hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低次元硫化物ナノ構造体の合成と触媒材料への展開

本研究ではこれまでに,N,W硫化物ナノクラスターを調製する際にCyDTAなどのキレート剤を用いると,NiとWからなる複合硫化物ナノクラスターが選択的に形成し,軽油中に含まれる難脱硫性化合物である4,6-ジメチルジベンゾチオフェン(4,6-DMDBT)の水素化脱硫(HDS)反応に対して著しく高い活性が得られることを見出している.昨年度は,このキレート剤の効果を明らかにするにあたって,キレート剤を用いないで調製した硫化物ナノクラスター上での4,6-DMDBTのHDS反応経路を詳細に調べ,これまでに知られていなかった反応経路を見出した.本年度はCyDTAの役割を検討した.まず,反応の全体像を明らかにするため,4,6-DMDBTの転化率を広い範囲で変えて反応を行い,生成物収率と選択性の変化を調べた.その結果,本反応では転化率に依存して生成物が異なり,低転化率域(510%)ではテトラヒドロジメチルジベンゾチオフェン(THDMDBT),ヘキサヒドロジメチルジベンゾチオフェン(HHDMDBT)とジメチルビフェニル(DMBPh),ジメチルシクロヘキシルベンゼン(DMCHB)が生成したのに対して,転化率が2080%の領域ではさらにジメチルビシクロヘキシル(DMBCH)も生成することが明らかとなった.数値解析法によって反応経路を検討した結果,CyDTAを用いて調製したNiW触媒上のHDS反応においても4,6-DMDBTとHHDMDBTのC-S結合の開裂と芳香環の水素化が同時に起こる経路,および4,6-DMDBTからHHDMDBTが直接生成する経路が存在することが明らかとなった.さらに,各経路の速度定数を,CyDTAを用いずに調製した触媒上のものと比較すると,CyDTAを用いて調製した触媒上では直接脱硫経路の速度定数が約2倍大きいことが明らかとなった.このことから,NiとWからなる複合硫化物ナノクラスターは4,6-DMDBTの芳香環を水素化することなくC-S結合を選択的に開裂する反応を促進すると推定された.本年度は特異な構造を有する硫化物ナノクラスターの触媒作用を明らかにするにあたって,まず汎用のアルミナ担体上に形成した硫化物ナノクラスターの触媒作用を明らかにすることを試みた。具体的には軽油の超低硫黄化を念頭に置いて,軽油中に含まれる難脱硫性化合物の4,6-ジメチルジベンゾチオフェン(4,6-DMDBT)の水素化脱硫(HDS)反応を用いてNiW/Al_2O_3触媒へのキレート剤(CyDTA)の添加効果を調べた。我々は既にNiW/Al_2O_3調製時にCyDTAを用いるとNiとWから構成される複合硫化物ナノクラスターが選択的に形成することを見出しており,CyDTAが4,6-DMDBTのHDS反応に対してどのような効果を示すのかに注目した。NiW/Al_2O_3触媒を用いた4,6-DMDBTのHDS反応(573K,5.1MPa(H_2))では3種の脱硫生成物(ジメチルシクロヘキシルベンゼン(DMCHB),ジメチルビシクロヘキシル(DMBCH),ジメチルビフェニル(DMBPh))と水素化生成物(テトラヒドロジメチルジベンゾチオフェン(THDMDBT)が生成した。この中でTHDMDBT,DMCHBおよびDMBCHを経由する反応経路を水素化(HYD)ルート,水素化を受けず脱硫されたDMBPhへの反応経路を直接脱硫(DDS)ルートと呼ぶ。まず,CyDTAを用いて触媒を調製すると,脱硫生成物の収率が約2倍向上することが明らかとなった。次いで,生成物選択性に注目すると,触媒調製時にCyDTAを用いるとDDSルートの選択性は向上するが,HYDルートの選択性はほとんど変わらないか,むしろやや低下する傾向を示すことが分かった。触媒調製時にCyDTAを用いるとNiとWから構成される複合硫化物ナノクラスターが選択的に形成することを考慮すると,このようなナノクラスターは4,6-DMDBTのC-S結合の解裂を促進して,トータルのHDS活性を向上させるものと推定される。昨年度は,N, W硫化物ナノクラスターを調製する際にCyDTAなどのキレート剤を用いると, NiとWからなる複合硫化物ナノクラスターが選択的に形成し,軽油中に含まれる難脱硫性化合物である4,6-ジメチルジベンゾチオフェン(4,6-DMDBT)の水素化脱硫(HDS)反応に対して著しく高い活性が得られることを見出した.本年度はこのキレート剤の効果を明らかにするにあたって,まずキレート剤を用いないで調製した硫化物ナノクラスター上での4,6-DMDBTのHDS反応経路を詳細に調べた.まず,反応の全体像を明らかにするため,4,6-DMDBTの転化率を広い範囲で変えて反応を行い,生成物収率と選択性の変化を調べた.その結果,本反応では転化率に依存して生成物が異なり,低転化率域(510%)ではテトラヒドロジメチルジベンゾチオフェン(THDMDBT),ヘキサヒドロジメチルジベンゾチオフェン(HHDNMDBT)とジメチルビフェニル(DMBPh),ジメチルシクロヘキシルベンゼン(DMCHB)が生成したのに対して,転化率が2080%の領域ではさらにジメチルビシクロヘキシル(DMBCH)も生成することが明らかとなった.

これらのことから,THDMDBT, HHDMDBT, DMBPh, DMCHBはいずれも初期生成物である可能性がある.反応経路についてさらに知見を得るために,数値解析法による検討を行った.得られた結果を既往の研究で提案されている反応経路と比較すると,4,6-DMDBTとHHDMDBTのC-S結合の開裂と芳香環の水素化が同時に起こる経路,および4,6-DMDBTからHHDMDBTが直接生成する経路が新たに見出された.本研究ではこれまでに,N,W硫化物ナノクラスターを調製する際にCyDTAなどのキレート剤を用いると,NiとWからなる複合硫化物ナノクラスターが選択的に形成し,軽油中に含まれる難脱硫性化合物である4,6-ジメチルジベンゾチオフェン(4,6-DMDBT)の水素化脱硫(HDS)反応に対して著しく高い活性が得られることを見出している.昨年度は,このキレート剤の効果を明らかにするにあたって,キレート剤を用いないで調製した硫化物ナノクラスター上での4,6-DMDBTのHDS反応経路を詳細に調べ,これまでに知られていなかった反応経路を見出した.本年度はCyDTAの役割を検討した.まず,反応の全体像を明らかにするため,4,6-DMDBTの転化率を広い範囲で変えて反応を行い,生成物収率と選択性の変化を調べた.その結果,本反応では転化率に依存して生成物が異なり,低転化率域(510%)ではテトラヒドロジメチルジベンゾチオフェン(THDMDBT),ヘキサヒドロジメチルジベンゾチオフェン(HHDMDBT)とジメチルビフェニル(DMBPh),ジメチルシクロヘキシルベンゼン(DMCHB)が生成したのに対して,転化率が2080%の領域ではさらにジメチルビシクロヘキシル(DMBCH)も生成することが明らかとなった.数値解析法によって反応経路を検討した結果,CyDTAを用いて調製したNiW触媒上のHDS反応においても4,6-DMDBTとHHDMDBTのC-S結合の開裂と芳香環の水素化が同時に起こる経路,および4,6-DMDBTからHHDMDBTが直接生成する経路が存在することが明らかとなった.さらに,各経路の速度定数を,CyDTAを用いずに調製した触媒上のものと比較すると,CyDTAを用いて調製した触媒上では直接脱硫経路の速度定数が約2倍大きいことが明らかとなった.このことから,NiとWからなる複合硫化物ナノクラスターは4,6-DMDBTの芳香環を水素化することなくC-S結合を選択的に開裂する反応を促進すると推定された.
イスラーム信仰復興運動における共同体（ウンマ）意識-イギリスの若い女性信者の場合

