hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
基幹Ｃ４化合物の発酵生産プロセス開発のための基盤研究

(3)宿主菌として想定している大腸菌において、基幹C4化合物中間生成の分解・代謝に関わる酵素遺伝子等の破壊を組み合わせて検討するとともに、これらへの基幹C4化合物生合成経路の導入を行った。(4)基幹C4化合物生合成経路を付与した組換え大腸菌株を用いて、基幹C4化合物生産量改善にむけた培養条件の検討を行った。培養温度、pH等の培養条件に関する検討を行うとともに、菌体内の酸化還元バランスの調節するために、特に酸素供給量とその他の培養条件を組み合わせて検討し、基幹C4化合物の生産性を向上させる培養条件の検討を行った。本研究では組換え微生物を用い、グルコース等の糖源を出発原料とする基幹C4化合物の発酵生産プロセスの開発を行った。そのために基幹C4化合物の新規生合成経路を設計し、経路内の各反応を司る酵素遺伝子の探索とそれらを集約した微生物の創出、宿主菌株の代謝改変、メタボローム解析等による人工生合成経路の最適化、生産条件の最適化を行った結果、基幹C4化合物生産に向けた成果が得られた。以下の研究進展の現状から判断した。(1)現在のところ、高活性型の変異アルデヒド脱水素酵素は得られていないが、スクリーニング系が確立できていることから、さらなる探索により取得できる見込みである。(2)大腸菌内での異種遺伝子発現の効率化を進められた。(3)中間生成物の分解・代謝経路を複数選択し、それらの遺伝子について単独あるいは複数の遺伝子破壊株を取得することに成功している。平成27年度に得られた結果を基にして引き続き、(1)基幹C4化合物生産に適したアルデヒド脱水素酵素の創出・導入、(2)基幹C4化合物生合成酵素発現系の最適化、(3)宿主菌の代謝改変、に関してさらなる検討を進める。(1)に関しては、さらに候補酵素遺伝子の評価・選別を行う。選別した酵素を親酵素として進化分子工学的手法やタンパク質工学的手法を用いた改良を繰り返し行い、高機能型酵素の創出へ向けた検討を進めるとともに、基幹C4化合物生合成経路への組み込みを検討する。(2)および(3)に関しては、各酵素遺伝子の宿主菌株への導入方法やプロモーターの検討等と、基幹C4化合物中間生成の分解・代謝に関わる酵素遺伝子等の破壊を組み合わせて検討する。さらに、(4)これまでの検討で構築した基幹C4化合物生産菌株による生産条件の最適化を図る。28年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物学平成26年度に得られた結果を基にして引き続き、(1)基幹C4化合物生産に適したアルデヒド脱水素酵素の探索・創出、(2)基幹C4化合物生合成酵素系の最適化、(3)宿主菌の代謝改変、に関してさらなる検討を進める。(1)に関しては、収集した候補酵素の評価・選別を行う。選別した酵素を親酵素として進化分子工学的手法やタンパク質工学的手法を用いた改良を繰り返し行い、高機能型酵素の創出へ向けた検討を進める。(2)に関しては、経路内酵素について現状で発現や活性が確認できているものに関しても、本反応に適した性質を有する酵素の探索と適用を適宜試して評価していく。特に、各酵素遺伝子の宿主菌株への導入方法やプロモーターの検討などを通して各酵素反応の力価調節を行う。
複素多様体の研究

リーマン面、さらに一般に任意の可換環の上の代数曲線に対して、自由フェルミオンの共形場の理論を展開した。これは従来複素数上で展開されていたが、理論を任意の可換環の上で展開することによってその数学的本質が従来以上に明らかになりつつある。すなわち、物理学における弦理論を通じて、共形場の理論が数論的多様体と密接な関係があることが従来から指摘されていたが、我々の理論は数論的曲線上での共形場の理論を直接構成したことになっている。さらに、任意の可換環上で共形場の理論を展開する際に、ヴィット(Witt)概型が大切な役割を果たしたが、一方ではヴィット概型は可換形式群の理論と密接に関係している。我々の研究によって、共形場の理論も可換形式群と密接に関係していることが判明した。共形場の理論を構成するための基本的なデータ代数曲線とその上の点から自然にヴィット概型の座標環を構成することができ、形式群とヴィット概型を結びつけるカルティエ(Cartier)の定理が主張するヴィット概型から代数曲線のヤコビ多様体から出来る形式群への自然な写像を具体的に記述することに成功した。これはトポロジーにおける楕円種数の理論と密接に関係していることが期待されており、目下その性質を研究中である。以上の理論は自由フェルミオンという可換なゲージ場に関する共形場の理論に関してであったが、その後この理論を非可換ゲージ場に拡張することが一部可能になった。この理論は代数曲線のベクトル束のモジュライ空間や曲線の退化とモジュライ空間との関係などが関係しており、これを数論的曲線上で展開することが目下進行中である。
受精における卵および精子の細胞内活性化機構に関する研究

今回の研究の目的は、受精直後の初期反応である卵細胞内カルシウムの上昇とそれに続く卵表層顆粒のエキソサイトーシスをリアルタイムに測定する方法を確立し、さらに細胞内カルシウム変動とエキソサイトーシスの間に介在するセカンドメッセンジャーを同定することであった。細胞内カルシウムとエキソサイトーシスはカルシウム感受性蛍光色素Fura2で卵細胞質を標識し、非透過性膜標識蛍光色素TMA-DPHで卵細胞膜を標識することによって測定された。これらの測定は340、380nmの2波長励起に対する510nmの蛍光比と360nm励起に対する450nm蛍光量をそれぞれコンピューター処理装置付き蛍光顕微鏡で解析することにより行われた。またエキソサイトーシスは、共焦点レーザー顕微鏡によりその時間的な変動が画像化された。実験はマウス卵と精子を使って行われた。細胞内カルシウムの上昇は精子の卵細胞膜への融合直後より始まり、一過性の上昇のみの場合とカルシウム振動をみる場合があった。卵表層顆粒のエキソサイトーシスは精子融合後約10分で始まり60分まで続いた。このエキソサイトーシスはBAPTA-AMで細胞内カルシウムをキレートし、その上昇をおさえた場合、完全に制御された。ゆえにエキソサイトーシスが細胞内カルシウムの上昇に依存していることが示された。次に、細胞内カルシウム変動とエキソサイトーシスの間に介在するセカンドメッセンジャーを同定するために、他の内分秘細胞でその介在が示唆されている因子、カルモジュリン、アクチン、低分子量Gプロテイン、NSF等について検討した。この結果、卵表層顆粒のエキソサイトーシスにはカルモジュリン、アクチン、低分子量Gプロテインは関与せず、NSPのみにその関与が示唆された。これらの結果の論文は現在投稿準備中である。
途上国で漁業者が資源管理組織に参加するインセンティブを探る

