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東ドイツ産業史序説　─ザクセンとテューリンゲンを結ぶ光学・精密機器工業─

平成30年度は、学部長就任により日程がとりづらくなったため、海外出張によるアーカイブ史料の収集は中断し、つぎの4点に集中して研究を進めた。(1)研究会での発表と問題整理:第9回近現代ヨーロッパ史研究会(平成30年5月27日、近畿大学)において、「ザクセンおよびテューリンゲンにおける写真・映像機器工業の展開」について報告した。討論で最も関心が集まったのは、「なぜ、カメラ製造の一大拠点が王都ドレスデンに誕生したのか」であった。カメラやレンズ製造の先発国はフランスやイギリスであったが、ドレスデンのカメラ・映写機製造は、写真紙や印画紙製造の優位、カメラボディーの製造に携わる家具・指物師の集積もあって19世紀末までに急成長を遂げた。上記の問いに答えるためには、さらに同地の経済事情の分析(例:ザクセンの繊維機械製造業の日人と技術の集積)が必要だが、それは今後の課題とした。(2)前年度に明らかにできなかった論点は、ドレスデンのカメラ製造企業の「国際競争力」であった。今年度は海外出張で入手したアーカイブ史料(元非公開文書)の一つである「ドレスデンにおける写真・映像機器工業に関する研究」の翻訳を通じて、1950年代にドレスデンで製造されたカメラの輸出上の問題点、課題克服に向けた業界再編の一端を垣間見ることができた。権力に臆することなく、企業側(とくに技術者たち)が、地方政府の行政機関(計画当局)に問題を投げかけている様子をうかがい知ることができた。分析対象となる時期が19世紀末から戦後に飛んだが研究上の意義があると考え、本学紀要に掲載した。(3)前年度の研究を通じて、本年度には新たな研究テーマが浮き彫りとなった。カメラ・映写機の製造と大衆化に寄与したロールフィルムの登場と生産に関する分析に向けて化学工業部門のアグファ・ヴォルフェンに関連する文献の収集を行った。平成30年度年度春からの、学部長(任期2年)就任により研究時間が大幅に減少したことで、研究にブレーキがかかったことによる。また、平成29年度から収集を続けている多くの文献の整理と読み込みに時間がかかっていることもその一因である。それでも研究課題を進めるべく、次の三点の研究を深めている。第一に、昨年度の研究の副産物として、写真用フィルム製造企業への関心が派生してきた。機械工業とともに19世紀後半以降のドイツ工業の重要な柱となる「化学工業」において、大衆消費時代の到来にも関連する写真部門の分析は、第二次大戦後の東ドイツ工業のもう一つの源流の解明に寄与すると考えている。この新たな課題への挑戦は、当初の研究のスピードを結果的に制約することになったが、写真、映画撮影のための機器の改良と新しい感光媒体としてのフィルムの登場は表裏一体の関係にあるので、後回しにせずに進めていきたい。第二に、昨年度から執筆とシリーズ化(研究ノート)を始めた「ドレスデンの写真・映像機器工業」の研究の一環として、個別企業の社史、広くザクセン、テューリンゲンの機械工業に関連する文献を新たに入手しているが、学務優先の日常もあって、整理と読み込みに時間がかかっている。第三に、一昨年度入手したアーカイブ史料の翻訳に時間がかかったことが理由としてあげられる。1950年代におけるドレスデンのカメラ製造企業の「国際競争力の低下」とその対策としての「経営統合」戦略に関する史料を活かすべく、その周辺事情に関する文献を収集したり、翻訳のより良き理解に向けた解説用の注の作成に時間が必要であった。平成31年・令和元年も学部長業務が継続するため、研究期間の延長についても考えておきたい。平成31年・令和元年度の研究は、これまで得られた知見を踏まえて、以下の二点を目標に据えたい。第一に、平成30年度中に執筆する予定だった事柄を研究ノートにまとめたい。第一次世界大戦前後から動きのあったドレスデンのカメラ製造企業の経営統合を中心に、新たに収集した文献のサーベイを進めながら分析を深めるためである。経済史研究が明らかにしてきた「巨大企業の20世紀」が、ICA(通称、イカ:4社合併により1909年設立)とツァイス・イコン(カール・ツァイス・イェーナ主導でICAほか3社が合併:1925/26年。28年までさらに2社合併)の誕生を事例に跡付けられるとともに、合併劇の推進力となった諸要因(国際的な技術革新競争、価格競争、市場獲得競争など)を整理して提示したい。第二に、平成30年度中に文献収集とサーベイを続けてきたアグファ・ヴォルフェン社(フィルム、写真剤)の歴史に関する論稿をまとめることにしたい。というのも、この研究は、19世紀末からのドレスデンの写真・映像機器工業の成長と再編と並行、連動するものだからである。すでに平成30(2018)年度に、1写真・映像機器、感光材料、フィルムの誕生と発展に関する文献、2それらの製品を生産する企業の歴史(とくにドレスデンのカメラ製造企業の古書、ベルリン、プロヴィンツ・ザクセンのフィルム製造企業)に関する文献の入手し分析を始めている。なお、繰り返し述べてきた通り、平成30年度春以来の学部長の業務の増加により、今年度は海外出張や学会報告のための国内出張は先送りにしてきた。平成31年度・令和元年度は、上記の二つの課題を実現するために、学会報告を見合わせざるを得ない。とはいえ将来的には学会への成果報告を通じて、自分の研究の相対化をはかる必要があるので、現時点で「研究計画の1年延長(基金使用の繰り越し)」も射程に入れていることを付け加えたい。

