hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工多能性幹細胞を用いた高効率エナメル芽細胞分化誘導法の確立

iPS細胞をアメロブラスチン(Ambn)高発現歯原性上皮細胞株SF2-24と共培養、もしくはSF2-24の培養上清を用いたconditioned medium(CM)存在下で培養することにより、iPS細胞をエナメル芽細胞に分化誘導することが可能であった。また、SF2細胞が培養液中に分泌するAmbnやNT-4、BMPシグナリングが、iPS細胞からエナメル芽細胞への分化過程において重要な役割を演じていることが示唆された。iPS細胞をアメロブラスチン(Ambn)高発現歯原性上皮細胞株SF2-24と共培養、もしくはSF2-24の培養上清を用いたconditionedmedium(CM)存在下で培養することにより、iPS細胞をエナメル芽細胞に分化誘導することが可能であった。現在、歯科領域においては、歯の細胞や組織の再生を応用した治療技術は確立していない。ヒトの歯の再生医療として人工細胞や人工歯胚再構築を応用するには、自家移植可能な十分な数の歯原性細胞を調整・調達する必要がある。そこで、我々は人工多能性幹細胞(iPS細胞)から歯原性細胞、中でもエナメル芽細胞を高効率に分化誘導するシステムの確立を本研究の目的とした。我々の以前の研究において、マウス由来iPS細胞とアメロブラスチン(Ambn)を高発現するラット歯原性上皮細胞株SF2-24との共培養系、SF2-24のconditioned medium (CM)培養系を行った結果、培養7日目と10日目でiPS細胞におけるエナメル芽細胞分化マーカーAmbnとエナメリン(Enam)、ならびに上皮細胞マーカーp63やサイトケラチン14(CK14)の発現が経時的に増加していた。共培養14日目の免疫染色で、iPS細胞塊周囲から分化した上皮細胞様集団の約95%がAMBN陽性細胞となっていたことから、iPS細胞とエナメル芽細胞との培養により、iPS細胞が一部エナメル芽細胞に分化誘導されることを明らかにしていた。本研究期間内に、iPS細胞をAmbn低発現歯原性上皮細胞のCMで培養した結果、iPS細胞におけるAmbn発現は誘導されなかった。また、SF2-24CMによる培養時に、抗NT-4抗体を加えた結果、CK14の発現増加は認められたがAmbnの発現が明らかに阻害されていた。本結果より、iPS細胞と歯原性上皮細胞株SF2-24のCM培養系によってiPS細胞をエナメル芽細胞に分化誘導することが可能であり、分化誘導に用いた細胞から分泌されるAmbnやNT-4がエナメル芽細胞への分化過程で重要な役割を演じていることが示唆された。このことは、iPS細胞を他の細胞と共培養することなく、これら誘導因子を利用して安全性の高い高効率エナメル芽細胞分化誘導法の確立に繋がると考えられる。歯科領域において、未だ歯の細胞や組織の再生を応用した治療技術は確立していない。ヒトの歯の再生医療を目的として、人工細胞や人工歯胚を再構築し応用するためには、自家移植可能でヒトの歯冠を形成するのに十分数の歯原性細胞を調達する必要がある。そこで、我々の研究グループでは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から歯原性細胞、中でもエナメル質を形成するエナメル芽細胞を高効率に誘導するシステムの確立を本研究の目的とした。我々の研究グループでは、以前から歯原性上皮細胞からエナメル芽細胞への分化維持には、エナメル芽細胞が分泌する細胞外基質アメロブラスチン(Ambn)が重要であることを明らかにしている。そこで、マウス由来iPS細胞とAmbnを高発現する歯原性上皮細胞SF2-24との共培養系ならびにSF2-24の培養上清による分化誘導系を行った結果、iPS細胞の一部をエナメル基質であるAmbnおよびエナメリンを発現する歯原性上皮細胞に分化させることに成功した。また、iPS細胞をAmbn低発現歯原性上皮細胞の培養上清で培養した結果、iPS細胞におけるAmbn発現は認められなかった。さらに、SF2-24培養上清による培養時に、神経栄養因子であるNT-4の抗体を加えた結果、Ambnの発現が顕著に阻害されていた。本結果より、分化誘導に用いた歯原性上皮細胞SF2から分泌される誘導因子として、AmbnやNT-4がエナメル芽細胞への分化過程で重要な役割を担っていることが示唆された。これらの因子を用いてより高効率のエナメル芽細胞分化誘導法の確立に繋がると考えられる。ヒトのエナメル芽細胞はエナメル質形成が完了すると消失してしまうため、本研究により得られるiPS細胞由来歯原性上皮細胞は、エナメル芽細胞の分化メカニズムの解析に有効であり、将来的なエナメル質再生、人工歯胚再構築実現の可能性をもたらすと考えられる。我々は、iPS細胞を歯原性上皮細胞との培養によってエナメル芽細胞に分化誘導することにすでに成功しており、本研究の期間内目標は、iPS細胞をエナメル芽細胞に分化誘導する主な因子の同定、それを応用した培養系を用いて効率の良い分化誘導法を検討することであった。今回、期間内に、エナメル芽細胞への分化にAmbnおよびNT-4が重要な役割を担っていることを明らかにすることが出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後、iPS細胞の分化誘導に用いるSF2-24細胞のconditioned medium (CM)に含まれるAMBNおよびNT-4以外の誘導因子についても検討を行い、それらを用いたエナメル芽細胞への効率化を図る。また、iPS細胞由来エナメル芽細胞をSCIDマウス皮下に移植してテラトーマの形成について検証することで、iPS細胞のエナメル芽細胞への分化効率および再生医療への安全性の検討を行うこととする。24年度が最終年度であるため、記入しない。
化石動物の性差・性別判定方法の確立

現生動物の角やとさかには性差が見られることが多い.性差は,主に性選択により発達し,種分化・形態的多様性に深く関連している.一方,化石動物の中にも角やとさかなどを持つものが多くいたが,性差が見出されているものはごく一部で,性差が見られない化石動物では,性選択以外のプロセスでとさかなどの構造が進化したとする仮説が提唱されている.しかし,多くの化石種に性的二型が見られないのは,先行研究の手法的欠陥による可能性が高いと考えられる.そこで本研究では,骨組織学的成長段階推定に基づく,新しい化石種の性的二型評価手法の確立を行う.現生動物の角やとさかには性差が見られることが多い.性差は,主に性選択により発達し,種分化・形態的多様性に深く関連している.一方,化石動物の中にも角やとさかなどを持つものが多くいたが,性差が見出されているものはごく一部で,性差が見られない化石動物では,性選択以外のプロセスでとさかなどの構造が進化したとする仮説が提唱されている.しかし,多くの化石種に性的二型が見られないのは,先行研究の手法的欠陥による可能性が高いと考えられる.そこで本研究では,骨組織学的成長段階推定に基づく,新しい化石種の性的二型評価手法の確立を行う.
大規模超電導電力貯蔵の実現をめざした超電導コイル用電流型電力変換器システムの開発

