hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中枢神経作用薬の効果を評価するためのバイオマーカーとしてのPET測定法の開発

PETを用いて医薬品の薬理作用や薬効をヒトで評価するために必要な要素技術を確立させるため、以下の項目について検討を行った。PETデータの再現性について、脳疾患のない人や脳変性疾患の患者を対象に、2週間以内に脳FDG-PET検査を2回行った結果、大脳皮質のFDG集積の変動はSUV値で8.0-9.5%、全脳値でノーマライズすれば4.1-6.5%であった。薬物治療の効果や病変の進行を評価するためには、測定方法の標準化と再現性の確立が必要であると考えられた。院内製剤として製造するPET用放射性薬剤を医薬品の臨床試験に用いる場合の品質管理に関しては規制当局のガイドラインがない。そこで、米国のcGMPをベースに作成された日本アイソトープ協会の2001年版基準に基づいて、C-11ドキセピン(DOX)、F-18フロロチミジン(FLT)、F-18フロロミソニダゾール(FMISO)、およびC-11PIB(アミロイドのトレーサ)を合成し品質管理する仕組みを構築し、先端医療センターのPET薬剤委員会の承認を得た。このうちFMISOはわが国で初めてヒトに使用した。薬の連投の効果をPET測定する臨床薬理学的試験を行った。抗ヒスタミン剤のオロパタジンの中枢鎮静作用は連用により軽減するといわれる。そこで17名の鼻炎患者に、プラセボ、初回オロパタジン実薬投与直後、および4週間の実薬服用後の実薬投与直後の3回、DOXによる脳ヒスタミンH1受容体のPET測定を行った。51回にわたるDOXの合成は一定の品質で行うことができた。結果は、初回オロパタジン投与によりH1受容体結合能が軽度低下し、薬によって受容体が一部占拠されたことが示唆された。4週間連投後はH1受容体結合能が著名に低下し、受容体のダウンレギュレーションが起こっていることが示唆され、医薬品の薬理効果をPET測定できることが示された。高齢化社会を迎えてアルツハイマー型痴呆の早期治療が重要となっているが、そのための早期診断や治療効果の評価と予測にはFDGによるPETイメージングが有効と期待されている。また、現在用いられている抗痴呆薬はアセチルコリンエステラーゼ(AChE)活性を阻害するが、^<11>C-MP4A(メチルピペリジル-4-アセテート)によるPETイメージングでAChE活性を測定すれば、薬理効果を直接測定できる。本年度は、早期のアルツハイマー型痴呆あるいは軽度認知障害(MCI)の患者をリクルートするために、神戸大学附属病院および神戸市内・近辺にて「もの忘れ外来」を開いている9つの医療機関と連携し、もの忘れ精密検診システムのネットワークを構築した。このネットワークに属する医療機関から先端医療センターへもの忘れを訴える患者の紹介を受け、PET、MR(形態画像とMRS)、および認知機能検査(ADASなど)を行って、診断し、紹介元にて治療あるいはフォローするという仕組みである。MRIによって脳血管障害を除外し、FDG-PETとMRI-morphometryおよびMRSによってアルツハイマーの早期診断を試みた。本年度は6名の新しい患者を登録し、検査結果に基いてドネペジル治療あるいはフォローアップを紹介元医療機関にて行っている。^<11>C-MP4Aについては、合成の準備を行った。将来治療薬臨床試験における薬理作用の評価に使えるように、院内GMPに適合するよう配慮した。

また、安全性と有効性を確認するためには、動物実験が必要であるが、本年度は、先端医療センターから隣接するバイオメディカル創造センターのRI実験室に放射性薬剤を運んで動物実験を行うための器具や手続きなど体制を整えた。PETを用いて医薬品の薬理作用や薬効をヒトで評価するために必要な要素技術を確立させるため、以下の項目について検討を行った。院内製剤として製造するPET用放射性薬剤を臨床研究に用いる場合は、品質管理が各施設に任されており、学会等のガイドラインもある。しかし、未承認薬の効果を測定するPET臨床薬理試験に用いて結果を規制当局に提出する場合にどのようなレベルの品質管理が必要かは、わが国はもちろん外国でも規制当局による明確なガイドラインがないことがわかった。そこで先端医療センターにおける基準を定めることにし、現在臨床使用しているFDG,C-11-doxepin,F-18-FLTなどの品質管理基準の作成に着手した。PETデータの再現性について、脳疾患のない人や脳変性疾患の患者を対象に、2週間以内に脳FDG-PET検査を2回行った結果、大脳皮質のFDG集積の変動はSUV値で8.0-9.5%、全脳値でノーマライズすれば4.1-6.5%であった。薬物治療の効果や病変の進行を評価するためには、測定方法の標準化と再現性の確立が必要であると考えられた。脳PET画像解析法として、いわゆる3D-SSPによる統計画像解析を行う場合には、正常データベースとしてどのデータセットを用いるかによって結果がかなり変わること、とくに画像再構成時のフィルタによる雑音の違いが結果に影響することがわかった。脳PETデータの動態解析に関して、施設によりまた画像処理コンピュータにより理論や計算方法が異なるため、最終的に得られる解析結果が変わってくる可能性がある。動態解析で常に問題となる入力関数の与え方について検討した結果。スプライン補間や指数関数近似など入力関数取り扱いの違いによって、脳糖代謝率の計算結果に最大10%以上の違いが発生することがわかった。院内製剤として製造するPET用放射性薬剤を医薬品の臨床試験に用いる場合の品質管理に関しては規制当局のガイドラインがない。そこで、米国のcGMPをベースに作成された日本アイソトープ協会の2001年版基準に基づいて、C-11ドキセピン(DOX)、F-18フロロチミジン(FLT)、F-18フロロミソニダゾール(FMISO)、およびC-11PIB(アミロイドのトレーサ)を合成し品質管理する仕組みを構築し、先端医療センターのPET薬剤委員会の承認を得た。このうちFMISOはわが国で初めてヒトに使用した。医薬品の中枢作用をPET測定できることを示し、実際的問題点を明らかにするために、薬の連投の効果をPET測定する臨床薬理学的研究を行った。抗ヒスタミン剤のオロパタジンの中枢鎮静作用は連用により軽減するといわれる。そこで、脳ヒスタミンH1受容体をPETでDOXを用いて測定し、オロパタジン服用による効果を評価した。17名の鼻炎患者に、プラセボ、初回オロパタジン実薬投与直後、および4週間の実薬服用後の実薬投与直後の3回、DOXによるPET測定を行った。51回にわたるDOXの合成は一定の品質で行うことができた。試験薬(プラセボと実薬)は市販のカプセルを用いて院内で調製し管理した。
ダイヤモンド上グラフェンの創製

