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クリプトスポリジウムオーシストの培養細胞への感染と迅速検出システムの開発研究

Cryptosporidiumはオーシストと呼ばれる殻に包まれた状態で存在するため、塩素消毒による不活性化が困難とされている。消毒の効果を評価するための検査技術においては、Cryptosporidiumの生死を判別するだけではなく、感染性の有無を評価することが重要となってくる。そこで、培養細胞にCryptosporidiumを感染させ、細胞内で増殖したオーシストをELISA検出し、感染性を定量評価する方法を検討した。また、スポロゾイトについてもELISA検出して、オーシストの脱嚢能を評価した。その方法を用いて紫外線処理したCryptosporidiumの不活性化を検査した。まず、10^210^4個の範囲でオーシストを植種した時の、細胞表面に接着したスポロゾイトをFixed cell-ELISA法を用いて検出した。生きたオーシストを植種したときには植種濃度依存的な吸光度の変化がみられたが、熱処理によって死滅したオーシストでは、吸光度の増加はみられなかった。また、後培養で増殖したオーシストをLivingcell-ELISA法を用いて検出した。これより、Living cell-ELISA法によって感染能を有したオーシストの数を反映した検出結果を得られると考えられた。紫外線を照射したオーシストについて、Fixed cell-ELISAで検出したスポロゾイトの生残率は低下しなかったが、Living cell-ELISAで検出したオーシストの生残率は紫外線照射量に応じて低下した。これより、紫外線処理したCryptosporidiumは脱嚢できるが、宿主細胞内で増殖できないことが示唆された。Cryptosporidium等の原虫類による水道水を介した水系感染の発生が大きな社会問題となっている。Cryptosporidiumはoocystと呼ばれる胞子状の殻に包まれた形態で環境中に存在しており、ヒトをはじめ多くの哺乳類の腸管粘膜上皮細胞の微絨毛内に寄生して増殖する。感染が水道水を介して発生する場合があること、水中のoocystの不活化の程度を定量評価する手法が必要不可欠であると考え、oocystの感染力に着目した。そこで感染力を保持したoocystを培養細胞に感染させるというin vitroでの定量方法について検討した。本研究においては、マイクロプレートを使用し、ヒト小腸由来の培養細胞にCryptosporidium parvumを感染させた後に、48時間培養し、細胞内で増殖したCryptosporidiumをELISAという吸光度を計測する方法で検出し、細胞に感染させて増殖したoocystを定量評価した。Cryptosporidium parvumのoocystは、in vitroでHCT-8細胞に感染させることができた。細胞内で増殖したCryptosporidiumをELISA検出することができた。それは少なくとも10030,000個のCryptosporidium parvum oocystを定量検出できたコラーゲンコートのマイクロプレートがHCT-8細胞の培養に最も適していた。一次処理溶液の濃度が0.6倍以上の場合、oocyst数に依存した用量作用曲線が得られた。以上の結果より、細胞培養という簡便な方法での、感染作用における評価系の開発の目処が1年目の研究で有するに至った。消毒の効果を評価するためめ検査技術においては、Cryptosporidiumの生死を判別するだけではなく、感染性の有無を評価することが重要となってくる。

その方法を用いて紫外線処理したCryptosporidiumの不活性化を検査した。まず、10^210^4個の範囲でオーシストを植種した時の、細胞表面に接着したスポロゾイトをFixed cell-ELISA法を用いて検出した。生きたオーシストを植種したときには植種濃度依存的な吸光度の変化がみられたが、熱処理によって死滅したオーシストでは、吸光度の増加はみられなかった。また、後培養で増殖したオーシストをLivingcell-ELISA法を用いて検出した。これよりLivingcell-ELISA法によって感染能を有したオーシストの数を反映した検出結果を得られると考えられた。紫外線を照射したオーシストについて、Fixed cell-ELISAで検出したスポロゾイトの生残率は低下しなかったが、Living cell-ELISAで検出したオーシストの生残率は紫外線照射量に応じて低下した。これより、紫外線処理したCryptosporidiummは脱嚢できるが、宿主細胞内で増殖できないことが示唆された。
中世和歌の研究―百首歌としての『千五百番歌合』を始発点として―

『千五百番歌合』は総勢30人がそれぞれ100首ずつ詠んだ和歌を歌合につがえた、和歌史上空前絶後の規模の歌合である。藤原定家など当時を代表する歌人から、後進の若手まで幅広い歌人が集結した本作は、歌人研究、歌壇研究に大きく貢献するものである。『新古今和歌集』同様後鳥羽院の下命のもとに成立した作品であり、『新古今和歌集』の成立に与えた影響も大きい。しかしながら、本作はその巨大さゆえにいまだ研究が十分には進んでいない。そこで本研究では、『千五百番歌合』を個々の歌人の作品(百首歌)の集合体と捉え、その全体像と多様性を明かすことを目標に、30人の作品を横断的に検討する計画を立てた。さらに歌合としての検討と百首歌としての検討、両面からの考察を行うことで、この複雑な作品の全体像を図式化せずに捉えることを目指した。『千五百番歌合』は一般の歌合とは異なり、十人の判者が300首ずつ分担して勝負・優劣の判定を行っている。そのためか、形式上実に多様な性質の判詞を備える歌合として知られているが、今年度はそれぞれの判者の狙いを文体、表現のありかたから考えた。百首歌として検討する際には、春・夏・秋・冬・祝・恋・雑の構造にまず着目する必要がある。前年度に恋・雑部の検討を中心に据えた検討を行った結果、『千五百番歌合』に特徴的な、多量かつ特異な古典作品の摂取がみられることを見出した。本年度はこれに基づき『千五百番歌合』の古典摂取、そしてそれを大きな撰集資料とする『新古今和歌集』の古典摂取のあり方に、下命者後鳥羽院がおよぼした影響について考察した。歌人単位の検討を行う中では、後鳥羽院時代に大きな影響力を持った権門歌人、源通親を特にとりあげ、その古典摂取のあり方について検討するとともに、彼の歌を論じる判者顕昭の批評の表現についても論じた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。勅撰集『新古今和歌集』の重要な撰集資料となった作品でもあり、『新古今和歌集』の成立に与えた影響も大きい。『千五百番歌合』は春・夏・秋・冬・祝・恋・雑の部立に分かれている。本年度は、まず恋・雑部の検討を中心に据え、歌人間の比較により見出すことのできる個々の特色と、作品全体の特色を抽出することに務めた。特に、藤原公継・公経という比較的若い歌人に、藤原定家ら時代を牽引した歌人にみられる特色とはまた異なる特色があることを指摘し、当時の歌壇の厚みと多様性を考察した。また、恋部において多数の歌人にみられる特色から、下命者後鳥羽院の狙いを検討した。前者は『東京大学国文学論集』13号に論文化して発表済みであり、後者は『国語と国文学』誌に掲載予定である。また本年度は、『千五百番歌合』のそれぞれの歌を丁寧に読み解く注釈的な作業を第一とした。『千五百番歌合』はいまだ注釈が公刊されていない作品である。本作は総勢3000首にのぼる上、参加者の中には年少の、他に大きな作品を残していない歌人も含まれている。一首一首の読解を積み上げていくことは、本作の研究を進める上で不可欠の土台となる。本年度はまず3000首一通りの簡単な注釈を試みた。以後、繰り返し検討を深め、より精密な注釈を目指す予定である。『千五百番歌合』恋部・雑部の検討により、歌人単位ではなく部立を単位として検討する試みは、当初の目算通り、有効な手法であることが確認できた。当初の計画では他の部立を先に扱う予定だったが、より慎重な検討を期すために先に恋部を扱った。検討の順序は入れ替えわったが、むしろそのために研究をより前に進めることができた。恋部の考察により、『千五百番歌合』全体にわたる特色を抽出し、それと『新古今和歌集』との関係について今後検討を深める材料を得られたことは大きな収穫である。また、『千五百番歌合』注釈作業も、今後の検討の土台となるのは言うまでもなく、現在考察を深めるためにも非常に重要な作業となった。ただし、3000首にものぼる大部の作品であるため、注釈の精度はまだ低い。世に問うことのできるほどの注釈を完成させるためには、相応の年月が必要になる見込みである。また、実際に検討を進める中で、やはり歌人を単位とした研究も並行して必要となってくることが明らかになった。本年度はその中でも公継、公経の両者を扱ったが、この二人についてもまだ検討すべき課題は残っている。

