hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キノコ類のゲノム多様性からヒト進化の新知見を得るための試行的研究

ヒトと密接な関係にあった生物種のゲノム情報は、ヒトゲノム解析のみでは伺いしることの出来なかった、人類進化に関する貴重な情報を与えてくれる。本課題では、ヒトが古くから食料や医薬品などとして利用してきたキノコ類のゲノム情報からヒトの進化に関する知見を引き出す基盤を整備するべく、菌根菌の一種であるLactirus volumesを対象に、全ゲノム塩基配列解析への利用を目標としたDNA抽出法の検討、およびその全ゲノムレベルで多様性の解析を行った。その結果、L. volumesのゲノムは非常に多型的であり、進化集団遺伝学的解析の対象として好適であることが明らかになった。キノコ類のゲノム多様性情報から、過去のヒトの移動や活動に関する知見を得るための情報基盤を整備する目的で、主に北半球に広く分布するベニタケ科のキノコであるチチタケの全ゲノム情報の解析を、次世代シーケンサー(ロシュ社GS Juniroシーケンサー)を用いて進行中である。チチタケ科のキノコ類は、動物・植物で一般的に用いられているエタノール保存後や、低温・超低温での保存後の抽出では著しいゲノムDNAの断片化をしめしており、野生のものを採取直後の子実体からの抽出のみが次世代シーケンサー解析に耐えうる品質のDNAの精製を可能にしている。また、その多様性を調査するため、主に北関東・東北の野生のチチタケを100株程度採取し、DNAを抽出、全ゲノム解析で同定された単一塩基多型の解析を行っている。ハラタケ目ベニタケ科の野生キノコ一種について、全ゲノム塩基配列決定をロシュGS Juniorシーケンサーを用いて行った。当初はペアエンド法とショットガン法の併用を予定していたが、収集したDNAの断片化が著しく、ショットガン法のみでの解析で約700ギガベースの塩基配列データを収集した。研究対象とした野生キノコでは、原因は不明であるが従来の手法では高品質ゲノムDNAの抽出することが困難であることが明らかになったので、DNA抽出条件の至適化を行った。キノコの全ゲノム多様性情報を取得し、ヒトの拡散についての新たな知見を得ることを目的とした本研究では、世界中に広範囲に分布しているが難培養性のためにゲノム多様性情報の報告例が少ないキノコ類を標的とした。そのモデルとしてチチタケLactarius volemusの解析を行った。10数個分の子実体を野外で採取、冷蔵保存し、採取後1種間以内に液体窒素で凍結・粉砕、CTAB法でゲノムDNAを抽出した。電気泳動によって高分子DNAの残存を確認した後、16SrRNA遺伝子領域の塩基非配列をサンガー法で解読、データベースとの照合により、チチタケである蓋然性が高いDNA試料1検体について、イルミナ社HiSeq2000によってペアエンドおよびメイトペアシーケンス(8kb)を行い、12.5ギガベースの塩基配列情報を取得した。これを、CLC Genomics Working Benchでアセンブリした。また、アセンブリの際には前年度までにロシュ社GS Juniorで得たシングルリードデータ約700Mb(他の地域より採集したチチタケの子実体に由来)をガイダンスリードとして投入した、その結果、およそ4500個のコンティグ(最大長970キロベース、最少1キロベース、N50=30キロベース)が得られた。推定ゲノムサイズは50メガベースで、既に報告のあるキノコ類のゲノムサイズと似通った大きさであった。マッピングされたリード情報から、ヘテロ接合状態の多型部位の調査したところ、およぞ20万の一塩基多型、2万の挿入/多型が検出された。非常に多型的であることが判明した。人類学チチタケゲノムの抽出条件が決定できず、次世代シーケンサー解析に利用可能なDNA量が限られているため、十分な被覆度が得られていないゲノム領域が多く存在している。当初予定していたキノコ1種の全ゲノム塩基配列決定作業は、概ね完遂できた。ただし、ショットガン法によって得られたコンティグのギャップを埋めるためのペアエンド法が、DNAの品質の問題のために実施できなかったので、これについては平成25年度の夏以降に同種のキノコの子実体が入手できた後に実施する予定である。一般的な単一塩基多型やサンガー法による塩基配列決定には、断片化したゲノムDNAでも十分なクオリティのデータが得られることがわかったので、今後はより多数の子実体を採取し、地域ごとの多様度の相違などの情報を得るとともに、次世代シーケンサーによる全ゲノム塩基配列決定に耐えうるDNAが精製可能な新鮮な子実体の採取を行い、全ゲノム配列の決定を完了する。平成25年度は、平成24年度の作業を引き継いで当該キノコのゲノム前塩基配列決定を完了し、バイオインフォマティクス解析によるゲノム多様性情報の整理を行うとともに、他のキノコ類で利用可能な遺伝的マーカーの探索をすすめる。チチタケゲノムの全塩基

配列決定について、これまでロシュ社の高速シーケンサーで決定したデータに加えて、イルミナ社の高速シーケンサーによる解析データを委託によって行い、より両者を統合してより精度の高い全ゲノム配列の構築を目指す予定だった。しかし、イルミナ社の高速シーケンサー解析に使用するためのゲノムDNAが、天候不順による子実体収穫量の低さと、DNA品質の低さから不足しており、委託解析を断念せざるを得なかった。よって実施委託料が次年度使用額となった。高品質ゲノムDNAが精製でき次第、高速シーケンサー解析の実施委託料として速やかに利用する。得られたキノコゲノムのドラフト配列から、遺伝子領域予測・ヘテロ接合となっている多型部位を予測するには、ジナリス社が提供するゲノム解析クラウドサービスGiNeSを利用する。分子進化学的解析手法を用いてゲノム情報を種間比較することにより、種特異的な遺伝子の有無、遺伝子ごとの配列保存度と特定の種で正の自然淘汰が作用した遺伝子の同定とそのジーンオントロジー解析、高度に保存された遺伝子間領域、保存度が低い遺伝子間領域の同定などを行う。パイロシークエンシングで同定された多型部位のうち、同法での正確なベースコーリングが難しい短い挿入/欠失多型および繰り返し多型については、従来のサンガー法を用いて塩基配列の確認を行う。長大なコピー数多型については蛍光定量PCR法(Applied Biosystems社ABI7900)を用いて確認する。種内・種間多型性の検証全ゲノム解析によって同定された多型部位および塩基置換率の高い領域について、申請者が国内野外フィールドおよび市場から収集した野生キノコ類、株式会社ハイファジェネシスから購入する日本産きのこ子実体粉末より抽出したDNA試料を材料に、生物地理学的解析に応用可能な座位の同定を目指す。
非定型的活性型EphA2による上皮間葉転換およびがん幹細胞化の制御機構

