hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオフィルム感染症におけるＡＢＣトランスポーターの役割の探索と齲蝕予防への応用

その結果、comC欠失変異株ではglnPおよびglnPとオペロンを形成しているSMu0731の発現は顕著に低下していた。以上の結果は、comCがglnPの発現に何らかの関与をしている可能性が示唆された。すでにStreptococus mutansにおけるABCトランスポーターの遺伝子スクリーニングは完了し、抽出された変異株の作製および分析についても概ね順調である。今後は歯周病菌における解析を進めて行きたいと考えている。バイオフィルムを形成する菌は薬剤耐性能が高く、これは薬剤耐性に必要な栄養素を取り込み不要な物質を排出する役割を持つ膜トランスポーターが関与していると考えられているが、その詳細は不明である。本研究の目的は、口腔内細菌の膜トランスポーターの機能解析を行うことで、バイオフィルム形成への関与を明らかにすることである。はじめに、グルタミンABCトランスポーター(GlnP)をコードしていると推定される遺伝子SMu0732を抽出し,変異株を作製し機能解析を行った。GlnP欠失変異株(ΔGlnP)を作製した後、バイオフィルムの構造を検討した。供試菌をヘキシジウムアイオダイドで染色し,0.5%スクロース含有化学合成培地にてバイオフィルムを形成させ共焦点走査型レーザー顕微鏡にて観察した。ΔGlnPによって作製されたバイオフィルムの構造は親株と比較して密度が粗となり厚みも減少しており、明らかに構造が変化していた。また、膜流動性を調べた結果、ΔGlnPでは流動性が変化していることが明らかとなった。これは、GlnPが膜トランスポーターであることを示唆している。そこで、耐酸性について検討したところ、親株と比較してΔGlnPでは耐酸性が著しく低下しており、これはGlnPが耐酸性に関連するイオンの輸送に関連している可能性が示された。さらに、S. mutansのバイフォイルム形成に関連するシグナル伝達システムのうち、Competence Stimulite Peptideを産生するComCについて、それをコードするcomCとglnPの関連を検討することとした。以上のことより、GlnPはバイオフィルム形成におけるシグナル伝達システムに強く関与している可能性が示された。すでに変異株の作製および分析については、順調に進んであり、今後はさらにS. mutansについては、他のABCトランスポーターの変異株の作製を行い分析を行う予定である。また、バイオフィルム形成における他のグラム陽性細菌との関連についても検討を行う予定である。P. gingivalisについては、さらにABCトランスポーターのスクリーニングを行う、抽出された変異株の作製を行う予定である。シグナル伝達システムとの関連も明らかになってきたため、それらの解析を進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
スフィンゴリピドーシスモデルマウスを用いた脳機能におけるスフィンゴ脂質の機能解析

クラッベ病は、リソゾーム酵素の一つであるガラクトシルセラミド分解酵素(GALC)の遺伝的欠損が原因である。自然発生のモデルマウスとしてtwitcherマウス(Twi)が知られている。この遺伝的系統をC57BL/6JからC57BL/6J-129SV混合系へ変えることにより、臨床的、生化学的、神経病理学的に、劇症型のクラッベ病モデル動物となることを明らかにした。129SV混合系統Twiの神経病理所見は特徴的で、脳海馬体CA3領域における神経細胞死が著明であった。本年度は、先入観を排除し、全脳の標本を詳細に検鏡し評価した結果、嗅球の僧帽細胞、淡蒼球およびマイネルト基底核、視床網様核、手綱核、乳頭体、動眼神経核、三叉神経運動核の発達障害が認められた。さらに大脳皮質の特定の領域での細胞構築の定型性が認められ、皮質の厚さも薄いことや、軽度の脳室拡大などの所見から、おそらく大脳皮質に入出力する線維が減少していることが考えられる。以上の解剖学的な所見から規則性を見出し、機能的な神経回路、神経伝導路、神経線維連絡との関連性を明らかにした(論文執筆中)。病状の発症と経過に関連する遺伝子群をDNAチップ(マイクロアレイ)を用いて網羅的に解析した。マイクロアレイで得られた実験データと、解析データベース(Ingenuity Pathways Analysis:IPA)を用いて遺伝子ネットワーク、パスウェイや生物学的機能情報を得た。特に神経疾患に関わる遺伝子群について解析した結果、近年、海馬体の神経細胞の保護に関わる可能性が報告されたCXCL3遺伝子の発現が低下していることが明らかとなった。その発現の低下は、生後14日頃より認められ、このことが脳海馬体の神経細胞死に関わっている可能性が示唆された。以上の結果をもとに、分子生物学的、免疫組織学的に検討を重ね、さらに興味深い知見を得ることができた。近年、スフィンゴ脂質は、細胞の増殖・再生・分化を含む様々な生物機能において、その役割が注目されている。なかでも神経機能の発現においては、特に重要な役割を担っている。クラッベ病(別名Globoid cell leuko-dystrophy(GLD))は、リソゾーム酵素の一つであるガラクトシルセラミド分解酵素(GALC)の遺伝的欠損が原因であり、乳児期に発症する致死性の脱髄疾患である。自然発生モデル動物として、twitcherマウス(Twi)が用いられている。最近、申請者らは、Twiの遺伝的系統を変えることにより、脳海馬体において、特徴的な神経細胞死が起こることを見出した。129Sv系統のTwiは、C57BL/6系統のTwiより寿命が短く、易刺激性、痙攣発作が認められ、脳においてラクトシルセラミドの明らかな蓄積が認められた。これら129Sv系統Twiの神経病理は、脳海馬体神経回路におけるスフィンゴ脂質の重要な役割を示唆している。本研究では、我々が独自に開発したTwiを用いて中枢神経病理所見を多角的に解析し、スフィンゴ脂質の脳海馬体神経細胞回路における役割ならびに神経細胞死のメカニズムを明らかにしてきた。129Sv系統Twiマウスの神経病理所見は特徴的で、特に、脳海馬体CA3領域における神経細胞死が著明であった。さらに、その他の脳領域にも領域特異的に神経細胞死が認められることから、本年度は、この神経細胞死と、神経ネットワークとの関連性を明らかにするために、これまで行ってきた神経病理学的検索をさらに進め、各種染色法を用いて詳細に検討を行った。詳細な神経細胞死の分布を調べ、その解剖学的な分布の規則性を見出し、機能的な神経回路、神経伝導路、神経線維連絡との関連性を明らかにした。(論文執筆中)本年度は、これまでの成果をもとに、極めて重要な知見を得ることができた。申請者らは、Twiの遺伝的系統を変えること(C57BL/6J-129SvEv混合系Twi)により、寿命が短くなり、易刺激性、痙攣発作が認められ、脳においてラクトシルセラミドの蓄積がおこることを明らかにした。さらに脳海馬体においては、特徴的な神経細胞死が起こることを見出した。本研究では、我々が独自に開発した129Sv系統Twiを用いて中枢神経病理所見を多角的に解析し、スフィンゴ脂質の脳海馬体神経細胞回路における役割ならびに神経細胞死のメカニズムを明らかにしてきた。129Sv系統Twiの神経病理所見は特徴的で、特に、脳海馬体CA3領域における神経細胞死が著明である。これまでに、この神経細胞死と、神経ネットワークとの関連性を明らかにしてきた。神経細胞死の分布より、その解剖学的な分布の規則性を見出し、機能的な神経回路、神経伝導路、神経線維連絡との関連性を明らかにした。病状の発症と経過に関連する遺伝子群をDNAチップ(マイクロアレイ)を用いて網羅的解析を行った。C57BL/6J系統Twiと129Sv系統Twiの脳における遺伝子の発現パターンを経時的に解析し、特異的神経細胞死に関連する遺伝子を選別した。

