hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SiCの2次非線形光学定数精密測定

SiCの値11.7pm/Vが小さく,理想的な正四面体配位からのずれの度合いで説明されることがわかった.以上より,SiCを用いた波長変換デバイスの正確な設計および評価が可能となり,今回得られた成果の意義は大きいと考えられる.SiCはSiにくらべ絶縁破壊電圧が10倍,熱伝導率が3倍大きく,バンドギャップエネルギーも3.2eVと大きいことから,可視光発生用高出力波長変換材料の決定版になる可能性がある.しかしながら,波長変換の効率を決定づける2次非線形光学定数については,過去の報告の間でばらつきがきわめて大きく,値が確定していなかった.この原因は,測定に用いられた試料の品質と測定法との両方にあると考え,本研究は高純度高品質結晶と精密測定法を用い,Sicの2次非線形光学定数を正確に決定することを目的として行っている.これまでに,基本波光源に波長1.064μmのQスイッチNd : YAGレーザを用い,(0001)面および(11-20)面試料に対し,回転型Makerフリンジ法とウェッジ法の2種類の手法で測定を行った.回転型Makerフリンジ法では平行平板試料内でのビームの重なりのズレまで考慮した多重反射効果解析手法を確立し,ウェッジ法では,異なるメーカー製の2種類の6H-SiCと1種類の4H-SiCを用い,測定結果に対して多重反射効果を考慮した解析を行った.その際に必要となる屈折率は測定データより間接的に得た値を用いていたが,解析の精度をさらに向上すべく,屈折率の直接精密測定を可能とするシステムを構築した.その結果,1cm角サイズの試料が得られる結晶では±10^4以下の精度で屈折率を決定でき,小さな口径の試料しか得られないSiCに対しても高精度屈折率測定を遂行する目途がついた.これにより,波長変換デバイスの正確な設計および評価が可能となるため,今回得られた成果の意義は大きいと考えられる
下肢機能評価手法と下肢運動認知能力指標を用いた足部機能の複合的評価システムの構築

本研究では、下肢機能評価手法と下肢運動認知能力指標を用いた足部機能の複合的評価システムの構築を目的とした。特に下肢機能と足爪の観測情報の関係、下肢機能と足爪異常の関係および跨ぎ動作における足部位置について、検討した。その結果、足爪異常と歩行能力、足部柔軟性に相関関係が認められた。跨ぎ動作における足部位置については、二つの障害物を跨ぐ動作は、三歩で跨ぐ群と二歩で跨ぐ群の特徴がわかった。平成27年度は、これまでに得られた実験結果を解析し、下肢の運動認知能力を測定する運動課題の1つとして「跨ぎ動作」を3次元位置測定装置により検討するための準備を行った。跨ぎ動作を評価する先行研究では、障害物を跨ぐ戦略が障害物を跨ぐ二歩手前で決まると報告している。しかし、先行研究では、障害物の設置位置が全ての対象者に対して同じ条件で行っている。つまり、障害物間の距離は、各対象者の歩幅に合わせて設置する必要がある。本研究では、複数の障害物を用いて障害物間の距離を各対象者の2ステップ長とした。解析した実験結果では、若年者を対象にheel-distanceおよびtoe-distanceに関する分析を行った。平成27年度は、3次元位置測定装置の購入に時間がかかり、一時期停滞してしまった。さらに購入後も実験環境の再検討や環境の整備などの必要性が生じたため、当初の予定より遅れている。平成28年度では、27年度に予定していた実験を行いデータ取得およびシステム構築の検討を行う。高齢者の転倒は社会的問題であり、対策として転倒予防が求められる。これまでに、日本では介護予防が提案され身体機能向上の試みとして、運動指導などの実施が行われている。しかし、いまだに決定的な転倒予防の方法は明らかではなく、定量的評価手法すら確実でない。本研究では、転倒リスクを推定する足部機能の複合的評価システムの構築を目的とした。主に、足部機能の評価には、歩行能力、下肢筋力、足部柔軟性の評価が可能な下肢機能評価手法により解析を行った。さらに足爪の観測情報では、足爪の形態評価が可能な足爪評価アプリケーションにより解析したところ、足爪異常が少なくなることで、下肢機能評価指標における歩行能力、足部柔軟性が向上することが明らかになった。このように、下肢機能と足爪の観測情報を用いることで下肢機能の向上の変化をとらえることができた。また、足指に機能不全がある400名以上の高齢者に聞き取り調査を実施したところ、歩行中における「つまづき」から転倒を経験した高齢者が多くいることがわかった。つまり、下肢機能評価手法、足爪の形態評価に加えて、「つまづき」の動作に着目し、下肢の運動認知能力を測定する運動課題の1つとして跨ぎ動作について検討した。その結果、複数の障害物を設置した場合、Toe-Distanceに影響を与えることを確認した。さらに複数の障害物を設置した場合、障害物を回避する戦略が大きく分けて二つあることを確認した。今後、障害物の設置条件を増やして障害物を回避する戦略が他にあるか検討する。また、下肢機能評価指標、足爪評価、またぎ動作の評価結果を自動化することで簡易システムになると考えられる。平成28年度の前半は、実験準備を早急に行う。さらに実験を行いデータの取得を開始する。平成28年度後半では、これまでに得られたデータも合わせて、下肢の運動認知能力を推定するシステム構築の検討を行う。研究成果については、こまめにまとめ学会発表あるいは論文投稿を行っていく予定である。学会は3件/年、論文は1編/年程度を目標に行っていく予定である。生活支援工学平成27年度は計画の遅れがあったことと、謝金を使用する必要が無かったために、次年度使用額が生じた。実験協力者への謝金、計算機周辺パーツ、学会発表のための旅費、論文投稿料として使用する。
閉塞性睡眠時無呼吸症候群の診断法の検討

閉塞性睡眠時無呼吸症候群の発症要因の一つに、上気道の解剖学的異常がある。その治療法の一つである口蓋垂軟口蓋咽頭形成術Uvulopalatopharyngoplasty(UPPP)は主に、中咽頭レベルの狭窄に有効な手術法と考えられるが、その手術を行なった場合、一般に有効率は50ないし60%と言われている。現在、我々術者にとって最大の関心事は、いかに的確な閉塞部位診断を術前に行ない、手術効果の予測性を把握し、適切な治療法を選別するかであり、そのためのセファロメトリー(咽頭顔面×線規格写真)の有用性について報告してきた。従来のセファロメトリーは各測定点間の距離と角度との検討であったが、本研究は、術前のレントゲン側面像について軟口蓋、口腔、舌、咽頭の側面積の測定を行ない、術前の治療効果の予測および術後の面積の評価を二次元的な検討で行なった。対象は、睡眠時呼吸障害、昼間の睡眠傾向、あるいは、いびきを主訴とする成人患者である。セファロメトリーを施行し、レントゲン写真をトレースして、スキャナーで画像を取り込み、MacintoshコンピュータでFlexl Trace1.02を使用し軟口蓋、口腔、舌、咽頭の側面積を測定した。各測定値について平均と標準偏差を求め、異なる患者群間でf検定による統計学的検討を行った。これらの結果をもとに、解剖学的異常の把握と、術後の治療効果の検討を行なった。
化学処理神経片で用いた末梢神経同種移植に関する実験的研究