受容体型チロシンキナーゼEphA2は、様々ながん細胞において発現しているタンパク質であり、その活性化機構についてはこれまでに解析が進められてきました。我々は最近、EphA2の新しい活性化機構を見いだしました。新規活性型EphA2の機能の一つとして、がん細胞の運動能を促進することを発見しましたが、その全貌は明らかになっておらず、機能解析が急務となっています。そこで、本研究では、これまでの我々の研究をさらに発展させ、がんの悪性化に関わる新規活性型EphA2の機能を明らかにし、がん分子標的治療への新たな情報提供を目指します。
脳梗塞に対する骨髄由来の血管内皮前駆細胞の導入-臨床応用に向けて

我々はSprague-Dawley(SD) ratの脳梗塞モデルで末梢血中にEPCと考えられるCD34(+)/CD133(+)細胞数が脳梗塞モデル作成後14日をピークとして約3倍に増加し梗塞巣において新生血管形成に関与し、脳虚血後の病態を修飾する可能性を見出した。まず、雄Sprague-Dawley(SD) ratにおいて、末梢血中にEPCと考えられるCD34(+)/CD133(+)細胞数が最も増加する、脳梗塞作成後14日に末梢血より単核球を分離し、培養により増加させた。あらかじめ小泉法による脳梗塞モデル作成時に同時に頭蓋骨穿頭も行い、単核球を培養増殖後、穿頭部から脳梗塞巣に移植を施行した群を、sham operationのみの群およびcontrol rat群とで比較検討した。梗塞巣のサイズについては、移植群においては、他の群に比べて小さい範囲に留まる傾向が認められた。梗塞巣の形態観察においては、BS-1 lectinとDiI-acetyl LDL取り込みを指標に分化した血管内皮細胞の数をカウントした結果、BS-1 lectin(+)/DiI-acetyl LDL(+)細胞数は、他の群と比べて増加している傾向が認められた。この傾向は、梗塞巣の周辺領域、いわゆるペナンブラに明らかであった。これらの結果は、脳梗塞後の血管新生に末梢血中の骨髄由来細胞による、いわゆる血管発生型血管形成の機序が関与する可能性があること、さらに脳虚血巣における血管発生が末梢血中の骨髄由来細胞により促進される可能性があることを示唆している。臨床応用を目的として、今後も引き続き、移植方法・移植細胞数の検討、移植細胞運命の探索、移植の効果判定などが必要と考えている。雄Sprague-Dawley(SD)ratの脳梗塞モデル(小泉法にて)を作成し、脳梗塞後Day7,14,21,28に抹消血を採取して単核球を分離後した。血管内皮前駆細胞と目されるCD34(+)/CD133(+)細胞の数をFACS scanで調べたところ14日後に平均50細胞/(1ml当たりの単核球数)で約2倍に増加し、ピーク値を迎えた。また14日のピーク値は7、21、28日と比べ有意に高値であった。Control ratおよびsham operation ratではこのような増加は認めなかった。さらに分離単核球を4日間の血管内皮分化条件の培養後BS-1 lectinとDiI-Acetyl-LDL取り込みを指標に分化した血管内皮の数をカウントした結果、BS-1 lectin(+)DiI-Acetyl-LDL(+)細胞数は脳梗塞作成後の抹消血単核球培養で有意に増加し、14日の単核球培養において約3倍に増加しピークを迎え、その値は全接着細胞数の4%であった。また培養細胞よりRNAを抽出しRT-PCRでBS-1 lectinの発現を調べたところ、培養Day0ではBS-1 lectinは検出できなかったが、Day4には明らかにBS-1 lectinが検出できた。従来の血管内皮前駆細胞が脳虚血後の血管新生に直接寄与しているとの知見に加え、我々の結果は脳虚血が誘因となり生理的反応として抹消血内に血管内皮前駆細胞を動因し、血管内皮前駆細胞が脳虚血後の病態を修飾している可能性を強く示唆するものである。昨年度の研究実績を踏まえ、本年度は脳梗塞モデルを用いた血管内皮前駆細胞(endothelial progenitor cell : EPC)の移植研究を行った。

まず、雄Sprague-Dawley(SD)ratにおいて、末梢血中にEPCと考えられるCD34(+)/CD133(+)細胞数が最も増加する、脳梗塞発症(作成)14日後に採血を行い、単核球を分離、培養し、増加させた。あらかじめ小泉法による脳梗塞モデル作成時に同時に頭蓋骨穿頭も行い、単核球を培養増殖後、穿頭部から脳梗塞巣に移植を施行した群を、sham operationのみの群およびcontrol rat群とで比較検討した。梗塞巣のサイズについては、移植群においては、他の群に比べて小さい範囲に留まる傾向が認められた。梗塞巣の形態観察においては、BS-1 lectinとDiI-acetyl LDL取り込みを指標に分化した血管内皮細胞の数をカウントした結果、BS-1 lectin(+)/DiI-acetyl LDL(+)細胞数は、他の群と比べて増加している傾向が認められた。この傾向は、梗塞巣の周辺領域、いわゆるペナンブラに明らかであった。これらの結果は、脳梗塞後の血管新生に末梢血中の骨髄由来細胞による、いわゆる血管発生型血管形成の機序が関与する可能性があること、さらに脳虚血巣における血管発生が末梢血中の骨髄由来細胞により促進される可能性があることを示唆している。現在、臨床応用を目指して適切な移植方法・移植細胞数の検討、加えて移植の効果につき検討を行っている。
ベータ崩壊測定によるニュートリノ質量探策に用いる高精度超伝導検出器の開発

本研究の目的はトリチウムのベータ崩壊によるニュートリノの絶対質量探索を行うための高精度超伝導検出器の開発と性能試験を行うことである。トリチウムベータ崩壊測定において従来行われている電磁スペクトロメーター法ではなく、理研で開発されている超伝導トンネル接合素子(STJ)を利用したベータ崩壊電子のエネルギースペクトルの精密測定により、従来の実験に生じる系統誤差から離れた実験を行うことができる。ニュートリノの質量探索実験にSTJを用いるためには、検出面の大面積化とエネルギー分解能の改善という2点が重要で、本研究ではこの点の向上を目指した開発を行い、また性能試験のために中性子ビームラインを用いた測定ポートの整備を進めた。2006年度では、原子力機構の原子炉JRR-3において新たな中性子ビームポートの整備と開発を行った。これは従来のビームポートでは中性子と周囲の物質との相互作用によるガンマ線バックグラウンドが多く、性能評価が難しかったためである。この新ビームポートにおいて従来のポートに比べ周囲からのガンマ線バックグラウンドを1/10程度以下に抑えることができた。超伝導トンネル接合素子については大面積500ミクロン角素子の開発を進め、7割弱程度の歩留り率を達成できた。2年にわたる研究期間において、検出器の大面積化や性能試験環境の整備を行うことができた。より高エネルギー分解能を目指すための新たな材質を用いた超伝導接合素子の完成は、今後の課題である。超伝導トンネル接合素子(STJ)は従来X線の測定に主として用いられてきたが、トリチウムのベータ崩壊測定においては低エネルギー重粒子の測定を行う必要がある。トリチウムは希少であり、水蒸気として容易に拡散する放射性元素であるためSTJのテストとしてトリチウムを用いることは容易ではない。そこでSTJを用いたベータ崩壊粒子測定テストとして原子力機構3号炉の熱中性子ビームのベータ崩壊を利用することとした。このテストにおいては中性子ベータ崩壊の測定自身が素粒子の標準理論の検証につながるという副次的な成果も期待できる。このため原子力機構の熱中性子ビームラインを改造し、基礎物理ポート(JRR-3 T1-4ビームライン装置名NBD)の建設を行った。この基礎物理用ポートに、100ミクロンおよび200ミクロン角のSTJを設置してベータ崩壊陽子のスペクトル測定を行った。現状は超伝導接合素子の面積が小さく、バックグラウンドのX線が多かったため、有意なベータ崩壊信号は得られなかった。より大面積の素子の作製およびバックグラウンドの低減が必要と考えられる。そこで素子の大面積化を目指し、理化学研究所のプロセスラインを使って500ミクロン角のNb/Al/Al_2O_3/Al/Nb接合の素子開発を行った。素子を構成しているNb,Al積層電極間で発生するリーク電流を従来サイズのSTJと同程度に抑え、素子を安定に動作させることに成功した。ただしエネルギー分解能については、現状では6keVのX線に対し20%となっており従来サイズのSTJにまだおよばないため、作成プロセスの最適化を進めていく必要があると考えている。
グルコース感受性蛍光指示薬を用いた麻酔薬の神経細胞内グルコースへの影響の検証

