hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メダカ突然変異体群の解析による始原生殖細胞の移動を制御する新しい分子機構の解明

2018(H30)年度においてはメダカの飼育環境の整備を更に進め、ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析・変異体作製や、初期胚解析に用いる孵化酵素の作製に必要な野生型を十分量産生出来る安定した環境を構築した。始原生殖細胞の移動に異常が見られる2種のメダカ突然変異体(kamigamo, shimogamo)について、これまでの遺伝学的な解析により、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることを突き止めているが、その原因遺伝子cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、始原生殖細胞の移動期胚における発現解析(ホールマウントin situハイブリダイゼーション)の為のプローブを現在作製している。更に、先の大規模な変異体表現型スクリーニングにおいて検出したshimogamo変異は1つのみであった為に、相補性検定による遺伝学的な確認を行う為に、CRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトメダカの作製に取りかかっている。同時に、shimogamo遺伝子についてはそれを一つしか持たない哺乳類とは異なり、メダカを含む小型魚類においてはパラログがもう一つ存在する。そこで、この遺伝子も始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりshimogamoパラログのノックアウトメダカの作製にも取りかかっている。更に、shimogamoパラログの発現解析に用いる為のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析を進めるために、cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、プローブの作製を進めている。研究代表者の所属の異動に伴う飼育環境・実験環境のセットアップや研究体制の再構築に引き続き時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じている。昨年度に引き続き、始原生殖細胞の移動に異常が見られ、かつその原因遺伝子がそれぞれヒト遺伝疾患に関る転写調節因子として知られる2種のメダカ突然変異体(kamigamo, shimogamo)について、以下の解析を行う。なお課題進捗の遅れについては、小型魚類の遺伝学的解析の専門家を2名程当初計画よりも増やし、これら研究者等との打ち合わせを頻繁に行って協力を得ながら、挽回に務める。更に、外部企業による業務委託サービス等を適宜有効に用いて進捗の改善を図る。・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoノックアウトメダカを作製し、先の大規模変異体スクリーニングにおいて得られたshimogamo変異との相補性試験を行う。・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoパラログのノックアウトメダカを作製し、この遺伝子が始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを調べる。・始原生殖細胞の移動期において、shimogamoおよびそのパラログやkamigamo遺伝子が発現している組織を、ホールマウントin situハイブリダイゼーションによって調べる。・転写調節因子と考えられるkamigamo、及び、shimogamoが、既知のケモカイン関連遺伝子の発現制御に関わっているのかどうかを調べる。つまり、これまでに始原生殖細胞の移動への関与が知られている既知のケモカインとその受容体遺伝子、cxcl12a/sdf1a、cxcl12b/sdf1b、cxcr4b、cxcr7等について、各変異体胚におけるそれぞれの遺伝子の発現を、ホールマウントin situハイブリダイゼーションによって調べる。脊椎動物の始原生殖細胞が体細胞と相互作用しながら生殖巣原基へと移動する為の分子機構は、近年ようやくその一端が分かり始めたところである。研究代表者等はこれまでに、発生の解析が容易な卵生小型魚類の利点を活かして脊椎動物で初めてかつ唯一の系統的な順遺伝学的スクリーニングを行い、始原生殖細胞の移動に異常が見られる突然変異体群を得て解析を行ってきた。本研究課題では、これら突然変異体群の解析を更に網羅的に進めることにより、始原生殖細胞の移動に関る分子機構の複合的な側面を掘り下げて解明する。平成28年度においては、始原生殖細胞の移動に異常が見られる劣性胚性致死突然変異体naruto(cpsf6変異体)の遺伝学的な解析について、始原生殖細胞の化学誘引物質(ケモアトラクタント)として働くケモカイン(cxcl12/sdf1)の濃度勾配の形成には、mRNAの適切な転写後消失が関わっていることを示した結果を、原著論文として国際紙に投稿・発表を行った。平成28年度において研究代表者が所属を異動し、更に、本課題は10月に追加採択され研究期間が半年以下であった為に、当該期間においては実験機器や実験動物の移動と研究環境のセットアップに割いた労力が結果的に大きいものとなった。その為に当初計画分の、始原生殖細胞の移動に異常が見られる2種のメダカ突然変異体(kamigamo, shimogamo)の詳細な解析については、引き続いて次年度に行う。遺伝的連鎖解析によって、これらの2種の変異体の原因遺伝子が、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることをこれまでに突き止めている。本課題は、2016年10月の追加採択であった為に、研究の開始が遅れた。また、研究代表者の所属の異動により、動物や機器の移動と実験環境のセットアップに労力を要し、当初の計画よりも遅れが生じている。平成29年度においてはメダカの飼育環境を整備し、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、及び、突然変異体作製に必要な野生型を十分量取ることが出来る安定した環境を作ることが出来た。

始原生殖細胞の移動に異常が見られる2種のメダカ突然変異体(kamigamo, shimogamo)について、これまでの遺伝学的な解析により、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることを突き止めているが、その原因遺伝子の始原生殖細胞の移動期胚における発現解析(ホールマウントin situハイブリダイゼーション)の為のプローブを現在作成中である。更に、先の大規模変異体スクリーニングにおいてshimogamo変異は1つしか取れていないので、これまで相補性検定による遺伝学的な確認が出来ていない。現在確認しているshimogamoの表現型がこの転写調節因子の機能不全が原因であることを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりノックアウトメダカを作製中である。同時に、shimogamo遺伝子についてはそれを一つしか持たない哺乳類とは異なり、メダカを含む小型魚類ではパラログがもう一つ存在する。そこで、この遺伝子も始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりshimogamoパラログのノックアウトメダカを作製中である。更に、shimogamoパラログの発現解析に用いる為のホールマウントin situハイブリダイゼーション用プローブを作製中である。本課題が一昨年度10月の追加採択で開始が遅れた上に、研究代表者の所属の異動による実験動物の飼育環境、及び、実験環境のセットアップに時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じている。2018(H30)年度においてはメダカの飼育環境の整備を更に進め、ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析・変異体作製や、初期胚解析に用いる孵化酵素の作製に必要な野生型を十分量産生出来る安定した環境を構築した。始原生殖細胞の移動に異常が見られる2種のメダカ突然変異体(kamigamo, shimogamo)について、これまでの遺伝学的な解析により、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることを突き止めているが、その原因遺伝子cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、始原生殖細胞の移動期胚における発現解析(ホールマウントin situハイブリダイゼーション)の為のプローブを現在作製している。更に、先の大規模な変異体表現型スクリーニングにおいて検出したshimogamo変異は1つのみであった為に、相補性検定による遺伝学的な確認を行う為に、CRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトメダカの作製に取りかかっている。同時に、shimogamo遺伝子についてはそれを一つしか持たない哺乳類とは異なり、メダカを含む小型魚類においてはパラログがもう一つ存在する。そこで、この遺伝子も始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりshimogamoパラログのノックアウトメダカの作製にも取りかかっている。更に、shimogamoパラログの発現解析に用いる為のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析を進めるために、cDNAのクローニング、及び、配列の解読を進め、プローブの作製を進めている。
21世紀東アジアにおける農村-都市関係の再編に関する研究

