hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者における顎関節症状の発現頻度からみた咬合支持の重要性

目的高齢者における顎関節症状の発現の実態を明らかにし,さらにその発現頻度と咬合状態との関係を明らかにすることを目的として,老人病院入院患者を対象とし顎関節と咬合に関する調査を実施した.方法今回は,高齢者における顎関節雑音の頻度と義歯の使用の有無との関係を分析するために,65歳から85歳までの年齢範囲の被験者であり,かつ残存歯により咬頭嵌合位が明確に定まらない者119名を対象とした.咬合に関する調査項目は義歯の使用の有無とし,義歯の有無により対象を2群に分類した.義歯を使用している群を義歯使用群,義歯を使用していない群を義歯不使用群とした.各群の人数は,男性・義歯使用群25名,男性・義歯不使用群19名,女性・義歯使用群43名,女性・義歯不使用群32名である.顎関節関する調査項目は顎関節雑音の有無とし,触診および聴診により診査した.結果顎関節雑音の発現頻度は,男性・義歯使用群では4.0%,男性・義歯不使用群では26.3%,女性・義歯使用群では11.6%,女性・義歯不使用群では34.4%であり,男女ともに義歯を使用していない群の方が,義歯を使用している群よりも顎関節雑音が高頻度に認められた.咬合が崩壊し,咬頭嵌合位が不明確になった高齢者において,義歯による咬合の回復を行わない場合,顎関節の退行性の変化がより高頻度に発現してしまうことが示唆され,義歯による咬合回復の重要性が再確認された.(目的)高齢者における顎関節症状の発現頻度を明らかにし,さらに咬合支持のとの関係について分析することを目的として調査をおこなった.(方法)調査対象は,埼玉県深谷市の老人病院入院患者のうち,顎関節と咬合に関する診査に対して同意,協力の得られた65歳以上の高齢者182名(男性63名,女性119名,平均年齢80.0歳)とした.咬合に関する調査項目は,咬合支持の有無とした.咬合支持の有無により対象を2群に分類し,咬合支持が存在している群を咬合支持群,咬合支持が欠如している群を支持欠如群と呼ぶ.顎関節症状に関する調査項目は,顎関節部の圧痛および顎関節雑音の有無とした.(結果)1)全調査対象の約4分の1に顎関節症状が認められたが,そのほとんどが顎関節雑音のみであり,疼痛を伴う重篤な症状の者は僅かであることが明らかになった.2)顎関節症状の発現は,男性で14.3%であるのに対して,女性では30.3%と高頻度に認められた.両群間の発現頻度には,カイ2乗検定により5%レベルで有意差が認められた.3)咬合支持の有無と顎関節症状の発現頻度との関係をみると,男女ともに支持欠如群では高い症状発現頻度を示すことが明らかになつた.特に,男性においては咬合支持群と支持欠如群の顎関節症状発現頻度に有意差がみとめられた.目的高齢者における顎関節症状の発現の実態を明らかにし,さらにその発現頻度と咬合状態との関係を明らかにすることを目的として,老人病院入院患者を対象とし顎関節と咬合に関する調査を実施した.方法今回は,高齢者における顎関節雑音の頻度と義歯の使用の有無との関係を分析するために,65歳から85歳までの年齢範囲の被験者であり,かつ残存歯により咬頭嵌合位が明確に定まらない者119名を対象とした.咬合に関する調査項目は義歯の使用の有無とし,義歯の有無により対象を2群に分類した.義歯を使用している群を義歯使用群,義歯を使用していない群を義歯不使用群とした.各群の人数は,男性・義歯使用群25名,男性・義歯不使用群19名,女性・義歯使用群43名,女性・義歯不使用群32名である.顎関節関する調査項目は顎関節雑音の有無とし,触診および聴診により診査した.結果顎関節雑音の発現頻度は,男性・義歯使用群では4.0%,男性・義歯不使用群では26.3%,女性・義歯使用群では11.6%,女性・義歯不使用群では34.4%であり,男女ともに義歯を使用していない群の方が,義歯を使用している群よりも顎関節雑音が高頻度に認められた.咬合が崩壊し,咬頭嵌合位が不明確になった高齢者において,義歯による咬合の回復を行わない場合,顎関節の退行性の変化がより高頻度に発現してしまうことが示唆され,義歯による咬合回復の重要性が再確認された.
電子線トモグラフィー法における高速自動撮影法の開発

本研究は、通常の方法では多大の労力と時間を要する「超高圧電子線トモグラフィー」の観察を、自動化および高速化の手法を開発することにより「高速自動撮影法」を確立することを目的としている。そのために次のような項目を開発した。1、新アルゴリズムのオートフォーカス。2、画像認識による視野位置補正。3、制御用画像の新しい撮像方式。4、自動撮像シーケンスによるシリーズ画像の撮影。これらのうち、特にオートフォーカスについては超高圧に適した新しい画像鮮鋭度方式を採用した。また画像記録用カメラと制御画像取得用カメラを専用とし、それぞれ最適化したことによって時間短縮、自動化を達成することができた。そのために次のような項目を開発する。1、試料を傾斜した際のフォーカスの変化を補正するための、新しいアルゴリズムのオートフォーカス。2、試料を傾斜した際の試料位置のずれを補正するための、制御画像を用いた画像認識による視野位置補正。3、上記1、2、が高速で行える制御用画像の新しい撮像方式。4、自動撮像シーケンスによる一連のシリーズ画像の高速撮影本年度は3について開発を行った。1、2、に用いる制御用画像のS/N比が精度に影響することが明らかになっているので、従来は最もS/N比が高い画像記録用冷却CCDカメラの画像を制御画像用にも用いてきた。ただし所要時間が長いという問題があった。この問題を解決する手法として、制御用画像を別の専用カメラで高S/Nで撮影できる構成にした。光路切り替えの方法として、いくつか考案したなかから2組の光学系を用意し高速で切り替える方法を選択した。制御画像撮像カメラとして高感度のCMOSデジタルカメラを用いた。また、操作室から試料傾斜装置と連動して、撮影のタイミングや画像転送ができる制御装置を製作し、一連の動作の一体性にも努めた。この結果、1枚あたり冷却CCDの場合露光時間4秒に処理時間を含めると約17秒要していたものが、露光時間0.5秒で約1秒で撮影できるようになった。上記1,2、の処理には計6枚の制御用画像が必要であるため、この1枚あたりの時間短縮はトモグラフィー自動撮影の大幅短縮の実現につながると考えている。[23年度]1、について、目標値付近でフォーカスを変えながら複数枚の画像を撮影し、それぞれの画像先鋭度を計算し、最も先鋭度の高いフォーカス位置を求める「画像先鋭度方式」を開発した。2、については撮影画像の中央付近で画像認識を行い、イメージシフトコイルを用いて像位置の制御を行った。1、2、とも十分な精度を得るには用いる画像のS/N比が重要であるが、冷却CCDカメラの画像では所用時間が長いという問題がある。[24年度]3の撮像方式に関して、制御用画像を別の専用カメラで高S/Nで撮影できる構成にした。光路切り替えについては2組の光学系を高速で切り替える方法を選択した。また、試料傾斜装置と連動して、撮影のタイミングや画像転送ができる制御装置を製作し、一連の動作の一体性にも努めた。この結果、条件によっては例えば1枚あたり約17秒要していたものが約1秒で撮影できるようになり、自動撮影時間の大幅短縮の実現につながった。[25年度]上記に加え、4の自動撮像シーケンスによる一連のシリーズ画像の高速撮影の開発を進めた。1、2、に対応した処理ソフトの変更、トモグラフィー撮影の全体のシーケンスの高速化設定、最適な撮影の制御の本体との一体化を進めた。得られた成果の全体を統合し、当初目標のトモグラフィー高速自動撮影のシステムが構築できた。特に、別途行っている遠隔観察とも組み合わせた場合、実用性の高いシステムが構築できたと考えている。

