hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳アミロイドβに固有の産生分泌メカニズムと蓄積制御

アルツハイマー病の原因となるAβペプチドが脳内の神経細胞から産生分泌される機序は不明である。(1)マウス脳の解析から、基質APPおよびAβ産生に関わるγセクレターゼはシナプス前膜の活性化ゾーンとそれに結合したシナプス小胞に局在することを解明した。(2)脳Aβ蓄積を促進するPresenilin-1の翻訳後修飾を検討したが有意な結果は得られなかった。(3)Aβ産生を抑制するILEI (ACDP)はシナプス前膜に局在していた。また、本症の脳では発現レベルの低下が認められた。ILEI様活性を示す治療薬開発に向け、ILEIとPresenilin-1との結合を解析し分子設計を目指して評価を継続している。1.脳内Aβ産生分泌部位の検討ーシナプス前部仮説の検証Aβ産生に関連する分子群として、γセクレターゼ複合体構成タンパク質(Presenilin, Nicastrin, APH-1, PEN-2)およびγセクレターゼ活性制御タンパク質p24a2について脳シナプス局在を検討した。ホモジナイズしたマウス脳組織を用い、超遠心分離によるシナプトゾーム単離やマーカー特異抗体によるシナプス小胞単離などを組み合わせ、種々の細分画化を行った。その結果、これらタンパク質はシナプス前部、とくにアクティブゾーンないしそれに融合したシナプス小胞に濃縮して局在していることが明らかとなった。これは脳実質内細胞間液Aβ濃度が神経活動に依存して変動するという報告に対応する所見として重要である。2.シナプス部γセクレターゼ複合体の分子修飾の解析γセクレターゼ複合体構成タンパク質のなかでも触媒部位を提供するPresenilin-1について、脳老化に伴う翻訳後修飾の評価方法の検討を進めている。Presenilin-1全分子のなかで修飾を受ける分子の割合は多くないことが予想され、これを鋭敏かつ的確に評価するには予想以上の困難があることが判明してきた。3. Aβ産生抑制タンパク質ILEI (ACDP)を標的とするADの予防的治療法の探索γセクレターゼ複合体に作用する分子として同定した分泌タンパク質ILEIは基質APP-C99の安定性を低下させAβ産生を抑制するが、アルツハイマー病患者の脳ではその発現レベルが減少していること、さらに、マウスにおけるILEIトランクジェニック(Tg)発現は、ADモデル(APP-Tg)マウスの脳アミロイド沈着と記憶障害の出現を抑制することを実験的に証明し論文報告した(Nature Communications 2014)。1.脳内Aβ産生分泌部位の検討ーシナプス前部仮説の検証Aβ産生に関連する分子群の脳シナプス局在について、マウス脳ホモゲネートを用いたシナプトゾーム分画やシナプス小胞の単離などによって解析した結果、これらはシナプス前部とくにアクティブゾーンないしそれに融合したシナプス小胞に濃縮して局在していることが明らかとなった。さらに、脳Aβ産生を抑制するタンパク質として同定しているILEIの脳内局在の検討から、ニューロン細胞体のトランスゴルジネットワークに加え、アクティブゾーンないしそれに融合したシナプス小胞への局在が認められた(論文投稿中)。2.シナプス部γセクレターゼ複合体の分子修飾の解析γセクレターゼ複合体構成タンパク質のなかでも触媒部位を提供するPS1について、脳老化に伴う翻訳後修飾の検討を進めている。現在まで、有力な候補となる分子修飾を特定できていない。検討を継続中である。3. Aβ産生抑制タンパク質ILEI (ACDP)を標的とするADの予防的治療法の探索ILEIはγセクレターゼ複合体に結合し、基質APP-C99の安定性を低下させAβ産生を抑制する。この結合を統計力学3D-RISM理論に拠って解析し、分子設計によるAβ産生阻害薬の開発を目指している。まず、この結合はPS1のC末端細胞外領域にあるDQL配列に依存すること、およびこの結合が複合体形成に依存せず、当該アミノ酸配列によることを確認した。また、ILEIの予測構造上にDQL配列の側鎖の分布をマッピングした結果、ILEI上のPS1認識部位の候補が特定できた。さらに、γセクレターゼ複合体の立体構造上におけるDQL配列領域に、ILEIのPS1認識部位をドッキングすると、ほとんど立体障害のない結合様式が予測された。現在、より恣意性の低いデータの導出を試みている。脳内Aβ産生分泌部位の検討では、p24α2に加えILEIのアクティブゾーン局在が確認できた。PS1の翻訳後修飾については検討を進めている。一方、ILEIに基づく創薬については、3D-RISM理論による解析が予想以上に捗り、薬剤の分子設計の可能性が高まった。以上より、達成度は「おおむね順調」と判断された。(1)脳内Aβ産生分泌部位の検討-シナプス前部仮説の検証:マウス脳の懸濁液からシナプス構造を分画化し(シナプトソーム)、さらに界面活性剤への溶解度差を用いた分画化やマーカータンパク質抗体への親和性によるシナプス小胞単離などを併用し、各分画に含まれるタンパク質を検出して仮説を評価した。その結果、基質APPおよびγセクレターゼ複合体はシナプス前膜、なかでも活性化ゾーンとそれに関連したシナプス小胞に濃縮して局在することが明らかとなり、シナプス前部仮説が支持された。(2)シナプス部γセクレターゼ複合体の分子修飾の解析:Aβ42

