hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造血幹細胞のホメオスターシスの維持と破綻

すでに幹細胞のニッチ分子として重要視されている3分子Ang-1、TPO (トロンボポエチン)、N-cadherin (N-カドヘリン)のシグナル研究に関して先駆的研究を進めており、優位性があると考える。幹細胞とニッチの相互作用を明らかにし、この解析結果をもとに、臨床的には、造血幹細胞のホーミング、動員(mobilization)をin vivoで制御できるようにする。2015年度、我々は、造血幹細胞の子孫である巨核球が、TPOを介して、幹細胞の細胞周期を制御しているというデータを得ている。幹細胞が直接の子孫細胞によって制御されるFeedbackを検証し、外来性および内在性のニッチによる造血幹細胞システムの恒常性を解明する。幹細胞ニッチに関する研究に関しては、巨核球から産生されるTPO (トロンボポエチン)が、造血幹細胞の静止期性を制御しており、子孫細胞が幹細胞の恒常性に寄与することを示した(J Exp Med, 2015)。造血幹細胞の代謝に関連した研究では、造血幹細胞は、解糖系によりエネルギーを得て、静止期を維持していること、その代謝調節に低酸素応答分子であるHIF-1αおよびその下流分子が関与していることを明らかにした(Cell Stem Cell, 2012& 2013)。このことは幹細胞が内骨膜の低酸素性ニッチにあることと一致し、幹細胞がROSに感受性が高いこととも関連すると考えられる。また、分担研究者の馬場理也らと、がん抑制遺伝子であるFolliculin(FLCN)変異マウスを用いて、造血幹胞における酸化的リン酸化の代謝シグナルを解析し、その造血幹細胞が、細胞回転をし、Apoptosisを起こすことを示した(Stem Cell, 2015)。さらに、オートファジー関連分子ATG7欠損マウスの造血幹細胞ではミトコンドリアの蓄積、並びに、幹細胞機能の低下を認めた。また、Tie2陽性造血幹細胞は、生体内でも自己複製分裂を示す頻度が高いことを示し、これらの自己複製幹細胞は、一部Autophagy機構によって維持されていることを明らかにした(Science, 2016)。造血幹細胞におけるDNA損傷反応における研究では、Cyclic di-GMP/STINGやInterferonが造血幹細胞の増殖を抑制することを見出した(Cell Rep, 2015)。また、p53関連アポトーシス促進因子であるASPP1の欠損は、造血幹細胞の特性を向上させるがDNA損傷Fociの消失が遅延すると共に、白血病発症のポテンシャルが劇的に上昇することも見出した(Cell Stem Cell, 2015)。研究代表者の須田年生が、2014年から2015年にかけて、研究室を、慶應義塾大学から熊本大学に移動したのに伴い、多少の立ち遅れがあったが、慶應時代からの多くの共同研究者の支援と本大型研究費によって、研究は順調に進み、初期の目的は果たしていると考えている。本研究の前半の成果により、新たな課題が立ちあがっており、その解決に、後半も努力したい。造血幹細胞ニッチと幹細胞動態の研究、ならびに幹細胞におけるDNA損傷反応に関する研究を展開し、しかるべき成果を得て論文発表すことができた。
化学発癌における活性中間体の動態と標的臓器DNA傷害ー臓器および種特異性との関連

本研究班は癌原物質の代謝的活性中間体の生成、不活性化、DNA付加体の生成とその構造特異性、傷害DNAの修復などを総合的に研究し、化学発癌における臓器特異性、種差、性差などの機構の分子レベルで解明することを目的として以下の成果を得た。1.癌原性へのテロサイクリックアミンのNー水酸化体の硫酸抱合を経てのin vitroでのDNA傷害はヒトを含めてすべての検討した動物で認められたが、ラットでは活性が高く、著しい種差が認められた。2.4ーヒドロキシアミノキノリンー1ーオキシド(4HAQO)静注後のDNA付加体生成のラット、マウス、モルモット、ハムスタ-などにおける検討では、4HAQOの発癌標的臓器において高値を示すという相関が認められた。高感受性のラットにおいては膵や腎でのDNA付加体の生成は低感受性のマウスに比べ初期に高くかつその除去が遅いことが明らかにされた。3.4ーメトキシー4ーアミノベンゼンNー水酸化酵素はマウスのオスの腎にのみ高い活性が認められ、他の動物では全く欠損しているという著しい種差が見出された。4.アミノアゾベンゼン誘導体のうち、癌原性3ーメトキシ体はDNA付加体の生成が高く、付加はDNA伸長反応を強く抑制したが、一方、非癌原性2ーメトキシ体はDNA付加体の生成も低く、かつ付加体によるDNA伸長反応の抑制は見られなかった。5.O^6ーアルキルグアニンーアルキル転移酵素欠損大腸菌に作り、標的遺伝子内の数箇所に高い頻度でG・CーA・Tトランジション突然変異が生じ、突然変異のホットスポットが存在することが明らかにされた。以上、DNA付加体の生成と癌原性の種差、臓器特異性などについては単にDNA付加体の量ではなく、その質(癌原性の強さ)が問題にされねばならず、それらについての詳細な研究が必要とされよう。
光ー圧力変換方式を利用した微小圧力分布センサ-による口唇閉鎖機能の定量的解析

本研究の目的は、開咬やアデノイド肥大などによる気道障害を伴った患者に多く認められる口唇閉鎖不全を定量的に評価することである。その際の仮説として、口唇閉鎖不全を伴う患者の最大口唇閉鎖力は健常者のそれよりも劣ることを想定した。口唇閉鎖力の測定系として、光ー圧力変換方式を利用した圧力分布センサ-を開発し、かつ臨床応用を可能にするためにディスポ-ザブルタイプのカ-トリッジを試作した。本システムの構造および原理は以下のようなものである;1)表面に微小な四角錐状の突起を備えたシリコンゴムシ-トを透明なアクリル板に近接させる。2)口唇によってシリコンゴムシ-トに圧力を与える。3)アクリル板に光を入射する。4)アクリル板の中を全反射しながら伝播した光が、口唇によってアクリル板表面に圧接されたシリコンゴムシ-ト突起部において乱反射を生じ、外部に射出する。5)圧力に比例した光量を写真フィルムに記録する。6)イメ-ジスキャナによりパ-ソナルコンピュ-タに入力し、画像処理によって圧力分布を測定する。本圧力分布センサ-の有効性を評価するために、臨床応用を試みた。被験者は対照群として口唇閉鎖不全を伴わない成人女性の正常咬合者5名を、また実験群として著しいinterlabial gapを有する成人女性の顎変形症患者5名を選択した。その結果、対照群の圧力分布パタ-ンは、口唇中央部に高圧力ゾ-ンを伴う対称形の多層状のパタ-ンを示したが、実験群においては圧力分布に偏位が認められ、不整形なパタ-ンを呈していた。また顎変形症患者の最大口唇閉鎖力は正常咬合者と比較して明らかに小さかったことから、口唇閉鎖不全と圧力分布パタ-ンとの間には強い相関があることが証明された。
ポリウレタンの表面ミクロ構造制御による高性能生医学材料の構築