【イギリスでのフィールドワーク調査】8月末から10月半ばまでオクスフォード、ロンドン及び北部イングランドにてタブリーギー・ジャマーアトの女性信者を対象にフィールドワーク調査を行った。今回の調査は、可能な限り多くのコンタクトを作り.タリームと呼ばれる経典の勉強会に参加することで、人々のウンマ意識の形成過程を調べることを目的とした。主に、マレーシアからのジャマーアトと呼ばれる布教グループとともにイングランド各地を回った。それぞれの地域において、様々なバックグラウンドを持つ人々がどのように人間関係を築いているのかを観察することに専念した。この運動のヨーロッパ支部が存在するデューズベリーにおいて他の女性ジャマーアトとともにモスクの離れで宿泊をし、勉強会にも参加した。そしてこの地区にあるイスラーム専門の書店において、この運動の経典やムスリム女性への教えについて書かれた書物を購入した。調査をして分かったことは、女性信者が「ウンマ」を必ずしもムスリムだけの共同体とは思っていなかったことである。彼女たちにとって「ウンマ」は、預言者ムハンマドの誕生以降の非ムスリム信者をも含めた全世界を指していた。信者同士では、「アッラーに基づく愛」が共有されているが,彼女たちの祈りはムスリムの共同体を超えた全世界にも向けられているということであった。イギリス政府の政策文書が認識するイスラーム共同体としての「ウンマ」とタブリーギー・ジャマーアトの女性信者の世界観も異なっていることが分かった。調査でわかったことは、東京大学駒場キャンパスで行われたUTCP Graduate Conferenceにて今年三月に発表した。今後の調査では、さらに女性信者との交流を深め、彼女たちにとって信仰とは何かということを調査する予定である。信仰について知るために、経典の教えを読み直す必要性もある。そして,イギリス政府の政策文書における「共同体」、特に"community"の概念の歴史的変遷の整理を行うことをもう一つの目的とする予定である。
遺伝子操作マウスを用いての甲状腺C細胞の細胞分化に関する分子機構の解析

Mash1はbHLH型転写調節因子であり、自律神経系の分化に関与している。Mash1ホモ変異型(-/-)マウスでは交感神経節が欠損し、嗅上皮の神経細胞や肺・神経内分泌細胞も形成されない。また出生直後に死亡する。甲状腺C細胞はカルシトニン(CT)を分泌する内分泌細胞である。C細胞の細胞分化に関する分子機構を解析するため、Mash1-/-マウス甲状腺を野生型マウスと比較して調べた。出生直後の野生型マウスC細胞は神経細胞様の特徴を有し、CTの他にCGRP,PGP9.5,TuJ1などの神経マーカーを呈示した。また転写調節因子NeuroDを発現した。一方Mash1-/-マウスではこれらC細胞マーカーは発現せず、C細胞は完全に欠損した。電子顕微鏡による観察でも、一日令野生型マウスでは特徴的な分泌顆粒を含有するC細胞を確認できたが、Mash1-/-マウスではC細胞は存在しなかった。第4咽頭嚢由来の鰓後体が甲状腺に侵入し、C細胞へと分化することはよく知られているので、C細胞欠損原因を解明するため、鰓後体の発生を調べた。胎生11.5日令(E11.5)で、野生型と同様にMash1-/-マウスで第4咽頭嚢から鰓後体が生じた。各種の神経堤細胞マーカーを用いて調べたが、どの遺伝子型マウスにおいても鰓後体内に神経堤細胞が侵入することはなかった。野生型では鰓体はE12.5でMash1を発現し、E13.5で甲状腺内に侵入、E14.5からC細胞として甲状腺実質内に分散し始めた。この時Mash1の発現は弱くなり、変わって神経マーカーであるCGRP、somatostatin,TuJ1がC細胞に発現し始めた。胎生後期になってNeuroD、続いてCTが発現した。一方Mash1-/-マウス鰓後体はMash1を発現せず、甲状腺内に侵入後多くのapoptosisを示し退化した。第4咽頭嚢、鰓後体および甲状腺C細胞には上皮細胞マーカーであるE-Cadherinが強く発現した。C細胞内でE-CadherinはCTと共存した。このような結果からC細胞は内胚葉上皮由来であり、またMash1はC細胞の細胞分化に関わる重要な遺伝子で、C細胞に神経細胞様の特徴を与えることが分かった。

出生直後の野生型マウスC細胞は神経細胞様の特徴を有し、CTの他にCGRP, PGP9.5, TuJ1などの神経マーカーを呈示した。また転写調節因子NeuroDを発現した。一方Mash1-/-マウスではこれらC細胞マーカーは発現せず、C細胞は完全に欠損した。電子顕微鏡による観察でも、一日令野生型マウスでは特徴的な分泌穎粒を含有するC細胞を確認できたが、Mash1-/-マウスではC細胞は存在しなかった。第4咽頭嚢由来の鰓後体が甲状腺に侵入し、C細胞へと分化することはよく知られているので、C細胞欠損原因を解明するため、鰓後体の発生を調べた。胎生11.5日令(E11.5)で、野生型と同様にMash1-/-マウスで第4咽頭嚢から鰓後体が生じた。各種の神経堤細胞マーカーを用いて調べたが、どの遺伝子型マウスにおいても鰓後体内に神経堤細胞が侵入することはなかった。E12.5で鯉後体は大動脈弓または内頚動脈基部と接し、野生型では鰓後体内にMash1が発現したが、Mash1-/-マウスでは発現することはなかった。E13.5で鰓後体は甲状腺内に侵入し、野生型マウスではE14.5からC細胞として甲状腺実質内に分散し始めた。この時Mash1の発現は弱くなり、変わって神経マーカーであるCGRP、somatostatin, TuJ1がC細胞に発現し始めた。胎生後期になってNeuroD続いてCTが発現した。一方Mash1-/-マウスでは甲状腺内に侵入後、鰓後体内に多くのapoptosisが出現し、退化すると考えられ、野生型で観察できたC細胞のマーカーは発現しなかった。このような結果からC細胞は内胚葉由来細胞であり、Mash1はC細胞の細胞分化に関わる重要な遺伝子であることが分かった。またNeuroDはC細胞の最終分化に関与し、CTの発現に関わると考えられた。Mash1はbHLH型転写調節因子であり、自律神経系の分化に関与している。Mash1ホモ変異型(-/-)のマウスでは交感神経節が欠損し、嗅上皮の神経細胞や肺神経内分泌細胞も形成されない。また出生直後に死亡する。甲状腺C細胞はカルシトニン(CT)を分泌する内分泌細胞である。C細胞の細胞分化に関する分子機構を解析するため、Mash1-/-マウス甲状腺を野生型マウスと比較して調べた。出生直後の野生型マウスC細胞は神経細胞様の特徴を有し、CTの他にCGRP, PGP9.5,TuJ1などの神経マーカーを呈示した。電子顕微鏡による観察でも、一日令野生型マウスでは特徴的な分泌顆粒を含有するC細胞を確認できたが、Mash1-/-マウスではC細胞は存在しなかった。第4咽頭嚢由来の鰓後体が甲状腺に侵入し、C細胞へと分化することはよく知られているので、C細胞欠損原因を解明するため、鯛後体の発生を調べた。野生型では鰓後体はE12.5でMash1を発現し、E13.5で甲状腺内に侵入、E14.5からC細胞として甲状腺実質内に分散し始めた。
NSF結合タンパク質の同定と開口分泌における役割

