hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロトン感知性受容体OGR1の慢性気道炎症、気道分泌への関与に関する研究

ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC)はOGR1を介して細胞外酸性を感知し、サイトカインを産生する。BSMCをpH6.3または7.4に調整した.0.1%BSA含有DMEMで刺激し、IL-8 mRNA発現をRT-PCRで、IL-8をELISAで測定した。pH6.3刺激によりBSMCは十分量のIL-8を産生、遊離したが、OGR1をsiRNAによってノックダウンしたBSMCでは酸性刺激によるIL-8産生は減弱した。PKC阻害薬、MEK1/2阻害薬、IkBリン酸化阻害薬、デキサメサゾン(DEX)は酸性刺激によるIL-8産生を抑制した。DEXはNF-kB p65リン酸化、DNAへの結合に影響しなかった。ヒト気管支平滑筋細胞(Bronchial smooth muscle cells:BSMC)から細胞外酸性刺激(プロトン刺激)により、産生される因子を検索した。私たちが今まで報告してきたIL-6、connective tissuegrowthfactor (CTGF)のほか、ケモカインとしてIL-8、MCP-1、マトリセルラー蛋白質トロンボスポンジン-1(TSP-1)、増殖因子のアンフィレグリン(AREG)が産生されることを見出した。これらの中で、IL-8の産生メカニズムを中心に研究を進めた。BSMCが細胞外酸性(プロトン)を感知する場合、プロトン感知性G蛋白質共役型受容体Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1 (OGR1)を介していると予想されたので、siRNAを導入してOGR1発現を低下させると、細胞外酸性刺激によるIL-8産生は有意に抑制された。各種細胞内シグナル伝達因子阻害薬を用いて、細胞外酸性刺激によるBSMCのIL-8産生に対する効果を検討した結果、MEK1/2阻害薬、Protein kinase C(PKC)阻害薬、IkB kinase阻害薬によってIL-8産生が抑制された。細胞外酸性刺激によるNF-kB p65(Ser536)のリン酸化をウェスタンブロットで解析すると、刺激によるリン酸化の増強はわずかであったが、IkB kinase阻害薬の前処置によって、リン酸化が強力に抑制されたことより、IL-8産生にはNF-kBの基底状態での活性が必要であると考えられた。また、デキサメタゾンは30分間の前処理で濃度依存性に細胞外酸性刺激によるBSMCのIL-8産生を抑制した。ヒト気管支平滑筋細胞からのプロトン感知性受容体OGR1を介するIL-8産生メカニズム、特に産生に関与する細胞内シグナル伝達因子を明らかにした点では研究は進展していると言える。さらにデキサメタゾンが、おそらく別の蛋白質の誘導を介さずにIL-8を遺伝子転写レベルで抑制することを発見し、この機序についても研究を進めたいと考えている。ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC)を細胞外pH6.3によるプロトン刺激を行い、プロトン刺激によるIL-8産生に対するデキサメタゾン(DEX)の抑制効果とその細胞内メカニズムを検討した。併せて、他の細胞内シグナル伝達因子のIL-8産生への関与についても検討した。プロトン感知性G蛋白質共役型受容体GPCRの1つOGR1(ovarian cancer G prptein coupled receptor1)の発現をsiRNAを用いてノックダウンした細胞ではプロトン刺激によるIL-8産生が抑制された。また、DEXは濃度依存性にプロトン刺激によるIL-8産生を抑制し、DEXのプレインキュベーションは30分で十分であり、プレインキュベーションがなくても、有意な抑制が観察された。プロトン刺激によって活性化し、IL-8産生に関与すると思われる、NF-kBとAP-1ファミリーの転写因子に関して、検討を加えた。プロトン刺激では対照として用いたTumor necrosis factor-alpha(TNF)に比べて、弱いもののNF-kB p65のリン酸化が確認された。IkappaBkinase (IKK)の阻害薬を用いるとプロトン刺激によるIL-8産生は完全に抑制されることより、NF-kBの活性はIL-8産生に必須であると予想された。DEXはp65のリン酸化や核蛋白内p65のコンセンサスDNA配列への結合増加を抑制しなかった。一方、BSMCをプロトン刺激した後、核から蛋白質を抽出し、AP-1コンセンサスDNA配列への結合を調べると、JunB及びJunDの結合増加がみられ、DEXはJunB及びJunDの結合を抑制した。siRNAを用いてJunDをノックダウンした細胞では、プロトン刺激によるIL-8産生が有意に抑制されたことより、DEXによるIL-8産生抑制にJunDの関与が示唆された。ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC)を用いて、OGR1介するプロトン刺激によるIL-8産生に対するグルココルチコイド(デキサメタゾン、DEX)の抑制メカニズムを転写因子を中心に解析することができ、DEXの作用機序を部分的ではあるが解明することができた。この点において、本研究は概ね順調に進展していると考えている。昨年度までの研究成果をふまえ、ヒト気管支平滑筋細胞(Human bronchial smooth muscle cells: BSMC)を細胞外酸性pH(pH6.3)で刺激し、interleukin-8 (IL-8)産生に対するデキサメサゾン(dexamethasone: DEX)の抑制効果について詳細な研究を進めた。

DEXは前処理30分間で研究を進めたが、前処理がなく、プロトン刺激と同時にDEXを添加しても有意にIL-8産生を抑制し、mRNA発現も抑制した。また、IL-8を刺激後短時間で産生するBSMCのロットを用いて実験を行っても、刺激後3時間でのIL-8産生をDEXは有意に抑制した。以上の結果より、DEXは別の蛋白質の翻訳を介して、IL-8産生を抑制するのではなく、おそらくグルココルチコイド受容体(glucocorticoid receptor: GR)と結合して核内へ移行したDEXが直接転写レベルでIL-8 mRNA発現を抑制するものと予想された。前年度までの研究結果と同様に、DEXは転写因子NF-kBのp65のリン酸化や、リン酸化されたp65のDNAの結合には影響しなかった。また、AP-1の各コンポーネント(c-Jun, JunB, JunD)のDNAの結合にも影響しなかった(昨年度得られたJunBおよびJunDのDNAへの結合抑制は繰り返した実験での再現性がみられなかった)。IL-8の遺伝子転写に関連する他の転写因子に関しても、DEXがDNAへの結合を抑制する結果は得られなかった。以上より、プロトン刺激によるBSMCのIL-8発現誘導のDEXの抑制機序として、転写因子のDNA結合後、mRNAの発現までのプロセスに、DEXとCR複合体が作用するものと予想された。ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC)はOGR1を介して細胞外酸性を感知し、サイトカインを産生する。BSMCをpH6.3または7.4に調整した.0.1%BSA含有DMEMで刺激し、IL-8 mRNA発現をRT-PCRで、IL-8をELISAで測定した。pH6.3刺激によりBSMCは十分量のIL-8を産生、遊離したが、OGR1をsiRNAによってノックダウンしたBSMCでは酸性刺激によるIL-8産生は減弱した。PKC阻害薬、MEK1/2阻害薬、IkBリン酸化阻害薬、デキサメサゾン(DEX)は酸性刺激によるIL-8産生を抑制した。DEXはNF-kB p65リン酸化、DNAへの結合に影響しなかった。ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC)からのプロトン刺激によるOGR1を介するIL-8産生の細胞内メカニズムを検討している過程でデキサメタゾン(DEX)が強力にこのIL-8産生を抑制することを発見した。対照として用いたTumor necrosis factor (TNF)刺激によるIL-8産生については一般にDEXによって抑制されることが知られているが、その場合の抑制は部分的であり、一方、プロトン刺激によるIL-8産生はDEXにより強力に抑制された。そこで、DEXによるIL-8産生抑制メカニズムについてNF-KBや他の転写因子への影響について解析を進める予定である。また、BSMCだけでなく、気道上皮細胞を用いた研究に着手していきたい。今後さらに、ヒト気管支平滑筋細胞を用いて、プロトンで刺激した場合にグルココルチコイド(デキサメタゾン、DEX)がJunDのAP-1コンセンサス
糖尿病性血管内皮障害に対する創薬標的分子としてのGRK2