3、上記1、2、が高速で行える制御用画像の新しい撮像方式。4、自動撮像シーケンスによる一連のシリーズ画像の撮影これらのうち本年度は1、2、について開発を行った。まず1、について、汎用機では電子ビームの傾きを変化させたときの像の移動量からフォーカスを合わせるウオブラー方式が一般に用いられる。しかし超高圧の場合は十分な傾きを得ることが困難なため精度が得られず不適当である。新たな方式としてフォーカスを変えた複数枚の画像から最適なフォーカス位置を検出する「画像尖鋭度方式」のオートフォーカスを考案し、この方式を中心に開発を行った。目標値付近でフォーカスを変えながら複数枚の画像を撮影し、そのそれぞれの画像から4方向の画像先鋭度を計算し、その値から最も先鋭度の高いつまりジャストフォーカスの位置を求める手法である。2、については撮影画像の中央付近512×512ピクセル程度で画像認識を行い、イメージシフトコイルを用いて像位置の制御を行った。ここで重要なのは1、2、とも用いる画像のS/N比が高くないと十分な動作・精度が得られないことである。従って、最もS/N比が高い冷却CCDカメラの画像を用いている。1、2、とも良好な結果が得られたが所要時間が長いという問題がある。次年度はこれら時間を要している画像取得の方法を3、で解決する予定である。研究概要の欄に示したうち、本年度の目標は下記の1、試料を傾斜した際のフォーカスの変化を補正するための、新しいアルゴリズムのオートフォーカス。2、試料を傾斜した際の試料位置のずれを補正するための、制御画像を用いた画像認識による視野位置補正。4、自動撮像シーケンスによる一連のシリーズ画像の高速撮影のうち3,の項目である。当初候補にあげていた蛍光板の表裏の同時撮影は顕微鏡本体の大幅な改造を要するため行わなかったが、エアーシリンダー駆動による光路切り替え方式によって目的の画像取得の方法が実現できた。この方法で概要欄に示したように制御画像の高速取得が実現できた。撮像位置はX線管理区域であるので実際の動作に必要な操作室からのレンズのフォーカス、撮影操作などの制御装置を作製した。また、顕微鏡本体の指示によって制御されている試料傾斜装置と連動して撮影を同期できるなどの実際の運用時に必要となる一体性の制御回路も作製実装した。X線環境下ではカメラの撮像素子をX線が貫くことが原因となる白点ノイズが発生するが、今回の実験中に素子の種類によってノイズの発生状況が異なる結果が得られており、このメカニズムの究明も進めている。研究概要の欄に示したうち、本年度の目標は下記の2項目である。1、試料を傾斜した際のフォーカスの変化を補正するための、新しいアルゴリズムのオートフォーカス2、試料を傾斜した際の試料位置のずれを補正するための、制御画像を用いた画像認識による視野位置補正1、については、汎用機で一般的に用いられているウオブラー方式ではなく、新たな方式としてフォーカスを変えた複数枚の画像から最適なフォーカス位置を検出する「画像尖鋭度方式」を中心に開発を行った。
歯髄組織疾患への光線力学的診断法の応用について

歯髄診断は電気診あるいは温度診といった患者の主観的な反応により診査を行い、術者の経験に依存度の高い診断法である。また、biopsyは不可能である。従って、診査における客観性、非侵襲性の確立が求められている。そこで光線力学的診断法を歯髄診断に応用する目的で以下の実験を行った。臨床診断において健康あるいは慢性歯髄炎、急性歯髄炎と診断されたヒト歯髄を凍結、薄切した。共焦点レーザー顕微鏡(LSM5 PASCAL, Zeiss)を用い、その凍結切片のautofluorescenceを観察した。excitation/detectionの組み合わせは488:543/505-530:560,543/560-615,488:543/505-530:560,633/650とした。歯髄のautoflorescenceはコンピューター上でソフトウエア(LSM5 PASCAL, Zeiss)を用いて画像として保存した。切片はその後、ヘマトキシリンエオジン染色し、歯髄の病態を観察した。autofluorescnceは得られた画像をソフトウエア(Win Roof, Mitani)を用いて数値化を行った。病理組織診断によると、臨床診断において健康歯髄と診断された標本では、歯髄細胞が観察された。臨床診断で慢性歯髄炎、急性歯髄炎と診断された標本では歯髄細胞の減少、好中球浸潤が観察された。autofluorescence値については全てのexcitation/detectionの組み合わせで観察された。単独のexcitation/detectionのautofluorescence値では臨床診断における健康歯髄、慢性歯髄炎、急性歯髄炎間で有意差は認められなかった。本研究により、歯髄からのautofluorescenceの検出が可能であることが判明した。今後、励起波長と検出波長の組み合わせを変えること、あるいはその組み合わせをいくつか用いることにより、歯髄の病態の変化を検出できる可能性が示唆された。歯髄疾患に対する光線力学的診断法・治療法の応用を検討するために基礎的検討を行った。すなわち、ヒト歯髄を抜随後、直ちに凍結・包理を行い、その後、厚さ約10μmの凍結切片を作成し、得られた切片を各種波長にてexcitationを行い、切片を各種波長でdetectionし、歯髄組織からのfluorescence値を測定し、病理診断との関連性を検討した。その結果、炎症歯髄において366nmの波長でのexcitationにおいては550nm付近にfluorescence値のpeakがあること、同じく405nmでは500530nm、440nmでは550nm付近にfluorescence値のpeakがあることが判明した。今後、症例数を集めるとともに、病理診断との関連性について検討し、さらに、至適excitation/detectionのコンビネーション、および2種類以上のexcitation/detectionのコンビネーションのfluorescence値を組み合わせることにより、診断精度が向上するかどうか検討を加えていく予定である。また、波長1,064nmのNd : YAGレーザーは色特異性を有するために、歯質に吸収されず、透過・散乱するために歯牙硬組織への応用が困難であった。これに対して青色・黒色等の色素をphotosensitizerとして応用さてきた。しかしながら、臨床的に口腔内で色素は使用困難であった。そこで3%酸化チタン水溶液をphotosensitizerとして用いたところNd : YAGレーザーによく反応し、光線力学的診断法・治療法への応用の可能性が示唆された。今後、各種波長の光あるいはレーザー、様々なinitiater、photosensitizerを用いて歯髄疾患に対する光線力学的診断法・治療法の臨床応用を検討していく予定である。