NSFはSNAPおよびSNAREと複合体を形成し、神経伝達物質の開口放出に関与することが知られている。最近、我々は英国のHenleyら(プリストル大)との共同研究によって、NSFがAMPA型のグルタミン酸受容体(GluR2)と相互作用していることを明らかにした。NSFとGluR2との相互作用は直接的であり、SNAPを介さない。SNAPやGluR2以外にNSFと相互作用するタンパク質を同定するために、酵母のtwo-hybrid法を用いてNSFと相互作用する脳タンパク質の検索を行った。しかしながら、相互作用するタンパク質として見つかったのは全てNSF自身であった。NSFはそのC末端で強く相互作用して六量体を形成することが知られており、そのためこのスクリーニング法ではNSF自身しか見つからなかったものと考えられる。NSFは神経伝達物質の開口放出以外にも有糸分裂時のゴルジ体の形成反応にも関与するが、この反応にはVCPというタンパク質も関与する。VCPはNSFと同様に六量体タンパク質であり、一次構造的にもNSFに類似している。最近、VCPの膜受容体はNSFと同様にSNAREであるという報告があり、VCPがNSFと協調して開口放出にも関与している可能性が考えられた。そこで、two-hybrid法でVCPと相互作用するタンパク質の検索を行ったところ、VCP間での相互作用は全く認められず、2つの新規タンパク質を同定することができた。その内の一つはp47であり、VCPと結合しているタンパク質であることが、ごく最近英国のWarrenのグループによって報告された。もう一つのタンパク質は未知のものであり、現在、その構造決定を進めている。今後、VCPの開口放出機構への関与について検討する予定である。
肝細胞の発がん過程に関与する新規のがん遺伝子ガンキリンの機能解析

ヒト肝がん組織を用いたcDNAサブトラクション法により、新規の遺伝子ガンキリン(アンキリンリピートよりなる蛋白)を単離した。機能解析により、ガンキリンは、(1)がん遺伝子であること、2)かん抑制遺伝子のRBと結合すること、(3)そのがん化能は、RBのリン酸化亢進(転写調節)とRBの分解促進(たんぱく分解)という二方向により発揮されること、が判明した(Nature Medicine、2000)。さらに、26Sプロテアソームの調節サブユニットの一因子であるガンキリンのがん化能について、他のがん抑制遺伝子産物の分解を促進していないかということを調べた。ガンキリンを過剰発現した細胞株では、あるがん抑制遺伝子産物の分解は高度に促進されていたが、RBの場合とは異なり、ガンキリンは、そのがん抑制遺伝子産物とは複合体を形成していなかった。さらに、DNA損傷後のアポトーシスに対して、抵抗性を示した。RBとは異なった機序によるガンキリンによるたんぱく分解の経路の存在とその経路による抗アポトーシス作用が示唆された。次に、転写調節という側面からのガンキリンのがん化能について、複合体を形成する他の転写因子への影響を調べた。その転写因子のDNA結合能を核内でプロックすることで、その転写活性化能を抑制していた。いままで、ウイルス発癌を中心に解明されてきたヒト肝がんについて、転写調節能とたんぱく分解制御能をもつ内因性たんぱくガンキリンを中心に解析をした。
フェニルヒドラジンによる溶血性貧血機構に関する研究

フェニルヒドラジンは、赤血球中でヘモグロビンと反応し溶血を起すハインツ体をつくる。ハインツ体は、ヘモグロビンの不可逆酸化的変性によって生じる。この現象の理解を目的として、フェニルヒドラジンを動物に投与して、赤血球中に発生するヘム由来異常成分の検出を行った。フェニルヒドラジン処理ラットの血液及びひ臓を、硫酸を含むメタノール溶液及び酢酸亜鉛処理して2種の色素,色素Iと色素【II】,を単離した。色素Iは、N-フエニルプロトポルフィリンIXのジメチルエステルの亜鉛錯体で、ビニル基をもつピロール環A,Bがフェニル化されており、色素【II】は、プロピオン酸残基をもつピロール環C,Dがフエニル化された2種の異性体の混合物であった。これらの色素が、生体内から検出されたことは、フエニル鉄を含むヘモグロビン分子が、赤血球中に含むことを示すものである。ヘモグロビンのヘムポケットにこのような大きな置換基が入ると、この分子は不安定化し不可逆変性しハインツ体生成に導くというフエニルヒドラジンによる溶血機構が考察できる。
確率マトリクス演算法による治水・利水システムの信頼性評価とその管理

