hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
寄生体を指標とした人類の移動と適応の進化史

EBウイルスは、母子間でウイルスゲノムが一致するのは3割程度であり、母方居住婚と父方居住婚する民族間で、ウイルスゲノム多様性に差異はなく、母子感染が主要感染ルートであることを否定した。同ウイルスグループの非侵襲的検出法を確立した。マラリア抵抗性形質の卵形赤血球症のバンド3タンパク質遺伝子のハプロタイプデータの解析から、27塩基対欠失は約4000年前にフィリピン中部で起こったことが示唆された。集団の系譜は遺伝子を調べるのが最良と考えられるが、遺伝子を遺さない個体間交渉については、情報が得られない。交易・交渉・訪問といった、遺伝子に残らない人と人とのふれあいの痕跡を、感染寄生体の研究から探ろうとするものである。感染様式と社会構造・婚姻体系を組み合わせ、ウイルスの系統を民族集団の関係に重ねることによって、集団間交渉や社会構成に新たな知見が得られると期待される。今年度は、指標とする寄生体としてはヒトに常在するウイルスであるEpstein-Barrウイルス(EBウイルス)、感染感受性・抵抗性形質についてはマラリア感染に関連する遺伝的多様性の解析を行った。EBウイルスの感染様式については、「家族内感染」、主として「母子感染」、することが常識であった。母子感染性が強ければ、ミトコンドリアDNAのように、「母系」を手繰ることが出来ると考えられ、人類集団を解析する上で新たなツールとなうことが期待される。実際どの程度「母子感染」するのかの検証を、2つのアプローチ、個々の母子間の解析と集団レベルでの解析、から試みた。比較的変異性の高いEBウイルスゲノムに存在するLMP1遺伝子の塩基配列を決定し「母と子」のペア間で照合した。その結果、母子で一致するのは3割程度であり、「母系」を追跡できないと判断された。つぎに、母方居住婚と父方居住婚する民族を選び出し、集団内のEBウイルスの多様性が母方居住婚<父方になるかを検証する作業を開始した。マラリア抵抗性関連形質については、卵形赤血球症に関連し、バンド3タンパク質遺伝子のハプロタイプデータの解析から、27塩基対欠失の起源を探ることを試み、東南アジア・オセアニア集団でハプロタイプの推定を済ませた。このデータと既知の集団移動史と併せ、27塩基対が何時何処で導入されたかを今後推定する。本研究の目的は、感染寄生体を手がかりとして、アジアを中心とした人類集団の移動・交渉・適応について、これまでとは違う切り口から再現しようとするものである。集団の系譜は遺伝子を調べるのがベストと考えられるが、遺伝子を遺さない個体間交渉については、情報が得られない。本研究計画では、そのような、交易・交渉・訪問といった、人と人とのふれあいの痕跡を、感染寄生体の研究から探ろうとするものである。一方、感染受容体・抵抗性遺伝子の検索からは、民族集団の適応・移動を探る。「家族内感染」、主として「母子感染」、することが常識であったEBウイルスの感染様式については、母子感染性が強ければ、ミトコンドリアDNAのように、「母系」を手繰ることが出来ると考えられたが、比較的変異性の高いEBウイルスゲノムに存在するLMP1遺伝子の塩基配列を決定し「母と子」のペア間で照合したところ、母子感染の占める割合が低く、「母系」を追跡できないと判断され、投稿論文を作成した。つぎに、母方居住婚と父方居住婚する民族を選び出し、集団内のEBウイルスの多様性が母方居住婚と父方居住婚でいかなるパタンになるか検討したところ、こちらも父方・母方間にウイルスゲノム多様性に差異はなく,母子感染が主要感染ルートであることを否定した。以上より、EBVを母系マーカーとすることが却下され、新たなマーカーの検索が必要となった。マラリア抵抗性関連形質については、バンド3タンパク質遺伝子のハプロタイプデータの解析から、27塩基対欠失の起源を探ることを試みたところ、27塩基対欠失の導入(出現)はフィリッピンで、約4000年前に起こったことが示唆された。対象とする寄生体には、潜伏感染を示す常在ウイルス、原虫としてマラリアを想定している。感染様式(母子感染・家族内感染)と社会構造・婚姻体系を組み合わせ、ウイルスの系統を民族集団の関係に重ねることによって、集団間交渉や社会構成に新たな知見をもたらすことも目的の1つである。感染受容体・抵抗性遺伝子の検索から、民族集団の適応・移動をさぐることとし、今年度はマラリア抵抗形質の1つであるG6PD欠損の分子多様性についてデータの収集に努めた。アジア・オセアニアの25の人類集団を検索の対象としたところ、11集団で8種の欠損変異型(Mahidol、Viangchan、Union、Vanua Lava、Kerala-Kalyan、Kaiping、Gaohe、Coimbra)が見つかった。

先行研究の結果と比較すると、各集団での変異型の分布は特徴的であることがわかり、保有集団の出自情報、大航海時代以降の歴史的背景と併せ解析を進めることとした。また、昨年度に解析報告した卵型赤血球症の結果と合わせ、マラリア抵抗性形質からみた、アジア・オセアニア人類集団の成立にアプローチする。研究代表者石田の両親が相次いで入院し、その看護・ケアに時間をとられた。その後、ターミナルケアに移行し両者とも他界した。その間、調査旅行をひかえざるをえず、研究の遅延を生じた。本研究の目的は、感染寄生体を手がかりとして、人類集団の移動・交渉・適応について、これまでとは違う切り口からアプローチしようとするものである。集団の系譜は遺伝子を調べるのがベストと考えられるが、遺伝子を介さない個体間交渉については、情報が得られない。本研究計画では、そのような、交易・交渉・訪問といった、人と人とのふれあいの痕跡を、感染寄生体の研究から探ろうとするものである。対象とする寄生体には、潜伏感染を示す常在ウイルスを想定している。感染様式(母子感染・家族内感染)と社会構造・婚姻体系を組み合わせ、ウイルスの系統を民族集団の関係に重ねることによって、集団間交渉や社会構成に新たな知見をもたらすことも目的の1つである。一般に、ウイルス感染検査は生体の一部を採取、すなわち侵襲的方法により行われている。侵襲的方法の良さはその効率にあるが、非侵襲的方法でウイルス感染を調べられるなら、それに越したことはない。そこで,ヘルペスウイルスの一種であるリンパ潜在ウイルスの検出を非侵襲的方法で試みた。糞試料を材料としてDNAを抽出、PCR法を用い、同ウイルス特異的DNAを増幅した。増幅DNAの塩基配列を解析することでウイルス特異的DNAの確認をした。特筆すべきは、消化管内寄生体ではなく、脈管局在性のウイルス感染を検出したという点である。EBウイルスは、母子間でウイルスゲノムが一致するのは3割程度であり、母方居住婚と父方居住婚する民族間で、ウイルスゲノム多様性に差異はなく、母子感染が主要感染ルートであることを否定した。同ウイルスグループの非侵襲的検出法を確立した。マラリア抵抗性形質の卵形赤血球症のバンド3タンパク質遺伝子のハプロタイプデータの解析から、27塩基対欠失は約4000年前にフィリピン中部で起こったことが示唆された。2年目にして、投稿原稿を2編作成できた。ただし、受理には至っていない点が、今後の努力目標である。H28年度は、研究の遂行を妨げる要素は無くなったので、期間延長したところで、まとめの調査、塩基配列決定とデータのとりまとめをおこなう。28年度が最終年度であるため、記入しない。人類学系統関係の精度を増すため、解析検体数を更に増やす必要がある。結果を簡潔に示す、ウイルス関連データが得られ、研究計画時の疑問を解くことができそうであるため。その間、調査旅行をひかえざるをえず、研究の遅延を生じ、研究機関延長を願い出たため。人件費を計上していたところ、該当する人物の健康状態がすぐれず、雇用を見合わせたため。
肺癌における術中リンパ節微小転移検出方法の確立に向けた総合的研究

