hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい甲州ワインの製造技術および地域食文化の構築に関する研究

本研究では甲州ブドウ果汁のプロリンを効率的に除去する技術の開発をめざし、ワイン発酵過程でプロリンを多く資化する酵母株の構築、取得を目的とした。まず、Saccharomyces cerevisiae OC-2株へPUT遺伝子群を個々に導入しプロリン高消費株の取得を試みた。結果、発酵条件下においてPUT4遺伝子導入株が最も高いプロリン消費を示すことがわかった。また、PUT4株を用いて甲州ブドウ果汁を発酵させた場合、親株の1.52.0倍のプロリン消費能力を示す事がわかった本研究では甲州ブドウ果汁のプロリンを効率的に除去する技術の開発をめざし、ワイン発酵過程でプロリンを多く資化する酵母株の構築、取得を目的とした。また、PUT4株を用いて甲州ブドウ果汁を発酵させた場合、親株の1.52.0倍のプロリン消費能力を示す事がわかった甲州ワインにはプロリンが多量に含まれており、これが酒質を低下させている可能性がある。本研究では、ワイン発酵中においてもプロリン利用可能な酵母株の取得およびプロリンを資化させるのに適した発酵条件の調査を行い、甲州ワインの新製造技術の開発および製品の評価をすることを目的としている。本年度は、遺伝子改変によるプロリン高消費株の取得を試みた。すなわち、酵母のプロリン代謝に関わる遺伝子であるPUT1(プロリンオキシダーゼ)、PUT3(プロリン代謝を活性化する転写因子)およびPUT4(プロリンパーミアーゼ)をワイン酵母Saccharomyces cerevisiae OC-2株よりクローニングし、ADHプロモーターを持ち、連結遺伝子が産生するタンパク質の過剰発現を促すプラスミドpAUR123に組み込んだ。これを同株に形質転換し、プロリン資化性の変化について調査を行った。甲州ブドウ果汁に各株を接種し発酵を行った結果、プロリン資化性は親株とほぼ同一であり、甲州ブドウ果汁中のプロリンを減じることはできないことがわかった。一方、SD合成培地にプロリン(0.5g/L)を加えた培地で同様の実験を行った結果、プロリン代謝経路に関係するタンパク質をコードするPUT3およびPUT4遺伝子を導入した株で、発酵条件下においても高いプロリン消費が見られた。これらの結果から、酵母のプロリン資化性を増大させるためには、細胞外のプロリンを細胞内に輸送するステップが重要であることが明らかとなった。これまでの研究から,プロリン代謝経路に位置するタンパク質をコードするPUT3およびPUT4遺伝子を導入した株は、酸素濃度が希薄な発酵条件下においても高いプロリン消費能を示す事がわかった。これらの結果から、酵母のプロリン消費性の増大には、細胞外のプロリンを細胞内に輸送するステップが重要であると推察された。平成22年度は、PUT3およびPUT4株のプロリン消費能力の増大について、より詳細に確認することを目的に、各遺伝子をゲノムDNAへ導入した酵母株を構築した後、SD合成培地甲および州ブドウ果汁におけるプロリン消費能を調査した。結果、PUT3株のプロリン消費能力は,親株との間に大きな差が見られなかったものの,PUT4株を用いて甲州ブドウ果汁を発酵させた場合、親株の1.52.0倍のプロリン消費能力を示す事がわかった。一方、ワイン酵母株(野生型)12株のプロリン消費能力を調査した結果、2株がやや高いプロリン消費能力を示す事がわかった。また,酵母の属種を判定するITS領域の解析を行った結果、全て野生ワイン酵母株がSaccharomyces cerevisiaeに属する事がわかり,これらの株の中からプロリン高消費株を分類学的手法により選択することはできないことがわかった。今後は,別の指標,即ちアゼチジン-2-カルボン酸取り込み量を指標としたプロリン高消費株の選択およびエタノール生産量、芳香成分生産量等を用いてワイン酵母株の選択行う必要があることがわかった。本年度に実施した実験結果から、甲州ブドウ果汁に含まれるプロリンの低減化には、PUT4遺伝子導入株の使用が有効であること、また本遺伝子の生理的機能から,酵母がプロリン高消費能を示すには,プロリンの細胞内輸送ステップが重要であることが確認された。平成21、22年度の研究結果から、PUT4遺伝子(プロリン膜輸送酵素をコード)導入した酵母株(P4株)を用いて甲州ブドウ果汁を発酵させた場合、親株に比べP4株は1.52倍程度のプロリン資化能力を示す事が明らかになった。また、平成22年度に予定していた酒質改善法の併用実験、すなわちスキンコンタクト法(色素および栄養成分が増大)およびコールドマセレーション法(ポリフェノール成分の保護)の検討については、平成22年度が猛暑(前年度平均気温+1.6°C)であり、甲州ブドウの収穫量が減少した為、平成23年度に延期する事とした。平成23年度は、P4株を用いて、甲州ワインの試験醸造を行い、パイロットスケールにおいても甲州ワインのプロリン低減化が可能であるか否かについて検証を試みる予定であった。本実験の準備として、栄養要求性マーカーを組み入れたSaccharomyces cerevisiaeOC-2株を構築し、PUT遺伝子群を導入した株を準備し、より精度の高いプロリン高資化性遺伝子について検討を行った。この結果、PUT4遺伝子導入株(P4N)が最もプロリンを資化することがわかり、平成22年度の結果を裏付けた。

P4N株を使用し、甲州ブドウ果汁を発酵させる予定であったが、平成23年度に山梨、長野地域で収穫された甲州ブドウに含まれるプロリン濃度は100200mg/Lと例年の1/10程度であり、本研究を実施し目的を達成することは困難であった。一方、ワイン酵母(野生株)から選択された高プロリン資化性株についても研究を進めた結果、2株を取得できた。研究では、ワイン発酵中においてもプロリン利用可能な酵母株の取得およびプロリンを資化させるのに適した発酵条件の調査を行い、甲州ワインの新製造技術の開発および製品の評価をすることを目的とした。甲州果汁中のプロリンを酵母に効率よく資化させる為、発酵条件(通気の有無)について調査を行った。結果、発酵初期に通気をしただけでは、酵母のプロリン資化能力に変化は見られなかった。この結果から、プロリンオキシダーゼの酸素要求のみがプロリン資化能力を左右する要因ではないことが明らかとなった。Saccharomyces cerevisiae OC-2株へPUT4遺伝子を導入した株(P4N)および親株を用いて試験醸造した甲州ワインの成分を調査した結果、P4N区ではプロリン濃度が40%低下したのに対して、総酸値、pH、エタノール濃度、フェノール成分、糖分、色調については両者の間に顕著な差は見られなかった。一方、野生株より取得した高プロリン資化性株を用いて試験醸造を行ったが、プロリン濃度は約20%低下するもののP4N株のプロリン資化能には及ばなかった。P4N株を用いて試醸した甲州ワイン、すなわち低濃度プロリンの品質について、味覚センサーを用いて評価を行った結果、コントロールと比較して苦味が低下していることがわかった。さらに、学生10名による官能検査の結果、コントロール区に比べてP4N区のワインは酸味を強く感じることが明らかとなった。平成22年度の夏季高気温の影響により、甲州ブドウの収穫量が激減してしまったことや平成23年度、同ブドウの栄養成分が大きく変化してしまったことに起因する。24年度が最終年度であるため、記入しない。酵母のプロリン資化性についての検討は問題なく進んでいる為、プロリン高資化性株の構築については目標を達成できる。また、応用面でのデータ収集に関しては、甲州ブドウ果汁のプロリン濃度を人為的に調節することによって一定の評価を求めていく予定である。
排卵される卵とされない卵の選抜機構に関する基礎的研究

