hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規レポーターシステムを用いて解き明かす炎症性疾患の発症と寛解のメカニズム

本研究は、活性化免疫細胞のin vivo生体解析およびex vivoの細胞解析の両方を可能とする新規レポーターシステムを構築し、炎症性疾患の発症から寛解に至る過程における免疫応答のダイナミズムを明らかとすることを目的としたものである。現在までの研究実績の概要:本研究で開発を進めてきた新規レポーターシステムは、免疫担当細胞全般で活性化初期に一過性の発現を示す「Nr4a1」の遺伝子座にルシフェラーゼ、GFP、タンパク不安定化ドメインをタンデムにつなぎ合わせた新規レポーター分子(Luc2-AcGFP-ds2)を挿入したBACクローンのトランスジェニックレポーターマウスである。28,29年度の研究により、「免疫応答をin vivo, ex vivoの両方で経時的に捉えるレポーターマウス」の作製に、世界に先駆けて成功した。30年度は、このレポーターマウスを用いた実験に着手し、現在までの研究で、自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の初期過程で、腰部から脊髄に沿って免疫応答の活性化が生じる現象を捉えた。特に、EAE発症の初期段階では第5腰椎(L5)に病原性T細胞が集積することが明らかとされているが、本レポーターマウスでもEAEの発症にさきがけ、L5から特異的に、免疫細胞の活性化を示すルシフェラーゼ発光が検出されている。従って本レポーターマウスは免疫応答の活性化部位を正確に示すことが確認された。現在、引き続きEAEにおける免疫応答活性化の場の推移と病態の変化を照らし合わせた解析を進めており、疾患の発症と寛解のメカニズムを分子・組織学的レベルで解明することが期待される。一番の難題であった新規レポーターマウスの開発に成功し、本マウスを用いた解析は順調に進められている。従って、研究はほぼ計画通り進行していると判断できるが、論文投稿及び学会発表に関し、十分に裏付けの取れたデータの取得は今年度中には間に合わず、補助期間延長の申請をするに至ったため、本研究の進捗状況は「やや遅れている」と判断した。Nr4a1新規レポーターマウスを用いたEAEの解析により、「研究実績の概要」の項で記述したとおり、EAEの発症にさきがけ、既報であるL5腰椎における強い免疫反応を捉えている。さらに、L5腰椎にさきがけて活性化する免疫応答の場、もしくはその後の病態の進行および寛解過程で特異的に免疫応答の活性化を示す場を捉えており、本年度の研究では、それらの結果をた追加実験、再現実験を実施し、十分に裏付けの取れたデータを基に論文投稿及び学会発表を行う予定である。炎症性疾患の研究においては、発症前後の個体間や細胞間の比較解析は広く行われてきている一方で、発症過程を詳細にモニターした研究は少ない。その主な理由の一つとして、分化段階にあるThやTregをin vivoで検出できる強力なシステムが確立されていないことが挙げられる。そこで本研究は、分化段階のThやTregをin vivoで低侵襲的にモニターでき、かつ生細胞として単離・解析できる新規レポーターマウスを構築し、この現状にブレイクスルーを与えるものである。当該年度の研究では、このレポーターマウスの作製に用いるBAC(bacterial artificial chromosome)コンストラクトの作製を行った。このコンストラクトは、Nr4a2遺伝子座を含む約200kb程の遺伝子領域を含むBACクローンに対し、Nr4a2の1st ATG下流にin vivo検出用のルシフェラーゼ遺伝子、およびFACS解析用のGFP遺伝子、およびそれらを一過性発現に導くタンパク分解促進ドメインをタンデムに連結したレポーターユニットを挿入したものであり、Red/ETというシステムを用いた組み換え手法により作製を行った。引き続き、このBACレポーターコンストラクトを用いてトランスジェニックマウスを12系統作製し、現在最適な系統の選択を行っているところである。計画書に記載した通り、初年度の計画はBACレポーターコンストラクトの作製、およびトランスジェニックマウスの作製であった。BACレポーターコンストラクトはPCRおよびシークエンスにより問題なく作製されていることを確認したうえ、トランスジェニックマウスも12系統と、理想的な数を作出することができたため、おおむね順調に進展していると評価できる。免疫システムは、Thによる正の応答と、Tregによる負の制御のバランスが的確に維持され、恒常性が保たれている。このバランスの破綻は、本研究対象である炎症性疾患を始め、様々な疾患の要因となる。しかし、このバランスの破綻の引き金はどう引かれるか、また、このバランスの崩れはどう増幅され、症状として現れるに至るのかという疑問点に対し、十分な答えは得られていない。本研究は、活性化初期段階の免疫細胞を特異的に標識する新規レポーターマウスを作製し、解析を進めることで、炎症性疾患の発症や自然寛解のメカニズムをステージを追って解明し、ひいては診断マーカーや治療標的の同定を目指す画期的な試みである。前々年度までの研究では、BACトランスジェニックベクターを構築し、レポーターマウス作製に着手した。そして前年度は、作製が完了したレポーターマウス末梢血からリンパ球やマクロファージを単離し、細胞レベルでレポーター分子の発現確認および動作確認を行った。その結果、14系統誕生したレポーターマウスのうち、3系統でレポーター分子の望ましい発現量が確認された。このレポーター分子は生体内イメージング用のルシフェラーゼとFACS解析用のGFPの融合分子であるが、ルシフェラーゼ活性は実にバックグラウンドの数万倍の活性を示し、生体内イメージングで検出できるレベルであることが示された。GFP蛍光の方も、上述3系統でバックグラウンドピークと完全に分離されるレベルの強度であることが確認された。

