hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖とインスリンによる腎血流生理調節と高血圧発症機序

一方、高食塩食により昇圧したDahlSラットでもショ糖の経口負荷によりさらに昇圧し尿蛋白も増加した。以上の結果から、糖負荷が血圧を上昇し、腎障害をもたらすことが示され、食塩負荷とは異なる昇圧メカニズムの関与が示唆された。腎組織標本の免疫組織学的解析等でメカニズムを検討中である。本研究では糖尿病やメタボリックシンドロームの病態を形成する因子である糖とインスリンに着目し、腎血流調節作用と高血圧発症機序を明らかにすることを目的とした。まずショ糖負荷Dah1食塩感受性高血圧ラットの血圧上昇メカニズムを検討した。Dah1食塩感受性高血圧(Dah1S)ラット、Dah1食塩非感受性高血圧(Dah1R)ラットおよびSprague-Dawley(SD)ラットに10%ショ糖を飲水ボトルで2週間投与したところ、Dah1SラットとDah1Rラットでは投与1週より有意な血圧上昇がみられたが、SDラットでは2週にわたり有意な血圧上昇はみられなかった。尿中の過酸化水素の排泄を検討し酸化ストレスの指標にしたところ、Dah1SラットとDah1Rラットではショ糖投与後有意な尿中過酸化水素の増加があったが、SDラットではその増加はごく軽度に留まり、ショ糖負荷による高血圧発症に酸化ストレスの関与が示唆された。また、Dah1Sラットでの血圧上昇と尿中過酸化水素排泄の増加は腎の近位尿細管に発現するNa-glucose cotransporter (SGLT)の阻害薬phlorizinの投与により抑制された。以上のことから、ショ糖負荷による血糖上昇はSGLTを介して腎酸化ストレスを亢進し、腎髄質血流を減少、ナトリウムの再吸収を亢進し高血圧発症に関与していることが示唆された。次にSGLTの腎髄質血流に対する役割を検討するために麻酔下ラットの腎髄質に光ファイバーを挿入し、腎局所血流をレーザードップラー法で検討した。その席果SGLT阻害薬であるphlorizinの腎髄質間質への前投与は、50%グルコース静脈内投与による髄質血流減少を抑制した。したがって、血糖の上昇は尿細管でのグルコース再吸収増加とともに腎髄質局所の酸化ストレスを増大し、腎髄質血流が減少するため血圧を上昇させることが示唆された。
フラーレンスートからの魅力ある炭素クラスターの抽出・分離・応用に関する研究

炭素電極を用いたアーク放電煤中には、通常の有機溶媒を用いた抽出が容易であるものと、煤のネットワーク中での強い相互作用により抽出が困難なものがある。有機溶媒で抽出可能なフラーレンは、分子的に安全なクラスターであり、むしろ抽出が困難なものの中にこそ興味深いクラスターが多く含まれているはずである。本研究は、水熱処理などによる方法を用いて、依然としてフラーレン煤中に残存している新規炭素クラスターの抽出、及び従来の炭素クラスターでは持ち得なかった化学合成による量子電磁気効果等の機能を有する炭素クラスターの創製と探索を目標としたものである。研究内容は、魅力的な炭素クラスター類を大量に含むアーク放電煤合成に関するもの、フラーレン酸化物二量体やC_<60>より炭素数の少ないフラーレン、いわゆるスモールフラーレンなどの合成・単離に関するもの、カーボンナノチューブの高収率合成および高純度精製に関するものに大別することができる。アーク放電煤合成に関する研究では、チャンバー内の圧力やガス条件・磁場の印加条件などの検討を行い、これが炭素クラスターの収量と密接に関連していることを明らかにした。フラーレン酸化物二量体の合成に関する研究では、フラーレン酸化物合成および二量体化プロセスの確立と、その単離、同位体同定に関する基礎的知見の獲得に成功した。一方フラーレン発見時には存在しないと考えられていたC_<60>以下のスモールフラーレンについても、アーク放電によるC_<36>の合成及びフラーレン煤からの抽出・分離を試み、合成時の装置依存性等を検討しているところである。カーボンナノチューブの高収率合成および高純度精製に関する研究では、アークプラズマの制御を通じてナノチューブ合成収率の向上および得られるチューブのサイズ制御を目指し、検討を進めた。磁場を印加してアークプラズマ中での炭素ラジカル密度を制御することによって、ナノチューブの生成時間や成長速度を制御しうることを見出した。有機溶媒で抽出可能なフラーレンは、安定な(分子的な)クラスターのみであり、真のクラスターの性質である準平衡性をもつ興味あるクラスターは、依然フラーレン煤のネットワーク中に強い相互作用のために残っていることが確信できた。そこで、本研究ではフラーレン煤中の手つかずの状態の新規炭素クラスターを水熱処理法を基礎とする方法により効率的に抽出し、化学合成法の力を借りて従来の炭素クラスターが示さなかった量子電磁気効果等の機能を有する炭素クラスターの創成と探索を目指す。本年度は、田路グループによるフラーレン煤から抽出した新規フラーレンをクレチマーグループが開発した合成法を用いて、量子電磁気効果をもつ準安定フラーレン多量体を合成し、構造解析およびその電磁気的物性および光物性を検討した。具体的には、研究分担者および協力者である、篠田工藤寿治修士が、3カ月間クレッチマー博士の研究室に滞在して、C140・Oフラーレン2量体の合成法ならびにC139新規フラーレンの合成を試みた。帰国後、その物性研究のための大量合成を行っているところである。また、11月のフラーレンに関する国際会議に一部の研究成果の発表し、さらに今後の研究方針についてクレッチマー博士と討論を行った。現在、平成12年度に計画している物性測定の準備として、クレチマーグループは、準安定多量体フラーレンのNMRを用いた構造決定のための装置開発を行っている。このように、国際共同研究初期段階の目的を達成した。我々は、アーク放電ススに含まれるフラーレン類の抽出・分離・精製および応用について研究を行ってきた。

