hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Role of a small GTP-binding Protein in Oxidative Stress-Induced Cell Death in Plants

小麦のwgp7遺伝子はGTPaseをコードし、小胞体輸送に関与する。wgp7の転写レベルは、傷や病原体や紫外線(UV C)処理による酸化ストレスが引き起こす細胞死条件下ですみやかに誘発される。本年度はこの誘発機構を解明するため、wgp7遺伝子の5'上流域の分離と性格づけを行った。PCR法により、wgp7の翻訳開始位置から約2kb上流のゲノムDNAを分離した。塩基配列を決定し、いくつかのシス配列と思われる領域を同定した。プライマー伸長反応により、転写開始位置を決定中である。wgp7遺伝子プロモーターの欠失変異を作り、GUSレポーター遺伝子につないだ。これをパーティクルガン法により小麦の葉やカルスに導入しその発現を調べた。予備的な結果では特UV Cで誘発が起こった。以上の方法で5'上流域で発現に必須な部分を調べている。さらにwgp7プロモーター/Gus遺伝子をイネに導入し、時間的、空間的なwgp7遺伝子の酸化ストレス条件下での発現様式を検討中である。酸化ストレスによって誘発される植物細胞死における小分子GTP結合蛋白質の役割Rab GTP分解酵素遺伝子である小麦のwgp7は傷や病原菌感染の情報伝達に関与すると言われている。本年度の研究目的は、1)wgp7遺伝子細胞内発現の速やかな誘発の検証、2)wgp7転写や蛋白の細胞内局在を調べる方法を確立すること、3)wgp7を発現するトランスジェニックタバコでの傷や病原菌感染の情報伝達を調べること、である。それぞれの結果については、1)現在酸化ストレスを与えた小麦の組織を用いてnuclear run-offの実験が進行中である。wgp7はさく状組織で発現し、維管束や厚壁組織では発現されなかった。傷と菌感染による細胞死との関係を調査中である。3)傷、病原菌感染、植物ホルモン処理をしたトランスジェニックタバコの情報伝達を検討している。野性タバコと異なり、傷によって病原菌感染特異的な遺伝子が誘発され、一方病原菌感染では病原菌及び傷特異的な転写物が誘発された。さらに傷とジャスモン酸投与を同時に行なうことによって、傷特異的遺伝子発現が抑えられた。このようなクロスシグナリングのメカニズムを検討中である。傷、病原体、紫外線などの酸素ストレスを植物へ与えると細胞死を引き起こす。小麦由来の小分子GTP分解蛋白遺伝子wgp7は酸素ストレスにより速やかに発現が誘発される。本研究の目的はこのようなストレス応答におけるwgp7遺伝子の役割を明らかにすることである。本年は以下に述べる実験を行なった。1.wgp7の転写物および蛋白の速やかな蓄積はそれぞれノーザン法およびウェスタン法により検出した。しかし、C末端側を用いて作成した抗体は特異性が不十分で、in situでの局在化を明らかにするまでには至らなかった。一方、リボプローブを用いたin situハイブリダイゼーションの実験が進行中である。2.wgp7を発現するタバコにおいて、傷と病原体感染応答の間にクロストークがあることを既に確立した。さらにその機構を探るためサイチル酸およびジャスモン酸の内生レベルを測定している。3.wgp7の速やかな転写物の蓄積機構を探るためそのプロモーターの活性を調べている。プロモーター下流にレポーター遺伝子をつなぎ、一方小麦の細胞培養系を確立して、遺伝子導入を行ないプロモーターの働きを明らかにする。
既婚男女の家族計画支援方法確立に向けた基礎的研究

家族計画指導の実態を明らかにすることを目的として、病院・診療所1000施設、助産所741施設を対象に調査を行った。460施設(回収率26.4%)から回答が得られ、455施設(有効回答率98.9%)を分析対象とした。回答者の職種は、助産師379名(83.3%)、看護師13名(2.9%)、保健師1名(0.2%)、医師61名(13.4%)、無回答1名(0.2%)であった。分娩取り扱い施設は289施設(63.5%)であった。分娩取り扱い施設289施設において、「入院中に家族計画指導を行っている」264施設、(91.3%)、「入院中には行っていない」14施設(4.8%)、「実施状況を把握していない」9施設(3.1%)、無回答2施設(0.7%)であった。入院中に家族計画指導を行っていない14施設のうち、「外来で家族計画指導を行っている」施設が6施設であったことから、270施設(93.4%)の褥婦は、入院中または退院後に外来で家族計画指導を受けていることが明らかになった。家族計画指導を行っていない施設は5施設(1.7%)であり、その他の施設は無回答または実施状況を把握していなかった。家族計画指導を行っている270施設のうち、「褥婦全員」を対象に指導を行っている施設が222施設(82.2%)と最も多かった。褥婦の夫に対する指導は「夫が参加できる場合は指導する」が126施設(46.7%)と最も多く、次いで「夫に対する指導は行っていない」102施設(37.8%)であった。「常に褥婦と夫を対象として指導を行っている」施設は5施設(1.9%)であった。1回の指導時間は過半数が10分以下であった。夫の協力がなければ家族計画の実施は困難であることから、褥婦だけでなく夫に対しても家族計画指導を行う必要性がある。また、既婚者が望まない妊娠に至らぬよう家族計画指導の充実を図る必要がある。所属機関の倫理審査後の修正に時間を要したため。また、国際学会発表のための準備に当初の計画より時間を要した。7月に「日本における既婚者に対する家族計画指導の実態と今後の課題」について学会発表を行い、いただいた意見をもとに洗練させ、論文を作成する。並行して「既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」に関する文献検索をさらに行い、倫理審査を受けるための準備を進める。本研究は、既婚男女の家族計画・避妊の実態を明らかにし、既婚男女の家族計画・避妊の実行を規定する要因を明らかにすることを目的としている。「研究1.既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」「研究2.既婚男女に対する家族計画・避妊に関する指導の実態調査」で構成しており、平成28年度は「研究1.既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」に関する文献検索を行った。現在、文献検索結果をもとに、研究1における調査項目を検討している。平成28年度は、研究者の所属施設において人事異動があり、教育活動などの業務が繁忙となったため、研究課題の遂行に支障をきたしたため。本研究は、既婚男女の家族計画・避妊の実行を規定する要因を明らかにすること、ならびに、医療者が既婚男女に対して行っている家族計画・避妊に関する指導の実態を明らかにすることを目的としている。研究計画では、既婚男女に対する調査を実施し、その後、医療従事者に対する調査を行うとしていたが、医療従事者に対する調査を先行することによって、既婚男女からより詳細なデータが得られると考えた。よって、平成29年度は、「既婚男女に対する家族計画・避妊指導の実態」に関する研究計画書等を作成するために、家族計画や避妊などに関する文献検索を行った。その後、研究計画書ならびに全国調査のための質問紙、研究協力を依頼する施設へ送付する依頼文書を作成した。所属機関の倫理審査委員会において倫理審査を受け、要望付き承認された。今後は速やかに要望された点について確認、修正を行う予定である。教育活動など大学における通常業務のため、文献検索や研究計画書の作成が遅くなってしまったため。

