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抗がん剤による味覚障害に対する補中益気湯とポラプレジングの比較研究

【研究目的】抗がん剤治療や放射線治療を受ける患者において味覚障害はしばしば発現する副作用である。味覚障害により抗がん剤の投与中止もしくは減量となることはほとんどないが、食事を味わう楽しみを失うことは、がん患者のQOLや治療意欲の低下など精神面に大きな影響を及ぼす。味覚障害の発生要因として、味覚伝導系障害、亜鉛欠乏、抗がん剤による味覚細胞、口腔粘膜への直接的な障害作用や唾液量の減少による口腔内乾燥などが考えられているが、確立された治療法がないのが現状である。東洋医学では人体の内臓器官を五臓六腑と表現し、五臓の一つに脾がある。脾の変調は口にもあらわれるとされ、味覚異常を引き起こすことがある。化学療法を受けた患者は基本的に気虚の状態であり、脾気虚の状態には補気剤である補中益気湯が効果的であると考えられる。本研究では、抗がん剤投与が行われる婦人科系癌入院患者を対象として、抗がん剤による味覚障害に対する補中益気湯およびポラプレジングの効果を比較する。【研究の実施】倫理員会の承認後、婦人科と薬剤部との共同で臨床研究として試験を開始した。対象は婦人科にて抗がん剤投与が行われる入院患者で、抗がん剤投与後に味覚異常症状を訴える患者とした。無作為にポラプレジング先行投与群と補中益気湯先行投与群に割り付け、クロスオーバー試験とし、味覚異常の有無と重症度を患者自身の日々の記録から判定した。1症例の結果であるが、味覚異常は(補中益気湯/ポラプレジング1=G2/G1、口腔内乾燥はG0/G1、口腔内疼痛はG1/G0、食欲不振はG1/G1であった。1症例であるため、効果について判断し難い。現時点での症例数は1症例とまだ少数であり、今後、さらに症例数を集積し、データの解析を行っていく予定である。
耐熱性リフォールディング触媒の開発と抗体産生への応用

本研究ではタンパク質をゆでながら巻き戻す高温リフォールディング技術の開発に取り組んだ。正しい立体構造の回復に依存して緑色蛍光を発するsfGFP-2SSを作成した。これを還元的に変性させた後,酸化剤により誤った架橋を形成させると蛍光は失われた。これを基質として高温条件での巻き戻しを実現するために耐熱性PDIにより,高温リフォールディング技術PTR法を確立した。PTRとは,高温と低温の温度サイクルにより変性タンパク質を正しい構造へと導くタンパク質のPCRである。病因分子を認識する抗体が医薬品として利用されており,複数のジスルフィド架橋を正しく導入する方法として展開が見込まれる。組換えタンパク質の発現時に複数のジスルフィド架橋を正しく導入することは,抗体医薬品など複数のジスルフィド架橋を持つタンパク質の製造には大きな課題である。タンパク質のリフォールディングを高温で効率的に進める触媒として,本研究では高度好熱菌Thermus thermophilusHB8がペリプラズム空間に発現させる耐熱性ジスルフィド異性化酵素TthA0610,TthA1422を同定し,その酵素化学的諸性質の解明と応用開発に取り組む。従来よりジスルフィド異性化酵素の評価法には,変性RNaseを基質としてRNA分解酵素の活性回復を指標とした酵素アッセイ法が用いられてきた。しかし,微量検定が難しいことやRNaseを用いるためにリフォールディング温度の上限が低いという制限があった。本研究では,高温でのタンパク質リフォールディングを目指しており,自己リフォールディング力が高い耐熱性superfolder GFP(sfGFP)に複数のジスルフィド架橋を導入した新規なPDI測定用基質を開発して,正しいS-S架橋形成に依存して緑色蛍光を発するsfGFP変異タンパク質を2種類,作成した。sfGFP-1SSは分子内に一本のジスルフィド架橋(P56C-L141C)を持ち,sfGFP-2SSは(P56C-L141C, S202C-T225C)の2本のジスルフィド架橋を持つ。5 mM DTT存在下8M塩酸グアニジンによってsfGFP-1SSまたはsfGFP-2SSを還元的に変性させた後,酸化剤(H2O2)を加えて誤った架橋形成を行わせて蛍光発光能を完全に失ったsfGFP-1SSとsfGFP-2SSをそれぞれ調製した。これらは透析によって還元剤と変性剤を除去しても蛍光の自己回復が進行しない安定な変性タンパク質として回収できた。この基質を用いてサーマス菌のTthA0610,TthA1422のジスルフィド異性化作用により正しく自己フォールディングさせる蛍光アッセイ法の最適条件の確立に取り組んだ。当初の計画通り,下記の項目を達成することができている。緑色蛍光タンパク質sfGFPにジスルフィド架橋を1本導入したsfGFP-1SS,2本導入したsfGFP-2SSを作成して,大腸菌内で組換えタンパク質として発現させて,アフィニティカラムにより精製するための条件を検討した。その結果として,再現性の高い発現系を構築した。さらにタンパク質を変性させた条件の下,誤ったジスルフィド架橋を導入するための酸化条件を検討して,銅イオンを触媒として後にペニシラミンのような銅キレート剤で回収する方法なども検討したが,結局,過酸化水素を用いて酸化させた後,余剰の過酸化水素はカタラーゼによって消去する方法が,自己リフォールディングによる回復率が高いことが判明した。高度好熱菌サーマス菌からクローニングしたジスルフィド異性化酵素を大腸菌で異種発現させて,同様にニッケルカラムによるHis-tagアフィニティ単体を用いた精製を行って,高い温度で働くリフォールディング触媒の発現系を確立した。この組換え酵素を用いてsfGPF-1SSおよびsfGFP-2SSのリフォールディングアッセイ法を確立した。組換えタンパク質の発現時に複数のジスルフィド架橋を正しく導入することは,抗体医薬品など多数のジスルフィド架橋を持つタンパク質の製造には大きな課題である。本研究では,タンパク質のリフォールディングを高温条件下で効率的に進める方法をin vitro, in vivoの系で確立して複数のジスルフィド架橋タンパク質を生産する微生物生産技術を開発する。すでに高温条件下でのジスルフィド導入の触媒として,高度好熱菌T.thermophilusHB8がペリプラズム空間に発現する耐熱性ジスルフィド異性化酵素TthA0610,TthA1422を同定しており,本研究では,その酵素化学的諸性質の解明と応用開発に取り組む。ジスルフィド異性化酵素の評価法には,変性RNaseを基質として,酵素活性を回復させたRNA分解酵素の酵素活性を指標とするin vitroアッセイ法が用いられてきた。しかし,間接的な評価法であるために微量検定が難しいことや,耐熱性酵素ではないRNaseを用いるために評価系の温度上限が低いという制限があった。本研究は,高温条件下でのタンパク質リフォールディングを目指しているので,熱安定性が高く自己フォールディング能が高い耐熱性superfolder GFP (sfGFP)を基質として,これに複数のジスルフィド架橋を導入した新規なPDI測定用基質を検討する。具体的には正しい立体構造の回復に依存して緑色蛍光を発する変異sfGFPを2種類作成した。これをマイルドな酸化的ミスフォールド状態に導くとこで,高温条件下でのタンパク質のリフォールディング反応を可能にする。

