hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CD44のバリアントアイソフォームをターゲットとした子宮内膜症の新規治療法の確立

当院での周術期にサンプリングされた子宮内膜症症例と、子宮内膜症から発生したと考えられる明細胞癌症例の腫瘍内容液を用いて、ELISA法で酸化マーカー(8ヒドロキシデオキシグアノシン:8-OHdG)、抗酸化マーカー(HO-1)を測定したところ、8-OHdGとHO-1いずれにおいても子宮内膜症症例において優位に高かった。この結果から子宮内膜症においては酸化ストレスに晒されているとともに、抗酸化能も高い状態にあること、一方で明細胞癌においては腫瘍内の環境が変化したためか、酸化ストレス、抗酸化能ともに低い状態にあると考えられた。また、当院で摘出した子宮内膜症性嚢胞および、明細胞癌に含まれる子宮内膜症性病変部分のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて、CD44v9、酸化・抗酸化マーカー(8OHdG、HO-1)の発現を免疫組織染色にて検討したところCD44v9陽性率は子宮内膜症症例において優位に高く、8-OHdG陽性率は明細胞癌合併症例において優位に高い結果が得られた。CD44v9の発現と、8-OHdGの発現において負の相関も認められており、抗酸化能の低下がDNA損傷を増幅させている可能性が示唆された。また、HO-1の発現においても子宮内膜症症例で優位に高い結果が得られた。この結果からも子宮内膜症において抗酸化能が高く、明細胞癌において抗酸化能は低下している事、そして抗酸化能が低下するとともにDNA損傷が増大すると考えられた。当初の予定としては、当院での周術期にサンプリングされた子宮内膜症症例、コントロール症例の保存血清を用いて、ELISA法で酸化マーカー(8ヒドロキシデオキシグアノシン:8-OHdG)、抗酸化マーカー(ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)、Total Antioxidant Capacity(TAC))を測定する。また、当院で摘出した子宮内膜症性嚢胞および正所子宮内膜組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて、CD44v9、酸化・抗酸化マーカー(8OHdG、HO-1)の発現を免疫組織染色にて検討する。という予定であったが、コントロール症例の血清や正所子宮内膜組織の検体採取が捗っておらず、引き続き正常例の検体の蓄積は行っていくものの、現状では当院の性格上、比較的豊富に蓄積のある卵巣癌症例の血清や組織との比較を行った。引き続きコントロール症例の蓄積を行っていくとともに、今回の子宮内膜症症例と、子宮内膜症から発生した明細胞癌との比較についても引き続き検討を行っていく。
保育者の被援助志向性の検討とグループアプローチによる介入に関する研究

保育者が他者への援助要請行動に影響を与える保育者被援助志向性を測定するために、保育者被援助志向性尺度の作成を行った。さらに、保育者被援助志向性と精神的健康、首尾一貫感覚とそれぞれ相関関係が認められた。さらに、一般的な保育の研修を受講した場合とグループアプローチの要素を取り入れた保育の研修を受講した場合とでは、両者ともに、事前、事後、フォローアップでの保育者被援助志向性の増加が認められなかった。被援助志向性について、保育者対象の研究が少ないため、本研究では、保育者の被援助志向性に着目して、保育者が職務上、困難に直面した際に、他者に援助を求めるかどうかの認知的枠組みを測定するための新たな尺度を作成することを目的とした。保育者11名(M=22.3歳、SD=1.35)に対して、半構造化面接を実施した。総面接時間は6時間14分4秒で一人当たりの平均面接時間は約34分であった。ICレコーダで録音した音声データをもとに被援助志向性にかかわる項目を作成して、その後、保育者にかかわっている臨床心理学の専門家3名程度により内容的妥当性の検討を行い、保育者の被援助志向性に関する予備項目が見出された。当該年度に予備項目について、構成概念妥当性や基準関連妥当性の検討を行うために保育者200300名程度に対して質問紙調査を実施し、その後、信頼性の検討を行うために保育者200名程度に対して再度、質問紙調査を実施する予定であったが、予備調査を実施した際に、当初の仮説と異なった結果が出たため、結果の検証と再度の文献の再検討を行ったため、予備項目の構成概念妥当性や基準関連妥当性の検討、さらには信頼性の検討も当該年度で実施することができなかった。次年度は、引き続き、妥当性・信頼性の検討のための調査を早急に実施して、保育者のための被援助志向性尺度を作成した後に、精神健康度などとの関連について調査を実施したい。前年度までの研究において、現職の保育者11名に対して、半構造化面接における音声録音データにより、保育者の被援助志向性に関する予備項目が見出され、臨床心理学専門家3名による内容的妥当性の検討を実施したことから、当該年度においては、この予備項目について、構成概念妥当性や基準関連妥当性の検討を行うために、現職の保育者574名に依頼を行い質問紙調査を実施した。当初の本計画の予定であると現職の保育者200300名に質問紙調査を実施する計画であったが、実際には、質問紙が戻ってきた調査対象者は460名となり、欠損値を除いた分析対象者は408名となった。現在、探索的因子分析や分布の確認などの統計的処理を実施し、分析と考察を行って結論を導き出す段階にきている。さらに、当初、当該年度に実施予定であった保育者の被援助志向性と精神的健康などの関連をみるための相関について分析・考察を行う研究については、計画では、現職の保育者200名を対象に質問紙調査を実施予定であったが、実際には、現職の保育者317名に依頼を行い、質問紙調査を実施した。現在、データ解析に向けてデータを整理している段階である。データの収集、整理を実施しているため、目途が付き、次年度は、保育者の被援助志向性に関する尺度が完成し次第、保育者に対してのグループアプローチによる介入研究を進めていきたいと考えている。実験群と統制群に分けての介入研究の調査を実施していきたいと考える。前年度、現職の保育者574名に質問紙調査を依頼し実施したが、460名からの回答があり、欠損値を除いた408名を研究対象者として、分析を実施した。保育者被援助志向性尺度の項目として内容的妥当性を満たす項目に対して、項目分析を実施し、さらに、天井効果・床効果を確認した後、G=P分析を実施、探索的因子分析<最尤法プロマックス回転>を行った。その結果、2因子に分かれた。その後、相関分析を行い、調査で同時に尋ねた職場用ソーシャルサポート尺度とは、正の弱い相関が示され、バーンアウト尺度とは、負の弱い相関が示され、特性被援助志向性尺度とは、正の中程度の相関が示された。また、確認的因子分析を行った結果、適合度もまずまずの値であったことから、基準関連妥当性、構成概念妥当性があると考えられた。また、再検査法の結果やα係数からも信頼性も認められた。ところで、現職の保育者317名に質問紙調査で依頼し実施をしたが、研究対象者を152名として、保育者被援助志向性と首尾一貫感覚、精神的健康度について相関分析を行った。保育者被援助志向性と首尾一貫感覚では、正の中程度の相関が示された。さらに保育者被援助志向性と精神的健康度では、負の弱い相関が示された。ところで、実際に保育者被援助志向性についての介入をグループアプローチで実施するために、保育者被援助志向性について事前の予備調査の結果で等質に近い群に分かれるように、統制群・実験群と分け、統制群には、通常の保育の研修を受けてもらい、実験群には、グループで話し合う研修を実施した。分散分析を行った結果、両群において実験前・実験後・フォローアップの変化に介入の効果を見出すことができなかった。