凍結新鮮標本に対して抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色を迅速ヒストファイン法を用いて施行し、H.E.染色に基づく従来の迅速診断法および通常の免疫染色法と比較検討した。今回の検討で、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色を迅速ヒストファイン法により実施するRapid法により、通常の免疫染色と同様の鋭敏度、特異度をもって転移リンパ節を検出できることが判明した。ただし、従来法で検出不可能で、免疫染色法で検出された微小転移例は認められず、診断医としての病理医の微小転移に対する認識から診断のスキルが向上し、通常法においても微小な転移を認知できるようになった可能性が示唆された。Rapid法の従来の迅速診断法に比しての必要に関しては、症例の集積と共になお慎重に評価する必要性があると思われた。Rapid法による染色方法に関しては、試行錯誤の末に以下の方法で評価が可能と結論した。今回使用している1次抗体(AE1/AE3)の通常のパ3フィン切片による染色において100倍希釈で使用している。従って、凍結切片を使用する本研究では5倍濃度の高いい20希釈で行った。また、凍結切片では抗体の浸透性をよくするために界面活性剤Triton-X100を加えたPBSにて3分処理した。この処理を行うことにより染色性が極めて良好となった。今回の方法では、凍結ブロックを1回作製し、染色、鏡検まで行った場合、30分を要した。実際は13個の凍結ブロックを作製しているので、さらの時間を要するであろうと考えられた。現在実際の臨床検体を使用して本染色方法を実施しデータを集積している。肺癌における積極的縮小術を推進する上で微小転移をも含めた術中リンパ節転移の診断方法の確立が必要である。肺癌症例において術中迅速診断に提出されたリンパ節個数は合計116個、1症例あたりの平均2.3個(1-10個)、サンプリングを実施したリンパ節ステーション数は平均1.1(1-3)であった。肺癌49症例中リンパ節転移を最終的に組織学的に確認できた10例中、術中の迅速診断にて転移を確認できたのは7例であった。この7例より摘出された16個の転移陽性リンパ節はいずれもRapid法、通常の免疫染色方法によって転移の存在を確認しえた。また、通常法にてリンパ節転移の認められなかった39例より迅速診断に供された100個の転移陰性リンパ節においては、Rapid法および通常の免疫染色方法においても転移は確認されなかった。ただし、従来法で検出不可能で、免疫染色法で検出された微小転移例は認められず、今後の検討課題と考える。通常法でリンパ節転移のみられなかった39症例において、郭清後も含めて摘出されたすべてのリンパ節に対してサイトケラチン法による免疫染色を行って検討を行ったが、微小転移を確認することはできなかった。この理由として、サンプル数の低さとともに診断医としての病理医の微小転移に対する認識から診断のスキルが向上し、通常法においても微小な転移を認知できるようになった可能性があげられる。Rapid法の従来の迅速診断法に比しての必要に関しては、なお慎重に評価する必要性がある。本研究では、ビタミンB2をトレーサーとしたセンチネルリンパ節診断法の実用性も検討を行った。
運動系の分子生物機構ー運動制御の物質過程ー

人類をはじめ、すべての動物の存在の最も具体的かつ最終的表現である運動の発現にかかわる要素である、中枢神経、末梢神経、筋肉よりなる運動系について、分子レベルの研究より、運動系の発達過程、運動系のエネルギー生産系の調節、運動系の代謝過程の遺伝子レベルでの調節、運動細胞の変性、老化・修復の機構、運動系細胞間の物質レベルでの情報伝達について研究を継続した。(1)運動系の発達とその異常の研究として、脳の発生から小児の運動機能の発達に至るまでの機構を、病理、生化学、分子遺伝学の側面から解析し統合すると同時に、特に運動発達の異常を細胞レベル、分子レベルで解明、(2)運動系における情報伝達の研究として、情報伝達の原理とその障害の機構を、脳のニューロン回路網と末梢運動神経系および筋肉なシナプスについて、シナプス前部伝達物質、シナプス後部の受容と情報変換機構を分子細胞レベルより解明、(3)運動系の分子・遺伝生物学的アプローチの研究として、ミトコンドリアの電子伝達系のエネルギー代謝機構とその異常、運動系細胞の固有な蛋白とその蛋白合成にかかわるDNAのモノクローナル抗体法とDNAシークエンスによる解明、運動系に異常をもつ遺伝性疾患のDNA上における異常などの研究、(4)運動系の変性と修復の成立過程の研究として、変性と修復の過程を、内因、外因、疫学的手法で追求し変性の結果生ずる異常を薬理学的手段を神経系の適応性とを用いて修復する基礎過程の分子レベルでの解析、(5)運動系における制御機構の研究として、運動系の統合中枢である錘体外路系等の機構を形態学、薬理学、生理学的手法でシナプスレベルで解明する。以上の研究を進め、遺伝性運動系疾患に関する遺伝子、運動系疾患の代表であるパーキンソン病モデル(サル)における組織の脳内移植法、運動疾患の脳内代謝課程のPETによる画像解析、運動系神経伝達物質関連酵素及び受容体のクローニングなどを研究した。
発展途上国の農村部における水浄化用のコスト的に有効な太陽光光触媒の開発