超電導磁気エネルギー貯蔵(SMES)は高効率かつ応答速度が極めて速い理想的なエネルギー貯蔵装置として期待されている。本研究は、超電導コイル用電力変換器システムの実験研究を行い、200V-100A級試作機を開発した。液体ヘリウム温度(4.2K)に冷却された超電導コイルを用いた実験結果より、超電導コイルへの直流電力が制御可能であることを確認し、SMES用変換器としての可能性を実証することに成功した。将来の電力システムにおいて,電力貯蔵設備の積極的な導入が必要不可欠になると予想される。超電導磁気エネルギー貯蔵(SMES)は,電気をそのまま貯められる特長から,高効率かつ応答速度が極めて速い理想的なエネルギー貯蔵装置として期待されている。しかしながら,大規模SMES装置を実現させるためには,超電導コイル用電力変換器システムの開発が必要不可欠な技術課題の一つとなる。このような背景のもと,本研究は,「高効率かつ制御性に優れた超電導コイル用電流型電力変換器システムの実験研究を行い,大規模SMES装置への適用の可能性を実証する。」ことを目的としている。平成20年度は,可変直列コンデンサーの機能を有する電流スイッチとサイリスタ変換器とを組み合わせた超電導コイル用電力変換器システムに関して可能性検討を行った。通常,サイリスタ変換器は,遅れ位相により超電導コイルへの直流電力を制御する。本研究では,電流スイッチを用いて進み位相で直流電力を制御することを試みるものであり,通常のサイリスタ変換器との多重接続を行うことにより電力変換器システムの最適化を行うものである。可能性検討の結果,可変直列コンデンサーにより超電導コイルの充放電制御の可能性を理論的に見出すことができた。また,概念の妥当性をより具体化するために実験機器の整備も進めており,平成21年度は,実証モデルを用いた実験研究を進めていく予定であり,実機レベルでの技術的課題の検討を進めていく予定である。本研究は,「高効率かつ制御性に優れた超電導コイル用電流型電力変換器システムの実験研究を行い,大規模SMES装置への適用の可能性を実証する。超電導コイル用変換器として使用されるサイリスタ変換器は,遅れ位相により超電導コイルへの直流電力を制御する。本研究では,可変直列コンデンサーの機能を有する電流スイッチを用いて進み位相で直流電力を制御し,サイリスタ変換器の直列補償を行うことを試みるものである。平成21年度は,200V-100A級電力変換器システムの試作機を開発し,液体ヘリウム温度(4.2K)に冷却された自己インダクタンス1.8Hの超電導コイルに接続した概念の実証実験を実施した。その結果,電流スイッチの位相制御により,進み位相で超電導コイルへの直流電力が制御可能であることを確認し,超電導コイルの充放電制御が可能になることを実証した。また,直列補償がされていない遅れ位相のサイリスタ変換器と多重接続を行うことにより,超電導コイルへの直流電力制御と無効電力補償が可能になることを確認し,超電導コイル用電流型電力変換器システムとしての適正を実証することに成功した。本研究で得られた成果は,今後パワーエレクトロニクス技術や超電導技術に関する国際会議等で報告を行う予定である。
昇圧チョッパ付NPCインバータの超小型化に関する研究

本課題では新昇圧チョッパをを用いたモータ駆動システムをシミュレーションおよび実機により構築し,直流リンク部のコンデンサリプル電圧5%を実現する新昇圧チョッパ制御法を開発する。新昇圧チョッパはNPCインバータに適した回路構成で昇圧と中性点電位(NPP)制御の両方の機能を合わせ持つ。NPP制御法を用いてコンデンサ容量を従来比の約1/8に低減する昇圧チョッパのPWMパターンを開発する。従来システムのコンデンサ容量は3900μFであることから,470μFに低減することを目標とする。H30年度は,NPCインバータを抵抗負荷に置き換えた回路構成に対し、昇圧およびNPP制御の理論構築を行い、シミュレーションと実験による有効性確認を行った。理論構築では昇圧チョッパのスイッチングモード解析を行い,状態平均化法により昇圧比,コンデンサリプル電圧の理論式を導出した。NPC昇圧チョッパは上側と下側のコンデンサ電圧を個別に制御するため、通流比も任意の値に制御できることが求められるが、それを実現できることを理論的に示した。有効性の確認のため、シミュレーションと実験を行った。シミュレーションにはPSIMを用いた。実験にはスイッチング素子にIGBTを用いた実験回路を構築した。スイッチング周波数は10kHzとした。バッテリ電圧を20Vとし、直流リンク電圧と上下コンデンサ電圧を任意の値に制御するため、通流比を任意の値で制御した。結果として、実機検証により、任意の通流比において昇圧、およびNPP制御の両方を実現できることが示された。NPCインバータを抵抗負荷に置き換えた回路において、昇圧、コンデンサ電圧の理論式を導出し、シミュレーションおよび実験により、その有効性を確認することができた。当初はシミュレーションのみの検討としていたが、共同研究者である芳賀准教授のご協力により、実機検証を前倒しで行うことができた。現在、抵抗負荷に置き換えている部分をNPCインバータに変更し、NPCインバータのみの実験回路を構築する。その際、PWM変調法は三角波比較法でまず実現する。その後、NPC昇圧チョッパと組み合わせ、昇圧チョッパ付NPCインバータの実験回路を構築する。その際、PWM変調法を空間ベクトル法に変更する。実験回路製作と並行し、シミュレーションにおいて、コンデンサ電圧リプルを最小化するためのNPP制御PWMパターンを構築し,その補償効果より確認する。研究遂行上で問題が生じた場合は,負荷を抵抗負荷に変更する,インバータを2レベルに変更する,キャリア比較法によるNPP制御など着実に遂行できるよう対処する。昇圧チョッパの出力モードとNPCインバータの出力ベクトルの協調制御を行うことで、コンデンサリプル電圧を最小化する条件を決定する。実験条件として、直流入力電圧を70V、バッテリ電圧を280Vまで昇圧することを目指す。NPCインバータの負荷は定格出力1.5kWのモータとし、定格運転時におけるコンデンサリプル電圧の評価を行う。モータ負荷において、提案するNPP制御がうまくいかなかった場合、上記と同様の対策で問題解決を図る。

実験条件として、直流入力電圧を70V、バッテリ電圧を280Vまで昇圧することを目指す。NPCインバータの負荷は定格出力1.5kWのモータとし、定格運転時におけるコンデンサリプル電圧の評価を行う。モータ負荷において、提案するNPP制御がうまくいかなかった場合、上記と同様の対策で問題解決を図る。実機実験用のコントローラであるPE-Expert4が主な購入物品である。この購入に際し、キャンペーンによる割引が適用できたたため、支出を抑えることができた。また、旅費について、学内の補助を受けることができたため、旅費の支出は不要であった。よって、翌年度の物品購入費に充当する予定である。
難治性肺疾患におけるmDiaの役割の解析

