hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
誘電分光による生体内の結合水測定と生体の劣化予測に関する研究

本年度は,水分含有率40wt%までの低含水率のゼラチンゲルの誘電特性を測定して,水分活性や示差走査熱量分析の結果と比較した.その結果,特に水分率70wt%と30wt%で,凍結水分率と水分活性に特徴的な変化がみられた.この変化が昨年度に示唆された二種類の異なる緩和時間をもつ結合水の性質となんらかの対応がある可能性が示唆された.また,6GHzで結合水の誘電率がほぼ0になることから,対象となる生体の高周波の誘電率から自由水量を推定する方法を提案し,実際の自由水量(凍結水量)と比較することで,その妥当性を明らかにした.また,具体的な応用の一つとして,皮膚表層の50μm程度の深さの結合水の誘電分光を実現するセンサーを作製した.即ち,巾5μmから数10μmの間隔と巾をもつ,厚さ1μm以下の櫛形電極を作成し,接触面に対して垂直方向の測定範囲を検討した.さらに,高速測定と簡便性を実現するために同センサーに作動TDRプローブを接続した測定系を構築した.前者の結果より,垂直方向の測定範囲は電極巾と間隔の和の値にほぼ等しいことがわかったものの,作動TDRプローブとセンサーの接触抵抗や電極の静電容量が原因となる緩和時間が相当に長くなってしまった.以上より,本年度試作したセンサ形状で50μm程度の空間分解能は実現できることがわかったが,必要な周波数範囲の測定の為には,作動TDRプローブとセンサの電気的接続を改善し,電極の静電容量を低くする形状に変更する必要があることが示唆された.ただし,測定値からスペクトルを算出する解析については,作動TDR法でもプローブの周波数分解能程度まで精度よく測定するプログラムは確立した.本年度は,含水量70%以上のブタの皮膚由来のゼラチンゲルを対象として,100Hz6GHzの周波数帯の誘導スペクトルを測定した.その結果,同試料は,質量2/3の水分を結合水として保持できることや,通常の水の約10倍と100倍の時間で緩和する二種類の結合水が存在し,その存在比は自由水の量に依存しないこと等が同測定法で推定できた.このことは,同軸プローブによる誘電測定で,含水率のみならず結合水の詳しい情報が得られることを示唆している.さらに,試料について水分活性測定と示差走査熱量分析による不凍水量の測定を行い,不凍水は結合水と一致すること等がわかった.また,TDR法による誘電スペクトルの測定と解析方法を試み,同じゼラチンゲル試料について,FDR法と同等の結果が得られた.その結果,広範囲の周波数帯の誘電スペクトル測定が,極短時間でできる可能性が示された.次年度は,低含水率のゼラチンゲルの誘電特性を測定して,水分活性や示差走査熱量分析の結果と比較することで,緩和過程と凍結や蒸発の特性の関係を明らかにする予定である.本年度は,水分含有率40wt%までの低含水率のゼラチンゲルの誘電特性を測定して,水分活性や示差走査熱量分析の結果と比較した.その結果,特に水分率70wt%と30wt%で,凍結水分率と水分活性に特徴的な変化がみられた.この変化が昨年度に示唆された二種類の異なる緩和時間をもつ結合水の性質となんらかの対応がある可能性が示唆された.また,6GHzで結合水の誘電率がほぼ0になることから,対象となる生体の高周波の誘電率から自由水量を推定する方法を提案し,実際の自由水量(凍結水量)と比較することで,その妥当性を明らかにした.また,具体的な応用の一つとして,皮膚表層の50μm程度の深さの結合水の誘電分光を実現するセンサーを作製した.即ち,巾5μmから数10μmの間隔と巾をもつ,厚さ1μm以下の櫛形電極を作成し,接触面に対して垂直方向の測定範囲を検討した.さらに,高速測定と簡便性を実現するために同センサーに作動TDRプローブを接続した測定系を構築した.前者の結果より,垂直方向の測定範囲は電極巾と間隔の和の値にほぼ等しいことがわかったものの,作動TDRプローブとセンサーの接触抵抗や電極の静電容量が原因となる緩和時間が相当に長くなってしまった.以上より,本年度試作したセンサ形状で50μm程度の空間分解能は実現できることがわかったが,必要な周波数範囲の測定の為には,作動TDRプローブとセンサの電気的接続を改善し,電極の静電容量を低くする形状に変更する必要があることが示唆された.ただし,測定値からスペクトルを算出する解析については,作動TDR法でもプローブの周波数分解能程度まで精度よく測定するプログラムは確立した.
aPKC/PARシステムを介した新規の上皮細胞・後期極性制御機構の解析

1)我々は本研究開始前までに、PAR-1bが基底膜主成分lamininのreceptorであるutrophin/dystroglycan複合体に結合し、そのbasolateral膜への局在を制御していること、そしてそのことを介してlamininの細胞膜表面への集積を抑制していることを明らかとしていた。本研究期間においては、この知見を論文化するにあたって弱点として指摘を受けた諸点、(1)PAR-1bが直接laminiの細胞外への集積に影響を与えていないこと、(2)PAR-1bのキナーゼ活性の関与する具体的な分子機構、の二点を明らかにすべく努力した。(2)については、「PAR-1bがbDGの細胞質領域のセリン814をリン酸化し、この領域の構造を大きく変化させること」、「PAR-1bは、bDGの細胞質領域とUtrophinとの相互作用をキナーゼ活性依存的に制御すること」、さらには「PAR-1bがaDGのlaminin結合に必須な糖鎖修飾をも制御していること」を新たに発見した。残念ながら本研究成果の発表を期間中には実現できなかったが、そのための大きな進展を作ったとともに、今後の新たな展開のための数多くの知見を蓄積した。2)一方、上記研究を進める中で、PAR-1bが上皮細胞極性に働く機構は、この複合体を介したもの以外にも存在することが明らかとなってきた。よって、TAPタグを利用した新たなPAR-1b結合タンパク質を同定する方法を開発し、新たな結合タンパク質を同定する努力を開始した。その結果、上皮細胞内で非常に強くPAR-1bと結合し、興味深い特性を示す新たなタンパク質の同定に成功した。その点でも、本研究が目指した上皮細胞極性制御機構のさらなる解明に大きな礎を作ることが出来たといえる。Utr/DG複合体は、上皮細胞のbasolateral膜に局在し細胞外の基底膜形成に必須な役割をしているタンパク質群である。我々は、PAR-lbがこの複合体と相互作用し、その膜への局在を制御していること、そしてそのことを介して基底膜主成分であるlamininの細胞膜表面への集積を抑制していることを明らかとした。今年度においては、こうした知見の論文化にあたって弱点として指摘を受けた諸点、特に、(1)PAR-lbが直接、lamininの細胞外への集積に影響を与えていないこと、および、(2)PAR-lbのキナーゼ活性の関与する具体的な分子機構、の二点を明らかにすべく努力した。特に(2)に対しては、「PAR-lbがbDGの細胞質領域の特定のセリン残基をリン酸化し、この領域の構造を大きく変化させること」、および「PAR-lbは、bDGの細胞質領域とUtrophinとの相互作用をキナーゼ活性依存的に制御すること」を新たに発見した。現在、これらの知見を加えて、最終的に論文を完成させる努力を進めている。2)新たなPAR-l結合タンパク質を介した機構一方、Utr/DG複合体の研究を進める中で、PAR-lbが上皮細胞極性に働く機構は、この複合体を介したもの以外にも存在することが明らかとなってきた。よって、TAPタグを利用した新たなPAR-lb結合タンパク質を同定する方法を開発し、新たな結合タンパク質を同定する努力を開始した。その結果、これまで見つかってこなかったPAR-lb結合タンパク質候補が多数、質量分析によって同定され、その中には、アクチン重合制御因子や、細胞内小胞輸送系の因子が含まれていた。現在、これらの因子とPAR-lbとの結合を確認するとともに、その結合の生理的意味について研究を進めているところである。

