hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
留学が学習者の英語力と内面的変容に及ぼす効果の統合的メカニズムに関する縦断的研究

本年度は1年間研究期間を延長した計4年間の最終の年度であり、次の点について主に研究を進めた。本研究で留学者から収集した留学中の出来事を振り返るインタビューデータを分析するために用いられる質的な分析手法であるTEA(複線経路等至性アプローチ)について、さらに正確な理解と運用を期するために、日本精神衛生学会で開催されたTEAに関するワークショップに参加し、演習形式を交えた講習を受けた。これまでは、個々の留学者別にTEA分析を行ってきたが、今回のワークショップでは、複数名の対象者のたどる留学中の経路の共通性を探り、その経路にさらに抽象的で一般性のあるネーミングをしていくという分析手法について研修を受けた。それを基に、留学体験者のうちこれまで別々に分析を行なってきた4名に対して再度TEAを行った。その結果、浮かび上がってきた共通の事象としては、まず一つには、個人のもともとの性格や、留学前の人生経験で培われた留学者の考え方や物事の認識の仕方が、留学中の出来事や分岐点での選択に大きな影響を与えることが判明した。また、留学中に遭遇する問題点や、多かれ少なかれ誰もが遭遇する留学中のある種の「スランプ」からの脱出には、周囲からの言語的、非言語的サポートや、偶発的かつ経路を進むのに促進的な出来事などの「社会的助勢」が関与していることが判明した。さらに、留学者の自発的な現地での人間関係への働きかけが本人の自己効力感の向上につながることがあらためて確認された。これらの知見については、今年度中に投稿予定で現在論文化を行っている最中である。平成27年度は2年次後期に半年間の留学をする学生からウェッブ上のポートフォリオを利用して、質的分析のための留学中の振り返りのデータを収集した。また、英語力の伸長を測る目的で、該当学生は留学前後にTOEICを受験した。また、異文化間能力の側面については、先行研究で多用されているIDI (Intercultural Development Inventory)の使用者・指導者としての認定を得るために、カナダ・トロントで開催された認定者セミナーに参加し、その資格を得た。平成28年度は異文化間能力の測定にこのテストを他のものと合わせて用いる予定である。その一方で、時間的制約から学生の音声的側面のデータと異文化間能力側面のデータを取ることができなかった。また、当該学生が帰国後の平成28年3月にインタビューを行う予定であったが、勤務大学の予期せぬ海外出張業務が入ったため、実施には至っていない。初年度の平成27年度は、科研申請当時には予定されていなかった勤務大学の海外出張業務が3件入り、その準備と実施に追われていたため。本年度は、昨年度留学した学生からeポートフォリオを用いて収集した留学中の記録を整理して、文字データとして整理した。次に、1)学生は留学中に何を経験したのか、2)2つの留学先で何か違いはみられるのか、3)時間とともに学生の経験は変化していくのか、について量的・質的に分析した。量的分析には、KH Coderというデータマイニングのためのソフトを使用して分析した。また、同時に質的解釈も行った。その結果、1)については、学生の記述は、「授業・クラスメイト」「言語」「ホストファミリー」「振り返り」の4つの分野について主に記述されていることが分かった。2)と3)については、2つの異なるキャンパスでは、異なる記述がされていることが量的に示された。この分析の結果については、12月1日3日に、シンガポール国立大学で開催されたThe Seventh CLS International Conference CLaSIC 2016 (於:シンガポール国立大学)で口頭発表を行った。加えて、過去4年分の本学の研究対象留学プログラムの学生アンケートの分析を行った。この4年間では本学の当該留学プログラムには大きな変化が加えられたので、1)4年間の変化、2)異なるキャンパスでの違い、3)学生は何を学んだか、4)学生はどのような問題を抱えていたか、5)大学としての今後の課題、についてプログラム評価の観点から分析を行った。その結果、1)学生の英語力の伸長の領域、2)ホームステイの形態や場所は、ホームステイの満足度と関係していないこと、3)留学生との混合授業の重要性、4)学生の振り返りが抽象的で浅い面があることなどが指摘された。この分析の結果については、3月19日20日に、京都大学で開催された第23回大学教育研究フォーラムで口頭発表を行った。今年度は前年度の遅れを取り戻すための作業に時間を要し、今年度予定の作業に少し遅れが生じた。また、本学で新たなプロジェクトが今年度立ち上がり、その主担当にも任命されたのでそれも影響している。加えて、本年度はデータ収集に自発的に協力してくれた学生の数が昨年度よりも少なくなったことも原因に挙げられる。本年度は次の3点について研究を進めた。一点目は、留学体験者のうち、留学中のポートフォリオを一定回数以上記録した学生を選定しインタビューを行った。インタビューデータは録音され文字起こしが行われた。そして、その中から1名を選定し、ケーススタディとして、TEA(複線経路等至性アプローチ)を用いて質的分析を行った。その結果、この学生は、自身の英語力への劣等感を周囲との関係の構築することによって、そして外部と外的諸問題を共に解決することによって乗り越えていくプロセスが明らかになった。この詳細については、2018年3月13日に、53rd RELC INTERNATIONALCONFERENCE(RELC

2018)で口頭発表で報告した。二点目は、上記のインタビューデータの中から4名をTEAによって分析した。その結果、1個人の性格や留学前の人生が「社会的助勢」や「社会的方向付け」として随所で影響を与える、2留学生活の最初は順調でも、後日何らかのスランプに陥る、3留学生活のスランプからの脱出には「社会的助勢」が関与している、4自発的な現地での人間関係への働きかけが、留学者の自己効力感の向上につながる、ことが明らかになった。この詳細については、2018年3月20日に、第24回大学教育研究フォーラムで口頭発表を行った。三点目は、昨年度の学会での口頭発表の論文化を行った。過去4年間の留学後の事後アンケートデータを基に、14年間の変化、2異なるキャンパスでの違い、3学生は何を学んだか、4学生はどのような問題を抱えていたか、5大学としての今後の課題の5つの問いについて、量的・質的分析を行った。その結果、留学先による違い、授業の種類による違い、ホームステイのタイプ(シングルまたはダブル)による違いについての特徴が明らかとなった。・勤務大学が採択された事業プロジェクトの責任者に任命され、平成29年度から本格的にスタートしたため。・インタビュー対象者との面会の調整やインタビューのスクリプト作成に時間をさらに要するため。・研究内容をさらに公表するための学会発表ならびに英語での論文執筆を考えているため本年度は1年間研究期間を延長した計4年間の最終の年度であり、次の点について主に研究を進めた。本研究で留学者から収集した留学中の出来事を振り返るインタビューデータを分析するために用いられる質的な分析手法であるTEA(複線経路等至性アプローチ)について、さらに正確な理解と運用を期するために、日本精神衛生学会で開催されたTEAに関するワークショップに参加し、演習形式を交えた講習を受けた。これまでは、個々の留学者別にTEA分析を行ってきたが、今回のワークショップでは、複数名の対象者のたどる留学中の経路の共通性を探り、その経路にさらに抽象的で一般性のあるネーミングをしていくという分析手法について研修を受けた。それを基に、留学体験者のうちこれまで別々に分析を行なってきた4名に対して再度TEAを行った。その結果、浮かび上がってきた共通の事象としては、まず一つには、個人のもともとの性格や、留学前の人生経験で培われた留学者の考え方や物事の認識の仕方が、留学中の出来事や分岐点での選択に大きな影響を与えることが判明した。また、留学中に遭遇する問題点や、多かれ少なかれ誰もが遭遇する留学中のある種の「スランプ」からの脱出には、周囲からの言語的、非言語的サポートや、偶発的かつ経路を進むのに促進的な出来事などの「社会的助勢」が関与していることが判明した。さらに、留学者の自発的な現地での人間関係への働きかけが本人の自己効力感の向上につながることがあらためて確認された。これらの知見については、今年度中に投稿予定で現在論文化を行っている最中である。平成27年度に収集したデータの分析を進めると同時に、当初の予定を変更して、一学年下の学生も縦断的研究の調査対象学生に新たに加える予定である。
精神分裂病の情動症状に関する分子生物学的及び行動薬理学的研究

