hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん化学療法誘発末梢神経障害治療を目指した分子標的薬の応用

本研究は、がん化学療法誘発末梢神経障害発症機序の解明と分子標的薬による治療応用を目指している。平成30年度は平成29年度から引き続き検討しているオキサリプラチン、パクリタキセル、ビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害誘導機構について解析を行い、抗がん剤投与14日目においてマウス皮膚、脊髄後根神経節及び腰髄において数種の因子が活性化していることを認めた。また、見出した因子のシグナル伝達阻害薬を抗がん剤と併用することで、抗がん剤誘発末梢神経障害モデルマウスの痛覚過敏及び冷過敏を抑制できることを明らかにしている。さらに、このシグナル伝達阻害薬は抗がん剤による抗腫瘍効果を増強することも明らかにしている。平成29年度に見出したマウス皮膚、脊髄後根神経節及び腰髄で活性化が認められた数種の因子とシグナル伝達因子の関連性を検討したところ、見出した数種の因子によりシグナル伝達因子が活性化することも明らかにした。さらに、活性化が認められたシグナル伝達因子の阻害により、見出した数種の因子の活性化が抑制されることも認めた。以上のことから、活性化が認められたシグナル伝達因子は抗がん剤末梢神経障害に関与する因子の発現を調節しており、これらシグナル伝達因子の阻害により抗がん剤末梢神経障害を抑制できる可能性を示唆した。さらに、シグナル伝達阻害薬は抗がん剤の抗腫瘍効果も増強することも本研究により明らかにしている。よって、見出したシグナル伝達阻害薬は種々の抗がん剤誘発性末梢神経障害治療薬として有用である可能性が考えられる。本研究はがん化学療法誘発末梢神経障害機序の解明と分子標的薬による治療応用を目指している。平成28年度はオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害誘導機構について解析を行い、両薬剤により、末梢神経障害が発症することを確認した。これらのモデルを用いて、末梢神経障害発症機構の解明を試みたところ、オキサリプラチン及びパクリタキセル投与後14目におけるマウス腰髄にて数種のシグナル伝達因子が活性化することを認めた。また、知覚過敏や疼痛に関与する受容体の発現変化についても同様のモデルマウスを用いて検討を行い、こちらにおいても数種の受容体の発現増加を見出している。これらについては、今後、活性化あるいは発現増加機構の詳細な解析を進め、末梢神経障害発症における役割について明らかにしていく予定である。さらに例数は少ないものの活性化が認められたシグナル伝達因子の阻害剤(分子標的薬)を用いてオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害を抑制できるか検討したところ、両薬剤による末梢神経障害を抑制できる可能性が認めている。以上のことから、活性化が認められたシグナル伝達因子がオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害に関与することが示唆され、これらを抑制する分子標的薬が末梢神経障害治療薬として有用である可能性が考えられる。今度はさらに例数を増やし、分子標的薬における末梢神経障害抑制効果について明らかにする。平成28年度において、オキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害に関わるシグナル伝達因子の同定を試みた。その結果、マウス腰椎においてオキサリプラチン及びパクリタキセルによる冷過敏痛覚過敏症状及び機械的痛覚過敏症状発現時において、数種のシグナル伝達因子の活性化、また、受容体の発現増加を認めている。さらに、シグナル伝達因子の阻害剤(分子標的薬)によりオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害を抑制できる可能性を認めた。これらのことから、研究計画通り、おおむね順調に進行していると考える。本研究は、がん化学療法誘発末梢神経障害機序の解明と分子標的薬による治療応用を目指している。平成29年度はオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害誘導機構について解析を行い、抗がん剤投与14日目においてマウス皮膚、脊髄神経後根節、及び腰髄において数種の因子が活性化していることを認めた。今後は、これら因子が平成28年度に見出したシグナル伝達因子の活性化にどう関与していくか検討を進める予定である。また、平成28年度において見出した腰髄におけるシグナル伝達因子の阻害剤によって、オキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害を抑制できることを明らかにし、腰髄においてもこの因子の抑制を確認している。さらに、本研究で見出したシグナル伝達因子がビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害モデルにおいても、腰髄で活性化し、この阻害剤でビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害を抑制できることも明らかにした。また、この阻害剤とパクリタキセルを併用することで、パクリタキセルの抗腫瘍効果を増強することも認めた。以上のことから、活性化が認められたシグナル伝達因子はオキサリプラチン及びパクリタキセルのみならず、ビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害に関与し、このシグナル伝達因子阻害剤(分子標的薬)が種々の抗がん剤末梢神経障害治療薬として有用である可能性が考えられる。今後は、抗がん剤誘発末梢神経障害の機序の全解明を目指し、検討を行い、有効な治療薬の開発を進めていく予定である。平成29年度において、平成28年度において明らかにしたシグナル伝達因子阻害剤(分子標的薬)によりオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害を抑制することを明らかにした。また、このシグナル伝達因子の活性化はビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害においても活性化し、その阻害剤により末梢神経障害を抑制できることを見出した。さらに、マウズ皮膚、脊髄後根神経節、腰髄において、シグナル伝達因子活性化に関与する数種の因子を確認した。以上のことから、研究計画通り、おおむね順調に進行していると考える。

