hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水環境DNAを活用した迅速で網羅的な水生昆虫の流域内種多様性の解明

これまで多くの地点で水域の生物モニタリングが盛んに行われてきた.従来のモニタリングでは生物採集や目視による生息確認を基本としているが,種名同定の困難さや現場調査の労力などの問題点がある.近年,従来の生物採集を基本とした生物モニタリングにかわり,生物が環境中に放出している環境DNAに着目されている.そこで本研究では,環境DNAの次世代シーケンス(NGS)解析による水生昆虫の種多様性評価を実現することを目的とし,NGS解析を利用した環境DNA分析による水生昆虫の種多様性解析,止水域由来の環境DNAを利用した環境DNAの流下距離の解明,環境DNA抽出方法の検討を行った.本研究では,従来の形態同定に基づく生物モニタリングにかわり,迅速かつ正確に水圏の生物多様性を明らかにする手段として,河川水中のDNAの次世代DNAシーケンシング解析から,水生昆虫の流域内種多様性を一気に網羅的に解析する技術を開発する.従来の生物モニタリングでは,未記載種・採取困難種,同定が困難な種の存在のため,正確な種数を定量することが難しい.そこで水生生物が水中に放出する環境DNAを用いて流域の種多様性を解明する.このDNAの効果的な「濃縮・抽出マニュアル」を整備し,大量のDNA塩基配列の解析を実現した「次世代DNAシークエンス分析」と,進化理論を応用しDNA配列のみを用いて機械的に種の境界を決定する「DNA種分類法」を利用して,容易かつ正確にすばやく水生昆虫の流域内種多様性を明らかにする.これまでに,水環境DNAの効果的な抽出方法を検討するため,多様な地点から採取した環境水を対象に,3種の消化酵素を用いてDNA抽出を行った.消化酵素はそれぞれ,環境水中に含まれる細胞の構成要素と考えられる脂質,タンパク質,糖質をそれぞれ分解する.これらの酵素を用いたDNA抽出を行い,DNAの濃度を測定して,最も効率の良いDNA抽出手法を明らかにした.また,重信川を対象に流域全土から採取した河川水の次世代DNA解析を行った.対象領域は昆虫網のCytochrome Oxidase I領域を対象に,次世代シーケンサーでジェノタイピングし,DNAデータベースを利用して,河川水中に含まれていたDNAの由来となる種を明らかにした.その後,次世代シーケンス解析で得られた水生昆虫の科のDNA配列数と,標本採集で得られた個体数の関係性を明らかにした.最後に,ダム湖など止水環境で増殖することが知られている藻類を対象に,環境DNAの流下距離を測定した.まず,環境DNAの回収効率の検証を行った.河川水を複数地点から採取し,実験室で0.2umのメンブレンフィルターを用いて濾過した.その後,糖質,タンパク質,脂質をそれぞれ分解する酵素反応を2時間行い,フェノール・クロロホルム法によりDNAを抽出した.さらに,PCR阻害物質を除去するためにカラム精製を行った.最後に,2本鎖DNAの蛍光標識によりDNA濃度を測定した.その結果,タンパク質分解処理によるDNA抽出法で最も濃度が高くなることが分かった.続いて,流域内水生昆虫群集の種多様性評価を行った.まず,ダム湖を含む流域複数地点で河川水と水生昆虫群集を採取した.次に河川水からDNAを上記の手法で抽出した.続いて昆虫を対象としたCOI領域のPCR増幅を行った.その後,MiSeqを用いた次世代シーケンス解析によるDNA塩基配列の解読を行った.最後に,DNAデータベースを活用して種名の検索を行った.ここで流域から得られた水生昆虫各科の個体数と,次世代シーケンス解析で得られたそれぞれの科の配列数の相関分析を行ったところ,有意な正の相関が見られた.これにより,環境水の次世代シーケンス解析により,流域に生息する水生昆虫種数とその生息数を推測することができる可能性が示された.止水環境で増殖することが知られている藻類を対象に,水中に含まれるDNAの濃度を測定することで,河川水中の環境DNAの流下距離を測定した.まず,ダム湖とその下流域から河川水を採取し,前述の手法と同様に河川水を濃縮し,CTAB法でDNA抽出した.その後,M. aeruginosaを検出する定量PCRを行った.その結果,ダム湖から約3-7 km程度流下していることが判明した.本実験は2年目に予定されていたが,1年目に一部を実施した.そのため,当初の計画以上に進展していると評価した.従来の形態同定に基づく水生生物モニタリングでは多大な労力と費用を要する。また、未記載種や希少種、隠蔽種、同定困難種な種数の定量をすることが難しい。そこで本研究では従来の形態同定に変わり、水中に存在する環境DNAに対して次世代シーケンサーを利用したメタバーコーディング解析を行うことで、水生昆虫の流域内種多様性を解析する技術の開発をした。まず、前年度までに採取した河川水から環境DNAを採取し、昆虫のミトコンドリアDNA上にあるCytochrome Oxidase I領域を増幅するPCRプライマーを用いてDNAの増幅を行なった。次に、MiSeqを用いた次世代シーケンス解析から、環境DNAに含まれていたDNAの塩基配列を得た。そして、これらのDNAの元となった生物をDNAデータベースから検索したその結果、現場調査で得られた水生昆虫の生息個体数と次世代シーケンス解析から得られた各分類群のリーズ数に有為な正の相関が見られた。これは同手法によって生息している水生昆虫の生物量を推測できる可能性を意味する。その一方で、陸上由来の昆虫や昆虫綱以外の生物のDNAも多量に検出された。

