hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
農業害虫の同定および種の多様性管理のためのコガネムシ上科DNAバーコーディング

DNAバーコーディングは特定の遺伝子領域の短い塩基配列を登録し,生物の検索・同定を促進するテクニックである.本研究は日本産コガネムシ上科甲虫のDNAバーコード情報の蓄積を進めることにより,農業害虫や外来種の早期・簡便な同定・判別を可能にしていくとともに,種の多様性管理のためのデータベースの構築を進めることを目指した.これまでにコガネムシ上科甲虫584分類群(種・亜種)のうち319分類群(54.6%)を収集・同定することができた.うち52分類群の294個体について塩基配列を決定し,日本産コガネムシ上科甲虫DNA barcodeデータベース(JScaBOL)を開設し,情報の集積を進めている.本研究は以下の6過程での進行で計画している。それぞれの進行状況を記す。1)サンプルの収集:北海道(十勝地方)と東北(青森県)において、各種採集トラップや任意採集によってサンプル採集調査を行い、各地方のコガネムシ上科甲虫類のサンプルを得ることができた。また、昆虫学会や応用動物昆虫学会、甲虫学会、コガネムシ研究の大会において、またコガネムシ研究会の会誌や昆虫同好会のメーリングリスト、Facebookなどで、全国の各分類群の専門家や各地の昆虫同好者にプロジェクトへの協力依頼を行い、協力者のネットワーク形成を行い、各地からの協力体制を構築できた。2)サンプルの同定:採集したサンプルや協力者から得られたサンプルは、順次同定作業を進めている。3)DNAバーコード領域の塩基配列の決定:クワガタムシ科で確認していたのと同様に、標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)でのPCR効率が悪く、代替プライマーを用いた塩基配列の決定をクワガタムシ科とコガネムシ科カブトムシ亜科を中心に進めた。4)サンプル情報およびDNA塩基配列のデータベース登録:多田内修(九大)を代表とする科研費研究成果公開促進費(データベース)に基づく「昆虫学データベース」に「日本産コガネムシ上科甲虫DNA barcodeデータベース(JScaBOL)」を開設し、サンプル情報と塩基配列データのデータベース化を開始した。5)サンプル標本およびDNAの保存:比較社会文化研究院のコレクションに入れるべく準備を進めている。6)学会発表および論文化による公表:コガネムシ研究会会誌の鰓角通信にプロジェクトの概要を記した論文を掲載し、プロジェクトの進行状況を報告した。本研究は以下の6過程での進行で計画している。それぞれの進行状況を記していく。1)サンプルの収集:四国(徳島県)において、各種採集トラップや任意採集によってサンプル採集調査を行い、この地方のコガネムシ上科甲虫類のサンプルを得ることができた。また、昆虫学会や応用動物昆虫学会、甲虫学会、コガネムシ研究会の大会において、またFacebook等において、全国の各分類群の専門家や各地の昆虫同好者にプロジェクトへの協力依頼を引き続き行い、協力者のネットワーク形成を進め、多数の方々から多くのサンプル提供を頂いた。2)サンプルの同定:採集したサンプルや協力者からご提供いただいたサンプルは、順次同定作業を進めている。3)DNAバーコード領域の塩基配列の決定:コガネムシ上科甲虫類は、標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)でのPCR効率が悪く、代替プライマーを用いた塩基配列の決定をクワガタムシ科とコガネムシ科を中心に進めた。4)サンプル情報およびDNA配列のデータベース登録:多田内修(九州大)を代表者とする科研費研究成果公開促進費(データベース)に基づく「昆虫学データベース」に「日本コガネムシ上科甲虫DNA barcodingデータベース(JScaBOL)」を一昨年に開設し、サンプル情報と塩基配列データのデータベース化を進めている。5)サンプル標本およびDNAの保存:九州大学大学院比較社会文化研究院のコレクションに収蔵するべく、DNA保存用の冷凍庫を設置した。6)学会発表および論文化による公表:甲虫学会において口頭発表を行い、進行状況の説明を行った。サンプルの収集は順調に進んでおり、同定作業も現時点では問題はない。サンプル情報およびDNA配列のデータベースづくりも進行している。PCRに一部問題があり、コガネムシ上科甲虫類はDNAバーコード領域の塩基配列を決定するために用いている標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)でのPCR増幅効率が悪く、増幅されない個体も多いため、塩基配列の決定が計画通りに進んでいない。代替プライマーの開発も行っているが、コガネムシ上科甲虫類に広範に用いることができる代替プライマーをまだ開発できておらず、計画の進行が遅れている。1)サンプルの収集:八重山諸島(石垣島・西表島)および本州の中部山岳地(長野県)において、各種採集トラップや任意採集によってサンプル採集調査を行い、これらの地方のコガネムシ上科甲虫類のサンプルを得ることができた。また、国際昆虫学会議(XXV International Congress of Entomology: USA)、日本甲虫学会、コガネムシ研究会の大会において、また昆虫同好者の集会等において、全国の各分類群の専門家や各地の昆虫同好者にプロジェクトへの協力依頼を継続して行い、更なる協力者のネットワーク形成を進め、多くのサンプル提供を頂いた。3)DNAバーコード領域の塩基配列の決定:クワガタムシ科とコガネムシ科を中心に、標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)および代替プライマーを用いた塩基配列の決定を進めた。

