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ホスフィン酸型ジヌクレオチド誘導体を含むsiRNA分子の創製

生体内で安定なsiRNA分子の創製を目的として,3'-突出末端をホスフィン酸型ジヌクレオチド誘導体で置換した新規修飾型siRNA分子を設計し,それらの合成を検討した.二つ合成法についてそれぞれ検討したが,いずれの場合においても目的とするホスフィン酸型ジヌクレオチドユニット(ジヌクレオチド誘導体)を効率良く合成することができなかった.生体内で安定なsiRNA分子の創製を目的として,3'-突出末端をホスフィン酸型ジヌクレオチド誘導体で置換した新規修飾型siRNA分子を設計し,それらの合成を検討した.二つ合成法についてそれぞれ検討したが,いずれの場合においても目的とするホスフィン酸型ジヌクレオチドユニット(ジヌクレオチド誘導体)を効率良く合成することができなかった.細胞内におけるRNA分子の諸機能のうち,RNA干渉は近年最も研究されている転写後遺伝子抑制効果であり,現在では哺乳類細胞へのRNA干渉の適用には,短鎖の二本鎖RNA(siRNA)分子が幅広く利用されている.ところが,天然型siRNA分子は生物学的に不安定であることから,なんらかの化学修飾を施す必要がある.そこで申請者は,RNA干渉効果の発現に深く関与しているタンパク質とsiRNA様短鎖RNA分子とのタンパク質-RNA複合体の結晶構造情報に基づき,siRNA分子の3'突出末端にホスフィン酸型ジヌクレオチドを有するsiRNA分子を設計した.本研究課題は,その修飾型ジヌクレオチドユニットの効率的合成法を確立し,それらをsiRNAに組み込んだ場合の有用性(RNA分解酵素耐性やRNA干渉効果)を明らかとすることを目的とした.ホスフィン酸型ジヌクレオチドユニット(ジヌクレオチド誘導体)の合成にあたり,二つ合成法を考案し,本年度はそれらについて検討した.すなわち,その一つとして,5'位にアルケニル基を有するウリジン誘導体と次亜リン酸ナトリウムとの分子間ラジカル反応を鍵反応とする段階的な合成法について検討した.その結果,目的とするジヌクレオチド誘導体を効率良く合成することができなかった.これは,用いた保護基や反応条件が不適切であったためであると考えられ,今後この点に関して更に検討する必要がある.また,別の合成法として,シリルケタール基を利用した分子内ラジカル環化反応を鍵反応とする合成法についても検討した.すなわち,まず5'位にアルケニル基を有するウリジン誘導体と3'位にエキソメチレン基を有するリボース誘導体との連結反応について検討したところ,望みとするシリルケタール体の生成は確認できなかった.更なる条件検討を行うことで合成できるものと考えられる.細胞内におけるRNA分子の諸機能のうち,RNA干渉は近年最も研究されている転写後遺伝子抑制効果であり,現在では哺乳類細胞へのRNA干渉の適用には,短鎖の二本鎖RNA(siRNA)分子が幅広く利用されている.ところが,天然型siRNA分子は生物学的に不安定であることから,なんらかの化学修飾をを施す必要がある.そこで申請者は,RNA干渉効果の発現に深く関与しているタンパク質とsiRNA様の短鎖RNA分子とのタンパク質-RNA複合体の結晶構造情報に基づき,siRNA分子の3'突出末端にホスフィン酸型ジヌクレオチドを有するsiRNA分子を設計した.本研究課題は,その修飾型ジヌクレオチドユニットの効率的合成法を確立し,それらをsiRNA分子に組み込んだ場合の有用性(RNA分解酵素耐性やRNA干渉効果など)を明らかとすることを目的とした.ホスフィン酸型ジヌクレオチドユニット(以下,ジヌクレオチド誘導体)の合成法を確立するために,官能基選択性が高いラジカル反応に着目し検討を行った.まず,前年度において,次亜リン酸ナトリウムを利用した段階的な合成法について検討したが,目的とするジヌクレオチド誘導体を効率的に合成することができなかった.本年度においても引き続き基質保護基を種々変更して検討したが,本合成法に従いジヌクレオチド誘導体を効率良く合成することは困難であることが明らかとなった.また,二つのアルケニル基をラジカルアクセプターとして,次亜リン酸酸ナトリウムをラジカルドナーとして用いる連続的ラジカル反応についても検討した.本合成法の基質として,二つのアルケニル基をシリルケタールで連結したシリルケタール体の合成を検討したところ,痕跡量ではあるが目的とする化合物の生成を確認することができた.更なる条件の最適化をはかる必要はあるものの,今後は本合成法に基づき検討する予定である.
アナフィラトキシンの制御による腎障害の治療法の開発

本研究において、C5aの末端のアルギニンを切断することでC5aの生理活性を飛躍的に弱めるアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ(CPR)が、抗アナフィラトキシン薬として使用できる可能性について、ラットのアナフィラトキシン依存性疾患モデルを用いて検討を行った。ラットCPRを大量に生成することが困難であるため、新たにクローニングしたラットCPR遺伝子をin vivoにおいて導入し、血中CPR濃度を高めることで研究の目的を達する方法をとった。これらの研究の結果、以下の点が明かになった。(1)生体への遺伝子導入をラットを用いて基礎実験を行った。その結果、尾静脈から逆行性に遺伝子を注入して肝臓に発現させる方法、腎静脈からやはり逆行性に遺伝子を注入して腎間質細胞に発現させる方法、いずれにおいてもそれぞれ肝臓および腎間質に遺伝子が導入された。(2)尿細管における遺伝子発現を抑制するために、アンチセンスODN(oligodeoxyribonucleotide)を静注すると比較的効率的に遺伝子発現がコントロールできることが明らかになった。(3)以上の方法で実際に様々な腎炎惹起性物質(ケモカインや成長因子等)の強発現ないし抑制を行うことで病状に有意な変化をきたすことができることが明らかになった。(4)ラットCPRの場合は、腎臓への遺伝子導入では有為な血中濃度の上昇は見られず、糸球体障害に対しても治療的効果は見られなかった。尾静脈から遺伝子を肝臓に導入する方法を用いた場合には、CPR血中濃度は約24倍に上昇した。以上のように、生体への遺伝子導入は技術的には比較的容易であり、CPRについても肝臓に遺伝子導入をした場合には血中濃度をある程度上昇できることが明らかになった。今後の方向性としては、活性化CPRをベクターに組み込んで同様の実験を行う必要があると考えられた。研究計画に添い、本年度は以下の5つの研究を行った。1.腎障害におけるアナフィラトキシンの関与が明らかな腎障害の実験モデルを作成した。雌ウイスターラットにそれ自体では腎障害を起こさないごく少量のlipopolysaccharide(LPS)と抗糸球体基底膜(GBM)抗体を投与して血栓形成性糸球体腎炎を惹起した。このモデルにおいて血栓形成がアナフィラトキシンとそれにより遊走される好中球依存性であることをC5a受容体拮抗ペプチドおよびシクロフォスファミドを用いて確認した。2.アナフィラトキシンを不活性化するカルボキシペプチダーゼRを活性化する抗血栓物質であるトロンボモデュリンと、活性化を起こさない対照抗血栓物質であるヘパリンを用いて、カルボキシペプチダーゼR(もしくはthrombin activatable fibrinolysis inhibitor、TAFI)によるアナフィラトキシンの不活性化により糸球体障害が軽減されることを確認した。3.マイクロプレートを用いた血中カルボキシペプチダーゼRの簡易測定法を確立した。これはマイクロプレート上でカルボキシペプチダーゼRの基質との反応性を色調の変化で見る系であり、本研究には必須の測定系である。4.ラットカルボキシペプチダーゼR遺伝子をベクターに入れて、細胞レベルの遺伝子トランスフェクションと、in vivoにおけるラット肝臓への遺伝子導入の基礎研究を行い、培養上清およびラット血中でこの酵素活性の上昇を確認した。5.腎灌流による腎臓への直接的な遺伝子導入法も検討し、エリスロポエチンをマーカーにした遺伝子導入の検討では血中濃度が有意に上昇することが確認されたので、カルボキシペプチダーゼR遺伝子を用いて腎臓への遺伝子導入を試みている。C5aの末端のアルギニンを切断することでC5aの生理活性を飛躍的に弱めるアルギニン特異的カルボキシ

