hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肥大型心筋症の成因に低分子量G蛋白質RasP21が関与する一免疫組織学的ならびにInSitu Hydridizationを用いたアプローチ-

近年、受容体を介する細胞膜情報伝達系の多くは、GTP結合蛋白質(G蛋白質)をトランスデュサーとして、種々の効果器と共役していることが明らかとなった。G蛋白質は3量体G蛋白質と低分子G蛋白質に分類される。低分子G蛋白質の1つであるRas p21は発癌、細胞増殖と密接に関係する。心筋細胞の強力な成長因子であるカテコールアミン等もRas p21と共役した受容体を通じて情報伝達することにより機能している。肥大型心筋症の特徴的組織所見は心筋細胞の肥大と錯綜配列および線維化である。特に錯綜配列は1種の良性腫瘍性変化であるので、肥大型心筋症の成因に腫瘍と関連したRas p21が関与するという仮説を考えた。この仮説を証明するために、ヒト肥大型心筋症30例、正常心7例、拡張型心筋症20例の心内膜心筋生検組織を対象に低分子量G蛋白質Ras p21(cH-rasおよびN-ras)ならびにその遺伝子の発現を免疫組織学的手法とin situ hybridization法を用いて検討した。その結果、以下のことが明らかとなった。1.低分子量G蛋白質Rsa p21の1つであるcH-rasは、正常心では発現がみられなかったが、HCMの70%、DCMの65%で発現していた。このcH-ras発現の程度は心筋細胞の肥大ならびに線維化の程度と相関した。しかし、錯綜配列との関連については、心生検組織中に高度の錯綜配列のある症例が少なく、検討できなかった。2.他のRas p21であるN-rasは、正常心、肥大型心筋症、拡張型心筋症ともに発現し、3群間で差がなかった。以上より、低分子G蛋白質Ras p21のうちcH-rasの発現が心筋症における心筋細胞の肥大、線維化等の病態に関与すると結論した。
骨格筋における免疫学的微小環境と筋機能

骨格筋の肥大・再生過程特異的なECMおよびその関連分子の発現動態ならびに発現制御機構の検証を目的とする。本年度までに見出したilaminin-beta3は骨格筋の肥大刺激および損傷再生過程においてのみ発現が骨格筋で誘導される分子である。筋損傷12時間から24時間でこの発現は増加し、それに伴いAkt、コラーゲンの発現も増加していた。その機能抑制のために中和抗体を筋注したところ、laminin-beta3の発現は増加し、それに伴いAktの発現も増加した。これはlaminin-beta3の活性低下に代償作用がはたらいたのではないかと考えられると同時に、laminin-beta3によるAkt発現調節が再生筋において強く考えられる。また、再生過程において線維芽細胞の増殖と小胞体ストレスの増加が認められ、線維芽細胞ならびに線維芽細胞の小胞体ストレスがlaminin-beta3の発現と関係することが示唆された。また、laminin-beta3とヘテロ三量体を形成するlaminin-alpha3, laminin-gamma2の増加も認められ、そのヘテロ三量体の受容体であるintegrin-alpha6-beta4の発現も増加しており、これらのシグナルカスケードが筋再生に重要であることが示唆された。今後これらのlaminin-integrinカスケードや線維芽細胞の増殖および小胞体ストレスが実際に筋再生過程に関与するかどうか、またどのように関与するのかを明らかにしていく平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度では骨格筋の質を規定する分子の探索として運動によって増加する代謝産物/細胞外マトリックスを同定することを目標とした。上記の目的のために、まずC57BL6Jマウスにいくつかの運動モデル(ランニングホイール、トレッドミル走、代償性過負荷)で増加し、筋萎縮・病態モデル(除神経、不使用、糖尿病)で減少するような分子の探索を網羅的に行い、クラスター解析を実施した。その結果、上記のような変化をするクラスターを見出しそのクラスターには骨格筋での発現が全く報告されていない細胞外マトリックス分子を多数含んでいた。qPCRにて発現変動を確認したところ、運動筋で発現増加/病的筋で発現減少する分子としてLaminin-332が同定された。非常に興味深いことにLaminin-332のレセプターであるインテグリンα6β4もその遺伝子発現量が増加しており、これらのシグナル経路が骨格筋の質を規定していることが推察された。しかしながらこれらの因子の発現レベルは決して高くなかったため、タンパク質レベルでの発現を確認したところ、Laminin-332の構成分子であるlaminin3bは通常筋ではかすかに発現しているが、代償性過負荷によってその発現が爆発的に増加し、除神経によってその発現がほとんど認められなくなった。Laminin-332は上皮組織においての発現が報告されているが骨格筋での発現の報告はなく、またその発現変化の程度の大きさから代償性過負荷による筋肥大/筋再生において重要なはたらきをしていることが考えらえた。また、Lamini-3bの局在を免疫染色にて観察すると、マクロファージの周辺で強いシグナルが観察され、マクロファージの性質を制御しているもしくはマクロファージが産生している可能性が示唆された。細胞外マトリックスの探索において、運動だけではなく疾患モデルを併用することで候補分子の同定が非常に効率的にすすめることができた。その結果、骨格筋の質を規定することが考えらえるLaminin-332-integrina6b4経路の同定につながり、またその変化の大きさから極めて重要なはたらきをしている可能性が示され新たな作業仮説の構築につながった。この点においては順調に進んでいる。しかしながら、メタボローム解析は勧めておらず、この点を含めてやや遅れていると考える。本年度は骨格筋でダイナミックなリモデリングが引き起こされる筋損傷モデルを用いた検討を行った。筋損傷の方法としてカーディオトキシンを使用し、筋損傷7日、14日、21日、28日後のタイムコースを設け、それぞれの筋凍結切片を蛍光免疫染色で観察したところ7日後のサンプルでのみ細胞膜上でラミニンbeta-3の発現が確認された。このことからラミニンbeta-3は損傷初期に発現が上昇することが明らかとなった。筋損傷時のラミニンbeta-3の詳細な発現動態を確認するために短いタイムコース(1, 3, 6, 12, 24時間)を設定し解析を行ったところ、損傷12時間後よりラミニンbeta-3は上昇し、24時間後も上昇したままであった。さらに、ラミニンbeta-3の下流で制御されているp44/42(ERK)やAktの発現も確認したところAktはラミニンbeta-3と同様の発現パターンを示しており、骨格筋におけるラミニンbeta-3 Akt経路が存在することが示唆された。この経路の詳細な分子メカニズムを検討するために、ラミニンbeta-3中和抗体をカーディオトキシンと共に筋中に投与したところ、中和抗体濃度依存的にラミニンbeta-3の発現が上昇した。下流にあるAktの発現量はラミニンbeta-3と同様に濃度依存的に発現量が上昇した。Aktの下流にあるタンパク質合成に関与するシグナルの発現量には影響を及ぼさなかったものの、タンパク質分解に関与するFoxoタンパク質の発現量は中和抗体濃度依存的に上昇した。