産生比を増加させるPresenilin-1の翻訳後修飾の可能性について検討するため、HEK293細胞およびカニクイザル脳の懸濁液を用い、抗Presenilin-1抗体でγセクレターゼ複合体を免疫沈降した後、抗リン酸化Ser/Thr抗体、抗リン酸化Tyr抗体、抗アセチル化Lys抗体、ニトロ化Tyr抗体を用いたイムノブロット法で検出を試みたが、いずれも有意ではなかった。(3)Aβ産生抑制タンパク質ILEI (ACDP)を標的とするADの予防的治療法の探索:脳ILEIはγセクレターゼ複合体同様にシナプス前分画での発現が確認された。ILEIはγセクレターゼ複合体に結合し、基質APP-C99の安定性を低下させAβ産生を抑制する。この結合を統計力学3D-RISM理論に拠って解析し、分子設計によるAβ産生阻害薬の開発を目指した。まず、この結合はPresenilin-1のC末端領域DQL配列に依存することを見出した。ILEIの予測構造上にDQL配列の側鎖の分布をマッピングした結果、ILEI上のLys84側鎖近傍に結合部位の候補が特定された。数種のLys84置換変異体を発現するプラスミドを作製し、ILEIノックアウトHEK293細胞に発現させて機能評価を継続している。アルツハイマー病の原因となるAβペプチドが脳内の神経細胞から産生分泌される機序は不明である。(1)マウス脳の解析から、基質APPおよびAβ産生に関わるγセクレターゼはシナプス前膜の活性化ゾーンとそれに結合したシナプス小胞に局在することを解明した。(2)脳Aβ蓄積を促進するPresenilin-1の翻訳後修飾を検討したが有意な結果は得られなかった。(3)Aβ産生を抑制するILEI (ACDP)はシナプス前膜に局在していた。また、本症の脳では発現レベルの低下が認められた。ILEI様活性を示す治療薬開発に向け、ILEIとPresenilin-1との結合を解析し分子設計を目指して評価を継続している。Presenilin-1の翻訳後修飾の評価方法については、予想外の困難さを認めた一方、Aβ産生に関連する分子群のシナプス前部への局在については、予想を超えて初年度内に成果をまとめられるまでに到達した。ILEI解析に関しては、ほぼ当初の計画通りに進めることができた。以上より、達成度は「おおむね順調」と判断された。1.脳内Aβ産生分泌部位の検討ーシナプス前部仮説の検証脳内Aβ産生部位として、シナプス前部のなかでもアクティブゾーンないしアクティブゾーンに融合したシナプス小胞が有力な候補であることが前年度までに判明した。一方、遊離型シナプス小胞にはAβ産生関連分子の局在はごく少量しか見られなかった。これはシナプス部でのAβ産生分泌機構やアルツハイマー病治療薬としてのAβ産生阻害剤開発を考える上で重要な所見である。Aβ産生抑制タンパク質であるp24α2やILEIも同部位に濃縮して局在することが明らかになったが、さらに詳細にシナプス部でのAβ産生分泌メカニズムの解析を進める。2.シナプス部γセクレターゼ複合体の分子修飾の解析γ
航空ネットワークとハブ空港の料金政策

平成30年度の研究実績として,国際学術専門誌(査読付き)の公刊論文1点および,国際学会の発表論文3点が挙げられる。これらの論文4点は本研究の目的と一致しており,得られた研究成果のもとで,航空および空港産業に対する具体的な政策提言がされている。当初の研究計画では,既存大手航空会社の競争戦略とハブ空港の料金政策に焦点を当てており、航空会社間の非対称性(市場シェアの違い)について,分析の視野から捨象していた。しかし,研究計画が進むにつれて、航空会社の市場シェア(滑走路の利用頻度)の違いによって,空港にもたらす混雑の度合いが異なり,その違いに応じる差別料金の必要性を認識するようになり,研究対象を拡大して,発展させることができたためである。また,両国を結ぶ複数空港まで拡張し,それぞれの空港の料金政策と滑走路の増設投資について,グローバル厚生およびローカル厚生の観点から議論できた点も研究が当初の計画以上に進めている理由の一つである。平成30年度では,研究計画調書の計画IIIにしたがい,国際ハブ空港間の補完的・代替的関係に注目しながら,複数ハブ空港の料金政策および滑走路の投資政策について,分析していく。具体的な実施計画については以下のように立てる。[1]現状調査では,欧米やアジア太平洋地域を中心に,国際航空ネットワークの運航の現状とハブ空港間の協力的・競争的関係を調査し,また複数ハブ空港の料金体系についても,その実態を把握しておく。[2]関連研究の収集・サーベイと再整理では,複数の国際ハブ空港を取り扱う論文をサーベイしながら,分析モデルの構築に活用する。[3]モデルの構築と分析では,上述の作業を踏まえて,モデルを構築し,定性・定量分析を行い,結果を得る。得られた結果について,解釈を与えると同時に実証研究の結果との関連性を明らかにする。それらを踏まえて,政策的な含意を引き出す。当初の研究計画では,既存大手航空会社の競争戦略とハブ空港の料金政策に焦点を当てており、ハブ空港の商業施設投資と空港使用料金の規制政策については、分析の視野から捨象していた。研究計画IとIIが進むにつれて、ハブ空港の商業収入の重要性と航空系・非航空系の料金規制のあり方なども重要な課題として認識するようになり、研究対象を空港の商業施設投資と空港料金の規制政策まで拡大して,発展させることができたためである。平成29年度の研究実績として,国際学術専門誌(査読付き)の公刊論文2点および,国際学会の発表論文1点が挙げられる。1点目の公刊論文“Optimal privatization and uniform subsidy policies: Anote"は本研究計画と深く関連している空港の料金政策を政府の補助金政策としての側面を取り上げ,民営化政策と補助金政策との関連性を空港経営と社会厚生の観点から分析している。2点目は公刊確定の論文であり,論文の題名は“Optimal Privatization Policyunder Private Leadership in Mixed Oligopolies"である。この論文は本研究の計画を拡張して,航空市場における民間空港と国営空港との役割(先導者・追随者)について議論している。この2点の公刊論文は近年研究が盛んに行われている混合寡占市場の分析手法を空港・航空産業に応用することによって,得られた研究成果である。3点目の国際学会の発表論文““International Hub: Congestion Pricing and Capacity Investment"は,本研究の計画II(ハブ型ネットワークの外部効果とハブ空港の料金政策を分析する計画)を拡張して,ハブ空港の混雑を緩和するための料金政策のみならず,滑走路の増設投資についても議論している。これらの論文3点は本研究の目的と一致しており,得られた研究成果のもとで,航空および空港産業に対する具体的な政策提言がされている。当初の研究計画では,既存大手航空会社の競争戦略とハブ空港の料金政策に焦点を当てており、ハブ空港の滑走路増設投資については、分析の視野から捨象していた。研究計画が進むにつれて、ハブ空港の混雑問題を解決するためには,空港使用料金に加えて,長期的な滑走路増設投資もきわめて重要な政策手段として認識するようになり、研究対象を拡大して,発展させることができたためである。また,空港の料金政策を政府の補助金政策としての側面を取り上げ,民営化政策と補助金政策との関連性が議論できた点も研究が当初の計画以上に進めている理由の一つである。今後の研究の推進方策として,研究計画調書の計画IIIにしたがい,国際ハブ空港間の補完的・代替的関係に注目しながら,ハブ空港間の料金競争が国際航空市場にもたらす効果を明らかにする。

[1]現状調査では,欧米やアジア太平洋地域を中心に,国際航空ネットワークの運航の現状とハブ空港間の協力的・競争的関係を調査し,また国有ハブ空港と民営化されたハブ空港間の料金競争についても,その実態を把握しておく。[2]関連研究の収集・サーベイと再整理では,国際ハブ空港間の非価格競争に関連する論文および,国内市場の複数ハブ空港の料金競争を分析する研究をサーベイしながら,分析モデルの構築に活用する。[3]モデルの構築と分析では,上述の作業を踏まえて,モデルを構築し,定性・定量分析を行い,結果を得る。得られた結果について,解釈を与えると同時に実証研究の結果との関連性を明らかにする。それらを踏まえて,政策的な含意を引き出す。平成30年度では,研究計画調書の計画IIIにしたがい,国際ハブ空港間の補完的・代替的関係に注目しながら,ハブ空港間の料金競争が国際航空市場にもたらす効果を明らかにする。具体的な実施計画については以下のように立てる。平成30年度では,研究計画調書の計画IIIにしたがい,国際ハブ空港間の補完的・代替的関係に注目しながら,複数ハブ空港の料金政策および滑走路の投資政策について,分析していく。[1]現状調査では,欧米やアジア太平洋地域を中心に,国際航空ネットワークの運航の現状とハブ空港間の協力的・競争的関係を調査し,また複数ハブ空港の料金体系についても,その実態を把握しておく。[2]関連研究の収集・サーベイと再整理では,複数の国際ハブ空港を取り扱う論文をサーベイしながら,分析モデルの構築に活用する。平成28年度において、当初予定していた印刷用紙等の物品の購入が必要なくなったため。(理由)平成29年度において、当初予定していた英文の校閲費用が必要なくなったため。
ミクログリアを標的としたうつ病治療に関わるストレス応答機構の解明研究