ペプチダーゼ(CPR)が、抗アナフィラトキシン薬として使用できる可能性について、ラットのアナフィラトキシン依存性疾患モデルを用いて検討を行った。その研究の結果、以下の点が明かになった。(1)生体への遺伝子導入をラットを用いて基礎実験を行った。その結果、尾静脈から逆行性に遺伝子を注入して肝臓に発現させる方法、腎静脈からやはり逆行性に遺伝子を注入して腎間質細胞に発現させる方法、いずれにおいてもそれぞれ肝臓および腎間質に遺伝子が導入された。(2)尿細管における遺伝子発現を抑制するために、アンチセンスODN(oligodeoxyribonucleotide)を静注すると比較的効率的に遺伝子発現がコントロールできることが明らかになった。(3)以上の方法で実際に様々な腎炎惹起性物質(ケモカインや成長因子等)の強発現ないし抑制を行うことで病状に有意な変化をきたすことができることが明らかになった。(4)ラットCPRの場合は、腎臓への遺伝子導入では有為な血中濃度の上昇は見られず、糸球体障害に対しても治療的効果は見られなかった。尾静脈から遺伝子を肝臓に導入する方法を用いた場合には、CPR血中濃度は約24倍に上昇したが、やはりC5a依存性糸球体障害に対する影響は極めて限られたものであった。その原因としては、ラット(ヒトも含めて)血中にはすでにかなりの量のCPRが存在しているために24倍程度の濃度上昇では十分な効果が得られなかったか、あるいは用いたCPR事態は末端にアルギニンが結合しているpro体であるため、活性が十分に発揮されていない可能性が考えられた。今後の方向性としては、活性化CPRをベクターに組み込んで同様の実験を行う必要があると考えられた。
司法試験短答式問題を対象にした自然言語処理と論理的推論の融合の研究

計画の当初において、手動によってPROLEGにより短答式問題を解けることを確認した。しかし、そこで作った、自然言語文から得られる述語とPROLEGの述語をつなぐ橋渡しルールについては、問題適用範囲が狭く、新しい問題に対応できないことが分かった。そこで、橋渡しルールとは別の手法を検討したが、うまくいかなかったため、自然言語で書かれた短答式問題に対して、述語の質問を行い、その述語の変数に対応する値を答えるという質問応答システムを使うことを考案し、初期的な実験を行った結果、ある程度の値の代入を得られることが分かったが実用性にはまだ検討が必要であることがわかった。短答式問題文から自然言語解析を用いて生成された述語およびPROLEGで用いられる述語と対応関係を手動で作り出し、それにより問題解決ができることを確認した。しかし、その対応関係を機械学習により一般化する手法については、対応関係があまりに多様であって、それらに対して機械学習できるくらいの量の事例を得ることが困難であることが判明した。今年度は、短答式問題の解答をできるだけ多く作るべく、PROLEGによる短答式の問題解法に集中した。また、PROLEGによる知識表現について、自然言語のパーザーからの出力形式に合致するようなRDF的な知識表現への変更について検討し、ある程度の評価を得た。また、判例ベースからのルール抽出についての研究を行った。機会学習からの対応関係ルール生成については、決定版的なものがなく、自然言語処理との連携を深める必要がある。当初の目的であった、機械学習による包摂関係の一般化についてはデータが少なすぎるという問題があるため、断念し、その代替措置として、短答式の自然言語文に対して、東大合格プロジェクトで用いていた質問応答システムを用いて、PROLEG述語の質問に対して、その述語の変数に対応する値を答える方法を使うことを考案し、初期的な実験を行った結果、ある程度の値の代入を得られることが分かったが実用性にはまだ検討が必要であることがわかった。上記で述べたように、当初の予定であった、手動で生成した対応関係の機械学習による一般化については困難であることがわかったため、他の方法を検討する必要がある。別テーマで判例の類似検索の研究を始めており、そこで得た自然言語の知見をこちらのPROLEGの述語と短答式問題を自然言語解析した結果のマッチングに応用したいと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。人工知能基礎以上を踏まえて、自然言語解析の出力からの情報を最大限用いることで、対応関係のヒントとなるような情報を抽出するとともにオントロジーを用いて頑健な対応関係を生成する手法について検討することにした。人件費が増える予測があったため、いったん、基金を追加配分したが、追加配分分は全部使われなかったため。当初の予定より40万円ほど、繰り上げて使っているので、今年は、研究補助員の雇用人数を減らして、研究を遂行する。
自殺企図歴がある外来患者を対象とした包括的自殺再企図予防プログラムの開発

本研究は、介入研究までを視野に入れた研究計画が平成27年4月に「基盤C(課題番号15K11822)」で採択されたため、研究期間を延長する。平成26年度は、先行研究のレビューおよび実際の調査に向けて準備を進めてきた。具体的には、自殺企図歴がある患者に関わっている外来看護師や自殺企図歴がある患者・家族を対象としたインタビュー調査を計画していたが、協力施設との調整に時間を費やしたため、調査を完了できなかった。研究期間が4年に延びたが、早急にインタビュー調査の完了に向けて取り組む。26年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒト、マウスモデルを用いた空置腸炎に対する自家糞便移植の病態改善機序解明

