を作製し、病原菌が感染した細胞でMAPK活性を時間的・空間的に観察することで、MAPKシグナル伝達機構の分子基盤を構築することを目的とした。本センサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように設計している。FRET強度には、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であり、リン酸化活性に依存して生体内で理想的な配置をとる構造を模索する必要がある。蛍光タンパク質の配向やリンカーの種類を検討し、FRET強度比(ON/OFF)が1.3以上となる実用レベルのセンサーの作製に成功した。また、MAPKセンサーに細胞内局在シグナルを付加し、任意に植物細胞内での局在を調整した。それらセンサーを一過的に発現させたベンサミアナタバコ葉に免疫応答を誘導すると、それぞれの細胞内局在部位においてFRETによる蛍光が観察された。この結果から、作製したMAPKセンサーが、MAPK活性のライブイメージングを可能にする有用なツールであることが示された。本年度は、実用レベルのセンサーの目安とされるFRET強度比(ON/OFF)が1.3以上であるMAPKセンサーを構築することを目的とした。センサー構造を模索し、FRET強度を評価したところ、病害応答性MAPKの活性化に伴ってFRET強度比が1.6のMAPKセンサーの作製に成功した。したがって、本センサーは非常に良好であると判断される。さらに、フォスファターゼに感受性であることから、MAPKの活性化に伴いONになるだけでなく、フォスファターゼによって再度OFFにもなるものと期待された。本MAPKセンサーを一過的に導入したベンサミアナ葉では、病原菌由来のエリシタータンパク質に応答したFRET蛍光が観察された。以上の結果より、予想を上回る成果が得られており、今後のさらなる発展が期待される。本年度に作製したMAPKセンサーをシロイヌナズナおよびベンサミアナタバコに導入し、モニター植物の作出を試みる。本研究では、MAPKセンサーに核外輸送シグナルと核局在シグナルを付加することで、核と細胞質基質にそれぞれ分配できることを確認している。シグナルペプチドを付加したMAPKセンサーを導入したモニター植物を作出できれば、核および細胞質基質でのMAPKの活性化を時間的・空間的に調べることができる。
中小ものづくり企業における英語使用に関するESP調査と分析

中小製造業における英語コミュニケーション・ニーズを調べるために、アンケート調査を行い、185社より回答を得た。そのうち26社に対して聞き取りを行った。国内やアジア企業との関係が強いにも関わらず、約半数の企業は英語が最も重要な外国語と答えた。また、特許取得経験のある企業のほうが、ない企業よりも英語の重要性を感じていた。聞き取りでは、国際コミュニケーション能力を備えた人材の不足が海外進出を躊躇させている現状が明らかとなった。今回の調査では、機械金属製造企業を中心に大田区内中小企業185社からアンケートの回答を得た。そのうちの23社に対しては、聞き取りも行った。アンケートの質問は「企業概要」「海外展開や海外との関わり」「取引先」「仲間取引き」「技術開発・製品開発」「試作業務・特許」「経営の方針」の5項目で、全体の質問数は36である。海外展開と外国語ニーズに関する項目に注目し、結果を分析した。海外展開について「直接投資」「業務提携」「直接投資と業務提携両方」を現在行っているか、準備中である企業は20%以下に留まり、135社(74%)の企業が「現在は実施していない」と回答した。しかし、最も関わりのある国はどこかとの質問に対し、中国を始めとするアジアの国をあげた企業が40%近くあった。内訳は中国が24.6%、5.7%が韓国、約5%がタイであるが、業務で最も必要とする外国語を英語と答えた企業は85社(48.3%)、中国語が10社、その他5社であった。英語が最も必要と答えた企業のうち、最も必要な英語技能を「読む」としたものが最も多く34.9%、次いで「話す」の28.9%であった。しかし、英語技能ニーズは海外事業への対応によって異なることが、分析から明らかとなった。海外事業展開をしている企業では「話す」が50%を占めていたが、展開していない企業では「読む」(41.8%)が「話す」(18.2%)を大きく上回った。また、大田区内中小製造企業405社のホームページを調査したところ、2007年10月時点で自社独自のホームページを持っている企業は285社、関連の団体や協会など自社のものではないがホームページを持っている企業は58社あった。