hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味覚受容体における味物質認識機構の解析

タンパク質の安定性と可溶性を考え、ATDをマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質として発現させた。hT1R2, hT1R3のそれぞれのATDのN末端側にMBPを配置し、2つのタンパク質の間にはTEVプロテアーゼ切断部位、さらに全体のN末端にヒスチジンタグ、C末端にFLAGタグを付加した融合タンパク質の発現系を構築した。培養温度を18°Cとし、Origami(DE3)にジスルフィド結合イソメラーゼ(DsbC)発現プラスミドを導入した大腸菌株において、目的タンパク質が可溶性画分に確認できた。hT1R2-ATDとhT1R3-ATDでは、hT1R3-ATDのほうが発現量が多かったので、以降の実験ではhT1R3-ATDとMBPの融合タンパク質を用いた。この融合タンパク質をヒスチジンタグに対するアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、プロテアーゼTEV処理によりMBPとhT1R3-ATDを切り離した。プロテアーゼ処理後に得られたT1R3-ATDの安定性は非常に低く、また濃縮も困難であった。T1R3-ATDの分子サイズをゲルろ過クロマトグラフィー、動的光散乱(DLS)、原子間力顕微鏡(AFM)の手段で解析したところ、予想されるサイズよりも遥かに大きいことが判明した。酵素学甘味物質と甘味受容体の分子相互作用解析を目指し、平成24年度に引き続き、甘味受容体の細胞外ドメイン(T1R3-ATD)の発現・精製・解析を試みた。T1R3-ATDとマルトース結合タンパク質(MBP)の融合タンパク質の間のリンカー配列を改変し、プロテアーゼ処理による切断効率の向上には成功したが、切断処理後のT1R3-ATDの安定性が低いという問題が生じた。また、T1R3-ATDの分子サイズの解析からは、分子がアグリゲーションを起こしている可能性が強く示唆された。将来的な甘味受容体と味物質の分子相互作用解析を目指し、平成24年度はヒト甘味受容体の細胞外ドメインの発現系構築を試みた。pET系のベクターを用いてhT1R2、hT1R3のそれぞれの細胞外ドメインのN末端側にマルトース結合蛋白質を配置し、2つの蛋白質の間にはTEVプロテアーゼ切断部位、さらに全体のN末端に(His)6タグ、C末端にFLAGタグを付加した融合蛋白質の発現ベクターを構築した。大腸菌Origami(DE3)にジスルフィド結合イソメラーゼ(DsbC)発現プラスミドを導入した菌においてこの融合蛋白質の発現を試み、目的蛋白質が可溶性画分に確認された。また、この発現系を用いて生産した融合蛋白質は、(His)6タグを用いたアフィニティクロマトグラフィ精製によってある程度精製されることが確認できた。しかしながら、TEVプロテアーゼ処理を行ったところ、融合蛋白質はTEVプロテアーゼによってほとんど切断されないことが判明した。味覚受容体の解析においてはマルトース結合蛋白質の除去が必要となるため、発現コンストラクトの再検討が必要な状況である。本年度は、甘味受容体へテロ二量体のうちのT1R3分子のN末端細胞外ドメイン(T1R3-ATD)の精製・解析を試みた。現在得られているT1R3-ATDの安定性が低く、また分子がアグリゲーションを起こしている可能性があることから、今年度は発現コンストラクトの再検討、界面活性剤の添加、マルトース結合タンパク質と融合した状態での機器測定を検討する予定である。平成24年度は、味覚受容体細胞外ドメインとマルトース結合蛋白質の融合蛋白質発現系の構築を行った。
地域型住宅モデルの地域適合プロセスに関する研究-住宅モデルの普及・定着と地域住宅設計者の役割-

全国各地で地域型住宅の開発が着実に進んでいる。地域型の住宅づくりの必要性は一定の社会的認知が得られるようになってきたといえる。ただし、これからの地域型の住宅づくりを継続的・安定的な形で進めていくために前提とすべき技術体系や組織体制のあり様については試行錯誤を繰り返している。このような状況の中で、開発・提案された地域型住宅モデルの地域への定着・普及に関わる地域住宅設計者への期待は大きい。本研究では、各地ですでに開発提案があり、その後一定の時間的経過のある地域型住宅開発事例の開発者を対象にアンケート調査を実施し、開発・提案された地域型住宅モデルの内容、その後の地域への普及・定着状況、地域の住宅生産システムに与えた影響・効果を明らかにした。また、地域の住宅モデルづくりに積極的に関わっている住宅設計者を対象に、地域の住宅生産の中で果たす多様な役割の実態調査を実施した。地域の設計事務所の設計者、大工・工務店の設計者など立場の違いによる役割・機能の違いを対比的に明らかにした。さらに、地域型住宅モデルとして特徴的な数タイプを抽出して、時系列的な分析を中心として、モデル住宅が地域の中に普及していく過程で中央の建築家、地元の設計者、地元の施工者が果たしてきた役割・効果・限界を明らかにした。以上の調査成果を踏まえ、多様な地域住宅設計者像の検討を行った。本研究は、提案・開発された多数の地域型住宅モデルが、どのような変容を経て地域の住宅生産システムの中に普及・定着していくのか、その影響と効果に着目している。とりわけ、開発のイニシャティブをとった中央の建築家やそれを地域の中で翻訳し展開した地元設計者および地元の施工者とのコミュニケーションの実態調査を通じて、地域住宅設計者の役割に検討を加えることをねらいとしている。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)地域型住宅モデルの地域適応に関する理論的検討(文献研究、理論研究)普及理論の検討から地域型住宅モデルの持つべき普及の一般的要件を定性的に明らかにした。住宅モデルが地域への定着をはかるための環境条件を具体的に住宅生産システム問題として展開する必要がある。(2)全国の地域型住宅モデルの地域への普及・定着プロセスの実態調査(調査研究)開発・提案された地域型住宅モデルの中で、実際に地域の中に一定量の普及・定着をみた富山県の八尾型住宅、福島県の喜多方型住宅に着目して、その定着プロセスを明らかにした。とりわけ、地域住宅生産のキーパーソンとして設計者の果たした役割の大きいことを示した。また、最近提案のあった群馬県新治型住宅について地域の住宅生産者および居住者調査をもとに今後の普及可能性を検討した。(3)曲型的な地域型住宅モデルの普及プロセスおける設計者の役割の実態調査(調査研究)富山県上平村の「克雪住宅」モデルの開発・普及過程の調査・分析を通じて中央の建築家と地元の設計者の協力関係が重要であることを明らかにした。地域性をどのように理解するか、その実現にどのような役割分担があったのかに着目して、両者のコミュニケーションプロセスを明らかにした。