今後は個々の歌人についての論究と、作品全体を論じる考察の双方をかわるがわる行い、相乗的に深めていく必要がある。元々の研究課題では、『千五百番歌合』を百首歌として扱う検討と、歌合として扱う検討を並行して行う予定だった。しかし、実際に検討を始めると、大部の作品であり論点を豊富に持つため、百首歌として検討すべき課題が非常に多いことに気付かされた。本年度は歌合としての検討は一度後に回し、百首歌としての検討を優先することとした。もっとも、今は百首歌としての検討を優先するが、歌合としての検討に方法的な問題があって検討できなくなったわけではない。むしろ、歌合として検討するための観点は、百首歌として検討し、また注釈をつけていく中でも徐々に積み上がってきている。『千五百番歌合』は総勢30人がそれぞれ100首ずつ詠んだ和歌を歌合につがえた、和歌史上空前絶後の規模の歌合である。藤原定家など当時を代表する歌人から、後進の若手まで幅広い歌人が集結した本作は、歌人研究、歌壇研究に大きく貢献するものである。『新古今和歌集』同様後鳥羽院の下命のもとに成立した作品であり、『新古今和歌集』の成立に与えた影響も大きい。しかしながら、本作はその巨大さゆえにいまだ研究が十分には進んでいない。そこで本研究では、『千五百番歌合』を個々の歌人の作品(百首歌)の集合体と捉え、その全体像と多様性を明かすことを目標に、30人の作品を横断的に検討する計画を立てた。さらに歌合としての検討と百首歌としての検討、両面からの考察を行うことで、この複雑な作品の全体像を図式化せずに捉えることを目指した。『千五百番歌合』は一般の歌合とは異なり、十人の判者が300首ずつ分担して勝負・優劣の判定を行っている。そのためか、形式上実に多様な性質の判詞を備える歌合として知られているが、今年度はそれぞれの判者の狙いを文体、表現のありかたから考えた。百首歌として検討する際には、春・夏・秋・冬・祝・恋・雑の構造にまず着目する必要がある。前年度に恋・雑部の検討を中心に据えた検討を行った結果、『千五百番歌合』に特徴的な、多量かつ特異な古典作品の摂取がみられることを見出した。本年度はこれに基づき『千五百番歌合』の古典摂取、そしてそれを大きな撰集資料とする『新古今和歌集』の古典摂取のあり方に、下命者後鳥羽院がおよぼした影響について考察した。歌人単位の検討を行う中では、後鳥羽院時代に大きな影響力を持った権門歌人、源通親を特にとりあげ、その古典摂取のあり方について検討するとともに、彼の歌を論じる判者顕昭の批評の表現についても論じた。これまで、『千五百番歌合』恋部・雑部を進めてきた。本年度は季部の検討に入る予定である。ただし、大部の作品であるがために、一度に扱える量には限りがあり、計画的に検討しなくてはかえって作品全体の体系性を見失ってしまう。ここでは本年度着目してきた先行作品の摂取を第一の観点とし、『千五百番歌合』全体にわたる共通項を取り出すことを優先したい。季部ではその特性から、恋部・雑部よりもさらに精密な比較が可能になる。自ずから検討の途上で、歌人間の多様性や、個々の歌人の特色も見出すことができるだろう。それらの検討も『千五百番歌合』全体の検討と関わらせながら、適宜課題としてゆく所存である。当初の研究計画に掲げた歌合としての検討のための準備も並行して進める。また、全ての検討の地盤となるのは、やはり注釈作業である。これまでに一通り目を通したとはいえ、今後より丁寧な解釈が必要になる。繰り返し見直してゆく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
心房性ナトリウム利尿ペプチドの分泌に影響を及ぼす因子の検討-容量および浸透圧負荷との関連-

心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の分泌調節機序およびその作用を実験的ならびに臨床的に検討した(研究(1)(8))。(1)ラットに容量および浸透圧負荷をかけると血漿ANP濃度は著増し、同時に心房圧の上昇と尿中Na排泄量の増加を認めた。(2)麻酔犬の左心房伸展(心房内留置バルーンによる)あるいは右心房の高頻度ペーシングによっても血漿ANP濃度は上昇し、さらに迷走神経切断によってこの上昇は影響されなかった。(3)同様にヒトの発作性心房頻拍数でも血漿ANP濃度が心房圧と共に上昇すること。(4)心不全ではその重症度に比例して血漿ANP濃度が高値を示し、この値は左右心房圧と有意に正相関することなどより、ANPは心房の伸展刺激に最も鋭敏に反応して分泌されるが、一部、心房内収縮頻度増加も関与すると考えられた。(5)心疾患以外にも腎不全をはじめとする浮腫性疾患、種々の高血圧症でも血漿ANP濃度は高値を示した。(6)腎不全では糸球体濾過値の低下と共に血漿ANP濃度は上昇しはじめ、ANPの血中濃度の測定により腎障害の程度を推測でき得ると考えられた。(7)これらの患者にANPを注入すると、血圧低下、尿中Na排泄量の増加さらにアルドステロン分泌抑制を認め、ANPには虚血性心疾患患者の冠動脈拡張作用があること、ANPによるNa利尿作用は血圧が高いほど増強されることを明らかにし、これらの疾患にANPを治療薬として応用し得ることを示した。(8)ANP投与により、血中および尿中cGMP濃度が著明に増加し、cGMPがANPのセカンドメッセンジャーとして機能していることを支持する所見と考えられるが、注入前の血漿cGMP濃度もANPのそれと密接な正の相関関係を有することから、血漿cGMP濃度は内因性ANPの活性をよく反映していると考えられる。以上よりANPは直接的あるいは体液量増加等による間接的な心房伸展刺激により血中に分泌され、血圧・体液量調節に何らかの役割を果していると考えられる。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)分泌機序の一端を知るために麻酔下ラットの容量負荷および浸透圧負荷時の血漿ANP濃度,心房圧,尿中NaおよびcGMP排泄量の変化を経時的に検討した。右心房,大腿動静脈および膀胱にカニューレを挿入し、それぞれ、心房圧,血圧測定,溶液注入および尿採取用とした。ANPおよびcGMP濃度測定は放射免疫法によった。1)容量負荷:体重の2%および1%に相当する等張液(NaCl,glucose)を1分間かけて静注した場合、尿量,尿中Na排泄量,尿中cGMP排泄量および血漿ANP濃度は用量依存性に増加し、投与5分後に最大となった。この時、右房圧もその変化に平行した(2%体重NaCl溶液:尿中Na排泄量+1680%,cGMP排泄量+84%,血漿ANP濃度+42%,右房圧+5.0mmHg)。これらの変化に両溶液間に明らかな差は認められなかった。2)浸透圧負荷:6Mおよび2M濃度の高張

