hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
WNKシグナル系の新規機能の探索と制御機構の解明

(1)慢性腎臓病における塩分感受性の発症と進展に関わるWNKシグナルの役割を解明するため、マウスCKDモデルとしてアリストロキア酸腎症(AAN)を用いて、高塩食摂取による血圧変化とWNKシグナル系分子の発現量を評価した。その結果、AANマウスは塩分感受性亢進を示し、腎臓におけるWNK1の蛋白発現亢進とSPAK/NCCのリン酸化亢進が認められた。高塩食負荷によってもWNK1-SPAK-NCCシグナルカスケードは抑制されず、塩分感受性亢進の原因と考えられた。SPAKノックアウトマウスではAANによるWNK1増加はあるもののリン酸化NCCの増加は認めなかった。これらの結果からWNK1-SPAK-NCCシグナルの過剰な亢進がCKDの塩分感受性亢進に関与すると考えられた。(2) Na-K-Cl共輸送体(NKCC)1は骨格筋形成を制御し,その阻害剤ループ利尿薬が筋再生を抑制しサルコペニア発症に関与する。当該年度において、さらにWNK1がSPAK,OSR1非依存性に長寿遺伝子forkhead box O (FOXO) 4を介し筋肥大を正に制御することを示した。まず、マウス骨格筋細胞C2C12,マウス骨格筋組織のWNK1は、それぞれ分化誘導、長期運動刺激によりタンパク発現量が増加した。C2C12細胞でsiRNAによるWNK1ノックダウンを行うと、筋管細胞径の萎縮ならびに筋萎縮関連遺伝子(atrogene)の転写増加を認めた.Atrogeneの主たる転写因子FOXO1/3a/4の核内局在を評価すると,siWNK1によりFOXO4の核内発現が増加しており,siFOXO4を同時に行うと筋管細胞萎縮とatrogene転写増加がキャンセルされた。WNK1-FOXO4シグナルは生理的に筋肥大を制御し,筋腎連関メカニズムの一端を担うシグナルとして新しい治療標的となる可能性があることが示唆された。遺伝性高血圧疾患である偽性低アルドステロン症II型(PHAII)において、原因遺伝子であるKLHL3とCullin3はユビキチンE3リガーゼを形成し、腎臓遠位尿細管でWNK1, WNK4を捉えて分解することでNCCを制御する。当該年度においてはKLHL3-/-マウスを作成、解析し、KLHL3の局在と生体内での機能につき検討した。内因性のKLHL3プロモーターの制御下にβgalを発現するKLHL3-/-マウスを作成、解析したところ、βgalのWestern blottingにおいて、KLHL3は腎臓、脳、眼、精巣、心臓で発現していることが明らかになった。特に脳と腎臓において強い発現が認められた。脳では海馬に強くLacZ染色を認めた。また、KLHL3-/-マウスの腎臓では、WNK1とWNK4の分解不良による発現増加を認め、PHAIIの形質を呈したが、KLHL3+/-マウスではWNKシグナル系の過剰亢進は認めなかった。細胞実験においては、野生型KLHL3は互いに結合して二量体を形成するが、野生型KLHL3と疾患変異型KLHL3は結合せず、二量体形成が阻害された。この結果から、KLHL3は生体において多臓器にわたり発現していることが判明した。今回作成したKLHL3-/-マウスは、腎臓以外の臓器におけるKLHL3の機能を探るのに有用であると考えられる。また、PHAII発症の病態生理において、KLHL3の変異によるWNKシグナルの制御の異常のメカニズムとしてはKLHL3の発現量ではなく、疾患変異型KLHL3の質的変化によるdominant negative効果が重要であることが明らかになった。KLHL3の二量体形成は、KLHL3の機能における重要なメカニズムの一端である可能性があると考えられた。本研究課題の当該年度の研究目的としてKLHL/Cul3/WNKシグナル制御メカニズムの解明、およびKLHL-Cullin3複合体によるWNKキナーゼ分解障害による病態の生体内での検討をあげていた。当該年度においてはまず、KLHL3のノックアウトマウスの作成に成功し、PHAIIの形質の再現に成功した。そして、このモデル動物を用いて、KLHL3の全身臓器での発現部位についての新知見を得た。さらにKLHL3変異によるPHAII発症メカニズムについての重要な新知見を得ることができた。当該年度においては:(1) KLHL-Cullin3複合体によるWNKキナーゼ分解障害による病態の生体内での検討(2) KLHL3/Cul3/WNKシグナルの各臓器での働きの解明、を行った。(1) KLHL3ノックアウトマウスを作製、解析した。KLHL3-/-マウスはPHAII様のphenotypeを示したが、KLHL3+/-マウスは示さなかった。このことからKLHL3変異によって起こる常染色体優性のPHAIIの病態形成には変異KLHL3タンパクのdominant negative効果が必要であることが示された。さらにこのdominant negative効果の発症メカニズムには、KLHL3の二量体形成が関与していることも示した。また、KLHL2ノックアウトマウスの作成、解析も行った。KLHL2-/-マウスはPHAII様phenotypeを示さなかった。KLHL2の発現部位は腎臓髄質に限局しており、KLHL2-/-マウスでは腎臓髄質においてWNK4の発現が増加していた。

