hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不飽和状態の岩石-水反応における水膜の役割

岩石の間隙を濡らす水膜を介した反応や物質移動がどのように起こるかを調べるために,間隙が水で満たされた飽和状態と,不飽和状態の両方において,Berea砂岩に通水して元素の溶解量を比較した.水膜を介した溶解が十分に起これば,不飽和・飽和状態の溶解速度の差は生じないと予測されたが,実際には不飽和状態のSiの溶解速度は飽和状態の50%であった.このような溶解速度の差が生じない別の砂岩との比較から,水膜を介した溶解の起こりやすさには,間隙表面の粗さが大きく影響すると考えられる.地表付近では,降水・排水・乾燥が断続的に生じ,岩石の間隙中は水と空気が混在した不飽和状態になる.鉱物と水が接触すると溶解や沈殿などの反応が起こるが,間隙に空気が入っている場合でも間隙表面には水膜が存在し,その水膜中で反応が進む可能性が指摘されている.本研究では,岩石内部で水膜がどのような状態で存在し,それを介した反応がどのように進行するかを明らかにすることを目的としている.多孔質な流紋岩のコア試料を用意し,間隙を予め水で飽和させた場合と,試料を乾燥させて間隙に水が入っていない場合のそれぞれにおいて,試料中に純水を一定水圧下で透過させて溶解挙動を調べる「透水溶解実験」を行った.乾燥試料に水を流した場合は,一部の間隙には水が浸入するが全ての間隙が水で満たされることはなく,不飽和状態になった.岩石内部では,水で満たされた部分と水膜で覆われた部分とで鉱物の溶解が起こり,溶出した元素を含んだ溶液が岩石から流出する.飽和状態,不飽和状態のそれぞれについて,流出した溶液中の元素濃度を測定して溶解量を調べた.また,不飽和状態の実験では,ときどき試料の重量を測定して含水量を算出し,間隙が水で満たされる割合(水飽和率)の経時変化も調べた.不飽和/飽和反応面積比は,不飽和状態で得られる溶解速度を飽和状態で得られる値で割ることにより算出できる.反応開始後14日が経過した時点において,反応面積比は61-83%であったのに対し,水飽和率は48%であった.反応面積比が水飽和率よりも大きいことから,少なくとも間隙表面全体の13-35%においては水膜を介した反応が起こっていると推定された.平成25年度までの研究で,不飽和状態の岩石-水反応における水膜の役割を調べるための透水-溶解実験の手順や解析手法がほぼ完成に至った.これを基に,平成26年度は,前年度に用いた流紋岩以外の岩石として,岩石の透水性の研究でよく用いられる米国Berea産の砂岩を用いて,透水-溶解実験を行った.この砂岩は,石英が主体であり,その他,長石,Ca・Mgの炭酸塩鉱物,粘土鉱物等が含まれている.実験では,まず不飽和状態として,乾燥させた岩石コア試料に一定水圧で水を流し,間隙が水で満たされる割合(水飽和率)と岩石を通過した溶液中に含まれる溶存元素の量(溶解量)が時間と共にどう変化するかを調べる.さらに,間隙を水で飽和させた状態でも溶解量を測定し,不飽和状態と比較することで,不飽和状態下で水膜を介した反応がどのように起こっているかを調べる.不飽和状態の実験では,水頭差(試料にかかる水圧)が小さい場合と大きい場合の2通りで実験を行った.乾燥試料に水を流すと,水頭差の大小にかかわらず,実験開始後1時間程度で水飽和率が約62%まで増加した.その後は,水頭差が小さい場合は水飽和率の変化が小さく,1週間経過後も水飽和率は73%であった.一方,水頭差が大きい場合は水飽和率の変化が大きく,4日後には94%に至った.このように,水頭差により水飽和率の上がり方が変化する,すなわち水膜の広がり方も変化することが分かった.また,飽和状態と不飽和状態との溶解速度の違いは,Siについては2倍程度であるのに対し,Caについては5倍程度であった.このことから,Caを含む鉱物とSiを含む鉱物とで,水膜を介した反応の起こりやすさに違いがあることが推察された.前年度に,Berea砂岩を用いて,岩石内部に水を透過させて溶解量を測定する実験を飽和・不飽和両状態下で行った結果,飽和状態と比べて,不飽和状態におけるSiの溶解量は約半分になった.一方,Fontainebleau砂岩を用いた同様の実験(Nishiyama and Yokoyama, 2013)では,不飽和状態であっても間隙表面を濡らす水膜を介した溶解が十分に起こり,不飽和状態と飽和状態で溶解量の違いが見られなかった.不飽和状態下の溶解挙動の違いの原因を,水膜中の元素の溶解と拡散を考慮する理論モデルを用いて考察した.モデルでは,鉱物粒間に気泡があり,鉱物表面は水膜で濡れた状態を想定し,1本の管の内壁を水膜が覆い,管の両端は低濃度の主流路に連結した状態を考えた.水膜中の元素濃度と溶解速度を計算した結果,水膜の厚さが薄いほど,また,溶出した元素が主流路に到達するまでの距離(拡散距離)が長いほど,全体として濃度が上がり溶けにくくなることが示された.水膜の厚さは,Berea砂岩では7-40 nm,Fontainebleau砂岩では7-18 nmと見積もられ,Berea砂岩の方が少し厚い.拡散距離には,鉱物粒径と鉱物表面の粗さが関係する.