さらに、地域型住宅モデルとして特徴的な数タイプを抽出して、時系列的な分析を中心として、モデル住宅が地域の中に普及していく過程で中央の建築家、地元の設計者、地元の施工者が果たしてきた役割・効果・限界を明らかにした。以上の調査成果を踏まえ、多様な地域住宅設計者像の検討を行った。
自己組織化メカニズムによるユーザ適応型ネットワーク制御システムの研究

近年の研究動向などにおいては,ストリーミングメディアサービスを実現するために,様々な手法を用いて,CPUやメモリ資源などの各種リソースを,適応的に割り当てる仕組みの検討が盛んである.また,提供されるストリーミングメディアコンテンツそのものについては,MPEG7により,従来のコンテンツに対して,「内容記述データ(メタデータ)に関する規約」が定められ,これによりストリーミングメディアコンテンツに対する内容ベースの検索が行えるようになった.しかし,これらの機構は,サービスを提供する側の立場に立ったいわば,管理側の都合を重視したものであり,一般のコンテンツ利用者/提供者から発生する要求に対して対処できる仕組みとなっていない.また,現在のインターネットに見られるように,不特定多数のユーザとサービスを対象としているため,非決定性・非形式性を含むものであり,継続性を維持しながら,リソースを最適配置するネットワーク体系になっていないのが現状である.そこで,研究代表者は,下記の2点に従って研究を実施した.・意味情報と嗜好情報に基づくP2Pシステムの提案と実装.本研究では,ブローカレスなピュア型P2Pネットワークを構築し,自らが情報配信者となる手法を提案・構築した.その際,利用者ユーザの嗜好情報に着目し,個人嗜好に基づいてパーソナル化を行うことでピアと自立させ,それらによる応答の連鎖によって,間接的に情報通信を行い,P2Pネットワークにおける情報の取捨選択をサポートした.・ポリシー選択型CDNプラットフォームの構成と検証広域なネットワーク上でCDNを用いるためのコストは高いという課題があり,CDNプラットフォームの最適化が必要である.そこで,コンテンツ配信にかかるコスト削減を目的としたポリシーを既存CDNに導入したP-CDNを提案・構築した.(1)QoSフロー/経路制御を統合的に行えるアーキテクチャの作成ユーザのネットワークに対する要求品質を十分に満たすように,オンデマンドに経路計算を行い,QOSPFのプロトコルを改良し,そのときにおける計算負荷を抑制するアルゴリズムを提案し,1要求あたりの平均応答時間が向上することを明らかにした.その提案手法は,サーバ側ルータが行う経路制御をクライアント側ルータが制御することで経路制御の分散化を行い,クライアント側ルータではQoS制御情報を含むルーティング情報をLRU方式によりキャッシュ化し,QOSPFで生成された経路情報を破棄せずにキュッシュに保存することで,利用者QoS要求に対して経路の再計算を削減するメカニズムである.また,本方式を用いることにより,大規模なネットワークにおいても1要求あたりの平均応答時間が向上することも明らかになった.(2)コンテンツ配信ネットワーク(CDN)の構築本CDNの特徴は,キャッシュサーバを用いたコンテンツ配信における「コスト削減」を目的としたもので,利益の多く生む場所の把握,利益の高いコンテンツの抽出,最適なサーバへの複製という3つの条件を満たすために,以下の手法を実現した.・ユーザクラスタリング方法としては,実験的に研究室/学科/大学のそれぞれに対して,ユーザの地域性・属性によってリクエストするコンテンツの種別やその頻度を計測し,グループ化を行った.・選択的コンテンツ抽出方法としては,キャッシュサーバにおけるログ情報を解析したところ,適切なリクエスト回数に達するまで,コンテンツの複製を行わないことに対する有効性を確認ができた.・最適サーバ探索方法として,上述したユーザクラスタリングの結果と,各キャッシュサーバとのラウンドトリップタイムを計算することで探索を行った.近年の研究動向などにおいては,ストリーミングメディアサービスを実現するために,様々な手法を用いて,CPUやメモリ資源などの各種リソースを,適応的に割り当てる仕組みの検討が盛んである.また,提供されるストリーミングメディアコンテンツそのものについては,MPEG7により,従来のコンテンツに対して,「内容記述データ(メタデータ)に関する規約」が定められ,これによりストリーミングメディアコンテンツに対する内容ベースの検索が行えるようになった.しかし,これらの機構は,サービスを提供する側の立場に立ったいわば,管理側の都合を重視したものであり,一般のコンテンツ利用者/提供者から発生する要求に対して対処できる仕組みとなっていない.また,現在のインターネットに見られるように,不特定多数のユーザとサービスを対象としているため,非決定性・非形式性を含むものであり,継続性を維持しながら,リソースを最適配置するネットワーク体系になっていないのが現状である.そこで,研究代表者は,下記の2点に従って研究を実施した.・意味情報と嗜好情報に基づくP2Pシステムの提案と実装.本研究では,ブローカレスなピュア型P2Pネットワークを構築し,自らが情報配信者となる手法を提案・構築した.その際,利用者ユーザの嗜好情報に着目し,個人嗜好に基づいてパーソナル化を行うことでピアと自立させ,それらによる応答の連鎖によって,間接的に情報通信を行い,P2Pネットワークにおける情報の取捨選択をサポートした.・ポリシー選択型CDNプラットフォームの構成と検証広域なネットワーク上でCDNを用いるためのコストは高いという課題があり,CDNプラットフォームの最適化が必要である.そこで,コンテンツ配信にかかるコスト削減を目的としたポリシーを既存CDNに導入したP-CDNを提案・構築した.
肺高血圧症の新規標的蛋白に関する基礎的・臨床的研究

