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ピーター・マシセンと20世紀アメリカ文学

本研究ではピーター・マシセンの作品に通底するのは「環境」と「正義」というテーマであると論じた。特にテキサス大学オースティン校のHarry Ransom Centerを訪問し、これまでマシセン研究であまり分析されることのなかったマシセンの原稿や手記を分析資料を含めてたことで、おマシセン研究の議論を刷新した。本研究の締めくくりとして、これまでの研究成果を海外出版用の原稿としてまとめ、英文校閲(約200ページ)を済ませると共に、海外学術出版局と出版交渉を始めた。研究対象であるピーター・マシセンが2014年4月に亡くなった為(享年86歳)、当初予定していたインタビューが不可能となり、初年度は資料収集と資料解題に注力した。特にマシセン関連の主要な作品を再読し、20世紀アメリカ文学論の構築に必要な議論の準備を進めた。収集したのは、モダニズム研究を中心に、20世紀後半のアメリカ文学研究に関わる資料である。2014年10月に単著American SeaLiterature: Seascapes, Beach Narratives, and UnderwaterExplorationsをニューヨークのPalgrave Macmillan社より出版した。本書において、マシセン後期の名作Far Tortuga(1975)を取り上げ、20世紀的アメリカ海洋文学の一つの到達点として、言語表現技法を議論している。すなわち、ナレーションによって風景が叙述されるというよりも、海環境を構成する水、風、人間を含めた生き物たちが、音や視覚的描写によって即物的に海の風景(海景)が示されている。航海記や探検記を素地として作られていく19世紀的アメリカ海洋文学の修辞学的伝統が、20世紀的環境問題や人種問題と関連づけられながら、モダニズム的手法により表現がそぎ落とされ、海環境が主体として表現し直されていると議論した。初年度に予定されていたインタビューが実施できなくなったため、20世紀アメリカ文学研究に関連する資料を調査・収集を続けた。特に20世紀後半のアメリカ文学研究実践や文学理論の動向について調査し、資料の解読を続けた。マシセン関連の特別資料を管理するテキサス大学オースティン校のHarry Ransom Centerを訪問し、調査をした。当施設ではマシセンの直筆原稿を始めとして、マシセンの初期の作品にまつわる様々な資料が閲覧可能であり、多くの資料をデジタルカメラで複写し持ち帰ることができた。特に、初期のマシセン作品がどのような編集プロセスを経て出版されたかを示す資料については、これまでマシセン研究で取り上げられたことが無く、本研究課題の新たな成果として期待される。第二回海外出張としてアメリカのピーボディエッセクス博物館及びハーバード大学図書館を訪問し、現代アメリカ文学研究関連資料を収集した。特に21世紀アメリカ文学研究関連資料が充実しており、多くの資料を収集することができた。二回の調査出張で収集した資料を検討、評価し、作品論との関連付けの検討を続けた。まだ資料整理及び解題が途中であり、学会発表やワークショップなどは参加できなかったが、論文出版の為に成果をまとめる準備を続けた。学会発表の予定が立たなかったため、その出張費を二回目の調査出張費に充てることになった。次年度には韓国で環境文学会関連の国際会議が開催予定であり、会議には参加予定である。また、香港で開催される国際会議に招待講演する予定である。初年度に作家が逝去した為、次年度以降の研究計画に少し調整が必要になったが、想定内の計画変更であったため、研究成果としては概ね順調であると判断した。また、二年目に予定していた学会発表が変更になったが、その際の代替的措置として調査出張実施を想定していたため、これも想定内の計画変更となった。結果として、2回の海外調査出張で、資料収集を充実させることができ、また、最終年度に国際会議で招待発表することになったため、概ね計画どおりと判断した。平成28年5月27日ー28日に香港大学で開催された国際会議"CONTEXTUALIZING ASIANECOCINEMA: PASTAND FUTURE"に招待され、カール・シュミットの海概念を批判的に検討し、現代アメリカの海環境をめぐる言説について、同年ピュリッツァー賞受賞したWilliam Finneganによる自伝的作品Barbarian Days: ASurfing Lifeを取り上げてサーフィンナラティブの現代文学的意義について整理した。更に、サーフィン文化を代表するドキュメンタリー映画The Endless Summerを取り上げながら、サーフィンナラティブと映像的表現を相互比較しながら、海環境における「海辺」と「海上」の物質的要素を明らかにし、結語としてそれが沖縄の辺野古問題に現れるドキュメンタリー映像にも見られることを議論した。6月には「第50回アメリカ学会年次大会:平成28年度アメリカ学会年次大会(東京女子大)」【部会B拡張主義と環境】「アメリカ拡張主義とアメリカ合衆国探検遠征(1838-42)」に招待され、研究発表した。アメリカの太平洋における覇権主義の展開(軍事・商業・植民地(領土拡大)の基盤を作ったウィルクスのアメリカ合衆国探検遠征について、21世紀的グローバリズムの展開を考える契機の一つとして、アメリカ拡張主義をアメリカ合衆国探検遠征から再考する必然について議論した。9月には『パナマ・太平洋万国博覧会ー1915サンフランシスコーPartI』全7巻をアティーナプレスより出版し、出版用パンフレットとして「パナマ・太平洋万国博覧会(Panama-Pacific International Exposition, 1915)とその意義について」を発行した。平成27年度に専攻課程の主任を務める傍ら、H30年度に予定している学部改組の検討委員としてカリキュラムや入試の作業部会に関わることで、研究時間が大幅に削減された。

更に、ピーター・マシセン関連の資料では、これまで検討されたことのない資料についての考察に時間を要しており、全体として計画が遅れることになった。本研究の締めくくりとして、これまでの研究成果を海外出版用の原稿としてまとめ、英文校閲(約200ページ)を済ませると共に、海外学術出版局と出版交渉を始めた。本研究ではピーター・マシセンの作品に通底するのは「環境」と「正義」というテーマであると論じた。特にテキサス大学オースティン校のHarry Ransom Centerを訪問し、これまでマシセン研究であまり分析されることのなかったマシセンの原稿や手記を分析資料を含めてたことで、おマシセン研究の議論を刷新した。当初予定していたインタビューが不可能になったが、その分集中的に資料の収集、整理と解読に充てることができた。5月に香港の国際会議で招待講演することになっており、これまでの研究成果を部分的に発表する予定である。5月の国内のアメリカ学会に招待発表することが決まっており、関連トピックについて発表予定である。また、11月に環境文学国際会議に参加し、研究成果について意見交換する予定である。これらの研究成果発表の機会をとおして、最終的な成果のとりまとめをすすめ、年度末には海外で成果を出版できるよう準備を続ける。研究の総括としてこれまでの研究成果をまとめ、海外で出版するための準備を進める。今後、アメリカを中心に出版社(編集者)とのコミュニケーションを始める。アメリカ文学当初の27年度の計画どおり、昨年度収集した資料を整理し解読を続けながら、議論をまとめる。マシセン関連の資料を更に収集するために、テキサス大学図書館を訪問する予定である。予定していた学会発表を実行しなかったため、当初計画に変更が生じ、使用額に変更があった。平成27年度に専攻課程の主任を務めたことにより、多忙を極め、研究時間を削られた。また、平成30認可予定の大学改組計画の検討委員、作業部会の委員として複数の委員会活動に関わったことで、本研究の出張計画に変更が生じた。更に、収集した資料の中に、これまでの研究で未使用のものがあり、その解読に時間を要した。上記の理由で研究計画に変更が生じ、研究期間を延長することとなった。図書発注に時間を要する為に、実際の予算執行額と年度末残高の正確な把握が遅れ、残額が生じることになった。既に別の国際会議と国内学会に参加が決まっており、その参加費に充てる予定である。当初予定していた最終年度計画の実行を、本年度に実施する。
液体窒素温度におけるポリイミドフィルムの特性評価とソフトアクチュエータへの応用

