hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリア品質管理を基盤とした加齢による卵の質の低下に対する新規治療法の開発

In vitroの体外受精実験では、加齢マウス由来の卵子は受精率および胚盤胞形成率が若年マウスと比べ有意に低下した。今回用いた生後1年のマウスは卵の質の低下を評価する実験系に用いるのは妥当と考えられた。2018年は加齢マウスを用いたマイトファジーの変化に関する検討を行う予定であった。しかしながら、加齢マウスを用いる実験系の問題点として、1飼育に1年以上の時間を要すること、2一匹から採取できる卵子数が若年マウスと比べ著しく少ないことがある。今回も加齢マウスとして研究に用いることが可能か妥当性を検討したため、マイトファジーの変化に関する検討を行うことができなかった。以上の理由で実験がやや遅れている。女性の加齢による妊孕力低下の原因として、卵の加齢による卵の質の低下が重要である。本研究では、ミトコンドリアの品質管理に着目し卵の質の低下のメカニズムを検討した。本研究では、卵の加齢とオートファジーによる選択的ミトコンドリア分解機構(マイトファジー)の変化を解析し、“卵の質の低下"に対する新しい予防・治療法の開発を目指す。研究初年度は、排卵後加齢卵(排卵後に時間が経過した卵)を用いた実験系にて、1ミトコンドリア転写因A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)の発現量の変化とミトコンドリア局在の変化、2オートファジー検出のマーカー分子であるLC3発現、3マイトファジーのマーカーであるParkinの発現を検討した。その結果、排卵後加齢卵では、新鮮卵と比べオートファジーが亢進している可能性が示唆された。またマイトファジーに関しても、排卵後加齢卵で亢進している可能性が示唆された。研究2年目は、母体加齢においても同様の現象が起きているかどうか検討を行った。加齢マウス(生後1年)を成熟雄マウスと交配させ、前核期胚を採取、胚盤胞形成について検討した。また、アポトーシス陽性細胞の割合を検討した。加齢マウス由来のin vivo胚は、若年マウスと比べ有意に胚盤胞形成率が低下し、アポトーシス細胞の増加が認められた。加齢マウス由来の卵について、TFAM、LC3、Parkinの発現を免疫蛍光染色にて検討した。排卵後加齢卵、母体加齢卵はいずれも卵の質が低下する事が明らかになったが、そのメカニズムにオートファジーおよびマイトファジーが関与している可能性がある。しかしながら、両者の卵の質の低下のメカニズムに関しては、すべてが同様と言うわけではないことが明らかとなった。今後さらに詳細な卵の質の低下の分子機構を解明する必要がある。今後マイトファジーの活性化と抑制をマイトファジーの刺激薬および阻害薬を用いて詳細に検討を行う予定である。さらに、母体加齢によるミトコンドリア品質管理の変化を検討する予定である。引き続き、加齢マウスを用いた母体加齢とマイトファジーの活性化の有無を明らかにする実験を行う予定である。加齢マウスから得られる卵子数は少ないため、蛋白レベルでの量的な変化を検出する方法は適切でなく、LC3やParkinなどの発現を免疫蛍光染色にて検討することにする。少数例での検討となるが、統計学的に検定が可能となるレベルまで実験を継続する予定である。
3次元統合化脳診断支援システムにおける大規模データーの高速処理に関する研究

平成14年度では、前年度に開発したボリュームデータ圧縮アルゴリズムの評価を行った。本アルゴリズムでは、ボリューム分割により生成したプロックに対し離散コサイン変換(DCT)を施す。各ブロックのDCT係数のうち交流成分をベクトルとして扱い、弱肉強食(LOJ)アルゴリズムを用いて生成した最適コードブックにより、これをベクトル量子化する。この結果、各ブロックは最も似ているコードベクトルのインデックスにより表現される。コードブックに対しては、JPEGの交流成分圧縮と同様にジグザグ方向の差分値をスカラ量子化した後にハフマン符号化を行い、データサイズを減少させる。また、残りのDCT係数である直流成分に対しても、隣接ブロック間の差分にハフマン符号化を適用し、データサイズを減少させる。本アルゴリズムの優れている点は、周波数空間における交流成分にのみベクトル量子化を行う点である。これにより、特に情報量の大きな直流成分の劣化を防ぎ比較的誤差の少ないデータ圧縮を実現する。また、コードブックと直流成分のハフマン符号化により、冗長な表現を減少させている。幾何学的三次元ボリュームの圧縮実験により、従来の圧縮手法と比べ提案手法が誤差と圧縮率の点で優れていることを示した。本アルゴリズムでは、コードブック生成に効率の良いLOJアルゴリズムを適用し高速な処理を指向しているが、このLOJアルゴリズムを並列化することにより、データサイズにスケーラブルな圧縮処理を実現した。分散メモリ型商用並列計算機や構築したPCクラスタを用いた並列コードブック生成実験により、台数の8割に近い並列処理効率を達成可能であることを示した。以上の結果から、ベクトル量子化によるデータ圧縮とその並列処理は、脳診断支援システムにおいて巨大な三次元データを実用的な時間内に扱うための基礎技術として有効であると結論する。これは重要な知見である。平成13年度では、ベクトル量子化によるボリュームデータ圧縮の基本アルゴリズムを開発、評価した。開発した圧縮アルゴリズムは、まず、ボリュームデータを分割することにより得られたブロックに対し、離散コサイン変換(DCT)を施す。次にブロック内DCT係数群を1つのベクトルとして扱い、ブロックの集合に対しコードブックを生成する。最後に、このコードブックを用いて、ブロック集合のベクトル量子化を行なう。本研究では、ベクトル量子化による圧縮を行なう場合でも、DCTによる周波数領域への変換によりデータの劣化を抑えた圧縮が可能であることを確認した。また、直流成分のように、データの重要な特徴を表している係数に対してベクトル量子化の度合を低くすることにより、主観的に劣化の少ない圧縮を実現できることが分かった。さらに、高速なコードブック生成アルゴリズムであるLOJアルゴリズムを適応することにより、非常に多数のベクトルを扱うボリュームのベクトル量子化においても、他の手法と比べて比較的短い処理時間で圧縮が行なえることを確認した。現在、提案アルゴリズムの詳細な性能評価に向けて,スカラー量子化によるボリューム圧縮手法との比較を準備中である。このため、ベクトル量子化データのエントロピー符号化処理を研究開発中である。また、次年度における研究展開へ向けて、ベクトル量子化アルゴリズムの並列化、及び、PCクラスタの構築に着手した。
現代的核力に基づく原子核殻構造と不安定核構造