本研究では、漁業資源の持続可能な利用に向けて、途上国漁村の共同管理を事例に、条件の異なる資源管理組織に属する漁業者の持つ組織参加のインセンティブと、それに影響を与える要因を明らかにすることを目的とする。本年度は、研究代表者の妊娠出産により8月まで研究を中断し9月から再開したが、当初予定していた現地調査を実施することが出来ず、関連文献と関係者からの情報収集に留まった。研究代表者が育児休業を取得し研究を一時中断したこと、また研究再開後も海外渡航が難しく、計画していた現地調査の実施が出来なかったため「遅れている」と評価した。事業期間の延長を申請する予定である。現地の情勢を再確認した上で、質問票の構築、試用、調査地の選定から順次、当初の計画に従い研究を推進する予定である。漁業資源の持続可能な利用に向けて、1990年代以降共同管理が広められてきた。それまで中央集権的だった天然資源の管理は、政府と地域共同体との間で管理の権限と責任を共有する仕組みとなった。近年、共同管理成功の鍵として、漁業者組織におけるリーダーの存在、ソーシャルキャピタル、明確なインセンティブの3要素の重要性が指摘されている。本研究では、外部支援や制度設計により、比較的短期間に変化を起こせるインセンティブに着目し、途上国漁村を事例に、条件の異なる資源管理組織に属する漁業者の持つ組織参加のインセンティブと、それに影響を与える要因を明らかにする。本年度は、研究体制の構築及び文献レビューによる資源管理の意識の測り方として適当な項目のリスト化に取り組んだ。これらをもとに漁業コミュニティのメンバーを対象とした聞き取り調査に用いる質問票作りに取り組み、うち一部を現地で試用し有効性を確認したが、1箇所での試用に留まった。今後、複数箇所での試用と質問票の調整・修正が必要である。年度計画においては、質問票の有効性を確認するための事前調査と質問票の修正、次年度以降の本調査を実施する調査地を選定するための情報収集を現地で行う予定であったが、年度後半に妊娠し、現地調査を実施することが出来なくなった。そのため、カンボジアで実施されているインセンティブを引き起こすと期待されるマイクロファイナンスのプロジェクトに関する情報収集と、同じくインセンティブを引き起こすと期待されるエコツーリズムについて、既にデータを収集済みであったタイ国漁村のエコツーリズムの成功事例の分析と研究成果の取りまとめを行った。本年度は、研究体制を整え、質問票の構築と試用、修正を予定していたが、妊娠により海外渡航による現地調査が困難となり、今年度計画していた事前調査を実施することが出来なかったため、質問票の複数箇所での試用と修正に至らず「やや遅れている」と評価した。本年度は、平成28年度の事前調査を受けて本調査を実施する予定であったが、研究代表者の妊娠により海外での現地調査を実施することが出来なかった。そのため、昨年度試用した質問票の項目整理、及び関連文献の収集にとどまった。7月より産前産後休暇及び育児休業を取得したことに伴い、本研究は中断している。研究代表者が妊娠したため、海外渡航による現地調査が困難となった。また、7月より産前産後休暇及び育児休業を取得したことに伴い、本研究は中断している。そのため、計画より「遅れている」と評価した。次年度は産前産後の休暇、育児休業のため研究を中断し、事業期間の延長を申請する予定である。次々年度に研究を再開し、現地の情勢を再確認した上で、今年度に実施出来なかった質問票の複数箇所での試用、調査地の選定から順次、当初の計画に従い研究を推進する予定である。育児休業終了後研究を再開し、事業期間の延長を申請する予定である。妊娠により海外渡航による現地調査が困難となったため、今年度計画していた現地調査2回分の旅費、謝金が未使用となった。研究代表者の妊娠により、当初計画していた海外渡航による調査が実施出来なかったこと、また7月から研究を中断したため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、研究再開後に現地調査を実施する際、当初の計画に従い旅費、謝金として使用する予定である。研究代表者の育児休業取得に伴い8月まで研究を中断していたこと、9月から研究再開したものの、海外渡航による調査を実施できなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、現地調査を実施する際の旅費、謝金として使用する予定である。

次年度は産前産後の休暇、育児休業により研究を中断し、次々年度に研究を再開する予定である。未使用金は、研究再開後に現地調査を実施する際、当初の計画に従い旅費、謝金として使用する予定である。
組織再生の時空間的制御系と幹細胞化因子の解析

傷害を受けた植物組織は、幹細胞の機能を獲得すると同時に空間位置情報を受容し、適切な位置に適切な組織の再生を行う。しかし、どの細胞が幹細胞化するのか、幹細胞化した細胞が、どのような遺伝子発現を通じて組織を再生しているのか、未解明である。本研究課題は、レーザーマイクロダイセクション法を用いて部位・組織別に回収した極微量組織からのトランスクリプトーム解析とホルモン解析を行い、網羅的かつ定量的な時空間変化を明らかにすることで、ANAC071ファミリーが傷害組織における「幹細胞化誘導因子」であることを示し、組織再生の時空間的制御系を細胞・分子レベルで明らかにすることを目的とする。
質量分析法を用いた超微量分子間相互作用スクリーニング法の開発

質量分析装置のイオン化法としてはMALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization)法を用い、単分子膜と化学修飾とを利用して種々の低分子リガンドを固定化した高機能試料台(ターゲットプレート)を調製し、タンパク質を含む種々の化合物について、質量分析法による超微量で分子間相互作用スクリーニングができる新規な系の確立を目指した研究を行った。本研究の特色は、MALDI型質量分析法における試料台に単分子膜の形成と化学修飾を施すという有機化学的視点を導入することにより、新規で独創的な展開が期待でき、従来にない超高感度(極微量)で高選択的なプロテオーム解析手法の開拓にも繋がる点である。高機能試料台作成に関しては、平滑な金箔上にSH基を用いてアルキル鎖とポリエチレングリコール(PEG)から成る自己組織化法で単分子膜を形成させ、その先に特定のペプチドを共有結合でつなぐ技術を確立させた。すなわち、PEGの一端の水酸基をエステル結合で増炭しつつ官能基変換を行いカルボキシル基あるいはアミノ基とし、ペプチド類をアミド結合で容易に結合できる官能基とした。実際にペプチド類を固定化できたので、試料台へのリガンド固定化技術は完成した。次に、本スクリーニング法の評価を、SH3ドメイン結合ペプチドを固定化して行った。ペプチドを固定化した試料台にSH3を含む多種類のタンパク質を添加し、その後に水で試料台を洗浄し、MALDI-MS測定したところ、SH3のみが高感度・選択的に検出できた。これによって、本法の妥当性が確認できた。現在、別のより高度な系で感度・選択性を確認中である。
ヒトCYPの遺伝子多型による薬物代謝活性変化の網羅的解析

