hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微粒子エピネフリンと100%酸素によるエピネフリンスプレーの開発

過去の報告と同様、約8分後に心停止を来たした。この状態から、体外式心臓マッサージのみでの効果を除外するためさらに8分間の無治療時間(過去の報告により決定)をおいた実験では、静脈投与群で4/7、エアゾル群では7例全例蘇生不能であった。無治療時間の短縮にて同様の検討を現在も検討中である。今後の検討事項として、・エアブラシよりさらに小粒子を作れるスプレー缶を作成してみること・呼吸の吸気に同期させた投与により、できる限りの気管内末梢投与をめざすこれらによって、より高いエピネフリン最大濃度、より短い到達時間を得ることが可能であると考えられ、引き続き研究を持続していく予定である。
超弦理論における宇宙初期多次元空間のコンパクト化と素粒子発生の研究

超弦理論は物理現象から遊離した数学理論ではないかという批判がある。現象を意識せずに論理的一貫性のみを追求すれば、その危険性があるにちがいない。一方、低エネルギー現象から遡って、理論が統一されるべきスケールに延長するとき、可能なモデルの可能性は強い制限をうける。おそらく、フリップドSI(5)【○!×】U(1)モデルを除いて、初期統一理論の可能性はないだろう。あるいは、プロトン崩壊を起こさないようなワインバーグ・サラム理論であろう。従って、現在次の方法をとる時期が成熟していると言える。つまり、超弦理論から、いかにして低エネルギーで可能なモデルを導くかの研究を行い、それを中間的な橋頭堡とすることである。我々は、研究の第一段階において、正しい世代数を自然な形で導く研究をした。一般に6次元空間をコンパクト化するとき、世代数が多くなりすぎる。これは、専ら6次元空間の自由度が多すぎるからである。我々は、セルフデュアルなローレンツ的格子を採用し、4次元または、2次元空間をコンパクト化する方式を採用した。この結果、SU(3)【○!×】SU(2)【○!×】U(1)の対称性をもつ三世代モデルが得られた。しかし、低エネルギー現象と一致させるためには、エキストラなU(1)^nを取り除く必要がある。このために複雑な方法として、非可換ゲージうめこみがある。ところが、最近有力な発見があった。コンパクト化によって得られたSUSYの有効理論にU(1)アノマリーが存在し、非くりこみ可能性定理にもかかわらず、ファイエット・イリオポラス項が生ずる。このスーパーポテンシャルのもとで、群が破れランクが落ちるが、超対称性が保たれる解が存在する。我々はこの可能性を研究し、現在終段階に近づいている。間もなく結果をとりまとめ雑誌に投稿すると共に、1989年春の学会で発表する予定である。
類洞内トロンビンレセプターの活性制御からみた脂肪肝手術適応拡大を目指した基礎研究

肝臓移植の発展にはドナー増加が必要であるが、障壁としてドナーの問題も指摘されている。特に脂肪肝の肝移植は移植成績が悪いだけでなくドナー合併症をも増加させドナー不適格となることが多い。本研究では脂肪肝移植動物モデルで脂肪肝内ではPAR-1という各種炎症を制御するレセプターが正常肝より増加し手術ストレスは同等であるがその生体反応がより強くでてしまうことから移植後早期に移植肝不全を来たし移植成績が悪くなってしまうことを突き止めた。さらに移植後にPAR-1阻害剤を投与することで移植成績の改善をみとめたことからこの結果をさらに検討することでドナープールの拡大が期待できると考えられた。ラット脂肪肝モデルにおいて肝臓でのPAR-1発現が上昇しており、ここに肝虚血再還流障害を加えると約30%のラットが48時間以内に死亡し、組織学的・血液検査上も肝障害がコントロール群に比較して増悪していることが判明していた。そこでPAR-1アンタゴニストを実験動物に投与して肝虚血再還流障害を作成すると明らかに肝障害が抑制された。このことから脂肪肝においてはPAR-1が強発現していることにより細胞障害が促進されている可能性が示唆された。ここでラットの肝臓から各種細胞を分離培養し、それぞれのPAR-1発現形式を検討すると、クッパー細胞にその発現が強く認められたため脂肪肝においてはクッパー細胞がトロンビンなどの刺激を最も受けやすい状況にあり、ここから障害が加わることにより細胞障害が増強されると考えられた。この細胞障害はサイトカインを介して引き起こされると考えたため分離培養したクッパー細胞をPAR-1アンタゴニストを投与し細胞刺激を加えると有意に炎症性サイトカインの発現が減少した。以上より、脂肪肝での虚血再還流障害はクッパー細胞でのPAR-1発現上昇によるストレス感受性の低下が原因であることを突き止めた。一方、正常肝(コントロール群)にPAR-1アンタゴニストを投与して虚血再還流障害を与えても生食投与群と肝障害の程度に有意差はみとめなかったことからこの効果は脂肪肝における肝障害により強くでるものと考えられた。最終年度は、脂肪肝ラットをドナーとした肝移植モデル(脂肪肝群)を作成し、正常肝ラットをドナーとした肝移植モデル(対照群)を作成した。冷粗血時間は6時間とした。対照群は全例28日まで生存したのに対し、脂肪肝移植群は48時間以内に約60%のラットが死亡(生存率40%)。温阻血モデルと同様、肝障害マーカーに差はなく、肝類洞内血栓と肝細胞障害が著明であった。PAR-1の発現はドナー肝においては脂肪肝モデルの発現が約2倍であったが移植直前のドナー肝では約1.8倍、術後は次第に発現差は縮小し、術後24時間目で1.4倍程度の発現となっていた。この結果からラット移植モデルにおいて脂肪肝ドナー内ではすでにドナー肝臓内でPAR-1が強発現していることにより虚血再灌流障害のストレスに対し脆弱であると思われる一方、対照群でも移植後に手術ストレスによりPAR-1の発現が上昇することで相対的に術後PAR-1の発現差が縮小していると考えられた。この結果から脂肪肝移植の拡大を目的としPAR-1アンタゴニストの有用性を検討するためにこの脂肪肝移植モデルに対し、1)ドナー術前にPAR-1アンタゴニスト投与モデル、2)冷虚血時の灌流液中にPAR-1アンタゴニストを追加して保存したモデル、3)移植後レシピエントに対してPAR-1アンタゴニストを投与したモデル、を作成し非投与群と比較したところ、レシピエントにアンタゴニストを投与した群に有意な術後生存率の改善(48時間後生存率60%前後)がみられた。上記から、ドナーやドナー肝のみのP対PAR-1処置には意味がないこと、脂肪肝移植成績が不良である理由はドナー肝とレシピエントの生体反応による二次障害である可能性が強く示唆された。今後、アンタゴニストの投与タイミングを詳細に検討しその二次反応の時期と機序を明らかにすることで今後ドナープールの拡大が可能となると思われた。食餌性脂肪肝のラットは60%高脂肪食を8週間摂取にて作成できた。このラットに70%、90分の虚血再灌流障害を与えると24時間以内に30%のラットが死亡した。一方正常肝(対照群)ラットでの死亡は認めなかった。組織では高度のうっ血や肝細胞壊死、アポトーシス細胞の増加が認められ、炎症性サイトカインは有意に増加していた。また、脂肪肝作成時にすでにトロンビンレセプターであるPAR-1が著明に増加しているものの、類洞内の血栓は正常肝と相違は認められず、また全身的な凝固機能も保たれていた。