(1)「PAR-1bがいかにUtrophin/DGの膜局在を制御するのか」という点に関しては、昨年度発見した「PAR-1bがDGの細胞質領域をリン酸化する」という機構、および、本年度新たに発見した「PAR-1bがUtrと直接結合しそれをリン酸化する」という機構各々について関与している可能性を精力的に検討した。しかし、外来性に導入したDGが正常に糖鎖修飾を受けないといった技術的困難を未だ克服するにいたらず、最終的な結論を得るに至っていない。(2)「apical極性を制御する他のシグナル系との関連」という点では、PAR-1b→Utr/DG系がRac1系とは独立していることを明確に示す結果を得ることができた。(3)「PAR-1bの新たな結合タンパク質の検索」という点では、アンカリングタンパク質の同定には至らなかったが、新たにPAR-1bが細胞内小胞輸送を制御する際に標的としていることが予想されるタンパク質の同定に成功した。PAR-1bはこのタンパク質を強くリン酸化することも明らかとなり、今後の研究の新しい展開を切り開く成果として高く評価できる。(4)「基質からのシグナルがいかに上皮極性を制御するのか」という点について網羅的に解析する計画については、上記(1)(3)の研究の展開との関連で着手するには至らなかった。
脳虚血後の白血球接着・血管外遊走に及ぼすプロポフォールの効果に関する研究

【目的】外傷、移植、虚血などに伴う脳の障害に白血球の炎症反応が関係している。これは多核白血球を除去すると脳障害が減ること、白血球と内皮との接着を阻害する処置、例えば抗ICAM抗体の投与で脳障害が減少することなどから推測される。一方静脈麻酔薬プロポフォールにはエンドトキシン血症における白血球血管内皮接着と遊走の阻害作用がある。またプロポフォールには、脳保護作用があり、その作用は単に脳代謝の低下だけでは説明できない。それ以外の機序は解明されていないが、プロポフォールの脳保護作用が白血球の接着抑制による可能性がある。そこで今回生体顕微鏡を使って脳虚血後の白血球の接着、血管外遊走を観察し、これらに及ぼすプロポフォールの影響を調べる目的で研究を行った。【方法】家兎をペントバルビタールで麻酔し、頭頂骨に窓を作り、直径20-30μmの軟膜静脈を生体顕微鏡で観察した。映像をカメラで撮影しコンピュータシステムに記録した。白血球の可視化のために蛍光物質(rhodamine 6G)を静脈内投与し蛍光生体顕微鏡を用い撮影記録した。1分間のローリング数、100μmあたりの白血球接着数、血管外遊走数を測定した。左右の総頸動脈に糸をかけ、閉塞、再灌流を可能にした。脳虚血は両総頚動脈の閉塞と脱血による平均血圧の低下(50mmHg)により行った。再灌流は総頸動脈の閉塞の解除と返血により行った。準備終了後、麻酔をイソフルラン1.5%(I群、n=8)、あるいはプロポフォール6mg/kg/hr(P群、n=8)に変更した。血圧、ガス分析、脳軟膜静脈の記録を行った後、脳虚血を1時間施行した。1時間後再灌流し測定項目を1時間毎測定した。【結果】血圧、ガス分析値、白血球の接着、血管外遊走ともに2群間に差はなかった。【考察】今回の実験結果からプロポフォールの脳保護作用は白血球の接着、遊走の抑制を介していないと推測される。1、動物および装置・2.5-3.0kgの家兎(Japanese White)をペントバルビタールで麻酔し、気管切開し動物用人工呼吸器で換気。麻酔はペントバルビタールとベクロニウムの持続静注で維持した。動脈と静脈にカテーテルを留置し動脈圧測定、血液ガス分析、薬液投与に用いた。・動物を腹臥位とし頭を固定し頭頂骨、硬膜を取り除きクラニアルウィンドウを作った。直径30μm前後の軟膜静脈を生体顕微鏡(オリンパス社製、既存)で観察した。映像をカメラシステム(キーエンス社製)で撮影しコンピュータシステム(既存)に記録した。2、白血球ローリング、接着、血管外遊走、血流速度の測定・白血球の可視化のために蛍光物質(rhodamine 6G)を静脈内投与し蛍光生体顕微鏡を用い撮影記録した。実験後、記録した映像を再生し1分間のローリング数、100μmあたりの白血球接着数、血管外遊走数を測定した。3、脳虚血の作成・左右の総頸動脈に糸をかけ、閉塞、再灌流を可能にする。

再灌流は総頸動脈の閉塞の解除と返血により行った。4、プロトコール・実験のための準備終了後、麻酔をイソフルラン1.5%(I群、n=8)、あるいはプロポフォール6mg/kg/hr(P群、n=8)に変更する。・血圧、ガス分析、脳軟膜静脈の記録を行った後、脳虚血を1時間施行、再灌流し測定項目を1時間毎測定する。・それぞれの値をI群、P群間で比較する。・以上現在予備実験の段階であり順次実験を進める予定である。
ナノバイオ応用のためのナノツールの創製と応用に関する研究

