hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フシコプラジン類生合成に関する網羅的遺伝子解析と効率的物質生産システムの確立

予定していたLocal BLASTによるアノテーションと各遺伝子候補の絞り込みまでは実施できたが、炭素骨格の形成を担う重要なテルペン環化酵素等の機能解析を開始するには至っていない。現在のところケモタイプCから得られたテルペン環化酵素遺伝子断片配列等についてRACE実験を行い、全長配列を確定しているところである。一方、部位特異的導入効率を高めることのできる形質転換ゼニゴケの作出については、作出に必要なプラスミドコンストラクトの作成を前倒しで着手した。ケモタイプCからはテルペン環化酵素遺伝子断片をはじめ幾つかの生合成酵素遺伝子候補が得られたが、ケモタイプAに関しては満足なテルペン環化酵素遺伝子断片が得られなかったことから、精製方法を変えてポリアデニル鎖を持たないmRNAのシーケンスも実施する予定である。また、前年度から引き続き候補酵素遺伝子群の全長配列を決定して行くと共に機能解析を行う。全長配列がすでに得られた候補遺伝子については従来の大腸菌や酵母を用いた機能解析を進めるとともに、部位特異的導入効率を高めることのできる形質転換ゼニゴケの作出とこれを利用したコハネゴケ由来フシコプラジン類生合成酵素遺伝子群の機能解析を行う予定である。次世代シーケンサー付属のサンプル調製機器およびシーケンスデータ取り込みとアセンブルに用いるコンピューターサーバーの相次ぐ故障により、予定していた研究計画からはやや遅れる結果となった。次年度に持ち越して使用する予定の研究費については、候補酵素遺伝子群の全長配列決定及び機能解析とケモタイプAからの新たなサンプル調製に用いる予定である。これらの研究計画を遂行する上で、確立されている方法を用いるため、特段の課題等は想定されないが、計画を遂行するため、次年度に予定していた部位特異的導入効率を高めることのできる形質転換ゼニゴケの作出は前倒しで実施するなどの対策を講じた。
慢性骨髄性白血病に関する遺伝子研究

我々は慢性骨髄性白血病の発症や薬剤感受性を左右すると思われる遺伝子群のSNPs解析を行い、発症に関与する因子の同定および薬剤感受性を予知できるか否かの研究を行った。まずインターフェロン感受性に関連すると思われる遺伝子150ほどを一次候補として選び、この中でJSNP登録してある遺伝子群からプロモーター部位とエクソンに,ミスセンス変異を起こすものを選び出し、最終的に50ほどのSNPsを抽出した。更に正常ボランティア86名からDNAを集めこれをコントロールとした。まず候補遺伝子のSNPs頻度が正常日本人のSNPs頻度と有意差があるどうかを検討した。つまり、CDK2,CEBPE, CylinD1,CYP1A1,CYP1A2,CYP2D6,GSTT2,GSTM1,IL12RB1,IL12B, IRF6,NQO1,ASB1,ASB2,CDKN1,CDKN3,GM-CSF, HDAC3,IFNGR2,JAK1,JAK3,PLCG1,TGF等の遺伝子の複数箇所に認められたSNPsを対象として、それぞれの頻度を正常人とと比較し、慢性骨髄性白血病の発症と関連する遺伝子を検索したが、いずれのSNPsも慢性骨髄性白血病の発症とは有意に関連していなかった。次に、薬剤感受性を左右する可能性として、上記遺伝子群に加え、我々が見つけたIFNRA1とIFNRA2のSNPsと臨床経過(急性転化までの期間)に有意差があるかいなかを検討したが、残念ながら有意差は確認できなかった。一部SNPsは解析症例数が少ない為に有意差が出なかった可能性があり、これらについては引き続き研究を続ける予定である。我々は慢性骨髄性白血病の薬剤感受性、特にインターフェロン感受性を左右する遺伝子群のSNPs解析を行い、薬剤感受性を事前に察知できるかどうかを目的に研究をはじめた。具体的にはインターフェロン感受性に関連すると思われる約150遺伝子ほどを一次候補として選び,これのSNPsがJSNPに登録してあるかを調べ,更にそのSNPsがプロモーター部位にあるか、ミスセンス変異を伴っているかを検討した。こうやって現在までのところおよそ60個所のSNPsについて検出できるようになった。また特にインターフェロンレセプターSNPsについては新規のSNPsを2箇所発見したが、報告準備中に欧米のグループに先を越されてしまった。この新規SNPs2ヶ所を含む合計3箇所のインターフェロンレセプターのSNPsについて慢性骨髄性白血病患者から薬剤感受性研究として承諾をいただいているDNAの内20サンプルについて調べた。その結果,SNPs2箇所はハプロタイプを形成することが分かったが,これらSNPs部位は少なくとも現在までのところ臨床効果との関連性は見られていない。更に我々はJSNPサイトに登録されていない、重要な遺伝子群のプロモーター領域を中心にSNPs検出を試みている。これにはDHPLC法を用いる検出法を採用しているが,このやり方で現在まで新規SNPsを約10箇所発見しており,これらの臨床効果との関連性を今後検討する予定である。また検出可能となった60箇所のSNPsも順次検索し、臨床効果との関連を調査する予定である。更にインターフェロンはいくつかの特異的副作用を惹起することが知られており,これら副作用との関連性も検討する予定である。まずインターフェロン感受性に関連すると思われる遺伝子150ほどを一次候補として選び、JSNPに登録してあるかどうかを調べ、登録してある遺伝子群からプロモーター部位とエクソンにミスセンス変異を起こすものを選び出した。更に正常ボランティアから白血球を集めこれをコントロールとした。

つまり、CDK2,CEBPE, CylinD1, CYP1A1, CYP1A2, CYP2D6, GSTT2, GSTM1, IL12RB1, IL12B, IRF6, NQO1, ASB1, ASB2, CDKN1, CDKN3, GM-CSF, HDAC3, IFNGR2, JAK1, JAK3, PLCG1, TGF等の遺伝子の複数箇所に認められたSNPsを対象として、それぞれの頻度を正常人とと比較し、慢性骨髄性白血病の発症と関連する遺伝子を検索したが、いずれのSNPsも慢性骨髄性白血病の発症とは有意に関連していなかった。次に、薬剤感受性を左右する可能性として、上記遺伝子群に加え、我々が見つけたIFNRA1とIFNRA2のSNPsと臨床経過(急性転化までの期間)に有意差があるかいなかを検討したが、残念ながら有意差は確認できなかった。一部症例は解析症例数が少ない為に有意差が出なかった可能性があり、これらについては引き続き研究を続ける予定である。
光環境制御・計測が可能なマイクロ流体チップによる単一細胞解析システムへの挑戦

