hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の過敏感細胞死を誘導する低分子化合物の特性解析

細胞死は植物の最も効率的な感染防御システムである。本課題では従来あまり着目されてこなかった低分子性の過敏感細胞死誘導因子の探索及び特性解析を通して、過敏感細胞死の分子機構の理解を深めることを目的として研究を行った。前年度までに、タバコモザイクウイルス(TMV)とタバコの組合せをモデル系として、30度(TMV感染による過敏感細胞死の非許容温度)での細胞死誘導活性を指標に細胞死誘導物質としてジテルペンの一種cis-abienolを単離同定した。本年度は、cis-abienolの役割を明らかにするべく、本物質による細胞死の誘導がTMV抵抗性遺伝子Mこ依存するか否かを調べたところ、N非存在下でも細胞死が起きることがわかった。また、cis-abienolが過敏感細胞死に関わるMAPK(WIPKとSIPK)を活性化する物質(WAF-1)と非常に良く似た構造をしていることを踏まえ、cis-abienolによる細胞死にこれらMAPKが必須かどうかを調べる目的で両MAPKの機能が低下した形質転換タバコに本物質を処理したところ、細胞死誘導が抑制されることが判明した。これらの結果は、TMVに感染したタバコにおいては、N遺伝子の機能の発現の有無に関わらずcis-abienolがMAPK依存的な過敏感細胞死の誘導因子のひとつとして働いていることを示唆している。定量測定の結果cis-abienolの内生量はTMV感染後と前では変化がなかったことから、本物質による過敏感細胞死誘導は物質の量的変動そのものではなく、例えば局在が変化するこよなどによるものであると推測された。
がんにおけるタンキラーゼによる統括的miRNA生合成制御機構の解明

さまざまながんで広くマイクロRNA(miRNA)の発現減少が認められることが知られているが、原因は明らかではない。本研究では、miRNA生合成に関わる複数の分子にポリ(ADP-リボシル)化酵素であるタンキラーゼに結合すると考えられるモチーフ配列があることに着目した。ポリ(ADP-リボシル)化とは標的タンパク質にポリ(ADP-リボース)鎖を付加する翻訳後修飾である。タンキラーゼによりポリ(ADP-リボシル)化されたタンパク質は、物性が大きく変化するとともに、ポリ(ADP-リボース)鎖がシグナルとなりユビキチン化による分解へと導かれることが知られている。miRNA生合成は、1pri-miRNAの転写、2pre-miRNAの産生、3pre-miRNAの核外輸送、4Dicerによるpre-miRNA切断、5RNA誘導型サイレンシング複合体の形成、の五段階から成る。前年度は、タンキラーゼが調節しているのはどのステップか明らかにするために、複数のmiRNAについてタンキラーゼ阻害剤処理下で、pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAを定量的に検出し、2すなわち、pri-miRNAからpre-miRNAへの切り出しの段階でタンキラーゼが調節していることが示唆されるデータを得た。本年度は、タンキラーゼによるmiRNA生合成調節のメカニズムの詳細を明らかにするために、pre-miRNAの産生に関わる複数の分子をクローニングし、それらの分子に存在するタンキラーゼ結合モチーフと考えられる配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。また、pre-miRNAの産生を定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を構築した。前年度の検討により、pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAについて、定量的RT-PCRにて定量的に検出することを試みたが、内部標準を探すのに手間取ってしまったものの、適当な内部標準を見出すことができ、pri-miRNA、pre-miRNA、mature RNAの定量ができるようになった。複数のpri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAについて、定量的RT-PCRで検出を行うことで、タンキラーゼ阻害剤を用いた検討、また、タンキラーゼの酵素活性のないPARP-DEADを用いた検討から、タンキラーゼの酵素活性がpri-miRNAからpre-miRNAを切り出すプロセスを調節している可能性が示唆されるデータが得られた。それらの結果を踏まえ、本年度はpri-miRNAからpre-miRNAを切り出すプロセスに関わっている主な分子のクローニングを試みた。DGCR8については速やかにクローニングできたものの、ヒト細胞のcDNAからのDROSHAのクローニングがうまく進まず、変異が入ってしまう状況が続いたが、テンプレートをマウスのcDNAに変えたことで全長のmDroshaのクローニングに成功した。得られたhDGCR8とmDroshaについては、それらの分子に存在するタンキラーゼ結合モチーフと考えられる配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。また本年度は、pri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を構築することができた。これにより、次年度の検討がスムーズに進むと考えられる。前年度は、miRNAのプロセッシングの複数あるステップのうち、pri-miRNAからpre-miRNAへと切り出されるステップにおいてタンキラーゼが調節している可能性が示唆されるデータを得た。本年度は、pri-miRNAからpre-miRNAの切り出しに関わる分子であるDGCR8とDroshaのクローニングを行い、それらの分子に存在するタンキラーゼと結合すると考えられるモチーフ配列のアミノ酸を置換した変異体を作製した。本年度に構築したpri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを定量的に解析できるようルシフェラーゼアッセイで評価できる実験系を用いて、タンキラーゼによるプロセッシングの調節について定量的に評価を行う。またDGCR8やDroshaの野生型および変異型を過剰発現にした実験系により、タンキラーゼとそれらの分子の結合について検討を行う予定である。DGCR8やDroshaの野生型および変異型を用いて、pri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングについても評価を行う予定である。これらの検討により、タンキラーゼがどのようにpri-miRNAからpre-miRNAのプロセッシングを調節しているのかについての詳細なメカニズムを明らかにする予定である。本年度は本研究の最終年度であるため、本検討で得られた結果をまとめ、国際学術誌に投稿する予定である。必要な論文改訂作業を行い、論文の掲載を目指すことにしている。また学会でも積極的に得られた知見を発表する予定である。様々ながんで広くマイクロRNA(miRNA)の発現減少が認められることが知られているが、原因は明らかではない。本研究では、miRNA生合成に関わる複数の分子に、ポリ(ADP-リボシル)化酵素であるタンキラーゼに結合するモチーフ配列があることに着目した。タンキラーゼによりポリ(ADP-リボシル)化されたタンパク質は、物性が大きく変化するとともに、ポリ(ADP-リボース)鎖がシグナルとなりユビキチン化による分解へと導かれる。ルシフェラーゼ・アッセイを用いた予備検討から、タンキラーゼがmiRNAを介したmRNA分解を抑制していることが示唆されるデータを得ている。miRNAを介したmRNA分解は、複数のステップからなる複雑なプロセスである。本年度は、タンキラーゼがどのステップに関与しているのか、詳細な検討を行った。miRNA