本研究は、がん化学療法誘発末梢神経障害発症機序の解明と分子標的薬による治療応用を目指している。平成30年度は平成29年度から引き続き検討しているオキサリプラチン、パクリタキセル、ビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害誘導機構について解析を行い、抗がん剤投与14日目においてマウス皮膚、脊髄後根神経節及び腰髄において数種の因子が活性化していることを認めた。また、見出した因子のシグナル伝達阻害薬を抗がん剤と併用することで、抗がん剤誘発末梢神経障害モデルマウスの痛覚過敏及び冷過敏を抑制できることを明らかにしている。さらに、このシグナル伝達阻害薬は抗がん剤による抗腫瘍効果を増強することも明らかにしている。平成29年度に見出したマウス皮膚、脊髄後根神経節及び腰髄で活性化が認められた数種の因子とシグナル伝達因子の関連性を検討したところ、見出した数種の因子によりシグナル伝達因子が活性化することも明らかにした。さらに、活性化が認められたシグナル伝達因子の阻害により、見出した数種の因子の活性化が抑制されることも認めた。以上のことから、活性化が認められたシグナル伝達因子は抗がん剤末梢神経障害に関与する因子の発現を調節しており、これらシグナル伝達因子の阻害により抗がん剤末梢神経障害を抑制できる可能性を示唆した。さらに、シグナル伝達阻害薬は抗がん剤の抗腫瘍効果も増強することも本研究により明らかにしている。よって、見出したシグナル伝達阻害薬は種々の抗がん剤誘発性末梢神経障害治療薬として有用である可能性が考えられる。平成29年度はオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害発症機構の解明を引き続き進める。平成28年度において、オキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害発症に関与するシグナル伝達因子の活性化及び受容体の発現増加を見出しており、シグナル伝達因子の阻害剤(分子標的薬)にて、障害を抑制できる可能性を認めている。そのため、これらの詳細な作用機構を明らかにする。平成29年度における研究計画は、活性化あるいは発現増加が認められたシグナル伝達因子及び受容体の詳細な痛みへの関与について解析を進めていく。また、担癌マウスを用いた検討により、オキサリプラチン及びパクリタキセルによる抗腫瘍効果に影響を与えるかについても検討する。これらにより生化が得られれば、順次、論文投稿や学会発表を行う。平成30年度はオキサリプラチン及びパクリタキセル誘発末梢神経障害発症機構の解明を引き続き進める。また、同時にビンクリスチン及びボルテゾミブ誘発末梢神経障害機構の解明についても行う予定である。また、平成29年度において、シグナル伝達因子活性化に関与する数種の因子を見出している。このことから、これら因子がシグナル伝達因子活性化に関与するか明らかにする予定である。平成30年度における計画は、活性化が認められた因子の関与について解析を進めていく。この成果が得られれば順次、論文投稿や学会発表を行う。平成28年度の研究計画では、必要な実験試薬及び実験動物の購入を行って検討を行った。
陽電荷フィルターを用いた低濃度の衛生指標微生物の濃縮方法に関する実験的検討

水中細菌及びウイルスについての陽電荷フィルターろ過法の適用性を評価するために,ガラス繊維ろ紙を対照として細菌とウイルスの捕捉能力を比較評価した。陽電荷フィルターはCuno Inc.社製Zeta-plus Virosorb 1MDS(平均孔径1μm)を使用した。対照とした微生物は,細菌については大腸菌とウェルシュ菌の2種,ファージについてはQβ,MS2,未同定の環境分離株の3種である。細菌については,培養菌,環境水のいずれの場合も陽電荷フィルターの捕捉率はガラス繊維ろ紙の捕捉率に比べると有意に高く,メンブランフィルターに匹敵する細菌捕捉能力があることがわかった。大腸菌ファージのフィルターへの捕捉が静電的な吸着によると考えられたので,pH依存性についても検討した。ファージQβ及びMS2の捕捉能力はろ過開始直後は数十%の捕捉率を示すものの,ろ過の継続に伴って捕捉率は速やかに減少した。ろ過面積2.3cm^2のフィルターで100mLろ過したときの全体の捕捉率はQβで2050%,MS2で3050%と低くpH依存性は認められなかった。これに対し環境分離株では顕著なpH依存性が認められ,pH6以下では90%を超える捕捉率であったが,pH7では70%,pH8以上では4050%程度となり,pHがアルカリ側になると捕捉率が著しく低下する傾向が認められた。このようなpH依存性はファージとフィルターの静電的性状に起因するものと考えられたので,調製用隔膜式液体等電点電気泳動装置ロトフォアを,両性電解質としてファルマライトを使用してファージの等電点を測定する試みを行った。等電点pHは実験毎に異なったうえ,ファージの回収率が数%以下となり,本装置を用いて信頼性の高い等電点を得ることはきわめて困難であった。本装置では泳動後にファージの90%以上が隔膜に付着しており,隔膜などの付着面を持たない方式の泳動装置を使用する必要があることが示唆された。陽電荷フィルタ-(ゼ-タプラスフィルタ-)のコリファ-ジ吸着能力を評価するために、6mMリン酸塩緩衝液(pH7)にコリファ-ジを添加してその捕捉能力を調べたところ、直径22mmフィルタ-で2x10^9cfu(5x10^8cf/mlに相当する)のファ-ジ量をほぼ完全に吸着することができた。次に、コリファ-ジが存在することが分かっている環境水を用いて同様の実験を行ったところ、濾過水量を増加させるにつれてファ-ジ捕集能力は著しく低下した。その低下の程度は環境水の水質に関連があるように見受けられ、なかでもアンモニア性窒素濃度に関係する傾向があったので、再び6mMリン酸塩緩衝液(pH7)にコリファ-ジを添加した系で、アンモニア性窒素の影響についての試験を行った。アンモニア性窒素の濃度を増加させるとフィルタ-を通過するファ-ジの量が増加したが、その影響は小さく、最終濃度が1Mになるようにアンモニア性窒素を添加しても濾液側に漏出するファ-ジの量は添加したファ-ジの10%程度であった。同時に塩化ナトリウムでも試験を行ったが,類似の結果となった。これらの結果から、陽電荷フィルタ-への吸着の低下にはそのほかにいくつかの水質因子が関与しているものと推測された。