さらに、本レポーター分子は免疫細胞全般で活性化後に一過性の発現を示すNr4a1遺伝子座に組み込んであるが、その発現はNr4a1遺伝子の発現を忠実に再現しており、今後のマウス個体を用いた実験でも活性化初期段階の免疫細胞を特異的に標識することが期待される。本研究では、新規レポーターマウスを作製する段階が最も困難であることが予想されていた。レポーター分子は生体イメージングおよびFACS解析の両方を可能にする前例のないものであり、さらに活性化初期段階免疫細胞をグローバルに標識するレポーターマウスも前例の無い先駆的なものであるからである。従って、本レポーターマウスの作製を完了し、さらに、予想していたものよりもより強くレポーター分子を発現するマウスが作製されたことが確認されたため、本研究は順調に進展していると評価できる。本研究は、活性化免疫細胞のin vivo生体解析およびex vivoの細胞解析の両方を可能とする新規レポーターシステムを構築し、炎症性疾患の発症から寛解に至る過程における免疫応答のダイナミズムを明らかとすることを目的としたものである。現在までの研究実績の概要:本研究で開発を進めてきた新規レポーターシステムは、免疫担当細胞全般で活性化初期に一過性の発現を示す「Nr4a1」の遺伝子座にルシフェラーゼ、GFP、タンパク不安定化ドメインをタンデムにつなぎ合わせた新規レポーター分子(Luc2-AcGFP-ds2)を挿入したBACクローンのトランスジェニックレポーターマウスである。28,29年度の研究により、「免疫応答をin vivo, ex vivoの両方で経時的に捉えるレポーターマウス」の作製に、世界に先駆けて成功した。30年度は、このレポーターマウスを用いた実験に着手し、現在までの研究で、自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の初期過程で、腰部から脊髄に沿って免疫応答の活性化が生じる現象を捉えた。特に、EAE発症の初期段階では第5腰椎(L5)に病原性T細胞が集積することが明らかとされているが、本レポーターマウスでもEAEの発症にさきがけ、L5から特異的に、免疫細胞の活性化を示すルシフェラーゼ発光が検出されている。従って本レポーターマウスは免疫応答の活性化部位を正確に示すことが確認された。現在、引き続きEAEにおける免疫応答活性化の場の推移と病態の変化を照らし合わせた解析を進めており、疾患の発症と寛解のメカニズムを分子・組織学的レベルで解明することが期待される。一番の難題であった新規レポーターマウスの開発に成功し、本マウスを用いた解析は順調に進められている。従って、研究はほぼ計画通り進行していると判断できるが、論文投稿及び学会発表に関し、十分に裏付けの取れたデータの取得は今年度中には間に合わず、補助期間延長の申請をするに至ったため、本研究の進捗状況は「やや遅れている」と判断した。まず、12系統作製されたレポーターマウスから、レポーターの発現強度、発現パターンに基づき、実験に最適な23系統に絞り込む。
Oscillation deathによる気柱振動抑制技術の開発

本研究の目的は,oscillation death(OD)を利用した熱音響自励振動の抑制手法の確立である.ODは,自励振動子間の相互作用が引き起こす現象の一つであり,振動の完全な停止(振動死現象)を意味する.燃焼ダクトをもつ機器では,熱的に誘起される気柱の自励振動である熱音響自励振動がしばしば生じる.この現象は機器の正常な運転を阻害するために,抑制方法の確立が望まれている.本研究の目的はODを利用して,できるだけ簡単な方法で熱音響自励振動を停止する方法を確立することである.平成30年度の研究では,レイケ管型の燃焼振動系を,気柱管で接続することにより時間遅れ結合を実現し,振動抑制を実証する実験を行った.燃焼振動子には平成29年度に作成し特性評価を済ませた実験系を使用し,接続する気柱管の太さと長さをパラメータにとって接続後の振動振幅および振動周波数を計測した.1本の気柱管でのみ結合する場合,より太い管で結合した場合に同相同期および逆相同期が観測されたことから,管の太さによって相互作用の強さが増強することは示されたが,振動停止には至らなかった.また2本の気柱管で接続する場合には,管長が自励発振する音波の波長の半波長および一波長の組み合わせのときにODが観測された.これらの結果を燃焼振動系に対して提案されているモデル方程式に基づいて考察を行い,結合強さは管の太さのみで決まるわけではないことが示された.また,予混合型の燃焼振動系装置を作成し,レイケ管型よりもかなり強い燃焼振動の発生を確認した.なお発振を左右するパラメータ(空燃比,流量,結合方式,共鳴管条件)がかなり多いことから,発振条件を系統的に探ることを中心的に行った.本研究の目的は,oscillation death(OD)を利用した熱音響自励振動の抑制手の確立である.ODは,互いに結合された自励振動子間の相互作用が引き起こす現象であり,振動の完全な停止(振動死現象)を意味する.燃焼ダクトをもつ機器では,熱的に誘起される気柱の自励振動である熱音響自励振動がしばしば生じる.この現象は機器の正常な運転を阻害するために,抑制方法の確立が望まれている.本研究の目的はODを利用して,できるだけ簡単な方法で熱音響自励振動を停止する方法を確立することである.平成29年度の研究では,燃焼系の自励振動を発生する装置の作成および,時間遅れフィードバックによるODの実証を行なった.内直径が40 mmで,長さが1.5 mの両端を大気開放したステンレス製の気柱管と,都市ガス配管と接続した小型のブンゼンバーナーからなる実験系を作成した.適当なガス供給量と空気供給量のもとでは,ブンゼンバーナーをある程度気柱管内に挿入すると熱音響自励振動が発生することを確認した.その発生条件を明らかにし,とくに気柱管端からのバーナー先端位置を変えながら,自励振動の音響振幅と周波数を求めた.とくに強い振動が発生する条件に対して,中空のチューブを気柱管側壁に接続することで時間遅れフィードバックを作用させ,振動停止を試みた.チューブ長さを音速で割って求められる遅れ時間が自励振動周期の半周期程度であるときに強い抑制作用が観測された.さらにチューブ径と長さを調整することで比較的広いバーナー位置の場合に単一のチューブで振動抑制可能なことを明らかにした.平成29年度の研究は,燃焼系の自励振動を発生する装置の作成から始めた.燃焼系の自励振動は多様な系で観測されているが,典型例であるレイケ管型の燃焼振動に注目した.レイケ管型の燃焼振動系は両端を大気に開放した気柱管と,その内部に挿入するブンゼンバーナーで構成される.市販の都市ガス用ブンゼンバーナーの一部を改良したバーナーを作成し,いろいろなサイズの気柱で試したところ,燃焼振動が起こりやすいガス供給量,空気供給量とバーナー挿入位置(軸座標位置)の組み合わせがあることを確認した.その上でもっとも強い燃焼振動が発生した内直径が40 mmで長さが1.5 mの気柱管について詳細な実験を行い,音響振動振幅と周波数のバーナー先端の軸座標位置に対する依存性を明らかにした.軸座標位置によっては複数の振動モードが発生したが,多くの場合は気柱管の基本モードの振動であった.そのあとで,時間遅れフィードバックを作用させるために,適当な長さと内径の中空のチューブを気柱管のおおよそ中間位置に接続し,チューブ他端を同じ軸座標位置に接続した.この位置では音圧の腹になるためフィードバックの作用がもっとも大きくなる.実験の結果,チューブ長さを音速で割って求められる遅れ時間が自励振動周期の半周期程度であるときに強い抑制作用が観測された.さらにチューブ径と長さを調整することで比較的広いバーナー位置の場合に単一のチューブで振動抑制可能なことを明らかにした.これまでの実験結果から,内径6 mmのチューブでも十分な抑制効果があることがわかった.このときチューブ断面積は気柱管断面積の2.3%にすぎない.これほどのチューブで抑制できるなら現実の燃焼系に接続するときの物理的制約も小さいと期待される.以上のことから,順調な成果が得られていると判断している.本研究の目的は,oscillation death(OD)を利用した熱音響自励振動の抑制手法の確立である.ODは,自励振動子間の相互作用が引き起こす現象の一つであり,振動の完全な停止(振動死現象)を意味する.