このうち,粒径はBerea砂岩の方が少し小さいが(Berea砂岩:約150μm,Fontainebleau砂岩:約200-300μm),表面粗さはBerea砂岩の方が約5倍大きい(BET法で測定した比表面積を元に算出).このため,Berea砂岩の方が拡散距離が長く,その影響で不飽和状態において溶解しにくかったと考えられる.これらの結果から,一般に不飽和状態下の岩石の溶解の起こりやすさは,表面粗さの違いの影響を大きく受けると推察される.岩石の間隙を濡らす水膜を介した反応や物質移動がどのように起こるかを調べるために,間隙が水で満たされた飽和状態と,不飽和状態の両方において,Berea砂岩に通水して元素の溶解量を比較した.水膜を介した溶解が十分に起これば,不飽和・飽和状態の溶解速度の差は生じないと予測されたが,実際には不飽和状態のSiの溶解速度は飽和状態の50%であった.このような溶解速度の差が生じない別の砂岩との比較から,水膜を介した溶解の起こりやすさには,間隙表面の粗さが大きく影響すると考えられる.平成25年度までに,透水-溶解実験の手法をほぼ完成させた.平成26年度は,造岩鉱物の種類や岩石の間隙構造の違いが水膜のでき方や水膜を介した反応にどのような影響を及ぼすかの評価を目的として,前年度に用いた流紋岩以外の岩石として砂岩を用いて実験を行った.流紋岩の場合は噴火時にマグマ中で発生した気泡が間隙であるが,砂岩の場合は鉱物粒子同士のすき間が間隙であり,間隙構造が大きく異なる.また,流紋岩はガラスが大半を占めるが,砂岩は石英が主体で,さらに炭酸塩鉱物や粘土鉱物を含む.したがって,造岩鉱物の種類にも大きな違いがある.実験結果から,通水開始時に水飽和率が急速に上がる現象は,両方の岩石で起こることが分かった.また,Caを含む炭酸塩鉱物の方が,Siを含む石英や粘土鉱物よりも水膜を介した反応が起こりにくいことが推察された.さらに,不飽和状態下で水を流した場合に間隙が水で満たされる割合(したがって,水膜の広がり方)は,岩石にかける水圧によって変化することも分かった.これらの様々な知見が得られたことから,研究は順調に進展したといえる.岩石-水相互作用平成26年度までの研究で,造岩鉱物の種類や岩石の間隙構造の違いが水飽和率の変化や水膜を介した反応にどのような影響を及ぼすかが分かってきた.これまでは,12週間以内の水飽和率の変化傾向を見てきたが,天然の岩石-水反応を考える上では,より長期間における水飽和率の変化傾向の情報が欲しい.したがって,今年度はより長期間の水飽和率の変化を調べる実験を行う.また,これまでに蓄積されたデータを基に,不飽和状態下における水膜の役割を考慮した反応・輸送モデルの作成を行う.まず,流紋岩や砂岩について,岩石内部の溶解速度や溶存元素濃度を反応・輸送式を用いて解析する理論計算モデルを作成し,実験結果と計算結果の比較を行ってモデルの妥当性を確認する.さらに,間隙径,粒径,鉱物組成,水膜の厚さ等の各因子が反応・輸送挙動に及ぼす影響を,できるだけ多くの因子について定式化する.その結果を組み込んで,様々な岩石の不飽和溶解挙動を予測するためのモデルの構築を目指す.平成25年度は,不飽和状態と飽和状態の反応面積の違いを調べるための実験・解析手法の確立が主な目的であった.透水溶解実験において,後に行った実験における溶解速度の方が前に行った実験で得られた値より小さくなることが多いという問題があり,飽和/不飽和反応面積比の過大評価もしくは過小評価につながっている可能性があった.このため,飽和→不飽和→飽和という順番で同じ試料を用いた実験を行うことにより,反応面積比の最大値と最小値を見積もった.これにより,実験結果の解釈の妥当性が大きく向上した.その他実験装置の工夫を含めて,実験手法の確立の目的は概ね達成できたと言え,今後この手法を他の岩石にも応用していく準備が整った.
ゴールデンハムスターを用いた新たな遺伝子改変モデルプラットフォームの確立

マウスでは各種の遺伝子改変技術が整備され、飼育・繁殖・取り扱いが容易なことから、哺乳類で最も多くの改変系統が作出されている。しかし表現型が現れないノックアウトマウスも多く、一部の研究分野では生理や代謝の特殊性により必ずしも最適なモデルではない。そこで飼育・繁殖が容易で、マウスよりも早い世代交代などを特長とするゴールデンハムスターに着目し、マウスで未解明の遺伝子の解析を試みる。この目的のために、in vivo (卵管内)ゲノム編集法を応用する。本研究の成果により、ハムスターはsecond choiceの研究モデルとなり、我が国の医学・生物学の発展を加速するものと期待される。
TACEの骨代謝・造血系における機能解析

本研究では膜型のタンパク質分解酵素であるTACEの機能を多岐にわったて解析し,TACEを不活化することにより,骨形成や造血に異常をきたすこと,またTACEが破骨細胞前駆細胞に発現する受容体を切断することにより破骨細胞分化に間接的に関わっていることを明らかにした.また,TACEの類縁遺伝子であるADAM10の遺伝子改変マウスも作成し,ADAM10が生体において顆粒球の産生を負に制御する因子であることを明らかにした.本研究では膜型のタンパク質分解酵素であるTACEの機能を多岐にわったて解析し,TACEを不活化することにより,骨形成や造血に異常をきたすこと,またTACEが破骨細胞前駆細胞に発現する受容体を切断することにより破骨細胞分化に間接的に関わっていることを明らかにした.また,TACEの類縁遺伝子であるADAM10の遺伝子改変マウスも作成し,ADAM10が生体において顆粒球の産生を負に制御する因子であることを明らかにした.細胞表面に発現した種々の膜型蛋白質は蛋白質分解作用を受け,その細胞外領域が可溶型蛋白質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,遺伝子の翻訳後機能調節機構として重要な役割を担うことが近年,明らかとなっている.本研究では上述のectodomain sheddingにおいて中心的な機能を有するTNFαconverting enzyme(TACE)と呼ばれる細胞膜結合型酵素に着目しその機能解析を行っている.本年度は研究代表者が過去に確立したTACE遺伝子改変マウスを利用し1)血液幹細胞増殖に関わる膜型増殖因子Flt3リガンドがTACEによって特異的に切断を受け,可溶化蛋白質となること,また同様に2)破骨細胞分化に必須の受容体であるRANKがTACEによって切断を受け,その結果破骨細胞分化シグナルが抑制されることをin vitro, in vivoで示した.Flt3リガンド,RANKはともに血液学,骨代謝で重要な位置を占めることからも,これらの遺伝子のectodomain sheddingによる翻訳後機能調節の一端を明らかにした本研究結果は,血液幹細胞分化,破骨細胞分化の理解の一助となることが期待される.またこれまでの研究からTACEを全身性に欠損した遺伝子改変マウスにおいて骨や造血器などに異常を呈することを観察しているが,本年度はより臓器特異的にTACEを欠損した遺伝子改変マウスを複数種作成し,これまで確認された表現系の解析を継続して行っている.細胞表面に発現した種々の膜型蛋白質は蛋白質分解作用を受け,その細胞外領域が可溶型蛋白質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,遺伝子の翻訳後機能調節機構として重要な役割を担うことが近年,明らかとなっている.本研究では上述のectodomain sheddingにおいて中心的な機能を有するTNFαconverting enzyme(TACE)と呼ばれる細胞膜結合型酵素に着目しその機能解析を行っている.本年度は研究代表者が過去に確立したTACE遺伝子改変マウスを利用し,おもにTACEの軟骨細胞における機能の解析,および以前報告したTACE遺伝子改変動物で観察された造血異常を中心に解析を行った.軟骨細胞特異的にTACEを欠損したマウスは成長軟骨に異常を呈し,長管骨に約10%程度の短縮が観察された.また興味深いことに本変異マウスでは骨折治癒が遷延することが明らかとなった.現在,これらの表現系のメカニズムの解析を継続して行っている,さらに,骨代謝領域の研究では,小胞体ストレスに注目し,小胞体ストレス伝達経路の一つであるIRE1α-XBP1がBMP2にて誘導される骨芽細胞分化に重要な機能を担っていることを明らかにした(発表論文参照).現在,これと併せTACEの活性化における小胞体ストレスの関連を検討している.また生体におけるectodomain sheddingをより広く理解するためTACEの研究と平行し,類縁遺伝子であるADAM10のコンディショナルKnockoutマウスを作成し,現在TACE遺伝子改変動物と同様に骨組織および造血系に注目し表現系解析を行っている.種々の膜型蛋白質は細胞膜上に発現したのち,蛋白質分解作用を受け,可溶型蛋白質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,様々な生命現象に深くかかわっていることが徐々に解明されつつある.TACEはこのectodomain sheddingの中心的な役割を担う酵素であり,研究代表者はこれまで,TACE遺伝子改変動物の解析を通して本酵素が造血・皮膚・骨など多くの組織・臓器の機能維持にかかわっていることを明らかにした.H23年度はこれらの研究成果をもとに,主に以下のような成果を得た.1)TACEを軟骨細胞特異的に欠損したマウスは成長軟骨の肥厚と,長管骨の短縮を認めるが,これらの表現型がEGFRシグナリングの低下に起因し,軟骨細胞におけるEGFRシグナリングを抑制することにより,破骨細胞の分化誘導を抑制しうることを解明した.これはTACEによるectodomain sheddingが間接的に破骨細胞の分化誘導を制御していることを示す初めてのデーターである(論文投稿準備中).2)TACEの類縁遺伝子であるADAM10の遺伝子改変マウスを作製し,ADAM10-Notchシグナリングが骨髄細胞の増殖を負に制御していることを明らかにした.Notchは細胞分化の運命決定に重要な機能を担っていることが知られているが,造血におけるその機能に関しては統一した見解に達していなかった.今回の研究から,Notchによる造血の制御に関して明確な回答を提示しえた(Yoda et.Blood). 3)TACE
リンパ球コリン作動系の免疫機能に及ぼす作用の分子薬理学的検討

