hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
共生窒素固定系における宿主認識機構に関する研究

1.レンゲ根粒菌の宿主特異性。レンゲ菌を他のマメ科植物に接種し宿主特異性を調べたが、レンゲ以外の植物根には菌の付着も見られなかった。レンゲ種子よりレクチンを抽出し、種々の根粒菌との凝集反応を調べたが、レンゲ菌のみと反応した。このレクチンを硫安分画、DEABーCMーセルロース処理により約30倍に精製した。次に、レンゲ菌より巨大プラスミドの分離を試みR.sp KohnosuとR.sp Naganoでそれぞれ2種のプラスミド(pRko1、pRko2、pRna1、pRna2)を得た。それらの分子量はそれぞれ72.7、201、112、293Mdと算定された。これらのプラスミド上にニトロゲナーゼをコードする遺伝子が存在するかどうかをnifDとのハイブリダイゼーション法で検討したところpRko1上に存在する可能性を見いだしたが、Nagano菌についてはクロモゾームDNAとも反応した。2.ダイズの根粒菌非着生種(rj1)。rj1とRj1の根の抽出液についてレクチン抗体法により差異を調べたが差異は認められなかった。光顕法により根粒菌の両者の根毛への付着を調べたが同様に付着した。しかし、rj1ではカーリングは認められなかった。次に、両者の根に含まれているタンパク質、可溶性画分を比較したが有意義な差は認められなかった。1.レンゲ根粒菌の宿主特異性をレンゲ,アルファルファ,クローバー,インゲン,ダイズに対する根粒形成の有無,菌の根毛先端への付着,感染糸の形成等を各段階で調べた.その結果レンゲのみにレンゲ根粒菌の付着,感染糸の形成,根粒形成が観察された.しかし他の植物に対しては菌の付着も見られなかったので,かなり高い宿主特異性を有することが明らかになった.次にレンゲ種子を粉末にし,緩衝液で抽出後, 3070%硫安飽和画分を得てこれを粗レンゲレクチンとした.この画分はレンゲ根粒菌を強く凝集させたが,他の根粒菌に対しては弱い凝集または全く凝集を起こさなかった.粗レクチンはヒトートリプシン処理赤血球のO型のみと反応し, A, B, AB型を凝集しなかった.この画分をDEAEーCellulose, CMーCelluloseにより約30倍に精製した.2.ダイズの根粒菌着生種(Rj1)と非着生種(rj1)の根の抽出液とダイズ種子レクチンに対する抗体を用いて,ウェスタンーブロッテイング法により検討したが,両者の間で差異はみられなかった.ダイズ根粒菌は根粒菌着生種(Rj1)と非着生種(rj1)の根毛の先端部へ付着したが,非着生種ではカーリングが起こらなかった.次に両者の根の可溶性タンパク質抽出液を2次元ポリアクリルアミド電気泳動により検討した.また両者からの根の浸出液を濃縮,除タンパクしてろ過したものを,逆層高速液体クロマトグラフィーで分析した.その結果両者の間に差が認められた.1.レンゲ根粒菌の宿主特異性に関し、本年度はアルファルファ菌等で根粒形成遺伝子などが存在するといわれている巨大プラスミドがレンゲ菌にも存在しているかどうか調べた。即ち、抽出はアルカリ溶菌法によったが、lysing bufferのpH、フェノール抽出の時間などを検討することにより、再現性よくレンゲ菌からプラフミドが分離できた。二次元アガロースゲル電気泳動の結果R,sp,KohonosuとR,sp,Naganoから異なった2本ずつのプラスミドが得られ、pRkol,pRko2,pRnal,pRna2と名付けた。次に水平ゲル電気泳動で分子量を求めた結果、それぞれ72.7、20.1、112、293Mdと算定された。

これらのプラアスミド上にニトロゲナーゼをコードする遺伝子が存在するかどうかをnifDとのハイブリダイゼーション法で検討したところpRkolに存在する可能性を見いだしたが、Nagano菌についてはクロモゾームとも反応した。2.ダイズの根粒菌着生種(Rjl)と非着生種(ril)の根より全タンパク質を抽出する方法を考え、二次元ポリアクリルアミド電気泳動にかけ両者を比較したが差は認められなかった。3.Polesitao winged bean rice bean等の根粒より菌を分離したが、Polesitao菌は全部Bradyrhizobi um(SAK)、winged bean菌はSAKとRhizobium(FAC)に属したものが認められたがrice bean菌はFAKと中間的な性質を示した。相互接種法により宿主特異性を調べたが、一般に広い特異性を有していた。しかし、菌種により植物の栽培品種と菌種により共生窒素固定能にはかなりの差が認められた。窒素固定活性の時間的経過を調べ、これらの植物種間で活性の強さを比較した。Pole sital winged beanのレグヘモグロビンを解析し、窒素固定活性との相互関係を調べた。Pole sitaoの場合3成分からなっていた。
窒素を利用したステンレス鋼の溶接・接合及び表面改質部のミクロ組織制御

ステンレス鋼の溶接・接合及び表面改質過程における窒素の吸収及び放出挙動は、γ/δ相比や固溶析出現象を左右し、ミクロ組織及び諸性質に極めて大きな影響を与える。従って、窒素の挙動の制御が溶接・接合及び表面改質部の諸特性の改善に有効と考えられるが、その基礎的情報は少ない。そこで本研究は、窒素を含む溶接雰囲気下でステンレス鋼の溶接・接合及びレーザ表面改質を行い、諸性質の変化を系統的に調べ、ミクロ組織を制御するための基礎的資料を得ることを目的として行い、以下の結果を得た。1、熱力学に基づいてアーク溶接における鉄合金の窒素定量予測式を構築し、ステンレス鋼溶接金属に適用した結果、実測値と良く一致した。2、レーザ溶接時のステンレス鋼溶接金属の窒素および酸素吸収挙動を調べた結果、アーク溶接の場合と比べて窒素および酸素ともに吸収量が著しく少なかった。レーザ溶融過程の窒素および酸素の吸収・放出挙動を熱力学的に検討した。3、雰囲気中の窒素分圧を制御することによって二相ステンレス鋼溶接金属中のγ/δ相比を大きく変えることができた。溶接金属の耐食性は窒素量が増加するほど向上した。窒素吸収による耐食性向上の原因を、γ/δ相比、合金成分の分布、窒化物析出などの観点から検討した。また、恒温熱処理において、母材に比べて溶接金属の方がσ相析出が遅く、溶接金属の窒素量が多く初期δ量が少ないほど、σ析出量が急激に増加する時間は早く、また最終的なσ析出量は少なくなった。さらに、σ析出がγ/δ界面構造に依存することを示し、界面制御によるσ脆化抑制の可能性を示唆した。4、高窒素高強度γ系ステンレス鋼JJ1を用いて、アルゴンと窒素の混合ガス雰囲気下でアーク溶解及び溶接を行ったところ、溶接雰囲気の窒素分圧を変化させることにより、溶接金属の窒素量、硬度および衝撃靭性を制御することができた。ステンレス鋼の溶接・接合及び表面改質過程における窒素の吸収及び放出挙動は、オーステナイト・フェライト相比や固溶及び窒化物析出を左右し、ミクロ組織及び諸性質に極めて大きな影響を与える。従って、同過程における窒素の挙動の制御が溶接・接合及び表面改質部の諸特性の改善に有効と考えれるが、その基礎的情報は少ない。そこで本研究は、窒素ガスを含む種々の溶接雰囲気下で各種ステンレス鋼の溶接・接合及びレーザ表面改質を行い、諸性質の変化を系統的に調べることによって、ミクロ組織を制御するための基礎的資料を得ることを目的としている。平成8年度は、ともに窒素が諸特性に大きな影響を及ぼすオーステナイト系ステンレス鋼JJ1と二相ステンレス鋼329J4Lについて調べ、以下の結果を得た。1)核融合炉用超伝導コイル支持構造材料として開発された高強度オーステナイト系ステンレス鋼JJ1を用いて、アルゴンと窒素の混合ガス雰囲気下で非消耗電極によるアーク溶解及びアーク溶接を行ったところ、溶接雰囲気の窒素分圧を変化させることにより、溶接金属の窒素量、硬度およびシャルピー衝撃靭性を制御することができ、溶接金属の機械的性質を母材程度に保つことができた。2)雰囲気中の窒素分圧を制御することによってSUS329J4Lス-パ二相ステンレス鋼溶接金属中のオーステナイト・フェライト相比を大きく変えることができた。また、溶接金属の機械的特性は窒素量が増加するほど向上した。恒温熱処理試験では、母材に比べて溶接金属の方がシグマ相析出が遅かった。

