hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関節運動を円滑化する感覚運動ペア刺激法:相反性抑制の合目的的な機能変化

主動筋が収縮すると同時に拮抗筋が抑制される相反性抑制の神経機能は,円滑な関節運動を行うための重要な役割を果たしている.近年,末梢神経に対する経皮的電気刺激と一次運動野への経頭蓋磁気刺激を組み合わせて呈示する感覚運動ペア刺激によって非侵襲的に脳機能を変化させることが可能になってきており,円滑な運動を促す新たなツールとして期待されている.本研究では,反復関節運動と感覚運動ペア刺激が相反性抑制に及ぼす影響を明らかにすることに成功した.平成24年度の研究では,主動筋に投射している一次運動野に対する連合性ペア刺激(Paired associative stimulation:PAS)の効果が,拮抗筋運動野の可塑的変化を誘導するか否かを検証することを目的とした.健常被験者10名を対象(男性5名,女性5名,平均年齢21.1歳)とし,橈側手根屈筋および橈側手根伸筋から誘発筋電図を記録した.経頭蓋磁気刺激のための刺激装置にはMagstim 200と直径70 mmの8の字コイルを用いた.PASは,手関節部の正中神経への経皮的電気刺激(安静時運動閾値の300%の強度)と一次運動野への経頭蓋磁気刺激(安静時運動閾値の130%の強度)を25 msの刺激間隔,0.25 Hzの刺激頻度で200回呈示した.一次運動野興奮性の指標として,PASに伴う橈側手根屈筋(主動筋)および橈側手根伸筋(拮抗筋)の単発運動誘発電位(motor evoked potential:MEP),short-interval intracortical inhibition(SICI),long-interval intracortical inhibition(LICI)の変化を観察した.PAS中の単発MEP振幅は,橈側手根屈筋および橈側手根伸筋において時系列的に増加した.SICIは,橈側手根屈筋,橈側手根伸筋ともにPAS前後後で変化を認めななかった.LICIは,橈側手根屈筋のみで有意に増加した(P < 0.0001).平成24年度の実験により,PASの効果が拮抗筋運動野の可塑的変化を誘導し得ることが示唆された.ただし,LICIの増加が橈側手根屈筋のみに認められたことから,PASによるMEP振幅の増加とGABAB性皮質内抑制の増加は異なる機序によって生じていると考えられた.主動筋が収縮すると同時に拮抗筋が抑制される相反性抑制の神経機能は,円滑な関節運動を行うための重要な役割を果たしている.近年,末梢神経に対する経皮的電気刺激と一次運動野への経頭蓋磁気刺激を組み合わせて呈示する感覚運動ペア刺激によって非侵襲的に脳機能を変化させることが可能になってきており,円滑な運動を促す新たなツールとして期待されている.本研究では,反復関節運動と感覚運動ペア刺激が相反性抑制に及ぼす影響を明らかにすることに成功した.平成23年度の研究では,1)相反的な筋に投射している皮質脊髄興奮性を評価する方法を探索すること,2)反復関節運動による相反性抑制機能の変化を検証することを目的とした.相反的な皮質脊髄興奮性の評価方法に関する検討では,健常被験者8名を対象とした.まず,橈側手根伸筋および橈側手根屈筋のhot spotを中心とした49刺激ポイントを経頭蓋磁気刺激(TMS)による安静時運動閾値の120%強度で刺激して各筋の運動誘発電位(MEP)を基に描出された運動野マップのcenter of gravity(CoG)を算出した.次に,橈側手根伸筋のCoG,橈側手根屈筋のCoG,橈側手根伸筋と橈側手根屈筋のCoGにおける中点において,安静時運動閾値の80ー170%の刺激強度にてMEPのinput-output(IO)curveを求めた.その結果,TMSによって誘発された相反的な2筋における運動野マップは異なる領域を構成しつつもオーバーラップしており,各筋のCoGにおいて誘発されたIO curveとCoGの中点において誘発されたIO curveに有意な相違を認めなかった.反復関節運動による相反性抑制機能の変化に関する検討では,健常被験者10名を対象とした.反復関節運動には,LED信号を合図に素早く手関節を伸展する運動を用い,運動の前後で橈側手根伸筋と橈側手根屈筋のCoGの中点におけるMEPのIO curveを求めた.その結果,反復関節運動後に橈側手根伸筋におけるIO curveの傾きが増加し,橈側手根屈筋におけるIO curveの傾きが減少した.平成23年度の実験により,TMSよって誘発された相反的な2筋における運動野マップは,異なる領域を構成しつつもオーバーラップしており,両筋を同時に刺激する最適刺激部位が存在した.また,反復関節運動によって相反性抑制の神経機能が変化することが示唆された.

平成23年度の予定であった反復運動練習に伴う運動誘発電位の相反的変化を明らかにすることができたため.平成24年度の研究では,paired associative stimulation(PAS)が相反性抑制機能に及ぼす影響を明らかにする.それによって,PASが反復関節運動前のコンディショニング刺激を提供する効果的なリハビリテーション・ツールとなり得るか否かを検証する.Paired associative stimulationに伴う物品費および消耗品費,研究成果を学会にて報告するために出張旅費,被験者謝金,研究結果を論文発表するための英文校閲費の執行を予定している.
ケイ酸塩鉱物の拡散係数に関する実験的研究と隕石の熱史の解析への応用

