hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光色素を用いた非侵襲的色素浸透試験法による接着性修復の辺縁封鎖性検討

両方で使用可能な、半導体レーザーによる近赤外線光を利用した非破壊観察装置の応用法を考案した。この蛍光色素と近赤外線レーザーの組合せは、眼科領域や消化器内科領域などでは既に臨床検査法として応用が始まっているが、歯科領域では初の試みである。当該新規手法を応用することによって、例えばヒト抜去歯上のエナメル質微小亀裂の存在と、それに対するレジンインプレグネーションテクニックの有効性について、非侵襲的検討法を実施することが可能となった。近年の歯科臨床において、咬耗症やエナメル質微小亀裂などが増加しているが、それに対して歯質接着性修復が頻用されており、その有効性検証は重要となっている。本研究は、蛍光色素を用いた非侵襲的な新規色素浸透試験法の構築を主眼としたものである。その結果、至適蛍光色素と、in vivo/in vitro両方で使用可能な半導体レーザーによる近赤外線光を利用した非破壊観察装置の応用法を考案した。これは、眼科領域などでは既に応用されているが、歯科領域では初の試みである。これにより、例えばエナメル質微小亀裂と、それに対するレジンインプレグネーションの有効性について、非侵襲的に検討することが可能となった。本研究課題のメインとなる蛍光色素試薬について、医科領域で活用されている蛍光試薬の中から絞り込んだ蛍光色素試薬を本研究で応用する際に、至適濃度などの実際の使用上の仔細な留意点を確立させることを急務とする。さらに、非侵襲レーザー観察装置とのマッチング、具体的な撮影観察方法についてノウハウを構築することを進めていく予定である。また、本観察法がある程度確立を得た後は接着性修復への検討のみならず、齲蝕など硬組織自体の検査法などへの幅広い応用を副次的に検討することも考慮している。今年度は研究計画の最終年度にあたり、接着修復の辺縁封鎖性検討を実施する。さらに、今後の研究内容の発展を意図して、エナメル質微小亀裂の検査などへの本検討手法の適用も視野に入れた研究を行う。また、得られた結果に関しては、国際学会発表および論文投稿を実施していく予定である。接着歯科学蛍光色素試薬選定に際して、候補とした蛍光色素のうち数種類は購入をせずに製造者からサンプルを入手して予備実験に臨み、使用法を確認したためが第一点である。加えて、高額な実験機器が偶然にも製造者の価格設定が安価に変更されたことと、設置費用が無料になったための二点である。物品費に関しては、平成28年度予定よりも購入消耗品が若干小量であったために、差額が生じていた。旅費に関しては、平成28年度予定通りの執行であった。人件費・謝金に関しては従来より計上されていない。その他として、論文執筆に関しての英文校正費用が未だ支払いがないために、差額が生じているものである。本研究課題のメインとなる蛍光色素試薬について、医科領域で活用されている蛍光試薬の中から絞り込んだ蛍光色素試薬を本研究で応用する歳に、至適濃度などの実際の使用上の仔細な留意点を確立させることを急務と考えている。この医科用試薬の中には、微少量でも非常に高価な製品が多いために、本研究における使用量からはある程度の必要経費が予想され、これに充当させる予定である。
微小共振器レーザーの発振スペクトルに関する研究

マイクロキャビティレーザーの出力スペクトルが、発振閾値以上でシャウロウ・タウンズ則に従わず、広いスペクトル幅を維持することを見いだした。したがって、マイクロキャビティレーザーの一次コヒーレンスは不良であるが、二次のコヒーレンスすなわち強度相関の程度を知ることを次の課題と定めた。平板形マイクロキャビティレーザーにおいては、その有効モード半径よりポンプ光ビーム半径が小さければ単一モード動作が、大きければ複数モード動作が起こると予想される。レーザーの強度揺らぎに対する標準的なフォッカー・プランク方程式が適用できるものと仮定すると、単一モードの閾以下ではボース・アインシュタイン的強度分布、閾以上ではポアソン的分布、複数モードでは閾の上下にかかわらずガウス的分布が得られる筈である。Q値の差により有効モード半径の異なる二つの平板形マイクロキャビティを用い、また励起光ビームの半径を様々に変えることにより、単一モード実験的に動作、複数モード動作の予想される状況を設定し、上記の出力強度分布が得られることを確認した。実験には発光媒体としてローダミン6Gを用い、励起光源にはパルス幅0.9nsの窒素レーザー励起色素レーザーを用いた。入出力特性上の各点において、一定入力で100200ショットの出力を測定し、出力の頻度分布を得た。標準的なフォッカー・プランク方程式による予測と半定量的な一致を見た。閾の定義がマイクロキャビティレーザーでは問題になっているが、閾近傍の頻度分布においては予測と異なる点が見られた。なお出力揺らぎの規格化分散は一般にモード数および平均出力とともに減少する傾向が見られた。
効率的不斉場を与えるY-P-Y型不斉配位子の設計と不斉反応開発

Y-P-Y型の骨格を持つ配位子において、配位子に不斉炭素を導入することで、二つのYの内の一方を選択的に配位させ、可能な二つのジアステレオマー錯体の一方を選択的に生じさせ得る。これによりリンがキラルとなり効率的不斉場が構築される。本研究は、効率的不斉場を構築するためにY-P-Y型の基本骨格を持ち金属への選択的配位でリンがキラルとなる不斉配位子を設計し、それを用いた効率的不斉触媒反応系を開発することを目的とする。Y-P-Y型配位子として光学活性フェネチルアミンユニットを持つN-P-N型不斉ホスフィンジアミン配位子1((S,S)-R-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2:R=Ph,^iPr,Et等)およびビスオキサゾリニルホスフィン配位子2を合成し、これを用いて各種遷移金属への選択的配位を検討した。ホスフィンジアミン配位子およびビスオキサゾリニルホスフィン配位子は共にロジウム(I)、パラジウム(II)、白金(II)への配位に際して一方のジアステレオマー錯体を選択的に生成させることができた。さらにホスフィンジアミン配位子において不斉窒素を持つものを合成し、金属への選択的配位により不斉なリンの構築と共に不斉窒素の固定が可能になることを示した。従来選択性の低いアクリル酸誘導体の不斉水素化ではロジウム(I)-(S,S)-^iPr-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2錯体を用いることで95%eeの高い選択性を得ている。パラジウム触媒による不斉アリルアルキル化では配位子により生成物の絶対配置が逆転し、配位子中の置換基によってN-ユニットの選択的配位が異なり生じるP-chiralityが異なることが示された。Y-P-Y型の骨格を持つ配位子において、配位子に不斉炭素を導入することで、二つのYの内の一方を選択的に配位させ、可能な二つのジアステレオマ-錯体の一方を選択的に生じさせ得る。Y-P-Y型配位子として光学活性フェネチルアミンユニットを持つN-P-N型不斉ホスフィンジアミン配位子((S,S)-R-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2)(R=Ph,^iPr,Et)を開発し、これを用いて各種遷移金属への選択的配位を検討した。ロジウム(I)、パラジウム(II)、白金(II)においてはアミノユニットの選択的配位が起こり、特に白金(II)においてはほぼ100%の選択性で一方のジアステレオマ-錯体を生成させることができた。この不斉水素化ではリンの不斉場に加え配位子のフリーのアミノユニットと基質のカルボキシル基との静電的相互作用が重要であることを明らかにした。