また、溶接金属の窒素量が多く初期フェライト量が少ないほど、シグマ相析出量が急激に増加する時間は早く、また最終的なシグマ相析出は少なくなった。ステンレス鋼の溶接・接合及び表面改質過程における窒素の吸収及び放出挙動は、オーステナイト/フェライト相比や個溶及び窒化物析出を左右し、ミクロ組織及び諸性質に極めて大きな影響を与える。従って、同過程における窒素の挙動の制御が溶接・接合及び表面改質部の諸特性の改善に有効と考えれるが、その基礎的な情報は少ない。そこで本研究は、窒素ガスを含む種々の溶接雰囲気下で各種ステンレス鋼の溶接・接合及びレーザ表面改質を行い、諸性質の変化を系統的に調べることによって、ミクロ組織を制御するための基礎的資料を得ることを目的としている。平成9年度は、熱力学に基づいてアーク溶接における鉄合金の窒素吸収の定量予測式を構築しステンレス鋼に適用した。また、二相ステンレス鋼の耐食性に及ぼす窒素の影響を調べ、以下の結果を得た。1)溶融池の温度を液相線より100K高いと仮定して合金組成の関数として表し、その温度での窒素0.1MPa雰囲気における平衡窒素溶解度を求め、溶接金属の窒素量の実測値との差をCr量の関数で表し、鉄合金溶接金属の窒素の定量式を作成した。それをアルゴン窒素混合ガス溶接雰囲気の場合に拡張し、ステンレス鋼溶接金属の窒素量の場合に適用した結果、実測値と良く一致した。2)雰囲気中の窒素分圧を制御することによってSUS329J1二相ステンレス鋼溶接金属中のオーステナイト/フェライト相比を大きく変えることができた。また、溶接金属の耐食性は窒素量が増加するほど向上した。窒素吸収による耐食性向上の原因を、オーステナイト/フェライト相比、合金成分の分布、窒化物析出などの観点から検討した。ステンレス鋼の溶接・接合及び表面改質過程における窒素の吸収及び放出挙動は、オーステナイト/フェライト相比や固溶及び窒化物析出を左右し、ミクロ組織及び諸性質に極めて大きな影響を与える。従って、同過程における窒素の挙動の制御が溶接・接合及び表面改質部の諸特性の改善に有効と考えれるが、その基礎的情報は少ない。平成10年度は、窒素分圧を変化させた溶接雰囲気でアーク溶接を行い、高窒素高強度オーステナイト系ステンレス鋼溶接金属の機械的性質に及ぼす窒素の影響ならびに二相ステンレス鋼溶接金属の高温変態挙動に及ぼす窒素の影響を調べ、以下の結果を得た。1)核融合炉用超電導マグネット支持構造用候補材料である高窒素高強度オーステナイト系ステンレス鋼JJ1の溶接金属の低温靭性と窒素の関係を調べ、溶接雰囲気から窒素を添加することによって溶接金属の窒素量を制御し、機械的性質を改善することができることを示した。2)雰囲気中の窒素分圧を制御することによって二相ステンレス鋼溶接金属中のオーステナイト/フェライト相比を大きく変えることができた。また、窒素量の異なる溶接金属の高温変態挙動について調べ、フェライトのオーステナイトおよびシグマ相への変態に及ぼす窒素の影響を明らかにした。さらに、フェライト/オーステナイト界面でのシグマ析出が、界面構造に依存することを示し、界面制御によるシグマ脆化抑制の可能性を示唆した。
IL-1αアンチセンス遺伝子導入を用いた膵癌転移機序の解明

【目的】膵癌における肝転移形成の進展機序についてInterleukin-1α(IL-1α)とその転写因子であるNFκBの関与および、IL-1αによる遺伝子発現の変化より検討した【方法】1.SW1990の肝転移能に対するアンチセイスIL-1αDNAの効果(経脾肝転移モデル)IL-1αのcoding regionに対するアンチセンスIL-1αcDNAを発現ベクターpIRES neoに挿入し、ヒト膵癌細胞株SW1990にリン酸カルシウム法にて遺伝子導入し、形質転換し、IL-1α非発現株を株化した。5週齢雄性ヌードマウスを用い、経脾肝転移モデルにて肝転移能を評価した。【結果】2.肝転移能を有するBxPc-3,SW1990にてNFκBの核内移行が認められ、NFκBの活性化が認められたが、非転移株のCapan-2、MiaPaCa-2では認められなかった。IL-1Ra、Antisense導入にてIL-1αを抑制したが、NFκBの活性に変化は認められなかった。【目的】膵癌における肝転移形成の進展機序についてInterleukin-1α(IL-1α)とその転写因子であるNFκBの関与および、IL-1αによる遺伝子発現の変化より検討した
ブラックタイガーにおける抗菌剤の残留性と調理による影響

