hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スパイラルによる小中高連携の代数カリキュラムの開発と知識の成長過程の解明

平成29年度の研究目的である、スパイラルを重視した数学的活動による小中高連携の「数の拡張」に関する代数カリキュラムとして、小学3年の単元「小数」や単元「分数」、中学1年の単元「比例」や単元「正負の数」、高校1年の単元「整数の性質」を開発すると共に、各々の単元における児童・生徒の学習活動や記述内容を質的に分析することから、学習の効果や知識の成長過程に関する考察を行っている。また、「方程式と関数」に関わる単元として、高校3年の単元「式と曲線」を開発し、楕円の極線の方程式に関する生徒の数学的探究の様相を明らかにしている。さらに、学校代数における数学的探究、数学学習とメタ認知との関係、数学的知識の成長に関する理論的な考察も継続して行っている。本研究の目的は,スパイラルを重視した数学的活動による小中高連携の代数カリキュラムを開発し,そのカリキュラムによる学習効果と学校代数に関わる児童・生徒の知識の成長過程を明らかにすることである。この目的の達成に向けて,平成30年度は「数の拡張」,「方程式と関数」,「数式および文字式による説明・証明」に関する代数カリキュラムを開発し,そのカリキュラムによる学習効果と児童・生徒の知識の成長過程について質的な考察を進めた。例えば,中学3年の単元「平方根」の中に,平方根について,写像の合成を数学的な背景にもつ操作活動で考え,その行為を言葉で表現して対象化することから,平方根の意味を解釈する数学的活動を取り入れた。その結果,写像の合成としての乗法の見方が倍の意味を豊かなものにすること等が明らかになった。また,単元「平方根」で扱った数学的活動が,三平方の定理や累乗根の学習への洞察,複素数の乗法を理解するための素地形成になっていた。また,中学3年の単元「関数y=x^2」において,立方体を3分割してできる斜錐体の体積を複数の「方法」で導くと共に,その「方法」を活かしてy=x^2のグラフで囲まれた領域の面積を導く数学的活動を取り入れた。その結果,具体物を用いた操作活動とその対象化が,底面からの連続的な軌跡として斜錐体の体積を捉えることを促していた。また,次元の行き来をしながら斜錐体の体積を複数の方法で導くこととその振り返りが,y=x^2のグラフで囲まれた領域の面積を区分求積の考えで導いたり,1/3倍の意味の実感したりすることにつながっていた。その一方で,斜錐体の底面に平行な切断面の形を捉えること等,空間図形の性質を見抜くことは生徒によって容易ではないことも明らかとなった。また,小中連携を重視した「数式および文字式による説明・証明」に関する単元開発とその授業分析も進めている。平成30年度の研究目的である,スパイラルを重視した数学的活動による小中連携の「数の拡張」,「数式および文字式による説明・証明」に関する代数カリキュラムとして,中学3年の単元「平方根」,乗法九九の拡張とその解釈に焦点をあてた小学校中学年から中学2年までの,小中連携の単元を開発すると共に、各々の単元における児童・生徒の学習活動や記述内容を質的に分析することから、学習の効果や知識の成長過程に関する考察を行っている。また,「方程式と関数」に関わる単元として、中学3年の単元「関数y=x^2」を開発し,斜錐体の体積とy=x^2のグラフで囲まれた領域の面積を相互に関連づけた生徒の数学的探究の様相を明らかにしている。さらに,学校代数における数学的探究や数学的知識の成長に関する理論的な考察も継続して行っている。
人型対話ロボットと連携した高齢者のためのケアリングとしての看護の方法の開発

平成30年度は研究の第2段階として,健常成人と人型看護ロボット(Caring Nurse Robot: CNR),健常者高齢者とCNR,認知症高齢者とCNRとの傾聴対話のデータ取得を開始した。楽しい対話プログラムの実証実験プログラム,Transactive Relationship看護理論(TR看護理論)によるケアリングとしての看護の機能を開発した。CRNは,ソフトバンクロボティクス(株)のPepperに搭載された介護予防アプリ〔(株)エクシング製〕を使用した。詳細を下記に示す。(1)Pepperに搭載するためのケアリングとしての看護の対話機能を開発し,31年度にPepperに実装するための準備(プログラミング)を行った。(2)実証実験1を行った。調査対象被験者にアクチグラフまたは加速度計と心電図を装着し,Pepperとの意図的なコミュニケーションを10分程度行った。実施前後で血圧,脈拍,体温を測定した。認知症患者では,Pepper導入前(4月)と導入後3ヶ月目(8月)に大・小の関節可動域(ROM)の測定【Image-Jというソフトを使用し静止画像を用い測定】,解析した。(3)観察評価試験を行った。Pepperを使用し,患者に対するラジオ体操第一の効果測定を行った。医療者対患者関係や役割の変化,Pepper主導での体操の進行状況,被験者の活動状況をビデオ撮影し, Pepperとテレビモニターによるラジオ体操第一の映像と介在者(作業療法士,看護師,介護福祉士)の説明で行い,Pepper,介在者,患者との関係性を分析した。また,本年度実施予定であった感性評価1は,研究協力施設の改築により,次年度に実施する。(1)実証実験1では,一部の被験者からPepperとの関わり前後における心拍変動解析を行い,運動時の自律神経活動の変化についての測定結果を得る事ができた。本年度に得た測定結果や測定方法の課題を参考に,来年度の自律神経機能評価を行う予定である。また,関節可動域の測定では,今後,顔認証システムを取り入れた自動計測機能を開発することにより,詳しい調査を行う予定である。(2)観察評価試験では,Pepperとテレビモニターによるラジオ体操第一の映像と介在者という組み合わせ,かつ,介在者の支援が丁寧に行われた施設では,Pepperを継続的かつ効果的に活用できるという成果が得られたため,介在者への支援方法の確立,Pepperを活用するためのインストラクターの養成に向けての準備が進んでいる。また,Pepperに搭載する介護施設専用の新たなアプリケーションの開発と改良を進めている。具体的には,傾聴対話を重視した対話アプリケーションの開発や対話性能の改良,介護施設において,対象者の個別性に配慮したリハビリテーション・レクリエーションの支援プログラムの開発である。本年度,行う予定となっているPepperの感性評価1を行う。三船病院,福寿荘に勤務している医療職者(医師,看護職,作業療法士,介護福祉士,事務職員など120名)のうち,20歳70歳代で,体操を行うため関節等に問題がないものを被験者とし,Pepperを使用した体操と対話の体験について気分,感想,満足度のアンケート用紙に記入していただく。また,第2段階ー2として,楽しい対話プログラムの実証実験プログラムとCNRに必要なTR看護理論によるケアリングとしての看護の機能の開発のプレテストを,前述の感性評価1の調査対象者の協力を得て行う。実証実験については,観察評価を行うとともに,客観的な測定としては,これまでに応募者らの研究チーム行ってきた自律神経機能評価のための心拍変動解析を中心に行い,CNRによる対話が,健常成人,健常高齢者,認知症高齢者の自律神経にどのような影響があるかを比較検討する。データベースに蓄積したデータを解析することでケアリングとしての認知症の看護を明らかにする。また,倫理的配慮として確実に個人情報が保護できる仕組みを確立する。5月に研究協力施設の院長及び看護部長に対して調査の説明を行い、院長の同意を得た。また、施設において、調査で使用する機器の動作確認を行った。6月には(株)エクシングと、1.研究内容の確認2.導入施設の見学3.導入施設での調査研究について研究打ち合わせをした。10月に名古屋にある社会福祉法人聖霊会老人保健施設サンタマリアを訪問し、ソフトバンクロボティクス(株)のPepperに搭載された介護予防アプリが稼働しているところを観察しながら(株)エクシングからその詳細について説明を受け、現在の適応範囲や改善を要する部分について意見交換した。また、視察終了後に、次年度に開発する予定の人型対話ロボットのための要求性能をエクシング社の開発者と協議した。12月にも、同様に、人型対話ロボットのための要求性能について、(株)エクシングの開発者と打ち合わせをした。人型対話ロボットを用いた看護のベースとなるTRETONについて、フィリピンで行われたInternational Forum for the Future of Nursingおよび3rd SPUP International Reserch Conferenceにて発表した。年度末に研究協力施設でのPepperロボットの導入に関して、三船病院の関係者、エクシング社の担当者、および、徳島大学のプロジェクトチームのメンバーで打ち合わせを行った。また、導入施設の視察をし、平成30年5月からの実証試験の準備を行った。研究協力してくださる病院、および、企業との研究打ち合わせを重ね、平成30年5月から看護ロボット本体及び搭載するソフトウエアのレンタルを開始する予定であり、次年度からの感性評価や実証実験の実施、また、CNR開発のための要求性能の同定に向けて準備が進んでいる。