特に、有機溶媒による抽出ができないフラーレン類は、有機溶媒による抽出が可能な物と比べてスス中で何らかの強い相互作用によりフラーレン類が多量に抽出されずに残っているものと確信している。そこで、本研究ではアーク放電スス中の新規炭素クラスターを水熱処理法などによる方法により効率的に抽出し、化学合成法の力を借りて従来の炭素クラスターが示さなかった量子電磁気効果等の機能を有する炭素クラスターの創生と探索を目指す。平成12年度は、研究代表者である田路和幸と協力者である佐藤義倫修士が、クレッチマー博士の研究室に赴きフラーレン類の抽出・分離・精製および応用についてディスカッションを行い、その後佐藤義倫修士はGothenburg University and Chalmers University of Technology(Sweden)のエレノアキャンベル教授の研究室に2ヶ月間滞在して新規炭素クラスターの化学合成および気相合成による合成法の技術取得に取り組んだ。帰国後、クレンチマー博士・エレノアキャンベル教授の両研究室において得た知識を基に、炭素クラスターの新しい合成方法および精製法を検討し実験を開始しているところである。また、12月のフラーレンに関する国際会議に一部の研究成果を発表した。最終研究年度にあたる平成13年度は、これまでの研究成果をもとに炭素クラスターの合成および物性研究を行い、当初の目的である現在まで研究対象となっていない炭素クラスターの抽出・分離・応用を行う予定である。アーク放電スス中には、有機溶媒による抽出が可能であるものと、ススのネットワーク中における強い相互作用により抽出が困難なものがあることが判っている。有機溶媒で抽出可能なフラーレンは、分子的な安定なクラスターであり、真のクラスター(準平衡性)を持つ興味深いクラスターは抽出が困難である。本研究は、水熱処理などによる方法を用いて、依然としてフラーレン煤中に残存している新規炭素クラスターの抽出、及び従来の炭素クラスターでは持ち得なかった化学合成による量子電磁気効果等の機能を有する炭素クラスターの創生と探索を目標としたものである。フラーレン発見時、C60以下のフラーレンは存在しないと考えられていたが、近年スモールフラーレンが確認された後は、新機能性を有すると考えられるスモールフラーレンは魅力ある炭素クラスターとして着目されだした。平成13年度は、研究代表者である田路和幸の協力者である秋本結輝修士が、4ケ月間クレッチマー博士の研究室に赴き、アーク放電によるスモールフラーレンC36の合成、及びフラーレン煤からの抽出・分離を試みた。帰国後、クレッチマー博士の研究室で得た知識・経験を基に、C36の合成における装置依存性等を検討し、実験を開始しているところである。クレッチマーグループもC36の最適な合成条件のさらなる検討を行っている。最終年度である今年度以降も、研究方針・成果などについてクレッチマーグループなど、海外や他の研究機関と積極的な学術交流を行いつつ、研究のさらなる発展を目指す。
連合学習による可塑的神経回路の情報処理過程

連合学習に伴う神経系の変化について研究してきた。軟体動物ウミウシは光を条件刺激、体動揺を無条件刺激として連合学習し、これは、それぞれの感覚受容器相互の直接的な抑制によると考えられている。すなわち学習獲得の帰結として、視覚系と前庭系の感覚受容器間のシナプス結合が変化し、これが二次ニューロン、運動ニューロンへ伝えられ行動の発現となるが、これらは微小ガラス電極法により、ワンステップずつ積み上げられてきた結論であった。我々はこれまで、光プローブによる計測システムを整備し、その過程でウミウシ中枢神経系では興奮性ニューロンの近傍には必ず抑制性のニューロンのあることを見出してき。今年度連合学習によって大きく変化することが予想される。A型視細胞、B型視細胞、腹側有毛細胞、背側有毛細胞の活動を電位感受性色素RH155を用いて光プローブによる同時計測して、今までの微小ガラス電極法の結果を再確認しようと計画した。これまでのところ、計画した4種の細胞すべてが色素RH155で一様に染まらないため、同時計測はできていない。今後、より膜透過性のよい色素に変更する必要があろう。学習によりシナプスがどのように修飾されるかは、ウミウシにおいても明確でないことから、この点を明らかにするため、現在、B型視細胞とそのポストとなる介在ニューロン間のシナプスについて検討している。その第一歩としてこれまで明確でなかった介在ニューロンの位置を同定し、それに電位感受性色素RH155を細胞内注入することにより、シナプスの変化をオプティカル記録で観察を開始した。
血中循環癌細胞のシングルセル解析による口腔癌次世代統合精密治療法の開発

癌における最大の悪性形質は転移である。転移を制すれば、腫瘍の原発巣の制御さえ行えば癌を完治させることが可能である。転移を起こす細胞の候補として循環癌細胞がある。原発巣からりだつした癌細胞が血流もしくはリンパ流にのり、遠隔部位に運ばれ、転移巣を形成する。この仮説については議論の余地はない。これまでにいくつかの癌腫で循環癌細胞の存在が極めて大がかりな分離装置で証明されていた。口腔癌では未だに循環癌細胞の報告はない。また、臨床応用を考える場合に、日常的に循環癌細胞を分離するシステムが必要である。そこで簡易にCTCを分離するシステムを新規に開発した。まず培養癌細胞と血液を混和し、この中から癌細胞を分離する手法を開発した。このためにサイズ分取により癌細胞を血球成分と癌細胞に分取する流体チップを開発した。このチップを用いると、培養癌細胞は血球成分から分離され、90%以上が回収でき、血液中の循環癌細胞(CTC)の分離に応用可能であることが示唆された。次にこのシステムの有効性を確認するために、腺様嚢胞癌細胞株ACCSからマウス転移モデルにより樹立された高転移かつGFPを発現するACCSM-GFPを用い、マウス転移モデルに腫瘍を形成させた。担癌状態のマウスの血液を採取し、本CTC分離システムに展開した。その結果GFP蛍光を有する細胞が回収できた。この回収されたCTCを用い、シングルセルレベルでの遺伝子変化を親株ACCSもしくは高転移株ACCSMと比較することを予定している。初年度である本年中にシングルセルに対する次世代シーケンスを行う予定であった。CTC分離システムによるCTC単離ができたが、シングルセルからの遺伝子量はやはり微量であり、ライブラリーの作成が困難であった。このためシングルセルからの次世代シーケンスが行えなかった。昨年、遺伝子バーコードを用いた新しいシングルセルからのライブラリー作成システムが発表され、応用可能となった。これを用いることにより、シングルセル解析ができる目途がついており、動物モデルにおける解析、口腔癌患者におけるCTCの解析へすすめていく予定としている。
熱帯雨林樹木の集団遺伝解析による氷河期レフュジア拡大の解明