本研究課題では,「プローブ型ナノツールを用いた局所環境制御技術による単一細胞解析システム」の構築を目的としている.今年度は,先ず,これまでに構築したナノ・マイクロデュアルピペット局所環境制御システムを用いて,ある化学物質を含む溶液と含まない溶液の同時噴出による局所化学物質濃度の定常状態の制御を行った.更に,本手法をNa^+駆動型べん毛モータの回転制御に応用し,Na^+を含む溶液と含まない溶液を同時に噴出しながら独立に噴出速度を制御することで,べん毛モータの回転の定常状態を,回転トルクにして10^2[pN・nm]オーダで精密に制御可能であることを示した.これにより,ナノ・マイクロデュアルピペット局所環境制御システムは,単一細胞解析のみならず,電気化学・化学的な反応により駆動する生物分子モータの駆動力制御に有用なツールであることを実証した.また,近年マイクロ構造体の駆動力として用いられ始めているこれら生物分子モータに対して,駆動力自体を制御するという,より高度な制御を実現する可能性を示した意味も大きい.そこで,将来的にはドラッグデリバリーシステムなどの革新的な技術の開発が期待される,細菌駆動マイクロロボットに着目して更に研究を進め,マイクロ・ナノピペットを用いた局所環境制御技術によるバクテリア駆動マイクロ構造体の運動制御手法と,付着数・位置などを制御して細菌駆動マイクロ構造体を作製することでより精密な運動制御を行うために,光ピンセットを用いた細菌のアセンブリ手法を提案した.そして,実験的に,誘引物質を用いたバクテリア駆動マイクロ構造体の運動方向制御,付着数・位置を制御してのバクテリア駆動マイクロ構造体の作製,光ピンセットを用いて十分な強度で単一の菌体をマイクロ構造体上にアセンブリ可能なこと,などを示した.本研究課題では,「プローブ型ナノツールを用いた局所環境制御技術による単一細胞解析システム」の構築を最終目標としているが,プローブ型ナノツールの一つであるナノピペットによる局所環境制御において,ナノピペットからの噴出量や噴出方向に関する評価は不可欠である.そこで,これまでに我々が作製した「有機ナノチューブ(ONT)ナノピペット」と呼ぶナノピペットからの電気的泳動力による溶液噴出に関して,主泳働力を特定することを目的に実験的な解析を行った.主泳動力を特定することで,より現象に即した数学的モデルの構築と,噴出量の定量的な評価・計測に生かすことができる.結果的に今年度は,噴出の主要因の特定にまでは至らなかったものの,可能性を絞り込むことができた.現在,特定に向けて引き続き研究を進めている.次に,実際に応用的な実験を行うことで,最終目標到達までの課題をより明確化することができ,更には未完成ながら本システムの有用性を示すことにより医・理学分野の協力者及び助言を得,より研究を深めることができると考え,計画を前倒しして,現在我々が有する"ナノピペットを用いた局所環境制御システム"を細菌のべん毛を対象とした単一細胞解析に応用した.細菌の移動器官であるべん毛は,べん毛繊維をべん毛モータと呼ばれる分子機械が回転させている.このような分子機械であるべん毛の機能を詳細に解析することで,べん毛の回転原理の解明などが期待される.今年度は,2本のピペットを用いてNa^+を含んだ溶液とNa^+を含まない溶液の噴出を切り替えることにより,ダイナミックかつ繰り返しNa^+駆動型べん毛の回転速度を操作可能であるという結果を示した.また,印加電圧を変えてNa^+を含んだ溶液の噴出量を変化させることにより,Na^+駆動型べん毛の回転速度を定量的に制御できる可能性も示すことができた.本研究課題では,「プローブ型ナノツールを用いた局所環境制御技術による単一細胞解析システム」の構築を最終目的としている.今年度は,先ず,ナノ・マイクロデュアルピペットを用いた局所環境制御システムを構築し,Na^+を含む溶液・含まない溶液の噴出を切り替えることにより,局所的なNa^+濃度をより任意かつダイナミックに制御することを実現した.しかしながら,更に研究を進めていく過程で,本手法では,短期的には濃度をある程度定量的に制御出来ても,長期的には,局所的なNa^+の供給と拡散の平衡によりある単一の濃度しか生成できないため,不十分であることが明らかとなった.そこで次に,同システムを,両ピペットに印加する電圧のON/OFF及び電圧値を独立に制御可能なように拡張した.本拡張により,Na^+を含む溶液とNa^+を含まない溶液を同時に噴出しながら,印加電圧により独立に噴出速度を制御し,その差分により決まるNa^+濃度を利用することで,ピペットに注入する溶液のNa^+濃度を変更することなく,局所的なNa^+濃度を定量的かつ長時間安定的に制御することを可能とした.これにより,任意に生成したNa^+濃度の変化に対するべん毛モータの回転速度の動的な応答を観察することなどが可能となり,べん毛モータの回転原理の解明などに貢献するものと期待される.また,実際に,解析だけではなく,べん毛モータのナノアクチュエータとしての応用という観点から実験を行い,即応性高く繰り返し・詳細かつ長時間安定的にNa^+駆動型べん毛の回転数を操作可能であることを示した.すなわち,我々の構築したナノ・マイクロデュアルピペットによる局所環境制御システムは,単一細胞解析のみならず,電気化学・化学的なエネルギーにより駆動する生物分子モータの駆動力の制御手法を確立するのに有用なツールであることを実証することが出来た.

本研究課題では,「プローブ型ナノツールを用いた局所環境制御技術による単一細胞解析システム」の構築を目的としている.今年度は,先ず,これまでに構築したナノ・マイクロデュアルピペット局所環境制御システムを用いて,ある化学物質を含む溶液と含まない溶液の同時噴出による局所化学物質濃度の定常状態の制御を行った.更に,本手法をNa^+駆動型べん毛モータの回転制御に応用し,Na^+を含む溶液と含まない溶液を同時に噴出しながら独立に噴出速度を制御することで,べん毛モータの回転の定常状態を,回転トルクにして10^2[pN・nm]オーダで精密に制御可能であることを示した.これにより,ナノ・マイクロデュアルピペット局所環境制御システムは,単一細胞解析のみならず,電気化学・化学的な反応により駆動する生物分子モータの駆動力制御に有用なツールであることを実証した.また,近年マイクロ構造体の駆動力として用いられ始めているこれら生物分子モータに対して,駆動力自体を制御するという,より高度な制御を実現する可能性を示した意味も大きい.そこで,将来的にはドラッグデリバリーシステムなどの革新的な技術の開発が期待される,細菌駆動マイクロロボットに着目して更に研究を進め,マイクロ・ナノピペットを用いた局所環境制御技術によるバクテリア駆動マイクロ構造体の運動制御手法と,付着数・位置などを制御して細菌駆動マイクロ構造体を作製することでより精密な運動制御を行うために,光ピンセットを用いた細菌のアセンブリ手法を提案した.そして,実験的に,誘引物質を用いたバクテリア駆動マイクロ構造体の運動方向制御,付着数・位置を制御してのバクテリア駆動マイクロ構造体の作製,光ピンセットを用いて十分な強度で単一の菌体をマイクロ構造体上にアセンブリ可能なこと,などを示した.
85歳以上の超高齢者を対象とした簡便な認知機能スクリーニング検査法の開発