糖尿病性合併症に共通した病理学的特徴は、血管内皮障害であることが知られている。申請者がこれまでに糖尿病性血管合併症においては、G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)がAktの上流にて血管弛緩因子であるnitric oxide (NO)の制御をかけていることを明らかにした。そこで、本研究では、糖尿病病態時に加速的に増加・蓄積される酵素GRK2に焦点を当て、血管内皮細胞がどのように障害されるのか、そして障害を受けた血管内皮細胞が機能をどのように維持しようと働くのかを明らかにすることを目指している。本年度は、糖尿病モデルマウスにGRK2の抑制を行い、GRK2発現の挙動やNO産生経路への影響を検証した。その結果、以下の結果を得ることができた。1.自然発症2型糖尿病モデルマウスで血管機能障害が生じているob/obマウスで様々な臓器のGRK2発現が増加していることを確認した。そこで、GRK2発現を抑制させるため、GRK2 siRNAを投与した。その結果、肝臓のGRK2発現を抑制することで、内臓脂肪中のMAPKの活性を抑制し、トリグリセリドの産生と内臓脂肪レベルを減少させることが明らかになった。2.高血圧を併発した2型糖尿病モデルマウスは降圧薬であるクロニジンにより血圧を下げるが、ひとたび休薬すると血圧が上昇し、さらに血管内皮障害が悪化することが明らかとなった。しかし、GRK2阻害薬をクロニジンと共に投与することで、どちらも休薬しても血圧の上昇が起こらず、かつ、Akt/eNOS活性化による内皮保護作用により血管内皮障害も起こらないことが明らかとなった。本年度は、GRK2阻害薬の2週間投与やGRK2 siRNAの単回処置を行うことでGRK2を中期的にまたは短期的に抑制させた糖尿病モデル動物を作成し、その臓器間ネットワークの検討や他剤との共処置を試みた。長期的なGRK2の抑制的制御を行うことを予定していたが、本年度中に動物舎の移転が行われ、長期投与を断念せざるを得なかった。しかしながら、現在、動物舎の移転が完了し、基礎データを集積中である。今後、動物実験を主に今年度できなかった長期投与と共に、詳細なGRK2シグナルを追っていきたいと思っている。これらのことを総合的に判断し、やや遅れているが、来年度中にはこの遅れは取り戻せると考えている。上記のように、どう本年度、長期的なGRK2抑制の影響を検討することができなかった。そこで、長期的なGRK2抑制のAkt/eNOS経路を中心とした内皮細胞への影響を検討する予定である。さらに、本年度の研究によって、糖尿病時、肝臓のGRK2発現を正常レベルまで抑制することで脂質代謝を改善させるという臓器間ネットワークが存在することを明らかとした。また、脂質代謝に影響をおよぼすことから、脂質異常症に対するGRK2の影響も検討するべきであることが新たに明らかとなった。この点については、GRK2の他疾患におけるターゲット分子となる可能性も示唆するものであったため、基盤データを積み重ねていきたいと考えている。さらに、糖尿病性血管障害においてもGRK2活性抑制により、血管内皮保護効果を明らかとしたことから、この保護効果の持続時間や、その保護によってクロニジンをはじめ、他剤が臨床時使用効果をあげるのではないかと期待されたため、さらなる検討を積み重ねていくことを予定している。また、既存の薬物によるGRK2抑制効果を中心に来年度はさらに臨床応用への基盤を作りたいと考えている。胸部大動脈においては、NO産生シグナルが血管緊張性調節に重要であり、本研究で見出された成果が糖尿病性血管障害に対する治療戦略の一助となるようさらに努力を重ねていく所存である。糖尿病性合併症に共通した病理学的特徴は、血管障害であることが知られている。申請者がこれまでに糖尿病性血管合併症においては、G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)がAktの上流にて血管弛緩因子であるNOの制御をかけていることを明らかにした。そこで、本研究では、GRK2に焦点を当て、糖尿病時血管内皮細胞がどのように障害され、そして障害を受けた血管内皮細胞が機能をどのように維持しようと働くのかを明らかにすることを目指している。本年度は、血管内皮細胞を用いて疑似的な糖尿病性血管障害状態を作り出し、GRK2発現の挙動を検討し、GRK2を抑制したマウスを用いた血管への影響を検証した。1.2型糖尿病モデルマウスで様々な臓器のGRK2発現が増加していることを確認した。その結果、肝臓のGRK2発現を抑制することで、短時間に劇的に糖代謝やインスリン抵抗性を改善し、血管機能を回復させることがわかった。2.ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に高グルコースおよび高インスリン処置をし、疑似的糖尿病性血管内皮障害状態を作り出した。その結果、GRK2発現および活性が増大することを確認した。その後、細胞を正常濃度のグルコースやインスリンに戻すことで、短時間で劇的にGRK2活性が減少し、血管機能(NO産生能)が改善することが明らかとなった。3.HUVECにアンギオテンシンIIと高濃度グルコースを処置し、高血圧を併発した糖尿病を想定した疑似的細胞モデルを作成した。