麻酔薬の血中グルコース濃度への影響を調べるために、経時的な血中グルコース濃度と1,5-アンヒドログルシトールの変化を測定した。同一の麻酔法で同一の手術を受けた糖尿病患者と非糖尿病患者を対象とした。糖尿病患者では同じ手術麻酔を受けても血中グルコース濃度と1,5-アンヒドログルシトールの変化が非糖尿病患者と大きく異なっていた。糖尿病患者への最適な麻酔薬の検証には糖尿病を合併した対象で検証を行う必要がある可能性が示唆された。本研究の目的は、種々の麻酔薬が神経細胞内グルコース濃度におよぼす影響を解明し、それにより糖尿病や神経系に合併症のある患者の麻酔に最適な麻酔薬を見出すことである。神経細胞内グルコース濃度を直接測定する計画であったが、まず投与された麻酔薬が生体のグルコース濃度にどのような影響を及ぼすのか検証した。手術麻酔時は手術侵襲によるストレスのため、内因性のカテコールアミンやステロイドホルモンの分泌が亢進し高血糖を来たしやすい状況にある。この高血糖が麻酔薬によってどのような影響を受けるのか検証した。方法として手術を受ける患者で手術中の血糖値の変動と1,5ーアンヒドログルシトール(1,5ーAG)の測定を行い、まず1,5ーAGが血糖評価の指標となりうるか検証を行った。対象は肝臓切除術を予定された患者とし、同じ手術麻酔法を受けた。糖尿病の有無は血糖の変動に大きく影響するため非糖尿病患者と糖尿病患者は分けて検証を行った。結果として、患者背景に有意差のない群間で比較を行えた。糖尿病患者では非糖尿病患者と比較して手術当日の血糖上昇率は有意に高かった。非糖尿病患者、糖尿病患者とも1,5ーAGは手術前と手術翌日では有意に低下した。非糖尿病患者では1,5ーAGの低下率は手術当日の血糖上昇率と有意な相関が認められたが、糖尿病患者では相関が認められなかった。糖尿病患者では同じ手術麻酔を受けても血糖値、1,5ーAGをはじめとした生体内での反応が非糖尿病患者と大きく異なっていることが確認された。糖尿病患者への最適な麻酔薬の解明には糖尿病を合併した対象で検証を行う必要がある可能性が示唆された。本研究の目的は、神経細胞において蛍光プローブを用いて細胞内グルコース濃度を経時的に測定し、種々の麻酔薬の細胞内グルコース濃度におよぼす影響を解明し、それにより糖尿病や神経系に合併症のある患者の麻酔に最適な麻酔薬を見いだすことである。1)グルコース感受性蛍光プローブを用いて麻酔薬による細胞内へのグルコース取り込みへの影響を検証する。これらのデータ取得は蛍光顕微鏡(Nikon、Ti-μ)および蛍光イメージング装置(AQA cosmos、浜松ホトニクス)を用いて行う。また、本測定のために対物レンズスーパーフルオール(Nikon)ならびに対物レンズプランフルオール(Nikon)を購入し、蛍光顕微鏡のセッティングを行った。また、蛍光イメージング装置で測定された蛍光量の解析のためにノートパソコンLIFEBOOK SH54/H(FUJITSU)を購入した。当初の標的細胞としてラット後根神経節(DRG)細胞を選択し、採取するSDラット(九動)を購入し細胞の採取ならびに細胞内グルコース濃度の測定を行った。研究の前段階として正常状態における細胞内グルコース濃度の測定を行わなければならない。その結果を用いて検量線を作成し、麻酔薬を作用させた際の細胞内グルコース濃度の変化を算出する必要があるからである。現在、検量線作成のための実験を行っている。しかし、細胞内グルコース濃度測定に至るまでにラット後根神経節細胞の採取に問題が生じ、生存しかつ安定した検体採取が困難であった。採取された検体で細胞内グルコース濃度の測定を行ったが、推定された蛍光量の測定ができず、検体の問題か、蛍光顕微鏡あるいは蛍光イメージング装置の問題か、グルコース感受性蛍光プローブの問題かを検証しつつ測定を繰り返し、検量線の作成を行っている段階である。今後は速やかに検量線を作成し実験を推進する。まずは平成24年度の研究実施計画であった1)グルコース感受性

蛍光プローブを用いて麻酔薬による細胞内へのグルコース取り込みへの影響を検証する。次に2)GFPで標識したGLUT1をHEK293細胞に強制発現させ、蛍光顕微鏡下に、経時的に麻酔薬によるGLUT4のtrans locationを観察するが、この際に平成25年度の研究実施計画であった3)GFPで標識したGLUT4をラット神経細胞に発現させた場合のGLUT4のtrans locationの観察も並列して行い、研究期間の短縮を図る。その後、4)細胞膜分画および細胞質分画それぞれのGLUT4のタンパク量をウェスタンブロット法を用いて定量し、5)インスリン受容体-GLUT4間の情報伝達機構におけるPKCおよびAktの活性化の程度を蛍光イメージング法およびWestern blotting法を用いて解析する。まず標的細胞採取のためにSDラット(九動)の購入ならびに細胞培養液等の消耗品の購入は継続していく。測定困難な原因が蛍光顕微鏡あるいは蛍光イメージング装置にあり、再調整が必要な場合には費用が生じる可能性がある。その他に平成24年度に購入予定であった全反射照明装置(Nikon, TIRF)、また細胞に目的蛋白を強制発現させるために遺伝子導入装置(NEPAGENE, NEPA21)の購入を計画している。本来は平成24年度に購入予定であったが研究進捗状況が芳しくないため平成25年度購入予定とした。同様に標的培養腫瘍細胞および遺伝子、ベクター等の購入を計画している。
ラットリンパ系臓器に対する免疫抑制剤の影響の検討