自由空間における核子-核子散乱データを高精度で再現するように作られた種々の現代的核力から出発して、原子核構造において基本的な性質である殻構造、及び自然界には安定には存在しない不安定核の構造を微視的に記述する方法の開発、及び実際の大規模数値計算を行った。本研究によりC、O、Ca、Ni等の原子核における基本的な構造がabinitioな計算により記述され、その微視的立場からの理解が深まった。近年、原子核における魔法数が安定核と不安定核では異なることが理論・実感の両面で活発に議論されている。本研究では、多体理論unitary-model-operator approach (UMOA)の方法を用い、pf殻領域までの原子核に対して現代的核力から出発した第一原理的な構造計算を行い、1粒子準位構造(殻構造)を調べることによってこの問題を微視的立場から解決することを目指している。さらに、現代的核力から微視的に導出した有効相互作用を用いた大規模殻模型計算により、炭素同位体を中心とした不安定核におけるエネルギー準位や電磁遷移強度について微視的立場からの理解を深化させることも本研究におけるもう一つの大きな課題である。これまでに、最も典型的なニ重閉殻核である^<16>Oの基底状態エネルギーやその近傍の原子核の1粒子あるいは1空孔状態における殻構造の他、中性子過剰核^<15>Cにおける1粒子準位構造、さらにはより重い領域である^<40>Ca近傍核における殻構造をUMOAの方法により微視的に記述することに成功してきている。さらには、近年実験的に測定され非常に話題になっている、^<16>Cにおける第一励起2^+状態から基底0^+状態への非常に小さな電気4重極遷移確率を新たに開発した大規模殻模型計算の方法によって矛盾なく記述することに、この種の微視的な計算方法では世界で初めて成功した。また、計算された低励起エネルギー準位についても実験値と非常に良い一致を示しており、本計算方法の信頼性が非常に高いことが確認された。現在、さらに重い炭素同位体に対する大規模殻模型計算が進行中であり、新たな知見を得ることが期待される。近年、原子核における魔法数が安定核と不安定核では異なることが理論・実験の両面で活発に議論されている。本研究では、多体理論unitary-model-operator approach(UMOA)の方法を用い、pf殻領域までの原子核に対して現代的核力から出発した第一原理的な構造計算を行い、1粒子準位構造(殻構造)を調べることによってこの問題を微視的立場から解決することを目指している。さらに、現代的核力から微視的に導出した有効相互作用を用いた大規模殻模型計算により、炭素同位体を中心とした不安定核におけるエネルギー準位や電磁遷移強度について微視的立場からの理解を深化させることも本研究にけるもう一つの大きな課題である。これまでに、最も典型的な二重閉殻核である16^Oの基底状態エネルギーやその近傍の原子核の1粒子あるいは1空孔状態における殻構造の他、中性子過剰核^<15>Cにおける1粒子準位構造、さらにはより重いsd殻領域である^<40>Ca近傍核における基底状態の諸性質をUMOAの方法により微視的に記述することに成功してきている。また、最近になってpf殻核である^<56>Niに対する計算も可能となった。さらには、新たに開発した大規模殻模型計算の方法によって、近年実験的に測定され話題となっている16^Cにおける第一励起2^+状態から基底0^+状態への抑制された電気4重極遷移確率を矛盾なく説明することにこの種の微視的な計算方法では世界で初めて成功した。また^<18>Cに対する電気4重極遷移確率の計算結果はその後報告された実験値と極めて近いことが確認され、本方法の信頼性が高められた。現在、さらに重い炭素同位体や酸素同位体に対する大規模殻模型計算が進行中であり、この領域の原子核に対する微視的立場からの統一的理解が深まることが期待される.自由空間における核子-核子散乱データを高精度で再現するように作られている種々の現代的核力から出発して、原子核における基本的性質である魔法数、基底状態エネルギー、一粒子エネルギー準位等の構造を多体理論unitary-model-operator approach(UMOA)によりpf殻領域の^<56>Ni程度の原子核まで微視的に記述することが可能となった。現在、より精密な計算結果を得るために模型空間を拡大した計算を実行中である。また、UMOAで用いられているユニタリー変換の方法を応用し、芯なしの殻模型計算のための有効相互作用を現代的核力から微視的に求め、中性子過剰炭素同位体や^<18>Oに対する大規模殻模型計算を行ってきている。中性子過剰炭素同位体である^<16>Cや^<18>Cについてはすでに前年度の研究において学術雑誌上に公表しているが、今年度はより重いドリップライン近傍核である^<20>Cや^<22>Cに対しても現実的な数値計算が出来るような方法を開発してきた。

この領域の不安定核構造を現代的核力に基づき微視的に記述するのは本研究が世界で最初である。^<16>Cと同様の模型空間の広さで^<20>Cや^<22>Cのような原子核の殻模型計算を行うと対角化する行列の次元数が10億次元を超え数値計算がかなり困難となるため、模型空間を少し縮小して計算する方法を考案した。この処方によっても^<16>Cの計算結果が以前のものとそれほど変わらないことを確認した上で、実際に^<20>Cや^<22>Cに対する殻模型計算を実行してきている。計算がかなり大規模となったため、まだ成果を学術雑誌に投稿するまでにはいたっていないが、日本物理学会での口頭発表等において途中経過を報告してきている。計算、解析が完了次第、論文としてまとめる予定である。一方で^<18>Oに対する殻模型計算が先に完了したため、その成果を論文にまとめ、学術雑誌Phys. Rev. Lett.に投稿した(現在審査中)。
分野横断的研究組織による検討会を定期的に開催した。先行研究や既存事例のレビューを通し、社会的フレイル等の概念共有と、理論的枠組みの構築を進めた。また、社会的活動性を向上する標準的手法と、それを実現する地域活動プログラムの在り方を検討した。特に、フレイルの定義を明確にした。フレイルとは、加齢により保有するフィジカル(身体的)・メンタル(精神的)・ソーシャル(社会的)な能力や資源が貧困化し脆弱性を抱えている状態である。千葉県柏市における高齢者大規模コホート研究(柏スタディ)の追加調査を実施した。社会的活動性の指標として、外出頻度・内容、交流(共食、支援の授受、ネットワーク)の頻度・内容、組織参加数・頻度、就労・ボランティア活動の有無・頻度、自宅外で行う活動(趣味・社会活動)の種類・数、社会的役割(家族・親族間での役割)の種類・数を用いた。また、空間、行動・行動様式、人間・社会関係、身体的・精神心理的・社会的フレイルに関するデータも同時に収集した。2012年からのデータと今回収集したデータを統合した縦断解析用データセットを作成し、フレイルの進行と社会的活動性低下の機序にかかる多変量解析に着手した。同柏市豊四季団地において、シニアによるコミュニティ活動のファシリテーションの一環として、ビデオ会話分析等を実施した。神奈川県鎌倉市大平山丸山地区において、住民主導による検討会議を複数回開催し、質問紙調査を実施した。上述の通り、フレイルの定義を理論的に明確することができた。これにより、具体的な介入方法の検討が進めやすくなった。また予定通り、高齢者大規模コホート研究(柏スタディ)を実施することができた。社会的活動性を向上する地域活動プログラムの研究開発として、千葉県柏市豊四季団地、神奈川県鎌倉市大平山丸山地区、秋田県秋田市、被災地復興都市である岩手県釜石市などでも、住民主導の検討会立上げに着手できた。(1)分野横断的研究組織による検討会を継続し、概念共有と理論的枠組みの構築を進める。(2)2012年から2018年までの高齢者大規模コホート研究データを用いて、フレイルの進行と社会的活動性低下の機序にかかる多変量解析を実施する。また、解析結果を社会的活動性を向上する地域活動プログラムの内容に反映させる。(2)高齢者の社会的活動性の維持・向上を可能にする標準的手法の構築として、この大規模高齢者コホート研究の分析結果をもとに、高齢者等にインタビュー調査やグループワーク等を実施する。量的データ解析と質的データ分析を行い、高齢者の社会的活動性の維持・向上を可能にする標準的手法を明らかにし、高齢者への介入プロセスモデルを構築する。(3)モデルフィールドにおける標準的手法の試行(介入)として、千葉県柏市豊四季団地、神奈川県鎌倉市等において、本モデルに基づく高齢者への介入プログラムを開発する。
量的データ解析と質的データ分析を行い、高齢者の社会的活動性の維持・向上を可能にする標準的手法を明らかにし、高齢者への介入プロセスモデルを構築する。(3)モデルフィールドにおける標準的手法の試行(介入)として、千葉県柏市豊四季団地、神奈川県鎌倉市等において、本モデルに基づく高齢者への介入プログラムを開発する。
即時負荷を可能にするナノ領域制御型インプラントシステムの創出