本研究では、ヒトの薬物代謝に関わる酵素の中でも主要な位置を占めるシトクロムP450(CYP)を対象とし、ヒトゲノムの一塩基多型(SNP)情報を基礎とする各種変異体の薬物結合性と薬物代謝活性の網羅的測定を通して、ゲノム情報に基づいたオーダーメード医療を可能にする分子論的指針の確立を目的とした。申請者がすでに構築したCYP2C9の大量発現系を用い、SNP情報に基づき作成したCYP2C9と2C19の各種変異体を調製した。これらCYPの野生型及び変異体について、微量平衡透析法を用いて薬物結合性の測定を行った。HPLCにて薬物結合量を定量したところ、CYP2C9で代謝されるジクロフェナクやワルファリンは予想通りCYP2C9に高い親和性を示したが、従来CYP3A4で代謝されると考えられてきたニフェジピンはジクロフェナクより数倍高い親和性を持つことがわかった。また、ジアゼパムはCYP2C19で代謝されると考えられてきたが、CYP2C19よりCYP2C9に対して高い親和性を持つことがわかった。これらの知見は、これまで考えられてきた薬物-CYPの特異性を根底から見直すべきであることを強く示唆している。さらに、SNP変異体について同様に結合親和性を測定したところ、すべての変異体において親和性が低下することがわかった。このことは、SNPを持つ患者に対して薬物を投与する際に、使用量を減らす必要があることを示唆している。以上の測定に加え、新たにCYPIA2、CYP2D6、及びCYP3A4のクローニングを終え、各タンパク質の精製法を確立した。本研究では、ヒトの薬物代謝に関わる酵素の中でも主要な位置を占めるシトクロムP450(CYP)を対象とし、ヒトゲノムの一塩基多型(SNP)情報を基礎とする各種変異体の薬物結合性と薬物代謝活性の網羅的測定を通して、ゲノム情報に基づいたオーダーメード医療を可能にする分子論的指針の確立を目的とする。今年度においては、まず申請者がすでに構築したCYP2C9の大量発現系を用い、SNP情報に基づき作成したCYP2C9と2C19の各種変異体を調製した。これらCYPの野生型及び変異体について、薬物結合性の測定を行った。CYPを薬物で滴定して吸収スペクトル変化を追跡したところ、ヘム鉄に水が配位した低スピン状態から薬物の結合に伴って高スピン状態へと変化した。この変化の度合いは薬物によって様々であることがわかった。また、微量透析法を用いてCYPに薬物を結合させ、HPLCにて薬物結合量を定量した。CYP2C9で代謝されるジクロフェナクやワルファリンは予想通りCYP2C9に高い親和性を示したが、従来CYP3A4で代謝されると考えられてきたニフェジピンはジクロフェナクより数倍高い親和性を持つことがわかった。また、ジアゼパムはCYP2C19で代謝されると考えられてきたが、CYP2C19よりCYP2C9に対してより高い親和性を持つことがわかった。今後薬物の種類を100種類程度に拡張し、検討を続けていく予定である。

これらCYPの野生型及び変異体について、微量平衡透析法を用いて薬物結合性の測定を行った。HPLCにて薬物結合量を定量したところ、CYP2C9で代謝されるジクロフェナクやワルファリンは予想通りCYP2C9に高い親和性を示したが、従来CYP3A4で代謝されると考えられてきたニフェジピンはジクロフェナクより数倍高い親和性を持つことがわかった。また、ジアゼパムはCYP2C19で代謝されると考えられてきたが、CYP2C19よりCYP2C9に対して高い親和性を持つことがわかった。これらの知見は、これまで考えられてきた薬物-CYPの特異性を根底から見直すべきであることを強く示唆している。さらに、SNP変異体について同様に結合親和性を測定したところ、すべての変異体において親和性が低下することがわかった。このことは、SNPを持つ患者に対して薬物を投与する際に、使用量を減らす必要があることを示唆している。以上の測定に加え、新たにCYP1A2、CYP2D6、及びCYP3A4のクローニーングを終え、各タンパク質の精製法を確立した。
時系列データ統合解析プログラムの開発とこれによる生物時計ネットワークの網羅的解析

本研究では、「生命現象に関する膨大な量の多次元の時系列データを収集・蓄積し、クラスタリング、生物情報と時系列データの相関分析、ネットワークの推定により新規知識を抽出するプログラム」を開発することを目標とした。昨年度までに試作した複数の解析ルーチンを改良し、それらを元にして「時系列データ解析プログラム」を試作した。この「時系列データ解析プログラム」を用いることで、遺伝子発現測定装置から出力される大量の時系列測定データを随時表示・解析しながらデータベース化して記録することに成功した。昨年度までに試作したルーチンを活用して、単細胞性緑藻クラミドモナスのリズム変異体を大規模スクリーニングし、105個のリズム変異体を分離することに成功した。そして、リズム異常の原因遺伝子を30個クローニングすることに成功した。30個の遺伝子に中の6個は、クラミドモナスの時計遺伝子候補であった。今後は、試作プログラムに未搭載の「クラスタリング機能」や「発現制御ネットワーク解析機能」を搭載してプログラム全体を完成させ、他の研究機関と共同で有用性の実証試験を実施する予定である。一方、藍色細菌の網羅的なタンパク質間相互作用ネットワーク解析のために、リアルタイムかつin vivoでタンパク質間相互作用を解析できる実験系の開発を試みた。時計タンパク質-蛍光タンパク質の融合タンパク質がin vivoで時計として機能することを確認したBRETのための株を作製したが、現時点までに時計タンパク質の相互作用をBRETで検出できていない。地球上に生存している生物のほとんどが生物時計を持っている。我々は、原核生物である藍色細菌の時計遺伝子と時計関連遺伝子のクローニングに成功した。解析の結果これらのタンパク質から構成される生物時計装置には、未知の遺伝子発現制御ネットワークやタンパク質相互作用ネットワークが存在していることが予想された。このようなメカニズムを理解するためには、転写・翻訳・分子間相互作用・代謝などの全てのネットワークを網羅的に解析できる手法が必要である。また、このようなタンパク質の機能や動態を解析するには、タンパク質の物性とリズム表現型との間の相関関係を抽出する手法が有効である。そのために本研究では以下のことを達成する:(1)生命現象に関する膨大な量の多次元の時系列データを収集・蓄積し、解析により新規知識を抽出する時系列データ統合解析プログラムの開発(2)藍色細菌の生物時計装置を中心とした遺伝子発現制御ネットワークの解明(3)藍色細菌の網羅的なタンパク質間相互作用ネットワーク解析のために、リアルタイムかっin vivoでタンパク質問相互作用を解析できる実験系の開発<平成18年度の成果>(1)開発するシステムの仕様を決定し、開発環境を整えた。システムは解析プログラムとデータベースサーバからなる。現在、プロトタイプの作成中である。(2)既存のシステムより更にハイスループット、あるいは高感度で測定できる生物発光リアルタイム測定装置を開発中であり、19年度初めには試作機が稼働する。これらの装置と上記プログラムを組み合わせることで様々な発光レポーターと形質を持った株を網羅的に測定することが可能になる。(3)時計タンパク質のBRETと蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を行うためにドナーとなる複数種の発光タンパク質を整備している。藍色細菌においてBRETを行うため株を作製した。現在はBRET測定のための実験条件を検討中である。
多様な循環システムの統合による循環型社会適応型農業モデルの構築に関する研究