胸腺ならびにT細胞表面抗原の胸腺における発現の変化を中心に,免疫抑制剤のラットの胸腺での分化成熟における作用を解析し,CyA,FK506,glucocorticoid(GC)において,ラット胸腺内で胸腺細胞の分化,成熟を抑制していることを解析した。また,FK506,GCのラット胸腺細胞における細胞分裂とapoptosisに及ぼす作用を検討し,FK506は胸腺細胞のBrdUの取り込みに影響せず,apoptosisも誘導されなかった。一方,GCは投与開始後すみやかに全体のラット胸腺細胞にapoptosisを惹起した。FK506は,胸腺細胞の分裂,apoptosisには影響を及ぼさず,胸腺細胞数の減少は,移住や動員に影響している可能性が示唆された。GCはラット胸腺細胞全体にapoptosisを誘導し,以前報告した分化,成熟の抑制は再生胸腺の分化過程を示している可能性が示唆された。このような胸腺内細胞分化過程において,apoptosisは重要な役割を坦っているがapoptosis誘導作用について,GCが発現誘導する「死の遺伝子」の存在の実体はいまだに不明で,他のapoptosis誘導経路に必要なP53,nur77,またはFas/Fasリガンドが関与しないとされている。胸腺内において,apoptosis signalがどのように細胞内情報伝達機構を介して核に伝わるかをラット胸腺のGC投与Apoptosisモデルを用いて解析し,胸腺内において,pI 4.0,MW 30Kの蛋白が消失し,pI 4.0,MW 14Kの蛋白が増加することを解析した。研究結果:胸腺組織像:H.E.染色では,FK506投与ラットにおいて胸腺の髄質部分の著しい縮小を認めた。萎縮は髄質全体に及んでいたが,もともとの髄質の残存部にエオジンに淡染する太い繊維様の部分を認めた。DSG投与ラットでは主に胸腺皮質を萎縮させた。まとめ:FK506,DSGをラットに投与し,胸腺,脾臓について検討し,次の結果を得た。1)FK506投与ラットにおいて胸線上皮性細網細胞の障害がみとめられた。2)FK506は,胸腺細胞の分裂には影響を及ぼさず,胸腺細胞数の減少は,移住や動員に影響している可能性が示唆された。3)in vitroおいて,FK506は胸腺上皮性細胞の増殖に影響を及ぼさず,in vivoとin vitroでの作用の違いが見られた。4)FK506は,胸腺内の伝達物質を介して上皮細胞に影響している可能性が示唆された。5)DSGは,胸腺皮質を萎縮させた。
ICG蛍光リンパ管造影法を用いたリンパ浮腫の超早期診断と早期治療、及び病態解明

リンパ浮腫は多くが乳癌や子宮癌の手術後の合併症として発症し、リンパ節郭清や放射線療法の併用はリンパ浮腫の発生を高める。診断・治療開始時はすでに進行してしまっていることが多く、症状軽度、又は未症状のうちに診断をつけることは困難である。また、リンパ浮腫の予防法も未だ確立されていない。今回、ICG検査を用いたリンパ浮腫早期診断法の確立及び、浮腫発症リスク群を見つけるべく、婦人科領域リンパ節郭清患者に対して、術前、術後のICG蛍光リンパ管造影を行い、リンパ流の変化を追った。結果、術前の時点でリンパ流が悪いものは高率にリンパ浮腫を発症した。また、未症状の内にごく早期のリンパ浮腫を示す異常ICG像を認めた。今後、これを用いてリンパ浮腫発症の予測、及び早期診断が可能であると考えられる。リンパ浮腫はリンパ液が何らかの理由によって皮下組織に貯留する結果生じる疾患であり、不治の病として患者のQOLを著しく阻害し、時には生命を奪う恐れのある疾患とされてきた。多くは、悪性腫瘍(子宮癌、乳射線療法)や感染、外傷によるリンパ流の途絶・閉塞により発生する。術後に発生する頻度としては、乳癌手術後に10一30%、子宮後に12-40%である。国内でも約12万人の患者がいるといわれ、進行する浮腫と戦っている。これまでの問題点として(1)リンパ浮腫の確立された診断法がなく、治療開始時期が明確ではない。診断・治療開始時はすでに進行してしまっていることが多い。(2)リンパ浮腫の確立された治療法がなく、発症後は徐々に増悪し治ることがない。(3)リンパ節廓清はリンパ浮腫発生の高リスクであるが、予防的治療が行われていない。これらの問題解決のための初の試みとして、本研究ではICG蛍光リンパ管造影法を用いて次の課題に取り組んでいる。(1)リンパ浮腫の超早期診断法の確立。(2)リンパ浮腫の早期治療を行い、完治を目指す。(3)リンパ節廓清等による高リスク群と予防的治療の適応評価。これはリンパ浮腫治療に関わる初の試みであり、コレラの確率により多くのリンパ浮腫患者のQOLだけでなく、将来的には2次性リンパ浮腫の発症をゼロに抑えることが可能となる。本研究では、ICG検査を用いたリンパ浮腫早期診断法の確立及び、浮腫発症リスク群を見つけるべく、婦人科との連携を行った。婦人科領域リンパ節郭清患者19名に対して、術前、術後にICG蛍光リンパ管造影を行い、リンパ流の変化を追った。術直後はほぼ全例で陰部を中心とした軽度から中等度の浮腫を認めた。その後、術前ICGでの流れが良好であったものは浮腫の改善を認めた。しかし、術前ICGの流れが不良であったものは、術直後より著名な浮腫を認め、一旦は軽快するものの、その後浮腫の進行を認めた。これらの患者に対してはリンパ管静脈吻合術を施行し、良好な結果を得られた。また、術前のICGにてリンパ流不良なものと良好なものがあった。術前リンパ流不良なのはリンパ節郭清後効率でリンパ浮腫を発症すると予測されるようになった。これらは予防的リンパ管静脈吻合術の良い適応となる。婦人科領域

リンパ節郭清患者に対して、術前、術後にICG蛍光リンパ管造影を行い、リンパ流の変化を追った。術直後はほぼ全例で陰部を中心とした軽度から中等度の浮腫を認めたが、ほとんどは2,3ヶ月で改善した。しかし、一部はdermal back flowを呈し、リンパ浮腫を発症していった。Dermal back flowの最初の兆候は"splash"であった。また、術前のICGにてリンパ流不良なものと良好なものがあった。術前リンパ流不良なものはリンパ節郭清後高率でリンパ浮腫を発症した。従って、術前にリンパ流不良なものは予防的治療の良い適応になると考えられた。また、術後のICG所見において"splash"を認めたものはその後全てリンパ浮腫が進行していった。従って、"splash"はリンパ浮腫の最も早期のICG所見であり、早期診断基準になり得ると考えられた。
北限のブナはどこから来たのか？－新発見の最前線創始者集団の由来探索と遺伝子流動－