歯髄診断は電気診あるいは温度診といった患者の主観的な反応により診査を行い、術者の経験に依存度の高い診断法である。また、biopsyは不可能である。従って、診査における客観性、非侵襲性の確立が求められている。そこで光線力学的診断法を歯髄診断に応用する目的で以下の実験を行った。臨床診断において健康あるいは慢性歯髄炎、急性歯髄炎と診断されたヒト歯髄を凍結、薄切した。共焦点レーザー顕微鏡(LSM5 PASCAL, Zeiss)を用い、その凍結切片のautofluorescenceを観察した。excitation/detectionの組み合わせは488:543/505-530:560,543/560-615,488:543/505-530:560,633/650とした。歯髄のautoflorescenceはコンピューター上でソフトウエア(LSM5 PASCAL, Zeiss)を用いて画像として保存した。切片はその後、ヘマトキシリンエオジン染色し、歯髄の病態を観察した。autofluorescnceは得られた画像をソフトウエア(Win Roof, Mitani)を用いて数値化を行った。病理組織診断によると、臨床診断において健康歯髄と診断された標本では、歯髄細胞が観察された。臨床診断で慢性歯髄炎、急性歯髄炎と診断された標本では歯髄細胞の減少、好中球浸潤が観察された。autofluorescence値については全てのexcitation/detectionの組み合わせで観察された。単独のexcitation/detectionのautfluorescence値では臨床診断における健康歯髄、慢性歯髄炎、急性歯髄炎間で有意差は認められなかった。本研究により、歯髄からのautofluorescenceの検出が可能であることが判明した。今後、励起波長と検出波長の組み合わせを変えること、あるいはその組み合わせをいくつか用いることにより、歯髄の病態の変化を検出できる可能性が示唆された。
ストレス時の交感神経亢進が卵巣の機能と組織に及ぼす影響

ストレス時の卵巣機能障害に交感神経亢進が関わる可能性をラットで調べた.短期ストレス(皮膚侵害刺激)による卵巣エストラジオール分泌低下が卵巣支配の2種類の交感神経のうち上卵巣神経の活動亢進に起因すること,卵巣エストラジオール分泌低下には,前駆体テストステロンからの変換反応の抑制が関わることを見出した.さらに交感神経を亢進させる長期ストレス(カイニン酸全身投与)により排卵障害を示唆する卵巣組織変化(嚢胞性卵胞数の増加,黄体数の減少)が生じることを示した.ストレス時の卵巣機能障害に交感神経亢進が関わる可能性をラットで調べた.短期ストレス(皮膚侵害刺激)による卵巣エストラジオール分泌低下が卵巣支配の2種類の交感神経のうち上卵巣神経の活動亢進に起因すること,卵巣エストラジオール分泌低下には,前駆体テストステロンからの変換反応の抑制が関わることを見出した.さらに交感神経を亢進させる長期ストレス(カイニン酸全身投与)により排卵障害を示唆する卵巣組織変化(嚢胞性卵胞数の増加,黄体数の減少)が生じることを示した.本研究は,ストレスによる卵巣機能障害における卵巣交感神経の役割を解明することを目的とする.これまでにラット卵巣を支配する交感神経(上卵巣神経,SON)の電気刺激が,卵巣エストラジオール分泌を抑制させることを報告した.今年度は第一に身体的ストレス刺激の一つとして皮膚侵害刺激が,上卵巣神経の活動に与える影響を調べた.麻酔ラットで卵巣提索に沿って卵巣に至るSONの遠心性活動を記録した.一側後肢の皮膚機械的侵害刺激(5分間)は,SON活動を増加させた.その増加反応は,刺激前値を100%とすると刺激中約125%に達した.増加したSON活動は刺激後も10分以上にわたり持続される例が多かった.この結果から,皮膚侵害刺激が交感神経を介して卵巣エストラジオール分泌を抑制する可能性が示唆される.第二にSON刺激による卵巣エストラジオール分泌低下の機序を検討した.SONがエストロゲン合成のどの過程を抑制するかを調べるため,まず前駆体テストステロンからエストラジオールへの変換反応に着目し,テストステロン測定法を確立させた.麻酔ラットの卵巣静脈血および末梢動脈血を採取し血漿中テストステロン濃度をEIA法で測定し分泌速度を求めた.テストステロン濃度は,末梢動脈血よりも卵巣静脈血で約4倍高値を示した.このことから卵巣からテストステロンが分泌されることが確認された.この手法を用いてSON刺激によるテストステロン分泌速度の変化を明らかにする予定である.更に,ストレス時の交感神経亢進が卵巣ホルモン分泌低下に続いて卵巣の卵胞や黄体組織の形態に及ぼす影響を調べる予定である.本研究は,ストレスによる卵巣機能障害における卵巣交感神経の役割を,ラットを用いて解明することを目的とする.ラット卵巣には2種類の交感神経(上卵巣神経:SONと卵巣動脈神経:OPN)が分布する.これまでに研究代表者は,SONは卵巣の血流とエストラジオール分泌を各々独立に低下させること,OPNは血流のみを低下させることを報告した.本研究課題において昨年度には,身体的ストレス刺激(皮膚侵害刺激)がSONの活動亢進を介して,卵巣エストラジオール分泌を抑制することを明らかにした.今年度はまず(1)SON刺激による卵巣エストラジオール分泌低下の機序を調べた.SONが前駆体テストステロンからエストラジオールへの変換反応を抑制する可能性に着目した.卵巣からのテストステロン分泌速度は,安静時において平均22±5pg/minであり,SON電気刺激中に約26%減少した.SON刺激中のテストステロン分泌抑制の度合いは,エストラジオール分泌抑制の度合いの約1/2であることから,SON刺激中にはテストステロンからエストラジオールへの変換反応が抑制されると考えられる.さらに,SON刺激はテストステロン分泌をも抑制することが明らかとなった.SON刺激中には,卵巣内の一連の性ホルモン合成過程が抑制される可能性が考えられる.今年度は引き続き(2)ストレス時の交感神経亢進が卵巣ホルモン分泌低下に続いて,卵巣の卵胞や黄体組織の形態に及ぼす影響を調べた.ラットへのカイニン酸全身投与が心臓交感神経活動を異常に亢進させるという先行報告に着目し,同様の手法を用いた.麻酔下ラットにおいてOPN遠心性活動はカイニン酸全身投与により著しく亢進した.カイニン酸投与群(約4か月後)の卵巣組織では対照群と比較して,嚢胞性卵胞数が多く,黄体数が少なかった.卵巣交感神経活動の慢性的亢進が卵巣組織の異常をもたらした可能性が考えられる.
α1-アンチトリプシンによるインフラマソーム経路を介した子宮・胎盤炎症の制御機構