液晶性セグメント化ポリウレタン(LCPUE)は,ソフトセグメントがポリオール,ハ-,グメントがビフェニル系の液晶基とトルエンジイソシアナ-ト(TDI)の繰り返しからから構成されている。このLCPUEは従来の結晶性ハードセグメントをもつポリウレタンとは異なった凝集構造、力学物性、生医学機能を示すものと予測される。平成6年度は日本側では「液晶ポリウレタン表面の分子運動特性評価法の確立」、「液晶ポリウレタン表面構造解析法の確立」について研究を進めてきた。さらに平成5年度に引き続いて原子間力顕微鏡観察(AFM)によるタンパク質の吸着挙動の評価に関しても検討した。一方、米国側では液晶ポリウレタンの合成及び基礎物性の評価が進行した。1)液晶ポリウレタンの合成1モルのポリテトラメチレンオキサイド(PTMO)と2モルのトリエンジイソシアナ-ト(TDI)からプレポリマーを合成し、液晶性のジオール1モルで鎖延長することによりLCPUEを得た。得られたLCPUEの熱的性質、凝集構造を明らかにした。2)液晶ポリウレタン表面の構造解析法の確立LCPUEの生医学材料としての応用は生体という水に富んだ環境で行われるので、通常の固体表面解析法のみでは生体適合性に関連した表面の組成を明らかにすることができない。含水状態での凍結乾燥X線光電子分光法(Freeze-etch XPS)、動的接触角法を用いて含水状態での表面構造の解析法を確立した。さらに表面形態の相分離状態の熱処理温度依存性を原子間力顕微鏡測定に基づき明らかにした。3)ポリウレタン表面の分子運動特性の評価LCPUE(Mn)は、403Kに、ハードセグメントの液晶一等方相転移を示した。XPS測定の結果はLCPUE(Mn)表面には、表面自由エネルギーの低いPTMOが濃縮されることを明らかにした。製膜後のLCPUE(Mn)表面のAFM像はnmオーダーで平滑であった。LCPUE(Mn)の378Kの熱処理によりハードセグメントの秩序性が向上した。LCPUE(2000)の場合、熱処理に伴い表面に数nmの高さの凹凸が生成した。SVM観察の結果、凸部分の弾性率は凹部分に比べて低く、凸部分がソフトセグメントに富んでいることが示唆された。このような構造はゴム状態のPTMOが表面で形態エントロピーを増大させようと収縮したことに起因すると考えられる。4)ポリウレタン表面と生体成分の相互作用ポリウレタン表面と血漿タンパク質の相互作用をフーリエ変換正規外吸収フローセル法に基づき評価し、ソフトセグメントの分率と血漿タンパク質の吸着速度、吸着量の関係を明らかにした。5)ミクロ相分離モデル表面へのタンパク質の吸着挙動有機シラン混合単分子膜をラングミュアー法に基づき調製し、相分離表面を得た。相分離表面を認識したタンパク質の吸着挙動をAFM観察により直接観察した。

5)ミクロ相分離モデル表面へのタンパク質の吸着挙動有機シラン混合単分子膜をラングミュアー法に基づき調製し、相分離表面を得た。相分離表面を認識したタンパク質の吸着挙動をAFM観察により直接観察した。平成5年度は「ポリウレタン表面のミクロ構造制御法の確立」、「ポリウレタン表面構造解析法の確立」について研究を進めてきた。また平成5年度に原子間力顕微鏡(AFM)観察によるタンパク質の吸着挙動に関しても検討した。しかしながら当初予定していた「液晶ポリウレタンを用いた新しい高分子生医学材料の開発」に関しては試料の合成の遅れなどもあり、平成5年度の後半からのスタートとなった。1)ポリウレタン表面のミクロ構造制御法の確立ポリウレタンは優れた力学的性質を有しており、生体成分との相互作用を低下させることによる抗血栓性の発現により長期間の臨床応用が可能となる。ポリウレタン表面のミクロ構造制御を製膜条件あるいは、種々の表面自由エネルギーを有する化学種の表面へのグラフト化により実現した。さらに表面ミクロ構造の表面局所架橋による固定化によりミクロ相分離構造を示す安定な表面の作製プロセス法を明らかにした。2)ポリウレタン表面構造解析法の確立ポリウレタンの生医学材料としての応用は生体という水に富んだ環境で行われるので、通常の固体表面解析法のみでは生体適合性に関連した表面の組成を明らかにすることができない。含水状態での凍結乾燥X線光電子分光法(Freeze-etch XPS)、動的接触角法を用いた含水状態での表面構造の解析法を確立した。3)高分子材料表面と生体成分の相互作用の解析シリコンウエハ-上に形成した相分離表面への血漿タンパク質の吸着挙動を吸着後の試料表面のAFM観察に基づき評価し、血漿タンパク質が材料の親疎水性を認識して吸着することを明らかにした。
ナノアパタイトとナノコラーゲンによる生体極似骨梁構造を持つ人工骨の開発