当初計画ではH30年度に最前線のブナ集団のマイクロサテライトおよびESTーSSR遺伝子座の分析を行う計画であり、これらについて、予定通り分析実験を行なった。北進最前線および既知の北限地帯に生育するブナの成熟期に達している25個体について、隣接する北限集団17集団との類縁関係を比較するために、MIG-seq法による次世代シーケンス解析を行った。その結果、2522座のSNPマーカーを得ることができた。このうち、欠損データ率20%でフィルタリングし、382座を得た。これらの遺伝子座を用いて主成分分析を行った結果、北進最前線の集団では第一軸で大きく分離し、他の北限の小集団が第二軸で大集団と分離した。同様に、個体ベースでの主成分分析でも北進最前線ブナ集団が大きく他の集団から離れる結果を得た。また、過去の集団サイズの増減を分析した結果、各集団で同一時期に集団サイズの減少が起きていることが示唆された。しかしながら、サイズの減少パターンは集団によって違いがあり、集団の歴史的な動態が反映されていると考えられる。また、北進最前線集団の集団サイズが小さいことも明らかになった。これらの結果は、分布北進最前線の小集団では隔離の影響による遺伝的浮動が大きいことを示している。マイクロサテライト92座を用いて集団の遺伝的多様性を分析した結果、最前線のブナ集団では遺伝的多様性の低下が著しいことが示唆された。最前線個体群で採取した種子については個体数が多かったため、本年度は抽出のみを行い、遺伝マーカー分析は次年度に行うこととした。当初計画通りに研究は進捗している。種子のマーカー解析については個体数が多いため、実験の効率を鑑みて、次年度にまとめて分析をすることとした。本研究は現在まで計画通り進行している。今後も研究計画に沿って以下のとおり進める。H31年度は引き続きマイクロサテライト分析を行い、核遺伝子SSR分析および次世代シーケンスのデータと合わせて各種解析を行い、遺伝子流動の実態と北進最前線のブナ集団の由来を明らかにする。以上の結果を総合して、学会発表および論文執筆を行う。2013年に発見された北進最前線のブナ集団において全ての個体から葉を採取し、DNA試料を抽出した。さらに、既知の北限地帯に生育するブナ集団の中から、最も近くの隔離集団、比較的面積の広い集団を選び、成熟木のDNAサンプルを採取し抽出を行った。これらの試料を用いて、ゲノムワイドに情報を得ることが出来るMIG-seq法を用いてNGS解析を行った。合計18集団、192個体のサンプルを用いて、まず、選択的プライマーによって2段階の絞り込みを行い,2522個のSNP推定遺伝子座を得た。これらについてジェノタイピングを行った。北進最前線集団と背後の北限地帯の集団17集団を用いて主軸分析を行ったところ、最前線集団および近隣の隔離集団は遺伝的浮動の影響によって集団分化が著しく起こっていることが示唆された。北進最前線集団は背後の北限集団内の比較的広い面積の集団に近縁な遺伝的変異を持つことから、これらの集団に由来する可能性が示唆された。コアレッセント解析に用いる使用するマイクロサテライト(SSR)遺伝子座は,12座の核SSRの分析は終了した。さらに、87座のEST-SSR遺伝子座について、マルチプレックスセットの開発を行った。集団の世代構成を調べるために大径木を中心に年輪解析用のコアサンプルを採取した。コアサンプルの解析結果から、最前線集団は1900年代初頭に侵入定着したことが示唆された。下層の若木については芽鱗痕を数えることによって年齢を推定した。芽鱗痕が確認できない下層木については既存のデータから樹齢を計算式によって割り出した。以上の結果から、北進最前線集団では約3世代の世代交代が行われていることが示唆された。当初計画ではH29年度に最前線ブナ集団の全ての個体からDNA試料を採取し、代表的な成熟木から年輪解析用コアサンプルの採取を行う予定であった。これらについて、予定通り試料採取を終了した。分析実験に関して、予定していた次世代シーケンス解析は目的集団および北限地帯を代表する集団について192個体の分析を終了した。さらに、次年度行うマイクロサテライト遺伝子座について12座の分析を終了した。さらに87座のEST-SSRについて研究対象集団での増幅の検討を終了した。以上、当初計画通り順調に進んでいる。

これらの結果は、分布北進最前線の小集団では隔離の影響による遺伝的浮動が大きいことを示している。マイクロサテライト92座を用いて集団の遺伝的多様性を分析した結果、最前線のブナ集団では遺伝的多様性の低下が著しいことが示唆された。最前線個体群で採取した種子については個体数が多かったため、本年度は抽出のみを行い、遺伝マーカー分析は次年度に行うこととした。当初計画通りに研究は進捗している。種子のマーカー解析については個体数が多いため、実験の効率を鑑みて、次年度にまとめて分析をすることとした。本研究は現在まで計画通り進行している。今後も研究計画に沿って以下のとおり進める。H30年度の研究計画では最前線のブナ集団のマイクロサテライトEST-SSR遺伝子座の分析を行う。H29年度に増幅が確認された遺伝子座すべてについて、18集団を対象に分析を行う。核遺伝子SSR分析および次世代シーケンスのデータと合わせてコアレッセント解析を行い、北進最前線のブナ集団の由来を明らかにする。H31年度は年輪解析を行う。また、種子の遺伝子分析と親子解析を行い、遺伝子流動の実態を明らかにする。以上の結果を総合して、学会発表および論文執筆を行う。H31年度は引き続きマイクロサテライト分析を行い、核遺伝子SSR分析および次世代シーケンスのデータと合わせて各種解析を行い、遺伝子流動の実態と北進最前線のブナ集団の由来を明らかにする。実験試薬および実験用ディスポーザブル製品がキャンペーンなど予算より安価で納入されたために、差額が生じた。次年度の助成金と合わせて、実験消耗品の購入に使用する計画である。ターゲットとする分布最前線個体群で採取した種子の数が多かったため、遺伝マーカーの分析は次年度にまとめて効率よく実験を行うこととした。そのため、分析用試薬購入のための物品費と実験補助の謝金を次年度に使用することとした。次年度は当初計画していたマイクロサテライト分析に加えて種子の分析を行う。
サンゴ礁魚類保全のための生息地パッチ群の評価：メタ群集理論と種数面積関係の応用

