hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
液相における固有構造クラスターの発達と結晶胚生成

液体は、一般に、均一、等方的な分子凝集状態と考えられており、過冷却状におけるガラス転移温度はすべての分子が動かなくなる温度とみなされている。我は、過冷却状態ではむしろ、"液体は秩序構造クラスターの凝集体であり、系の性質はクラスターの大きさ、クラスター内分子配置の秩序度などにより支配される"と考える立場から、研究を進めた。1)ジブチルフタレートの不可逆的緩和過程を温度一定条件下で追跡し、緩和関数の非線形性が平衡の平均緩和時間の非アレニウス性(フラジル性)に原因することを見出した。また、クラスター分布を考慮した緩和の計算機実験を行い、クラスター分布の形は時間とともに大きく変化するという"不可逆過程の特性"を示唆する結果を得た。2)1,3-ジフェニル-1,1,3,3-テトラメチルジシロキサンの液体と結晶のガラス転移は比較的近い温度で出現することが確認された。これは、液体における分子再配置運動の活性化単位が結晶におけるそれに近いことを意味し、液体における活性化単位を考察するうえに重要な知見を与えるものである。3)3,3′-ジメトキシ-4,4′-ビス(2,2′-ジフェニルビニル)ビフェニルの過冷却状態における結晶核生成温度領域をDSCにより検討し、核生成がガラス転移温度345Kより175K低い170Kでも進行することを発見した。これは、ガラス転移温度で凍結する分子再配置運動はクラスター内の分子であり、クラスター外の分子の運動が核(一種のクラスター)の生成を促進することを示している。4)トリフェニルエチレンの過冷却状態において、結晶胚凝集に基づく、新しい結晶化過程を発見した。結晶胚は液体中の構造クラスターとして常に存在しているものと考えられ、その解明を促すものである。
日本脳炎ウイルスとウエストナイルウイルスの血清学的鑑別法に関する研究

本研究課題ではウエストナイルウイルス(WNV)感染症の日本への侵入に備えて、フラビウイルスの同一血清型群に属する日本脳炎ウイルス(JEV)とWNV感染症との鑑別診断法を開発するための基礎的研究を行ってきた。平成17年度、WNVとJEVの各中空粒子(SvPs)を抗原として、ELISAやIFA、ウエスタンブロッティング法等の実験室内鑑別診断法を確立した。SvPsは粒子内にウイルス由来の遺伝子を含まないため、安全に取り扱えるため汎用性があるものと考えられた。平成18年度は、フラビウイルス属の感染鑑別に最も有効であるとされるウイルス中和試験について検討した。古典的な中和試験では生ウイルスを使用するため、WNV等の病原体レベル3の病原体の検査はバイオセーフティーレベル3実験室で行わなければならない。また、感染事故が起こる危険性もあるため、より安全なWNVの検査法の開発が求められている。そこで、生ウイルスの代替としてウイルス様粒子(VLP)のウイルス中和試験への使用可能性について検討することを目的に、各種レポーター蛋白質を発現するVLPを作製した。VLPはウイルス構造蛋白質のコーディング領域を欠いたRNA(レプリコン)を内包するウイルス様粒子構造体である。レプリコンとウイルス構造蛋白質を細胞に共発現することにより、培養上清中にVLPが産生される。本研究では蛍光色素や分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子をレプリコンに導入し、これらのレポーター蛋白質が発現するVLPを作製した。また、粒子の殻がWNV(VLP-WNV)あるいはJEV(VLP-JEV)の構造蛋白質で構成されるVLPの作製に成功した。現在、VLP-WNVおよびVLP-JEVを用いて、通常のBSL2実験室で実施可能な中和試験法の開発を行っている。近年、ウエストナイルウイルス(WNV)の日本への侵入が危惧されており、ウイルス検査法と予防・治療法の早期開発が期待されている。しかし、日本ではWNVに近縁の日本脳炎ウイルス(JEV)が存在しており、両者の血清疫学や診断において両ウイルスに対する抗体の交差反応が問題となっている。そこで本課題研究では、ウイルスのゲノムRNAを含まないがウイルスの膜蛋白質であるprMとE蛋白質を含む膜蛋白質で構成される中空粒子(SvPs)を用いた両ウイルス感染の鑑別検査法(抗体検出法)の開発を目的としている。本年度は、(1)WNVとJEVのSvPsの作製と、(2)SvPsを利用したWNVとJEV感染の鑑別法の開発を行った。(1)フラビウイルスのゲノムは一本のプラス鎖RNAであり、5'端より構造蛋白質のC、prM、E蛋白質がコードされている。更に、その下流にウイルスRNAの転写等に必要な非構造蛋白質がコードされている。SvPsは、C蛋白質のカルボキシル(C)-末端を含むprMとE遺伝子を細胞に発現させることにより培養上清中に放出される。WNVのNY株、Eg101株およびJEVのJaGAorO1株、Beijin株の当該遺伝子を哺乳動物細胞に発現させ、それぞれのSvPsを得た。SvPsを疎精製あるいは密度勾配遠心法により精製したものを、WNVとJEV感染の鑑別法の開発に使用した。(2)各SvPsを抗原として、WNVあるいはJEV感染マウス血清に含まれる各ウイルスに対する抗体の鑑別検査を行った。免疫蛍光抗体法では交差反応が認められた。ELISA法では交差反応は認められたが、両者の鑑別は可能であった。また、ウエスタンブロツト法では検討した検査法の中で最も効果的に両者を鑑別することができた。

本研究課題ではウエストナイルウイルス(WNV)感染症の日本への侵入に備えて、フラビウイルスの同一血清型群に属する日本脳炎ウイルス(JEV)とWNV感染症との鑑別診断法を開発するための基礎的研究を行った。前年度、WNVとJEVの各中空粒子を抗原としたELISAやIFA、ウエスタンブロッティング法等の実験室内診断法により、各ウイルス感染マウス血清を鑑別出来ることを示した。本年度は、フラビウイルス属の感染鑑別に最も有効であるとされるウイルス中和試験について検討した。WNVあるいはJEVを感染させたヒヨコ血清を用いて生ウイルスを用いた中和試験を行った。その結果、各ウイルス感染ヒヨコ血清は各ウイルスを特異的に中和した。古典的な中和試験では生ウイルスを使用するため、WNV等の病原体レベル3の病原体の検査はバイオセーフティーレベル(BSL)3実験室で行わなければならない。また、感染事故が起こる危険性もあるため、より安全なWNVの検査法の開発が求められている。そこで、生ウイルスの代替としてウイルス様粒子(VLP)のウイルス中和試験への使用可能性について検討することを目的に、各種レポーター蛋白質を発現するVLPの作製を試みた。VLPはウイルス構造蛋白質のコーディング領域を欠くRNA(レプリコン)を内包するウイルス様の粒子構造体である。レプリコンとウイルス構造蛋白質を細胞に共発現することにより、培養上清中にVLPが産生される。今回は蛍光色素や分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子をレプリコンに導入し、これらのレポーター蛋白質が発現するVLPを作製した。また、粒子の殻がWNV(VLP-WNV)あるいはJEV(VLP-JEV)の構造蛋白質で構成されるVLPの作製に成功した。現在、VLP-WNVおよびVLP-JEVを用いて、通常のBSL2実験室で実施可能な中和試験法の開発を行っている。
多周波ESRを用いた希薄金属め電子構造と磁気特性に関する研究