燃焼ダクトをもつ機器では,熱的に誘起される気柱の自励振動である熱音響自励振動がしばしば生じる.この現象は機器の正常な運転を阻害するために,抑制方法の確立が望まれている.本研究の目的はODを利用して,できるだけ簡単な方法で熱音響自励振動を停止する方法を確立することである.平成30年度の研究では,レイケ管型の燃焼振動系を,気柱管で接続することにより時間遅れ結合を実現し,振動抑制を実証する実験を行った.燃焼振動子には平成29年度に作成し特性評価を済ませた実験系を使用し,接続する気柱管の太さと長さをパラメータにとって接続後の振動振幅および振動周波数を計測した.1本の気柱管でのみ結合する場合,より太い管で結合した場合に同相同期および逆相同期が観測されたことから,管の太さによって相互作用の強さが増強することは示されたが,振動停止には至らなかった.また2本の気柱管で接続する場合には,管長が自励発振する音波の波長の半波長および一波長の組み合わせのときにODが観測された.これらの結果を燃焼振動系に対して提案されているモデル方程式に基づいて考察を行い,結合強さは管の太さのみで決まるわけではないことが示された.また,予混合型の燃焼振動系装置を作成し,レイケ管型よりもかなり強い燃焼振動の発生を確認した.なお発振を左右するパラメータ(空燃比,流量,結合方式,共鳴管条件)がかなり多いことから,発振条件を系統的に探ることを中心的に行った.レイケ管型の燃焼振動系を2つ用意し,互いに中空のチューブで結合し,相互作用させることを計画している.両者に周波数差がないときとあるときの比較を行い,時間遅れフィードバックと時間遅れ結合の振動停止に対する類似点,相違点を検討する.燃焼振動を発生しやすい燃焼方式として空気と燃焼をあらかじめ混合しておいてから燃焼させる予混合燃焼方式がある.この場合,火炎面における圧力揺らぎが燃料と空気を予混合する区間を伝搬するときの時間遅れが燃焼発生の原因となっていることが指摘されている.そこで,この予混合距離を可変とする実験装置(バーナー部分と共鳴管)を作成し,この系に対しても自己フィードバックによる燃焼振動抑制を試みる.2月に発注した工作物の納品が4月に遅れたため.
腎疾患高感受性C57BL/6マウス系統の開発

日本において慢性腎臓病患者数は増加の一途を辿っている。腎疾患に根本的な治療法がないことが一因となっており、創薬・治療法開発が不可欠である。しかしながら病因が多様であることに加え、ヒト腎疾患に近似した表現型を呈する有用なモデル動物が少ないことも解析遅延の要因となっている。これはモデル開発に多用されるC57BL/6マウス系統が腎疾患抵抗性の傾向があることに起因する。そこで本研究は、腎疾患感受性系統を利用したQTL及びDNAアレイ解析により、腎疾患感受性に関連するゲノム領域を同定し、腎疾患高感受性のC57BL/6マウス系統を開発した。この系統は創薬研究・治療法開発に貢献することが期待される。人工透析患者数は増加の一途を辿っているが、残念ながら未だ腎疾患に根本的な治療法はない。病因が多様であることに加え、ヒト腎疾患に近似した表現型を呈する有用なモデル動物が少ないことも創薬・治療法開発遅延の要因となっている。これはモデル開発に多用されるC57BL/6マウス系統が腎疾患抵抗性の傾向があることが一因と考えられる。そこで本研究では腎疾患高感受性のC57BL/6マウス系統を樹立し、多用なヒト腎疾患モデル作製に対応可能な汎用性の高い系統として広く分譲し、創薬・治療法開発に貢献することを目的としている。1.腎疾患感受性に関連するゲノム領域の同定:腎疾患高感受性であるDBA/2マウス系統および抵抗性C57BL/6の比較(QTL解析およびDNAマイクロアレイ解析)により、腎疾患感受性に関連するゲノム領域を同定した。2.上記ゲノム領域をもつC57BL/6系統を作製:1.で同定したゲノム領域を持つコンジェニック系統(背景C57BL/6)を作製し、表現型解析を開始した。慢性腎臓病患者数増大に伴い、人工透析患者数は増加の一途を辿っているが、残念ながら未だ腎疾患に抜本的な治療法はない。腎疾患は病因が多様、病態も複雑であることに加え、ヒト腎疾患研究に利用可能なモデル動物が少ないことも創薬・治療法開発遅延の原因となっている。その一因として、腎疾患モデル動物開発には欠かせない遺伝子改変マウス作製にあたり、多用されるC57BL/6系統が腎疾患に抵抗性であり、腎不全に至るモデルマウスの作製が非常に困難であることがあげられる。そこで本研究では腎疾患高感受性のC57BL/6マウス系統を開発し、多様なヒト腎疾患モデルマウス作製に対応可能な汎用性の高い系統として広く分譲し、創薬・治療法開発に貢献することを目的としている。昨年度までに、腎疾患系統および腎疾患に感受性の高い系統(ICGNマウスおよびDBA/2マウス)とC57BL/6の比較解析により腎疾患高感受性ゲノム領域(1,2,13番染色体)を同定した。今年度は、ICGNあるいはDBA/2(D2)マウスの1,13番染色体の腎疾患感受性ゲノム領域を持つC57BL/6背景のコンジェニック系統(ICGNchr1/B6, D2chr1/B6, ICGNchr13/B6)を作製した。さらにそれらのマウス系統の病態解析を実施したところ、ICGNchr1/B6およびICGNchr13/B6系統は自己免疫疾患様の表現型を呈し、D2chr1/B6系統は高脂血症の傾向があり、腎疾患感受性傾向のある系統が樹立できた。今後、公的マウス資源バンクからの分譲体制を整備し、腎疾患の研究者へマウスの提供を行うことにより、研究進展の一助としたい。本研究は創薬・治療法開発に利用できる新規腎疾患モデルマウスの作製を目的とし、本年度は腎疾患感受性に関与するゲノム領域の同定を行い、その領域を持つコンジェニック系統を作製を開始した。QTL解析およびDNAマイクロアレイ解析により腎疾患感受性に関与するゲノム領域の絞り込みに成功し、予定通り進行している。さらに前述したゲノム領域を持つコンジェニック系統の作製に着手し、順調に研究が進展している状況である。実験動物学H27年度には、腎疾患感受性ゲノム領域を持つコンジェニック系統の表現型解析に取り組み、作製したマウスが汎用性の高い系統として利用可能かどうか、慎重に評価を進める。具体的には、血清生化学解析(血清アルブミン、BUN,クレアチニン等)、腎病理検査(PAS染色、シリウスレッド染色、電子顕微鏡による観察等)、遺伝子発現解析(炎症・線維症に関与する分子をReal Time PCR方にて解析)を実施する。腎疾患モデルとして有用な系統と評価した後、資源バンクへの登録を行い、広く分譲する予定である。当初、今年度中に腎疾患感受性ゲノム領域についての論文投稿を計画していたが、その領域を持つコンジェニック系統の表現型解析結果を含めた論文を作成する方がより質の高い内容となると判断した。そのため投稿にかかる費用として当該助成金が生じた。

次年度は本研究で作製した新規腎疾患モデルマウスの表現型解析を実施するため、以下の研究費を要する。病態解析に必要な消耗品の内訳として、病理検査用試薬(染色液・抗体等)、Real Time PCR試薬、血清生化学用試薬等の費用、新規腎疾患モデルマウスの動物飼育費を計上した。また成果を学会・論文で発表するための費用を計上した。
近世日本における量制統制の基礎的研究