本研究は,氷河期の東南アジア熱帯雨林レフュジアの位置および,氷河期以降の熱帯雨林植生拡大の歴史を,同熱帯低地林の主要構成樹木であるフタバガキ科樹木を中心とした複数種の集団遺伝学的解析によって明らかにすることを目的としている。30年度は29年度に引き続いて,マレー半島,スマトラ島およびボルネオ島での植生調査と遺伝解析用の葉サンプルを採取した。これらのサンプルからDNAを抽出し,遺伝解析を行った結果,以下のことが明らかになった。(1)スマトラ島とマレー半島のフタバガキ科3種6集団のマイクロサテライト解析の結果から,スマトラ島集団では集団サイズの変動が検出されなかったのに対し,マレー半島集団では氷河期後に起こったと考えられる集団拡大が示唆された。(2)フタバガキ科2種の集団の塩基配列多様性を調査した結果,北ボルネオ集団はマレー半島集団とは対照的に,集団サイズの減少を経験していることが示された。(3)フタバガキ科のRNA-seqデータを基に,42核遺伝子座を特異的に増幅するプライマーを設計した。このうち,16遺伝子座がフタバガキ科の複数属に適用可能であることを確認した。(4)低地フタバガキ林および泥炭湿地林に生育する2種のジェルトンの集団遺伝解析の結果,両種が互いに交雑可能であることを明らかにした。30年度はブルネイやインドネシアでの植生調査と遺伝解析用のサンプルを新たに採取することができ,インドネシアの2地点を除き,予定のサンプリングをほぼ完了した。核遺伝子座を特異的に増幅できるプライマーを複数設計し,アンプリコンシーケンス解析を実施する準備も進行しており,おおむね順調に進展している。今年度8月にインドネシアでの野外調査を実施する予定である。DNA分析は,これまでに得られたサンプルを材料に継続的に行う予定である。東南アジア熱帯雨林は,過去の気候変動と海水準変動による森林面積の拡大・縮小を繰り返しながら現在の分布に至っている。熱帯林縮小期のレフュジアの特定と森林面積の変動の歴史の解明は,現在の熱帯林の生物多様性とその地理的分布を明らかにするために重要であるが,これまでの研究では熱帯林の歴史的変遷について,異なる見解が示されている。本研究の目的は,熱帯樹木の遺伝的変異パターンから過去の森林動態を明らかにすることによって,氷河期レフュジアの位置を特定することである。このために,スンダ陸棚中央の島嶼部を中心に7地点での植生調査とサンプル採取,そして熱帯雨林樹木7種の集団遺伝解析を行う。29年度はブルネイ,マレーシアサラワク州およびマレー半島での植生調査およびDNA分析用の集団サンプルを採取し,それらの一部についてDNA分析を行った。その結果,以下のことが明らかになった。(1)フタバガキ科Shorea curtisii24集団の葉緑体塩基配列および各マイクロサテライトの解析結果から,マレー半島のS. curtisii集団は過去にボトルネックを受けた後,分布を急速に拡大したことが示された。(2)ブルネイで採取したフタバガキ科4属8種の集団サンプルについて,葉緑体および核遺伝子のDNA配列を決定し,種間での遺伝的変異パターンを比較した。(3)マラッカジンコウ(Aquilaria malaccensis)の葉緑体DNA変異の地理的分布を調査した結果,スンダ大陸中央部に位置するナトゥナ島のハプロタイプは,スマトラや西カリマンタンで見つかったハプロタイプとは異なっていることを明らかにした。29年度は,調査を予定している7地点の内,3地点で調査を実施することができた。植生調査に加え,各地点でDNA分析に十分な数のサンプルを得ることができた。予定しているインドネシアでの野外調査についても,現地カウンターパートと十分な議論をすることができた。DNA分析については,葉緑体DNA塩基配列と核マイクロサテライト領域の変異を調査した。まだ,解析する個体数はまだ十分ではないが,今後の研究の具体的な方向性を決めることができた。

30年度はブルネイやインドネシアでの植生調査と遺伝解析用のサンプルを新たに採取することができ,インドネシアの2地点を除き,予定のサンプリングをほぼ完了した。核遺伝子座を特異的に増幅できるプライマーを複数設計し,アンプリコンシーケンス解析を実施する準備も進行しており,おおむね順調に進展している。今後は,インドネシアでの野外調査およびサンプリングを集中して行う。また,分析の完了していないサンプルの分析を行う。フタバガキ科については29年度に得たRNAseqのデータを解析し,新たなDNAマーカーを作成する。これによって,サンプリングがほぼ完了している3種のフタバガキ科ショレア属について,ゲノムレベルでの集団遺伝解析を行う予定である。今年度8月にインドネシアでの野外調査を実施する予定である。DNA分析は,これまでに得られたサンプルを材料に継続的に行う予定である。
がん抑制遺伝子RB1CC1のシステム破綻による発がん機構とその制御

RB1CC1はRBを介した細胞増殖抑制の系とTSC-mTOR-autophagyを介した蛋白合成・制御、細胞成長の系をクロストークさせながら、組織、生体の恒常的システム維持に貢献する。RB1CC1が細胞核内で、RB経路の転写へ貢献する機構について解析を行なった。RB1CC1分子は細胞核内でhSNF5, p53両分子と転写因子複合体を形成する。本転写複合体はp16, p21,RB1すべての発現を亢進させ、RB経路を増強し、細胞増殖を抑制する。RB1CC1の発現状態が乳癌症例の生存率に大きく関連していることを明らかにした。RB1CC1の細胞核内の局在を病理標本において簡便に判別することによって、臨床的予後が推定でき、治療選択の一指針にもなり得ることが明らかになった。RB1, p53の免疫組織化学的評価と組み合わせることによって、ER, PgR, Her2を用いたtriple-negative乳癌の鑑別に同等、もしくはそれ以上の精度で予後判定が可能となった。一方で、精巣腫瘍特異的発現を示すDMNT3Lの生物学的機能、臨床学的意義を明らかにした。本年度はRB1CC1が細胞核内に入り、RB経路の転写へ貢献する内容について、詳細に解析した。これら転写複合体はp16, p21, RB1すべての発現を亢進させ、RB経路を増強し、細胞増殖を抑制することが明らかとなった。更に、RB1CC1の発現状態が乳癌症例の生存率に大きく関与していることが明らかにできた。このことは、乳癌症例数323、10年近くにわたる経過解析においても確認された。更に、RB1, p53の免疫組織化学的評価と組み合わせることによって、ER, PgR, Her2を用いたtriple-negative乳癌の鑑別に同等、もしくはそれ以上の精度で予後判定が可能であることも解った。
変形性股関節症の病態解明に対する分子生物学的アプローチ:カテプシンKの役割