哺乳類の雌は性成熟に達すると、各々の種に固有の周期で固有の数の卵を排卵する。本研究では多数存在する卵細胞の中から排卵に到達する卵が、どのような機構で選抜されているのかという問題について追求した。卵巣に於いては、実際に排卵する数よりもかなり多くの濾胞がホルモンの刺激を受けて発達を開始するが、その99%以上は排卵されることなくアトレシアにより消失する。このためアトレシア、すなわち濾胞閉鎖をもたらす機構を解明することで排卵される卵の選抜への理解が深まるものと考え、アトレシアの引き金である顆粒膜細胞のアポトーシスがどのような刺激によって誘導されるのかを明らかにしようと試みた。本研究ではラットを用い、卵巣内に発現するGnRHが濾胞の成熟と閉鎖の両機構に関与しているとの説を立証するため、ラットGnRH受容体mRNAをin situハイブリダイゼーション法により検出した。その結果、GnRH受容体mRNAは主として閉鎖を起こした濾胞の顆粒膜細胞と、正常なグラーフ濾胞や排卵直前の濾胞顆粒膜細胞に強く見られることが明らかになった。また、閉鎖を起こした後で退化しつつある濾胞の顆粒膜細胞や、閉鎖中の濾胞と成熟した濾胞の顆粒膜細胞、特に濾胞壁を形成する細胞に強い発現が見られることなどを確かめた。これらの事実から卵巣ないGnRHはこれまで推察されていたように、濾胞の閉鎖と排卵に関連して発現することが強く示唆された。しかし、HCGを投与してもGnRH受容体の発現様式に顕著な変化が見られないことから、その発現は生殖腺刺激ホルモンによる単純な制御だけではなく、より複雑な環境の支配下にあることが判明した。現在、さらに脳下垂体除去やGnRHの作用を阻害する薬剤などを使用して、GnRH受容体発現を変動させる条件を探している。哺乳類の雌は性成熟に達すると、その種に固有の周期で固有の数の卵を排卵する。排卵数は下垂体から分泌されるFSHの分泌量によって決定されているが、このFSHの分泌量は濾胞顆粒膜から分泌されるインヒビンにより制御されているらしい事も分かってきた。このように排卵される卵の数が一定に保たれる機構についてはかなり研究が進んでいるが、一方で多数存在する卵細胞の中から排卵にまで到達する濾胞が、どのような機構で選抜されているのかという問題については不明な点が多い。卵巣においては実際の排卵数よりもかなり多くの濾胞が、生殖腺刺激ホルモンの刺激を受けて発達を開始するけれど、その99%以上は排卵されることなく顆粒膜細胞のアポトーシスにより退化・消失する。この変性を誘導する機構を解明することにより、排卵される卵の選抜機構への理解が深まるものと考えられる。本研究の目的はマウスあるいはラットの卵巣を用いて顆粒膜細胞のアポトーシスが、どのようなホルモン環境によって誘導されるのかを解明することで排卵されない濾胞の選抜機構を明らかにすることである。まず始めに濾胞の成熱過程を組織学的に解析し基礎的データを入手するためにBrdUとコルヒチンを用いて、活発に増殖中の濾胞顆粒膜細胞の動態を解析した。この結果、マウスの濾胞は直径30-70μmの間に成熟するものと、休止状態で留まるものの選抜が行われていることが判明し、成果は論文として投稿中である。この結果をもとに、70μm以上の濾胞でアポトーシスを起こすものと、昨年われわれの研究室で行われた変性濾胞にGnRHmRNAが強く発現するという事実の相関関係を調べている。

また、下垂体から分泌される生殖腺刺激ホルモンの関与についても、その受容体の動態を調べることで追求中である。哺乳類の卵巣に於いては、実際の排卵数よりもかなり多くの濾胞がホルモンの刺激を受けて発達を開始するが、その99%以上は排卵されることなくアトレシアを起こし消失する。アトレシアは顆粒膜細胞のアポトーシスが原因で起きることから、どのような条件によりアポトーシスが誘導されるのかをラットで調べた。まず、GnRHと顆粒膜細胞のアポトーシスとの関係に注目して、ラット卵巣のGnRH受容体mRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法により調べた。その結果,GnRH受容体mRNAは主として閉鎖を起こした濾胞の顆粒膜細胞と、正常なグラーフ濾胞や排卵直前の濾胞の顆粒膜細胞に強く見られることを明らかにした。また、閉鎖を起こした後で黄体に変化しつつある濾胞にも発現が見られることなどを明らかにした。さらに、卵巣の発達過程の生後5日には受容体mRNAのシグナルは見られないが、生後10日になると間質細胞にシグナルが現れ、15日になるとほとんどの前胞状細胞とごく初期の胞状細胞の顆粒膜細胞にもシグナルが発現することを明らかにした。なお、これらの濾胞はやがて閉鎖する運命にあると思われる。以上のような事実から、卵巣内GnRHはこれまで推察されていたように、濾胞の閉鎖と排卵に関連していることが強く示唆された。現在は下垂体を除去したラットや、GnRHのアンタゴニストを投与したラットでの実験を行なっている。他方、濾胞の成長をより詳しく知るため急激な発育を開始し、さらに分化が起こる時期をプロムウリジンの取り込みやコルヒチンによる細胞分裂の観察から明らかにし、その成果はすでに論文として公表した。
生体内力学による細胞の形態、増殖、自殺の調節機構