本研究では,ブラックタイガーにおけるオキシテトラサイクリン(OTC)及びオキソリン酸(OA)の体内動態及び残留特性を明らかにすることを目的とし,さらに,加熱調理がエビ体内に残留している薬物に及ぼす影響について検討し,以下の結論を得た.1.両抗菌剤ともサイナス内投与後の動態は2-コンパートメントモデルによって解析され、以下のモデル式が得られた.2.経口投与後の残留OTCは筋肉において投薬後10時間に最高濃度(5.09μg/g)を示した.最高濃度以後,OTCは減少し,投与後120時間で残留基準値(0.2ppm)以下になった.一方,殻においては投薬後120時間まで高濃度で推移し,その消失相は認められなかった.筋肉における消失相の半減期は22.0時間と算出された.また,その消失曲線より我が国の残留基準値(0.2ppm)に達する時間は112時間(4.7日)と算出された.一方,経口投与後のOAは投薬後4時間に筋肉及び殻ともに最高濃度(筋肉:1.76μg/g,殻:8.17μg/g)に達した.最高濃度以後,両組織ともOAは減少し,それらの濃度は投与後96時間で筋肉0.016μg/g及び殻0.282μg/gにまで減少した.それらの消失半減期は筋肉で20.2時間及び殻で21.9時間であった.OTCのバイオアベイラビリティは35.6%と算出され,血リンパ蛋白結合率は49.0±7.6%(n=11)であった.一方,OAのバイオアベイラビリティは7.9%と算出され,血リンパ蛋白結合率は66.2±10.5%(n=12)であった.3.残留OTCは筋肉で,茄でる及び揚げるの加熱操作により5060%程度減少し,焼くについては3040%の減少がみられた.しかし,殻についてはいずれの加熱調理においてもその分解消失は20%程度にすぎなかった.一方,残留OAは茹でる,焼く,揚げるの加熱調理により筋肉及び殻とも2030%消失したにすぎなかった.また,OTCについては12分間茄でることより残留濃度を80%程度まで減少させることができたが,OAではその減少率は50%程度であった.したがって,通常の加熱調理による残留OTC及びOAの減少は期待できないと考えられた.本研究では,ブラックタイガーにおけるオキシテトラサイクリン(OTC)及びオキソリン酸(OA)の体内動態及び残留特性を明らかにすることを目的とし,さらに,加熱調理がエビ体内に残留している薬物に及ぼす影響について検討し,以下の結論を得た.1.両抗菌剤ともサイナス内投与後の動態は2-コンパートメントモデルによって解析され、以下のモデル式が得られた.2.経口投与後の残留OTCは筋肉において投薬後10時間に最高濃度(5.09μg/g)を示した.最高濃度以後,OTCは減少し,投与後120時間で残留基準値(0.2ppm)以下になった.一方,殻においては投薬後120時間まで高濃度で推移し,その消失相は認められなかった.筋肉における消失相の半減期は22.0時間と算出された.また,その消失曲線より我が国の残留基準値(0.2ppm)に達する時間は112時間(4.7日)と算出された.一方,経口投与後のOAは投薬後4時間に筋肉及び殻ともに最高濃度(筋肉:1.76μg/g,殻:8.17μg/g)に達した.最高濃度以後,両組織ともOAは減少し,それらの濃度は投与後96時間で筋肉0.016μg/g及び殻0.282μg/gにまで減少した.それらの消失半減期は筋肉で20.2時間及び殻で21.9時間であった.OTCのバイオアベイラビリティは35.6%と算出され,血リンパ蛋白結合率は49.0±7.6%(n=11)であった.一方,OAのバイオアベイラビリティは7.9%と算出され,血リンパ蛋白結合率は66.2±10.5%(n=12)であった.3.残留OTCは筋肉で,茄でる及び揚げるの加熱操作により5060%程度減少し,焼くについては3040%の減少がみられた.しかし,殻についてはいずれの加熱調理においてもその分解消失は20%程度にすぎなかった.一方,残留OAは茹でる,焼く,揚げるの加熱調理により筋肉及び殻とも2030%消失したにすぎなかった.また,OTCについては12分間茄でることより残留濃度を80%程度まで減少させることができたが,OAではその減少率は50%程度であった.したがって,通常の加熱調理による残留OTC及びOAの減少は期待できないと考えられた.【目的】本研究ではブラックタイガー(Penaeus monodon,和名:ウシエビ)における抗菌剤のオキシテトラサイクリン(OTC)及びオキソリン酸(OA)の残留特性を明らかにし、さらに、これらの残留抗菌剤が加熱調理によって、どのような影響を受けるのかを調べることを目的とする。本年度はブラックタイガー組織におけるこれら抗菌剤の分析法の検討を行った。さらに、タイ国にて馴致飼育されたブラックタイガーにOTCのサイナス内投与及び経口投与実験を行った。【方法】供試エビにはタイ国サムットサーコーン水産研究所で飼育されたブラックタイガー(体重20-30g)を用いた。

分析法の検討:各組織試料として血リンパ1ml、筋肉2.5g及び殻1.0gを実験に用いた。血リンパについては両抗菌剤ともハイセップカラム(スペルコ社製、USA)を用い、蛍光法による直接注入法によって行った。筋肉及び殻については、OTCでSep-Pak C18、OAでBond Elut C18による固相抽出法によって分析を行った。投与実験:投薬方法は、OTCの投与量が50mg/kgとなるようにカテーテルを用いた強制経口投与法で行った。投薬後、所定時間ごとに5尾ずつ取り上げ、血リンパ、筋肉及び殻を採取した。【結果】本分析法による各組織における添加回収率は次のとおりであった。OTC:血リンパで98.9%、筋肉で82.5%、殻で82.3%、OA:血リンパで97.9%、筋肉で82.2%、殻で81.4%であった。したがって、本分析法はブラックタイガー組織の残留OTC及びOAの分析に適用可能と考えられた。現在、本法によるOTCを経口投与したブラックタイガー組織について分析実験を行っている。【目的】本研究ではブラックタイガー(Penaeus monodon,和名:ウシエビ)における抗菌剤のオキシテトラサイクリン(OTC)及びオキソリン酸(OA)の残留特性を明らかにし、さらに、これらの残留抗菌剤が加熱調理によって、どのような影響を受けるのかを調べることを目的とする。本年度はタイ国にて馴致飼育されたブラックタイガーにOTCのサイナス内投与及び経口投与実験を行った。【方法】供試エビにはタイ国サムットサーコーン水産研究所で飼育されたブラックタイガー(平均体重23g)を用いた。サイナス内投与:OTCを滅菌PBSに1%となるように溶解し、27G注射針を装着したマイクロシリンジによりエビ腹部サイナス内に投与した。経口投与:OTCの投与量が50mg/kgとなるように餌料に混ぜ、ディスパーサーでペースト状にした後、カテーテルを用いて強制投与した。いずれも投薬後、所定時間ごとに5尾ずつ取り上げ、血リンパ,筋肉及び殻を採取し、昨年度確立したHPLC分析に供した。得られたデータをWinNonlin ver.1.1(Scientific Consulting, Inc.,USA)によりファーマコキネティック解析した。【結果】サイナス内投与におけるOTCの体内動態はtwo-compartment open modelに従って解析され、得られたモデル式は、Ct=35.4exp(-3.5303t)+10.6exp(-0.0429t)であった。その分布容及びクリアランスはそれぞれ869mL/kg及び38.7mL/kg/hであり、分布・排泄は非常に速かった。一方、経口投与におけるOTCの体内動態はモデル解析が不能であったため、Noncompartment法により解析した。その吸収・分布・排泄も速く、最高濃度、最高濃度到達時間及び消失半減期は21.1μg/mL、4h及び16.4hであった。バイオアベイラビリティは35.6%と算出され、硬骨魚のものよりもかなり高かった。【目的】本研究ではブラックタイガー(Penaeus monodon)における抗菌剤のオキシテトラサイクリン(OTC)及びオキソリン酸(OA)の動態特性を明らかにする。また、これらの残留抗菌剤が加熱調理によって、どのような影響を受けるのかを調べる。本年度は、昨年タイ国にてOAをサイナス内投与及び経口投与されたブラックタイガー組織の分析及び調理操作が残留OTC及びOAに与える影響について実験を行った。【方法】供試エビにはタイ国サムットサコーン水産研究所で飼育されたブラックタイガー(平均体重22g)を用いた。
酸化物イオン伝導性をもつ蛍光体を用いた新規発光デバイスの開発