チタン製インプラント表面の反応性は,表面形状や性状に大きく左右されることが知られている.とくにμmオーダの表面形状付与により細胞形態を変化させ,骨新生を向上させる試みがなされている.しかし,骨治癒の飛躍的向上にはナノ領域における分子レベルの精密な機能発現が重要である.これまで電気化学的手法によりインプラント表面にリン酸カルシウムを析出させる試みがなされてきたが,結晶が比較的大きく,反応性が低いため,生体高分子のスキャフォールドとして不十分であった.本研究により,リン酸カルシウムナノ微粒子による,チタン表面修飾技術を達成した.擬似体液中での液中放電により,リン酸カルシウム結晶の成長を抑制しつつ,結晶性の高いナノ微粒子をチタン表面に析出させることが可能となったためである.これにより生体系特有と見なされてきた,生体高分子との高次構造を人工材料であるチタン表面に再現することができる.即時負荷を目的としたインプラント体は高トルクで埋入されるため,インプラント体の表面の微粒子は埋入時に剥離しやすい.このため,即時負荷インプラントのコーティング層は数μm以下の厚さで母材と強力に接着していることが望ましい.本研究で開発した液中放電処理法は,処理中に新たに形成されたTiO酸化膜中にリン酸カルシウムナノ微粒子が傾斜的に析出するため,これまで市場で提供されている熱噴射による処理よりも,この点有効である.また本法は液中でインプラント体を電極とするため複雑な形状を有する現在のインプラント体表面修飾技術として適している.また,本処理によって得られたリン酸カルシウムナノ微粒子単体でも,硬組織再生に有用であることが明らかとなった.チタン製インプラント表面の反応性は,表面形状や性状に大きく左右されることが知られている.とくにμmオーダの表面形状付与により細胞形態を変化させ,骨新生を向上させる試みがなされている.しかし,骨治癒の飛躍的向上にはナノ領域における分子レベルの精密な機能発現が重要である.これまで電気化学的手法によりインプラント表面にリン酸カルシウムを析出させる試みがなされてきたが,結晶が比較的大きく,反応性が低いため,生体高分子のスキャフォールドとして不十分であった.本研究により,リン酸カルシウムナノ微粒子による,チタン表面修飾技術を達成した.擬似体液中での液中放電により,リン酸カルシウム結晶の成長を抑制しつつ,結晶性の高いナノ微粒子をチタン表面に析出させることが可能となったためである.これにより生体系特有と見なされてきた,生体高分子との高次構造を人工材料であるチタン表面に再現することができる.即時負荷を目的としたインプラント体は高トルクで埋入されるため,インプラント体の表面の微粒子は埋入時に剥離しやすい.このため,即時負荷インプラントのコーティング層は数μm以下の厚さで母材と強力に接着していることが望ましい.本研究で開発した液中放電処理法は,処理中に新たに形成されたTiO酸化膜中にリン酸カルシウムナノ微粒子が傾斜的に析出するため,これまで市場で提供されている熱噴射による処理よりも,この点有効である.また本法は液中でインプラント体を電極とするため複雑な形状を有する現在のインプラント体表面修飾技術として適している.また,本処理によって得られたリン酸カルシウムナノ微粒子単体でも,硬組織再生に有用であることが明らかとなった.申請者らはこれまで多くの研究助成を受けながら,生体材料としてのチタンに対して,加工と表面処理の一連の研究を行ってきた.放電を利用した技術は,他の歯科領域の研究機関ではほとんど研究されていない独創性の高いものである.特に,世界に先駆けてワイヤ放電加工法の有用性に着目し,基礎研究を行い,これを実用化することに成功した.一連の研究は,放電のエネルギーがチタンの成形加工だけではなく,表面改質にも応用できることを見出した現存するインプラントシステムには以下の問題点がある,(1)インプラント体は,新生骨との直接結合により機能しうるが,3-6ヶ月の骨治癒期間が必要とされる.口腔機能の維持,審美および心理社会面の観点から,インプラント体を顎骨に埋入後,直ちに機能させる(即時負荷)技術が求められているが,現状では適応症が限られている.(2)インプラントの母材であるチタン表面には天然歯に見られる免疫機構がないことから長期的な維持が難しい.また術式としては感染防御のため,術創を骨結合獲得までの期間,一度閉鎖する2回法が推奨されている.(3)インプラント埋入部位によっては骨量の不足により,インプラント補綴そのものが不可能な症例もある。これらの問題点の解決策として(1)インプラント体の形状や微小表面構造(マイクロメートルオーダ)の改良により,主に細胞応答を向上.(2)抗菌効果の得られる薬剤をチタン表面にコーティング.(3)自家骨移植や,骨充填材,おもにリン酸カルシウム系セラミックスによる,埋入部位の骨増量,などが検討されている.しかし,細胞応答の向上のみでは,骨結合促進には限界がある.抗菌効果は一般に細胞毒1生を伴う.また自家骨採取はドナー部位が制限される.骨充填材は生体内での安定性に1および成形性が悪く,インプラント表面と反応しないことから,即時負荷において重要なインプラントの初期固定が難しい.したがって本研究では,(1)マイクロオーだからさらにナノレベルの表面修飾により,生理活性物質や生体高分子の反応性を著しく向上させる.(2)抗菌性と生体適合性を融合させる.(3)インプラント体表面と反応性の高い骨充填材を開発する.本研究の更なる推進によって,ナノスケールでインプラント表面を制御できるものと考えられる.

