hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クォーク物質の物性とコンパクト星の磁場の起源

QCDの有効理論を用いて、フェルミ液体論に基づいてクォーク物質の強磁性相転移を議論し、温度-密度平面での磁気的相図を導出した。理論的には相互作用の遮蔽効果を議論して新たな非フェルミ液体効果が磁化率に出現することを示した。コンパクト星内部でのハドロンークォーク相転移を研究し、混合相の特徴を明らかにするとともに、重力波スペクトルへの影響を議論した。カイラル相転移に伴う非一様相の出現を議論し、対称性の破れを効果的に取り入れる理論形式を提案した。本年度はフェルミ液体理論とQCDを基礎に、有限密度・温度でのクォーク物質の帯磁率を計算し、その磁気的性質を詳細に調べるとともに、強磁性相への相転移を考察し、密度・温度平面において磁気的相図を描いた。ゲージ相互作用を用いると物理量に赤外発散が現れることが知られているので、意味のある結果を得るためにはグルオンの遮蔽効果を考慮することが不可欠である。実際微視的な計算によってクォーク多体効果を計算すると、縦波グルオンにはデバイ質量で表わされる静的遮蔽があり、相互作用レンジは短距離になり、赤外発散は修復される。一方横波グルオンは動的遮蔽しか受けず、フェルミ面近傍の相互作用を考えるとランダウーミグダルパラメターにはLog発散が残る。T=0の場合に、フェルミ液体理論を用いて帯磁率を計算すると、横波グルオンの効果としては状態密度とスピン依存相互作用に含まれるLog発散が相殺して有限値を与え、結局縦波グルオンの効果としてデバイ質量のLogで与えられる結合定数の非解析的項が現れるのが特徴的である。一方有限温度では横波グルオンの動的遮蔽効果が主要な温度依存性を与えることがわかった。この効果を注意深く考慮すると、温度依存性としてT^2Log Tをもつ異常項が現れる。これは従来のフェルミ液体理論では無かった効果で、非フェルミ液体効果と呼ばれるものである。これまで比熱に対しては多くの著者らによってTLog Tの依存性をもつ非フェルミ効果が議論されてきたが、我々の発見したものは全く新しいものである。これらの研究により、密度・温度平面での相図が得られ、超新星爆発時での磁場の発現など強磁場中性子星(マグネター)との関連が議論できるようになった。本年度の一つの重要な成果として、物理学会での招待講演がある。そこではQCDの磁性として自発磁化(強磁性)とスピン密度波についての研究成果を発表し、当該分野の専門家のみならず、周辺分野を含め幅広い分野の研究者に研究内容を知ってもらう良い機会となった。研究成果の発表としてはこの他にも京都で一月に開催された国際会議で招待講演を行ったことが特筆される。研究成果としては、大きく分けて二つのことが挙げられる。一つは、前年度に引き続き、自発磁化をフェルミ液体論の枠組みで扱い、温度一密度平面での磁気的相図を完成させ、理論的にはゲージ相互作用による非フェルミ液体効果を確認したことがある。他の一つはコンパクト星内部でのクォークーハドロン相転移を有限温度で考察し、混合相の性質を明らかにすると共に、状態方程式を導出したことである。この問題は直接クォーク物質の物性とは関係がないが、将来コンパクト星の現象とクォーク物質の物性の関係を議論するときに重要な役割を果たすことが予想できる。これらの研究および最近の他の著者たちの仕事との関連において、新しい課題として、これまであまり視野に入れてこなかった磁化が空間的に非一様なスピン密度状態の可能性および一様な強磁性状態との関連など統一的理解が重要になってきたと考えている。この問題は密度一温度平面でのカイラル対称性の回復、QCD臨界点の性質と密接に関連しており、高エネルギー重イオン衝突でのQGP生成の物理とも関係しているので興味深い。その他、連繋研究者との共同研究により、強磁性相における集団運動状態であるプラズマ振動の理解も進み、現在論文を準備している。スピン波などスピンに依存する集団励起の問題は引き続き重要な課題として残っている。本年度の一つの重要な成果は、クォーク物質における非一様構造の研究が挙げられる。最近カイラル対称性の回復に伴う非一様相の出現が話題になっているが、我々は一種の密度波状態(二重カイラル密度波)について数年前に既に研究を行い発表している。この仕事は、現時点の見地から非一様相に関する研究の先駆的な役割を果たしたと見なされている。そこで以前の研究の深化、拡張、現象との関連などを現代的観点からさらに議論するいい機会となった。まず非一様相発現の物理的機構を明らかにし、固体物理における密度波などとの関連で議論されているフェルミ面のネスティング効果と類似の機構が働くことを示した。また、以前の二重カイラル密度波の議論を対称性の破れの効果を取り入れて拡張できることを示した。結果はいくつかの国際会議で既に発表されており、現在論文を準備している。

もう一つの特筆すべき成果として、クォーク物質の相対論的磁性に関する総合報告を、NOVA社から出版される本の一章として出版されることになり、現在印刷中である。これにより、専門雑誌での総合報告とは異なりより幅の広い読者を対象に我々の研究が紹介されることになった。また、中性子星と状態方程式に関する本の出版に関しても数章の分担執筆を依頼され現在執筆中であり、非専門家の読者に中性子星の物理の魅力を発信できることを期待している。その他、中性子星内部での非閉じ込め転移の証拠を重力波の観測によってどのように観測されるかという問題について論文を発表し、観測されるスペクトルの特徴を明らかにした。
学習障害児における注意・記憶機能と実行機能の認知神経心理学的評価に関する研究

