hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体計測に整合するナノチューブの形成と次世代バイオセンサへの応用

カーボンナノチューブは、ナノメートル領域におけるセンシングに適した多くの優れた特徴を有する。特に、半導体性ナノチューブの電界効果トランジスタ構造(field-effect transistors, FET)においては、そのコンダクタンスがキャリア密度に非常に敏感であるため、センサー用途に非常に適している。ナノチューブ・トランジスタは、Kongらによってガスセンサーに応用した例が報告されている。しかしながら、生体系分子の分析には、ほとんどの場合、水中環境が要求される。無機半導体デバイスや有機半導体デバイスにとって、水は悪影響を及ぼす原因となる。ナノチューブもこの例外ではない。このため、ナノチューブを水に暴露した状態で、そのコンダクタンスを安定して計測するための手法を確立することは非常に重要である。本研究では、単層カーボンナノチューブをチャネル層に用いた電界効果トランジスタを形成し、電極を保護するユニークな手法を施した結果、カーボンナノチューブのコンダクタンスを電界効果構造で水中において計測することに成功した。カーボンナノチューブは気相堆積法によってパターニングを施した基板の上に形成される。そして、電極は、シャドーマスクによって形成される。我々は、ナノチューブ・トランジスタにおいて、水を媒体とした特性の劣化は、主としてコンタクト領域においておこることを見出した。今回の実験では、このコンタクト領域は、疎水性の感光性エポキシでコーティングが施され、水による劣化が最小限になるようになっている。コーティングを施した後、ソース・ドレイン電極の間の真ん中当たりにスリットを開けた。このようにして、ナノチューブのチャンネル層のみが直接水に暴露された場合に、デバイスの水への応答は閾値電圧がシフトすることを見出し、これは可逆的でかつ再現性があることを見出した。ナノチューブの化学センサー応用を進めるため、単層カーボン・ナノチューブの熱CVD形成と、そのFETへの応用を進めた。単層ナノチューブは常圧CVDによってパターニングを施したシリコン基板上に形成される。この手法は、Honjie Daiらによって開発されたものをベースにして、条件を最適化した。まず、100nmのSiO2を有するN型ドープシリコン基板の上に、触媒のパターニングを施す。ここで、レジストをスピンコートした後、フォトリソグラフィーマスクを通して、エキシマレーザ(KrF,λ=248nm,20mJ/pulse,20Hz)を4分間照射し、現像する。アルミナでサポートされたFe/Moの触媒をメタノールに溶かし込み、PMMAのパターンの上にのせる。アセトンでリフトオフし、触媒のパターニングを完成させる。ここで、直径4μmの島状の触媒が縦18μmで横50μmの繰り返し周期でできる。この基板をCVDの炉に入れてナノチューブを形成する。ここでは、直径1インチの石英管を用いる。まず、基板温度を850°Cに昇温して、アルゴンガス(1l/min)と水素ガス(100ml/min)の混合ガス雰囲気下で30分間保持する。引き続き、メタンガス(500ml/min)アルゴンガス(50ml/min)と水素ガス(500ml/min)の混合ガス雰囲気下で、5分間ナノチューブを合成する。ナノチューブを合成後、直ちに、基板にメタルマスクをのせて、ソース・ドレイン電極を形成し、トランジスタ構造を完成させる。本手法はレジスト・フリープロセスであるので、ナノチューブの表面がきれいであり、On状態の2端子抵抗測定で80Ω以下の良好な特性が得られた。
持続型テキスト分類学習のためのフィードバックナビゲーション

本研究では,テキスト分類学習における訓練データの準備に要するユーザの負担を軽減するための方法の開発を目的とし,トランスダクティブ学習を利用したクエリ拡張,制約付きクラスタリングにおける制約選択,アクティブ学習を利用したスパムフィルタリングなどの研究を主に行った.各研究とも従来手法に比べより良い手法を提案することができた.本研究では,テキスト分類学習における訓練データの準備に要するユーザの負担を軽減するための方法の開発を目的とし,トランスダクティブ学習を利用したクエリ拡張,制約付きクラスタリングにおける制約選択,アクティブ学習を利用したスパムフィルタリングなどの研究を主に行った.各研究とも従来手法に比べより良い手法を提案することができた.本年度は,主に2つのテーマに関する研究を行った.「トランスダクティブ学習による最小文書判定からのクエリ拡張」に関する研究では,情報検索を行う際のユーザフィードバックとして適合文書が1つ見つかるまでの最小文書判定情報しか与えられない場合に有効に機能するクエリ拡張方法を提案した.提案手法の特徴は,最小のフィードバック情報から適合文書である可能性の高い他の文書を見つけ出すためにトランスダクティブ学習のSGTアルゴリズムを利用する点と単語のスコア計算を行う際に不足する統計情報を補うため複数の学習結果を重ね合わせて単語のスコア計算を行う点にある.実験において標準的な手動フィードバック型,擬似フィードバック型クエリ拡張方法と比較した結果,提案手法は初期検索結果が良くない場合に効果を発揮することが分かった.また,「文字列解析に基づくネットワークトラフィックデータからの異常発見」に関する研究では,ネットワーク上の異常トラフィックを,時系列データの文字列表現手法を用いて検出する方法を提案した.文字列表現による異常発見方法としてマルコフモデルによる方法が既に提案されているが,ネットワークデータに適用した場合,誤検知が多く,これをそのまま使用すると発見効率が悪い.このため,マルコフモデルによって列挙された文字列集合にクラスタリングによるはずれ値検出手法を適用することで,誤検知を取り除く方法を提案した.実際にトラフィックデータを使用した実験を行った結果,提案手法の有効性を示すことができた.本年度は,まず前年度に引き続き「トランスダクティブ学習を利用した最小ユーザフィードバックによるクエリ拡張方法」について研究を継続した.本年度は特に既存の高性能なクエリ拡張手法(言語モデルをベースにした手法)との比較実験を行い,その結果を論文にまとめた.比較実験において,提案手法は全体的な検索精度については比較手法とほぼ同等の結果を示した.また,提案手法は,比較手法に比べて拡張単語数が圧倒的に少なく,検索に要する計算コストが少なくて済むという利点があるという結論が得られた.従来のフィードバックを利用した検索改善方法はフィードバックコストが考慮されておらず,実際の利用を考えた場合にユーザに大きな負担を強いることが予想されたが,本研究では現実的なフィードバックコストでフィードバックがない場合よりも性能を上げることができており,他の対話的なシステムへの応用についても期待することができる.次に,Connectivity Kernelを利用したクラスタリングへの制約付与方法について検討した.クラスタリングでは,一般にクラスタ内距離(クラスタ内メンバー間の距離の総和)とクラスタ間距離(クラスタ中心またはクラスタ代表点間の距離)を減らすことでよいクラスタが得られるとされているため,我々はこの2つの距離を減らすことができる制約を選択する方法を提案することとした.また,クラスタ間距離として2クラスタ間にSVMによって作成した超平面からのマージンを利用することで,uncertainty samplingによる制約選択を行うこととした.本年度は, Connectivityカーネルを利用した制約付きクラスタリング方法とアクティブ学習を利用したスパムフィルタリング方法についての研究を行った.Connectivityカーネルを利用した制約付きクラスタリングでは,制約を利用してデータ間の距離を調節するアプローチに基づき,具体的な調節方法としてConnectivityカーネルを利用する方法を提案した.また,従来研究では不十分であったクラスタリングにおける効果的な制約選択方法について検討を行い,意外性の基準に基づいた制約選択方法を提案した.実験を行った結果,カーネルの効果及び提案した制約選択方法の効果を確認することができた今後は本研究での基礎的な結果をもとに,制約選択の効果について理論的な背景についても明らかにする必要がある.アクティブ学習を利用したスパムフィルタリングでは,スパムフィルタ学習におけるアクティブ学習の効果について調べた.スパムフィルタリングを行うには,フィルタの学習が欠かせないが,ユーザがある程度の数のスパムをシステムに教え込まねばならず,負担を感じるユーザも少なからずある.このためアクティブ学習によりフィルタ学習に効果的なデータのみをユーザに判定してもらうことで,システムに教え込むデータ数をできるだけ抑えることが期待でき,ユーザの負荷の軽減につながる.本研究では, Naive Bayesと期待損失に基づくデータ選択方法について実データを使用した実験を行い,アクティブ学習の効果を確認した.
高齢者の転倒を防ぐ-身体能力と運動認知能力の関連-