生合成は、1pri-miRNAの転写、2pre-miRNAの産生、3pre-miRNAの核外輸送、4Dicerによるpre-miRNA切断、5RNA誘導型サイレンシング複合体の形成、の五段階から成る。タンキラーゼが調節しているのはどのステップか明らかにするためにタンキラーゼ阻害剤処理下において、複数のmiRNAについて、pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAを定量的に検出することにした。このため、内部標準となるRNAの検討から行った。本年度の検討から、miRNA生合成のステップのなかでタンキラーゼが関与しているステップを明らかにすることができた。今後は、これらの結果を踏まえ、分子機序を明らかにしていく。Pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNAについて、定量的RT-PCRにて定量的に検出することを試みたが、内部標準を探すのに手間取ってしまったものの、適当な内部標準を見出すことができ、pri-miRNA、pre-miRNA、mature RNAの定量もできるようになった。HeLa細胞を用いた検討により、miRNA生合成のステップのうち、タンキラーゼ阻害剤処理により顕著に効率が下がるステップがあることを見出した。このことがほかの細胞にもあてはまる普遍的な現象なのか調べるために、A549細胞およびHEK293T細胞でも同様の検討をおこなったところ、そもそも発現しているmiRNAに差があるものの、HeLa細胞と同様の現象を認めた。Loss of function実験として、タンキラーゼ阻害剤を使用したが、siRNAによるノックダウン実験でも同様の結果になるか検討したが、siRNA処理により内部標準としているsmall RNAの発現が顕著に変動してしまい、複数のsmall RNAを試したものの適当な内部標準が見出せなかった。そこで、Loss of function実験として、PARP-DEADであるタンキラーゼの変異体を過剰発現させることにした。その結果、タンキラーゼ阻害剤処理時と同様の現象が観察された。これらの結果から、miRNA生合成のプロセスをタンキラーゼのPARP活性が促進していることが明らかとなった。当初は、miRNA生合成に関わる複数の分子にタンキラーゼ結合配列があったことから、それらの分子とタンキラーゼの結合に着目し、タンキラーゼが生合成のどのステップに関与しているか調べる予定であった。本年度は、タンキラーゼが直接作用する分子の同定はまだできていないものの、タンキラーゼがmiRNA生合成のどのステップを修飾しているのか明らかにすることができた。さまざまながんで広くマイクロRNA(miRNA)の発現減少が認められることが知られているが、原因は明らかではない。
多点筋電図法・vEMGの開発

骨格筋の表面筋電図を計測して可視化するためのvEMG(visual electromyography)のモジュールと、その可視情報を定量化するための画像解析システムに関する基礎的方法の二点を開発した。コーディングおよび伝送にはLEDの色信号を用いた。このモジュールを多数用いることで、あたかも筋電図のトポグラフを直接見るかのような測定システムの実現への道を拓いた。本研究では、表面筋電図を可視化するためのvEMG(visual electromyography)のモジュールと、その可視情報を定量化するための画像解析システムに関する基礎的方法の二点を開発した。光を伝送に用いる非接触の筋電位計測技術の基礎を確立した。1.vEMGモジュール双極誘導の表面筋電図の包絡線振幅に応じて緑赤に色調を変える発光ダイオードを備えたハードウェアモジュールを作成した。このモジュールは単独で作動し、その入力は双極誘導のための2つの生体電極、アース電極、そして筋電位の増幅率や較正方法を設定するためのスイッチであり、出力は混色発光するLEDと、筋電位の生波形および包絡線の電圧信号であった。内部にはアナログ増幅部、フィルタ部、マイコンによるエンコードおよびその他処理部、LED駆動部とプログラミングおよび通信用コネクタが設けられた。骨格筋を実測した結果、発揮筋力に応じて実際に色調が変わり筋活動の様子を可視化することに成功した。前腕などの筋が多い部位における多点計測でもクロストーク(電極間干渉)は問題とならず、このモジュールを多数用いることで、あたかも筋電図のトポグラフを直接見るかのような測定システムの実現への道を拓いた。2.画像解析システムLEDの色信号をカメラで読み込んで、表面筋電位の皮膚上の包絡線振幅を算出するシステムを作成した。マシンビジョンシステムによってLED発光のスペクトルを抽出し、緑と赤の発光強度の比を求め筋電位の包絡線をデコードした。モジュールからの電圧信号とデコードされた信号を比較したところ、高い一致性を示した。可視光をコーディング規則ならびに伝送方法として、非接触で表面筋電位を計測することに成功した。環境光による外乱やカメラ側の性能の影響を受ける可能性があるため、システム全体におけるコーディング規則と較正方法の最適化が残された課題である。
網膜変性疾患に対する国産遺伝子導入ベクターを用いた治療法の開発

1.網膜変性モデル動物における遺伝子治療効果の検討について1)遺伝子治療技術の開発・・神経栄養因子を搭載した新規サル由来レンチウイルス(SIV)ベクターを開発し、さらに臨床応用に向けたベクターの大量生産系が確立された。2)網膜変性モデル動物RCSラット、rdsマウスにおける2種類の神経栄養因子同時発現による相乗的治療効果の検討2種類の網膜変性モデル動物に対する遺伝子治療研究において、ヒトPEDFならびにヒトFGP2を単独で網膜内に発現させることによる網膜変性抑制効果と、両者を同時に発現させることにより、組織学的検討ならびに網膜電図を用いた電気生理学的な機能評価においても相乗的な高い治療効果が得られることが明らかとなった。2.神経前駆細胞を用いた遺伝子治療法の確立について1)毛様体境界部からの神経前駆細胞の分離・培養法の確立・・毛様体境界部の上皮細胞が無血清培地下に球状塊を形成して培養される過程で、本来発現している上皮系の細胞骨格(サイトケラチン)の発現が低下し、未分化神経細胞のマーカーであるnestinの発現が上昇することが明らかとなった。2)毛様体由来神経前駆細胞に対する遺伝子導入効率の検討・・毛様体から分離・培養した神経前駆細胞様細胞塊にSIVベクターを用いて効率的な遺伝子導入が得られることを明らかにした。また、遺伝子導入された細胞は、二次細胞塊を形成することが明らかとなった。3.その他1)大型動物を用いたSIVベクターの遺伝子発現特性を検討・・小動物での結果と同様に、2年以上の安定した遺伝子発現が確認できた。2)加齢黄斑変性の発症に関連する血管新生のメカニズムと関連する因子の検討・・VEGP-A以外の関連の可能性について示唆する所見を得た。1.網膜変性症モデル動物における遺伝子治療効果の検討について(1)組換えウイルスベクターの作製・・神経栄養因子であるhumanFGF-2を搭載したSIVベクター(SIV-FGF-2)を作製。また、同じ神経栄養因子である色素上皮由来因子(PEDF)とFGF-2の2遺伝子を搭載したSIVベクター(SIV-dual)も新規に作製した。(3)網膜変性症モデル動物rdsマウスでの遺伝子発現の確認・・レポーター遺伝子であるlacZを用いた病理組織学的検討により、これまでの研究結果と同様に網膜色素上皮細胞に特異的に遺伝子が導入され、少なくとも1年間は安定に発現することを確認できた。(4)rdsマウスにおける遺伝子治療効果の確認・・生後3適齢のrdsマウスの網膜下にSIV-FGF2ベクターを投与することにより、視細胞変性の組織学的な抑制と電気生理学的な神経保護効果を確認できた。また、1年間の観察期間において、FGF-2の過剰発現により予想される副作用である病的血管新生は認められなかった。(5)新規神経栄養因子の探索・・酵素的に分解した豚硝子体より各種カラムを利用して数種類のタンパクを分離することができた。2.神経前駆細胞を用いた遺伝子治療法の確立について(1)毛様体境界部からの神経前駆細胞の分離・培養法の確立・・無血清培地下に球状の未分化な神経細胞を含む細胞塊の安定した採取法を確立。また、その形成過程や細胞塊の病理組織学的解析を行い、既存の上皮細胞から脱分化によりnestin陽性の神経細胞が生じる可能性を示唆する所見を得た。(2)虹彩色素上皮細胞からの未分化細胞の分離・培養法の確立・・マウス虹彩より分離した虹彩色素上皮細胞をある条件にて培養することによりnestin陽性の神経前駆細胞を得ることができた。