1.鉱物単結晶の作成地球上の岩石,また隕石鉱物中に多量に含まれるケイ酸塩鉱物のうちダイオプサイド(CaMgSi_2O_6)をチョクラルスキー回転引き上げ法にて合成した.単結晶は直径15mm,長さ70mmで,ひび割れ,不純物や泡の混入はないように見えた.単結晶は,結晶の回折パタンをX線回折装置にて,電子顕微鏡とエネルギー分散型元素分析装置により化学組成分析を行った.これらによりダイオプサイド単結晶の合成に成功した事が確認された.今年度からダイオプサイド単結晶中の種々の元素の拡散定数の実験的研究を行う.2.メリライト鉱物中のBとBeの拡散係数の実験的研究太陽系形成初期の年代史を考える上で,太陽系で最も古い物質であるCAIと半減期が非常に短く現在では壊変した娘核種の同位体比異常として,その存在が確認される消滅核種の研究は非常に重要である.種々の消滅核種の存在と,それを含む鉱物との組み合わせ,そして娘核種の鉱物中の拡散を計算で,初期太陽系における隕石母天体,またCAIの形成史を定量的に評価する事が可能になる.近年,CAIs中に150万年の半減期をもつ消滅核種^<10>Beが存在していたことが,^<10>Bの同位体の過剰として発見された(McKeegan et al.,2000;Sugiura et al.,2001).Sugiura et al.,(2001)は一つのCAI中の半減期の異なる二種類の消滅核種(メリライト中のB-Be系とアノーサイト中のAl-Mg系)を測定し,それらの鉱物中の分布がCAI形成時/後に撹乱をうけたと報告している.そこで本研究では,娘核種の拡散係数を実験的に決定し,CAI形成時/形成後の熱史を定量的に求める事を目的としている.拡散加熱実験など試料作成と熱史の計算はアリゾナ大学にて,拡散係数の測定にはアリゾナ州立大学の二次イオン質量分析計を用いて行った.850-1100度の温度範囲でメリライトの端成分ゲーレナイト中のBとBeの拡散係数を精度よく決定した.CAIの形成後の隕石母天体内の熱史ではアノーサイト中のAl=Mg系は乱されるが,メリライト中のB-Be系は元々の分布を保持する事が計算の結果確認された.しかしながら形成時の高温領域においては,両系ともに撹乱を受ける事,またアノーサイト中のAl-Mg系に比べるとメリライト中のB-Be系は乱されにくい事がわかった.今年度の研究は大きく分けて3つ行った.以下にそれぞれを示す.1.鉱物単結晶の作成アイソトープ総合センターにおいてケイ酸塩鉱物であるメリライトの単結晶(オケルマナイト,ゲーレナイト)をチョクラルスキー回転引き上げ法にて合成した.これらの結晶を使用して,2.の拡散実験をアリゾナ大学にて行った.2.メリライト及び輝石中のカリウムの拡散係数の測定太陽系で最も古い物質であるCAI(Ca, Al-rich inclusion)中に半減期が10万年と非常に短い消滅核種^<41>Caが発見されている(例えばSrinivassan et al.,1994).^<41>Caの娘核種である^<41>KのCAI鉱物中の不均一分布に着目し,それがCAI形成後の熱史において,どのように攪乱されたかを定量的に議論した.1.で作成したメリライト(オケルマナイト,ゲーレナイト)および天然輝石(ダイオプサイド)中のKの拡散係数をそれぞれ実測した,拡散加熱実験など試料作成はアリゾナ大学にて行い,拡散係数の測定にはアリゾナ州立大学設置の二次イオン質量分析計を用いて行った.実測したそれぞれの拡散係数を用いてCAI形成後の熱史の計算を行い,CAIが隕石母天体に取り込まれたのは太陽系形成に先立つ超新星爆発などによる元素合成の時から170万年以内であることがわかった.この研究は平成15年8月の隕石学会にて口頭・論文発表を行った.3.かんらん石中のクロミウムの拡散係数の測定近年,様々な種類の隕石鉱物中に370万年の半減期をもつ消滅核種^<53>Mnの存在の証拠が,^<53>Crの同位体の過剰として発見されている(Lugmair and Shukolyukov,1998).本研究で着目したパラサイトと呼ばれるかんらん石と鉄からなる石鉄隕石の一種は,その特異的な組織から小惑星のコア・マントル付近を形成していたと考えられている.パラサイト中のかんらん石にも消滅核種^<53>Mnの壊変による^<53>Crの同位体比過剰が発見されており(Lugmair and Shukolyukov,1998),かんらん石中の^<53>Crの同位体分布は,パラサイト形成後の熱史を考える上で重要である.そこで,かんらん石中のCrの拡散係数を実験的に求める事により,かんらん石ひいてはパラサイトの熱史を定量的に計算する事が可能になる.本実験は,2.と同様にアリゾナ大学,およびアリゾナ州立大学にて同様の手法により行った.その結果,Omolonと呼ばれるパラサイトは100万年に6から50度の速度で冷却された事.またかんらん石のサイズと冷却速度,および時間の関係の初期温度の依存性を得る事ができた.この研究は平成16年3月の月惑星会議にて口頭・論文発表を行った.1.鉱物単結晶の作成

地球上の岩石,また隕石鉱物中に多量に含まれるケイ酸塩鉱物のうちダイオプサイド(CaMgSi_2O_6)をチョクラルスキー回転引き上げ法にて合成した.単結晶は直径15mm,長さ70mmで,ひび割れ,不純物や泡の混入はないように見えた.単結晶は,結晶の回折パタンをX線回折装置にて,電子顕微鏡とエネルギー分散型元素分析装置により化学組成分析を行った.これらによりダイオプサイド単結晶の合成に成功した事が確認された.今年度からダイオプサイド単結晶中の種々の元素の拡散定数の実験的研究を行う.2.メリライト鉱物中のBとBeの拡散係数の実験的研究太陽系形成初期の年代史を考える上で,太陽系で最も古い物質であるCAIと半減期が非常に短く現在では壊変した娘核種の同位体比異常として,その存在が確認される消滅核種の研究は非常に重要である.種々の消滅核種の存在と,それを含む鉱物との組み合わせ,そして娘核種の鉱物中の拡散を計算で,初期太陽系における隕石母天体,またCAIの形成史を定量的に評価する事が可能になる.近年,CAIs中に150万年の半減期をもつ消滅核種^<10>Beが存在していたことが,^<10>Bの同位体の過剰として発見された(McKeegan et al.,2000;Sugiura et al.,2001).Sugiura et al.,(2001)は一つのCAI中の半減期の異なる二種類の消滅核種(メリライト中のB-Be系とアノーサイト中のAl-Mg系)を測定し,それらの鉱物中の分布がCAI形成時/後に撹乱をうけたと報告している.そこで本研究では,娘核種の拡散係数を実験的に決定し,CAI形成時/形成後の熱史を定量的に求める事を目的としている.拡散加熱実験など試料作成と熱史の計算はアリゾナ大学にて,拡散係数の測定にはアリゾナ州立大学の二次イオン質量分析計を用いて行った.850-1100度の温度範囲でメリライトの端成分ゲーレナイト中のBとBeの拡散係数を精度よく決定した.CAIの形成後の隕石母天体内の熱史ではアノーサイト中のAl=Mg系は乱されるが,メリライト中のB-Be系は元々の分布を保持する事が計算の結果確認された.しかしながら形成時の高温領域においては,両系ともに撹乱を受ける事,またアノーサイト中のAl-Mg系に比べるとメリライト中のB-Be系は乱されにくい事がわかった.
生体保護物質としての糖類の水和ダイナミクスにおよぼす影響の研究