平成30年度は研究の第2段階として,健常成人と人型看護ロボット(Caring Nurse Robot: CNR),健常者高齢者とCNR,認知症高齢者とCNRとの傾聴対話のデータ取得を開始した。楽しい対話プログラムの実証実験プログラム,Transactive Relationship看護理論(TR看護理論)によるケアリングとしての看護の機能を開発した。CRNは,ソフトバンクロボティクス(株)のPepperに搭載された介護予防アプリ〔(株)エクシング製〕を使用した。詳細を下記に示す。(1)Pepperに搭載するためのケアリングとしての看護の対話機能を開発し,31年度にPepperに実装するための準備(プログラミング)を行った。(2)実証実験1を行った。調査対象被験者にアクチグラフまたは加速度計と心電図を装着し,Pepperとの意図的なコミュニケーションを10分程度行った。実施前後で血圧,脈拍,体温を測定した。認知症患者では,Pepper導入前(4月)と導入後3ヶ月目(8月)に大・小の関節可動域(ROM)の測定【Image-Jというソフトを使用し静止画像を用い測定】,解析した。(3)観察評価試験を行った。Pepperを使用し,患者に対するラジオ体操第一の効果測定を行った。医療者対患者関係や役割の変化,Pepper主導での体操の進行状況,被験者の活動状況をビデオ撮影し, Pepperとテレビモニターによるラジオ体操第一の映像と介在者(作業療法士,看護師,介護福祉士)の説明で行い,Pepper,介在者,患者との関係性を分析した。また,本年度実施予定であった感性評価1は,研究協力施設の改築により,次年度に実施する。(1)実証実験1では,一部の被験者からPepperとの関わり前後における心拍変動解析を行い,運動時の自律神経活動の変化についての測定結果を得る事ができた。本年度に得た測定結果や測定方法の課題を参考に,来年度の自律神経機能評価を行う予定である。また,関節可動域の測定では,今後,顔認証システムを取り入れた自動計測機能を開発することにより,詳しい調査を行う予定である。(2)観察評価試験では,Pepperとテレビモニターによるラジオ体操第一の映像と介在者という組み合わせ,かつ,介在者の支援が丁寧に行われた施設では,Pepperを継続的かつ効果的に活用できるという成果が得られたため,介在者への支援方法の確立,Pepperを活用するためのインストラクターの養成に向けての準備が進んでいる。また,Pepperに搭載する介護施設専用の新たなアプリケーションの開発と改良を進めている。具体的には,傾聴対話を重視した対話アプリケーションの開発や対話性能の改良,介護施設において,対象者の個別性に配慮したリハビリテーション・レクリエーションの支援プログラムの開発である。
ロタウイルスの遺伝学的多様性と種間伝播に関する研究

本研究の目的は、ヒト由来のA群ロタウイルスで非定型的性状を有するもの、および動物ロタウイルスについて遺伝子解析を行い、動物とヒトの間におけるロタウイルスの感染・伝播の様態を明らかにすることである。今年度は次の3つの研究成果を得た。(1)昨年度から解析を行っていたウシ由来B群ロタウイルスについて、9種類の遺伝子分節のクローニングと遺伝子配列の決定を行なった。系統解析の結果、ウシB群ロタウイルスはヒト、マウス、ヒツジのB群ロタウイルスとは異なる系統に属し、B群では動物間の伝播は稀であることが示唆された。(2)ヒトロタウイルスの世界的な新興型として認識されるG12型ウイルスの由来について探るため、動物で唯一G12型が検出されているブタのG12型A群ロタウイルスRU172株について、その全遺伝子配列を決定し解析した。その結果、一部の遺伝子分節はあるヒトロタウイルス株に非常に近いものの、他の遺伝子分節はブタロタウイルスの配列と高い一致率を示した。この知見から、ブタおよびヒトのG12型ロタウイルスは、ブタとヒトのロタウイルスの遺伝子再集合体であった可能性、またはブタとヒトのG12ロタウイルスが同じ共通の祖先ウイルスに由来し、別個に分子進化したことが示唆された。(3)ヤギA群ロタウイルスについて初めて全遺伝子配列を決定し(G034株)、既知のヒト・動物ロタウイルスと系統解析を行った。その結果、ヤギロタウイルスの一部の遺伝子分節はG6, G8, G12などの非定型的ロタウイルスの遺伝子分節と高い一致率を示した。このことからヒトの非定型的ロタウイルスの形成にヤギロタウイルスの伝播、遺伝子再集合が関与したことが示唆された。本研究の目的は、ヒト由来のA群ロタウイルスで非定型的性状を有するもの、および動物ロタウイルスについて遺伝子解析を行い、動物ロタウイルスのヒトへの感染の様態を明らかにすることである。今年度研究対象としたのは中国でヒトから分離されたR479株と、インドでウシから検出されたB群ロタウイルスである。R479株は中国では稀な抗原性G4P[6]を有しており、亜群I、II両方の抗原性を持つユニークな特徴を有していた。R479株のG4を規定するVP7遺伝子の配列を決定し、遺伝学系統を解析すると、従来のG4ヒトロタウイルスの系統には属さず、ブタ由来ロタウイルスGottfried株に近いことが分かった。P[6]を規定するVP4遺伝子も従来より知られるP[6]ヒトロタウイルスとは遺伝学的に距離を保っていたが、関連性の高い動物ロタウイルスは判明しなかった。さらに本ウイルスの全遺伝子分節について遺伝子配列を決定し、既知の遺伝子配列とともに系統解析を行なった。その結果、VP6遺伝子はブタロタウイルスの系統に属し、NSP3遺伝子はウシロタウイルスの系統に属しており、他の遺伝子分節はヒトロタウイルスの系統に属していた。すなわちR479株は、ブタロタウイルス由来のVP6,VP7とウシロタウイルス由来のNSP3を持つことがわかり、少なくとも2種の動物(ブタ、ウシ)からの人へのロタウイルス感染と、ヒトロタウイルスの間での遺伝子再集合を経てできたウイルスであると考えられた。ウシ由来B群ロタウイルスについては現在までに5種類の遺伝子分節のクローニングに成功し、現在配列の決定を行なっている。今後、ヒトロタウイルスとの遺伝学的関連を解析する予定である。
将来の出来事の発生確率がわからない場合の非完備市場における取引の研究