1.網膜変性症モデル動物における遺伝子治療効果の検討について(1)2種類の神経栄養因子同時発現による初代培養網膜神経細胞に対する神経保護効果の検討・・本年度の研究では、作用機序の異なる神経栄養因子を組み合わせた保護効果の検討を行った。具体的には、神経栄養因子である色素上皮由来因子(PEDF)ならびに線維芽細胞増殖因子(FGF-2)、それぞれの遺伝子を搭載したサル由来レンチウイルス(SIV)ベクター(SIV-PEDF, SIV-FGF-2)を培養細胞(サル腎臓細胞:Cos7)に導入し、その培養上清のグルタミン酸傷害に対する初代培養網膜神経細胞への保護効果を検討した。単独群よりも同時発現群で有意な保護効果が得られることが明らかとなった。(2)網膜変性症モデル動物RCSラットにおける2種類の神経栄養因子同時発現による相乗的治療効果の検討・・これまでのRCSラットに対する遺伝子治療研究において、PEDFならびにFGF-2を単独で網膜内に発現させることによる治療効果を明らかにしてきた。本年度の研究では、さらにこれらの遺伝子を同時に網膜内で発現させる(SIV-PEDFとSIV-FGF-2の同時投与)ことにより、組織学的検討ならびに網膜電図を用いた電気生理学的な機能評価においても相乗的な治療効果が得られることが明らかとなった。これらの結果より、作用機序の異なる神経栄養因子を組み合わせることで、より低い濃度のベクター投与によるより高い治療効果が期待できることが示唆された。2.神経前駆細胞を用いた遺伝子治療法の確立について毛様体境界部からの神経前駆細胞の分離・培養法の確立・・昨年度までの結果を詳細に検討し、毛様体境界部の上皮細胞において、球状塊を形成して培養される過程で本来発現している上皮系の細胞骨格(サイトケラチン)の発現が低下し、未分化神経細胞のマーカーであるnestinの発現が上昇することが明らかとなった。1.網膜変性症モデル動物における遺伝子治療効果の検討について(1)網膜変性症モデル動物RCSラットにおける2種類の神経栄養因子同時発現による相乗的治療効果の検討・・これまでのRCSラットに対する遺伝子治療研究において、ヒトPEDFならびにヒトFGF-2を単独で網膜内に発現させることによる網膜変性抑制効果と、両者を同時に発現させることにより、組織学的検討ならびに網膜電図を用いた電気生理学的な機能評価においても相乗的な高い治療効果が得られることが明らかとなった。本年度は、これらの結果をさらに発展させ、より低いベクター濃度での治療効果の検討を行った。SIV-hPEDF, SIV-hFGF-2をそれぞれこれまでの1/10の濃度で同時に投与した場合(totalでは1/5)、これまでの単独投与群と同等の治療効果が得られた。(2)網膜変性症モデル動物rdsマウスにおける2種類の神経栄養因子同時発現による相乗的治療効果の検討・・これまでのRCSラットに対する治療効果を、原因遺伝子が異なり、動物種も異なるモデル動物を用いて検討した。遺伝子導入後3ヵ月という長期間の経過観察において、組織学的検討ならびに網膜電図を用いた電気生理学的な機能評価では、RCSラットと同様な相乗的な高い治療効果が得られることが明らかとなった。2.神経前駆細胞を用いた遺伝子治療法の確立について毛様体由来神経前駆細胞に対する遺伝子導入効率の検討
同相群の構造の研究

1.多様体の同相群が完全(即ち、その交換子部分群と一致する)であることはEdwards-Kirbyの仕事を考え合わせるとAndersonらにより知られている。ここでは、葉層構造を保つ同相群F(M,F)について考察する。先ず葉を保つ同相群が完全であることをEdwards-Kirbyの手法を応用することにより示し、さらに、余次元1葉層に対して葉層構造を保つ同相群の1次元ホモロジー群を考察した。このとき、葉層がD型成分を持たず、R型成分を有限個しか持たないなら、同相群F(M,F)の1次元ホモロジー群は自明であることを示した。また、葉層がD型成分を持つなら、その1次元ホモロジー群は非自明であることおよびトーラスT^m上の無理数線形葉層の場合、その1次元ホモロジー群を決定した。さらに上記結果のリプシッツ版、即ち葉層構造を保つリプシッツ同相群について考察した。このとき、葉層がD型成分を持つとき、上と異なる様相が現れることを発見した。また、余次元2、3のコンパクト葉層の同相群を考察し、その同相群が完全である十分条件を見つけた。2.GをコンパクトLie群とし、MをG-多様体とする。ここでは、Mの同変微分同相群D_G(M)の構造について考察する。我々は、Mが余次元1軌道を持つ、G-多様体のD_G(M)が考察し、その1次元ホモロジー群を決定した。さらに、リプシッツ同相群についてその構造を解明し、Mが主G-束のとき、その同変リプリッツ同相群が完全であることを示した。3.4次元多様体上の向きづけ可能な閉曲面によるコンパクト葉層の安定性について考察し,葉が双曲的曲面のとき、C^1-摂動に対してこの葉層が不安定であることを示した。主な研究対象は葉層構造論およびその関連分野、特にある種の幾何構造を保つ(微分)同相群の構造についてである。(A)余次元1葉層(今西英器氏との共同研究)および余次元2、3コンパクト葉層を保つ同相群の1次元ホモロジー群(これは群の交換子部分群による剰余群)について考察した。主な結果は次の通りである。定理1. Fを余次元2のコンパクトC^1-葉層とする。このとき、Fが二面体葉を持たなければ、F(F)は完全である。定理2. Fを余次元1葉層とする。Fがdenseな成分を持たず、Reeb成分を有限個しか持たないとすると、Fを保つ同相群F(F)は完全である。特に、S^3上のReeb葉層F_Rに対してF(F_R)は完全である。(B) G-多様体の同変微分同相群Diff^∞_G(M)の1次元ホモロジー群を考察し、次の結果を得た(阿部孝順氏との共同研究)。また、同相群の部分群であるリプシッツ同相群の構造を考察し、その応用としてコンパクトLie群Gが自由に作用するG-多様体に対してそのリプシッツ同変同相群が完全であるという結果を得ている(阿部孝順氏との共同研究)。1.多様体の同相群が完全(即ち、その交換子部分群と一致する)であることはEdwards-Kirbyの仕事を考え合わせるとAnderson(Mather)らにより知られている。我々は、葉層構造を保つ同相群について先ず葉を保つ同相群が完全であることを示し、さらに、余次元1葉層に対して葉層構造を保つ同相群の1次元ホモロジー群を考察した。