Phospholipase C-related catalytically inactive protein (PRIP)がミクログリアの機能を調整するという仮説のもとで、Prip欠損マウスを用いて、炎症下におけるうつ病様行動に与えるPRIPの役割とその分子機構解明を行うことが本研究の目的である。PRIP欠損マウスはLPS投与により引き起こされる摂餌量抑制に対して脆弱性を示した。PRIPは、視床下部ミクログリアにおけるAKT-IKK経路を抑制し、グリア細胞間の情報伝達を介した炎症性サイトカインの産生を制御することで脳内炎症を調節する分子であることが明らかとなった。Phospholipase CはToll-like receptor 4を介した炎症反応を制御することが明らかとなっており、我々はPLCの構造類似体であるPLC-related catalytically inactive protein (PRIP)の欠損マウスが炎症に対して脆弱性を示すことを見出した。うつ病などの精神疾患の病態生理はいまだに不明な点が多く残されている。近年、脳内における免疫応答の亢進がうつ病の病態に関与することが明らかとなってきた。本研究では、PRIPと脳内免疫応答の関与を明らかとすることを目的としてPrip欠損マウスを用いて実験を行っている。これまでに我々は、Prip欠損マウスがストレス負荷に対して脆弱性を示すことを見出し、ストレス応答におけるPRIPの関与の可能性を明らかにした。また、Prip欠損マウスはlipopolysaccharide (LPS)誘発性の摂食抑制行動に対して脆弱性を示し、これは視床下部における炎症反応の亢進によるものである可能性を見出した。加えて、PRIPは脳内免疫応答を司るミクログリアにおける炎症反応を制御することも明らかとした。よって、PRIPが脳内免疫応答を制御し、中枢機能に関与する分子であるという知見を得た。慢性ストレスによる応答として、野生型とPRIP欠損マウス間にうつ病様行動に有意な差を観察した。慢性ストレスにより脳内炎症が引き起こされることから、lipopolysaccharide (LPS)投与による炎症反応時における中枢機能を解析したところ、PRIP欠損マウスは炎症反応時の摂食行動が野生型に比べて有意に低下することを見出した。また、PRIP欠損マウスにおいて、摂食中枢である視床下部の炎症性サイトカインの遺伝子発現は野生型よりも亢進しており、これは脳内免疫担当細胞であるミクログリアにおける抗炎症性サイトカインの発現低下によるものである可能性を見出した。これらの結果は当初の計画通り、ミクログリアにおいて、PRIPがストレス応答に対して重要な役割を担うことを示すものである。うつ病は、睡眠障害や抑うつ気分、摂食障害、社会的引きこもりなどの症状を呈する疾患である。うつ病には脳内における炎症反応の亢進が深く関与することが明らかとなってきた。これまでにPrip欠損(KO)マウスは野生型(WT)マウスに比べて、lipopolysaccharide(LPS)による視床下部における炎症性サイトカインの発現や、それに伴う摂餌量低下が増大することから、PRIPは中枢炎症を負に制御する分子であることを明らかにした。本年度は、PLC-related catalytically inactive protein (PRIP)の中枢炎症反応における役割の解明をミクログリアに着目して試みた。MACSシステムを用いて視床下部から単離したミクログリアにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現を、qPCR法を用いて検討した結果、KOマウスにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現はWTマウスに比べて有意に高かった。初代培養ミクログリアを用いた検討において、KOはWTよりもAKTーIKK経路が亢進している一方で炎症性サイトカインの発現には遺伝子型間に差は観察されなかった。しかしながら、ミクログリア-アストロサイトの共培養系をLPSで刺激するとミクログリアにおける炎症性サイトカインの発現はWTに比べてKOで上昇した。これらの結果は、PRIPによるAKT-IKK経路の亢進は、グリア間の情報伝達を増大させる役割を担うことを示唆している。本研究において、PRIPは中枢炎症において、グリア間コミュニケーションを調節することで摂餌行動を制御する分子であることを明らかとした。本年度は、ミクログリアにおいて、PRIPがストレス応答に重要な役割を担うことを示した。今後は、ミクログリアにおけるPRIPの機能を、炎症反応時のシグナル機構や、グリア細胞間あるいはグリア細胞-神経間の情報伝達などに着目して分子生物学的手法を用いて解明することを目的として研究を行う予定である。薬理学海外からの試薬の輸入が年度内に間に合わなかったため。すでに試薬は入手している。研究計画に変更はなく、記載の計画通りに研究を遂行する予定である。
気相中および水中の有機塩素化合物を高効率で無害化するための光触媒の開発