金融資産の将来の分布が不明な中で条件付き請求権の市場構造を明らかにした。すなわち、損失に対する引き当てを行わない投資家が市場に参加できないこと、条件付き請求権の価格は買い手の増加によって高まるが、買い手と売り手の割合は取引量に影響を及ぼさないことなどを明らかにした。また、取引費用が存在する中でマーケット・メーカーと投資家がそれぞれ最適な行動をとるとき、市場変動にかかわらず、マーケット・メーカーの収益が安定するように取引費用が決まるなど、原資産市場の特徴を明らかにした。さらに情報の不完全な中での研究の応用として、原資産の従う確率が不確実な中での最適なペアーズ・トレーディング手法を導出した。投資家のタイプを(i)金融資産の将来の分布について十分な情報を持っている投資家、(ii)金融資産の将来の分布についての情報は不十分だが、その見通しは比較的楽観的であり、リスクに備えた引き当てが少ない、(iii)将来分布についての情報が不十分であるため、将来の見通しを可能な限り悲観的に推定し、リスク事象の発生に対して十分な引き当てを行う、と三つに分類したうえで、条件付き請求権の取引がどのように行われるか分析した。その結果、タイプ(ii)の投資家は条件付き請求権市場になんらのインパクトも及ぼさないことがわかった。従って、当該市場はタイプ(i)とタイプ(iii)の投資家によって形成されることを証明できた。さらに、タイプ(i)の投資家のリスクに対する感応度の低下や、タイプ(iii)の投資家の初期資産の増加といった変化により条件付き請求権の取引量が活発化することを明らかにした。当初予定していた研究テーマに沿って、さまざまなタイプの投資家が存在する中で条件付き請求権の取引の構造を明らかにできただけでなく、それぞれの投資家の市場における役割(タイプ(i)の投資家のリスク感応度やタイプ(iii)の投資家の資産が市場にあたえるインパクトなど)を明らかにできた。以上の成果から、研究は予定通り順調に進んでいると考えられる。派生証券市場に関する初年度までの研究により、金融資産の将来の分布について十分な情報を持たないまま特にリスクに備えた引当てをおかない投資家は市場に参加することさえできないことが明らかになった。ただし、ここまでの研究では投資家の選好のタイプは指数効用に限定していたので、2016年度においては効用関数をより一般のInada条件を満たす凹関数に拡張して議論を展開した。そして、特に金融資産の将来の分布について情報を持たない代わりにリスクに備え引き当てを行う投資家に焦点をあてた分析を行い、派生証券価格の均衡価格の導出を行った。具体的には、上記したより一般の効用関数のもとで投資家がどのような価格を市場にオファーするかを以下の4つの段階を経て順次分析した。(i)金融資産に関する十分な情報をもたずリスク引き当てをあてない(ii)十分な情報を持つがリスク引き当てはあてない(iii)十分な情報をもち、リスク引き当ても行う。以上の3つのケースについて分析したのち、最後に(iv)情報を持たないがリスク引き当てを行う投資家のオファー価格を導出した。その結果、市場における買い手に対する売り手の割合の増加は派生証券価格を増加させるという直感に合致する結論が得られただけでなく、両者の割合は市場における派生証券の取引量にはなんらの影響も及ぼさないという新たな知見を得ることができた。当初の予定では、指数型の効用関数を仮定したうえで派生証券市場の分析を行った後、原資産市場の分析を行う予定だった。そして、その後に可能であれば一般化した効用関数での分析を行うこととしていた。しかし、研究を行う中で、一般化した効用関数のもとでの分析も見通しがついたので、実施してみたところ想定通りの結果が得られた。派生証券市場に関する過年度までの研究により、金融資産の将来の分布について十分な情報をもたないまま特にリスクに引き当てをおかない投資家はその効用関数がInada条件を満たす一般の凹関数を持ちさえすれば市場に参加しないことが明らかになった。こうした成果は"On the market structure with random2017年度はこうした派生証券市場の構造に関する研究を進めるとともに、原資産市場の研究にも注力した。一つは原資産市場の摩擦に関する研究である。これは投資家とマーケット・メーカーが存在する市場構造を考えるものである。すなわち、マーケット・メーカーの収益源を取引費用とし、投資家もマーケット・メーカーも最適な行動をとるとき最適な取引費用がどのような水準になるかを考察することで原資産市場の構造を明らかにした。こうした研究により原資産のボラティリティや収益率などの変動によって最適な取引費用も変動するのだが、マーケット・メーカーの収益は比較的安定することが観察されるなど興味深い結果が得られた。この研究の成果は"A noteon market structure with transaction costs"として2018年6月から7月にかけてポルトガルで開催されるIFABS2018コンファレンスで公表予定である。また、情報の不完全な中での投資家の行動の研究の応用として、(派生証券ではなく)原資産の運用手法の研究も行った。特に原資産の従う確率分布が不確実な中で最適なペアーズ・トレーディングの手法を導出した。この研究成果は"An entropic approach forpair trading"おしてEntropy誌に掲載された。

