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中国における労働者の権利擁護に関する研究 -労働組合・NPO法人・CSR-

中国では、農民工による集団的労働紛争が頻発している。彼らの多くは労働組合に加入しないため、集団的労働紛争の多くが、労働組合のコントロール外で起こっている。中国では、労働組合が、労働者の利益代表としての機能を十分に果たしていないだけでなく、労使の利益調整をめぐる紛争解決の法制度が十分に整備されていない。そこで、労働紛争の企業内での調整機能の強化や未然の予防を目的とした日常的な労使コミュニケーション制度の創設の取り組みが進められている。本年度は、労働契約法施行後の状況について、非正規雇用の広がりと集団的紛争の発生(広州ホンダや中国東方航空のストライキ)を取り上げて、研究を行った。また、工会(労働組合)と並んで、企業内の労働者の集団的組織である従業員代表大会制度について、その法律上の地位・機能・実態について研究を行った。これらの研究で明らかになったことは、中国では、法律上、労働者に様々な権利が付与されるようになってきており、従業員代表大会や工会(労働組合)には、法律上、かなり強い権限が付与されている。しかしながら、その権利の実効性を高めるためのサポート体制が不十分であり、特に、工会(労働組合)などの組織が、労働者の権利や利益の保護に必ずしも積極的ではなく、組合活動を行った組合幹部の地位を保障するためのシステムがないことから、工会(労働組合)に頼らず、自主的な集団的活動を超すようになってきている(非正規労働者や若年労働者による非公式なストライキなど)。上記の研究では、今後、中国において、工会(労働組合)をどのように位置づけ、実際に、労働者代表として積極的に活動することが重要であることを指摘した。特に、非正規労働者や若年労働者の利益にも十分配慮した活動が、工会(労働組合)にも求められよう(そうしなければ、社会の不安定要因ともなりかねないことも留意が必要である)。こうした傾向は、東アジアの諸地域に共通の状況でもある。また、台湾において、労働組合の活動を保護する不当労働行為制度が2011年5月1日よりスタートする(法整備は既に実施され、施行を待つ状態)。こうした台湾での取り組みは、大陸中国においても参考になるものである。本研究は、現代中国における労働者の権利擁護の現状を明らかにし、中国の実情を踏まえた労働者の権利擁護の方法について研究するものであるが、本年度は、まず、近年注目されている集団的労働紛争の実情とその解決手続について研究を行った。その中で、労働組合や従業員代表制度といった労働者の利益代表システムが十分に機能していないこと、権利紛争(労働協約や労働契約ですでに定められている権利についての紛争)は労働紛争仲裁や裁判を通じて解決がはからられているものの、利益紛争(例えば、賃金の引上げとその額の調整)の調整システムが十分な法整備がなされていないことなどを明らかにした。また、集団的労働紛争の事後的な解決だけでなく、未然の予防のために、労使コミュニケーション制度の整備が、政府の主導の下に進められていることについても研究を進めた。さらに、労働紛争の主な原因である賃金や労働時間に関して、時間外労働やその手当の未払い問題とその法規制を明らかにするために、労働時間・休憩休日・時間外労働の法規制について研究を進め、休憩時間の規制が不十分であること、労働行政による監督があまり機能していないことなどを明らかにした。そして、労働行政部門による労働監督や労働者の権利実現の手段に対する法規定や実態について、研究を進めた。他方で、企業のCSR(社会的責任)や企業外のNPO法人による労働者の権利意識の啓蒙活動については、文献資料や若干の聞き取り調査を行ったところ、現段階では、それほど広がりを見せていないようであることが分かった。しかし、地方による差が大きく、一部の地方では、そうした活動がみられることから、今後、中国全体に広がる可能性はあろう。本年度は、中国で頻発する集団的労働紛争(いわゆるストライキなど)に関して、労働組合(工会)の法的位置づけ、実際の機能、紛争解決手続の問題点等について研究を行った。中国の集団的労働紛争は、労働組合のコントロールの外で、突発的に発生しており、法律上も、集団的労働紛争の解決手続が整備されているとはいいがたい。なぜなら、社会主義の建前の下、経済の主体である集団所有制においては、企業の所有者と労働者との間に利益の対立がないことを前提としており、そうした国家の制度的に「想定外」の事象について、法的に制度を整備することは、そうした「想定外」のことを法的に許容することになり、社会主義の建前との矛盾をきたすことになる。そこで、実態として生じる集団的労働紛争については、地方の労働行政がケーズバイケースで対応している。そして、労働組合は労働者の権利保護の機能を果たしておらず、農民工を保護する活動を行うNGOが一部で活動を行っている実態がある。他方で、中国では、紛争の発生及び拡大を防止するため、日常的な労使のコミュニケーションを促進する仕組みの強化に力を入れている。

また、こうした集団的労働紛争の発生の背景にあるのは、法律上明記された労働時間や賃金に関する規定が遵守されていないことが指摘できる。そこで、本年度の後半では、法所定の労働者の権利、特に、労働時間に関する法的保護、時間外労働手当、休憩休暇の法制度について研究を行った。さらには、こうした法違反を犯した使用者に対する法的制裁の仕組み及びその実態についても研究を行い、労働行政の機能についても考察した。こうした考察に当たって、中国の労働事件の裁判例などを参照して、労働契約法や労働法の法解釈の現状についても研究を行った。中国における集団的労働紛争の実態とその解決手続について、文献資料や聞き取り調査によって明らかにすることができた。また、そうした労働紛争の原因としての労働時間の法規制の不備等および労働組合・従業員代表の機能不全について検討を行った。さらに、労働行政部門の機能と実態について研究を進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、労働行政部門と労働紛争仲裁・裁判所(人民法院)を通じた労働者の権利実現のシステムについて、法律上の強制手段(過料、賠償金等)について研究を進めている。また、中国における労働CSRの取り組みと労働NPOの活動状況について聞き取り調査等を行っている。労働CSRや労働NPOの分野は、まだ中国では十分に活動の広がりがみられない状況であることがわかってきたが、地方によってかなり違いがあるようである。また、政府の働きかけにより、労働紛争の解決や労働者の権利擁護・要求実現のために、企業内の労使コミュニケーション制度の構築を推進している。こうした制度を通じて、大規模な労働争議を予防する取り組みが図られており、この点についても研究を進める予定である。
慢性脊髄炎の新規自己抗体同定と病原性モノクローナル抗体作成の試み