末梢神経の修復において、自家神経移植では修復する神経が太い場合や大量の移植神経を必要とする場合には十分量の移植片が得られず、また足関節および足底外側部の知覚障害を引き起こす。同種移植ではそれらの欠点が克服できるが、免疫反応により神経再生がさまたげられるため移植片の抗原性を低下させて拒絶反応を低減し、基底膜などの軸索再生に快適な環境を残す処理方法の探究が求められる。われわれは移植神経にエタノールによる化学処理を加えることで抗原性をもつ蛋白成分などを変性させ、神経再生に必要とされるラミニンをもつ基底膜を温存する方法の開発研究を開始し、家兎において比較的良好な神経再生を認めた。しかし、その再生状態は自家移植に及ばず、今後処理方法の改善がのぞまれた。本実験ではエタノール処理方法に改善を加え、各処理段階での処理神経を組織学的、生化学的に検索した。最初は50%100%エタノールで各4時間ずつ段階的に処理を加えると処理神経内の基底膜上のラミニンの免疫組織化学による反応は減少し、形態学的にも膜の硬化を認め移植後の軸索再生も満足すべきものではなかった。そこで処理濃度の上限を90%ととし、処理を2回くりかえすことで処理不足を補う方法で改善を試み、処理神経内には残液が残るもののラミニンンを十分に残した基底膜を温存することができた。またラット座骨神経を用いた移植において移植後3か月で腓腹筋より良好な活動電位を導出し、組織学的にも良好な軸索再生を得た。1)アルコール段階処理神経の組織学的検索:1991年に平澤らの報告したアルコールを用いた移植神経片段階的方法に準じてラット坐骨神経に対して処理を行い、その横断面を光顕および電顕による組織学的検索と抗ラミニン抗体を用いた免疫組織化学による検索を施行し、抗原性の抑制の可能性と神経再生の足場となる可能性について評価した。処理神経の神経周膜はその形態および連続性を保ち、神経束内では細胞成分は処理を受け変性し、軸索内部も同様に変性処理され空洞化しており、抗原性の低下が予測された。また髄鞘はシュワン細胞の基底膜を含む膜状構造物が処理されずにほぼ連続性を保って残されており、神経再生にとってよい環境を残しているものと思われた。またラミニンによる免疫組織化学では組織学的に観察された残された膜状組織に一致してほぼ均一な染色性を認め、基底膜に存在するラミニンが処理後も良好に残されていた。2)家兎を用いた処理神経移植実験:家兎坐骨神経に対して同処理を施した処理神経移植を行い、移植後3カ月で灌流固定後に移植片を摘出し、その横断面を光顕および電顕で観察評価した。移植神経内に再生神経が多数伸長してきているが、神経束全体の軽度萎縮を認め、周膜外に再生軸索のherniationが認められ、処理がやや強すぎる可能性が示された。再生軸索の髄鞘形成および内部の形態は良好であった。また再生軸索はシュワン細胞の基底膜に沿って伸長している像がみられた。同種移植末梢神経片に対して、エタノールにて50%,50%→70%,70°→70%→90%,50%→70%→90%→100%処理を各4時間ずつ加えて、変性させた各処理神経片を組織学的検索(横断面の光顕及び電顕による観察)、抗ラミニン抗体を用いた免疫組織化学,ハイドロキシプロリン法によるコラーゲン量の定量により評価した。またそれぞれを移植し、12週后に移植片を摘出して光顕及び電顕にて観察した。<結果>エタノールによる処理が進行するにしたがって移植神経片内の細胞成分の変性処理が進行したが、膜性分は温存され、ラミニンによる免疫組織化学でもラミニンは残存していた。コラーゲン含有率は処理とともに上昇した。新鮮同種移植よりも再生は良好であったが、自家移植よりも劣っていた。<考察>

処理が進行しすぎると、膜の硬化萎縮がすすむため再生に悪影響があるものと思われた。適当な濃度までの処理方法の検索が必要であると考えられた。以上の結果はH5、日本整形外科学会基礎学術集会で発表した。末梢神経の修復において、sural nerve等を用いた自家神経移植では、修復を必要とする神経が太い場合や腕神経叢損傷に対する修復時などに大量の移植神経を必要とする場合などには十分量の移植片が得られず、また足関節および足底外側部の知覚障害を引き起こす。同種移植が可能となれば、移植に必要な太さおよび量の神経移植片が得られる。しかし免疫反応により神経再生がさまたげられるため、移植片の抗原性を低下させて拒絶反応を低減し、基底膜などの軸索再生に快適な環境を残す処理方法の探求が求められている。われわれは移植神経にエタノールによる化学処理を加えることで抗原性をもつ蛋白成分などを変性させ、神経再生に必要とされるラミニンをもつ基底膜を温存する方法の開発研究を開始し、家兎において比較的良好な神経再生を認めた。しかし、その再生状態は自家移植に及ばず、今後処理方法の改善がのぞまれた。本実験ではエタノール処理方法に改善を加え、各処理段階での処理神経を組織学的・生化学的に検索した。最初の50%100%エタノールまで各4時間ずつ段階的に処理を加えると処理神経内の基底膜上のラミニンの免疫組織化学による反応は減少し、形態学的にも膜の硬化を認め、移植後の軸索再生も満足すべきものではなかった。そこで処理濃度の上限を90%とし、処理を2回繰り返すことで処理不足を補う方法で改善を試み、処理神経内には残査が残るもののラミニンを十分に残した基底膜を温存することができた。またラット坐骨神経を用いた移植において移植後3カ月で腓腹筋より良好な活動電位を導出し、組織学的にも良好な軸索再生を得た。
南部アフリカの白人女性文学における「白人家庭」の人種/ジェンダーの政治学

