hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞周期の制御異常

がん細胞における細胞周期制御異常の機構を明らかにすることを目的として研究を進め以下の事実を明らかにした。1.APCによって活性化されるGEF分子Asefのファミリー分子を見出してAsef2と命名し、細胞の形態、接着、運動の制御に関与することを明らかにした。2.AsefがJNKシグナルの活性化を引き起こすこと、APCがこの活性を促進することを見出した。3.AsefおよびAsef2遺伝子欠損マウスを作製した。4.β-catenin-cadherin複合体に結合しCdc42およびRacを標的とするGAP分子RICSの細胞内局在を明らかにし、結合分子2種類を同定した。5.β-catenin-TCF複合体による転写活性化を促進し、細胞transformationを促進する作用をもつB9Lの遺伝子欠損マウスを作製し、血管、心臓に異常を起こし胎生致死となることを見出した。8.DLGと結合しているRap1特異的なGAP分子SPALのファミリー分子2種類を見出しその性質を明らかにした。7.タイトジャンクションの裏打ち蛋白質MAGI-1に結合する候補分子Rassf1に類似する分子Rassf6の解析を行った。8.接着分子JAM4とE3ユビキチンリガーゼLNX1の相互作用の解析を行った。9.MAGI-1と遺伝性ネフローゼの原因遺伝子産物のひとつであるnephrinの相互作用の解析を行った。がん細胞における細胞周期制御異常の機構を明らかにすることを目的として、大腸癌のがん抑制遺伝子APC、Wntシグナル伝達経路および上皮細胞間結合の裏打ち蛋白質BAP1/MAGIの機能を明らかにすることを目的として研究を進め以下のような結果を得た。1)Rac特異的なGEF活性をもつAPC結合蛋白質Ascfが、細胞運動の亢進を引き起こす活性をもつことを明らかにした。2)Wntシグナルを負に制御するb-catenin結合蛋白質ICATは、APC、b-cateninまたはAxinに変異のある癌細胞特異的に細胞周期の停止を引き起こす活性をもつことを明らかにした。ICATノックアウトマウスは脳、頭蓋骨などの形成に異常がみられた。4)APC-DLG複合体にさらに結合する新規蛋白質2種類を見出し機能を解析した。5)b-catenin-TCF4複合体の標的遺伝子の単離を試み、候補遺伝子を単離した。6)上皮細胞間結合の裏打ち蛋白質BAP1/MAGI-1の極性をもった細胞内局在にはC末端領域が必要十分であることを見出した。7)上皮細胞の接着斑などの裏打ち蛋白質でカテニンファミリーに属するp0071にPDZドメインをもつ新規の裏打ち蛋白質PAPINが結合することを見出した。さらに、PAPINにはLIM領域をもつDRALが結合することを明らかにしたがん細胞における細胞周期制御異常の機構を明らかにすることを目的として、大腸癌のがん抑制遺伝子APCおよびBAP1/MAGI・PAPINなどの上皮細胞膜裏打ち蛋白質の機能を解析し以下の知見を得た。1、大腸癌細胞で発現している変異APC断片は、Rac特異的なGEF活性をもつAPC結合蛋白質Asefを恒常的に活性化することにより細胞接着の低下、細胞運動の異常な亢進を引き起こしている可能性が示唆された。2、Wntシグナルを負に制御するβ-catenin結合蛋白質ICATは、APC、β-cateninまたはAxinに変異のある癌細胞特異的に細胞周期のG2停止および細胞死を引き起こすことを明らかにした。大腸癌症例の約半数でICATの発現亢進がみられた。ICATノックアウトマウスは大脳形成不全、中脳過形成、腎臓欠失、頭蓋骨形成不全等の表現形質を示すことを明らかにした。3、APCがKAP3を介してKIF3A/3Bと複合体を形成していることを明らかにした。この複合体形成によりAPCの微小管に沿った移動、細胞先端への集積が起こり、細胞運動が制御されている可能性が示唆された。4、APCはアルマジロリピートドメインに結合するzincfinger蛋白質によってユビキチン化されプロテアソーム依存的分解を受けることを明らかにした。5、β-catenin-TCF複合体による転写活性化を促進する機能をもつL9を、SrcあるいはAblと同時に強制発現するとβ-cateninと共にPODsに集積することを見出した。6、β-cateninおよびTGF-bの標的遺伝子の単離を試み、候補遺伝子を単離した。7、上皮細胞間結合の裏打ち蛋白質BAP1/MAGI-1に結合する分子を探索して、2種類の新規分子を同定して解析している。