本課題では、85歳以上の超高齢者の認知機能の実態を明らかにし、さらに、超高齢者を対象とした簡便な認知機能スクリーニング検査法を開発することを目的とし、1健常高齢者のうち85歳以上の者(超高齢健常群)、2健常高齢者のうち65歳以上85歳未満の者(前期・後期高齢健常群)、3認知症患者のうち85歳以上の者(超高齢認知症群)の3群を対象に、各種認知機能検査や精神症状評価、日常生活動作などのデータを収集している。これまでに1超高齢健常群8名、2前期・後期高齢健常群43名、3超高齢認知症群13名、計64名のデータを収集している。平成30年度は、研究者本人が出産に伴う産前産後休暇及び育児休暇を取得したため、研究を一時中断した。ただし、研究協力者リストを整理し、育児休暇から復帰後、すぐに研究データ収集を行えるように準備を行った。平成30年5月から平成31年3月末までの11か月間、出産に伴う産前産後休暇及び育児休暇を取得したため、本研究に取り組む時間がきわめて制限され、予算の執行も中断したことから、当初の予定より研究データの収集が遅れた。産前産後の休暇又は育児休業の取得に伴う補助事業期間延長申請を行い、今年度前半は、平成30年度に予定していたデータ収集を引き続き進めると同時に、中間解析を行う。年度後半からは全てのデータをもとに解析を行い、成果報告としてまとめる。超高齢社会を迎えた我が国では85歳以上の超高齢者の人口比率が増加の一途をたどり、認知症有病率も急増している。認知症対策のひとつとして、人口増加比率の高い超高齢者層に注目し、超高齢者の認知機能を正確に把握・評価しながら、適切な医療、ケアにつなげていくことが今後の社会基盤を設計する上で重要である。しかしながら、現在一般的に利用されている認知機能スクリーニング検査では、85歳以上の超高齢者に対して信頼性、妥当性が十分に検討されていない。そこで、本研究課題では、85歳以上の超高齢者の認知機能の実態を明らかにし、さらに、簡便に認知症・非認知症を鑑別することが可能な認知機能スクリーニング検査法を開発することを目的とする。研究の実施計画として、以下の3群に対して各種認知機能検査(MMSE、CDT、ADAS-J cog、リバーミード行動記憶検査、言語流暢性課題)や精神症状評価(NPI、GDS)などのデータを収集する。対象者は1健常高齢者のうち85歳以上の高齢者(超高齢健常群)100名、275歳以上85歳未満の後期高齢者(後期高齢健常群)100名、3認知症患者のうち85歳以上の超高齢者(超高齢認知症群)100名の計300名程を予定している。本年度はシステマティックレビューを行い、研究プロトコールを立案した。また、京都府立医科大学医学倫理審査委員会に研究計画書を提出し、承認待ちの状況である。今後は、倫理審査委員会の承認を得次第、対象者をリクルートし、データ収集を行う。平成27年7月から平成28年3月末まで、出産に伴う産前産後休暇及び育児休暇を取得したため、本研究に取り組む時間がきわめて制限され、予算の執行も中断したことから、当初予定していた研究データの収集には至らなかった。認知症対策のひとつとして、人口増加比率の高い超高齢者層に注目し、超高齢者の認知機能を正確に把握・評価しながら、適切な医療、ケアにつなでていくことが今後の社会基盤を設計する上で重要である。しかしながら、現在一般的に利用されている認知機能スクリーニング検査では、85歳以上の超高齢者に対して、信頼性、妥当性が十分に検討されていない。そこで、本課題では、85歳以上の超高齢者の認知機能の実態を明らかにし、さらに、簡便に認知症・非認知症を鑑別することが可能な認知機能スクリーニング検査法を開発することを目的とする。対象者は、健常高齢者のうち85歳以上の高齢者(超高齢者健常群)、275歳以上85歳未満の後期高齢者(後期高齢健常群)、3認知症患者のうち85歳以上の超高齢者(超高齢者健常群)それぞれ100名、計300名を予定している。京都府立医科大学医学倫理審査委員会での承認が下り、平成28年度前半からデータ収集を開始する段階であったが、より効率よく進めるために他施設共同研究に変更することとし、他施設と資料の共有や保管方法などの検討を行った。現在は他施設共同研究への軽微な変更として、迅速審査の承認待ちの状況である。倫理審査委員会の承認を得次第、速やかに研究対象者のリクルートを行う。京都府立医科大学医学倫理審査委員会での承認が下り、28年度前半からデータ収集を開始する段階であったが、データ収集をより効率よく進めるために他施設共同研究に変更することとし、本学の研究開発・質管理向上統合センターへの研究相談、他施設と資料の共有や保管方法などの検討を行った。

所属機関の倫理委員会において迅速審査で対応可能なため速やかにデータ収集に進むことができると考えていたが、予想していた以上に時間がかかっており、現在も承認待ちの状況であり、研究対象者のリクルートの開始がやや遅れている。本課題では、85歳以上の超高齢者の認知機能の実態を明らかにし、さらに、簡便に認知症・非認知症を鑑別することが可能な認知機能スクリーニング検査法を開発することを目的とし、1健常高齢者のうち85歳以上の者(超高齢健常群)、2健常高齢者のうち65歳以上85歳未満の者(前期・後期高齢健常群)、3認知症患者のうち85歳以上の者(超高齢認知症群)の3群を対象に、各種認知機能検査(MMSE、CDT、ADAS-J cog,、リバーミード行動記憶検査、言語流暢性検査)や精神症状評価(GDS、孤独感尺度)、日常生活動作(ADL、IADL、JST式活動能力指標)などのデータを収集している。平成29年度は、データ収集を迅速化させるために、協力機関の追加として申請していた軽微な変更点に関して、京都府立医科大学医学倫理審査委員会での承認を受け、データ収集を再開した。協力機関からのデータ提供も含めると、1超高齢健常群8名、2前期・後期高齢健常群43名、3超高齢認知症群13名、計64名のデータを収集した。また、85歳以上の超高齢者における認知機能の特徴について先行研究をレビューし、総説にまとめて論文化した。レビューした結果では、超高齢者では、加齢の影響によって作業速度や近時記憶が低下しやすい一方、言語機能は保たれやすいという見解でおおむね一致している。また、記憶の中でも単語再認は比較的保たれやすく、超高齢者でも手がかりの利用による効果は維持されやすいと考えられる。ただし、超高齢者は検査施行時の気分状態などによって認知機能検査の結果が変動しやすいことも指摘されており、認知機能に影響を与える要因についても十分配慮する必要が考えられる。85歳以上の超高齢健常群のリクルートに難渋している。平成29年度後半からは健常高齢ボランティアのリクルートを加速させるために、京都市内で実施責任者及び実施担当者らが行う市民対象の認知症講義を開催した際に研究協力の呼びかけを行い、徐々に協力の申し込みが増えていることから、次年度も引き続き呼びかけを続ける予定である。本課題では、85歳以上の超高齢者の認知機能の実態を明らかにし、さらに、超高齢者を対象とした簡便な認知機能スクリーニング検査法を開発することを目的とし、1健常高齢者のうち85歳以上の者(超高齢健常群)、2健常高齢者のうち65歳以上85歳未満の者(前期・後期高齢健常群)、3認知症患者のうち85歳以上の者(超高齢認知症群)の3群を対象に、各種認知機能検査や精神症状評価、日常生活動作などのデータを収集している。これまでに1超高齢健常群8名、2前期・後期高齢健常群43名、3超高齢認知症群13名、計64名のデータを収集している。平成30年度は、研究者本人が出産に伴う産前産後休暇及び育児休暇を取得したため、研究を一時中断した。ただし、研究協力者リストを整理し、育児休暇から復帰後、すぐに研究データ収集を行えるように準備を行った。平成30年5月から平成31年3月末までの11か月間、出産に伴う産前産後休暇及び育児休暇を取得したため、本研究に取り組む時間がきわめて制限され、予算の執行も中断したことから、当初の予定より研究データの収集が遅れた。申請中の倫理審査が許可され次第、対象者のリクルートを進める。健常高齢者のボランティアには、京都市内で行う市民対象の認知症講義などでの研究協力の呼びかけを行う予定である。28年度は1超高齢健常群30名、2後期高齢健常群40名、3超高齢認知症群30名、計100名を予定している。申請中の倫理審査が承認され次第、対象者のリクルートを速やかに進める。
表面プラズモン応用による高効率近接場プローブヘッドの研究