2004年度は都内で毎月開かれている「アフリカセミナー」第67回(6月19日)にて「J.M.Coetzee(南アフリカ)のDisgrace(邦題『恥辱』)(1999)における土地へのまなざし」というタイトルで発表した。秀逸なOlive Schreiner論を展開したCoetzeeの現代の南アを舞台にした作品において描かれる、土地とそこに生きる「白人の家庭」の政治学を通して、Schreinerの描く約一世紀前の白人家庭表象研究に寄与する考察が可能になった。また、9月2-17日まで南アフリカのケープタウン大学とイギリスのロンドン大学で資料収集に努めた。主にSchreinerの未完の大作であるFrom Man to Manが扱う「白人家庭」内の人種とジェンダーの問題を今までのようなイギリス帝国主義的な背景からではなく、南アフリカの白人女性の自己形成という視点から捉えようとする上で欠かせない資料を入手した。それは、当時Schreinerも関心を寄せていた南アフリカのBlack Peril(黒人男性による白人女性への性的暴行)の問題とそれをはるかに上回るWhite Peril(白人男性による黒人女性への性的暴行)に関するものであった。尚、2005年にミネルヴァ書房から刊行予定の図書に、Schreinerのthe Story of an African Farmについて原稿を執筆したが、今までの研究成果が生かされた内容となっている。2002年度は8月にジンバブエのInternational Bookfairに参加して資料を集め、その後、南アフリカ共和国のGrahamstownにあるNational English Literary Muserumにおいて研究調査を行い、南部アフリカの白人女性作家についての様々な文献を収集した。その資料を活用し、今年度は、特にOlive Schreinerの小説The Story of an African Farmに的を絞り、その白人家庭における人種観、女性観とダーウィニズムとの関係を1つの基礎的な研究として行った。その結果、作品の中でダーウィニズムが人種やジェンダーに関する進歩的な思想に深く影響を与えていながら、かつその人種差別思想にも深く関連しているというその相反する影響力が明らかにされた。さらに、ダーウィニズムが南アフリカという特異な風景の中にある白人家庭全体の表象の重要な思想的背景であることが究明された。この研究結果は、2003年3月6-9日にボストンで開催されたNEMLA(Northeast Modern Language Association)の年次学会にて"Darwinism and South African Landscape Descriptions"というタイトルで発表され、貴重なフィードバックを得た。現在、その発表原稿を元にして投稿用の論文を執筆中である。
シングルフォトンエミッションCTによる局所脳血流測定についての基礎的, 臨床的研究

シングルフォトンエミッションCT(HEADTOME)による局所脳血流(rCBF)の測定に関する基礎的課題として,画質,およびrCBF測定値の精度の向上について検討した.臨床的には,痴呆患者のrCBFを測定し,健常者のrCBFとの対比も行った.1.基礎的課題について:Xe-133のγ線エネルギーは81KeVと低いため,深部での空間分解能と定量性が著しく劣化する.これを改善するために, 81KeVのphoto peakに対し, 75110KeVの非対照なウィンドウレベルを設定した.更に, 128個のシンチレーション検出器のウィンドウレベルのチェックと調製を容易にする機構を開発した.これによって,分解能はFWHMで15mmと大巾に改善された. rCBF測定値の精度を左右する因子として, Xe吸入装置の設定と吸入法,頭部データ収集の開始時期,及び鼻腔内Xeの散乱線が考えられた.これらの因子を詳細に解析し,誤差や不安定要素が最小となる対策を検討し実施した.この対策により,測定手技に起因する測定誤差も著明に改善された.炭酸ガス分圧(PaCO_2)が脳血流を鋭敏に左右する事はよく知られているが,日常検査では動脈血採血を要するためその補正は省かれているのが現状である.マウスピースによる呼吸は,呼吸パターンの変動をもたらし,それによるPaCCO2の変動は脳血流測定上無視出来ない程大きい事がわかった.煩雑な動脈血採血を伴わないで呼気ガス中の炭酸ガス濃度による脳血流補正法を確立した.この補正により,特に経過追跡間の軽微な変動の測定精度が向上した.2.臨床的課題について:アルツハイマー病(AD),多発梗塞性痴呆(MID)のrCBF像を撮り, ADでは側頭頭頂部の特異的な低下, MIDではひまん性の低下パターンを示す事がわかった.又, AD患者の側頭頭頂部のrCBF低下の程度は長谷川式痴呆スケールによる痴呆の程度と極めて強い相関が認められた.精神神経疾患への応用も可能となった.シングルフォトンエミッションCT(HEADTOME)による局所脳血流(rCBF)の測定に関する基礎的課題として,画質,およびrCBF測定値の精度の向上について検討した.臨床的には,痴呆患者のrCBFを測定し,健常者のrCBFとの対比も行った.1.基礎的課題について:Xe-133のγ線エネルギーは81KeVと低いため,深部での空間分解能と定量性が著しく劣化する.これを改善するために, 81KeVのphoto peakに対し, 75110KeVの非対照なウィンドウレベルを設定した.更に, 128個のシンチレーション検出器のウィンドウレベルのチェックと調製を容易にする機構を開発した.これによって,分解能はFWHMで15mmと大巾に改善された. rCBF測定値の精度を左右する因子として, Xe吸入装置の設定と吸入法,頭部データ収集の開始時期,及び鼻腔内Xeの散乱線が考えられた.これらの因子を詳細に解析し,誤差や不安定要素が最小となる対策を検討し実施した.この対策により,測定手技に起因する測定誤差も著明に改善された.炭酸ガス分圧(PaCO_2)が脳血流を鋭敏に左右する事はよく知られているが,日常検査では動脈血採血を要するためその補正は省かれているのが現状である.マウスピースによる呼吸は,呼吸パターンの変動をもたらし,それによるPaCCO2の変動は脳血流測定上無視出来ない程大きい事がわかった.煩雑な動脈血採血を伴わないで呼気ガス中の炭酸ガス濃度による脳血流補正法を確立した.この補正により,特に経過追跡間の軽微な変動の測定精度が向上した.2.臨床的課題について:アルツハイマー病(AD),多発梗塞性痴呆(MID)のrCBF像を撮り, ADでは側頭頭頂部の特異的な低下, MIDではひまん性の低下パターンを示す事がわかった.又, AD患者の側頭頭頂部のrCBF低下の程度は長谷川式痴呆スケールによる痴呆の程度と極めて強い相関が認められた.精神神経疾患への応用も可能となった.シングルフォトンエミッションCT(HEABTOME)による局所脳血流(rCBF)の測定に関し、昨年の基礎的研究に引き続き次の項目について検討を行った。(1)呼気中炭酸ガス濃度(%【CO_2】)と動脈血炭酸ガス分圧(Pa【CO_2】):脳血流はPa【CO_2】に大きく左右されるため、rCBFの論議にはPa【CO_2】の測定が必須とされている。呼気ガスモニター装置による、rCBF測定中の呼気中%【CO_2】を連続的に則定しているが、その値と、同時に採血した動脈血のPa【CO_2】とを比較した。その結果、%【CO_2】Pa【CO_2】は、相関係数:r=0.92の極めて強い正の相関を有する事が確認された。従って、PA【CO_2】の代りに%【CO_2】を用い、Pa【CO_2】の指標とする事が実用上可能であると考えられた。(2)老年健常グループのrCBF:6778才(平均71.6±4.2才)の健常ボランティアのrCBF、%【CO_2】及び簡易知的精神機能スケール(長谷川DRスケール)を測定した。