独自のホームページを持つ企業のうち65社(22.8%)しか英語のホームページを持っておらず、独自ではないホームページでは1社のみである。これは全体のわずか16%である。平成19と20年度に金属機械関連を中心に、東京都大田区の中小製造企業を対象に行ったアンケート調査では、回答のあった185社の50%近くが「最も必要な外国語」は英語と答えている。平成20年度の分析結果では、特許を取得しているか申請経験のある企業のうち56%以上が、英語が「最も必要な外国語」と答えおり、外国語は必要ないと回答した企業は約3割であった。それに対し、特許申請経験のない企業では、36%しか英語が必要と答えておらず、60%近くが外国語は必要ではないとしている。平成20年度は、大田区で行ったものと同様のアンケートを埼玉県内の中小企業へ配布し、その一部の回収を行った。平成20年度は、従業員に対して英語教育または英語学習への支援を行っているのか、外国語力のある人材は確保しているかについて聞き取りを行い、その背景を探った。データの一部で分析を行い、従業員の英語コミュニケーション教育は、時間と経済的な理由から難しい状況が明らかとなった。調査した大田区中小製造企業の英語ホームページ開設割合は16%しかないが、平成20年度は英語ホームページの表記形式、内容や英語のレベルを探った。中小企業の英語ホームページの多くには、製品紹介が含まれているが、製品の写真と名称、または簡単なスペックのみが英語である場合が多く、製品の特長や用途などの記述は少ないことが分かった。詳細な分析を行うためには対象企業の承諾を得て行う必要があり、21年度では承諾を得られた企業の英語のホームページの分析を行う予定である。ものづくりを支える先進的な中小企業の多くは、海外取引を積極的に進め、業績を伸ばしているが、申請者が平成19年度と20年度に東京都大田区の中小製造企業を対象に行ったアンケート調査では、海外展開をしている企業は20%以下に留まり、135社(74%)の企業が「実施していない」と回答した。調査した企業の40%近くが、最もかかわりのある国としてアジアの国をあげ、調査した企業の50%近くが最も必要な外国語は英語と答えている。しかし、英語のホームページを開設している企業は調査した約400社中16%にとどまっている。聞き取りからは海外企業からのアプローチに対し、中小企業が後ろ向きである状況も浮かび上がっており、英語でのコミュニケーションへの不安が海外との交渉への糸口を失わせている状況を示唆している。

平成21年度の分析結果では、調査した企業のうち、特許取得の経験や海外展開の有無などにより、英語コミュニケーションニーズが異なっていることが明らかとなった。特許出願のある企業では、その56%以上が英語が「業務で最も必要な外国語」であると回答しているが、出願経験のない企業の59%以上は、外国語は必要ないと回答した。また、最も必要な英語の技能については、海外展開のある企業の約54%がspeakingとし、次いで23%がreadingと回答した。海外展開のない企業では、readingと回答したものが約54%を占め、speakingとしたものは約23%と逆の結果となった。平成21年度に、埼玉県内の中小製造業に対してもホームページの調査を行ったところ、大田区と同様に英語化は進んでおらず、海外取引に消極的であることも聞き取りより分かった。ホームページの英語部分の記述について一部で分析を行ったところ、製品名や製品の説明や記述の一部が英語である場合が多いことが分かった。
永久歯エナメル質初期齲蝕の客観的診断法ならびに管理システムの確立の検討

齲蝕罹患様相が多様化した初期齲蝕は,あらためて客観的な齲蝕診断の確立が必要である。さらに初期齲蝕の管理に際しては,齲蝕リスクファクターの評価を行いながら,科学的根拠に基いた合理的なシステムを構築する必要がある。そこで筆者らは,第一に初期齲蝕(様)診断の臨床的な基準を図る目的で,従来型の探針を改良した齲蝕診断と,DIAGNOdentを使用して客観的な齲蝕診断を行った後,組織標本を製作してその関係を検討した。・先端直径が0.25mmならびに0.50mmの球形で、最大触診圧が150g以上加わらないように特殊加工した齲蝕診断用の探針を開発した。これにより、歯質を極力破壊せず、かつ初期齲蝕の程度を客観的に判断できることが可能となった。・CCDスキャナを利用し、外光の影響を受けずに色彩を分解・解析し、齲蝕の色を8つのパターンに分類できる齲蝕画像診断装置を開発した。