hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キトサナーゼ立体構造の解明と新規キトサナーゼの創造

1 Bacillus circulans MH-K1キトサナーゼの立体構造の解明本キトサナーゼの遺伝子を大量発現系に組み込んで生産・精製した酵素を用いて結晶化実験を行なった結果、硫安を沈澱剤として用いたときに直方体の結晶が得られた。その空間群はP21212でユニットセル・パラメーターはa=57.7,b=43.3,c=128.0Aであった。このnative結晶の解析を進めると同時に重金属置換体の取得を試みた結果白金の置換体が最も解析に良好であった。この置換体を用いてMAD法により回折データを取得し解析を行なった所、3.0Aの解像度で電子密度地図が得られた。現在α-helixの特定が可能となり、β-sheetの特定を行なっている。これにnative結晶の電子密度地図を重ねて精密化してゆく予定である。2部位特異性変異による変異キトサナーゼの生産と触媒アミノ酸の特定MH-K1キトサナーゼの触媒アミノ酸部位を一次構造の保存性とリゾチームとの相同性から推定し、そのアミノ酸を改変した変異体酵素を生産させ酵素活性を測定した。合計10個のアミノ酸の改変を行なった結果、37番目のGluと55番目のAspが触媒アミノ酸として可能性が高い事が示された。また52番目のAspが触媒活性に関与しているらしい。3その他の由来のキトサナーゼのクローニング等Nocardioides sp. K-01株のキトサナーゼ遺伝子のクローニングを試みた結果、部位遺伝子が取れた。これと蛋白から決定された一次構造により、本キトサナーゼの一次構造が決定された。X線結晶解析による立体構造解析は良質の結晶とその重金属置換体の取得がキイ・ポイントとなっている。Bacillus circulans MH-K1キトサナーゼ蛋白については斜方晶系の直方体結晶が硫安を沈澱剤として取られ、その空間群(P2_12_12)やユニットセル・パラメーター(a=57.7,b=43.3,c=128.0A)も決められている。この結晶に対して現在迄約50種におよぶ重金属を試みた結果、確実に入っていると思われる白金の置換体を中心にネイテイブ結晶と比較して電子密度図の精密化を行なっている。一方MH-KIキトサナーゼの触媒アミノ酸として可能性の高い37番目のGlu、55番目のAsp、56番目のGlu、73番目のAspをそれぞれSerに部位特異性変異により変換した変換体遺伝子を作り、これを高発現系であるBacillus brevis 47-5Qに導入し、発現させるが出来た。それぞれの変異体を精製して酵素活性を測定したところ前者の3アミノ酸はいずれも活性に深く関与している事が示唆された。73番目の変異体は生産されなかった。この変異キトサナーゼを現在精製中で、これを用いて結晶を取るのが楽しみです。放線菌Nocardioides sp.K-01株のキトサナーゼの生化学的特性が決められ、その一次構造が決定/推定された。現在この遺伝子のクローニングを行なっている。またこの酵素蛋白質の結晶化条件の検討が行なわれつつある。現在までに緩衝液に0.1Mトリス・塩酸pH7.2で沈澱剤に14%ポリエチレングリコール6,000,0.2M CaCl_2存在下で針状の結晶が得られた。この条件を改善して結晶解析に耐えられる結晶を得たい。さらに新たにキトサナーゼ生産菌A-01株が取られ、その酵素の生化学的特性が明らかにされている。A-01株の酵素は他のキトサナーゼに較べ安定性が高く、立体構造を他の酵素と比較検討することによりその特性の構造的基礎を明らかにしたい。

1野性型キトサナーゼ立体構造の解明硫安存在下で得られた結晶を用いて種々の重金属に浸漬して重金属置換体を検索した結果、0.5mMK_2PtCl_4に24時間浸漬したものが良好な回折図を得た。この重金属置換体を用いてMAD法によりデータを取得した。これを用いて解析したところ、最大で3.0Aの解像度で電子密度地図が得られた。現在α-helix部位の特定が行なわれ、β-sheetの検索途中である。今後これにnativeな結晶データを重ねてさらに精密化して酵素分子の立体構造と構築する予定である。2部位特異性変異による変異キトサナーゼの生産と触媒アミノ酸の特定本キトサナーゼと一部の一次構造相同性を示すリゾチームの触媒アミノ酸を参考にして、変異アミノ酸を決定して部位特異性変異を行ない、得られた変異体酵素の活性を測定した。変異を行なった部位は以下の通り:L21V,D22S,E37S,D40N,E51Q,D52E,D52N,D55N,D55S & E56S。その結果E37S,D55N,D55S & E56Sの変異体酵素が活性を失ったことから同酵素の触媒アミノ酸はリゾチームと同様にE37とD55である可能性が高い事が示された。またD52Eでは活性の94%が保持されているがD52Nでは61%であったので、このAspは触媒アミノ酸ではないものの酵素機能に重要な役割を持っていると考えられる。
哺乳類胎仔生殖細胞の操作による遺伝子導入技術の開発研究