最終年度は、グラフェンを電子デバイスに応用するために、低抵抗オーム性電極を得るための指針を見出すことを目指した。グラフェンデバイスの低抵抗化に向けては、グラフェンとコンタクト電極との接触抵抗をいかに小さくするかが重要な課題である。これまでグラフェンの電極材料としては、Ti、Cr、およびNiが典型的に使用されており、これらはカーボンナノチューブやフラーレンといったカーボン系ナノ材料でも広く用いられている電極材料である。グラフェンデバイスのコンタクト抵抗に関してはいくつかの報告がなされているが、同じ電極材料であってもコンタクト抵抗値にバラツキが見られており、その議論はまだ道半ばである。また、これまでの報告では、へき開したグラフェンをそのまま利用しているため、グラフェンとコンタクト電極とのオーバーラップ面積(コンタクト領域)やチャネル領域が異なる複雑な系での結果である。今回、グラフェンと金属電極とのコンタクト抵抗をより議論しやすくするため、コンタクト領域とチャネル領域をパターニングしたグラフェンデバイスを作製し、伝送線路(TLM)法での評価を行った。その結果以下のことが判明した。コンタクト電極としてTiに着目して多端子グラフェンデバイスを作製し、Transfer Length Measurement法を用いて真空中で室温電気伝導測定を行った。測定データからコンタクト抵抗、コンタクト抵抗率およびグラフェンシート抵抗を抽出し解析した結果、コンタクト抵抗がキャリアタイプに依存しないこと、さらに、従来報告されたグラフェンデバイスに比べ低抵抗率コンタクト(10^<-6>Ω・cm^2以下)を有するデバイスの作製に成功したことを見出した。本年度は第一段階として、従来技術の欠点とその改善をはかることから出発した。従来のトランジスタはドーパントが高濃度ドープされた低抵抗Siを基板とし、絶縁膜としてSiO_2を使用している。このグラフェン/SiO_2/低抵抗Si基板構造の目的は、基板Si側からSiO_2を介してグラフェンに電界を印加することによって、グラフェン内の電子または正孔濃度を制御することにある。しかしながら、比誘電率εSiO2の値は3.9程度と小さいため、1桁以上の電子・正孔濃度を制御するためには大きなゲート電圧が必要となる欠点があった。また、SiO_2膜上のグラフェンは、グラフェン/SiO_2/低抵抗Si基板を通した光の多重干渉効果により、光学顕微鏡によって観察することできることが知られているが、小さな比誘電率εSiO2値のために、干渉コントラストがやや不鮮明である欠点があった。そこで、SiO_2の比誘電率に比べて大きな高誘電率を持つ誘電体薄膜(高誘電体薄膜または強誘電体薄膜)を用いることにより、上記2つの欠点を同時に解決する手法を探索した。SiO_2の比誘電率3.9に比べて2.2倍大きな絶縁膜としてAl_2O_3を選定し、グラフェン/Al_2O_3/低抵抗Si基板構造を用いた素子を作製し、電気伝導特性を調べた。Al_2O_3膜およびSiO_2膜上ともに、グラフェンに特徴的な正ゲート電圧時の電子および負ゲート電圧時の正孔による両極性伝導を示した。Al_2O_3膜上とSiO_2膜上とを比較すると、SiO_2よりもAl_2O_3の方が鋭いピークとなっており、ゲート電圧変化に対する感度が良く効率的にグラフェン内のキャリア濃度を制御出来ていることが分かった。これはAl_2O_3膜の比誘電率がSiO_2膜比べて大きく、対応して静電容量が大きくなる結果、Al_2O_3膜上のグラフェン内に発生する電子または正孔が、同じゲート電圧に対してより高濃度になるためである。このように、高誘電体材料ほどグラフェン内のキャリア濃度を大きく制御できることが実証された。
バクテリオファージゲノム及び遺伝子の共通性と多様性

T4類縁ファージはT4ファージからの相同性の違いの度合いによって、Teven, Pseudo-Teven, Schizo-Teven, Exo-Tevenに分類される。最近、これらT4類縁ファージの全ゲノム配列が次々と決定されつつある。当研究室では、昨年テイルリゾチーム蛋白質(gp5)の結晶化・立体構造の解明に成功した。この蛋白質はN末端ドメイン、リゾチームドメイン、C末端ドメインの3つのドメインからなり、C末端ドメインは新規の3本鎖βヘリックス構造を形成している。このようなドメイン構造がT4ファージ類縁ファージの間でどのように保存されているかを調べた。その結果、RB69,RB49などPseudo-Tevenファージではβヘリックスの長さが若干異なるだけで構造も保存されていると考えられたが、Schizo-TevenファージであるKVP40ではリゾチームドメインが欠失していることが分かった。さらに、Exo-Tevenファージのspm2ではN末端ドメインだけが相同性が高く、リゾチームドメインもC末端ドメインも相同性が低く、3本鎖βヘリックスの存在も明らかではない。そこで、英国のMann博士より、spm2ファージのDNAを譲り受け、PCR法によって同ファージの遺伝子5をクローニングした。配列の確認も行ったがまだ大量発現には成功していない。他方、最近次々にファージの全ゲノム塩基配列が決定されつつある。そこで、これらのファージを検索し、69種、約7千五百のORFを収集した。これを国立遺伝研西川建教授の構築されたGTOPに登録し、同教授のご協力を得て網羅的な相互塩基配列比較を行うと共に、各ファージのゲノムの物理地図を作製している。
動的錯体制御による触媒的ヘテロ原子導入新反応

本研究では、遷移金属錯体の動的挙動を精密に制御することにより、従来の概念では不可能であった新規触媒的へテロ原子導入反応を開発することを目的として研究を行った。その結果、水に代表される極性小分子の触媒的活性化に直接繋がる「低原子価ルテニウム錯体と水との反応」を詳細に検討した結果、いくつかの重要な新規錯体を合成し、その特異な構造と反応性を明らかにした。1.水配位O価ルテニウム錯体の合成:不斉環境にある水分子我々が初めて合成したO価ルテニウムアクア錯体、Ru(dimethyl fumarate)_2[1,2-bis(diphenyl-phosphino)ethane](H_2O)(1)の構造と動的挙動について詳細な検討を行った。錯体(1)中の水の酸素原子は、ルテニウムへの配位とdimethyl fumarate配位子の二つの非等価なカルボニル酸素との水素結合により、キラル中心となっている。ラセミの錯体1は自然分晶またはキラルカラムを備えたHPLCにより光学分割可能であった。さらに、温度可変^1H NMR測定とDFT計算により、配位した水分子の回転と反転過程を明らかにした。2.オキサメタラサイクル部位を有する二核2価ルテニウムアクア錯休の合成と構造O価ルテニウム錯体Ru(η^6-1,3,5-cyclooctatriene)(η^2-dimethyl fumarate)_2(2)と水との反応を、(S, S)-DLPAMP配位子共存下で行った結果、オキサメタラサイクル部位を有し、酸素配位と非等価な水素結合により酸素上にキラル中心を有する水が配位した、新規二核2価ルテニウムアクア錯体(3)を単離収率26%で得た。3.新規オキソ架橋ルテニウム4核錯体の合成と構造リン配位子を添加せずに、錯体(2)と水とを、1,4-ジオキサン中、6時間加熱還流した結果、水分子の活性化が進行した後、ルテニウムの酸素親和性による自己集積化が進行したと考えられる新規オキソ架橋ルテニウム4核錯体(4)が単離収率73%で得られた。本研究では、中心金属の動的挙動を精密に制御することにより、従来の概念では不可能であつた新規遷移金属錯体触媒反応を開発することを目的とする。近年の有機合成化学および有機工業化学における最重要研究課題の一つは、石油基幹原料として重要なオレフィン等不飽和炭化水素への触媒的ヘテロ原子導入新反応の開発であり、社会的に強く要請されている。そこで本研究では、我々がこれまで先駆的に独自の方法で詳細な検討を行ってきたルテニウム錯体の触媒化学を基礎とし、アミン、アルコール、チオール、および水分子の触媒的活性化による不飽和炭化水素の新規高選択的官能基化反応の開発を行った。本年度はまず、ルテニウム錯体触媒を用いるアミノアルケン類の分子内酸化的アミノ化反応による新規環状イミン合成法を開発した。