発生過程において生体内力学が細胞の形態や増殖速度、細胞死といった生命現象に対してどのような影響を与えるのかをショウジョウバエをモデルシステムとして用いて解析した。Rho、Racやミオシン変異体の表現型の解析などから、細胞の形態は細胞骨格の機能に依存した張力の影響を受けて決定されていることが明らかになった。また物理力と組織の増殖や細胞死との関係を調べるための実験系を確立した。平成21年度はまず細胞の形態と細胞膜の張力との間の関係を調べた。具体的には複眼細胞においてnon-muscle myosinやsmall G-proteinであるRho,Racの機能を操作し、その細胞形態に及ぼす影響を解析した。non-muscle myosinの機能を喪失した細胞は膜の張力が減少した結果、細胞の接着角に変化が見られ、また同時にadherens junctionのレベルにおいて、細胞の面積が増大した。特に後者の表現型は非常に顕著であった。この2つの表現型は膜の張力の減少から理論的に予想される表現型であり、またdminant-negative型のRhoやRacの発現を誘導した際にも同様の表現型が観察された。これらの結果は細胞の形態が細胞膜の張力と接着性によって決定されるというモデルを支持しており、非常に重要であると考えているが、同様の結果が他のグループより発表されたため(Warner S.J.and Longmore G.D.J.Cell Biol.185(6) : 1111-1125, 2009)、この時点で終了することとした。次に組織のコンパートメント形成に興味を持ち研究を開始した。コンパートメントは生物の様々な組織に広く存在することが知られているが、その形成機構の分子的基盤は明らかでない。そこで国立遺伝学研究所で作成されたRNAi transgenic lineを用いてこの過程に関わる遺伝子のスクリーニングをショウジョウバエ系統をいくつか作成した。しかしながらこの研究に関しても他のグループから、コンパートメント形成には境界面特異的なミオシンに依存した膜の張力の亢進が本質的メカニズムであるという結果が報告された(Landsberg KP et al.Curr.Biol.19(22) : 1950-1995, 2009)。そこでこの問題に対しては今後はmyosinとhedgehogの機能をつなぐact-upやchickadeeのコンパートメント形成における機能を調べていきたいと考えている。最後に組織内の張力/圧縮力と増殖/細胞死との間の関係を調べるためにin vitroで成虫原基を伸張させるために必要な設備をセットアップした。またin vivoで張力/圧縮力の効果を調べるための系も確立した。平成22年度はまず細胞の相対サイズと細胞パターンの関係を明らかにすることを目指し、実験をおこなった。Dominant Negative型および活性化型のインシュリン受容体を複眼の一部の細胞で強制発現させ、細胞のサイズを変化させることにより、どのような変化がおこるのか調べた。しかしながら予想に反し、Dominant Negative型のインシュリン受容体を複眼において誘導しても細胞サイズには全く影響が見られなかった。同様の操作を翅など複眼以外の組織に施した際には組織サイズの顕著な減少が見られたことから、この実験系自体は正常に機能していることが示された。そこでさらにインシュリン受容体のコピー数を増やすなどして、同様の実験を再度試みたが、残念ながらやはり複眼細胞のサイズに変化は見られなかった。また活性化型インシュリン受容体を発現させた場合は、ほぼ全ての個体が死んでしまい、表現型の解析を行うことが出来なかった。今回、複眼においてこの系が機能しなかった理由は不明であるが、今後はHippo pathwayなどの他の増殖シグナル伝達系を操作することにより細胞サイズを変化させる実験を試みたい。組織内の張力/圧縮力に関しては、成虫原基に張力を与えながら培養する系を確立した。そこでこの条件下で細胞分裂の様子を調べたところ、コントロールと比較し細胞分裂が誘導されていると見られるサンプルが存在した。しかしながら現時点ではまだサンプル間のブレが大きく結果の再現性に問題があるため、今後はさらに実験条件を詳しく検討し、張力と増殖の間の関係を明らかにしていく予定である。
歯根膜細胞の分化過程におけるナノレベル元素分析と局在構造解析

本研究課題では、溶液中に存在する生体試料を、常温常圧下においてナノレベルで観察することができる高分解能誘電率顕微鏡を用いて、骨芽細胞分化過程の詳細を可視化し、その全容を理解することを目的としている。本年度は主に以下の3つの成果を得た。1.マウス骨髄間質細胞であるKUSA-A1細胞を骨芽細胞分化誘導培地で培養し、4-10日目に高分解能誘電率顕微鏡観察を行ったところ、誘導群にみられる粒子は4-320nm(中央値90nm)であり、その大きさは経時的に増加していた。石灰化過程において中心的な役割を果たす基質小胞の大きさについての報告と一致しており、観察された粒子が基質小胞であることが示唆された。2.観察された粒子が細胞内においてどのように形成されるかについて検討するために、KUSA-A1細胞を分化誘導培地に交換後、7時間において高分解能誘電率顕微鏡観察を行ったところ、多数の粒子が白い膜状構造物中に形成されることが明らかとなった。同構造物の詳細な解析により、同粒子はMultivesicularbody中に形成されることが示唆された。3.石灰化過程で細胞内に形成される粒子がリソソーム経路で分泌されているかどうかを検討するために、リソソーム中のATPase阻害剤であるBafilomycin A1を骨芽細胞分化誘導培地中に添加して同様の観察を行ったところ、Bafilomycin A1処理群では粒子が観察されなくなった。このことから、骨芽細胞内に形成される同粒子はリソソーム経路で分泌されることが示唆された。以上の得られた結果を取りまとめ、国内の学会で発表を行うとともに、英語論文を投稿した。1.マウス骨髄間質細胞であるKUSA-A1細胞を用いて、同細胞が高分解能誘電率顕微鏡観察に必要な窒化シリコン薄膜上で培養可能であること、石灰化誘導用培地(βグリセロリン酸およびアスコルビン酸含有α-MEM)を用いた骨芽細胞への分化誘導が可能であることを確認した。さらに誘電率顕微鏡観察を行い、細胞内小器官の高コントラスト撮影を実現した。2.KUSA-A1細胞を分化誘導培地で培養し、誘電率顕微鏡観察を行ったところ、誘導群においてのみ、粒子の形成が観察された。微細元素分析およびラマン分光イメージングにより、この粒子を詳細に解析したところ、リン酸とカルシウムを多く含み、ハイドロキシアパタイトに特有な960cm-1のラマンシフトを有することが明らかとなり、この粒子は石灰化過程において中心的な役割を果たす基質小胞であると考えられた。3.骨芽細胞分化過程における基質小胞の形成・分泌過程の分子機構を解明するため、既知の石灰化関連遺伝子について、ゲノム編集技術を用いたノックアウト細胞クローンを作製した。中でもAlpl遺伝子のノックアウト細胞では上記で観察された基質小胞は全く観察されず、基質小胞形成に必須の遺伝子であることが示唆された。以上の得られた結果を取りまとめ、国内の研究会で発表を行った。予定していた窒化シリコン薄膜上での培養条件の最適化、高コントラスト観察が可能な撮影条件の検討が完了し、骨芽細胞分化過程の形状構造観察に成功した。さらに次年度に予定していた微細元素分析およびラマン分光イメージングを誘電率顕微鏡観察に組み合わせた分析、CRISPR/Cas9を用いたノックアウト細胞クローンの樹立までが本年度中に遂行されたため。

引き続き、研究分担者・研究協力者との打ち合わせを綿密に行いながら、本年度に確立したナノレベル観察法を用いて、骨芽細胞の分化過程の経時的な観察を行うことで、基質小胞の形成分泌機構を明らかとすることを目指す。
ACAT阻害剤ピリピロペン類の生合成とそれを利用した新規成分の創製

