hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体機能分子を固定したソフト界面の表面力測定

研究代表者は表面力測定を中心手段として、分子間・表面間相互作用を明らかにし、「力」を観測量として複雑系を研究する新しい研究領域を確立したいと考えて研究を行っている。表面力、即ち表面問に働く力の距離依存性は、表面の荷電状態、固さ・柔らかさ、立体構造、界面エネルギー、また界面の液体の組織構造形成など、固一液界面のキャラクタリゼーションにユニークな情報を与え、これらの環境応答(塩濃度、pH、温度など)をその場で評価できる。また、ポリヒスチジンタグによる表面へのタンパク質分子の配向固定化法を開発し、酵素のサブユニットを表面に配向固定化し、基質存在下で相互作用を測定し、酵素一基質複合体の相互作用を初めて直接的に観測している。本研究課題では、ソフト界面の分子科学の確立に資するため、表面力測定と界面分光法を用いて生体を含むソフト界面の特性を考える上で重要な界面の水構造の分子レベル評価を行うとともに、様々な生体分子を配向制御して固定化する方法を開発し、表面力測定によりDNAの転写制御に関与するタンパク質群の分子認識相互作用の評価を行った。本研究は、2つの表面間の相互作用の距離依存性を直接評価できる表面力測定を中心手段とし、分子認識など、固-液界面における分子膜の特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学に寄与することを目的とし、さらに生体分子間の相互作用、医用材料表面の評価を可能とする方法論の開発を目指す。具体的には、様々な生体分子の配向制御した固定化法の開発、DNAの転写制御に関与するタンパク質群の相互作用の直接測定を行い、さらに領域内の他の研究者の扱う高分子ブラシ層ならびに分子認識系の評価を行い、その特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学の確立に資する。本研究は、2つの表面間の相互作用の距離依存性を直接評価できる表面力測定を中心手段とし、分子認識など、固-液界面における分子膜の特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学に寄与することを目的とし、さらに、生体分子間の相互作用、医用材料表面の評価を可能とする方法論の開発を目指す。具体的には、遺伝情報転写に関わるタンパク質群、および糖などの生体機能分子を対象とし、様々な生体分子の配向制御した固定化法の開発、DNAの転写制御に関与するタンパク質群の相互作用の直接測定、また表面における水和構造の評価を行う。さらに、領域内の他の研究者の扱う高分子ブラシ層ならびに分子認識系の評価を行い、その特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学の確立に資する。本年度は、表面力測定を幅広い生体分子に適用するために、現在、汎用的に用いられているタグユニットとしてグルタチオン-S-トランフェラーゼ(GST)、ならびにマルトースバインディンクプロテイン(MBP)を用いたタンパク質固定化法を検討・確立した。本年度は、表面力測定のためのタンパク質の配向固定化法として、タグユニットとしてグルタチオン-S-トランフェラーゼ(GST)ならびにマルトースバインディンクプロテイン(MBP)を用いた方法を確立した。この方法を用いて、黄色ブドウ球菌の転写因子タンパク質SigBと、その阻害因子タンパク質RsbWを表面に配向固定化し、これらのタンパク質間の相互作用力をコロイドプローブ原子間力顕微鏡法により直接評価した。また、糖鎖について界面の分光を開始した。平成21年度は、ポリスチジンタグ(His-tag)とキレート単分子膜間の相互作用を利用してニワトリ卵白リゾチーム(HEL)と、その抗体であるHyHEL 10scFvを表面に配向固定化し、コロイドプローブAFM法によりこれらのタンパク質に働く特異的相互作用力の直接測定を行い、タンパク質の表面への固定化密度に依存して相互作用力が変化することを見いだし、これらのタンパク質の密度と特異的相互作用力の相関を検討する。

また、枯草菌の胞子形成過程で機能するホスホリレーシグナル伝達系に関与するタンパク質問を表面に配向固定化し、相互作用力の直接測定を開始した。本研究は、2つの表面間の相互作用の距離依存性を直接評価できる表面力測定を中心手段とし、分子認識など、固-液界面における分子膜の特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学に寄与することを目的とし、さらに、生体分子間の相互作用、医用材料表面の評価を可能とする方法論の開発を目指す。具体的には、遺伝情報転写に関わるタンパク質群、および糖などの生体機能分子を対象とし、様々な生体分子の配向制御した固定化法の開発、DNAの転写制御に関与するタンパク質群の相互作用の直接測定、また表面における水和構造の評価を行う。さらに、領域内の他の研究者の扱う高分子ブラシ層ならびに分子認識系の評価を行い、その特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学の確立に資する。平成22年度は、枯草菌の胞子形成過程で機能するホスホリレーシグナル伝達系に関与するタンパク質を表面に配向固定化し、相互作用力の直接測定を行った。胞子形成時に機能するホスホリレーシグナル伝達系は、ATPにより自己リン酸化したKinAが、リン酸基をSpoOF以下他のシグナルタンパク質へ伝達し胞子形成遺伝子群の発現を誘導するプロセスである。本研究では、KlnAとSpoOFをそれぞれ表面に配向固定化し、KinA-SpoOF間相互作用Mg^<2+>およびCa^<2+>存在下でコロイドブローブ原子間力顕微鏡(AFM)法により直接測定し、2価イオンの効果を検討した、2価陽イオンを含まない溶液中ではATPを添加しても特異的相互作用は観察されなかったが、Mg^<2+>とCa^<2+>を含む溶液中では、ATPの添加後に接着力が観察された,従って、KinAとSpoOF間には、ATPとMg^<2+>とCa^<2+>の共存下で特異的な相互作用が働くことがわかった。本研究は、2つの表面間の相互作用の距離依存性を直接評価できる表面力測定を中心手段とし、分子認識など、固-液界面における分子膜の特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学に寄与することを目的とし、さらに生体分子間の相互作用、医用材料表面の評価を可能とする方法論の開発を目指す。具体的には、様々な生体分子の配向制御した固定化法の開発、DNAの転写制御に関与するタンパク質群の相互作用の直接測定を行い、さらに領域内の他の研究者の扱う高分子ブラシ層ならびに分子認識系の評価を行い、その特性を明らかにし、ソフト界面の分子科学の確立に資することを目的としている。平成23年度は、平成22年度にひき続いて、枯草菌の胞子形成過程で機能するホスホリレーシグナル伝達系に関与するタンパク質(KinAとSpoOF)を表面に配向固定化し、相互作用力の直接測定を行った。ATP存在下でKinAとSpoOF修飾表面間の接着力(引力)に対する補因子Ca^<2+>,およびMg^<2+>イオンそれぞれの効果を評価した。また、生体適合性表面として典型的に用いられるポリエチレングリコール(PEG)修飾表面の吸着抑制機構、およびPEGの分子鎖長、コンフォメーション、水和、密度などの影響を調べるため、金表面上に種々の分子量のチオールPEG鎖のブラシ層を調製し、ツインパス型表面力装置を用いて、純水中のPEGブラシ層間の表面力測定による評価を行った。
RNAヘリカーゼによる核小体とストレス顆粒の機能関連制御機構の解明