平成29年度は、4つの重点を柱に研究を進め、以下の成果が得られた。(1)研究会での発表と問題整理:5月の近現代ヨーロッパ史研究会において、拙著『東ドイツ工業管理史論』の到達点と今後の課題、とりわけ後者の論点について報告し、メンバーの方々の意見をいただいた。個別の地域(ザクセン、テューリンゲン)ならびに工業部門(写真・映像機器工業)を選択し、その歴史を19世紀に遡って分析する必要性については、おおむね賛同を得られたが、戦後史に最大の重心を置くべきではないかというご意見をいただいた。(2)関連書籍の入手:購入にあたっては、1写真・映像機器、感光材料、フィルムの誕生と発展に関する文献、2ザクセン、テューリンゲン経済史、3両地域の代表的精密機器、機械メーカーの歴史に関する文献(カール・ツァイス社、ドレスデンのカメラ製造企業など)を購入。(3)海外出張と文献・資料収集:8月下旬から9月中旬にドレスデン、ベルリン、ライプチヒ、イェーナに滞在。ドレスデンでは、ザクセン州公文書館にて、第二次世界大戦以降のドレスデンのカメラ企業に関する社内文書、公文書を入手した。ベルリンでは、国立図書館にて日本に所蔵確認できなかった書籍のコピーし、また市内の古本店にて東西ドイツ経済史の書籍を購入。ライプチヒでは、国立図書館文館にてザクセンの産業遺産、精密機器ならびに化学工業関連書籍のコピーを行った。イェーナでは、カール・ツァイス社に関する情報を同社博物館、大学図書館で入手した。(4)研究ノートの作成:収集した文献と資料に拠りながら、本学紀要『人文・自然科学研究』第30号に「ザクセンとテューリンゲンにおける写真・映像機器工業の展開(1)ー産業立地、国際競争、経営統合の観点からー」(1840年代から1909年頃まで)を投稿・発表した。同研究ノートは、今後シリーズ化して発表する。平成29年度においては、春の研究会で研究課題の焦点を明確にすることができた。そこで確定した方針にしたがい、一年を通じて邦語ならびに外書文献を国内で購入することができた。また8月から9月にかけての海外出張中に公文書館や国立図書館などで第一次史料や書籍のスキャンおよびコピーを行うことができた。年度途中で学務にやや多くの時間をさかねばならなくなった(図書館長、大学基準協会自己点検評価担当、教務、FD担当)が、入手した資料にもとづいて研究ノートの作成にこぎ着けることができた。本研究は、1840年代から1990年代までの長いタイムスパンを分析対象としているが、平成29年度は、ザクセン・テューリンゲンの光学・映像機器工業の黎明期となった19世紀の動向(自由主義段階)について、先行研究の分析、技術史の研究の成果も交えながら明らかにすることができた。その成果の一つである研究ノートでは、数あるドイツの大都市のなかで、なぜドレスデンにカメラ企業の集積がみられるようになったのかを明示することができた。これは、後述するカール・ツァイス社が主導した「経営統合」=企業集中の歴史につながる論点である。研究の副産物として、撮影用フィルムの誕生、とりわけアメリカのロール・フィルムの生産がドイツのフィルム生産への刺激となり、それが世紀末以来のザクセン・アンハルトの化学工業地帯において写真フィルムの製造が始まったことが見えてきた。
iPS細胞・ES細胞を用いたダウン症候群における合併症の新規治療法・予防法の開発

我々はOCT3/4、SOX2、KLF4の3遺伝子、それらにc-MYCを加えた4遺伝子を導入することにより樹立されたダウン症候群患者由来iPS細胞を,AGM-3細胞株と共培養した後、フローサイトメトリーによるヒトCD45+細胞の比率及び血液コロニー形成法による造血細胞活性を検討したところ、CD45+細胞の比率、形成される血液コロニー数が健常人由来iPS細胞の約23倍であった。また網羅的遺伝子発現解析により発現が上昇している造血関連遺伝子は21番染色体に含まれる遺伝子で18あり、その中にはGATA-I、RUNX1が含まれていた。定量的RT-PCRにおいてもその発現の上昇が確認された。21番染色体のトリソミーに起因するダウン症候群の患者では、出生後も白血病、低身長、特徴的な肥満など、中胚葉を起源とする組織・細胞(血液、骨、脂肪細胞など)に様々な合併症を発症する頻度が高い。しかし、これらの合併症の発症機序と21番染色体上の遺伝子過剰の関係についてはほとんど解明されていないため、その発症予防法も確立されていない。そこで我々は、ダウン症候群患者由来iPS細胞および21番染色体を導入されたヒトES細胞から造血/血液細胞や間葉系細胞を分化誘導し、それらを細胞生物学的および分子生物学的に解析することにより、これらの合併症の発症機序の分子基盤を解明する事を計画した。その結果、ダウン症患者iPS細胞及び健常人由来iPS細胞を造血/血液細胞に分化誘導した後、血液細胞コロニー法を用いて、その造血/血液細胞への分化能を比較検討したところ、DS-iPS細胞からの分化誘導系においては、健常人由来iPS細胞からの分化誘導系と比較べて、全血球系において造血が亢進していることが明らかとなった。さらにDS-iPS細胞と健常人由来iPS細胞から造血/血液細胞への分化過程における遺伝子発現をマイクロアレイで解析したところ、21番染色体上のRUNX1の発現が亢進しており、このことはリアルタイムPCR法による解析でも確認された。以上の結果は、ダウン症候群患者の造血障害には、21番染色体トリソミーによるRUNX1の発現亢進が深く関与している可能性を示唆しており、これを標的とするダウン症候群及びTAMにおける造血障害に対する新規治療法の可能性が示された。
マイクロピクセル電極を用いた高増幅率粒子検出器の開発

本研究はマイクロピクセル電極を用いた粒子検出器μPICの増幅率向上を図るものである。μPICは京都大学の谷森グループが開発を進めてきたものであるが,本研究では電極配置や電場分布を変更することにより,より高い増幅率を得て高エネルギー実験に広く応用できる検出器を開発することを目指している。今年度は,シミュレーション結果に基づいてポリイミド基板上に300μmピッチで直径50μmの陽極を三角格子状に並べたマイクロピクセル電極μPICを試作した。これに電圧供給用および信号読み出し用に製作した回路基板を取り付け,データ収集システムを構築してμPICの基本特性を測定した。μPIC本体の絶対増幅率を算出するために,まずテストパルスを入力して測定システムの較正を行った。次に,55FeのX線源を用いて,今回試作したμPICに標準的な電圧をかけて,従来のμPICで得られていた増幅率が得られるかどうかの確認を行った。測定の結果,増幅率は従来のμPICと同等でありシミュレーションの結果とも矛盾しないことが確認できた。現在はマイクロピクセル電極での放電のために標準的な電圧以上の高い電圧をかけることができず,これ以上の増幅率は得られていない。しかし,陽極-陰極間電圧およびドリフト電圧を変化させて増幅率を測定したところ,シミュレーションで予想された傾向と一致することがわかり,放電対策を施せば所期の性能が期待できることが確認できた。また,放電するピクセルの修理方法を確立し,今後更に高い増幅率を得るめどをたてることができた。
Tup1-Cyc8コリプレッサー複合体の構造機能解析