入院中に家族計画指導を行っていない14施設のうち、「外来で家族計画指導を行っている」施設が6施設であったことから、270施設(93.4%)の褥婦は、入院中または退院後に外来で家族計画指導を受けていることが明らかになった。家族計画指導を行っていない施設は5施設(1.7%)であり、その他の施設は無回答または実施状況を把握していなかった。家族計画指導を行っている270施設のうち、「褥婦全員」を対象に指導を行っている施設が222施設(82.2%)と最も多かった。褥婦の夫に対する指導は「夫が参加できる場合は指導する」が126施設(46.7%)と最も多く、次いで「夫に対する指導は行っていない」102施設(37.8%)であった。「常に褥婦と夫を対象として指導を行っている」施設は5施設(1.9%)であった。1回の指導時間は過半数が10分以下であった。夫の協力がなければ家族計画の実施は困難であることから、褥婦だけでなく夫に対しても家族計画指導を行う必要性がある。また、既婚者が望まない妊娠に至らぬよう家族計画指導の充実を図る必要がある。所属機関の倫理審査後の修正に時間を要したため。また、国際学会発表のための準備に当初の計画より時間を要した。平成29年度は、「研究1.既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」の倫理審査を受け、承認後はWeb会社と打ち合わせを行い、研究を開始する予定である。「既婚男女に対する家族計画・避妊指導の実態」に関する全国調査をできるだけ早く実施する。結果返送後は、得られたデータを確認しながら、「既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」に関する質問項目の作成を並行して進めていく予定である。7月に「日本における既婚者に対する家族計画指導の実態と今後の課題」について学会発表を行い、いただいた意見をもとに洗練させ、論文を作成する。並行して「既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」に関する文献検索をさらに行い、倫理審査を受けるための準備を進める。平成28年度に「研究1.既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」に関する質問紙を作成し、倫理審査委員会で承認を得た後に、インターネット調査会社を介して調査を開始する予定であったが、実施できなかったため。当初の計画通りに研究遂行することができず、全国調査の実施に至らなかったため。この未使用額については、平成30年度に全国調査を行う計画であるため、印刷代、郵送代、学会参加費・旅費として使用する。当初の計画では、インターネット調査会社を利用して既婚者を対象とした家族計画・避妊の実態調査を行い、その後、国内の病院・診療所及び助産所における家族計画・避妊に関する指導の実態調査を行うこととしていたが、順番を入れ替えたため、使用額が計画と異なってしまった。今後、インターネット調査会社を利用して既婚者を対象とした家族計画・避妊の実態調査を行う予定である。平成29年度は、「研究1.既婚男女の家族計画・避妊の実態調査」について、倫理審査委員会で承認を得た後に、インターネット調査会社を介して調査を開始する。
動的運動時の皮質制御と中枢疲労との関係の解明

本研究(5ヶ年)は動的運動中の脳部位における機能的相補性による筋の協働作用の活性化と中枢疲労の発生過程及び中枢疲労耐性との関係を解明することである。本年度は研究1年目にあたり、運動中の前頭前野(prefrontal cortex; PFC)の疲労応答について検討することであった。本年度の研究成果はJournal of Human Ergologyに掲載し発表した。研究成果の内容は下記に示す。目的:酸素の増加は皮質活性化を反映しているため、近赤外分光法(NIRS)は、持続的運動タスク中の両側の前頭前野(PFC)活性化を調べるために使用することができる。この研究では、最大自発的筋力(MVC)でのハンドグリップタスク中の両側PFCの時間経過による活動化を調べる。方法:健康な右利きの男性被験者7名がこの研究に参加した。機能的NIRSプローブを皮質上に配置して、被験者は3秒間のMVCでのハンドグリップタスクを50回繰り返し発揮する。結果:対側前頭前野(Contra-PFC)及び同側前頭前野(Ipsi-PFC)の酸素化値は、ベースライン値と比較すると、運動タスクの開始後から有意に増加し(p<0.01)、その後徐々に減少した。一方、Ipsi-PFCの酸素化値は、ベースライン値と比較すると、有意な増加がタスク終了まで続いた。Conra-PFCでの有意な増加が消滅するまで、MVCと積分筋電図(iEMG)は、タスク開始から有意に低下したが(p<0.05)、その後、Ipsi-PFCの有意な増加が継続する中、タスク終了まで筋機能はほぼ一定のレベルを保持した。結論:Ipsi-PFCは疲労困憊に至る運動中に有意に活性し、筋機能をある一定レベルに保持する可能性がある。当初の予定より実験環境の整備が早期に整い、研究を遂行することができた。また、他大学の研究者の協力を得ることができたため、実験デザイン、測定、分析及び成果発表が円滑に進めることができたことが大きいと考える。今後は疲労困憊に相当する動的運動における中枢疲労及び中枢疲労耐性との関係について検討する。疲労困憊に至る動的運動中にM1の活性が漸減すると、他の脳部位に運動強度の持続に対する機能的相補性が出現する可能性が考えられる。そのため、運動中にM1を含む複数の脳部位の血液量と動員される複数の筋肉の活動を同時に測定し、疲労困憊まで時系列的に測定する。動的運動を疲労困憊まで行いながら、複数の脳部位と筋肉の活動を測定することで、運動中の皮質制御と中枢疲労の発生過程、及び中枢疲労耐性との関係を明確にすることが可能である。また、今後の研究では正確な運動強度の設定が必要となる。個人の運動強度の決定には、事前時の疲労困憊までの最大運動中の呼気ガス測定と分析を行い正確に運動強度を設定する予定である。以上のように、本研究では脳部位の正確な脳血液量の変化を捉え、運動中の中枢疲労の発現条件及び中枢疲労耐性への影響を検証する。

そのため、運動中にM1を含む複数の脳部位の血液量と動員される複数の筋肉の活動を同時に測定し、疲労困憊まで時系列的に測定する。動的運動を疲労困憊まで行いながら、複数の脳部位と筋肉の活動を測定することで、運動中の皮質制御と中枢疲労の発生過程、及び中枢疲労耐性との関係を明確にすることが可能である。また、今後の研究では正確な運動強度の設定が必要となる。個人の運動強度の決定には、事前時の疲労困憊までの最大運動中の呼気ガス測定と分析を行い正確に運動強度を設定する予定である。以上のように、本研究では脳部位の正確な脳血液量の変化を捉え、運動中の中枢疲労の発現条件及び中枢疲労耐性への影響を検証する。本年度は、他大学の研究者の協力により、実験を他大学施設を利用して進めることができたた。そのため、当初の本年度予算額より使用額を抑えることができた。しかし、今後は脳領域の測定だけではなく、全身運動中の生理学的指標の測定が必要となる。そのため、本年度の残金は測定機器の購入等に使用することとなる。
神経特異的ノックアウトマウスを用いた、神経の極性形成に関わる分子の解析