酸化チタン光触媒をドープしたNb-S TiO_2、Ta-S doped TiO_2では、太陽光下でのOrange IIの脱色速度がドープしていないTiO_2やS doped TiO_2より速くなった。吸収波長が可視領域側にシフトしたことにより、ドープしていないTiO_2やS doped TiO_2より太陽光の可視領域の光をより利用できるようになったためである。また、Nb-S TiO_2とTa-S TiO_2では、Nb-S TiO_2の方がTa-S doped TiO_2より脱色速度が速かった。これは、Nb-S doped TiO_2の方が、吸収波長が可視領域側にシフトしており、また、UVランプ照射下での脱色速度が速いためである。太陽光には約13[mW/cm^2]の紫外線が含まれているため、太陽光照射下で最もはやくOrange IIを脱色したNb-S doped TiO_2について、紫外線がわずかにしか(太陽光の約1000分の1)含まれていない蛍光灯を照射してOrange IIの脱色実験を行った。その結果、Nb-S doped TiO_2は紫外線が非常に少ない状態でもOrange IIの脱色でき、また、ドープしていないTiO_2より速くOrange IIを脱色できることが確認できた。Nb-S doped TiO_2では、可視-紫外線吸収スペクトルを測定した結果から、ドープしていないTiO_2、S-doped TiO_2に比べて吸収波長が可視領域側に大きくシフトしているため、このことが、活性が向上したと考えられる。Nb-Sドープ酸化チタンの方が、Ta-Sドープ酸化チタンより脱色速度が速かったが、Nb-S酸化チタンの方が結晶サイズが小さく、吸収波長が可視領域側にシフトしており、また、紫外線照射下での活性が高いためと考えられ、TaとSの共ドープより、NbとSの共ドープのほうが効果的に太陽光照射下での活性を向上させることが分かった。コストの面から考えてもTaとSの共ドープよりNbとSの共ドープの方が良いと考えられる。研究は順調に行われ、一定の成果が得られた。光触媒は、光エネルギー(紫外線が主であるが、太陽光の適用についても多くの研究がある)を用いることにより有害有機物質を水と二酸化炭素にまで分解できる触媒である。従来の光触媒よりもOHラジカルを大量に発生させ、環境問題を引き起こす有機物質を迅速かつ効率的に低コストで水と二酸化炭素にまで処理できるプロセスの開発を目的としている。太陽光でも高い分解能を持つ光触媒の調製を進めている。安価で簡単な方法で作製した触媒の特性の測定など行っている。市販の酸化チタン触媒(P25 Degussa)に硫黄を加水分解法によりドープした。酸化チタン触媒に硫黄をドープしたことによりアナターゼの割合が若干増加し、オレンジIIの分解速度は1.5倍になる結果が得られた。実験から焼成温度が重要な効果を持つことが解った。焼成温度を100°Cから550°Cに上げることにより脱色速度が6倍になった。しかし、焼成温度をさらに700°Cに上げると結晶のサイズが大きくなり活性は大きく低下する実験結果が得られた。SEM写真から、焼成温度が550°Cまでは温度上昇により粒子のサイズが減少することが確かめられた。XRD(粉末X線回析装置)によって、ドープしない場合の結晶平均径は23.31nmであり硫黄をドープすることにより20.75nmに減少することが確認された。XPS(X線光電子分光)の結果から168.9eVにピークが見られるが、このことはS^<6+>によってTi^<4+>が置換されたことを示している。研究は順調に進行しており、今後さらに分解能の高い光触媒を得るための調製法の検討を行う。非常に積極的に研究に取り組んでいる。

Nb-Sドープ酸化チタンの方が、Ta-Sドープ酸化チタンより脱色速度が速かったが、Nb-S酸化チタンの方が結晶サイズが小さく、吸収波長が可視領域側にシフトしており、また、紫外線照射下での活性が高いためと考えられ、TaとSの共ドープより、NbとSの共ドープのほうが効果的に太陽光照射下での活性を向上させることが分かった。コストの面から考えてもTaとSの共ドープよりNbとSの共ドープの方が良いと考えられる。研究は順調に行われ、一定の成果が得られた。
高大接続をめざす高大連携による学習支援システム構築に関する研究

高校での進路学習に大学生と高校生の協働的な学習機会を設け、その効果を検証した。またSSH研究指定校卒業生対象の意識調査を実施し大学教育への円滑な接続を促進する要因を明らかにして、大学進学を見通した教育実践上の方策を考える示唆を得た。その結果、高校教育に内在されている大学教育を準備する学習内容や方法に着目した学習プログラムの構築の可能性が展望された。1.内容:島根県内の3高校において、大学生と高校生との協働学習による進路意識啓発に資する教育的活動を実施し、その効果を検証した。その結果(1)協働的学習は進路探究にさほど積極的でなかった生徒の意識の変容に効果的であること、(2)生徒の学習活動へのかかわりの濃淡によって変容する意識に差が生まれること、(3)学年段階が低い場合に協働学習の効果がより高いことが明らかになった。また、この過程で、情意発達を促す協働的学習方法について文献調査を実施し、インシデント・プロセス法を援用した協働的学習方法の開発を行った。インシデント・プロセス法によって「情報収集能力」「情報分析能力」「意思決定能力」の向上を期待できる。2.意義と重要性:(1)複数の高校の協力のもとで進路意識啓発をめざす高校生と大学生の協働的学習機会を設定することができた。これは今後の定量的・定性的研究を継続的にすすめるうえでの基盤となるものである。(2)インシデント・プロセス法を活用し実践に適用可能な協働的学習方法について開発できた。これは高校生の進路意識を啓発するアクティブな学習形態を生む基礎を築いたものである。(3)協働学習に参画する大学生組織を形成した。継続的に高校生の学習活動にかかわる大学生を組織化したことによって大学生自身のキャリア形成をとらえる基礎ができた。3.今後の課題:(1)進路意識を大学の学習に必要な力の中に定位するための文献研究をすすめること(2)実践校において継続的な定量調査を実施し意識変容の過程をとらえること(3)大学生のキャリア意識の変容過程をとらえる調査を実施すること1.内容:昨年度に引き続き、島根県内の3高校において、大学生と高校生との協働学習による進路意識啓発に資する教育的活動を実施し、その効果を検証した。その結果昨年度と同様(1)協働的学習は進路探究にさほど積極的でなかった生徒の意識の変容に効果的であること、(2)生徒の学習活動へのかかわりの濃淡によって変容する意識に差が生まれること、(3)学年段階が低い場合に協働学習の効果がより高いことが明らかになった。同一高校の同一対象学年に年度を継続して実施したことで、持続的な教育活動の有用性が確認できた。また、今年度新たに高校生を対象とした大学教育への適合性を高める課題探究活動を開始し、認知的側面と情意的な側面からの学習支援システムの構築に着手した。2.意義と重要性:(1)複数の高校の協力のもとで進路意識啓発をめざす高校生と大学生の協働的学習機会を設定し継時的な実践研究ができた。今後研究を継続的にすすめるうえでの基盤となるものである。(2)ゲーミング・シミュレーションを授業過程に導入し実践に適用可能な協働的学習方法について開発できた。(3)協働学習に参画する大学生組織を指導育成した。大学生のインストラクション・スキルが向上し大学生自身のキャリア形成をとらえる基礎ができた。3.今後の課題:(1)進路意識を大学の学習に必要な力の中に定位するための文献研究をすすめること(2)情意的な発達と認知的な発達の両側面から大学教育への適合性を高める取り組みをすすめその効果を検証すること(3)大学生のキャリア意識の変容過程をとらえる調査を実施すること1.内容:昨年度に引き続き、島根県内の3高校において、大学生と高校生との協働学習による進路意識啓発に資する教育的活動を実施し、その効果を検証した。また、SSH研究指定校1校の卒業生を対象とする意識調査を行い、その結果をもとにした実証的研究を通して、高大接続をめぐる問題状況をとらえる多面的な要素や次元を抽出するとともに、大学教育への円滑な接続を促進する要因を明らかにして、大学進学を見通した教育実践上の方策を考えるための具体的な示唆を得ることができた。高校教育におけるどのような学習経験や能力認知が大学における能力認知に寄与するかを検証し、「学習の接続」の問題状況と促進要因を明らかにした。質問紙調査の因子分析をもとに、重回帰分析を行った。