当初の計画に沿って下記の項目を達成している。緑色蛍光タンパク質sfGFPにジスルフィド架橋を1本導入したsfGFP-1SS,2本導入したsfGFP-2SSを組換えタンパク質として大腸菌で発現させてNi-NTAスピンカラムによる簡便な精製法を確立して変性タンパク質として安定な基質として調製した。この変性sfGFPを基質に用いてTthA0610,TthA1422のジスルフィド異性化作用により正しく自己フォールディングさせる蛍光アッセイ法の最適化を検討した。市販の牛肝臓由来タンパク質ジスルフィド異性化酵素(PDI)を標品酵素とした。TthA0610によるGFP-2SSの蛍光回復程度は実験の度に大きく異なっており,これはPDIを触媒に用いたときも同様だったので,再現性の低さは触媒ではなく基質の状態,つまり変性sfGFPの酸化状態に依存することが示唆された。とくに,酸化剤とその処理条件がsfGFP-2SSの蛍光消失の程度と回復収率に強く影響することから,H2O2の濃度や処理時間を最適化した。またミスフォールドしたGFP-2SSを,ニッケルカラム担体を用いて簡便に精製してアッセイに供する方法も確立した。反応系の酸化還元電位を調節するレドックス緩衝成分としてGSH/GSSGのグルタチオン系を用いて,温度条件や反応時間を検討した結果,PDI触媒とGSH/GSSG緩衝剤に依存して再現性よく蛍光が回復したので簡便・高感度にPDI機能を評価できる反応系を確立した。組換えTthA0610を大腸菌細胞内に発現させたとき,触媒して働く温度の上限は40°Cであった。しかしペリプラズム空間に移行するSecシグナル配列を付加して発現させると,稼働温度は50°Cが上限であった。本酵素がペリプラズムへの移行過程において立体構造の安定性が向上することが示唆された。本研究ではタンパク質をゆでながら巻き戻す高温リフォールディング技術の開発に取り組んだ。正しい立体構造の回復に依存して緑色蛍光を発するsfGFP-2SSを作成した。これを還元的に変性させた後,酸化剤により誤った架橋を形成させると蛍光は失われた。これを基質として高温条件での巻き戻しを実現するために耐熱性PDIにより,高温リフォールディング技術PTR法を確立した。PTRとは,高温と低温の温度サイクルにより変性タンパク質を正しい構造へと導くタンパク質のPCRである。病因分子を認識する抗体が医薬品として利用されており,複数のジスルフィド架橋を正しく導入する方法として展開が見込まれる。抗体分子を組換えタンパク質として生産する場合,多数のジスルフィド架橋を正しく導入することが技術的に大きな課題とされている。
近視難聴合併症とシナプス病態の関連の解明

1. SLITRK6ファミリーのナンセンス変異を、近視難聴合併症の患者を含む独立の3家系で発見し、Slitrk6欠損マウスでは生後発達におけるシナプス形成の遅延、視軸長の増加がおきることを報告した。先天性近視難聴合併症の病態の理解に貢献し、シナプス形成障害と感覚障害の関連を明らかにすることができた。(Tekin et al., 2013)2.海馬の抑制性ニューロンに発現する後シナプス膜タンパク質の1つELFN1が、代謝共役型グルタミン酸受容体の一つmGluR7に結合して前シナプスへの集積を引き起こし、抑制性ニューロンのシナプス可塑性を制御していることを発見した。この遺伝子の変異がてんかん・多動症のような脳の興奮抑制バランスの乱れを背景とした病態に関係する可能性を示した。(Tomioka et al., 2014)26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。請者はこれまでに脊椎動物のLRR膜タンパク質と高次脳機能の関連に注目して、その1グループであるSlitrkファミリーを世界に先駆けて報告し、主にノックアウトマウスの解析によりその生物学的意義についての研究を進めてきた。その過程でSlitrk6が内耳の神経回路網形成に重要な役割を持つこと、Slitrk6欠損マウスは感音性難聴のモデルマウスとなること、Slitrkファミリータンパク質にはシナプス誘導活性があることを報告した。最近、SLITRK6のナンセンス変異が、難聴・近視合併症の患者を含む独立の3家系で発見されたとの連絡を共同研究者より受け、応募者がSlitrk6欠損マウスの眼の表現型を解析したところ、視軸長の増加が確認され、このマウスが難聴・近視合併症の疾患モデルとなることが明らかとなった。このマウスでは生後発達過程での網膜の高度な感覚受容に特化したリボンシナプスの形成が遅延していた。これらの成果を誌上発表・プレス発表した(Tekin et al., J. Clin. Invest. 2013;"近視と難聴の合併症の原因遺伝子「SLITRK6」を発見"http://www.riken.jp/pr/press/2013/20130402_1/ )。これらの成果を受けて、Slitrk6変異マウスのリボンシナプス微細形態・シナプス機能の評価を更に進めた。引き続き「Slitrk6のリボンシナプス誘導の分子メカニズム」と「Slitrk欠損動物を用いたシナプス病態の改善法」について研究計画を進める。世界初となる近視難聴合併症の原因遺伝子ならびに疾患モデル動物を誌上報告できた点で、大きな成果が挙げられたと考えている。また、新たなシナプス膜タンパク質の分子機能と生理機能を明らかにすることができた(投稿中)。近視の発症メカニズムそれ自体についてもいくつかの先行的な研究があるのみで、仮説が定着している状況とは言い難い。本研究は実験操作、遺伝的解析が比較的容易なげっ歯類モデル動物で近視の原因解析が行えるため、遺伝子レベルから機能異常まで一貫した解析が行える。リボンシナプスの形成メカニズムとその機能異常に関連した病態はこれまでにほとんど知られておらず、リボンシナプスの生理学的意義の解明についても貢献できる可能性がある。本研究の遂行により、近視と難聴という非常に頻度の高い感覚障害について、新たな発症メカニズムを解明・提唱できるものと予想する。このことは、医学的、社会的にも非常に大きな貢献となり、治療と対処を対象とする研究分野や神経組織の再生の研究にも大きな波及効果を与える。今後、以下の点を中心に解析を進める。1. Slitrk6のリボンシナプス誘導の分子メカニズムの解明。a)受容体型タンパク質チロシン脱リン酸化酵素(Ptpr)との相互作用の検討。b)ニューロトロフィンシグナリングとの関連の解明。c)プロテオーム解析によるSlitrk6の分子作用機序の検討。d)新たなシナプス誘導アッセイ系を用いたSlitrk6のシナプス誘導活性の検討。e)遺伝学的手法を用いたPtpr,ニューロトロフィンシグナリングとの相互作用の検討。f)Slitrkタンパク質の機能を変化させる低分子化合物の探索。2. Slitrk欠損動物を用いたシナプス病態の改善法の検討。a)ウイルスベクターを用いた分子ツールの発現。b)低分子化合物の投与による影響の評価。c)細胞移植による機能改善の評価。
食品蛋白質の構造・ゆらぎ・機能相関に関する基礎的研究

