hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
葉酸リセプターベータ発現活性化マクロファージを標的とした慢性炎症の治療薬の開発

抗葉酸リセプターβイムノトキシン関節内投与によるメチル化BSA誘発関節炎の治療効果を示した。さらに静脈注射によるブレオマイシン誘発強皮症の線維化抑制を皮膚の肥厚、ハイドロキシプロリン量の減少により明らかにした。また、皮膚線維化部位に早期に浸潤するマクロファージは葉酸リセプターβ発現、TGFβ産生細胞であり、イムノトキシンの投与はこれらのマクロファージ数を減少させた。このモデルでの線維化抑制の機構としてイムノトキシンによるCTGF産生の抑制は早期では明らかでないことから、TGFβ産生マクロファージの減少の結果、CTGF産生を産生する線維芽細胞が減少することが示唆された。1)抗葉酸リセプターベータ(FRーB)抗体による強皮症線維化抑制効果:昨年度、ブレオマイシン皮下投与によるマウス強皮症モデルにおいて、抗マウス葉酸リセプターベータ抗体イムノトキシンを静脈注射したところ、皮膚のFRーB発現マクロファージの減少が見られたことを報告した。今年度ブレオマイシン投与4週経過のマウスにおいて、抗マウス葉酸リセプターベータ抗体イムノトキシンの静脈注射は皮膚の肥厚、ハイドロキシプロリン量の減少を生じることを明らかにした。また、ブレオマイシン投与8日後のTGF-β産生細胞の多くは、FRーB発現マクロファージであることを明らかにした。さらに強皮症モデルに対する抗葉酸リセプターβ抗体イムノトキシンは、皮膚TGFβ産生を抑制することをリアルタイムPCR法にて明らかにした。また、2週間計5回のイムノトキシンの投与では、トキシンに対する免疫原性は少なかった。以上の結果から、強皮症の皮膚線維化抑制に抗マウス葉酸リセプターベータ抗体イムノトキシンを静脈注射は有効であり、治療への展開が期待できると考える。2)血清可溶性葉酸リセプターベータの測定:関節リウマチ患者血清において、血清可溶性葉酸リセプターベータが生物製剤効果の判定の指標となるかについて検討した。10名の患者において、生物製剤治療前、治療後1か月、3か月において血清可溶性葉酸リセプターベータ値とSDAI,cDAI, DAS28値と相関をみたところ、比例する傾向がみられたが有意差はなかった。さらに症例を追加検討する。3)葉酸リセプターベータに結合する生体内の葉酸誘導体の探索:昆虫細胞をもちいて、可溶性葉酸リセプターベータを多量に精製することに成功した。現在可溶性葉酸リセプターベータカラムをもちいて、炎症血清や臍帯血に葉酸リセプターベータに特異的に結合する葉酸誘導体が存在するか検討している。1抗葉酸リセプターβ抗体による強皮症線維化抑制効果:昨年度抗葉酸リセプターβ(FR-B)抗体イムノトキシンによるマウス強皮モデルの線維化抑制効果を明らかにしたが、今年度は強皮症モデルでは初期の浸潤マクロファージの多くはFRーB陽性、TGFβ産生細胞であることを明らかにした。また、イムノトキシンによるconnective tissuegrowthfactor産生抑制は軽度であった。臨床応用を考え、抗体の静脈注射での治療効果を検討したが、皮膚の厚さやハイドロオキシプロリン量の有為な減少はみられなかった。2新規葉酸誘導体の検索:可溶性葉酸リセプターβに結合する新規の葉酸誘導体を関節リウマチ関節液を用いて検討したが、HPLCによる解析では葉酸、5メチルテトラハイドロ葉酸、テトラハイドロ葉酸と異なるピークは検出できなかった。3抗葉酸リセプターαβ抗体の発見:抗葉酸リセプターβ抗体の中に葉酸リセプターαとも反応する抗体が見出されたので、この抗体の性質について検討した。この抗体は既知の抗葉酸リセプターα抗体や抗葉酸リセプターβ抗体に比べて高親和性であることを可溶性葉酸リセプターα、可溶性葉酸リセプターβをもちいて明らかにした。1抗葉酸リセプターベータ(FRーB)抗体による強皮症線維化抑制効果ブレオマイシン皮下投与によるマウス強皮症に抗マウスFRーB抗体イムノトキシンを静脈注射したところ、皮膚内のFRーB発現マクロファージの減少が見られた。現在、ブレオマイシン投与3週経過マウスにおいて、皮膚の肥厚、ハイドロキシプロリン量、TGF-beta量への影響を検討している。2ラット関節炎における抗ラットFRーB抗体イムノトキシンの治療効果抗ラットFRーB抗体イムノトキシンをメチル化BSA誘発関節炎の関節局所投与をおこなったところ、コントロール群(PBS,VHーPE38)に比べて有意に、関節腫脹の軽減や病理組織学的に、炎症病態の軽減、軟骨・骨破壊の抑制効果がみられた。

既にヒトのインビトロの系において葉酸リセプターベータ発現マクロファージが破骨細胞になることを示しているが、実際カテプシンK陽性の破骨細胞も減少した。この成果は印刷中である。3血清可溶性葉酸リセプターベータの測定測定系におけるリウマチ因子の影響を避けるため、キャプチャード抗体をF(ab)`2に処理し、関節リウマチ患者関節液10例と変形性関節症患者関節液10例の可溶性葉酸リセプターベータ値の測定をおこなった。関節リウマチ患者関節液において有意な増加がみられた。また、M1,M2刺激による可溶性葉酸リセプターベータの産生を測定したが、明らかな差はみられなかった。現在、関節リウマチ患者血清において、生物製剤の効果の判定になり得るかについて検討している。1抗葉酸リセプターベータ(FRーB)抗体による強皮症線維化抑制効果次年度はヒト強皮症皮膚のFRーB発現細胞について検索する予定であるが、ほぼ計画を達成しており、論文作成中である。2血清可溶性葉酸リセプターベータの測定はほぼ計画を達成しており、学会発表予定である。3葉酸リセプターベータに結合する生体内の葉酸誘導体の探索次年度集中して、研究をおこなう。4ラット関節炎における抗ラットFRーB抗体イムノトキシンの治療効果計画を達成し、論文掲載をおこなった。(1)の理由ラット関節炎における抗葉酸リセプターベータイムノトキシン関節局所投与の有効性を示すことができた。可溶性葉酸リセプターベータの測定系を確立した。さらに昨年度十分な検討ができなかった葉酸リセプターベータに結合する生体内の葉酸誘導体の探索をおこなう。抗葉酸リセプターベータ抗体の臨床応用が本研究の目的であり、動物実験において、強皮症の肺線維症、皮膚線維症や関節炎局所注の有効性が示唆された。今後抗体のヒト化やトキシンの免疫原性の低下に向けての研究をおこなう予定である。平成24年度は、可溶性葉酸リセプターβの測定系を既に確立したので、関節リウマチ患者血清の可溶性葉酸リセプターβ測定をおこなう。平成23年度に引き続いて強皮症モデルにおける抗FRーβ抗体イムノトキシンの線維化抑制効果についての研究をおこなう。また、平成23年度に着手できなかったFRーβに高親和性の葉酸誘導体の開発や抗マウスFRーβ抗体RNase、抗マウスFRーβ抗体NFーkBインヒビターの作成をおこなう。平成25年度は、炎症モデル動物における抗マウスFRーβ抗体RNase、抗マウスFRーβ抗体NFーkBインヒビターの作用の検討をおこなう。FRーβに高親和性の葉酸誘導体とトキシンや薬剤をリンカーにて結合させ、インビトロの系にてこれらの炎症抑制効果を検討する。葉酸リセプターベータに結合する生体内の葉酸誘導体の探索次年度集中して、研究をおこなう。特に葉酸誘導体の同定のためには、HPLCと質量分析計を使用するための研究費が必要である。また、最終年度のため、論文発表の費用、学会発表の費用が必要である。可溶性葉酸リセプターβ測定の抗体作製、精製の為の試薬が必要である。強皮症モデルにおける抗FRーβ抗体イムノトキシンの線維化抑制効果についての研究のため、動物購入費、イムノトキシン精製の為の各種カラムが必要である。
人の動作の冗長性の映像解析によるオンライン抽出