本研究の目的は1「今まで不可能であった整数電子スピンが観測可能な高感度多周波ESR(300GHz)装置の開発」、2「1を用いたサイレントスピンをもつ金属タンパク質の電子状態と機能相関」、3「1を用いた左手系物質(LHM)候補の透磁率評価と材料開発へのフィードバック」である。1.定在波の影響が大きく開発中の170、250GHzのシステムはまだ実用レベルに達していない。しかし50GHzの低周波で定在波を減じるフィルターを開発済みであり、170,250GHz用を作成し組み込む予定である。また、より小さな信号を検出するためには背景信号が問題である事が分かり、対処法を考慮中である。このためデオキシヘモグロビンの130GHz以上のESRは測定できなかった。2.昨年、世界初の整数スピン金属タンパク質の多周波ESRに成功したMn^<3+>置換ミオグロビンの精密解析(パウダー、単結晶)を行いヘム周辺の配位構造との相関を議論した。また整数スピンの解析に使われてきた低磁場のパラレルモードESRは異方性の大きさを約10倍も過大評価してしまう事が分かった。これは過去の報告が信用できず、本研究で開発した強磁場多周波ESRの信頼性の高さを示唆する。原因は低磁場測定のため、高次(4次)の異方性項が無視できないためと分かつた。本研究で研究協力者の学生である堀谷正樹氏が阪大のドクターを授与された。3.本装置で、磁気共鳴を用いたLHM候補である数種類(体積充填率数十%)の強磁性Niナノグラニュラー薄膜の透磁率の虚部、実部測定を広い温度範囲1.4300Kで行った。その結果、何れの温度域でもナノ粒子間の双極子相互作用の分布が広く特に低温では磁気共鳴信号がブロードであった。つまり透磁率の絶対値変化が小さく、LHMに必要な負の透磁率を実現するには相互作用の分布が狭く鋭い磁気共鳴信号を得る必要がある。この指針の基、研究協力者側で新しい材料を合成している。本研究の目的は(1)高感度多周波ESR(300GHz)装置の開発、(2)(1)を用いたサイレントスピンをもつ金属タンパク質の電子状態と機能相関、(3)(1)を用いた左手系候補物質(LHM)の透磁率評価と材料開発へのフィードバックである。以下に本年度の成果を示す。(1)に関し飛躍的な進展があった。すなわち偏光を利用した共振器のマッチング機構を開発し35,50,70,95,130GHzにおいて目標の感度を実現した。このマッチング機構の実現により十数テスラにおよぶ広い磁場掃引下でも非常に安定な測定が可能になった。これは、線幅の狭い標準試料に基づく感度指標に現れないが金属タンパク質試料にありがちな非常にブロードな信号も高感度かつ精密に測定できる事を意味する。また磁場変調(1mT)を用いない方式を採用し、1Tを超える線幅を持つ系では世界最高の感度を実現した。この機構は偏光を用いており周波数上限がなくより高周波への応用もできる。現在170GHz、250GHzの開発を進めている。(2)還元型ヘム鉄と同じS=2をもつMn^<3+>置換ミオグロビンの測定を行った。(1)のシステムを用い33122GHzの5つの周波数で最大線幅約8Tにも及ぶ多周波ESRの観測に成功した。これは世界初の整数スピン金属タンパク質の多周波ESRである。解析を行った結果、市販ESRでは不可能なシングルイオン異方性D=-3.77cm^<-1>E=0.077cm^<-1>が精密に決定できた。このD値はモデル錯体類(2.5cm^<-1>)に比べかなり大きく金属タンパク質中の特異な電子構造を示唆している。デオキシヘモグロビンの測定も行いシグナルは観測できたが、35-130GHz(磁場0-14T)の測定ではスペクトル構造が背景に対して不明瞭で解析は困難である。130GHzで変化の兆しが見えており、170,250GHzの測定により解決されると考える。(3)透磁率実部の評価のためESR吸収と同時に共振周波数も精密(10^<-10>)に測定できるシステムを開発した。薄膜試料は準備できており来年度はこのシステムを用いて組成と透磁率の相関を明らかにし、LHM材料開発へ指針を与える。2.昨年、世界初の整数スピン金属タンパク質の多周波ESRに成功したMn^<3+>置換

ミオグロビンの精密解析(パウダー、単結晶)を行いヘム周辺の配位構造との相関を議論した。また整数スピンの解析に使われてきた低磁場のパラレルモードESRは異方性の大きさを約10倍も過大評価してしまう事が分かった。これは過去の報告が信用できず、本研究で開発した強磁場多周波ESRの信頼性の高さを示唆する。原因は低磁場測定のため、高次(4次)の異方性項が無視できないためと分かつた。本研究で研究協力者の学生である堀谷正樹氏が阪大のドクターを授与された。3.本装置で、磁気共鳴を用いたLHM候補である数種類(体積充填率数十%)の強磁性Niナノグラニュラー薄膜の透磁率の虚部、実部測定を広い温度範囲1.4300Kで行った。その結果、何れの温度域でもナノ粒子間の双極子相互作用の分布が広く特に低温では磁気共鳴信号がブロードであった。つまり透磁率の絶対値変化が小さく、LHMに必要な負の透磁率を実現するには相互作用の分布が狭く鋭い磁気共鳴信号を得る必要がある。この指針の基、研究協力者側で新しい材料を合成している。
乳化液膜分離プロセスの実用化研究