パラジウム(II)-(S,S)-Ph-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2錯体を用いたエナンチオ場選択的アリルアルキル化でも90%eeの不斉選択性を得ている。さらに白金(II)錯体を用いたアルケンのヒドロシリル化でも高い不斉選択性を得た。今後さらに新規N-P-N型配位子を合成し選択的配位により得られる不斉場の評価を行う。Y-P-Y型の骨格を持つ配位子において、配位子に不斉炭素を導入することで、二つのYの内の一方を選択的に配位させ、可能な二つのジアステレオマー錯体の一方を選択的に生じさせ得る。これによりリンがキラルとなり効率的不斉場が構築される。本研究は、効率的不斉場を構築するためにY-P-Y型の基本骨格を持ち金属への選択的配位でリンがキラルとなる不斉配位子を設計し、それを用いた効率的不斉触媒反応系を開発することを目的とする。Y-P-Y型配位子として光学活性フェネチルアミンユニットを持つN-P-N型不斉ホスフィンジアミン配位子((S,S)-R-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2)(R=Ph,^iPr,Et)およびビスオキサゾリルホスフイン配位子を合成し、これを用いて各種遷移金属への選択的配位を検討した。ホスフィンジアミン配位子およびビスオキサゾリルホスフイン配位子は共にロジウム(I)の、パラジウム(II)、白金(II)への配位に際して90%以上の選択性で一方のジアステレオマー錯体を生成させることができた。さらにホスフィンジアミン配位子において不斉窒素を持つものを合成し、金属への選択的配位により不斉なリンの構築と共に不斉窒素の固定が可能になることを示した。従来選択性の低いアクリル酸誘導体の不斉水素化ではロジウム(I)-(S,S)-^iPr-P[o-(Me_2N(Me)CH)C_6H_4]_2錯体を用いることで95%eeの高い選択性を得ている。この不斉水素化ではリンの不斉場に加え配位子のフリーのアミノユニットと基質のカルボキシル基との静電的相互作用が重要であると共にminor成分の反応が不斉選択性を支配する可能性が示された。
我が国と欧米の中絶医療実態の比較研究

オランダ中絶医協会前会長オルハ・ルーバー医師へのインタビューにより、オランダの中絶医療・ケアの実際が、以下の点から明らかとなった。(1)性教育の徹底、(2)中絶前後のカウンセリング、(3)安全な中絶手技の導入、(4)看護師へのメンタルケア、(5)妊娠中絶費用の無料化オランダでの妊娠中絶は、我が国のようにオンデマンドで行われておらず、中絶に至るまでの女性はトータルにケアされ、尊重されるシステムが整備されていた。こうしたシステムは、我が国では未だ整えられてはおらず、早急な導入が必要であると考えられた。研究課題「我が国と欧米の中絶医療実態の比較研究」の目的としては、(1)欧米の優れた中絶医療・ケアの辞令調査、(2)そうした医療・ケア導入の背景の学術的調査・研究、(3)我が国のリプロダクティブ・ヘルスの改善のための中絶医療変革とその方向性呈示であったが、平成25年度としては「オランダ」訪問を企画し、平成26年3月13日には、人工妊娠中絶に特化した「Abortion Clonic( Rutgershuis-Oostクリニック)」のDr. Olga Loeberと看護師へのインタビューに加え施設内見学、翌14日にはDr. Evert Ketting宅を訪問し、インタビューを行なった。Dr. Olga Loeberはオランダ中絶医協会の前会長であり、Dr. Evert Kettingは前ナイメーヘン大学公衆衛生学部教授で、オランダを中心にヨーロッパの中絶・避妊・性行動について40年近く研究をされており「WHO」や「ユニセフ」のコンサルタントとして現在も活躍されているその道の権威であることから、両氏へのインタビューは、本研究課題の目的の(1)、(2)遂行の上で、大変有意義なものであった。平成25年度の研究実施計画として、国内の中絶医療と中絶ケア実施に対する調査・研究のため、国内産科医療者のインタビュー、インターネット調査、研究会開催を予定していたが、主担当者の水野の産休のため、行なわれていない。1.ミーティング:第一回目は、平成24年5月19日、神奈川県立保健福祉大学において開かれ、海外調査予定国であるオランダの地理関係やオランダの2005年妊娠中絶法評価報告書(http://www.ngva.net/downloads/WAZ_evaluatie_Definitieve_webversie_b.pdf)の情報を交換した。第二回目は、平成24年9月6日、金沢大学医薬保健学域保健学類11号館1219教室で開かれ、オランダにおける中絶の提供状況についての知識の共有と、中絶を求める女性の調査(翻訳資料)の検討を行い、加えて、オランダの調査日程変更の検討が行なわれた。第三回目は、平成24年10月27日、金沢大学医薬保健学域保健学類5号館5209教室で開かれ、水野の妊娠・出産と産後休暇予定をふまえ、オランダ訪問計画を再考するとともに、国内調査(アンケート)の原案作成が話し合われた。2.学会発表:平成24年11月17日於金沢大学医薬保健学域保健学類・鶴間地区で行なわれた「第31回日本医学哲学・倫理学会大会ワークショップ」で「妊娠中絶の何が問題か」を発表した。研究課題「わが国と欧米の中絶医療実態の比較研究」の目的としては、(1)欧米の優れた中絶医療・ケアの事例調査。(2)そうした医療・ケア導入の背景の学術的調査・研究、(3)わが国のリプロダクティブ・ヘルス改善の為の中絶医療変革とその方向性の呈示であり、この目的の下に、平成26年3月13日には、オランダ訪問を行ない、人口妊娠中絶に特化した「Abortion Clinic (Rutgershuis-Oostクリニック」のDr. Olga Loeberと看護師へのインタビューと施設内見学を行なった。翌14日にはDr Evert Ketting宅を訪問しインタビューを行った。Dr. Olga Loeberはオランダ中絶医協会の前会長であり、Dr Evert Kettingは前ナイメーヘン大学公衆衛生学教授であって、オランダを中心にヨーロッパの中絶・避妊・性行動について40年近く研究をされており、また「WHO」や「ユニセフ」のコンサルタントとして現在も活躍されている方であることから、両氏へのインタビューは、本研究課題遂行のうえで大変有意義なものであって、それを、現在、まとめつつある状況にある。また、現在のオランダにおける優れた中絶医療・ケアの状況が、どのような経緯で、そうなってきたのかの歴史・背景を探ることにより、わが国のあるべき姿を描ける可能性もあり、そのために、主に、オランダに関する文献調査も進行中である。最終年度実施研究の成果: 2014年3月13日、オランダ・アルンヘム(Arnhem)にあるミルドレッド・ルトヘルスハイス・クリニック(Mildred Rutgershuis kliniek、オランダで最初にできた中絶クリニック)で、オランダ中絶医協会(NGvA, Nederlandse Genootschap van Abortusartsen)前会長オルハ・ルーバー医師(Olga Loeber〈MD〉)に行なったインタビューの文字起こし、及び、オランダ妊娠中絶法評価報告書抄訳を作成し、オランダとわが国の中絶医療実態の比較研究を試みた。本研究から判った事: 1984年にオンデマンド(請求次第)で中絶が認められたオランダでは、中絶医療は健康保険の対象ではあるが、匿名化はなされていた。中絶の95%はクリニックで行なわれており、その方法はディスポ・プラスティック吸引法が主流であった。