今年度も,昨年度に引き続き,中華鍋操作の基本動作を一例にとりあげ,技能動作習得過程に関する基礎的な分析を進めた.まず,動作を,マーカの軌道や主成分得点の時系列推移によって特徴付けしたが,これでは,教師のアドバイスと非熟練者の習得過程との関連については十分な考察は困難であった.そこで,中華鍋操作の基本動作が周期的な動作であることに注目して,動作の基本周期,基本周波数の寄与率,標準偏差,位相差の四つの評価指標を用いて動作の詳細な特徴付けと考察を行った.この結果,習得過程におけるアドバイスの影響を示すことができ,習熟度によってアドバイス内容に差異があること,非熟練者によってアドバイスの解釈が異なること,などがわかった.また,非熟練者の状態変化を適切に把握するためには,外から観察するだけでは不十分であり,非熟練者と教師のやり取りなど,その状態に至るまでの経緯に対する理解が求められることが示された.教師は,アドバイスとそれによる動作の変化をみながら,非熟練者の状態に関する理解を深め,それに応じて,その都度アドバイスを追加・変更し,非熟練者の動作を矯正していく.このことは,アドバイス付きの技能動作の習得過程は,非熟練者が動作のコツを理解し,習得していく過程であるだけではなく,その非熟練者の状態を,教師がインタラクションを通じて把握していく過程でもあることを示している.したがって,技能動作習得過程の支援のためには,非熟練者の状態に関する理解を容易にするような,教師とのインタラクションの設計が一つのポイントとなる.(1)映像解析による動作の数量化:今年度は,動作のポイントとなる代表的な点の特徴量を,ハリスの特徴点検出オペレータとそのトラッキングの枠組みにおいて数量化した.特徴点は画像中で濃淡変化が比較的急峻な部分において検出されるため,その位置は一般に動作に追従しやすいが,照明に対する人の動きに伴って見え方が変化するとトラッキングが困難になるという問題があった.そこで,特に特徴点周辺の輝度パターンを局所的な画像基底で表現し,動作に従って対象の見え方が変化する場合でも安定な追従を行う特徴量を開発した.原理的に,様々に変化する見え方をそれら基底の線形結合で近似できる手法であり,その有効性を実画像で確認した.(2)人の動作の基本解析:映像解析のためのアルゴリズムは開発中であったため,今年度は,映像データは利用せず,動作の理論モデルに基づいて,動作習熟過程の基本的な理解を目指した.動作の事例として,組み立て作業の中で部品間の接触を伴う組み付けフェーズの動作を取り上げ,その習熟の過程を,組み立てに伴う種々の誤差の効率的な吸収の仕方を学習するプロセスとしてモデル化した.組み付けには,部品・ワークの寸法誤差・形状誤差や作業誤差などの様々な誤差が影響するが,これまでの組立作業設計に関する研究ではこれらの誤差にどの様に対応するべきかまでは検討できていなかった.そこで,接触状態を定義するだけではなく,どの接触状態にそれぞれいくらの確率で存在するかを表わす概念状態を導入し,この概念状態の遷移図上で組立作業経路を構成する新組立作業設計法を提案した.さらに,この組立作業設計法を具体的な組付けモデルに適用することによってその有用性を確認した(1)映像解析による動作の数量化:映像解析の手掛かりとして、動作のポイントとなる特徴点群の抽出とそれらの追跡を行うにあたり、昨年度は追跡する特徴点周辺の輝度パターンを局所的な画像基底で表現することを提案したが、今年度はさらに、照明位置を変化させる前処理なしで時系列画像そのものから追跡点周辺の照明変動基底を獲得し、それらを逐次更新しながら追跡する手法を開発した。これにより、陰影変化の輝度分布への影響が支配的で従来法では対応の難しかったテクスチャレス領域での特徴点追跡に成功した。人体の剛体部分に関しては、特徴点群の座標の軌跡を含む行列の因子分解などにより動作の数量化が可能である。(2)人の動作の基本解析:今年度は、人の動作の具体的な事例として中華鍋の操作を取り上げ、全身の動きのデータ取得を試験的に行った。映像解析のためのアルゴリズムは引き続き開発中であるため、MC(モーションキャプチャ)システムを備えた専用のスタジオを利用し、マーカ付の専用の衣服を着用した被験者の動きを、それらマーカの3次元座標を連続的に表示することによって可視化した。動作の冗長性を明らかにする観点から、特に熟練者と非熟練者のそれぞれを被験者として対象動作の撮影を行い、それらの動作間で差異が観測されることを定性的に確認した。また、その差異のうち動作の習熟に影響の大きい部分の見極めとその数値化を行う方法について検討した。今年度も,昨年度に引き続き,中華鍋操作の基本動作を一例にとりあげ,技能動作習得過程に関する基礎的な分析を進めた.まず,動作を,マーカの軌道や主成分得点の時系列推移によって特徴付けしたが,これでは,教師のアドバイスと非熟練者の習得過程との関連については十分な考察は困難であった.そこで,中華鍋操作の基本動作が周期的な動作であることに注目して,動作の基本周期,基本周波数の寄与率,標準偏差,位相差の四つの評価指標を用いて動作の詳細な特徴付けと考察を行った.

