hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歳差運動する容器を用いた撹拌翼をもたない混合器の開発

こまの首ふり運動のように、回転する物体の自転軸がほかの軸のまわりを回転する運動を「歳差運動」とよぶ。弱く歳差運動をする容器内に流体を充填すると、滑らかな容器内に強く乱れた流れを維持できる。この性質に着目することにより、撹拌翼を用いない新しいタイプの混合器の開発を目指した室内実験や数値シミュレーションによる基盤研究を行った。その結果、歳差容器内に強い乱流を維持する最適なパラメタや容器形状を明らかにすることができた。自転軸がそれとは平行ではない軸のまわりを一定角速度で回転する運動のことを歳差運動とよぶ。本研究では流体を充填した容器を歳差運動させると(たとえ容器内壁面が滑らかであっても)内部に乱れた流れを容易に維持できることに注目し、この運動機構を用いた『撹搾翼をもたない新しいタイプの混合器』の開発を目指している。本年度は球形の容器を用いてパラメタを系統的に変化させた室内実験を行った。具体的には粒子画像流速測定法により、球体の中心を通り自転軸に垂直な面内の速度の時系列を計測し、歳差運動する球体容器内に維持される乱流の統計性質のペラメタ依存性を調べた。その結果、(1)維持される乱流の平均流の構造は歳差の強さ(歳差の角速度の自転角速度に対する比)にのみ依存し、自転角速度の大きさにはほとんど依存しない。(2)自転角速度を固定して歳差強さのみを変化させた場合、乱流の強度は歳差強さが0.05程度(つまり歳差角速度の大きさが自転角速度の5%程度)の場合に最大化される。またこの最適値は自転角速度で定義されるレイノルズ数にはほとんど依らない。(3)このとき(テーラー長で定義される)乱流レイノルズ数は、自転角速度で定義されるレイノルズ数の平方根程度となる。ということが明らかとなった。以上の実験結果により『歳差運動する球体容器を用いた撹搾翼をもたない混合器』の最適パラメタの設定のための指針が具体的に示されたことになる。弱い歳差運動(自転軸が他の軸のまわりを回転する運動)をする容器内には発達した乱流が維持されるという性質に着目して撹拌翼をもたない混合器を提案するにとを目指し、室内実験および数値シミュレーション研究を遂行した。今年度のおもな成果は以下の通りである。まず室内実験ではこの性質の容器形状への依存性を調べた。具体的には、昨年度まで重点的に行ってきた球形容器の実験に加えて、回転楕円体形状の容器の用いた実験を行った。これは、球形容器は歳差運動をしてもその形状が保たれるので壁面の粘性応力のみが流れを駆動し乱流生成装置としては必ずしも最適とは言えない可能性があるためである。そこで球形容器および回転楕円体容器の2種類の容器のそれぞれにおいて、(自転角速度の大きさ、短軸半径および流体の動粘性係数により定義される)レイノルズ数を固定したまま、乱流が維持される最低の歳差の強さ(自転角速度の大きさに対する歳差角速度の大きさ)を評価した。その結果、予想に反して、球形容器の場合の方がより弱い歳差で乱流が維持されるという興味深い結果を得た。しかもより大きなレイノルズ数ほど臨界歳差強さの比も大きいことが明らかとなった。一方で、数値シミュレーションでは歳差運動をする球形容器内の乱流をスペクトル法により高精度よく再現し、その渦構造を調べた。その結果、境界層内には自転軸まわりにほぼ平行に揃った渦構造が観察されるとともに、内部にはリング状の乱流が活発な領域が見出された。今後さらに詳細な検討が必要であるが、これらの秩序構造は歳差運動をする容器内の発達した乱流の維持機構の解明の鍵を握るものと期待される。歳差運動をする容器を用いた混合器の開発に向けた基盤研究を行った。歳差容器内には撹拝翼を用いることなく発達した乱流を維持することができるため、この混合器は被混合物の構造を破壊しにくいという応用上の特長をもつ。また境界条件が単純であり、支配パラメタが「自転の強さを表すレイノルズ数」と「歳差の強さを表すポアンカレ数」の2つのみであるため、室内実験と数値シミュレーションを同一の条件下で行えるという特長ももつ。そこで維持される乱流のパラメタ依存性や混合能力を明らかにするため、室内実験と数値シミュレーションを並行して行った。以下がその成果である。(1)室内実験により乱流が維持されるための最低のポアンカレ数の容器形状依存性を調べた。具体的には球体と回転楕円体容器を用いた比較実験を行った。ここで回転楕円体容器は長軸が自転軸に一致する楕円率0.9のものを用いた。このわずかな楕円率は結果に大きな影響を与え、

しかも乱流維持のためには回転楕円体の方がより大きなポアンカレ数を要することが分かった。(2)自転軸に垂直な中心断面内の平均流速場と乱流強度分布を粒子画像流速測定により求めた。その結果、これらは2つのパラメタのうちポアンカレ数のみに依存することが明らかとなった。(3)スペクトル法を用いた数値シミュレーションを実行した。とくに室内実験により強い乱流が維持されることが知られるパラメタ(レイノルズ数10000、ポアンカレ数0.1)における数値シミュレーションを行った結果、室内実験結果を精確に再現した。また、室内実験での断面計測で明らかになった強乱流領域が環状の3次元構造を有することが明らかになった。(4)歳差容器内流に移流される流体粒子群の追跡の数値シミュレーションを行い、混合度の時間依存性を定量的に評価した。その結果、上述のパラメタでは約10自転周期程度で一様な混合が達成されることが分かった。
居住文化対応型の部分断熱改修におけるヒートショックの改善方策

