hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機分子触媒/遷移金属錯体触媒の融合化に基づく協奏触媒系の構築による高度分子変換

本研究は、これまで申請者が携わってきた、「有機分子触媒」に「遷移金属錯体触媒」二つの触媒を融合した協奏触媒系を開拓することによって従来法では困難であった革新的な分子変換を実現するとともに、効率と選択性に優れた光学活性化合物の供給法を確立することを目的とした。検討の結果、遷移金属触媒と有機分子触媒を組み合わせたリレー触媒系の確立によって新たな触媒反応系の開発に成功した。環境への負荷軽減を目的とした有機変換反応の高効率化と高選択性を実現する上で、機能性を高めた新規触媒の設計開発は益々重要となってきている。この解決を図るアプローチとして、有機分子触媒による不斉合成反応が挙げられる。有機分子触媒は、(i)取り扱いが容易、(ii)回収再使用が可能、(iii)温和な反応条件、などといった多くの利点から、2000年前後から急速に発展してきた研究分野である。しかしながら、有機分子触媒の適用範囲は、これまでの有機合成化学で確立された変換反応の域を出るものではなく、多くは従来法に代わる環境調和型分子変換といった価値観から開発研究が進められてきた。一方、遷移金属錯体を触媒とする分子変換は、多段階の変換反応を一挙に短縮する、あるいは新たな結合形成を可能にすることで、現在の有機合成化学の発展に大きく貢献してきた。本研究は、申請者が開発したキラルリン酸触媒に、遷移金属錯体触媒の得意とする化学結合の触媒的な活性化を組み合わせ、双方の触媒が有する優れた機能を融合するという斬新な発想のもと、環境への負荷軽減を図る高効率的かつ高選択的な高度分子変換反応を実現することを目的としている。本研究では、二成分触媒の一つに有機分子触媒、特に申請者らが独自に開発したキラルリン酸触媒を取り上げ、これに遷移金属触媒を組み合わせたリレー触媒系の開発を目指している。このリレー触媒系の構築により二つの触媒系を融合したワンポット触媒反応を開発することが最大の特徴である。本年度は特に金属錯体触媒により不安定活性中間体となるカルボニルイリドの生成、引き続く不斉リン酸触媒による不斉還元によりイソクマリン誘導体の不斉合成を行った。その結果、高いエナンチオ選択性で生成部を得ることに成功し、しかも、不斉金属錯体による不斉発現はまったく観測されず、キラルリン酸触媒の添加が必須であることを明らかにした。その結果、高いエナンチオ選択性で生成部を得ることに成功し、しかも、不斉金属錯体による不斉の発現はこの反応系ではできず、不斉リン酸触媒の添加が必須であることを明らかにした。有機分子触媒と金属錯体触媒による二成分触媒系の開発では、多種多様な組み合わせが可能である。組み合わせの可能性を探るためには広範な文献調査と多くの実験が必要であるが、震災の影響により、初期スクリーニングを思うように進めることができなかった。その結果、平成23年度は金属錯体触媒によるカルボニルイリドの生成と引き続く不斉リン酸触媒による不斉還元反応の開発のみにとどまってしまった。23年度末より始まった震災からの復旧が順調に進めば、当初の計画通り、金属錯体触媒ならびに不斉リン酸触媒、双方の特徴を最大限に生かしたワンポットリレー触媒系の開発を進めることができると考えている。

有機分子触媒と金属錯体触媒による二成分触媒系の組み合わせの可能性を探ることを最優先に、金属ヒドリド錯体を用いた炭素炭素二重結合の異性化などを起点としたリレー触媒系の開発研究をさらに推し進める。また、金属錯体触媒による環化を起点とした変換反応は活性中間体を生じる魅力的な反応系である。この金属錯体触媒による環化反応と不斉リン酸触媒を組み合わせたリレー触媒系の開発研究を新たに展開したいと考えている。平成23年度十分に検討することができなかった多種多様な組み合わせの探索についても、平成24年度に改めて実施することで、今後の開発研究が当初の計画通りになるまで復旧できるように努めたい。引き続き、有機分子触媒/金属錯体触媒による二成分触媒系の開発を検討する。この開発には、有機合成用の試薬、溶媒、測定溶媒などを必要とするため、研究費は主にこれらの消耗品に充てる予定である。
超臨界二酸化炭素を用いた噴霧晶析法による高性能有機薄膜創製と薄膜自由設計への展開