Methamphetamine(MAP)隔日漸増投与によっで慢性覚醒剤中毒モデルを作成し、攻撃性の増強に覚醒剤反復投与が影響するかどうかを検討した。MAP反復投与したラットのケージに生食(生理的食塩水)反復投与したラットを置くと、MAP反復投与ラットによる顕著な攻撃行動が認められ、さらに雄の性行動が認められた。生食反復投与ラットのケージに生食反復投与ラットを置いた場合には、攻撃行動も性行動もあまりみられなかった。したがって、MAPを大量反復投与したラットでは、異常な攻撃行動も性行動も顕著にあらわれた。恐怖条件付けストレスによって観察される不安行動もMAP反復投与ラットで増強してみられた。MAPの不安行動に対する効果はドーパミン2受容体遮断薬によって減弱したが、興奮性アミノ酸拮抗薬によっては影響をうけなかった。さらに、グルタミン酸放出抑制剤であるMS-153を投与し、不安行動の発現に対する影響を検討した。MS-153は用量依存性に恐怖条件付けの獲得過程を抑制し、さらにいったん獲得した不安行動に対しても抑制効果を示した。これらの結果は、内因性のグルタミン酸の機能を抑制することが不安・恐怖の獲得の抑制につながることを示唆している。扁桃体、視床背内側核破壊の不安行動の発現に対する影響を検討した。その結果、両側扁桃体あるいは両側視床背内側核破壊は恐怖条件付けの獲得過程と発現過程の両過程を抑制したを抑制した。以上の結果は、扁桃体と視床背内側核が不安行動において重要な役割をはたしていることを示唆している。グルタミン酸神経伝達とも関連を有するproteinkinase Cの阻害剤であるstaurosporineを慢性投与したところ、恐怖条件付けの発現過程は影響をうけなかったが、獲得過程は抑制された。Methamphetamine(MAP)隔日漸増投与によって慢性覚醒剤中毒モデルを作成し、攻撃性の増強に覚醒剤反復投与が影響するかどうかを検討した。恐怖条件付けストレスによって観察される不安行動もMAP顕著にあらわれた。反復投与ラットで増強してみられた。不安行動における脳内ドーパミン、グルタミン酸、protain kinase Cの役割を明らかにするために、恐怖条件付けの際にそれぞれの拮抗薬を投与して不安行動に対する影響を解析した。ドーパミンD1/5遮断薬、グルタミン酸取り込み促進薬、protein kinase C阻害剤の投与はそれぞれ恐怖条件付けの獲得過程を抑制した。したがって、恐怖条件付けの過程にはドーパミン、グルタミン酸、protein kinase Cが関与していることが示唆された。現在、覚醒剤投与ラットにおける攻撃行動、不安行動の増強におけるこれらの薬剤の効果も検討中である。グルタミン酸トランスポーターであるGLT-1 mRNAのin situ hybridization実験を行い、MAP急性投与がmRNA発現を刺激する傾向がえられた。慢性覚醒剤中毒モデルラットの不安行動における内因性グルタミン酸の役割を明らかにする目的で、覚醒剤を投与しないラットに対して、グルタミン酸放出抑制剤であるMS-153を投与し、不安行動の発現に対する影響を検討した。

なお、MS-153の効果は条件付けの3時間前と30分前の投与ではみられたが、24時間前の投与ではみられなかった。したがって、MS-153の効果持続時間は比較的短時間であると考えられた。MS-153を慢性投与するとMS-153の恐怖条件付け獲得過程に対する効果は増強した。これらの結果は、内因性のグルタミン酸の機能を抑制することが不安・恐怖の獲得の抑制につながることを示唆している。覚醒剤はドーパミンをはじめとするモノアミンに対して主たる作用を持つが、当教室のこれまでの検討では、覚醒剤のグルタミン酸に対する作用が行動感作を惹起することが示されてきた。したがって、グルタミン酸に対する作用を介した不安・攻撃性に対する覚醒剤の影響について、今後MS-153を用いて検討していく。慢性覚醒剤中毒モデルラットの不安行動に関わる内因性グルタミン酸の作用脳部位を明らかにする目的で、覚醒剤を投与しないラットに対して、扁桃体、視床背内側核破壊の不安行動の発現に対する影響を検討した。両側扁桃体あるいは両側視床背内側核を高周波破壊し、フットショックによる恐怖条件付けを行い、24時間後に再びラットをショック箱に入れた際の不安行動(すくみ行動)を観察した。両側扁桃体破壊ラット及び両側視床背内側核破壊ラットでは、不安行動は有意に低く出現した。すなわち、両脳部位破壊は恐怖条件付けの獲得過程を抑制した。さらに、いったんフットショックによってショック箱に恐怖条件付けを行った後に、脳破壊を行い、10日間の回復期間の後にラットをショック箱に再曝露する実験を行ったところ、いったん獲得されたはずの条件恐怖は両側扁桃体破壊ラット及び両側視床背内側核破壊ラットで有意に低く出現した。したがって、両脳部位破壊は恐怖条件付けの発現過程を抑制した。以上の結果は、両側扁桃体破壊及び両側視床背内側核破壊が恐怖条件付けの獲得過程と発現過程の両過程を抑制することを示している。覚醒剤中毒モデルラットでは恐怖条件付けによる不安行動が増強するが、覚醒剤が不安増強を引き起こす脳部位としては、扁桃体と視床背内側部がその候補としてあげられる。今後、覚醒剤の作用脳部位を明らかにするために、扁桃体や視床背内側核に覚醒剤およびグルタミン酸拮抗薬を脳局所投与し、恐怖条件付けに対するを検討することにより、覚醒剤による不安増強に関わる神経回路を解明したい。
メドウフェスク由来候補遺伝子移入によるペレニアルライグラスの越冬性向上効果の検証