本研究は,高齢者の転倒を予防するために,身体運動能力だけでなく高齢者特有の認知を視野に入れ,運動と認知が相互にどのように影響し合い,転倒へと結びついてしまうのか,という問題の一端を理解することを目的とした実験的研究である.前年度までに,運動認知を測定する運動課題は跨ぐ動作,運動認知の評価にはアフォーダンスの知覚を用いることが,研究遂行上安全かつ簡便に評価が可能であると分かった.よって,本年度は,跨ぐ動作時の身体運動能力と運動認知との関連を定量的に調査した.対象は地域在住高齢者とし,過去一年間の転倒の有無,転倒恐怖感,身体バランス能力,前頭葉機能,足趾筋力,重心動揺などを測定した.また,跨ぐことが可能であると判断する最大の高さ(推定値)と実際に跨ぐことが可能な最大の高さ(実測値)を距離にて評価した.さらに,この推定値と実測値を除して,認知誤差率を算出した.認知誤差率が高くなると運動認知が実際の能力よりも大きい状態を示し,また小さくなると運動認知が実際の能力よりも低い状態を示す.得られた指標を用いて,運動認知と身体運動能力などとの関連を調査した.結果,運動認知能力と転倒することへの恐怖感,身体バランス能力(重心動揺)は関連する傾向があることが分かった.以上より,運動認知よりも身体運動能力が劣っている高齢者,すなわち自分の身体運動能力を過信する傾向にある高齢者は,転倒に対する恐怖感や身体バランス能力からネガティブな影響を受けている可能性があり,特に恐怖感が運動と認知に関連しているものと考えられた.本研究の目的は,高齢者の転倒を予防するために,身体運動だけでなく高齢者特有の認知を視野に入れ,運動と認知が相互にどのように影響し合い転倒へと結びついてしまうのか,という問題の一端を理解することである.上記の目的を達成するために平成17年度は,実験装置の作成および開発,資料収集,さらに研究フィールド調査を行った.まず,実験装置の作成および開発では,共和電業社製の歩行分析システムおよび三次元動作解析を同期させて記録可能なシステムを作成した.さらに,歩行分析システムと三次元動作解析とのデータを統合し力学的分析も可能にするために,プログラミングソフトであるMatlab(Mathworks社製)を用いて解析用プログラムを作成した.運動認知能力を測定する装置として,またぎ動作つぎに,資料収集では,転倒予防に関連する身体能力を測る指標として,どのような指標が適しているのかを調査し,調査項目を検討した.結果,Functional Reach Test,最大一歩幅,開眼片脚立位時間,握力,足趾把握力などが転倒予防のスクリーニングとしても用いやすいので,これらの指標を調査に用いることに決定した.また,研究フィールド調査は,本研究の対象者を決めるために行った.結果,地域在住の在宅高齢者が最も転倒予防への関心が強く,調査協力が得られることが分かった.さらに,年代も70歳代であり,本研究の対象者として最も適していると考えられた.よって,本研究の対象者は地域在住の在宅高齢者とすることとした.以上が本年度の研究実績である.次年度は本年度の研究実績を踏まえて,フィールドでの測定を行うこととする.本年度は,昨年度構築した重心動揺計測システムの測定応用の検討,および転倒経験高齢者と非転倒経験高齢者での身体能力と運動認知能力との関連について検討を行った.まず,重心動揺計測システムの測定においては,高齢者においても指示が簡便に行え,計測が可能であることが確認できた.また,計測結果の解析プログラムとして,重心動揺矩形面積,総軌跡長,移動軌跡の標準偏差などを解析可能なプログラムを作成した.また,先行研究において,重心動揺計測の結果からバランス能力の臨界値を算出する方法が検討されているものがあったため,次年度にはこの指標も解析に加える予定である.次に,転倒経験高齢者と非転倒経験高齢者において,身体能力と運動認知能力の間に差があるのかを検討した.課題を「異なった高さの棒を跨ぐ」とし,実際に跨げる高さの限界値を身体能力の指標とし,跨げる高さの予測値を運動認知能力の指標として,両者の関連を調査した.結果,非転倒経験高齢者では,身体能力と運動認知能力の間に関連があり,身体能力と運動認知能力はほぼ同程度であった.しかしながら,転倒経験高齢者では,身体能力と運動認知能力の間に差があり,実際の身体能力よりも高い運動認知をする傾向があることが分かった.さらに,転倒経験高齢者および非転倒経験高齢者にバランス能力などの差が無かったことから,転倒予測に運動認知能力の測定が用いられるものと思われた.しかしながら,バランス能力および身体能力発揮時の姿勢制御能力を数値化していないため,この部分を次年度測定し,追加検討する必要があると考えている.