本研究では、まず、1983年から3年間にわたって社団法人日本計量協会が行った「計量に関する歴史資料の調査研究」の報告書をもとに、日本全国に散在している近世における量制関係の歴史資料の所在確認を行った。さらに、これに加え、全国の博物館・文書館・資料館・個人などに対して文書による照合を行って、近世の計量器ならびに文書資料(史料)の有無を確認した。その結果、所蔵者単位にして約120機関・個人、資料単位にして約5900件(うち計量器約300件、史料約5600件)の情報を収集することができた。また、量制に関する研究文献情報の収集をも進め、国内外の研究者の強力により、日本・韓国・中国・台湾・アメリカ・フランス・ドイツ・ハンガリー・ロシアなどを中心に、約1000件の文献情報を得た。これら集積した情報は、データベース化を継続して行っている。次に、前述の史料所在情報に基づいて、主要史料の調査を行った。とくに、京都市歴史史料館では京都枡座福井家の史料(国指定重要文化財)約5000点を所蔵しており、その量・内容ともに他に類例を見ず、本研究においても集中的に調査した。調査に際しては、御用留類を熟覧して、主要部分の写真撮影も行った。その他の機関・個人所蔵の資料も含め、合計で、計量器約50件、史料約120件を写真で収集した。これらの史料の分析の結果、近世に江戸幕府が設置した江戸と京都の枡座以外にも、水戸藩・越後高田藩・岡山藩・仙台藩・佐賀藩などが独自の枡座(枡屋)を有することが判明し、また、江戸の枡座は上州高崎に販売所を設置していたことも判明した。さらに、幕府の公定枡以外にも、美濃地方の弥惣枡など庶民の生活に密着した枡の存在を掘り起こすことができた。
絶滅に瀕したタナゴ類の生息域外保存マニュアル構築に向けた人工繁殖技術の開発

本研究では、計画時に設定した下記の目標について調査・実験を展開し、成果を得ている。飼育下における繁殖特性調査本年は、昨年調査対象とした種に関するデータを追加すると同時に、新たにタナゴAcheilognathus melanogasterを対象とした繁殖特性調査を実施した。畸形体の出現要因の究明実験中に得られた仔稚魚の観察により、タナゴ亜科の人工繁殖時に頻出する体の湾曲と腹部の膨潤との2種の畸形の出現要因を検証した。本調査により、体の湾曲が神経系ないし筋肉系における異常に起因すると確かめられた。また、腹部膨潤個体は、メチレンブルーといった薬液の飼育水への添加や先天的な形成不全によって生じた腎機能の異常に起因すると強く示唆された。本成果により、タナゴ類に生じる畸形の発生要因の一端が明らかとなり、健苗育成に向けた情報が集積された。遺伝的多様性と健苗性との相関の検証小規模な個体群を形成する傾向にあるアブラボテTanakia limbataに着目し、国内4水系産の親魚を用いて人工繁殖飼育成績および遺伝的多様度の相関を調査した。本実験において、きわめて小さな個体群を形成する奈良県産・福井県中池見湿地産の個体は、本種が比較的多く見られる滋賀県産・兵庫県産の個体に比べて孵化率ないし浮上率が低下する傾向にあった。他方で、RAPD-PCRによって求めた親魚の多様度と飼育成績の相関を示すデータは得られず、実験に供する個体数の増加や解析手法の改善といった課題が残された。論文執筆・繁殖技術のマニュアル化採用期間中に得られたデータに基づいて複数の学術論文を執筆・投稿中である。とりわけ、タナゴ類の繁殖技術マニュアルの原形となり得る繁殖特性ならびに畸形体の出現要因に関する主要な部分を、近畿大学農学部紀要に発表予定(印刷中)である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、タナゴ亜科の生息域外保存技術について、計画時に設定した4項の目標について調査・実験を展開し、現在までに下記成果を得ている。飼育下における繁殖特性調査現在までに、科学的な調査が十分に実施されていないヤリタナゴ、アブラボテ、イチモンジタナゴ、カネヒラ、シロヒレタビラ、ミナミアカヒレタビラについて、二枚貝を用いて最終成熟させる搾出採卵法における基礎的な繁殖特性を調査し、各種の産卵様式ならびに初期成長における特性を明らかとした。飼育下における人工繁殖技術の開発採用以前に発表したタナゴ類仔稚魚の薬浴法について検証を進め、低濃度メチレンブルーでの約40日を超える超長期薬浴によって卵黄嚢が膨潤する畸形が誘発されることが明らかとなった。現在、胴体が湾曲する畸形体と併せて発生要因の精査を試みている。また、ホルモン剤の投与による催熟実験を行ない、17αーヒドロキシプロゲステロンを腹腔注入することで二枚貝を用いない人工繁殖が可能であることを確認した。遺伝ステータスと健苗性における相関の検証タナゴ亜科の中でも小規模な個体群を形成する傾向にあるアブラボテに着目し、日本国内5水系から採集した個体を用いて人工繁殖および交配実験に取り組んでいる。今後得られた仔稚魚の生残率や健苗性を精査し、必要に応じて遺伝的多様度を解析することで両者の相関について検証していく予定である。人工繁殖技術のマニュアル化現在までに得られたデータに基づいてモノグラフを作成中である。最終的には、タナゴ類の効率的な繁殖技術(選抜育種ないし系統保存の好適手法)を示すマニュアルとしての体裁を整え、いずれかの媒体で公開することを予定している。

とりわけ、タナゴ類の繁殖技術マニュアルの原形となり得る繁殖特性ならびに畸形体の出現要因に関する主要な部分を、近畿大学農学部紀要に発表予定(印刷中)である。飼育実験の進捗により、人工繁殖に不可欠な基礎情報が集積しつつある。また、採用前より取り組む人工繁殖技術の開発の進展により一部は学術雑誌で発表できる段階に到達し、申請時の初年度目標はほぼ達成されている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、更なる飼育実験に取り組みタナゴ亜科の繁殖特性に関する基礎情報の集積に努めるとともに、遺伝的ステータスと飼育成績の相関に関する知見の収集を試みたい。また、これまでに得られた情報を精査し、学術論文として発表していきたいと考えている。
超高速時間分解X線吸収微細構造測定