この結果,習得過程におけるアドバイスの影響を示すことができ,習熟度によってアドバイス内容に差異があること,非熟練者によってアドバイスの解釈が異なること,などがわかった.また,非熟練者の状態変化を適切に把握するためには,外から観察するだけでは不十分であり,非熟練者と教師のやり取りなど,その状態に至るまでの経緯に対する理解が求められることが示された.教師は,アドバイスとそれによる動作の変化をみながら,非熟練者の状態に関する理解を深め,それに応じて,その都度アドバイスを追加・変更し,非熟練者の動作を矯正していく.このことは,アドバイス付きの技能動作の習得過程は,非熟練者が動作のコツを理解し,習得していく過程であるだけではなく,その非熟練者の状態を,教師がインタラクションを通じて把握していく過程でもあることを示している.したがって,技能動作習得過程の支援のためには,非熟練者の状態に関する理解を容易にするような,教師とのインタラクションの設計が一つのポイントとなる.
現代中国の「代耕農」現象にみる移動のハビトゥスの民族誌的研究

中国の農村地帯は現在、相次ぐ工場建設や若者の流出、高齢化の進展に起因する、農業従事者の構造変化という新たな局面を迎えている。それを端的に象徴するのが、「代耕農」、即ち外地から流入してきた農業従事者の存在である。本研究は、「代耕農」に関する現地調査を通して、中国沿海部地域の現在を端的に象徴する「よそ者」に依存した農村の存立形態について明らかにするとともに、かれら「よそ者」らの一種の生存戦略として見なしうる頻繁かつ柔軟な移動実践を「移動のハビトゥス」と概念化し記述することにより、中国の社会的動力の一端を通時的/共時的位相において探究する。
沿岸堆積物境界層におけるデトリタス食物連鎖と有機物の分解過程

本研究は海底の堆積物と底層との境界層におけるデトリタス食物連鎖とそこでの炭素・窒素の動態について解析を行った。モデル海域として神奈川県・三崎付近の水深10mの内湾を選び、海底境界層付近における微生物群集の季節変化、環境因子の解析、底生成物の現存量とその代謝活性等について1992年度に現地調査を行った。本年度は得られた試料の分析および補足調査を8-9月に行なった。本研究では海底最表層の供給源である沈降粒子についても、海底設置型の時系列式セヂメントトラップを開発して測定を行った。この一連の解析で得られた成果は以下の通りである。(1)堆積物最表層において細菌群集および従属栄養鞭毛虫類は単位体積当たり最大値を示したが、堆積物の深度に従っての減少は従属栄養鞭毛虫類の方が大きかった。又水中と堆積物最表層中での細菌群集と従属栄養鞭毛虫類の数を比較すると、水中では約1000:1に対して堆積物最表層では約100:1と従属栄養鞭毛虫類の割合が増加していた。このことは堆積物最表層が微細な有機デトリタス等、細菌群集以外にも従属栄養鞭毛虫類の餌料となるものが多いことを反映していると考えられる。(2)沈降粒子の内、海底近傍でトラップされるものは堆積物最表層と比較的類似した有機物組成を示し、明らかに中層での有機物に富んだ沈降粒子とは異なっていた。又海底設置型のトラップ実験からは、沈降とそこからの剥離の二つの現象が同時に起こっていることが推定され、海底境界層での物質輸送を考える時水平方向での輸送が重要であることが分かった。(3)堆積物中の有機炭素の鉛直分布は季節的に有為な変動を示しこれには表層での植物プランクトンの生産・沈降が大きく寄与している。更に表層5cmまでの有機炭素量の増加は底層への供給とほぼ1カ月以内で同調しており、底生生物による堆積物の物理的撹乱が考えられる。この海域には春先多くの底性生物の現存量・活性がありこの考えと矛盾しない。本研究は内湾域や沿岸域での炭素・窒素循環における堆積物ー底層水境界層の重要性に注目し、その物質循環における役割を定量的に把握することを目的としている。本年度はモデル海域として相模湾に面した小網代湾の水深約10mの定点を選び、堆積物表層から水表層の光合成層までの、懸濁物質の特性や生物組成及び生物量の推定、溶存栄養塩の鉛直分布等の季節変化の解析を行った。その結果海底直上約10-20cmまでに、その上の層とは栄養塩等の溶存物質の濃度が明らかに異なり且つ懸濁粒子の多い層が、春から秋にかけて検出された。又各種のセジメントトラップによる沈降粒子の解析では、堆積物に直接設置したトラップのほうが、水中に設置したトラップより捕集速度が高いこと、又シリンダー状のトラップに比較して、平面状のトラップに捕集され沈降物の性状が異なることが明らかになった。これらの結果は、浅海域の底層付近では水平方向での懸濁物の移動が、鉛直方向での移動に比べて卓越していることを示唆している。又水平方向での移動の場合、比較的比重の小さい有機物に富んだ分画が、より異動しやすいことも明らかになった。しかし現場の堆積物を使った再懸濁実験では、現場で観測される通常の流速範囲での堆積物最表層の再懸濁はあまり大きくないことが示唆された。これは堆積物最表層に発達した、おそらく生物活動による3次元的マトリックスによるものであり、このようなはっきりした最表層の構造と、水平方向での再懸濁物質の活発な移動という現象は現在のところ矛盾している。この点に関しては今後最表層の構造と生物活動との関係を明らかにしていくことで解析を進めたい。又大型ベントスの機能にかんしても、顕微鏡とビデオカメラを組み合わせて、代謝活性を定量化する手法を開発し、現在デーテの解析中である。

(2)沈降粒子の内、海底近傍でトラップされるものは堆積物最表層と比較的類似した有機物組成を示し、明らかに中層での有機物に富んだ沈降粒子とは異なっていた。又海底設置型のトラップ実験からは、沈降とそこからの剥離の二つの現象が同時に起こっていることが推定され、海底境界層での物質輸送を考える時水平方向での輸送が重要であることが分かった。(3)堆積物中の有機炭素の鉛直分布は季節的に有為な変動を示しこれには表層での植物プランクトンの生産・沈降が大きく寄与している。更に表層5cmまでの有機炭素量の増加は底層への供給とほぼ1カ月以内で同調しており、底生生物による堆積物の物理的撹乱が考えられる。この海域には春先多くの底性生物の現存量・活性がありこの考えと矛盾しない。
アクチナイド化合物に於るcーf混成効果の理論