哺乳類胎仔生殖細胞を用いた発生工学技術の開発を目的として、始原生殖細胞の培養、遺伝子導入、生殖細胞顕微操作について研究した。まず移動期の始原生殖細胞を体外で培養して増殖させるための培養方法を改良したのち、培養下で胎仔生殖細胞に遺伝子導入を行う方法について詳細な検討を行った。アポトーシスを抑制する働きを持つことが知られているbcl-xLやアデノウイルスE1b19kDa遺伝子の強制発現が培養下の生殖細胞でも細胞死を抑える効果を持つことを示した。マウス始原生殖細胞をサイトカインLIFを培養液に加えると同時にフォルスコリンやレチノイン酸存在下で培養することによって樹立したEG細胞株について、生殖細胞の性質を保持しているかを検定するために胎仔精巣や卵巣の体細胞との再凝集塊を作成しWミュータントマウスの精巣や卵巣内へ移植して配偶子分化が起きるかを調べる実験を行ったが、テラトーマに転換しているらしく、生殖細胞の分化は見られなかった。培養操作を加えた生殖細胞からの動物個体の再構築に応用する可能性を念頭において、生殖細胞や配偶子の顕微操作について研究した。まず減数分裂直後の円形精子細胞と卵子を融合させることによって仔マウスを作出することに成功したが、使用する精子細胞の発生段階や顕微操作方法について詳細な検討を行って、顕微注入などの方法改良により、その効率を大幅に向上させることに成功した。さらに精母細胞を用いた顕微授精を試みた。二次精母細胞(2N)まで遡って雄性配偶子として用いられることが明らかにされているが、さらに減数分裂前の一次精母細胞(4N)を用いる方法の開発を試みた。成熟中卵子と電気融合し,さらにその成熟完了卵子を活性化したところ、正常二倍体胚が得られることが分かった。精子細胞の顕微授精の場合にDNAを同時注入することで、トランスジェニックマウスが得られるかどうか試みた。GFP遺伝子を用いたところ、4細胞期から蛍光を見られはじめ、胚盤胞まで発生した15個の胚のうち、5個が蛍光を発し、少なくとも、精子細胞と同時に卵子へ注入したDNAが前核に取り込まれたことが確認された。これまでに、移動期の始原生殖細胞を体外で培養して増殖させるための培養方法を改良して、ほぼ胎仔内と同程度の増殖を行なわせることに成功した。また、生殖巣に到着後の生殖細胞を培養下で生存維持させる方法についても、細胞内cAMPレベルを上昇させるフォルスコリンなどを用いることによって大幅な改良に成功した。これらと平行して、培養中の生殖細胞への遺伝子導入も開始しており、一過性発現を生殖細胞の1020%という高率で確認するところまで導入方法を改善した。この方法を用いて、これまでに細胞を不死化させるがん遺伝子であるSV40T遺伝子や、細胞のアポトーシスを抑制することが知られているBcl-2、Bcl-XL、Ad2E1B19kDaなどの遺伝子を導入したが、これらのうちBcl-XLとAd2E1B19kDaについて培養下での胎仔生殖細胞の死滅を抑制する効果がみられることを発見した。また生殖巣原基中で雌雄分化を始めた生殖細胞については、これまで培養下で生存させることが困難であったが、胎仔生殖巣由来の体細胞株を樹立することに成功して、共培養などの効果を検討した。一方、培養操作を加えた生殖細胞からの動物個体の再構築については、減数分裂直後の円形精子細胞と卵子を融合させることによって仔マウスを作出することに成功したが、使用する精子細胞の発生段階や顕微操作方法について詳細な検討を行って、顕微注入などの方法改良により、その効率を大幅に向上させることに成功した。

精子細胞の顕微授精の場合にDNAを同時注入することで、トランスジェニックマウスが得られるかどうか試みた。GFP遺伝子を用いたところ、4細胞期から蛍光を見られはじめ、胚盤胞まで発生した15個の胚のうち、5個が蛍光を発し、少なくとも、精子細胞と同時に卵子へ注入したDNAが前核に取り込まれたことが確認された。生殖巣へ到着後のマウス始原生殖細胞を取りだし、サイトカインLIFを培養液に加えると同時にフォルスコリンやレチノイン酸存在下で培養することによって樹立したEG細胞株について、生殖細胞の性質を保持しているかを検定するために胎仔精巣や卵巣の体細胞との再凝集塊を作成した。これらをWミュータントマウスの精巣や卵巣内へ移植して配偶子分化が起きるかを調べる実験を行ったが、いまのところテラトーマに分化しているらしく、生殖細胞の分化は見られなかった。また、生殖巣から取り出した生殖細胞への培養下での遺伝子導入を行うことによって、アポトーシスを抑制する働きのあるbcl-xLやbcl-2遺伝子の発現が培養下での生殖細胞の生存を促進する効果があることを確認した。さらに、生殖細胞の長期体外培養系を開発するために、胎仔生殖巣の体細胞からの細胞株樹立を行って、それらの性質について検討した。一次精母細胞を用いた顕微授精の試み:現在の技術では、精細胞は、二次精母細胞(2N)まで遡って雄性配偶子として用いられることが明らかにされている(マウス)。そこで、さらに減数分裂前の一次精母細胞(4N)を用いる方法の開発を試みた。成熟中卵子と電気融合し、さらにその成熟完了卵子の活性化したところ、正常二倍体胚が得られることが分かった。精細胞の体外減数分裂の試み:減数分裂前の精細胞のみを含む生後15日令の精巣細胞を10日間培養することで、体外で減数分裂を完了させる方法を開発した。精子細胞の顕微授精を用いたDNA注入:マウスでは、精子細胞を用いて容易に産子が得られる。そこで、同時にDNAを注入することで、トランスジェニックマウスが得られるかどうか試みた。マウス胎仔生殖細胞を卵巣や精巣から分離した体細胞と組み合わせて、共培養や再凝集塊培養を行うことによって細胞間相互作用を行なわせる方法について研究した。培養条件を改良して生殖細胞が配偶子分化へ向かう段階を培養下で維持できるかどうかを検討するとともに、胎子生殖巣から取り出した雌雄体細胞から細胞株の樹立を行った。生殖細胞を抗体-磁気ビーズ法により単離する方法、生殖細胞を蛍光色素により生体ラベルする方法、生殖細胞と体細胞との凝集塊を作成する方法、減数分裂期の細胞を抗体によって検出する方法などについて改良した結果,胎子生殖細胞を体細胞と共培養することによって、培養下で減数分裂に入る、つまり卵母細胞へと分化する生殖細胞を検出することに成功した。さらに生殖細胞への遺伝子導入方法に関して最近開発された電気パズルを応用した方法を検討した。一方、遺伝子導入された生殖細胞から動物個体を再構築するために、一次精母細胞による顕微受精方法を検討した。一次精母細胞は減数分裂前の染色体が4倍体の精細胞である。
CD45のB細胞分化段階物異的作用機序の分子基盤