核小体とストレス顆粒は,それぞれ核と細胞質に存在するRNP顆粒である。両者はともにリボソーム代謝およびストレス応答に関与することが明らかになっているが,核小体とストレス顆粒の機能的関連についてはほとんど明らかになっていない。本研究では,両者の機能的関連の鍵となり得るDEAD-boxタンパク質に着目し,1核小体とストレス顆粒の機能的関連に関与するDEAD-boxタンパク質の同定,またそれらの,2リボソーム代謝における機能解析およびストレス応答時における局在・動態解析,3機能発現における酵素活性の重要性の検証,以上の3点を行うことで,核小体とストレス顆粒の未知なる機能的関連の解明を目指す。
界面活性剤添加による乱流低減現象の物理モデル構築

パイプラインなどでは、乱流の活発な運動量輸送により大きな流動抵抗が生じてしまう。この問題を克服するために、流体に微量の界面活性剤を添加して流動抵抗を低減させる手法がある。しかし、溶液中の界面活性剤ミセルのミクロ構造と乱流というマクロな構造との相互作用が未解明であるため、この抵抗低減現象の物理機構は解明されていない。本研究では、界面活性剤のミセル構造と乱流を同時に計測する実験を行い、抵抗低減現象を記述する物理モデルを構築する。
環境教育における意思決定能力育成プログラムの開発

環境教育において意思決定能力の育成は重要な課題の一つである。本研究の目的は、小中学生の意思決定能力の実態を明らかにし、この能力を育成するためのプログラムを提案することであった。まず、米国環境教育の調査結果から、具体的指標となる学習ガイドラインを明らかにした。次に、小中学生を対象とした調査結果から、児童及び生徒の意思決定能力は低調であることを明らかにした。以上の結果を基に、意思決定能力を育成するための具体的な指導方法や授業計画を作成した。本年度(平成25年度)は,昨年度(平成24年度)の研究結果をもとに,さらに「意思決定能力」育成に関する調査を進めるとともに,環境リテラシー及び意思決定に関する調査問題を作成し,実施することであった。具体的には,まず,1環境教育における意思決定能力育成に関して,さらに調査を行う。米国における環境リテラシー育成に関する研究や実践活動の状況について,北米環境教育学会(NAAEE)の学習のためのガイドラインについて分析した。特に,ミドルレベル(5ー8学年)を中心に行った(担当:今村)。次に,2米国における最新の意思決定能力育成の研究の調査のために,科学・技術・工業・数学・環境等を含めた新しい科学カリキュラム改革運動の中心であるSTEM教育を積極的に推進している米国アイオワ州(アイオワ大学及び小学校)及びミネソタ大学(ミネソタ大学及びミドルスクール)を訪問し,環境リテラシーだけでなく科学的・技術的リテラシー等を中心とした包括的なリテラシー育成の基本的考え方と学校現場での実態を調査した(担当:今村)。尚,STEM教育には,北米環境教育学会(NAAEE)も大きな影響を与えており,調査の必要性があると判断した。3前述1で作成した調査問題(調査用紙)について,中学校生徒を対象に調査を行い,その結果を分析した。そして分析結果から,中学校における環境リテラシー,特に「意思決定能力」の育成に関する問題点を指摘するとともに,調査用紙の有益性も確認した(担当:今村・那須)。この研究成果は,連携協力を行っている山形県教育センターで等を通じて,山形県環境教育指針の改訂にも活かされることとなった(担当:今村)。ただし,研究会を開催してこれらの成果も含めて意見交流を行うことはできなかった。平成24年度は研究の初年度として,研究体制の構築と,環境リテラシーとしての「意思決定能力」の明確化及び児童・生徒の実体解明のための調査の準備を行った。具体的には,まず,1日本及び米国の環境教育及び科学教育の「意思決定能力」の育成に関する先行研究や取り組みについて,文献を中心に調査を行った。特に、米国の北米環境教育協会(North American Association for Environment Education:略称NAAEE)における環境リテラシー育成のための学習ガイドラインや指導のためのガイドラインを調査した(今村)。さらに,日本での環境リテラシーや意思決定に関する研究について、エネルギー環境教育及び科学教育に関わる学会やESDの指導者養成プログラム(愛媛大学)についても調査を行い,情報の収集に努めた。以上のことより,児童・生徒に必要な意思決定能力や意思決定のための具体的支援ツールについて明らかにした。その成果の一部は,著書としてまとめた(今村)。次に,2地域での研究協力体制を確立するために,「やまがたエネルギー環境教育研究会(代表:那須稔雄)」とも連携を図り,意思決定能力育成のための研究協力体制について検討した。また,地域でのネットワーク構築のための取り組みの一貫として,環境教育講演会や体験活動を実施した(今村,那須)。そして,3先行研究の調査結果から,NAAEEの学習ガイドラインを参考にして,「環境リテラシー」及び「意思決定能力」に関する小学校用の調査問題を試作し,調査を実施(試行調査)した(今村)。その結果,児童は環境問題に対する意識は高いものの,実際に意思決定やそれに基づいた行動について課題が多いことがわかった。これにより,調査用紙の有益性も確認した。ただし,研究会を開催してこれらの成果も含めて意見交流を行うことはできなかったのは残念であった。本年度は(平成26年度)は、昨年度まで(平成24,25年度)の研究結果をもとに、「意思決定能力」の育成、および環境リテラシーとしての意思決定に関する調査を行い、その結果をまとめた。また、意思決定を中心とした学習プログラムを作成し、試行することであった。具体的には、まず、1環境教育における意思決定能力の育成に関して、昨年度に引き続き、北米環境教育協会(NAAEE)で示している『学習のためのガイドライン(略称)』を分析した。その結果、ガイドラインは、米国の科学教育スタンダードや新たに提案されているSTEM教育との関係を明らかにすることができた。2前述1で分析したミドルレベルのガイドライン(5-8学年)をもとに、調査用紙を作成し、中学校第3学年の生徒を対象に調査を実施し、その結果をまとめた。さらに、昨年度の小学校(K-4学年)での調査結果も踏まえて、我が国の児童生徒の環境リテラシー及び意思決定能力の実態を明らかにした。3意思決定場面を想定したエネルギー利用に関する意思決定場面を想定した簡易学習プログラムを協同開発し、試行した。その結果、プログラムの有益性を明らかにすることが出来た。