本研究は、難治性呼吸器疾患におけるRhoエフェクター分子mDiaの役割を解析し、病態解明や将来の治療法開発に応用することを目標とする。急性喘息動物モデルにおいて、mDia1欠損マウスでは、有意に野生型マウスより気管支肺胞洗浄液中の細胞数・好酸球数とも少なく、Th2サイトカインも低値であった。気道過敏性に関してもmDia1欠損マウスでは、野生型より抑制傾向がみられた。mDia1は、アレルギー気道炎症に寄与し、治療標的となりうる。本研究は、難治性呼吸器疾患において、Rhoエフェクター分子mDiaの役割を解析し、病態解明や将来の治療法開発に役立てることを目標としている。研究代表者は、ROCK/Rhoキナーゼ阻害薬が、ヒト肺線維芽細胞を用いた実験において、プロスタグランジンF2αとその受容体FPの線維化促進効果を抑制することを発見したことから(Oga T,et al.Nat Med 2009)、mDiaの組織における炎症や線維化における関与を推定した。mDiaにはmDia1,mDia2,mDia3の3つのアイソフォームが存在するが、本研究ではmDia1欠損マウスを研究分担者より供与して頂き(Sakata D, et al. J Exp Med 2007)、研究に使用した。まず研究代表者は、ブレオマイシンを用いた肺線維症モデルを用い、肺の線維化や炎症を評価する手技を確立し、この遺伝子改変マウスに適用した。ブレオマイシンを経気管的に肺に投与後、21日目にコラーゲン量の指標として肺のハイドロキシプロリンを測定すると、mDia1欠損マウスでは、野生型マウスに比較して、有意に減少していることが判明し、mDia1の肺線維化における効果を確認した。また並行して、気管支喘息動物モデルを立ち上げ、同様にこのマウスに適用した。その結果、mDia1欠損マウスでは、有意にアレルギー性炎症と気道過敏性が抑制されていた。このように、mDia1は、肺線維症と気管支喘息の慢性呼吸器疾患の動物モデルにおいて、炎症と線維化の両面に関与していることが明らかになった。これらの疾患は、罹患率も高く、未だ根治する薬剤が存在せず、病態も未知の部分が多く、研究の推進は重要である。平成23年度は、これらの病態におけるmDia1の関与の機序について解明するよう、実験を重ねていく予定である。本研究は、難治性呼吸器疾患において、Rhoエフェクター分子mDiaの役割を解析し、病態解明や将来の治療法開発に応用することを目標としている。主にmDia1欠損マウスを、急性慢性喘息動物モデルに適用して、炎症、線維化への評価をすすめている。急性炎症期は、マウスに卵白アルブミン(OVA)をアラムとともに2回感作後、1週間OVAを連日吸入させて発症させ、評価する。気管支肺胞洗浄液(BALF)中において、野生型マウス、mDia1欠損マウスともに、非発症マウスより、好酸球を中心として細胞数が増加していたが、mDia1欠損マウスでは、有意に野生型マウスより総細胞数、好酸球、リンパ球、好中球が少なかった。また、気道過敏性もmDia1欠損マウスでは、野生型より抑制傾向がみられた。血清OVA特異的IgEを測定すると、発症群では有意に上昇していたが、mDia1欠損マウスの方が、野生型マウスより有意に低値であった。一方、慢性炎症期は、OVAの連日吸入を2週間と3週間に延ばして、評価した。野生型では、急性期より炎症が徐々に消退傾向にあったが、mDia1欠損マウスでは、炎症レベルは野生型マウスに追いついていき、長期的な炎症抑制は認められなかった。既報では、mDia1欠損マウスでは、T細胞の増殖と遊走能の低下が示されており、本研究では、それがアレルギー性炎症の発症機序に遅れを生じている可能性を考えた。本年度は、喘息モデルでの線維化の評価(コラーゲン測定や組織)や、仮説に基づいて細胞の遊走実験や、過敏性に直結する細胞の収縮能などの評価を行い、本モデルにおけるmDia1の役割を明らかにして、まとめることを目標とする。mDia1欠損マウスを、急性と慢性喘息動物モデルに適用して、炎症、線維化への評価を実施した。急性炎症期は、マウスに卵白アルブミン(OVA)をアラムとともに2回感作後、1週間OVAを連日吸入させて発症させ、評価した。気管支肺胞洗浄液(BALF)中において、野生型マウス、mDia1欠損マウスともに、非発症マウスより、好酸球を中心として細胞数が増加していたが、mDia

1欠損マウスでは、有意に野生型マウスより総細胞数、好酸球、リンパ球、好中球が少なかった。FACSによる解析では、BALF中のリンパ球に関して、喘息発症mDia1欠損マウスでは、野生型に比較して、Tリンパ球、CD4陽性Tリンパ球、CD8陽性Tリンパ球、Bリンパ球、のいずれも減少していた。また、BALF中のTh2サイトカインであるIL4, IL13も、野生型喘息発症マウスの上昇より、mDia1喘息発症マウスでは軽減されていた。血清OVA特異的IgEを測定すると、発症群では有意に上昇していたが、mDia1欠損マウスの方が、野生型マウスより有意に低値であった。気道過敏性に関してもmDia1欠損マウスでは、野生型より抑制傾向がみられた。一方、慢性炎症期は、OVAの連日吸入を2週間と3週間に延ばして評価し、野生型では、急性期より炎症が徐々に消退傾向にあったが、mDia1欠損マウスでは、炎症レベルは野生型マウスに追いついていき、長期的な炎症抑制は認められなかった。既報では、mDia1欠損マウスでは、T細胞の増殖と遊走能の低下が示されており、本研究では、それが急性のアレルギー性炎症の発症機序に遅れを生じているが、慢性的にはT細胞の遊走能も野生型と追いつくため差がみえなくなる可能性を考えた。mDiaの効果を、最初アレルギーモデルと線維症モデルとの2つのモデルを途中まで平行して進めていたため、迷ってしまったが、現在はまずアレルギーモデルをすすめることで方向性が定まったので、遅れは問題ない。24年度が最終年度であるため、記入しない。アレルギーモデルを完遂し、英文論文や学会等で発表する。方向性は決まっているので、今後大きな問題点はない。
Nampt阻害による肺癌増殖抑制効果の検証