糖尿病や骨粗鬆症などによる歯槽骨吸収の重症化した患者に対する骨再生療法の開発を目的として、糖尿病や骨粗鬆症モデル動物において、幾何構造を持つDDS-HB37Hにナノ・アテロコラーゲンをコートし、標的薬剤を付与した間葉系幹細胞を培養付着させ骨形成における血管成長とコラーゲンとの関係の評価を行った。その結果、DDS-HB37Hは骨形成促進因子であるOsterixやALPとともにVEGFmRNAの発現を増強させた。また、骨組織形成が進行する部位のVEGFの発現が増加し豊富な血管の形成された。したがって、DDS-HB37Hは糖尿病や骨粗鬆症患者に対する骨再生療法として有効と考えられた。糖尿病・骨粗鬆症合併症モデル動物を作成し、骨欠損を作成するとともに採取した骨の骨質およびBMP-2、IGF-1、TNFa、IL-1、RANKL、PTHの発現について免疫組織染色とin situハイブリダイゼーションによる組織遺伝子学的を解析した。その結果、糖尿病・骨粗鬆症合併症では献上動物と比較してBMP-2およびIGF1の発現が低下し、TNFaおよびIL-1が上昇していることがわかりつつある。しかしながら、RANKLおよびPTHについては、ばらつきが多く検証を追加中である。一方、ナノハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体に対する間葉系細胞の骨芽細胞分化の検討も進行中で、ISO10993に準じて骨髄間葉系細胞の育成状態と分化度を検証した。その結果、何れのTCPの表面にも,間葉系細胞が良好に付着していた.何れのTCPの孔内においても,TBによる基質形成およびALPにより骨芽細胞分化が確認された。血管用組織形成は,何れのTCPでも,培養系での確認はできなかった。従来の37HbTCP(H)に比べ,コラーゲンコート37HbTCP(C)では,ハニカム孔内部への付着細胞数が増加していた.コラーゲンコート37HbTCP(C)では,D14において培養細胞による石灰化が確認された。骨形成遺伝子の変化は、再現性がうまく得られないため、現時点での評価は難しい。今後は、検証に使用しているプライマー配列の修正、骨髄細胞の培養条件を再検討し条件を整えて計画を遂行していく予定である。ナノコラーゲンにナノアパタイトをチタンを基盤として形成し、間葉系幹細胞を骨芽細胞分化をかけて培養した。結果、実験群ではオステオカルシンの発現や石灰度の増加など骨芽細胞への分化傾向が増していた。ナノハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体に対する間葉系細胞の骨芽細胞分化の検討を、ISO10993に準じて骨髄間葉系細胞への細胞毒性、育成状態と分化度を検証した。その結果、何れのTCPの表面にも,間葉系細胞が良好に付着していた.血管誘導能をもつハニカム型のTCPの孔内においても,TBによる基質形成およびALPにより骨芽細胞分化が確認された。骨形成遺伝子の変化は、H25年度では再現性がうまくかったが、検証に使用しているプライマー配列を修正、また、抽出過程を変更した結果、コラーゲン付加TCPの孔内における間葉系幹細胞では。アクチンとVEGFの発現が非コートに比べて増強していることが明らかとなった。骨芽永続的に形成維持されるには骨芽細胞による骨形成のみならず、質の悪くなった骨を吸収改変する破骨細胞に機能が重要である。そこで以上の結果を踏まえ、H27年度はナノコラーゲンに対する破骨細胞の形成や機能の変化について、共存培養系を用いて検討中である。【目的】これまでに我々は,幾何構造による血管形成と骨形成による効率的な骨再生材料の開発を行い,ハニカム型37H-β-TCP(37H)が効率的に骨形成することを実証してきた(Yagamiet al.JBMME, 2012).そこで、今回はハニカム型37H-β-TCPにアテロコラーゲンをコート(Col37H)したものにおいて、骨形成における血管成長とコラーゲンとの関係の評価を行った。【方法】In vitroにおいて間葉系幹細胞をCol37Hとともに培養し、骨形成遺伝子および血管形成遺伝子との関連と検討した。また、ラット頭頂骨骨膜下へ同担体を埋入後、16週後にサンプルを周囲組織と共に摘出し、非脱灰硬組織切片にて組織解析を行った.【結果および考察】間葉系細胞の培養において、Col37HはOsterixやALPとともにVEGFmRNAの発現を増強させた。移植実験では何れの担体の孔内においても,カルセインおよびアリザリンによる骨組織形成が確認された.2週後においてCol37Hでは37Hよりも、VEGFの発現が増加し、骨膜側および既存骨膜側骨表面からの太くて豊富な血管の形成された。そして、ハニカム孔内における骨形成は,Col37Hの方が37Hより多く形成されていた.骨密度は、Col37Hのほうが37Hに比べやや高かった。

以上のことより、Col37Hは早期の骨形成を促進することができ、より効率的な骨形成法が行えると思われ,骨再生療法へ貢献できると考えられる.糖尿病や骨粗鬆症などによる歯槽骨吸収の重症化した患者に対する骨再生療法の開発を目的として、糖尿病や骨粗鬆症モデル動物において、幾何構造を持つDDS-HB37Hにナノ・アテロコラーゲンをコートし、標的薬剤を付与した間葉系幹細胞を培養付着させ骨形成における血管成長とコラーゲンとの関係の評価を行った。その結果、DDS-HB37Hは骨形成促進因子であるOsterixやALPとともにVEGFmRNAの発現を増強させた。また、骨組織形成が進行する部位のVEGFの発現が増加し豊富な血管の形成された。したがって、DDS-HB37Hは糖尿病や骨粗鬆症患者に対する骨再生療法として有効と考えられた。ナノコラーゲンとそれに対するハイドロキシアパタイトの結晶化に成功しており、間葉系細胞の骨分化培養により骨分化および石灰化迄観察されている。また、ショートコラーゲンへのナノクリスタルアパタイトの結晶コートにおける生体内骨形成実験では、骨形成の促進と、骨質の改善が見られた。6ヶ月までの経過では、長期的な骨の形成速度と質には既存のアパタイトやコラーゲンとの差は見られないが、形成初期における速度と質に有意な増加が見られた。医歯薬学ナノ基質に対して幹細胞の初期応答や文化の過程で、アクチンとVEGFの発現が非コートに比べて増強していることから、生体における骨組織形成環境が整いつつある1週以内の変化が重要と思われる。また、人工的に形成された骨においても、永続的に形成維持されるには骨芽細胞による骨形成のみならず、質の悪くなった骨を吸収改変する破骨細胞に機能が重要である。そこで以上の結果を踏まえ、H27年度はナノコラーゲンに対する破骨細胞の形成や機能の変化について、共存培養系を用いて検討中である。組織標本の遺伝子解析が安定しないため。今後は、ナノコラーゲンに対するアパタイト析出方法の改変と、検証に使用しているプライマー配列の修正、骨髄細胞の培養条件を再検討し条件を整えて計画を遂行していく予定である。研究計画の遂行に必要な旅費の支出が予定額より少なかったため。試薬および組織切片作成物品に使用する予定である。
超音波組織ドップラー法を用いた胎児心機能の定量化および不整脈解析

背景:胎児の心機能評価のための指標は、いまだ確立していないが、近年、組織ドプラ法を用いた心機能評価法が注目されている。今回我々は組織ドプラ法を用い、正常胎児において左室心筋運動速度(収縮期S波)を測定し、心収縮力(EF)との相関の有無について検討した。方法:対象は在胎週数17週から35週の正常胎児20例を用いた。心臓超音波断層診断装置はALOKA社製SSD-6500を使用し,3.5-5.0MHz探触子にて、経母体腹壁より胎児の心臓4腔断面を描出した。組織ドップラーを用い、4腔断面全体をカバーするようにScan Areaを設定し、Raw Dataとして3秒間のシネループをHard Disk上に記録した。その後、LAN経由で専用コンピューターにデータを転送しcustomizedsoftware(e-DMS4.1.8)を用い、off-lineにて測定を行った。僧帽弁弁輪部の心室中隔と左室側壁の2カ所にサンプルボリュームをおき、各々組織ドプラ法を用いて左室壁収縮運動速度(S波)を測定し、連続3心拍の平均を求めた。シネループより得られた拡張末期および収縮期における画像より左室心内膜面をトレースし、area-length法を用いて得られた心室内容積より左室駆出率LVEFを計算した。以上より得られたLVEFを胎児左室収縮能の指標とし、組織ドップラーで得られたS波との相関関係を検討した。結果:心室中隔、左室側壁のS波平均値は各々2.39±0.36m/s(1.62-2.82)、2.76±0.6m/s(1.49-3.57)であった。EFは平均0.68±0.08(0.52-0.81)であった。KVEFとS波の心筋運動速度は心室中隔、側壁の両者で正の相関を示し、統計学的に有意であった。(心室中隔r=0.82,p=0.0002側壁r=0.68,p=0.005)結語:組織ドプラ法を用いたS波の測定は、正常胎児においても、左室収縮能を反映する指標として有用である可能性が示唆された。今後の展望:症例数の蓄積と異常胎児の早期診断の可能性について検討を加え、さらに右重機能に関しても検討していく予定である。
日本型流通システムのミクロ行動分析