サンゴ礁礁池の81リーフとスズメダイ科魚類全種を対象に種数面積関係とリーフ高、競争優位種の縄張り、競争劣位種のリーフ間移動を調べた。その結果、背の高い大リーフでは競争種は立体的に棲み分けていた。ハナナガスズメダイは競争優位種であり、大リーフ平面を占拠し、クロソラスズメダイ(Sn)は競争劣位種であり、背の高い大リーフでは側面を利用したが、中リーフでは共存しなかった。Snは大半のリーフに生息し、分散種であった。浅い礁池では、リーフ高は最大で2m程であり、大面積からの予測より生息種数は少なかった。大リーフ側面や小リーフが競争劣位種の逃避所となり、種数体積関係は総生息種数を予測する有効な指標である。84リーフに生息するスズメダイ科魚類のメタ群集について、平成23年度までに種数面積関係にリーフ高を加えると生息種数の予測精度は上ることがわかった。しかし、その理由は不明瞭であった。平成24年度には、高い大リーフを斜め上より水中で撮影し、その画像を観察板として、競争優位3種(クロソラスズメダイ、ハナナガスズメダイ、スズメダイモドキ)の行動(空間配置と攻撃頻度)を繰り返し観察し、統計的に十分なデータを取得した。行動圏のオーバーレイによって立体的棲み分けを明示できた。低い大リーフでは、競争優位3種は共存できるものの種間攻撃頻度が高く、摂餌頻度が低下することも明確にできた。大リーフでは、生息種数は多いが競争優位種の空間占拠による負の影響が大きく種密度は低下した。高い大リーフでは、立体的棲み分けにより競争の影響が緩和された。以上の結果をJournal of the Marine Bilogical Association of the United Kingdom(JMBA)に投稿し、一部修正後に受理の見通しとなっている。これと並行し、競争劣位種が分散優位種なのかどうか、ミナミイソスズメダイを中心に個体識別法によってリーフ間移動パターンを調査したが、実際には移動が見られなかった。立体的棲み分けの成果について、24年度7月の国際サンゴ礁シンポジウム(ICRS 2012:豪州ケアンズ)にて研究発表を行う際、Princeton大学のPinsky博士により「仔稚魚期の分散種が競争劣位種なのではないか」と指摘され、また、博士のご厚意により、サンプルがあればDNAを用いた個体群の分散/定住比を解析してくれることになった。そこで、リーフ間での成魚の移動が希な競争劣位種について、北限個体群(愛媛県南部)で採集を行い、石垣島等の亜熱帯に適応した個体がどの程度混入しているのか現在確認中である。次年度までの調査により、それまでの研究によって判明していた「大リーフでは種数面積関係から予測されるよりも生息種数が少ない」ことについて、その理由を明らかにすることができた。すなわち、大リーフでは藻類食魚の種間競争が激しく、背の高いリーフでは競争劣位種はリーフ側面を利用して競争を回避できるものの、平坦なリーフでは共存ができない。サンゴ礁の礁池では水深が浅いため、大リーフは相対的に平坦なリーフとなり、結果的に面積から予測されるよりも生息種数が少なくなる。この成果を平成25年度、Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom誌に公表した。しかし、最終年度に行った競争劣位種の個体識別追跡調査により、当初の「競争劣位種はリーフ間の移動によって競争を回避するため中小リーフの存在は総生息種数を高める」という仮説は、競争劣位種が基本的にリーフ間を移動しなかったので支持されなかった。しかし、個体数の多い種の中に、生息リーフ数が非常に少ない種と多い種が存在し、前者は競争優位種、後者が分散優位種として認識できることがわかった。この特徴により、これまで注目されてこなかった種間競争が浮き彫りになった。例えば、デバスズメダイとクラカオスズメダイは共にサンゴ礁に分布し、エダサンゴに共存もするが、本研究から、デバスズメダイは競争優位種(分散劣位種)で最適な生息場所に大群を形成するが、クラカオスズメダイは分散優位種(競争劣位種)でデバスズメダイとの競争を回避して最適ではない場所に幅広く生息する。競争劣位種にとっては定着時のリーフ選択が定着後のリーフ間移動よりも重要であると推察された。このようにメタ群集の理論『競争と分散の種間トレードオフ』から予測される一般的傾向がサンゴ礁魚類に適用でき、種数面積関係の特徴を説明できた。この点に関して成果をまとめ、国際誌に投稿予定である。石垣島白保サンゴ礁に散在する84個のパッチリーフにおけるスズメダイ科魚類全種のメタ群集についての前回の基盤研究によって、種数面積関係にリーフ高を加えると、生息種数の予測精度を向上させられることが示唆された。

しかし、空間を占拠する競争最優位種(縄張り制藻類食魚)3種の中の1種だけが統計的には生息種数に負の影響を与えているにすぎず、また他種とは立体的に棲み分けているようであり、なぜリーフ高×面積から生息種数が予測できるのか明らかではなかった。今回、種数体積関係を再調査して確かめた上で、競争優位種の種間行動等を立体的リーフにて観察した。局所群集内での種間相互作用や局所群集間での移動を把握するために、競争優位種(縄張り制)5種、すなわち、クロソラスズメダイ、ハナナガスズメダイ、スズメダイモドキ、ハマクマノミ、カクレクマノミを対象に、標識等によって個体を識別し、15分間の行動観察を繰り返し、さらに3ヶ月間の移動個体を調査した。スズメダイモドキのみが15分間に隣接パッチに移動するが他種は基本的に移動せず、3ヶ月間の調査では5種ともに希にしか移動しなかった。このうち移動が希なカクレクマノミ1種に注目し、イソギンチャクを生息地パッチと見なしたメタ個体群について、その面積と個体数、体長との関係を解析した。その結果、大パッチほど総個体数や総体長は大きいが、劣位個体は成長を犠牲にすることにより優位個体と共存し、大パッチでは種内競争が大きいことがわかった。この成果はBehavioral Ecology誌に受理された。この成果をメタ群集に適用したところ、興味深いことに、大パッチでは総個体数や総生息種類数は多いが、大パッチでは優位種の空間占拠により生息種数に負の影響を与えるため、種密度が低くなること、高さのあるパッチでは立体的棲み分けにより、優位種の負の影響が緩和されることがわかってきた。平成24年度までに、なぜ種数面積関係にリーフ高のデータを加えると生息種数の予測精度が上がるのかについて明確に説明できるようになった。このデータ解析には、平成23年度に購入したパソコンや統計ソフトを利用し、また、データの収集・整理・解析には、平成24年度に購入した図鑑類や統計学、海洋生物学等の専門書を活用した。競争優位種の立体的棲み分けについて、平成24年に豪州ケアンズでの国際学会(ICRS 2012)と水産大学校での日本魚類学会で報告した。その報告内容を国際誌(JMBA)に投稿した。原稿は英文校閲の後、投稿・修正・再投稿を経て、現在、一部修正後に受理の見通しとなっている。しかし、競争劣位種が分散優位種となっているのかどうかについては、実際に野外で調べた結果、むしろ「リーフ間移動を個体毎に識別して23年追跡するだけでは明らかにできないのではないか」ということがわかってきた。実際には近距離のリーフ間で移動しない種類が幼生期に大きく移動する場合があり、ICRS 2012における議論の結果、Princeton大学のPinsky博士のご厚意により、競争劣位種の北限個体群を対象に、現在この点を分析・確認中である。したがって、大リーフで低い場合に種密度が低下する理由は「競争劣位種の浮遊幼生稚魚が大リーフへの定着を避けるため」であると言う別の仮説を得ることができた。しかしながら、本研究の目的は、メタ群集理論、特に競争と分散の種間トレードオフに注目しながら、大リーフでの種間競争の実態から種数体積関係を規定する仕組みを明らかにし、サンゴ礁魚類保全のための生息地パッチ群の評価方法を確立することである。
高等植物遺伝子のタッギングの為の基礎研究