1.平成4年度の第1回打ち合わせ検討会において研究実施計画の確認を行った。また,前年度に組み立てたミニプラントを用い,カラム操作によるフェノールの回収・除去実験を共同操作のもとに3日間にわたって実施した。連続運転に対する内水相や液膜相の構成ならびに操作条件の検討を行い,実用操作上の問題点を抽出し、乳化,透過・濃縮,相分離,解乳化の各ステップの今後の検討課題を明確にした。2.第2回の打ち合わせ検討会では,各ステップに関する研究成果が報告された後,ミキサー・セトラー操作によるフェノール回収の合同実験を2日間にわたり行った。カラム操作と同様,本操作においても良好なフェノール除去が可能であることが示された。3.各ステップに対する研究成果ならびにカラムおよびミキサー・セトラーによる連続運転の結果,内水相にNaOH水溶液,液膜相の界面活性剤にポリアミン,溶剤にシェルゾル71を用いたエマルションを使用し、緩速攪拌を付与した交流高電圧解乳化装置の採用により,フェノールを効率的に回収・除去するための実用的な乳化液膜プロセスを構築することができた。4.銅の濃縮・回収に関しても、各担当分野の研究成果,カラム操作による共同実験ならびに連続運転を行った結果,液膜相としては,担本にLIX860,界面活性剤にジオレイルグルタミン酸エステル誘導体とジオレイルリン酸の混合系の使用が有効であることが示された。また,エマルションの解乳化には問題がなく,連続操作は容易に行えるが,銅の濃縮率を上げるためには原料相のPhのコントロールが重要であることを明らかにした。1.研究打ち合せの第1回の会合において、平成3年度の研究実施計画の確認を行った。また、乳化液膜分離プロセスの乳化ステップ、透過・濃縮ステップ、相分離ステップ、解乳化ステップに関して、各ステップ担当者から報告された既往の研究成果の検討結果に基づき、残された問題点の抽出ならびにその解決策について意見交換を行った。さらに、実運転の際の分離対象物質およびシステムの講成ならびにプロセスの規模等について意見交換を行い、分離対象物質としてフェノ-ルおよび金属特に銅を選定した。2.乳化型液膜によるフェノ-ルの回収・除去プロセスの構築を目的として、ミキサ-・セトラ-操作あるいはカラム操作を行った場合の操作条件とフェノ-ルの除去率などの関係を解析した結果、および界面活性剤の選定、相分離、連続解乳化操作等について検討した結果が各ステップ担当者から報告された。それらの結果を基にして総括的な検討を行い、1001000ppmのフェノ-ル含有水溶液を110l/hの速度で処理するプロセスの規模を設定し、各担当者が乳化装置、ミキサ-・セトラ-装置、カラム装置、解乳化装置を製作した。さらに、それらの装置を用い、各ステップに対するテストを重ね、界面活性剤としてはジオレイルグルタミン酸エステル誘導体が適当であること、溶剤にはケロシンあるいはシェルゾ-ルを使用すればよいこと、排水基準値までフェノ-ルの除去が可能であることなどが明らかとなった。3.各ステップで製作された装置を持ち寄り、カラムおよびミキサ-・セトラ-をそれぞれ用いた場合のプロセス全体の組み立てを行い、ミニプラントの設営を完了した。また、それらのテスト運転を実施した。4.次年度は、まず、これらのプロセスを用い、フェノ-ルおよび銅の分離を対象として、プロセスの連続運転を長期にわたって実施する。
TBX5による転写制御の新展開

心臓は、遺伝子の働きによって初期発生がコントロールされ、拍動する心臓が形成される(genetic program)。しかし、一旦拍動する心臓が形成されると、拍動、血流がその後の心臓発生に大きく影響すると考えられている(epigenetic program)。これは、遺伝子が形態や機能を作り出す順経路とは逆に、機能(拍動や心拍)に起因する力刺激が遺伝子発現を変えて心臓発生を調節する逆経路が存在することを意味している。この双方向の調節関係が成り立つことで、心臓をはじめとするさまざまな器官形態の合目的的性、恒常性が維持されると考えられる。本研究は、力刺激と遺伝子発現を結びつける分子実体を明らかにすることで、いまだ未解決のシグナル伝達経路の一端を解明することを目的とする。Tbx5とMKL2単独ではANFプロモーターを10倍程度しか活性化できないが、これにMKL2を共導入すると200-300倍の強力な転写活性化が認められる。これに、non-canonical Wntシグナル経路で働くForminドメイン蛋白Daam1の活性化変異体C-Daam1を加えると、転写は1000倍程度まで増強する。この増強効果は、活性化型のRhoAを共導入しても得られる。このことは、Tbx5の機能が、non-canonical Wnt経路下、その他のシグナルによるRhoA活性化によるアクチン骨格のリモデリングに敏感に反応することを意味している。このメカニズムを詳細に解明する目的で、ANF promterの配列を分析した結果、未知のモチーフが見つかり、Tbx5/MKL2の協調的な働きを増強していることがわかった。また、心拍に依存して機能する因子の同定を行ない、miR-21、miR-143を見出した。これらは心拍を止めると発現が消え、再開させると回復する。こノメカニズム解明の目的で、それぞれのpromoter領域の同定を行ない、miR-21において成功した。miR-21promoterには、AP-1、b-catenin、NFAT、STAT、SRFの結合部位が保存されて残っており、その中でもMAPキナーゼ/AP-1、SRF、b-cateninが協調的な作用をすること、未知のモチーフが重要であることを見出し、心拍依存的な発現を調節する分子機構の一端を明らかにした。Tbx5、MKL2単独ではANFプロモーターを10倍程度しか活性化できないが、両者を共導入すると200300倍の強力な転写活性化が認められる。このメカニズムを詳細に解明する目的で、ANF promoterの配列を分析した結果、未知のモチーフが見つかり、Tbx5/MKL2の協調的な働きを増強していることがわかった。また、MKL2は成体の心臓においても物理的刺激によって核内に移行して力学刺激を細胞内に伝達する機能をもつことがわかった。また、心拍に依存して機能する因子の同定を行ない、複数遺伝子を見出した。この心拍依存性メカニズム解明の目的で、それぞれのpromoter領域の同定を行なった。そして、AP-1、b-catenin、NFAT、STAT、SRFの結合部位を責任モチーフとして同定した。また、このような力刺激反応性promoterは生体内でも機能していることを確認した。これによって力の可視化にいたる糸口をつかむことができた。Tbx5はMKL2によって強力に活性化され、標的であるAnf遺伝子の転写を強く誘導する。しかしながら、MKL2は非刺激状態では細胞質にある。MKL2が細胞質から核内に移行してTbx5を活性化する刺激として、細胞/組織への力学刺激を同定した。MKL2はゼブラフィッシュにおいて、心筋細胞では心拍依存的に核内に移行する。また、マウスでは大動脈結紮による左心室圧負荷によっても核移行を示す。また、培養細胞では、伸展刺激によって核移行を起こすことができる。このことから、Tbx5の転写因子としての活性は、細胞/組織への力刺激が重要であり、また胎仔/成体心臓においては心拍、血圧などの力学的要因が関与していることがわかった。MKL2は、Tbx5以外にもSRFも活性化することが既に報告されている。このことは、力刺激依存的な発現を示す遺伝子が、Anf以外にも存在することを示唆している。