今年度は,搬送を1064 nm,加熱を808nm,可視光による蛍光環境計測,と複数の機能を異なる波長の光により可能とする光環境センサを作製し,光環境センサの選択的細胞導入手法の確認に成功した.光環境センサは,直径1 umのポリスチレンビーズに,温度感受性を有する蛍光色素のRhodamine B(蛍光波長580 nm),808 nmの光を選択的に吸収する近赤外吸収剤のFDN-002で導入することで作製した.ポリスチレンビーズの屈折率は1.6と水(屈折率:1.3)より高く,1064 nmのレーザで光ピンセットによる操作が可能である.作製した光環境センサについて電気抵抗ナノパルス式の粒径分析器のqNANOでサイズを計測したところ,平均粒径0.98 um,標準偏差0.1 umの粒径分布が得られた.作製した光環境センサの波長による吸収特性の違いを評価した.厚さ150 umのガラス製マイクロ流路に808 nmおよび1064 nmの赤外吸収剤の濃度を変えた染色液を導入し,各波長の吸収率を評価した.結果は,1 mg/mlの際に808 nm,1064 nmの吸収率はそれぞれ85 %,1 %とレーザ吸収の波長特異性が確認された.また,808 nmレーザ照射時の光環境センサの加熱実験を行った.この光環境センサの温度感度は-1.4 %/°Cである.10 mWでは温度上昇が確認できなかったが,40 mWにおいては,60秒の加熱で約27°Cの温度上昇が確認された.実験環境は37°Cであり,従来研究で得られた細胞導入に必要な60°C以上への加熱が可能であることを確認した.この光環境センサを.1064 nmのレーザで搬送後,808 nmのレーザで約10秒加熱することで,細胞内へ光環境センサ導入に成功した.光環境センサが細胞内に導入されているとともに,導入された細胞の生存が確認され,提案手法の有効性を確認した.異なる波長の赤外光で光環境センサの操作および加熱を選択的に実行でき,可視光の蛍光を用いて環境計測が可能センサの作製と機能動作を確認でき,また本光環境センサを用いて細胞内導入に成功したため,概ね順調に成果がでていると考える.今年度では,搬送,加熱,計測の複数の機能を,異なる波長の光を用いて同一の光環境センサで実現する手法の有効性を確認した.今後はセンサのサイズ分布,1064 nmによる操作特性,808 nmによる加熱の評価を行うとともに,光操作によるセンサの選択的細胞導入ついて,細胞導入時間,導入成功率,細胞生存性等の定量的な評価を行う.今年度は,搬送を1064 nm,加熱を808nm,可視光による蛍光環境計測,と複数の機能を異なる波長の光により可能とする光環境センサを作製し,光環境センサの選択的細胞導入手法の確認に成功した.光環境センサは,直径1 umのポリスチレンビーズに,温度感受性を有する蛍光色素のRhodamine B(蛍光波長580 nm),808 nmの光を選択的に吸収する近赤外吸収剤のFDN-002で導入することで作製した.ポリスチレンビーズの屈折率は1.6と水(屈折率:1.3)より高く,1064 nmのレーザで光ピンセットによる操作が可能である.作製した光環境センサについて電気抵抗ナノパルス式の粒径分析器のqNANOでサイズを計測したところ,平均粒径0.98 um,標準偏差0.1 umの粒径分布が得られた.作製した光環境センサの波長による吸収特性の違いを評価した.厚さ150 umのガラス製マイクロ流路に808 nmおよび1064 nmの赤外吸収剤の濃度を変えた染色液を導入し,各波長の吸収率を評価した.結果は,1 mg/mlの際に808 nm,1064 nmの吸収率はそれぞれ85 %,1 %とレーザ吸収の波長特異性が確認された.また,808 nmレーザ照射時の光環境センサの加熱実験を行った.この光環境センサの温度感度は-1.4 %/°Cである.10 mWでは温度上昇が確認できなかったが,40 mWにおいては,60秒の加熱で約27°Cの温度上昇が確認された.実験環境は37°Cであり,従来研究で得られた細胞導入に必要な60°C以上への加熱が可能であることを確認した.この光環境センサを.1064 nmのレーザで搬送後,808 nmのレーザで約10秒加熱することで,細胞内へ光環境センサ導入に成功した.光環境センサが細胞内に導入されているとともに,導入された細胞の生存が確認され,提案手法の有効性を確認した.異なる波長の赤外光で光環境センサの操作および加熱を選択的に実行でき,可視光の蛍光を用いて環境計測が可能センサの作製と機能動作を確認でき,また本光環境センサを用いて細胞内導入に成功したため,概ね順調に成果がでていると考える.今年度では,搬送,加熱,計測の複数の機能を,異なる波長の光を用いて同一の光環境センサで実現する手法の有効性を確認した.今後はセンサのサイズ分布,1064 nmによる操作特性,808 nmによる加熱の評価を行うとともに,光操作によるセンサの選択的細胞導入ついて,細胞導入時間,導入成功率,細胞生存性等の定量的な評価を行う.
音響を利用した各種シート材料の複数枚誤送検出に関する研究

平成12年度は主に種々の材質のシートの特性インピーダンスを実測し理論解析に導入するための研究を行った。以下に今年度の成果を具体的に記す。(1)布などの多孔性物質の音響特性を正確に得るには実測に頼る他ない。そこで、布などのシート状の多孔質材料の音響特性の実測を行い、データの収集ならびに定性的、定量的な考察を行った。(2)実測値から導出した定数を音響系の理論解析に導入する事で、種々の材質に対するセンサの設計が行えるようなシステムの構築を行った。(3)布枚数の非接触測定に関し、位相を用いた方法において、実験・理論両面で有意な成果が得られたため、日本機械学会論文集へ投槁した(校閲中)。(4)布枚数の非接触測定に関し、振幅を用いた方法について実験を行った結果、従来は本方法で難しかった振幅差を利用した枚数検出が可能であることが明らかとなった。(5)多孔質構造を持つ粒状の食品がポリエチレン等の袋に入った状態における内容初種類の非接触認識において実験ならびに理論解析を行った。(6)粉体に関するデータの収集も行った。上記の成果について日本機械学会において2件の口頭発表を行った。以上から、当該年度の目的は達成された。平成11年度は主に伝達関数の位相差を利用した検出法を確立するための研究を行った。1.紙の他の種々の薄膜材料について枚数と伝達関数の位相の関係から求めた位相差が最大になる最適周波数と各種条件との関係を実験により求めた。2.実用では装置の簡略を図るため、最適周波数の正弦波パルスを発してからマイクがそれを拾うまでのセンサの入出力位相差=時間間隔が枚数により異なることを利用する。各種材料の環境による影響を正確に得るため、センサ内に最適周波数の正弦波を放射し、センサの入出力信号の時間間隔を高分解能で測定した。3.布枚数の非接触測定に関して、実験・理論両面で有意な成果が得られたため、現在日本機械学会論文集へ投稿の準備をしている。また、多孔質構造を持つ食品(小麦粉、米、コーン、大豆)がポリエチレン等の袋に入った状態における内容物種類の非接触認識において理論解析を行った。この成果については日本機械学会において口頭発表を行った。
ペプチドを用いたがん転移を阻害する抗がん剤の創製