今後、大腸癌や炎症性腸疾患の増加に伴い、空置腸炎の増加も予想され対策は急務である。我々は、空置腸管の腸内細菌叢を解析し、空置腸炎に対する新しい治療法として自家糞便移植の有用性を報告した(Tominaga K, et al.Gut.2018)。しかし、未だメカニズムが解明されていない空置腸炎に対しては標準的な治療法は定まっていない。本研究では臨床的なデータを更に集積すると共に、腸内細菌叢の変化や腸管粘膜の制御性T細胞やIgA抗体などの免疫学的な研究を行うことを目的とする。空置腸炎の腸内細菌、免疫機構を通した病態メカニズム解明を行い最終的には自家糞便移植の有用性を明らかにしていきたいと考えている。
サビタイジングの機能局在の同定と競技能力との関連性について

持続的な広い注意集中と瞬間的に的確な情報処理を求められるアイスホッケーのゴールキーパーを対象に、subitizingの特徴について機能局在と競技能力との関連性について、誘発脳波を中心に検討すると共に発生源の推定を行った。実験の結果、ゴールキーパーは他のプレーヤと同様に刺激個数の関数として反応時間は増加するものの、正確な判断をなす傾向が示された。誘発脳波では、頭頂部から後頭部かけて顕著なN1成分が見出され、刺激個数の少ない方にP3成分が顕著な傾向が見出され、sLORETA解析の結果この領域に発生源の存在を認めた。スポーツの競技場面においては、合目的的な行動遂行のために瞬時の情報処理能力が求められ、この能力の優劣が勝敗に大きく影響する。本研究では、サビタイジングsubitizingに焦点をあて、状況判断能力の生理学的根拠となる眼球運動と背景脳波やP300、CNVを主とした事象関連脳電位から、定位反応や意識下での注意能力との関連性を明らかにすることにより、スポーツ競技特性とサビタイジングとの関連性を明らかにすると共に、主に関与する機能局在の同定と競技能力との関連性について瞬間情報処理についての方略を明らかにする。そのことにより、バイオフィードバックへの応用とそれを用いたメンタルトレーニング技法の実証科学的基礎となる根拠をさぐるとともに、ADHDの処方など他分野への応用可能性についても検討することを目的とした。今年度は、文献収集を行うと共に次の3点から実験を行った。1.サビタイジング(瞬間的識別できる個数4個程度)機能についてスポーツ場面への応用として、スポーツ場面(ラクロス選手)での状況判断能力を今次作成したスポーツ版TAT図版で競技能力との関連性を試みた。2.動的視野における反応時間との関連性を見るために、アキュ・ビジョンを用い出力(動作)系との饗応動作の検討を行った。さらに3.バイオフィードバック技法を用い、生体信号の認知と主観的な対応関係を基にメンタルトレーニングへの応用を試みた。これについてはバイオフィードバック研究第41巻1号(2014年)27ー36頁に掲載された。優れた競技パフォーマンスを達成するためには、高次の状況判断能力や瞬時の合目的的な情報処理能力が不可欠であり、この能力の優劣が勝敗に大きく影響する。本研究では、視覚情報処理能力としてサビタイジングsubitizingに焦点をあて、眼球運動と脳波の解析を主に、定位反応や意識下での注意能力との関連性を明らかにすることにより、サビタイジングの機能局在の同定と競技能力との関連性について瞬間情報処理についての方略を明らかにすると共に、情報抽出のための覚醒水準をセルフ・コントロールするためのメンタルトレーニング技法の実証科学的基礎となる根拠をさぐるとともに、情報処理様式の特性からADHD等の処方など他分野への応用可能性についても検討する。前年度の結果に基づき、1スポーツの実際場面(バレーボール)をシュミレートした刺激条件を設定し、特に競争場面における情報処理に影響を及ぼす自律神経機能(ECG)と実行機能との関連性を見た結果、特性不安の高さが瞬時情報処理に影響を与えることを明らかにした。2同様に競争事態における情報抽出に及ぼす主観的な要因(競争心の高低)の違いとパフォーマンスと関連についてEEGの成分特徴から明らかにした(バイオフィードバック研究,42巻)。32ヶ月にわたるメンタルトレーニングへの応用としてポジティブ・セルフトークの効果についてEEGの特徴から明らかにした(SEME,2014)。高い競技パフォーマンスを達成する上で重要な要因となっている状況判断といったワーキングメモリーにおいて、身体的、情動的、認知的要因からの注意メカニズムのもととなるサビタイジングsubitizing(瞬間的な状況判断対象識別数)の基礎的な実験と、それらに大きな影響を与える心理的プレッシャーとパフォーマンスとの関係、ストレス・コーピング(対処法)のための呼吸、皮膚温、心拍を用いたバイオフィードバック・トレーニングに関する応用的な実験を行った。主要な結果としては以下の通りである。1.アイスホッケーにおける具体的な課題を用い、EEGの同定を行い、パフォーマンスとの関連について検討を行った。そこでは、刺激提示構成要素数と反応時間、N2pc、N1、機能局在的な成分としてはCDA成分の関連性を見出し、47th Applied Psychophysiology and Biofeedback in Seattle, USAで発表した。2.心理的プレッシャーに対するコーピングとして比較的長期間にわたり、実際の競技場面におけるバイオフィードバック技法を用いた定量的研究の実証性を高めたメンタルトレーニングとして非接触型の測定機器の導入についての信頼性と妥当性を競技パフォーマンスの側面から検証した。3.感情状態が状況判断という認知行動に及ぼす影響について、焦りといった不快感情が誘発脳波の後期CNVとP300といった成分の増大をもたらし、行動の準備と結果に対する注意を高める(第23回感情心理学会)。4.最終年度の研究成果のまとめとして、「サビタイジングの機能局在の同定と競技能力の関連性について」42頁からなる報告書の作成を行った。

