hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PGC-1α/Nrf2経路に着目した運動による難聴予防機序の解明と予防法の開発

内耳におけるPGC-1α/Nrf2経路の局在を検討するための基礎実験として、PGC-1αの局在およびNrf2経路の効果と作用部位の解析を行った。さらに難聴の予防におけるNrf2経路の効果が酸化ストレスからの防御にあることから、酸化ストレス防御に関与するミトコンドリアに着目し、ミトコンドリア機能異常をもつマウスの検討を研究に含めた。・内耳蝸牛におけるPGC-1αの局在に関しては、進捗状況の項で記すように、まだ再現性のある結果が得られていない。・一方、Nrf2経路の難聴予防に対する効果と作用部位については、先行研究と同様に検証を行い、騒音暴露による負荷をかけたマウス内耳においてNrf2の発現を抑えたマウスで難聴の程度が高く回復が損なわれること、さらにその障害がNrf2活性化薬である2-cyano-3,12 dioxooleana-1,9 dien-28-imidazolide (CDDO-Im)により軽減されることを確認した。過去の報告と同様に、Nrf2活性化薬が騒音負荷によって生じた酸化ストレスから蝸牛を保護していることが示唆された。その作用部位については、難聴を生じたマウスの組織像から有毛細胞および蝸牛外側壁であることが類推された。・ミトコンドリア機能障害が酸化ストレスの原因になることから、ミトコンドリア病モデルマウスの聴力およびその蝸牛の形態変化を検討した。ミトコンドリア病モデルマウスでは対照に比べて加齢とともに早期に難聴を呈すること、および蝸牛のラセン神経節およびラセン靭帯の下方の細胞が減少することを見出した。これらの研究の実施に加え、日本耳鼻咽喉科学会、日本聴覚医学会、アジアオセアニア耳鼻咽喉科頭頸部外科学会に出席し、難聴を研究領域をする国内外の研究者と情報交換を行った。内耳におけるPGC-1α/Nrf2経路の局在を明らかにするために行っているPGC-1αに関する免疫組織化学において、再現性のある結果が得られていない。この局在が明らかにならないと、これから進める研究において、運動による難聴効果が発現する内耳の部位を明らかにすることが困難である。この研究段階を試薬および組織の条件を変化させて遂行する必要がある。PGC-1αの内耳における局在が正確に同定されていないことから、難聴に対する予防効果が期待される運動負荷の程度を、PGC-1α/Nrf2経路に関係して評価することが出来ていない。・マウス内耳におけるPGC-1α/Nrf2経路の局在を免疫組織化学において明らかにする(昨年度の継続研究)。・マウスを複数の条件で運動負荷し、免疫組織学的にPGC-1αならびにNrf2が最も活性化される運動強度を探索する。免疫組織学的な評価が困難な場合には、他の感覚器官・神経器官に影響を与える運動強度を文献等から検索し、これを用いることを考慮する。・24か月間運動負荷を行うマウス群とコンロロール群の間で聴力の変動を聴性脳幹反応(ABR)で継時的に測定する。一部のマウス群には蝸牛障害を生じる騒音負荷ないしシスプラチン投与を行う。本年度から来年度にかけた主たる負荷をかけつつ動物管理を継続する。・マウスの加齢に伴う聴力変化がNrf2活性化剤の投与で抑制できるかどうかを、ABRおよび内耳形態(有毛細胞、ラセン神経節、血管条、ラセン靭帯)の変化により評価する。内耳におけるPGC-1α/Nrf2経路の局在を明らかにするために行っているPGC-1αに関する免疫組織

化学において、再現性のある結果が得られていない。この局在が明らかにならないと、これから進める研究において、運動による難聴効果が発現する内耳の部位を明らかにすることが困難である。この研究段階を試薬および組織の条件を変化させて遂行する必要がある。PGC-1αの内耳における局在が正確に同定されていないことから、難聴に対する予防効果が期待される運動負荷の程度を、PGC-1α/Nrf2経路に関係して評価することが出来ていない。・マウス内耳におけるPGC-1α/Nrf2経路の局在を免疫組織化学において明らかにする(昨年度の継続研究)。・マウスを複数の条件で運動負荷し、免疫組織学的にPGC-1αならびにNrf2が最も活性化される運動強度を探索する。免疫組織学的な評価が困難な場合には、他の感覚器官・神経器官に影響を与える運動強度を文献等から検索し、これを用いることを考慮する。・24か月間運動負荷を行うマウス群とコンロロール群の間で聴力の変動を聴性脳幹反応(ABR)で継時的に測定する。一部のマウス群には蝸牛障害を生じる騒音負荷ないしシスプラチン投与を行う。本年度から来年度にかけた主たる負荷をかけつつ動物管理を継続する。・マウスの加齢に伴う聴力変化がNrf2活性化剤の投与で抑制できるかどうかを、ABRおよび内耳形態(有毛細胞、ラセン神経節、血管条、ラセン靭帯)の変化により評価する。
肝転移を標的とした小細胞肺癌に対する新規分子標的治療の開発