稲岡らのグルーブによりヒト破骨細胞特異的システインプロテアーゼ(カテプシンK)cDNAのクローニングが報告された。(BBRC,206,89-96,1995)。私は稲岡らのグループより開発された方法を用いて正常および変形性股関節症のヒト大腿骨頭におけるカテプシンKmRNAの発現をRT-PCR法で定量し、本遺伝子の発現と骨破壊との関連性について検討することを目的として実験を開始した。変形性股関節症の骨頭において、骨破壊が起こり、その進行度に比例してカテプシンKの発現は破骨細胞で強く発現していると予想している。最初に、骨からmRNAを抽出する方法を検討した。骨のような硬い組織からmRNAを抽出するのは困難であったが、ブタの大腿骨頭を液体窒素中で機械的に粉砕する方法を検討したmRNAを抽出することが可能となった。次に変形性股関節症の患者より摘出された大腿骨頭を液体窒素で冷凍し-80°Cに凍結保存した。なお、変形性股関節症の手術には人工股関節置換術が広く行われており、その時摘出した骨頭は不用となる。この骨頭を用いて実際にmRNAを抽出した。RT-PCR法を用いてカテプシンKmRNAの発現量の検討を行ったところ、バンドの存在が確認できた。その時、骨巨細胞腫から抽出したmRNAをポジティブコントロールとして用いた。現在、カテプシンKmRNAが高発現を示すであろうと推測されるリウマチの滑膜や既に本遺伝子の高発現の報告のある巨細胞腫(様々の種類の巨細胞腫)についても冷凍保存してあり、今後解析する予定である。
インフルエンザウイルスゲノム・細胞内集合機構の解明

インフルエンザウイルスのゲノムRNAは8本に分節化しており、それぞれのRNA分節が異なるウイルス蛋白質をコードしている。したがって、異なるウイルス株が細胞に重複感染すると、一部のRNA分節を交換して再集合したゲノムを持つハイブリッドウイルスが生じることがある。この遺伝子再集合によって、数十年に一度、ヒトに適応し世界的な大流行(パンデミック)を引き起こす新型ウイルスが出現する。したがって、インフルエンザの細胞増殖機構や新型ウイルスの出現機構を考える上で、RNPの集合機構を解明することが重要である。これまでに、蛍光顕微鏡法と細胞の超薄切片を用いた電子顕微鏡法で細胞内の同一領域を解析し、ウイルス感染細胞の微細構造を解析した。その結果、ウイルス感染細胞内に存在するRNPの形態を捉えることにに成功し、細胞質内の集合状態におけるRNP構造を明らかにした。また、免疫電子顕微鏡法を実施し、特定の細胞小器官とRNPを同時に標識する事でRNP分子の局在を詳細に絞り込んだ。さらに、電子線トモグラフィーを用いることによって、細胞内のRNPのより高解像度の構造を3次元で捉えた。インフルエンザウイルスが有する8本のRNPは感染過程において一本ずつバラバラに分かれ、再び8本に集合する(遺伝子再集合)。複数のウイルス株が細胞に同時感染すると、一部のRNA分節を交換した新しいゲノム構成を持つハイブリッドウイルスが生じる。この遺伝子再集合が新型ウイルスが生まれる原因となる分子機構である。したがって、インフルエンザの防疫戦略を考える上で、RNPの集合機構を解明することが非常に重要である。これまでに、蛍光標識を用いた光顕微鏡法と細胞の超薄切片を用いた電子顕微鏡法で同一領域を解析する相関顕微鏡法を用いた解析を行った。その結果、ウイルス感染細胞内に存在するRNPの微細構造を解析することに成功し、細胞質内の集合状態におけるRNP構造を明らかにした。さらに、免疫電子顕微鏡法を実施し、電子顕微鏡像でもREおよびRNPを特異的に検出する事で細胞内分子の局在を同定できた。また、次年度に予定していたクライオ電子顕微鏡法を用いた細胞内RNPの観察を試み、試料調製方法の最適化に用いる基礎的なデータを取得した。これまでに、相関顕微鏡法を用いることでウイルス細胞内に局在するRNPの微細構造が明らかになった。さらに、免疫電子顕微鏡法によって特異的にRNPおよびオルガネラを同定できた。一方で、集合の場を同定するには、クライオ電子顕微鏡法等を用いたさらに詳細な構造解析が必要と考えられる。今後は、詳細な細胞内RNPの形態および局在を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡法を用いた形態解析を行う。本年度に予定していた相関顕微鏡法の解析が予定より早く終了し必要な試薬類も予定より少量で済み、クライオ電子顕微鏡法に用いる試料調製法の検討を進めた。また、2月の所属機関変更に伴い予定していた予算の執行を遅らせたため、次年度使用額が生じた。次年度は、主にクライオ電子顕微鏡法に必要な資材および計算機器を準備し、細胞内RNPの集合過程について詳細に形態学的解析を実施する。
脳血管緊張の脳内動的制御機構の研究

本研究は頭蓋内圧・圧波-plateau wave-の発現機構を脳血管床の神経源性因子として重要な役割を果たすと推定される脳幹に注目し解明することを目的とした。【I】脳血管床の制御に関与する脳内局在部位を硬膜外バルーン法による頭蓋内圧亢進モデルの作製によって検討した。swelling群、noswelling群の組織学的検索から、swelling群では、視床下部、中脳及び脳幹網様体に小出血巣を認め、Evans Blueの漏出がみられ、BBBの破錠による脳浮腫が観察された。また毛細血管の拡大がみられ脳内血液含有量の増大がレーザー血流量計で示された。【II】青斑核複合体(LC)、コリン作動受容性橋領域(CPA)、延髄網様体(MRF)が脳血管床の制御にどのように関与しているかを単一ニューロンの発射活動の記録、脳内薬物微量注入法を駆使して検索した。(i)LCにグルタメイトを微量注入すると、ICPは下降し、血圧の極軽度の上昇がみられた。単一LCニューロンの発射活動を連続記録した結果、plateau波の圧上昇相に先行してスパイク発射が減少し、plateau相では極度に減少し、また圧の下降相に先行してスパイク活動が増加した。(ii)CPAにAchを微量注入するとICPの上昇が惹起された。CPA単一ニューロンの発射活動の増加とICPの上昇が発射頻度の低下とICPの下降が密に相関していた。(iii)MRFにグルタメイトを微量注入するとBPの上昇を伴うICPの下降が惹起された。MRFニューロンの発射活動はLCニューロンと類似しており、ICPの上昇に先行して発射活動が顕著に低下した。(IV)CPAニューロンとLC、及びMRFニューロン間には抑制性結合が存在し、CPAニューロンの軸索分枝がLCとMRFの両者に下行していた。【III】CAPが何等かの原因で発火すると中枢性nor-adrenergic system(LC、MRF)は抑制され、脳血管が拡張し、脳血管床の増大を来し(脳血流量の増加)頭蓋内コンプライアンスの低下した状況ではICPの上昇が惹起されplateau waveが形成される。平成3年度は、成猫を用い、クロラロ-ス麻酔下に実験を行なった。頭蓋内圧(ICP),脳血流(CBF)、脳動静脈酸素分圧較差(AVjDO_2)、呼気Co_2分圧、大腿動脈圧(BP)、EEG Power spectrumを連続記録した。新たに得られた所見として、I〕5分、15分間脳虚血後の各種モニタ-の動向:(1)5分あるいは15分間脳虚血delayed swelling群:脳圧迫除去後ICPは徐々に上昇を来し、やがて脳死状態に至る群。CBFは圧迫除去後一過性の著明な増加を認めた後、コントロ-ル値の1/3の値にまで低下し続けた。AVjDO_2とCBFから算出したCMRO_2の時間経過は圧迫除去後コントロ-ル値の約50%で9時間以上経過しても改善を認めなかった。速波成分(α_2+β)の周波数百分率をみると速波帯域の占める割合は著明に少なかった。