情報処理特性の評価は,主として、WISCやK-ABCなどの心理検査によって行われてきた。これらの検査では、課題を遂行していくプロセスに関する検討は困難である。この点で、課題の遂行プロセスに関して評価を行う評価システムの開発が必要である。また検査課題が脳機能のどのような側面を反映しているのか,生理心理的指標による検討が必要である。一方、情報処理特性に基づく支援方法の開発にあたっては,多くの学習障害児が困難を示す学習課題に対して,個別の援助条件を整備することが重要である。以上より,本研究では,以下の検討を行なった。(1)注意・記憶機能と実行機能を評価する測定システムを作成し,健常小児に適応してその標準値を収集する。それにより、学習障害児の認知特性のアセスメントを可能にする評価システムを開発した。(2)学習課題に関しては,学習障害児が多くの困難を示す漢字学習について,その困難の様相を明らかに士,かららの認知処理特性との関連で検討を行なった。これに基づき,学習支援課題をコンピュータにより作成し、学習障害児に適応して,その有効性を検討した。(3)記憶機能と実行機能の評価方法として近赤外光による脳血流動態の測定方法の有効性を検討した。具体的には,実行機能及び言語課題を遂行している際の脳血流量の変動を、成人を対象として測定し,K-ABCの実行機能課題において,前頭前野の血流増加を観察した。これらの検討をとおして、教育現場で利用可能な実行・記憶機能の評価システムを開発した。また学習支援に関しては,小学校の漢字を対象とし、子どもの認知特性を考慮できる学習支援ソフトを開発した。さらにK-ABCの検査課題と脳機能との関連を評価することができた。これに基づき,子どもが学習課題を行っているときの生理的指標の評価に基づき,最適な学習環境を構成することが可能であることが示された。近年、学習障害児に対する治療教育の必要が指摘されており、教育プログラムの作成に有効な診断方法の開発が求められている。その中で、注意・記憶因子と共に、継次的処理に関与する実行機能を評価することは、学習障害児の指導計画上、重要である。コンピュータによる記憶・実行機能の評価法として、CANTAB(ケンブリッジ神経心理学テストバッテリ)があるが、言語刺激を用いていない。そこで、本研究では、注意・記憶機能と実行機能を評価する測定システムを作成することを研究課題とした。また、評価に基づく支援を行い、その改善過程を検討することから、教育プログラムの作成に有効な診断方法について明らかにすることを目的とした。平成12年度においては、注意・記憶課題として、CPT課題、ストループ課題、ハノイの塔課題を作成した。また、学習達成段階を評価するために、漢字達成度の評価システムを開発した。漢字達成度の評価システムは、漢字の描画過程を記録することができる。これにより、注意記憶機能と実行機能の機能水準と、学業達成水準との関連について、個人に即して検討することができ、的確な学習診断と援助が可能である。平成13年度においては、さらに、ウイスコンシンカード分類課題(WCST)をコンピュータによって評価するシステムを作成する。これによって、学習障害児の指導に有効な評価システムを開発する。また、評価システムによる診断に基づいて、学習支援を行い、その改善経過を検討することによって、評価システムの有効性を検討する。

一方、情報処理特性に基づく支援方法の開発にあたっては,多くの学習障害児が困難を示す学習課題に対して,個別の援助条件を整備することが重要である。以上より,本研究では,以下の検討を行なった。(1)注意・記億機能と実行機能を評価する測定システムを作成し,健常小児に適応してその標準値を収集する。それにより、学習障害児の認知特性のアセスメントを可能にする評価システムを開発した。(2)学習課題に関しては,学習障害児が多くの困難を示す漢字学習について,その困難の様相を明らかに士,かららの認知処理特性との関連で検討を行なった。これに基づき,学習支援課題をコンピュータにより作成し,学習障害児に適応して,その有効性を検討した。(3)記憶機能と実行機能の評価方法として,近赤外光による脳血流動態の測定方法の有効性を検討した。具体的には,実行機能及び言語課題を遂行している際の脳血流量の変動を、成人を対象として測定し,K-ABCの実行機能課題において,前頭前野の血流増加を観察した。これらの検討をとおして、教育現揚で利用可能な実行・記憶機能の評価システムを開発した。また学習支援に関しては,小学校の漢字を対象とし、子どもの認知特性を考慮できる学習支援ソフトを開発した。さらにK-ABCの検査課題と脳機能との関連を評価することができた。これに基づき,子どもが学習課題を行っているときの生理的指標の評価に基づき,最適な学習環境を構成することが可能であることが示された。
苦み受容機構の再検討

視覚や嗅覚受容機構に比べ、味覚受容機構には未解決の問題が多い。味蕾を構成する個々の細胞が持つ電気生理学的な特性や、味刺激に対する応答性、支持細胞、分泌細胞と受容細胞の分類など、基本的な理解も十分でない。その理由の一つとして過去の生理学的研究が単離細胞について行われてきたことにある。単離細胞では形態学的な同定が困難なうえ、味蕾の中に占める位置などが不明である。本研究では、カエル茸状乳頭のスライス標本を作成し、ホールセルパッチクランプ法による応答記録後に、細胞内染色された細胞の形態を観察し、各細胞の生理学的な特性と形態との対応付けを行った。粘液細胞、Wing型細胞、Rod型細胞など形態の異なる細胞はそれぞれ異なるイオンチャネルを持ち、味刺激に対する応答性も異なっていた。粘液細胞は味刺激に応答せず、またこれまで支持細胞であるとされてきたWing型細胞はキニーネに応答性を示した。われわれはすでにホールセルクランプ法による実験でキニーネがカエル味細胞膜の陽イオンコンダクタンスを上昇させることを報告したが、さらに今回、味細胞のアウトサイドアウトパッチ膜にキニーネを投与したところ、チャネルの開口を観察することが出来た。苦み受容はこれまで細胞内二次伝達物質が関与するG蛋白を介する機構であると考えられてきたが、この発見は苦み受容も直接的なチャネルの開閉によって行われていることを示すものである。われわれはさらに、この苦み受容チャネルコンダクタンスは外液のカルシウム濃度に依存することをノイズ解析を行って示した。無カルシウム液中では単一チャネルコンダクタンスは約5pSから12pSに上昇し、キニーネとの親和性も上昇した。これらの結果は苦み受容機構における細胞内二次伝達物質の関与を否定するものではないが、味細胞における苦味応答が細胞表面にあるチャネル開閉によって発生するものであることを示している。味蕾はどのような細胞によって構成されているのか、それぞれの細胞はどのような電気生理学的な特性をもっているのか、どの細胞が味覚受容細胞でありどのような味刺激に応答するのか、どの細胞が支持細胞や分泌細胞なのかなど、基本的な問題にも十分な解答は出されていない。その理由の一つとしてこれまでの生理学的研究が単離細胞について行われてきたことにある。単離細胞では形態学的な同定が困難なうえ、味蕾の中でどこに存在したのかが分からない。本年度は、まず味細胞の形態と反応性との対応を検討するため、カエル茸状乳頭のスライス標本を作成し、ホールセルパッチクランプ法による応答記録後に、細胞内染色された細胞の形態を観察し、各細胞の生理学的な特性と形態との対応付けを行った。乳頭の最表層に位置する粘液細胞間にはダイカップリングが見られ、電気的結合の存在を示唆した。粘液細胞からは抵抗性のリーク電流のみが記録された。乳頭中層の上部に細胞体のあるWing型細胞は粘液細胞からの隙間から乳頭表面に向けて先端が矢羽状の太い樹状突起を伸ばしていた。この細胞はNa電流とK電流を持ち、活動電位の発生も見られた。Rod型細胞の細胞体は乳頭の中層下部に位置し細い樹状突起を乳頭表面に伸ばしていた。この細胞もNa電流とK電流を持っていたがWing型細胞に比べNa電流の振幅は有意に小さかった。Wing型細胞はキニーネに応答したが、Rod型細胞と粘液細胞での応答は見られなかった。