免疫刺激は,T細胞においてACh産生と遊離を促進し,さらにM_5 mAChR発現を増強すること,またB細胞についてもM_5 mAChR発現を増強することを発見した.これらの結果は,免疫刺激時にリンパ球コリン作動系活性が上昇する可能性を示唆するものである.すでに我々は,TおよびB細胞上のmAChRを刺激するとCa-シグナリングを誘発し,c-fos遺伝子発現増強を引き起こして,細胞機能を活性化することを発見している.これらの知見は,リンパ球上の,なかでも特にM_5mAChRが免疫機能の制御に関与している可能性を示唆するものである.その他に,薬理学的には,M_3mAChRもCa-シグナリング誘発やc-fos遺伝子発現増強に関与する可能性が示唆されている.リンパ球上のnAChRを刺激するとCa-シグナリングを誘発するが,短時間の刺激では耐性が生じてリンパ球機能に対する作用は明確ではなかった.in vitroにおける8週間に渡るニコチン刺激はα7サブユニットを始めとする様々なnAChR発現を減弱させ,同時にニコチンによるCa-シグナリングを強く抑制すること発見した.これらの知見は長期間のニコチン刺激が免疫機能に影響を及ぼす可能性を示唆するものである.2004年9月にNobel ConferenceNo.44-Inflammatory Reflexがストックホルムで開催され,川島は20名のシンポジストの一人として招待された.副交感神経系と免疫系との間にクロストークがあると広く考えられているが,副交感神経終末と免疫系細胞との直接的相互作用を支持する組織学的証拠は発見されていない.そこで,我々が発見したリンパ球コリン作動系の関与を考えた方が,これまでの観察結果をより論理的に説明できることを講演した.免疫刺激は,T細胞においてACh産生と遊離を促進し,さらにM_5 mAChR発現を増強すること,またB細胞についてもM_5 mAChR発現を増強することを発見した.これらの結果は,免疫刺激時にリンパ球コリン作動系活性が上昇する可能性を示唆するものである.すでに我々は,TおよびB細胞上のmAChRを刺激するとCa-シグナリングを誘発し,c-fos遺伝子発現増強を引き起こして,細胞機能を活性化することを発見している.これらの知見は,リンパ球上の,なかでも特にM_5mAChRが免疫機能の制御に関与している可能性を示唆するものである.その他に,薬理学的には,M_3mAChRもCa-シグナリング誘発やc-fos遺伝子発現増強に関与する可能性が示唆されている.リンパ球上のnAChRを刺激するとCa-シグナリングを誘発するが,短時間の刺激では耐性が生じてリンパ球機能に対する作用は明確ではなかった.in vitroにおける8週間に渡るニコチン刺激はα7サブユニットを始めとする様々なnAChR発現を減弱させ,同時にニコチンによるCa-シグナリングを強く抑制すること発見した.これらの知見は長期間のニコチン刺激が免疫機能に影響を及ぼす可能性を示唆するものである.2004年9月にNobel ConferenceNo.44-Inflammatory Reflexがストックホルムで開催され,川島は20名のシンポジストの一人として招待された.副交感神経系と免疫系との間にクロストークがあると広く考えられているが,副交感神経終末と免疫系細胞との直接的相互作用を支持する組織学的証拠は発見されていない.そこで,我々が発見したリンパ球コリン作動系の関与を考えた方が,これまでの観察結果をより論理的に説明できることを講演した.アセチルコリン(ACh)は,一般に神経伝達物質として認識されている.しかしながら,我々は神経系をもたない真正細菌,菌類,植物,海綿などにもAChが存在することを発見した.従って,AChは生命の起源より細胞間機能調節因子として働いており,神経系をもつ生物が出現したときに神経伝達物質の一つとして利用されたと考えることができる.さらに我々はリンパ球がAChを産生し,AChに対する受容体を発現してことを発見し,リンパ球におけるコリン作動系の存在を提唱した.このリンパ球コリン作動系の生理的役割を解明し,新しい作用メカニズムをもつ免疫調整薬開発のための理論的根拠の構築を目的として,以下の検討を行なった.1.免疫機能異常とリンパ球コリン作動系活性との関連の解明免疫機能異常モデルとして,自己免疫性糸球体腎炎を発症するMRL/lprマウスを用いて正常マウスと比較した.糸球体腎炎が発症する20週令において,1)血液,2)胸腺,3)脾臓におけるリンパ球ACh含量の上昇が観察された.リンパ球におけるACh合成酵素の遺伝子発現の変化を検討中である.2.プロスタグランディンE_2のTリンパ球におけるACh産生調節への関与の検討T細胞白血病細胞株MOLT-3において,T細胞活性化因子フィトヘマグルチニン刺激時における,1)EP_4受容体サブタイプ発現が増強され,2)EP_4受容体作動薬はACh産生と遊離を上昇させた.3.リンパ球機能に影響を及ぼすムスカリン受容体(mAChR)サブタイプの特定各種mAChRノックアウト(KO)マウスを入手することができた.まず野生型マウスのリンパ球に発現しているmAChRサブタイプを調べた.その結果,M2-M5の4種のサブタイプが発現していることが判明した.KOマウスで確認中である.これらの知見から,リンパ球コリン作動系が免疫機能調節に関与している可能性が確認された.