この可能性を確かめるため、力依存的な発現を示す遺伝子を探索し、複数同定した。とくに、miR-143、miR-21はゼブラフィッシュの心臓において、それぞれ大動脈管、房室弁に限局して発現するが、両者とも心拍/血流を止めると発現が消失し、再開させると速やかに発現が回復することがわかった。miR-143、miR-21のプロモーター/エンハンサー部位にはSRF結合部位が存在し、MKL2と強調して発現誘導することも確かめた。また、このようなプロモーター/エンハンサーを用いて力刺激に対する遺伝子発現を可視化することも可能となった。以上、Tbx5を糸口に、力刺激に対する反応の一端をMKL2をモデルとして明らかにした。
メラノコルチンシステムの赤血球造血および骨髄形成機構におけるin vivo解析

ヒト臍帯血由来造血幹細胞から誘導された赤芽球はメラノコルチン受容体(MCR)を発現しており、各分化段階において副腎皮質刺激ホルモンの刺激を受けて増殖、分化、脱核が調節される。しかしながら、in vitro系でみとめられるMCRを介した副腎皮質刺激ホルモンの作用が生体においても生理的に機能するかについては不明である。そこで、メラノコルチンシステムを介する赤血球造血機構についてMCRノックアウトマウスを用いたin vivo実験系において検証するとともに、各種幹細胞からの成熟赤血球の誘導や造血器官形成の分子基盤の解明に向けた検討をおこなう。ヒト臍帯血由来幹細胞から誘導した赤芽球には副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)およびその誘導体の受容体であるメラノコルチンレセプター(MCR)が発現しており、赤芽球の各分化段階においてACTHの刺激を受けて下流のシグナルを調節することが所属研究室の研究により明らかにされている(Simamura et al., 2015)。ヒト臍帯血由来造血幹細胞を用いたin vitro実験系で見出された赤芽球成熟分化におけるACTHの作用が生体においても生理的に機能しているかについて明らかにすることを目的として、ノックアウトマウスを用いたin vivo系での解析をおこなった。本年度は脱核を伴う赤芽球の最終分化に重要なMC5Rについて解析をおこなった。MC5Rノックアウトマウスの末梢血において未脱核の赤芽球はみとめられなかった。赤血球の形態についても併せて解析したが、野生型マウスと比較して大きな変化はみられなかった。以上のように、末梢血についてはMC5Rノックアウトの影響が表れないと考えられた。この結果を受け、次年度ではMC5Rノックアウトマウスの造血組織について組織学的な解析をおこなうとともに、MC5Rの下流のシグナルについて解析する。さらに、in vitro実験系でMC5Rよりも前段階に発現するMC1RおよびMC2Rが、in vivo実験系においてはMC5Rのノックアウトの影響を保障した可能性を考慮に入れて、MC2Rノックアウトマウスの解析をおこなう必要がある。本年度は所属研究室が保有するMC5Rノックアウトマウスの末梢血について解析をおこなった。当初、MC5Rノックアウトマウスの末梢血に未脱核の赤芽球が出現することが予想されたが、予想に反し、脱核率は正常であった。併せて赤血球の形態について併せて比較したが、MC5Rノックアウトマウス末梢血の赤血球はほぼ正常な形態であり、野生型マウスと比較して大きな変化はみられなかった。現在、in vitro実験系で見出されたMC5Rの赤血球造血への影響をin vivo系で見いだせておらず、その差が生じたメカニズムについても明らかにできていないため、達成度は「やや遅れている」と判断した。造血組織における赤血球造血に関するメラノコルチンシステムの役割について検証するため、野生型およびMC5Rノックアウトマウスから造血器官を採取し、組織学的に比較解析をおこなう。赤血球造血は胎生期には発生段階に応じて卵黄嚢、肝臓、脾臓および骨髄において、出生後は骨髄においておこなわれる。また、出血等により赤血球が過剰に失われた際は出生後においても脾臓や肝臓において髄外造血が起こることが知られている。さらに、近年、胎盤においても造血幹細胞の存在が明らかにされつつある。このため、成獣については骨髄、肝臓および脾臓を、胎生期においては肝臓、脾臓およびその原基に加えて、胎盤について解析をおこなう。得られた結果を基にして、MC5Rの下流のシグナルについて免疫組織化学的および分子生物学的解析をおこなう。さらに、赤芽球分化においてMC5Rより先に発現するMC2Rのノックアウトマウスについての解析をおこない、結果を公表する予定である。

この結果を受け、次年度ではMC5Rノックアウトマウスの造血組織について組織学的な解析をおこなうとともに、MC5Rの下流のシグナルについて解析する。さらに、in vitro実験系でMC5Rよりも前段階に発現するMC1RおよびMC2Rが、in vivo実験系においてはMC5Rのノックアウトの影響を保障した可能性を考慮に入れて、MC2Rノックアウトマウスの解析をおこなう必要がある。本年度は所属研究室が保有するMC5Rノックアウトマウスの末梢血について解析をおこなった。当初、MC5Rノックアウトマウスの末梢血に未脱核の赤芽球が出現することが予想されたが、予想に反し、脱核率は正常であった。併せて赤血球の形態について併せて比較したが、MC5Rノックアウトマウス末梢血の赤血球はほぼ正常な形態であり、野生型マウスと比較して大きな変化はみられなかった。現在、in vitro実験系で見出されたMC5Rの赤血球造血への影響をin vivo系で見いだせておらず、その差が生じたメカニズムについても明らかにできていないため、達成度は「やや遅れている」と判断した。造血組織における赤血球造血に関するメラノコルチンシステムの役割について検証するため、野生型およびMC5Rノックアウトマウスから造血器官を採取し、組織学的に比較解析をおこなう。赤血球造血は胎生期には発生段階に応じて卵黄嚢、肝臓、脾臓および骨髄において、出生後は骨髄においておこなわれる。また、出血等により赤血球が過剰に失われた際は出生後においても脾臓や肝臓において髄外造血が起こることが知られている。さらに、近年、胎盤においても造血幹細胞の存在が明らかにされつつある。このため、成獣については骨髄、肝臓および脾臓を、胎生期においては肝臓、脾臓およびその原基に加えて、胎盤について解析をおこなう。得られた結果を基にして、MC5Rの下流のシグナルについて免疫組織化学的および分子生物学的解析をおこなう。さらに、赤芽球分化においてMC5Rより先に発現するMC2Rのノックアウトマウスについての解析をおこない、結果を公表する予定である。
心筋症ハムスターの症状進展に伴う心筋コラーゲン代謝の変化-遺伝子レベルからのアプローチ-