近年越冬性の改良が強く求められているペレニアルライグラスと交雑可能なメドウフェスクについて、その越冬性関連ゲノム領域を同定する目的で、ペレニアルライグラスにメドウフェスクの一部のゲノム領域が移入したイントログレッション集団を材料に用い、候補遺伝子のアプローチおよび戻し交雑後代のQTL解析により遺伝解析を行った。5つの候補遺伝子を対象にその周辺領域の遺伝子型と耐凍性の関係を解析した結果、VRN1遺伝子周辺領域に耐凍性向上効果が示唆された。一方、圃場越冬性のQTL解析の結果第7連鎖群にメドウフェスク由来アリルが正の効果を示す領域を同定した。1葉身においてメドウフェスク(MF)型アリルの耐凍性向上効果が確認されたVRN1遺伝子について、これまで用いていた材料においてはVRN1座の他に別の染色体での移入が関与している可能性が考えられたことから、DNAマーカーおよびGISH法によりVRN1遺伝子座周辺のみMFからペレニアルライグラス(PR)へ移入した個体を再度選抜し、葉身の耐凍性を評価した。その結果、MF型の耐凍性が高いという再現性が得られたため、今後の試験材料にすることとした。MF由来MFH2およびCBF遺伝子座周辺領域がPRへ移入した個体について葉身の耐凍性を評価した結果、遺伝子型間で有意な差異は認められなかった。γ-チオニンをコードすると考えられるMFH3について、多交配によるイントログレッション系統を作出し、MF型、PR型ホモ各4母系について黒色小粒菌核菌の接種検定を行ったが抵抗性に有意な差異は認められなかった。一方各4母系をバルクとした幼苗の冠部の耐凍性はMF型のほうが優れる傾向が認められた。MFH4のイントログレッション系統を作出し幼苗の冠部耐凍性を評価したが遺伝子型による有意な差異は認められなかった。2MFH2、MFH3およびMFH4について35Sプロモータによる過剰発現形質転換体T3世代を作出し、導入遺伝子の発現量の高い各2-3系統を選抜した。3候補遺伝子のアプローチに加え、二倍体イントログレッション集団を用いたQTL解析によりMF由来アリルの越冬性向上効果を検証した。これまでの試験で越冬性QTLの存在が示唆された第七連鎖群にMF由来部分染色体が移入した個体の戻し交雑後代集団について札幌の圃場で越冬性を評価した結果、越冬後生存率および越冬後緑部割合について、イネOs08g33630オーソロガス遺伝子座の近辺にMFアリルがPRアリルに対し正の効果を示すQTLが認められた。1メドウフェスク由来越冬性候補遺伝子のホモ型イントログレッション個体の作出と解析まず本研究で越冬性候補遺伝子の対象とするVRN1、CBFおよび3つのメドウフェスク高発現遺伝子MFH2、MFH3およびMFH4の自然条件の低温馴化時の発現量をメドウフェスク(MF)とペレニアルライグラス(PR)各2品種で比較した。その結果、MFHはMFでPRと比較し510倍の発現量を示した。一方、VRN1は種間で有意な発現量の差異は認められず、またCBFは5つのホモログにより異なる傾向を示した。次にVRN1、MFH3およびMFH4について、MF「まきばさかえ」に由来する各遺伝子を含む周辺ゲノム領域がPR「八ヶ岳D12号」に移入した個体間の交配を行った。後代について各候補遺伝子の遺伝子型毎に1015個体のバルクとして電解質漏出法による葉身の耐凍性を評価した。その結果、VRN1周辺領域の移入について耐凍性の差異が認められ、PR型ホモ、ヘテロ、MF型ホモの順に耐凍性が強かった。一方、MFH3およびMFH4については候補遺伝子の遺伝子型間で耐凍性に明瞭な差異は認められなかった。各遺伝子型3個体を対象に低温馴化時の遺伝子発現量を評価した結果、MFH2およびMFH3については、MF型ホモはPR型ホモの1.52倍の発現量であったが有意差はなかった。一方、VRN1はMF型ホモ、ヘテロ、PR型ホモの順に発現量が高く、その差異は有意であった。2メドウフェスク高発現遺伝子のシロイヌナズナ過剰発現形質転換体の作出MFH2、MFH3およびMFH4について35Sプロモータによる過剰発現形質転換体T2世代を作出した。1メドウフェスク(MF)アリルのペレニアルライグラス(PR)へ移入により耐凍性向上効果が認められたVRN1について、最終年度はその周辺領域の移入個体を2個体選抜し、それらの交配により分離集団を作出した。分離集団におけるVRN1周辺領域はMF由来アリルの頻度が極端に低い傾向が認められた。

葉身の電解質溶出法による耐凍性検定の結果、VRN1遺伝子座MFホモ型の電解質溶出率平均値は、ヘテロ型およびPRホモ型より低い結果を示したが、有意な差異は得られなかった。今後別の手法による耐凍性の評価を含め再現性を確認する必要がある。また遺伝子発現解析の結果、MF由来アリルの移入により、低温処理後の発現量増加が抑制される傾向が複数年次において認められ、耐凍性の差異との関連が示唆された。その他の候補遺伝子であるCBFおよびMF高発現遺伝子(MFH2、MFH3およびMFH4)については、そのMF由来アリル周辺領域の移入に有意な耐凍性向上効果は認められなかった。2MFH2、MFH3およびMFH4の過剰発現シロイヌナズナ形質転換体について、幼植物体の耐凍性を評価したが、野生型との有意な差異は認められなかった。3圃場越冬性のQTLが認められた、MF由来7番染色体移入個体の分離集団を用い、雪腐病黒色小粒菌核菌の接種試験を行った結果、雪腐病の抵抗性について有意なQTLは認められなかった。圃場越冬性のQTLは黒色小粒菌核病抵抗性のみによるものではなく、その他の複数要因が関与するQTLである可能性が示唆された。<まとめ>本研究を通じ、メドウフェスク由来VRN1周辺領域(4番染色体)が耐凍性に、7番染色体が圃場越冬性に、それぞれ正の効果を示す可能性が示唆された。さらなる再現性の評価が必要であるが、選抜DNAマーカーとしての利用にむけて重要な知見が得られた。植物分子育種学5つの越冬性候補遺伝子のうち、葉身の耐凍性の検証については、全ての遺伝子で完了した。ホモ型イントログレッション系統の作出と冠部の耐凍性の評価については、MF型の移入により雄性不稔になるケースが認められたことなどから2遺伝子(MFH3,MFH4)のみ評価を行うことができた。シロイヌナズナ形質転換体を用いた機能解析については予定通り固定系統が作出され、すでに耐凍性の評価を開始している。また追加実験としてQTL解析による候補遺伝子座の探索を開始し、越冬性に関与するQTLを同定できた。イントログレッション個体の解析については、本年度は目的領域の移入個体間交配後代を作出し、その耐凍性を評価することが目的であったが、5つの遺伝子のうち3つの遺伝子についてこれを達成できた。また、そのうちVRN1についてはMF由来遺伝子の耐凍性向上への関与が期待できる結果が得られた。一方、残りの2つの遺伝子領域(CBFおよびMFH2)については、今年度、移入領域を小さくするため、MF由来の当該遺伝子領域が移入した個体をPRにより戻し交雑し、得られた後代のうち、当該遺伝子を含みかつ移入領域の小さい個体を選抜した。シロイヌナズナを用いた遺伝子の機能解析については、計画ではT0形質転換体の作出が目標であったが、実際に解析を行うT2世代まで作出することができた。1葉身で耐凍性への関与が示唆されたVRN1については、MFホモ型になると雄性不稔を示すことから当初の予定を変更し、移入領域の狭いヘテロ個体間の交配後代を用いたQTL解析を行い、冠部の凍結耐性への効果の検証を行う。あわせて低温馴化関連遺伝子などの発現比較を行う。冠部での耐凍性への関与が示唆されたMFH3についてはホモ型イントログレッション系統を用い再現性の確認を行う。CBFについてはホモ型イントログレッション系統を作出し冠部耐凍性の評価を行う。2シロイヌナズナ形質転換体については耐凍性検定および雪腐病抵抗性検定をおこなう。
日本の身体技法を素材とした体育と保健のクロスカリキュラムと教材の開発