土壌や地下水の汚染物質として問題視されている有機塩素化合物の無害化効率を向上させることを目的に実験を行った。まず、気相中におけるトリクロロエチレンの光触媒分解においては2つの方法により無害化効率を向上できた。1)副生成物の2次的な処理副生成物として、ジクロロ酢酸、ホスゲン、クロロホルムが生成した。このうちジクロロ酢酸は酸化チタン表面に蓄積するが、水蒸気を含む空気を流して光照射することにより、ホスゲンと二酸化炭素に分解できた。反応後のガスに含まれるホスゲンはアルカリ性の水溶液に通すことで除去できた。一方、クロロホルムは十分な接触時間をとることで、酸化チタン上において二酸化炭素へ完全に分解できた。ただし、クロロホルムの場合は生成した無機の塩素が触媒表面に蓄積するために、光照射時間の増加とともに触媒活性が著しく低下した。この低下を抑えるために、水酸化カルシウムを共存させることが有効であることを見出した。2)副生成物の生成を抑制する手法の確立:ゾル-ゲル法で作成した酸化チタンペレットを粉末に粉砕し、銅粉や水酸化カルシウム粉末と共存させると、これらが無機の塩素をトラップし、有害な副生成物の生成を抑制できることを見出した。さらに、水酸化カルシウムを表面につけたペレットを作成し、副生成物の生成抑制への効果について調べた。その結果、ペレットでも塩素がトラップされ、二酸化炭素への完全分解率が増加することを見出したが、副生成物の生成への抑制効果は粉末系の方が優れていることがわかった。一方、水系では、酸化チタン表面をシリル化して疎水性場を導入し、水中からのトリクロロエタンの吸着除去率を70%まで向上させることができた。しかし、疎水性が高すぎると酸化チタンの正孔により直接疎水性場が分解され、トリクロロエタンの光触媒分解効率が減少した。導入する疎水性部分の炭素含量と光触媒活性の関係を調べたところ、導入量は0.6C%以下の低濃度領域で実験することが必要であることがわかった。気相系および水系での有機塩素化合物の無害化効率を向上させるために実験を行った。光触媒による浄化技術として実用化されつつあるのは、土壌や地下水の汚染物質であるトリクロロエチレン(TCE)等の有機塩素化合物の分解装置である。しかし、光触媒分解の結果、副生成物としてクロロホルムやホスゲン等の有害な塩素系化合物が生成することが知られている。平成14年度の研究では、二酸化チタンに水酸化カルシウムや銅粉を共存させることにより、クロロホルムやホスゲンの生成を抑制できること、処理後のガスを中和する際にホスゲンは水にトラップされるがクロロホルムは大気中へ放出されることを明らかにした。そこで本年度は、まず気相系において二酸化チタンペレットを用いたクロロホルムの光触媒分解反応について研究した。二酸化チタンペレットはゾル-ゲル法で合成した。その結果、塩素化エチレン類やエタン類と異なり、クロロホルムは完全に二酸化炭素へ分解できるが、反応の進行とともに無機の塩素が触媒表面に蓄積し、光触媒活性が著しく減少していくことを見出した。さらに、水酸化カルシウムを触媒と共存させることにより、光触媒活性の低下を抑制できることがわかった。以上のことより、TCEから副生成するクロロホルムを光触媒分解することでTCEの完全無害化を達成するためには、塩素の蓄積による触媒活性の低下を抑えることが必要であることがわかった。一方、水系では気相系よりも分解効率が低いために、光触媒を用いた汚染物質の浄化技術は実用化されていない。水系での効率の低さは反応物質の光触媒表面への吸着を水分子が阻害するためであると考えられている。そこで、有機物の触媒表面への吸着性を高めるために、二酸化チタンペレット表面をシリル化して、CH_3、C_2H_5、C_6H_5、C_<18>H_<37>基で修飾した。これらをトリクロロエタン(TCA)水溶液に浸したところ、表面修飾をしていない場合にはTCAの吸着が全く見られなかったのに対して、いずれの有機鎖で修飾した二酸化チタンにおいてもTCAが吸着し、とくにC_<18>H_<37>の場合には吸着率が約70%にも達し、水系での吸着除去に有効であることがわかった。

その結果、ペレットでも塩素がトラップされ、二酸化炭素への完全分解率が増加することを見出したが、副生成物の生成への抑制効果は粉末系の方が優れていることがわかった。一方、水系では、酸化チタン表面をシリル化して疎水性場を導入し、水中からのトリクロロエタンの吸着除去率を70%まで向上させることができた。しかし、疎水性が高すぎると酸化チタンの正孔により直接疎水性場が分解され、トリクロロエタンの光触媒分解効率が減少した。導入する疎水性部分の炭素含量と光触媒活性の関係を調べたところ、導入量は0.6C%以下の低濃度領域で実験することが必要であることがわかった。
セレン輸送タンパク質のapoER2受容体を介する２型糖尿病悪化メカニズムの解明

本研究は、哺乳類の組織に、選択的に必須微量元素であるセレンを分配するタンパク質である、セレンタンパク質Pの生理的な機能を解析することを目的としている。セレンの代謝異常が2型糖尿病を悪化させることが近年報告されてきている。肝臓で合成され、精巣、腎臓、脳、筋肉へセレンを輸送するセレンタンパク質Pが糖尿病を悪化させるメカニズムを分子レベルで解析する。セレンを含有するアミノ酸のセレンタンパク質Pへの取り込みは厳密に制御されているため、一般的なタンパク質の過剰発現を利用した方法では大量に生成することが困難である。そこで今年度は、セレンタンパク質Pを発現させるベクターの部位特異的変異の導入と組換えを行い、生成するタンパク質の構造の最適化と発現量の向上に成功した。さらにこれらのタンパク質をマウスの培養細胞で発現させ、in vitroで機能を維持したまま細胞外に分泌されることを確認した。また研究の目的とする遺伝子の発現を抑制するためにRNA干渉法を利用した。この実験のためにレンチウイルスを作製、細胞に感染させ、9割の遺伝子発現を抑制することに成功した。セレンタンパク質Pが細胞に取り込まれる場合の指標を簡便に解析することを目的とし、培養細胞中の複数のセレンタンパク質のうち、セレンの濃度に依存する遺伝子をリアルタイムPCRで解析した。その結果、特定の遺伝子群の発現量がセレンの濃度に依存することを明らかにし、放射性同位体を使用することなく、セレンタンパク質Pの取り込み効率を測定することが可能になった。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ウランとアンモニアの反応による高窒素含有量のウラン窒化物生成の熱の学的研究

NH_3のH_2とN_2への解離を抑えることで不安定なNH_3が得られるが,このNH_3が高い窒化能の,水素化能力を持つことを理論的に確めた。このことを実験的に確証するため,当該年度はまず,1.U+NH_3(気流),2.U+N_2(気流)の反応を400-900°Cの温度範囲で行った。これらの反応から同一温度では1の反応で得られるウラン窒化物U_2N_3のN/U比が大きいこと,即ち,NH_3を気流として用いてその解離を抑えると高い窒素活量が得られることが確められた。有力な核燃量候補であるUNはU_2N_3の高温熱分解で得られる。このU_2N_3と2UC+(3/2)N_2=U_2N_3+2Cの反応で作成することが提案されているが,この際温時に生じる炭素をH_2との反応でCH_4として除去しなければならない。このため1200°C以上の温度が必要である。本研究ではNH_3のもつ高い水素化能力に着目し,CとNH_3気流の反応によるCH_4の生成に関する実験的研究を600-900°Cの温度範囲で行った。その結果900°CでもNH_3気流を用いれば炭素をCH_4として除去することができることがわかった。即ち,UC+NH_3の反応を利用すれば,900°Cでも炭素を含まないウラン窒化物を得ることができる。また,低い温度(300°C以下)で適当な反応容器を用いれば,NH_3を気流にしなくても,閉鎖系でNH_3の解離を抑えることができる。本研究ではウランとNH_3の閉鎖系での反応を250-300°Cで行い,反応に伴うNH_3,H_2,N_2,の分圧の変化,生成物のX線回折による個定を行いNH_3の窒化能力を調べた。その結果これらの低い温度でもNH_3を用いればU_2N_3の生成が可能であることが確認された。ウランとN_2の反応ではこれらの温度では全く反応が進行しないことも実験的に確めた。NH_3を気流として用いると、高温においても、そのH_2とN_2への平衡解離が抑制される。NH_3の平衡分圧より高いNH_3分圧と平衡分圧より小さい水素分圧、窒素分圧が得られる。これらの気流は熱力学的に不安定である。NH_3気流とウランが反応してU_2N_<3+x>が生成する反応NH_3=N(in U_2N_<3+x>)+(3/2)H_2の反応式に基づいて、熱力学的解析、統的熱力学的解析を行い、NH_3気流の窒素活量(AN)が次式で与えられることを〓〓した。