(1)本年度は病的心のモデルである高血圧自然発症ラット(SHR)を用い、小動物の心臓の少量の検体より正確に総コラーゲン量を測定する方法の確実を行った。コラーゲンの定量にはコラーゲンに特異的なアミノ酸であるハイドロキシプロリンを定量する方法を用いた。コラーゲンは通常約13.4%のハイドロキシプロリンを含量するため、ハイドロキシプロリン含量に7.46をかけることによりコラーゲン含量をmg単位で算出した。湿重量100mg程度の心筋を用いることにより総コラーゲン量を正確に測定できた。(2)高血圧自然発症ラット(SHR)の心筋組織を用い、画像解析によりコラーゲン容積率を現在算出中である。今後、生化学的手法で求めた総コラーゲン量と画像解析により求めたコラーゲン容積率の関係等を検討していく。(3)病的心のコラーゲン含量が時間経過とともに如何なる変化を示すかを生化学的手法を用いて検討した。高血圧自然発症ラット(SHR)および対照のWKYラットを用いて20週齢、30週齢のコラーゲン含量の変化を測定した。その結果、20週齢のSHRでは心筋コラーゲン含量が同週齢のWKYラットに比して有意に低値を示した。一方、SHRの心筋コラーゲン含量は30週齢で有意に増加したが、WKYラットの心筋コラーゲン含量は有意な変化を示さなかった。30週齢のSHRで認められた心筋コラーゲン含量の増加は左心室に認められる機能低下をよく反映していた。病的心の心不全発症機序を考える上で重要な所見と考えられる(投稿準備中)。
コンピテンシー志向の授業づくりに関する日独比較国際研究

本研究の目的は、ライプツィヒ大学一般教授学研究室Maria Hallitzky教授との日独比較国際共同研究を実施することによって、コンピテンシー志向の授業づくりの意義と課題を明らかにすることである。2018年度には事前に打ち合わせ等を密に行った上で、2019年2月20日にライプツィヒに渡航し、共同研究に着手した。ライプツィヒ大学一般教授学研究室では、ビデオ記録に基づく授業研究および授業研究を軸とした教師教育に着手している。本研究では、ライプツィヒ大学一般教授学研究室とのコンピテンシー志向の授業づくりに関わる授業分析の共同実施や、学会発表に向けた研究交流、さらに教師教育に関わる研究交流を行っている。ライプツィヒだけではなく、ドイツ語圏内における学校へのフィールドワーク調査も継続的に実施している。ビーレフェルト近郊の小中学校では、子どものコンピテンシー獲得を明示化するための自己評価シートおよびポートフォリオを導入している学校への調査を行った。同校を含め、継続的にフィールドワークを重ねることで、一過的ではない教育実践の側面と教師教育との関係に踏み込んだ検討を行う。2018年度はライプツィヒに渡航して共同研究に着手したばかりであるが、2019年度に入ってライプツィヒ大学における教員養成および教師教育にもフィールド調査を拡大することができている。コンピテンシー志向の授業づくりのフィールドワーク、コンピテンシー志向の授業づくりのための教員養成および教師教育へのフィールド調査を継続し、研究成果の公開につとめる予定である。ライプツィヒ大学での共同研究の開始状況およびその推移は順調である。研究環境も整っており、Hallitzky教授および一般教授学研究室との共同研究に引き続き着手する。今後の研究の推進については、以下の三点に重点的に取り組む。第一に、コンピテンシー志向の授業に関わるフィールドワークと授業分析である。ライプツィヒをはじめとした学校へのフィールドワークを実施するとともに、すでに入手している日独の授業記録を共同で分析する作業に着手する。第二に、コンピテンシー志向の授業づくりを支える教師教育への着手である。ライプツィヒ大学における教員養成およびザクセン州・ライプツィヒにおける教師教育の取組に関与しながら、教師教育のフィールドへの調査および教員研修の共同開発などに着手する。第三に、学会発表および論文執筆による研究成果の公開である。世界授業研究学会(WALS)をはじめとした国際学会での共同研究発表や、英語およびドイツ語による論文の執筆に着手し、論文の投稿や著書の執筆・編集に着手する。内定年度:2017本研究の目的は、ライプツィヒ大学一般教授学研究室Maria Hallitzky教授との日独比較国際共同研究を実施することによって、コンピテンシー志向の授業づくりの意義と課題を明らかにすることである。
神経免疫疾患におけるバリア破綻機序の解明：中枢，末梢神経のバリア機能の違いは何か

血液脳関門(BBB)と血液神経関門(BNB)は共に神経系のバリアとして各々の内部環境を維持している.BBBとBNBの相違点を明らかにすることで,免疫性神経疾患の分子レベルでの病態解明が期待できる.本研究は当教室で確立したBBB構成内皮細胞株(TY10)とBNB構成内皮細胞株(FH-BNB)の遺伝子をDNAマイクロアレイを用いて比較した.その結果,hedgehog signaling pathwayに関わる遺伝子の発現が両者で異なっていた.蛋白レベルでの解析を行ったところ,特にdesert hedgehogが,BBBとBNBのバリア機能の違いに関与していることが明らかになった.平成27年度はdesert hedgehogがBBBとBNBのバリア機能に影響を及ぼすかどうかを検討した.実験の結果,desert hedgehogがヒトBNB構成内皮細胞のバリア機能を上昇させ,claudin-5の蛋白量を増加させることが明らかになった.しかし,その詳細なメカニズムや免疫性神経疾患への関与は明らかになっておらず,研究は予定より遅れていると考える.血液脳関門(BBB)と血液神経関門(BNB)は共に神経系のバリアとして各々の内部環境を維持している.BBBとBNBの相違点を明らかにすることで,免疫性神経疾患の分子レベルでの病態解明が期待できる.本研究は当教室で確立したBBB構成内皮細胞株(TY10)とBNB構成内皮細胞株(FH-BNB)の遺伝子をDNAマイクロアレイを用いて比較した.その結果,hedgehog signaling pathwayに関わる遺伝子の発現が両者で異なっていた.蛋白レベルでの解析を行ったところ,特にdesert hedgehogが,BBBとBNBのバリア機能の違いに関与していることが明らかになった.平成26年度はDNAマイクロアレイを用いてヒトBBB構成内皮細胞とヒトBNB構成内皮細胞の遺伝子発現を網羅的に比較検討した.GSEAの結果,hedgehog signaling pathwayの発現量がBBBとBNBで異なることが明らかになり,同pathwayがBBBとBNBのバリア機能の違いに関わっている可能性があることが明らかになった.BBBとBNBの違いに関与する候補遺伝子がみつかり,研究は順調に進展していると考える.平成28年度はdesert hedgehogがBNB構成内皮細胞のバリア機能のみを上昇させる機序を解明し,その後,同蛋白が免疫性末梢神経疾患へ関与するかどうかを明らかにすることを目標にする.具体的にはsmoやgliといったhedgehog signaling pathwayに関わる蛋白の阻害剤を使用して,同pathwayのうちどのようなシグナル伝達経路がバリア機能に関わっているかを明らかにする予定である.その後,CIDP患者血清をBNB構成内皮細胞へ作用させることでdesert hedgehogに関わる遺伝子の変化を検討する予定としている.神経免疫学,パーキンソン病H27年度はdesert hedgehogのみをターゲットとした解析を行っており,他の遺伝子や蛋白の解析が予定より少なかったため次年度使用額が生じた.平成26年度はDNAマイクロアレイとそのデータ解析を主に行っており,予定より細胞動態や蛋白の解析が少なかったため次年度使用額が生じた.細胞培養液や細胞培養用ディッシュなどの細胞培養のための消耗品,ウエスタンブロッティングや免疫細胞化学による解析のための抗体,各種阻害剤を複数購入する.研究成果をいち早く臨床の現場にフィードバックするため,国内外での学会発表のための旅費と論文作成のための英文校正の費用を計上する.細胞培養液や細胞培養用ディッシュなどの細胞培養のための消耗品,ウエスタンブロッティングや免疫細胞化学による解析のための抗体,各種阻害剤を複数購入する.研究成果をいち早く臨床の現場にフィードバックするため,国内外での学会発表のための旅費と論文作成のための英文校正の費用を計上する.
miRNAによる歯特異的遺伝子発現制御メカニズムの解析とその制御法の開発