小細胞肺癌細胞株のsphere形成分画を用い、SCIDマウス多臓器転移モデルにおいて検討したところ、特異的に肝転移が増加する結果が得られた。そこでこれらの細胞分画に発現する分子の中から肝転移関連遺伝子Bを同定した。shRNAを用いて遺伝子Bのノックダウンを行い、恒常的に遺伝子B発現を抑制すると、他臓器転移に影響を与えることなく肝転移が減少した。また、臨床的に小細胞肺癌の予後因子を検討したところ、重要な予後因子であるPSと関連する臓器転移として肝転移が同定された。以上から、肝転移を標的とする治療開発の臨床的重要性と遺伝子Bを標的とした肝転移制御の可能性が示唆された。SCIDマウスによるヒト肺癌細胞の多臓器転移モデルにおけるこれまでの解析から、肺癌細胞株の幹細胞分画は野生株に比較し肝転移が増加することを確認した。これらの細胞株のマイクロアレイ解析から、肝転移と関連する数種類の遺伝子を同定した。本年度は、これらの遺伝子群から選択した遺伝子Bの作用を検討した。肺癌細胞株SBC5に対して、レンチウイルスによるshRNAシステムを用いて、恒常的に遺伝子Bの発現をノックダウンした細胞株を作成した。遺伝子導入は野生株と幹細胞様分画に対して行い、それぞれの遺伝子Bノックダウン株を作成した。これらの細胞株のin vitroにおける活性を、野生株と比較した結果、増殖能には有意な差を認めなかった。次にこれらの細胞株を用いて、SCIDマウスによる多臓器転移能を検討したところ、野生株の遺伝子Bノックダウン株においても、幹細胞様分画の遺伝子Bノックダウン株においても、肺転移や骨転移には影響を与えることなく、肝転移数のみが減少した。以上から、遺伝子Bは肺癌細胞の肝転移に関連した分子であることが強く示唆された。現在、遺伝子Bの強制発現株の作成のため、遺伝子発現ベクターの作成を進めている。SCIDマウスによるヒト肺癌細胞の多臓器転移モデルにおけるこれまでの解析から、肺癌細胞株の幹細胞分画は野生株に比較し肝転移が増加することを確認し、これらの細胞株を用いて、肝転移に関連のある遺伝子Bを同定した。昨年度は、肺癌細胞株SBC5に対してレンチウイルスによるshRNAシステムを用いて遺伝子Bをノックダウンしたところ、特異的に肝転移数が減少することを確認した。本年度は、もう一つの細胞株であるLC319/bone2に対してノックダウン株の作成を行い、恒常的に遺伝子B発現を抑制した細胞株を作成した。さらに、遺伝子Bの発現ベクターの作成を行っている。一方、小細胞肺癌患者において肝転移が予後を規定する因子となるか否かについて、臨床的に解析を行った(学内倫理委員会承認済み)。その結果、少数例の解析結果ではあるが、初診時に肝転移を有する症例の予後は、肝転移のない患者に比較して不良であり、小細胞肺癌において肝転移を制御する治療法の開発の重要性を示唆する結果が得られた。当初の予定では平成27年度に遺伝子Bのノックダウンによる複数の細胞株での実験および遺伝子B強制発現株の作製を完了できるよう研究を進めていたが、現在これらの実験の進行中である。一方で、臨床的に小細胞肺癌患者において肝転移の存在が予後に影響するか否かに関する検討結果が終了し、自施設のみの解析結果ではあるが予後不良因子の可能性を示唆するデータが得られたことは予想以上の進展である。また最終目的である治療応用可能は遺伝子Bに対する抗体作製も現在進行中である。以上から、全体の評価としてはやや遅れている評価した。SCIDマウスによるヒト肺癌細胞の多臓器転移モデルにおけるこれまでの解析から、肺癌細胞株のsphere形成能を有する細胞として純化した幹細胞分画は野生株に比較し肝転移が増加することを確認し、これらの細胞株を用いて肝転移に関連のある遺伝子Bを同定した。まず小細胞肺癌細胞株SBC5に対してレンチウイルスによるshRNAシステムを用いて恒常的に遺伝子Bをノックダウンした細胞株を作成した。通常の遺伝子Bノックダウン株および幹細胞分画であるsphere形成細胞分画の多臓器転移能を検討したところ、いずれの実験においても遺伝子Bのノックダウン株は特異的に肝転移数が減少することを確認した。その後、肺腺癌細胞株であるLC319/bone2に対して同様にノックダウン細胞株を作成し検討を行った。その結果、肝転移は減少したものの、肺転移についても減少する傾向を認めた。研究データの再現性を確認するため、さらにLC319/bone2のsphere形成分画での再実験を予定している。一方で、最近7年間で当科で診療した小細胞肺癌患者を対象に予後因子を検討した。多変量解析の結果、年齢、PS、間質性肺炎、肝胆道系酵素上昇が予後因子として同定された。また肝転移とPSに相関を認めた。以上の結果から、小細胞肺癌患者においては、間質性肺炎の合併とともに、肝転移の重要性が示唆された。臨床的にはさらに大規模な症例を対象とした研究が望まれる。以上の基礎研究および臨床研究成果から、肺癌特に小細胞肺癌においては、肝転移を標的とした治療の重要性が示唆された。

また、臨床的に小細胞肺癌の予後因子を検討したところ、重要な予後因子であるPSと関連する臓器転移として肝転移が同定された。以上から、肝転移を標的とする治療開発の臨床的重要性と遺伝子Bを標的とした肝転移制御の可能性が示唆された。肺癌肝転移に関連する分子の同定に向けて研究を進めており、当初のスクリーニング計画に沿って行ったマイクロアレイ解析の結果、遺伝子Bを同定した。また、遺伝子Bのノックダウン株を作成したところ、肺転移や骨転移に影響を及ぼすことなく、肝転移のみが減少したことから、遺伝子Bは肝転移に特異的に関連する分子である可能性が高い。したがって当初目指した肝転移関連遺伝子の一つが同定できていると考えている。これまでの検討結果を検証するための遺伝子Bの強制発現ベクターの作成がまだ完成しておらず、当初の予定からみてやや進行が遅れている内容である。以上から、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。平成28年度には、LC319/bone2のSCIDマウスにおける多臓器転移実験および遺伝子Bの発現ベクターの作成と肺癌細胞株への遺伝子導入を行い、in vivo実験を進める。また、遺伝子Bに対する抗体作成を進め、治療応用可能な抗体作製を目指す。一方で、ヒト小細胞肺癌の肝転移巣における遺伝子発現の解析や遺伝子Bのリガンドの同定および肝組織での発現状況の解析も試みる。呼吸器内科学遺伝子Bのノックダウン細胞株はまだ1種類しか検討できていない。今後同様の実験を複数の細胞株を用いて検証する必要がある。さらに遺伝子Bの強制発現株も複数の細胞株で作成し、検討を進める予定である。同時に遺伝子Bに対する抗体作成に着手し、遺伝子Bの機能を阻害するブロッキング抗体をスクリーニングする。さらに倫理委員会の承認の後、ヒト肺癌の肝転移巣における遺伝子Bの発現とそのリガンドの発現について、免疫染色等の手法を用いて検討を行いたい。平成28年度3月納品となり支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。平成28年4月に支払い完了予定である。
磁場誘起相変態を利用したマンガン系次世代超磁歪材料の創製