このことから、KLHL2は腎臓髄質特異的なWNKシグナル制御因子であることが示された。(2) WNK4ノックアウトマウスを作製、解析した。WNK4-/-マウスが肥満症に対して抵抗性を有することを見出し、WNK4が脂肪細胞の分化誘導の調節因子であることを発見した。また、骨格筋細胞の分化の過程でNKCC1が誘導されること、そしてこの過程はループ利尿薬により阻害されること、さらにはループ利尿薬が運動による筋線維の肥大化を抑制することも示した。このことから、NKCC1は筋肉の分化、運動誘発性肥大に重要な役割を果たしていることが示された。本研究課題の当該年度の目標として:(1)新規KLHL3/Cul3/WNKシグナル制御メカニズムの解明(2) KLHL-Cullin3複合体によるWNKキナーゼ分解障害による病態の生体内での検討(3) KLHL3/Cul3/WNKシグナルの各臓器での働きの解明、を挙げていた。当該年度においてはKLHL3、KLHL2、およびWNK4のノックアウトマウスの作成に成功し、KLHL3とKLHL2によるWNKシグナルの制御メカニズムについて重要な新知見を得ることができた。また腎臓以外の、脂肪組織や筋肉におけるWNKシグナル系の機能についても新規発見を行った。(1)慢性腎臓病における塩分感受性の発症と進展に関わるWNKシグナルの役割を解明するため、マウスCKDモデルとしてアリストロキア酸腎症(AAN)を用いて、高塩食摂取による血圧変化とWNKシグナル系分子の発現量を評価した。その結果、AANマウスは塩分感受性亢進を示し、腎臓におけるWNK1の蛋白発現亢進とSPAK/NCCのリン酸化亢進が認められた。高塩食負荷によってもWNK1-SPAK-NCCシグナルカスケードは抑制されず、塩分感受性亢進の原因と考えられた。SPAKノックアウトマウスではAANによるWNK1増加はあるもののリン酸化NCCの増加は認めなかった。これらの結果からWNK1-SPAK-NCCシグナルの過剰な亢進がCKDの塩分感受性亢進に関与すると考えられた。(2) Na-K-Cl共輸送体(NKCC)1は骨格筋形成を制御し,その阻害剤ループ利尿薬が筋再生を抑制しサルコペニア発症に関与する。当該年度において、さらにWNK1がSPAK,OSR1非依存性に長寿遺伝子forkhead box O (FOXO) 4を介し筋肥大を正に制御することを示した。まず、マウス骨格筋細胞C2C12,マウス骨格筋組織のWNK1は、それぞれ分化誘導、長期運動刺激によりタンパク発現量が増加した。C2C12細胞でsiRNAによるWNK1ノックダウンを行うと、筋管細胞径の萎縮ならびに筋萎縮関連遺伝子(atrogene)の転写増加を認めた.Atrogeneの主たる転写因子FOXO1/3a/4の核内局在を評価すると,siWNK1によりFOXO4の核内発現が増加しており,siFOXO4を同時に行うと筋管細胞萎縮とatrogene転写増加がキャンセルされた。WNK1-FOXO
フィルダム-地山系におけるフィルダム三次元浸透流解析に関する研究

本研究では、地山を含めたフィルダムの定常浸透流実験と三次元有限要素法の定式化および解析を行った。地山形状モデルとして、Type(1)三角柱モデルおよびType(2)V字谷モデルを設定した。この結果、以下のことなどが明かとなった。1.室内実験(1)地山を有するフィルダムでは地山の特性が浸潤面に直接反映する。(2)Type(1)では、ダムの天端から下流側の範囲で流線が末広がりとなり、Type(2)では、ダムの法先に収束するように流線が得られた。この結果は、二次元では起こり得ない。(3)特にType(2)の場合、設計基準で得られる浸潤線より高い位置に浸潤面が生ずるので地山条件によってはダムの安全上問題が生ずる場合が考えられる。(4)ダム浸潤面の形状には地山角度および勾配の代償とダム堤長の長さが大きく関与する。2.FEM解析実験結果を基に地山角度、勾配さらにダム堤長の長さを変えながら解析した。(1)ダムが二次元浸透流として取扱いできるダム堤長の長さは、影響係数αによって表せる。(2)地山勾配の大小にかかわらず、Type(1)ではダム天端から下流側の範囲で等水位線は天端側に向かって上向きの放物線となる。Type(2)では下向きの放物線となる。(3)これらの結果は実験で得られた傾向と同じであるが、解析では地山角度などの違いによる放物線の曲率の程度を明らかにした。今年度は均一型フィルダム-地山系の三次元浸透流解析を以下の項目について行った。1.地山系を三角柱モデルとし、二次元モデルに対して山体の迫り出しを75%,60%,20%とし堤体内の浸潤面へ与える影響について実験を行った。この結果、20%では影響が少ないが、75%では設計基準の二次元モデルで得られる浸潤面とは大きく異なる結果を得た。2.地山をV字谷モデルとした場合の浸潤面への影響を調べた。この地山形状は堤体下流側の通水断面積が激減するタイプである。二次元模型では安全を保っていたダムでも、この三次元モデルでは、地山の影響がダム下流側で大きく現れ貯留水深を上げたとき、ダム下流の堤体が崩壊した。V字谷モデルの延長上で逆台形のモデルについても実験を行ったがこのタイプはいずれもダム中央軸での浸潤線は二次元モデルより高い。3.このため、V字谷モデルのダム下流側で上昇する浸潤面を押さえるための手段としてダムの法尻から一定幅の水平ドレーンを設置し、この水平ドレーンの埋設率が8%,31%,63%の場合についてその効果を調べた。この結果、ドレーンの設置はダム下流側の浸潤面を低く押さえることができるが、30%ほどの水平ドレーンでもダム天端からドレーン先端間の浸潤面を二次元で得られる水面まで低下させることは出来なかった。4.今後、フィルダムの三次元数値解析を行う上で、コアタイプでは堤体内で不飽和領域が多くなるのでF.E.M.など取り扱いに注意が必要である。このため今年度は、前面コア型フィルダムのコア下面のサヤ土部分の不飽和領域の発生過程について実験的に調べた。この結果、コア土とサヤ土の透水係数比が10倍程度でも不飽和領域はかなりの範囲をもち、この比の増加につれコアの傾斜に関係無くサヤ土における等圧力線が平行に近づくことなどが分かった。今年度は、以下の項目について三次元有限要素法の定式化を行い、数値実験を行った。1.V字谷の地山に築堤される均一型フィルダムの場合(1)前年度までの室内実験により得られている結果によれば、ダム下流側の浸潤面は設計基準で提示される二次元解析で得られる値より高い位置で求められるが、今年度の数値解析においても同様の結果が得られた。