通常、蛋白質や脂質膜等の生体物質は、液体である水が存在しないと、その高次構造を保持することができない。ところが、ある種の生物は極度の乾燥や凍結にも耐えることができ、その際、トレハロース等の糖類が水の代替物質として作用することが知られている。これらの糖類は分子レベルで生体物質の揺らぎを抑制していると考えられ、分子運動に糖が与える影響は非常に興味深い。そこで、蛍光相関分光法(FCS)や、蛍光消光法による実験を行なった。水溶液の糖濃度を上昇させると、糖水溶液中の蛍光性分子の励起三重項(T_1)状態の寿命τ_<trp>が長くなることをFCSにより見出した。T_1状態は大気中の酸素によって消光される。よって、高濃度の糖水溶液中でT_1、状態の寿命が延びる原因としては、酸素濃度もしくは酸素分子の拡散速度の低下が考えられる。糖分子と酸素分子が何か特別な相互作用をするとは考えにくいので、その原因は溶液中の自由体積の低下といったような物理的なものが考えられる。クリプトビオシス時にその生物の生命機能は完全に停止しているので、水や酸素等の循環を遮断したほうが、生体物質の長期保存には有利なのかも知れない。さらにリン脂質2重膜ベシクルを細胞のモデルとして、凍結に対する糖類の保護能についてもFCSと蛍光消光法で調べた。蛍光消光法はベシクル外に存在する蛍光色素を消光剤によって消光し、ベシクルに内包された色素の割合を求める実験法である。その結果、スクロースやトレハロースを凍結時に添加しておくと、ベシクルの保持効率が上昇することがわかった。特にトレハロースでは、ベシクルの内外に添加した場合の効果が大きい。さらにFCSで凍結時のベシクルの凝集についての糖類の効果も調べた。ところが、ある種の生物は極度の乾燥や凍結にも耐えることができ、その際、トレハロース等の糖類が水の代替物貿として作用することが知られている。そこで、蛍光相関分光法(FCS)により、微小空間内の分子の並進拡散運動を測定した。水溶液の糖濃度を上昇させると、糖水溶液中の蛍光性分子の励起三重項(T_1)状態の寿命τ_<trp>が長くなることを見出した。直鎖アルコール溶液中でも同様な実験を行ったが、T_1状態は観測されずτ_<trp>は糖水溶液およそ50wt%の濃度に相当するが、T_1状態はほとんど観測できなかった。よって、高濃度の糖水溶液中でT_1状態の寿命が延びる原因としては、酸素濃度もしくは酸素分子の拡散速度の低下が考えられる。溶存酸素計による測定の結果,トレハロース水溶液について、25°C,1013mBarの時、0wt%、30wt%、58wt%の濃度でそれぞれ、7.1、7.1、6.7mg/lという値を得ており、濃度変化はほとんどない。よって、T_1状態の寿命が延びる原因は酸素分子の拡散速度の低下によると結論された。
酸素透過性セラミックスの表面交換反応ダイナミクスとその支配因子の解明

酸素透過性セラミックスの表面交換反応の評価法として酸素透過測定が応用できるが、これまでの本手法は酸化物イオンのバルク拡散が支配的と仮定しているため、酸素透過における表面交換反応の影響を正確に考慮することが困難であった。表面交換反応が支配的な場合、検出される酸素透過速度によって導出される酸素ポテンシャル差を過大評価する原因となる。また酸素透過速度の実測値は測定試料厚の減少に伴って(表面積)/(体積)が増加し表面交換反応の影響が強くなるため、理論値に従わず飽和する傾向がある。そこで本研究は酸素透過測定から表面交換反応の影響を正確に評価する手法を検討した。これより酸素透過性セラミックスの各温度における酸素透過速度と表面交換反応の関係を調査した。La-Ca-Fe系の試料について、酸素透過速度の温度依存性を測定した。測定温度は800 - 1000°C、高酸素分圧側を大気とし、低酸素分圧側にHeガスを5 - 40 sccm流した。以上の高/低酸素分圧差間の酸素ポテンシャル差をNernstの法則より起電力に換算しE_tとした。試料の表面とガス中の酸素ポテンシャル差については8%イットリアドープジルコニアからなる円錐形微小電極および金電極を試料表面に接触させ、酸素ポテンシャル差による起電力E_sを測定した。バルク間の酸素ポテンシャル差はE_b= E_t-E_sより見積もった。温度の低下に伴いE_bはほぼ一定にもかかわらず、E_sが増加したことから、本対象試料は温度低下とともに表面交換反応が支配的になることが分かった。2018年度に酸素透過測定装置の故障があったため、一部予定よりも酸素透過測定の実施が遅れている。酸素透過測定装置の修理が完了したため、本装置により、効率的かつ重点的に表面交換反応を評価する。一方で、XPSにて、酸素透過性セラミックスの表面状態を調査し、両者の相関の有無を検討する。本研究では、酸素透過性セラミックスの表面交換反応を支配する主因子を明らかにすることを目的としている。今年度は、主にLa-Ca-Fe系ペロブスカイトに注目し、La/Ca比を系統的に変化させたセラミックス試料の作製条件を検討し、各組成の単相試料を得た。その表面交換反応を導電率緩和法にて調べた結果、酸素透過性能が高い組成の試料において、高いイオン拡散係数及び、高い表面交換反応係数を示すことを確認した。一方、以上の試料表面を、XPSにて室温で調べたところ、表面交換反応が速い試料の表面ほどO1s軌道に起因するピークがシャープであり、表面交換反応が遅い試料ほどブロードになる傾向があることが分かった。このO1sピークがブロードなほど、格子内酸素の結合状態と異なる多数の酸素結合状態が存在することを意味する。このような格子内酸素と異なる表面の酸素結合状態は、表面交換反応にとって不利に働くことが分かった。本年度は、酸素透過測定装置を用いた表面交換反応の評価を予定していたが、ガス分析装置が故障したため、この実験を延期せざるを得なかった。その分、当初の計画より遅れている。上記故障した装置の修理が完了したので、酸素透過測定装置の表面交換反応評価を効率を上げて行うことに重点を置く。
国際私法についてのマイコンによる自学自習システムの開発研究