炭酸カリウムおよび酢酸アリル共存下、新規ルテニウム触媒系[RuCl_2(CO)_3]_2/dppp[dppp=1,3-bis(diphenylphosphino)propane]を用いることにより、アミノアルケン類の分子内酸化的アミノ化反応が良好に進行し、対応する5、6員環の環状イミンならびにインドール誘導体が高収率かつ高選択的に得られることを見出した。本反応は、高価なアミノアルキン類を用いることなく、安価なアミノアルケン類から環状イミン類、およびインドール類を直接合成する有機合成上、極めて有用な反応である。次に、従来、硫黄に代表されるカルコゲン原子化合物は、遷移金属錯体の触媒毒として作用することが知られていたが、我々は、ルテニウム錯体触媒(CpRuCl(cod)およびCpRuCl(PPh_3)_2,[Cp=cyclopentadienyl, cod=1,5-cyclooctadiene])を用いることにより、他の遷移金属錯体触媒では不可能であつた炭酸プロパルギル類を用いるチオール類の一般的なS-プロパルギル反応の最初の例を見出した。さらに、ルテニウム錯体を用いる水分子の活性化のモデルとして、我々が初めて合成したRu(η^6-cot)(dmfm)_2錯体(1)[cot=1,3,5-cyclooctatriene, dmfm=dimethyl fumarate]と過剰の水との反応を、dppe[dppe=1,2-bis(diphenylphosphino)ethane]存在下で検討した結果、水が配位した新規0価ルテニウム錯体Ru(dmfm)_2(dppe)(H_2O)(2)が良好な収率で得られることを見出した。錯体2の単結晶X線構造解析結果は、配位した水が2分子のdmfm配位子のカルボニル酸素原子との間に水素結合を有し、安定化されていることを示しており、この水素結合のために、錯体2が初めて単離可能となったことが明らかとなった。本研究では、中心金属の動的挙動を精密に制御することにより、従来の概念では不可能であった新規遷移金属錯体触媒反応を開発することを目的とする。近年の有機合成化学および有機工業化学における最重要研究課題の一つは、石油基幹原料として重要なオレフィン等、不飽和炭化水素への触媒的ヘテロ原子導入新反応の開発であり、社会的に強く要請されている。そこで本研究では、我々がこれまで先駆的に独自の方法で詳細な検討を行ってきたルテニウム錯体の触媒化学を基礎とし、アルコール、アミン、硫黄化合物等の極性小分子の触媒的活性化による不飽和炭化水素の新規高選択的官能基化反応の開発、およびこれらの高効率変換反応を可能にする新規0価ルテニウム錯体触媒の合成を行うことを目的とする。ルテニウム錯体触媒は、アルコールの酸化反応やアルコールを用いるアミンのN-アルキル化反応等、アルコール水酸基の活性化を経る水素移動反応に高い触媒活性を示すことが知られている。これらの反応では一般に、アルコール水酸基のルテニウム活性種への酸化的付加、続くβ-水素脱離反応により、ケトンあるいはアルデヒドが生成するが、我々はβ-水素脱離反応が進行しない1,1-二置換アリルアルコール類の酸化的環化カルボニル化反応、および1,1-二置換ホモアリルアルコール類の触媒的炭素-炭素結合切断反応を開発し報告している。本研究では、さらに炭素鎖を一つ延ばした1,1-二置換4-ペンテン-1-オール類を基質に選び、ルテニウム錯体触媒を用いる新規変換反応の開発を行った。その結果、酢酸アリルおよび炭酸カリウム共存下、一酸化炭素加圧下において、Ru_3(CO)_<12>/PPh_3触媒系を用いる1,1-二置換4-ペンテン-1-オール類の酸化的環化反応が良好に進行し、対応する2,3-ジヒドロフラン誘導体が高収率で得られた。
炎症性腸疾患における末梢血および粘膜T細胞の活性化およびアポトーシスに関する検討