日本型流通システムの特徴を、具体的な企業の実践行為レベルで分析するという研究目的に即して、長期財務分析、聞取り調査、企業アンケート調査を実施し、それに基づき、優秀小売企業を選び出し、小売業務、商品調達、商品供給の3つの下位システムで構成される小売経営において、持続的な競争優位性の基盤となっている組織能力は何かを導出した。中核的な組織能力は、事業分野の特性と歴史的な初期条件の2つの要因から大きな影響を受けているとの分析結果を得た。法政大学内に設置した「ミクロ流通研究会」において研究協力者を組織化し,定期的に研究会を開催し,文献レビューと統計分析を進め,日本の優秀小売・卸売企業を選び出し,その競争優位性に関する基礎的な分析を実施した。それと並行して,食品スーパー分野では強きの源泉となる業務システムに関するアンケート調査を実施し,低価格志向とバラエティ志向という対照的な戦略グループを導き出し,それぞれの業務システムの聞き取り調査を実施し,一部の成果を公表した。他方で,競争優位の1つとして物流システムがある点に着目し,総合スーパー,食品スーパー,ドラッグストア,ホームセンターの各事業分野における一括配送センターの設置・稼動状沈を中心としたアンケート調査を実施した。その集計結果は平成20年度にまとまる予定。日本型流通システムの国際移転問題では中国における総合スーパー,食品スーパー,卸売業の現地調査を行い,日中比較と移転状況に関するデータを集めた。日本の総合商社による卸売業事業め移転可能性,および中国総谷スーパーの発展状況に関する論文は平成20年度内に公表する予定である。個別企業分析ではスーパー系以外に,ユニクロ,しまむら,ヤマダ電機,コメリ等の各分野で圧倒的な強さを発揮する専門店企業に関する財務分析と聞き取り調査を進めている。その結果,それぞれめ強さの源泉には,商品開発,サプライ・チェーン,人材開発等の違いがある点が示唆されている。今後は,その点を丹念に実証し,統一的な概念化を図ることが研究課題となっている。法政大学イノベーション・マネジメント研究センター内にミクロ流通研究会を設置し、中堅・若手を中心に10名の研究者を組織した。定期的に研究会を開催し、分析枠組みを検討するとともに、(1)日本の優秀小売企業、(2)小売業の配送センター配置戦略、(3)食品スーパーの店舗業務に関する調査を実施した。その分析結果に基づき、各業態分野からイズミ、セブン-イレブン・ジャパン、ファースト・リテイリング、コメリ、しまむら等12社の優秀企業を選定し、その競争優位の持続性がどのような経営戦略により維持されているかを探った。年度末には2泊3日の研究合宿を開催し、相互理解を深めると同時に、2010年研究書刊行に向けて各自の担当事例と各自の執筆構想を話し合った。具体的には、競争相手との違いを生み出している各社の中核的な組織能力が何かを特定し、その発生と発展・変容のプロセスを実証的に明らかにした。さらには、各事例研究を比較検討することで小売企業の競争優位性構築のメカニズムを理論的に分析し、小売りイノベーション・モデルを概念化することを目標にしている。当初計画通り、矢作が全体の研究計画を策定し、外川が補佐する形で、順調に研究成果を積み上げた。なお、われわれの研究成果の一部が、『日経MJ(流通新聞)』2009年3月20日付け1面で、「日本の優秀小売企業の条件」として取り上げられた。日本小売企業の卓越性を検討するため、長期財務データを行うと同時に、個別企業の聞取り調査を実施した。その結果得られた企業8社の卓越性について、組織能力の生成・発展・変容・移転の観点から持続的な競争優位性の源泉を明らかにする事例研究に取り組んだ。また、全体的な戦略パターンを探るため、小売企業の配送センターの配置・機能設計および食品スーパーにおける店舗運営管理に関する2つのアンケート調査を実施した。以上の作業を実施するため、法政大学イノベーション・マネジメント研究センター内にミクロ流通研究会を設置し、研究協力者として10名程度のメンバーを組織し、研究会を継続的に開催した。その結果、持続的な競争優位性の基盤となる組織能力として、総合スーパー・イズミの地域密着型経営、食品スーパー・ヨークベニマルの店舗運営能力、コンビニエンス・ストア・セブン-イレブン・ジャパンの単品管理経営、アパレル・ショップ・ユニクロの製販統合型事業モデル、ホーム・ファニシング・ストア・ニトリの深いイノベーション、ホーム・センター・コメリの独自業態創造、家電量販店・ヤマダ電機の一番店主義経営、平和堂湖南の連続的な適応力を特定し、その形成過程を中心に分析した。2010年3月末まで大半の作業を終了し、各事例研究の草稿が6月末にはほぼ集まる予定であり、2010年度中には研究書(日本経済新聞出版社)を刊行する見通しである。
肝性脳症における神経伝達アミノ酸と脳幹シナプトソ-ム機能