本研究は,高齢者の転倒を予防するために,身体運動能力だけでなく高齢者特有の認知を視野に入れ,運動と認知が相互にどのように影響し合い,転倒へと結びついてしまうのか,という問題の一端を理解することを目的とした実験的研究である.前年度までに,運動認知を測定する運動課題は跨ぐ動作,運動認知の評価にはアフォーダンスの知覚を用いることが,研究遂行上安全かつ簡便に評価が可能であると分かった.よって,本年度は,跨ぐ動作時の身体運動能力と運動認知との関連を定量的に調査した.対象は地域在住高齢者とし,過去一年間の転倒の有無,転倒恐怖感,身体バランス能力,前頭葉機能,足趾筋力,重心動揺などを測定した.また,跨ぐことが可能であると判断する最大の高さ(推定値)と実際に跨ぐことが可能な最大の高さ(実測値)を距離にて評価した.さらに,この推定値と実測値を除して,認知誤差率を算出した.認知誤差率が高くなると運動認知が実際の能力よりも大きい状態を示し,また小さくなると運動認知が実際の能力よりも低い状態を示す.得られた指標を用いて,運動認知と身体運動能力などとの関連を調査した.結果,運動認知能力と転倒することへの恐怖感,身体バランス能力(重心動揺)は関連する傾向があることが分かった.以上より,運動認知よりも身体運動能力が劣っている高齢者,すなわち自分の身体運動能力を過信する傾向にある高齢者は,転倒に対する恐怖感や身体バランス能力からネガティブな影響を受けている可能性があり,特に恐怖感が運動と認知に関連しているものと考えられた.
室内気流分布を考慮した住宅の通風性能評価手法の開発研究

住宅等の通風性能を定量的に評価するためには、外部風、室内外温度差に基づく室内の通風性状の時間変化をCFD等の手法により明らかにする必要がある。本研究では、室内の気流分布に特に影響が大きいと思われる要素として、地域による気象条件の影響(地域指標)、建物の周囲状況の影響(立地指標)、建物の形状・窓の配置等の違いによる影響(建物性能指標)の3要素を用い、この3つの指標を使用して総合的通風性能評価指標を提案することを研究目的とする。本研究では地域評価指標として新たに通風デグリアワー(CVDH)の概念を構築する。CVDHの算出方法は、基準最小風速0.3m/s時のSET*の時間変化を計算し、快適範囲の上限であるSET*が26°Cを超えている時間を対象に、各地域の実風速データによるSET*と比較し、下限値のSET*を23°Cとして時間数にSET*差を乗じて算出する。CVDHにより、それぞれの地域において、気流のみの影響により、SET*が26°Cを超えている時間に人体の体感温度をどの程度低下させるかを非暖房期間を対象とし、地域における相対的評価をするための指標として用いることが可能である。日本全体の通風設計資料としてアメダス約840地点のCVDHを計算し、全国のCVDHマップ作成した。本研究ではさらに、全国のCVDHマップよりCVDHの5段階グレードを作成し、地域指標を作成した。立地指標は建蔽率の変化による平均通風量比を算出し、グレード分けを行った。建物性能指標は建物性能が室内気流性状に及ぼす影響を解析し、評価対象領域における気流速度0.3m/s以上の容積の割合を用いて5段階のグレード分けを行った。これらの3要素を本研究では単純平均し、総合通風性能評価指標を開発した。本研究は建物の通風性能を定量的に評価する手法の開発を目的とする。通風には、時間的、空間的な分布があり、建物が建てられる地域の気候条件、市街地・郊外などの建蔽率の変化、窓の位置関係や開口部の大きさなどによって変化すると考えられる。そのため、室内外気流同時解析による乱流数値計算及び多数室熱負荷・換気回路網計算により、夏季および中間季の通風時の室内の体感温度指標を算出し、通風が有効な時間の長さ及び通風のみで快適性を得られる面積を算出し、これらの結果から通風性能をグレードで評価することを提案する。近年、乱流数値計算に関する研究が発達し、高い精度で室内外気流を解析することが可能である。しかし、一般的に計算負荷が大きく、現在のコンピュータの性能では長期にわたる温度・気流分布を予測することは困難である。一方、多数室熱負荷・換気回路網計算は、すでに設計ツールとして一般化されている技術であり、予測精度の実績がある。多数室熱負荷・換気回路網計算では通風のように、室内の気流分布が大きい環境では通風の効果を正確に捉えることは困難である。そこで、本研究では、夏季および中間季の数ヶ月間の室内温度・気流分布を室内外気流同時解析による乱流数値計算及び多数室熱負荷・換気回路網計算により算出する。本年度は通風による室内温度気流分布の解析手法について検討する。建物内外気流の予測には標準k-εモデルを用いた数値解析手法を用い、通風時の室内の温度やグローブ温度等の算出は多数室の熱負荷・換気回路網計算ソフトであるTRNSYS-COMISモデルを用いる。気象データは日本建築学会・拡張アメダス気象データを用いる。住宅モデルとして単純住宅モデルと日本建築学会標準住宅モデルを対象とし、通風時の室内外気流分布を上空の風向、窓の開閉条件、建蔽率をパラメータとして数値流体解析を行う。
アフィン量子群上のextremalウエイト加群のpath modelの研究

柏原正樹氏は、(一般の)Kac-Moodyリー環gに付随する量子群$U_q(g)$上の可積分既約最高ウエイト表現の一般化として、整ウエイト$lambda$をextremalウエイトとするextremalウエイト加群$V(lambda)$を導入した。このgがアフィン・リー環で、整ウエイト$lambda$が"レベル・ゼロ"である場合には、このextrtemalウエイト加群$V(lambda)$の商加群として、アフィン量子群の有限次元表現、特に、中島啓氏により代数幾何学的手法を通して導入されたstandard加群$M(lambda)$が得られる。そしてこれは、V.ChariとA.Pressleyにより導入された量子Weyl加群$W(lambda)$と同じものである事が分かっている。平成14年度から平成16年度における研究において、我々は、整ウエイト$lambda$が(レベル・ゼロの)の基本ウエイト達の和である場合に、型が$lambda$のLakshmibai-Seshadri path全体の成すcrystal $B(lambda)$からnull rootを法(modulo)として得られる商crystal $B(lambda)_{cl}$を考察した。そして、この商crystal $B(lambda)_{cl}$が実は、アフィン量子群の(レベル・ゼロの)の有限次元基本表現の結晶基底のpath model達のテンソル積とcrystalとして同型であることを示した。これらの事から、商crystal $B(lambda)_{cl}$が、standard加群$M(lambda)$の結晶基底のpath modelとみなせる事が分かる。さらに、この結果を使って、アフィン量子群上のstandard加群$M(lambda)$を、アフィン・リー環gの標準的な(有限次元簡約)部分リー環$g_O$に付随する量子群$U_q(g_O)$に制限したときの分岐則を、gのWeyl群Wの元達とW上のBruhat orderを用いて組合せ論的に記述する事が出来た。最近柏原正樹により導入されたextremalウェイト加群は、Kac-Moodyリー環gに付随する量子群U_q(g)上の可積分既約最高ウェイト加群L(Λ)の一般化である。特にgがaffineリー環の場合には、このextremalウェイト加群は、V.ChariとA.Pressleyにより導入されたquantum Weyl加群や、中島啓により代数幾何学的手法を通して導入されたstandard加群と密接に関係している事が分かり、現在非常に活発に研究されている。可積分既約最高ウェイト加群L(Λ)の結晶基底に対しては、P.Littelmannによって、その組合せ論的な実現であるpath modelが得られている。このpath modelでは、gのWeyl群Wの元の、ある条件を満たす様な順序付けられた列の集まりとして、結晶基底を実現している。結晶基底の、この様な具体的な実現は、表現論における様々な問題(テンソル積の分解や、表現の部分環への制限に関する分岐則等)の解決に非常に有効であった。私は、gがaffineリー環の場合に、このextremalウエイト加群の結晶基底(その存在は、柏原により証明されている)の、path modelによる組合せ論的な実現を行なった。そして、この実現を用いて、extremalウエイト加群を(有限次元半単純リー環に付随する)部分量子群に制限した時の分岐則を決定した。