末梢血より比重遠心法を用いて末梢血単核細胞を,また手術標本の粘膜組織より酵素法で細胞浮遊液を得た後,比重遠心法で粘膜固有層単核細胞を分離した.これらの細胞からmagneticcell sorting (MACS)を用いて末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞を分離した.FITC標識抗CD4抗体によるフローサイトメトリー解析で純度はそれぞれ99.0±0.3%,98.5±0.4%であり,MACSにより末梢血及び大腸粘膜組織より純度の高いCD4陽性T細胞を効率的に分離することが可能であった.単球・マクロファージ系のアクセソリー細胞の非存在下の培養では各種マイトジェン及び可溶性の抗CD3,抗CD28抗体による細胞増殖と活性化(IL-2受容体α鎖の発現)は比較的軽度であった.そこで抗CD3,抗CD28抗体を固相化したwellで末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞の経時的な培養を行った.末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞のIL-2受容体α鎖及び膜型TNFαの発現は96時間でピークがみられ,抗CD3抗体単独の固相化よりも抗CD3及び抗CD28抗体の固相化により高い陽性率を示した.またこれらの活性化マーカーの発現率は末梢血CD4陽性T細胞よりも粘膜固有層CD4陽性T細胞において高値を示した.培養上清中のIFNγ活性も活性化マーカーと同様な傾向を示し,今回用いた抗CD3,抗CD28抗体による末梢血及び粘膜固有層T細胞の活性化はアクセソリー細胞を必要としない有用な実験系であることが明らかにされた.クローン病の治療に使用されている抗TNFαモノクローナル抗体(インフリキシマブ)を固相化抗体で活性化した粘膜固有層CD4陽性T細胞に添加するとアポトーシスが誘導され,炎症性腸疾患患者において各種薬剤の治療効果をin vitroで予測できることが示唆された.さらにインフリキシマブ治療をクローン病患者13例に行い,治療前後で臨床活動度(CDAI)は13例中12例(70点以上改善した有効例は6例,46.1%)で改善し,血清TNFα,IL-6,sIL-2R濃度は低下した.CDAIが70点以上低下した有効例と非有効例とを比較検討したところ,治療前に血清TNFαの高い症例でinfliximabの非有効例が多く,血清TNFα濃度の測定は,インフリキシマブ治療の有効性の予測の一助となる可能性が示唆された.末梢血より比重遠心法を用いて末梢血単核細胞を,また手術標本の粘膜組織より酵素法で細胞浮遊液を得た後,比重遠心法で粘膜固有層単核細胞を分離した.これらの細胞からmagneticcell sorting (MACS)を用いて末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞を分離した.FITC標識抗CD4抗体によるフローサイトメトリー解析で純度はそれぞれ99.0±0.3%,98.5±0.4%であり,MACSにより末梢血及び大腸粘膜組織より純度の高いCD4陽性T細胞を効率的に分離することが可能であった.単球・マクロファージ系のアクセソリー細胞の非存在下の培養では各種マイトジェン及び可溶性の抗CD3,抗CD28抗体による細胞増殖と活性化(IL-2受容体α鎖の発現)は比較的軽度であった.そこで抗CD3,抗CD28抗体を固相化したwellで末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞の経時的な培養を行った.末梢血及び粘膜固有層CD4陽性T細胞のIL-2受容体α鎖及び膜型TNFαの発現は96時間でピークがみられ,抗CD3抗体単独の固相化よりも抗CD3及び抗CD28抗体の固相化により高い陽性率を示した.またこれらの活性化マーカーの発現率は末梢血CD4陽性T細胞よりも粘膜固有層CD4陽性T細胞において高値を示した.培養上清中のIFNγ活性も活性化マーカーと同様な傾向を示し,今回用いた抗CD3,抗CD28抗体による末梢血及び粘膜固有層T細胞の活性化はアクセソリー細胞を必要としない有用な実験系であることが明らかにされた.クローン病の治療に使用されている抗TNFαモノクローナル抗体(インフリキシマブ)を固相化抗体で活性化した粘膜固有層CD4陽性T細胞に添加するとアポトーシスが誘導され,炎症性腸疾患患者において各種薬剤の治療効果をin vitroで予測できることが示唆された.さらにインフリキシマブ治療をクローン病患者13例に行い,治療前後で臨床活動度(CDAI)は13例中12例(70点以上改善した有効例は6例,46.1%)で改善し,血清TNFα,IL-6,sIL-2R濃度は低下した.CDAIが70点以上低下した有効例と非有効例とを比較検討したところ,治療前に血清TNFαの高い症例でinfliximabの非有効例が多く,血清TNFα濃度の測定は,インフリキシマブ治療の有効性の予測の一助となる可能性が示唆された.末梢血より比重遠心法を用いて末梢血単核細胞を,また手術標本の粘膜組織より酸素法で細胞浮遊液を得た後,比重遠心法で粘膜固有層単核細胞を分離した.これらの細胞からmagneticcell sorting(MACS)を用いて末梢血および粘膜固有層CD4陽性T細胞を分離した.FITC

標識抗CD4抗体によるフローサイトメトリー解析で純度はそれぞれ99.0±0.3%,98.5±0.4%であり,MACSにより末梢血および大腸粘膜組織より純度の高いCD4陽性T細胞を効率的に分離することが可能であった.単球・マクロファージ系のアクセソリー細胞の非存在下の培養では各種マイトジェンおよび可溶性の抗CD3,抗CD28抗体による細胞増殖と活性化(IL-2受容体α鎖の発現)は比較的軽度であった.そこで抗CD3,抗CD28抗体を固相化したwellで末梢血および粘膜固有層CD4陽性T細胞の経時的な培養を行った.末梢血および粘膜固有層CD4陽性T細胞のIL-2受容体α鎖および膜型TNFαの発現は96時間でピークがみられ,抗CD3抗体単独の固相化よりも抗CD3および抗CD28抗体の固相化により高い陽性率を示した.またこれらの活性化マーカーの発現率は末梢血CD4陽性T細胞よりも粘膜固有層CD4陽性T細胞において高値を示した.培養上清中のIFNγ活性も活性化マーカーと同様な傾向を示し,今回用いた抗CD3,抗CD28抗体による末梢血および粘膜固有層T細胞の活性化はアクセソリー細胞を必要としない有用な実験系であることが明らかにされた.さらに現在,クローン病の治療に使用されている抗TNFαモノクローナル抗体(インフリキシマブ)を固相化抗体で活性化した粘膜固有層CD4陽性T細胞に添加するとアポトーシスが誘導され,この実験系により炎症性腸疾患患者において各種薬剤の治療効果をin vitroで予測することが可能であることが示唆された.平成16年度の研究から、magnetic cell sorting(MACS)により末梢血および大腸粘膜組織より純度の高いCD4陽性T細胞を効率的に分離することを可能にしたことと、クローン病の治療に使用されている新しい治療薬の抗TNFαモノクローナル抗体(infliximab)を固相化抗体で活性化した粘膜固有層CD4陽性T細胞に添加するとアポトーシスが誘導され,炎症性腸疾患患者において各種薬剤の治療効果をin vitroで予測することが可能であることが示唆された。平成17年度はこの研究成果をさらに発展させるべくクローン病患者13例にinfliximab治療を行い、治療前後で臨床活動度(CDAI)、血清TNFα、IL-6、soluble IL-2 receptor(sIL-2R)濃度を評価した。Infliximabによる治療後に13例中12例(92.3%)でCDAIの低下が見られ、そのうち6例(46.1%)でCDAIが70点以上低下した。infliximab治療前後のTNFα、IL-6、sIL-2Rの濃度については、TNFα活性は13例中12例で治療後に低下し、IL-6活性は13例中12例で治療後に低下し、sIL-2Rは全例で低下がみられた。治療前のTNFα、IL-6、sIL-2Rの濃度を、CDAIが70点以上低下した有効例と非有効例で比較を行ったところ、TNFαの血清濃度の平均値は、infliximab有効例で2.1±0.7ng/ml、無効例で8.3±2.2ng/mlであり、infliximab有効例で治療前のTNFαの血清濃度が有意に低値を示した。一方治療前のIL-6、sIL-2R濃度は、治療効果との明らかな関係はみられなかった。治療前のPBMCにおけるCD4陽性
皮膚筋炎におけるFcγRⅡBの役割について検討