しかし、マクロファージなどの炎症細胞浸潤は著明であり脂肪肝においては炎症が過剰に発現しやすい状態であることが推察された。上記より脂肪肝においてはPAR-1が過剰発現しており、PAR-1の細胞障害のシグナルが入りやすい状態であることが推察され、このため移植における脂肪肝はグラフト不全に陥りやすく、また肝切除においての脂肪肝は予備能の低下がおこっているものと推察された。今後、脂肪肝に対して安全な移植医療の提供と肝切除の遂行をめざし、(1)PAR-1アンタゴニストの投与により脂肪肝に対する虚血再灌流障害の軽減の可能性(生存率、炎症性サイトカインの産生能、炎症細胞浸潤、組織所見の改善)を探り、(2)ラットより肝細胞・マクロファージ、類洞内皮細胞を分離培養してPAR-1の発現傾向を探索し、これらの細胞を共培養することで細胞相互関係をPAR-1の観点から検討していく予定である。これまでは、計画書に記載した仮定と結果がほぼ一致しており、おおむね順調に研究計画が進行していると考えている。本年の計画は脂肪肝の作成と正常肝と脂肪肝との肝障害の差異を検討することであり、この点に関しては順調に伸展しているものと考えている。大動物の脂肪肝モデルを作成し、同様の結果が得られるかどうかを検討する予定。脂肪肝に対して安全な移植医療の提供と肝切除の遂行をめざし、(1)PAR-1アンタゴニストの投与により脂肪肝に対する虚血再灌流障害の軽減の可能性(生存率、炎症性サイトカインの産生能、炎症細胞浸潤、組織所見の改善)を探り、(2)ラットより肝細胞・マクロファージ、類洞内皮細胞を分離培養してPAR-1の発現傾向を探索し、これらの細胞を共培養することで細胞相互関係をPAR-1の観点から検討していく予定である。大動物の購入費、飼料費、投与薬剤購入費にほぼ全額を使用する予定である。ラットの購入と飼育費、脂肪肝モデル作成のためのえさの購入。手術器具及び薬剤の購入を予定している。
ファインセラミクスの超高温強度を評価するための非接触形変位計測システムの開発

1000°Cを超える高温下でセラミックスの強度評価を正確に行うためには負荷試験中,試験片に生じる変位を精度よく測定することが必要である.本研究は変位計測システムの開発を中心として,総合的にセラミックスの高温強度試験装置の設計・製作を目指したものである.完成した本試験装置はレーザー光線を利用した非接触形変位計測システム,カンタルスーパ33を発熱体とする円筒二分割高温電気炉と温度制御装置,および負荷試験装置としての閉ループ型電気油圧式材料試験機とから構成されている.なお,負荷用治具は窒化けい素およびNi-基超耐熱合金を用いて新たに設計製作された.本装置を用いて窒化けい素セラミックスの高温強度試験を実施した結果,主として次のことが判明した.(1)本研究で開発されたレーザー光線を利用した変位計測システムによると1000°C以上での負荷試験中,セラミックスに生じる100300μm程度の変位を測定範囲の約2%の精度で非接触的に測定可能である.(2)本変位計による窒化けい素セラミックスの変位計測結果によると, 1100°Cまでの試験温度下では荷重Pと変位δとの間に直線関係が成立した.しかし,この温度以上の試験温度下では,温度の上昇につれてP-δ関係は上に凸に折れ曲り,窒化けい素は塑性変形を生じることが示唆された.(3)曲げ強度は, 1000°Cまでは室温におけるそれとほぼ等しいが, 1000°C1100°Cで強度は増加し, 1100°Cで極大値を示した.そして,これは1200°C以上の温度下で急減した.シェブロンノッチ形試験片を用いた破壊靱性値試験の結果,破壊靱性値K_<IC>は室温1000°Cまではほとんど変わらず,これは1100°C辺りで極小値を示した.このように曲げ強度が極大値を示す温度でK_<IC>は極小値を示す.1000°Cを超える高温下でセラミックスの強度評価を正確に行うためには負荷試験中,試験片に生じる変位を精度よく測定することが必要である.本研究は変位計測システムの開発を中心として,総合的にセラミックスの高温強度試験装置の設計・製作を目指したものである.完成した本試験装置はレーザー光線を利用した非接触形変位計測システム,カンタルスーパ33を発熱体とする円筒二分割高温電気炉と温度制御装置,および負荷試験装置としての閉ループ型電気油圧式材料試験機とから構成されている.なお,負荷用治具は窒化けい素およびNi-基超耐熱合金を用いて新たに設計製作された.本装置を用いて窒化けい素セラミックスの高温強度試験を実施した結果,主として次のことが判明した.(1)本研究で開発されたレーザー光線を利用した変位計測システムによると1000°C以上での負荷試験中,セラミックスに生じる100300μm程度の変位を測定範囲の約2%の精度で非接触的に測定可能である.(2)本変位計による窒化けい素セラミックスの変位計測結果によると, 1100°Cまでの試験温度下では荷重Pと変位δとの間に直線関係が成立した.しかし,この温度以上の試験温度下では,温度の上昇につれてP-δ関係は上に凸に折れ曲り,窒化けい素は塑性変形を生じることが示唆された.(3)曲げ強度は, 1000°Cまでは室温におけるそれとほぼ等しいが, 1000°C1100°Cで強度は増加し, 1100°Cで極大値を示した.そして,これは1200°C以上の温度下で急減した.シェブロンノッチ形試験片を用いた破壊靱性値試験の結果,破壊靱性値K_<IC>は室温1000°Cまではほとんど変わらず,これは1100°C辺りで極小値を示した.このように曲げ強度が極大値を示す温度でK_<IC>は極小値を示す.レーザー外径測定器(アンリツ(株)製M-522AS型)を購入し、これを用いて微小変位計測装置を構成した。さらに、赤外線ゴールドイメージ炉(真空理工(株)製P-65CP型)を購入し、その、1,000゚C1,300゚Cの範囲の炉内温度分布を測定した。また、窒化けい素セラミックスの常温における基本的な強度特性を把握するために、平滑試験片,ヌープ圧子により予き裂を導入した試験片およびシェブロンノッチを導入した試験片に関する四点曲げ破壊試験を実施した。そして、これより破壊靭性値KICを求めた。得られた主な結果は次のように取りまとめられる。1.レーザー変位測定器をを用いて四点曲げ試験中の窒化けい素セラミックスのたわみを測定した結果、破壊までに生じる200300μm程度の微小変位を測定範囲の約2%程度の精度で非接触的に測定可能であることが判明した。2.赤外線ゴールドイメージ炉にはレーザー光線を通過させるための石英ガラス製の窓を設けてある。これが1,000゚C1,300゚Cの範囲の温度分布を設定温度の±1、0%以内に抑えることが困難な主な原因になっていいる。これを克服するためには炉内の治具の配置等についてのより詳細な検討が必要である。3.ヌープ圧子による予