本理論班は他理論班である芳田班と密接に協力し乍ら、専ら実験グループと直接協力して行う理論研究を中心に今年度も以下に示す様な成果を収め、概ね初期の目標を達成した。1.バンド理論は最も定量性の高い計算として諸理論の出発点となっている。我々はfー電子の様な最も複雑な系にも相対論的効果をきちんと含んだ対称性で分類されたバンド計算を自己無矛盾に遂行するプログラムの開発を目指して来たが、今年度に於て略完了し、現実に作動を始めている。これは特にフェルミ面の実験の解析に最も偉力を発揮するが、永年の懸案であったCeSn_3のフェルミ面の精密実験が極めて純良な単結晶の育成に成功した大貫により行われ、上記の方法による長谷川のバンド計算が極めて良い一致を示し、この問題に結着をつけた。これは世界的にも最も進んだものであり、今後更に大きな偉力を示すと思われる。2.不純物近藤状態の理論は、静的熱力学量については厳密解が得られているが、より複雑な系及び動的物理量については近似解しかない状況である。酒井等はこの問題に対して繰込群の方法を拡張して厳密解を得るのに成功しSmやTmのより複雑な近藤系の静的及び動的物理量の厳密解を得るのに成功し、多くの重要な知見を得つつある。ウラン系は比較的弱い相関という意味で最も複雑な系であり、今後はウラン系への適用が大きなテーマになる。3.その他従来の延長の仕事も著実に進歩している。特に酒井、竹茂の光電子分光等の内殻励起に伴うスクリーニング機構の研究は従来の解釈の変更を求める重要なものである。又同じ強相関系としての高温超伝導系との比較、類似性に伴った研究も多くなされている。尚、理論研究会は芳田班及び高温超伝導の理論班である福山班と合同で行われた。
ヒストン修飾を標的とした天然物の探索とエピジェネシス制御機構解析への応用

本研究では,ヒストン修飾を司るポリコーム複合体中心分子BMI1,およびBMI1の発現を制御することが知られているウィント(Wnt)やヘッジホッグ(Hh)シグナルに作用する化合物を見出すことを目的として,天然物を対象としたスクリーニング研究を行った.BMI1プロモーター活性を評価するルシフェラーゼ細胞アッセイシステムを構築し,良好な活性を示す植物種を数種選別した.一方,Wntシグナル阻害作用をもつ天然物として,オオバコ科植物からジテルペン,センダン科植物からリモノイドを単離し,またナス科植物からHhシグナル阻害作用をもつ高度に酸化されたステロイド誘導体を単離した.本研究では,ヒストン修飾を司るポリコーム複合体中心分子BMI1,およびBMI1の発現を制御することが知られているウィント(Wnt)やヘッジホッグ(Hh)シグナルに作用する化合物を見出すことを目的として,天然物を対象としたスクリーニング研究を行った.BMI1プロモーター活性を評価するルシフェラーゼ細胞アッセイシステムを構築し,良好な活性を示す植物種を数種選別した.一方,Wntシグナル阻害作用をもつ天然物として,オオバコ科植物からジテルペン,センダン科植物からリモノイドを単離し,またナス科植物からHhシグナル阻害作用をもつ高度に酸化されたステロイド誘導体を単離した.スクリーニング法(細胞アッセイシステム)の構築:ポリコーム群タンパク質Bmi1に関して,そのプロモーター活性を評価するルシフェラーゼ細胞アッセイシステムを構築するための検討を行った.現在,入手したプラスミドをアッセイ用細胞に導入し,安定発現細胞を構築中である.一方で,本方法はBmi1プロモーター活性を増強する化合物のスクリーニングに適しているが,低分子試薬や特定の遺伝子導入などの方法により,Bmi1プロモーターをいったん活性化させ,活性化されたBmi1プロモーター活性を低下させる化合物のスクリーニングも併せて行うことが必要であるため,活性化方法についても検討中である.スクリーニングサンプルの準備:上記のアッセイ細胞システムを用いてスクリーニングを行うための準備として,当研究室保有の天然物抽出エキスコレクションの調製・拡充を行った.すなわち,タイ・バングラデシュ産植物エキス,千葉県産を中心とした放線菌菌株の収集分離,エキスコレクションの作製を行った.ある種の癌ではBmi1の発現がヘッジホッグシグナルまたはウィントシグナルによって制御されることが知られている.このようにBmi1と関連性が指摘されているヘッジホッグシグナル,ウィントシグナルを標的としたスクリーニングを行った.ヘッジホッグ阻害成分としてはナス科植物より酸化分解型ステロイド誘導体,ウィント阻害成分としてはセンダン科植物よりリモノイド型テルペン化合物を単離した.近年,ヒストン修飾やDNAメチル化などのエピジェネティックな転写制御機構が種々の生命現象や疾患等に大きく関わることが知られてきているが,本研究では,ヒストン修飾を司るポリコーム複合体PRC1の中心分子BMI1,およびBMI1の発現を制御することが知られているウィント(Wnt)やヘッジホッグ(Hh)シグナルに作用する化合物を見出すことを目的として,天然物を対象としたスクリーニング研究を行った.1)まずBMI1プロモーター活性を評価するルシフェラーゼ細胞アッセイシステムの構築を行い,目的の安定発現細胞の構築に成功した.まずBMI1プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ配列を含むレポータープラスミドを作成し,次に作成したプラスミドをアッセイ用細胞(ヒト胎児由来腎臓上皮細胞293T)に導入することにより,安定発現細胞の構築を行った.すなわち播種した細胞に構築したプラスミドを導入し,ピューロマイシンによる選択培養を行った後,単一のコロニーが形成された複数のクローンについてルシフェラーゼ活性試験を行い,陽性対照による発光の変化等の実験により最も良好な結果を示した細胞株をスクリーニング用細胞として選別した.選別した細胞では,陽性対照によってルシフェラーゼ発光量が低下するとともにBMI1タンパク質が減少することがウェスタンブロットにより判明した.すなわち,BMI1プロモーター活性とタンパク質発現量に相関性があることが確認した.次に本評価システムを用いて保有する植物エキスコレクションに対するスクリーニングを行い,良好な活性を示す植物種を数種選別した.2)Wntシグナル阻害作用をもつ天然物のスクリーニングの結果,オオバコ科植物からジテルペンscopadulciol,センダン科植物からリモノイドtrichillin H,を単離し,これらの作用機構に関する知見を得た.3)ナス科植物からHhシグナル阻害作用をもつ高度に酸化されたステロイド誘導体physarin Hを単離した.天然物化学細胞アッセイシステムの構築についてプラスミドの準備を整え,実験を開始した.現在,実験条件の詳細について順次検討を行っているところである.その一方で,スクリーニング用サンプルの収集,構築に努め,順調にコレクションの拡充を行った.また,関連性が指摘されているシグナル分子ヘッジホッグ,ウィントに対するスクリーニング研究を行い,各々に関する活性植物成分を見出した.アッセイシステムの構築を完成させ,当研究室に保有し継続して拡充している天然物抽出エキスコレクションを対象として,スクリーニングを行う.

