hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粒子フィルタによる神経細胞カルシウム蛍光時系列の解析

本年度,交付申請書に記載した2件の研究を行った.1件は,細胞内のカルシウムイオンをカルシウム指示色素によって測定する1波長カルシウムイメージングの1点の蛍光時系列から,細胞内カルシウムイオン濃度を推定する較正の問題である.この問題はカルシウム指示色素が実用化された初期の段階から定式化されてきた重要な問題で,以降決定論的な較正式と較正パラメータに対する実験的同定方法が多く提案されてきたが,細胞に侵襲等不可逆的操作を加えないで較正パラメータを同定することができない点,観測時にノイズによるシグナルの劣化が原理的に避けられないため決定論的な較正式では結果に誤差が生じてしまう点など,問題があった.本研究では,細胞内のカルシウムイオンが蛍光時系列として観測される過程を,カルシウム濃度,濃度変化の不連続点,色素濃度の3つを潜在変数とした状態空間モデルによってモデル化した.さらにパラメータに対し蛍光強度のダイナミックレンジという色素固有の性質をベイズ統計の枠組みにおけるパラメータの事前分布に用いることで,侵襲的な方法でのパラメータ同定を必要としない,かつノイズで劣化した時系列を用いて正しいカルシウム濃度の推定ができる統計的方法を開発した.提案した方法は,潜在変数に対しパラメータの周辺化事後確率を用いたベイズ推定を行う.それを逐次モンテカルロ法によって実現した.数値実験および生理実験データを用いて提案手法の有効性の検証を行った.もう1件の研究は,1件目の問題を空間的に拡張し,樹状突起を計測した多点の蛍光時系列から樹状突起上で生じる時空間的なカルシウム濃度変化とカルシウム流量を定量的に推定する問題である.樹状突起内でのカルシウムイオンと色素,カルシウムバッファの反応拡散過程をモデル化し,空間的な次元をもつ高次の状態空間モデルを構築する.パラメータと潜在変数の推定を行うアルゴリズムを拡張カルマンフィルタで実装した.数値実験によって提案手法の有効性を検証した.生理実験データを用いた検証は今後の課題である.本年度,交付申請書に記載した2件の研究を行った.1件は,細胞内のカルシウムイオンをカルシウム指示色素によって測定する1波長カルシウムイメージングの1点の蛍光時系列から,細胞内カルシウムイオン濃度を推定する較正の問題である.この問題はカルシウム指示色素が実用化された初期の段階から定式化されてきた重要な問題で,以降決定論的な較正式と較正パラメータに対する実験的同定方法が多く提案されてきたが,細胞に侵襲等不可逆的操作を加えないで較正パラメータを同定することができない点,観測時にノイズによるシグナルの劣化が原理的に避けられないため決定論的な較正式では結果に誤差が生じてしまう点など,問題があった.本研究では,細胞内のカルシウムイオンが蛍光時系列として観測される過程を,カルシウム濃度,濃度変化の不連続点,色素濃度の3つを潜在変数とした状態空間モデルによってモデル化した.さらにパラメータに対し蛍光強度のダイナミックレンジという色素固有の性質をベイズ統計の枠組みにおけるパラメータの事前分布に用いることで,侵襲的な方法でのパラメータ同定を必要としない,かつノイズで劣化した時系列を用いて正しいカルシウム濃度の推定ができる統計的方法を開発した.提案した方法は,潜在変数に対しパラメータの周辺化事後確率を用いたベイズ推定を行う.それを逐次モンテカルロ法によって実現した.数値実験および生理実験データを用いて提案手法の有効性の検証を行った.もう1件の研究は,1件目の問題を空間的に拡張し,樹状突起を計測した多点の蛍光時系列から樹状突起上で生じる時空間的なカルシウム濃度変化とカルシウム流量を定量的に推定する問題である.樹状突起内でのカルシウムイオンと色素,カルシウムバッファの反応拡散過程をモデル化し,空間的な次元をもつ高次の状態空間モデルを構築する.パラメータと潜在変数の推定を行うアルゴリズムを拡張カルマンフィルタで実装した.数値実験によって提案手法の有効性を検証した.生理実験データを用いた検証は今後の課題である.
ホヤの金属結合タンパク質を組み込んだリポソームの作製

海産無脊椎動物のホヤのバナジウム濃縮細胞(バナドサイト)は、海水濃度の1000万倍に相当する350mMものバナジウムを濃縮している。しかしながら、このように極端な濃度勾配に逆らって金属を濃縮する際に共役するエネルギー機構の解明はまだ手掛けられていなかった。われわれは、バイドサイトの液胞内がpH1.92.4という強い硫酸酸性を示し、そこに濃縮されたバナジウムが低酸化状態の3価に還元されて濃縮されていることを明らかにしてきた。さらに、免疫学的手法を用いてこの細胞に液胞型H_+-ATPaseが存在し、この酵素の得異的阻害剤により液胞内の低pHが維持できなくなることを見い出した。そこで、バナジウムを選択的に輸送するタンパク質が、H_+-ATPaseの働きにより形成された液胞内外のプロトンの電気化学的ポテンシャル差をバナジウムの濃縮エネルギーとして利用しているか否かを検討するために、ホヤの血漿中及び血球中に存在する金属結合能を有するタンパク質を精製し、これらを人工脂質に組み込んだプロテオリポソームを作製することを目標として研究を進めた。本研究では、スジキレボヤのバナドサイトに含まれるタンパク質を可溶化し、DEAE・セファセルの陰イオン交換カラムによる分画を行い、さらにSDS-PAGEによりバナジウム結合タンパク質を抽出した。バナドサイトからタンパク質を抽出する作業は、共存するペロテアーゼのために困難であったが、プロテアーゼ阻害剤存在下で抽出を行うことにより、分子量15.5-kDaのバナジウム結合タンパク質を得ることに成功した。今後、さらに血球および血漿から金属結合タンパク質の精製を進めるとともに、これらを人工脂質に組み込んだ金属取り込み能を有するプロテオリポソームを構築して、金属を特異的に認識する機構と濃縮エネルギー機構を明らかにしていきたい。
教育的コンテンツを対象とした高度情報統合・配信に関する研究