本研究では抗AQP4抗体研究やEAE研究を通じて確立した実験系を液性免疫が病態に関与すると思われる神経免疫疾患、特に自己免疫性脊髄炎に応用し、自己抗体の発見と病態の解明を目的とする。対象は1抗AQP4抗体や抗MOG抗体等の既知の自己抗体が陰性2既存の神経免疫疾患が否定的3臨床症状や画像所見から脊髄が主病巣4ステロイドパルスや血液浄化療法、大量ガンマグロブリン療法などの免疫療法が有効を満たす症例である。症例の血清からIgGを生成し、ウェスタンブロットや質量分析装置を用いて抗原の同定を目指す。抗原を同定した自己抗体は、特異性及び病勢との関連を検討し、バイオマーカーとしての意義を検討するとともに、病原性を評価し、治療ターゲットとしての可能性を検討する。病原性が示唆される場合にはsingle cell sortingを使用した抗体遺伝子クローニングを行い、病原性モノローナル抗体を作成する。また視神経脊髄炎患者髄液にはAQP4抗体以外の抗体も存在すると考えられており、我々はラット脳に反応する抗体を同定している。本研究の特色は当施設で長年保存してきた血清、髄液及び血球を用いて未知の自己抗体を脊髄炎で同定し、診断バイオマーカーを確立するとともに、シングルセルテクノロジーにより病原性モノクローナル自己抗体を作成し、治療法の開発につなげることである。シングルセルテクノロジーを用いて神経免疫疾患患者由来のモノクローナル抗体作成を行っている研究室は国内に他に存在せず、本研究をきっかけに日本発の独自の神経免疫疾患研究の発展が期待できる。アクアポリン4抗体のリコンビナント抗体作成に成功した。アクアポリン4以外の抗原を認識する抗体も同定できている。更に抗原の同定を進める視神経脊髄炎(neuromyelitis optica;NMO)は繰り返す視神経炎と脊髄炎及び抗アクアポリン4抗体の出現を特徴とする中枢神経炎症性疾患である。我々は視神経脊髄炎(NMO)における抗アクアポリン4抗体の病原性を世界に先駆けて報告し、NMOがアクアポリン4抗体によるアストロサイトパチーであることを明らかにした。さらに急性期NMO患者の免疫吸着後カラムから精製したIgGをパッシブトランスファーすることにより世界で初めてNMO動物モデルを作成した。本研究では42歳NMO女性の再発時髄液からプラズマブラストのシングルセルソーテイングを行い、アクアポリン4抗体遺伝子をクローニングした。アクアポリン4強制発現HEK293細胞に対するフローサイトメトリー及び免疫染色でアクアポリン4に対する結合を確認した。その中から合計8クローンのアクアポリン4抗体が合成出来た。またアクアポリン4強制発現HEK293細胞にヒト血清とともに添加してLDHの培地への増加を測定することにより、アクアポリン4抗体の細胞障害性を確認した。クローニングしたアクアポリン4抗体遺伝子は293T細胞に強制発現させ、リコンビナントアクアポリン4抗体を大量に合成することに成功した。また本年度は原因不明の脊髄炎患者血清の収集を行った。十数例の脊髄炎患者血清を集め、ラット脊髄に対する免疫染色を行ったところ数例の陽性症例を見出した。視神経脊髄炎患者由来モノクローナルアクアポリン4抗体の大量の合成に成功した。また原因不明の脊髄炎患者血清を用いてラット脊髄に対する免疫染色を行い数例の陽性症例を見出した。今後の慢性脊髄炎及び視神経脊髄炎研究の発展につながると考えられる。視神経脊髄炎患者由来モノクローナルアクアポリン4抗体を用いて視神経脊髄炎動物モデルの作成や新たな病態メカニズムの解明に役立てていく。また質量分析等の手法を用いて慢性脊髄炎患者に出現する自己抗体同定を目指す更に抗原の同定を進める研究が順調に推移し、抗体やプラスミドなどの購入が少額で目的が達成できたため。当初予定した実験を実行する必要がなくなったため
敗血症における血管内皮グリコカリックスの超微形態的考察

本研究の目的は、グリコカリックスの正常な3次元構造を臓器ごとに同定したうえで、敗血症時の急性血管内皮傷害下における変化を検証し、敗血症による臓器障害の成因を血管内皮傷害の観点から個々の臓器について検証することである。連続型毛細血管は最も一般的な毛細血管で、心臓、肺、骨格筋、神経に存在する。内皮細胞は核の部分で厚いが、そのほかの部分は0.1-0.2 &micro;mと薄い。細胞同士の連結部は強く結合しており、内皮細胞の外側を基底膜が完全に覆っている。硝酸ランタンを用いて血管内皮グリコカリックスを描出するとグリコカリックスが血管内皮全体を覆うように存在していることが確認された。また、同形態を示す心臓、肺、脳の血管のグリコカリックスを比較したところ脳>心臓>肺の順で厚さが異なり臓器ごとでも形態が異なることが証明された。腎臓の糸球体に認められる有窓型毛細血管は特徴的な小孔構造を有している。解剖学的にはこの小孔は60-80nmであるが小孔を覆うように存在するグリコカリックスによって孔のサイズは15nmほどまで狭小化する。さらに基底膜をこえてタコ足細胞のレベルまで達すると孔のサイズは6nmほどとなるのに加えて、タコ足細胞の表面もグリコカリックスで覆われていることが観察され、アルブミンや大分子は通過することができない構造になっていた。肝臓で認められる洞様型毛細血管は、血管内皮間の結合は弱いため、卵円形の孔がある。血液はこの孔を通してDisse腔と交通しビリルビンなどの物質の交換を行っている。この血管のグリコカリックスは孔を覆っておらず、心臓や腎臓の血管に比べてグリコカリックスの構造が薄いことがわかった。リポ多糖投与により血管炎を誘発すると、いずれの血管においても血管内皮グリコカリックスは傷害され剥がれ落ちる。その結果、血管内皮細胞の表面が血管腔に露出し内皮細胞は傷害されることも確認できた。当初予定していた肺、心臓、腎臓、肝臓の血管の形態の調査だけでなく脳の血管の形態の確認も行うことができ、論文化できたため。従来は血管内外の静水圧と膠質浸透圧のバランスで水が移動すると考えられ、間質に異動した水は静脈に再吸収され除去されると考えられていた。近年、内皮グリコカリックス層は内皮透過性調節機能を担い、血管内外の物質輸送に関与することが明らかになった。これに伴い、間質の水は血管内へ再吸収されずそのほとんどがリンパ系によって除去されることが明らかになった。敗血症により間質への水の漏出が増加するため、その除去に関してリンパ管の構造変化とその機能を明らかにする。血管内皮の管腔表面に存在する内皮グリコカリックス層は血管透過性調節においての重要な役割を担っている。内皮グリコカリックス層は、血管の構造が臓器ごとに大きく異なるため、それぞれの血管に対する固有の性質の有無などはさらなる研究が必要であるため本研究では、まずグリコカリックスの正常な3次元構造を臓器ごとに同定したうえで、敗血症時の急性血管内皮傷害下における変化を検証するものである。血管内皮グリコカリックスは構造的に不安定であり,本研究では硝酸ランタンを用いた電子染色を行い描出に成功した。また、グリコカリックスは,急速輸液によるシェアストレスの増加によっても引き起こされるため、灌流固定時の内皮グリコカリックスに対するShear Stressを減弱するため,右心耳を切開し圧を開放すること,灌流液の速度を1mL/分と低値にすること,心臓腎臓肝臓への灌流がしやすいように頸動脈を結紮することを行い,グリコカリックスの超微形態を描出した。心臓、肝臓、腎臓、肺の血管内皮グリコカリックスの正常像を確認した。心臓と肺は連続型毛細血管に属し、どちらもグリコカリックスが血管内皮全体を覆うように存在していた。腎臓の糸球体に認められる有窓型毛細血管は特徴的な小孔構造を有しているおり、この小孔は小分子を通過させるが,タンパク質などの大分子の通過を制限しているといわれている。この孔はグリコカリックスによって覆われさらに狭小化しているように観察された。肝臓で認められる洞様毛細血管は大きく不整形な孔があり,血管内皮細胞は非常に薄く,非連続的で基底膜は確認できない。この血管のグリコカリックスは孔を覆っておらず,また,心臓や腎臓の血管に比べグリコカリックスの構造が薄いことがわかった。いずれの血管も敗血症においてグリコカリックスが脱落していることが確認できた。正常血管内皮構造の描出と敗血症時のグリコカリックスの形態学的変化についてはすでに検証が終わっており(Crit Care 2017、Chest 2018 in Press)、当初の予定以上に研究は進展している。