本研究は,21世紀初頭における広義の東アジア四力国(中国,韓国,タイ,インドネシア)における農村と都市との関係のあり方を問い直し,新たな農村一都市関係の再編の方向や、課題を探る目的で実施された。ここで取り上げる四力国は、21世紀はじめの(1)農村と都市の状況(都市人口の割合・国連統計)、(2)産業構造(第一次産業の就業人口比率・ILO)、(3)一人あたりの国内総生産(ドル・世界銀行)といった指標から見ればかなりの差異がある。これら三つの指標からでも、これら四力国の農村や都市をめぐる現状が推察できる。たとえば、3の指標から見れば、先進国の仲間入りを遂げつつある韓国に対して、中心国入りを目指すタイ、途上国の中国、インドネシアという分類が可能となる.また、(1)と(2)の指標からは、韓国を除けば他の国々では、まだまだ農村(村落)居住の人口が多いし、農業に従事する人々が多数派を占めていることが分かる。すでに工業化を達成し、都市居住の非農林漁業従事者が大多数を占める韓国と、工業化が進行中の他の三力国とでは、農村と都市との関係もかなりな差異があることは自明であろう。しかし、共通していえることは、農業が兼業化し、農業経営の多様化が進行中であるということである。農業を経営するのみならず、生活に必要な資金をも農外から得ないと、農村での生活が容易ではない状況が深化している。そのため、農外労働で収入を得るために、都市との関係を深めざるをえなくなってきている。都市も、工業化の展開の中で、首都や工業化の拠点となる大都市以外にも、地方の中核都市の発展もみられるようになってきた。したがって、一口に農村といっても、どのような規模の都市に近いか遠いかで、その有様にも大きな違いが生じている。大都市や地方の中核都市に通勤可能な距離に位置する農村では、村から通えるが、都市の労働市場から遠く離れた場所に村があれば、都市に出て働かなければならなくなる。また、農村から都市へ出て行くという場合でも、農村居住者の世代間の差異も顕著になりつつある。このように大きな変動を遂げつつある農村と都市との関係を、具体的に農村のほうから対都市との関係の持ち方を、四力国で調査し分析したものが今回の報告書の内容である。問題意識は共有しつつも、それぞれの農村一都市関係の国情にあわせて調査票を作成しているので、必ずしもすべての内容が対比できるものとはなりえていないが、個人のライフヒストリーの聞き取りには、個人が大きな状況の変化の中で、いかに生き抜いてきたのかが農村と都市の関係を背景に読み取れてくる。本年度は、韓国、中国、タイ、インドネシアで、程度の差はあるが予備調査を実施した。調査予定の村落だけでなく、同じ地方都市と結びつく複数の周辺村落において聞き取り等を実施した。

また補足的に日本および台湾に関する資料収集も行った。これらの調査・資料収集を通じて、以下のような知見を得ることができた。農村から首都や大都市への人口の集中傾向は、調査した東アジア地域では引き続き存在している。グローバル化する現代社会の展開を反映している。その中で地方都市の存在意義が低下傾向を示すこともあるが(とくに韓国)、国の地方政策の後押しもあり、地方都市の発達はある程度みられる(とくにタイ)。一方、都市移動による農村人口の減少という展開は多少とも存在するが、その中身は兼業化の条件をふまえて検討される必要がある。農村と地方都市の関係では、韓国の安東市やインドネシアのジョグジャカルタ市には良質の中等教育機関を多いため、周辺農村の中高生が集まる。とくに韓国では、子供の修学のため親子共ども地方都市に転出し、農村の高齢化が深刻である。大学進学時には首都等へ行くので人口定着は弱いが、文教地域として地方都市が地方文化の拠点になる。一方タイのコーンケーン市は、高等教育志向の相違のため、農村にとって修学より就業や娯楽の場としての役割が大きい。中国では、改革・開放政策により、農村と地方都市の関係の新展開が生じつつある。農村住民が、首都と地方都市に対するもつ意識や言説については、さらに聞き取り調査を深める必要があるが、若年層を含めて、首都等に対する過度の「幻想」はなさそうである。と同時に、言説における首都と地方都市の差異化は農村の人々の間で進んでいる。韓国のように首都への求心力が強い社会ではとくにこの傾向は強い。次年度以降は、アンケート調査の実施を中心にしてこれらを数量的に把握し、分析を深めてゆく予定である。3カ国でアンケート調査を実施した。韓国の慶尚北道安東市周辺農村、中国の山東省鄒平県内農村、タイ国東北部コーンケーン市周辺農村である。調査農村は地方都市から30キロ以内にあり、地方都市への通勤・通学が可能である。インドネシアについては、本年度は聞き取り調査を実施し、次年度にアンケート調査を実施する予定である。アンケート調査では世帯票と個人票(世帯主と配偶者が対象)の二種類の調査票を用いて、韓国・タイでは全数調査、中国ではサンプル調査を実施した。調査票記入は面接調査を基本とし、必要に応じて留置を行った。現地共同研究者との研究協力体制が構築され、農村側の調査への関心も高かったため、調査票の回収率・有効票率は極めて高く、8090パーセントに達している。世帯調査の主要項目は、各世帯の基礎的なデータ(世帯員数、農業経営状況、農外収入への依存度、仕送り状況など)、各世帯員の年齡・性別就業・就業状況、学歴、首都(大都市)や地方都市とのつながり(居住経験、訪問の程度や目的)、他出子弟の居住地、就業・修学状況、経済的関係の有り様、将来の移動・帰郷の可能性、そして都市との関係から見た世帯の生活形態の過去・現在・将来の見通しなどである。個人調査の主要項目は、居住歴(農村、地方都市、首都など)、主職・副職(それぞれの初職・現職、職業変化、そして各職の勤務地、通勤方法など)、首都(大都市)・地方都市に対する意識・関心・期待、都市発展の農村への影響に関する意識、首都(大都市)・地方都市の発展や問題点に関する意識、あるべき都市-農村関係についての意識などである。本年度中はアンケート調査の集計実施
プロテオグリカン合成律速酵素に対する未知の酵素活性化物質の発見と同定