肺動脈性肺高血圧症(PAH)は重篤かつ致死的であり、本質的治療薬の開発が待ち望まれている。PAHの血管平滑筋細胞は癌類似の増殖性を有し、肺動脈抵抗血管の狭小化を来す。そこで、患者由来肺動脈平滑筋細胞(PAH細胞)の網羅的遺伝子解析および各種のオミックス解析により新規病因蛋白の探索を進め、合成病因蛋白によるPAH細胞増殖性試験、血管平滑筋特異的遺伝子欠損マウスでの検証を行い、複数の新規病因蛋白を同定した。また、一部の病因蛋白は血漿中に分泌されることが分かり、患者血清中濃度が、予後予測能を有することが判明した。このように、PAH患者由来の臨床検体を用いた基礎研究の臨床応用研究を進めた。肺動脈性肺高血圧症(Pulmonary arterial hypertension, PAH)は、血管内皮機能低下・血管平滑筋細胞増殖・炎症細胞浸潤などが複雑に相互作用し、肺微小血管の壁肥厚・狭小化(肺血管リモデリング)が進行する致死的疾患である。早期診断は循環器専門医でも難しく、肺移植実施施設に紹介された時点で、既に終末期にあることも多い。重症患者を救う最終手段は依然として肺移植以外に無いが、ドナー数は限られ、移植まで間に合わない症例が多い。なかでも特発性肺動脈性肺高血圧症患者(IPAH)の多くは急速な進行を示し、高度の肺動脈リモデリングを示す。PAHは、依然として内科的根治療法のない致死性疾患である。東北大学病院は、長年にわたり、肺高血圧症に対する基礎的・臨床的研究を行ってきた。しかし、肺高血圧症治療薬の多剤併用療法によっても助けられない症例も依然多く、従来の肺血管拡張作用を標的にした治療法以外の新たな病因蛋白の探索と創薬が必要である。我々は、最近、当科にライブラリー化した患者由来肺組織や肺動脈血管平滑筋細胞を網羅的に解析して候補遺伝子・新規病因蛋白の探索を行い、新規病因蛋白としてを発見した。本研究では、この発見に基づき、全く新しい作用機序からの肺高血圧症の治療法の開発を目指している。これまで様々な治療薬の開発が進められてきたが、そのいずれも肺血管拡張作用を標的にしたものである。しかし、その多剤併用療法によっても治療効果が得られない症例も多い。肺血管リモデリングの基盤は肺微小血管平滑筋細胞の異常増殖であるが、この増殖抑制を標的とした治療薬開発により、より有効な治療薬開発が期待できる。従って、我々は、PAH由来血管平滑筋細胞から分泌される新規増殖因子のスクリーニングとそれを標的とする薬剤開発を目指すことを着想した。当科にライブラリー化した肺組織や血管平滑筋細胞を網羅的に解析し、PAH由来平滑筋細胞で特異的に発現・分泌される蛋白を対象に候補遺伝子・新規蛋白の選択・絞り込みを行い、全く新しいPAH病因蛋白を発見したことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。なかでも特発性肺動脈性肺高血圧症患者(IPAH)の多くは急速な進行を示し、高度の肺動脈リモデリングを示すため、内科的多剤併用療法によっても右心不全のコントロールに難渋し、若くして死亡する症例も多い。このようにPAHは、依然として内科的根治療法のない致死性疾患である。東北大学病院は、肺高血圧症・肺移植専門施設としての実績を有し、長年にわたり、肺高血圧症に対する基礎的・臨床的研究を行ってきた。しかし、肺高血圧症治療薬の多剤併用療法によっても助けられない症例も依然多く、従来の肺血管拡張作用を標的にした治療薬以外の新たな病因蛋白の探索と創薬が必要と考えられている。以上の背景を踏まえ、我々は最近、PAH患者由来組織の網羅的解析により新規病因蛋白の探索を行い、3種類の新規病因蛋白を発見した。3種類の新規蛋白は、PAH患者の肺組織(特に肺血管平滑筋細胞)に強い発現を示し、その合成蛋白は血管平滑筋細胞増殖作用を示した。また、平滑筋細胞特異的な遺伝子欠損マウスは慢性低酸素性の肺高血圧の発症の減弱を示した。本研究では、この発見に基づき、全く新しい作用機序からの肺高血圧症の治療薬のハイスループットスクリーニングを進めている。PAH領域において、これまで様々な治療薬の開発が進められてきたが、そのいずれも肺血管拡張作用を標的にしたものである。しかし、その多剤併用療法によっても十分な治療効果が得られない症例も多い。従って、本研究を進める切り口として、我々は、PAH由来血管平滑筋細胞から分泌される増殖因子のスクリーニングとそれを標的とする薬剤開発を目指すことを着想した。こうした切り口により、PAH患者由来の肺組織や血管平滑筋細胞を網羅的に解析し、PAH由来平滑筋細胞で特異的に発現・分泌される蛋白を対象に候補遺伝子・新規蛋白の選択・絞り込みを行い、全く新しいPAH病因蛋白3種類を見出した。

以上の手法による研究は順調に進んでいると考えられ、実際、マウスの肺高血圧モデルを用いた検証を行うことができたことから、進捗状況としては「おおむね順調に進展している」と考えられる。肺動脈性肺高血圧症(Pulmonary arterial hypertension, PAH)は、血管内皮機能低下・血管平滑筋細胞増殖・炎症細胞浸潤などが複雑に相互作用し、肺微小血管の壁肥厚・狭小化(肺血管リモデリング)が進行する致死的疾患である。早期診断は循環器専門医でも難しく、肺移植実施施設に紹介された時点で、既に終末期にあることも多い。重症患者を救う最終手段は依然として肺移植以外に無いが、ドナー数は限られ、移植まで間に合わない症例が多い。なかでも特発性肺動脈性肺高血圧症患者(IPAH)の多くは急速な進行を示し、高度の肺動脈リモデリングを示すため、内科的多剤併用療法によっても右心不全のコントロールに難渋し、若くして死亡する症例も多い。このようにPAHは、依然として内科的根治療法のない致死性疾患である。東北大学病院は、肺高血圧症・肺移植専門施設としての実績を有し、長年にわたり、肺高血圧症に対する基礎的・臨床的研究を行ってきた。しかし、肺高血圧症治療薬の多剤併用療法によっても助けられない症例も依然多く、従来の肺血管拡張作用を標的にした治療薬以外の新たな病因蛋白の探索と創薬が必要と考えられている。以上の背景を踏まえ、我々は最近、PAH患者由来組織の網羅的解析により新規病因蛋白の探索を行い、3種類の新規病因蛋白を発見した。3種類の新規蛋白は、PAH患者の肺組織(特に肺血管平滑筋細胞)に強い発現を示し、その合成蛋白は血管平滑筋細胞増殖作用を示した。また、平滑筋細胞特異的な遺伝子欠損マウスは慢性低酸素性の肺高血圧の発症の減弱を示した。本研究では、この発見に基づき、全く新しい作用機序からの肺高血圧症の治療薬のハイスループットスクリーニングを進めている。肺動脈性肺高血圧症(PAH)は重篤かつ致死的であり、本質的治療薬の開発が待ち望まれている。PAHの血管平滑筋細胞は癌類似の増殖性を有し、肺動脈抵抗血管の狭小化を来す。そこで、患者由来肺動脈平滑筋細胞(PAH細胞)の網羅的遺伝子解析および各種のオミックス解析により新規病因蛋白の探索を進め、合成病因蛋白によるPAH細胞増殖性試験、血管平滑筋特異的遺伝子欠損マウスでの検証を行い、複数の新規病因蛋白を同定した。また、一部の病因蛋白は血漿中に分泌されることが分かり、患者血清中濃度が、予後予測能を有することが判明した。このように、PAH患者由来の臨床検体を用いた基礎研究の臨床応用研究を進めた。最終的に絞り込まれたPAHの新規病因蛋白3種類に関して、血管平滑筋特異的遺伝子欠損マウスおよび過剰発現マウスを作成し、慢性低酸素性肺高血圧症モデルによる検討を行う。これらの動物実験は当科で継続的に行っており、既にそのノウハウも蓄積している。病因蛋白が動物実験でも証明された場合は、その病因蛋白の発現・分泌レベルを制御する薬剤のハイスループット・スクリーニング(HTS)を行う。米国や日本で承認済みの数千の薬剤ライブラリーに加えて、東北大学独自で臨床応用目的に開発した薬剤ライブラリーの中から有望な薬剤を検索することで、時間的・経済的に最も効率の良い方法を採用する。
ラット顎下腺発癌およびヒト唾液腺腫瘍における筋上皮様細胞の動態