皮膚筋炎患者のB細胞は活性化していることが予想される。理由として、皮膚筋炎以外の膠原病、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチや全身性強皮症では、B細胞が活性化していることが報告されており、同じ膠原病に属する皮膚筋炎でもB細胞が活性化している可能性がある。B細胞の活性化機序として、B細胞上の抑制分子であるFcγRIIBの発現の低下が考えられる。そのため皮膚筋炎におけるB細胞上のFcγRIIBが、病態や疾患活動性のバイオマーカーとしての役割があるかを検討した。皮膚筋炎患者、健常人から末梢血を採取し、FcγRIIB発現をフローサイトメトリー法、RT-PCR法により検討した。特にB細胞をnaiveB細胞、memoryB細胞(preswithed memory B細胞、double negative memory B細胞、switched memory B細胞)、plasmablastの3つのサブユニットに分類し、各々における発現の違いを検討したが、有意差な認めなかった。また、B細胞の活性化マーカー(CD80、86、95)の発現も検討したが、B細胞の活性化はみられず、FcγRIIBとの相関もみられなかった。FcγRIIB発現を発現高値群、低値群に分類し、臨床症状(CK値、Ald値、間質性肺炎の有無、悪性腫瘍の有無、抗体別(抗MDA5抗体、抗TIF1抗体、抗ARS抗体))との関連を調べたが、有意差は認めなかった。皮膚筋炎におけるB細胞上のFcγRIIB発現が疾患活動性のバイオマーカーとなる可能性、またB細胞の活性化が病態の一つである事が明らかになれば、B細胞を標的とした治療が有効となる可能性があり、臨床的に意義があると考えたが今回の結果では予想した結果は得られなかった。理由として、皮膚筋炎以外の膠原病、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチや全身性強皮症ではB細胞が活性化していることが報告されており、同じ膠原病に属する皮膚筋炎でもB細胞が活性化している可能性がある。皮膚筋炎におけるFcγRIIBの役割を検討するために、B細胞上のFcγRIIB発現をフローサイトメトリー、RT-PCR法により検討し、病態におけるFcγRIIBの役割や疾患活動性のバイオマーカーとしての役割があるかを検討する。皮膚筋炎におけるB細胞の活性化が病態の一つである事が明らかになれば、B細胞を標的とした治療が有効となる可能性があり、臨床的に意義がある。皮膚筋炎患者、それ以外の膠原病患者、健常人から末梢血を採取し、FcγRIIB発現量をフローサイトメトリー法、RT-PCR法により検討する。特にB細胞をnaiveB細胞、memoryB細胞(preswithed memory B細胞、double negative memory B細胞、switched memory B細胞)、plasmablastの3つのサブユニットに分類し、各々における発現量の違いを調べる。また、B細胞の活性化マーカー(CD80、86、95)の発現量も検討し、FcγRIIBの関係についても確認する。FcγRIIB発現量に関しては、臨床症状、重症度、治療経過における推移も検討する。現在検討に必要なsampleを増やしている。患者から採取した末梢血を当日にsample作成、フローサイトメトリーによる解析を行わなければならず、患者受診日、実験日の調整が困難である。また、症例によってはB細胞が少なくsampleとして不適切となるため。患者からのsample数を増やし、検討していく。研究が遅延し、今後モデルマウスの使用も検討しているため。
衛星計測による波浪・海氷などの海洋環境情報の解明のための基礎研究

海洋構造物あるいは船舶の設計の際、波浪・海氷などの海洋環境要素は、重要なパラメーターであり、それらに関する情報取得のためのさまざまな研究・計測が行われている。しかし、現実には観測手段の限界により、局地的・断片的な情報取得に留まっている。広領域での持続かつ安定的な波浪・海氷の情報に対する要求は増大しつつあり、衛星によるリモートセンシング技術の発達、数値計算及び海洋計測能力の進歩がこれまで困難であった持続かつ安定的な波浪・海氷などの海洋環境情報の取得を可能なものとした。このような可能性を現実のものとし、実用化するための基盤作りがこの研究の目的である。波浪・海氷などの海洋環境要素は、時間的にも空間的にも変化が大きい現象であり、その実態の把握のための実海域での計測も極めて困難であえる。また衛星搭載されたセンサーの種類により、計測方法や得られる情報の量・質の相違するため、計測しようとする物理量と計測センサーの出力との相関を明らかにする必要がある。研究の成果は次の通りである。1.衛星データを可視化するためのツールを開発した。2.実験水槽にて、マイクロ波散乱計センサーを用い、水面のマイクロ波散乱計測を行い、波浪・風のマイクロ波散乱特性を明らかにした。3.受動マイクロ波センサーにより計測された海氷情報を海氷の移動・分布シミュレーションに用いるためのデータ処置ツールを開発した。
SPring-8放射光による[鋼/イオン]反応のナノ解析

X線吸収微細構造(X-ray Absorption Fine Structure; XAFS)測定の結果,(1)合金元素としてのCrが,さび層の保護性を担うゲーサイト(α-FeOOH)に取り込まれ,超微細Crゲーサイトを生成すること,(2)塩分飛来環境で耐食性向上効果を期待され合金元素として添加されるNiは,さび層中のアカガナイト(β-FeOOH)あるいはスピネル酸化物の特定のサイトに存在し,塩化物イオンの腐食加速効果を低減すること,(3)さび層を構成する各種Fe酸化物の存在量比と合金元素および腐食環境条件の関係,(4)環境中に存在する塩化物イオンがさび層の構造に及ぼす影響,などを明らかにした.また,鉄鋼材料の大気腐食さび層の形成初期過程をその場観察を試みた結果,白色X線を利用した回折法を用いることが,連続的に変化するさび構造を迅速にとらえる点で有利であることがわかった.この方法により,初期に生成するさび物質の構造が共存するイオン種と関連することや,乾湿繰り返しに伴うさびの相変化などが明らかになった.これらのことは,合金元素や環境因子が腐食生成物であるさび層の構造と防食性さらには腐食反応に大きな影響を与えることを示している.X線吸収微細構造(X-ray Absorption Fine Structure; XAFS)測定の結果,(1)合金元素としてのCrが,さび層の保護性を担うゲーサイト(α-FeOOH)に取り込まれ,超微細Crゲーサイトを生成すること,(2)塩分飛来環境で耐食性向上効果を期待され合金元素として添加されるNiは,さび層中のアカガナイト(β-FeOOH)あるいはスピネル酸化物の特定のサイトに存在し,塩化物イオンの腐食加速効果を低減すること,(3)さび層を構成する各種Fe酸化物の存在量比と合金元素および腐食環境条件の関係,(4)環境中に存在する塩化物イオンがさび層の構造に及ぼす影響,などを明らかにした.また,鉄鋼材料の大気腐食さび層の形成初期過程をその場観察を試みた結果,白色X線を利用した回折法を用いることが,連続的に変化するさび構造を迅速にとらえる点で有利であることがわかった.この方法により,初期に生成するさび物質の構造が共存するイオン種と関連することや,乾湿繰り返しに伴うさびの相変化などが明らかになった.これらのことは,合金元素や環境因子が腐食生成物であるさび層の構造と防食性さらには腐食反応に大きな影響を与えることを示している.21世紀に入りますますの社会資本の充実が叫ばれる一方で,急速に進む社会の高齢化・財政の逼迫により,社会資本を構成する鋼構造物などの保守管理は困難になりつつある.しかしながら,我が国における機器,構造物,プラント,交通システムなどの腐食対策費は現時点で約4兆円もの巨額に相当する.社会資本を構築する鉄鋼材料の長期耐久性を確保し,増加の一途をたどる防食・保守に要する人的・経済的負担を低減することが,戦略的に構造改革を進めている我が国の国家的使命であると言っても過言ではない.そのためには,水,酸素,腐食性物質,汚染物質等と鉄鋼材料の相互作用により進行する腐食劣化を基礎的に理解し対応策を検討しなければならない.本研究では鉄鋼材料の腐食劣化機構を解明するために,SPring-8大型放射光施設を用いた腐食劣化のその場観察を行う.具体的には,水溶液に覆われた鉄鋼材料表面におけるFeイオンと鋼中に添加されているその他金属のイオンおよび腐食環境から供給される亜硫酸ガスや塩化物イオンとの反応,さらには各腐食段階における反応生成物構造をリアルタイムで解析する.今年度は,独自に腐食装置を設計し,種々のイオン種を含有した水溶液膜を鋼材表面に形成し,腐食を進行させながら反応過程を時分割のX線回折測定によりその場観察することを試みた.その結果,初期腐食生成物は結晶性が低く,3次元的な周期性が確立されていないことや,乾湿繰り返しに伴い比較的早期に生成するFe(OH)_2,Fe(OH)_3はFeOOH, Fe_3O_4,Fe_2O_3へ変化する傾向が認められた.さらに,乾湿繰り返しが進むにつれて主要な腐食生成化合物種と液膜中のイオン種に相関が認められた.21世紀に入りますますの社会資本の充実が叫ばれる一方で,急速に進む高齢化・財政の逼迫により,社会資本を構成する鋼構造物などの保守管理は困難になりつつある.しかしながら,我が国における腐食対策費は約4兆円もの巨額に相当する.社会資本を構築する鉄鋼材料の長期耐久性を確保することが,戦略的に構造改革を進めている我が国の国家的使命であると言っても過言ではない.そのためには,水,酸素,腐食性物質,汚染物質等と鉄鋼材料の相互作用により進行する腐食劣化を基礎的に理解し対応策を検討しなければならない.本研究では鉄鋼材料の腐食劣化機構を解明するために,SPring-8大型放射光施設を用いた腐食劣化のその場観察を行う.具体的には,鉄イオンと鋼中に添加されているその他金属のイオンおよび亜硫酸ガスや塩化物イオンとの反応をリアルタイムで解析する.今年度までに独自の腐食装置を設計し,種々の水溶液膜を鋼材表面に形成し腐食反応過程をX線回折測定によりその場観察することに成功している.その結果,初期腐食生成物は3次元的な周期構造が確立されていないことや,比較的早期に生成する水酸化鉄はオキシ水酸化鉄と酸化鉄へ変化する傾向が認められた.