当初の研究計画にしたがって、牛乳蛋白質と卵蛋白質約10種について、音速度と密度の精密測定を行い、その断熱圧縮率を決定した。得られた圧縮率は(410)x10^<ー12>cm^2/dynで、これらの貯蔵蛋白質や栄養蛋白質は、プロテア-ゼやそのインヒビタ-に比べてゆらぎが大きく,輸送蛋白質より小さくなっている。蛋白質のゆらぎは、部分比容が大きく、疎水性が高いほど大きくなる傾向にあり、ヘリックス部分はダイナミックドメインとしてゆらぎを大きくする方向に作用している。圧縮率の統計解析より、Leu,Glu,Phe,Hisの4アミノ酸はゆらぎを増し、Asn,Gly,Ser,Thrの4アミノ酸は小さくする方向に寄与しており、他の12アミノ酸の影響は小さい。これらの結果は、蛋白質の構造の特異性がゆらぎにかなり敏感に反映することを示しており、統計解析より得られた回帰式を用いて、未知の蛋白質の圧縮率(ゆらぎ)を推定することが可能となった。一方、これらの食品蛋白質の圧縮率と起泡性との相関を調べた結果、ゆらぎの大きい蛋白質ほど起泡性が良くなっており、また、ゆらぎの大きい蛋白質ほどプロテア-ゼによる消化性も良いことがわかった。圧縮率の大きい蛋白質は変性の自由エネルギ-変化も小さく、ゆらぎの大きい蛋白質は構造が不安定になっていることが明らかとなった。熱安定性との相関はあまり良くないが、ゆらぎの大きい蛋白質は熱安定性が良くなる傾向が見られ、蛋白質分子内のcavityは熱や機械的摂動に対して一種の緩衝作用を持っていることが期待される。これらの結果は、構造のゆらぎが蛋白質の機能や性質の発現にとって重要な因子であることを示している。これらの研究成果は裏面に示すように、2編の論文および総説として発表されている。平成元年度の研究計画にしたがって、牛乳蛋白質と卵蛋白質約10種について、音速度と密度の精密測定を行い、その断熱圧縮率を決定した。得られた圧縮率は(410)x10^<-12>cm^2/dynで、これらの貯蔵蛋白質や栄養蛋白質は、プロテア-ゼやそのインヒビタ-に比べてゆらぎが大きく、輸送蛋白質より小さくなっている。これらの研究成果は裏面に示すように、2編の論文として発表予定である。

当初の研究計画にしたがって、牛乳蛋白質と卵蛋白質約10種について、音速度と密度の精密測定を行い、その断熱圧縮率を決定した。得られた圧縮率は(410)x10^<ー12>cm^2/dynで、これらの貯蔵蛋白質や栄養蛋白質は、プロテア-ゼやそのインヒビタ-に比べてゆらぎが大きく、輸送蛋白質より小さくなっている。蛋白質のゆらぎは、部分比容が大きく、疎水性が高いほど大きくなる傾向にあり、ヘリックス部分はダイナミックドメインとしてゆらぎを大きくする方向に作用している。圧縮率の統計解析より、Leu,Glu,Phe,Hisの4アミノ酸はゆらぎを増し、Asn,Gly,Ser,Thrの4アミノ酸は小さくする方向に寄与しており、他の12アミノ酸の影響は小さい。これらの結果は、蛋白質の構造の特異性がゆらぎにかなり敏感に反映することを示しており、統計解析より得られた回帰式を用いて、未知の蛋白質の圧縮率(ゆらぎ)を推定することが可能となった。一方、これらの食品蛋白質の圧縮率と起泡性との相関を調べた結果、ゆらぎの大きい蛋白質ほど起泡性が良くなっており、また、ゆらぎの大きい蛋白質ほどプロテア-ゼによる消化性も良いことがわかった。圧縮率の大きい蛋白質は変性の自由エネルギ-変化も小さく、ゆらぎの大きい蛋白質は構造が不安定になっていることが明らかとなった。熱安定性との相関はあまり良くないが、ゆらぎの大きい蛋白質は熱安定性が良くなる傾向が見られ、蛋白質分子内のcavityは熱や機械的摂動に対して一種の緩衝作用を持っていることが期待される。これらの結果は、構造のゆらぎが蛋白質の機能や性質の発現にとって重要な因子であることを示している。これらの研究成果は裏面に示すように、2編の論文および総説として発表されている。
放射線の影響による浸潤能亢進の分子機序の解明

多くの乳癌治療に放射線療法が用いられているが、治療後に浸潤癌としての再発に関わる分子メカニズムは、未だ解明されていない部分も多い。本研究では、非浸潤性乳癌細胞において、放射線照射後の浸潤能獲得過程に関わる分子の同定、および分子メカニズムの解析を、細胞の3次元培養モデルを用い行った。乳腺上皮細胞の3次元培養実験系において、放射線照射後の浸潤能獲得に、α5SS1-integrinとNF-κBのシグナルが関わっている可能性が示唆された。乳癌は、その原因となる分子や分子機序が多種多様であり、放射線照射による癌細胞への影響を含め、未だ明らかにされていない部分が多い。放射線療法による乳癌治療の際、悪性度の高い癌としての再発が問題とされるが、放射線照射によって誘導される癌の悪性化に関連した詳細な分子メカニズムは明らかにされていない。本研究では、乳癌細胞における放射線の影響とその分子機序を理解する事によって、放射線治療に適した乳癌を見分ける分子マーカーを同定し、さらに、放射線照射後の再発を防ぐための分子標的の候補を得るための知見を得る事を目的に解析を行った。放射線照射後に、浸潤能が上昇する乳癌細胞を、細胞外基質の3次元環境で培養したモデルを用い、放射線照射後の浸潤能亢進に関連した分子の同定を試みた。乳癌の中でも、非浸潤性乳癌の3次元培養細胞モデルでは、放射線照射後に生き残った細胞において、浸潤能が増し、悪性度の高い形態が観察された。また、放射線照射による浸潤能亢進に、細胞接着分子インテグリンと転写因子NF-κBのシグナルが関与している事が示唆される結果を得る事ができた。さらに、放射線照射後に、特異的に活性化されるインテグリン関連の分子メカニズムを明らかにする必要があると考え、分子の網羅的解析を行った。その結果、放射線照射後の浸潤能上昇とインテグリンのタンパク質発現亢進に伴い、インテグリン制御に関わる複数の分子が連動して発現変化している事を見出した。本研究により、乳癌への放射線照射後によって活性化され、悪性度の高い乳癌としての再発を制御する分子メカニズムの一端が明らかになった。詳細な分子メカニズムの全貌を解明するには、今後の解析が必要とされるが、本研究により得られた結果は、放射線治療効果を最大に引き出すための知見に繋がる可能性が期待できる。近年、癌の放射線治療が普及し、乳癌の治療においても一般的に放射線治療が併用されるようになってきている。乳癌治療の際、放射線療法を行うことによって、外科的切除のみの場合に比べて再発率が半減されることが報告されている。しかし、放射線療法を行ったにもかかわらず再発した場合は、その約半分が、より悪性度の高い癌として浸潤能や転移能を獲得していることも報告されている。乳癌はその原因となる分子や浸潤・転移等の分子メカニズムが複雑でかつ多種多様であり、放射線に対する影響も含め、未だ解明されていない部分も多い。本研究は、乳癌細胞における放射線の影響とその分子メカニズムを理解することよって、多種多様な乳癌の中から放射線治療に適した乳癌を見分けるための分子マーカーを同定し、さらに放射線療法後の再発を防ぐための分子標的の候補を得ることを目的とする。本年度は、乳癌細胞における放射線の影響を調べるため、再構成基底膜(ラミニンリッチマトリゲル)による3次元培養モデルを用いて解析を行った。浸潤能が高い乳癌細胞MDA-MB-231と浸潤能が低い乳癌細胞SK-BR-3を3次元培養し、0Gy, 2Gy, 8GyのX線を照射し、細胞死等の解析を行った。また、これらの乳癌細胞に放射線を照射後、生き残った細胞を3次元マトリックスから取り出し、取り出した細胞を用いて、インベージョンアッセイによる浸潤能を測定した。その結果、放射線照射後に浸潤能の亢進が認められる乳癌細胞を特定することができた。また、浸潤能の亢進に伴い、発現量が変動する分子の検討を行った結果、浸潤能亢進とタンパク質発現量の間に相関が見られる分子を確認することができた。本研究は、乳癌細胞における放射線の影響とその分子メカニズムを理解することよって、多種多様な乳癌の中から放射線治療に適した乳癌を見分けるための分子マーカーを同定し、さらに放射線療法後の再発を防ぐための分子標的の候補を得ることを目的としている。特に、23年度は、1)実験系の確立、2)放射線照射後に浸潤能が上昇する乳癌細胞株の特定を試みた。まずは、乳癌の3次元培養を用いた放射線照射の実験系を検討し、適切な実験系と細胞系を確立することを計画しており、すべて順調に進行できた。さらに、浸潤能亢進に伴い、タンパク質発現が増加する分子の候補もいくつか得られたため、本年度の研究は、当初の計画に従い順調に進展している。