Real time-PCRとWestern blottingによりターゲット遺伝子のmRNAとタンパク質の発現を確認した。免疫組織学的にも、その局在も明らかにしている。本年度は、これまでの成果をもとに、さらに興味深い知見を得ることができた。クラッベ病は、リソゾーム酵素の一つであるガラクトシルセラミド分解酵素(GALC)の遺伝的欠損が原因である。自然発生のモデルマウスとしてtwitcherマウス(Twi)が知られている。この遺伝的系統をC57BL/6JからC57BL/6J-129SV混合系へ変えることにより、臨床的、生化学的、神経病理学的に、劇症型のクラッベ病モデル動物となることを明らかにした。129SV混合系統Twiの神経病理所見は特徴的で、脳海馬体CA3領域における神経細胞死が著明であった。本年度は、先入観を排除し、全脳の標本を詳細に検鏡し評価した結果、嗅球の僧帽細胞、淡蒼球およびマイネルト基底核、視床網様核、手綱核、乳頭体、動眼神経核、三叉神経運動核の発達障害が認められた。さらに大脳皮質の特定の領域での細胞構築の定型性が認められ、皮質の厚さも薄いことや、軽度の脳室拡大などの所見から、おそらく大脳皮質に入出力する線維が減少していることが考えられる。以上の解剖学的な所見から規則性を見出し、機能的な神経回路、神経伝導路、神経線維連絡との関連性を明らかにした(論文執筆中)。病状の発症と経過に関連する遺伝子群をDNAチップ(マイクロアレイ)を用いて網羅的に解析した。マイクロアレイで得られた実験データと、解析データベース(Ingenuity Pathways Analysis:IPA)を用いて遺伝子ネットワーク、パスウェイや生物学的機能情報を得た。特に神経疾患に関わる遺伝子群について解析した結果、近年、海馬体の神経細胞の保護に関わる可能性が報告されたCXCL3遺伝子の発現が低下していることが明らかとなった。その発現の低下は、生後14日頃より認められ、このことが脳海馬体の神経細胞死に関わっている可能性が示唆された。以上の結果をもとに、分子生物学的、免疫組織学的に検討を重ね、さらに興味深い知見を得ることができた。
大気浮遊微粒子と付着有害化学物質のIn-Situレーザ計測

大気中を浮遊する微粒子のIn-Situレーザ計測を目的として,時間分解型レーザ誘起ブレイクダウン分光(LIBS)システムを構築した.これにより,大気中浮遊微粒子ならびにそれに付着する重金属系有害化学物質について,微粒子に関しては組成,濃度,粒径を,また化学物質については元素,組成比,濃度を定量的に測定することを可能とした.また,ブレイクダウン発光特性を評価し,元素のイオン化ポテンシャルとレーザのフォトンエネルギーの関係を明らかにすることで,多光子吸収プロセスがブレイクダウン現象の第一過程であり,それに引き続いて発生するカスケード電離の2つの生成メカニズムが存在することを明らかにした.また,エアロゾルをガスに導入しブレイクダウンを発生させるとき,粒子からガスへのカスケード電離によるエネルギーの伝播が行われることや、粒子表面で多光子電離によって生成した電子が微粒子中心部でカスケード電離を生じさせている可能性も示すことができた.さらに,微粒子の分散性を良くするために,微粒子を水溶液中に分散させて,LIBSシステムの実用性を検証した.その結果,単成分微粒子系でも多成分多分散系であっても,ICP-AESと同等の検出精度で微粒子を計測することができることを示した.実際の交差点でのサンプリングや,鉱山湧水,湖沼水などの実環境試料を用いたIn-Situレーザ計測を行い,同時にSEMやICP-MSなどのEx-Situ計測の結果と比較することで,本In-Situレーザ計測システムが,Ex-situ計測の結果と整合することも示した.大気中を浮遊する微粒子のIn-Situレーザ計測を目的として,時間分解型レーザ誘起ブレイクダウン分光(LIBS)システムを構築した.これにより,大気中浮遊微粒子ならびにそれに付着する重金属系有害化学物質について,微粒子に関しては組成,濃度,粒径を,また化学物質については元素,組成比,濃度を定量的に測定することを可能とした.また,ブレイクダウン発光特性を評価し,元素のイオン化ポテンシャルとレーザのフォトンエネルギーの関係を明らかにすることで,多光子吸収プロセスがブレイクダウン現象の第一過程であり,それに引き続いて発生するカスケード電離の2つの生成メカニズムが存在することを明らかにした.また,エアロゾルをガスに導入しブレイクダウンを発生させるとき,粒子からガスへのカスケード電離によるエネルギーの伝播が行われることや、粒子表面で多光子電離によって生成した電子が微粒子中心部でカスケード電離を生じさせている可能性も示すことができた.さらに,微粒子の分散性を良くするために,微粒子を水溶液中に分散させて,LIBSシステムの実用性を検証した.その結果,単成分微粒子系でも多成分多分散系であっても,ICP-AESと同等の検出精度で微粒子を計測することができることを示した.実際の交差点でのサンプリングや,鉱山湧水,湖沼水などの実環境試料を用いたIn-Situレーザ計測を行い,同時にSEMやICP-MSなどのEx-Situ計測の結果と比較することで,本In-Situレーザ計測システムが,Ex-situ計測の結果と整合することも示した.時間分解型のレーザーブレイクダウン分光法(YAGレーザー:波長532nm、繰返し数20Hz、最大出力200mJ)を用いて環境中エアロゾルの代表的な物質である炭酸カルシウム粒子(JIS規格)の定量検出、及びブレイクダウンプラズマの知見を分光学的手法によって得ることを目的とした。本実験では、炭酸カルシウム微粒子をTSI製アトマイザによって噴霧することによりエアロゾル試料を製作した。エアロゾル濃度の制御は分散水の濃度を変化させることによって行った。また、一定時間捕集させたフィルターから粒子を希硝酸で溶出させてICP測定することによって得られた値からカルシウム濃度を算出した。噴霧させたエアロゾル試料にレーザーを集光させることによって炭酸カルシウム粒子をブレイクダウンさせ、ブレイクダウン領域からの発光をファイバで収集し、スペクトルを観測した。また、エアロゾル粒子は空間的に不均質に存在するため、気体試料や液体試料と比べてパルスごとの発光強度のばらつきが大きい。既往の研究からブレイクダウンの発光領域は1mm^3程度であるといわれている。噴霧試料中の一つ一つの粒子がその微小領域に存在する確率は小さい。そのため、発光のヒストグラムは稀現象を記述するポアソン分布に従う。この発光の性質に基づきカルシウム粒子の定量検出を行った。パルスレーザーが照射された直後に水に由来する初期発光が観測された。その後キャリアガスであるN_2から生じるN原子・イオンスペクトル発光が起こった(0300ns)。それに続いてN_2バンドスペクトルとCa原子・イオンがほぼ同時に発光し始めた。この性質を元に時間遅れ、ゲート幅共に10□sに設定してCaの定量検出を行った。炭酸カルシウム粒子のブレイクダウン発光は、100500μg/m^3の濃度範囲において直線性を示し、TRE-LIBSにより定量測定が可能であることを確認できた。また、分散水の噴霧によるエアロゾル試料の生成は検量線作成に有効であることがわかった。微粒子計測にあたって、微粒子を均質濃度状態で測定するために、水溶液中に分散させた。水中でのブレイクダウン現象は、周囲の水分子によって緩和・抑制されるために水環境で測定できることは、大気中でも確実に計測できることを意味する。水中に粒径のそろったTiO_2微粒子を分散させ、重金属としてEuを結合させた。結合量に関しては、別途バッチ法による吸着実験から評価した。