本年度は昨年度試作した時間分解X線吸収微細構造測定システムを用いて、レーザー励起に伴うイオンの酸化数の変化を捉えることを試みた。対象とする試料はヨウ素アニオン(I^-)を含む水溶液とし、この水溶液膜表面にフェムト秒レーザーを単レンズを用いて集光照射することでプラズマ生成を誘起した。さらに水溶液膜の裏面に遅延時間をもって高強度のフェムト秒レーザーパルスを対物レンズを用いて集光照射しパルスX線を発生させてプローブ光とし、水溶液表面で誘起されるであろうI^-の酸化数の変化をヨウ素のX線吸収端(4.9keV)付近の微細構造の変化として捉えることを試みた。励起光照射の有無で比較した差スペクトルを求めたところ、遅延時間0psではほとんど何の変化も観測されなかった。一方、遅延時間4psではヨウ素のX線吸収端近傍に限り差スペクトル強度の減少が観測された。これはプラズマ生成に伴ってI^-がI、もしくはI^+へとイオン化が進み、ヨウ素の酸化数が増加することによってX線吸収端が高エネルギー側にシフトしたためと考えられる。こうした実験結果は世界的に見ても例が極めて限られており、今回のように水溶液をパルスX線光源に用いた例は皆無である。今回デモンストレーションとしてではあるが、時間分解X線吸収微細構造測定に成功したことは極めて意義深いと考えている。様々な塩を溶かすことができる水溶液を光源とすることで、様々な試料と対象とすることが可能となり、時間分解X線吸収微細構造測定の汎用化に一歩前進したと考えている。本研究では超高速時間分解X線吸収微細構造(XAFS)測定のためのシステムを構築し、実際の系に適用し光励起に伴う超高速分子構造変化を直接観測することを目的とする.本年度はその準備として,塩化セシウム水溶液を用いたフェムト秒レーザー誘起X線の発光強度の増加と,定常XAFS測定を行った.X線発光強度の増加のためには,p偏光のメインレーザーパルスに先立ちs偏光のプレパルスを照射するというダブルパルス照射実験を行った.ここで二つのパルスの時間間隔を変化させたところ,0-15nsの間に4つのX線発光強度のピークが観測された.X線発光スペクトル測定を行ったところ,もっともX線発光強度が高いときには,シングルパルス照射の時の最適条件と比べて,銅のX線吸収端付近においておよそ800倍程度X線発光強度が増加していることが明らかとなった.つづいて得られたX線パルスをプローブ光とするX線回折計を試作した.光学系には点光源に最適なvon Hamos型を採用し,分光結晶にはX線回折強度や分解能が十分な湾曲LiF(200)を用いた.検出器には半導体検出器もしくはX線CCDカメラシステムを用い,試料には銅箔および硫酸銅水溶液を用いた.銅箔のX線吸収端構造を測定したところ,従来の放射光施設で測定した結果と一致した.さらに銅の価数が異なる硫酸銅水溶液を測定したところ,価数の増加に伴う吸収端の高エネルギーシフトが明瞭に観測された.このことは今回試作したXAFS測定計が十分能力を有することを示していると言える.本年度は昨年度試作した時間分解X線吸収微細構造測定システムを用いて、レーザー励起に伴うイオンの酸化数の変化を捉えることを試みた。
立体構造予測によるOTOF遺伝子変異を原因とする先天性難聴の治療を目指す研究

本研究では、培養細胞およびOTOF遺伝子欠損マウスを用いて、OtoferlinのERK1様構造から想定されたことに発端する、OTOF遺伝子の関わるリン酸化シグナル経路の探索を行った。リン酸化機構が関与しているか不明であるが、同マウスにおいてAuditory Neuropathyの発症モデルとなりうる新規内耳神経奇形を発見した。OtoferlinはOTOF遺伝子の遺伝子産物でAuditory Neuropathy(AN)の原因遺伝子であり、内耳有毛細胞において、SNARE複合体を形成し、カルシウム依存的にシナプス小胞分泌および小胞のリサイクルに重要な働きがあることが知られている。Otoferlinを介するSNARE複合体分子メカニズムとその構造情報については当初未知であった。そこで、本研究室で見つかった5種類の新規OTOF遺伝子変異のそれぞれの病害メカニズムを調べるために、Otoferlinを構成する6つのカルシウム結合ドメイン(C2A-F)の立体構造を分子モデリングにより作成した。また、バイオインフォマテックス的調査より、このOtoferlinがリン酸化に関与する可能性が挙げられたため、培養細胞を用いてOtoferlinを含むSNARE蛋白質SNAP25およびSyntaxinlaの発現ベクターを作成し、キナーゼの活性化また阻害をしたときの結合様式を調べることを目的とし実験に着手した。分子モデリングは6つのC2ドメインにおける最適の鋳型蛋白質を選出することにより作成した。特にC2Aドメインの構造は精度の高い予測構造をモデリングすることに成功した。当研究室で見つかった新規病的変異DAsp1842Asnは、C2Aドメインの上にあり、Asp1842はカルシウムイオンと直接相互作用しており、これがAsnに変異することにより静電的斥力がはたらき結合を阻害したものと考えられた。また、当研究室のAN患者より同定したOTOF遺伝子の変異が入ったOtoferlin発現ベクターをそれぞれ5種類作成した。本研究では、OTOF周囲のリン酸化機構の同定には至っていないが、OTOF遺伝子の変異がどのような構造メカニズムの障害によりANを発症するか説明するための有効な分子モデリング手法および、Otoferlinの分子メカニズムを解析続行するための基盤を確立できたことであり、今後の変異情報の蓄積が、更なる詳細なOtoferlin分子機能の解明に繋がることが予想される。本成果は、基礎的なANの発症モデルを確立するだけでなく、AN治療を目的とする治療薬開発に繋がることが期待され、本研究データはその基盤構築に重要な意義があると考えられる。Auditory Neuropathy(AN)は外有毛細胞の機能は正常であるが、聴覚神経が機能しないことにより発症する感音性難聴の総称であり、OtoferlinはOTOF遺伝子の遺伝子産物でANの原因遺伝子である。バイオインフォマテックス的調査より、このOtoferlinがリン酸化に関与する可能性が挙げられたことから、実際に生体マウスにおいてOTOF遺伝子の関係するリン酸化機構の存在を確認するため、OTOF遺伝子欠損マウスを用いて発生段階において解析することを目的とし実験に着手した。OTOF遺伝子欠損マウス(ENSMUSG62372)を用いて、発生段階初期(生後0日)からアダルト(12カ月齢)における内耳形態を調べてみたところ、正常マウスに比べて蝸牛神経節において神経細胞が明らかに減少しているという形態異常があることを世界に先駆けて発見した。生後半日の蝸牛神経節においても神経細胞の減少が観られたことから、胎生期において発生に異常があると推察することができた。本研究におけるOTOF遺伝子欠損マウスの解析での、発生段階における蝸牛神経の形態異常という新たなフェノタイプを発見した事は、他の遺伝子異常によっても発症するANの病態解析のモデルとなりうる点が、重要な進展である。本研究成果による、本マウス蝸牛神経の病態発生機構を発生段階における形態学的解析の蓄積は、Otoferlinの関与するリン酸化メカニズムの解析を進められることに繋がることが期待される。また、これら分子基盤レベルにおいて解析を進めることにより、ANの発症機構が明らかとなり、基礎的なANの発症モデルを確立するだけでなく、AN治療を目的とする治療薬開発に繋がることも期待される。本研究成果はその切り口となったことに重要な意義があると考えられる。
有機・無機ハイブリッド薄膜を用いた匂いセンサの開発