以上の結果から、シナプス構造が認められていないため支持細胞であるとされてきたWing型細胞は味受容細胞であろうと結論した。Rod型細胞はキニーネには応答しなかったが、他の味刺激には応答する可能性もある。視覚や嗅覚受容機構に比べ、味覚受容機構には未解決の問題が多い。苦み受容機構をとってみても、細胞内二次伝達物質の関与が示唆されていたが、1996年にわれわれはホールセルクランプ法による実験でキニーネがカエル味細胞膜の陽イオンコンダクタンスを上昇させることを報告し、さらに最近の実験で味細胞のアウトサイドアウトパッチ膜にキニーネを投与したところ、チャネルの開口を観察することが出来た。この結果はこれまでの苦み受容機構に関する仮説とは全く異なっている。そこで本年度は、苦み受容チャネルの性質を精査するため、アウトサイドアウト膜標本によって得られたチャネルを記録し、その性質(イオン透過性、細胞部位による分布、作用物質のスクリーニング、開口の動力学的検索など)をホールセル記録法のデータをノイズ解析したものと比較検討した。アウトサイドアウト膜標本にキニーネを投与するとチャネルの開口確率が上昇した。単離した味細胞をホールセル記録し、キニーネを投与すると内向き電流が生じ、電流の揺らぎは投与量に依存して増大した。これらのデータから単一チャネルコンダクタンスを求めるといずれも約5pSであった。チャネルコンダクタンスは外液のカルシウム濃度に異存し、無カルシウム液中では12pSに上昇した。カルシウムの有無によってキニーネとの親和性が変化しK1/2値が無カルシウム液中では0.48mMであったものが1.8mMのカルシウム存在下では2.8mMに上昇した。スペクトル解析によってパワー分布曲線を求めたところ、いずれの標本においてもこの曲線は2つのローレンツ曲線によって近似され、カルシウムの有無は遮断周波数には影響しなかった。これらの結果から、味細胞における苦味応答は細胞表面にあるチャネル開閉によって発生しているという結論が立証された。苦み受容機構をとってみても、細胞内二次伝達物質の関与が示唆されていたが、1996年にわれわれはホールセルクランブ法による実験でキニーネがカエル味細胞膜の陽イオンコンダクタンスを上昇させることを報告し、さらに最近の実験で味細胞,のアウトサイドアウトパッチ膜にキニーネを投与したところ、チャネルの開口を観察することが出来た。この苦み受容チャネルコンダクタンスは外液のカルシウム濃度に依存するので、本年度はカルシウムの効果をウシガエル舌から単離した味紬胞をホールセルクランプ法で記録し、キニーネ投与時に発生する電流の揺らぎをノイズ解析して検討した。キニーネ応答時の電流から求められた単一チャネルコンダクタンスは約5pSであったが、無カルシウム液中では12pSに上昇した。キニーネとの親和性もカルシウムの有無に依存し、K1/2値が無カルシウム液中では0.48mMであったものが1.8mMのカルシウム存在下では2.8mMに上昇した。応答の最大値はカルシウムの存在によって約20%減少した。電流の揺らぎのパワー分布曲線における遮断周波数カルシウムには依存しなかった。
後向きステップを有するチャネル乱流の能動的・受動的制御に関する研究

後向きステップ流れは伝熱促進の手段として有効な流れ場であり、ステップ入口ではく離したせん断流れは下流で再付着し、その近傍で熱伝達率は高い値を有することが知られている。しかしながら、ステップ下流の再循環領域では低い熱伝達率となってしまうことから、この領域での伝熱特性を向上させることが可能となれば、エネルギーの有効利用に貢献できることになる。本研究では後向きステップ流れの能動的・受動的制御について検討した。能動的制御に関しては再循環領域の低運動量の流体を吸い込む、あるいは再循環領域に高速流体を吹き込む制御法について、受動的制御に関してはステップ上流にスリットを設け、このスリットから高速流体を再循環領域に導くという制御法について検討した。受動的制御については、昨年度までの研究により本研究で提案した制御法により再循環領域の熱伝達率を向上しうることが判明したために、今年度は特に性能の向上が顕著に見られた条件につき、再循環領域ならびに再循環領域下流領域における流れの特性を詳細に調査した。能動的制御については、吹き出し、吸い込みを行うためのスリット幅、吹き出し、吸い込み流量を様々に変化させた実験を行い、伝熱特性、圧力損失特性を調査した。その結果、特に吸い込みの場合において、吸い込み流量の比較的小さい条件においても再循環領域の熱伝達率を大幅に上昇させることができ、かつ圧力回復特性も良好となることが明らかとなった。吹き出しの場合には、吹き出し直後の熱伝達率は向上するもののその後の減少傾向が顕著となることが判明した。さらに、能動的制御を行った際の速度分布、乱流強度分布、壁面せん断応力の測定などを行うことにより時間平均特性、乱流特性を詳細に調査した。それらの結果をふまえ、後向きステップ流れにおける熱輸送と流れの特性との関係について考察した。しかしながら、ステップ下流の再循環領域では低い熱伝達率となってしまうことから、この領域での伝熱特性を向上させることが可能となれば、エネルギーの有効利用にも多大な貢献をすることになる。本研究では、後向きステップ流れの能動的・受動的制御について検討した。能動的制御に関しては再循環領域の低運動量の流体を吸い込む、あるいは再循環領域内に高速流体を吹き込む制御法について、受動的制御に関しては、ステップ上流にスリットを設け、このスリットから高速流体を再循環領域に導くという方法について調査した。特に、本年度は受動的制御の場合について重点をおき、ステップ上流の高速流体を導くためのスリットの幅、角度等を種々変化させた条件のもとで、制御を行わない場合と行った場合とで圧力損失特性、伝熱特性ならびに流路内の流動状況がどのように変化するのかについて実験的に調査した。スリットの幅については2mm12mmの範囲で変化させ、角度については30°と45°の場合について検討した。その結果、本研究で提案する受動的制御により、再循環領域の熱伝達率を飛躍的に高めることができることが判明した。特に、角度が30°の場合ではスリットの幅が8mm程度で、角度が45°の場合ではスリットの幅が6mm程度において最も大きな性能向上が見られた。また、スリットを設けることにより、ステップ下流の側壁面近くにおける逆流は完全に消滅し、ステップ上流から導かれた高速流体が壁面に沿って流れることが確認された。