以上の結果から、筋損傷時に骨格筋で発現するラミニンbeta-3は、損傷初期(12時間後)より発現が上昇し、それに伴って下流の分子であるAkt-Foxo経路を制御していることが明らかとなったため、タンパク質分解経路を制御する上流因子である可能性が示唆された。上皮組織特異的なラミニンの発現が筋肥大時・筋再生時に発現誘導されること、その受容体と考えられる分子並びにその下流のシグナル経路は見出せたものの、それらの分子・カスケードが実際に筋肥大や筋再生にどれだけ関与するのかといった機能解析まで行えていない。コマーシャルベースの抗体がほとんど存在せず、しっかりとワークする抗体が1つのみであったがそのメーカーが抗体の作成を見合わせていることが原因である。現在他社の抗体を試すと同時に抗体作成及び代替法の模索を行っており、それが完了次第、機能解析に着手する。骨格筋の肥大・再生過程特異的なECMおよびその関連分子の発現動態ならびに発現制御機構の検証を目的とする。本年度までに見出したilaminin-beta3は骨格筋の肥大刺激および損傷再生過程においてのみ発現が骨格筋で誘導される分子である。筋損傷12時間から24時間でこの発現は増加し、それに伴いAkt、コラーゲンの発現も増加していた。その機能抑制のために中和抗体を筋注したところ、laminin-beta3の発現は増加し、それに伴いAktの発現も増加した。これはlaminin-beta3の活性低下に代償作用がはたらいたのではないかと考えられると同時に、laminin-beta3によるAkt発現調節が再生筋において強く考えられる。また、再生過程において線維芽細胞の増殖と小胞体ストレスの増加が認められ、線維芽細胞ならびに線維芽細胞の小胞体ストレスがlaminin-beta3の発現と関係することが示唆された。また、laminin-beta3とヘテロ三量体を形成するlaminin-alpha3, laminin-gamma2の増加も認められ、そのヘテロ三量体の受容体であるintegrin-alpha6-beta4の発現も増加しており、これらのシグナルカスケードが筋再生に重要であることが示唆された。今後これらのlaminin-integrinカスケードや線維芽細胞の増殖および小胞体ストレスが実際に筋再生過程に関与するかどうか、またどのように関与するのかを明らかにしていく昨年度見出したLaminin-b3の発現変化に関して、代償性過負荷モデルを使って経時的な発現変化の検証を行う。ウェスタンブロット、qPCRによる発現解析のほかに組織切片を作成し、組織学的変化ならびに免疫染色、FISHによって発現部位および発現細胞の同定を試みる。このとき、Laminin-b3の発現部位の近傍に存在するマクロファージの性質を表面抗原を用いた免疫染色またはマイクロダイセクションによって細胞を単離後シングルセルqPCR法などによって解析する。上記研究によってLaminin-b3(laminin-332)の重要性がより強固なものとなったら、Laminin-332が骨格筋に含まれる細胞にどのような影響を与えるのかを検討する。具体的にはマウス骨格筋を酵素処理することによって単核細胞を回収する。
Ｂｔ毒素の進化を模倣した、殺虫タンパク質の人為的改変

今年度は4つの課題を並行して研究を進めた。1Bt毒素新規受容体探索系の改良:昨年度構築した探索系が有効かどうかを調べるために、LC-MS/MSを用いて解析したところ、リポカリンなどのCry1Aa毒素に結合することが既知のタンパク質が検出されたが、期待していたABCトランスポーターC2(ABCC2)は検出されなかった。2Sf9細胞上のCry1Ca受容体候補の推定:Spodoptera frugiperdaの卵巣由来の培養細胞であるSf9細胞はBt毒素の一種であるCry1Caに感受性を示す。そこでCry1Caの受容体同定を目指し、Sf9細胞上に発現するABCトランスポーターfamily分子の配列をPCソフトを利用して解析したところ、18個のSfABCトランスポーター配列が予測できた。3ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析:ABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸残基が存在するBt毒素上の領域を異なるBt毒素間ですげかえた変異体を構築したが、毒素の活性化に必要なトリプシン処理に対する耐性を失っており、続く実験に用いることができなかった。現在、別の手法による変異体の構築を急いでいる。4タンパク質工学実施のためのファージパニング手法の改良:本研究で用いるABCトランスポーターにはC末端にFLAGタグが融合される。そこで抗FLAG抗体を提示するプレートやビーズを担体として用いることにし、ABCトランスポーターの安定的可溶化条件や、担体への固定化条件、ファージの担体への非特異的結合を防ぐ方法などを求め、試行錯誤を重ねた。その結果、抗FLAG抗体提示磁気ビーズを用い、UV照射によりDNAを破壊し増殖できないようにしたファージ(UVファージ)をブロッキング剤として高濃度で用いることでファージパニングが可能であることが明らかとなった。本研究の主軸のひとつであるBt新規受容体探索系が予想以上に難航しているが、クリアすべき課題がより具体的に見えてきている。また、本研究の最終目標であるタンパク質工学のためのファージパニング手法の改良を無事に終えた。ゆえに総合的に見れば、研究はおおむね順調に進展していると言えるだろう。各課題の詳細な進捗状況を以下に述べる。1Bt毒素新規受容体探索系の改良:抗ABCC2抗体を用いたウエスタンブロッティングでは検出できていることから、LC-MS/MSで検出するにはABCC2の絶対量が足りなかった、もしくはリポカリンなどの多量のタンパク質にマスクされ検出できなかった(相対量が足りない)のではないかと考えられた。2Sf9細胞上のCry1Ca受容体候補の推定:現在HEK293T細胞での異所発現システムを使用して、予測配列が得られたこれらのSfABCトランスポーターがCry1Caの機能的受容体として作用できるかどうかを分析している。3ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析:現在、別の手法による変異体の構築を急いでいる。具体的にが活性化状態で組換え大腸菌に毒素を産生させる方法、活性化しない前駆体状態の毒素のまま結合親和性解析に用いる方法、受容体結合に関連するドメインIIの部分のみ発現させる方法を考えた。このうち、活性化しない前駆体状態の毒素のままでは結合親和性解析することが難しいことが明らかとなった。現在残る2つの方法を実施するべく準備を急いでいる。4タンパク質工学実施のためのファージパニング手法の改良:UVファージの高濃度濃縮に手間がかかるのが難点だが、ファージ選抜時に非特異的結合を抑えるのに重要な要因であることが明らかになったため、調整を怠らないように注意している。新規受容体探索系の構築が予想以上に困難であり、最終年度までもつれ込んでいる。ゆえに探索系に関しては当初の予定を変更し、受容体既知のCry1Aa毒素の受容体(特にABCトランスポーターfamily分子)がLC-MS/MSで検出てできるような、モデル実験系の構築を目指す。具体的には、Cry1Aaの受容体であるカイコガのABCC2がLC-MS/MSで検出できるように濃縮し、毒素と結合能をもつだけの非受容体タンパク質と分けるための方法を決定し、モでル実験系の構築を急ぐ。一方で、新規受容体の推定法として昨年度実施していた、昆虫培養細胞Sf9細胞上のABCトランスポーターfamily分子の推定とクローニングが順調に進んでいる。Cry1Caの受容体となりうるかどうかをHEK293T細胞による異所発現系で急ぎ解析し、論文としてまとめ発表する。昨年度までの結果から毒素のループ根元の部位にABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸が存在していることが示唆されている。毒素間でもそれが共通しているか、毒素間でループ根元領域をすげ替えた変異体作製を急ぎ、結果をまとめ、論文として発表する。また、Sf9細胞はCry1Caには感受性だがCry1Aaには非感受性である。また、本研究の主軸のもうひとつである、Bt毒素の人為的改変を実際に実施する。土壌細菌が産生するBt毒素は昆虫側の受容体と特異的に結合することで高い殺虫特異性を生じる。今までの研究からBt毒素が昆虫側の受容体に結合できるよう変異を重ね、進化してきたことが考えられた。しかし受容体が明らかになっているBt毒素はごく一部である。本研究はBt毒素が利用できる受容体をより多く明らかにし、タンパク質工学的手法によるBt毒素の人為的改変の方法論を確立することを目的とする。本年度は3つの内容を主軸に研究を進め、以下のような成果を得た。