さらに,主要な腐食生成化合物種と液膜中のイオン種に以下のような相関があることが初めて明らかとなった.1.硫酸イオンによりα-FeOOHが優先生成する.2.クロムイオンにより生成物の結晶がナノメートルオーダーに微細化する.3.塩化物イオンによりβ-FeOOHが優先生成する.4.ニッケルイオンによりマグネタイトが優先生成するが,塩化物イオンが共存すると単斜晶のアカガネアイトが生成し,腐食反応を抑制する.21世紀に入り社会資本の充実が叫ばれる一方,急速に進む高齢化・財政の逼迫により,鋼構造物などの保守管理は困難になりつつある.しかし,我が国の腐食対策費は約4兆円もの巨額に相当する.社会資本を構築する鉄鋼材料の長期耐久性を確保することが,戦略的に構造改革を進めている我が国の国家的使命であると言っても過言ではない.そのために,水,酸素,腐食性物質,汚染物質等と鉄鋼の相互作用により進行する腐食を基礎的に理解し対応策を検討しなければならない.本研究では鉄鋼材料の腐食機構解明のため,SPring-8大型放射光施設を用いた腐食のその場観察を行う.具体的には,鉄イオンと鋼中に添加されているその他金属のイオンおよび硫酸や塩化物イオンとの反応をリアルタイムで解析する.研究期間中に独自の腐食装置を設計し,腐食反応過程をX線回折測定によりその場観察することに成功している.その結果,初期腐食生成物は3次元的な周期構造が確立されていないことや,比較的早期に生成する水酸化鉄はオキシ水酸化鉄と酸化鉄へ変化する傾向が認められた.さらに,主要な腐食生成化合物種と液膜中のイオン種に以下の相関があることが初めて明らかとなった.1.硫酸イオンによりα-FeOOHが優先生成する.2.クロムイオンにより生成物の結晶がナノメートルオーダーに微細化する.3.塩化物イオンによりβ-FeOOHが優先生成する.4.ニッケルイオンによりマグネタイトが優先生成するが,塩化物イオンが共存すると単斜晶のアカガネアイトが生成し,腐食反応を抑制する.これらの研究成果により,水,酸素,腐食性物質,汚染物質等と鉄鋼材料の相互作用により進行する腐食劣化の基礎的理解が進み,腐食生成物制御による鉄鋼材料の長期耐久性を確保するための指針が得られたと考えられる.
都市下水モニタリングによるアジアの薬剤耐性菌蔓延の実態調査

本研究は4つの研究項目からなり,各項目で本年度に実施した内容を以下にまとめる。(1)都市下水のサンプリング:海外共同研究者の協力を得て,タイ,カンボジア,ベトナム等の拠点で,定期的に都市下水のサンプリングを行う体制を整備した。一部の拠点では,サンプリングのみならず,研究項目(2)におけるスクリーニングまで実施できる体制を目指し,実験室環境の準備やトレーニングを行った。(2)都市下水からの重要な耐性菌のスクリーニング:院内感染の原因として重要な耐性菌グループ「ESKAPE」に含まれるいくつかの種類の細菌について,研究項目(1)で採取した都市下水からスクリーニングするための手法を平板培養法を基本として確立した。確立した手法によるスクリーニングの正確さに関する検討を始めた。(3)スクリーニングされた菌株からの耐性遺伝子の検出:研究項目(2)で単離・同定されたESKAPEグループの限られた数の菌株に対して,薬剤感受性試験と耐性遺伝子の検出を試験的に実施した。(4)耐性遺伝子の進化的相同性に基づく耐性菌の地域性と広域拡散の把握地域間の相同性を評価するためには,同一地域内の日間・季節間変動を把握する必要がある。タイ・バンコクの3か所の下水処理場を1月に視察し,対象の処理場として選定した。また,処理場内の採取地点を決定し,下水と活性汚泥のサンプリングを行ってDNA抽出試料を得た。また,現地における定期的なサンプリングのため,共同研究先のカセサート大学において,サンプリング方法と試料前処理・保存方法についてのトレーニングを行った。国内の比較先として,金沢市,富山市,堺市の6か所の下水処理場において各3回ずつ下水と活性汚泥のサンプリングを行い,遺伝子解析のためのDNA抽出を行った。海外拠点でのサンプリング開始が若干遅れているが,その他は研究開始時の年次計画通りに研究が進んでいるため。次年度も,研究開始時の年次計画通りに研究を推進する。カウンターパートに依頼する調査内容の調整に時間を要してしまい,各国におけるサンプリング開始が遅れたため。次年度使用額は,遅れた分のサンプリングやそこで得られたサンプルの分析のために使用する。
第四紀黎明期の地磁気擾乱-気候とのリンク