さらに、一般的な保育の研修を受講した場合とグループアプローチの要素を取り入れた保育の研修を受講した場合とでは、両者ともに、事前、事後、フォローアップでの保育者被援助志向性の増加が認められなかった。予備調査段階での当初の仮説と異なる結果が見出されたために、その後の研究の検証や再度の先行研究、文献等の検討作業を研究途中のプロセスに入れざるを得なかったことによる研究プロセスの遅れが、現在でも影響を与えている。ただし、研究データについては、必要なデータをできるだけ遅れを取り戻すために、全国の保育者に協力を依頼し、データ収集に関しては、おおむね順調にいっている。現職の保育者574名に対して、構成概念妥当性、基準関連妥当性などを分析するためのデータを依頼し、実際に欠損値を除く分析対象者が408名となり、当初予定人数よりも多くの協力者を得ることができた。現在、解析、考察中である。さらに、精神健康度などとの概念の相関を分析するために現職の保育者317名に依頼し、そのデータの整理、分析を実施しているところである。心理学計画で昨年度までに実施しなければならない研究におけるデータ収集については、すでに調査が済んでおり、分析、考察などの実施を早め、早急に、保育者の被援助志向性に関する尺度の完成にこぎつけたいと考えている。そして、今年度の夏もしくは冬の時期に保育者へのグループアプローチの介入を実際に実施し、データを測定し、最終的な結論を出せるようにしていきたいと考えている。なお、保育者へのグループアプローチの介入研究に関しては、実験群、統制群というように、一定の協力者が必要であるため、協力者を得られるために保育団体との連携をとりながら、本研究課題の推進を図りたいと考えている。実際に保育者のための新しい被援助志向性に関する尺度作成とその妥当性・信頼性の検討が、今年度の大きな目的であったが、予備項目を作成する際の予備調査の段階で、当初の仮説とは異なる結果が見出されたため、その結果の細かな検証と再度の先行研究、文献等の検討の作業を研究途中のプロセスの中に入れざるを得なかったため、当該年度の研究計画よりやや遅れている状況である。詳しくは、他者に援助を求めるかどうかの認知的枠組みを測定するための新たな保育者のための被援助志向性の尺度を作成するために、担任の職務ができるだけ重ならない、15歳児の担任やフリーの役割を行っている現職の保育者11名に対して、半構造化面接の実施をした後に、ICレコーダで録音した音声データをもとに被援助志向性にかかわる項目を作成後、保育者にかかわっている臨床心理学の専門家、3名程度により内容的妥当性の検討を実施することに留まった。現在のところ、保育者の被援助志向性に関する予備項目が見出された段階にある。研究の進捗状況がやや遅れているため、次年度の使用額が生じているものと考えられる。例えば、前年度実施した研究協力者に対する謝金等の支払いが、これからの支払い手続きとなるため、謝金等の使用額が次年度の使用額として生じたことが一つの要因としてあげられる。また、文献にかかる金額や研究で必要な諸経費について、できるだけ節約をしながら研究を実施しているため、次年度への使用額が生じたものと考えられる。さらに、成果について、大きな成果が出る前であるため、学会等の諸経費が次年度使用額として生じたものと考えられる。昨年度の研究段階で当初の仮説と異なる予備研究の結果の細かな検証を時間をかけて実施したため、研究計画に関する変更は特に考えていない。
胎児性ヒト肝チトクロームPー450分子種の発現と発癌の相関性に関する研究

本研究はヒト胎児肝の主要なチトクロームPー450分子種の一つであるPー450HFLaの生理機能を明らかにし,胎児性チトクロームPー450(Pー450HFLa)の発現と発癌の関連性を検討することを目的とした.即ち, Pー450HFLa抗体を用い肝癌組織におけるPー450HFLa発現の確認,組織化学的染色による局在性の検討また,生理機能を利用した活性測定による発現の確認等から発癌と胎児性チトクロームPー450との相関を明らかにすることを目的として,以下の結果を得た.1)再構成系において,精製Pー450HFLa標品はデヒドロエピアンドロステロン3ー硫酸(DHEAーS)の16α位水酸化を触媒した.また,本活性はチトクロームb_5添加により著しく増加した.2)胎児肝におけるPー450HFLa存在量とDHEAーS 16αー水酸化活性の間に高い相関性が認められた.3)胎児肝におけるDHEAーS 16αー水酸化活性はPー450 HFLa抗体添加によってほぼ完全に阻害され,Pー450HFLaが胎児肝のDHEAーS 16αー水酸化酵素であることが確証された.4) HepatoblastomaおよびHepatoma共に陽性染色を示し,その染色程度には差が認められなかったが,いづれの場合も未分化型細胞より分化型細胞がより濃く染色された.5)肝癌患者の血中にDHEAーS 16αー水酸化体およびPー450HFLa抗体と反応するたんぱくの存在は確認できなかった.6)他の研究グループとの共同研究により,各種婦人科悪性腫瘍において, Pー450HFLaの局在性が認められた.本研究はヒト胎児肝の主要なチトクロームPー450分子種の一つであるPー450HFLaの生理機能を明らかにし,胎児性チトクロームPー450(Pー450HFLa)の発現と発癌の関連性を検討することを目的とした.即ち, Pー450HFLa抗体を用い肝癌組織におけるPー450HFLa発現の確認,組織化学的染色による局在性の検討また,生理機能を利用した活性測定による発現の確認等から発癌と胎児性チトクロームPー450との相関を明らかにすることを目的として,以下の結果を得た.1)再構成系において,精製Pー450HFLa標品はデヒドロエピアンドロステロン3ー硫酸(DHEAーS)の16α位水酸化を触媒した.また,本活性はチトクロームb_5添加により著しく増加した.2)胎児肝におけるPー450HFLa存在量とDHEAーS 16αー水酸化活性の間に高い相関性が認められた.3)胎児肝におけるDHEAーS 16αー水酸化活性はPー450 HFLa抗体添加によってほぼ完全に阻害され,Pー450HFLaが胎児肝のDHEAーS 16αー水酸化酵素であることが確証された.4) HepatoblastomaおよびHepatoma共に陽性染色を示し,その染色程度には差が認められなかったが,いづれの場合も未分化型細胞より分化型細胞がより濃く染色された.5)肝癌患者の血中にDHEAーS 16αー水酸化体およびPー450HFLa抗体と反応するたんぱくの存在は確認できなかった.6)他の研究グループとの共同研究により,各種婦人科悪性腫瘍において, Pー450HFLaの局在性が認められた.
歯胚中の象牙芽細胞層およびセメント芽細胞層の石灰化機構について