病院では薬剤による中絶も行なわれているが、中絶クリニックではあまり行なわれていない模様であった。中絶希望患者に対し、医師には養子縁組制度など中絶回避のための説明が義務づけられ、5日間の待機期間を経ても中絶意志が変わらなければ中絶を受けられる制度があった。中絶施設は、ペンションのような概観で清潔で明るく施術後は中絶後ケアとして十分なカウンセリングの機会があった。オランダの中絶率は増加しており出生数1000のうち8件となっているが、その主な理由は被西欧諸国からの移民で、その原因には文化的背景などが関わっているとの話があり、オランダ人に中絶が少ない理由としてカルヴァン主義的背景が挙げられていた。本研究の意義、重要性:オランダの中絶医療の現況調査により、わが国における(1)早期からの性教育(リプロダクティブ・ヘルス、ライツ)、(2)中絶法の改善、(3)カウンセリング(ケア)の必要性が再認識された。オランダ中絶医協会前会長オルハ・ルーバー医師へのインタビューにより、オランダの中絶医療・ケアの実際が、以下の点から明らかとなった。(1)性教育の徹底、(2)中絶前後のカウンセリング、(3)安全な中絶手技の導入、(4)看護師へのメンタルケア、(5)妊娠中絶費用の無料化オランダでの妊娠中絶は、我が国のようにオンデマンドで行われておらず、中絶に至るまでの女性はトータルにケアされ、尊重されるシステムが整備されていた。こうしたシステムは、我が国では未だ整えられてはおらず、早急な導入が必要であると考えられた。平成24年度は研究分担者の妊娠・出産・育児休暇の為に、同年度の欧州訪問予定が25年度に持ち越された。平成26年度は、研究代表者の大学退職と市内総合病院産婦人科部長就任に伴う研究協力員への職替えもあって、平成26年度に予定されていた米国訪問が不可能となり、研究の遂行に遅れが生じた。オランダでの中絶医療のインタビュー内容(約1.8万字)とオランダ妊娠中絶法評価報告書抄訳(約9万字)は、Webページに掲載予定。産婦人科平成27年度は、平成26年度に予定されていた米国訪問を実行し、米国の中絶医療の実態を調査する予定である。また、平成27年度は、本事業の最終年度となるので、前年度に行なわれたオランダ中絶医協会全会長のDr Evert KettingとWHOやユニセフのコンサルタントとして今も活躍されているDr Evert Kettingのインタビューの文字おこしを完了し、事業報告とする予定である。平成24年度の76万円あまりの予算が執行されなかったが、これは、オランダへの訪問調査が主担当者の水野の妊娠・出産・産休で実施出来なかったからである。また、平成25年度研究実施計画として、国内の中絶医療と中絶ケア実施に対する調査・研究のため国内産科医療者のインタビュー、インターネット調査、研究会開催を予定していたが、これも、主担当者の水野の産休のため行なわれていない。しかし、平成25年度は、上記オランダ訪問インタビューが行なわれることになり、当初の期待以上の成果が得られたと考えられたことから、本研究は概ね順調に進展しているものと考えた。
角膜上皮細胞へのダイレクトリプログラミングが可能な薬剤開発

角膜上皮幹細胞疲弊症では幹細胞疲弊に伴う結膜および血管侵入に加えて眼表面上皮の分化異常が生じる。その結果、正常上皮が角化(皮膚化)して高度の角膜混濁をきたし、著明な視力低下を引き起こす。以前に6つのコア転写因子(PAX6, OVOL2, KLF4, SOX9, TP63, MYC)を用いて皮膚線維芽細胞から角膜上皮細胞へのダイレクトリプログラミング(ある分化細胞から違う分化細胞の強制誘導を行う方法)に成功し、これらのコア転写因子が角膜上皮の正常分化を制御することを報告した。しかし、転写因子による遺伝子導入には臨床的ハードルが高いため、低分子化合物による創薬の可能性を探索する必要がある。本研究では低分子化合物を用いて角膜上皮細胞へのダイレクトリプログラミングを行う薬剤を探索する。角膜上皮細胞へのダイレクトリプログラミングが可能な薬剤開発の可能性を探るために、角膜上皮細胞と病的上皮のモデルである表皮角化細胞のマイクロアレイデータを解析し、角膜上皮細胞で発現が8倍以上高いまたは低い遺伝子を選択した。CMap(The Connectivity Map:ヒト細胞に化合物を作用させて生じる遺伝子発現変化のデータベース)を用いて、角膜上皮細胞で高発現している遺伝子を増強させる低分子化合物を8877選択し、そのうち、Scoreが90以上となり角膜上皮細胞で高発現となる候補低分子化合物を13種類、一方で、Scoreが-90以下となり角膜上皮細胞で低発現となる候補低分子化合物を48種類選択した。低分子化合物の選定に多くの解析が必要であったため、進捗状況はやや遅れている。候補薬剤が選定されてきたため、今後は、得られた角化上皮細胞から角膜上皮細胞への誘導候補薬物と、その反対の角膜上皮細胞から角化上皮細胞への誘導候補薬物の作用機序からシグナル経路を予測するという手法によりそのメカニズム解明を行う。
母体血よりの胎児DNA分離による出生前遺伝子解析