1.D-ガラクトサミン投与により誘導したラットの急性肝不全モデルのうち、異常脳波(高振幅徐波)を示すものを実験に供した。庶糖密度勾配遠心法により、脳幹(延髄と橋)シナプトソ-ムを上清とミトコンドリア分画に分離し、ミトコンドリア分画の抑制性神経伝達アミノ酸(γ-アミノ酪酸GABA、グリシン)と興奮性神経伝達アミノ酸(グルタミン酸Glu、アスパラギン酸)濃度を測定した。その結果、GluとGABA濃度はともに減少し、またGlu/グルタミンGlnの比も低値を示し、神経細胞と神経膠細胞との間のGlu-Gln回路の異常が示唆された。そこで、シナプトソ-ム・ミトコンドリア分画でのGln→Gluを触媒するグルタミナ-ゼ活性の調節機構を検討したところ、前年度までの研究成績と同様、塩化アンモニウム、メルカプタン、低級脂肪酸でその活性が強く抑制され、さらにCa^<2+>、芳香族アミノ酸でも活性低下の成績が得られた。しかし、ベンゾジアゼピン(BZ)やGABA/BZ受容体/Cl^-チャンネル複合体拮抗剤の添加による影響はみられなかった。2.肝不全モデルに分枝鎖アミノ酸液(各42-63mM)を輸液すると(10m /kg)、脳幹シナプトソ-ム・ミトコンドリア分画のGlu/Gln比の低下が是正され、GABA濃度の回復も認められた。これらの変化は主として脳幹神経細胞内のアンモニア濃度の低下により生じた可能性が強い。3.以上より、神経細胞内アンモニア濃度が神経細胞内の神経伝達アミノ酸濃度の維持に重要な調節機構を発揮し、脳内アンモニア代謝の是正が肝性脳症の治療に極めて重要であることを示唆している。今後、さらに、ラットの初代培養神経細胞や神経膠細胞におけるグルタミナ-ゼ活性に及ぼすアンモニアと分枝鎖アミノ酸の影響をin vitroで直接観察し、肝性脳症の基本的病態を明らかにしたい。
近世・近代の日本における「行き倒れ」とその救済の歴史的特質の究明

1,研究会を5回開催し、代表者・分担者のほか3人の研究者を招聘して次の7報告を得た。i)代表者藤本清二郎:2018年7月29日、「紀州藩における旅人病人継ぎ送り政策の展開過程」、同年11月25日、「近世『行き倒れ』の構造と貧困・身分(乞食・非人)・旅」(近世史フォーラム、於大阪市阿倍野区)、2019年3月22日、「紀州藩における乞食非人・巡礼の行き倒れについて」。ii)分担者竹永三男:1月26日「行旅病人・行旅死亡人関係公文書(県庁文書・町村役場文書)の保存・公開状況ー全国の公文書館調査からー」。iii)関連研究(招聘):松浦智博氏2019年1月12日「近世宿駅研究からみた行き倒れ」、大杉由香氏「近現代日本の連帯と救済の歴史にみる生存と国家・社会」、同年1月26日、小川信雄氏「埼玉県熊谷町役場文書の行倒病死人史料について」、3月22日大杉氏「戦前期から戦時期の都市部におけるインテリ層が運営した児童愛護NPOの実態」2,藤本は投稿論文「紀州藩における旅人病人継ぎ送り政策の展開」(『紀州経済史文化史研究所紀要』39号、2018年12月)、「近世における移動・行き倒れの構造(試論)ー播州・林田藩領の事例からー」(『部落問題研究』第227号、2018年12月)を発表した。なお後者の論文は、昨年までの基盤研究(B)(15H0327)の成果に属するが、本研究期間中に発展させ、まとめたものである。これらによって、近世の行き倒れは、i)村の経済構造(百姓の再生産構造)を基礎過程とする「貧困・救済」と、ii)百姓町人身分である「旅人」とその成り立ち保証としての領主保護政策(往来手形をによる村継送り)iii)秩序底辺の身分(乞食非人)や道心者・無宿の永続化形態(身分)という三つの問題群の全体という見通しをえた。竹永は報告によって成果を単著『「行き倒れ」の近代史』(仮題)にまとめるための準備を進めた。1,近世「行き倒れ」に関して。1紀州藩の政策、同藩領の実態について、本藩の尾鷲、田辺領、伊勢田丸領の史料調査を実施し、分析、報告、論文化を進めた。一部、乞食非人・巡礼の行き倒れに関しても分析、報告をおこなったが、論文化が残った。2中国地方、広島藩とその藩領については、すでに昨年以前の準備として史料調査をおこない、一部の分析をおこなっていたが、本年度はさらに分析を進め、論文執筆の準備を進めた。3中部地方(信州)の調査、研究は未着手となった。4さらに、理論的見通しを検討した結果、村・百姓の「貧困・救済」問題が「行き倒れ」の大きな構成要素であることから、畿内や江戸の延宝飢饉時、天保飢饉時の「貧困・救済」について研究史の検討を行った。2,近代「行き倒れ」に関して。1行旅病人救護・行旅死亡人取扱い関係文書の収集を、京都府立京都学・歴彩館所蔵の京都府庁文書について行うとともに、2町村役場文書中の同関係文書の整理を、島根県(簸川郡平田町)・長野県(埴科郡寺尾村)について行ったことにより、現時点で確認できる戦前期の府県・町村役場文書中の「行き倒れ」救護・取扱関係文書の収集・整理をほぼ終了させた。また、小川信雄氏を研究協力者として招聘し、埼玉県・千葉県に関する研究報告を受け、関東地方における「行き倒れ」救護・取扱の実態を確認した。3、研究協力者は、研究会に出席し、報告への意見を述べた。また、招聘した研究者の報告から、近世近江の事例と交通政策、行き倒れ処理過程における幕藩関係について示唆を得た。また現代の大阪における社会政策の展開等についての報告から現代の見通しについて示唆を得て、近世と近現代の断絶連続の流れを検討することができた。1,近世「行き倒れ」については、現在確認した事例および到達した論点を、「国家と個人・地域」という視点から学術的意義を検討する。そのための報告を準備する。同時に、個別事例を他の地域に求め、基礎を広げる。その対象地域としては、参詣者が多いような群集地の事例を求める。そのため、中部地方の史料調査、分析を実施し、中国地方広島藩領の史料(広島県立文書館所蔵史料群)分析を深め、報告および論文化を図る。2,近代の「行き倒れ」については、府県・町村役場文書の収集・整理・確認をほぼ完了させたことを承けて、1これまでの研究で空白に近かった町村役場の「行き倒れ」対応実態の分析を行い、府県の対応と付き合わせて行政対応の全過程を解明するとともに、2未解明であった戦時下の「行き倒れ」の実態を収集済みの東京都公文書館所蔵文書の分析に基づいて行い、戦前期を通した「行き倒れ」実態の究明につなげる。3,研究協力者の参加を得てより幅の広い議論をするとともに、他の科研費プロジェクト(大杉由香代表基盤研究(C)「こどもの命と人権における地域史研究」)と交流を図り、現在の福祉行政と「行き倒れ」の関係を、生活保護法等を素材として分析する。