1996年に日本小児歯科学会が発表した「小児の歯の外傷の実態調査」において幼若永久歯の外傷の頻度の高さが改めて浮き彫りになった。外傷により歯髄処置を必要とする幼若永久歯の症例は、多い。しかし完全抜髄および感染根管処置後の失活歯に対する根管充填処置後(Apexification)に伴う根尖閉鎖には、その由来の細胞や石灰化機構に不明な部分が多い。また添加された硬組織の不十分な石灰化が指摘されている。今回、我々は歯根の形成に関与する象牙芽細胞の基質小胞性石灰化に焦点を置いた。実験材料は、胎生8ケ月のウシの歯胚を使用し、象牙芽細胞および象芽前質を分離し、Aliの方法に従い、コラゲナーゼ処理後、分画遠心により基質小胞面分を調製した。得られた基質小胞画分を蔗糖密度勾配遠心法により分画後、Alkaline phosphatase(ALP),Protease,Lactate dehydrogenase(LDH)を指標酵素として検索を行い、以下の結果を得た。2.基質小胸中のProteaseは、Zn^<2+>,Fe^<2+>,Co^<2+>を必要とするMetalloproteaseであった。3.現在、基質小胸中のmetralloproteaseを精製中で、今後DNAsequenceを同定する予定である。4.セメント芽細胞層についても同様に検索中である。歯胚の石灰化機構を解明するために、生化学的手法および免疫組織学的手法を用いて、平成10年度は象牙芽細胞層の基質小胞性石灰化機構を中心に検索した。基質小胞は軟骨や歯などの硬組織石灰化部位の細胞外基質小胞中に存在する小胞であり,初期石灰化に重要な役割を演じているとされている.この小胞は細胞からの発芽により形成されるため,細胞の形質膜由来と思われるアルカリフォスファターゼ(ALP)を高濃度に含む.平成10年度使用した材料は、象牙芽細胞層の回収の困難性を考慮にいれ、ウシの歯胚を選択した。ウシ歯胚より象牙芽細胞層を分離し、コラゲナーゼ処理後、Aliらの方法に従い、基質小胞画分を分離した。この基質小胞画分には基質小胞の外に、ALPを含まず、乳酸脱水素酵素(LDH)を含む小胞が存在し、この小胞にはカルシウムの取り込みに重要であるAnnexinが存在しないことを明らかにした。これはこの小胞が従来の基質小胞とは異なる機能を担っていることを示唆している。現在、プロテインゴールドAを使用した免疫組織学的手法により、両小胞の形態学的観察を併せて行っているところである。近年、幼若永久歯の外傷の頻度が増加している。幼若永久歯の歯内療法後(Apexification,Apexogenesis)の根尖閉鎖は、不明な部分が多い。そこで歯根の形成や根尖閉鎖に関与する象牙芽細胞層やせメント芽細胞層の石灰化(特に基質小胞性石灰化)を探索した。併せて石灰化を行わない永久軟骨である下顎頭関節軟骨や気管軟骨部の基質小胞についても検索した。実験にはウシ歯胚を使用し、象牙芽細胞やセメント芽細胞層を分離後、Aliの方法に従いコラゲナーゼ処理後、分画遠心により基質小胞画分を調製した。得られた基質小胞画分を調製し蔗糖密度勾配遠心法により分画後、Alkaline phosphatase ALP)やLactate dehydrogenase(LDH)を指標酵素として検索した。その結果、歯胚の両層にはALP,LDHを含む基質小胞の外にLDHのみを含む小胞が存在した。また気管軟骨部や下顎頭関節軟骨部にはALP,LDHを含む基質小胞の外に密度の重いALP,LDHを含む基質小胞様小胞が存在した。またLDHのisoenzymeは、異なっていることを明らかにした。
薬物性肝障害・薬剤治療抵抗性発症のメカニズムの解明-インスリン抵抗性の関与-

平成18年度の研究では、インスリン抵抗性のモデルマウスであるKK-A^yマウスを用いて、アセトアミノフェン誘導肝障害がインスリン抵抗性マウスで増悪し、肝細胞におけるROSの産生増強がその増悪メカニズムに深く関与していることを示した。そこで、今年度ではアセトアミノフェン肝障害増悪メカニズムの詳細な解析と、肝細胞の脂肪沈着とアセトアミノフェン肝障害増悪の関連についての研究を行った。in vivoの検討では、KK-A^yマウスの肝臓ではアセトアミノフェン処置後のJNK-2の活性化が著明に亢進しており、肝細胞壊死の亢進に関与したことが明らかになった。肝細胞の脂肪沈着については遊離脂肪酸の影響に注目し、初代培養肝細胞に遊離脂肪酸を添加してROSの産生メカニズムに対する影響を調べた。その結果、遊離脂肪酸によって前処置を行うと肝細胞の細胞質内に脂肪滴が沈着し、tert-butyl hydroperoxide添加による肝細胞壊死およびROS産生が増悪した。今回の研究により薬物性肝障害の発症・増悪におけるインスリン抵抗性の関与とそのメカニズムの一端が解明され、ひいては薬物性肝障害の発症予防・早期治療におけるターゲットとしてインスリン抵抗性に伴うシグナルの変化が重要であることが示された。また、肝細胞脂肪沈着によるROS産生刺激に対する感受性の亢進は非アルコール性脂肪性肝炎の発症・進展にも関与している可能性があり、メタボリックシンドローム関連の肝障害全般のメカニズム解明にも関連しうる結果と考えられた。本研究ではインスリン抵抗性の増大による薬剤性肝障害発症の感受性の変化とそのメカニズムについて検討を進めている。本年度は、インスリン抵抗性モデルマウスであるKK-Ayマウス(KK-Ay)と、コントロールマウスのC57BL6(BL6)マウスにアセトアミノフェンの過剰投与を行い、両群で比較すると共にその障害メカニズムを、主に活性酸素種(ROS)の産生増強について解析した。両群にアセトアミノフェンを腹腔内投与すると、KK-AyではC57BL6と比較してより強くネクローシスおよびアポトーシスが誘導され、脂質過酸化の亢進を認めた。また、KK-Ayではアセトアミノフェン添加前から脂質過酸化が軽度亢進しており、インスリン抵抗性の存在下では定常状態ですでに酸化ストレスが発現亢進し、NASHの発症やウイルス肝炎における病態増悪に関与している可能性が示唆された。肝組織中の活性型JNKlおよび2はいずれも両種でアセトアミノフェン投与後に有意な増加を認めたが、活性型JNK2がKK-AyでBL6の2倍以上の有意な増加を認めたのに対して、活性型JNKlは両種間で差を認めなかった。BL6およびKK-Ayより単離した初代培養肝細胞に少量のt-BuOOH(20μM)を添加したところ、BL6由来の肝細胞には変化がみられなかったが、KK-Ay由来の肝細胞ではネクローシスを来した。また、KK-Ay由来の肝細胞では約1.4倍のROSの亢進が認められた。したがって、KK-Ayの肝細胞はROSの産生亢進およびROSによる刺激に対する脆弱性を有し、主にJNK2の活性化を介して肝障害の増悪を引き起こしたと考えられた。この事象は薬剤性肝障害のみならず、NASHを含めたメタボリックシンドローム関連の肝障害の発症メカニズムにも深く関与している可能性が示唆された。これらの結果の一部は平成18年の米国肝臓学会にて発表した。
二次元分子膜面内での分子会合構造の制御