その結果、(1)すすんで問題を解決する能力が高いと考える高校生が「学士力」に関連するさまざまな力を有していると認識していること、(2)しかし、課題解決的な学習の学習過程で他者との協働性が必ずしも強くなく、進学後の社会的に協働する学習に弱さがあること、(3)世界規模・地球規模で考えたり、自分が学ぶ意義を社会的な文脈に位置付けて考える学習経験が弱いこと、(4)SSHの教育プログラムのなかで先端的な研究に触れる体験が科学的リテラシーの習得に影響を与えること、しかし学習が個人レベルの問題に収斂する傾向があること、が明らかになった。2.意義と重要性:高大接続の教育活動の展開にあたって(1)アクティブな学習活動の有為性を生かしつつ、学習の振り返りによる学習能力の自巳認知を高めること、(2)先端的な研究に触れることなどを通して、世界的社会的な視点から学習の意義づけを図ること、(3)課題解決的な学習の中で自己と他者との協働の学習機会をもつことが大学教育への円滑な移行を促進するという知見を得た。本研究によって高校教育と大学教育の間にある問題の所在が明らかになり、高校教育に埋め込まれた大学教育を準備する学習内容や方法に着目しは大学教育を準備する高校教育の在り方を示すことによって、大学教育の質保証を担保する基盤を形成する意義を見い出した。
超好熱菌の複合金属酵素のナノアッセンブリー機構解析

超好熱菌エネルギー代謝系の主要複合金属酵素は、学術上重要なだけでなく、バイオナノセンサーやエレクトロナノテクノロジー等への産業利用も見込まれる。ポストゲノム・ポストストラクチャー時代の応用展開を考え、超好熱菌の複合金属酵素をコードする遺伝子クラスターの簡易発現系ストラテジーの大枠を考案した。各種分光学的解析、結晶構造解析等と合わせて検討・改善を重ね、当初の主たる研究目標をほぼ達成できた。構造が堅く扱い易い超好熱菌の複合鉄硫黄酵素等をモデルとし、複合金属酵素ナノアッセンブリー機構解析を目的として各種解析を行ない、平成18年度には以下の成果を得た。1.先に解明した超好熱菌鉄硫黄蛋白質スルレドキシンの結晶構造に基づき、(1)三残基置換により[2Fe-2S]クラスターを単核鉄中心に変換した人為蛋白質を作成し、各種分光学的解析を行い、(2)その高分解能X線構造解析にも成功した。分子アッセンブリー機構の基礎的知見を得るため、これらの構造情報をもとに、他の変異酵素を作成・解析をすすめている。2.鉄硫黄クラスター挿入機構の動的微細構造解析には、分光学的解析法の発展が不可欠である。このため国内外との共同研究で、HYSCORE,ENDOR,共鳴ラマンスペクトル解析に適した鉄硫黄クラスター合成系フェレドキシンのサンプル作成と結晶化および測定をすすめた。理論解析には還元型立体構造が望ましく、今後詳細な解析とシミュレーション等を行う予定である。3.超好熱菌複合金属酵素として、古細菌の2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素2種(ORF2つおよび4つ)とコハク酸:キノン酸化還元酵素(ORF4つの膜蛋白質)の発現を試み、(1)前者2種につき、複合体して発現、精製する系をつくることができた。(2)超好熱菌酵素の場合、サブユニットとしても比較的安定に発現できることがわかってきた。これは複合金属酵素の分子進化の観点から、極めて興味深い。(3)分光学的解析から、発現酵素の問題点を絞り込めた。すなわち、大腸菌発現系由来の精製酵素では、活性に不可欠な鉄硫黄クラスターが部分的に分解するという知見を得た。従って、次年度以降にホロ酵素の再構成系作成を目指す。結晶化も平行してすすめたが、現在構造解析に適した条件は見つかっていない。次年度以降にさらに検討する予定である。構造が堅く扱い易い超好熱菌の複合鉄硫黄酵素等をモデルとし、複合金属酵素ナノアッセンブリー機構解析を連携して行い、平成19年度には以下の主要成果を得た。1.先に解明した超好熱菌鉄硫黄タンパク質スルレドキシンとその変異酵素の4種の結晶構造に基づき、リガンド変異酵素を新たに2種作成、EPR・共鳴ラマン・EXAFS・高分解能X線結晶構造解析を行い、鉄と亜鉛の選択結合機構につき、新知見を得た。今後さらに若干解析を加え次年度に成果公表する。3.超好熱菌複合金属酵素として、古細菌ゲノム配列情報で見いだした2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素(ORF4つ)を発現・解析し、その基質を同定、さらに本酵素の酸素分子による失活機構を解析した。これは次年度に成果発表する。4.古細菌型コハク酸:キノン酸化還元酵素(ORF4つの膜結合蛋白質)の発現系開発に成功しリコンビナント精製酵素につき、EPR・共鳴ラマン解析・結晶化を行った。現在分解能は8Å程度だが、世界初の重要な成果である。次年度は精製法・結晶化条件改善を加え、中程度以上の分解能での結晶構造解明を目指したい。構造が堅く扱い易い超好熱菌の複合鉄硫黄酵素等をモデルとし、合金酵素ナノアッセンブリー機構解析を連携して行い、平成20年度には以下の主要成果を得た。1.先に解明した超好熱菌鉄硫黄タンパク質スルレドキシンとその異酵素の6種のX線結晶構造から、タンパク質マトリックスにおける鉄と亜鉛イオンの選択結合機構につき、さらに検証、を重ねた。とくに、単結晶のEXFAS測定、結晶サンプルをいた重金属置換効果を検討し、作業仮説を検証できたので、原著論文として今後成果公表する。2.鉄硫黄クラスター挿入機構に関する研究の一環として、Thermus thermophilus HB8のmitoNEETホモログ(Tth-NEET0026)を発現・同定・結晶構造解析を行い、細菌型酵素の構造を1.8A分解で決定した。また、分光学的解析を行い、学会発表した。3.古細菌ゲノム配列情報をもとに、超好熱菌複合金属酵素をコードする遺伝子クラスターを大腸菌で大量発現させる簡易ストラテジーを開発し、学会発表した。また、標的遺伝子クラスターの非翻訳領域に変異を導入し、系統的に発現解析した。4.古細菌型コハク酸:キノン酸化還元酵素(ORF4つの膜結合蛋白質)の発現系開発に成功しリコンビナント精製酵素につき、精製法および結晶化方法の改善を検討した。現在分解能は6A程度であり、今後、中程度以上の分解能での結晶構造解明を目指したい。