本研究のI章「循環型農業の技術的可能性」では、1)完熱堆肥の投入による有機栽培が害虫防除効果を有すること、2)慣行水稲収量の8割程度を確保するとすれば、殺虫剤を使用しない稲作が可能であること、3)こうした栽培が環境修復効果を有することを、4)循環型野菜作農業の養分収支が農業の持続性に貢献していることを事例に基づき明らかにした。また、水鳥と共生する冬期湛水不耕起栽培の可能性および生物系廃棄物と循環型農業のあり方について展望した。II章「循環型農業のLCA評価」では、LCA評価手法を循環型農業に適用する上での課題を検討し、欧州の事例等に学びながらLCA評価に基づく酪農の飼養頭数規模に適した飼料作物栽培面積やそれが確保された場合の循環型農業の実現性等について北海道の事例を対象に明らかにした。III章「循環型農業の展開事例」では、大規模畜産経営、大規模露地野菜作経営、大規模稲作経営を対象にして、経営内循環、コミュニティ・サービス循環、ビジネス循環の組み合わせによる循環型農業への取り組みの現状を分析し、循環を完結に近づけていく上での課題について整理した。IV章「循環型農業の地域マネジメント体制」では、循環型農業を面的に展開していく上で不可欠な田畑輪換等土地利用調整、土づくり、品質管理システムの構築に向けたJA組織等による地域マネジメントのあり方について、3地域の事例調査に基づき明らかにした。V章「循環型農業の法制度的枠組と政策体系」では、「循環基本法」、「農業環境3法」の検討を踏まえ、循環型農業推進の新たな枠組法の体系案を提示し、「食料・農業・農村基本計画」における農業環境・資源保全政策の評価や適正農業規範の実効性確保策について提案した。終章「循環型農業モデルの構築と今後の課題」では、以上の検討を踏まえ、循環型農業モデルを提示するとともに、それを具体化していく上での課題について整理した。補論には、海外調査、森林生態系の動向等に関する研究成果を収録した。研究初年度の本年は、主に多様な循環システムの構築に取り組む国内外の先進的事例を対象に現地調査を行い、技術的および経営経済学的視点から検討を試みた。その結果、例えば技術的視点からの検討では、無農薬・無化学肥料ないしは有機栽培を実施している稲作農家(東北)の分析から、イネの生育に必要な量だけ完熟堆肥を投入することで、害虫を防除し域内の窒素循環が可能となることが明らかになった。また既往研究をもとにわが国の土壌特性の変化を検討した分析からは、リン酸の集積が水田では微増に止まっているのに対して普通畑や樹園地では大きく増加する傾向にあることが明らかになった。一方、資源の経営内循環、コミュニティ循環、ビジネス循環に取り組む先進事例の経営経済学的検討からは、以下の点が明らかになった。はじめに循環型多品目露地野菜生産に取り組む(有)月山パイロットファームでは、独自の輪作体系と雑草防除体系を確立して経営内循環を図ると共に、域内畜産農家の堆肥を用いて地力維持に努めるなどコミュニティ循環も行われており、今後の東北地域における循環型農業のビジネスモデルになりうることが明らかになった。次に、JAを中核としたブロックローテーション転作(米・麦・大豆の2年3作体系)に取り組む宮城県桃生町では、今後の輪作体系として域内耕畜農家の連携による土づくりを確立して行こうとする担い手集団が現れ始めていた。このような資源のコミュニティ循環およびビジネス循環を確立していくためには、個々の農家や農業経営体の取り組みだけでは限界があり、地域資源のマネジメント主体としてJAや市町村の関与が不可欠である。

この点において、地域複合営農方式に取り組む長野県飯島町や、環境保全型土づくりをもとにした減農薬・減化学肥料米の生産・販売を展開する新潟県JA越路さんとうの取り組み内容は、循環型農業を確立していく上で十分に参考になることが明らかになった。今年度は初年度に引き続き、主に多様な循環システムの構築に取り組む国内外の先進的事例を対象に現地調査を行い、技術的および経営経済学的視点から検討を試みた。その結果、例えば技術的視点からは、慣行防除時の約8割の収量を生産者が諒解するならば殺虫剤を使用しなくとも稲作が可能であること、また無農薬栽培には慣行栽培と較べて天敵の増加等の優位性があり、安全なコメづくりの観点からも否定されるべきでないことが明らかにされた。一方、バイオガスのトラック輸送とパイプライン輸送の経済効率性を比較検討したLCA分析からは、長期的(約30年後)にはパイプライン方式に優位性がみられることが明らかにされた(ただし、人件費は考慮せず)。また、循環型農業へのLCAの適用可能性を検討したサーベイからは、LCA研究で頻繁に利用されるCO2や温暖化といった評価指標が、農家の環境負荷改善に向けた誘因になり難いことが明らかにされた。さらに、堆肥の経営内循環とビジネス循環に取り組む2つのタイプの経営比較から、両者の発展経路の相違には、経営者の理念のみならず土地賦存量の違いが大きく影響していることが明らかにされた。このほかに、循環型農業の構築に向けた法制度等の課題を明らかにするために、ドイツ連邦農業研究所、ニーダーザクセン州農林省、シューマックバイオガス社(フライブルグ)を訪問し農林大臣等との意見交換および関連資料の収集を行なった。その分析結果は現在取りまとめ中である。最終年度は、これまでの研究を一層推進し、多様な循環システムの構築に取り組む先進的事例を対象とした現地調査や既往研究(調査データベースを含む)の再検討を行い、循環型社会適応型農業モデルの構築に必要な条件と政策支援のあり方を考察した。その結果、技術観点からは、1)わが国の水田に地力低下は認められないものの、有機質資材の使用にあたっては土壌診断の結果に基づき、腐食度が高く、C/N比の低い、重金属等を含まない資材を施与することが重要であること、2)有機物循環を基本としながら先端技術である肥効調節型肥料や遺伝子組み換え植物を用いた最大効率最小汚染農業の実践が生物多様性に富む自然生態系の保全に貢献すること、4)生物多様性を備えた水田生態系の修復は、水田のみならず池や用水(川)など周辺環境の修復がセットになった時に可能となること、5)家畜糞尿処理システムの開発・改良にPCR-変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法が有効であること、等々が明らかにされた。一方、バイオガスプラントを設置した200頭規模の酪農経営を対象としたLCA分析からは、6)農地への窒素投入量をEU硝酸塩指令と同等と仮定した場合、約80haの飼料作物を栽培することで資料の自給と家畜糞尿の循環が自己完結的に可能となること、7)ドイツのような混合発酵方式の導入によりメタンガスの発生量を約22%増加できれば、化石エネルギーに依存しない持続可能な循環型農業が実現できることが明らかになった。
パッセンジャー変異合成致死性による新規がん代謝治療標的探索