Au(111)面への電位制御吸着によるシクロデキストリン類のナノチューブ形成と、気/液界面から金属表面へ移送することにより作成したフラーレン類のエピタキシャル薄膜形成に関する研究を通して、吸着を利用した二次元自己組織化(Adsorption-induced self-organization)法が二次元分子配列制御の手法として大変有効であることが明らかにした。シクロデキストリン類のAu(111)表面への吸着挙動では、電極電位を負に分極させ、適当に金属表面への分子の吸着を押さえることで、シクロデキストリン自身の自己組織化を誘起することができることを明らかにした。このような条件下で、シクロデキストリンはポリロタキサン中のシクロデキストリンの配列と類似のナノチューブ構造をポリマーの存在なしに自発的に形成する。さらに、フラーレンのような難水溶性分子であっても、気/液界面のLangmuir膜を水平付着法でAu(111)表面へ移し取ると、真空蒸着法で作製した薄膜と同じエピタキシャル薄膜を形成できることが明らかになった。有機分子の吸着は基板からのエピタキシャルな影響と有機分子間の相互作用(自己組織力)とのバランスで吸着構造は決定されている。近年申請者らは比較的吸着力の弱い基板を選択すると溶液からの吸着という非常に簡便な手法でさまざまな有機分子から高度に配向した二次元分子膜を自己組織的に作製できることを見出した。さらに分子膜中の分子形状や吸着高次構造を溶液中で高解像度に走査型トンネル顕微鏡(STM)を用いて観察することに成功している。本研究では多成分系の分子膜及び分子間の相互作用に注目し研究を行い、以下の成果を現在までに得ている。1)気液界面を利用したフラーレンエピタキシャル分子膜の作成気液界面に展開したフラレーン分子膜を単結晶金表面に移し取ることによりエピタキシャル薄膜が作成できることを明らかにした。C60だけではなく、C70及び混合膜においても蒸着により作成されたものと本質的に同様なエピタキシャル薄膜が作成できた。混合膜においては、C70がC60の格子の間に立って配列している様子が溶液中のSTM観察により明らかとなった。2)ホスト・ゲスト反応の直接観察吸着を利用したシクロデキストリン類の配向固定化を検討した。基盤の選択及び電極電位の設定による吸着力と自己組織力の適当なバランスを設定すると、金属単結晶表面でシクロデキストリンが自己組織化しチューブ状の構造を作ることが明らかとなった。ポリロタキサンにおいても観察されているチューブ状の構造が包接されるポリマーなしに生成したことは、制御した吸着をうまく利用することで、分子の自己組織化を誘起できることを示しており、隣接するシクロデキストリンの水酸基同士による水素結合がその駆動力であることを明らかにした。
身体活動の格差を生み出すメカニズムの解明と新たな普及戦略の構築

健康格差は世界的な公衆衛生上の課題であり、身体活動・スポーツの実践についても、収入や学歴といった社会経済的要因による社会的な「格差」の存在が知られている。本研究では、1)学際的データを用いて身体活動量の格差を生み出すメカニズムを明らかにするとともに、2)大規模社会実装研究により、格差を考慮した新たな普及戦略モデルの効果を検証する。本研究は、公衆衛生学・行動経済学など多様な学問を融合させ、普及戦略に関する既存の理論を発展させるとともに、頑強な因果推論デザインで検証する。これにより、健康格差やスポーツ無関心層の対策を進めるための科学的基盤を構築し、実社会での応用につなげる。
複素多様体と複素解析の研究

代表者(佐藤宏樹)は二つの双曲的Mo^^<^>bius変換により生成された群が離散群となるための条件を与え,種数2の実型Schottky空間の形状及び境界様相を明らかにした.この結果は近くTo^^<^>hoku Math.J.より発表される予定である.更に,純双曲的Fuchs群の場合Jorgensenの不等式が極値となる数は第I型では16,第IV型では4であることを示した.また,一般のKlein群に対するJorgensenの不等式が極値を与える例を与え,Klein群の列の代数的収束と幾何学収束の違いを考察した.諸沢俊介は無限生成Fuchs群の極限集合のある種の部分集合についてそのハウスドルフ次元と収束指数の関係を調べた.奥村善英は穴のないRiemann面のTeichmu^^̈ller空間のlength parametersの最小個数はその空間の次元と一致することを示した.中西敏浩はFuchs群のBers embeddingによるTeichmu^^̈ller空間の内半径が最小値2をとるためのいくつかの条件を与え,Riemann面上のPoincare^^ ́metricに対する測地線の自己交差をもつものの長さの評価について,2,3の結果を得た.戸田暢茂は退化した関数系に対する一般化したCartanの予想とdefectなどについて,また,代数的微分方程式の代数型解についていくつかの結果を得た.谷口雅彦は一般のRiemann面上重要な不変量に対する擬等角変形の下での一階,二階の一般的な変分公式を導いた.藤本坦孝は〓^3内の非平担完備極小曲面のGauss写像に関し,除外指数の定義を改良することにより以前に得た結果の拡張を行なった.伊藤正之は方物型方程式のDirichlet問題の非正則点の特徴付けをWiener型の容量を用いて行なった.中井三留はMyrberg型二葉円板がrigidになる例,及びnonrigidになる例を与えた.さらに,Schro^^̈dinger方程式の超関数解が連続となるための必要十分条件を与えた.代表者(佐藤宏樹)は二つの双曲的Mo^^<^>bius変換により生成された群が離散群となるための条件を与え,種数2の実型Schottky空間の形状及び境界様相を明らかにした.この結果は近くTo^^<^>hoku Math.J.より発表される予定である.更に,純双曲的Fuchs群の場合Jorgensenの不等式が極値となる数は第I型では16,第IV型では4であることを示した.また,一般のKlein群に対するJorgensenの不等式が極値を与える例を与え,Klein群の列の代数的収束と幾何学収束の違いを考察した.諸沢俊介は無限生成Fuchs群の極限集合のある種の部分集合についてそのハウスドルフ次元と収束指数の関係を調べた.奥村善英は穴のないRiemann面のTeichmu^^̈ller空間のlength parametersの最小個数はその空間の次元と一致することを示した.中西敏浩はFuchs群のBers embeddingによるTeichmu^^̈ller空間の内半径が最小値2をとるためのいくつかの条件を与え,Riemann面上のPoincare^^ ́metricに対する測地線の自己交差をもつものの長さの評価について,2,3の結果を得た.戸田暢茂は退化した関数系に対する一般化したCartanの予想とdefectなどについて,また,代数的微分方程式の代数型解についていくつかの結果を得た.谷口雅彦は一般のRiemann面上重要な不変量に対する擬等角変形の下での一階,二階の一般的な変分公式を導いた.藤本坦孝は〓^3内の非平担完備極小曲面のGauss写像に関し,除外指数の定義を改良することにより以前に得た結果の拡張を行なった.伊藤正之は方物型方程式のDirichlet問題の非正則点の特徴付けをWiener型の容量を用いて行なった.中井三留はMyrberg型二葉円板がrigidになる例,及びnonrigidになる例を与えた.さらに,Schro^^̈dinger方程式の超関数解が連続となるための必要十分条件を与えた.
分化誘導したSH-SY5Y細胞におけるメタンフェタミンの細胞毒性