また細かい同定可能なものは一部にとどまり、また外国産の種が参照される結果となった。今後はこれらの問題点を改善していく必要がある。続いて上記DNA配列に対してDNA種分類法による種分類を行なった。DNA種分類法は解析領域の種分化速度の変化から種分化境界を推定する手法である。隠蔽種の検出に有力な手法と考えられ、真の種数を把握する点において有効であると考えられる。本研究では形態同定と同程度の種数が検出され、一定の効果が見られたと考えられる。これまで多くの地点で水域の生物モニタリングが盛んに行われてきた.従来のモニタリングでは生物採集や目視による生息確認を基本としているが,種名同定の困難さや現場調査の労力などの問題点がある.近年,従来の生物採集を基本とした生物モニタリングにかわり,生物が環境中に放出している環境DNAに着目されている.そこで本研究では,環境DNAの次世代シーケンス(NGS)解析による水生昆虫の種多様性評価を実現することを目的とし,NGS解析を利用した環境DNA分析による水生昆虫の種多様性解析,止水域由来の環境DNAを利用した環境DNAの流下距離の解明,環境DNA抽出方法の検討を行った.前年度に続き,水環境DNAの抽出効率の検証を行う.環境水中には由来となった生物の異なる雑多なDNAが含まれる.本研究ではDNA抽出時に異なる酵素を用いた.これにより,それぞれ異なる生物由来のDNAが抽出された可能性がある.そこで,DGGE法を用いて各抽出DNAに含まれる生物の多様性を評価し,より多様な種を検出できる手法を明らかにする.また,次世代シーケンス解析で得られた水生昆虫DNAデータから全水生昆虫DNAの配列間の系統関係を表す進化系統樹を構築する.そして,この系統関係を最も良く再現するPTPモデル(種分化-種内多型混合モデル)の系統分化速度を最尤推定し,系統樹内の種分化の境界年代を推定する.これによって導かれた種間の境界年代に基づいて,水環境DNAに含まれていた水生昆虫群集の種数を定量化する.次に,流域内の250m河川区間ごとの流速・水深・水温の空間分布を,分布型流出水文モデルにより定量する.理論上,水環境DNAの流下距離がわかれば,対象種の生息域の下流側で検出されるその種の水環境DNA濃度の空間分布(流程分布)が推定できる.この原理を逆手にとり,河川水から検出された各DNA種の水環境DNA濃度の流域内の空間分布と,環境DNAの流下距離から全DNA種の流域内生息分布を推定する.河川生態一部の解析依託費,英文校正費,参考文献購入費,レンタカー借り上げ費などが想定よりも安価であったため.参考文献購入費,レンタカー借り上げ費,DNA解析用消耗品費として使用予定.
CD40活性化B細胞の抗原処理、提示能、および抗原特異的T細胞誘導能の検討

CD40活性化B細胞(CD40-B)は、樹状細胞に匹敵する抗原提示能を有し、かつ少量の血液より増幅し樹立可能であるため、小児や血球減?を伴う患者など多量の血液採取が難しい人からも十分量の抗原提示細胞を得ることが可能である。抗原をコードしたmRNAは、方形波エレクトロポレーションにて、ほぼ100%CD40活性化B細胞に導入することが可能であった。また、抗原蛋白を添加したCD40活性化B細胞を抗原提示細胞とすることで、複数の抗原特異的CD4+T細胞を同時に樹立することができ、CD40活性化B細胞は細胞療法等に用いられる抗原提示細胞として有用と考えられた。CD40活性化B細胞(CD40-B)は、樹状細胞に匹敵する抗原提示能を有し、かつ少量の血液より増幅し樹立可能であるため、小児や血球減少を伴なう患者など多量の血液採取が難しい人からも十分量の抗原提示細胞を得ることが可能であり、腫瘍免疫などの細胞療法において有用である。平成21年度の本研究計画では、1)CD40-B細胞への抗原遺伝子(mRNA)の導入による抗原提示の検討および2) CD40-B細胞への抗原蛋白添加による抗原提示の検討を予定した。1)の抗原遺伝子IVT-mRNAのCD40活性化B細胞への導入に関して、ドイツ・マインツ大学Dr. Sahinより供与されたpSTIベクターにEGFP遺伝子を組み込んだものを使用し、In vitro transcription法にて作成したmRNAの導入条件を検討した。250, 350, 450Vおよび250,350,450・s, Squarewaveの各組み合わせにて導入効率、CD40-B細胞生存率を検討した結果、いずれの条件でもEGFP発現はほぼ100%と良好であったが、発現強度および細胞に対する毒性を考慮し、350V,350・・sの条件が最適と判断した。現在、pSTIにCMV-pp65、Cyclin D1、CD133、alpha B-crystellinの各cDNAを組み込んだベクターを作成終了し、遺伝子導入実験を行っている。比較を行っている。CD40活性化B細胞(CD40-B)は、樹状細胞に匹敵する抗原提示能を有し、かつ少量の血液より増幅し樹立可能であるため、小児や血球減少を伴う患者など多量の血液採取が難しい人からも十分量の抗原提示細胞を得ることが可能であり、腫瘍免疫などの細胞療法において有用である。平成22年度の本研究計画では、1)遺伝子導入CD40-B細胞を用いた抗原特異的T細胞の樹立および特異性の検討、2)抗原特異的細胞傷害性T細胞の認識するHLA、エピトープの解析、3)抗原特異的CD4+T細胞の樹立、4)抗原特異的CD4+T細胞の認識するHLA、エピトープの解析、を予定した。1)では、CD133、alpha B-crystellin発現mRNAを作成し、CD40B細胞にエレクトロポレーション法にて導入、CD8陽性T細胞を刺激しCTL樹立を試みた。現在までに抗原特異的CTLは樹立できておらず、現在も継続中である。CTLが樹立でき次第、2)の実験を行う。3)4)抗原特異的CD4+T細胞の樹立については、CMVpp65由来ペプチド(K509 ; KYQEFFWDANDIYRI)添加CD40B細胞を抗原提示細胞として、抗原特異的CD4+T細胞クローンを作成し、組み換え蛋白添加CD40B細胞の抗原提示能を解析した。樹状細胞との比較にて、プロテアソーム阻害剤、クロロキン存在下での抗原提示能に差がみられ、CD40B細胞では、樹状細胞とは異なる抗原提示経路の存在が示唆された。現在詳細を解析中である。
ヒト唾液高プロリン含有ペプチドP-B関連遺伝子の探索とその遺伝子産物の機能