【研究目的】本研究では、第一に、CD45の分化段階特異的な作用機序の分子基盤について、CD45の基質、その制御機構、下流のシグナル伝達経路を解析すること、第二には、CD45以外の重要なチロシンホスファターゼを同定し、その作用様式を分化段階の異なるB細胞で解析することを目的としている。これらの解析により、最終的には病的状態の修復に資する標的分子が明らかされる可能性が期待される。【研究成果】(1)CD45の成熟B細胞株BAL-17における制御:未熟B細胞株WEHI-231において、蛋白質チロシンリン酸化、カルシウムイオンの動員、増殖抑制、アポトーシスの過程がCD45によりネガティブに制御されていることを報告していた。この研究で、BAL-17におけるCD45の制御を、CD45陰性クローンを用いて解析した結果、上記のいずれの過程をもポジティブに制御していることが明らかになった。このことは、細胞の分化段階の違いにより、CD45が異なる制御を行っていることを示唆している。(2)CD45による基質の同定とその制御機構:WEHI-231のCD45陰性クローンにおいて、蛋白質のチロシンリン酸化が構成的に亢進した。このクローンを用いてCD45の基質の検索を行った結果、Src型チロシンキナーゼ(Lyn、Blk、Lck)およびSykキナーゼの中で、Lynのチロシンリン酸化だけが亢進し、その酵素活性も上昇していることが明らかになった。このことは、LynがCD45の選択的な基質になっていること、しかもLynのチロシンリン酸化とキナーゼ活性をCD45がネガティブに制御していることを示唆している。その機構を解明するために、WEHI-231細胞とCD45陰性クローンを^<32>Pで標識した後、Lynをcyanogen bromideで切断し、SDS-PAGEで展開して自己リン酸化部位とネガティブ制御部位のリン酸化の程度を比較した。その結果、CD45陰性クローンでは両部位のチロシンリン酸化が抗原レセプター刺激以前に亢進していることが明らかになり、Lynの酵素活性は両部位のリン酸化のバランスにより制御されている可能性が示唆された。(3)CD45により制御されるシグナル伝達経路:BAL-17とそのCD45陰性クローンを用いて、NAPキナーゼファミリーの活性化を比較検討した。その結果、CD45欠失によりERKの活性化が増強すること、JNKの活性化には著しい相違は見られないことが明らかになった。現在、p38の活性について解析している。また、WEHI-231におけるCD45による制御についても検討している。これらの解析により、分化段階の相違がCD45のMAPキナーゼ制御様式にどのような影響を与えているのかについての知見が得られるものと期待される。選択的な制御が行われていれば、その上流あるいは下流のシグナル伝達分子について解析を進めていく予定である。(4)CD45以外のチロシンホスファターゼによるB細胞シグナル伝達の制御:B細胞抗原受容体刺激後に誘導されるチロシンホスファターゼ遺伝子をノーザン解析とサブトラクション法で検索したところ、すでにB細胞シグナルをネガティブに制御しいることが報告されていたSHP-1が捕まってきた。この酵素の作用機序を解明する目的で、SHP-1結合蛋白の同定を試みた。WEHI-231、BAL-17において、抗原レセプター刺激後にチロシンリン酸化される少なくとも3種類(150kD、110kD、75kD)の蛋白がSHP-1-GSTと結合すること、この結合は抗SHP-1抗体による免疫沈降後にも同様に認められることが明らかになった。さらに、結合分子中の75kDの分子はSH2領域を含む造血系の分子としてすでにクローニングされていたSLP-76であり、その結合は抗原レセプター刺激以前から認められることなどを明らかにした。現在、SHP-1に結合する他の蛋白の同定を急いでいる。

このことは、LynがCD45の選択的な基質になっていること、しかもLynのチロシンリン酸化とキナーゼ活性をCD45がネガティブに制御していることを示唆している。その機構を解明するために、WEHI-231細胞とCD45陰性クローンを^<32>Pで標識した後、Lynをcyanogen bromideで切断し、SDS-PAGEで展開して自己リン酸化部位とネガティブ制御部位のリン酸化の程度を比較した。その結果、CD45陰性クローンでは両部位のチロシンリン酸化が抗原レセプター刺激以前に亢進していることが明らかになり、Lynの酵素活性は両部位のリン酸化のバランスにより制御されている可能性が示唆された。(3)CD45により制御されるシグナル伝達経路:BAL-17とそのCD45陰性クローンを用いて、NAPキナーゼファミリーの活性化を比較検討した。その結果、CD45欠失によりERKの活性化が増強すること、JNKの活性化には著しい相違は見られないことが明らかになった。現在、p38の活性について解析している。また、WEHI-231におけるCD45による制御についても検討している。これらの解析により、分化段階の相違がCD45のMAPキナーゼ制御様式にどのような影響を与えているのかについての知見が得られるものと期待される。選択的な制御が行われていれば、その上流あるいは下流のシグナル伝達分子について解析を進めていく予定である。(4)CD45以外のチロシンホスファターゼによるB細胞シグナル伝達の制御:B細胞抗原受容体刺激後に誘導されるチロシンホスファターゼ遺伝子をノーザン解析とサブトラクション法で検索したところ、すでにB細胞シグナルをネガティブに制御しいることが報告されていたSHP-1が捕まってきた。この酵素の作用機序を解明する目的で、SHP-1結合蛋白の同定を試みた。WEHI-231、BAL-17において、抗原レセプター刺激後にチロシンリン酸化される少なくとも3種類(150kD、110kD、75kD)の蛋白がSHP-1-GSTと結合すること、この結合は抗SHP-1抗体による免疫沈降後にも同様に認められることが明らかになった。さらに、結合分子中の75kDの分子はSH2領域を含む造血系の分子としてすでにクローニングされていたSLP-76であり、その結合は抗原レセプター刺激以前から認められることなどを明らかにした。現在、SHP-1に結合する他の蛋白の同定を急いでいる。本研究は、CD45による制御がB細胞分裂化段階に依存して異なってくる可能性について検討し、その分子機構を明らかにしようとして始められた。その結果、次のことが明らかになった。第一に、CD45は成熟B細胞において、未熟B細胞の場合と明らかに異なる作用機序を有していることが明らかとなった。すなわち、CD45は、抗原レセプター刺激後に誘導される増殖制御をポジティブにしかも決定的に制御しているが、アポトーシスには関与しておらず、いずれの過程をもネガティブに制御している未熟B細胞の場合と対照的であった。第二に、CD45遺伝子をCD45陰性クローンへ発現する予備実験の段階で、未熟B細胞株由来のCD45陰性クローンにおいて、CD45と結合する蛋白(CD45-AP)の発現が低下していることを明らかにした。このことは、CD45の機能を理解するためにはCD
近世日本における朱熹『家礼』の受容・展開と諸思想との交錯―闇斎学派を始点として

本年度の具体的成果は、論文2本(「稲葉黙斎の喪礼実践論」『日本思想史学』50号、「埋葬と家礼」『共存の人間学』1号)と、書評1本(「横山俊一郎著『泊園書院の明治維新」『東アジアの思想と文化』10号)であり、概ね順調に研究を進めることができた。本研究の主な課題は、近世日本における『家礼』の受容・展開過程を、闇斎学派を始点としながら、諸思想・諸宗教との交錯という視点から明らかにすることにあった。論文「稲葉黙斎の喪礼実践論」では、闇斎学派儒者の稲葉黙斎が、近世後期において儒仏混淆的な喪礼実践のあり方を構想していたことを明らかにし、また論文「埋葬と『家礼』」では、そのような黙斎に代表される儒仏混淆論が、(間接的な形ではあるものの)実際にいくつかの近世大名墓に体現されていた事実を紹介した。また後者は、韓国語論文であり、国際的な波及力が見込まれる。このように、『家礼』と仏教との関連に関しては、当初の目論見以上の成果をあげることができた。神道・国学との関連については、残念ながら具体的成果を残すことができなかったが、未刊行史料の調査をすることで、必要史料を蒐集することはできた。また現在、それら蒐集史料を活かした論文(斎藤英喜・山下久夫編『日本書紀1300年史を問う』収録予定)を準備中であり、次年度の上半期に刊行を予定している。今年度中の論文化は叶わなかったものの、今年度の資料蒐集の成果に基づいて、原稿準備に入れたという意味では、それなりの成果をあげることはできたと考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
熱傷瘢痕と巨大色素性母斑の治療に用いる自家培養真皮の開発