さらに、この結果を用いて、standard加群を(有限次元半単純リー環に付随する)部分量子群に制限した時の分岐則についても、結果を得た。柏原正樹氏により導入された、アフィン量子群U_q(g)上のextremalウエイト加群V(λ)は、extremalウエイトλ∈Pが正、又は負の"レベル"を持つ場合には、それぞれ既約最高ウエイト加群、又は最低ウエイト加群になる。一方、extremalウエイトλが"レベル・ゼロ"である場合には、未だにその構造は充分に解明されていないが、非常に重要かつ興味ある研究対象であると認識されている。我々は、平成14年度における研究で、extremalウエイトλが基本ウエイトω_iの場合には、extremalウエイト加群V(λ)=V(ω_i)の結晶基底B(ω_i)の組合せ論的な記述をするpath modelを得た。本年度の研究においては先ず、このpath modelが実は、型がω_iのLakshmibai-Seshadri pathと呼ばれる、gのWeyl群Wの元の(ある条件を満たす順序付けられた)列の集まりとして、非常に具体的に記述出来る事を示した。柏原正樹氏は、(一般の)Kac-Moodyリー環gに付随する量子群U_q(g)上の可積分既約最高ウエイト表現の一般化として、整ウエイトλ∈Pをextremalウエイトとするextremalウエイト加群V(λ)を導入した。gがアフィン・リー環でλ∈Pが"レベル・ゼロ"である場合には、このextremalウエイト加群V(λ)の商加群として、アフィン量子群U^l_q(g)(=U_q([g,g]))の有限次元表現、特に、中島啓氏により代数幾何学的手法を通して導入されたstandard加群M(λ)が得られる。そしてこれは、V. ChariとA. Pressleyにより導入された量子Weyl加群W(λ)と同じものである事が分かっている。
BMP骨誘導における細胞支持体の幾何学的要素の役割-骨形成のトポバイオロジー

BMP(骨形成蛋白質)による異所性の軟骨・骨誘導がその担体によって大きく左右されることを認識して後、その担体の諸性質の中でとくに幾何学的要素を明確にするため本年度は、ヒドロキシアパタイト担体に集中した。先ず、多孔性と充実性のヒドロキシアパタイト焼結体とを比較したところ、気孔がないと全く骨も軟骨も誘導されないことを見いだした。その理由は血管が進入し難いためと推測され、気孔の重要性が再確認された。そこで気孔径のみが異なる5種類(100-200,200-300,300-400,400-500,および500-600μm)のブロック体を作製した。これらの担体にリコンビナントBMP2を複合して比較した。即ち、摘出物中のオステオカルシン、およびアルカリフォスファターゼ活性を定量すると共に、組織学的に比較観察した結果、300-400μmの担体が最も効率よく骨を作ることを発見した。この範囲の気孔径(300-400μm)の値から離れるほど、両指標の値が低下していくことがわかった。さらに興味深いことには形態学的観察において、500μmまでの気孔径では、気孔の内壁に沿った骨形成が行われるのに対して、500μm以上の気孔径では内壁性の骨形成は不完全となり、気孔の中心部への骨形成が観察されるようになったことである。以上の結果は、明らかに血管形成に適した立体構造に関与するものであり、その意味で血管確保構造と呼ぶことが出来る。アパタイトを材質とした骨形成用の細胞支持体において骨形成に最適の気孔径が存在してそれが300-400μmであることを世界で初めて示したものである。このような最適気孔径の発見は、ヒドロキシアパタイト以外の素材でも材質による修正を加えることで適用できると考えられる。この意味で最適気孔径の発見は今後の人工臓器開発の上できわめて有用な概念を提供するものである。本研究は細胞環境としての細胞外マトリックスの諸機能のうち細胞支持体としての機能に注目し、さらにその幾何学的構造が細胞の分化と増殖にいかなる効果を与えるかの追求を目的とした、前例のない独創的研究である。本年度は、従来著者らが開発してきた人工細胞支持体を(1)顆粒状(2)ブロック状(3)線維状に分類し、できるだけ同一材料で幾何学的形態の異なる細胞支持体をBMP担体として比較することにした。線維状ガラス膜(FGM)のメッシュサイズ1ミクロンと0.6ミクロンのものとを比較した結果、前者のみが軟骨を優先的に形成したが、後者は全く形成しないことがわかった。この問題は、さらにメッシュサイズの異なるFGMをシリーズで調製し、比較分析する予定である。顆粒状のヒドロキシアパタイトでは、150ミクロンの細孔をもつもの(PPHAP)と細孔のないもの(SPHAP)を比較したところ前者では旺盛な骨形成が、後者では全く骨形成が起こらないことを明らかにした。この問題は、さらに細孔の大きさを6段階に変えたシリーズのブロック状ヒドロキシアパタイト(PBHAP)にて検討することにした。さらに同一サイズの細孔をもつPBHAPとPPHAPを比較した結果、両者とも骨形成を誘導したが、後者(PPHAP)の方が、前者(PBHAP)よりも定量的に高度の骨形成を誘導することがわかった。