平均rCBFは50.7±7.2ml/100g・minで、3565才のグループ(51.2±7.1)と比し有意の差はなかった。又、rCBFの年令や長谷川DRスケールとの相関は各々r=-0.34、r=0.26で、有意の相関は認められなかった。しかし、rCBFの%【CO_2】との相関はΥ=0.87の強い正相関が認められた。(3)痴呆症例のrCDF:アルツハイマー病(AD)、アルツハイマー型(SDAT)及び多発梗塞性痴呆(MID)についてrCBFと長谷川DRスケールを測定した。平均rCBFは、いづれの痴呆でも健常グループに比べ有意に低かった。ADとSDATでは平均rCBFは長谷川DRスケールの低下の程度に比例して低下したが、MIDではその傾向は明らかでなかった。ADでは両側の側頭、頭頂菊後部のrCBF低下が目立ち、その領域のrCBFは長谷川DRスケールと特に強い相関(Υ=0.87)が認められた。以上のような検討により、病態によるrCBFの変化を、より鋭敏に測定、評価する為の指標が大分明確になってきた。
ALK1下流遺伝子TMEM100の新規転写制御機構と血管形態形成における意義

ALK1シグナル伝達系は血管形成に必須であり、ヒト血管疾患の病因・病態に重要な意義を有する。その下流因子として新たに同定されたTMEM100の欠損マウス胎仔は、重篤な血管形成異常を示して死亡するが、その細胞レベルの研究はほとんど行われていない。TMEM100は既知のALK1系下流遺伝子群と異なる発現制御様式を有することが我々の先行研究で示唆された。そこで本研究では、TMEM100の内皮エンハンサーを同定し、それを介した転写制御機構を明らかにするとともに、胎生致死性を回避した誘導型内皮特異的欠損マウスを用いた血管形成解析によって血管形態形成におけるTMEM100の意義の解明を試みる。本研究は、ALK1シグナルの新規下流遺伝子TMEM100について、(課題1)血管内皮特異的発現制御機構および(課題2)血管形成における分子機能の解明を目指している。TMEM100は典型的なALK1下流遺伝子群と異なり、SMAD転写因子による直接の転写制御を受けないことが、所属研究室の先行研究により明らかになっている。さらに、Bacterial Artificial Chromosome(BAC)-トランスジェニック(Tg)マウスを用いたレポーター解析により、これまでにマウスTmem100およびヒトTMEM100遺伝子の両者において遠位に存在する内皮細胞特異的エンハンサーの同定に成功している。課題1では、同定したTmem100内皮細胞特異的エンハンサーを制御する転写因子を同定するため、Luciferaseレポーター解析およびLacZレポーターTgマウス解析により内皮細胞での遺伝子発現制御において主要な役割を担っている転写因子を候補としてエンハンサー活性における機能を検討した。その結果、複数の転写因子がエンハンサー活性に重要であることを示唆する結果が得られた。また、課題2ではTmem100の誘導型内皮特異的欠損マウス(iECKO)を作出し、胎生致死性を回避した網膜血管形成解析系を導入・確立した。Tmem100iECKO新生仔マウス網膜では血管新生の遅延をはじめとした様々な血管形成異常が観察された。さらに、内在性Tmem100-LacZノックインマウスを用いて新生仔網膜におけるTmem100の発現パターンを解析した結果、Tmem100が動脈内皮細胞特異的且つ経時的に特徴のある局所発現パターンを示すことが明らかになった。以上に示すように、TMEM100の発現制御機構および分子機能の解明に向けて順調に研究を進めている。課題1においては当初の計画通り、in vitroおよびin vivoの検証によりTmem100の内皮細胞特異的エンハンサーを制御する候補転写因子を特定することができた。今年度はそれら候補転写因子とTmem100内皮細胞特異的エンハンサーの直接結合や、候補転写因子欠損によるTmem100の発現減少を証明する必要がある。課題2については、新生仔網膜解析系を用いてTmem100の発現パターンおよび欠損による表現型が確認できた。今後は引き続きTmem100の血管形成過程での生命現象における役割を明らかにすることを目指し、より詳細な表現型解析に加えTmem100欠損で影響を受ける下流因子の探索も行う。これらの項目について本年度内の完了は妥当であると考える。研究実績に記載の通り、TMEM100の内皮細胞特異的エンハンサー領域内で複数の転写因子が発現制御に関わっていることが示唆されたため、本年度はChIP解析によりTMEM100内皮細胞特異的エンハンサーの候補転写因子への結合を証明するとともに、この転写因子欠失マウスにおけるTmem100発現解析を行う。また、候補転写因子結合配列を含むTmem100内皮細胞特異的エンハンサー領域をCRISPR/Cas9遺伝子編集により欠失したマウスでTmem100発現変化を解析する。これらの検討から、課題1ではALK1シグナルによる発現制御のみでは説明できなかったTMEM100の血管内皮特異的発現機構を明らかにすることを目指す。課題2では、Tmem100の内皮細胞における欠損により網膜血管発生異常を示すことを確認したため、今後は引き続き細胞レベルの詳細な表現型解析を行う。特に、Tmem100欠損が引き起こす内皮細胞異常により生ずる壁細胞動員能への影響に着目する。この解析から得られた表現型が胎生期のTmem100欠損による血管発生異常においても共通して生じているか明らかにするため、網膜に加えてTmem100欠損マウスの胎仔・yolk sacも用いて検証を進める。さらに、Tmem100iECKOマウスから内皮細胞を単離し、RNA sequencingにより網羅的遺伝子発現解析を行うことでTmem100欠損によるシグナル伝達異常の解明を試みる。本研究は、ALK1シグナルの新規下流遺伝子TMEM100について、(課題1)血管内皮