すなわち、損失に対する引き当てを行わない投資家が市場に参加できないこと、条件付き請求権の価格は買い手の増加によって高まるが、買い手と売り手の割合は取引量に影響を及ぼさないことなどを明らかにした。また、取引費用が存在する中でマーケット・メーカーと投資家がそれぞれ最適な行動をとるとき、市場変動にかかわらず、マーケット・メーカーの収益が安定するように取引費用が決まるなど、原資産市場の特徴を明らかにした。さらに情報の不完全な中での研究の応用として、原資産の従う確率が不確実な中での最適なペアーズ・トレーディング手法を導出した。上記した2015年度の研究成果はワーキングペーパーにまとめたが、この成果の学術雑誌への掲載を目指すとともに、内外に成果を示すべく学会へ積極的に参加する。また、条件付き請求権市場における投資家の振る舞いを効用無差別価格の原理によるだけでなく、効用ベース価格の原理にも基づくとした場合に取引の構造がどのように変化するか、分析の射程を拡張する。上記した2016年度の成果をまとめたワーキングペーパーの査読付き学術雑誌への掲載を目指すとともに内外の学会での発表を行い研究成果のアピールに努める。また派生証券だけでなく原資産の取引についても、不確実性がある中で投資家がどのようにふるまうかについて分析を進める。金融・ファイナンス学内業務の都合で当初予定していた国際学会への参加を見送ったこと、また理論的研究を優先し数値シミュレーションのセットアップを部分的に2016年度に切り替えたため、使用計画が後ろ倒しになりました。2016年度中の成果をまとめたワーキングペーパーについて英文校正および学術雑誌への投稿にあてるための費用として40000円を予定していたが、予算執行期間中にはワーキングペーパーは完成したものの英文校正を依頼する時間がなかったため。ワーキングペーパーの英文校正および学術雑誌への投稿費に充てる予定である。
酸素分圧画像を指標とする強度変調放射線治療モデル実験

本研究課題は、腫瘍内の酸素分圧を指標として放射線照射の線量を制御することにより、放射線治療モデル実験の効果が変化するかを明らかにすることを目指していた。モデル実験を行うために、マウス後肢に作製した腫瘍を対象とする小型マルチリーフコリメータの開発、マウス腫瘍内の酸素分圧データからマルチリーフコリメータの開口部を決定する計算法およびプログラムを開発した。加えて、均一放射線照射の場合の腫瘍成長カーブと通常の腫瘍成長カーブを取得し、酸素分圧を指標とする放射線照射実験の比較対象データを取得した。腫瘍モデルはSCC VII細胞をマウス後肢に移植し作製した。平成28年度は、主に二つの課題に取り組んだ。(1)後肢に腫瘍を作製したマウスを想定し、マウス後肢を+45度、0度、ー45度回転した場合の放射線照射領域の投影を求めるプログラムを開発した。投影された低酸素領域の形状に合わせ、後述のマルチリーフコリメータの開口部を決定することを想定している。入力するデータは64×64×64の三次元データである。ボクセルの寸法が1mmでは無い場合には、データの回転操作を行った後、ボクセルサイズを1mmに変更し、マルチリーフコリメータの操作を容易にする。(2)マウス後肢の腫瘍に合わせた、小動物用のマルチリーフコリメータを開発した。開口部は最大で縦横20mmであり、厚さ1mmの鉛板(幅10mm)を片側20枚、合計で40枚使用する構造となっている。手動で鉛板を動かすことにより、マルチリーフコリメータの開口部の形状を整形する。試作したマルチリーフコリメータは、十分に遮蔽が可能であるか、開口部の形状に合わせた放射線照射が可能であるか検証した。放射線が一点から放射されるため、僅かに開口部よりも広がった部位に放射線が照射されることが分かった。しかし、実用的には問題が程度の広がりであることも明らかとなった。当初予定よりも進んでいる部分として、マウス後肢に移植した腫瘍の成長カーブを取得した。C3Hマウスの後肢にSCC VII細胞を移植し、腫瘍の成長を観察した。また、放射線(24 Gy)を単回照射した後に腫瘍成長カーブを取得した。これらのデータは、平成29年度に予定している放射線治療モデル実験の際に、基準となるデータとして利用される。低酸素領域の投影を求めるプログラムの開発と、マルチリーフコリメータの製作が行われており、当初予定した課題は概ね達成した。また、腫瘍成長カーブの取得は、前倒しで課題が実施されており、全体としては「予定より進んでいる」と判断した。投影プログラムの改良や、マルチリーフコリメータの改良を実施し、より簡便かつ実用的な実験装置に仕上げて行くことが求められる。研究期間を通して、主に四つの課題に取組んだ。(1)三次元酸素分圧画像データより放射線照射領域を求めるプログラムを開発した。入力される画像のピクセルサイズが小動物用のマルチリーフコリメータのリーフの幅(1mm)に一致しない場合に、画像のピクセルサイズをリーフ幅に変換する計算プロセスにバイリニア法を採用し、エッジ部分で発生するアーティファクトを抑制した。(2)マウス後肢に作製する腫瘍に合わせた小動物用のマルチリーフコリメータを開発した。開口部は最大20mmであり、厚さ1mmの鉛板でマルチリーフを構成した。また、開発したマルチリーフコリメータが十分に放射線を遮蔽することを実験的に検証した。(3)腫瘍モデルマウス(C3H HeJマウス、腫瘍細胞はSCC VII)を対象とし、空間的に均一な24Gyと13Gyの単回照射後の腫瘍成長カーブを取得した。低酸素量領域に24Gy、有酸素領域に13Gyの照射を行った場合には、取得した二つのデータの間に腫瘍成長カーブが現れると予想される。腫瘍体積倍加時間は、13Gy単回照射では3日、24Gy単回照射では15日であった。(4)腫瘍モデルマウスのイメージング実験を行った。窒素14Nおよび15Nで標識したdicarboxy-PROXYL酸素感受性プローブをマウスへ尾静脈投与し、酸素分圧イメージングを試みた。腫瘍内部での血流不足のためプローブが腫瘍の中心部へ十分送達されず、電子常磁性共鳴(EPR)イメージングの信号強度が十分に得られなかった。EPR信号強度とプローブの緩和時間の画像は得られているが、酸素分圧画像へ変換するためには信号対雑音比が不足していることが明らかとなった。全体としては、強度変調放射線治療モデル実験に必要な要素技術を開発し、モデル実験の手前まで到達した。二年計画の本課題は、平成29年度が最終年度である。

本課題の目標である、酸素分圧を指標とした放射線治療モデル実験を行うため、平成29年度は腫瘍モデルマウスを用いた放射線照射実験を実施する。当初計画では15 Gy程度の照射を計画していたが、平成28年度に24 Gyの照射で腫瘍成長カーブを取得した。そのため、引続き24 Gyの照射を基準として、実験を進めていく。低酸領域とそれ以外の部位の放射線照射量を変化させ、腫瘍成長カーブにどのような影響があるのかを明らかにする。酸素分圧を指標にした放射線照射群と、均一照射群に優位差があれば、本実験で提案する手法の有用性が示されることになる。簡単なモデル実験では優位差が示されない場合には、実験計画を見直し、放射線照射の計画を変更する予定である。計測工学当初予定していたよりも、マルチリーフコリメータの試作に係る経費が少なくて済んだため、次年度使用額、約18万円が生じた。当初計画で予定している放射線照射実験の際に、マウス用のマルチリーフコリメータの改良を行うことを想定しており、その際の経費として使用する計画である。また、予定よりも前倒しで放射線治療モデル実験をすすめるため、実験回数が増加することが想定される。そのため、放射線照射実験に必要な腫瘍細胞の調達や実験動物に関わる経費が増大することが考えられる。それらの経費として次年度使用額を充当する計画である。
3歳から就学期までの環境移行における社会化・文化化についての追跡的研究