レーザの出力を、EuイオンがブレイクダンしないがTiO_2微粒子はブレイクダウンする強度に調整し、Euイオン溶存溶液、EuをTiO_2微粒子に付着・結合させて分散させた溶液、TiO_2微粒子の分散溶液を対象として、レーザ誘起ブレイクダウン分光測定を行った。その結果、TiO_2微粒子に結合するEuを結合していないEuと分離して、定量的にIn-Situで計測できることを確認した。また、ブレイクダウン発光の寿命を評価した結果、Euがイオン種として結合する場合と、Euが沈殿などの固相を形成してTiO_2微粒子表面に存在する場合とで寿命が異なることも明らかにした。このことは、ブレイクダウン発光寿命より、微粒子表面における付着有害化学物質のスペシエーションに関する情報を取得できることを示唆している。実際の大気雰囲気では、微粒子は1種類ではない。そこで、Eu_2O_3微粒子りほかに、Al系微粒子やCa系微粒子を混合分散させて溶液系を対象として、計測を行った結果、各元素ごとにIn-Situ定量計測が可能であることを明らかにした。多分散系における微粒子の計測の可能性を検証するために,代表的な環境微粒子である酸化アルミニウム系微粒子と炭酸カルシウム系微粒子を用い,酸化ユウロピウム微粒子がそれらと共存している系を対象として,計測を行った.その結果,アルミニウム,カルシウム,ユウロピウムともに,それらが単独で存在する船の検出精度と同等の検出が可能であることが確認されるとともに,定量化のための検量線もほぼ等しいことを明らかにした.ただし,アルミニウム,カルシウム,ユウロピウムについて,検量線の勾配が互いに異なっていた.このことは,本研究において使用した微粒子の粒径分布が互いに異なることに原因があると考えられ,ブレイクダウン領域における発光確率の評価から,それを裏付けることができた.また,実際の大気中の微粒子をサンプリングして,実験室での予測と同等の精度で大気浮遊微粒子が計測できる見通しを得ることができた.同時に,分散性が良いことから,兵庫県明延鉱山から採取した地下水中の分散微粒子も用いて,実用性について検討した.その結果,電子顕微鏡やICP分光など,Ex-Situ計測で得られた結果と同じ結果をIn-Situレーザ計測でも得られることを確認した.
電子線誘起反応を利用した複合酸化物の微細加工法に関する研究

我々が提案している電子線誘起反応を利用した複合酸化物の微細加工プロセスに関し、電子線誘起反応のメカニズムの解析ならびに強誘電特性を発現し得るパターンを作製するためのプロセスの検討を行った。電子線誘起反応のメカニズムの解析に関しては、まず電子線照射による前駆体薄膜中の化学結合の変化をFT-IRにより分析した。また、電子線照射により前駆体薄膜から発生するガスの分析を質量分析器を用いて行った。以上の結果より、以上より、電子線照射により前駆体R-COO-MのR-COOM及びCO-OMの結合が切断され、有機基の一部はガス(CO及び炭化水素)となって脱離し、金属原子はプロトンを結合してM-OHの形で残留し、親油基を失うので有機溶剤に対して不溶となると結論づけた。電子線に対する露光感度は、前駆体の有機基の部分によって変化し、ナフテン酸金属塩では2.5×10^<-3>C/cm^2、オクチル酸金属塩では1.5×10^<-4>cm^2であった。このオクチル酸金属塩の露光感度は、電子線に対するレジスト材として一般的なPMMAとほぼ同等の値であった。有機基の部分の構造を検討することで、より高感度の前駆体材料を開発することができるものと思われる。電気的特性に関しては、これまではリーク電流が大きく評価できなかったが、本焼前に上部白金電極を堆積し、パターンとし一括して焼成することで大幅にリーク電流を低減することに成功し、SrBi_2Ta_2O_9、Pb(Zr,Ti)O_3ともに良好なD-Eヒステリシス特性を観測することができた。また、電子線照射によりパターン化した方が、特性が改善されるという興味深い結果を得た。微細加工性に関しては、SEMを改造した描画装置においても線幅300nmのパターンを作製することが可能であった。描画に電子線を用いるので、100nm以下のパターンも容易に作製可能と思われる。以上より、本プロセスが強誘電体を始めとする機能性酸化物の微細加工に有効であることが実証された。不揮発性メモリー材料として注目を集めている強誘電体材料を始め、各種の機能性酸化物材料を半導体集積回路と組み合わせることで新しいデバイス創成の可能性が広がるが、そのためには酸化物材料の微細加工技術を確立する必要がある。一般的なプロセスでは、一様な薄膜を形成した後、フォトリソグラフィとエッチングにより加工を行っている。しかし、酸化物は結晶粒/粒界構造となることが多く、パターンサイズが粒径と同程度となってきた場合には加工性に問題が生ずる。また、反応性ガス等によるダメージの問題も深刻である。我々は、ある種の有機金属塩材料が電子線に反応し溶剤に不溶となることを発見し、その性質を利用して前駆体段階でパターンを形成し、その後の熱処理で目的の物質に結晶化させる微細加工プロセスー電子線誘起反応微細加工プロセスーを提案し、その研究を進めている。本年度は、一般的な走査型電子顕微鏡(SEM)にブランキング電極を付加し、電子線描画装置として使えるように改造した。また、有機金属塩材料が電子線照射により不溶となるメカニズムを調べるため、フーリエ変換赤外分光(FT-IR)分析により前駆体薄膜の結合の変化を調べた。