これにより、主観的になりがちだった、視覚による齲蝕診断が客観的に行えるようになった。・DIAGNOdentの値は,齲蝕の進行状態や形態により、明らかに異なる測定値が得られ,信頼性があったが、プラークの有無、齲窩の着色・乾湿・硬さ、軟化歯質の量、そして測定プローブの挿入角度などの影響を受けるため、測定に際しては十分に注意をする必要があることがわかった。・0.25mm探針で感知できず、視診や探針による触診では健全歯されてしまう群もDIAGNOdentにより初期齲蝕の診断が下されるケースがめだった。・0.5mm探針で感知できる齲蝕群のDIAGN0dent測定値は、2690とばらつきが見られた。・先端が鋭利となっているプローブ群と先端が直径0.25m皿となっているプローブ群のDIAGNOdent測定値平均値に統計的有意差は認められず,鋭利プローブと0.25mmプローブは,ほぼ同一の齲蝕検出能力があり、臨床上0.25mmプローブを用いることが有効であることが示唆された。1.初期齲蝕の臨床的診断法の客観的診断法を確立する目的で、今年度は予備的検討を以下のように行った。定期的検診で来院した管理患児を対象に、対象児の第一大臼歯健全歯および初期状態の齲蝕歯70歯を被験歯にして、診査者の視診検査、探針(プローブ)診査、レーザー齲蝕診断器(DIAGNOdent,Kavo社)測定、歯面拡大写真(ベルサイトフリーズ、タカラベルモント社)による裂溝形態および齲窩の大きさの観察を行った。なお探針先端の太さは、従来型の鋭利探針、0.25探針、0.5CPIプローブを用いた。2.その結果、鋭利探針と0.25探針は、DIAGNOdent齲蝕診断測定値はほぼ2030の値を示した。これに対し、0.5CPIプローブは他の2種の探針に比べ有意に高い値を示した。もしも鋭利探針を用いることが齲蝕病巣の最石灰化の障害とならば、0.25探針を用いての齲蝕診査であっても客観的なレーザー診断による測定値ではほぼ同一値を示すことが明らかになった。3.今回の予備的検討から、視診、探針診査、レーザー齲蝕測定結果と抜去歯を用いた病理学的組織像との関係を検討する。近年,齲蝕診査は視診を中心に初期齲蝕の診断にはCPIプローブを用いて検出する方法が国際的にも認知されているが,わが国の小児の口腔状況での合理的方法での検討がみられない。そこで,永久歯エナメル質咬合面裂溝齲蝕の客観的診断法を確立する目的で,小児期の第一大臼歯42歯を被験歯に,先端太さが異なる鋭利,0.25,CPIの3種類のプローブを作成し,プローブ審査および視診による齲蝕および色調の診査を行った。客観的検査法としてレーザー齲蝕診断器DIAGNOdent(KAVO)にて測定し,プローブ診査,視診による齲蝕および色調診査との関係について検討した。同時に抜去歯の歯について,上記のような診査を行い,抜去後切片標本を作製し,組織学的な検索を行った。その結果,プローブとDIAGNOdent値との関係については,鋭利プローブと0.25プローブとの間に有意な差はみられなかったが,CPIプローブと鋭利プローブおよび0.25プローブとの間に有意な差がみられ,CPIプローブは大きい値を示した。また,視診による診査とDIAGNOdent値との関係では,C歯とCOおよび健全歯との間に有意な差が認められた。組織標本での検討では,齲蝕診査では0.25プローブの脱灰像はエナメル質に限局し,CPIプローブでは象牙質に脱灰が波及していた。このような結果からCPIプローブと0.25プローブを用いて齲蝕の診査診断することは,より合理的な初期齲蝕診断法であることが示唆された。今後は抜去歯による検討を数と内容を増やし行う予定である。

さらに初期齲蝕の管理に際しては,齲蝕リスクファクターの評価を行いながら,科学的根拠に基いた合理的なシステムを構築する必要がある。そこで筆者らは,第一に初期齲蝕(様)診断の臨床的な基準を図る目的で,従来型の探針を改良した齲蝕診断と,DIAGNOdentを使用して客観的な齲蝕診断を行った後,組織標本を製作してその関係を検討した。・先端直径が0.25mmならびに0.50mmの球形で、最大触診圧が150g以上加わらないように特殊加工した齲蝕診断用の探針を開発した。これにより、歯質を極力破壊せず、かつ初期齲蝕の程度を客観的に判断できることが可能となった。・CCDスキャナを利用し、外光の影響を受けずに色彩を分解・解析し、齲蝕の色を8つのパターンに分類できる齲蝕画像診断装置を開発した。これにより、主観的になりがちだった、視覚による齲蝕診断が客観的に行えるようになった。