2年間の研究より、以下の成果が得られた。1.多地点同時マトリクス法による降雨ー流出のシミュレ-ション:水系一貫した複数流域での降雨シミュレ-ションを行うため、1次マルコフ性に基づくマトリクス型の降雨シミュレ-ションを行なった。利水ではBrasらの線形型の流域シミュレ-ションを、治水では、流域規模・数・利用形態に応じて貯流関数法で流出量を算定し、目的別流量とその条件付確率を求めた。2.マトリクス演算法による河川水量・水質の確率的評価:河川の分岐、合流、ダム貯水池、取水、浄化、再利用、氾濫(越流)等の水循環形態を時・空間的条件付き確率をベ-スにしたマトリクスで表現し、合流演算手法であるShift Operationとその逆変換法によって、任意基準地点での水量、水質の確率的評価を可能とした。3.システムの多目的評価とその統合化:河川表流水の水量、水質を各地点に設けられた基準値に対する安全度、回復度、深刻度で表わし、ト-タルな意味での信頼性評価を行った。また、システムの策定・管理への意志決定情報として、社会目標への接近をはかるべく、ベクトル最適化による目的の統合を図った。4.コンフリクトアナリシスによる配置・規模・建設手順の決定:治水・利水システムの建設にあたっては、上下流問題・施設規模・建設時点に対する地域間の、コンフリクトが発生する。メタゲ-ム理論の一種であるコンフリクトアナリシを用いて、自治体と地域住民をプレ-ヤ-とし、異なるあいまいな好み度、時間と共に変化する好み度を制約条件として、建設意志決定の支援プログラムを作成した。本年の主要課題は(1)流量の時・空間条件付き確率の算定、(2)マトリクス演算法による水量・水質の評価、(3)多目的評価とその統合化、である。まず、課題(1)については、1次マルコフ性のもとで降雨の多地点同時シミュレ-ション法の定式化を行った。短期流出では貯留関数法とモンテカルロシミュレ-ションによって流量の条件付き確率を算定した。長期においては、半句単位としており、流量デ-タより直接確率分布を求めた。いずれも、最上流域で時間的条件付き確率、他の流域では、最上流域対する空間的確率とした。課題(2)については、マトリクスの確率要素を考慮した形、貯水池及び利水システムによる流量確率の遷移構造を明らかにした。治水においては、shift-operationによって合流過程の定式化が図れた。利水においては、貯水池操作・分流・消費・合流などの過程があり、各々の利用パタ-ンを想定して定式化を行った。その結果、並列・直列のダム群、支川流入、ダムと地下貯水池の有機的利用など任意のシステムでの流量確率の算定が可能となった。課題(3)については、安全度指標として、信頼度、回復度、深刻度を用いた。システム設計にあたっては、その建設・管理費用の最小化が目的となるが、信頼度を制約条件とした。回復度、深刻度も2次制約として取入れ、信頼度を満たす範囲内であるレベルまでは許容することにした。これは、多目的計画法でいう辞書編纂型に相当し、目的間に重みを付けた方法である。この基準によって、利水システムの長期管理シミュレ-ションが可能となった。また、水量の減少傾向を過程してシミュレ-ションを行い、長期気候変動下での耐渇水性のある利水システム策定の指標を得ることができた。次年度は、今年度の成果を基に研究課題の達成を図りたい。本年度は、2年目であると共に最終年度であるので、全体の総括と次の課題について研究を行った。1.システムの多目的評価とその統合化

河川表流水の水量、水質を各地点に設けられた基準値に対する安全度、回復度、深刻度で表わし、ト-タルな意味での信頼性評価を行った。また、システムの策定・管理への意志決定情報として、社会目標への接近をはかるべく、ベクトル最適化による目的の統合を図った。渇水時に於ける貯水池の実時間操作として、パタ-ン分類による流況の分類と予測、および、節水率を放流ル-ルにする知識ベ-スを作成しファジイ制御を導入した手法を提案した。さらに、分類されたパタ-ンにおいては、対数正規確率分布を仮定して信頼度を求め、渇水期間を計算し回復度を求めた。それによって、1次マルコフ性の基でのマトリクス演算とパタ-ン分類による流況評価を結合することが出来た。2.コンフリクトアナリシスによる配置・規模・建設手順の決定治水・利水システムの建設にあたっては、上下流問題・施設規模・建設時点に対する地域間のコンフリクトが発生する。そこで、メタゲ-ム理論の一種であるコンフリクトアナリシスを用いて、自治体と地域住民をプレ-ヤ-とし、異なるあいまいな好み度、時間と共に変化する好み度を制約条件として、建設意志決定の支援プログラムを作成した。曖昧性に対してはファジイ推論を用い、時間変化に対しては時間遷移マトリクスの作成により対処した。
次世代シーケンサーで迫るナガキクイムシの共生微生物生態

ナラ枯れの媒介者である“太平洋型"のナガキクイムシ(以下、“太平洋型")について、坑道(巣)壁における微生物群集構造を明らかにした。“太平洋型"を穿孔させたコナラ丸太を割材し、穿孔虫の蛹室2検体と水平坑道4検体の坑道片を切り出した。これらを希釈平板法(培養法)による菌類群集の解析、および次世代シーケンサーを用いた全微生物群集の解析(非培養法)に供試した。希釈平板法によって、“太平洋型"の菌類群集はカシノナガキクイムシのものと酷似したものであることが判った。また非培養法によって、供試した6検体全てからActinomyces sp.が検出され、“太平洋型"の共生者である可能性が示唆された。本研究の目的は、ナラ枯れ(ブナ科樹木萎凋病)の媒介者であるカシノナガキクイムシ(Platypus quercivorus,以下、カシナガ)が樹木内で大増殖するメカニズムを、共生微生物との関係を端緒として解明する。すなわち、「虫の餌資源と考えられる共生菌類は、巣内でどのようにして安定的に供給され得るのか?」という問いに対し、「巣内の共生菌類群集の成立には、バクテリア群集が関与している」という仮説を立て、これを検証するための基礎的知見を蓄積することを目的とする。本研究では、カシナガ、“太平洋型カシナガ"、ヨシブエナガキクイムシ、ヤチダモノナガキクイムシの4種を供試予定である。24年度は、上記4種の中で最も手に入りづらいと想定していた“太平洋型カシナガ"のサンプルが手に入り、培養法による巣内の菌類群集解析を行った。この結果、“太平洋型カシナガ"はカシナガと同種の可能性が高い酵母が巣内で優占していることが判った。また、ヨシブエナガキクイムシについてもサンプルが手に入り、培養法による巣内の菌類群集解析を遂行している。上記2種については、次世代シーケンサーを用いた非培養法による微生物群集解析を実施するため、巣内の微生物ペレットを凍結して保存した。また、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析のコストパフォーマンスを上げるため、タグをつけたプライマーを設計した。和歌山県白浜市にコナラの丸太を囮木として設置し、ナガキクイムシを穿孔させた。これを割材し、穿孔したナガキクイムシ6頭および蛹室(2検体)と水平坑道(4検体)の坑道片を切り出した。分子生物学的手法によって穿孔虫の種を推定したところ、主として日本海側で発生しているナラ枯れの媒介者であるカシノナガキクイムシ(以下、カシナガ)とは分子系統学的にかけ離れていることが確認できた。蛹室(2検体)と水平坑道(4検体)は、1希釈平板法(培養法)による菌類群集の解析、および2次世代シーケンサーを用いた微生物群集解析(非培養法)に供試した。希釈平板法によって、“太平洋型"の坑道の菌類群集は、カシナガのものと酷似したものであることが判った。すなわち、Ambrosiozyma kashinagacola(旧名Candida kashinagacola)と未同定の子嚢菌系酵母Candida sp.の2種が優占しており、ナラ菌Raffaelea quercivoraと併せた3種が6検体全てから分離された。また、菌類群集に関しては、次世代シーケンサーを用いた培養を介さない手法によっても同様の結果が得られた。上述の6検体は、次世代シーケンサーを用いた原核微生物の群集解析にも供試した。その結果、6検体全てからActinomyces sp.とみられる放線菌の配列が検出された。加えて、γ-プロテオバクテリアと考えられるバクテリアも検出された。24年度は、供試予定のカシナガ、“太平洋型カシナガ"、ヨシブエナガキクイムシ、ヤチダモノナガキクイムシの4種のうち、分布域が最も限定されている“太平洋型カシナガ"のサンプルが手に入った。貴重なサンプルであったため、次世代シーケンサーによる群集解析のサンプル調製と共に、培養法による菌類群集解析を優先的に実施した。また、これによって得られた菌株に新規性の高い希少な酵母が含まれていたため、詳細な同定作業を実施している。以上の実験作業に時間を費やしたため、次世代シーケンサーによる解析が当初の想定より少し遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。