超臨界二酸化炭素利用の噴霧晶析法により得られるTIPSペンタセン薄膜の結晶粒特性に及ぼす操作因子(1基板表面状態[自己組織化単分子膜(ヘキサメチルジシラザン,オクチルトリクロロシラン,オクタデシルトリクロロシランおよびフェネチルトリクロロシラン)による基板表面処理],2基板傾斜角度,3基板温度,4噴射ノズルの種類)の影響を系統的に調査した。その結果,第一に,基板表面処理により基板の表面自由エネルギー(基板表面の安定性)が変化し,薄膜の成長機構が変化することを明らかにした。これにより,薄膜を構成している結晶粒の形態が異なることを見いだした。第二に,基板傾斜角度を増加させることにより,堆積粒子の減少と結晶粒の基板水平方向への成長促進が生じることで薄膜の均一性と結晶性が向上することを示した。第三に,基板上の結晶成長単位の運動エネルギー増加に寄与する基板温度上昇ならびに基板の表面自由エネルギーを低下させる表面処理(溶質ー基板間相互作用の低下)により表面集積過程を促進させることで,結晶粒サイズが減少し,有機薄膜トランジスタのキャリア移動度が低下することを示した。これは,表面集積過程の促進が,基板水平方向の結晶成長よりも,結晶と基板表面に到達した結晶成長単位の再揮発を促進したことが原因であることを明らかにした。最後に,膨張ノズルとしてオリフィス型ノズルを採用することにより,堆積粒子の低減と時間あたりの薄膜の膜厚増加・薄膜の基板水平方向の結晶性向上が可能であることを見いだした。さらに,我々が開発した紫外可視分光光度計を利用した飽和溶解圧力探索法により温度353.2及び373.2 K,圧力1825 MPaの超臨界二酸化炭素に対するTIPSペンタセンの高精度な溶解度を蓄積した。さらに,半経験式であるChrastil式により得られた溶解度の良好な計算が可能であることを示した。平成30年度は,以下の二つの項目を検討したことから,それぞれの現在までの進捗状況を評価する。(1)本技術による有機製膜に及ぼす種々の操作因子の影響の解明平成30年度は,超臨界二酸化炭素利用の噴霧晶析法により得られるTIPSペンタセン薄膜の結晶粒の粒径・形態・結晶構造・分子配向性に及ぼす操作因子(1基板表面状態,2溶質溶解温度,3溶質溶解圧力,4噴射距離,5噴射時間,6基板温度)の影響を系統的に調査し,本技術による有機薄膜機構の解明に繋がる基礎データの蓄積を行い,薄膜設計の指針を明らかにする計画であった。しかしながら,前年度のテトラセン製膜の結果から,1基板表面状態と6基板温度以外の操作因子が製膜に及ぼす影響が小さいことが判明したことから,本年度は1と6以外の操作因子の影響は検討しなかった。その代わりに,予備検討により製膜に対して大きな影響を及ぼす可能性が示された7基板傾斜角度と8噴射ノズルの種類を新たな操作因子に追加し,その影響を明らかにした。つまり,前年度の結果に基づくことにより,本手法による薄膜創製に及ぼす影響について研究計画以上に進捗し,本技術による高性能な有機薄膜設計への指針が得られた。(2)超臨界二酸化炭素に対する有機半導体材料の溶解度の測定とモデル開発平成29年度は,我々が開発した「紫外可視分光光度計を利用した飽和溶解圧力探索法」により温度353.2及び373.2 K,圧力1523 MPaの超臨界二酸化炭素に対するテトラセンの高精度な溶解度の測定が可能であったことより,研究計画通りの進捗であると評価できる。さらに,研究計画通りに,半経験式であるChrastil式およびPredictive SRK状態方程式に基づく熱力学モデルより得られた溶解度の相関を試み,これらのモデルの溶解度計算への有用性を示したことから,研究計画通りの進捗であると評価できる。(1)本技術による有機製膜に及ぼす種々の操作因子の影響の解明次年度は,超臨界二酸化炭素利用の噴霧晶析法により得られる有機薄膜の結晶粒の粒径・形態・結晶構造・分子配向性に及ぼす操作因子(1基板表面状態[自己組織化単分子膜による基板表面処理],2基板傾斜角度,3基板温度,5噴射ノズルの種類)の影響を系統的に調査し,本技術による有機薄膜機構の解明に繋がる基礎データの蓄積を行い,薄膜設計の指針を明らかにする。さらに,本技術の実用化に向けた製膜装置・プロセスの検討として,基板をxy方向に動かすことにより大面積の有機半導体薄膜が可能となる装置の製作を行い,製膜を試みる。有機半導体材料としてTIPSペンタセンに加えて,溶液塗布法で作製された有機薄膜トランジスタにおいて高いキャリア移動度が報告されている2-デシル-7-フェニル[1]ベンゾチエノ[3,2-b][1]ベンゾチオフェン(Ph-BTBT-10)を新たな有機半導体材料として用いる。基板は,SiO2/Siウェハを用いる。基板は,種々のSAM処理により表面エネルギーや有機半導体材料との親和性を変化させ,薄膜創製に及ぼすSAM処理(基板表面状態)の影響を検討する。(2)超臨界二酸化炭素に対する有機半導体材料の溶解度の測定とモデル開発本年度は,種々の温度・圧力の超臨界二酸化炭素に対するPh-BTBT-10の溶解度を蓄積する。測定手法としては,我々が開発した「紫外可視分光光度計を利用した飽和溶解圧力探索法」を用いる。測定条件は,温度308.2408.2 K,圧力1025 MPaの範囲とする。

さらに,状態方程式,溶液論,経験式に量子化学を加味した熱力学モデルにより得られた溶解度の相関を試みる。超臨界二酸化炭素利用の噴霧晶析法により得られるテトラセン薄膜の結晶粒特性に及ぼす操作因子(1基板表面状態[自己組織化単分子膜(SAM)(ヘキサメチルジシラザン,オクチルトリクロロシラン,オクタデシルトリクロロシランおよびフェネチルトリクロロシラン)],2噴射距離,3噴射時間,4基板温度)の影響を調査した。その結果,表面処理により薄膜トランジスタのキャリア移動度が向上した。これは,表面処理により基板の自由エネルギーが低下(基板表面の平滑化)し,基板表面上での分子の表面拡散が促進され緻密な薄膜を形成したためである。つまり,テトラセン薄膜創製に対して,基板表面処理は非常に有効であることが示された。また,噴射距離の増加に伴い,島状から樹枝状へ結晶粒の形態が変化した。これは,噴射距離の増大に伴う溶体濃度の低下による物質移動過程の減少により説明できる。次に,基板温度の増加に伴い,基板上の結晶粒密度の減少,結晶粒サイズの増大及び結晶粒形態が島状から樹枝状への変化が生じた。噴射時間の変化により得られた結晶粒の成長速度及び噴射距離と基板温度を変化させた結果を晶析工学の観点から解析を行ったところ,噴射距離と基板温度は結晶粒成長の成長機構(律速段階)に影響を与えることが判明し,緻密かつ結晶粒界の少ない良好薄膜を創製する最適値(閾値)が存在ことわかった。つまり,SAM処理した基板に対して,本研究で明らかになった基板温度と噴射距離の最適値を用いることにより良好な製膜が可能となる指針が得られた。さらに,我々が開発した「紫外可視分光光度計を利用した飽和溶解圧力探索法」により温度353.2及び373.2 K,圧力1523 MPaの超臨界二酸化炭素に対するテトラセンの高精度な溶解度を蓄積した。さらに,半経験式であるChrastil式およびPredictive SRK状態方程式に基づく熱力学モデルより得られた溶解度の良好な計算が可能であることを示した。平成29年度は,以下の二つの項目を検討したことから,それぞれの現在までの進捗状況を評価する。(1)本技術による有機製膜に及ぼす種々の操作因子の影響の解明平成29年度は,超臨界二酸化炭素利用の噴霧晶析法により得られるテトラセン薄膜の結晶粒の粒径・形態・結晶構造・分子配向性に及ぼす操作因子(1基板表面状態[自己組織化単分子膜(SAM)(ヘキサメチルジシラザン,オクチルトリクロロシラン,オクタデシルトリクロロシランおよびフェネチルトリクロロシラン)による基板表面処理],2溶質溶解温度,3溶質溶解圧力,4噴射距離,5噴射時間,6基板温度)の影響を系統的に調査し,本技術による有機薄膜機構の解明に繋がる基礎データの蓄積を行い,薄膜設計の指針を明らかにする計画であった。その結果として,1基板表面状態,4噴射距離,5噴射時間,6基板温度が薄膜創製に及ぼす影響については研究計画通りに進捗し,本技術による有機薄膜設計への指針が得られたが,2溶質溶解温度,3溶質溶解圧力の影響について検討を行うことができなかったため,次年度に早急に実施する必要がある。(2)超臨界二酸化炭素に対する有機半導体材料の溶解度の測定とモデル開発
一軸性延伸法の開発とその有機導体研究への適用