本萌芽研究において第二年目(平成16年度)に行った研究は次の通りである。1.第一年目に作成したクロスカリキュラムと教材づくりの構想に基づいて、「入り口教材」の授業実践としては、(1)「からだにある穴さがし」と(2)「生きている証拠さがし」(そのバリエイションとしての「誰の手?」)の授業実践にとり組んだ。また、それらの入り口から入った「典型教材」の実践としては、(3)「体温」、(4)「息(呼吸)」、(5)「脈(心臓、血液循環)」、(6)「からだの感覚」等の授業実践にとり組んだ。これらの授業の中では、体育と保健をクロスさせるために、「持久走」、「体ほぐしの運動」、「マット運動」等にも合わせてとり組んだ。その結果、これら子どもにとって目で見え手で触れる世界を探検する「入り口教材」を導入とすること、また、そうした複数の入り口から入って結節点を結んだ「典型教材」について見える世界(実感できる世界)と見えない世界を往還しながら授業を進めること、しかもそこでは、「からだのつくり・しくみ・はたらき」についての理論的学習と運動することを通しての実技的学習を結びつけること、等において、従来の体育や保健の授業では得られなかった教育効果をあげることができることがわかった。2.第一年目に引き続き、内観的身体技法、二軸感覚に基づく身体操法(ナンバ動作)、アレキサンダーテクニークなどの身体技法の習得のための講習会に取り組み、それを、授業実践において特に理論的学習と実技的学習を結びつける教材づくりの素材として応用した。3.「典型教材」の教材・教具づくりにおいては、目で見、手で触れることのできる映像教材や実物教材を購入・作製して活用した。4.「典型教材」の授業実践の中で、ある教材の授業展開の中で他の教材の授業展開との重なり合いが生じてきた。そこから、このカリキュラムと教材の開発のストラテジーの第一段階を「入り口教材」、第二段階を「典型教材」とすると、「典型教材の内的統合」という第三段階の課題が見えてきた。残された「入り口教材」と「典型教材」の授業実践による検証、また、第三段階以降のストラテジーの開発が今後の課題である。本萌芽研究において第一年目(平成15年度)に行った研究は次の通りである。1.これまでの保健(からだの学習)と体育(からだほぐし)の教材づくり・カリキュラムづくりと授業実践の整理と追実践を行った。その結果、「からだのあなさがし」「生きている証拠探し」「からだ新聞づくり」「呼吸」「からだのつくり・しくみ・はたらきに応じた使い方」「感じたものにしたがって動く」などの教材づくり・授業づくりの見通しを得ることができた。2.本萌芽研究における教材づくり・授業づくりのための素材として、「野口体操」「操体法」「内観的身体技法」「古武術の身体技法」「民俗芸能の身体技法」などの講習を行い、その習得をはかった。3.以上を踏まえて、二年目に取り組む教材づくり・カリキュラムづくりの構想を、5つの「入り口教材」(「からだのあなさがし」「生きている証拠探し」「からだと健康に関する生活調べ」「人間らしいからだの特徴」「からだと心の悩み」)による授業実践と、その各々の入り口から入った授業展開の中で結節点を結んだテーマでの「典型教材」(「呼吸」「体温」「身体感覚」他)による授業実践とで組み立てることにした。これらはいずれも、体育と保健の双方にまたがった性格のものである。

そこから、このカリキュラムと教材の開発のストラテジーの第一段階を「入り口教材」、第二段階を「典型教材」とすると、「典型教材の内的統合」という第三段階の課題が見えてきた。残された「入り口教材」と「典型教材」の授業実践による検証、また、第三段階以降のストラテジーの開発が今後の課題である。
旧日本軍人による蒋介石支援に関する聴取り調査研究:戦後日中関係史の再構成にむけて