本研究では、液体窒素温度付近で柔軟に駆動可能なソフトアクチュエータについて研究を行った。極限環境で駆動可能なソフトアクチュエータを実現するために、本研究ではポリイミド(PI)フィルムの溶着技術の開発・評価を行った。本技術により、PI製バルーン、および湾曲動作を実現するPI製ソフトアクチュエータを実現した。開発したアクチュエータは、これまでのソフトアクチュエータでは実現不可能であったー195度付近において駆動を実現した。本研究は、液体窒素温度付近(ー196°C)において駆動可能な低温環境用ソフトアクチュエータの確立を目標としている。目標達成のために3つの段階に研究を分けており、基盤課題としてアクチュエータの主材料となるポリイミドフィルム同士の溶着強度の評価、本課題としてバルーン型アクチュエータの試作・評価、発展課題としてロボットハンドやアームへの利用を視野に入れた湾曲駆動を実現するソフトアクチュエータの開発、を段階的に進める。これらを通して、構成材料の評価からアクチュエータ製作・評価、低温用ガス圧駆動システムの確立まで一貫して取り組む。本年度はアクチュエータを試作するための基盤課題として、1溶着強度評価実験であるフィルム剥離試験を液体窒素温度環境において行うために、液体窒素温度に対応した専用のフィルム引張試験機を開発した。本試験機を室温において使用し、2アクチュエータの主材料となるポリイミドフィルム同士の溶着強度評価に成功し、溶着温度と室温における溶着強度の関係を明らかにした。測定した溶着強度より、アクチュエータの製作に必要となる溶着条件やアクチュエータが駆動可能な最大印加圧力が設定可能となった。加えて、平成28年度に先立ち、3アクチュエータの駆動に必要となる窒素ガスを使用した駆動システム、および4空圧アクチュエータ用低温性能評価装置に関して構築を行った。これらを利用することで、次年度以降、試作した低温用アクチュエータの評価を円滑に進める。また平行して、5湾曲型アクチュエータの湾曲角度および先端における発生力に関する設計パラメータの導出を行った。今後、試作したアクチュエータの評価を通じて導出した設計パラメータの検証を行っていく。(1)液体窒素温度環境においてフィルム剥離試験を行うために、専用の引張試験機を製作した。液体窒素デュワー内にフィルム試験片およびフィルム把持部のみを挿入することで冷却を行い、それ以外の測定系統・駆動系統を室温環境に設置することで、安価かつ校正が容易な構成を実現した。本試験機を使用し、溶着条件として溶着温度を変更した試料片について、室温および液体窒素温度付近における剥離試験に成功した。剥離試験より室温環境では、溶着温度に依存して溶着強度が113737N/mと大きく変化する結果が得られ、アクチュエータを製作する溶着条件の重要性が明らかとなった。本結果をもとに、次年度以降のアクチュエータ製作条件を決定していく。一方で、液体窒素温度付近における剥離試験の回数が不十分であり、継続して試験を行っていく。(2)液体窒素温度環境では空気中の水分は固化し、酸素が液化する等の課題があり、一般的に使用される空気圧システムでは駆動が行えない。そこで、乾燥窒素を使用した低温用ガス圧駆動システムを構築した。今後、本システムを液体窒素環境におけるアクチュエータ駆動に利用していく。(3)新たに空圧アクチュエータ用低温性能評価を構築した。構築した評価装置は、本研究以前に開発した評価装置と比較して、倍以上の大きさのアクチュエータが搭載可能、複数のアクチュエータの同時駆動、光学系統の高画質化などに成功している。今後、試作したアクチュエータは室温・低温共に本装置を利用して評価を行っていく。(4)湾曲型アクチュエータの湾曲角度および先端における発生力に関する設計パラメータの導出を行った。今後、アクチュエータの試作・評価を通じて、導出した式等の妥当性および有効性を検証する。本研究は、液体窒素温度付近(ー196°C)において駆動を実現するソフトフィルムアクチュエータの確立を目標としており、研究を基盤課題、本課題、発展課題の3つのステップに分けている。昨年度、基盤課題としてアクチュエータの主材料となるポリイミドフィルム同士の溶着強度についての評価を進めた。本年度は本課題であるバルーン型アクチュエータの試作・性能評価を実施し、さらに発展課題としてロボットアーム等への応用を視野に入れた湾曲型フィルムアクチュエータの試作・評価を行った。バルーン型アクチュエータを利用した実験では、昨年度得られた溶着強度から推定した耐久度と同程度の実験結果が得られ、従来と比較して高いガス圧を印加可能である事が示された。また基盤課題に再度戻ることによって、より強い溶着方向を選定した。選定された溶着方向を元にバルーン型アクチュエータの製作を行った。試作によって、従来と同サイズで、さらに高いガス圧の印加が実現された。最大印加圧力が向上したことにより、駆動源として使用した際の最大発生力の大幅な向上が期待される。発展課題である湾曲型アクチュエータの製作では、片方のフィルムを折り曲げた蛇腹構造とすることで湾曲動作を実現した。試作した湾曲型アクチュエータについて、室温およびー195°C付近で駆動評価を行った。いずれの温度においても、想定どおりの動作を実現している。一方で、フィルムを折り曲げた部分での強度低下が見られた。また製作プロセスが複雑であり、大量生産が困難という課題が挙がった。