チタン製インプラント表面の反応性は,表面形状や性状に大きく左右されることが知られている.とくにμmオーダの表面形状付与により細胞形態を変化させ,骨新生を向上させる試みがなされている.しかし,骨治癒の飛躍的向上にはナノ領域における分子レベルの精密な機能発現が重要である.これまで電気化学的手法によりインプラント表面にリン酸カルシウムを析出させる試みがなされてきたが,結晶が比較的大きく,反応性が低いため,生体高分子のスキャフォールドとして不十分であった.本研究により,リン酸カルシウムナノ微粒子による,チタン表面修飾技術を達成した.擬似体液中での液中放電により,リン酸カルシウム結晶の成長を抑制しつつ,結晶性の高いナノ微粒子をチタン表面に析出させることが可能となったためである.これにより生体系特有と見なされてきた,生体高分子との高次構造を人工材料であるチタン表面に再現することができる.即時負荷を目的としたインプラント体は高トルクで埋入されるため,インプラント体の表面の微粒子は埋入時に剥離しやすい.このため,即時負荷インプラントのコーティング層は数μm以下の厚さで母材と強力に接着していることが望ましい.本研究で開発した液中放電処理法は,処理中に新たに形成されたTiO酸化膜中にリン酸カルシウムナノ微粒子が傾斜的に析出するため,これまで市場で提供されている熱噴射による処理よりも,この点有効である.また本法は液中でインプラント体を電極とするため複雑な形状を有する現在のインプラント体表面修飾技術として適している.また,本処理によって得られたリン酸カルシウムナノ微粒子単体でも,硬組織再生に有用であることが明らかとなった.
ILー2がキラー細胞の生体内動態に及ぼす影響についての検討ートランスジェニックマウスを用いてー

キラ-細胞による抗腫瘍効果亢進を期待して投与が試みられているILー2の生体内での機能を検討する目的で、ILー2産生トランスジェニックマウスの作製を試みた。マウス受精卵に導入するDNAとしてはヒトジェノミックILー2遺伝子(gILー2)とプロモ-タ-部位をマウスのメタロチオネインのそれと交換したもの(MTgILー2)を用いた。ヒトILー2遺伝子を使用したのは、培養系でヒトILー2がマウスのキラ-活性を誘導し得ること及びマウスの内因性ILー2とを識別するためである。2種類のDNAをB_6マウス受精卵に導入したところ、別個に得られたgILー2仔マウス37匹のうち4匹がトランスジェニックであることが尾のDNAを使用したSouthern blot解析の結果明らかとなった。一方MIgILー2の方は、30中8匹がトランスジェニックであった。これら仔マウスを支配するため成長を待ったところ、2週令より運動失調症状が出現し成長も遅れた。また妊婦トランスジェニックマウスがなかなか得られないので、一部のトランスジェニックマウスは体外受精を試み、他は病理組織学的検索に供した。その結果成熟トランスジェニックマウスの小脳にはリンパ球,単球,好中球を主体とした炎症細胞の浸潤が著明で小脳実質構造はほとんど保たれていなかった。その他の臓器に変化は認められなかった。体外受精で得られたF_1トランスジェニックマウスを経時的に検索すると、小脳の変化は生後4日目のくも膜下腔におけるリンパ球集簇に始まり、以後実質的に単球と共に浸潤していった。こられリンパ球はT及びB細胞でILー2レセプタ-陽性細胞も検出された。以上の結果は、小脳のリンパ球浸潤による小脳変化は導入されたヒトILー2遺伝子により誘導されたことを示唆する。交配によるF_1マウスの収得が困難であったため検索が遅れたが、現在トランスジェニックマウス中のヒトILー2を測定中である。
前立腺癌発癌機序における活性酸素関連遺伝子の多型解析

MnSOD-AA型はPCa全体でOR=1.90(95%CI=0.97-3.71)であったが,aggressive PCaではOR=2.86(95%CI=1.10-7.40)であった.更に71歳以上のaggressive PCaではOR=4.89(95%CI=1.74-25.7)であったが,70歳以下では相関を認めなかった.non-aggressive PCaでは年齢によらず,MnSOD-AA型と相関を認めなかった.MnSOD-AA型はaggressive PCaのリスクであると考えられる.MnSOD-AA型は潜在前立腺癌においてリスクであるが,これまでの報告に一貫性がない原因の一つに対照群における潜在癌の存在(Verification Bias)が挙げられる.対照群に潜在癌が含まれると,偽陰性結果が多くなり,統計学的解析力も低下する,MnSOD-AA型は高齢者潜在前立腺癌のリスクであると考えられるが,70歳以下の群ではVerification Biasが影響している可能性も否定はできない.今後,更に酸化ストレス関連遺伝子における遺伝子多型解析をすすめ,解析サンプル数を増やす予定である.
マウス接触光過敏症における抑制性Th2細胞のT細胞受容体の解析

接触光過敏症(contact photosensitivity;CPS)は遅延型過敏症の一型であり、テトラクロロサリチルアニリド(TCSA)を光ハプテンとすることにより誘導可能である。このCPSは、光感作部皮膚に中波長紫外線(UVB)を前照射することによりCD4+の光ハプテン特異的サプレッサーT細胞(Ts)が誘導され感作成立が抑制される。我々は、Ts誘導マウス脾細胞をTCSA光修飾細胞で抗原刺激を行うことにより、99%がCD4+のフェノタイプを持ち、in vivoおよびin vitroにおいて抗原特異的な抑制活性を有し、高濃度にTsを含む細胞群(pulsed T cell;Tp)を精製し、またバイオアッセイをもちいて蛋白レベルでのサイトカイン産生パターンを調べたところTpが抗原刺激によりIL-4を産生し、また、TpよりmRNAを抽出しRT-PCR法により調べたところIL-4,IL-10のシグナルを認め、Th2としての性格を有することを示した。さらにTpのT細胞受容体(TCR)をマウスTCRVβに対する抗体を用いて調べたところVβ7とVβ13の2種類のクローンからなることがわかり一方の影響を除外したうえでin vitroにおいて調べたところVβ7を有するクローンに抑制活性があることがわかった。さらにこの抑制活性はIL-10に対する抗体を加えることで消失した。in vivoにおいてTs誘導マウス脾細胞を抗Vβ7抗体と補体で処理しナイーブマウスに投与したところ抑制活性が消失した。これらよりVβ7を有するT細胞が抑制活性を有しその活性はIL-10にある事を示し,このときTs投与マウスにおける惹起反応の抑制とリンパ節細胞内のVβ7陽性細胞数とに相関が見られた.またTpにおいてTh2タイプのサイトカイン産生を示すクローンはVβ7であることを確認した.接触光過敏症(contact photosensitivity;CPS)は遅延型過敏症の一型であり、テトラクロロサリチルアニリド(TCSA)を光ハプテンとすることにより誘導可能である。これらよりVβ7を有するT細胞が抑制活性を有しその活性はIL-10にある事を示し,このときTs投与マウスにおける惹起反応の抑制とリンパ節細胞内のVβ7陽性細胞数とに相関が見られた.またTpにおいてTh2タイプのサイトカイン産生を示すクローンはVβ7であることを確認した.
潰瘍性大腸炎合併大腸癌の早期発見のための分子イメージングの開発