本研究の最終目標は,大気中の水分や酸素に強い酸化物蛍光体の薄膜を用いた高輝度・高効率の発光素子(酸化物EL素子)をゾルゲル・焼成法という簡便な方法で作製することである.この目標が達成されれば,耐久性が高く,大面積の発光素子を安価に製造できるようになるはずである.我々は,以下の「研究の目的」で述べるように,新しいメカニズムで酸化物蛍光体を発光させることができることを提案している.本研究期間内では,このメカニズムの検証と高輝度・高効率の酸化物EL素子を実現する構造の解明を目指し,様々な酸化物や金属の薄膜を積層した構造の酸化物EL素子を作製し,その電気・発光特性を調査する.本研究の最終目標は,大気中の水分や酸素に強い酸化物蛍光体の薄膜を用いた高輝度・高効率の発光素子(酸化物EL素子)をゾルゲル・焼成法という簡便な方法で作製することである.この目標が達成されれば,耐久性が高く,大面積の発光素子を安価に製造できるようになるはずである.我々は,以下の「研究の目的」で述べるように,新しいメカニズムで酸化物蛍光体を発光させることができることを提案している.本研究期間内では,このメカニズムの検証と高輝度・高効率の酸化物EL素子を実現する構造の解明を目指し,様々な酸化物や金属の薄膜を積層した構造の酸化物EL素子を作製し,その電気・発光特性を調査する.
非監査サービスが監査人の独立性に与える影響に関する研究

本研究の目的は、監査人が、同一の被監査会社と、監査サービス契約と非監査サービス契約とを同時に締結している場合に当該非監査サービスの提供が監査人の独立性に与える影響について、経済学的なモデル分析を行なうとともに、監査実務における非監査サービスの影響とその対応について明らかにすることである。本研究の概要はつぎのとおりである。1)監査人をエージェントとし、株主と経営者をプリンシパルとするコモン・エージェンシー・モデルを想定して、監査人が同一の被監査会社と監査サービス契約と非監査サービス契約とを同時に締結している場合に生じるエージェンシー問題(監査人のモラル・ハザードの問題)を明らかにした。2)先行研究のモデルに基づいて、監査サービス契約と非監査サービス契約とを同時に締結したとしても、一定の条件を満たすことによって、監査人の独立性は保たれ、真実の監査報告がなされることを示した。すなわち、本研究では、非監査サービスの提供が必ずしも監査人の独立性を侵害するとは限らないことを析出している。3)監査人に支払われる非監査報酬と利益操作との間に正の相関があることを示して非監査サービスが監査人の独立性を損なうことを証明した実証研究がある一方で、市場ベースのインセンティブにより、非監査報酬が監査人の独立性を損なうことはないとする実証研究があるなど、非監査サービスが監査人の独立性を損なうか否かについての先行実証研究の結果は必ずしも一致していないことを指摘した。4)企業の経営活動がグローバルに展開している昨今においては、監査人の独立性を確保するための全世界的なシステムが不可欠であるが、すでにこのような管理システムを社内に整備している大手の会計事務所では、当該システム運用維持管理に膨大なコストを要しており、監査人の業務そのものに支障をきたしかねない状況にあることを指摘した。監査人の独立性は、市場経済において、会計監査が有効に機能するために必要不可欠な諸条件のうち、最も重要なものである。監査人の独立性については、被監査会社が監査人を任命し、さらには監査報酬を支払っているという矛盾した関係についての研究と、監査人が自らの被監査会社に提供する非監査サービスについての研究に大別される。本研究では、監査人が、同一の被監査会社と、監査サービス契約と非監査サービス契約とを同時に締結している場合に当該非監査サービスの提供が監査人の独立性に与える影響についての経済学的なモデル(監査人と被監査会社との間のコモン・エージェンシー・モデル)を用いて分析することを目的としている。本年度は、本研究の初年度であるため、主に基礎研究に注力した。具体的には、監査人による非監査サービスの提供に関する周辺概念を明確にしたうえで、先行諸研究の詳細な整理・検討を行なった。本年度の研究の結果、まず、監査人が実際に採用している監査サービスにおいては、リスク・アプローチに基づく監査が行われていることを確認し、当該アプローチに基づく監査の問題点を明らかにした。さらに、監査人と被監査会社とのコモン・エージェンシー・モデルを用いた先行諸研究から、監査人が被監査会社に対して、監査サービスと非監査サービスを同時提供したとしても、監査人の独立性が損なわれるのは稀であることが論証可能であることを確認している。これらの研究成果は、本研究の次年度以降の基盤となるものである。
知的障害特別支援学校における協同学習の実践研究-集団随伴性を導入した授業づくり-

○研究目的協同学習の成立条件に、5つの基本要素(Johnson, Johnson, &Holubec, 1993)がある。その中の互恵的な相互依存性は,行動分析学において集団随伴性と呼ばれ、強化子の呈示方法により「非依存型」「相互依存型」「依存型」の三つのシステムに分類されている(小島2000)。本研究では,知的障害特別支援学校小学部低学年の児童を対象に,集団随伴性(非依存型,相互依存型)を適用したゲーム活動を実施し,活動条件の違いがゲーム中の児童の仲間への注目の生起に与える影響を検討した。○研究方法対象児4名(A児, B児, C児, D児:小12年:広汎性発達障害)に「箱つみゲーム」を19回実施した。内訳は,条件1(5回),条件2(8回),条件3(6回)である。箱は一人10個積み上げた。条件1は個人戦で,条件2, 3においては,ペア(A児-B児, C児-D児)で実施し,集団随伴性を適用した。条件1(非依存型)では,各個人が時間内に10個の箱を積み上げることができるとシールを渡した。条件2(相互依存型I)では,ペアで10個の箱を同じ場所に時間内に積み上げることができるとシールを渡した。条件3(相互依存型II)では,ペアで箱を運んで渡す役と箱を受け取り積み上げる役に分かれ実施し, 10個の箱を時間内に積み上げることができるとシールを渡した。記録は,録画したVTRを利用し, 10個の箱を積む間に相手の行為に注目した回数を測定した。○研究成果結果,対象児4名とも,条件1(非依存型)よりも条件2, 3(相互依存型)で仲間への注目の生起率が高くなった。また,同じ相互依存型集団随伴性でも,活動形態により違いが見られた。同時に箱を積み上げる個別の活動形態(条件2)よりも,箱を運んで渡す役,箱を積み上げる役と役割を明確にした協同行為の活動形態(条件3)の方が仲間への注目を促すことが示唆された。
がん指向性ナノチューブによる音響化学的アポトーシス誘導を利用したがん治療法の開発