AN=(1/1<p)・(PN^<H3>/PH_2^<3/2>)(Kp:平衡〓〓)。以上の理論的考察の妥当性を確めるため、400800°C(100°C間隔)で、U+NH_3(流速100ml/min)とU+N_2(1気圧)の反応を行い、それぞれの反応で生成したU_2N_<3+x>のN/Uをきめた。同一温度で比較すれば、つねに前者の反応で生成したU_2N_<3+x>のN/Uが後者の反応で生成したU_2N_<3+x>のN/Uより大きいことが分かった。これはNH_3気流の窒素活量が1気圧のN_2の窒素活量(AN=1)より大きいことを実験的に確めたことになる。また、実験中のガス分析及び理論式からANを評価するとNH_3気流のそれは10^3のオ-ダである。このことは、NH_3気流を用いれば高窒素含有量のU_2N_<3+x>が得られること、また、このようなU_2N_<3+x>をN_2との反応で得ようとすれば、非常に高圧のN_2を用いなければならないということを示唆している。また、600°Cで、ウランとNH_3気流、NH_3/H_2混合気流、NH_3/N_2混合気流,N_2気流の反之を行い生成したU_2N_<3+x>のN/Uを求めた結果も、理論的考産を支持することが確められている。NH_3のH_2とN_2への解離を抑えることで不安定なNH_3が得られるが、このNH_3が高い窒化能力、水素化能力を持つことを理論的に確めた。このことを実験的に確証するため、当該年度はまず、1.U+NH_3(気流),2.U+N_2(気流)の反応を400-900°Cの温度範囲で行った。これらの反応から同一温度では1の反応で得られるウラン窒化物U_2N_3のN/U比が大きいこと、即ち、NH_3を気流として用いてその解離を抑えると高い窒素活量が得られることが確められた。有力な核燃料候補であるUNはU_2N_3の高温熱分解で得られる。このU_2N_3と2UC+(3/2)N_2=U_2N_3+2Cの反応で作成することが提案されているが、この際同時に生じる炭素をH_2との反応でCH_4として除去しなければならない。このため1200°C以上の温度が必要である。本研究ではNH_3のもつ高い水素化能力に着目し、CとNH_3気流の反応によるCH_4の生成に関する実験的研究を600-900°Cの温度範囲で行った。その結果900°CでもNH_3気流を用いれば炭素をCH_4として除去することができることがわかった。即ち、UC+NH_3の反応を利用すれば、900°Cでも炭素を含まないウラン窒化物を得ることができる。また、低い温度(300°C以下)で適当な反応容器を用いれば、NH_3を気流にしなくても、閉鎖系でNH_3の解離を抑えることができる。本研究ではウランとNH_3の閉鎖系での反応を250-300°Cで行い、反応に伴うNH_3,H_2,N_2,の分圧の変化、生成物のX線回折による固定を行いNH_3の窒化能力を調べた。その結果これらの低い温度でもNH_3を用いればU_2N_3の生成が可能であることが確認された。ウランとN_2の反応ではこれらの温度では全く反応が進行しないことも実験的に確めた。
エピジェネティクスに注目したARDSの病態解析

肺組織におけるヒストンアセチル化のターゲットの検索肺障害モデルとして、マウスに経気管的にリポポリサッカライド(LPS)を投与し、その後生じる肺損傷の程度を乾湿重量比、アルブミン漏出試験ならびに組織化学的手法で評価した。LPSの投与は乾湿重量比ならびにアルブミン漏出量を増加させ、組織化学的には肺胞間質組織への炎症細胞の浸潤が認められた。ヒストンアセチル化のターゲットとして、組織エンドペプチダーゼの一種NEPを想定し、肺における活性を測定した。NEP活性とNEP発現量はいずれもLPS投与肺において減少し、LPSによる組織炎症がNEPの発現量を変化させることが明らかとなった。今後ヒストンアセチル化酵素阻害剤を肺内投与し、NEP活性がどのように変化するのかを検討したい。肺組織におけるヒストン修飾酵素の発現と酵素活性マウス肺を摘出しmRNAを精製、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)およびヒストンアセチル化酵素(HAT)の肺における発現をリアルタイムPCRによって定量した。その結果、HDACおよびHAT mRNAの発現が肺組織において存在することが確認できた。次に、免疫組織化学によって肺におけるヒストンアセチル化の状態を確認した。マウス肺をホルマリン固定し、凍結切片を作成、アセチル化ヒストン抗体を用い蛍光免疫組織化学によってアセチル化したヒストンを可視化した。アセチル化したヒストンはI型およびII型肺胞上皮ならびに肺胞マクロファージと思われる細胞において認められた。今後、肺の各細胞に特異的なマーカーとの二重染色を行うことでどの種類の細胞に存在するのかを同定したいと考える。ヒストン修飾酵素阻害剤の肺障害に及ぼす影響肺障害モデルとして、マウスに経気管的にリポポリサッカライド(LPS)を投与し、その後生じる肺損傷の程度を乾湿重量比、アルブミン漏出試験ならびに組織化学的手法で評価した。アセチル化ヒストン抗体による免疫組織化学では、浸潤炎症細胞とおもわれる細胞と一致してヒストンのアセチル化が認められた。今後、HDAC阻害剤トリコスタチンの抗炎症作用を明らかにするため、肺障害モデル作成と同時にトリコスタチンを経気管的に投与して、乾湿重量比およびアルブミン漏出量を定量、組織化学的に炎症反応を評価したい。
GRINレンズ付き高品位CCD生体蛍光顕微鏡による心内膜下微小循環解析