三元合金MnCoGeの格子体積が600Kで生じる相変態により著しく変化することに注目し、これを利用した全く新しいタイプの超磁歪材料の可能性を探索した.本研究により我々は、MnCoGeの化学量論的組成からわずかにCoを減じることにより相変態を生じる温度が急激に減少し、その一方でキュリー温度は殆ど変化しないことを明らかにした.特にCoを8%程度減じた試料では、マルテンサイト変態温度がキュリー温度を下回っており、相変態を磁場により誘起するための条件を満たしている.すなわち、MnCoGeは磁場誘起結晶構造相転移を利用した、新しいタイプの超磁歪材料として極めて有望であることが明らかにされた.三元合金MnCoGeの格子体積が600Kで生じる相変態により著しく変化することに注目し、これを利用した全く新しいタイプの超磁歪材料の可能性を探索した.本研究により我々は、MnCoGeの化学量論的組成からわずかにCoを減じることにより相変態を生じる温度が急激に減少し、その一方でキュリー温度は殆ど変化しないことを明らかにした.特にCoを8%程度減じた試料では、マルテンサイト変態温度がキュリー温度を下回っており、相変態を磁場により誘起するための条件を満たしている.すなわち、MnCoGeは磁場誘起結晶構造相転移を利用した、新しいタイプの超磁歪材料として極めて有望であることが明らかにされた.本研究は、全く新しいタイプの超磁歪材料を創製することを目的とするものである。具体的には、Mn-Co-Ge合金で観測された磁場誘起相変態を利用することを目指し、Mn-Co-Geをべースとする、Ni_2In型からTiNiSi型への相変態を示す強磁性合金に対して磁場誘起相変態の発生条件を調べ、実用上不可欠な、室温での磁場誘起相変態を発現するための条件を明らかにする。平成19年度は、適切な組成条件を調べるためMn-Co-Ge合金の組成を系統的に変化させた試料を作製し、磁化測定を行いキュリー温度と相変態温度の変化を調べた。その結果、Coを化学量論的組成より減じて欠陥を作ることによりキュリー温度をほとんど変化させることなくNi_2In型からTiNiSi型への相変態温度のみを低下させられることを見いだした。これにより磁場誘起相変態の発生可能な温度を実用上適切な温度範囲に設定することが可能になった。また平行して、強磁性形状記憶合金として注目を集めるNi-Mn-Ga合金の磁性研究も行った。今回の研究によって、MnCoGeの化学量論的組成からわずかにCOを減じることによりNi_2In型からTiNiSi型への相変態を生じる温度が急激に減少し、その一方でキュリー温度は殆ど変化しないことを明らかにした。特にCoを8%程度減じた試料では、マルテンサイト変態温度がキュリー温度を下回っており、相変態を磁場により誘起するための条件を満たしている。また、マルテンサイト温度がキュリー温度以下となった試料に対して窒素温度から250°CまでのX線構造解析を行った結果、マルテンサイト変態が熱弾性型であることを確認した。これらの結果から、Coを8%程度減じたMnCoGeが磁場による相変態を生じる条件を満たすことが明らかになった。また、今回我々はチョクラルスキー法によるMnCoGeの単結晶化を目指したが、引き上げによる試料冷却の際に発生する相変態に起因する体積膨張によって試料が脆化し、単結晶を得ることができなかった。この点は今後の課題である。我々はMnCoGeについての研究の他に、双晶変形を原理とする超磁歪材料の候補として知られるホイスラー型Ni_2MnGa系合金の研究も合わせて行った。特に、Ni_2MnGaのMnをFeに置きかえたときにFeの磁気モーメントが著しく増大することに注目し、Ni_2MnGaのMnの半分をFeで置きかえ、さらに(MnFe)とGaの組成比をずらしたNi_2(MnFe)_<1+x>Ga_<1-x>について、詳細な磁気相図を作成した。
プラスマ樹状細胞に発現する新規抑制性レセプターの機能解析

私たちが発見同定した抑制性NKレセプターLy49Qは、NK細胞には発現せず、マクロファージなどの骨髄球系細胞に発現するユニークな分子である。私たちはこのLy49Qが、主要なI型インターフェロン産生細胞であるプラスマ樹状細胞(PDC)に発現すること、ミエロイド系樹状細胞には発現が認められないことを見出した。抑制性NKレセプターは一般に、MHCクラスIおよびその関連分子を認識して免疫学的寛容に重要な役割を果たすことから、Ly49QもPDCにおいて細胞間認識と免疫機能制御に関わっていることが強く示唆される。本研究は、PDCにおけるLy49Qの役割を明らかにすることを目的として行い、以下の成果を得た。(1)PDCの分化マーカーとしてのLy49Q ; PDCにLy49Q陽性と陰性の2つの異なる亜集団が存在することを見出し、Ly4gQ陰性PDCは刺激によってLy4gQ陽性PDCへと移行すること、Ly4gQ陰性PDCに比較してLy49Q陽性PDCはI型インターフェロンの産生能が低いことを見出した。また骨髄内PDCではLy49Qの発現が増加するに伴いMHCクラスII、CD4などのPDC分化マーカーの発現も増強することから、Ly4gQ陰性PDCはLy4gQ陽性PDCより未熟なPDCであること、Ly49Qはこれまで明らかでなかったPDCの分化段階を識別する良いマーカーであることを見出した。(2)Ly49Qのトランスジェニックマウスの樹立;野生型およびITTM欠損型Ly49Qを発現するトランスジェニックマウスを樹立した。(3)PDCの細胞骨格制御におけるLy4gQの役割;抗体によってPDC表面のLy4gQを架橋すると、PDCの接着高進と細胞極性形成が誘導されたことから、マクロファージと同様にPDCにおいてもLy49Qが細胞接着や細胞骨格の制御に関わる可能性が示唆された。抗Ly49Q抗体がPDCのサイトカイン産生に与える影響を検討した結果、抗Ly49Q抗体はサイトカイン産生には影響を与えなかった。近年私たちが同定した新規抑制性レセプターLy49Qは、一次構造上NK細胞が自己識別に用いるNKレセプターに属するにも関わらず、NK細胞には発現せず、マクロファージと樹状細胞の一部に発現する、ユニークなレセプターである。私たちは、このLy49Qが、ウイルス感染時にIFNαを産生する主要な責任細胞であるプラスマ樹状細胞に発現することを見いだした。本研究では、プラスマ樹状細胞におけるLy49Qの機能を明らかにすることを目的として行い、本年度は以下のことを見いだした。(1)プラスマ樹状細胞上のLy49Qの発現は、IFNα処理によって増強すること、(2)未熟骨髄球系樹状細胞にも発現が認められること、(3)未熟骨髄球系樹状細胞における発現は、poly I:CおよびCpGによって発現増強が認められるが、他のTLRリガンドでは発現誘導が認められないこと、(4)骨髄球系樹状細胞における発現は、in vivoにおいてもアジュバンド刺激で誘導されること、(5)Ly49Qが細胞に発現することにより、細胞接着が阻害されること、を見いだした。Ly49Qの発現誘導と増強に認められるTLRリガンドの指向性から、Ly49Qは感染時に樹状細胞上に発現誘導され、抑制性レセプターとして機能する可能性が考えられた。