記録密度を上げる目的で,記録ビットを小さくするほどデーターデーター転送レートが低下する。この改善のために,1996年に面発光レーザー(VCSEL)の二次元アレイを用いた超並列光ヘッドを提案し,2001年にVCSEL用のエピウェーハにて10μm素子を縦横100個ずつ二次元に同時形成できた(全素子が2mm×2mm)が,各レーザー素子からの出力はせいぜい0.1mWであった。超並列近接場光ヘッドでは8μmの出力窓から発するレーザーを100nm以下の超微小開口を通して近接場光に変換することである。平成16年度までは100nm開口で1μWの出力が得られた。平成17年度は,開口を30nmにすること,その開口からの近接場出力を記録に必要な10μWに増大させるパワーアップが研究課題である。研究室で開発した三次元のFDTD(時間領域差分法)解析により,開口を穿孔する材料に金,銀,アルミ,銅などの薄膜金属を選び,薄膜金属表面に幅が10nmで高さが30nm,ピッチが118nmのナノ構造の回折格子を形成することで近接場光エンハンスメント現象が起こることがわかった。直線偏光波が金属薄膜に近づくと,s偏光波(横波)の電界強度に応じて薄膜を構成する金属原子の電子雲が表面に偏り,表面プラズモン密度波(縦波)が生じる。光波はGaP結晶の中から30nm開口のある金薄膜へ進む。光波とプラズモン波の分散関係を調べると,光波は線形であるのに対して,プラズモン波は非線形である。光波とプラズモン波との位相整合のためには回折格子のグレーティングベクトルを利用するのがベストである。すなわち,逆格子はエネルギーのデメンジョンなので,物質中の光波・プラズモン波の波数分散を逆格子によるエネルギー保存則を利用して整合させることが可能であることがわかった。近接場光を効率よく引き出すために,(1)VCSEL出力部に高性能反射防止膜をコートした半導体(GaP)マイクロレンズを設置し,開口付近にVCSELレーザービームを集光させる研究と(2)80nm厚の金薄膜に幅30nm,高さ30nm,ピッチ120nmの二次元回折格子アレイとを作製した。しかしながら,18年度に実験すべきことが残った。NSOM(走査近接場顕微鏡)技術による近接場光のスループット測定技術の確立とプラズモンの回折格子による共鳴実験のための入射波長微調整技術である。また30nmで無く,10幅のナノ加工グレーティング技術も今後の課題である。研究完成まで,あと1-2年であろう。面発光レーザー(垂直共振器面発光半導体レーザー)は二次元の面アレイが容易に可能である。

そこで直径10μm程度の100×100面アレイを用いて合計1万個の超並列光ヘッドをもつ近接場光を応用した新光ディスク方式を1996年に提案し1997年以来研究を続けている。この研究を実用化させるためには通常はきわめて効率の低い近接場光発生効率を3桁以上向上させることである。その一方法として,本年度は,表面プラズモン・ポラリトンによる増強効果を応用することにした。通常は直径10nmのナノ金属粒子による光の電界成分の共鳴効果を利用するのであるが、われわれの研究は二次元アレイ化がポイントであるので,ナノ粒子ではなく直径30nmの超微小開口からエバネッセント光(近接場光)の増強効果を,ナノ断面構造を持つグレーティングによって可能かどうかを試みている。すなわち,30nmのナノ開口から取り出す近接場光の効率向上を目指す。本年度の研究成果は次の二点である。(1)半導体結晶側に幅10nmで高さが30nm、ピッチが118nmのグレーティング構造を付加させた金薄膜をコートし,半導体側からレーザー光を照射すると金属面に誘起されたマイナスの電子とプラスの電荷の波(表面プラズモン・ポラリトン波)が共鳴増強されることが三次元FDTD(時間領域差分法)のシミュレーションの結果わかった(国際会議,信学会で発表,JJAP論文投稿)。(2)上の理論値を実験的に確かめるために,シリコンウェーハ上に酸化膜で構成した二次元導波路を形成し外部からレーザー光を入射させた。ただし,導波路の上に金のグリッドをコート加工した部分と単なる平面導波路のみの部分とを同時に励振できるように二次元導波路全面に亘ってレーザービームが入射できるように構成してある。今回の金のグリッドは理論値で得た最適値ではない幅やピッチであるが,結果的に表面プラズモン・ポラリトンの発生による光増強効果を観察できた。(ドイツで開催された国際会議MOC04および米国でのOptics East2004で発表した。)記録密度を上げる目的で,記録ビットを小さくするほどデーターデーター転送レートが低下する。この改善のために,1996年に面発光レーザー(VCSEL)の二次元アレイを用いた超並列光ヘッドを提案し,2001年にVCSEL用のエピウェーハにて10μm素子を縦横100個ずつ二次元に同時形成できた(全素子が2mm×2mm)が,各レーザー素子からの出力はせいぜい0.1mWであった。超並列近接場光ヘッドでは8μmの出力窓から発するレーザーを100nm以下の超微小開口を通して近接場光に変換することである。平成16年度までは100nm開口で1μWの出力が得られた。平成17年度は,開口を30nmにすること,その開口からの近接場出力を記録に必要な10μWに増大させるパワーアップが研究課題である。研究室で開発した三次元のFDTD(時間領域差分法)解析により,開口を穿孔する材料に金,銀,アルミ,銅などの薄膜金属を選び,薄膜金属表面に幅が10nmで高さが30nm,ピッチが118nmのナノ構造の回折格子を形成することで近接場光エンハンスメント現象が起こることがわかった。直線偏光波が金属薄膜に近づくと,偏光波(横波)電界強度に応じて薄膜を構成する金属原子の電子雲が表面に偏り,表面プラズモン密度波(縦波)が生じる。光波はGaP結晶の中から30nm開口のある金薄膜へ進む。光波とプラズモン波の分散関係を調べると,光波は線形であるのに対して,プラズモン波は非線形である。光波とプラズモン波との位相整合のためには回折格子のグレーティングベクトルを利用するのがベストである。
ディプレッション凝集を利用した高度排水処理システム実現のための前処理技術の開発