本年度では、「METH曝露によるマクロピノサイトーシスの過形成が、神経毒性作用にどう関わっているか」、「METH曝露によるマクロピノソーム過形成がもたらすリソソーム機能変化」について検討を行い、『METHによる新たな細胞死経路機序の確立』を目指すこととした。第一に、GFP-Ras及びGFP-Rac1を用いた蛍光観察では、METH曝露2時間後の細胞内空胞と局在が一致した。また、RasインヒビターのFTS及びRac1インヒビターのEHT1864を前投与したところ、METH曝露による細胞内空胞形成が有意に消失した。以上より、METHによる細胞内空胞がマクロピノサイトーシス経路に沿って進行していることが確認された。第二に、リソソームの活性化について検討した結果、lamp1,2の発現はMETH曝露の時間依存的に上昇し、カテプシンLのプロセシングは有意に減少した。また、オートファジー関連分子変動では、LC3-IIの発現は有意に上昇する一方、p62の発現減少が認められなかったことから、METH曝露後では、オートファゴソームの形成までは進行しているが、オートファゴソームの分解が阻害されている可能性が確認された。以上より、METH曝露後のマクロピノソーム過形成により、マクロピノソームからリソソームへの移行に伴うリソソームの肥大化により、リソソームの正常機能が低下し、本来のオートファジーの流れを正常に維持できなくなることで、細胞内にMETHを含んだ未消化物質が増大し、最終的に細胞死を引き起こしている可能性が考えられた。以上の結果を総括すると、高濃度METHの曝露により、細胞内でマクロピノサイトーシスが過剰に形成され、このマクロピノソームがリソソームと融合することで、リソソーム内での正常な機能が保てなくなり、最終的に細胞死に至ると考えられた。覚せい剤であるメタンフェタミン(METH)は、神経終末への過剰なドパミン放出により細胞死を引き起こし,神経毒性作用を発現させる。METHによる神経毒性に関する研究では、現在apoptosis型やnecrosis型、autophagy型細胞死経路の存在が知られているが、詳細な分子細胞学的機構の確立はなされていない。そこで本研究では、レチノイン酸(RA)により分化誘導したSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫由来細胞を用い、METHによる細胞死作用機序を検討し、現在報告されている経路とは異なる、新たな細胞死経路の解明を目指すこととした。実験方法は、SH-SY5Y細胞を2日間培養後,RAを投与し4日間分化誘導を行った。そして0-10mMMETHを24時間曝露した後の細胞形態変化を観察し、アポトーシス関連分子変動を定量的に評価した。その結果、METHの濃度・時間依存的に細胞死割合が上昇し、METH 7mM以上で有意に細胞死亡率が増加した。しかしながら、カスパーゼ3およびPARPは、各濃度とも顕著な活性上昇は認められず,METHによる細胞死はカスパーゼ非依存的であると考えられた。未分化のSH-SY5Y細胞を用いても、分化誘導後の結果と同様であった。一方、METH曝露直後より細胞内に空胞化が確認された。この空胞について、蛍光顕微鏡による観察を行い、オートファジー及び小胞体マーカーでは局在が認められなかったが、エンドサイトーシスマーカーの取り込みは顕著に確認された。更にアミロライド及びサイトカラシンDの前投与により空胞形成が抑制された。以上の結果より、METHによる空胞形成はマクロピノサイトーシス由来であることが確認され、METHによる神綴細胞毒性は、このマクロピノサイトーシスの過形成が関わっている可能性が示唆された。今後の課題は、METH曝露によるマクロヒノサイトーシスの過形成が、神経毒性作用にどう関わっているのか、詳細な検討を行う必要がある。更に,培養細胞での細胞死経路を解明した上で,動物レベルにおいて、METHが脳内でどのような働きをして神経毒性を発揮するのかを検討する。

以上より、METH曝露後のマクロピノソーム過形成により、マクロピノソームからリソソームへの移行に伴うリソソームの肥大化により、リソソームの正常機能が低下し、本来のオートファジーの流れを正常に維持できなくなることで、細胞内にMETHを含んだ未消化物質が増大し、最終的に細胞死を引き起こしている可能性が考えられた。以上の結果を総括すると、高濃度METHの曝露により、細胞内でマクロピノサイトーシスが過剰に形成され、このマクロピノソームがリソソームと融合することで、リソソーム内での正常な機能が保てなくなり、最終的に細胞死に至ると考えられた。
神経筋疾患における摂食嚥下障害メカニズムの解明