1.自学自習システム構築のための人工知能ソフトの選定。本研究は、マイコン用人工知能ソフト(エキスパート・システム)を使用して、国際私法の自学自習システムを構築するものであるから、まず多数市販されているマイコン用人工知能ソフトの技術資料や実演を参考にして比較検討を行い、学習システム構築に適するソフトの候補を「創玄」と「ハイパーブレイン」に絞り、両者を使用して、代理の準拠法の決定につき、簡単な自学自習システムを構築してみるという実験を実施した。この結果、自学自習システムの構築には、「創玄」の方が操作が簡単であり適しているとの結論をえた。2.「創玄」を使用しての試行用システムの試作。次に、「創玄」を使用して、国際的裁判管轄の決定を対象として、自学自習システムを構築し、試作したシステムを繰返し試用してみることにより、逐次改良を重ねた結果、実用に耐えうると評価できる自学自習システムを構築することができた。今回の試作と試用により、今後「創玄」を使用して、国際私法の全分野につき自学自習システムを構築できるとの確実な見通しを得ることができた。3.試作した自学自習システムの試用による評価。本年度は多数の学習者の試用に供することはできず、少数の試用者にとどまったが、この試作した自学自習システムの使用により、どのような論理過程を経て国際的裁判管轄の有無が決定されるのかを、各段階を一つ一つ追いながら理解して行くとともに、自己の推論や考え方がどの点において間違っていたかを明確に把握することが可能になり、従来の講義の聴講や読書による学習方法に比して、利用者の学習能率の向上と理解程度の深化が期待できるとの確信を得た。
先天形態異常症候群《診断３割の壁》の克服にむけた「臨床遺伝医の眼」の共有システム

先天形態異常症候群に対して家系ゲノム解析を行っても、既知症候群として診断可能な症例は現状で全体の3割程度にとどまっている。残りは極めてまれ、ないし未知の症候群と考えられる。残り7割の診断には、「臨床医の眼」による正確な症状記述の積み重ねにより、過去の症例から一群とすべき症例を見きわめることが必須である。もし、多くの医療従事者がこの「臨床医の眼」を共有できれば、先天形態異常症候群の診断精度を大きく高められる。本家研究が目指すのは医療従事者のための情報共有学習システムである。一方、本研究と平行して、海外では大規模な顔貌画像および診断結果データに基づく機械学習を応用した先天性形態異常症候群診断補助システムの性能が急速に向上していることが報告されてきている。こうしたシステムの一つがFace2Gene (https://www.face2gene.com/ )である。しかし、このシステムの学習の多くがヨーロッパ系集団の情報を用いて実施されてきていることから、はたしてFace2Geneが本邦の症例に対しても性能を発揮するのかどうかは不明であった。このため、代表研究者は本研究のために準備をすすめてきた本邦症例のデータを用いることでFace2Geneの性能評価を試みた。75名・48症候群を持つ患者群、およびダウン症候群をもつ患者群それぞれについて、上位10位の候補症候群に正しい診断が含まれるかを評価したところ、高い感度をすでにもつことが明らかになり、またダウン症候群をもつ患者群33名では年齢による影響も限定的であることも明らかになった。この結果については論文を現在投稿中である。対象症例については100例以上について顔貌画像および臨床診断情報をとりまとめることができている。さらに追加症例についての解析準備を進めている。Face2Geneの本邦症例を用いた性能評価については前述のとおり現在論文を投稿中である。情報のアノテーションのためのヒト表現型オントロジー(HPO)の利用については、とくに手分けしたアノテーションのためにはその日本語化が重要である。代表研究者はAMED-GA4GH GEM Japanワークショップへの参加を通して情報収集を行った。Face2Geneの性能評価の結果、高品質顔貌画像があるにもかかわらず診断できない症候群があることが明らかになった。これらの症候群の検出感度改善のためには本邦症例の登録が必要であると思われる。また、本研究のためのデータセットに対するアノテーションと特徴値抽出システムの実装を試みる。本年度はシステムの実装に先立ち、本研究のためのデータを用いた海外システムFace2Geneの評価を先行させたため次年度使用額が生じた。次年度は、システムの実装をすすめ、必要となる機器の購入を行う予定である。
脳内光スイッチによる魚類の成長と成熟の人為制御

水産重要種であるマツカワ(Verasper moseri)の成長が,対照(屋内光)に対して,発光ダイオードを光源とする特定波長光によって促進された。この効果は,マツカワがほとんど摂餌をしない(すなわち一定の実験期間に体重が減少する)低水温でも有効であった。本研究の成果は,特定波長光照射が養殖魚の生産に有効であること示唆する。一方,成長と摂餌行動に係わる神経内分泌系の遺伝子発現は従来の知見とは異なる挙動を示したことから,特定波長光が成長を促進するしくみの解明については,今後一層の研究が必要である。(1)光環境と成長の関連:(1)蛍光灯照射下の白および黒色水槽でキンギョをそれぞれ3週間飼育したが、摂餌量に差異は認められなかった。(2)発光ダイオード光(青、緑、赤)照射下でキンギョをそれぞれ3週間飼育したが、摂餌量に顕著な差異は認められなかった。(3)自然光下の白および黒色水槽でトラフグをそれぞれ一定期間飼育したところ、飼育後20日目の瞬間成長率は白色水槽が黒色水槽に比べて高い傾向が見られた。また、飼育後の脳内のメラニン凝集ホルモン(MCH)遺伝子の発現量は白色水槽で高い傾向が見られた。(2)光環境と成熟の関連:(1)上記(1)-(1)と(2)のキンギョにおいて生殖巣の発達を調べたが、差異は認められなかった。(2)自然光下の白および黒色水槽で一定期間飼育したサクラマスにおける脳内のMCH遺伝子発現量は白色水槽で高い傾向が認められた。また、この遺伝子の発現量はメスがオスよりも高いことを認めた。(3)光環境とマツカワのMCHとGnRHの関連:自然光下の白および黒色水槽で3週間飼育したマツカワにおいて、脳内MCH遺伝子は白色水槽の方が高いという再現性を得た。GnRH遺伝子発現量の定量については現在計画中である。(4)光環境とキンギョのMCHとGnRHの関連:上記(1)-(1)と(2)のキンギョにおいて、脳内MCH遺伝子発現量は白色水槽の方が高いという再現性を得た。さらに無色の透明水槽での同遺伝子の発現量は黒色水槽におけるものと同等であることを見出した。(5)光環境が未知の脳ホルモン遺伝子の発現に及ぼす効果:白色水槽で飼育したキンギョの脳を用いて、脳で発現量が多い遺伝子が濃縮されたサブトラクションcDNAライブラリーを構築した。(1)光環境と成長の関連:マツカワにおいてcDNAクローニング済みの桿体オプシン,赤色感受性オプシン,緑色感受性オプシン,青色感受性オプシンおよび紫外線感受性オプシンについて,それぞれのcDNAを用いて発現コンストラクトを作製した。これらの成果により,組換えタンパク質を用いる遺伝子工学的手法での,各オプシンの光吸収極大の測定が可能になった。(2)光環境と成長の関連:昨年度,トラフグ幼魚(体重約100g)において白色背景色が成長促進効果を持つことを認めた。本年度は,白色背景色の効果を体重約300gのトラフグを用いて調べた。飼育後1週間で体色に違いが見られ,白色水槽の魚は黒色水槽に比べて明るくなったが,両群で体重および摂餌量に有意な差は見られなかった。総じて,成長に伴って摂餌率は減少していくが,白色背景色の成長促進効果は摂餌率の高い成長初期に強く,成長に伴って弱くなることが示唆された。(3)光環境と魚類のMCHと生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンの関連:キンギョの脳内MCH mRNA量は白水槽飼育群の値が黒水槽飼育群の値よりも約17倍高かった。すなわち,背景色とMCH遺伝子発現の関係に再現性を得た。一方,ガラス水槽で飼育していたキンギョの脳内MCH mRNA量は黒色水槽飼育群の値と同等であった.以上のより,ガラス水槽飼育魚におけるMCH mRNA含量を通常の値と考えたとき,白背地という異常な光環境においてMCH遺伝子が過剰発現していると考えられる。(4)未知の脳ホルモン遺伝子の発現に及ぼす効果:白水槽と黒水槽でそれぞれ3週間飼育したキンギョ脳を用いて,脳サブトラクションcDNAライブラリーを作製した。その中から約350個のcDNAを単離し,塩基配列を決定した。交付申請書に記した研究実施計画の項目ごとに報告する。(1)赤オプシン(LWS, 552 nm)、第二の緑オプシン(RH2-C, 490 nm)、第二の青オプシン(SWS2B, 416 nm)、および紫外線オプシン(SWS1, 367 nm)について吸収極大を明らかにした。第三の緑オプシン(RH2-A)は偽遺伝子であることが判明した。(2)発光ダイオード光(赤、緑、青)がマツカワの視床下部-脳下垂体系のホルモン遺伝子に及ぼす効果を調べた。