i)代表者藤本清二郎:2018年7月29日、「紀州藩における旅人病人継ぎ送り政策の展開過程」、同年11月25日、「近世『行き倒れ』の構造と貧困・身分(乞食・非人)・旅」(近世史フォーラム、於大阪市阿倍野区)、2019年3月22日、「紀州藩における乞食非人・巡礼の行き倒れについて」。ii)分担者竹永三男:1月26日「行旅病人・行旅死亡人関係公文書(県庁文書・町村役場文書)の保存・公開状況ー全国の公文書館調査からー」。iii)関連研究(招聘):松浦智博氏2019年1月12日「近世宿駅研究からみた行き倒れ」、大杉由香氏「近現代日本の連帯と救済の歴史にみる生存と国家・社会」、同年1月26日、小川信雄氏「埼玉県熊谷町役場文書の行倒病死人史料について」、3月22日大杉氏「戦前期から戦時期の都市部におけるインテリ層が運営した児童愛護NPOの実態」2,藤本は投稿論文「紀州藩における旅人病人継ぎ送り政策の展開」(『紀州経済史文化史研究所紀要』39号、2018年12月)、「近世における移動・行き倒れの構造(試論)ー播州・林田藩領の事例からー」(『部落問題研究』第227号、2018年12月)を発表した。なお後者の論文は、昨年までの基盤研究(B)(15H0327)の成果に属するが、本研究期間中に発展させ、まとめたものである。これらによって、近世の行き倒れは、i)村の経済構造(百姓の再生産構造)を基礎過程とする「貧困・救済」と、ii)百姓町人身分である「旅人」とその成り立ち保証としての領主保護政策(往来手形をによる村継送り)iii)秩序底辺の身分(乞食非人)や道心者・無宿の永続化形態(身分)という三つの問題群の全体という見通しをえた。竹永は報告によって成果を単著『「行き倒れ」の近代史』(仮題)にまとめるための準備を進めた。1,近世「行き倒れ」に関して。1紀州藩の政策、同藩領の実態について、本藩の尾鷲、田辺領、伊勢田丸領の史料調査を実施し、分析、報告、論文化を進めた。一部、乞食非人・巡礼の行き倒れに関しても分析、報告をおこなったが、論文化が残った。2中国地方、広島藩とその藩領については、すでに昨年以前の準備として史料調査をおこない、一部の分析をおこなっていたが、本年度はさらに分析を進め、論文執筆の準備を進めた。3中部地方(信州)の調査、研究は未着手となった。4さらに、理論的見通しを検討した結果、村・百姓の「貧困・救済」問題が「行き倒れ」の大きな構成要素であることから、畿内や江戸の延宝飢饉時、天保飢饉時の「貧困・救済」について研究史の検討を行った。2,近代「行き倒れ」に関して。1行旅病人救護・行旅死亡人取扱い関係文書の収集を、京都府立京都学・歴彩館所蔵の京都府庁文書について行うとともに、2町村役場文書中の同関係文書の整理を、島根県(簸川郡平田町)・長野県(埴科郡寺尾村)について行ったことにより、現時点で確認できる戦前期の府県・町村役場文書中の「行き倒れ」救護・取扱関係文書の収集・整理をほぼ終了させた。また、小川信雄氏を研究協力者として招聘し、埼玉県・千葉県に関する研究報告を受け、関東地方における「行き倒れ」救護・取扱の実態を確認した。3、研究協力者は、研究会に出席し、報告への意見を述べた。また、招聘した研究者の報告から、近世近江の事例と交通政策、行き倒れ処理過程における幕藩関係について示唆を得た。また現代の大阪における社会政策の展開等についての報告から現代の見通しについて示唆を得て、近世と近現代の断絶連続の流れを検討することができた。1,近世「行き倒れ」については、現在確認した事例および到達した論点を、「国家と個人・地域」という視点から学術的意義を検討する。そのための報告を準備する。同時に、個別事例を他の地域に求め、基礎を広げる。
分散配置型マイクロ動吸振器アレイによる超低振動高効率大型ブームスプレーヤの実現

この研究の目的は、農業用ブームスプレーヤに小型低出力のアクティブ動吸振器を多数配置してマイクロ動吸振器アレイを形成することで単位時間あたりに入力される振動エネルギーの吸収に必要なエネルギー吸収能力をアレイ全体で確保し、低振動で安定かつ超大型なブームスプレーヤの実現を可能とし、大規模農業において問題となる農薬散布作業を格段に効率化することである。平成30年度は、ブームスプレーヤのブームが農薬散布作業時に風により加振される場合を想定し、風による流体力により定常加振される片持ちはりに小型軽量化を実現した回転型アクティブ動吸振器(Active Wheel Damper)AWDを適用した場合の除振性能の評価を行った。この実験によりAWDのトラクター走行時の地面の凹凸により定常的に入力される加振力ならびに風による流体力に起因する流体関連振動に対する振動抑制性能を評価することが可能である。この実験により小型軽量化されたAWDは定常加振力に対しても十分な除振性能を発揮することが示された。得られた成果は、除振装置として実用化を目指すうえで重要な成果である。また、この研究の特性上、多数の小型低出力AWDをすべて同型でそろえて構築する必要があるが、当初計画より遅れているものの、平成30年度内に十分な数量のセンサー、アクチュエーターとマイコンを準備できた。当初の計画からの遅れにより小規模動吸振器アレイによる振動制御実験の実施および複数AWDの最適取り付け位置の検討には至らなかったが、これについてはこの研究課題の最重要の項目であり、次年度に確実に実施する計画である。これまでの研究成果については、日本機械学会北海道学生会第48回学生員卒業研究発表講演会で発表だけでなく、地域の技術展示会への出展、北見工業大学に設置されているオホーツク農林水産工学連携研究推進センター主催のシンポジウムで発表した。平成29年度には回転型アクティブ動吸振器(Active Wheel Damper)AWDの小型化・高性能化を実施し、平成30年度にはブームスプレーヤのブームが農薬散布作業時に風により加振される場合を想定し、小型軽量化したAWDを風による流体力により定常加振される片持ちはりに適用して除振性能の評価を行った。この実験では定常加振力に対する振動抑制性能の評価が可能である。したがってAWDのトラクター走行時の地面の凹凸による定常加振力ならびに風による流体力に起因する流体関連振動に対する除振性能を評価することが可能であり、小型軽量化されたAWDは定常加振力に対しても十分な除振性能を発揮することがこの実験により示された。したがって、AWD単体の小型化・軽量化・高性能化についての進捗は順調に進展しているといえる。しかしながら、この研究課題全体中の主要な課題の一つである、多数の小型低出力AWDによる除振装置アレイの構築と除振制御の実現についての進捗は遅れている。この研究の特性上すべて同型で十分な数量のセンサーやアクチュエーターならびにマイコンの準備に時間を要したためであり、平成30年度中にこれらの部品の調達と基板製作の回路の設計は完了したものの、複数台の小型AWDを用いた小規模動吸振器アレイによる振動制御実験の実施および小型AWDアレイの最適取り付け位置の検討には至らなかったことから「やや遅れている」と評価した。同型で十分な数量のセンサーやアクチュエーターならびにマイコンの確保は完了し、回路のプリント基板化のための回路図の設計についてもすでに完了している。複数台の小型AWDを用いた小規模動吸振器アレイによる振動制御実験の実施および小型AWDアレイの最適取り付け位置の検討を確実に実施する計画である。プリント基板の製作会社に基板の製作を依頼することで、次年度当初に複数台のAWD装置を構築できる見込みであり、複数台の小型AWDを用いた小規模動吸振器アレイによる振動制御実験、および実際のブームスプレーヤのブームにAWDを取り付けて除振性能評価実験を行い、当初計画の研究項目のうち、現在までに実施が遅れていた小規模動吸振器アレイによるブームスプレーヤのブームの除振についての研究を進める。複数のAWDの製作に時間を要することも想定し、数学モデルを用いた理論解析ならびに数値シミュレーションについても並行して実施することで、計画より遅れている複数の小型低出力AWDによる除振制御の実現について複数AWD間の調整に必要な情報や方法について前もって検討を行い、実験装置が揃い次第、制御系に検討した手法を実装して実験を実施できる状態とする。そして、ブームスプレーヤに適用した場合の実走時の除振性能評価を実施する。この研究の目的は、農業用ブームスプレーヤに小型低出力のアクティブ動吸振器を多数配置することでマイクロ動吸振器アレイを形成し、必要な振動エネルギーの吸収率を確保することでより低振動で安定かつ超大型なブームスプレーヤの実現を可能とし、大規模農業において問題となる農薬散布作業を格段に効率化することである。平成29年度は、これまでに構築済みの回転型アクティブ動吸振器(Active Wheel Damper)AWDに対し、回路やコントローラーで構成される制御システムを簡素化し、小型低出力で低コストのDCモーターでの動作を可能とすることで小型軽量化を実現し、最終的な研究目的を達成するために必要な小型低出力のAWDを構築した。そして、単体での除振実験を行うことで、除振性能を評価した。この結果、小型の片持ちはりに対して小型低出力のAWD単体の動作によって明確な除振効果を確認した。得られた成果はこの研究の根幹を成す重要な成果である。