出芽酵母Tup1-Cyc8複合体は、Tup14分子とCyc81分子とが結合した分子量約400kDaの転写抑制因子である。本研究では、Tup1-Cyc8複合体がどのように標的分子と相互作用し、機能を発揮するのかを解明することを目的とする。具体的には、Tup1-Cyc8複合体の立体構造をX線結晶構造解析とX線溶液散乱法とを組み合わせた方法で解明し、さらに立体構造を基盤として酵母を用いた機能解析を行った。さらに、そして、これまで達成することができなかったTup1全長の発現・精製を行って構造機能解析の基盤を構築した。「Tup1-Cyc8コリプレッサー複合体がどのような複合体を形成し転写抑制機能を発揮しているのか」を構造学的視点から調べるために、Tup1N-Cyc8複合体の結晶化を行った。その結果、0.6 M Magnesium sulfate, 0.1 M HEPESsodium pH 7.5, 4% v/v 2-Methyl-2,4-pentanediolの条件において最も分解能が高く、回折点に伸びがない回折データが得られた。しかし、現状での分解能は6Åと構造解析には困難であった。分解能の向上を目指した結晶化条件の最適化を行い、さらにその蛋白質の分散度が評価できるX線溶液散乱法を用いて単分散性を評価し、その情報をもとに混合の割合等を変化させたが、構造解析に適した結晶は得られていない。また、機能解析については、Tup1のアミノ酸72-93の領域が重要であることが示唆され、さらにアミノ酸74-76をアラニンに置換した変異体の転写抑制能を解析したところ、その機能の喪失が見られた。昨年に引き続いてTup1のN末端領域(Tup1N)とCyc8の複合体の結晶化を行った。しかし、構造解析可能な良好な回折強度データが得られなかったため、X線小角散乱法を用いて低分解能での構造解析に取り組んだ。まず、Cyc8単体での構造解析に取り組んだところ、Cyc8は多量体を形成し、まるでTup1を取り囲むような構造をしていることが示唆された。厳密に何量体を形成しているかといったストイキオメトリーを決定するためには更なるデータ収集が必要であるが、もしCyc8が単体のときと同様な形を保持してTup1と結合しているとすれば、私達が以前報告したTup1変異体の実験結果と合致している。機能解析について、昨年度は、Tup1のN末端領域(1-92アミノ酸)に含まれる74-76アミノ酸位の3連続グルタミン酸(EEE)が転写抑制に重要な機能をもつことをアラニン置換変異株を用いて示したが、本年度は3連続グルタミン酸をすべてグルタミン(QQQ)あるいはアスパラギン酸(DDD)に置換した変異株を作製し、接合型、凝集性および標的遺伝子の転写抑制能を定量化した。tup1-QQQ変異株は野生型TUP1株と同じ転写抑制能を示したのに対して、tup1-DDD変異株はtup1-AAA変異株と同様にtup1遺伝子破壊株と野生型株の中間程度の転写抑制能を示した。従って、Tup1Nの3連続グルタミン酸はその負電荷ではなく、その側鎖長が転写抑制に重要であると結論した。ヒストンと相互作用すると報告されている中央領域(93-281アミノ酸)を欠失させたtup1変異株が、意外なことに野生型株と同様にプロモーター領域をヘテロクロマチン状態に維持することを明らかにした。この結果は、Tup1がヒストンとの相互作用と介せずに転写抑制するのか、あるいはTup1が中央領域以外の領域でヒストンと相互作用するのかを示唆した。Tup1のN末端領域(Tup1N)とCyc8の複合体の結晶化を行ったが、構造解析可能な良好な回折強度データが得られなかった。そこでX線小角散乱法を用いて、Tup1N-Cyc8の複合体の構造解析を行った。その結果、Cyc8はTup1Nを取り囲んで結合して、さらにCyc8はTup1N同士を重合させる「のり」の働きがあることが示唆された。これは、私達が2012年に提案したTup1-Cyc8が重合して機能を発揮するという仮説を部分的にではあるが裏付けるものであった。さらに、共同研究者として産総研のグループが加入して、Tup1全長(320kDa)の発現と精製に取り組んだ。Tup1全長の発現は大腸菌発現系や通常の酵母発現系では困難であったが、産総研グループが開発してきた、低温で目的遺伝子を発現させる酵母を用いて発現したところ、Tup1が上清に発現していることが確認できた。続いて精製に取り組んだ。種々のクロマトグラフィーを試験したが、最終的にはNiアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーの精製ステップを経ることで、95%以上の高純度のTup1を得ることができた。

具体的には、Tup1-Cyc8複合体の立体構造をX線結晶構造解析とX線溶液散乱法とを組み合わせた方法で解明し、さらに立体構造を基盤として酵母を用いた機能解析を行った。さらに、そして、これまで達成することができなかったTup1全長の発現・精製を行って構造機能解析の基盤を構築した。現状でX線結晶構造解析に関しては、結晶化には成功しているものの、構造解析が可能な高分解能データの収集が困難であった。そこで新たにX線小角散乱法に取り組んだが、これについては予想外に良いデータが得られ、Cyc8単体の分子の外形まで決定できることができた。よって、おおむね順調に進展していると考えている。生物学現段階では、Cyc8単体の多量体形成様式やTup1N-Cyc8複合体の構造決定にまでは至っていない。今後は、他の物理化学的手法(例えば、等温滴定熱測定)やより多くのX線小角散乱のデータの蓄積によって、Cyc8単体の多量体形成様式とTup1N-Cyc8複合体の立体構造の決定をしたいと考えている。また、今期に新たに分担者が加入し、大腸菌や通常の酵母の系では発現が困難だったTup1全長の発現を、酵母の低温誘導発現系によって試験する予定である。これが得られれば全長の発現・精製・解析を行う。また、ヒトTup1ホモログであるTLEが、我々が示した酵母Tup1と同様に4量体を形成し、興味深いことにヒストンH4と相互作用することが示された(EMBO J., 33:719)。この報告は我々の結果と一致しており、Tup1が中央領域以外の領域でヒストンと相互作用する可能性を強く示唆する。そこで、今後はTup1の中央領域に加えて、四量体形成に必要なN末端領域についてもヒストンとの相互作用を解析することも計画する。大腸菌にてヒストンH3とH4を発現し可溶化することに成功したので、GST-Tup1(1-92)およびGST-Tup1(1-92)AAAとの結合をGSTプルダウンアッセイにより調べる。また、これと並行して、出芽酵母から粗精製したヒストンタンパク質(H2A、H2B、H3、H4)を用いてFar-western法によりTup1(1-92)およびTup1(1-92)AAAとの結合を確認する。また、中央領域を欠失させたTup1が標的遺伝子プロモーター領域にリクルートされることをクロマチン免疫沈降法により調べることも計画する。構造研究に関してはTup1N-Cyc8複合体の結晶は得られたものの、結晶の改良に時間を要している。一方で、機能解析については、Tup1のアミノ酸72-93の領域が重要であることが示唆され、さらにアミノ酸74-76をアラニンに置換した変異体の転写抑制能を解析したところ、その機能の喪失が見られた。また、S. cerevisiae Tup1の中央領域(93-281アミノ酸位)をGST融合タンパク質として大腸菌で発現・可溶化することに成功した。同様にC. albicans Tup1で相当する中央領域(94-139アミノ酸位)の発現にも成功した。大腸菌のレアコドンが原因で発現が困難であった酵母ヒストンH3およびH4タンパク質を大腸菌Rosetta細胞を用いて発現させることができた。Tup1Nに含まれる74-76アミノ酸位の3連続グルタミン酸(EEE)に注目し、部位特異的アラニン置換により、これらの単独(AEE、EAE、EEA)、二重(AAE、AEA、EAA)、三重(AAA)変異株を構築した。三重変異株においてTup1による転写抑制能が失われた。Tup1N-Cyc8の単体と複合体の発現・精製を行って研究を進めてきており、解析は計画どおり進みつつある。より詳細な解析を進めるためにも、Tup1全長の構造情報が必要となり、今年度、新たな分担者が加入して酵母低温誘導発現系を試験することになったため。
生物多様性獲得機構としての生物間相互作用の進化学的解析：植物寄生菌を材料にして