唾液腺、乳腺、汗腺などの腺房細胞の周囲には筋上皮細胞が存在しこの細胞が分泌に何らかの関係があるのではないかといわれている。種々の唾液腺腫瘍において腺管様講構造とともに筋上皮の増殖が認められており、その由来について様々な検討がなされているが、その詳細については不明な点も多い。カルポニンは平滑筋細胞のアクチン、トロポミオシンの結合蛋白であり、筋上皮細胞のマーカーとして有用であることが知られている。今回ラット唾液腺の化学発癌過程における筋上皮の関与を検索するためにカルポニンの局在を発癌までの経時的変化を比較検討した。正常顎下腺ではカルポニンは腺房および介在部導管周囲の筋上皮細胞および血管平滑筋に陽性に示した。発癌剤埋入後、短期間では萎縮した腺細胞周囲に陽性細胞を認め、その後発癌剤周囲に発生する前癌病変と考えられる重層扁平上皮層では、陰性を示したが、その外側に増殖する小さな導管様構造の周囲にはカルポニン陽性細胞を認めた。また癌腫形成後も扁平上皮化した部分では陰性であり、腺管状に増殖する部分では最外周の細胞に陽性を示した。腫瘍における腺管状構造の形成には胞巣最外周のカルポニン陽性細胞の配列が必要であろうと考えられた。これらの結果よりカルポニン陽性細胞の存在が腫瘍細胞巣の形態と関係することが示唆された。以上を第46回日本口腔外科学会総会で報告した。ラットの顎下腺体内に1%DMBA/オリーブ油を含ませたスポンジを埋入して作成した顎下腺癌を用いカルポニン(CAL)をマーカーとして免疫組織化学的に筋上皮細胞の動態を検討した。CALは扁平上皮様構造を示す部分では陰性であるが導管様構造を示す部分では外周の細胞に陽性を示し、しばしば導管様構造の周囲の結合組織内にもCAL陽性細胞が認められた。現在、発癌剤埋入後の週齢を追ってその詳細を検討中である。臨床標本において筋上皮のマーカーであるCALと導管基底細胞のマーカーであるメタルチオネイン(MT)を用い、閉塞性唾液腺炎について免疫組織化学的に検討した。その結果閉塞性変化を被った筋上皮細胞と導管様構造物の基底側細胞はCAL、MTの両者に陽性を示した。また、閉塞した唾液腺の平滑筋細胞ではCALのみが陽性反応を示し、増殖核抗原(PCNA)は充実性胞巣および腺管状構造を示す腫瘍細胞で陽性率が高く、索状配列を示す部分ではほとんど陽性を示さないことも確認された。これらの結果より筋上皮細胞や導管基底細胞が閉塞性変化を被ることで幼弱化することが示唆された。また、左側口蓋に発生した比較的大きな多形性低悪性度腺癌を経験し、その腫瘍細胞においてS100蛋白、KL1ケラチン、上皮膜抗原(EMA)、癌胎児性抗原(CEA)、bcl2癌抑制遺伝子産物の発現が免疫組織化学的にも認められるが、c-erbB-2およびK-rasの再構成や増幅を認めず、p53のエクソン5、6、7、8における変異は認められないことを岐阜歯科学会誌に報告した。
ガドリニウム刺激による皮膚線維芽細胞のリプログラミングの可能性

腎機能低下患者にMRI検査時のガドリニウム(Gd)の投与によって生じる腎性全身性線維症を対象にして病態形成の検討をおこなったところ、培養線維芽細胞の増殖能の上昇がみられることと、病変局所の真皮において、CD34陽性の線維芽細胞が多数みられることを見出した。上記の研究結果はGdの刺激が線維芽細胞をある程度の未分化方向へ巻き戻す可能性を示している。本研究ではGd添加下で線維芽細胞を培養し、CD34の発現増強がみられること、未分化状態に関連する遺伝子、タンパク発現について検討する。さらに、そこから培地の環境を変化させ、transdifferentiationを起こす可能性についても検討する。
PINK1-Parkin介在性マイトファジーに関与する新規分子の機能解析