昨年度のうちにヨシブエナガキクイムシと“太平洋型カシナガ"のサンプルが手に入り、次世代シーケンサー用に検体を調製する前段階まで処理を進めた。今年度は、入手の容易なカシナガのサンプルを入手するとともに、実際に次世代シーケンサーを駆動させてデータを取得する作業を8月末までに終了させる。次世代シーケンサーによる群集解析に時間がかかるようであれば、サンプル入手の難易度がやや高いヤチダモノナガキクイムシは、本年度中の解析実施に見切りをつけることも検討する。また、解析結果をもとに共生系のメンバーとして重要と推定されるグループのバクテリアについて、培養を試みる。さらに、培養に成功し株が確立したものについては、申請者が所属するカルチャーコレクションに菌株を寄託する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ガスクラスターイオンビームによる有機高分子の選択的結合破断と表面分析への応用

本研究では、複数の高分子試料の測定結果から、分子構造(官能基の種類)とクラスターイオンの照射条件(Eatom、クラスターの大きさ等)により解離パターンおよび結合解離の閾値が変化することを見いだした。また、短時間で大量のスペクトルデータを取得できるようにし、解析時の統計的な誤差を小さくできるようにした。その結果、スペクトルのEatom依存性に、分子構造以外の情報が含まれていることが示唆されている。今後は、同様な分子構造を持ちながら積層構造や配向性の異なる試料から得られる二次イオンスペクトルと、その統計解析結果を元にして、複雑なスペクトル解析法の基本的な考え方を確立していく。本研究の目的は、運動エネルギーと大きさを精密に制御した気体クラスターイオンを有機分子薄膜に照射し、スパッタリング時に起きる分子内化学結合の破断を制御することで、二次イオン質量分析(SIMS)におけるスペクトル解析を大幅に簡略化し、分子種の同定を容易にすることである。平成26年度はまず第一段階として、分子層の膜厚および荒さを原子間力顕微鏡(atomic force microscope:AFM)で測定しながら、高分子やアミノ酸など複数のモデル試料の作製方法を検討した。高分子モデル試料のポリビニルピロリドン(Polvinylpyrrolidone, PVP:(C6H9NO)n)および、ポリ4-ビニルピリジン(Poly(4-vinyl pyridine),P4VP:(C7H7N)n)試料を、Eatomを変えながら複数回SIMS測定しスペクトルを比較したところ、SIMSスペクトルには、試料ポリマーのモノマーユニットを含む代表的な解離イオン種が検出されることがわかった。そこで、代表的な解離イオン種のピークを抜き出し、その強度のEatom依存性を主成分分析の手法を用いて解析した。スコアプロットとローディングプロットから、それぞれのピーク強度のEatomに対する傾向を考察したところ、PVPでは、Eatomを大きくしていくと、まず主鎖の切断がおこり、次に環状構造部が切断され、続いて5員環ラクタム構造が破壊されることが、P4VPでも、Eatomの増大と共に、環状構造が破壊されていくことがわかった。また、環状構造が破壊させる閾値エネルギーが六員環と五員環で異なることがわかった。この結果は、分子構造の違いにより結合破断の閾値エネルギーが異なることを示しており、今後有機分子試料のスパッタ過程の制御方法を確立するための重要な基礎データとなる。本研究の目的は、運動エネルギーと大きさを精密に制御した気体クラスターイオンを有機分子薄膜に照射し、スパッタリング時に起きる分子内化学結合の破断を制御することで、ガスクラスターイオンビーム(GCIB)による二次イオン質量分析(SIMS)においてスペクトル解析を大幅に簡略化し、分子種の同定を容易にすることである。まず、高分子モデル試料のポリビニルピロリドン(Polvinylpyrrolidone, PVP:(C6H9NO)n)など数種類の試料を、Eatomを変えながら複数回SIMS測定しスペクトルを比較した。SIMSスペクトルには、試料ポリマーのモノマーユニットを含む代表的な解離イオン種が検出されることがわかった。そこで、代表的な解離イオン種のピークを抜き出し解析を行った。PVPの例では、Eatomを大きくしていくと、まず主鎖の切断がおこり、次に環状構造部が切断され、続いて5員環ラクタム構造が破壊されることが、他の試料でも良く似たEatom依存性を示すことがわかった。さらに高い精度で解析するために、Eatomをランダムに変えながら連続してSIMS測定を行うシステムを製作し、短時間で大量のスペクトルデータを取得できるようにした。この大量のデータをこれまでに製作してきた統計解析用プログラムで解析したところ、スペクトルのEatom依存性には、分子内化学結合の結合エネルギーの他の要因にも依存することを示唆する結果が得られた。この結果は、GCIB-SIMSにおけるスペクトルのEatom依存性データには、分子構造の違いだけでなく、試料の立体構造や力学的特性等、試料の物性に関する多くの情報が含まれることを示しており、今後のGCIB-SIMSデータの解析法を確立するための重要な基礎データとなる。本年度は、前年度からの予定通り、Eatomをランダムに変えながら連続してSIMS測定を行うシステムを製作し、短時間で大量のスペクトルデータを取得できるようにした。そのため、より正確にEatom依存性を解析できるようになった。大量のデータを解析できるようになったことで、スペクトルのEatom依存性に当初予想していた分子構造情報以上のものが含まれている可能性が示唆され、その詳細について新たに検討することが必要となった。また実験の過程で、分子構造情報に関しては、Arクラスターの他に水やメタノールのクラスターを用いることでより詳細に検討できる可能性を見いだし、その検討も行っている。これらの当初予想されていなかった結果を見いだしたため、当初計画よりやや遅れている。また、データ取得システムを作成し、短時間で大量のスペクトルデータを取得できるようにした。その結果、より多くのデータを解析することができるようになり、解析時の統計的な誤差を小さくできるようにした。このように構築してきた実験システムで、スペクトルのEatom依存性に、分子構造以外の情報が含まれていることが示唆されている。本年度は、前年度までに測定した種々のSIMSデータおよびポリビニルピロリドン(PVP, (C6H9NO)n)試料のEatom依存