本研究では、部分断熱改修を実施した京町家における有効なヒートショックの改善方策を明らかにすることを目的とした。ヒートショックの危険性が高い水廻り空間に着目し、水廻り空間を断熱改修することによって、ヒートショックの改善が可能かどうかを被験者実験により検証した。その結果、水廻り空間の断熱改修によって温熱環境が改善されたこと、被験者の生理量・心理量がともに改善されたことを明らかにした。すなわち、水廻り空間の断熱改修がヒートショックの改善に有効であることを明らかにした。本研究は、温暖地域の伝統的木造住宅の温熱環境を改善する手法として「部分断熱改修」の可能性に着目した上で、部分断熱改修の最大の課題である「ヒートショック」の改善方策を検討するものである。具体的には、1.部分断熱改修によるヒートショックの発生実態を把握すること、2.温熱環境の改善・住み方の工夫という2つのアプローチから有効なヒートショックの改善方策を明らかにすることを目的としている。平成28年度は、主として「1.部分断熱改修によるヒートショックの発生実態の把握」に取り組んだ。部分断熱改修を実施した京町家と実施していない京町家2件を対象として、冬期の住み方調査・温熱環境実測を実施した。部分断熱改修を実施している京町家の方が主要居室の温熱環境が良好であるものの、暖房室内外の温度差が大きくなっていること、トイレや脱衣所の温度が10°Cを下回っており、ヒートショックの発生する可能性が高いことなどを明らかにした。さらに、部分断熱改修を実施した京町家を対象として、暖房室内外を往復してもらう被験者実験を実施した。移動時における被験者の血圧や心拍等の生理量、温冷感や快適感などの心理量の変化を調査した。その結果、空気温度だけではなく、生理量・心理量の変化には壁表面からの冷放射や着衣量も影響していることが確認された。また、被験者実験では、トイレや脱衣所における補助暖房の有無による比較を行い、経路空間の空気温度が低くても、トイレや脱衣所の温熱環境の改善によって生理量・心理量の結果が改善しうることを明らかにした。その他にも、部分断熱改修と同じ入れ子型空間構造を持つ新築住宅(平成の京町家)の設計者ヒアリング調査を実施し、部分断熱改修の設計において参考となる知見を得た。平成28年度は「研究目的(1)部分断熱改修によるヒートショックの発生実態の把握」を予定しており、該当する京町家の冬期における住み方調査・温熱環境調査、及び、部分断熱改修を実施した京町家における被験者実験を実施することができた。これらの実験結果については、より精緻な分析を引き続き行っていく必要があるものの、概ね計画通りに研究を進めることができている。本研究は、温暖地域の伝統的木造住宅を対象として居住文化対応型の部分断熱改修の可能性に着目したものである。部分断熱改修では、冬期に暖房室内外の温度差が拡大するため、ヒートショックの危険性が高くなることが課題である。そこで、(1)部分断熱改修によるヒートショックの発生実態の把握、(2)温熱環境の改善・住み方の工夫という2つのアプローチから有効なヒートショックの改善方策を明らかにすることを研究の目的とした。平成29年度は、主に「(2)温熱環境の改善・住み方の工夫という2つのアプローチから有効なヒートショックの改善方策の解明」に取り組んだ。京都府京都市中京区に位置する京町家(京都の伝統的木造住宅)を対象として、ヒートショックの改善方策を検討した。ヒートショック発生の危険性が高い水廻り空間の断熱改修を実施した上で、断熱改修によるヒートショックの緩和可能性を被験者実験により検討した。今回の断熱改修は、押出法ポリスチレンフォームを用いて研究者自身によって実施した。断熱改修前後の温熱環境を比較することにより、今回の改修によって温熱環境が改善されたことを確認した。さらに、暖房室と断熱改修後の水廻り空間を往復してもらう被験者実験を実施した。その結果、経路空間の温熱環境が改善されていない場合でも、水廻り空間の断熱改修によってヒートショックの緩和が可能であることが明らかになった。経路空間においては、スリッパや衣服の着用などの住み方の工夫で対応できることも確認できた。一方、水廻り空間の温熱環境が改善された場合でも、床が無断熱の場合は被験者の生理量・心理量の評価が低くなった。ヒートショックの改善に向けては、空気温度だけではなく床からの熱伝導にも配慮することが重要であると明らかになった。平成28年度の実験結果から、着衣量が変化せざるを得ないトイレや脱衣所におけるヒートショック対策が必要であることが確認できた。平成29年度は、トイレと脱衣所に対象を限定してヒートショックの改善方策を検討する予定である。住み方の工夫という点については、移動経路、移動時の着衣量、暖房空間の温度によってヒートショック緩和の可能性があるかどうかを検討していく。

また、建物の温熱環境という点については、空気温度だけではなく壁表面からの放射も被験者の生理量・心理量に影響していることが把握できたため、トイレ・脱衣所のみの部分断熱改修の可能性を検討する予定である。対象京町家において、仮設的な部分断熱改修を実施し、再度被験者実験を実施することで、ヒートショックの改善方策としての有効性を検証することとしている。29年度が最終年度であるため、記入しない。建築計画29年度が最終年度であるため、記入しない。
漢方薬による腸内細菌叢の変化とアレルギー発症予防の機序解明

漢方薬の腸内細菌に及ぼす影響について明らかにするとともに、アレルギー発症抑制が腸内細菌の変化を介して可能であるかどうかを検討した。まず漢方薬が腸内細菌叢に対してどのような影響を与えるかを検討した。従来の培養法では細かい腸内細菌の変化を捉えることが不可能であったが、腸内細菌のDNAを制限酵素で切断して塩基長を解析するT-RFLP法を用いて解析した。その結果、漢方薬では処方ごとに腸内細菌をある一定の方向に変化させることが分かった。腸管遺伝子発現と腸内細菌との関連を調べたところ、抗生剤(シプロフロキサシン)投与にて腸内細菌が変化し、ヒートショックプロテインの発現が低下した。このヒートショックプロテインの発現は漢方薬十全大補湯にても変化し、腸内細菌の変化を伴っていた。腸内細菌のない無菌マウスではこの遺伝子発現の変化は観察されず、ヒートショックプロテインの変化には腸内細菌の存在が不可欠であることが示唆された。次に抗生剤投与モデルでアレルギーを発症しやすくなるかどうかについて検討した。まずは免疫寛容の系を確立するために予備実験を行い、卵白アルブミン10mgの単回投与にて免疫寛容の誘導できることが分かった。このモデルを用いて抗生剤(セフジトレンピポキシル、アモキシシリン、カナマイシン)を投与し、免疫寛容が誘導できないかどうかを検討した。カナマイシン投与にて少し卵白アルブミン特異的IgEの上昇が見られたものの、基本的に免疫寛容は抗生剤投与により破綻しなかった。しかしながら経口的免疫寛容を誘導しなかった群において、逆に卵白アルブミン特異的IgEの上昇が抑制されており、抗生剤投与にて何らかの免疫系の破綻を来たしていることが分かった。トリ卵白アルブミンをアレルゲンとしたマウスアレルギーモデルにて、同抗原の経口投与による免疫寛容と腸内細菌の関係を調べる研究を行った。生後6週目より、同抗原をアジュバンドと共に腹腔内免疫して、抗原特異的な免疫応答を調べた(耳介腫脹、血中各種抗体、脾細胞の各種サイトカイン)。寛容は初回免疫日の数日前より連日経口投与にて誘導し、抗原特異的不応答を確認した。次に、ペニシリン系抗生物質サワシリンの混入餌投与による腸内細菌の生物学的修飾を行うため、胎児期(出産前)、生後3週目或いは寛容誘導開始3日前より同剤を投与した。現在、予備的解析段階で、サワシリン投与と経口免疫寛容の関係を検討中である。一方、腸内細菌の有無による遺伝子発現の相違を包括的に把握するために、Gene Chipを用いてIQIマウスの脾臓における網羅的遺伝子解析を実施した。脾臓においては腸内細菌の存在依存的にプロテオソーム、ユビキチン系などのタンパク質分解サイクルや複数の転写制御因子の抑制が認められた。また、アレルギー関連因子としてHsp70の増加およびその転写因子の減少また、Hsp70と関連が報告されているMHCクラスIの減少が認められた。現在、腸内細菌再構成マウスによる上記の変化の確認と、これらの遺伝子のアレルギー発症への影響についてさらに詳細に解析中である。
社会基盤施設の安全性の飛躍的向上を可能とする超高性能繊維補強コンクリートの開発