次に大腸菌群ファ-ジの静電的性状を明らかにするために、ファ-ジの環境分離株を用いてロトフォア等電点電気泳動装置による泳動試験を試みたところ、泳動後のファ-ジ濃度が著しく低い値となった(回収率は1%あるいはそれ以下)。そこでその原因について調べたところ、隔壁として使用されているメンブレンコアにファ-ジが大量に吸着すること、等電点電気泳動の際に使用する両性電解質がファ-ジ濃度を大きく低下させることの2点が明らかになった。このことはフィルタ-へのファ-ジの吸着についての研究の遂行に大きな支障となるので、さらに検討を行っている。試料水のpHが陽電荷フィルタ-(ゼ-タプラスフィルタ-)のウイルス吸着能力に及ぼす影響を調べるために、コリファ-ジを含む試験液をろ過して、ろ液中に漏出するファ-ジ量を定量し、フィルタ-の吸着特性の評価を試みた。吸着量は試験液とろ液のファ-ジ濃度差から算出した。供試ファ-ジはT1、QβとMS2の3株と河川から分離したコリファ-ジ1株(未同定)の計4株とした。T1と環境分離ファ-ジでは陽電荷フィルタ-への吸着の程度がpHに大きく依存し、酸性条件では効果的に吸着できたが、pH値が7を超えるとファ-ジ捕集効果は大きく減少した。一方、小型RNAファ-ジのQβとMS2ではフィルタ-への吸着が悪く、pH4ー9の範囲での吸着率は20ー50%程度と低い値を示した。このことは陽電荷フィルタ-ではろ過濃縮過程でウイルスのセレクションが行われることを示唆しており、実用化に当たって今後検討すべき課題の一つと考えられる。隔膜式等電点電気泳動装置ロトフォアを用いてファ-ジの等電点を求める際の問題点(昨年度)について検討を加えた。供試ファ-ジとして、T1、Qβ及び環境分離株(未同定)の3株を用いた。いずれの株も泳動過程でロトフォアのメンブレンコアに大量に吸着し、液中に残存するファ-ジは1%にも満たなかった。そこで誘出剤を添加してメンブレンコアに吸着したファ-ジを誘出させたところ、大量のファ-ジが回収された。液側に残存したファ-ジの泳動後の濃度分布とコアに吸着したファ-ジの濃度分布には概ねよい一致がみられ、泳動と吸着が並行して生じていることを伺わせる結果となってはいるものの、このような現象は泳動結果の信頼性を著しく損なうものである。従って、この方法では何等かの方法でこの吸着を阻止できなければ、ファ-ジの泳動には不適当と判断された。昨年度に引続いて、大腸菌ファージT1とQβ及び環境分離株(未同定)の3株を供試ファージとして隔膜式等電点電気泳動装置ロトフォアの利用可能性を検討した。その結果、いずれのファージ株も隔膜に大量に吸着されることが再確認された。更に、吸着プロファイルと液中残存プロファイルには、等電点ピーク近傍では類似性があることも再確認された。このことは、泳動過程で隔膜を通過しなければならないような本装置では、隔膜の材質などを変更しないかぎり、正確な等電点は求められないことがわかった。現在、この吸着現象を抑制するような隔膜は開発されておらず、ファージなどのウイルスの等電点電気泳動を行うには無隔膜方式のものを使用しなければならないことが明らかになった。細菌については大腸菌群とウェルスシュ菌を供試菌とし、陽電荷フィルターの捕集能力について、室内実験を行っている。一部得られた結果によれば、ウェルシュ菌についてはきわめて高い捕集率を示す傾向が認められるデータが入手されつつある。大腸菌群については、ウェルシュ菌よりも若干捕集率が低い傾向が認められるデータが入手されている。
広域分散ネットワークにおける小型望遠鏡による協調観測システムの構築

平成19年度は,18年度に引き続き大阪大学で開発されているP2PフレームワークであるPIAXを用いて,望遠鏡のコントロールをネットワークを介して遠隔制御するソフトウェアの開発を行うとともに,こうした望遠鏡を提供するユーザとそれを利用するユーザがP2Pネットワークでコミュニティを形成した際に,お互いを信頼するために必要な基準を提供する仕組み提案した.以下具体的に述べる.(1)望遠鏡システムについて晴れている地点の望遠鏡を選択するために,各地の気象センサのデータを利用して予測し,空間的に補間することでセンサの無い場所の気象状態を把握できるようにした.(2)レピュテーションシステム望遠鏡を共有するようなコミュニティにおいては,各ピアが信頼できるかどうかをリソース提供側,使用側ともに判断する必要がある.我々はこれにWebのページランクなどで用いられるEigen trustモデルを元に,信頼できないピアを効率的に排除する手法の提案を行った.インターネット環境に複数の小型の望遠鏡を接続し、遠隔操作による複数の望遠鏡による協調観測や取得したデータの共有環境の構築が本研究の目的である。今年度は、とくに必要な機器の整備とその評価、最終的に構築する環境の最も簡単な場合についての実装を行った。具体的には、小型望遠鏡の周辺機器として撮像に必要な冷却CCDと簡易な分光器、制御用PCを購入し、制御用PCと直接接続して、機器本体の動作・制御の評価と機器の精度の確認を行った。また、本研究は、接続可能な小型望遠鏡が実際に増加していくように簡易な導入形態である必要があるが、その点で当初考えていたグリッドによる環境の構築は好ましくないと考えられたため、大阪大学で開発中のモバイルエージェントによるP2Pのアプリケーションフレームワークを用いた環境へとアーキテクチャの改良を行った。このフレームワーク(PIAX;P2P Interactive Agent eXtensions)には、位置情報をキーとしてサービスの検索が効率よくできる機能が備わっており、このサービスを利用する2次元的に散らばった望遠鏡を効率よく探索できる。このフレームワークをもとに、望遠鏡の制御サービスを持ったピアに接続したピアから望遠鏡を制御できるようになり、天体の導入に際して天球のグラフィックから天体を選んで導入するインターフェースを作成した。次年度では、これら基本的な単体の望遠鏡の遠隔操作を拡張し、協調観測するためのスケジューリングや制御のしくみについて研究する計画である。平成18年度は,大阪大学で開発されているP2PフレームワークであるPIAXを用いて,望遠鏡のコントロールをネットワークを介して遠隔制御するソフトウェアの開発を行った.研究目的にあわせて今年度の研究内容を以下に記す.(1)ネットワークを介した望遠鏡,撮像装置のコントロールと精度17年度に作成した基本部分に加えて,Javaで作成されたユーザインタフェースを作成し,観測地点の観測時の星空をプラネタリウムのように表現し,観測したい天体を選ぶことで望遠鏡が自動導入するようにした.さらに一部の冷却CCDの遠隔制御を可能にする機能を作成し,和歌山大,和歌山県のみさと天文台の協力を得て,1台ではあるが遠隔からの天体の観測,撮像に成功した.(2)協調観測のためのスケジューラまた,P2Pネットワーク上で複数の望遠鏡を接続する際に必要な,地球上の緯度,経度の範囲を指定すると,その範囲にあるP2Pネットワーク上の望遠鏡を検索し接続する機能も開発した.(3)撮像画像のデータ管理撮像された画像のデータをP2Pネットワーク上に形成されたコミュニティで共有する場合,例えば新天体の発見に関わるデータなどすぐには一般に公開できないものもあり,このようなデータ共有のセキュリティや,望遠鏡の提供者と利用者の信頼関係を表す信頼モデルについての検討を行った.平成19年度は,18年度に引き続き大阪大学で開発されているP2PフレームワークであるPIAXを用いて,望遠鏡のコントロールをネットワークを介して遠隔制御するソフトウェアの開発を行うとともに,こうした望遠鏡を提供するユーザとそれを利用するユーザがP2Pネットワークでコミュニティを形成した際に,お互いを信頼するために必要な基準を提供する仕組み提案した.以下具体的に述べる.(1)望遠鏡システムについて晴れている地点の望遠鏡を選択するために,各地の気象センサのデータを利用して予測し,空間的に補間することでセンサの無い場所の気象状態を把握できるようにした.(2)レピュテーションシステム望遠鏡を共有するようなコミュニティにおいては,各ピアが信頼できるかどうかをリソース提供側,使用側ともに判断する必要がある.我々はこれにWebのページランクなどで用いられるEigen trustモデルを元に,信頼できないピアを効率的に排除する手法の提案を行った.
癌ではなぜメチル化と脱メチル化が同時におこるのか？