神経細胞の軸索や樹状突起の形成には様々な蛋白が重要である。本研究では軸索への蛋白輸送に重要と考えられている蛋白VAMP7のノックアウトマウスを作成・解析した。VAMP7ノックアウトマウスでは神経組織に形態学的な異常は認められなかった。しかしノックアウトマウスからの海馬培養細胞では、正常マウスに比して僅かながら軸索伸長の抑制が認められ、VAMP7が軸索への極性輸送に働くことが示唆された。この結果は細胞内輸送の専門雑誌Trafficに掲載された。神経細胞の軸索や樹状突起の形成には様々な蛋白が重要であるが、本研究は極性輸送に関わる蛋白のノックアウトマウス(全身のノックアウトマウスまたは必要に応じて神経特異的ノックアウトマウス)を作成・解析して、神経細胞の極性輸送と極性形成との関連を解明することを目的としている。小胞体に局在する蛋白「p31」の神経特異的ノックアウトマウスを作成したところ、神経組織において広範なアポトーシスが認められ、細胞内においては小胞体同士の異常な融合が形態学的に観察された。さらに本研究では、p31欠損によって小胞体からゴルジ体への極性輸送が阻害され、これがアポトーシスにつながることを解明し、p31蛋白が小胞体の形態維持と機能に不可欠であるという結果を、平成21年度にMolecular and Cellular Biologyに発表した。現在は、極性輸送に重要と考えられる3つの遺伝子「Rab8a,Syntaxin3,VAMP7」が、神経組織の極性の形成・維持に与える影響の解明を、Rab8aとSyntaxin3は神経特異的ノックアウトマウスを、VAMP7は全身ノックアウトマウスを用いて、研究を進めている。具体的には、大脳皮質と海馬、小脳における組織系の異常の有無を、通常の組織染色および軸索・樹状突起の蛋白に対する抗体を用いた免疫蛍光染色を用いて観察している。また、ノックアウトマウスの海馬の初代培養系を用いて、軸索と樹状突起の伸長の様子も観察している。他グループの研究において、Syntaxin3欠損により神経突起の伸長が抑制されることが報告されているが、私達の神経特異的ノックアウトマウスを用いた解析ではこの報告とは異なる興味ある結果が得られており、現在投稿の準備を行っている。神経細胞において蛋白の軸索への輸送に重要と考えられている蛋白「VAMP7」のノックアウトマウスを作成したところ、予想に反して神経組織に形態学的な異常は認められなかった。しかしノックアウトマウスからの海馬培養細胞においては、正常マウスに比して僅かながら軸索伸長の抑制が認められ、VAMP7が軸索への極性輸送に働くことが示唆された。この結果は細胞内輸送の専門雑誌「Traffic」に投稿中である。現在は、極性輸送に重要と考えられる遺伝子Syntaxin3が、神経組織の極性の形成・維持に与える影響の解明を、神経特異的ノックアウトマウスを用いて、研究を進めている。神経細胞の軸索や樹状突起の形成には様々な蛋白が重要であるが、本研究は極性輸送に関わる蛋白のノックアウトマウス(全身のノックアウトマウスまたは必要に応じて神経特異的ノックアウトマウス)を作成・解析して、神経細胞の極性輸送と極性形成との関連を解明することが目的であった。この結果は細胞内輸送の専門雑誌「Traffic」に掲載された。
錯体化を駆動力とした赤色発光型ゲルの創製とその機能化

本研究では、強い赤色発光という特性を有する錯体型のゲル化剤の創製を行うことを計画した。分子内にウレア結合を導入した配位子の合成を行ないユーロピウム金属との錯化を行った。その過程で、使用する溶媒によりその溶液がゲル化することを見出し、かつそのゲルが強い赤色発光を示すことも明らかにした。二本鎖型では、配位子と錯体で類似のゲル化挙動を示したが、三本鎖型では、興味あることに錯体にすることでゲル化能が低下することが見出された。近年、ソフトマテリアルが多くの分野で注目されている。その中でゲルは典型的なソフトマテリアルであり、最も注目されている物質群の一つである。一方、我々はジケトン配位子がユーロピウム金属と安定な錯体を形成し、紫外光照射により非常に強い赤色発光を示すことを見出しているが、その際、アミド結合を含む配位子を用いた場合、興味あるゲル化挙動を確認した。そこで、強い赤色発光という特性を有する錯体型のゲル化剤の創製を行うことを計画した。すなわち、錯体形成と水素結合形成を駆動力とした全く新しいタイプのゲル化剤の創製、及び赤色発光型ゲルの機能化について明確にする。具体的には、錯体化と水素結合形成の二つを駆動力としたゲル化過程を調べた。まず、水素結合部位として、アミド基、及びウレア基を有する配位子の合成を行った。一般に、ゲル化挙動は溶媒の種類、濃度、温度等の影響を受けることが知られていることから、ジケトン配位子の錯体化に伴うゲル化について、種々条件検討を行った。具体的には、水素結合性の溶媒、極性溶媒、非極性溶媒等、あるいは、それらの混合溶媒を用いた場合のゲル化挙動を検討した。さらにゲル化濃度についても詳細に調べた。その結果、ゲル化挙動とアルキル鎖長、種類との相関関係を見出すことができた。ジケトン配位子の様々な類縁体を合成しその特性を調べる一環として、分子内にウレア結合を導入した配位子の合成を行ないユーロピウム金属との錯化を行った。近年、オルガノゲル、ヒドロゲルが多くの分野で注目されている。また、長鎖アルキル部位として、一本鎖、二本鎖、三本鎖を有する多種多様のジケトン配位子、及び、グルタミン酸骨格を持つジケトン配位子の合成を行った。二本鎖型では、配位子と錯体で類似のゲル化挙動を示したが、三本鎖型では、興味あることに、錯体にすることでゲル化能が低下することが見出された。