その細胞からは正常細胞よりも多くの細胞膜断片が産生され、NO合成酵素の発現を減少させることを明らかにした。GRK2が細胞膜断片産生・放出を誘導しているのではないかと考え、詳細な検討を開始した。本年度は、1培養細胞系を確立させ、疑似的な糖尿病性血管障害モデル細胞を用いたGRK2活性因子を検討していくこと、2GRK2を欠損させた場合の効果やGRK2と様々なタンパクの相互作用を検討していくことを予定していた。1に関しては培養細胞系を確立させ、基礎データを蓄積中である。本年度は、高インスリン・高グルコース処置の結果やアンギオテンシンII・高グルコース処置の結果を報告することができた。2に関しては、細胞を用いた方法を検討することを予定していたが、動物モデルの実験を先行して検討した。今後、細胞モデルでも検討し、詳細なGRK2のシグナル伝達を追っていきたいと考えている。さらに、糖尿病モデルマウスを用いた実験においても、細胞膜断片産生放出に関する全く予期していなかった多くのデータを集めることができた。それぞれの実験において、多くの課題が見つかり、来年度の予定と合わせて検討していきたい事項が見つかった。しかしながら、これらのことを総合的に判断し、現在、概ね順調に進捗していると考えている。糖尿病性合併症に共通した病理学的特徴は、血管内皮障害であることが知られている。申請者がこれまでに糖尿病性血管合併症においては、G-protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)がAktの上流にて血管弛緩因子であるnitric oxide (NO)の制御をかけていることを明らかにした。そこで、本研究では、糖尿病病態時に加速的に増加・蓄積される酵素GRK2に焦点を当て、血管内皮細胞がどのように障害されるのか、そして障害を受けた血管内皮細胞が機能をどのように維持しようと働くのかを明らかにすることを目指している。本年度は、糖尿病モデルマウスにGRK2の抑制を行い、GRK2発現の挙動やNO産生経路への影響を検証した。その結果、以下の結果を得ることができた。1.自然発症2型糖尿病モデルマウスで血管機能障害が生じているob/obマウスで様々な臓器のGRK2発現が増加していることを確認した。そこで、GRK2発現を抑制させるため、GRK2 siRNAを投与した。その結果、肝臓のGRK2発現を抑制することで、内臓脂肪中のMAPKの活性を抑制し、トリグリセリドの産生と内臓脂肪レベルを減少させることが明らかになった。2.高血圧を併発した2型糖尿病モデルマウスは降圧薬であるクロニジンにより血圧を下げるが、ひとたび休薬すると血圧が上昇し、さらに血管内皮障害が悪化することが明らかとなった。しかし、GRK2阻害薬をクロニジンと共に投与することで、どちらも休薬しても血圧の上昇が起こらず、かつ、Akt/eNOS活性化による内皮保護作用により血管内皮障害も起こらないことが明らかとなった。本年度は、GRK2阻害薬の2週間投与やGRK2 siRNAの単回処置を行うことでGRK2を中期的にまたは短期的に抑制させた糖尿病モデル動物を作成し、その臓器間ネットワークの検討や他剤との共処置を試みた。長期的なGRK2の抑制的制御を行うことを予定していたが、本年度中に動物舎の移転が行われ、長期投与を断念せざるを得なかった。
グローバル化時代における課題解決型ジャストインタイム・イノベーションに関する研究

本研究では、グローバル化時代における課題解決に向けたイノベーションアプローチについて、次の研究成果を得た。まず、ジャストインタイム概念のもと、直面する課題の解決方策としてのシステムモデリングの提案、およびその検証を行った。また、製品を回収し再生産を行うシステムを取り上げ、経営工学手法に基づくシステム要因解析等を行った。さらに、アジアの工場となった中国や欧州における自動車産業に関する現状把握、およびそのマネジメントシステムに調査、分析を行った。本研究では、価値観の多様化、グローバル化する現代社会におけるビジネス分野の課題解決に向けたアプローチの提案,および実際の問題への適用による社会への貢献を目指した研究の取り組みを行っている。本年度は,従来の組み立て産業を中心としたモノづくり分野に対して、これまでの効率面・経済面に関する観点のみならず、持続可能社会実現にむけた要因についての検討を行い、グリーンイノベーションへの貢献を目指した活動を実施した。今日のグローバル化するモノづくりの現場においては、資源の有効活用や各組織における無駄をなくすためのマネジメントシステムへの取り組みは重要であり、従来の大量生産、大量消費のモノづくりシステムから循環型システムへの移行が求められている。本研究では製品ライフサイクルの概念に基づき、製品寿命を終えた製品を回収ー分解ー再生産を行うための新たな循環型システムの提案を行い、解体部品や再生品の需要の不確実性を考慮したシステムについてその性能評価を行っている.変化の激しい現代社会において、提案アプローチは従来の効率性・経済性に加え、環境側面への貢献も行っており、システムの状況やビジネス環境に応じた新たな課題解決アプローチの提案といえる。本研究では、価値観の多様化、グローバル化する現代社会におけるビジネス分野の課題解決に向けたアプローチの提案、および実際の問題への適用による社会への貢献を目指した研究の取り組みを行っている。本年度は、主としてグローバル企業における実際のサプライチェーンに基づき、従来の課題であった需要の不確実性への対応や製品ライフサイクルに起因する要因を取り上げ、システムのモデリングを行い、ジャストインタイム的な課題解決を試みている。また、本研究では課題解決のための需要変動を考慮したシステムに新たな分析を試みている。一つは製品価格に基づくコスト要因を考慮した課題解決であり、もう一つは従来型の需要のみの変動と、実需要と需要予測値とのズレに関する変動を比較し、様々なビジネスシナリオのもとでの評価・比較を行ったものである。これらの結果については、例えば、"A Study on the Semiconductor Supply Chain Management in Automotive Industry"(Journal of Japan Industrial Management Association, Vol.64, No.2E, pp.284-292 )等において公表を行っている。本研究では、グローバル化する現代社会におけるビジネス分野の課題解決に向けたアプローチの提案,および実際の問題への適用による社会への貢献を目指した研究の取り組みを行っている。本年度は,近年特に企業の社会的責任(CSR)の一つとして重要視されている「環境への配慮」に焦点を絞ったマネジメントシステム構築を取り上げ、この分野における課題解決のアプローチを示した。従来の大量生産、大量消費のモノづくりシステムにおいては生産ー消費ー廃棄の一方通行型のモノの流れであったのに対し、本研究では環境問題解決にむけた閉ループ型生産システムのモデル化と生産環境の不確実性を考慮したシステムの運用法についての提案を行った.これは従来の経済性のみを追求した課題解決とは大きく異なり,今後のビジネス社会においては重要なものであると考えられる.具体的には、まず需要変動等の不確実な生産環境下において,製品ライフサイクルが終了した製品の回収、分解・再生産システムに関するモデリングを提案し,平均費用を最小化する分解方策,総利得を最大化する発注政策等についての検討を行った.それらの成果については、"A design for closed loop manufacturing systems with consideration for parts quality"(Asian Conference of Management Science & Applications)等において公表を行った。本研究では、環境に配慮したモノづくりシステムの構築にむけて、近年企業が直面する課題解決のためのJITイノベーションを提案し、山積する様々な課題に対するジャストインタイムな解決についての提案の検討を行った。さらに、不確実な環境下においてグローバル化する企業経営に対し、継続的なPDCA(Plan-Do-Check-Act)サイクルをまわした改善マネジメントシステムを提案し、持続可能な低炭素社会の実現への方策について検討を行った。また、2009年12月に閣議決定された新成長戦略(基本方針)において、アジア経済戦略として重要視されているアジア諸国に対して、本研究の成果を活かし、モノづくり分野における国際競争力強化への貢献のあり方を模索した。具体的にはまず、省資源・省エネルギーの観点から持続可能な生産・物流システムを構築するための企業システムのモデリング、およびその解析と最適化についての検討を行った。ここでは、グローバル企業として活動を行う、自動車産業における2次サプライヤーを対象としたサプライチェーンにおいて、需要の不確実性および、リードタイムの影響を考慮したシステムのモデル化とその解析を実際の企業における評価システムに基づいて行った。また、中国自動車産業に関する現状の把握およびサプライチェーンモデリングに関しての提案を行い、不確実需要を考慮して平均費用を最小化する最適政策を求め、各種生産環境におけるその特性についての検討を行った。社会システム工学