8、昨年度カテニンp0071結合分子として報告した新規PDZ蛋白質PAPINの上皮細胞内局在決定の分子機構を明らかにしている。また、PAPINがp0O71を介して、ErbB2裏打ち分子ERBINと三者複合体を形成することを明らかにしている。9、Ephrin-B結合分子として報告されている細胞膜裏打ち分子PDZ-RGS3とオーバーラップする遺伝子の産物C2PAが、熱ショック応答依存性遺伝子転写制御に関与することを明らかにした。がん細胞における細胞周期制御異常の機構を明らかにすることを目的として、大腸癌のがん抑制遺伝子APCおよびBAP1/MAGI・PAPINなどの上皮細胞膜裏打ち蛋白質の機能を解析し、以下の知見を得た。

1)大腸がん細胞で発現している変異APC断片は、Rac特異的GEF分子Asefを恒常的に活性化して細胞接着の低下、細胞運動の異常な亢進を引き起こしていることを明らかにした。正常APCを発現するがん細胞ではAsefの恒常的活性化は起こっていなかった。2)APCは、KAP3を介してKIF3A/3Bと複合体を形成し、微小管に沿って移動して細胞先端に集積するが、Asefも先導端に集積することを見出した。APCとAsefは先導端のみでなく細胞接着面、ラッフリング膜などでも局在が一致した。3)癌遺伝子Bc19の産物と相同性のあるB9Lを見出し、β-cateninに結合してβ-catenin-TCF複合体による転写活性化を促進することを明らかにした。4)APCにRing fingerタイプのユビキチンligaseが結合し、ユビキチン化-プロテアソームによる分解を引き起こすことを明らかにした。5)β-cateninおよびTGF-βの標的遺伝子を単離した。6)上皮細胞間結合のtight junctionの裏打ち蛋白質BAP1/MAGI-1がBAP1/MAGI-1と協働してtight junctionにおける分子の透過性を制御する可能性を明らかにした。7)BAP1/MAGI-1に結合する新規分子Caromが、細胞極性が確立したあとにはadherence junctionに局在してCASKと相互作用することを明らかにした。8)I型肺胞上皮細胞に発現している膜貫通蛋白質T1αとReceptor for advanced glycation endproducts (RAGE)が、I型肺胞上皮細胞の極性マーカーとして使用できることを明らかにした。がん細胞における細胞周期制御異常の機構を明らかにすることを目的として、大腸癌のがん抑制遺伝子APC、Wntシグナルの機能を解析し以下のような知見を得た。1.APCとAsefは細胞密度や増殖因子刺激に応じて細胞接着面、細胞質、細胞運動の先端部分(先導端)、ラッフリング膜、核など様々に局在を変化させ、細胞接着、細胞運動に関与することを明らかにした。2.β-catenin-cadherin複合体に結合するGAP分子RICSは、Cdc42およびRacを標的とし、Srcファミリーのチロシンキナーゼによりリン酸化を受けることを見出した。3.癌遺伝子BCL9の産物と相同性のあるB9Lが、Pygoおよび未知の因子と結合してβ-catenin-TCF複合体による転写活性化を促進し、細胞transformationを促進する作用をもつことを明らかにした。B9Lが大腸癌の30%の症例で異常発現していることを見出した。4.TGF-βの擬受容体BAMBIがWntシグナルの標的で、TGF-βによる増殖抑制を解除する作用があること、大腸癌、肝癌の70%程度で過剰発現していることを見出した。5.Wntシグナルの負の制御因子DKK1が、β-catenin-TCFの直接の標的遺伝子で、負のフィードバックループを形成していることを見出した。6.DLGがRap1特異的なGAP分子SPALと結合してシグナル伝達の足場として機能することを明らかにした。DLGホモ欠損マウスは誕生直後に死に、ヘテロ欠損マウスは癌を発症した。
反応性ポリマーブラシ構造に基づく高機能マイクロチップインターフェースの構築