[視床下部]プロオピオメラノコルチン(POMC)遺伝子の発現が青および緑色光により上昇した。メラニン凝集ホルモン(MCH)遺伝子の発現は青および緑色光照射により低下した。オレキシンおよび神経ペプチドY遺伝子の発現に変化は認められなかった。[脳下垂体]POMC遺伝子の発現が、視床下部での動態と同様に青および緑色光照射により上昇した。成長ホルモン遺伝子発現は緑色光下において減少傾向が認められた。(3)青色光がキンギョにおいてMCH遺伝子の発現を促進することを再現できた。緑および赤色光では上昇しない。また同一の試料において、POMC遺伝子の発現は緑および赤色光で上昇し、青色光では変化がなかった。(4)昨年度マツカワにおいて第二のMCHを発見した。今年度はその一次構造を明らかにした。また、質量分析により当該ペプチドを同定した。本ホルモンの活性および背地色に対する応答は第一のMCHと同等であることを認めた。(5)体色調節に関与する黒色素胞刺激ホルモンをコードする、第二および第三のPOMC遺伝子を発見した。第二POMCは脳と脳下垂体で発現することから、既知の第一POMCと同様の機能を有すると考えられる。第三POMCは脳下垂体と頭腎で発現することから、未知の生命過程に関与するものと推測される。特記事項として,本年度は魚類生理に及ぼす特定波長光の効果に極めて重要な現象を認めた(第7項参照)(1)マツカワの成長にともなう視物質の発現:各種オプシンの眼球内mRNA含量が0歳から1歳にかけて減少する群(赤型オプシンLWS,青型オプシンSWS2Bと紫外線型オプシンSWS1)と変化しない群(緑型オプシン:RH2Bと青型オプシンSWS2A),さらに上昇する桿体オプシンRH1のグループに分かれた。(2)マツカワの各種オプシンの吸収極大: RH1, SWS1, SWS2,RH2,およびLWSの全構造を決定した。これらのオプシンのcDNAを用いて視物質を再構成し最大吸収波長を測定した結果,一部のオプシンが特徴的な値を示した。(3)特定波長光と成長および成熟関連遺伝子の関連:低水温期において,マツカワの脳内メラニン凝集ホルモンmRMA濃度が青および緑色光照射により低下した。(4)光強度とホルモン遺伝子発現:次年度に向けて飼育設備を整えた。(5)背地色と成長および成熟関連遺伝子の関連:黒背地馴致したキンギョの脳下垂体において,黒色素胞刺激ホルモンをコードする遺伝子の発現量が上昇することを認めた。(6)背地色とホルモン遺伝子の関連:次年度に向けて分析対象を絞り込んだ。(7)光環境と成長および成熟の関連:マツカワにおいて,水温が次第に上昇する春夏季(平均水温10°C以下)には赤色LED光照射群の摂餌量と日間成長率は青および緑の各LED光照射群よりも低かった。この差は水温の上昇とともに消失した。水温が次第に低下する秋冬季(平均水温17°C以上)には, LED光照射群間で摂餌量と日間成長率に差は見られなかった。しかし水温の低下に伴って(平均水温13.3°C),赤色LED光照射群と環境光照射群では摂餌量と日間成長率が減少した。さらに水温が低下したところ(平均水温8.8°C),これらの差は拡大した。
改変シグナル分子によるサイトカイン機能の制御

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。IL-2,IL-3,Epoなどの細胞増殖を強く促進するサイトカインにより転写因子STAT5が活性化されることを我々は見い出していたが、このSTAT5の機能を探るために優性抑制型変異体の作成を試みた。STAT5のチロシンリン酸化部位を含むC末側を欠損した変異体を過剰に発現させることで、内在性のSTAT5の活性を抑制することが示された。即ち、サイトカインで誘導される初期遺伝子の中でPim-1,Cis,Id-1,Osmなどの発現がこの変異STAT5により特異的に抑制された。我々はGM-CSFあるいはEpoによるシグナル伝達経路の一部しか活性化できない変異受容体からのシグナルの解析により、これらの遺伝子発現がSTAT5により制御されていることを示唆する結果をすでに得ていたが、今回の変異STAT5の発現実験はこの可能性を強く支持するものである。さらに我々はOsmの遺伝子を単離し、そのプロモーター領域の解析から、STAT5結合部位がサイトカインによるOsm発現誘導に必須であることを証明した。これらの結果はC末側欠損STAT5が優性抑制型変異体として作用することを強く示すものである。また、変異STAT5の発現によりIL-3依存性の増殖が抑制されるという結果を得た。これはSTAT5が増殖に関与し得るということを示す初めての結果であり、STAT5により抑制されているどのような遺伝子が細胞増殖に関与するのか今後の重要な課題である。