潰瘍性大腸炎に合併する大腸がんの発見に、新たに開発したがんで光るプローブが有効か否かを検討した。潰瘍性大腸炎に合併する大腸がんの動物モデルの大腸標本や、外科手術で切除した患者さんの大腸標本にこのプローブを散布すると、数分後にがんの部位で強く光りだすことが明らかとなった。この研究により、新たに開発したプローブが、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌の内視鏡での早期発見に有用である可能性が考えられた。浦野らにより開発された癌細胞に取り込まれた後に初めて発光する蛍光プローブを用いて、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌(以下潰瘍性大腸炎関連大腸癌)の動物モデルにおける高感度蛍光イメージングの有用性を検討中である。その後、EGFRやHER2などの大腸癌の標的タンパクが過剰発現している腫瘍細胞株にプローブが取り込まれるか否か、さらにエンドサイトーシスに伴うpH低下により蛍光上昇が起こるか否かを検討することにより抗体蛍光プローブの特異性を確認した。UC関連大腸癌モデルマウスの摘出標本を用いて、抗体蛍光プローブのex vivoでの評価を行う。モデルとしてはまずデキストラン硫酸/とアゾキシメタン惹起性大腸癌マウスを使用した。本モデルマウスの大腸を摘出し、粘膜面を表側にして迅速に固定し、粘膜表面に抗体蛍光プローブを散布する。室温にてインキュベーションした後、イメージアナライザー(MaestroTM, CRI)を用いて癌部と非癌部の発光状態を経時的に観察した。観察終了後、ホルマリン標本を作製し、HE染色、免疫染色(EGFR, HER2, p53,β-catenin, Ki-67など)による組織像を観察し、蛍光イメージング像と対比した。浦野らにより開発された各種蛍光プローブを用いて、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌(潰瘍性大腸炎関連大腸癌)での蛍光イメージングの有用性を検討中である。本年度は、おもに潰瘍性大腸炎関関連大腸癌モデルマウスを用いた動物実験を行なった。モデルとしては、デキストラン硫酸/アゾキシメタン惹起性大腸癌マウスとT細胞β受容体/p53遺伝子二重欠損マウスを使用した。大腸摘出標本に蛍光プローブ(抗epidermal growthfactor receptor(EGFR)抗体や抗humanepidermal growthfactor receptor type2 (HER2)抗体などの抗体プローブや、cathepsinやγglutamyltransferase (GGT)などの酵素プローブ)を添加し有用性をex vivoで評価した。大腸を摘出後、粘膜面を表側にして迅速に固定し、粘膜表面に蛍光プローブを散布する。室温にてインキュベーションした後、イメージアナライザー(MaestroTM, CRI)を用いて癌部と非癌部の発光状態を経時的に観察を行なった。その結果、特に抗EGFR抗体やGGTプローブでは腫瘍部に一致して明瞭な発光像が得られることが明らかとなった。観察終了後には、ホルマリン標本を作製し、HE染色、免疫染色(EGFR, HER2, p53,β-catenin, Ki-67など)による組織像を観察し、蛍光イメージング像との対比を行なった。また、マウスの大腸癌細胞株を用いたin vitroの実験を行った。大腸癌細胞株に蛍光プローブを添加し、FACSを用いて蛍光プローブの発光状態を観察した。その結果、使用している蛍光プローブの特異性が確認された。さらに、ヒト大腸腫瘍での検討も開始した。切除標本に蛍光プローブを添加し、動物の場合と同様の蛍光像が得られるか否かについて検討中である。本研究では、浦野らにより開発された蛍光プローブが潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌(潰瘍性大腸炎関連大腸癌)の分子イメージングに有用であるか否かを検討した。まずマウスおよびヒトの大腸癌細胞株を用いたin vitroでの検討を行った。蛍光プローブ(抗epidermal growthfactor receptor(EGFR)抗体などの抗体プローブや、cathepsinやγ-glutamyltransferase (GGT)などの酵素プローブ)を大腸癌細胞株に添加したのちにFACS解析を行ない、使用する蛍光プローブが大腸腫瘍細胞で陽性像を示すことを確認した。つぎに潰瘍性大腸炎関関連大腸癌モデルマウスとしてデキストラン硫酸/アゾキシメタン惹起性大腸癌マウスおよびT細胞β受容体/p53遺伝子二重欠損マウスの2種類を作製して、蛍光プローブのex vivoでの有用性を検討した。摘出大腸粘膜に蛍光プローブを散布し、イメージアナライザー(MaestroTM, CRI)を用いて発光状態を経時的に観察した。その結果、一部の蛍光プローブ、特に抗EGFR抗体やGGTプローブで癌に一致して明瞭な発光像が得られることが明らかとなった。さらに、ヒト大腸癌を用いたex vivoでの検討を行なった。外科的または内視鏡的に摘出した通常大腸癌または潰瘍性大腸炎関関連大腸癌組織の粘膜に蛍光プローブを散布し、イメージアナライザーを用いて発光状態を観察した結果、一部の蛍光プローブ、特にGGTプローブで癌に一致して明瞭な発光像が得られることが明らかとなった。以上の結果より、本研究で使用した蛍光プローブを用いた内視鏡分子イメージングが、潰瘍性大腸炎患者に合併する大腸癌の早期発見に有用な手段となり得る可能性が強く示唆された。