速波成分の時間的動向はCMRO_2の時間経過とほぼ一致していた。(2)5分間脳虚血noswelling群:全経過中ICPの上昇がわずか、一過性に留まる。CBFは圧迫除去後一過性の増加を認めた後、control値よりも低下し、その後改善した。CMRO_2は圧迫除去後5時間を経て回復した。EEGでの速波帯域の減少はきわめてわずかであった。swelling群では視床下部、中脳及び脳幹網様体に小出血巣を認めた。これらの部位のEvans Blueの漏出がみられ、BBTの破掟による脳浮腫がみられた。また脳細・毛網血管の拡大がみられ脳血液含有量の増大が示唆された。これらの部位の機能不全が脳腫脹の発現に関与しているものと示唆された。尚、平成3年度に購入したレ-ザ-組織血流計は、CBFの測定に、体温測定用ユニットは猫の全身状態の管理に、引算増巾器はCerebral perfusionpressureの測定に使用し、これら設備は研究の進展に大いに役立った。平成4年度は、カオリン注入による水頭症ネコを用い、クロラロース麻酔下に実験をおこなった。頭蓋内圧(ICP)、大腿動脈圧(BP)、呼気CO_2分圧を記録しながら、単一ニューロンのスパイク発射活動を連続記録し、spike discriminatorを通しスパイク数として表示した。【I】青斑核複合体(LC)、コリン作働性受容性橋被蓋野(CPA)、延髄網様体(MRF)の化学的促通効果の検索;(1)LCにグルタメイトあるいはカルバコールを微量注入すると、10-20秒の潜時の後ICPの低下が誘発された。MRFのグルタメイトによる化学的促通によっても同様のICP下降が惹起された。(2)一方CPAにカルバコールを微量注入し、CPAニューロンを賦活するとICPの上昇が誘発された。【II】LC、MRF、CPAの単一ニューロンの発射活動とICP変動、特に圧波発現との時間的因果関係の検索;(1)LCニューロンの発射活動は圧波(プラトー波)の圧上昇相に先行してスパイク発射が減少し、プラトー相では極度に減少し、また圧の下降相に先行してニューロン活動が増加した。即ち青斑核複合体のニューロンの活動が低下すればICPの上昇が、ニューロン活動の上昇とICPの下降が時間的に密に連関していることがわかった。(2)MRFニューロンのICP変動時の発射活動様態はLCニューロンと類似していた。(3)CPAニューロンはプラトー波様圧変動上昇相に先行して発射頻度が次第に増加し、プラトー相では高頻度の発射を維持し、圧の下降相に先行し、あるいはほぼ同期して発射頻度が減少している。橋被蓋野ニューロンが活動、興奮する時点とICP上昇が時間的に密に連関していることが判明した。【III】LCとCPA間のニューロン結合の検索;(1)CPAに微小電気刺激を加えると単一LCニューロンの自発発射は抑制された。CPAニューロンの軸索分岐はLCに分布すると同時にMRF領域に下行していた。〔I〕延髄網様体(MRF)の化学的促通効果の検索:MRFにグルタメイトの微量注入をおこなうとBPの上昇を伴うICPの下降が惹起された。このICP下降効果は青斑核複合体(LC)の化学的促通効果と類似していた。
界面制御による材料機能設計

本研究班は、材料作製のプロセスにおける界面制御、ならびに材料界面の制御を行うことによって、材料の機能の向上と界面の特殊な性質を発揮させるることを目的として研究を進めてきた。河合は、真空紫外領域のエキシマレ-ザ-アブレ-ションを利用したレ-ザ-MBE法を用い、薄膜表面の構造と化学組成を制御することによって、LayerーbyーLayerに膜を成長させることを主眼に研究を推進している。本年度は、酸化物超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_8単結晶を作製し、そのへき開面上にBi_2Sr_2CuO_6半導体バリアをLayerーbyーLayerに超薄膜を作製して、トンネル接合を作り、トンネルスペクトルの測定を行った。トンネルスペクトルからBi系酸化物超伝導体の超伝導性は、BCS理論の枠内にあるが、従来の超伝導に見られない強い相関の存在が認められた。曽我は、変調構造を持つ湿潤シリカゲルを強酸の水溶液で溶媒置換することによって、ミクロポアを含まないで、しかも高温まで安定な多孔質構造の作製に成功した。この材料は触媒担体としても有用であるために、今後この方向に発展させる計画を持っている。山中は、結晶構造内の界面を原子レベルで制御するために、一連の層間化合物を対象として、新しい機能性の材料の研究・開発を進めている。本年度は、TiO_2ゾル粒子をインタ-カレ-トした粘土層間架橋多孔体を合成し、リチウム2次電池の正極活物質としての利用を検討し、優れた特性を持つことを見いだした。南は、溶融条件や急冷条件を制御することにより、超イオン伝導性αーAgIのガラスマトリックス中への常温凍結に成功した。橋本は、ブロックあるいはランダム共重合体を含む複雑な高分子アロイの相溶性および自己秩序化構造の基礎を明らかにした。岡本は、αーFi_<16>N_2薄膜に於ける巨大磁化発現機構の解明を行い、さらに半導体にイオン注入し、深い準位に関する知見を得た。以上の計画研究の研究成果を中心として、公募研究との連携を取りつつ、研究を推進した。
沿岸生態系における構造転換：高度観測と非線形力学系理論に基づく実証アプローチ

「生態系の構造転換」は生態系の力学的性質の変化がその原因とされる。しかしこの変化を野外で検出した研究例は存在しない。本研究では、沿岸域の魚類群集を主とした全国多地点での高頻度群集観測データと非線形力学系理論に基づくモデリングを利用し、沿岸生態系の構造転換の実証的理解を大きく前進させることを目的とする。具体的には、全国の沿岸生態系を環境DNA手法・潜水目視により高頻度観測し、現場における生態系の力学的性質の変動を評価し、その巨視的パターンと駆動メカニズムを解明する。さらに観測データから生態系の安定性を評価する手法や「構造転換」の予兆を検出する手法の基礎を確立する。
マルチスペクトルイメージングによる透明・半透明物体のモデリングと質感編集