特異的発現制御機構および(課題2)血管形成における分子機能の解明を目指している。TMEM100は典型的なALK1下流遺伝子群と異なり、SMAD転写因子による直接の転写制御を受けないことが、所属研究室の先行研究により明らかになっている。さらに、Bacterial Artificial Chromosome(BAC)-トランスジェニック(Tg)マウスを用いたレポーター解析により、これまでにマウスTmem100およびヒトTMEM100遺伝子の両者において遠位に存在する内皮細胞特異的エンハンサーの同定に成功している。課題1では、同定したTmem100内皮細胞特異的エンハンサーを制御する転写因子を同定するため、Luciferaseレポーター解析およびLacZレポーターTgマウス解析により内皮細胞での遺伝子発現制御において主要な役割を担っている転写因子を候補としてエンハンサー活性における機能を検討した。その結果、複数の転写因子がエンハンサー活性に重要であることを示唆する結果が得られた。また、課題2ではTmem100の誘導型内皮特異的欠損マウス(iECKO)を作出し、胎生致死性を回避した網膜血管形成解析系を導入・確立した。Tmem100iECKO新生仔マウス網膜では血管新生の遅延をはじめとした様々な血管形成異常が観察された。さらに、内在性Tmem100-LacZノックインマウスを用いて新生仔網膜におけるTmem100の発現パターンを解析した結果、Tmem100が動脈内皮細胞特異的且つ経時的に特徴のある局所発現パターンを示すことが明らかになった。以上に示すように、TMEM100の発現制御機構および分子機能の解明に向けて順調に研究を進めている。課題1においては当初の計画通り、in vitroおよびin vivoの検証によりTmem100の内皮細胞特異的エンハンサーを制御する候補転写因子を特定することができた。今年度はそれら候補転写因子とTmem100内皮細胞特異的エンハンサーの直接結合や、候補転写因子欠損によるTmem100の発現減少を証明する必要がある。課題2については、新生仔網膜解析系を用いてTmem100の発現パターンおよび欠損による表現型が確認できた。今後は引き続きTmem100の血管形成過程での生命現象における役割を明らかにすることを目指し、より詳細な表現型解析に加えTmem100欠損で影響を受ける下流因子の探索も行う。これらの項目について本年度内の完了は妥当であると考える。研究実績に記載の通り、TMEM100の内皮細胞特異的エンハンサー領域内で複数の転写因子が発現制御に関わっていることが示唆されたため、本年度はChIP解析によりTMEM100内皮細胞特異的エンハンサーの候補転写因子への結合を証明するとともに、この転写因子欠失マウスにおけるTmem100発現解析を行う。また、候補転写因子結合配列を含むTmem100内皮細胞特異的エンハンサー領域をCRISPR/Cas9遺伝子編集により欠失したマウスでTmem100発現変化を解析する。これらの検討から、課題1ではALK1シグナルによる発現制御のみでは説明できなかったTMEM100の血管内皮特異的発現機構を明らかにすることを目指す。
抗癌剤を組み込んだ溶解型ゼラチンマイクロスクエアの抗癌剤徐放性の基礎的研究

正常豚を用いた基礎実験で、低エンドトキシン性ゼラチン(RMG)にシスプラチンを含有させると、溶解とともに抗癌剤が溶出されることが判明している。今回200-500μm、500-1000μmのパウダー状の溶解型ゼラチンスポンジ(溶解型ゼラチンマイクロスクエア;RMP)を作製した。生食内での溶解時間は、120°C熱架橋RMP200-500μmで159.2±12.4h、500-1000μmで168.8±15.9hであった。125°C以上は不溶性であった。120°CRMPを用いた豚肝動脈塞栓術では、肝辺縁に壊死、塞栓物質残存があり、より細径の粒子で壊死率が高く、より細径の動脈に塞栓物質が分布していた。東日本大震災により、溶解型ゼラチンマイクロスクエアを作成するゼライス株式会社が被災したことにより、溶解型ゼラチンマイクロスクエアの作成が大幅に遅れており、溶解型ゼラチンマイクロスクエアを用いた基礎実験ができずにいる。このため、マイクロスクエア化されていない溶解型ゼラチンを用いた正常豚を対象に、経カテーテル動脈塞栓術における抗癌剤の徐放性および、正常組織に対する障害について、従来臨床の場え使用されてきたゼラチンスポンジと比較検討した。抗癌剤の徐放性については前年度に報告済みである。今回、正常豚の脾動脈を異なるゼラチンスポンジ(従来型ゼラチンであるSpongelと溶解型ゼラチンであるRM-Gelatin)で塞栓し、その塞栓効果及び組織障害を比較検討した。正常豚5頭に対して、Spongelを造影剤(Iopamiron 370)10mlにて混和し、脾動脈塞栓術を施行。また、正常豚5頭に対して、RM-Gelatin (50kDa、130°C熱架橋)を造影剤(Iopamiron 370)10mlにて混和し、脾動脈塞栓術を施行。塞栓前、直後、30分後、約1時間後、2時間後、3日後に血管造影を施行。再開通性の評価を行い、塞栓3日後にそれぞれの豚をと殺。脾臓を摘出し、10%ホルマリン液で固定し、HE染色を行い、脾臓の組織障害の程度を比較検討した。短時間溶解型ゼラチンであるRM-gelatinはSpongelと比較して、組織障害が少なく、約60分で溶解する。RM-gelatinでは、少なくとも30分間は十分な塞栓効果が認められる。RM-gelatinでの塞栓時は、二次血栓形成が示唆され、それに伴う塞栓時間延長の可能性はあり、できるだけ選択的に塞栓するのが望ましい。正常組織の障害をできるだけ少なくしたい場合の一時止血や短時間の塞栓効果を期待する分野において、新たな一時塞栓物質となりえる。【目的】これまで我々は低エンドトキシン性ゼラチンを用いて、シート状の溶解型ゼラチンスポンジ製剤を開発し、基礎的、動物実験的検討を報告してきた。今回溶解型マイクロスクエアとしてのRMGパウダー(RMP)を作製することができたので、1RMPの熱架橋温度の違いによる生食内での溶解時間の測定、2RMPによる豚肝動脈塞栓で、血管撮影による血管再開通性、病理組織で肝組織の障害、塞栓物質の残存率を評価した。【対象と方法】1200-500μm、500-1000μmのRMP(7%濃度、50KDa)を110°C、115°C、118°C、120°C、122°C、125°Cで24時間熱架橋したものを、生食内で37°C恒温漕振盪下で溶解時間の測定、2RMP200-500μm(A群)、500-1000μm(B群)でそれぞれ2頭ずつ肝動脈塞栓し、塞栓前、塞栓直後、1時間、2時間、3時間、24時間、48時間後に血管撮影。2日後の病理組織で肝梗塞率、RMPの残存率を評価した。【結果】1120°C熱架橋RMP200-500μmで159.2±12.4h、500-1000μmで168.8±15.9hであった。2120°CRMPを用いて肝動脈塞栓施行。血管撮影上は24時間後に再開通していたが、肉眼的に肝辺縁に壊死を生じ、壊死率はA群7.6±5.1%、B群2.6±2.5%、RMPの残存率はA群で100-200μm、B群で200-500μmの血管内で高かった。【結語】RMPは生食内で溶解し、血管撮影上も再開通がみられたが、病理的には肝辺縁に壊死、塞栓物質の残存があった。また、より細径の粒子で壊死率が高く、塞栓物質もより細径の動脈に分布していた。