23年度に得られた結果を基にして、放射線照射によって浸潤能を亢進する乳癌細胞を用い、関連分子の特定を行う。さらに、乳癌3次元培養系を用いて、放射線照射後の浸潤能に関わる詳細な分子機序を解析する。分子の下流の解析には、免疫沈降等の手法を用いて確認する。放射線照射株と非照射株(コントロール)の3次元培養細胞のタンパク抽出液から免疫沈降し、放射線照射株でのみ特異的に結合してくる分子を特定する。分子が特定できれば、放射線照射により誘導される浸潤能が、分子の阻害によって抑制されるかを検討する。分子阻害剤としては、阻害抗体や細胞透過性ペプチド等を用いる。さらに、乳癌細胞の3次元培養系によって得られた結果を用い、マウスモデルにおいて、放射線によって亢進した乳癌の浸潤・転移の抑制に、上記の阻害剤が有効かを検討する。マウスモデルとしては、ルシフェラーゼを安定発現させた乳癌細胞株をマウスに投与し、浸潤・転移の有無を、ルシフェラーゼのin vivoイメージングによって検討する。次年度は、細胞の3次元培養に必要な試薬・マトリゲル等、免疫沈降に必要な抗体類、アッセイに必要なキット類等の購入に研究費の使用を計画している。また、得られた成果を学会で発表するための旅費や、論文投稿のための校閲・投稿料等に使用する。今年度は、実験計画に含まれている複数の乳癌細胞における放射線の影響を調べる実験において、比較的初期に、適切な細胞を見つけることができた。そのため、検討する細胞数を当初計画していた数より減らす事ができ、消耗品類の消費も減らす事ができたため、使用残額が生じた。今年度は残額は、次年度の研究において、検討する阻害剤を増やす等、有効活用する予定である。
卵巣の老化および卵細胞における欠失ミトコンドリアDNA蓄積とその局材の解明

材料及び方法体外受精における採卵時に得られた卵細胞より、未受精その他の理由により実際の胚移植に不必要であった卵細胞を、患者の同意を得て使用した。また、婦人科領域各種疾患による手術時に摘出された標本より卵巣の一部を、患者の同意を得て使用した。得られた組織よりtotal DNAを抽出し、ミトコンドリアDNA上の塩基番号8201から8220と13650から13631のプライマーペア-を用い遺伝子増幅装置にてDNAを増幅した。また卵巣組織切片をスライドグラス上に固定し、ジゴキシゲニンラベルされたプライマーを用いたin situ PCRを行った。結果卵細胞から得られたDNAでは、欠失ミトコンドリアDNAの増幅は認められなかった。閉経後の症例の卵巣より得られたDNAからは、約0.5kbのDNAが増幅され、この塩基配列を調べたところ、ミトコンドリアDNAのうちATPaseからND5の領域までの約5kbを欠失していることが確認できた。また、定量的PCRによる解析では欠失ミトコンドリアDNAの正常ミトコンドリアDNAに対する相対的存在量は、症例の年齢が高くなるほど多くなることがわかった。考察と今後の展開卵細胞での欠失ミトコンドリアDNAの存在は証明できなかった。今回得られた卵細胞は全て体外受精における排卵誘発に反応して採取されたものであり、老化のない細胞であったためと考えられた。今後症例数を増やし、特に高齢での体外受精症例からの採取卵、また排卵誘発に反応不良の未熟卵等での検討が必要と考えられる。今回in situ PCRに用いた卵巣標本には原始卵胞が存在しなかったため、卵細胞及びその周囲での欠失ミトコンドリアの有無をみるには不適当であった。今後、閉経前の症例より得られた卵巣での検討を予定している。
ホヤ胚への遺伝子導入