液中に分散した微粒子を全て塊状に凝集させる技術及びその指針を確立した。高分子電解質及び電解質無機塩を適量、被処理液に添加して撹拌することで、一次粒子を残すことなく、塊状凝集体を形成させることに成功した。特に実際の排水処理等で問題となってくる懸濁物質が非常に希薄なサスペンションに対しても、効果的に塊状凝集体を形成させることができたため、今後実プロセスへの適用に向けて十分な可能性を示すことができたと思われる。アルミナ(平均粒子径0.5μm)をモデル粒子として用いて、高分子電解質(ポリカルボン酸アンモニウム)を添加して、スラリー中で粒子を塊状に凝集させることを試みた。高分子電解質の添加量と粒子濃度を系統的に変化させてスラリー調製を行い、調製したスラリーの重力沈降挙動を比較することによって、塊状粒子形成に及ぼす影響を検討した。その結果、粒子濃度に関しては極めて薄い5ppmまで、適当な高分子電解質添加量を選択することによって、粒子を塊状に造粒可能であることが明らかとなった。さらに、重力沈降時に非常にクリアーな清澄層が確認されたため、造粒されずに溶液中に残存する一次粒子はないことがわかった。高分子電解質添加量に関しては、添加量が比較的少ない領域では、溶液中の高分子電解質濃度よりも単位粒子質量あたりの高分子電解質添加量が重要な制御因子となるが、塊状凝集が発生する比較的高分子電解質添加量が多い領域では、溶液中の高分子電解質濃度がある臨界値を下回ると、粒子を塊状凝集させることが難しくなることが明らかとなった。スラリー調製時の攪拌条件の影響について、攪拌時間や攪拌速度が塊状凝集体形成に及ぼす影響についても検討したが、攪拌条件については明確な影響が見られなかった。塊状凝集体を形成しているスラリーについては、重力沈降後に形成された堆積層の充填率が比較的高く、堆積層は傾けると瞬時に流れ出すほどの高い流動性を持っていることが明らかとなった。凝集剤は、沈降濃縮においては粒子の沈降速度を増し、ろ過においては微粒子による目詰まりを防ぐこととケークのろ過抵抗を下げることができるが、その一方で、ケークのろ過抵抗が下がるということは、ケークの含水率が高くなり、固液分離効率が低くなることを意味する。ケークの高い含水率は、ろ過に続く運搬・乾燥工程に大きな負荷、エネルギーをかけることにため、プロセスの省エネルギー化のためには、ケーク含水率を少しでも下げることが切望されている。また、近年では環境への関心の高まりから、回収した粒子の再資源化が望まれるプロセスがあるが、添加する凝集剤の成分が悪影響を及ぼすために再資源化が難しいということも見られる。そこで高分子電解質のディプレッション効果を利用して、液中に分散した微粒子を全て塊状に凝集させる技術及びその指針を確立した。高分子電解質もしくは価数の低い電解質無機塩を適量添加して、スラリーを撹拌することで、液中の一次粒子を残すことなく塊状に凝集させることが可能で、かつこのように調製したスラリーであれば濃縮後の堆積物の濃度がこれまでの凝集剤を加えた場合よりも高く、かつ濃縮物が流動性を保持していることがわかった。
円の自己同相写像の成す有限生成群の剛性について

本研究では,幾何学的群論の手法を用い,単位円の向きを保つ自己同相写像の成す群について,その有限生成無限部分群の構造を研究する.特に,このような群のうち, Serreの性質FHと呼ばれる群作用の固定点性質を持つものの探索を目的とする.円の自己同相写像の成す有限生成群のうち, Thompson群と呼ばれる有限表示無限単純群は,広く研究されている.本研究ではThompson群とその一般化が性質FHを弱めた性質を持つことに注目し,円の自己同相写像の成す有限生成群の中でThompson群のある種の一般化として得られるものについて,性質FH及びそれに関連する性質を研究する.本研究では,幾何学的群論の手法を用い,単位円の向きを保つ自己同相写像の成す群について,その有限生成無限部分群の構造を研究する.特に,このような群のうち, Serreの性質FHと呼ばれる群作用の固定点性質を持つものの探索を目的とする.円の自己同相写像の成す有限生成群のうち, Thompson群と呼ばれる有限表示無限単純群は,広く研究されている.本研究ではThompson群とその一般化が性質FHを弱めた性質を持つことに注目し,円の自己同相写像の成す有限生成群の中でThompson群のある種の一般化として得られるものについて,性質FH及びそれに関連する性質を研究する.
炭素クラスタ-の振動構造決定と成長過程の解明

以下の3点について実験を行った。1.しきい電子スペクトル測定を炭素および珪素クラスタ-を対象として行った。クラスタ-の負イオンは、レ-ザ-蒸発法によって生成し、パルス電場による飛行時間法によりサイズ分離を行った。光脱離実験は特定の負イオンに同期した色素レ-ザ-を照射して光電子放出を起こさせて行った。脱離によって生じた光電子のうちしきい電子(ゼロ運動エネルギ-電子)を遅延パルス電場により選別して測定しながら色素レ-ザ-の波長を走査して、しきい電子スペクトルを測定した。まずSi原子について測定を行い、^3P状態の3つのJレベルを完全に分離することができた。分解能は20cm^<-1>であった。クラスタ-についてはSi4量体を測定し、振動構造がはっきりと分離した形でスペクトルを得た。2.偶数個の炭素原子で構成される炭素クラスタ-(偶数クラスタ-)は直鎖構造であれば電子状態がスピン3重項、環状であれば1重項である。そこで6極磁石を利用して3重項の4、6量体(=直鎖クラスタ-)を検出した。またC_4,C_6クラスタ-中に収束できない成分、つまり1重項の環状クラスタ-が存在していることも示唆する結果を得た。3.レ-ザ-蒸発で直接生成した正負クラスタ-イオンを同時にイオントラップに閉じ込めて反応実験を行った。反対荷電を持つ粒子の同時閉じ込めの成功は初めてのことである。酸素の存在下でクラスタ-の反応性をサイズの関数として測定した結果、正イオンが比較的容易に酸化されるのに対して、負イオンクラスタ-の反応性は非常に低いことが分かった。特に奇数クラスタ-の酸化物はほとんど観測されなかった。
精密有機化学と抗体工学を駆使した環境負荷物質のイムノアッセイ技術の確立