本研究では、層状無機酸化物と金属錯体との複合膜を用いて、高感度で特定の分子を電気化学的に検出・定量する機能界面の構築を目指した。そのためにまず、粘土粒子が水中で無限膨潤することを利用したラングミュア・ブロジェット法による粘土単一層超薄膜および人工積層した粘土多層膜の製造を行った。つぎに、そのようにして製造された構造規則性を有する粘土層積膜を用いて、電気化学測定によって電流値の大きさからキラルな有機分子の同定を行った。行った実験は以下のとおりである。有機長鎖アルキルアンモニウムの単分子膜を水相上に形成した。水相中には、単層剥離したナトリウムモンモリロナイトが含まれる。気液界面において粘土粒子とアルキルアンモニウム分子膜との複合化が起こった。これをシリコン基板にZ膜として積層した後、メタノール中に浸し有機層を取り除いた。その後新たに、水溶性のRu(II)錯体([Ru(phen)_3](ClO_4)_2)を含む水溶液に基板を浸漬し水溶性Ru(II)錯体を粘土膜に吸着させた。これら各段階で得られた薄膜をAFM、外部反射赤外分光法、in-plane XRDおよび鏡面X線反射法によって解析した。その結果、シリコン酸化膜上に形成されたモンモリロナイト単一層膜の上に水溶性の金属錯体が吸着し単分子層を形成することが確認された。また、同様な修飾電極を光照射し、得られた光電流の大きさによってキラル分子の検出を試みた。その結果、Ru(II)ポリピリジル錯体と粘土薄膜との複合膜で修飾したITO電極はキラル分子として1,1'-ビナフトールの絶対配置を含めて検出できることが解った。その後あらたに、水溶性のRu(II)錯体([Ru(phen)_3](C10_4)_2)を含む水溶液に漬けこの錯体を吸着させた。その結果、Ru(II)ポリピリジル錯体と粘土薄膜との複合膜で修飾したIT0電極はキラル分子として1,1'-ビナフトールの絶対配置を含めて検出できることが解った。
不随意の咬み締めによる咬傷を予防するためのプロテクター作成法の確立

神経疾患あるいは昏睡状態などを原因とする『不随意の咬み締め』によって、自分の歯で歯肉などを傷害して、口腔内裂傷を起こしてしまう患者も多数存在する。これらの口腔内裂傷を予防するためには、「口腔内に装着するプロテクター」の使用が有用である、対象患者の大部分は、不随意の咬み締めと同時に開口制限も有するため、その場合は、プロテクター作成に必須の印象採得が非常に困難である。院内他科との連携も含め、こうした患者の治療を行うに当たって解決しなければならない重要な問題として、「プロテクターに用いる適切な材質と印象採得法の検討」が挙げられる。そこで、「不随意の咬み締めによる咬傷を予防するためのプロテクターの作成法を確立」することを目的として、下記二点について検討した。1咬み締めによる口腔内裂傷を予防するのに必要十分な強度を持つ材料(あるいは材料の組み合わせ)2開口制限患者の印象採得を容易にする方法材料の選択に関しては、強度が高ければ高いほど咬み締め予防には有効であるのは明らかだが、それは同時に装着に伴う違和感を増大させるとともにプロテクターによる口腔軟組織傷害(潰瘍など)を惹起する可能性もある。特に昏睡状態患者では痛みを訴えることが出来ないため、口腔軟組織傷害が重篤化する恐れが高い。そこで、プロテクターは弾性のある合成樹脂材料を用いて作成した。開口制限を有する患者に対する対応としては、これまでに当科で研究・改良されてきた分割トレーによる印象採得法を応用した。本実験においては、シミュレータの開口を制限(1センチを想定)した状態に設定し、開口制限患者の印象採得を模擬的に行い、良好な結果を得た。
尿路結石から分離された未知細菌の病原性及び分子生物学的解析

研究代表者等は、患者から摘出した尿路結石をアルコールで消毒後、血清及び抗生物質を添加しないダルベッコーMEM培地にて37°C、10%炭酸ガス条件で長期にわたり培養を行うことで25μm径の結石様物質が培養皿全面に増加してきた。この結石様物質を植え継ぎすると再び増加してきた。この様な生命体の例としてCiftcioglu等の報告している、Nanobacteriaが想定された。その後も多くの尿路結石から同様の生命体が分離され、我々はこれをNanobacteriaとして細菌学的解析を加えた。増殖形態としては、小単位の結石様物質が分裂又は出芽様の形式でおこる場合と培養液表面に浮遊して分裂する形式が観察された。この小単位を電子顕微鏡で観察すると結石の内部に細菌様の構造が観察された。しかし、細菌リボソームRNAに対するユニバーサルプライマーを用いた解析からは特定の細菌に対するPCR産物は得られなかった。増殖因子を大量に培養し、その成分分析を種々の方法で行ったが、核酸や培養に用いた牛胎血清由来のタンパク質以外のものは明確には確認できなかった。増殖粒子の主成分はハイドロキシアパタイトであるが、コアー構造を有する点から単なる無機物の結晶とは考えられなかった。Spring-8の高輝度放射光を用いて、増殖因子が集積して形成された尿路結石様構造物の構造が尿路結石そのものにも存在し、この増殖因子様構造物が核となって尿路結石の成長が起こることが明らかになり、この因子が生体内でおこる石灰化に関係している可能性がより明確になった。現在、増殖因子を構成している生物由来の有機成分を免疫学的方法により解析を進めているが、決定的な成績は得られていない。研究代表者等は、患者から摘出した尿路結石をアルコールで消毒後、血清及び抗生物質を添加しないダルベッコーMEM培地に入れ37°C、10%炭酸ガス条件で長期にわたり培養を行うと25μm径の小単位の結石様物質が培養皿全面に増加してきた。この様な生命体の例としてCiftcioglu等の報告しているNanobacteriaが想定された。細菌であるか否かを明らかにする目的で培養液全体からDNAを抽出し、リボタイピングを行った。その結果、一部変異が存在するもののStaphylococcus saprophyticusに相当することが明らかになった。結石様物質の培養を低温条件にさらした試料からMicrococcus様の細菌が分離された。しかし、この細菌の増殖は著しく遅く、倍化時間は数時間に及び従来のグラム陽性球菌とは著しく性質が異なっていた。他の結石から得たDNAを用いてリボタイピングした結果も菌種は異なるもののグラム陽性球菌に相当する塩基配列が得られた。今後は、分離した細菌がヒトなどの造骨に関係するオステオポンチン様のタンパク質を産生しているのか、あるいは分離した細菌がどの様な過程をへて石灰化するかに検討を要する。研究代表者等は、患者から摘出した尿路結石から増殖性の小粒子(15μm)を分離した。昨年度はこの増殖性粒子から核酸の抽出を行い、リボタイピングから細菌種の同定を試みたが、グラム陽性菌に相当する塩基配列が得られた。しかし、タンパク質の検出には成功しなかった。今年度は増殖性粒子を抗原としてモノクロナール抗体の作成を試み、得られたモノクロナール抗体を用いて抗原の同定を試みた。ウェスターンブロット解析では分子量14kDaのバンドを検出する抗体が明らかになったが、他の多くのクローンでは血清アルブミンまたはその近傍のタンパク質に反応するものしか検出できなかった。現在、モノクロナール抗体を用いて抗原を濃縮することを試みている。増殖性粒子は血清を含む培地中では単個体として存在するが、血清を除いた培地ではその形成までに数ヶ月を要するが尿路結石様の構造を呈するようになる。この結石形成過程を解析する目的で高輝度放射光施設(SPring-8)において、結石様物質及び増殖性粒子のCT像観察及び元素分析を行った。元素分析の結果から、結石様物質及び増殖性粒子を構成する物質はハイドロキシアパタイトであることが明らかになった。増殖粒子のCT像は分解能力の関係で明確には観察できなかったが、結石様構造物の形成は増殖粒子が凝集したものの上にハイドロキシアパタイトが層状に蓄積したものであることが明らかになった。すなわち、結石様構造物の形成には2段階の反応が必要であることが明らかになった。このことからも、増殖粒子の増加は単なるリン酸カルシウムの蓄積(無機化学反応)ではなく何らかの生物学的反応が必要であると思われる。