計画した研究目的・計画に則って、(1)肺癌のNampt阻害による腫瘍増殖抑制効果の検証と、(2)Nampt阻害による腫瘍増殖抑制効果の作用機序の検証を行った。まず、RT-PCRを用いた実験で、肺癌細胞では正常細胞に比べてNampt mRNAの発現量が高いことがわかった。次に、数種の肺癌細胞株を用いてNampt阻害薬の抗腫瘍効果を評価したところ、EGFR遺伝子変異を有する細胞株で、高い抗腫瘍効果が確認された。さらに、EGFR阻害薬に耐性のEGFR遺伝子変異をもつ肺癌細胞株でも、高い抗腫瘍効果が認められた。次に、肺癌細胞内の増殖シグナル活性の変化を比較したところ、Nampt阻害によって、肺癌の生存・増殖に関わるEGFR系のシグナルが抑制されることが明らかとなった。さらに、Nampt阻害薬の投与で、これら肺癌細胞株にアポトーシスが誘導されることを確認した。肺癌における変異EGFRは、細胞増殖の際に細胞内のATPを多量に取り込むことが知られている。一方、Namptは細胞内ATPの生合成に寄与するという報告があるため、Nampt阻害による肺癌細胞内ATPの合成阻害が、抗腫瘍効果の作用機序ではないかと考えられた。ATPアッセイを行ってこれを検証したところ、Nampt阻害により肺癌細胞内のATP濃度が減少することがわかった。マウスを用いたIn vivo実験でも、in vitro実験と同様にNampt阻害剤による移植肺癌の増殖抑制効果が確認された。また、Nampt阻害剤を投与した移植腫瘍で免疫染色を行ったところ、EGFRの下流シグナルの活性が抑制されていることが明らかとなった。本研究により、肺癌細胞のNamptを阻害すると、(1)細胞内ATP合成能が低下し、(2)EGFRシグナル活性が抑制され、(3)細胞増殖抑制効果・アポトーシスが誘導されることが明らかとなった。以上の一連の研究・検証は、国内外でも初めての試みであり、肺癌の新たな治療ターゲットの確立に寄与する可能性が示唆された。我々はこの成果を国際学会で発表し、英論文として世界に公表した。
大腸癌肝転移に関与する癌微小環境におけるmicroRNAの機能解析

癌間質は癌細胞とクロストークをすることにより、癌細胞の悪性化に関わっているとされ、その働きが近年注目されている。しかし、癌進展に関わる癌間質のmiRNAプロファイルについては、まだ十分明らかになっていない。2018年度までの研究でmiRNAアレイによる網羅的解析により、大腸癌進展と関連する癌間質のmiRNAとしてmiR221および222を同定したため、大腸癌間質におけるmiR221および222発現について検討した。当科で切除された進行大腸癌101例の原発巣からlaser capture microdissection(LCMD)にて癌間質を切り出し、qPCRを行い、癌間質における発現から高発現群と低発現群にわけ、2群における肝転移等の臨床病理学因子と予後について検討した。PCRによる発現解析では、miR221、miR222高発現群では低発現群に比較して肝転移、遠隔転移、脈管浸潤が多く、全生存期間が不良であった。さらに細胞内でのmiR221および222発現の局在を同定するためにin situ hybridization(ISH)を20例の大腸癌症例(肝転移あり12例、肝転移なし8例)で施行した。その結果肝転移症例では75%の症例が間質中線維芽細胞にmiR222発現をみとめたが、肝転移なし症例では25%の症例で発現を認めるのみであった(P=0.04)。一方、miR221に関しては肝転移症例で線維芽細胞の発現が高い傾向はみられたものの、有意差はなかった。癌間質における2つのhighly homologous miRNA, miR221およびmiR222の線維芽細胞における過剰発現は大腸癌進展に関連している可能性が示唆された。計画書で予定していた大腸がん切除標本でin situ hybridizationを行い、miR221,222の癌間質での局在をできたため線維芽細胞にmiR221,222を導入することでがん関連線維芽細胞の機能を持つようになるのか導入実験を行う。先行研究のmiRNAアレイによる網羅的解析により、大腸癌進展と関連する癌間質のmiRNAとしてmiR221および222を同定したため、大腸癌間質におけるmiR221および222発現について検討した。また同様に癌細胞も同時にlaser capture microdissectionで切り出し、同様に予後について検討した。miRNAアレイによる網羅的解析の結果、原発巣癌間質において、miR221およびmiR222はCCH+で有意に高かった。さらにqPCRによる発現解析では、miR221高発現群では低発現群に比較して肝転移、遠隔転移、脈管浸潤が多く、全生存期間が不良であった。同様にmiR222高発現群では低発現群に比較して肝転移、遠隔転移が多く、全生存期間が不良であった。一方、癌細胞におけるmiR221およびmiR222発現と臨床病理学的因子の間に有意な相関はなかった。癌間質における2つのhighly homologous miRNA, miR221およびmiR222の過剰発現は大腸癌進展に関連している可能性が示唆された。計画書で予定していた100例以上での大腸がん切除標本でlaser capture microdissectionを行い、PCRを施行できたため癌間質は癌細胞とクロストークをすることにより、癌細胞の悪性化に関わっているとされ、その働きが近年注目されている。

計画書で予定していた大腸がん切除標本でin situ hybridizationを行い、miR221,222の癌間質での局在をできたため癌間質のmiRNAとしてmiR221および222の局在を判定する目的で、ISHを施行する予定。またほかの大腸がん肝転移にかかわるmiRNAを同定する予定線維芽細胞にmiR221,222を導入することでがん関連線維芽細胞の機能を持つようになるのか導入実験を行う。必要経費として計上したPCR用製品の一部が本研究の予備実験で使用したものを使用することができたため、次年度分に繰り越す予算を確保できた。また翌年のISH用製品は高価で30年度予算では足りない恐れがあるため。2018年度使用予定の抗体が納入できなかったため、この未使用額については平成31年度の抗体購入に充てる
ガラス-金属の陽極接合性に対する表面コーティング層の効果