生殖器官における多機能タンパク質α1-アンチトリプシン(A1AT)の発現と胎盤炎症における意義を検討した。胎盤絨毛にはインフラマソーム系のひとつNLRP3/カスパーゼ-1/IL-1beta産生経路が存在する。また、絨毛でのサイトカイン発現に内因性A1AT発現が干渉していることが分かった。本知見は、早産を誘発する絨毛膜羊膜炎などの妊娠初期絨毛での炎症にインフラマソーム系が関与し、この経路を構成する分子が新たな治療標的になる可能性を示した。胎盤絨毛は、TLRを介して炎症性サイトカインやケモカインを産生することが知られている。このTLRシグナリングの変化は、早産を招く絨毛膜・羊膜炎に代表される胎盤の炎症や慢性炎症を特徴とする子宮内膜症に寄与する可能性が考えられる。そこで、胎盤におけるインフラマソームの意義を検証するために、NLRP3インフラマソーム関連因子に及ぼす病原体関連分子パターン(PAMPs)とダメージ関連分子パターン(DAMPs)の効果を検討した。末期胎盤から単離・培養したヒト絨毛栄養膜細胞をLPS(PAMPs)、ATP(DAMPs)、またはNLRP3インフラマソーム活性化因子・ナイジェリシンで処置した。栄養膜細胞のインフラマソーム構成因子並びに炎症性サイトカインの発現を解析した。qRT-PCR法により検討したところ、インフラマソーム関連因子であるNLRP3並びにカスパーゼ1の発現は、マクロファージ細胞株U937の約1/3程度であったが、IL-1β発現はLPSに応答して著しく上昇した。なお、ジブチリルcAMP(Db-cAMP)で分化誘導するとこれらNLRP3,カスパーゼ1, IL-1βの発現は、著しく低下した。また、LPS/ATP処置は、活性型カスパーゼ1蛋白質(p20)量と共にIL-1β放出量を増加させた。ナイジェリシンは、IL-1β分泌量を増加させたが、インフラマソーム阻害薬・グリベンクラミドは、ナイジェリシンまたはLPSとATP共処置によるIL-1β放出を抑制した。以上の結果から、胎盤絨毛栄養膜細胞においてTLR4を介するインフラマソーム系が機能しており、特に妊娠早期の未分化な細胞では、早産と関わる絨毛炎症の病態生理機構に関与する可能性が推察された。ヒト絨毛癌細胞BeWo細胞や絨毛外栄養膜HTR8細胞を用いた検討では、カスバーゼ1やインフラマソーム関連因子の発現が低く、検出が困難であった。現在、初代培養細胞(胎盤絨毛と子宮内膜間質細胞)を中心に検討しているが、合併症を有さない帝王切開による正常分娩胎盤の入手の困難さもあり、予定する全ての実験を遂行することができなかった。また、個体差も原因の1つと考えられる実験間でのデータのばらつきもあり、再現性の確認に時間が費やされた。SERPINA1 (α1-アンチトリプシン)は胎盤で発現している多機能タンパク質であり、セリンプロテアーゼ阻害活性をもつが、その活性に依存しない細胞保護作用をもつ。シャペロンプロテアーゼに分類されるHigh-temperature requirement A serine peptidase 1(HTRA1)も同様に胎盤に高発現し、PE病態に関与することが示唆されている。最近、ヒト胎盤のSERPINA1は、このHTRA1の基質となることが報告され、両蛋白質の相互作用を検討した。単離栄養膜細胞においてSERPINA1とHTRA1の発現を確認した。LPS処置はSERPINA1蛋白質の発現量を増加させたが、HTRA1量に変化はなかった。SERPINA1は、合胞体栄養膜細胞に発現すると共に脱落膜細胞に高度に発現し、絨毛外栄養膜細胞(EVT)に発現はなかった。一方、HTRA1は、主に合胞体栄養膜細胞と脱落膜に侵入した間質性の絨毛外栄養膜細胞(EVT)に発現していた。FGR併発PE患者では、HTRA1については、正常妊娠と比較して合胞体栄養膜細胞での染色強度が低下している検体が多かった。栄養膜細胞のSERPINA1発現量はHTRA1と比較して低かったが、TLR4リガンドで上昇したことから炎症性応答に関わることが示唆される。また、母体脱落膜細胞で高度に発現するおけるSERPINA1は、EVT浸潤に関わるプロテアーゼHTRA1の活性制御を介してEVT浸潤を制御している可能性も考えられた。合併症を有さない帝王切開による正常分娩の入手の困難さが続いているためα1-アンチトリプシン(A1AT)は多機能タンパク質であり、以前の研究で内膜症マウスモデルの病変様組織において発現量が低下するタンパク質として同定した。子癇と関連するという報告もあり、胎盤炎症におけるインフラマソーム系の関与を末期胎盤由来の絨毛栄養膜細胞を用いて検討した。栄養膜細胞でのインフラマソーム構成タンパク質ASC、カスバーゼ-1前駆体、活性型カスバーゼ-1、IL-1β前駆体、活性型IL-1βの発現を検出したので、カスパーゼ-1活性化に及ぼすLPSとNLRP3インフラマソームを活性化するニゲリシンの影響を検討した。LPSまたはニゲリシン処置は、活性型カスパーゼ-1の発現量並びにIL-1β分泌量を有意に増加した。一方、NLRP3インフラマソーム経路を阻害するグリベンクラミドの処置はIL-