食の安心・安全の確保と信頼しうる食の提供のため免疫的化学測定法を利用した低分子残留農薬分析法を確立した。付随して新規ルテニウム触媒の開発にも成功し様々なカルベン移動反応に展開できた。現在用いられている農薬の簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する分子センサーをELISA法やイムノクロマトキット化に寄与することができた。すなわち低分子農薬に触媒的精密合成技術を用いてリンカーを導入し、蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成した。得られた抗体の分析精度をppbレベルの分析精度を持つ低分子残留農薬分析法を確立した。本研究は、イムノアッセイを利用した低分子残留農薬分析法を確立し、実質的に現在用いられているすべての農薬の簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する分子センサーを提供することを目的とする。具体的には、下記(1)および(2)の成果を得た。(1)触媒合成:ビス(オキサゾリニル)フェニルパラジウム(Phebox-Pd)およびオキサゾリニルフェニルルテニウム(Pheox-Ru)を合成し、触媒活性を同時に検討するためカウンターアニオンを変化させた系(BF4-, PF6-, OAc等)や配位子の芳香族環上置換基を電子供与基や電子吸引基を芳香族環に有する系を併せて合成した。さらにPhebox-Ru系触媒では芳香族環にカルボニル基やヘテロ原子が直結した農薬系でハロゲンを利用することなく直接的にオルトメタレーションを経由してカルボニル基末端を有する側鎖を導入する検討を行う。加えて新規有機金属化合物はNMRやX線構造解析によってその錯体構造を精査できた。(2)ハプテン合成:上記で得られるPhebox-またはPheox-Pd系またはPheox-Ru触媒、さらに最近開発に成功した新規合成法を含むマクロ多孔性架橋教重合体触媒を用いて殺菌剤農薬とのヘックー溝呂木反応やカルベン挿入反応などによりハプテング群を合成した。カルベンヘックー溝呂木反応の場合は、触媒はPhebox-Pd触媒以外にも古典的な既知パラジウム系を同時に精査し効率のよい系を見出した。その結果、ハプテン群の合成手法の確立に成功し、クロロタロニル、ボスカリド、イソキサチオン、イミダクロプリド、フェンバレレート2種(COOMe, COOH)、アセタミプリド、アゾキシストロビン、クロルフェナピル等、総計15種類合成した。本研究は、精密有機合成化学と抗体工学との先端融合技術を用いることより免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した低分子残留農薬分析法を確立し、実質的に現在用いられているすべての農薬の簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する分子センサーを提供することを目的とする。すなわち低分子農薬に触媒的精密合成技術を用いてリンカーを導入し、巨大蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成する。得られる抗体の分析精度をppbレベルの分析精度を目標として環境負荷物質としての低分子残留農薬分析法の確立をする。その結果、8種ネオニコチノイド系農薬のイムノクロマトキット試作品、アフラトキシンB1、メパニピリム、チアメトキサム、エマメクチン、ニテンピラム、アセタミプリド、イソプロチオラン、ピリダリル、ミクロブタニルハプテン等9種類のハプテン合成に基づく標識試薬作製、メパニピリムに対するモノクローナル抗体(間接競合ELISAによるIC50値: 1.4 ng/mL)等の作製に成功した。またカビ毒(DON, NIV)用ハプテンを合成した。クロチアニジン、ジノテフラン、ボスカリドのキット化を行った。イムノクロマトキットの試作品を提供できる段階に達した。これらの成果は、国内会議5件、国際会議5件、学術論文3報で報告した。免疫的化学測定法(イムノアッセイ)を利用した低分子残留農薬分析法を確立し、農薬の簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する分子センサーを提供することを目的としている。ハプテン群合成に必要なリンカー導入に関するリン酸エステル基導入や酢酸ユニット導入触媒の開発に成功し、標的用農薬ハプテン4種、イムノクロマト法によるキット化試作品作製、ネオニコチノイド系用キットの完成などを含めて国内会議5件、国際会議5件、学術論文3報で報告したこと、また新規農薬抗体の作製およびそのイムノクロマトグラフィーにセットしキット化に成功し,実証試験の段階に到達していることから当初の予定の目標とした抗体作製を段階を大きく超えて進展している。すなわち(1)低分子農薬に触媒的精密合成技術を用いてリンカーを導入し、(2)巨大蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成する。(3)得られる抗体の分析精度をppbレベルの分析精度を目標として環境負荷物質としての低分子残留農薬分析法の確立をする。上記(1)ー(3)のプロセスにより農薬ハプテン合成ータンパクとの融合ーマウス免疫ー抗体作成ー

農薬分子センサー化およびキット化を行う。一方、これまで環境負荷物質に対して精密有機合成技術でリンカーの導入を検討しているが、逆に高分子量の担持用タンパクにリンカーの導入を検討する。すなわち、タンパクの部分構造であるアミノ基やカルボキシル残基にリンカーを導入し(主に縮合反応を用いる)、続いて標的農薬官能基群とのカップリングを試みる。農薬ハプテン分子の全合成や合成的修飾よりも実験的に遥かに簡便で、免疫用のタンパクとの標的農薬ハプテンとの融合体が容易に提供できるため迅速に抗体作成が完成する可能性があるため精査する。その結果、精密有機合成学を駆使した方法に於いて標的農薬の10種類において抗体作製とそのキット化に成功した。特に、ネオニコチノイド系農薬5種のモノクロナール抗体を利用した簡易キットの試作に成功し、連携企業における実証試験を企画している。食の安心・安全の確保と信頼しうる食の提供のため免疫的化学測定法を利用した低分子残留農薬分析法を確立した。付随して新規ルテニウム触媒の開発にも成功し様々なカルベン移動反応に展開できた。現在用いられている農薬の簡便、廉価、迅速、高精度、自在な測定環境などの特徴を有する分子センサーをELISA法やイムノクロマトキット化に寄与することができた。すなわち低分子農薬に触媒的精密合成技術を用いてリンカーを導入し、蛋白と結合させてマウス免疫することで分子センサーとしての標的農薬特異的なモノクロナール抗体を作成した。得られた抗体の分析精度をppbレベルの分析精度を持つ低分子残留農薬分析法を確立した。本研究の最終目的、すなわち残留農薬検査キットの開発を達成するための第一段階は、精密有機合成化学を基盤としたハプテン群の全合成であり、第二段階は抗体作作成である。ハプテン合成はELISA法による標的農薬の選択的定性・定量を達成するために、リンカー導入分子の設計が極めて重要である。実用に耐えうる感度(ppbレベル)の抗体が得られるまでハプテン合成の最適化を行うと同時に、適切な抗体が得られたときはと直ちにキット化し実用化する。平成26年度目標ではハプテン合成のためのリンカー導入技術の確立と、精密有機合成化学を基盤としたハプテン群の全合成を行うことを目標とした結果、いずれも目標を達成し、なおかつ15種類の農薬ハプテンの合成に成功した。以上の理由で平成26年生初期目標を上回っていると判断される。具体的には、ハプテン群を触媒的反応を利用して合成した。即ち、オキサゾリニルフェニルパラジウム(Phebox- or Pheox-Pd)がハロゲン化アリールとアリールボロン酸との反応において触媒作用し効率的にアリール/アリーカップリング生成物が生成する。この触媒を用い、ヘックー溝呂木反応や薗頭反応に応用が可能であることを見出し、触媒効率も同様のレベルであることを確認した。従ってPhebox-あるいはPheox-Pd触媒によって様々なアリールハロゲン構造を有する殺菌剤、殺虫剤などのアクリル系カルボン酸リンカーを導入できた。さらに、触媒的炭素ー炭素結合生成反応においてジアゾエステル類の触媒的カルベントランスファー反応においても優れたルテニウム系触媒を見出した。二重結合や活性水素を室温においてさえも高効率で進行し相当するシクロプロパン化合物や、炭素ーヘテロ原子結合を含む生成物を与える。
正常上皮細胞と変異細胞の境界で特異的に機能する細胞膜タンパク質の探索