陽極接合は、ガラスと金属との低温・精密接合法として近年注目されているが、その接合機構に関する基礎的研究は少ない。本研究は、下地金属の表面に各種金属のコーティング層を形成し、ガラスと陽極接合することによって、界面現象に対する金属特性の影響を系統的に調べ、接合機構の解明につなげることを主目的とする。ガラス側の接合試片はホウ珪酸ガラスとし、一方、下地金属は、ガラスとほぼ等しい熱膨張係数をもつ鉄基合金コバ-ルとした。まずコバ-ル合金自身をガラスと接合した結果、接合界面の近傍のガラス中にNa欠乏層が形成され、さらにこの中にKの欠乏層と濃化層が形成されることが分かった。これらの欠乏層内のさらに界面の近傍に、厚さ約100nmの非常に薄いFe-Si系非晶質酸化物層が形成されることを、透過電子顕微鏡観察によって見いだし、従来、接合媒体と示唆されてきた陽極酸化層の形成を実証した。Feと比べて、ガラス中へ陽イオンとして拡散侵入することが非常に困難な、SiおよびAlをガラスと接合した場合、接合面の密着化が著しく加速され、一方界面近傍のNaおよびK欠乏層の幅は非常に狭くなった。これと比べてガラス中に多量に拡散侵入し得るAgの場合は、Na欠乏層は非常に幅広くなったが、Kの欠乏層および濃化層は認められず、代わってAgがNa欠乏層のほぼ全域にわたって侵入していた。但し、Agのガラスとの接合強さは非常に低い。これらの結果について、ガラス中の電位分布の解析に基づき検討を加えた結果、Na欠乏層中に形成される非常に強い電場を、金属から供給される陽イオンが打ち消す効果を考えることによって、いずれも説明することができた。さらに、ガラスとコバ-ル合金との継手に接合時とは逆方向の電圧を印加することによって、界面分離し得ることを示し、継手の分離の可能な接合法としての可能性を示唆した。ガラスと金属との陽極接合における継手性能の材料学的支配因子を解明するため、接合表面に各種金属薄膜をコーティングしたコバ-ル合金(ガラスとほぼ等しい熱膨張係数を持つ)をホウケイ酸ガラスと接合し、金属の種類によって接界面現象と継手性能がどのような影響を受けるかを調べようとしている。まずコバ-ル合金とガラスとを直接接合した場合、界面近傍のガラス中にNaの欠乏した巾数μmの領域が認められた。このNa欠乏領域内には,さらにKの欠乏領域と、それに隣接してKの濃化領域の形成が認められた。この欠乏層には、NaおよびKイオンとの結合が切れたOイオンによる負電荷が蓄積され、金属表面に強い静電引力を及ぼすのみならず、ポアソンの式による解析の結果、急峻な電位勾配が生じ,金属とガラス中のOイオンとの反応を促進することが示唆された.接合界面領域には,透過電子顕微鏡観察の結果、厚さ約100nmのFe-Si-O系非晶質酸化物層および厚さ約10nmの高Fe濃度結晶酸化物層が観察された。Fe-Si-O系非晶質酸化物中のFeイオンは、ガラスの着色状況から、大部分がFe^<3+>であり、従来、Fe^<2+>が支配的とされた熱封着法による界面反応層とは異なることが示唆された。コバ-ル合金表面に、アルミニウムおよびシリコンをコーティングした場合、直接接合の場合と比べて、接合面の密着化が大巾に促進され、またNaおよびKの欠乏領域およびKの濃化領域のいずれもが、非常に狭くなった。

これは、シリコンおよびアルミニウムの場合、Na,Kイオンの欠乏領域にはコバ-ル合金の場合と比べて,高密度の電荷が蓄積されていることを示唆している.またアルミニウムとガラスとの界面には,これらの酸化物から成ると考えられる高電気抵抗層が存在することが,界面インピーダンス測定によって示唆された。今後,アルミニウムおよびシリコンをコーティングした場合について,界面微細構造の観察をさらに続ける予定である。ガラスと金属との低温・精密接合法として近年注目されている陽極接合の接合機構について,材料学的に検討を加えるため,共通の下地金属の表面に各種金属の薄膜をコーティングし,ガラスと陽極接合することによって,界面現象に対する金属特性の影響を系統的に調べようとした。ガラス側の接合試片はホウ珪酸ガラスとし、一方、下地金属は、ガラスとほぼ等しい熱膨張係数をもつ鉄基合金コバ-ルとした。表面にコーティングする金属は,鉄に比べてガラス中への拡散侵入の困難なSiとAl,および大量に拡散侵入し得るAgを選んだ.SiおよびAl薄膜をガラスと接合した場合、コバ-ル合金の場合と比べて,接合面の密着化が著しく加速された.またSiおよびAlとの接合界面の近傍のガラス中には,Na欠乏層が形成され、さらにこの中ではNaよりもかなり移動度の低いKの欠乏層と濃化層が形成された。これらの層は,コバ-ル合金との接合界面近傍においても同様に形成されるが,いずれもコバ-ル合金との界面で観察されるものの方が非常に厚かった.さらに,コバ-ル合金と接合されたガラスにおいては,接合界面と反対側の表面の近傍に,Naの濃化層が観察されたが,SiおよびAlと接合された場合は,観察されなかった.これと比べてガラス中に多量に拡散侵入し得るAgの場合は、Na欠乏層は非常に幅広くなったが、Kの欠乏層および濃化層は認められず、代わってAgがNa欠乏層のほぼ全域にわたって侵入し,また,ガラスの陰極側表面の近傍には,顕著なNaの濃化が認められた.陽極接合中のガラス内での電位分布を解析した結果,接合される金属のイオンの侵入,および界面酸化層の形成による,Na欠乏層内の電場の打ち消し効果によって,これらの結果を説明することができた.さらに、ガラスとコバ-ル合金との継手に接合時とは逆方向の電圧を印加することによって、界面分離し得ることを示し、継手の分離の可能な接合法としての可能性を示唆した。
ウェーブレットを用いた船内騒音の相関解析とその適応制御に関する研究

●不快帯域の適応騒音制御平成12年度の成果に基づき,ウェーブレットを用いた不快な船室内騒音の時間周波数解析及び合成を行い,不快帯域同定の検討を行った.まず,船内を生活の場としているクルーによる騒音評価を行った.その結果,隣室の機関制御室との騒音の比較から400Hz以下を重点的に制御することが有効であることを明らかにした.ただし,400Hz下の全帯域において10dB程度の低減が必要であったが,ピーク値のみの低減効果(20dB)にとどまった.クルーによる聴感評価によると低減されたと言うより,騒音の音色が変わったという印象であった.この実験結果により入力信号の特性の影響が少ない適応制御手法の検討の必要性が生じた.●制御アルゴリズムの検討サウザンプトン大学音響振動研究所において文部科学省在外研究員(短期)の機会を得たので,効果的に制御を行うためにアルゴリズム面からの検討を行った.平成12年度の成果により,ウェーブレットによる相関解析で参照信号の同定は行えていたので,制御アルゴリズムにより制御器の収束性能を向上させることに集中した.ピーク値のみの低減にとどまってしまうのが,plant(アクチュエータとエラーセンサ間の伝達関数)特性と入力信号の特性によることを明らかにし,それを回避し高速に最適解に収束するアルゴリズムを開発した.また,従来のアルゴリズムとの比較も兼ねて,今までのアルゴリズムを系統的にまとめる作業も行った.・非定常負荷時のウェーブレットによる非定常相関まず,シミュレーション及び相関の高い音響信号を用いて行った.Chirp信号と調波構造を持つ信号にて行い,コヒーレンスのみでなく信号の自己相似性の解析も可能であることを明らかにした.その知見に基づき,非定常負荷をかけた場合の非定常相関解析を行った.機関室及び室内振動と音響の非定常相関解析を行った.これにより,負荷変動時の特異点を抽出が可能であることを明らかにした.具体的には,定常時の各所の振動信号をモデリングして,基底ウェーブレットとすることにより,急減速時室内騒音の異音解析も可能とした.これは従来のフーリエ解析に基づく方法では検出が不可能であった.・ウェーブレットを用いたアクティブノイズコントロール(ANC)参照信号の探査ウェブレットによる非定常相関係数からANC参照信号の探索を行った.即ち,エンジン各所の振動が変動を伴う場合も,どの点が参照信号として最適であるかを評価することが可能となった.これを用いたワークステーション内のANCシミュレーションにより,消音量の可能性を調査した.16chDATで機関室や制御対象となる部屋内パネル振動を参照信号として,制御対象となる部屋の音響信号を所望信号とした制御を行った.これまでの研究においては機関そのものと音響のコヒーレンス解析から機関振動を参照信号として制御を行っていたが,今回の解析によりパネル振動の方が参照信号としてはより有効である結果が得られた.この結果より,現在,目標とする20dBの消音効果を船室内シミュレーションにおいて一部の帯域で得ることに成功している.●不快帯域の適応騒音制御平成12年度の成果に基づき,ウェーブレットを用いた不快な船室内騒音の時間周波数解析及び合成を行い,不快帯域同定の検討を行った.まず,船内を生活の場としているクルーによる騒音評価を行った.その結果,隣室の機関制御室との騒音の比較から400Hz以下を重点的に制御することが有効であることを明らかにした.ただし,400Hz下の全帯域において10dB程度の低減が必要であったが,ピーク値のみの低減効果(20dB)にとどまった.クルーによる聴感評価によると低減されたと言うより,騒音の音色が変わったという印象であった.この実験結果により入力信号の特性の影響が少ない適応制御手法の検討の必要性が生じた.●制御アルゴリズムの検討サウザンプトン大学音響振動研究所において文部科学省在外研究員(短期)の機会を得たので,効果的に制御を行うためにアルゴリズム面からの検討を行った.平成12年度の成果により,ウェーブレットによる相関解析で参照信号の同定は行えていたので,制御アルゴリズムにより制御器の収束性能を向上させることに集中した.ピーク値のみの低減にとどまってしまうのが,plant(アクチュエータとエラーセンサ間の伝達関数)特性と入力信号の特性によることを明らかにし,それを回避し高速に最適解に収束するアルゴリズムを開発した.また,従来のアルゴリズムとの比較も兼ねて,今までのアルゴリズムを系統的にまとめる作業も行った.
難治性嗅神経障害の病態生理解明とその診断・治療法開発のための分子生物学的研究