アセチルコリン(ACh)は,一般に神経伝達物質として認識されている.しかしながら,AChは皮膚のケラチン細胞,気道の粘膜上皮細胞などの様々な非神経性組織にも存在し,細胞間機能調節物質として働いている可能性が指摘されている.さらに,我々はリンパ球がAChを産生し,AChに対する受容体を発現していることを発見し,リンパ球におけるコリン作動系の存在を提唱した.このリンパ球コリン作動系の生理的役割を解明し,新しい作用メカニズムをもつ免疫調節薬開発のための理論的根拠の構築を目的として,以下の検討を行った.1.免疫機能異常とリンパ球コリン作動系活性との関連性の解明免疫機能異常モデルとして,自己免疫性糸球体腎炎を発症するMRL/1prマウスを用いて正常マウスと比較した.糸球体腎炎が発症する20週令において,リンパ球のACh合成酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)活性が上昇してしていた.2.プロスタグランジンE2のTリンパ球におけるACh産生調節への関与の検討T細胞系白血病細胞株CEMにおいて,EP4作用薬がChAT遺伝子およびその酵素活性を増強することにより,ACh産生を増大させることが明らかとなった.3.リンパ球機能に影響を及ぼすムスカリン受容体(mAChR)サブタイプの同定M3,M4およびM5 mAChRノックアウト(KO)マウスから調製したリンパ球において,KOされたサブタイプを除くM2-M5サブタイプの遺伝子発現を確認した.KOマウスにおける各サブタイプ遺伝子の発現レベルが野生型と差がなかったことから,代償的なmAChR遺伝子発現は起こらないことが明らかとなった.現在,各種サイトカイン(インターロイキン-2,-10など)発現調節に関与するサブタイプを確認中である.これらの知見から,リンパ系コリン作動系が免疫機能調節に関与している可能性が確認された.TおよびB細胞上にはムスカリンおよびニコチン受容体(それぞれ,mAChRおよびnAChR)が発現している.T細胞活性化因子フィトヘマグルチニン(PHA)は,T細胞においてアセチルコリン(ACh)産生,その産生酵素コリンアセチルトランスフェレース(ChAT)およびM_5 mAChRのmRNA発現を増強する.またAChは,TおよびB細胞上のmAChRおよびnAChRに作用して,カルシウム(Ca^<2+>)シグナリングを誘発する.これらの知見から,免疫細胞におけるmAChRおよびnAChRの役割を明らかにする目的で,M_5 mAChRノックアウト(KO)マウスおよびニコチン(Nc)を連続投与したマウスを用いて,卵白アルブミン(OVA)に対する抗体産生の変化を検討した.1.マウスにNc(1または2mg/kg, sc, twice daily)を5週間連続投与した.第3週目にOVAで初回免疫し,さらに第4週終了後に追加免疫をした.第4および6週終了時に尾動脈より採血を行ない,抗体価を測定した.Ncの用量依存的にOVA対する抗体価の減弱が観察された.Ncは,脾臓の単核白血球(MNL)におけるChATおよびnAChRα7サブユニットのmRNA発現を有意に減弱させた.胸腺のMNLにおいては,NcはChAT mRNA発現を有意に減弱させたが,α7サブユニットのmRNA発現には影響を及ぼさなかった.
スピングラスとナノ磁性粒子系におけるガラス的振舞-実験とシミュレーション