大学内に散在する講義・講演ビデオ、プレゼンテーション資料、研究論文等の教育および研究に関するコンテンツを蓄積し、各素材を有機的に統合し、ネットワークを介して付加価値の高い知識資源を配信し、有効利用することを目指して研究を行ってきた。主たる研究成果としては、講義・講演ビデオと講義・講演で用いるプレゼンテーション資料を同期させてメタデータを用いて統合蓄積し、同期情報を有効利用して検索する手法であるUPRISE、研究論文データベース中の論文の参照関係をマイニングすることで研究論文間の流れの抽出と研究論文のクラスタリングを行い研究のマクロな流れの理解を助けるリサーチマイニング手法、教育・研究コンテンツを蓄積・解析・配信することなどを対象としたワークフローシステムを構成する手法、蓄積・検索において必要となるメタデータを記述するXMLの効率的な格納方法に関する手法等を提案し、評価を行ってきた。また、それらを蓄積・検索するための基盤として、講義・講演ビデオ、プレゼンテーション資料、研究論文等の幅広いコンテンツを登録し、UPRISEやリサーチマイニングのような検索手法を可能とすると同時に全文検索やメタデータに基づく検索機能も提供するKnowldegStore(KS)を構築し、実際に大学関係者のコンテンツの蓄積を開始した。UPRISEに関しては、その検索機能と利用者インタフェースの改善を行うとともに、レーザーポインタ情報を用いた検索や音声情報を用いた検索の手法を提案し、大学で実際に行った講義に適用してその効果を確認した。また、リサーチマイニング手法に関しても、実際の論文データベースに適応させて効果を確認すると同時に、利用しやすいユーザインタフェースの開発を行った。ワークフローに関しては、故障を考慮してQoSを保つ手法の提案を行い、その効果を示した。XMLの格納に関しても、効率の良い格納手法や検索手法の提案を行い、その効果を示した。大学内に散在する講義・講演ビデオ、プレゼンテーション資料、研究論文等の教育および研究に関するコンテンツを蓄積し、各素材を有機的に統合し、付加価値の高い知識資源をネットワークを介して配信してすることを目指している。これまでに、講義・講演ビデオとプレゼンテーション資料を同期させてメタデータを用いて統合蓄積し、同期情報を有効利用して検索する手法、研究論文データベースの参照関係をマイニングすることで研究論文間の流れの抽出と研究論文のクラスタリングを行い研究のマクロな流れを理解する手法、教育・研究コンテンツを蓄積・解析・配信することなどを対象としたワークフローシステムを構成する手法等を提案し、評価を行ってきた。今年度は、これまでの研究を更に進め、機能の充実を図り、蓄積・検索のための基盤の整備を行うとともに、次のステップへの検討を開始した。蓄積・検索のための基盤としては、講義・講演ビデオ、プレゼンテーション資料、研究論文等の幅広いコンテンツを登録し、UPRISEやリサーチマイニングのような検索手法と同時に全文検索やメタデータに基づく検索も可能とするKnowldegStore(KS)を構築し、実際に大学関係者のコンテンツの蓄積を開始した。また、UPRISEに関しては、その検索機能と利用者インタフェースの改善を行うとともに、レーザーポインタ情報を用いた検索や音声情報を用いた検索のための検討を開始した。リサーチマイニング手法に関しては、マクロな研究の流れを解析するためのクラスタリングの粒度設定指針に関して研究を行った。
視覚的認知・意識に関わる脳内プロセスの非侵襲的定量計測

本研究の目的は視覚的認知や意識の問題を客観的指標となる物理量の計測という立場から自然科学的研究手法で捉え理解することである。そこで注目したのが意識の一階層である視覚的アウェアネス(visual awareness)を定量的に研究することのできる稀少な現象であるとの考えが受け入れられつつある両眼視野闘争過程(左右の眼に個別に与えられる異なる刺激が交互に知覚される過程)である。本研究では、この視野闘争中の不随意な眼球運動を両眼独立に高精度で測定し、知覚交替に伴う眼球運動変化時刻と被験者の主観に基づくボタン押しの交替時刻に基づく知覚交替時刻との対応関係に関して詳細な検討を行った。知覚運動図形の交替に伴う視運動性眼振(OKN)の緩徐相における眼球運動方向が変化する時刻を抽出した結果、視野融合時と同様、視野闘争時においてもOKNの変化はボタン押し交替より有意に先行する事が判明した。OKN変化に対するボタン押し交替の遅れが視野融合時に比べ視野闘争時は有意に増大した。又、ボタン押しに比べOKN変化の個人差が小さく知覚交替を客観的かつ正確に決定できる事が分かった。本研究ではさらにこの視野闘争に関連する中枢神経活動をfMRIにより検討した。被験者には知覚交替に応じたボタンの押し分けを指示した。実験は両眼に呈示される刺激の向きが同一(視野融合条件)、縦と横と異なる(視野闘争条件)、同一であるが、直前の視野闘争条件におけるボタンの押し分けにより記録した時間間隔により縦、横を交替させる(再現条件)各27sの3つのブロックから成る。視野闘争、視野融合、再現の各条件間の比較を行った結果、後頭葉のブロードマンの脳地図における18、19野(視覚前野)、頭頂葉の7野、前頭葉の6野において視野闘争に関連すると思われる活動を捉えることができた。本研究は視覚的認知(visual awareness)や意識の問題を従来の心理学や哲学的立場からではなく、客観的指標となる物理量の計測という立場から自然科学的研究手法で捉え理解することを目的として行われた。人間のように左右両眼の視野に重複部がある動物では、両眼視に固有の知覚過程が生ずる。この両眼視の機能の中で、両眼視野闘争(左右の眼に個別に与えられる異なる刺激が交互に知覚される過程)として知られている現象は、視覚的認知や意識を定量的に研究することのできる稀少な現象であるとの考えが受け入れられつつある。本研究では、この両眼視野闘争における知覚図形の内的交替に関連する大脳皮質部位と神経活動を事象関連電位、自発脳波律動の変動、眼球運動に基づき非侵襲的に検討した。被験者9名を対象に、知覚図形の内的交替を被験者のボタン押しにより決定し、これをトリガとして頭皮上20点の脳波α波分散、および事象関連電位の時空間変化について計測・検討を行った。また比較のため視野闘争過程を生じさせるのに用いた2つの競合する刺激を外的に交替させ、それに伴う脳波変動と刺激の交替とは関わらないボタン押しのみによる変動も計測した。視覚刺激は1°×1°の縞刺激である。その結果、脳波α波分散については、後側頭から後頭にかけて約-500msからα波分散の減衰が始まり、約-250msに減衰ピークが見られた。一方、事象関連電位については、左頭頂から左後側頭において-400msから0msにかけて時間的にブロードな陰性の電位成分が見られた。脳波α波分散の減衰、および陰性電位成分共に知覚交替に関連した神経活動を反映すると推察された。さらに、競合運動する刺激を呈示された場合に生ずる視野闘争時において、知覚交替に伴う眼球運動変化の抽出により客観的に被験者の知覚している図形を検出することに成功した。
小細胞肺癌の循環腫瘍細胞を根絶する新規抗腫瘍免疫療法の開発