試料の形状に囚われずに、有機導体のような柔らかい結晶に一軸的な延伸を印加するための方法の開発及び有機物に対する適用を行った。昨年度の研究により提案した方法で試料に延伸を印加することが可能なことが判明したため、今年度は昨年度に得られた結果の外部公表(論文投稿)、延伸印加下における構造解析実験の開発及び適用物質の拡充を重点的に遂行した。I)延伸印加下における構造解析実験低温X線構造解析装置に取り付け可能な構造解析可能な一軸延伸ホルダーの製作を行った。試料に対する見込み角は150度ほど取ることが出来た。昨年度の予備測定において物性変化が見出されたTMTSF系の試料に対して、一軸延伸下における構造解析を試みた。延伸印加前はブラッグスポットが観測されていたのにもかかわらず、延伸下においてはこれが消えることが判明した。これは試料中に乱れが生じていると考えられ、この系において、構造と物性の関係を調べることが難しいことが示唆された。II)適用物質の拡充他の有望な物質系としてβ"型分子配列を持つ有機導体を選択した。実験を遂行する前に、基底状態が不明だったβ"-(BEDT-TTF)2CsCd(SCN)4のそれを調べた結果、電荷密度相であることを明らかにした。延伸実験は現在遂行中である。最後に、本研究で作成した低温における延伸を印加する試料ホルダーを使用して、"有機超伝導体を用いた超伝導接合の作成"の実験を遂行したことを付記しておく。試料の形状に囚われずに、有機導体のような柔らかい結晶に一軸的な引っ張り(延伸)を印加するための方法の開発を行った。今年度は、I)考案した方法で実際に引っ張れるのか、引っ張れるとしたらどの程度の延伸を印加できるのか、II)低温に下げたときにどのような問題・効果が現れるのか、III)どのような試料に対して一軸延伸法の効果が大きいのか、の3点に関して研究を行った。I)に関しては、室温において1%以上の延伸を印加できることが判明した。また、エポキシロッドの表面に張ったひずみゲージと中に入れた場合の比較により、ひずみゲージの使用法によるゲージ率の変化に関する情報も得る事ができた。II)に関しては、エポキシロッドとその周りのステンレスリングの熱収縮の量の違いから、室温から低温に下げると、自然に引っ張りが印加されてしまうことが判明した。また、低温において、引っ張りを加えた場合、エポキシロッドの硬化によって印加できる引っ張り量が小さくなることも見出された。III)に関しては、NbSe_3および擬一次元超伝導体TMTSF_2X(X=PF_6,CIO_4)に対してこの方法を適用し、NbSe_3については先行研究と同様な結果を得ると共に、これまで引っ張れなかった方向に延伸を印加した場合の物性変化に関する情報も得ることができた。TMTSF_2Xに関しては、分子の一次元鎖に平行と垂直方向に引っ張りを加え、平行では物性の変化は小さいが、垂直方向に印加した場合には絶縁体的な振る舞いが誘起されることを見出した。これに関しては、もう少し多種の試料を試す必要があると考えられ、次年度も探索を続ける予定である。
アナログフロントエンドに着目したIoT指向エッジコンピューティング教育基盤の創生

本研究は「自然界のデータを受信・増幅・処理するAFE技術に着目した実践的教育基盤の創生」を目的としている。具体的には(1:開発)ミニマルファブを活用した実践教育特化型AFEエッジデバイスの開発(2:教育)主要AFE技術(増幅回路とフィルタ回路etc.)のe-learningシステム構築(3:実証)IoT指向エッジコンピューティング教育基盤の創生と社会実装手法の提案までを行う。本年度の実績は、ミニマルファブを活用するためのツールの試用、アナログフロントエンド教育のための教材開発およびコンテンツマネジメントシステムの仕様策定である。実績の概要としては、教育効果・産学連携の2つが主である。1つ目は、東北でのIoT実験実証を通じて、エッジデバイスの必要性とシステムの堅牢性を確認するための<情報系>実践的システム設計等(プログラム開発等)が可能になったことに加えて、<電子系>であるセンサを含むLSIレベルまで意識できる教育に遷移できたことにより、学習者の伸びしろが大きくなったことである。2つ目はその過程で、産学連携等のコラボレーションが生まれ、自分たちが開発するシステムの社会実装まで目を向けれるようになってきたことである。「実践的教育」という幹に「システム開発・保守運用」「産学連携」を枝として据えることによって、STEM的能力・社会人基礎力(人間力)向上のプラットフォームの構築への道筋ができたことが本年度の成果である。学外発表は9件行っており受賞者も輩出することができた。現在、LSI設計ツールはデファクトスタンダードなものから国産のもの、そして、フリーで使えるものまで沢山存在する。ミニマルファブを活用するためには、利用のための敷居を低くする必要がある。そのため、今回は、演算増幅器や簡単なマイクロプロセッサを題材として、学生にツールに触れてもらい、その難易度を調査し概ね想定通りのフィードバックを得ることができた。その過程で、動画等を利用した教育教材の作成を行い、統合教育環境として、CMS(Contents Management System)のような仕組みを作ることが必須であるという考えに至った。LSI試作に関しては、ミニマルファブではなく通常のファブを利用し、おおむね順調に実施することができた。本研究では「アナログ」というキーワードに着目し、「データ受信」「増幅」「処理」を意識できる人材育成を目指しており、本年度は、企業と連携して、センサから処理までを学ぶことができる教材の開発に至った。今後は、現在作成した教材の利用効果を含め、実践的教育基盤の創生に向けて検討を行っていく。研究進捗や計画に大きな変更は無く、課題としてはミニマルファブでの試作との協調が考えられる。ミニマルファブはまだ一般的ではないが、少しずつその重要性は高まってきている。安定期を待って教育基盤を作るのではなく、黎明期から未来を予測して仕組みを作ることが重要だと考えている。研究実績の概要にも示した(1:開発)(2:教育)(3:実証)をバランスよく行い、研究期間全体を通じて、研究テーマ名にも記しているIoT・AFE・エッジコンピューティングを意識した教育を実施していく予定である。

今後は、現在作成した教材の利用効果を含め、実践的教育基盤の創生に向けて検討を行っていく。研究進捗や計画に大きな変更は無く、課題としてはミニマルファブでの試作との協調が考えられる。ミニマルファブはまだ一般的ではないが、少しずつその重要性は高まってきている。安定期を待って教育基盤を作るのではなく、黎明期から未来を予測して仕組みを作ることが重要だと考えている。研究実績の概要にも示した(1:開発)(2:教育)(3:実証)をバランスよく行い、研究期間全体を通じて、研究テーマ名にも記しているIoT・AFE・エッジコンピューティングを意識した教育を実施していく予定である。AFEから得た情報を処理するためのIoTの運用コスト(開発・保守)が大きくなった。ミニマルファブの活用に関しては申請書に書いた通り、立上り段階であるため、実際の学生による試作は次年度に持ち越すことにした。我々の取組は「実践的教育基盤の創生」がテーマであるため、時代のニーズや変遷に伴って、フィールド実験や試作を柔軟に行っていく必要があり、研究期間を通じた研究費の柔軟な運用が可能であることに感謝している。
頭頸部癌における新規治療ターゲット CIN85の機能解析