硝酸ランタンを用いて血管内皮グリコカリックスを描出するとグリコカリックスが血管内皮全体を覆うように存在していることが確認された。また、同形態を示す心臓、肺、脳の血管のグリコカリックスを比較したところ脳>心臓>肺の順で厚さが異なり臓器ごとでも形態が異なることが証明された。腎臓の糸球体に認められる有窓型毛細血管は特徴的な小孔構造を有している。解剖学的にはこの小孔は60-80nmであるが小孔を覆うように存在するグリコカリックスによって孔のサイズは15nmほどまで狭小化する。さらに基底膜をこえてタコ足細胞のレベルまで達すると孔のサイズは6nmほどとなるのに加えて、タコ足細胞の表面もグリコカリックスで覆われていることが観察され、アルブミンや大分子は通過することができない構造になっていた。肝臓で認められる洞様型毛細血管は、血管内皮間の結合は弱いため、卵円形の孔がある。血液はこの孔を通してDisse腔と交通しビリルビンなどの物質の交換を行っている。この血管のグリコカリックスは孔を覆っておらず、心臓や腎臓の血管に比べてグリコカリックスの構造が薄いことがわかった。リポ多糖投与により血管炎を誘発すると、いずれの血管においても血管内皮グリコカリックスは傷害され剥がれ落ちる。その結果、血管内皮細胞の表面が血管腔に露出し内皮細胞は傷害されることも確認できた。当初予定していた肺、心臓、腎臓、肝臓の血管の形態の調査だけでなく脳の血管の形態の確認も行うことができ、論文化できたため。今後は敗血症におけるリンパ管の構造と機能の検討を行っていく。従来は血管内外の静水圧と膠質浸透圧のバランスで水が移動すると考えられ、間質に異動した水は静脈に再吸収され除去されると考えられていた。近年、内皮グリコカリックス層は内皮透過性調節機能を担い、血管内外の物質輸送に関与することが明らかになった。これに伴い、間質の水は血管内へ再吸収されずそのほとんどがリンパ系によって除去されることが明らかになった。敗血症により間質への水の漏出が増加するため、その除去に関してリンパ管の構造変化とその機能を明らかにする。差額が10000円以下であることから、当初予算と実使用額に誤差を生じたもの。この差額に関しては、研究遂行に必要な物品などの充当する
金属蛋白質中に含まれる遷移金属クラスターの生体特殊反応場による機能制御

本研究では、B.schlegelii由来のフェレドキシン(Bs.Fd)を対象として研究を行った。Bs.Fd中のHis^<26>、Asp^<35>、Val^<38>、Ala^<47>を、それぞれTyr^<26>、His^<35>、Glu^<38>、Pro^<47>に置換した変異型フェレドキシンの遺伝子を調製した。この変異型遺伝子を大腸菌に導入することにより、変異型フェレドキシンを、大腸菌内で発現させた後、カラムクロマトグラフィーによりそれぞれの変異型フェレドキシンの精製を行った。精製した変異型フェレドキシンの電子吸収スペクトルを測定したところ、酸化型においては、すべての変異型フェレドキシンが同一の電子吸収スペクトルを示した。また、これらのスペクトルは野生型フェレドキシンとも同一であった。このことから、いずれの変異型フェレドキシンにおいても、鉄硫黄クラスターは、野生型フェレドキシンの場合と同様な構造を有していると考えられる。次に、精製した変異型フェレドキシンと還元剤であるジチオナイト(Na_2S_2O_4)との反応を行った。その結果、26、35、38番目のアミノ酸に変異を導入したものは、野性型と同様な反応が進行した。これに対し、47番目に変異を導入したもの(H47P Fd)は、ジチオナイトにより還元される鉄硫黄クラスターの割合が低下することが分かった。これは、変異導入により、[4Fe-4S]クラスターの酸化還元電位が低下し、ジチオナイトにより還元されなくなったためであると考えられる。H47PFdのCDスペクトルを測定したところ、野性型および他の変異型フェレドキシンのCDスペクトルとは異なるスペクトルを示した。このことから、H47PFdでは、変異導入により鉄硫黄クラスターの近傍のコンフォメーションが変化し、そのため酸化還元電位が低下したものと考えられる。
負分子イオンによるプラズマ加熱用高速中性粒子ビーム発生の基礎研究