具体的には、錯体化と水素結合形成の二つを駆動力としたゲル化過程を調べた。まず、水素結合部位として、アミド基、及びウレア基を有する配位子の合成を行った。一般に、ゲル化挙動は溶媒の種類、濃度、温度等の影響を受けることが知られていることから、ジケトン配位子の錯体化に伴うゲル化について、種々条件検討を行った。具体的には、水素結合性の溶媒、極性溶媒、非極性溶媒等、あるいは、それらの混合溶媒を用いた場合のゲル化挙動を検討した。さらにゲル化濃度についても詳細に調べた。その結果、ある程度の長さ以上のアルキル鎖を有する配位子の錯体において、赤色に発光するゲルの形成に成功した。また、このようなゲル化は、錯体形成と水素結合ネットワーク形成の二つを駆動力としたものであることが示唆された。ある分子がゲルとして機能するためには、基本的には分子が三次元網目構造を形成する必要がある。その駆動力としては、主に物理的な相互作用、化学的な結合等を挙げることができる。また、ごく最近架橋点可動型のゲルも報告されている。一方、錯体形成は、金属の周りに配位子が配位結合により集まることにより生じると考えることができる。そこで、本研究課題では、分子間の水素結合形成に加え錯体化を駆動力としたゲル化、すなわち三次元架橋網目構造形成について明らかにするとともに、それを活用した機能性材料の開発を計画した。このような錯体形成を主な駆動力としたゲル化については、一部報告されているもの、系統的な研究は全く行われておらず、非常に新しいゲル形成の方法論を提供するものであり、学術的な意味も大きい。また、形成されたゲルは紫外光照射により強い赤色発光を示すことから、様々な応用が考えられ、機能性ゲルとしての優位性もある。さらに、カリックスアレーン類似の分子内空孔を形成していることから、ゲスト分子を選択的に取り込む可能性がある。すなわち、このような分子認識機能を有するゲル化剤の創製も行える。ここで提案している錯体構造を活用することにより、ゲル化の特性に加え、他の分子を識別できるホスト分子として機能し得る新しい系の構築が可能である。さらに、紫外光照射による強い赤色発光も示すことから、これまでにない独創的な機能性材料の開発につながるものと確信している。このような計画の主要部分を占める基本的なゲル化剤の開発に平成24年度中に達成できた。これまで、ソフトマテリアルを目指した種々の機能性ゲルが報告されている。
線虫におけるペプチド性神経伝達物質の検索

線虫における種々の神経ペプタイドの存在を免疫組織化学の手法を用いてスクリーニングした。オキシトシン、サブスタンスPに対する抗体に対して陽性を示す細胞が存在することを見いだした。このうちまず最初に、比較生物学的に解析の進んでいるオキシトシン類似物質についての解析を進めた。ラット・オキシトシン遺伝子をプローブとして線虫染色体DNAをサザンブロット解析したところ、ラット・オキシトシンと高度に相同する遺伝子を確認した。その後、このオキシトシン類似物質の遺伝子の遺伝子座を決定するために、まず英国MRC研究所のDr.Alan Coulsonより供与されたYACフィルターを用いたマッピングを行ったところ、この遺伝子座は第一染色体セントロメア近傍に存在することを確認した。現在、さらに精細な解析を行っている途中である。また、神経ペプタイドの発現をmRNAレベルで分析するために、迅速・簡便な非放射性標識によるin situ hybridization法の開発が必要となったが、これを申請者は新たにPCR法を応用してクローニングする必要のないcRNAのin vitro合成法を考案し、平成5年度の組織細胞化学会(神戸)において発表した。この方法を用いて線虫におけるオキシトシンの存在をmRNAレベルで検討している。一方、サブスタンスPについては、腹部に存在する大型のニューロンのみが免疫学的に陽性を示すことを見いだし、このニューロンの同定を試みたが、光学顕微鏡レベルの観察では不可能であるので、さらに電子顕微鏡による微細な構造解析と共焦点顕微鏡による3次元的解析を現在続行中である。
微弱光イメージングを可能にする超伝導転移端センサ多素子読み出しの開発

超伝導検出器を用いた単一光子検出器を多素子化・アレイ化し、超高感度かつ分光可能な大型カメラを実現する多素子読み出しを開発する。超伝導転移端センサは、光子を高い効率(> 98%)で検出できる一方、応答が速い(時定数< 1us)ために多素子を読み出すのが困難であった。本研究では、この高速応答を逆手に取る。光子による信号の立ち上がりのみをフィルタによって取り出す、これまでにない方式の読み出しを開発する。この方式では、超伝導転移端センサーでは不可能と考えられてきた二次元読み出しを実現できる可能性がある。2018年度は主にフィルタの設計・試作・性能評価を行なった。2017年度に回路シミュレーションを行い、LCRフィルタ(インダクター、抵抗、コンデンサからなるフィルタ)を用いることに決定した。2018年度は、シミュレーションから得られた静電容量、抵抗およびインダクタンスを提供する回路素子の選定を行なった。極低温(4K)で性能評価を行い、期待通りの性能が得られることを確認した。本研究では10MHz前後の信号を読み出すため、通常の極低温実験に用いるケーブルでは読み出すことが難しいことが判明した。そこで、極低温で動作する超伝導同軸ケーブルを導入し、超伝導転移端センサーからの高速信号を直接読み出すことに成功した。来年度は同軸ケーブルを用いて、フィルタからの信号を読み出す予定である。本研究では可視光を用いてセンサーの読み出し試験を行う予定である。しかし、超伝導転移端センサーについては、各研究グループによって近赤外域における光子の応答は詳細に調べられていたが、可視域での性能評価の例はほぼなかった。そこで、近赤外から可視域まで詳細に性能評価を行い、センサーの応答特性に関する知見を得た。この結果から、本研究で開発中の新しい読み出しでは、可視光の信号としてどのようなものが得られるかわかった。今年度はフィルタの研究に注力した。フィルタの評価系を制作し、市販のコンデンサおよび抵抗を液体ヘリウム温度(4K)まで冷やし、性能評価を行なった。さまざまな市販品を試験し、極低温においても正しく動作するパーツを確保した。インダクタンスについては、PCボード上のトレースで実現することを2017年度に決定した。2018年度は、実際にPCボードを設計・試作し、必要なインダクタンスを実現・コントロールできることを4Kで示した。一方、超伝導転移端センサーとの統合試験については、冷凍機の準備状況の遅れから来年度に行うことにした。一方で、本研究の重要な要素である高速信号の読み出しに取り組むことができ、超伝導同軸ケーブルの導入によって10MHz程度の高速信号を正確に読みだせることを実証した。本研究では可視光検出をターゲットとしている。しかしながら、世界的にみても、超伝導センサーにおける可視光検出の研究がほぼ行われてこなかった。そこで、センサーの可視光の応答を詳細に評価し重要な知見が得られた。このように、2018年度は本研究に付随する重要な課題を発見・解決することができた。TES検出器との統合試験を行う。まずは1素子とフィルタを接続し、既存の読み出し回路で得られる信号と、フィルタを透過する信号を比較する。検証するべき項目は(1)TES検出器が安定に動作するか(2)可視域の光子を入れた場合に十分な振幅の信号が得られるかの二点である。もし信号の波高が十分でない場合、紫外域の光子を用いて試験を行う。1素子で動作実証した後、4素子で動作試験を行う。平成29年度は回路シミュレータを用いて、回路設計を行った。フィルタを通して読み出す信号は、光子が到来した際の信号の立ち上がりのみである。もし、立ち下がりの信号(立ち上がりよりも1桁以上遅い)もフィルタを透過してしまうと、TESの電熱フィードバックに影響を及ぼし、不安定性につながる。したがって、読み出し試験に用いる予定のTES検出器の時定数に合わせた設計を行った。用いるフィルタの仕様をLCフィルタ(インダクターとコンデンサからなるフィルタ)に決定し、回路素子の選定を行った。当初、微細加工技術でインダクターを作成する予定だったが、回路の寄生インダクタンスがフィルタのインダクタンス成分を形成することが判明した。したがって、新規に作成する必要がないことを確認した。LCフィルタの評価システムの設計、準備を行った。試験については平成30年度に行う予定である。回路シミュレーションにより、二次元読み出しができることを確認した。光子の信号を仮想的に生成し、8X8ピクセルアレイで読み出せることをシミュレーションで確認した。シミュレーション結果を元に、LCフィルターを用いることに決定した。当初、インダクターを微細加工技術で作成する予定だったが、回路の寄生インダクタンスがフィルタのインダクタンス成分を形成することが判明した。