また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。IL-2,IL-3,Epoなどの細胞増殖を強く促進するサイトカインにより活性化される転写因子STAT5の機能を探るために優勢抑制型変異体dnSTAT5を作成し,造血細胞で発現させた.dnSTAT5はIL-3依存性細胞BaF3ではIL-3依存性の増殖を抑制し,STAT5で制御されている遺伝子の中には増殖に関与するものがあることを示した。一方,EPOに応答して分化する赤芽球細胞株SKT6では,(1)STAT5を活性化するプロラクチン(PRL)受容体を発現するとPRL依存性に分化すること,(2)STAT5の活性化が起こらないEPO受容体の変異体では分化誘導が認めれないこと,さらに,(3)dnSTAT5を発現するとEPOによる分化誘導を抑制した。以上の結果から,STAT5はSKT6細胞では分化誘導に重要な役割を果たしていることが強く示唆された。このように,STAT5は細胞ごとに異なる機能を示すことが明になった。一方,IL-3やEPOなどはRasの活性化を介して細胞死の制御を行うが,活性化型Rasのeffectordomainに変異を導入した部分活性化型Rasの発現によりRasはRaf/Mapキナーゼ系とラパマイシン感受性のシグナル系を活性化し、それぞれが細胞死の抑制に作用するとの結果を得た。今後はdnSTAT5,Ras変異体をはじめ様々なサイトカインシグナル分子の活性化型および優性抑制型をレトロウイルスベクターを用いて初代培養細胞系などより生理的条件下で発現し、各シグナル系の機能を検証する予定である。IL-2,IL-3,Epoなどの多くの細胞増殖を強く促進するサイトカインにより活性化される転写因子STAT5の機能を探るためにSTAT5を活性化しない変異サイトカイン受容体および優性抑制型変異体STAT5を作成して赤芽球分化に対する作用を調べた。EPOで分化するSKT6細胞ではEPOによる分化誘導にSTAT5が重要な役割を果たしていることが示された。
カイラル超伝導体の単一ドメインにおける新奇量子輸送現象の探索

カイラル単一ドメインとされるマイクロメートルサイズのSr_2RuO_4超伝導体において電子輸送測定を行い、パリティの破れた電流-電圧特性を発見した。この結果は、クーパー対の内部自由度によりSr_2RuO_4試料がカイラル単一ドメインを形成し、ゼロ磁場で自発磁化していること、また外部磁場を印加することによりドメインのカイラリティが変化していることを示している。我々はこの物理的起源として、単一ドメインSr_2RuO_4の試料端におけるマヨラナフェルミオンの励起を提案した。本年度はSr_2RuO_4試料作製から電子輸送測定までを行った。マイクロメートルサイズのSr_2RuO_4単結晶に対して、電子ビームリソグラフィーを用いて試料へ金電極を6端子取り付けた。試料上の金電極へ局所的に電子ビームを照射し溶着を行った。その結果、試料との接触抵抗を大幅に減少させることに成功し電気測定が可能となった。これらの実験手法は他の微細な異方的超伝導体の単結晶試料にも適応できる可能性があり、電子輸送特性を研究するために大変重要な技術である。実験技術を論文(H.Nobukane et al., Jpn.J.Appl.Phys., 49 020209 (2010))として発表した。マイクロメートルサイズのSr_2RuO_4は超伝導状態において興味深い電流-電圧特性を示した。発生電圧が印加電流に対して偶関数になっており、パリティの破れた電流-電圧特性を発見した。測定試料サイズはこれまでの実験結果から示唆されているカイラル単一ドメインサイズと同程度である。以上から単一ドメインサイズに試料をすることでカイラルp波超伝導体の新奇な現象を顕著に観測できたと考えている。結果及びその解釈としてヘリカル渦の流体力学的な運動を提案した論文(H.Nobukane et al., Solid State Commun.149 1212 (2009))を発表した。さらに研究の進展として、パリティの破れた電流-電圧特性に対する磁場依存性が明らかになっている。現在、その結果をPhys.Rev.Bに投稿中である。これらの研究成果を3件の国際学会(うち1件の招待講演)と日本物理学会2009年秋季大会にて発表を行った。本研究の目的は、単一ドメインサイズのSr_2RuO_4試料を用いて、カイラルp波超伝導体におけるトポロジカルな新奇量子現象を電子輸送測定により探索することである。昨年度までの研究成果として、単一ドメインサイズの試料においてパリティの破れた電流-電圧特性を明らかにした。いったいパリティの破れた電流-電圧特性の起源は何であろうか?本年度は、その起源をより詳細に明らかにするために、単一ドメインサイズSr_2RuO_4の試料端へ金電極を取り付け、電子輸送測定を行った。試料端にはカイラル超伝導体のトポロジカルな性質が顕著に現れるため、未解決な電流-電圧特性の起源に迫れる可能性がある。まず、これまでに測定した試料と同様にパリティの破れた電流-電圧特性が観測された。さらに新しい結果として、c軸に平行に0 Oeから1200 Oeへ磁場を印加したとき、450Oe付近を境として印加電流の向きにかかわらず、正電圧の発生(すなわちV(+I)=V(-I))から、負電圧の発生(-V(+I)=-V(-I))へ、系統的に変化することを初めて発見した。この結果は、Sr_2RuO_4試料がカイラルな単一ドメインであり、ゼロ磁場で自発磁化していること、また外部磁場を印加することによってドメインのカイラリティが変化していることを示している。これはSr2RuO4がカイラル超伝導体である有力な実験結果である。また、我々はパリティの破れた電流-電圧特性の起源として、単一ドメインの試料端におけるマヨラナフェルミオンの励起を提案した。実験結果、及び議論は、Physical Review B 83,144502(2011)に掲載された。本研究によるSr_2RuO_4超伝導体中のマヨラナフェルミオンの発見により、今後は物性実験の立場から素粒子物理とのトポロジーに関する普遍数理構造の追求に興味が持たれる。
未発表長編を基盤とする１９－２０世紀転換期マーク・トウェイン像の再構築