小児の重症熱傷の治療後に生じる瘢痕(引きつり)は成長に伴い機能障害を引き起こす。また、小児の巨大色素性母斑(真皮組織中の色素沈着)は社会への順応において精神的な障害を引き起こす。そこで、これらの皮膚疾患に対する新しい治療法を可能にする新規の自家培養真皮の研究開発を行った。研究期間に行った研究項目は下記のとおりである。1)自家培養真皮の冷凍保存条件を詳細に検討し、凍結保存・解凍操作に耐えうる最適なマトリックスを開発した。2)凍結保存・解凍後の自家培養真皮中の線維芽細胞の生存率および産生される種々の細胞成長因子を測定した。解凍後も血管新生に重要な血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の産生能力が保持されることを明らかにした。3)自家培養真皮の臨床応用において、自家培養真皮を適用した上に保護材として上皮成長因子(EGF)含有ヒアルロン酸スポンジを開発した。培養系の実験で、EGFが培養真皮中の線維芽細胞に作用して、VEGFとHGFの産生量を顕著に高めることを明らかにした。自家培養真皮とEGF含有ヒアルロン酸スポンジの併用により、線維芽細胞の能力を最大限に発揮できる治療法の可能性が確認できた。本研究では、自家培養真皮の実用化に向けた基盤を構築することを目的としている。そこで、これらの皮膚疾患に対する新しい治療法を可能にする新規の自家培養真皮の研究開発を進めている。具体的には、マトリックスの最適な構造設計と最適な生体内分解速度の決定、線維芽細胞の最適播種密度と線維芽細胞が産生する各種細胞成長因子の定量、さらには、予備臨床研究により移植床形成の組織学的な観察を行う。平成19年度に明らかにした項目は下記のとおりである。1)熱傷瘢痕や巨大色素性母斑を切除した全層皮膚欠損に自家培養真皮を適用して、その上にごく薄い自家分層皮膚を移植する。自家培養真皮のマトリックスが移植床と分層皮膚との間でバリアーになると分層皮膚は移植床からの養分の供給が阻害され壊死する。最適な分子間架橋の導入により、マトリックスの構造を保持すると同時に速やかに分子レベルになって創傷治癒を促進し、かつ瘢痕形成を抑制する作用を最大限に発現する設計が重要な鍵となる。このような観点からマトリックス設計の最適条件を解明した。2)自家培養真皮は、線維芽細胞は生着して真皮様組織の一成分になると同時に、種々の細胞成長因子を産生して周辺組織からの細胞浸潤を誘導して増殖を促進する。それゆえ、より高密度でマトリックスに播種することが望ましい。そこで、最適播種密度を解明した。3)自家培養真皮の臨床応用において、一定の規格内で細胞活性を保持していることは安全性の基準となるため重要である。年齢、性別、皮膚採取部位と線維芽細胞のサイトカイン産生量の関連性を調べる。実際には、各患者の皮膚由来線維芽細胞から作成した培養真皮が産生するVEGFの産生量を定量する。患者数6名について関連性を解明した。本研究では、平成12年度16年度の厚生労働科学再生医療ミレニアムプロジェクトで多施設臨床研究に使用した同種培養真皮の研究成果を基にして、新たに自家培養真皮の実用化に向けた基盤を構築することを目的としている。

具体的には、マトリックスの最適な構造設計と最適な生体内分解速度の決定、線維芽細胞の最適播種密度と線維芽細胞が産生する各種細胞成長因子の定量、さらには、予備臨床研究により移植床形成の組織学的な観察を行う。平成20年度に明らかにした項目は下記のとおりである。1)自家培養真皮は手術日に合せて作成する。しかしながら、小児の場合、発熱等で直前になって手術日の変更が生じる場合が多い。これに対処するため、自家培養真皮の冷凍保存条件の検討を行った。凍結保存・解凍操作に耐えうるマトリックスの最適設計を行った。2)凍結保存・解凍後の自家培養真皮中の線維芽細胞の生存率および産生される種々の細胞成長因子を調べた。解凍後も血管新生に重要な血管内皮成長因子(VEGF)、肝細胞成長因子(HGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の産生能力が保持されることを明らかにした。3)自家培養真皮の臨床応用において、自家培養真皮を適用した上に保護材として軟膏塗布ガーゼを使用する。軟膏塗布ガーゼに代わる新規の被覆材として上皮成長因子(EGF)含有ヒアルロン酸スポンジを開発した。培養系の実験で、EGFが培養真皮中の線維芽細胞に作用して、VEGFとHGFの産生量を顕著に高めることを明らかにした。自家培養真皮とEGF含有ヒアルロン酸スポンジの併用により、線維芽細胞の能力を最大限に発揮できる治療法の可能性が確認できた。本研究では、平成12年度16年度の厚生労働科学再生医療ミレニアムプロジェクトで多施設臨床研究に使用した同種培養真皮の研究成果を基にして、新たに自家培養真皮の実用化に向けた基盤を構築することを目的としている。小児の重症熱傷の治療後に生じる瘢痕(引きつり)は成長に伴い機能障害を引き起こす。また、小児の巨大色素性母斑(真皮組織中の色素沈着)は社会への順応において精神的な障害を引き起こす。そこで、これらの皮膚疾患に対する新しい治療法を可能にする新規の自家培養真皮の研究開発を進めている。平成21年度に明らかにした項目は下記のとおりである。1)自家培養真皮の冷凍保存条件の検討を行った。凍結保存・解凍操作に耐えうる最適なマトリックスを開発した。3)自家培養真皮の臨床応用において、自家培養真皮を適用した上に保護材として上皮成長因子(EGF)含有ピアルロン酸スポンジを開発した。自家培養真皮とEGF含有ピアルロン酸スポンジの併用により、線維芽細胞の能力を最大限に発揮できる治療法の可能性が確認できた。多施設臨床研究に使用した同種培養真皮は、水溶性エポキシ化合物で分子間架橋を導入したピアルロン酸スポンジ層と紫外線照射により分子間架橋を導入したコラーゲンスポンジ層の2層性マトリックスであった。これに対して0本研究で開発したマトリックスは、紫外線照射により分子間架橋したコラーゲンの3次元網状構造体の中に、未架橋のピアルロン酸分子を組み入れたマトリックスであり、移植早期にピアルロン酸分子が溶出して血管新生を伴う創傷治癒を促進することを特徴としている。
誘電エラストマー基複合材料の構造設計による革新的アクチュエーターの開発