本研究では後向きステップ流れの能動的・受動的制御について検討した。能動的制御に関しては再循環領域の低運動量の流体を吸い込む、あるいは再循環領域に高速流体を吹き込む制御法について、受動的制御に関してはステップ上流にスリットを設け、このスリットから高速流体を再循環領域に導くという制御法について検討した。受動的制御については、昨年度の研究より本研究で提案した制御法により再循環領域の熱伝達率を向上しうることが判明したために、特に性能の向上が顕著に見られた条件につき、再循環領域ならびに再循環領域下流領域における速度分布、速度変動の乱流エネルギー、レイノルズ応力、壁面せん断応力の測定などを行うことにより、時間平均特性、乱流特性を詳細に調査した。それらの結果をふまえ、熱輸送と流れの特性との関係を明確にすることを試みた。能動的制御については、吹き出し、吸い込みを行うためのスリット幅、吹き出し、吸い込み速度を変化させうる流路を作成し、壁面静圧分布、熱伝達率の測定などを行った。その結果、特に吸い込みの場合において、吸い込み速度の比較的小さい条件においても再循環領域の熱伝達率を大幅に上昇させることができ、かつ圧力回復特性も良好となることが明らかとなった。吹き出しの場合には、吹き出し直後の熱伝達率は向上するもののその後の減少傾向が顕著となることが判明した。後向きステップ流れは伝熱促進の手段として有効な流れ場であり、ステップ入口ではく離したせん断流れは下流で再付着し、その近傍で熱伝達率は高い値を有することが知られている。しかしながら、ステップ下流の再循環領域では低い熱伝達率となってしまうことから、この領域での伝熱特性を向上させることが可能となれば、エネルギーの有効利用に貢献できることになる。受動的制御については、昨年度までの研究により本研究で提案した制御法により再循環領域の熱伝達率を向上しうることが判明したために、今年度は特に性能の向上が顕著に見られた条件につき、再循環領域ならびに再循環領域下流領域における流れの特性を詳細に調査した。能動的制御については、吹き出し、吸い込みを行うためのスリット幅、吹き出し、吸い込み流量を様々に変化させた実験を行い、伝熱特性、圧力損失特性を調査した。その結果、特に吸い込みの場合において、吸い込み流量の比較的小さい条件においても再循環領域の熱伝達率を大幅に上昇させることができ、かつ圧力回復特性も良好となることが明らかとなった。さらに、能動的制御を行った際の速度分布、乱流強度分布、壁面せん断応力の測定などを行うことにより時間平均特性、乱流特性を詳細に調査した。
疾患に関連する蛋白質<翻訳後修飾>の複数同時探索系の確立

本研究では、疾患と関連する蛋白質翻訳後修飾を効率よく同定する手段として、多数の蛋白質について複数の翻訳後修飾の同時複数探索系を確立することを目的としている。そのためのステップとして、まず翻訳後修飾としてリン酸化、およびアセチル化に焦点を当て、ヒトの細胞からこれら翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討・評価した。具体的には、ヒト滑膜肉腫細胞株SW982細胞の抽出蛋白質を用い、リン酸化蛋白質、もしくはアセチル化蛋白質に対する抗体アフィニティーカラムによって、これら翻訳後修飾を受けた蛋白質の精製を試みた。その結果、2.6mgの細胞抽出蛋白質から108μgのリン酸化蛋白質が、256μgの細胞抽出蛋白質から4.9μgのアセチル化蛋白質が回収され、これらの組み合わせにより両翻訳後修飾の同時評価が可能と考えられた。本年度、さらにLC-MS/MSを用いてカラム溶出画分中の蛋白質を同定することに加えて、従来の検出方法である電気泳動とそれに続くリン酸化検出蛍光色素もしくはアセチル化リジン抗体を用いた検出方法により、リン酸化蛋白質もしくはアセチル化蛋白質が抗体アフィニティーカラムによって十分精製されていることを検証した。その結果、リン酸化蛋白質画分からは多数のリン酸化蛋白質を示すバンドが検出された。アセチル化蛋白質の画分からは、数本のアセチル化蛋白質を示すバンドが検出された。また、蛋白質がリン酸化とアセチル化を同時に受けていることを示すバンドも、数本検出された。以上より、ヒトの細胞からリン酸化、アセチル化を受けた蛋白質が効率的に精製可能であることが示された。また、LC-MS/MSにおいても同様の結果が得られていることから、精製後、電気泳動を用いずに、LC-MS/MSのみで各翻訳後修飾蛋白質を検出することが可能であることが示された。今後、リン酸化、アセチル化以外の翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討し、最終的に10個以上の翻訳後修飾の同時検出技術の確立したい。本研究では、疾患と関連する蛋白質翻訳後修飾を効率よく同定する手段として、多数の蛋白質について翻訳後修飾の同時複数探索系を確立することを目的としている。平成21年度は、翻訳後修飾としてリン酸化、およびアセチル化に焦点を当て、ヒトの細胞からこれら翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討した。具体的には、ヒト滑膜肉腫細胞株SW982細胞の抽出液を用い、リン酸化蛋白質、もしくはアセチル化蛋白質に対するアフィニティーカラムによって、これら翻訳後修飾を受けた蛋白質の精製を試みた。その結果、2.6mgの細胞抽出蛋白質から108μgのリン酸化蛋白質が、256μgの細胞抽出蛋白質から4.9μgのアセチル化蛋白質が回収された。LC-MS/MSを用いて、カラム溶出画分中の蛋白質を同定したところ、リン酸化蛋白質画分からは、223個の蛋白質、および136個のリン酸化ペプチドが同定された。同定された蛋白質の中には、32個のリン酸化部位が報告されているLamin A/Cなどが含まれていた。アセチル化蛋白質の画分からは、28個の蛋白質、および24個のアセチル化ペプチドが同定された。同定された蛋白質の中には14個のアセチル化部位が報告されているMyosin-9などが含まれていた。また、Myosin-9およびMyosin light polypeptide 6は両画分で同定されており、これらの蛋白質がリン酸化とアセチル化を同時に受けていることが示唆された。以上、今年度の研究により、ヒトの細胞からリン酸化、アセチル化を受けた蛋白質を効率的に精製する方法を確立できた。さらに、LC-MS/MS解析により、リン酸化、アセチル化を同時に受けていると思われる二つの蛋白質の同定に成功した。今後、リン酸化、アセチル化以外の翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討し、最終的に10個以上の翻訳後修飾の同時検出技術の確立を試みる予定である。

以上より、ヒトの細胞からリン酸化、アセチル化を受けた蛋白質が効率的に精製可能であることが示された。また、LC-MS/MSにおいても同様の結果が得られていることから、精製後、電気泳動を用いずに、LC-MS/MSのみで各翻訳後修飾蛋白質を検出することが可能であることが示された。今後、リン酸化、アセチル化以外の翻訳後修飾を受けた蛋白質を精製する方法を検討し、最終的に10個以上の翻訳後修飾の同時検出技術の確立したい。
糖タンパク質の生理機能解明のためのオリゴ糖鎖の水溶液中における立体配座解析