(2)前年度はこの対策として、下流側で生ずる浸潤面の高さを下げるために、ドレーンを配置する事を提案したが、数値解析でこの効果について検討した。この結果、奥行き方向に全幅一杯にドレーンを設置しなくても効果が現れることなどが分かった。2.地山を三角柱とした場合の均一型フィルダムの場合(1)この場合の浸潤面を数値解析により求めた。この結果、浸潤面の形状はダムの堤頂部を過ぎて堤体断面が下流側に広がるにつれ地山方向に向かって低下して行く。一方、浸潤面の中央軸上の浸潤線の高さは二次元解析で得られる値より高い。3.前面コア型フィルダムのコア部に亀裂が生じた場合(1)二次元の場合、コア亀裂の位置が堤体の底に近ければ浸潤面への影響が少ない。一方、この亀裂の位置が水面に近くなればコアの効果は激減し、コア下面以降の浸潤線は、均一型の場合の浸潤線と近似してくる。(2)三次元の場合、コア亀裂部分付近では浸潤面への影響は二次元の場合と同様であるが、亀裂個所から遠ざかると奥行き方向ではコアの効果が発揮され、明らかに二次元解析とは異なる結果が得られた。本研究では、地山を含めたフィルダムの定常浸透流実験と三次元有限要素法の定式化および解析を行った。地山形状モデルとして、Type(1)三角柱モデルおよびType(2)V字谷モデルを設定した。この結果、以下のことなどが明かとなった。1.室内実験(1)地山を有するフィルダムでは地山の特性が浸潤面に直接反映する。(2)Type(1)では、ダムの天端から下流側の範囲で流線が末広がりとなり、Type(2)では、ダムの法先に収束するように流線が得られた。この結果は、二次元では起こり得ない。(3)特にType(2)の場合、設計基準で得られる浸潤線より高い位置に浸潤面が生ずるので地山条件によってはダムの安全上問題が生ずる場合が考えられる。(4)ダム浸潤面の形状には地山角度および勾配の大小とダム堤長の長さが大きく関与する。2.FEM解析実験結果を基に地山角度、勾配さらにダム堤長の長さを変えながら解析した。(1)ダムが二次元浸透流として取扱いできるダム堤長の長さは、影響係数αによって表せる。(2)地山勾配の大小にかかわらず、Type(1)ではダム天端から下流側の範囲で等水位線は天端側に向かって上向きの放物線となる。Type(2)では下向きの放物線となる。(3)これらの結果は実験で得られた傾向と同じであるが、解析では地山角度などの違いによる放物線の曲率の程度を明らかにした。
調和解析に関わる関数空間上の作用素の研究

本研究の目的は、「調和解析に関わる関数空間上の作用素の研究」のテーマの下に各分担者の立場から研究を行うことであった。研究の詳しくは冊子体にあるが、研究概要は、次の通りである。佐藤は、測度空間のローレンツ空間上の作用素の性質について研究した。また、ハンケル変換とヤコビ直交関数系の関係から、ヤコビ直交関数系のローレンツ空間のある作用素について、ハンケル変換上の作用素についての結果の類似を示した。岡安は、作用素の組の本質的定値性,本質的半定値性の研究、正値三角多項式の係数に関するFejerの定理及び関数空間上の正値線形写像に関するKorovkin型の定理に関する研究を行った。森は、有理形写像f : C^m→P^n(C)の除外値の消去の問題で、これまでは、P^n(C)の超曲面の除外値の消去の証明はm=1の場合であったが、今回m【greater than or equal】1の場合も証明できた。水原は、Morrey関数とb lock(関数)およびRieszポテンシャルに関連したLp関数の弱分解定理を示した。また、その結果を応用して、Rieszポテンシャルとの交換子の、Morrey空間上の有界性について、局所可積分関数がBMO関数であることの必要性を示した。仲田は、リーマン球面上のメビウス変換の不連続群における極限集合と有理関数の複素力学におけるジュリア集合に対して、これら特異集合上の不変なt-次元確率測度を用いて、そのハウスドルフ次元の評価について考察した。河村は、カオス写像の測度空間上への写像の一般化と、確率密度関数の変化について研究した。この研究を深化させる過程でヒルベルト空間上の作用素および抽象バナッハ束おける興味ある結果を得た。関川は、有理関数のFatou集合の成分の連結度について,例によって調べた。また、単位開円板からそれ自身の中への正則関数のn次導関数について成り立つある不等式について研究した.本研究の目的は、「調和解析に関わる関数空間上の作用素の研究」のテーマの下に各分担者の立場から研究を行うことであった。また、単位開円板からそれ自身の中への正則関数のn次導関数について成り立つある不等式について研究した.今年度の研究の目的は調和解析に関連する関数空間について、役割分担の立場から各分担者が研究を行うことであった。各分担者の研究は次の通りである。佐藤は、ハンケル変換のローレンツ空間上の作用素の空間及びヤコビ直交関数系のなすローレンツ空間上の作用素の空間の性質をフーリエ変換の作るローレンツ空間上の作用素の空間の性質との比較の観点から研究を行った。岡安は、本質的definite作用素について、同時ユニタリ伸張の可能性について及び正値三角多項式の係数の絶対値の評価について研究し、結果を発表した。森は、ネバリンナ除外値の消去の問題に関し、新しい結果を証明した。また、P.C.HUとの共同研究により先に述べた結果を拡張し、これらの結果を発表した。水原は、一般の増大関数を持つモリー空間上でCalderon-Zygmund作用素との交換子、及びRiesz potentialとの交換子の有界性を示し、結果を発表した。仲田は、リーマン球面上の有理関数の複素力学系において、そのジュリア集合のハウスドルフ次元の評価及びフアトウ集合の性質について考察した。河村は、カオス力学系における確率密度関数の収束、及び作用素環を用いて状態関数の収束の研究を行った。また、1次元カオス力学系において、同相カオス写像が存在するための相空間の特徴付けを行った。そして、結果を発表した。関川は、一般次元のメビウス変換のClifford数を用いた表現に関して、文献を検討し、平面に作用する群との相違点などを研究した。

今年度の研究の目的は、調和解析に関連する関数空間について各分担者の立場から研究を行うことであり、研究内容は、次の通りである。佐藤は、ハンケル変換とヤコビ直交関数系の関係から、ヤコビ直交関数系のローレンツ空間のある作用素について、ハンケル変換上の作用素についての結果からその類似について研究した。岡安は、作用素の組の本質的定値性,本質的半定値性の研究、正値三角多項式の係数に関するFejerの定理及び関数空間上の正値線形写像に関するKorovkin型の定理に関する研究を行った。森は、有理形写像f:C^<rn>→P^n(C)の除外値の消去の問題で、これまでは、P^n(C)の超曲面の除外値の消去の証明はm=1の場合であったが、今回m【greater than or equal】1の場合も証明できた。水原は、Morrey関数とb lock(関数)およびRieszポテンシャルに関連したLp関数の弱分解定理を示した。また、その結果を応用して、Rieszポテンシャルとの交換子の、Morrey空間上の有界性について、局所可積分関数がBMO関数であることの必要性を示した。仲田は、リーマン球面上のメビウス変換の不連続群における極限集合と有理関数の複素力学におけるジュリア集合に対して、これら特異集合上の不変なt-次元確率測度を用いて、そのハウスドルフ次元の評価について考察した。河村は、カオス写像の測度空間上への写像の一般化と、確率密度関数の変化について研究した。この研究を深化させる過程でヒルベルト空間上の作用素および抽象バナッハ束おける興味ある結果を得た。
異種材料の可逆的インターコネクションに関する研究