今回の研究では頭頸部扁平上皮癌細胞株では、CIN85が増殖能以外に浸潤能にも正に相関していることを示した。EMT関連遺伝子には有意な変化を証明できなかった。頭頸部扁平上皮癌細胞株のマイクロアレイおよびウエスタンブロッティング実験結果から、PI3K/Akt経路の関与が新たに示すことができた。CIN85はアダプター遺伝子であり、その接合分子は多岐にわたる。多用な経路をたどり、表現型に寄与していると考えられる。今回の研究結果から、CIN85は頭頸部扁平上皮癌においてMAPK経路以外にPI3K/Akt経路も介して腫瘍増勢、進展に寄与していることが考えられた。Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)は頭頸部扁平上皮癌で高頻度に発現し、EGFR signalingが発癌、増殖、浸潤、転移といった癌の進展に大きく関与することは臨床検体による研究および分子生物学的基礎研究により示されている。EGFRに対する分子標的薬(cetsuximabなど)の治療効果は限定的である。その原因として、EGFRシグナル下流での恒常的シグナル伝達などが一因と考えられる。今回の研究では、レセプターの内在化とシグナルの両方を統合しうるアダプター蛋白c-Cbl-Interacting Protein of 85 kDa (CIN85)に着目した。CIN85は様々な細胞に発現し、上流シグナルを統合し下流分子につなぎ機能発現をおこなう。CIN85の特徴的な機能のひとつのEGFRを含むreceptor tyrosine kinases(RTKs)のリガンド結合後の内在化を促進する機能により、内在化後のEGFR分解を促進する腫瘍増勢に負に寄与する因子と考えられてきた。申請者は、CIN85発現量と臨床パラメーターの関係性の解析を行い、進行病期の頭頸部癌組織ではCIN85が高発現していることを見いだし、ヒトの癌においてCIN85発現量と腫瘍進展に関係性がある初めての証拠を示した。頭頸部癌細胞株の実験において、CIN85はTGF-α刺激によるRas活性化およびその下流分子であるc-Raf,MEK,ERKの活性化を促進し、頭頸部癌の持続増殖に必須なc-Mycの発現量を増加、細胞増殖を促進させることを示した。最近の報告では乳がんにおいてCIN85はPI3-Akt経路を通じて腫瘍浸潤能を高めたとの知見が得られた。頭頸部癌にいてもCIN85の高発現が腫瘍浸潤能を高めることを証明しており、分子生物学的機序の解析を進めている。EGFRに対する分子標的薬(ce tsuximabなど)の治療効果は限定的である。頭頸部癌細胞株の実験において、CIN85はTGF-α刺激によるRas活性化およびその下流分子であるc-Raf,MEK,ERKの活性化を促進し、頭頸部癌の持続増殖に必須なc-Mycの発現量を増加、細胞増殖に正に相関することを示した。最近の報告では乳がんにおいてCIN85はPI3- Akt経路を通じて腫瘍浸潤能を高めたとの知見が得られた。

申請者は、CIN85発現量と臨床パラメーターの関係性の解析を行い、進行病期の頭頸部癌組織ではCIN85が高発現していることを見いだし、ヒトの癌においてCIN85発現量と腫瘍進展に関係性がある初めての証拠を示した。頭頸部癌細胞株の実験において、CIN85はTGF-α刺激によるRas活性化およびその下流分子であるc-Raf,MEK,ERKの活性化を促進し、頭頸部癌の持続増殖に必須なc-Mycの発現量を増加、細胞増殖を促進させることを示した。今回の研究でCIN85ノックダウン細胞株を用いて網羅的発言解析を行った。腫瘍進展の分子生物学的機能解析を進めた。後日、最終報告する。今回の研究では頭頸部扁平上皮癌細胞株では、CIN85が増殖能以外に浸潤能にも正に相関していることを示した。EMT関連遺伝子には有意な変化を証明できなかった。頭頸部扁平上皮癌細胞株のマイクロアレイおよびウエスタンブロッティング実験結果から、PI3K/Akt経路の関与が新たに示すことができた。CIN85はアダプター遺伝子であり、その接合分子は多岐にわたる。多用な経路をたどり、表現型に寄与していると考えられる。今回の研究結果から、CIN85は頭頸部扁平上皮癌においてMAPK経路以外にPI3K/Akt経路も介して腫瘍増勢、進展に寄与していることが考えられた。平成26年度6月に九州がんセンターに異動し、主な実験が移動先で行うこととなりました。したがって、実験の体制準備に時間を要しました。既に細胞実験は再開しており、解析を進めております。異動先において臨床検体に関する倫理委員会の承認を得た段階であり、病理科に協力を仰いでタンパク発現解析を進めつつあります。異動先での実験体制は整いつつある。九州大学施設の協力も仰ぎながら実験を行う。マイクロアレイに関しては外部の研究機関を積極的に利用する。一般臨床も行っており安定した研究時間の確保が難しかったことから、細胞培養などの実験は困難でした。予算が希望額よりも減額されており、初年度にマイクロアレイ実験予算を組むのが難しかった。基金されていることから26年度予算を合わせて実験を行う予定です。また、免疫染色の条件設定に時間がかかっていることも実験が遅れている理由です。交付していただいた金額の問題や申請者の実験時間の確保が十分に行えなかったことから、初年度に予定していたマイクロアレイ実験(網羅的遺伝子発現解析)は行っておらず、翌年度予算と合わせて行う方針としたために次年度使用額が生じました。6月から代表者は所属機関が九州がんセンターに移動し、実験時間を確保できる予定である。移動先にも分子学的実験施設がありそれを利用して実験を行う。必要な部分は外部の研究機関を積極的に利用する。網羅的遺伝子発現解析を行うが、外部委託とした。その後の確証実験にも試薬が必要と考える。具体的にはmRNAレベルでの確認(quantitative RT-PCR)、蛋白レベルでの解析(免疫染色、フローサイトメトリーなど)にも多くの試薬が必要となると思われる。
初期自立論証派中観思想の解明