き裂導入試験片においては、焼鈍材の破壊靭性値の方が非焼鈍材のそれより大きい。また信頼性の高い破壊靭性値が得られるとされているシェブロンノッチ試験片による破壊靭性値は焼鈍材のそれに近い値をとる。それ故、ヌープ圧子による予き裂導入材を用いて破壊靭性を評価する際には、残留応力を除去するめこれに焼鈍を施すべきである。4.ヌープ圧子により予き裂を導入する際、等価き裂長さaeをae【>!】0.1mmとすべきことが示唆された。すなわち、ae【>!】0.1mmのき裂長さ域においてはき裂寸法の増加につれて破壊靭性値は減少し、ae【>!】0.1mmのき裂長さ域でこれが一定値に収束することがわかった。
柿ポリフェノールオリゴマーの製造技術の確立と抗加齢機能性食品の開発

柿高分子ポリフェノール(タンニン)を原料とし、新しい低分子化技術によって柿ポリフェノールオリゴマーを製造し、抗加齢機能性素材としての可能性を明らかにした。従来のポリフェノールの製造は、茶葉からカテキン類、ブドウ種子や松樹皮からプロアントシアニジンのように、それぞれの植物に含まれるポリフェノールをもともとの形のまま抽出精製する方法で行われてきた。本研究においては、エピガロカテキンニ量体四量体を、柿タンニンの低分子化(イノベーション)によって得ることを新たなシーズとしている。柿タンニンはエピガロカテキンの重合体であるため、そのままでは体内で有効利用されないが、低分子化する事によって薬理効果が高まる。本研究に先駆けて行われた「平成15年さきがけ研究開発助成事業」(富山県)において、富山県産の柿皮タンニンを断片化して得た柿ポリフェノールオリゴマーが強力な抗酸化活性を示すことが判明しており、本年度は柿皮タンニンの低分子化を効率化し、量産化のための製造技術の確立を行なった。得られた柿ポリフェノールオリゴマーの品質評価をin vitroの系(抗酸化活性、酵素阻害活性等)で行なった。なお、本研究は従来に無い新規技術を用いており、最適化の後に事業化を目指している。柿ポリフェノールオリゴマーについて、疾患モデルを用い加齢に関連する機能解析を行なった。まず老化の危険因子の糖尿病について、2型糖尿病モデルを用いて検討し、オリゴマーの肝組織に対する作用から抗老化作用への可能性が示唆された。そこで最初に、細胞老化の指標のDNAとSirt1に及ぼす作用を検討し、オリゴマーによって改善作用を示した。次いで、SAMP8を用い、寿命と老年性認知症に対する作用、さらにオリゴマーの作用機序を明らかにするために、抗老化に関連する分子の解明にもとり組んだ。その結果、SAMP8にオリゴマーを連日経口投与した場合、寿命の延長効果が認められた。現在、寿命延長因子として知られているSirt1の活性化剤のresveratrolとオリゴマーは、いずれもSAMP8の脳組織におけるSirt1を増加させ、寿命延長にSirtlが関与している可能性が示唆された。一方、18週齢と38週齢のSAMP8にオリゴマーを経口投与した場合、認知障害が改善され、海馬でのaxon、dendrite、synapse密度が増加し、neurogenesisの可能性が示された。また、hypothalamusやchoroid plexusでVEGFR-2のリン酸化を認め、VEGFR-2のリガンドとアンタゴニストを用いた実験から、オリゴマーによる記憶障害改善作用は、VEGFR-2を介していることが示唆された。
神経回路発達障害は小児期の認知・行動異常を説明するか-精神機能と神経幹細胞移植-

胎生期のアルコール暴露によって胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)モデルラットを作成した。モデルラット群は,新奇物体探索試験における記憶・認知機能,社会相互作用試験における社会コミュニケーションの各機能に異常を示した。これに対し,モデル動物に神経幹細胞を経静脈的に移植した群では,その異常が正常対象群に近いレベルへ改善されることが分かった。また,モデル動物では,社会機能関連領域(前部帯状回,扁桃体)において,ポストシナプス蛋白PSD95の発現が低下し,それらが,細胞移植群では対象群のレベルに発現増加していることを認めた。また, FASDモデルでは,同領域においてGABA系interneuronのsubtypeであるparvalbumin陽性細胞が有意に減少し,それらが神経幹細胞移植によって改善することが示された。加えて,移植する神経幹細胞をRI標識し,移植後にRIスキャンによって脳内での分布を解析した結果,移植神経幹細胞が,信頼・愛情に基づく社会性行動に関係すると考えられているオキシトシン・バソプレッシン作用部位(視床下部室傍核・視索上核)に強く集積していることを見出し,神経幹細胞移植による社会性機能回復の機序にオキシトシン・バソプレッシン神経機構の増強効果が関連する可能性が推察された。本研究は,胎児性アルコール症候群(FASD)モデル動物を作成し,経静脈的神経幹細胞移植を行なった際の脳諸領域の神経回路障害の変化と個体の認知・行動異常変異を解析し,神経発達障害の衝動性・社会認知異常に対する新たな治療法としての細胞移植療法の可能性について検討を進めることを目的としている。本年度は,(1)コントロール群,および作成した病態モデル群の一部には,蛍光・RI二重標識神経幹細胞を経静脈的に移植した。細胞移植による行動障害の変化について,認知・記憶,および社会コミュニケーションの機能等についての行動薬理学的解析を実施した。また,(2)移植細胞の脳移行,既存脳内神経ネットワークへの組み込みについて,脳諸領域の組織切片を用いた免疫化学的解析を実施した。新奇物体探索性試験において,コントロール群ではサンプルオブジェクトよりも新奇オブジェクトの探索時間が有意に長かったが,FASDモデル群においては差がなかった。一方,細胞移植を行った群では,コントロール群同様,新奇オブジェクトの探索時間が有意に長く認知・記憶の障害が抑制されていた。社会相互作用試験においては,コントロール群に対し,FASDモデル群は同じ空間に新たに入れた同種のラットに対する接触の試みが乏しい一方,細胞を移植した群では,新たに現れた他ラットに対する接触性が有意に増加し,社会性・コミュニケーション等の障害が改善したことが考えられた。また,経静脈的に移植した神経幹細胞は,側脳室周囲,および前部帯状回,海馬,扁桃体を含む,脳の複数の領域で神経系の細胞に分化・成熟していることが観察された。加えて,移植細胞の一部は,扁桃体において,GAD陽性のGABAergicニューロンとして分化・成熟していたが,扁桃体は,個体の社会認知機能に重要な役割を持つ領域であり,これらの細胞群がモデル動物のそうした行動改善効果とどう関わるかが注目された。本研究は,胎児期のアルコール・ストレス暴露による個体の認知・行動異常の脳内メカニズムとして,神経回路網の発達異常の観点から研究を進め,末梢静脈からの神経幹細胞の移植が,アルコール誘発精神疾患モデル動物の不安・行動量の異常や,認知・記憶,そして社会的なコミュニケーションの機能異常を改善させる可能性を探ろうとするものである。本年度は,本治療法による記憶・社会認知機能の改善効果が,関連脳領域における神経回路網の修復・再生と結びついているかどうかについて解析を行うとともに,将来の細胞移植療法の臨床応用を見据えた,細胞・薬物(栄養因子/向精神薬)combined療法の可能性について検討を実施した。胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)モデルを用いた検討で,障害モデル群では,社会性相互作用試験における社会コミュニケーションの各機能に異常を認め,一方で,モデル動物に神経幹細胞を移植した群では,それらの異常が健常対象群に近いレベルへ改善することが示された。社会機能関連領域(前部帯状回,扁桃体)での組織学的検討において,モデル動物では,ポストシナプス蛋白PSD95の発現が低下し,細胞移植群では,対象群のレベルに発現増加していることを認めた。