液(NaCl,glucose,urea,mannitol)の1mlを1分間かけて静注した場合、1)と同様に著明に尿中Na排泄量(+4290%)、cGMP排泄量(+233%)および血漿ANP濃度(+119%)が増加した〔()内は6MNaCl溶液注入時の変化〕。この時、右心房圧も急速に上昇して6MNaCl溶液では+10.5mmHgとなった。これらの変化は各溶液間では明らかな差を認めなかった。以上の所見はANP分泌は体液量増加が心房圧に反映されて調節されていることを示しており、高浸透圧も心房圧を介する間接的な刺激であると考えられた。同時にANP作用のsecond messengerとも考えられているcGMPの尿中排泄も増加しており、これは両刺激時の利尿反応にANPが一部関与していることを示唆している。今後、これらの心房圧を介するANPの分泌刺激が神経性調節を受けているかどうかを検討するために、除神経下の麻酔大で心房圧上昇時(balloon inflationおよびrapid atrial pacingによる心房刺激)のANP分泌反応を検討したい。心房刺戟時に生じる多尿には迷走神経反射が関与するとの報告があるが,近年この利尿現象には心房性Na利尿ペプチド(ANP)の役割が重要であると考えられるようになった.本研究ではANP分泌機序の一端を明らかにするために,心房圧上昇時の血漿ANP濃度の変化ならびにそれに及ぼす迷走神経切断(迷切)の影響を検討した. 8匹の麻酔下のイヌの左心耳より挿入したバルーンカテーテルにより,左房圧をおよそ+2(A期), +4(B期)および+6mmHg(C期)上昇させ,それぞれ15分間,維持した.別の7匹のイヌの右心耳にペーシング用電極を装着し, 120, 160および200拍/分の心房ペーシングをそれぞれ15分間続けた.各時間で尿中Na排泄量(UNaV)および血漿ANP濃度を測定した.次に両側頚部迷切後に同様の操作を繰り返した.その結果,バルーンによる左房圧の上昇とともに血漿ANP濃度はB期(+16%), C期(+35%)に有意に上昇した.心房ペーシングにても心拍数が増加するにつれ,左房圧が上昇し(+2.4mmHg), UNaVも有意に増加した(+44%).血漿ANP濃度は160拍/分(+78%)および200拍/分(+130%)で有意に増加した.いずれの刺戟による血漿ANPの増加も迷切によって影響されなかった.以上より両実験共に左房圧の上昇と平行してANP濃度が増加し,左房圧の上昇はANP分泌を刺戟すると考えられる.しかし心房ペーシングによるANP濃度の増加の方がバルーンによるそれよりも大きかったのは心房収縮頻度自体がANP分泌に促進的に作用した可能性がある.血漿ANP濃度の増加が高度の時には, UNaVも増加しており, ANPが所謂tachycardia polyuriaに関連してると考えられる.迷切により血漿ANP濃度の変化は影響されなかった.このことはANP分泌は迷走神経反射を介さず心房レベルで調節されていると推測される.次年度は主として浮腫性疾患におけるANP分泌動態を臨床的に検討する予定である.心筋症ハムスターは特発性心筋症の疾患モデルと考えられ、カテコールアミンや心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)などの体液性因子の異常が指摘されている。そこで生後5、11および32週齢の心筋症ハムスターならびにその対照ハムスターの計56匹の血中ならびに心房、心室組織内ANP濃度、血漿cGMP濃度および心室内ノルエピネフリン(NE)、ドーパミン(DA)濃度を測定した。その結果、心室重量/体重比はいずれの時期でも心筋症ハムスターで高値を示した。5週齢心筋症ハムスターの右房内
女性生殖器系がんサバイバーのためのテーラーメイドケアの開発と評価