多様な競技場面にできるだけ近づけた実験として、提示刺激の作成とそれらの刺激提示時をトリガーとしたEEGの解析に時間を要しており、特に多様な解析法の習熟が、得られたデータの処理を今後促進できるものと思われる。サビタイジングに影響を及ぼす要因の分析が必要とされる。体育心理学サビタイジングに影響を及ぼす主体側の要因として、対象へのモチベーションや自我関与をコントロールすることにより、応用的側面(バイオフィードバック、メンタルトレーニング)への展開を図る。これらの成果をPerceptual and Motor Skillsに投稿する。タキストスコープ(瞬間刺激提示装置)を用い、状況認知、判断時の背景脳波と事象関連脳電位を測定・分析し、注意のメカニズムのTonic的側面の検証、Phasic的側面の解明と、競技能力・運動パフォーマンスとの関連について検討することをについて、特に脳波の解析ソフト(ダイポール法による脳波の解析)についての習熟度が不十分な為、脳波についてはマッピング段階で解析を終えてはいるが、現段階で基礎的な実験を終えることができたこと、以前の研究を引き継いではいるが25年度の成果を交え、学会誌に掲載されたことからの評価である。大きくは2つあげられる。1実験室状況から出て、多様な競技場面に発生する心理的要因に可能な限り近づけた実験を試みており、限られた少数の被験者であったこと。2EEGの多様な解析法の習熟に時間を要した。残された脳波の解析ソフトの習熟とともに前年度の結果に基づき、セルフ・コントロールの可能性についてEEGバイオフィードバック技法による注意力のコントロール・トレーニングを実施する。フィードバックモダリティー、フィードバック信号、至適トレーニング期間等の方略について検討し、注意力トレーニングの公式化を図る。その成果をバイオフィードバック研究やスポーツ心理学研究に投稿するとともにPerceptual and Motor Skillsへの投稿を図る。スポーツにおける多様な競技場面にできるだけ近づけた実験として、作成した提示刺激並びに、これまでの解析法の習熟により、多くの被験者を用い、より実験を推進する。また、今年度はサビタイジングに影響を及ぼす要因の分析結果をまとめる(報告書冊子の作成)のに使用したい。申請者が購入機器(解析ソフトを含む)の習熟に時間を要し人件費を使う必要がなかったこと、サビタイジング用刺激図形の作成に時間を要したことから現有の機器による実験を行ったことにより、未使用額が発生した。上記理由による状況は改善し、4月からは実験開始を行っており、最新の解析法によるサビタイジングの中枢機能局在に関する同定が可能となり、今年度は申請時の計画通りに進めることができる。
レーザー誘導反応による燃焼化学反応の制御

反応場にレーザー光等の外的因子を入射することで、場の反応平衡を変化させ化学反応を誘導し制御する、新しい工学的手法の開発を行うための基礎的検討を行うことを目的としている。本手法の対象は、反応経路がほぼ明らかにされており、しかもその生成量が微量でありながら工業分野でその抑制対策が重要な燃焼場における窒素酸化物の生成反応を対象とし、本誘導反応手法を用いるその生成抑制効果について実験的および理論的に検討を進めている。平成9年度は、次に示す本手法の理論的考察を実施した。(1)燃焼シミュレーションコードを用い、メタン-空気燃焼におけるNO_Xの生成経路の反応速度パラメータ(頻度因子,活性化エネルギー)を変化させることにより,NO_X低減のために関与が大きな化学種および反応経路を推定した。(2)メタン-空気の燃焼反応に関与する化学種の振動エネルギー,振動-回転エネルギー,および結合エネルギーの計算を行い、(1)で推定した化学種との共鳴周波数領域を推定した。(3)メタン-空気燃焼場にレーザー光を導入し、レーザー光の波長(周波数),光強度とNO生成量との相関を検討するための実験系を整備し実験を実施したが、顕著な反応改善にはつながらず、実験系の光学系配置を改良し再度検討することが必要であるものと考えられた。(1)燃焼シミュレーションコードを用い、N_xの生成経路の反応速度パラメータ(頻度因子、活性化エネルギー)を変化させることにより、NO_x低減のために関与が大きな化学種を推定した。(2)アセチレン-空気の燃焼反応に関与する化学種の振動エネルギー、振動-回転エネルギー、および結合エネルギーの計算を行い、(1)で推定した化学種との共鳴周波数領域を推定した。(3)アセチレン-空気燃焼場にレーザー光を導入し、レーザー光の波長(周波数)、光強度とNO_x生成量との相関を検討するための実験系を整備する。
4次元声道モデルに基づいた鼻咽腔閉鎖機能診断、治療システムの開発

鼻咽腔閉鎖不全により生じる開鼻声を治療するために、音響的、空気力学的手法を応用した開鼻声の定量的評価システムを臨床に応用している。しかし手術法の選択や発音補助装置の製作をする際には、さらに鼻咽腔閉鎖運動も考慮する必要がある。研究代表者らによる先行研究によって、健常者の口蓋帆挙筋と上咽頭収縮筋を中心とする鼻咽腔閉鎖運動は3次元的に明らかになった(岩崎、片岡ら四次元MRIによる発音時の鼻咽腔閉鎖運動の観察-鼻咽腔閉鎖パターンと口蓋帆挙筋の動きとの関連の検討2006)。この運動の違いは主に口蓋帆挙筋の位置と走行の違いによることが明らかになった。このデータを基に口腔粘膜に類似した素材を用いて鼻咽腔閉鎖ロボット(3次元声道実態モデル)を製作し、このモデルで音声を合成を始めた(荒井,片岡ら軟らかい素材による軟口蓋を伴う声道の物理模型信学技法2008-103).このモデルで鼻咽腔開存部の形態、大きさ、声源などが音声に及ぼす影響を検討している。開鼻声や鼻咽腔閉鎖不全の程度の診断が難しい症例を臨床的に診断し、それらの症例のファイバースコープ所見、音声の音響学的・聴覚的特徴を把握した上で、鼻咽腔閉鎖ロボットにより音声産生過程(鼻咽腔閉鎖運動)、音声の音響学的・聴覚的特徴の関連を明らかにする。【目的】同期サンプリング法(Synchronized Sampling Method, SSM)を応用した高速シネMRIを用いて健常成人の鼻咽腔閉鎖運動を再構築し3次元動画像を得る。健常者の鼻咽腔閉鎖運動を4次元的に把握し、4次元声道モデルを構築する。【方法】対象は健常成人12名(男性5名、女性7名)である。MRI装置は島津-マルコーニMAGNEX ECLIPSE 1.5TPower Drive250を使用した。被験者はMRI装置内で仰臥位となり、外部トリガーの信号に合わせて128回検査音を繰り返し発話した。検査音は、音節/impee/とした。4D-MRIでの鼻咽腔閉鎖運動の観察、特に軟口蓋、咽頭側壁、咽頭後壁の動態を舌運動、口唇閉鎖などと関連付けて計測した。【考察】安静時の鼻咽腔形態を把握すると、閉鎖パターンが予測でき、その情報は補綴的発音補助装置の作成に役立つと考えられた。また、得られた情報を鼻咽腔閉鎖不全の評価に応用できる可能性が示唆された。【目的】同期サンプリング法(SyRchronized CutiiNliiis Method,SSM)を応用した高速シネ厭1を用いて健常成人の鼻咽腔閉鎖運動を再構築し3次元動画像を得る。