加えて,末梢から投与した標識神経栄養因子(BDNF-FITC)が,海馬の歯状回の細胞に取り込まれていることを見出し,移植細胞の生存・機能的分化を促進させる併用薬物としての有用性を示した。が考えられた。今後,移植幹細胞としての骨髄細胞の有用性を調べるとともに,BDNF,あるいは種々の向精神薬との併用療法の有効性について解析を行い,アルコール・ストレス誘発精神疾患に対する細胞療法の臨床応用に向けた検討を進めていきたいと考えている。本研究は,胎児期のアルコール・ストレス暴露による個体の認知・行動異常の脳内メカニズムとして,神経回路網の発達異常の観点から研究を進め,末梢静脈からの神経幹細胞の移植が,アルコール誘発精神疾患モデル動物の不安・行動量の異常や,認知・記憶,そして社会的なコミュニケーションの機能異常を改善させる可能性を探ろうとするものである。これまでに,胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)モデルに対する神経幹細胞の経静脈的移植の有用性について解析を行い,異常な神経回路網を再構築することによるFASDの認知・行動異常の改善を目指した再生医療の可能性として検討を進めてきた。本年度は,GABA系神経の障害との深い関係が指摘されている社会コミュニケーションの障害の問題について,(1)特に,自閉症モデル動物でその異常が顕著に認められているオスーメスinteractionの行動変化について評価を実施し,FASDモデルでは本行動機能が大きく障害されており,神経幹細胞の移植がこの行動異常をコントロール群に近いレベルへ改善させることを明らかにした。また,(2)FASDモデルでは,帯状回,および扁桃体領域において,GABA系interneuronのsubtypeであるparvalbumin陽性細胞が有意に減少し,それらが神経幹細胞移植によって改善することを示した.さらに,(3)移植する神経幹細胞をRI標識し,移植後にRIスキャンによって脳内での分布を解析した結果,移植神経幹細胞が,信頼・愛情・絆に基づく社会性記憶,社会性行動に関係すると考えられているオキシトシン・バソプレッシン作用部位に強く集積していることを見出した。今後,本研究の臨床応用を進める上で,骨髄由来間葉系幹細胞移植の有効性を見極めていくとともに,神経幹細胞の移植療法が,こうした社会性機能,特に社会的結束(つながり)行動を増強させる可能性についても解析を実施していきたいと考えている。
ヘリアナンセスキテルペンのエナンチオ制御合成

ヒマワリ(Helianthus annuus L. var. SH-222)に含まれアレロパシー活性を有するヘリアナン型セスキテルペン類の中で、特異なスピロ環構造を有するヘリスピロンBをターゲットとし、その初めてのエナンチオ制御全合成の達成を目的に検討を行った。また、前年度に行ったヘリスピロンA,Cの全合成研究途上に見出した非配位型ルイス酸を用いる新規炭素一炭素結合生成反応の一般化を図った。さらに、その新規変換反応の応用展開の一環として、ヘリアンヌオールEの全合成への展開を行い、以下に示す1-3の成果を挙げた。1、ヘリスピロンBの初めての全合成をめざして検討を行い、超原子価ヨウ素反応剤を用いる環化反応により、基本炭素骨格であるスピロ環構造を有する化合物を合成することが出来た。今後、ヘリスピロンBの全合成の完成に向けて検討を続けたい。2、非配位型ルイス酸であるシリルトリフラートによってプロモートされる転位反応による炭素一炭素結合形成反応の一般化を検討し、そのスコープとリミテーションを明らかにすることが出来た。今後の課題は、汎用性の拡大と応用展開であり、継続的な研究を行っていきたい。3、上記2で確立した転位反応に基づく新規炭素一炭素結合生成反応を応用することにより、ヘリアンヌオールEの4例目となるエナンチオ選択的全合成を達成した。この合成研究により、従来の方法で問題となっていた環境に適合しない反応剤の使用を避ける新たな合成ルートを開発することが出来た。ヒマワリ(Helianthus annuus L.var.SH-222)に含まれアレロパシー活性を有するヘリアナンセスキテルペン類の中で、生合成前駆体と考えられているヘリビサボノールA, Bおよび特異なスピロ構造を有するヘリスピロンA, Cをターゲットとし、それらの初めてのエナンチオ制御全合成の達成と絶対立体構造の決定を目的に検討を行い以下に示す14の成果を挙げた。1、ヘリビサボノールA, Bに対して提出されている構造を持つ化合物を合成したが、天然物とは一致せず、いずれの構造も誤りであることを明らかにした。2、ヘリビサボノールAについては、提出構造のジアステレオマーが天然物の正しい構造であることを合成により明らかにし、同時に絶対立体構造も決定できた。しかし、ヘリビサボノールBについては、可能性のある化合物をいくつか合成したがいずれも天然物とは一致せず、天然物の構造を明らかにすることができなかった。3、従来の天然物には例を見ない特異なスピロ構造を有するヘリスピロンAおよびCの初めてのエナンチオ制御全合成を達成した。鍵反応として、分子内細見-桜井反応および分子内オキシマイケル反応を組み合わせて用いた。本研究により、未決定であった絶対立体構造を明らかにすることができた。4、ヘリスピロンA, Cの全合成研究途上、ルイス酸としてTBSOTfを用いて分子内細見-桜井反応を行ったところ、炭素-酸素結合が炭素-炭素結合に変換されるという前例のない反応を見いだすことができた。今後、その一般化により、有用な方法論となることが期待される。
フランス文学における総合的生成研究-理論と実践