潰瘍性大腸炎に合併する大腸がんの動物モデルの大腸標本や、外科手術で切除した患者さんの大腸標本にこのプローブを散布すると、数分後にがんの部位で強く光りだすことが明らかとなった。この研究により、新たに開発したプローブが、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌の内視鏡での早期発見に有用である可能性が考えられた。前年度は、デキストラン硫酸/アゾキシメタン惹起性大腸癌マウスにおける大腸癌の発生頻度が30-40%と大幅に低下した。そのため、予定の担癌マウス数を確保し、その後の解剖、腸管摘出、抗体蛍光プローブの散布、イメージアナライザーでの観察、ホルマリン固定後のHE染色、免疫染色など一連の実験を行なうためには予定以上の期間が必要であった。本年度は、動物モデルにおける大腸癌の発生頻度は大幅に回復したため、実験はほぼ順調に進行した。もう一つの大腸癌モデルであるT細胞β受容体/p53遺伝子二重欠損マウスでの実験も概ね予定通り進行している。次年度から着手予定であった、ヒト大腸腫瘍の摘出標本を用いたex vivoでの検討も開始することができた。炎症性腸疾患今後は、ヒト大腸癌の摘出標本を用いたex vivoでの検討を中心に実施する。外科的または内視鏡的に摘出された通常大腸腫瘍または潰瘍性大腸炎関関連大腸癌組織を使用し、腫瘍粘膜面を表側にして採取組織を迅速に固定したのちに、各種蛍光プローブ(抗EGFR抗体や抗HER2抗体などの抗体プローブや、cathepsinやγGGTなどの酵素プローブ)を散布する。室温にてインキュベーションした後、イメージアナライザーを用いて癌部と非癌部の発光状態を経時的に観察する。観察終了後、ホルマリン標本を作製し、HE染色、免疫染色(EGFR, HER2, p53,β-catenin, Ki-67など)による組織像を観察し、蛍光イメージング像との対比を行なう。さらに、前年度から実施している潰瘍性大腸炎関関連大腸癌モデルマウス(T細胞β受容体/p53遺伝子二重欠損マウス、デキストラン硫酸/とアゾキシメタン惹起性大腸癌マウス)を用いたex vivoでの検討に関する追加実験を行なう。すなわち、摘出標本に蛍光プローブを添加した後に腫瘍部の割面標本を作製し、組織レベルでの蛍光陽性細胞の局在、特異性を検討する。次に、デキストラン硫酸/とアゾキシメタン惹起性大腸癌マウスとT細胞β受容体/p53遺伝子二重欠損マウスを使用してin vivoでの検討を行う。抗体蛍光プローブを注腸投与したのちに蛍光内視鏡検査を行い、大腸粘膜での発光状態を確認し、発光部より生検を行い、その組織像を検討する。その後大腸を摘出して固定し、イメージアナライザーを用いて発光状態を再度観察する。最後に、これまでに動物モデルとヒト標本での検討から得られた結果をまとめ、その成果の発表する。本年度は、最初にEGFR抗体、HER2抗体などを蛍光プローブによりラベル化して抗体蛍光プローブの作製を行い、EGFRやHER2などの大腸癌の標的タンパクが過剰発現している腫瘍細胞株にプローブが取り込まれるか否か等を検討しプローブの特異性を確認した。次にデキストラン硫酸/とアゾキシメタン惹起性大腸癌マウスとT細胞β受容体/p53
新規な殺蚊Cry46Abトキシンの作用機構とトキシン間シナジー効果の解明

Cry46Abはヒト白血病ガン細胞に対する細胞損傷活性とアカイエカ幼虫に対する殺虫活性を併せ持つトキシンである。また他の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aaや11Aa、11Baなど)と混合することで、アカイエカ幼虫に対する殺虫活性が顕著に増強(2倍5倍)され、持続利用可能な蚊防除システムに寄与する新しい微生物資材として期待される。殺虫活性の増強は作用機構が異なるトキシンを混合した結果と考えられ、Cry46Abの作用機構を解明すること及び他のCryトキシンとの比較研究が喫緊の課題となっている。本年度はCry46Abの作用機構の中心を構成すると考えられる小孔形成について電気生理学的な解析を進めた。実験では大豆由来のリン脂質(アゾレクチン)を用いて人工平面膜を作製し、そこにトリプシンで活性化させた組換えCry46Abを加えて小孔を形成させた。その結果、イオンチャネルの様に小孔の開状態と閉状態の間を遷移する膜電流が観察され、最終的に3種類のバッファー(150 mM KCl、NaCl、CaCl2)条件下におけるシングルチャネルコンダクタンスを求めることに成功した。また非対称なバッファー条件下で行ったシングルチャネル解析の結果から、Cry46Abチャネルがカチオン選択的であることが明らかになり、K+とCl-の透過比(PK/PCl)は約4と見積もられた。またCry46Abチャネルが透過させるカチオンはK+ > Na+、K+ >Ca2+、Ca2+ > Na+であることが明らかになった。実施予定のCry4Aaや11Aa、11Baについても同様の解析が進めば、Cry46Abと他の殺蚊Cryトキシン間における作用機構上の差異も明らかになり、殺虫Cryトキシンの作用機構、さらには殺虫活性の増強につながる因子の特定に寄与すると考えている。本研究の第一目標は新しい殺蚊Cry46Abトキシンの作用機構、特にCry46Abの小孔形成メカニズムを解明することである。これに関して本年度は主にCry46Abが人工平面膜上に形成する小孔の電気生理的な解析を進め、その性状のいくつか(イオン選択性)を明らかにすることができた。一方、小孔形成と殺虫活性の関連性については明らかになったとは言えず、比較研究に用いる既知の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)についても同様の解析を進める必要があった。本年度はこれら組換えトキシンの調製条件の最適化に時間がかかり、具体的な解析を行うまでに至らなかったが、現時点で問題はほぼ解決できており、次の段階に進める準備も整った。(1) 3種類の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)について、本年度行ったCry46Abと同様な解析を行い、これらが人工平面膜上に形成する小孔の性質を明らかにする。Cry46Abも含めた比較を進めることで、トキシンが標的細胞膜上に形成する小孔の性質と殺虫活性の関連性、そして殺虫活性助長効果との関連性を明らかにする。(2) Cry46Abが形成する小孔の性質、特にイオン選択性をコントロールする技術の開発を始める。Cry46Abの膜貫入部位は、構造的な類似性から大まかに特定可能であるため、その領域を標的とする変異導入解析を行い、作製した変異体が形成する小孔についても電気生理的な解析を始める。本研究の第一目標は新しい殺蚊Cry46Ab

トキシンの作用機構、特にCry46Abの小孔形成メカニズムを解明することである。これに関して本年度は主にCry46Abが人工平面膜上に形成する小孔の電気生理的な解析を進め、その性状のいくつか(イオン選択性)を明らかにすることができた。一方、小孔形成と殺虫活性の関連性については明らかになったとは言えず、比較研究に用いる既知の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)についても同様の解析を進める必要があった。本年度はこれら組換えトキシンの調製条件の最適化に時間がかかり、具体的な解析を行うまでに至らなかったが、現時点で問題はほぼ解決できており、次の段階に進める準備も整った。(1) 3種類の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)について、本年度行ったCry46Abと同様な解析を行い、これらが人工平面膜上に形成する小孔の性質を明らかにする。Cry46Abも含めた比較を進めることで、トキシンが標的細胞膜上に形成する小孔の性質と殺虫活性の関連性、そして殺虫活性助長効果との関連性を明らかにする。(2) Cry46Abが形成する小孔の性質、特にイオン選択性をコントロールする技術の開発を始める。Cry46Abの膜貫入部位は、構造的な類似性から大まかに特定可能であるため、その領域を標的とする変異導入解析を行い、作製した変異体が形成する小孔についても電気生理的な解析を始める。本研究では新しい殺蚊トキシンCry46Ab以外にも、既知の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa及び11Aa, 11Ba)が形成する小孔の性状を調査する。しかし組換えCry4Aa及び11Aa, 11Baの調製において、Cry46Abと同様の手法では収量が低くなるという問題が生じた。次年度使用が生じた理由は、これら組換えトキシンの調製方法を最適化するのに時間がかかったためで、現時点でその問題もほぼ解決している。本年度の残額は当初の予定通り、組換えCry4Aa及び11Aa, 11Baが形成する小孔の電気生理学的な解析に必要な消耗品を購うために使用する。
世界の都市空間を対象とした高解像度衛星画像データによる空間形態解析