MRI装置は島津-マルコーニMAGNEXECLIPSE 1.5TPower Drive250を使用した。被験者はMRI装置内で仰臥位となり、外部トリガーの信号に合わせて128回検査音を繰り返し発話した。検査音は、音節/impee/とした。4D-MRIでの鼻咽腔閉鎖運動の観察、特に軟口蓋、咽頭側壁、咽頭後壁の動態を舌運動、口唇閉鎖などと関連付けて計測した。【考察】これらの計測データを基に、声道モデルの作成を開始した。その詳細は音響学会誌に論文発表した。健常者8名(男性4名と女性4名)の[impee]発音時の4次元MRI撮像を行った。MRIの撮像法はSynchronized Sampling Method (SSM)法を用いた。得られた三次元画像を時間軸状に配列して四次元データとした。四次元データから/i/、/m/、/p/発音時のフレームを特定し抽出した。健常者の[impee]発音時の声道の3次元動画像を得て、口唇、舌、下顎および鼻咽腔の動態と音声波形を同期して観察することが可能であった。鼻咽腔閉鎖運動について、Croftらによる鼻咽腔閉鎖パターンに基づいて分類したところ、CoronalパターンCircularパターン、Circular with Passavant ridgeパターンを認めた。軟口蓋、鼻咽腔開存部および口蓋帆挙筋(LVP筋)の安静時及び母音/i/と子音/p/発音時の位置と形状を、正中矢状断面と水平断面で観察した。その結果、安静時にLVP筋は楕円形状をしており、その長軸は前後方向を向いていたが、軟口蓋が最大挙上すると鼻咽腔開存部に向かって回転した(タイプA)。また軟口蓋の中等度の挙上ではLVP筋の長軸は近心に平行移動した(タイプB)。発音時の軟口蓋の運動が顕著なCoronal patternの被験者のLVP筋の運動はタイプAを示し、Circularタイプの被験者は子音/p/ではタイプA、母音/i/ではタイプBを示した。上咽頭収縮筋は健常者においては、Circular with Passavant ridgepatternの被験者のみパサバント隆起の形成に伴う顕著な運動が認められた。これらの結果に基づき、ゲル素材の軟口蓋、咽頭壁を持ち、軟口蓋の挙上とともに、咽頭側壁、後壁の運動ができる声道模型を開発し、上記の4つの鼻咽腔閉鎖パターンを実現した。鼻咽腔の形状の変化に伴い産生される開鼻声の音響学的変化を検討した。いずれの鼻咽腔閉鎖パターンにおいても鼻咽腔開存面積が増大すると第1,2フォルマント間のレベルが上昇し、開鼻声が顕著になる事が確認された。
Tollファミリー分子による病原体認識機構の解明とそれを応用した癌免疫療法の開発

グラム陰性菌の膜成分リポ多糖(LPS)を免疫細胞が認識する機構についての解析を進めた。LPSはToll-like Receptor4(TLR4)と我々が発見したTLR4会合分子MD-2による複合体TLR4/MD-2によって認識されることを我々は昨年報告した。本年はTLR4/MD-2のプロトタイプであり、我々が発見したRP105/MD-1複合体のLPS認識における役割をノックアウトマウスを用いて検討した。RP105ノックアウトマウスのB細胞は問題なく産生され、分化し、B細胞レセプター、CD40を介するシグナルには異常は認められなかったが、LPS刺激による増殖反応と抗体産生反応において低応答性を示した。低応答性のメカニズムを細胞株を用いて検討したところ、TLR4/MD-2とRPl05/MD-1が、B細胞におけるLPS認識において機能的に協力していることが明らかになった。TLR4は単独ではLPSを認識できず、MD-2が会合したTLR4/MD-2複合体になって初めてLPSを認識できる。MDタンパクはLPS認識に重要な役割を果たしている。このMDタンパクの機能解析を進め、以下の成果を得た。1.MDタンパクの役割を明らかにするために、昨年度のRP105ノックアウトマウスに続いてMD-1ノックアウトマウスを作成し、その解析を行った。またその解析のためにマウスMD-1に対するモノクローナル抗体も作製した。RPl05欠損B細胞はLPS低応答性を示すが、MD-1欠損B細胞も同様なLPS低応答性を示した。そこで、MD-1欠損B細胞の細胞表面でのRP105、MD-1の発現を調べてみると、MD1ばかりでなく、RP105の発現も検出できなかった。すなわち、MD-1がRPl05の細胞表面への発現に必須の分子である事が明らかになった。2.MD-2の機能解析としてlipid A誘導体を用いた実験を行った。Lipid IVaはLipid Aの誘導体であり、マウスにはアゴニストとして、ヒトにはアンタゴニストとして作用する。この種特異的な薬理作用がTLR4によって規定されるのか、MD-2によって規定されるのか検討するためにマウスTLR4/ヒトMD-2のキメラ複合体を発現する細胞株を確立し、LipidIVaに対する応答性を検討したところ、ヒトと同様にLipidIVaは拮抗剤として作用した。MD-1がRP105の発現に必須であることをノックアウトマウスを用いて示した。MD-2においても同様である可能性があり、MDタンパクはTLRの発現に重要な役割を果たしている可能性がある。さらにMDタンパクはTLR4によるLPS認識に必須の分子であることをLipid IVaを用いて示した。LipidIVaの結果はTLR4によるLPS認識の微妙な特異性がMD-2によって影響されることを示しており、TLR4のエンドトキシン認識にMD-2が直接関わっていることを示唆している。これらの結果は癌免疫療法のために免疫賦活剤を開発するうえで、TLRばかりでなくMDタンパクも標的分子となりうることを示唆している。

MD-1がRP105の発現に必須であることをノックアウトマウスを用いて示した。MD-2においても同様である可能性があり、MDタンパクはTLRの発現に重要な役割を果たしている可能性がある。さらにMDタンパクはTLR4によるLPS認識に必須の分子であることをLipid IVaを用いて示した。LipidIVaの結果はTLR4によるLPS認識の微妙な特異性がMD-2によって影響されることを示しており、TLR4のエンドトキシン認識にMD-2が直接関わっていることを示唆している。これらの結果は癌免疫療法のために免疫賦活剤を開発するうえで、TLRばかりでなくMDタンパクも標的分子となりうることを示唆している。
アンジオテンシンIIAT2受容体を介した腎機能調節作用の検討