スクリーニングにより活性成分を単離し,化学構造を決定するとともに,精製した化合物が抽出エキスの段階で示した活性を保持しているかどうか再評価を行う.また,得られた活性化合物がエピジェネティック遺伝子発現制御機構へのどのような影響を及ぼすか調べる.すなわち,DNAメチル化,ヒストン修飾(メチル化,ユビキチン化),がん抑制遺伝子Cdkn2a等の発現への影響や,数種のがん細胞における癌の悪性度との相関等について注目し,種々の生化学的手法を用いて解析する.物品費について3301円だけ使い残しがでたものの,ほぼ当初の予定通りに物品費を使い切った.0円となるまでの使い切りはあえて行わなかった.26年度も当初の予定より物品費が3301円増えるものの,ほぼ当初の予定通りに物品費を中心に使用する予定である.
自然免疫を介した炎症防御機構の臓器間相互関連の解明と、その臨床応用に関する研究

腹腔内感染に起因する急性肺障害発症機序におけるKupffer細胞(KC)の役割を検討。ラットにKC抑制物質塩化ガドリニウム(GD)を投与後、盲腸結紮穿刺腹膜炎(CLP)モデルを作成、死亡率と肺障害を検討。死亡率はコントロール(C)群で60%、GD群は12時間以内に全て死亡。GD群でC群と比較し急性肺障害が急性増悪。IL-10の発現は、GD群では発現が低下。炎症時に肺と肝臓の自然免疫系は、相互に関連しあっている事実が明らかとなった。腹腔内感染に起因する急性肺障害発症機序におけるKupffer細胞(KC)の役割を、ラット腹膜炎モデルで検討した。雄性S.D.種ラットを用い、KC抑制物質塩化ガドリニウム(GD)を前投与後、盲腸結紮穿刺腹膜炎(CLP)モデルを作成し,致死率、臓器障害を肝・肺で検討した。また、両臓器でのメディエーター発現を検討した。結果;死亡率はコントロール群(C、生理食塩水投与)C群で60%(CLP後7日)、GD群は12時間以内に全て死亡。肝障害は認めなかった。死因は、急性肺障害であり、GD群でC群と比較し障害が増悪した。TNF-α発現は両群で差を認めなかった。IL-10の発現は、C群では肝、肺でともにCLP後早期に増加を認め、GD群では発現が低下していた。炎症性サイトカインならびにケモカインの肺での発現はGD群で増加した。KC消去によるIL-10抑制が宿主の生存と肺障害発症と進展に関与する事実が解明された。KCは感染免疫において中心的な役割を果たしていると考えられた(Kono et al.J.Surg.Res.2008 In press)。また、炎症時に肺と肝臓の自然免疫系は、相互に関連しあっている事実が明らかとなった。目的:腹腔内感染に起因する急性肺障害発症機序における肝臓のマクロファージであるKupffer細胞(KC)の役割を、ラット腹膜炎モデルで検討した。方法:雄性S.D.種ラットを用い、KC抑制物質である塩化ガドリニウム(GD)を24時間前に投与後、盲腸結紮穿刺腹膜炎(CLP)モデルを作成し、致死率、臓器障害を肝・肺で検討した。また、両臓器での炎症性メディェーター発現を検討した。結果:死亡率はコントロール群(C、生理食塩水投与)C群で60%(CLP後7日目)、GD群は12時間以内に全て死亡した。死因は、急性肺障害であり、GD群でC群と比較し障害が急性増悪した。肝臓と肺におけるpro-inflammatory cytokineであるTNF-α発現は両群で差を認めなかった。一方、anti-inflammatory cytokineであるIL-10の発現は、C群では肝ならびに肺でともにCLP後早期に増加を認めたが、GD群では発現が低下していた。これに伴い、各種炎症性サイトカインならびにケモカインの肺での発現はGD群で増加した。考察:KC消去によるIL-10発現低下が宿主の生存と肺障害発症と進展に関与する事実が解明された。KCは感染免疫において中心的な役割を果たしていると考えられた(Kono et al. J. Surg. Res. 2008 In press)。
磁性酸化物人工超格子単結晶膜の作製と物性

本研究の目的は2種類の酸化物を交互にエピタキシャル成長させた人工超格子を作り、界面での磁気的相互作用を利用した新しい磁性材料を得ることである。このために、出来るだけ完全性の高い単結晶薄膜を作製することはもちろん、基板との界面、薄膜表面状態を正確に知る必要がある。本年度は磁性酸化物としてFe_3O_4を取り上げ、界面、表面の状態をメスバウア効果の測定によって調べた。酸表を10^<-4>Torr程度真空蒸着の容器に導入しながら、鉄を蒸発し、200300度に加熱したサファイヤc面基板の上に析出させると(111)を基板面に平行にしたFe_3O_4単結晶が得られる。内部転換電子メスバウア効果は少量の^<57>Feでもスペクトルが得られるので、界面、表面の研究に最適である。この測定によって、1500〓の厚さの膜はバルクと同じVerwey転移をすることを認めた。次に表面と界面の磁性を研究するため、メスバウア核でない^<56>Feを用いて作製した(111)面単結晶膜の上にメスバウア核^<57>Feからなる数原子層のFe_3O_4を積層した試料と基板の上に数原子層の^<57>Fe_3O_4、次に^<56>Fe_3O_4を積層した1000〓程度の単結晶薄膜を作製した。表面はFe_3O_4のバルクと同じスペクトルであり、空気中でも表面数原子層は決して酸化されず、安定であることを示した。またサファイヤ基板との界面もFe_3O_4のスペクトルを示している。ただスペクトルは広がり、界面の結晶性は悪い。これは基板の格子常数との不一致が8%にもなるためと思われる。膜は柱状に成長した微細構造を示している。これに対し、不一致が小さいMgO(100)に成長させると(100)面成長したFe_3O_4単結晶膜が生成し、結晶性もよいので同様な手法で界面を検討している。一方互いに結晶構造が異なっているNiO/ZnO人工超格子を作った。ZnOが薄い場合はNiOと同じNacl構造になっている。今後、Fe_3O_4/NiO系やYFeO_3/YMnO_3系の人工超格子の磁性について検討する予定である。
relがん遺伝子産物の活性制御機構及び生理機能の解析