本研究は、蒋介石・岡村寧次が中心となった日本と中国との間の様々な分野における非公式な人的繋がりが、戦後初期の日中関係の形成にどのようにかかわっていたのかを浮かび上がらせることを目的とした。1.昨年度に引き続いて、山西省に残留して閻錫山・国民政府軍と協力し合って共産党軍と戦った経験を持つ元残留兵およびその関係者に対して、埼玉・京都・島根・兵庫などで複数回にわたって丹念に聴き取りおよび資料収集を実施した。2.山西残留当事者は戦後の中国で戦犯として収容されたが、彼らの調査や裁判を担当した党中央の検察官や裁判官が遼寧省撫順市に一同に集う機会が2010年6月に持たれたため、そこに参加して聴き取りを行った。彼らとは、北京で蒋介石研究学術シンポに参加して台湾の研究者との研究交流を行った別の機会にもコンタクトを取り、聴き取りを重ねた。3.日本敗戦後に台湾に派遣された旧日本軍人の軍事顧問団である「白団」の関係者からの聴き取りを行う予定であった。しかし、台湾への渡航直前に東日本大震災が発生したため出発が不可能となり、残念ながら調査が実現できなかった。今後の課題としたい。現段階で明らかになった課題は、当事者、関係者の高齢化が進んでいるため、早い段階でオーラルヒストリーをまとめる必要があるという点である。聴き取りとその史料的裏付けを同時に進めながら作業を行ってきたが、非公式の人的交流が研究対象であるだけに、聴き取った内容同士を照合しながら検証していく側面の方が大きくなる。そうした作業をさらに進めれば、戦後初期の日中間に軍事・政治的連携を構築しようとする主体的な動きが存在したことを示す史料の空白が、かなりの程度埋められることを確認できた。以上の研究成果の一部を、研究協力者として本研究に携わった石田隆至とともに発表した。本研究は、蒋介石・岡村寧次が中心となった日本と中国との間の様々な分野における非公式な人的繋がりが、戦後初期の日中関係の形成にどのようにかかわっていたのかを浮かび上がらせるために、高齢化する当事者への聴き取り調査を一人でも多く行うことで、史料記録として残されていない歴史を聴き取りによって蓄積していくことを目的とした。具体的には、山西省に残留して閻錫山・国民政府軍と協力し合って共産党軍と戦った経験を持つ元残留兵およびその関係者、また東北部に残った後シベリアに抑留された関係者の経験を聴き取った。全国各地に住む元重要戦犯、および元前線兵士や民間人ら、計十数名から時間をかけて複数回にわたって丹念に聴き取りを行った。聴き取りの焦点としては、残留に至る経緯、残留の目的や理念がどう説明されたか、残留の体制、実際の残留活動の実態、国民党軍とのかかわりのほか、帰国後の活動や残留、また抑留経験者同士の交流などの様子についても聴いた。今回の調査の中で興味深かった点としては、残留の中心者が呼びかけた理念には「スムーズな引き揚げの実現」や「日本帝国の復興のための足場を作るための残留」といった名目がいくつかあったなかで、呼びかけに応じた兵士たちには敗北感が希薄だったことや軍の指揮系統が残っていたなどから「皇国日本の再興」という側面は比較的受け入れられやすかったこと、国民党の閻錫山軍への軍事協力という名目とはよそに、戦闘が長期化し苦戦するにつれて日本軍が前面に出て共産党軍と戦闘を交わしており、それは「反共」意識が末端の兵士にまで根深く浸透していたがゆえに可能であったこと、帰国後に残留兵を見捨てて先に帰国した司令官や参謀を訪ねた末端兵らが「カネが欲しければ台湾へ行ってもらってこい」などと聞かされていた点などがあった。いずれも、日本軍と国民党軍との繋がりの深さを物語る内容であった。今後の課題としたい。
ゼブラフィッシュ線条体における直接及び間接経路投射神経の個別可視化解析

研究代表者は、既に同定したマーカー遺伝子のtac1を用いて領域特異的なBAC遺伝子組み換え系統を作製することで、これらの領域特異的に蛍光タンパクを発現させることに成功し、さらに作製した遺伝子組み換え系統を用いて投射パターンを詳細に解析したところ、脚間核と呼ばれる領域がそれらの細胞群から投射を受け、哺乳類における淡蒼球の相同領域に相当することが分かった。さらにこれらの細胞群の適応的な行動の学習に与える影響を検討するため、新たに極小部位を選択的に破壊する電気破壊法及び手術法を開発し、これら線条体の細胞群に対して投射をする脳外套部領域を電気的手法で破壊したところ、適応的行動課題の成功率が低下した。さらに、代表者はゼブラフィッシュの環境に応じて適切な行動を選ぶ能力を測定するための課題として、Y迷路選別課題を確立した。この課題は全自動で行われることに加えて学習時間も従来の課題に比べて格段に短いため、実験者が行動実験に費やす時間を劇的に短縮することが可能になった。また、それらの意思決定の課題を顕微鏡下で再現するための準備として、2光子顕微鏡イメージングを行いながら魚に視覚刺激を提示する方法を開発することに成功した。このシステムでは、高速ゲーティング検出器と高速制御可能なLEDディスプレイを組み合わせることで、視覚刺激が撮像に干渉せずに、動物に対して提示することを可能にしている。この技術により、従来は難しかった広波長にわたる視覚刺激をイメージング中に提示することが可能になった。これらの発見と技術は、今後のゼブラフィッシュ大脳基底核のin vivoイメージングのための重要な知見となると予想される。当初の目標であった行動実験課題の確立、及びイメージングのための基本的なシステムの構築に成功しているため。今後は実際に課題を行わせた遺伝子組み換えゼブラフィッシュを用いて、イメージングを行い解析を進めていく。深部において十分な解像度を保ったままで撮像できる条件の探索が今後の課題となる。本研究は線条体の直接経路及び間接経路の神経活動を初めて明らかにすることで、線条体における情報処理メカニズムについての理解を試みるものである。既に得られた直接経路特異的な遺伝子組換え系統を用いて,直接経路神経細胞からentopeduncular nucleusへの投射を発見し、これによりゼブラフィッシュにおける哺乳類淡蒼球の相同領域を同定した。この結果は硬骨魚類においても、哺乳類同様の大脳基底核に対応する神経回路が進化的に保存されていることを強く示唆するものである。すなわち、終脳の基本的な構造が硬骨魚類から哺乳類まで保存されていることから、今までげっ歯類、霊長類に集中していた線条体研究をさらに発展させ、進化的に保存された線条体の機能に対する統一的な見解が得られると期待される。現在この領域におけるマーカー遺伝子を同定し,遺伝子組換え系統の作出を試みている。また、直接経路特異的な遺伝子組み換え系統を用いて遺伝的なカルシウムインジケーターを発現させ,稚魚における線条体の神経細胞の、自発的な神経活動に伴う輝度変化を計測することに成功している。現在はこの系を成魚においても確立すべく、水流や拍動による振動を抑えてゼブラフィッシュの保持が可能な固定方法、及び各種カルシウムインジケーターを検討している。その後、行動学習成立前、成立後のゼブラフィッシュのin vivoイメージングによって得られた画像から各細胞の活動を解析し、直接経路、間接経路の細胞の活動パターン、学習に伴う活動の変化を捉えることにより、線条体における情報処理メカニズムについての理解を飛躍的に高めると期待できる。すでに確立されたゼブラフィッシュ直接経路特異的な遺伝子組み換え系統を用いて、ゼブラフィッシュ成魚における大脳基底核神経回路およびその関連領域の形態解析を行った。その結果、外套部から大脳基底核への投射、及び大脳基底核から視床への投射を確認し、硬骨魚類でも哺乳類同様に皮質-大脳基底核-視床ループを介した行動制御がなされていることが示唆された。また、状況に応じた行動選択能力をゼブラフィッシュで定量的に測定するための行動パラダイムとして、Y迷路課題を確立することに成功した。これは電気刺激を罰として用いて、Y字型の水槽の底面に表示される特定の色を手がかりに水槽内の特定の区域に移動することをゼブラフィッシュに学習させる課題であり、数十試行の短い間に学習させることが可能である。この課題は状況に応じた適切な行動の学習を必要とするため、大脳規定核の機能を必要とすると予想される。今後はカルシウムイメージングによる機能解析および破壊実験を用いて、この仮説を検証していく。また、2光子顕微鏡下でカルシウムイメージングを行うための視覚刺激提示システムを開発し、これを生きたゼブラフィッシュ成魚で適用することに成功した。これは視覚刺激提示と蛍光検出を高速で交互に切り替えることで両者の干渉を防ぐシステムであり、すべての視覚刺激をもちいた2光子顕微鏡研究に応用可能な、汎用性の高いものである。