高プロリン含有蛋白質P-B関連遺伝子の発現制御機構、発現組織、系統樹上での発現位置等を把握することにより、その機能を解明することを目的として本実験を行った。P-B関連遺伝子をクローニングするため、ヒトゲノムライブラリーをP-BcDNAのフラグメントをプローブとしてスクリーニングした。得られたクローンB41はP-B遺伝子そのものではなくP-B関連遺伝子の3'側領域を含むものであった。そこでB41の5'側フラグメントをプローブとして再度クローニングしb21を得た。b21の塩基配列決定を行ったところ、b21はP-B関連遺伝子(PBIと命名)の全領域をカバーしており、そのサイズはおよそ6.4kbである。P-BcDNAと照合の結果、PBIは3つのエキソンより成り、それぞれのサイズは、88bp,68bpおよび508bpである。PBIは転写開始因子TATAbox,翻訳開始配列ATG終止コドンTAAポリA付加シグナルAATAAAを有し、また2つのイントロンはGT-AG規制にあてはまる。従ってPBIは発現可能な遺伝子と考えられる。PBIがコードすると考えられる蛋白質(P-B1と命名)は22残基のシグナル配列と112残基の成熟蛋白質配列より成る。P-B1とP-Bのシグナル配列は完全に一致する。P-B1の成熟蛋白質のサイズはP-Bのものの約2倍で、P-B1のN末側61残基はP-B57残基と高いホモロジーを示す。なおラットのPR-Vβ1,マウスのMSG1も明らかに同じグループに属する蛋白質である。ヒト唾液腺cDNAをPCRで増幅後、制限酵素消化により解析したところP-B1はヒト唾液腺では発現していない見込みである。ヒト遺伝子ライブラリー(Charon35)をP-BcDNA由来の400bpより成るフラグメントをプローブとしてスクリーニングしたところ約20kbpのクローンが得られた。このクローンのベクター近接領域0.8kbp(PBGI)をサブクローニングし塩基配列を解析したところP-BcDNAと高いホモロジーを示す部分を含んでいた。この部分はP-BcDNAのシグナルアミノ酸配列第19残基にあたる塩基より下流500bpに相当するがP-BcDNAの配列と完全には一致しない。従ってPBGIはP-Bの関連遺伝子である。P-BcDNA由来のフラグメントをプローブとするヒトゲノム制限酵素消化物のサザンハイブリダイゼーションの結果に基ずいてP-Bがマルチジーンファミリーのメンバーである可能性が強いと考えていたが、今回の研究によりこのファミリーには少なくとも2つのメンバーが存在することが明らかになった。また、PBGIはP-BcDNAの5側領域を含んでいないのでP-B関連遺伝子は複数のエクソンより構成されると考えられる。なおプローブの標識には非放射性蛍光試薬を用いた。陽性クローンの塩基配列の解析についても非放射性塩基配列解析用試薬を用いジデオキシ法で行なった。ヒト唾液高プロリン蛋白質P-B遺伝子及びその関連遺伝子をクローニングする為ヒトゲノムライブラリー(Charon35)をP-BcDNA断片をプローブとしてスクリーニングした。得られた陽性クローンB41の塩基配列を解析したところ、B41はP-Bと類似しているが同一でない蛋白質に対応する遺伝子の断片であると考えられた。そこでこの遺伝子をPBIと名付けた。次にB41の5'側に相当するオリゴヌクレオチドをプローブとして再度ヒトゲノムライブラリー(EMBL3)をスクリーニングして陽性クローンb21を得た。b21の塩基配列を解析したところ、このクローンはB41の5'側に延長部分を有するものであrことが判明した。

b21DNAの約7kbの塩基配列をP-BcDNAの塩基配列と比較した結果PBIは3個のエキソンより成り、b21にPBIの全領域が含まれると判断された。PBIは転写に必要とされるプロモータ配列を上流域に含み、スプライシングに必要なCURAY配列を2個のイントロン内に含んでいる。2個のイントロンは共にGT-AG規則を満たしている。また、エキソン部は開始コドンATGに始まり終止コドンTAAにより終結する134残基の蛋白質をコードすることが可能である。この蛋白質の成熟型をP-B1と名付ける。終止コドンTAAの下流にはポリA付加シグナルが存在する。P-B1とP-Bは高いホモロジーを有するがP-B1のサイズはP-Bの約倍である。P-B1の顎下腺での発現をPCR法により検討したが、顎下腺では発現されていないと考えられる。極めて類似した蛋白質でありながら、P-Bのみ顎下腺で発現されている必然性について今後検討して行きたい。高プロリン含有蛋白質P-B関連遺伝子の発現制御機構、発現組織、系統樹上での発現位置等を把握することにより、その機能を解明することを目的として本実験を行った。P-B関連遺伝子をクローニングするため、ヒトゲノムライブラリーをP-BcDNAのフラグメントをプローブとしてスクリーニングした。得られたクローンB41はP-B遺伝子そのものではなくP-B関連遺伝子の3'側領域を含むものであった。そこでB41の5'側フラグメントをプローブとして再度クローニングしb21を得た。b21の塩基配列決定を行ったところ、b21はP-B関連遺伝子(PBIと命名)の全領域をカバーしており、そのサイズはおよそ6.4kbである。P-BcDNAと照合の結果、PBIは3つのエキソンより成り、それぞれのサイズは、88bp,68bpおよび508bpである。PBIは転写開始因子TATAbox,翻訳開始配列ATG終止コドンTAAポリA付加シグナルAATAAAを有し、また2つのイントロンはGT-AG規則にあてはまる。従ってPBIは発現可能な遺伝子と考えられる。PBIがコードすると考えられる蛋白質(P-B1と命名)は22残基のシグナル配列と112残基の成熟蛋白質配列より成る。P-B1とP-Bのシグナル配列は完全に一致する。P-B1の成熟蛋白質のサイズはP-Bのものの約2倍で、P-B1のN末側61残基はP-B57残基と高いホモロジーを示す。なおラットのPR-Vβ1,マウスのMSG1も明らかに同じグループに属する蛋白質である。ヒト唾液腺cDNAをPCRで増幅後、制限酵素消化により解析したところP-B1はヒト唾液腺では発現していない見込みである。
ヒト骨芽細胞様細胞を用いる加温自家骨再植法の加温条件の検討

脱灰処理されていない加温自家再植骨の経時的変化を検討するため、下記の実験を行った。1.方法:12週齢オスSDラットの頭蓋骨に、直径8mmの骨欠損を作成し、下記の4群に分けた。(1)欠損群:骨欠損のまま放置する群、(2)対照群:切除骨を再植する群、(3)加温群:切除骨を65°C・30分加温したのち再植する群、(4)煮沸群:切除骨を30分煮沸したのち再植する群。手術後2・4・8週に屠殺し、手術部位の脱灰及び非脱灰標本を作成した。HE染色、塩基性フクシン・メチレンブルー重染色を行い、後者よりパーソナルコンピューターを用い移植骨量と新生骨量を求め、新生骨の割合を算出した。2.結果:対照群2・4・8週目に移植骨内部で新生骨がみられた。加温群8週目に断端から移植骨の外側皮質と内側皮質の間に楔状の新生骨が認められた。8週目の煮沸群では、新生骨は移植骨表面にみられるものの移植骨内にはほとんど見られなかった。頭蓋骨欠損部の全骨量に占める新生骨の割合を算出したところ、4週から8週にかけて対照群と加温群では新生骨の割合は増加傾向を示すのに対し、煮沸群では変化がほとんど認められなかった。3.今後の展開:3群とも移植骨が残存しており、さらに長期にわたる観察が必要である。脱灰処理を行っていなくても再植された自家加温骨は、対照骨と同様に新生骨に置換されていくことが示唆された。今後、同様な実験系でラベリング等を行いさらに詳細な経時的変化について観察する予定である。さらに、骨芽細胞様細胞を用い、加温骨の加温条件を検討してゆきたい。
アルカロイド化合物：ハルミンによる免疫制御機構の解明および免疫疾患への治療応用