平成24年度においては、これまでの調査をもとに循環型システムのモデル化と評価、ジャストインタイム生産システムおよびMRPシステムの運用に基づく解体システムの比較等、国際ジャーナルへの発表を行った。特に自動車解体等、実際のシステムに基づいたモデリングとシステム評価の提案を行っており、異なる分野におけるイノベーションのきっかけとなることが期待される。平成25年度においては、現実の不確実ビジネス環境における課題解決にむけ、必要な時に必要な分析ツール(今年度は主にシステムモデリング)を活用したジャストインタイム的なアプローチの提案を行った。本研究における考え方は、様々な分野の課題解決に向けた適用が可能であり、本研究の目的である新たなジャストインタイムイノベーションへの進展が期待される。平成23年度のおいて、ビジネスにおける重要課題である環境側面に対する解決のアプローチを示し、国際ジャーナルおよび各種国際会議における発表を行うことができた。さらに今後はより複雑な現実課題に対するジャストインタイムな課題解決アプローチの提案と,異なる分野における課題解決への取り組みが期待される。これまでの研究成果を背景に、今後はグローバル企業におけるジャストインタイムな課題解決に向けたイノベーションの検討を行っていく。資材調達から生産に至るサプライチェーンの効率的運用やリスクマネジメントなどに焦点を当て、日本的ものづくり方式のメリットを取り入れながら、海外企業を含めた課題解決アプローチに関する研究を進める。これまでの研究成果を背景に、最終年度である今年度は、実社会が抱える課題の特性に基づいた課題解決アプローチの整理、および業種業界を越えた更なる提案手法に基づく課題解決の可能性に関する検討を行う。また、現実社会が直面する複合的要素をもつ課題の解決に向けたジャストインタイム的なイノベーション創出への提案を目指す。これまでの成果を活かして,さらに複雑化する実際のシステムやグローバルビジネスにおける課題解決への適用を進める.また,ジャストインタイム(JIT)の概念に基づいた課題解決アプローチの枠組みを提案し、実際のグリーン・プロダクト等への適用を通じて評価を行い、より高いレベルへの課題解決へと向かう継続的改善システムの構築を目指す.本年度は、本務校の公務出張等のため、出席予定の国際会議業務をキャンセルしたため、予定の研究費使用額に達することがなかった。
「優れた」小学校キャリア教育実践プログラムの開発研究

「優れた」小学校キャリア教育プログラムについて三つの側面から研究し、成果を得た。一つは歴史的側面であり過去の実践と現代の実践とに通底する理念を析出することができた。二つ目は海外のキャリア教育実践との比較研究を行い、「優れた」に近づく方策を提示した。三つ目は実際の「優れた」実践に携わることにより、実践校の独自性を活かしたプログラム開発を行ったことである。今年度は3年間に亘る研究の初年度にあたり、教育実践事例収集を中心に研究を実施した。「優れた」小学校キャリア教育プログラムの「優れた」を明確にするため、全国4つの小学校の実践事例を報告・分析するとともに、都内の5つの小学校における「優れた」キャリア教育実践の研究に携った。そのうち4校は小中連携においてキャリア教育の実践に取り組んでいた。こうした実践研究では、発達段階に即したプログラム開発において能力や態度の育成が実践にどのように反映しているかに焦点をあて実践事例の整理にあたった。「優れた」実践とは、学校の教育課題と直結した実践に多く見られることから、教育課題を明確にしながら「優れた」キャリア教育を推進している実践者やそうした活動を支援するNPOや教育コーディネーターを招き、3回のシンポジウムを開催し、「優れた」キャリア教育について、その要件や周囲からの支援についての多くの見解を得た。また、学校改革とキャリア教育との原初的関係性を歴史的に辿るため大正期の小学校実践についてまとめた。さらに、わが国の「優れた」キャリア教育研究に当たり、国際比較の観点も取り入れた。ひとつは、韓国で行われた国際学会での講演である。わが国のキャリア教育の「優れた」実践を紹介し、諸外国の研究者や実践者の批判を仰いだ。もうひとつは米国ケンタッキー州、カリフォルニア州のキャリア教育について訪問調査である。現在米国で拡大するキャリア・テクニカル教育の実態を視察調査し、特に小学校の優れたキャリア教育プログラム「Engineering is Elementary」について授業を見学するなど研究調査を進めた。米国の調査研究は、キャリア教育の組織、キャリア発達促進のための資源、職業とのつながり、学力向上への取り組みの4つの観点で行なわれた。諸外国における知見は、「優れた」の意義を多角的に捉える上で非常に有効であった。平成23年度の研究計画は以下の3点が中心であった。1.国内外のキャリア教育実践に関する情報、教材の整理・紹介「優れた」キャリア教育実践を可能にする教材の収集では国内外の実践を調査し、今年度は4つの優れた実践(山形県、福岡県、東京都2つ)を冊子『進路指導』を通して紹介した。また、東京都荒川区の二小学校、一中学校の研究を通し、小中連携の「優れた」キャリア教育の実践として、中一ギャップを克服するための移行支援の授業開発を行い、一定の成果を得た。2.「優れた」キャリア教育実践に対する認識調査「優れた」キャリア教育実践を一般化するため、キャリア教育の研修会などを通して、「優れた」実践についての認識を調査し定性的なデータを収集した。調査に当たっては、小学校教師のデータ数の収集に苦戦したため、中学校や高等学校の教師の調査も同時におこないデータ数の確保に努めた。3.海外調査研究アジアのキャリア教育については日程の調整がつかず、米国視察に切り替えた。米国の視察では、キャリア教育を実践するための教師用資料、教師の能力開発を支えるシステムや教員養成機関の視察を経て多くの知見を得ることができ、研究に新たな視点を加えることができた。以上の研究実績に加え、優れたキャリア教育実践を可能にするため、教師の専門性向上のためのキャリア教育研修会のプログラム開発に着手し、「優れた」を実践する教師養成についても研究を広げることができた。1.国内外の「優れた」小学校キャリア教育実践の紹介:「優れた」キャリア教育実践を可能にする教育内容や教材開発の視点で実践を調査し、今年度は4つの優れた実践(栃木県、東京都、ドイツ・フランクフルト市、沖縄県)を冊子『進路指導』を通して紹介した。特に、荒川地区の二小学校、一中学校の研究を通し、小中連携の「優れた」キャリア教育の実践として、中一ギャップを克服するための移行支援の授業開発を行い、一定の成果を得た。2.「優れた」小学校キャリア教育実践の歴史的考察:「優れた」キャリア教育実践について、戦前に実践された生活綴方教育運動としての「北方教育」を通して考察を行った。その結果、「北方教育」が尋常及び高等小学校を通し実践した書くことによる生き方の教育の創造は、現在にも通底する「優れた」書くことを通した自己理解の要素が内在することを明らかにした。この成果は早稲田叢書32『書くことによる生き方の教育の創造北方教育の進路指導、キャリア教育からの考察』(学文社、2013)に単著としてまとめた。3.海外調査研究及び翻訳:イギリスのロンドン大学訪問を通し、教員養成における教師キャリアの形成について研究を深めた。キャリア教育を推進する教師にとって、自らのキャリア形成を自覚することで、教室でのキャリア教育実践が充実するといった仮説からの訪問である。一方、イギリスの学校を訪問し、キャリア教育につながるシチズンシップ教育やWRL(work-related learning)の実践について理解を深めた。