Rel活性化シグナル伝達因子であるTRAF6を欠損したマウスを作成、解析し以下の結果を得た。(1)大理石骨病を呈するTRAF6-/-マウスの骨組織を観察したところ破骨細胞がほとんど存在していなかった。そこで骨芽細胞依存的に脾臓細胞中の前駆細胞から破骨細胞を分化誘導する培養系を用いて解析した。その結果、TRAF6-/-マウス破骨前駆細胞が骨芽細胞が産生する破骨細胞分化因子(ODF/RANKL)に応答できないためにTRAP陽性の破骨細胞に分化できないことが判明した。これは破骨前駆細胞に本来存在し破骨細胞への分化に必須なRANKシグナル伝達経路がTRAF6の欠損により遮断されたことを示しており、RANKによるRel活性化がこの系において重要な役割を果たしている可能性が高い。(2)TRAF6-/-マウス胎児由来線維芽細胞ではTNF受容体からのシグナルは正常であるにもかかわらず、IL-1刺激依存的なRelやJNKの活性化は全く起こらなかった。さらにこの細胞に野生型のTRAF6を遺伝子導入により発現させたところIL-1刺激に依存したRelやJNKの活性化が回復した。すなわち、TRAF6がIL-1刺激依存的なRelやJNKの活性化に必須であることが明らかとなった。(3)TRAF6-/-線維芽細胞に種々の変異型TRAF6を導入しIL-1刺激依存的なRelやJNKの活性化について解析した。その結果、JNK活性化を担う領域がRINGフィンガーとZnフィンガーであるのに対して、Rel活性化を担う領域はよりZnフィンガーとCoiled-coilであった。TRAF6分子内の異なる領域を用いてRelとJNKを活性化させることからTRAF6がIL-1シグナルの分岐点でありかつ、Relの経路とJNKの経路のバランスを制御している可能性が高い。
フェノール類-アルデヒド-一酸化炭素の三成分反応によるγ-ラクトンの一段階合成

1-あるいは2-ナフトール類と脂肪族あるいは芳香族アルデヒドを、パラジウム-トリフェニルホスフィン-トリフルオロ酢酸触媒存在下、3-5気圧の一酸化炭素雰囲気、100°C程度の比較的穏和な条件下で処理すると、これらの三成分がタンデムに結合し、ナフトフラノン誘導体が得られることを見い出した。また、本反応におけるラクトン生成経路の推察から、中間体として関与すると考えられる2-ヒドロキシベンジルアルコールタイプの化合物を別途合成し、本反応条件下処理したところ、効率よくカルボニル化反応が進行し、イソクマラノン誘導体が良好な収率で得られることがわかった。本反応のように、ハロゲンフリーで穏和な条件下、ベンジルアルコール類のカルボニル化反応に成功した例はない。
塩基配列データベースをはじめとする生物学データベースの構築と利用に関する研究

本研究成果の中で最も重要なのは,「第13回国際塩基配列データベース実務者会議」であるので,それを中心に報告する。本会議は,2000年5月16日18日に,米国メリーランド州ベセスダ市内で開催された。DDBJからは,舘野義男教授(DDBJバンク長),菅原秀明教授,宮崎智助手のほか,DDBJスタッフ3名の計6名が参加し,ホストのNCBIおよび欧州のEBIからの参加者とともに,国際塩基配列データベースに関するさまざまな問題を議論した。本会議で決定した重要事項は以下のとおりである。(1)HTGドラフト配列のquality score作成について。ヒトゲノム計画の中心である英米のいわゆるG5(5大配列決定センター)は,GenBank/EMBLに対してquality scoreファイルの自動作成を要求してきた。日本のヒトゲノム配列決定センターからもDDBJに同様のファイル作成の要求があったので,対応することになった。(2)DDBJの提案で,full length insert cDNAのためだけのdivision(FLI)が設けられることになった。(3)DDBJの提案により,これまで普遍遺伝暗号表が用いられてきたplastidに対して,新しく定義された暗号表11を用いることになった。(4)EMBLの提案により,これまで明確な使用方法が確立していなかった/exceptionの使用法を明確にすることになった。(5)GenBankが,/geneの使用を1エントリーあたり1回に制限し,それ以外は同義語として/gene_synを用いることを提案したが,EMBLとDDBJの反対にあい,却下された。このほか,研究代表者の五條堀孝らが,米国,オーストラリア,イタリア,ドイツ,中国の生命情報学関連の研究機関を歴訪し,各国における生命情報学データベースの構築と利用状況を調査した。1. DNAデータベース国際共同構築を円滑に押し進めるため,以下のとおりNCBIとEBIにおいてDNAデータベース構築の実態調査と国際会議に出席し発表を行った。(1)小林、太田、宮崎、池尾が5月にEBIにおいて国際実務者会議,国際諮問委員会に出席し発表した。(2)五條堀が10月にEBIにてデータベース構築・運営に関する実態調査を行った。(3)舘野が10月にNCBIにてデータベース構築・運営に関する実態調査を行った。2.欧米における様々な生物学データベース構築と利用に関する実体調査を以下のとおり行った。(1)5月と3月に池尾がバーゼル大学(スイス)へ。(2)6月に斎藤がブリティッシュコロンビア大学(カナダ)とワシントン大学(米国)へ,(3)6月に五條堀がコロンビア大学(米国),11月にナポリ大学(イタリア)へ,(4)12月に太田がカリフォルニア大学(米国)へ,(5)12月に菅原がAmerican Type Culture Co11ection(米国),2月にローレンス・リバモア国立研究所(米国)へ,(6)1月に宮崎がハワイ大学(米国),3月にミシガン州立大学(米国)へ。3.近年生命情報科学の研究がさかんに行われて来ている非欧米地域における生物学データベース構築と利用に関する実体調査を以下のとおり行った。(1)8月に西川がロシア科学アカデミー細胞遺伝学研究所(ロシア),10月に北京大学(中国)へ,(2)1月に五條堀がサンホセ大学(コスタリカ)へ,2月に中国科学院遺伝研究所及び昆明動物研究所(中国)へ,(3)2月に舘野が中国科学院生物学研究所(中国)へ,(4)3月に斎藤が中国科学院微生物研究所(中国)へ。1.DNAデータベース国際共同構築を円滑に押し進めるため,以下のとおりNCBIとEBIにおいてDNAデータベース構築の実態調査と国際会議に出席し発表を行った。(1)今年度は4月に国立遺伝研究所(三島)において国際実務者会議,国際諮問委員会が開催された。

(2)11月に舘野と菅原がEBI(英国)にて開催されたDNAチップに関する会議に出席し発表した。2.抗米における様々な生物学データベース構築と利用に関する実体調査と国際会議に出席し発表を以下のとおり行った。3.近年生命情報科学の研究がさかんに行われて来ている非欧米地域における生物学データベース構築と利用に関する実体調査と国際会議に出席し発表を以下のとおり行った。本研究グループは、上記課題において以下の活動を行った。1.DNAデータベース国際共同構築を円滑に押し進めるため、以下の通りNCBIとEBIにおいてDNAデータベース構築の実態調査と国際会議に出席し発表を行った。舘野、宮崎が5月にNCBIにおいて国際実務者会議、国際諮問委員会に出席し発表した。2.欧米における様々な生物学データベース構築と利用に関する実態調査と国際会議に出席し発表を以下のとおり行った。3.近年生命情報科学の研究が盛んに行われてきている非欧米地域における生物学データベース構築と利用に関する実態調査を以下の通り行った。(1)7月に舘野が上海血液学研究所へ。宮崎が第9回国際菌株保存機関連盟集会に出席(オーストラリア)(2)8月に西川がAsia-Pacific Advanced Network会議に出席(中国)(3)1月に舘野が国際分子進化学界(コスタリカ)へ。(4)3月に舘野が、シンガポール国立大学、中国科学院上海研究所へ。菅原がBIOTEC(Thailand)へ斎藤が中国科学院遺伝研究所(北京)へ
心臓MRIを用いたフューチャートラッキングストレイン法による予後予測の検討