誘電エラストマーアクチュエーターの粘弾性と応答性を改善するため,ナイロン繊維を利用して複合エラストマーシートを開発した。カーボングリス内のカーボンブラック含有率は40wt%の場合,変形量と絶縁耐力を両立できる.繊維などの強化材間隔を狭くすることで拘束力を増加することができ,変形方向の制御および最大変形量の増加を行うことが出来た.また,強化材太さを変えることで拘束力を増加させ,曲げ変形を制御できた.さらに,繊維の間隔や方向による影響を評価するため,異方性を考慮した非圧縮超弾性材料モデルを導入し,有限要素法により誘電エラストマーにおける電気・力学連成挙動の解析手法を構築した.アクリル系誘電エラストマーを用い,平行繊維の複合エラストマーシートを作製する。ナイロン繊維をアクリル系誘電エラストマーシートの上に設けて、その上に同じ厚さのアクリル系誘電エラストマーシートをカバーして、複合エラストマーシートを作製した。作製した複合エラストマーシートの上下にカーボングリースを電極として塗布し、その後,駆動する複合エラストマーシートと受動するエラストマーシートの2層構造を持つユニモルフアクチュエーターを作製した。試験用材料の入手と試験片の作製とともに,高圧電源装置を購入し,試験装置および計測システムを立ち上げた。作製したユニモルフアクチュエーターを用いて片持ちはりのように電界誘起曲げ試験を行った。直流電圧の増加とともに電界誘起曲げ変形をビデオカメラで撮影して,その後撮影した画像により曲げ変形の曲率を測定し,電界強度との関係を調査した。ナイロン繊維より太いポリマー棒を使って、上記の同じ方法でユニモルフアクチュエーターを作製し、より高い曲げ変形の曲率を得た。また、一定電圧の耐久試験を行って、ポリマー棒強化エラストマーユニモルフアクチュエーターの方が優れた。太いポリマー棒をお使って、繊維より良い効果を実現した。誘電エラストマーアクチュエーター(DEA)を用いて電界誘起曲げ試験を行い,電界誘起曲げ試験により曲げ変形の曲率を測定し,電界強度との関係を調査した。研究成果としては,(1)複合型DEAの曲率予測モデルを作成し,実験結果と比較を行った結果,変形層複合化DEAは4kVまでの低電圧で一致,制御層複合型DEAは,8kVまでの低電圧で一致した.(2)粘弾塑性モデルは,実験結果と精度よく一致し,クリープ予測ができた.(3)得られた係数から,各ひずみ量を算出した結果,DEAの複合化により,弾性ひずみ,粘弾性ひずみ,粘塑性ひずみは増加する.(4)電極材料の比較により,電極材料は柔軟性と,電極面積が拡大しても,電極となる充填剤が一定以上の比率を保てるものが最適だとわかった.炭素繊維をアクリル系誘電エラストマーシート(VHB)の上に設ける作業を行った。強化用炭素繊維を電極としても使用するため,導電性の考慮とシートの周囲にショットを防止する方法に工夫した。しかし,炭素繊維の効果はナイロン繊維の効果より悪い結果になった。今後、原因を調べる予定である。繊維の間隔や方向による影響を評価するため,異方性を考慮した非圧縮超弾性材料モデルを導入し,有限要素法により誘電エラストマーにおける電気・力学連成挙動の解析手法を構築した.その上,変形シミュレーションにより各種材料モデルの妥当性について検証を行い,誘電エラストマーに最適な材料モデルを確立した.さらに,作製したユニモルフアクチュエーターに対するシミュレーションにより,変形を表す曲げ曲率と荷重の関係を明らかにした。昨年度,研究設備や材料などの手配が順調に進展した上,研究員と大学院生が増員し,炭素繊維に関する研究が予想外であったが,ほかの研究内容が計画より多く進展した。アクリル系誘電エラストマーアクチュエーターの粘弾性と応答性を改善するため,ナイロン繊維を利用して複合エラストマーシートを開発した。変形を阻害しない柔軟性を持ち,変形により電極面積が拡大しても,カーボンブラックなどの導電材料が一定以上の比率を保てるものが最適であるということがわかった.カーボングリス内のカーボンブラック含有率は40wt%の場合,変形量と絶縁耐力を両立できる.繊維などの強化材間隔を狭くすることで拘束力を増加することができ,変形方向の制御および最大変形量の増加を行うことが出来た.また,強化材太さを変えることで拘束力を増加させ,曲げ変形量を減少させる原因となる内側に巻く変形を制御できた.さらに,誘電エラストマー材料モデルとして,代表的なNeo-Hookeanモデル,Arruda-Boyceモデル,Gentモデルなどを利用してきた。本研究では,繊維の間隔や方向による影響を評価するため,異方性を考慮した非圧縮超弾性材料モデルを導入し,有限要素法により誘電エラストマーにおける電気・力学連成挙動の解析手法を構築した.その上,変形シミュレーションにより各種材料モデルの妥当性について検証を行い,非圧縮異方性超弾性体材料モデルを導入し,電界誘起大変形に対する非線形解析手法を構築して,解析結果と試験結果との比較により新しい誘電エラストマー材料の開発および革新的誘電エラストマーアクチュエーターの性能向上を実現した。実験の結果から,強化材による変形方向制御および変形量の向上には,拘束力の強さと軽量化を兼ね備えた材料が望ましいと考えられる.そこで,現在までに広く研究開発が行われてきた高分子系複合材料のように,誘電性エラストマーに強化材(この場合,ガラス繊維や粘土鉱物など)を複合させることで,従来の材料に比べ優れた特性を発現する材料の開発が期待される.誘電エラストマーアクチュエーターの粘弾性と応答性を改善するため,ナイロン繊維を利用して複合エラストマーシートを開発した。

カーボングリス内のカーボンブラック含有率は40wt%の場合,変形量と絶縁耐力を両立できる.繊維などの強化材間隔を狭くすることで拘束力を増加することができ,変形方向の制御および最大変形量の増加を行うことが出来た.また,強化材太さを変えることで拘束力を増加させ,曲げ変形を制御できた.さらに,繊維の間隔や方向による影響を評価するため,異方性を考慮した非圧縮超弾性材料モデルを導入し,有限要素法により誘電エラストマーにおける電気・力学連成挙動の解析手法を構築した.計画の通り、研究を遂行する。今後,誘電エラストマーの電気力学解析と実験結果の比較により,新しいモデルを構築する。機械材料講演者の都合で講演を来年度に変更したので、謝金を支出しなかった。また、材料費を節約した。来年度の予算が不足ので,予定支出の旅費と消耗品費がほかの予算から支出された。謝金と消耗品に使用する予定である。
ピンインは中国語の相互コミュニケーションにどう貢献するのか―語彙から文への検討