SIMSスペクトルをこれまでよりデータ数を増やし主成分分析(PCA)により解析した。その結果、主成分1では、多数ある二次イオンピークを化学結合の解離部位の違いによる成分に明確に分類できることがわかった。さらに、主成分2(PC2)にもまだ1540%の情報量が残っていることがわかった。これはこれまでの研究から、深さ方向の分布や、表面の硬さなどの情報を反映していると考えられる。この結果から、一次イオン照射による試料分子の分解を抑制するのではなく、むしろEatomを調整することで能動的に制御すれば、試料表面・界面の分子構造情報と化学構造の深さ方向分布という、材料開発に必須の情報を、短時間で同時に同時に得られることが示唆される。本研究では、複数の高分子試料の測定結果から、分子構造(官能基の種類)とクラスターイオンの照射条件(Eatom、クラスターの大きさ等)により解離パターンおよび結合解離の閾値が変化することを見いだした。また、短時間で大量のスペクトルデータを取得できるようにし、解析時の統計的な誤差を小さくできるようにした。その結果、スペクトルのEatom依存性に、分子構造以外の情報が含まれていることが示唆されている。今後は、同様な分子構造を持ちながら積層構造や配向性の異なる試料から得られる二次イオンスペクトルと、その統計解析結果を元にして、複雑なスペクトル解析法の基本的な考え方を確立していく。平成26年度は、膜厚と荒さに再現性のある試料の作製方法を検討した。これにより、表面荒さがほぼ同じで分子構造が異なる複数のモデル試料が作製可能となり、再現性の良いSIMSスペクトルを得られるようになった。そのようにして作製したモデル試料に、運動エネルギーと大きさ(クラスターサイズ;クラスターの構成原子数)を精密に調整しながらArクラスターイオンを照射してSIMS測定を行った。また、得られたSIMSスペクトルを多変量解析(主成分分析、多変量スペクトル分離)するためのプログラムを作成した。実験では、これらの解析法により、SIMSスペクトルのEatom依存性を分類し、定性的に解釈できることがわかった。また、化学結合破断の閾値エネルギーが分子構造によってことなることがわかった。現時点では、サンプル数が少ないため、分子構造と化学結合破断の閾値エネルギーを系統的に示すことは難しいとはいえ、窒素含有五員環、六員環の結合を破断するための大凡のEatom値の目安は示された。次年度以降は、測定回数およびサンプル数を増やし、より正確な関係性を詳細に調べていくための基礎データが得られた。以上より、研究の進展はおおむね順調と考えている。ここまでの研究で、複数のモデル試料の測定結果から、分子構造(官能基の種類)とクラスターイオンの照射条件(Eatom、クラスターの大きさ等)により解離パターンおよび結合解離の閾値が変化することを見いだした。
炎症反応に関わるエフェクターT細胞の機能制御機構の解明

【目的】炎症反応は病原体に対する生体防御のみならず、自己免疫疾患やアレルギー疾患、粥状動脈硬化など多くの疾患発症にも関与する。従って、炎症制御機構の解明は免疫学において最も重要な研究課題のひとつである。本研究では、マウスモデルを用いた自己免疫/アレルギー/炎症性疾患発症におけるCD4陽性エフェクターT細胞の関与について、特にその制御分子と考えられるOX40の機能に焦点を当てて、その制御機構の解明を目指す。【結果】OX40シグナルはCD4陽性T細胞の恒常性維持に関与し、種々の炎症反応の惹起と遷延化を促進することが知られる。CD4陽性T細胞の移入実験により、OX40シグナルが記憶T細胞の一種である、エフェクター記憶T細胞生存促進に必須であることが明らかになった。他方、セントラル記憶T細胞の生存と機能にはOX40シグナルが必要でないことが分かり、OX40がCD4陽性エフェクター記憶T細胞恒常性維持に選択的に関与することが判明した。他方、以前よりOX40シグナルが自然発生制御性T細胞の免疫抑制機能を阻害することを報告していたが、今回の研究で、OX40シグナルがTGFβ依存的に産生される誘導性制御性T細胞の分化を抑制することが明らかになった。さらに、OX40シグナルを阻害することにより誘導性制御性T細胞の分化を人為的に促進させることが可能であることが判明した。以上に結果はOX40シグナル制御により、制御性T細胞依存的免疫寛容を人為的に制御できる可能性を示唆しており、OX40による自己免疫・炎症反応の制御機構の一端が明らかとなった。【目的】炎症反応は病原体に対する生体防御のみならず、血管新生や創傷治癒など生体の恒常性維持に重要な役割を果たす。さらに、自己免疫疾患やアレルギー疾患、粥状動脈硬化など多くの疾患発症にも関与する。【本年度の結果】OX40シグナルはCD4陽性T細胞の恒常性維持に関与し、種々の炎症反応の惹起と遷延化を促進することが知られる。他方、OX40L遺伝子導入マウスがC57BL/6系統依存的に炎症性腸疾患を自然発症することから、感受性系統と抵抗性系統の交配マウスを用いた遺伝子連鎖解析を行い、炎症性腸疾患感受性候補遺伝子IBDX(仮名)を見出した。IBDX mRNA発現は疾患感受性系統(C57BL/6)において疾患抵抗性系統に比べて3分の1に減弱していた。OX40過剰シグナルとC57BL/6系統におけるIBDX機能不全が同時に作用することが、腸管炎症と密接に関連していると推察される。IBDXがT細胞に発現することから、IBDXによる炎症性T細胞機能制御機構の存在を想定して研究を進行中である。【結果】

OX40シグナルはCD4陽性T細胞の恒常性維持に関与し、種々の炎症反応の惹起と遷延化を促進することが知られる。CD4陽性T細胞の移入実験により、OX40シグナルが記憶T細胞の一種である、エフェクター記憶T細胞生存促進に必須であることが明らかになった。他方、セントラル記憶T細胞の生存と機能にはOX40シグナルが必要でないことが分かり、OX40がCD4陽性エフェクター記憶T細胞恒常性維持に選択的に関与することが判明した。他方、OX40L遺伝子導入マウスがC57BL/6系統依存的に炎症性腸疾患を自然発症することから、感受性系統と抵抗性系統の交配マウスを用いた遺伝子連鎖解析を行い、炎症性腸疾患感受性候補遺伝子を見出した。同遺伝子mRNA発現は疾患感受性系統(C57BL/6)において疾患抵抗性系統に比べて3分の1に減弱していた。そこで同遺伝子の遺伝子導入マウスを作成し、OX40L遺伝子導入マウスと交配したところ、IBD発症が有意に抑制された。従って、同遺伝子の機能不全とOX40過剰シグナルが同時に作用することが、腸管炎症と密接に関連していると推察された。現在、同遺伝子の免疫反応における機能を解析中である。
Rickettsia japonica主要抗原遺伝子の解析