このとき、葉層がD型成分(dense component)を持たず、R型成分(Reeb component)を有限個しか持たないなら、同相群F(M,F)の1次元ホモロジー群は自明である。(即ち、完全である)ことを示している。また、葉層がD型成分を持つなら,その1次元ホモロジー群は非自明であることおよびトーラスT^m上の無理数線形葉層の場合、その1次元ホモロジー群を決定した。2.GをコンパクトLie群とし、MをG-多様体とする。我々は、Mの同変微分同相群D_G(M)の構造について考察する。Mが主G-束のとき、Banyaga、阿部-福井によりD_G(M)は完全であることが示されている。我々はMが余次元1軌道を持つG-多様体のD_G(M)が考察し、その1次元ホモロジー群を決定した。さらに、リプシュッツ同相群についてその構造を解明し、Mが主G-束のとき、その同変リプシュッツ同相群が完全であることを示した。
ミトコンドリアプラスミドの父性遺伝性を制御する核因子の探索

ナタネミトコンドリアプラスミドの持つ父性遺伝性の機構解明を目指して、QTL解析を行った。プラスミド伝達率の異なるナタネ品種「農林16号」と「Westar」の交雑に由来するF2集団102個体を供試し、連鎖地図作成とプラスミドの父性伝達に関するQTL解析を行い、1374.7 cMをカバーする遺伝地図を作成し、A5、C2、C9染色体に1つずつQTLを検出した。この結果、父性遺伝性は比較的少数の核遺伝子により制御されていることが明らかとなった。高等植物のオルガネラゲノムは、一般に母性遺伝性を示すことが知られており、ナタネを含むBrassica属植物においても、ミトコンドリアゲノムは母性遺伝することが示されている。しかし、ナタネミトコンドリア中に存在する11.6kbの線状プラスミドは、ミトコンドリアゲノムが厳格な母性遺伝を行う場合であっても、花粉親から次代へ伝達されるというきわめて特異的な性質を持っている。本課題においては、その現象の機構解明を目指して、プラスミドの遺伝性(伝達性及び維持安定性)を制御する核遺伝子群の探索のために、プラスミドの遺伝性を制御するQTL解析を行う。本年度は、プラスミド伝達率78.8%のナタネ品種「農林16号」と、伝達率が27.5%の品種「Westar」の交雑に由来するF2集団102個体を供試して、連鎖地図の作成とそれを基にしたプラスミドの父性伝達に関するQTL解析を行った。これまでに、167マーカーがマップされ、24の連鎖群を得た。現在までのところ、部繋がっていない連鎖群も存在するが、24のうち22の連鎖群が所属する染色体(A1C9)を決定した。この連鎖地図をもとにして、QTL解析を行った結果、プラスミドの伝達に関与すると考えられるQTLがA5染色体に2つ、C9染色体に1つ検出された。今後、このQTL周辺のマーカー数を増やしより詳細なマッピングを行うとともに、QTL周辺のArabidopsisとのシンテニー等を利用して、父性遺伝に関わると考えられる遺伝子の探索を行っていく。本年度は、昨年度に引き続いて、プラスミド伝達率78.8%のナタネ品種「農林16号」と、伝達率が27.5%の品種「Westar」の交雑に由来するF2集団102個体を供試して、連鎖地図の精細化とプラスミドの父性伝達に関するQTL解析を行った。175個のマーカーにより22の連鎖群が得られ、それぞれナタネの19本の染色体に関連づけられた。遺伝子地図は1374.7cMをカバーし、マーカー間平均距離は7.9cMを示した。解析の結果、A5、C2、C9染色体に1つずつQTLが存在することが明らかとなり、それぞれqPpt1、qPpt2、qPpt3と名付けた。それぞれのLOD値は4.97、3.45、3.35であり、寄与率は25.0%、22.2%、37.1%を示した。また、3つのQTL間に明らかなエピスタシスはみられなかった。これらの結果は、ミトコンドリアプラスミドの父性遺伝は独立した比較的少数の核遺伝子により制御されていることを示している。高等植物のオルガネラゲノムは、一般に母性遺伝性を示すことが知られており、ナタネにおいても、ミトコンドリアゲノムは母性遺伝することが示されている。しかし、ナタネミトコンドリア中に存在する11.6kbの線状プラスミドは、ミトコンドリアゲノムが母性遺伝を行う場合であっても、花粉親から次代へ伝達されるという特異的な性質を持っている。本課題では、その現象の機構解明を目指して、プラスミドの遺伝性を制御する核遺伝子群の探索のために、QTL解析を行うこととしている。