2018年度では,(1)音声理解における中日漢語の音韻的類似性の影響,(2)音節・語レベルの知覚・産出におけるピンイン知識の貢献度,(3)語彙力,聴解力,ピンイン,音韻的類似性がコミュニケーション理解に及ぼす影響という3つの課題をめぐり,相互コミュニケーションにおける習得要因の関係を検討した。そのため,2017年10月2018年度の前期では,課題(1)について,2058語の中日同形語の2字漢字語客観的音韻類似性を計算し,「2字漢字語の日韓中越データベース」における指標として音韻類似性を加えた。その後,中国人日本語学習者60名を対象に,(1)日本語の語彙能力テストおよび(2)日本語の2字漢字語の語彙性判断実験を行い,日本語の語彙性判断における日中2字漢字語の客観的音韻類似性を検証した。さらに,日本人中国語学習経験者と非経験者,合計107名を対象に,100語の中日2字漢字同形語の主観的音韻類似性判断の実験を行い,中日同形語の2字漢字語客観的音韻類似性判断との相関を検討した。2018年度の後期からは,課題(2)と(3)について,以下のように多様な実験およびテストを実施した。42名の日本人中国語学習者に対して,中国語の(1)2音節の声調組み合わせ弁別実験,(2)2字漢字語の語彙命名課題(中国語の語彙産出),(3)韻律理解実験,および2種類の中国語能力テスト(聴解テストおよび語彙テスト)を実施し,学習者による文における韻律的情報の理解の背景諸要因および特徴を考察した。2018年度では,3つの課題を検証するための実験および調査をすべて遂行した。今はこれらの結果を学会で発表した後,論文に執筆し,学会誌に投稿する準備をしている。現在,3つの研究課題を行った研究結果をまとめて論文を執筆している。今後は,これらの研究結果に踏まえた上で,学習者による中国語の文における韻律的理解を検討し,さらに,母語の日本語の韻律的理解と比較したいと考えている。最終的に,語から文への日中両言語の韻律による言語処理を比較することで,日中相互的言語の影響における韻律理解のメカニズムを解明する。
歯科用卑金属合金と陶材との接合方法

スパッタリング法によって卑金属系合金(Ni-Cr系、Fe-Ni-Cr-Co-Mo系)と陶材との接合強さの改善ならびに接合機構の解明を目的として、前回はCrをスパッタ処理した場合について検討した。その結果、金属と陶材の間にCr酸化物を介在させることにより、良好な接合体を得ることに成功した。ひきつづき、今回は最近インプラント用や義歯用として注目されているTiをスパッタ材とし、前回と同様の方法でスパッタ処理を施して、陶材との接合強さの改善を試みた。結果を要約すると下記の通りである。Tiスパッタ処理後、種々の条件で酸化処理したものについて陶材を焼付けたところ、処理条件によっては金属と陶材とが強固に接合するものと、逆に剥離するものとがある。例えば陶材焼成温度に相当する800°C60分の酸化処理のものでは、Tiを主とした複合酸化物層が著しく厚くなり、酸化物層内の所々に隙間ができて脆い状態になるために剥離しやすくなる。これに対して酸化物層の成長を抑制するような条件、例えばTiスパッタ処理後酸化処理を行わずに陶材焼成する方法のものでは、陶材とで強固に接合する。この接合体の界面を中心に電顕観察や線、点分析を行った結果によると、Ni-Cr系合金にはTi、Crが、またFe系合金ではTi、Cr、Feなどが陶材中に数μm拡散しており、引張試験を行ったところ、Ni-Cr系は330590kgf/cm^2、Fe系では120480kgf/cm^2の接合強さが得られた。以上のように、卑金属系合金に対するTiスパッタ処理は、Tiを主とした酸化物層の形成を極力抑制するような方法によって良好な接合体が得られ、卑金属合金と陶材との接合を改善できることがわかると共に、Tiが陶材焼付用として有望であることが示唆された。
時間割引アノマリーと異時点間選択行動の経済分析：負債保有、肥満、喫煙行動への含意

5カ年計画による本研究では、時間割引に関して近年行動経済学の分野で報告されている双曲割引などの数々の変則現象(時間割引アノマリー)の発生原因を解明し、併せて肥満、負債保有、喫煙、健康管理行動など、異時点選択に関わる人々の実際の行動への影響を実証的に明らかにした。その成果は代表的な国際学術誌(Journal of Health Economics, Journal of Economic Dynamic & Control, Health Economics等)に掲載されるとともに、著書『自滅する選択』にまとめられ韓国語にも翻訳された。同書は2012年に第55回日経・経済図書文化賞を授与された。時間割引率とそのアノマリーを実証的に計測し、実際の異時点間の選択行動への影響を明らかにするとの「研究の目的」から、本年度は「実施計画」にしたがって、以下の研成果をあげた。第1に、アンケートによるクロスセクションデータを用いて、時間選好率と時間割引バイアス(双曲割引、符号効果)が肥満ややせなどの体格と有意に説明することを実証的に明らかにした。とりわけ、双曲割引や符号効果と体格の関係を直接分析した実証研究は、文献上初めてのものであり、Social Science Research NetworkにアップしたDPは期間ダウンロード数でTop10に入った。この研究は、経済学以外の専門誌や一般向けの新聞・雑誌からも関心を寄せられ、広く公表された(『Q&Aでわかる肥満と糖尿病』9・10月号(2009)、Vol.8/No5、「特集医療経済と保険適応」;雑誌『プレジデント』200910.5号「締め切りを守れない人はなぜ肥満リスクが高いのか」など)。第2に、選好の確率的ゆらぎ(嗜好ショック)を導入し、その不確実性によって発生するリスクを消費者が回避するところから時間割引が誘発されるような理論モデルを構築し、その草稿をいくつかのセミナー報告し(東京大学、2009年5月;京都大学、同年7月)、関連分野の研究者との意見交換を行った。第3に、康明逸氏とともに時間割引と喫煙の関係をアンケートパネルによって実証的に明らかにし、その結果をIAESのプラハ大会で報告した、パネルデータを用いて喫煙と時間割引の関係を分析した初めての貢献として位置づけられる。最後に、時間割引と負債保有との関係をアンケートパネルデータによって分析し、ワークショップ「異時点間選択の経済学」で報告、意見交換を行った。補助金の一部を2010年度に繰り越し、危険回避度と時間割引率の相関、双曲割引など、関連問題に関するインターネットアンケート調査を行い、次年度の分析に必要なデータを収集した。とりわけ、双曲割引や符号効果と体格の関係を直接分析した実証研究は、文献上初めてのものであり、Social Science Research NetworkにアップしたDPは期間ダウンロード数でTop10に入るとともに、医療経済学の分野で国際的にもっとも定評のあるJournal of Health economicsに掲載された。今年度は時間割引率に関する2種類のデータを入手し、現段階で分析をほぼ終了している。1つは、2006年-2007年のエアコン取引のPOSデータであり、そこから得られる省エネと価格、販売情報から消費者の時間選好率を推定している。いま1つは、日経リサーチを通じて行ったインターネット調査「時間とリスクに関する選好調査」であり、これより双曲割引や符号効果という時間割引特性が人々の負債行動や健康と仮説通りの相関を示すことが解明されている。これらについては、来年度出版成果にまとめることを目指す。1.平成22年度にインターネットを用いて行った「時間とリスクに関するアンケート調査」のデータを用いて、双曲割引や符号効果という時間割引率特性が負債行動とどのような相関を持つかを検証した。特に、締め切りのある仕事をどの程度早めに行うかについての計画と実際に関する回答のデータ回答データから、回答者をソフィスティケイトであるのかナイーブであるかを識別し、その上で、双曲割引と負債の相関が両タイプの間で有意に異なることを示した。研究結果は、Ikeda and Kang (2011)としてDPの形にまとめられた。2.喫煙行動に及ぼす影響についてパネル分析を行い、Kang and Ikeda (2011)としてDPにまとめ、国際誌に投稿した。国際誌からは改訂の要請があり、コメントにしたがった改訂版を再度投稿した。3.時間選好率が富の減少関数である場合に、2国経済における財政政策や選好ショックが従来の結論とどのように変わってくるかを分析し論文にまとめた。同論文をJournal of Economicsに投稿したところ、強い改訂の要請があった。4.双曲割引による時間非整合的行動がもたらす不利益とそれに対する対策をテーマとした書物を出版するための準備作業を行った。