抗がん剤治療は、広範囲のがんをその治療範囲とする点において他の方法よりも優れているが、抗がん剤治療によって生じる副作用は看過できない問題である。副作用が起こる主な原因としては、抗がん剤ががん細胞だけでなく正常細胞へも送達されることが挙げられる。さらに、抗がん剤が効きにくいがんに対する抗がん剤治療においては、この非選択性ゆえに抗がん剤の投与量を上げることができず、抗がん剤治療そのものを難しくする例も存在する。そこで本研究では、がん細胞選択的に抗がん剤を送達する方法論の確立・応用を目指している。以下、特許出願の前なので、がんの種類、標的タンパク質、ペプチド配列、cPDCの構造等詳細は示さない。本年度は、あるがん細胞で過剰に発現している膜タンパク質Aに結合する特殊環状ペプチドBを、薬剤と結合させた特殊環状ペプチドー薬剤複合体(cyclic peptide-drug conjugate: cPDC)を作成した。がん細胞の中でcPDCから薬剤が放出されるように、薬剤は適切なリンカーを介してペプチドBと結合させた。現在、作成したcPDCが仮説通り標的細胞選択的に細胞障害活性を示すかどうか評価を行なっている。また、cPDCの標的選択性は特殊環状ペプチド部位に依存すると考えられるため、このペプチドには高い血清安定性が求められる。そこで、ペプチドBの血清安定性を評価したところ、ある程度安定であることがわかった。ペプチドBの血清安定性をさらに向上させるため、ペプチドB配列の中で他のアミノ酸に置換可能なアミノ酸部位を特定した。また、この置換可能アミノ酸が、どのような側鎖を持つアミノ酸への置換が可能であるのかも明らかとした。これらの知見を基に、ペプチドBのアナログを種々合成した。その結果、ペプチドBよりも高い血清安定性を持ち、且つ膜タンパク質Aにも高い結合親和性を持つペプチド配列を見出した。研究実績の概要に記した通り研究が進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。研究実施計画に基づいて研究を進める。
フェムト秒レーザーを用いた時間分解計測による生体光学特性値の推定

フェムト秒レーザーからストリークカメラまでの光学計測系に於いて、複数の反射型減光フイルターを用いたため、不必要な反射光が光路に迷入していることが判明し、光学計測系を構築し直した。しかし、以前と同様の高精度のIRF(FWHMが約3 ps)が得られなくなったため、送受光ともに光ファイバを短くしストリークカメラスリットでの光ファイバの位置変更等を行い、以前と同様のIRFが得られるようになった。大脳の白質を選択的に計測するために、空間分解法計測法の導入も考え、複数のsource-detector (SD) distanceでの計測を可能にする光ファイバホルダーを新に作成した。ラット計測においては、初年度まではイソフルレン麻酔下で自発呼吸のもとに手術・計測を行ってきたが、血圧上昇による止血困難や自発呼吸の不安定性による低酸素血症が生じたため、レスピレーターによる呼吸管理に変更した。ラット用喉頭鏡を用いて気管内にチューブを挿入にして、送気ならびに排気用チューブに接続した。また、保温マットを用いることで指摘体温を維持し、良好な全身状態を保って計測することができた。計測後にラット脳の組織標本を作製し、光ファイバによる脳挫滅は最小限に押さえられていること、また、現在の方法で知覚野の大脳皮質は確実に計測できることを確認した。一方、白質領域は小さく、海馬が隣接しているため、ラット脳で白質を計測するためには、二層モデルに対するlookup tableの作成も必要と思われた。初年度に分担研究者の病欠により研究進行が著しく遅れたが、今年度は精力的に実験を行いある程度キャッチアップした。しかし、計測系に様々な不備が見つかり計測系の再構築を行い、またラットの状態をより良く保つ工夫などに時間を割いたため、全体の進捗状況としては、まだやや遅れている。multi-distance計測法を試みるために、まず、複数のsource-detector(SD)間隔でファントムを計測し、至適SD間隔を求める。これまで、モンテカルロ法でルックアップテーブル(LUT)を作成してきたが、輻射輸送方程式(RTE)の数値解を用いたLUTも作成するために、RTE数値解析法の高速化を図る。空間分解計測法(spatially resolved spectroscopy, SRS)を導入するために、ラテックス粒子と食紅で生体光学特性値に近い値に調整した液体ファントムをsource-detector (SD)間隔1.25 mm. 1.5 mm, 1.75 mmで計測した。その結果、現状の光ファイバの直径とNAを維持したままでは、SD間隔1.75 mmは十分な光量を得ることができないことが明らかになった。また、ラット脳白質が極めて薄いことから、SD間隔を1.25mmのまま2層脳モデルに対するMC法によるlookup table (LUT)作成が必要であると結論した。以前から、光伝播の拡散近似は、受光部の光源からの距離が平均自由行程の10倍ほど(通常10 mm程度)はなれている媒体では成立するが、低い散乱係数や高い吸収係数の媒体では成立しないことが知られているが、本研究で用いている反射型時間分解計測で拡散近似が成立する条件は確定していない。そこで、イントラリポスとインクで調整した液体ファントムを用いて時間分解計測を行い、拡散方程式の解析解から求めたTPSFと実測データを比較することにより、SD間距離と平均自由行程の比ならびに、吸収係数と散乱係数の比から拡散近似成立条件を決めることができた。ラットの計測手技を改良することに時間を要し、研究全体としてはやや遅れているが、最終年度のキャッチアップは可能である。

これまで、モンテカルロ法でルックアップテーブル(LUT)を作成してきたが、輻射輸送方程式(RTE)の数値解を用いたLUTも作成するために、RTE数値解析法の高速化を図る。ラット脳を灰白質(大脳皮質)と白質の二層平板モデルとし、先行研究の時にMC法で作成したLUTを用いてまず灰白質の光学特性値を求め、次に白質の光学特性値を変化させて新規のLUTを作成し、白質の光学特性値を実験的に求める。さらに、RTEによるLUT作成も試みる。
S波偏向異方性を用いた火山前線近傍の上部マントルの不均質構造の研究