本研究の目的は、国内および海外の都市空間を対象として、空間の形態に着目し、高解像度衛星画像データから、その構造や配置パターンを解析する手法を考案することである。空間の形態とは、道路や街区、緑地、水系、建物などの幾何学的情報を示すもので、都市構成要素ともいえる。また、実際に複数の都市空間に対してその分析手法を適用し、同一の評価軸による都市空間の相対化、レベル化を行って分類することを想定している。まず、地形図などの正確な幾何学的情報を使用して、空間のスケールと空間構成要素の形態との関係を捉えるために、東京23区内の地理情報システムデータを用いて、空間構成要素の規模、形、配置に関する分析を行った。これを参考として、東京都の渋谷周辺5km四方の高解像度衛星画像データから、スケールごとに抽出されるべき空間構成要素を抽出・分類し、都市構成要素の階層的記述の方法を検討した。具体的には、高解像度衛星画像を縮尺の異なる多数の画像に分け、画像ごとに表れる都市構成要素やそのパターンについて、目視による抽出を行った。次いで、抽出した要素の集合形態から、マクロスケール、中間スケール、ミクロスケールの3スケールに分類し、要素の階層的記述を行った。主に、ミクロスケールでは、人造物、地表面、鉄道、道路の分類、中間スケールでは街区と道路等の分類、マクロスケールでは、図と地の分類が行われた。最後に、画像処理による空間構成の自動抽出の方法について検討し、都市構成要素の一部(ミクロスケールの分類に表れた「質感」要素)の抽出を実際に行い、自動抽出の可能性を確認した。本研究の目的のひとつは、国内および海外の都市空間を対象として、空間の形態に着目し、高解像度衛星画像データから、その構造や配置パターンを解析する手法を考案することであり、空間の形態とは、道路や街区、緑地、水系、建物などの幾何学的情報を示すものである。また、実際に複数の都市空間に対して上記の手法を適用し、同一の評価軸による都市空間の相対化、レベル化を検討して、都市空間の分類を試みることも予定されている。本年度は、はじめに東京都内の渋谷駅周辺の5km四方を対象として、高解像度衛星画像データ(解像度1m、4バンドカラー、水平誤差±1.75mのデジタルオルソ・エキスパート画像)をサンプルとして使用し、画像特性の分析を行った。その結果、高解像度衛星画像データから巨大な緑地や水系などは比較的抽出しやすいが、それ以外の情報の抽出は困難であり、従って、空間形態の認識プログラム、空間パターンの解析プログラムの作成するための予備的研究として、地形図などの正確な幾何学的情報を利用して、空間のスケールと空間構成要素の形態(大きさと形)との関係について把握することが必要であると認識した。これに基づき、東京23区内という広域を対象として、既存の地理情報システムデータ(GISデータ)を使用し、空間構成要素のカテゴリーごとに、規模、形、配置に関する分析を行った。空間構成要素のカテゴリーとしては、公園、農地、駐車場、未利用地、園地などが挙げられ、それぞれの規模分布や空間的な分布状況を把握した。これらのデータは、高解像度衛星画像データについての空間形態の認識プログラム、および空間パターンの解析プログラムを作成する上で基礎的データとして取り扱われる。
膵癌におけるバイオマーカーの探索ーＣＴＯＳ法を用いた検討

膵癌の薬物治療の効果予測に有効なバイオマーカーを発見するため、超音波内視鏡ガイド下針生検(FNA)により採取した膵癌組織の余剰サンプルから、癌細胞を単離培養して、治療効果予測となりうるバイオマーカーを探索することを目的としている。現在までのところ、1大腸癌の臨床検体では高い成功率で癌細胞の単離培養が可能となる手法(CTOS法)の膵癌細胞培養への応用、2大腸癌のEGF受容体に対する分子標的治療薬のセツキシマブの治療効果予測の重要なバイオマーカーとして報告されているKRAS変異と膵癌に臨床応用されている抗EGF受容体阻害薬エルロチニブの膵癌培養細胞に対する抗腫瘍効果の関係の検討を行った。1大腸癌細胞では、申請者が開発した手法で大腸癌組織を機械的に細断、酵素処理を行った細胞塊は細胞間接着を維持しており、浮遊培養下アノイキスを回避し高い生存性を保った球状の安定した細胞塊CTOS(cancer tissue-originated spheroids)を形成したが、膵癌由来培養細胞では、浮遊条件下、球状の細胞塊を形成しなかった。膵癌培養細胞ではE-cadherinの発現が認められず、細胞間接着が不良であるため浮遊培養条件下でアノイキスが生じたことが原因となっていることが考えられた。2大腸癌組織由来CTOSに対して、5-FUは用量依存性に抗腫瘍効果を発揮したが、セツキシマブはRAS野生型細胞に対しても抗腫瘍効果を発揮しなかった。膵癌培養細胞では、RASの野生型/変異型に関わらず、エルロチニブは細胞増殖抑制効果を示した。また、ゲムシタビンと併用した場合、KRAS野生型ではエルロチニブとゲムシタビンの併用効果は認められなかったが、KRAS変異型ではゲムシタビン単独に比べエルロチニブを併用した場合有意に抗腫瘍効果が増強した。膵癌に対する治療効果予測バイオマーカーの探索目的で、消化器癌患者の1手術時摘出腫瘍組織の余分サンプル、2超音波内視鏡ガイド下の吸引針生検の余分検体、を用いてCTOS (cancer tissue-originated spheroid)培養法による細胞株を5例樹立し、薬剤感受性をin vitro、in vivoで分子生物学的に検討し、ドライバー分子の候補となる分子を抽出した。これらの分子機構の臨床面での意義を明らかにするため、症例の臨床データーを解析し、抗癌剤耐性に寄与する因子を明らかにした(2013年10月第21回日本消化器関連学会週間で発表予定)。手術サンプル、生検サンプルを用いたバイオマーカーを検討する際の基礎的予備実験として、3D spheroid培養下で調整した種々の消化器がん由来培養細胞株7株を免疫不全マウスに同所移植する実験系において、抗癌剤・分子標的治療薬の感受性、浸潤能を分子生物学的に検討した。さらに抗癌剤5FU耐性に寄与する分子機構を明らかにし、ヒトCTOS5例からの結果と比較し、バイオマーカー、治療標的となり得る分子の絞り込みを行った。膵癌患者からのサンプルでCTOC細胞株の樹立を目指していたが、針生検では当初の予想に反してCTOS細胞株を樹立するために十分な余剰サンプルを得ることができず、現在膵癌での検討が止まっている状態である。そのため実験系の樹立のため大腸癌外科手術標本を用いてCTOS細胞株を樹立、現在10系統ほど樹立、継代可能な状態となった。現在これら細胞を用いて、抗腫瘍薬として現在使用されている、抗EGFR薬や抗IGF抗体を添加して、細胞を回収、Western Blotにてこれら薬剤のCTOS細胞株へのシグナル伝達に及ぼす影響を解析中である。