本研究では、ハルミンが標的因子Xを介してLPS誘導性のIL-6産生を抑制していることを明らかにした。またハルミンがLPSによるエンドトキシンショックを抑制するはたらきがあることを発見した。ハルミンはTreg細胞分化を促進するはたらきがあることを示していたが、この促進効果においてもハルミンの標的因子Xを介して行なわれていることを解明した。一方でハルミンはTh17細胞の分化を抑制する作用を有しているが、Th17細胞分化抑制においても標的因子Xを介していた。以上のことから免疫応答におけるハルミンの薬理作用は標的因子を介していることが証明された。ハルミンの標的因子Xをマクロファージ(RAW細胞)に安定発現させ(RAW/X)、コントロール細胞(RAW/Neo)とともにLPSまたはLPS+ハルミンで刺激し、IL-6の産生を比較した。その結果、LPS+ハルミンの刺激においてRAW/X細胞ではハルミンによるIL-6産生抑制がコントロール細胞よりも有意に強いことが明らかになった。このことからハルミンによる炎症性サイトカインの産生抑制効果は標的因子Xを介していることが示された。一方で、ハルミンはLPSにより誘導される抗炎症性サイトカインであるIL-10の産生を促進する。このハルミンによるIL-10産生促進に関しても標的因子Xを介して行われていることが判明した。また非常に興味深いことに、RAW/NeoおよびRAW/XをLPS単独で刺激するとIL-6の産生がRAW/Xにおいて有意に抑制されていることが明らかになった。この結果は標的因子Xが炎症応答を抑制するはたらきがあることを示唆している。次にLPS投与によるエンドトキシンショックに対するハルミンの効果を調べた。LPSとハルミンを同時に投与したマウスではLPS単独投与のマウスに比べて生存率が有意に改善することが示された。ハルミンの類似体であるハルマリンやハルマンなどの投与においても生存率が改善したことからハルミンなどのアルカロイド系化合物は免疫応答を抑制する作用があることが明らかとなった。本年度はT細胞におけるハルミンの作用機序を解明した。Th17細胞分化時においてハルミンがStat3の活性化を抑制していることが明らかになった。このことによりハルミンはTh17細胞分化を抑制しているものと考えられる。一方でハルミンはTh17細胞およびTreg細胞分化時におけるSmad2の活性化には影響しないことも明らかになった。以上の結果からハルミンはTGF-bのシグナルを直接的には抑制していないことが示された。今後はハルミンがどのようにIL-6のシグナルを抑制しているのかを解明していく必要がある。昨年度にマクロファージにおいてハルミンは標的因子Xを介してIL-6などの炎症性サイトカインを抑制していることを明らかにした。T細胞においてもハルミンがこの標的因子Xを介して作用しているのかを解析した。標的因子X欠損T細胞を用いてTreg細胞分化におけるハルミンの効果を調べたとこと野生型T細胞ではTGF-bによるTreg細胞分化はハルミン添加により促進されていたが、標的因子X欠損T細胞ではハルミンによる分化促進作用がキャンセルされていた。またTh17細胞分化においても同様に調べた所、野生型T細胞ではハルミンによりTh17細胞分化が抑制されていたが、標的因子X欠損T細胞ではハルミンによる分化抑制効果がキャンセルされていた。以上のことからマクロファージと同様にT細胞においてもハルミンは標的因子Xを介して薬理作用を示していることが明らかになった。免疫これまでにマクロファージにおけるハルミンの標的因子Xを同定していたが、実際に標的因子Xを介しているかは不明であった。今回ハルミンの標的因子Xを介してハルミンが炎症性サイトカインの産生を抑制していることが示されたので、マクロファージにおけるハルミンと標的因子Xの関連は証明された。また、ハルミンのin vivoにおける効果も確認でき実際に炎症抑制剤として利用できる可能性も示された。以上の結果から本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。今後はハルミンによるin vivoにおける効果においても標的因子Xを介しているのかを標的因子X欠損マウスを用いて確認する。また、T細胞においてもハルミンが標的因子Xを介して効果を発揮するのかを検証する。T細胞においてハルミンが標的因子を介していないことが示されれば、半田ビーズを用いてT細胞におけるハルミンの標的因子を新たに同定していく予定である。平成25年度の実験においてはこれまでに購入されていた試薬などで実験を行うことができ、当初想定されていた物品費が抑えられたため。新たな試薬の購入や研究成果の発表を行うために国内外の学会に参加するための旅費などに対して使用予定
最新分析技術を駆使した材料中の水素-転位ダイナミックス検出と脆化メカニズム解明

体心立方(BCC)の純鉄および面心立方(FCC)のInconel 625の変形過程における水素脱離挙動を引張試験機に取り付けた質量分析器を用いて評価した。その結果、弾性変形範囲では水素の放出は認められず、一方、塑性変形が開始する耐力を超えると急激に水素放出は増加し、その後最大に達し、徐々に減少する。この脱離挙動は可動転位による水素輸送と密接に関係している。この転位と水素の相互作用が起きると、格子欠陥形成が促進され、延性低下を引き起こす。(1)水素-転位ダイナミックスの検出近年進歩の著しい「最新の水素分析技術」と基本となる「力学試験」と組み合わせ、材料中の水素-転位の動的な挙動を検出することを目指す。具体的には、(1)変形中における材料内からの水素を高感度に検出する装置開発、(2)転位の水素トラップ効果と転位の移動に伴う水素dragging motion効果の影響を解明することを目的とする。(2)微視的な水素-転位の動的な相互作用と巨視的な力学特性との関係解明材料個々の特殊性と普遍的な共通性を見出し、巨視的な力学的因子(水素脆化試験)の結果との対応から、脆化へ及ぼす水素の役割・本質を抽出し、水素脆化メカニズムを見直すことを目的とする。材料中の水素-転位ダイナミックスを検出するにあたり、BCC系金属として工業用純鉄、FCC系金属としてInconel625を用いて、水素誘起格子欠陥の生成促進因子および水素脆化感受性をひずみ速度の観点からの検討をした。水素を添加した純鉄を引張速度1.0mm/minと0.02mm/minで塑性ひずみ0.04までひずみを負荷し、その後、室温で水素を放出させ、再度、同一条件で水素チャージした。その結果、時間をかけて引っ張った引張速度0.02mm/minの試験片の方が大幅に水素量の増加が認められた。本試験は純鉄に塑性変形しか与えていないので、水素量の増加は純鉄中の格子欠陥増加に対応する。また、水素を添加した純鉄を引張速度1.0mm/minと0.02mm/minで破断まで負荷した結果、0.02mm/minの延性低下の割合が大きかった。以上の結果から、引張速度が遅いほど、すなわち転位移動速度が遅いほど、水素誘起格子欠陥生成が促進され、水素脆化感受性も高まることが判明した。本試験の試験片は平滑材であり、切り欠きを導入していないので、応力集中部への応力誘起水素拡散を考慮しなくてよいため、転位による水素のdragging motionが原因と推察される。引張速度が速いと水素は転位の動きに追従できず、転位と水素の相互作用は生じにくい。一方、引張速度が遅い場合、水素は転位の移動に追従でき、特に、刃状転位周りは水素雰囲気を保ちながら移動可能であり、転位と水素の相互作用が生じやすい。具体的には、水素が転位の移動を容易にしたり、転位同士の切りあいの際、原子空孔が生じるが、転位周りに水素が存在すれば、生成した原子空孔を水素が占有し安定化し、水素誘起格子欠陥生成を促進しさらには水素による延性低下を助長したと推察される。材料中の水素-転位ダイナミックスを検出するにあたり、BCC系金属として工業用純鉄、FCC系金属としてInconel625を用いて、室温における転位による水素の輸送現象解明を目的とした。引張試験中に試験片から放出される水素を検出するために、低ひずみ速度引張試験機(SSRT)に真空チャンバを取り付け、そこに質量分析器(QMS)を組み込み装置を試作した。試験片表面の吸着水起因の水素、および応力を負荷しなくても拡散する水素を除去することで、変形過程における水素放出挙動を解析した。その結果、純鉄およびInconel625ともに、弾性変形過程では水素の放出は認められず、一方、塑性変形開始とともに急激に水素放出が開始し、その後徐々に水素の放出も低下する。塑性変形初期の急激な水素放出は、刃状転位による水素の輸送に起因し、その後の水素放出の低下は、転位密度の増加とともに平均転位移動速度が低下し、さらに結晶粒界などに転位がpile-upすることに起因すると推察される。また、従来、刃状転位が水素を輸送すると報告されていたが、本研究では変形後期でも水素の放出が検出された。この結果から、変形後期ではらせん転位が主となるため、静水圧応力場を持たないらせん転位も水素と相互作用し、転位の輸送に大きく貢献していることが判明した。さらに、ひずみ速度依存性についても検討し、ひずみ速度を遅くするほど転位による水素の輸送量も増加する。しかし、水素の拡散速度より遅くすると、逆に、水素の輸送量は減少する。以上、変形過程における水素-転位ダイナミックスの検出に成功した。