次に,この酵素活性化因子があると考えられているサイトゾル画分(100,000xg,上清)を調整し,トリプシン処理や,熱処理で酵素活性化作用が失われることや,酵素と酵素活性化因子をインキュベートした後,酵素をアルカリフォスファターゼ処理すると酵素活性が低下することを確認し,酵素活性因子はプロテインキナーゼであると推定した.この結果は第42回日産婦北日本連合地方部会(7-8,Oct,1994)で発表した.プロテインキナーゼと考えられる酵素活性化物質の生化学的性格を明らかにするためサイトゾル画分を調整し,ゲル濾過にかけ,幾つかの蛋白質画分に分け,それぞれ回収して分子サイズに決定した.その結果200kDa,70kDa,30kDa付近の分子サイズを持つ蛋白質がサイトゾル画分にあることがわかった.それぞれの蛋白質画分を濃縮し反応液に添加し,どの蛋白画分に酵素活性化因子が存在するのかを検討中である.次に,この酵素活性化因子があると考えられているサイトゾル画分(100,000xg,上清)を調整し,トリプシン処理や,熱処理で酵素活性化作用が失われることや,酵素と酵素活性化因子をインキュベートした後,酵素をアルカリフォスファターゼ処理すると酵素活性が低下することを確認し,酵素活性因子はプロテインキナーゼであると推定した.この結果は第42回日産婦北日本連合地方部会(7-8,Oct,1994)で発表した.プロテインキナーゼと考えられる酵素活性化物質の生化学的性格を明らかにするためサイトゾル画分を調整し,ゲル濾過にかけ,幾つかの蛋白質画分に分け,それぞれ回収して分子サイズに決定した.その結果200kDa,70kDa,30kDa付近の分子サイズを持つ蛋白質がサイトゾル画分にあることがわかった.それぞれの蛋白質画分を濃縮し反応液に添加し,どの蛋白画分に酵素活性化因子が存在するのかを検討中である.
第1群抗不整脈剤のNa channel抑制作用とその分子薬理学的解析

第1群抗不整脈薬はa,b,c,の3亜群に分類され臨床的に使用される場合の薬物選択の基準ともなっている。しかしその分類に作用機構に基づいた合理的且つ定量的な基準はまだ存在しない。申請者らは本年度20μM mexiletine,5μMflecainide,100μM QX222及び20μM quinidineに関しモルモット乳頭筋標本において外液K^+(2.7及び10mM)Tyrode液中に活動電位を測定しそのV_<max>(Na電流の指標である)抑制の頻度依存性(0.0167ないし4Hzの内の6-9点)を検討した。オリンパス高級実体顕微鏡は標本分離および電極挿入時に、また三次元油圧マイクロマニプレ-タは電極挿入に使用した。これらの結果は昨年3月“抗不整脈薬に関する国際シンポジュウム(名古屋)"において発表した正常Tyrode液中の1mM nicorandil(膜電位、V_<max>に影響することなく活動電位幅のみを短縮する)の存在及び非存在下の上記抗不整脈薬の結果と併せて考察し同シンポジウム発表のモデルよりも更に高度な二つのモデル(Na channelの開、閉、不活性化状態に応じて^<1)>各抗不整脈薬の親和性が変化する(モジュ-レイテットレセプタ-仮説)および^<2)>その易接近性が変化する(ガ-デッドレセプタ-仮説);何れも開(m)および不活性化(h)blocked channelの形成および膜電位に関する連立微分方程式を数値解により求める)についてコンピュ-タ-シミュレ-ションを行ない一応の最適解を得た。これにより膜電位変化時の各薬物作用態度の違いを各状態における解離定数の違いとして定義できる。これらの計算は実験値と計算値の二乗誤差を最小にする解を直接探索法により求めるもので一回の計算に数分数10分を要しこれを数100回反復する。これらが真の最適解か或は見かけのもの(局処的最小値)かの判定にはなお慎重な検討を必要とすることが明らかとなったので現在さらに追加計算を行なっている。終了次第発表の予定である。
動的キラルなうセミ触媒を用いた不斉触媒反応の開発

現代の有機合成化学において、光学活性分子を高効率的に不斉合成しようとするキラルテクノロジーはまさに成熟の域に達している。その中心的役割を担うのが均一系不斉金属錯体であるが、そのほとんどは光学活性な不斉配位子とアキラルな金属錯体によって構築するといった手法がとられている。その結果、不斉触媒反応を指向した不斉金属錯体の開発研究は新規不斉配位子の設計に集中しているのが現状である。そこで本申請研究では、これまで不斉触媒に全く用いられていない安価で入手の容易な動的キラル配位子(ラセミ配位子)を導入し、ラセミ触媒を用いた新たな方法論及び触媒系を見出すことを目的としている。今回、BIPHEPs-Rh錯体の熱力学的及び速度論的な手法による軸不斉制御を検討した。その結果、速度論的な不斉制御において、不斉活性化剤としてキヤレジェンを用いることで完全に単一のジァステレオマー錯体を得ることに成功した。特にDM-BIPHEPの場合、対アニオンがTfO、BF_4、PF_6、及びC10_4の錯体では完全に副生成物を抑えて、単一のジァステレオマーのみを得ることに成功した。さらに、得られた光学的に純粋なBIPHEPs-Rh/diene錯体を不斉触媒反応に用いた。その結果、1,4-付加反応では高収率且つ高ェナンチオ選択的に生成物を得ることはできなかったものの、不斉水素化反応では最高91%eeと高エナンチオ選択的に反応が進行することを見出した。また、このときBIPHEPsは反応中でラセミ化していないことも証明した。すでに申請者らは、動的キラルな配位子としてBIPHEP配位子を有する金属錯体(Ru, Rh, Pd, Pt)を不斉制御し、さらに優れた不斉触媒として機能することを見出している。この際、用いる中心金属によってその錯体の動的挙動が全く異なり、また適用できる反応も異なる。そこでまず今回は、これまでの後周期遷移金属に代わり、前周期遷移金属(Zr, Ti, Hf)を用いた錯体の動的挙動について調査した。その結果、動的キラルなZr錯体の軸不斉をキラルなDABNTfを用いることで制御することに初めて成功した。また、これまでの軸不斉制御のみならず、面不斉を有する動的キラルなラセミ触媒の不斉制御にも成功した。即ち、軸不斉BIPHEP-Ru錯体を酸化することによって得られた面不斉BIPHEPO-Ru錯体に不斉制御剤としてDABNTfを作用させることでその面不斉を制御できた。
イヌ腫瘍の新規診断マーカーと転移因子としてのエキソソーム分子の機能解析