2018年度については、大きく分けると以下の2つの成果を得た。1)薄板形非晶質鋼繊維及びフック形鋼繊維補強セメント複合体の引張挙動に及ぼすひずみ速度の影響本研究では、薄板形非晶質鋼繊維およびフック形鋼繊維により補強されたセメント複合体について、ひずみ速度が引張挙動に与える影響を評価した。その結果、非晶質鋼繊維は繊維とマトリックスの付着性能が大きく、薄板形状によってひずみ速度に関わらず繊維が引き抜かれず、破断することを確かめた。一方、フック形鋼繊維は静的荷重ではマトリックスから引き抜かれたが、高ひずみ速度では繊維が引き抜かれずマトリックスが破壊する挙動が現れた。非晶質鋼繊維補強セメント複合体の引張強度、ひずみ能力および靭性は、フック形鋼繊維補強セメント複合体に比べて大きいが、動的増加係数は小さくなることがわかった。2)薄板形非晶質鋼繊維の長さが繊維補強セメント複合体の動的引張挙動に及ぼす影響本研究では、非晶質鋼繊維の長さおよびひずみ速度が繊維補強セメント複合体の引張挙動に及ぼす影響について調査した。その結果、静的および動的ひずみ速度条件で長さ30mm非晶質鋼繊維は、繊維の比表面積と形状比が大きいため、マトリックスとの付着性能が優れるので、繊維がマトリックスから引き抜かれず破断される傾向が現れた。一方、長さ15mmの非晶質鋼繊維は、形状比が小さく繊維の混入個体数が多いため、マトリックスとの付着効率が減少して繊維がマトリックスから引き抜かれた。繊維の形状比が大きいほどマトリックス内部での拘束力と架橋作用の範囲が大きいため、引張強度、ひずみ能力および引張靭性が増加した。基本的な実験は、受入研究者が来日前に実施していており、その応用的な研究を来日後に実施する形となったため、スムーズに研究を進めることができた。ここまで、研究は当初の計画通り順調に進んでおり、このままの状態を保ち続けることを心掛ける。今年度は2年目(最終年度)になるので、前半で実験を終了させ、後半には研究成果を査読付き論文集に投稿することに注力する。
煎出で起こる生薬成分の化学変化の解明による薬効理解のための基礎的研究

天然物の成分研究は有機溶媒による冷浸で得た抽出物を用いて行うことが基本であり,生薬の含有成分に関する知見の大多数はその検討の結果によるものである.一方,漢方処方における湯液は,複数の生薬を混ぜ合わせた後に水から煮出すため,成分の化学構造の変化や脂溶性成分が抽出されにくいなどの実態が考えられる.また,現在の医療制度では漢方処方における散剤や丸剤はエキス製剤(水煎出物)が利用されているため,本来の散剤や丸剤とは成分組成が異なる可能性がある.そのため,本研究では生薬を煎じることで起こる含有成分の化学的変化を追跡することで,漢方で頻用される湯液の薬効をより良く理解するための基礎を構築する.天然物の成分研究は有機溶媒による冷浸で得た抽出物を用いて行うことが基本であり,生薬の含有成分に関する知見の大多数はその検討の結果によるものである.一方,漢方処方における湯液は,複数の生薬を混ぜ合わせた後に水から煮出すため,成分の化学構造の変化や脂溶性成分が抽出されにくいなどの実態が考えられる.また,現在の医療制度では漢方処方における散剤や丸剤はエキス製剤(水煎出物)が利用されているため,本来の散剤や丸剤とは成分組成が異なる可能性がある.そのため,本研究では生薬を煎じることで起こる含有成分の化学的変化を追跡することで,漢方で頻用される湯液の薬効をより良く理解するための基礎を構築する.
造血ニッチが維持する破骨細胞前駆細胞の性質

以前、造血を支持する骨芽細胞が破骨細胞前駆細胞も支持するという仮説をたてた。In vitroにおける破骨細胞分化では、細胞周期の停止したpOCP(post-mitotic osteoclast precursors、増殖後破骨細胞前駆細胞)を介して分化することを明らかにした。平成19年度は、pOCPから破骨細胞への分化機構を解析することを目的とし、本研究を計画した。実験計画は、以下のテーマを明らかにすることを目標とし、遂行した。(計画1)前駆細胞から破骨細胞分化期間の解析:E-GFPを発現するマウスを用いて実験を試みたが、蛍光強度の減弱などにより、解析が困難であった。現在、全身性にβガラクトシダーゼを発現するROSA26マウスを用いて実験系の構築中である。(計画2)QuOPの局在の解析:QuOPマーカーは、RANK^+、c-Fms^+、Ki6767^-(増殖マーカー)、TRAP^-である。そこで、破骨細胞が存在しないRANKL欠損マウスを用いてQuOPの局在解析を試みた。(1)RANKL欠損マウスの脛骨は、骨量の上昇を呈し、TRAP陽性細胞は認められない。(2)RANKL欠損マウスにおいて、骨組織に沿った場所にのみRANK、c-Fmsダブル陽性細胞(QuOPs)が認められた。さらに、それらのほとんどはKi67陰性であった。活性型ビタミンD_3の投与、卵巣切除、骨折治癒過程におけるpOCPの局在および量的変化については、現在解析中である。(計画3)pOCPへの分化に必須なシグナル伝達経路の解析:RANKのプロモーター制御下にCre組み換え酵素を発現するマウスは現在作製中である。作製後破骨細胞分化に必要と考えられてきたシグナル伝達分子(p38MAPキナーゼ、NFATc1など)をloxP siteで挟んだマウスを構築し、生体内の造血ニッチにおけるpOCPへの分化に必須なシグナル伝達経路を明らかにしていく。造血はニッチに存在する骨芽細胞が支持する。我々は、この骨芽細胞が、分化が進んだ破骨細胞前駆細胞も支持するという仮説をたてた。前駆細胞にRANKLが作用すると、細胞周期の停止と共に破骨細胞へと分化する。我々は、(1)破骨細胞分化過程は、細胞周期の進行と停止を境にフェーズ1と2に分割できること、(2)フェーズ1と2の間にはpOCP(post-mitotic osteoclast precursors、増殖後破骨細胞前駆細胞)が存在すること、(3)フェーズ1にはp38MAPKとNFATc1が、フェーズ2にはNFATc1が必要であることを報告した(第23回日本骨代謝学会抄録、p194、:0-079)。平成18年度の科学研究補助金により、以下の知見を得た。1.破骨細胞分化のシグナル解析レトロウイルスによる破骨細胞前駆細胞へのNFATc1の過剰発現は、非RANKL刺激下で破骨細胞分化を誘導する。以上の分化系により、(1)P38MAPK阻害剤は、NFATc1誘導性の破骨細胞形成を抑制すること、(2)NFATc1の過剰発現は、p38のリン酸化には影響しないことが明らかになった。以上より、フェーズ1において、p38MAPKとNFATc1は破骨細胞分化に対して協調して働くことが示唆された。2.pOCPの存在様式の解析マウスにブロモデオキシウリジン(BrdU)を飲料水に加え投与し、Ca欠乏食で飼育した。飼育後、破骨細胞をTRAP染色にて観察した。また、破骨細胞の分化過程におけるBrdUの取り込みをBrdU染色にて観察した。その結果、(1)Ca欠乏食による飼育は、破骨細胞数の増加を誘導したが、それらの核はBrdU陰性であった。以上より、急激に分化した破骨細胞は、細胞周期の停止したpOCP由来であることが示唆された(第24回日本骨代謝学会抄録、p208、:O-136)。