1]ナノサイズ強磁性粒子の磁化は、粒子の磁気異方性で決まるエネルギー障壁を熱活性化過程で乗り越える過程でその向きを変える(超常磁性)。その特性時間は、通常のスピングラスの微視的スピンの反転時間スケールに比べて数桁以上大きい。a)このようなナノ粒子が互いに近距離に閉じ込められた系では、ナノ粒子モーメント間の双極子相互作用のため系全体としてスピングラス的特性を示す。特にそのガラス的振舞いの時間スケールは、モデルスピングラスに対する数値シミュレーションで再現できる時間スケールに近づく。この点を踏まえて、Fe-N強磁性ナノ粒子系が示すエイジング現象を詳しく調べ、温度変化の大きさが転移温度の数%以内であるような温度シフト過程、温度サイクル過程において、若返り効果は見られないこと、エイジングの記憶が累加的に保たれること、但し、温度変化直後には特徴的な遷移現象(Kovacs効果)が見られることなどを明らかにした(投稿論文準備中、一部を磁気国際会議2003で発表)。b)ナノ粒子が十分希釈であると、個々の粒子モーメントは互いに独立に振舞うが、粒子サイズに分布があり、従って、その緩和時間(ブロッキング温度)に分布があることだけで、系全体としてはきわめて微妙な記憶効果を示し得ることを、粒子モーメントに対するマスター方程式に基づき明らかにした(投稿論文準備中)。2]低温スピングラス相の実体解明が未だに進まない理由の一つは、スピングラス相関長を直接実験的に観測できない点にある。ナノサイズのスピングラスを用意できれば、系のサイズ効果から相関長を見積もれるものと期待される。この線に沿った共同研究を慶応大学佐藤教授グループと進めているが、粒子サイズを揃えた系の作成法が難しく、決定的な結論を得るに到っていない。3]本研究代表者が行った3次元イジングスピングラス模型のモンテカルロシミュレーションでは、スピングラス相は一様磁場に対して不安定であり、微小磁場でも系の平衡状態は常磁性になるとの結論が導かれている。これを実験的に検証する目的で、イジングスピングラスFe_xMn_(1-x)TiO_3の磁場中エイジング過程の実験も進めている。同一磁場に対する、磁場中冷却磁化とゼロ磁場冷却磁化がずれ始める温度が冷却速度に依存することや、このずれ温度を交流磁化率で見たときの周波数依存性について解析したところ、シミュレーションとよく符合する結果が得られている(投稿論文準備中、一部を米国物理学会2004で発表)。ナノサイズ強磁性粒子の磁化反転ダイナミックスは、粒子の磁気異方性で決まるエネルギー障壁を熱活性化過程で乗り越える過程であり、測定時間スケールで決まるブロッキング温度近傍で特徴的なスロー・ダイナミックスを示す(超常磁性)。このようなナノ粒子が多数互いに近距離に閉じ込められた系では、ナノ粒子モーメント間の双極子相互作用が系の磁気的性質を支配し、系全体としてスピングラス的特性、特にガラス的振舞い、を示す。ナノ粒子モーメントの反転に要する時間が、通常のスピングラスの微視的スピンの反転時間スケールに比べて、数桁大きい分だけ、観測される有効時間スケールはシミュレーションで調べられる時間窓に近づく。この点を踏まえて、研究分担者が来日後、まず、Fe-N強磁性ナノ粒子系が示すエイジング現象の関する実験を開始した。複素磁化率を通して、等温エイジング過程、温度シフト過程、温度サイクル過程を調べ、スピングラスドメインの成長則等の測定を行った(本学低温センターのMPMSを利用)。対象としているFe-Nナノ粒子系はスピングラス転移温度と上記のブロッキング温度が近いため、粒子系としてのスピングラス特性と個々の粒子の超常磁性の双方を取り込んだ解析を進め、温度シフト過程に伴う若返り効果が見られない等、上記の予想通り、シミュレーション結果に近い測定結果が得られつつある(磁気国際会議2003に発表申込)。Fe-N強磁性ナノ粒子系の実験と並行して、イジングスピングラスFe_xMn_(1-x)TiO_3の磁場中エイジング過程の実験も開始した。後者、磁場中エイジング現象については、シミュレーション側からも新たな成果が得られた。すなわち、スピングラス相に対する液滴描像によると、スピングラスドメインの平均サイズが磁場の値で決まる、ある特性長に達すると、ゼーマンエネルギーがスピングラスの相互作用エネルギーを凌駕し、スピングラス状態が不安定になるものと予想されている。これまでこの動的過程を直接見る実験、シミュレーションは報告されていなかったが、磁場シフトを大きく取るシミュレーションにより、このクロスオーバーを捉えることに初めて成功し(投稿論文準備中)、同様の戦略による実験を開始した。

b)ナノ粒子が十分希釈であると、個々の粒子モーメントは互いに独立に振舞うが、粒子サイズに分布があり、従って、その緩和時間(ブロッキング温度)に分布があることだけで、系全体としてはきわめて微妙な記憶効果を示し得ることを、粒子モーメントに対するマスター方程式に基づき明らかにした(投稿論文準備中)。2]低温スピングラス相の実体解明が未だに進まない理由の一つは、スピングラス相関長を直接実験的に観測できない点にある。ナノサイズのスピングラスを用意できれば、系のサイズ効果から相関長を見積もれるものと期待される。この線に沿った共同研究を慶応大学佐藤教授グループと進めているが、粒子サイズを揃えた系の作成法が難しく、決定的な結論を得るに到っていない。3]本研究代表者が行った3次元イジングスピングラス模型のモンテカルロシミュレーションでは、スピングラス相は一様磁場に対して不安定であり、微小磁場でも系の平衡状態は常磁性になるとの結論が導かれている。これを実験的に検証する目的で、イジングスピングラスFe_xMn_(1-x)TiO_3の磁場中エイジング過程の実験も進めている。同一磁場に対する、磁場中冷却磁化とゼロ磁場冷却磁化がずれ始める温度が冷却速度に依存することや、このずれ温度を交流磁化率で見たときの周波数依存性について解析したところ、シミュレーションとよく符合する結果が得られている(投稿論文準備中、一部を米国物理学会2004で発表)。
インフルエンザウイルス―口腔細菌混合感染による致死的感染症発症とその機構