毎年数回研究分担者による最新の研究成果発表の機会を持ち、異なった作家の生成研究の前提条件や方法論に関する共通の理解を得た上で、班員による自由な意見交換を行い、方法論においていくつかの公約数を抽出した。また最終年度には、本共同研究の知見を核として、生成研究をテーマとした日本語の学術書の編纂を企画、準備した。当初の研究代表者・吉田城が平成17年6月に逝去したため、分担者であった田口紀子が代表者となり、当初の計画通り研究を進めている。まず9月に第1回の研究会を開き、今後の研究組織の打ち合わせを行い、当初の吉田案に基づいて共同研究を行うことで合意した。あわせて松澤がフロベール、和田章男がプルーストの草稿研究の現状とその問題点を報告し、異なる作家研究における草稿研究の動向についての共通認識を班員の間で共有した。田口はこのような作家ごとに異なる生成研究の現状をふまえ、この共同研究全体の具体的方法論の可能性を検討した。増田はルソーやディドロの作品の執筆過程を中心に、作品の生まれた時代状況、影響関係、間テクスト性について検討を行った。永盛は17世紀の劇作家が古典作品からどのように主題や構成を採り、創作においてどのように活用したのかについての検証を行った。稲垣はロマン主義の主要作家に関する一時資料の調査を中心に、資料発掘と整理を行い、ロマン主義文学の生成研究の基礎を固めた。和田章男は1909年から1911年にかけてのプルースト草稿をよりどころに、語彙とイメージの時系列的変遷に関して統計学的な視点も導入して研究を行った。松澤は数多くの関連資料をふまえフロベール生成研究をさらに推進するとともに、日本近代文学に生成研究を応用する準備を行った。加藤は和田章男とともに出版計画を進めているプルースト・カイエのディプロマティック・エディションの基礎固めを行い、その成果をプルースト研究誌に発表した。三野はカミュの研究資料の総合データベースの構築をはかった。水野はネルヴァルに関する生成研究の問題点をまとめた。その成果に基づき第2回研究会(4月8日)で基調発表を行う予定である。和田光昌は文学言語が医学など諸科学と取り結ぶ関係などについての研究の見地から、多領域を包摂する生成研究のあり方を検討した。平成18年度は三回の研究会を催した。4月8日(土)の研究会では、加藤靖恵「Cahier64 - Leconte de Lisleと「花咲く乙女たち」」、水野尚「ネルヴァル研究における生成研究の現在」の研究発表が行われた。加藤の発表は、プルースト作品の生成における間テクスト性の役割について、水野の発表は、「シルヴィー」の複数の版の間での異同の分析から、テクストの再解釈が示された。9月16日(土)の研究会では和田光昌「フロベール『ブヴァールとペキュシェ』の草稿に見る知と語り」、増田真「音楽論から記憶と夢想の詩学へ-ルソーの文学美学の形成の一側面」の研究発表が行われた。和田は作品の草稿分析からその背後にある時代の「知」の確定を試み、増田はルソー研究での「草稿」の意味を論じ、例として音楽論をめぐる著作のテクストからいかにルソーが自己の文学美学を形成したかを検討した。12月16日(土)の研究会では三野博司「ギロチンをめぐる三つのテクスト-『異邦人』『ギロチン』『最初の人間』」、吉川一義「プルースト-批評から創作へ」の研究発表が行われた。三野はカミュにおけるギロチンのテーマがどのように変遷したかを三作品において検証し、吉川はプルーストの批評作品がどのように創作へと結びついたかを読書のテーマについて明らかにした。以上の研究発表に加えて、本研究のテーマに基づいた国際シンポジウム(本年12月開催予定)の実現に向けて準備を始めた。現在班員を中心とした発表者17名を確定し、プログラムの決定に向けて作業を行っているところである。平成19年4月に定例研究会を開催し、永盛克也氏『ラシーヌ悲劇の生成過程(試論)』と稲垣直樹氏『"Hugo, helas"(A. Gide)-ユゴー研究における生成研究の位置』の2件の研究発表に基づいて、時代と文学の状況によって大きく異なる「テクスト生成」のあり方と方法論について、班員による活発な意見交換が行われた。さらに12月7目-9日の3日間、京都の関西日仏学館に於いて、国際シンポジウム"Comment nait une〓uvre litteraire?-Brouillons, contextes culturels, evolutions thematiques-"を開催した。フランス、アメリカから9名、また国内から班員を含めた19名の専門家が、17世紀から20世紀までのフランス文学の生成について報告し、活発な議論が戦わされた。このシンポジウムは「テクスト生成」に関して作家や時代を横断して行われる世界ではじめての大きなシンポジウムであり、報告者のみならず、参加した多数のフランスや日本の研究者からも、非常に高い評価を得た。さらにこのシンポジウムの報告書としてフランス語での論文集を刊行する予定である。

すでに原稿はほとんど集まり、具体的なフランスの出版社との交渉も近々始めることになっていて、順調にいけば2009年度の出版が見込まれている。平成20年7月12日に定例研究会を開催し、井上櫻子氏「『新エロイーズ』における田園詩的主題とその変奏-サン=プルーの欲望とその抑圧の問題を中心に」と小黒昌文氏「プルーストと写真芸術-世紀転換期の視覚文化をめぐって」の2件の研究発表に基づいて、作家にその時代の文化的状況が及ぼす影響とその影響の作品への反映について、班員による活発な意見交換を行った。その後は研究会は開かず、平成19年12月に開催した国際シンポジウム『文学作品はいかにして生まれるか?』の成果のフランスでの出版のため、原稿のとりまとめや図版の収集などを行った。原稿と図版は現在すべて整い、目下フランスのChampion社と出版交渉を行っている。予定通り進めば、Comment nait une oeuvre litteraire?-Brouillons, contextes culturels, evolutions thematiques-のタイトルで2010年には刊行される見通しである。さらに本共同研究の知見を核として、生成研究をテーマとした日本語の学術書の編纂を企画した。科研のメンバーに加えて数人の専門家に機構を依頼し、15世紀から現代までフランス文学の主要な作家をカバーする、世界でも類を見ない総合的生成論となる。読者としてはフランス文学の専門家のみならず、隣接分野の研究者、大学院生、また文学に興味を持つ学部学生もターゲットに入れており、これらの読者層に学問全体のパースペクティヴと先端の研究成果を提供することができるものと考えている。現在ほとんど原稿は集まっており、これも計画では『文学作品が生まれるとき(仮題)』として、京都大学学術出版会から2009年度中には刊行の予定である。
細胞内イメージングを目指した認識部位修飾フォルダマーによるタンパク質の認識

細胞表面あるいは細胞内での特定タンパク質の選択的なイメージングのためには、短いペプチドとそれを選択的に認識し結合できる人工分子との組み合わせを発見/開発することが非常に重要である。我々は、この目的のために、オリゴプロリンをペプチド鎖として選択し、これを認識できるコラーゲン類似の三重らせん型レセプター分子を合成し、そり認識挙動を吸収スペクトルの温度変化、CDスペクトルの温度変化、傾向的体などを用いて検討した。その結果、コラーゲンようのプロリン、ヒドロキシプロリンを含むオリゴペプチド二本を自由度を抑えたコネクターでつないだレセプター分子が、オリゴプロリン類縁体ペプチドと親和性を示すことを見いだした。これは、これまでに知らせていないペプチドプローブペアとして、タンパク質ラベル化などに利用できる可能性があり、詳細な配列選択性の検討や、認識力の向上などに研究を進めていく計画にしている。我々は、この目的のために、オリゴプロリンをペプチド鎖として選択し、これを認識できる人工分子をフォルダマーを含めて検討した。まずオリゴプロリンの特定部位にアルギニンを導入した。また、これとの相互作用が期待されるフォスフォン酸を有する人工分子の合成ルートを確立し、このルートに沿って複数種類の人工レセオプターの合成に成功した。ペプチドとこれらの人工分子の相互作用を等温熱量滴定によって評価したが、現在のところ強力な相互作用を見いだすには至っていない。
壮年期を終えた雄のチンパンジーにおける適応戦略