この様な生命体の例としてCiftcioglu等の報告している、Nanobacteriaが想定された。その後も多くの尿路結石から同様の生命体が分離され、我々はこれをNanobacteriaとして細菌学的解析を加えた。増殖形態としては、小単位の結石様物質が分裂又は出芽様の形式でおこる場合と培養液表面に浮遊して分裂する形式が観察された。この小単位を電子顕微鏡で観察すると結石の内部に細菌様の構造が観察された。しかし、細菌リボソームRNAに対するユニバーサルプライマーを用いた解析からは特定の細菌に対するPCR産物は得られなかった。増殖因子を大量に培養し、その成分分析を種々の方法で行ったが、核酸や培養に用いた牛胎血清由来のタンパク質以外のものは明確には確認できなかった。増殖粒子の主成分はハイドロキシアパタイトであるが、コアー構造を有する点から単なる無機物の結晶とは考えられなかった。Spring-8の高輝度放射光を用いて、増殖因子が集積して形成された尿路結石様構造物の構造が尿路結石そのものにも存在し、この増殖因子様構造物が核となって尿路結石の成長が起こることが明らかになり、この因子が生体内でおこる石灰化に関係している可能性がより明確になった。現在、増殖因子を構成している生物由来の有機成分を免疫学的方法により解析を進めているが、決定的な成績は得られていない。
口腔癌微小転移に対する遺伝子診断法の開発

頸部リンパ節転移、遠隔転移の有無は口腔癌の重要な後因子である。微小転移を含めた正確な転移診断方法の開発は重要な課題である。平成10年から平成13年の4年間で以下の研究内容に取り組んだ。1.腔癌頸部リンパ節転移の実態を光学顕微鏡卞に譁細に観察すること。2.口腔癌微小転移の遺伝子診断用マーカーは何が良いかを基礎的に検討すること。4.循環血中、骨髄中癌細胞検出の基礎研究-スメア標本、サイトスピン、ビーズによる癌細胞の分離濃縮法。[結果]1.口腔癌73症例から採取した病理学的に転移陰性のリンパ節554個のうち、23リンパ節に3ミリ以下の微小転移を見出した。12.3%の患者でpN upgradingが認められた。5ミリ以下の小リンパ節6個にも微小転移が検出された。微小転移の平均短径は1.36±0.85mmであったことからリンパ節転移の診断には1mm間隔で標本作製することを提唱した。2.Conventional PCR法ではKeratin 13とSCCA mRNAsが有用な口腔癌微少転移の遺伝子診断用マーカーとなることを明らかにした。3.onventional PCR法で12口腔癌、212頸部リンパ節を遺伝子診断に用いた。SCCAは18.7%のリンパ節で陽性となり、準連続切片での検出率4.6%よりも高感度検出であることが示された。SCCAを用いた定量化PCRでは1ールリンパ節でのSCCAの発現量からカットオフ値を0.97arbitrary unitとすることにより、遺伝子診断への実用化が可能となった。4.形態学的な循環癌細胞の検出法を検討した。血液1mlを溶血後サイトスピンすることにより、従来の塗末標本では30枚以上の標本を要する細胞観察を1.3x2.0cmのスライドグラス1枚上で観察することが可能となった。また、ビーズによる癌細胞濃縮分離では口腔扁平上皮癌の場合EGFR抗体付着ビーズが優れた回収成績を示すことを明らかにした。平成10年度の研究実績としてはK13,K19,SCC antigen mRNAを遺伝子マーカーとして頸部リンパ節微小転移の遺伝子診断法の意義を検討した。頭頸部癌患者21人から得られた12の原発巣、211個の頸部リンパ節(半割し、残りは準連続切片に供した)、4口腔癌培養細胞、6正常粘膜、10対照リンパ節(良性腫瘍患者から採取)、7唾液腺を対象として、遺伝子発現を検討した。トータルmRNAを抽出し、逆転写酵素でcDNAを作成し、この産物をPCR法で増幅した。増幅産物は電気泳動後、エチジウム・ブロマイド染色を施した。目的遺伝子確認のためサザン・ハイブリダイゼーションおよびシークエンシングを行った。その結果、196個の組織学的転移陰性リンパ節中、K13,K19,SCC antigen mRNAはそれぞれ28個(14.3%),103個(52.6%),38個(19.4%)に発現していた。K13,SCC antigen mRNAを共発現したリンパ節は16個(8.2%)であった。対照リンパ節ではK13,SCC antigen mRNAは発現しなかったが、K19は4/10個に発現していた。