火山前線近傍の上部マントルにおいては、沈み込むプレート上面付近で生成されたマグマが上昇し、マントルウェッジ域に不均質構造を形成することが予想される。本研究では、この領域に対してS波の偏向異方性を用い検出し、上昇するマグマの形態を探ることを試みた。火山前線近傍の全体的な領域を明らかにするために、遠地深発地震のS波のコアからの反射波であるScS波の偏向異方性を調べた。ScS波は同一地震を広範囲の観測点で調べることができ、その到達時刻が、P波、S波から離れているため、それらのコーダ波に混じらないため良好な記録が得られた。その解析の結果、火山前線を挟んで海溝側の東側の観測点においては、S波偏向異方性がほとんど観測されなかった。一方、火山前線の西側の観測点では、明瞭なS波偏向異方性が観測され上部マントルに異方性領域が存在し、上部マントルの不均質構造が示唆された。また、地震波速度やQ値のトモグラフィーの結果と比較すると、明瞭なS波偏向異方性が観測された観測点の下のマントルウェッジに低速度域や減衰域が得られ、偏向異方性の解析結果と調和的な結果が得られた。また、ScS波の解析だけでは、異方性領域が沈み込むプレート内部にあるのか、またその上のマントルウェッジにあるのか限定が困難であるため、深発地震の解析もおこなった。その結果、ScS波の偏向異方性が観測された観測点においては、深発地震のS波においても偏向異方性が観測され、その偏向方向はScS波とS波について同様の方向が得られ、マントルウェッジにおいて異方性領域が存在することがわかった。
Research on visualization and information extraction from ancient Mongolian historical documents

本研究では、デジタル化した古代モンゴル文字文書の固有表現の抽出方法を提案した。歴史的文書の分析に必要な時間と手間の軽減を目的とし、個人名や地名の固有表現を、サポートベクタマシンを用い抽出した。抽出した固有名詞やその他情報を用い、伝統的モンゴル文字古文書のデジタル版を作った。抽出された固有名詞、解説や字訳は、TEIガイドラインに基づきエンコードを行った。これを基に、デジタル・ヒューマニティーズ研究用Webベースプロトタイプシステムを開発した。本システムでは、伝統的モンゴル文字の原文テキストやそのラテン文字訳を表示・検索可能であり、更にハイライトされた固有表現や原文のスキャン画像を表示可能である。
常在腸内細菌に対する消化管粘膜防御および共存機構の解明

本研究では腸内細菌叢およびその代謝産物が腸管免疫機構に与える影響を検討した。手術標本から粘膜平滑筋細胞を分離培養し、腸内細菌産物であるLPS(Lipopolysacchalide)とSodium butyrateがによる遺伝子発現の変化を検討した。LPSとButyrateは粘膜平滑筋細胞においてそれぞれ単独の刺激で種々の遺伝子発現を誘導するが、共刺激によりさらに異なる遺伝子発現を誘導した。これらの結果は、腸内細菌叢が消化管細胞にあたえる複雑な影響を示している。無菌マウスを用いた常在腸内細菌叢導入モデルからの粘膜固有層リンパ球(LPMC)分離:無菌マウスに常在腸内細菌叢を導入した際の遺伝子発現の変化を検討するため、まず予備実験として同系統(ICRマウス)の通常マウスからのLPMC分離、RNA回収を行った。1匹のSPFマウス小腸からは、612x10^6個、大腸からは12x10^6個のリンパ球と、それぞれ616μg、0,28μgのRNAを回収することが可能であった。これらの結果から、腸内細菌叢導入前後で約30匹の無菌マウスを購入することとした。ところが、今年度当初には日本クレア社から無菌マウス1匹あたり5900-8500円で購入可能であったものが、年度途中で購入が不可能となり、あらたに注文した場合設備投資等含め約30匹で400万円以上の値段となることが判明した。当研究課題に分配された研究費では現実的に購入不可能であり、従って大幅な研究計画変更を余儀なくされた。腸管粘膜平滑筋細胞の分離と培養:そこで腸内細菌の腸管粘膜に与える影響を検討するため、腸管粘膜に存在する平滑筋細胞細胞に注目した。粘膜中の平滑筋細胞は粘膜の骨格をかたち造るのみならず、腸管免疫・恒常性の維持にも大きな役割を持つと考えられるが、腸内細菌がその機能にどのような影響を与えるかは明らかでない。そこで手術標本から粘膜平滑筋細胞を分離培養し、腸内細菌およびその産物が与える影響を検討することとした。現在までのところ、6例のサンプルから平滑筋細胞を分離し、免疫染色によりα-SMA・desminともに陽性であることを確認した。現在これらの細胞を用いて、腸内細菌由来物質であるLPSやbutyrate, ammonia等が与える変化(遺伝子発現や機能の変化)を検討中である。無菌マウスを用いた常在腸内細菌叢導入モデルからの粘膜固有層リンパ球(LPMC)分離:昨年度から無菌マウス購入が不可能となり、常在腸内細菌叢導入モデルの作成が事実上不可能となった。従って大幅な研究計画変更を余儀なくされた。現在までのところ、6例のサンプルから粘膜平滑筋細胞(M-SMC)を分離し、免疫染色によりα-SMA・desminともに陽性であることを確認した。これらの細胞を用いて、腸内細菌由来物質であるLPSやbutyrate,が与える変化(遺伝子発現や機能の変化)を検討した。LPS単独刺激ではIL-8,CCL2,CXCL1などのケモカイン産生が亢進し、一方butyrate単独刺激ではIL-8産生は亢進、CCL2とCXCL1は高濃度で低下した。しかしButyrateはLPS刺激によるIL-8,CCL1,CXCL2産生を全て抑制した。これらの新たな知見が得られたため、現在論文作成中である。当初無菌マウスに常在腸内細菌叢を定着させる「通常化モデル」を用いて研究を行う予定であったが、無菌マウスの販売が中止され入手不可能となったため、大幅な研究計画の変更を余儀なくされた。そこで臨床検体(大腸)から腸管粘結膜に存在する平滑筋細胞に着目し、腸内細菌由来産物であるLPSやButyrateが腸管結膜平滑筋細胞に与える作用を研究することとした。臨床検体から大腸粘膜平滑筋細胞を分離培養し、LPS単独、Butyrate単独、LPS+butyrate刺激による平滑筋細胞の遺伝子発現の変化をArray法を用いて検討した。LPS単独刺激ではIL-8, CCL2, CXCL1などのサイトカイン遺伝子発現が亢進した。Butyrate単独刺激ではIL-8発現は用量依存性に亢進、CCL2, CXCL1発現は低濃度(0.5mM以下)でやや亢進するが高濃度(1mM以上)では低下することを見いだした。

butyrateとLPSの共刺激を行うと、butyrate低濃度で(0.5mM以下)ではLPS単独刺激と比べていずれのサイトカイン産生もやや亢進するが、高濃度(1mM以上)では低下し、その程度はそれぞれのサイトカインで異なっていた。これらの遺伝子発現の変化は定量的PCR法やELISA法によっても確認された。これらの結果は、腸内細菌によって産生されるbutyrateがその濃度により双極性に腸管免疫反応に作用し粘膜防御・共存機構に働きかけることを示しており、炎症性腸疾患(特に潰瘍性大腸炎)の病態に関与する可能性が考えられる。さらに、LPSとButyrateの共刺激の結果から、腸内細菌は様々な物質を介して腸粘膜を構成する細胞に対して複雑に作用することを示唆しそおり、生体と腸内細菌の共存機構を解明するためにはこれらの複難な相互作用の研究が重要であると考えられる。これらの知見を発表するため、現在論文作成中である。
溶接模擬熱処理を応用した粒界組織制御による応力腐食割れに免疫なステンレス鋼の創成