・アジア地域および南米で新たに発見された13新種,2変種を11編の論文として記載した.・総説において,うどんこ病菌の地理的起源,分子時計を用いた進化年代の解析,形態進化について論議した.また,Erysiphe属およびGolovinomyces属の網羅的系統解析を行いこれらの属の系統関係を初めて明らかにした.・日本およびアジア地域各国(中国,韓国,インド,インドネシア,タイ,イラン)の共同研究者と共にアジア地域におけるうどんこ病菌の多様性を調査した.1)東・東南アジア産うどんこ病菌の形態・分子系統解析インドネシアおよび日本で採集したうどんこ病標本に加え当研究室保存の乾燥標本について,形態記載を行うとともにrDNA ITS, 28SおよびIGS領域の塩基配列を決定し,系統学的位置を明らかにした.9新種2変種および1新組み合わせを発見し,Mycoscience, Mycological Progress, Mycotaxonなど専門的国際誌に8つの原著論文として公表した.我が国におけるうどんこ病菌の初記録3種,新宿主植物16種について形態・分子系統解析を行った.2)1世紀ぶりのうどんこ病菌の再発見1921年にジャワ島で発見され,その後1世紀にわたって見つからなかったうどんこ病菌を再発見した.この菌はうどんこ病菌とは異なる菌であると見なされていたがその後うどんこ病菌に再分類されたものである.本研究の結果,本菌がうどんこ病菌であることが証明され,原記載では発見されなかった不完全世代を新たに記載した3)Golovinomyces属菌の大規模系統解析世界中から採集したGolovinomyces属菌の大規模分子系統解析を行った.本属菌の最初の宿主植物はキク科であり,キク科と共種分化した後他の植物科に宿主拡大したと推察された.Golovinomyces属菌はグループごとに宿主範囲が1植物科または連に限定され,植物の系統と密接に関連しながら多様化したことがわかった.もっとも派生的な場所に位置するグループは多様な植物科に寄生するグループであった.このことから,Golovinomyces属菌の中には,宿主範囲を狭く限定する静的なグループと,現在活発に宿主範囲を拡大しつつあるグループが存在することが明らかになった.このような多様化戦略の違いの機構は今後の研究課題である.この成果は米国菌学会の機関誌であるMycologiaに受理された.1)東・東南アジア産うどんこ病菌の形態・分子系統解析インドネシアおよび日本で採集したうどんこ病標本に加え当研究室保存の乾燥標本について,形態記載を行うとともにrDNA ITS, 28SおよびIGS領域の塩基配列を決定し,系統学的位置を明らかにした.9新種2変種および1新組み合わせを発見し,Mycoscience, Mycological Progress, Mycotaxonなど専門的国際誌に8編の原著論文として公表した.我が国におけるうどんこ病菌の初記録3種,新宿主植物16種について形態・分子系統解析を行った.2)韓国の研究者との共同研究により,ホウノキに寄生するうどんこ病菌Erysiphe magnoliaeの形態および分子系統解析を行った.この成果は,ヨーロッパの菌学専門誌Sydowiaに掲載された.3)タイの研究者との共同研究により,タイでは未記録であったうどんこ病菌Phyllactinia cassiae-fistulaeの形態および分子系統解析を行った.この成果はAfrican Journal of Biotechnologyに掲載された.4)インドの研究者との共同研究により,タマリロに発生するうどんこ病菌を初めて報告し,他3種のうどんこ病菌とともに形態および分子系統解析を行った.この成果はEnvironment & Ecologyに掲載された.・アジア地域および南米で新たに発見された13新種,2変種を11編の論文として記載した.・総説において,うどんこ病菌の地理的起源,分子時計を用いた進化年代の解析,形態進化について論議した.また,Erysiphe属およびGolovinomyces属の網羅的系統解析を行いこれらの属の系統関係を初めて明らかにした.・日本およびアジア地域各国(中国,韓国,インド,インドネシア,タイ,イラン)の共同研究者と共にアジア地域におけるうどんこ病菌の多様性を調査した.1)複数遺伝子領域の塩基配列解析の技術確立チューブリン,カルモジュリン,アクチン,EF1a,rDNA IGS領域を増幅するためのプライマーの設計およびDNA抽出法,PCR条件の検討を行った.このうち,rDNA IGS領域は技術確立に成功し,現在うどんこ病菌の塩基配列に用いている.チューブリンとEF1aはプライマーの設計およびPCR条件はほぼ確立できたが,まだ実用化には至っていない.他の遺伝子領域についてはまだPCRによる増幅に成功していない.2)うどんこ病標本の採集日本およびインドネシアにおいてうどんこ病標本の採集を実施した.そのうち,重要と考えられる標本について形態観察と分子系統解析を行った.その結果,現在までに変種を含む6新種を発見した.また,インドネシア・ジャワ島において90年前に一度だけ発見され,その後未報告だったうどんこ病菌を見つけることが出来た.この菌の形態観察および分子系統解析を行い,系統的位置を初めて明らかにした.これらの成果は,国際専門誌に順次論文として公表しつつある.3)我が国に分布するうどんこ病菌リストの作成2012年にうどんこ病菌の新しいモノグラフが出版され,うどんこ病菌の分類体系が大きく変更されることになった.それに合わせ,日本のうどんこ病菌の学名を更新すべく,日本に分布するうどんこ病菌のリストとともに,学名の新旧対照表を作成し,論文として公表した.