・DIAGNOdentの値は,齲蝕の進行状態や形態により、明らかに異なる測定値が得られ,信頼性があったが、プラークの有無、齲窩の着色・乾湿・硬さ、軟化歯質の量、そして測定プローブの挿入角度などの影響を受けるため、測定に際しては十分に注意をする必要があることがわかった。・0.25mm探針で感知できず、視診や探針による触診では健全歯されてしまう群もDIAGNOdentにより初期齲蝕の診断が下されるケースがめだった。・0.5mm探針で感知できる齲蝕群のDIAGN0dent測定値は、2690とばらつきが見られた。・先端が鋭利となっているプローブ群と先端が直径0.25m皿となっているプローブ群のDIAGNOdent測定値平均値に統計的有意差は認められず,鋭利プローブと0.25mmプローブは,ほぼ同一の齲蝕検出能力があり、臨床上0.25mmプローブを用いることが有効であることが示唆された。
ライフサイクルを考慮した製品管理システムに関する研究

近年、製品が製造されてから廃棄されるまでの過程である製品ライフサイクルについて、情報システムの整備が進められている。現在、回収過程の一元管理を実現する技術として、電波を用いた固体認識技術であるRadio Frequency IDentification (RF-IDタグ)が注目されている。本研究では、RF-IDタグを利用した製品ライフサイクルにおいて、知識情報処理を用いて効率的な製品の流れを実現することを研究の目的とする。製品ライフサイクルのうち、開発、調達、製造、配送、販売といった一連の業務のつながりであるサプライチェーンは、プロセス全体の流れを把握することが困難である。今年度の研究ではサプライチェーンにおいて業務の流れを複数設定し、それらを相対的に評価するシミュレーションシステムを開発した。このシステムから提供される情報を利用する方法により、利用者の目的に応じたサプライチェーンの構築が可能となる。また製品ライフサイクルのうち、利用、回収、処理、再利用といった一連の製品回収業務の流れについて、配送方針や回収業者・処理業者の業者数を設定した上で、配送量や処理量といった条件を様々に変化させて評価を行なうシステムを構築した。このシステムにより、RF-IDタグ情報を利用する方法によってあらゆる状況において低コスト・低環境負荷の製品回収業務が実現できることが確認できた。さらに製品ライフサイクルにおいて必須となる企業情報システムの連携について、それらを支えるアーキテクチャと連携技術の分析を行った。その結果、システム連携は4つのタイプに分類され、必要となる技術やアーキテクチャはタイプごとに異なることが判明した。現在、回収過程の一元管理を実現する技術として、電波を用いた固体認識技術であるRadio Frequency IDentification(RF-IDタグ)が注目されている。本研究では今年までに、リサイクル・リユースを考慮し、廃棄パソコンを細分化して各部品毎に回収、処理を行う場合について、コスト優先、環境負荷優先における最適な配送方法を決定する方法を提案した。提案方法では、RF-IDタグにより各部品では処理時間、部品識別番号などの情報を保有しているものとし、待ち行列で表現される回収業者・処理業者に対してデータが出入りする動作により各部品の流れを表現する。提案方法の有効性を確認するためにシミュレーションシステムを構築した。本システムでは、単位時間毎に行う部品別回収業務の流れを表現し、全体として最適な回収業務を行うために線形計画法を活用している。本システムによりRF-IDタグを利用した部品別回収業務と従来の部品別回収業務との比較実験を行い、RF-IDタグ情報利用によるコスト抑制の効果を確認した。本研究では昨年度までに製品の静的な流れに着目し、リサイクル・リユースを考慮した製品の回収業務における低コスト・低環境負荷となる配送方法の実現を行っている。今年度は製品の動的な流れに着目し、サプライチェーンで表現される製品の製造過程において最適な生産方法を決定する方法を提案した。提案方法では階層構造をもつ多段階生産工程モデルについて、RF-IDタグから供給される情報をもとに製品を製造するメーカ内部およびそれをサポートするサブメーカ内での部品の流れを管理することができる。提案方法の有効性を確認するためにシミュレーションによる評価システムを構築した。本システムでは、単位時間毎に行う製造部品の流れを表現し、様々な条件での製造のコスト・時間を算出して比較・検討を行うことができる。本システムによりRF-IDタグを利用した生産業務による効果を確認するための実験を行い、RF-IDタグ情報利用によるコスト抑制・時間短縮の効果を確認した。