透明・半透明物体の見えは,物体と入射光との相互作用,すなわち,反射・屈折・散乱・吸収などにより豊かな質感を生じる.本研究では,透明・半透明物体と入射光との相互作用が入射光の波長に依存することから,多波長照明や多波長画像,つまり,マルチスペクトルイメージングによる透明・半透明物体のモデリングと質感編集に取り組む.透明感や半透明感の編集技術,ならびに,その要素技術(透明物体の幾何学的特性の推定や半透明物体の光学的・分光学的特性の推定)の開発を通して,透明・半透明物体の質感認知機構の解明の推進に貢献する.透明物体に関しては,水を対象として,水面と水底(水中物体を含む)の形状復元に取り組んだ.具体的には,水は可視光に対して透明であるのに対して,近赤外光に対しては吸収のために半透明であることから,可視光と近赤外光という異なる波長で得られる相補的な手掛かりを統合した形状復元について基礎的な検討を行った.特に,静的シーンを仮定した形状復元技術を開発した.また,マルチスペクトルイメージングにより,分光反射率未知の物体表面上において水を検出する手法も提案した.半透明物体に関しては,半透明物体上で観察される反射成分(鏡面反射成分・拡散反射成分)と散乱成分(表面下散乱成分)の光学的特性の推定に取り組んだ.具体的には,プロジェクタを用いた能動照明の枠組みで,等方的な散乱媒体を仮定して,反射・散乱成分の分離と反射率・散乱特性(点拡がり関数:PSF)の推定の両方に適した投影パターンを設計した.また,外観検査のための半透明物体の表面粗さの推定,および,マルチスペクトルイメージングによる半透明物体の外観検査にも取り組んだ.平成30年度の計画では,水面・水底の形状復元,および,半透明物体の光学的・分光学的特性の推定に取り組む予定であった.これらに加えて,水の検出や半透明物体の外観検査などにも取り組んでいることから,当初の計画以上に進展していると言える.水面・水底の形状復元,および,半透明物体の光学的・分光学的特性の推定を中心に,前年度に開発した技術をブラッシュアップする.透明・半透明物体の見えは,物体と入射光との相互作用,すなわち,反射・屈折・散乱・吸収などにより豊かな質感を生じる.本研究では,透明・半透明物体と入射光との相互作用が入射光の波長に依存することから,多波長照明や多波長画像,つまり,マルチスペクトルイメージングによる透明・半透明物体のモデリングと質感編集に取り組む.透明感や半透明感の編集技術,ならびに,その要素技術(透明物体の幾何学的特性の推定や半透明物体の光学的・分光学的特性の推定)の開発を通して,透明・半透明物体の質感認知機構の解明の推進に貢献する.透明物体に関しては,水を対象として,水面と水底(水中物体を含む)の形状復元に取り組んだ.具体的には,水は可視光に対して透明であるのに対して,近赤外光に対しては吸収のために半透明であることから,可視光と近赤外光という異なる波長で得られる相補的な手掛かりを統合した形状復元について基礎的な検討を行った.特に,静的シーンを仮定した形状復元技術を開発した.また,マルチスペクトルイメージングにより,分光反射率未知の物体表面上において水を検出する手法も提案した.半透明物体に関しては,半透明物体上で観察される反射成分(鏡面反射成分・拡散反射成分)と散乱成分(表面下散乱成分)の光学的特性の推定に取り組んだ.具体的には,プロジェクタを用いた能動照明の枠組みで,等方的な散乱媒体を仮定して,反射・散乱成分の分離と反射率・散乱特性(点拡がり関数:PSF)の推定の両方に適した投影パターンを設計した.また,外観検査のための半透明物体の表面粗さの推定,および,マルチスペクトルイメージングによる半透明物体の外観検査にも取り組んだ.平成30年度の計画では,水面・水底の形状復元,および,半透明物体の光学的・分光学的特性の推定に取り組む予定であった.これらに加えて,水の検出や半透明物体の外観検査などにも取り組んでいることから,当初の計画以上に進展していると言える.水面・水底の形状復元,および,半透明物体の光学的・分光学的特性の推定を中心に,前年度に開発した技術をブラッシュアップする.
EITとDynamic CTを用いて肺障害の程度と換気の関連性を解明する

Acute respiratory distresssyndrome(ARDS)を生じた肺では様々な程度の肺障害が混在して生じる。現時点でComputed Tomography(CT)でその肺障害の程度、局在を静的に評価することはできるが実際にどのように換気されているのかは明らかになっていない。本研究では近年開発された動的に含気を評価できるElectrical impedance tomography(EIT)とCT及びdynamic CTを同条件で同時期に測定、撮影することで肺障害の程度と換気の関連性を明らかにすることを目的としている。研究の初年度には症例収集を行っている。呼吸不全症例の肺は健常肺に比して収縮してしまっている事が多いため実際に撮影した症例のdynamic CTを解析し撮像範囲内に横隔膜の動きによって肝臓などの腹腔内臓器がどの程度映り込んできているかを確認した。本研究の乳頭を基準としたEITの測定範囲内にはおおむね肺野が占めていてDynamic CTでも、EITでも主に肺野の測定、撮影ができることが明らかとなった。年間10例の予定だったが初年度は7例と遅れている。要因としては対象症例が生じた際に担当医もしくはDynamic CTを撮影できる放射線技師が不在のことがあり対象症例で本研究を施行できなかったことが挙げられる。症例収集の遅れが生じた分は必要に応じて3年目にも症例収集を行うことで必要症例数を満たす方針とする。画像データ解析ソフトに関しては初年度は当施設に採用されているソフトウェアで解析することができたため追加で解析ソフトウェアを購入する必要がなかった。2年目、3年目により高度な解析をする際に解析ソフトを購入するために資金を使用する予定である。
生活習慣病における血管内皮特異的オートファジー制御機構の解明