ただし、研究会等を通じて意見交換をしたり、成果を公表するまでには至らなかった。以上のことより、平成24年度26年度の3年間を通して環境リテラシーとしての意思決定能力の育成に関するガイドライン作成のための資料収集とプログラムの試案を示すことができた。よって、意思決定能力育成プログラムの開発のための研究基盤は構築できたと考える。なお、意思決定能力育成プログラムのためのガイドラインの提案や小中学校における実践については、課題が残った。今後は、さらに研究を進展させるとともに、成果を順次公表していく予定である。理科教育、環境教育平成25年度は,1「意思決定能力」についてさらに調査を進め,2特に,米国での訪問調査を行い,3調査結果を基にした調査問題(調査用紙)の改善を行い,413の成果をまとめることで,児童・生徒の意思決定能力に関する現状とともに,その育成の考え方や指導方法についても明らかにすることであった。これに対して,まず1については,ミドルレベル(第58学年)の北米環境教育学会(NAAEE)の学習ガイドラインを翻訳・分析した(今村)。次に,2の米国での訪問調査では,昨年度できなかった新しい米国科学教育スタンダード(NGSS)や,STEM教育を中心に,意思決定能力の育成に関する現地視察と聞き取り調査を行った(今村)。特に,アイオワ州やミネソタ州といった教育研究先進地域での大学と現地小中学校での様子も調査し,情報の収集に努めた。その結果,環境リテラシーだけでなく科学的・技術的リテラシー育成の一環として,意思決定や批判的思考スキルの育成を重視していることが明らかとなった。そして,3調査問題の作成については,1の先行研究の結果から,「環境リテラシー」及び「意思決定能力」に関する中学校用の調査問題を試作し,調査を実施(試行調査)した(今村・那須)。その結果,調査用紙の有益性を確認した。尚,研究会を開催して本年度の成果も含めて意見交流を行うことができなかったのは残念であった。また,北米環境教育学会の活動(学会)には参加できなかったのは残念であったが,各州の環境リテラシーに関する情報は取集できた。以上のことより,当初の計画に対して,多少の課題や一部研究の軌道修正は必要であったが,想定の範囲内であり,おおむね予定通り進んでいる。平成24年度は研究の初年度として,1研究協力体制の構築を図り,2日米の環境教育の先行研究を調査し,環境リテラシーとしての意思決定能力について明らかにすることである。そして,3児童・生徒の意思決定能力に関する実体解明のための調査の準備を行うことであった。これに対して,まず1研究協力体制については,「やまがたエネルギー環境教育研究会(代表:那須稔雄)」と連携を図り,環境教育に関する講演会や活動(「環境に学び・遊ぶ」/講演:地域環境を生かした朝日町の取り組み、他))を行うことができた。
伝統知の多面性に即した保護手法の総合的研究

平成30年度は、前年度に引き続き、国内外の関連分野の研究成果の収集、整理及び分析を行うとともに、国内の関係機関や企業等へのヒアリング調査や意見交換を行った。法制化をめぐる動きに関しては、国内における伝統知の保護に関連した法律や制度の改正状況について文献調査及びフィールド調査を行った。また、11月には生物多様性条約(CBD)第14回締約国会議(COP14)が開催されたため、CBD第8条(j)項及び関連条項の実施に関する文書の内容把握、議論の状況等の分析を実施した。今回のCOP14では、「生物多様性の保全及び持続可能な利用に関連する伝統的知識の還元に関する任意ガイドライン」と「第8条(j)項及び関連条項の文脈における関連する重要な用語及び概念の用語集」が採択されており、CBD第8条(j)項関連のこれまでのCBDにおける取組において一区切りを迎えた。これらの調査・研究を通じて得られた成果については、年度末に取りまとめて論考として公表した。この他、WIPOにおける伝統的知識等に関する法的文書をめぐる議論についてもフォローし、企業関係者・実務家等と課題や解決策について検討した。この他、予定していた中国における中医薬や文化遺産の保護等に関する法整備・実施の状況についての調査も行った。平成30年度に得られた成果を基に、現時点での課題・今後予定される国内外の動きなどを整理し、中間まとめを行うとともに、次年度の研究実施に係る方針・計画の再検討を行った。国内外で様々な法的文書の作成が進んだ一年であったため、今後、その実施状況について注視していく必要がある。国内外の文献調査及びヒアリング調査・意見交換、フィールド調査を予定通り実施することができ、現在の課題と対策状況について整理することができた。また、国内外で伝統知の保護に関連した法的文書の作成が進んだことから、それに対応して、調査を実施し、成果を公表することができた。さらに、国際的な交渉の場では、利益配分の対象などの拡大を強く求める途上国等の主張を受けて、論点が多様化・複雑化してきていることから、当初の予定では想定されていなかった範囲についても、内容に取り組めるように、計画の見直しも実施した。これらのことから、本研究は、おおむね順調に進展しているといえる。平成30年度の中間まとめ・計画再検討を受けて、令和元年度は国内外の法的文書の実施状況の把握及び課題整理に主眼を置き、その進展にあわせて研究を実施する。具体的には、わが国における名古屋議定書の実施状況なども踏まえつつ、伝統知の利用・保護等に関し、運用上の問題点の検証を行う。また、CBDで作成されたガイドライン等の影響や課題などの分析を行う。この他、現在WIPOで検討が続いている伝統的知識等に関する法的文書について、条約化の動き/国内法整備の動きにおける問題点を分析する。この他、国内外の文献等の調査や関係機関等との意見交換は継続する。加えて、オーストラリアやカナダなど、先住民の保護の歴史や経験を有する国に関する海外調査、意見交換等も予定している。平成29年度は4か年計画の初年度にあたるため、国内外の動向及び研究状況の把握・整理を行った。平成29年5月22日、我が国は「生物の多様性に関する条約の遺伝資源の取得の機会及びその利用から生ずる利益の公正かつ衡平な配分に関する名古屋議定書(名古屋議定書)」の受諾書の寄託を行い、同議定書を締結した(平成29年8月20日に我が国について効力発生)。そして、その国内実施のために、「遺伝資源の取得の機会及びその利用から生ずる利益の公正かつ衡平な配分に関する指針(ABS指針)」を作成・公布した。また、世界知的所有権機関(WIPO)でも、伝統的知識の保護に関する議論、文書の策定が進められた。さらに、生物多様性条約(CBD)関連では、伝統的知識に関し、第8条(j)項及び関連条項に関するアドホック公開作業部会(8j-WG)が開催され、伝統的知識の還元に関するガイドラインの起草が行われた。こうした国内外の動きを受けて、関連文献や国際機関の文書・記録等を基に論点や主張の整理を行うとともに、関係会合への参加や関係機関等との議論を通じて、国際的な交渉事項や実務上の問題点について検討を行った。また、研究会・講演会等で関係機関や研究者に対し、研究開発の実施上の注意喚起を行った。この他、伝統的知識の保護に関し、中国が国内法の起草を進めていることから、その草案を翻訳して検討するとともに、国内の関係者とその影響等について検討を行った。これらの研究の実施により、本課題に取り組む上での全体像を描くとともに、論点を網羅的にカバーし、その相互関係を整理することができた。また、成果については適宜公表した。その上で、次年度以降の実施計画の再検討を行った。当初の予定通り、適宜国内外の動きの把握・分析を行い、大きな進展が見られた国際機関における議論については、重要なものを論文としてまとめ公表した。また、我が国における名古屋議定書の国内実施に関しては、関係者と意見交換を積極的に行い、論点の抽出や課題の整理などを行うとともに、関係機関・研究者に注意喚起を行った。また、我が国の名古屋議定書批准・国内実施を受けて、平成30年度以降の実施計画を見直して、方向性を定めることができた。