平成20年度の研究目的に照らして、次のような結果がえられた。子どもの自律に関する追跡調査では、環境移行時に焦点化した質問紙調査から、親が就学前施設に期待する内容が大きく変化していることが明らかになった。幼稚園・保育所で子どもが学ぶ能力として、第1位に「コミュニケーション能力」があげられた。約20年前のTobinらの調査結果では「コミュニケーション能力」を第1位にあげた日本人はほとんどいない。また日本人に特徴的な対人的信念である「同情・共感・他者への配慮」をあげる親は激減した。これらの理由を、社会・経済的変化とマスコミ言説などとの関係から分析する必要がある。また都市部の親が幼稚園を選択する際には、平均3園を見学していることや子どもの生活習慣の自立に関する意識がかなり高いことがわかった。さらに入園後(数か月後)の調査からは、子どもの変容を意味づけたり、成長といった視点からとらえ直そうとしている様子が示唆された。第2の目的は4歳児の幼稚園環境へのかかわりを引き続き観察することであった。本研究は追跡的アプローチを採用するため、データ収集と分析とを同時進行させることは困難である。そこで、まず昨年入園した3歳児の変化について分析を進めた。その結果、入園初期には慎重さや躊躇ともみられる「動けなさ」が観察された。人や事物へのかかわりは、教師の仲介や促しによって出現する場合が多かった。それは、子どもにとっての新奇な環境である集団のもつ意味を考慮する必要があろう。4歳児クラスに進級した子どもについて、さらに継続的に観察した結果、モノやメディアを介した自然形成的な集合体が発生し、相互交流を伴う遊びへと展開するようになった。また、1か月程度にわたって遊びが継続するようになること、特定の仲間を選択することも見られるようになった。環境の資源化を進めると共に、園児が選択的利用を行うようになってきたと結論づけられた。
PET用脳内酢酸代謝イメージング薬剤の開発

ターゲットトレーサーであるF-18標識フルオロ酢酸エチル(EFA)は、ethyl O-mesyl-glycolateを出発原料とし、カセット型FDG専用合成装置を用いて、高度な化学的・工学的知識なしに簡便に無菌製剤を製造ことに成功した。得られたF-18標識EEAは、生理食塩水中では不安定であるがエタノール溶液中では6時間後でも安定であった。霊長類のコモンマーモセットを用いた体内動態実験では、F-18標識EFAの血中未変化体量を酢酸エチル抽出法により測定した。その結果、未変化体は投与1分後で35%、2分後で1%であることを確認した。さらにその代謝物をRadio-TLC法により定性分析したところ、血中に存在する放射能はF-18標識フルオロ酢酸(FA)であることを確認した。これまでに、Brain Uptake Index実験およびPETイメージング実験で、F-18標識EFAはF-18標識FA-に比べ脳移行性が高いことを確認しているが、エステル体での脳への集積は短時間で行われたと考えられた。さらに、ラット脳で速やかに脱エステル化が起こることを確認しているため、投与直後はエステル体として血流に依存した挙動を示し、その後速やかに代謝され脳内でFAとして存在すると考えられた。これらの結果より、F-18標識EFAはF-18標識FAのプロドラッグとして脳内酢酸代謝イメージングに利用できるだけでなく、これまでにほとんど報告のないF-18標識体の血流診断薬剤としての性質をも有していることが強く示唆された。ターゲットトレーサーであるF-18標識フルオロ酢酸エチル(EFA)およびその代謝物のF-18標識フルオロ酢酸(FA)の合成は、ethyl O-mesyl-glycolateを前駆体とし、PET薬剤自動合成装置を用いてそれぞれ合成することに成功した。EFAの血中での安定性をC-14標識体を用いて検討したところ、代謝速度に種差が認められ、げっ歯類では急速に分解されたが霊長類では比較的安定であることが確認された。脳イメージング薬剤として重要な要素である脳への取り込み率はbrain uptakeindex(BUI)法により測定した。その結果、C-14標識EFAは125.9±4.1%(n=4)と、C-14標識FAの33.3±3.7%に比べ非常に高く、さらに脳血流の指標であるトリチウム水よりも高い脳移行性を示した。さらに、ラット脳ホモジネートを用いた代謝実験では脳組織で速やかに加水分解されることが確認されたことから、脳内でEFAの脱エステル化は速やかに進行し、F-18標識EFAがF-18標識FAのプロドラッグとして機能する可能性が示唆された。次にこれらの結果より、F18標識EFAの生体PETイメージング実験には霊長類が適していると考えられ、コモンマーモセットを用いて体内動態を検討した。その結果、投与後早期から脳への高い放射能集積と滞留が確認された。得られたデータより薬物動態解析を行ったところ、3-コンパートメントモデルに非常によく相関した。一方、^<18>F-FAでは脳への集積がほとんど認められなかった。以上の結果より、F-18標識EFAは脳イメージング薬剤としての性質を十分に有していることが確認さ、今後代謝物等の詳細な検討を行うことによりPET用脳内酢酸代謝イメージング薬剤としての可能性を検討する。
膵癌幹細胞を標的としたSTAT1/Shh両シグナル経路阻害による膵癌治療の開発