本研究の目的は負分子(又は原子)イオンを用いた核融合炉用の中性粒子ビーム入射装置の概念設計と理論的検討であった。現在の中性粒子入射加熱装置に対する研究は、数百keV以上のビームエネルギーに対しては中性化効率の高い(重)水素負イオンの生成・引出しを中心にトカマク炉を対象として進展している。例えば回転励起された分子の解離性付着による負イオン生成を利用した大出力イオン源の開発が各国で精力的に行なわれようとしている。一方核融合炉規模の大型装置においては比較的重い原子または分子の中性ビームによるプラズマ加熱の有効性は理論的には指摘されてきたが、設計研究例は極めて少ない。そこで本研究では負イオンの生成過程の基礎的研究および関連する実験に必要な真空紫外レーザー及びそのシステムに関する資料収集、ビーム入射装置システムの設計研究を行った。一例としてドナー原子としてXe、負分子イオンとしてS【F_6】を選択し、Xeの光励起、光電離過程及びS【F_6】の電子付着による負分子イオン生成過程について調査した。その結果多光子電離過程によるXeの電離にはAvFとXeFのエキシマレーザーの組み合わせで効率的に行えることがわかった。また単光子共鳴遷移による励起とそれに続く電界電離によるXeからの電子供給が負分子イオンの高効率生成に有効であると思われ、それに必要なレーザー波長の検討を行った。(147nm)。一方中性化に必要なレーザー波長についても調査し、ヨウ素レーザーを用いた入射加熱装置の概念設計を進めた。またこれらと並行して(重)水素負イオンを用いたシステムについても検討し、上記システムと設計比較するとともに、従来の正イオン源システムの当センターでの運転経験に照らしてこれらシステムの将来性について検討を試みた。(147nm)。
動脈硬化危険因子の重積とその遺伝要因の解明

インスリン抵抗性における血管内皮細胞機能とCD36発現量とPPARγ発現量に対するHMG-CoA還元酵素阻害薬の効果目的:インスリン抵抗性の病態では血管内皮細胞が障害され、血圧上昇や臓器障害に関与する。高血圧自然発症ラット(SHR)のインスリン抵抗性の原因遺伝子として第4染色体上のCD36の変異が報告された。CD36遺伝子型とMSマーカーのD4Rat101とD4Rat24にはLETOとOLETで差はなかったが、D4Rat151はLETOとOLETFで相違していた。OLETFの第4染色体上にはQTLが報告されており原因遺伝子が第4染色体上に存在する可能性は残された。インスリン抵抗性における血管内皮細胞機能とCD36発現量に対するHMG-CoA還元酵素阻害薬の効果目的:インスリン抵抗性の病態では血管内皮細胞が障害され、血圧上昇や臓器障害に関与する。成績と結論:cerivastatinはコレステロール値を変化させずにOLETFの血管内皮細胞機能と、特にLecithinized SODに対する血管拡張反応を改善させた。cerivastatinは大動脈のCD36発現量も増加させた。
原発性乳癌の新しい診療アルゴリズムに関する研究

原発性乳癌の予後因子である腋窩リンパ節転移の有無を治療開始前に予測する数理モデルの開発・評価を行った。国内2施設から291例の症例データを得て予測モデルを作成し、韓国ソウル大学病院の174例を用いて評価を行った。予測モデル作成は決定木アルゴリズムの一つであるAlternating Decision Tree(ADTree)を採用した。構築されたモデルは、学習用データでROC曲線下面積(AUC)=0.770、独立した評価用データでAUC=0.772と高い汎用性を示した。モデルによる予測確率20%以下をリンパ節転移低リスクと仮定すると偽陰性率は5.3%であった。また、ADTreeモデルはデータ欠損にも耐性を示した。さらに同一データでの精度比較では、既存モデルはADTreeモデルに及ぼなかった。本結果を国際学会にて報告し、現在論文投稿中である。さらに、Web上で予測確率を計算可能なサイトを作成し、多施設共同で前向き評価試験を遂行中である。術前化学療法による病理学的完全奏効(Pathological complete response,pCR)を治療開始前に予測する数理モデルの開発・評価を行った。国内のがんセンター・大学病院より得られた150例のデータを用いて予測モデルを作成し、臨床試験から得た173例のデータにより評価を行った。モデル作成にはADTreeアルゴリズムを用いた。ADTreeモデルは、学習用データでAUC=0.766,評価用データで0.787と高い予測精度を示した。予測確率20%以下をpCRの可能性が低い群と仮定した場合、偽陰性率は7.7%であった。ADTreeモデルはエストロゲン受容体(ER)陽性のluminal type乳癌においてAUC=0.779と高い予測精度を示した。一方、ER陰性HER2陰性のTriple negative乳癌では、AUC=0.531と予測精度改善が必要と考えられた。同一データでの精度比較では、既存モデルはADTreeモデルに及ばなかった。さらに、Web上で予測確率を計算可能なサイトを作成し、多施設共同で前向き評価試験を計画中である。閉経後ER陽性乳癌患者を対象としてアロマターゼ阻害剤(exemestane)による術前療法を行った臨床試験で、臨床的治療効果の予測因子を探索した。その結果、年齢、腫瘍径、ER発現度、増殖マーカー(Ki-67)と治療効果との関連が示唆された。さらに、Body mass index (BMI)が低値(BMI<22kg/m2)の群は、中間値(22≦BMI<25kg/m2)や高値(BMI≧25kg/m2)群に比較して、奏効率が低い事が示された(21.7%,56.0%,60.6%,p=0.01)。さらに多変量解析でもBMI低値は独立した効果不良の予測因子であった。この結果を論文報告し国際学会で発表した。1)腋窩リンパ節転移予測モデルの評価試験手術前の臨床病理学的情報から、腋窩リンパ節転移を予測する数理モデルの開発を行った。原発性乳癌のリンパ節転移は術前化学療法などの適応判断に関わる。約150例の学習データ、約140症例の評価データを国内の癌センター・大学病院から得た。モデル構築は、決定木アルゴリズムのAlternating decision tree (ADTree)を用いた。ADTreeはデータ欠損の存在下でも予測可能であるが、過学習の可能性があるためresampling, cross-validationにより過学習抑制を試みた。モデルは、学習データでAUC=0.917,評価データでAUC=0.77と高精度な予測が可能であった。モデル汎用性の検証のため、ソウル大学病院から約170例のデータを得て解析中である。今後、論文発表、web上モデル設置、多施設共同前向き評価試験を計画している。2)術前化学療法効果予測モデルの構築と評価試験術前化学療法開始前の臨床病理学的情報から、病理学的完全奏効(pCR)を予測する数理モデルを開発した。治療開始前の効果予測は適応の適正化に有用である。治療終了時の効果予測は切除範囲設定に関与する。術前化学療法の臨床試験から、学習用に約170例、評価用に約180例のデータを得た。モデルの予測精度は、学習データAUC=0.946,評価データAUC=0.822と高く、更に改良を加え論文報告の予定である。3)術前ホルモン療法の効果予測ホルモン受容体陽性乳癌を対象に術前ホルモン療法が検討中である。術前ホルモン療法の効果予測マーカー探索研究の統計解析に関与した。その結果、年齢、腫瘍径、エストロゲン受容体発現度、増殖マーカー(Ki-67)の治療効果との関連が示唆された。bodymass indexの治療効果との関連も検討し論文報告を進めている。