インフルエンザAウイルス(IAV)と肺炎レンサ球菌などのレンサ球菌との複合感染は、その感染症を重症化させることが知られている。一方、病原性が弱い細菌と考えられている口腔レンサ球菌も病原性の強い他のレンサ球菌とゲノム相同性が高いことが知られ、口腔レンサ球菌とIAVとの複合感染による病原性が重症化の可能性が考えられる。本研究では、インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌のひとつであるStreptococcus sanguinisとの複合感染により肺炎による症状の重症化が認められることを明らかにし、その原因としてIAV感染細胞でのgp96発現上昇とそれによる細菌の細胞への付着能増強が示唆された。昨年度は、マウスモデルを用いて、インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌であるStreptococcus mutans, S. sanguinis, S. salivariusとの混合感染による感染症憎悪の有無について検討した。その結果、非致死量のインフルエンザウイルスを経鼻感染させ、その3日後にS.mutansもしくはS.sanguinisを経鼻感染させることにより、体重減少の有意な憎悪が認められ、マウスの衰弱現象が認められた。また、これらのマウスの肺から両病原体が検出されたことから、感染性の肺炎を発症していることが示唆された。しかし、マウスの死亡までには至らなかった。一方、コントロールであるインフルエンザウイルスとS. pyogenesとの混合感染においては、80%以上のマウスが死亡していた。インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌との混合感染においても感染症の憎悪の可能性を示唆したものの、致死的感染には至っていないため、現在致死的感染症に至る感染条件を模索中である。また、インフルエンザウイルスにも株によって強毒株と弱毒株が存在しており、株の違いによる感染症の憎悪の違いも考えられるため、ウイルス株を変えた場合での現象の相違についても検討を進める必要があるように思われる。今年度は、上記内容に加え、混合感染による病態変化を検討し、どの臓器においてどのような病態変化が生じているのかを検討する。また、その病態変化に至る微生物側および宿主側の因子を検索するために、病態変化を示す臓器および、そこに生息する微生物の性状変化について遺伝学的手法を用いて検討する予定である。平成26年度に一部の口腔レンサ球菌(Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutans)において、インフルエンザウイルスとの混合感染によって感染症の重症化が認められることを明らかにしたが、平成27年度は、その病態の状況および重症化の原因を検討すべく、Streptococcus sanguinisに焦点をあてて研究を行った。病態について組織病理学的に検討を行ったところ、肺胞部分の炎症性細胞浸潤が混合感染によって顕著にみられた。また、肺における微生物量について検討したところ、肺でのインフルエンザウイルス感染価に変化は認められなかった一方、Streptococcus sanguinis数の肺での増加が認められた。肺での細菌数の増加について、肺胞上皮細胞のインフルエンザウイルス感染により、同細胞へのS. sanguinisの付着能が増強したことによるものかを検討するために、我々は、in vitro系を用いて肺胞上皮細胞株にインフルエンザウイルスを感染させ、非感染状態の細胞と比較してのS. sanguinisの細胞への付着能の変化の有無を調べた。その結果、ウイルス感染によって細菌の上皮細胞への付着・進入が有意に増強することを明らかにした。我々は、ウイルス感染による肺胞上皮細胞へのS. sanguinisの付着増強に関与する因子を検索しており、ウイルス感染により発現する細胞側の因子がS. sanguinisの付着・進入の増強に関与する可能性を見出しており、現在その可能性の確認とそのメカニズムの詳細について検討を進めている。口腔レンサ球菌とインフルエンザウイルスとの混合感染によって感染症が重症化することを平成26年度に確認した。平成27年度は感染症重症化を誘導するメカニズムの一端を絞り込むことを目標としていたが、研究成果にも示したように、インフルエンザウイルス感染による肺胞上皮細胞の付着増強がその重症化に関連することを明らかにするとともに、付着増強に関与する細胞側の因子の可能性を示唆している。今後、この細胞側の因子の可能性を明らかにし、その因子による細菌の付着増強のメカニズムと感染症重症化との関連性を明らかにすれば、口腔レンサ球菌とインフルエンザウイルスとの混合感染による感染症重症化に到る分子生物学的メカニズムの一端を明らかにすることが期待できる。以上より、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。我々は平成27年度までにインフルエンザウイルスとStreptococcus sanguinisとの並行感染によって、感染症が重症化することをマウスモデルにより明らかにした。また、肺での細菌数の増加すること、その増加が肺胞上皮細胞への付着増強によることを見出した。平成28年度は、インフルエンザウイルス感染によって肺胞上皮細胞がどのようなメカニズムによってS. sanguinisへの付着能を増強させるかについて検討を行った。まず、インフルエンザウイルス感染によって肺胞上皮細胞上にgp96タンパクの発現が上昇することを明らかにした。このタンパクは、ナイセリア属菌などの上皮細胞への付着能の増強に関与することが報告されていることから、我々はgp96タンパクの細菌付着への可能性を検討するべく、インフルエンザウイルス感染後にgp96インヒビターを添加することによって肺胞上皮細胞上のgp96発現を抑制させた上で、S. sanguinisの付着能の変化を観察したところ、付着能がほぼ完全に抑制することを確認した。さらに、gp96タンパクに結合するS. sanguinis表層

タンパクの検索をプルダウン法を用いて検討したところ、数本のタンパクが結合すること、それらの大多数がABCトランスポーターであることを見出した。現在、該当するトランスポーターとgp96との結合によってインフルエンザウイルス感染後のS. sanguinisの付着侵入さらには、並行感染による感染症の病態憎悪に関する詳細な解析を進めている。インフルエンザAウイルス(IAV)と肺炎レンサ球菌などのレンサ球菌との複合感染は、その感染症を重症化させることが知られている。一方、病原性が弱い細菌と考えられている口腔レンサ球菌も病原性の強い他のレンサ球菌とゲノム相同性が高いことが知られ、口腔レンサ球菌とIAVとの複合感染による病原性が重症化の可能性が考えられる。本研究では、インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌のひとつであるStreptococcus sanguinisとの複合感染により肺炎による症状の重症化が認められることを明らかにし、その原因としてIAV感染細胞でのgp96発現上昇とそれによる細菌の細胞への付着能増強が示唆された。昨年度は、マウスでのインフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌との混合感染による致死的感染症のモデルの作製と、その病理学的特徴について検討を行う予定であった。モデルについては進展をみせており、完全なモデルの作製には至ってはいないものの、次年度までにはモデルが完成し、それらの病理学的特徴を検討することが可能である。以上より、当初の計画の方向で研究が進行していると思われる。まず、インフルエンザウイルスとStreptococcus sanguinisとの混合感染による感染症重症化に関与すると考えられる、ウイルス感染によって発現する細胞側の因子について、実際にこれが細菌の付着・侵入の増強に直接関与し、混合感染による感染症重症化に直接関与するかをin vitroならびにin vivoの実験系を用いて検討し、明らかにする。さらにこの因子がStreptococcus sanguinis以外の口腔レンサ球菌、さらには混合感染により感染症の重症化を誘導することが知られている病原細菌について直接関与しているか否かを検討し、本因子の混合感染による感染症重症化の関与の強弱について明らかにしていく。細菌学今年度は、インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌の混合感染による致死的感染症発症の可能性について引き続き検討をすすめる。具体的には、1ウイルスと細菌の感染のタイミングについて詳細な検討を行う。2インフルエンザウイルスの株を変更することにより、致死的感染症の発症が誘導しやすくなるか否かを検討する。その結果、致死的感染症の誘導が認められた場合、その病態を詳細に解析する。具体的には1各臓器における病原体の集積分布、2最も多くの病原体が認められた臓器、組織における病理学的変化の検討、32において、その臓器における炎症の特徴についてゲノミクス的手法を用いて検討する。
維管束を介した時間情報の共有メカニズムの解明