また同じ抗EGFR薬であっても、小分子化合物と抗体製剤では細胞増殖抑制効果に差を認めており、細胞接着がその治療効果に影響を及ぼしている可能性を現在解析中である。まずは、十分なサンプル、確立した実験系である手術時摘出腫瘍組織の余分サンプルから樹立したCTOS細胞株を用いて、抗腫瘍薬として現在使用されている、抗EGFR薬や抗IGF抗体を添加して、細胞を回収、Western Blotにてこれら薬剤のCTOS細胞株へのシグナル伝達に及ぼす影響を解析中である。また引き続き膵癌患者からのCTOS細胞株樹立を継続して試みる。引き続き上記CTOS細胞株樹立、継代および上記CTOS細胞に対するエルロチニブの標的蛋白であるEGFR蛋白の発現など、各種蛋白の発現を免疫染色を用いて評価を行う。また膵癌患者よりCTOS細胞が樹立できれば、現在前向き登録している膵癌患者の予後と、CTOS細胞よりDNAを採取して、EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CAなどの遺伝子変異を調べ、バイオマーカーを調査するための試薬等に研究費使用を計画している。
先天性糖代謝異常による突然死予防のための遺伝子分析による基礎的研究

FBPase欠損症およびG6Pase欠損症(糖原病1型)によって引き起こされる可能性のある乳児突然死症候群についてその予防をはかるための手段として、遺伝子分析による保因者スクリーニングの可能性について基礎的検討を行ってきた。また日本人および欧州人FBPase欠損症について遺伝子変異の検索をおこなった。以下の様な研究成果を得た。1一般健常集団223名について、日本人FBPase欠損症で高頻度でみられるエクソン7のG挿入変異の有無について、PCR後にSSCP法にて分析した。約10%のサンプルについては、エクソン7のG挿入変異直前のG塩基がA塩基に変異する正常遺伝子多型の存在が明らになった。2日本人FBPase欠損症13名にについて、PCR後に直接塩基配列決定法により遺伝子変異の検索をおこなった。その結果として、10名中の4名で変異が検出された。残りの3名については検出されなかった。変異の内分けはG挿入変異が46%(10/22アリール)、G164S変異が14%(3/22アリール)A177D変異が4%(1/22アリール)、E30X変異が9%(2/22アリール)、V325A変異が4%(1/22アリール)であった。3欧州人FBPase欠損症10名についても、同様に遺伝子変異の検索をおこなった。その結果として、10名中の3名で何らかの変異が検出された。残り7名については変異が検出されなかった。変異の内分けはG挿入変異が5%(1/20アリール)、Q228X変異が10%(2/20アリール)であった。エクソン1関連の変異によりmRNAが検出できない症例が1例で10%(2/20アリール)あった。その他の原因でmRNAが検出できない症例が5%(1/20アリール)あった。1 FBPase欠損症およびG6Pase欠損症(糖原病1型)によって引き起こされる可能性のある乳児突然死症候群についてその予防をはかるための手段として、遺伝子分析による保因者スクリーニングの可能性について基礎的検討を行ってきた。2第一団として一般健常集団223名について、日本人FBPase欠損症で高頻度でみられるエクソン7のG挿入変異の有無について検討した。PCR後にSSCP(single strand conformation polymorphism)法にて分析した。ところが約10%のサンプルにおいて、正常サンプルのバンドとは異なる挙動をしめすバンドが認められた。このバンドは、エクソン7のG挿入変異のサンプルのバンドと良く似た挙動を示した。SSCP法の分析条件等を変更後も、約10%のサンプルにおいて見られた正常サンプルのバンドとは異なるこのバンドと、G挿入変異のサンプルのバンドとの分離は困難であった。この約10%のサンプルについて直接塩基配列決定法にて塩基配列を決定した。その結果この約10%のサンプルについては、エクソン7のG挿入変異直前のG塩基がA塩基に変異していることが判明した。この遺伝子変異によりアミノ酸には変化はない。正常遺伝子多型と思われる。以上よりSSCP法による変異の検出は困難と思われる。マススクリーニングに適した検出方法としてオリゴヌクレオチド-ハイブリゼエ-シオン(ASO)法でのスクリーニングを検討している。3新たな日本人FBPase欠損症での遺伝子変異の解析:あらたに4名のFBPase欠損症患者で遺伝子変異を同定した。その内の2名はhomozygoteの、他の2名はheterozygotoのいずれもG挿入変異であった。

以上のような成績を参考にして、当初予定の遺伝子変異の頻度を決定予定である。1一般健常集団223名について、日本人FBPase欠損症で高頻度でみられるエクソン7のG挿入変異の有無について、PCR後にSSCP法にて分析した。約10%のサンプルについては、エクソン7のG挿入変異直前のG塩基がA塩基に変異する正常遺伝子多型の存在が明らになった。2 SSCP法による変異の検出と困難と思われ、マススクリーニングに適した検出方法としてオリゴヌクレオチド-ハイブリゼエ-シオン(ASO)法でのスクリーニングを検討してきたが、ASO法における基本的測定条件の検討中である。引き続いて日本人集団でのFBPase欠損症の高頻度遺伝子異常の検索に移る予定である。3日本人FBPase欠損症13名について、PCR後に直接塩基配列決定法により遺伝子変異の検索をおこなった。その結果として、10名中の4名で変異が検出された。残りの3名については検出されなかった。変異の内分けはG挿入変異が46%(10/22アリール)、G164S変異が14%(3/22アリール)A177D変異が4%(1/22アリール)、E30X変異が9%(2/22アリール)、V325A変異が4%(1/22アリール)であった。4欧州人FBPase欠損症10名についても、同様に遺伝子変異の検索をおこなった。その結果として、10名中の3名で何らかの変異が検出された。残り7名については変異が検出されなかった。変異の内分けはG挿入変異が5%(1/20アリール)、Q228X変異が10%(2/20アリール)であった。エクソン1関連の変異によりmRNAが検出できない症例が1例で10%(2/20アリール)あった。その他の原因でmRNAが検出できない症例が5%(1/20アリール)あった。