われわれはBMP(骨形成蛋白質)の皮下埋植による異所性の軟骨・骨誘導の実験系において、軟骨と骨の誘導がその際に使用する担体によって大きく支配されることを発見し、多数の担体によってどのような担体の性質がそれぞれ骨と軟骨の誘導に導くのかを追及してきた。その際、同一の物理的、化学的性質を持つ担体でも、その幾何学的性質によって異なるらしいことに気づいた。そこで本年度は同質のヒドロキシアパタイトの焼結体で気孔径のみが異なる5種類(100-200, 200-300, 300-400, 400-500,および500-600μm)のブロック体を作製した。これらの担体にリコンビナントBMP2を複合し、ラットの皮下に埋植し、2および4週間後に摘出した。摘出物中のオステオカルシン、およびアルカリフォスファターゼ活性を定量すると共に、組織学的に観察した。【結果】5種類の気孔径をもつ担体を比較した結果、300-400μmの担体がオステオカルシンおよびアルカリフォスファターゼ共に最高の値を示すことが明らかになった。この範囲の気孔径(300-400μm)の値から離れるほど、両指標の値が低下していくことがわかった。さらに興味深いことには形態学的観察において、500μmまでの気孔径では、気孔の内壁に沿った骨形成が行われるのに対して、500μm以上の気孔径では内壁性の骨形成は不完全となり、気孔の中心部への骨形成が観察されるようになったことである。以上の結果は、この種の多孔体ヒドロキシアパタイトを材質とした骨形成用の細胞支持体において骨形成に最適の気孔径が存在しそれが300-400μmであることを世界で初めて示したものである。この明確な結果が今後の人工臓器開発の上で果たす役割はきわめて大きいといえる。
コンパクトディスク型マイクロチップを用いる感染症検査システムの開発

本研究では,小型で全自動かつ迅速診断が可能な感染症検査システムを開発することを目的として,リアルタイム測定が可能な新規コンパクトディスク(CD)型蛍光検出システムを開発した。本蛍光検出システムは,光源(LED)と光検出器(フォトダイオード)をCD型マイクロチップと一緒に回転させることにより,試料導入から分離・検出に至る一連の分析操作を,CD型マイクロチップの回転を停止させることなく,全自動で行うことが可能である。さらに,ポイント・オブ・ケアテスト(POCT)のための,バッテリー駆動が可能な小型でポータブルな携帯型蛍光検出システムを開発し,これを用いてウイルス抗体検査が可能なことを示した。本研究は,現場で,誰もが,簡便かつ迅速に感染症の検査が可能な小型で安価な分析システムを開発することを目的としている。すなわち,コンパクトディスク(CD)型のマイクロチップを作製し,マイクロチップ上のリザーバー内の試料溶液を,遠心力を利用してマイクロチップ内の分離・検出チャンバーに送液し,抗原抗体反応を利用して試料中の目的成分を分離した後,小型でポータブルな蛍光検出器を利用して分離した成分を検出する新規分析システムを開発し,これをウイルス抗体検査に応用しようとするものである。平成27年度は,我々がこれまでに開発してきたCD型マイクロチップとは異なる新しい流路デザインのCD型マイクロチップを作製し,チップを回転させたときにそれぞれのリザーバーから溶液が流れ出す回転速度を理論と実験の両面から検討した。その結果,CD型マイクロチップの回転速度を段階的に増加させていくことにより,回転半径の大きな円周側のリザーバーから順番に溶液を分離・検出チャンバーに送液することに成功し,送液の再現性についても従来のデザインに比べて向上させることができた。また,有機ELと有機フォトダイードを真空蒸着法により作製し,これらを光源と光検出器とする小型でポータブルな新規蛍光検出システムを開発した。レゾルフィンをモデル試料として用い,開発したシステムの性能評価を行ったところ,良好な直線性を示す検量線が得られ,従来法と同等の感度,再現性で測定できることが確認された。平成27年度は,新しい流路デザインのCD型マイクロチップとチップを回転させるためのターンテーブルを開発し,チップの回転により生じる遠心力を利用してリザーバー内の溶液を分離・検出チャンバーに送液する方法を検討した。これにより,送液の再現性を従来よりも向上させることができた。また,発光材料としてIr(ppy)3を用いたりん光有機ELデバイス及び銅フタロシアニンを光電変換層とする有機フォトダイオードデバイスを作製し,これらを光源と光検出器とする小型の蛍光検出システムを開発した。開発した蛍光検出システムの性能評価をレゾルフィンをモデル試料として用いて行ったところ,従来法と同等の感度,再現性で測定できることが確認された。以上のように,研究は当初の計画通り順調に進展している。平成28年度は,前年度に作製したCD型マイクロチップを用いる酵素免疫測定法(ELISA)について検討した。すなわち,CD型マイクロチップの検出チャンバーの内壁に抗IgG抗体を固定化し,タンパク質の非特異的吸着を防止するためのBSAによるブロッキング処理を行った後,チップ上のリザーバーに入れたIgG溶液,洗浄溶液,HRP標識抗IgG抗体溶液,洗浄溶液および過酸化水素を含むAmplex Red溶液を,チップの回転による遠心力を利用して順次検出チャンバーに導入し,酵素反応により生成したレゾルフィンの蛍光強度を前年度に開発した小型蛍光検出システムを用いて測定することにより,IgGの定量を行った。その結果,IgGの濃度が増加するにしたがって蛍光強度は増加し,500 ng/mL以上の濃度でほぼ一定の値となることがわかった。このとき,100 ng/mL以下の濃度範囲におけるIgGに対する検量線は良好な直線性を示し,検出限界(3σ)は19 ng/mLと見積もられた。また,異なる4枚のCD型マイクロチップを用いて行ったIgGの繰り返し測定における相対標準偏差(RSD)は3.111.3 %であった。また,96穴マイクロプレートと市販のマイクロプレートリーダーを用いる従来のELISA法によるIgGの測定についても検討したところ,本法の感度は従来法よりもやや劣るものの,検量線の直線性や測定の再現性についてはほぼ同等であることが確認された。平成28年度は,前年度に開発した新しい流路デザインのCD型マイクロチップとターンテーブルを用いて,チップの回転により生じる遠心力を利用してリザーバー内の試薬と試料を分離・検出チャンバーに送液してELISAを行う方法を検討した。IgGをモデル試料として用い,抗体の固定化方法や試薬濃度,反応時間,ブロッキング試薬の種類などの測定条件を最適化した結果,開発したシステムを用いてELISAが可能なことが確認され,96穴マイクロプレートと市販のマイクロプレートリーダーを用いる従来のELISA法と比較して,試薬や試料の使用量を約1/70に,分析時間を約1/4に削減することに成功した。また,本システムの重量は市販のマイクロプレートリーダーと比較して約1/10であり,分析システム全体の大幅な小型化と軽量化を達成することにも成功した。以上のように,本研究課題は当初の計画通り順調に進展している。平成29年度は,PDMSと活性炭を用いて小型の遮光性9穴マイクロタイタープレートを作製するとともに,LEDとフォトダイオードを用いるバッテリー駆動が可能な手のひらサイズの蛍光検出器(プレートリーダー)を作製した。