その結果、電子線照射により前駆体中のカルボキシレートが分解し、金属元素は親油基を失って水酸化物の形で膜中に残存するため有機溶剤に不溶になるとの結論を得た。また、前駆体の親油基の炭素数により露光感度が異なることも分かり、より高感度の前駆体材料探索の足掛かりとすることができた。また、本プロセスを実際に強誘電体Pb(Zr.Ti)O_3等の微細加工に応用した。得られたパターンはそのままでは大きなリーク電流を示し強誘電性を確認するには至らなかったが、表面のマイクロクラックを埋める処理を施すことでリーク電流を大幅に低減することに成功した。我々が提案している電子線誘起反応を利用した複合酸化物の微細加工プロセスに関し、電子線誘起反応のメカニズムの解析ならびに強誘電特性を発現しうるパターンを作製するためプロセスの検討を行った。電子線誘起反応のメカニズムの解析に関しては、まず電子線照射による前駆体薄膜中の化学結合の変化をFT-IRにより分析した。また、電子線照射により前駆体薄膜から発生するガスの分析を質量分析器を用いて行った。以上の結果より、電子線照射により前駆体R-COO-MのR-COOM及びCO-OMの結合が切断され、有機基の一部はガス(CO及び炭化水素)となって脱離し、金属原子はプロトンを結合してM-OHの形で残留し、親油基を失うので有機溶剤に対して不溶となると結論づけた。電子線に対する露光感度は、前駆体の有機基の部分によって変化し、ナフテン酸金属塩では5×10^<-3>C/cm^2、オクチル酸金属塩では1.5×10^<-4>C/cm^2であった。このオクチル酸金属塩の露光感度は、電子線に対するレジスト材として一般的なPMMAとほぼ同様の値であった。有機基の部分の構造を検討することで、より高感度の前駆体材料を開発することができるものと思われる。電気的特性に関しては、これまでリーク電流が大きく評価できなかったが、本焼成前に上部白金電極を堆積し、パターンと一括して焼成することで大幅にリーク電流を低減することに成功し、SrBi_2Ta_2O_9、Pb(Zr,Ti)O_3とも良好なD-Eヒステリシス特性を観測することができた。また、電子線照射によりパターン化した方が、特性が改善されるという興味深い結果を得た。微細加工性に関しては、SEMを改造した描画装置においても、線幅300nmのパターンを作製することが可能であった。描画に電子線を用いるので、100nm以下のパターンも容易に作製可能と思われる。以上より、本プロセスが強誘電体を始めとする機能性酸化物の微細加工に有効であることが実証された。
蛋白相互作用モジュールの組み換えによる分子進化の再構成の試み

生命の基本単位である細胞は、蛋白、脂質、糖質、核酸から構成されるが、中でも蛋白同士の相互作用は細胞の構造の大枠を決定する点で重要である。ほとんどの蛋白分子は、蛋白相互作用に関わるモジュールをもち、その組み合わせを利用して、多彩な蛋白相互作用を実現している。本研究では1)人為的な蛋白相互作用モジュールを組み合わせて、実際に自然界に存在するよりも、より強固な蛋白相互作用を実現できるかどうか、2)より強固な蛋白相互作用をもつ蛋白分子を、細胞レベルで淘汰選択することが可能かを、明らかにしようとしている。平成18年度は既知の蛋白相互作用であるWW領域とproline-rich配列をもとに蛋白相互作用の強弱をレポーターによって検出する仕組みの構築を行い、平成19年度には、低分子量GTP結合蛋白質RhoAを用いてRhoAの活性化に応じて蛋白質相互作用に変化を起こすことを試みた。平成20年度には、種々の細胞と種々の刺激を用いて実験を継続した。同時に第三の方法として、細胞内の蛋白相互作用を、分子局在によってモニターする系の構築に着手し、自家発光蛍光タグを融合した複数の蛋白の遺伝子と、発現ライブラリーを同時に細胞に組み込むためのレンチウイルスベクターの作製を行った。生命の基本単位である細胞は、蛋白、脂質、糖質、核酸から構成されるが、中でも、蛋白同士の相互作用は細胞の構造の大枠を決定する点で、重要である。また、蛋白は、脂質、糖質、核酸の合成・分解をつかさどる酵素活性を担うが、蛋白相互作用は、酵素活性の調節にもかかわり、細胞外情報を細胞内に伝える仕組みとしても重要である。細胞を構成する蛋白分子の配列情報が集積した結果、ほとんどの蛋白分子が、蛋白相互作用に関わるモジュールをもち、その組み合わせを利用して、多彩な蛋白相互作用を実現していることが知られている。本研究では、1)人為的な蛋白相互作用モジュールを組み合わせることにより、実際に自然界に存在するよりも、より強固な蛋白相互作用を実現できるかどうか、2)より強固な蛋白相互作用をもつ蛋白分子を、細胞レベルで淘汰選択することが可能かを、明らかにすることを目的としている。平成18年度には、DNA結合領域と融合した蛋白AおよびDNA活性化領域と融合した蛋白Bを同時発現して、両者が蛋白Aと蛋白Bが相互作用するときに、細胞外に分泌されるルシフェラーゼがレポーターとして発現すると同時に、細胞外に分泌されるアルカリホスファターゼを内在性のレファレンスとする1体型のレポーターベクターを作成した。さらに、蛋白Aとして低分子量G蛋白であるRhoA、蛋白BとしてRhoAの調節分子であるRhothekinおよびRhoGDIをもちいることを計画し、両者が相互作用するときに、レポーターである分泌型ルシフェラーゼのみならず、DNA結合領域と融合したRhoAそのものも発現するベクターの構築に着手した。平成18年度には、蛋白相互作用を反映して分泌型ルシフェラーゼをレポーターとして発現すると同時に、分泌型アルカリホスファターゼを内在性のレファレンスとして発現する1体型のレポーターベクターを作成した。また、当初計画によるWWドメインを対象とする試験を行ったが、十分な相互作用を実現できなかった。そこで、平成19年度には対象を変更し、DNA活性化領域に融合した低分子量G蛋白RhoAと、DNA結合領域に融合したRhoA標的蛋白Rhothekinを同時発現する1体型ベクターを作成した。このRhoA/Rhotekinベクターとレポーターベクターを共発現し、RhoAをリポ多糖によって細胞外から活性化させて、RhoA-Rhotekinの相互作用が成立する条件をつくりだし、実際にレポーターのシグナルが増強されるかの検討に着手した。ところがこれまで期待するような十分な応答が得られていない。平成20年度は最終年度にあたるので、細胞系や刺激方法を変えて試行を継続する。同時に第三の方法として、細胞内の蛋白相互作用を、分子局在によってモニターする系の構築に着手し、自家発光蛍光タグを融合した複数の蛋白の遺伝子と、発現ライブラリーを同時に細胞に組み込むためのレンチ
ヒト腎移植におけるサイトカインの変動と免疫抑制レベルとの相関に関する検討