1β分泌の上昇を抑制した。次に、カスパーゼ-1とIL-1β産生における内在性A1AT発現の意義について検討したところ、LPSで刺激された両mRNA発現量は、特異的siRNAによるA1AT発現抑制により上昇したが、活性型カスパーゼ-1量とIL-1β分泌量には影響がなかった。栄養膜細胞におけるHTRA1(High-temperature requirement A serine peptidase1)発現とA1ATとの相互作用について、免疫沈降法とウェスタンブロット法にて検討した。HTRA1とA1ATは各々、主に絨毛外栄養膜細胞と脱落膜細胞に発現していた。以上、絨毛においてインフラマソーム系(NLRP3/カスパーゼ-1/IL-1β産生経路)が機能しており、内因性A1ATによる制御を示唆した。本知見は、早産を誘発する絨毛炎症へのインフラマソーム系の関与とその機能調節におけるA1ATの役割を推察させる。本経路構成分子が流早産抑制のための治療標的になる可能性も考えられた。生殖器官における多機能タンパク質α1-アンチトリプシン(A1AT)の発現と胎盤炎症における意義を検討した。胎盤絨毛にはインフラマソーム系のひとつNLRP3/カスパーゼ-1/IL-1beta産生経路が存在する。また、絨毛でのサイトカイン発現に内因性A1AT発現が干渉していることが分かった。本知見は、早産を誘発する絨毛膜羊膜炎などの妊娠初期絨毛での炎症にインフラマソーム系が関与し、この経路を構成する分子が新たな治療標的になる可能性を示した。不死化子宮腺細胞(EM-1)を用いた検討に加えて、HMGB-1とPGE2処置によるインフラマソームの活性化、インフラマソームアダプタータンパク質ASCのノックダウンの影響を直ちに検討したうえで、予定通り28年度の実験計画であるα1-アンチトリプシンとの関係の検討に着手する。α1-アンチトリプシン(SERPINA1)とHTRA1の胎盤における発現に関して、それらの発現調節因子の解明とより詳細な時空間的相互作用を解析することが必要である。特に、SERPINA1の発現は、脱落膜にみられたため、脱落膜細胞での機能解析と内膜症の発症と進展における意義を解析していく予定である。生殖内分泌学、薬理学予定した初代培養実験の細胞採取が滞ったため本研究は、3年間で完結させる予定になっているが、前年度は胎盤絨毛と子宮内膜の十分なサンプル採取ができず、初代培養の実験を予定通り遂行することができなかったため。初年度成しえなかった当初の研究調書の予定していた実験項目を遂行する。計画通り、ヒト子宮内膜細胞と絨毛栄養膜細胞のインフラマソーム経路を介した炎症反応と内因性α1-アンチトリプシンとの関係を解析する。
外科的がん切除後のせん妄発症を予測するバイオマーカーの探索

超高齢社会において、入院高齢者の半数が陥る「せん妄」は普遍的ながら重篤な疾患であり、消失後にも死亡率上昇、自立性低下及び認知機能低下を続発的に生じることが明らかとなり、世界的に関心が高まっている。またせん妄はがん医療及び緩和ケアにおける克服すべき重要課題の一つであり、超高齢社会に呼応し適応が拡大する健常高齢者の手術成績や、Quality of Lifeの維持に深刻な影響を及ぼしている。しかし、その生物学的機序は未解明のままであり、未だ確立された予防及び治療方法がない。術後せん妄発症の最も有望な仮説として、白血球から過剰放出された炎症性サイトカインがBlood Brain Barrierを超えて中枢神経へ移行し、マイクログリアを介した神経炎症がせん妄を起こす病理が報告されている。しかし、白血球から炎症性サイトカインを過剰放出させる機序や、どのサイトカインがせん妄を惹起するか明らかでない。一方で末梢血中のドパミンは末梢血単核球の炎症性サイトカイン分泌を促進する役割や、精神疾患との関連が報じられている。更にドパミン拮抗薬によりせん妄発症を50%程度予防できることから、ドパミンのせん妄発症への関与が示唆される。以上から本研究は末梢血単核球で過剰生成されたドパミンを介して、炎症性サイトカイン過剰分泌が術後せん妄を惹起するとの仮説下に、術後早期(潜伏期)にせん妄発症を予測するバイオマーカーを探索する。同時に術後せん妄のデータベースを作成することで、継続的なせん妄予防研究の基盤を作る。初年度(2018年度)は、今後の研究基盤となる高侵襲外科的がん切除後のせん妄に関する試料と情報の蓄積を行い、その一部で代表的な炎症性サイトカインのInterleukin-6とせん妄の関連について解析を行った。本研究は頭頚部・食道・肝胆膵がんの6時間を超える手術を予定する患者を対象に、手術直前・直後・術後1日目朝・4-7日目朝に、診療採血に追加して血液検体を採取する。手術せん妄発症の有無と重症度及び表現型をDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-5とDelirium Rating Scale-Revised-98を用いてそれぞれ術後5日間評価する。また炎症と関連する臨床検査結果や、バイタルサインを、チャールソン併存疾患指数や米国麻酔学会術前状態分類、使用薬剤などの臨床情報と合わせて記録する。加齢はせん妄のリスクだが、脳が健常な若年者にせん妄が起こる機序を解析することで重要な知見が得られる可能性があり、年齢を高齢者に限定しない。2018年度は284名に説明を行い、そのうち252名から同意を得て、情報と試料の集積を実施し、219名のせん妄評価を完遂し、そのうち70名(32.0%)にせん妄の発症を確認しており、研究の基盤となる充分なサンプルサイズでの術後せん妄データベースを作成した。また術後せん妄発症との関連について、炎症性サイトカインと術後せん妄の発症を検討したところ、Interleukin-6(IL-6)は、手術直後でも、その後に術後せん妄を発症する群で高い値を示していた。また、IL-6の濃度とせん妄の重症度が正の相関を示していた。2018年度には研究基盤となる高侵襲外科的がん切除後のせん妄に関する試料と情報の蓄積が出来たが、従来のせん妄の評価は評価者の主観が影響することが免れない。そこで、より質の高い手法で術後せん妄発症メカニズムの解析を行うため、2019年度は客観的な脳機能の評価として脳波測定を追加する。術後の安静保持を要する期間でも測定が可能なように、簡易脳波計を用いる。またInterleukin-6以外の液性因子(主として炎症性サイトカイン)の術後せん妄発症への関与について、2018年度に蓄積した血漿や末梢血単核球を用いて免疫学的解析を実施する。