本研究の目的は、歯の発生におけるmicroRNA(miRNA)の発現やその役割についての解析である。今回、胎生16日、出生後1、3日のマウス歯胚でのmiRNAの発現パターンを明らかにした。このうちmiR-1の発現について、real-time miRNA PCR法を用いて各ステージ間の有意な差を確認し、マウス歯胚での組織内発現をin situ hybridization法にて確認した。これらの結果はmiR-1が歯の形成において重要な役割を担う可能性を示唆している本研究の目的は、歯の発生におけるmicroRNA(miRNA)の発現やその役割についての解析である。これらの結果はmiR-1が歯の形成において重要な役割を担う可能性を示唆している本研究の目的はこれまでに知られていない歯の発生におけmicroRNA(miRNA)の発現状況や、その役割についての解析である。我々はこれまでに胎生16日、出生後1日、3日のマウスの歯胚よりmiRNAを抽出し、ジェノパールmiRNAアレーを用いて、miRNAの発現パターンを明らかにしていた。このうち歯胚でのmiRNA発現プロファイルと、他の組織(脳、肺、腎臓、肝臓、皮膚、骨、筋肉、精巣等)のmiRNAの発現様式と比較し、歯胚に特異的なmiRNA候補の同定を行ない、特徴的な発現をしている66のmiRNAを同定した。また歯胚形成において極めて重要な役割を担うGJA1に特異的なmmu-miR-1、101a、101b、200a、338-3p、376a、434-3を同定し、このうちmmu-miR-1、101a、376a、434-3pが胎生16日に比較して出生後3日で特徴的に発現量が変化するのを確認した(International Association fordental research, trontoにて発表)。次にmmu-miR-1、mmu-mir-127について各ステージのマウス歯胚における組織内発現をin situ hybridization法にて確認した(インターフェイス口腔健康科学国際シンポジウムにて発表)。さらに各ステージの歯胚から抽出したtotal RNAから、分化過程におけるmiRNAの発現についてreal-time miRNA PCR法を用いて解析を行ない、各ステージ間における有意な差を確認した。これらの結果はmiRNAが歯の形成において重要な役割を担うことを示唆しており、歯の発生研究において極めて重要な知見が得られた。今後、歯原性上皮細胞株SF2を用いてmiRNAをノックダウンし、歯胚の発生段階に特異的な分子の発現の変化を検討していく予定である。本研究の目的はこれまでに知られていない歯の発生におけるmicroRNA(miRNA)の発現状況や、その役割についての解析である。これまでに胎生16日、出生後1日、3日のマウスの歯胚でのmiRNAの発現パターンを明らかにし、特徴的な発現をしている66のmiRNAを同定した。このうち歯胚形成に重要な役割を担うconnexin43に特異的なmiR-1、101a、376a、434-3pが胎生16日に比較して出生後3日で特徴的に発現量が変化するのを確認した。またmiR-1について各ステージのマウス歯胚における組織内発現をin situ hybridization法にて確認した。さらに各ステージの歯胚から抽出したtotal RNAから、分化過程におけるmiRNAの発現についてreal-time miRNAPCR法を用いて解析を行ない、各ステージ間における有意な差を確認した。加えて歯原性上皮細胞株SF2を用いてmiR-1をノックダウンし、Western blot法によりconnexin43の発現が増強されることを確認した。さらにmiR-1をノックダウンしたSF2細胞を免疫染色し、特徴的な発現パターンを示すことを確認した。さらにmiR-1をノックダウンしたSF2細胞では、細胞増殖へ影響を及ぼすことを確認した。これらの結果は、miRNAが歯の形成において重要な役割を担うことを示唆しており、歯の発生研究において極めて重要な知見が得られた。結果をまとめ、現在投稿準備中である。
肥大型心筋症から拡張型心筋症類似病態に至る生化学的機序

肥大型心筋症から拡張型心筋症類似病態に至る機序とその頻度を解明する目的で研究を行い以下の結果を得た。1.心筋逸脱酵素の変動:(1)CPK-MM isoform.CPK-MMのisoformであるMMa,MMb,MMcのうち、血中ではMMa,MMbが正常対照群に比し高値、MMcは逆に低値であることを明らかにした(Clinical Science 1991:81:723-726)。すなわち肥大型心筋症では安静時においても心筋障害が存在することを示している。(2)CPKおよびLDH isozyme.CPK-MBとLDH1の持続的高値が肥大型心筋症患者の約70%で認められることを報告し(Circulation 1992;86(Suppl I):I-591)、持続的心筋障害は本症の一般的な特徴であることを明らかにした。2.心電図及び心エコー図の変化:肥大型心筋症患者26名の12誘導心電図におけるQRS電位の総和は約70カ月の経過観察により34.8±9.8mVから23.8±9.8mVに減少した。心エコー図より計測した左室拡張末期径は41.8±5.6mmから47.8±7.2mmに増加した。(JACC 1993;21:354A)。経過観察中、6例が典型的な肥大型心筋症から拡張型心筋症類似病態に進展した。3.タリウム心筋シンチグラム:タリウム-201心筋シンチグラムによる50ケ月以上の経過観察により26例の肥大型心筋症のうち17例(65%)ではタリウム摂取の著しい減少が認められ、その減少は徐々に持続的に進行するのが特徴であった(JACC 1993;21:354A)。4.肥大型心筋症患者の冠動脈造影所見:肥大型心筋症では約40%の患者で冠動脈と左室の間にシャントが存在し、本症における持続的心筋障害の一因と考えられる(Circulation 1993;88(Part2):I-211)。以上より、肥大型心筋症では心筋逸脱酵素の上昇、心電図QRS電位減少、タリウム摂取の減少で示される慢性の心筋障害が存在しており、肥大型心筋症から拡張型心筋症類似病態への移行は肥大型心筋症の自然経過の可能性を示唆している。平成3年度は、当初の計画どうり、肥大型心筋症の心筋逸脱酵素の変動について以下の2点につき検討した。第1点として、CPKの3つのisoform MMa、MMb、MMcの変化につき検討した。MMaは心筋組織内isoformであり、血中レベルは通常低値である。