本研究ではCsA使用腎移植患者末梢血リンパ球の各種サイトカイン産生能を検討し、これがCsA至滴投与量を決定するための免疫抑制レベルの指標、あるいは拒絶反応の早期診断の指標となりうるか否かを検討した。結果は免疫抑制が十分である場合、常に約4050%のインタ-ロイキン2(IL-2)産生抑制を示しているが、拒絶反応時においては、この抑制が消失し、ほぼ正常あるいはそれ以上のIL-2産生を示し、ステロイド大量療法により再び著明な抑制を示すようになることから、IL-2産生抑制が認められない、すなわち不十分な免疫抑制状態が拒絶反応発生につながることが示唆された。また腎毒性により腎機能低下に陥った患者においてはIL-2産生抑制は十分あることからIL-2を拒絶反応とCsAによる腎毒性との鑑別診断の指標に使用しうる可能性が示唆された。IL-2以外にインタ-ロイキン1(IL-1)およびガンマ-インタ-フェロン(γ-IFN)の産生能においてもIL-2同種の結果が得られIL-2ばかりでなくIL-1、γ-IFNといったサイトカインの産生が抑制されており、なかでもIL-2は活性測定も容易でかつ患者の免疫抑制状態を反映し、免疫動態の示標となりうると考えられた。以上の実験結果を遺伝子のレベルで確認するため、患者リンパ球よりmRNAを抽出し、各サイトカインのcDNAを用いてhybridizationを行い、mRNAのレベルにおいてもCsA使用腎移植患者においては健常人に比べてIL-2およびγ-IFNの各サイトカインにおいて著明なmRNA誘導の抑制があることが証明された。さらに、活性化T細胞レセプタ-であるIL-2およびトランスフェリン(IF)レセプタ-陽性細胞の占める割合と急性拒絶反応(AR)との相関関係を検討した結果AR発症直前には両レセプタ-陽性細胞の割合が上昇し拒絶反応の免疫学的モニタリングとして有用と考えられた。シクロスポリン(CSA)投与腎移植患者42名のリンパ球が産生する平均ガンマ-インターフェロン(α-IFN)は、54.3±12.4IU/mlと健常人23名の平均134.1±18.8IU/mlに比べ、約60%の抑制が認められた。透析患者より得たリンパ球(n=20)ではこのような抑制は認められず(130.7±16.8IU/ml)、また免疫抑制剤としてイムラン(Az)を使用した患者より得たリンパ球(n=22)でも平均96.0±16.1IU/mlとCsA使用患者に比べて抑制率は軽度であった。同様にIL-1産生に関してもCaA使用患者(n=20)では、平均5.1±0.7IU/mlと健常人平均13.0±2.9IU/ml(n=21)に比べて約60%の抑制が認められた。透析患者では平均15.5±4.7IU/mlと健常人平均よりむしろ高めであった。Az使用患者においては10.1±2.7IU/mlとα-IFN同様、CsA患者に比べて抑制は軽度であった。これらα-IFNとIL-1の産生抑制を遺伝子レベルで検討する目的で、リンパ球およびマクロファージよりmRNAを抽出し、それぞれα-IFNcDNAおよびIL-1(α、β)cDNAを用いてハイブリダイゼーションをおこない、それぞれのmRNAの産生を検討した。

その結果、CSA使用患者においては、培養上清で検討したのと同様にmRNAレベルにおいても健常人、Az使用患者に比べて優位にその産生が抑制されており、mRNAへのtranscription以前のレベルでこれらサイトカインの産生が抑制されていることが判った。またCsAはFACSを用いて検討したところ、IL-2レセプターには影響を与えないとされてきたが、IL-2レセプターに対するcDNAを用いて検討したところCsA患者リンパ球は、その発現が抑制されており、CaAはサイトカインの産生ばかりでなく、IL-2の受容体の発現にも抑制効果を示し、その結果、強い免疫抑制効果を示すことが明らかとなった。今後、拒絶反応発症時にこれらの遺伝子発現がどのようにコントロールされているかを検討することは、拒絶反応のメカニズムの解明にもつながり、重要と考える。本研究ではCsA使用腎移植患者末梢血リンパ球の各種サイトカイン産生能を検討し、これがCsA至適投与量を決定するための免疫抑制レベルの指標、あるいは拒絶反応の早期診断の指標となりうるか否かを検討した。結果は免疫抑制が十分である場合、常に約4050%のインタ-ロイキン2(ILー2)産生抑制を示しているが、拒絶反応時においては、この抑制が消失し、ほぼ正常あるいはそれ以上のILー2産生を示し、ステロイド大量療法により再び著明な抑制を示すようになることから、ILー2産生抑制が認められない、すなわち不十分な免疫抑制状態が拒絶反応発生につながることが示唆された。また腎毒性により腎機能低下に陥った患者においてはILー2産生抑制は十分あることからILー2を拒絶反応とCsAによる腎毒性との鑑別診断の指標に使用しうる可能性が示唆された。ILー2以外にインタ-ロイキン1(ILー1)およびガンマ-インタ-フェロン(γーIFN)の産生能においてもILー2同種の結果が得られILー2ばかりでなくILー1、γーIFNといったサイトカインの産生が抑制されており、なかでもILー2は活性測定も容易でかつ患者の免疫抑制状態を反映し、免疫動態の示標となりうると考えられた。以上の実験結果を遺伝子のレベルで確認するため、患者リンパ球よりmRNAを抽出し、各サイトカインのcDNAを用いてhybridizationを行い、mRNAの発現を検討した。その結果、培養上清のレベルで得られた結果と同様にmRNAのレベルにおいてもCsA使用腎移植患者においては健常人に比べてILー2、ILー1およびγーIFNの各サイトカインにおいて著明なmRNA誘導の抑制があることが証明された。さらに、活性化T細胞レセプタ-であるILー2およびトランスフェリン(TF)レセプタ-陽性細胞の占める割合と急性拒絶反応(AR)との相関関係を検討した結果AR発症直前には両レセプタ-陽性細胞の割合が上昇し拒絶反応の免疫学的モニタリングとして有用と考えられた。
難治癌の迅速病態診断リキッドバイオプシーの開発とプレシジョン医療への応用