この研究は、将行ホヤのホメオボックス遺伝子の機能を明らかにしていく1つの有力な方策として、遺伝子導入の方法論を確立することを目指したものである。また、実験材料のマホヤ胚が冬季しか得られないため2年継続の形をとった。1.胚への遺伝子の導入法確立に当たってモデルとして用いる遺伝子については、ホヤでは適当なものがなかった。しかし、ホヤにおいてはニワトリβーアクチンとクロスハイブリダイズする遺伝子があり、それらが発現パタ-ンの違いから少なくとも4つに分類できることを明らかにしたので(西駕、未発表)、本研究の1プロジェクトとして、これらの遺伝子の単離に取り掛かった。その結果、64細胞期から発現を開始し、発生の進行と共に次第に発現が増加するタイプ、maternalに存在、あるいは、恒常的に発現をするタイプの2種の遺伝子を単離しアクチン遺伝子と同定した(西駕、発表準備中)。その他の1つである筋肉型アクチンの単離については、京大、佐藤らとの共同論文報告がある(Kusakabe et al.,1991)。2.ホヤ胚へのマイクロインジェクションについては、いくつかの条件を勘案し、マウス卵へのマイクロインジェクションと同様な方法で、コリオンを残した状態で側方から針を刺入する方法を試してみた。胚へ針を刺入出来る時期、針の径などいくつかの基礎的な情報や、約半数の実験胚が後期尾芽胚までは対照胚と同様発生した等の予試験的な結果は得られたが、方法に対する習熟度、例数がこの期間では十分とはいえず、方法として確立するところまでは至っていない。今後は、この方法に対して習熟度を深め、導入したDNAの性状や発現について明らかにしていきたい。そして上記のアクチン遺伝子のプロモ-タ-領域が、この方法で同定できることを示したい。この研究計画は実験材料のマボヤ胚が冬季しか得られないため2年継続の形を取っている。今年度の研究計画の進捗状況は以下の通りである。1.マボヤ胚で時期特異的、非特異的に発現するβーアクチン様遺伝子の単離マボヤ胚の初期発生過程でのNorthern blot解析から、ニワトリβーアクチン遺伝子とクロスハイブリダイズするmRNAが4種ある事、およびそれらの発現パタ-ンを明らかにした。その中で8.16ー64細胞期に胚で初めて出現し初期発生の間発現が維持される遺伝子と恒常的に発現しているβーアクチン様遺伝子に着目し以後の研究に用いることにした。これらの遺伝子を単離するために64細胞期のcDNAライブラリ-を作成し、cDNAクロ-ンを十数個単離した。現在それらの分別に取りかっている。次年度にそれらの5'上流域を含むゲノムDNA断片を単離しCAT遺伝子等との融合遺伝子を作製する予定である。2.マボヤ胚へのマイクロインジェクション当初の計画通り、マイクロマニュピュレ-タ-、インジェクタ-、研磨器等を購入し、ホヤ搬入を行い、今冬からホヤ胚を発生させてみた。実際に、実験室で成体マボヤを数カ月の期間維持することが出来、正常な胚発生を行わせることが出来た。マイクロインジェクションの予試験として、末受精卵から2細胞期のいくつかの発生段階のマボヤ胚に数種の方法でマイクロインジェクションを試みた。現在のところ、卵膜を残した状態で微小ガラス管を刺入し緩衝液などを導入、少なくとも後期尾芽胚までは50%程度の割合で正常に発生させることができている。次年度ではこの技術を確立させ、上記の融合遺伝子DNAあるいは抗体等の導入実験を試みたい。1、ホヤ胚で時期特異的、非

特異的に発現をするβーアクチン様遺伝子の単離ホヤホメオホックス遺伝子発現のノザン解析の過程で、ニワトリβーアクチンとクロスハイブリタイスする遺伝子があること、そしてそれらが発生時期特異的に発現するもの、恒常的に発現するものなど、発現パタ-ンから少なくとも4つに分類できることが明らかにしてきた(西駕、未発表)。本年度は、これらのアクチン様遺伝子の内、発生初期から発現を開始し発生の進行と共に次第に発現が増加するもの、maternalに存在、あるいは、恒常的に発現をする、2種のアクチン遺伝子を64細胞期cDNAライブラリ-より単離、同定した(西駕、発表準備中)。その他の遺伝子の1つは、発現パタ-ンから筋肉型アクチンと予想された。この遺伝子の単離については、京大、佐藤らとの共同論文報告がある(Kusakabe et al.,1991)。2、ホヤ胚へのマイクロインジェクションについては、平成2年度に試行した、コリオンを残したまま卵細胞へマイクロインジェクションするという方法を引き続き試してみた。しかしながら、ホヤの飼育管理が不調で卵の得られた回数が予想より大幅に下回ってしまったため、方法として確立するのに十分な例数をこなすことが出来なかった。3、抗体の導入についても、上と同様の状況であるが、この場合は導入する抗体を遠心しフィルタ-で濾過をしても針が目詰まりしやすい傾向があり、この点に配慮が必要と思われる。
熱ストレスによる貯蔵果実の鮮度維持技術の開発

本研究は、筆者が開発した新しい知能的制御法を活用して、果実の鮮度維持(水損失や呼吸を最小にする)、そして高品質化(糖度を上げる、適度な硬さにする)ための最良の温度操作パターン(熱ストレスと低温の最適な組合せ)をシステム科学的に究明し、その技術の実用化をはかることである。1.温度変化(545°C)に対するトマトの水損失、呼吸、果皮色、硬さ、糖度の変化を調べた。温度が高くなるにつれ、トマトの水損失速度、呼吸速度、果皮色はいずれも反応が大きくなるが、35°C以上では逆に低くなり、そして一旦このような熱ストレスを12時間以上与えると、その後はもとの温度(低温)に戻しても抑制された。すなわち、熱ストレスによる果実の鮮度維持の効果が認められた。2.カオスの概念を導入して、果実の内部品質を簡易かつ非破壊で計測する新しい方法を開発した。これは果実が選果過程でトレイを転がるときのトレイの振動特性から、果実の硬さ(追熟度合い)を推定する。振動データのアトラクターを見ることによって、その形から果実の硬度が推定できた。3.3層のニューラルネットワーク(学習によるシステム同定法)を用いることにより、複雑な温度に対するトマトの水損失速度、呼吸速度、果皮色の動的モデルが構築できた。4.次に、このモデルのシミュレーションから、目的関数(貯蔵期間における水損失速度、呼吸速度、果皮色の3つの値)を最小にする温度操作を、遺伝的アルゴリズムを用いて求めることが出来た。最適値は、収穫後直ちに40°Cの熱ストレスを与え、その後急激にもとの温度(低温)に戻すパターンであった。5.この温度操作をトマト(果菜類)から温州ミカンや伊予柑などの柑橘類に拡大し、熱ストレスの効果を調べた結果、トマトより、柑橘類の方が大きかった。6.以上の結果より、本最適制御システムの有効性が確かめられ、実用化の見通しを得た。(1)貯蔵環境が自由に制御できる恒温恒湿器にトマトを入れ、温度変化(050°C)に対するトマトの水損失、呼吸、果皮色、硬さ、糖度などを計測し、それらの動的な挙動をシステム科学的に調べた。貯蔵におけるトマトの水損失速度、呼吸速度、果皮色はいずれも温度が高くなるに従って反応が大きくなるが、35°C以上では逆に低くなり、そして一旦このような熱ストレスを12時間以上与えると、その後はもとの温度(低温)に戻しても抑制されており、再度温度を上げてもそんなに増加しなかった。熱ストレスによる水損失、呼吸、追熟の抑制効果、すなわち鮮度維持の効果をシステム科学的に承り扱えると分かった。なお、糖度に関しては、もう少し実験を必要とした。(2)3層のニューラルネットワークを用いて、システム同定手法により、温度に対するトマトの水損失速度、呼吸速度、果皮色の変化(緑色から赤色へ)の動的モデルを構築できた。