法制化をめぐる動きに関しては、国内における伝統知の保護に関連した法律や制度の改正状況について文献調査及びフィールド調査を行った。また、11月には生物多様性条約(CBD)第14回締約国会議(COP14)が開催されたため、CBD第8条(j)項及び関連条項の実施に関する文書の内容把握、議論の状況等の分析を実施した。今回のCOP14では、「生物多様性の保全及び持続可能な利用に関連する伝統的知識の還元に関する任意ガイドライン」と「第8条(j)項及び関連条項の文脈における関連する重要な用語及び概念の用語集」が採択されており、CBD第8条(j)項関連のこれまでのCBDにおける取組において一区切りを迎えた。これらの調査・研究を通じて得られた成果については、年度末に取りまとめて論考として公表した。この他、WIPOにおける伝統的知識等に関する法的文書をめぐる議論についてもフォローし、企業関係者・実務家等と課題や解決策について検討した。この他、予定していた中国における中医薬や文化遺産の保護等に関する法整備・実施の状況についての調査も行った。平成30年度に得られた成果を基に、現時点での課題・今後予定される国内外の動きなどを整理し、中間まとめを行うとともに、次年度の研究実施に係る方針・計画の再検討を行った。国内外で様々な法的文書の作成が進んだ一年であったため、今後、その実施状況について注視していく必要がある。国内外の文献調査及びヒアリング調査・意見交換、フィールド調査を予定通り実施することができ、現在の課題と対策状況について整理することができた。また、国内外で伝統知の保護に関連した法的文書の作成が進んだことから、それに対応して、調査を実施し、成果を公表することができた。さらに、国際的な交渉の場では、利益配分の対象などの拡大を強く求める途上国等の主張を受けて、論点が多様化・複雑化してきていることから、当初の予定では想定されていなかった範囲についても、内容に取り組めるように、計画の見直しも実施した。これらのことから、本研究は、おおむね順調に進展しているといえる。平成30年度は、国内外の動向及び研究状況の把握・整理と、関係機関・研究者との意見交換・ヒアリング調査の作業を継続する。その上で、我が国を含む名古屋議定書締約国の同議定書の実施状況を分析しつつ、本年度予定されているWIPOの伝統的知識等に関連した政府間会合及びCBDの締約国会議における議論の進展をフォローし、それらの成果・課題を踏まえて、中間とりまとめを行う予定である。加えて、中国で進められている国内法の整備状況・実施状況を調査し、関係者との議論を通じて、我が国への影響、対策等について検討を行う予定である。平成30年度の中間まとめ・計画再検討を受けて、令和元年度は国内外の法的文書の実施状況の把握及び課題整理に主眼を置き、その進展にあわせて研究を実施する。具体的には、わが国における名古屋議定書の実施状況なども踏まえつつ、伝統知の利用・保護等に関し、運用上の問題点の検証を行う。また、CBDで作成されたガイドライン等の影響や課題などの分析を行う。この他、現在WIPOで検討が続いている伝統的知識等に関する法的文書について、条約化の動き/国内法整備の動きにおける問題点を分析する。この他、国内外の文献等の調査や関係機関等との意見交換は継続する。
細胞接着因子固定化歯科用インプラント材料の開発

チタンインプラントと上皮組織との接合は未だ不十分であり,その結果,細菌の侵入や上皮のダウングロースなどが起こり,インプラント周囲炎を引き起こす可能性があるとされている.ラミニン,フィブロネクチンなどの細胞接着タンパク質のチタン表面への固定化により,上皮付着機構を有するチタンインプラント材の開発が可能と考え,比較的簡便でかつ確実に固定化できる方法としてトレシルクロリド(CF_3CH_2SO_2,Cl)の利用を試みた.チタンディスクをコロイダルシリカ溶液(pH9.8)により鏡面仕上げした.トレシルクロリドを鏡面研磨チタン表面に塗布し,37°Cにて2日間反応させた.水/アセトン混合溶液にて洗浄,乾燥後,トレシル化チタンをpH7.4のフィブロネクチン/リン酸緩衝溶液(0.1mg/ml)に37°Cで1日間浸漬した.トレシル化チタン表面のX線光電子分光(XPS)測定を行ったところ,トレシルクロリド由来のFlsのピークが688.6eV付近に観察された.また530.3eV付近にTiO_2の酸素原子由来のO1sピークが,532eV付近にトレシルクロリドの付加によって生成した有機酸素原子に由来するO1sピークが観測された.トレシル化チタンにフィブロネクチンを固定化し,その後,純水で洗浄した試料のXPS測定では,フィブロネクチンに由来するN1sのピークが399.9eV付近に観察された.このピークは60秒間のエッチングによっても消失しなかった.また,フィブロネクチン固定化後,60分間超音波洗浄した試料においてもフィブロネクチン由来のN1sピークが観察された.以上の結果から,トレシルクロリドを用いた反応によって,チタン表面に簡便にフィブロネクチンが固定化できる事が判明した.チタンインプラントと上皮組織との接合は未だ不十分であり,その結果,細菌の侵入や上皮のダウングロースなどが起こり,インプラント周囲炎を引き起こす可能性があるとされている.ラミニン,フィブロネクチンなどの細胞接着タンパク質のチタン表面への固定化により,上皮付着機構を有するチタンインプラント材の開発が可能と考え,比較的簡便でかつ確実に固定化できる方法としてトレシルクロリド(CF_3CH_2SO_2,Cl)の利用を試みた.チタンディスクをコロイダルシリカ溶液(pH9.8)により鏡面仕上げした.トレシルクロリドを鏡面研磨チタン表面に塗布し,37°Cにて2日間反応させた.水/アセトン混合溶液にて洗浄,乾燥後,トレシル化チタンをpH7.4のフィブロネクチン/リン酸緩衝溶液(0.1mg/ml)に37°Cで1日間浸漬した.トレシル化チタン表面のX線光電子分光(XPS)測定を行ったところ,トレシルクロリド由来のFlsのピークが688.6eV付近に観察された.また530.3eV付近にTiO_2の酸素原子由来のO1sピークが,532eV付近にトレシルクロリドの付加によって生成した有機酸素原子に由来するO1sピークが観測された.トレシル化チタンにフィブロネクチンを固定化し,その後,純水で洗浄した試料のXPS測定では,フィブロネクチンに由来するN1sのピークが399.9eV付近に観察された.このピークは60秒間のエッチングによっても消失しなかった.また,フィブロネクチン固定化後,60分間超音波洗浄した試料においてもフィブロネクチン由来のN1sピークが観察された.以上の結果から,トレシルクロリドを用いた反応によって,チタン表面に簡便にフィブロネクチンが固定化できる事が判明した.チタン上に,歯科用接着剤を用いてカルボキシル基を有するポリマーを接着させ,このカルボキシル基と細胞接着因子のアミノ基との縮合反応によって,細胞接着因子を固定化させる手法を試みた.方法としては,純チタンディスクに金属接着性プライマー(アロイプライマー,クラレ)を塗布し,乾燥する.次に,歯科用接着剤である4-META/MMA-TBBレジン(スーパーボンドC&B,サンメディカル)のモノマー液をチタン面に塗布し,チタン基板上でモノマーを重合させる.その後,10%ポリメチルメタクリレート(PMMA)/トルエン溶液を塗布し,PMMAをチタンに接着させる.その後,4N NaOH水溶液に50°Cで浸漬して,PMMAを加水分解させ,クエン酸で中和後,カルボキシル基の生成を調べた.PMMAはチタンに良好に接着したものの,加水分解反応が良好に進行せず,カルボキシル基をチタン表面に生成することは出来なかった.そこで,次にポリアクリル酸をチタンに接着させてみた.ポリアクリル酸/エタノール溶液を用いる事により,上記と同様の方法によりポリアクリル酸をチタンに強固に接着でき,チタン表面にカルボキシル基を導入することができた.しかしながら,ポリアクリル酸が水溶性であるために,細胞接着因子との反応中にポリアクリル酸が溶解してしまった.ポリアクリル酸を架橋して水に不溶性にする必要があるものと思われれる.新たな固定化方法としてトレシルクロライドを用いた反応を現在検討中である.すなわち,チタンの水酸基にトレシルクロライドを反応させてチタン表面にトレシル基を導入する.その後,表面トレシル基と細胞接着因子とのアミノ基との反応によりチタン表面に細胞接着因子を固定化するものであり,チタン表面に効率良く,トレシル基を導入する条件について実験中である.チタンインプラントと上皮組織との接合は未だ不十分であり,その結果,細菌の侵入や上皮のダウングロースなどが起こり,インプラント周囲炎を引き起こす可能性があるとされている.