DDX3Xという蛋白質を高発現する癌細胞は浮遊で生存することが可能となり、高い浸潤、増殖能を有する癌幹細胞の性質を獲得することを報告してきた。本研究において、小細胞肺癌を解析した結果、遠隔転移を持つ進展型患者ではDDX3Xを発現している循環腫瘍細胞が存在しており、限局型という遠隔転移のない患者ではDDX3X陽性の循環腫瘍細胞が存在しないことを明らかとした。また、限局型ではDDX3Xに反応するTリンパ球が存在するのに対して、進展型では認められなかった。以上の結果は、DDX3Xに対する抗腫瘍T細胞免疫が高い転移能を持つDDX3X陽性循環腫瘍細胞を駆逐し、遠隔転移を防いでいることを示した。小細胞肺癌の循環腫瘍細胞を駆逐する癌幹細胞(CSC)特異的抗腫瘍免疫療法の開発を目的とする、ことを目的として平成26年度より本研究を行った。1.オンコリスバイオファーマとの共同研究として行った末梢血循環腫瘍細胞の検討では、進展型小細胞肺癌患者より得られた5検体中全てでテロメラーゼ活性を有する循環腫瘍細胞が検出された。また、この循環腫瘍細胞の染色により、4検体でDDX3Xの発現を認めた。一方、限局型小細胞肺癌患者から得られた7検体中3検体でテロメラーゼ陽性の循環腫瘍細胞を検出したが、DDX3Xの発現をもつものは一つも認められなかった。2.末梢血中CD4+ T細胞がDDX3Xに反応してIFNγを産生するか検討したところ、限局型小細胞肺癌患者12症例中5例で反応を認めたが、進展型小細胞肺癌患者7症例、健康ボランティア6例では全く反応を認めなかった。以上より、進展型小細胞肺癌患者は末梢血を循環する腫瘍細胞が存在すること、その細胞は癌幹細胞化、EMTを進めると考えられるDDX3Xを発現しているが、これに対するT細胞免疫反応を欠如していることが明らかとなった。限局型小細胞肺癌では逆にDDX3Xに対するT細胞免疫応答が認められ、末梢血を循環する腫瘍細胞はDDX3Xを発現していないことから、DDX3Xに対するT細胞免疫が末梢血における血行性転移の障壁として働いている可能性が示唆された。これらの結果は、論文投稿の準備中である。小細胞肺癌患者の末梢血循環腫瘍細胞についてTelomeScan F35を用いて検出を試みた。TelomeScan F35はテロメラーゼ陽性細胞においてGFPを発現するよう遺伝子改変されたアデノウイルスであり、不死化細胞である癌細胞はこのウイルス感染によりテロメラーゼを有するため蛍光を発する。また、miR-142-3pを組み込むことにより血球系細胞への感染を最小限に抑制している。この系を用いて検討した結果、CD45-GFP+循環腫瘍細胞を14症例中6例で検出した。CellSearchと同様な手法であるEpCAM発現による検出率は、3/14でありTelomeScan F35の約半数の症例のみで認められた。EpCAM陽性循環腫瘍細胞検出例は全てTelomeScan陽性症例に含まれていた。Telomerase陽性循環腫瘍細胞は生細胞を検出する系でありながら、死細胞でも検出可能なEpCAM陽性細胞検出系よりも感度が高い結果となった。TelomeScan陽性細胞は、7.5mlの全血検体から最大235個を検出した。臨床病期との関連では、N0-1症例では検出されなかったのに対して、N2症例で40%、N3症例で57.1%の検出率であった。遠隔転移を持たないM0症例では37.5%に陽性であり、M1症例では50%の陽性率であった。また、我々が癌幹細胞化、EMT化を促進する蛋白質として注目しているDDX3Xは、遠隔転移陽性症例の循環腫瘍細胞全てにおいて発現されていた。一方、遠隔転移を持たない限局型の小細胞肺癌症例ではDDX3X陽性循環腫瘍細胞は認められなかった。末梢血循環腫瘍細胞を生細胞として捉え、解析する系としてTelomeScan F35は有望であると考えられた。以上の結果は、2015年日本癌学会総会において発表した。本研究では、小細胞肺癌患者の1.手術検体、2.生検検体、3.末梢血循環腫瘍細胞、4.末梢血T細胞、についてDDX3Xの発現、stemness marker、DDX3Xに対するサイトカイン産生能などを解析するものである。平成26年度において、#3の末梢血循環腫瘍細胞におけるDDX3X発現解析をすでに10症例で終了した。#4の末梢血

T細胞DDX3X反応性の解析も26症例について終了しており、有望な結果を得ている。この結果は論文投稿の準備中である。#2の気管支鏡生検検体の解析は、通常生検検体では難しいことが判明しEBUS-TBNA検体を用いることに変更して進めている。以上より、研究目的については概ね順調に進展していると判断できる。呼吸器内科1.小細胞肺癌臨床検体を用いた循環腫瘍細胞、生検腫瘍組織からのDDX3X発現を、更に症例数を増やして検討を進める。さらに、循環腫瘍細胞におけるPD-L1発現の検討を追加する。3.小細胞肺癌患者末梢血より分離したCD4 T細胞、CD8 T細胞のDDX3X反応性検討を継続して進める。小細胞肺癌の末梢血循環腫瘍細胞、末梢血Tリンパ球の解析は当初の予定通り進んでいるが、気管支鏡生検検体については通常生検では組織の挫滅が強く十分な検査結果が得られないことが判明した。現在、EBUS-TBNA生検検体を用いて解析を進めているが、症例数が当初予定よりも少なかったため、抗体購入費として残余が生じた。昨年度残余の55,387円については、今年度抗体購入費として使用することを予定している。
新規治療開始HIV感染症患者の免疫系の活性化と骨密度低下の機序の解明