女性生殖器系がんサバイバーを対象に横断的自記式質問紙調査を行った。結果より導出したテーマ(リンパ浮腫、排泄障害、更年期症状、メンタルヘルス、セクシュアリティ)のシステマティックレビューを基にテーラーメイドケアを構築した。テーラーメイドケアの効果を評価するため、ランダム化比較試験を行った。その結果、実験群はQOL尺度の社会性や家族との関係で有意に改善した。また、実験群は介入前後でQOL尺度の身体症状が有意に改善した。これは、テーラーメイドケアのセミナー参加により同じ悩みを抱く患者間の連携や医療者との関係の強化により生じた効果と考えた。また、身体症状に対する対処法の習得が促進されたためと考えた。【目的】本年度は、女性生殖器系がんの治療に伴う合併症や心理社会的問題のアルゴリズム構築に向けたシステマティックレビューを行う予定だった。だが、既存の国内外の文献検索では、女性生殖器系がんサバイバーがどの時期にどのような苦痛を抱くのかが不明確であり、システマティックレビューの方向性が定まらず、CQ(clinical question)立案が困難だった。従って、まず多様な苦痛を術後経過に応じて調査した。子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がんで術後治療を終了した患者を対象に自記式質問紙調査を行った。【結果】現在までに子宮頚がん24名、子宮体がん23名、卵巣がん20名、無記名8名から回答を得た(平均年齢58.9歳)。術直後から治療後までを通して辛さを強く自覚したのは、「夜間覚醒」「不安感」等だった。術直後では「便秘」「残尿測定」「尿意の感覚鈍磨」「足のだるさ」が多かった。化学療法中には治療の副作用である「手足のしびれ」「食欲不振」「吐き気」「嘔吐」が多く、放射線治療中には「腹部はり感」「残便感」「下痢」や、「残尿測定」「尿意の感覚鈍磨」「残尿感」などの排泄に関する苦悩が多かった。術後治療終了後は、強く訴える症状は少なくなり「肩こり」「手足の冷え」が残る程度だった。術後から治療後にかけて多く悩んだことは、「再発」「治療の副作用」「リンパ浮腫」「がんとのつきあい方」「家事や仕事と治療の両立」だった。【考察・今後の課題】結果より、術直後から治療後に感じる苦痛には経過を通して常に抱くものと、治療に伴う副作用や合併症が主な原因である苦痛が複合的に生じていた。従って、がんサバイバーへのケアは、時期に応じて提供するケアと、経過を通して継続的に行うケアを両側面から検討すべきことが明らかとなった。今後は更に詳細な分析を行った結果を踏まえて、CQを抽出し、システマティックレビューを効率的に進める予定である。【目的】昨年度実施した実態調査(女性生殖器系がんサバイバーの健康上の問題と生活上の困難の経時的変化)を基に、ケア構築に向けたシステマティックレビューを行うことが本年度の目的だった。【結果】実態調査データの分析からは、女性生殖器系がんサバイバーに対するケアとして、6つのテーマが抽出された(「リンパ浮腫」「セクシュアリティ」「更年期症状」「メンタルサポート」「排泄障害」「再発の症状緩和」)。レビューアー12名でテーマを分担し、各テーマに応じたクリニカルクエスチョン(CQ)を立案した。CQの大要はテーマの実態、関連要因、効果的なケアを明らかにすることである。司書や研究メンバーで、検索キーワードと検索式を検討した。検索結果に関してレビューアーと会議を繰り返し、検索式を洗練させた。全体的に、治療や予防の文献は多いがケアに関する文献が少ないため検索式の検討は難行し、多数のキーワードを採用し広範囲から検討することとした。医中誌Web、PubMed、CINAHLを用いて5204件の文献がピックアップされた。文献のタイトルと概要を検討し、評価に用いる文献リストを作成した(リンパ浮腫79件、セクシュアリティ88件、更年期症状58件、メンタルサポート115件、排泄障害55件、再発の症状緩和106件、合計501件)。Oxfordエビデンスレベルを用いてCQを基にレビューを執行中である。立案したCQのうち、テーマの実態や関連要因は解決する可能性があるが、効果的なケアは文献数が限られエビデンスレベルも低く有益な解決が導きだせない可能性が高い。【考察・今後の課題】網羅的にレビューをしても、女性生殖器系がんの看護に関する文献は限られた。効果的なケアが抽出できないテーマがあると思われるが、その場合は実態や関連要因からケアを構築する。今後はシステマティックレビューを完了させ、ケアのコンテンツ作成が課題となる。【当該年度の目標・方法】

当該年度の目標は、1システマティックレビューを完了し、2それを踏まえたケアプログラムを構築することであった。1では12名のレビューアーが6つのテーマをCQに応じてレビュー検討した。レビュー評価には、Oxfordエビデンスレベルを採用した。司書の支援を得ながら、検索式を検討した。データベースにはPubMed、CINAHL、医中誌Webを用いた。シソーラス用語、MeSH用語、SHの他にフリータームのキーワードを選定し、検索式を検討した。2ケアプログラムは、レビュー結果と婦人科外来の現状を踏まえ、研究メンバーとの討議により開発する。【結果】1検索式の検討では、看護に関する文献の抽出が難しく、司書との打ち合わせや会議を繰り返し、キーワードを最大限にするような工夫をはかった。最終的な検索式にて総数6719件の論文を抽出した。その後、タイトル、概要、研究デザインなどから採用文献を吟味し、評価に用いる文献リストを作成した。評価対象となった文献は501件である。文献レビューからは、健康課題の実態や関連要因に関するCQは解決する傾向があったが、効果的なケアに関しては文献数が限られ、エビデンスレベルも低く有益な解決が導きだせなかった。2ケアプログラムは、人的資源・物的資源が限られる外来事情を鑑み、ケアニーズの高い対象者をより適切に抽出するためのスクリーニングチェックシートの開発と、集団学習会のための教育コンテンツの開発とし、開発中である。【考察・今後の課題】網羅的なレビューを行ったが、女性生殖器系がんサバイバーに対する看護は研究的にも実践的にも十分に発展していないと考慮された。そのため、現在の外来医療の現状に即したケアプログラムを構築することが重要と考えた。今後は、日本の婦人科外来事情に即した効率的で効果的な外来看護を開発し、効果を評価する事が今後の課題である。女性生殖器系がんサバイバーは、卵巣欠落症状、下肢リンパ浮腫、排泄障害などの術後合併症や、女性性の喪失感や自尊心低下などの苦痛を抱くことが多い。だが、サバイバーと関わる外来看護師は診療の補助を中心とした役割を担うことが多く、心理的支援や合併症へのケアは充実していない。本研究の目的は、外来診療形態を考慮し、女性生殖器系がんサバイバーを対象としたテーラーメイドケアを開発し、その効果を評価することである。テーラーメイドケアプログラムは、2つの要素(情報提供、集団学習会)から構成し、先行研究で行ってきたシステマティックレビュー結果を含めた。ケアプログラムの内容には、5つのテーマ(更年期症状、排泄障害、リンパ浮腫、心のケア、セクシュアリティ)に関するケアを含めた。集団学習会では、知識提供の他に医療者との相談時間や対象者同志の交流を含めている。ランダム化比較試験の研究デザインを用いてデータ収集を開始した。対象者は子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がんの手術終了後3ヶ月から1年未満の患者とした。また、スクリーニングチェックによりケアニーズの判定を行い、ケアニーズが有る患者のみを対象者とする。実験群にはテーラーメイドケアプログラムを行い、対照群は通常ケアとした。アウトカム指標には、患者と医療者の変化を含めた。患者の変化にはQOL、自己効力感、医療に対する満足感、合併症発症率などを、医療者の変化では職務満足度を測定する。
養魚用無魚粉飼料の開発に関する基礎的研究