神経筋疾患は筋肉や神経の機能不全や変性により運動がコントロールできなくなる疾患である。一方、摂食嚥下機能障害には様々な原因が知られているが、その一つに神経筋疾患における運動障害が知られている。そこで、本研究では、摂食嚥下機能に関わる口腔・咽頭やその周囲における筋の変性や神経への影響について調べた。また、中枢である脊髄におけるグリア細胞への影響についても調べた。摂食・嚥下障害は今日の社会において、死因の上位である誤嚥性肺炎の原因になる他、突然の窒息により命を落とす原因にもあげられる。しかしながら、摂食・嚥下障害の原因は様々な要因があり、いまだ解明されてないことも多い。神経筋疾患においても、摂食・嚥下障害は大きな問題であり、摂食・嚥下障害の回復方法、新たな治療法の解明が待たれている。そこで、本研究では神経筋疾患に焦点を置き、神経筋疾患モデルマウスを用いて、摂食・嚥下障害のメカニズムを解明することを目的としている。本年度は、まず神経筋疾患モデルマウスにおける口腔・咽頭領域の変化を確認した。ワイルドタイプマウスと神経筋疾患モデルマウスを過剰麻酔でと殺し、4%ホルムアルデヒドにて潅流固定し、鼻腔、口腔、咽頭、喉頭を一塊にして取り出した。その後、凍結切片法にて組織を薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色のほか、各種抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、ワイルドタイプマウスと神経筋疾患モデルマウスとを比較したところ、嚥下障害にかかわる咽頭の一部の筋ならびに喉頭の一部の筋に変性が認められた。しかし、摂食障害にかかわる口腔ならびにその周囲における変性の有無については詳細に比較することができなかった。そこで、今後、咽頭や喉頭における筋や支配神経の変性を詳細に解明する予定である。さらに、摂食にかかわる口腔組織や支配神経である三叉神経系ニューロンの変性や細胞死について調べる予定である。摂食・嚥下機能不全は、今日の社会において日々の生活に影響を与えるばかりか、場合によっては死因に関係したりすることもある。しかしながら、その原因は様々な要因があり、現在も様々な角度から研究が行われている。神経筋疾患においても、摂食・嚥下機能不全は大きな問題であり、摂食・嚥下機能不全の原因の究明や治療法の開発が必要とされている。そこで、本研究では神経筋疾患モデルマウスを用いて、摂食・嚥下機能不全のメカニズムの解明を目的としている。最終年度である本年度はワイルドタイプマウスと神経筋疾患モデルマウスを過剰麻酔でと殺し、4%パラホルムアルデヒドにて潅流固定し、咽頭・喉頭・三叉神経節や脳幹を取り出した。その後、凍結切片法にて各種組織を薄切した。その切片を使用し、calcitonin gene-related peptide (CGRP)や細胞死のマーカーであるcasepaseなどの各種抗体を用いて、免疫染色をおこなった。その結果、神経筋疾患モデルマウスでは四肢の筋にて、ヘマトキシリンエオジン染色でエオジンが濃染し、強い萎縮の認められる体肢の筋の筋線維において細胞死のマーカーであるcaspaseの発現が認められた。また、口腔及び頚部においては、舌骨に付着する筋の筋線維に萎縮が認められ、エオジンに濃染していた。また免疫染色の結果、運動終板にはCGRPの集積も観察された。しかしながら、他の口腔・咽頭・喉頭の筋にcaspaseの発現は認められなかった。本年度は研究目的を達成すべく研究計画にそって行われた。具体的には、ワイルドタイプマウスと神経筋疾患モデルマウスを用いることで、摂食・嚥下障害の原因として推察できる筋の変性を見つけることができた。しかし、摂食障害の原因については今後さらに研究を行う必要がある。口腔解剖学本年度の結果を受け、次年度は本年度得られた切片を利用し、まずは解析を行う予定である。さらに、追加で組織採取・切片作成・免疫染色などを行う予定である。次年度使用額は、今年度の研究がおおむね順調に進展し、効率よく研究を進めることができたことにより発生した。次年度請求額とあわせて、今後の研究推進に使用する予定である。
ドイツ法とEU法における企業組織変動に係る労働関係法制に関する研究

企業組織再編、すなわち、(1)事業譲渡、(2)合併、分割等が計画・実施される際の労働規制法、とくに労働関係の帰趨について、ドイツ法を対象に研究を行った。ドイツでは、(1)事業譲渡については民法典613a条、(2)合併・分割等については組織再編法(Umwandlungsgesetz)において、それぞれ規制がおかれている。事業譲渡(Betriebsubergang)が行われる際には、民法典613a条においては、労働関係を強制的に移転し、かつ事業譲渡を理由とした解雇および集団的労働条件(労働協約・事業所協定等)も含めた労働条件の不利益変更を禁止する規制が設けられている。ドイツでは、事業譲渡は、日本と同様、事業に属する権利義務の移転に際して、個々の債権者の同意を必要とする個別(特定)承継の考え方によって処理されると解されている。しかし、労働関係については、民法典613a条により特別の規制がなされており、労働関係は新たな事業所有者へ強制的に移転する旨が定められているのである(民法典613a条1項)。しかし、このような労働関係の強制移転を望まない労働者も考えられるところ、そうした労働者に対しては、異議申立権(Widerspruchsrecht)が認められている(民法典613a条6項)。また、ドイツでは、日本と同様に、個別(特定)承継と包括権利承継が区別されており、労働関係の移転に関しても、上記の事業譲渡の際の個別(特定)承継の場合と、合併(Verschmelzung)等の際の包括権利承継による場合とが区別されていた。しかし、1994年に分割(Spaltung)や合併等の企業組織再編を規制する組織再編法(Umwandlungsgezetz)が制定され、包括権利承継の立場がとられている分割や合併においても、強制的な労働関係の移転について規制する民法典613a条の一部の適用を前提とする立法がなされた(組織再編法324条)。これらの立法過程での議論や、争い・学説等を検討し、ドイツにおける企業組織再編の際の労働関係の帰趨や労働者保護の制度に関して詳細に検討を加え、そのプラスの面とマイナス面を検討することで、日本法に問題点等を浮き彫りにした。ドイツおよびEUにおいて、企業の組織再編が計画される際の従業員代表の役割について、研究を行った。そのため、まず、ドイツの従業員代表である事業所委員会の役割について、概要をまとめ、そして、当該事業所に所属する労働者の差別禁止や不利益取扱の禁止について、事業所委員会はどのような役割を果たすのか、について詳細な分析を行った。これらの研究により、ドイツの事業所委員会は、就業形態、性別、人種または年齢等の異なる労働者を公正に代表し、使用者に対して労働者の意見を適宜に公正に反映する仕組みを有していることを明らかにした。そして、上記の研究成果を踏まえ、企業組織再編の際の事業所委員会の役割について、検討を行った。ドイツでは、企業組織再編は主に、(1)事業譲渡(民法典613a条)、(2)合併・分割(組織変更法・Umwandlungsgezetz)、(3)事業の閉鎖や縮小等の措置が典型例である事業変更(Betriebsanderung)(事業所組織法111条ないし113条)がそれぞれ規制されており、事業所委員会は、(2)(3)の場面で大きな役割を担う。そして、ドイツでは、企業組織再編の際に、事業所委員会が関与することにより、労働者の権利を保護する仕組みを整備している。しかしながら、事業所委員会は労働者保護のみを主張するのではなく、企業の組織再編の必要をも考慮し、その手続きに関与するバランスの取れた制度を構築している。という分析結果を得た。この研究は、これまで一般的であった「ドイツ労働法=労働者の権利を保護する法」との観点からの研究との関係で、新たな視点を提示した。