ラミニン,フィブロネクチンなどの細胞接着タンパク質のチタン表面への固定化により,上皮付着機構を有するチタンインプラント材の開発が可能と考え,比較的簡便でかつ確実に固定化できる方法としてトレシルクロリド(CF_3CH_2SO_2Cl)の利用を試みた.チタンディスクをコロイダルシリカ溶液(pH9.8)により鏡面仕上げした.トレシルクロリドを鏡面研磨チタン表面に塗布し,37°Cにて2日間反応させた.水/アセトン混合溶液にて洗浄,乾燥後,トレシル化チタンをpH7.4のフィブロネクチン/リン酸緩衝溶液(0.1mg/ml)に37°Cで1日間浸漬した.トレシル化チタン表面のX線光電子分光(XPS)測定を行ったところ,トレシルクロリド由来のFのピークが688.6eV付近に観察された.また530.3eV付近にTiO_2の酸素原子由来のO1sピークが,532eV付近にトレシルクロリドの付加によって生成した有機酸素原子に由来するO1sピークが観測された.トレシル化チタンにフィブロネクチンを固定化し,その後,純水で洗浄した試料のXPS測定では,フィブロネクチンに由来するN1sのピークが399.9eV付近に観察された.このピークは60秒間のエッチングによっても消失しなかった.また,フィブロネクチン固定化後,60分間超音波洗浄した試料においてもフィブロネクチン由来のN1sピークが観察された.以上の結果から,トレシルクロリドを用いた反応によって,チタン表面に簡便にフィブロネクチンが固定化できる事が判明した.
心筋収縮運動装置の形成機構

C-蛋白質はミオシンの集合の制御に関わる一方、筋原繊維内の弾性繊維蛋白質コネクチン(タイチン)に結合し、サルコメア構造の形成で重要な役割をもつ。心筋C-蛋白質の突然変異が家族性心筋肥大症の一因となることが報告されているが、このことは心臓の形態形成と機能維持におけるC-蛋白質の重要性を示唆している。本研究では心筋形成におけるC-蛋白質の役割を解明するために、マウスの筋形成過程でのC-蛋白質の発現を心筋、速筋、遅筋C-蛋白質に対するcDNA断片をプローブとしてノーザンブロット法で解析、心筋では発生過程を通じて心筋C-蛋白質のみを発現、骨格筋では遅筋型から速筋型への変換が起こることを見出した。マウスでのこの事実は、ニワトリでは骨格筋の発生初期に心筋C-蛋白質が主要成分として発現されることと大きく異なる。そこで更に、C-蛋白質アイソフォームを識別する抗体を用いて蛋白質レベルで更に解析した結果、上記の事実が蛋白質レベルでも確認された。心筋C-蛋白質の特異的な役割を理解するために、マウスの骨格筋C-蛋白質と心筋C-蛋白質の全構造を比較検討することとした。そのためにマウス速筋、遅筋C-蛋白質のcDNA分離、全構造を決定した。その結果、C-蛋白質分子間でN-端側の変異が大きく、ニワトリ、マウス、ヒトの心筋C-蛋白質に共通に見られるリン酸化部位が骨格筋C-蛋白質では欠損することが明らかになった。従って、N-端側領域とりわけリン酸化部位が心筋C-蛋白質の特異的な機能に重要と判断される。既報告のように、ニワトリ心筋C-蛋白質にはリン酸化部位を含む15アミノ酸残基の配列の有無により異なる2種のアイソフォーム(I型、II型)がある。そこで、この15残基を特異的に認識する抗体を作成、I型とII型の発現、局在の違いの有無を検討した結果、心筋ではI型、II型の発現が示唆されたが、胚骨格筋ではI型がほとんど発現されないことがわかった。
特異点の研究

(A)交付申請書の実施計画のIIIに挙げた特異点に関するワ-クショップはこの補助金の一部を使って開催することができた。外国人十数名日本人二十数名が参加しこじんまりしたしかし密度の濃いものになった。日本人の若い研究者に良い刺激を与えたことと、参加者の間で議論が活発に行われていくつかの共同研究の基礎ができたことは成果である。(B)今年度の研究によって得られた新たな知見の主なものは次の通りである。各項の番号は交付申請書にあげた研究実施計画のそれに対応する。(1)福田はコンピュ-タ実験でヒルベルトの第16問題にたいしてある予想を得た。(2)岡は非退化完全交叉特異点に自然なストラティフィケ-ションの存在を示した。藤田は特異点のあるDel Pesso多様体の分類をほぼ完成した。石井は正規孤立特異点の多重数種の漸近的挙動に関する或法則を得た。(5)二木はKaehlerーEinstein計量の存在に対する障害のeta不変量としての解釈を得た。藤原はFeynmanの経路積分をソボレフ空間上の広義積分としての収束を証明した。丹野はCR多様体の(1,3)型の不変量の存在およびその性質を調べた。(7)森田はTorelli群の構造とホモロジ-3球面のCasson不変量との関連を明らかにした。(8)盛田はある法則に従う力学系の閉軌道の分布が素数定理に従うことをしめした。
M期チェックポイントシステムの機能制御ネットワークの解明