316L系ステンレス鋼を対象として、溶接模擬熱処理により粒界のみに島状δフェライト相が晶出・分布した、極めて優れた応力腐食割れ(SCC)進展抵抗を有する粒界組織を創成する。加えて、δ相の熱時効に伴う硬化ならびにミクロ組織変化の機構論と速度論を熱時効試験による実測評価ならびに熱力学計算による予測の両面から比較・検討し、熱時効劣化感受性の低い(機械特性・耐食性が維持される)δ相の成分設計指針を確立・実証する。
天竜川流域の生業空間と民俗

<研究目的>天竜川流域の集落およびその周辺における生業を空間的に掘握し、高度経済成長期以前とそれ以後の変容を捉え、天竜州流域の独特の生業空間を記録した。<研究方法>各種文献史資料を用いながら、地域の生業に係わってきた古老への聞き取り調査を中心に生業空間を把握した。調査地の集落の高度経済成長期までの生業および生業空間を把握し、高度成長期を経て、それらがどのように変質していったかを調査した。河川流域の独特の生業空間を把握するため、岩手県釜石市および遠野市内の遠野川流域の調査をし、遠野川流域の自然環境と生業の関係を整理して参考にした。天竜川流域において、中流域の長野県飯田市和田と静岡県浜松市水窪を、下流域では、静岡県磐田市寺谷と静岡県磐田市掛塚を調査地点とした。<研究成果>和田、水窪、寺谷、掛塚の4調査地点で実地調査に入った。各調査地点において、1/25,000の地形図(山間の集落においては1/10,000の地形図も併用)および1/50,000の土地利用図を利用して、自然地形と土地利用、生業の関係を、聞き取り調査を実施し、統計資料を参照しながら、整理していった。水窪地区は、天竜川流域における山間地独特の農業と林業を展開してきた地域で、昭和30年代まで「焼畑造林」が継続して行われていた。高度経済成長期を経て、林業、畑作による生業が企業誘致した製造業に転換してく過程が明らかになり、山間の河川流域における生業変遷を読み取ることができた。また、山間部の水田稲作農耕が今までの行政史では不明であったが、太平洋戦争以前においても河川流域の棚田の開発、経営は盛んであり、その実態を統計、地形図および聞き取りによって記録することができた。林業においても機械化が進む前の段階の林業技術が把握でき、搬出方法も聞き取りによって記録することができた。
肥厚性瘢痕、ケロイドへ継続発展する慢性感染の分子基盤解明

瘢痕形成反応が過剰となる疾患(肥厚性瘢痕、ケロイド等)の病変形成メカニズムを明らかにすることを目的として研究を進めてきた。これら病変の発生メカニズムとしてメカニカルストレスがある。しかし、その病態を摸する動物モデルはなく、病態の基礎的解明も進んでいない。我々は、医学研究に最も広く用いられる実験動物であるマウスを用い、病態モデルの新規作製に努めてきた。創作製場所として腹壁を選んだ。腹壁全体は筋肉で覆われ、腹壁筋肉は恒常的に張力がかかった状態であることから、形成される肉芽にも張力が負荷されると考えた。確かに、腹壁筋層に欠損創を作製すると、独特な肉芽組織が形成され、その形態は張力のかからない場所での肉芽とは全く異なることを見出した。腹壁に形成された肉芽はヒトの瘢痕病変で見られるような結節様に増殖した独特な形態を示した。さらに、治癒組織では膠原線維が大量に蓄積した線維化が亢進した組織の残存も認めた。以上の結果から、生理的環境下での腹部での張力負荷がヒト病変に類似した病変をマウスで発生させ、独特な瘢痕を形成さたと考えた。本モデルは、生理的環境下で瘢痕を発生しうる世界初の動物モデルであり、今後の瘢痕病変形成の病態解明や治療法の開発に貴重な基盤材料となる。さらに、本研究を進めて行く中で、肉芽内に筋肉の再生現象を見出した。筋肉には筋肉の幹細胞が存在し、筋傷害により幹細胞が反応し、筋芽細胞が発生・増殖し、筋菅形成を経て成熟した筋細胞へと分化し、筋再生が行われる。本創傷治癒研究では、肉芽内でこの一連の細胞変化を細胞特異的タンパク発現などにより、細胞分化の推移を知ることが可能となっている。瘢痕形成と筋再生の関係を見ると、過剰な瘢痕形成は筋再生を阻害することを見出し、再生阻害と瘢痕病変の関係が明らかになりつつあることから、本研究は今後の再生医療の展開にも重要な情報を提供できる。本研究3年目(最終年)では、これまで得た研究結果の公的な成果発表を行う予定である。特に、我々が本研究で到達した瘢痕形成動物モデルは、世界的に見ても今までに全く発表されていないことから、今後の瘢痕形成疾患(肥厚性瘢痕、ケロイド)の病態解明や治療法の開発に極めて貴重な方法となるため、この作製法をインパクトの高い海外専門誌に投稿する予定である。さらに、この方法を他の研究者と共有できるようにするため、本動物モデルの作製法や手技の動画を作製し、論文と同時投稿する予定である。また、対外的評価を得るため、国内学会のみならず、国際学会にも出席し、創傷治癒、再生、瘢痕形成を研究課題とする多くの世界の研究者と意見交換し、交流を深め、共同研究できるようにしたい。特に、創部での再生と瘢痕形成の関係は、今後の再生医療において極めて重要な課題となることが予想できることから、今回の研究を基盤として、新たな展開ができるように準備する予定である。本年度は、本研究のまとめの時期として位置づけする。今まで行ってきた研究をまとめ、発表することに主眼を置き、足りない実験がある場合は補充して行く。筋肉幹細胞と再生治癒研究は瘢痕形成を抑制できたコラーゲンジペプチド(Pro-Hyp)を用いた結果と合わせ、学会発表および論文投稿を行う予定である。もしも、本年度中に本研究が終了できなかった場合、本年度採択されたコラーゲンペプチドの研究(基盤研究B:代表;佐藤健司:コラーゲンジペプチドによる間葉系成体幹細胞増殖に関する研究)に包含させ、本研究をさらに進める予定である。瘢痕形成が過剰となる肥厚性瘢痕やケロイドの病態形成メカニズムを明らかにすることを本研究の目的としている。この目的達成のためには、信頼性のある病態モデルの確立が必須であるため、申請書類に記載したように、動物感染モデルの作製に平成28年前半は鋭意努力を重ねた。しかし、創感染は広範囲に壊死を生み、動物死に至るまでの敗血症状態に陥り、結果的に炎症が強く、創部に形成される肉芽の増殖反応を得ることはできなかった。そのため平成28年後半では、全く別のアプローチを試み、よりシンプルだが新規の動物モデルの確立に至った。肥厚性瘢痕やケロイドの病態メカニズムとしてメカニカルストレスが重要であることが知られているものの、信頼性のある病態モデルは未だ確立されていない。創部にかかるメカニカルストレスは創傷治癒に関わる細胞の機能を変化させ、肉芽増殖を起こすとの仮説を立てた。筋肉で覆われたマウス腹壁に創を作製すると、その治癒過程で肉芽形成が刺激されることを見出した。腹壁は皮膚と筋層からなり、皮膚は収縮と再生能が極めて高く、容易に治癒するが、筋層に作製した創は筋肉が有する張力によりメカニカルストレスが負荷され、肉芽形成が亢進することを見出した。更にその組織反応を証明するため、TGF-β経路にあるリン酸化SMAD発現を検証した。張力負荷のない背部に作製した創ではリン酸化SMAD発現は微弱であるものの、腹壁創部の肉芽内ではリン酸化SMAD発現が強発現していた。以上より、メカニカルストレスによる肥厚性瘢痕形成を摸するモデルであると確信した。