新規にcARTを開始した31例を対象に、cART開始1年間の骨密度骨密度低下と関連のある因子の同定を行った。テノホビルおよびプロテアーゼ阻害薬使用症例で骨密度低下が有意であった。またCD4陽性Tリンパ球が低い症例ほど骨密度の低下が大きかった。CD4陽性Tリンパ球のレベルと関連を認めたことで、骨密度の低下には何らかの免疫学的な影響が関与していることが裏付けられた。しかしながら、LPS刺激に対する単核球のIL-1betaの産生量とCD4陽性Tリンパ球のレベルとの間に関連は認めなかった。cART開始1年間には骨密度が大きく低下するため、それを予防する方策を講じる必要があると考えられた。HIV感染症患者で骨密度が低下することは、我々を含む国内外の研究で明らかになっている。HIV感染症のどの時期に特に骨密度の低下が認められるかを解明することは、骨密度低下を予防、軽減する上できわめて重要と考えられるが、この点に関してはまだ十分知見が得られていない。我々は、cART導入後のHIV感染症患者の骨密度の推移を詳細に検討した。その結果、cART導入後約半年は、cART導入前と比べ、著しく骨密度が低下することが判明した。その一方で、cART導入後約半年以降の患者では、一部(約15%)を除き、ほとんど骨密度の低下が進展しないことが判明した。骨密度の推移がなぜこのような経過をたどるかについての機序は、全く解明されていないが、cART導入後約半年以降の患者では、ほとんどの患者で骨密度の大きな変化を示さないことから、この時期の骨密度の低下には、抗HIV薬の関与が最も疑われる。一方cART導入後間もない時期については、抗HIV薬の種類に関わらず低下がみられることが示されている。cART導入直後は、ウイルス量が急速に低下し、抑制されていた宿主の免疫系が活性化することが知られている。そのため、cART導入早期の骨密度の大きな低下の原因として、宿主の免疫系の(過剰な)活性化、特に単球・マクロファージやTリンパ球の活性化が関与していている可能性が推測される。本研究は、基礎的・臨床的アプローチの両面から、cART導入早期の単球・マクロファージやTリンパ球の活性化と骨密度低下の関連および分子機序を解明することを目的として行っている。新規に抗HIV薬を開始した2症例を対象として、経時的に骨密度の測定および血液および尿中の種々のマーカーを測定した。ただ平成27年度は検討症例数が少ないため、統計学的な解析は行っていない。本研究は新規に抗HIV薬を開始する症例を対象として行うが、平成27年度は新規にcARTを開始した症例が非常に少なかった。またAIDSを発症してcARTを開始した症例が、患者状況により、エントリーできなかったことも研究対象者の減少の一因となった。ただしエントリーした患者では、以下の検討を行った。cART開始時の、年齢、性別、(推定)HIV感染症罹患年数、治療薬等の患者情報を調査した。cART開始時および24週後に、既治療群では、エントリー時と24週後にDXA(Dual-energy X-ray Absorption)を用いて、腰椎および両側大腿骨頸部の骨密度の測定を行った。さらにcART開始時、cART開始4週後、12週後および24週後に、白血球数、白血球分画、(高感度)CRP、HIV RNA量、リンパ球サブセット(CD4陽性Tリンパ球数、CD8陽性Tリンパ球数)を測定した。またRANKLやOPG、活性型ビタミンD3(1α,25(OH)2D3)、PTHやIL-1&#61538;、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインの測定用に、血清を冷凍保存した。細胞レベルでの病原微生物による単球の活性化の解析を、TLR4で認識されるLPSとTLR7/8で認識されるHIV特異的ssRNAで刺激し行うが、この実験系を確立した。本研究は、基礎的・臨床的アプローチの両面から、cART導入早期の免疫系、特に単球・マクロファージやTリンパ球の活性化と骨密度の変化を検討し、骨密度の変化に関連する因子を解析することで、その分子機序を解明することを目的としている。平成28年度は、新規にcARTを導入した患者(新規治療群)2例とcART開始後1年以上経過し、HIV RNA量が検出感度以下の症例(既治療群)20例の解析を行った。既治療群では目標症例数の解析ができたが、新規患者数が少なかったため、新規治療群の目標症例数は確保できなかった。新規治療群では、症例数が少ないため有意な結果は導けないが、約1年間の推移で、リンパ球サブセットを用いた解析では、CD4陽性細胞数の増多を認めた。しかしながら、単球・マクロファージ系に有意な変化は見られなかった。またHIV RNA量は検出感度以下まで低下した。DXA(Dual-energy X-ray Absorption)を用い腰椎および両側大腿骨頸部の骨密度の測定では、2症例すべてで両部位の骨密度の低下を認めた。一方既治療群では、全例でリンパ球サブセットの有意な変化は認めず、HIV RNA量は検出感度以下のまま推移した。約1年間の推移で、腰椎および両側大腿骨頸部の骨密度の変化は認めなかった。現在解析の途中経過ながら、cART導入初期には、骨密度の低下が認められるが、cART

導入1年以上経過し治療経過が良好な症例では、骨密度はほとんど変化しない可能性が指摘できる。ただし、現時点で得られているデータからは、免疫学的変動と骨密度の変化は不明である。平成28年度は、エントリーできた症例に対しては、解析をほぼ行うことができた。その結果、確定的ではないが、新規治療群と既治療群の骨密度の推移の傾向をつかむことができた。新規患者については、何名確保できるかは予測不可能であり、平成28年度の検討症例数は少なかったが、平成28年度後半から患者数が増加しており、平成28年度はより多くの症例がエントリーできる見込みである。我が国を含むアジアからのHIV感染症患者と骨密度低下に関する報告は少ない。本研究は、基礎的・臨床的アプローチの両面から、cART導入早期の免疫系、特に単球・マクロファージやTリンパ球の活性化と骨密度の変化を検討し、骨密度の変化に関連する因子を解析することで、その分子機序を解明することを目的としている。現在までの国内外での研究から、cART導入時の骨密度の低下は明らかになりつつあるが、免疫学的な面では有意なものは明らかになっていない。骨密度低下と関連のある臨床的指標の探索は、平成27年度からの研究と同様の解析を継続した。その結果、日本人男性HIV感染症患者で新規にcARTを開始した31例を対象に、cART開始直前と開始1年度の骨密度骨密度低下と関連のある因子の同定を行った。核酸系逆転写酵素阻害薬のテノホビルおよびプロテアーゼ阻害薬使用症例で骨密度低下が有意であった。またCD4陽性Tリンパ球が低い症例ほど骨密度の低下が大きかった。治療薬の因子を除外すると、CD4陽性Tリンパ球のレベルと関連を認めたことで、当初の推測通り臨床的な解析からは、骨密度の低下には何らかの免疫学的な影響が関与していることが裏付けられた。新規にcARTを開始した5例について、cART開始4週目前後でのLPS刺激に対する単球の活性化の程度をIL-1betaの産生量を指標として、ELISA法を用いて解析を試みた。しかしながら、検索症例数が少ないこともあるが、IL-1betaの産生量とCD4陽性Tリンパ球のレベルとの間に関連は認めなかった。3年間の本研究からは、cART開始1年間には骨密度が大きく低下するため、それを予防する方策を講じる必要があると考えられた。また骨密度低下とCD4陽性Tリンパ球のレベルとの間に関連があり、骨密度の低下には免疫学的な機序が関与していると考えられた。新規にcARTを開始した31例を対象に、cART開始1年間の骨密度骨密度低下と関連のある因子の同定を行った。テノホビルおよびプロテアーゼ阻害薬使用症例で骨密度低下が有意であった。CD4陽性Tリンパ球のレベルと関連を認めたことで、骨密度の低下には何らかの免疫学的な影響が関与していることが裏付けられた。しかしながら、LPS刺激に対する単核球のIL-1betaの産生量とCD4陽性Tリンパ球のレベルとの間に関連は認めなかった。cART開始1年間には骨密度が大きく低下するため、それを予防する方策を講じる必要があると考えられた。本研究は新規に抗HIV薬を開始する症例を対象として行うため、平成28年以降も多くの新規患者をエントリーさせて研究を継続する。
遺伝子解析に基づいた難聴発症メカニズムの解明および個別化医療システムの構築