材料中の水素一転位ダイナミックスを検出するにあたり、代表的な高強度鋼である焼戻しマルテンサイト鋼、伸線パーライト鋼を用いて、室温における転位による水素の輸送現象解明を目的とした。引張試験中に試験片から放出される水素を検出するために、低ひずみ速度引張試験機(SSRT)に真空チャンバを取り付け、そこに質量分析器(QMS)を組み込み装置を試作した。試験片表面の吸着水起因の水素、および応力を負荷しなくても拡散する水素を除去することで、変形過程における水素放出挙動を解析した。その結果、焼戻しマルテンサイト鋼および伸線パーライト鋼ともに、弾性変形過程では水素の放出は認められず、一方、降伏点近傍で水素放出が開始し、その後急激に水素の放出が低下し、無応力状態での水素放出より低下する。塑性変形初期の急激な水素放出は、刃状転位による水素の輸送に起因し、その後の水素放出の低下は、転位密度の増加とともに平均転位移動速度が低下し、さらに結晶粒界などに転位がpile-upすることに起因すると推察される。さらに、無応力状態での水素放出より低下する理由は、転位間の相互作用により水素トラップサイトが形成し、これが水素放出の抑制作用をして作用したことが原因と考えられる。以上、高強度鋼の変形過程における水素-転位ダイナミックスの検出に成功し、平成19年度に得られた純鉄における挙動とは大きく異なることを見出した。材料中の水素-転位ダイナミックスを検出するにあたり、代表的な高強度鋼である焼戻しマルテンサイト鋼、伸線パーライト鋼を用いて、室温における転位による水素の輸送現象解明を目的とした。引張試験中に試験片から放出される水素を検出するために、低ひずみ速度引張試験機(SSRT)に真空チャンバを取り付け、そこに質量分析器(QMS)を組み込んだ装置を試作した。その結果、焼戻しマルテンサイト鋼および伸線パーライト鋼ともに、弾性変形の後半から水素の放出が認められた。これを確認するため、弾性域で繰り返し応力を負荷すると、それに伴って、水素の放出が検出された。さらに変形を続けると、降伏点近傍で水素放出が最大となり、その後急激に水素の放出が低下し、無応力状態での水素放出より低下する。弾性変形後期の水素放出は、格子膨張による効果であり、降伏点近傍での水素放出は、刃状転位による水素の輸送に起因し、その後の水素放出の低下は、転位密度の増加とともに平均転位移動速度が低下し、さらに結晶粒界などに転位がpile-upすることに起因すると推察される。さらに、無応力状態での水素放出より低下する理由は、転位間の相互作用により水素トラップサイト(主に転位、原子空孔)が形成し、これが水素放出の抑制作用をして作用したことが原因と考えられる。以上、高強度鋼の変形過程における水素-転位ダイナミックスの検出に成功し、平成20年度に得られた高強度鋼における水素放出挙動をより詳細に検討し解明できた。
可換*半群上の有限個のnegative squareをもつ関数に関する研究

本研究課題の対象である関数の特殊な場合として正定値関数がある.この積分表示について調べることは本研究課題を進める上で意義深い.可換*半群上の正定値関数が,指標半群上の正則ボレル測度で積分表示出来るような可換*半群を半完全,その表現測度がいつも一意に定まるとき完全であるという.成果の第一として,有理数半群Qの直積半群(Q^κ,+,*)(*構造は一般)において,そのconelike*部分半群を考え,その完全性を示した.今までは*構造が恒等的の場合に証明されていたが,2次元の場合で*構造が(p,q)^*=(p,-q)のときに定理が成立することを示し,一般の*構造でもこのことから既知の保存性を使うことにより証明した.更に3次元以上については,帰納法を使うことにより証明した.これが現在,外国雑誌に投稿中の論文の主定理である.また,正定値及びモーメントの概念を作用素値関数の意味に拡張し,作用素値関数の意味での積分表示可能性と完全性・半完全性の関係を調べた.作用素値関数の場合,スカラー値関数の正定値に対応する正値性として正定値及び正型の2種類が考えられる.成果の第二として,正定値(作用素値)の意味での一意的積分表示可能性及び正型の意味での一意的積分表示可能性が完全性と同値であることを得た.また,半完全な半群として知られている非負整数半群N_0,整数半群Z,さらには(Z^2,+,(p,q)^*=(q,p))が正型の意味で半完全であることも示した.この結果については現在論文としてまとめる方向にある.本研究課題の対象である関数の特殊な場合として正定値関数がある.この積分表示について調べることは本研究課題を進める上で意義深い.可換*半群上の正定値関数が,指標半群上の正則ボレル測度で積分表示出来るような可換*半群を半完全,その表現測度がいつも一意に定まるとき完全であるという.成果の第一として,有理数半群Qの直積半群(Q^κ,+,*)(*構造は一般)において,そのconelike*部分半群を考え,その完全性を示した.今までは*構造が恒等的の場合に証明されていたが,2次元の場合で*構造が(p,q)^*=(p,-q)のときに定理が成立することを示し,一般の*構造でもこのことから既知の保存性を使うことにより証明した.更に3次元以上については,帰納法を使うことにより証明した.これが現在,外国雑誌に投稿中の論文の主定理である.また,正定値及びモーメントの概念を作用素値関数の意味に拡張し,作用素値関数の意味での積分表示可能性と完全性・半完全性の関係を調べた.作用素値関数の場合,スカラー値関数の正定値に対応する正値性として正定値及び正型の2種類が考えられる.成果の第二として,正定値(作用素値)の意味での一意的積分表示可能性及び正型の意味での一意的積分表示可能性が完全性と同値であることを得た.また,半完全な半群として知られている非負整数半群N_0,整数半群Z,さらには(Z^2,+,(p,q)^*=(q,p))が正型の意味で半完全であることも示した.この結果については現在論文としてまとめる方向にある.
動的らせん高分子からなる剛直主鎖型コレステリック液晶の開発と応用