トウェイン晩年の未発表作品の中で最も取り上げられることの少ない長編『それはどっちだったか』Which Was It? (1899-1906)を日本語に訳出しつつ、同時期のトウェイン作品群や別の書き手の作品と突き合わせることによってその意義を探った。その結果、この小説はこの作家の盛期と晩年を繋ぐような主題群を盛り込んでおり、無視して差し支えない作品であるどころか、トウェインの隠れた代表作と呼んでも過言ではない位置を占めることが明らかになった。また、作品が執筆された時期のアメリカ合衆国の多人種的・多民族的な様相をより深く理解するうえでも、『それはどっちだったか』が重要な作品であることも解明された。2011年度より、文学者Mark Twainが最晩年に執筆した『自伝』完全版(University of California Press, 2010)の第1巻を分析してきたが、これについて論じた長めの書評が日本英文学会の査読を通過し、2012年末に『英文学研究』に掲載された。この作業から、やはり晩年に書かれた未発表原稿"Indiantown"や_Which Was It?_などの諸作品と、『自伝』との繋がりも見えてきたので、それを今後の研究に生かしていきたいと考えている。2012年度はまた、晩年のTwainと親交を持った若きHelen Kellerの自伝を分析することによって、世代の異なる二人の自伝の書き手が共有していた時代意識(例えば米西戦争に対する批判的スタンス)や、〈自分を書く〉という行為をめぐる自意識的な考えを浮き彫りにすることができた。2012年後半に京都大学で開かれた日本英文学会関西支部大会で口頭発表し、2013年2月に入子文子監修・中村善雄編『水と光:アメリカの文学の原点を探る』(開文社出版)において活字化することができた。総じて言うと、2012年度は、TwainよりKellerに力点を置いた研究活動を行ったが、Twainの『自伝』に書き込まれたKellerへの言及や、両者の親交・影響関係などを考慮するならば、脇道にそれたというよりも、当初の研究目的・研究計画を更に広く深く実践する方向で研究が行われたと言える。本研究の一環として2011年度に発表・刊行したトウェイン晩年の未発表草稿「落伍者たちの避難所」に関する論考を、本年度では再度練り直し、2013年8月にニューヨーク州エルマイラで開催された第7回マーク・トウェイン研究国際学会において英語での口頭発表を行なった。この大会では、世界各国から集まったトウェイン研究者たちと交流し、有意義な情報交換を行なうことができた。(報告文は、2014年4月発行の学会誌『マーク・トウェイン:研究と批評』第13号に掲載。)更にその後、発表原稿を英語論文として執筆し直し、学会誌_Mark Twain Studies_に投稿した。同論文は採用され、2014年度中に刊行される最新号に掲載される予定である。2013年度は、トウェインの未発表長編『それはどっちだったか』および原型となる短編作品「インディアンタウン」の翻訳作業に最も多くの時間を費やした。8月に海外での発表を終えてから、半年近くにわたって集中的な作業を行なうことによって、2014年3月末に訳稿は無事完成した。二作品併せて400字詰め原稿用紙にして750枚近くの分量のデータとなった。版元探しも順調に進み、彩流社から2014年度のうちに刊行できるめどもつけることができた。本年度(2013年度)は、本研究の眼目の一つである翻訳作業が終了し、海外への研究成果の発信という課題も遂行することができた。難所を乗り越えて、充実した進展を見ることができた一年であったと言える。2011年度の研究の中心は、文学者Mark Twainが最晩年に執筆した『自伝』完全版(University of California Press, 2010)の第1巻を分析することにあった。これについて論じた書評が、2012年度中に学会誌『英文学研究』に掲載される予定である(現在査読中)。また、この自伝から得られた成果を参考にして、晩年期の作家の思考を知る上で不可欠でありながら、これまで等閑視されてきた未完の長編作品_The Refuge of the Derelicts_(1905-6)を分析し、2011年11月に京都大学英文学会において研究発表を行った。更に、その成果を基にして論考「老境のマーク・トウェイン--『落伍者たちの避難所』を中心に」を完成させた。これは、金澤哲(編著)『アメリカ文学における「老い」の政治学』(松籟社)と題する共同研究書の一章を構成する論考として年度内に出版された(2012年3月)。

本論考は、晩年のTwainの(とりわけダーウィニズムをめぐる)社会意識・宗教意識と強く繋がった、人間の老い・死をめぐる作家の認識について論じたもので、同時期に書かれた自伝、エッセイ、未刊行長編群の分析も取り込んだ作品論である。2012年1月には、シアトルで開催されたMLA年次大会に出席し、次いでカリフォルニア大学バークレー校で資料調査にあたった。その成果の一部は上述の論考に生かされることになった。また資料調査の過程において、同時代人であるHelen Kellerとの交友が、これまで考えられてきた以上に両者のアメリカ社会への考え方に影響を与えていることが分かってきた。次年度以降はそちらの方向にも留意して更に研究を進展させていく予定である。2014年度は本研究のまとめとして、マーク・トウェインの未発表長編『それはどっちだったか』と原型となる短編「インディアンタウン」を日本語に翻訳し、長い解説を添えて出版することをを最大の目標として取り組んだ。2013年度までに訳出作業は一通り終了していたので、今年度は時間をかけて読み直し、訳文に手を入れて完璧を期した。それに付す解説については、『それはどっちだったか』をトウェインの作品群全体の中にどのように位置づけることができるかを検証することを主眼に置いた長い論考となったが、8月から11月にかけて断続的に取り組んで完成させ、2015年3月に彩流社から出版することができた。これによって、本研究の最も重要な成果を広く社会に向けて還元することができた。また、ディケンズ・フェローシップ日本支部と日本マーク・トウェイン協会が2014年6月に共同開催したシンポジウムにおいて、チャールズ・ディケンズの旅行記『アメリカ紀行』とトウェイン『それはどっちだったか』を比較し、両者の奴隷制表象の相違点を探る報告を行なった。このシンポジウムでの成果が、上記の長い解説文を書く準備作業として大いに役立った。加えて本研究においては、『それはどっちだったか』と同じくトウェインの晩年期に書かれた長めの未発表作品「落伍者たちの避難所」も検討の素材としたが、その英語版論文を日本マーク・トウェイン協会が発行する英文号会誌に発表して(2014年10月)、研究成果を海外に発信することができた。総じて言うなら、4年間にわたる研究の道筋は当初の計画からやや変わっていったものの、最終的には目標にしていた研究目標を達成し、無事に最終年度の研究を終えることができた。アメリカ文学当初の実施計画のうち、Mark Twainの完全版『自伝』第1巻を分析するという作業は、『英文学研究』での書評掲載という形で無事に遂行することができた。またその作業の過程で、未発表作品"Indiantown"や_Which Was It?_の解釈に繋がるような記述を『自伝』のなかに発見することができたのは、大きな収穫だった。また、晩年のTwainとアメリカ・世界の同時代情勢との関連を再検討するという課題に関しては、出版されたHelen Kellerをめぐる論考において、Twain, Kellerに共通する米西戦争に対する批判的態度という形で取り上げることができた。上記のような研究上の達成・展開があった一方で、未発表長編_Which Was It?_の訳出作業に遅滞が生じているので、次年度にはこの方面に関してより力を入れて研究作業を進めていく必要がある。なお、海外での学会出張・資料調査には、校務等で時間を取ることができず、その分の旅費は使えずに終わった。
経口投与できる抗体医薬をめざした鼻咽頭リンパ組織を利用したIgA抗体の製造