ピリピロペンAは天然物として最も強いACAT阻害活性を示すものの一つであり、薬剤開発のリ-ド化合物として現在積極的に研究が展開されている。その構造は天然物としては極めて稀なピリジノαピロン環を含み特にこの部分構造がどのようにして生合成されるかは興味深い問題である。そこでその生合成経路を明らかにする試みとしてピリピロペン生産株Aspergillus fumigatus FO-1289の生産培地に各種[^<13>C]標準前駆体[1-^<13>C]、[2-^<13>C]、[1,2-^<13>C_2]酢酸ナトリウム、[2-^<13>C]メバロノラクトンを加え標準ピリピロペンAを単離精製し^<13>CNMR解析を行なった。デカリン部分は、予想したようにメバロン酸経路よりファルネシルピロリン酸を経由して構築されることが明らかになった。一方α-ピロン部分には2分子の酢酸がインタクトに取り込まれているものの、ピリジン環の全炭素とα-ピロン環の6'位の炭素にはいずれの前駆体の取り込みも認められなかった。このユニットはニコチン酸の骨格に相当することから、[1-^<14>C]ニコチン酸を培養液中に添加したところ^<14>C標識ピリピロペンAが得られた。すなわち、ニコチン酸はカルボン酸部分が脱炭酸することなく、そのままこのユニットを構築していると推定された。そこでさらに^<14>C標識ピリピロペンA(84mCi/mol)をジョーンズ酸化反応によりオキソ体とした後ナトリウムメトキシドで処理することにより、非放射性の分解物と出発原料の放射比活性が保存された[^<14>C]ニコチン酸(84mCi/mol)を回収した。以上の結果からピリピロペンAの生合成は、ピリジノα-ピロン部分はニコチン酸をアシルプライマーとして2分子の酢酸が縮合して形成し、これがメバロン酸を経由して形成したセスキテルペンと結合しピリピロペンの共通基本骨格が形成され、最後にアセチル基が3箇所に導入され構築されたことが明らかとなった。
遺伝子非翻訳領域異常による福山型筋ジストロフィー発症の分子機構に関する研究

福山型筋ジストロフィー(FCMD)は、常染色体性劣性遺伝疾患で、日本では発症率が高く、新生児1万人当たり約1人に発症する。'98年に分担研究者の戸田らはその本体遺伝子を同定し、多くの患者では、数種の反復配列を含むDNA断片が本来遺伝子の3'側の非翻訳領域に挿入されていることが判明した(創始者ハプロタイプ)。一般に、疾患に至る遺伝子異常の部位はタンパク質翻訳領域であるが、FCMDの様に非翻訳領域での異常の場合、疾患発症の原因はタンパク異常では説明できない。理論的には、遺伝子の転写時あるいは転写後の異常が考えられ、これは遺伝疾患発症分子機構の新しい概念に属する。昨年までの研究で本研究者らは、FCMD遺伝子由来の転写産物(pre-mRNAおよびmRNA)の核内での存在をin situハイブリダイゼーション法(ISH法)で可視的に捉えることに成功し、転写後のRNAの動態異常が疾患の原因と推察した。この仮説を更に検証するため、今年度は、FCMD原因遺伝子の3'側非翻訳領域部分、及び、患者の遺伝子で検出される挿入DNA断片を含む各種のプローブを用いたTwo-color ISH法を行った。実験には、(1)創始者ハプロタイプホモ接合の患者(挿入断片をホモに持つ患者)、(2)複合ヘテロ接合の患者(創始者ハプロタイプと他のDNA変異を持つ患者)及び(3)正常対照者の各々のリンパ芽球細胞株由来の核標本を用いた。その結果,FCMD遺伝子の3'側非翻訳領域部分を指標にした場合、FCMD遺伝子の転写産物は、患者群では正常者群の約20%という低いレベルを示した。これは共同研究者らの分子生物学的検索結果と矛盾しない。つまり、DNA断片の挿入を持つ異常なallele由来の転写産物はある程度転写されるが、細胞核内でも低レベルであることが示唆された.福山型筋ジストロフィー(FCMD)は、常染色体性劣性遺伝疾患で、日本では発症率が高く、新生児1万人当たり約1人に発症する。つまり、DNA断片の挿入を持つ異常なallele由来の転写産物はある程度転写されるが、細胞核内でも低レベルであることが示唆された.常染色体劣性遺伝病の福山型筋ジストロフィー(FCMD)は,分担研究者の戸田らの研究により新規遺伝子が同定され,3'側の非翻訳領域に数種の反復配列を含むDNA断片(トランスポーザブル・エレメント)が挿入されていることが判明している.非翻訳領域でのDNA異常の場合、疾患発症の原因はタンパク異常では説明不可能で,理論的には遺伝子の転写時あるいは転写後の異常(つまりRNAレベルの異常)が考えられるため,FCMDに関して,転写後のRNAの動態およびその性状を検索する目的で,ISH法を行った.プローブとして用いたcDNAクローンは,(1)FCMD原因遺伝子の3'側非翻訳領域部分(挿入部位より上流の領域)(緑黄色),および(2)患者の遺伝子で検出される挿入DNA断片(赤色)を含むクローンで,Two-colorのin situハイブリダイゼーション(Two-color ISH)法により2色に色分けして行った.実験は,(a)創始者ハプロタイプホモ接合の患者(3Kb挿入断片をホモに持つ患者),(b)複合ヘテロ接合の患者(創始者ハプロタイプと他のDNA変異を有する患者)及び(c)正常対照者の各々のリンパ芽球細胞株由来の核標本を用いて行った.その結果,(1)DNA断片の挿入されているmutant allele由来のmRNAは,患者細胞核内では正常細胞核内での値に比較して低レベルにしか存在しないこと,(2)反復配列を含む挿入領域部分と相同性のある転写産物が,核内に多く存在することが示唆された.今後さらに詳細に検討すると共に,分子生物学的な他の手法によって別の側面からも検討する必要があると思われる.

福山型筋ジストロフィー(FCMD)は、常染色体性劣性遺伝疾患で、日本では発症率が高く、新生児1万人当たり約1人に発症する。'98年に分担研究者の戸田らはその本体遺伝子を同定し、多くの患者では、数種の反復配列を含むDNA断片が本体遺伝子の3'側の非翻訳領域に挿入されていることが判明した(創始者ハプロタイプ)。一般に、疾患に至る遺伝子異常の部位はタンパク質翻訳領域であるが、FCMDの様に非翻訳領域での異常の場合、疾患発症の原因はタンパク異常では説明できない。理論的には、遺伝子の転写時あるいは転写後の異常が考えられ、これは遺伝疾患発症分子機構の新しい概念に属する。昨年までの研究で本研究者らは、FCMD遺伝子由来の転写産物(pre-mRNAおよびmRNA)の核内での存在をin situハイブリダイゼーション法(ISH法)で可視的に捉えることに成功し、転写後のRNAの動態異常が疾患の原因と推察した。この仮説を更に検証するため、今年度は、FCMD原因遺伝子の3'側非翻訳領域部分、及び、患者の遺伝子で検出される挿入DNA断片を含む各種のプローブを用いたTwo-color ISH法を行った。実験には、(1)創始者ハプロタイプホモ接合の患者(挿入断片をホモに持つ患者)、(2)複合へテロ接合の患者(創始者ハプロタイプと他のDNA変異を持つ患者)及び(3)正常対照者の各々のリンパ芽球細胞株由来の核標本を用いた。その結果,FCMD遺伝子の3'側非翻訳領域部分を指標にした場合、FCMD遺伝子の転写産物は、患者群では正常者群の約20%という低いレベルを示した。これは共同研究者らの分子生物学的検索結果と矛盾しない。つまり、DNA断片の挿入を持つ異常なallele由来の転写産物はある程度転写されるが、細胞核内でも低レベルであることが示唆された.
中性子共鳴反応における時間、空間反転非保存の研究