本研究では極めて悪性度の高い胸部難治癌(肺癌、食道癌、胸膜中皮腫)の組織・血液試料と多数の遺伝子・蛋白質の解析技術や血液中の微量分子の検出技術を基盤として、実用的な臨床診断に応用可能な癌由来分子(バイオマーカー)を同定・検証することをめざす。これらに基づき、バイオマーカーによる発癌リスクや未病・早期癌を検出する血液診断法、さらには体質や癌の個性に対応した個別化医療(プレシジョン医療)に応用可能な診断法の開発を進め、将来的な癌年齢層の健康寿命の延長とQOLの向上に役立つ情報を得る。
大規模量子格子模型シミュレーションのための新しいフレームワークの構築

我々の対象とする量子格子模型(量子スピン系・電子系)は、その格子構造・位相空間・相互作用を指定することにより定義されるが、これらの情報を統一的かつ柔軟に記述するためのXMLフォーマット(http://xml.comp-phys.org/)に基づき、量子格子模型のファイル入出力、アプリケーション側からの基底やハミルトン行列要素などを参照するためのオープンソースライブラリをC++言語により作成してきた。本研究課題の主要な成果物の一つである作成されたALPS(Algorithms and Libraries for Physics Simulations)ライブラリは、現在バージョン1.3aが公開されている(http://alps.comp-phys.org)。また、ALPSフレームワーク(XMLフォーマットとライブラリ)の有効性の実証も兼ねて、クラスターアルゴリズム量子モンテカルロ法を用いたアプリケーション(ALPS/looper)を作成した。このアプリケーションパッケージでは、「連続虚時間ループアルゴリズム」と呼ばれる量子スピン系のモンテカルロ手法としては現在最も強力な方法を用いて、任意の格子上で定義された任意の大きさのスピンをもつ量子スピン模型の量子モンテカルロ計算が実行可能となっており、ALPSフレームワークの柔軟性と有効性を確認することができた。ALPS/looperについても、現在バージョン3.2b1が公開されている。さらに、空間的な非等方性の非常に強い擬三次元量子反強磁性体の相転移やスピンギャップと空間的なランダムネスが競合する低次元量子磁性体における量子相転移の問題などに応用し、熱ゆらぎ・量子ゆらぎ・ランダムネスが共存・競合する量子格子模型における新奇な物性を明らかにすることができた。量子格子模型の大規模シミュレーションのための新たなフレームワーク構築の完成を目指し、平成15年度は以下の研究を行なった。1)量子格子模型は、格子構造、模型が定義される位相空間、およびそれらの上で定義される相互作用(ハミルトニアン)により記述されるが、このうち位相空間と相互作用についてのXMLフォーマット案を作成した(Model XML Format)。また、このXMLフォーマット形式で定義されれた模型を読み込み、ハミルトニアンを行列の形で生成するC++ライブラリ(Model Library)を開発した。また格子構造を扱うライブラリ(Lattice Library)についても改良を行なった。これらのライブラリ(ALPSバージョン1.0)は平成16年3月末に公開される予定である。2)ALPSライブラリを利用するアプリケーションプログラムとして、研究代表者が開発した量子モンテカルロライブラリLooperをALPSライブラリ上に移植し、新フレームワークの有効性、効率を検証した。このパッケージはALPS/looperとして平成16年4月末に公開の予定である。3)量子モンテカルロ法を用いた大規模シミュレーションにより、非常に弱く結合した擬一次元、擬二次元のハイゼンベルグ反強磁性体のネール温度を詳細に調べた。弱結合領域におけるネール温度の鎖間、面間相互作用依存性は、従来のランダム位相近似では十分に説明できず、「繰り込まれた最近接格子数」を用いた修正ランダム位相近似により良く記述されることを明らかにした。また、全相互作用領域において良くネール温度を与える経験式を提案した。この経験式は実際の物質の実験結果の解析にも非常に有用であると期待される。量子格子模型の大規模シミュレーションのための新たなフレームワーク構築を目指し、平成15年度に引き続き平成16年度は以下の研究を行なった。1)XMLフォーマット形式で定義されれた量子格子模型を読み込み、そのハミルトニアンを行列の形で生成するC++ライブラリ(Model Library)を開発した。2)これまで開発されたライブラリをALPSライブラリとしてまとめ、平成16年3月末にバージョン1.0を公開した。その後もバージョンアップを重ね、平成17年3月末時点ではバージョン1.2.1を公開中である。3)ALPSライブラリを利用するアプリケーションプログラムとして、量子モンテカルロライブラリALPS/looperを開発し、平成16年6月にバージョン3を公開した。4)ALPSライブラリ、ALPS/looperライブラリにもとづく、量子モンテカルロ法を用いた大規模シミュレーションにより、スピンギャップをもつ一次元スピン1量子スピン系に対するボンドランダムネスの効果を調べた。特に「ひねり秩序演算子」の方法をランダムスピン系にはじめて適用することにより、従来よりも格段に詳細な基底状態相図を得ることに成功した。ランダムネスの分布関数による相図の概形の質的な違いなど、今まで他の方法で得られていたものとは本質的に異なる結果により、スピンギャップ系に対するランダムネス効果の統一的な観点からの理解にむけた様々な新しい知見が得られた。

このアプリケーションパッケージでは、「連続虚時間ループアルゴリズム」と呼ばれる量子スピン系のモンテカルロ手法としては現在最も強力な方法を用いて、任意の格子上で定義された任意の大きさのスピンをもつ量子スピン模型の量子モンテカルロ計算が実行可能となっており、ALPSフレームワークの柔軟性と有効性を確認することができた。ALPS/looperについても、現在バージョン3.2b1が公開されている。さらに、空間的な非等方性の非常に強い擬三次元量子反強磁性体の相転移やスピンギャップと空間的なランダムネスが競合する低次元量子磁性体における量子相転移の問題などに応用し、熱ゆらぎ・量子ゆらぎ・ランダムネスが共存・競合する量子格子模型における新奇な物性を明らかにすることができた。
金属ナノ粒子低次元超格子を用いたナノ電子・磁気デバイスの創製