M期チェックポイントは、細胞増殖過程における遺伝情報の安定な伝達に必要な細胞周期制御メカニズムです。今回、我々は、M期チェックポイントには、2つの独立した制御経路が存在していることを明らかにしました。これらは、M期チェックポイントの発動に関わるとともに、紡錘体と動原体の正常な結合を促すエラー訂正機構にも関与しているものと思われます。今回の結果は、染色体安定分配機構の分子基盤の一端を明らかとするとともに、染色体数異常に起因する疾患等に対する理解の一助となるものと期待出来ます。複製された染色体DNAが次世代へと過不足なく均等に分配されるためには、M期において染色体と紡錘体が正しく結合しなければなりません。M期チェックポイントは、紡錘体と染色体の結合状態をモニターし、染色体分配の均等性を保障するメカニズムです。M期チェックポイントタンパク質Mad2は、紡錘体と正しく結合していない染色体を識別し、その染色体のキネトコア上に特異的に集積します。本研究では、Mad2のキネトコア集積を制御するナノシステムネットワークの解明を目指します。本年度はまず、1)分裂酵母の微小管変異株を利用した生細胞顕微鏡観察によりキネトコアと紡錘体の結合過程を解析する系を作成しました。この系により、「紡錘体と未結合のキネトコア」、「紡錘体と単極的に結合したキネトコア」、「紡錘体と二極的に結合したキネトコア」の識別が可能になりました。次に、この系でのMad2のふるまいを観察したところ、2) Mad2は、「紡錘体と未結合」および「紡錘体と単極的に結合した」キネトコア上に特異的に集積することが明らかとなりました。さらに、遺伝的解析により、3)「紡錘体と未結合」のキネトコアへのMad2集積にはDASH複合体が、「紡錘体と単極的に結合した」キネトコアへの集積にはBub1タンパク質が必須となることが明らかとなりました。これらの結果より、DASH複合体は紡錘体微小管とキネトコアの結合状態を感知する分子センサーとして機能しており、一方Bub1は姉妹キネトコア間の張力の有無を感知するセンサーとして機能している可能性が示唆されました。現在、これらの成果を他の研究成果と取りまとめ、公表の準備を進めています。M期チェックポイントは、M期スピンドルと染色体(=キネトコア)が正常に結合するまでM期後期の進行を抑制し、遺伝情報の完全な伝達を保障する生体制御機構です。本研究では「DASH複合体」、「Mad2」、「Bub1」などの生体ナノシステムの機能を解析し、さらにそれらの機能連携を明らかにすることにより、M期チェックポイントという高次生命現象の機能制御ネットワークを解明しようとするものです。本年度は、実施計画に従い、スピンドル-キネトコア結合異常を修復する「エラー訂正機構」とチェックポイント制御機構の機能的相関についての解析を行いました。GFP融合タンパク質を用いて、チェックポイントタンパク質Mad2やスピンドル、キネトコアの動態を生細胞中で観察したところ、M期特異的なキネトコア構成因子であるDASH複合体を欠いた細胞中では、1)Mad2のキネトコアへの局在化に異常があること2)一旦脱落したキネトコアのスピンドルによる再補足に異常があること、が明らかとなりました。この結果は、DASH複合体がスピンドルとキネトコアの結合状態を監視するモニター機構として働いている可能性を示唆しています。そのモニター機構は、結合異常を感知するとチェックポイントを発動して細胞周期を停止するとともに、「エラー訂正機構」を活性化して結合異常を修復するものと考えられます。これらの結果を、前年度にえられたBub1タンパク質の機能解析の結果とあわせてとりまとめ、Molecular Biology of the Cell誌に公表しました。
Neuropilin1の翻訳後修飾によるVEGF反応性調節機構の解明

申請者はVEGF受容体であるNeuropilin1(NRP1)の糖鎖修飾がVEGF感受性を調節することを見出し報告している(Shintani Y, et. al EMBO J 2006)。虚血性心疾患や閉塞性動脈硬化症へのVEGFの遺伝子治療は満足な結果が得られなかったが、その原因を申請者は病変部位での受容体側のVEGF感受性の低下にあるという仮説をたてている。NRP1の糖鎖修飾は血管内皮細胞と平滑筋細胞で異なり、反応性を規定することを報告したが、今年度は糖鎖修飾の意義を検討する過程で、NRP1の新規結合タンパクの同定に成功し、同定したリン酸化酵素とin vivo条件でタンパク複合体を形成すること、その複合体の形成が血管内皮細胞と平滑筋細胞で異なることを見出した。さらにそのリン酸化酵素によりにおいてin vitro条件のみならず、in vivo条件でもNRP1がリン酸化を受けることを発見している。現在は当該リン酸化酵素によるNRP1のリン酸化部位の同定を行っている段階である。今後はリン酸化部位の同定、さらにリン酸化特異的抗体の作成をおこない以下のような解析に役立ていきたいと思う。すなわち新たに発見したNRP1の新たな翻訳後修飾であるリン酸化の生理的意義、病態モデル動物でのリン酸化の動態、さらに糖鎖修飾との関連、両者の修飾によるVEGFR2受容体への影響、およびVEGF感受性への影響などである。
ホルモン応答性イオンチャンネル開閉機構とその解析

腎メサンギウム細胞はAVPやAII投与により収縮する。この際に細胞膜のCa^<2+>ーactivated Cl^ーチャンネルが開き、膜は脱分極する。AVPやAIIによって活性化される他のイオンチャンネルを検索するためにパッチクランプのcellーattach法を用いた単一チャンネル電流の計測を行った。AVP,AII投与前には殆んどのパッチにイオンチャンネルはみられなかったが、約15%のパッチに25pSのイオンチャンネルが同定された。反転電位は膜電位で約0mVであり、それよりも過分極側で内向き、脱分極側で外向きになる電流であった。このチャンネルは外液のNa^+イオンとK^+イオンの双方に透過性があり、非選択性陽イオンチャンネルと結論された。AVPやAII投与後、細胞の収縮とともにこのイオンチャンネルの開口確率が増加した。またホルモン投与後に別のイオンチャンネルが記録された。このチャンネル電流は約40pSのコンダクタンスを持ち,反転電位は約ー80mVであった。この電位はネルンストの式から期待されるK^+イオンの平衡電位と一致し,40pSのチャンネルはK^+チャンネルであると結論された。Excisedパッチ法を用いて、細胞質側のCa^<2+>濃度を1μMに上昇させると,25pS,40pSの2つのチャンネルの開口確率は増加し,Ca^<2+>濃度を10^<ー8>に低下させると両方のチャンネルの開口が抑制された。このことから,25pS,40pSのチャンネルともその活性化には細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が必要であることが判明し,25pSのチャンネルはCa^<2+>ーactivated nonーselective cationチャンネル,40pSのチャンネルはCa^<2+>ーactivated K^+チャンネルであると結論された。AVPやAIIによる細胞収縮の際には細胞内プ-ルからCa^<2+>が動員されて細胞内Ca^<2+>濃度が上昇することが知られており,25pS,40pSのチャンネルはこの細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を介して活性化されると考えられた。
具体的な改善例から見るIRによる学生の情報の効果的利用に関する研究