嗅覚伝導路における神経回路の傷害と再生の分子メカニズムの検討を行った。(1)カロリー制限により傷害後の基底細胞の分裂の賦活化が低下し、組織の再生が不完全に終わることが示された。遺伝子の網羅的解析により、本現象に炎症性サイトカインの上昇が関与している可能性が示唆された。(2)嗅粘膜傷害後の再生過程で組織脂肪酸組成が変化し、脂肪酸が脂質メディエーターとして神経再生に関与している可能性が示唆された。(3)喫煙モデルを用いた検討で、タバコ煙曝露により実験的嗅粘膜傷害後の再生が遅延することが示された。1カロリー制限モデルにおける嗅神経上皮の細胞動態の解析:マウスに隔日で低カロリーペレットを与え、摂取カロリーを通常摂取カロリーの約64%に調節して飼育したカロリー制限マウスと対照群マウスの嗅神経上皮の細胞動態の解析を行い、カロリー制限により基底細胞の分裂増殖が抑制され、またメチマゾール傷害を与えた際の神経再生が不完全になることが明らかとなった。2新規ドラッグデリバリーシステムを用いた神経上皮の傷害制御・再生促進に関する解析:神経栄養因子であるBDNFのmRNAを高分子ポリマーに抱合しナノミセルとして嗅粘膜に点鼻投与する新しい方法を開発し、これをメチマゾール傷害後の嗅神経上皮に投与することで神経再生が加速することが明らかとなった。3嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の網羅的解析:8週齢マウスにメチマゾール投与による嗅粘膜傷害を惹起し、傷害後2週間の神経再生が盛んな時期に粘膜を摘出し、メタボローム解析システムを用いて粘膜の脂肪酸組成を非傷害マウスの嗅粘膜と比較した。結果として、嗅粘膜にはDHAが豊富に含まれており、また傷害からの再生過程で脂肪酸組成が大きく変化することが見出された。4n-3脂肪酸合成酵素トランスジェニックマウス(FAT-1マウス)の解析:2と関連してn-3脂肪酸合成酵素のトランスジェニックマウスで体内のn-3/n-6脂肪酸バランスが高く維持されているFAT-1にメチマゾールに嗅粘膜傷害を惹起し再生過程を組織学的に追跡したところ、FAT-1マウスでは傷害後の嗅神経の嗅球への軸索投射が促進されることが見出された。1.カロリー制限が嗅神経上皮の細胞動態に与える影響の解析:2ヵ月齢雄C57BL6マウスをコントロール食と36%カロリー制限下に1ヶ月飼育した後、メチマゾール投与で嗅粘膜傷害を惹起した。さらに2ヶ月飼育を行い鼻腔組織を採取、嗅粘膜を組織学的に解析した。その結果、カロリー制限群では傷害後の嗅上皮再生がコントロール群に比べ不完全であった。この背景にある分子機構を探るため、コントロール食とカロリー制限食で1ヶ月維持したマウスより嗅粘膜を採取し、DNAマイクロアレイ法にて遺伝子発現の差異を網羅的に解析した。カロリー制限群ではIL-6等の炎症性サイトカインが優位に上昇しており、これが組織再生に影響した可能性が考えられた。2.嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の網羅的解析2ヵ月齢雄C57BL6マウスにメチマゾールによる嗅粘膜傷害を惹起した。コントロール群(非傷害群)と傷害後14日の神経再生の盛んな時期に嗅粘膜を摘出し、脂肪酸代謝物の一斉定量分析システム(メタボローム解析システム)でアラキドン酸、EPA,DHA,及びそれぞれに由来する約250種類の代謝物を測定した。その結果、傷害後2週間の時点では抗炎症作用を持つ脂肪酸代謝物が有意に増加していた。傷害後の嗅神経再生過程に脂肪酸がメディエーターとして関与する可能性が示唆された。カロリー制限が嗅神経上皮の細胞動態に及ぼす影響の解析については組織学的解析がほぼ終了し、現在分子生物学的解析に移行している。本年度中に学術誌に投稿できる見込みである。嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の網羅的解析については実際に神経上皮再生期に脂肪酸組成の変化があることが明らかとなった。今後分子機構の解析や臨床応用への橋渡し研究など大きな展開が期待できる状況となった。新規ドラッグデリバリーシステムを用いた神経上皮の傷害制御・再生促進に関する解析については論文が学術誌に受理された。1.嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の解析2か月齢雄C57BL6マウスにメチマゾールによる嗅粘膜障害を惹起した。コントロール群(非傷害群)と傷害後4日、14日、2か月の時点で鼻腔組織を採取、切片を作成し、切片に抗12/15リポキシゲナーゼ抗体による免疫染色を行ったところ、陽性細胞を鼻腔側壁の嗅粘膜固有層の血管周囲に認めた。陽性細胞はコントロールおよび傷害後4日、2か月の組織にはほとんど認められず、嗅神経の再生期に一時的に遊走浸潤する細胞と考えられた。細胞腫の同定のため、マスト細胞(トルイジンブルー染色)、マクロファージ(抗F4/80抗体免疫染色)、好酸球(シリウスレッド染色)をそれぞれ行い抗12/15LOX抗体染色と比較したところ、マクロファージ染色および好酸球染色の分布が抗12/15LOX抗体染色とオーバーラップし、陽性細胞はマクロファージまたは好酸球の可能性があると考えられた。嗅覚障害に対して行われる内視鏡下鼻内手術(ESS)の目的は嗅裂気流を最適化することであるが、術前後の気流動態を可視化することは困難である。そこでCFDの手法を用いて、手術術式と術後の嗅裂気流の動態の変化を解析した。