4)サンプル情報およびDNA配列のデータベース登録:「昆虫学データベース」の「日本コガネムシ上科甲虫DNA barcodingデータベース(JScaBOL)」への追加登録に向けて、サンプル情報と塩基配列データの整理を進めている。5)サンプル標本およびDNAの保存:九州大学大学院比較社会文化研究院のコレクションに収蔵するべく、DNA保存用の冷凍庫を設置した。6)学会発表および論文化による公表:国際昆虫学会議と日本甲虫学会においてポスター発表を行い、進行状況の説明を行った。現在所属しているセンターの教育・実習の業務が当初の予定よりも多忙となり、本計画の当初計画よりも進行が遅延している。多忙化した原因は同部所の教員補充の遅延と、更なる教員の転出が生じたことにより、担当業務が大幅に増加してしまったことによる。サンプルの収集はほぼ順調に進んでいるが、ビロウドコガネ類など一部の群の収集が遅れている。サンプル整理に手間取り、一部同定作業が遅延しているものもあるが、同定に問題は生じていない。サンプル情報およびDNA配列のデータベースづくりも進行している。PCRについては増幅に問題があり、コガネムシ上科甲虫類はDNAバーコード領域の塩基配列を決定するために用いている標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)でのPCR増幅効率が悪く、増幅されない個体も多い。そのため、代替のプライマーを用いて実験を進めているが、塩基配列の決定が計画通りに進んでいない。本研究は以下の6過程での進行に基づき計画している。それぞれの進行状況を記していく。1)サンプルの収集:延長年に当たる本年は採集調査を実施していない。これまでに形成したサンプル提供の協力体制から、協力依頼に応じていただいた昆虫同好者の方々より追加のサンプル提供を頂いた。2)サンプルの同定:これまでに収集したサンプルについて、糞虫類を中心に同定作業を進めた。3)DNAバーコード領域の塩基配列の決定:特にクワガタムシ科を中心に、標準プライマーセット(LCO1490とHCO2198)および代替プライマーを用いた塩基配列の決定を進めた。4)サンプル情報およびDNA配列のデータベース登録:DDBJへの登録に向けて塩基配列データについて、および「昆虫学データベース」の「日本産コガネムシ上科甲虫DNA barcodingデータベース(JScaBOL)」への追加登録に向けて、サンプル情報と塩基配列データについて整理を進めている。5)サンプル標本およびDNAの保存:九州大学大学院比較社会文化研究院に設置したDNA保存用の冷凍庫に、これまでのDNA抽出したDNAを保存している。その他のサンプル標本についても、九州大学大学院比較社会文化研究院の標本庫に保存をしている。6)学会発表および論文化による公表:クワガタムシ科を中心に日本昆虫学会大会(1題)、日本甲虫学会大会(2題)および九州・沖縄昆虫研究会・日本鱗翅学会九州支部合同大会(3題)において口頭およびポスター発表を行い、これまでの成果を報告した。また、得られた結果について、順次取りまとめの上、論文化を進めている。
ヒト羊水幹細胞による子宮炎症制御を介した早産/胎児炎症反応症候群治療薬の開発

世界では年1500万件の早産分娩が存在し、その主原因は子宮炎症である。子宮炎症は早産をきたすだけでなく、胎児炎症反応症候群(FIRS)も引き起こす。FIRS罹患児は胎児期に臓器障害をきたし出生後治療は困難を極める。現在、早産回避やFIRSへの治療法は無く新規治療法開発が期待されている。本研究では、早産・FIRSモデルを用い、羊水幹細胞(hAFS)が「子宮炎症の場」に遊走・生着し、抗炎症効果により早産予防やFIRS治療効果を発揮する、との仮説を検証する。本研究が成功すれば、患者羊水由来の幹細胞治療を用いた臨床応用が可能であり、母児にとって極めて安全な新規幹細胞治療法になると考える。
ナノシートの異方性を用いた光圧による巨大配向構造の誘起と機能性ナノシートの光操作

ナノシートは、厚さが1ナノメートル程度、広がり方向のサイズが数マイクロメートルに及ぶ二次元の異方性粒子である。ナノシートは、特異的な電子的性質を示し、大きな注目を集めている。応募者は、一枚のナノシートを光圧により自在に制御することに世界で初めて成功した。この成果は、ナノシートを高機能な光・電子デバイスに応用する上でボトルネックとなっていた「向き配置を自在に制御すること」を可能にする技術として大きな注目を集めている。本研究では、レーザーの光圧を利用し、多数のナノシートの向き・場所を時空間的に自在に制御できるようにする。さらに、機能性に優れたナノシートの光トラッピングにも挑む。
中央アジアにおける文化人類学的観点から見たヒト常在菌の遺伝子型調査

人の常在菌として口腔内に存在するカンジダ・アルビカンスについて,複数の遺伝子型解析により,民族毎(生活環境,人種,宗教を含めて)の特徴を見出す目的で,新疆ウイグル自治区(トルファン,イリ,カシュガル)とトルコ(アダナ)にて,健康人ボランティアからサンプル採取を行った.その結果,各地域毎に特徴的な遺伝子型と全ての地域において共通性の高い遺伝子型が認められたが,カシュガルでは明確な主要遺伝子型が確認できず,極めて多岐に渡っている事がわかった.また,アダナにおいては,genotype Dの出現頻度が非常に高く,これまでの一般的な報告とは異なっていた.人の常在菌として口腔内に存在するカンジダ・アルビカンスについて,複数の遺伝子型解析により,民族毎(生活環境,人種,宗教を含めて)の特徴を見出す目的で,新疆ウイグル自治区(トルファン,イリ,カシュガル)とトルコ(アダナ)にて,健康人ボランティアからサンプル採取を行った.その結果,各地域毎に特徴的な遺伝子型と全ての地域において共通性の高い遺伝子型が認められたが,カシュガルでは明確な主要遺伝子型が確認できず,極めて多岐に渡っている事がわかった.また,アダナにおいては,genotype Dの出現頻度が非常に高く,これまでの一般的な報告とは異なっていた.海外での調査を開始するにあたって,調査対象地域の地域情報の収集を分担者の堀江が担当し,資料調査を開始した.また,ISHAM2009(Satellite in Beijing,5月29日6月3日北京滞在)に出席し中国研究者との討論により,当地の情報収集を行った.また,北京大学医学部の李教授に本課題の試料収集についての協力を要請し,快諾を得た.調査の準備として,野外での試料採取法の検討を行い,必要装備品を準備した.分担者の神戸は,採取後のサンプル処理に関する方法の検討と比較対照として日本国内で分離された株について解析を開始した.当初の計画では9月中旬より10日間程度の試料採取旅行を計画していたが,7月に発生した現地暴動事件のため,渡航を見合わせた.その後,渡航再開の見通しが立たないために,北京大学医学部李教授を介して現地と連絡を取り,現地協力者(パリダアブリズ助教授)が現地で採取した菌株を北京大学まで運び,日本からも代表者(田中)と分担者の矢口が北京大学へ受け取りに行った.そこでは今後の試料採取計画等の討議も合わせて行った.一方,エイズ患者由来の株については,既にこちらの手元に株があったので,薬剤感受性試験を中心に解析を行った.その結果は,ウイグル人のエイズ患者由来のカンジダアルビカンスは,その他の地域の株よりフルコナゾール耐性株の出現頻度が高い傾向であった.その内容について,日本医真菌学会雑誌へ投稿し,掲載可能な内容であるとの結果を得ている.サンプル採集旅行として2010年8月27日9月4日中華人民共和国の新彊ウイグル自治区へ出かけた.現地では,新彊医科大学皮膚科学教室のホイ教授とパリダ助教授の手配により,トルファン地方でのサンプル採集を行った.健康人が多く集まる市場の一角で,ウイグル人を中心に口腔洗浄液を収集した.検体収集協力者の内訳は以下の通りであった.ウイグル人93名,漢民族4名の合計97名(男女比は男:5名,女:92名)で年齢層は5歳55歳であった.これらの検体から口腔内真菌が分離されたのは48検体で陽性率は49.5%,さらにC.albicansが分離されたのは22検体で陽性率は22.7%であった.その後,得られたコロニーの同定とgenotypingを行った.Non-albicans分離菌は,同定キットとD1D2の塩基配列より同定を確定した.今回得られたデータは,次年度以降に別地域で分離する菌株と比較して行く.一方で,既にこれまで収集してきた日本人の皮膚カンジダ症患者感染部位と非カンジダ症患者の口腔より分離したC.albicansのgenotypeの特徴をmicrosatelliteのフラグメント解析により調べた.その結果,常在部位由来C.albicansには4種類,感染部位由来C.albicansでは3種類のmajor genotypeが確認された.4種類の中で3種のgenotypeは同じで,これらは非感染者口腔内に常在菌として広く生息しているものと考えられた.残りの1つのC.albicansの感染力は他のgenotypeと比べて低いと考えられる.さらに,各個人当たりに生息するC.albicansのgenotypeは均一でなく,特に非カンジダ症患者の50%で,2種類以上のgenotypeが確認された.平成23年度のサンプル採集計画の立案を目的として,共同研究者であるアブリズ・パリダ助教授(新疆医科大学)を7月4日24日に招聘した.前年度の採集地および方法の評価と今年度の採集地に関する現地情報に付いて打ち合わせを行った.その結果前回(トルファン,ロップノール)とは異なる地域(北西部のイリ)で行う事を決定した.また,口腔洗浄液を収集するグループと生育コロニーを採取するグループの2班にわけて作業することとした.すなわち,分担者の矢口,神戸が先発隊として出発し(8月8日17日),後発隊として田中が出かけた(8月14日21日).新疆医科大学にてサンプルの引き継ぎを行い,後発隊の田中がサンプルを持ち帰った.