本研究では、in vitroで白血病由来細胞株HL-60細胞に対してポリヒドロキシカーボンナノチューブ(PHCN)と超音波照射の併用によりアポトーシスが誘導された。アポトーシス誘導は細胞の形態学的変化およびcaspase-3の活性化により確認した。PHCNと超音波照射の併用により誘発されたアポトーシス細胞数は、PHCNまたは超音波単独処置に比べて有意に高かった。音響化学的に誘発されたアポトーシスおよびcaspase-3活性は、ヒスチジンにより阻害された。これらの結果は、HL-60細胞に対し、PHCNと超音波照射の併用により産生される活性酸素種がアポトーシス誘発に関与することを示唆している。細胞の死は、ネクローシスとアポトーシスに大別される。ネクローシスは、火傷、毒物、ウイルス感染、薬物投与などによる過剰かつ突発的な刺激によって誘発される受動的な細胞死であり、遺伝子に支配されない細胞死として定義されている。また、細胞がネクローシスを起こした際、細胞内容物が細胞外に流出し炎症などの副作用を起こす。一方、アポトーシスは、遺伝子に支配された遺伝子と言われ、生命の根幹に位置する細胞の自己消去機能と考えられている。アポトーシスは死というよりはむしろ生物が獲得した生への戦略手段であると考えられる。がん細胞ではこのアポトーシス誘導機能が、消失あるいは減弱しているために異常増殖して周囲の正常細胞を駆逐し、生命をおびやかすと考えられている。アポトーシスを誘発した細胞は、酵素的に小体に分解され、最終的にはマクロファージに貪食され、副作用を伴わない細胞死として処理される。超音波によってアポトーシス誘導することができれば、より選択的で副作用の少ないがん治療が期待できる。本研究は、アポトーシス誘導するナノ粒子としてナノカーボンチューブ誘導体を使用し、集束した超音波によるマイクロバブルを生成・破壊さらには、これらナノ粒子の音響化学的活性化作用を用いることにより、これまで困難であった腫瘍組織選択性のアポトーシス誘導を目指すものである。この方法では、ナノ粒子が十分に患部に集積していることを確認した後、薬物の活性化治療に適した超音波を照射することによりナノカーボンチューブ誘導体の活性化による化学的抗腫瘍効果とアポトーシス誘導を発揮させ腫瘍の治療を行う。本研究では、超音波照射により音響化学的に活性化しアポトーシスを誘導するナノカーボンチューブ誘導体を用い腫瘍選択性を備えた新規がん治療法の開発を目指した。ナノ粒子には超音波によって音響化学的に活性化することが期待される水酸化ナノカーボンチューブなどのナノカーボンチューブ誘導体を用いる。最初に培養細胞を用いてこれら水酸化ナノカーボンチューブの超音波による活性化によるアポトーシス誘導をin vitroの実験で確認を行った。アポトーシス誘導の判定は、蛍光顕微鏡による形態変化の観察、アネキシンV染色、DNA断片化のアーガロース電気泳動による検出によって行った。異なる3つの確認法でアポトーシス細胞が同定されたことにより今回の実験でアポトーシスが誘発されていることをかくにんした。がん細胞ではアポトーシス誘導能が、消失あるいは減弱しているために異常増殖すると考えられている。組織深部到達性に優れる超音波によって腫瘍集積性薬物を抗腫瘍活性化する音響化学療法によって腫瘍組織に局在的にアポトーシスを誘導することが可能であれば、ネクローシスを経由しない副作用の少ないがん治療が期待される。また、近年、いくつかのナノ粒子が超音波照射によって音響化学的に活性化することが分かってきている。本研究では、これまでの技術では困難であった腫瘍組織に選択的にアポトーシスを誘導することを目的に、超音波照射により音響化学的に活性化しアポトーシスを誘導するがん指向性多機能型カーボンナノチューブを用い、腫瘍選択性を備えた新規がん治療法の開発を目指す。本研究は、アポトーシス誘導するナノ粒子としてカーボンナノチューブ誘導体を使用し、超音波によるマイクロバブルを生成・破壊さらには、これらナノ粒子の音響化学的活性化作用を用いることにより、これまで困難であった腫瘍組織選択性のアポトーシス誘導を目指すものである。この本年度は、薬物の活性化治療に適した超音波を照射することによりカーボンナノチューブ誘導体の活性化による化学的抗腫瘍効果とアポトーシス誘導の確認を行った。培養細胞の浮遊液を用いて、超音波によって音響化学的に活性化し、アポトーシス誘導を示す化学修飾付単層カーボンナノチューブのスクリーニングを行ったところ水酸基修飾、ポリエチレングリコール修飾が、アポトーシス誘導を誘導することを確認した。次に、カーボンナノチューブ誘導体の音響化学的活性化に適する超音波周波数および照射強度の設定を行ったところ、周波数1MHz,強度3 W/cm2で最も多くの細胞にアポトーシスが観察された。さらにDNAのラダーも観察され化学修飾付単層カーボンナノチューブの音響化学的活性化によってアポトーシスが誘導されることが証明された。最後にアポトーシス誘導におけるシグナル経路の同定を行った。実行・カスパーゼであるカスパーゼ-3とイニシエーター・カスパーゼであるカスパーゼ8の活性化を経時的に測定した。カスパーゼ-3、8の活性化に伴いアポトーシスが進行することが認められた。がん治療に広く用いられている化学療法は、がん細胞(または組織)を正常細胞(または組織)と識別してアタックする能力において充分ではなく、このため、その現状における副作用は、臨床的に望ましいレベルに必ずしもとどまっていない。細胞がネクローシスを起こした際、細胞内容物が細胞外に流出し炎症などの副作用を起こす。