現在、コラーゲンの分布密度、筋線維芽細胞、新生血管などからの解析をさらに進めている段階にある。一方、この動物モデルの結果を基に、ヒトの肥厚性瘢痕やケロイド病変のリン酸化SMADを検討した結果、リン酸化SMAD発現が病変形成の線維芽細胞に認め、モデルの正当性を得ている段階である。平成29年度は動物モデルの確立を目指し、研究をスタートしたが、動物モデルの作製に多くの努力と時間を費やしたことで研究の遅れが多少生じている。現在まで、肥厚性瘢痕・ケロイドの満足のゆく動物モデルは確立されていない。このことは、本分野の基礎研究進展の阻害要因となっている。本研究の中心的課題であった感染創モデルの作製の極めて高い困難さに気付かされが、結果として、信頼性の高い腹壁損傷後の自然治癒モデル確立に到達できた。しかし、モデル作製当初は、腹壁創の自傷行為によるほとんどの動物の死亡から始まり、張力を負荷させるためのデバイスの開発など、様々なtry and errorを繰り返したが、満足のゆくモデルには到達できなかった。しかし、最終的に単純だが創部に腹壁自身が有する張力が負荷されるモデルが最良であることに気付くことができた。このことは、今後の研究を進める上で極めて重要な基礎的基盤となると考えられる。当初の研究計画の実験的支柱部分に変更が生じてしまったが、それをリカバーし、さらにそれ以上のモデルに達しえたと考えている。また、その作製過程の試行錯誤から、切創モデルと組織欠損モデルの2種類のモデルを得ているため、創部の質の違いからの検索も可能となっている。これらのモデルは、我々の知る限り世界初の信頼性のある肥厚性瘢痕・ケロイドの動物モデルであることと確信している。しかし、さらに創部に形成される肉芽の質の解析をさらに行わなければならない。この信頼性のある動物モデルにより得られる組織内変化の詳細を明らかにすることにより、ヒト病変の解析のポイントを絞ることが可能となると考えられる。瘢痕形成反応が過剰となる疾患(肥厚性瘢痕、ケロイド等)の病変形成メカニズムを明らかにすることを目的として研究を進めてきた。これら病変の発生メカニズムとしてメカニカルストレスがある。しかし、その病態を摸する動物モデルはなく、病態の基礎的解明も進んでいない。我々は、医学研究に最も広く用いられる実験動物であるマウスを用い、病態モデルの新規作製に努めてきた。創作製場所として腹壁を選んだ。腹壁全体は筋肉で覆われ、腹壁筋肉は恒常的に張力がかかった状態であることから、形成される肉芽にも張力が負荷されると考えた。確かに、腹壁筋層に欠損創を作製すると、独特な肉芽組織が形成され、その形態は張力のかからない場所での肉芽とは全く異なることを見出した。腹壁に形成された肉芽はヒトの瘢痕病変で見られるような結節様に増殖した独特な形態を示した。さらに、治癒組織では膠原線維が大量に蓄積した線維化が亢進した組織の残存も認めた。以上の結果から、生理的環境下での腹部での張力負荷がヒト病変に類似した病変をマウスで発生させ、独特な瘢痕を形成さたと考えた。本モデルは、生理的環境下で瘢痕を発生しうる世界初の動物モデルであり、今後の瘢痕病変形成の病態解明や治療法の開発に貴重な基盤材料となる。さらに、本研究を進めて行く中で、肉芽内に筋肉の再生現象を見出した。筋肉には筋肉の幹細胞が存在し、筋傷害により幹細胞が反応し、筋芽細胞が発生・増殖し、筋菅形成を経て成熟した筋細胞へと分化し、筋再生が行われる。本創傷治癒研究では、肉芽内でこの一連の細胞変化を細胞特異的タンパク発現などにより、細胞分化の推移を知ることが可能となっている。
難治性皮膚疾患に対する特定波長を利用した光線療法<座瘡と白斑の治療>