従来のインド中観思想史は、分派史として理解されてきた。これは、チベット仏教の伝承を無批判に採用したものであった。そこで、初期自立論証派の論師バーヴィヴェーカの思想に注目して、彼の思想とその伝承とを比較研究することを通して両者の矛盾点を指摘し、その実態を正しく理解することを目指した。その結果、バーヴィヴェーカを巡る従来の思想史理解には訂正を要する箇所があることを指摘することができた。平成20年度の研究成果として下記の事項がある。(1)バーヴィヴェーカ著『般若灯論』、及びアヴァローキタヴラタによる複註『般若灯論広註』の第25章に関して、クリティカルエディションの作成と日本語訳の下訳を完成した。(2)バーヴィヴェーカ著『大乗掌珍論』の日本語訳の下訳を完了した。(3)チベット仏教の宗義書文献の中で、ゲルク派に属する学僧クンチョク・ジクメワンポ著『宗義宝環』に関して、仏教諸学派に関する記述の日本語訳の下訳を完了した。以上の研究成果の中で、(1)・(2)は、初期自立論証派中観思想の担い手であるバーヴィヴェーカの思想を知る上で重要な作業である。バーヴィヴェーカは、後代、特にチベットにおいて経量行中観学派の論師として位置づけられているが、この呼称は、彼の認識論的議論を根拠にしている。バーヴィヴェーカの認識論的議論は、瑜伽行学派批判の文脈の中に頻出するため、彼の思想を経量行中観学派という呼称を手がかりにして考察する場合、(1)・(2)の成果は本研究の基盤になるものであると言える。(3)は、先に述べた「経量行中観学派」という呼称が意味する内容を具体的に知る上で重要な作業である。インドとチベットという空間的距離や、バーヴィヴェーカと、後のチベット仏教隆盛期という時間的距離を鑑みれば、チベット仏教に伝えられる解釈をそのままバーヴィヴェーカの思想研究に導入することは困難である。そのため、(3)によってインドとチベットでの文脈の差異を明確化することができたと考えている。本研究の意義は、従来、チベットや東アジアの伝承に基づいて理解されてきたインド思想史の研究方法に対して、研究対象とする思想と、それに対する伝承とを批判的に比較研究することによって両者の間の差異を明確化し、インド思想史の実態を明らかにするための方法論を構築することにある。そのために、平成21年度の研究目的として、平成20年度に作成したバーヴィヴェーカ著『般若灯論』およびアヴァローキタヴラタによる復註『般若灯論広註』の下訳を校正し、出版準備を整えること、そして、この翻訳に基づいた思想研究を実施することを掲げた。前者は、平成22年度に学位請求論文という形で公開する予定になっている。後者に関しては、二つの視点を導入して研究を実施した。第一番目の視点は、バーヴィヴェーカによる瑜伽行学説批判の内容を考察することを通して、彼の思想的特徴を認識論的な観点から明らかにしようとするものである。第二番目の視点は、バーヴィヴェーカに関するチベットや東アジアの伝承を整理し、これを第一番目の視点に基づいた研究と比較研究することによって、バーヴィヴェーカの思想とその伝承との差異を明確にしようとするものである。その成果は、『仏教学セミナー』第91号、および『印度哲学仏教学』第25号に掲載される予定である。本研究の重要性は、従来の中観思想史が、帰謬論証派中観思想を中心に構築されてきたのに対して、これを自立論証派(自立派)中観思想の展開史として位置づけようとした点にある。その時、自立派の中でも瑜伽行中観学派に対する研究は一定の成果を上げているが、初期自立派として位置づけられるバーヴィヴェーカの思想研究が「帰謬派による批判対象」という極めて偏った問題関心に基づいて成されてきたことに注意し、認識論という枠組みの中で、バーヴィヴェーカの思想的独自性と、その後代への影響の内容を明らかにしようとした点も重要であると言えよう。
DNAメチル化を指標としたinvivo短期発癌性指標遺伝子の網羅的検索

最終年度である今年度は,マウスCpGアイランド・ライブラリーから単離した994クローンを用いてマイクロアレイを作製し,代表的な非遺伝子傷害性肝発がん物質であるphenobarbital(PB;50ppm,500ppm混餌),遺伝子傷害性肝発がん物質であるdiethylnitrosamine(DEN;10ppm飲水),非発がん性の肝毒性物質であるacetaminophen(APAP;10,O00ppm混餌)を最高28日間まで投与したマウスの肝臓について,メチレーションの網羅的解析を行った。即ち,抽出した肝臓ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素処理し,非切断断片をメチル化DNAとして特異的に増幅して蛍光標識し,マイクロアレイとのハイブリダイゼーションを行った。無処置対照とのシグナル差を1.2倍で区別すると,PB, DENのそれぞれでメチル化状態の増加したCpGアイランドが多数検出されたが,DENはPBよりメチル化・脱メチル化のpotencyが低かった。APAPでは,メチル化状態の変化したクローンは殆どなかった。このことから,28日間投与であっても作用機構の異なる肝発がん物質間や肝毒性物質でメチル化プロファイルのパターンに差のあることが示唆された。本結果を更に検証するために,マイクロアレイで無処置対照とPB投与群との間でメチル化の程度に差が見出された一つのCpG領域につき,bisulfite sequencing法によりその頻度を解析したところ,アレイデータを支持する結果が得られた。以上より,今回我々が作製したカスタムCpGアイランド・マイクロアレイはゲノムDNAメチル化の検索に十分有効なツールとなり得ることが示唆され,今後より大規模なマイクロアレイの構築により,発がん物質に特徴的なメチル化プロファイルのパターンの特定が期待される。今年度は,CpGアイランド・マイクロアレイ作製のためのcDNA調製を中心に研究を進めた。購入したマウスCpGアイランド・ライブラリーから1002クローンの単離を終了し,それぞれのフラグメントをPCR法によって増幅した。次いで,クローン当たり300μlのPCR産物について限外ろ過膜による精製とDNA定量を行い,アレイにスポットするcDNAサンプルとした。アレイヤーはインクジェット方式のものを用い,日本ガイシ株式会社に作製を依頼した。ラベリングとハイブリダイゼーションの陽性及び陰性対照をアレイに網羅するため,陽性対照としてmouseのハウスキーピング遺伝子であるcyclophilin E,β-actin,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)のgenomic DNA配列,陰性対照としてBacillus subtilisのphenylalaninebiosynthesis associated protein(PheB), diaminopimerate decarboxylase(LysA), dehydrodipicolinate reductase(DapB)の部分配列のクローニングを終了し,同様の精製を行った。現在,各クローンの塩基配列決定のためダイデオキシ法でシークエンス解析を進め,約200クローンの配列解析を終了している。
悪性黒色腫のmatrix metalloproteinase 産生能と基底膜湿潤能

我々は,悪性黒色腫組織(in vivo)において黒色腫細胞表面,細胞質内にMMP-2が発現されていることを免疫組織化学的に確認した。今回染色した症例ではMMP-9の発現が確認できなかった。悪性黒色腫組織35例(原発巣15例、転移巣20例)の染色を行ったが陽性の症例は4例(原発巣1例、転移巣3例)のみであった。陽性の症例でも腫瘍巣は均一な染色ではなく、部分的に陽性所見が得られたのみであった。悪性黒色腫組織において細胞接着分子の発現とMMPの産生に関して原発巣における腫瘍細胞の深達度、転移巣における発現程度と患者の予後,治療効果の関連性の統計的な検討を行ったが、有意な所見は得られなかった。より症例数を増やしての検討が必要と考えられた。培養悪性黒色腫細胞(in vitro)におけるMMPの産生能力と細胞接着分子の発現を調べ、腫瘍-基底膜の接着、基底膜湿潤能に与える影響を検討した。基底膜湿潤能力との関連性をトランスウエルチャンバーを利用したinvasion assayを行い検討した。ELISAを用いた検討では培養黒色腫細胞におけるMMPの発現は確認できなかった。またinvasion assayにおいて各MMPに対する抗体を添加しても湿潤能力には影響しなかった。コラーゲンなどの細胞外基質に対する腫瘍の接着に関しても検討したが、各MMP抗体は影響せず、主にインテグリン抗体による抑制効果が強かった。湿潤に対するより有効な実験モデルを検討する必要がある。
細胞性粘菌由来の抗腫瘍因子DIFのレセプターの同定及び新規DIFアナログの開発