分析結果の整理、出版社との交渉、スケジュールの設定、文献の整理、全体を紹介する序章の草稿執筆などである。5.平成24年度への繰り越し分については、消費者の時間選好率を推定するために、エアコンや冷蔵庫など耐久電気機器の省エネ機能と価格のPOSデータを、東北大震災後まで整備した。そのうえで、まず2007年時点のデータを用いて予備的な分析を行った。その結果、同時点では、省エネ機器の価格データから推定される時間選好率は一般非耐久財消費データから推定されるものよりも高く、したがって、省エネ機能が市場で効率的に取引されていないことが示された。1.大阪大学GCOEの選好に関するパネルデータを用いて、時間割引が喫煙行動に与える影響についてパネル分析を行った論文をHealth Economicsに発表した。同論文は、時間割引が、そのレベルだけではなく、双曲割引、および符号効果を通じて喫煙行動に影響を与えることをパネル分析で示した初めての研究である。2.消費に関する習慣形成と貨幣保有に関する習慣形成が並行して行われる国際マクロ経済モデルを構築し、為替レートと経常収支の動学経路の特性を分析した。習慣形成がこのように独立に進行していく可能性については、文献上ほとんど議論されておらず、ユニークな貢献である。同論文は、Modern Economyに掲載された。3.前年度行動経済学会会長講演で報告した意志力と消費者行動に関する研究を、池田(2013)としてまとめ、行動経済学会機関誌に発表した。4.一般向け著書池田(2012)がハングル語に翻訳され、韓国で出版された。1.時間選好率が富に関して逓減的である場合の含意を2国世界経済モデルによって明らかにし、Hirose and Ikeda (2012, JOE)とHirose and Ikeda (2012, JEDC)として出版した。前者では1財モデルで動学的な見地から政策含意を解明したのに対して、後者では2財モデルで交易条件の変化を考慮した場合の分析を行った。時間選好率が富の減少関数であることは実証的にサポートされる性質であるにもかかわらず、理論的な分析は文献上数少ない。その意味で貢献は意義深い。2.中国復旦大学の学生を被験者として時間割引率を推定する経済実験の結果を論文にまとめ、双曲割引と先送り行動の関連性を示唆する結果を示した。論文はSasaki et al. (2012)の形で出版された。3.肥満、負債、喫煙、ギャンブル、先延ばしなど、人びとの自損的行動と双曲割引の関係を理論と実証の双方から解明し、政策対応を考察した一般向け著書池田(2012)を出版し、第55回日経経済図書文化賞を受賞した。同書は本科研研究をベースにし、その研究成果を社会に発信したものである。4.意志力を考慮した消費者モデルを考案し、消費・貯蓄選択と時間選好形成への含意を明らかにした。
アルドラーゼアイソザイムの免疫化学的研究

アルドラーゼルはA型、B型、C型の3種のアイソザイムの存在が知られている。A型は筋肉に、B型は肝に、C型は脳に主として含まれており、それぞれ免疫学的性質が異なっている。組織の癌化に伴ない、癌組織のアルドラーゼアイソザイムパターンは発生母組織に関わりなくA型が優位になることが知られている。私たちの開発したRIA法により、癌患者血清中6080%にA型の上昇が認められたが、早期の癌での陽性率は比較的低かった。今回A型の他、B型、C型においても固相法に基づくRIA法を確立し、組織、血清で検討したところB型は肝に多く含有されており、肝障害時、血清で高値を示す傾向がみられ、GOT,GPTと相関を示した。アルドラーゼBは肝以外にはほとんど含まれていないため、GOT,GPTよりさらに肝に特異的なアイソザイムであり、新しいタイプの肝機能検査法としての応用が期待される。癌患者血清のアルドラーゼBの低下する例が、癌のstageには無関係に5070%に認められ、新しいタイプの腫瘍マーカーとして臨床応用される可能性が示唆された。この現象の原因は未だ不明であるが、癌患者血清中にはアルドラーゼBを抑制する因子の存在は認められず、生体例の反応であることが推測されている。C型は脳および神経組織に多く含有されており、一部の癌組織にも見いだされている。癌患者血清の2030%にアルドラーゼCの上昇を認めたが、脳腫瘍(ブリオーマ)患者血清においてもほぼ同様の上昇率を示し特に脳腫瘍特異性は認られなかった。脳血管障害患者血清では、脳の障害の程度によって、陽性率が決定されることが示唆され、血清アルドラーゼCの測定により脳卒中の診断、経過観察に応用が期待される。これら3つのアイソザイムを同時測定することにより、Serological biopsyとして、種々の疾患の鑑別に応用可能と思われた。
ヒューマノイドによる日常環境マニピュレーションの物理モデル内在・獲得統合型実現法