1. Bt毒素新規受容体候補同定のための受容体探索系の構築:当初計画していた方法では受容体とは考えにくい雑多なタンパク質(夾雑物)ばかりが検出され、既知の受容体すら検出できなかったことから、夾雑物を減らし目的とする受容体候補分子を濃縮する、新しい探索系の構築を試みた。外注先の質量分析計が故障した関係で最終的な確認はできていないが、代表的なBt毒素Cry1Aaの既知の受容体であるABCトランスポーターC2 (ABCC2)を検出できる、新しい探索系が構築されつつある。2.新規受容体候補分子の受容体機能の評価:先行研究で新規受容体候補として報告されていたABCトランスポーターA (ABCA)を発現させた培養細胞はBt毒素の一種であるCry2AaおよびCry2Abに対する感受性を示した。ゆえにABCAはCry2AaおよびCry2Abの機能的な受容体であることが示唆された。3. ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析:筆者の先行研究を基にさらなる解析を続けたところ、Cry1Aaのループ2、3の根元の領域のある決まった範囲に、細胞傷害活性や結合に重要なアミノ酸残基が何点か存在することが明らかになった。本研究の最終目標であるタンパク質工学的手法によるBt毒素の人為的改変の方法論の確立に向けた準備を着実に進めている。特に「3. ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析」において、ABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸残基がABCトランスポーターと結合できるBt毒素間で保存されている傾向があることが明らかになった。すなわち今後のタンパク質工学ではBt毒素のこの領域を改変すれば、受容体との結合親和性が高い毒素変異体を得られる可能性が高いという感触をつかんだことになる。また「1.新規受容体の同定に用いる新しい探索系の構築」に成功しつつある。系の再構築をしていた関係で、受容体が既知のBt毒素でしか実験できておらず、本目的である受容体未知のBt毒素を用いた解析には至っていないが、本来計画していた探索系における問題発覚から半年でそれに換わる探索系を構築できたことは大きい。今年度は4つの課題を並行して研究を進めた。1Bt毒素新規受容体探索系の改良:昨年度構築した探索系が有効かどうかを調べるために、LC-MS/MSを用いて解析したところ、リポカリンなどのCry1Aa毒素に結合することが既知のタンパク質が検出されたが、期待していたABCトランスポーターC2(ABCC2)は検出されなかった。2Sf9細胞上のCry1Ca受容体候補の推定:Spodoptera frugiperdaの卵巣由来の培養細胞であるSf9細胞はBt毒素の一種であるCry1Caに感受性を示す。そこでCry1Caの受容体同定を目指し、Sf9細胞上に発現するABCトランスポーターfamily分子の配列をPCソフトを利用して解析したところ、18個のSfABCトランスポーター配列が予測できた。3ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析:ABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸残基が存在するBt毒素上の領域を異なるBt毒素間ですげかえた変異体を構築したが、毒素の活性化に必要なトリプシン処理に対する耐性を失っており、続く実験に用いることができなかった。
心筋細胞α_1受容体サブタイプと機能調節シグナル伝達分子機構