そこで、フィルムに対して塑性加工を施し、蛇腹構造と同様の動作を実現する莢状構造を製作するフィルム型取り装置を製作した。(1)バルーン型アクチュエータの製作を行い、最大印加圧力に関する評価実験を行った。試作したアクチュエータに空気を印加し、溶着部よりリークが生じる圧力を最大印加圧力とし測定した。最大印加圧力は170kPaと大きく、フィルモティクス用アクチュエータとして十分であった。また溶着試験より算出された最大印加圧力と同程度であり、溶着強度の限界までアクチュエータとして利用できていることが確かめられた。(2)アクチュエータへの最大印加圧力が溶着強度に依存していることが確かめられたことから、基盤課題に戻り、より強い溶着の実現を目指した。これまでのT字剥離方向からせん断剥離方向に溶着方向を変えることで、更なるアクチュエータの性能向上を目指した。引張試験機による剥離試験の結果、せん断剥離方向ではT字剥離方向の7.6倍の強度向上が見られた。また試作したアクチュエータでは、最大印加圧力が3.2倍と大きく向上した。(3)湾曲動作を実現する蛇腹構造を持ったアクチュエータを試作・評価した。蛇腹構造の製作には、ポリイミドフィルムを折り曲げる事で製作を行った。試作したアクチュエータについて、室温およびー140°C付近において評価を行った。1関節あたり、印加圧力30kPaにおいて最大発生力30mNm、無負荷時の最大湾曲量27度であった。ハンドリング用アクチュエータへの応用などが期待できる。(4)蛇腹構造を有したアクチュエータの製作では、蛇腹を繰り返し展開・収納することによる疲労破壊が生じやすかった。加えて折り曲げプロセスが複雑であり、ロボットへの使用を視野に入れると、同じ性能のアクチュエータが複数必要である事から、より簡易なアクチュエータ製作手法が必要であった。そこで塑性変形をフィルムに対して施し、湾曲動作を実現する莢状構造を製作するフィルム型取り装置を製作した。本研究は,液体窒素温度付近(ー196°C)において駆動を実現するソフトフィルムアクチュエータの確立を目標としている.昨年度,発展課題として液体窒素温度環境において駆動可能な湾曲型アクチュエータを実現した.一方でアクチュエータの製作方法に起因した耐久性の低下が生じたことから,莢状構造を成型可能なフィルム型取り装置の開発を進めた.本年度は,1フィルム型取り装置を用いて湾曲型アクチュエータを試作・評価した.加えて,2成型の自由度,生産性を向上させた熱間圧空成型法を確立し,3同成型法を利用した湾曲型アクチュエータの試作・評価を行った.1昨年度開発したフィルム型取り装置を用いて,これまで開発してきた蛇腹構造を持つアクチュエータと同出力を目指した莢状湾曲型アクチュエータの製作を行った.室温およびー136°Cにおいて駆動実験を行い,いずれの温度環境においても発生トルクは同程度の性能を有することを確認した.また,繰り返し駆動試験を行い,約4倍の繰返し回数まで耐えられる事を確かめた.2フィルム型取り装置では,一度に1つの構造しか成型できず,また非対称性を持つ構造等の成型が不可能であった.そこで,本年度はポリイミドフィルムの熱間圧空成型法を確立した.
新規誘導法で樹立された神経幹細胞は脳梗塞を治療しうるか？

神経幹細胞特異的な4つの転写因子群をマウス皮膚線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて強制発現させることで、iNS細胞株を誘導した。得られたiNS細胞株はニューロンとグリア細胞にそれぞれ分化できることも確認した。また脳梗塞マウスモデルの検討ではiNSC細胞移殖群ではvehicle群と比較して、明らかな生存率の改善と運動機能改善効果を認めた。以上の実験結果から新規iNS細胞株は脳梗塞急性期において治療効果があることが明らかになった。本研究はマウス皮膚線維芽細胞より神経幹細胞を直接的に誘導し(induced neuronal stem cells; iNSC)、脳梗塞などを含む神経疾患への治療応用へ展開するための基礎的研究基盤を確立することが目的である。平成25年度はまず細胞移植源となるグリーンマウスの入手ならびに交配を行った。また日本の研究環境に合わせて、ダイレクトリプログラミング法に用いるウイルスベクターの再構築を進めた。具体的には神経幹細胞を直接的に誘導するための転写因子群であるSox2, FoxG1, Brn2を発現するレトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターを準備した。さらに、これまでのダイレクトプログラミング法を用いた神経系細胞の誘導法に関し、これまでの文献や関連情報を集めると共にそれをレビューし、`Direct reprogrammed neuronal cellsas a novel resource forcell transplantation therapy`という内容で英語総説をCell Transplantation誌に発表した。本研究はマウス皮膚線維芽細胞より神経幹細胞を直接的に誘導し(induced neural stem cells; iNSCs)、脳梗塞などを含む神経疾患への治療応用へ展開するための基礎的研究基盤を確立することが目的である。平成25年度に主にダイレクトリプログラミングを行うためのウイルスベクターの構築を行った後、平成26年度は韓国建國大学のDong Wook Han博士との共同研究により神経幹細胞特異的な4つの転写因子(ここではFactor Xsとする)をマウス皮膚線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて強制発現させることで、iNS細胞を誘導した。また至適条件下でニューロンとグリアに分化誘導し、免疫染色で評価した。培養開始4週間後、皮膚線維芽細胞の形態はクラスター状に変化し、EGF,FGF存在化で継代することで、iNS細胞株を誘導した。得られたiNS細胞株はNestin, Sox2, Olig2などの神経幹細胞マーカーが陽性であることが確認された。またニューロンとグリア細胞にそれぞれ分化させた場合、ニューロンのマーカーであるMAP2, Tuj1、アストロサイトのマーカーであるGFAP,オリゴデンドロサイトのマーカーであるGalCがそれぞれ陽性であることも確認でき、このiNS細胞株が多分化能を持つことも確認できた。以上の結果よりこのダイレクトリプログラミング法によって誘導されるiNS細胞はニューロン、アストロサイト、オリゴデンドサイトに分化誘導可能であり、多分化能を持つことが示された。平成25年度に主にダイレクトリプログラミングを行うためのウイルスベクターの構築を行った後、平成26年度は韓国建國大学のDong Wook Han博士との共同研究により神経幹細胞特異的な4つの転写因子(ここではFactor Xsとする)をマウス皮膚線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて強制発現させることで、iNS細胞株を樹立した。またin vitroの実験系において、その細胞株が多分化能を持つことも確認した。その上で、平成27年度に、虚血24時間後のマウス脳梗塞モデル(30分一過性脳虚血モデル)の虚血周辺部に未分化なiNSC細胞を1×105個を細胞移殖を行い、その後の生存率、運動機能、脳梗塞体積等を検討したところ、iNSC細胞移殖群ではコントロール群と比較して、明らかな生存率の改善と運動機能改善効果を認めた。移植後28日後、8ヶ月後の検討の結果、移植された細胞は大部分がアストロサイト等のグリア細胞に分化していることが明らかになった。また移植後8ヶ月までの間で、その細胞移殖群から腫瘍形成は認めないことを確認している。以上の実験結果から、本実験で用いたiNS細胞株が脳梗塞急性期において治療効果があり、かつ安全性の高さが示された。以上の結果を既に英語論文にまとめ現在投稿中である。現在、すでにマウス脳梗塞モデルに対してiNS細胞株を移植手術を行い運動機能評価等を行っているが、iNS細胞株の腫瘍形成などの安全性を確認するために移植後6ヶ月間の長期生存モデルの経過を観察する必要が生じた。このため当初の予想よりも、脳組織解析を全て終了させることに時間を要することとなっている。脳神経外科学長期生存モデルの経過観察を行い、iNS細胞移植で腫瘍が生じないかを注意深く観察する。また同時に免疫組織学的手法を用いて、移植治療による治療効果の検討を早急に進める。