その後,千葉大学にて純化作業と同定作業を行い,遺伝子型の決定を行った.12月21日,22日には分担者の神戸が千葉大学にて追加の試験を行い,DNAとして名古屋大学へ持ち帰った.その後,神戸はマイクロサテライト法を用いた解析を行った.一方,採取したサンプルからは,カンジダ・アルビカンス以外の酵母菌も少なからず分離され,その同定を分担者の松澤が行った.検体提供者によっては,複数の菌種を口腔内に持つものもあり,その関連性に付いても検討して行く予定である.イリで採取されたサンプルは,153人の提供者のうち42人(27.5%)が陽性で,そのうち複数の遺伝子型を持つ場合が6人いた.陽性率については,前年度とほぼ同等であり,今後,他地域の調査結果と合わせて詳細に検討して行く.平成24年1月にトルコのイルキット教授(ククロバ大学医学部微生物学教室)に面会することができ,最終年度にトルコでのサンプル採取を共同で行うための打ち合わせを行った.最終年度として,トルコ共和国,アダナ市にてサンプルを収集した.サンプル採取には,アダナ市内にあるククロバ大学医学部のイルキット教授に協力いただいた.実験室の提供,サンプル採取の為の健康人ボランティア(歯腔学部学生)の招集,現地調達の物品の購入など事前の打ち合わせ通りに全て満足の行く状態で協力頂いた.ボランティアから集めたサンプルは,これまで同様に現地実験室にて分離し,千葉へ持ち帰った.千葉大学にてDNA抽出後,半量を名古屋大学へ送付し,千葉大学,名古屋大学でそれぞれ遺伝子解析を行い,新疆ウイグル自治区内で得られたサンプルと比較対照としての日本国内分離株からの結果を総合的に検討した.今回のトルコのサンプルは,ABC genotypeにおいて,これまでとは明らかな相違が見られた.すなわちCandida albicans類縁菌としてのC. dubliniensis (genotype D)の割合が非常に高かった.新疆各地では1株も見られず,また対照株としての日本産株(千葉県内)では93株中1株と言う頻度であるにもかかわらず,トルコの場合は,93株中20株にも及んだ(22%).過去の論文では,C. dubliniensisは,C. albicansよりも病原性が高いとか,HIV陽性患者に発症し易い等の指摘も見られたが,今回の健康人ボランティアからの高頻度の分離結果はそれらを否定するものであった.昨年度に引き続き,新疆ウイグル自治区内,西方地域であるカシュガルにてサンプルを採集した.これまでと同様に現地協力者(新疆医科大学恵教授,同アブリズ教授)の同行のもと,健康なウイグル人を中心にサンプル採取を行った.集めたサンプルは新疆医科大学の実験室にてカンジダ・アルビカンスを分離し,千葉大学へ持ち帰った.千葉大学にて,クロモアガーにて輸送中のコンタミの有無の確認も兼ねて再分離を行い,同定を確定した.遺伝子解析用に菌体を加熱処理後,半量を名古屋大学へ送り,千葉大学,名古屋大学にてそれぞれ各担当分の遺伝子解析を行った.期間末に結果の検討会を予定していたが,新疆医科大学のアブリズ教授の渡航手続きが間に合わず,次年度へ繰り越した.翌年度末の2月に研究報告会を千葉大学にて行った.5年計画のうち初年度は,新彊ウイグル自治区内での混乱により渡航自粛をしたために,集められたサンプルは少なかったが,その翌年からは各方面へ順調に採取旅行が行えている.また,最終年度のトルコでの採取に付いても現地協力者との連絡が取れるようになり,計画は概ね順調に進行している状況である.25年度が最終年度であるため、記入しない。
ノックアウトマウスを用いた網膜神経節細胞死の分子遺伝学的研究