心筋細胞α_1受容体は,種々の哺乳類心筋細胞において,単収縮時間延長と収縮蛋白質Ca^<2+>感受性増強に伴われた特徴的な陽性変力作用を惹起する。一方,心筋細胞α_1受容体は,心筋細胞肥大や虚血再灌流時の不整脈発生に関与していることが明らかになり,その病態生理学的意義の重要性が認識されてきている。α_1受容体刺激は,イノシトールリン脂質(PI)代謝を促進し,その結果inositol 1,4,5-trisphosphate(IP_3)とdiacylglycerol(DGA)を生成する。ウサギ心室筋細胞においてはα_<1B>サブタイプが約60%を占め,主として陽性変力作用とPI代謝促進に共役されている。残りの約40%はα_<1A>サブタイプに属するが,α_<1D>サブタイプの存在も心筋細胞で確認されている。今年度の研究においてα_<1A>サブタイプは陽性変力作用とともに,PI代謝促進を伴う陽性変力作用に対して抑制性効果をも引き起こすことを明らかにし,その機序の詳細を分析した。α_1アゴニスト・メトキサミンは,PI代謝促進を起こすエンドセリン(ET-1, ET-3)の陽性変力作用を抑制した。この抑制効果は,α_<1B>遮断薬クロルエチルクロニジンの存在下でも起こり,WB 4101や(+)-タムスロシンで拮抗されるので,α_<1A>サブタイプ刺激を介して起こるものと考えられる。さらに[Ca^<2+>]_o上昇,Bay k 8644,ホルスコリンなどの陽性変力作用はメトキサミンで影響を受けず,またエンドセリンによるPI代謝促進はメトキサミンで阻害されないので,メトキサミンンの抑制効果はPI代謝促進以降のシグナル伝達過程で発揮されるものと推定される。このように本研究の結果はα_<1A>受容体が,陽性変力作用のみならず陰性変力作用にも共役されており,その受容体はメトキサミンで効果的に刺激されることを示す。またフェニレフリンは抑制性α_<1A>受容体サブタイプに対してメトキサミンほど効果的なアゴニストではないことが示された。心筋細胞α_1受容体は,種々の哺乳類心筋細胞において,カテコールアミンの陽性変力作用を仲介している。心筋細胞α_1受容体は,心筋細胞肥大や虚血再潅流時の不整脈発生に病態生理学的意義をもち,そのシグナル伝達機構に対する興味はにわかに高まった。心筋細胞においても,α受容体刺激は,イノシトールリン脂質(PI)代謝を促進し,その結果生ずるinositol 1,4,5-trisphosphate(IP_3)とdiacylglycerol(DGA)の細胞機能調節における生理的意義が,推定されている。本研究では,心筋細胞収縮性を機能制御の指標として,PI代謝促進と収縮性修飾の特徴の関連性を,選択的α受容体アゴニストおよびアンタゴニストをもちいて検索した。ウサギ心室筋細胞においてはα_<1B>サブタイプが約60%を占める。このサブタイプはPI代謝促進に共役されており,クロルエチルクロニジン(10^<-7>-10^<-5>M)により選択的に拮抗される。一方,α_<1A>サブタイプは,(1)PI代謝促進に共役したWB 4101感受性受容体と,(2)PI代謝には共役していないが,フェレフリン(PE)の最大反応に関与している(+)-niguldipine感受性受容体が存在する。WB 4101および5-メチルウラピジルによる前者の受容体遮断は,PEの濃度反応曲線の右方平行移動を起こす。WB 4101は,PEによるPI代謝促進の約40%を遮断する。後者の受容体遮断は,PEの最大反応の約20%の抑制を引き起こす。Denopamineや低濃度のHV723は,後者の受容体サブタイプを選択的に遮断する。さらに,選択的α_<1A>サブタイプアゴニストのメトキサミン(ME)は,PI代謝促進作用とともに,α_<1A>サブタイプ刺激を介して,PI代謝促進にともなわれた陽性変力作用を,PI代謝促進作用に影響を与えずに,選択的に阻害する作用をもつことを見いだした。この作用は,受容体間のクロストークの可能性を示唆する重要な調節機序であることが推定され,現在さらにその調節の生理的意義を追求中である。

今年度の研究においてα_<1A>サブタイプは陽性変力作用とともに,PI代謝促進を伴う陽性変力作用に対して抑制性効果をも引き起こすことを明らかにし,その機序の詳細を分析した。α_1アゴニスト・メトキサミンは,PI代謝促進を起こすエンドセリン(ET-1, ET-3)の陽性変力作用を抑制した。この抑制効果は,α_<1B>遮断薬クロルエチルクロニジンの存在下でも起こり,WB 4101や(+)-タムスロシンで拮抗されるので,α_<1A>サブタイプ刺激を介して起こるものと考えられる。さらに[Ca^<2+>]_o上昇,Bay k 8644,ホルスコリンなどの陽性変力作用はメトキサミンで影響を受けず,またエンドセリンによるPI代謝促進はメトキサミンで阻害されないので,メトキサミンンの抑制効果はPI代謝促進以降のシグナル伝達過程で発揮されるものと推定される。このように本研究の結果はα_<1A>受容体が,陽性変力作用のみならず陰性変力作用にも共役されており,その受容体はメトキサミンで効果的に刺激されることを示す。またフェニレフリンは抑制性α_<1A>受容体サブタイプに対してメトキサミンほど効果的なアゴニストではないことが示された。
トーラスプラズマのHモード輸送障壁形成の定量的研究

昨年度までに、バリア構造のモデルを開拓し、乱流輸送の抑制の検証法を構想した。そして、電場形成・遷移および乱流抑制の実験検証を進めた。また、電場曲率効果について、当初定式化した機構だけではなく、独立な機構の重要な働きも見出した。計画は極めて順調に進展し、予想以上の広がりが実現している。非線形構造である振動型の帯状流によって、乱流塊が捕捉され輸送障壁内に侵入する現象も解析し、輸送障壁内部での揺動の起源の一つとして定式化した。さらに何十年も未解明だった問題(装置容器の材料や給気法が主プラズマの閉じ込めに影響する実験事実)にも研究を拡張した。かねてより代表者らは閉じ込め装置の壁材がH-モードの閉じ込め改善度に影響する上で中性粒子の役割を指摘してきた。その考えを拡張し、粒子補給によって生み出される乱流揺動を解析した。その結果、粒子補給量がプラズマ閉じ込めに影響すること、この機構が生成されたH-モードをより安定状態ならしめることなどを見出した。別の未解明問題としては、H-モード遷移の閾値より低い入力状態でプラズマ中央部での崩壊現象が起きると、それに付随してH-モード遷移が起きるという実験観測が30数年知られて居る。従来は、崩壊現象による熱パルスが「不足していた」パワーを補うことが原因だろうと考えられていたが、大型装置での実験の詳細分析の結果、乱流塊と急峻な径電場の伝播が遷移を引き起こして居ることを実証した。こうした改善閉じ込め現象などに関する成果は、何十年来知られていた未解明問題に取り組む新たな糸口となると期待される。さらには、乱流がプラズマ中のプラズマ断面の一部分に乱流が局在すること(H-モードに重要な働きを持つ可能性を代表者らが理論的に指摘している)のレビューを出版し、今後の研究者への指針を与えた。粒子補給によって生み出される乱流揺動を解析し、この機構が生成されたH-モードをより安定状態ならしめることなどを見出した。また、H-モード遷移の閾値より低い入力状態でプラズマ中央部での崩壊現象が起きると、それに付随してH-モード遷移が起きるという現象について、乱流塊と急峻な径電場の伝播が遷移を引き起こして居ることを観測し論文原稿にとりまとめた。こうした成果は、何十年来知られていた未解明問題に取り組む新たな糸口となると期待される。予想以上に進展して居ると結論する。2018年度までの成果に立脚し、2019年度には、次のようなテーマについて選び研究を進める。(1)理論モデルと実験との比較が進められ、揺動計測の実験データ解析も充実しつつある。この流れをさらに充実させ、研究統合を発展させる。(2)次に、輸送障壁内の乱流輸送を研究する。乱流塊が移送される過程として測地線音波(メゾスケール電場の一種)と呼ばれる揺動に昨年より着目しているが、それに加え、径電場の曲率による乱流排斥の効果も検討する。かねてより分担者らによって、複数の種類の乱流揺動が存在しうる場合、イオンスケールの揺動が径電場で抑制されると、さらに波長の短い揺動が逆に増える可能性があることが理論的に指摘されており、そうした問題も考察する。輸送障壁が、空間的に、または時間的に、二段階の遷移を示す可能性もあり研究を進める。(3)粒子補給に伴う乱流駆動という新しい機構に着目することによって、輸送障壁がより安定化される機構を理論的に研究する。(4)トカマクでは内部崩壊現象が起きると、中心部から周辺部へエネルギーが急に放出され、H-モード遷移に影響することが知られている。乱流塊と急峻な径電場の伝播が遷移を引き起こして居ることを観測した。その物理機構を研究する。(5)これまでの研究によって培われた輸送障壁の描像を、さらに広い自然界の問題に応用し波及効果を増すことにも務め、そのために分担者を増員する。国際共同データ解析の活動もふくめて、本計画で示される物理モデルの第一原理的な実験観測の方法も考察を続ける。実験研究・観測を指導している。それらの国際的共同実験研究のとりまとめにも寄与する。理論・実験等について得られた成果を取りまとめ、成果の発信に努める。この研究は、先進的プラズマ乱流物理学の成果に立脚し、核融合研究の高温磁場閉じ込めプラズマのH-モードの定量的モデル構築を目的とする。代表者らが創始した径電場分岐理論に立脚し、最新のマルチスケール乱流物理学を取り入れ、H-モード理論を完備する。電場曲率の重要性や遷移の時定数など、空間・時間の双方から国内外のトカマク実験と比較し、検証を行う。H-モードの輸送障壁の形成機構や構造の定量的モデルを提示し、核融合燃焼プラズマ研究や制御のための学理基盤を構築する事を目指す。この目的に向けて、理論研究および実験的研究を進めて大きな成果を得た。バリア構造の理論を改革し、電場曲率の重要性を定量的に示した。乱流抑制への効果に関する評価式を研究し、電場勾配および電場曲率の双方を含む形に定式化する事に成功した。この式を用いれば、乱流輸送の抑制を実験で定量的に検証出来る事を示した。その結果を用い、JT-60Uトカマクでの詳細電場計測実験結果にもとづき、乱流輸送の抑制を実験で定量的に検証した。