RB遺伝子の近傍に位置するSUCLA2が、RB遺伝子領域の欠失に極めて頻繁に巻き込まれることが判った。65症例の前立腺がんを調査したところ、グレードの高い6症例においてRBとSUCLA2が同時に発現消失していた。さらに、このタイプの遺伝子欠失を持つがんは、前立腺がんだけでなく、様々な希少がんを含むことも判明した。SUCLA2は、TCA回路の一部であるsuccinyl CoAを可逆的にsuccinateに変換するsuccinate CoA ligaseヘテロダイマーのbeta-subunitを構成する重要な代謝酵素であり、この欠失は広汎な代謝経路に影響を与えるものと考えられる。事実、SUCLA2遺伝子の生殖系列欠失は、メチルマロン酸尿症等の先天性疾患の原因となることが判明している。また、我々は、前立腺がんにおけるSUCLA2発現抑制がミトコンドリアの最大呼吸能を低下させることも突き止めた。つまり、SUCLA2の欠失は、がん細胞の代謝経路に「脆弱性」をもたらす。当初は、SUCLA2のアイソザイムであるSUCLG2の阻害が合成致死性を発揮すると考えたが、その効果は、限定的であることが判った。そこで、我々は、SUCLA2を欠く前立腺がん細胞株とそこにSUCLA2を再構成した前立腺がん細胞株を作成、CRISPR-CAS9ライブラリー(全代謝遺伝子2,751種類)を用い、SUCLA2を欠く前立腺がん細胞株において特異的にドロップアウトする代謝遺伝子を検索し、8の候補遺伝子を得た。さらに我々は、SUCLA2欠失前立腺がん特異的に細胞死を誘導する化合物のスクリーニングを行い、現在までに、天然化合物ライブラリーのスクリーニングから、化合物2種類がSUCLA2欠失株特異的に細胞傷害性を示すことを明らかにした。がんにおいてしばしばホモ型欠失するがん抑制遺伝子(ドライバー欠失)の近傍に位置し、このような遺伝子の欠失に「巻き込まれる」代謝遺伝子(パッセンジャー欠失)を探索した。そのような代謝遺伝子のうち、ホモ型欠失時にその機能を補完するアイソザイムのコピー数ないし発現量が少ないものは、アイソザイム遺伝子産物の阻害によって、代謝経路がほぼ完全に遮断され、合成致死性(synthetic lethality)が発揮されることによって、抗腫瘍効果を得る可能性がある。我々は、これまでに、膵がんにおいて29%の頻度で欠失するSMAD4がん抑制遺伝子とmalic enzyme 2(ME2)の同時欠失(約90%)が、そのアイソザイムであるME1あるいはME3の阻害と合成致死性を示す可能性、および、前立腺がんにおいてRB1に随伴欠失するSUCLA2とSUCLG2の阻害が合成致死性を示す可能性を探索してきた。さらに、我々は、特定の腫瘍において合成致死性を来す代謝遺伝子ペアの探索法を工夫し、c-bioportal等のゲノムデータベースを用いて種々のがんにおいて頻繁に欠失するがん抑制遺伝子の近傍を探索し、合成致死性を来すことが期待できる新たな代謝遺伝子ペアを見出した。SMAD4がん抑制遺伝子と高頻度に共欠失するME2とME3の合成致死性については、米国のグループからNature誌に報告がなされ、撤退することになったが、未だ報告のないSUCLA2とSUCLG2の合成致死性については引き続き探索を行った。SUCLA2を欠失する前立腺がん細胞株が入手できなかったため、CRISPR・CAS9法によってSUCLA2を欠失させ、SUCLG2を追加的にノックダウンする実験系を作製した。また、CRIPRライブラリーを作製し、SUCLA2欠失細胞でドロップアウトする遺伝子を同定する実験系の作製を行った。ゲノムデータベースの検索によって、前立腺がんの約15%においてRB1とSUCLA2代謝遺伝子の同時欠失が起こることを見出した。SUCLA2を欠失する前立腺がん細胞株を入手できなかったため、CRISPR・CAS9法によって前立腺細胞株DU145においてSUCLA2を欠失させ、SUCLG2を追加的にノックダウンする実験系を作製した。現在、細胞増殖、細胞生存率、治療感受性に対する差違を観察中である。また、CRISPRライブラリーを作製し、SUCLA2欠失細胞において特異的にドロップアウトする遺伝子を同定する実験系の作製を行った。さらに、特定の腫瘍において合成致死性を来す代謝遺伝子ペアの探索法を工夫し、c-bioportal等のゲノムデータベースを用いて種々のがんにおいて頻繁に欠失するがん抑制遺伝子の近傍を探索し、合成致死性を来すことが期待できる新たな代謝遺伝子ペアを見出した。

当初は、SUCLA2のアイソザイムであるSUCLG2の阻害が合成致死性を発揮すると考えたが、その効果は、限定的であることが判った。そこで、我々は、SUCLA2を欠く前立腺がん細胞株とそこにSUCLA2を再構成した前立腺がん細胞株を作成、CRISPR-CAS9ライブラリー(全代謝遺伝子2,751種類)を用い、SUCLA2を欠く前立腺がん細胞株において特異的にドロップアウトする代謝遺伝子を検索し、8の候補遺伝子を得た。さらに我々は、SUCLA2欠失前立腺がん特異的に細胞死を誘導する化合物のスクリーニングを行い、現在までに、天然化合物ライブラリーのスクリーニングから、化合物2種類がSUCLA2欠失株特異的に細胞傷害性を示すことを明らかにした。CRISPR・CAS9法によって前立腺細胞株DU145においてSUCLA2を欠失させ、SUCLG2を追加的にノックダウンする実験系を用い、SUCLA2とSUCLG2の合成致死性を決定する。既に見出したシーズのがん治療標的としての有効性を明らかにし、かつ、そのPOCを得るために、メタボローム解析や13Cトレーサー法等を用いた代謝フラックス解析を行う。また、標的候補の見出された腫瘍ごとに適切なin vitro及びin vivoモデル系を準備し、阻害剤等の薬効を検討する。更には、同様の標的可能性を示す候補代謝遺伝子群を広範囲の腫瘍・データベースにおいて探索することを目的とする。CRISPR/CAS9法によるSUCLA2のノックアウトに予想以上の時間がかかってしまい、SUCLA2ノックダウンによる合成致死性の検討が遅れてしまった。また、CRISPR/CAS9ライブラリーによるドロップアウトスクリーニングも遅れることとなり、次年度使用額が生じてしまった。平成30年度にSUCLA2ノックダウンによる合成致死性の検討とCRISPR/CAS9ライブラリーによるドロップアウトスクリーニングを行うこととした。
帆走式洋上風力発電施設の基本計画技術確立に関する研究