アポトーシスは死というよりはむしろ生物が獲得した生への戦略手段であると考えられる。またがん細胞ではアポトーシス誘導能が、消失あるいは減弱しているために異常増殖すると考えられている。組織深部到達性に優れる超音波によって腫瘍集積性薬物を抗腫瘍活性化する音響化学療法によって腫瘍組織に局在的にアポトーシスを誘導することが可能であれば、ネクローシスを経由しない副作用の少ないがん治療が期待される。また、近年、いくつかのナノ粒子が超音波照射によって音響化学的に活性化することが分かってきている。本研究では、腫瘍細胞に選択的にアポトーシスを誘導することを目的に、多機能型カーボンナノチューブを超音波照射により音響化学的に活性化しアポトーシスを誘導するがん治療法の開発を目指す。本研究では、in vitroで白血病由来細胞株HL-60細胞に対してポリヒドロキシカーボンナノチューブ(PHCN)と超音波照射の併用によりアポトーシスが誘導された。アポトーシス誘導は細胞の形態学的変化およびcaspase-3の活性化により確認した。PHCNと超音波照射の併用により誘発されたアポトーシス細胞数は、PHCNまたは超音波単独処置に比べて有意に高かった。音響化学的に誘発されたアポトーシスおよびcaspase-3活性は、ヒスチジンにより阻害された。これらの結果は、HL-60細胞に対し、PHCNと超音波照射の併用により産生される活性酸素種がアポトーシス誘発に関与することを示唆している。今後は次の13の項目を検討する。1Hoechst 33342などの蛍光色素を使用すると、アポトーシス細胞のクロマチンの凝集を蛍光顕微鏡下で観察することがきることが報告されている。今後は最初にHoechst 33342を用いて細胞染色を行いクロマチンの凝集を確認する。2アポトーシス誘導には、いくつものシグナル伝達経路が関わっていると考えられ、それらのなかでも主経路としてカスパーゼによるシグナル経路が報告されている。本実験においては、エフェクター・カスパーゼであるカスパーゼ-3とイニシエーター・カスパーゼであるカスパーゼ8および9の活性化を経時的に測定する。さらにアポトーシスの誘導との関係を薬物速度論的に解析する。カスパーゼ-3、8および9の阻害剤添加によるカスパーゼ-3, 9および8の活性化とアポトーシス誘導に対する阻害効果を調べそれぞれの経路の寄与を見積もる。3カスパーゼの最終ターゲットの一つに、ポリ(ADP)リボースポリメラーゼ(PARP)あり、この分解によって細胞がアポトーシスを起こすと考えられているが、アポトーシス進行にどの程度寄与しているかは明らかでない。今年度はPARPを同定しその分解とアポトーシス進行との関係を速度論的に解析する。今年度は、音響化学的抗腫瘍効果に関与する活性酸素種の同定を行う。
ポータブル嚥下機能評価システムの新開発

本研究は,現在まで嚥下障害の診断に用いられているVideofluorography(VF)法にかわり,嚥下にかかわる舌運動,頚部運動,喉頭挙上運動を利用して嚥下機能を非侵襲的に計測評価でき,VF法の及ばない在宅・訪問診療などでの利用に実際的なポータブルの嚥下機能評価システムを開発することを目的とした。歪ゲージ式圧力センサーを舌圧計測に,圧電式加速度センサーを喉頭運動計測に用いるポータブル嚥下機能評価システムを試作した。これにより成人被験者30名の嚥下検査を行い,中心間距離20mmで口蓋正中部に設置した前後2個の舌圧センサーの出力発生時の時間差T1と喉頭運動との時間差T2および各圧力の最大値を求めた。水10ml嚥下時のT1は190±101ms, T2は437±162msとなった。さらに,同意の得られた被験者26名についてVideofluorography(VF)法による嚥下造影検査を行い,10倍希釈バリウム溶液10ml嚥下時の,嚥下開始から食塊の最後方部が下顎下縁を通過するまでの時間(VFT1)とT1との間に有意な正の相関関係を認めた(Spearmanの順位相関係数:rs=0.494,P=0.0134)。以上の結果より,従来VF法によってのみ測定評価が可能であったパラメータを今回開発したシステムを用いる嚥下機能評価によっても推定できる可能性が明らかとなった。さらに従来行われていない嚥下時の舌圧の計測など,本システムが嚥下機能・嚥下障害の解明と適切な機能診断の確立に有用なツールとして役立つことが示された。1.ポータブル嚥下機能評価システムの試作中心間距離2cmで設置した2個のフラッシュダイヤグラム形圧力変換器(NEC三栄・9E02-P16),圧電式加速度変換器(NEC三栄・9F04)2個,デジタルオシロレコーダ(NEC三栄・RA1200)より成るポータブル嚥下機能評価システムを試作した。その際,圧力変換器を接着する材料の物理的特性,防水対策および感染防御策,加速度変換器の貼付部位について,本装置を実用化するために必要な多くの知見を得た。2.試作システムによる嚥下機能評価問診およびアンケートにより摂食嚥下困難,誤嚥性肺炎の既往を認めない成人30名について,本システムによる客観的嚥下機能評価結果を行った。その結果,本システムで嚥下舌圧の伝達する速度,舌運動と喉頭運動の時間的関係が定量的に評価できることが明らかとなった。さらに同意の得られた一部の被験者についてVFとの同時測定を行い,その結果および嚥下困難等の自覚症状を照らし合わせたところ,本システムは,全体の情報量はVF法による嚥下機能評価より制限されるものの,嚥下訓練の対象として取り上げられる主要な舌,喉頭の運動を適確に把握する評価指標を多く提供できる特色を有することが明らかとなった。

本研究は,現在まで嚥下障害の診断に用いられているVideofluorography(VF)法にかわり,嚥下にかかわる舌運動,頚部運動,喉頭挙上運動を利用して嚥下機能を非侵襲的に計測評価でき,VF法の及ばない在宅・訪問診療などでの利用に実際的なポータブルの嚥下機能評価システムを開発することを目的とした。平成12年度に試作したポータブル嚥下機能評価システムにより30名の嚥下機能検査を行い,口蓋部に中心間距離で20mmで位置する舌圧センサーの出力発生時の時間差(T1),後方の舌圧センサーからの出力の最大値(P2)等が有用であることを確認した。その後,同意の得られた被験者26名についてVideofluorography(VF)法による嚥下造影検査を行い,10倍希釈バリウム溶液10ml嚥下時の,嚥下開始から食塊の最後方部が下顎下縁を通過するまでの時間(VFT1),食塊の最前方部が下顎下縁に到達してからその最後方部が下顎下縁を通過するまでの時間(VFT3)などを計測し,開発した評価システムとVF法それぞれによる機能評価の比較検討を行った。各パラメータの関係について検討したところ,T1とVFT1の間に有意な正の相関関係を認めた(Spearmanの順位相関係数: rs=0.494,P=0.0134)。一方で,VFT3とP2の間に正の相関のある傾向が窺われた(Pearsonの相関係数: r=0.400,P=0.424)。以上の結果より,従来VF法によってのみ測定評価が可能であったパラメータを今回開発したシステムを用いる嚥下機能評価によっても推定できる可能性が明らかとなった。さらに従来行われていない嚥下時の舌圧の計測など,本システムが嚥下機能・嚥下障害の解明と適切な機能診断の確立に有用なツールとして役立つことが示された。
分子集合体を用いたナノカプセルの調製と機能性複合材料の創製