本研究では,単腕,双腕マニピュレータロボットからヒューマノイドロボットまで多様なロボットに適用可能な自律行動実現能力の向上のための運動生成や視覚・音声認識からなるロボットシステム構成を,モデルに対するロバスト性に重点を置きながら研究した.ロボットの物理モデルに基づく,ロボット構成に汎用的な動作生成法として,解析勾配を用いた最適化計算によって目標誤差を最小にするコンフィギュレーション列を生成する手法により,多様な形態のロボットによるマニピュレーション動作が生成可能であることを示した.これは,解発散項による局所最適解回避や組み合わせタスク目標の連続関数近似により,従来のタスクモデル記述では表現することの難しい目標タスクにまで適用可能であることが明らかとなった.また,動力学シミュレーションを活用した全身姿勢修正により,前述の手法のように解析的な勾配を利用することが難しい複雑形状での多点接触姿勢を効率的に生成可能であることを示した.また,運動生成のみならずロボットシステム全体への展開として,タスク遂行のための大局的状態遷移において,タスクスケジュールモデルに基づいた自律的サブタスク動作遷移と人からの音声,視覚,力覚提示から獲得されるインタラクションモデルに基づいたサブタスク動作遷移修正に基づいて,大規模タスクを確実に実行可能なロボットシステムを構成した.これらの成果は,シミュレーション上でのマニピュレータ,モバイルマニピュレータ,小型ヒューマノイド,等身大ヒューマノイドの動作実現,等身大ヒューマノイドロボット実機による全身環境接触動作やマニピュレーション動作を伴う一連のタスク実現により有効性が検証された.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
微小孔アレイと微小電極アレイを用いた細胞共培養と細胞外電位計測

シリコン基板を加工することで角型のマイクロウェルをアレイ状に製作し、各ウェルの底面(一辺300μm)に多数の微小孔(直径3μm)を有する窒化シリコン(SiN)製の自立膜(厚さ1μm)を形成した。この膜の裏面にコラーゲンを、膜表面にラミニンを修飾し、膜裏面に大量のアストロサイトを、膜表面に単一の神経細胞を順次播種し、SiN多孔膜を挟んだ共培養を行った。単一神経細胞は、微小孔を通じてアストロサイトと相互作用しながら成長し、軸索を伸展させて自身の樹状突起とシナプスを形成する。このとき、神経細胞とアストロサイトの間で良好な細胞間コミュニケーションが形成されていれば、培養日数の経過とともにシナプス数が増加し、神経細胞の活性が長期に渡って維持される。この効果を定量的に評価するために、シナプスに局在する小胞型グルタミン酸トランスポータを蛍光染色することでシナプス数をカウントし、シナプス数の経時変化を調べた。その結果、共培養開始から2週間でシナプス数が急激に増加し、それ以降はシナプス数が高いレベルで維持され、5週間に渡って神経細胞の高活性が維持された。次に、SiN自立膜(厚さ約2μm)の中心部1.1mm角の領域に、白金黒製の微小電極(1辺54μm)を8×8個のマトリックス状に形成した。このSiN膜の電極形成面にラミニンを修飾した後に、神経細胞とアストロサイトを播種し、同一面上で共培養を行った。共培養10日目に、神経細胞の典型的な細胞外電位波形である二相性のスパイク信号列を計測することに成功した。さらに、SiN膜に多数の微小孔(直径約6μm)を形成した。SiN膜の電極非形成面にコラーゲンを、電極形成面にラミニンを修飾した後に、電極非形成面にアストロサイトを、電極形成面に神経細胞を順次培養し、SiN膜を挟んで共培養を行った。共培養9日目に、神経細胞の細胞外電位を計測することに成功した。本研究の目標は、半導体加工技術を用いて微小孔アレイと微小電極アレイを有するSiN製の膜状構造体を製作し、SiN膜の両面に異種細胞を培養することで微小孔アレイを通じた良好な細胞間コミュニケーションを実現し得る共培養技術を構築するとともに、表面側に培養した細胞の電気的信号を微小電極アレイにより多点で計測する技術を構築することである。本研究では、現在までにすでに最終目標に近い段階の成果が得られている。さらに、本共培養法の有効性を単一細胞レベルで定量評価する手法の構築は、当初の研究計画に無かったものであり、当初目標を上回る成果である。SiN多孔膜を介して単一神経細胞とアストロサイト群の共培養系を構築する技術を改良する。マイクロウェル底面のSiN多孔膜を用いたこれまでの方法では、大きな凹凸構造を有するウェルアレイへの表面処理に不具合が生じたため、単一神経細胞培養の成功率が極めて低い結果となった。今後は、これを解決するために、シリコン製の円形フレームで支持された比較的広いフラット面を有するSiN多孔膜を製作し、この膜表面に単一神経細胞を配列する技術を構築する。そして、膜裏面のアストロサイト群との共培養系において、単一神経細胞のシナプス数をカウントし、神経細胞の活性を定量的に評価することで、本共培養技術の有効性を実証する。次に、SiN自立膜の表面に64個の微小電極と多数の微小孔を形成したデバイスを製作し、SiN膜裏面の電極非形成面にアストロサイトを、電極形成面に神経細胞を順次培養する技術を最適化する。このデバイスの外周部にはアンプ装置との電気的接続に必要な電極パッド・アレイが形成されているため、これを培養液等で汚染せずにSiN膜両面への表面修飾及び細胞播種を確実に行う必要がある。そのため、SiN膜両面に形成する培養チャンバ等の構造や製作方法を最適化するとともに、表面修飾と細胞播種の手順や条件を最適化する。その後に、SiN膜を挟んで共培養を行った状態で、神経細胞の細胞外電位を多点で計測する技術を確立する。半導体加工技術を利用して、シリコン製の円形フレームで支持され、多数の微小孔(直径約3μm)を有する、SiN(窒化シリコン)製の膜状構造(厚さ1μm)を製作した。このSiN多孔膜は細胞の寸法と比べて充分に薄いため、膜を挟むようにしてその両面に異種細胞を共培養すれば、異種細胞間の距離が極めて短くなり、微小孔を通じて細胞間の液性因子の移動や細胞どうしの接着が起こることが期待でき、良好な細胞間コミュニケーションを実現できる。実際に神経細胞とアストロサイトを用いて本共培養技術を構築した。まず、SiN膜面の細胞接着性を向上させるために、アストロサイト培養面にコラーゲンを、神経細胞培養面にラミニンを、順番に修飾する技術を構築した。次に、マウス大脳皮質アストロサイトをSiN膜の片面に播種し接着を待った後に、SiN膜を裏返して他方の面にマウス海馬神経細胞を培養した。そして、アストロサイトのGFAP(Glial fibrillary acidic protein)及び神経細胞のβ-Tubulin IIIを異なる蛍光色素で二重染色することで、それぞれの細胞の形態や線維・突起の伸長を観察し、細胞の接着性等を評価した。さらに、細胞外電位を多点で同時計測することが可能なデバイスを製作する技術を構築した。