昨年度に行った透過電子顕微鏡解析から、Ras変異細胞は正常細胞と比較して細胞膜の波打ち度合いおよび突起の頻度が高いことが明らかになった。そこで、今年度は、このようなRas変異細胞の細胞自律的な形態制御に関与するBARファミリータンパク質の探索および機能解析を行った。例えば、5種類のBARタンパク質をそれぞれ過剰発現する細胞株を用いた解析や免疫染色による検討を行った結果、細胞膜の陥入形成に関与するFBP17および突起形成に関与するSRGAP2を同定した。これまでに、蛍光顕微鏡レベルで、FBP17とSRGAP2は共にRas変異細胞において、RasV12の発現依存的に細胞間接着部位に集積し、同様の挙動を示すことが明らかになった。現在、これらのBARタンパク質の細胞膜における局在性や機能の使い分けの可能性を免疫電顕により検討している。さらに、Ras変異細胞においてFBP17もしくはSRGAP2をノックダウンした細胞株を樹立した。これらのノックダウン細胞の細胞膜の微細構造を観察した結果、ノックダウンしていないRas変異細胞と比較して、細胞突起および細胞間隙が劇的に減少していた。また、Ras変異細胞側でのFBP17もしくはSRGAP2のノックダウンにより、変異細胞の正常細胞層からの逸脱が抑制された。この時、ノックダウン細胞に隣接する正常細胞に、細胞競合マーカーであるフィラミンの集積も見られなくなった。以上の結果から、FBP17およびSRGAP2によるRas変異細胞の細胞自律的な形態変化が、正常細胞と変異細胞の相互認識に関与する可能性が考えられた。今年度は、ノックダウン細胞株などを用いた蛍光・電子顕微鏡解析により、Ras変異細胞の細胞自律的な形態制御に関与するFBP17とSRGAP2を同定することに成功した。今後、正常細胞と変異細胞の相互認識に関する分子・形態的メカニズムが明らかになる可能性が高いと考えられるため。これまでに、細胞膜の波打ち度合いに関する電子顕微鏡解析から、正常細胞と変異細胞の境界において、正常細胞側の細胞膜の波打ち度合いが、単独培養より増加する結果が得られている。今後は、正常細胞において、この形態変化を制御する因子の同定を試みる。ノックダウン細胞株などを用いた蛍光・電子顕微鏡解析を用いる予定である。小腸の上皮細胞層にRas変異細胞の出現をモザイク状に誘導できる細胞競合モデルマウスを用いて、ex vivoもしくはin vivoにおけるFBP17およびSRGAP2の機能解析を試みる。これらのBARタンパク質ががん細胞と正常上皮細胞を識別するための生体マーカーとなり得る可能性を探る。正常細胞とRas変異細胞の混合培養時特異的に、細胞境界に特徴的な局在を示し、かつ変異細胞の正常細胞層からの排除を制御する細胞膜タンパク質や細胞膜関連タンパク質の探索と、蛍光免疫染色および電子顕微鏡解析などにより候補の絞り込みを進めた。まず、SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acid in Cell culture)法により、単独培養時と比較して混合培養時に1.4倍以上の変化が見られた9種類の細胞膜タンパク質について検討を行った。その結果、正常細胞と変異細胞の境界を構成する、正常細胞側の細胞膜で経時的にTIRAPの局在の増減が見られることが明らかになった。一方、研究代表者が確立した、正常細胞と変異細胞の混合培養を用いた光顕-電顕相関観察法を用いて、正常-変異細胞境界、変異-変異細胞境界、そして単独培養における正常もしくは変異細胞境界を構成する細胞膜について、波打ち度合いや突起の頻度に関する詳細な電子顕微鏡解析を行った。その結果、正常細胞と変異細胞の単独培養を比較すると、変異細胞の境界を構成する細胞膜の方が、波打ち度合いと突起の頻度が大きいことが明らかになった。また、正常-変異細胞境界の正常細胞側、および正常細胞に囲まれた変異細胞間の細胞膜では、波打ち度合いと突起の頻度が、単独培養と比較して共に増加することも明らかになった。そこで、細胞膜の突出や陥入構造の形成に関与する6種類のBARファミリータンパク質に注目した。蛍光免疫染色や蛍光標識した候補タンパク質を発現する細胞株を用いた局在解析、候補タンパク質のノックダウン細胞株を用いた検討の結果、FBP17が、正常細胞層からの変異細胞の排除における細胞膜の微細形態を制御している可能性が推測された。今年度はSILAC法もしくは詳細な電子顕微鏡解析により、変異細胞の正常上皮細胞層からの逸脱に関与する有力な候補タンパク質(TIRAPおよびFBP17)が同定され、今後、さらに分子・形態的メカニズムが明らかになる可能性が高いため。

また、Ras変異細胞側でのFBP17もしくはSRGAP2のノックダウンにより、変異細胞の正常細胞層からの逸脱が抑制された。この時、ノックダウン細胞に隣接する正常細胞に、細胞競合マーカーであるフィラミンの集積も見られなくなった。以上の結果から、FBP17およびSRGAP2によるRas変異細胞の細胞自律的な形態変化が、正常細胞と変異細胞の相互認識に関与する可能性が考えられた。今年度は、ノックダウン細胞株などを用いた蛍光・電子顕微鏡解析により、Ras変異細胞の細胞自律的な形態制御に関与するFBP17とSRGAP2を同定することに成功した。今後、正常細胞と変異細胞の相互認識に関する分子・形態的メカニズムが明らかになる可能性が高いと考えられるため。候補タンパク質の分子メカニズムを追究するため、ルシフェラーゼをレポーターとした遺伝子発現解析や免疫沈降法により、候補タンパク質の機能が既知の経路もしくはEDAC特有の新規経路により制御される可能性を明らかにする。このようにして培養細胞系で絞り込まれた有力な候補タンパク質については、小腸の上皮細胞層にRas変異細胞の出現をモザイク状に誘導できる細胞競合モデルマウスを用いて、ex vivoもしくはin vivoにおける機能解析も進めることにより、候補タンパク質が超初期がんと正常上皮細胞を識別するための生体マーカーとなり得る可能性を提示する。これまでに、細胞膜の波打ち度合いに関する電子顕微鏡解析から、正常細胞と変異細胞の境界において、正常細胞側の細胞膜の波打ち度合いが、単独培養より増加する結果が得られている。今後は、正常細胞において、この形態変化を制御する因子の同定を試みる。ノックダウン細胞株などを用いた蛍光・電子顕微鏡解析を用いる予定である。小腸の上皮細胞層にRas変異細胞の出現をモザイク状に誘導できる細胞競合モデルマウスを用いて、ex vivoもしくはin vivoにおけるFBP17およびSRGAP2の機能解析を試みる。これらのBARタンパク質ががん細胞と正常上皮細胞を識別するための生体マーカーとなり得る可能性を探る。今年度に購入予定だった、電子顕微鏡用器具などの高額な物品の納品が大幅に遅れたため、研究費の使用計画にも遅れが生じた。来年度は、今年度に遅延した分の使用計画と併せて研究費を使う予定である。細胞培養に使用する器具や培地、抗体なども購入する予定である。電子顕微鏡用器具および試薬等の高額な物品を今年度に購入予定だったが、納品が大幅に遅れたため、研究費の使用計画にも遅れが生じた。