1.眼球発育期に発現する新規遺伝子の解析昨年度にクローニングした眼球発育期に発現する新規遺伝子の解析を行った。まずその発現について出生前後のマウスの全眼球を用いてRT-PCRで解析した。この遺伝子は胎生後期より生後10日頃まで高い発現がみられ、その後生後14日目頃より発現が低下していた。さらに大人のマウスの眼球内では全く発現が見られなかった。またin situ hybridizationにおいても出生10日頃より眼内のあらゆる組織での発現が一様に低下していた。さらにこのマウスの遺伝子のヒトでの全塩基配列を決定した。これはヒトにおいても高い相同性を持ったまま保存されていた。またzincfinger domainが5'側にあり何らかの転写因子である可能性が示唆された。2.上記遺伝子のノックアウトマウスの作成昨年度、WT1遺伝子を用いたCreを含むターゲッティングベクター及ぴloxPを含む5'側の上記遺伝子のターゲッティングベクターはES細胞での相同組み替えはみられなかった。そのため上記遺伝子の通常のターゲッティングベクターを作成した。このベクターは、昨年度のベクターよりやや3'側のゲノムを用いて作成したが、ES細胞へのエレクトロポレーションにより、相同組み替えが起こらないことが確認された。以上よりこの遺伝子の変異をもつマウスとして、上記遺伝子の一部に変異をもつトランスジェンックマウスの作成が有用と考えられた。1.網膜分化を誘導する遺伝子のクローニングマウスcDNAライブラリーおよびRACEを用いて、網膜成長に関与する遺伝子の全塩基配列を決定した。この遺伝子は、798塩基対からなっており、266アミノ酸のタンパク質をコードしていることが示唆された。さらに未知の遺伝子であったため、NCBIに登録した。これは、northern hybridizationおよびin situ hybridizationの解析より、発達期の網膜に特異的に発現することが示唆された。さらに臓器別の発現の違いをnorthern hybridizationで解析したところ、この遺伝子は全臓器で発現がみられ、特に肺や精巣で高い発現があった。また、この配列の解析からヒト遺伝子の全塩基配列も決定した。2.上記遺伝子のノックアウトマウスの作成、検討上記網膜分化誘導遺伝子の遺伝子配列の解析より、この遺伝子は5つのエキソンから構成されていた。この遺伝子の上流のベクターでは、ES細胞へのエレクトロポレーションにより、相同組み替えがおこらないことが示唆された。WT1遺伝子を用いたCreを含むターゲッティングベクターでは、胚細胞レベルでは相同組み替えがおこらないことが示唆された。なお、5200塩基対および10000塩基対の2種類のベクターを作成したが、ともに相同組み替えはおこらず、組み替え効率において遺伝子配列の長さは関与しないことが示唆された。
異種シナプス間競合原理に基づく小脳神経回路発達の分子機構

プルキンエ細胞に対する平行線維と登上線維によるシナプス回路発達の過程は、回路発達研究に最も適したモデル系のひとつである。平行線維シナプスに選択的なグルタミン酸受容体δ2の遺伝子ノックアウトマウスの解析から、この分子が平行線維シナプス側の強化分子として機能し、その欠失により平行線維終末とプルキンエ細胞スパインの間のシナプス結合率が低下しフリースパインが生じることを見い出した(Kurihara et al., 1997, J. Neurosci. 17:9613-9623:下図参照)。今回、平行線維支配の弱まった環境において、もう一つの入力線維である登上線維支配がどのように変化していることを神経トレーサー標識、蛍光多重染色、電顕解析法などを用いて解析した。その結果、遠位樹状突起に出現したフリースパインを目がけて、登上線維支配の遠位拡大が生じ、これが周囲のプルキンエ細胞に及ぶことにより登上線維による多重支配が生じた(Hahimoto et al, 2001; J.Neurosci. 21:9701-9712; Ichikawa et al., 2002, J.Neurosci. 22:8487-8503)。これらの事実は、プルキンエ細胞のシナプス回路が異種入力線維間の競合を基盤として樹状突起に対するドメイン的支配が確立し、ここでδ2が平行線維シナプス側の強化分子機構として機能していることを示している。同時に、登上線維側にも強化分子機構が存在し、δ2と拮抗する形で平行線維支配の過度な近位化(拡大化)を防いでいる可能性をも示唆する。その拮抗分子機構が、P/Q型カルシウムチャネルがその役割を担っていることも明らかすることができた(Miyazaki et al., 2004, J. Neurosci. 24:1734-1743)。年度は、小脳プルキンエ細胞シナプス回路発達におけるグルタミン酸受容体デルタ2(GluRδ2)の機能的役割について神経解剖学的な検討を行って以下の成果を得ることができた。平行線維と登上線維という2種の興奮性入力が形成する小脳プルキンエ細胞のシナプス回路は、精緻な小脳運動制御系と運動学習の細胞基盤となる。平行線維シナプスには、(GluRδ2)と命名されたこのシナプスだけで機能する特異なグルタミン酸受容体が存在している。シナプス回路形成におけるこの分子機能を知る目的で、(GluRδ2)遺伝子欠失マウスを神経解剖学的に解析した。その結果、(GluRδ2)欠損により本来平行線維が支配すべき遠位樹状突起のシナプス数が半減し、シナプス結合を持たない裸の棘突起が多数出現した。さらに、この裸の棘突起をめがけて登上線維の支配領域が本来の近位樹状突起から遠位樹状突起にも拡大し、この登上線維の遠位化が周辺のプルキンエ細胞にも及ぶことにより、プルキンエ細胞対する多重支配が生じることが判明した。これらの所見から、(GluRδ2)は平行線維シナプスの強化分子としてその形成を促進し、登上線維支配の過度な遠位化を防ぐことにより単一支配を確立させる分子機構である結論した。この成果は、プルキンエ細胞のシナプス回路は異種入力間の競合的相互関係に立って形成されることを物語っており、登上線維シナプスの強化分子の存在を予言している。プルキンエ細胞は小脳における主要な情報処理ニューロンで、協調運動や運動学習機能において中心的役割を果たしている。