イヌの腫瘍の診断と治療法の改善のために新規のバイオマーカーの探索を行った。特にエキソソームと呼ばれる小分子が腫瘍から分泌されることに着目した。研究ではイヌの血液からエキソソームを超遠心法と呼ばれる方法で分離抽出した。抽出したエキソソームが人で報告されているものと同じかを表面の抗原マーカーで確認した。さらに、近年、腫瘍のバイオマーカーとして注目されているマイクロRNAの分子に着目した。複数のイヌの腫瘍で特異的に発現するマイクロRNAの同定が行えた。また、エキソソーム内のマイクロRNAの発現もリアルタイムPCR方で確認できた。本研究はエキソソーム解析がイヌの腫瘍診断の転移マーカーとなり,且つ,腫瘍の転移メカニズム解明の糸口となるという“仮説"を証明する研究であり,以下の2つの研究を当初計画した。1)血液中のエキソソーム解析による腫瘍診断(転移&再発)分子マーカー発見への挑戦。2)腫瘍特異的エキソソームの培養細胞への特異的作用の観察から転移機構解明への挑戦。1)に関しては体液中のエキソソームの抽出を市販のキットを用いて行い、エキソソーム分画を分離していないものとmicroRNA分子の発現の差異を確認した。その結果は、エキソソームを分離した場合にプロファイルに差異があるということはエキソソームに含まれるmicroRNAと含まれないmicroRNAの存在を支持する結果である。エキソソーム中のmicroRNAの次世代シーケンスによるプロファイルは未だ行えていないが、腫瘍サンプル(乳腺腫瘍、肝細胞癌、メラノーマ)とそれらに対応する正常組織のmicroRNAの発現を次世代シーケンスで解析した。これらは今後のバイオマーカー探索とエキソソームプロファイルの参考となる貴重なデータである。2)に関しては複数のイヌ腫瘍細胞の培養を確立している。さらに、腫瘍細胞を低酸素で培養することで、増殖が促進されること、抗アポトーシス効果の可能性があることを発見した。また、抗癌剤に対する感受性の変化も見られることが観察された。これらの条件の変化に対応した培養上清中のエキソソームを観察することで、腫瘍の変化に対応したバイオマーカーの探索のヒントが得られる可能性がある。本研究では転移のメカニズムを観察するために血液中のエキソソームを分離して、腫瘍マーカーの可能性を探るものである。現在、エキソソームの分離法に関しては進行しているが、未だ次世代シーケンスによる網羅的な解析が行われていない。この理由は十分なRNA量を確保するだけのエキソソームを臨床サンプルから得るのが難しいことにある。近年、伴侶動物であるイヌの高齢化に伴い腫瘍(癌)で死亡するケースが非常に多くなっている。本研究はイヌの腫瘍の新規診断マーカーの発見と転移機構の解明の糸口としてのエキソソーム分子の解析を目的として研究を計画した。特にイヌの腫瘍における特異的なマイクロRNAを同定すること、さらに、腫瘍特異的エキソソームの抽出に着目することを計画した。前年度ではエキソソームの抽出と含有マイクロRNAの測定、イヌ細胞株の培養と低酸素などの刺激や抗がん剤への反応を観察することに成功した。最終年度はさらに以下の2つの研究で成果があった。1)エキソソームを超遠心で抽出し、イヌの血液中のエキソソームの分離に成功した。抽出したエキソソームに対してウェスタンブロットなど膜タンパクマーカーで確認し、最適な抽出法を確認できた。腫瘍罹患イヌの腹水と血液中のエキソソームを抽出し、腫瘍で非常に多く発現する癌性マイクロRNAであるマイクロRNA-21の測定を行い腹水中に多く見られることを新規に発見した。2)肝細胞癌、メラノーマ、乳腺腫瘍、肥満細胞腫で次世代シーケンス解析を行い含有マイクロRNAの発現、mRNAの発現プロファイルを得た。特に肝細胞癌では細胞株に増殖が速いものと遅いものがありその違いに関与するマイクロRNAとそのターゲット遺伝子の詳細な解析を行った。また、メラノーマでは肺転移、リンパ節転移、転移が生じていない腫瘍をそれぞれ分けて次世代シーケンス解析を行った。臨床サンプルから十分な解析(次世代シーケンス解析)をするだけのRNA分子が採取できない可能性がある。今後、培養細胞などから得られないかを検討する。また、腫瘍組織から次世代シーケンスで腫瘍特異的なmicroRNAの検索を検討し、腫瘍関連エキソソーム含有microRNAの探索を行う。獣医画像診断本研究では腫瘍症例の血液中のエキソソームを分離して、腫瘍マーカーの可能性を探ることが最重要課題である。現在、エキソソームの分離法は進行しているが、未だ次世代シーケンスによる網羅的な解析が行われていない。この理由は十分なRNA量を確保するだけのエキソソームを臨床サンプルから得るのが難しかったことにある。

次世代シーケンス解析が非常に多くの予算を必要としていることから、このような予算の使用状況にある。血液中のエキソソームの分離が難しい場合は、培養細胞や腫瘍組織からRNA分子を抽出して、次世代シーケンス解析を行う。この時に現在、未使用の予算が使用される計画である。
ランダムウォークを持つ距離空間とその位相