さらにこれらの細胞群の適応的な行動の学習に与える影響を検討するため、新たに極小部位を選択的に破壊する電気破壊法及び手術法を開発し、これら線条体の細胞群に対して投射をする脳外套部領域を電気的手法で破壊したところ、適応的行動課題の成功率が低下した。さらに、代表者はゼブラフィッシュの環境に応じて適切な行動を選ぶ能力を測定するための課題として、Y迷路選別課題を確立した。この課題は全自動で行われることに加えて学習時間も従来の課題に比べて格段に短いため、実験者が行動実験に費やす時間を劇的に短縮することが可能になった。また、それらの意思決定の課題を顕微鏡下で再現するための準備として、2光子顕微鏡イメージングを行いながら魚に視覚刺激を提示する方法を開発することに成功した。このシステムでは、高速ゲーティング検出器と高速制御可能なLEDディスプレイを組み合わせることで、視覚刺激が撮像に干渉せずに、動物に対して提示することを可能にしている。この技術により、従来は難しかった広波長にわたる視覚刺激をイメージング中に提示することが可能になった。これらの発見と技術は、今後のゼブラフィッシュ大脳基底核のin vivoイメージングのための重要な知見となると予想される。既に得られた直接経路特異的な遺伝子組換え系統を用いて,直接経路神経細胞からentopeduncular nucleusへの投射を発見し、これによりゼブラフィッシュにおける哺乳類淡蒼球の相同領域を同定した。また、既に稚魚における線条体の神経細胞の、自発的な神経活動に伴う輝度変化を計測することに成功している。これは当初の計画における極めて重要な進展である。当初の計画通り、行動実験系とイメージングに用いる遺伝子組み換え系統の作製がおおむね予定通りに進捗している。当初の目標であった行動実験課題の確立、及びイメージングのための基本的なシステムの構築に成功しているため。行動学習成立前、成立後のゼブラフィッシュのin vivoイメージングによって得られた画像から各細胞の活動を解析し、細胞種別の細胞の活動パターン、学習に伴う活動の変化を捉える。今後は上述の系を組み合わせることで、大脳基底核およびその関連領域の神経細胞群が、状況に応じた適切な行動の選択時にそれぞれどうはたらいているのかを、2光子カルシウムイメージングを用いて明らかにする今後は実際に課題を行わせた遺伝子組み換えゼブラフィッシュを用いて、イメージングを行い解析を進めていく。深部において十分な解像度を保ったままで撮像できる条件の探索が今後の課題となる。
アルカリ骨材反応の制御に対するポゾラン材料の有効利用に関する研究

一般に、構造物に対して補修・補強を行うことは、その当初における建設よりも困難な面を持つ場合が多いことが知られている。しかも、アルカリ骨材反応によって損傷を受けた構造物の補修・補強は現実には困難な場合もあり、建設時における材料面からの防止対策の確立が望まれている。その対策の一つとして、高炉スラグ,フライアッシュ,シリカフュームなどのいわゆるポゾラン材料の使用はアルカリ骨材膨張の防止上非常に有効であり、アメリカ,イギリス,ドイツなどではこの方法が推奨されている。しかし、ポゾラン材料の添加によるアルカリ骨材膨張の防止機構は複雑で未解明の部分も多く、その添加量と品質によって効果に限界があり、逆に膨張を促進する場合もあるとされている。本研究では、アルカリ骨材膨張の抑制に有効なポゾラン材料の選択とその適切な使用方法を検討した。本研究の範囲内で得られた主な結論を以下に示す。1.高炉スラグは、混入率が高いほどモルタルバーのアルカリ骨材膨張を抑制する効果を示すが、今回使用した高炉スラグでは混入率60%でも膨張抑制効果は小さかった。2.フライアッシュは、混入率5%ではかなり大きいモルタルバーの膨張を示したが、2530%で膨張を抑制することができた。3.シリカフュームは、他のポゾラン材料と異なり膨張開始材令を遅延させる効果を持つが、混入率が少ないとかえってモルタルバーの膨張は増大し、2530%では抑制することができた。4.市販のB種高炉セメント(高炉スラグ含有量=45%)、B種フライアッシュセメント(フライアッシュ含有量=18%)を用いることによって、コンクリートバーのアルカリ骨材膨張を抑制することが可能であった。
新型ヘルペスウイルス(HHV-6,HHV-7,KSHV)感染病態の分子機構

ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)、HHV-7およびKSHV(HHV-8)は、最近同定された新しいヘルペスウイルスである。現在これらのウイルスと種々の疾患における病態との関連が精力的に検討されている。本研究では、これらのウイルス感染による病態を、感染細胞における機能的変化の分子機構を明らかにすることによって解析した。一連の研究によって得られた成果を以下に示す。1.HHV-6接種によってCD4陽性T細胞はアポトーシスを生じる。アポトーシスの程度は、TNF-αおよび杭Fas抗体添加によって著しく増強する。アポトーシスをきたす細胞にはウイルス複製は認められず、ウイルス感染による間接的機構が関与していると考えられた。2.CD4陰性細胞にアデノウイルスベクターを用いてCD4遺伝子を導入することによってHHV-7感染性が獲得されたことより、CD4はHIV-1同様HHV-7の感染レセプターでもあることが示された。また、CD4遺伝子導入細胞上で、これら2種のウイルスが競合感染することも明らかとなった。3.骨髄系細胞におけるHHV-6潜伏感染と再活性化のメカニズムを明らかにする目的で、新たに樹立した骨髄系細胞株HHV-6を接種し、HHV-6の動態を観察した。今回樹立した細胞株の1系統において、HHV-6が潜伏感染し、PHAによってウイルス複製が生じることが明らかとなった。これは、骨髄系細胞におけるHHV-6潜伏感染と再活性化の初めてのモデルである。4.HHV-6およびHHV-7感染によってHIV-1 coreceptor CXCR4発現が著明に抑制され、HIV-1感染が阻止されることが明らかとなった。この抑制は転写レベルでの異常によるものであり、ウイルス感染によって転写因子CXCR4 promoter結合パターンに変化が生じることが示された。本研究では、HHV-6、HHV-7およびLSHV(HHV-8)などの新型ヘルペスウイルス感染による病態を、主としてin vitroにおける感染実験系で検討し、下記のことを明らかにした。1)HHV-6感染によってCD4陽性T細胞はTNF-αや抗Fas抗体によるアポトーシス感受性が上昇する。このアポトーシス感受性亢進は直接ウイルス感染は必要なく、主にウイルス非感染bystander cellsにおいて認められる。2)HHV-6およびHHV-7感染によってそれぞれ細胞表面CD3とCD4の発現が著名に抑制され、さらにどちらのウイルス感染によってもHIV-1のcoreceptorである細胞表面CXCR-4発現が著しく低下することが明らかとなった。これらの分子発現低下は、遺伝子の転写以降における障害によるものであることが判明した。また、あらかじめHHV-6またはHHV-7を接種したCD4陽性T細胞においてはHIV-1増殖が抑制されることも明らかとなった。3)Pityriasis rosea患者の急性期末梢血単核球から高頻度にHHV-6ゲノムが検出された。また、Mycosis fungoides患者リンパ節からHHV-7を分離し、HHV-6およびHHV-7とこれらの疾患との関連性が示唆された。4)日本人リンパ腫におけるKSHV(HHV-8)の関与をPCRによって検討したところ、頻度は低いものの一部のリンパ腫細胞においてゲノムの存在が確認され、KSHVとリンパ腫との関連性が示唆された。今回の検討で、リンパ球は新型ヘルペスウイルス感染によって多様な機能的変化をきたすことが明らかとなった。また、新たな疾患との関連性も示唆された。現在さらに、in vitroにおける感染実験系と臨床検体を用いた解析を進行している。