しかしながら、小型低出力のAWDの構築に時間を要したうえ、この研究の特性上、多数の小型低出力AWDをすべて同型でそろえて構築しなければならず、ある程度の数量を容易に調達できるセンサーやアクチュエーターならびにマイコンの選定が想定より難しく選定に時間を要したため、複数台の小型AWDを用いた小規模動吸振器アレイによる振動制御実験の実施および小型AWDアレイの最適取り付け位置の検討には至らなかった。研究成果については、国内で有数規模の日本機械学会Dynamics and Design Conference D&D2017で発表を行っただけでなく、日本農業新聞の記事として掲載されるなど一般に対しても広く情報を発信した。また、北見工業大学に設置されているオホーツク型先進農業工農連携研究ユニット主催の地域交流会でも発表を行った。平成29年度には、本研究の最終目標の実現のための根幹をなす、小型低出力AWD装置の構築と単体除振実験を最重要かつ最優先の課題として実施した。また、ここで構築したAWD装置は動吸振器アレイを構築するために、同型のセンサーやアクチュエーターおよびマイコンを必要数だけ確保する必要があるため、今後も継続的に調達が可能かどうかを念頭において部品の選定を進めた。これまでに構築済みのAWD装置のモーターの制御方式を大幅に簡略化するため、制御回路の設計を大幅に変更することとなったため、当初の想定以上に時間を要したが、シンプルで小型の部品のみでAWDを構成することが可能となり、得られた回路設計を基に、制御基板の量産が容易となった。加えて少数の動吸振器を適用した場合のブーム振動の数学モデルを構築し、除振装置単体での除振性能を真鍮製の小型模擬ブームの除振実験により評価し、良好な結果が得られた。しかし、計画していた複数台の除振装置の構築および動吸振器アレイの構築には至らなかったことから、この点については計画から遅れる結果となった。しかしながら、前述の通り、制御回路基板は量産が可能となったため、次年度以降の動吸振器アレイの構築の準備は整ったといえる。一方で、農業機械メーカーの協力を得ることができ、実機としては中型の散布幅15.9mのブームスプレーヤに対し、構築した小型低出力AWDを適用しての実験についても実施した。単体のAWDのみを適用した場合の実験を行うことで、当初の想定通り、実機レベルの大きさのブームに対しては小型低出力AWDでは除振効果があまり得られないことが確認できた。除振装置アレイにより大型のブーム除振が実現できれば本研究課題の優位性を実証するための比較実験となると考えられることから、この実験を前倒しして実施したといえる。以上から進捗状況を「おおむね順調に進展している。」と評価した。この研究の目的は、農業用ブームスプレーヤに小型低出力のアクティブ動吸振器を多数配置してマイクロ動吸振器アレイを形成することで単位時間あたりに入力される振動エネルギーの吸収に必要なエネルギー吸収能力をアレイ全体で確保し、低振動で安定かつ超大型なブームスプレーヤの実現を可能とし、大規模農業において問題となる農薬散布作業を格段に効率化することである。
妊娠成立のための子宮内環境の構築と再構築