石英、金、ガラス、プラスチックなど様々な表面へ効率良く反応性ブラシを構築する材料合成と物理化学的評価に関して以下のように検討を行った。1)ヘテロ2官能性ポリエチレングリコール(PEG)誘導体の合成自由末端に官能基を有するポリマーブラシの構築のため、様々な官能基を有するヘテロ2官能性PEGの合成を行った。特に集積チップ様にシラノール末端のヘテロ2官能性PEGの合成に成功した。2)自由末端に官能基を有するグラフトポリマーの合成高密度ポリマーブラシ構築用にグラフトポリマーの合成を行った。シラノール基を有するメタクリル酸エステルモノマーを用い、ヘテロ2官能性PEGマクロモノマーとのグラフト共重合を行い、高分子ガラス表面処理剤を合成した。3)上述の材料による機材表面へのポリマーブラシの構築それぞれの官能基による機材表面への共有結合の導入。条件の最適化を行った。4)ポリマーブラシ表面の物理化学評価表面処理剤の構造、処理方法とぬれ、ゼータ電位、AFM、XPS等により構築したブラシ表面の物理化学的評価を行った。特に相分離性の低いグラフトポリマーに関して、コモノマーのモル比こコントロールすることにより最適化した表面はブロックと同様の性能を示していることがわかった。5)ポリマーブラシ表面の生化学的評価タンパク質の吸着、細胞接着特性に関して検討を行った。タンパク質としてはアルブミンの他、表面特性や分子サイズの異なるリゾチームやIgG等を用いて評価した。
近藤格子化合物における低励起結晶場分裂の無接触分光法による探究

トンネル分光によりセリウム化合物の研究を進めた。特にその結晶場励起のスペクトル構造、近藤半導体のエネルギーギャップの形成機構を探ることを主な目的とした。ここでは近藤半導体CeNiSn、CeRhSbについて得られた結果の概要を述べる。多結晶によるトンネルコンダクタンスの測定では、そのエネルギーギャップ構造を初めて直接観測した。測定温度4.2KにてCeNiSnでエネルギーギャップ8-10meV、CeRhSbでは20-27meVが得られた。これらの値は近藤温度T_K(【square root】4K(CENiSn)96K(CeRhSb))と同程度かやや大きい。近藤半導体のフェルミ面近傍での準粒子状態密度の関数形は知られていないが、得られた実験データはギャップの確率分布(Gauss分布)を考慮したBCS状態密度曲線と殆ど一致していることを初めて見い出した。これはギャップが強い異方性を持つことを示唆している。トンネルスペクトルの温度変化の測定ではCeNiSnでは12K、CeRhSbでは25K付近以下でスペクトルに構造が現れ始めており、フェルミ面に部分的にギャップが開き始めていることを示している。これらは帯磁率がピークをとる温度T_χ及び電気抵抗が弱い肩を持つ温度と一致する。更に温度を下げて行くとCeNiSnでは6K、CeRhSbでは10K以下でギャップが急速に発達していることが明かになった。これらは磁気比熱の温度比C_m/Tがピークをとる温度T_<cp>に等しい。以上をまとめるとCeNiSn、CeRhSb共にギャップは温度上昇によりT_<cp>【planck's constant】.1T_K迄は急激に減少、T_C【planck's constant】.2T_K以上で消失し金属的に振る舞うと云える。この様なギャップの強い温度依存性は強相関物質の特徴と考えられる。
時分割測光によるエネルギー変換分子機械の設計・機能原理の解読

1.時分割測光システムと顕微鏡の結合倒立蛍光顕微鏡の励起光源にフラッシュランプ励起型のパルス色素レーザーを用い、パルスレーザー蛍光顕微鏡なるものを試作した。現在、0.3マイクロ秒の時間分解能(露光時間)で蛍光像をディジタル化して記憶させることができる。すでに細胞膜電位の立ち上がりを画像としてとらえることに成功し、また偏光蛍光像の解析が行なえることも確かめた。偏光測定の場合、回転ステージの使用により試料の向きを選べる。画像測定の場合、検出には高感度テレビカメラを用いるが、カメラのかわりに偏光子と光電子増倍管をとりつけ、高精度高時間分解能の偏光測定を行なうことも可能である。上記パルスレーザーを光源に用い、顕微鏡下の燐光偏光解消測定に予備的ではあるが成功した。2.アクチン線維の動的構造の解析アクチン線維を三重項プローブニオシンで標識し偏光解消測定を行なうとアクチン線維のねじれ異動がとらえられることはすでに報告した。ここでは制御蛋白質(トロポミオシン・トロポニン)やミオシンとの相互作用について検討した結果、制御蛋白質の結合によりアクチン線維は数倍ねじれにくくなりかつねじれの単位が1μm程度に増大すること、制御されたアクチン線維にミオシンが結合してもねじれやすさは余り変化しないことが示された。3.バクテリオロドプシンの光プロトンポンプ機構の解析高度好塩菌のエンベロープベンクルを用いて、大きなpH勾配下でバクテリオロドプシンのポンプ機構を解析できるようになった。内側のpHが10以上ではポンプが働かないこと、外側のpHは4.59.4の範囲で余り影響しないこと、内側のpHが高くなるとM中間体の寿命が長くなること、などがわかった。