Cytochrome b5 reductase(b5R)遺伝子の異常による遺伝性メトヘモグロビン血症の出生前診断を目的として、異常部位の塩基配列の解明と確定診断への遺伝子増幅技術(PCR法)の適用を試み、胎児細胞を安全に収集する方法として母体流血中に含まれる胎児有核赤血球を対象とし、そのDNAを分析する標準的な操作を検討した。b5R遺伝子の解明から、本症の3種の病型に対してそれぞれ異なったエクソン部位の塩基配列異常の対応することが明らかとなり、それぞれのPCR法におけるプライマーを用意することが可能となった。母体流血中からの胎児有核赤血球の分離収集については、先ず臍帯血を利用して比重法による分離法を検討した。有核赤血球の確認には顕微鏡によるほか、比較的含有量の多い酵素の親和定数や活性化エネルギーのちがい等を用いた。DNAの抽出法については、蛋白水解酵素を用いる方法、市販の各種抽出キットによる方法を比較した結果、有機溶剤や酵素を使用しないものが簡便、迅速で回収率が高いので推奨された。以上の抽出法を臍帯血から分離した有核赤血球に適用し、b5R遺伝子のPCR法による増幅を試みた。しかしながら、母体流血中からの有核赤血球の比重法による単離にはバラツキが多く、胎児細胞採取の確実性を期すためには、むしろミクロマニピュレータを用いて一個一個の有核赤血球を顕微鏡下に捕集する方法が理想的と考えられた。母体血中の胎児由来細胞について、遺伝性メトヘモグロビン(MtHb)血症で異常を来すMtHb還元酵素の遺伝子を解析し、危険性の少ない出生前診断に資するのが本研究の目的であった。本年は、以下の基礎的検討を行った。比重法によって分離したヒト白血球よりDNAを抽出し、これを段階希釈してMtHb還元酵素に対するプライマーを用いたPCR法を適用した。その結果、DNA1.6pgまで電気泳動法による蛍光染色にてMtHb血症で異常を来す塩基配列部の検出が可能であることを確認した。また、顕微解剖的に分別採取した1個の白血球についても、増幅回数を増すことにより同様の検出が可能であった。2)胎児由来細胞のDNA解析胎児由来の赤芽球を臍帯血より顕微解剖的に1個分別採取し、前記同様のPCR法にてMtHb還元酵素遺伝子の確認を行った。現在のところ、MtHb血症で異常を来す塩基配列部エクソン2領域の検出を可能とした。また、性別についてもX染色体、Y染色体それぞれに特有のプライマーを使用したPCR法によって、胎児の性別との一致を確認できた。以上から、1個の胎児細胞についてもMtHb血症の遺伝子診断は可能と考えられ、母体血中における出現頻度の非常に少ない胎児赤芽球を用いて、安全に遺伝性代謝障害の出生前診断を行う見通しを立てることができた。Cytochrome b5 reductase(b5R)遺伝子の異常による遺伝性メトヘモグロビン血症の出生前診断の目的に対し、胎児の組織の一部を得る最も安全な方法として母体流血中に含まれる胎児細胞を分離採取する手技を確立し、そのDNAを分析する標準的な操作を検討した。胎児細胞としての確実性を期すためには、有核赤血球を用いることが理想的であったので、先ず臍帯血から比重法によってこれを分離し、顕微鏡下に有核赤血球であることを確認するとともに、比較的含有量の多い酵素の活性を中心に親和定数、活性化エネルギーを比較して他の血球成分の混入をチェックした。DNAの抽出法については、蛋白水解酵素を用いる方法、市販の各種抽出キット(IsoQuick種橋器械、Micromixバイオロジカ、WBキット和光純薬、セパジーン三光純薬)による方法を比較した結果、有機溶剤や酵素を使用しないものが簡便、迅速で回収率が高いので推奨された。

以上の抽出法を臍帯血から分離した多数の有核赤血球やミクロマニピュレータによって単離した一個一個の有核赤血球に適用し、b5R遺伝子のPCR法による増幅を試みた。しかしながら、母体流血中からの有核赤血球の比重法による単離にはバラツキが多く、確実に一個一個の有核赤血球を捕取するにはミクロマニピュレータの設置が必須であると考えられた。
企業経営型果樹作経営における意思決定支援に関する基礎研究