2)最近日本で新たに発見されたうどんこ病菌の本邦未記載種および新寄主植物をMycoscience誌3編の論文として掲載した.さらにもう1編は現在投稿中である.3)ハスうどんこ病菌Erysiphetakamatsuiの有性世代を40年ぶりに再発見し,形態を詳細に再検討するとともに,分子系統学的解析を行った.この成果はMycoscience誌に掲載された.4)ウドンコカビ科で最大の属であるErysiphe属の網羅的な分子系統解析を行い,属全体の系統関係を初めて明らかにした.この成果の第1報は米国菌学会が発行するMycologia誌に掲載された.第2報も同紙に投稿中である5)DNA情報を用いて植物病原菌を同定するDNAバーコーディングの一環として,DNAデータベースに登録されているITS領域のシークエンスデータを病原菌の種と対応させる国際プロジェクトに参加し,うどんこ病菌について担当した.この成果はFungal Diversity誌に掲載された.菌類分子系統進化学1)複数遺伝子領域の塩基配列解析の技術確立IGS領域についてはシークエンス技術を確立できたが,チューブリンとEF1a遺伝子領域についてはペンディング状態である.2)東・東南アジア産うどんこ病菌の形態および分子系統解析期待以上の成果が得られていると考えている.来年度は再度インドネシアでの採集を行い,東南アジアにおけるうどんこ病菌の多様性獲得機構について検討していきたい.3)Golovinomyces属菌の系統解析これの解析,論文作成には3年ほどかかったが,今年度中に論文作成を終了し,Mycologia誌に受理されたことで一応の成果が得られたと考えている.1)複数遺伝子領域の塩基配列解析の技術確立IGS領域についてはシークエンス技術を確立できたが,チューブリンとEF1a遺伝子領域についてはペンディング状態である.これについては今後も継続的に技術開発に取り組む予定である.2)東・東南アジア産うどんこ病菌の形態および分子系統解析昨年はインドネシアでうどんこ病菌の採集を行ったが,現地の交通事情の悪さもあって予定していた数の標本を集める事はできなかった.そのため,研究期間を1年延長し,研究を継続する事にした.日本など東アジア産うどんこ病菌の解析は順調に推移し,多くの新種,新産種の解析を終える事ができた.その結果は随時専門誌に論文として公表していく予定である.1)複数遺伝子領域の塩基配列解析の技術確立ほぼ目標通りに進行しているが,チューブリンとEF1aの解析技術確立までには至っていない.2)うどんこ病標本の採集と解析昨年度インドネシアでうどんこ病標本の採集を行い,ある程度の標本を採集した.インドネシアはうどんこ病菌フロラについては未解明の地域であり,新種等も多いので来年度も継続して採集していきたい.
集束イオンビームを用いて作製した強磁性トンネル接合におけるスピン注入磁化反転

強磁性トンネル接合におけるスピン注入磁化反転は不揮発性磁気メモリの高集積化に不可欠であり、応用上、磁化反転に要する電流密度を低減することが課題である。理論予測から反転電流が強磁性材料の飽和磁化やダンピング定数などの磁気パラメータに依存すると考えられており、反転電流を低減するためにはこれらの相関関係を検証することが重要となる。そこで本年度は、これまで強磁性トンネル接合(MTJ)の磁化反転層に用いてきたCo-Fe-B合金のB組成を増加することで飽和磁化を減少させた接合におけるスピン注入磁化反転特性の評価を試みた。Co-Fe-B合金の組成は(Co50Fe50)100_<-x>B_x(X=20,25,30)である。2.5nmのMgOを障壁層に用いたMTJを作製し、熱処理後にすべての組成において250%の高いTMR比が得られた。また、B量の増加に伴い熱処理によるTMR比の熱処理温度依存性に違いが見られるものの、TMR比の最大値は同程度であるためB添加による結晶構造や格子間隔への影響は小さいと考えられる。次に、MgOの膜厚を0.3-0.9nmとし、EBリソグラフィを用いて100nmサイズに加工したMTJにおけるスピン注入磁化反転を観測し、バイアス電流のパルス幅に依存しない反転電流密度J_<c0>を熱活性モデルによる解析を用いて導出した。その結果、B量を増やしたMTJにおいてJ_<c0>の値が減少した。また、TMR比から導出されるトンネルスピン分極率およびVSMやFMRを用いて見積もった飽和磁化やダンピング定数の値から理論的に予測される項を計算すると測定したJ_<c0>と概ね比例関係にあることが分かった。この結果により、反転電流低減のための素子設計の指針がより明確になり、今後のスピン注入現象を利用する様々なデバイスの開発に貢献することが期待できる。本年度は,電流による磁化反転が可能な微小強磁性トンネル接合(MTJ)の作製プロセスを確立し,スピン注入磁化反転の本質的な特性を測定および見積もるため要素技術の確立を目的とした.1.ナノメータサイズ強磁性トンネル接合の作製集束イオンビームによって形成したタングステンの微小パターンをマスクとするプロセスを用いて最小140×250nm^2のMTJを作製し,140Ωμm^2の接合抵抗(RA)および17%のトンネル磁気抵抗(TMR)比を得た.また,加工プロセスに電子線リソグラフィを導入することによって,最小100×200nm^2のMTJを作製し,30%以上のTMR比を得た.2.強磁性トンネル接合の低抵抗,高出力化酸化マグネシウムの極薄膜を中間絶縁層とするMTJを作製し,6Ωμm^2のRAを得た.また,磁場中熱処理によって最大90%のTMR比を得た.3.スピン注入磁化反転の観測上記低抵抗MTJに面直方向にDC電流を印加し,接合にかかる電圧を4端子法により測定した.この際,印加電流によって抵抗が変化し,その変化率がTMR比と等価であることから,微小強磁性体の磁気モーメントが電流によって符号反転したことを確認した.このとき反転に要した電流密度は7.7×10^6A/cm^2であった.また,熱処理温度の上昇に伴って,反転電流密度も増加することが分かった.4.パルス電流による測定DC電流からの熱擾乱による反転確率の増加を抑制し,微小強磁性体の本質的な反転電流密度を見積もるために,パルス電流による測定系の構築を行った.パルス電圧発生器を用いて1ミリ秒から1秒の幅を持つパルス電流を接合に印加し,ロックインアンプによる4端子測定を行うことで抵抗の変化を読み取ることができた.また,磁気モーメントの初期角に起因した磁化反転の確率や分布の測定が可能であることを示した.微小強磁性体におけるスピン偏極電流を利用した磁化反転現象を高機能スピンデバイスに応用する際、磁化反転に要する電流密度を低減することが求められている。本研究では、スピン注入磁化反転における反転電流密度の低減を狙い、スピントルクと競合する磁気緩和の観点から強磁性材料や素子構造の最適化に関する研究を行う。本年度は、以下の事項について研究を行い、各々に対する知見を得た。1.微小素子の作製とスピン注入磁化反転の評価電子線リソグラフィ、Arイオンミリング等を用いて最小100×200nm^2の面積を有する微小強磁性トンネル接合(MTJ)を90%以上の高効率で作製可能な加工プロセスを確立した。CoFeB/MgO/CoFeBを基本構造とするMTJにおいて、RA=7Ωμm^2の低抵抗領域で150%以上の高TMR比を得ることに成功した。パルス電流を用いた測定法により見積もった熱擾乱に依存しない反転電流密度(J_<CO>)は最小6.7×10^6A/cm^2であった。このJ_<CO>と熱揺らぎ耐性(E/K_BT)は磁化反転層の保磁力に伴い増加した。これは、熱処理によって結晶化したCoFeBの磁化分布に起因すると考えられるため、熱処理に対する磁気特性の制御が重要であることが分かる。2.強磁性体における磁気緩和の評価J_<CO>の低減には、スピン注入磁化反転機構と関係する磁気緩和を調べる必要があるため、強磁性共鳴(FMR)によって磁化反転層に用いる強磁性体のダンピング定数αを見積もった。