ダニ抗原特異的免疫療法におけるT濾胞ヘルパー細胞と制御性B細胞の解析

アレルギー性鼻炎合併喘息6症例を対象にダニ舌下免疫療法(SLIT)を開始し、治療前、治療3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月の濾胞ヘルパーT(Tfh)細胞と濾胞制御性(Tfr)細胞を中心に、制御性T(Treg)細胞及び制御性B(Breg)細胞もFACSで検討した。現在、5症例が12ヶ月経過している。また、コナヒョウヒダニ(コナダニ)特異IgE, IgG4, IgG, IgA抗体を測定した。ヤケヒョウヒダニ(ヤケダニ)特異IgEは測定済みであるが、IgG4, IgG, IgA抗体は今後測定予定である。現時点の6症例の結果では、B細胞に対しIgE産生能を有するTfh2細胞の経過中の有意な段階的低下と、対照的にメモリーB細胞のみにIg産生能を有するTfh1細胞の段階的増加を認めた。Tfh17細胞は経過で変化はなかった。Tfr細胞は有意な変化はなかった。Treg細胞は概ね段階的増加を認めたが、Breg細胞では一定の傾向はなかった。測定したコナダニおよびヤケダニ特異的IgEは既報のとおり、一度上昇したが6ヶ月経過すると徐々に低下した。コナダニ特異IgG4は3ヶ月より有意な増加を認め、12ヶ月時点でも上昇傾向である。コナダニ特異的IgGおよびIgAに関しては有意な変化はなかった。新たな知見として、Tfh2/Tfh1細胞比の段階的減少および12ヶ月目のTfh2/Tfh1細胞比とコナダニ特異IgG4は非常に強い負の相関を認めた。これら知見はダニ特異的免疫療法中の遮断抗体IgG4の継続的な増加とTfh細胞、および、特異的IgEの減少とTfh細胞の強い関連を示唆する。一方、12ヶ月経過のダニSLITの臨床的効果は4症例が有効であった。これらの症例では、TNSSおよびACQ問診票スコアの改善、呼気一酸化窒素濃度の低下、肺機能1秒量の増加、治療薬剤の減量を認めている。また、これらの有効症例ではコナダニ特異IgG4の持続的な増加を認めている。実績としての12ヶ月経過のダニ免疫療法の登録症例は6例であるが、現在、他に15症例がエントリーされていて、順次経過を追って患者末梢血によるex vivoの検討が進行する予定である。症例数の増加により、信頼性のある結果を導く事が可能である。今までの結果から、Tfh2/Tfh1細胞比とダニ特異的IgEの遮断抗体IgG4の関連、特にTfh1細胞とIgG4の関連の重要性が示唆されている。ダニ特異的免疫療法におけるIgG4遮断抗体の産生の機序解明に繋がる知見と考えられる。最終的には計30症例をエントリーし、24ヶ月まで観察し、ex vivoの検討をまとめたい。ダニ免疫療法を行わない症例もエントリーし対照群としたい。ex vivoの結果をもとに、成功例と不応例においてその基盤となる免疫療法の諸免疫的機序の解明、特にTfh、Tfr細胞とダニ特異的IgE, IgG4, IgA産生の機序についてin vivoの系を確立し、検討し、新たな知見としてアレルゲン特異的免疫療法の包括的な機序の解明を進めたい。アレルギー性鼻炎合併喘息のダニ免疫療法の臨床的有効性の検証は、非ダニ免疫療法群と対照し、各種バイオマーカーを用いてさらに検討する。

また、これらの有効症例ではコナダニ特異IgG4の持続的な増加を認めている。実績としての12ヶ月経過のダニ免疫療法の登録症例は6例であるが、現在、他に15症例がエントリーされていて、順次経過を追って患者末梢血によるex vivoの検討が進行する予定である。症例数の増加により、信頼性のある結果を導く事が可能である。今までの結果から、Tfh2/Tfh1細胞比とダニ特異的IgEの遮断抗体IgG4の関連、特にTfh1細胞とIgG4の関連の重要性が示唆されている。ダニ特異的免疫療法におけるIgG4遮断抗体の産生の機序解明に繋がる知見と考えられる。最終的には計30症例をエントリーし、24ヶ月まで観察し、ex vivoの検討をまとめたい。ダニ免疫療法を行わない症例もエントリーし対照群としたい。ex vivoの結果をもとに、成功例と不応例においてその基盤となる免疫療法の諸免疫的機序の解明、特にTfh、Tfr細胞とダニ特異的IgE, IgG4, IgA産生の機序についてin vivoの系を確立し、検討し、新たな知見としてアレルゲン特異的免疫療法の包括的な機序の解明を進めたい。アレルギー性鼻炎合併喘息のダニ免疫療法の臨床的有効性の検証は、非ダニ免疫療法群と対照し、各種バイオマーカーを用いてさらに検討する。