(3)次に、この動的モデルのシミュレーションから、目的関数(貯蔵期間における水損失速度、呼吸速度、果皮色の3っの値)を最小にする温度操作を、遺伝的アルゴリズムを用いて求めると、3つの量とも最初に、急激に40°Cの熱ストレスを与え、その後急激にもとの温度に戻すパターンが最小となり、このような単純な温度操作が貯蔵果実の鮮度維持をもっと進める上で有効であることを示し、また実用化しやすいと言える。本研究は、筆者が開発した新しい知能的制御法を活用して、果実の鮮度維持(水損失や呼吸を最小にする)、そして高品質化(糖度を上げる、適度な硬さにする)ための最良の温度操作パターン(熱ストレスと低温の最適な組合せ)をシステム科学的に究明し、その技術の実用化をはかることである。最終年度は以下のような結果を得た。1.果実の内部品質を簡易かつ非破壊で計測する新しい方法として、カオスの概念を導入して、従来より行われている果実の打撃による果実の振動特性から、また新しい方法として、果実が選果過程でトレイを転がるときのトレイの振動特性を解析することにより、果実の硬さ(追熟度合い)を推定する方法を開発研究した。この方法は、1次元の振動の時系列データを2次元のアトラクターに移し替えることで、その形(アトラクターの傾き)から、果実の硬度を推定する。2.今までに得られた熱ストレスによる最良の温度操作は、収穫後直ちに、すなわち果実が新鮮な段階で、40°Cの熱ストレスを約1日与え、その後は通常の貯蔵温度(低温)に下げるパターンであり、これ(適切な熱ストレス負荷による効果)により果実の水分損失や呼吸量が明らかに減少し、鮮度維持に有効であった。この温度操作をトマト(果菜類)から温州ミカンや伊予柑などの柑橘類に拡大した。熱ストレスの効果はトマトより、柑橘類の方が大きかった。3.以上の結果より、本最適制御システムの有効性が確かめられ、実用化の見通しを得た。
セルロース誘導体を高分子担体とする生体関連物質の合成研究

1.オリゴヌクレオチド類の合成研究:(1)アセチルセルロース担体を用いるオリゴマー合成の有用性を検討したところ、DNAでは8量体、RNAでは13量体程の鎖長まで効率良く合成が行えた。(2)修飾塩基ヌクレオシド[プソイドウリジン(Ψ)、1-β-D-リボフラノシルチミン(rT)、および5,6-ジヒドロウリジン(D)]ならびに5'-末端リン酸基を含むRNAオリゴマー等の合成を検討した。その結果、各ヌクレオシドおよびリン酸基等の各官能基の保護法の開発、さらにセルロース担体を用いるΨおよびrTを含む12量体、5'-末端リン酸基を含む11量体の合成、ならびにCPG担体を用いるDを含む8量体の合成を行うことができた。2.2,-O-(α-ならびにβ-D-リボフラノシル)アデノシンの合成研究:ポリ(ADP-リボース)の基本的な化合物ならびにYeast initiator tRNA^<Met>の構成成分の2'-O-(α-ならびにβ-D-リボフラノシル)アデノシンの合成を検討した。フッ化D-リボフラノシル誘導体、D-リボフラノシルフェニルカルバマートおよび-トリクロロアセトイミダート誘導体等を用いて2'位水酸基が遊離のアデノシン糖受容体についてグリコシル化反応を種々検討したところ、標記化合物をそれぞれ高立体選択的に合成することができた。3.オリゴ糖類の合成研究:グリコシルカルボナートおよび-カルバマート誘導体を用いる新規グリコシル化反応を開発することができた。さらに後者を用いて四糖類までの合成を行うことができた。4.安定同位体標識ヌクレオシドの合成研究:NMR法による核酸-核酸あるいは核酸-蛋白質相互作用における認識機構の解明に有用な^2Hおよび^<15>N標識ヌクレオシドの合成を検討したところ、(1)高立体選択的(2'R)-[2'-^2H]-2'-デオキシリボヌクレオシドの合成法、(2)高立体選択的(2'S)-[2'-^2H]-2'デオキシリボヌクレオシドの合成法、(3)塩基部環外アミノ基^<15>N標識ヌクレオシドの効率の良い合成法等を開発することができた。1.ヌクレオシド類複素環部に対する保護基の検討:グアノシンO^6位の保護基としては、ジフェニルカルバモイル基(DPC基;畑ら)の他により緩和な塩基性条件下で除去できる2ーシアノエチル基(CE基;Jonesら)などが知られている。三つのグアニル酸単位を含むRNA型13量体(2項参照)の化学合成における両者の有用性を比較した。その結果、後者が前者に勝ることを確認するとともに、O^6ー(2ーシアノエチル)グアニル酸素子の合成収率を3040%(Jonesら)から6070%と改善することができた。

また、プソイドウリジン(Ψ)のN^1ならびにN^3位の保護基としては、ベンゾイル、アニソイル、および2,6ージメトキシベンゾイル基を導入しその安定性を比較検討したところ、N^1位のみをベンゾイル基で保護することで十分実用に耐えることが確かめられた。2.アセチルセルロ-ス誘導体を高分子担体とするRNA型13量体(AAGGAAAAUUAUG)の合成:担当者らは、当該高分子担体に対して4ー(2ーヒドロキシエチルスルホニル)ジヒドロシンナモイル基をスペ-サ-として用いる手法について既に報告した。これに代るスペ-サ-として3ー(カルボキシ)プロピオニル基を用いて標記13量体を構築した処反応溶媒(ピリジン)に対する溶解性ならびに沈澱性(エタノ-ルからの)共に問題なく、グアノシンのO^6位の保護基にDPC基を用いた場合には130A_<260>単位、また、CEを用いた場合には240A_<260>単位を得ることができた。3.アセチルセルロ-ス誘導体を高分子担体とする酵母菌アラニンtRNA TΨCステムル-プ部の合成研究:1ならびに2項の成果を踏まえて、Ψならびに1ーβーDーリボフラノシルチミン(T)を含む標記tRNAの特定部(UCCGGTΨCGAUU)の構造を構築し、合成法の有用性を示すことができた。1.酵母tRNA^<Phe>のDール-プ部の合成研究:ジヒドロウリジン(D)は、酸および特に塩基性条件下不安定であり、その安定性に適した保護基の選択と導入に関連して基礎的検討を行なった。Dは、オリゴマ-合成時に用いられる酸性条件で安定であること、1:1濃アンモニアーエタノ-ル溶液中室温下5時間で10%程分解することがChaixらにより報告せれていることから、5′ー位にジメトキシトリチル(DMTr)基、2′ー位にテトラヒドロピラニル(Thp)基という最も一般的な保護基を用いることにした。その導入法は、Dの安定性を考慮し、あらかじめ保護した2′ーοーThpウリジンをRhーH_2で還元し、2′ーοーThp Dを合成したのち、5′ーDMTr化し容易に目的とする5′ーοーDMTrー2′ーοーThp Dを得ることが出来た。2.5′ー末端リン酸を含むオリゴリボヌクレオチドの合成研究:RNAリガ-ゼの基質となる5′ー末端リン酸を含むオリゴマ-(酵母tRNA^<AIa>の3′ー末端部11量体)の合成を検討し、5′ー末端リン酸の保護基として2ー[2ー(モノメトキシトリチルオキシ)エチルチオ]エチル基を含むヌクレオチドユニットを開発することができた。このユニットを含む4量体を液相法により合成したのち,アセチルセルロ-ス担体上標記11量体をブロック縮合法により合成することができた。またこの際、アセチルセルロ-ス担体上スペ-サ-として3ー(カルボキシ)プロピオニル基を用いて好結果が得られ、その有用性を見いだすことができた。3.ポリ(ADPーリボ-ス)ならびに関連化合物の合成研究:標記合成における際本的な化合物2′ーοー(αーDーリボフラノシル)アデノシンをアデノシンの2′ーοー(αーDーリボシル)化により合成することを計画し、合成中間体であるN^6ーベンゾイルー3′,5′ージーοーベンジルアデノシンならびに2,3,5ートリーοーベンジルーDーリボフラノ-スの合成を行なった。1.Yeast tRNA^<Phe>のD-ループ部の合成研究:ジヒドロウリジン(D)の安定性を念頭に置いてアデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、およびウリジン(U)塩基部の保護基の選択およびその導入を検討した。
破骨細胞融合の骨代謝における役割の解明