心臓MRI画像にfeature tracking (FT)法を用い、計測した左室ストレイン値は心エコー画像にspeckle tracking法を適応し算出されたストレイン値と良好な相関を示した。一方FT法によるストレイン計測は右室の長軸方向ストレイン値以外全て予後予測能を有し、特に左室のトランスバースストレイン、右室のラディアルストレインは、年齢、性別、左室(右室)駆出率で補正後も予後予測に有用であった。以上の結果よりCMR画像にFT法を用いて計測されたストレイン値は信頼に値するものであり、ストレイン値は予後を予測する上で、既存の方法同様極めて有用であることが証明された。心臓MRI(CMR)は心機能を定量的に評価する上で最も優れた方法である。ストレインは心機能評価の有用な指標であるが、CMRを用いたストレイン計測は特殊な画像収集方法、解析ソフトが必要であり、広く臨床には普及していない。Feature tracking (FT)法は心エコー図の2D speckle tracking法同様cine CMR画像からストレイン値を計測できる簡便かつ新たな方法である。本研究の目的は1):同日に心エコー図検査と、CMRを施行した患者を対象に、2D, 3D心エコー図法より計測されたストレイン値と対比することによりFT法によるストレイン値計測は信頼できる正確な方法であることを証明するこ。2): CMR FT法により得られたストレイン値が、予後予測の新たな指標になり得ることを後方視的に検討し、最適カットオフ値を決定すること。3):その最適カットオフ値を用いてFT法によるストレイン計測の予後に対する有用性を前方視的に多施設で検討することである。本研究の最初の目的であったFT法より求めたストレイン値の信頼性を実証する研究に関しては、心エコー図法より求めたストレインと比較しても、その値はほぼ同一であり、両方法に良い相関があることを確認し、論文を作成、投稿し、論文は受理され、電子版で閲覧可能である。心疾患患者の重症度診断、予後予測、あるいは手術前患者のリスクを評価する上で、心機能評価は日常臨床できわめて重要である。通常心機能評価は心エコー検査を用いて行われるが、良好な画質を得ることはできず、ある一定の割合で存在する画質不良例では正確な評価は困難となる。一方心臓MRI(CMR)はほぼ全例で、良好な画像を得ることができ、心機能を定量的に評価する上では、現時点で最も優れた方法であると考えられる。またガドリニウムを用いた遅延造影による心筋線維化の検出は虚血性心疾患患者や各種心筋症患者の予後予測に極めて有用である。しかし腎機能が低下している患者には施行することができないことが問題点である。ストインは心機能を定量的に評価する上で左室駆出率同様有用な指標であるが、過去のCMRを用いたストレイン計測は特殊な画像収集方法、解析ソフトが必要であり、広く臨床には普及していなかった。一方近年登場したFeature tracking (FT)法は心エコー図の2D speckle tracking法と同様cine CMR画像からストレイン値を計測できる簡便かつ新たな方法である。我々はこの方法が予後予測に簡便かつ有用なものであるとの仮説を立てた。本研究の目的はこの仮説を証明するために1): FT法によるストレイン値計測は信頼できる正確な方法であることを既存の確立されている方法と比較検討することで証明し、2):予後予測の新たな指標になり得ることを後方視的、前方視的に多施設で検討することである。FT法により得られた左室容量、駈出率、ストレイン値は心エコーによる2D/3D speckle tracking法によりえられた左室容量、駆出率、ストレインと良好な相関を示した。また後ろ向きの予後調査でもFT法による左室のトランスバースストレイン、右室のラディアルストレインは予後予測に有用であった。以上の研究結果を投稿し、現在までに以下の2本の論文が学術雑誌に掲載された。心臓MRI(CMR)は空間分解能に優れ、心機能を定量的に評価する上で、最も優れた方法である。左室ストインは心機能を定量的に評価する上で有用な指標であるが、CMRを用いたストレイン計測は特殊な画像収集方法、解析ソフトが必要であり、広く臨床には普及していなかった。近年登場したFeature tracking (FT)法は心エコー図の2D speckle tracking法同様cine CMR画像からストレイン値を計測できる簡便かつ新たな方法である。本研究の目的はこの仮説を証明するために1): FT法によるストレイン値計測は信頼できる正確な方法であることを証明し、2):予後予測の新たな指標になり得ることを後方視的、前方視的に多施設で検討することである。平成29年度は最後の前方視的研究を施行した。具体的には平成2729年に各施設で施行されたCMR症例を収集し、約380例のCMRデータを解析用のコンピューターに移行した。現在多断面の短軸断層CMR画像に通常計測を適応、左室容量、左室駆出率(LVEF)を計測している最中である。また今後別の検者がFT法によりストレイン計測を実施する。最終登録患者の予後観察期間が6ヶ月となる平成30年6月より予後評価を実施し、約3ヶ月程度で予後調査を終了する予定である。