本年度は、前年度より継続して行っているCD24、hedgehog signal構成分子、転写因子STAT1発現の連関解析を中心に行った。ASPC-1、Panc-1、SUIT-2細胞株を用いた。CD24をsiRNAを用いて抑制した実験では、western blotではpSTAT1は3細胞株共に著変なかった。shh発現は、Panc-1、SUIT-2細胞株で低下したが、ASPC-1細胞株では、変化が認められなかった。realtime PCR法でも、shh発現は、Panc-1、SUIT-2細胞株で有意に低下した。一方で、プラスミドを用いてCD24を強制導入する実験では、western blotでは、pSTAT1の発現はASPC-1細胞株では低下したが、Panc-1細胞株では変化が認められなかった。Shhの発現は、ASPC-1、Panc-1細胞株共に変化が認められなかった。real time PCRでは、ASPC-1細胞株ではShh、Gli1発現が有意に亢進した。まだ3つの細胞株での解析ではあるが、実験を繰り返しているが、CD24、hedgehog signal構成分子、転写因子STAT1発現の連関解析において未だ一定の傾向が得られていない。今後はさらに細胞株を増やして再現実験を行う予定としている。また、CD24分子が膵癌においては、増殖には関与せず、浸潤亢進に関与することは再現性が得られており、今後そのメカニズム解析に進んでいく予定である。今年度は、細胞レベルでの治療標的機能の同定を行った。膵癌細胞株(AsPC-1、SUIT-2、Panc-1、CFPAC-1)を標的として、CD24分子の導入(plasmid)および阻害(siRNA)により、増殖能、浸潤能の変化を解析した。CD24発現の高いSUIT-2細胞はCD24 siRNA導入により、約80%のCD24抑制が認められた。一方CD24発現の低いASPC-1細胞はCD24 plasmid導入により約60%のCD24発現が認められるようになった。増殖能の検定では、CD24の抑制、強制発現共に影響が認められなかった。一方、浸潤能の検定では、CD24抑制により有意な浸潤能低下が認められ、CD24発現亢進により有意な浸潤能の増強が認められた。次にHedgehogシグナルとの連関解析では、CD24抑制によりShh発現の低下が認められ、CD24発現亢進によりShhの発現増強が認められた。CD24とShhの間に介在する転写因子としてSTAT1を想定し、STAT1およびpSTAT1の蛋白発現解析をwestern blot法で行ったが、一定の結果が未だ得られておらず、再現実験を繰り返しているところである。膵組織におけるCD24、STAT1、Hedgehogシグナル関連分子発現の免疫組織染色法では、数例の解析を終了し、全例でCD24、STAT1、Hedgehogシグナル関連分子発現が認められた。今後は症例を増やし、さらに慢性膵炎、PanIN、膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)についても解析を行っていく予定である。STAT1、pSTAT1の発現解析では再現性が得られず、実験を繰り返しているが、細胞レベルでの治療標的機能はある程度、同定できた。膵組織を用いたCD24、STAT1、Hedgehogシグナル関連分子発現の免疫組織染色の症例を増やし、また、慢性膵炎、PanIN、膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)についても解析を行っていく。さらに、STAT1/Shh経路を制御する2次的膵癌特異的経路を同定し、膵癌治療への応用を検討する。さらには、免疫不全マウスを用いて、治療法の検証まで行いたい。膵組織におけるCD24、STAT

1、Hhシグナル関連分子発現プロファイルの作成が不十分であること、また、STAT1の関与がいまだ再現性がなくはっきりしないことより、STAT1/Shh経路を制御する2次的膵癌特異的経路の探索がまだ行われておらず、その分の研究費用が次年度使用額となる。今年度は、それらを重点的に行うと共に、免疫不全マウスを用いた知慮実験を行い、STAT1/Shh両シグナル阻害の有効性を検証していきたい。
患児の自己臍帯血由来細胞を用いた唇顎口蓋裂児の顎裂再建治療の基礎研究

母体の超音波検査による唇顎口蓋裂患児の出生前診断情報を、出産と同時に行う患児の自己臍帯血採取とリンクさせることで、患児の顎裂部骨欠損の再建を自己臍帯血幹細胞により実現することを目的とする基礎実験である。ヒト臍帯血から分離した凍結保存単核球細胞群からin-vitroで骨芽細胞に分化させる実験の結果、骨形成能を有する間葉系幹細胞の分離は確認できなかった。免疫不全ラットを用いた動物実験でヒト臍帯血由来単核球群移植による骨再生実験は継続中である。研究成果:研究用保存臍帯血から単核球細胞を分離した。研究用臍帯血は研究計画では大学病院内の臍帯血バンクから調達予定だったが、臍帯血バンクの閉鎖移動に伴い、これが困難になった。換わって、理化学研究所バイオリソースセンターから研究用保存臍帯血を購入した。本年度はこれをFACS(fluorescence-activated cell sorter)を用いてOPC(Osteogenic progenitor cell)を単離し、その細胞数を計測中である。さらにこのOPCをosteogenic mediaで培養中で、骨芽細胞に分化した細胞数も計測中で、最も効率的骨芽細胞に分化させうる培養条件を検討中である。現在は、分離により得られた単核球をMSC用の骨芽細胞誘導培地で培養している。骨芽細胞への分化と骨基質の産生を確認するために分化した骨芽細胞をOsteoblast-specific markerであるAlkaline phospataseとRunx2の2種類を用いて同定中である。困難な場合はDNA量の計測で代用する予定である。また形成された骨基質の確認はまだ行えていない。これまでの研究の意義:将来患児が自己臍帯血由来単核球移植を受けたときに、有効な骨基質の産生が得られることを確認するための第一段階である。重要性:研究の第2段階である、SCIDマウス頭蓋骨に形成した骨欠損部へ移植し実際に骨形成能を評価する実験はどうしても行いたい。この第一段階で研究費を使いすぎないよう、次の段階への早期の移行を検討中である。臍帯血由来間葉系幹細胞を分離培養しin-vitroで骨芽細胞に分化させる実験について。DMEM+10% FBSで14日間培養した後、Stem Pro osteogenesis differentiation kit (Invitrogen)で20日間培養し、評価を行った。MSC表面抗原Positive: CD29, CD44, CD90, CD105、Negative: CD14, CD45での確認、骨芽関連遺伝子発現(PCR)、骨芽関連タンパク発現(ALP, TRACP酵素活性)のいずれも確認できなかった。臍帯血由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞の誘導と樹立に関する報告は複数あるが、1個体の臍帯血に含まれる間葉系幹細胞は107108個含まれる単核球細胞のうち110個程度と考えられている(0.010.001%以下)。臍帯血中大部分を占めるマクロファージを除去しない限りvitroでの培養は困難であると思われた。今後細胞を取り除く方法はCD45陽性細胞であるマクロファージをRosette Sep法を用いて分離する方法を試みる予定である。SCIDマウスの頭蓋骨の骨欠損に臍帯血細胞を移植し、in vivoでの骨再生を確認する実験について。マウスの頭蓋骨に直径3mmの骨欠損を作る実験では移植容積の維持が困難である事が実験により判明した。動物種を重症免疫不全ラット(F344/NJcl-rnu系)に動物種を変更し、移植腔も直径5mm、厚さ1mmの頭蓋骨欠損に変更したが、この骨欠損はラットの骨細胞により完全に修復されてしまう事が分かった。更に移植条件を変更し、ラットの頭蓋骨骨膜下に気腔率60%のβ-TCPブロックで作製した移植腔(内径5mm厚さ1mm)とすることで、骨芽細胞が良好に増殖する移植条件を得た。現在も臍帯血由来単核細胞群移植によるin-vivoでの実験を継続中である。交付額に合わせ、当初の研究内容を変更中。骨芽細胞への分化と骨基質の産生を確認するために分化した骨芽細胞をOsteoblast-specific markerであるAlkaline phospataseとRunx2の2種類を用いて同定中であるが、まだ形成された骨基質の確認は行えていない。早期に研究の次の段階である、SCIDマウス頭蓋骨に形成した骨欠損部へ移植し実際に骨形成能を評価する実験への移行を検討中である。唇顎口蓋裂27年度の研究計画ではSCIDマウス頭蓋骨に形成した骨欠損部に臍帯血由来単核球を移植する骨形成実験を行う予定である。臨床での実現性を示すために計画を実現したい。