以上の研究実績に加え、優れたキャリア教育実践を可能にするための教師のキャリア形成に今後研究をシフし、教師の専門性開発やキャリア教育研修会のプログラム開発の準備段階として教師のキャリア発達の局面を取り上げた『教師というキャリア』(雇用問題研究会、2013)との翻訳を発刊した。理由は三つである。ひとつは、荒川区の二小、一中学校との研究でキャリア教育の実践として移行支援の授業モデルを開発することができたこと。二つ目は、米国カリフォルニア州の小学校等の視察を通し、教師用キャリア教育実施マニュアルなどの資料を得、「優れた」の指標を検討する資料としたこと。三つ目は「優れた」キャリア教育実践についてアンケート調査を通し現場の教師の意見を収集することができたことである。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでのキャリア教育実践の整理をもとに「優れた」実践を可能にすると考えられる実践組織、プログラム開発、実践、資源、評価、組織文化などの視点によって要件を洗い出し、どの小学校でも利用可能な小学校キャリア教育プログラム開発方法を提示する。その際には小学校キャリア教育の進展に伴い明らかになった様々な成果や課題をもとに、これまでの海外研究調査資料、研究当初のキャリア教育における歴史的研究成果、キャリア教育の評価についての研究などを盛り込み、中学校、高等学校につながりを意識した小学校6年間のキャリア教育プログラムの提示を行う。最終的には、「優れた」キャリア教育実践をささえる要件まで含んだ総合的な小学校キャリア教育実践プログラムについてまとめていく予定である。
ナノギャップ電極による電気抵抗型バイオチップの作製

DNAは二重らせんの塩基対の重なりを介して分子構造内で電子(またはホール)移動か起こることが明らかになったが、分子の導電性に関する情報を取得するにはナノメートルサイズのギャップを持つ電極の作製が必要となる。そこで本研究では、正負一対のマイクロ電極にチオール分子や半導体分子をバインダーとして金ナノ粒子を連結させ、粒子間にナノスケールのギャップを形成することでDNAをはじめとする目的分子の導電性の計測を目指した。ナノ粒子を固定して作製したナノギャップセンサ電極の電気的、分光学的特性評価、表面観察を行った。その結果、炭素数が10のアルキルチオール、デカンチオールをバインダーとして用いた場合、最適条件下では50nmの粒径を持つ金ナノ粒子が単層で二次元に配列した様子が観察された。また、そのギャップにそれぞれ配列の異なる2種のプローブDNA(12塩基)を固定化した12nmの金ナノ粒子を配置した。この粒子膜にターゲットとしてそれぞれのプローブと相補的な配列をもつDNA(24塩基)を添加したとき電気抵抗には減少がみられた。この抵抗変化はハイブリダイゼリションに伴い、12nmのナノ粒子が50nmのナノ粒子により形成された二次元膜の空隙を架橋することにより、連続的に結合した金ナノ粒子膜を形成することに起因する。それにより粒子間の電子ホッピングが容易になり抵抗が減少するものである。一方で、ミスマッチ部位を有するDNAを添加したとき、配列中のミスマッチ塩基の増加に伴い電気抵抗変化は小さくなった。これらの成果について、学術誌(米国電気化学会Joumal of Electrochemical Society誌,王立化学会Chemical Communications誌,日本分析化学会Analytical Sciences誌)への掲載、国内外学会(欧洲分析化学会議EUROANALYSIS2009など)での発表を行った。二重らせんの塩基対の重なりを介して分子構造内で電子(またはホール)移動が起こることが明らかになったが、マイクロメートルサイズのDNA、さらにDNAを構成するナノサイズの塩基配列の導電性に関する情報を取得するには、ナノサイズのギャップを持つ電極の作製が必要となる。そこで本研究では、一本鎖プローブDNAをバインダーとして、その両側に金ナノ粒子を結合させ、粒子間にナノスケールのギャップを形成し、一本鎖プローブDNAによるブリッジは微視的に絶縁性であるが、相補的なターゲットDNA存在下で二重らせんを形成することにより導電性を発現することを利用し、このとき生じる微小な電気抵抗変化をナノギャップにより高感度に検出することで、新しいDNA検出法の開発を目指した。電極基板の作製とナノ粒子固定化に関する検討を行い、絶縁性基板にイオンスパッタまたは真空蒸着法により正負一対のマイクロ電極を作製し、電極ギャップにナノ粒子を固定することでナノギャップを持つセンサ電極を作製した。また、その電極の電気的、分光学的特性評価、表面観察を行った。その結果、最適条件下では50nmの粒径を持つ金ナノ粒子が単層で二次元に配列した様子が観察された。センサ電極へのDNAの固定化とセンシング特性評価を行い、相補鎖を滴下したときの電気抵抗変化がミスマッチを持つDNAを滴下したときよりも格段に大きくなることがわかった。これらの成果について、学術誌(米国電気化学会Journal of Electrochemical Society誌,王立化学会Chemical Communications誌, Electroanalysis誌)への掲載、国内外学会(日本分析化学会、電気化学会、国際電気材料会議など)での発表を行った。
学習内容の深い理解を促す指導方法を導入した保健授業の実践的検討