プロテオーム解析による重症薬疹の早期診断バイオマーカーの検索

SJS/TENをはじめとする重症薬疹は、発症頻度は低いものの、ひとたび発症すると重篤になりやすく死亡率も高いが、早期診断、重症度予測できるようなバイオマーカーは十分ではない。そのため当該分野では未施行であるプロテオーム解析を用いた網羅的な探索を取り入れることで新規バイオマーカー候補を発見した。SJS/TEN患者と重症ではない通常薬疹患者の末梢血単核球を原因薬剤で刺激した培養上清を用いて、質量分析を行い、SJS/TEN患者のみにみられた候補タンパクを絞りこんだ。さらにtarget proteomicsによりタンパク発現量を定量し、上位のもの7種を同定した。そのタンパクを、SJS/TEN患者血清や通常薬疹患者、健常者の血清を複数サンプル用いELISAにて測定。健常者や通常薬疹患者と比較し、有意に上昇しているタンパクを1種を同定した。自己免疫性水疱症やウイルス感染症でも上昇していないことを確認し、またAUCカーブによる特異度などを検討した上で、バイオマーカーとして十分利用可能であると考えた。ここまでの研究成果について、論文化し、Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice誌に2019年5月に受理された。プロテオミクス解析によりSJS/TENのバイオマーカーとして有用なタンパクを1種類同定し、論文化し、国際医学雑誌および国際学会で発表できたため。バイオマーカーとしての有用性を検討したり、他のバイオマーカー(granulysinなど)と組み合わせることでより診断精度を高められる可能性があるか検討する。また、迅速検査キットの開発にも着手したい。プロテオーム解析により、SJS/TENのバイオマーカーとしてgalectin-7を同定したが、今後の展望として多数、他施設のサンプルによる検討や、他のバイオマーカーと組み合わせることによる精度上昇に関して検討する必要性がある。また迅速診断キットの開発にも可能であれば着手する。そのため、galectin-7のELISA法や、抗体による免疫染色などを実行したり、または国内外の研究者との情報交換および連携するために次年度にも引き続き使用額が発生する。
大気波動を介した金星熱圏-下層大気結合の数値シミュレーション

本研究は、金星雲層(50-70km)起源の大気波動が中間圏(70-110km)・熱圏(>110km)の風速場に与える影響を、大気大循環モデル(GCM)を用いた数値シミュレーションにより解明することを目的としている。この目的達成のため、我々は、1)先行研究で考慮されてこなかった惑星規模の波を考慮した数値シミュレーション、2)風速観測とシミュレーション結果との比較、3)先行研究において取り扱いが不十分だった小規模な大気重力波の取り扱いの改良、及び数値シミュレーション、を達成目標と定め研究を行なってきた。まず、我々は惑星規模の波を考慮した数値計算を行い、金星熱圏では、惑星規模の波の中でケルビン波が最も卓越し伝搬することを世界で初めて示唆した。また、本研究では高度110km付近の風速観測を行っているドイツ・ケルン大学の研究チームと連携し、シミュレーションと風速観測との比較を行なった。その結果、高度約110km付近の数日スケールの風速変動強度は本シミュレーションで示唆されるケルビン波による風速変動強度と整合的であり、従来不明であった熱圏変動の要因の一部がケルビン波にあることを示唆した。続いて、重力波の取り扱いを改善した数値計算を行った。その結果、小規模な重力波が下層から上層に運動量を輸送し、熱圏において100m/sに及ぶ高速東西風を駆動することを示唆した。計算による熱圏高速東西風強度の高度分布は、先行研究の風速の高度分布とよく一致する結果であった。また、本研究では初めて熱圏高速東西風のローカルタイム分布に着目し、高度約100-110kmの熱圏高速東西風強度は昼側より夜側で強いことを示唆した。このような、熱圏高速東西風強度の昼夜依存性は先行研究の観測より示唆されていたものの、数値計算によりその存在を実証したのはこの研究が初めてである。本研究は、大気波動を介した金星下層大気(高度<70km)と熱圏(110km)の大気結合過程を、大気大循環モデル(GCM)を用いて解明することを目的としている。本年度は、GCMから得られたシミュレーション結果と観測との比較を目的に、金星の高度95km付近で発光するO2-1.27um大気光の一次元化学モデルを作成し、GCMと組み合わせて下層大気起源の大気波動の大気光分布への影響を見積もった。