ヒトの女性が閉経後も長く生存することは、ヒトという種に進化した特徴とされる。実際、雌のチンパンジーは死の直前まで繁殖能力を維持する。一方、雄のチンパンジーは最盛期を越えると優劣順位が降下し、性的競争では不利になるが、生存と繁殖のポテンシャルは維持する。本研究は、野生チンパンジーの成熟雄を対象に、最盛期を終えた雄がゆっくり老化していく時期がもつ適応的意義を探り、ヒト科における老年期の起源を再考することを目的とする。「最盛期を終えた雄は、できるだけ長く生きられる低リスクの生活を選び、低頻度の繁殖機会を積み重ねて生涯繁殖成功を最大化する」という生存・繁殖戦略が明らかになることを期待している。
光誘起スピンクロスオーバー格子の構築による動的電子機能創製

ジオキソレン配位子はそのπ軌道がルテニウムイオンのd軌道と近いことから、分子内の電荷移動が極めて容易に起こりうることが知られている。本研究では、集積構造の基本素子であり、平面型のルテニウム錯体の合成を行い、更に、それらを集積化させることにより、光励起により伝導電子と磁性電子が同時に影響される新しい光誘起格子の構築を行った。酢酸ルテニウムと4当量のテトラクロロカテコール、8当量の水酸化ナトリウムをTHF中で反応させ、Ru_2(5+)中心を持つ二核錯体、Na_3[Ru_2(Cl_4Cat)_4](thf)(1)、を紫色微結晶として得た。この二核錯体の各々のルテニウムには二つのカテコラートが同じ平面上からキレート配位し、ルテニウム間距離は2.273(1)Åで直接結合があることが分かった。この錯体1をAgClO_4で酸化することによりRu_2(6+)中心を持つ錯体、Na_3[Ru_2(Cl_4Cat)_4](thf)(2)を得ることに成功した。この錯体1と同様ルテニウム-ルテニウム結合を持ち、かつその距離は2.2233Åで1よりも短くなっていることが分かった。これは異なる二つの酸化状態に於いて、その構造を比較検討できた非架橋型ルテニウム錯体の最初の例であり、Ru_2(6+)の方が強い金属一金属結合を生成することを示した初の例である。この2核(5+)錯体をピラジン(pyz)、あるいはテトラジン(tz)と反応させ、トリス型ルテニウム錯体がpyz、(あるいはtz)で連結された一次元ポリマー、Na_2[Ru(Cl_4Cat)_3(pyz or tz)]、を単結晶として得ることに成功した。カテコラートとpyz環が交互にスタックした構造を有しており、室温で半導体程度の電気伝導性が確認された。
感覚組織形成におけるモザイク様細胞配列形成機構の解析

本研究では、特徴的な細胞パターンをもつ嗅上皮に着目して、モザイク様の細胞パターンの形成機構の解析を行ってきた。本年度は、(1)発生過程の嗅上皮組織を用いた細胞再配列過程の経時観察、(2)遺伝子改変マウスを用いた細胞配列への影響の検討、(3)培養細胞を用いた細胞選別実験、をそれぞれ行った。これまでの研究によって、嗅上皮上の異なる機能を持つ細胞はそれぞれ異なる細胞接着分子群を発現していることを明らかにしている。また、培養細胞を用いた実験からは、同種親和的に働くカドヘリン分子、および、同種、異種親和的の両面に働くネクチンの2つの細胞接着分子が協調して細胞間の識別、接着、運動を制御することによって、モザイク様の細胞パターンを形成していることを明らかにした。また、昨年度中に嗅上皮組織の培養が可能になり、細胞境界を蛍光タンパク質によって標識したトランスジェニックマウスを用いて経時観察を行ったところ、顕微鏡下にて直接、嗅上皮上の細胞が運動によって自らの位置を変え再配列を行う過程を観察することが出来た。また、培養細胞を使って、嗅上皮の細胞と同様の接着分子を発現するモデル細胞を作成し、この細胞を用いて細胞選別実験を行い、細胞パターンの検討を行ったところ、嗅上皮で見られるものと同様の細胞パターンを再現することが出来た。さらに、これらの接着分子をノックアウトしたマウスを用いて、嗅上皮の細胞パターンを検討したところ、パターンの異常を示したことから、これらの分子が実際に嗅上皮の特徴的なパターン形成に関与していることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。鼻腔の嗅上皮組織では嗅細胞と支持細胞が特徴的なモザイク模様に配列しており、これらの配列が発生過程の細胞の再配列運動によって生じること、また嗅細胞と支持細胞では細胞ごとに様々な細胞接着分子が特徴的なパターンで発現していることをこれまでに見出している。本研究では組織内の細胞配列形成の機構を明らかにする目的で、マウス嗅上皮で見られる特徴的な細胞配列に着目し、(1)発生過程の嗅上皮組織を用いた細胞再配列過程の経時観察、(2)遺伝子改変マウスを用いた細胞配列への影響の検討、(3)培養細胞を用いた細胞選別実験、をそれぞれ行っている。(1)の組織培養とその経時観察については、これまでに、マウス嗅上皮の組織培養法を樹立し、細胞境界を標識する遺伝子改変マウスを用いることで、発生過程の嗅上皮組織を顕微鏡下で培養、維持しながら細胞の再配列運動を可視化することに成功した。これによって、新しい知見が得られつつある。また、(2)の遺伝子改変マウスを用いた研究項目については、嗅細胞において特異的な遺伝子欠損をさせるための遺伝子改変マウスを既に導入し、現在、様々な分子を嗅細胞で特異的に欠損させたマウスの交配を進め、解析の準備を行っている段階である。(3)の培養細胞を用いた細胞選別実験については、これまでに嗅上皮を構成する細胞で発現している様々な細胞接着分子を同定し、これらを発現するモデル細胞を作成した。現在、これらの細胞を用いて、様々な組合せにおける細胞選別実験を行っている段階である。発生過程のマウスから摘出した嗅上皮組織を48時間以上にわたって培養する技術を確立できた点は、大きな進歩であった。また、この組織培養の技術とともに、細胞境界をEGFPで標識する遺伝子改変マウスを用いて、嗅上皮の細胞境界とともに細胞配列を可視化することが出来た。これら2つが出来たことにより、本研究の最も大きな目的である、嗅上皮組織における再配列運動を、生きたまま観察することが可能になり、今後の研究の進展に目処が立った。