CT画像を基にvirtual ESSによる汎副鼻腔根本術を行い,術前,術後の鼻腔の気流解析の比較検討を行った.Virtual ESSでは,従来の篩骨洞開放群と,篩骨洞開放に加え上鼻道を十分に開放させた群を作成した.解析結果により、篩骨洞の開放の際に,上鼻道を十分に開放することが術後の嗅裂部における気流量の増加につながることが明らかになり、上鼻道の開放が術後の嗅覚改善に寄与する可能性が示唆された.嗅覚伝導路における神経回路の傷害と再生の分子メカニズムの検討を行った。(1)カロリー制限により傷害後の基底細胞の分裂の賦活化が低下し、組織の再生が不完全に終わることが示された。遺伝子の網羅的解析により、本現象に炎症性サイトカインの上昇が関与している可能性が示唆された。(2)嗅粘膜傷害後の再生過程で組織脂肪酸組成が変化し、脂肪酸が脂質メディエーターとして神経再生に関与している可能性が示唆された。(3)喫煙モデルを用いた検討で、タバコ煙曝露により実験的嗅粘膜傷害後の再生が遅延することが示された。1カロリー制限モデルにおける嗅神経上皮の細胞動態の解析:組織学的解析がほぼ終了し、現在1本目の論文投稿を準備している。本組織解析で明らかとなった細胞動態の変化の背景分子メカニズムを調べるため、コントロール食とカロリー制限食で飼育したマウスの嗅粘膜からRNAを回収しDNAマイクロアレイ解析を行った。現在同解析結果に基づいて定量PCRによる確認作業を準備している。2新規ドラッグデリバリーシステムを用いた嗅神経上皮の傷害制御・再生促進に関する解析:神経栄養因子であるBDNFのmRNAを高分子ポリマーに抱合しナノミセルとして嗅粘膜に点鼻投与することで傷害後の組織再生が促進されることが示された。本研究はすでに論文が受理された。3嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の網羅的解析:若齢動物の非傷害時、傷害からの回復期における脂肪酸組成の解析が行われた段階であるが、両者で脂肪酸組成が大きく異なっているという興味深い結果が得られており、今後の研究の進展が期待できる。4n-3脂肪酸合成酵素トランスジェニックマウス(FAT-1マウス)の解析:組織学的解析が進行している。これまでは理研で飼育したマウスで解析を行っていたが、国内移送の手続きが完了したため今後東京大学耳鼻咽喉科での繁殖が可能となり、研究が迅速に進むことが期待できる。1.嗅神経上皮の傷害・再生過程における遺伝子、蛋白発現の網羅的解析においては次世代シークエンサーを用いて非傷害時と傷害後再生期の遺伝子発現の網羅的解析を行い、データが出たところである。今後は再生期に発現が増加または低下するいくつかの遺伝子群にターゲットを絞って蛋白発現の定量、組織内分布を調べ、また遺伝子欠損マウスを用いた嗅粘膜の解析を行う予定である。2.嗅神経上皮の加齢・傷害・再生過程における組織脂肪酸組成変化の網羅的解析においてはn-3脂肪酸合成酵素トランスジェニックマウス(FAT-1マウス)および12/15-LOX欠損マウス、及び飼料にn-3脂肪酸を添加して飼育するマウスに嗅粘膜傷害を惹起させ、組織の再生の評価及びその過程における遺伝子、蛋白、脂肪酸組成の網羅的解析を行う予定である。
関節リウマチの骨髄における発現遺伝子の解析

関節リウマチ(RA)例および変形性関節症(OA)例のCD34陽性骨髄細胞のmRNA発現量を比較するとFKBP5 (FK506-binding protein 5)遺伝子および転写因子NFkBのmRNAがRA例でより強く発現していた。FKBP5遺伝子を導入した細胞株RAW264.7を炎症性サイトカインTNFαで刺激するとNFkBの発現亢進および線維芽細胞様細胞への形態変化が確認された。これよりFKBP5によるNFkBの活性化が骨髄細胞の線維芽細胞様細胞への変化を通じRAの病態を形成している可能性が示唆された。関節リウマチ(RA)の病態において骨髄細胞の異常が知られており、これまでRAの骨髄でいくつかの遺伝子の発現亢進が報告されている。本研究の目的はRAの骨髄における遺伝子発現を検討し、RAの病態形成に係わる遺伝子を抽出し、RAの病態解明および新たな治療法を開発することである。本研究ではRAの骨髄CD34陽性細胞におけるmRA発現を検討した。RA44例および対照疾患として変形性関節症(OA)32例のCD34陽性骨髄細胞からRNAを精製・cDNAを合成し、これまでに骨髄における発現亢進の報告のあるAmphiregulin、CXCR4、FKBP5(FK506-binding protein 5)につき、mRNA発現量をリアルタイムPCR法にて定量的に解析した。その結果、3種の遺伝子のうちFKBP5 mRNAはOAに比べRAで有意に強く発現していた。患者背景との相関を検討したが、FKBP5 mRNA発現量は年齢、性別、血清C-reactive protein濃度、治療薬(非ステロイド性消炎鎮痛薬、メトトレキサート、ステロイド剤)との有意な相関はみとめられなかった。これより、RA骨髄CD34陽性細胞におけるFKBP5mRNAの発現亢進は治療薬や炎症による二次的変化ではなく、RAのより根源的な病態に関係するものと考えられた。次に、RAの病態におけるFKBP5の機能を確認するため、同遺伝子をマウス・マクロファージ様細胞RAW264.7にトランスフェクションし、同遺伝子の高発現株を作成した。現在、同細胞の形態的・機能的特徴の解析を行っている。本研究は、関節リウマチ(RA)の病態における骨髄細胞の遺伝子発現異常を解析し、RAの病因・病態を解明し新たな治療法を開発する事を目的としている。前年度までの研究において、RA例および対照疾患として変形性関節症(OA)例のCD34陽性骨髄細胞のmRNA発現量をリアルタイムPCR法にて測定したところFKBP5FKBP5 mRNA発現量と各種患者背景因子との相関はなかった。また、炎症に関与する転写因子NFkBのmRNA発現量についても同様に検討したところ、OA例に比べRA例で強い発現が確認された。一方、健常者のCD34陽性骨髄細胞を炎症性サイトカインTNFαで刺激したところ、NFkBのmRNA発現量は増加したがFKBP5のmRNA発現量は増加しなかった。これらより、RA骨髄CD34陽性細胞におけるFKBP5 mRNAの発現亢進は治療薬や炎症による二次的変化ではなく、RAの病態によるものと確認された。次にFKBP5遺伝子をマウス・マクロファージ様細胞RAW264.7にトランスフェクションし、同遺伝子の高発現株(stable transfectant)を作成した。このFKBP5発現クローンにおいて、NFkB発現量をルシフェラーゼアッセイ法にて測定したところ恒常的なNFkBの発現が確認された。しかし同クローンをTNFαで刺激したところ、有意なNFkB発現亢進は確認できなかった。同様に、IL (interleukin)-6や血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の発現量もcontrolと有意差を見いだせなかった。しかし、クローンを約2週間培養したところ線維芽細胞様細胞への形態変化が確認された。これより、NFkB活性化がこの形態変化に関与している可能性が示唆された。前年度までの研究において、関節リウマチ(RA)例および対照疾患として変形性関節症(OA)例のCD34陽性骨髄細胞のmRNA発現量を測定したところFKBP5 (FK506-binding protein5)遺伝子のmRNAがOA例に比べRA例で有意に強く発現している事を発見した。FKBP5 mRNA発現量と各種患者背景因子との相関はなかった。また、炎症に関与する転写因子NFkBのmRNA発現量についても同様の結果であった。健常者のCD34陽性骨髄細胞を炎症性サイトカインTNFαで刺激するとNFkBのmRNA発現量は増加したがFKBP5のmRNA発現量は増加しなかったことから、RA骨髄CD34陽性細胞におけるFKBP5 mRNAの発現亢進は治療薬や炎症による二次的変化ではなく、RAの病態によるものと確認された。FKBP