DNAメチル化は遺伝子の修飾の1つであり、遺伝子の配列を変えることなく遺伝子のスイッチとして働く。DNAメチル化は癌で癌抑制遺伝子を不活性化することにより癌の原因となっているが、今回我々はDNAメチル化酵素のDNMT3Bががん細胞では特別なフォームを形成することにより、癌化の一因になっていることを発見した。2DNMT3B△5の癌におけるセントロメア領域脱メチル化への関与の解明●DNMT3B△5強制発現によるセントロメア領域のメチル化(堀居(分担))DNMT3B△5発現の低い癌細胞株にDNMT3B△5cDNAを導入して強発現させ、セントロメア領域の繰り返し配列であるサテライトDNA脱メチル化されるかどうかをBisulfite法で検討した。●DNMT3B△5のノックダウンによるセントロメア領域のメチル化(堀居(分担))逆にDNMT3B△5の発現が高い癌細胞株においてDNMT3B△5特異的なsiRNAを用いてDNMT3B△5の発現のみ減少させ、サテライトDNAがメチル化されるか調べた。●大腸がんにおけるDNMT3B△5発現とセントロメア領域の脱メチル化の相関(畑田(代表))臨床サンプルにおいてDNMT3B△5発現とセントロメア領域の脱メチル化が相関することを調べた。●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5の癌形成への関与の解明:これまでに大腸がんのマウスモデル(ApcMin/+)マウスに通常型のアイソフォームDnmt3b2を強発現すると癌の発生が上昇するという報告がある。そこで、DNMT3BD5をテトラサイクリン誘導性プロモーターを用いた系でトランスジェニックマウスを作成し(CBA系統マウスを使用)、ApcMin/+(C57BL/6系統マウス)と交配することによりDNMT3BD5トランスジーンをもったApcMin/+マウスを作成する。そしてテトラサイクリンでDNMT3BD5を発現誘導しApcMin/+マウスと比べて大腸がんの発症が上昇するかどうかを調べた。●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5によるゲノム不安定化への関与の解明:CBAとC57BL/6系統マウス間の多型を利用し複数のマーカーでLoss of hegerozygosity(LOH)が上昇しているかを明らかにした。●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5による癌抑制遺伝子のメチル化の解明:DNMT3BD5DTg, ApcMin/+マウスにできた大腸がんでMIAMI法を用いてメチル化を網羅的に調べApcMin/+マウスと比べて癌抑制遺伝子のメチル化が亢進しているかどうか確認した。●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5によるセントロメア領域の脱メチル化の解明:DNMT3BD5DTg, ApcMin/+マウスにできた大腸がんでApcMin/+マウスと比べてセントロメア領域の脱メチル化が起こっているか確認した。申請者らはこれまでに癌におけるエピゲノムの重要性(Hatada et al. Nature Genetics 1996, 14:171-173)に視点をおき、網羅的なアプローチ(Hatada et al. PNAS 1991,88:9523-9527; Hatada etal. Oncogene 2006,25:3059-3064)を用いて研究してきた。エピゲノムのうちDNAメチル化の変化はそのかなめをなしており、特定の癌抑制遺伝子のCpGアイランド領域に起こるメチル化は癌化の機構と関連して注目を集めている。一方、癌のゲノム全体としては脱メチル化が起こることが知られている。これは主に繰り返し配列に起こるものであり、特にセントロメア領域の脱メチル化などによりゲノムの不安定化を招きloss of heterozygosity (LOH)を起こす原因となっていることが知られている。このように癌では一見矛盾するメチル化、脱メチル化という両方向の変化が同時に起こっているわけであるが、これがどのような機構により制御されているかに関してほとんどわかっていない。本研究は最近我々がみいだした癌特異的なDNAメチル化酵素の新規アイソフォームDNMT3B△5により、癌において観察される「癌抑制遺伝子のメチル化、セントロメア領域の脱メチル化という両方向の変化」を説明できることを証明するとともに、癌化への関与を検討した。当初の予定通りに実験が遂行されている。NMT3B△5の癌における癌抑制遺伝子のメチル化への関与の解明●DNMT3B△5強制発現による癌抑制遺伝子のメチル化(畑田(代表))DNMT3B&#61508;5発現の低い癌細胞株にDNMT3B&#61508;5 cDNAを導入して強発現させ、癌抑制遺伝子がメチル化されるかどうかを網羅的なメチル化解析法(MIAMI法)を用いて調べた。●DNMT3B△5のノックダウンによる癌抑制遺伝子のメチル化(畑田(代表))逆にDNMT3B&#61508;5の発現が高い癌細胞株においてDNMT3B&#61508;5

特異的なsiRNA(エクソン4とエクソン6がスプライシングしてつながった配列に特異的)を用いてDNMT3B&#61508;5の発現のみ減少させ、癌抑制遺伝子が脱メチル化されるかどうかを同様にして調べた。●がんにおけるDNMT3B△5発現と癌抑制遺伝子のメチル化の相関(畑田(代表))複数の癌細胞においてDNMT3B&#61508;5発現と癌抑制遺伝子のメチル化が相関することを調べた。以上のように当初の計画どおりに進展している。3DNMT3B△5の癌細胞表現型への関与の解明●DNMT3B△5の細胞増殖能への関与の解明(落谷(分担))DNMT3B△5発現の低い癌細胞株にDNMT3B△5 cDNAを導入して強発現させ、細胞増殖能がどうなるかを検討する。●DNMT3B△5の腫瘍形成能への関与の解明(落谷(分担))DNMT3B△5発現の低い癌細胞株にDNMT3B△5 cDNAを導入して強発現させ、コロニー形成能、ヌードマウスの腫瘍形成能がどうなるか調べる。4DNMT3B△5の個体レベルでの癌形成への関与の解明●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5の癌形成への関与の解明(堀居(分担))これまでに大腸がんのマウスモデル(ApcMin/+)マウスに通常型のアイソフォームDnmt3b2を強発現すると癌の発生が上昇するという報告がある。そこで、DNMT3B△5をテトラサイクリン誘導性プロモーターを用いた系でトランスジェニックマウスを作成し(CBA系統マウスを使用)、ApcMin/+(C57BL/6系統マウス)と交配することによりDNMT3B△5トランスジーンをもったApcMin/+マウスを作成する。そしてテトラサイクリンでDNMT3B△5を発現誘導しApcMin/+マウスと比べて大腸がんの発症が上昇するかどうかを調べる。●大腸がん発がんモデルマウスにおけるDNMT3B△5によるゲノム不安定化への関与の解明(森田(研究協力者))CBAとC57BL/6系統マウス間の多型を利用し複数のマーカーでLoss of hegerozygosity(LOH)が上昇しているかを明らかにする。DNMT3B△5の癌におけるセントロメア領域脱メチル化への関与の解明●DNMT3B△5強制発現によるセントロメア領域のメチル化DNMT3B△5発現の低い癌細胞株にDNMT3B△5cDNAを導入して強発現させ、セントロメア領域の繰り返し配列であるサテライトDNA脱メチル化されるかどうかをBisulfite法で検討する。●がんにおけるDNMT3B△5発現とセントロメア領域の脱メチル化の相関がん細胞においてDNMT3B△5発現とセントロメア領域の脱メチル化が相関することを調べる。次年度の動物を用いた実験に多くの研究費が見込まれるため、次年度に研究費を持ち越した。メチル化解析のためbisulfite法のための試薬や細胞培養の培地、プラスチック類などを購入する。
日本の大学IRにおいて重要な役割を有する「教学データ」の分析手法モデルの構築