糖タンパク質の生理機能を明らかにするために、糖蛋白を構成している等鎖の水溶液中の立体配座を^1H-NMRスペクトルの磁気異方性効果を利用して解析した。今まで、この方法は、等鎖解析の分野に適用された例がないために、基礎的な方法論の解析を行った。モデル化合物としてO-結合型糖タンパク質コア部分のピリジアルアミノ化糖を用いた。3.Galβの部分のピラノース環の立体配座解析を行った。3.Galβ1-3GalNAc-PA,Galβ1-3GalNAc-olの脂肪族骨格プロトンを比較して、高磁場又は低磁場シフトしているプロトンを選択し、その中でピリジンカンによる磁気異方性効果が現れているプロトンを選んだ。5.Galβ1-3GalNAc-PAの可能な配座異性体は、モンテカルロ法により発生させた構造を分子力学計算で最適化することにより得た。6.5で発生させた配座異性体の中から^1H-NMRスペクトルの測定結果と一致するものを選び出すことにより、立体構造を決定した。○-結合型糖タンパク質コア部分のピリジルアミノ化糖鎖を解析した。3.Galβ部分のピラノース環の立体配座解析を行った。4.Galβ1-3GalNAc-PAとGalβ1-3GalNAc-01の脂肪族骨格プロトンを比較して、高磁場または低磁場シフトしているものを選択し、その中でピリジン環による磁気異方性効果が現れるプロトンを選んだ。5.Galβ1-3GalNAc-PAの可能な配座異性体を、分子力学計算法(MM2)を利用したモンテカルロ法を用いて発生させた。6.5.で計算した配座異性体の中で^1H-NMRスペクトルの測定結果と一致するものを選び出すことにより立体構造を決定した。現在、さらに分子量の大きい、枝分れが多いオリゴ糖を解析している。糖タンパク質の生理機能を明らかにするために、糖タンパク質を構成している糖鎖の水溶液中の立体配座を解析した。昨年度の研究では、オリゴ糖の立体配座を^1H-NMRの磁気異方性効果を利用して解析するために、効率よくオリゴ糖の全プロトンの解析を支援するプログラムの開発をGalβ1-3GalNAC-PA及びGalβ1-3GalNAc-olを用いて行った。本年度は、この方法を用いて更に長い糖鎖の糖アルコールと相当するPA化糖の^1H-NMRスペクトルを解析し、それらのデータの比較から磁気異方性効果による影響を検討した。この磁気異方性効果の影響と分子力学計算を利用した配座発生法から得られた構造が最も良く一致する配座を探索することにより、水溶液中のオリゴ糖の立体配座を決定した。2.上記-PAと-olの脂肪族骨格プロトンを比較して、高磁場又は低磁場シフトしているものを選択し、その中でピリジン環による磁気異方性効果が現われているプロトンを選んだ。3.上記-PAの可能な配座異性体を、分子力学計算法(MM2)を用いるモンテカルロ法配座発生プログラムで計算し、この中で^1H-NMRスペクトルの測定結果と一致するものを選び、立体構造を決定した。
リハ治療効果を脊髄で評価する基盤研究： In vivoパッチクランプ法を用いて

ギプス固定した右後肢に対する振動刺激はギプス抜去後の他動的な右足関節背屈可動性、右膝関節の動的機能、歩行能力を改善した。正常マウスの右後肢で痛覚閾値を測定し、左後肢に振動刺激を加えると痛覚閾値の上昇が見られた。生体動物の脊髄後角から単一神経細胞を記録した条件で右後肢にピンポイント痛覚刺激を行うと、抑制性シナプス電流の増加部位は興奮性のそれよりも大きく、その範囲はより近位方向に拡がっていた。また、下降性抑制系の一つであるノルアドレナリンは、痛覚刺激による興奮性シナプス電流の増加を有意に抑制した。これらのことは、特に感覚系の定量的改善効果を脊髄後角レベルで確かめるための基盤になると考えられた。1.マウスの歩行評価に関しては、まず右後枝に対する膝屈曲位ギプス固定法を確立した。さらに、そのギプス抜去後にマウスの歩行動作及び水泳動作を上方よりビデオ撮影し、image Jにて解析を行うと、左回転よりも右回転をしている事がわかった。2.マウスギプス抜去後の膝関節可動域測定については、マウスを覚醒下もしくは麻酔下にて上方よりの写真撮影を行い、image Jにて膝関節の角度測定を行った。その結果、2週間固定では膝伸展角度が元通りになったが、6週間固定では膝屈曲拘縮を残す結果となった。3. von-freyフィラメント法を用いた足底感覚評価に関しては、マウス覚醒下で体幹固定する事が可能となったので、足裏の感覚をvon-freyフィラメント法ではなく、5Hz、50Hz、250Hz及び2000Hzのサインカーブによる電気刺激を加える事により感覚閾値を測定した。その結果、予測に反して感覚閾値は低下し、正常よりも弱い刺激で反応する感覚過敏が起きていた。キャストによる右後肢膝関節固定マウスに対して、固定期間中に足底部への振動刺激を与えた群(振動刺激群)と与えなかった群(コントロール群)の差を検証した。2週間と6週間のキャスト固定を比較すると、6週間固定の方が2週間固定に比べ、膝関節伸展可動性により制限が見られたものの、振動刺激群はコントロール群とでは膝関節の可動性に何ら影響がなかった。また足底部の感覚閾値を測定すると、コントロール群において若干の感覚閾値上昇が観察されたが、振動刺激群と比較しても統計学的有意差は無かった。しかしながら40秒間の自由歩行において、振動刺激群はコントロール群よりも総歩行距離(p < 0.05)、最大歩行速度(p < 0.05)及び平均歩行速度(p < 0.05)の値が多かった。また、自由歩行における方向転換の方向において振動刺激群はコントロール群に比べ、より左回りの可能な例が多かった(p < 0.05)。自由水泳において、水泳距離、最大水泳速度及び平均水泳速度に差はなかったが、振動刺激群はコントロール群に比べより真直ぐ及ぶ割合が多かった(p < 0.05)。自由歩行における足跡分析を行なうと、遊脚相と立脚相の割合に差は認められなかったが、振動刺激群のほうがより広い足裏面で床に接地していた(p < 0.05)。それらの一連の行動における変化は、振動刺激群とコントロール群における右足関節背屈可動性の差として現れていた(p < 0.05)。当初はvon-Fleyフィラメント法を用いて感覚検査を行う予定であったが、電気刺激装置による痛覚閾値評価をマウス覚醒下で繰り返し実験することができるようになったので、電気刺激装置を利用して感覚閾値の評価を行なった。キャスト抜去後の関節可動性評価、行動様式の変化についてはほぼ実験が終了している。キャストモデルマウスに関して、キャスト固定期間中に足底部への振動刺激を与えた群(振動刺激群)は、振動刺激を与えなかった群(コントロール群)に比し、キャスト抜去後の自由歩行において総歩行距離と最大歩行速度の値が大きかった。その理由には2つ考えられた。その1番目の理由として、振動刺激群のマウスはコントロール群のマウスに比べ、足関節の他動的な背屈可動性のあることがわかった。また2番目の理由として、自由水泳の結果から振動刺激群のマウスはコントロール群のマウスに比べ、膝関節の自動可動性があり、水泳時の膝関節屈伸時の速度も早いことがわかった。しかしながら、振動刺激群とコントロール群における自由歩行の差に対して、感覚閾値は変わらなかった。その理由として、感覚閾値を測定するために用いた電気刺激の刺激周波数が2000Hzであったことに由来しているのではないかと考えた。そこで感覚閾値に対して振動刺激が効果的であるか否かをより詳細に調べる実験を行った。正常マウスを用いて、後肢の感覚閾値を測定するために、4種類の電気刺激周波数(5 Hz、50 Hz、250Hzそして2000 Hz)を用いた。各々の電気刺激周波数での感覚閾値を測定した後に、同側及び対側後肢足底部に対して2分間の振動刺激を加え、その後15分間感覚閾値を測定した。その結果、2分間の同側及び対側後肢への振動刺激は、少なくとも振動刺激後15分後に感覚閾値を上昇させることがわかった。また更なる定量的感覚検査を確立させるために、マウス覚醒下の前後肢に対して熱刺激を用いて逃避反応を起こる時の熱刺激閾値(温度)を測定する方法にも成功した。