複数の磁性層を有する交換結合型TMR多層膜において磁化反転層のみのFMRスペクトルを分離して評価できることを示し、CoFeB単層膜と同様に膜厚が薄くなるに従いαは増大することが分かった。磁化反転層が2nmの膜厚ではα=0.015であり、バルク値と比べて5倍大きくなった。αの膜厚依存性はスピンポンピングに起因すると考えられるため、スピンの拡散防止層として磁化反転層に薄い絶縁体を隣接すると、αの増大を抑制できることが分かった。強磁性トンネル接合におけるスピン注入磁化反転は不揮発性磁気メモリの高集積化に不可欠であり、応用上、磁化反転に要する電流密度を低減することが課題である。理論予測から反転電流が強磁性材料の飽和磁化やダンピング定数などの磁気パラメータに依存すると考えられており、反転電流を低減するためにはこれらの相関関係を検証することが重要となる。そこで本年度は、これまで強磁性トンネル接合(MTJ)の磁化反転層に用いてきたCo-Fe-B合金のB組成を増加することで飽和磁化を減少させた接合におけるスピン注入磁化反転特性の評価を試みた。Co-Fe-B合金の組成は(Co50Fe50)100_<-x>B_x(X=20,25,30)である。2.5nmのMgOを障壁層に用いたMTJを作製し、熱処理後にすべての組成において250%の高いTMR比が得られた。また、B量の増加に伴い熱処理によるTMR比の熱処理温度依存性に違いが見られるものの、TMR比の最大値は同程度であるためB添加による結晶構造や格子間隔への影響は小さいと考えられる。次に、MgOの膜厚を0.3-0.9nmとし、EBリソグラフィを用いて100nmサイズに加工したMTJにおけるスピン注入磁化反転を観測し、バイアス電流のパルス幅に依存しない反転電流密度J_<c0>を熱活性モデルによる解析を用いて導出した。その結果、B量を増やしたMTJにおいてJ_<c0>の値が減少した。また、TMR比から導出されるトンネルスピン分極率およびVSMやFMRを用いて見積もった飽和磁化やダンピング定数の値から理論的に予測される項を計算すると測定したJ_<c0>と概ね比例関係にあることが分かった。この結果により、反転電流低減のための素子設計の指針がより明確になり、今後のスピン注入現象を利用する様々なデバイスの開発に貢献することが期待できる。
JNK結合分子による細胞接着斑と運動極性形成制御機構の解析

HT1080細胞のI型コラーゲンおよびファイブロネクチン(FN)上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方、MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞接着斑の代謝回転を誘導し、阻害変異体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制した。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化を調節することにより細胞接着斑の代謝回転と細胞運動を制御していることが示唆された(T. Takino et al., Experimental Cell Research,2006)。細胞運動時、MT1-MMPは細胞接着斑の集積と代謝回転が頻繁に起こる運動先端部の内側でECMを分解していた。細胞接着斑におけるMT1-MMPの機能に着目し、FAKの細胞接着斑標的ドメインをMT1-MMPとMT1-MMPの阻害変異体に付与し、細胞接着斑におけるMT1-MMPの役割を解析した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPはFNへの接着後、迅速に細胞接着斑でFNを分解した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPの阻害変異体はMT1-MMP発現細胞におけるFN分解と細胞運動、3次元ECMへの細胞浸潤を顕著に抑制した。以上の結果から、細胞接着斑におけるMT1-MMP機能の重要性と、その活性阻害ががん浸潤・転移抑制に効果的であることが示された(T. Takino et al., Cancer Research, 2007)。細胞外マトリックスによる細胞刺激は、MAPK(ERKやJNK)、PI-3K/Akt、Rhoファミリーを活性化することで細部運動・浸潤を誘導する。インテグリン/FAK/p130Cas/Crk/DOCK1l80/Rac経路を介してJNKを活性化する。この活性化反応は細胞接着斑において行われることが知られているが、詳細な機構については不明な点が多い。そこでMT1-MMPによる細胞外マトリックス分解が細胞接着斑の代謝回転、インテグリンを介した情報伝達に及ぼす影響を調べた。MT1-MMPを発現していない細胞にMT1-MMPを発現させると、ファイブロネクチン上での細胞運動の亢進とともに、ファイブロネクチンの分解と細胞接着斑の代謝回転を誘導した。MT1-MMPを高発現しているHT1080細胞のファイブロネクチン上での細胞運動は、MMP阻害剤BB94により抑制さ、ファイブロネクチン分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認めちれた。一方MT1-MMPの過剰発現はブァイブロネクチン分解、細胞運動と細胞接着斑の代謝回転の亢進を誘導し、優性阻害体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は、ファイブロネクチンへの接着により誘導されるERK活性化を抑制する一方で、FAKの自己リン酸化(チロシン397番)を亢進していた。以上の結果からMT1-MMPによるファイブロネクチン分解は、細胞接着により誘導されるERK活性化、FAKの自己リン酸化を調節することにより細胞接着斑、細胞運動を制御していることが示唆された。また、細胞接着斑に局在するMT1-MMPの優性阻害体を作製し、この阻害体発現がインテグリンーFAKを介したシグナル伝達を抑制すること、腫瘍細胞浸潤を顕著に抑制することを既に明らかにしている。現在はMAPKに対する影響を検討中である。JNK結合分子は細胞接着斑におけるJNKの局在と活性化部位を誘導することで細胞運動時の極性形成・維持を制御していると予想される。