その後統計解析を行い、その結果をもとに論文を作成し、投稿する予定である。一方約半数の患者は左室機能低下症例と考えられ、左室機能不全を拡張型心筋症、虚血性心筋症、二次性心筋症の3群に分け、各群での有用性をサブグループ解析で検討することも考えている。一方有意な結果が出なかった場合は、観察期間が短いことも考えられるため、全ての患者の観察期間が最低1年となる平成30年12月に予後調査を再実施し、再解析を行うことも考えている。心臓MRI画像にfeature tracking (FT)法を用い、計測した左室ストレイン値は心エコー画像にspeckle tracking法を適応し算出されたストレイン値と良好な相関を示した。一方FT法によるストレイン計測は右室の長軸方向ストレイン値以外全て予後予測能を有し、特に左室のトランスバースストレイン、右室のラディアルストレインは、年齢、性別、左室(右室)駆出率で補正後も予後予測に有用であった。以上の結果よりCMR画像にFT法を用いて計測されたストレイン値は信頼に値するものであり、ストレイン値は予後を予測する上で、既存の方法同様極めて有用であることが証明された。平成28年度は、当大学病院を含む複数施設で平成25、26年に施行したcine CMR画像を後方視的に収集し、FT法を用いて各症例のストレイン値を計測。また予後を調査し、予後予測に最も有用なストレインは何か、またそのストレイン値による予後予測の最適カットオフ値を決定し、この結果を基に論文を作成する。現在までに解析は終了し、論文を作成、現在投稿中である平成29年度は、平成2728年に各施設で施行した心不全の既往のあるCMR症例にFT法によるストレイン計測を実施。平成29年12月に予後評価を実施。平成28年度に行った後方視的研究から得られた種々のパラメーターの至適カットオフ値の予後予測能を他の予後指標と比較検討し、その有益性を実証する予定である。平成29年度は最後の前方視的研究を行う。具体的には平成2728年に各施設で施行されたCMR症例を収集し、多断面の短軸断層CMR画像に通常計測を適応、左室容量、左室駆出率(LVEF)を計測する。左室機能低下例の予後予測は臨床的に極めて重要であることを念頭に、対象症例中左室駆出率が低下している症例(LVEF<45%)を抽出し、同症例にFT法によるストレイン計測を実施する。平成29年6月に予後評価を実施し、各種ストレイン計測値の予後予測能を前向きに検討する。良い結果が得られれば論文を作成し、投稿する。現在のところCMRデータの収集は全て終了し、約350例のCMRデータが集まっており、現在解析用のコンピューターにデータを移行し終わったところである。予後調査を行う6月までに、通常計測、F T法による計測をそれぞれ別の検者が行う。予想としては約半数の患者は左室機能低下症例を考えられ、最終的に研究対象となり得る患者総数は170から200例程度と推察される。本年6月から約2ヶ月程度で予後調査を実施。その後統計解析を行う予定である。全体として有意差が得られた場合、左室機能不全を拡張型心筋症、虚血性心筋症、二次性心筋症の3群に分け、各群での有用性も出来れば検討したいと考えている。一方結果がはかばかしくない場合は、観察期間が短いことも考えられるため、全ての患者の観察期間が最低1年となる本年12月に予後調査を再実施し、再解析を行予定である。
発生と変性における細胞死による神経選択機構の分子遺伝学的基盤

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。神経系での選択的細胞除去は散在的に観察される。発生初期のほぼ均一な細胞集団における細胞選択機構については、特定の細胞死因子によって死細胞が選択されるメカニズムに加え、細胞間でのわずかなシグナルの差が細胞に不可逆的な変化を与え、その結果選択の方向(細胞死・生存)が決定づけられる可能性が想定される。このような生体での選択的細胞除去制御機構は、ショウジョウバエや線虫などの個体を対象にした遺伝学的な手法によって初めて明らかにされると期待される。本研究において、これまでに準備してきた複眼あるいはそれを構成する光受容細胞の消失を指標にした細胞死誘導遺伝子スクリーニングを大規模に行う。現在までに約5000系統のGSスクリーニングによって神経細胞死を誘導する系統が約1.6%の頻度で得られた。このスクリーニングで得られたGS系統の原因遺伝子を同定した結果、小胞体関連分解ERADに関与するトランスロコンの主要構成分子Sec61aが神経細胞死を効率よく誘導することを明らかにした。Sec61aの機能を減ずるとポリグルタミンによる細胞内にユビキチン化蛋白質の蓄積と神経変性が抑制され、この分子が神経変性シグナルの調節に関与する事が明らかになった。上記機能獲得型の細胞死遺伝子のスクリーニングに加え、染色体欠失系統を用いた機能欠損型の細胞死関連遺伝子のスクリーニングを行った。その結果JNK活性化と細胞死抑制遺伝子iapファミリーの安定性を制御する遺伝子も得ており現在解析を進めている。生体内で生きたまま分子の機能を解析するための強力な手段として蛍光蛋白質を用いたFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用する方法が注目されている。

FRETを利用することで優れた時間・空間的分解能により目的分子の動態を解析することが出来る。我々はFRETのドナーにECFPを、アクセプターにVenusを用い、両蛍光たんぱく質にカスパーゼ切断至適配列DEVDを挿入した新規カスパーゼ3 indicator「SCAT3」を開発し、このペアを採用することで、初めて生きた細胞内で安定的にカスパーゼ活性化の解析を可能にした。さらにUAS-Gal4システムにてSCAT3を発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。我々はスピニングデイスクを用いたマルチポイントスキャン型を採用することにより、24時間以上生体内において退色することなく蛍光イメージングを行うシステムを構築した。Scabrous-Gal4を用いて剛毛前駆細胞でSCAT3を発現させたところ、翅成虫原基でのScabrous陽性細胞クラスターで弱いながらカスパーゼの活性化が検出された。このようなカスパーゼの活性化は予想外でありカスパーゼの活性化シグナルが発生の細胞死以外の局面でも機能しうることを示唆している。翅成虫原基における死細胞をTUNEL法で観察するとScabrous陽性細胞クラスターには殆どシグナルが観察されず、Scabrous陽性細胞クラスター内でのカスパーゼ活性化は細胞死以外の機能を持つことが予想された。この観察は、カスパーゼ活性化シグナルが細胞死誘導のみならず細胞運命決定にも関与することを示唆するものであり重要である。カスパーゼによる細胞運命決定に関与する分子を同定する目的で染色体欠失系統を用いた遺伝学的なスクリーニングを行い、カスパーゼの調節因子および基質候補分子を見出した。プログラム細胞死実行因子カスパーゼは細胞死に必要なプロテアーゼであり、細胞死刺激により活性化され、様々な基質を切断することにより細胞死を実行する。ショウジョウバエを用いた遺伝学的な研究からカスパーゼ阻害蛋白質IAPレベルの調節に関与する新規キナーゼを同定した。さらに、,カスパーゼの生理機能を解析していく中でカスパーゼ活性が細胞死のみならず細胞分化をも調節していることが明らかになった。ショウジョウバエ末梢神経系の感覚器は、1個の神経系前駆細胞(SOP)が2回分裂し、1本の剛毛とそれに接続する神経組織を形成する。ところが、シヨウジョウバエカスパーゼ活性化因子Dapaf-1突然変異ショウジョウバエでは、その剛毛(macrochaete)の増加が観察された。さらに興味深いことに、この現象は細胞死の阻害による細胞数の増加に依存しないことが明らかとなり、カスパーゼが細胞分化に積極的に関与していることが示唆された。この基質の同定のために、カスパーゼを阻害した際の神経系細胞系譜の変化(剛毛の増加)を促進または抑圧するような染色体領域の探索(ドミナントモディファイアースクリーニング)を行った。スクリーニングの結果カスパーゼの基質が遺伝学的に同定された。ほ乳類GSK3βホモログであるShaggyはWinglessシグナルを介して剛毛の発生を制御している。