ショウジョウバエにおいて、PINK1及びParkinノックアウトでは、胸部ミトコンドリア変性が観察される。これらの表現型を指標として、PINK1とPUBP1との遺伝学的相互作用の有無を確認した。まず、PINK1ノックアウトハエではミトコンドリア局在性GFPシグナルによるミトコンドリア変性に伴う形態変化が観察されるが、PINK1ノックアウトとPUBP1ノックダウン(RNAi)、または、PUBP1を過剰発現させたショウジョウバエを掛け合わせた子において、いずれも変化は見られなかった。また、Parkinノックアウトとの掛け合わせにおいても同様の結果であった。すなわち、ミトコンドリア変性の改善は見られなかった。次にミトコンドリアの機能指標としてATP産生量を測定したが、有意な変化は見られなかった。以上の結果から、PINK1-Parkin経路マイトファジーにおける遺伝学的相互作用はなく、主要な役割を担っていないことが示された。しかし、PINK1、Parkinノックアウトによるミトコンドリア変性は劇的であることから、PINK1-Parkinシグナル伝達を制御するような分子においては改善がみられない可能性も考えられる。また、PUBP1のみでのノックダウンにおいてミトコンドリア形態に影響が見られたことから、PUBP1がミトコンドリア機能に関与する可能性が示唆された。今後は、basalのマイトファジーやオートファジーを指標として、PUBP1が影響するかどうかを検討する予定である。昨年度に引き続き、PINK1-Parkinシグナル伝達におけるPUBP1の生理的意義を検討する予定である。マイトファジー及び、オートファジーを生体内で観察できるショウジョウバエを樹立しているので、これらに関してPUBP1の影響を観察する。また、iPS由来ドパミン神経細胞におけるPUBP1の役割についても検討する予定である。まず、PUBP1ノックアウト培養細胞を用いてPINK1-Parkinマイトファジーを正に制御していることを見出した。具体的には、ミトコンドリア外膜タンパク群(TOM20、Mfn1など)の発現量を指標として、野生型と比較し、PUBP1ノックアウト細胞ではPINK1-Parkinマイトファジーが遅延する結果を得た。また、オートファゴソーム形成の場となる小胞体部位のマーカータンパク質DFCP1の出現頻度を確認した結果、野生型と比較して、PUBP1ノックアウト細胞においてオメガソーム様の紐状のDFCP1シグナルが多く見られた。次に、PUBP1がFYVEドメインを持つことから、オートファゴソーム膜形成に関与する可能性があるため、PUBP1ノックアウト細胞におけるオートファゴソームの形態を観察したところ、野生型と同様であることを確認した。すなわち、PUBP1はオートファゴソーム膜形成に関与しない。先行論文において、PUBP1は飢餓状態によるオートファジー誘導の際、リン酸化修飾されることが報告されている。そこで、PINK1-Parkinマイトファジーに関与するキナーゼを過剰発現させた結果、通常状態においてもPUBP1のリン酸化修飾が観察されることを見出した。以上の結果から、PUBP1はPINK1-Parkinリン酸化シグナル伝達に関与し、オートファゴソーム膜形成過程の上流で機能する可能性が示唆された。現在、申請時の予定通り、計画を進められている。PUBP1がPINK1-Parkinシグナル伝達に分子レベルで関与することを示し、生体レベルで検証する準備もできている。また、PINK1-ParkinマイトファジーがPINK1、及びParkinに連鎖するパーキンソン病発症に関与することをiPS由来ドパミン神経細胞で示し、国際論文としてまとめることができている。平成30年度では、PINK1-Parkinシグナル伝達におけるPUBP1の生理的意義を検討する予定である。生体内においてPUBP1がPINK1-Parkinマイトファジーに関与するかどうかを検討するために、PUBP1ノックダウン(RNAi)及び、過剰発現したショウジョウバエを入手している。これらのハエを用いてPINK1、Parkinと遺伝学的相互作用があるかどうかを検討する。

また、PUBP1ノックダウン(RNAi)とオートファジーを生体内で観察できるGFP-RFP-ATG8が同時に発現するショウジョウバエを樹立しているので、オートファジーやマイトファジーにおけるPUBP1の生理学的意義を明らかにする予定である。また、培養細胞内において、PINK1-Parkinに関与するキナーゼを発現させるとPUBP1のリン酸化修飾されることを見出している。今後、このリン酸化修飾部位を同定し、PUBP1のリン酸化修飾がPINK1-Parkinマイトファジーに関与するかどうかを確認する。必要であれば、ショウジョウバエを用いてその生理学的意義を検討する。昨年度に引き続き、PINK1-Parkinシグナル伝達におけるPUBP1の生理的意義を検討する予定である。マイトファジー及び、オートファジーを生体内で観察できるショウジョウバエを樹立しているので、これらに関してPUBP1の影響を観察する。また、iPS由来ドパミン神経細胞におけるPUBP1の役割についても検討する予定である。
ガラクトマンナン多糖を用いた環境適合型高吸水性ヒドロゲルの調製と熱的性質

マメ科植物の種子から抽出される多糖であるガラクトマンナンは、安価で、高粘度であることから、工業的に生産されている。ガラクトマンナン多糖はマンノース主鎖にガラクトース側鎖を有する化学構造をしているが、側鎖の頻度の異なるグアーガム、タラガム、ローカストビーンガムなどがあり、これらはゲル化、液晶化などの高次構造変化がみられる。本研究では、側鎖の頻度の異なるガラクトマンナン多糖を用いてヒドロゲルの調製方法を検討した。示差走査熱量分析および落球法により、得られたゲルの熱的性質を明らかにすることを目的とした。各種ガラクトマンナン多糖を用いてヒドロゲルが調製可能か検討したところ、凍結-解凍を繰返すことにより、ローカストビーンガムはヒドロゲルを形成することが明らかとなった。ガラクトース側鎖の頻度の高いグアーガム、タラガムなどはゲルを形成しなかった。この結果から側鎖の頻度がゲル形成に寄与することが明らかとなった。ローカストビーンガムを用いて、冷却速度を変えて凍結させ、ゲル化させたところ、冷却速度により異なるジャンクションゾーンを形成することが分かった。示差走査熱量分析(DSC)でゲル中の氷の構造を検討したところ、冷却速度により束縛水量が異なり、ゲル中の氷の構造が異なる結果が得られた。凍結-解凍法により調製したローカストビーンガムヒドロゲルのゲル-ゾル転移を検討したところ、ローカストビーンガムヒドロゲルはゾル化せず、熱不可逆性ゲルであることが分かった。この結果から熱的に安定な構造を形成していることが示唆される。ガラクトマンナンとκ-カラギーナンを混合してヒドロゲルを調製すると、熱可逆性のゲルが得られた。混合するガラクトマンナンの側鎖の頻度によりゲル-ゾル転移温度が異なることが分かった。ガラクトマンナン多糖はマンノース主鎖のガラクトース側鎖を有する化学構造をしているが、側鎖の頻度の異なるグアーガム、タラガム、ローカストビーンガムなどがあり、これらはゲル化、液晶化などの高次構造変化がみられる。本研究では、側鎖の頻度の異なるガラクトマンナン多糖を用いて物理・化学架橋ヒドロゲルの調製方法を検討した。示差走査熱量分析により、得られたゲルの熱的性質を明らかにし、さらに膨潤挙動を検討することを目的とした.各種ガラクトマンナン多糖を用いてヒドロゲルが調製可能か検討したところ、凍結-解凍を繰返すことにより、ローカストビーンガムはヒドロゲルを形成することが明らかとなった。
ナノ磁性微粒子を用いた医用診断のための高精度磁場・磁性流体シミュレーションの開発