初年度(2018年度)は、今後の研究基盤となる高侵襲外科的がん切除後のせん妄に関する試料と情報の蓄積を行い、その一部で代表的な炎症性サイトカインのInterleukin-6とせん妄の関連について解析を行った。本研究は頭頚部・食道・肝胆膵がんの6時間を超える手術を予定する患者を対象に、手術直前・直後・術後1日目朝・4-7日目朝に、診療採血に追加して血液検体を採取する。手術せん妄発症の有無と重症度及び表現型をDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-5とDelirium Rating Scale-Revised-98を用いてそれぞれ術後5日間評価する。また炎症と関連する臨床検査結果や、バイタルサインを、チャールソン併存疾患指数や米国麻酔学会術前状態分類、使用薬剤などの臨床情報と合わせて記録する。加齢はせん妄のリスクだが、脳が健常な若年者にせん妄が起こる機序を解析することで重要な知見が得られる可能性があり、年齢を高齢者に限定しない。2018年度は284名に説明を行い、そのうち252名から同意を得て、情報と試料の集積を実施し、219名のせん妄評価を完遂し、そのうち70名(32.0%)にせん妄の発症を確認しており、研究の基盤となる充分なサンプルサイズでの術後せん妄データベースを作成した。また術後せん妄発症との関連について、炎症性サイトカインと術後せん妄の発症を検討したところ、Interleukin-6(IL-6)は、手術直後でも、その後に術後せん妄を発症する群で高い値を示していた。また、IL-6の濃度とせん妄の重症度が正の相関を示していた。2018年度には研究基盤となる高侵襲外科的がん切除後のせん妄に関する試料と情報の蓄積が出来たが、従来のせん妄の評価は評価者の主観が影響することが免れない。そこで、より質の高い手法で術後せん妄発症メカニズムの解析を行うため、2019年度は客観的な脳機能の評価として脳波測定を追加する。術後の安静保持を要する期間でも測定が可能なように、簡易脳波計を用いる。またInterleukin-6以外の液性因子(主として炎症性サイトカイン)の術後せん妄発症への関与について、2018年度に蓄積した血漿や末梢血単核球を用いて免疫学的解析を実施する。従来の計画では、2018年度の予算の大部分を-80°C冷凍庫の購入を含む血液試料(血漿・末梢血単核球)の分離・冷凍保存に関する費用に使用する予定だったが、研究分担者の青木一教が所属する国立がん研究センター研究所の設備を利用してサンプルの保存をすることが出来たので、当該予算を2019年度に持ち越した。持ち越しで生じた予算は、申請時には予定していなかったが、客観的なせん妄評価指標となる脳波測定に必要な費用や、せん妄発症に係る各種サイトカイン等の免疫学的解析に必要な費用として使用することを計画している。
広汎及び局所脳虚血における病態とtherapentic windowの解明

本研究の目的は、虚血性脳血管障害の病巣中心部(Core)に置ける病態を十分に把握し、その適切な治療法と病態生理を動的・多面的な研究から追究することであった。虚血性病変の中心部では、まず細胞性浮腫(cytotoxic edema)が生じるが,NMRを用いてT_2(横緩和時間)の連続記録から定量的にかつ経時的に浮腫進展状況を検討すると、浮腫は虚血直後から発生し、約20分でピークに達した。SODはまた、急性期血管閉塞時にみられる白血球刺激による赤血球凝集能亢進をも抑制することが証明され、これら薬剤の広汎および局所脳虚血モデルにおいて有効に作用することが示された。
高齢化社会の費用・負担と老人資産の活用

人口高齢化の進行は,ほとんど全ての先進国に共通である。最も著しい例は,日本である。そこで,人口変化の影響をうまく処理するため調整が必要とされるいくつかの鍵となる分野がある。それらの1つは,公共支出である。年齢構造の変化は,公的プログラムへの需要に影響を与えるが,それは,老人のための公共支出への人口上の圧力が増大するためである。例えば,GDPに占める社会保障コストのシェアは,老人人口の増大にともない,2000年には,16.5%,2010年には,23.6%,2025年には33.8%になると予測されている。同時に,われわれが税や社会保険料として負う負担も増大するだろう。例えば,国民所得に占める税と社会保険料のシェアの合計は,2000年には,40.2%,2010年には,45.2%,2025年には,51.5%になるという予測も示されている。そこには,現行制度が維持されるという仮定がある。しかしながら,政府は,将来においてもその負担を50%以内に抑制すべきだと考えている。これを行なうためには,政府は,年金,医療,社会福祉のコストを効率的に削減しなければならない。そこで政府は,既にいくつかの分野でそれを行なってきている。このような状況下,老人の実物資産も活用されなければならない。例えば,地域によっては,老人は,仲介者としての地方の公社を通じて金融機関から,あるいは直接,地方の公社から担保付き借入を行なうことができる。この場合,担保物件というのは,老人が今住んでいる土地・住宅である。また,昨今,わが国では,土地・住宅を売り,外国で一生を終えるため海外へ行く老人もいる。いくつかの理由から,もっとも可能性のある国の1つはフィリピンである。本研究は,高齢化社会における費用・負担のあり方とそこにおける老人資産活用の位置づけについて分析を加えた。高齢化の進行に伴い問題となるのは社会保障費である。これは,年金,医療,福祉の三分野に分類でき,それぞれが大きな課題を抱えている。というのは,高齢化が進むにつれ,年金受給者,多額の医療費がかかる高齢者(特に後期高齢者),要介護の老人,が増加するからである。もちろん社会保障費の増大そのものは問題ではない。しかし,それが国民が負担してもよいと考える水準を越えるとなれば問題は別である。これに応えるためには,まず現在の社会保障の構造そのものを望ましいものに変えなければならない。無駄・非効率なものの排除である。これが第一である。その後,更に費用高騰圧力が避けられないとすれば道は三つしかない。給付水準を引き下げるか(受益者負担の引き上げ),保険料を引き上げるか,投入する税を増大させるか,の三つである。年金,医療,福祉と分かれた現行制度の構造自体を見直すだけでも大きな社会的摩擦が予想される。したがって,早急に構造改革を行いながら,給付水準の引き下げにより適切な給付水準へのコンセンサスを形成し,また,その財源として,社会保険料か税への依存を求めていく,これが現実的な対応であると考えられる。その際,老人資産の活用については,それが可能な個人とそうでない個人との格差が大きいと考えられるので,まずは適切な公的社会保障水準の確保を第一とし,その後それを上回るサービスを得るものとして,または,利用可能な選択肢の一つとして位置づけられるべきものであるように思われる。高齢化・小子化社会における負担のあり方を考える場合,しばしば言われる所得・消費・資産の課税バランスが問題となる。現在,政府収入に占める割合を見ると,それぞれ73%,15%,12%である。社会保険料を含めて,所得への依存が大きい。