金属ナノ粒子を組織化すると、量子サイズ効果を利用した低消費電力・低発熱のナノ電子デバイスを構築することができる。さらに、金属ナノ粒子の二次元組織化技術は、Tbits/inch^2級の超高密度磁気記録媒体の創製にも極めて有用である。本年度は、デバイス構成単位となるAuクラスターの選択的大量合成、単一微細Auナノ粒子のSTS測定によるトンネル抵抗の評価、nc-AFMによるAuナノ粒子上の単一電子の観察、Auナノ粒子二次元超格子の粒子間距離低減に向けたポルフィリン誘導体保護Auナノ粒子の合成・キャラクタリゼーションについて検討した。また、高い一軸結晶自記異方性および保磁力を有するFePtナノ粒子の溶媒フリー合成法の開発を行った。ナノデバイスの新規構成単位と期待されるAuクラスターの選択的大量合成では、ホスフィン保護AU_<11>クラスターとチオールとの配位子交換反応により、Au_<25>クラスターの選択的大量合成に成功した。Auナノ粒子の電子物性として、粒径2nm程度のアルカンチオール保護Auナノ粒子のSTS測定により、アルカンチオール層のトンネル抵抗がヘキサンチオールからオクタンチオールへの変化で1桁増加することを明らかにした。また、nc-AFMによる力測定により、Auナノ粒子上の単一電子観察に成功した。Auナノ粒子の保護配位子として、ポルフィリン誘導体であるmeso-5,10,15,20-tetrakis(2-thioacethylphenyl)porphyrinおよびmeso-5,10,15,20-tetrakis(2-thioacethylmethylphenyl)porphyrinを設計・合成し、Auナノ粒子の合成を行った。UV-visスペクトルから、ポルフィリン環がナノ粒子表面に対して平行に位置しており、ポルフィリン環とAuナノ粒子表面間の距離がポルフィリン環の電子状態や構造に影響していることが分かった。次に、磁性ナノ粒子であるFePtナノ粒子の合成を、無溶媒条件下、オレイン酸、オレイルアミン存在下、鉄および白金アセチルアセトナートのポリオール還元により行った。その結果、磁気デバイスの実用サイズである6nmの単分散FePtナノ粒子が得られ、その二次元超格子は高い熱安定性を示した。個々が機能単位である金属ナノ粒子をBottom-up architectureで組織化することにより、量子サイズ効果を利用した低消費電力・低発熱のナノ電子デバイス(単電子メモリ、トランジスタ)を構築することができる。本年度はまず、有機配位子間の弱い相互作用を利用することにより、種々の対称性(三回・四回・六回対称)を持つ超微細Auナノ粒子二次元超格子の創製を行った。また、高い一軸結晶自記異方性および保磁力を有するFePtナノ粒子の新規合成法を開発し、その自己組織化二次元超格子における熱処理前後の結晶構造ならびに磁気特性変化について検討した。Auナノ粒子二次元超格子の対称性制御に関し、塩基性配位子であるbis-4,4'-(4,4'-dithiobutyl benzyl)-N,N,N',N'-tetraethyl amineを合成し、Auナノ粒子の保護配位子として用いたところ、2.4±0.2nmの超単分散Auナノ粒子が得られた。この塩基性Auナノ粒子にベンゼン-1,3,5-トリカルボン酸あるいは酢酸を添加し中和後、親水性基板に水溶液として展開することにより、三回対称疑似ハニカムあるいは四回対称正方晶二次元超格子を形成させることに成功した。次に、磁性ナノ粒子であるFePtナノ粒子の合成を、ジオクチルエーテル中オレイン酸、オレイルアミン存在下、鉄アセチルアセトナートおよび白金アセチルアセトナートのポリオール還元により行った。前駆体比を変化させることで、Fe含有量を容易に組成制御可能な単分散FePtナノ粒子(粒径3.1nm)が得られた。これらFePtナノ粒子は自己組織化により、アモルファス炭素基板上で超格子構造を形成し、Fe含有量3964atomic%の範囲で熱処理によるfccからL1_0への結晶構造変化や磁気特性変化を確認した。本年度は、有機配位子間の弱い相互作用を利用することにより、気水界面、液液界面にて微細Auナノ粒子超格子の大面積化を行うとともに、単一粒子STS測定による有機配位子層厚とトンネル抵抗の相間について検討した。また、高い一軸結晶自記異方性および保磁力を有するFePtナノ粒子の溶媒フリー合成法の開発、異方性相分離CoPdナノどんぐりの合成、および、Auナノ粒子の磁性測定を行った。Auナノ粒子超格子の大面積化に関し、2,6-bis(1'-(n-thioalkyl)benzimidazol-2-yl)pyridine (n=8,10,12)保護1.5nm Auナノ粒子を気水界面で熱処理することにより、数cm^2にわたる六方晶二次元超格子を得ることができた。また、酸性配位子あるいは塩基性配位子で保護した2.4nm Auナノ粒子溶液を接触させたところ、液液界面にて酸-塩基相互作用に誘起されたAuナノ粒子三次元超格子を大面積で得ることに成功した。