高精度な磁場・磁性流体シミュレーション・ツールの開発を行なった.具体的なツール開発としては,磁場と磁性流体のマルチフィジックス・シミュレーション・ツールの開発を行ない,ナノスケール磁性微粒子と外部コイルの高精度マルチスケール・シミュレーション・ツールの開発を行なった.開発したシミュレーション・ツールの精度を実験と比較することで検証を行なった.さらに,シミュレーションの高速化を目指し,並列化計算への対応を図った.これにより,高速に高精度な磁場・磁性流体シミュレーションが行えるようになった.高精度な磁場・磁性流体シミュレーション・ツールの開発を行なった.具体的なツール開発としては,磁場と磁性流体のマルチフィジックス・シミュレーション・ツールの開発を行ない,ナノスケール磁性微粒子と外部コイルの高精度マルチスケール・シミュレーション・ツールの開発を行なった.開発したシミュレーション・ツールの精度を実験と比較することで検証を行なった.さらに,シミュレーションの高速化を目指し,並列化計算への対応を図った.これにより,高速に高精度な磁場・磁性流体シミュレーションが行えるようになった.主に磁場と磁性流体問題のシミュレーションの高精度化に関する研究を行ってきた.すでに有限要素法による磁場と磁性流体問題のマルチフィジックス・シミュレーション・コードを開発してきたが,マルチスケール問題を解くための十分な精度は得られない上に,計算時間・使用メモリ容量にも大きな問題がある.これは商用ソフトにも同様のことが言える.そこで,解析手法として大規模解析に有力とされている高速多重極展開法を使用することで,マルチスケール問題の解決に取り組んだ.このように微小(局所)空間から大域的空間までのマルチスケールを扱う問題の解法は注目を浴びており,大変に価値ある研究である.高速多重極展開法は,本来は,磁気ソースなどが広範囲に点状に分散しているときに有効な手法である.しかし,本研究では点状に分散している問題から発展させ,外部マグネット(非点状物)と磁性微粒子(点状物)の磁場問題に高速多重極展開法を応用し,マルチスケール問題を解決した.さらに,ナノワイヤーなどの線状物質が解析を困難にしており, 3次元解析ではより高速化が求められる.また,流体解析に有限体積法を利用することで,解析の安定化をはかり,より精度の良い解析を行えるようにした.実験結果と比較したが, 2次元での比較は比較的よく一致するが, 3次元では一部相違が見られた.また, 2種類の磁性微粒子が存在するときのシミュレーション・コードの開発が必要であるが,現時点では,精度のよい解析が行えていない.主に磁場と磁性流体問題のシミュレーションの高精度化および高速化に関する研究を行ってきた.すでに有限要素法などによる磁場と磁性流体問題のマルチフィジックス・シミュレーション・コードを開発してきたが,マルチスケール問題を解くための十分な精度は得られない上に,計算時間・使用メモリ容量にも大きな問題がある.これは商用ソフトにも同様のことが言える.そこで,高速化に関してOpen MPを利用することで,計算時間の短時間化に取り組んだ.Open MPだけでは,23倍程度の高速しか図れず,以前として問題は残っているが,まずは高速化を達成できた.しかし,今後はGPGPUなどの使用により,さらなる高速化を達成することで,高解像で高精度なシミュレーションが実現できることが望まれる.さらに,ナノワイヤーなどの線状物質が解析を困難にしており,3次元解析ではさらなる高速化が求められる.また,流体解析に有限体積法を利用することで,解析の安定化をはかり,より精度の良い解析を行えていたが,より高精度化を目的として有限要素法による流体解析シミュレーション・コードを新たに構築した.実験結果と比較したが,3次元では一部相違が見られていたが,実験モデル(チャネル形状)と実験の相違を埋めることで改善が見られた.また,2種類の磁性微粒子が存在するときのシミュレーション・コードの開発が必要であるが,現時点では,精度の良い解析がまだ行えていない.主に磁場と磁性流体のシミュレーションの高精度化と高速化に関する研究を行なってきた.これまでに開発してきた磁気カラムのシミュレーションを行なった結果,医用診断のための液体磁気クロマトグラフィーに適していないことが,開発したシミュレーション・ツールから分かった.開発してきた磁気カラムは,磁性流体の進行方向に対して,磁気カラム内の磁場勾配は正負が交互に発生しており,磁性流体が蛇行する原因を作っていた.これでは,効果的な磁気分離が行えないことが,開発してきたシミュレーション・ツールから判断できるようになった.そこで,磁気カラム内で磁場勾配が上下で正負になるような,新しい磁気カラムを開発してきた磁場・磁性流体シミュレーション・ツールを使用して設計した.今後は,実験で新しく設計した磁気カラムの性能を検証する.また,磁気分離をシミュレーションするために,2種類の磁性微粒子を扱えるようにシミュレーション・ツールの改善を行なってきた.まだ,計算時間に問題点があるが,2種類の磁性微粒子をシミュレーションで扱えるようになり,高精度な磁場・磁性流体のシミュレーションの開発に成功した.しかし,2種類の磁性微粒子の相互作用など,まだミクロレベルでの磁気的挙動が明らかになっておらず,今後は,実験とシミュレーションの比較により磁気的挙動を明らかにする必要がある当該年度の成果としては,メゾスコッピクレベルでの磁場・磁性流体のシミュレーションが高速かつ高精度に行えるようになった.
生体試料中睡眠薬のスクリーニング並びに定性/定量分析の迅速化に関する研究

生体試料(尿、血液、臓器等)中の睡眠薬の分析は、事件の真相解明への大きな手助けとなるため、殺人、レイプ及び昏睡強盗等の重要犯罪事案をはじめとして、鑑定嘱託される件数は非常に多く、そのうえ緊急を要するケースが多いため、迅速でスクリーニング的に行える検査法が強く求められている。本研究の目的は、わが国で流通する全ての睡眠薬及びその代謝物(抱合体を含む計80種類以上)を対象として、1時間以内にスクリーニングから定性及び定量が可能となる分析システムを構築することであった。今回の分析法構築に際し、分析機器(LC-MS-MS)としては、アプライドバイオシステムズ社製API Q TRAP 3200を用いた。分析対象とした睡眠薬及び抱合体を除く代謝物(計70種程度)については、標準品を用いてMS-MS条件を最適化し、プロダクトイオンスペクトル-ライブラリを構築した。トリアゾラム、エチゾラム、ブロチゾラム、アルプラゾラム、ブロマゼパム及びオキサゼパム等の睡眠薬成分のように、ほとんどが抱合代謝物として尿中から排泄されるようなものについては、実際の使用者尿を用いて、MS-MS条件の最適化を実施した。これら薬物/代謝物の抽出条件を検討したところ、メタノールによる除タンパク処理法により、抱合代謝物を含め、良好な分析結果が得られた。抽出及び濃縮操作の所要時間は概ね20分程度、LC-MS-MSによる分析及び解析に要する時間は1検体約30分程度となった。本研究で確立した分析法により、約80種類の薬物/代謝物を分析対象として、1時間以内に検査することが可能となった。但し、フルラゼパム及びプラゼパム等数種の睡眠薬の抱合代謝物については、MS-MS条件の最適化が未実施のため、ヒト肝ミクロゾーム等を用いたin vitroでの合成を行い、随時プロダクトイオンスペクトル-ライブラリに追加していく予定である。
数値シミュレーションによる超臨界マイクロプラズマ放電機構の解明