それだけでなく,近年,所得税率,法人税率の引き下げが求められており,その課税ベースを広げるにしても今後大きく所得に依存することはできない。であるとすれば、消費課税か資産課税となる。今回,現行の消費課税としての消費税に今後大きく依存する場合に生じる問題点を扱った。特に問題となるのは,1つは,帳簿方式の採用であり,今1つは,課税最低限の水準や簡易課税制度といった中・小規模事業者対策である。OECD諸国で付加価値税を採用し帳簿方式を用いているのはわが国だけである。インボイスを用いてもさほど変わらないという意見もあり,また,インボイスを用いることによって問題がなくなるわけでもない。しかし,今後税率を大きく引き上げ,消費税に依存していくのであれば,税額計算における透明性の一層の確保は必要であり,そのためにもインボイス方式の採用が求められる。その際,税額を別記しない,即ち,税込みの商品価格を表示するだけのインボイス採用国の例もあるが,税額・税率をインボイスに別記する方式が望ましい。特に,軽減税率を導入するなど複数税率を採用する場合そうである。また,課税最低限を設けてもいいが,その水準は1,000万円以下に思い切って引き下げるべきである。また,諸外国の例から簡易課税制度はなくすことも可能である。これらの措置を設けるメリットは否定しないが,事業者にとって消費税は消費者からの預かり金であり,税制への信頼を確保するためにも益税を正当化することはできない。テーマ「高齢化社会の費用・負担と老人資産の活用」については以下のようにまとめたい。<研究の課題>第1篇人口構造の現状と今後の推移の研究第II篇高齢化とそれにともなう費用との関係についての分析第III篇高齢化とそれを支える負担との関係について分析第IV篇構造改革の視点から捉えた高齢化,費用,負担の研究第V篇老人資産活用の可能性の研究第VI篇老人資産を活用した海外への移住についての事例研究<結び>最初に「1」では,高齢化の進行について国際比較を含め分析を加える。続く「II」では,高齢化にともなう費用について,同じく「III」では,その負担について検討を加える。これらについては既に多方面で触れられているが,その妥当性を含め再度光をあてたい。「IV」では,このような高齢化,費用,負担について経済の構造改革の観点から捉え直す。というのは,経済の構造改革が,21世紀にかけての大きな避けられない課題と考えているからである。この点,徹底的な構造改革を実施したニュージーランドの例も取り上げたい。続く「V」では,高齢者の資産にはどのような活用方があるのか,現状を整理し,可能性を探る。最後に,「VI」では,資産の売却などを通じて,生活の場をより快適とみなした海外に移す試みについて,その現状と問題点を探る。なお,本研究において,しばしばニュージーランドへの言及がみられるが,それは筆者が近年,ニュージーランドの多方面の試みに関心を寄せているからである。
核融合における熱電変換の基礎及び応用研究

平成12年度は主にビスマス・アンチモン(BiSb)の磁場特性についての研究を行った。この材料は、古くは1960年代初頭にそれの磁場効果についての論文が数多く出版され、磁場を印可することによって熱電特性が改善され、性能指数が2倍程度になることが報告されている。これは他材料の研究から見れば極めて大きな改善であるが、現在この効果は利用されていない。一方、1990年代に磁場印加によって却って性能が劣化する報告もあり、従来の結果とは矛盾していた。従来は半導体のミクロ輸送現象(ボルツマン方程式で記述できる現象)が磁場印加によってどのように変化するかが検討されてきたが、我々は一般化オーム法則及び熱流束方程式などのマクロ輸送現象が以上の矛盾を説明する可能性があると見て、研究を進めた。これは、マクロ方程式を2次元でself-consistentに解く計算機コードを開発すると同時にそれを検証するための実験を行った。その結果、電気抵抗率については電極/サンプル形状の効果が極めて大きいこと、またゼーベック係数に関しても同様であると同時に、ホール係数、ゼーベック係数、ネルンスト係数が関連することが分かり、従来の研究報告ではそれらの効果について記述されていないことが、矛盾を引き起こした大きな原因であることを突き止めた。そして、磁場印加によって増大することは、ミクロ現象/マクロ現象の総合によって説明できることを実験/計算を通じて説明を行った。また、熱電変換の応用として、超伝導/低温システムに利用する電流リードに熱電半導体を利用したPeltier Current Leadの実験装置の設計を行うと同時に、最適設計/実験データ解析を行う計算機コードの開発を行った。平成10年度5月末に名古屋で第17回国際熱電変換会議があり、研究代表者の山口はprogramChairmanとして参加し、会議を運営した。これは全世界15カ国から総勢約350人の研究者が集まり、研究論文200本を発表した。地球温暖化防止会議(COP-3)後の会議のこともあり、省エネルギー対策として熱電変換が見直されているので、従来の国際会議に比べて盛況であった。そこでの科研費のグループの発表論文は報告書に記載したように6件あり、下記のようである。米永は高温材料として最近注目されているSiGeの単結晶の製作方法及び輸送係数の測定を行った。奥村は磁場中で半導体の輸送係数を測定するときに、複数の効果が混在するのでそれらを無矛盾に解くソフトを開発し、通常の測定方法での誤差を評価した。山口は通産省のプロジェクトとして最近進められているポーラス材料の可能性について理論的な検討を行い、新しいポーラス形状を提案した。池田は磁場中のGeの輸送係数を測定し、理論との比較を行った。中村はネルンスト効果を利用した素子についての理論的な検討を行った。桜井は超伝導コイルで用いる電流リードに熱電半導体を応用したPdtier current leadの基礎研究を行い、BiSbは液体窒素温度領域で良好な特性を示すことを得た。また、本年はLHDでのエネルギー変換研究のために、素子の真空、加熱試験を行うための試験ベンチを購入した。これは最高850°Cまで真空中で加熱でき、質量分析器が取り付けてある。これによって、素子の加熱・真空試験を行う。また、power factorの大きな材料を探すために、半導体中のキャリアーの有効質量及びキャリアー密度を電気的に測定した輸送係数から解析を行って求めるのではなく、直接測定するための光学機器を従来からのネルンスト係数を計るために購入した超伝導コイル装置に組み込む装置を製作した。半導体の磁場中の輸送現象を詳しく調べるために、ボルツマン方程式を厳密に解くコードを開発した。その結果、低い磁場の時にネルンスト係数の符号が反転する実験結果が得られていたが、それに対応する計算結果を得た。

半導体中の輸送パラメータを決めるミクロなパラメータ(キャリアーの有効質量、キャリアー密度、ギャップエネルギーなど)を直接測定するために、半導体に電磁波を打ち込む装置を開発し、実験を行った。低温での測定結果は従来の電気的な測定と同じオーダーの値を示し、その測定原理を確認した。大型ヘリカル実験装置での発電実験を行うための基礎検討を行った。これはダイバータに入る熱流束やそれによるダイバータ部の温度上昇を複数のショットに対してデータをまとめた。その結果、第3サイクル程度の実験であれば、BiTe系材料による熱電素子を利用すれば、発電が可能であることが分かった。超伝導装置などへの応用を検討するために、低温での熱電材料試験を行う装置を整備した。これによって、60K程度から常温までの磁場中の輸送パラメータの測定が可能になった。同時に、欧州共同体の素粒子物理学研究所で建設中の大型ハドロン衝突器で利用される超伝導コイルヘの応用について先方で講演を行い、共同研究を実質的に進めるための検討を始めた。ネルンスト効果を利用した素子は発電に伴う熱流が低温側から高温側に流れる。これは通常のゼーベック効果素子とは逆方向の熱流になるので、同じ性能指数であれば高い変換効率となり、既存の熱電半導体程度の性能指数でタービン発電機程度の効率が得られることが判明した。また、この目標に沿っての現状の材料(インジウム・アンチモン)の性能指数は常温付近で5%程度まで来ていることが分かった。今後は、不純物濃度の高い材料で試験する必要があろう。平成12年度は主にビスマス・アンチモン(BiSb)の磁場特性についての研究を行った。この材料は、古くは1960年代初頭にそれの磁場効果についての論文が数多く出版され、磁場を印可することによって熱電特性が改善され、性能指数が2倍程度になることが報告されている。これは他材料の研究から見れば極めて大きな改善であるが、現在この効果は利用されていない。一方、1990年代に磁場印加によって却って性能が劣化する報告もあり、従来の結果とは矛盾していた。従来は半導体のミクロ輸送現象(ボルツマン方程式で記述できる現象)が磁場印加によってどのように変化するかが検討されてきたが、我々は一般化オーム法則及び熱流束方程式などのマクロ輸送現象が以上の矛盾を説明する可能性があると見て、研究を進めた。これは、マクロ方程式を2次元でself-consistentに解く計算機コードを開発すると同時にそれを検証するための実験を行った。その結果、電気抵抗率については電極/サンプル形状の効果が極めて大きいこと、またゼーベック係数に関しても同様であると同時に、ホール係数、ゼーベック係数、ネルンスト係数が関連することが分かり、従来の研究報告ではそれらの効果について記述されていないことが、矛盾を引き起こした大きな原因であることを突き止めた。そして、磁場印加によって増大することは、ミクロ現象/マクロ現象の総合によって説明できることを実験/計算を通じて説明を行った。また、熱電変換の応用として、超伝導/
植物形質転換用超小型バイナリーベクターの開発