これまで、我々は、その処理基盤となる平行線維・プルキンエ細胞間シナプスに特異的なグルタミン酸受容体GluRδ2を欠失する遺伝子ノックアウトマウスの回路解析を行なってきた。その結果、GluRδ2の欠失により、遠位樹状突起における平行線維とプルキンエ細胞スパインとの間のシナプス形成率が低下して多数のフリースパインが生じ、プルキンエ細胞当たりの平行線維シナプスは約半分にまで減少した。さらに、登上線維の支配にも遠位拡大化が二次的に誘導され、これが周囲のプルキンエ細胞の遠位樹状突起にも波及することにより、遠位型の多重支配が生じることを明らかにした。これらの事実は、GluRδ2が平行線維側の強化分子として平行シナプス形成を強化し、登上線維支配の過度な遠位化を防ぐ分子機構であることを示している。本年度は、これと拮抗する登上線維側の強化分子機構として、登上線維活動によりカルシウム流入を誘導するP/Q型カルシウムチャネルα1Aに着目した。α1A欠損マウスでは、登上線維支配の近位退縮化が生じ、樹状突起の基部および細胞体に対する近位重複型の多重支配が生じた。一方、平行線維は本来の遠位樹状突起にとどまらず、近位樹状突起から細胞体にまで支配が拡大していた。以上の結果より、プルキンエ細胞のシナプス形成は異種入力線維間の激しい競合を基盤として発達することを示しており、これがそれぞれ入力線維に特異な強化分子機構に立脚していることを物語っている。NMDA型グルタミン酸受容体を介するカルシウム流入は、臨界期における体性感覚野や視覚野での競合的シナプス改築を制御していることが広く知られている。我々の研究成果は、競合的な神経活動に伴うカルシウム流入が小脳における機能的シナプス回路成熟にも重要な鍵となっていることを示している。プルキンエ細胞に対する平行線維と登上線維によるシナプス回路発達の過程は、回路発達研究に最も適したモデル系のひとつである。平行線維シナプスに選択的なグルタミン酸受容体δ2の遺伝子ノックアウトマウスの解析から、この分子が平行線維シナプス側の強化分子として機能し、その欠失により平行線維終末とプルキンエ細胞スパインの間のシナプス結合率が低下しフリースパインが生じることを見い出した(Kurihara et al.,1997,J.Neurosci.17:9613-9623:下図参照)。今回、平行線維支配の弱まった環境において、もう一つの入力線維である登上線維支配がどのように変化していることを神経トレーサー標識、蛍光多重染色、電顕解析法などを用いて解析した。その結果、遠位樹状突起に出現したフリースパインを目がけて、登上線維支配の遠位拡大が生じ、これが周囲のプルキンエ細胞に及ぶことにより登上線維による多重支配が生じた(Hahimoto et al.,2001;J.Neurosci.21:9701-9712;Ichikawa et al.,2002,J.Neurosci.22:8487-8503)。これらの事実は、プルキンエ細胞のシナプス回路が異種入力線維間の競合を基盤として樹状突起に対するドメイン的支配が確立し、ここでδ2が平行線維シナプス側の強化分子機構として機能していることを示している。同時に、登上線維側にも強化分子機構が存在し、δ2と拮抗する形で平行線維支配の過度な近位化(拡大化)を防いでいる可能性をも示唆する。その拮抗分子機構が、P/Q型カルシウムチャネルがその役割を担っていることも明らかすることができた(Miyazaki et al.,2004,J.Neurosci.24:1734-1743)。
失われた中生代材化石のタイプ標本のネオタイプ指定に関する研究

植物化石を研究する古植物学において、化石種の基準となるタイプ標本は命名法上極めて重要である。日本の中生代材化石は、小倉譲(東京帝国大学)、島倉巳三郎(東北帝国大学)、西田誠(千葉大学)、山崎純夫・綱田幸司(早稲田大学)らによって研究され、今までに約20属約70種が報告されている。これらの種のタイプ標本のほとんどは、研究者が所属していた大学博物館等に保管されている。しかしながら、山崎純夫・綱田幸司が新属・新種として報告した種のタイプ標本は、両氏が所属していた早稲田大学になく、紛失している。山崎・綱田両氏ともすでに他界され、標本の所在などを聞く事もできない。両氏が提唱した新属・新種は1属7種で、上部三畳系の成羽層群(岡山県)、美祢層群(山口県)、下部ジュラ系の来馬層群(富山・新潟・長野県)、上部ジュラ系下部白亜系の鳥巣層群(高知県)から報告されている。本研究では新たに採集した材化石の中から、山崎・綱田が新属・新種として報告した種のネオタイプ(新基準標本)を指定することを目的とした。今年度は、来馬層群(5/306/2)、鳥巣層群・成羽層群(7/2427)、美祢層群(8/35)の材化石産地の現地調査・材化石の採集を行った。今回の調査以前に採集したものを含めて、来馬層群から21点、成羽層群から16点、美祢層群から14点の新たな材化石を収集することができた。鳥巣層群からは新たな材化石は収集できなかった。これらの中から保存が比較的良いものなどを選定し、合計50枚の薄片プレパラート製作を業者に依頼した。それぞれの薄片を検鏡した結果、成羽層群から報告されたXenoxylon nariwaense Yamazaki etTsunadaのネオタイプ指定できる標本が見つかった。この内容に関して論文を執筆し、現在投稿準備中である。また、来馬層群からもまとまった材化石フロラが明らかになったので、現在論文の執筆準備中である。
ＤＶ担当支援者による二次加害防止のためのスーパービジョン体制