昨年度までに、プラスミド伝達率78.8%のナタネ品種「農林16号」と、伝達率が27.5%の品種「Westar」の交雑に由来するF2集団102個体を供試し、連鎖地図作成とプラスミドの父性伝達に関するQTL解析を行い、1374.7 cMをカバーする遺伝地図を作成し、A5、C2、C9染色体に1つずつQTL検出し、それぞれqPpt1、qPpt2、qPpt3と名付けた。今年度は、3つのQTLの中で最も高いLOD値4.97、寄与率25.0%を示すA染色体上のqPpt1について、2011年に新たに公開された近縁種Brassica rapaのゲノム配列を利用して、遺伝地図の精密化とQTL領域の絞り込みを試みた。ナタネのQTL領域周辺のマーカー情報からB. rapaの相同領域を確認し、その配列情報からSSR配列を検索した。作成した80個のSSRマーカーのうち、両親間で多型が検出できた4マーカーはいずれもQTL領域にマップされ精密化が図れるとともに、QTL領域とB.rapaゲノム配列の関係が明らかになり、今後のQTL遺伝子のクローニングに向けた基礎情報を得ることができた。また、この過程で、A5染色体短腕の端部に、これまでに報告のない大きな逆位が存在していることが明らかになった。QTLとの関係は不明であるが、種分化やシンテニーの面から興味深い。本研究課題では、プラスミドの遺伝性を制御する遺伝子群の単離に向けて、プラスミドの遺伝性に関するQTL解析を行い、関与するQTL遺伝子座を明らかにすることを目的としており、2年目までにQTL解析を終えることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。前年度までに検出されたプラスミド伝達に関する3つのQTL領域のうち、比較的詳細なマップ情報が得られたA5染色体上に座乗するqPpt1について、シロイヌナズナやB.rapaの相同領域の塩基配列等を参考にして、QTL候補遺伝子の絞り込みを行うとともに、遺伝子単離に向けて、qPpt1を単因子として持つ系統作成のための交配等を行う。
河川環境改変がニホンウナギの分布や成長に与える影響の解明

護岸や河川横断工作物による生息環境の変化がニホンウナギの成長期にあたる黄ウナギの生態に与える影響を理解することが本研究の目的である.初めに,日本の18河川と9湖沼の漁獲量減少率と護岸率との関係を検討した結果,護岸率が高い河川・湖沼ほど減少率が高いことを発見し,護岸による環境改変が本種の生息に悪影響を与える可能性が示された.利根川で野外調査を実施した.テレメトリー実験の結果,黄ウナギは夜間の1時間に数10m程度しか移動しないこと,冬は活動しないこと,1年間の行動圏が狭いこと,元々の生息場所への回帰性を持つこと,個体間の行動圏の重複は少ないことなどが分かった,また,汽水淡水域の護岸域と自然河岸域(計15地点)から黄ウナギ586個体を採集したところ,護岸域の密度と肥満度は自然河岸域よりも低く,その傾向は小型個体で顕著であることが分かった.胃内容物,遺伝子,炭素・窒素安定同位体比の解析から黄ウナギの摂餌生態を検討した結果,摂餌量は護岸域の方が低く,このことが水域間の肥満度の差を生み出すものと推測された.自然河岸域の主要な餌生物は陸生ミミズ類と推定されたが,これらは護岸域で採集された個体の胃内容物からは全く出現しなかった.これにより,護岸はミミズ類の供給を通した陸ー河川生態系の繋がりを断ち切っていることが示唆された.支流根木名川での採集調査からは,護岸であってもブロックや蛇籠の区間は黄ウナギが高密度で生息しており,これらの構造物は黄ウナギの生息環境を再生・保全する上で非常に重要であることが示された.耳石酸素炭素安定同位体比を用いて天然加入個体と放流個体の識別法を開発し,利根川河口堰の上・下流域で採集された個体を判別したところ,調査した全ての水域で天然加入個体が高い割合を示したことから,本河口堰はニホンウナギの上流への移動をある程度可能にしていることが推察された.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。ニホンウナギは我が国の重要な水産資源であるが,稚魚であるシラスウナギの採捕量は近年激減しており,資源の保全が急務となっている.近年,成育場である沿岸域の都市化や人口増加に伴う河川・湖沼の環境改変による本種への影響が懸念されているが,その詳細は不明である.外洋と沿岸,双方に跨がって展開される彼らの生活史の中で,資源管理を行うことが可能な場所は沿岸域だけであり,生息環境変化の影響を正確に評価することは本種資源の保全策立案のために極めて重要である.そこで,本研究では,環境改変として水際線の護岸工事に着目し,護岸による生息環境の改変がニホンウナギにどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的とし,研究を展開した.初めに,国内の河川・湖沼における護岸工事の進行と漁獲量減少との関係を解析した結果,護岸率が高い河川,湖沼ほど漁獲量の減少率が高いことが明らかになり,護岸による本種の餌生物や隠れ家等の減少が漁獲量減少の一因となっていることが示唆された.次に,利根川水系において野外調査を実施した結果,自然河岸域に比べてニホンウナギの生息密度が低かった護岸域では,餌生物の多様性や摂餌量も低い傾向にあることが明らかになった.また,バイオテレメトリー実験の結果,ニホンウナギは個体毎に約1年間に亘って,限定的な分布・移動を示し,狭い生活圏を持つことが分かった.生息環境への定着性が強いため,餌環境が悪化している護岸域にも長期に亘って分布し続け,結果的に護岸域に分布する個体の栄養状態が悪化していることが明らかになった.以上より,護岸による餌環境の悪化によってニホンウナギの生息に悪影響が及んでいる可能性が示唆された.また,保全の観点から,多自然川づくりによって河川改修が実施されている同水系の根木名川においてニホンウナギの分布を調査した結果,人工的な河岸構造物であっても,河岸に蛇籠が設置された水域においては本種やその餌生物が多く生息する傾向にあった.この結果は,蛇籠を用いた河川改修は生息環境の改善に一定の効果が現れている可能性を示唆するものである.護岸や河川横断工作物による生息環境の変化がニホンウナギの成長期にあたる黄ウナギの生態に与える影響を理解することが本研究の目的である.初めに,日本の18河川と9湖沼の漁獲量減少率と護岸率との関係を検討した結果,護岸率が高い河川・湖沼ほど減少率が高いことを発見し,護岸による環境改変が本種の生息に悪影響を与える可能性が示された.利根川で野外調査を実施した.テレメトリー実験の結果,黄ウナギは夜間の1時間に数10m程度しか移動しないこと,冬は活動しないこと,1年間の行動圏が狭いこと,元々の生息場所への回帰性を持つこと,個体間の行動圏の重複は少ないことなどが分かった,また,汽水淡水域の護岸域と自然河岸域(計15地点)から黄ウナギ586個体を採集したところ,護岸域の密度と肥満度は自然河岸域よりも低く,その傾向は小型個体で顕著であることが分かった.胃内容物,遺伝子,炭素・窒素安定同位体比の解析から黄ウナギの摂餌生態を検討した結果,摂餌量は護岸域の方が低く,このことが水域間の肥満度の差を生み出すものと推測された.