1.目的平成9年度はAT2受容体刺激を介するアンジオテンシンII(AII)の、心機能および腎機能におよぼす役割を検討するために、イヌにAT2受容体選択的アゴニスト(Phe-amino-)angiotensinIIを投与し、平均動脈圧、心拍数、腎血流量および心拍出量に与える影響を検討した。その結果、(^6Phe-amino-)angiotensinII10ng/kg/minの投与により、投与前と比較して平均動脈圧、心拍数および心拍出量は有意に変化しなかったが、腎血流量は有意に増加したことから、AT2受容体刺激を介した腎血管拡張作用の存在が示唆された。今年度はうっ血性心不全において、AT2受容体刺激が心・腎血行動態におよぼす効果を検討した。2.方法(1)雑種成犬に高頻度右室ぺーシングを約4週間行い、うっ血性心不全の状態に導入した。3.結果心不全犬に対する(^6Phe-amino-)angiotensinII10ng/kg/minの投与は、心拍出量、腎血流量に有意な変化を与えなかった。また、カプトプリル、ロサルタンの投与は一過性の心拍出量、腎血流量の増加をもたらしたが、CGP42112A投与では有意な変化はなかった。4.考察うっ血性心不全において、AT1受容体刺激を阻害する薬物が有意に腎血流量を増加させたのに対し、AT2受容体選択的アゴニストとAT2受容体拮抗薬投与では変化しなかったことより、うっ血性心不全における腎血流量調節に果たすAT2刺激の役割は少ないと考えられた。1.目的レニン-アンジオテンシン系は最も重要な昇圧系の一つであり、AIIのほとんどすべての生理作用はAT1受容体が担っているものと理解されている。一方、AT2受容体を介したAIIの生理的役割についても様々な研究かなされ、AT2刺激がAT1を介した作用に対して何らかのmodulatorとして働いているものと想定されているが、未だ十分な解明がなされていない。そこで、本年度はAT2受容体刺激を介するAIIの心機能および腎機能におよぼす役割を検討するために、イヌに無麻酔無拘束の状態で、AT2受容体選択的アゴニスト(Phe-amino-)angiotensinIIを投与し、平均動脈圧、心拍数、腎血流量および心拍出量に与える影響を検討した。2.方法(1)雑種成犬6匹の内腸骨動脈にカテーテルを挿入留置し、上行大動脈起始部と右腎動脈に電磁血流プローブを装着した。なお、動脈圧は圧トランスデューサーを用いて、心拍出量および腎動脈血流量は電磁血流計を用いてそれぞれ測定し、それらのデータはAnalog-digital converter(Mac Lab II)で処理し、Macintosh computerで解析した。(2)上記の実験犬に対し、(Phe-amino-)angiotensinII10ng/kg/minを投与し、平均動脈圧、心拍数、腎血流量および心拍出量に与える影響を観察した。3.結果4.考察生理状態において、アンジオテンシンIIはAT2受容体刺激を介して直接腎血管を拡張させていることが示唆された。
生体関連金属錯体を触媒とする二酸化炭素の不斉固定化

光学活性な生体関連金属錯体として、骨格に7つの不斉炭素を有する天然のビタミンB12誘導体を基本骨格として用い、有機溶媒に対する溶解性を向上させるためアルキルエステル基を導入した疎水性ビタミンB12錯体を合成し、電子スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、質量分析スペクトル、電子スピン共鳴スペクトルおよび元素分析で同定した。この錯体は各種有機溶媒に対して高い溶解性を示し、均一系触媒として優れた性質が期待できた。また半経験的分子軌道計算により不斉アルキル錯体の安定性を見積ったところ、S体が安定に生成する結果が得られた。そこでこの錯体を電解触媒として二酸化炭素存在下、2-ブロモエチルベンゼンの不斉電解反応をDMF溶媒中-1.4V vs. Ag/AgCl行ったところ、2-カルボキシエチルベンゼンが得られた。そこでこの生成物をカラムクロマトグラフ法により単離し、その光学純度をキラルHPLCにて見積もったところ、計算結果に反してほとんどラセミ体であった。そこでさらに側鎖に不斉アミノ酸を化学修飾したビタミンB12錯体を合成し、その不斉転写効率を改善することを試みた。しかし不斉反応はほとんど進行しなかった。これはアルキル錯体への二酸化炭素の挿入が、コバルト-炭素結合のホモリシス開裂後、起こっているために錯体からの不斉転写が抑制されたためと考えらる。光学活性な生体関連金属錯体として、骨格に7つの不斉炭素を有する天然のビタミンB12誘導体を基本骨格として用い、様々な側鎖置換基を有する疎水性ビタミンB12錯体を合成した。いずれも高収率で合成することが出来、電子スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、質量分析スペクトル、電子スピン共鳴スペクトルおよび元素分析で同定した。またこの錯体の酸化還元挙動をサイクリックボルタンメトリー法により検討したところ、窒素雰囲気下、N, N-ジメチルホルムアミド中で、Co(II)/Co(I)の酸化還元電位が-0.7V vs. Ag/AgClに観測され、有機電解触媒として使用できることが明らかとなった。また基質としてラセミ体の2-ブロモエチルベンゼンを加えたところ、新たにコバルト一炭素結合を有するアルキル錯体の1電子還元波に由来する不可逆波が観測され、基質であるハロゲン化アルキルが、アルキル錯体を経由して活性化されることが明らかとなった。さらに二酸化炭素を通気しながら測定すると、触媒電流の増加がみとめられた。すなわちこれらの現象は、電気化学的に活性化された疎水性ビタミンB12錯体のCo(I)種が、求核的に基質である2-ブロモエチルベンゼンと反応してアルキル錯体を与え、その開裂によって生じたカルバニオンが二酸化炭素と反応していることを示唆している。
マイクロRNAによる癌微小環境の制御・維持機構の解明

本研究では、癌の進展を有利に導く癌微小環境の各側面(血管新生、免疫制御など)に関与するマイクロRNA(miRNA)の異常を同定し、それらのmiRNA群による癌微小環境の制御・維持機構を明らかとすることを目的とする。まず、造血器悪性腫瘍において、特徴的な染色体異常に起因する癌遺伝子の異常を伴う悪性リンパ腫に注目し、これらの腫瘍細胞で発現異常が認められるmiRNAの同定、および、その発現異常のメカニズム解析を行った。この結果、悪性リンパ腫において高発現を示すmiRNA-Xを同定し、miRNA-Xがこの癌遺伝子的異常、およびその下流の細胞内シグナル伝達経路の活性化に伴って誘導されることが明らかとなった。また、レンチウイルスを用いて特定のmiRNAの機能を阻害するシステムを樹立した。次に、このシステムとin silicoにおけるmiRNAの標的予測を組み合わせて詳細な検討を行った結果、miRNA-Xが様々な癌抑制因子を標的とすること、さらにリンパ腫細胞においてヘルハーT細胞サブセット特異的な転写因子を調節することで、リンパ腫細胞の免疫表現型を制御していることが明らかとなった。これらの結果は、悪性リンパ腫の臨床サンプルにおけるDNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析の結果ともよく合致することをin silico解析により検討し確認した。現所沢、このmiRNA-Xが腫瘍細胞の免疫表現型に与える影響の、in vivoの腫瘍形成における意義(血管新生の促進など)、および、その修飾による治療応以下への可能性を検討している。
新しい横隔膜ペーサーの開発