これにより、開発期間を大幅に短縮できる。コンデンサについては、市販品でよいことを明らかにした。コンデンサの選定を行い、準備した。LCフィルターを試験するための評価システムを設計し、準備した。フィルタの評価は平成29年度中に終えることはできなかったが、インダクタンスを新規開発する必要がなくなったため、開発に要する時間を大幅に短縮できることがわかった。上記の点から、研究はおおむね順調に進展しているといえる。超伝導検出器を用いた単一光子検出器を多素子化・アレイ化し、超高感度かつ分光可能な大型カメラを実現する多素子読み出しを開発する。超伝導転移端センサは、光子を高い効率(> 98%)で検出できる一方、応答が速い(時定数< 1us)ために多素子を読み出すのが困難であった。本研究では、この高速応答を逆手に取る。光子による信号の立ち上がりのみをフィルタによって取り出す、これまでにない方式の読み出しを開発する。この方式では、超伝導転移端センサーでは不可能と考えられてきた二次元読み出しを実現できる可能性がある。2018年度は主にフィルタの設計・試作・性能評価を行なった。2017年度に回路シミュレーションを行い、LCRフィルタ(インダクター、抵抗、コンデンサからなるフィルタ)を用いることに決定した。2018年度は、シミュレーションから得られた静電容量、抵抗およびインダクタンスを提供する回路素子の選定を行なった。極低温(4K)で性能評価を行い、期待通りの性能が得られることを確認した。本研究では10MHz前後の信号を読み出すため、通常の極低温実験に用いるケーブルでは読み出すことが難しいことが判明した。そこで、極低温で動作する超伝導同軸ケーブルを導入し、超伝導転移端センサーからの高速信号を直接読み出すことに成功した。来年度は同軸ケーブルを用いて、フィルタからの信号を読み出す予定である。本研究では可視光を用いてセンサーの読み出し試験を行う予定である。しかし、超伝導転移端センサーについては、各研究グループによって近赤外域における光子の応答は詳細に調べられていたが、可視域での性能評価の例はほぼなかった。そこで、近赤外から可視域まで詳細に性能評価を行い、センサーの応答特性に関する知見を得た。この結果から、本研究で開発中の新しい読み出しでは、可視光の信号としてどのようなものが得られるかわかった。今年度はフィルタの研究に注力した。フィルタの評価系を制作し、市販のコンデンサおよび抵抗を液体ヘリウム温度(4K)まで冷やし、性能評価を行なった。さまざまな市販品を試験し、極低温においても正しく動作するパーツを確保した。インダクタンスについては、PCボード上のトレースで実現することを2017年度に決定した。2018年度は、実際にPCボードを設計・試作し、必要なインダクタンスを実現・コントロールできることを4Kで示した。一方、超伝導転移端センサーとの統合試験については、冷凍機の準備状況の遅れから来年度に行うことにした。
水分凍結と材料劣化という積雪寒冷地域を考慮したＲＣ部材の疲労耐久性評価

本研究では,環境温度と含水状態に着目し,両者を制御した静的および疲労の載荷試験より,コンクリート円柱の圧縮と割裂引張の強度特性に加え,RCはりの曲げを評価した.その結果,気乾状態のコンクリートは,環境温度の影響を受けず,飽水状態のコンクリートは常温下で静的強度と疲労破壊回数が低下し,低温下では静的圧縮強度は増加したが強度増分に見合う圧縮疲労破壊回数の増加は認められなかった.一方,RCはりの曲げは,飽水状態において常温の耐荷性,耐疲労性は低下し,低温の耐荷性は向上した.しかし,低温と常温の耐疲労性は,疲労破壊回数としては同等ではあったが疲労破壊モードが変化することを明らかにした.種々の環境要因がRCはりの耐疲労性に及ぼす影響のなかで,低温環境下や含水状態がRCはりの耐疲労性に及ぼす影響を評価した研究例は極めて少ない現状にある。本研究課題における1年目では,環境温度とコンクリート中の含水状態に着目したRCはり供試体による静的載荷試験と高サイクル疲労試験を実施し,RCはりの耐疲労性を実験的に検討した。この実験では,含水状態の影響評価にあたり,既往の研究で行われている水中疲労試験に依らず,気中において含水状態を制御し,所定の含水量以上の水の侵入を絶ち載荷試験を実施したことも特徴である。その結果,(1)円柱供試体を用いた圧縮強度試験より,気乾状態に比べ飽水状態にあるコンクリートは,常温では圧縮強度が低下し,低温では圧縮強度とヤング率の両方が増加した。(2)RCはりの静的載荷試験より,常温環境で飽水状態にある場合,最大荷重時の変位およびひび割れ分散性が低下し,一方で低温環境の場合は,凍結の影響で曲げ剛性と,最大荷重および最大荷重時の変位が増加した。このように常温における気乾状態のRCはりと異なる挙動が環境温度や含水状態によって生じる可能性を示した。(3)RCはりの疲労試験より,常温環境で飽水状態の場合,耐疲労性の低下が示された。このことから,飽水状態は,RCはりの耐疲労性の低下要因になりうると考えられた。供試体の破壊形態は,常温環境が主鉄筋の疲労破断であったのに対して低温環境で凍結したことによって上縁コンクリートの圧壊に破壊モードが変化した。これより,環境温度と含水状態によりRCはりの疲労破壊形態は異なる可能性が示された。種々の環境要因がRCはりの耐疲労性に及ぼす影響のなかで,低温環境下や含水状態がRCはりの耐疲労性に及ぼす影響を評価した研究例は極めて少ない現状にある。本研究では,環境温度とコンクリートの含水状態に着目したRCはりの高サイクル疲労試験を実施し,耐疲労性を実験的に検討した。その結果,常温環境は飽水状態のRCはりで耐疲労性が低下したが,低温環境では常温の気乾状態のRCはりと耐疲労性に大差はなかった。しかし,供試体の疲労破壊形態は,常温環境では主鉄筋の疲労破断であったのに対して,低温環境では上縁コンクリートの圧壊となり,RCはりが凍結することによって破壊モードが変化することを示した。すなわち,(1)円柱供試体を用いた圧縮強度試験の結果,気乾状態に比べ飽水状態にあるコンクリートは,常温では圧縮強度が低下し,低温では圧縮強度とヤング率の両方が増加した。(2)RCはりの静的載荷試験の結果,常温環境で飽水状態にある場合,最大荷重時の変位が小さくなり,ひび割れ分散性が低下した。一方,低温環境で飽水状態にある場合は,凍結の影響で曲げ剛性と,最大荷重および最大荷重時の変位が増加した。このように,環境温度や含水状態によって,常温における気乾状態のRCはりとは異なる挙動が生じる可能性が示された。(3)RCはりの疲労試験の結果,常温環境で飽水状態の場合,耐疲労性の低下が示された。このことから,飽水状態は,水中疲労試験の結果と同様に,RCはりの耐疲労性の低下要因になりうると考えられた。供試体の破壊形態は,常温環境下における供試体は主鉄筋の疲労破断であったのに対して,低温環境で凍結した供試体は上縁コンクリートの圧壊に破壊モードが変化した。低温環境と部材を用いた疲労試験という,これまで例のなかった載荷試験において水がコンクリートに浸入した状態の影響,コンクリート内部の水分が凍結した影響を示し,耐疲労性の低下のみならず,破壊モードが変化することまで明らかにしたものであり,概ね順調に進展しているものと自己評価した。疲労を受けるRC部材へ侵入した水は,耐疲労性を低下させるが,この水の凍結が耐疲労性に及ぼす影響は未解明である.本研究では,環境温度と含水状態に着目し,両者を制御した静的および疲労の載荷試験より,コンクリート円柱の圧縮と割裂引張の強度特性に加え,RCはりの曲げを評価した.その結果,静的圧縮強度は,含水率が大きくなるにつれて,常温は低下傾向を,低温は増加傾向を示し,低温の飽水状態は,常温で気乾の約1.5倍に圧縮強度が増加した.コンクリートの耐疲労性は,圧縮の場合,常温と低温ともに飽水状態で耐疲労性の低下が示された.