本研究は,養殖生産量の高いブリを対象魚種とし,各種タンパク質原料の利用性改善を計りながら,無魚粉飼料の開発に必要な基礎知見の集積を目的とした。無魚粉飼料の性能改善には、EAA添加が必要で、添加EAAの吸収と、原料タンパク質由来のEAAの吸収とに同時性を与えることが重要である。そこで、物性や形態の異なる飼料の消化管内滞留時間が血漿遊離アミノ酸(EM)の挙動に及ぼす影響等を中心に検討するため、同じ基本組成の原料混合物を大型と小型のエクストルーダを用いて、ドライペレット(SDPおよびEPと略す)とシングルモイストペレット(SMP)を作製し、結晶Met, Lys, Trp(AA)を添加し試験飼料とした。その結果、消化管内における飼料の消長はその形態に左右され、血漿FAAの挙動にも影響を与え、滞留時間の長いSDPでは血漿中FAA濃度のピークの出現が遅く、飼料タンパク質由来のアミノ酸と添加EAAの吸収に同時性がみられた。さらに、SMPの場合にも、飼料の粘着性を高め、消化管内における崩壊を遅らせるとSDPの場合と同じ効果が得られた。飼料に添加したEAAは飼料形態に関係なく効率よく吸収され、成長に対する効果が認められた。魚粉区より劣るものの、SDP区は他区よりも優れた成績を示した。すなわち、無魚粉飼料の性能は製造方法・条件によって異なることがわかった。無魚粉飼料には魚粉飼料のEAA組成に合わせて結晶EAAを補足添加したが、前者の血漿FAAは後者よりも全般に高濃度で、特にMetは給餌後24時間まで著しく高く、アミノ酸インバランスが示唆され、無魚粉区の飼育成績が劣る理由の一つと推察された。不足するアミノ酸を補足する場合は、個々のアミノ酸の吸収率や血漿FAAのバランスを考慮した添加が必要であることがわかった。無魚粉飼料の性能を改善するためには、EAAの添加が必要であり、その効率を高めるには添加したEAAの吸収と、原料タンパク質由来のEAAの吸収とに同時性を与えることが重要なポイントになる。そこで、今年度は物性や形態の異なる資料のブリ消化管内における滞留時間を調べるとともに、それらが血漿中の遊離アミノ酸(EEA)の挙動に及ぼす影響について調べた。ほぼ同じ基本組成の原料混合物を大型および小型のエクストルーダを用いて、ドライペレット(それぞれSDPおよびEPと略す)を製造するとともに、シングルモイストペレット(SMP)を作製し、それぞれの飼料に結晶Met,Lys,Trp(AA)を添加したものを試験飼料として平均690gのブリに給餌した(水温21.7-240°C)。その結果、胃における各試験飼料の滞留時間はSMP+AAが最も短く、次いでEP+AAでそれぞれの給餌後3hおよび6hより速やかに減少した。しかしSMP+AAが18h以降ほとんど胃に滞留しなかったのに対して、EP+AAでは24hまで滞留がみられた。一方、SDP+AAは胃における滞留時間がEPより長く、30hでも滞留が認められた。また、飼料に添加したAAは飼料形態に関係なく給餌直後より吸収されており、LysとTrpの血漿濃度は各形態の飼料区ともほぼ同じパターンで推移したが、Met濃度は飼料の胃内容物の消長と同調したパターンを示した。以上、消化管内における飼料の消長は血漿中のFAAの挙動にも影響を与え、滞留時間の長い飼料ほど血漿中FAA濃度のピークの出現が遅く、かつその後の減少が緩やかになる傾向がみられた。平成12年度はこれらの結果を踏まえて再度飼料形態と添加EAAの血漿パターンとの関係を検討する予定である。

平成12年度も物性や形態の異なる飼料のブリ消化管内における滞留時間と血漿中の遊離アミノ酸の挙動との関係を調べるため、ほぼ同じ基本組成の原料混合物を大型および小型のエクストルーダを用いて、ドライペレット(それぞれSDPおよびEPと略す)を製造するとともに、シングルモイストヘレット(SMP)を作製し、それぞれの飼料に結晶メチオニン(Met),リジン(Lys),トリプトファン(Trp)を添加したものを試験飼料としてブリに給餌した。その結果、SMPの場合にも、飼料の粘着性を高め、消化管内における崩壊を遅らせるとSDPの場合と同じように飼料タンパク質由来のアミノ酸と添加した結晶EAAの吸収に同時性がみられ、飼料の消化管内滞留時間と血漿遊離アミノ酸の消長に相関があることがわかった。また、飼料に添加したEAAは飼料形態に関係なく給餌直後より効率よく吸収され、成長に対する添加効果が認められた。無魚粉飼料区の飼育成績は魚粉区には及ばなかったものの、SDP区は他区よりも優れた成績を示した。すなわち、無魚粉飼料の性能は製造の方法や条件によって異なることがわかった。無魚粉飼料には魚粉飼料のEAA組成に合わせて結晶EAAを補足添加したが、無魚粉区の血漿遊離アミノ酸は魚粉区よりも全般に高濃度になっており、特にMetの濃度は著しく高く、アミノ酸インバランスを引き起こしている可能性が示唆された。すなわち、不足するアミノ酸を補足する場合は、個々のアミノ酸の吸収率や血漿中の遊離アミノ酸バランスを考慮した添加が必要であることがわかった。平成13年度はほぼ同一の配合組成で物性がそれぞれ異なる3種類の飼料を製造し、必須アミノ酸(EAA)の添加効果を血中のアミノ酸濃度と飼育成績の面から比較した。すなわち、大型と小型の二軸エクストルーダを用いてEAA混合物(リジン、メチオニン、トリプトファン)添加および無添加のSDPおよびEPを製造するとともにシングルモイストペレット(SMP)を作製し、添加したEAAの利用性を血漿中の遊離アミノ酸の挙動との関連から検討を加えた。また、主たるタンパク質源に濃縮大豆タンパク質、大豆油粕およびコーングルテンミールを配合した無魚粉のSDP、EPおよびSMP飼料を作製し、長期飼育試験によりEAAの添加効果を各飼料間で比較検討した。飼育試験は当歳魚のブリを用いて海面の小割生け簀で実施した。その結果、魚粉および無魚粉飼料の摂餌性に問題は無く、成長は魚粉飼料区で最も優れていたが、飼料の形態に係わらずEAA添加によって成長が改善された。無魚粉飼料の中では、大型のエクストルーダを用いて作成したSDPの成長が優れていた。EAA添加区のブリ血漿中のEAA濃度は無添加区より高く、ブリは飼料の形態に係わらず添加したアミノ酸を効率よく吸収することがわかった。しかしながら、飼料に添加した結晶EAAと飼料タンパク質から誘導された同じEAAの間に給餌後の経時的濃度変化に顕著な相違が観察された。さらに、EAA添加した無魚粉飼料区の血漿遊離アミノ酸の濃度変化は対照区の魚粉飼料区と明らかに異なることがわかった。特に、添加したEAAのうちメチオニン濃度が給餌後24時間まで著しく高く、アミノ酸インバランスを起こしていることが示唆され、このことが魚粉飼料区と比較してEAA添加の無魚粉区で飼育成績が劣る結果となったのではないかと推察された。
脊髄損傷に対する神経移植の有効性に関する研究