1.四国東南部に発生した発疹性熱性疾患の患者から分離した新種の紅斑熱群リケッチアのRickettsia japonicaについて、表面抗原遺伝子の塩基配列より推定される制限酵素を用い遺伝子型鑑別を可能にした。R.japonica DNAをR.rickettsii 190-kDa表面抗原遺伝子のプライマーRr190.70p:Rr190.602nを用いてPCR法により増幅し、M13mp19 RFのEcoRI部位でクローニングを行い、非放射性ケミルミネッセントDNAシークエンシングにより増幅産物の塩基配列を決定した。PCR増幅DNAは533bpであり、プライマー間の491bpにはR.rickettsiiの対応する領域と比較して35塩基置換があり、プライマー対には夫々1及び2塩基の置換がある。PCR増幅領域全体では、これらのリケッチア間に構成塩基について93%相同、アミノ酸では85%相同である。R.japonica増幅DNAの塩基配列を認識する制限酵素を選び、制限断片長多型(RFLP)を調べると、認識部位に塩基置換のあるPstI、AluI、MunI、HinfIではR.Japonicaの識別は可能である。塩基置換のないAvaII、HindIII、TaqI、MspIでは、R.rickettsiiを始め他の紅斑熱群リケッチアとの識別は不能である。3.本研究で開発したPCR/RFLP法を用い、紅斑熱患者多発地の室戸地方において採集したフタトゲチマダニを調べたところ、R.japonicaゲノムDNAの存在が確認され、R.japonicaの媒介節足動物であると推定された。
ジーントラップにCre/loxPを組み合わせた遺伝子改変マウスライブラリーの作製

本研究は、ジーントラップ法によりランダムに遺伝子を破壊したES細胞から順次キメラマウスを作製し、実験動物として供給するための遺伝子改変マウスライブラリーを作ることを主目的としている。1)ES細胞でのジーントラップと破壊遺伝子の同定PGKプロモーターの制御下に内在性遺伝子のpoly-A付加シグナルを利用してPuromycin耐性遺伝子を発現する、と同時に、内在性遺伝子のプロモーターの制御下にCreリコンビナーゼを発現する新規トラップベクターを開発した。このトラップベクターを用いてES細胞でジーントラップを行い、約600個の薬剤耐性クローンを単離、解析した。残念ながら、トラップベクターの構築不備等により、内在性遺伝子がトラップされたものは64クローンであった。トラップした遺伝子を3'-RACEにより解析した結果、既知遺伝子が9つ、ESTで報告されている遺伝子が2つ、それ以外は新規遺伝子であった。現在、ベクターを改良するとともに、トラップ実験を続けている。2)ES細胞クローンからのキメラマウス作製と解析トラップした遺伝子を同定できたES細胞クローンから、順次キメラマウスを作製している。その結果、これまでに約10ラインの遺伝子欠損マウスを作製することに成功している。今後は、ホモ個体にしてマウスの表現型を調べると同時に、遺伝性疾患との関連についても検討する。またトラップした遺伝子のプロモーターの制御下にCreリコンビナーゼが正しく発現しているかどうか検討し、コンディショナルノックアウトマウス作製のcre発現トランスジェニックマウスとしての有用性についても調べる。
子どもの殺虫剤曝露と健康影響に関する研究

ピレスロイド系殺虫剤ペルメトリンのマウス妊娠期曝露による仔への影響について調べた。母マウスに0,5,35及び70mg/kg/dayのcis-ペルメトリンを妊娠1日目から妊娠18日目まで強制経口投与し、出産後21日目に母マウス及び仔マウスを解剖した。妊娠期における母マウスの体重及び摂餌量はcis-ペルメトリン投与による影響がみられなかった。出産仔数及び出産後21日目までの生存率はcis-ペルメトリン投与による影響がみられなかった。出産後21日目における母マウスの体重、肝重量及び着床数はcis-ペルメトリン投与による影響がみられなかった。また、雌雄それぞれの仔マウスの体重及び臓器重量はcis-ペルメトリン投与による影響がみられなかった。一方、cis-ペルメトリン投与により、雄仔の血漿中テストステロン濃度が用量非依存的に低下した。既報によれば、ピレスロイド系殺虫剤フェンバレレートを妊娠期曝露した場合、出産後80日目の雄仔の血漿中テストステロン濃度は不可逆的に低下するのに対して、授乳期曝露した出産後80日目の雄仔のそれは可逆的であった。本研究でテストステロン濃度の低下原因として、胎仔期に受けた曝露影響が不可逆性的に現れた場合もしくは授乳期に母乳中の残留ペルメトリンによる場合が考えられるため、更なる検討が必要である。また、マウスの妊娠期におけるcis-ペルメトリン曝露が雄性ホルモンへの影響が考えられたことから、雌性ホルモンへの影響についても検討する必要がある。地域一般生活者集団の子ども及びその親の殺虫剤尿中代謝物量をガスクロマトグラフ/質量分析計を用いて測定した。大人と子どもの尿中代謝物濃度の幾何平均値(μg/L)は、有機リン系殺虫剤(OP)代謝物についてはジメチルリン酸8.2と8.0、ジエチルリン酸2.9と3.5、ジメチルチオリン酸2.7と3.6、ジエチルチオリン酸1.0と1.2、ジアルキルリン酸(DAP)19.2と21.9、ピレスロイド系殺虫剤代謝物についてはジメチルシクロプロパンカルボン酸0.3と0.3、3-フェノキシ安息香酸(3PBA)0.4と0.4であった。いずれの代謝物濃度も大人、子どもそれぞれで性別による有意差はみられず、また、大人と子どもの間に有意差はみられなかった。また、家族ごとのDAP濃度は親子全員の尿中代謝物濃度がほぼ同レベルの家族と、家族の構成員間で代謝物濃度が大きく異なる家族が存在した。家族ごとの3PBA濃度はDAP濃度程大きく異なる家族はなかった。尿中代謝物濃度をクレアチニン補正した場合、大人と子どもの間に有意差はみられた数値もあったが、子どものクレアチニン濃度が大人よりも低値を示すこと、補正前の数値に有意差がないことから、曝露レベルはほぼ同じと考えられた。親子のOPの尿中代謝物濃度範囲の幅は家族により大きく異なったが、生活習慣や食事等の違いにより変動する可能性が考えられた。今回は少数例の検討にとどまっているため、子どもの曝露量についてはさらに例数を増やして検討を行う必要がある。子どもの殺虫剤曝露と健康影響を調べる予備実験として、体内におけるペルメトリン(PM)の毒性とperoxisome proliferator-activated receptor α(PPARα)の活性化との関連について調べた。代謝速度が異なるcis-またはtrans-PMを野生型マウス、PPARαノックアウトマウスおよびヒト型PPARαノックインマウスに6週間経口投与したところ、tans-PM投与により、野生型マウスにおいては体重当りの肝重量の増加、前立腺と精嚢の総重量および体重当りの前立腺と精嚢の総重量の減少、ヒト型PPARαマウスにおいては前立腺と精嚢の総重量および体重当りの前立腺と精嚢の総重量の減少がみられた。また、野生型およびヒト型PPARαマウスにおいて、PPARαの標的遺伝子であるMCADおよびVLCADのmRNAレベルはtrans-PM投与により有意に増加した。さらにtrans-PM投与によるこれらの遺伝子のmRNAレベルはcis-PM投与より有意に高かった。一方、PPARαノックアウトマウスにおいてはこれらの変化がみられなかった。PMの尿中代謝物である3-フェノキシ安息香酸(3PBA)はcis型よりtrans型で有意に高く排泄されることから、3PBAがPPARαの活性を誘導しているかもしれない。PPARαおよび他の標的遺伝子発現を引き続き測定すると共に、PMが引き起こす毒性とPPARαの活性化との関連を明らかにする必要がある。また、野生型マウスの妊娠期におけるcis-PM曝露が母マウスへの生殖毒性および仔マウスの生殖器や脳の発達への影響について検討する。