栄養素の取り込みが概日時計によって制御されており、それらの栄養素は光や温度と同様に概日リズムに影響を与えることに着目し本研究を開始した。根の概日時計の働きによって道管内では栄養素の周期的な濃度変化が生じ、これが根の時間情報として葉へと伝えられている可能性が考えられたことから、本研究では、様々な栄養素を植物に投与した際に起こる概日リズムの変化を葉と根で独立に測定することを通じて、シグナル伝達物質として機能する栄養素の同定、および、こうした時間情報の伝達が持つ生物学的意義の解明を目的に以下の研究を行った。(1)根から吸収されたAHA1は地上部の概日周期の安定性を制御する根にカリウムを投与する実験やカリウムを欠乏させた培地での生育実験から、根でのカリウムシグナルは地上部の概日周期を不安定化することを明らかにした。この分子メカニズム関わる因子を同定するため、AHA1に着目し解析したところaha1変異体では根におけるカリウムの取り込みリズムが消失していること、またカリウムだけでなくカルシウムやマグネシウムといった陽イオンの取り込みも消失していることを明らかにした。(2)こうした地上部における概日周期の安定化が持つ生物学的意義を明らかにするため、糖シグナリングに着目した。カリウムイオンは様々な応答プロセスに関わるが、その一つに光合成への影響が知られている。また糖は概日リズムを生み出すと共に地上部から根へ時間情報を伝える物質であると想定されている。根または地上部に糖を投与すると概日周期の安定性に影響が現れることを確認した。以上より、根からAHA1を介して取り込まれたカリウムならびにカルシウム、マグネシウムといったイオンは地上部へと輸送されることで根の持つ時間情報を地上部へと伝え、またそれによって安定化された概日時計によって生み出された糖が根へと時間情報を伝えていることを明らかにした。概日時計は地球の自転による約24時間の明暗周期や季節変化に対応するためのメカニズムであり、多くの遺伝子の発現制御に関わっている。こうした概日時計の仕組みは、ほぼ全ての細胞に見られ、動物では脳の時計が神経や体液を通じて末梢の時計を制御していることが知られている。植物ではそのような仕組みは知られていないが、単なる細胞の集合体ではなく多細胞生物として協調的に環境応答を行うためには、個々の細胞が持つ時間情報を統合する仕組みが植物にも存在していると考えられる。最近、申請者らは植物にも動物と同様に概日時計の組織特異的な機能分担が見られることを発見した。また、別の研究者グループの報告から地上部の時間情報が地下部へと伝わっている可能性が示唆されている。さらに、申請者は根から取り込まれたカリウムなどの無機イオンが地上部の概日時計を制御しうることを見出している。これらを総合すると、植物における時間情報の共有は地上部から地下部への篩管と地下部から地上部への道管を通じて行われている可能性が考えられた。そこで本研究では、組織ごとに概日リズムを計測することで、離れた2つの組織間で時間情報がどのように伝わるのかを明らかにする。さらに、道管・篩管への取り込みに関わるトランスポーターの発現や活性、そして実際の道管液・篩管液の濃度に概日リズムが見られるかどうかを検証することで、時間情報を媒介する物質の同定を目指す。カリウムが根から地上部へと輸送され、概日リズムの周期の安定性に関わっていることを明らかにできた。この結果は、これまでに想定されていなかった根と地上部の間での時間情報のやり取りの可能性を強く示唆するものであり、引き続き研究を進めることで、植物における時間情報の認識機構が明らかになると想定される。また、申請書に記載したその他研究についても概ね順調に成果が出ており、計画に遅れはない。

以上より、根からAHA1を介して取り込まれたカリウムならびにカルシウム、マグネシウムといったイオンは地上部へと輸送されることで根の持つ時間情報を地上部へと伝え、またそれによって安定化された概日時計によって生み出された糖が根へと時間情報を伝えていることを明らかにした。カリウムがどこで、どのように概日時計を制御しているかを明らかにするために、葉におけるカリウムの局在を調べその場でのRNAーseq解析を行う。他の植物種では柵状組織に高蓄積することがしられているため、申請者らはすでに柵状組織と海綿状組織を単離する技術を開発している。また、道管内カリウム濃度のリズムが重要であることをしめすために、ICP-MSを用いて道管内のカリウム濃度の定量を行うと共に葉における概日リズムとの関係を明らかにする。年度末に異同が確定し、引越の準備等で実験を継続できず、異動後に実験を再開した方が合理的であると考えられたため
汎用的な自動定理発見ツールの実現と応用

自動定理発見問題に対して帰結演算による自動定理発見法が提案されたがいまだ実現されていない.本研究では,帰結演算による自動定理発見法において中心的役割を果たす汎用自動前向き帰結演算システムを実装し,公理的集合論において帰結演算による自動定理発見を試みるのが最終目的である.支援期間内には,論理式を構成する語彙,論理式の構成規則,公理,そして,推論規則を入力として自由に与えられるようにした汎用前向き推論エンジンFreeEnCalの開発を行った.また,開発したFreeEnCalの処理アルゴリズムを見直し処理の高速化を行った.自動定理発見問題に対して帰結演算による自動定理発見法が提案されたがいまだ実現されていない.本研究では,帰結演算による自動定理発見法において中心的役割を果たす汎用自動前向き帰結演算システムを実装し,公理的集合論において帰結演算による自動定理発見を試みるのが最終目的である.支援期間内には,論理式を構成する語彙,論理式の構成規則,公理,そして,推論規則を入力として自由に与えられるようにした汎用前向き推論エンジンFreeEnCalの開発を行った.また,開発したFreeEnCalの処理アルゴリズムを見直し処理の高速化を行った.自動定理発見とは、予め与えられた定理を自動的に証明することではなく、計算機を用いて新しい定理を自動的に発見することである。自動定理発見問題は、自動定理発見の一般的な方法を求めるという問題である。この自動定理発見問題に対して帰結演算を用いた自動定理発見の理論的基礎と方法が提案された。この方法の特徴は、推論の妥当性を基礎付ける論理体系とそれぞれの分野の定義や公理、定理、また、それら二つを入力として受け取り入力された論理体系に従いそれぞれの分野の公理や定理から新たな定理の導出を行う椎論プログラムを明確に分離した点にある。帰結演算を用いた自動定理発見法を実現するためには、実用的な推論プログラムが必要不可欠であるが、そのような推論プログラムはいまだ実現されていない。本研究では、申請者が研究・開発を行ってきた汎用前向き自動帰結演算システムEnCalの汎用性と処理速度を高め、帰結演算による自動定理発見法の中心的部品である実用的な推論プログラムとして使用し、帰結演算による自動定理発見法に基づいた汎用的な自動定理発見ツールを開発することを目的としている。形式論理における統語論の観点からすると、ある論理体系は、論理式を構成する語彙、論理式の構成規則、公理、そして、推論規則を定めることにより定義することができる。EnCalは、論理式を構成ずる語彙と論理式の構成規則、そして推論規則をプログラムに組み込む形で持っており、利用者がこれらを自由に定義することはできない。このため、任意の論理体系や形式理論を扱えないという問題があった。そこで、本度は、EnCa1を論理式を構成する語彙、論理式の構成規則、公理、そして、推論規則を入力として自由に与えられるようにした汎用前向き推論エンジンFreeEnCalの提案をし、そのプロトタイプの開発を行った。自動定理発見とは、予め与えられた定理を自動的に証明することではなく、計算機を用いて新しい定理を自動的に発見することである。この方法の特徴は、推論の妥当性を基礎付ける論理体系とそれぞれの分野の定義や公理、定理、また、それら二つを入力として受け取り入力された論理体系に従いそれぞれの分野の公理や定理から新たな定理の導出を行う推論プログラムを明確に分離した点にある。本研究では、帰結演算による自動定理発見法に基づいた汎用的な自動定理発見ツールを開発することを目的としている。平成19年度は論理式を構成する語彙、論理式の構成規則、公理、そして、推論規則を入力として自由に与えられるようにした汎用前向き推論エンジンFreeEnCalのプロトタイプの開発を行った。本年度は、平成19年度に開発したFreeEnCalの処理アルゴリズムを見直し処理の高速化を試みた。FreeEnCalの処理時間の大半は導出された結論が既に導出済みであるかどうかを調べる重複検査処理に費やされていた。そこで、FreeEnCalの処理対象である論理式の構造に着目し、重複検査を論理式単位ではなく、論理式を構成する要素単位で行い、無駄な処理を削減することによって処理の高速化を行った。これにより、従来の重複検査アルゴリズムに比べて大幅な速度向上を達成することができた。
化学療法抵抗性白血病を治癒に導く新規細胞免疫療法の開発研究