自然河岸域の主要な餌生物は陸生ミミズ類と推定されたが,これらは護岸域で採集された個体の胃内容物からは全く出現しなかった.これにより,護岸はミミズ類の供給を通した陸ー河川生態系の繋がりを断ち切っていることが示唆された.支流根木名川での採集調査からは,護岸であってもブロックや蛇籠の区間は黄ウナギが高密度で生息しており,これらの構造物は黄ウナギの生息環境を再生・保全する上で非常に重要であることが示された.耳石酸素炭素安定同位体比を用いて天然加入個体と放流個体の識別法を開発し,利根川河口堰の上・下流域で採集された個体を判別したところ,調査した全ての水域で天然加入個体が高い割合を示したことから,本河口堰はニホンウナギの上流への移動をある程度可能にしていることが推察された.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。野外調査では予想以上のサンプルやデータの取得に成功し,その後の試料分析,データ解析等,いずれも順調に進んでいる.成果の一部はすでに国際誌への掲載が決定しているものや査読中のものがある.それに続く成果についても国内の学会において発表し,学術誌に公表すべく準備を進めている.すでに解析が終わったデータについて全て国際誌に投稿するとともに,現在もデータを取り続けているバイオテレメトリーによる分布域のモニタリングについては,今後より多様な個体のデータ解析を行っていくことで,河川内の分布や行動特性をより詳細に明らかにしていく予定である.また,水際線の改変以外の生息環境の変化についてもその影響を評価する予定である.具体的には,河口堰やダム建設など河川横断構造物がニホンウナギの遡上や降河回遊に与える影響である.この検証には,耳石の酸素安定同位体比分析を用いた天然遡上個体の河川内分布調査やバイオテレメトリーを用いた降河回遊個体の追跡等を予定している.
ストレス応答マイクロＲＮＡが制御するＭＵＣ１の役割について

本来は膜結合型糖タンパク質であるMUC1の多機能性、特に電離放射線、低酸素分圧、紫外線などの環境ストレス下における機能に注目した。特にマイクロRNAを介したMUC1発現制御がストレス対応に重要な役割を担っているのではないかと考えている。MUC1の低酸素分圧に対する応答について検証した結果、HeLa S3細胞を低酸素分圧条件下で培養すると、MUC1の発現レベルが培養開始後2時間以内に低下し、6時間後ではMUC1の発現が検知できないレベルにまで低下していた。その原因タンパク質と考えたαNACとγ-タキシリンのsiRNAを導入したところMUC1の発現が減少しポジティブを示唆するデータが得られた。本研究では、本来は膜結合型糖タンパク質であるMUC1の多機能性、特に電離放射線、低酸素分圧(Hypoxia)、紫外線など様々な環境ストレス下における働きに注目した。MUC1あるいはそのカルボキシル末端断片(MUC1-C)は、膜、ミトコンドリア、小胞体、核など細胞内の様々な場所で働いていることが最近明らかになった。従って、細胞が受ける異なる外因ストレスに対して、こうした様々な細胞内器官において、異なるストレスによる刺激に様々なメカニズムで対応している可能性がある。特に、われわれはmicro RNA (miRNA)を介したMUC1発現制御がこうしたストレス対応に極めて重要な役割を担っていると考えている。よって、本研究の目的は、外的ストレスに細胞が対応する際、それぞれのストレスに対応した異なるmiRNAが産生され、刺激の種類と程度に応じてMUC1の発現ないしは糖鎖などのタンパク修飾がなされているという仮脱のもとに研究を進め、MUC1が有する多様性がいかに重要であるかを検証していく。本年度は、環境ストレス(Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1およびmiRNAの役割を知るために、MUC1の環境ストレス応答について検証した。これまでの予備実験の結果では、HeLa S3細胞を低酸素分圧条件下で培養すると、MUC1の発現レベルが培養開始後2時間以内に低下し、6時間後ではMUC1の発現が検知できないレベルにまで低下していた。さらに、今まで我々の研究室で研究してきた因子との関連についても検証した。特に、cPLA2との関連には興味を持ち、cPLA2のコンディショナルノックアウト(CKO)マウスを利用して、解析していくことも考えている。本研究では、本来は膜結合型糖タンパク質であるMUC1の多機能性、特に電離放射線、低酸素分圧(Hypoxia)、紫外線など様々な環境ストレス下における機能に注目した。MUC1あるいはそのタンパク質のカルボキシル末端断片(MUC1-C)は膜、ミトコンドリア、小胞体と核内で別の働きを持ち、細胞の増殖やアポトーシスに深く関与していると考えられている。こうした様々な細胞内器官において、異なるストレスによる刺激に様々なメカニズムで対応している可能性がある。特に、われわれはマイクロRNA(miRNA)を介したMUC1発現制御が、こうしたストレス対応に極めて重要な役割を担っているのではないかと考えている。よって、本研究の目的は外的ストレスに細胞が応答する際、それぞれのストレスに対応した異なるmiRNAが産生され、刺激の種類と程度に応じてMUC1の発現または糖鎖などのタンパク修飾がなされているという仮説のもとに研究を進め、MUC1が有する多様性がいかに重要であるかを検証している。本年度は、環境ストレスである低酸素分圧(Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1およびmiRNAの役割を知るために、昨年度に引き続きMUC1の低酸素分圧に対する応答について検証した。これまでの予備実験の結果では、HeLa S3細胞を低酸素分圧条件下で培養すると、MUC1の発現レベルが培養開始後2時間以内に低下し、6時間後ではMUC1の発現が検知できないレベルにまで低下していたが、その原因タンパク質候補のsiRNAを導入して試してみたところ、ポジティブを示唆するデータが得られた(タンパク質名は論文発表まで非開示)。さらに、cPLA2との関連も解析するため、cPLA2のノックアウトマウスが完成させた。よって、本研究の目的は外的ストレスに細胞が応答する際、それぞれのストレスに対応した異なるmiRNAが産生され、刺激の種類と程度に応じてMUC1の発現または糖鎖などのタンパク修飾がなされているという仮説のもとに研究を進め、MUC1が有する多様性がいかに重要であるかを検証した。環境ストレスである低酸素分圧(Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1およびmiRNAの役割を知るために、MUC1の低酸素分圧に対する応答について検証した。実験の結果では、HeLa S3細胞を低酸素分圧条件下で培養すると、MUC1の発現レベルが培養開始後2時間以内に低下し、6時間後ではMUC1の発現が検知できないレベルにまで低下していたが、その原因タンパク質候補のsiRNAを導入して試してみたところ、ポジティブを示唆するデータが得られた(タンパク質名は論文発表まで非開示)。