日本の高等教育においてIR(Institutional Research)に対する注目が集まって早や10年。近年では、教育の質保証および教学マネージメントの必要性が益々強調され、平成30年11月の中央教育審議会「2040年に向けた高等教育のグランドデザイン(答申)」では「教育の質保証や情報講評に取り組まない大学は、社会からの厳しい評価を受ける」とまで述べられ、自大学を客観的に調査研究するIRの役割が益々重視されている。日本の大学IRの特徴の1つは教学データを重んじていることであり、多くの大学においてIR担当部署を設置する一方で、分析手法イメージの欠如という大きな問題を抱えている。そこで、本研究は、日本の大学IR活動を促進するため、(1)研究者の所属する大学を一事例にした「教学データの分析手法モデル」の構築・公開、(2)「成績に特化した学生アンケート」の開発、(3)全国の大学・短大における大学IRの実態把握(調査票調査)を行う。2830年度においては、所属大学において、IR室への諸データの集積が進んでおり、個々のデータの分析を行うとともに、統合するためのデータ整理を中心に作業を進めている。具体的には、成績をはじめとする教務データ(入学時のプレイスメントテスト等含む)、学生アンケート、PROG(就業力テスト)、学修観テスト(新入生に対して行った精神的回復力、学習動機、協同作業等に関する調査)などが挙げられる。他方、様々に活発化しているIR活動の動向を把握するための全国の大学への調査票調査を令和元年6月に実施するための準備も着実に進んでいる。(実施までに著名研究者の意見を多数伺い拡充する予定ではあるが)調査票を完成させ(3月)、創価大学倫理委員会の審査を申請し合格している(3月)。また、学生アルバイトによって郵送先リストの整理も8割方完了している。現在、日本の大学IR活動が活発化し、多様化・複雑化しつつあり、他方、他の研究者が一昨年末にIRに関する全国調査を行ったことから、現在の実態把握のための全国調査に関しては、その知見等をふまえたほうがより実りのある調査ができると考え、また回答者が回答しやすい時期に配慮して、(計画よりも遅らせて)令和元年6月に全国調査を行う予定で準備を進めている。一方、急遽、30年度に研究代表者の学内における所属移動があったことから、研究者が所属する大学を一事例とする教学データに関する統合・分析に関して、十分に行うことができなかったため、「補助事業期間延長申請」を行い、承認されたという状況にある。それらの状況を鑑みて判断した。(1)日本の大学におけるIR活動の実態および課題を把握するために、文献調査に一層まい進しつつ、令和元年6月に全国調査を実施する。調査票は既に完成し、所属大学の倫理委員会審査に合格もしているが、より実りある調査を行うため、さらに本研究領域において著名な2名の研究者によるアドバイスをもらいつつ、また大学評価コンソーシアム等の協力も得られるように尽力する。そして、調査結果についても所属大学の倫理委員会審査を受けた上で学会発表、論文発表を行っていく。(2)教学データの統合・分析を進め、得られた知見(分析手法および成績に関わる項目)については、(所属大学の倫理委員会審査を受けた上で)ダミーデータをもとに学会発表・論文発表を行っていく。日本の大学IRの特徴の1つは教学データを重んじていることだが、多くの大学ではその分析手法イメージの欠如という大きな問題を抱えている。そこで、本研究は、日本の大学IR活動を促進し、日本の大学IRの実態と課題を把握した上で、研究者の所属する大学を一事例にして「教学データの分析手法モデル」の構築および「成績に特化した学生アンケート」の開発することを目的としている。28年度の課題は、(1)日本の大学におけるIR活動の実態および課題を把握することと(2)所属大学におけるデータの統合および分析であった。(1)に関しては、近年、多くの著籍、論文、報告書が出版されていることから、文献調査を重点的に行い、実践事例を把握し、かつ、目的・組織形態・方法別に分類を行った(継続中)。また、IR活動従事者の集会が活発化していることから、担当者の相互交流・相互学習・情報共有を目的とした「大学評価担当者集会2016」(主催:大学評価コンソーシアム)などに参加し、(a)他大学におけるIR活動の情報収集、(b)担当者交流(人脈づくり)、そして、(c)本研究で実施予定の全国大学調査票調査に関して2名の著名研究者からアドバイザーの承諾を得、さらに(d)(調査票調査では回収率が重要になるが)大学評価コンソーシアムに実施時の協力してもらうことへの内内な承諾を得ることができた。(2に関しては、27年度および28年度卒業生(退学者含)のデータを入手し、分析のためのデータベースの作成(主にエクセル)および分析のためのデータ加工を行った。また、卒業生(退学者含)の固定値をもとに成績等に注目しながら分析を行った(継続中)。また、手法モデルの公開(報告書の作成)を見据えて、有効なエクセル関数の使い方やさまざまな分析のやり方、さらにグラフ等のアウトプットに関して、プリント・スクリーン機能等を活用して、情報を蓄積した。計画では、全国調査を28年度に行うことになっていた。しかし、現在、日本の大学IR活動が活発化し、多様化・複雑化しつつあり、他方、近年、急増している出版物の文献調査を通して、当初想定していた「全国調査」の質問項目では、現在の実態把握をするには不十分と判断するに至った。