今後は、これまでに細胞配列に異常が観察されている様々な遺伝子欠損マウスを用いて、組織培養を行うことにより、細胞配列が異常になる過程を詳細に観察し、そのメカニズムを明らかにする予定である。遺伝子欠損マウスを用いた嗅上皮における細胞パターンの解析と培養細胞を用いた細胞選別の研究についても順調に進展している。これまでの研究結果から、様々な細胞接着分子が性質の異なる細胞接着分子と協調して細胞間の識別、接着、運動を制御することによって嗅上皮のモザイク様の細胞配列を形成している可能性を想定し、組織培養と培養細胞を用いた研究を組み合わせて研究を進める。特に、細胞間接着とシグナル伝達など様々な細胞機能が細胞配列形成に及ぼす作用を統合的に検討する。嗅上皮組織の経時観察では、遺伝子改変マウスを用いて嗅細胞や支持細胞を蛍光標識して顕微鏡下で培養を維持したまま細胞の再配列過程の経時観察を行う。同時に遺伝子改変マウスを用いて嗅上皮の細胞特異的な遺伝子ノックアウトや本来発現しない細胞への異所的な遺伝子発現を行い、組織内での細胞再配列への影響を検討する。さらに、これらの実験で着目した分子を発現する培養細胞を作成して細胞選別実験を行い、細胞間の接着親和性や細胞間に働く力が細胞配列に及ぼす影響について解析する。
HF溶融塩を用いる機能性物質の創製を目指した新規精密制御フッ素化法の開発

当研究室でここ数来蓄積してきたHF取り扱いのノウハウを有効に生かして種々の組成から成るHF溶融塩(HF-塩基溶液等)を合成し、HF溶融塩を反応場およびフッ素源として生物活性物質・機能性素材等の中間体や原体としての利用が期待される有機フッ素化合物を合成するための新規精密制御フッ素化法の開発を行なった。平成9年度平成11年度の実績は以下の通りである。2. EG-ArIF_2はHF溶融塩を反応溶媒とすることで、β-ケトカルポニル化合物のα-fluorination、ターミナルオレフインのvic-difluorination、官能基を持つオレフインの環化フッ素化、シクロオレフインの環縮小を伴うgem-difluorination等の優れた反応試薬となる。また、末端アセチレンとの反応で得られる[E]-2-Fluoroalkenylヨードニウム塩(1)はPd触媒等によりカルボメチル化やアミノ化反応、Heck型カップリング反応などを起こし、しかも1の立体を保持した種々の[E]-型-フルオロオレフインを与える新規立体選択的合成法となることを明らかにした。3.HF溶融塩の存在下、ArIF_2と一級オレフインを反応させるとvic-ジフルオロアルカンが収率よく得られるた。一方、不飽和アルコールあるいは不飽和カルボン酸との反応ではフルオロ環状エーテルあるいはフルオロラクトンが得られた。4.β-位にMeS基を二個もつジビニルケトンをトリフルオロ酢酸水銀とピリジン-6HF錯体の存在下に反応させるとフルオロ環化反応が促進し、フルオロペンテノン誘導体が好収率で得られることを見出した。5.有機電解部分フッ素化に優れたHF溶融塩を用いて、電子求引基を共役するジェンやスチレンからvic-ジフッ素化が進行すること、また芳香族側鎖の電解部分フッ素化によりモノおよびジフッ素化体が良好な収率で得られることを明らかにした。一方、p-位に置換基を持たないフエノール類の電解フッ素化を行うと4,4-ジフルオロシクロヘキサ-2,5-ジエンノン(2)および4-フルオロ-4-置換シクロヘキサ-2,5-ジエンノン誘導体を与え、2を還元することにより4-フルオロフェノール類が容易に得られることを明らかにした。6.アミノベンゼン類の光脱アミノフッ素化反応に関する機構の解明を行い、工業的規模での生産技術の開発とその応用を行った。当研究室でここ数来蓄積してきたHF取り扱いのノウハウを有効に生かして種々の組成から成るHF溶融塩(HF-塩基溶液等)を合成し、ハイテクケミカルとして有用な生物活性物質・機能性素材の中間体や原体として期待される有機フッ素化合物を合成するための有用な手段としてHF溶融塩を反応場およびフッ素源とする新規精密制御フッ素化法の開発を行なった。平成9年度の実績は以下の通りである。1.HFと有機塩基、HFとアルキルアンモニウム塩の種々の割合により調整したHF溶融塩を合成し、分光学的手法・電気化学的手法によりHF溶融塩中の特性を検討した。

2.1.の方法で得られたHF溶融塩はオレフィン、オキシラン、不飽和アルデヒドおよびジエノンとの反応においてこれまでにない新規なフッ素化生成物を与えることが明らかとなった。3.光学活性なエポキシアルコールと(RO)_nTiF_<4n>との錯体をHF溶融塩で開環フッ素化すると位置選択的および立体選択的なフルオロジオールが得られた。4.ArIF_2自身のフッ素化活性は低いが反応系にHF溶融塩を加えることで反応性が著しく向上し、ケトエステル類のフッ素化が容易に進行する。この反応を利用して光学活性なケトエステルからジアステレオ選択的含フッ素カルボニル化合物が合成できる。5.HF溶融塩中でヨードべンゼン類を電解酸化すると容易にArIF_2が生成し、このArIF_2をメディエタ-とする間接電解(in-cell法)が可能となる。また、二層型電解層を用いることによりArIからArIF_2が容易に合成できるex-cell法によるフッ素化が可能なことも明らかにした。6.有機電解部分フッ素化における支持電解質兼溶媒として優れたHF溶融塩を開発し、アルデヒド、ケトン、不飽和ケトエステル、ラクタム等種々カルボニル化合物の電解フッ素化反応の開発を行った。当研究室でここ数来蓄積してきたHF取り扱いのノウハウを有効に生かして種々の組成から成るHF溶融塩(HF-塩基溶液等)を合成し、HF溶融塩を反応場およびフッ素源として生物活性物質・機能性素材等の中間体や原体としての利用が期待される有機フッ素化合物合成のための新規精密制御フッ素化法の開発を行なった。平成10年度の実績は以下の通りである。2.1.項の方法で得られたTol-IF_2をHF溶融塩溶液存在下でアルキンと反応させると[E]-2-フルオロアルケニルヨードニウム塩(1)が選択的に生成することを明かにした。3.2.項で得られた1をPd(OAc)_2および塩基の存在下、α,β-不飽和カルボニル化合物と温和な条件下でHeck型反応を行うことによりδ-フルオロ-α,β,γ,δ不飽和カルボニル化合物が得られた。反応は立体選択的に進行し1の立体は保持され、新たに生成した二重結合は[E]-型となった4.HF溶融塩の存在下、ArIF_2と一級オレフインを反応させるとvic-ジフルオロアルカンが収率よく得られるた。一方、不飽和アルコールあるいは不飽和カルボン酸との反応ではフルオロ環状エーテルあるいはフルオロラクトンが得られた。5.β-位にMeS基を二個もつビニルケトンをトリフルオロ酢酸水銀とピリジン-6HF錯体の存在下に反応させるとフルオロ還化反応が促進し、フルオロペンテノン誘導体が好収率で得られることを見出した。6.有機電解部分フッ素化における支持電解質兼溶媒として優れたHF溶融塩を開発し、カルボニル等の官能基をもつ不飽和化合物、芳香核側鎖の電解フッ素化反応の開発を行った。当研究室でここ数来蓄積してきたHF取り扱いのノウハウを有効に生かして種々の組成から成るHF溶融塩(HF-塩基溶液等)を合成し、HF溶融塩を反応場およびフッ素源として生物活性物質・機能性素材等の中間体や原体としての利用が期待される有機フッ素化合物を合成するための新規精密制御フッ素化法の開発を行なった。平成11年度の実績は以下の通りである。
単一細胞における電気活動と形態解析の同時処理システムの開発