本年度は前年度に引き続き, RCD空間と呼ばれる測度距離空間についての研究を続けた. Bishop型不等式を満たすようなRCD空間についての性質についてまとめて論文として発表した.このような空間を考える一つの動機としては,非崩壊Ricci limit空間と呼ばれる解析しやすい対象の類似物をRCD空間にも定義することにあった.その試みは正則集合の一意性, Hausdorff次元の整数性,接錐が距離錐になることなどを示せたことである程度成功したと言って良い.しかしこの二つのクラスは完全に一致しているわけではない.実際非崩壊のRicci limit空間ではないようなBishop型不等式を満たすRCD空間は実際に論文の中で具体例を挙げている.この二つのクラスはどれほど異なっているのであろうか.論文で例に挙げている空間はユークリッド空間内の閉凸集合であり,その測度は通常のHausdorff測度になっている.そこで一般にBishop型不等式を満たすRCD空間の測度はHausdorff測度かという疑問が生じる.現在そこまでは証明できてはいないが,互いに絶対連続であることはすでに分かっている.現在解析的な手法を用いてこれを証明しようとしているが,その過程でやはり正則集合の分布が大事であることに気づいた.まだpreprintの状態であるが,正則集合が正測度を持つための十分条件を一つ得たのでそれについても現在研究を引き続き行っている.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はまず有限次元とは限らない測度距離空間で正のRicci曲率を持つものに対して,直径が有限になるための必要十分条件を求めた.この結果は熱核の縮小性をうまく使って得ることができ,一般的なrandom walk付きの距離空間に拡張できる.さらに直径の上限を熱核を用いて具体的に記述することができた.熱核の縮小性は与えられた測度距離空間のSobolev空間がHilbert空間になっているということを経由して得られるが, Sobolev空間がHilbert空間でない場合に同様の結果が成り立つか調べる,すなわち縮小性を持つような確率過程を構成することができるかという問題は今後の課題である.本結果はRiemann多様体上ですら知られていなかった評価であり,測度距離空間の幾何学のRiemann幾何学への還元ともみなすことができる.現在この結果に関する論文を作成し投稿中である.また一月から三月の間ドイツはBonnのHausdorff研究所に滞在した.そこで幾つかの共同研究を始めた.現在Sajjad Lakzian氏(HCM)と低次元のRCD空間の分類問題に取り組んでおり,次元が真に2より小さい場合の分類に成功した.この結果はRicci limit空間と呼ばれる, Ricci曲率を一様に下から抑えた多様体の列のGromov-Hausdorffの意味での極限空間における分類定理の類似であるが,測度についての情報も凸性を用いて記述している点が新しい.本研究により考察すべき低次元の測度距離空間が明らかになり,そのような空間上のrandom walkを具体的に考察することが可能になる.27年度はまず前年度末に得られていた結果である低次元RCD空間の分類定理について,証明に少し誤りがあったのでそれを修正した.特に測地線が分岐しないことを示すのに,最適輸送のテクニックを使った.これはもともとRajala-Sturmによって使われていた議論を我々の設定に合うように注意深く修正したものである.さらに一次元の円周に正の曲率を持つRCD空間がGromov-Hausdorff位相の意味で収束しないことを測度のRadon-Nikodym微分の凸性を用いて示した.次に一次元とは限らないようなRCD空間の中で扱いやすいクラスを定めることを行った.具体的にはRCD空間上でBishop型の不等式を満たすようなクラスを定義し,そのような空間の接錐についての考察を行った.RCD空間の重要な例であるRicci limit空間では非崩壊という非常に扱いやすいクラスがある.この非崩壊のRicci limit空間は接錐が距離錐と呼ばれる性質の良いものになっていることがすでに示されている.しかしながら非崩壊という定義は,近似する多様体列がない限り定義できないのでRCD空間には基本的に定義できない.そこで非崩壊なRicci limit空間ではBishop不等式が成り立つことに着目してBishop型の不等式が成り立つようなRCD空間の研究を行った.するとこのような空間は接錐が距離錐であり, Hausdorff次元が整数になるということが示せた.RCD空間上にBishop型の不等式を仮定することで,空間の局所的な性質が良いものであるということが示せた.このような局所的な性質がわかると,例えばRCD空間から何かよい空間への写像の調和性なども論じられると思われる.空間からWasserstein空間への写像の中で良いものを見つけるという課題であったので, 27年度の研究は大きな進歩であるが,まだ写像の空間に対しての研究までは到達していない.したがってやや遅れているという評価が妥当であると考えている.本年度は前年度に引き続き, RCD空間と呼ばれる測度距離空間についての研究を続けた.Bishop型不等式を満たすようなRCD空間についての性質についてまとめて論文として発表した.このような空間を考える一つの動機としては,非崩壊Ricci limit空間と呼ばれる解析しやすい対象の類似物をRCD空間にも定義することにあった.

その試みは正則集合の一意性, Hausdorff次元の整数性,接錐が距離錐になることなどを示せたことである程度成功したと言って良い.しかしこの二つのクラスは完全に一致しているわけではない.実際非崩壊のRicci limit空間ではないようなBishop型不等式を満たすRCD空間は実際に論文の中で具体例を挙げている.この二つのクラスはどれほど異なっているのであろうか.論文で例に挙げている空間はユークリッド空間内の閉凸集合であり,その測度は通常のHausdorff測度になっている.そこで一般にBishop型不等式を満たすRCD空間の測度はHausdorff測度かという疑問が生じる.現在そこまでは証明できてはいないが,互いに絶対連続であることはすでに分かっている.現在解析的な手法を用いてこれを証明しようとしているが,その過程でやはり正則集合の分布が大事であることに気づいた.まだpreprintの状態であるが,正則集合が正測度を持つための十分条件を一つ得たのでそれについても現在研究を引き続き行っている.熱核の定量的な性質から距離空間の直径を評価した今年度の仕事は,適切なrandom walkの概念の定義に役に立つと考えている.すなわち確率過程としてなんらかの縮小性を持ったものを考えることで,空間の幾何学的な情報をより詳しく得ることができる.さらに,逆に縮小性を持たない熱核を持つような空間でその熱核だけから幾何学的な情報を得ることができるか考えることも面白い問題であると考えている.また低次元RCD空間の分類は性質の良い測度距離空間は何かという問いへの一つの答えであり,ひいてはその上の確率過程等の研究に役立つものであると考えている.次元の高いRCD空間においても特別な場合にこの分類を用いて考えることができるので,この結果の応用範囲はさらに広いと思われる.しかしながら本年度は離散的な空間に対する具体的な研究, Wasserstein空間上の解析にまでは到達することができなかった.したがって完全に予定通りとは言えないが,おおむね研究は順調に進行していると考えている.現在までにBishop不等式を仮定したRCD空間自体の局所的な性質が非常に良いものであることがわかった.さらに最近Gigli氏により測度距離空間の微分構造と呼ぶべきものが定義され,盛んに研究されている.そこでこのGigli氏の結果も参考にしつつ,さらなる研究を推し進めていくことを考えている.28年度が最終年度であるため、記入しない。まずは現在進行中の低次元RCD空間の研究を進める.RCD空間上で定義されるregular setという概念がある.このregular set上適切に定義される次元が存在するが,この次元が測度距離空間上一定であるかどうかは未解決である.Ricci limit空間ではごく最近崩壊する場合でさえ一定の次元を持つことが証明された.しかしながらRCD空間上ではRicci limit空間で我々が利用できるような幾何学的な手法がうまく使えないことが多い.
新しい触媒的芳香環構築反応を駆使したらせんπ造形