ウイルスベクターや細胞移植源の準備等は整ってきているが、ダイレクトリプログラミング法によるiNSC細胞樹立がまだできておらず、速やかに細胞株樹立を進める必要がある。平成26年度にiNSCsの移植手術を受けた動物モデルの免疫組織学的検討を行う予定であった。しかし細胞移植後の腫瘍形成が起こるかどうかを検討するため、細胞移植後6ヶ月以上長期生存させて解析する必要があるが、これに当初想定よりも時間を要することとなり、長期生存モデルの解析と成果発表を行うことが出来ない見込みとなったため、未使用額が生じた。iNSC細胞株樹立を速やかに進める。このため、長期生存モデルの解析と成果発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。想定していたよりもダイレクトリプログラミング法に用いるためのウイルスベクター再構築に時間を要したため、現時点でiNSCが樹立できていないため。早急にiNSCを樹立したのち、マウス移植実験へ移行する予定である。
ドコサヘキサエン酸による破骨細胞分化抑制機序の解明

DHAの処理時間を検討した結果、DHAは破骨細胞の後期に存在することが必須であり、破骨細胞融合過程に作用していると考えられた。sRANKL存在下で3日間培養したBMMsの遺伝子発現プロファイルを調べ、DHAおよびEPAによって相反する方向に発言が変動する遺伝子を比較した。GO解析の結果、細胞運動、細胞接着、細胞間シグナル伝達および細胞形態形成に関連する遺伝子群が抽出された。また、定量的PCR分析によって破骨細胞における細胞融合過程に不可欠な遺伝子であるDC-STAMPの他、Siglec-15、Tspan7、およびMst1rなどの遺伝子がDHAにより阻害されることを確認した。DHAを添加する期間を変えて実験した結果から、破骨細胞分化後期の細胞融合過程に作用していることが明らかとなったため、破骨細胞分化後期での遺伝子発現変化について、マイクロアレイを用いて検討した。RANKL無処置、RANKL無処置およびDHA処置、RANKL処置、RANKL処置およびDHA処置について検討したところ、RANKLで発現が誘導され、DHAで抑制される遺伝子群に破骨細胞分化関連遺伝子が多く含まれていた。さらに、RANKL無処置、RANKL処置、RANKL処置およびDHA処置、RANKL処置およびEPA処置で比較し、DHAとEPAで反対の動きをする遺伝子群を検索した。このグループには細胞接着、細胞運動などに係る遺伝子などが多く抽出された。今後、抽出したこれら遺伝子の作用機序についてさらに検討を進めていく。我々はn-3系高度不飽和脂肪酸(PUFA)の中でドコサヘキサエン酸(DHA)が強い破骨細胞分化抑制作用を持つ一方、同じn-3系PUFAであるEPAでは逆に破骨細胞分化が促進されることを見出した(Prostaglandins Other Lipid Mediat., 2010)。本研究では、DHAの破骨細胞分化抑制作用機序を明らかにすることにより、新たな骨疾患の治療目的を提示することを目標とした。そこで、その時点でのBMMsの遺伝子発現をマイクロアレイにより網羅的に解析し、DHAおよびEPAによる遺伝子発現の変動について比較した。解析の結果から、細胞運動性、細胞接着、細胞形態形成、細胞間シグナル伝達および脂質代謝過程に関連する遺伝子群が影響を受けていることが示された。また、定量的PCRの結果から破骨細胞における細胞融合過程に不可欠な遺伝子であるDC-STAMPの他、Siglec-15、Tspan7、およびMst1rなどの遺伝子についてEPAでは阻害されないがDHAにより阻害されることが確認された。マウス骨髄由来単核球(BMM)をRANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)またはM-CSF(Macrophage-Colony Stimulating Factor) + RANKL存在下で培養し、破骨細胞への分化を誘導するin vitro単培養系を用い、破骨細胞分化のどの段階で分化を抑制しているか遺伝子発現を指標に検討した。これまでの検討結果からEPAでは巨大かつ核数の多い破骨細胞が形成されているが、DHAでは大きさ及び核数ともに小さい破骨細胞しか観察されないこと、多核化していない細胞もTRAP陽性となっていることが示されており、PUFAはfusion過程に作用している可能性が高いと考えられた。DHAの作用時間を変化させて検討した結果、sRANKL添加後TRAP陽性となる過程(sRANKL添加直後2日後)のみDHAを添加した場合には破骨細胞形成は抑制されず、その後のfusion過程でDHAが存在することで破骨細胞形成が抑制されることが明らかとなった。DHAがfusion過程にどのような作用を及ぼすのか、破骨細胞分化に伴う遺伝子発現変化から検討することを試みた。マイクロアレイを用いてsRANKL無処置、sRANKL無処置およびDHA処置、sRANKL処置、sRANKLおよびDHA処置の4群の遺伝子発現を比較した。sRANKLおよびDHA処置3日後にRNAを抽出し、種々の遺伝子の中から、sRANKL処置によって発現が増加し、かつ、DHA処置によって増加が抑制される遺伝子を探索した。今後、これら遺伝子の破骨細胞分化に対する作用について検討する。DHAの破骨細胞形成抑制作用に関連する受容体から検討を進めるという当初の計画からは変更があるが、マイクロアレイによる遺伝子解析結果などから、DHAが作用する遺伝子群が、EPAとの違いに関してデータを集めることができた。GO解析の結果、DHAとEPAで反対の変動を示す遺伝子ではembryo development, cell motility, cell adhesion, cell morphogenesis, cell-cell signaling, lipid metabolic processなどの遺伝子群が濃縮されていた。これらの中には破骨細胞分化に関連するDC-STAMP、Siglec-15、Tspan7およびMst1rなどが含まれた。今後はこれらの結果をもとに機能解析を行っていく。DHAが作用する破骨細胞形成抑制作用に関連する受容体については明らかになっていないが、薬物処理時間を変化させた実験からDHAが細胞融合過程に対して作用することを確認した。