超臨界流体中の微小平行平板放電において、絶縁破壊電圧が臨界点において降下することが実験的に確認されている。本研究では、この現象を説明する理論を提唱し、数値シミュレーションを用いて、一般的に、高密度媒体中における絶縁破壊現象を解析する手法を確立した。超臨界状態においては、我々の3次元MDシミュレーションが示すように、流体中に原子のクラスターと小さな空隙(マイクロキャビティ)が生成される。この際、そのマイクロキャビィにおいて電子が十分加速されることにより、イオン化に必要な運動エネルギーを、背景流体の平均的な密度が比較的高いにもかかわらず得られる。このため、臨界点近傍においてイオン化率(すなわち第一タウンゼント係数)が増大する。このイオン化率の上昇値は、背景流体の原子(分子)配位に依存しており、我々は、分子動力学シミュレーションを用いて、モデル流体の臨界点近傍において、このようなマイクロキャビティ構造をもとめ、この与えられた構造にたいして、一様電場のもとにおける電子衝突のシミュレーションを行い、電子の速度分布関数(エネルギー分布関数)やその他の衝突の関係する物理量の測定をおこなった。第一タウンゼント係数は、過去の研究から、気体のように、密度が低い場合と、液体のように密度が高い場合で、そのN/E(流体密度Nと電場Eの比)依存性が異なることが知られている。これは第一タウンゼント係数が液体原子や分子の構造因子に依存するためであるが、本研究では、電子衝突に関する直接数値シミュレーションにより、第一タウンゼント係数を計算する手法を確立した。現在、これらの成果を投稿論文にまとめている。高圧高温の中性である超臨界流体を電離することにより得られるプラズマ放電においては、超臨界状態における原子のクラスタリング等、超臨界流体に特有の現象のために、放電機構が通常の気体放電機構と異なる。本研究は、このような超臨界流体における堆積の小さなプラズマ(マイクロプラズマ)の放電機構を理論と数値シミュレーションを用いて解析し、その基礎的性質を明らかにすることを目的とする。とくに、平成16年度は、微小ギャップにおける超臨界流体中の放電実験において報告されている放電開始電圧が大きく降下する観測事実説明する理論モデルを構築した。このモデルは、超臨界状態において、流体中に原子のクラスターと小さな空隙(マイクロキャビティ)が生成され、そのマイクロキャビィにおいて電子が十分加速されることにより、イオン化に必要な運動エネルギーを、背景流体の平均的な密度が比較的高いにもかかわらず得られることが、臨界点近傍においてイオン化率(すなわち第一タウンゼント係数)が増大する主たる理由という仮説に基づいている。いうなれば、超臨界状態においては、マイクロキャビティという電子の通りやすい道(電子チャネル)が、そこで電子が衝突なく加速されること(電子チャネリング)により、イオン化率が上昇する。このイオン化率の上昇値は、背景流体の原子(分子)配位に依存しいる。現在、分子動力学シミュレーションを用いて、超臨界流体の熱平衡状態と、イオン率などのプラズマパラメータの関係を定量的に調べている。
ゲノムDNAの精密有機化学合成

本研究は、10万塩基対以上の細菌のゲノムDNAを迅速かつ高純度で化学合成することを最終目的としている。汎用されているホスホロアミダイトDNA合成では、固相担体上に一塩基ずつ鎖伸長を行い、目的のオリゴヌクレオチドを得ている。しかし、数十量体のDNAオリゴマーであれば、迅速かつ高純度で安定供給が可能であるが、数百量体のDNAオリゴマーになると鎖伸長効率やデブリネーションの問題から化学合成が困難である。そこで、安定供給できる50-100量体の合成DNAオリゴマーを縮合ブロックとし、固相担体上でフラグメント合成を行うことで、10万塩基以上のDNA鎖の合成を目指して研究を進めてきた。まず、10量体程度のオリゴヌクレオチドの末端をホスホロアミダイト化、もしくはH-ホスホネート化することで縮合ブロックを合成し、その後、別途合成したオリゴヌクレオチドと様々な条件下で縮合反応を検討した。しかし、予期に反してその縮合反応効率は非常に低く、この縮合反応の繰り返しにより、非常に長いDNAの合成は困難であることが分かった。そこで、この縮合反応を効率よく行うために、縮合ブッロクを一本鎖DNAリガーゼを用いて連結させる反応を考案した。この時、縮合ブッロクを順序よく連結させるためには、オリゴヌクレオチドの5'位水酸基にピロリン酸結合を介しアデノシンを導入する必要がある。このアデニル化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトユニットを過剰のHOBtによって、活性化・リン酸転位反応を経て調整したリン酸化試薬を用いることで、世界で初めて、短時間に効率よく合成することに成功した。今後は、この縮合ブッロクを用いた酵素的連結反応を行い、長鎖DNAの合成を行っていく予定である。数十量体のDNAオリゴマーであれば、迅速かつ高純度で安定供給が可能であるが、数百量体のDNAオリゴマーになると鎖伸長効率やデプリネーションの問題から化学合成が困難である。そこで、安定供給できる50100量体の合成DNAオリゴマーを縮合ブロックとし、固相担体上でフラグメント合成を行うことで、10万塩基以上のDNA鎖の合成を目指して研究を進めてきた。長鎖DNAオリゴマー同士の縮合効率を極限まで高めるために、強い磁性をもつナノビーズを用いたDNA合成の検討をおこなった。この磁性ビーズは粒径が200nmと非常に小さく、DNA固相合成の固相担体として汎用されてCPG(粒径200μm)を用いた縮合よりも分子の衝突確率を高めると期待される。このナノビーズに担持したチミジンの5'水酸基を遊離にした後、3'ホスホロアミダイトユニットを用いて縮合をおこなったところ、非常に高い縮合効率ならびに単離収率で目的のTpTダイマーの合成に成功した。次に、この手法を長鎖のオリゴマー合成に応用するために、DNAオリゴマーのホスホロアミダイトユニットへの変換を試みた。当研究室で開発した中性条件下除去可能なシリルリンカーを用いて、リン酸基の保護基をのこしたDNAオリゴマーを合成し、ホスホロアミダイト化をおこなった。しかし、長鎖のDNAホスホロアミダイト化合物は容易に加水分解を受けてしまうため、単離精製が非常に困難であった。現在は、縮合ユニットをホスホロアミダイト体から、化学的に非常に安定なH-ホスホネート体へと変更し、長鎖DNA縮合ブッロクの合成とそれを用いた縮合条件の検討を行っている。

このアデニル化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトユニットを過剰のHOBtによって、活性化・リン酸転位反応を経て調整したリン酸化試薬を用いることで、世界で初めて、短時間に効率よく合成することに成功した。今後は、この縮合ブッロクを用いた酵素的連結反応を行い、長鎖DNAの合成を行っていく予定である。
SRKラットの三叉神経運動核、顔面神経核、疑核ニューロンの細胞移動障害