活性型ビタミンD_3の投与、卵巣切除、骨折治癒過程におけるpOCPの局在および量的変化については、現在解析中である。(計画3)pOCPへの分化に必須なシグナル伝達経路の解析:RANKのプロモーター制御下にCre組み換え酵素を発現するマウスは現在作製中である。作製後破骨細胞分化に必要と考えられてきたシグナル伝達分子(p38MAPキナーゼ、NFATc1など)をloxP siteで挟んだマウスを構築し、生体内の造血ニッチにおけるpOCPへの分化に必須なシグナル伝達経路を明らかにしていく。
半導体上におけるRu錯体の光触媒機能材料発現と人工光合成系への応用

1、有機金属錯体を出発原料とした高活性酸化チタン薄膜の開発高効率な光エネルギー変換系、光触媒系の構築のための理論的検討を行なった結果、反応気質の供給律速や環境光スペクトルの実測値を考慮すればミクロン程度の膜厚の透明な半導体薄膜が応用上重要であることを示すことができた。そこで、Ti-テトライソプロポキシドを出発原料として噴霧熱分解法、CVD法、およびゾルゲル法により酸化チタン薄膜を作製し、それらの光触媒薄膜をアセトアルデヒドの光触媒分解反応に基づいて活性評価し、製膜法の最適化を図ることにより平滑透明でしかも活性標準光触媒であるP25粉末を凌ぐ高活性な光触媒薄膜の開発に成功した。2、半導体表面のハイブリッド修飾法の検討Ru錯体による表面修飾と平行して、還元反応を促進し正味の光触媒活性を向上させる貴金属修飾について検討した。その中で、金属イオンの吸着特性や錯化剤による残存金属イオンの除去、あるいは担持金属の密着強度の検討を通じて、従来の無電解めっき法に代る新規な光ファインパタ-ニングの実用レベルの技術を確立することができた。3、炭酸ガス還元をモデル系とした光触媒機能の高効率発現に向けた電気化学的検討新規に開発する有機金属/半導体材料複合系を用いて炭酸ガスの還元への応用を試みるための予備的検討として、金属電極による炭酸ガスの電気化学的還元を加圧条件下あるいは重水中で行い、従来の報告に比べはるかに大きな電流密度の実現と反応機構についての新規な知見を得ることができた。
構造変換酵素PPIaseの転写調節反応における遺伝学的・生化学的解析

蛋白質の構成変換を酵素学的に行うペプチジル・プロリル・シス・トランス・イソメラーゼ(PPIase)に着目し、その酵素の意義と機能の解析を核局在性酵素を中心として進めた。1)ペプチジル・プロリル・シス・トランス・イソメラーゼ(PPIase)をコードする遺伝子の分裂酵母からの単離と解析分裂酵母を用いた遺伝学的解析を進めるために、PPIase酵素活性ドメイン領域を用いたPCR法により分裂酵母PPIaseをコードする遺伝子を分裂酵母ゲノムから単離した。この遺伝子をコードするPPIaseとすでに単離されている他種PPIaseとの一次構造比較により、多様なPPIaseの進化的保存性と細胞内局在性との間に相関関係のあることを見出した。単離したPPIaseは核局在性を担うことが予想されたが、実際にその局在性を調べたところ、核に局在していることを確かめられ、このルールの妥当性を支持する結果となった。更に核局在性PPIaseが酵素活性ドメイン領域以外に長い領域を持つことからその一次構造を比較したところ、進化的保存性のある様々なドメイン領域を持つことが明らかとなった。2)ペプチジル・プロリル・シス・トランス・イソメラーゼ(PPIase)による転写活性化能の検出PPIaseがTFIIDのサブユニットと相互作用する因子として単離されているので、PPIaseによる転写活性化能を解析したところ、PPIase自身が転写を活性化する能力を有することが示された。3)ペプチジル・プロリル・シス・トタンス・イソメラーゼ(PPIase)と相互作用する因子群の単離PPIaseの機能解析を進める目的で、PPIaseと相互作用する因子群をtwo-hybrid法より多種単離した。
タンパク質量のリアルタイムモニタリング

ルシフェラーゼレポーターを用い、生きた細胞においてタンパク質量をリアルタイム測定する手法の開発と、その手法の生物時計研究への応用を試みた。モデル系として、緑藻クラミドモナスの時計タンパク質を用いた。その結果、クラミドモナスの時計タンパク質ROC15, ROC40, ROC66, ROC75のタンパク質量を反映するレポーターの作製に成功した。さらに、このレポーターシステムを用いて、ROC15の光誘導性の分解機構を見出し、その性質の詳細な解析を行うことに成功した。ルシフェラーゼレポーターは感度・定量性・簡便性に優れ、遺伝子発現の活性を測定する技術として生命科学の多岐にわたる分野で利用されている。特に、この技術を生細胞に適用し、さらにゲノム解析のスケールにまで大規模化した「生物発光リアルタイム測定システム」(JST先端計測分析技術・機器開発事業、平成1721年度、チームリーダー:石浦正寛)は、次世代シークエンサーの登場で新時代を迎えた遺伝学において鍵となるシステムである。しかし、ルシフェラーゼを用いたこれまでのレポーターアッセイは、専らプロモーターの活性に着目したものであった。近年めざましく理解の進んでいる転写後制御の重要性や、ゲノム配列解読後のタンパク質の動態の理解の重要性の観点から、今後はタンパク質の量的変動を正確に測定できるレポーターが不可欠である。今年度は、レポーターの改良を行った。具体的には、緑藻クラミドモナスの時計タンパク質をモデルとして、使用するルシフェラーゼ遺伝子および、それらのバリアントを用いたレポーター遺伝子を作製し、細胞に導入して、生物発光の動態と実際のタンパク質の動態を比較し、最もタンパク質の動態を反映するレポーターを絞り込んだ。我々は、予備的な実験から緑藻クラミドモナスの時計タンパク質ROC15のC末端にホタルルシフェラーゼを融合させたレポーターを作製し、このタンパク質の特徴である、タンパク質量のリズミックな変動と、光照射後の極めて早い分解を生物発光として測定できることを発見していた。本年度は、ROC15に加え5つの時計タンパク質(ROC40、ROC55、ROC66、ROC75、ROC114)のレポーター遺伝子を作製を作製した。時計遺伝子の停止コドン直前にルシフェラーゼのコード配列を挿入することで、時計タンパク質のC末端にルシフェラーゼを融合したレポーターを発現させた。できるだけ本来の遺伝子機能を損なわないよう、時計遺伝子のゲノム断片にルシフェラーゼを組込み、そのDNA断片を野生株の核ゲノムに移入した。その結果、ROC114を除く4つの時計遺伝子を用いたレポーター遺伝子に関して、生物発光を示す形質転換体を得た。本研究は、ルシフェラーゼレポーターを用いてタンパク質量を生きたままの細胞でリアルタイムモニタリングする手法を開発し、生物時計研究への応用を目指す。本研究はルシフェラーゼレポーターの新たな使い方を提案する斬新で挑戦的な課題である。今年度は、昨年度までに作製に成功した緑藻クラミドモナスの時計タンパク質ROC15の量的変動を正確に測定できるレポーターを用い、このシステムの実用性を検証した。その結果、当初の予定通り、このシステムを用いてタンパク質の変動に異常を来す変異体の分離に成功した。生物時計研究は当初の計画通り進んだ。さらに、現段階で十分な成果が得られたことから、当初は最終年度に予定していた論文発表を、前倒しで今年度に発表することができた。当初計画したレポーター株5種のうち、4種の作製に成功した。既に作製していた1種と合わせて、十分な種類のレポーター株が得られたため。研究を計画通り進める。