また、この結果を元に、遺伝子発現についてマイクロアレイを用いた解析を行った。解析結果を元に、標的と考えられる遺伝子についてリアルタイムPCRなどにより解析を開始しており、おおむね順調に進捗しているものと考えられる。DC-STAMPは破骨細胞形成に必須であり(Kurita, et al., J Exp Med 2004, 200, 941-946)、特に細胞融合過程に必要であると報告されている(Yagi et al., J Exp Med 2005, 202, 345-351)。また、Siglec-15は多核化およびアクチンの再構成などに必要と考えられている(J Biol Chem 2012, 287, 17493-17502)。これらのマイクロアレイの解析結果から抽出された、DHAの破骨細胞分化抑制作用に関連して変動が認められた種々の遺伝子の機能解析を行う(森田・中浜・穐山)。DHAの作用とシグナル伝達経路の関与についてタンパク発現・リン酸化についてもウェスタン・ブロッティング法等によって検討する(中浜・穐山)。食品・サプリメント等から様々な脂肪酸が摂取されている。これまでn=3系として類似の効果をもつと思われていた破骨細胞分化に対してはDHAとEPAが反対の作用をもつことが明らかとなり、他のn=3系脂肪酸(DPAなど)の作用およびこれらの相互作用について検討する(中浜・穐山)。マイクロアレイの解析を進め、DHAの作用を破骨細胞分化に伴う遺伝子発現変化から検討する(中浜・穐山)。DHAは細胞融合過程に作用していると考えられる。我々の研究では、接着分子の1つであるMac-1が破骨細胞分化に重要な役割を果たすことが分かっていたが、Mac-1結合する分子であるICAM-2が重要な役割を果たしていることを示した。DHAがこのような接着分子の発現にどのように影響するかリアルタイムPCR及びウエスタン・ブロッティング法を用いて検討する(中浜・穐山)。破骨細胞の分化にはRANK-TRAF6シグナルによるnuclear factor of activated Tcell c1(NFATc1)の活性化が必須である(Gohda J. et al.,EMBO J.,24, 790-299, 2005)。しかし、RANK-TRAF6シグナルの特異的増幅機構についてはまだ不明な点が多い。DHAの作用とシグナル伝達経路の関与について検討する(森田・中浜・穐山)。新たに発見された細胞内シグナル分子について、薬物の治療標的になりうるかを検討する。必須脂肪酸として様々な脂肪酸が摂取されており、これら脂肪酸との間に相互作用を示すと考えられる。
内分泌攪乱物質のヒトへの影響を外挿するためのサルを用いた分子的疫学的リスク評価

内分泌攪乱物質のヒトへの影響を外挿するためサルを用いて分子的疫学的にリスク評価を行った。ダイオキシン(TCDD)のサルにおける体内移行は多くの臓器に取り込まれた。胎児への移行は胎盤を経由して移行し多くの臓器に取り込まれた。TCDDの移行による臓器影響について遺伝子発現の変動から研究した。CYP1A1の発現において乳腺、皮膚、腎臓で数倍増加し、膵臓、肝臓、脳では微増し、心臓、肺、甲状腺、卵巣では変動が検出されなかった。発現の変動はTCDDの臓器移行量に依存して増加した。TCDD移行の大きい乳腺においてはTCDDに依存して16個の遺伝子に発現増加があり17個の遺伝子に発現減少が検出された。野生群および飼育群のサルから血液中のダイオキシン量を調査した。両群からは多くの異性体が検出され、TEQにはポリ塩化ジベンゾフランとコプラナポリ塩化ビフェニルが多くを占め、ポリ塩化ジベンゾパラダイオキシンは低含量であった。サルに発現する遺伝子の構造解析からヒトとの類似性を評価した。サルのcDNAライブラリーから約3千個のクローンを得て塩基配列ののちBlast検索による比較を行い、サルの発現遺伝子は分子構造において94%、発現頻度において96%、平均して94%のヒトとの類似性を示した。ヒトへの外挿としてサルを用いる有用性が他の実験動物を上回り明確となった。臓器に移行したTCDDの遺伝子発現の攪乱が解明され、健康被害を受けやすい下地が形成されると推測された。胎児に経胎盤で内分泌攪乱物質が取り込まれたことから、胎児における次世代環境は検討すべき今後の重要な課題と示された。サルの遺伝子構造解析はDNAチップなどとして胎児影響を網羅的に研究する基盤としなる可能性が示された。サルは生理的に極めてヒトに近い特徴をもつことから内分泌攪乱物質のヒトへの影響を調べるうえでのモデルとして有用である。胎児期は内分泌攪乱物質の影響が大きいと考えられるため、母ザルに内分泌攪乱物質を投与して胎児移行や影響をみた。投与物質を定量して対照と較べると、フタル酸エステル、ビスフエノールA、植物エストロゲンなどは胎盤を透過して胎児に移行した。ダイオキシン類似物質をサルに投与すると脳を含む各種の臓器で関連遺伝子群の変動が認められた。Cyp1A1やGSTpiの変動が大きかった。変動する遺伝子群をクローニングして解析後保存し、将来のDNAチップによる影響評価に備えることができた(飯田景子その他、環境ホルモン学会、2001年12月つくば市)。またその他の薬物代謝酵素についても比較検討して霊長類の特性を推定した。内分泌攪乱物質の食品や体内への混入は環境から来ていると疑われる。フタル酸エステルの霊長類への汚染を調査した。フタル酸エステルのサルにおける取り込みは野性群と飼育群ともに生じていた(Asaoka et al.1999,2000)、ヒトへの影響を調べるため飲食品中のフタル酸エステルの調査を日本と韓国を比較して行った(Yano K., et al. Bull. Environ. Contam. Toxicol., in press,2001)。日本における飲食品は韓国のものより高濃度で検出された。フタル酸エステルの生産量と汚染度には関連があると予測された。サルでの内分泌攪乱物質の汚染調査を進めるためアジアにおけるサルの汚染調査のため血液による予備的な調査を行い野生サル約20個体の血液試料を分析した。これらの結果より内分泌攪乱物質はヒトの胎児の脳に入って異常な遺伝子発現を引き起こす可能性が高いことが外挿された。内分泌攪乱物質のヒトへの影響を外挿するためにサルを用いて分子的疫学的にリスク評価を行うことは、サルの代謝機構がヒトに極めて近い特徴のためヒトの生体リスクを外挿するうえで大変有用である。これまでにサルを用いて内分泌攪乱物質の汚染調査、体内動態、胎児移行など広範囲の研究をおこなった。これらの結果は内分泌攪乱物質の汚染が進んだ現状に予防的対処をする際に有効な判断の根拠となった。今年度は引き続き国内外の疫学研究のためタイ、インドネシア、ベトナム、韓国と日本のサルやヒトの内分泌攪乱物質による汚染と疾病の調査をおこない、乳児用粉ミルクのフタル酸エステルによる汚染度について報告した(矢野その他、日本化学会第82秋季年会)。環境ホルモンの胎児移行について研究したところ、ビスフェノールAはサル胎児の脳を含む多くの器官に移行した。霊長類における妊娠後期の胎盤が完成された時期においても内分泌攪乱物質の胎児移行の危険があることが解明された(K.Uchida, etal. Jurnal of Health Science、2002)。これまでサルへの影響をみるのに薬物代謝系の遺伝子発現の変動を調べてきたが感度のよいものであった。このため今年度は更に多くの遺伝子について評価系の構築を計るため胎児を含めていくつかのcDNAライブラリーを作成して検討したところ多数の独立クローンが得られた。このなかには薬物代謝酵素、ホルモンレセプター、転写因子、DNA修復、細胞の分裂やアポトーシス因子など有用なものがあった。これらの塩基配列決定およびDNAチップの試作を進めて内分泌攪乱物質の影響を網羅的に評価する基盤を研究した(飯田その他、第5回環境ホルモン学会、2002)。