ラット胸髄に脊髄損傷を作製すると、損傷部位より遙か離れた薄束核でGFAP反応、ミクログリア反応、basicFGF反応が強く出現することを確認した。このことから脊髄損傷部位より離れた部位で、神経組織の再生に関連した動きが起こることが推測された。脊髄損傷後に有効とされるメチルプレドニゾン大量投与を行い、ラット脊髄損傷モデルで脊髄損傷遠隔部におけるアストロサイト、ミクログリアへの影響を検討した。胸髄損傷後、メチルプレドニゾン投与により後索核のアストロサイトの反応性は増加し、ミクログリア、basic FGF反応も継続した。実験的脊髄損傷の機能回復に効果が認められている新しい薬剤である21-アミノステロイドをラット胸髄損傷後に9時間連続投与し、後索核の細胞反応を検討した。その結果、72時間後の比較で、生食投与のコントロール群に比べ、アストロサイト、ミクログリアの細胞数増加を認めた。コントロール群と比べ、反応細胞の形態的差異は認めなかった。Basic FGF反応に有意な変化を認めなかった。これらのことから、メチルプレドニゾンおよび21-アミノステロイドは損傷局所への効果ばかりでなく、脊髄損傷後遠隔部においても細胞反応を刺激し、神経再生の賦活に関与している可能性が示唆され、損傷治癒の目的で行う神経移植においてもプラスに働くとも考えられ、今後の脊髄損傷実験では損傷局所にとどまらず、神経を連続するシステムととらえ、遠隔部での細胞反応の詳細な検討が必要であることが示唆された。本年度、ラット脊髓損傷モデルの作成を行った。(材料および方法)体重約200gのSDラット30匹を10匹ずつ3群に分けた。A群では、ケタラール麻酔下にTh1から6まで椎弓切除を行い、Th3のレベルで双極電気凝固摂子により脊髓を電気凝固した。B群では、A群と同様にTh1から6の椎弓切除を行い、5グラムの分銅を30センチメートルの高さよりC3レベルの脊髓上に落下させた。C群では、Th1から6の椎弓切除を行い、液体窒素に浸した摂子でC3のレベルの脊髓をはさんだ。術後、下肢の運動機能を観察した後、ペントバルビタール腹腔内注入し、脱血屠殺した。脱血の際、左心室より2.5%グルタルデヒドを含んだリン酸緩衝液を注入し、灌流固定した。脊髓を取り出し、光顕および電顕的に組織の検討を行った。(結果)運動機能の障害はC群が最も著明であり、B群が最も軽度であった。病理学的にもC群の障害範囲が最も広かった。B群では、神経症状は様々であり、一定した運動機能障害が作成できなかった。今後、C群を用いて様々な薬剤の影響を検討する。脊髄損傷の治療の可能性として、脊髄損傷部位への移植を考えスタートしたが、最近、脊髄損傷部位より遥か離れた部位で、種々の組織反応が起こっている事が知られてきており、我々は、移植の最適部位および移植物質を決定するために、免疫組織学的検討を加えた。ラット胸髄後索一側に脊髄損傷を作成すると、同側の薄束核にGFAP反応、マイクログリア反応、basicFGF反応が強く出現している事を確認した。また、全脊髄損傷でも両側の薄束核を中心に強い組織学的変化を認めた。時間的には、脊髄損傷後すでに24時間後よりGFAP反応、マイクログリア反応が出現し、3日目から7日目まで認められる。このことは脊髄損傷部位より離れた部位で、神経組織の再生の動きがすぐに開始される事を示し、かつ、星状膠神経細胞とマイクログリアが相互に影響を及ぼしている可能性を示唆している。3日目以後にbasic FGF反応が強く認められる事より、basic FGFが組織反応を引き起こしている一つの物質である可能性がある。これらの結果より、脊髄損傷部位に対して移植を考えるほかに、損傷部位より離れた部位で神経再生の活動を賦活する事により、脊髄損傷の治療が可能になる事が示唆された。

移植に使える物質として種々の神経栄養因子を含む細胞が考えられる。どの部位で、どの栄養因子が効果的かを次年度に探る予定である。神経損傷に対する治療法として脊髄移植が考えられるが、臨床的には、脊髄損傷に対して有効な治療法として、急性期のメチルプレドニゾロン(MPSS)大量療法が知られている。その損傷部位における様々な効果は実験的に確認されているが、損傷の遠隔部の中枢に対する作用は知られていない。そこで脊髄損傷モデル遠隔部において認められるアトスロサイト反応、ミクログリア反応、bFGF反応を観察し、各グリア反応に対するMPSS大量療法の影響を観察、検討した。実験:NASCIS-2のプロトコールに基づき、MPSSを静脈内投与とした。対照群には生理食塩水を投与した。損傷72時間後、潅流固定し、GFAP(アストロサイト),OX-42(ミクログリア),bFGFのモノクローナル抗体を使用し免疫組織染色を行い、形態学的差異を比較、検討した。結果:後索核におけるアストロサイトの反応は、生食投与群と比較しMPSS投与群で増加していた。ミクログリアの反応は両者に明らかな差異はみられなかった。MPSS投与により、従来の報告からアストロサイト,ミクログリアの反応性は低下すると考えられたが、アストロサイト、ミクログリアの反応性は投与後も維持され、bFGF反応も維持されていた。後索核には反応性アストロサイトは増生が認められた。このことから、MPSS大量療法は損傷局所だけでなく遠隔部中枢に対しても作用し、グリアから放出される神経栄養因子によって神経保護、機能維持、再生促進に関与している可能性が示唆され、神経損傷、神経移植時に有効であると推測された。
neuronal identity決定と高次脳機能との関係の解析

哺乳動物の脊髄には運動神経や介在神経等の多種類の神経細胞が存在し、体と脳を繋ぐ中継基地として重要な機能を担っている。これらの神経細胞の性質決定と機能を制御する機構を明らかにするため、脊髄の特定の神経細胞で特異的に発現するBarファミリーのホメオボックス遺伝子、MBH1の発現制御の解析を行った。MBH1発現細胞は、胎生10.5日のマウス胎仔脊髄の蓋板近傍で生じ、発生が進むとともに脊髄の中央部(翼板と基板の境界付近)へ移動する。この移動パターンは、Math1発現後にcommissural neuronへ分化する細胞と酷似している。MBH1のゲノムDNA断片をレポーター遺伝子のlacZと繋いだ様々なコンストラクトを作り、トランスジェニックマウスを作製した。lacZをMBH1本来の発現と比較することにより、MBH1の発現制御領域がMBH1タンパク質の翻訳領域の下流に存在することが明らかになった。さらに、転写因子が結合するコンセンサス配列に変異を導入したトランスジェニックマウスを種々作製し、転写制御配列を同定した。また、得られたトランスジェニックマウスを用い、神経細胞の種々のマーカーと比較することにより、MBH1はcommissural neuronの中でもLh2を発現する細胞群で特異的に発現することが明らかになった。一方、マウス胎仔内でのMBH1遺伝子の機能を明らかにするため、electroporationを用い、マウス胎仔の脊髄へ効率よく遺伝子導入する実験系を確立した。この実験系により、MBH1遺伝子を強制発現させると、本来は脊髄背側の神経細胞になるべく細胞がcommissural neuronへ分化することが示され、MBH1遺伝子はcommissural neuronへの分化を制御することが明らかとなった。
軟X線レーザー時間分解小角散乱法によるフェムト秒レーザーアブレーションの研究