1.Pseudomonas由来pVS1のDNA複製タンパク質遺伝子repA〔高コピー型、野生型、低コピー型(LC)の3種〕と、プラスミド安定化領域(parとstaAの2種)を適当に組み合わせ、アグロバクテリウムで安定に維持される小型プラスミド骨格群を作製した。うち5種にPnos::Hyg^RマーカーとP35S::gusAレポーター遺伝子を組込んだ超小型バイナリーベクターを構築した。これら5種の小型バイナリーベクターは8.69.65kbと非常にコンパクトである上、Hyg^RとgusA遺伝子間に4種のマルチクローニング部位(MCS)を有する。またgusAとGateway部位特異的組換えカセットとの置換により、3種類のGateway対応ベクターを得た。2.アグロバクテリウムに組込んだ上記5種の小型ベクターを組織培養を介した形質転換法によりイネに、またfloral dip法によりシロイヌナズナに形質転換した。その結果、何れのベクターもイネおよびシロイヌナズナ双方に良好な形質転換効率をもたらした。また、各種ベクター個別導入Hyg^RシロイヌナズナT1後代系統から各10個体の幼植物体を選んでGUS活性染色に供したところ、全50個体でGUS活性が観察された。さらに、形質転換イネのサザン解析の結果、repA-LC+staAを組み込んだpSTARH301G形質転換イネにおいて、導入T-DNAコピー数の低減効果が見られた。3.イネ由来の除草剤耐性(2点変異)型アセト乳酸合成酵素遺伝子(mALS)に関し、1,368および557bpの長短2種のプロモーター配列を有し、コード領域中のHindIII認識部位を消失させたmALSサブクローン(インサート:各3789および2978bp)を得た。これらmALSカセットを2種の小型ベクターpSTARH301GとpPARH501Gに組込み、合計4種のmALSバイナリーベクターを構築した。これらをアグロバクテリウム経由でイネに形質転換したところ、何れにおいても良好な形質転換結果を得た。1.新規ベクター骨格の構築:PseudomonasプラスミドpVS1の複製関連タンパク質遺伝子repAのタイプ〔野生型と2種類の変異型、すなわちプラスミドコピー数を下げる点変異〔Low copy(LC)〕と上げる点変異〔High copy(HC)の計3クラス〕と、プラスミド安定化領域par(pSC101由来)あるいはsta(pVS1)の組み合わせが、細菌におけるベクターの安定維持に寄与すると仮定し、各種repAにstaあるいはparを加えた種々のプラスミドを、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で複製可能なシャトルベクターとして構築した。2.アグロバクテリウムにおけるプラスミド安定性検定:各プラスミドを有するアグロバクテリウム系統を無選抜条件(薬剤なし)で液体培養し、増殖した細菌の一部を無選抜寒天プレート、次に薬剤選抜プレートにて培養した。上記液体培養の一部を百万倍に希釈してさらに液体培養を継続し、前述の寒天培養を行った。このような操作を繰り返すことで各プラスミドの安定性を評価した。その結果、比較的コピー数が高いrepA-HC系プラスミドでは、安定化領域を欠いてもプラスミドが比較的安定に維持されることが判明した。

またpar領域(0.4kb)を含むプラスミドは、sta領域と同様、repA-WおよびrepA-LC系プラスミドの安定性向上に寄与することが判明した。3.プラスミド誘導体(植物用発現ベクター)の構築と植物への形質転換:上記の結果を元に、安定度の高いプラスミド骨格に植物用選抜マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、マルチクローニング部位等を有する種々の新規バイナリー型発現ベクターを構築中である。17年度は、これら最小バイナリーベクターを、組織培養を用いないin planta法でシロイヌナズナに、組織培養を用いる形質転換法でイネ等に導入し、形質転換効率や挿入コピー数などを解析予定である。PseudomonasプラスミドpVS1のDNA複製タンパク質遺伝子repAのタイプ(高コピー型、野生型、低コピー型の3種)、およびプラスミド安定化領域(parとstaの2種)の組み合わせが、ベクターの細菌内安定性に大きく貢献すると想定し、前年度作製した種々の小型プラスミドベクター骨格群のうち5種につき、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Pnos::Hyg^R)とgusAレポーター遺伝子(P35S::gusA)を組込んだ超小型バイナリーベクターを構築した。得られた5種の小型バイナリーベクターは、上記2種の遺伝子を組込んでも8.69.65kbと非常にコンパクトである上、Hyg^RとgusA遺伝子間に4種のマルチクローニング部位(MCS)を有する。上記の各プラスミドはアグロバクテリウムEHA101系統に組込んだ後、組織培養をベースにした形質転換法によりイネに、またin planta法によりシロイヌナズナに遺伝子導入を試みた。その結果、何れのバイナリーベクターを用いても、イネおよびシロイヌナズナの双方において良好な形質転換効率が得られた。さらに、5種の何れかのベクター導入によって得られたHyg^Rシロイヌナズナ系統(T1世代)より、各10個体の幼植物体を選んで、X-GlucによるGUSレポーターアッセイに供したところ、全個体(10x5=50)においてGUS活性を示す青色の染色が見られた。2点変異を有するイネ由来の除草剤耐性型アセト乳酸合成酵素遺伝子(mALS)のゲノミッククローンをテンプレートにしたPCRにより、1,368および557bpの長短2種のプロモーター配列を有するmALSサブクローン(インサートはそれぞれ3789および2978bp:共に塩基配列確認済み)を得た。これら2種のmALSインサートを2種の小型バイナリーベクターpSTARH301GとpPARH501Gに組込み、最終的にmALSマーカー遺伝子を有する4種のバイナリーベクターを構築した。