一方、cis-ペルメトリン投与により、雄仔の血漿中テストステロン濃度が用量非依存的に低下した。既報によれば、ピレスロイド系殺虫剤フェンバレレートを妊娠期曝露した場合、出産後80日目の雄仔の血漿中テストステロン濃度は不可逆的に低下するのに対して、授乳期曝露した出産後80日目の雄仔のそれは可逆的であった。本研究でテストステロン濃度の低下原因として、胎仔期に受けた曝露影響が不可逆性的に現れた場合もしくは授乳期に母乳中の残留ペルメトリンによる場合が考えられるため、更なる検討が必要である。また、マウスの妊娠期におけるcis-ペルメトリン曝露が雄性ホルモンへの影響が考えられたことから、雌性ホルモンへの影響についても検討する必要がある。
高病原性インフルエンザの治療研究における新戦略と基礎的アプローチ

様々な宿主をもつインフルエンザウイルスはそれぞれの宿主の体温に適応せねばならない。インフルエンザウイルスのPB2サブユニットが温度適応に関与していることが知られているがPAサブユニットについては知られていない。そこで細胞内レプリコン系を用いて、インフルエンザウイルスのvRNA、cRNA、mRNAの合成をそれぞれ、様々な温度環境の下で測定した。その結果、温度適応に対するPAサブユニットの重要性が示され、特にPAサブユニット上の114番目のアミノ酸の重要性が示唆された。これらの発見により、インフルエンザウイルスの温度適応には、PB2やPAの遺伝子再集合が関与しており、遺伝子の入れ換えによって温度に適応していることが示唆された。この様にインフルエンザウイルスの特性を基礎的な視点から突き詰める事により、新しい薬剤開発、治療方法の正しい道筋を探ることができた。2009年に我々が経験した新型インフルエンザウイルスのパンデミックにより、経済、社会に大きな打撃を与えたことは記憶に新しい。今後も、同様のパンデミックが起こることは容易に想像ができる。また、高病原性であった場合にはその影響は計り知れない。そこで、本研究では、高病原性のインフルエンザウイルスの毒性に関する知識を深めるために、インフルエンザウイルスの温度への適応に注目した研究を行った。インフルエンザウイルスはトリとヒト以外にも様々な動物に感染する人獣共通感染症であり、様々な亜型が存在する。これら宿主の体温は大きく異なり、また同亜型内には様々な毒性の違いがある。高病原性インフルエンザウイルスに至ってはヒトに対する致死率が50%を超える。そこで、これら病原性に関わる因子として、インフルエンザウイルスの持つ遺伝子複製酵素の温度特性に注目した。現在までに、H1N1、H3N2、H5N1、及び新型H1N1の遺伝子複製酵素をクローニングし、それぞれの酵素活性を細胞内転写・複製系を用いて、34°C、37°C、42°Cで比較した。結果、それぞれの株で転写及び遺伝子複製の温度特性が全く異なることを見出した。また、その温度特性に関わる因子として、遺伝子複製酵素の構成蛋白質のひとつが非常に重要な働きをしていることを突き止めた。さらに研究を詳細に進めるため、重要な蛋白質に遺伝子変異を導入し、責任アミノ酸の同定を行った。この部位は今までに報告されていない全く新しい部位であるが、遺伝子複製において、鋳型遺伝子の転写開始位置への結合に非常に重要な部位に近いことがわかった。現在は、細胞内の転写・複製系だけでなく、試験管内の転写・複製系も用いてメカニズムをさらに詳細に追及しており、結果をまとめ国際学術雑誌及び国際学会への報告の準備を行っている。またこの結果から新規治療法への応用を検討している。この亜種の多様性により、インフルエンザウイルスは広範囲な宿主域を持つと考えられる。新規亜種の誕生には、遺伝子分節の入れ換えが関与しており、この入れ換えにより、宿主因子への適応、温度への適応を変化させていると我々は考えている。トリとヒトでは体温が大きく異なり、特に温度への適応が重要な因子となる。そこで、本研究では、インフルエンザウイルスが独自に持つ酵素である遺伝子複製酵素に注目し、温度への適応のメカニズムを探っている。遺伝子複製酵素は、三種類のたんぱく質から構成されており、この三種類のたんぱく質の入れ換えにより、酵素活性の特性が変わる事を以前までに報告し、また、今回、温度への適応についても、この三種類のたんぱく質の入れ換え、特にPAサブユニットと呼ばれるたんぱく質の重要性を報告した。現在は、温度適応への詳細なメカニズムについて、PAサブユニットを中心として研究継続している。インフルエンザウイルスは様々な動物に感染する人獣共通感染症であり、多数の亜型が存在する。この亜種の多様性により、インブルエンザウイルスは広範囲な宿主域を持つと考えられる。新型インフルエンザウイルスの発生には、遺伝子分節の入れ換えによる亜型の変化が関与しており、この入れ換えにより、宿主因子への適応、温度への適応を変化させている。これまでに、宿主への適応について、インフルエンザウイルスの持つ遺伝子複製酵素が関わる事が示唆されている。また、温度適応に関しても同様に遺伝子複製酵素が関わっており、これにより、体温が大きく異なるトリとヒトにそれぞれ適当していると考えられる。このように宿主や温度への適応はインフルエンザが効率よく増殖するための重要な因子となる。そこで、本研究では、インフルエンザウイルスが独自に持つ酵素である遺伝子複製酵素に注目し、温度変化に対する適応のメカニズムを細胞内レプリコン系、および試験管内実験系を用いて探った。遺伝子複製酵素は、3種類のたんぱく質から構成されており、それぞれのタンパク質は異なる遺伝子分節によりコードされている。

本研究において、この3種類のタンパク質の入れ換えにより、酵素活性の特性が変わる事を見出した、また、温度への適応についても、この3種類のたんぱく質の入れ換え(特にPAサブユニットと呼ばれるタンパク質)の重要性を報告した。またこの研究過程において、PB2およびPAサブユニットの特定の組み合わせにより、遺伝子複製酵素の活性が完全に喪失することを見出し報告した。現在は、この遺伝子複製酵素の活性喪失のメカニズムをさらに探究し、遺伝子複製酵素に対する阻害薬としての応用を試みている。