これらを用いて,ELISA法による麻疹および風疹に対する抗体価検査を検討したところ,市販の96穴マイクロタイタープレートとデスクトップサイズのマイクロプレートリーダーを用いる従来法と一致した検査結果が得られた。また,前年度までに開発したCD型マイクロチップを用いる分析システムでは,検出時にチップの回転を停止させる必要があったので,CD型の電子回路基板上にバッテリー,電源,光源,検出器,アンプ,データ処理器等を集積化し,これをCD型マイクロチップと一体化して回転させることにより,CD型マイクロチップを回転させたままリアルタイムに測定することが可能な分析システムを開発した。このシステムを用いてグルコースの定量を検討した。即ち,検出チャンバーの内壁にHRPとGlucose Oxidaseを固定化したCD型マイクロチップを作製し,Amplex Redを含む種々の濃度のグルコース水溶液をチップ上のリザーバー内に導入した。このチップを回転させてリザーバー内の試料溶液を検出チャンバーに送液し,酵素反応により生成したレゾルフィンの蛍光強度を測定することによりグルコースの定量を行った。その結果,チップを回転させると蛍光強度が時間経過に伴って徐々に増加することが確認され,開発したシステムによるグルコースの全自動リアルタイム測定に成功した。以上のように,本研究では3年間で,現場で,誰もが,簡便かつ迅速に感染症の検査が可能な小型で安価な分析システムの基盤技術を確立することに成功した。本研究では,小型で全自動かつ迅速診断が可能な感染症検査システムを開発することを目的として,リアルタイム測定が可能な新規コンパクトディスク(CD)型蛍光検出システムを開発した。本蛍光検出システムは,光源(LED)と光検出器(フォトダイオード)をCD型マイクロチップと一緒に回転させることにより,試料導入から分離・検出に至る一連の分析操作を,CD型マイクロチップの回転を停止させることなく,全自動で行うことが可能である。さらに,ポイント・オブ・ケアテスト(POCT)のための,バッテリー駆動が可能な小型でポータブルな携帯型蛍光検出システムを開発し,これを用いてウイルス抗体検査が可能なことを示した。平成28年度は,CD型マイクロチップに抗体を固定化する方法を検討する。すなわち,固定化方法として物理吸着のほか,シランカップリング剤などを用いる化学修飾について検討し,固定化の再現性が良好で,測定チャンネル間の固定化密度が均一になるような固定化条件を明らかにする。次に,イムノグロブリンA(IgA)をモデル試料として,開発した分析システムとマイクロチップを用いる酵素免疫測定法(ELISA)の検討を行う。試薬濃度,反応時間,ブロッキング試薬の種類など測定条件の最適化を行い,感度,再現性等を従来の96穴マイクロタイタープレートを用いるELISAと比較する。平成29年度は,開発した分析システムによる麻疹や風疹等の感染症に対する抗体価検査を検討するとともに,96穴マイクロプレートと市販のマイクロプレートリーダーを用いて,従来のELISA法とのクロスチェックを行う。
Tリンパ球の胸腺外分化と肝類洞の役割

その名の由来のように、T細胞は胸腺で分化・成熟するリンパ球である。しかし、胸腺の無いヌ-ドマウスや加齢で胸腺が退縮したヒトや動物でも、末梢にはかなりのT細胞が存在することから、胸腺外分化T細胞の存在が示唆されていた。筆者らは本研究で、この胸腺外分化が肝類洞で集中的に起こっていることを見い出したものである。胸腺外分化T細胞には、通常のT細胞と異なる多くの性状があることも明らかになった。代表的なものを下記すると次のようになる。1)αβとγδT細胞からなる。3)胎生期の肝には無く、生後、肝類洞に出現し、加齢と共に増加する。4)intermedicate TCR細胞として同定される。つまり、通常のT細胞よりも、膜上のTCRの数が少ない。5)negative selectionのプロセスが無く、自己応答性の禁止クロ-ンもつくられる。6)系統発生学的に古いT細胞と考えられた。たとえば、NK細胞と同様に、常時ILー2RβとLFAー1を発現している。7)癌、細菌感染、加齢、自己免疫疾患で活性化する。8)胸腺内の分化とは、相拮抗して活性化される。9)自己寛容を誘導するリンパ球の可能性がある。10)エストロゲンやTNFβで、この経路が活性化される。以上のような多くの特徴をもっていて、いろいろな難病の免疫学に深くかかわっていることが推察される。胸腺の退縮した老齢のヒトやマウス、あるいは、先天的に胸腺の無いヌ-ドマウスでも、末梢には特有のTリンパ球が存在することから、胸腺外Tリンパ球分化経路の存在が示唆されていた。筆者らは,この胸腺外Tリンパ球が、肝類洞で集中的に起こっていることを明らかにできた。肝類洞に存在するこれらのT細胞は、芽球状の形態を示し、in vitroで自発増殖能を持つことからも、他の末梢免疫臓器にあるリンパ球とは性状が異なり、分化、増殖の一つの部位として肝を考える由縁である。蛍光抗体で肝のαβT細胞を染色すると、胸腺と同様に、TcR intensityがdullのものとbrightのものからなる二相性を示すことが明らかになった。他の、末梢血、脾臓、リンパ節などのαβT細胞はbrightのみの一相性を示す。ここで興味深いのは、肝類洞のdull αβTcRは、胸腺のdull TcRとbright TcRの中間のintensityを示し、“intermediate"というべきものであった。一方、肝のbright TcRは他の臓器のbright TcRとintensityが一致している。胸腺摘出したマウスでは、肝のbright TcR細胞や、他の末梢のbright TcR細胞が漸時減少してゆくことから、intermediate TcR細胞のみが、胸腺外分化T細胞と結論できる。ヌ-ドマウスでは、肝でも末梢でも、intermediate TcR細胞のみからなっている。γδT細胞も、肝では特有のものがある。PCR法で、使用されているV gene segmentを検索したところ、肝ではVγl or 2/Vδ6が好んで使用されていて、これまで知られてきた胸腺内分化して末梢に移行したものとは異なる。以上のことから、特有のαβおよびγδTリンパ球が肝類洞で胸腺外分化、増殖していることが明らかになった。胸腺外分化

T細胞には、通常のT細胞と異なる多くの性状があることも明らかになった。代表的なものを下記すると次のようになる。1)αβとγδT細胞からなる。3)胎生期の肝には無く、生後、肝類洞に出現し、加齢と共に増加する。4)intermedicate TCR細胞として同定される。つまり、通常のT細胞よりも、膜上のTCRの数が少ない。5)nagative selectionのプロセスが無く、自己応答性の禁止クロ-ンもつくられる。6)系統発生学的に古いT細胞と考えられた。たとえば、NK細胞と同様に、常時ILー2RβとLFAー1を発現している。7)癌、細菌感染、加齢、自己免疫疾患で活性化する。8)胸腺内の分化とは、相拮抗して活性化される。9)自己寛容を誘導するリンパ球の可能性がある。10)エストロゲンやTNFβで、この経路が活性化される。以上のような多くの特徴をもっていて、いろいろな難病の免疫学に深くかかわっていることが推察される。
腫瘍形成における宿主pH感知性受容体の役割～受容体欠損マウスを用いた解析