移植条件を変えながら、4グループ計64匹を使用する予定だったが、縮小し、最も細胞数の多い群のみ1グループと対象群で行う予定である。保存臍帯血から分離した臍帯血由来単核球細胞を、フィブリン糊、β-TCPなどの担体とともにSCIDマウス頭蓋骨に人工的に形成した骨欠損部に移植する。移植後8週まで観察し、移植細胞による骨形成能を評価する。現在は、分離により得られた単核球をMSC用の骨芽細胞誘導培地で培養している。培養条件を変えながら最適な条件を検討中であるため、分化した骨芽細胞の同定が予想より困難である。Alkaline phospataseとRunx2の2種類を用いての同定をこのまま続けるよりも、研究の第2段階である、SCIDマウス頭蓋骨に形成した骨欠損部へ移植し実際に骨形成能を評価する実験はどうしても行いたいので、この第一段階で研究費を使いすぎないよう、次の段階への早期の移行を検討中である。研究の次の段階である、SCIDマウス頭蓋骨に形成した骨欠損部へ移植し実際に骨形成能を評価する実験を行う。ここで、形成された骨基質の確認に予定通りAlkaline phospataseとRunx2の2種類を用いての同定を行う予定である。
魚類主要組織適合性抗原遺伝子の探索と分析

魚類のMHCの遺伝子は、哺乳類のMHC遺伝子をプロ-ブとしたクロスハイブリダイゼ-ションによってはつかまえることができなかった。しかし、ヒト、マウス、ニワトリのMHC遺伝子を比較すると、システインの近傍だけが強く保存されていることが分る。そこで2カ所のシステイン領域に対するプライマ-を作製し、メダカのゲノムDNAを鋳型としてPCR法を行い、これらのプライマ-に挟まれた遺伝子を増幅させた。その結果、哺乳類のMHCクラスII遺伝子と5060%の相同性を示す、約190bpのメダカの遺伝子断片が3種類得られた。これら3種の遺伝子断片同士の相同性も5060%であった。この3者の関係が同じ遺伝子座に存在する別の対立遺伝子であるのか、あるいは別の遺伝子座に乗っている遺伝子であるのかは現在のところ不明である。次に、近交系メダカHB32CとHO4CとのF1からmRNAを精製し、λgt10をベクタ-としてcDNAライブラリ-を作製した。このcDNAライブラリ-をメダカのMHCクラスII様遺伝子断片をプロ-ブとしてスクリ-ニングしたが、陽性シグナルを得ることはできなかった。そこで近交系メダカHO4CのmRNAからcDNAを合成したのちPCR法を行ったところ(リバ-スPCR法)、ゲノム遺伝子の場合と同様190bpの遺伝子断片の増幅がみられた。したがって、メダカのMHCクラスII様遺伝子配列をもつ遺伝子が発現している可能性が高いものと考えられる。リバ-スPCR法によって増幅された190bp遺伝子断片をプロ-ブとしてcDNAライブラリ-をスクリ-ニングしたところ、81個の陽性シグナルが得られた。現在、この陽性シグナルのセカンドスクリ-ニングならびに、リバ-スPCR法によって増幅された遺伝子断片のクロ-ニングおよびシ-クエンスを行っている。
カビの吸入と接触によるアトピー性皮膚炎増悪作用に関する研究

カビに,アトピー性皮膚炎を悪化させる作用があるか動物実験を行って調べた.台所や風呂場に生えているススカビの抽出物を予め気道に注入したマウスでは,カビを気道に注入していないマウスよりも症状が悪化する傾向がみられた.またアトピー性皮膚炎の炎症部に,ススカビの抽出物を塗ったところ,著しく症状が悪化した.以上の実験結果より,炎症部位にカビが接触したり,予めカビを吸入した状態であったりすると,アトピー性皮膚炎が悪化する可能性が示唆された.カビに,アトピー性皮膚炎を悪化させる作用があるか動物実験を行って調べた.台所や風呂場に生えているススカビの抽出物を予め気道に注入したマウスでは,カビを気道に注入していないマウスよりも症状が悪化する傾向がみられた.またアトピー性皮膚炎の炎症部に,ススカビの抽出物を塗ったところ,著しく症状が悪化した.以上の実験結果より,炎症部位にカビが接触したり,予めカビを吸入した状態であったりすると,アトピー性皮膚炎が悪化する可能性が示唆された.カビはアトピー性皮膚炎の発症原因のひとつと考えられているが、これまで実験的に、カビ抗原が誘発するアトピー性皮膚炎モデルは確立されていない。本研究では、カビは発症を誘発する物質ではなく、アトピー性皮膚炎をさらに増悪する作用を有するものと考え、アトピー性皮膚炎モデルマウスの症状や病態に、カビがどのような影響を及ぼすか調べることを目的とした。H19年度は、室内に浮遊する真菌を吸入した場合(経気道的曝露)を想定して、動物実験を行った。実験には、主たる室内浮遊真菌であるススカビ(アルテルナリア)とカンジダを用いた。NC/Ngaマウスに、週に1回、計5回、ススカビまたはカンジダの抽出物0.5μgを気管内に投与した。3回目の投与からアトピー性皮膚炎を誘発する処理を並行して行った。すなわち、ダニ抗原5μgを耳介に2日毎に8回、皮下注射した。ダニ抗原のみを皮下注射したアトピー性皮膚炎誘発群と、ススカビ、カンジダの気管内投与を併用したアトピー性皮膚炎誘発群の症状を比較した結果、ススカビを気管内投与したアトピー性皮膚炎群において、統計的な有意差は認められないものの、アトピー性皮膚炎誘発群よりも皮膚症状の増悪がみられた。一方、カンジダ気管内投与を併用した群では増悪作用はみられなかった。アトピー性皮膚炎誘発処理を行わず、ススカビ、カンジダの気管内投与のみを行った群では、アトピー性皮膚炎様症状はみられなかった。これらのことから、ススカビがダニ抗原誘発性アトピー性皮膚炎を増悪する可能性が考えられる。現在、血清中総IgE値、病理、組織中サイトカイン産生に関して解析中である。本研究では、カビはアトピー性皮膚炎の発症原因物質ではなく、増悪因子ではないかと考え、モデルマウスを用いて検討した。20年度は、アトピー性皮膚炎患部にカビが接触したときの影響を見た。ダニ抗原を頻回投与し、NC/Ngaマウス耳介にアトピー性皮膚炎を発症させた。その後、5μg/mouseのススカビ(アルテルナリア)またはカンジダ抽出部を炎症部位に塗布した。その結果、ススカビを塗布した群に症状の増悪を認めた。またカンジダを塗布した群も有意差を認めなかったものの増悪傾向を示した。血清中抗原特異的IgG1抗体産生も症状の結果と同様の傾向を示した。皮下組織中の好酸球数は、カビを塗布したどちらの群も増加していた。一方、総IgE値はアトピー性皮膚炎を誘発した群の値よりも減じ、皮下組織中マスト細胞数もススカビ塗布群でアトピー性皮膚炎誘発群に比し減少した。組織中のサイトカイン産生を測定した結果、Th2サイトカインのIL-13産生は、抗原特異的IgG1値と同様の傾向を示した。一方、IL-18産生は総IgE値と同様の傾向を示した。IL-18はIgE産生を増強することが知られており、このサイトカイン産生の低下によりIgE産生が低下したことが示唆される。以上の結果から、カビを患部に塗布すると、Th2サイトカイン産生、IgG1抗体産生、好酸球浸潤が強まり、さらにIgG1抗体と結合した好酸球数から放出される炎症惹起物質により症状が増悪したと考えられる。この増悪にはIgEやマスト細胞は関与していないことが示唆された。カビの影響は、カンジダよりもススカビの方が強く、また短期吸入よりも患部に接触する方が、影響が強かった。本研究の結果により、カビがアトピー性皮膚炎を増悪する環境要因であることが示唆された。
腫瘍細胞のDNA機能異常における核タンパク質の相互作用