1.スポレーション中性子をアンモニアを用いた偏極陽子フィルターで偏極させてトリウム、インジウム、銀、よう素、すず、アンチモン、キセノン等の原子核に当て、透過中性子及び中性子捕獲ガンマ線を精度よく測定した。これにより中性子の核によるp波共鳴吸収における弱いマトリックス・エレメントを統計的解析法を用いて決定することができた。2.ビームの進行方向に垂直に偏極させた0.734eVの中性子をランタン核に当てたとき透過して出てくる中性子のスピン方向が入射中性子のスピン方向に対して回転する角度を測定し、パリティ非保存項の実数部を決定する試験的研究を行なった。3.ペンタセンをドープしたナフタレン及びp-タフェニールにレーザービームを照射し、triplet状態に励起した状態でマイクロ波によって動的偏極を起こさせる陽子偏極法を開発した。これによって陽子を約30%偏極することに成功し、中性子偏極用フィルターとして用いることが可能であることを実証した。4.時間反転パラメターの測定に必要な中性子偏極度測定装置として偏極ヘリウム3フィルターを製作した。またその偏極度をNMR測定法と中性子透過法で測定し、それらの相対的較正を行なった。3.偏極中性子と整列した原子核の反応における時間反転の破れを探索するためにホルミウム中での低速中性子の減偏極データを解析し、20eV以上の中性子では減偏極が顕著とはならないことを確認した。eV領域の中性子と原子核の反応における空間反転対称性の大きな破れは時間反転対称性の検証の新たな実験的方法の可能性を与えるものであり、時間反転対称性検証実験への発展の上で重要な意味を持つ。我々はこれまでランタン139などのp波共鳴吸収断面積の入射中性子ヘリシティーに対する依存性を測定し、空間反転対称性の破れの著しく大きな増幅度を精密に測定した。その結果、増幅効果はp波共鳴と隣接するs波共鳴との干渉によるという解釈でほぼ良いことが分ったが、ロスアラモス研究所で研究されたウランなどの重い原子核では2波干渉だけでは説明できない可能性を示唆する結果が得られている。この点を研究する際、弱い相互作用の複合核状態における強度を決定することは大変重要である。吸収断面積の入射ヘリシティー依存性だけでは核分光学的因子と弱い相互作用強度を分離しきれないため、複合核状態から放出されるγ線の角度相関項を測定することによって両者を分離するという方法をとった。γ線は様々な状態間遷移から放出され角度依存性は遷移によって異なるため、エネルギー分解能のよいNaI(Tl)シンチレーターを用い、ランタン標的からの単一γ線を分離することが出来た。しかし各γ線の計数率は小さいので、我々は入射中性子の速度とγ線のエネルギーを一事象毎に測定するデータ収集システムを開発した。その結果、格段に測定効率がよくなり、これまでに得られたデータからはランタン139のp波共鳴では弱い相互作用の強度を示す行列要素の値の範囲が1.6meV<W<7.9meVという結果が得られている。また並行して、標的を中性子が透過する際に起こる空間反転を破るような中性子のスピン回転の測定が現在進行中である。以上の実験結果をもとに時間反転対称性の検証実験の準備が進行中である。低速中性子と原子核との反応における空間・時間反転の対称性の破れを研究するためにまず中性子を偏極し、それを種々の原子核にあてて、そのp波吸収断面積の中性子ヘリシティー依存性の測定からパリティー非保存効果の増巾現象を発見した。特に本年度はこの現象を時間反転の破れの探索に適用するために次のような基礎実験を行い重要な研究成果をもたらした。・時間反転の実験のためのLa核の偏極に成功した。これはNd^<3+>:LaAlO_3結晶中のLaを動的偏極法により低温高磁場で偏極させるもので1.5K,23KGにおいてすでに20%の偏極に成功した。更に低温にすることにより、高偏極が確実現される。・ホルミウム単結晶中の減偏極の測定を行った。これまでホルミウム結晶中での中性子の減偏極によって時間反転実験は困難とされていたが、この研究によって1eV以下の中性子は結晶中でかなりの減偏極を起こすが、1eV以上では顕著な減偏極は見られないことを発見した。これによって中性子-ホルミウム反応における5ベクトル相関係数の研究に道を開くことになった。・常温における水素核の偏極をレーザー光を用いて行うことに成功した。少量のペンタセンを混ぜたナルタリンの単結晶にレーザー光をあて、triplet stateに励起したペンタセンの電子スピンの偏極を動的偏極法によって陽子にtransferした後、安定なsingletのground stateに移す方法によって陽子を偏極させた。これによって永年の夢であった陽子の常温偏極が実現し、中性子スピンの偏極に新しい方式を取り入れることが可能となった。・偏極中性子の核による共鳴吸収において、放出ガンマ線の放出方向と中性子スピンの相関を測定した。これによってハドロン間相互作用における弱い相互作用の行列要素を決定した。これらの成果をふまえて、現在偏極ランタン(La)核及び整列ホルミウム(Ho)核に偏極中性子ビームを当てて時間反転の破れの測定に取り組んでいる。これまでに低エネルギー中性子の原子核によるp波共鳴吸収で大きなパリティー非保存効果を発見し、その機構の解明に大きな努力を払ってきた。この現象の原因は核力に含まれる弱い相互作用の僅かな寄与が複合状態において蓄積されることによることが判明した。