今回検討した血中におけるMMa,MMb、MMcの各レベルは正常対照群では11%、22%、41%であるのに対し、肥大型心筋症群では19%、27%、34%でありMMa、MMbは肥大型心筋症で有意に高値、MMcは有意に低下していた。MMa/MMc比は対照群では0.30;肥大型心筋症群では0.61と肥大型心筋症群で有意の高値を示した。以上の結果は肥大型心筋症患者では心筋内から血中へのMMaの逸脱が亢進しており慢性の心筋障害が存在することを示している。(Clinical Science 1991;81:723ー726)。第2点として、CPK、LDHの各isozymeの変化と心電図、心エコ-図の変化について検討した。CPK、LDHのisozymeとしては心筋分画を反映するCPKーMB、LDH_1について検討した。心エコ-図は心室中隔厚、左室後壁厚、左室拡張末期径(平均観察期間78カ月)の変化を、心電図は標準12誘導のQRS電位の総和の変化を検討した(平均観察期間84カ月)。CPKーMBの異常高値(>2.5%)及びLDH_1が30%以上を示す症例は肥大型心筋症患者の約65%に認められた。コエコ-図所見では心室中隔厚、左室後壁厚とも有意の減少を、また左室拡張末期径は有意の高値を示した。心淡図のQRS電位の総和は32.60mVから25.20mVへと有意の減少を示し、10%以上の減少を示した症例は約60%に認められた。以上の結果は、肥大型心筋症の多数例において、著しい心筋障害が進展していることを示しており、この変化に、心筋逸脱酵素の持続的上昇が強く関与していることを示している(Lancetに投稿予定)。平成4年度では、CPK及びLDHのisozymeのうちCPK-MBとLDH_1の持続的高値が肥大型心筋症の約70%で認められること、更に心電図及びエコー図からも心筋障害が進行することを報告した。(Circulation 1992;86(suppl-I):I-591)。肥大型心筋症におけるエコー図の経時的変化では、心室中隔厚及び左室後壁厚の持続的な減少とそれに伴う左室腔の拡大が特徴であった。更に左房径の持続的な拡大も特徴の一つであり、左房径の拡大とともに左心機能の障害も生じていることが明らかとなった。心電図変化の特徴はほぼ全誘導にわたるQRS電位が減高すること、またそれに伴い陰性T波音も減少するのが特徴であった。心電図の経年的変化から肥大型心筋症から拡張型心筋症類似病態への変化には20年前後の時間が必要と考えられた。更に平成4年度にはタリウム-201心筋シンチグラムを用い50カ月以上の観察が可能であった25例の肥大型心筋症のうち18例では著しいタリウムの取り込み欠損が進行してきた(American College of Cardiology,3月14-18日;93,Anaheimにて発表)。これらの結果は肥大型心筋症で認められる20年前後の軽度ながら持続的な心筋逸脱酵素の上昇が拡張型心筋症類似病態を確実に引きおこすことを示している。これらの変化はβ遮断薬、Ca拮抗薬では抑制不可能と思われる。平成5年度は肥大型心筋症の心筋性状を把握する目的で核磁気共鳴画像(MRI)による評価を行った。MRIはSE法による評価に加えdiethylene triamine pentaacetic acid(Gd-DTPA)負荷による評価も行った。肥大型心筋症では60%強の症例においてGd-DTPAで造影効果が認められた。平成3年、4年に報告した肥大型心筋症で持続的に認められる心筋逸脱酵素の上昇を観察して明らかにした心電図上のQRS電位の減少並びにタリウム摂取の減少を合わせ考えると、Gd-DTPAの造影効果も左室心筋の障害あるいは変性を示唆する所見と考えられる。肥大型心筋症で認められる持続的心筋障害の原因を明らかにする目的で本症の冠動脈造影所見を解析した。冠狭窄、冠攣縮を有さない肥大型心筋症患者48例の冠動脈所見を解析し以下の結論を得た。肥大型心筋症では左右冠動脈は対照群に比し冠動脈径は有意に大であった。更に肥大型心筋症では20症例(42%)において冠動脈から左室腔へのシャントが存在した。
T細胞分化決定における分子機構の解析

Notch1の誘導型遺伝子欠損マウスおよび活性化型Notch1分子の造血幹細胞への遺伝子導入の解析から、T/B細胞分化決定期においてNotchシグナルはT細胞への分化を一義的に決定するものと考えらている。本研究では、これらの現象を分子レベルで詳細に解析するべく、in vitroでの再構築系の確立およびT細胞分化決定に重要な転写因子GATA3との関連を追求した。活性化型Notch1(ICN1)遺伝子をマウス造血前駆細胞に導入し、胎仔胸腺器官培養(FTOC)および骨髄支持細胞(OP-9)を用いた2次元培養系にて、B並びにT細胞への分化について解析した。同時に、Notch分子の活性化に必須の蛋白分解酵素(γ-secretase)の特異的阻害剤を用いて同シグナル欠損の影響を調べた。上記2種のin vitro分化系にて、ICN1遺伝子導入によりすべての細胞がT細胞へ分化し、逆にNotchシグナルを抑制するとT細胞分化が完全に阻害された。またOP-9等の骨髄支持細胞上の2次元培養においても、ICN1の遺伝子導入はT細胞分化を選択的に誘導し、胸腺環境をまったく使わずにin vitroにてT細胞をはじめて造り出すことに成功した。また、GATA3遺伝子欠損マウス胎仔肝臓細胞(GATA3 KOmが胎齢12.5日で致死であることから、胎齢11.5日胎仔を用いた)にGATA3遺伝子を導入して機能不全を解除する実験系の開発の過程で、胎齢11.5日造血前駆細胞ではGATA3が発現しても十分な機能を発揮できず、機能回復にはNotchシグナルによって誘導される何らかの現象が必須であることを示した。さらに、GATA3欠失をICN1単独では解除できないことから、NotchシグナルはGATA3の上流に位置して機能することが推察された。Notchは広く保存された遺伝子で、種々の細胞の系列決定に関与することが知られている。近年、Notch-1誘導型遺伝子欠損マウスが樹立され、すべての血液細胞の中で、T細胞のみが消失することが報告された。一方、T細胞特異性の高い転写因子GATA3は、同様の遺伝子欠損形質を示すことから、両分子は、リンパ系幹細胞からT細胞系列に分化決定される際に、非常に重要な役割を果たしていることが予想された。本研究では、造血幹細胞を含む未分化細胞から、T/B細胞が分化する際の、上記2つの分子の役割をin vitroで解析するシステムの確立を試み、両分子がいかなる関係でT細胞分化を制御しているのか、その分子機構の解明を目指した。胎齢15日マウス胎仔肝臓細胞より、Lin(-)c-kit(+)細胞をsortingにて純化し、支持細胞OP9およびIL-7存在下に培養し、B細胞ならびに顆粒球系細胞への分化を誘導した。また同時に、dGuo処理胎仔胸腺ヘHD培養により導入し、IL-7存在下FTOC培養により、T/B両細胞への分化も観察した。その際、活性化体であるNotch-1細胞内ドメイン(ICN1)、あるいはGATA3cDNAを、retrovirus-vectorを用いて遺伝子導入し、その影響を観察した。ICN1を導入した場合は、0P9/IL-7培養系では、B細胞系、顆粒球系、いずれの系列への分化もほぼ完全に阻害された。一方、HD/FTOC系では、先と同様B細胞の出現は完全に抑制されたが、T細胞は十分に分化していた。Notchシグナルは、ある種の細胞の分化を抑制することが知られ、それとは別に、2種以上の系列への分化が可能な際にどちらか一方への分化を選択的に誘導するという2つの事象が知られている。本系では、顆粒球系の分化は抑制され、T/B決定期では、T系列の分化を誘導した。これに対し、GATA3を導入した場合は、0P9/IL-7培養系ではB細胞分化のみを完全に抑制し、HD/FTOC系でも同様に、B細胞分化を抑制した。以上のことから、GATA3は、T/B分化決定期にて、Notchシグナルと非常に類似の機能を保持することが明らかになった。今後両者の機能不全系におけるそれぞれの補完性を調べる実験を通して、両者の関係をより明確にする予定である。