本実験の範囲内における常温のコンクリートの割裂引張強度は,静的載荷,疲労載荷ともに含水状態の影響は明確には見て取れず,この種の影響は,圧縮強度の方が大きいと考えられた.つまり,気中であっても飽水状態が保たれれば,コンクリート間隙中の飽水した自由水の凍結も耐疲労性に影響することが示された.RCはりの静的載荷試験の結果,常温の飽水状態は,最大荷重時の変位が小さくなり,ひび割れ分散性が低下した.一方,低温の飽水状態は,凍結によって曲げ剛性と,最大荷重および最大荷重時の変位が増加した.RCはりの疲労載荷試験の結果,常温の飽水状態の場合,耐疲労性の低下が示された,このことから,飽水状態は,水中疲労載荷試験の結果と同様に,RCはりの耐疲労性の低下要因になりうると考えられた.これに対して,低温環境におけるRCはりの疲労載荷試験は,常温の気乾状態と比較して疲労破壊回数に明確な違いは認めらなかった.しかし,水分の凍結で剛性が増加したことで,たわみは小さくなった.また,ひび割れの分散性が悪くなる傾向であった.本研究では,環境温度と含水状態に着目し,両者を制御した静的および疲労の載荷試験より,コンクリート円柱の圧縮と割裂引張の強度特性に加え,RCはりの曲げを評価した.その結果,気乾状態のコンクリートは,環境温度の影響を受けず,飽水状態のコンクリートは常温下で静的強度と疲労破壊回数が低下し,低温下では静的圧縮強度は増加したが強度増分に見合う圧縮疲労破壊回数の増加は認められなかった.一方,RCはりの曲げは,飽水状態において常温の耐荷性,耐疲労性は低下し,低温の耐荷性は向上した.しかし,低温と常温の耐疲労性は,疲労破壊回数としては同等ではあったが疲労破壊モードが変化することを明らかにした.平成26年度から供試体を用いた疲労試験を行う計画とした。環境温度制御式万能載荷試験装置による疲労試験は,要素試験,部材試験ともに当初計画の通り実施できた。これにより,本研究課題の基準になる健全な鉄筋コンクリートの耐疲労性を明らかにできており,材料劣化と水分状態が耐疲労性に及ぼす影響の実験研究にシフトできるため,おおむね順調に進展していると考えている。今後は,1条件当たりの供試体数を増やし,部材レベルにおけるこの種の影響の再現性を確認するとともに,版状の部材においても評価すると同時に実験結果の考察に基づく研究成果の取りまとめを行う予定である。コンクリート工学研究計画に従った実験の実施に加え,1条件当たりの供試体数を増やし,部材レベルにおけるこの種の影響の再現性を確認するとともに,版状の部材においても評価する予定である。これに関連して,今年度作製する供試体数を増やし,時間をあけずに疲労試験における実験結果のバラツキが評価できる実験体制にする予定である。当初計画で積算した消耗品の単価よりも安価に同等品が購入できたことで,差額が生じた.本研究課題の2年目にあたり,載荷試験など各種実験とこれにともなう作業が生じ,種々の物品を購入するため,使用額が生じている。また,学会等における研究発表や現地調査などに旅費を計上している。実験を実施するための準備に当たって,台木や養生シート,金具類といった準備工に必要な備品の充当にしようする計画である.また,旅費に使用する予定である。工具用消耗品や載荷計測消耗品および文具類といった消耗品の購入と,東北地方における劣化構造物調査ならびに学会発表のための旅費を計画している。
天然素材を起源とする抗酸化物質の単離と構造研究