生食内での溶解時間は、120°C熱架橋RMP200-500μmで159.2±12.4h、500-1000μmで168.8±15.9hであった。125°C以上は不溶性であった。120°CRMPを用いた豚肝動脈塞栓術では、肝辺縁に壊死、塞栓物質残存があり、より細径の粒子で壊死率が高く、より細径の動脈に塞栓物質が分布していた。溶解型ゼラチンマイクロスクエアの作成が遅延しており、本年は、その原料となる溶解型ゼラチンスポンジの抗癌剤吸着効果とその徐放性をみる正常豚肝動脈を用いた動物実験および正常豚の脾動脈を用いた溶解型ゼラチンスポンジの塞栓効果およびその安全性をみる実験を行うことに大半を費やした。つまり、抗癌剤(シスプラチン)を正常豚肝動脈から持続動注する群、および約2時間で溶解する溶解型ゼラチンスポンジにシスプラチンを吸着させ持続動注する群、約6時間で溶解する溶解型ゼラチンスポンジにシスプラチンを吸着させ持続動注する群で動物実験を行い、持続動注群に比し、後2者の持続動注群で、肝静脈血中のPt濃度を長時間維持することが判明した。また、従来型ゼラチンスポンジ(肝細胞癌に対して動脈塞栓術を行う際に通常用いられ、約1-2週間で溶解する)で豚脾動脈を塞栓する群と溶解型ゼラチンスポンジ(約1時間で溶解する)で塞栓する群でその組織障害を比較した結果、後者での塞栓で有意に組織障害が少なかった。このことより、溶解型ゼラチンで塞栓する際、標的臓器の正常組織への障害はできるだけ少なくなり、標的腫瘍の虚血性変化が得られる可能性が判明した。以上、溶解型ゼラチンマイクロスクエアが完成し、同様の実験を行っても、抗癌剤の徐放効果および安全性が得られる可能性が示唆された。前年度と同様の追加実験を施行した。以下の通りである。【目的】我々は低エンドトキシン性ゼラチンを用いて、シート状の溶解型ゼラチンスポンジ製剤を開発し、基礎的、動物実験的検討を報告してきた。今回パウダー状のRM(RMP)を作製。1RMPの熱架橋温度の違いによる生食内での溶解時間の測定、2RMPによる豚肝動脈塞栓で、血管撮影による血管再開通性、病理組織で肝組織の障害、塞栓物質の残存率を評価した。【対象と方法】1200-500μm、500-1000μmのRMP(7%濃度、50KDa)を110°C、115°C、118°C、120°C、122°C、125°Cで24時間熱架橋したものを、生食内で37°C恒温漕振盪下で溶解時間の測定、2RMP200-500μm(A群)、500-1000μm(B群)でそれぞれ2頭ずつ肝動脈塞栓し、塞栓前、塞栓直後、1時間、2時間、3時間、24時間、48時間後に血管撮影。2日後の病理組織で肝梗塞率、RMPの残存率を評価した。【結果】1120°C熱架橋RMP200-500μmで159.2±12.4h、500-1000μmで168.8±15.9hであった。2120°CRMPを用いて肝動脈塞栓施行。血管撮影上は24時間後に再開通していたが、肉眼的に肝辺縁に壊死を生じ、壊死率はA群7.6±5.1%、B群2.6±2.5%、RMPの残存率はA群で100-200μm、B群で200-500μmの血管内で高かった。【結語】RMPは生食内で溶解し、血管撮影上も再開通がみられたが、病理的には肝辺縁に壊死、塞栓物質の残存があった。また、より細径の粒子で壊死率が高く、塞栓物質もより細径の動脈に分布していた。東日本大震災により、溶解型ゼラチンマイクロスクエアを作成するゼライス株式会社が被災したことにより、溶解型ゼラチンマイクロスクエアの作成が大幅に遅れており、溶解型ゼラチンマイクロスクエアを用いた基礎実験ができずにいる。このため、マイクロスクエア化されていない溶解型ゼラチンを用いた正常豚を対象に、経カテーテル動脈塞栓術における抗癌剤の徐放性および、正常組織に対する障害について、従来臨床の場え使用されてきたゼラチンスポンジと比較検討した。我々の検討では、溶解型ゼラチンは抗癌剤であるシスプラチンの徐放性を有していること、また、従来のゼラチンスポンジに比し、肝臓や脾臓など正常組織に与える組織障害は少ないことが判明した。
細胞分化に応答する蛋白質FT27の機能と遺伝子発現調節に関する研究

マウス胚性腫瘍幹細胞株F9の分化系を用いて未分化細胞特異的な発現を示す遺伝子群を単離し、発現調節機構や遺伝子産物の機能解析を目指して、以下の研究を行った。1.未分化特異的な遺伝子群をより確実に、しかも直接的にスクリ-ニングする為に、neo遺伝子をマ-カ-としたgene trapping vectorを用いた。このvectorをF9細胞に導入後、挿入部位に依存してG418耐性能を獲得したクロ-ンを選択し、これらの内、レチノイン酸による分化誘導後にG418感受性となる細胞株4種を単離した。これらの細胞株では、分化誘導初期にneo RNAの顕著な減少が認められた。2.上記4種の細胞株由来の染色体のDNAを用いてサザンブロット解析行った結果、2種の細胞株では単一コピ-、他の株では複数コピ-の導入vectorがタンデムに挿入されていた。3.挿入部位周辺の制限酸素地図を作製後、適当な制限酸素で染色体DNAを切断し、環状化した後、electroporation法による大腸菌への形質転換を行って、細胞に導入したvector DNA及び挿入部位周辺の染色体DNAを単離した。4.4種の細胞株の内の一つ、G3から単離した染色体DNA断片をプロ-ブにノ-ザンブロット解析を行った結果、未分化F9細胞では対応する転写産物が検出されたが、そのレベルはレチノイン酸処理後の細胞では著しく減少していた。また、サザンブロット解析の結果、このDNA断片はマウス染色体上に存在する中等度反復配列であることが判明した。他のクロ-ンについても同様の解析を行っている。
腸管のmotilityからみた小腸移植後急性拒絶反応の早期診断法