(1)=瘡に対する青色光を用いた光線力学療法の効果についての研究では顔面および体幹部の=瘡に高輝度狭帯青色光narrow-band blue light (400-430nm)照射機器であるMultuClearTMをよる青色光照射を行い、良好な治療効果を得るためのプロトコールを発表した。(2)XTRAC UltraLaserTMを用いたエキシマレーザーの尋常性白斑に対する治療効果の検討においては50回照射で顔面、四肢体幹では100%に色素出現を認め、特に難治性とされる手足においても70%で色素出現をみとめ非常に有効性が高いことが示された。前実験として行ったヒト3次元培養表皮モデルを利用したnarrow-band UVB、broad-band UVB,エキシマレーザー、エキシマライト照射による表皮角化細胞からのサイトカイン賛成のELISA法による検討ではET-1が紫外線の照射量依存性に多く産生されることが明らかになった。1、〓瘡に対する青色光を用いた光線力学療法の効果についての検討では、高輝度狭帯域青色光照射器であるmulticlear^<TM>(CureLight Ltd.)により10名の難治性〓瘡患者の座瘡を対象とした照射を行い、週12回、24J/cm^2での照射で、平均治療回数12.4回で、約80%の有効率が得られた。罹患部位にのみ光線照射が可能であるという機器特性を有するmulti clear^<TM>による青色光線照射によって、紅斑、水痘などの副作用も一切なく、通常座〓瘡患者に処方される内服薬および外用薬を使用することなく、良好な治療効果が得られたことから、本ブロトコールの有用性が確認された。2、Narrow-band UVB療法および308nmエキシマレーザー照射の尋常性白斑に及ぼす色素再生作用についての検討では、その前実験として、ヒト3次元培養皮膚モデル(LabCyte EPI-MODEL,株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング)を使用した中波長紫外線Broad-band UVBおよび311nmNarrow-band UVB、308nmエギシマランプ、308nmエキシマレーザー照射による表皮角化細胞からのサイトカイン産生測定を、ELISA法を用いて行なった。ヒト培養皮膚に対する紫外線照射の研究は多くあるが、実際の紫外線照射時に大きく関与してくる角質を欠いていることから、今回角質を有し、よりヒトの皮膚に近い構成をとるヒト3次元培養表皮モデルを使用した。その結果、ある種のサイトカインでは紫外線の照射線量依存性に多く産生されていることが明らかになった。1,?瘡に対する青色光を用いた光線力学療法の効果についての検討では,高輝度狭帯域青色光照射器であるmulti clearTM(CureLight Ltd.)により10名の難治性?瘡患者の?瘡を対象とした照射を行い,週12回,24J/cm^2での照射で,平均治療回数12.4回で,約80%の有効率が得られた。罹患部位にのみ光線照射が可能であるという機器特性を有するmulti clearTMによる青色光線照射によって,紅斑,水庖などの副作用も一切なく,通常?瘡患者に処方される内服薬および外用薬を使用することなく,良好な治療効果が得られたことから,本プロトコールの有用性が確認された。2,Narrow-band UVB療法および308nmエキシマレーザー照射の尋常性白斑に及ぼす色素再生作用についての検討では,その前実験として,ヒト3次元培養皮膚モデル(LabCyte EPI-MODEL,株式会社ジャパン・ティッシュ、エンジニアリング)を使用した中波長紫外線Broad-band UVBおよび311 nmNarrow-band UVB,308nmエキシマランプ,308nmエキシマレーザー照射による表皮角化細胞からのサイトカイン産生測定を,ELISA法を用いて行なった。ヒト培養皮膚に対する紫外線照射の研究は多くあるが,実際の紫外線照射時に大きく関与してくる角質を欠いていることから,今回角質を有し,よりヒトの皮膚に近い構成をとるヒト3次元培養表皮モデルを使用した。その結果,ある種のサイトカインでは紫外線の照射線量依存性に多く産生されていることが明らかになった。3,308nmエキシマレーザーを尋常性白斑患者45例に週2回の間隔で最長50回まで照射し,良好な結果が得られた。この臨床結果については2007年10月,2008年4月の皮膚科学会にて報告した。1、〓瘡に対する青色光を用いた光線力学療法の効果についての検討では、高輝度狭帯域青色光照射器であるmulti clear^<TM>(CureLight Ltd。)により10名の難治性〓

瘡患者の〓瘡を対象とした照射を行い、週12回、24J/cm^2での照射で、平均治療回数12.4回で、約80%の有効率が得られた。罹患部位にのみ光線照射が可能であるという機器特性を有するmulti clear^<TM>による青色光線照射によって、紅斑、水疱などの副作用も一切なく、通常〓瘡患者に処方される内服薬および外用薬を使用することなく、良好な治療効果が得られたことから、本プロトコールの有用性が確認された。2、Narrow-bandUVB療法および308nmエキシマレーザー照射の尋常性白斑に及ぼす色素再生作用についての検討では、その前実験として、ヒト3次元培養皮膚モデル(LabCyte EPI-MODEL,株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング)を使用した中波長紫外線Broad-band UVBおよび311nmNarrow-band UVB、308nmエキシマランプ、308nmエキシマレーザー照射による表皮角化細胞からのサイトカイン産生測定を、ELISA法を用いて行なった。ヒト培養皮膚に対する紫外線照射の研究は多くあるが、実際の紫外線照射時に大きく関与してくる角質を欠いていることから、今回角質を有し、よりヒトの皮膚に近い構成をとるヒト3次元培養表皮モデルを使用した。その結果、ある種のサイトカインでは紫外線の照射線量依存性に多く産生されていることが明らかになった。
非晶質傾斜超格子を用いた極低雑音アバランシェ増幅型光導電膜の研究

a-Si:H/a-Si_<1-x>C_x:H傾斜超格子アバランシェフォトダイオード薄膜において、入射したフォトンは、これまでの研究より、電子がこのバンドオフセット領域で,ほぼ100%の確率でインパクトイオン化を起こすことがわかった.本年度は、この傾斜超格子アバランシェフォトダイオード膜の雑音特性を評価した.一般的なアバランシェフォトダイオードでは増倍率が増加するに従い,アバランシェ増倍率の揺らぎに起因する過剰雑音:Fが発生する.根本的にアバランシェ増倍現象は統計的な事象であり,この揺らぎを避けられない.一方,傾斜構造を持つアバランシェフォトダイオードは、バンドオフセットの領域のみでインパクトイオン化を引き起こさせることが可能である.したがってインパクトイオン化の回数は傾斜構造の挿入段数で制御が可能であり,インパクトイオン化の回数の揺らぎはない.このことを明らかにするために,a-Si:H/a-Si_<1-x>C_x:H傾斜構造を持つアバランシェフォトダイオード、および傾斜を持たない通常のa-Si:Hアバランシェフォトダイオードの過剰雑音特性を評価した.その特性を図に示す.これらの過剰雑音は、フォトダイオードに逆バイアスを印加しているときに,波長500nmの単色光を照射し、そのときの光電流をFFT(高速フーリエ変換器)をもちいて測定している.通常のフォトダイオードでは増倍率が増加するにつれ,過剰雑音が増加しているのに対し、傾斜横造を有するフォトダイオードにおいては、過剰雑音係数は1で変化せず,過剰雑音を発生していないことがわかった.a-Si:H/a-Si_<1-x>C_x:H傾斜超格子アバランシェフォトダイオード薄膜において、入射したフォトンは、これまでの研究より、電子がこのバンドオフセット領域で,ほぼ100%の確率でインパクトイオン化を起こすことがわかった.本年度は、この傾斜超格子アバランシェフォトダイオード膜の雑音特性を評価した.一般的なアバランシェフォトダイオードでは増倍率が増加するに従い,アバランシェ増倍率の揺らぎに起因する過剰雑音:Fが発生する.根本的にアバランシェ増倍現象は統計的な事象であり,この揺らぎを避けられない.一方,傾斜構造を持つアバランシェフォトダイオードは、バンドオフセットの領域のみでインパクトイオン化を引き起こさせることが可能である.したがってインパクトイオン化の回数は傾斜構造の挿入段数で制御が可能であり,インパクトイオン化の回数の揺らぎはない.このことを明らかにするために,a-Si:H/a-Si_<1-x>C_x:H傾斜構造を持つアバランシェフォトダイオード、および傾斜を持たない通常のa-Si:Hアバランシェフォトダイオードの過剰雑音特性を評価した.その特性を図に示す.これらの過剰雑音は、フォトダイオードに逆バイアスを印加しているときに,波長500nmの単色光を照射し、そのときの光電流をFFT(高速フーリエ変換器)をもちいて測定している.通常のフォトダイオードでは増倍率が増加するにつれ,過剰雑音が増加しているのに対し、傾斜横造を有するフォトダイオードにおいては、過剰雑音係数は1で変化せず,過剰雑音を発生していないことがわかった.
新規受精調節タンパク質による卵保護膜制御機構の分子解析