準連続切片の組織学的検討では、9リンパ節(4.6%)に11個の微小転移巣を認めた。K13gene(-),K19gene(+)のリンパ節8個に異所性唾液腺の存在が確認された。以上のことから、K13,SCC antigen遺伝子の共発現が頸部リンパ節微小転移遺伝子診断の指標となりうることが示唆された。頸部リンパ節の特徴として、K19を保有する唾液腺の迷入があることやK19遺伝子は単核球からのillegitimate gene expressionがあることから、本遺伝子は微小転移の指標とはならないことが判明した。本研究成果は英文投稿中である。本年度の研究成果としては、さらに唾液腺腫瘍への応用を図るため、唾液腺におけるケラチンファミリーの解析、種特異性の検討をおこない、英文2編に発表した。平成11年度の研究実績として、まず、口腔癌の微小転移の実態を形態学的に検証した。口腔癌患者73名から採取した554リンパ節にHE染色、ケラチン免疫染色を施し、3mm以下の微小転移巣の検出を行った。その結果、16症例、23リンパ節に微小転移を認めた。9例でpNupgradingが見られた。また、直径5mm以下の小リンパ節に6個の転移巣を検出した。微小転移の平均短径は1.36+-0.85mmであり、リンパ節微小転移の病理診断には1mm間隔での切片作製が必要であることを明らかにした(Virchows Arch,in press)。次にK20の遺伝子マーカーとしての可能性を検討した。その結果、K20は原発巣においても発現を欠くものが見られ、微小転移リンパ節においても陰性を示したことから、指標としての有用性は乏しかった。一方、K13はケラチンファミリーの中では通常のPCR法を用いた場合、単独では厳密な指標にはなり得ないが、有用性が高いマーカーと考えられた。また、ほとんどの口腔癌に発現するテロメラーゼ活性の測定が口腔癌リンパ節微小転移のマーカーになりうるか検討した。正常リンパ節でも弱い活性が見られたものの、転移リンパ節では高い活性を示したことから、適切なカットオフ値の設定により利用可能であることが示唆された(Arch Pathol Lab Med,in press)。平成12年度は特に癌細胞の遺伝子変異をマーカーとする手法であるMASA法による解析を行った。口腔癌新鮮症例の生検組織からDNAを抽出し、p53エクソン48の領域での変異の有無を調べたところ、約半数に変異が検出された。p53exon5のコドン158にシトシンがチミンに置き換わる変異などが見られた。この特異的な変異塩基がアンチセンスの3'末端になるようにプライマーを設定してPCRを行い、変異のある癌細胞のDNAのみを特異的に増幅した。原発腫瘍や明らかな転移リンパ節ではmutant alleleが検出されたが、シークエンスで変異を認めないリンパ節ではバンドは検出されなかったことから、高い特異性が示された。この手法はtarget geneに変異がなければ使えないこと、各症例の変異毎にブライマーを作製する煩雑さがあること、またDNA検出であることからたとえばマクロファージに貪食された癌細胞でも陽性に出ることが確認された。口腔癌ではp53の変異は、検索エクソンの範囲によるが、5070%程度であり、rasでは510%程度である。従って、口腔癌微小転移の遺伝子診断にはp53を指標としたMASA法が有用であることを明らかにした。
長距離光ファイバ伝送路安定化による高精度キャリア分配システムの開発

長距離光ファイバを用いた精密周波数分配システムの開発を目指した。光ファイバ型干渉計に誘起される位相雑音は、周波数分配精度を制限した。この干渉計の雑音は、超安定環境によって極限まで低減された。密閉、真空、温度安定化、音響遮蔽、および除振は干渉計の雑音を低減するのに有効であることがわかった。達成された精度はこれまで報告されている中で最高のものである。このシステムにより、遠く離れた多くの利用者との間で、ほぼ劣化のない正確な周波数を共有することが可能となる。・伝送用狭線幅光源の開発長距離化に対しては、コヒーレンスを確保するため主光源のスペクトル線幅を1 kHzよりも十分小さくすることが求められるが、市販のファイバレーザー等ではこれを満たさないため、伝送用光源の開発が必要であった。申請者のチームは、ULE(Ultra-Low Expansion)光共振器を用いて安定化した1064 nmのNd:YAGレーザーに光コムを位相同期(PLL)することにより、コムの線幅を1 Hzレベルに狭窄化している。これを利用して波長1.55 μmの半導体レーザーをコムにオフセットロックすることで伝送光源の狭線幅化に取り組んだ。当初、レーザーは電流と温調の2重制御を用いることで、光源については伝送に悪影響を与えぬよう十分堅牢な状況にすることを目標としていたが、半導体レーザーをコムに安定にロックすることができなかった。この原因は、半導体レーザーを駆動する電流コントローラーの電流ノイズであり、根本的な原因は実験室の電源設備であることが確認された。・光増幅器の配置及び関連特性に関する検討ファイバ長が100 km以上になると伝播損失を補うため、光アンプやリピーターレーザーを用いて光増幅を行うことが必須となる。リピーターレーザーを本研究に組み込むとシステムが煩雑になり、リンクの堅牢性が犠牲になるので光アンプ方式の採用を検討した。光アンプとしては利得20 dBが得られる双方向EDFA(Erbium Doped Fiber Amplifier)を中間点に配置するのが最もシンプルである。線幅1 kHzの光源を用いて、120 kmの距離でEDFAによる光増幅が伝送光源の安定度を劣化させないことを確認した。当初、レーザーは電流と温調の2重制御を用いることで、光源については伝送に悪影響を与えぬよう十分堅牢な状況にすることを目標としていたが、半導体レーザーを駆動する電流コントローラーの電流ノイズにより、レーザーをコムに安定にロックすることができなかった。これは、実験室の電源設備に起因するものであり、解決が困難であった。また、研究組織の改編により、実験室の移転が行われたこともあり、研究の進捗が計画よりも遅れるに至った。・1.55 μm伝送用狭線幅光源の開発当初、波長1.55 μmの伝送用光源として狭線幅光コムに位相同期(PLL)された半導体レーザーを使用する予定で開発を進めていたが、実験室の電源ノイズにより所望の性能に到達しないことがわかった。そのため計画を変更し、ULE(Ultra-Low Expansion)光共振器にPDH(Pound-Drever-Hall)法を用いて直接ロックされた1.55 μm半導体レーザーを利用することにした。本光源のシステムを構築したが、出力部分の光ファイバが環境変動により強度雑音を受けやすいことが判明し、その改善に取り組んだ。出力部分をよりシンプルな構成とすることで強度雑音の低減に成功した。その後、光源の周波数雑音及び強度雑音のより詳細な評価に着手した。・中途局形成のための干渉計の評価前年度の研究により伝送局や中途局等を構成するための光ビート干渉計の出力信号に周囲の環境変動の影響が現れることがわかった。より高い精度での伝送及び信号評価を行うため、干渉計の温調システムや防振機構を開発した。温度制御は室温において±1 mKレベルで実現可能であることを確認した。温度制御の性能は、10 mの光ファイバ中を伝播するレーザー光の位相変動から見積もった。また、新たに導入したパッシブ除振台で数Hzから100 Hzまでの振動ノイズを除去できることを確認した。安定化された長距離光ファイバ伝送路においては中途局等の雑音が顕在化する可能性があるため、より精密なシステムの検討を行った。研究組織の改編や実験室の移転のため、前年度の進捗が既に遅れていた。また、当初の計画の手法では光源の精度が要求値に達していなかったため、別の手段の検討及び新たなシステムの設計を行った。新たに開発したシステムの妥当性についても検証する必要が生じたため、進捗が遅れるに至った。・中途局の開発本研究の要である中途局の開発に着手した。中途局は、局Aおよび局Bから伝送された信号をそれぞれ抜き出し、伝送路で受けたファイバノイズを補償する役割を持つ。ここで、光ビート干渉計の出力信号に周囲の環境変動が影響することがわかった。長距離光ファイバ伝送路において受けるファイバノイズは雑音補償システムによって除去される。しかし、光ビート干渉計において生じるファイバノイズはシステムノイズフロアとなり、除去不可能である。光時計の研究が急速に進展し、さらに精度が向上したこともあり、この干渉計のノイズフロアが解決すべき課題となった。・干渉計の雑音の評価干渉計の雑音を低減するためには、干渉計を実験室環境から隔離する必要があった。そのため、超安定環境を用意した。