その結果、雲層起因(50-70km)のケルビン波が高度120km付近まで伝搬し、大気光の発光領域・発光強度に4日周期の時間変動を生じさせることを示唆した。本結果と地上望遠鏡・探査機による大気光観測の結果を比較することで初めて理論-観測の両面から金星超高層大気循環を理解することが可能となる。また、本研究ではこれまでケルビン波や熱潮汐波といった惑星規模の波の金星熱圏風速場への影響を見積もってきた。ここで小規模な重力波の影響をパラメタリゼーションで新たに考慮することにより、重力波の金星熱圏風速場への影響を新たに見積もった。先行研究のシミュレーションにおいても、重力波のパラメタリゼーションを用いた研究が行われてきたが、それらのパラメタリゼーションでは単一波長の波しか扱えなかったり、熱圏固有の分子拡散による重力波の減衰過程を考慮できなかったりと、重力波に関わる物理過程を十分考慮できなかった。本研究では、Medvedev et al. [2000]の重力波パラメタリゼーションを用いることで、複数の波長の波や分子拡散過程の重力波への影響を初めて考慮した。シミュレーションの結果、重力波の運動量輸送によって高度110km以上において風速約80m/s程度の西向きの高速東西風が形成されることを示した。また、この高速東西風の影響により、O2大気光の発光領域が00:00LTから02:30LTへとシフトすることを示唆した。
熱的挙動を考慮した断面修復コンクリートの一体性評価モデルの提案

断面修復工法はコンクリート構造物の様々な劣化状況に応じて利用されているが,外気温変化が激しい使用環境においては,断面修復部にひび割れや剥離などの劣化現象が現れている。しかし,このような問題点を考慮した断面修復材の選定や評価手法はまだ備えられていない。本研究では,断面修復を行ったコンクリートの修復界面における両材の熱的挙動の違いおよび,熱的挙動の違いに伴う断面修復部の熱膨張,断面修復部の形態の3点に着目し,それぞれの関係を明らかにする。そして,既設コンクリートの線膨張係数および修復形態により,実環境に適合する断面修復材の選定ができる断面修復とコンクリートの一体性評価モデルを提案する。
膵導管上皮のカルシウム吸収機構-新しい膵石予防法の研究-

膵液は消化酵素を含むアルカリ性の消化液である。高濃度(140 mM)の重炭酸イオン(HCO3-)とともに、わずかに存在する炭酸イオン(CO32-)は、Ca2+と結合してCaCO3として析出する。膵石の形成を防ぐために、膵導管上皮は膵液中のCa2+を吸収するメカニズムを持っていると推定される。本研究では、ラット膵導管細胞におけるCa2+輸送体の局在と生理活性を解析し、Ca2+吸収機構を明らかにした。膵液は、高濃度(100150mM)の重炭酸イオン(HCO_3^<->)を含むため、炭酸イオン(CO_3^<2->)も0.031mMの濃度で存在すると推定される。CO_3^<2->は、腺房細胞から分泌されるmMレベルのCa^<2+>と結合し、不溶性のCaCO_3となる。膵導管細胞は、膵液中のCa^<2+>を吸収することにより、膵石の形成を抑制していると推定される。本研究では、膵導管細胞のCa^<2+>輸送およびCa^<2+>輸送体の発現を検討した。SD系雄性ラットから膵を摘出し、径100150μmの小葉間膵管を単離した。併せて、ヒト膵管癌由来の培養細胞Panc-1を用いた検討も行った。ラット単離膵管とPanc-1細胞には、Ca^<2+>チャネルであるTRPV5、TRPV6、TRPP2、plasma membrane Ca^<2+>-ATPase(PMCA1b)、Na^<+>-Ca^<2+>交換体であるNCX1、Ca^<2+>結合タンパクであるCBD9kのmRNA発現が認められた。単離膵管にFura-2を負荷し、管腔と表層を別個に灌流した状態(microperfusion)で、細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)を測定した。単離膵管の表層と管腔をCa^<2+>を含まない溶液で灌流を開始した。管腔灌流液にCa^<2+>を加えると、表層からCa^<2+>を加えた場合に比べて、より大きい[Ca^<2+>]_iの増加が見られた。膵導管細胞の管腔膜上のCa^<2+>チャネルは、膵液からのCa^<2+>吸収を担っている可能性がある。膵液は、高濃度(100150mM)の重炭酸イオン(HCO3^-)を含むため、炭酸イオン(CO_3^<2->)も0.031mMの濃度で存在すると推定される。