モデルによる予測確率20%以下をリンパ節転移低リスクと仮定すると偽陰性率は5.3%であった。また、ADTreeモデルはデータ欠損にも耐性を示した。さらに同一データでの精度比較では、既存モデルはADTreeモデルに及ぼなかった。本結果を国際学会にて報告し、現在論文投稿中である。さらに、Web上で予測確率を計算可能なサイトを作成し、多施設共同で前向き評価試験を遂行中である。術前化学療法による病理学的完全奏効(Pathological complete response,pCR)を治療開始前に予測する数理モデルの開発・評価を行った。国内のがんセンター・大学病院より得られた150例のデータを用いて予測モデルを作成し、臨床試験から得た173例のデータにより評価を行った。モデル作成にはADTreeアルゴリズムを用いた。ADTreeモデルは、学習用データでAUC=0.766,評価用データで0.787と高い予測精度を示した。予測確率20%以下をpCRの可能性が低い群と仮定した場合、偽陰性率は7.7%であった。ADTreeモデルはエストロゲン受容体(ER)陽性のluminal type乳癌においてAUC=0.779と高い予測精度を示した。一方、ER陰性HER2陰性のTriple negative乳癌では、AUC=0.531と予測精度改善が必要と考えられた。同一データでの精度比較では、既存モデルはADTreeモデルに及ばなかった。さらに、Web上で予測確率を計算可能なサイトを作成し、多施設共同で前向き評価試験を計画中である。閉経後ER陽性乳癌患者を対象としてアロマターゼ阻害剤(exemestane)による術前療法を行った臨床試験で、臨床的治療効果の予測因子を探索した。その結果、年齢、腫瘍径、ER発現度、増殖マーカー(Ki-67)と治療効果との関連が示唆された。さらに、Body mass index (BMI)が低値(BMI<22kg/m2)の群は、中間値(22≦BMI<25kg/m2)や高値(BMI≧25kg/m2)群に比較して、奏効率が低い事が示された(21.7%,56.0%,60.6%,p=0.01)。さらに多変量解析でもBMI低値は独立した効果不良の予測因子であった。この結果を論文報告し国際学会で発表した。
イネ種子プロテインボディを医療用タンパク質の消化管へのデリバリーに利用する研究

申請者はイネ種子中のプロテインボディ-I(PB-I)に内在性プロラミンが蓄積する仕組みを詳細に解析してきた。本研究は、その仕組みに新技術を追加し、医療用タンパク質をPB-Iの特定領域へ局在化し、人や家畜の腸管へドラッグデリバリーすることで、少量で効果の高い薬品用マイクロ容器を創出する事を目的とする挑戦的な研究である。医療用タンパク質をPB-Iの特定領域へ局在化するためには、プロラミンのプロモーター配列が重要であり、PB-Iの中に安定に蓄積させるためには、ある程度の長さのプロラミンコード配列が必要であることが明らかになった。この結果は、今後の経口ワクチン米の研究開発に大いに役立つと期待される。本研究は、イネ種子に存在するプロテインボディをヒトや家畜の消化管へのドラッグデリバリー用のマイクロ容器として利用を目指す挑戦的な研究である。申請者はイネ種子中に存在するプロテインボディ-I(PB-I)に内在性プロラミンが蓄積する仕組みを詳細に解析してきた。本研究はその仕組みに新しい技術を追加し、医療用タンパク質をPBの特定領域へ局在化し、ヒトや家畜の消化管へドラッグデリバリーすることで、少量で効果の高い薬品用マイクロ容器を創出する事を目的とする研究である。具体的な研究項目は以下の通りである。(1)PB-I輸送に必要なプロラミン配列(プロラミンコード領域)の最小領域を明らかにする。(2)目的タンパク質を消化管内で切り離すリンカー配列を探索する。(3)イネ培養細胞(カルス)中で、有用タンパク質を高蓄積する人工PBを生成する。本年度は(1)について研究を進めた。医療用タンパク質のモデルとしGFPを用い、アミノ酸配列の相同性が高いが、PB-I内部におけるプロラミンの局在性が異なる13-a prolaminと13-b prolaminのコード配列を用いて、GFP融合タンパク質を発現する組換えイネを作出し、種子胚乳内のPB-I中に局在するプロラミンミニマム配列を調査した。その結果、13-a prolaminと13-b prolamin共に開始メチオニンからおよそ80アミノ酸配列までがPB-Iへの局在性に関与することが明らかになった。1)PB-I輸送に必要なプロラミン配列(プロラミンコード領域)の最小領域を明らかにする本年度は1)について研究を進めた。アミノ酸配列の相同性が高いが、PB-I内部におけるプロラミンの局在性が異なる13-a prolaminと13-b prolaminのコード配列を用いて、GFP融合タンパク質を発現する組換えイネを作出し、種子胚乳内のPB-I中に局在するプロラミンミニマム配列を調査したところ、PB-Iへの局在性に関与するアミノ酸配列が明らかになった。本年度は医療用タンパク質のモデルとしGFPを用い、アミノ酸配列の相同性が高いが、PB-I内部におけるプロラミンの局在性が異なる13-a prolaminと13-b prolaminのコード配列を用いて、GFP融合タンパク質を発現する組換えイネを作出し、種子胚乳内のPB-I中に局在するプロラミンミニマム配列を調査した。その結果、13a-1プロラミンでは開始メチオニンから68残基、13b-2プロラミンでは開始メチオニンから82残基までの部分配列が存在すればPB-I内部の中間層または最外周層にそれぞれ局在することを明らかにした。還元剤添加/無添加のサンプルバッファーまたはSDS無添加のサンプルバッファーによる抽出を行い、プロラミン-GFP融合タンパク質のジスルフィド結合形成の有無や疎水性の度合いについて調べた。その結果、プロラミン-GFP融合タンパク質のPB-Iへの蓄積には、部分配列におけるジスルフィド結合の形成よりもむしろ疎水性の性質が重要であることを明らかにした。PB-I輸送に必要なプロラミン配列(プロラミンコード領域)の最小領域を明らかにすることを目的とした。13a-1プロラミンでは開始メチオニンから68残基、13b-2プロラミンでは開始メチオニンから82残基までの部分配列が存在すればPB-I内部の中間層または最外周層にそれぞれ局在することを明らかにした。本年度は、医療用タンパク質のモデルとしGFPを用い、アミノ酸配列の相同性が高いが、PB-I内部におけるプロラミンの局在性が異なる13-a prolaminと13-b prolaminのコード配列を用いて、それぞれのプロモーター配列が逆になるようにデザインした。