果樹作における企業経営の展開に際して,関連する経済主体の意思決定に関する基礎的知見を収集するためには,分析対象とする活動主体について,補助金等の政策的支援の利用状況や普及機関とのコミュニケーションの程度,農産物の販売状況等に関する側面(制度利用),気候条件や土壌特性等の資源利用状況,機械・施設等の装備の適正さなどに関する側面(技術条件),リスクに対する態度や期待形成の特徴等に関する側面(経営者能力)に関する経緯と現状に関する情報の整理が有効であることが確認された.このような問題意識を具体化する分析枠組みとして"Livelihood Trajectory Approach"の有効性を提起した.本研究では,永年生作物の特殊性等のために事業展開が相対的に遅れている果樹作における企業経営を研究対象として,家族経営から企業経営への発展に必要な意思決定支援方策に関する基礎的知見の整理を目的とする.平成25年度は,分析対象とする企業経営・果樹経営の選定と,すでに調査実績のある企業経営を対象としたデータ収集(アンケート調査,および,経営者との対面調査)を実施した.また,農業経済経営学以外の分野における議論を参考にした企業経営に関する概念整理(一般経営学等,他分野を横断した文献レビュー)を行い,2次データ(統計資料等)の収集・整理による生産状況・市況情報・技術情報等の動向分析とともに,果樹作経営における企業経営の展開を学術的に議論するための立論部分を強化する作業を行った.ところで,果樹作では,すべての管理作業を機械化・施設化することが難しいという労働使用的な技術特性が存在する.よって,一般に,個別の農家が大規模化して市場における高いシェアを得る,あるいは,量販店に対する計画的な大量出荷に成功するなどという行動を観察することは難しい.具体的には,農協共販等の出荷組織によって,機械・施設の共同利用,市場との取引・交渉を含めた集出荷対応,(品種選択等の)生産技術の統一によるブランド形成を行うなど,複数の農家を組織化する場合がほとんどである.よって,野菜作,果樹作の生産構造を議論する場合には,農家数や担い手の賦存状況等による労働力の推移,品種別の作付面積から土地利用の変化等から農家行動を議論するだけでなく,一定の地理的な広がりを基礎とする産地を単位とした生産行動(産地間競争を含む)を議論することも有効である.そこで,単位農協等を単位とした場合の産地としての企業経営発展への支援状況についても,情報収集を行った.本研究では,永年生作物の特殊性等のために事業展開が相対的に遅れている果樹作における企業経営を研究対象として,家族経営から企業経営への発展に必要な意思決定支援方策に関する基礎的知見の整理を目的とする.平成26年度は,前年度に引き続き,分析対象とする企業経営・果樹経営の選定と,すでに調査実績のある企業経営を対象としたデータ収集(経営者との対面調査)を実施した.また,農業経済経営学以外の分野における議論を参考にした企業経営に関する概念整理(一般経営学等,他分野を横断した文献レビュー)を行い,2次データ(統計資料等)の収集・整理による生産状況・市況情報・技術情報等の動向分析とともに,果樹作経営における企業経営の展開を学術的に議論するための立論部分を強化する作業を継続した.ところで,果樹作では,すべての管理作業を機械化・施設化することが難しいという労働使用的な技術特性が存在する.よって,一般に,個別の農家が大規模化して市場における高いシェアを得る,あるいは,量販店に対する計画的な大量出荷に成功するなどという行動を観察することは難しい.具体的には,農協共販等の出荷組織によって,機械・施設の共同利用,市場との取引・交渉を含めた集出荷対応,(品種選択等の)生産技術の統一によるブランド形成を行うなど,複数の農家を組織化する場合がほとんどである.よって,野菜作,果樹作の生産構造を議論する場合には,農家数や担い手の賦存状況等による労働力の推移,品種別の作付面積から土地利用の変化等から農家行動を議論するだけでなく,一定の地理的な広がりを基礎とする産地を単位とした生産行動(産地間競争を含む)を議論することも有効である.そこで,単位農協等を単位とした場合の産地としての企業経営発展への支援状況についても,情報収集を継続した.本研究では,永年生きる作物の特殊性のために事業展開が相対的に遅れている果樹作における企業経営を研究対象として,家族経営から企業経営への発展に必要な意思決定支援方策に関する基礎的知見の整理を目的とした.平成27年度は,企業経営への発展を議論する視点として,制度利用・技術条件・経営者能力の3つの視点を取り上げた.具体的に,果樹作における企業経営の展開に際して,関連する経済主体の意思決定に関する基礎的知見を収集するためには,分析対象とする活動主体について,補助金等の政策的支援の利用状況や普及機関とのコミュニケーションの程度,農産物の販売状況等に関する側面(制度利用),気候条件や土壌特性等の資源利用状況,機械・施設等の装備の適正さなどに関する側面(技術条件),リスクに対する態度や機体形成の特徴等に関する側面(経営者能力)に関する経緯と現状について,その時々の意思決定に応じた対応関係とともに,情報を整理する必要があることが確認された.つまり,詳細な事業展開と意思決定のダイナミクスを分析対象としなければならない.このような問題意識から経済主体の行動を分析する枠組みとして"Livelihood Trajectory Approach"の有効性を提起した.平成28年度には,農家への研究成果のフィードバックと議論の作業を残している.このプロセスにおいて,以上のアプローチの有効性を確認する.ただし,農家への研究成果のフィードバックと議論の作業が残されており,28年度にこれらの作業を実施する予定である.

本研究では,永年生作物の特殊性のために事業展開が相対的に遅れている果樹作における企業経営を研究対象として,家族経営から企業経営への発展に必要な意思決定支援方策に関する基礎的知見の整理を目的とした.具体的に,企業経営への発展を議論する視点として,制度利用・技術条件・経営者能力の3つの視点を取り上げた.果樹作における企業経営の展開に際して,関連する経済主体の意思決定に関する基礎的知見を収集するためには,分析対象とする活動主体について,補助金等の政策的支援の利用状況や普及機関とのコミュニケーションの程度,農産物の販売状況等に関する側面(制度利用),気候条件や土壌特性等の資源利用状況,機械・施設等の装備の適正さなどに関する側面(技術条件),リスクに対する態度や期待形成の特徴等に関する側面(経営者能力)における経緯と現状について,その時々の意思決定に応じた対応関係とともに,情報を整理する必要があることが確認された.つまり,詳細な事業展開と意思決定のダイナミクスを分析対象としなければならない.このような問題意識から経済主体の行動を分析する枠組みとして"Livelihood Trajectory Approach"の有効性を提起した.平成28年度には,農家への研究成果のフィードバックと議論の作業を行い,以上のアプローチの有効性を確認した.特に,果樹作のようなダイナミックな意思決定を必要とする場面での支援を対象とする場合,市場リスク,降雨リスクなどの外部条件を考慮した事業展開が重要であることが確認された.果樹作における企業経営の展開に際して,関連する経済主体の意思決定に関する基礎的知見を収集するためには,分析対象とする活動主体について,補助金等の政策的支援の利用状況や普及機関とのコミュニケーションの程度,農産物の販売状況等に関する側面(制度利用),気候条件や土壌特性等の資源利用状況,機械・施設等の装備の適正さなどに関する側面(技術条件),リスクに対する態度や期待形成の特徴等に関する側面(経営者能力)に関する経緯と現状に関する情報の整理が有効であることが確認された.このような問題意識を具体化する分析枠組みとして"Livelihood Trajectory Approach"の有効性を提起した.本研究では,果樹農業における企業経営の展開について,成功事例,進行事例,あるいは失敗事例から経営意思決定に関する基礎的知見を収集し,追随する家族経営・小規模経営へ行動規範として提供可能な意思決定支援方策策定に資する情報整理を目的とする.さらに,家族経営や地縁的な集団経営等から出発し,企業経営へと発展を遂げた農業経営を対象として,その成長プロセスの事例的解明,企業経営への展開を模索しながらも実現に至っていない農業経営を対象とした制約条件の抽出等,時系列的視点からの情報収集・整理を行うことを予定している.これらの作業を行うためには,各地で活発化している事例に関する情報を事前に収集するなど,実際のヒアリング調査にむけた準備作業が重要となるが,最終年度に向けて,これらの作業を蓄積することが出来た.ただし,農家への研究成果のフィードバックと議論の作業が残されており,28年度にこれらの作業を実施する予定である.農業経営学
遺伝的腫瘍における器官分化の可変性に関する研究