一定のDNA断片を高等植物染色体上の遺伝子内に挿入して不活性化させ、挿入DNA断片を不活性化された遺伝子と連鎖させる遺伝子タッギング法は、挿入DNA断片をプロ-ブとするサザンハイブリダイゼ-ション法などにより不活性化された遺伝子の検出やクロ-ン化が容易に行えるため、未知の遺伝子の同定、マッピング、クロ-ン化、発現調節機構の解明などに有効な手段となり得ると思われる。本研究では、プロモ-タ-を持たない薬剤耐性標識遺伝子を含むDNA断片や、トウモロコシの転移因子Ac/Dsをタバコなどのプロトプラストに直接法で導入し、形質転換体を得て植物個体を再生してトランスジェニック植物を作出し、種子繁殖を行い、再生個体や次世代植物中での導入DNA断片の安定性を検討して、高等植物タッギングのための基礎的デ-タを得ようとするものである。(1)遺伝子タッギングにおいて、導入DNA断片と不活性化された遺伝子の両者が共に安定に次世代に伝達されることは重要な要件である。プロモ-タ-を持たぬ導入薬剤耐性標識遺伝子が植物遺伝子のエキソンに挿入された場合の安定性を検討するためのモデル実験として、ハイグロマイシン耐性(Hm^rとカナマイシン耐性(Km^rの両耐性遺伝子がdicistronic mRNAの生成により発現されるようなプラスミドをタバコに導入、両耐性を示すトランスジェニック植物を得て種子繁殖を行った。現在両耐性遺伝子の次世代への伝達様式を検討中である。(2)トウモロコシの転移因子AcやDsを遺伝子タッギングに利用するために、これら転移因子が転移に伴って切り出されるとHm^r遺伝子が活性化されるようなプラスミドをプロトプラストに導入し、活性化されたHm^r遺伝子を指標として形質転換体を分離した。現在トランスジェニック植物の作出と転移因子の転移能を検討中である。
13、14世紀東アジア諸言語史料の総合的研究 元朝史料学の構築のために

本研究の目標は、素材や言語について多様な性格を有する13,14世紀の東アジア史史料について、さまざまな言語や地域の専門家の共同により、総合的な史料学を構築することであった。この3年間、我々は、国内はもとより、中国、台湾、韓国、フランスなどに存在する史料を調査し、それを共同で検討した。具体的な作業としては、1史料の現状把握と目録の作成2新史料の紹介を通じて、元朝を中心とするこの時代の東アジアの史料について、全体像を学会に提供することを目指した。研究の重点は、この時代の特徴的な史料である石刻に置かれ、現地調査によって情報を得た多くの石刻を共同で読み、その成果を学界に提供した。また、この時代の史料学の現状と将来のあるべき姿について、デジタル化、国際化などをふまえて、明らかにした。研究会を通算26回開催し、石刻史料については、この研究により現地調査から録文、読解にいたるシステムについての共通の認識が得られた。また、典籍史料については、すでにそのほとんどが知られていると思われがちであるが、未紹介の文献がいまだ見出されるとともに、既知の資料の中にも未開拓の部分があることを、明らかにできた。後者の例としては、事林広記の研究をあげることができる。文書については、我が国では利用されていない、鴿子洞文書を共同研究し、その価値を紹介した。もう1つの目標であった諸言語史料の総合化については研究途中で終わったが、パスパ碑文については、世界的な史料状況を整理できた。また、モンゴル帝国における諸言語についての知識を有する研究者の共同作業を実現したことは、漢語史料の利用において大きな力を発揮した。16年度の目標は、史料の基礎調査とデータの共有化であった。近年中国で多数出版される石刻資料集を、国内書店経由だけではなく、現地でも収集し、その内容の目録を作成し、公刊した。海外の研究機関所蔵資料については、国家図書館(パリ)、国家図書館(台北)、中央研究院歴史語言研究所(台北)での調査をおこない、現地調査は、中国の北京、山東、陝西、山西、浙江、江蘇、福建などでおこなった。これらの調査で、新資料はもとより、既知資料についても、より良好な状態のものを少なからず収集しえたほか、台湾、中国、アメリカなどの元朝史学界を代表する研究者との意見交換の機会を持ち、本研究への協力要請をおこなうことができた。また、メンバーの過去の調査写真のDB化作業、および、内外の研究機関における所蔵石刻拓本の調査と、入手可能な画像の入手によって、資料の共有作業をスタートさせた。定例の研究集会は8回開催し、石刻史料の輪読、現地調査の報告、メンバー外の関係諸分野の研究者の研究報告を受けた。研究集会に本科研メンバーだけではなく多数の若手研究者の参加を得たのは、学の継承という本研究の目的の1つを具体化できたと考える。また、これらの研究活動の成果公開の場として、"13,14世紀東アジア史料通信"を創刊し、本年度は3号の刊行をみた。第1号掲載の徳永の「耶律鋳夫妻墓誌」録文訳註は、研究集会での共同作業の最初の成果であり、同史料の世界初の訳註・活字化である。また、3号の村岡論考は、ある石刻の記述からクビライの庶弟の子孫とその投下領についての新知見を提供した。掲載した他の現地調査報告や資料目録も、研究情報の学界での共有化という観点から意義が大きいと考えている。本年度の史料調査およびそれに基づく研究成果については、来年度以降も"史料通信"および学会誌等において逐次公開の予定である。17年度においては、16年度から継続しての史料の基礎調査とともに、それを踏まえての成果の刊行にも努めた。