今までに我々はDC-STAMPのノックアウトマウスの解析により、破骨細胞の細胞融合に必須の分子であることが分かっている。今回、DC-STTAMPの過剰発現マウスを作成することによって、DC-STAMPは破骨細胞特異的に骨量を制御し、またDC-STAMPの機能を抑制する事で、破骨細胞による骨吸収抑制と骨芽細胞の活性上昇の両面から、骨量を増加させることが可能となる事が示唆された。今までに、DC-STAMP欠損マウスでは破骨細胞の細胞融合が完全に欠失すること、骨吸収能の低下により、骨量の増加することが明らかとなっている。また、DC-STAMP過剰発現マウスではDC-STAMPの過剰発現により破骨細胞の細胞融合の有為な亢進を認める事を既に見出している。平成21年度の結果により、骨代謝制御に関しては、in vivoでの骨密度の測定、骨形態計測、骨吸収アッセイを行いDC-STAMP欠損マウスでは、破骨細胞による骨吸収が抑制されているが、骨芽細胞による骨形成は促進されており、その結果骨量は増加していた。それに対しDC-STAMP過剰発現マウスでは、破骨細胞による骨吸収の亢進、および骨芽細胞の活性と骨量の低下を示した。これらのことより、DC-STAMPは破骨細胞特異的に骨量を制御し、またDC-STAMPの機能を抑制する事で、破骨細胞による骨吸収抑制と骨芽細胞の活性上昇の両面から、骨量を増加させることが可能となる事が示唆された。今までに、DC-STAMP欠損マウスでは破骨細胞の細胞融合が完全に欠失し、それに伴う骨吸収能の低下により、骨量の増加をきたすことが明らかとなっている。逆に、DC-STAMP過剰発現マウスでは破骨細胞の細胞融合の有為な亢進および骨吸収能の上昇を認める事を既に見出している。平成22年度の結果により、骨代謝制御に関しては、in vivoでの骨密度の測定、骨形態計測、骨吸収アッセイを行いDC-STAMP欠損マウスでは、破骨細胞による骨吸収が抑制されているが、骨芽細胞による骨形成は促進されており、その結果骨量は増加していた。DC-STAMPは破骨細胞特異的に骨量を制御し、またDC-STAMPの機能を抑制する事で、破骨細胞による骨吸収抑制と骨芽細胞の活性上昇の両面から、骨量を増加させることが可能となる事が示唆された。そこで今年度は骨量を増加させる因子としてTGF-βに着目し、解析をおこなった。TGF-βは破骨細胞の分化を抑制し、骨吸収を抑制することを明らかにすることができた。TGF-βは骨基質内では潜在型のTGF-βとして存在し、活性化には破骨細胞由来の強酸が必要であることは既に知られている。これらの解析により新たな生理的な骨代謝を利用した骨量増加の可能性が示唆された。次に、DC-STAMPの過剰発現だけで破骨細胞の多核化が起こるのか、in vitroにおいてDC-STAMP過剰発現細胞をM-CSF単独での培養をおこなったが、細胞融合は認められなかった。このことからDC-STAMP以外に細胞融合を制御する新たな分子が必要であることが明らかとなった。
学校における参加型地震防災学習を通じたサイエンスコミュニケーションの研究

防災教育の成果を、実践の場で問う手段が求められている。このとき、学校という条件を限定し、そこで専門家と共になされる実践参加型防災学習のデザインを課題とすることで、全国一律の学校制度の定着力を生かした効果的な提案をなし得る。言い換えれば、「専門家の知識を実践参加型の防災教育を通していかに効果的に定着させるか」が課題である。そこで本研究では、地震学に関する実践参加型の防災学習プログラムを小学校・中学校・高等学校・大学の各年代で構築し、従来の知識伝達型の授業との適切な組み合わせでそれらを実施することによって、学校教育各年代の防災教育でつけるべき力と教育方法の関係を整理された形で提示する。
大動脈瘤の革新的な治療法開発:組織修復を制御するマイクロRNAの同定と機能解析

大動脈瘤は、無症状のまま進行し、破裂・突然死を来す原因不明の疾患であり、欧米における有病率は高齢者人口の約1割である。我が国でも年間約10万人の新規発症があると推定され、なお増加傾向にある。外科的手術が唯一の根治的治療法であり、小径大動脈瘤に対する効果的な治療法も無い現状を打開するためには、病態の解明と革新的な治療法の開発が急務である。また、より低侵襲の血管内治療でも、ステントグラフトの長期成績改善、適応拡大のために薬物との複合療法の開発が求められている。大動脈瘤病態は統合的な遺伝子発現調節による組織破壊であり、その制御により大動脈瘤の退縮治癒が可能である。本研究は、マイクロRNA(miRNA)が遺伝子発現を統合的に調節し、大動脈瘤病態を形成するとの仮説に基づき、治療標的となり得るmiRNAの同定を目的とした。野生型、JNK1ノックアウトおよびJNK2ノックアウトマウス由来の大動脈平滑筋細胞をTNFαで刺激、または野生型マウス由来の大動脈平滑筋をJNK阻害薬(SP600125)の存在下でTNFα刺激することにより、JNK依存性に制御されるmiRNA群の同定を試みた。miRNAを網羅的に解析するために、miRNAアレイ(LC Science社)を用いて解析を行ない、JNK依存性に発現が制御されるmiRNA群を同定した。さらにJNK1、JNK2特異的に制御されるmiRNA群も同定した。その結果、炎症、組織修復に関わる多くの遺伝子がmiRNAで制御されている可能性が示された。生体内でmiRNAの発現または機能を制御するためには、効率が良く部位(大動脈瘤)特異的な核酸導入システムの開発が必要と考えられる。本研究の成果を生かすため、今後は、部位特異的核酸導入システムの開発を進める予定である。本研究は、マイクロRNA(miRNA)が遺伝子発現を統合的に調節し、大動脈瘤病態を形成するとの仮説に基づき、治療標的となり得るmiRNAの同定を目的としている。今後、バイオインフォマティクス手法により、各miRNAの機能推定と検証を進める予定である。
日本古代国家・社会における書儀の受容に関する基礎的研究