今年度は、以下に示す研究を実施し有益な知見を数多く得た。カチオン性ロジウム(I)/軸不斉ビアリールビスホスフィン錯体触媒を用いた[2+2+2]、[2+1+2+1]、および[2+2+1]付加環化反応を用いた触媒的環構築法を検討し、S字型ダブル[11]ヘリセンの不斉合成、ジベンゾテトラセンジオンの合成、シクロペンタジエンの不斉合成、[6]シクロパラフェニレンの合成、高歪みケージ型分子の合成、ベルト型[8]シクロパラフェニレンの合成、メビウス型[10]シクロパラフェニレンの不斉合成などに成功した。また、これらの合成されたπ共役分子の結晶構造、電子構造、光学特性、およびキロプティカル特性を実験と理論計算により明らかにした。さらに、得られたジベンゾ[7]ヘリセンが興味深いメカノクロミズムと燐光を示すことも見いだした。パイ結合活性化反応による触媒的環構築法も検討し、カチオン性金(I)/軸不斉ビアリールビスホスフィン錯体触媒を用いた、エンインカルボニルの不斉環化反応を見いだした。シグマ結合活性化反応による触媒的環構築法も検討し、2つのエステル部位を有する電子不足Cpロジウム(III)錯体触媒を用いると、安息香酸とアルキンとの脱炭酸を伴う酸化的[2+1+2+1]付加環化反応が、温和な反応条件にて高収率で進行することを見出した。また、ペンダントアミド部位を有するCpロジウム(III)錯体触媒を用いることで、温和な反応条件にて高選択的な付加環化反応を見出した。これらの成果は、パイ電子系化合物合成における触媒的芳香環構築反応の高い有用性を示すものである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度の研究では、以下に示す成果が得られた。(1)カチオン性金(I)および銀(I)触媒を複合的に用いることにより、アルキンのエナンチオ選択的分子内二重ヒドロアリール化反応が室温で進行し、[6]アザヘリセンが中程度の光学純度で得られた。また、アルキンのエナンチオ選択的分子内四重ヒドロアリール化反応も室温で進行し、光学的に純粋なS字型[10]アザヘリセンが得られた。興味深いことに、[6]アザヘリセンは検出限界以下のCPL発光特性しか示さないのに対し、S字型[10]アザヘリセン単分子としては高いCPL発光特性を示すことがわかった。(2)カチオン性ロジウム(I)触媒存在下、ヘキサインのエナンチオ選択的分子内[2+2+2]付加環化反応が進行し、[9]および[11]ヘリセン類縁体が高い光学純度で得られた。また、X線結晶構造解析により構造を明らかにした。(3)カチオン性ロジウム(I)触媒存在下、ビアリール架橋テトラインとケイ素架橋ビスプロパルギルアルコールのエナンチオ選択的分子間[2+2+2]付加環化反応が室温で進行し、トリフェニレン骨格を有するシラ[7]ヘリセンが高い光学純度で得られた。さらに、CPL発光特性調べたところ、単分子としては高いCPL発光特性を示すことがわかった。平成27年度の研究では、以下に示す成果が得られた。(1)カチオン性金(I)および銀(I)錯体触媒を複合的に用いると、テトラインのエナンチオ選択的分子内四重ヒドロアリール化反応が室温で進行し、[10]アザヘリセンが極めて高いエナンチオ選択性で得られた。(2)カチオン性ロジウム(I)錯体触媒を存在下、フェナントレン骨格を2つ有するトリインのエナンチオ選択的分子内[2+2+2]付加環化反応が室温または80度で進行し、[9]ヘリセン類縁体が極めて高いエナンチオ選択性で得られた。(3)カチオン性ロジウム(I)錯体触媒を存在下、ナフタレン骨格を2つ有するテトラインとジインとのエナンチオ選択的分子間[2+2+2]付加環化反応が室温で進行し、ベンゾピセン骨格を2つ有する[9]ヘリセン類縁体が極めて高いエナンチオ選択性で得られた。さらに、軸不斉ヘテロビアリールのエナンチオ選択的合成や、多官能性シクロパラフェニレンの合成にも成功した。特に、多官能性シクロパラフェニレンでは、他班との共同研究により、その自己組織化ナノチューブ形成能を明らかにし、その構造を決定することに成功した。平成27年度の研究では、カチオン性金(I)および銀(I)錯体触媒を複合的に用いた[10]アザヘリセンの不斉合成、カチオン性ロジウム(I)錯体触媒を用いた[9]ヘリセン類縁体およびベンゾピセン骨格を2つ有する[9]ヘリセン類縁体の不斉合成に極めて高いエナンチオ選択性で成功した。さらに、軸不斉ヘテロビアリールのエナンチオ選択的合成や、多官能性シクロパラフェニレンの合成と自己組織化ナノチューブ形成にも成功しており、研究計画はおおむね順調に進展している。平成28年度の研究では、以下に示す成果が得られた。(1)カチオン性ロジウム(I)触媒を用いて、様々な高選択的(不斉)[2+2+2]付加環化反応の開発と、拡張π電子系化合物の合成に応用した。

具体的には、フェナントレン骨格をもつトリインの合成、[9]ヘリセンのエナンチオ選択的合成た、ベンゾピセン誘導体およびアザベンゾピセン誘導体の合成、ベンゾピセン骨格を有するラダー化合物および[9]ヘリセンの合成、ドナー/アクセプター型シクロパラフェニレンの合成、環サイズの小さい[8]シクロパラフェニレンオクタカルボキシレートの合成に成功した。また、1,2-ケイ素転位ビニリデン錯体生成と1,2-炭素転位によるアルキリデンベンゾオキサシロール合成に成功した。(2)カチオン性金(I)および銀(I)触媒を用いたアルキニルケトンのエナンチオ選択的分子内ヒドロアリール化反応による、軸不斉ビアリールの不斉合成に成功した。(3)電子不足カチオン性ロジウム(III)触媒を用いた、アニリドとアルキン酸エステルとの二重環化反応、室温付近の温和な条件で進行する不飽和カルボン酸とアルキンの[4+2]付加環化反応を開発した。さらに、カチオン性ロジウム(I)触媒を用いたジインとシクロプロピリデンアセトアミドとの[2+2+1]付加環化反応による多置換フルベンの合成に成功し、これを用いて合成した多置換フルベンシクロペンタジエニルRh(III)錯体がsp2およびsp3C-H結合活性化に極めて高い触媒活性を示すことを見出した。この新触媒を用いると、ベンズアミドとアルキンの[4+2]付加環化反応ではなく、形式的Lossen転位を含む[3+2]付加環化反応が進行し多置換インドールが収率良く得られることを見出した。この多置換フルベンシクロペンタジエニルRh(III)錯体は構造のチューニングが極めて容易であり、今後、さらなる新規芳香環構築触媒反応への適用が期待できる。平成28年度の研究では、カチオン性ロジウム(I)触媒を用いて、様々な高選択的(不斉)[2+2+2]付加環化反応の開発と、拡張π電子系化合物の合成に成功した。また、カチオン性金(I)および銀(I)触媒を用いたアルキニルケトンのエナンチオ選択的分子内ヒドロアリール化反応による、軸不斉ビアリールの不斉合成に成功した。さらに、電子不足カチオン性ロジウム(III)触媒を用いた、アニリドとアルキン酸エステルとの二重環化反応、不飽和カルボン酸とアルキンの[4+2]付加環化反応を開発した。このように、研究計画はおおむね順調に進展している。カチオン性ロジウム(I)触媒を用いて、末端アルキンと不活性内部アルキンとの化学および位置選択的[2+2+2]付加環化反応、およびジインとアセナフチレンとの不斉[2+2+2]付加環化反応を開発した。また、カチオン性ロジウム(I)錯体触媒を用いた[2+2+2]付加環化反応により、ホスファ[9]ヘリセンの不斉合成、ジベンゾ[7]ヘリセンのの不斉合成とダブルジベンゾ[6]ヘリセンの合成に成功した。さらに、カチオン性ロジウム(I)触媒を用いたキラルヘキサインの分子内[2+2+2]付加環化反応により、バニスター型分子の不斉合成にも成功した。これらのキラル分子は、CPLスペクトルおよびECDスペクトルにおいて比較的大きな異方性因子を示すことがわかった。π結合活性化反応による触媒的環構築法も検討し、カチオン性金(I)および銀(I)触媒を用いたジアルキニルケトンのエナンチオ選択的分子内連続ヒドロアリール化反応による、カルボ[6]ヘリセンおよびS字型ダブルカルボ[10]ヘリセンの不斉合成に成功した。
in-situ伝導度測定による半導性ZnO薄膜成膜初期の成長機構の解明