膵導管細胞は、膵液中のCa^<2+>を吸収することにより、膵石の形成を抑制していると推定きれる。本研究では、膵導管細胞におけるCa^<2+>輸送の生理学的特性と分子実体を検討した。ラット膵から単離した小葉間膵管(直径100μm)とヒト膵管癌由来の培養細胞Panc-1を用いた。RT-PCRにより、Ca^<2+>チャネルであるTRPV5、TRPV6、TRPP2、plasma membrane Ca^<2+>-AIPase (PMCA1b)、Na^+-Ca^<2+>交換体であるNCX1、Ca^<2+>結合タンパクであるCBD9kのmRNA発現が認められた。このCa^<2+>輸送はLa^<3+>により抑制された。膵管などの管腔組織では、primary ciliaが管腔内の機械的・化学的刺激を感知してシグナルを周囲に伝えることにより構造が維持される。このシグナルには、Ca^<2+>チャネルTRPP2(polycystin2)をはじめとするいくつかのciliaタンパクが重要な役割を果たしていると推定されている。

今年度は、fibrocystinの遺伝子(PKHD1)変異を原因とする多発性嚢胞腎症のモデルであるpolycystic kidney(PCK)ラットの膵導管の形態と機能を解析した。PCKラットの膵では、膵管が拡張し、膵管周囲の線維化が見られたが、嚢胞は見られなかった。膵をコラゲナーゼで処理した後、腺房組織を取り除き、膵管樹を単離した。PCKラットでは正常ラットに比べて、胆膵管、主膵管、一次分枝の内径が約2.8、1.8、1.5倍に拡張していた。麻酔下で純粋膵液を採取した。PCKラットでは、carbamylcholine刺激による膵酵素(アミラーゼ)分泌は正常ラットと差は無かったが、生理的投与量(0.03μmolkg^<-1>h^<-1>)のsecretin刺激下の膵液分泌量が約40%減っていた。単離した小葉間膵管セグメントを37°CのHCO_3^--CO_2緩衝液で表層灌流するとし、PCKラットの膵管ではsecretin(10nM)刺激下の溶液分泌が約40%増えていた。単離膵管の管腔をmicroperfusionし、膵導管細胞内Ca^<2+>膿度([Ca^<2+>]_i)を測定した。管腔内ATPによる[Ca^<2+>]_i反応は、管腔の灌流方向(十二指腸側/腺房側から)に依存していた。正當ラットの膵管では、腺房側から灌流した場合の[Ca^<2+>]_i反応が大きかったが、PCKラットでは逆であった。PCKラットの膵は慢性膵炎に類似した組織所見を示し、膵導管は管腔内刺激に対して正常と異なる[Ca^<2+.]_i反応を呈した。
自発および電気刺激誘発の脳律動計測によるヒト脳機能結合地図の作成

近年の生体信号解析技術の発展に伴い、BOLD信号のゆらぎに代表される超低周波律動から皮質脳波で計測される高周波律動まで広帯域の神経発振現象の記録・解析が、脳機能や睡眠といった生理的状態や病態下で可能となってきた。本研究計画では、てんかん・腫瘍外科術前評価目的で頭蓋内電極を留置した患者を対象に、術前に自発低周波律動の非侵襲的計測(rs-fMRI)を行い、電極留置中に大脳皮質・白質の単発電気刺激により誘発される脳律動を生理的状態(言語機能・睡眠など)・病態(てんかん)下で計測・解析した。これにより包括的なヒト脳機能結合地図の作成と、睡眠やてんかんに関わるヒト脳のネットワーク動態の解明の礎を築いた。平成26年度は、難治部分てんかんの焦点摘出術の術前評価のために硬膜下電極を慢性留置する患者で、研究への参加の同意を得た患者複数名において、術前の安静時機能的MRI(rs-fMRI)および拡散強調画像撮像を行うとともに、単発電気刺激による因果性を持った皮質誘発反応(CCEP)を様々な脳領域で睡眠時も含めて計測した。脳腫瘍の覚醒下手術をおこなった症例を対象に、術前の解剖学的白質線維追跡から推定された背側言語白質経路(弓状束)を単発刺激し、計測された皮質誘発反応の分布から弓状束の両端を担う皮質の特定に成功した。包括的なCCEPデータの解析から、皮質誘発反応として律動性応答を示す脳特異領域があることを見いだし、国内学会(口演)で成果発表した。また、一次体性感覚野で導出したCCEPと体性感覚誘発電位において、それぞれに関連した高周波律動の主たる周波数帯域が異なる(前者が80-160 Hzで後者は200 Hz以上)ことを明らかにした。本内容は国内学会(ポスター)にて発表し、現在国際英文誌に投稿中である。