本研究では、「DV関連法に基づく担当支援者による被害者への二次加害防止策の構築」を目指し、支援者が所属する組織の方針や業務規定によるスーパービジョン体制がもたらす二次加害防止策の構成要素への影響性を考察することを目的とした。方法は、DV被害者支援を行っている母子生活支援施設職員を対象にフォーカスグループインタビューを実施し質的内容分析を行った。その結果、職員の立場の変化に伴い、支援者としての視点の変化も生じており、それが支援方法にも反映されているという様相が見えてきた。この様相をふまえて、二次加害防止を含む支援の質の向上を目指すためのスーパービジョンの留意点を示唆した。本研究は、「ドメスティック・バイオレンス関連法に基づく担当支援者による被害者への二次加害防止策の構築」をめざし、国内外の支援者の二次加害行動や現象に焦点を当て、その支援者が所属する組織の方針や業務規定によるスーパービジョン体制がもたらす二次加害防止策の構成要素への影響性を考察し、効果的二次加害防止策の構図を創成する。上記の中でも特に次年度の調査対象として、New York Asian Women's Centerでの情報収集がとても有益であったため、次年度にはヒアリング調査の実施目的で訪れる予定となっている。なお本ヒアリング調査実施に向けて、既に法政大学研究倫理審査の承認を得ている。本研究は、「ドメスティックバイオレンス関連法に基づく担当支援者による被害者への二次加害防止策の構築」をめざし、国内外の支援者の二次加害行動や現象に焦点を当て、その支援者が所属する組織の方針や業務規程によるスーパービジョン体制がもたらす二次加害防止策の構成要素への影響性を考察し、効果的に二次加害防止策の構図を創成することを目的としている。2015年度は、日本とアメリカのDV被害者支援組織に所属する支援者を対象にヒアリング調査を予定していた。日本においては、DV被害者を対象とした緊急一時保護を行っている母子生活支援施設3施設の職員19名を対象にヒアリング調査を実施した。その口述データを分析したところ、DV被害者支援の限界要素が結果的に二次加害発生に影響を及ぼしていることがわかってきた。同様にアメリカにおいても調査を実施する予定であったが、日本における調査にて収集した口述データの質的分析に時間を要していることに加え、日本における調査の分析結果をふまえてアメリカにおける調査に臨む必要があると判断したため、アメリカにおける調査は実施できていない。よって2016年度は遅れている分析作業を早急に進め、アメリカ(New York Asian Women's Center)における調査の実施を行っていく予定である。なお、本調査の実施に向けて、既に法政大学研究倫理審査(勤務先)、ルーテル学院大学研究倫理委員会(所属大学院)の承認を得ている。アメリカにおいての調査も実施する予定であったが、日本における調査にて収集した口述データの質的分析に時間を要していることに加え、日本における調査の分析結果をふまえてアメリカにおける調査に臨む必要があると判断したことにより、アメリカにおける調査が実施できていないため。本研究は「ドメスティック・バイオレンス関連法に基づく担当支援者による二次加害防止策の構築」をめざし、国内外の支援者の二次加害行動や現象に焦点を当て、その支援者が所属する組織の方針や業務規程によるスーパービジョン体制がもたらす二次加害防止策の構成要素への影響性を考察し、効果的な二次加害防止策の構図を創生することを目的としている。2015年度は、日本のDV被害者支援組織に所属する支援者を対象にヒアリング調査を実施した。具体的には、DV被害者を対象とした緊急一時保護を行っている母子生活支援施設3施設の職員19名を対象に、フォーカスグループインタビューを行い、分析をしたところ、DV被害者支援の限界要素が結果的に二次加害発生に影響を及ぼしているかもしれないという仮説が見えてきた。これをふまえて2016年度は、本調査データの分析をさらに進めることと、アメリカにおいても同様のヒアリング調査を実施予定としていた。2016年度は、2015年度に日本で実施したヒアリング調査にて収集したデータの分析をさらに進めたところ、DV被害者支援を行う支援者の二次加害の認識の様子と、DV担当支援者が行っているDV被害者家族への支援の質を高めるための要因の様相がわかってきたため、この結果の一部を投稿論文にて発表した。アメリカにおいても同様のヒアリング調査を実施予定であったが、所属大学において急な業務が発生してしまったために、未実施のままとなった。大学内の実習事務に関する学内外での調整作業等が発生し、その対応に約6か月間を要したために研究計画を遂行することが困難となった。このため、アメリカにおけるヒアリング調査は未実施となり、遅れてしまうこととなった。今年度は、DV被害者支援を行う支援者の実態に焦点を当て、特に支援者が提供する支援の質の向上の機会について把握するための調査データの分析を行った。具体的には、東京都・神奈川県のDV担当支援者を対象として郵送調査を実施してあったもののうち、量的データの分析に焦点を当てて分析と考察を行った。対象者は福祉事務所、女性相談センター、子ども家庭支援センターといった公的機関に所属するDV担当相談員352名を対象とした。具体的には支援者に求められている専門性を維持・向上させるための体制の現状を5件法で尋ね、さらにその現状を受けて支援者が得たいと考えているサポートについて記述式で尋ねた。その結果、これまではDV被害者支援における支援の質の向上に向けた課題として、所属組織内・外における研修の有無や、研修参加をサポートする組織体制や制度改正を指摘するものにとどまっていた。

しかし本調査結果から、DV担当支援者の支援の質の向上の機会の方策を探る上で、その種類に着目した際に、「外部研修」「内部研修」の他に、「同僚関係」や「上司・部下関係」といった支援者関係間においても実現可能な支援の質の向上の機会が潜在しているように思われ、すでに稼働している様子もわかってきた。一方で、DV担当支援者の実態として一人職場であったり、5年間の雇止めというルールが設けられている組織もあり、先に述べたような支援者関係を身近に持つことが困難であったり、持つことができてもすぐに別の組織へ移り新たに関係構築をせざるを得ない状況において勤務するDV担当支援者においては必ずしも有効とは言えず、この点が本調査の限界と言える。本研究では、「DV関連法に基づく担当支援者による被害者への二次加害防止策の構築」を目指し、支援者が所属する組織の方針や業務規定によるスーパービジョン体制がもたらす二次加害防止策の構成要素への影響性を考察することを目的とした。方法は、DV被害者支援を行っている母子生活支援施設職員を対象にフォーカスグループインタビューを実施し質的内容分析を行った。その結果、職員の立場の変化に伴い、支援者としての視点の変化も生じており、それが支援方法にも反映されているという様相が見えてきた。この様相をふまえて、二次加害防止を含む支援の質の向上を目指すためのスーパービジョンの留意点を示唆した。本調査であるヒアリング調査に向けて予備調査を実施し、研究倫理審査も通過しているが、海外の最新の先行研究レビューについては十分にできていないため。日本における調査にて収集した口述データの分析作業を早急に進め、アメリカにおける調査の実施を行っていく予定である。同時に、国内外の先行研究レビューも継続していく。日本においてすでに収集しているデータの分析・考察も未完了であること、そして、本研究の調査期間を考慮し、2017年度はすでに収集できているデータの分析・考察を丁寧に行うことにより、日本に焦点を当てた二次加害防止策の構図の創生を行う。また、その結果をまとめ、学会発表や論文投稿をしていく。家族福祉これまで収集した先行研究レビューの内容を土台としつつ海外の最新の先行研究レビューを十分に行い、本調査実施の折には過不足なく情報収集ができるよう最善を尽くす。2015年度に予定していたアメリカにおける調査の実施ができなかったため。大学内の実習事務に関する学内外での調整作業等が発生し、その対応に約6か月間を要したために研究計画を遂行することが困難となったため。予備調査にご協力いただく予定になっていた施設・機関の都合上、アメリカでの予備調査時期が早まったことにより、当初予定していた国内外の最新の文献取り寄せ・購入費予算を予備調査の旅費に充当したため。2016年度にアメリカにおける調査を、8月9月に予定して実施していく。
日・米・イスラエル・パレスチナにおけるウォーター・リテラシーに関する調査