本研究の目的は、異種材料を低温で直接接合したり、これを逆に接合界面で理想的に分離したりする事ができる可逆的インターコネクションの新しい手法を提案し、開発するものである。本研究で提案する手法は「表面活性化による常温接合」と1)「界面組織の制御」、2)「接合界面の水素吸脱による分離」という概念を組み合わせることにより、常温での直接接合と可逆的分離を同時に実現するものである。1)のコンセプトを実現するためにAlとSUS304ステンレス鋼について実験を行い、2)のコンセプトを実現するためにAlと水素吸蔵合金の1つであるLaNi_<4.5>Al_<0.5>についての実験を行った。さらにこの技術のエレクトロニクス実装への応用を想定して、水素吸蔵合金をインサート層として導入する接合構造を提案した。1:ステンレス-Alの常温接合体は20MPa程度の引張り強度が得られた。接合界面を透過電子顕微鏡により観察した結果、ステンレスとAlは数nmの中間層を介して接合していた事が確認された。接合体の分離は、真空中823Kで2時間加熱した試料は外力を特別に印加する事無しに分離することが可能であった。分離はAlリッチな脆い反応生成物層とAlの間で生じていた。2:薄膜上のインサート層を介した接合体の接合強度試験を引き剥がし法により行った結果、充分な強度が有ることを確認した。これらの接合体を水素雰囲気下に曝した結果、薄膜状のインサート層は膜の形状で銅との界面で剥離し、バルク状のインサート層は粒径約1μmの微粉体となって分離する事を確認した。金属やセラミクスなどの無機材料の接合を接合界面での反応又は組織をコントロールすることで可逆的な接合と分離を可能にする技術を提案し、技術開発を行った。ここで提案する分離技術は、1)脆に反応層の形成による界面の脆化、2)水素吸収による接合体の微粉化による分離、を利用したものである。また、接合はなるべく脆弱な反応層の形成を押さえるために表面活性化による常温接合を行った。適用例として1)の場合は、Alと低炭素オーステナイト系ステンレス鋼(JIS SUS304)、2)の場合はLaNi_<4.5>Al_<0.5>とAlを取り上げた。真空中でアルゴン高速原子線(FAB)を接合材料表面に照射し、オージェ電子分光分析により表面上の不純物元素の変化を観察した。FAB照射に伴いこれらの不純物元素は減少し、減少が飽和するのに要した時間を照射時間とした。接合材料はFAB照射により清浄・活性化した後真空中で圧接された。接合界面の凝着力は表面上の不純物元素の減少とともに増大した。LaNi_<4.5>Al_<0.5>/Al及びSUS304/Alの常温接合は可能であり充分な強度が得られた。SUS304/Alの接合界面を透過電子顕微鏡により観察した結果、ステンレスとAlは常温で接合しても10nm程度の中間層を接合している事が明らかになった。分離実験:1)LaNi_<4.5>Al_<0.5>/Alの接合体を室温で分離するため、高圧水素の容器に導入し30気圧の水素ガスを添加した。接合体のLaNi_<4.5>Al_<0.5>のみが微粉化し分離可能であることが確認された。2)SUS304/ALの接合体を真空中823Kで2時間加熱した結果、接合界面に脆弱な反応層が形成され、外部から応力を加えることなしに分離できることが確認された。分離はAlリッチな脆い反応生脆成物層とAlの間で生じていた。

材料及び部品レベルでのリサイクルを容易に行うために水素を利用して接合体を界面で分離する技術を提案し、実施した。ここで提案する分離技術は、水素を吸収すると膨張し、微粉化する性質を持つ水素吸蔵合金をインサート層としてあらかじめ界面に挿入することにより分離を実現するものである。この技術のエレクトロニクス実装への適用を想定した接続構造を提案し、薄膜状の合金を挿入した構造に関しても検討を行った。まず、このコンセプトを実現するために水素吸蔵合金の一つであるLaNi_<4.5>Al_<0.5>とAlの接合実験を行った。水素と合金の反応は合金の組成に敏感に影響されるため、合金の組成を変えずに接合する必要がある。拡散接合や溶接などでは界面の組成が変化してしまうため、本研究では、表面活性化によるる常温接合を行った。接合材料は真空中での高速原子線(FAB)照射により清浄・活性化した後真空中で圧接された。接合界面の凝着力はFAB照射による表面上の不純物元素の減少とともに増大した。LaNi_<4.5>Al_<0.5>/Alの常温接合は可能であり充分な強度が得られた。この接合体を30kg/cmの水素雰囲気に曝したところ合金が微粉化し、接合界面で分解することが確認された。薄膜状の合金層は厚さ0.31.7μmのものを作成した。薄膜は銅/水素吸蔵合金(LaNi_5)/銅の多層構造を真空中で抵抗加熱蒸着法及びフラッシュ蒸着法により作成した。分離は30kg/cmの水素雰囲気で行った。薄膜状のインサート層を介した接合体の接合強度試験を引き剥がし法により行った結果、充分な強度が有ることを確認した。これらの接合体を水雰囲気下に曝した結果、薄膜状のインサート層は膜の形状で銅との界面で剥離し、バルク状のインサート層は粒径約1μmの微粉体となって分離する事を確認した。
血栓症の成因と病態,とくに血液凝固とその制御機構障害への分子生物学的アプローチ