また、本酵素の鉄硫黄クラスターの生理的電子伝達機能には、サブユニットアッセンブリーよる性質変化が必須であることを分光学的手法により明らかにした。呼吸鎖複合体としては初の例であり、原著論文として今後成果公表する。
急性期脳虚血の病態における一酸化窒素生成機構の役割

虚血モデルとして、ラット中大脳動脈閉塞(MCAo)を用いることによって得られた結果を以下に列挙する。1)LNA(1mg/kg、腹腔内投与)をMCAo後5分、3、6、24時間の計5回投与することでMCAo後72時間における梗塞巣を縮小させた。2)4時間の永久閉塞モデルにおけるLNA(1mg/kg、腹腔内投与、虚血後5分、3時間)の効果は、血流には影響しなかったがspecific gravityの低下を有意に阻止した。脳微小血管の線分化像を蛍光像から特種画像により変換して脳微小循環障害を計測するとLNAの低容量は改善傾向を示す。3)2時間MCAo-2時間再潅流モデルにおけるLNA(1mg/kg、腹腔内投与、虚血後5分、再潅流直後)の効果は、再潅流後のdelayed hypoperfusionを阻止しspecific gravityの低下を有意に阻止した。4)LNAのMCAo48時間後における脳浮腫(dry-wet法、水分含有量)にたいする効果は、MCAo後5分、3、6、24時間の投与方法では、0.01-1mg/kgと極めてlow doseで有効であり、3mgを越えると無効となる。有効容量では、血圧、脳血流量にたいして有意な影響を来たさない。5)4時間MCAoで虚血中心部で産生されるNOを測定すると、虚血早期(10-60分)及び虚血後3時間にピークを迎えるNO overproducionが認められる。6)5)にLNAを1mg/kg腹腔内投与するとNO productionは、減弱する。7)6)と共にLNAによる梗塞巣の縮小を認めた。8)脳微小血管(MV)におけるCa-dependent(E-cNOS),Ca-independent(E-iNOS)のNOS活性をMCAo後経時的に測定すると、cNOSはMCAo直後にbaselineの約7-8倍にまで上昇し、それが下降傾向を辿り、1週間後に再度上昇する。一方iNOSは、MCAo後4時間にて上昇しており24時間後まで持続する。著者が得た以上の結果は、NOが脳虚血において悪玉として働くことを示唆している。一酸化窒素合成酵素阻害剤(NOSI)のラット中大脳動脈閉塞モデル(MCAo)に於ける脳浮腫、脳梗塞阻止効果からNO合成系が虚血性脳細胞障害に深く関わる事について詳細に検討することが今回の目的であった。「方法」(1)SDラットをハローセン麻酔下にてMCAoを作成し、無作為に生食((1)群)或いはL-NNA(0.001,0.003,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10mg/kg.IP:(2)-(10)群;各群7匹)[5min,3,6,24hours after MCAo]を投与した。MCAo後48時間にて屠殺し、脳内水分含量(dry-wet method)及び脳内Na,K,Ca濃度(原子吸光法)を測定した。(2)SDラットをハローセン/笑気麻酔下にてminiclipを用いてPO,RE(各群4匹)を作成した。CBFは、水素クリアランス法(患側4、健側1本)により測定した。

L-NNAは、POでは、MCAo後5分、3時間、REでは、MCAo及びRE後5分に腹腔内投与した。「結果」(1)L-NNAは、(4)-(8)で脳水分含量、脳内Na濃度の増加を用量依存性に阻止した。虚血後4,24時間では、I-NOSが48時間では、C-NOSが有意に活性化されていた。(2)L-NNA(1mg/kg,IP)の虚血後投与によりPO及びRE共にSGの低下を有意に阻止した。「結論」以上の結果は、L-NNAの0.01-1mg/kgが本モデルにおける至適量であり、虚血早期のMVにおけるI-NOS活性化が虚血性脳障害機構に深く関与することを示している。虚血モデルとして、ラット中大脳動脈閉塞(MCAo)を用いることによって得られた結果を以下に列挙する。1)LNA(1mg/kg、腹腔内投与)をMCAo後5分、3、6、24時間の計5回投与することでMCAo後72時間における梗塞巣を縮小させた。2)4時間の永久閉塞モデルにおけるLNA(1mg/kg、腹腔内投与、虚血後5分、3時間)の効果は、血流には影響しなかったがspecific gravityの低下を有意に阻止した。脳微小血管の線分化像を蛍光像から特殊画像により変換して脳微小循環障害を計測するとLNAの低容量は改善傾向を示す。3)2時間MCAo-2時間再灌流モデルにおけるLNA(1mg/kg、腹腔内投与、虚血後5分、再灌流直後)の効果は、再灌流後のdelayed hypoperfusionを阻止しspecific gravityの低下を有意に阻止した。4)LNAのMCAo48時間後における脳浮腫(dry-wet法、水分含有量)にたいする効果は、MCAo後5分、3、6、24時間の投与方法では、0.01-1mg/kgと極めてlow doseで有効であり、3mgを越えると無効となる。有効容量では、血圧、脳血流量にたいして有意な影響を来たさない。5)4時間MCAoで虚血中心部で産生されるNOを測定すると、虚血早期(10-60分)及び虚血後3時間にピークを迎えるNO overproductionが認められる。6)5)にLNAを1mg/kg腹腔内投与するとNO productionは、減弱する。7)6)と共にLNAによる梗塞巣の縮小を認めた。8)脳微小血管(MV)におけるCa-dependent(E-cNOS),Ca-independent(E-iNOS)のNOS活性をMCAo後経時的に測定すると、cNOSはMCAo直後にbaselineの約7-8倍にまで上昇し、それが下降傾向を辿り、1週間後に再度上昇する。一方iNOSは、MCAo後4時間にて上昇しており24時間後まで持続する。著者が得た以上の結果は、NOが脳虚血において悪玉として働くことを示唆している。
多様な環状構造の可逆変換－トランスフォーマブルマクロサイクルの創成

マクロサイクルは、末端を持たない閉じた構造により同一の化学組成・分子量の鎖状分子とは異なる物性・化学特性を示すことから広い分野で研究対象であるが、合成には多くの課題があり、望みの構造とサイズのマクロサイクルの自在合成は用意ではない。本研究では機械的結合を持つ分子であるロタキサンの動的構造特性を利用した新しい環化方法を提案し、多様な多環構造やカテナンなどのインターロック分子への構造変換が可能なトランスフォーマブルマクロサイクル群を創製する。さらに分子の形状変換系を駆動力とするマクロな刺激応答システムへの展開を目指す。
在宅生活自立高齢者の閉じこもりに関する縦断的研究