本研究は,中学校及び高等学校の保健授業において,学習内容の「深い理解」を促すための指導法として「ピア・インストラクション:PI」を取り入れた授業実践を行い,その効果について検証することを目的とした。2018年度は,高等学校の「社会生活と健康」単元に位置づく「食品保健にかかわる活動」をテーマとした授業実践を行った。まず,申請者と現職の高等学校保健体育科教師とのカンファレンスを開催し,前年度の中学校保健授業での実践によって示された知見や課題,高等学校の学習指導要領解説や教科用図書に示された内容等を踏まえて,授業の展開やPIの概念問題づくり等の検討を行った。それに基づき,2018年12月に関東地方の公立高等学校1校の2学年の2クラスを対象に授業実践を行った。授業効果については,学習内容に関する知識(7項目),関心(4項目)について,授業前,授業直後,授業3か月後に調査を実施してその変容を把握した。加えて,授業直後調査では,授業での思考についての生徒の主観的評価を,授業3か月後調査では,授業で学習した内容についての生活場面での活用や探求の状況を,それぞれ把握した。授業実践の結果,PIの活動において議論した「HACCPの意義」などに関する知識問題の正答率が授業前後で向上し,3か月後まで維持されていた。また,「ニュース等で報道される食品の安全に関する問題」や「食品の安全を守るために行政が行っている取組」への関心への肯定的回答についても同様の効果が示された。また,授業において「様々な考えをめぐらせながら理解できた」や「自分なりに筋道を立てながら考える場面があった」と回答した生徒が8割以上を示した。なお,学習した内容について授業後の生活場面で活用したり探求したりした生徒が少ないながらも見られ,具体的には,食品表示の確認の習慣化や食品添加物の安全性を調べたことなどが挙げられていた。本研究では,中学校および高等学校の保健授業において,生徒における保健知識の「深い理解」を促すための指導法として近年注目されている「ピア・インストラクション:PI」を取り入れた授業実践を行い,その効果について量的,質的の両面から検証することを目的としている。平成29年度は中学校での授業実践を行なった。授業テーマは「健康な生活と疾病の予防」単元に位置づく「感染症の原因と予防」とした。まず,申請者と現職の中学校保健体育科教師とのカンファレンスを複数回開催し,PIを取り入れた国内外の授業実践の先行知見を踏まえて,授業の構成と展開,PIの概念問題づくり等の検討を行った。それを踏まえ,平成29年11月に関東地方の公立中学校1校の3学年の3クラス(実験群:Aクラス26名,Bクラス26名,対照群:Cクラス27名)を対象に授業を実施した。授業効果の評価については準実験デザインを採用し,量的評価として,学習内容に関する知識,意識等についての質問紙調査,質的評価として,学習意欲とコミュニケーション力の観点から抽出した典型生徒におけるPI活動時の発話内容の分析等を実施した。その結果,ピア・インストラクションを取り入れた保健授業は、「自然環境の変化による感染症の発生」や「感染症の予防とマスク」等に関する知識の習得度,「感染症が起きる原因」や「感染症の広がり方」に関する関心度の向上等の効果があることが示唆された。また,典型生徒を対象とした発話分析において,普段の授業で消極的な傾向の生徒であっても,PI活動時に,主体的に参加していると捉えることができる発話をしていることも確認された。当初の予定通り,平成29年度中に中学校での授業実践を行うことができたが,授業効果について分析途中となっているデータが一部残っているためである。

平成30年度は,前年度に実施した中学校での実践の効果についてのデータの分析を更に進め,学会発表を行う。また,当初の計画に従って高等学校での授業実践を行う。授業の展開や評価の方法等についての方針は基本的に中学校での実践を踏襲するが,高等学校の学習指導要領に示された内容や,認知面での発達段階を踏まえたものとする。情報収集や研究打ち合わせに係る旅費が,地理的な条件から当初の予想より安価となったため。ただし,平成30年度に参加予定の学会の開催地および研究実践校は,いずれも研究拠点からやや遠距離に位置するため,前年度繰り越した額を平成30年度の旅費等に充当することとした。
日本人重症マラリア患者に対する適正療法確立に関する薬物動態学的研究

わが国では輸入マラリアが増加しており、その医療対応が重要な問題になっている。しかも、薬剤耐性熱帯熱マラリアの克服のため開発されたメフロキン、アルテミシニンなどの新規薬剤は国内ではいずれもオーファンドラッグとして存在するため、日本人を対象とした薬物動態学的検討はほとんど実施されていない。加えて、メフロキンは、病態や人種により薬物動態パラメータが異なる知見も得られている。そこで、日本人重症熱帯熱マラリア患者に対する標準療法を確立する目的でメフロキンを初めとする新規薬剤の薬物動態と治療効果などを検討した。1)現在、わが国で熱帯熱マラリアの治療に広く使用されているメフロキンは経口薬として開発され、その生体内有効率は85%以上とされている。また、本研究で確立した定量法によれば、メフロキンのT_<max>は612時間、消失半減期はおよそ2週間前後で、長く治療有効濃度を維持し、治療効果も良好であった。2)メフロキンの消失半減期が長期化する原因として腸肝循環の存在を示唆する報告があるため、ラットを用いて精査したが、その存在は確認されなかった。3)新規開発されたアルテミシニン誘導体は多剤耐性熱帯熱マラリアにも奏効するが、再燃傾向が高く、メフロキンの追加療法でそれを防止できることが判明している。そこでアルテミシニンのC12位の酸素二重結合をコハク酸で置換したアーテスネートを先行投与した結果、612時間後には原虫の変性像がみられ、病悩期間を短縮するなどQOLが高く、キニーネの非経口療法に匹敵する効果を発揮する療法と思われた。また、メフロキンの体内動態にも影響を及ぼさなかった。1.生体試料中の光学異性メフロキン(R,S-体、S,R-体)の定量法の確立稀用薬に属するメフロキンの血中濃度と治療効果の指標となる赤血球原虫感染率を検討するために必要な分離分析法を、高速液体クロマトグラフを用いて確立した。すなわち、血液試料を除蛋白した後、メフロキンをアルカリ性化でmethyl tert.-butyl etherに抽出した。ついで、残査にキラル試薬である(-)-1-(9-fluorenyl)ethyl chloroformateを加えて誘導体化して、高速液体クロマトグラフで測定する定量法を確立した。本定量法は、メフロキンラセミ体を投与された患者における光学異性メフロキンの血中濃度を、十分に追跡できる、高感度で特異性の高い方法であることを確認した。2.患者におけるメフロキンの体内動態今年度はメフロキンを投与されたマラリア感染患者における体内動態を検討した。メフロキンラセミ体を投与後の血漿および全血中のいずれにおいても、メフロキンのR,S-体の濃度の方がS,R-体の濃度よりも28倍高いことが示された。3.ラットにおけるメフロキンの体内動態メフロキン20mg/kgをラットの静脈内投与した後の血漿中メフロキン濃度を測定し、動態学的解析を行い、メフロキンの全身クリアランスは平均4.1ml/min/kg、分布容積は19.7L/kgおよび消失半減期は60時間であることを明らかにした。1980年代に開発されたメフロキンはクロロキン耐性熱帯熱マラリアにも有効な抗マラリア薬としてすでに多くの国々で臨床使用されており、WHOの必須薬剤リリストにも収録されている。経口錠として開発された本剤の生体内有効利用率は85%以上であるが、最近の知見によれば、その体内動態は人種、病態により変動するとされている。しかし、本剤は熱帯病研究班から入手することは可能であるが、国内未承認の希少薬に属するため、薬物情報に乏しいのが現状である。