ヒトへルぺスウイルス6型(HHV-6)、HHV-7およびKSHV(HHV-8)は、最近同定された新しいヘルペスウイルスである。現在これらのウイルスと種々の疾患における病態との関連が精力的に検討されている。本研究では、これらのウイルス感染による病態を、感染細胞における機能的変化の分子機構を明らかにすることによって解析した。一連の研究によって得られた成果を以下に示す。1.HHV-6接種によってCD4陽性T細胞はアポトーシスを生じる。アポトーシスの程度は、TNF-αおよび抗Fas抗体添加によって著しく増強する。アポトーシスをきたす細胞にはウイルス複製は認められず、ウイルス感染による間接的機構が関与していると考えられた。2.CD4陰性細胞にアデノウイルスベクターを用いてCD4遺伝子を導入することによってHHV-7感染性が獲得されたことより、CD4はHIV-1同様HHV-7の感染レセプターでもあることが示された。また、CD4遺伝子導入細胞上で、これら2種のウイルスが競合感染することも明らかとなった。3.骨髄系細胞におけHHV-6潜伏感染と再活性化のメカニズムを明らかにする目的で、新たに樹立した骨髄系細胞株にHHV-6を接種し、HHV-6の動態を観察した。今回樹立した細胞株の1系統において、HHV-6が潜伏感染し、PHAによってウイルス複製が生じることが明らかとなった。これは、骨髄系細胞におけるHHV-6潜伏感染と再活性化の初めてのモデルである。4.HHV-6およびHHV-7感染によってHIV-1 coreceptor CXCR4発現が著明に抑制され、HIV-1感染が阻止されることが明らかとなった。この抑制は転写レベルでの異常によるものであり、ウイルス感染によって転写因子CXCR4 promoter結合パターンに変化が生じることが示された。
Cav3．2リン酸化修飾経路の同定・摂動による入眠行動の分子基盤探求

入眠とは覚醒から睡眠という行動学・生理学的に相互排他的な状態変化を担う行動であり、その制御は個体の適切な睡眠覚醒のために必要不可欠である。本研究では、入眠に重要な分子であるCav3.2の大規模機能解析系と質量分析によるリン酸化解析からCav3.2リン酸化修飾経路を同定し、その経路を摂動した遺伝子改変マウスの作製およびその睡眠表現型解析から、Cav3.2のリン酸化修飾による機能制御が入眠過程に重要であるという仮説を検証することを目的とする。
細菌の共生による害虫の農薬抵抗性化：農薬分解菌はどこから来て、どう選択されるのか

申請者らは、土壌細菌Burkholderia属の農薬分解菌が害虫カメムシの消化管に共生し、農薬抵抗性を与えることを見出した。この共生系成立過程を明らかにするために、分解菌の宿主外での分解菌の生態を調べた。分解菌が共生したカンシャコバネナガカメムシが見つかった畑で、土壌や作物体にBurkholderia属と分解菌がどのように分布しているか解析し、分解菌は土壌や作物体を経由してカメムシへ感染することを示した。またフェニトロチオンの連用で土壌中では分解菌が出現・増加するが、その際はじめは分解菌が複数種現れるが、菌数増加とともに分解菌同士で競合が起こり多様性のバランスが崩れることが明らかとなったこれまでに我々が農耕地土壌から分離した有機リン系農薬(フェニトロチオン)分解細菌と産総研のグループが分離したカメムシ消化管に共生する細菌(非農薬分解菌)は、近縁な分類群に属することが示された。そこで産総研と共同研究を行い、我々が分離したフェニトロチオン分解細菌を、ダイズの難防除害虫ホソヘリカメムシの体内に共生させ、フェニトロチオン抵抗性になるという新規な現象を発見した。本研究では農薬分解細菌の土壌中における存在量と多様性および農薬分解能に関する特徴を総合的に解析し、土壌からカメムシへの移行経路を明らかにすることを目的とした。害虫カメムシが消化器にフェニトロチオンを分解するBurkholderia属細菌を共生させることによって殺虫剤に対する抵抗性を獲得することを実験的に示した。一方で、Brkholderia属分解菌を共生させたカメムシが実際に沖縄県南大東島のサトウキビ畑で見つかった。このことからサトウキビ畑土壌に存在する分解菌の多様性と菌数とそこに占めるカメムシ共生分解菌の割合を調査した。その結果、土壌中にはフェニトロチオンを分解するBurkholderia属細菌が多数・多様に存在し、そのうち限られた種がカメムシに共生している可能性を示した。さらに感染特性と分解菌の性質を明らかにするためマイクロコズム実験で得たBurkholderia属の分解菌8株を用いて性質を検討した。分解菌はフェニトロチオン資化性菌で、既存の分解菌と同様の代謝経路を有していた。また分解菌の増殖速度やKm値とVmaxは多様であった。また分解菌のフェニトロチオンに対する親和性(Km値とVmax)が、分解菌が土壌で優占するために重要であることを示した。以上から、カメムシの感染能力は分解能ではなく系統分類的な違いが重要であることを示した。これまでに我々が分離したフェニトロチオン分解細菌を、ダイズの難防除害虫ホソヘリカメムシの体内に共生させ、フェニトロチオン抵抗性になるという新規な現象を発見した。昨年度はBrkholderia属分解菌を共生させた農薬抵抗性カメムシが実際に沖縄県南大東島のサトウキビ畑に存在することを見出し、土壌中にはフェニトロチオンを分解するBurkholderia属細菌が多数・多様に存在し、そのうち限られた種がカメムシに共生している可能性を示した。この結果を受けて本年度は南大東島土壌におけるBurkholderia属細菌の存在量(菌数)と多様性を解析しその分布を検討した。昨年度にBurkholderia属細菌の16Sリボゾーム遺伝子に特異的なPCRプライマーを設計し、土壌中の菌数を定量PCRで計数する方法とこのプライマーを用いてPCR増幅した断片を次世代シーケンサーでメタゲノム解析する方法を開発した。この方法と確立した分解菌分離計数方法を組み合わせて土壌Burkholdderia属細菌の全貌を解析した。その結果、Burkholderia属細菌は10の7乗個/g土壌存在していた。また全Burkholderiaに占める共生能をもつ種の割合は平均で5060%を占めていた。このことから土壌にはカメムシに共生する能力を有するBurkholderia属細菌が多数存在することが示された。土壌のBurkholderia属細菌の多様性は土壌pH、CN比など影響をあまり受けないことも示された。さらにこのメカニズムにより実際の農耕地(サトウキビ畑)で、カメムシが薬剤抵抗性を獲得していることを示した。これらの結果から、農耕地にフェニトロチオンを継続散布すると分解菌が出現し、その一部がカメムシの取り込まれることがわかった。また土壌で増殖した分解菌には、共生能のあるもとのないものがいることも示された。本年は、マイクロコズム実験で農薬散布頻度と分解菌の増殖および多様性さらに共生能の関係を明らかにすることを目的とした。黒ボク土壌を充填したマイクロコズムに2週間に一度の割合でフェニトロチオンを散布した。その結果、散布回数が増えるに従い菌数が増殖した。散布ごとに分解菌を分離して多様性を調べたところ、散布するに従い多様性は増加するがやがて1種に収束することが明らかになった。さらにカメムシへの共生能を調べると、多様性は大きい時期にカメムシへの共生能を持つ菌株も増殖するが、菌数の増加とともに共生能を持たない菌株1種になった。