本報告書は、「在宅生活自立高齢者の閉じこもりに関する縦断的研究」を研究課題として、平成15年から17年度の3年間にわたって研究した成果をまとめたものである。寝たきりにいたる過程に閉じこもり状態像が存在し、その状態像に陥らないことの予防を目指して、ADL自立高齢者において、以下の点を明らかにした。1.外出頻度によって、閉じこもりが判定できるか。(1)外出頻度が週1回以下を閉じこもりと判定するのは有用である。(2)外出頻度によって閉じこもりと判定された者は要介護に移行する率が高い。社会交流のある高齢者でも、閉じこもり状態になると要介護に移行する。2.外出頻度による閉じこもりに地域差があるか。閉じこもり率は710%程度である。地域差が認められる。3.ADL自立高齢者において閉じこもりと関連する要因は何か。閉じこもりに関連する要因は「高次生活活動能力」の関与が大きい。4.高次生活活動能力自立高齢者における閉じこもり発生要因は何か。高次生活活動能力自立高齢者において、閉じこもり発生要因は、男女とも、どの年齢においても、「友人・別居家族・親族との交流頻度」が少ないことであった。【結論】高齢期において、外出頻度が少なくなり、家に閉じこもる状態は要介護に移行する。さらに、自宅において、友達や近隣、身内と会っておしゃべりする機会があるような者でも、外出が少ないことは要介護に移行しやすい。高齢期の閉じこもり状態は要介護移行リスクであり、頻繁に外出し、社会的刺激を受けることが特に重要と考えられる。予防的支援としては、先ず、閉じこもり状態を解消し、友人等をつくる「場」の支援が必要になる。さらにその場で行われる具体的支援は「高次生活活動能力(老研式活動能力指標)」を向上させるようなサービスになると推察される。地域差が認められる。本年度の研究は、地域に在住している生活自立高齢者を対象に閉じこもり割合やその状態像を明らかにすることである。(1)兵庫県五色町の対象者地域在住の65歳以上の高齢者2,127人を対象に、閉じこもりの状態像とその関連要因を明らかにした。閉じこもりの判定には外出頻度を用い、1週間に1回程度以下の外出しかしない者を閉じこもりとし、外出介助と社会交流を組み合わせて閉じこもりの状態像をIからIVに分類した。「閉じこもりI」は一人で外出困難かつ社会交流はある、「閉じこもりII」は一人で外出困難かつ社会交流はない、「閉じこもりIII」は一人で外出可能かつ社会交流はある、「閉じこもりIV」は一人で外出可能かつ社会交流はないとした。閉じこもり率は8.5%であった。その状態像は、「閉じこもりI」が1.4%、「閉じこもりII」が1.0%、「閉じこもりIII」が4.2%、「閉じこもりIV」が1.9%であった。閉じこもりの約半数は一人で外出可能でありかつ社会交流のある「閉じこもりIII」群であり、社会接触のある閉じこもりがいることを明らかにした。また、閉じこもり群と関連する因子には特に歩行能力の低下が強く関連していた。そのため、アンケート調査で閉じこもりと判定された者に対して、「5m歩行速度」・「Timed up & go」・「Timed up & goカップ付き」の3種目の歩行調査を行った。その結果、外出頻度の低下に伴い、各項目の歩行時間が増加し、閉じこもり群には歩行機能の低下があることが明らかになった。(2)大都市近郊高槻市の生活自立前期独居者大都市近郊高槻市の生活自立前期

独居者1,216人おいて「ひとりで遠出できない」ことが要介護状態移行の危険因子と考えられるかを検討するため、「ひとりで遠出できない」者の特徴を横断的に明らかにした。前期で生活自立高齢者であっても、「ひとりで遠出できない」者は日常生活自立度の低下や要介護移行リスクを数多く有していた。これら独居者は「近隣閉じこもり」のハイリスク者として注目すべきであることを明らかにした。本年度の研究は平成12年度にADL自立高齢者を対象に、閉じこもり状態像別した集団の追跡調査を行い、要介護状況の発生を検討した。自立生活の在宅高齢者において、外出頻度から判定した閉じこもりが要介護に移行するか、また低水準の社会交流がより強く要介護状態の発生を増幅するのかを明らかにするために、閉じこもりおよびその状態像から要介護の発生状況を検討した。平成12年10月に兵庫県五色町の65歳以上の自立生活の在宅高齢者を対象(2046人)に閉じこもりに関する質問紙調査を行った。その後平成15年3月末日まで追跡し(追跡期間:30ヶ月)、要介護移行について調査した。閉じこもりの判定には外出頻度を用い、1週間に1回程度以下の外出しない者を「閉じこもり」とし、外出介助と社会交流を組み合わせた閉じこもり状態像をIからIVに分類した。「閉じこもりI」は一人で外出困難かつ社会交流はある、「閉じこもりII」は一人で外出困難かつ社会交流はない、「閉じこもりIII」は一人で外出可能かつ社会交流はある、「閉じこもりIV」一人で外出可能かつ社会交流はないとした。本地域において、自立生活の在宅高齢者の閉じこもり率は7.5%、30ヶ月追跡後の要介護移行率は12.7%であった。閉じこもりの約半数は閉じこもりIIIであった。外出が「1週間に1回程度以下」は「23日に1回以上」に比して有意に高い要介護移行率を示し、また閉じこもり群は非閉じこもり群に比べて移行率が高率であった。85歳未満の高齢者では、閉じこもりは要介護移行のリスク因子であった。閉じこもりの状態像別では非閉じこもり群と比較してどの群も高い要介護移行率を示した。社会交流のない群はある群と比べて(IIとI、IVとIII)、要介護移行率が高い傾向を示した。以上の結果から85歳未満の自立生活の在宅高齢者においては、閉じこもりが要介護移行のリスク因子になる。閉じこもりの判定には外出頻度・「週に1回程度以下」を使用するのが有用である。さらに閉じこもり状態像において、社会交流のないことは要介護移行により強く関連することが認められた。【目的】生活機能の自立した非閉じこもりの在宅高齢者において,閉じこもりの発生に関連する要因について検討した.【対象と方法】兵庫県五色町に在住する65歳以上の高齢者に対して,平成12年10月と平成15年3月に自記式,記名の質問紙調査を行った.回収者のうち,年齢が85歳未満,介護保険未利用,基本的日常生活動作および老研式活動能力指標が全て自立し,ひとりで遠出できる非閉じこもり高齢者732人を対象に,閉じこもりの発生に関連する個人的要因について性・年齢別に解析した.閉じこもりの判定には外出頻度を用い,1週間に1回以下の外出しかしない者を「閉じこもり」とした.
刺激と報酬の連合学習過程における前頭前皮質と中脳辺縁系ドパミンシステムの相互作用