生活習慣病の血管内皮機能変化と、オートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や心血管病への進展にどのような役割をもつのか検討した。血管内皮のオートファジー関連分子を探索したところ、内皮機能に関与する新規オートファジー制御分子群を明らかにした。生活習慣病による影響を、酸化ストレスや伸展刺激を加えた培養血管内皮に再現したところ、オートファジー誘導が見られた。高血圧や高インスリン血症のモデル動物においても、血管内皮のオートファジーを確認した。生活習慣病においては、血管内皮のオートファジー制御を伴う内皮の変容が示唆された。将来の研究開発基盤となる重要な基礎データを得た。本研究では、生活習慣病における血管内皮機能変化と内皮細胞のオートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や脳心血管病への病態進展にどのような役割をもつのか明らかにすることを目的としている。平成26年度には、血管内皮細胞のオートファジー制御に関わる分子の探索を行い、以下の結果を得た。ヒト培養血管内皮細胞にオートファジーを誘導後、DNAマイクロアレイ、プロテインアレイ解析を行い、内皮細胞のオートファジー関連性分子の選定を行った。血管内皮のオートファジー誘導により有為な発現変化を示す分子群を探索したところ、細胞内cyclic AMP (cAMP)の調整に重要なphosphodieseterase type3、発生や組織再生に必要なTGF/BMPシグナルの細胞内調整因子smad,そして細胞生存に関与するpim kinaseを選定した。培養血管内皮細胞において、これら選定分子を強制的に発現調節を行ったところ、オートファジーの制御が見られ、さらには細胞増殖、一酸化窒素(NO)、血管再生能などの血管内皮機能にも関与することが確認できた。アレイ解析データよりさらなる関連分子の選定を進めている。本研究は、生活習慣病における血管内皮機能変化と内皮細胞のオートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や脳心血管病への病態進展にどのような役割をもつのか明らかにすることを目的とする。平成26年度に、血管内皮細胞のオートファジー関連分子をいくつか選定できたが、平成27年度においては核内レセプター関連分子も血管内皮細胞のオートファジー制御に関与することを発見できた(国際学会にて発表)。また、生活習慣病のモデル動物の中で、高血圧モデルラット(SHR)の動脈血管内皮層を電子顕微鏡レベルで観察したところ、オートファジーの誘導が確認できた。高血圧や動脈硬化による影響を、酸化ストレスや伸展刺激を加えた培養血管内皮細胞にて再現したところ、刺激18時間後にオートファジー誘導が見られた。これらの実験結果より、生活習慣病の高血圧においては、血管内皮のオートファジーカスケードが活性化されている可能性がある。近年、高血圧や糖尿病などの生活習慣病との関連が注目されているアルツハイマー病においても血管内皮のオートファジーについて検討を行った。記憶障害が出現している8ヶ月齢のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、海馬領域の電子顕微鏡解析および組織免疫染色を行ったところ、海馬微小血管内皮にオートファジーが誘導されていることを確認した(国内学会招待講演にて発表)。生活習慣病とアルツハイマー病、または脳血管病において、共通する血管内皮の変化、オートファジーが確認できた。交付申請書の平成27年度以降の研究目標に沿って順調に研究を進めている。血管内皮細胞のオートファジ制御に関わる新たな分子を発見し国際学会で発表した。高血圧と血管内皮のオートファジー制御についての研究成果の一部は、国内学会招待講演にて発表を行った。次年度や将来の研究につながる重要な基礎データーを得ることができた。本研究は、生活習慣病における血管内皮機能変化と内皮細胞のオートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や心血管病への病態進展にどのような役割をもつのか明らかにすることを目的とする。平成26年度および27年度以降の研究計画を進めることで、血管内皮細胞のオートファジー関連分子をいくつか選定することができた。今後の研究展開が期待できる新規分子も含まれている。生活習慣病のモデル動物を用いた検討からは、高血圧や高インスリン血症の状態で血管内皮にオートファジーが誘導されることを発見している。培養細胞とモデル動物の実験系から、血管内皮のオートファジーカスケード活性化に伴う内皮機能変化の可能性が示唆された。生活習慣病の関連疾患として注目されるアルツハイマー病のモデル動物においても、脳血管内皮にオートファジーが誘導され、さらには血管内皮機能の変化を示唆する微小血管密度の低下も見られた。認知症の主な原因となるアルツハイマー病においても、生活習慣病と共通した血管内皮の変容が起きている可能性がある(医療・医薬業界誌にて発表)(国内学会にて発表)。これまでの研究実績として、将来の研究開発基盤となる重要な基礎データーを得ることができた。交付申請書の平成27年度以降の研究目標に沿って研究を進めている。一部の研究項目については、追加実験や再現実験が必要となっているが、おおむね順調に進展している。医療・医薬業界からの取材もあり(薬事日報2016秋期特集号)、本研究への関心の高さについても手応えを感じている。将来の研究開発につながる重要な基礎データーを得ることができた。

生活習慣病の血管内皮機能変化と、オートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や心血管病への進展にどのような役割をもつのか検討した。血管内皮のオートファジー関連分子を探索したところ、内皮機能に関与する新規オートファジー制御分子群を明らかにした。生活習慣病による影響を、酸化ストレスや伸展刺激を加えた培養血管内皮に再現したところ、オートファジー誘導が見られた。高血圧や高インスリン血症のモデル動物においても、血管内皮のオートファジーを確認した。生活習慣病においては、血管内皮のオートファジー制御を伴う内皮の変容が示唆された。将来の研究開発基盤となる重要な基礎データを得た。本研究は、生活習慣病における血管内皮機能変化と内皮細胞のオートファジー制御機構の関連性を探り、血管内皮のオートファジーが動脈硬化や心血管病への病態進展にどのような役割をもつのか明らかにすることを目的とする。研究計画を進めることで、血管内皮細胞のオートファジー関連分子をいくつか選定することができた。平成29年度の延長期間には、確認実験や、追加実験を行い、血管内皮の性ホルモン関連分子など研究展開が期待できる新規分子の発見にもつながっている(国際学会発表American Hear Association Scientific Session 2017)(招待講演日本高血圧学会2017)。生活習慣病のモデル動物を用いた検討からは、高血圧や高インスリン血症の状態で血管内皮にオートファジーが誘導されることを発見している。培養細胞とモデル動物の実験系で、血管内皮のオートファジーカスケード活性化に伴う内皮機能変化の可能性も明らかになった。生活習慣病の関連疾患として注目されるアルツハイマー病のモデル動物においても、脳血管内皮にオートファジーが誘導されており、生活習慣病と共通した血管内皮の変容が起きている可能性がある(招待講演Veterans Affairs Palo Alto Health Care System 2017)。このように将来の研究開発基盤となる重要な基礎データを得ることができた。交付申請書の平成26年度の研究目標に沿って順調に研究を進めている。血管内皮細胞のオートファジー制御に関わるいくつかの候補遺伝子を発見できた。また、生活習慣病研究や、大規模なデータ解析、データベースの構築で著名な米国研究機関にて、招待講演の機会を得て、本研究成果の一部を未発表データとして発表した。基礎、臨床の著名な研究者との交流もあり、今後の研究推進に重要な種々のアドバイスやフィードバックを得ることができた。平成27年度以降の研究計画において、まだ検討ができていない研究項目を進める予定である。生活習慣病の糖尿病モデルでの検討、虚血モデルでの検討、脳梗塞モデルでの検討が含まれ、血管内皮のオートファジー制御の解明を行う。平成27年度以降の研究計画において、確認実験が必要となった研究項目を進めるとともに、論文発表の準備を行う。血管分子生物学平成26年度の研究計画において得られた結果に対し確認実験(マイクロアレイ、プロテインアレイを含む)、さらなる関連分子の選定、そして平成27年度以降の研究計画に沿って、以下の研究を推進する予定である。(1)生活習慣病のモデル
ゲノム組み換え酵素RAG2の機能解析