そこで、日本人患者、特に重症患者に対するメフロキンの適正療法を確立する目的で、メフロキンの迅速定量法を確立し、薬物動態学的検討を加えた。1.高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるメフロキンラセミ体の定量法を確立し、治療目的でメフロキンを1,000mg投与した患者の薬物動態を検討した。その結果、若干の個体差が認められたが最高血中濃度到達時間は46時間、最高血中濃度は1,000ng/mL前後となり、消失半減期は14日間前後であった。また、これらの薬物動態パラメータ値に関しては、他の報告と比較した結果、消失半減期は欧米人より短縮する傾向がみられた。2.WHOはメフロキンの投与量を無免疫患者には25mg/kgとしているが、15mg/kgで有効治療濃度を十分維持し、治療後の再燃は皆無であった。3.最近はアルテミシニン誘導体のアーテスネートの投与を先行させ、メフロキンを追加する療法が案出されているが、この併用療法を実施した結果、アーテスネート投与後612時間で熱帯熱マラリア原虫に変性像がみられ、病悩期間が短縮する印象を受けた。また、メフロキンの体内動態に影響を及ぼさなかった。
消化器疾患の摂食異常における摂食調節ペプチドの意義

ヘリコバクター・ピロリは日本人の半数以上に感染し、慢性胃炎や消化性潰瘍、さらには胃がんの原因とされている細菌である。我々は、ヘリコバクター・ピロリ感染と、各種の摂食調節因子、代謝調節因子との関連について臨床的研究を行った。その結果、ヘリコバクター・ピロリ感染は、摂食調節ペプチドであるグレリンや、代謝に関連するホルモンであるアディポネクチンの血中濃度の変動を介して、患者の栄養状態に影響を与えている可能性が示された。本研究では、消化器疾患と摂食異常というテーマで、摂食調節ペプチドとヘリコバクター・ピロリ(HP)感染(課題I)およびインターフェロン(IFN)療法(課題II)との関連を検討している。平成22年度はそれぞれに関して以下のような研究成果を得た。課題I:社会保険京都病院において、HP感染の有無別およびHP除菌前後に胃粘膜生検組織、血漿を採取し、神戸薬科大学において検体のアッセイを行った。胃粘膜組織では摂食調節ペプチドであるグレリンおよびその活性化酵素であるGOATのmRNA発現量を解析した。また、血漿ではグレリン(活性型のアシルグレリン、不活性型のデスアシルグレリン)濃度を測定した。その結果、HP陽性者では陰性者に比較してグレリンとGOATのmRNA発現が低値であった。血漿においてもアシルグレリン、デスアシルグレリン濃度が陽性者において共に低値を示した。HP除菌後では胃粘膜中のグレリンmRNAが有意に増加し、GOATのmRNAは有意差はないものの増加傾向にあった。血漿中のアシルグレリンは増加傾向にあり、デスアシルグレリンは有意に減少した。除菌前後において明らかなBMIの増加は見られなかった。今後は、グレリン以外の摂食調節ペプチドについても測定予定である。また、この結果は平成23年度中に論文等で公表予定である。課題II:大阪鉄道病院において倫理委員会の承認を得て、慢性肝炎に対するIFN治療が摂食に及ぼす影響の検討を開始した。具体的には、IFN治療開始前および開始後2、4、8週の血漿採取を11月から開始した。解析は平成23年度に実施予定である。平成23年度はそれぞれに関して以下のような研究成果を得た。課題I :社会保険京都病院において、HP感染の有無別およびHP除菌前後に胃粘膜生検組織、血漿を採取し、神戸薬科大学においてアッセイを行った。平成22年度の検討でグレリンおよびその活性化酵素であるGOATの検討を終えているため、平成23年度はHPと血中レジスチンおよびビスファチン濃度の関連についてELISAにて検討した。その結果、血中レジスチンおよびビスファチン濃度はHP感染の有無で有意な差を示さず、HP除菌前後でも有意な変動を示さなかった。さらに、血中α-Klothoタンパクの濃度とHP感染の関連についても同様に検討したが、こちらもHPの状態で有意な差を認めなかった。現在、症例数を増やしてアッセイを追加すると共に、被験者を層別化してデータの解析を行っている。グレリンに対する検討結果は平成23年度中に論文を投稿して受理され、印刷待ちの状態である。課題II :大阪鉄道病院において倫理委員会の承認を得て、慢性肝炎に対するIFN治療が摂食に及ぼす影響の検討を開始した。具体的には、IFN治療開始前および開始後2、4、8週の血漿採取を行い、摂食状況と共にアシルおよびデスアシルグレリンの血中濃度を測定した。しかし、パイロットスタディで有意な変動がみられなかったことから、解析方法等について検討中である。本研究では、消化器疾患と摂食調節異常というテーマで、摂食調節ペプチドとヘリコバクター・ピロリ(HP)感染(課題I)およびインターフェロン(IFN)療法(課題II)との関連を検討した。平成24年度は以下のような検討を行った。課題I:研究協力施設において、HP感染の有無別およびHP除菌前後に胃粘膜組織、血漿および血清を採取し、神戸薬科大学においてmRNA、血中ペプチドのアッセイを行った。平成22年度には血中グレリンとその活性化酵素である胃粘膜内GOATの検討を行い、平成23年度は血中レジスチンおよびビスファチン濃度について検討した。血中レジスチンおよびビスファチン濃度はHP感染の有無で有意な差を示さず、HP除菌前後でも有意な変動を示さなかった。さらに、血中α-Klothoタンパクの濃度とHP感染の関連について検討したが、こちらもHPの感染状況で有意な差を認めなかった。このため、平成24年度は症例数の増加等の対策を行ったが、やはり有意な関連を確認できなかった。