内分泌攪乱物質ダイオキシンのサルへの曝露を行った器官を採取して遺伝子の発現を調べたところCYP1A1その他の遺伝子発現に攪乱が生じていて器官の障害から健康被害を受けやすい下地が形成されると推測された(浅岡その他、第5回環境ホルモン学会、2002)。内分泌攪乱物質のヒトへの影響を外挿するためサルを用いて分子的疫学的にリスク評価を行った。ダイオキシン(TCDD)のサルにおける体内移行は多くの臓器に取り込まれた。胎児への移行は胎盤を経由して移行し多くの臓器に取り込まれた。TCDDの移行による臓器影響について遺伝子発現の変動から研究した。CYP1A1の発現において乳腺、皮膚、腎臓で数倍増加し、膵臓、肝臓、脳では微増し、心臓、肺、甲状腺、卵巣では変動が検出されなかった。発現の変動はTCDDの臓器移行量に依存して増加した。TCDD移行の大きい乳腺においてはTCDDに依存して16個の遺伝子に発現増加があり17個の遺伝子に発現減少が検出された。野生群および飼育群のサルから血液中のダイオキシン量を調査した。両群からは多くの異性体が検出され、TEQにはポリ塩化ジベンゾフランとコプラナポリ塩化ビフェニルが多くを占め、ポリ塩化ジベンゾパラダイオキシンは低含量であった。サルに発現する遺伝子の構造解析からヒトとの類似性を評価した。サルのcDNAライブラリーから約3千個のクローンを得て塩基配列ののちBlast検索による比較を行い、サルの発現遺伝子は分子構造において94%、発現頻度において96%、平均して94%のヒトとの類似性を示した。ヒトへの外挿としてサルを用いる有用性が他の実験動物を上回り明確となった。臓器に移行したTCDDの遺伝子発現の攪乱が解明され、健康被害を受けやすい下地が形成されると推測された。胎児に経胎盤で内分泌攪乱物質が取り込まれたことから、胎児における次世代環境は検討すべき今後の重要な課題と示された。サルの遺伝子構造解析はDNAチップなどとして胎児影響を網羅的に研究する基盤としなる可能性が示された。
高温溶解型温度刺激応答性高分子の開発とその温度応答を用いた抗腫瘍性酵素の活性制御

近年、薬剤を目的部位へ移動させ、かつ、薬剤の機能を制御しつつ作用させる徐放制御型のバイオターゲティング技術が検討され始め、その研究の中心として、温度刺激応答性高分子ゲルを活用した検討が行われている。この研究は主にN-isopropyl acrylamideを主骨格とする用いた感温性ゲルを用いて行われており、その特徴として低臨海溶液温度(LCST)以下で膨潤、それ以上で収縮する。この機能を利用しLCST以下で薬剤を含ませたゲルを調整し、LCST以上にすることにより薬剤の放出制御が達成することが可能となる。しかし、このシステムではゲルの収縮に伴って薬剤がゲルの収縮中のマトリックスを通過し放出されるため迅速な放出は難しい、かつ、抗腫瘍酵素などの高分子薬剤を放出させることは困難である。そこで、本研究では、温度変化により膨潤・収縮を可逆的にできる機能性高分子を開発し、これを抗炎症作用を有する酵素の活性部位近傍に修飾した酵素ハイブリッドを開発した。さらに、調製したハイブリッドの温度格とするポリマー、及びビニールスルホン酸ナトリウムとメタクリル酸メチル共重合体を連鎖移動重合により調製し、これらポリマーを抗腫瘍性のSODに固定化した酵素ハイブリッドを開発した。さらに、このハイブリッドの性質をin vitroで分析し、温度変化により活性を調節できることを実証した。本研究では、直鎖状の低温域で不溶状態、高温で可溶状態となる高温溶解型温度刺激応答性高分子を抗消炎作用を有する生体高分子の活性部位近傍に固定化した生体ハイブリットを調製し、その温度刺激による活性制御法を開発することを検討している。平成11年度は高温溶解型温度刺激応答性高分子の開発を行った。具体的内容を以下に記す。高温溶解型温度刺激応答性高分子の合成b)SMMおよびSGについて、それぞれ最適重合条件を決定した、また、最適条件で調製した高分子について、分子量、NMR、FT-MS、DSC等の熱分析を行いその特性を検討した。平成12年度は、抗腫瘍性酵素であるSOD等を酵母、乳酸菌から精製し、調製した酵素に各高温溶解型温度刺激応答性高分子を固定化することを検討する。さらに、温度により活性制御を行わせるための固定化条件を検討する。本研究では、直鎖状の低温域で不溶状態、高温で可溶状態となる高温溶解型温度刺激応答性高分子を抗消炎作用を有する生体高分子の活性部位近傍に固定化した生体ハイブリットを調製し、その温度刺激による活性制御法を開発すること検討している。平成11年度は高温溶解型温度刺激応答性高分子を開発した。この高分子を利用して平成12年度は抗腫瘍性酵素であるSOD等を酵母、乳酸菌から精製し、調製した酵素に各高温溶解型温度刺激応答性高分子を固定化することを検討した。生体分子ハイプリットの調製とその温度変化を利用した酵素活性a)温度刺激応答性高分子を修飾したSODの調製昨年度、合成した高温溶解型温度刺激応答性高分子の重合条件を元に、高分子末端にアミノ基を有する高分子を調製した。さらに、従来の研究成果を元に乳酸菌L.lactisおよび酵母S.cerevisiae由来のSODを大量に調製・精製を行った。。高分子末端にアミノ基を有する温度刺激応答性高分子と、精製したSODに存在するカルボキシル基を共有結合させることにより、生体分子ハイブリットを調製する。このときの結合状態を最適化するための条件を決定した。平成13年度は、高温溶解型温度刺激応答性高分子を固定化した抗腫瘍性酵素を用いて活性制御の可能性を検討する。本研究では、直鎖状の低温域で不溶状態、高温で可溶状態となる高温溶解型温度刺激応答性高分子を抗消炎作用を有する生体高分子の活性部位近傍に固定化した生体ハイブリットを調製し、その温度刺激による活性制御法を開発する≡と検討している。平成11および12年度は局温溶解型温度刺激応答性高分子を開発した。この局分子を禾岨ヨして平成13年度は抗腫瘍性酵素であるSOD等を酵母、乳酸菌から精製し、調製した酵素に各局温溶解型温度刺激応答性局分子を固定化することを検討した。1)SODの活性近傍への温度刺激応答性高分子の修飾高分子末端にアミノ基をする温叉刺{