1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-1-hexanone(DIF-1)は細胞性粘菌D. discoidedeumの柄細胞分化誘導因子である。DIF-1は哺乳動物細胞に対して増殖抑制、分化誘導などの生理的作用を有する。この作用が起こる早い時期に細胞内カルシウムの上昇することが知られている。今回の研究では先ず、カルシウムイオンとの関連からDIF-1のレセプターの一つと考えられるカルシニューリン(CaN)に注目して、CaNへのDIFアナログの作用を解析した。DIF-1とDIF-2は低濃度(10-30nM)では直接カルシニューリンを活性化した。また高濃度(10-30μM)では阻害することを見いだした。またヒト白血病細胞K562細胞Akt/protein kinase Bの活性をDIF-1処理後を追跡したところ、30分から6時間にわたって経時的な活性化が見られた。そしてこの活性化には細胞内カルシウム濃度の増加が必要であった。インシュリンを分泌するinsulinoma細胞(INS-1)に対して、DIF-1は用量依存的に細胞死を惹起した。このアポトーシスはDIF-1はcaspase independent apoptosisであることを明らかにした。DIF-1が抗腫瘍作用ばかりでなく、in vitroでinfluenza virus A/PR/8/34の増殖を抑制することを明らかにした。しかし真菌(C. albicans, C. neoformas, A. fumigatus)や細菌(S. aureus, E. coil, P. aeruginosa)には作用しないことを見いだした。1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-1-hexanone(DIF-1)は細胞性粘菌のD.discoideumの柄細胞分化誘導因子であり、細胞内カルシウム濃度を変化させることがその引き金の一つと考えられている。DIF-1は哺乳動物細胞に対しても細胞内カルシウムの上昇、増殖抑制、分化誘導などの生理的作用を及ぼす事が明らかになってきている。本年度の研究では先ずDIF-1のレセプターの一つの候補と考えられるカルシニューリンに対するDIF-1の作用をヒト白血病細胞HL-60を用いて解析した。DIF-1処理後、経時的に細胞を核、ミクロゾーム及び細胞ゾルに分画してカルシニューリンのトランスロケーションの有無を調べた。その結果、処理後30分でカルシニューリンが細胞ゾルからミクロゾーム分画へトランスロケーションすることが明らかとなった。更にDIF-1がイン・ビトロでもカルモジュリン存在下に直接カルシニューリンを活性化することを見いだした。この事実はカルシニューリンがDIF-1のレセプターの可能性を支持しているが、証明には更に実験が必要であると考えている。またヒト白血病細胞K562細胞のAkt/protein kinaseBの活性をDIF-1処理後を追跡したところ、30分から6時間にわたって経時的な活性化が見られた。DIFは細胞性粘菌の柄細胞分化誘導因子として同定された物質であるが、哺乳類腫瘍細胞に対しても、細胞内カルシウムの上昇、増殖抑制、アポトーシス誘導、分化誘導などの多彩の生理機能を及ぼすことが明らかにされている。昨年度は、DIFの直接的な細胞内標的分子について検討し、DIFが細胞内のカルシウム上昇を惹起するとともにカルシニューリンの活性化を起こすことを明らかにしてきた。今年度は、Xenopus laevisの卵母細胞のProgesteron(PG)で誘導されるgerminal vehicle break down(GVBD)に対する効果を解析した結果、DIF-1が10-40μMの濃度でPGで誘導されるGVBDを阻害することが分かった。また、同時にPGで誘導されるMAP kinaseとc-mos mRNA translationの活性化も阻害された。

その理由はDIF-1がPGで誘導されるcAMPの減少のブロックに起因することが判明した。またヒト白血病Jarkat細胞はDIF-3によりアポトーシス誘導されるが、それを詳細に検討した結果DIF-3はJac/Statシグナル伝達系を活性化することを見いだした。DIF-3処理は細胞質のJac1とTyk2の一過性発現増大を惹起した。またStat1の発現を増大をし、その核への移行は阻害したが、ISGF3とIRF2は全く変化しなかった。これらの結果はDIFがJarkat細胞のJac/Statシグナル伝達系を構成する初期反応を活性化するとともに、Stat分子の動態に顕著な影響を及ぼすことを示している。細菌、真菌、ウイルス:DIF-1が抗腫瘍作用ばかりでなく、in vitroでinfluenza virus A/PR/8/34の増殖を抑制することを明らかにした。しかし真菌(C.albicans, C.neoformas, A.fumigatus)や細菌(S.aureus, E.coli, P.aeruginosa)には作用しないことを見いだした。
海洋における菌類様原生生物の分布と生態系・有機物動態への寄与

海の中にある有機物の9割はいわゆる生き物そのものではなく、糞や死骸や溶存態有機物と呼ばれる非生物態の有機物である。これを従属栄養細菌などが栄養源として利用・分解し、別の形に変えるプロセスは地球上の炭素循環の重要な一部である。海洋でのこのプロセスの担い手として、細菌だけでなく真核微生物も関わっているのではないかと考え、単細胞真核微生物である「菌類様原生生物」について、海洋漂泳区での有機物分解・変換の担い手としての寄与と、食物連鎖(生態系)の中での位置づけを評価することを目指す。
糖ナノ粒子を犠牲母材に用いた酵素内包シリカナノカプセルの新規調製法と機能評価

酵素は生体由来の優れた触媒であるが,一般に耐久性が低い.しかし,ナノカプセルなど保護膜内に酵素を劣化させずに封じ込めることができれば,耐久性の著しい向上が見込まれ,従来適用できなかった場所で酵素を利用できるようになると考えられる.そこで本研究では,酵素を劣化させずにナノカプセル内に閉じ込める全く新しい方法を開発することを目的とした.さらに,調製した酵素内包ナノカプセルを,これまで利用できなかった細胞内に導入することで,細胞内での酵素の新規反応特性や機能を明らかにする.同時に,バイオ医薬品の新規生産法の開拓などに応用展開する.以上のようにして,新しい酵素工学の構築を図る.酵素は生体由来の優れた触媒であるが,一般に耐久性が低い.しかし,ナノカプセルなど保護膜内に酵素を劣化させずに封じ込めることができれば,耐久性の著しい向上が見込まれ,従来適用できなかった場所で酵素を利用できるようになると考えられる.そこで本研究では,酵素を劣化させずにナノカプセル内に閉じ込める全く新しい方法を開発することを目的とした.さらに,調製した酵素内包ナノカプセルを,これまで利用できなかった細胞内に導入することで,細胞内での酵素の新規反応特性や機能を明らかにする.同時に,バイオ医薬品の新規生産法の開拓などに応用展開する.以上のようにして,新しい酵素工学の構築を図る.
19世紀前半アイルランドにおける教育振興任意団体への公費補助に関する社会史的研究