本研究では、信州大学の管理する難聴患者DNAバンクのうち、インベーダー法を用いたスクリーニング検査で原因の明らかとならなかった難聴患者500名を対象に、難聴の原因遺伝子として報告されている遺伝子の網羅的解析を実施し、稀な原因遺伝子変異を見出すとともにその臨床像を明らかにすることができた。また、前項の既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行っても難聴の原因を特定できなかった症例のうち、家系内に複数罹患者をみとめ、なおかつ家族のDNA試料のある家系を対象に、全遺伝子のエクソン領域を網羅的に解析するエキソーム解析を行い、新規原因遺伝子候補を複数見いだすことができた。平成27年度は、当研究室の難聴患者DNAバンク(約6500名)のうち、インベーダー法を用いた難聴スクリーニング検査で原因の明らかとならなかった難聴患者500例を対象に、難聴の原因遺伝子として報告されている遺伝子の網羅的解析を行った。その結果、大規模集団における日本人難聴患者の原因遺伝子変異のスペクトラムを明らかにすることができた(Nishio and Usami 2015)。また、既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行っても難聴の原因を特定できなかった症例のうち、比較的大きい家系5家系を対象に全遺伝子のエクソン領域を網羅的にエキソーム解析を実施した。その結果、うち3家系より、新規の難聴原因候補遺伝子を同定することができた。これらの遺伝子に関して内耳における局在を明らかにすることを目的に、マウス内耳における発現部位を免疫組織染色で確認を行った。また抗体の入手が困難であった1遺伝子に関しては、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により内耳を部位別に分断し、RNAを抽出して遺伝子発現を確認し、内耳における機能的役割について検討を行った。当初の計画どおり500例に対するターゲットリシークエンス解析が完了した。また、原因の特定できなかった家系に関してエクソーム解析を実施し候補遺伝子を同定することができた。平成28年度は、当教室の管理する難聴患者DNAバンク(約6500名)のうち、717例を対象にインベーダー法+次世代シークエンス法を用いた19遺伝子154変異の網羅的スクリーニング検査を行い原因遺伝子変異の種類と頻度を明らかにした(Mori et al., 2016)。その結果、日本人難聴患者の原因遺伝子変異として、GJB2遺伝子が最も多く、次いでSLC26A4、CDH23遺伝子が多いことが明らかとなった。また、臨床像別に検討を行ったところ、KCNQ4遺伝子やミトコンドリア遺伝子変異は遅発性の進行性難聴群に多く認められることを明らかにした。また、上記スクリーニング検査を行っても原因の特定に至らなかった難聴患者を対象に次世代シークエンサーを用いた既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行い、稀な原因遺伝子変異による難聴家系を複数家系見出し報告した(Kitano et al 2017 in press)。また、新規遺伝子変異の見出されたDIAPH1遺伝子変異に関しては共同研究により難聴発症の分子メカニズムとしてAuto-regulationの不全によるアクチンバンドルの過形成により生じることを明らかにした(Ueyama et al., 2016)。さらに、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により、蝸牛における遺伝子発現の解析を行い、蝸牛内の部位ごと(コルチ器、外側壁、ラセン靭帯、ラセン神経節)における既知難聴原因遺伝子の発現レベルに関して報告を行った(Nishio et al., 2017)当初の計画通り1000例を対象に既知難聴原因遺伝子のターゲットリシークエンス解析が完了した。また、原因の特定できなかった家系を対象に全エクソーム解析を実施し候補遺伝子を同定することができた。さらにレーザーマイクロダイセクション法によりコルチ器に発現する遺伝子を同定した。平成29年度は、当教室の管理する難聴遺伝子データベースのうち2540例を対象に次世代シークエンス解析を実施したデータを元に、コピー数多型を検出するプログラムの開発を行った。その結果、250例より何らかのコピー数多型が見出された。このうち、41例(1.7%)はSTRC遺伝子の2コピー欠失変異であり、常染色体劣性遺伝形式をとる難聴の原因となっていることが明らかとなった。また、結果を論文として取りまとめて報告した(Nishio et al. Mol Genet Genomic Med. 2018 in press.)また、既知難聴原因遺伝子のうち、低音障害型感音難聴の原因であるWFS1遺伝子に関して詳細に検討を行った。その結果、日本人難聴患者2550例中19家系に13種類の原因遺伝子変異を見出した。見出された19家系はいずれも進行性の低音障害型感音難聴を呈していた。また、optic atrophyを伴う症例は19家系中1家系であり、稀な随伴症状であることが確認された。(Kobayashi et al., PLoS One 2018)また、既知難聴遺伝子をターゲットしたパネル解析を実施しても難聴の原因特定に至らなかった症例を対象に全エクソーム解析を行い、新規原因候補遺伝子の探索を行った。その結果、解析を行った複数の家系で候補となる原因遺伝子変異が複数同定された。そこで、全エクソーム解析で得られた候補遺伝子に関して、内耳での機能的意義を推定することを目的に内示における遺伝子発現をリアルタイムPCR法およびRNA-Seqにより検討した。加えて、いくつかの原因に関しては蛍光免疫染色を行い、内示における局在に関しても検討を行った。

本研究では、信州大学の管理する難聴患者DNAバンクのうち、インベーダー法を用いたスクリーニング検査で原因の明らかとならなかった難聴患者500名を対象に、難聴の原因遺伝子として報告されている遺伝子の網羅的解析を実施し、稀な原因遺伝子変異を見出すとともにその臨床像を明らかにすることができた。また、前項の既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行っても難聴の原因を特定できなかった症例のうち、家系内に複数罹患者をみとめ、なおかつ家族のDNA試料のある家系を対象に、全遺伝子のエクソン領域を網羅的に解析するエキソーム解析を行い、新規原因遺伝子候補を複数見いだすことができた。平成28年度は前年度までに既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行っても難聴の原因を特定できなかった症例のうち、比較的大きい家系を対象に全遺伝子のエクソン領域を網羅的にエキソーム解析を実施し、新規の難聴原因候補遺伝子を同定する。また、新規の遺伝子に関しては機能や難聴発症のメカニズムが不明であることより、マウス内耳における発現部位を免疫組織染色およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により内耳を部位別に分断し、RNAを抽出して遺伝子発現を確認することにより、内耳における局在や機能的役割について検討を行い、論文として報告する。平成29年度は前年度までに既知難聴原因遺伝子の網羅的解析を行っても難聴の原因を特定できなかった症例のうち、比較的大きい家系(家族歴を有する家系)を中心に全遺伝子のエクソン領域を解析する全エクソーム解析を行い、新規の難聴原因遺伝子変異を同定する。また、新規に同定された遺伝子変異に関しては、機能未知である場合が多いことより、マウス内耳における発現部位を免疫組織染色およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により同定し、内耳における局在や機能的役割に関して検討を行う。また、最終年度であるため成果を取りまとめ論文として報告を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。耳鼻咽喉科学耳科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
滑らかな設計抽象化に関する研究