SRKラットは常染色体劣性遺伝性の神経奇形ラットであり、振戦、歩行失調、躯幹を捻るような異常運動を特徴とする。当該研究期間における成果は以下の如くである。HRP(ワサビ過酸化酵素)をSRKラットの脊髄に注入したところ、錐体路ニューロンが大脳皮質の垂直方向に異所性に分布することより、SRKラットではリーラーマウスと同様の大脳皮質異常があることがわかった(Ikeda and Terashima,1997)。この奇形ラットでは、大脳皮質の細胞構築異常の他にも海馬の細胞構築にも異常が認められており(Woodhams and Terashima,in press)、さらに嗅球、蝸牛神経背側核、小脳等の皮質構築を特徴とする領域や、顔面神経核、疑核、三叉神経運動核にもリーラーに類似する細胞構築異常が見つけることができた(Fujimoto et al.,1998)。またリーラーマウスでは海馬や上丘に回路異常があるが、SRKラットにおいても同様の回路異常がある(Woodhams and Terashima,1999)。リーラーマウスの原因遺伝子リーリンが同定された1995年を前後にして、さまざまなリーラーフェノタイプ動物が見つかってきた。スクランブラーマウス、ヨタリマウス、cdk-5ノックアウトマウス、p35ノックアウトマウスなどである。このようなリーラーフェノタイプ動物の原因遺伝子を探求することにより、大脳皮質の層構造ができる過程に関与するメカニズムや、大脳皮質の入出力線維の回路形成の分子メカニズムが明らかとなる。それ故、SRKラットの原因遺伝子を解明し、この奇形ラットがこのようなリーラーフェノタイプ動物の中でどのような位置を占めるか明らかにすることために、SRKラットの分子生物学的解析の一端としてリーラーの原因遺伝子リーリンの発現をノザンおよびin situ hybridization法により検討した。またリーリンがコードするリーリン蛋白の抗体により免疫組織化学的に検討した。結論的にいえば、SRKラットはリーリン遺伝子の異常であることが判明した。Shaking Rat Kawasaki(SRKラット)は、川崎市にある財)実験動物中央研究所のウイスター系ラットのコロニーに発見された常染色体劣性遺伝性の神経奇形ラットで、振戦、捩じるような異常運動、歩行障害等の小脳性運動失調を示す。このミュータントラットは、組織学的にみて極めてリーラー奇形マウスに類似する。もしこのSRKラットの異常が、マウス・リーラーと同様にリーリン遺伝子の欠損によるものか、あるいはリーリン蛋白に対する受容体をコードする未知の遺伝子の異常であるならば、SRKラットは、神経芽細胞の移動メカニズムを明らかにする上で極めて重要なモデル動物になりうる。特に、咀嚼に関わる口腔・顔面領域の筋を支配する運動ニューロン群(orofacial motoneurons)の細胞移動のメカニズムの研究は全く未開な分野なので、リーラーマウス、SRKラットは特に有用な実験動物になりうることが期待される。本研究は、正常およびSRKラット(成体)の三叉神経運動核、顔面神経核、疑核の細胞構築ををそれぞれ逆行性に標識し、標識ニューロンの形態と分布を比較して、SRKラットの上記神経核に異常が有るかどうかを調べた。

成体正常ラットおよびSRKラットの咀嚼筋(開口筋として顎二腹筋前腹、顎舌筋;閉口筋として咬筋、側頭筋)、顔面筋(鼻唇筋、オトガイ筋、後耳介筋,顎二腹筋後腹)、腹部食道にワサビ過酸化酵素(Horseradish Peroxidase;HRP)を微量注入し、それぞれ三叉神経運動核、顔面神経核、疑核の運動ニューロンを逆行性標識し、HRP組織化学(TMB;Mesulam法)により標識ニューロンを証明した。SRKラットにおいて、標識顔面神経核ニューロンと疑核ニューロンは背腹方向に広く広がった。同様の結果が、LacZ組換えアデノウイルスを用いた標識法においても得られた。Shaking Rat Kawasaki(SRKラット)は、実験動物中央研究所のウイスター系ラットのコロニーに発見された常染色体劣性遺伝性の神経奇形ラットで、小脳性運動失調を示す。一方、ヨタリマウスは、inositol-1,4,5-triphosphateに対する受容体遺伝子の標的組換えマウスを作成する過程で生じた奇形マウスで、歩行失調、振戦等の運動性失調を特徴とする。SRKラット、ヨタリマウスともにリーラーマウスと同様の皮質構築異常を呈する。リーラーマウスでは脳幹の神経核、たとえば顔面神経核、疑核、三叉神経運動核の細胞構築異常があることが知られているが、SRKラット、ヨタリマウスにおいてもこれらの神経核に異常があるかどうか不明であるので検討した。SRKラット、ヨタリマウス、対照動物の咀嚼筋(開口筋として顎二腹筋前腹、顎舌筋;閉口筋として咬筋、側頭筋)、顔面筋(鼻唇筋、オトガイ筋、後耳介筋、顎二腹筋後腹)、腹部食道にHRPを微量注入し、それぞれ三叉神経運動核、顔面神経核、疑核の運動ニューロンを逆行性標識し、HRP組織化学(TMB;Mesulam法)により標識ニューロンを証明した。SRKラット、ヨタリマウスともに、顔面神経核の外側亜核に分布する標識ニューロン群が、背腹方向に広く分布していた。また両ミュータント動物ともに腹部食道の横紋筋を支配する疑核ニューロンが、正常位置(いわゆるcompact formation)から第四脳室底に至るまで広く分布していた。三叉神経運動核については、大きな細胞構築異常を認めなかった。咀嚼に関わる口腔・顔面領域の筋を支配する運動ニューロン群の細胞移動障害が疑われるリーラーマウス、SRKラット、ヨタリマウスは、これらの神経核ニューロンの細胞移動のメカニズム解明に有用な実験動物になりうることが期待される。Shaking Rat Kawasaki (SRKラット)は、川崎市にある財)実験動物中央研究所のウイスター系ラットのコロニーに発見された常染色体劣性遺伝性の神経奇形ラットで、振戦、捩じるような異常運動、歩行障害等の小脳性運動失調を示す。一方、ヨタリマウスはinositol-1,4,5-triphosphateに対する受容体遺伝子の標的組換えマウスを作成する過程で生じた奇形マウスで、歩行失調、振戦等の運動性失調を特徴とする。リーラーマウスでは脳幹の神経核、たとえば顔面神経核、疑核、三叉神経運動核の細胞構築異常があることが知られている。SRKラット、ヨタリマウスにおいてもこれらの神経核に異常があるかどうか検討した。SRKラット、ヨタリマウス、対照動物の咀嚼筋(開口筋として顎二腹筋前腹、顎舌筋;