具体的には、出来上がったレポーターを実際の研究に利用し、実用性を実証する。生物発光リアルタイム測定システムを用いて、ROC15タンパク質の光依存的分解が起こらなくなる変異体を分離する。また、最終年度の成果をもとに、論文を執筆する。本年度は、ほぼ予定通りの成果を得た。よって、来年度は当初の計画通り、得られたレポーター株の生物発光が、時計タンパク質の発現パターンを正確に反映していることを確認する。具体的には、生物発光リアルタイム測定と時計タンパク質のウエスタンブロット解析を行い、それらの結果を照らし合わせる。また、時計タンパク質は、量の変動の他にも翻訳後修飾や複合体形成、核局在/DNA結合などの様々な特徴を示すが、一義的に量の変化を反映していることを確認する。実験方法の改良により、当初の予定より少ない額で研究を遂行することができた。次年度使用額は、当初の予想より解析が進んでいる緑藻時計タンパク質ROC15のリアルタイム測定に関連した解析を行うための予算に充てる。具体的には、大規模測定のための培養関連消耗品、発光基質等の購入である。次年度の研究費は、上記の計画遂行のため、主に以下の消耗品類の購入に充てる。遺伝子実験用試薬:クローニング試薬(PCR酵素、制限酵素、プラスミド抽出キット、コンピテントセルなど)および発現解析関連試薬(RNA抽出キット、Klenow酵素、ラベリングキット、ハイブリダイゼーション試薬など)を含む。タンパク質実験用試薬類:抗体、タンパク質抽出試薬、アフィニティカラム類、プロテアーゼ阻害剤、アクリルアミドゲル、ウエスタンブロット関連試薬、ルシフェラーゼアッセイキットなど。培養用器具:フラスコ等のガラス器具類、シャーレ・ウェルプレートなどのプラスチック器具類発光基質:ルシフェラーゼの基質類(主にルシフェリン、場合によってはデカナール、セレンテラジン)
心血管系の負荷応答と病態形成:遺伝子転写シグナルと病態生理に基づく治療戦略の確立

1.心筋細胞の負荷条件下での機能を検討するため単一心筋細胞張力測定系に細胞内カルシウム測定系を組み合わせ張力・カルシウムトランジエントの同時測定を行なった。この結果従来の報告と異なる応答を見出し、クロスブリッジサイクリングとの関係が示唆された。薬物および遺伝子導入の影響を検討中である。2.血管病態における平滑筋細胞の脱分化、増殖の分子機構を解明するため、平滑筋細胞分化に関わる新規転写因子の同定と、平滑筋分化を調節する情報伝達経路、さらに平滑筋分化に作用する薬剤の同定を試みた。まず、転写因子に関しては、publicおよびprivate databaseの解析により、平滑筋での作用が推測される転写因子を複数、見出した。これらに関して、平滑筋細胞分化、血管病変での発現を解析した。特にzincfingerを2か所に持つ新規転写因子は平滑筋分化で発現増加し、平滑筋分化マーカー遺伝子の転写を調節することを明らかとしている。今後、この転写因子の研究により、平滑筋分化の転写因子ネットワークによる調節機構解明に重要な情報が得られると考えている。また平滑筋分化の情報伝達経路に関しては、我々が新しく確立したinvitro平滑筋分化系を用いて検討を進め、平滑筋細胞の初期分化にp38 MAPKが、またより後期の分化マーカー遺伝子の発現調節に、p42/44 MAPKが重要であることを明らかとしている。薬剤に関しては、特にリガンド依存性転写因子である核内受容体に作用する薬剤に着目し研究を進め、PPARに作用する薬剤が、他の化合物と共同して平滑筋分化を推進することを認めている。これらの研究によって、動脈硬化、特に不安定プラークに対する新しい治療戦略が得られると考える。1.圧負荷ストレスに関してはラット大動脈縮窄モデルを作成し心肥大形成の経時変化を確認した。各週令の組織よりRNAを抽出しDNA Chipを用いて遺伝子発現レベルを解析、これまでに報告された結果との相違点について検討している。2.虚血再灌流については培養心筋細胞に低酸素・再酸素化刺激を加えた後培養液上清をゲル濾過にかけ各分画の生理活性を1)血管平滑筋収縮作用2)心筋カルシウムトランジエントに対する作用によって評価した。活性分画より物質の単離を試みている。3.サイトカインストレスに関してはTNF-αついて検討した。TNF-αを加えて培養した心筋細胞よりRNAを抽出、活性化されるものをDNA Chipにより検出したが持続的に発現する転写因子は現在発見されていない。4.ミオシン軽鎖については家族性肥大型心筋症において報告された突然変異のうち筋の短縮速度を増加させるとされるもの4種類、アクチンとの相互作用部位に変異を持つもの1種類のcDNAを作製した。これをアデノウイルスベクターを用いて単離心筋細胞内で発現させる予定である。また単離心筋細胞の機能評価のために単一心筋細胞の発生張力とカルシウムトランジエント同時測定システムを開発した。5.転写因子BTEB2とGal4のNNA結合ドメインの融合タンパクをを発現するよう形質転換した酵母に血管のcDNAライブラリーを加え培養を行った。陽性クローンからプラスミドを回収し絞り込みを行っている。6.NOSの発現レベルおよび活性、さらにNO産生を測定するシステムを完成した。Klotho遺伝子を発現するCOS細胞に対しサイトカイン刺激を加え反応を解析している。
新奇なスピン液体相を形成するフラストレート化合物の多角的熱力学研究