そこで、実施を優先することもできたが、拙速で稚拙な全国調査を行うよりも、綿密で質の高い調査を行うために、平成28年度は、文献調査を丁寧に行い、調査企画の段階から練り直すことに専念した。日本の大学IRの特徴の1つは教学データを重んじていることであり、多くの大学においてIR室を設置している一方で、分析手法イメージの欠如という大きな問題を抱えている。そこで、本研究は、日本の大学IR活動を促進し、日本の大学IRの実態と課題を把握する一方で、研究者の所属する大学を一事例にして「教学データの分析手法モデル」の構築および「成績に特化した学生アンケート」を開発することを目的としている。28年度、29年度においては、所属大学において、IR室への諸データの集積が進んでおり、個々のデータの分析を行うとともに、統合するためのデータ整理を中心に作業を進めている。具体的には、成績をはじめとする教務データ(入学時のプレイスメントテスト等含む)、学生アンケート、PROG(就業力テスト)、学修観テスト(新入生に対して行った精神的回復力、学習動機、協同作業等に関する調査)、3年生に大して行った「社会人として活躍する準備状況の自己点検票」などが挙げられる。30年度は諸データの統合を進め、分析を始めるが、集積されたデータにはすでに卒業生もいることから、固定値をもって当初予定していた「成績に関わる要因」の追求を始めている。他方、全国調査による実態把握に関しては、さまざまに活発化しているIR活動の動向把握を進め、他方、年末に別の研究者たちがIR全国調査を実施したことから連携体制を整え、現在、調査票の設計ならびに住所録の整理を始めている。現在、日本の大学IR活動が活発化し、多様化・複雑化しつつあり、他方、他の研究者が年末にIRに関する全国調査を行ったことから、その知見をふまえたほうがより実りのある調査ができると考え、全国調査を30年度に行うことにした。一方、研究者が所属する大学を一事例とする教学データに関する分析に関しては、ほぼ順調に進んでいるのでそのように判断した。日本の高等教育においてIR(Institutional Research)に対する注目が集まって早や10年。近年では、教育の質保証および教学マネージメントの必要性が益々強調され、平成30年11月の中央教育審議会「2040年に向けた高等教育のグランドデザイン(答申)」では「教育の質保証や情報講評に取り組まない大学は、社会からの厳しい評価を受ける」とまで述べられ、自大学を客観的に調査研究するIRの役割が益々重視されている。日本の大学IRの特徴の1つは教学データを重んじていることであり、多くの大学においてIR担当部署を設置する一方で、分析手法イメージの欠如という大きな問題を抱えている。そこで、本研究は、日本の大学IR活動を促進するため、(1)研究者の所属する大学を一事例にした「教学データの分析手法モデル」の構築・公開、(2)「成績に特化した学生アンケート」の開発、(3)全国の大学・短大における大学IRの実態把握(調査票調査)を行う。2830年度においては、所属大学において、IR室への諸データの集積が進んでおり、個々のデータの分析を行うとともに、統合するためのデータ整理を中心に作業を進めている。
エピジェネティクス可視化マウスの開発とそれらを用いた発生・脱分化過程の動態解析

最近の研究からエピジェネティクスは発生・分化過程のみならず、腫瘍形成過程などの病態進行過程においてもダイナミックに変化することが明らかとなってきている。発生・分化過程及び病態進行過程のエピジェネティクス動態を解析するために、申請者はエピジェネティクス・レポーターマウスの開発を行い、それらを用いた発生・分化過程及び発がん過程のエピジェネティクス動態解析を行った。DNAのメチル化修飾やヒストンの翻訳後修飾を始めとするエピジェネティックなマークは細胞分化過程のみならず、刺激や環境の変化によってもダイナミックに変化することが明らかとなってきている(Ueda, J., etal.,Mol. Cell. Biol., 2014)。しかし、現在エピジェネティクス研究で広く用いられている実験手法は、サンプルを固定してしまうことから、エピジェネティクスの動態解析には必ずしも向いていない。また、免疫染色法以外の手法では多数の細胞の平均を扱うため、マイナーな細胞集団の挙動は見過ごされてしまう。このような問題を克服するため、本申請課題では、エピジェネティクな変化を可視化したレポーターマウスを開発し、それらを用いて細胞の分化過程、病態(特に癌化)の進行過程のエピジェネティクス及びクロマチンの動態解析を行うことを目的としている。既にDNAのメチル化修飾の変化を生きたままマウスの全身の細胞で解析できる「メチロー(MethylRO:Methylationprobe in ROSA26 locusの略)」マウスを開発し、それを用いた着床前初期胚発生過程のライブセルイメージング解析を行い、論文として発表した(Ueda, J., et al., Stem Cell Reports, 2014;上田他、実験医学、2015)。いくつか技術的に乗り越えなければならない課題はあるが、将来的にはこれらのエピジェネティクス・レポーターマウスをいくつかの病態モデルマウスと組み合わせることで、病態進行過程のエピジェネティクな変化を生きたまま追跡・解析することを計画し、目指している。ここ最近の研究からエピジェネティクスは発生・分化過程のみならず、腫瘍形成過程などの病態進行過程においてもダイナミックに変化することが明らかとなってきている。発生・分化過程のエピジェネティクス動態を解析するために、これまでに申請者らはDNAのメチル化修飾を生きたマウス個体の全身で可視化したレポーターマウスを開発してきた。本研究では新たなエピジェネティクス・レポーターマウスを作製すると共に、これらのレポーターを用いて体細胞のリプログラミング過程並びにマウス着床前初期胚の発生過程におけるエピジェネティクス・リプログラミングの動態解析を、ライブセルイメージング手法を用いて行うことを目的としている。当初計画していたような、エピジェネティクス・レポーターマウスを作製することはまだできていないが、東京工業大学の木村宏博士、佐藤優子博士、近畿大学の山縣一夫博士との共同研究によって、ヒストンの翻訳後修飾を可視化したレポーターマウスの開発に成功した。また、本研究期間中にメチル化DNAを可視化したレポーターマウスの仕事を論文として発表することができた。このマウスを用いて初期胚発生やES細胞の樹立過程のライブセルイメージング解析を行ったところ、細胞が分化するに伴ってメチル化DNAが集積するヘテロクロマチンが明瞭になっていく(固定化されていく)ことが明らかとなった。即ち、メチル化DNAの増減だけでなく、クロマチン構造そのものが細胞分化の指標となることを明らかにした。さらに、メチル化DNAのレポーターマウスと発がんモデルマウスを掛け合わせて腫瘍内のメチル化DNA及びヘテロクロマチン構造を調べたところ、正常細胞とは異なることが明らかとなった(未発表)。現在、「不完全なリプログラミング過程と考えられる」発がん過程のメチル化DNAの動態を解析するための準備を進めている。既にDNAのメチル化修飾の変化を生きたままマウスの全身の細胞で解析できるメチローマウスを開発し、それを論文として発表した。また、東京工業大学の木村宏博士、佐藤優子博士、近畿大学の山縣一夫博士との共同研究によって、ヒストンの翻訳後修飾を可視化したマウスを2系統樹立することに成功しており、現在これらのマウスを用いて発生分化過程のエピジェネティクス動態解析を進めている。当初計画していたエピジェネティクス・レポーターマウスをいくつか開発できたことから、既に目標は半分以上達成できたものと考え、「おおむね順調に進展している」と判断した。現在は申請課題の後半部分に相当する、病態進行過程のエピジェネティクス動態解析に焦点を絞り、準備を進めている。発生生物学2014年度はエピジェネティクス・レポーターマウスの開発に主眼を置いていたが、2015年度は病態進行過程のエピジェネティクス動態解析に焦点を絞り研究を進めていく。現在、病態進行過程の解析を行うために、メチローマウスをいくつかの発癌モデルマウスと交配している。病気を発症するのに少々時間(数ヵ月)を要するため、2015年度の後半から本格的な解析を始められるものと考えている。年度途中で大阪大学から中部大学に所属が変わり、実験を2ヶ月ほど一時中断する必要があったため、当初計画していた支出額よりも少なくなった。2015年度に繰り越した分は、中部大学で実験をセットアップするために使用する予定である。
都市域における異常出水の予測とその流出抑制工法の開発に関する研究