フェムト秒レーザアブレーションにおける非熱効果は、周辺組織の熱損傷を抑制した高精度加工技術確立の要となる。我々はそのダイナミクス解明に向けて、短パルス軟X線レーザー光をプローブとした斜入射X線小角散乱法の開発に取り組んだ。開発した装置からは回折格子のような周期表面構造を持つ試料からは明瞭な散乱信号を得た。一方、照射欠陥ような周期性に乏しい試料からの信号は検出器の熱ノイズに隠れてしまった。また、フェムト秒レーザーによるダブルポンプパルスを用いた時分割紫外・赤外反射率測定を成功させた。さらに、ソフトマテリアルのレーザー損傷の研究に向け偏極中性子と水素核偏極試料を用いた反射率測定手法を確立した。軟X線レーザーおよび軟X線用CCD検出器を用いて小角散乱測定装置を構築した。本装置を用いて可視・赤外光用の回折格子を標準試料としてその散乱測定を行ったところ、理論予想どおりの散乱パターンが得られた。しかし、フェムト秒レーザーアブレーションによって縞状パターン生成が確認された金試料を用いて同様の実験を行ったところ、対応する散乱像を得ることができなかった。この縞状パターンは回折格子に比べて周期対称性が悪いため散乱スポットは大きく広がってしまい、各スポットの散乱強度がCCDカメラの熱ノイズに隠れてしまったことがその原因と考えられる。一方、フェムト秒レーザーアブレーションダイナミクスの研究を目的とした紫外・赤外プローブ光による時間分解反射率実験に関しては2つの成果を挙げた。一つ目は、高強度フェムト秒レーザーを照射した高分子試料において膜剥離を示す時間分解反射率の振動が観測されたものである。照射後の顕微鏡写真像との比較から、レーザー光照射後数十ピコ秒以内に非熱効果による膜状剥離体が現れ、そのサブナノ秒後に熱損傷によって照射面が損傷しているという結論が得られた。二つ目は、ダブルポンプパルスの時間間隔を変えながら照射後に現れる時間分解反射率の振動変化を測定したものである。ダブルポンプパルスの照射間隔が20ps以下では膜剥離を示す反射率の振動は残存するのに対し、それ以上では消失していることが観測された。本結果から、高強度フェムト秒レーザー照射から非熱効果によって剥離膜が生成する時間スケールは20ps程度であり、それ以上の間隔を開けて照射した第2ポンプ光は第1ポンプ光照射によって生成した膜を破壊しているものだと推察した。膜剥離時間の理論予測値も10psであり、本実験を通じてその妥当性が証明された。これらの研究は2報のApplied PhysicsLetters誌に掲載された。全く新しい試みであったX線レーザーを用いた小角散乱測定を成功に導いた点は評価できるが、光学デバイスではなく、測定対象とするフェムト秒レーザーアブレーションした試料において散乱を得ることができなかったことは今後の課題である。一方、X線レーザーを用いていないものの、紫外・赤外プローブ光を用いた時間分解分光研究に関しては、その成果がApplied Physics Letters誌に2報掲載されるなど順調に成果を生んだものと自負している。その知見を生かして今後の研究進捗につなげていきたいと考えている。軟X線レーザーを用いた斜入射X線小角散乱測定装置の開発、および本装置を用いたフェムト秒レーザーアブレーションにより金表面に生じた欠損(クレーター)の構造研究に関する昨年度の研究成果をInternational Conference of X-ray Laser 2016において発表するとともにProceedingsを執筆し受理された。また、類似の条件でアブレーションされた試料の顕微鏡観測に関する研究も同Conferenceで発表し、そのProceedingsも受理されている。また、派生技術としてレーザーアブレーションによって石英表面に過渡的に生じる自由電子による反射(プラズマミラー技術)を用いた真空紫外光の波形測定技術を確立し、その論文が掲載された。X線と並行して中性子ビームを用いた小角散乱および反射率測定実験も積極的に進めた。報告者は自身が持つ核偏極技術を用いて、薄膜試料中の水素核スピンを熱平衡の50倍に相当する偏極度10%程度まで高めた上、その水素核偏極度を変化させながら偏極中性子の反射率を測定するスピンコントラスト中性子反射率測定を世界で初めて成功させた。これによってシリコン基板上にスピンコートされたジブロック共重合体のうち、どちらの基が優先的にシリコン基板に吸着するかを見分けられることを見出した。このほか、水素核偏極中性子小角散乱法を用いた自動車用タイヤゴムの構造研究や、時分割中性子小角散乱法を用いて開発された高分子フォトニック結晶の作成手法に関する論文が掲載された。軟X線レーザーを用いた斜入射X線小角散乱測定装置については赤外光用グレーティングを標準試料を用いて期待通りの散乱プロファイルが得れれることを確認した。その結果は国際会議で発表し、その場において活発な議論が展開されるとともに、Proceedingsが受理されるなどの一定の評価を得るに至った。その一方で、グレーティングのような明確な周期構造を持たない金表面のアブレーション欠損面の測定では、CCDカメラの熱ノイズに隠れて構造情報を反映した微小な散乱信号を抽出することができなかった。問題を解決するにはフォトンカウンティングができる光電子増倍管をベースとした低ノイズ2次元検出器が必要である。しかし現在、軟X線に関してはそのようなデバイスは開発されていないことからその解決策が模索されている。本研究開発の派生技術として、真空紫外光(波長160nm)の波形計測技術を確立し、論文にまとめた。