申請者らは、側鎖にジイソプロピルアミノメチル基を有するポリフェニルアセチレン(poly-1)の塩酸塩が濃厚水溶液条件下で剛直主鎖型液晶を形成し、極少量の光学活性な酸の添加により液晶相はネマチック液晶からコレステリック液晶へと変化し、液晶状態では、希薄溶液中よりも感度よく光学活性な酸のキラリティー検出が可能であることを見い出している。本研究では、この現象の一般性を確かめることを目指し、様々な官能基を有するポリフェニルアセチレンやポリイソシアニドなどについて、水中でのコレステリック液晶形成と不斉増幅現象が起こるかどうかについて調べた。その結果、本年度は以下に示す結果を得た。1.光学活性体の添加により一方向巻きのらせん構造を誘起したホスホン酸エステル残基を有するポリフェニルアセチレン誘導体や、らせん構造を記憶として保持したカルボキシル基を有するポリフェニルイソシアニドのナトリウム塩が濃厚水溶液中でコレステリック液晶に特徴的な縞状組織を示すことを見い出した。2.水だけでなく、難燃性、再利用が可能、液体温度範囲が広いなどの理由から、近年、環境調和型の溶媒として注目されているイオン性液体中でも同様のコレステリック液晶を形成するかどうかについても検討を行った。その結果、一方向巻きのらせん構造を記憶として保持したポリフェニルイソシアニド誘導体が、高濃度条件下、イオン性液体中で、複屈折性を示し、コレステリック液晶に特徴的な縞状組織を示すことを見い出した。3.Poly-1が、水中で光学活性な酸存在下、水に可溶となり、一方向巻きに片寄ったらせん構造の形成に由来する誘起CDを示すことを見い出した。低温では光学活性な酸のキラリティーに非常に感度良く応答し、0.005%の酸の鏡像体過剰率もCDにより検知可能であった。誘起CDは濃度および温度依存性を示し、AFMや光散乱測定より高温、高濃度では会合体を形成している可能性が高いことが示唆された。さらに、誘起CDの温度応答性を利用して、構造の異なる鏡像異性の光学活性な酸存在下、温度によるCD符号の反転を起こすことを見い出した。申請者らは、側鎖にジイソプロピルアミノメチル基を有するポリフェニルアセチレンの塩酸塩(poly-1-HCl)が水溶液条件下で剛直主鎖型液晶を形成し、極少量の光学活性な酸の添加により液晶相はネマチック液晶からコレステリック液晶へと変化し、液晶状態では、希薄溶液中よりも感度よく光学活性な酸のキラリティー検出が可能であることを見い出している。本研究では、この現象の一般性を確かめることを目指し、以下に示す結果を得た。1.申請者らは、光学不活性なポリ(4-カルボキシフェニルイソシアニド)のナトリウム塩(poly-1-Na)に光学活性アミン存在下、水中で一方向巻きに片寄ったらせん構造が誘起され、さらに記憶として保持可能であることを見い出しているが、分子量の低いpoly-1-Naは濃厚水溶液中で液晶を示さなかった。また、従来の合成法では数平均分子量(M_n)が数万程度の比較的低分子量のポリマーしか得られていない。そこで、高分子量体の合成を目指し、触媒としてパラジウムあるいはニッケルの金属錯体を用いて、溶媒、反応温度、重合時間等の反応条件を様々に変えて(4-エトキシカルボニル)フェニルイソシアニドの重合を行ない、分子量および収率におよぼす効果について検討を行なった。その結果、塩化ニッケル六水和物を触媒としてテトラヒドロフランとメタノール混合溶媒中(9/1,v/v)で重合を行なったところ、M_n=2.1×10^5の高分子量のポリマーが定量的に得られることを見い出した。また、側鎖のエステル基を加水分解して水溶性のpoly-1-Naへと変換し、光学活性アミン存在下、水中でらせんの誘起を行ったところ、これまで用いてきた比較的低分子量のポリマーと同程度の誘起円二色性(CD)を示した。得られた高分子量のpoly-1-Naの濃厚水溶液を偏光顕微鏡で観察したところ、明確な複屈折性を示し、コレステリック液晶に特徴的な縞状組織を示すことを見出した。2.Poly-1-HClが濃厚水溶液中で剛直主鎖型液晶を形成する特徴を最大限に利用して、濃厚液晶水溶液からずり配向フィルムを作製し、その固体フィルムのX線回折を行い、poly-1-HClのらせん構造の決定を行った。その結果、poly-1-HClのらせん構造が23残基で10回転する23/10らせん構造であると結論付けられ、これまで明らかでなかったポリフェニルアセチレンのらせん構造を初めて決定することに成功した。

1.光学活性体の添加により一方向巻きのらせん構造を誘起したホスホン酸エステル残基を有するポリフェニルアセチレン誘導体や、らせん構造を記憶として保持したカルボキシル基を有するポリフェニルイソシアニドのナトリウム塩が濃厚水溶液中でコレステリック液晶に特徴的な縞状組織を示すことを見い出した。2.水だけでなく、難燃性、再利用が可能、液体温度範囲が広いなどの理由から、近年、環境調和型の溶媒として注目されているイオン性液体中でも同様のコレステリック液晶を形成するかどうかについても検討を行った。その結果、一方向巻きのらせん構造を記憶として保持したポリフェニルイソシアニド誘導体が、高濃度条件下、イオン性液体中で、複屈折性を示し、コレステリック液晶に特徴的な縞状組織を示すことを見い出した。3.Poly-1が、水中で光学活性な酸存在下、水に可溶となり、一方向巻きに片寄ったらせん構造の形成に由来する誘起CDを示すことを見い出した。低温では光学活性な酸のキラリティーに非常に感度良く応答し、0.005%の酸の鏡像体過剰率もCDにより検知可能であった。誘起CDは濃度および温度依存性を示し、AFMや光散乱測定より高温、高濃度では会合体を形成している可能性が高いことが示唆された。さらに、誘起CDの温度応答性を利用して、構造の異なる鏡像異性の光学活性な酸存在下、温度によるCD符号の反転を起こすことを見い出した。
新たな病原体特異性を有するレクチン受容体ヘテロ二量体の戦略的探索