市川は、流域内の地表面を浸透面と不浸透面に分離することを試み、国土地理院が作成した「土地利用細密情報」を利用した。対象地域を東京都全域にとり、土地利用の変化を昭和49年から10年間見てみた。その結果、土地利用の面では大きな変化が認められなかった。さらに、地表面から、降雨時にどれだけ土中に浸透しているかを、下水道のポンプ場の揚水量から推定する方式を考案し、実流域に適用し、降雨時の実際の浸透量を求めた。和田は、都市域の浸透能を増加させるための施設や貯留施設の設置を行った際の雨水排水量の面での効果だけでなく、都市域から発生する非特定汚染源による汚濁物質の流出抑制に寄与する効果を数学的に定量化した。江藤は、雨天時の濁負荷の消減量(放流負荷消減率と定義している)を実際の降雨の確率分布から計算した。さらに、雨水を積極的に利用する立場での雨水貯留槽の利用可能性と経済性を計算した。松井は、下水道と河川の整備計画導入における治水概念の差を原理的に明らかにし、その成果を大阪市平野川で起きた水害事件に適用した。下水道は雨水を排除するという「公的」側面を持つが、その施設は人為的に建設された「人工公物」の側面があり、どこに線を引くのが妥当であるかを論じた。吉本・小出は水害シュミレーションの作成を通じ、その適用性について論じた。都市域においては、流下時間が短いこともあり、その予測の精度と予測までの時間との関係について最適モデルのあり方を論じた。楠田・村上は下水管内の水理モデルの開発とその計算手法の確立のための研究を行った。雨水の動きは水理条件によるとはいいながらも、その境界条件・初期条件・さらには計算の時間間隔・距離間隔のとりかた、分合流時の背水曲線の評価等条件によりさまざまなケースが起きるので、その取扱について在来の研究成果を踏まえ、発展させた。盛岡は雨水制御のリスクアセスメントを行い、防災計画の指針を提示した。何れも現在雨水制御の面で緊急かつ不可欠の課題であり、その成果が実際の河川や下水道計画に応用されることが期待でき、本研究の目的は達成された。
ラット膵発癌モデルの開発による膵癌早期診断マーカーおよび新規治療法の確立

ラット膵臓特異的なハイドロダイナミック遺伝子導入法(HGD)を用いた膵発癌に関連する遺伝子群の検証と、HGDによるモデル動物作製のための標的遺伝子決定を行う。1.膵癌モデル作成のための遺伝子発現プラスミドの作成予定していた、ラットへの遺伝子導入のためのプラスミドを三種類、作成した。2.ラット膵臓への選択的なHGDの条件検討については、これまでにMol Ther Nucleic Acids, 2017で報告しているが、その条件を再度、in vivoで確認した。以上の結果に基づき、ラット膵臓への遺伝子導入の準備が進んでいる。ラット膵発癌モデルの確立し、HGD前後のラットの経時的な全身状態や動物用画像データ、血液を採取する。膵癌ラットの腫瘍組織を分子生物学的、組織学的に検討するとともに、経時的な血清の解析により早期診断マーカーの検証を行う。ラット膵発癌モデル確立後の遺伝子発現の検証や血液検査データ解析等を次年度に行うこととなったため、その費用一部を次年度に使用する予定である。
神経系におけるオンコジンン産物の機能と細胞死

1.Bcl-2タンパクに対する特異的抗血清の作成プログラム細胞死を抑制するオンコプロテインBcl-2の一次構造のうち98-111番のアミノ酸配列に相当する部分ペプチドを合成し,これを抗原として家兎を免疫して抗血清を得た.また41-54番に対する抗血清を米国の研究施設より分与された.両抗体の特異性,力価を検討した結果,両者ともウエスタンブロット上26kDaのBcl2タンパクを認識すること,および免疫組織化学的にラット脳内神経細胞に局在するBcl-2を陽性に染色することが判明した.2.ラット脳細胞の組織培養下におけるBcl-2の発現ラット脳より神経細胞,アストログリア,オリゴデンドログリア,ミクログリアの純培養,混合培養を作成し,上記抗体を用いてBcl-2タンパクの発現を免疫細胞化学,ウエスタンブロットにより研究した.その結果,試験管内では神経細胞のみならずグリア細胞もBcl-2タンパクを産生しており,とくにアストログリアで高レベルであることが判明した.bcl-2が神経細胞のみでなくグリア細胞のプログラム細胞死にも関与している可能性が示唆された.bcl-2のホモログとして最近発見されたbcl-X遺伝子の産物に対する抗体を作成,入手し,現在特異性,力価の検定を行っている.1.Bcl-2タンパクに対する特異的抗血清の作成プログラム細胞死を抑制するオンコプロテインBcl-2の一次構造のうち98-111番のアミノ酸配列に相当する部分ペプチドを合成し,これを抗原として家兎を免疫して抗血清を得た.また41-54番に対する抗血清を米国の研究施設より分与された.両抗体の特異性,力価を検討した結果,両者ともウエスタンブロット上26kDaのBcl2タンパクを認識すること,および免疫組織化学的にラット脳内神経細胞に局在するBcl-2を陽性に染色することが判明した.2.ラット脳細胞の組織培養下におけるBcl-2の発現ラット脳より神経細胞,アストログリア,オリゴデンドログリア,ミクログリアの純培養,混合培養を作成し,上記抗体を用いてBcl-2タンパクの発現を免疫細胞化学,ウエスタンブロットにより研究した.その結果,試験管内では神経細胞のみならずグリア細胞もBcl-2タンパクを産生しており,とくにアストログリアで高レベルであることが判明した.bcl-2が神経細胞のみでなくグリア細胞のプログラム細胞死にも関与している可能性が示唆された.bcl-2のホモログとして最近発見されたbcl-X遺伝子の産物に対する抗体を作成,入手し,現在特異性,力価の検定を行っている.
ダイアンソウイルスの細胞間移行とゲノム複製機構との関連性の解明