本研究では,IRによる学生の情報のデータ収集・分析,それを通じた改善の具体例の把握とモデルの構築,および学生の情報の管理・運用に関する現状分析とIR導入課題について検討を行った。研究の結果,1)機関レベルのIRではEM等の各機能についてkeyperformanceindicatorsが設定され,活動や改善が評価される傾向があること,2)特に教育面では,部局におけるIR機能と中間組織による促進が密接に関連しており,IR機能の内容は分野別質保証に規定される部分があること,3)日本における学生の情報の管理・運用については,学内規程をはじめ,組織文化やデータの統一様式という点で課題があること,が明らかになった。本年度は,IRによる学生の情報のデータ収集・分析・改善の具体例の把握とモデル構築,および学生の情報の管理・運用の現状分析とIR導入の課題の検討について研究を進めるとともに,研究で得られた知見の整理とまとめを実施した。本研究の知見の一つとして,IRの実践領域の課題として,学内の情報管理規定,個人情報保護管理規定,学内デジタルデバイドおよび学内の部局間における意識の差異等があることが明らかになった。情報管理規定等については,実際には現状の情報技術の進展を考慮せず,旧態依然とした規定で運用を行っている場合があり,このことがIR導入の障壁となっているケースが複数確認された。また,学内部局間の意識の差異については,専門領域個別の教育の課題やグローバル圧力,必要なデータの種類等の差異がその根底にあり,必ずしもIRに対する理解の不足等が要因ではないことが明らかになった。すなわち,機関のIRとして収集されるデータでは,必ずしも改善に有効なデータとは言えず,学内の統一的なシステムに入力される以前のデータをむしろ利用すべき状況が多いことが確認された。ここからは機関としてのIRに連携する分散配置型あるいはボトムアップ型のIRがモデルとして提示され得る。また,海外先進事例の検討からは,既に岡田(2009,2011)で指摘している,機関としての個別機関と政府の中間に位置する中間組織の重要性に加え,専門分野としての中間組織の役割と機能の重要性が確認された。このことから,Clark(1983)が高等教育システムをマトリックス構造やLoose Webと表現したように,機関を縦軸とするならば,横軸としての専門領域の視点を,セクショナリズムに陥ることなくどのようにIRに反映していくかが課題であり,今後分野別質保証の観点からIRをいかに関連させていくかがわが国のIRを実質化していく上で重要と考えられる。本研究は,大学における学生の情報を機能的に管理・運用する枠組みとしてIR(Institutional Research)に着目し,その具体的な改善例やモデルから学生の情報を分析することで可能となる学生支援と教育改善のあり方を検討するものである。本年度は,米国を中心とした諸外国におけるIRを利用したEM(Enrollment Management)について文献研究から検討し,次年度に実施する先進事例調査の準備を行うとともに,わが国における学生の情報の管理・運用についての現状の整理を実施した。EMはその機能から諸類型に細分化することが可能であるが,幾つかの大学ではEMの各機能についてkey performance indicatorsを設定することにより,活動成果や改善を実質的に評価していることが明らかになった。また,文献読解に加え,計量書誌学的観点からEMに関連する文献の著者・所属・機関特性等の情報を整理し,先進事例抽出のためのデータベースを作成した。加えて,収集したEMに関する論文についてテキストマイニングによる探索的分析を実施し,EMの各機能に関連するキーワードの析出等を行った。国内の大学における学生の情報管理・運用に関しては,各種機関特性から機関類型を作成し,各類型に該当する大学関係者の聞き取り調査を実施し,情報管理に利用されているソフトウェアやアクセス権限,運用状況やスケジュール等の現状に関する把握を行った。本年度は特にEMに関する文献研究に焦点を当て,文献について読解・計量書誌学的整理・テキストマイニング等の多角的アプローチを採用し,また対象とする文献の範囲をできるだけ広げ,EMに関する知見の整理と精緻化に時間を掛けたため,当初の研究スケジュールからは若干の遅れが生じている。但し,この作業は本研究で予定している調査を実施する上で必要な段階であり,当初より状況として想定された事態であるため,次年度で本研究を完遂できる見込みである。次年度は,本年度に選定されたIRによる学生支援と教育改善の先進事例について,特に米国の大学を対象として学生の情報管理・運用に関する訪問調査を実施し,EMおよびIRの実働の細部を確認・補完する。加えて,よりマクロにわが国における学生の情報管理・運用の現状についてアプローチするため,本年度の研究スケジュールから実施が遅れている大学各部局(事務局長等)を対象にした調査を実施し,その構造と日本的特質について検討する。これらの研究成果については学会報告や機関誌に投稿するとともに,実践領域の利益に供するためにウェブサイトを構築し,サイト上で公開する。本年度の研究スケジュールから調査実施に遅れが出ているため,調査関連費用については次年度執行する。

また次年度は,先進事例についての訪問調査のため,海外旅費を主要な費用として計上している。より効率的な学生の情報の管理・運用モデルを構築するため,情報管理・運用に関する文献資料の購入にも使用する見込みである。加えて,本研究で得られた成果を広く社会へ発信するため,研究成果発表に係る国内旅費や校正等の費用を計上している。なお,研究代表者の所属機関が次年度より変更となり,機関が所蔵する図書資料や設備等の研究環境について変動があると予測されるため,この補填・整備として若干の支出が見込まれる。
アレルギー疾患治療への分子生物学的アプローチ