V(D)J組み換え酵素RAG2の全長タンパク質を精製しその機能解析行うため、昨年度は改良型無細胞タンパク質合成法での発現に成功したが、得られた精製タンパク質は活性を有さなかった。そこで今年度はメタノール資化酵母、Pichia pastorisを使った系を採用し全長RAG2タンパク質の精製を試みた。Pichia pastorisはタンパク質の大量発現を簡便かつ低コストで達成できる発現系として知られている。成功すれば構造解析や点変異体の解析への応用も期待できるため本方法を採用した。まず、メタノールで発現を誘導できるAOX1プロモーターを有するpPICベクターに全長RAG2遺伝子をN末にHis x6タグ、C末にmycタグをつけた形でサブクローニングした。次にこのベクターを相同組み換えでPichia pastorisゲノムに導入し、マーカーによる選択で組み換え酵母を作成した。メタノール添加により誘導すると、RAG2タンパク質の発現が認められた。Ni-NTAカラムによりタンパク質を精製し、これを用いてDNA切断活性を行った結果、特異的切断の検出に成功した。Hela細胞より精製したC末を欠くRAG2のDNA結合活性・切断活性と比較してPichia pastoris由来全長RAG2タンパク質の切断活性は決して高くはないが、培養細胞を用いた系より簡単にスケールを増やせるので今後は精製方法を改良し、組み換えシグナル配列の微妙な相違点の認識や順序の制御、及びDNA修復にも関与すると思われるC末側の機能解析を行う予定である。本研究では活性制御領域を含む全長のRAG2を精製し、C末部位によるV(D)J組み換え制御の分子機構を解明するごとを目的としている。平成13年度はまず、改良型無細胞タンパク質合成法を用いて全長のRAG2の精製を試みた。本方法はタンパク質合成阻害因子の混入が少ない小麦胚芽抽出液を用いており、さらに重層法を用いることで従来のバッチ法に比べ510倍の合成効率でタンパク質合成を行うことが可能とされている(PROTEIOS)。成功すれば簡単に高収量が得られると予想され(一回の反応で最大20μg)、様々な点変異体の解析への応用も期待できるため本方法を採用した。まず、タバコモザイクウイルス由来翻訳増強配列(Ω配列)を有するpEU系ベクターに全長RAG2遺伝子をN末にHis x6タグ、C末にmycタグをつけた形でサブクローニングした。次にT7 RNAポリメラーゼを用いてmRNAを合成し、重層法にて翻訳反応を行い、翻訳物はNi-NTAカラムで精製した。様々な改良・試行錯誤の結果、最終的に約1μg程度の精製RAG2タンパク質を得ることに成功した。Hela細胞より精製したC末を欠くRAG2は1反応あたり1ngでも十分にDNA結合活性・切断活性を有するので、機能解析には十分量を精製することに成功したといえる。しかし、これを用いてDNA結合活性・切断活性を測定した結果、両活性とも有さないことが判明した。タンパク質は可溶性であるので、おそらく翻訳後修飾、特にリン酸化状態の問題ではないかと考えられる。そこで、現在2つのアプローチをとっている。一つは、活性のないRAG2をカゼインキナーゼIIで活性化させることができるかどうかを問うこと、もう一つは系を変更して違うアプローチをとることである。後者に関してはPichia pastorisを使った系を採用し、現在、発現ベクターへのサブクローニングを行っているところである。
ダイズにおける紫外線UV-B耐性機構とシグナル伝達の分子的解析

1、ダイズにおける紫外線UV-B応答性MYB転写因子GmMYB29B1の機能解析(1)転写因子GmMYB29B1の転写活性化機能を担ったドメインを酵母の実験系で探索したところ、C末端における30アミノ酸残基が必要かつ十分であった。(2)大腸菌で発現させたGmMYB29B1のDNA結合領域はターゲット遺伝子CHS(chalcone synthase)のプロモーターに存在するH-box配列を特異的に認識することがin vitro実験系(EMSA)で明らかとなった。(3)マメ科植物のウイルスベクター(pClYVV)にB1を挿入したプラスミド構築を作成し宿主ソラマメに接種したところ、アントシアニン蓄積量とCHS発現量の増大が見られた。これより、B1がin vivoにおいてもCHSの発現調節因子として働くことが明らかとなった。2、窒素栄養欠乏応答性MYB転写因子の遺伝子クローニング(1)窒素栄養欠乏応答性MYBとしてミヤコグサより3つの遺伝子(LjMYB101、LjMYB102、LjMYB103)、ついでLjMYB101にオーソロガスなダイズ遺伝子(GmMYB101)を単離した。これらは全てMYBスーパーファミリーのグループ10に属し、機能的に関連した遺伝子群であることが示唆された。(2)LjMYB101は地下部、LjMYB103は地上部において、それぞれ窒素栄養欠乏に応答した顕著な発現上昇を示した。両者は系統的にも極めて近縁であり、マメ科植物において組織特異性を獲得して機能分化したものと推測された。(3)大腸菌で発現させたLjMYB101のDNA結合領域はGmMYB29B1と同様にH-box配列を含むMYB Type IID配列を認識した。LjMYB101はこれに同調して発現上昇するCHSとGln1の転写因子として働く可能性が示唆された。本研究ではUV-Bシグナル伝達経路の解明を目的とし、紫外線UV-Bにより発現上昇する転写因子GmMYB29B1を「つりエサ」としてこれを認識するタンパク質を同定する為にYeast two-hybridシステムを用いた実験を進めた。Yeastの転写因子であるGAL4のDNA結合領域(BD)にGmMYB29B1のコード領域(B1)をつないだプラスミド構築と、GAL4の転写活性化領域(AD)にターゲットとなる任意のcDNA(X:ダイズ胚軸由来の約100万個のcDNAのライブラリー)をつないたプラスミド構築を行った。Yeast細胞内においてGmMYB29B1を認識するcDNAをスクリーニングする作業を開始したところ、BD-B1が単独で転写機能を発現を誘導し、そのままてはスクリーニングを行うことが出来ないことが判明した。そこで転写活性化機能をを削除したB1変異体の作製を試みた。その結果、B1のC末端側の特定領域の酸性アミノ酸を置換することによって機能が著しく減退することが判明した。現在はこのようにして得られたB1変異体を用いたスクリーニングを行っている。また、ダイズにおけるChryptochrome遺伝子の分子的解析とそのUV-Bシグナル伝達との関わりを解析することを第二の目的とし、ダイズChryptochrome遺伝子のクローニングと発現解析を行った。