即ち、13-a prolaminプロモーター下流に13-b prolaminのコード配列とGFP融合タンパク質を発現する様に、また、13-b prolaminプロモーター下流に13-a prolaminのコード配列とGFP融合タンパク質を発現する様に、それぞれ組換えイネを作出し、種子胚乳内のPB-I中に局在するプロラミンミニマム配列を調査した。その結果、13-a prolaminと13-b prolaminのコード配列に関わらず、13-a prolaminプロモーターを用いると中間層に、13-b prolaminプロモーターを用いると最外周層に融合タンパク質が局在することが明らかになった。3年間の研究結果から、医療用タンパク質をPBの特定領域へ局在化するためには、プロラミンのプロモーター配列が重要であり、PB-Iの中に安定に蓄積させるためにはある程度の長さのプロラミンコード配列が必要であることが明らかになった。申請者はイネ種子中のプロテインボディ-I(PB-I)に内在性プロラミンが蓄積する仕組みを詳細に解析してきた。本研究は、その仕組みに新技術を追加し、医療用タンパク質をPB-Iの特定領域へ局在化し、人や家畜の腸管へドラッグデリバリーすることで、少量で効果の高い薬品用マイクロ容器を創出する事を目的とする挑戦的な研究である。医療用タンパク質をPB-Iの特定領域へ局在化するためには、プロラミンのプロモーター配列が重要であり、PB-Iの中に安定に蓄積させるためには、ある程度の長さのプロラミンコード配列が必要であることが明らかになった。この結果は、今後の経口ワクチン米の研究開発に大いに役立つと期待される。研究項目(1)(3)について以下の様に研究を進める。(1)PB-I輸送に必要なプロラミン配列(プロラミンコード領域)の最小領域を明らかにする。本研究により、最小領域が明らかになったので、実験データを追加し、論文投稿へ進める予定である。(2)目的タンパク質を消化管内で切り離すリンカー配列を探索する。上記で明らかになった最小配列とGFPとの間に入るリンカー配列について検討を進める。(3)イネ培養細胞(カルス)中で、有用タンパク質を高蓄積する人工PBを生成する。最小配列とモデルタンパク質の融合タンパク質を発現する形質転換カルスを作出する予定。次年度の研究費については、交付申請書に記載した計画に従って使用する予定である。目的タンパク質を消化管内で切り離すリンカー配列を探索し、上記で明らかになった最小配列と目的タンパク質との間に入るリンカー配列について検討を進める。また、イネ培養細胞(カルス)中で、有用タンパク質を高蓄積する人工PBを生成する。農学ほぼ計画通りに当該助成金を使用したが、年度末の購入品が間に合わず残額が生じた。翌年度の研究計画に従い、当該助成金と合わせて、翌年度の助成金を使用する予定である。
冬期被災時の命を守る厳冬期対応型避難所に関する研究

我々は厳冬期の避難所について評価・検証・開発を行った。外気温が氷点下15°C前後のとき,体育館内の気温は0°C前後,床面はさらに2°C低く推移した.この環境では多数の低体温症を発症する可能性が示された.開発したシェルターを外気温氷点下17°Cの厳冬期に無暖房で運用した結果,シェルター内は体温のみで加温され,約4°Cで推移した.無暖房であったため,二酸化炭素の上昇はごくわずかであり,社会環境基準を満たす濃度であった.睡眠調査では寒さによる覚醒が40%を超えた.また低温による血圧の顕著な上昇も確認された.適切な暖房方法の開発が急務であるとともに,避難所環境のアセスメントを実施することが災害時に必要である。平成27年度に予定していた研究項目は,1)公共体育館型避難所の現状把握,2)試験用シェルターIの設計,3)公共体育館型避難所の寒冷期環境,4)試験用シェルターIの検証の計4項目である.これらについて以下に概要を記す.1)公共体育館型避難所の現状把握では,小学校等の公共体育館における冬期対策について,停電を想定した暖房対策を実施している自治体はごく少数であり,ポータブル式簡易ストーブのみで氷点下10°Cの環境を暖めることはほぼ不可能で,発災の際に低体温症を防ぐことができる環境の提供は厳しい.これらを踏まえ2)試験用シェルターIの設計では,可能な限り天井高を下げ狭小空間を作りながらも多くの人数を収容可能なシステムを検討した.幕地に関しては,暖気を保持可能なことはもちろんのこと,適度な透過性(可視性),難燃性生地,展開・収納性などを考慮した.3)体育館型避難所の寒冷期環境測定は,平成28年1月に検証した.氷点下16°Cの外気温時に無暖房の所内は氷点下3°Cとなり,100名の人員が出入りするだけでもプラス2°Cとなった.この環境で生活温度を創り出すべく4)試験用シェルターIの実践展開を行った.課題のひとつである「展開」はこれまでの約1/4の時間で完結し,この中を開放型ジェットヒーターで加温することで,平均でプラス8°Cの空間を創り出すことに成功した.大きな成果を得た反面,課題も浮き彫りとなった.一つは二酸化炭素である.広大な体育館の中においても,わずか60kWほどのジェットヒーターによる二酸化炭素貯留は想定をはるかに超えるものとなった.二つめの問題点は温度差である.暖房器近縁の環境と,離れた環境の温度差が激しく就寝場所に格差を生じた.今後進めるシェルターの改良は,暖房機材の展開手法と並行して進める必要がある.体育館を貸し切り,厳冬期の寒冷環境を実証できるフィールドがあることは,本研究を遂行するための絶対条件である.大学の全面的な協力が本研究を順調に進めている.シェルターの開発については,体育館や舞台システムの設計を専門とする業者と協働することで安全への配慮を十分に行った開発を可能にしている.平成28年度に予定していた研究項目は,1)試験用シェルター1の安全性・居住性の検証,2)睡眠計,血圧計を用いた避難所生活・就寝評価,3)シェルター1の改良,4)得られた成果の公表の計4項目である.これらについて以下に概要を記す.1)試験用シェルター1の安全性・居住性の検証ならびに2)睡眠計,血圧計を用いた避難生活・就寝評価では,昨年度試作したシェルター1を2017年1月に仮想避難所として130名を対象に展開した.氷点下22°Cのコンディション下で,暖房のない体育館内の気温は-2°Cを示した.前年度表出した暖房によるCO2濃度上昇に対処するため,暖房を全く使用せずにシェルター1の評価を行った.気温は全域6°C前後で推移したが,段ボールベッドと寝袋の併用で約8割の参加者はある程度就寝できた.シェルターの中で就寝した者とシェルターの外で就寝した者との主観的な就寝状況の違いが示され,閉鎖的空間としてのシェルターの有用性が見いだされた.しかし就寝直前の血圧は平均で10mmHg程度上昇し,起床後もその値を維持したことから,寒冷環境が体にストレスを与える可能性が示唆され,今後の検討課題となった.また参加者の7割は男性であり,平均年齢も45歳であることから,高齢者等を想定するとさらに有効な手立てを考えなければならない.就寝場所の一酸化炭素は検出されず,CO2濃度は昨年度の1/2に抑えられた.3)シェルター1の改良ではさまざまなタイプの公共体育館を踏まえ,後付でも展開可能なウィンチによる展開手法を確立した.支柱のない大型シェルターは重量物であり,安全に展開することが求められる.次年度に進めるシェルター2の実施設計に向けて検討を進める.4)得られた成果の公表では,日本集団災害医学会,避難所・避難生活学会等避難所環境評価に関連する学会で発表した.第32回寒地技術シンポジウムでは寒地技術賞を受賞した.災害対応に当たる国・都道府県・市町村の様々な部署の防災担当者との連携を図ることで,本研究の遂行と検証が実現されている.特に避難所の中で運営側として健康管理を求められる保健師との協働は,避難所で最も注意を必要とする要援護者への配慮を念頭に実証することができている.