結核菌のアジュバント活性を担うC型レクチン受容体MincleとMCLがヘテロ二量体を形成し、相互に細胞表面発現を上昇させると共に、タンパク安定化を促すことで、リガンドに対する応答を増強することを明らかにした。一般的にレクチン受容体はリガンド親和性が弱いため、同種受容体の凝集によってavidityを増大させる仕組みが見受けられる。今回見出したヘテロ二量体は、親和性の低い受容体が、生物学的に意味のある結合力を確保する上での新たな戦略と考えられる。また、この異なるレクチン受容体によるヘテロ二量体の形成によって、認識する病原体の多様性が広がることも期待される。結核菌のアジュバント活性を担うC型レクチン受容体Mincle(Clec4e)とMCL(Clec4d)がヘテロ二量体を形成し、相互に細胞表面発現を上昇させると共に、タンパク安定化を促すことで、リガンドに対する応答を著しく増強することを明らかにした。一般的にレクチン受容体はリガンド親和性が弱いため、同種受容体の凝集によって高野結合を形成し、avidityを増大させる仕組みが見受けられる。また、この異なるレクチン受容体によるヘテロ二量体の形成によって、認識する病原体の多様性も格段に広がり、病原体-宿主間の相互作用のメカニズムと生体応答がこれまで以上に明らかになっていくと期待される。免疫学
シリコン網膜による画像の圧縮再生と奥行き抽出

本研究では、セルラ-ニューラルネットワーク(CNN)のダイナミクスによる新しい圧縮再生方式を用いて、2枚の画像から3次元の情報を得る奥行き抽出について研究することである。Direct Dynamic Halftoning(DDH)の過程において、シンドロームと呼ばれる構造圧縮された左右差分情報が多重ビットのAD変換器を用いることなく並列ニューロン群のダイナミクスによって量子化される。伝送されたデジタルシンドロームは、アナログフィルタのダイナミクスによってアナログシンドロームに復号され、Dynamic Depth Extraction(DDE)の過程において、局所領域の平均的なシンドロームがほぼ零となる対応点をダイナミックに同時探索する。ここでは、協調競合作用が有効的に利用される。すべてのダイナミクスは、一般化されたCNNの状態方程式で記述される。このような画像の圧縮再生と奥行き抽出に関するアルゴリズムを主要設備で検証した。構造圧縮された時間差分情報をCNNで圧縮し復元する符号復号化方式を左右の濃淡画像のずれから奥行きを抽出する方式に結合して、圧縮と認識を組み合わせることを試みた。大規模なシリコン網膜を一般的に解析するシミュレーションプログラムを完成させ、提案した画像の圧縮再生と奥行き抽出のダイナミクスの正当性を実験的かつ理論的に確認した。さらに、画像の2値化動作を行なうCNNのパイプライン動作の正当性をハードウェア記述言語で確認した。アメリカのMOSISを使ってチップを作成するためにCADを整備し、簡単なCNNチップのレイアウトを作成した。Direct Dynamic Halftoning (DDH)の過程において、シンドロームと呼ばれる構造圧縮された左右差分情報が多重ビットのAD変換器を用いることなく並列ニューロン群のダイナミクスによって量子化される。伝送されたデジタルシンドロームは、アナログフィルタのダイナミクスによってアナログシンドロームに復号され、Dynamic Depth Extraction (DDE)の過程において、局所領域の平均的なシンドロームがほぼ零となる対応点をダイナミックに同時探索する。平成7年度では、画像の圧縮再生と奥行き抽出に関するアルゴリズムを主要設備で検証した。すなわた、構造圧縮された時間差分情報をCNNで圧縮し復元する符号復号化方式を左右の濃淡画像のずれから奥行きを抽出する方式に結合して、圧縮と認識を組み合わることを試みた。大規模なシリコン模様を一般的に解析するシミュレーションプログラムを完成させ、提案した画像の圧縮再生と奥行き抽出のダイナミクスの正当性を実験的かつ理論的に確認した。画像処理を主要設備のディスプレイ上に表示して視覚化した。さらに、NTTが開発したパルテノンというハードウェア記述言語を用いてCNNのLSI設計化を実際に行った。本研究では、セルラ-ニューラルネットワーク(CNN)のダイナミクスによる新しい圧縮再生方式を用いて、2枚の画像から3次元の情報を得る奥行き排出について研究することである。伝送されたデジタルシンドロームは、アナログフィルタのダイナミクスによってアナログシンドロームに復号され、Dynamic Depth Extraction(DDE)の過程において、局所領域の平均的なシンドロームがぼほ零となる対応点をダイナミクスに同時探索する。構造圧縮された時間差分情報をCNNで圧縮し復元する符号復号化方式を左右の濃淡画像のずれから奥行きを抽出する方式に結合して、圧縮と認識を組み合わることを試みた。

さらに、画像の2値化動作を行なうCNNのパイプライン動作の正当性をハードウェア記述言語で確認した。アメリカのMOSISを使ってチップを作成するためにCADを整備し、簡単なCNNチップのレイアウトを作成した。
マイクロスケール流体力学と相変化現象に関する研究

沸騰等の相変化を伴う熱流体力学現象のマイクロスケールな相変化現象の解明を目的として研究を行い、次の成果が得られた。1.狭い水平矩形管内における単相流、サブクール沸騰および沸騰二相流の熱流動特性テフロン製基板上の厚さ18μmの銅箔ヒーターで挟んだ隙間寸法0.6mm2.07mm、幅8mm、長さ200mmの平行平板間の水平矩形流路に、入口蒸気クオリティ00.3の水または水二相流を100kg/m^2s2,000kg/m^2sの質量流束で流し、一様熱流束100kW/m^2600kW/m^2で両面のヒーターを加熱することにより、狭い隙間内の沸騰二相流を形成させ、圧力損失と熱伝達率を測定した。圧力損失の測定ではテスト部出入口間の差圧を差圧変換器で測定し、熱伝達率の測定では予めダブルブリッジで銅箔の局所抵抗値の温度依存性を測定し、この結果をもとに抵抗測定からヒーター表面温度を求めた。沸騰二相流の熱伝達率は、2.07mmから1.58mmへの隙間間隔の減少に対して変化しなかったが、さらに1.09mm,0.60mmへと隙間間隔を減少させるにつれて、減少した。これは狭い隙間で沸騰伝熱が促進されるという従来の結果に反しているが、狭い隙間では気泡の成長が抑制されるため沸騰に対してより高い過熱度を必要とするという理論的予測および細管で沸騰伝熱が抑制されるという従来の結果と矛盾しない。この沸騰熱伝達は低クオリティで流速の影響を受けるが、高クオリティでは流速の影響を受けない。また、この隙間内の沸騰熱伝達率はRohsenowのプール沸騰熱伝達率より大きい。この隙間内の沸騰熱伝達率の実験式を求めた。隙間内の水単相流の摩擦圧力損失係数は通常流路の摩擦圧力損失係数よりも大きくなった。この単相流摩擦圧力損失の実験結果を用いて隙間内二相流摩擦損失の実験結果を無次元化し二相流増倍係数を求めた結果、通常流路に対するChisholm,ロシア標準法、Martinelli-Nelson、均質流のモデルから計算した二相流増倍係数よりも小さくなった。2.垂直環状流路内におけるポストドライアウト熱伝達狭い流路では蒸気温度が上がるためポストドライアウト熱伝達率は普通の流路より低下することがわかった。
肺悪性腫瘍のラジオ波治療における焼灼範囲拡大化の基礎的研究