しかし、1994年に分割(Spaltung)や合併等の企業組織再編を規制する組織再編法(Umwandlungsgezetz)が制定され、包括権利承継の立場がとられている分割や合併においても、強制的な労働関係の移転について規制する民法典613a条の一部の適用を前提とする立法がなされた(組織再編法324条)。これらの立法過程での議論や、争い・学説等を検討し、ドイツにおける企業組織再編の際の労働関係の帰趨や労働者保護の制度に関して詳細に検討を加え、そのプラスの面とマイナス面を検討することで、日本法に問題点等を浮き彫りにした。
バイオフォースによる放射性セシウムの生体除染

2011年3月、福島第一原子力発電所の爆発事故によって大気中に放出された放射性物質は広範な環境汚染をもたらした。本研究では、被さい牛の放射性Csの糞便からの排出を検証し、微生物による生体からの効果的除染方法の基盤を確立することを目的とした。被さい牛では放射性Csが種々の臓器および糞便から検出された。放射性Csの濃度は糞便で高かった。このことは腸内フローラ構成細菌が積極的に放射性Csを取り込んだためと考えられた。腸内フローラ構成細菌の放射性Csの取り込み率は38-81%と高かった。プロバイオティック細菌の取り込み率は低かったが、評価用培地のK濃度が関与すると考えられた。東日本大震災に伴う東京電力福島第一原子力発電所の爆発事故によって大気中に放出された放射性物質は福島県を中心に広範な地域に環境汚染をもたらした。放射性CsはCs-137とCs-134が1:1の比で放出され、種々の機関からそれぞれ約10 PBqと報告されている。現在、最も問題となるのは物理的半減期が長いCs-137が長期にわたって存在し、農産物を介して生体内に取り込まれることである。生体内除染はこれまで吸着材を中心に行われてきたが、低レベルの放射性Csには効果がないことが報告されている。本研究の目的は微生物による生体からの効果的除染方法の基盤を確立することである。原発事故後安楽死された放れ牛の筋肉から加熱抽出によって放射性Csを含む試料を調整した。また、環境材料(土壌)から標準試料を作成し、検量線を作成した。れによって、福島原発事故後時間経過による減少していく放射性Csを事故当時の時間軸に戻して変化を追うことができた。CsはKと似た挙動を示すとされている。観測されている「濃縮」は環境中と細胞内での電解質濃度の差に由来し、Kに対して際だってCsを濃縮する様な生物種は観測されていない。代謝に伴って用いた細菌が単に放射性Csを吸着しているか、あるいは取り込んでいるかを検証するために死菌と生菌での比較を行った。結果として死菌での吸着率は1%未満である一方、生菌は積極的に放射性Csを取り込むことがわかった。腸内フローラ構成細菌は放射性Csをよく取り込み、人での腸内細菌としてBifidobacterium longumがプロバイオティクス細菌の候補として有用であることが示唆された。腸管内でよく増殖し、糞便として排出することが低レベルの放射性Cs排出に効果的であると考えられた。2011年3月11日に発生した東日本大震災に伴う福島第一原子力発電所の爆発事故によって大気中に放出された放射性物質は広範な地域に環境汚染をもたらした。現在、最も問題となるのは物理的半減期が長い137Csが長期にわたって存在し、農産物を介して生体内に取り込まれることである。現在では検査体制の整備から基準値を超える食品が消費にまわることはなくなっている。一方で自主規制として設けられている20ー30Bq/kg未満の放射性Csは検出限界未満となり、消費への不安は未だに存在している。申請者は腸内フローラを構成する細菌が効率よく放射性セシウムを取り込むことを見出した。安全性が確認されているだけでなく、生きた状態で腸管に届き、腸管内で増殖し、かつそれが長く定着するのではなく糞便としてすみやかに排出が促進されることが望ましい。国民のニーズにこたえる緊急課題であるため、すでにプロバイオティクスとして使用されている乳酸菌およびビフィズス菌に焦点を絞りこんだ。本年度は研究協力者らとともに効果の認められるビフィズス菌を選抜し、これを特殊ビーズに封じ込める技術開発を行った。種々の食品において、カリウム含有量は炎光光度計とカリウムイオン電極を用いて測定した場合、両者はよく一致する。本研究での使用のために測定が容易なカリウムイオン電極を入手した。一方で有用乳酸菌及びビフィズス菌の選抜を行った。ここで問題となったことはラクトバチルス属の細菌では生育環境にKイオンが多く必要とされ、これを減少させると生育阻害が起こった。生物の生理的機能においてCsはKの代替にはならず、取り込み実験ではビフィズス菌が適していると考えられた。病気:申請者に腫瘍が見つかり、その摘出手術を行ったため。畜産業では、この影響で放射性ヨウ素による牛乳汚染および放射性セシウムによる牛肉汚染が問題となった。見えない放射能に対する国民に不安は大きい。このことから、放射性セシウムの吸収抑制や排出促進に効果がある薬品・食品への関心が高まっている。そこで、微生物による生体からの効果的除染方法の基盤を確立することを目的に実験を行った。腸内フローラ構成細菌4菌株、プロバイオティック細菌3菌株を供試菌とし、福島原発旧警戒区の牛由来ブイヨン添加BHI培地またはMRS培地で培養した。

培養終了後、菌体と培養上清に分離し、各々の放射線量を測定すると同時に、培地のKイオン濃度を測定した。BHI培地では腸内フローラ構成細菌の放射性Csの取り込み率は38-81%と高かった。一方、MRS培地ではプロバイオティック細菌の取り込み率は6%以下となった。死菌では取り込みを認めなかった。CsはNa-KポンプでKイオンと同様に同族のCsが取り込まれると考えられている。取り込み率の差違は各培地の違い-すなわち、Kイオン濃度に依存すると考えた。実際、MRS培地のKイオン濃度はBHI培地よりも有意に高かった(p<0.01)。プロバイオテック細菌の評価にはK濃度の低い新たな培地を作る必要があるとして、変法スキムミルク培地を作成した。この培地を使用することで放射性Csの取り込み評価が可能となった。また、BHI培地にKを添加すると有意に取り込み率は低下した。2011年3月、福島第一原子力発電所の爆発事故によって大気中に放出された放射性物質は広範な環境汚染をもたらした。本研究では、被さい牛の放射性Csの糞便からの排出を検証し、微生物による生体からの効果的除染方法の基盤を確立することを目的とした。被さい牛では放射性Csが種々の臓器および糞便から検出された。放射性Csの濃度は糞便で高かった。このことは腸内フローラ構成細菌が積極的に放射性Csを取り込んだためと考えられた。腸内フローラ構成細菌の放射性Csの取り込み率は38-81%と高かった。プロバイオティック細菌の取り込み率は低かったが、評価用培地のK濃度が関与すると考えられた。1.初年度において、福島原発事故由来の放射性Cs含有試料の調整を行った。この試料を培地に10%添加することで取り込みあるいは吸着実験を可能とするシステムを構築することができた。さらに、環境材料(土壌)から標準試料を作成し、検量線を作成することで菌体および残存培地の放射性Cs濃度を測定することができた。2.プロバイオテクスならびに腸内フローラ構成細菌について放射性Cs取り込み率を比較した。この結果に基づき、有用微生物の候補を選ぶことができた。3.死菌と生菌を比較することで生菌による積極的な取り込みが明らかとなった。異常のことから本研究はおおむね順調に進展していると判断した。CsはKと似た挙動を示すとされている。観測されている「濃縮」は環境中と細胞内での電解質濃度の差に由来し、Kに対して際だってCsを濃縮する様な生物種は観測されていない。代謝に伴って常に生体内のアルカリ金属、アルカリ土類金属は細胞を出入りしており、微生物もこれらのイオンを取り込むことが予想できる。そこで、取り込み効率の良い細菌を用いてプルシアンブルー、アルギンサン塩などの吸着材の効果の判定を微生物取り込み阻害効果によって比較する。選抜結果から、Bifidobacterium longumのいくつかの株を候補とし、吸着阻害についての実験を行う。ホールボディカウンター(NaIシンチレーションカウンター)によって体内残存の放射性Csの測定を行うための基礎実験を開始する。最大サイズの牛ファントムの作成はすでに成功しており、最小サイズのマウスファントムを作成する。体内の放射性Csがこのシステムで測定できるかどうかを検討する。動物微生物学種々の食品において、カリウム含有量は炎光光度計とカリウムイオン電極を用いて測定した場合、両者はよく一致する。
口蹄疫ウイルスRNAの特異的翻訳抑制と耐病性家畜開発に向けたアプローチ