I.遺伝性異常fibrinogen(Fbg)の解析:平成810年度の3年間に国内外から入手した10余家系について新しい知見(変異型を含む高次構造異常とその機能障害や臨床症状との関係など)が7家系で得られた.これらは各年度毎の報告書にその概要を記載してあるが,ここではこれらを総括して要約する.軽度の出血を示したFbg Caracas IIのFbn電顕像では,疎に結合したfibrin(Fbn)線維が頻回に切断された様相を呈し,形成されたゲルも多くの洞状構造を示していた.一方,出血の他,血栓塞栓症を呈したFbg MarburgのFbnゲルは,極く細かく,分岐に富む線維が緊密な網目構造を作り,水溶液の透過性も低い.このため一旦血栓が形成されると血流阻害に結びつき,血栓症の成因となることが考えられた.またFbn塊が線溶酵素プラスミンに完全に抵抗したことも上の結論を支持している.Fbg Niigat(BβAsn-160→SerとBβAsn-158への余剰糖鎖の付加,Blood投稿中)の電顕像ではFbn線維は著しく湾曲し,余剰糖鎖がプロトフィブリルの側々結合を阻害していることが判明した.実際,酵素処理して糖鎖を除去した所,Fbgゲルの形成障害は著明に改善した.これらの他,血栓症を伴うFbg Pretoria(南アフリカ共和国)で新変異型γCyS-139→Tyr(未発表)を,また国内からの異常分子Kurashiki I,Kamogawqa,Tokyo IVおよびOsaka VIで,いずれも新しい変異型と機能障害,臨床症状との関係を明らかにした(Kurashiki:γGly-268→Glu,Blood 87:4686-4694,1996;Kamogawa:γArg-275→Ser,Thromb Haemostas,印刷中;Tokyo IV,γAla-327→Thr,未発表;およびOsaka VI,Bβ鎖C末12残基の延長,未発表).未発表分子はいずれも1999年8月開催予定の国際血栓止血学会で報告の予定であり,分析終了と共に論文化することにしている.II.接着分子としてのFbnの分子機作:FbgはFbnへと転換されて初め接着活性を示し,線維芽細胞に於ては従来報告されていたβ_3-integrinのみでなくβ_1-integrinにも作用することを見出した(J Biol Chem272:8824-8829,1997).またFbn上でのglioma細胞株の接着・伸展は最初にFbn,次いで細胞自らが分泌したfibronectinと,共にβ_1-integrinを介して2段階に進展するという興味ある所見が得られ,組織修復や腫瘍細胞の転移のメカニズムの一端が明らかになった(Thromb Resに受理され印刷中).またキニノゲンには接着活性の他,これを阻害するという二面性の作用機作が存在し,炎症や血栓の形成と調節に与る新しい機序が示された(J Biochem124:473-484,1998)。I.遺伝性異常fibrinogen(Fbg)の解析:平成810年度の3年間に国内外から入手した10余家系について新しい知見(変異型を含む高次構造異常とその機能障害や臨床症状との関係など)が7家系で得られた.これらは各年度毎の報告書にその概要を記載してあるが,ここではこれらを総括して要約する.軽度の出血を示したFbg Caracas IIのFbn電顕像では,疎に結合したfibrin(Fbn)線維が頻回に切断された様相を呈し,形成されたゲルも多くの洞状構造を示していた.一方,出血の他,血栓塞栓症を呈したFbg MarburgのFbnゲルは,極く細かく,分岐に富む線維が緊密な網目構造を作り,水溶液の透過性も低い.このため一旦血栓が形成されると血流阻害に結びつき,血栓症の成因となることが考えられた.またFbn塊が線溶酵素プラスミンに完全に抵抗したことも上の結論を支持している.Fbg Niigat(BβAsn-160→SerとBβAsn-158への余剰糖鎖の付加,Blood投稿中)の電顕像ではFbn線維は著しく湾曲し,余剰糖鎖がプロトフィブリルの側々結合を阻害していることが判明した.実際,酵素処理して糖鎖を除去した所,Fbgゲルの形成障害は著明に改善した.これらの他,血栓症を伴うFbg Pretoria(南アフリカ共和国)で新変異型γCyS-139→Tyr(未発表)を,また国内からの異常分子Kurashiki I,Kamogawqa,Tokyo IVおよびOsaka VIで,いずれも新しい変異型と機能障害,臨床症状との関係を明らかにした(Kurashiki:γGly-268→Glu,Blood 87:4686-4694,1996;Kamogawa:γArg-275→Ser,Thromb Haemostas,印刷中;Tokyo IV,γAla-327→Thr,未発表;およびOsaka VI,Bβ鎖C末12残基の延長,未発表)

.未発表分子はいずれも1999年8月開催予定の国際血栓止血学会で報告の予定であり,分析終了と共に論文化することにしている.II.接着分子としてのFbnの分子機作:FbgはFbnへと転換されて初め接着活性を示し,線維芽細胞に於ては従来報告されていたβ_3-integrinのみでなくβ_1-integrinにも作用することを見出した(J Biol Chem272:8824-8829,1997).またFbn上でのglioma細胞株の接着・伸展は最初にFbn,次いで細胞自らが分泌したfibronectinと,共にβ_1-integrinを介して2段階に進展するという興味ある所見が得られ,組織修復や腫瘍細胞の転移のメカニズムの一端が明らかになった(Thromb Resに受理され印刷中).またキニノゲンには接着活性の他,これを阻害するという二面性の作用機作が存在し,炎症や血栓の形成と調節に与る新しい機序が示された(J Biochem124:473-484,1998)。a.Fibrinogen(Fbg)の遺伝性変異の解析:Fbg Caracas IIの電顕学的分析で見出されたFbnゲル構造の異常,およびFbg Kurashiki Iで重合障害の分子機作を解明して投稿していた2つの論文が印刷された(業績目録参照).Fbnの重合障害を主徴とするFbg Niigataで糖付加構造を作る新変異型(Bβ-Asn 160→SerとAsn-X-Serの配列形成)を同定した.この変異はヘリックス構造の中央に在ることから,重合障害への余剰糖鎖の関与の模様を次年度に分析の予定である(第16回国際血栓止血学会,Florenceで報告の予定).また,反復する一過性虚血発作で黒内障と診断された患者に見出されたFbg KumamotoでFbnゲルへのthrombinの親和性が著しく低いことが判明した.この為,thrombinを吸着限局化して新たなFbn形成を抑制する機構が障害され,易血栓性に陥っているものと結論し,Thrombosis and Haemostasisに投稿中である.ドイツから解析を依頼されているFbg MarburgではAα鎖150残基の欠如の為,変異Aα鎖にalbumin1分子がdisulfide結合し,これが活性型第XIII因子に触媒されて他のFbnのγ鎖とisopeptide結合による架橋を形成すること,この為Fbn立体構造が変化し線溶酵素plasminに抵抗することが判明した.この患者で観察された出血と血栓形成という二律背反する現象の一部はこの事実に由るものと理解された.この成績は国際血栓止血学会(既出)で報告の予定で,目下投稿を準備中である.b.接着分子としてのFbnの分子機作:線維芽細胞はFbn培地上で接着,進展するが,この時,従来知られていたvitronectin受容体(αvβ3)のみならずβ1-classの受容体を発現する事を見出し,J.Biol.Chem.に投稿,受理された.Fbg→Fbn転換により,接着分子としての活性中心をなす2箇所のRGD配列が露呈されることも判明したことから,血栓形成時に血中に出現するFbn-Fbg複合体上での線維芽細胞の接着伸展を解析し,投稿準備中である.この解析に自家製の抗体JF-43(Blood 88:2109,1996)が威力を発揮した.1.遺伝性異常fibrinogen(Fbg)の解析:初年度から継続している10余家系での分析から,幾つかの新知見が得られたので報告した(研究発表を参照).特記すべき分子として,術後の出血,血栓症,創傷治癒不全というFbgの生理機能に関わる三大徴候をすべて示したFbg Marburg(ドイツからの依頼.Aα鎖C末150
透明導電性酸化物を用いた酸化物超伝導体デバイスの試作研究