本課題は、フラストレートしたスピン系に特徴的に生じる量子スピン液体状態における、熱力学的な側面からの理解と新たな現象開拓を進めることを目的とする研究である。最終年度である、平成23年度は、基底状態がスピン液体になる有機三角格子Mott絶縁体であるEtMe_3Sb[Pd(dmit)_2]_2を中心に、カチオン部の置換によって現れる基底状態の熱力学的特徴の系統的な変化を調べることを行った。カチオンをMe_4Sb,EtMe_3Asにした系では基底状態は反強磁性となり有限のγ項は消失する。またEt_2Me_2Sbの塩は電荷秩序状態に位置し、ここでもγ項は零になる。同時に、両秩序相での熱容量の値はスピン液体相と比較すると抑制され、その効果はC_pT^1 vs T^2の傾きに相当するβの値に顕著に反映することが判明した。スピン液体状態が、二量体ユニット内の電荷の自由度を通して格子の自由度ともカップルし、比較的柔軟な格子をつくることが明らかになった。さらに、これらの物質で生じるC_pT^1のhump構造につて検討を行い、三角格子性からのずれを示すパラメターであるt'/tとhump温度に相関があることが明らかになった。上記の有機三角格子系の熱測定と並行して、カゴメ格子のフラストレート系である天然鉱物であるVolborthite (Cu_3V_2O_7(OH)_2・2H_2O)の微少量試料を行った。特に、試料依存性を詳細に検討したところ、3Kより高温の温度領域では熱容量に大きな試料依存性はないが1 K付近の構造にガラス凍結のような性質を示す試料と相転移的なピーク構造を示すケースがあることが判明した。1 K付近に生じる磁気異常は短距離的な秩序形成であり試料の質や不純物によって大きく影響を受けることが明らかになった。スピン液体中で生じる新しいタイプの相転移であること考えられ、今後の理論研究の展開に大きな指針を与える結果である。本研究は、フラストレートしたスピン系の作り出す量子スピン液体状態に対して、熱力学的な側面からの理解と新たな現象開拓を進めることを目的として計画した。平成22年度は、分子性化合物の電荷移動錯体で二次元の三角格子構造をもつκ-(BEDT-TTE)_2Cu_2(CN)_3 EtMe_3Sb[Pd(dmit)_2]_2の基底状態を調べるため、極低温領域での単結晶を用いた熱測定を系統的に行った。極低温領域ではBEDT-TTF分子の末端主チレン基のプロトンとEtMe_3Sbのメチル基の回転トンネルによる大きなショットキー熱容量が現れた。これらの影響を排除するため、重水素化したBEDT-TTF分子からなる試料と、EtMe_3Sb^+のメチル基を重水素化した試料を準備した。単結晶を用いた熱容量測定の結果、両塩とも絶縁体状態であるにも関わらず、有限の電子熱容量係数をもつことが明らかになり、ギャップのないスピン液体状態が形成されていることが示唆される。後者の塩では電子熱容量係数の値が倍程度に増加している。重水素置換によってカチオンのサイズが小さくなることで、反強磁性状態に近づくためであると思われる。次に、Cu^<2+>が二次元カゴメ格子を形成するS-1/2のフラストレート系であるボルボサイトの極低温測定を行った。大阪大学で現有している^3He冷凍装置と、分子科学研究所の300μWの希釈冷凍装置を用いて最低温度110mKまで、最大磁場7Tまでの測定を粉末試料のペレットを用いて行った。C_pT^<-1>の温度変化が、1K付近でキンク構造をとり、の温度でスピン系の相変化が起こっていることが確認された。また、より低温領域で、ショットキー熱容量が現れることが確認され、磁場依存性からこの熱容量は、Cuの核比熱によるものであることが確認された。基底状態では何らかの短距離秩序が形成されていることが強く示唆される。

上記の有機三角格子系の熱測定と並行して、カゴメ格子のフラストレート系である天然鉱物であるVolborthite (Cu_3V_2O_7(OH)_2・2H_2O)の微少量試料を行った。特に、試料依存性を詳細に検討したところ、3Kより高温の温度領域では熱容量に大きな試料依存性はないが1 K付近の構造にガラス凍結のような性質を示す試料と相転移的なピーク構造を示すケースがあることが判明した。1 K付近に生じる磁気異常は短距離的な秩序形成であり試料の質や不純物によって大きく影響を受けることが明らかになった。スピン液体中で生じる新しいタイプの相転移であること考えられ、今後の理論研究の展開に大きな指針を与える結果である。
沖縄の食文化の特徴-琉球王朝時代の食生活研究を中心に

沖縄の食文化の特徴を明らかにしたいと考え, 3ヶ年にわたって研究をすすめてきた.特に琉球王朝時代,交易を行なった中国,東南アジア,日本など外来文化の影響を受けたと思われるので,食生活の史的考察を行う必要があると考え,文献検索を中心に,各地域での聴取調査と資料収集を行なった結果,次の知見を得たので報告する.沖縄の食文化は琉球王朝時代に交流の深かった中国の影響が大きいが,東南アジア,台湾などの外来文化も受容し,それを融合しながら特異な食文化を形勢したいといえる.日本の食文化との大きな違いは,先史時代から家畜の獣肉を食用にしてきた歴史があり,仏教の影響による肉食禁止や忌避のない肉食文化を有することである.特に18世紀以降は豚肉の食習が定着し料理も発達した.仏事であろうと豚頭を供え豚肉料理が主流であるのも中国食文化の影響に他ならない.長崎の卓袱料理との関連性も把握できた.八重山の焼香(法事)行事食事は現在も霊供盆を中心にした精進料理であり宮良殿内「祭之時膳符日記」の献立とほぼ同様である.伝統的な献立形態が継承されているが,食材料は多少変化し行事食の変遷をみることができた.霊供盆の材料,料理,器には日本の精進料理との共通性がみらにれ,八重山の食文化には日本の影響が濃厚である.沖縄本島と異なるのは何故か,その形成の次期はいつ頃か,更に検討する必要がある.八重山の古文書,石垣家の「膳符日記」の解読を完了し活字化した.琉球王朝末期から近年までの約百余年にわたる行事の献立記録があり,材料,料理の詳細な資料が得られた.前掲の宮良殿内の膳符日記と併わせると,八重山の食生活史,食文化の研究資料に役立つ.今回は予算の都合上,ワープロによる活字化を試みたが,今後,解読を加え製本したいと考えている.沖縄の食文化の特徴を明らかにしたいと考え, 3ヶ年にわたって研究をすすめてきた.特に琉球王朝時代,交易を行なった中国,東南アジア,日本など外来文化の影響を受けたと思われるので,食生活の史的考察を行う必要があると考え,文献検索を中心に,各地域での聴取調査と資料収集を行なった結果,次の知見を得たので報告する.沖縄の食文化は琉球王朝時代に交流の深かった中国の影響が大きいが,東南アジア,台湾などの外来文化も受容し,それを融合しながら特異な食文化を形勢したいといえる.日本の食文化との大きな違いは,先史時代から家畜の獣肉を食用にしてきた歴史があり,仏教の影響による肉食禁止や忌避のない肉食文化を有することである.特に18世紀以降は豚肉の食習が定着し料理も発達した.仏事であろうと豚頭を供え豚肉料理が主流であるのも中国食文化の影響に他ならない.長崎の卓袱料理との関連性も把握できた.八重山の焼香(法事)行事食事は現在も霊供盆を中心にした精進料理であり宮良殿内「祭之時膳符日記」の献立とほぼ同様である.伝統的な献立形態が継承されているが,食材料は多少変化し行事食の変遷をみることができた.霊供盆の材料,料理,器には日本の精進料理との共通性がみらにれ,八重山の食文化には日本の影響が濃厚である.沖縄本島と異なるのは何故か,その形成の次期はいつ頃か,更に検討する必要がある.八重山の古文書,石垣家の「膳符日記」の解読を完了し活字化した.琉球王朝末期から近年までの約百余年にわたる行事の献立記録があり,材料,料理の詳細な資料が得られた.前掲の宮良殿内の膳符日記と併わせると,八重山の食生活史,食文化の研究資料に役立つ.今回は予算の都合上,ワープロによる活字化を試みたが,今後,解読を加え製本したいと考えている.沖縄の食文化の特徴を明らかにするには、琉球王朝時代の食生活の史的考察が必要だと考え、史料ならびに古文書等の文献検索と分析を行なった。また古文書等の検証と古老からの聴取調査も行なった。その結果、次のような知見を得たので報告する。1;沖縄の食文化を特色づけるものに古くから獣肉類を食べる習慣があるなかでも特に豚肉を主流とした料理が発達し庶民生活に定着しているがそれは何故か、史的考察を試み、肉食の変遷と背景について検討した。その結果を日本生活文化史学会で発表した。論文は同学会誌「生活文化史NO11」に掲載された。2;八重山に保存されていた古文書の中から「石垣殿内膳符日記」「竹原家膳符日記」等の資料を得た。琉球王朝末期から明治時代にかけて40年間の記録があり、祭祀,法事,生年祝等の献立や料理,材料から当時の食生活研究には貴重な資料となる。そこで、これ等の古文書の読み下しと解説を行い活字化したいと準備中である。3;八重山石垣市の法事について聴取調査と現地取材をし、供物,献立,料理を詳細に調査することができた。膳符日記との比較研究により、変遷と特徴を把握した。八重山の霊供盆は日本の精進料理との類似性がみられ仏教文化の影響が濃厚にあるように見受けられるが、三味物といった中国の習俗も受容れていた。その影響について検討中である。4;久米村の習俗を通じて流入した中国文化の影響も多大であったと考え孔子廟祭祀,清明祭,焼香行事の供物,料理の調査を行なった。豚,鶏,魚,その他の供物,御三味は中国の習俗を受容したものでありそれが約3百年もの間連綿と継がれている。