横隔膜ペーシングに伴う横隔膜疲労における筋疲労の有無につき実験的検討を加えた。雑種成犬24頭を用い、右頚部横隔神経を白金電極を用いて電気刺激し、ペーシングした。刺激条件は、パルス幅200μsec、周波数25Hz、パルス列持続時間1.2秒とした。呼吸回数を1分間38回(1群)、25回(2群)、12回(3群)とし、経横隔膜圧(Pdi)が初期の60%以下になった時点を横隔膜疲労とし、経時的に一回換気量(VT)、筋電位(Edi)、伝導時間(CT)、電極間電流(E)の時間的経過を観察した。また疲労後、アミノフイリン10mg/kgを投与し、その後の変化を45分間観察した。10頭では疲労後、刺激の極性を陽波から陰波へ転換し、Pdi,Ediの変化を観察した。疲労に達する時間は、1群(70分)、2群(149群)、3群(371分)と、3群間に有意(P<0.05)差があった。VT、Ediも疲労時有意に低下したが、CT,Eには変化がなかった。アミノフイリン投与によりPdiは3群とも有意に増加した。一方、Ediは有意の変化を示さなかった。非疲労時にアミノフイリンを投与した6頭ではPdi,Ediともに有意の変化はなかった。以上よりアミノフイリンは筋自体に作用し、疲労時にのみ効果が発現した。また疲労時にアミノフイリンの効果が有意であったことから、ペーシングに伴う疲労の一因として筋自体の疲労が明かとなった。横隔ペーシングを臨床使用するにあたり、生体からの神経パルス、炭酸ガス値から刺激装置の刺激頻度を制御するハードウェアの開発は目下検討中である。
凸多面体を巡る組合せ数学の代数的諸相についての国際研究集会の企画調査

現在研究代表者らは国際研究集会「凸多面体を巡る組合せ数学の代数的諸相」を平成16年7月に札幌で開催する準備を進めているが,根幹となる研究領域を(1)グレブナー基底と組合せ数学(2)凸多面体の三角形分割と整数計画(3)外積代数とalgebraicshifting(4)単項式イデアルの極小自由分解(5)斉次整域の正則度と重複度,とする原案が有力である.当該企画調査では,当該分野の昨今の研究動向などに関する周到な調査を遂行し,上記項目を研究集会の研究領域の根幹とすることの妥当性を吟味するため,Oberwolfach型の中規模国内準備会議を2回開催した.すなわち,「グレブナー基底の理論的有効性と実践的有効性」(責任者:大杉英史/於:京都大学/平成14年7月)と「ジェネリックイニシャルイデアルの研究」(責任者:寺井直樹/於:大阪大学/平成14年12月)である.前者においては凸多面体の三角形分割と整数計画問題,符号理論と暗号理論などにおけるグレブナー基底の果たす役割について多角的に研究した.後者においては多項式環と外積代数のジェネリックイニシャルイデアルの相互関係を可換代数と組合せ論の両面から具象的に探究した.その他,平成14年6月にイタリアで開催された研究集会「可換代数の昨今の潮流」に研究代表者と研究分担者の一部が参加し,当該分野の研究の進展状況を把握した.当該企画調査の結論として,上記の根幹となる研究領域はすべて妥当であると判断され,個々の研究領域において当該国際研究集会に相応しい話題を選別する作業を推進した.現在研究代表者らは国際研究集会「凸多面体を巡る組合せ数学の代数的諸相」を平成16年7月に札幌で開催する準備を進めているが,根幹となる研究領域を(1)グレブナー基底と組合せ数学(2)凸多面体の三角形分割と整数計画(3)外積代数とalgebraicshifting(4)単項式イデアルの極小自由分解(5)斉次整域の正則度と重複度,とする原案が有力である.当該企画調査では,当該分野の昨今の研究動向などに関する周到な調査を遂行し,上記項目を研究集会の研究領域の根幹とすることの妥当性を吟味するため,Oberwolfach型の中規模国内準備会議を2回開催した.すなわち,「グレブナー基底の理論的有効性と実践的有効性」(責任者:大杉英史/於:京都大学/平成14年7月)と「ジェネリックイニシャルイデアルの研究」(責任者:寺井直樹/於:大阪大学/平成14年12月)である.前者においては凸多面体の三角形分割と整数計画問題,符号理論と暗号理論などにおけるグレブナー基底の果たす役割について多角的に研究した.後者においては多項式環と外積代数のジェネリックイニシャルイデアルの相互関係を可換代数と組合せ論の両面から具象的に探究した.その他,平成14年6月にイタリアで開催された研究集会「可換代数の昨今の潮流」に研究代表者と研究分担者の一部が参加し,当該分野の研究の進展状況を把握した.当該企画調査の結論として,上記の根幹となる研究領域はすべて妥当であると判断され,個々の研究領域において当該国際研究集会に相応しい話題を選別する作業を推進した.
脳の記憶メカニズムに基づいた生体分子メモリシステムの実用化