循環系の中で中心的役割を果たす心臓自体の栄養血管である冠微小循環の解析は極めて重要な課題である。ところが、拍動を繰り返す心筋内を走行するため、その拍動特性観察に大きな制約を受け、これまで顕微鏡映画法による心外膜側微小血管の観察のみが行われてきた。そして、心筋虚血の発生しやすい心内膜側など心筋内の微小循環の観察は不可能であった。本研究は、近年のハイテクノロジーの代表である(1)GRINレンズ(2)高品位CCD撮像素子を用い、(3)アクセス法を工夫した生体蛍光顕微鏡を開発することにより、これまで明らかでなかったin vivo心内膜側冠微小循環解析を可能とする装置の開発を目的とした。併せて本法の波及効果として、通常の生体顕微鏡ではアクセスの困難である腎微小循環の解析を試みた。本システムの性能評価を行った結果、観測視野は1.4×0.8mm^2、線識別の限界は約2.5μm、偏位計測精度は約1.5μmであった。すなわち、毛細管の形状のみならず、血管内を流れる赤血球の識別も可能であることが判った。そこで、本システムを用いて、イヌの冠微小循環の観察を行った。従来のシステムよりも細い2030μm以下の血管の拍動特性も鮮明に観測できた。なお、蛍光対応は光量の制約のため心外膜側完備症血管観察のみを行っているが、FITCデキストランによる明瞭な蛍光イメージを得ることができた。また、腎内微小循環の観察時、糸球体及び輸入輸出動脈の観察が可能となった。例えば、血管収縮剤(アンギオテンシンII)の昇圧量投与による輸入・輸出動脈血管径が同程度に収縮することが観察された。すなわち、本システムによりこれまで不可能であった心筋内微小血管の観察、腎内の糸球体、輸入輸出動脈の観察が可能となり、これらの微小循環に対する種々の生理活性物質の影響をin situで解析できる強力な武器になりうることが明らかとなった。ところが、心臓の拍動に伴う動きのため、その拍動特性観察に大きな制約を受け、これまで顕微鏡映画法による心外膜側微小血管の観察がが唯一の方法であった。そして、心筋虚血の発生しやすい心内膜側の微小循環観察は全く不可能であった。本研究は、近年のハイテクノロジーの代表である(1)GRINレンズと(2)高品位CCD撮像素子を用い、かつ(3)アクセス法を工夫した生体蛍光顕微鏡を開発することにより、これまで明らかでなかったin vivo心内膜側冠微小循環解析を可能とする装置の開発を目的とした。また、今回開発したGRINレンズ付き高品位CCD生体蛍光顕微鏡の波及効果として、通常の生体顕微鏡ではアクセスの困難な他臓器の微小循環解析を試みた。本年度は、GRINレンズ付き広視野CCD顕微鏡およびGRINレンズホルダーの試作および、それによる微小循環動態の解析を目標した。すなわち、高品位テレビ用のCCDカメラにニードルプローブを装着した高品位CCD生体顕微鏡を試作した。これにより達成された空間分解能は2mumで、通常のテレビモニタでは精度に問題があった直径50mum以下の細動脈細静脈も鮮明に観察できることを確認した。予備的に製作したCCD生体顕微鏡を用い、形状を工夫したニードルプローブを開発して、臓器へのアクセスビリティーを検討した。

その結果、心筋内微小血管の観察、腎内の糸球体、輸入輸出動脈の観察が可能となり、これまで困難であった種々の生理活性物質の冠および腎微小循環への影響をin situで解析できることが明らかとなった。心臓自体の栄養血管である冠微小循環の解析は極めて重要な課題であるが、心臓の拍動に伴う動きのため、これまで顕微鏡映画法による心外膜側微小血管の観察がが唯一の方法であった。そのため、心筋虚血の発生しやすい心内膜側微小循環の観察は全く不可能とされてきた。そこで我々はニードルレンズ型CCD生体顕微鏡(CCD2万画素)を開発し、心内膜側心筋内微小血管の観察に世界に先がけて成功した。本研究では、観測視野サイズを拡大した上でCCD生体顕微鏡の分解能の向上し、拍動心のような観測視野内で動く微小循環の解析を目的とした。本年度は、GRINレンズ付き広視野CCD(200万画素)顕微鏡及びGRINレンズホルダーを試作した。本システムの性能評価を行った結果、観測視野は1.4×0.8mm^2、線識別の限界は約2.5μm、偏位計測精度は約1.5μmであることが判った。実際に微小血管を観察した結果、毛細管の形状や血管内を流れる赤血球イメージの識別が可能であった。本システムによりイヌ冠微小循環の観察を進めているが、従来のシステムよりも細い2030μm以下の血管の心拍動に伴う径変化を鮮明に観測できた。なお、蛍光対応は光量の制約のため心外膜側冠微小血管観察のみを行っているが、FITCデキストランによる明瞭な蛍光イメージを得ることができた。つだ、本システムの他臓器への応用として、腎内微小循環を観察したが、腎糸球体はもとより、糸球体の輸入および輸出動脈の観察が可能であった。例えば血管収縮剤アンギオテンシンIの昇圧量投与は輸入・輸出血管を同程度に収縮させることが明らかにされた。本システムは直径50μm以下の冠・腎微小血管の観察を可能とした点に特徴があり、心筋内で拍動する冠微小血管の解析やこれまでアクセスが不可能であった腎内微小循環の観察に極めて有効な手段を提供することが判った。
学習理論を利用したテキスト情報からの知識獲得に関する研究

概念形成、知識獲得などの知的創造機能を実現するためには、高度な学習メカニズムの開発が必要である。たとえば、テキスト情報から知識獲得を行なう高次自然言語理解システムを開発する場合には、テキストを解析するにつれて漸増的に領域知識を獲得するメカニズムが必要になる。また、現実世界を対象とする領域は不完全かつ不正確なweakーtheory domainであるために、新たな知識を獲得するたびに領域知識を半自律的に修正・管理するメカニズムが必要になる。以上のような考え方に基づいて、本研究課題では、学習理論に基づくテキスト情報がらの知識獲得に関する研究を行なっている。本年度は以下のテ-マに重点を置いて研究を行なった。(1)不完全な知識を補完するために、説明に基づく学習(EBL)と類推推論を融合した学習メカニズムを開発した。本メカニズムの特徴として、記憶された過去の事例のうち、類似した修正案を一般化することによって、FalkenhainerやRajamoneyらが提案した一般化ル-ルと同等なル-ル集合を構築することができることが挙げられる。(2)不正確な知識を同定・削除するために、EBLと類似性に基づく学習を融合した学習メカニズムを開発した。本メカニズムは、本質的にFlannとDietterichのIOEと同等であるが、IOEが正の例のみを用いているのに対し、本メカニズムでは正の例と負の例を共に用いている。(3)事例ら基づく学習とEBLを利用した知識獲得支援システムを開発した。本システムでは、まず事例に含まれる属性から想起されるカテゴリ-に入力事例を分類する。もし分類が失敗するとインタビュ-メカニズムが起動され、入力事例に対してEBLを利用したインタビュ-が行なわれ、新規のカテゴリ-に属する代表的な属性集合、およびカテゴリ-と各属性との間に内在する因果関係が範例として獲得される。
芍薬甘草湯が抗癌薬パクリタキセルの副作用を緩和するメカニズムの研究