本研究は、19世紀前半アイルランドにおける教育振興任意団体への公費補助を対象として、教育をめぐる国家と市民社会の関係性の変容を明らかにした。具体的には、教育政策の理念が、1810年代までの非宗派主義による統合から、1820年代に転換し、政府の側ではもはや宗教教育による統合ではなく、異なる宗派の子どもたちが混在する状況それ自体を統合の資源とみなす「自由主義的統合」の理念が産まれたこと、国民学校制度はそうした理念の具体化であったことを明らかにした。平成26年度に実施した研究の成果は、次の通りである。1)史料蒐集に関しては、国内においてはHCPPを中心とした電子データベースを使用して、議会議事録、議会委員会および政府委員会報告書を中心に、国民学校制度の成立に至る公文書史料の蒐集をほぼ終えることができた。海外ではアイルランド国立公文書館・国立図書館・Represantative Church Body Libraryを中心に、アイルランド国民教育協会等の任意団体に関する史料の蒐集を行った。また、大学図書館を通じてDublin Diocesan Archivesにカトリック教会文書に関する追加史料の複写を依頼し、無事史料を入手することができた。二次文献に関しても、予定より若干予算を超過したものの、国内外の重要な文献を中心に、順調に蒐集を進めることができた。2)研究交流に関しては、史料調査と並行して海外の研究者の助言を得、平成25年11月に史学会大会で報告した反悪徳協会に関する草稿をほぼまとめることができた。今後できる限り早い刊行を目指していく。国内では、複数の全国規模の学会および研究会に参加し、またその一部に関しては運営にも携わることで、研究者との交流を深めた。3)蒐集した史料読解に関しては順調に進んでおり、平成27年5月に開催される第65回日本西洋史学会大会近代史部会において、アイルランド国民学校制度の成立過程に関する報告を予定している。ほぼ完成した反悪徳協会の論文に関しては、1800年代から1810年代の任意団体への補助金支出がどのような理由から正当化されたかを解明したという点で、アイルランド公教育史上の意義が認められる。また、27年5月の国民学校制度に関する報告は、国民学校制度の再解釈およびこれまで対照的に理解されてきたアイルランドとイングランドの公教育制度を統一的に理解する視座を提示するという点で、学術的な意義がある。当該年度に実施した研究成果は、以下の通りである。(1)史料調査・史料蒐集等について2015年9月に、アイルランド国立図書館において1830年代から1850年代までに刊行された、国民学校制度に関する出版物を調査・蒐集した。また、アイルランド国教会が管轄するRepresentative Church Body Libraryにおいて、国民学校制度に対抗するために結成された教育振興団体であるChurch Education Society for Irelandに関する史料調査および蒐集を行った。国民学校制度の成立以降、当該制度が「世論」においてどのような評価を受けていたか、またそれと対抗する宗派的教育振興任意団体の反応がいかなるものであったのかを解明する上で、上記の史料の蒐集は必要不可欠である。また二次文献に関しては、アイルランド就学率に関する最新かつ最も信頼度の高い研究調査等を中心に、19世紀アイルランド公教育史に関する主要な文献を蒐集することができた。(2)研究成果の公表について2015年5月17日、日本西洋史学会第65回大会において、「1820年代アイルランド民衆教育における「公共性」の変容ー1825年アイルランド教育調査委員会報告書を中心に」と題する報告を行った。前年度に進めていた、国民学校制度の成立に至るまでの1820年代の教育政策理念の変遷に関する報告であり、本研究の主要な部分を構成する報告としての意義がある。史料蒐集および調査は順調に進んでいるが、初年度、次年度での研究成果の公表を、学会発表というかたちでしか行うことができておらず、論文のかたちで公表することが遅れている。学会報告その他で指摘された問題点について、新たな史料や先行研究の再蒐集、再検討が必要となったためである。また、一部は海外の学会誌への投稿を目指して英語で執筆をしているため、英文校正にやや時間を要している。研究実施計画に従って、当該年度は過去二年間の研究成果を論文その他のかたちで発表することを予定していた。したがって当該年度は海外へ渡航して史料調査を行うことはせず、主として論文執筆と学会報告を行った。具体的には、1「反悪徳協会」に関するモノグラフ、2「国民学校制度」に関するモノグラフ、319世紀前半のアイルランドにおける就学率に関するレヴュー論文の三本を執筆、投稿することを予定していた。3に関しては、19世紀前半アイルランドにおける就学率のレヴュー論文を、青山学院大学教育人間科学部紀要に発表した。近年発表された、アイルランド就学率に関する画期的な研究成果をレヴューしたものであるが、単なる内容紹介ではなく、数量的な就学率研究の動向から、これまでの制度政策史研究を中心としたアイルランド教育史の通説がどのように刷新され、書き換えられる可能性があるかを論じた。また2に関しては、2015年度に西洋史学会で行った報告をもとにしつつ、新たな史料や先行研究の再蒐集、再検討を行った上で論文を執筆し、学会誌に投稿した。これらは、19世紀アイルランドにおける公費助成(国家介入)の変容と公教育制度の展開を解明するという本研究の中核を構成する研究成果である。1に関しては、当該年度での論文化が若干遅れている。学会報告としては、アイルランドとイングランドの公教育制度の展開を比較しつつ、近代イギリスにおける教育ヴォランタリズムの歴史的条件について論じる報告を進化経済学会において行った。