Zn(C_5H_7O_2)_2-H_2O-O_2系を原料としたMOCVD法によって(012)Al_2O_3およびSiO_2基板上に合成時間を変化させて薄膜を合成し、その成長機構について検討した。どちらの基板上の薄膜も析出時間の増加にともなって見かけの抵抗率は減少し、その後ほぼ一定の値となった。(012)Al_2O_3基板上の薄膜は合成時間15分から10^<-3>Ω・cm台の低い抵抗率をもつ薄膜が得られたのに対し、SiO_2基板上では30分でほぼ一定の値となり、その値は10^<-1>-10^<-0>Ω・cmと(012)AL_2O_3より2桁高い値となった。成膜時間15分の薄膜についてAFMの観察を行った結果、SiO_2基板上での薄膜は島状で不連続であったのに対し、(012)Al_2O_3基板上では層状の薄膜が観察された。この成長様式の差はTEMの断面方向観察でも確認された。従って両者の成長様式の差が抵抗率がほぼ一定となる時間の差に対応していると考えられた。また、(012)Al_2O_3基板上の薄膜が層状成長したエピタキシャル薄膜であり、粒界をほとんど含まないと考えられるのに対し、SiO_2基板上の薄膜は柱状構造した1軸配向薄膜であり、多くの粒界が存在しているという違いが、一定になった時の両者の抵抗率の差の原因だと考えることができる。
子どもの「アニミズム・死の概念発達」と生活体験-Death Educationの方略を求めて-

1)子どもの「死の概念発達と関連要因」を明らかにする。2)子どもが日常生活の中で出会う「死」を通して「死」や「死後の世界」をどのように考えているか実態を把握する。3)Death Educationのための指針を開発する目的で調査を実施した。調査対象は、小学校1学年から中学校3学年までの合計2,690名で、地域別では北海道が989名、関東が935名、九州が766名であった。死の概念の構成要素である(1)生物・無生物の識別は、学年(小学13年と小学46年、小学13年と中学13年)、地域(北海道-関東)、性別、学年・性別間と、(2)死の不動性は、学年(小学13年と小学46年、小学46年と中学13年)、地域(北海道-関東、関東-九州)、性別、学年・地域、学年・性別、地域・性別間と、(3)死の不可逆性は、学年(小学13年と中学13年、小学46年と中学13年)、地域(北海道-九州、関東-九州)、性別、学年・性別間と、(4)死の普遍性は、学年(小学13年と小学46年、小学13年と中学13年)、地域、学年・地域、学年・性別間と、(5)時間の概念では、学年(小学13年と小学46年、小学46年と中学13年)、地域、性別、学年・地域、学年・性別間、学年・地域・性別と有意に異なる関連があった。死の概念(5つの構成要素の和)は、学年、地域、性別、学年・地域、学年・性別、地域・性別、学年・地域・性別の全てと有意に異なる関連があることが確認された。つまり小児の死の概念発達は、学年、生活環境、性別による影響を受けており、その結果異なることが考えられる。Death Educationの方略指針の作成において、学年、生活環境、性別等を考慮に入れたプランが必要である。そこでまず、北海道における方略を開発中である。本研究の研究期間は,平成10年度から平成12年度までの3年間である。初年度である10年度の主なとり組み・活動状況は:1)質問紙の作成にむけての文献検索(アニミズム,認知的発達,小児の死の概念,小児をとりまく社会環境,Death-Education)である。これらの文献検索を通して,「小児の死の概念発達」と「小児の死の概念発達に関連する要因」に関する質問紙の作成に着手した。また2)小児の死生観(命の尊さ,動物や弱いものに対する思いやり)の発達に大きな影響力がある「小児をとり巻く環境・人間関係」の側面にも注目し,本研究に有用な既存の小児と環境(人間関係)に関するスケールを検討し,選定している。さらに本研究のデータ収集は,質問紙とともに半構成的面接によって,子どもたちが日常生活の中で出会う「死」をどのように受け止め,またその体験に対してどのようなFeelingを抱いているのかを把握する計画である。この半構成的面接は,子どもの心理状態に少なからず何らかのインパクトを与えることが予測される。そのための準備として,3)「生と死を考える会」セミナー(上智大学)に参加し,子どもと実際に死について語る活動を行っているホスピシボランティアの方の体験,子どもの反応,留意点等について研修を積み,研究計画に沿った準備に生かしている。まもなくプレテストを終了し,本格的に本調査を進めていく段階に入っている。

2年目である11年度の主なとり組み・活動状況は:1)文献検索や過去に行った研究をベースに「小児の死の概念発達」と「小児の死の概念発達に関連する要因」に関して作成した質問紙(生物・無生物の識別,アニミズム,時間の概念,死の不可逆性・不可避性)を用いて,本調査を実施した。2)本調査を実施した地域は,10年・20年前に実施した「小児の死の概念発達」に関する研究との比較も意図し,北海道,関東,九州の3地域を選んで実施した。3)調査対象は,小学校1年生から中学校3年生である。小学1年4年が約300名で合計1,200名前後,小学5年6年が約300名で合計600名前後,中学1年が約500名,中学2年3年が約300名で合計600名前後の,合計3,000名前後である。調査の実施にあたっては,「生と死を考える」セミナー(上智大学)で子どもと実際に「死ぬについて語る」活動を行っているホスピスボランティアの方の体験,子どもの反応,留意点等,学んだ研修内容を生かし実施した。調査活動は,ほぼ終了の運びである。今後は,本格的にデータの入力・分析に入る予定である。1)子どもの「死の概念発達と関連要因」を明らかにする。2)子どもが日常生活の中で出会う「死」を通して「死」や「死後の世界」をどのように考えているか実態を把握する。3)Death Educationのための指針を開発する目的で調査を実施した。調査対象は、小学校1学年から中学校3学年までの合計2,690名で、地域別では北海道が989名、関東が935名、九州が766名であった。(1)死別体験の状況、(2)生物・無生物の識別、(3)死の概念発達、(4)死のイメージ、(5)死後の世界について、年代別・性別・地域別、体験別に検討を行った。その結果、身近な人との死別体験者は、約5割から8割と学年が高くなるほど増加し、過去の研究と同様の結果であったが、地域差が確認できた。生物・無生物の識別は、中学生の男子でも約3割が「ポケモンは生きている」と答え、地域差はないが性別間に差が見られ女子よりも高かった。死の概念発達は、年代・性別・地域により有意な差が見られる項目が確認できた。死のイメージは男女とも約6割が「こわい」と回答し、死後の世界については、全学年を通して5割以上が「ある」と回答している。家族や友人と、死について話したいかという回答には、全学年とも5割を下回っており、死について6割以上が「話したくない」と回答している。しかし一方で、「大好きな人が死んだらどうしてあげたいか」との質問に、子どもなりにしてあげたいことを挙げている。身近な人との死別の時を家族と語り合うことの意義・実践活動がDeath Education指針の基盤である。
超微粒子プラスミド複合体を用いた腫瘍免疫遺伝子治療システムの構築