シンポジウム、オープンフォーラム、ワークショップを通じて、水と教育に関する専門家のコミュニティが形成された。有効的に教育するための知識と方法に関して、建設的な討論はいまも継続中である。本研究では、水に関する基礎的知識(ウォーターリテラシー)評価ツールを開発し、それは様々な地域で妥当性の検討のために試験的に導入された。その結果、水に関する知識、スキル、そして開発しやすい性質の文化的で環境的に適切な側面は社会全体に認識されたといえる。本研究調査の二年目であり、アメリカ、ワシントン州のオリンピア、プルマン、スポカーン、シアトル、レドモンド;カナダの首都オタワや東京;又オンラインで:水門学者、教師、教育行政の方、政府機関の方、研究者、水利権法律専門家や、ジャーナリストとのインタビュー、学校訪問、施設見学等を行った。さらに日本にいる水活動家と会い十月に2日間にわたる国際ビデオカンファレンスによるウォーター・リテラシー・シンポジウムや二月に一日のウォーター・リテラシー・オープン・フォーラムを計画・実行した。十月のシンポジウムには水に関する知識関連の専門的な立場で、アメリカ、ワシントン州とインド、ニュー・デリー、ブンデルカンドからの講師が招かれた。オンライではイスラエル、テルアヴィヴ;パレスチナ、ベツレヘム;アメリカ、ワシントン、スポカーンやシンガポール、それに中国やフィリピンなどでの経験を持つ専門家も含めて日本から多数のスピーカーが参加し、英日・日英の通訳も提供された。二月の東京でのウォーター・リテラシー・オープン・フォーラムには約50人の教育者、学生、研究者やビジネスの方が参加した。両方のイベントで次世代が必要とする水の知識について多方面の立場から議論された。これらのイベントの一環として、「次世代に必要な水知識は何か」という点に関心のある人々のコミュニケーションツールとしてフェースブックを解説した。この萌芽的研究を進めていく中で、水知識自体にかかわる広範囲な視点を必要とすることがわかったため、この範囲のより良い理解を得ることに付加的に注意が払われた。したがって、水リテラシー検査ツールと民族学的調査は最終年度まで延期した。結果、水不足の経験に関する調査は、ワシントン州およびアラブ首長国連邦の教育者からのフィードバックに基づいて構築され、各地において地元の教師を含む、地域の環境条件に適合されるように設計された。過去の研究結果概要としては、共編のモノグラフが1月に刊行された。これは所属研究機関付置の教育研究所が和英両文にて刊行しているもので、オンラインと印刷物の双方の形態で読むことができるため、広く世間に向けて発信することが可能となっており、本研究課題に対する多くのスペシャリストたちと協議するきっかけにもつながっている。2014年3月29日にはオープンフォーラムを研究機関で開催し、約45名の参加があった。参加者たちは各専門分野に分かれて討議を行い、次世代に必要なウォーターリテラシーとはどういうものかにつき、様々な側面から語り合うよい機会となった。また、2014年6月にアメリカはモンタナ州で開催予定の「プロジェクトWET」の年次大会で本フォーラムの結果を発表する予定である。初年度は必要な装置の調達に加え、ウォーター・リテラシー(WL)問題の関連文献およびビデオ調査、研究現場の地域を訪問してのフィールド・ワーク、関連の学術行事への参加、WL関係の専門家人財の間でネットワーク作りなどを行った。文献およびビデオ調査では、1.水欠乏および汚染関連問題の図書館の文献、2.よく知られている水文学レポートのpdf (例えば、The Third World Water Report等)、3.国際比較学力テストの内容に基づくオンラインレポート(CivEd、TIMSS)、4.用水権、水融資および水の環境に関する約30-50のドキュメンタリーおよびビデオ、5.学術行事およびフィールド・ワークの間に集められたWL関連の文献、材料文化[material culture]を対象とした。関連学術行事としては、1.2011年11月沖縄県那覇市に開かれた日本人類学会の大会で研究法の問題に関して発表、2.2012年1月に東京で開かれたパル・システム主催の福島原発事故以降の水質や汚染問題の研修会に参加、3.2012年3月フランス・マルセーユで開かれた第6世界水フォーラムに参加。ネットワーク作り活動としては、1.訪問先及び学術行事で約50人の同僚と本研究についての相談をし、2.本研究について同僚との連絡を継続するために「水知識」についてのGoogleグループやメーリングリストを確立し、3.WL問題の展開しつつある理解と本研究の進展を報告するため、ウォーター・リテラシー・ブログを確立し、4.学内の研究所に連絡をとり、今年度の秋のテレビ会議のシンポジウムの計画を検討、5.テレビ会議のシンポジウムの共催の協力についての日本国際協力機構との交渉を開始した。社会科学・国際比較教育学地域間の水問題の範囲や、数多くの新しい参加者や地域からの研究への参加により、本調査への概念的な広がりが与えられているとともに、研究の網羅する問題が拡大している。一方、民族学調査を行うべき小学校での研究活動許可を得るのは、米国とイスラエルでは思ったよりも困難であったため、アクセスへの努力がまだ必要になる。喜ばしいことに、日本だけでなく、国際的にもウォーターリテラシーへの関心は広がっている。

しかし、本研究成果が同時に別公的研究資金(環境総合研究推進費)による2015年度以降の持続可能な地球開発という別への道も開いたこと、さらに、研究代表者の学内役職就任なども手伝ってウォーターリテラシーの研究そのものへの集中がまったくできなかった。しかしながら、両研究には引き続き細心の注意を払って進めていく所存であり、本研究については一年の研究期間延長を認められたところである。分析調査や学者、行政者、教育者との面談は大体順調に進みましたが、面談中に重要な書類を追加で受け取ることもあり、それも分析する必要が生じました。ネットワーク作りは、対話と協力のたたき台になっているブログにより大きな拡がりを見せ、現在300近いヒットになっています。シンポジウムが実用的な理由で特に遅れましたが2012年10月初旬に行うことになっています。最終年度であるので、所属研究機関での第二回国際シンポジウムを主催する。またイスラエル・パレスチナに研究出張し、引き続き民族学調査を実施する。さらに、研究成果公表としてのモノグラフも完成させたい。2014年度中に、イスラエル・パレスチナ・アメリカを再訪し、この地域のウォーターリテラシーに関するさらなるデータ収集を行う予定である、これらのデータは分析後様々な場で報告することになる(その中には、今後開催予定のウォーターリテラシーオープンフォーラムも含まれる)。また翻訳依頼による結果の転載も試みたい。残る2年間で次の課題に集中する予定です:環境的に相対性のあるWL知識、水の枯渇体験、教育配信を含むWL学習環境。そのため、民俗学調査手引を作成し、さまざまな研究地点で利用します。その準備のために、まずは水資源の専門家やWL関係の教育者とのビデオ会議によるシンポジウムが本年度の10月に開催されます。同会議の結果に基づいて知識人アンケートを実施・インターネットによる回収の後、その結果に基づいてWL学力検査ツールと水の枯渇体験アンケートを作成し、各地域で利用していく予定です。年度末のアメリカ出張が3月から4月をまたいでいたために精算が遅れ、海外出張旅費の未使用が20万円強残った。こちらについては旅費精算により全額使用する見込みである。別の資金配分があったことに加え学内役職就任で多忙を極め、予定していた研究がまったく進められなかった。残額はイスラエルとパレスチナへの海外出張によるデータ収集と、収集したデータの翻訳・分析の謝金に利用する予定である。後者は2014年の夏と2015年1月・2月に、また前者は2014年末から翌年初めにかけて行う。次年度の研究費は海外出張旅費(シンポジウム招聘費用を含む)がほとんどを占める。また今年度の未使用額はすべてシンポジウム開催費用であったため、10月に全額使用予定。
水平大規模渦の力学過程から見た海浜流理論の新展開