「沖縄の食文化の特徴について」の研究課題の最終年度にあたり,これまで集収してきた資料の整理と研究のまとめを行なった.1.八重山の古文書等の文献検索と分析を行い,八重山の焼香行事食の歴史的考察を行う一方,石垣市在住の古老から聴取調査,ならびに内原家の焼香(年忌)の取材と調査を行い,焼香行事の形態,供物,霊供盆,客膳の献立や供え方など,詳細に調らべ,現在の実態を識る貴重な資料が得られた.その形態や献立は,古文書『宮良殿内,祭之時膳付日記』石垣家の『膳符日記』と比較検討した結果,ほぼ同様であり,伝統的な献立形態が継承されている.しかし,食材料や料理法には多少の変化があり,焼香行事食の歴史的な変遷をみることができた.特に霊供盆は動物性食品を一さい用いず,精進料理で構成されており,食材料や料理法,器の名称にも日本の精進料理との類似性があるなど,豚肉料理を主流とする沖縄本島とは異なる特色がある.八重山は17世紀初頭,大和在番が設置され,桃林寺の建立や仏教の招来に伴なって日本の文化が流入した背景があり,食文化にもその影響が強い.以上の結果は日本生活文化史学会で発表した.2.前年度に引き続き,石垣家の古文書『膳符日記』の解読と解説を行ない1866年から1978年までの約百年余の行事食の献立,料理,食品などについて詳細な資料が得られた.まだ未公開の文献だけに,宮良殿内の膳付日記と併わせて,琉球王朝時代から近年までの食生活史,食文化研究の貴重な資料になるものと思われる.今回は,読み下しのみ活字化した.
コミュニティ型コンテンツのコンテンツホール検索に関する研究

BlogやSNS等のコミュニティ型コンテンツにおいてユーザの気づいていない情報をコンテンツホールと呼び,このコンテンツホールを検索する手法を提案してきた.これまで,本研究ではコミュニティ型コンテンツの対話解析,単語の曖昧性の解消といった基盤技術の研究を行った.今年度はそれらの技術を用いて,コミュニティ型コンテンツの内部ユーザにとってのコンテンツホール検索とコミュニティの外部ユーザにとってのコンテンツホール検索の2つのシステムを提案した.ここで,内部ユーザとは,コミュニティ型コンテンツに参加しているユーザを示し,外部ユーザとは,そのコミュニティ型コンテンツを閲覧しているのみのユーザを示す.内部ユーザ向けコンテンツホールシステムでは,コミュニティ内部のユーザが見落としている情報を抽出することを目的とし,SNS等のコミュニテノ型コンテンツとWikipediaを比較し,SNS上で議論されていない情報をWikipediaから抽出して提示するシステムを提案した.外部ユーザ向けコンテンツホールシステムでは,コミュニティの外部ユーザが知らない情報で且つ重要な情報をSNSから抽出することを目的とし,SNSとWikipedia及び他の一般のWebページとを比較し,SNSに特有且つ重要な情報を抽出し提示するシステムを提案した.そして,テーマを映画と医療にしぼり,これらのコミュニティに対して,外部ユーザ向けシステムの実験を行い.その有用性を示した.今年度の研究成果は,論文誌1本,紀要1本,国際会議4本,研究会3本である.BlogやSNSのコミュニティ型コンテンツにおいて,ユーザの気づいていない情報である「コンテンツホール」を検索するシステムの提案,及びその基盤技術としてコミュニティ型コンテンツの文書解析を行った.今年度は以下の2つのシステムを開発し,その有用性を示した.・コンテンツホールの検索システムWikipediaとコミュニティ型コンテンツを比較することにより,その差分情報をコンテンツホールとして抽出及び提示するシステムを開発し,評価実験を行い有用性を確認した.本システムはユーザが入力したキーワードに関連するWikipediaのページ群及びコミュニティ型コンテンツを検索し,これら2つのコンテンツを比較し,Wikipediaにあって,コミュニティ型コンテンツにない情報をコンテンツホールとして提示する.・コミュニティ型コンテンツの文書解析の研究コミュニティ型コンテンツはユーザが自由に記述するために,表記揺れが多く,コンテンツホール抽出時に問題となる.そこで,表記揺れ解消の第一弾として,カタカナ語の表記揺れを判断するシステムを開発し,Web上にて一般に公開した.具体的には,ヴァイオリンとバイオリンのようにカタカナ語同士が表記揺れなのか別物を指しているかを判断するシステムを開発し,デモシステムをWebにて一般公開した.今年度の研究成果は,紀要1本,国際会議3本,研究会8本,受賞1本である.BlogやSNS等のコミュニティ型コンテンツにおいてユーザの気づいていない情報をコンテンツホールと呼び,このコンテンツホールを検索する手法を提案してきた.これまで,本研究ではコミュニティ型コンテンツの対話解析,単語の曖昧性の解消といった基盤技術の研究を行った.今年度はそれらの技術を用いて,コミュニティ型コンテンツの内部ユーザにとってのコンテンツホール検索とコミュニティの外部ユーザにとってのコンテンツホール検索の2つのシステムを提案した.ここで,内部ユーザとは,コミュニティ型コンテンツに参加しているユーザを示し,外部ユーザとは,そのコミュニティ型コンテンツを閲覧しているのみのユーザを示す.内部ユーザ向けコンテンツホールシステムでは,コミュニティ内部のユーザが見落としている情報を抽出することを目的とし,SNS等のコミュニテノ型コンテンツとWikipediaを比較し,SNS上で議論されていない情報をWikipediaから抽出して提示するシステムを提案した.外部ユーザ向けコンテンツホールシステムでは,コミュニティの外部ユーザが知らない情報で且つ重要な情報をSNSから抽出することを目的とし,SNSとWikipedia及び他の一般のWebページとを比較し,SNSに特有且つ重要な情報を抽出し提示するシステムを提案した.そして,テーマを映画と医療にしぼり,これらのコミュニティに対して,外部ユーザ向けシステムの実験を行い.その有用性を示した.今年度の研究成果は,論文誌1本,紀要1本,国際会議4本,研究会3本である.
Schwann細胞を3次元培養したバイオ人工神経による末梢神経の再生