現在私たちは、Ly49Qのリガンドの同定を進めると同時に、Ly49Qの野生型およびITIM欠損型のトランスジェニックマウスを樹立し、Ly49Qの機能解析を進めている。私たちが発見同定した抑制性NKレセプターLy49Qは、NK細胞には発現せず、マクロファージなどの骨髄球系細胞に発現するユニークな分子である。私たちはこのLy49Qが、主要なI型インターフェロン産生細胞であるプラスマ樹状細胞(PDC)に発現すること、ミエロイド系樹状細胞には発現が認められないことを見出した、抑制性NKレセプターは一般に、MHCクラスIおよびその関連分子を認識して免疫学的寛容に重要な役割を果たすことから、Ly49QもPDCにおいて細胞間認識と免疫機能制御に関わっていることが強く示唆される。本研究は、PDCにおけるLy49Qの役割を明らかにすることを目的として行い、以下の成果を得た。(1)PDCの分化マーカーとしてのLy49Q;PDCにLy49Q陽性と陰性の2つの異なる亜集団が存在することを見出し、Ly49Q陰性PDCは刺激によってLy49Q陽性PDCへと移行すること、Ly49Q陰性PDCに比較してLy49Q陽性PDCはI型インターフェロンの産生能が低いことを見出した。また骨髄内PDCではLy49Qの発現が増加するに伴いMHCクラスII、CD4などのPDC分化マーカーの発現も増強することから、Ly49Q陰性PDCはLy49Q陽性PDCより未熟なPDCであること、Ly49Qはこれまで明らかでなかったPDCの分化段階を識別する良いマーカーであることを見出した。(2)Ly49Qのトランスジェニックマウスの樹立;野生型およびITIM欠損型Ly49Qを発現するトランスジェニックマウスを樹立し、PDCおよびマクロファージの分化と機能について解明を進めている。(3)PDCの細胞骨格制御におけるLy49Qの役割;抗体によってPDC表面のLy49Qを架橋すると、PDCの接着高進と細胞極性形成が誘導されたことから、マクロファージと同様にPDCにおいてもLy49Qが細胞接着や細胞骨格の制御に関わる可能性が示唆された。抗Ly49Q抗体PDCのサイトカイン産生に与える影響を検討した結果、抗Ly49Q抗体はサイトカイン産生には影響を与えなかった。(4)Ly49Qのリガンド;Ly49Qのリガンドがβ2m会合型分子であることを明らかにし、MHCクラスIの発現がLy49Qの発現レベルを制御しうることを見出した。
東日本大震災からの農業復興における企業の役割と支援モデルの実証的評価研究

東日本大震災からの農業復興における企業の支援の実態を企業側、地域側両面から分析した。その結果、企業による支援は企業ならではの本業の能力を生かしている点、迅速に支援を展開している点などで地域側から非常に高い評価を受けている。企業は支援動機としては社会貢献が中心であった。しかし、結果的に社員の意識や士気の向上、取引先からの評価向上など本業の発展につながる成果も見られた。今後は、企業による農業復興支援について、自助や公助と連携するとともに、認知度を高めていく必要があるといえる。農業と企業の関係が深まりつつあるなかで発生した東日本大震災からの農業復興において、企業の役割も従来になく活発に行われている。本研究は、こうした取り組みを体系化しつつ分析することで、将来起こりうる災害からの農業復興における企業の役割の円滑な発揮や企業と農業の新たな関係についての理論構築を目的としている。平成25年度の前半では、「2次情報の集中的な収集」によって、企業による農業復興事例を31事例収集し、その内容を分析・整理した。「主要プロジェクトに関する関係者ヒアリング」と合わせた分析により、支援形態として、当該企業による直接支援とNPO法人などを介した間接支援があること、さらに直接支援には企業単独のものと複数社が連携しているものがあることがわかった。支援内容も農業経営、流通販売など事業に参画するものや、人・物・金・情報などの経営資源の提供など多様な内容であることもわかった。加えて、支援する側の企業の特性や考え方から企業の支援活動を4つのパターンに類型化して分析した。さらに、企業による農業復興支援の特性として、企業活動と直結させている企業とあえて切り離している企業があることがわかった。年度後半では、「被災した地方自治体へのアンケート調査」を実施し、特定被災地方公共団体など76市町村から回答を得た。その結果、被災市町村による企業の農業復興支援に対する期待は震災直後に比較して高まっていること、企業による農業復興支援を受けた実績のある被災市町村は企業による支援が農業復興に不可欠であると認めているとともに、企業の支援と国・県による支援の相互補完関係を構築することが有効であるとしている、等のことがわかった。一連の研究により、断片的に知られていた企業による農業復興支援が体系化されるとともに、支援を受けた側として市町村の評価が高く、企業支援が有効であることも強く示唆された。平成26年度の前半では、「農業復興支援企業へのアンケート調査」を実施した。農業復興支援を行っている190社に対して調査票を発送し、25%の回収率であった。農業復興支援の内容や、連携先の有無、連携理由、行政による農業復興支援との相違点などのデータを得た。こうした取り組みから、経営継承とは別の観点から企業が農業経営の継続性向上に寄与できることが示唆された。平成26年度の後半では、「企業による復興支援内容の類型化と特性分析」として、上記のアンケート調査の結果をさらに分析し、上記テーマに沿った類型化と特性分析を行った。分析は主としてクロス集計とし、支援企業の業種特性と農業復興支援区分の関係、農業復興支援区分と連携先との関係などを明らかにした。前者では水産農林業では、「自社技術やノウハウの提供」「農業経営・雇用創出」が、製造業は「技術・ノウハウの提供」が、商業は「販路提供・購買実施」が支援の中心になっていることなどがわかった。後者では、「販路提供・購買実施」「人材提供」「技術・ノウハウの提供」を支援している企業の多くは支援に際して連携体制を構築していることなどがわかった。一連の研究により、平成25年度に実施した自治体側からの知見に加え、企業側からの特性分析により、より深い実態把握とその特性分析につながった。本研究は、こうした取り組みを体系化しつつ分析することで、将来起こりうる災害から農業復興における企業の役割の円滑な発揮や企業と農業の新たな関係についての理論構築を目的としている。平成27年度は、農業復興を支援した企業、企業による支援を受け入れた農業法人、さらに、両者を仲介した市役所の各主体について、ヒアリングを実施し時系列的な動きを追跡する中で、発生する課題点等の抽出を行った。具体的には、企業側としてヤマト福祉財団、農業法人として福島県の合同会社飯豊ファーム、市役所は相馬市役所とした。企業による農業復興支援の事例収集が1つにとどまり、市場メカニズムによる復興理論の構築や農業復興における自助・共助・公助の位置づけと組織間連携理論の構築には十分に至らなかったため。本研究は、こうした取り組みを体系化しつつ分析することで、将来起こりうる災害からの農業復興における企業の役割の円滑な発揮や企業と農業の新たな関係についての理論構築を目的として実施した。平成25年度は、企業による農業復興事例の収集、関係者ヒアリング等から企業支援を4つに類型化した。被災自治体へのアンケート調査から、市町村による企業の農業復興支援に対する期待は震災直後よりも後から高まることや企業支援を受けた市町村はそれが不可欠としていること、企業と国・県の補完関係構築が有効、などとしている。