一方、HP感染とアディポネクチン値の関連を検討したところ、HP感染の有無でアディポネクチン値に有意な差を認めなかったものの、HP除菌に成功した患者では、血中総アディポネクチン値および各分画の有意な上昇を認めた。HP除菌に失敗した患者では、総アディポネクチン値および高分子量アディポネクチン値は有意に上昇したが、中・低分子量アディポネクチン値は有意に変化しなかった。この検討結果は論文にて報告した。課題II:慢性肝炎に対するIFN治療が血中グレリンに及ぼす影響の検討については,パイロットスタディにおいて有意な関連を確認できなかった。C型肝炎に対する治療方針の変化(テラプレビルの保険収載)とも重なったために、継続した検討は困難と考え、課題IIについては終了することになった。ヘリコバクター・ピロリ感染とグレリンおよびグレリン活性化酵素GOATに関しては、予定通り解析を終了した。他の摂食調節ペプチドに関し検討を進めている。インターフェロンに関しては、検体収集・解析実施の進行は予定通りであるが、予想した結果と異なることから解析方法を再検討している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後も保存された血清・血漿を利用して摂食調節ペプチドおよび関連物質の測定を行うとともに、データの解析を進めていく予定である。
イリジウム錯体を用いた低酸素病態イメージング技術の実用化

我々の研究グループは低酸素病態に焦点を当て、簡便で安価な分子イメージング技術の確立を目指している。我々が提案する低酸素組織イメージング法は、「がん」などが正常組織に比べて低酸素状態にあることに着目し、低酸素環境下でのみ発光するイリジウム錯体(BTP)を使ったイメージング技術である。申請者は本研究助成金で1)BTPの長波長改良体と高輝度改良体を作製して検証した、2)BTPの抗体作製、などを行った。我々の研究グループは低酸素病態に焦点を当て、その超早期診断に向けて、簡便で安価な分子イメージング技術の確立を目指している。我々が提案する低酸素組織イメージング法は、がん、動脈硬化、脳梗塞、心筋梗塞部位が正常組織に比べて低酸素状態にあることに着目し、低酸素環境下でのみ発光するイリジウム錯体(btp)_2Ir(acac)(BTP;分子量712)を生体に投与し、そのリン光(励起波長445-500nm;発光波長600-700nm)を利用してin vivoイメージングシステムで生体の低酸素病態を検出する全く新しいタイプの分子イメージング法である。既に我々は、BTPの発光をヌードマウスに移植した浅部腫瘍で観察していた。本研究ではマウス皮下の浅部腫瘍だけではなく、深部組織の低酸素状態をより鮮明に観察することを目指して、BTPの励起波長と発光波長の長波長化、発光強度の増加による高感度化した改良体の開発を行っている。平成21年度はBTPの長波長改良体であるBTPHSA(励起波長500-600nm;発光波長700-800nm)を作製し、長波長の励起光、検出光で浅部ヌードマウス移植腫瘍をイメージングした。BTPHSAとBTPの腫瘍探索可能深度を比較したところ、BTPは5-6mm程度なのに対してBTPHSAは12-14mmの深度の腫瘍を探索可能であった。更にBTPHSAでマウス肝臓裏に移植した腫瘍(深度10mm程度)のイメージングに成功した。我々が提案する低酸素組織イメージング法は、がん、動脈硬化、脳梗塞、心筋梗塞部位が正常組織に比べて低酸素状態にあることに着目し、低酸素環境下でのみ発光するイリジウム錯体(BTP;励起波長445-500nm;発光波長600-700nm)を生体に投与し、in vivoイメージングシステムで生体の低酸素病態を検出する全く新しいタイプの分子イメージング法である。平成22年度はマウス皮下の浅部腫瘍だけではなく、深部組織の低酸素状態をより鮮明に観察することを目指して、BTPの励起波長と発光波長の長波長化(生体透過能力が優れている)、発光強度の増加による高感度化した改良体の作成と検証を行った。長波長改良体として芳香族配位子のπ共役系を拡張したBTQ、アセチルアセトンをスクシニルアセトンに変えたBTQSA,TTPHSA,DTTPHSA,BTBQSA、側鎖にアミノ基を付加させたBTPHNH_2を作成しマウスで検証したが、昨年度作成した長波長改良体BTPHSAよりマウス腫瘍を効率よくイメージング出来る改良体は得られなかった。また高輝度化を目指し、分子内エネルギー移動原理に着目し作成したBTP-ローダミンは試験管内で輝度がBTPと比較して約1.5倍程度の増加に留まり動物実験でも大きな成果は得られなかったが、BTPの側鎖をジメチルアミノ基に変更した改良体BTPDMは細胞、個体レベルでBTPより5-8倍その輝度が増加した像を得た。そこで現在、長波長改良体BTPHSAの側鎖にジメチルアミノ基を付加した改良体を作成しつつある。我々が提案する低酸素組織イメージング法は、がん、動脈硬化、脳梗塞、心筋梗塞部位が正常組織に比べて低酸素状態にあることに着目し、低酸素環境下でのみ発光するイリジウム錯体を使った新しい分子イメージング技術である。平成23年度は、1)前年度に開発した新規イリジウム錯体BTPDMの検証、2)イリジウム錯体の細胞内動態を検証するための抗体作成、を行った。1)高輝度改良体の検証:イリジウム錯体BTPにジメチルアミノ基を二個付加した高輝度改良体BTPDMはBTPと比較して1/10の低濃度で腫瘍をイメージングすることが出来た(前年度後半-今年度前半の成果)。この新規高輝度改良体の組織および細胞内の取り込み量を測定するために、ICP-MS(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry:誘導結合プラズマ質量分析計)を用いてイリジウム錯体の取り込み量を測定した。前年度に顕微鏡によるイリジウム錯体のシグナル比較は成功していたが、ICP-MSによる検証は、イリジウム錯体の細胞内、組織内における定量が可能となり、イリジウム錯体の代謝などを知る上で、大きな進展を得た。

2)イリジウム錯体改良体の細胞内動態を検証する:我々が開発している一連のイリジウム錯体の基本骨格となるBTPをKLH(Keyhole limpet hemocyanin;スカシガイのヘモシアニン)に付加した化合物を作製し、これを抗原としてウサギでポリクローナル抗体を作製した。またこのウサギ血清から抗体成分を精製した。現在、BTPの細胞内局在を解析中である。