神経栄養因子遺伝子を導入したSchwann細胞を3次元的に共重合体チューブに封入したハイブリット型人工神経を作製し、その神経誘導能をラットモデルで組織学的に評価した.生後3日ラット坐骨神経から単離培養したSchwann細胞に、アデノウィルスを用いて神経栄養因子(BDNF、CNTF、NT3)遺伝子を導入した(コントロールはGFP).In vitroの検証として、各Schwann細胞の培養上清(3週)を後根神経節と培養し、神経節からの軸索の伸展距離を比較検討した。次にこの活性型Schwann細胞をゲルに包埋してカプロラクトンとポリ乳酸の共重合体のチューブに封入し、ラット坐骨神経の15mm欠損に移植、12週で、組織学的検討を行った.神経節の軸索伸展距離(μm)は、BDNF^*118±50、CNTF^*130±52、NT3 99±38、GFP62 ±14で、神経線維密度(数/mm^2)はBDNF^*17513±1833、CNTF^*15011±3400、NT3 9573±1495、GFP9305±2893、総神経線維数はBDNF^*3887±767、CNTF2453±1215、NT3 1989±1597、GFP1470±276であった.遺伝子導入Schwann細胞からの軸索伸展が著しいことから、導入Schwnn細胞からの神経栄養因子の分泌が増強しているものと思われた.また移植実験で、BDNF遺伝子導入Schwann細胞を封入した人工神経は、特に高い神経誘導能を有していることが判明した.神経栄養因子遺伝子を導入したSchwann細胞を3次元的に共重合体チューブに封入したハイブリット型人工神経を作製し、その神経誘導能をラットモデルで組織学的に評価した.生後3日ラット坐骨神経から単離培養したSchwann細胞に、アデノウィルスを用いて神経栄養因子(BDNF、CNTF、NT3)遺伝子を導入した(コントロールはGFP).In vitroの検証として、各Schwann細胞の培養上清(3週)を後根神経節と培養し、神経節からの軸索の伸展距離を比較検討した。次にこの活性型Schwann細胞をゲルに包埋してカプロラクトンとポリ乳酸の共重合体のチューブに封入し、ラット坐骨神経の15mm欠損に移植、12週で、組織学的検討を行った.神経節の軸索伸展距離(μm)は、BDNF^*118±50、CNTF^*130±52、NT3 99±38、GFP62 ±14で、神経線維密度(数/mm^2)はBDNF^*17513±1833、CNTF^*15011±3400、NT3 9573±1495、GFP9305±2893、総神経線維数はBDNF^*3887±767、CNTF2453±1215、NT3 1989±1597、GFP1470±276であった.遺伝子導入Schwann細胞からの軸索伸展が著しいことから、導入Schwnn細胞からの神経栄養因子の分泌が増強しているものと思われた.また移植実験で、BDNF遺伝子導入Schwann細胞を封入した人工神経は、特に高い神経誘導能を有していることが判明した.人工神経は、外径2mm、内径1mmのtube構造をした生体吸収性polymerで、内壁はpolycaprolactone(PCL)とpolylactic acid(PLA)の共重合体によるスポンジ構造よりなり、スポンジの孔径は、Schwann細胞(直径約30μm)のseedingが容易となるように平均50μmに調節した.その外周は、PLAの細い線維で編んだメッシュ構造で取り囲み、tube構造の維持を図った.Tubeの表面は、細胞の接着をよくするためtype1 collagenでcoatingした.Wistar ratの坐骨神経からcollagenaze/dispazeを用いて分離培養したSchwann細胞を、12x10^5cells/mlの細胞浮遊液として、この生体吸収性polymerで作製した人工チューブにseedingした.これを培養系に移行して、CO_2 incubatorで48時間培養したところ、電子顕微鏡(SEM)で、大量のSchwann細胞がチューブ内に3次元培養されている様子が観察された.次に、Schwann細胞付加チューブを、Wistar ratの坐骨神経を切断して作製した20mmのgapに移植し、8週での組織学的に神経の再生を観察した.コントロールのsilicone tubeでは、切断神経間に架橋組織は見られず、一方、Schwann細胞をseedingしたチューブを移植した群では、全例でtube内腔に太い架橋組織が見られ、多数の再生有髄神経が誘導されていた.ハイブリッド型人工神経の軸索誘導能力を高めるため、播種するSchwann細胞に、神経誘導因子の導入を試みた.この研究は、遺伝子の導入によって蛋白レベルでSchwann細胞の機能をコントロールし、神経再生能力の優れたSchwann細胞を播種することで、自家神経移植をしのぐハイブリッド型人工神経を開発することを目的としている.最初に、制限酵素で切り離した神経栄養因子であるcDNAを、サイトメガロウィルスプロモーターと蛍光色素のGFP遺伝子が組み込まれている非増殖型アデノウィルスベクターに組み込み、大腸菌内で相同組み換えをおこさせてコントラクトを完成させた.

次に、これをヒト胎児腎由来細胞株293細胞に導入して培養した.約1週間で、GFPの発色が強くなった時点で、293細胞壁を破壊してウィルスを細胞外に放出させ、これを繰り返して濃縮を続けた.最終的に高濃度のウィルスを作製し、これをSchwann細胞にかけて感染させ、遺伝子導入を図った.神経栄養因子遺伝子導入Schwann細胞をウェスタンブロットで調べたところ、コントロールに比べて大量の神経栄養因子を発現していることが判明した.また、Schwann細胞の特異マーカーのS100蛋白も発現していることが確認された.この遺伝子導入したSchwann細胞を、生体吸収性のスポンジチューブ内に3次元培養したものを、ラット坐骨神経の欠損部に移植、再生軸索の経過を観察した研究では、遺伝子導入したSchwann細胞を含むハイブリッド型人工神経が、遺伝子導入しないSchwann細胞を含む人工神経よりも、多くの再生神経を誘導していた.