本年度はこれらの解明のために実験を更にすすめるとともにこれらの現象を用いた時間反転の探索のための基礎的実験を行なった。本年度の成果としては次のものがあげられる。・液体窒素の温度において少量のペンタゼンを混ぜたナフタリン単結晶にレーザー光をあてて励起状態とし、それにマイクロ波を照射することにより電子偏極を陽子に移す方法で陽子を偏極させた。この偏極法で陽子が自然状態の偏極の数万倍以上となり、約13%の偏極がはじめて確認された。これによって透過中性子スピンの偏極が高温で行なえることが判明した。更にタ-フェニール結晶についても同様の試みを行なっている。こられの成果は高エネルギー物理学の研究にも役立てられる。・ネオディウムを少量混ぜ合わせたLaAlO_3結晶中のランタン核を1.5K,23KGで動的に偏極し、約25%の偏極を得た。更にそれを熱外中性子をあてて中性子の透過度を測定するとともに透過中性子の偏極度を詳しく調べた。これにより中性子のランタン核による共鳴吸収反応を用いた時間反転非対称性の研究に新しい道を開くこととなった。・0.73eVの中性子をランタン核にあてた時に発生するガンマ線の中性子スピンの方向に対する非対称性をNaIシンチレーションカウンターを用いて精度よく調べ、核力における弱い相互作用についての新しい情報を得ることができた。これにより時間反転非対称度測定の感度を決定した。これらの研究成果によって熱外偏極中性子を用いた素粒子の対称性の研究を更に行なうための基礎を築くことができ、現在その測定に取り組んでいる。1、本研究ではまず加速器よりのスポレーション中性子を偏極させてウラン、トリウム、インジウム、よう素アンチモン、キセノン等の原子核に当て、透過中性子及び中性子捕獲ガンマ線を精度良く測定した。これにより中性子の核によるp波共鳴吸収におけるパリティ非保存効果の増幅メカニズムを解明し、ハドロン相互作用における弱いマトリックスエレメントを決定することができた。2、次にペンタセンをドープしたナトタレンを液体窒素にひたしてレザービームを照射し、triplet状態に励起した状態でマイクロ波によって動的偏極をおこさせる新しい陽子偏極法を開発した。これによって陽子を約30%偏極することに成功し、中性子偏極用フィルターとして用いることが可能であることを実証した。この陽子偏極法は高エネルギー反応のスピン依存性の測定にも適用できることが明かになった。3、時間反転パラメターの測定に必要な中性子偏極度測定装置として偏極ヘリウム3フィルターを製作した。そのために、レザーによるヘリウム3の偏極を試みた。またその偏極度をNMR測定法と中性子透過法で測定し、それらを相対的に較正する方法を見出した。4、偏極中性子と整列した原子核の反応における5ベクトルの相関を測定して時間反転の破れを探索するためにホルミウム中での低速中性子の減偏極を測定した。その結果、20eV以上の中性子では減偏極が顕著とはならないことを見出し、時間反転の破れの探索に道を開いた。1.スポレーション中性子をアンモニアを用いた偏極陽子フィルターで偏極させてトリウム、インジウム、銀、よう素、すず、アンチモン、キセノン等の原子核に当て、透過中性子及び中性子捕獲ガンマ線を精度よく測定した。
電極活物質/高分子固体電解質二次電池系におけるイオン輸送過程と電荷移動過程の解析

本年度はリチウム負極の顕微鏡観察及び交流インピーダンス測定から,固体およびゲル電解質中の特性比較を行い,イオン輸送過程・電荷移動過程を解析した.交流インピーダンス法による評価では,電解質にポリメタクリル酸メチル(PMMA)ゲル電解質及びポリエチレンオシド(PEO)固体電解質を適用した.どちらの複素インピーダンスプロットにも二つの半円がみられ,時間経過に伴い増加した.しかし,第1円の時定数の経時変化がそれぞれの電解質で異なった.すなわち,PMMAゲル系では時定数の大きな変化が見られた.これは,ゲル中の有機溶媒が徐々にリチウムと反応して,複数の反応生成物によるリチウムイオン伝導の抵抗膜相の形成に起因している.一方,PEO系では時定数はほとんど変化していないことから,同一組成の皮膜が単純に膜厚方向に成長している考えられる.以上の結果から,PEO固体電解質の方がリチウムに対してより安定であることが示された.さらに,窓付き電気化学セルを用いた顕微鏡観察により,新たにCO_2を添加したゲル電解質中でのリチウムの析出形態について評価した.その結果,CO_2添加によるデンドライト抑制が見られ,その結果は充放電サイクルを重ねるとより顕著に現れた.これは有機溶媒系と同様に,CO_2添加によって生成するLi_2CO_3等のリチウムイオン伝導性の良好な固体皮膜による表面改質の効果と考えられる.本年度はリチウム負極の顕微鏡観察及び交流インピーダンス測定から,固体およびゲル電解質中の特性比較を行い,イオン輸送過程・電荷移動過程を解析した.交流インピーダンス法による評価では,電解質にポリメタクリル酸メチル(PMMA)ゲル電解質及びポリエチレンオシド(PEO)固体電解質を適用した.どちらの複素インピーダンスプロットにも二つの半円がみられ,時間経過に伴い増加した.しかし,第1円の時定数の経時変化がそれぞれの電解質で異なった.すなわち,PMMAゲル系では時定数の大きな変化が見られた.これは,ゲル中の有機溶媒が徐々にリチウムと反応して,複数の反応生成物によるリチウムイオン伝導の抵抗膜相の形成に起因している.一方,PEO系では時定数はほとんど変化していないことから,同一組成の皮膜が単純に膜厚方向に成長している考えられる.以上の結果から,PEO固体電解質の方がリチウムに対してより安定であることが示された.さらに,窓付き電気化学セルを用いた顕微鏡観察により,新たにCO_2を添加したゲル電解質中でのリチウムの析出形態について評価した.その結果,CO_2添加によるデンドライト抑制が見られ,その結果は充放電サイクルを重ねるとより顕著に現れた.これは有機溶媒系と同様に,CO_2添加によって生成するLi_2CO_3等のリチウムイオン伝導性の良好な固体皮膜による表面改質の効果と考えられる.
リンパ節HEVに選択的に高発現する新規L-セレクチンリガンドの同定と機能解析

リンパ球ホーミングはリンパ球が高内皮性細静脈(HEV)と特異的な相互作用をすることから始まる。この相互作用はリンパ球上のL-セレクチンを介したローリング及び接着、血管外遊走から成る多段階反応である。我々はこれまで、HEVに発現し、ムチン様ドメインとIgドメインを併せ持つ新規膜タンパク質nepmucin(申請時はHev-2の仮称であったが、今回正式に命名)を同定し、リンパ節に発現しているnepmucinがL-セレクチン結合性糖鎖を有することを明らかにした。今年度、我々はnepmucinが生体内においてL-セレクチンリガンドとして機能するかについて明らかにするために、HEVにおけるL-セレクチン結合性糖鎖の生合成に必要な酵素群(LSST, FucTVII, C1GnT, C2GnT)を導入した細胞株を用いnepmucln/IgGキメラを作製し、このキメラ蛋白質がリンパ球ローリングを媒介するかについて検討した。その結果、nepmucin/IgGは既知のリンパ球ローリングを媒介する分子GlyCAM/IgGと少なくとも同程度に効率よくL-セレクチン依存性ローリングを媒介することが示された。Nepmucinを介したこのローリングはnepmucinのムチン様ドメインを介するが、我々は更にnepmucinがそのIgドメインを介して、L-セレクチン非依存的なリンパ球接着を媒介することを見出した。この接着はPMA等の刺激により亢進した。予備的な結果ではあるが、この接着を阻害する抗nepmucinモノクローナル抗体をマウスに静脈投与したところ、HEVに結合するリンパ球数が減少したことから、HEVに発現するnepmucinはin vivoでリンパ球ホーミングに重要な役割を果たしていることが示唆された。
アセチルサリチル酸によるＢＲＯＮＪ発症の予防法の開発