合成抗酸化剤に発癌等の副作用が危惧されていること,ならびに活性酸素種の生体への障害と種々の疾病との関係が明らかにされてきていることから,薬草および野菜等の天然素材を起源とする抗酸化物質の探索を企図し,ロダン鉄法によるMeOHエキスの抗酸化スクリーニングにおいて強い活性を示した蔓荊子(Vitex rotundifoliaの種子),人参(Daucus carota)地上部およびペル-産生薬のマティコ(Piper elongatum)地上部とパジャロボボ(Tessaria integriforia)全草のエキス中の活性成分の単離,構造解明を行った.また,アレルギー性疾患の原因の一つとして活性酸素種の関与が知られていることから,これまでにウイキョウ(Foeniculum vulgare)果実から得た抗酸化物質について抗I型アレルギー活性の指標の一つとされるヒアルロニダーゼ活性阻害試験を実施した.各MeOHエキスを各種カラムクロマトで,分離,精製し,蔓荊子から14種,人参から1種,マティコ地上部から11種,ならびにパジャロボボ全草から12種の化合物を単離し,それらの構造を各種機器スペクトルならびに化学反応により決定した.また,それらの化合物のうち20種についてロダン鉄法を実施し,蔓荊子の4種,人参の1種,マティコ地上部の8種およびパジャロボボ全草の3種に合成抗酸化剤のBHAよりも強い活性を見出した.さらに,ウイキョウ果実からこれまで得た6種のオリゴスチルベン類について,ヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行い,2種に市販の抗アレルギー剤のDSCGと同程度の活性阻害効果を確認した。今後,さらに上記各エキス中の抗酸化成分の研究を進めると共に,強い抗酸化活性を示した化合物のヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行い,活性酸素の消去を作用機序とする抗アレルギー物質の探索を行う.合成抗酸化剤に発癌等の副作用が危惧されていること,ならびに活性酸素種の生体への障害と種々の疾病との関係が明らかにされてきていることから,薬草および野菜等の天然素材を起源とする抗酸化物質の探索を企図し,ロダン鉄法によるMeOHエキスの抗酸化スクリーニングにおいて強い活性を示した蔓荊子(Vitex rotundifoliaの種子),人参(Daucus carota)地上部およびペル-産生薬のマティコ(Piper elongatum)地上部とパジャロボボ(Tessaria integriforia)全草のエキス中の活性成分の単離,構造解明を行った.また,アレルギー性疾患の原因の一つとして活性酸素種の関与が知られていることから,これまでにウイキョウ(Foeniculum vulgare)果実から得た抗酸化物質について抗I型アレルギー活性の指標の一つとされるヒアルロニダーゼ活性阻害試験を実施した.各MeOHエキスを各種カラムクロマトで,分離,精製し,蔓荊子から14種,人参から1種,マティコ地上部から11種,ならびにパジャロボボ全草から12種の化合物を単離し,それらの構造を各種機器スペクトルならびに化学反応により決定した.また,それらの化合物のうち20種についてロダン鉄法を実施し,蔓荊子の4種,人参の1種,マティコ地上部の8種およびパジャロボボ全草の3種に合成抗酸化剤のBHAよりも強い活性を見出した.さらに,ウイキョウ果実からこれまで得た6種のオリゴスチルベン類について,ヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行い,2種に市販の抗アレルギー剤のDSCGと同程度の活性阻害効果を確認した。今後,さらに上記各エキス中の抗酸化成分の研究を進めると共に,強い抗酸化活性を示した化合物のヒアルロニダーゼ活性阻害試験を行い,活性酸素の消去を作用機序とする抗アレルギー物質の探索を行う.
薬用食品から高インスリン血症の改善を機序とする生活習慣病改善作用成分の探索

本課題は,肥満の形成過程などにおいて観察される高インスリン血症を改善することで過度の肥満,種々生活習慣病の発症を抑制する物質を探索することを目的とする.本研究の成果は,生薬コウズクより得たフェニルプロパノイド成分,生薬センキュウより得たフタリド成分,およびブラジル生薬であるCarapa guianensisより得たリモノイド成分の一部が肝細胞中の中性脂肪含量を有意に低下させることを見いだした.さらにマウスを用いたin vivoでの評価では,コウズクから得たフェニルプロパノイドの3日間の投与により,糖負荷時の耐糖能の改善,肝臓中中性脂肪含量の有意な低下が観察されることを明らかにした.本研究課題は,糖尿病の発症前,肥満時に観察される高インスリン血症を改善することにより,過度の肥満,種々生活習慣病の予防・改善に寄与する物質を探索することを目的とする.本研究の初年度の成果としては,生薬「コウズク」から,フェニルプロパノイド成分の一部にマウスにおいて,肝中性脂肪含量の低減と耐糖能の改善を見いだし,日本生薬学会第62回年会などで報告している.今後,化合物の確保ができ次第,長期投与時における,インスリン分泌に与える影響などを検討していく予定である.さらに,ブラジル生薬であるCarapa guianensisより得たリモノイド成分に肝細胞内中性脂肪低減作用を見いだし,既に報告している(Tetrahedron, 71, 2753-2760 (2015)).In vitroの実験のみでなく, in vivoの試験においても有効な化合物を見いだしており,研究期間が3年の研究課題としては,概ね順調であると判断出来る.本課題は,主に糖尿病や高脂血症などの種々生活習慣病の発症の基礎病態と考えられる肥満の形成過程,並びに糖尿病発症初期段階において観察される高インスリン血症によりもたらされる過度の肥満,種々生活習慣病の発症を抑制する物質を薬用にも供される食品から探索することを目的とする.昨年度の報告では,タイなどでスパイスなどとしても使用されコウズク(Alpinia galanga,果実)から,フェニルプロパノイド成分を活性成分として明らかにしている.今年度の研究成果としては,コウズクの主活性成分として得られたフェニルプロパノイド成分について,in vivoにおける耐糖能改善作用と肝臓中中性脂肪低減作用を見いだし,第34回メディシナルケミストリーシンポジウムおよび第33回和漢医薬学会学術大会にて,報告した.当該の研究では,フェニルプロパノイド成分の3日間の経口投与により有効性が確認出来ている.現在,糖質負荷時のインスリン分泌に与える影響,投与量の最適化,作用機序等の検討を並行して進めている段階である.上記の内容に加え,タイ産薬用食物や国内産食品由来抽出エキスを用いたスクリーニング試験を実施しており,タイ産植物であるAnaxagorea luzonensis木部抽出エキスなどに有効性を見いだしており,現在,有効成分の特定を目的に,含有成分の精査を行ってる.In vitroでの実験で見いだした化合物の,実験動物への経口投与により,当初計画通り,肝臓中中性脂肪含量の低減と,耐糖能改善作用を既に見いだしている.研究計画の最終年度には,血中インスリン濃度の測定,長期連続投与時の遺伝子発現変化などを計画しており,当初の研究計画に鑑み,概ね順調に推移していると判断出来る.本課題は,主に糖尿病や高脂血症などの種々生活習慣病の発症の基礎病態と考えられる肥満の形成過程,並びに糖尿病発症初期段階において観察される高インスリン血症によりもたらされる過度の肥満,種々生活習慣病の発症を抑制する物質を薬用にも供される食品から探索することを目的とする.今年度の研究成果としては,ブラジル生薬アンディローバ種子油より単離したリモノイド成分が肝細胞内の中性脂肪含量を低下させる事を明らかにし,食品薬学シンポジウムにて報告している.さらに,本課題のこれまでの研究成果から,ローズヒップ,センキュウおよびコウズクから得た薬理活性成分について種々の学会において報告した.現在,糖質負荷時のインスリン分泌に与える影響,投与量の最適化,作用機序等の検討を並行して進めている段階である.成果については,データが出そろった段階にて,論文として投稿する予定である.一方,本研究の一環として実施した研究の成果として,生薬センキュウから得た抽出エキスおよびエキスから調製した脂溶性分画は,インスリン様の糖消費促進作用を有することを新たに見いだした.現在,薬理活性成分を同定すべく,これの探索研究も並行して実施している.本課題において得られた成果の代表的なものとしては,生薬センキュウの抽出エキスがマウス肝臓中中性脂肪含量の低下作用を有することを明らかにするとともに,耐糖能の改善作用を有する事を明らかにした.さらに,in vitroの実験に於いて,肝細胞内中性脂肪含量を低下させる化合物としてsenkyunolide類を明らかにした.本課題は,肥満の形成過程などにおいて観察される高インスリン血症を改善することで過度の肥満,種々生活習慣病の発症を抑制する物質を探索することを目的とする.本研究の成果は,生薬コウズクより得たフェニルプロパノイド成分,生薬センキュウより得たフタリド成分,およびブラジル生薬であるCarapa guianensisより得たリモノイド成分の一部が肝細胞中の中性脂肪含量を有意に低下させることを見いだした.さらにマウスを用いたin vivoでの評価では,コウズクから得たフェニルプロパノイドの3日間の投与により,糖負荷時の耐糖能の改善,肝臓中中性脂肪含量の有意な低下が観察されることを明らかにした.