1.NMRでMyb-DNA複合体の構造を決定した。2.A-MybとB-Mybの組織特異的な転写活性化能とそのcofactorの結合部位を明らかにした。3.ポリ(ADP・リボース)合成酵素(PAP)と相互作用するタンパク質を同定した。4.PPlg2は3種類のformで存在し、GRP78がPPlg2のシャペロンとして、基質特異性を決定する制御サブユニットであることを示した。5.ポリADP・リボシル化がDNA損傷後のG1期及びG2期停止制御と、p21とMDM-2遺伝子の転写制御に関与することを示した。6.肝発癌過程で増殖能力に関与するDNA機能異常の解析、及び、紫外線照射による光産物の免疫組織学的検出に有用な実験モデルを確立した。7.ラット及びウシ胸腺細胞核でアポトーシスを起こす3種類のエンドヌクレアーゼを見出した。また、PAP阻害剤(3AB)がHL-60細胞の細胞死を引き起こす事を見出した。8.ショウジョウバエにおいてPAPの欠損変異体を単離した。9.Mvb、PPlg2やPAPなどについては、相互作用をする蛋白質が明らかになりつつある。さらに、細胞増殖制御にとって重要な転写因子間の相互作用を、蛋白質の立体構造に基づき、原子レベルで理解することが重要である。このような蛋白質間の精緻な相互作用による転写調節やDNAの機能制御を明らかにしていくことが必要であり、その事により、異常な振る舞いを見せる腫瘍細胞の増殖機構の本質に一歩づつ近づくものと考えられる。
植物ポリフェノールと生体成分の分子間相互作用

植物ポリフェノール類(カテキン類)が生理機能を発揮するためには、生体成分、特にリン脂質二重層に対する相互作用が重要であると考えられる。本研究では、NMRを用いてカテキン類のリン脂質膜中における存在位置や動的挙動を明らかにした。さらに、植物ポリフェノール類のリン脂質膜に対する親和性を、リン脂質カラムを備えたHPLC測定によって数値化する評価系を構築した。カテキン類の脂質膜中における立体構造・立体配置・運動性を明らかにするために、固体NMR法を用いて物理化学的に解析した。1.固体NMRを測定するためには、立体構造や立体配置に関する情報を取得したい部位(galloyl基のカルボニル炭素)を安定同位体ラベルした13C-ECgが必要である。そこで、まず13C-gallic acidを合成し、これにECをカップリングさせて、13C-ECgを得た。2.合成した13C-ECgを多重膜リポソーム(MLV)に作用させて固体NMR測定を行なった。31PNMR測定により、13C-ECgの存在において化学シフト異方性の値が非存在下と比較して顕著に変化した。このことから、脂質膜に作用したカテキン類はリン酸基付近の運動性や構造に影響を及ぼし、さらに脂質膜中の比較的表面付近に位置していることが示唆された。この結果は、我々が以前に報告した溶液NMRでの結果を支持している。13CNMR(static)測定では、13C-ECgのカルボニル炭素のパウダーパターンが観測された。パウダーパターンは分子の運動状態を反映したシグナルであり、今回得られた一種類のパウダーパターンより、カテキン類は脂質膜中において一種類の軸回転運動を有していることが明らかとなった。先行研究において、2H-EGCgの運動性に関する情報を得ることに成功しているが、今回の測定結果も同様の結果であった。また、13CNMR(MAS)測定によって脂質膜と相互作用したときのカテキン類の運動速度を初めて見積もることができた。3.溶液NMRを用いた解析を発展させ、相互作用に関する新たな知見を得た。特に、13C-ECgを用いた異種核NOE測定や重水素ラベルされたリン脂質を用いた測定により、カテキン類が脂質膜表面と近接して存在しているという確かな証拠を得ることに成功した。リン脂質分子を固定相に持つ特殊なカラム(Immobilized Artificial Membrane:IAMカラム)を用いてHPLC分析を行い、その保持時間からポリフェノール類とリン脂質との親和性を簡便に解析できる系を構築し、カテキン類(EC,EGC,ECg,EGCg)及びメチル化カテキン類(EGCg-4'OMe,EGCg-3"OMe,EGCg-4"OMe,EGCg-4',4"diOMe)のリン脂質親和性を数値化した。EGCg-4"OMe及びEGCg-4',4"diOMeは、EGCgをメチル化して合成した。各カテキン類及びメチル化カテキン類についてIAMカラムを用いてHPLC分析し、得られた各ピークの保持時間(t_R)を式K_<IAM>=(t_R-t_0)/t_0に代入して、K_<IAM>値としてリン脂質親和性を算出した(t_0はIAMカラムに保持されない物質の溶出時間)。カテキン4種類の分析の結果、リン脂質への親和性の強さはK_<IAM>値が大きい順にECg>EGCg>EC>EGCとなり、リポソームへの取り込み量やn-octanol/PBS系での分配係数の結果と強い相関を示した。このことより、化学構造の違いによるカテキン類の疎水性の強弱がリン脂質膜への相互作用の違いを決定づけていることが示唆された。しかし、メチル化カテキン類にはカテキン類で見られた相関性が得られなかった。従って、メチル化カテキン類とリン脂質膜への相互作用には疎水性以外の要因(立体構造やリン脂質分子との安定性)も関与していることが推測された。従来のリポソームを用いた系では、実験操作が煩雑であり、多量の試料が必要であったが、本法は少量の試料で簡便にリン脂質膜に対する親和性を測定することが可能であり、他のポリフェノール類や食品成分とリン脂質膜との親和性評価にも応用できると期待される。