26年度は農業復興支援企業へのアンケートから、企業が農業経営の継続性向上に寄与できることが示唆された。さらに、この調査の結果をさらに分析し、上記テーマに沿った類型化と特性分析を行い、支援企業の業種特性と農業復興支援区分の関係、農業復興支援区分と連携先との関係などを明らかにした。27年度は企業、企業支援を受けた農業法人、さらに、両者を仲介した市役所にヒアリングを実施し時系列的に発生する課題点等の抽出を行った。28年度は企業支援の幅を広げボランティアによる農業支援の状況を明らかにするとともに、企業と農業法人が連携して新たな農業法人を設立することで、復興支援から成長産業化への展開を図っている事例を分析した。こうした取り組みによって、企業による農業復興は行政やボランティアとの役割分担と協力の下でより有効に機能することや企業のCSR的な取り組み意識と企業特有の能力の活用を軸に進められていることがわかった。しかし、一部には農業復興を事業機会として捉えているケースも散見された。こうした一連の研究により、企業による農業復興支援の有効性と効果的な支援のための方策が明らかになった。東日本大震災からの農業復興における企業の支援の実態を企業側、地域側両面から分析した。その結果、企業による支援は企業ならではの本業の能力を生かしている点、迅速に支援を展開している点などで地域側から非常に高い評価を受けている。企業は支援動機としては社会貢献が中心であった。しかし、結果的に社員の意識や士気の向上、取引先からの評価向上など本業の発展につながる成果も見られた。今後は、企業による農業復興支援について、自助や公助と連携するとともに、認知度を高めていく必要があるといえる。当初想定していた「ケーススタディによる復興支援プロジェクトの評価」には至っていないが、論文作成や学会報告などが着実に行われているため。平成28年度は研究年次を延長していただいたため、前年度の不足していた以下の点を重点的に研究していく予定である。1ケーススタディによる復興支援プロジェクトの評価:ヤマト福祉財団以外の事例調査を実施する。2市場メカニズムによる復興理論の構築:経済主体である企業が農業復興支援を行う際の経済的・非経済的効用を整理し、企業が自発的に復興支援を行う際の理論構築を行う。3農業復興における自助・共助・公助の位置づけと組織間連携理論の構築:自助・共助・公助の特質と限界を理解した上で、各々のあるべき取組と組織間の相互連携の方策を考察し、理論化を図る。農業経営学平成27年度は研究の最後の年となっており、以下の研究を進めていく予定である。1ケーススタディによる復興支援プロジェクトの評価:前項で実施した類型ごとの代表的なプロジェクトを選定し、多角的なケーススタディを実施する。このケーススタディは、企業、自治体、関係する農業者等からヒアリング調査やデータ収集を実施する。
形態制御された規則合金ナノ結晶の創製

貴金属錯体(Cu錯体、Pd錯体、又はAg錯体)の共存下では、Ni錯体単独では還元されない温和な反応条件下でNi錯体が還元され、Ni系合金ナノ粒子が生成することを見出した。先に生成した貴金属ナノ粒子(Cuナノ粒子、Pdナノ粒子、Agナノ粒子)が卑金属錯体(Ni錯体)の還元を触媒するという非常に興味深い結果が得られた。合金ナノ結晶を創生するには、還元されにくい卑金属錯体が貴金属錯体と同じ温度で熱分解し、同時に金属原子が凝集、結晶成長させる必要がある。そこで、熱分解温度が一致する卑金属錯体と貴金属錯体を探索し、一段階反応で規則合金ナノ結晶を創製することを目的とした。一段階反応が実現すれば、特定の結晶面に配位して結晶成長を抑制する保護剤を用いた規則合金ナノ結晶のサイズ・形状制御が可能になると期待できる。還元性を有するジオール存在下、卑金属錯体(ニッケル)と貴金属錯体(パラジウム、銀、および銅)を反応させることにより、ほぼ同時に熱分解が進行し、合金ナノ粒子が合成できることを見出した。得られたナノ粒子の粉末X線回折(XRD)より、合金相が形成されたことを確認した。また、ニッケル錯体と銅錯体の仕込み比を変化させて、生成する合金ナノ粒子の金属組成比を制御した。その結果、ニッケル-銅ナノ粒子では、組成比をNi:Cu=80:200:100へ制御できることが分かったる得られたニッケル-銅ナノ粒子の粒子径はニッケルの割合が高くなるにつれて増大した。反応過程において、最初に銅ナノ粒子が生成した後、銅ナノ粒子表面でニッケルが還元され析出する。そのため、銅の割合が減少すると核となる銅ナノ粒子が減少し、ニッケル-銅ナノ粒子の粒子径が増大したと考えられる。さらに振動試料型磁力計(VSM)を用いて磁気特性評価を行なった。二元金属ナノ粒子は二種類の金属塩を化学還元して合成されるが、金属の還元電位の違いにより、還元されやすい金属がコアとなったコア-シェル型ナノ粒子や単一金属ナノ粒子の混合物が生成することが多い。特に還元電位の差が大きい貴金属と卑金属では相分離しやすく、アニール処理なしでの合金ナノ粒子の合成が困難である。そのため、アニール処理による保護層の脱離により溶媒への再分散が困難であり、一次粒子の凝集、融着により形態が制御されていない。本申請課題では、卑金属錯体と貴金属錯体がほぼ同時に熱還元されるよう設計し、アニール処理なしで一段階で合金ナノ結晶を合成することを目的とする。アニール処理なしで合成できれば、保護層の脱離によるナノ結晶の凝集や融着を防ぐことができ、保護層に合わせた様々な溶媒に再分散できるため、プリンテッド・エレクトロニクス応用が可能である。本研究において、Cu錯体、Pd錯体、又はAg錯体の共存下では、Ni錯体単独では還元されない温和な条件下でニッケル錯体が還元され、Ni系合金ナノ粒子が生成することを見出した。Ni-Cu合金ナノ粒子は、Ni:Cu=20:8060:40の組成比では均一な固溶体となった。Ni-Pd合金ナノ粒子の合成においては、組成比がNi:Pd=50:5099:1の広い範囲で定量的にNiが還元されPdナノ粒子が高い触媒作用を示すことが明らかとなった。還元されにくい卑金属錯体を貴金属錯体と同じ温度で熱分解し合金ナノ粒子を合成することに成功した。また、ナノ粒子の組成比の制御可能範囲を調べることができたことから、予定に沿っておおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。卑金属錯体の還元には、貴金属ナノ粒子が必要であるため、卑金属に対する貴金属の割合をどこまで低減させることができるかについて検討する。具体的には、貴金属ナノ粒子の比表面積を増大させるため、貴金属ナノ粒子の粒子径を小さくする方法を検討する。
性ステロイドが骨と免疫系のサイトカインネットワークに及ぼす細胞生物学的影響の研究