帆走式洋上風力発電施設は帆の力により浮体を航走させ、排他的経済水域の中の風況の良い場所で効率的に風力発電を行い、得られた電力を水素に変換して我が国へシャトルタンカーにより運搬するというコンセプトである。ここで計画している浮体は長さが約2,000mに及ぶ超大型の浮体で、帆走だけで十分な操縦性能が得られるのか、また強度は大丈夫なのかなどの課題がある。本研究により模型試験と数値計算のレベルではあるが、それらが大丈夫なことが確認された。本研究では帆走式洋上風力発電施設の基本計画の中でもコンセプトの根幹に関わる次の2つの機能用件に焦点を当てて研究を行う。(i)係留無しで自己位置を維持できる機能(ii)台風や巨大低気圧に伴う荒れた気象・海象下でも安全を確保できる機能この2つの機能要件を達成しつつ、且つEPR値を最大限向上させるために、本年度は以下の3項目について研究を実施した。1.全体模型の抵抗試験・斜航試験大阪大学工学部所有の船舶海洋工学水槽と東京大学生産技術研究所所有の海洋工学水槽の主要目と曳引車のスペックから全体模型の主要目を決定し、試験模型の設計及び製作を行った。さらに、この模型を用いて、大阪大学所有の船舶海洋工学水槽において抵抗試験・斜航試験を行った。この実験で主要なのはストラット間の干渉効果とストラットとロワーハル間の干渉影響がどの程度現れるのかを把握することである。これらが、移動速度と斜航角でどのように変化するのかをシステマチックに調査するため、干渉効果がないと考えて得られる推定値との比較も同時に行った。2.風波共存時模型試験計画立案風波共存時の模型試験を自航状態で行うため、実機スケールと模型スケール間での摩擦抵抗増加分および風車に働く風抗力の付加を実現する試験法を検討した。また、風車に働く風抗力と帆に働く揚・抗力を滑車と錘で模擬した航行試験を行い、所定の斜航角で直進することを確かめた。3.航行ロジック・発電量検討衛星データや気象予想データを用いて、最適航路を見つけるためのロジック構築を目指した。その結果、年間設備利用率がコンスタントに40%以上となるロジック構築に成功した。また、そのロジックによる運行シミュレーションで得られる出会い海・気象の統計データを用いて疲労被害度の検討も行った。東京大学生産研究所(西千葉)の海洋工学水槽において19年度に計画した風波共存時模型試験計画に従い、揚力・抗力模擬装置を用いた模型実験を実施した。その結果、ストラット間の干渉影響により、揚力が減少するが、同時に誘導抗力も減少するため、当初の計画より迎角を増やしてやれば、予定の推進性能を発揮することを確かめた。また、上記干渉影響により、基本計画時には想定していなかった回頭モーメントが発生することも判明したが、小型の舵を取り付けることにより航路維持が可能なことが分かった。また、これらの結果に基づいてポーラ曲線を最計算したところ、その形は変わるものの、予定どおりの推進性能を発揮することが分かった。さらに、このポーラ曲線に基づく運航シミュレーションを実施し、45%以上の設備利用率を達成できることを確かめた。(独)国立環境研のプロジェクトでデータ収集が行われた浮体システム基本計画作成に必要な浮体構造の情報、風車や帆の構造や重量、水素発生プラントの容積や重量、水素貯蔵部の容積と重量、その他の補機類の重量などの情報を用い、浮体排水量推定、復原性推定などを浮体形式変更に応じてシステマチックに行える、データ整理編集ソフトを整備した。また、波浪中で作用する応力が小さいと考えられるメインハル+アウトリガーの新浮体形式を提案し、上記ソフトにより、浮体の復原性について検討した。さらに、比較的粗いメッシュを用いての推定であるが、波浪中の流力弾性応答についても計算を実施し、新形式浮体の大まかな構造応答を把握した。今年度は19年度に得られた最適形状ストラットの揚力・抗力のデータと20年度に実施した全体模型の抵抗試験・斜航試験で得られたストラット間干渉効果及びストラットとロワーハルの干渉影響を用いて、操縦性シミュレーションに必要な操縦性微係数を推定した。また、揚力線理論に基づく干渉影響の推定法を開発し、それを用いて操縦性微係数を精度よく推定することが可能になった。これらの値を用いて、一般的な操縦性方程式であるMMGモデルに従って操縦性シミュレーションを実施し、帆走性能を表すポーラ曲線を得た。このポーラ曲線を用いて航行シミュレーションを実施し、昨年提案したロジックにより、40%以上の設備利用率が簡単に得られることを確認した。次に、20年度に提案した数種類のプラントについて、pFFT-FE流力弾性応答解析コードによる波浪中の流力弾性応答解析を実施し、構造要素のうち弱点と考えられるストラット部分に荷重の掛からない全体構想を明らかにした。これに基づき新しいMono-hull Typeのコンセプトを提案した。

この浮体形式に対して、前述の操縦性微係数推定法を適用し新しいポーラ曲線を得、これに基づく航行シミュレーションを実施した。その結果、この浮体形式でも十分な位置保持性能があることと、40%以上の高い設備利用率を簡単に得られることが確認できた。また、疲労強度についても検討し、20年置きの入渠により、浮体構造の健全性を維持できることを確かめた。また、発電単価も従来型より一割程度良くなることも分かった。これらの成果により、帆走式洋上風力発電装置の基本計画技術を確立することができた。
マクロファージ種認識分子CD47遺伝子の異種臓器への導入効果による拒絶回避の戦略