本研究によりMT1-MMPによる細胞外マトリックスの分解・再編は細胞接着斑の代謝回転を促進することにより、インテグリンーFAK情報伝達経路を制御し、細胞極性形成・維持に密接に関与していることが示唆された。HT1080細胞のI型コラーゲンおよびファイブロネクチン上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され,ECM分解の減少,細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方,MT1-MMPの過剰発現はECM分解,細胞運動と細胞接着斑の代謝回転を誘導し,阻害変異体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制した。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化を調節することにより細胞接着斑の代謝回転と細胞運動を制御していることが示唆された(T.Takino, et. al.,Experimental Cell Research,2006)。細胞運動時,MT1-MMPは細胞接着斑の集積と代謝回転が頻繁に起こる運動先端部の内側でECMを分解していた。細胞接着斑におけるMT1-MMPの機能に着目し,FAKの細胞接着斑標的ドメインをMT1-MMPとMT1-MMPの阻害変異体に付与し,細胞接着斑におけるMT1-MMPの役割を解析した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPはFNへの接着後,迅速に細胞接着斑でFNを分解した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPの阻害変異体はMT1-MMP発現細胞におけるFN分解と細胞運動,3次元ECMへの細胞浸潤を顕著に抑制した。以上の結果から,細胞接着斑におけるMT1-MMP機能の重要性と,その活性阻害ががん浸潤、転移抑制に効果的であることが示された(T.Takino, et. al.,Cancer Research,2007)。
罹患同胞対を利用した2型糖尿病感受性遺伝子の解明に関する研究

九州沖縄地域で本邦における最大の2型糖尿病罹患同胞対解析研究を行うための研究組織を構築することを目標として、下記を行った。1.本研究組織の全体会議を開催し(平成16年10月22日)、九州地域における2型糖尿病罹患同胞対研究の方針を検討し、今後の協力体制やスケジュールについて確認した。2.既に検体採取済の2型糖尿病罹患同胞対102ペア・204例について解析を終了し、協力全機関を掲載した英原著論文を発表した。3.同上症例群102ペアのプロファイルの再整備(BMI、合併症情報など)を行い、平成16年3月末までに全例で達成できた。4.2型糖尿病罹患同胞対の増加を目的として、各分担研究者の所属する医療機関およびその関連病院群において2型糖尿病症例の同意の下に症例アンケート調査を行った。1)兄弟姉妹の2型糖尿病症例の存在の有無2)1)が「有り」の場合、本研究内容を聞く意思の有無3)1、2)が「有り」の場合、兄弟姉妹症例が本研究内容を聞く意思の有無4)3)が「有り」の場合の罹患同胞対症例の通院医療機関名など5.4を集計した結果、兄弟姉妹症例両方の通院医療機関が把握され、かつ両方に研究内容を聞く意思がある2型糖尿病罹患同胞対を新規に100ペア以上把握した。これにより、九州沖縄全域の罹患同胞対症例計200ペア以上の所在データベースが構築された。以上の結果により、平成17年度以降に、本研究組織の主導の下で新規2型糖尿病罹患同胞対からの検体の採取および症例プロファイル整備を行う準備体制を確立し得た。
縁辺海観測研究計画(NEAR-GOOS)の展開のための基礎研究

海洋は地球環境変動に大きな役割を果たし、海洋生物資源、海洋空間の活用は人類の将来を左右するが、海洋諸過程の解明は遅れている、半閉鎖的な縁辺海である、日本海、東シナ海で新手法を含む観測を強化し、国際共同(UNESCO/IOC/WESTPAC事業NEAR-GOOS:日本、中国、韓国、ロシアが参加)でリアルタイムで収集する温度、塩分、海流、化学物質、生物量などの海洋の現況データをもとに数値モデルによる海況予報を確立し、海洋過程の理解を深める。化学物質、生物量などは海洋予報モデルで拡散と輸送の評価で縁辺海の海洋環境を予測し、世界海洋観測システム(GOOS)の構築に貢献する。本研究では国内研究の連携がはかられ、観測の中心となる機関に職員を派遣し、11月6日に東京大学海洋研究所でシンポジウムを開催した。NEAR-GOOSニュースレターとして発行されるが、今年度の主な成果は1)海底ケーブルを利用する縁辺海への黒潮流入量の測定では、津軽海峡、浜田釜山、福岡隠岐、鹿児島奄美、大島三宅島八丈、沖縄台湾での観測体勢が整備されデータを収集した。2)水位変動を用いた黒潮変動のモニタリングは気象庁、水路部のデータ提供による解析が進められた。3)定期フェリーや人工衛星観測による縁辺海の海洋変動モニタリングが整備された。4)縁辺海の海洋予報モデルの開発が進められた。5)縁辺海の環境変化に関わる化学物質のモニタリング法を研究した。6)ブイシステムと衛星観測による海洋基礎生産のモニタリングを開発した。7)東シナ海の海況モニタリングを実施した。これらは縁辺海観測国際協同研究計画(NEAR-GOOS)で実施したが、平成11年度から特定領域研究(B)の発足を申請した。
有機ハイドライド中の水素貯蔵量の迅速可視化を目指したπ共役らせん高分子の開発

メチルシクロヘキサン(MCH)とトルエン(TOL)は、水素貯蔵媒体の1つである有機ハイドライドの構成物質である。両者(MT)の混合比は水素吸蔵量と等価にみなすことができるが、それを知るには大型分析装置が必須である。本研究では、このMT混合比を簡便かつ迅速に視認できる指示薬の開発を最終目標とし、その主材候補の色彩可変ならせん状置換ポリアセチレンとMT分子間との分子間相互作用に関する新たな知見を得る。近年注目されているらせん高分子の精密構造制御と分子間相互作用、および精密センシングの分野を発展させるとともに、水素エネルギー社会の実現に資するインフラの構築にも寄与する。
グルコース応答性 MafA キナーゼの制御系からβ細胞の血糖感知システムの理解へ