2015年度まではおおむね順調であったが、2016年4月に起こった熊本地震の影響で、2016年度は研究機器がほとんど使えなかった。そのためにほとんど動物実験を行うことができなかった。そのような理由で、今回科研費Cの延長願いを出し受理していただいた。現在は、再セットアップをほとんど完了し、今年度は昨年度の分を行う予定である。最初の実験として、キャスト固定マウスに対するリハビリテーションとしての振動刺激の効果を探る実験を行った。右後肢にキャスト固定し、振動刺激を行なう群(vibration群)と振動刺激を行なわない群(Control群)の2群に分け、右後肢の膝関節伸展可動性と感覚閾値の変化を観察したが、両群で膝関節の伸展可動性と感覚閾値に改善効果を示さなかった。次に、マウスの歩行動作に対する振動刺激の効果を検証した。vibration群はControl群に比し、明らかに動きが良く、それはvibration群の足関節背屈角度がControl群の背屈角度に比し、有意に高い値を示すこと。更に振動刺激がマウス右後肢の動的膝機能に働きかけたためであった。2番目の実験として、正常マウスの感覚閾値に対する振動刺激の影響を探った。右後肢で感覚閾値を測定し、左右後肢へ別々に振動刺激を加えると、右側振動刺激では5Hzの電気刺激での感覚閾値が、左側振動刺激では50Hzの電気刺激での感覚閾値が有意に上昇していた。それらの事は、振動刺激が触覚ではなく、痛覚閾値を上げることを示唆している。3番目の実験として、熱刺激を用いた定量的感覚閾値測定方法を確立させるための実験を線維筋痛症モデル(FM)マウスに試みた。その結果、FMマウス作成前に比し、FMマウス作成後の方が有意に熱刺激による感覚閾値が低下していた。4番目として、脊髄後角における感覚評価方法の確立と下降性抑制系の1つであるノルアドレナリン(NA)賦活による感覚応答の修飾作用を見た。麻酔下で脊髄後角に対して生体パッチクランプ法を実施した。グルタミン酸作動性興奮性シナプス後電流(EPSCs)を測定した条件下で、NA投与がピンチ刺激によるEPSCs増強作用の減弱に作用していた。ギプス固定した右後肢に対する振動刺激はギプス抜去後の他動的な右足関節背屈可動性、右膝関節の動的機能、歩行能力を改善した。正常マウスの右後肢で痛覚閾値を測定し、左後肢に振動刺激を加えると痛覚閾値の上昇が見られた。生体動物の脊髄後角から単一神経細胞を記録した条件で右後肢にピンポイント痛覚刺激を行うと、抑制性シナプス電流の増加部位は興奮性のそれよりも大きく、その範囲はより近位方向に拡がっていた。また、下降性抑制系の一つであるノルアドレナリンは、痛覚刺激による興奮性シナプス電流の増加を有意に抑制した。これらのことは、特に感覚系の定量的改善効果を脊髄後角レベルで確かめるための基盤になると考えられた。平成26年度中に行うべき項目については、ほぼ達成できているので達成度はほぼ予定通りと自己評価した。尚、Invivoパッチクランプ法については、現在拘縮した膝関節に対する伸張刺激装置のセッティングを行っており、固定装置と麻酔装置のセッティングが終わり次第、実施する予定である。感覚刺激や運動刺激に対する神経応答を麻酔下での脊髄後角で記録する。単一神経細胞応答のみならず、脊髄後角上での細胞外記録法も併用することで、健側(左)とキャスト側(右)での感覚刺激や運動刺激に対する神経応答を比較することが出来る。また即時効果としての振動刺激の効果も脊髄後角レベルで検証する。
深海生物が硫化水素を無毒化する機構は浅海生物にも存在するか?

深海熱水噴出域や冷水湧出域に生息する無脊椎動物は細胞内にタウリンなどを蓄積することで無毒化していることが示唆されている。本研究では、この機構が浅海から深海まで普遍的であるか解明するため、タウリンやその類縁体を細胞内へ輸送するタウリン輸送体(TAUT) mRNAを定量することを目的とした。深海性二枚貝のシチヨウシンカイヒバリガイおよび浅海性二枚貝であるムラサキイガイを用いて硫化物曝露実験を行なったところ、両者ともに同様の硫化物無毒化機構をもつ可能性が示唆された。深海熱水噴出域や冷水湧出域では、多量の硫化水素が存在する。近年、このような環境に生息する生物の体内にチオタウリンが多く蓄積されていることが報告され、硫化水素の無毒化に関与していることが示唆されてきた。これまで、チオタウリンやタウリンなどを細胞膜上で輸送するタウリン輸送体が硫化水素の無毒化に関与している可能性を明らかにしてきたが、この機構が深海生物に特化したものなのか、浅海の生物も持つ既存の機構を応用しているのかは不明であった。本年度は、シンカイヒバリガイ類のタウリン輸送体が浅海の無脊椎動物と同様に、浸透圧調節に関与しているのか明らかにすることを目的とし、研究を遂行した。採集したシンカイヒバリガイ類を高浸透圧条件(天然海水に人工海水の素を溶解し、塩分39-40に調整したもの)、低浸透圧条件(天然海水を純水で希釈し、塩分34に調整したもの)で24時間までの飼育を行ない、8時間、24時間後に解剖を行なった。解剖では、鰐、足、外套膜を単離し、液体窒素による凍結保存を行なった。また、同じタイムコースで硫化物曝露に対する影響を調べるため、天然海水に硫化ナトリウム九水和物を溶解した溶液に生貝を曝露し、解剖した。これらのサンプルは、RNA抽出を行なった。現在、リアルタイムPCRによるタウリン輸送体mRNAおよび共生菌16SrDNAの定量を行なっている。また、硫化物濃度が異なる環境に生息するシンカイヒバリガイ類のタウリン輸送体mRNA量の比較を行なうため、複数地点のコロニーから採水し、シンカイヒバリガイ類の採集を行なった。しかしながら、どの地点でも硫化物がごく低濃度しか検出されなかったため、来年度の調査航海においても引き続き研究する予定である。深海熱水噴出域や冷水湧出域では、生物に有毒な硫化水素が多量に存在するにも関わらず、豊かな生物群集が形成されている。これまで行なった研究により、チオタウリンやタウリンなどを細胞膜上で輸送するタウリン輸送体(TAUT)が硫化水素の無毒化に関与している可能性を明らかにしてきた。その一方、浅海の無脊椎動物ではTAUTが浸透圧調節に関与することが知られており、これら2つの機構を二枚:貝類が浅海から深海まで普遍的に有するかは明らかにされていない。本研究では、伊豆小笠原海域の明神海丘(熱水噴出域)に生息する二枚貝であるシチヨウシンカイヒバリガイを用い、硫化物に対するTAUT遺伝子の応答を調べるため、48時間までの短期曝露実験を行なった。試験区は硫化ナトリウム添加区Gmg/lOL、10mg/lOL)、チオ硫酸ナトリウム添加区(10mg!10L)、非添加区(コントロール)の4試験区とし、各試験区に8個体ずつ用いた。24時間後、48時間後に解剖ののち一80°Cで保存した。また、硫化物は添加後に濃度が変化するため、8時間ごとに添加した。さらに、シチヨウシンカイヒバリガイは低浸透圧での短期飼育も行なった。100%海水(コントロール)、97.5%、95.5%、85.0%の試験区に分けて飼育し、24時間、48時間後に解剖ののち一80°Cで保存した。これらの実験で解剖した鰭組織から、常法により全RNAを抽出し、リアルタイムPCRに供するために逆転写反応を行なった。また、シチヨウシンカイヒバリガイとムラサキイガイのTAUT遺伝子は高い相同性があり、TaqManプローブの配列は一致しているが、シンカイヒバリガイ類に汎用性のあるプライマー配列が異なっていたことから、ムラサキイガイのリアルタイムPCR用プライマーを新たに設計した。
慢性関節リウマチの病態形成に対する肝細胞増殖因子の役割についての研究