分離菌をグループ分けして菌体レベルでの分解に関するパラメーター(増殖速度、Km、Vmaxなど)を測定し数理生物的に解析したところ、フェニトロチオンに対する親和性が高く分解能力も高い種が最終的に優先した。以上の結果からフェニトロチオンを数回散布した分解菌の多様性が大きい状態で共生能を有する分解菌がカメムシに取り込まれると結論した。この結果から過度なフェニトロチオンの散布を避けて、他の殺虫剤と交互に用いるなどすれば、分解菌によるカメムシの耐性化は防止できると推定された。申請者らは、土壌細菌Burkholderia属の農薬分解菌が害虫カメムシの消化管に共生し、農薬抵抗性を与えることを見出した。この共生系成立過程を明らかにするために、分解菌の宿主外での分解菌の生態を調べた。分解菌が共生したカンシャコバネナガカメムシが見つかった畑で、土壌や作物体にBurkholderia属と分解菌がどのように分布しているか解析し、分解菌は土壌や作物体を経由してカメムシへ感染することを示した。またフェニトロチオンの連用で土壌中では分解菌が出現・増加するが、その際はじめは分解菌が複数種現れるが、菌数増加とともに分解菌同士で競合が起こり多様性のバランスが崩れることが明らかとなった本年度の目的は昨年度開発したメタゲノム的手法を用いて実際の農耕地におけるフェニトロチオン分解能を有するBurkholderia属細菌の多様性と菌数を分析し、農薬分解菌の菌数と多様性を明らかにすることである。各項目について当初計画している実験を実施し目的の成果を得た。具体的には下記に示した。1)Burkholderia属細菌の16Sリボゾーム配列特異的PCRプライマーにより、土壌中のBurkholderia属細菌数をはじめて詳細に定量することに成功した。その結果土壌1gあたりに10の7乗個の同細菌が存在することを明らかにした。2)農耕地土壌のBurkholderia属細菌の多様性をBurkholderia属細菌特異的PCRプライマーを用いてメタゲノム解析し、詳細な多様性を明らかにした。その結果、Burkholderia属細菌に占めるカメムシと共生能力を有する菌株の割合が極めて多く、土壌は共生菌のリザーバーとして機能していることをはじめて示した。以上により計画通り進捗していると判断する。27年度が最終年度であるため、記入しない。土壌微生物学本年度は土壌中に存在するBurkholderia属細菌の全体像を解明した。即ちBurkholderia属細菌特異的PCRプライマーによるメタゲノムデータを取得し解析するパイプラインを構築した。そしてこれらを用いて土壌におけるBurkholderia属細菌の全貌を定量的定性的に明らかにすることに成功した。今後はこのデータをベースに本研究課題の目的であるどのようにして共生能を有するBurkholderia属の農薬分解菌がカメムシと出会うのかを明らかにする。すなわちカメムシが棲息する植物体における分解菌の分布や菌密度などをメタゲノム手法や培養法を組み合わせて解析する。さらに抵抗性カメムシの出現を防止するための検定方法の開発と土壌における分解菌増殖条件を明らかにする。以上から農薬抵抗性カメムシ出現機構を解明し出現防止法を提示する。
抗心筋細胞膜モノクローナル抗体による拡張型心筋症の病態生理の解析

本研究の目的は、心筋症の発症過程を直接外界に接する細胞表面膜の側から捉えんとするものである。すなわち、抗自己心筋抗体のtarget antigenとなりうる抗原の解析とその単離、及び細胞表面巻くに直接働く液性因子を同定することより、心筋症発症過程を解明することを目的とする。そこで、以下の2点に関し解析を行った。(1)心筋細胞膜に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いて膜抗原の解析、純化、同定を行うこと、(2)心筋細胞膜に直接働く因子としてサイトカインに着目し、心筋症におけるその発現、及び細胞障害性を検討すること、である。その結果、(1)細胞表面膜に対する数種のモノクローナル抗体産生株の樹立に成功した。特に20-C-5、194-A-1の2種は、血管内皮細胞に特異的であると共に、尿細管(近位尿細管以遠のネフロン)の細胞膜とも交叉を示した。すなわち、これらの抗体は、細胞膜のトランスポーター等の分化した抗原を認識していると考えられる。現在分子量28Kdの20-C-5の対応抗原を純化しており、N末の解析を行っている。(2)病理学的心筋炎の所見のないヒト拡張型心筋症剖検例におけるIL_1α、β、IL_6の発現をモノクローナル抗体を用いたsandwitch assay、及びbioassayにより測定した。心筋症10例のうち4例に1424ng/gWeiglit tissueのIL_1βの発現を認めた。IL_1αも同一症例で約1/10量の発現を認めた。正常例ではIL_1α、βとも発現は認めなかった。これに対しIL_6は、正常例と差を認めなかった。IL_1βの心筋細胞障害性を細胞培養系で検討したところ、本物質は心筋細胞に対しproteolyticに働くことが示された。すなわちi)IL_1の定量は、病理的に心筋炎と診断されない場合でも、炎症の存在を示す有力なマーカーになりうること、更にii)本物質の発現自体が心筋症発症の原因になりうること、またiii)IL_1は異物等の刺激があって初めて産生されるので、その発現は心筋内にウィルス等の存在を示す有力な根拠になりうることが示された。