ラジオ波凝固療法は、肺悪性腫瘍の低侵襲的局所治療として近年臨床に応用されだし、高い成果が期待されている。本研究は、さらにその成果を向上させる、すなわち焼灼領域を拡大させるための基礎的研究であり、ブタ肺を焼灼することによって行った。同じエネルギーを用いて焼灼領域を拡大させるためには、エネルギーを伝播しやすくすることが必要であり、そのため肺空気内に生理食塩水を注入して焼灼する実験をまず行った(第一の実験)。さらに、血流を一時的に遮断することにより、血流の焼灼に対する冷却効果を阻害し、結果として焼灼域の拡大を図ることが可能であるかを実験的に確認した(第二の実験)。焼灼にはLeVeen電極針(Radiotherapeutics)とジェネレーター(RF2000 or 3000;Radiotherapeutics)を使用し、展開径は2cmとした。第一の実験において焼灼は生理食塩水3mlを注入して焼灼する群と注入せずに焼灼する群の2群に分けてアルゴリズムを同一にして焼灼を行った。焼灼を終了後、両肺を摘出し、焼灼部の容積を測定し、さらに顕微鏡的に焼灼範囲の組織学的変化、焼灼範囲内の細胞の凝固壊死の程度など評価した。その結果生理食塩水の注入により約2倍の焼灼容積が得られ、焼灼も均一となることがわかった。第二の実験においては、一時的血流遮断の方法として一時的塞栓物質であるDegradable starch microspheres(以下DSM)を肺動脈内に注入した。焼灼は、肺動脈塞栓を行わずに焼灼する群と肺動脈を塞栓して焼灼する2群に分けて行った。その結果、動脈塞栓を行った群は塞栓を行わなかった群に比して焼灼容積が約2倍となった。肺動脈塞栓前後SaO_2の有意な低下はなく、塞栓領域肺には組織学的に損傷は認めなかった。以上より一時的肺動脈塞栓は凝固壊死容積を安全に有意に拡大することが実験的に証明された。平成17年度は、代表者である金澤右の考案した実験方法に基づき、三村秀文が具体的に計画する動物実験を、岡山大学自然生命科学研究支援センター動物資源部門にて郷原英夫と向井敬が中心となって以下の手順で施行した。動物としては、ブタ6匹を使用した。胸骨縦切開にて開胸下で肺に電極針を直視下に穿刺して行った。焼灼にはLeVeen電極針(Radiotherapeutics)とジェネレーター(RF2000;Radiotherapeutics)を使用し、電極針は8本の展開針を持ち、展開径は2cmとした。焼灼は以下の4群で行った。(1)液体注入を行わない群(2)室温の色素液8ccを注入する群。焼灼は上葉2カ所、下葉2カ所の肺表面より約5cm深部で行い、ブタ6匹で各群は計12カ所の焼灼が得られた。焼灼を終了後、両肺を摘出し、焼灼部を横切開し、焼灼部の最大断面での径を測定し、各群間で有意差検定を行った。また色素の広がりと焼灼の広がりとを肉眼的には評価した。固定された標本は、岡山大学医学部放射線医学教室内で、ヘマトキシリン・エオジン染色し、顕微鏡的に焼灼範囲の組織学的変化、焼灼範囲内の細胞の凝固壊死の程度など評価した。以上の動物実験を、3-4回に分割して行い、平成17年度中に本研究の動物実験の全てを終了した。

これらの動物実験から得られるデータをまとめ、郷原英夫と向井敬が、国内学会において発表した。平成18年度は、考案した実験方法に基づき、具体的に計画する動物実験を、岡山大学自然生命科学研究支援センター動物資源部門にて以下のごとく施行した。2年の研究期間の2年目に当たる本年度の実験の主たる研究目的は、一時的血流遮断が焼灼域拡大効果を示すか否かを検証するものである。凝固壊死範囲拡大のために血流を一時的に遮断することにより、cooling effectを阻害し、結果として焼灼域の拡大を図ることが可能であるかを実験的に確認した。一時的血流遮断の方法として一時的塞栓物質であるDegradable starch microspheres(以下DSM)を肺動脈内に注入した。手順は以下のごとくである。動物としては、ブタ5匹を使用した。肺動脈塞栓は大腿静脈から肺動脈内にカテーテルを進め、肺葉単位で選択的に塞栓した。なお肺動脈塞栓前後のSaO_2を測定した。胸骨正中切開にて開胸下で肺に電極針を直視下に穿刺して行った。焼灼にはLeVeen電極針(BostonScientific)とジェネレーターは昨年度科学研究費で購入したRF3000(BostonScienticic)を用いた。電極針は8本の展開針を持ち、展開径は2cmのものを使用した。焼灼は以下の4群で行った。(1)肺動脈塞栓を行わずに焼灼する群、(2)肺動脈塞栓直後に焼灼した群、(3)肺動脈塞栓15分後に焼灼した群、(4)肺動脈塞栓30分後に焼灼した群。焼灼終了後、両肺を摘出し、焼灼部を電極針に沿って切開した。焼灼部の最大断面での最大径、最小径を測定した。さらに焼灼域を3mm間隔でスライスし、各断面での焼灼面積を測定して、総焼灼容積を算出した。固定された標本は、岡山大学医学部放射線医学教室内でヘマトキシリン・エオジン染色し、顕微鏡学的に焼灼範囲の組織学的変化、焼灼範囲内の血管の凝固壊死、塞栓部肺の損傷の程度などを評価した。実験から得られた結果は以下のごとくである。肺動脈塞栓前後SaO_2の有意な低下はなく、塞栓領域肺には組織学的に損傷は認めなかった。凝固壊死容積は(1)群0.9±0.5cm^3、(2)群2.1±0.4cm^3、(3)群2.1±1.0cm^3、(1)群1.9±0.6cm^3となった。肺動脈塞栓を行った(2)(4)群は塞栓を行わなかった(1)群に比して有意に焼灼容積が大きかった(P<0.05)。以上より肺動脈塞栓は凝固壊死容積を有意に拡大することが実験的に証明された。これらの結果は、郷原英夫と向井敬が、国内外の学会において発表し、海外のpeer review雑誌に投稿中である。