慢性関節リウマチ(RA)患者の関節水腫部位より採取した関節液についてその肝細胞増殖因子(HGF)濃度が著明に上昇しており,炎症性の浸潤細胞より産生されていると考えられていたが,関節腔内では多形核白血球(PMN)のみが肝細胞増殖因子を産生していることが,培養上清中の経時的な増加,mRNAのPMNでの特異的な発現より明らかになった。さらに,HGFが,RA患者の骨髄でも著明に上昇していること,骨髄球系分画より産生されていることも明らかになった。RAでは全身性に骨髄球系の細胞がこの物質の産生能を獲得し,この疾患の病態に関与していると考えられた。SLEなどの好中球増加が見られない膠原病においてはHGFの増加は末梢血,骨髄液および関節液には見られなかった。RAにおける関節炎の特徴は滑膜の異常な増生をともない種々のサイトカインが局所で上昇していることである。傍関節性骨粗鬆症の一つの要因に考えられているサイトカインはIL-6であるが関節液中ではHGFとIL-6濃度は正相関する。さらにRAにおいて炎症局所である関節液中に動員され活性化していると考えられる付着性の多形核白血球がHGFを産生することは、RAの関節炎の病態形成にHGFが重要な役割を果たしていることを強く示唆している。一方、活性化した付着性の多形核白血球細胞の培養液中HGF濃度の上昇は培養開始24時間後から72時間後までのあいだで1,25(OH)_2D_3に濃度依存性に抑制された。この操作は細胞のバイアビリティーには影響せず,活性型ビタミンDは免疫担当細胞の分化に促進的に働くことが知られていることから,ビタミンDによりHGF産生が抑制的に調節を受けていると考えられた。われわれの以前の研究で関節液中でビタミンDの1α水酸化酵素活性が上昇していることを見いだしているが,以上のことよりこの酵素活性上昇は防衛的な反応であると考えられる。HGFは最近の研究では強力な血管新生作用を有することが明らかにされている。これらのことよりRAの滑膜増殖の早期に浸潤するPMNが特に血管に富んだ炎症性滑膜の増殖に関与していることが示唆された。活動性慢性リウマチ患者の関節穿刺液中の細胞を密度勾配法により骨髄球系、単球系及びリンパ球系に分画しそれぞれについての肝細胞増殖因子(HGF) mRNAの発現を検討した。細胞の収率を上げるため関節洗浄による回収も試みたがnorthern blot法による検討では十分な検出感度は得られなかったためやはり、RT-PCR法を行う必要があった。サイクル数をあげ高感度のPCRを行い検出されたバンドは骨髄球系分画に特に優位に認められた。これは、in vitro培養系での産生能と一致する結果であった。単球系及びリンパ球系分画にみられたバンドは増幅されているため有意性はなお不明であり、細胞の分画が不十分であることが一因と考えている。今後はプライマーの工夫による感度、特異性の向上、また細胞を大量に処理できる正確な分画法を考案中である。

感度の向上が可能となれば、疾患の活動性との関係を検討するため内因性コントロールを用いた定量的RT-PCR法を行いうる。同様の検討を手術で摘出された滑膜及び周囲組織についても行った。炎症細胞浸潤の多い炎症性滑膜組織にてHGFmRNAのバンドが優位に認められた。浸潤した炎症細胞由来と考え、in situ hybridyzationを試みている。慢性関節リウマチ患者の関節水腫部位より採取した関節液の塗抹標本を作成し、Zamboni液で固定後、Sakaguchiの方法に準じて、肝細胞増殖因子の特異的モノクローナル抗体を用いた免疫化学染色法にて肝細胞増殖因子を産生している細胞を検索中である。活動性慢性リウマチ患者の骨髄穿刺液、末梢血液、および関節穿刺液中の細胞を密度勾配法により骨髄球系(主に好中球)、単球系及びリンパ球系に分画しそれぞれについての肝細胞増殖因子(HGF)の産生能およびmRNAの発現を検討した。HGFは骨髄球分画の培養上清中にのみ認められた。特に骨髄液および関節液の細胞において著明に認められた。northern blot法による検討ではいずれの分画でも十分な検出感度は得られなかったため、RT-PCR法を行った。プライマーを工夫し高感度のPCRを行い検出されたHGFのバンドは他のサイトカインと異なり骨髄球系分画にのみ認められた。これは、in vitro培養系での産生能と一致する結果であった。このことは骨髄ですでに好中球が活性化されており、それらが炎症部位に移動してくる可能性を示唆している。慢性関節リウマチ患者の関節液の塗抹標本における肝細胞増殖因子(HGF)の特異的モノクローナル抗体を用いた免疫化学染色法にてHGFを産生している細胞は,関節内に浸潤してきた多形核球(好中球)であることが確認された。また、手術症例より得られたリウマチ性に増殖のみられた滑膜について同様の検討を行った。滑膜に新生してきた毛細血管周囲にわずかに検出されたが,予想に反して好中球は乏しく組織内に浸潤している細胞は単核球優位で,ほとんどHGFは検出されなかった。同様にin situ hybridyzationでは優位な所見が得られなかった。内因性コントロールを用いた定量的RT-PCR法では関節液中の多核球での検討を行うと病勢に関係なく常にmRNAが検出され,好中球内に誘導がかかるとことよりもむしろ遊走浸潤してくる細胞数が増加することによりHGF活性が増加していると考えられた。しかし急速に関節水腫が増加してきた時期の一部の症例より採取した検体において検出されるmRNAの多いものがあり,病気の超急性期においては増加している可能性がある。骨髄においては骨髄球系以外にもストローマ細胞からもHGFが産生されており,骨髄内でのHGF産生系は単一ではなかった。末梢血よりも好中球を分画して検討をしたところ,関節液中の好中球よりも弱いながら,HGF産生が見い出された。これらのことより,好中球が種々のサイトカインにより活性化され関節腔中に遊走浸潤する過程においてHGF産生能を獲得するものと考えられた。
高感度抗IAP抗体スクリーニングアレイの開発と癌診断への応用