近年、閉経後の婦人に対してエストロゲンを中心としたホルモン補充療法(HRT)が行われるようになり脂質代謝や骨代謝等の改善が報告されているが、HRTによってそれらの代謝機構がどの様な調節を受けているかは未だ解明されていない。エストロゲンはマクロファージ等の種々の免疫担当細胞に働きサイトカインを介して免疫機構を調節することが知られている。サイトトカインは種々の細胞から産生されその特異的なレセプターにシグナルを伝達するタンパク質で、前述の免疫担当細胞以外に、骨組織等においても一群の細胞機能の維持に働いている。すなわち、HRTはそれらのサイトカインを介して閉経婦人の免疫機構や骨代謝を調節している可能性がある。骨組織も免疫組織と同様に多種のサイトカインを介した複雑なネットワークを形成し、骨芽細胞や破骨細胞等による骨形成と骨吸収の代謝が営まれている。閉経後の婦人では骨塩量の減少が著しく、加齢とともに骨粗鬆症が進行する。我々は両側卵巣摘出婦人を用いた閉経婦人のモデルを利用し、閉経後の骨塩量の減少は骨形成に上回る骨吸収の亢進によって引き起こされていることが示した。すなわち、骨吸収のマーカーであるピリジノリンの尿中排拙は卵摘直後より急激に上昇しその後は緩やかに下降する。一方、骨形成のマーカーであるオステオカルシンは卵摘後1年後より増加するが34年後には下降しプラトーに達する。これらの結果は、更年期女性における骨塩量の減少が高回転型の骨塩量減少であることを示した。また、この骨塩量減少のメカニズムを調べるため、腹水細胞からmagnet-binding抗体法で得られた単球を株化ストローマ細胞とM-CSF、PTHおよび1α, 25(OH)_2D_3と共培養した破骨細胞の培養を試みた。はHRTの骨作用の機序として、骨芽細胞や破骨細胞のデストロゲンレセプターを介した直接作用とIL-1やIL-6等のサイトカインの誘導を介した間接作用が考えられている。よって、エストロゲンの破骨細胞に及ぼす効果を、IL-1やIL-6等のサイトカイン産生能や、M-CSF等の種々のサイトカインに対する反応性の変化をみることによって検討した。近年、閉経後の婦人に対してエストロゲンを中心としたホルモン補充療法(HRT)が行われるようになり脂質代謝や骨代謝等の改善が報告されているが、HRTによってそれらの代謝機構がどの様な調節を受けているか未だ解明されていない。サイトカインは種々の細胞から産生されその特異的なレセプターにシグナルを伝達するタンパク質で、前述の免疫担当細胞以外に、骨組織等においても一群の細胞機能の維持に働いている。すなわち、今回の研究ではHRTがそれらのサイトカインを介して閉経婦人の免疫機構や骨代謝をどのように調節しているかを調べた。閉経婦人のHRT前後の末梢単核細胞の凍結保存と解凍後のサイトカイン産生能の検討。

当科更年期外来にて治療予定の閉経後5年以上を経過した閉経婦人からヘパリン処理下に末梢血を採取しFicoll法にて単核細胞を分離精製し液体窒素で凍結保存した。かつ、同一患者の16カ月間のエストロゲン投与後に同様に末梢単核細胞を得、保存した。同一症例のHRT前後の細胞を解凍し、種々のレクチンで刺激しIL-1、IL-6等の各種のサイトカインの産性能を比較検討した。同一症例のHRT前後の細胞は種々のレクチン刺激によりIL-1、IL-6等の各種のサイトカインの産生したが、培養後の細胞の各群におけるレセプターの発現量の違いをFACScanで解析し、実際の抗菌活性や抗腫瘍活性の違いを調べる必要がある。同意が得られた患者末梢血あるいは腹水細胞からmagnet-binding抗体法により抗CD14抗体を用いて単球を分離精製した。得られた単球を株化ストローマ細胞とM-CSFまたはGM-CSFPTHおよび1α,25(OH)_2D_3と培養した。今後はこれらの共培養から得られた細胞が破骨細胞であるかを種々の方法で確認検討する必要がある。閉経後の婦人では骨塩量の減少が著しく、加齢とともに骨粗鬆症が進行する。我々は両側卵巣摘出婦人を用いた閉経婦人のモデルを利用し、閉経後の骨塩量の減少は骨形成に上回る骨吸収の亢進によって引き起こされていることが示された。すなわち、骨吸収のマーカーであるピリジノリンの尿中排出は卵摘直後より急激に上昇しその後は緩やかに下降する。一方、骨形成のマーカーであるオステオカルシンは卵摘後1年後より増加するが34年後には下降しプラトーに達する。これらの結果は、更年期女性における骨塩量の減少が高回転型の骨塩量減少であることを示している。また、この骨塩量減少のメカニズムを調べるため、腹水細胞からmagnet-binding抗体法で得られた単球を株化ストローマ細胞とM-CSF,PTHおよび1α,25(OH)_2D_3と共培養した破骨細胞の培養を試みた。かつ、同一患者の16ケ月間のエストロゲン投与後に同様に末梢単核細胞を得、保存した。同一症例のHRT前後の細胞は種々のレクチン刺激によりIL-1、IL-6等の各種のサイトカインを産生し、また、培養後の細胞の各群におけるレセプターの発現量の違いをFACScanで解析し興味ある知見を得た。HRT後のサイトカイン産生能の比較は、さらに症例を増し、細かく検討する必要がある。しかし、個々の症例における実際の免疫活性の違いは実験条件等の違いから正当な評価ができなかった。
シナプス前性機能素子の局在制御機構