我々はこれまで、ヒトマクロファージによるブタ細胞の貪食機序が、異種細胞間CD47-SIRPシグナルの不応性によるものであることをin vitroで明らかにしてきた。本研究では、小動物モデルにおいてレシピエント種CD47を発現したドナー細胞を確立し、in vivoでCD47遺伝子導入によるマクロファージ性拒絶反応抑制効果を解析することを目的とし、マウスCD47を発現したラットインスリン産生細胞株を作成した。今後はこの細胞株を糖尿病マウスに移植し、CD47遺伝子導入によるマクロファージ性拒絶反応抑制効果を解析する。我々はこれまで、自然免疫応答を司るヒトマクロファージによるブタ細胞の貪食機序が、異種細胞間CD47-SIRP□シグナルの不応性によるものであることをin vitroで明らかにしてきた。本研究ではこれらの研究成果を発展させ、小動物モデルにおいてレシピエント種CD47を発現したドナー臓器を確立し、臓器レベルでのCD47遺伝子導入によるマクロファージ性拒絶反応抑制効果を解析することを目的としている。まずin vivo遺伝子導入装置(CUY21SC)を使用し、レシピエント種CD47を発現したドナー臓器の作製を行った。方法はマウス腎動脈にカテーテルを挿入し、腎臓を電極で挟んだ後にpKS33-hCD47vectorをカテーテルより注入し、パルス出力を行った(75VPon100msec Poff900msec3回)。1週間後、腎臓を摘出しヒトCD47発現を免疫組織染色で確認した結果、限局的にその発現を認めた。次に肝臓に遺伝子導入する目的で、門脈よりpKS336-hCD47vectorを注入し、パルス出力を行った。導入1週間後における肝臓の免疫組織染色では、賢臓よりもヒトCD47の発現効率は低いことが確認された。今後さらにCD47遺伝子導入効率の向上を図った後、遺伝子導入マウス腎臓・肝臓を摘出しex vivoにてヒト全血で腎灌流、肝灌流を行う予定である。灌流はTN式摘出臓器灌流装を改良し、ヒト血液で臓器灌流を行い、定時的に灌流血液・生化学・免疫学的検査と灌流臓器のレーザー微小循環血流計による組織血流を測定する。本研究では、これらの研究成果を発展させ、小動物モデルにおいてレシピエント種CD47を発現したドナー臓器を確立し、臓器レベルでのCD47遺伝子導入によるマクロファージ性拒絶反応抑制効果を解析することを目的としていたが、ドナー臓器の開発が困難であったため、小動物モデルでレシピエント種CD47を発現したドナー細胞を作成し、in vivoでマクロファージ性拒絶反応抑制効果を検討することにした。小動物モデルとしてラット→マウス異種移植モデルで研究を行った。まずラット-マウス間でのCD47-SIRP□シグナルの不応性を証明するため、マウスマクロファージとラット細胞を混合培養し、マクロファージSIRP□にチロシンリン酸化を認めないことを免疫沈降ウェスタンブロット法で確認した。次にマウスCD47を発現したラット細胞を作製した。具体的にはpRcCMV-mouseCD47vectorを用い、ラットインスリン産生細胞株にマウスCD47をリポフェクション法で遺伝子導入した。今後はこのマウスCD47を発現したラットインスリン産生細胞株を糖尿病マウスの腎皮膜下に移植する。糖尿病発症には、ストレプトゾトシン投与モデルを用いる。生着延長効果は血糖値と血清中ラットインシュリン量を指標に検討し、CD47遺伝子導入によるマクロファージ性拒絶反応抑制効果を解析する。
Rasファミリー活性化因子の多様性からのゲノム進化の検討

Rasスーパーファミリー蛋白質は線虫から哺乳類まで保存されている。とくにRasファミリー分子のRas(let60),Rap1(rrp1)R-Ras(ras2),Ra1(ra1)が存在する。(()は線虫にも存在するRasファミリー分子である。)Ras、Rap, R-Rasは哺乳類では複数の遺伝子が存在しているがグアニンヌクレオチド交換因子は共通である。しかし、進化にともない複数のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)が出現し、触媒ドメインは共通していても制御ドメインが異なることから、高次機能の獲得に制御ドメインの獲得が重要と予想した。今年度はRap1分子が遊走する際の活性化メカニズムについて検討した。遊走には単層培養血管内皮細胞のスクラッチモデルでのwound healig assayとマイクロピペットからのスフィンゴシン1-燐酸による走化性誘導刺激による一方向性遊走を行った。方向が決まった運動ではRap1は細胞膜伸展部位で活性化されることがわかった。これは昨年度までに構築したFRET原理をもとに作製したRap1活性化可視化プローブの検討で明らかにした。細胞の運動には微小管の伸展が必要であるが、Rap1から微小管に局在するRAPLへのシグナルが重要であることを示した。Wound healingでは細胞が基質と接着する際にCrkが膜先端部に移動し、膜先端部でのRap1の活性化がおきていた。ここではCrk-C3G(Rap1のGEF)-Rap1のシグナルがおきていることが予想された。また、この方向性をもった細胞運動でも微小管の伸展を伴うことから、Rap1-RAPLのシグナルが重要であると考えられた。ショウジョウバエの極性にはRap1が不可欠であり、哺乳類でもRap1が極性形成に必要であることから、ハエから哺乳類にいたるまでC3G-Rap1系が極性の形成に重要であることが示唆された。
CD28, ICOSを介する補助シグナルとT細胞免疫応答

T細胞の活性化や機能発現に非常に重要な役割を果たす補助シグナル分子において、特に活性化を促進するCD28およびICOSの機能的役割について、細胞内領域に変異を導入したトランスジェニックマウスを用いて研究を行った。獲得免疫応答の制御においてT細胞は中心的な役割を果たしている。T細胞の活性化や機能発現には抗原特異的なシグナルに加え補助シグナル分子を介するシグナルを必要とする。特にCD28ファミリー分子はT細胞の活性化に極めて重要な役割を果たしており、CD28分子をノックアウトした場合免疫不全に近い状態に陥る。また、CD28シグナル非存在下でTCRシグナルのみが伝達された場合、抗原特異的な負応答性が誘導される。これを利用して、我々にとって不利益なアレルギー反応や移植臓器の拒絶反応を補助シグナル阻害することで緩和できないかという試みがなされてきている。本研究では、CD28及びCD28のファミリー分子であるICOSの細胞内領域に変異を導入した変異分子を発現するマウスを用いて、CD28及びICOSのシグナル伝達経路のメカニズムを解明し、T細胞の機能発現における補助シグナルの役割をより詳細に検討することを目的としている。本年度はCD28の細胞内領域に存在する機能的モチーフ(YMNMモチーフ及び二つのPxxPモチーフ)が、CD28のチロシンリン酸化とT細胞の機能(増殖、IL-2産生)にどのような役割を果たしているのかを中心に検討した。その結果、CD28のチロシンリン酸化にはYMNMモチーフのチロシンが必須であること。このチロシンのリン酸化がナイーブCD4^+T細胞の増殖やIL-2産生に重要なこと。これまでCD28のチロシンリン酸化誘導に重要であるとされていたC末端側のPxxPモチーフはCD28のチロシンリン酸化には関与しないこと。しかしながらC末端側のPxxPモチーフに変異を導入するとT細胞の増殖やIL-2産生が減弱すること、が明らかとなった。以上のことから、CD28はチロシンのリン酸化依存的な経路と非依存的な経路の両方の経路を活性化させてT細胞の機能発現を惹起していることが明らかとなった。T細胞の活性化・機能発現には抗原特異的なシグナルに加えて、補助シグナル分子を介するシグナルが非常に重要であり、その中でも、CD28ファミリー分子は初期の活性化やサイトカイン産生、エフェクター細胞の機能発現において最も重要である。そこでCD28ファミリー分子を介するシグナル伝達経路の解析と生体内でのT細胞の反応におけるCD28ファミリー分子の役割を同時に解析する方法として、CD28及びICOSの細胞内領域に変異を持つ変異補助シグナル分子を発現するトランスジェニックマウス(Tg)を作製した。CD28及びICOSは細胞内領域に酵素活性を持っておらず、細胞内領域に様々な分子をリクルートすることによりシグナルを伝達することが明らかとなっている。CD28細胞内領域の各種変異TgマウスのT細胞を抗CD28抗体で刺激したところ、YMNMモチーフのYをFに置換した場合、CD28のチロシンリン酸化がほとんど見られなくなり、ERKやAktのリン酸化誘導が減弱した。この結果からCD28細胞内領域にはチロシン残基は4つ存在しているが、YMNMモチーフのYがチロシンのリン酸化に必須であることが明らかとなった。また、このYF変異CD28を発現するT細胞は、抗TCR抗体と抗CD28抗体で刺激した際の増殖やIL-2産生が野生型CD28を発現するT細胞と比較し減弱することが明らかとなった。一方、Lckが結合しCD28のチロシンリン酸化に重要であるとされていたC末側のPxxPモチーフに変異を導入した場合、チロシンのリン酸化には変化が見られなかったものの、T細胞の増殖やIL-2産生は減弱した。従って、CD28の補助シグナルにはCD28のチロシンリン酸化に依存する経路とそうでない経路があることが示唆され、それぞれ、YMNMモチーフとC末側PxxPモチーフが重要な役割を果たしていることが示唆された。T細胞の活性化・機能発現には抗原特異的なシグナルに加えて、補助シグナルが重要であり、中でもCD28ファミリー分子が最も重要な役割を果たしている。CD28ファミリー分子であるCD28及びICOSの細胞内領域に変異を持つトランスジェニックマウス(Tg)を作製し、CD28及びICOSを介するシグナルの役割について検討した。また、GVH病の動物モデルを用いてin vivoにおけるCD28シグナルの役割について検討した。CD28補助シグナルは、T細胞増殖因子であるIL-2の産生を強力に促進する。一方、ICOSのIL-2産生誘導能は弱い。そこでICOS細胞内領域の機能的モチーフであるYMFMモチーフをCD28が有するYMNMモチーフに置換した、ICOS YMNM-TgマウスのT細胞をTCRとICOSに刺激をしたところ、CD28刺激とは異なり、強いIL-2産生は誘導されなかった。さらに、ICOS分子の細胞内領域をCD28の細胞内領域に置換した、ICOS-CD28 chimera-TgマウスのT細胞でも強いIL-2産生は誘導されなかった。以上から、CD28の強いIL-2産生誘導能には、細胞内領域のみならず、細胞膜貫通領域や細胞外領域も関与している可能性が示唆された。