本研究は、金属酸化物の透明導電性膜をノーマル金属(N)として用いることにより良質なSNS(S:超伝導体)接合型高温超伝導デバイスを試作することを目的として遂行された。まず、YBa_2Cu_3O_7(YBCO)とインジウムースズ酸化物(ITO)の単独接合の電流-電圧(IV)特性について、ダイオードに対する一般式I=I_0exp(eV/nkT)を用いて解析した。その結果、"判定指数"nは0.50.8となりショットキー接触的であると言う結論に達した。理想的なショットキー接触を仮定して、そのエネルギー障壁の温度依存性を調べると、温度と共に直線的に増加している。これは接合面付近に界面層が存在することを示唆している。基板界面におけるITOの性質を調べるために、その熱処理効果についてXPS測定により化学結合解析を行い、その結果基板に酸化物を用いた場合に熱処理によるイソジウム原子の基板への拡散が抑えられ、ITOがより安定であることを明らかにした。次にN層としてITOとインジウム酸化物(スズを含まない)In_2O_3の2種類を用いたSNS接合の特性を調べた。その結果、両者とも室温では直線性を示し、液体窒素温度ではジョセフソン素子と定性的に一致する特性が得られた。素子特性はIn_2O_3を用いた場合の方が優れているようである。ところで、In_2O_3を用いたSN接合の逆方向特性に微分負性抵抗が現れる場合がある。これはN層の不均質部分での電子なだれ等によるものと考えられ、スイッチング素子として使える可能性もある。以上の結果から透明導電性膜を用いて酸化物超伝導デバイスが作製できることを明らかにした。またYBCO/ITO界面ではショットキー障壁が存在すると考えられ、この効果を利用して従来のノーマル金属を介した接合とは性質を異にする新しいタイプの超伝導デバイスの開発が期待できる。平成5年度は、透明導電材料としてインジウム-スズ酸化物(ITO)を用いて研究を進め、次のような結果が得られた。1)ITOの熱処理効果の基板依存性についてXPS測定により化学結合分析を行い、その結果基板に酸化物を用いた場合に熱処理によるインジウム原子の基板への拡散が抑えられ、ITOが安定であることを明らかにした。この成果はITOの基礎物性と素子への応用との両面で評価されるものと考えている。2)ITO基板上の酸化物Y-Ba-Cu-O(YBCO)薄膜が、液体窒素温度領域で超伝導を示す成膜条件を見い出した。3)YBCO/ITO/YBCO接合を作製し、その電流-電圧特性を測定したところ、weak link型で期待される結果が得られ、SNS接合デバイスができることを示した。ただし下部電極としてのTBCOがbulk(焼結体)と薄膜の場合では特性が異なっている。また臨界電流の温度変化の度合いは通常のSNSと比べ変化が少ない。4)結果3)については、TBCO/ITO界面状態が重要な役割を果たしていると考え、YBCO-ITO単独接合を作製してその電流-電圧特性を測定したところ、TBCO側がプラスとした場合の高バイアス電圧領域で指数関数的に電流が増加するという特性が得られ、また整流性も確認できた。更にこれらの性質は、YBCOが薄膜よりbulkの場合に顕著に観測された。これらの結果は界面におけるショットキー障壁の存在を示唆している。以上の成果から透明導電性膜を利用して酸化物超伝導デバイスが作製できることを実証した。

特に興味ある点は、実験結果からYBCO/ITO界面で何らかのエネルギー障壁が存在すると考えられ、従来のノーマル金属を介した接合とは性質を異にする新しいタイプの超伝導デバイスとなる可能性はあることで、この点を掘り下げることを今後の課題の1つとしたい。昨年度の研究結果から、インジウムースズ酸化物(ITO)を用いて試作したSNS素子における特性は、YBCOとITOとの界面における電子状態が重要な役割を果していると推測される。平成6年度では、次の2つの事柄について研究を進めた。(1)SNS素子の特性を理解するために、YBCO-ITO単独接合のノーマル状態での電流-電圧(IV)特性について解析し、この接合が半導体のpn接合的かショットキー接合的かを検討した。(2)SNS素子のIV特性が、透明導電性酸化物の変化にどのように依存するかを調べた。得られた主な結果次の通り。1)SN素子のIV特性データをダイオードに対する一般式J=Joexp(eV/nkT)(ここでn=1,2はそれぞれショットキー接触的・pn接合的)で解析した結果、"判定指数"nは、0.50.8となりショットキー接触的であると判定される。そこで理想的な接触を仮定してそのエネルギー障壁の温度依存性を調べると、温度と共に直線的に増加している。これは接合面付近に界面層が存在することを示唆している。2)N層としてITOとインジウム酸化物(スズを含まない)In_2O_3の2種類を用いたSN接合について特性を調べた。その結果、In_2O_3の場合の方が非直線性が強く現れ、更に逆方向特性に微分負性抵抗が現れる場合がある。これはN層の木均質部分での電子なだれ等によるものと考えられ、スイッチング素子として使える可能性もある。3)SNS接合について、ITOとIn_2O_3を用いたものとも、室温では直線性を示すのに対し、液体窒素温度ではジョセフソン素子と定性的に一致する特性が得られた。素子特性はIn_2O_3を用いた場合の方が優れているようである。以上の結果から透明導電性膜を用いて酸化物超伝動デバイスが作製できることを明らかにした。またYBCO/ITO界面ではショットキー障壁が存在すると考えられ、この効果を利用して超伝導/縮退半導体デバイスの可能性を示した。
シナプス伝達の分子遺伝学的解析