生体諸臓器の細胞機能は多くは細胞膜を介した情報伝達に始まり,細胞内セカンドメッセンジャ-から機能タンパクの変化をへて細胞機能制御が行われる。本研究は細胞内物質調節下に細胞膜電気活動の測定と形態・機能変化を併せて記録することにより,細胞の興奮ー機能連関とその神経体液性調節のメカニズムを解明する研究法を確立しようとすることを目的とする。(1)単一細胞における電気活動と機能解析。心臓ペ-スメ-カ-細胞,心房筋細胞についてムスカリン性K電流の活性化機構をアラキドン酸代謝産物その他の活性物質について検討,G結合タンパクの関連性をみた。気管支平滑筋に関しては,細胞長径の短縮率と電位依存性Ca電流の測定に成功し,両者の動きの関連をみた。小腸平滑筋細胞では腸管機能調整薬の収縮とCaあるいはK電流系作用をみた。膵腺房細胞においてはムスカリン性電流のアラキドン酸による抑制反応をみ,細胞のエクソサイト-シスを意味する膜表面積の増加を膜容量変化としてみながら刺激ー分泌連関を検討した。(2)細胞内Caストアの動態と機能。脱分極刺激によるCa電流と細胞内Ca濃度変化の同時記録を行った。盲腸平滑筋細胞において脱分極に伴う蛍光強度は概ね直線的に変化したが,それぞれの積分値の時間経過でみると後者にはわずかの遅れがあった。同様な観察は弛緩相についても行われた。平滑筋スキンドファイバ-を用い,Ca漏出速度と取り込み量との関係からファイバ-中の筋小胞体をいくつかのコンパ-トメントに分けて考える必要があることを示した。(3)血管平滑筋細胞内のCa分布の画像解析。培養細胞を用い,Caの細胞内局在とその薬物による局所応答を多次元画像解析により解析した。これにより,細胞内Ca貯臓部位上のカフェイン,イノシト-ル3リン酸感受性チャネルの分布が細胞によって異なること,これが細胞成長サイクルに規定されるものがあること,をみた。今年度は本プロジェクトを成功させるための以下の準備的実験及び装置の設置を行なった。(1)単一細胞で細胞内カルシウムの測定:購入したスペックス社製の蛍光光度測定装置を用い、単一血管血管筋細胞、心筋細胞、単一膵臓腺細胞の細胞内カルシウムの変動をフラー2AMにより測定し、ノルアドレナリンやアセチルコリンなどの生理活性物質による変化をみた。(2)細胞内環境を変化させずに細胞内電気活動を測定する方法として、イオノフォアであるナイスタチンを使用したパッチクランプ法を確立した。このナイスタチン法では、電極先端に接触した細胞膜に1価イオンだけを通過させる小口ができ、膜抵抗が著減する。しかしながら、細胞内のアデニンヌクレオチドの様な代謝物質はこの穴を通過できないので、生理的な細胞内環境を保ちつつ、電気活動の測定が可能となった。この方法で、これまで測定の困難であった気管上皮細胞などでも、繊毛運動を保ちながら電気活動の測定ができる様になった。(3)コントラスト増強法による細胞内構造物の観察に関しては、ラットの腹腔内肥満細胞を使用し、細胞内顆粒の分泌をモデルに検討を加えている。これまでの所、それぞれの細胞内構造物を特定するにはさらに工夫がいると思われる。共焦点顕微鏡の使用を行うか、あるいは細胞内に標色色素を注入するなどの試みを行いたいと考えている。

(4)(1)と(2)の成果を基礎に細胞の電気活動の測定と細胞内カルシウムの同時測定を現在行おうとしている段階であり、スペックス蛍光測定装置とパッチクランプセットの設置を完了した。以上、本年度はこのプロジェクトの第一段階であるが、それぞれの準備実験から今後、種々の目的で使用可能な方法(たとえばナイスタチンを用いたパッチクランプ実験)が確立できた。次年度は、これらの準備を基礎に最終目標の各細胞の興奮一機能連関の研究を行うことができる。1.平滑筋細胞における細胞内Ca^<2+>の測定報告者はラット大動脈血管培養平滑筋細胞において細胞内Ca^<2+>調節機構を検討し、K^+、カフェイン、アンギオテンシンIIの各々による細胞内Ca^<2+>の増加機構が細胞分化の段階により異なることを見出した。また細胞内Ca^<2+>とパッチクランプ法による膜電流の同時測定にも成功した。2.膵腺細胞アセチルコリンによる細胞内Ca^<2+>上昇に伴うK^+電流の出現を指標にアセチルコリン作用の発現・脱感作について報告した。また、アラキドン酸による細胞内Ca^<2+>の遊離の調節機構について検討している。この主題に関し、細胞内Ca^<2+>と膜電流の同時測定を試みている。3.心筋細胞アラキドン酸代謝物質による心筋細胞ムスカリン性K^+チャンネルの活性化の生理的意義について検討し、α受容体作用に関与していることを明らかにした。また細胞内環境を維持した状態でパッチクランプ法による細胞電気活動の測定を可能とするため、イオノフォア、ナイスタチンによる膜電位固定法を確立し、報告した。この方法を用いて、種々のアゴニストや薬剤の膜電流系に対する効果を検討し、その有用性を確認した。この方法は細胞内環境を長く生理的な条件に保持し、細胞の収縮も持続する。従って、形態変化と膜電流系の同時解析に適切な方法と考えられた。1.心房筋細胞。Gタンパクベ-タ-,ガンマサブユニットによるムスカリン性K電流の活性化にフォスフォリバ-ゼA2活性化を介したアラキドン酸代謝促進が関与しているか否かを検討し,このチャネル活性化は直接的な作用であることを知った。2.気管支平滑筋細胞。単離細胞についてアセチルコリン,ヒスタミン,Kによる用量依存性収縮をみ、これに関連する電位依存性Ca電流が主にL型に由来することを示した。3.小腸平滑筋細胞。アセチルコリンが振動性の外向きCa感受性K電流を抑制することから,この電流抑制のメカニズムを細胞の収縮と地緩との関係から検討した。4.膵腺房細胞。膜容量の増加を来す細胞内機構はカルシウム依存性と非依存性のものがあり,前者はイノシト-ル代謝系などによる細胞内カルシウム増加反応で誘発されることを示した。5.骨格筋。興奮収縮連関において,CaによるCa放出機構を介するカフェイン拘縮は膜電位センサ-が不活性化すると抑制されることが明らかになった。6.血管平滑筋細胞。フラュによる細胞内Caの局在した分布をきたす細胞内小器官を同定し,またアンジオテンシン2によるその局所応答を画像解析した。これにより,細胞内貯蔵部位からのCa放出機構が細胞間で異なることが示された。7.門脈平滑筋細胞。サボニン処理によってスキンドファイバ-として,フラ2法によりCa放出を測定した。