本研究の目的は、100点以上現存する中国敦煌・トルファン文献書儀の分類整理を行い、精度の高い校訂本文を作成し、その上で日本古代国家・社会における書儀の受容の実態を明らかにすることである。文字を持たなかった日本の古代社会は、表現媒体として中国の文字である漢字を摂取し、漢字を使って自らの思考や感情を表記するようになったが、その際、実用的な一種の百科全書である中国の書儀は、従来考えられていた以上に積極的に活用されたと推測される。16年度に中国武漢で開催された国際学会で、台湾故宮博物院所蔵の「唐人月儀帖」と敦煌文献朋友書儀との関係を明らかにし、17年度には、これに加えてかつて私が学界に紹介した日本個人蔵の朋友書儀写本とあわせ、朋友書儀に関して、高い精度の校訂本文を作成した。またロシア所蔵の敦煌文献に最古の書儀である「索靖月儀帖」断簡があることを見出した。その上で日本古代社会における書儀の受容の具体的な様相を、正倉院文書などの検討を通じて明らかにした。(以上、「研究成果報告書」所収)いわゆる吉凶書儀については、これまで本格的な検討がなされてこなかったロシア所蔵の敦煌文献について、写真版からのピックアップを行った。ただほとんどが断片であり、一覧表作成をするにとどまっている。また科学研究費基盤研究(B)(課題番号17320096)「在ベルリン・トルファン文書の比較史的分析による古代アジア律令制の研究」(研究代表者:小口雅史法政大学教授)の共同研究者として17年10月にベルリン国立図書館所蔵のトルファン文書を調査した際、書儀の類も実見・調査した。朋友書儀・月儀の検討から、日本における初期の往来物についての検討が必要になったと認識した。往来物の中でもとくに「十二月往来」に分類される「古往来」と月儀との関連についての比較研究に今後は取り組むつもりである。本研究課題は「平成15年度科学研究費補助金の交付の内定について」で不採択となり、年度の3分の2を過ぎた11月に入って追加採択されたものである。したがって、研究実績として公表するに足るだけの成果は出せていないのが現状である。しかしながら、来年度以降の本格的な研究に備えての準備段階として、研究環境の整備などを積極的に行うことができた。まず中国の研究者による敦煌写本書儀研究について、その現状と課題とを整理した。敦煌写本書儀については、すでに多くの写本が校訂されて翻刻出版されており、新しい撮影技術による写真版の出版も継続的に行われ、IDP(INTERNATIONAL DUNHUANG PROJECT)により、英国所蔵の敦煌文献はインターネットでその鮮明な写真が公開されるにいたっている。こうしたなか、いくつかの主要な書儀文献を選んで、より精度の高い校訂を施し、その上で書儀そのものの分析を行う必要があることを再認識した。設備備品費によって、これまで十分な考察がなされていなかったロシアに所蔵されている敦煌文献の写真版(『俄蔵敦煌吐魯番文献集成』)を購入するとともに、研究補助者の協力によって、活字化された敦煌事儀と写真版とを蒐集・整理し、誤植や校訂の誤りなどのチェックを始めたところである。また九州大学の坂上康俊氏を代表とする科学研究費基盤研究(B)

「中国法制文献の日本への伝来とその伝存状況に関する基礎的研究」の研究分担者として、中国の宋代法制史研究者戴建国氏を招いての研究会において、仮寧令に関する報告を行ったが、これは書儀に引用された法制史料の分析の成果であり、この研究会に来年度は中国の書儀研究の第一人者である趙和平氏を招待するよう計画中である。日本古代の文献資料の中から、書儀の影響を拾い集める作業については、今年度は時間不足でできなかったが、研究補助者の協力により、来年度行いたいと思っている。今年度における最も大きな成果は、9月2日から5日に中国武漢大学において開催された「中国三至九世紀歴史発展与唐宋社会変遷国際学術研討会」に参加し、「唐代書儀文化対日本的影響」のタイトルで研究報告したことである。本報告は、日本古代における書儀受容の具体像を敦煌写本書儀と日本の正倉院伝存の書儀との比較を中心に述べたものであるが、あわせて台湾故宮博物院所蔵の「唐人月儀帖」と敦煌写本の朋友書儀との関係を明らかにしたことが成果としてあげられる。招聘を受けての学会参加であったが、「大会主題発言」として、全体会において発表し、中国における書儀研究の第一人者である呉麗娯氏(中国社会科学院)から好意的な評論を得ることができた。またこの学会においては、同じく大会主題発言において、広州博物院の程存浩氏による研究報告の評論人に指名され、これを行った。学会の期間中、中国・韓国及び台湾の研究者との友好を深めることができたことも収穫であった。今年度は上記国際学会での発表と関連して、朋友書儀を中心に検討を加えた。ほぼ全ての朋友書儀の写真コピーを入手することができたので、かつて私が学会に紹介した日本の個人蔵の敦煌写本朋友書儀、及び台湾故宮博物院の「唐人月儀帖」と合わせ、精度の高い校訂本文を作成することが可能となった。いわゆる吉凶書儀については、朋友書儀と密接に関わる部分のみを検討するにとどまった。なお当初予定していた日本古代の法制史料や外交文書・書状などの文献資料から書儀の影響を拾い集める作業が遅れているが、今年度の朋友書儀に関する研究成果を得て、むしろ日本における初期の往来物についての考察を優先するべきではないかと、若干の研究計画の見直しを考えている。本研究の目的は、100点以上現存する中国敦煌・トルファン写本書儀の分類整理を行い、精度の高い校訂本文を作成し、その上で日本古代国家・社会における書儀の受容の実態を明らかにすることである。文字を持たなかった日本の古代社会は、表現媒体として中国の文字である漢字を摂取し、漢字を使って自らの思考や感情を表記するようになったが、その際、実用的な一種の百科全書である中国の書儀は、従来考えられていた以上に積極的に活用されたと推測される。近年中国のすぐれた研究者たちによって、唐代書儀の全容が明らかになりつつあるが、まだ不備も多い。本研究において唐代の代表的書儀の校訂本文作成を目指したのは、そうした現状が背景にある。一昨年度中国武漢で開催された国際学会で、台湾故宮博物院所蔵の「唐人月儀帖」と敦煌写本朋友書儀との関係を明らかにしたが、本年度は、これに加えてかつて私が学界に紹介した日本個人蔵の朋友書儀写本とあわせ、朋友書儀に関して、校訂本文を作成したことが成果である。いわゆる吉凶書儀については、ロシア所蔵の敦煌文献写真版から新たに何点かのピックアップを行い、また科学研究費基盤研究(B)(課題番号17320096)