その結果、輸送障壁を形成するために、電場曲率が本質的な役割りを果たしている事を具体的に示した。更に、代表者らが創始した径電場分岐理論の表式をJFT-2Mトカマクでの計測データに適用し、H-mode遷移の動力学を実験で検証する事に成功した。さらに、周辺輸送障壁の遷移モデルとコアの輸送ヒステリシスとの統合を考えた。その研究に付随して、水素同位体効果の新しい説明の研究を開始した。fuelling fuels turbulenceという着想を得た。また、この研究の一環として、運動量輸送の理論を改良した。実験解析によるcross-bispectrumの重要性を総観した。波及効果としていくつかの不安定性への適用を進めた。平成28年度までに、「研究実績の概要」に説明したように、理論や実験による確認方法等の研究が大きく進んだ。研究目的の中心をなすテーマについて大きな進展が得られるとともに、当初予想もされていなかった研究テーマについて進展が生まれた。例を挙げると、乱流輸送の抑制を実験で定量的に検証し電場曲率が本質的な役割りを果たしている事を具体的に示したこと、また、代表者らが創始した径電場分岐理論の表式を用いH-モード遷移の動力学を実験で検証する事に成功した。これらを始め大きな成果が上がり、予想以上の成果が達成されたと自己評価する。この研究は、先進的プラズマ乱流物理学の成果に立脚し、核融合研究の高温磁場閉じ込めプラズマのH-モードの定量的モデル構築を目的とする。代表者らが創始した径電場分岐理論に立脚し、最新のマルチスケール乱流物理学を取り入れ、H-モード理論を完備する。国内外のトカマク実験と比較し、検証を行う。H-モードの輸送障壁の形成機構や構造の定量的モデルを提示し、核融合燃焼プラズマ研究や制御のための学理基盤を構築する事を目指す。この目的に向けて、理論研究および実験的研究を進めて大きな成果を得た。バリア構造のモデルについて電場勾配および電場曲率を相補的に含む形に定式化した。JT-60Uトカマクでの詳細電場計測実験結果を対象に、乱流輸送の抑制を定量的に検証した。同様の手法を、JFT-2Mトカマクの実験データに適用し、電場勾配および電場曲率の双方が揺動強度の抑制に相補的に寄与していることを示した。乱流揺動と乱流輸送の双方に対する効果を定量的に評価することにより、輸送障壁形成において、電場勾配および電場曲率の双方が本質的な役割りを果たしている事を具体的に示した。電場曲率効果について、当初定式化した機構だけではなく、独立な機構の重要な働きも見出した。並行して、周辺輸送障壁の遷移モデルをコアの輸送ヒステリシス(温度勾配と熱流束の関係式に現れるヒステリシス)解析に応用した。この系の非線形伝播応答の理論式を多くの実験装置に適用し、非拡散的な速い応答の評価を進め、総合論文も発表した。また、輸送障壁内の乱流輸送の研究を開拓した。乱流揺動によりメゾスケール場(帯状流や測地線音波GAM)が作られると、乱流揺動を抑制する事とともに、本研究では、GAMによって揺動が空間を大域的に移送され、輸送障壁に侵入する研究成果も得られた。大域的な過程を取り入れ、輸送障壁内部での乱流輸送の研究に新展開が得られた。「研究実績の概要」に説明したように、理論や実験による確認方法等の研究が大きく進んだ。
高分解能電子顕微鏡法によるマンガン酸化物の電荷・軌道秩序状態の研究