実験1.ラット小腸運動機能評価の確立1-(A)腹腔内埋込み型フォーストランスデューサー(FT)【方法】Wistar Rat(n=5)を用いて、胃・十二指腸・空腸の3点に埋込み型FTを縫着した後、送信機を腹腔内に留置した。【結果】ラットの生存期間は05日(平均2.2日)であった。死後解剖の結果、送信機が大きいことによる摂食障害による衰弱死、腸閉塞が考えられた。【考察】埋込み型FTは、ラットへの応用は現段階では困難かと考えられた。実験2.ラット小腸切断術後の小腸運動機能評価実験3.ラット小腸移植後の小腸運動機能評価実験1.ラット小腸運動機能評価の確立1-(A)腹腔内埋込み型フォーストランスデューサー(FT)【方法】Wistar Rat(n=5)を用いて、胃・十二指腸・空腸の3点に埋込み型FTを縫着した後、送信機を腹腔内に留置した。実験2.ラット小腸切断術後の小腸運動機能評価実験3.ラット小腸移植後の小腸運動機能評価1.ラット正常腸管運動のコントロール小腸移植群とのコントロールのため、ラット用strain gauge force transducerを幽門部、十二指腸下降脚、十二指腸水平脚、上部空腸の4点に装着し、正常腸管運動のパターンを記録した。1) FM送信機によるTeremetry systemでの測定(n=5)送信機の腹腔内埋め込み型であるため、摂食障害、腸閉塞を認め、結果として平均生存期間は2.2日(0-5日)であったため、コントロールとしての腸管運動測定は不可能と判断し、増幅器、抵抗回路を介したコンピュータヘの直接接続のsystemへの変更を余儀なくされた。2)直接接続での測定(n=3)平均生存期間は13日(0-22日)と延長し、装着後6時間後から死亡までの測定が可能であった。主な、死亡原因は室温などの飼育環境、リード線トンネルの感染、transducer同士の強固な癒着であった。測定結果は、幽門部では、空腹期、食後期ともに同様の持続的な律動波を認めた。そのほかの部位で、特に十二指腸下降脚、水平脚で空腹期に、phase III(1分間に8-12回の連続した収縮)様の収縮波群を認めたが、上部空腸では明らかな収縮波群は確認できなかった。今後、飼育環境の改善とともに、装着・測定に関して更なる技術向上が必要である。2.ラット小腸移植モデルの確立異所性小腸移植の確立のため、ドナー操作(グラフト採取(n=5))、レシピエント操作(n=1)を施行した。現在、技術的な向上のため訓練中である。【結果】ラットの生存期間は05日(平均2.2日)であった.死後解剖の結果、送信機が大きいことによる摂食障害による衰弱死、腸閉塞が考えられた。実験2.ラット小腸切断術後の小腸運動機能評価実験3.ラット小腸移植後の小腸達動機能評価
腎細胞癌におけるアデノウイルスレセプターを用いた遺伝子治療の開発

【目的】腎癌細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の抗腫瘍メカニズムとアテソウイルスレセプター(CAR)の関係を検討した。【方法】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるFR901228で処理し、細胞増殖、細胞周期プロファイルの変化やアポトーシスの有無を検討した。また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤による腎癌細胞のcoxsackie and adenovirus receptor(CAR)発現量をFACSとRT-PCRを用いて検討した。FR901228で処理した腎癌細胞株とp53アデノウイルスベクターによる治療効果をin vivo, in vitroで検討した。【結果】フローサイトメーターでの腎癌細胞株のCAR発現はVMRC-REW:60%,A-498:9%,Caki-1:8%,ACHN:13%であった。0.010.5ng/mlのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理した腎癌細胞のCAR発現効果は、フローサイトメーターやRT-PCR法にてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の濃度に比例してCAR発現量が増加していた。0.5ng/mlのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理した腎癌細胞のadCMV-β-galの感染効率は58倍増強していた。至適濃度でのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた場合、adCMV-p53単独より、約1/5以下の力価で同じ治療効果を認めた。In vivoでは、腫瘍が約160mm^3になってから、ヒストン脱アセチル化に腫瘍に注入、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤静注とadCMV-p53腫瘍に注入をした場合を比較した。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とadCMV-p53で治療した腫瘍は明らかに有意に縮小傾向が認められた。【結論】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、腎癌細胞のCAR発現を増加させる作用を認めた。アデノウイルスをベクターとする腎癌に対する遺伝子治療の効率を改善させるために、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が有効である可能性を示唆される。結果:腎癌組織のCARは、ほとんど発現していなかった。0.011.0ng/mlのFR901228で処理した腎癌細胞のCAR発現効果はFR901228の濃度に比例してCAR発現量が増加していた。1.0ng/mlのFR901228で処理した腎癌細胞のadCMV-β-galの感染効率は58倍増強していた。これらの結果、至適濃度でのFR901228を用いた場合、アデノウイルスベクター単独より、約1/5以下の力価で同じ治療効果が期待された。結論:HDIであるFR901228は、腎癌細胞のCAR発現を増加させる作用があり、今後の腎癌の遺伝子治療法に有用であると考えられる。【目的】腎癌細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の抗腫瘍メカニズムとアデノウイルスレセプター(CAR)の関係を検討した。【方法】HDAC阻害剤であるFR901228で処理し、細胞増殖、細胞周期プロファイルの変化やアポトーシスの有無を検討した。また、FR901228による腎癌細胞のcoxsackie and adenovirus receptor(CAR)発現量をFACSとRT-PCRを用いて検討した。FR901228で処理した腎癌細胞株とp21アデノウイルスベクターによる治療効果をin vivo, in vitroで検討した。

【結果】FR901228で処理により濃度依存性の増殖抑制が認められ、著明なアポトーシスが誘導されていた。細胞周期抑制蛋白であるp21発現が増加していた。0.011.0ng/mlのFR901228で処理した腎癌細胞のCAR発現効果はFR901228の濃度に比例してCAR発現量が増加した。1.0ng/mlのFR901228を用いた場合、p21アデノウイルスベクター単独より、約1/3以下の力価で同じ治療効果があった。【結論】HDAC阻害剤はアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療法に対して作用増強剤になると考えられる。
ウシ腎臓モデルと腎症自然発症例の尿中NAGアイソザイムパターン-尿中アイソザイムパターンは腎ホモジネート中のパターンを反映するか