抽象化はソフトウェア開発において重要な役割を果たすが,どの関心事を設計としてモデル化し,どの関心事をコードとして記述すべきかを判断することは容易ではない.また,開発の進行と共に設計とコードの間のバランスを再考をせざるを得ず,その結果として,両者間の抽象度が変化する.本研究では,適切な抽象化を支援するための概念「滑らかな設計抽象化」,開発支援環境iArchおよび抽象化のためのソフトウェアパターン集を提案した.「滑らかな設計抽象化」とは,設計モデリングとプログラム実装の間を滑らかに移動した収束点として適切な抽象度が得られるという考え方である.設計はソフトウェアアーキテクチャの抽象的な記述であり、コードはその設計を実装したものである。設計は「適切に」抽象的でなければ意味がないが、「適切な」レベルを発見するのは容易ではない。本研究では、インタフェース機構Archfaceを発展させ、設計とコード間の整合性検査をトリガーに反復的に両者のバランスを再考し「滑らかに」抽象レベルを決定するための技術を明らかにする。「滑らかな設計抽象化」を実現するための機構は、1)抽象レベルを設定するためのArchface、2)抽象レベルを測定するためのメトリクス、3)設定した抽象レベルを保持しつつ設計とコードの整合性を検証するための機構、の3本柱で構成される。平成25年度は、Archfaceのための型システムについて研究を行った。Archfaceではプログラムモジュールだけでなく設計モデルもモジュールと考えるため、設計モデルとコードの両方に対して機能する型システムを構築する必要がある。我々の型システムではArchfaceはアーキテクチャ点を公開すると考える。モジュールとしての設計モデルがそのインタフェースすなわちArchfaceに適合しているとは、設計モデルの中に公開されたアーキテクチャ点に対応する設計点が含まれていることを意味する。一方、クラスなどのプログラムモジュールがArchfaceに適合するとは、公開されたアーキテクチャ点に対応するプログラム点がコード中に存在する場合である。また、抽象レベル測定のためのメトリクスについては、設計点、プログラム点、アーキテクチャ点の間の比率として算出する方法を考案した。現在、本研究と並行して、Archfaceベースの統合開発環境iArchを構築しており(基盤研究(B)にて開発)、今回の型検査アルゴリズム、抽象レベル測定メトリクスをこの開発環境の中に実装した。設計はソフトウェアアーキテクチャの抽象的な記述であり、コードはその設計を実装したものである。平成26年度は、基本アイデアを数理的に形式化した。その成果は、ソフトウェア工学分野におけるトップカンファレスの一つであるASE2014 (Automated Software Engineering)に論文採択された。また、従来より開発を進めていたArchfaceベースの統合開発環境iArchの機能拡張を実施した。具体的には、抽象度を考慮した「リファクタリング支援」「リバースエンジニアリング支援」「データフロー図とのトレーサビリティ支援」を開発した。最終年度の平成27年度は、これまでの研究成果を整理し、ジャーナルに投稿する予定である。平成25年度はArchfaceのための型システムについての研究を行い、平成26年度は基本アイデアを数理的に形式化した。平成27年度は、我々のアイデアをツール化したiArchの機能を充実させた。本研究と並行して、平成26年度より「不確かさを包容するモデル駆動開発機構に関する研究」(基盤研究A)をスタートさせており、本研究の成果を「不確かさ」に関わる研究にも応用した。不確かさが扱えるようにArchfaceを拡張したArchface-U、iArchを拡張したiArch-Uを開発した。本研究は研究計画の面では順調に進んでおり所定の成果を上げているが(ソフトウェア工学のトップカンファレンスASE2014への論文採録など)、更なる発展を目指して一年間研究期間を延長したい。具体的には、研究成果を報告するための学会参加や論文投稿をもう少し実施したい。また、支援ツールiArchの機能強化を実施したい。本研究では、インタフェース機構Archfaceを発展させ、設計とコード間の整合性検査をトリガーに反復的に両者のバランスを再考し「滑らかに」抽象レベルを決定するための技術を明らかにした。

「滑らかな設計抽象化」を実現するための機構は、1)抽象レベルを設定するためのArchface、2)抽象レベルを測定するためのメトリクス、3)設定した抽象レベルを保持しつつ設計とコードの整合性を検証するための機構、の3本柱で構成される。平成25年度はArchfaceのための型システムについての研究を行い、平成26年度は基本アイデアを数理的に形式化した。平成27年度と28年度は、我々のアイデアをツール化したiArchの機能を充実させた。また、ソフトウェア工学のトップカンファレンスであるASE2014に論文採録されるなど、研究業績としても大きな成果を残した。本研究と並行して、平成26年度より「不確かさを包容するモデル駆動開発機構に関する研究」(基盤研究A)をスタートさせており、本研究の成果を「不確かさ」に関わる研究にも応用した。不確かさが扱えるようにArchfaceを拡張したArchface-U、iArchを拡張したiArch-Uを開発した。平成28年度には、統合開発環境iArch-U(オリジナルのiArchの機能を含む)をオープンソースソフトウェアとしてGitHubから正式に公開すると共に、英語版の公式Webサイトを開設し、研究成果を世界に向けて発信した。抽象化はソフトウェア開発において重要な役割を果たすが,どの関心事を設計としてモデル化し,どの関心事をコードとして記述すべきかを判断することは容易ではない.また,開発の進行と共に設計とコードの間のバランスを再考をせざるを得ず,その結果として,両者間の抽象度が変化する.本研究では,適切な抽象化を支援するための概念「滑らかな設計抽象化」,開発支援環境iArchおよび抽象化のためのソフトウェアパターン集を提案した.「滑らかな設計抽象化」とは,設計モデリングとプログラム実装の間を滑らかに移動した収束点として適切な抽象度が得られるという考え方である.応募時の目標は概ね達成されており、研究成果はトップカンファレンスASE2014に論文採択された。ただ、ASE2014で発表した形式化は基本的なレベルに留まっており、さらなる掘り下げが必要である。これについては最終年度に取り組む予定である。研究の更なる発展を目指して、研究期間を一年間延長する。平成28年度が最終年度であり、今までの研究成果をトップカンファレンス論文やジャーナル論文の形にまとめたい。本研究と並行して進めている「不確かさを包容するモデル駆動開発機構に関する研究」(基盤研究A)は、本研究で開発したインタフェース機構Archfaceを不確かさが扱えるように拡張したものであり、平成29年度以降は、技術面だけでなくツール実装面でも一本化して行く予定である。
新規転移モデルによる浸潤・転移機構の解明ならびに抗転移薬の作用機序の解明