脳の記憶メカニズムに基づいたCaMKII分子メモリの工学的な実用化を目指し、生化学実験、細胞生物学実験、コンピュータシミュレーションによる検討を行った。特に、CaMKII分子メモリを光により読み書き可能にすることを目指し、CaMKII-FRETの昆虫細胞発現系の構築、HeLa細胞における分子活性の光による制御について検討し、CaMKII分子メモリは工学的に応用可能であることを確認した。また、現実の脳のスパインにおけるメモリ関連分子の局在を明らかにするために、形態を詳細に再現したスパインにおける関連分子の反応拡散シミュレーションを行った。まず、研究実施場所として、当初想定していた東京大学大学院・理学系研究科・生物科学専攻・黒田真也研究室が遠方であったため、京都大学大学院・医学研究科・青木一洋特定准教授に、青木研究室にて本研究課題の推進に必要な実験を行わせていただくことをお願いし、ご承諾いただいた。現在、同研究室にて実験を行っている。平成26年度は、本研究課題以外の、研究者代表者自身を雇用している研究課題(脳科学研究戦略推進プログラム「脳プロ」)を推進することを優先させたため、本課題の進展は若干遅れた。それでも、第一に生体分子メモリ(CaMKII-FRET)の読み出しのために必要な蛍光顕微鏡の扱いに習熟し、CaMKII-FRETと同様のFRETプローブであるEpac1-campsにより観測の条件検討を行った。第二に、CaMKII-FRETの光刺激方法であるCaged-Ca2+の選定と適切なCa2+解放のための条件検討を行った。第三に、(1) AddgeneよりCaMKII-FRET(Camui-CR)のcDNAを入手し、(2) cDNAより野生型(WT)に加えてT286A, T305A, T286AT305A,3つの点変異Insertを作成し、(3) InsertをpFastBac1ベクターへ導入してバクミドを作成し、(4)バクミドをSf21細胞へTransfectionし、(5) WT, T286A, T305A, T286AT305A CaMKII-FRETのバキュロウイルス産生とタンパク発現の確認を行った。今後、各種CaMKII-FRETをSf21細胞内にて大量生産し、生産したCaMKII-FRETを精製して光刺激実験に供する予定である。平成27年度は、本研究課題以外の研究者を雇用している研究課題(「脳科学研究戦略推進プログラム[脳プロ]」)を推進することを優先させざるを得ず、本課題の進展は大変遅れた。ただし、昨年度より、野生型(WT)に加えてT286A, T305A, T286AT305A,3つの点変異を作成し、cDNAをpFastBac1ベクターへ導入し、pFastBac1ベクターより作成したバクミドをSf21細胞にTransfectionしてバキュロウイルスの作成を行った。さらに、WT, T286A, T305A, T286AT305Aの4つのCaMKII-FRETタンパク質をSf21細胞内にて大量に生産中である。さらに、光学系の検討・習熟のため、京都大学大学院・医学研究科・松田ー青木研究室にて、蛍光顕微鏡および共焦点蛍光顕微鏡の使用方法を習った。また、精製CaMKIIにおける再構成実験に加えて、HeLa細胞などの培養細胞をドメインとしてCa2+刺激に対するCaMKII-FRET活性のNMDA受容体依存的な局在を定量的に観測する可能性を検討している。そのために、HeLa細胞内において、EGTA-Ca, NPEC-DAなどのケージド化合物を用いて細胞内局所へCa2+刺激を行うための条件検討を行っている。さらに、CaMKII同様のFRETを示すEpac-campsのFRET活性を用いて細胞内局所活性の観測の条件検討を行っている。研究実施者が代表者一人のみであるため、研究の推進に必要な時間を確保することが極めて困難になっている。本研究科課題と、異なるが相補的な関係にある「脳プロ」の研究推進と同調させることにより、効果的に本研究課題を推進させる予定である。平成28年度は、本研究課題以外の研究者を雇用している研究課題「革新的技術による脳機能ネットワークの全容解明プロジェクト(革新脳)」、および「記憶構造を解明する新しい光操作・画像法の開発(CREST;研究代表者,河西春郎)」を推進することを優先させざるを得ず、本課題の進展は大変に遅れた。ただし、本年度は引き続きCaMKII-FRETと同様にFRETを示すEpac-campsを用いてHeLa細胞における細胞内局所活性の観測および解析を行うと共に、ケージド化合物EGTA-Caにより局所Ca2+刺激を行うための条件検討を行った。さらにCaMKII-FRETの時空間動態を定量解析するために必要な反応拡散シミュレーションに必要な環境を整えた。特に、沖縄科学技術大学院大学のEric De Schutterらにより開発されたSTEPSと呼ばれるシミュレータに着目した。STEPSは、二次元平面中において観測されるCaMKIIの反応拡散を効果的にシミュレーションすることができる。さらにデンドライトやスパインなどニューロンの解剖学的な形状を考慮したときにCaMKIIがどのように反応拡散するかをシミュレーションすることができる。そこで、研究協力者より電子顕微鏡写真に基づいたスパインーデンドライトの三次元形状データを入手し、形状データをSTEPSに取り込むことを試みた。その結果、改善の余地は残るものの、STEPSへの取り込みに成功し、動作を確認した。

本研究科課題と、異なるが相補的な関係にある「革新脳」と「CREST」の研究推進と同調させることにより、効果的に本研究課題を推進させる予定である。まず、研究において必要な実験の実施場所として、共同研究者(京都大学大学院・医学研究科)の研究室にて本研究課題の実験を行わせて頂いていた。しかし、共同研究者の転出により、当初予定していた実験の実施が不可能になった。そこで、平成30年度は方針を変更して、コンピュータシミュレーションにより、生体メモリ分子CaMKIIの空間方向へのメモリ機能について調べた。我々の過年度の実験ではCaMKIIは隣接CaMKII分子と相互作用しなかった。この場合、CaMKII分子メモリの空間解像度は(理論的に)CaMKII分子一つとなる。しかし、近年の別の研究によりCaMKIIは状況により隣接分子と相互作用することが明らかとなりつつある(Bhattacharyya eLife 2016 Mar 7;5:e13405)。そこで、CaMKII分子メモリ同士が相互作用を持ちつつ二次元平面内を拡散するときの分子メモリの空間解像度をシミュレーションにより調べた。その結果、ある程度、空間解像度は低くなるものの、反応拡散メカニズムによりメモリは安定して存在できることが明らかとなった。さらに、現実の脳のスパインと同じ形状のドメインにおけるCaMKII分子メモリの振る舞いについてシミュレーションにより調べた。脳では、NMDA受容体が活性化してスパインへCa2+流入が生じ、Calmodulin (CaM)と結合してスパインのCaMKIIが活性化することで記憶が生じる。シミュレーションでは、CaMKII活性(分子メモリ)は活性化スパインに局在するものの、分子メモリを消去する要素であるCalcineurin (CaN)の活性はスパイン形態に依存して非活性化スパインへ広がりうることが明らかとなった。脳の記憶メカニズムに基づいたCaMKII分子メモリの工学的な実用化を目指し、生化学実験、細胞生物学実験、コンピュータシミュレーションによる検討を行った。特に、CaMKII分子メモリを光により読み書き可能にすることを目指し、CaMKII-FRETの昆虫細胞発現系の構築、HeLa細胞における分子活性の光による制御について検討し、CaMKII分子メモリは工学的に応用可能であることを確認した。また、現実の脳のスパインにおけるメモリ関連分子の局在を明らかにするために、形態を詳細に再現したスパインにおける関連分子の反応拡散シミュレーションを行った。生体分子メモリの実用化を目指した本研究課題は極めて順調に進んでおり、現在のところ本質的な困難には直面していない。問題は、研究実施者が研究代表者一人のみであるため、研究の推進に必要な時間を確保することが困難なことである。それでも、本研究科課題と、異なるが相補的な関係にある「脳プロ」の研究推進と同調させることにより、効果的に本研究課題を推進させる予定である。次年度使用額が生じた理由は、本課題の進展そのものが大変に遅れていることが理由である。