クラスリン依存性エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を新規に構築した。この系を用いて小胞GABAトランスポーターVGATのエンドサイトーシス・シグナル配列の探索を行い、N末端領域内のPhe-44を中心とする新しいタイプのシグナル配列を見出した。VGATはこのシグナル配列を介してAP2と結合し、クラスリン依存性エンドサイトーシスによってシナプス小胞に局在することを明らかにした。シナプス前性機能素子にはその細胞内局在制御がシナプス伝達に重要であるものが多く、特にシナプス小胞タンパク質は効率よくエンドサイトーシス-リサイクリングされることが必要である。本研究では、培養細胞発現系におけるクラスリン依存性エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を新しく構築して、幾つかのシナプス小胞神経伝達物質トランスポーターをモデル分子としてエンドサイトーシス・シグナル配列の探索を行った。Gタンパク質共役型受容体の一つであるムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプをレポーター分子として利用し、目的タンパク質の細胞質側領域を各々ムスカリンM2受容体の第3細胞内ループ欠損部位に挿入したキメラ受容体を作製した。これらをGTP水解活性欠損のダイナミン・ドミナントネガティブ変異体共発現下あるいはクラスリン・ドミナントネガティブ変異体共発現下で培養細胞に発現させ、細胞表面のムスカリン受容体のみに結合する親水性リガンド[3H]NMSを用いたリガンド結合実験によりダイナミン依存的あるいはクラスリン依存的な定常的エンドサイトーシスの解析を行った。予備実験として高親和性コリントランスポーターCHT1や小胞アセチルコリントランスポーターVAChTの細胞質側領域を検討したところ、C末端領域に既知のエンドサイトーシス・シグナル配列を確認することができた。次に、シグナル配列がよく知られていない小胞GABAトランスポーターVGATの細胞質側領域を検討したところ、N末端領域において新しいエンドサイトーシス・シグナル配列を同定した。小胞型神経伝達物質トランスポーターがシナプス小胞に局在するためにはトランスポーターのエンドサイトーシスが必須なステップとなる。これまでに、ムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプをレポーター分子とするクラスリン依存性エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を構築して、小胞GABAトランスポーターVGATのシグナル配列の探索を行った。その結果、N末端領域においてPhe-44を中心とする新しいタイプのエンドサイトーシス・シグナル配列を同定した。VGATの各種変異体をHEK293細胞に発現させて細胞表面発現量を解析した結果、Phe-44付近のアミノ酸配列がVGATのエンドサイトーシスに重要な役割を果たすことが分かった。また、VGATのN末端領域をHisタグあるいはGST融合タンパク質として大腸菌で大量発現・精製した。これらを用いてラット脳可溶画分のプルダウンアッセイを行った結果、クラスリン系アダプタータンパク質AP2と相互作用することを見出した。AP2はα, β2, μ2, σ2からなるヘテロ四量体であるが、バキュロウィルス-昆虫細胞発現系によるAP2各サブユニットの組換えタンパク質との相互作用を解析した結果、VGATはα/σ2複合体と特異的に結合することを見出した。VGATはPhe-44付近のシグナル配列を介してAP2と結合し、クラスリン依存的にエンドサイトーシスされると考えられる。シナプス伝達において、シナプス前部における小胞型神経伝達物質トランスポーターによるシナプス小胞への神経伝達物質の充填は不可欠であるが、トランスポーターがシナプス小胞に局在するためにはエンドサイトーシスが必須なステップとなる。本研究では、培養細胞発現系におけるムスカリン性アセチルコリン受容体をレポーター分子とするクラスリン依存性エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を構築した。この系を利用して、小胞GABAトランスポーターVGATのエンドサイトーシス・シグナル配列の探索を行ったところ、VGATのN末端領域においてPhe-44を中心とする新しいタイプのシグナル配列を見出した。N末端領域の組換えタンパク質を用いた生化学的実験の結果、VGATはクラスリン系アダプタータンパク質AP2のalpha/sigma2サブユニットと特異的に結合することを見出し、その結合様式はジロイシンモチーフと類似していることが分かった。また、VGATのシグナル配列をAlaに置換させた変異体をラット海馬初代培養神経細胞に発現させてシナプスでの局在を解析したところ、シナプス小胞より形質膜に多く局在しており、このシグナル配列はVGATのシナプスにおけるエンドサイトーシスに重要であることが分かった。VGATはPhe-44付近のシグナル配列を介してAP2と結合し、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介してシナプス小胞に局在すると考えられる。新しく見出した小胞GABAトランスポーターVGATにおけるエンドサイトーシス・シグナル配列の相互作用分子を同定できたため、順調に進展していると考える。神経生化学VGATのエンドサイトーシス・シグナル配列のさらなる機能解析を行うとともに、小胞グルタミン酸トランスポーターVGLUT1のエンドサイトーシス・シグナル配列の同定を試みる。エンドサイトーシス・シグナル配列検索系を構築すると共にその有効性を確認できたため、順調に進展していると考える。今回新しく見出した小胞GABAトランスポーターVGATのエンドサイトーシス・シグナル配列について、その変異体の機能解析や相互作用分子の同定などにより詳細な分子機能を明らかにする。
生体物質のキラリティー認識能力への鋭敏なプローブの開発

生体反応のメカニズムを解明する一環として、[5]チアヘテロヘリセン(I)誘導体をプローブとして、生体高分子ないし生体物質の作る不斉な場のキラリティー認識能力を調べ以下の結果を得た。1.プローブの合成と評価・・I、Iの2-ヒドロキシメチル(II)、2-カルボン酸(III)、及びIIのステアリン酸エステル(IV)を合成した。これらの化合物は、常温では適度な速度で両対掌体(P及びM体)間のラセミ化を起こし、キラリティー認識能力のプローブに適していた。2.ウシ血清アルブミン(BSA)によるIIIの不斉変換反応・・BSAによりIIIもらせん構造が固定される不斉変換反応を起こすが、IIとは異なり、そのキラリティーは左らせん構造のM体であった。3.種の異なる血清アルブミンによるキラリティー認識能力の違い・・9種類の動物の血清アルブミンのキラリティー認識能力をIIをプローブとして調べた。アルブミンとIIの作る錯体の誘起のCDスペクトルは種の違いにより大きく異なり、アルブミンの活性サイトの立体構造の違いが反映されていた。4.ウシ血清のキラル識別能力へのプローブ・・ウシ血清にIIを作用すると、血清中のアルブミンによるIIの取り込みに由来する誘起CDスペクトルが観測され、IIはキラリティー識別のプローブとして血清へも適用可能であった。さらに、この方法で温和な熱処理により生じた血清の僅かな変化をも明瞭に検知できた。5.糖尿病ラットの血清への応用・・アロキサン投与の糖尿病性ラットの血清にIIを加えた試料の誘起CDスペクトルは、正常ラット血清のスペクトルと比べ吸収強度が弱くブロードニングがみられ、病変により血清のキラル識別能力が低下したことが示唆された。6.キラルミセル中での挙動・・光学活性なステアロイルセリンの作るミセルとIIIVとの相互作用を検討した。いずれのプローブもそのヘリセン部分の反転を遅くして、ミセルの配向性を高める作用を有することが判った。生体反応のメカニズムを解明する一環として,常温でラセミ化の速い[5]チアヘテロヘリセン(I)及びその誘導体をプローブとして用い,生体高分子化合物のキラリティー認識能力を調べ,以下のような結果を得た.1.プローブ化合物の合成及び評価・・・I及びIの2-ヒドロキシメチル(II),2-アルデヒド,2-カルボン酸(III)誘導体をそれぞれ合成した.これらの化合物は,常温では適度な速度で両対掌体(P及びM体)間のラセミ化を起こし,キラリテイー認識能力のプローブに適していることが判明した.2.ウシ血清アルブミン(BSA)によるIIIの不斉変換反応・・・BSAによりIIIもそのらせん構造が固定化される不斉変換反応を起こすことが分かったが,その挙動はIIのそれと大きく異なった.即ち,IIIはBSAへ少なくとも3倍モル以上結合し,そのキラリティーはIIの場合とは逆の,左らせん構造を持つM体に由来するものであった.3.種の異なる血清アルブミンによるキラリティー認識能力の違い・・・9種類の動物の血清アルブミンのキラリティー認識能力における差異をIIをプルーブとして調べた.その結果,アルブミンとIIのつくる錯体の示すCDスペクトルは種の違いによって大きく異なり,アルブミンの活性サイトの立体構造の違いが反映されていることが明らかになった.4.ウシ血清による不斉識別能力へのプローブ・・・