強相関電子系物質であるマンガン酸化物は、遷移金属であるマンガンイオンが持つd電子の内部自由度である電荷、軌道、スピンに加えて、格子系との強い相互作用により、金属-絶縁体転移、巨大磁気抵抗効果や電荷・軌道秩序構造などの特異な物理的特性を示す。最近、マンガン酸化物で見出された電子の局在性に起因した電荷秩序構造と電子の遍歴性に起因した強磁性金属状態の共存状態(相分離状態)が見出され、巨大磁気抵抗効果や金属-絶縁体転移と強く相関していることが明らかになってきている。本研究では、マンガン酸化物での相分離状態及び電荷・軌道秩序構造に関するナノ構造について透過型電子顕微鏡法およびローレンツ電子顕微鏡法を用いて研究を行った。以下本研究で得られた主な成果成果について示す。1.La_<1-x>Ca_xMnO_3の電荷/軌道秩序状態の2相共存状態や相転移過程を初めて観察し、その構造の初期成長段階でpaired Jahn-Teller stripes(PJTS)が基本構造単位として重要な役割を果たすことを見出した。2.マンガン酸化物のMnサイトの一部をCrイオンで置換することによって得られるNd_<0.5>Ca_<0.5>Mn_<1-y>C_yO_3において、Crで2%置換することにより絶縁体-金属転移が誘発されることを見出すとともに、ローレンツ電子顕微鏡観察を行うことにより数十nmサイズの強磁性領域と電荷・秩序構造が共存する電子相分離状態の直接観察に成功し、電子相分離の実態をはじめて実空間像として示した。3.(La_<5/8-x>Pr_x)Ca_<3/8>MnO_3での相分離状態における強磁性磁区構造観察を行い、ミクロンサイズで強磁性金属状態と電荷秩序構造が共存している電子相分離状態の存在を明らかにした。4.スピネル型構造をもつAlV_2O_4において、約で700K正方晶構造から菱面体構造への相転移が電荷秩序構造の形成を伴っていることを明らかにした。また、この電荷秩序構造は、[111]方向に2倍周期を持つ長周期構造であることを見出した。本研究では、巨大磁気抵抗効果や電荷/軌道秩序状態に起因する金属・絶縁体転移という特異な物理的性質を示すペロブスカイト型マンガン酸化物を研究対象として、電子の内部自由度である電荷、スピン及び軌道間の相互作用を明らかにすることを目的としている。本年度は、ペロブスカイト型マンガン酸化物が持つ3d電子の内部自由度である電荷、スピン、軌道に加え、格子系が強く相互作用することにより出現する。巨大磁気抵抗効果や電荷秩序という特異な物理的特性とナノ構造との相関について研究を行った。特に最近の研究により、ナノスケールでの強磁性金属状態と電荷秩序状態の共存状態(相分離状態)と、マンガン酸化物が示す特異な物理的特性との相関関係について明らかにされつつあるので、本研究で用いるナノスケールでの空間分解能を持つ透過型電子顕微鏡法は非常に有効な手段である。

具体的には、代表的な電荷/軌道秩序状態の形成による金属・絶縁体転移を示すNd_<0.5>Sr_<0.5>MnO_3を用いて研究を行った。その結果、高温相である強磁性金属相において、電荷/軌道秩序状態がナノスケールのクラスター状態で存在しており、強磁性金属状態と電荷秩序状態の共存状態(相分離状態)が実現していることを明確に示した。また、金属・絶縁体転移に伴うナノ構造の変化を調べた結果、低温相である電荷/軌道秩序状態中に存在する反位相境界より、高温相である強磁性金属状態が核生成、成長することがわかった。この結果より、金属-絶縁体転位に伴う67桁に及ぶ大きな電気抵抗率の変化は、金属相の形成過程に深く関与しており、パーコレーション的電気伝導に起因していることをはじめて実験的に明らかにした。さらに、Mnイオンの一部をCrイオンで置換することにより得られるNd_<0.5>Ca_<0.5>Mn_<1-y>Cr_yO_3において、Cr置換により電荷/軌道秩序状態による反強磁性絶縁体状態から強磁性金属状態に変化すること、また、この強磁性金属状態においても数十ナノスケールで電荷/軌道秩序状態がマイクロ分域として存在し、ミクロスケールでの相分離状態が形成されていることをはじめて見いだした。強相関電子系物質として特徴づけられる遷移金属酸化物は、固体内の電子が持つ内部自由度である電荷、スピン及び軌道間の強い相互作用に起因した超伝導特性や金属-絶縁体転移、巨大磁気抵抗効果、電荷秩序構造など種々の特異な物理的特性を示す。最近、我々はこのような多種多様な物理的特性を示す強相関電子系物質の一つであるマンガン酸化物において、電子の局在性に起因する電荷秩序状態と電子の遍歴性に起因する強磁性金属状態の共存状態(相分離状態)の存在を明らかにし、相分離状態と物理的特性との相関について研究を進めている。今年度は、Nd_<0.5>Ca_<0.5>MnO_3等において見いだされている電荷/軌道秩序状態に着目し、Mnサイトの一部を他の遷移金属(CrイオンやScイオン)で置換することによる電荷/軌道秩序構造の構造変化を調べるとともに、新しく誘起される強磁性金属相と電荷/軌道秩序状態との相分離状態についてローレンツ電子顕微鏡法及び高分解能電子顕微鏡法を用いて研究を行った。以下、今年度得られた主な研究成果を示す。(1)Mnイオンの一部をCrイオンで置換すると、新たな強磁性金属状態が出現することを見出した。さらに、そのナノ構造を透過型電子顕微鏡を用いて調べた結果、強磁性金属相への転移温度である120K以下では、電荷/軌道秩序状態は数十ナノメートルのサイズで存在しており、強磁性金属相と相共存していることが明らかとなった。さらに、ローレンツ電子顕微鏡法を用いて強磁性分域の観察を行った結果、強磁性金属状態は10-20nmサイズのマイクロ分域として存在していることの直接観察に初めて成功した。(2)一方、Mnサイトの一部をScイオンで置換した場合、Crの場合とは異なり、新たな強磁性金属相は出現せず、60K以下の低温領域では、長距離秩序を持った電荷/軌道秩序状態が形成されていることが見出された。強相関電子系物資であるマンガン酸化物は、遷移金属であるマンガンイオンが持つd電子の内部自由度である電荷、軌道、スピンに加えて、格子系との強い相互作用により、金属-絶緑体転移、巨大磁気抵抗効果や電荷・軌道秩序構造などの特異な物理的特性を示す。
ベルリンの壁開放のインターナル・メカニズムの究明:政教コアリション戦略の行方