制御性T細胞(regulatory T cells ; Tregs)が自己抗原(Th1型)や外来抗原(Th2型)に対する免疫応答の何れも制御し、このバランスに影響していると推測されている。成人気管支喘息患者での制御性CD25^<high>CD4^+ T細胞の検討をした。CD25^<high>CD4^+ T細胞の数や表現型には差はみられなかったが、喘息患者におけるCD25^<high>CD4^+ T細胞の機能に異常が見られた。喘息患者の慢性気道炎症に対する抑制能力の欠如及び、Tregs自身がIL-5を産生し好酸球を活性化し、その病態を増悪させる可能性が推測された。次に、罹患歴及び吸入ステロイド使用期間が非常に短く、気道の炎症が様々な要因により修飾されていない小児を対象にした。小児のCD25^<high>Tregの表面抗原解析結果は、非喘息コントロール群と喘息患児群で大きな差は見られなかった。しかし、regulatory活性を持つとされているCD25^<high>CD4^+ T細胞中のCD45RO^+ T細胞が成人(約85%)に比べ、小児では約55.04%と少なかった。小児患児群で、CD25^<high>CD4^+ T細胞は不応答(anergy)細胞であるにも関わらず、抗体刺激時に細胞内Ca^<2+>流入が見られた。非喘息コントロール成人での結果から、CD4^+ T細胞中のCD25^<high>CD4^+CD45RO^+ T細胞の割合がCa^<2+>不応答細胞の割合と一致した。更に、成人喘息患者のCD25^<high>CD4^+ T細胞のCD45RO^+マーカー発現細胞の割合は、非喘息コントロールと変わらないにも関わらず、Ca^<2+>不応答性細胞の割合がかなり減少しており、CD25^-CD4^+ T細胞の増殖抑制能も減弱していた。つまり、表面抗原マーカーとCa^<2+>不応答性を測定する事によりTregsの機能異常を測定できると考えられた。臨床データとTregsの機能解析を検討した結果、Tregsの異常が考えられる群は、検査値異常が認められ、また、罹患歴が長い傾向があった。つまり、機能異常が認められない患児に比べ気道での炎症が亢進している事が推測された。我々が確立した測定系によりTregsの機能異常をより厳密に検出する事が可能になった。この測定系は気道炎症の指標になるのではないかと推測される。また、小児患児ではステロイドの減量やoutogrowingが予測できる可能性が示唆された。正常動物には制御性T細胞(regulatory T Cell : Treg)と呼ばれる細胞群が存在し、アレルギー反応の制御に関わっていると報告されている。

ヒトの喘息におけるCD25^<high>Tregの機能を詳細に検討し、病態との関係を明らかにすることを試みた。CD25^<high>Tregの表面抗原解析結果は、健常人と喘息患者で大きな差は見られなかった。抗CD3抗体刺激による細胞内Ca^<2+>流入を9人の喘息患者と5人の健常人で検討したところ、喘息患者のCD25^<high>Tregの反応性は、健常人と異なる2つのパターンに分類でき、それぞれをType1とType2とした。Type1のCD25^<high>Tregは、不応答(anergy)細胞であるにもかかわらず抗体刺激時に健常人CD25^-T細胞と同様に多数の細胞に細胞内Ca濃度の上昇が見られた。Type2は、多数のCD25^<high>TregにCa2+流入が見られたが、ピーク値が低く細胞内Ca^<2+>濃度は健常人のCD25^-T細胞やType1のCD25^<high>Tregよりも低値を示した。また、抗CD3抗体刺激下でのサイトカイン産生は健常人と同様に、Type2ではanergyの定義どおりIL-2をほとんど産生せず、その結果増殖もあまり示さなかった。更に、CD25^-T細胞と混合培養することによりIL-2の産生及び増殖抑制活性を示した。ところが、Type1ではanergyの定義を満たさず抑制活性も示さなかった。FOXP3 mRNAは喘息患者CD25^<high>Treg及びCD25^-T細胞は、いずれも健常コントロール群に比べ高値を示した。以上の結果より、喘息患者ではCD25^<high>Tregの機能が失調しているグループがおり、恐らく、慢性炎症が十分に制御出来ていない可能性が推測された。アレルギー疾患治療を目指し、アレルギー患者の免疫担当細胞の変化を調べ、治療の指針を考えることを目的に本研究を行った。制御性T細胞即ちCD25^<high>CD4^+CD45RO^+T細胞(Treg)に着目し、Tregの質と量を健常人と喘息患者で比較検討したところ、成人では、量的変化は見られず、質的変化が見られた。即ち、本来Tregは不応答性であるはずが、成人喘息患者のTregは刺激により、Ca流入がみられ、免疫反応が亢進する方向の反応が観察された。このCa流入の程度は喘息の病態とは明確に関連付けることはできなかった。これは成人喘息患者は罹患機関が長くステロイドなど薬物治療が行われ、症状が安定しているために、免疫担当細胞の質的変化と病態が一致しなかったと考えられる。従って、本年はそれら薬物治療の影響が少ないと考えられる、罹患期間の短い小児喘息患者を対象にTregの機能と病態の関係を調べた。小児喘息患者も成人喘息患者と同様にCa反応性が成人小児とは異なる結果を得た。また、小児ではT細胞中のTregの割合が成人に比べ低いことも分かった。しかし、Ca反応性と病態との直接的相関は見られなかった。そこで、Treg細胞マーカーを持つT細胞中のCa不応答性細胞数の割合を比較したところ、健常小児と喘息小児とで明らかな差異が認められた。同様の比率を成人喘息患者で調べたところ、同じような結果を得た。本来ならば、TregがCa不応答細胞であるから、TregとCa不応答細胞は1:1の割合にあると考えられる。
一本鎖DNAヘアピン構造を認識する複製タンパク質の構造と機能

priA遺伝子は、大腸菌染色体88.7分の位置に存在し、これまでに同定されていない新しい遺伝子であることが明かとなった。一方、構造解析の結果、priAはヌクレオチド結合タンパク質に共通に保存されている2つのモチ-フを所有していることが示された。特にGXGXXGKTを含むモチ-フは大腸菌の分子量75kD前後の他の3つのヘリカ-ゼuvrD、rep、helDとはその近傍まで含めてよく保存されいることから、進化的な関連が示唆された。さらに、priAはCXXC配列が4個クラスタ-をなして現われる領域を持ち、Zinc-finger用の構造を持つ可能性が示唆された。プラスミドから計11個の独立のn'サイトを単離し、その構造を比較した結果、一次構造の上から5つのグル-プに分類された。いずれも安定なヘアピン構造を形成しうるが、一次構造上ですべてに保存された配列は見い出されないことから、n'タンパク質はヘアピンの高次構造を認識していると推察された。染色体priA遺伝子を欠損した変異株を作成し、その抽出液を調製した結果、このものはのSSからRFへの複製及びColEI型のプラスミドであるpBR322DNA複製活性を有しておらず、その複製にはn'タンパク質の添加を必要とした。また、ニトロセルロ-スフィルタ-上に固定したn'タンパク質は、野生型のn'サイトとは結合するが、メチレ-ション保護の実験から接触ヌクレオチドと同定された部位に変異を持つn'サイトとは結合しないことが示された。現在、N端及びC端の欠失誘導体および、ヌクレオチド結合ドメインあるいはCXXCモチ-フの点変異体を作成し、これらの変異タンパク質の機能を上記のようにして確立されたアッセイ法を用いて測定している。