我々は、生体に投与後、腫瘍内で高い遺伝子発現を示すDNA複合体の調製法を確立している。サイトカインをコードしたプラスミドの複合体は、坦癌モデルマウスにおいて著しい治癒効果を示した。さらに効率よく免疫を惹起するため、結核菌タンパクESAT-6などの遺伝子についても検討した。これらは単独でも高い腫瘍増殖抑制効果を示し、さらにサイトカイン遺伝子を組み合わせると、抗腫瘍活性はさらに向上した。また、これらはイヌの原発性腫瘍に対しても高い治癒効果を示した。我々は、ポリアニオンによる保護コーティングで生体成分との非特異的な副作用を低減し、さらに希薄な条件化で得た微小な複合体粒子を、保護コーティングしたのち凍結乾燥濃縮することで、極微小な複合体の安定な濃厚分散液を得ることに成功した。この技術を用いて免疫賦活化サイトカインGM-CSFの遺伝子をコードしたプラスミドの極微小な複合体を調製し、その生体毒性を調べた。プラスミド量にして0.5mgの各複合体を1日おきに3回、マウスの皮下に投与した。翌日採血して血液スクリーニング検査を行い、生体内における毒性を調べたところ、各血球数、肝機能、腎機能において、ほとんど目立った数値の変化は見られなかった。また、投与後35時間の観察において発熱も認められなかった。マウスを用いた実験で安全性が確認されたので、実際の動物臨床の場で、癌に罹患したイヌに、GM-CSF遺伝子を持つプラスミド複合体を局所内投与、腹腔内投与、または静脈内投与し、治癒効果を調べた。口腔内にメラノーマを再発したイヌに対して、腫瘍切除後、局所にプラスミド量にして0.51mgの製剤を投与したところ、同じ箇所での再発が全く見られなくなった。また、メラノーマが肺転移し、食欲の無くなったイヌに1mgを静脈内投与したところ、一時的に症状が軽減し、食欲が回復した。反復投与後の血清を調べたところ、肝機能、腎機能に異常は認められなかったが、一過性のCRPの上昇が見られた。その他、リンパ腫、乳腺腫瘍のイヌに対しても、顕著な治癒、延命効果が認められた。我々はこれまでに、DNAの複合体にヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのポリアニオンによる保護コーティングを施し、生体成分との非特異的な副作用を低減し、さらに希薄な条件化で得た微小な複合体粒子を、保護コーティングしたのち凍結乾燥濃縮することで、極微小なDNA複合体の安定な濃厚分散液を得ることに成功している。昨年度は、この技術を用いて免疫賦活化サイトカインGM-CSFの遺伝子をコードしたプラスミドの極微小な複合体を調製し、それらが、坦癌モデルマウスにおいて、さらにはイヌ、ネコなどの中型動物の自然発生癌に対して著しい治癒効果を示すことを確認した。今年度は、より高い治療効果を得るために、GM-CSFの樹状細胞分化・成熟効果を増強させる目的で、GM-CSFとIL-4との混合製剤を作成した。また、別の抗腫瘍サイトカインとして、インターロイキン-2(IL-2)をコードしたプラスミドについても同様に複合体を調製した。坦癌モデルマウスにおける治癒実験において、IL4を加えることによる増強効果は認められず、GM-CSF単独と同等の効果であった。一方、IL-2を用いた製剤は、B16メラノーマを移植した坦癌モデルマウスにおいて、非常に高い腫瘍増殖抑制効果を持つことが確認された。細胞、生体に対する安全性が確認されたので、イヌIL-2の遺伝子をコードしたプラスミドを合成し、これらの複合体を実際の動物臨床の場で、癌に羅患したイヌに腫瘍局所内投与し、治癒効果を調べる臨床実験を開始した。我々はこれまでに、DNAの複合体にコンドロイチン硫酸などのポリアニオンによる保護コーティングを施し、生体成分との非特異的な副作用を低減し、特殊な条件下で極微小なDNA複合体の安定な濃厚分散液を得ることに成功している。一昨年度は、この技術を用いて免疫賦活化サイトカインGM-CSFの遺伝子をコードしたプラスミドの極微小な複合体を調製し、それらが、坦癌モデルマウスにおいて、さらにはイヌ、ネコなどの中型動物の自然発生癌に対して著しい治癒効果を示すことを確認した。作年度は、より高い治療効果を得るために、他の抗腫瘍サイトカインとして、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-12(IL-12)などをコードしたプラスミドについても同様に複合体を調製した。坦癌モデルマウスにおける治癒実験において、IL-2を用いた製剤は、B16メラノーマを移植した坦癌モデルマウスにおいて、特に高い腫瘍増殖抑制効果を示した。しかし、サイトカインの発現のみでは、抗腫瘍活性には限界があった。効率よく免疫システムを惹起するには、サイトカインだけではなく、デインジャー・シグナルの存在が必要なのではないか、と考えた。そこで、アデノウィルス、結核菌などの高い抗原性を持つ微生物タンパクのプラスミドを合成し、その複合体を同様に調製した。

坦癌モデルマウスにおける治癒実験において、結核菌タンパクESAT-6、あるいはAg85Bをコードしたプラスミドを用いた製剤は、単独でもB16メラノーマを移植した坦癌モデルマウスにおいて、高い腫瘍増殖抑制効果を示した。さらに、これらの微生物タンパクと、IL-2などのサイトカインを組み合わせることで、著しく高い抗腫瘍活性が達成された。また、これらは生体毒性が非常に低いことを確認した。