シナプス伝達の分子遺伝学的解析シナプス伝達が起るためには、伝達物質を含んだシナプス小胞がシナプス前終末の膜と融合して内容をシナプス間隙に放出しなければならない。この過程には多くの蛋白が関与している。SNARE仮説はこれらの蛋白がどのように相互作用するかを示したものである。我々はこの分子機構を、重要な蛋白を欠失したショウジョウバエ突然変異体を用いて研究した。神経型シナプトブレビン(n-syb)はシナプス小胞膜を貫通する蛋白で、テタヌス毒素の標的蛋白である。n-sybを欠失する突然変異体では神経を刺激してもシナプス電流は発生しない。しかしながら微小シナプス電流(mSCs)は残存し、その頻度は高K液中においてCa^<2+>に依存する。またmSC頻度はクモ毒やCa^<2+>イオノフォアーでも増大する。これらの結果はこの突然変異体で残存するmSCはCa^<2+>依存性を持つことがわかった。またcAMPは野生型幼虫ではmSCの頻度を増大させるが、この変異体においては、その作用は見られなかった。したがってn-sybなしでおこる小胞融合にはcAMP依存性がないことがわかった。(Yoshihara et al.,1999)Cysteine-string-protein(CSP)もまたシナプス小胞上にある蛋白であり、電位依存性Ca^<2+>channelと相互作用を持つことが知られている。この蛋白の温度感受性変異体では高温では神経刺激によってシナプス電流が発生しない。そこでその状態においてはCa^<2+>channelが働かないのではないかと考え、Ca^<2+>指示薬を用いて神経終末のCa^<2+>濃度を測定した。その結果csp変異株では32゚では神経終末においてCa^<2+>濃度の上昇が少いことがわかった。さらにシナプス小胞が小胞融合部位にdockしていることが、Ca^<2+> channelが正常に働くために必要なのではないかと考え、シナプス小胞のない状態で神経終末のCa^<2+>濃度の上昇を調べた。shibireは高温において小胞の取り込みが阻害される突然変異体である。したがって高温で刺激するとシナプス小胞が枯渇する。この状態ではCa^<2+>の上昇は見られなかった。(Umbach et al.,1998)シナプス前終末にある代謝型グルタミン酸受容体の活性化により、シナプス伝達が促進されることがわかった。この促進効果はadenylate cyclaseが関与しており、cAMPが増加することによって発現する。したがってadenylatocyclaseの機能が低下している突然変異体rutabagaでは代謝型グルタミン酸受容体活性化の効果がほとんど見られなかった。(Zhang et al.,1999)本研究期間においては次の二つの研究成果が得られた。1)シナプス伝達におけるシナプトブレビンの役割シナプトブレビンはシナプス小胞上にある主要な蛋白であり、シナプス伝達に関与していると考えられている。そこで我々はシナプトブレビンが欠失しているショウジョウバエの突然変異体の幼生において、パッチクランプ法を用いて神経筋シナプス伝達を調べた。神経を刺激して出る誘発性シナプス電流は、試みたどのような条件下でも出なかった。しかし自発性微小シナプス電流は残存し、しかもその頻度は、Caの濃度に依存して変化した。このことからシナプトブレインは誘発性シナプス伝達には不可欠であるが、自発性シナプス小胞の融合には必須ではないことがわかった。2)シナプス小胞のリサイクリングシナプス小胞はその内容物、主として伝達物質、を放出するとリサイクルされて再び伝達物質で満たされることが知られている。そこで我々は色素FMI-43を用いて、ショウジョウバエ突然変異株、shibire、において、このリサイクルの過程を調べた。shibireはリサイクルに必要な蛋白、dynamin、が温度感受性に働かなくなり高温32°では、伝達物質放出後にシナプス小胞が枯渇するためにシナプス伝達が起らなくなる。このようにして完全にシナプス小胞を枯渇させた後常温にもどして色素を取込ませるとシナプス前終末が均一に染る。しかし単に常温で色素を取込ませるとシナプス前終末の表面に近い部分のみが染る。一度色素を取込ませたあと再び刺激して放出させると、前者においては中心部の色素はのこるが後者においては完全になくなる。このことからシナプス小胞には二つのプールがあり、一つは容易に放出し得るプール(readily releasable pool)で、他は極端な条件においてのみ放出されるプール(reserve pool)であると考える。

これらの結果はこの突然変異体で残存するmSCはCa^<2+>依存性を持つことがわかった。またcAMPは野生型幼虫ではmSCの頻度を増大させるが、この変異体においては、その作用は見られなかった。したがってn-sybなしでおこる小胞融合にはcAMP依存性がないことがわかった。(Yoshihara et al.,1999)Cysteine-string-protein(CSP)もまたシナプス小胞上にある蛋白であり、電位依存性Ca^<2+>channelと相互作用を持つことが知られている。この蛋白の温度感受性変異体では高温では神経刺激によってシナプス電流が発生しない。そこでその状態においてはCa^<2+>channelが働かないのではないかと考え、Ca^<2+>指示薬を用いて神経終末のCa^<2+>濃度を測定した。その結果csp変異株では32゚では神経終末においてCa^<2+>濃度の上昇が少いことがわかった。さらにシナプス小胞が小胞融合部位にdockしていることが、Ca^<2+> channelが正常に働くために必要なのではないかと考え、シナプス小胞のない状態で神経終末のCa^<2+>濃度の上昇を調べた。shibireは高温において小胞の取り込みが阻害される突然変異体である。したがって高温で刺激するとシナプス小胞が枯渇する。この状態ではCa^<2+>の上昇は見られなかった。(Umbach et al.,1998)シナプス前終末にある代謝型グルタミン酸受容体の活性化により、シナプス伝達が促進されることがわかった。この促進効果はadenylate cyclaseが関与しており、cAMPが増加することによって発現する。したがってadenylatocyclaseの機能が低下している突然変異体rutabagaでは代謝型グルタミン酸受容体活性化の効果がほとんど見られなかった。(Zhang et al.,1999)シナプス伝達の分子遺伝学的解析シナプス伝達が起るためには、伝達物質を含んだシナプス小胞がシナプス前終末の膜と融合して内容をシナプス間隙に放出しなければならない。この過程には多くの蛋白が関与している。SNARE仮説はこれらの蛋白がどのように相互作用するかを示したものである。我々はこの分子機構を、重要な蛋白を欠失したショウジョウバエ突然変異体を用いて研究した。神経型シナプトブレビン(n-syb)はシナプス小胞膜を貫通する蛋白で、テタヌス毒素の標的蛋白である。n-sybを欠失する突然変異体では神経を刺激してもシナプス電流は発生しない。しかしながら微小シナプス電流(mSCs)は残存し、その頻度は高K液中においてCa^<2+>に依存する。またmSC頻度はクモ毒やCa^<2+>イオノフォアーでも増大する。
間葉系幹細胞におけるHLAクラスIb分子発現機構の解明と細胞移植療法への応用