分子生物学の進歩に伴い,癌で発現が亢進あるいは低下し,浸潤・転移能の増強や治療抵抗性の発現と密接に関与する分子群が,報告されるようになった。今回我々は,抗Survivin, LivinおよびXIAP自己抗体に注目し,各種消化器癌,肺癌や乳癌患者の血清診断を試みた。癌患者29例中14例(48%)で,いずれかの自己抗体が検出された。なかでも,抗Survivin自己抗体の陽性率が最も高く, 45%(13/29)であった。SurvivinおよびLivin遺伝子をクローニングするため、ヒト大腸癌細胞および肺癌細胞株よりtotal RNAを抽出し、cDNAを作製した。次にPCR法で両遺伝子を増幅し、サイクルシークエンス法を用いて塩基配列を調べた。塩基配列に変異や欠失、挿入が無いことを確認後、増幅産物をDirectional TOPOエントリーベクターに導入しクローニングした。さらに、大腸菌発現用のディスティネーションベクターpET104BioEase-DESTに組み換えた。このベクターを大腸菌に導入し、リコンビナントSurvivinおよびLivin蛋白を発現させた。両蛋白のN末端にはビオチンタグが付いているため、ストレプトアビジン-アガロースで両蛋白を回収した。ビオチンタグをエンテロキナーゼで切断後、EIAプレートに固相化し、抗Survivinおよび抗Livin抗体検出用ELISAを作製した。肺癌患者血清37例を対象とし、抗Survivin抗体および抗Livin抗体の陽性率を調べたところ、それぞれ58.1%、51.3%であり、両者を組み合わせると、71%まで上昇した。また、リコンビナントSurvivinおよびLivin蛋白をSDS電気泳動し、ELISAで陽性と判定された血清を用いてimmuno-blottingを行ったところ、バンドが検出され、本測定系の特異性を確認できた。現在、同様の方法で、リコンビナントNAIP、XIAP、c-IAP1、c-IAP2およびTsIAP蛋白を精製し、自己抗体検出用ELISAを作製中である。XIAP遺伝子をクローニングするため、ヒト大腸癌細胞よりtotal RNAを抽出後、cDNAを作製した。次にPCR法で遺伝子を増幅し、サイクルシークエンス法を用いて塩基配列を調べた。このベクターを大腸菌に導入し、リコンビナントXIAP蛋白を発現させた。両蛋白のN末端にはビオチンタグをエンテロキナーゼで切断後、EIAプレートに固相化し、抗XIAP抗体検出用ELISAを作製した。一方、昨年度作製した抗Survivin抗体および抗Livin抗体検出用ELISAを用い、乳癌患者血清46例を対象とし、両抗体の陽性率を調べたところ、それぞれ23.9%、32.6%であり、両者の組み合わせで、52.2%まで上昇した。また、肝臓癌患者血清29例を対象とし、抗Survivin抗体の陽性率を調べたところ、24.1%であった。現在、抗Survivin抗体、抗Livin抗体および抗XIAP抗体検出系を組み合わせた際の陽性率の変化を検討中である。さらに、Immuno-PCR法を組み合わせた高感度検出系の作製に取り組んでいる。ヒト大腸癌細胞からcDNAを作成し、PCR法でsurvivin、LivinおよびXIAPを増幅後、6XHis tagのついた蛋白発現用ベクター(pET151/D-TOPO)にクローニングした。その塩基配列は、サイクルシークエンス法で確認した。これらのコンストラクトを、大腸菌(BL21 Star-DE3)に形質転換後、得られたコロニーを250mlのLuria-Bertani培地を用い、37°C、150rpmの条件下で一晩培養し、各々の蛋白をIPTGで誘導した。発現した蛋白は、His-tag蛋白精製用カラムで精製した。得られた蛋白の純度と特異度は、それぞれSDS-PAGE後のCBB染色とウエスタンブロッティングで確認した。精製recombinant蛋白は、0.1μg/mlの濃度でELISAプレートに固相化した。基準値は、健常者33名の血清を用い、2SD法で決定した。札幌医科大学附属病院の外来、入院患者(大腸癌9例、胃癌3例、膵癌1例、乳癌6例、肺癌10例)の血清を使用し、血清中のsurvivin、LivinおよびXIAPに対する自己抗体の陽性率を検討した。大腸癌患者9例のうち、4例(44%)で抗survivin自己抗体と抗livin自己抗体が、2例(22%)で抗XIAP自己抗体が陽性であった。胃癌患者3例中1例(33%)で、全ての自己抗体が陽性となった。本検討で行った唯一の膵癌患者では、3種類全ての自己抗体が陽性であった。

乳癌患者6例に関しては、1例(16%)が抗survivin自己抗体,2例(33%)が抗livin自己抗体陽性で、XIAPが陽性の患者はいなかった。肺癌患者10例中6例(60%)で抗survivin自己抗体、4例(40%)で抗livin自己抗体、3例(30%)でXIAP自己抗体が、それぞれ陽性であった。
非水溶媒を用いた希土類電解質溶液の熱物性と構造の研究

1)希土類リン酸塩ガラス(Ln(PO_3)_3・KPO_3)のラマンスペクトルを測定して系列でどのように変化するかを調べた。PO_2対称振動(ν1)の振動数をプロットすると、(La^<3+>Pm^<3+>)グループと(Eu^<3+>Lu^<3+>)グループの間に明らかに振動数の不連続が観測される。このことは、不連続領域においてガラスの構造(希土類イオンの内部配位数)変化があることを示していると考えられ、ラマンスペクトルからも確認されたことになる。この実験結果から、水溶液のみだけでなく系列の途中での配位数が変化することがかなり一般的な現象であることを示していると解釈される。2)希土類硝酸塩水溶液においては、NO_3^<-->イオンは部分的に希土類イオンに直接配位している。今回は濃度が高い希土類硝酸塩水溶液において、NO_3^-イオンが希土類イオンにどのように配位しているかを調べるために、Ln(NO_3)_3・6H2O結晶を90°Cで融解して融体のラマンスペクトルを測定した。その結果希土類イオンに配位しているNO_3^-の振動数にも配位数の変化が反映されていることが明かとなった。3)Speddingらの希土類電解質水溶液に関するデータが、溶液の塩濃度が増加すると、9配位の水和イオン[Ln(H2O)9]^<3+>が増加することを支持していることを見いだした。そこで、どのような機構でこのような異常な挙動を示すのか調べるために、EuCl_3とGdCl_3水溶液にLiCl,HCl,CsClを添加してラマンスペクトルを測定した。その結果LiCl,HClとCsClのいずれを添加しても[Gd(H2O)9]^<3+>が増加することが明らかになった。このことから、外圏錯体の生成で説明するのが良いとの結論に達した。4)Sc-PMBP錯体を合成しその分光学的性質、x一線結晶構造解析および熱的性質について検討した。さらにフラーレンにの分離にCeO_2が非常に有効であることが明かとなった。