界面活性剤としてAOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)を用いてAOT逆ミセルを形成させ,AOT逆ミセルの分散・合一特性を利用して逆ミセル内部に温度応答性物質であるpoly-N-イソプロピルアクリルアミドのナノ粒子を形成させた後,ナノ粒子をジビニルベンゼン(DVB)で包括する機能性複合材料の創製を試みた.調製したナノカプセルの粒径,形状,カプセル化率,収率及び温度応答性に及ぼす調製条件の影響を検討した.その結果,1)平均粒径はAOT濃度,DVB濃度及びDVB重合時間に影響を受け,p-NIPAMの重合時間には影響を受けない.2)収率はDVB添加量のみに依存し,他の調製条件の影響を受けない.3)カプセル化率はp-NIPAMの重合時間及びAOT濃度に依存し,他の調製条件の影響を受けないことを明らかにした.これらの結果は,昨年度の結果とほぼ同様であり,逆ミセルの大きさ・数に影響を受ける.また,温度応答性物質ナノ粒子を予め調製することにより,カプセル化率の向上が見られ,より大量の目的物質をナノカプセル内に封じ込めることができると考えられる.しかしながら,目的物質(本研究ではL-プロリン)の内包状態を徐放挙動から考察すると,目的物質が温度応答性物質内に包括されている訳ではなく,温度応答性物質内部に存在するもの,温度応答性物質外部(温度応答性物質とジビニルベンゼン間)に存在するものがあることが示唆された.このことから,ナノカプセル調製時の回収・乾燥・保存方法の改良が必要であり,改良を施すことにより温度応答性を持ったナノ粒子の創製が可能であると考えられる.界面活性剤としてAOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)またはTween85(ポリオキシエチレントリオレイン酸ソルビタンエステル)を用いて逆ミセルを形成させ,逆ミセルごとスチレン/ジビニルベンゼン共重合体により包括することによりナノカプセルを調製した.調製したナノカプセルの粒径,形状,カプセル化率及び収率に及ぼす調製条件の影響を明らかにした.逆ミセルを用いずにカプセル調製を行った場合,不定形粒子が調製され,球状の粒子は調製されなかったが,逆ミセルを用いることにより球状粒子が調製され,その粒径は約600nmであった.調製されたナノカプセルは凝集傾向が見られたが,微小な力で凝集を解消することが可能であった.また,カプセル化率は逆ミセルの大きさ,数及び界面活性剤の特性影響を受けることを明らかにした.逆ミセルの大きさ及び数が増大する調製条件(界面活性剤濃度の増加,注入水量の増加)においては逆ミセルの大きさ及び数の増加に従いカプセル化率が低下した.これらの結果は全逆ミセルの界面積と逆ミセルを包括するモノマー量によって説明が可能であった.また,陰イオン性界面活性剤であるAOTは非イオン性界面活性剤であるTween85に比べイオンの影響を受けやすいことを明らかにした.即ち,注入水中のイオン強度の増加によりカプセル化率が低下することを明らかにした.さらに,いずれの界面活性剤においても注入水のpHに依存せずカプセル化が可能であることを明らかにした.これらの結果から,逆ミセルを用いて調製したナノ粒子をコーティングする技術の構築ができたと考えられる.界面活性剤としてAOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)を用いてAOT逆ミセルを形成させ,AOT逆ミセルの分散・合一特性を利用して逆ミセル内部に温度応答性物質であるpoly-N-イソプロピルアクリルアミドのナノ粒子を形成させた後,ナノ粒子をジビニルベンゼン(DVB)で包括する機能性複合材料の創製を試みた.調製したナノカプセルの粒径,形状,カプセル化率,収率及び温度応答性に及ぼす調製条件の影響を検討した.その結果,1)平均粒径はAOT濃度,DVB濃度及びDVB重合時間に影響を受け,p-NIPAMの重合時間には影響を受けない.2)収率はDVB添加量のみに依存し,他の調製条件の影響を受けない.3)カプセル化率はp-NIPAMの重合時間及びAOT濃度に依存し,他の調製条件の影響を受けないことを明らかにした.これらの結果は,昨年度の結果とほぼ同様であり,逆ミセルの大きさ・数に影響を受ける.また,温度応答性物質ナノ粒子を予め調製することにより,カプセル化率の向上が見られ,より大量の目的物質をナノカプセル内に封じ込めることができると考えられる.しかしながら,目的物質(本研究ではL-プロリン)の内包状態を徐放挙動から考察すると,目的物質が温度応答性物質内に包括されている訳ではなく,温度応答性物質内部に存在するもの,温度応答性物質外部(温度応答性物質とジビニルベンゼン間)に存在するものがあることが示唆された.このことから,ナノカプセル調製時の回収・乾燥・保存方法の改良が必要であり,改良を施すことにより温度応答性を持ったナノ粒子の創製が可能であると考えられる.
組織エレメントによる３次元組織再生のためのダイナミックカルチャー技術の開発