応答性局分子と、SODに存在するカルボキシル基を共有結合させることにより、生体分子ハイブリットを調製した。このときの結合状態を最適化することを検討した結果、SODへの修飾率は36%であり、調製した酵素の活性は温度を低下させることにより、軽減することができた。2)温度変化による酵素活性の制御生体触媒ハイブッドの温度応答性を調べた、40°C可溶状態、20°C以下で不溶状態となることが判明したので、各温度における反応速度論的パラメーターを測定した結果、温度低下に伴って最大速度V_<m2x>は1/20に低下し、K_mの値も低下することが判明した。
脈絡膜異常血管の３次元画像解析

本研究ではドップラー光干渉断層計(OCT)を用いて、生体人眼の網脈絡膜における絶対血流量計測および3次元血管構造解析を行った。その結果、生体人眼における脈絡膜血流量計測手法の開発、網脈絡膜疾患のおける異常血管3次元構造解析が可能となった。この研究を通して、ドップラーOCTがドップラーOCTは短時間かつ安全な代替検査として、現行の造影検査と同様な運用が可能な事が実証された。この予備研究成果をふまえて、2013年8月からドップラーOCTの本格的な臨床運用を開始した。ドップラーOCTは東京医大茨城医療センター眼科外来に設置され、技術者の直接支援なしに、眼科医師および視能訓練士で運用されている。。2014年4月までに延388人の患者に計測を行い、その内訳は糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、近視性黄斑症、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、網膜細動脈瘤、等の多岐にわたっている。計測結果は順次解析しており、その研究成果を日本眼科学会総会およびARVOに計6台の演題を投稿して、全て採用された。異常脈絡膜血管の解析をするためには、血流量の定量が重要となる。そこで正常眼3眼を対象に計測を試みた。まず3次元DopplerOCT画像を撮影し、脈絡膜血管の位置を同定した。次に隣接する2枚のB-scanにおける、脈絡膜血管からのDoppler信号および、血管走行角度から、脈絡膜血管の絶対血流速度を算出した。さらに3次元ドップラーOCT画像から脈絡膜血管径を計測し、絶対血流量を算出した。得られた血流量を、同時に計測したパルスオキシメータの指尖波波計と対応させることにより、脈絡膜血管絶対血流量の拍動変化を算出した。計測は各眼それぞれ3ヵ所の脈絡膜血管に対して行った。対象とした全ての脈絡膜血管で、絶対血流量の拍動変化が算出された。収縮期絶対血流速度(平均±標準偏差)は46.9±12.5 mm/s、収縮期絶対血流量は5.9±3.6 μl/min、血管径は70±14 μmであった。3回計測による変動係数は9.3±4.9 %であった。血管分岐前後における血流量の比較では、測定誤差4.0 %であった。この研究により、生体人眼脈絡膜血管における収縮期絶対血流量の計測に世界で初めて成功した。Doppler OCTによる脈絡膜異常血管の3次元構造解析も実施した。まずポリープ状脈絡膜血管症の栄養血管の3次元構造を解析し、脈絡膜から網膜色素上皮下に伸展する状態の観察に成功した。さらに滲出型加齢黄斑変性と近視性黄斑変性に併発した脈絡膜新生血管の描出に成功した。さらに異常血管が抗血管新生療法により退縮していく状態を、Doppler OCTを用いることにより、造影剤なし観察する事に成功した。Doppler OCTでポリープ状脈絡膜血管症の異常血管網を観察する事により、異常血管網の網膜色素上皮剥離内における3次元構造の観察に成功した。眼科学ドップラーOCTの実用化に関する予備的研究を実施し、ドップラーOCTが蛍光眼底撮影を補完する検査機器として、臨床実用性があることが実証された。またまたドップラーOCTは蛍光眼底撮影と比較して、造影剤を使わない安全な検査、数秒で検査ができる利便性、3次元画像解析が可能、といった優位性があり、次世代眼科診断機器として実用性が高い事も判った。この成果を基に、眼科外来におけるドップラーOCTの本格臨床運用を開始した。このドップラーOCTは、1)100,000 A-scan/secの高速撮影、2)inter B-scan計測による高感度ドップラー計測、3)中心波長1060nmによる脈絡膜撮影、といった網脈絡膜疾患に特化した性能である。この結果、1)ドップラーOCTが通常の眼科外来業務の中で運用可能な事、2)通常の眼科画像検査が可能な患者であればドップラーOCTの撮影が可能である事が判り、ドップラーOCTの臨床実用化への道が開けた。脈絡膜血管の収縮期絶対血流量を計測する手法の実証に成功した。これにより脈絡膜血管異常について定量的に解析する手法が確立された。さらに脈絡膜血管異常を有する30眼についてDoppler OCTによる撮影を行った。滲出型加齢黄斑変性や近視性黄斑症に併発する脈絡膜新生血管については、Doppler OCTを用いて、非侵襲的に観察できる事が証明された。また治療前後の変化の観察にも成功し、臨床応用できることが証明された。またポリープ状脈絡膜血管症に関する計測では、異常血管網3次元構造解析に成功した。これによりポリープ状脈絡膜血管症の発症過程を、網脈絡膜3次元構造と対比させて研究する手法が確立された。既に計測した延388人の患者の解析を進める。