ビスホスホネート(BP)製剤服用者に発症する抜歯後の顎骨壊死(BRONJ)は、極めて重篤な症状を呈し、難治性の疾患であるが、十分な解明がなされているとは言えない。そのため、早期に予防法および治療法を確立することが望まれている。そこで、本研究では、BRONJに対するアセチルサリチル酸(アスピリン)の作用と効果を明らかにすることを目的とした。BRONJ発症過程において、アセチルサリチル酸を投与することで炎症反応が軽減した。以上の結果から、アセチルサリチル酸はBRONJを軽症化する可能性が示唆された。ビスホスホネート(BP)系薬剤の服用者に発症する顎骨壊死(BRONJ)は、極めて重篤な症状を呈し、難治性の疾患である。BP製剤投与中の患者に対して侵襲的歯科治療を行う場合、BP製剤の休薬が推奨されている。小児においても小児骨形成不全や骨ページェット病などの骨代謝異常疾患の治療薬として使用されている。そのため、小児歯科領域においても、BP製剤服用者の患者に遭遇する可能性がある。しかし、BP製剤の休薬がBRONJ発生を予防するという明らかな臨床的エビデンスは存在していない。そこで、本研究は、BRONJの発症機序の解明とアセチルサルチル酸(アスピリン)によりBRONJの予防が可能であるかについて、実験マウスを用いて検討を行った。BP製剤はゾレドロン酸水和物(Zometa)を使用した。Zometaを週1回、マウスの尾静脈から投与した。投与1か月後に上顎第一臼歯を抜去し、抜歯2か月後にマウスを屠殺し、マウスの抜歯窩周囲に発症しているBRONJの重篤度について肉眼的あるいは組織学的検討を行った。抜歯2か月後のアセチルサリチル酸非投与群では、抜歯窩が上皮で被服されず、歯槽骨が露出しているBRONJ様症状を発症した。脱灰後に作成した組織切片では、抜歯窩周囲の歯槽骨における骨細胞の喪失していた。一方、抜歯2か月後のアセチルサリチル酸投与群においては、全てのマウスの抜歯窩は上皮で被服されており、抜歯窩周囲の歯槽骨における骨細胞の喪失は減少していた。以上の結果から、アセチルサリチル酸投与によりBRONJ発症を抑制できる可能性が示唆された。ビスホスホネート系薬剤の服用者において抜歯後に発症する顎骨壊死(BRONJ)は、極めて重篤な症状が発症し難治性の疾患であることから、発症を予防することが重要となっている。抜歯処置が必要な場合は、BP製剤の休薬が推奨されているが、BP製剤の休薬がBRONJ発生を予防するという明らかな臨床的エビデンスは存在していない。初年度の研究において、マウスモデルを用いてアセチルサルチル酸(アスピリン)を投与した実験群ではBRONJの発症が抑制されることを明らかにした。そこで、昨年度の研究では、BRONJ発症過程におけるアスピリンの抑制作用機序について検討を行った。ゾレドロン酸水和物(Zometa)をマウスの尾静脈に毎週投与を行い、投与1か月後に上顎第一臼歯を抜去、抜歯2か月後にマウスの屠殺を行い、アスピリン投与群と非投与群における抜歯窩周囲の組織像について比較検討を行った。アスピリン非投与群において、抜歯窩における顎骨壊死部の周囲では、好中球の浸潤を伴う炎症所見が広範囲に確認されたのに対し、アスピリン投与群では顎骨壊死部の周囲において浸潤している好中球の数は有意に減少し、炎症状態を呈している組織像の範囲は減少していた。一方、血中のTh1細胞数を測定したところ、アスピリン投与群ではアスピリン非投与群に対して有意に減少していることが判明した。また血漿中のTNF-αおよびIL-1βの濃度を定量したところ、アスピリン投与群ではアスピリン非投与群と比較して同じく有意に低下していることが判明した。以上の結果から、BRONJ発症過程において、アスピリンを投与することで炎症反応が軽減し、BRONJの発症が軽症化する可能性があることが示唆された。平成26年度の研究において、マウスモデルを用いてアセチルサルチル酸(アスピリン)を投与した実験群ではBRONJの発症が抑制されることを明らかにした。平成27度の研究では、BRONJ発症過程におけるアスピリンの抑制作用機序について検討を行い、炎症反応の軽減によりBRONJの発症が軽症化する可能性を明らかにした。そこで、今年度は昨年度と同様に、昨年度に得られた結果を踏まえて詳細に検討した。ゾレドロン酸水和物(Zometa)をマウスの尾静脈に毎週投与を行い、投与1か月後に上顎第一臼歯を抜去、抜歯2か月後にマウスの屠殺を行い、アスピリン投与群と非投与群について比較検討を行った。アスピリン投与群に比べアスピリン非投与群において、Treg細胞の機能低下に伴うTh17細胞の増加と血中IL17濃度の上昇が認められた。

また、これらに関係して、CD25中和抗体の投与はBRONJ症状を悪化させることが認められた。これらの結果より、アスピリンを投与することでTreg細胞の機能低下によるTh17細胞の免疫応答が収束し、BRONJの発症が軽症化する可能性があることが示唆された。ビスホスホネート(BP)製剤服用者に発症する抜歯後の顎骨壊死(BRONJ)は、極めて重篤な症状を呈し、難治性の疾患であるが、十分な解明がなされているとは言えない。そのため、早期に予防法および治療法を確立することが望まれている。そこで、本研究では、BRONJに対するアセチルサリチル酸(アスピリン)の作用と効果を明らかにすることを目的とした。BRONJ発症過程において、アセチルサリチル酸を投与することで炎症反応が軽減した。以上の結果から、アセチルサリチル酸はBRONJを軽症化する可能性が示唆された。当初の研究計画に沿って順調に研究が進んでいる。さらに、研究計画書作成時と比較して新しい知見が得られており、今年度の実験を継続することでさらなる成果を上げられる可能性があると考えている。矯正・小児系歯学次年度は、本年度同様に、BRONJモデルマウスを用いた実験の他に、実験動物で得られた情報に関して、in vitroでの詳細な検討を行う予定である。また、本年度と同様に炎症性サイトカインの培養上清中への放出量やmRNA発現をそれぞれRT-PCR法やELISA法を行い定量し、BP剤に対する細胞応答について検索を行う予定である。物品費(消耗品費)においてキャンペーン品があり、当初予定額より支出が抑えられ、経費の節約ができ、次年度使用額が生じた。次年度は、本年度同様に、BRONJモデルマウスを用いた実験の他に、実験動物で得られた情報に関して株化細胞を用いてアセチルサリチル酸によるBRONJ抑制効果のメカニズムに関して詳細に検討を行う予定である。BRONJ発症機構におけるアセチルサリチル酸の薬理学的作用について、骨芽細胞、間質細胞、マクロファージなどに対するBP剤の作用に関して検討を行う予定である。一定期間培養後に、BP剤を作用し、細胞生存度assay、細胞増殖assay、BrdU assay等を行い、BP剤の培養細胞に対する影響を調べる。また、炎症性サイトカインの培養上清中への放出量やmRNA発現をそれぞれRT-PCR法やELISA法を行い定量し、BP剤に対する細胞応答について分子生物学的に検索を行う予定である。経費の節約により生じた未使用額243,853円については、3月に納品された消耗品の支払い、および、今年度の炎症性サイトカイン測定に関連する消耗品購入に使用する。未使用額は前年度に納品されたTaqman gene expression assay(RT-PCR法)、I型コラーゲン、旅費の4月支払いに充てる。また、経費の節約により生じた未使用額18,954円については、今年度の炎症性サイトカイン測定のためのRT-PCR法およびELISA法に関する消耗品購入に使用する。
要介護高齢者の自然排泄移行に向けた訪問看護実践モデル開発のための基礎的研究