(1)レポーター遺伝子としてGUS遺伝子を用い、Ng rol遺伝子発現に影響を与える因子の検索とcis因子の解析を行なった。その結果、Ng rolB,Ng rolCは組織特異性と植物ホルモン応答性に関して、発現活性こそ1/21/3に低下しているが、Ri rolB,Ri rolCと同様なシス領域を保持している。(3)17の遺伝的腫瘍特異的cDNAクローンのうち、クローンTID771は両親のカルス細胞でも発現せず、植物ホルモン(オーキシンとサイトカイニン)およびストレス関連物質(アブシシン酸、サリチル酸)ジャスモン酸メチル)にも反応しない遺伝的腫瘍特異的クローンである。(4)クローンTID771の抗体を作成し、ウェスタンブロッティングで調べた発現の時間的経過はmRNAの蓄積と同様に、奇形腫の原基の形成時期に対応している。(5)クローンTID771の翻訳産物は腫瘍組織の表層に分布している。
ネットワーク構造のスパースモデリングとリサンプリングによる統計的推測

大規模なネットワークデータが近年容易に入手できるようになり,ネットワークに潜む構造を理解することが応用上も重要になっている.ネットワークは多くの場合スパース性をもち,各ノードが他のノードに接続するリンク数はノード数に比べてとても小さい.このような複雑ネットワークの研究が注目されているが,ネットワークデータを統計解析するツールの研究は不十分である.そこでネットワーク成長モデルの優先的選択関数や適応度などのメカニズムをネットワークデータから推定する方法を開発する.本年度は次の成果が得られた.(1)分析ツールのソフトウエアPAFitの開発ではこれまで優先的的選択関数と適応度の2つの効果を同時にノンパラメトリック推定していた.これに加えてクラスタ性の効果の検討を行った.優先的選択関数とクラスタ性を同時にノンパラメトリック推定する手法を開発,実装して,シミュレーションと実データ解析で検証した.(2)様々な分野のネットワークデータにPAFitを適用して,優先的選択関数と適応度のメカニズムが広く存在することを昨年度より多くの実データで確認した.さらに,優先的選択と適応度の貢献度を定量的に比較する手法を考案した.(3)パラメータ推定の信頼区間を近似計算する手法について,シミュレーションによって有効性を確認した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。大規模なネットワークデータが近年容易に入手できるようになり,ネットワークに潜む構造を理解することが応用上も重要になっている.ネットワークは多くの場合スパース性をもち,ノードとリンクからなるグラフと考えると各ノードが他のノードに接続するリンク数(次数)はノード数に比べてとても小さい.このような複雑ネットワークの研究が注目されているが,ネットワークデータを統計解析するツールの研究は不十分で,今後さらに重要になると考える.そこで本研究では,ネットワーク成長モデルの優先的選択関数や適応度などのメカニズムをネットワークデータから推定する方法を開発する.そしてリサンプリング法などの手法をもちいて推定結果の信頼度の計算を行い,科学的知見に結びつけることを試みる.とくに本年度は次の成果が得られた.(1)分析ツールのソフトウエアPAFitの開発を引き続き行い,優先的的選択関数と適応度の同時推定が安定に行えるようになった.ベイズモデルのハイパーパラメータ推定は従来困難だったが,クロスバリデーションの工夫によって問題が解決した.改良したPAFitはCRANにて公開した.(2)様々な分野のネットワークデータにPAFitを適用して,優先的選択関数と適応度のメカニズムが広く存在することを確認した.(3)リサンプリング法によってパラメータ推定の信頼度を計算する方法をいくつか実装して,シミュレーションによってこの方法の性質を比較検討した.成長ネットワークの成長メカニズムを推定する方法について従来より安定した推定が行えるようになった.これを実データに実際に用いることによって,単に方法論の開発ではなく,サイエンスとして興味深い知見が得られたことは当初の期待を超える成果といえる.リサンプリング法については検討を行い,予備的結果が得られている.大規模なネットワークデータが近年容易に入手できるようになり,ネットワークに潜む構造を理解することが応用上も重要になっている.ネットワークは多くの場合スパース性をもち,各ノードが他のノードに接続するリンク数はノード数に比べてとても小さい.このような複雑ネットワークの研究が注目されているが,ネットワークデータを統計解析するツールの研究は不十分である.そこでネットワーク成長モデルの優先的選択関数や適応度などのメカニズムをネットワークデータから推定する方法を開発する.本年度は次の成果が得られた.(1)分析ツールのソフトウエアPAFitの開発ではこれまで優先的的選択関数と適応度の2つの効果を同時にノンパラメトリック推定していた.これに加えてクラスタ性の効果の検討を行った.優先的選択関数とクラスタ性を同時にノンパラメトリック推定する手法を開発,実装して,シミュレーションと実データ解析で検証した.(2)様々な分野のネットワークデータにPAFitを適用して,優先的選択関数と適応度のメカニズムが広く存在することを昨年度より多くの実データで確認した.さらに,優先的選択と適応度の貢献度を定量的に比較する手法を考案した.(3)パラメータ推定の信頼区間を近似計算する手法について,シミュレーションによって有効性を確認した.今後は,ネットワークの成長メカニズムとして優先的選択度と適応度以外のものを含めることの検討や,成長履歴(タイムライン)が未知の場合への対応を検討する.また,リサンプリング法についても引き続き検討を行う.得られた手法を様々な実データへ適用する.29年度が最終年度であるため、記入しない。
鳥取県における女性と地域政治の変容過程――戦後から現代まで――