腫瘍形成には低pH(高プロトン)が伴うことはよく知られている。この細胞外pH低下が宿主細胞の腫瘍形成制御に対してどのような役割を発揮しているかは不明である。本研究では最近同定されたプロトン感知性受容体の機能に関して受容体欠損マウスを用いて解析した。その結果、宿主のプロトン感知性受容体は腫瘍形成に影響を与えていること、また、細胞外pH低下はマクロファージのM1-M2フェノタイプ変化を起こすことが示唆された。腫瘍形成には低酸素と酸性化(低pH)が伴う。低pHに対する癌細胞、宿主の応答機構の詳細は不明である。本研究では最近同定されたプロトン感知性受容体の関与を中心に、腫瘍形成を巡る癌細胞と宿主の攻防における低pHの役割を解析した。個体レベルの腫瘍形成とOGR1ファミリー: B16F10、LLC1あるいはPAN02細胞をプロトン感知性受容体欠損マウスの皮下に移植した後の腫瘍重量を測定した。その結果、TDAG8欠損マウスでは野生型マウスと比較してやや抑制的、ほとんど無効(LLC1の場合)、あるいは促進的な傾向がみられた(PAN02の場合)。また、OGR1欠損マウス、GPR4欠損マウスでの知見を考慮すると、がんの種類によるプロトン受容体の関わりの違いがあることが示唆された。マウスマクロファージを用いたM1/M2変化とpH環境:マクロファージにはTDAG8が著明に発現している。そこで、細胞外pH低下がM1やM2タイプのサイトカイン産生にどのような影響をもたらすかを調べた。その結果、細胞外pHが7.6から6.8に低下するとM1マーカー(iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12)はいずれも低下し,一方、M2マーカー(arginase,Clec7a, Ym-1, IL-10)はいずれも増加することが、mRNAレベルで判明した。TDAG8欠損マウスから調製したマクロファージでは、LPSで刺激したマクロファージでは細胞外pH低下の作用を抑制するのに対して、INF-γ存在下ではTDAG8欠損の効果は観察されなかった。また、M2マーカーの細胞外pH低下による促進作用はTDAG8欠損の影響を受けなかった。このように、M1-M2のフェノタイプ変化は細胞外pHで変化をうけ、その一部の作用にTDAG8の関与が示唆されたものの、この受容体だけでは説明されない機構の存在が示唆された。低pHに対する癌細胞、宿主の応答機構(低pHバイオロジー)の詳細は不明である。本研究では最近同定されたプロトン感知性受容体(OGR1ファミリーGPCR)の関与を中心に、腫瘍形成を巡る癌細胞と宿主の攻防における低pHの役割を解析することを目指した。個体レベルの腫瘍形成とOGR1ファミリー:マウス由来癌細胞としてLLC1をマウス皮下に接種した。炎症性マクロファージ(M1)と非炎症性(腫瘍付帯性: tumor-associated)マクロファージ(M2)をそれぞれ、iNOS,アルギナーゼの抗体染色法で調べたところ、腫瘍中には約10%のマクロファージの集積が観察され、野生型マウスの場合、M2がM1の3倍程度を占めた。TDAG8欠損マウスにおいては、M1/M2比がやや増加している傾向が観察された。その事を反映してか、腫瘍サイズはTDAG8欠損マウスでやや低下している傾向が観察された。しかし、有意な差は観察されておらず、今後、さらなる解析が必要である。インビトロにおけるM1/M2フェノタイプ変化:Th1サイトカイン(INF-g)あるいはTh2サイトカイン(IL-4, IL-13)やIL-10などで処理するとマクロファージはそれぞれM1、M2に分化する。そこで、pH変化がこれらのM1/M2変化にどのような効果を与えるかについて解析した。腹腔内にチオグリコレートを投与して回収したマクロファージを用い、iNOS、アルギナーゼ発現はmRNA(real-time PCR)、タンパク(ウエスタンブロッティング)で調べた。細胞外pHを低下させると、iNOS発現の低下、一方で、アルギナーゼの発現増強が観察された。この知見は酸性pHでM1からM2への変化を示唆している。今後、さらに別のマーカーを用いて、この点を検証し、そのメカニズムを解析する。プロトン受容体欠損マウスがなんらかの形でマクロファージの機能変化にかかわっていることが示唆された。また、マクロファージを用いた細胞レベルの実験で、細胞外pH低下がM1、M2変化にかかわっている可能性が示唆された。しかし、個体レベルの腫瘍形成におけるプロトン受容体の関与ははっきりした結論が得られなかった。平成24年度は個体レベルの腫瘍形成におけるプロトン受容体の関与ははっきりさせる実験と細胞レベルのマクロファージのM1,M2変化のメカニズムの解明に全力をつくす。

平成23年度は個体レベルの実験がおもうように進展しなかったため、それに付随した研究費を24年度にまわした。今後はこの個体レベルの実験のためのマウスの維持のための経費、それに付随するジェノタイプイングのための費用、また、マクロファージの調整、各種mRNAの測定のためのプローブ、各種サイトカイン測定のためのキットなどに研究費を使用する。
偏微分方程式に対する初期値問題における諸問題

上記課題について平成2年度中に行われた研究実績は次のとうりである。1.偏微分方程式の研究(1)双曲型方程式に対する初期値問題の解の存在及び解の特異性の伝播についての研究(研究代表者梶谷邦彦,分担者若林誠一郎)(2)楕円型偏微分方程式に対する境界値問題に対するFeller半群の存在についての研究(分担者平良和昭)2.確率論の研究(1)SpaceーTimeのレビ過程に対するエネルギ-の研究(分担者神田護)(2)直積空間D[[0.1]:R^α]の研究(笠原勇二)3.統計学の研究(1)ヴイスハルト根の分布のグラフについての研究(分担者杉浦成昭)4.代数幾何の研究(1)P進複策巾のPalesとbー関数に関する研究(分担者木村達雄)(2)ゴ-レンスタイン独立特異の研究(分担者渡辺公夫)5.微分幾何の研究(1)コンパクトリ-グル-プの中のclusedリ-部分群の安定性についての研究(田崎博之)6.位担幾何の研究(1)無限次元多様体の研究(酒井克郎)7.非線型方程式(1)弾性体方程式の大域的な解の存在についての研究(柴田良弘)上記課題について平成2年度中に行われた研究実績は次のとうりである。1.偏微分方程式の研究(1)双曲型方程式に対する初期値問題の解の存在及び解の特異性の伝播についての研究(研究代表者梶谷邦彦,分担者若林誠一郎)(2)楕円型偏微分方程式に対する境界値問題に対するFeller半群の存在についての研究(分担者平良和昭)2.確率論の研究(1)SpaceーTimeのレビ過程に対するエネルギ-の研究(分担者神田護)(2)直積空間D[[0.1]:R^α]の研究(笠原勇二)3.統計学の研究(1)ヴイスハルト根の分布のグラフについての研究(分担者杉浦成昭)4.代数幾何の研究(1)P進複策巾のPalesとbー関数に関する研究(分担者木村達雄)(2)ゴ-レンスタイン独立特異の研究(分担者渡辺公夫)5.微分幾何の研究(1)コンパクトリ-グル-プの中のclusedリ-部分群の安定性についての研究(田崎博之)6.位担幾何の研究(1)無限次元多様体の研究(酒井克郎)7.非線型方程式(1)弾性体方程式の大域的な解の存在についての研究(柴田良弘)
新規癌抑制物質セラミドによるアポトーシス誘導時のMAPキナーゼ系とJNKキナーゼ系の解析