経口投与によって粘膜局所ではたらく抗体医薬の創製をめざして、病原細菌やウイルス由来の抗原に対してIgA型モノクローナル抗体の作製法の開発に取り組んだ。すなわち、マウスを経鼻免疫してIgA産生誘導を行うとともに、鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)を利用してIgAモノクローナル抗体を作製した。抗原としては、腸管出血性大腸菌O157:H7由来のベロ毒素の糖鎖結合サブユニット(Stx1B)を組換え型として発現し、タンパク質を完全に精製して用いた。Stx1Bは、マウスに対して免疫原性が低くIgA抗体産生誘導が困難であったが、抗原の化学的な架橋、ポリスチレン微粒子への吸着、リポソームへの封入によって、免疫効率の大幅な改善を認めた。得られたIgAモノクローナル抗体は、Stx1Bが認識する糖鎖を含む人工糖鎖リガンド(グロボトリオースをポリリシン骨格に結合させたポリマー)と固相化Stx1Bとの相互作用を極めて効率良く阻害した。一方、可溶性のStx1Bと細胞表面の標的糖鎖への結合に対しては、部分的な阻害にとどまった。その原因を調べるため、表面プラズモン共鳴を用いてIgA抗体への可溶性Stx1Bの結合を速度論的に解析したところ、強い中和活性を示したIgG抗体の場合と比較して、結合速度、解離速度の両面において劣っていることが分かった。さらに、Stx1B特異的IgAおよびIgGモノクローナル抗体をコードする全長cDNAを単離し、植物抗体をはじめとする組換え型抗体の作製の準備が完成した。また、今回の経鼻免疫およびNALTを用いる方法で、コレラ毒素や卵白アルブミンに対するIgAモノクローナル抗体の確立にも成功し、IgAモノクローナル抗体製造法としての応用性が高いことが示された。経口投与によって粘膜局所ではたらく抗体医薬の創製をめざして、病原細菌やウイルス由来の抗原に対して、IgA型モノクローナル抗体のあらたな作製法の開発に取り組んだ。抗原としては、腸管出血性大腸菌O157:H7由来のベロ毒素(Stx1)を選んだ。安全に実験が遂行できるように、糖鎖結合サブユニットであるBサブユニット(Stx1B)を組換え型として発現し、タンパク質を完全に精製して用いた。Stx1Bは、マウスに対して粘膜ルートを介した免疫原性が特に低かったが、Stx1Bを化学的に架橋することで免疫原性を著しく改善することができた。また別の手法として、ポリスチレン微粒子にStx1Bを吸着させて経鼻免疫することで、免疫原性の改善を認めた。コレラトキシシを粘膜アジュバントとして用いて架橋Stx1BでBALB/cマウスを経鼻免疫し、実用的なレベルの分泌型IgA抗体価を得ることができた。鼻咽頭リンパ組織から単細胞浮遊液を作製し、細胞表面にIgAを発現しクラススイッチしたB細胞をマグネチックセルソーターで分離した。マウスミエローマ細胞と細胞融合し、Stx1Bに対するIgA型モノクローナル抗体を確立した。得られたモノクローナル抗体は、グロボトリオースをポリリジン骨格に結合させた人工糖鎖リガンドと固相化Stx1Bとの間の結合を極めて有効に阻害し、ベロ毒素の糖鎖認識活性を阻害しうるIgA型モノクローナル抗体であることが判明した。得られたIgA抗体のStx1Bに対する結合特性についてBIACOREによる速度論解析を実施中である。一方、リポソーム表面にStx1Bを化学的に結合させることに成功している。今後、粘膜免疫の効率をさらに高めるため、リポソームを活用した複合抗原の経鼻投与を活用し、さらに効率的なIgAモノクローナル抗体の作製めざす予定である。

経口投与によって粘膜局所で働く抗体医薬の創製をめざし、マウス鼻咽頭リンパ組織(NALT)を利用してIgA型モノクローナル抗体の作製を実施するとともに、性状解析を行った。腸管出血性大腸菌O157:H7由来のベロ毒素の糖鎖結合サブユニット(Stx1Bに結合するIgAモノクローナル抗体の作製に成功した。また、コレラ毒素や卵白アルブミンに対するIgAモノクローナル抗体の作製にも成功した。Stx1Bに対するIgAモノクローナル抗体は、ポリマー型人工糖鎖リガンドの固相化Stx1Bへの結合を強力に阻害したが、CD77陽性のバーキットリンパ腫RAMOS細胞への可溶性Stx1Bの結合を強く阻害できなかった。一方、脾臓細胞から作製したStx1Bに対するIgGモノクローナル抗体は、RAMOSへのStx1Bの結合を完全に阻害するとともに、Stx1ホロトキシンが誘導するアポトーシスを有効に阻害した。BIACOREのセンサーチップに抗IgA(あるいはIgG)抗体を固相化し、モノクローナル抗体をキャプチャーさせ、アナライトとして可溶性StxlBを導入して結合解離速度を比較した。現在得られているIgAモノクローナル抗体を用いた場合でも、Stx1Bの結合を表面プラズモン共鳴で特異的に検出できることが証明された。しかし、IgG抗体と比較すると結合および解離速度の両面において劣っていた。この結合親和性の違いが生物活性の違いに現れているのか、IgA分子特有の立体障害が原因であるのかは今後の研究課題である。一方、IgAおよびIgG型モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のcDNAをクローニングし、IgGの可変部とIgAの定常部を持つキメラ遺伝子を作製した。また、Stx1Bに対する粘膜免疫の誘導においても、リポソームを用いた粘膜局所への抗原導入の有効性が明らかとなった。