2018年度は、1鳥取県において戦後から現在に至る期間に行われたすべての選挙結果を確定(選挙年月日、立候補者名、得票数など)すること、2その過程で女性の立候補者・当選者を確定すること、3戦後期から昭和30年代にかけてのいわゆる女性の戦時参画の草分け的人物について可能な限り個別調査をすること、4関連文献・資料の収集、などを行った。1については、県の選挙管理委員会がその大部分を整理し公表しているので、基本的にはそれを利用した。しかし、そこから漏れているものもある。とりわけ、昭和20年代から市町村合併が進む30年前後までの選挙については、わからないものが多い。市町村史誌(昭和の合併後に作成されたものがほとんど)などで当選者の氏名のわかるものもあるが性別は不明、また得票数や立候補者全員の氏名なども不明が多い。地元の新聞記事などをあたり、収集作業を進めた。2女性については、衆議院選挙で当選したのは昭和21年に1名、1999年に繰り上げ当選した1名、合計2名。その他、参議院と首長選挙(いずれも当選者はいない)については女性の立候補者、県議や市議、町村議選挙は立候補者と当選者について確定作業を進めた。3各種選挙のうち女性の当選者については、とりわけ昭和21年の衆議院議員から昭和30年前後にかけての県議・市町村議に当選したことが確認できた10数名についてその足跡をたどる作業をした。とりわけ初の女性代議士となった田中たつについては、共同研究者が論文としてまとめた。4地域社会と女性の政治参画に関する各種文献については、確認できたものから収集した。以上であるが、特に選挙結果の確定作業に多くの時間を割かざるをえなかったが、戦後期の女性議員たちを追跡していく中で、親族の皆さまから資料や写真などの提供を受け、公文書館や自治体で引き取っていただくこともできた。2017年度はやや手探りの部分もあって作業がはかどらなかったが、2018年度は選挙結果の確定作業だけでなく、初期の女性議員たちを確認しその足跡をたどる作業などもできたことから、おおむね順調な1年であったと考えている。加えて、戦後最初の衆議院議員選挙で鳥取県から当選した田中たつに関する資料の提供を受け、公文書館の協力などを得て共同研究者は研究論文を作成した。また、戦後の鳥取県の女性議員に関する俯瞰的論考を代表者と共同研究者が連名で『選挙研究』に投稿できたことで、この研究の大枠ができあがった。これについては識者の意見も出てくるであろうから、それらを参考にしつつ来年度のまとめに生かしていきたい。次年度の方針として、1選挙結果についてはできるだけ古いものまで確定作業を進め、女性の立候補者や当選者がいないか確認していく、2確認できた女性の立候補者や当選者のうち、昭和30年代初めくらいまでの期間については、個別に人物像をたどってみたい、3鳥取県における地域社会と女性の政治参画について、日本はもちろん他の地域に関する文献なども参考にしつつ、戦後史を俯瞰できるまとめをしたい、と考えている。平成29年度の前半は鳥取県に在住する女性地方議員のうち現職ならびに元職、計4名より聞き取りを行い、女性議員としての活動の足跡と平成・昭和という時代における地域政治の在り方について語っていただいた。本研究が目指す戦後から平成の大合併という期間の女性と地域政治の動向を生身の人間から聞き取るという意味では、これだけではもちろん限界はある。ただ、聞き取りを行った1名は80才を超え、戦前から戦後の鳥取における幼少期についても語ってくれただけでなく、その後回顧録を出版したことでわれわれの研究にとって非常に有益な情報源だと考えている。後半は主に文献や資料・データの収集にあたった。鳥取県において女性をめぐる文献や資料は2000年代になって『とっとりの女性史』という形でまとめられるが、これ以外で継続していたものとしては「連合婦人会新聞」と極めて断片的ではあるが「地域婦人会新聞」がある。他は県・市町村誌史や広報誌さらに各地の民俗誌、日本海新聞をはじめとする新聞記事などがあり、これらについては図書館などで順次閲覧・収集を進めている。地域政治をめぐる選挙データなどは県の選挙管理委員会でまとめられたものを中心に大部分は容易に入手できるが、そこから漏れたデータについては市町村誌や新聞などから丹念に拾い集める作業を続けていった。もちろん、いずれの作業もなかなか骨の折れることばかりであり、次年度以降も続ける予定である。以上から、本研究を遂行する上での見通しはほぼ立てることができた。ただし、戦後から昭和50年頃までの女性にまつわる政治や生活に関する情報が初年度ご本人の都合などもあり絶対的に不足しており、これについては次年度の重要な課題として残ることになる。このあたりの問題を含め引き続きインフォーマントを探し聞き取りを続けると同時に、資料・文献などの収集・整理も続けていくことが必要である。概要で触れたように、女性の政治参画に関するもの、地域社会や地域政治にかかわり文献や資料、選挙データなどについて、どこにどのような資料・文献があるかについてはおおむね見当がついた。しかし、それらの閲覧・収集・整理についてはそう簡単ではないことが判明しているが、年度末の異常気象で現地へ行くことが難しくなり十分時間を確保することができなかったことが大きな理由である。これについては次年度以降改善できると考えている。聞き取りについては内容の文字化も終わり、順次整理できている。ただし、聞き取りを行った議員たちは在任期間の比較的長い人たちではあるものの過去30年が活躍の最盛期であり、それ以前にさかのぼって得られる情報は少ない。

本研究の趣旨からすると、古い時代についてのインフォーマントをもう少し探し出し、戦後から現代に至る時代の情報をバランスよく配置できるようにするのがいいのだろうと考えている。2018年度は、1鳥取県において戦後から現在に至る期間に行われたすべての選挙結果を確定(選挙年月日、立候補者名、得票数など)すること、2その過程で女性の立候補者・当選者を確定すること、3戦後期から昭和30年代にかけてのいわゆる女性の戦時参画の草分け的人物について可能な限り個別調査をすること、4関連文献・資料の収集、などを行った。1については、県の選挙管理委員会がその大部分を整理し公表しているので、基本的にはそれを利用した。しかし、そこから漏れているものもある。とりわけ、昭和20年代から市町村合併が進む30年前後までの選挙については、わからないものが多い。市町村史誌(昭和の合併後に作成されたものがほとんど)などで当選者の氏名のわかるものもあるが性別は不明、また得票数や立候補者全員の氏名なども不明が多い。地元の新聞記事などをあたり、収集作業を進めた。2女性については、衆議院選挙で当選したのは昭和21年に1名、1999年に繰り上げ当選した1名、合計2名。その他、参議院と首長選挙(いずれも当選者はいない)については女性の立候補者、県議や市議、町村議選挙は立候補者と当選者について確定作業を進めた。3各種選挙のうち女性の当選者については、とりわけ昭和21年の衆議院議員から昭和30年前後にかけての県議・市町村議に当選したことが確認できた10数名についてその足跡をたどる作業をした。とりわけ初の女性代議士となった田中たつについては、共同研究者が論文としてまとめた。4地域社会と女性の政治参画に関する各種文献については、確認できたものから収集した。以上であるが、特に選挙結果の確定作業に多くの時間を割かざるをえなかったが、戦後期の女性議員たちを追跡していく中で、親族の皆さまから資料や写真などの提供を受け、公文書館や自治体で引き取っていただくこともできた。2017年度はやや手探りの部分もあって作業がはかどらなかったが、2018年度は選挙結果の確定作業だけでなく、初期の女性議員たちを確認しその足跡をたどる作業などもできたことから、おおむね順調な1年であったと考えている。加えて、戦後最初の衆議院議員選挙で鳥取県から当選した田中たつに関する資料の提供を受け、公文書館の協力などを得て共同研究者は研究論文を作成した。また、戦後の鳥取県の女性議員に関する俯瞰的論考を代表者と共同研究者が連名で『選挙研究』に投稿できたことで、この研究の大枠ができあがった。これについては識者の意見も出てくるであろうから、それらを参考にしつつ来年度のまとめに生かしていきたい。女性の政治参画に関する資料・文献、地域社会や地域政治にかかわり文献や資料、選挙データなどについては鋭意閲覧・収集・整理を進めていく予定で、これは時間をかければ着実に進行することがわかっているので、進めたい。
神経幹細胞から特異的ニューロン・グリア細胞を産み出す分子メカニズムの解析と応用