(1)本研究は、文献調査と、BStUおよび連邦公文書館における旧機密資料の収集・分析により、ベルリンの壁開放のインターナル・メカニズムとしての東独出国運動の発展と当局の政教コアリション戦略を究明した。(2)ドイツ研究者の既存研究をサーベイ、批判した。(3)旧機密資料を効率的に閲覧することができ、そのうちのおよそ半分、すなわち約1.5万ページ(340フォルダー)の資料を収集した。本年度の成果としての論文「東独出国運動の発生:逃亡の時は過ぎ,闘うべき時が来た」は, 10年余のちに東独政権党を窮地に追い込むことになる東独出国運動の発生(1970年代半ば)の様相を,両独国家と教会の関係およびリーザの医師ニチュケのケースを中心に,詳しく論じた。その内容はわが国では殆ど知られていないがベルリンの壁を崩壊に導いた最重要要因を明らかにしたものであり,また,ドイツでの研究状況とは大きく異なる視点からの切り込みでもある。通例ドイツにおける研究では国内に留まって東独改革に努力した勢力と国内改革に見切りをつけて出国を希望し東独を捨てた勢力に二分して考えるが,実は後者の大部分は出国の自由の実現という要求を掲げて体制改革のための闘争を東独国内において展開したのであり,その運動はベルリンの壁開放の1年前の新外国旅行政令として未だ不十分ながら実現し,この新政令がさらなる自由化要求を勢いづけたという見方が私見の視点である。出国運動こそが最も効果的な国内改革を実現させたと言いうる。出国運動をめぐっては初期から運動当事者と教会と両独国家が複雑な絡み合いをしていた。その象徴の1つがいわゆる「自由買い」(東独内の政治犯を西独政府が買い取るもので,西独人を含む)であるが,その発端は教会も絡む逃亡援助による逮捕者救援であったことが明らかになった。今後さらにこれら三者の絡み合いに注視しながら,運動の展開過程を研究する。なお,東独政権党政治局・書記局文書をマイクロフィッシュに収録したもの(そのうち既刊行は70年代末まで)を購入したので,目下それを精査中である。これらの購入を優先したため,ドイツでのアーカイブ調査は予算上の理由から次年度に延期した。本年度は、第1に、上記テーマに関係するドイツでの諸議論を包括的に検討した。その結果、教会関係者の諸議論も含めて、諸議論の大部分が、東独出国運動の性格を著しく誤解した議論であることが判明した。すなわち、殆どの議論が出国運動の国内(東独内)での改革運動でもあったし、しかも最も戦闘的なそれであったということを見ていない。これについての論文をほぼ取りまとめたので、まもなく投稿予定である。第2に、ドイツ・ベルリンの旧東独秘密警察公文書館(BStU)において本テーマ関連文書を閲覧した。本年度の大部分をかけて周到に事前準備をしたことと同公文書館の研究協力担当職員の積極的な助力があいまって、短期間に約10000ページにのぼる文書を精査することができた。そのうち約5000ページが本テーマにとって有用であることがわかり、それらの複写を申請した。同公文書館の文書は、その性質上、プライバシー情報を含む可能性があるため、公文書館職員が全ページを審査して該当箇所(氏名、住所など)を黒塗りにした形でコピーされるという規則になっている。そのため複写完成・日本への送付には23ヵ月かかるだろうとのことであり、まだ到着していない。第3に、旧東独の政党と政府の公文書をマイクロフィッシュ化した資料のうち1980年代の部分を購入し精査する予定であったが、刊行が予告よりも半年近く遅れてしまい、入荷が翌年度にずれ込んだ。やむなく補助金支出の繰り越し申請をおこない、承認され、その後2010年5月に入荷したが、添付されるべきガイドブックが未完成とのことで、それがようやく同年11月に到着した。そのため目下精査に努めているところである。本年度は、(1)ドイツ連邦公文書館所蔵資料のうち前年度補助金の繰り越し支出(刊行が予定より半年遅れたため)により購入した公刊文書の精査、(2)昨年度補助金旅費により現地で収集し複写依頼し本年度8月に到着した旧東独秘密警察文書の精査(約6000ページ、文書の性格上私的情報の有無の審査と黒塗りのために依頼後複写完成までには数ヵ月必要)、(3)ドイツ連邦公文書館(ベルリン)と旧東独秘密警察文書館(BStU)に出張し文書調査(数万ページにわたる文書閲覧しうち約8000ページの複写を依頼)、(4)研究成果とりまとめを予定した。概ね順調に経過した。例えばインターナル・メカニズム解明の1つのポイントたる1988年4月「中央決定」についてドイツ研究者の見解を疑問とした(青木2008)が、今回の調査(3)において私見を裏付ける資料を発見することができた。

但し(2)については、資料集(マイクロフィッシュ)の半年遅れの刊行の上、刊行時に添付されるべきガイドブックがようやく年末に送られてきたために作業が遅れている。(4)について、本課題関連のドイツでの論争状況を批判的に検討した論文が現在印刷中である。上記の(1)(2)(3)等の全資料を活用したとりまとめを行いつつある。但し(3)の複写資料のうちの多くの到着は、上記(2)と同じ理由により本年夏頃となる。また大震災被災により作業が一時中断された。
微小電流領域における放電プラズマの安定限界-微小プラズマ加工の可能性-

ぬれ現象に対し表面エネルギーの値は極めて重要であることが判明した.ぬれ領域の先端にはハロ領域があり,ぬれ現象の解明には真の表面エネルギーの値が必要となった.信頼できる表面エネルギーの値を実験的に求めるのが難しい.分担者が中心となり,分子(動)力学等に使用される原子間ポテンシャルの決定方法であるMEAM(Modified Embedded Atom Method)の表面問題への適応を検討した.具体的には,走査型トンネル電子顕微鏡や低速電子線回折などによって計測された固体表面原子の配列とMEAMによるポテンシャルから推定される配列を比較した.検討は,面心立方格子(FCC)構造,体心立方(BCC)構造,単純立方構造,およびダイアモンド構造を取る物質で,MEAMパラメーターが決められている全ての物質に対して行った.その結果,シリコン(111)表面における7×7構造をMEAMポテンシャルはかなり正確に表現することがわかった.また,FCC金属の(110)表面においては理想構造をとるものとMissing Row構造をとるものがあるが,MEAMポテンシャルは多くの系に対し,実験と同じ構造を予言することが判明した.量子化学計算でない方法が表面の原子間結合状に対しこれほど有効であると言うのは驚くべき結果と言える.但し,物質によっては実験値と相反する結果となるものもあり,MEAMの適用は慎重でなければならない一面も明らかになった.同時に,実験における境界条件が真に正しいとも限らない点も考慮する必要がある.しかし,おおむねMEAMは多原子系のポテンシャルとして期待できるという結論をえた.さらにそれを用い,表面エネルギーの値の表を多くの原子に対し作ることができた.ぬれ現象に対し表面エネルギーの値は極めて重要であることが判明した.ぬれ領域の先端にはハロ領域があり,ぬれ現象の解明には真の表面エネルギーの値が必要となった.信頼できる表面エネルギーの値を実験的に求めるのが難しい.分担者が中心となり,分子(動)力学等に使用される原子間ポテンシャルの決定方法であるMEAM(Modified Embedded Atom Method)の表面問題への適応を検討した.具体的には,走査型トンネル電子顕微鏡や低速電子線回折などによって計測された固体表面原子の配列とMEAMによるポテンシャルから推定される配列を比較した.検討は,面心立方格子(FCC)構造,体心立方(BCC)構造,単純立方構造,およびダイアモンド構造を取る物質で,MEAMパラメーターが決められている全ての物質に対して行った.その結果,シリコン(111)表面における7×7構造をMEAMポテンシャルはかなり正確に表現することがわかった.また,FCC金属の(110)表面においては理想構造をとるものとMissing Row構造をとるものがあるが,MEAMポテンシャルは多くの系に対し,実験と同じ構造を予言することが判明した.量子化学計算でない方法が表面の原子間結合状に対しこれほど有効であると言うのは驚くべき結果と言える.但し,物質によっては実験値と相反する結果となるものもあり,MEAMの適用は慎重でなければならない一面も明らかになった.同時に,実験における境界条件が真に正しいとも限らない点も考慮する必要がある.しかし,おおむねMEAMは多原子系のポテンシャルとして期待できるという結論をえた.さらにそれを用い,表面エネルギーの値の表を多くの原子に対し作ることができた.
変形性関節症の予防や治療を目指した結合組織成長因子発現制御ペプチドの探索と評価