本研究では、頭部固定状態の覚醒マウスにおいて、多電極電気生理記録と光遺伝学的細胞同定手法をもちいて、内側前頭前皮質の神経活動に対するドパミンの影響を検証した。その結果、音刺激(CS)および飲水報酬(US)をもちいた古典的条件づけ学習課題において、高頻度発火型の抑制性神経細胞(FS INs)のうちパルブアルブミン陽性細胞が、CSおよびUSに対して正の応答を示すことを発見した。この応答はドパミン受容体1型阻害薬であるSCH23390の皮下投与により抑制された。さらに、中脳ドパミン神経細胞の光遺伝学的刺激がFS INsに対して同様の応答を誘導することが判明した。まず、野生型C57NL/6Jマウスをもちいて、頭部固定条件の覚醒マウスが1時間以内で学習可能な、遅延あり古典的条件づけ課題の実験条件を検討した。その結果、2種類の音刺激(10kHz純音またはホワイトノイズ)をもちいた課題において、約半数のマウスが報酬と連合された刺激に対して有意に高い反応を示すような実験系の確立に成功した。つづいて、ドパミン細胞特異的にチャネルロドプシンを発現するDAT-cre/Ai32またはTH-cre/Ai32マウスの腹側被蓋野よりレーザーダイオード一体型シリコンプローブをもちいて多細胞同時記録を実施する実験条件を検討した。しかしながら、光感受性細胞からの記録に成功する確率は非常に低く、現在ChR2の導入方法を遺伝子改変マウスではなくウイルス投与に変更した系でさらなる検討を実施している。そして、この学習課題をより内側前頭前皮質(mPFC)依存的なものにするための実験条件を検討した。その結果、上述の行動試験系を発展させ、より高次の認知機能を必要とする連合学習課題を訓練することに成功した。これは、報酬が提示される飲水ポートを2本設置し、「音刺激1ー右ポートより報酬」「音刺激2ー左ポートより報酬」という連合性を学習させる知覚弁別課題である。この課題は刺激とポートの関係性を変更することで行動選択に可塑性を誘導する(set shifting)ことも可能であり、本研究課題において理想的な行動試験系である。さらに、このような知覚弁別課題およびset shifting課題を遂行中のマウス両側mPFCより多細胞同時記録を実施し、刺激あるいは行動に対して選択的な応答を示す神経活動を記録することに成功した。平成26年度はこれらの実験系を活用して、研究を遂行していく予定である。前年度に確立した、頭部固定状態の覚醒マウスをもちいた古典的条件づけ課題において、シリコンプローブをもちいて内側前頭前皮質(mPFC)の神経細胞活動を記録した。その結果、高頻度発火型の抑制性神経細胞(FS IN)が、報酬(US)および報酬を予期させる音刺激(CS)に対して、潜時が数十百ミリ秒、持続時間が一秒弱という速い正の応答を示すことが判明した。光遺伝学的な細胞種同定手法により、その大多数はパルブアルブミン(PV)陽性細胞であることが確認された。この応答はドパミン受容体1型(D1R)阻害薬であるSCH23390の皮下投与により阻害されたことから、D1R経路に依存することが示唆された。さらに、DAT-creマウスをもちいてmPFCより電気生理記録しながらドパミン細胞選択的に光刺激したところ、FS INがUSおよびCS提示時と同様に正の応答を示した。以上の結果より、mPFCに投射する中脳ドパミン神経細胞は報酬に関連する情報をPV細胞に秒未満という速い時間尺度で伝達している可能性が示唆された。一方で、中脳ドパミン細胞からの電気生理記録については、TH-creマウスの発現選択性にかかる問題や、記録にもちいる電極や手法の条件検討不足により、安定した結果を得ることができなかった。この点については、今年度までに構築した実験系を応用し、次年度以降の研究計画において引き続き検討していく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。システム神経生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。頭部固定条件の覚醒マウスをもちいた行動試験系の確立に成功し、さらにそれを認知課題にまで発展させたことは当初の計画以上の進展であり、評価に値する。また、両側mPFCやmPFCー海馬など、複数領域からの多細胞同時記録を安定的に実施可能になった点も順調に進展している。しかしながら、光感受性細胞からの神経活動記録については、いまだ成功率が非常に低い状態であり、実験系の改善を要する。ウイルス投与により皮質領域にChR2を発現させた状態での細胞同定には成功していることから、問題は標的領域であるVTAの深度、あるいは遺伝子改変マウスにおけるChR2発現であると推察される。

これらを改善するために、実験手技のさらなる向上、およびウイルス投与による光感受性タンパク質の導入を検討していく。また、投射経路特異的な細胞標識については、研究計画に挙げたWGA-creによる手法の確立には失敗したものの、現在代替案としてヘルペス単純ウイルス(Herpes simplex virus: HSV)をもちいた実験を検討しており、発現細胞数は少ないながら、mPFCに投射するドパミン細胞を特異的に標識することに成功している。以上を総合的に考慮すると、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。平成25年度の研究により、頭部固定状態の覚醒マウスにおいて、2種類の連合学習課題を訓練することに成功した。今年度はそれらを活用して、以下の要領で研究を実施する予定である。1.複数の音刺激と単一の報酬ポートをもちいた連合学習:今年度はこの実験系に逆行性感染ウイルスであるヘルペス単純ウイルス(Herpes simplex virus: HSV)を導入し、投射先特異的にドパミン細胞を標識したうえで神経活動を記録する。具体的には、DAT-creあるいはTH-IRES-creマウスのmPFCまたは側坐核(nucleus accumbens: NAc)にhEF1α-LS1L-hCHR2(H134R)-mCherryを投与し、逆行性に標識されたドパミン細胞を光遺伝学的に導入したうえで、この連合学習が成立する過程の複数時点において、シリコンプローブにより神経活動を取得する。2.複数の音刺激と複数の報酬ポートをもちいた弁別学習:この学習課題を応用したset shifting課題にはmPFCおよび同領域におけるドパミンが必須であることが報告されているため、その過程においてmPFCおよびVTAの神経活動を記録、およびmPFCにおけるドパミンを光遺伝学的に制御することで行動が変化する可能性を検証する。最後に、ASDモデルマウスをもちいて上記の課題を実施する。
ニトロカテコールアミン類の高感度分析法の開発とその応用