単一Auナノ粒子STS測定より、配位子層のメチレン基2個の増加がトンネル抵抗を1桁増大させることが分かった。次に、磁性ナノ粒子であるFePtナノ粒子の合成を、無溶媒条件下、オレイン酸、オレイルアミン存在下、鉄および白金アセチルアセトナートのポリオール還元により行った。その結果、磁気デバイスの実用サイズである6nmの単分散FePtナノ粒子が得られた。これらFePtナノ粒子は自己組織化により、アモルファス炭素基板上で正方晶超格子を形成した。また、一連の3d遷移金属-貴金属二元金属ナノ粒子の合成において、二相が異方的に相分離したCo_9S_8/PdS_xナノ粒子(CoPdナノどんぐり)の合成に成功した。さらに、種々の粒径を有する高分子保護Auナノ粒子の磁気特性をXMCDにて測定した結果、1.9nm Auナノ粒子が極低温で強磁性スピン偏極を示すことが分かった。金属ナノ粒子を組織化すると、量子サイズ効果を利用した低消費電力・低発熱のナノ電子デバイスを構築することができる。さらに、金属ナノ粒子の二次元組織化技術は、Tbits/inch^2級の超高密度磁気記録媒体の創製にも極めて有用である。本年度は、デバイス構成単位となるAuクラスターの選択的大量合成、単一微細Auナノ粒子のSTS測定によるトンネル抵抗の評価、nc-AFMによるAuナノ粒子上の単一電子の観察、Auナノ粒子二次元超格子の粒子間距離低減に向けたポルフィリン誘導体保護Auナノ粒子の合成・キャラクタリゼーションについて検討した。また、高い一軸結晶自記異方性および保磁力を有するFePtナノ粒子の溶媒フリー合成法の開発を行った。ナノデバイスの新規構成単位と期待されるAuクラスターの選択的大量合成では、ホスフィン保護AU_<11>クラスターとチオールとの配位子交換反応により、Au_<25>クラスターの選択的大量合成に成功した。Auナノ粒子の電子物性として、粒径2nm程度のアルカンチオール保護Auナノ粒子のSTS測定により、アルカンチオール層のトンネル抵抗がヘキサンチオールからオクタンチオールへの変化で1桁増加することを明らかにした。また、nc-AFMによる力測定により、Auナノ粒子上の単一電子観察に成功した。Auナノ粒子の保護配位子として、ポルフィリン誘導体であるmeso-5,10,15,20-tetrakis(2-thioacethylphenyl)porphyrinおよびmeso-5,10,15,20-tetrakis(2-thioacethylmethylphenyl)porphyrinを設計・合成し、Auナノ粒子の合成を行った。UV-visスペクトルから、ポルフィリン環がナノ粒子表面に対して平行に位置しており、ポルフィリン環とAuナノ粒子表面間の距離がポルフィリン環の電子状態や構造に影響していることが分かった。その結果、磁気デバイスの実用サイズである6nmの単分散FePtナノ粒子が得られ、その二次元超格子は高い熱安定性を示した。
パーキンソン病原因遺伝子産物DJ-1とその結合蛋白質のX線結晶構造解析と機能相関

家族性パーキンソン病PARK7の原因遺伝子産物であるDJ-1には,これまで疾患の原因とされる五つの変異(M26I, E64D, A104T, D149A, L166P)と,疾患に関与しないとされる変異(R98Q)が発見されている.このうちL166P変異体は非常に不安定であり,DJ-1としての機能が失われることがパーキンソン病の原因であると考えられている。一方,その他の変異体については野生型と大きく異なる性質を示した知見はこれまでに無く,何故パーキンソン病を引き起こすのかについては未知である.そこでこれら変異により疾患を引き起こすメカニズムを構造生物学的観点から明らかにすることを目的として,L166P変異体を除く五種全ての変異体を作製し,X線結晶構造解析を行った.五種の変異体についてそれぞれ精製,結晶化を行い,分解能2Åで構造を決定した.野生型DJ-1との構造比較を行った結果,E64D, R98Q, D149Aの変異は分子表面に位置しており,野生型との全体構造の違いは認められなかった.以上より,E64D, D149Aの変異は,何らかのDJ-1結合タンパク質との結合を消失することにより疾患を引き起こすことが示唆される.一方,興味深いことに,M26I, A104Tの変異は分子内部に位置するにもかかわらず,やはり野生型との全体構造の違いは認められなかった.従って,これらの変異体は全体構造,表面残基ともに野生型と全く同じであるといえるため,疾患の原因ではない,多型の一つである可能性が示唆される.しかしながら,DJ-1は微生物由来のプロテアーゼと極めて類似した構造をもつことからプロテアーゼであると考えられており,微小な構造の変化がその活性に大きな影響を与えるという可能性も考えられる.本年度はDJ-1のプロテアーゼ活性およびDJBPの結晶構造解析に関する研究を行った.1.DJ-1のプロテアーゼ活性についてDJ-1のプロテアーゼ活性はC末端ヘリックスα9によって阻害されているという仮説を検証するため,α9を欠失させた変異体DJ-1(1-174)を作成し,プロテアーゼ活性の測定を行った.しかしながら,native体との有意な活性の差は認められなかった.このことから,α9はDJ-1のプロテアーゼ活性の制御に直接関与しているのではないと考えられる.2.DJ-1とDJ-1結合タンパク質DJBPについて複合体の結晶構造解析に向けてDJ-1とDJBPとのプルダウンアッセイによる複合体形成の確認を行った.しかしながら,CBB染色では有意な結合を確認することが出来なかった.このことから,DJ-1とDJBPとの結合はきわめて弱いものであると予想され,複合体の構造解析は難しいと考えられた.次いで,DJBP全長の結晶化を試みたが現在までに結晶は得られていない.DJBP全長に対してプロテアーゼによる限定分解を試みたところ,いくつかの領域が得られた.これらの領域について結晶化を試みたところ,トリプシンによる限定分解で得られた,DJBPの229残基から329残基に相当する断片について結晶が得られた.この結晶について水銀誘導体を用いたMAD法により解析を行い,分解能1.6Åの構造を得た.得られた構造はEF-hand様の構造を有していた.EF-handはカルシウム結合モチーフであるが,本構造ではカルシウムに相当する電子密度は見られなかった.構造上でカルシウム結合部位に当たる部分のアミノ酸を見てみると,一般的なカルシウム結合配列を有していないことから,この領域はカルシウム結合能を有していないものと考えられる.家族性パーキンソン病PARK7の原因遺伝子産物であるDJ-1には,これまで疾患の原因とされる五つの変異(M26I, E64D, A104T, D149A, L166P)と,疾患に関与しないとされる変異(R98Q)が発見されている.このうちL166P変異体は非常に不安定であり,DJ-1としての機能が失われることがパーキンソン病の原因であると考えられている。一方,その他の変異体については野生型と大きく異なる性質を示した知見はこれまでに無く,何故パーキンソン病を引き起こすのかについては未知である.そこでこれら変異により疾患を引き起こすメカニズムを構造生物学的観点から明らかにすることを目的として,L166P変異体を除く五種全ての変異体を作製し,X線結晶構造解析を行った.五種の変異体についてそれぞれ精製,結晶化を行い,分解能2Åで構造を決定した.野生型DJ-1との構造比較を行った結果,E64D, R98Q, D149Aの変異は分子表面に位置しており,野生型との全体構造の違いは認められなかった.以上より,E64D, D149Aの変異は,何らかのDJ-1結合タンパク質との結合を消失することにより疾患を引き起こすことが示唆される.一方,興味深いことに,M26I, A104Tの変異は分子内部に位置するにもかかわらず,やはり野生型との全体構造の違いは認められなかった.従って,これらの変異体は全体構造,表面残基ともに野生型と全く同じであるといえるため,疾患の原因ではない,多型の一つである可能性が示唆される.しかしながら,DJ-1は微生物由来のプロテアーゼと極めて類似した構造をもつことからプロテアーゼであると考えられており,微小な構造の変化がその活性に大きな影響を与えるという可能性も考えられる.