昨年度より新たに導入した段ボールベッドは,本研究で開発したシェルターとの相性が良く,外気温がマイナス20°Cまで下がる中,無暖房で展開することを可能とした.また熊本地震の検証により,本研究に活かされる事例が獲得された.災害対策事案は日進月歩でめまぐるしく変化するため,今後も関係機関と綿密に連携を取りながら,より良い環境を創り出す.外気温が氷点下17°C前後で推移した場合に体育館内の気温は氷点下3°C前後となった.厳冬期の東北・北海道の体育館型避難所では暖房がない場合,氷点下一桁の気温を生じることは想定内としなければならない.たとえ15°Cの気温があったとしても,高齢者や小さな子どもでは低体温症を発症する可能性がある.沖縄を除く日本のすべての地域に寒冷期災害対策の推進が急務である.新たに開発されたシェルター2は,既製品の三方幕テントとの組みあわせによって実現され,設営時に専門的な技術者を必要とせず,100名収容の空間をわずか30分で完成させた.すべての素材は防炎性能を有するものであり,安全な空間提供を可能とする.天井高が2200mm確保されているため,居住性は高く,国際人道ガイドラインであるスフィア基準にも合致する.天幕が頑丈な帆布で形成されていることから,天井からの落下物が避難者に直撃することを避けられるとともに,避難者自身が高い天井下で就寝する不安感を和らげるものとなった.さらに絶えず流れ続ける館内の空気から隔絶されるため,体感気温の明らかな上昇が確認された.シェルター内は段ボールベッドを敷き詰めることで床下からの冷気を遮断し,さらに一人ひとりの空間を形成させてプライバシーに配慮する空間とした.外気温が氷点下15°Cを下回る中で,本シェルターシステムを無暖房で運用し,仮想避難者160名による実証試験を行った.シェルター内は参加者の体温のみで加温され,約4°Cで推移した.完全無暖房であったため,二酸化炭素の上昇はごくわずかであり,社会環境基準を満たす濃度であった.睡眠状況調査では寒さによる睡眠覚醒が40%を超えた.また入眠直前の血圧の顕著な上昇も確認された.適切な暖房方法の開発が急務であり,これらとのバランスを考慮しつつ,避難所環境のアセスメントを積極的に実施することが避難者の健康維持に貢献できる.我々は厳冬期の避難所について評価・検証・開発を行った。外気温が氷点下15°C前後のとき,体育館内の気温は0°C前後,床面はさらに2°C低く推移した.この環境では多数の低体温症を発症する可能性が示された.開発したシェルターを外気温氷点下17°Cの厳冬期に無暖房で運用した結果,シェルター内は体温のみで加温され,約4°Cで推移した.無暖房であったため,二酸化炭素の上昇はごくわずかであり,社会環境基準を満たす濃度であった.睡眠調査では寒さによる覚醒が40%を超えた.また低温による血圧の顕著な上昇も確認された.適切な暖房方法の開発が急務であるとともに,避難所環境のアセスメントを実施することが災害時に必要である。当初の計画どおり,開発したシェルターIの検証を進めながら,改良型のシェルターを本年度の厳冬期に展開する準備を進める.当初の研究課題に含めていなかった暖房の設営手法についても,切り離せない要素として取り入れ,安全に最大限配慮した暖房避難所の開発を進める.折しも発災した熊本地震では熊本に在住するたくさんの方々が苦労を強いられている.我々の果たすべき役割は,現状を把握しながら,次に活かすことである.災害が起きるごとにやり直しになるのではなく,これまで経験された事象を積み重ね,研究的視点によって解決策を見出し,次の災害時の困難感を軽減することが責務である.
原始脊椎動物における視床下部-下垂体制御機構の理解とその進化的基盤を探る

ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)の下垂体の次世代シーケンス解析により、GHをコードする遺伝子の全長配列を同定した。推定されるアミノ酸配列は203残基であり、第75位、177位、194位、202位のアミノ酸にシステイン残基が認められ、これらがGH分子の立体構築に寄与していると推察された。また、第109位から122位までのアミノ酸配列から合成ペプチドを作出し、ウサギに免疫し、抗血清を得た。作出した抗血清を用いた免疫組織化学染色により、成熟個体の腺下垂体を構成する細胞隗の周辺部の細胞に免疫陽性反応が認められた。現在、GH遺伝子の発現部位の同定やGH分子の機能解析を進めている。今から約5億年前に誕生した無顎類・ヌタウナギは、現存する最古の脊椎動物である。研究代表者らは、これまで、ヌタウナギ類の下垂体から生殖腺刺激ホルモン(GTH)を世界で初めて単離し、この動物の生殖内分泌現象の一端を明らかにしている。しかし、GTHを除く下垂体ホルモンや、下垂体機能の制御に関わる脳内・視床下部領域における内分泌因子については、未だに知見が乏しく、視床下部-下垂体の機能的な連関についても理解されていない。本研究は、ヌタウナギ類の視床下部-下垂体系を分子レベルで捉え、得られた成果を基盤として、ヌタウナギ類における繁殖、初期発生、成長・代謝制御機構を個体レベルで理解することを目的としている。本年度は、上述した内分泌中枢器官ごとに発現する遺伝子群を網羅的に探索し、ホルモン関連分子の同定を進めた。まず、研究代表者が、連携研究者である東京大学大気海洋研究所の兵藤晋氏と共同研究体制を構築し、次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子探索を進行させるため、ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)の視床下部と下垂体組織を30尾分採取した。各器官における網羅的な大規模シーケンス解析を、Roche社製の機器(GS Junior)を用いた。平均シーケンス長を400塩基対、総リード数約15万の解析を行い、現在、視床下部-下垂体組織での発現遺伝子のプロファイリングを行っている。一方、未成熟個体の下垂体を固定標本とし、組織切片をヤツメウナギやサメ類の成長ホルモン(GH)に対する抗血清を用いた免疫組織化学的染色に供した。その結果、GTHを産生する細胞以外に、GHを産生する細胞が認められた。このことから、ヌタウナギの下垂体には、GTH以外に、少なくとも、GHを産生する細胞が存在する可能性が示唆された。最も原始的な脊椎動物であるヌタウナギ類の下垂体からは生殖腺刺激ホルモン(GTH)が同定されているが、GTHを除く下垂体ホルモンについては、未だに知見が乏しい。本研究では、ヌタウナギ類の下垂体組織における網羅的遺伝子探索を進め、この動物における繁殖、初期発生、成長・代謝制御機構に関連する内分泌因子を同定すること目的として研究を進めた。三崎臨海実験所周辺海域で採集されたヌタウナギ(Eptatretus burgeri)を題材に、下垂体で成長ホルモン(GH)が産生されているかを、前年度より詳細に組織細胞化学的手法で探索した。抗ヤツメウナギGH抗体を用いた免疫組織化学染色により、成熟が進んでいないヌタウナギの腺下垂体細胞の一部に強い免疫陽性反応が認められ、それらの細胞の大部分がGTH産生細胞と一致していた。この事は、ヌタウナギの下垂体にもヤツメウナギのGH分子に構造が似たホルモン分子が存在する可能性を強く示唆している。さらに、上記の成果を受け、ヌタウナギの脳と下垂体で発現する遺伝子群のプロファイルを得るために、新たに未成熟個体20尾から下垂体を採取後、全RNAを抽出し、次世代シーケンス解析を進めた。現在、総数約27万のシーケンスから、約6,200個のcontig配列が得られ、下垂体で発現する遺伝子プロファイルの構築とそのデータベース化を進めている。脊椎動物の多様性の背景には、神経系や内分泌系などの情報伝達系の進化と多様化が関わっている。下垂体は、脊椎動物に特有の内分泌器官であり、個体の生殖、成長、代謝といった生命活動に不可欠な様々のホルモンを産生・分泌している。しかし、最も原始的な脊椎動物とされる無顎類・ヌタウナギの下垂体は、極めて原始的な形態を示し、中枢である脳との連絡系がないことから、長い間、機能的なホルモンは生産されていないとされてきた。しかし、近年、ヌタウナギの下垂体に、生殖活動を制御するホルモン、生殖腺刺激ホルモン(GTH)が同定され、この動物群にも機能的な下垂体ホルモンが産生されていることが示されている。本年度の研究活動においては、神奈川県三崎沖の相模湾より採取したヌタウナギ(Eptatretus burgeri)の下垂体を次世代シーケンス解析に供し、全リード数119,906、平均リード長は411.46塩基対、全contig数は11786、平均contig長は525.45塩基対規模の解析を終えた。得られたcontig配列内に顎口類の成長ホルモン(GH)に相同性を示す配列が得られた。ヌタウナギGH遺伝子の全塩基配列を同定するためにRACE-PCR法を行い、ヌタウナギGHをコードする870塩基対から成る遺伝子配列を世界で初めて単離した。ヌタウナギのGHは203個のアミノ酸から成り、GH分子の立体構造を特徴づける

4個のシステイン残基は全て保存されていた。顎口類のGH分子には共通のコンセンサス配列として24アミノ酸残基が存在するが、ヌタウナギのGH分子内にはこの24残基中、16残基が保存されていた。また、ヌタウナギのGHのアミノ酸配列を他の魚種と比較すると、顎口類とは約27%、同じ無顎類であるウミヤツメとは約30%の相同性を示した。現在、ヌタウナギのGH分子の機能解析を進めている。ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)の下垂体の次世代シーケンス解析により、GHをコードする遺伝子の全長配列を同定した。推定されるアミノ酸配列は203残基であり、第75位、177位、194位、202位のアミノ酸にシステイン残基が認められ、これらがGH分子の立体構築に寄与していると推察された。また、第109位から122位までのアミノ酸配列から合成ペプチドを作出し、ウサギに免疫し、抗血清を得た。作出した抗血清を用いた免疫組織化学染色により、成熟個体の腺下垂体を構成する細胞隗の周辺部の細胞に免疫陽性反応が認められた。現在、GH遺伝子の発現部位の同定やGH分子の機能解析を進めている。次世代シーケンス解析が全RNA抽出ならびに逆転写反応の段階で順調に進まず、今年度まで時間を要してしまった。ようやく大規模なデータの整理とデータベース化が整い、これから機能的ホルモンの探索に入る段階であり、当初の計画より遅れていることは否めない。生物学2014年度に得られたヌタウナギ下垂体の次世代シーケンス解析データ内からGHをコードする遺伝子を見出し、その全長構造を同定する。また、成長段階や成熟段階の異なる個体の下垂体におけるGH遺伝子の発現動態を捉えるとともに、組換え型GHの構築を進めたい。現在、脊椎動物のGHの作用ターゲットである肝臓のインスリン様成長因子(IGF)の遺伝子クローニングをヌタウナギで進めており、最終的に、組換え型GHを肝臓の培養系に供し、IGFの遺伝子発現変動を指標に、ヌタウナギのGHの機能評価へと繋げたい。初年度の実験の最大の目標は、ヌタウナギの視床下部と下垂体、それぞれの器官で発現する遺伝子群を網羅的に解析することであった。次世代シーケンス解析を進められた部分は順調と言えるが、大量のシーケンスを基盤に、その後の遺伝子群のプロファイリングに時間を費やし、予定していた目標を次年度に持ち越すこととなった。しかし、遺伝子解析を進める一方で、下垂体組織の組織学的解析を進め、ヌタウナギの下垂体に成長ホルモン(GH)の存在を示すことができたことは、今後、GH遺伝子の同定を進めるうえで、大きな研究背景・根拠を得たと考えている。今後は、ヌタウナギの下垂体と視床下部組織で発現する遺伝子プロファイルを早急に構築し、有顎類の視床下部で発現する生殖関連ペプチドや成長・代謝関連ペプチド下垂体で産生される成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモンにターゲットを絞り、全長配列のクローニングを行うとともに、それらの内分泌因子の機能や相互的な機能連関を理解したい。例えば、これらの内分泌因子の発現部位をin situ hybridization法や免疫組織化学的な解析手法により明らかにするとともに、未成熟期(成長期)、成熟開始期、配偶子形成期等における発現動態をリアルタイムPCR法を取り入れて定量し、それらのホルモン分子の機能的な側面に迫りたいと考えている。次年度、4月25日から4日間、研究材料の採取と共同研究者との研究打ち合わせのため出張をあらかじめ計画していた。