抗癌薬パクリタキセルの副作用に末梢神経疼痛がある。芍薬甘草湯はパクリタキセルによるマウスの末梢神経痛を軽減させると報告された。一方、神経因性疼痛に電位依存性T型Caチャネル(Cav3.2)の関与が報告された。そこで、芍薬甘草湯がT型Ca電流を抑制するかをヒトT型Caチャネルを発現させたHEK293細胞を用い、ホールセルクランプ法で調べた。すると、芍薬甘草湯はhCav3.2 T型カルシウム電流を濃度依存性に抑制した。IC50値は1.3 mg/ml、Hill係数は1.1であった。パクリタキセルによる末梢神経疼痛を芍薬甘草湯が軽減させる機序に、T型Ca電流抑制作用が関与する可能性が示唆された。H9c2細胞を用いて、その遅延整流性K電流(IKur)に対する芍薬甘草湯の作用を、ホールセルクランプ法で調べた。芍薬甘草湯はIKurを濃度依存的に抑制した。IC50値は1.3mg/mlでHill係数は1.2であった。芍薬と甘草をそれぞれ単独で、10mg/mlの濃度で調べたところ、甘草>芍薬甘草湯>芍薬の順に抑制作用が強いことがわかった。甘草の主成文の1つであるグリチルリチンは抑制作用を示さなかった。IKurの遺伝子はKv2.1と報告されている。Kv2.1はラットの骨格筋にも存在することが、RTーPCR法で確認できた。芍薬甘草湯はこむらがえりに即効する。こむらがえりは、骨格筋の膜外側局所のK濃度が高くなることが原因の1つと考えられる。芍薬甘草湯がこむらがえりを抑える機序として、IKur抑制により筋繊維からのKイオン流出が減少し、その間にNa-K ATPaseによるKイオンの筋繊維内への流入が起こることで、筋繊維局所の膜内外のKイオン濃度のバランスが正常化することが考えられる。芍薬甘草湯は、こむらがえりの特効薬として古くから用いられてきた漢方薬である。Hidakaらは、「芍薬甘草湯がパクリタキセルによるマウスの末梢神経痛を軽減させる」(European J Pain 13,22-27,2009)を報告した。また、Okuboらは、神経因性疼痛にT型カルシウムチャネルCav3.2)が関与することを示した(Br J Pharmacol 166,1738-43,2012)。すなわち彼らは、マウスの足底にNaHSを注入して知覚過敏と異痛を引き起こした後、T型カルシウムチャネル(Cav3.2)阻害薬、またはTRPA1チャネル阻害薬を投与すると、知覚過敏や異痛が抑制されると報告した。そこで、芍薬甘草湯の神経因性疼痛を抑制する機序に、T型カルシウムチャネル(Cav3.2)の抑制が関与するかを調べた。そのために、T型カルシウムチャネル(Cav3.2)を発現したHEK293細胞を入手した。その細胞を用いて、ホールセルクランプ法でT型カルシウムチャネル電流を測定しながら、芍薬甘草湯をタイロード液に溶かしたものを、細胞外液として還流した。細胞内液はセシウムアスパラギン酸を主成文とした。芍薬甘草湯10mg/mlは、T型カルシウム電流を完全に抑制した。芍薬甘草湯の濃度を1mg/ml, 3mg/ml, 10mg/mlとして、抑制の程度を調べたところ、芍薬甘草湯は、T型カルシウム電流を濃度依存性に抑制することがわかった。芍薬甘草湯のIC50値は1.3mg/mlで、ヒル係数は1.1であった。このことから、芍薬甘草湯の神経因性疼痛を抑制する機序に、T型カルシウムチャネル(Cav3.2)の抑制が関与していることが示唆された。パクリタキセルは固形癌の治療に用いられている抗癌薬であるが、副作用に末梢神経疼痛が知られている。芍薬甘草湯はパクリタキセルによるマウスの末梢神経疼痛を軽減させることが報告された。また、神経因性疼痛に電位依存性T型カルシウムチャネル(Cav3.2)が関与していることが報告されている。そこで、芍薬甘草湯がT型カルシウム電流を抑制するかを、ヒトT型Caチャネル(hCav3.2)を発現させたHEK293細胞を用いてホールセルクランプ法で調べた。その結果、芍薬甘草湯はCav3.2 T型カルシウム電流を濃度依存性に抑制した。10mg/mlの芍薬甘草湯はT型Ca電流を完全に抑制した。芍薬甘草湯のIC50値は1.3 mg/mlでHill係数は1.1であった。神経因性疼痛に有効な漢方薬には、芍薬甘草湯の他に、牛車腎気丸と附子がある。そこで、牛車腎気丸と附子のT型Ca電流に対する作用も調べた。牛車腎気丸10 mg/mlはT型Ca電流を-20 mMでコントロールの57.7 ±6.6 %に減少させた。附子10 mg/mlはー20mVでT型Ca電流をコントロールの58.3 ±5.6 %に減少させた。

これらのことから、芍薬甘草湯は牛車腎気丸や附子よりも強くT型Ca電流を抑制することがわかった。結論として、パクリタキセルによる末梢神経疼痛を芍薬甘草湯が軽減させる機序に、T型Ca電流抑制が関与する可能性が示唆された。抗癌薬パクリタキセルの副作用に末梢神経疼痛がある。芍薬甘草湯はパクリタキセルによるマウスの末梢神経痛を軽減させると報告された。一方、神経因性疼痛に電位依存性T型Caチャネル(Cav3.2)の関与が報告された。そこで、芍薬甘草湯がT型Ca電流を抑制するかをヒトT型Caチャネルを発現させたHEK293細胞を用い、ホールセルクランプ法で調べた。すると、芍薬甘草湯はhCav3.2 T型カルシウム電流を濃度依存性に抑制した。IC50値は1.3 mg/ml、Hill係数は1.1であった。パクリタキセルによる末梢神経疼痛を芍薬甘草湯が軽減させる機序に、T型Ca電流抑制作用が関与する可能性が示唆された。芍薬甘草湯が、神経因性疼痛の原因となるCav3.2を抑制することが明らかになったから。薬理学芍薬甘草湯のどの成文が主に、Cav3.2の抑制に関与しているかを調べる。また、神経痛を抑制するとされる他の漢方薬、たとえば牛車腎気丸なども、Cav3.2抑制作用があるか調べる。芍薬甘草湯のK電流に対する作用を調べ、論文として報告したが、パクリタキセルとの相互関係についての研究が遅れている。当初計画した培養細胞を用いた系では、臨床濃度の範囲で芍薬甘草湯の作用を示すことができた。平成27年3月分の支出がまだ入っていない。また、研究結果を論文にまとめるために、1年間の実施機関の延長を申請し受理された。パクリタキセルのK電流などに対する作用と芍薬甘草湯の作用がどう関連するかを調べる。芍薬甘草湯はこむら返りを起こしている骨格筋は弛緩させるが、起こしていない正常な筋の収縮抑制はしない。このことから、こむらがえりを起こしている筋には、正常な筋とは別の分子変化が起こっている可能性が高い。そこで、骨格筋がこむらがえりを起こすことによって筋繊維内の分子がどう変化するかを、in vitroのモデル細胞を用いて再現させ、それに対する芍薬甘草湯の作用を調べる。パクリタキセルは、H9c2細胞のK電流を時間依存的に抑制する。そこで、このパクリタキセルの作用を芍薬甘草湯が抑制するかを調べる。論文作成費などに使用する予定である。試薬代を節約したため。迩年度に試薬を購入して使用する。骨格筋繊維内分子のmRNAや蛋白質の発現量の変化を調べるために、RTーPCR法やウエスタンブロット法のための、塩基プライマーや抗体などの試薬を購入する。また、ホールセルクランプ法関連の消耗品を購入する。
日本発の新しい外傷重症度スコアの開発