中国刊行の石刻資料集の調査収集、内容の目録化を継続し、公刊した。国内では、京都大学人文科学研究所や大阪外国語大学石浜文庫などの所蔵資料の調査をおこない、海外の研究機関所蔵資料については、韓国ソウルの奎章閣、誠庵文庫の共同調査、各メンバーによる中国各地の図書館の調査をおこなっている。現地調査は、中国の北京、山西、河南、河北、遼寧、内蒙古、韓国の江華島などでおこなった。これらの調査で、いくつかの学界未紹介の新資料を報告でき、既知資料のより良好な状態のものを少なからず収集しえたのみならず、史料の現況とそれを取り巻く環境についても知見を深めた。海外との交流では、今年度は中国が主となり、とくに中国社会科学院を中心とする元朝史研究関係者と数度の意見交換の機会を持つことができたのは意義が大きい。また、調査成果や各種DBからの電子テキストの収集による資料の共有作業、各自のかつての調査資料のデジタル化も継続しておこなっている。定例の研究集会は8回開催し、史料の輪読、現地調査の報告などをおこなった。学の継承という本研究の目的の1つの具体化のため、研究集会に多数の若手研究者の参加をみただけではなく、現地調査についても参加、協力を得た。また、NEWSLETTER"13,14世紀東アジア史料通信"は、4-6号を刊行し、調査の報告や研究成果の報告の場とした。掲載した報告には、新知見が少なくなく、また史料目録の類もこの時代の研究者にとって有用なものであると自負している。前年度、本年度の調査およびそれに基づく研究成果については、来年度以降も"史料通信"および学会誌等において逐次公開の予定である。また、森田が概説書『中国の歴史・下』(昭和堂)の共編者となり、本研究から3名が執筆したのも、成果の公開の点で有意義であったと考える。研究の最終年度にあたる本年度は、報告論文集の作成を目標に、研究集会を合計9回開催した。また、台湾、中国などで海外調査をおこなった。その一方で、史料の基礎調査の取りまとめとともに、それを踏まえての成果の刊行に努めた。研究活動の主たる内容としては、中国刊行の石刻史料集の調査収集、内容の日録化、大阪外国語大学石浜文庫の所蔵資料の調査などをおこなった。最終年度であるため、過去2年よりは海外調査の数は減らしたが、史料所蔵関としては、台北の国家図書館や故宮でのメンバーによる補完的な共同調査をおこなうとともに、中国では、北京、山西、河南、陝西、遼寧、新募などでの現地調査をおこなった。今年度においても、いくつかの学界未紹介の新資料を報告できたのみならず、史料の現況とそれを取り巻く環境についても知見を深めることができた。また、本研究の目的としている調査成果や各種DBからの電子テキストの収集による資料の共有化の作業も継続している。研究集会では、石刻史料を中心とした史料の読解、現地調査の報告などとともに、研究成果論文作成のための予備報告の場とした。学の継承という本研究の目的の1つの具体化のため、本年度も研究集会に多数の若手研究者の参加をみた。NEWSLETTER"13,14世紀東アジア史料通信"は、第7号を刊行したが、今回は新出の鴿子洞文書に関係する論考を中心としたものであり、掲載した史料日録の類とともにこの時代の研究者にとって有用なものであると考える。また、3年間の共同研究の成果として、研究参加者の論文・史料目録11篇を、成果報告書に掲載することができた。
青年期肥満者の食行動異常において摂食関連ホルモンが脳内ドパミン報酬系に及ぼす影響

肥満の維持・増悪には、空腹ー満腹感によらない食の報酬的側面が関与している。その機序として、脳内報酬系起始核である腹側被蓋野(ventral tegmental area: VTA)におけるドパミンとアディポカインの相互作用の可能性が推測される。マウスを用いた電気生理学的実験から、以下の研究結果を得た。(1)VTAドパミン神経において、レプチンは直接的な神経活動抑制に加え、ドパミン受容体機能に対する減弱効果を有する。(2)高脂肪食負荷肥満マウスにおいて、このレプチンによる直接的抑制からの回復時間は体重依存的に短縮する。[研究成果の具体的内容]マウスの脳スライス標本に細胞外記録法を用いて、摂食関連因子であるレプチンが脳内食報酬中枢である中脳腹側被蓋野(ventral tegmental area: VTA)ドパミン神経に及ぼす機能変化を電気生理学的に検討した。レプチンのVTAドパミン神経に対する効果として、以下の3点を明らかにした。(1)レプチンは、投与初期の一過性興奮に続き持続性抑制の2相反応を示した。レプチンによる初期一過性興奮はシナプス前反応によるもので、グルタミン酸作動性興奮性シナプス伝達の関与が示唆された。レプチンによる持続性抑制はシナプス後反応による直接的なもので、K+チャネルが関与していた。(2)電気生理学的かつ薬理学的に同定したVTAドパミン神経は、更に、レプチン応答性神経(75%)とレプチン非応答性神経(25%)に分類された。レプチン応答性神経とレプチン非応答性神経の間には、ドパミンD2受容体作動薬に対する感受性や活動電位(action potential:AP)電流の発生頻度やAP電流幅などの電気生理学的特性に違いがみられた。(3)高脂肪食負荷肥満マウスのVTAドパミン神経は、非肥満マウスのものに比べて、レプチンによる抑制効果の減弱やレプチン非応答性神経の割合が増加していた。[研究成果の意義と重要性]本研究は、VTAドパミン神経に対するレプチンによるシナプス前・シナプス後2相性変化を世界で初めて明らかにした。また、その細胞内機序を薬理学的に同定することに成功した。さらに、肥満マウスVTAドパミン神経のレプチン応答性に関して、「レプチンードパミン相互作用」という概念を導入し、食行動異常の是正を柱にした肥満治療薬開発に関して基礎的知見が得られるのではないかと考えられる。[研究成果の具体的内容]マウスの脳スライス標本に細胞外記録法を用いて、脳内食報酬系中枢である腹側被蓋野(ventral tegmental area: VTA)ドパミン神経における「レプチン-ドパミン相互作用」を証明した。(1)摂食関連ホルモンであるレプチンは、レプチン受容体を介して直接的にVTAドパミン神経活動を抑制した。このようなレプチンン応答性神経は、全VTAドパミン神経の65%を占めた。一方、レプチンによる抑制効果のみられないレプチン非応答性神経は、全VTAドパミン神経の35%を占めた。(2)全VTAドパミン神経において、ドパミンはD2受容体を介してVTAドパミン神経活動を抑制した。(3)レプチン応答性神経にレプチン処理を行うと、ドパミンによる神経活動抑制は有意に減弱した。しかし、レプチン非応答性神経では、このような反応はみられなかった。(4)レプチン応答性神経におけるレプチン処理後のドパミン効果減弱は30分以上にわたり観察された。[研究成果の意義と重要性]本研究成果から、神経伝達物質ドパミンと抹消アディポカインであるレプチンが食報酬中枢であるVTAで相互作用を及ぼすことが分かった。今後、肥満モデルマウスにおいても同様の実験を行う。「レプチン-ドパミン相互作用」を軸として、肥満の食行動異常の中枢機序を解明できれば、新規肥満治療薬開発に基礎的知見を提供することが可能ではないかと考えられる。[研究成果の具体的内容]高脂肪食負荷肥満マウスの脳スライス標本に細胞外記録法を用いて、脳内食報酬系中枢である腹側被蓋野(ventral tegmental area: VTA)ドパミン神経における「レプチンードパミン相互作用」を調べた。非肥満マウスと比較して肥満マウスでは、このレプチンードパミン相互作用が減弱していた;(1)レプチン応答性VTAドパミン神経は、全VTAドパミン神経の65%を占め、この割合は肥満マウスと非肥満マウスの間で差がなかった。(2)肥満マウスと非肥満マウス両群において、レプチン応答性VTAドパミン神経にレプチン処理を行うと、D2受容体を介したドパミン自己抑制効果の減弱がみられた。(3)このレプチンによるドパミン自己抑制減弱効果持続時間は、非肥満マウスと比較して肥満マウスにおいて有意に短縮していた。[研究成果の意義と重要性]本研究から、神経伝達物質ドパミンと末梢性アディポカインのレプチンが食報酬中枢であるVTAで相互作用を及ぼし、この相互作用は肥満で減弱することが分かった。本研究結果は、「末梢ー中枢連関」の視点から肥満における食報酬系機能異常を明らかにし、今後の新規肥満治療薬開発に基礎的知見を提供できると考えられる。