これは、本研究の成果をブリテン史のなかに位置づけるための作業としての意義を持つ。本来の計画では、当該年度中に、過去二年間における研究の成果をすべて論文のかたちで発表することを予定していたが、論文として発表できたものは一本に留まった。学会報告や学会誌への投稿と修正要求などで指摘された問題点について、新たな史料や先行研究の再蒐集、再検討が必要となったためである。一年間の研究期間延長を行った最終年度では、再度構築した研究計画に従って、研究成果の発表および追加の史料調査・研究交流を行った。研究成果の発表に関しては、2015年に西洋史学会で行った報告をもとに論文を執筆し、『西洋史学』に投稿し、「19世紀前半アイルランドにおける教育改革と国民統合ー国民学校制度の成立1821年-1831年ー」として同雑誌に掲載された。この論文は、アイルランド教育史上の画期とされる国民学校制度(1831年)に関する従来の対立する二つの定説に対して、両者を総合する新しい解釈を提示したことにその意義がある。具体的には、1810年代までの公教育政策理念が1820年代に転換して国民学校制度の成立を帰結することを明らかにしたこと、宗教教育による統合ではなく、宗派が混在する「市民社会」としての学校に統合を期待する統合の理念が具体化された事例として国民学校を位置づけるという点で、アイルランド教育史に新たな知見をもたらすものと言いうる。他に比較史的な考察の部分で本研究と関連するものとして、イングランドの国民協会に関する論文を執筆し、History of Education誌に受理された。史料調査としては、アイルランド国立公文書館、アイルランド国立図書館およびRepresentative Church Body Libraryで追加の史料調査を行ったほか、トリニティ・カレッジ・ダブリンのスーザン・パークス名誉教授と面談し、研究に関する助言を受けた。その他、国内の西洋史・アイルランド史・教育史関係の学会やワークショップに参加し、研究交流を行った。本研究は、19世紀前半アイルランドにおける教育振興任意団体への公費補助を対象として、教育をめぐる国家と市民社会の関係性の変容を明らかにした。具体的には、教育政策の理念が、1810年代までの非宗派主義による統合から、1820年代に転換し、政府の側ではもはや宗教教育による統合ではなく、異なる宗派の子どもたちが混在する状況それ自体を統合の資源とみなす「自由主義的統合」の理念が産まれたこと、国民学校制度はそうした理念の具体化であったことを明らかにした。現在まで、史料蒐集に関しては、議会議事録、議会委員会および政府委員会報告書を中心に、国民学校制度の成立に至る公文書史料の蒐集をほぼ終えることができた。海外ではアイルランド国立公文書館・国立図書館・ChurchRepresantative Body
ピロリ菌病原因子ＯｉｐＡ相互作用分子の生化学的探索

ピロリ菌には複数の病原因子を有することが知られており、それの相乗効果により重篤な疾患を導くと考えられる。本研究で、胃に炎症を引き起こすOipAタンパク質を得ることに成功した。また、OipAタンパク質はピロリ菌の細胞膜でBabAタンパク質(胃に接着する働きを持つタンパク質)と複合体を形成していることが分かった。本研究の成果により、今後OipAタンパク質と胃のタンパク質との作用、またはOipAタンパク質と他の病原因子との相互作用が明らかになると考えられる。膜タンパク質であるrOipAタンパク質は可溶化することが精製の必要条件である。そこで種々の界面活性剤を検討した結果、コール酸ナトリウムとDDMがrOipAの可溶化・精製に有効であることが分かり、Hisタグによるアフィニティー精製でrOipAタンパク精製標品を得ることに成功した。さらに、ゲル濾過により精製標品を分析したところ、精製標品中におけるrOipAタンパク質はモノマーの状態で存在することが分かった。我々は以前に、OipA遺伝子をノックアウトしたピロリ菌株をAGS細胞に感染したところ、野生株と比較してAGS細胞からのIL-8産生が有意に低いことから、OipAタンパク質はIL-8産生を誘導する機能をもつと報告した(Yamaoka et al , PNAS , 2000)。そこで今回、AGS細胞を用いてrOipAタンパク質精製標品での感染実験を行った。その結果、モノマーとしてのrOipAタンパク質ではIL-8産生を誘導しないことが明らかとなった。このことから、OipAタンパク質はオリゴマーとして、または他の分子と複合体を形成することで機能的に働くことが示唆された。次に、DDMで可溶化したHp26695株の膜タンパク質をサンプルとしてHigh Resolution Clear Native PAGEを行うことでOipAタンパク質複合体の解析を行った。その結果、OipAタンパク質は約700kDaの複合体を形成していることが明らかとなった。さらに2次元目にSDS-PAGEを行ったところ、4つのタンパク質で複合体が形成されていることが明らかとなった。このOipAの相互作用分子候補である4つのタンパク質については現在同定を進めている。本研究では、ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)の病原因子であるはOipAの直接的な機能やその相互作用分子の解明を目的としている。OipAについて生化学的解析を行うために、まずはピロリ菌の大量培養法を確立した。ピロリ菌は液体培地での継代培養では増殖しないことがわかったため、多くの寒天培地上で培養した後、5Lフラスコをピロリ菌培養用気体で充填して液体培養を行うことで、一度に10L培養可能なピロリ菌大量培養方法を確立した。ピロリ菌の病原因子の一つであるOipAについて生化学的解析を進めるために、組み換えタンパク質の作製を試みたが、当初は大腸菌では発現が確認できなかった。様々な組み換えタンパク質発現法を試み、コムギ胚芽を用いた無細胞合成系で組み換えOipAの発現に成功した。この組み換えOipAの可溶化を行い、精製法を確立することができた。一方、ピロリ菌からのnative OipAの分取には成功していないため、現在検討を行っている。組み換えOipA単量体が得られたことで、今後はこの分子をプローブとして、相互作用分子の探索を行えるようになった。機能不明分子の機能解析を行うためには、相互作用分子の探索は非常に有効な手法であるが、これまで得られていなかったOipA単量体が得られたことは、今後のOipA解析に向けた重要な一歩となった。OipAを含む超分子複合体の解析を進めるために、現在はピロリ菌の菌体破砕方法の検討を行っている。この際の破砕方法により、OipAが分解してしまうことから、OipAは生化学的に不安定な分子であることがわかった。今後は、OipAが分解されないような破砕方法を確立する必要がある。コムギ胚芽を用いた無細胞合成系で組み換えOipAの発現に成功し、可溶化および精製法を確立することができた。これにより研究実施計画通り、OipA単量体の分取に成功した。一方、OipAを含む超分子複合体の分析については、OipAが生化学的に非常に不安定ということがわかり、超分子複合体の同定には至っていない。抗OipA抗体により、培養したピロリ菌中にOipAが発現していることは確認できており、菌体破砕の過程でOipAが分解することがわかったため、OipAが分解しない温和な破砕方法の検討を行っている。組み換えOipAの精製に成功したので、円二色性分散計などを用いた二次構造分析、分光光度計による分析などを行い、物理化学的解析を進める。OipAを含む超分子複合体をピロリ菌から精製することを試みる。この複合体が解離しないような可溶化条件を探索する。

沈殿法を繰返し行う精製法を試みるなど、複合体が解離しないような穏和な条件下にて精製を行う。組み換えOipAをプローブとして、免疫沈降法などにより、OipAと相互作用する宿主細胞由来分子およびピロリ菌由来分子の探索を試みる。組み換えOipA作成は、困難と考え様々な方法を考慮していたが、無細胞合成系を使う計画に早めに切り替え、コムギ胚芽を用いた無細胞合成系で組み換えOipAの発現に成功することができ、若干の研究費を次年度に繰り越すことができた。25年度は、これらの資金も合わせて、二次構造分析、分光光度計による分析などを行い、物理化学的解析を進め、予定以上の成果を上げたいと考えている。