5遺伝子をマウス・マクロファージ様細胞RAW264.7にトランスフェクションし、同遺伝子のstable transfectantを作成、このクローンをTNFαで刺激したところNFkBの発現亢進および線維芽細胞様細胞への形態変化が確認された。TNFα刺激によりFKBP5の発現亢進はみられなかったことから、FKBP5とNFkBの活性化の機序は異なり、FKBP5によるNFkBの活性化が骨髄細胞の線維芽細胞様細胞への変化を通じRAの病態を形成している可能性が示唆された。さらに、膠原病領域において強皮症は線維芽細胞の増殖と膠原線維の増殖から皮膚硬化をきたす疾患である。そのため患者背景・病態とFKBP5その他の遺伝子の関係を明らかにすべく強皮症患者データベースを構築、解析を行った。
グリアシンシチウムを介するエネルギー供給機構の破綻による巨大脱髄巣形成機序の解明

MS、NMO、Balo病におけるコネキシンの神経病理学的解析が完了した。NMOの脊髄ではisolated perivascular lesionは白質に多発していることを見出した。Th1細胞由来の液性因子がCx43を低下させることを見出した。変異SOD1-Tgマウスにおいて、脊髄灰白質のオリゴデンドロサイトでCx47やCx32が著明に低下することを発見した。グルコース担体および乳酸単体の脱髄病巣における変化について検討し、アストロサイト足突起MCT4の急性期病変での脱落を確認した。血管内皮のGLUT1やMCT1は保持されており、グリア細胞を介した栄養供給障害が存在する可能性を見出した。中枢性脱髄性疾患、とくに多発性硬化症と視神経脊髄炎の剖検標本を用いて、グルコースおよび乳酸トランスポーターである各種GLUT、MCTの発現パターンについて病理学的解析を行った。その結果、急性期脱髄病巣ではアストロサイトの足突起に発現するMCT4の脱落が観察され、MCT4は病巣に浸潤した泡沫状マクロファージの膜表面に発現していた。一方、血管内皮細胞に発現するGLUT1やMCT1は比較的保持されていた。GLUT5は活性化ミクログリアや泡沫状マクロファージに発現亢進していた。GLUT3は障害された軸索で発現が認められた。栄養トランスポーターの神経病理学的検討は概ね完了に近づいている。また、FDG-PETやMRSを用いたMSやNMO患者の画像的研究についても計画を検討している。多発性硬化症、視神経脊髄炎、Balo病の脱髄病巣におけるコネキシン(Cx)蛋白の神経病理学的解析が完了し、急性期の脱髄病巣では共通してアストロサイトのCx43脱落が広汎に認められることを見出した。一連の研究成果を英文総説として発表した(Masaki K. Neuropathology, 2015)。脱髄病巣におけるCx43脱落機序を解明するため、マウス大脳由来初代培養アストロサイトを用いてCx43発現を変化しうる因子を検討した。その結果、T細胞サブセットの中でもTh1細胞由来の液性因子がCx43発現を低下させることを見出した(Watanabe M, Masaki K, et al. Scientific Reports 2016)。一方、Cx43脱落と脱髄の関連をin vivoで評価するため、当科で新たな遺伝子改変マウスを作製した。現在までにTamoxifenによりinducibleなアストロサイト特異的Cx43 conditionalknockout(cKO)マウスの作成に成功している。また、Cx30 KOマウスにEAEを誘導し、視神経でミクログリアの活性化が亢進していること、軸索障害が生じていることを見出した。さらに、グリアシンシチウム破綻の観点から、中枢神経系に広く発現するグルコーストランスポーター(glucose transporters: GLUTs)および乳酸トランスポーター(monocarboxylate transporters: MCTs)の脱髄病巣における変化について解析した。アストロサイト足突起に発現するMCT4の急性期病変での脱落を発見した。一方、血管内皮細胞に発現するGLUT1やMCT1は保持されており、グリア細胞を介した栄養供給経路に障害がある可能性を見出した。これまでの多発性硬化症に加えて、視神経脊髄炎の剖検複数例での神経病理学的解析が順調に進行している。神経病理学的研究については、MSとNMO各群においてどの栄養トランスポーターが最も障害されているかを明らかにする。また、神経画像的研究についても検討をすすめていく。脱髄性疾患グルコース・乳酸トランスポーターの神経病理学的解析を視神経脊髄炎やtumefactive multiple sclerosis、Balo病の剖検標本でも解析を進めていく。これにより、血液脳関門からアストロサイト、オリゴデンドロサイトなどのグリア細胞を介した軸索への栄養供給経路と、各疾患における障害部位の差異などについて検討できる。各種抗体の購入額が予想よりもやや低額で抑えられたため。試薬や抗体などの物品が予定より少ない額で購入・使用可能であったため。次年度も神経病理学的研究を継続予定であり、抗体購入など物品費として使用する。実験に必要な抗体や試薬などの物品費に使用する予定。