受精のプロセスは、卵を取り囲む保護膜と精子との適切な相互作用から始まる。アフリカツメガエル卵保護膜に存在するダイカルシンは、保護膜を構成する糖蛋白質に結合し保護膜ー精子間相互作用を制御し受精を調節する。ダイカルシンおよびその標的となる保護膜糖蛋白質の一部欠失変異体の結合能を解析し、両蛋白質間の相互作用領域を同定した。つぎにダイカルシン作用が過剰な場合(低受精能保護膜)および欠失した場合(高受精能保護膜)において、保護膜フィラメントのレクチン染色像および電子顕微鏡解析における超微細構造が異なることが分かった。以上より、ダイカルシンは卵保護膜の受精能特性を制御し受精を調節することが明らかとなった。平成25年度において、ダイカルシンの卵周囲構造内糖鎖制御を介した受精阻害作用の分子機構を解析することを目的とし、下記の成果を得た。1.ダイカルシンとgp41の相互作用の解明のために、ダイカルシン側に存在するgp41結合領域を解析した。まず、ダイカルシンの一部領域を欠失した変異蛋白質を作製し、変異蛋白質とgp41との結合能を解析したところ、ダイカルシンのN末端側に結合領域が存在することが推定された。結合領域をより狭く絞るために、推定結合領域内において複数の合成ペプチドを作製し、gp41との結合能を解析したところ、2つのアミノ酸領域が最大結合能をもつことが分かった。2つの合成ペプチドがダイカルシンの受精阻害作用に必須領域であるとすると、これらペプチドも同様に受精阻害作用をあわらすと想像できたので、あらかじめ未受精卵と合成ペプチドを反応させた後媒精したところ、合成ペプチドは用量依存的に受精を阻害することが分かった。また、合成ペプチドは、ダイカルシンと同様に、卵保護膜内糖鎖分布パターンを変化させることがわかった。以上より、これらのアミノ酸領域がgp41結合領域であり、ダイカルシンのもつ受精阻害作用の責任領域であることが示唆された。2. gp41側のダイカルシン相互作用領域を同定するために、gp41の一部領域を欠失した変異蛋白質を作製し、変異蛋白質とダイカルシンとの結合能を解析したところ、gp41のZP-Cドメイン内に結合領域が存在することを示唆する結果を得た。3.哺乳類におけるダイカルシンの受精調節作用を検討するため、過剰量のマウスダイカルシンホモローグをあらかじめ未受精卵と反応させた後媒精させ前核形成率により受精率を評価したところ、マウスダイカルシンホモローグが用量依存的に受精を阻害することがわかった。この結果は、ダイカルシンの作用の種を越えた普遍性を示唆する上で重要な知見である。平成26年度において、ダイカルシンの卵周囲構造内糖鎖制御を介した受精阻害作用の分子機構を解析することを目的とし、下記の成果を得た。1.ダイカルシンとgp41の相互作用の解明のために、gp41側に存在するダイカルシン結合領域を解析した。まず、gp41の一部領域を欠失した変異蛋白質を作製し、変異蛋白質とダイカルシンとの結合能を解析したところ、gp41のZP-Cドメイン内に結合領域が存在することが推定された。結合領域をより狭く絞るために、推定結合領域内において複数の合成ペプチドを作製し、ダイカルシンとの結合能を解析し、最大結合能をもつアミノ酸領域を明らかにした。この領域に相当する合成ペプチドを、あらかじめ未受精卵と反応させた後媒精したところ、受精率は増加した。以上より、このアミノ酸領域がgp41側のダイカルシン結合領域であり、gp41を介する作用に必須領域であることが示唆された。2.ダイカルシン側とgp41側双方の相互作用領域に相当する合成ペプチド反応後の卵保護膜フィラメントの微細構造を走査電子顕微鏡により解析した。gp41側の相互作用領域に相当する合成ペプチドを反応させ、受精能を高くしたところ、保護膜表面は「凸凹」した形態をとることが明らかとなった。一方で、ダイカルシン側の相互作用領域に相当した合成ペプチドにより受精能を低くした場合、保護膜表面は「平坦」な形態をとることが明らかとなった。すでに、ダイカルシンの作用により精子先体反応が阻害されることが明らかになっていることから、保護膜フィラメントの3次元構造が先体反応に影響を与えることが示唆された。以上の結果は、保護膜フィラメントの微細構造と受精能が相関することを明らかにした点で重要な知見である。平成27年度において、ダイカルシンの卵周囲構造内糖鎖制御を介した受精阻害作用の分子機構を解析することを目的とし、下記の成果を得た。1.ダイカルシン側とgp41側双方の相互作用領域に相当する合成ペプチド反応後の卵保護膜フィラメントの微細構造を透過型電子顕微鏡により解析した。ダイカルシン側の相互作用領域に相当する合成ペプチドを反応させ、受精能を低くしたところ、保護膜フィラメントは、卵形質膜に平行に配置することが明らかとなった。一方で、gp41側の相互作用領域に相当した合成ペプチドにより受精能を高くした場合、保護膜フィラメントはランダムに錯綜した配置をとることが明らかとなった。この結果は、前年度の走査型電子顕微鏡解析において、低受精能では保護膜表面が「平坦」な形態をとり、高受精能では、「凸凹」した形態をとる結果と整合性があると考えられる。以上の結果は、保護膜フィラメントの微細構造と受精能が相関することが明らかになった点で重要な知見である。