結合組織成長因子(CTGF/ CCN2)は,軟骨細胞の増殖・成熟及び基質合成を促進し,関節軟骨を修復できることが報告されている.本研究では,CCN2の発現を亢進する新規化合物を網羅的に探索し,in vitroにてその機能解析を行った.その結果,CCN2の発現を促進する因子として同定されたハルミンは軟骨分化促進作用,抗炎症作用の双方を持ち合わせる変形性関節症の予防,治療に有用な分子である可能性が示唆された.結合組織成長因子(CCN2)は,軟骨細胞の増殖・成熟及び基質合成を促進し,軟骨特異的CCN2過剰発現マウスにおいては膝関節軟骨の加齢性変化に抵抗性を示す事や,実験的変形性関節症モデルの関節腔内にCCN2を投与すると関節軟骨を修復できる事が報告されており,CCN2は変形性関節症の予防や治療に有効であると考えられている.そこで本研究では,変形性関節症の予防・治療を目的に,CCN2の発現を亢進する新規化合物を網羅的に探索し,その機能解析を行った.スクリーニング実験では,ヒト軟骨肉腫由来軟骨細胞株(HCS-2/8)を使用し,86種類のオーファンリガンドで刺激し,培地中のCCN2のタンパク量をELISA法にて定量した.細胞への毒性は,MTS法およびLDH毒性試験にて検討した.その結果,小分子化合物であるHarmineがCCN2の発現を上昇させる唯一の分子として同定され,5 nMの濃度では,細胞増殖を抑制するも,細胞毒性は認めず,軟骨分化を促進した.以上の結果より,CCN2の発現を促進する因子として同定されたHarmineは軟骨分化促進作用,抗炎症作用の双方を持ち合わせる変形性関節症の予防,治療に有用な分子である可能性が示唆された.結合組織成長因子(CTGF/ CCN2)は,軟骨細胞の増殖・成熟及び基質合成を促進し,関節軟骨を修復できることが報告されている.本研究では,CCN2の発現を亢進する新規化合物を網羅的に探索し,in vitroにてその機能解析を行った.その結果,CCN2の発現を促進する因子として同定されたハルミンは軟骨分化促進作用,抗炎症作用の双方を持ち合わせる変形性関節症の予防,治療に有用な分子である可能性が示唆された.結合組織成長因子(CCN2)は,軟骨細胞の増殖・成熟及び基質合成を促進し,軟骨特異的CCN2過剰発現マウスにおいては膝関節軟骨の加齢性変化に抵抗性を示すことや,実験的変形性関節症モデルの関節腔内にCCN2を投与すると関節軟骨を修復できることが報告されており,CCN2は変形性関節症の予防や治療に有効であると考えられている.そこで本研究では,変形性関節症の予防・治療を目的に,CCN2の発現を亢進する新規化合物を網羅的に探索し,in vitroでその機能解析を行った.スクリーニングの結果,検索したオーファンリガンドライブラリー中ではHarmineがCCN2の発現を上昇させる唯一の分子として同定され,5 nMの濃度において,細胞増殖を抑制するも,細胞毒性は認めず,軟骨分化マーカーの遺伝子発現を促進し,軟骨分化を促進した.また興味深いことに,HarmineはTNF-αの刺激により誘導されたMMP1,3,13の遺伝子発現を抑制し,TNF-αの刺激により抑制された軟骨分化を促進した.平成24年度の研究実施計画は,in vitroにおける新規同定ペプチドの軟骨分化促進作用の検討を行うことである.実際に,新規同定ペプチドの細胞毒性試験や,軟骨分化促進作用,更には炎症環境下での効果についても検討し,非常に有益なデータを得ることができた.よって本研究は当初の研究計画通りに順調に進展していると考える平成25年度は前年度の研究を基に, in vivoにおける新規同定ペプチドHarmineの変形性関節症の予防効果の検討を行う.Harmineを8ヶ月齢マウスの餌に混ぜ摂取させる.経時的(2,4,8週)に血液を採取し血中CTGF濃度をELISA法にて確認する.そのCTGFの血中濃度の上昇が認められた新規同定ペプチドにおいて,経口投与による変形性関節症の予防効果の検討を行う.つまり,通常マウスは約20ヶ月齢にて加齢性の変形性関節症症状を示すことが知られているため,8ヵ月齢のマウスに12ヶ月間経口投与を続ける.12カ月後に,マウスを屠殺し,膝関節および顎関節を回収し,マイクロCTを用い,骨棘の有無など骨形態学的に評価する.その後組織切片を作製し,H.E染色およびトルイジンブルー染色を用い,マウスの膝関節および顎関節の組織学的検討を行う.また,免疫染色法を用い,関節部におけるCTGFの発現,軟骨特異的マーカーのAgrecan,Type II collagenの発現およびMMP1,3,13の発現を非投与群と比較し,Harmineの変形性関節症に対する予防効果を評価する.更に,本研究ではin vitroにおいてHarmineが軟骨分化を促進することを明らかにしたが,メカニズムは未だ解明されておらず今後の課題である.in vivoの検討と並行してメカニズムの解明にも取り組む.平成25年度は前年度の研究に基づいたHarmineの軟骨分化促進効果のメカニズムの解明を目標とし,また, in vivoにおけるHarmineの変形性関節症の予防効果の検討を行う予定である.そのため,研究費は実験試薬購入や動物購入,飼育に当てられ,学会参加,論文投稿など研究発表の機会にも使用する予定である.