レス堆積物から得られた詳細な古地磁気変動は、ガウス-マツヤマ(G-M)地磁気逆転が20回を越える多数の極性反転を起こす擾乱期を伴うことを明らかにした。それは第四紀の直下、レッドクレイ層の直上に位置し、冬季モンスーンが極めて強い寒冷乾燥期に堆積したレス中に起こっている。G-M境界付近の地磁気擾乱と寒冷乾燥気候の同時発生は、大阪湾コアのデータも支持し、地磁気と気候のリンクを示唆している。G-M境界と同様な地磁気擾乱をUpper Olduvai境界、Matuyama-Brunhes境界にも見つけた。○ガウス-マツヤマ地磁気極性境界付近およびマツヤマ初期の地球磁場の詳細復元:大阪湾1700mコアの深度1410m1270mまでの112個の試料の古地磁気分析を行い、ガウス-マツヤマ極性境界と複数回のショートイベント(短期逆転,地磁気エクスカーション)を見つけた。これは、我々のグループが中国黄土高原で見つけている810回のショートイベントの一部を日本でも観測できたと考えられ、ガウス-マツヤマ地磁気極性境界付近で地磁気擾乱が実際の地磁気現象である可能性が高まった。また、既に採取済みの中国黄土高原Baojiにおける中国レスの詳細古地磁気分析により、マツヤマ初期(2.58-1.95Ma)にも4回のショートイベントを見つけた。期間が長いマツヤマ中期(1.77-1.07Ma)にはショートイベントは2回しか起こっていないというBaojiでの観測事実を考慮すると、ガウス-マツヤマ極性境界付近の擾乱がマツヤマ初期にも影響を残している可能性がある。平成20年度の中国黄土高原Xifengにおける試料採取は、19年度の結果を踏まえて、紅粘土-レス境界付近から上位に集中して行うという方針が決まった。○ガウス-マツヤマ地磁気境界付近の花粉分析による古気候の詳細復元:大阪湾1700mコアの深度1410m1270mまでの間で、64層準の試料について花粉分析を行った結果、木本花粉化石300個以上検出できた層準は32層準しかなかった。木本花粉化石300個以上検出できた層準でも、ほとんどの層準で化石の保存状態は悪かった。堆積物の年代が古いため風化の影響が出ているものと思われる。現段階では、ガウス-マツヤマ地磁気境界直前に寒冷化が起こっている可能性が見つかっている。今後、花粉含有率と岩相の関係を調べ、花粉データ密度を上げる方策が必要である。中国黄土高原のレス・古土壌についてガウス・マツヤマ地磁気極性境界付近の試料採取を行ろた。黄土高原南部のPingliang、Xifeng、Lingtaiの3か所で地質調査を行い、地層の連続性、堆積物の一様性、アクセスの良さからLingtaiを主要試料採取場所として選んだ。レス・紅粘土境界を挟む厚さ25mの地層からほぼ連続したブロック試料300kgを採取した。これまでに約50%のブロック試料から磁気分析試料を整形し、帯磁率測定を行った。それを従来の研究結果に照らし合わせ、対象とする258万年前のガウス・マツヤマ境界の層位を推定した。また、研究協力者(楊天水・中国地質大准教授)の協力で取得していたXifengの古地磁気試料の分析の結果、ガウス・マツヤマ境界付近には地磁気擾乱は記録されていないことが分かった。これについては、本年度の地質調査で堆積間隙が原因であることを明らかにした。これは、従来行われていたXifengにおける古地磁気・古環境研究の見直しの必要性を示唆する重要な発見である。大阪湾1700mコアの古地磁気分析の結果、強い二次的磁化の影響を受けているゾーンの存在を見つけた。それは、中国黄土高原Baojiで発見している地磁気擾乱の時期に一致していることから、二次的磁化の割合が大きいのは初生磁化が小さいため、つまり当時の地磁気強度が弱かったためと思われる。さらに、このゾーンは花粉分析から分かっている寒冷化の時期とも一致していることが分かった。今後、さらに詳細な古地磁気変動を調べ、気候についてもより詳細な花粉分析を行って地磁気変動との相関を調べる必要性が確認できた。中国黄土高原Baojiのレス・古土壌層の古地磁気を高密度間隔(最高2cm)で再分析した結果、ガウス・マツヤマ地磁気逆転が28回の小反転を含む地磁気擾乱を伴うことを明らかにした。また、その擾乱期を含む地磁気逆転トランジションはレッドクレイ層直上のレスL33層の中に記録されている。

深海底コアの古地磁気データから、逆転に伴う地磁気強度減少はガウス・マツヤマ境界の数万年前から起こっていることが分かっているので、中国黄土高原ではレッドクレイ層の最上部付近ですでに地磁気強度が減少していた可能性がある。温暖気候を示すレッドクレイが突然終わり、寒冷乾燥気候を示すレスが堆積し始め、地磁気擾乱期終了後に温暖湿潤な古土壌層S32の堆積が起こった後、新定義による第四紀が始まる。これら第四紀直前の劇的な気候変化がガウス・マツヤマ地磁気逆転にともなう地磁気擾乱、地磁気減少と何らかの相関がある可能性は極めて高い。Lingtaiにおけるレッドクレイ層からS32層までの古地磁気分析結果もほぼ同様の地磁気擾乱を明らかにしている。さらに、200km離れたBaojiとXifengにおけるマツヤマ・ブリュンヌ境界の古地磁気を使って、多数の小反転現象が岩石磁気的原因に依らないことを実証した。大阪湾1700-mコアの古地磁気分析から、ガウス・マツヤマ地磁気極性境界をほぼ決めることができた。磁気的に不安定な湖成堆積物のため多数の小反転記録は得られなかったが、小反転の存在は確認できた。花粉分析から、ガウス・マツヤマ地磁気逆転境界はトウヒが卓越する寒冷気候帯に起こっていることが分かった。これにより、中国黄土高原で見つけた古地磁気逆転トランジション層序と古気候層序相関を大阪湾のコアでも確認できた。
光導電性有機顔料薄膜のpn制御