関節軟骨組織を3次元再構築するための動的培養技術および再生された軟骨組織の非侵襲評価技術を開発した.静水圧刺激と動的流れ刺激を同時に実現する動的培養法として,応力ーひずみ制御による動的圧縮応力負荷の条件下で再生軟骨を培養する技術の開発を行った.開発した動的培養システムを用いることにより,コラーゲンおよびプロテオグリカンの産生量,機械特性の向上が共に促進されることが示された.また,軟骨組織の非侵襲評価法としてテラヘルツ時間領域分光分析を適用したところ,分光分析により得られる複素誘電率から軟骨組織の形成度を非侵襲的に評価可能であることが示された.関節軟骨組織を3次元再構築するための動的培養技術および再生された軟骨組織の非侵襲評価技術を開発した.静水圧刺激と動的流れ刺激を同時に実現する動的培養法として,応力ーひずみ制御による動的圧縮応力負荷の条件下で再生軟骨を培養する技術の開発を行った.開発した動的培養システムを用いることにより,コラーゲンおよびプロテオグリカンの産生量,機械特性の向上が共に促進されることが示された.また,軟骨組織の非侵襲評価法としてテラヘルツ時間領域分光分析を適用したところ,分光分析により得られる複素誘電率から軟骨組織の形成度を非侵襲的に評価可能であることが示された.静水圧刺激と動的流れ刺激を同時に実現する動的培養法として,応力-ひずみ制御による動的圧縮応力負荷の条件下で再生軟骨を培養する技術の開発を進めた.具体的には,応力-ひずみを動的に制御可能な力学試験機をベースに,再生軟骨にサイクリックなひずみを負荷するシステムを構築した.本システムは,無菌的な条件の下で温度,湿度,CO2濃度がコントロール可能である.脱分化型のフェノタイプを有するウシ膝軟骨細胞(P2)を用い,これまでに開発してきた動的流れ場におけるスフェロイド形成技術を応用してウシ軟骨細胞からなるスフェロイドを同時多量に作製した.次いでモールドを用いてスキャホールドフリー3次元体を形成させた.この3次元体を開発したシステムに適用した.具体的には,37°C,湿度100%のもとで,20%ひずみを0.110Hzの頻度で,1日当たり2時間負荷し,計5日間にわたり動的培養をおこなった.動的培養後の3次元体の総コラーゲン量,プロテオグリカン量の定量,力学的特性の計測を行ったところ,5.0Hzの動的ひずみ負荷培養が,軟骨組織形成という観点で最適であることが示された.これにより,軟骨細胞からスフェロイドを経て3次元化した組織に,動的培養が適応可能であること,そして動的ひずみ負荷が,生化学的刺激と同様,軟骨組織形成に対して促進的に働くことが明らかとなった.今後は,このシステムをベースに,未分化な細胞ソースへの適用可能かどうかも検証する.前年度までの研究で確立された動的流れ場での培養技術,非拘束圧縮培養技術に加え,本年度では拘束圧縮培養技術を確立し,ウシ軟骨細胞から構成される3次元組織をこれらの動的な培養環境下で培養を行い,軟骨組織の形成を多角的に検証した.これらの動的培養法において,プロテオグリカンおよびコラーゲン産生量では動的流れ場での培養と非拘束圧縮培養では有意差は見られなかったが,拘束圧縮培養においてはそれらの産生量が低下していた.これは拘束圧縮培養においては組織の側方が拘束され,酸素供給・拡散が妨げられるために,軟骨細胞のバイアビリティに影響を及ぼしたものと考えられる.一方,生体組織の持つ階層構造という観点からは差が見られた.生体軟骨組織においては,細胞の形態等から表層,中間層,深層の3層に分けることのできる階層構造を構築しており,各層において軟骨細胞のフェノタイプや組織の力学的特性が異なることが知られている.3種類の動的培養を実施したところ,いずれも異方性を有した組織が構築された.その中で,拘束圧縮培養において形成された軟骨組織は,生体軟骨と類似した階層構造を形成することが示された.拘束圧縮培養においては,圧縮による側方にひずみが生ずることがブロックされており,そのことにより組織内部の静水圧が上昇していることが推察される.これらの条件は生体の関節軟骨が圧縮を受ける場合の力学的な環境に近いため,より生理的な力学的環境を生む動的培養法であると考えられる.今後は,より明確な階層構造の実現に向けて動的培養条件の検証を続けていく予定である.再生軟骨の組織形成度を非侵襲的に評価する技術の開発を進めた.再生軟骨の組織形成度は,コラーゲンやプロテオグリカンの産生量や機械的特性の定量を通じて評価可能であるが,通常は破壊的な方法によって評価されている.一方,再生軟骨はテーラーメードであることから非侵襲計測法の開発は必須である.軟骨組織を形成する主要なマトリックスの一つはsGAGと呼ばれるプロテオグリカンである.このsGAGは硫酸基を持つため,水分子を配向させることにより,軟骨組織の高い含水率および機械的特性における粘性を実現させている.テラヘルツ波は,分子間相互作用と同じエネルギーレベルにあるため,軟骨組織に対してテラヘルツ時間領域分光を適用したところ,テラヘルツ帯の特定の波長における軟骨組織の複素誘電率のデータとsGAG量および機械的特性のあいだに高い相関が見られた.このことにより,テラヘルツ時間領域分光により再生軟骨の非侵襲評価が可能であることが示された.前年度までに条件設定を終えた動的流れ場での培養技術を、今年度はiPS細胞に適用した。

増殖因子を用いてヒトiPS細胞から軟骨様細胞に分化させた細胞を二次元培養により増殖させた後、細胞懸濁液を作製しクローニングリングを用いて積層培養した。1日後、そのまま静置培養を続けるグループと動的培養を行うグループに分けて6日間培養し、組織形成度の評価を行った。その結果,遺伝子発現レベルにおいても、コラーゲンtype I、コラーゲンtype IIおよび転写因子Sox9共に動的培養により増加していることが示された。また、力学的強度、マトリックス産生(コラーゲン,プロテオグリカン)はいずれも旋回培養という動的な培養により増加することが示された。一方、組織形成という点においては、ヒトiPSから軟骨細胞様細胞に分化させた細胞を用いた場合は、ブタ関節軟骨細胞を用いた場合と比較して、中心壊死を起こす確率が高く、確実に組織形成ができるかどうかという点においては劣っていた。これは、用いたヒトiPSから軟骨細胞様細胞に分化させた細胞が、軟骨細胞と同等の低酸素要求性および低栄養要求性を実現出来ていないことによると考えられた。したがって、これまでに確立した動的培養の条件およびシステムを改良し、組織内部の細胞に対する酸素供給および栄養供給をさらに増加させる必要があると考えられた。今後は、動的培養の条件を改良し、成熟軟骨細胞のみならず未分化細胞にも同等に適用可能な三次元組織構築技術の開発を目指す。軟骨組織創製のための動的培養技術の開発において,中心壊死を起こさず,かつ異方性を有する3次元組織を形成させる技術の開発が予定通り進んでいる.今後は,研究計画に示されるように,再生組織の外形形状の制御を可能とする技術の開発を進める.25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに開発した動的培養技術を用いて、成熟軟骨細胞だけでなくiSP細胞から軟骨様細胞に分化させた細胞を用いて、関節軟骨細胞への分化コントロール、マトリックス産生を実現することができた。そして一定の確率で3次元組織化を実現することができた.本研究は,動的培養技術と再生組織形状制御技術の開発を主な目標としている.一方,細胞ソースとしては成熟した軟骨細胞を用いて研究を進めている.今後,これらの技術の開発が進んだ折には,細胞ソースとして未分化な細胞に動的培養技術と再生組織形状制御技術を適用して行く予定である.25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、より確実な三次元組織再構築を実現するために、酸素供給および栄養供給の効率化を進め、動的培養条件を検証する。また、組織エレメントから3次元組織を構築するコンセプトをさらに進め、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスと複合させることにより、より迅速に再生組織の力学的特性を向上させ、同時に軟骨細胞のフェノタイプの維持を図ることのできる方法を検証する。
甲状腺癌の未分化転化に関する分子病理学的研究

甲状腺専門病院である伊藤病院において、昭和54年1月から平成6年2月の間に生検、あるいは手術的に切除された甲状腺未分化癌は69例である。また、分化型の癌である乳頭癌・濾胞癌の一部に未分化癌を混じえていた、あるいは分化癌術後に未分化癌を発生した、といったanaplastic transformationを起こしたと考えられる症例は24例であった。こうした症例を用い、癌抑制遺伝子であるp53を一次抗体として免疫組織化学的染色を行ったところ、未分化癌例の約7割の症例で陽性所見が得られ、予後との相関関係が示唆された。最近では種々の悪性腫瘍でp53の変異の研究が進んでおり、単に悪性転化時における消失の有無だけでなく、個々の症例についてのpoint mutation、deletionパターンの解明が行われている。現在、分化癌と未分化癌が併存する症例のパラフィンブロックを用い、p53のhot spotであるexonを用い、その変異をPCR-SSCP法により探るべく、primerを準備中である。