昨年度、ニトロカテコールアミン類の高感度分析を行うための条件検討の内、蛍光誘導体化条件の最適化を行った。本分析法においては化学発光検出による高感度を行おうと考えているが、カテコール環6位のニトロ基の影響により、カテコールアミンに比べてニトロカテコールアミンは化学発光効率が低い。そこで今年度においては、Pt-Rh還元カラムを用いてニトロカテコールアミンのニトロ基をアミノ基にオンラインで還元することにより、化学発光検出における感度上昇を目指した。本研究において用いたHPLCシステムは以下の通りである。ニトロカテコールアミンを陽イオン交換カラムと逆相カラムの順に用いて分離した。その後、還元カラムによりオンラインでニトロ基を還元した後、蛍光誘導体化試薬(エチレンジアミン)と100°Cで反応させ、生じた蛍光物質と化学発光試薬(TDPO+H_2O_2)とを反応させた。最終的に生じた化学発光を検出した。還元カラムを設置する位置について検討した結果、逆相カラムにより分離されたニトロカテコールアミンが、100°C下で還元カラムを通過してから蛍光誘導体化試薬と反応する条件が最もオンライン還元に適していることがわかった。還元カラムにより、カラムがない時と比べておよそ40-170%化学発光検出における感度が上昇した。今後、還元カラムを組み込んだ、ニトロカテコールアミン分析系を構築し、生体試料へと応用する予定である。ニトロカテコールアミン類が市販されていないことから、はじめに、カテコールアミン(ノルエピネフリン、エピネフリン及びドーパミン)と亜硝酸ナトリウムの反応によりニトロカテコールアミン類(ニトロノルエピネフリン、ニトロエピネフリン及びニトロドーパミン)の合成を行い、HPLC-UV検出、NMR及びMSを用いて純度の確認を行った。続いて、ニトロカテコールアミン類の高感度分析を行うための条件検討を行った。ニトロカテコールアミンはポストカラムにおいてエチレンジアミンと蛍光誘導体化を行い蛍光誘導体に導き、その蛍光誘導体を過シュウ酸エステル化学発光検出法により検出することを考えている。ODSカラムにおけるカテコールアミンとニトロカテコールアミンの計6種化合物の分離を検討し、オンラインにおける蛍光誘導体化条件の最適化を行った。その結果、100°C、コイル長20mにおいて最も高いピーク高さが得られた。
原発性胆汁性肝硬変におけるHLA DR8の意義

この予備実験ではT細胞クローンのうちpeptideに反応するものは認められなかった。また混合peptideに対する反応性も認められていない。これは生理的な抗原のprocessingと異なる抗原peptideが作製された可能性があるが、EB-trBの抗原peptide提示能が十分でない可能性も考えられる。これらの可能性を考慮して、EB-trBを用いてPDC-E2のcDNAtransfectantを作製した。vectorとしてpREP4plasmidを用いtransfectantを作製し、PDC-E2の発現をdotblot法で確認した。このtransfectantのclass II上には、生理的にprosessされたPDC-E2peptideが結合している可能性があり、T細胞クローンの3H-Thymidincの取り込み試験では、コントロールと比較して有意に反応性を示すものが存在した。ただし抗原peptideに対する特異性を確認することは困難である。現在transfectantよりclass IIを精製し結合peptideを解析中である。さらにtransfectantをtargetとして、患者末梢血リンパ球による細胞傷害試験を行うと高いE/Tratioではあるが、細胞傷害性を示すクローンが認められた。このことはclassIに抗原peptideが結合しているか、あるいはclassII拘束性の細胞傷害性T細胞が存在する可能性を示唆する所見であり今後解析を行う。
高齢者福祉施設における肺炎球菌保菌と莢膜型の分子疫学解析～高齢者肺炎予防に向けて

咽頭ぬぐい液を直接短時間混合増菌培養後DNAを抽出し、肺炎球菌に特異的な遺伝子(自己融解遺伝子)lytAをPCRで検出することができた。またPCRにより23価ワクチンに含まれる莢膜型に特異的なプライマーを用いて、lytA陽性者の莢膜型を決定することができた。我々が改良した混合増菌培養からのPCR検出法による成人健常者の肺炎球菌保菌率は、従来の分離培養法による保菌率より数倍高く検出感度が高かった。また個人の熟練に依存せず検出に要する時間も分離培養法に比べて短時間であった。平成25年度も平成23・24年度と同様に、40歳以上の成人を対象とした某市Aと本学との連携講座において、研究の同意を得た参加者に対して年齢、家族構成、孫(小学校入学前)との接触機会、23価肺炎球菌ワクチンならびにインフルエンザワクチン接種の有無等のアンケートを実施後、咽頭ぬぐい液を採取した。de Goria Carvalho Mらの方法(J Clin Microbiol. 2010;48:1611-1618)に準じて、咽頭ぬぐい液から肺炎球菌を分離せずに、そのまま増菌培養してDNAを抽出後、肺炎球菌に特異的であるautolysin遺伝子(lytA, 300bp)をPCRにて検出した。その後、lytA陽性サンプルに関して、23価肺炎球菌ワクチンに含まれる莢膜型をPCRにて検出することに成功した。その結果、参加者35名中15名(42.9%)がlytA陽性であり肺炎球菌の保菌が認められた。その中で23価肺炎球菌ワクチンに含まれる莢膜型であったのは8名(53.3%)で、14型が3名、10A型が2名、23F型が1名、6B型が1名、4型が1名であった。今回莢膜型が検出された参加者の中で、3名が13年未満に23価肺炎球菌ワクチンを接種していた。さらに、以前の結果から肺炎球菌の感染経路に小児との接触が深く関係していることが示唆されていたため、今年度は某総合病院の小児科外来で肺炎球菌の保菌調査を実施する予定である。また、高齢者に対しては平成25年度に隣接地域である某市Bとの連携講座を新たに立ち上げることに成功し、今年度は40歳以上の成人を対象に肺炎球菌の保菌調査を実施するとともに、23価肺炎球菌ワクチン接種推奨のための講義を行うことになっている。平成2324年度にかけて、40歳以上の成人を対象とした某市と本学との連携講座において、研究の同意を得た参加者に対して年齢、家族構成、孫との接触機会、23価ワクチン接種の有無等のアンケートを施行後、咽頭ぬぐい液を採取した。そのぬぐい液からde Goria Carvalho Mらの方法(de Goria Carvalho Mら. J Clin Microboil. 2010;48:1611-1618)に準じて肺炎球菌を増菌してサンプルを作製後、肺炎球菌に特異的であるautolysin遺伝子(lytA,300bp)をPCRにて検出した。その結果、H.23年には参加者36名中11名(30.5%)が、H.24年には参加者39名中10名(25.6%)がlytA陽性であり肺炎球菌の保菌が認められた。その肺炎球菌の保菌状況とアンケート結果から、23価ワクチン接種についてはH.23年の肺炎球菌保菌者11名中10名(90.9%)が未接種であったが、H.24年では保菌者10名中3名(30%)のみが未接種で残りは3年以内にワクチンを接種していた。したがって、23価ワクチンには含まれていない莢膜型の肺炎球菌を保菌している可能性が示され、今後従来の方法である莢膜膨化試験ではなく、PCRにより莢膜型を判定していく予定である。また、孫(小学校入学前)との接触については、H.23年の保菌者11名のうち8名(72.7%)が数か月に数回程度、H.24年の保菌者10名中3名(30%)のみが週に1回程度孫と接触していた。これらの結果から、肺炎球菌の感染経路に小児との接触が深く関係していることが示唆された。そのため、市中における小児の肺炎球菌保菌状況を知るために、今後某総合病院(病床数500)小児科で外来患児から咽頭ぬぐい液を採取する予定である。20112013年に人口210万人規模の市において、市内在住の本研究の趣旨の理解と同意が得られた4085歳の健常者(本人が自覚する疾患を有さない者)110名を対象とした。