1.新規転移モデルの作製と解析。癌組織はheterogeneousな細胞集団と言われている。癌組織に類似した生体内での浸潤・転移機構の解明を目的に,蛍光ラベルした浸潤・転移能に相違のあるヒト舌癌細胞株(非転移性:SQUU-A転移性:SQUU-B)を混和後同所性移植し,局在を検討した。移植7日では同様の分布を示したが、徐々に非転移性癌細胞が中心部より消失し,21日では辺縁部に認めるにすぎなかった。従来辺縁部の細胞が浸潤・転移に関連していると考えられてきたが,転移性・非転移性の両癌細胞が局在していた。この新規モデル系は組織での腫瘍の進展の解明に有用なモデル系であると考えられた。2.抗転移薬(HGFのアンタゴニストNK4,エンドスタチン)の作用機序の解析NK4は供与していただいたアデノウイルス発現ベクターを使用し,エンドスタチンのアデノウイルス発現ベクターは当科にて作製した。nullとそれぞれのアデノウイルス添加後の遺伝子の発現の差をdifferential display法にて検討し,RT-PCR法にて確認したが,相違のある遺伝子を得ることができなかった。そこでマイクロアレイ解析を行ったところ,発現の相違を多数検出したので,その再現性の検討を行っている。NK4の場合,デスモコリン3の発現の相違を検出したので,非転移性癌細胞株と転移性癌細胞株での相違を検討した結果,非転移性癌細胞株では発現していたが,転移性癌細胞株で消失しており,転移抑制に関与することが示唆された。1.新規転移モデル系の作製および解析同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のあるヒト舌癌細胞株SQUUの各クローン(A:非転移,B:高転移,C:造腫瘍能なく間葉系の性質)をホスト細胞とし,蛍光発色Enhanced Green Fluorescent Protein(EGFP)(緑)や発光色の変異体DsRed(赤色),ECFP(シアン)を発現する癌細胞株を作製。A由来A-EGFP(緑色)とB由来B-DsRed(赤色)は恒常的に蛍光発色を示した。C由来C-ECFPは不安定なため再作製中。A-EGFPとB-DsRedをそれぞれ同所性移植し,浸潤像と転移率がホスト癌細胞移植時と変化がないことを確認。A-EGFP,B-DsRedの混合群を移植し,経時的(移植後1日,21日,35日)に検討。1日では均等に混在。21日,31日後の腫瘍先進部では主にB-DsRedの局在を認めた。現在剖検時を(1日,7日,14日,21日,28日,35日)とし,検体数を増やし検討中。各クローン単独および混合群移植後35日のMMPの発現を免疫染色にて検討し,有意差はなかった。組織内MMP活性検出法であるfilm in situ zymography(FIZ)法にて腫瘍先進部のB-DsRedにMMP-2,MMP-9の活性型の発現を認めた。移植部の細胞を酵素処理し,FACS sortにてそれぞれ回収したA-EGFPならびにB-DsRedとin vitroの各癌細胞間の遺伝子の発現の相違をGenomic Figer Print法およびDifferential Display法にて検討し,発現の相違を6バンド検出したので,その遺伝子の塩基配列を解析している。2.抗転移薬効果の検討ならびに作用機序の解析各クローンを同所性移植したヌードマウスに,抗転移薬NK4を投与したところ,腫瘍増殖の抑制を認め,移植後35日では転移を認めなかった。移植日数を増大させ転移の有無を検討中。PCNA染色とTUNEL染色にて,投与群に癌細胞のアポトーシスが増大。免疫染色ならびにFIZ法にてMMPの発現を検討している。1.浸潤・転移関連遺伝子の解析同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のあるヒト舌癌細胞株

SQUUの各クローンにおけるin vitro, in vivo(舌移植部)での遺伝子の発現をGenomic Figer Print法およびDifferential Display法にて検討したが,検出効率が悪かった。そので,ヒト肝臓由来のアレイ(15000個),およびヒト白血球由来のアレイ(15000個)によるマイクロアレイ解析(アレイは九州大学大学院農学研究院・田代康介助教授より供与)に変更し解析を行った。約200種類遺伝子の発現の相違を得たので,そのシークエンスならびにその遺伝子のトランスフェクタントを作製し機能解析を行っている。2.抗転移薬効果の検討ならびに作用機序の解析抗転移薬はNK4(HGFのアンタゴニスト)ならびエンドスタチンについて検討を行っている。高転移性クローンを用い,in vitroでの浸潤能の変化をインベイジョンアッセイにて検討した結果,NK4添加にて浸潤能の低下を認めたが,エンドスタチンでは変化がなかった。in vitroでの抗転移薬の癌細胞に対する作用機序の解明のために,各抗転移薬を高転移性クローンに添加した群と非添加群における遺伝子の発現の相違についてGenomic Figer Print法およびDifferential Display法を行ったが相違を検出しなかった。そこで,上記マイクロアレイ解析にて検討した。遺伝子の発現の相違をNK4に関しては約50種類検出,エンドスタチンに対しては約20種類検出したので,そのシークエンスを行っている。in vivoでの検討は抗転移薬の入手ならびに投与法のため発現アデノウイルスベクターによる方法を取ることとした。NK4に関してはADCMV・NK4は東北大学の貫和教授より供与していただいた。エンドスタチンに関しては現在作製中である。作製後投与群と非投与群での遺伝子の発現の相違をマイクロアレイ解析する。1.浸潤・転移関連分子の解析(癌と間質および癌細胞間相互作用を考慮)浸潤・転移能に相違のある舌癌細胞株の遺伝子の発現をin vitroとin vivo(1種類の癌細胞株の同所性移植群,転移性・非転移性癌細胞株を混在した新規転移モデル群)にて各々マイクロアレイ解析を行い比較検討した。in vivoにて発現する遺伝子を認めたので,それらの遺伝子を同定した。in vivoでは(ヒトの遺伝子と一部共通性が有る場合)マウスの遺伝子を検出している可能性があるので,これらの遺伝子を発現している細胞の同定を行っている。新規転移モデル群の解析より得られた癌細胞間の相互作用に関与する遺伝子を10種類同定した。これらの遺伝子の局在を検討している2.抗転移薬の作用機序の解析抗転移薬NK4(HGFのアンタゴニスト)とエンドスタチンについて検討した。NK4(アデノウイルス発現ベクター:東北大学貫和教授より供与)はin vitroとin vivoともに浸潤能をおさえた。投与・非投与群の遺伝子の発現をマイクロアレイ解析し,発現の相違遺伝子を同定した。エンドスタチンは市販の試薬を使用したが,浸潤能を押さえず,マイクロアレイ解析にて相違を認めた20種類の遺伝子の再現性もなかったので,当科にてエンドスタチンのアデノウイルス発現ベクターを作製し,投与にて血管内皮細胞の浸潤能の抑制や動物の皮下移植の腫瘍の増殖抑制を認めた。
高選択的グリコシル化反応開発へのアプローチ