とりあえずの目標としては、1)糖尿病網膜症の病的血管解析、2)ポリープ状脈絡膜血管症の異常血管解析、を重点的に行い、平成26年度中の論文投稿を目指したい。また、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、網膜細動脈瘤、脈絡膜新生血管といった疾患の解析も順次進め、学会発表、論文投稿を目指す。さらに、これらの研究成果を基に、実用化への取り組みを加速させる。平成24年度に得られた成果の臨床応用を目指し、100眼の計測を目指す。平成24年度に得られた研究成果は手動で行なった。しかし計測の再現性確保および実用化のためには、解析の自動化が必要である。そこで異常血管検出の自動化のために、病態ごとに、最適なフィルターや信号閾値設定を検討し、解析の半自動化を目指す。また対象眼数を増やして解析手法を改良する事により、解析方法の信頼性を向上させる。さらに3次元構造を数値化する手法を開発し、臨床応用に向けたパラメーターの構築を行う。こうして得られた解析手法を基に、加齢黄斑変性等の各種網脈絡膜疾患の3次元病態解析を実施する。また診断技術、治療効果判定への応用を実施し、臨床応用を目指す。大容量ハードディスクの購入を予定していたが、未使用額21,965円では不足しているため、次年度予算分として購入延期したため。大容量ハードディスクの購入費用として約5万円を使用する。それ以外に、脈絡膜3次元構造を解析プログラムを作成するためのソフトLabViewのライセンス更新料として313,000円が必要となる。さらに解析用コンピューターの新規購入、論文執筆および投稿掲載に関する費用、学会発表のための出張費用が必要となる。その他の消耗品の購入に約10万円が必要となる。脈絡膜3次元構造を解析プログラムを作成するためのソフトLabViewのライセンス更新料として313,000円が必要となる。さらに解析用コンピューターの新規購入に約20万円が必要である。論文執筆および投稿掲載に関する費用が約30万円、学会発表のための出張費用が約20万円必要となる。
アミロイドβ蛋白質(Aβ)沈着過程で出現するAβ顆粒陽性グリア細胞の意義の解明

アミロイドβ蛋白質(Aβ)は若年者の脳でも産生されている.正常では,産生されたAβが適切に除去されるために,脳へのアミロイド沈着が生じないと考えられる.アルツハイマー病患者剖検脳では,しばしば,Aβ顆粒を細胞体の中に含むグリア細胞が観察されるが,そのようなグリア細胞が脳でのAβ分解・代謝の一部を担っている可能性がある.そこで,本研究では,培養細胞およびラット脳を用いて細胞外Aβ濃度が上昇したときのミクログリア,アストロサイトの反応を明らかにし,脳へのAβ沈着の過程を産生と代謝のバランスという視点から考察した.ラット新生仔由来の一次培養ミクログリアは0.11μMレベルのAβ濃度においても細胞外Aβを効率よく取り込み,一定濃度以上でAβは細胞内に顆粒状に蓄積するが,培養液からAβを除去すると徐々に細胞内Aβ顆粒は消失する.Aβ1-42はAβ1-40に比べモル比で100倍以上の差で蓄積しやすい.この取り込みはアストロサイトとの混合培養で抑制されず,また,両者の混合培養においてAβ蓄積は主としてミクログリアに生じた.同種(ラット)抗Aβ抗体や補体蛋白質の存在下でもミクログリアによるAβ取り込み蓄積は促進されることはなかった.また,既知のミクログリア細胞膜上Aβ結合蛋白質であるマクロファージ(Mφ)スカベンジャー受容体(MSR)ノックアウトマウスの大槽にヒトAβを注入した場合も,大脳の髄膜MφによるAβ取り込み細胞内蓄積は通常通り観察された.Aβのミクログリア細胞膜へ結合の一部はAβの部分シーケンス(13-16)HHQKを介するとされているが,大過剰のHHQKペプチドの存在下でも取り込み・蓄積が生じた.これらの実験結果は,ミクログリアによるAβ取り込みには複数の経路があり,それは貪食とは異なる取り込みの機構によることを示している.ヒト剖検脳において,主としてアストロサイトに顆粒状Aβ蓄積が認められる部位では,何らかの局所的な要因,特に神経細胞由来の因子などによる,ミクログリアのAβ取り込み経路の抑制が生じていることが示唆された.ミクログリアが本来はきわめて効率よく細胞外Aβを取り込むのにも関わらず,アルツハイマー病変の大部分で,ミクログリアへ顆粒状Aβ蓄積を伴わずに細胞外Aβ沈着が生じている,という点に,今後のAβ沈着機構解明の糸口があると考えられる.アミロイドβ蛋白質(Aβ)は若年者の脳でも産生されている.正常では,産生されたAβが適切に除去されるために,脳へのアミロイド沈着が生じないと考えられる.アルツハイマー病患者剖検脳では,しばしば,Aβ顆粒を細胞体の中に含むグリア細胞が観察されるが,そのようなグリア細胞が脳でのAβ分解・代謝の一部を担っている可能性がある.そこで,本研究では,培養細胞およびラット脳を用いて細胞外Aβ濃度が上昇したときのミクログリア,アストロサイトの反応を明らかにし,脳へのAβ沈着の過程を産生と代謝のバランスという視点から考察した.ラット新生仔由来の一次培養ミクログリアは0.11μMレベルのAβ濃度においても細胞外Aβを効率よく取り込み,一定濃度以上でAβは細胞内に顆粒状に蓄積するが,培養液からAβを除去すると徐々に細胞内Aβ顆粒は消失する.Aβ1-42はAβ1-40に比べモル比で100倍以上の差で蓄積しやすい.この取り込みはアストロサイトとの混合培養で抑制されず,また,両者の混合培養においてAβ蓄積は主としてミクログリアに生じた.同種(ラット)抗Aβ抗体や補体蛋白質の存在下でもミクログリアによるAβ取り込み蓄積は促進されることはなかった.また,既知のミクログリア細胞膜上Aβ結合蛋白質であるマクロファージ(Mφ)スカベンジャー受容体(MSR)ノックアウトマウスの大槽にヒトAβを注入した場合も,大脳の髄膜MφによるAβ取り込み細胞内蓄積は通常通り観察された.Aβのミクログリア細胞膜へ結合の一部はAβの部分シーケンス(13-16)HHQKを介するとされているが,大過剰のHHQKペプチドの存在下でも取り込み・蓄積が生じた.これらの実験結果は,ミクログリアによるAβ取り込みには複数の経路があり,それは貪食とは異なる取り込みの機構によることを示している.ヒト剖検脳において,主としてアストロサイトに顆粒状Aβ蓄積が認められる部位では,何らかの局所的な要因,特に神経細胞由来の因子などによる,ミクログリアのAβ取り込み経路の抑制が生じていることが示唆された.ミクログリアが本来はきわめて効率よく細胞外Aβを取り込むのにも関わらず,アルツハイマー病変の大部分で,ミクログリアへ顆粒状Aβ蓄積を伴わずに細胞外Aβ沈着が生じている,という点に,今後のAβ沈着機構解明の糸口があると考えられる.アルツハイマー病患者剖検脳において,しばしば,細胞内にAβ顆粒を含むグリア細胞(ミクログリアおよびアストロサイト)が観察される.このグリア細胞内顆粒に含まれるAβは,アミノ(N)末端側のシーケンスを認識する抗体に陰性であり,Aβがグリア細胞に取り込まれ,さらに限定的に処理されることが推定される.