日本外傷データバンクに登録された16歳以上の外傷患者の一部を対象とし、緊急室到着時の年齢と生理学的指標(意識、呼吸、血圧)から簡便に入院中死亡リスクを予測できる生理学的外傷重症度スコアを作成した。この新しい生理学的外傷重症度スコアは日本外傷データバンクの残りの登録患者を用いた内部検証と、国外で行われた外傷を対象としたランダム化比較試験の対象患者を用いた外部検証において、既存の2つの生理学的外傷重症度スコアより、receiver operating characteristics (ROC)解析とpartial ROC解析(感度>0.9)と再分類改善度解析で高い予測精度を示した。本研究で開発を進めている既存のものよりも簡便でベッドサイドで暗算が可能である外傷重症度スコア、TRIAGES scoreは、2014年に更新された最新の日本外傷データバンクのデータを最終の対象コホートとしてスコアの構築と外部検証を進めている。現行のスコアはcomplete data analysis(予測変数と目的変数に欠損値のある対象は除外して検討する手法)を前提としてロジスティック回帰分析を行っていたが、対象となる症例数が全体の50%以下になるなどのバイアスが無視できないため、構築コホート、検証コホート、また、London School of Hygiene & Tropical Medicine, Professor Ian Robertsから外部検証コホートとして提供を受けたCRASH-2コホート(Lancet 2010;376:23-32)の3コホートについて、欠損値の多重補完を行い、再度の解析を進めている。本研究で開発を進めている既存のものより簡便でベッドサイドで暗算が可能である外傷重症度スコア、TRIAGES scoreは、日本外傷データバンク2010年度版をもとに開発したものであるが、データベースが2012年に更新されたため、新たにスコアの開発と内部検証を改めて行った( http://www.jtcr-jatec.org/traumabank/index.htm )。また、London School of Hygiene & Tropical MedicineのProfessor Ian Robertsからランダム化試験CRASH-2のコホート(Lancet. 2010 376:23-32. http://crash2.ishtm.ac.uk )の提供を受けて外部検証コホートとした。上記の研究結果は、日本救急医学会総会で発表した。2013年中の投稿を目指し、英文論文を作成中である。いくつかのデザインの変更を行った。データソースは、日本外傷データバンク2014年度版を変更し、外傷症例146111例を対象とした。組み入れ基準は、小児外傷の特殊性に留意して、16歳以上に変更した。そのため、本スコアは成人対象のスコアとすることにした。データの欠測値を処理するために、新たに多重代入法を用いた処理を行うこととし、これにより欠測によるバイアスを避けることが可能となった。最終的に完成したスコアは、既存のRevised Trauma Score (RTS)と比較して、Area Under Curve (AUC)を+0.021、Net Reclassification Improvementを+0.239、それぞれ有意(いずれもP<0.001)に改善することが示された。解析の変更は以上で終了として、最終的な学会報告をWorld Congress of Disaster and Emergency Medicine (2014/4/21-24, Cape Town, South Africa)で行った。現在、診断精度の研究のための報告ガイドラインであるSTARD statementに準拠して論文化作業を行っている。平行して、平成27-28年度に行われる日本救急医学会主導の重症外傷を対象とした多施設共同観察研究で、TRIAGES scoreの前向き外部検証を行うことを予定している。この前向き外部検証によって、TRIAGES scoreの妥当性を確認するとともに、救急医療と災害医療への普及を目指していきたい。日本外傷データバンク2015年度版を最終的にデータソースとして用い、対象を16歳以上の熱傷を除く病院に直接搬送された外傷症例として最終的な解析を行った。予測変数(患者の生理学的指標)と転帰(入院中死亡)のデータセットで、外れ値はロバスト回帰で外し、欠測値は多重代入法で補完する手法を用い、選択バイアスの非常に小さなデータセットを作成できた。モデルの頑健性の確認は、日本外傷データバンクのデータセットと、Clinical Randomisation of Antifibrinolytics in Significant Hemorrhage (CRASH-2)の研究者から提供されたデータセットの複数で検証し、さらに、complete case analysisも行った。さらに派生研究が続いている。現在、本研究の外傷重症度調整の回帰分析の経験に基づいて、外傷患者のICUでの診療の質を評価する研究と、外傷患者の診療の質の年次推移の研究が進行している。前記のように科学的な成果は十分に達成されつつあると自己評価しているが、当初予定していたソフトウェアでの配信は進捗していない。ジャーナルへの受理が得られず、遅れている。また、スコアのソフトウェアでの配信が十分に進捗していない。論文化作業は完了目前であり、今後の研究に向けた取り組みも確立しつつある。

論文発表と並行して、この外傷重症度スコアを重症度調整の標準化ツールとした観察研究をさらに追加する。前向きの外部検証を行う。論文発表を目指す。また、前向き多施設観察研究での本スコアの検証がすでに行われている。救急医学前向き外部検証の予定が確立した。統計解析はSTARD statementに準拠した最終的なモデルを確立しており、従来のものよりも簡便でかつ優れたものを提供できていることが既に確認されている。論文化も同様にSTARD statementに準拠して進行中である。論文発表と前後してオンラインデータベースとスマートフォン用ソフトウェアの開発を通じ、前向き検証を行う予定である。TRIAGESスコアの開発が終了し、外部検証での有効性が確認できた。一方で、TRIAGES+ scoreは利用可能な外部検証コホートの提供が無く、検証が進んでいない。TRIAGESscoreの有効性は、今後は論文化と、ウェブサイトでやスマートフォンソフトウェアでの普及をめざす。論文の英文校正費用の支出が予定より遅れたため。論文の英文校正費用などの投稿費用の支出が遅れたため。外部検証のために独立したオンラインデータベースの立ち上げを行うよりも、多施設共同研究の研究計画の一部に参画することが妥当と考え、その分の資金は繰越した。本年度中に英文校正費用を支出する。本年度中に論文投稿関連費用の支出を行う。前述のように、オンラインデータベースとフマートフォン用ソフトウェアを通じ、日本外傷学会の外傷専門医研修施設に協力を依頼した上で前向き検証を行う。TRIAGESscoreは論文化し、スマートフォンソフトウェアの開発を行う。また協力施設とともに前向き検証を行う。TRIAGES+ scoreは外部検証を行う必要があるが、適切なコホートが入手できなかった場合、TRIAGES scoreの前向き検証と同時に行う。本研究と派生研究の学会発表、スマートフォン用ソフトウェアの開発費用、論文作成・校正、ホームページ作成などの情報発信に用いる。オンラインデータベースの開発が進捗しておらず、このために計上した人件費やサーバー使用料金が繰越しとなった。また学会旅費の使用が想定よりも少なくて済んだ。次年度以降にオンラインデータベースの立ち上げを行う。また、論文化のための諸費用、学会発表のための諸費用として使用する。