また、GATA3遺伝子欠損マウス胎仔肝臓細胞(GATA3 KOmが胎齢12.5日で致死であることから、胎齢11.5日胎仔を用いた)にGATA3遺伝子を導入して機能不全を解除する実験系の開発の過程で、胎齢11.5日造血前駆細胞ではGATA3が発現しても十分な機能を発揮できず、機能回復にはNotchシグナルによって誘導される何らかの現象が必須であることを示した。さらに、GATA3欠失をICN1単独では解除できないことから、NotchシグナルはGATA3の上流に位置して機能することが推察された。
多局所網膜電図による緑内障眼検出法の新たな提案

緑内障眼の視機能を測定する検査法として自覚的検査法である視野検査があるが、他覚的検査法は存在しない。今回の研究で、我々は、緑内障眼の視機能を他覚的検査法である多局所網膜電図(mfERG)を用いて評価できることを報告することに成功した。自覚的検査法は、高齢者、認知症のある方、精神発達遅延のある方、幼小児には困難な検査法であり、他覚的検査法であるmfERGはそのような患者様に特に有用な検査になると思われる。研究に用いている多局所網膜電図(mfERG)記録装置は広く普及しているが、その初期設定の記録条件で得られる網膜の応答を示す波形は、全視野刺激網膜電図(ERG)や、高価なために普及していない局所網膜電図(fERG)で得られる波形とは異なる。本研究では、mfERG記録装置の記録条件を変えるという工夫でfERG、ERGで得られる波形と同様の波形を得ることが可能であることを証明し、更に緑内障の早期発見への応用を目的としている。2012年5月6日9日に米国フロリダ州フォート・ローダーデールで開催された国際学会:ARVO(The Association for Research in Vision and Ophthalmology:視覚と眼科学研究協会会議)では、視神経炎症例について、mfERG記録装置の記録条件を変えるという工夫でfERG、ERGで得られる波形と同様の波形を得ることが可能であることを発表した。2013年5月5日9日に米国ワシントン州シアトルで開催されたARVOでは、緑内障症例からmfERGを記録しN2応答密度が減弱することを発表した。緑内障症例ではfERGやERGのPhNRが減弱するので、N2応答密度がPhNRに相当することを示した。この報告内容についてまとめた英文論文が2014年4月に受理された。2013年のARVOでの発表、2014年に受理された英文論文では、中心網膜を5つの部位に分けてそれぞれの網膜部位からの網膜応答を記録したが、2014年5月4日8日に米国フロリダ州オーランドで開催されたARVOでは、中心網膜を7つの部位に分けて緑内障症例から記録した結果を発表した。記録する網膜をより多くの部位に分けて記録することで、網膜機能障害の状態についてより詳細な情報を得る可能性があることを示し、緑内障の早期発見に有用である可能性が高いことを示した。研究に用いている多局所網膜電図(以下mfERG)記録装置のもともとの記録条件で得られる波形は局所網膜電図(以下fERG)、全視野刺激網膜電図(以下ERG)で得られる波形とは異なると考えられている。本研究では、mfERGの記録条件を変えることでfERG、ERGで得られる波形と同様の波形を得ることが可能であることを証明し、緑内障の早期発見への応用を目的としている。mfERGの記録条件を変えることで以下の学会報告をした。視神経が障害されるという点で緑内障と共通する視神経炎症例では局所網膜電図や全視野刺激網膜電図のphotopic negative response(PhNR)が減弱することが報告されているので、同症例からmfERGを記録し、N2成分の応答密度が減弱することを初めて報告し、mfERGのN2応答密度がfERGあるいはERGのPhNRに相当すると考えられることを報告した。その際に光干渉断層計を用いて神経線維層厚との関連を示した。2013年5月5日9日に米国ワシントン州シアトルで開催された国際学会ARVOでの発表内容は次の通りである。緑内障症例ではfERGやERGのPhNRが減弱することが報告されているので、同症例から多局所網膜電図を記録し、N2応答密度が減弱することを報告した。このことからmfERGのN2応答密度がfERGあるいはERGのPhNRに相当すると考えられることを報告した。上記2つの研究成果を示すことで、mfERGがその記録条件を変えるだけで緑内障の早期発見に役立つ可能性を示した。多局所網膜電図による緑内障眼検出法に結びつく研究成果として、国際学会誌に論文を掲載し(Curr Eye Res. 2015 Jan;40(1):77-86. Epub 2014 May 15. Alterations of photopic negative response of multifocal electroretinogram in patients with glaucoma.)、国際学会: ARVO(The Association for Research in Vision and Ophthalmology)AnnualMeetingで緑内障眼検出のための多局所網膜電図のさらなる可能性を示唆する発表をした。現在、臨床現場で行われている緑内障検査のなかで、眼球機能の緑内障性変化を捉える検査法は、視野検査を代表とする自覚的検査法(被検者がボタンを押して反応することで検査結果を得るなど、検査結果が被検者の反応に依存する検査法)のみであり、眼球機能の緑内障性変化を捉える多覚的検査法(被検者の反応に依存しない検査