申請者はRNAウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus(RCNMV)の移行タンパク質(MP)と結合する宿主因子タンパク質を、免疫沈降法と質量分析によってタバコ(Nicotiana benthamiana)植物から多数同定した。これらのうちGlyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH-A)遺伝子の全長cDNAをクローニングし、GAPDH-A遺伝子がRCNMVの細胞間移行過程に関与する宿主因子であることを明らかにした。さらに、GAPDH-Aタンパク質の細胞内局在性の詳細な調査結果等から、GAPDH-AはMPと複製酵素との共局在性を正に制御する因子であり、この働きによってウイルスの効率的な細胞間移行が行われることを明らかにした。申請者はRed clover necrotic mosaic virus (RCNMV)の移行タンパク質(MP)の細胞内局在性と移行能との関連について調べた。C末端70アミノ酸を欠失させた変異MPは、一本鎖RNA結合能や原形質連絡の開閉機能に影響を受けることなく、小胞体への斑点状の局在(ウイルス複製酵素とそこで会合する)だけが出来なくなり、また変異MPをコードするウイルスの細胞間移行機能もこれと平行して落ちることを明らかにした。このことはMPの小胞体膜でのウイルス複製酵素との会合がRCNMVの細胞間移行にとって必須の過程であることを示すものである。この結果をVirology誌に投稿し、受理された(Kaido et al.2011 in press)。さらに、親水性アミノ酸残基が連続する領域に欠失を導入した変異MPシリーズを作製し、異常な細胞内局在性を示し且つ細胞間移行機能を失った多種類の変異MPを得た。これらのうち細胞壁局在性を失った変異体はいずれも巨大な塊状となって細胞周縁部の小胞体膜に局在したことから、細胞内輸送経路に関与する宿主因子との相互作用の欠損が疑われる。Tandem affinity purification法と質量分析によってベンサミアナ植物の全可溶性タンパク質画分から得られた、RCNMV MPと相互作用する可能性が高いと判定された宿主因子候補タンパク質をコードする遺伝子のうち、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH-A)遺伝子をクローニングした。リンゴ小球型潜在ウイルス(ALSV)を利用してGAPDH-A遺伝子のサイレンシングを誘導した植物において、RCNMV増殖レベルが低下することを示す結果を得た。さらに、GAPDH-Aの細胞内局在性が、RCNMV RNAの複製と関連して葉緑体から小胞体膜へと変化する様子が観察された。また予備実験の結果では、GAPDH-A遺伝子をサイレンシングした植物細胞ではRCNMV MPの細胞内局在性に異常の見られる例が多数見つかったことから、GAPDH-AはMPの細胞内での正常な局在性に関与する宿主因子ではないかと考えられる。昨年までにRCNMV MPと相互作用する宿主植物(Nicotians benthamiana)因子を、Tandem affinity purification法と質量分析によって多数同定した。平成23年度の研究では、それらの中から葉緑体局在シグナルを持つGlyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH-A)遺伝子をクローニングし、RCNMV増殖における役割について調べた。ウイルスベクターによってGAPDH-A遺伝子をサイレンジンクした植物葉におけるRCNMV増殖レベルは、サイレンジンクを誘導していない葉と比較して低下するが、プロトプラストではサイレンジンクの有無に拘わらず同レベルのRCNMV RNAおよびMP蓄積が観察されたことから、GAPDH-AはRCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子であり、MPの安定性には関係無いことが明らかとなった。またRCNMV RNA1の複製が起きる条件下で、葉緑体局在性のGAPDH-Aタンパク質はER膜上の小斑点状構造へも局在するようになった。さらに、GAPDH-A遺伝子をサイレンジングした植物細胞ではRCNMV MPのER膜上の小斑点状構造局在が著しく減少した細胞が多数観察された。これらの結果と、RCNMVの複製酵素複合体を構成するp27タンパク質と相互作用する因子としてGAPDH-Aが単離されたという結果(Mine and Okuno, unpublished results)とを総合して、GAPDH-AはRCNMVの複製酵素複合体中のp27とMPとを橋渡しする因子であり、MPが複製酵素複合体中のRCNMV RNA1を捕捉するのを助けることを通じてRCNMVの細胞間移行に寄与するというモデルを提唱したい。今年度の研究で、申請者は免疫沈降実験を行い、in vivoでGAPDH-AとRCNMV MPが確かに結合することを明らかにした。またp27とMPとの免疫沈降を行い、両者が相互作用することを明らかにした。

しかし大腸菌に発現させたp27とMP間のin vitroにおける免疫沈降実験によって両者の相互作用が確認されたことから、p27とMPは直接結合すると考えられ、GAPDH-Aがp27とMPの間に介在するというモデルは否定された。さらにGAPDH-Aをサイレンシングさせた植物におけるp27-MP間相互作用が減少するかどうかを調べたが、減少傾向は見られなかったことから、GAPDH-A以外にp27-MP間の結合を介助する因子が存在することが示唆された。実験に関してこれまでのところ大きなトラブルや見込み違いもなく、順調に進展している。サイレンシング誘導植物からのプロトプラストの単離とウイルス感染実験で多少もたついたが、植物の培養条件などを検討した結果、解決できた。またサイレンシング誘導条件にも検討を加え、ほぼ100%の植物にサイレンシング誘導できるようになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。RCNMVの細胞間移行におけるGAPDH-A遺伝子の働きについての作業仮説を証明するために、GAPDH-Aタンパク質とRCNMV MPおよびp27タンパク質との結合について、免疫沈降法やGST-pulldownアッセイによって、in vivoおよびin vitroで結合し得るのか否かを調べる予定である。さらにBiFC法についても検討したい。さらに、RCNMV以外のウイルス増殖への影響があるのかどうか調べ、影響を受けるウイルスと受けないウイルスの移行タンパク質との相互作用の有無や、移行タンパク質の局在性について調べることを計画している。