これまでの海浜流理論では,一方向規則波など比較的単純な波浪場を対象として,海浜流の形成メカニズムを,ラディエイション応力,水面勾配,底面摩擦力,水面混合作用の力学バランスとしてとらえる平衡海浜流の枠組みに基づいてきた.しかしながら,現地波浪を念頭におくと,多方向で不規則であることが波浪の大きな特徴であり,これからの海浜流研究にとって,現象の非定常性・非平衡性が海浜流場全体にどのような影響を与えるか(例えば,砕波帯周辺に発生する水平大規模渦の形成との関わりなど)を明らかにしていくことが重要であると考えられる.そこで本研究では,ラディエイション応力の時空間的変化を最も基本的な形で含んでいる二方向重合波浪場を対象として,非定常・非平衡な海浜流の基本的な性質を室内実験によって明らかにすることを試みた.ここで対象とする二方向重合波浪場では,重ね合わせる波の条件によって場に形成される波群の沿岸方向移動速度が変化するため,このような非定常現象の空間構造をどのように測定するかが大きな問題となる.そこで本研究では,造波装置前面の水位変動と砕波帯内各地点の流速とを同時計測することによって,すべての地点の流速データの位相関係を合わせる手法を開発し,波群によって引き起こされた海浜流系の空間平均像を抽出することに成功した.そして,このように抽出された海浜流の空間構造から,波群の節の部分に非常に強い沖向き流れ(rip current)が発生し,そのrip currentが比較的表層付近にジェットのように集中した強流帯を形成していることを明らかにした.さらに,このようなrip currentの時空間構造は,波群の沿岸方向移動速度によって大きく変化し,波群の移動速度が速くなるとrip currentは不明瞭となり,それに代わって蛇行流的なパターンが現れることを見いだした.このような波群の移動速度の変化にともなう流況の変化は,波群の移動速度と平均的な沿岸流速の相対関係が重要な支配因子となっており,両者がほぼ一致する場合に強いrip currentが形成されることがわかった.これまでの海浜流理論では,一方向規則波など比較的単純な波浪場を対象として,海浜流の形成メカニズムを,ラディエイション応力,水面勾配,底面摩擦力,水面混合作用の力学バランスとしてとらえる平衡海浜流の枠組みに基づいてきた.しかしながら,現地波浪を念頭におくと,多方向で不規則であることが波浪の大きな特徴であり,これからの海浜流研究にとって,現象の非定常性・非平衡性が海浜流場全体にどのような影響を与えるか(例えば,砕波帯周辺に発生する水平大規模渦の形成との関わりなど)を明らかにしていくことが重要であると考えられる.そこで本研究では,ラディエイション応力の時空間的変化を最も基本的な形で含んでいる二方向重合波浪場を対象として,非定常・非平衡な海浜流の基本的な性質を室内実験によって明らかにすることを試みた.ここで対象とする二方向重合波浪場では,重ね合わせる波の条件によって場に形成される波群の沿岸方向移動速度が変化するため,このような非定常現象の空間構造をどのように測定するかが大きな問題となる.そこで本研究では,造波装置前面の水位変動と砕波帯内各地点の流速とを同時計測することによって,すべての地点の流速データの位相関係を合わせる手法を開発し,波群によって引き起こされた海浜流系の空間平均像を抽出することに成功した.そして,このように抽出された海浜流の空間構造から,波群の節の部分に非常に強い沖向き流れ(rip current)が発生し,そのrip currentが比較的表層付近にジェットのように集中した強流帯を形成していることを明らかにした.さらに,このようなrip currentの時空間構造は,波群の沿岸方向移動速度によって大きく変化し,波群の移動速度が速くなるとrip currentは不明瞭となり,それに代わって蛇行流的なパターンが現れることを見いだした.このような波群の移動速度の変化にともなう流況の変化は,波群の移動速度と平均的な沿岸流速の相対関係が重要な支配因子となっており,両者がほぼ一致する場合に強いrip currentが形成されることがわかった.
複合酵素膜による医用バイオセンサーの高性能化の研究

バイオセンサーを医療分野へ応用する際に、測定対象となる血液中に共存する妨害物質の影響を低減して高選択的に目的物質を測定することは重要な課題である。本研究では、主に血液中の乳酸濃度を測定するバイオセンサーに焦点をしぼり、センサーによる測定に対する血液中のビタミンC(別名;アスコルビン酸)による妨害を低減ないしは完全に除去することを検討した。この目的を達成するために、乳酸酸化酵素(LO_X)とアスコルビン酸酸化酵素(AO_X)の2種類の酵素を電極上に同時に固定化した複合酵素膜を用いる方法を採用することとした。複合酵素膜を作製するために、アビジンとビオチン標識酵素を交互に固定化する交互累積膜法を実施した。この方法では、アビジンとビオチンとの強固な結合のため、これらのタンパク質がほぼ単分子層を形成して累積固定化されることが判明した。本法により作製した酵素薄膜の構造を重量法や分光法により明らかにすることができた。はじめに、LO_Xを電極上に同時に固定化して乳酸センサーとする際の、それぞれの酵素の固定化量と固定化順序の最適化を実施した。アスコルビン酸は電極により直接酸化され易いため、LO_Xだけを固定化したセンサーでは、約0.1mM(血中正常値)のアスコルビン酸が共存すると著しい妨害電流(約20%)が観察された。この結果より、LO_Xだけを固定化したセンサーでは血液中の乳酸濃度を正確に測定することは不可能であることが判明した。一方、AO_Xを同時に固定化するとアスコルビン酸がAO_Xにより分解されるため、乳酸濃度が0.1mM以上の範囲では0.1mMのAO_Xによりほとんど妨害を受けなかった。固定化するAO_Xの量はLO_Xの1/10程度で充分であったが、AO_Xの安定性が元来かなり低いことを考慮すると、LO_XとAO_Xを1:1として固定化するのが現実的であると判断される。また、電極上へのLO_XとAO_Xの固定化順序をかえて、種々の乳酸センサーを作製したが、性能に著しい差異は見られなかった。いずれの複合酵素膜で修飾した乳酸センサーでも、血液中の正常値の乳酸を正確に測定することが可能である。本研究では、酵素を固定化するに際してアビジン・ビオチン法を採用してきたが、アビジン以外にもストレブトアビジンや脱糖鎖アビジンも使用することができることが判明した。また、レクチンと糖鎖との特異結合を利用して、コンカナバリンAとマンノース標識酵素を用いてLO_XとAO_Xの複合酵素膜を作製することも可能であった。本法は、多様な複合酵素膜を作製するための汎用的方法として有用であることが明らかになった。