神経幹細胞は胎児期および成体の脳内で自己複製をしながら、ニューロンやグリア細胞を産み出す。Olig2は、胎児期の腹側脊髄に発現し、運動ニューロンとオリゴデンドロサイト前駆細胞の発生に必須の転写因子である(Ono et al. Mol Cells 2009)。平成21年度は、GST-Olig2融合タンパクを用いて、ラット脳ライセートからOlig2に結合する候補因子をマススペクロメトリーにて多数同定した。さらに、これらの候補因子の胎生期脊髄における発現パターンをin situhybridization法にて調べ、pMNドメインとの共発現がみられるかどうか、また、ニューロン産生期あるいはグリア産生期に共発現するのかについて詳細に解析した。Olig2と共発現を示し、タンパクの一次構造などから転写に関わっていることが示唆される因子について、タグ付き発現ベクターを構築し、免疫沈降法によりOlig2結合部位の同定を試みている。さらに、ニワトリ胚やマウス胚にエレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、運動ニューロンやオリゴデンドロサイトの発生・分化に対する影響を調べている。平成22年度は、shRNAコンストラクトを作製、あるいは、ドミナントネガティブ体を作製し、これらのコンストラクトをニワトリ胚やマウス胚に遺伝子導入することにより機能抑制実験を行う予定である。本研究は、神経幹細胞から特異的ニューロン・グリア細胞を産み出す分子メカニズムを明らかにするために、運動ニューロン、および、オリゴデンドロサイトの分化に必須の転写因子であるOlig1, Olig2転写因子に結合する因子を同定し、それぞれの転写コンプレックスの神経幹細胞から特定のニューロン・グリア細胞への分化制御における役割を明らかにすることを目的としている。本年度は、酵母2ハイブリッドスクリーニング、および、プロテオミクス解析にで同定したOlig転写因子の結合因子候補の発現解析を継続して行った。また、Cos細胞への遺伝子導入後に免疫沈降実験を行い、Olig転写因子と結合候補因子が実際に結合することを確認した。同定した結合因子のうち、Olig Binding Protein1 (OBP1), Olig Binding Protein2 (OBP2)と名前の付けた2つの因子に着目し、ニワトリ胚を用いたエレクトロポレーションによる遺伝子導入法を用いて、運動ニューロンおよびオリゴデンドロサイト分化における機能についての解析を進めている。またOBP1については、マウスを用いて機能喪失実験を行うために、ノックアウトマウス作製を開始し、その作製に成功した。さらに、Olig2がリン酸化を受ける転写因子である事を見いだし、そのリン酸化部位の同定を行った。現在は、リン酸化酵素の同定、Olig2リン酸化の細胞分化における意義についての解析を進めている。
江戸時代の上方における幕府の機構と法令・裁判に関する実証的研究

本研究は、関東とならぶ拠点地域であった江戸時代(日本近世)の上方(かみがた)において、幕府がどのような機構(組織・制度・過程)を作りあげ、そこでの法令と裁判がどのような内容や特徴をもっていたのかを学術的に問うものである。その要点は次の3つである。1江戸時代の中期を中心に、上方における幕府の機構や法令・裁判のあり方とその歴史的な展開を実証的に明らかにする。2法令と裁判を切り口に、関東・上方の2つを拠点とする幕府支配の特質や近世国家の構造を把握する。3上方の機構や法令・裁判に関する原史料(古文書)を幅広く調査・収集・分析し、そのうち未刊行で重要なものを翻刻(活字化)・紹介する。
特殊ベント・プロモーターを利用した新規高発現ベクターの構築

ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。Clostridium perfringensはシアリダーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼなど多種類の有用な酵素を産生する。しかしながら、それらの分離精製は困難でありBiotechnologyによる量産が望まれる。それら有用酵素の遺伝子はAT含量が極端に高く、分子量が大きいため、大腸菌等、他の宿主-ベクター系での発現はCodon biasにより非効率的であり、他の宿主による量産は不可能である。我々は、C. perfringensのフェレドキシン遺伝子(fdx)のプロモーター領域に存在する5つのPhased A-tractsは、強い折れ曲がり構造をとり、fdxのプロモーター活性を高めることを見いだした。このプロモーターを用いたC. perfringens用高発現ベクターの開発を目的に、fdxプロモーターと分泌性シアリダーゼの遺伝子(nanI)のTranscriptional fusionを行い、NanI産生性について検討した。プラスミドpPSVのMultiplecloning siteにfdxプロモーターを含む-69から+1までの断片とnanIの+2から転写終結配列までの領域を挿入したプラスミドpPSF-Nを構築した。これをC. perfringens Strain 13に形質転換した。対照として、pPSVにnanI遺伝子全体をクローン化したプラスミドpPSV-N、あるいはpPSVで形質転換した2種類のStrain 13を用いた。Strain 13/pPSF-NはStrain 13/pPSVの3,000倍、Strain 13/pPSV-Nの60倍のNanIを培地中に産生した。Strain13/pPSF-Nの培養上清を少量を用いてSDS-Polyacrylamide gel電気泳動で調べたところ、他の成分は微量ないし少量であるのに対し、NanIは多量に検出された。Clostridium histolyticum菌のコラゲナーゼ遺伝子を、同様にfdxとTranscriptional fusionを行いStrain 13で発現させたところ、120kDaのコラゲナーゼが多量に培地中に産生された。これらの結果は、fdxプロモーターの高発現ベクター開発に向けての有用性を示す。

pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。