本研究は,ウシの尿中NAG活性値ならびにアイソザイム測定を腎疾患診断マーカーとして確立する目的で実施したものであり,以下のような成果が得られた.(1)健康牛の尿について4MU-NAG法,MCP-NAG法,PNP-NAG法を用いてNAGを測定し相関を調べた結果,各測定値間には有為な相関性が認められた.またウシの性差や年齢差による比較では,尿中NAG濃度をNAG指数であらわした場合には有意差はないことが判明した.(2)セルローズアセテート膜電気泳動法とDEAEセファロースミニカラム法によりアイソザイムパターンを検討して,健康牛のパターンはA,B分画は約8:2であり、この値はヒトやマウスの値と類似していた.(3)多数の自然発症例を収集して尿中NAG指数とアイソザイムパターンを分析した.その結果,尿中NAG指数は健康牛と比較して明らかに高値を示し,アイソザイムパターンではB分画の増加(A:B=6.5:3.5)が明らかであり,このパターンはヒトや実験動物で報告されている尿細管障害パターンと同様であった.次に症例の腎臓の病理組織学的変化と,NAGアイソザイムパターンを比較検討した.その結果腎臓では明らかな尿細管病変像が観察されており,尿中NAG指数とアイソザイムパターンは腎疾患診断マーカーに成り得ることが示された,(4)ウシ腎症モデルの作成:重クロム酸カリウムによる腎症モデルではNAG指数は最高で62U/gと高値を示しB分画の増加が観察され,尿細管病変と良好に相関していた腎ホモジネート中のアイソザイムパターン分析も同様な変化を示した.以上のことから,尿中NAG指数とアイソザイム分析はウシの腎疾患診断マーカーとして有効である事が証明された.本研究は,ウシの尿中NAG活性値ならびにアイソザイム測定を腎疾患診断マーカーとして確立する目的で実施したものであり,以下のような成果が得られた.(1)健康牛の尿について4MU-NAG法,MCP-NAG法,PNP-NAG法を用いてNAGを測定し相関を調べた結果,各測定値間には有為な相関性が認められた.またウシの性差や年齢差による比較では,尿中NAG濃度をNAG指数であらわした場合には有意差はないことが判明した.(2)セルローズアセテート膜電気泳動法とDEAEセファロースミニカラム法によりアイソザイムパターンを検討して,健康牛のパターンはA,B分画は約8:2であり、この値はヒトやマウスの値と類似していた.(3)多数の自然発症例を収集して尿中NAG指数とアイソザイムパターンを分析した.その結果,尿中NAG指数は健康牛と比較して明らかに高値を示し,アイソザイムパターンではB分画の増加(A:B=6.5:3.5)が明らかであり,このパターンはヒトや実験動物で報告されている尿細管障害パターンと同様であった.次に症例の腎臓の病理組織学的変化と,NAGアイソザイムパターンを比較検討した.その結果腎臓では明らかな尿細管病変像が観察されており,尿中NAG指数とアイソザイムパターンは腎疾患診断マーカーに成り得ることが示された,(4)ウシ腎症モデルの作成:重クロム酸カリウムによる腎症モデルではNAG指数は最高で62U/gと高値を示しB分画の増加が観察され,尿細管病変と良好に相関していた腎ホモジネート中のアイソザイムパターン分析も同様な変化を示した.以上のことから,尿中NAG指数とアイソザイム分析はウシの腎疾患診断マーカーとして有効である事が証明された.今年度の研究目的は以下の通りであった. 1.ウシの腎疾患診断マーカーとして尿中NAGアイソザイム分析を応用するために,ウシ腎症モデルと自然発症例のアイソザイム分析を行い,腎臓の病理組織学的所見と比較検討する.2.尿中NAGアイソザイムパターンが腎組織中パターンを反映するか検索するとともに尿細管由来低分子蛋白の尿中排泄との関連性を明らかにする.この目的に従って以下のような研究を実施し,研究成果が得られた.(1)ウシの尿中NAG指数ならびにアイソザイム分析法の確立:ウシの腎疾患診断マーカーとして尿中NAGアイソザイム分析を応用するために,健康牛の尿について4MU-NAG法,MCP-NAG法,PNP-NAG法を用いてNAGを測定し相関を調べた.また,供試牛の性差や年齢差による比較の結果,尿中NAG濃度を尿中クレアチニンで除して得られるNAG指数を使用すれば比較が可能であることが判明した.次にセルロースアセテート膜電気泳動法とDEAEセファロースミニカラム法によりアインザイムパターンを検討して,健康牛のパターンを得た.(2)腎症自然発症例における検討:多数の自然発症例を収集して,尿中NAG指数とアイソザイムパターンを分析した.その結果,尿中NAG指数は健康牛と比較して明らかに高値を示し,アイソザイムパターンではB分画の増加が明らかであり,このパターンはヒトや実験動物で報告されている尿細管障害パターンと同様であった.次に症例の腎臓の病理組織学的変化と,NAGアイソザイムパターンを比較検討した.その結果腎臓では明らかな尿細管病変像が観察されており,尿中NAG指数とアイソザイムパターンは腎疾患診断マーカーに成り得ることが示された.現在も,自然発症例を継続して収集中.(3)ウシ腎症モデルの作成:重クロム酸カリウムによる腎症モデルの作成に成功.

現在,腎ホモジネート中のアイソザイムパターン分析を実施中.本研究は,ウシの尿中NAG活性値ならびにアイソザイム測定を腎疾患診断マーカーとして確立する目的で実施したものであり,以下のような成果が得られた.(1)健康牛の尿について4MU-NAG法,MCP-NAG法,PNP-NAG法を用いてNAGを測定し相関を調べた結果,各測定値間には有為な相関性が認められた.またウシの性差や年齢差による比較では,尿中NAG濃度をNAG指数であらわした場合には有意差はないことが判明した.(2)セルロースアセテート膜電気泳動法とDEAEセファロースミニカラム法によりアイソザイムパターンを検討して,健康牛のパターンはA,B分画は約8:2であり、この値はヒトやマウスの値と類似していた.(3)多数の自然発症例を収集して尿中NAG指数とアイソザイムパターンを分析した.その結果,尿中NAG指数は健康牛と比較して明らかに高値を示し,アイソザイムパターンではB分画の増加(A:B=6.5:3.5)が明らかであり,このパターンはヒトや実験動物で報告されている尿細管障害パターンと同様であった.次に症例の腎臓の病理組織学的変化と,NAGアイソザイムパターンを比較検討した.その結果腎臓では明らかな尿細管病変像が観察されており,尿中NAG指数とアイソザイムパターンは賢疾患診断マーカーに成り得ることが示された.(4)ウシ腎症モデルの作成:重クロム酸カリウムによる賢症モデルではNAG指数は最高で62U/gと高値を示しB分画の増加が観察され,尿細管病変と良好に相関していた.腎ホモジネート中のアイソザイムパターン分析も同様な変化を示した.以上のことから,尿中NAG指数とアイソザイム分析はウシの腎疾患診断マーカーとして有効であることが証明された.