真空紫外光は、軽元素分子の励起やリソグラフィーによる集積回路作成などの用途から注目されている一方、物質透過性が極端に悪くその計測技術も他の光に対して大きく遅れていた。我々が開発した本技術が将来実用化されることが期待される。中性子ビームを用いた小角散乱および反射率測定においては、中性子と水素核の散乱能が互いのスピンの向きによって大きく異なることを利用したスピンコントラスト変調技術を用いた研究を展開した。スピンコントラスト中性子小角散乱法を用いて自動車用ゴムタイヤ中におけるシリカ粒子の分散状態を決定した論文が掲載された。また、スピンコントラスト中性子反射率測定を世界で初めて成功させた。当初はX線レーザーの反射測定により表面構造を測定する計画であった。しかし、いくつかの試料を用いて測定したところ、X線レーザーの波長領域で用いるCCDカメラではノイズレベルが高く非常に高いナノレベルの周期構造を持つ試料系以外所望の構造情報を得ることが難しいことが判明した。そこでそれに代わる手法として、表面構造の測定に水素核偏極薄膜試料と偏極中性子を用いた反射率法を適用する手法を考案した。本手法は中性子の水素核に対する散乱能が互いのスピンの向きに強く依存する性質を用いて、核偏極度に依存して変化する複数の反射率曲線から多層膜における複数の表面・界面構造を一意に決定するものである。大強度陽子加速器施設(J-PARC)物質生命実験施設(MLF)の偏極中性子反射率計に新たに開発した薄膜試料用核偏極装置を組込み、水素核偏極度によって大きく異なるブロック共重合体薄膜材料の偏極中性子反射率曲線を得ることに成功した。それぞれの反射率曲線は異なる振動周期およびスロープを持ち、振動周期から試料の核偏極度を決定し、スロープからは試料表面・界面の面粗さを独立に決定することができることが見いだされた。フェムト秒レーザアブレーションにおける非熱効果は、周辺組織の熱損傷を抑制した高精度加工技術確立の要となる。我々はそのダイナミクス解明に向けて、短パルス軟X線レーザー光をプローブとした斜入射X線小角散乱法の開発に取り組んだ。開発した装置からは回折格子のような周期表面構造を持つ試料からは明瞭な散乱信号を得た。一方、照射欠陥ような周期性に乏しい試料からの信号は検出器の熱ノイズに隠れてしまった。また、フェムト秒レーザーによるダブルポンプパルスを用いた時分割紫外・赤外反射率測定を成功させた。さらに、ソフトマテリアルのレーザー損傷の研究に向け偏極中性子と水素核偏極試料を用いた反射率測定手法を確立した。昨年度の研究実績である、可視・赤外光用回折格子を模擬試料として用いたX線レーザー小角散乱測定の結果は本年度5月に開催されるThe 15th International Conference on X-Ray Lasersにおいて発表するとともに論文執筆も行う予定である。また、測定手法の改良に向けて必要とされるイメージング検出器の条件を見積っている。また、試料に照射されるX線レーザー光強度の増加に向けて、現在用いられている赤外・可視・紫外光フィルターの最適化も検討している。
光化学系I複合体の分子集合装置の精製ならびにその機能と構造の解析

系I複合体の分子集合メカニズムには未知の部分が多い。本研究では、緑藻クラミドモナスを材料として、系I複合体の分子集合に必須であるYcf4を含む大きな複合体(以下、分子集合装置と略記)の構造・機能解析を進める。アフィニティーカラムで精製した分子集合装置をショ糖密度勾配超遠心分離で精製後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーと電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行い、1500kDa以上の大きな構造体であることを示した。系I複合体が分子集合する過程を明確に示した研究はこれまで殆どなされていない。本研究では、パルスラベル・チェイス実験と、カラムクロマトグラフィー、SDS-PAGEを駆使し、研究を進めた。その結果、系I複合体の周辺部に位置しているPsaG、Kサブユニットが結合することにより、LHCIとPSIコアとの結合が安定化し、系I複合体の分子集合が完結するという過程を示した。より詳細に系I複合体の分子集合過程を研究するためには、PSI-LHCIの構造を知る必要がある。そこで本研究では、PSI-LHCIのアンテナザイズ、LHCIタンパク質のコピー数を生化学的に求めた。クラミドモナスにおけるPSI-LHCIのアンテナザイズを、P700の光酸化とHPLCにより求めた。これらの結果により、アンテナサイズを270-300クロロフィル程度であると決定した。次に、PSI-LHCIにおける、PSIコアに対するLHCIタンパク質のコピー数を求めた。High-TrisとMES-Trisを組み合わせた二種類の電気泳動システムによって、各LHCIタンパク質をシングルスポットとして高度に分離したのち、蛍光色素によって染色し定量した。PSIコアに対して8-9のLHCIタンパク質が結合しており、これはアンテナサイズの結果とも良く一致している。本研究では、緑藻クラミドモナスを材料として、系I複合体の分子集合に必須であるYcf4を含む大きな複合体(Ycf4複合体)の生化学的解析を進め、系I複合体の分子集合装置であることを証明し、系I複合体が分子集合する過程の解明を目的とする。1、Ycf4複合体のアフィニティーカラムによる精製条件を最適化し、Ycf4複合体の主要なサブユニットを、Cop2、Ycf4、PsaF、MASAPであると決定した。また、英国のJon Nield博士との共同研究によって、電子顕微鏡を用いたsingle particle analysisで構造を解析した。精製した標品には大きな構造体と小さな構造体が観察された。これらの構造と機能との関連は今後の課題である。コファクターの解析は、今後進めていく予定である。2、パルスラベル・チェイス実験で新規に合成された系IタンパクがYcf4複合体上で分子集合することを確かめた。その研究過程で、系I複合体の分子集合中間体の同定に成功した。分子集合中間体は周辺部のサブユニットの一部を欠損し、系I集光性アンテナクロロフィルタンパク質複合体(LHCI)との結合が弱いと考えられる。系I複合体はYcf4複合体上で1分以内に、ある程度の安定性を保った分子集合中間体となり、1時間程度の時間をかけて残りの周辺部のサブユニットが結合した成熟型の系I複合体へと完成すると考えられる。3、MASAPに対する抗体を合成オリゴペプチドで作成し、複合体への特異的な結合を現在解析中である。アフィニティーカラムで精製した場合は、弱い結合のサブユニットは脱落する可能性がある。Ycf4複合体の新たなサブユニットの存在や、系I複合体のサブユニットを取り込んでいる証拠を示すために、野生株から、より穏和な条件でYcf4複合体を精製する手法を確立した。得られた複合体のポリペプチド組成を現在解析中である。本研究では、緑藻クラミドモナスを材料として、系I複合体の分子集合に必須であるYcf4を含む大きな複合体(Ycf4複合体)の生化学的解析を進め、系I複合体の分子集合装置であることを証明し、系I複合体が分子集合する過程を明確に示す。1、Ycf4複合体をアフィニティーカラムで精製すると系I複合体のサブユニットはPsaFだけであった。系I複合体を取り込む過程を明らかにするために、他の系I複合体のサブユニットを含む分子集合装置を野生株のチラコイド膜からより穏和な条件で、ショ糖密度勾配超遠心分離とイオン交換カラムクロマトグラフィーを駆使し、精製した。精製された標品はPsaAタンパク質を含み、分子集合の極めて初期段階の複合体を精製したとみられる。現在、英国のJon Nieldとの共同研究によって、電子顕微鏡を用いたsingle particle analysisによる構造解析と醗した精製条件の最適化を行っている。2、系I複合体コアの部分から周辺部のサブユニットへと分子集合する。前年は系I複合体の分子集合中間体を同定したが、本年はさらに詳細なサブユニット解析を行った。PsaG, H, I, Lサブユニットに対する抗体を新たに作成し、分子集合をウェスタン解析した。分子集合中間体はPsaG, Kが結合していないためにLHCIとの結合が緩くなり、PsaFが精製過程で脱落する。しかしながらPsaL, I, HはLHCIとは反対側に存在するために分子集合中間体、成熟型いずれも系I複合体とより近い側のものが強く結合していた。前年の分子集合中間体の同定の内容と併せた論文を現在執筆中であり、まもなく投稿する。