(1)子宮内腔液から得たタンパク質や代謝産物の情報から、子宮内環境構築に向けた候補因子の絞り込みを継続し、子宮内環境構築のための最小限遺伝子を特定する。ここでは新規タンパク解析(iTRAQ)法を用い、1933種類のタンパク質が子宮腔内に存在することを見つけた。次に、1933種類の子宮灌流液タンパク質からバイオインフォマテックおよび当研究室が保有するウシ胚トロホブラスト細胞と子宮内膜上皮細胞の共培養実験系を駆使し、機能を確認しながら、8種類のタンパク質を子宮内環境構築のためのタンパク群として同定した。(2)ウシには胎盤形成に必須な細胞融合能をもつ遺伝子として、当研究室が共同研究で発見したBERV-K1とフランスのグループが発見したSyncytin-Rum1が存在する。両遺伝子の精査によりBERV-K1がSyncytin-Rum1に比べ、内在化した年代が新しいこと、細胞融合能を検証するとBERV-K1がSyncytin-Rum1よりも優れていることから、ウシ胚はBERV-K1を優先的に使い、胚トロホブラスト細胞の融合を行っていることが考えられた(2015年に発表した「融合機能のバトンタッチ」を裏付ける)。そこで2018年はこの両方の内在性レトロウイルス遺伝子の発現調節機構の解明を行なった。(3)ウシ・トロホブラスト細胞CT-1細胞だけではなくF3細胞と共に、2核、3核細胞の形成機構に迫る。当初、何故、細胞の接着と乖離が同時進行するのか分からなかった。本研究より、トロホブラスト細胞の子宮内膜接着中に上皮間葉系転換(EMT=細胞の乖離)が同時進行しているときに、細胞の多核化が起こることを見出した。胎盤の形成が妊娠の成立と安定化を示すならば、その成立のためには細胞の多核化が起こらなければならない。これを成し遂げるために、子宮内では両細胞の接着と乖離が同時進行されなければならない。妊娠のための子宮内膜の構築に必要な最小タンパク質群は、子宮灌流液中の1933種類からたった8種類にまで絞りこむことができた。これは単にバイオインフォマテックを使い絞り込んだのではなく、当研究室が保有するウシ子宮内膜上皮細胞とウシ胚トロホブラスト細胞による共培養系を駆使しながら、子宮内環境を模倣することによって絞り込んだものである。ウシ内在性レトロウイルス遺伝子に関しては、その発現制御をあぶりだし、米国ニューオーリンズで2018年7月に開催された生殖の国際学会(Society for the Study of Reproduction)にて発表した。子宮内環境の構築では、ウシトロホブラスト細胞の子宮内膜への着床時に癌の転移で見られる上皮間葉系転換(EMT)EMTが起こらなければいけないこと、また、それが他の遺伝子発現の中で同時進行しなければならないことを証明し、これも米国ニューオーリンズで開かれた国際学会にて発表した。子宮内環境の構築は、これまでの通りウシ子宮内膜細胞とトロホブラスト細胞の共培養系を駆使しながら進めていく。これまで単に一つとか二つ(あるいは少数)の遺伝子発現をコントロールすれば着床環境が再現できると考えられてきたが、着床の進行には「両細胞の接着」と「乖離現象」が同時に進行しなければならないことを発見したことにより、この2つの現象の再現・構築法が妊娠のための改な知見となり得る。また、それをどこかで制御することにより不受胎を作り出すこと(新たな避妊技術)も可能となろう。いずれにしても、着床現象は一地点での模倣ではなく、着床現象と遺伝子発現の流れと捉え、かつ、その再現が「真」の妊娠率向上法になる。本申請目的は、妊娠促進のための子宮内環境の構築と再構築である。当初、夏以前からの採材を計画していたが、抽出RNAの「質」に問題があり、これらのRNAは次世代シーケンサー(RNA-seq)解析には不向きであることが判明し、再度の採材が必要となった。また、これまでの外注により明らかにしたRNA-seqデータより、子宮内環境を明らかにするためには遺伝子発現解析だけではなく、発現タンパク質の解析およびメタボローム解析を含め総合的かつ包括的に子宮内環境を明らかにする必要が出てきた。一方、子宮内環境の精査は当初のRNA-seqデータが活用できることから、新たな採材中やタンパク質の網羅的解析およびメタボローム解析中も進めることができるので初年度に計画した研究は完遂できる。実際、異なるインターフェロンによる効果(Nakamura et al., 2016、Kusama et al., 2017)や、子宮内環境の構築に必須な胚トロホブラスト細胞と子宮内膜細胞の接着の際に起こる、癌の転移時に見られる現象、上皮間葉系転換の遺伝子発現制御解析は初期の計画以上に進めることができた(Kusama et al., 2016、Kusama et al., 2016)。さらに、妊娠のための子宮内環境の構築後に必須な内在性レトロウイルスの胎盤形成に関わる論文を発表した(Imakawa et al., 2016)。採材したRNAの質がRNA-seq解析に適さないことが判明し、新たな採材が必要となった。しかしながら。これまでの外注RNA-seqより得た遺伝子発現データとウシ胚トロホブラスト細胞・子宮上皮細胞の共培養系を駆使しながら、妊娠のための子宮内環境の構築のための研究は進めることができた(研究発表の項、参照)。

本申請目的は、妊娠促進のための子宮内環境の構築と再構築である。子宮内環境を精査していく中で、RNA-seqによる胚トロホブラスト細胞と子宮内膜層からの遺伝子発現やタンパク質発現だけではなく、子宮腔内に存在するタンパク質成分およびメタボローム解析による代謝成分の解析が必要となった。さらに、当研究室のデータより、子宮腔内に存在する胚または子宮内膜から分泌されるエクソソーム成分を含めないと子宮内環境が構築できないことが明らかになった。そのため、直接経費を変更し、タンパク質(iTRAQ)、メタボローム解析およびエクソソーム解析を進めることとなった。ウシ子宮腔内に存在するタンパク質群約2000から、バイオインフォマテックスおよび共培養系を駆使しながら、子宮内環境を作り得る最小限の遺伝子12個を特定するとともに、胚トロホブラスト細胞が分泌するエクソソームの特性を明らかにした(Kusama et al., 2018、Latifi et al., 2018)。また、受胎・不受胎で変化し、子宮内環境を反映する血液内代謝産物およびタンパク質も見出した。新たに発見した胚盤胞特異的に発現する内在性レトロウイルスBERV-K3もウシ固有の遺伝子であることを発見した(Sakurai et al., 2017)。このことにより、これまでに発見された胚トロホブラスト細胞特異的に発現する内在性レトロウイルスBERV-K1、Syncytin-Rum1もウシ固有のものであることにより、遺伝子改変などによる研究にマウスは使えず、ウシ細胞あるいはウシ個体で進めなければならないことが明らかとなった。本申請は、妊娠成立のための子宮内環境の構築と再構築が目的である。胚トロホブラスト細胞と子宮内膜の遺伝子やたんぱく質発現を解析中、それらが反映されている子宮灌流液の精査が必須となった。灌流液はタンパク質の網羅的な解析に加え、メタボローム解析、さらにエクソソーム解析を行い、数千の因子群の中から、バイオインフォマテックスおよび胚トロホブラスト細胞と子宮内膜上皮細胞の共培養系で精査・検証を行った結果、タンパク質として12種類、代謝産物として7種類、さらにエクソソームをベースに組み立てないと子宮内環境の構築にならないことを明らかにした。(1)子宮内腔液から得たタンパク質や代謝産物の情報から、子宮内環境構築に向けた候補因子の絞り込みを継続し、子宮内環境構築のための最小限遺伝子を特定する。ここでは新規タンパク解析(iTRAQ)法を用い、1933種類のタンパク質が子宮腔内に存在することを見つけた。次に、1933種類の子宮灌流液タンパク質からバイオインフォマテックおよび当研究室が保有するウシ胚トロホブラスト細胞と子宮内膜上皮細胞の共培養実験系を駆使し、機能を確認しながら、8種類のタンパク質を子宮内環境構築のためのタンパク群として同定した。(2)ウシには胎盤形成に必須な細胞融合能をもつ遺伝子として、当研究室が共同研究で発見したBERV-K1とフランスのグループが発見したSyncytin-Rum1が存在する。両遺伝子の精査によりBERV-K1がSyncytin-Rum1に比べ、内在化した年代が新しいこと、細胞融合能を検証するとBERV-K1がSyncytin-Rum1よりも優れていることから、ウシ胚はBERV-