海椎茸(Renilla)ルシフェラーゼと蛍(Firefly)ルシフェラーゼ遺伝子を持つジシストロニックレポータープラスミドを用い、細胞mRNAが行うキャップ依存性翻訳はRenillaルシフェラーゼ活性(1st cistron)、FMDV-IRES活性はFireflyルシフェラーゼの活性(2nd cistron)で測定した(ジシストロニックIRESベクター)。FireflyルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼの比(F/R)が小さくなるほど、よりFMDV-IRES特異的に翻訳が抑制されると考えられる。このアッセイ系を用いて解析をした結果、FMDVの感染域とIRES活性は相関しない事を明らかにした。しかしながら、siRNAを用いて翻訳に関与する宿主因子の作用を検討した結果、PTBや4E-BP1といった宿主因子がFMDVの感染感受性の決定に寄与する可能性も明らかとなった。これらの結果は、査読のある国際紙(BMC Veterinary Research)に投稿して受理されている。また、宿主因子作用の阻害剤(低分子化合物)の探索も開始した。以上の事から、研究はおおむね順調に進行している。昨年度までの研究では、口蹄疫ウイルス(Foot-and mouth disease virus ; FMDV)ゲノムRNAの非翻訳領域(5'UTR)内の40Sリボゾームの内部認識領域(Internal Ribosomal Entry Site; IRES)からの翻訳活性をHEK293(ヒト)、MDCK(イヌ)、MDBK(ウシ)、CPK(豚)細胞株でIRES活性を比較した結果、翻訳活性はMDBK, MDCK, HEK293, CPK細胞の順で強かったため、FMDVの感染域との相関はない事が明らかとなった。また、IRES活性に関与する宿主因子が、poly-pyrimidine-tract binding protein (PTB), eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1)とIRES trans-acting factor (ITAF45)である事が明らかとなった。これら宿主因子の翻訳における作用は各種細胞株で確認できた。そこで今年度は、FMDV-IRES活性を阻害する薬剤や低分子化合物のスクリーニングに役立つFMDV-IRES発現細胞の樹立を行った。由来する動物種によって細胞でのIRES活性が大きく異ならない事や、siRNAによるゲノムワイドなランダムノックダウンが容易にできるように既に全ゲノム配列が明らかとなっているヒト由来の細胞HEK293を用いて作製した。これらの細胞では、海椎茸(Renilla)ルシフェラーゼと蛍(Firefly)ルシフェラーゼ遺伝子の間にFMDV-IRES配列を持つジシストロニックレポータープラスミドを発現させ、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて発現細胞を樹立した。その結果、FireflyルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼを発現する40クローンの細胞株を樹立した。今後これらの細胞を用いてFireflyルシフェラーゼ活性のみを阻害し、Renillaルシフェラーゼ活性を阻害しない物質を探索する事によってFMDV-IRES特異的な阻害剤を得る予定である。また、ゲノムワイドなsiRNAやCrispr/Cas9によるランダムノックダウンにも有用なツールとなる事が期待される。1.今年度は、siRNAだけではなく、宿主因子の作用阻害剤も用いて、FMDV-IRES活性に関与する翻訳因子の活性を抑制する事を試みる。2. FMDV-IRESを発現する細胞株を樹立し、阻害剤のスクリーニングに用いる。3.FMDV抗病性動物作出への試みとして、FMDV-IRES活性に関与する宿主因子(4E-BP1等)を欠損するノックアウトマウスを用いたFMDV感染実験の共同研究の可能性を探索する。4. 2で探索したFMDV-IRES活性の発現を抑制する阻害剤を用いて、共同研究によりFMDV感染への効果を評価可能か、検討を進める。5. FMDV-IRES活性を動物体内で測定する方法を新たに確立する。具体的には、FMDV-IRESを発現するジシストロニックベクターのプラスミドDNAをハイドロダイナミック法でマウス肝臓内で発現する実験系を確立する。この系では、ルシフェラーゼ活性を測定する事によって動物体内でのFMDV-IRES活性の測定が可能となる。この実験系を用いて、4E-BP1, PTB等の宿主因子作用の阻害剤を投与し、IRES活性を生体内で特異的に阻害できる物質を探索する。生体内でのFMDV-IRES活性測定系が確立すれば、抗FMDV活性を持つ新たな薬剤をスクリーニングできる実験系として、応用研究への展開が期待される。ウイルス学、分子生物学
胆管癌悪性化における癌内線維芽細胞の役割の解明と新規治療への応用

胆管癌の代表的な治療である手術療法、放射線療法や抗癌剤の効果は非常に限られているだけでなく、患者の生活の質を低下させる。それ故、より根治的な胆管癌の治療法の開発が望まれる。本研究では、胆管癌悪性化の原因を解明し新規治療開発に役立てるために、患者胆管癌手術検体を用いたpatient-derived tumor xenograft (PDX)モデルを樹立する。さらに、患者胆管癌由来CAFsを抽出し、胆管癌との共移植系PDXモデルを確立する。さらにCAFsが胆管癌の浸潤、転移や薬剤抵抗性に与える影響を解明し、CAFsと胆管癌の相互作用を媒介する遺伝子やシグナルを同定し、新規治療法の基礎を確立する。