近年、癌化のメカニズムとして増殖・分化の調節異常のみならず、アポトーシスによる細胞死を誘導する為のシグナル伝達機構の異常が注目されている。すなわちアポトーシスの誘導機構の解析は、従来よりの抗癌剤による化学療法・分化療法とは作用機序の異なる新たな癌治療法の開発に寄与するものと考えられる。従来スフィンゴ脂質は主として膜構成成分として考えられてきたが、スフィンゴミエリンの分解産物であるセラミドが"スフィンゴミエリン・サイクル"(スフィンゴミエリン【tautomer】ホスフォリルコリン+セラマイド)と名づけられた機構を介して、HL-60白血病細胞のアポトーシス誘導時に細胞内シグナルメッセンジャーとして機能もしていることを、最近我々は報告した(Okazaki,T.et al.,J.Biol.Chem.,265:15823-15831,1990,Okazaki,T.,et al.,J.Biol.Chem.,264:19076-19080,1989)。核内転写因子(NF-κB、AP-1、c-mycなど)は細胞の増殖・分化調節をDNAレベルで行うための制御要素として重要であり、我々は白血病細胞アポトーシス誘導における脂質メッセンジャーであるセラミドを介したシグナル伝達経路と核内転写調節因子AP-1との関連を検討した。その結果、セラミドによる白血病細胞HL-60のアポトーシス誘導にはAP-1活性の早期の増強が不可欠であることが判明した(Sawai,H.,Okazaki,T.,et al,J.Biol.Chem.,270:27326-27331,1995)。AP-1ヘテロダイマーの構成成分であるfos・junファミリイのアポトーシス誘導時のmRNAレベルの変化を検討したところ、TNF-αや熱ショックではfosファミリィが増強するにもかかわらずセラミドでは僅かしか変化しないことが判明した。現在、さらに詳細に検討している。
液胞アミノ酸排出機構解明によるオートファジーアミノ酸リサイクルの生理的意義の検討

液胞内には細胞全体の70-90%の塩基性アミノ酸が蓄積する。網羅的な局在解析によって同定したVBT1遺伝子を破壊すると液胞内塩基性アミノ酸含量が大幅に低下することを見出し、液胞内に蓄積するアミノ酸の生理的意義を理解するための足がかりを得た。並行して中性・塩基性アミノ酸を液胞外へと排出するトランスポーターAvt4の活性調節について研究を進めており、窒素飢餓条件でのAvt4の細胞内レベルの増加が、GATA転写因子Gln3とGat1の二重欠損によって低く抑えられることを明らかにしている。そこで、AVT4プロモーター領域のGln3/Gat1結合配列に変異を導入したところ、窒素飢餓条件でのAVT4 mRNAとAvt4タンパク質レベルがGln3とGat1の二重欠損株同様低く抑えられたことから、GATA転写因子が直接AVT4の転写に機能することが示唆された。一方、プロモーターへの変異導入によってAVT4の発現量が低下しても窒素飢餓条件での液胞内アミノ酸は野生株と同様に減少した。したがって、アミノ酸排出活性への影響を検出するには至っておらず、AVT4発現誘導の生理的意義を明らかにすることはできなかった。AVT4以外の液胞アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現についても、窒素飢餓条件での誘導とGATA転写因子欠損の影響をリアルタイムRT-PCRによって検討し、以前のマイクロアレイ解析と一致した結果を得たとともに、GATA因子依存的に窒素飢餓条件で発現量が増加する新規液胞アミノ酸トランスポーター遺伝子を見出した。液胞膜局在性トランスポーターの網羅的同定に向けて出芽酵母ゲノムにコードされるトランスポーター全228種のGFP融合タンパク質の発現プラスミドライブラリーを作成中であり、個々の細胞内局在も同時に観察中である。本研究の結果と既存データベースの情報を合わせて、液胞膜局在性トランスポーターをリストアップし、その過剰発現による液胞内アミノ酸含量の変化を順次検討している。また、Avt4 N末端親水性領域と相互作用する因子の同定に向け、酵母Two-hybridスクリーニングおよび、共免疫沈降/GST pull-down実験を進めている。特にリン酸化に応答した相互作用の変化を考慮し、推定リン酸化部位をアラニンもしくはアスパラギン酸に置換した変異型Avt4を用いた相互作用因子探索も並行して進めている。液胞アミノ酸リサイクルの生理的意義については、液胞アミノ酸トランスポーター多重欠損による胞子形成効率および飢餓条件での生存率低下を検出することに成功した。そこで液胞アミノ酸トランスポーター過剰発現/欠損によるTORC1活性の変化を検討したが、顕著な変化を検出するには至っていない。しかし、オートファジー活性の持続・減衰への影響については示唆的な結果を得ており、今後の解析によってTORC1活性とのリンクを明らかにできると考えている。網羅的解析より見出してきた新規液胞アミノ酸トランスポーター遺伝子破壊株の中には液胞膜小胞のアミノ酸輸送活性と液胞内アミノ酸含量の変化が一致しないものがある。この矛盾点を解消するために、液胞膜小胞単離法や液胞膜小胞内外のアミノ酸濃度について再検討する。推定リン酸化部位をアラニンもしくはアスパラギン酸に置換した変異型Avt4 N末端親水性領域をBaitにしたTwo-hybridスクリーニングを現在進めており、相互作用する候補タンパク質を数種単離している。スクリーニングをさらに進めるとともに、これら候補タンパク質とのin vivoでの相互作用を検討する。また、GSTとAvt4 N末端親水性領域の融合タンパク質を過剰発現する酵母株や、大腸菌での組換えタンパク質発現系を構築しており、これらを用いたGST pull-downによっても、相互作用タンパク質同定に向けた実験を行う。新規に同定した液胞アミノ酸トランスポーターの単一欠損や他のトランスポーターとの多重欠損による胞子形成効率および飢餓条件での生存率の低下を調べ、顕著な低下を示したものについて順次TORC1およびオートファジー活性の変化やマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行う。