本研究の目的は化学的糖鎖合成の基本であるグリコシル化反応において、より高い立体選択性をえることにある。糖供与体の活性化によって発生する反応中間体であると考えられるオキソカルベニウムイオンはカチオンであるから、電子供与性の有機化合物(リガンド)を反応系内に加えれば、オキソカルベニウムイオンとリガンドとの間に何らかの相互作用を期待することができる。その結果、糖受容体のオキソカルベニウムイオンへの求電子的な攻撃する方向をコントロールしうるのではないかと予測した。同時に、オキソカルベニウムイオンに相互作用しうる化合物は、この中間体のカチオニックな性質を相殺して反応性を低下させてしまう恐れもある。そこで本年度は3価のリンを脱離基として有する糖供与体、すなわち2,3,4,6-テトラベンジルグルコースのジエチルフォスファイト(ジエチル亜リン酸エステル)とピリジン-2-メタノールとの間のグリコシル化反応を例として添加剤の検討を行った。添加剤無しの条件下、2,3,4,6-テトラベンジルグルコースのジエチルフォスファイト(α:β=ca7:3)とピリジン-2-メタノールの塩化メチレン溶液に、-78°C下TMSOTfを滴下、撹拌することにより、約60%の収率で目的物である(2-ピリジルメチル)-2,3,4,6-テトラベンジルグルコシドをα:β=40:60で得た。同様の反応をプロピオニトリル中で行うと、選択性はα:β=70:30となり若干ながらα体が増加した。ニトリル基がオキソカルベニウムイオンに相互作用しているためと考えられる。そこで塩化メチレンを溶媒とする反応系に1当量の1,1,3,3-テトラメチル尿素を加えた。この化合物はHMPAなどと同様、リチウムなどの金属カチオンに配位すると考えられる化合物である。上記の条件と同様の反応の結果、収率は極端に低下してしまった。1,1,3,3-テトラメチル尿素はオキソカルベニウムイオンに相互作用してその活性を著しく低下させてしまうことがわかった。
セロトニン神経路の発達・成熟に対する栄養因子の作用機序の解明

モノアミン神経系は脳の広範な領域に投射し、脳の発達や機能調節を担っている。そのため、脳の発達期におけるモノアミン神経系の発達・機能異常は、自閉症などを始めとする種々の神経精神疾患の病態に寄与すると考えられている。しかし分化終了後のモノアミン神経細胞の発達や生存に対して、個々の栄養因子の作用差や、セロトニン神経路の形態的・機能的な発達や成熟への関与については不明な点が多い。本研究では栄養因子群によるセロトニン神経の発達成熟に対する制御機構に着目し、この疑問に迫った。H26年度はラット菱脳初代培養系を用い、以下の基盤データを得た。(1)各栄養因子の生存・発達への影響とその差異:予備実験では、BDNF, FGF2, GDNFなどの栄養因子毎に、セロトニン神経の生存や形態的発達に対する作用の違いが見られた。そこで、免疫化学的手法を用いて、細胞の生存や形態的・機能的発達を比較した。FGFファミリー(FGF2・FGF4・FGF8)については、いずれもセロトニン神経の生存・発達に促進作用を示した。これらの栄養因子は、同じ発生起源であるドーパミン神経に対しても増殖因子として作用する。初代培養細胞では、微量のドーパミン細胞の混入、およびTPH/THの2重陽性細胞がみられる。BDNFやGDNFは、セロトニン細胞の生存/発達促進効果に加え、こういった2重陽性細胞の増加もみられる。しかしながら、FGF2については2重染色性に対する変化はみられなかった。(2)サリドマイド及びその誘導体による、生存・発達抑制効果の検証:予備実験では、サリドマイドはセロトニン神経の生存・発達に抑制作用を示した。そこで、サリドマイドとその誘導体(レナリドマイド・ポマリドマイド)処理によるセロトニン神経への発達抑制作用を、免疫化学的手法にて評価した。その結果、レナリドマイドおよびポマリドマイドについては、サリドマイドのような生存・発達抑制効果は見られなかった。サリドマイドの作用機序を明らかにするため、サリドマイドに関連する炎症シグナルの一つであるIκB/NFκBの変化をウェスタンブロット法にて検出した。その結果、サリドマイド添加により、NFκBの低下を認めた。また、bFGF添加群でのNFκBの変化は確認できなかったが、FGF2とサリドマイドの両方を添加した群では、サリドマイド単独使用でみられたNFκBの低下が阻害されたことから、炎症性シグナルの関与の可能性が考えられる。1)昨年度の研究で観察されたTPH/TH2重陽性細胞の性質について、発達段階での変化を追うことからその性質を推察した。ラットの胎生14日から生後3日までの縫線核では、セロトニン神経細胞のマーカーであるトリプトファン水酸化酵素(TPH)と、ドパミン神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素(TH)2重陽性細胞は徐々に数が減少した。それと並行し、TPH陽性細胞数は増加した。同様に、ラット菱脳初代培養細胞では、培養開始から培養8日目までの間に、2重陽性細胞数は減少した。これらの結果から、この2重陽性細胞は発達段階の初期に限定的に存在する細胞であり、未分化な性質の細胞である可能性が示唆された。2)サリドマイドによる生存・発達阻害効果について、TPH陽性細胞に正の生存・発達活性を示す栄養因子群と共投与することで、その作用機序を推察した。TPH陽性細胞に対して活性を示すFGF2, BDNF, NRG1をサリドマイドと共投与すると、これらはサリドマイドによる生存・発達障害活性を阻害する。しかし、TPH/TH2重陽性細胞に対しては、サリドマイドの作用に対する阻害効果を示したのはBDNFのみだった。3)サリドマイドの中心的な標的分子であるセレブロンがE3ユビキチンリガーゼであることから、上記のようなセロトニン細胞に対する阻害がユビキチンープロテアソーム系に関連する可能性を検討した。ブロードなプロテアソーム阻害剤であるMG132を初代培養細胞に添加したところ、TPH陽性細胞、およびTPH/TH陽性細胞に対する阻害効果は得られなかった。培養細胞でのユビキチン化阻害効果は、サリドマイドとMG132で同様の効果が見られたことから、我々の条件で見られたようなサリドマイドの生存・発達阻害効果には、ユビキチンープロテアソーム系の関与の可能性は低いことが示唆された。上記の結果について、論文作成を進めている。H26年度は、研究計画に基づき、培養系を用いた栄養因子およびサリドマイドの発達/生存に対する効果やその違いをを検討できた。そのため、本研究仮説である、分化完了後のセロトニン神経に対して栄養因子が異なる効果をもたらすという仮説の検証はできたと考えている。しかしながら、サリドマイドの標的分子であるセレブロンについては、予備実験等進めているが、十分なデータを取るところまでは到達できていない。