ウシ血清にIIを作用させると,BSA-II錯体と基本的に同一のUV,CDスペクトルが得られ,IIはキラリティー識別のプローブとして血清へも適用できることが分かった.さらに,温和な熱処理による血清の僅かな変化が,IIを用いることにより明瞭に検知された.生体反応のメカニズムを解明する一環として、[5]チアヘテロヘリセン(I)およびその誘導体をプローブして用い、昨年度得た血清アルブミンとの相互作用の知見を発展させ、生体高分子化合物ないし生体物質の作る不斉な場におけるキラリティー認識能力を調べ、以下のような結果を得た。1.プローブ化合物の合成と評価・・・I、Iの2-ヒドロキシメチル(II)、2-カルボン酸(III)、およびIIのステアリン酸エステル(IV)をそれぞれ合成した。これらの化合物は、常温では適度な速度で両対掌体(PおよびM体)間のラセミ化を起こし、キラリティー認識能力のプローブに適していることが判明した。2.ウシ血清のキラル識別能力へのプローブ・・・ウシ血清にIIを作用すると、血清中のアルブミンによるIIの取り込みに由来する誘起CDスペクトルが観測され、IIはキラリティー識別のプローブとして血清へも適用可能であることが判った。さらに、この方法で温和な熱処理により生じた血清の僅かな変化をも明瞭に検知することができた。3.糖尿病ラット血清への応用・・・アロキサンを投与した糖尿病ラットより得た血清にIIを加えた試料の誘起CDスペクトルは、コントロール群である正常ラット血清より得たスペクトルと比べ、吸収強度が弱くブロードニングがみられ、病変により血清のキラル識別能力が低下したことが示唆された。4.キラルミセル中での挙動・・・光学活性なN-ステアロイルセリンの作るミセルをキラルな場として、IIIVとの相互作用を検討した結果、いずれのプローブもそのヘリセン部分の反転を遅くして、ミセルの配向性を高める作用を有することが判った。
分子生物学的手法を用いた精神異常惹起物質投与動物における異常発現蛋白の同定と病態

1、メッセンジャーRNAの微量定量法の確立するため、reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)を用いる方法を検討してきたが、厳密な定量化が極めて困難であった。最終的に死後脳において標的物質の変化を検討することを考慮すると、むしろ合成ペプチドを用いて標的物質に対する抗体を作製し、ウェスタンブッロティングにより定量化する方法が妥当と考えられた。cDNAが入手可能で比較的発現の多いメッセンジャーRNAについてはノザンブロティングで定量し、それ以外では合成ペプチドを用いて標的蛋白に対する抗体を作製することを原則とする方向が妥当であると思われた。2、細胞内情報伝達において重要な役割を担っているカルシウム結合蛋白のなかでも神経特異的ビジニン類似蛋白のメッセンジャーRNA発現の変化を、ノザンブロティングによりフェンサイクリジン(PCP)単回投与ラットの大脳辺縁系を中心に時間経過(急性:1時間後、遷延性:24時間後)を考慮して調べた。PCP投与後1時間ではいずれの部位においても有意な変化がみられなかったが、24時間後では、側坐核で有意な減少がみられた。こうした遅延性変化はヒトにおけるPCP精神病発病の時間経過と一致し、何らかの連関が示唆された。この結果はJournal of Neural Transmissionに発表の予定である。3、ウェスタンブッロティングによる免疫定量として、現在、グルタミン酸トランスポーターに対する抗体を作製し、PCP急性投与、メタンフェタミン(MAP)急性ならびに反復投与により行動学的に逆耐性を形成したラット脳において検討中である。MAP急性投与では有意な変化はみられなかったが、PCP急性投与後24時間では海馬での減少がみられた。MAP反復投与により行動学的に逆耐性を形成したラットでは線条体で有意の増加がみられた。この結果は平成6年度3月に学会発表の予定である。1.cDNAが入手可能であった機能がよくわかっていないカルシウム結合蛋白(特に、神経特異的ビジニン類似蛋白)のメッセンジャーRNA発現の変化を、ノザンブロティングによりアンフェタミンやフェンサイクリジン急性投与ラットの大脳辺縁系を中心に時間経過を考慮して調べた。最終的な結果ではないが、側坐核、嗅内皮質等、いくつかの部位で時間依存的な変化がみられることが明かになりつつある。この結果は平成5年度3月に学会発表の予定である。2.メッセンジャーRNAの微量定量法の確立するため、reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)を用いる方法を検討してきたが、厳密な定量化が極めて困難であった。現在では合成ペプチドを用いた特異抗体の作製に着手している。subtractive cDNAクローニングについては、まずフェンサイクリジン急性投与ラットの辺縁系皮質において検討中である。1、細胞内情報伝達において重要な役割を担っているカルシウム結合蛋白のなかでも神経特異的ビジニン類似蛋白のメッセンジャーRNA発現の変化を、ノザンブロティングによりフェンサイクリジン(PCP)単回投与ラットの大脳辺縁系を中心に時間経過(急性:1時間後、遷延性:24時間後)を考慮して調べた。

2、精神特異的ビジニン類似蛋白のような比較的発現の多いメッセンジャーRNAについてはノザンブロティングによる定量が可能であったが、最終的に死後脳において標的物質の変化を検討することを考慮して、合成ペプチドを用いて標的物質に対する抗体を作製し、ウェスタンブッロティングにより免疫定量を行った。現在、グルタミン酸トランスポーターに対する抗体を作製し、PCP急性投与、メタンフェタミン(MAP)急性ならびに反復投与により行動学的に逆耐性を形成したラット脳において検討中である。MAP急性投与では有意な変化はみられなかったが、PCP急性投与後24時間では海馬での減少がみられた。MAP反復投与により行動学的に逆耐性を形成したラットでは線条体で有意の増加がみられた。この結果は平成6年度3月に学会発表の予定である。