脱炭素酵素ナトリウムポンプ複合体の全体構造の決定

OAD2複合体はATPをエネルギー源としないプリミティブなナトリウムポンプの一つである。OAD2複合体の全体構造は明らかとなっていないが、三つのサブユニットOAD-α、OAD-β、OAD-γが4:4:4で構成されていると考えられている。本研究の最終目的である複合体の全体構造を決定するには至らなかったが、新たに高活性の安定したOAD2複合体を精製することに成功し、サブユニットが4:2:2で複合体を形成していることを示唆することができた。OADは三つのサブユニットOAD-α、OAD-β、OAD-γで形成されており、脱炭素転移酵素として働くOAD-αの酵素活性には自身のビオチン化が重要であることが知られている。OAD-γのN末端にHisタグを付加した組み換えOAD2複合体を大量培養する際にビオチンを添加することビオチン化したOAD-αを効率よく産生することに成功し、それに伴って高活性の組換えOAD複合体を大量発現することができた。ビオチンアフィニティーカラムとNi-NTAアフィニティーカラムを併用することで安定したOAD-α、OAD-β、OAD-γの三者複合体を得ることに成功した。また精製法の確立を行う中で、Ni-NTAカラムとゲル濾過クロマトグラフィーによる精製の結果、OAD-α、OAD-β、OAD-γの三者複合体とOAD-β、OAD-γの二者複合体を含む溶出ピークが得られた。組換えOAD複合体はOAD-γ、OAD-α、OAD-β遺伝子をコードしているオペロンをそのまま発現ベクターに組み込んでおり、OAD-α、OAD-β、OAD-γは1:1:1の割合で翻訳されているにも関わらず二種類の複合体が形成されていた。三者複合体の溶出ピークのSDS-PAGEの結果を合わせるとOAD-α、OAD-β、OAD-γは1:1:1ではなく2:1:1の割合で複合体を形成していると考えられる。OAD2複合体の全体構造はOAD-α、OAD-β、OAD-γが4:4:4で構成されていると知られていたが、今回の結果から4:2:2である可能性が強く示唆された。安定したOAD2複合体の精製に成功したことにより、全体構造を決定するための複合体の結晶化を精力的に行ってきたが、微結晶や結晶様の沈殿は得られたが、構造解析に十分な結晶を得ることは出来なかった。本研究では最終目的である複合体の全体構造を決定するには至らなかったが、新たに高活性の安定したOAD2複合体を精製することに成功した。組換えOAD複合体を大量発現すると非ビオチン化OAD-αが大量に存在し、そのために非ビオチン化OAD-αと結合しているOAD-γ及びOAD-γと結合しているOAD-βが、精製初期のビオチンアフィニティークロマトグラフィーの段階でかなり損失しているという問題が起こっていた。そこでこの問題を解決するためにビオチン化OAD-αの存在比を大きく増加させる条件検討を行った。まず初めにビオチン化酵素BirAを共発現させることを試みた。しかし、BirAとOAD2複合体を共発現させた大腸菌C43(DE3)ではコロニーは生えるものの、液体培地で濁度が上がらないという問題が生じた。IPTGによる発現誘導後、溶菌化がみられ、集菌することができなかった。次に、IPTGによる発現誘導前にビオチンを付加することでビオチン化OAD-αの割合を増加できないかと考え、終濃度10μMになるようにビオチンを培地に付加して培養、発現誘導を行った。同時に精製条件の改善を目指し、Ni-TNAアフィニティーカラムとゲル濾過クロマトグラフィーでの精製を行った結果、様々な界面活性剤でゲル濾過クロマトグラフィー試みた中で、ドデシルマルトシドを用いたバッファー条件でOAD-α、OAD-β、OAD-γの三者複合体とOAD-β、OAD-γの二者複合体のOAD2を分離することが出来、安定した三者複合体の精製に成功した。精製過程でサンプルの損失の大きいゲル濾過クロマトグラフィーを使ってもなお、1LのLB培地から約0.1mgと以前の二倍量の安定した複合体を精製することに成功した。自動結晶化ロボットMosquitoを用いて精製したOad2複合体の結晶化を行ったところ、以前とは異なる結晶化条件で微結晶を得ることに成功した。ビオチン化酵素の共発現は成功しなかったが、培養段階でビオチンを付加することでビオチン化OAD-αの割合が増加した組換えOAD複合体を大量発現することに成功し、最終精製標品の収量を二倍に増やすことに成功した。