有機半導体を電子デバイスとして本格的に応用するには、シリコンなどの無機半導体において日常的に行われているpn制御(価電子制御)を達成しなければならない。最近我々は、反応性昇華精製によって超高純度化したペリレン顔料(Me-PTC)に臭素をド-ピングしたところ、弱いn型であるMe-PTCがp型化し、単一の有機半導体がp、n型双方の性質を持ちうることを初めて示した。本研究ではこの成果に基づき、まず、これまで有機半導体では不可能とされてきた、Pnホモ接合の作製を試みた。臭素ド-ピングによってp型化したMe-PTCとn型Me-PTCを積層したセルは、セルのどちら側から光照射しても光電流の作用スペクトルに顕著なマスキング効果を示し、両顔料の接合界面にpnホモ接合が形成されていることが確認された。このpnホモ接合は、0.4V以上の大きな光起電圧を示した。これは、有機半導体における初めてのpnホモ接合の形成である。次いで、弱いn型性であるペリレン顔料薄膜への無機半導体添加を行い、薄膜のフェルミレベルを積極的に制御することを試みた。無機半導体としてn型の硫化カドミウム(CdS)を用いた。Me-PTCとCdSを2つの蒸着源から同時に蒸発させる共蒸着によって、有機/無機複合薄膜を作製した。Me-PTC単独膜のフェルミレベルはバンドギャップ中央付近にあるが、CdS添加率の増大にともなって大きくマイナス側にシフトした。以上の結果は、伝導電子を多く持つn型無機半導体の添加によって有機半導体の光電物性をコントロールできる可能性を示している。
ダイズ根圏フザリウムの脱窒様式とN2O発生への寄与

N2Oは温室効果ガスであり、マメ科作物根圏はN2Oの主要な発生源である。本研究では、根粒根圏の糸状菌N2O生成について、下記の成果を得た。亜硝酸を利用するカビ脱窒が当該根粒根圏で生じていた。根粒根圏から12株のフザリウム分離株を得た。N2O発生圃場のダイズ根粒根圏における糸状菌群集構造解析の結果、分離フザリウム株が圃場およびポットでも優勢であった。大部分のフザリウム単離株が亜硝酸からN2Oの顕著なカビ脱窒反応を触媒し、主に二分子の亜硝酸から一分子のN2Oが生成していた。以上の結果より、ダイズ根粒根圏では亜硝酸利用型のカビ脱窒によりN2O発生が実質的に起きていると結論された。本研究では、ダイズ根圏N2O発生へのカビ脱窒の寄与・様式・削減策を明らかにするために、1.根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、2.硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、3. 15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の寄与度評価、4.非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性を明らかにすることを目的としている。本年度は、主に15N同位体のN2O分子偏在性解析で重要なデータが得られた。硝化細菌と糸状菌が発生するN2Oの15N同位体のN2O分子偏在性のインデックスであるSite preference (SP)値が近いことが知られているので、ダイズ根圏に硝酸または亜硝酸(1 mM)を導入した際に発生するN2O分子のSP値を測定した。その結果、硝酸添加より亜硝酸添加によって高いSP値が得られた。亜硝酸添加の場合は、ダイズ根粒菌の寄与も考えられたので、亜硝酸還元酵素遺伝子nirKを破壊したダイズ根粒菌が共生したダイズ根圏に亜硝酸を添加したこころ、野生株のダイズ根粒菌接種よりSP値がさらに上昇した。分離フザリウムの培養では亜硝酸のみからN2Oを発生すること、フザリウムをはじめとするカビ脱窒のSP値は30パーミル前後と高いという二つの理由から、本結果は亜硝酸をN2Oの基質にするカビ脱窒がダイズ根圏で生じていることが強く示唆された。また、分離フザリウムがダイズ根圏で優占種であることのRISA多型解析による証明、硝酸および亜硝酸存在下における分離フザリウムの培養特性やITS配列の詳細な解析を行った。本研究では、ダイズ根圏N2O発生へのカビ脱窒の寄与・様式・削減策を明らかにするために、(1)根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、(2)硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、(3) 15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の寄与度評価、(4)非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性を明らかにすることを目的としている。昨年度は、15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の寄与度評価と分離フザリウムがダイズ根圏で優占種である事実を明らかにし、ダイズ根圏において亜硝酸を基質とするカビ脱窒でN2Oが生成していることを証明した。そこで、本年度は(1)根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、(2)硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、(4)非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性の実験を実施した。15N標識亜硝酸(99 atom%)を添加したGP培地で根圏分離フザリウムFK2株およびFK7株の培養液から生成されるN2Oの15N濃度をガスクロマトグラフ質量分析計で測定した。その結果、ハイブリッドN2O(15N14NO)は生成されたN2Oの0.5-1.0%であり、大部分が亜硝酸窒素由来のみから生成されるN2O(15N15NO)であった。根粒抽出液を加えても同様であった。したがって、共脱窒で生成されるN2Oは確かに生成されているが、量的には少なかった。アンモニアを添加したGP培地に分離フザリウムを接種し土壌懸濁液を少量接種したところ、アンモニアの消費とN2O生成が起ったが、植継ぎ培養を続けたところその活性は消失したので、一過的な硝化細菌とフザリウムの共生体は形成されたものの、安定な実験系の構築はできなかった。非脱窒型フザリウムFK1株をダイズ根圏に接種したところ、根圏からのN2O発生が明らかに低下した。本結果は、ダイズ根圏のようなCN比が低い環境において、非脱窒型フザリウム接種によるN2O発生削減の実用化に繋がる可能性がある。

以上の結果より、ダイズ根粒根圏では亜硝酸利用型のカビ脱窒によりN2O発生が実質的に起きていると結論された。本年度は、最も優先度の高い15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の解析が進んだ。そこで、論文をまとめるために、分離フザリウムがダイズ根圏で優占種であることのRISA多型解析による証明、硝酸および亜硝酸存在下における分離フザリウムの培養特性やITS配列の解析などにエネルギーをさいた。論文発表を軸に研究展開するためには重要であると思われる。また、本年度は、根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、非脱窒型フザリウムによるN2O削減については、いくつかの予備実験を実施し、来年度につながる興味深いデータが得られた。土壌微生物学、植物微生物学上記の論文発表とそのための追加実験に来年度前半は集中する。本年度は、根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能について、本年度の予備実験結果に基づいて、以下のような研究を行う。根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャルについては、亜硝酸存在下でN2Oを発生するSP培地の培養に、15N標識の亜硝酸を添加し、発生するN2O分子の質量分析を行う。15N14NO、14N15NOが検出されれば共脱窒が起こっていることが証明できる。硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能の解析については、アンモニアを添加したSP培地において、硝化細菌(または根圏土壌)とフザリウムを接種して、抗生物質等を入れた様々な条件で培養を試み、添加アンモニアがN2Oに安定的に変換される共培養系の確立を目指す。本研究では、ダイズ根圏N2O発生へのカビ脱窒の寄与・様式・削減策を明らかにするために、(1)根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、(2)硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、(3) 15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の寄与度評価、(4)非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性を明らかにすることを目的としている。平成26年度には、(3) 15N同位体のN2O分子偏在性解析によるカビ由来N2O発生の寄与度評価の研究が進み、補足データ取得のための実験も行い、現在論文執筆中である。平成27年度は、(1)根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、(2)硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、(4)非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性の実験を本格的に実施するために、予算の繰越を行った。平成27年度は、(1)根圏分離フザリウムの共脱窒ポテンシャル、(2)硝化細菌とフザリウムの共生体の形成と機能、(4)非脱窒型フザリウムによるN2O削減の可能性の実験を本格的に実施するために、試薬購入やFISHなどの顕微鏡観察のための人件費を計上している。