本研究は、HLAクラスIb分子群(HLA-E, HLA-F, HLA-G)がヒト骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)が有する免疫調節作用に関与する可能性を想定し、BM-MSCにおけるそれらの発現様式を検討するとともに、その薬理学的な制御方法を探索することを目的として実施された。HLAクラスIb分子のmRNAの発現を定性的・半定量的に評価する系を確立するとともに、高感度ELISAやフローサイトメトリーによってHLAクラスIb分子の蛋白発現を評価する系を確立したが、今回の検討に用いたMSCにおいてはHLA-E以外のHLAクラスIb分子の細胞表面における蛋白発現を確認することはできなかった。今後、骨髄以外の組織に由来するMSCにおけるHLAクラスIb分子の発現に関してもさらなる検討が望まれる。本研究の目的は、ヒト間葉系幹細胞(MSC)におけるHLAクラスIb分子の発現調節機構を検討するとともに、その薬理学的・生化学的な制御方法を探索することを通じて、MSCの特性を利用したさらに有効性の高い細胞治療法開発のための基礎的知見を得ることである。平成22年度の研究では、まず、ヒト骨髄由来MSC・歯髄由来MSC・造血器系細胞株を用いてHLA-E,-F,-G mRNAの発現をRT-PCR法等を用いて定性的・半定量的に評価する系を確立した。また、高感度ELISA、フローサイトメトリー等によってHLA-E,-F,-Gの蛋白発現を評価する系の確立を目指したが、この経過中に、特にHLA-Gの測定系において過去の文献で用いられていた実験方法に問題点があることが判明した。そこで、研究協力者らとELISAおよびイムノブロット法による適正なHLA-G蛋白の検出系を開発し、それらの方法を用いて、骨髄由来MSC・歯髄由来MSCにおけるHLA-G蛋白の発現を確認したところ、いずれにおいても、未刺激下ではHLA-Gの蛋白発現をほとんど検出できないことが判明した。次いでIL-10存在下で骨髄由来MSCを培養した後の、培養上清・細胞溶解物を用いて同様の検討を行ったが、いずれからもHLA-Gを検出することはできなかった。今後は、次年度以降の研究において、HLA-E,HLA-F蛋白の発現を正確に検出するための測定系を確立する予定である。平成23年度の研究実施計画では、ヒト骨髄由来MSCにおけるHLA-E,-F,-GのmRNAおよびタンパク発現の検討を行うとともに、MSCに発現するこれらのHLAクラスIb分子の免疫調節機能の検討を行うことを目標とした。まず、ヒト骨髄由来MSC・歯髄由来MSC・造血器系細胞株を用いてHLA-E,-F,-G mRNAの発現を定性的・半定量的に評価する系を確立するとともに、高感度ELISA、フローサイトメトリー等によるHLA-E,-F,-Gの蛋白発現を評価する系を確立することに成功した。また、既に他の多くの研究グループによって報告されているHLA-Gタンパクの検出系に特異性の上で問題があることが判明したため、造血器系細胞株等を用いて検出方法の改良を試みたところ、既報と異なり、MSCの細胞溶解物・培養上清中のHLA-Gタンパクは存在してもきわめて微量であることが判明した。この成果は、これまでの文献報告におけるHLA-Gの意義を再考する契機となる重要な知見と考えられる。また、HLA-Fの発見者であるD.Geraghty博士より、それぞれ異なったエピトープを認識する3種類のHLA-Fに対するモノクローナル抗体を入手し、細胞表面にHLA-Fを構成的に発現する造血器系細胞株を見出すことに成功した。胎盤以外の組織では、通常HLA-Fは細胞質内に分布し、その細胞表面への発現はきわめて限定的な条件下でしか起こり得ないと考えられてきたため、HLA-Fを構成的に細胞表面に発現する細胞株を見出すことができたことは非常に画期的と考えられる。本研究は、ヒト間葉系幹細胞(MSC)におけるHLAクラスIb分子の発現様式を検討するとともに、その薬理学的・生化学的な制御方法を探索することを通じて、MSCの特性を利用した有効性の高い細胞治療法開発のための基礎的知見を得ることを目的として実施された。本研究の成果として、ヒト骨髄由来MSC・歯髄由来MSC・造血器腫瘍

由来細胞株を用いてHLA-E, -F, -G mRNAの発現を定性的・半定量的に評価する系を確立するとともに、高感度ELISA、フローサイトメトリー等によるHLA-E, -F, -Gの蛋白発現を評価する系を確立することに成功した。しかし、その過程において、従来から多くの研究グループによって報告されているHLA-Gタンパクの検出系に特異性の上で問題があることが判明した。そのため、造血器系細胞株等を用いて検出方法の改良を試みたところ、既報と異なり、MSCの細胞溶解物・培養上清中のHLA-Gタンパクはきわめて微量にしか存在しないことが判明した。この成果は、これまで報告されてきたHLA-Gタンパク検出の真偽性を再考する契機となる重要な知見になると考えられるため、今後、臍帯血・脂肪細胞等に由来するMSCにおけるHLA-Gタンパクの発現についても検討を行いたいと考えている。HLA-Fについては、それぞれ異なったエピトープを認識する3種類のモノクローナル抗体を入手し、細胞表面にHLA-Fを構成的に発現する造血器系細胞株を見出すことに成功した。胎盤以外の組織では、通常HLA-Fは細胞質内に分布し、その細胞表面への発現はきわめて限定的な条件下でしか起こり得ないと考えられてきたため、HLA-Fを構成的に細胞表面に発現する細胞株を見出すことができたことは非常に画期的と考えられるが、本研究の実施期間中においては、MSCの細胞表面におけるHLA-Fの発現を確認することはできなかった。当初の予想と異なり、今回の研究で使用したMSCにはHLA-G蛋白およびその可溶化アイソフォームのいずれの発現も確認されなかったため、HLA-Gを介するMSCの免疫調節機能の解析を行うことは困難となった。一方、HLA-F蛋白の細胞表面への発現をフローサイトメトリーを用いて検出することが可能となったため、今後MSCにおけるその発現解析を通じてHLA-Fの新しい機能を見いだせる展望が得られつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究結果を踏まえ、本年度は当初の研究計画を変更し、現在までにすでにHLA-E,HLA-F蛋白の細胞表面への構成的な発現が確認された造血器系細胞株を用いて、各種のサイトカインの影響を含むHLA-E,HLA-Fの発現制御機構についての検討を継続する。また、造血支持能等を指標とした間葉系幹細胞機能の半定量的アッセイを利用し、間葉系幹細胞に発現するHLA-E,HLA-Fが造血支持能や免疫調節能に関与している可能性を検討する。さらに、現在、連携研究者とスクリーニングを進めている間葉系幹細胞の機能腑活化物質が、HLA-E,HLA-Fの発現量を制御し得るかについても検討を行う。