現在,新たに生薬抽出物の一部に,in vitro試験において,これまで試験した中で,最も強い肝細胞内中性脂肪低減作用を見いだしており,現在,含有成分の精査を遂行するとともに,活性本体の特定を進めている段階である.In vivoでの有効性を確認するとともに,創薬シードとしての可能性を検討していく.前記,進捗状況の欄に記載している通り,概ね順調に研究が進展していることから,これまでに見いだしたフェニルプロパノイドの薬理学的機序の解析を進めるとともに,並行して実施していたタイ天然薬用食物を研究題材としたスクリーニング試験にて,有効性を見いだしている数種の植物についても,有効成分の特定を進めていく予定である.食品薬学,生薬学学内での支出(支払い)期日に遅延したため,2016年度内において未使用金が発生した.2016年度内に,すでに当該研究に係る物品は購入済みである.2016年度内に未使用金分の物品は既に購入済みである.事務手続き上,執行は2017年度になる.
肝非実質細胞に発現する新しい接着分子のクローニングとその機能の解明

細胞は、細胞外マトリックスとの相互作用によりその形態と機能が変化する。本研究は、その相互作用に関与する新しい蛋白のクローニングを目的にした。。【研究成果】1.細胞外マトリックスに対する接着分子を含むと想定される細胞膜分画に対する抗体を用い、伊東細胞のcDNAライブラリーより未知の蛋白をクローニングし、6456 bpの塩基配列を決定した。2.予測されるアミノ酸配列の検討から、本蛋白はN側にセリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性ドメインを繰り返しで2個有することが明らかになった。プロテインキナーゼ(PK)活性ドメインの系統樹の検討より、本蛋白はPKCと同じくAGCグループに属すると考えられる。AGCグループのPKの多くは、リセプターと複合体を形成し、外部からの情報を細胞内に伝達する。クローニングした蛋白も同様の機能を有する可能性が高い。また、このドメインのC側下流にはleucine zipperと考えられるドメインが存在し、この部分で複合体を形成すると推定された。2.本蛋白のmRNAは、単離伊東細胞、Kupffer細胞、類洞内皮細胞に発現していたが、肝実質細胞には認められなかった。伊東細胞を培養するとその発現は、単離直後に比して減弱した。3.予測されるアミノ酸配列に基づいた合成ペプチドに対する抗体は、高抗体価のものは得られなかった。現在、PK活性ドメインおよびleucinezipperドメインを組込んだリコンビナント蛋白を用いて抗体の作製を行なっている。。申請者は、肝の細胞外マトリックスに対する細胞膜上の接着分子と推定される未知の蛋白のcDNAを伊東細胞の発現cDNAライブラリーよりクローニングした。本蛋白は、肝実質細胞には発現せず、伊東細胞、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞等の肝非実質細胞に発現していた。予測されるアミノ酸配列より、coiled-coil構造をとるドメインおよびセリン/スレオニンプロティンキナーゼ活性ドメインを有すると推定された。この蛋白は約8kbのmRNAに対応しており、本研究において全塩基配列を明らかにし、その機能を解明することを目的とする。本年度の成果は以下のごとくである。【.encircled1.】より長いinsertを有するクローンを分離するために、cDNAライブラリーの再スクリーニングを行なったが、3kb以上のinsertを有するクローンは得られなかった。現在は、one-sided PCRを用いて5'および3'端の延長を行なっている。これまでに、0.6kbの塩基配列を新しく決定しており、この部分にはATP接着ドメインが存在し、本蛋白がセリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性ドメインに必要なすべてのconsensus motifsを有することを明らかにした。現在までに決定している3.4kbにおいては、蛋白をコードするフレームに開始コドンは見られない。【.encircled2.】予測されるアミノ酸配列C端の合成ペプチドおよび大腸菌に発現させたリコンビナント蛋白を、ウサギに免疫しているが、未だ十分な抗体価の抗血清は得られていない。【.encircled3.】伊東細胞における本蛋白の発現は、単離直後に比し、培養により減弱することを明らかにした。申請者は、肝の細胞外マトリックスに対する細胞膜上の接着分子と推定される未知の蛋白の部分cDNAを伊東細胞cDNAライブラリーよりクローニングした。本研究ではその全塩基配列決定と機能解明を目的とした。1.より長いinsertを有するクローンを分離するために、cDNAライブラリーの再スクリーニングを行なったが、3kb以上のinsertを有するクローンは得られなかった。その為、rapid amplification of cDNA end (RACE)法を用いて5'および3'端の塩基配列決定を行なった。これまでに、6456bpの塩基配列を決定した。その予測されるアミノ酸配列の検討から蛋白のN側にセリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性ドメインが繰り返して2個存在することが明らかになった。プロテインキナーゼ(PK)活性ドメインの系統樹の検討から、本蛋白はPKCと同じくAGCグループに属すると考えられる。

今回、クローニングした蛋白も同様の機能を有する可能性が高い。また、このドメインのC側下流には:leucinezipperと考えられるドメインが存在し、この部分で複合体を形成すると推定された。2・伊東細胞における本蛋白の発現は、単離直後に比し、培養により減弱した。伊東細胞クローン株を用いた検討でも正常伊東細胞と似た形質を有するクローン株で発現が強く、筋線維芽細胞様の形質を有するクローン株では発現が弱かった。3.予測されるアミノ酸配列の合成ペプチドに対する抗体は、高抗体価のものは得られなかった。現在、PK活性ドメインおよびLeucine zipperドメインを組込んだリコンビナント蛋白を用いて抗体の作製を行なっている。