自然排泄が可能となった要介護高齢者に実施した訪問看護師の援助、自然排泄への影響要因を明らかにした。訪問看護師10名にインタビューを行い、質的分析の結果、訪問看護師の援助は「要介護高齢者の排泄に関わる情報の把握とアセスメントをする」「便の性状を整え排便習慣をつくる」「訪問看護の時間にトイレでの排泄を誘導する」「トイレへの移動動作の安定のためにリハビリテーションを行う」「生活機能低下をもたらす健康状態をモニタリングする」の5つ、自然排泄への影響要因は「要介護高齢者の行動変容を捉える」「家族のセルフケア機能を維持する」「他の専門職の協力を得て要介護高齢者の排泄行動の変容を促す」の3つを抽出した。本研究の目的は、訪問看護援助により、自然排泄が可能となった要介護高齢者の事例から、自然排泄移行の影響要因と、訪問看護師の具体的援助方法を明らかにし、要介護高齢者の自然排泄移行に向けた訪問看護実践モデルの構成概念を抽出することである。自然排泄は、トイレ、ポータブルトイレ、尿便器といった排泄に使用する用具を用いて排尿、排便ができることと定義している。今回は、訪問看護経験年数が3年以上の訪問看護師を対象に半構造的面接を実施し、訪問看護援助により自然排泄が可能となった要介護高齢者の実際の事例について、その状況、実施した看護援助内容とその援助を実施した理由を半構造化面接により得る。研究協力施設8カ所において、担当者から研究対象候補者である訪問看護師を紹介され、研究者が研究協力依頼を行った。2016年4月1日の時点で10名の研究対象者から協力を得て、訪問看護援助により自然排泄が可能となった要介護高齢者12名についてのデータを収集した。面接時間は平均40分であり、インタビューデータは研究対象者の許可を得て録音した。分析は、質的記述的に行い、録音したインタビューデータを文字におこし逐語録としたものをデータとする。これを熟読して意味ある内容ごとに切片化し、要介護高齢者の自然排泄移行に影響した要因、訪問看護師の具体的援助方法を示す内容を抜き出す。さらに、意味内容が類似するものを集めて分類し、サブカテゴリー、カテゴリーを抽出する。現在はこの分析作業を行っており、今後はこの分析の結果作成した要介護高齢者の自然排泄移行の影響要因、訪問看護師の具体的援助方法の構成要素に、考察を加えて要介護高齢者の自然排泄移行を支援すると考えられる訪問看護援助内容を抽出し、要介護高齢者の自然排泄移行に向けた訪問看護実践モデルの構成概念を生成する。データ収集は平成27年8月から開始したが、インタビュー調査実施にあたり、研究者と研究対象者のスケジュール調整に時間を要したため、データ収集期間が予定より延長した。平成28年6月にはデータ収集終了を予定しており、すでに収集したデータについては分析を進めているため、今後はこれ以上の遅れはないと考えられる。訪問看護援助により、自然排泄が可能となった要介護高齢者の事例から、訪問看護師の援助と、自然排泄移行の影響要因を明らかにすることを目的とした。研究対象は、8カ所の訪問看護ステーションに勤務する訪問看護師10名であった。訪問看護師は、訪問看護援助により、自然排泄が可能になった要介護高齢者1名を選定しインタビューに答えた。10名の訪問看護師から要介護高齢者12名のデータを得た。得られたデータは、要介護高齢者の自然排泄移行に影響した要因、訪問看護師の援助について語られた内容に着目して意味内容が類似するものを集めコンテンツとして分類した後、コンテンツ間で意味が類似するものを収集し、抽象度を高めて領域として分類した。さらに、領域間で意味が類似するものを収集し、抽象度を高めて焦点として分類した。結果、訪問看護師が選定した要介護高齢者は、男性6名、女性6名であり、年齢は70歳代3名、80歳代6名、90歳代3名、要介護度は要介護1が2名、要介護3が4名、要介護4が3名、要介護5が3名であった。訪問看護師の援助は、104のコンテンツが含まれる26の領域、さらに「要介護高齢者の排泄に関わる情報の把握とアセスメントをする」「便の性状を整え排便習慣をつくる」「訪問看護の時間にトイレでの排泄を誘導する」「トイレへの移動動作の安定のためにリハビリテーションを行う」「生活機能低下をもたらす健康状態をモニタリングする」の5の焦点に分類された。自然排泄の影響要因は、47のコンテンツが含まれる11の領域、さらに「要介護高齢者の行動変容を捉える」「家族のセルフケア機能を維持する」「他職種と連携する」3の焦点に分類され、要介護高齢者の自然排泄移行にはこの3つの要因が大きく影響していると示唆された。本結果分析より、要介護高齢者の自然排泄移行に向けた訪問看護実践モデルの構成概念を検討する上で示唆を得ることができた。訪問看護師10名にインタビューを行い、質的分析の結果、訪問看護師の援助は「要介護高齢者の排泄に関わる情報の把握とアセスメントをする」「便の性状を整え排便習慣をつくる」「訪問看護の時間にトイレでの排泄を誘導する」「トイレへの移動動作の安定のためにリハビリテーションを行う」

「生活機能低下をもたらす健康状態をモニタリングする」の5つ、自然排泄への影響要因は「要介護高齢者の行動変容を捉える」「家族のセルフケア機能を維持する」「他の専門職の協力を得て要介護高齢者の排泄行動の変容を促す」の3つを抽出した。現在協力が得られている研究対象者のデータ収集を行い、平成28年6月までに終えることを予定している。随時、録音もしくは得られた内容を逐語録としてデータとし、質的記述的分析を進める。要介護高齢者の自然排泄移行に向けた訪問看護実践モデルの構成概念の生成にあたっては、訪問看護実践者の協力を依頼しており、実践者の視点での具体的助言も得る。在宅看護次年度使用額が生じた理由として、データ収集に関する交通費が当初の予定よりも抑えられたこと、学会や研修への参加回数が少なかったこと、また、移動先に持ち運びができ、データの保存や分析に使用するためのノートパソコンを購入する予定であったが、研究計画が予定より遅れたため、平成27年度中の購入ができなかったことがあげられる。前年度未使用額の使用計画として、データ収集にかかる交通費や謝金、テープ起こしを業者に依頼するための使用、移動先で使用するノートパソコンの購入費とすることを予定している。