変異CD28を発現するTgマウスをドナーとし、急性GVH病の動物モデルを誘導したところ、WT CD28を発現するマウス以外は急性GVH病が発症しなかったことから、CD28細胞内領域の変異を導入したいずれのモチーフも急性GVH病の誘導に重要であることが明らかとなった。また、細胞内領域を欠失した変異CD28を発現するマウスをホストに慢性GVH病を誘導したところ、野生型をホストとした場合は見られない全身性強皮症様症状が誘導された。今後、この病状の変化を明らかにすることで、強皮症様症状に関わるメカニズムを明らかにする計画である。
ヒト大うつ病障害診断バイオマーカーの選定評価

現在、うつ病疾患の解明は大きな課題となっている。しかしながら、うつ病疾患の診断は、医師による患者の主観的症状の判断や問診に基づいており、生物学的所見に基づく定量性や客観性を持った診断や予防が非常に困難な状況にある。そこでこれらを克服するために、妥当性のある有用な診断バイオマーカーを確立することが重要であると考えられる。しかしながら他の疾患と比べてうつ病疾患の場合、他の疾患で見られるような生物学的な疾患病態について、未だ明らかになっていないことが多い。よって、ヒトうつ病疾患患者の血漿や脳脊髄液成分由来のオミックス解析から様々なユニークな疾患代謝産物が次々と同定されてきているにもかかわらず、動物レベルでの研究手段が限られているため、同定された疾患代謝産物の機能とうつ病疾患の病態との関係性を明らかにすることが困難な状況にある。すなわち、ヒトうつ病疾患の診断や治療経過判断に向けた妥当性の高い有用なヒトうつ病疾患診断バイオマーカーの確立に向けて大きな障害となっているのである。そこで本申請研究課題では、連携研究者である功刀浩博士と服部功太郎博士らによってヒトうつ病疾患患者由来の血漿成分もしくは脳脊髄液成分から同定された。およそ200種類の疾患代謝産物群を網羅的にマウスの脳室・脳実質内投与もしくは血液内投与する。そしてこれら疾患代謝産物投与による脳機能への影響について、動物行動薬理学的試験とin vivo脳機能イメージング法によって、解析を行う。これにより妥当性の高い臨床応用にむすびつく有用なヒトうつ病疾患診断バイオマーカーを確立させる。本年度も平成29年度に引き続き、ヒトうつ病疾患代謝産物のマウスの脳室・脳実質内への投与とマウスのin vivo 2光子脳機能イメージングによる脳内活動変化の計測を行った。他の疾患と比べてうつ病疾患の場合、他の疾患で見られるような生物学的な疾患病態について、未だ明らかになっていないことが多い。よって、そこでこの状況を打開するためには、今まで行われてきた動物行動薬理学的な実験系に加えて、同定された疾患代謝産物によって脳内がどのような生理的変化を起こすのか、脳内反応を直接モニターし、神経生理学的にヒトうつ病疾患診断バイオマーカーを評価することが必要であると考えられる。以上のような背景の下、平成29年度に確立された方法を用いて、疾患脳代謝産物の中でも特に疾患スコアとの相関が強い疾患代謝産物を3種選定した。これらは、浸透圧ミニポンプを使用して脳室・脳実質内投与された。また、同定された疾患代謝産物の脳室内投与によって脳内がどのような生理的変化を起こすのか、脳内反応を直接モニターし、神経生理学的にヒトうつ病疾患診断バイオマーカーを評価するためのマウスのin vivo2光子脳機能イメージング法の評価方法を開発し論文に報告した(O'hashi et. al., 2019)。また引き続き、3種の疾患代謝産物をうつ病と関連が想定されている大脳皮質前頭野の投与を行い、オープンフィールド試験、尾懸垂試験、強制水泳試験、シュクロース嗜好性試験を行い行動学的にもヒトうつ病疾患診断バイオマーカーを評価している。現在、申請者が発表した論文の方法によって、マウスの脳室・脳実質内に投与された疾患代謝産物によって投与部位の神経活動がどのような変化を起こすか解析中である。今後は、この方法で神経生理学的にヒトうつ病疾患診断バイオマーカーを評価するだけでなく、一般的なうつ病モデル動物にもこの方法を適用し、神経活動がどのように変化しているのか解析する。in vivo2光子イメージングやマクロイメージングによって神経回路網活動や構造変化を観察すれば、うつ病疾患代謝産物の機能だけでなく、うつ病の病変部位の特定や病変機序など、動物レベルでうつ病発症のメカニズムを探れるのではないかと考えている。そこで本申請研究課題では、連携研究者である功刀浩博士と服部功太郎博士らによってヒトうつ病疾患患者由来の血漿成分もしくは脳脊髄液成分から同定されたおよそ200種類の疾患代謝産物群を網羅的にマウスの脳室・脳実質内投与もしくは血液内投与する。本年度は、マウスの脳室・脳実質内投与法の確立および血液内投与法の確立とマウスのin vivo 2光子脳機能イメージング法のセットアップを行った。