血糖値維持に必須な膵β細胞の機能を支える転写因子MafAを、GSK3に加えてMaCKがリン酸化することがMafAの機能発揮(DNA結合とBeta2との会合)に必須であることを明らかにした。また、糖尿病によるβ細胞の機能破綻には、原因不明のMafAリン酸化低下が主たる原因である可能性を突き止め、リン酸化を模倣する小分子化合物も1種同定した。リン酸化低下の原因解明により、β細胞の血糖感知系を含めた機能維持と、糖尿病時の機能破綻の分子機構の解明に近づくことができるだろう。本研究では、インスリンの発現に必須な転写制御因子MafAの制御系を解明することを通じて、膵島β細胞の血中グルコース濃度(血糖値)の感知システムを理解することを目的としている。本年度はまず、MafAをリン酸化するキナーゼとして同定したMaCK(仮称)の各種変異体を作成して解析を行い、以下の知見を得た。MaCKはそのC末端領域を介して、MafAと比較的安定な複合体を形成する。この複合体形成には、MafAのリン酸化状態や、MaCKのキナーゼ活性には依存しないことも明らかにした。また、MaCKは、インスリンの発現制御においてMafAと共同して働く転写因子Pdx1およびBeta2もリン酸化することを発見した。これらの事実は、MaCKがインスリン遺伝子発現を調節する鍵シグナル分子であることを示唆しており、その意義と制御機構の解明に継続して取り組んでいるところである。また、インスリン遺伝子のプロモーター上で、MafAは、同族の転写因子グループに属するATF2との複合体として存在していることを発見した。いくつかの機能阻害実験を行い、この複合体形成はインスリン遺伝子の転写に必須であることを証明した。さらに、ATF2はPdx1およびBeta2とも相互作用することを免疫共沈降実験により明らかにし、MafA-ATF2-Pdx1-Beta2からなるβ細胞特異的な転写複合体がインスリン遺伝子の効率的な発現を司っていることを解明した。以上のように、インスリン遺伝子の発現調節機構に注目することによって、β細胞機能の維持に必須な転写制御因子の構成要素とその制御に関わる分子の同定に成功した。これらの成果により、グルコース濃度の変化、β細胞の発生・分化過程、糖尿病の進行などに伴ったβ細胞機能不全などの状況において、この転写複合体の機能や組成がどのように変換されるかを調べることが可能となった。膵島β細胞は、血糖値維持のために他の細胞とは異なる独特のグルコース感知とシグナル伝達系を備えている。この系の破綻はβ細胞のグルコース感受性の低下(インスリン分泌低下)ひいては糖尿病発症につながるが、どのような生体分子がこの系を構成しているのかは未だによくわかっていない。キナーゼMaCK(仮称)は、既知キナーゼGSK3とともにβ細胞特異的な転写因子MafAをリン酸化する分子として申請者が発見した。MaCKは、β細胞の培養条件を高グルコースから低グルコースへと変化させると細胞内の局在が細胞質から核へと変化させる。本研究は、この現象を巡る分子機構を解明することを通じて、β細胞のグルコース感知と応答システムを理解することを目標としている。長期的にβ細胞を高グルコース条件下で培養すると、2型糖尿病における糖毒性と同様のβ細胞機能低下を引き起こすことが知られているが、昨年までに、このときにMafAのリン酸化状態が著しく低下することを見いだした。また、リン酸化の低下したMafAタンパク質は、その標的遺伝子であるインスリンのプロモーターへの結合が低下し、インスリンmRNAの発現を低下させる原因となっていることをあきらかにした。また、リン酸化の低下によってMafAの構造変換が生じ、分子内相互作用を引き起こしてDNA結合が阻害されるという新規分子機構をあきらかにし、MaCK下流の分子機構を解明することができた(論文投稿中)。また昨年度までに、β細胞においてMafAのリン酸化を低下させる小分子化合物を1種類発見した。血糖値維持のために、膵島のβ細胞は独特のグルコース感知系とシグナル伝達系を備えている。この系の破綻はβ細胞のグルコース感受性(例えばインスリン分泌)を低下させ、糖尿病の発症につながるが、この系を構成する分子はよくわかっていない。本研究は、インスリン遺伝子の発現に必須な転写因子MafAを同定したことに端を発し、MafAをリン酸化するキナーゼ(既知であったGSK3と本研究代表者が同定したMaCK:仮称)の振る舞いを調べることによって、この系の分子実体と作動機序の解明を目的とする。前年度までに、MaCKの細胞内分布の解析に加えて、β細胞の高グルコース暴露によって(糖尿病発症時の持続的高血糖状態に類似)MafAのリン酸化が低下することを見出だした。リン酸化が低下したMafAはDNA結合能を失うためにインスリンの発現が減少することも明らかにし、MafAを介した系の分子機構の一部を解明することを達成した(論文投稿準備中)。

前年度末の時点で、MafAのリン酸化を低下させる小分子化合物を1種類同定していたので、本年度はこの薬剤の作用機序の解明を目指した。培養β細胞株を用いた検討により、この阻害剤によってβ細胞機能(インスリンなどのβ細胞特異的遺伝子の発現)が低下することを明らかにした。一方、MafAのリン酸化部位の変異体を用いた一連の解析から、この阻害剤はGSK3やMaCKではなく、別の部位のリン酸化を阻害することがわかった。この責任キナーゼの同定を各種のsiRNAを用いてを試みたが、現在までのところ成功していない。これらの一連の解析により、MafAは複数のキナーゼによる多重なリン酸化によって厳密にその機能を制御されていることが判明し、その仕組みを解き明かすことがβ細胞機能の維持と糖尿病治療・予防に重要な知見を与えることがより一層明白になったと言える。申請当初の達成目的は、MaCKの制御という「シグナルの上流」の解明であったが、今年度までにはMafAのリン酸化による活性制御という「シグナルの下流」の重要性が研究途上で大きく浮上し、学術上および研究戦略上、そちらを優先せざるを得なかったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までに、MaCKの細胞内局在制御の解明に加えて、β細胞においてMafAのリン酸化を低下させる小分子化合物を1種類発見した。2型糖尿病における糖毒性・β細胞機能障害の際には、MafAのリン酸化低下が起こることはすでに別途発見している。したがって、本年度はこの阻害剤がMaCKを阻害することによってMafAのリン酸化を低下させるのかどうか、この阻害剤の暴露によってβ細胞の機能低下が生じるかなど、2型糖尿病における糖毒性との関連性を、MaCK活性と関連させつつ解明するという新しい方向性を模索することがより重要である。以上の解析と、MaCKの活性制御機構を多面的に検討し、β細胞内のグルコース感知・シグナル伝達系の理解と、その破綻の分子機構のより一層の解明を目指す。