日本人に最も多いHLA-A24陽性白血病細胞を選択的に認識できるWilms tumor1特異的細胞傷害性T細胞クローン由来T細胞レセプター遺伝子(A24/WT1-TCR)の中で、標的親和性と安全性とを高めた新規A24/WT1-TCR遺伝子の同定に成功した。白血病細胞はIFN-γ存在下でPD-L1の発現し、A24/WT1-TCR-T細胞(活性化T細胞)はPD1を高発現しており、白血病細胞と遺伝子導入T細胞との間にPD-L1/PD1 axisが存在することを明らかとした。免疫チェックポイント阻害剤を併用することで、白血病特異的T細胞療法の治療効果をさらに高めることができる可能性が示された。白血病特異的細胞傷害性T細胞(CTL)クローン由来T細胞レセプター(TCR)遺伝子を用いた新たな遺伝子改変T細胞療法の開発目的で研究を遂行し、下記の結果が得られた。我々がすでに樹立したWT1特異的HLA-A24拘束性CTLクローンからTCR遺伝子を単離し、その発現ベクターをタカラバイオ株式会社との共同研究によって構築した。本レトロウイルスベクターは内在性TCR発現を抑制しする新規ベクターである。末梢血T細胞に遺伝子導入したところ、白血病腫瘍抗原特異的TCR発現T細胞(WT1-TCR-T細胞)は元のCTLクローン同様、HLA-A24拘束性に白血病細胞を殺傷することがin vitro実験系で確認された。さらに、ヒト白血病細胞移植ヒト化マウスの実験系を用いて検討したところ、WT1-TCR-T細胞を養子免疫することによって、ヒト白血病細胞の増殖を著明に抑制した。白血病細胞では、PD-L1分子を発現していない細胞も存在したが、それらの白血病細胞においてもIFN-γ存在下で培養することでPD-L1分子が発現することが確認できた。また白血病特異的T細胞レセプターを遺伝子導入した細胞障害性T細胞(WT1-TCR-T細胞)では、活性化とともにPD-1の発現が亢進することが確認された。これら腫瘍細胞側のPD-L1分子の発現ならびに、免疫細胞側のPD-1分子の発現は、ともに腫瘍局所での細胞免疫療法効果減弱の一員となっていると考えられた。当初の計画どおり、WT1特異的HLA-A24拘束性遺伝子発現レトロウイルスベクターを構築し、ヒト末梢血T細胞に遺伝子導入できた。また、WT1-TCR-T細胞がWT1特異的HLA拘束性に白血病細胞を殺傷することが証明できた。白血病細胞や白血病特異的TCR発現T細胞におけるPD1,PD-L1の発現解析も行えた。これらの結果から、当初の目標をほぼ達成できたと考えている。我々は、まず最初に効果的な白血病特異的T細胞療法の確立を試みた。日本人に最も多いHLAアリルであるHLA-A24陽性白血病細胞を選択的に認識できるWilms tumor 1 (WT1)特異的細胞傷害性T細胞クローン由来T細胞レセプター(TCR)遺伝子(A24/WT1-TCR)を単離した。タカラバイオ株式会社が開発した、内在性TCRを抑制することで遺伝子導入するTCRの発現を安全に高めることができるsiTCRレトロウイルスベクターにA24/WT1-TCRを組み込み、末梢血T細胞に遺伝子導入した。その結果、A24/WT1-TCR遺伝子導入T細胞(A24/WT1-TCR-T細胞)は、in vitroおよびin vivoの実験系において、A24/WT1陽性白血病細胞を選択的に傷害した。さらに、標的親和性と安全性とを高めた新規A24/WT1-TCR遺伝子の同定にも成功し、これらのTCR遺伝子を導入したT細胞がA24/WT1陽性白血病細胞をより効率よく認識できる可能性を示した。次に、抗白血病効果の増強を目的として、A24/WT1-TCR-T細胞療法と免疫チェックポイント阻害剤との併用療法の可能性を検討した。白血病細胞におけるPD-L1の発現をフローサイトメトリー法で検討したところ、一部の細胞においてはPD-L1の発現がみられなかった。しかしながら、IFN-γ存在下によってこのような細胞がPD-L1の発現を獲得することを見出した。加えて、A24/WT1-TCR-T細胞(活性化T細胞)がPD1分子を高発現していることも明らかとした。以上より、白血病細胞と遺伝子導入T細胞との間にはPD-L1/PD1 axisが存在することを明らかとした。従って、免疫チェックポイント阻害剤を併用することで、白血病特異的T細胞療法の治療効果をさらに高めることができる可能性が示された。本年度の研究によって、白血病特異的TCR遺伝子をヒト末梢血T細胞に遺伝子導入することによって、白血病特異的CTLを容易に作製できることが証明できた。

来年度は臨床応用に向けて、抗PD-1抗体をもちいた実験を追加しその効果を検証する。さらに、抗腫瘍効果をin vivo実験系で詳細に検討する計画である。また、WT1特異的TCRをヒト造血幹細胞に遺伝子導入し、HLA-A24トランスジェニック免疫不全NSGマウスに移植して、WT1特異的HLA-A24拘束性CTLがマウス体内で分化増殖することを確認し、様々ながんに対する抗腫瘍効果をヒト化マウスのin vivo実験系で検証する計画である。腫瘍治療学・細胞免疫療法現在の達成度は記載のとおり、今年度は白血病細胞、HLA-A24拘束性WT1特異的T細胞受容体T細胞をもちいたin vitroでの解析が中心であったため予定より物品購入が少なかったため。来年度は、WT1特異的TCRをヒト造血幹細胞に遺伝子導入し、HLA-A24トランスジェニック免疫不全NSGマウスに移植して、WT1特異的HLA-A24拘束性CTLがマウス体内で分化増殖することを確認し、様々ながんに対する抗腫瘍効果をヒト化マウスのin vivo実験系で検証するために予算を使用する計画である。