さらに、以前からわれわれの研究室で研究しているストレス応答に関与するcPLA2との関連も解析するため、cPLA2のノックアウトマウスを完成させ、cPLA2とMUC1との関連を検証した。本来は膜結合型糖タンパク質であるMUC1の多機能性、特に電離放射線、低酸素分圧、紫外線などの環境ストレス下における機能に注目した。特にマイクロRNAを介したMUC1発現制御がストレス対応に重要な役割を担っているのではないかと考えている。MUC1の低酸素分圧に対する応答について検証した結果、HeLa S3細胞を低酸素分圧条件下で培養すると、MUC1の発現レベルが培養開始後2時間以内に低下し、6時間後ではMUC1の発現が検知できないレベルにまで低下していた。その原因タンパク質と考えたαNACとγ-タキシリンのsiRNAを導入したところMUC1の発現が減少しポジティブを示唆するデータが得られた。環境ストレス(電離放射線、紫外線、温熱、Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1の役割を知るために、われわれの研究室で研究している因子との関連を昨年に引き続き検証した。特に、cPLA2との関連には興味を持っており、新規性も高い。今までの研究で作成してきたcPLA2のコンディショナルノックアウト(CKO)マウスはCreマウス(トランスポゼース発現マウス)との交配によってcPLA2ノックアウトマウスを作出することができる。実際の交配実験でも理論どおりにCreでトランスポゾンが飛び、cPLA2ノックアウトマウスが誕生した(昨年度報告済み)。今年度はこのノックアウトマウスをゲノム上でcPLA2 nullにする作業を行ったが、予想以上にcPLA2 nullの染色体がホモになる確率が低く、2段階での作出を余儀なくされた。少々は遅くなったが、安定してcPLA2 nullのノックアウトマウスが作出できるようになり、本研究での利用、解析が一層進むことになると考えている。分子生物学環境ストレス(電離放射線、紫外線、温熱、Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1の役割を知るために、主に環境ストレス応答し、且つMUC1に関与するmiRNAのスクリーニングと同定を行う。そして同定されたmiRNAを使った機能解析やMUC1と相互作用するタンパク質について詳細に解析する予定である。さらに、ライン化された培養細胞だけでなく、より正常細胞に近い初代培養細胞においても環境ストレス応答がMUC1と特異的miRNAによって制御されていることを解析していきたい。また、cPLA2 nullノックアウトマウスより、MEF細胞を作製、または肺などから培養細胞を分離して、環境ストレス実験を行い、MUC1の挙動を観察し、cPLA2とMUC1の関係も明らかにしたい。環境ストレス(電離放射線、紫外線、温熱、Hypoxia)に対する細胞応答に際してのMUC1の役割を知るために、今まで我々の研究室で研究してきた因子との関連についても検証した。
Hippoシグナル経路による細胞競合機構とその破綻病態

(1)細胞レベルの研究:通常二次元培養下では、YAP発現細胞では接着因子の発現が低下し、接着能が弱いために、野生型細胞がYAP発現細胞の下に潜り込み、野生型細胞は足場依存性増殖シグナルが増強し、YAP発現細胞はこのシグナルが抑制されるために細胞競合現象の敗者となることを示した。一方、接着能の低いPetri dishやPolyhema-coat dishでの培養下では、YAP発現細胞は勝者に転換することを見出した。また、YAP発現細胞が敗者として、排除される際に生じる物理的力を可視化するために、FRETプローブを用いた。本プローブは、N末端から、アクチニン由来のアクチン結合ドメイン、mChery、クモ糸タンパク質、EGFPが融合されている。興味深いことに、YAP発現細胞が排除される際にFRETが生じることを見出し、細胞排除時に物理的力が生じる可能性を示した。さらに、YAP発現細胞を排除するシグナルを同定するために、標的既知化合物ライブラリーを用いてスクリーニングした結果、COX阻害剤が同定した。種々の阻害剤を検討した結果、YAP発現細胞で産生され、細胞外に分泌されたプロスタグランジンE2が、YAP発現細胞と周辺細胞の両方に作用して、排除シグナルの一端を担っていることを見出した。(2)個体レベルの研究:YAP活性化皮膚片を野生型マウスに移植した時にだけ、移植皮膚上皮が拒絶・剥離されることを見出した。野生型皮膚片を野生型やYAP活性化マウス皮膚に移植しても、YAP活性化皮膚片をYAP活性化マウス皮膚に移植しても拒絶は見られなかった。YAP活性化皮膚片上皮はヘミデスモゾームを構成するCOL17A1の発現が弱く、周囲の野生型上皮に押されることで、皮膚上皮剥離を認め、Hippo経路による細胞競合様現象が、ヒト皮膚移植効率を支配する可能性を示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Hippoシグナル伝達系は下流の転写共役因子YAPをリン酸化し、YAPの細胞増殖作用を負に制御することで、器官サイズや発がんを制御する。近年、ショウジョウバエにおいて、適応度の高い細胞が低い細胞を排除する細胞競合現象に、Hippo-YAPシグナル系が関与することが明らかとなった。しかしながら、哺乳動物Hippo-YAPシグナル系の細胞競合における役割については不明な点が多い。また個体レベルにおける細胞競合を検討するために、HTVi法でYAP(5SA)cDNAを静注してモザイク状にいれると、活性化YAPを発現する肝細胞が消失することを見出した。また野生型マウスやYAPが活性化したマウスをYFPでラベルするための交配も完了した。このように、細胞競合の解析は着実に進んでいる。また、扁平なメダカ変異体の解析から、YAPが細胞張力や組織張力の制御に関与して、組織の構築や配置に必須の役割を果たすことを見出した。細胞競合との関連は今後の課題であるが、「適応度」の差を感知機構の解明に貢献する可能性がある。細胞レベルでは、イヌ腎臓由来培養細胞株(MDCK)を用いて、YAPの細胞競合における役割を目的に実験を行った。その結果、1)活性型YAP発現細胞は、親株細胞との混合培養依存的に、apical面へ突出誘導されること、2)この突出誘導にはTEADを介した転写活性やPI3K-mTOR-S6K経路が重要であること、3)周辺細胞におけるfilaminの発現が必須であること、4)活性型YAP発現細胞は、Ras(G12V)やv-Src発現細胞を周辺細胞とした場合には突出しないことを見出した。すなわち、活性型YAP発現細胞は親株細胞に対しては敗者、Ras(G12V)やv-Src発現細胞に対しては勝者の表現型を示すことが明らかとなった。以上の結果は、活性型YAP発現細胞では、周辺細胞の細胞状態に応じて勝敗が決定されることを明らかにした。また活性型YAP発現細胞が親株細胞に対して敗者となることは、マウス胎児線維芽細胞株(NIH3T3)やマウスケラチノサイト細胞株(Pam212)においても認められた。、組織レベルでは、マウスの肝臓においてHippoシグナル系をモザイク状に破綻(YAPを活性化)させた場合、細胞は免疫非依存的に細胞移動、細胞死、クッパー細胞による貪食を経て、肝臓から排除されることを見出した。興味深いことに、この排除現象には、肝障害が必要であること、すなわち、活性型YAP発現細胞は、外部環境に応じて、細胞増殖するか、細胞移動するかの運命が異なることが判明した。Hippo経路が関与する細胞競合現象を、細胞レベルおよび組織レベルで解明しつつあり、また十分な研究業績をもつことから、研究はおおむね順調に進展していると言える。本研究「Hippoシグナル経路による細胞競合機構とその破綻病態」では、(1)哺乳類細胞競合現象の可視化、(2)勝者細胞と敗者細胞の差を手掛かりにした「適応度」差の感知機構や競合後の細胞排除機構解析、(3)細胞競合の個体における生理的役割と破綻病態解明、の3つのアプローチによって、細胞競合現象を解明する。ショウジョウバエにおいてはHippo経路分子が細胞競合の最も重要な制御分子とされつつあるが、哺乳類の細胞競合に関わる遺伝子群はいまだほとんど不明である。

また成体マウスの肝臓に若いマウス由来の肝細胞を移植した際、肝臓のサイズは一定のまま若い移植肝細胞が宿主の古い肝細胞を競合的に排除して組織内の占有領域を順次拡大していく現象は、“哺乳動物組織における細胞競合"の1例として知られているが、その分子機構は不明である。これまで研究代表者は、Hippo経路の構成分子のノックアウト(KO)マウスやコンディショナルKOマウスを数多く作製し、また研究分担者はマウス肝臓における細胞競合モデルを独自に構築することに成功し、共同して肝臓が細胞競合モデルとして重要であることを見出している。本研究ではこれら申請者が、様々なアプローチで細胞競合現象を研究する世界的な研究者が集まる当該領域に参画し、有機的かつ緊密に連携しつつ、Hippoシグナル経路による哺乳類細胞競合機構とその破綻病態を研究する。これによって、哺乳類組織構築における細胞競合の分子機構、細胞適応度の解明、細胞競合による破綻病態の解明も可能となり、生命科学の新たな次元の創出が期待される。また、本研究の成果は、細胞競合という新しい生物学的コンセプトを起点として広範な生命科学領域の向上と強化につながるとともに、がんをはじめとするヒト難治性疾患の病態解明と治療戦略の開拓に貢献することが期待される。<これまでの研究成果>In vitroの通常培養では、これまでYAP過剰活性化細胞は、隣接した周辺正常細胞に対して敗者となり突出誘導される事、RASやSRC活性化細胞を周辺細胞に用いると突出誘導されないことを報告した(Scientific Reports 2016)。さらにin vivoで肝臓での細胞競合の可視化を可能とし、エタノールなどで障害をうけた肝細胞においてはYAP過剰活性化細胞は敗者になるのに対し、障害のない肝細胞では勝者となることを見出した(論文投稿中)。これらYAP過剰発活性化細胞が、条件によって勝者と敗者が逆転する現象はin vitroでもさらに認められ、YAP過剰活性化細胞は、(1)通常培養では培養皿底面への接着力が減弱して、野生型に比し敗者になること、(2)ペトリ皿やpHEMAコート皿などの細胞浮遊培養条件下での単独培養では増殖が高く、野生型との混合培養時にはさらにより増殖力が強くなり勝者になることを見出した。このように細胞競合様現象の勝敗の一因は、細胞接着の状態変化に依存する可能性が高いこと、通常培養では接着性が高い細胞同士が凝集しようとするために、二次的に接着性が弱い細胞が押し出され排除される可能性があることも示唆された。以上のように進捗状況はおおむね順調に進展している。ショウジョウバエにおいてHippo経路分子が細胞競合の重要な制御分子の1つとされているが、哺乳類の細胞競合に関わる遺伝子群はほとんど不明である。これまで我々は、哺乳類細胞競合現象の可視化を行い、in vitroの細胞通常培養条件下では、YAP過剰発現細胞は隣接した正常細胞に対して敗者となり頂端側に排除されることを報告した。また本排除現象は隣接細胞の状態によって勝者に変わりうることも見出した。次に平成29年度には、in vivoモザイク解析を行うことで、donor肝細胞がrecipient肝の障害の有無によってYAP活性化依存的に勝者にも敗者にも変わりうることを見出した。すなわち、肝障害の無い時はYAP活性化肝細胞は勝者として振る舞い増殖する一方、障害時にはYAP活性化肝細胞は敗者として類洞側に排除されクッパー細胞により貪食されることを見出した。
２次性副甲状腺機能亢進症における副甲状腺メガリンの病態生理学的役割の研究

メガリンは近位尿細管細胞で、ビタミンD結合蛋白の尿細管細胞への取込みを介して、ビタミンD活性化に寄与する。病的副甲状腺ではメガリン発現が低下しており、VDの副甲状腺細胞内への取込み低下が想定される。インフォームドコンセントを得た上で、副甲状腺腺腫を用いて初代培養を行った。メガリンのリガンドであるHis-RAPを培養液中に添加したところ、蛍光二重染色でメガリンは細胞膜に、His-RAPは細胞膜および細胞内にシグナルを認めた。副甲状腺細胞はメガリンを介し、His-RAPを細胞内に取込むことが示された。副甲状腺も尿細管と同様にメガリンを介してDBPを取込み、細胞内でVDを活性することが示唆される。本研究では、病的副甲状腺におけるメガリン発現低下の病態を解明するために、1副甲状腺機能亢進症の進展に伴うメガリン発現の変化、2副甲状腺においてメガリンを非機能化した際の、副甲状腺ホルモン分泌能への影響、3副甲状腺におけるビタミンD受容体(VDR)の発現低下が、メガリン発現低下の原因になるか、を検討することである。正常および病的副甲状腺を用いて、免疫組織化学法を用い、メガリンの発現を検討した。副甲状腺アデノーマ(Adenoma)、およびびまん性過形成を呈したSHPT副甲状腺(Diffuse)は、正常副甲状腺(Normal)と比較しメガリンの発現が低下していた。結節性過形成を呈するSHPT副甲状腺(Nodular)において、メガリンの発現はさらに低下していた。また、メガリンの発現状態は、VDR発現と正の相関を示した。インフォームドコンセントを得た原発性副甲状腺機能亢進症患者より副甲状腺腺腫を採取し、初代培養を行った。メガリンのリガンドであるHis-RAPを培養液中に添加し、His-RAPとメガリンの細胞内局在を検討した。ガリンは細胞膜に、His-RAPは細胞膜および細胞内にシグナルを認めた。さらに蛍光二重染色で、細胞膜周囲に共局在を認めたことより、副甲状腺細胞はメガリンを介し、His-RAPを細胞内に取込むことを示した。さらに培養液中に25OHDを添加することで抑制されたPTH分泌を、His-RAP投与によって解除できるかを現在検討中である。本研究では、病的副甲状腺におけるメガリン発現低下の病態を解明するために、1副甲状腺機能亢進症の進展に伴うメガリン発現の変化、2副甲状腺においてメガリンを非機能化した際の、副甲状腺ホルモン分泌能への影響、3副甲状腺におけるビタミンD受容体の発現低下が、メガリン発現低下の原因になるか、を検討することである。