さらに、「意識の消失は情報統合量の減少によって生じる」という情報統合理論の観点から、単発電気刺激で誘発される高周波律動を統合情報量の指標として、生理的意識変容である睡眠において、睡眠深度による局所・ネットワークレベルでの情報統合の変容を12人の患者において各睡眠段階(覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠)で比較検討した。その結果、睡眠時の皮質間結合性・興奮性が睡眠ステージ依存性に動的に変容し、ノンレム睡眠は覚醒時より抑制されやすいこと、レム睡眠は両者の状態の中間に位置すること、さらにそれらの動態は脳葉により異なることを、ヒト脳で初めて明らかにした。本内容は今年度の国内学会(口演)にて発表し、現在国際英文誌に投稿中である。難治部分てんかんの焦点摘出術の術前評価目的で硬膜下電極を慢性留置する患者で本研究計画に同意が得られた者を対象に、大脳皮質・白質の単発電気刺激を行い、留置電極から因果性を持った皮質誘発反応(CCEP)を計測した。これを皮質間機能的結合の動的指標として、関心脳領域や睡眠段階ごとの反応様式の相違を解析し、ヒト脳機能結合地図作成の礎を築くことに成功した。具体的には一次体性感覚野で記録されるCCEPと体性誘発感覚電位に関連した高周波律動帯域の比較から、高周波活動の周波数は、水平・垂直伝播といった入力様式および入力する皮質層により規定されることを明らかにした。また、CCEPとCCEPに関連した高周波律動を各々皮質の結合性・興奮性の指標として着目し、覚醒時とレム睡眠時は同等の皮質間結合性を示すが、ノンレム睡眠では結合強度が低下すること、前頭葉は睡眠時に皮質興奮性が増すことを明らかにした。これらの研究を国際英文誌に発表した。さらに、頭頂葉の内側と背外側刺激のCCEPを解析し、頭頂葉内側の楔前部が前運動野背側部(PMd)に、後部帯状回は中部帯状回と結合をもち、上頭頂小葉はPMdと豊富な結合をもつことを示した。包括的なCCEPの解析から中心溝周囲の大脳皮質では、外的入力により背景律動が同期し、律動性応答を示す特性を見出した。加えて、弓状束近傍の脳腫瘍手術において背側言語白質経路(弓状束)の推定が困難な症例でも、術中のCCEPの反応様式から弓状束の両端皮質を同定し同部位のCCEPを弓状束温存のモニタリング指標にできることを明らかにした。以上は国内学会で発表、一部国際誌に公開した(Usami et al. 2015, Kobayashi et al. 2015)。全研究成果は研究代表者が関連の国際・国内招待講演でも発表した。今後は、侵襲下で得られた上記の頑健なデータと術前に撮像したrs-fMRIによる自発律動のデータを標準脳上に集約し、脳機能結合地図作成を継続する予定である。

電気刺激による誘発脳律動(CCEP)の記録・解析に関しては、解析対象とする周波数帯域を広げるとともに、統計解析手法の改善を行い、脳律動現象と脳内ネットワークの全体像の把握を確実に行うこととした。これにより解析は順調に進んで、学会での発表、学術誌への投稿に至っており、ヒト脳機能結合地図の解明に向けて成果を上げていると考えている。一方、膨大なデータを蓄積しつつあるrs-fMRIを用いた自発脳律動に関しては、解析手法を試行錯誤して妥当な方法を模索している段階である。臨床システム神経科学引き続き症例を蓄積し、包括的なヒト脳機能地図作成のため、合計15名以上の患者のリクルートを目指す。解析に関してはrs-fMRIにも注力してBOLD信号の相関解析を進めCCEPで同定された皮質間機能的結合との共通性・差異を明らかにする。さらに術中白質刺激を行う症例を蓄積し、直接の皮質ー白質ー皮質結合を同定できたネットワークに関して解析も進め、rs-fMRIとの比較検討を行ってrs-fMRIによる皮質間機能結合の経路の解明を目指す。多数症例で系統的に大脳皮質に単発刺激を与え直後からの誘発脳活動計測するためには、電気刺激用チャネル切り替えボックスに加え、時定数回路が調整・変更された脳波アンプシステムが必要である。このシステムの確立のために研究費を用いる予定であったが、機器作成に時間がかかるため、次年度に繰り越すこととなった。昨年度購入予定であった、時定数回路が調整・変更された特注の脳機能マッピング用脳波アンプシステムは、部品調達などの観点から早めの発注を予定する。本年度は、本研究計画をさらに遂行するため、脳深部を含めた多点記録が可能なステレオ脳波の技術習得のため、国際ワークショップへの参加を予定する。また昨年度に引き続きrs-fMRIとCCEPの各データの収集の継続、相関の解析と、学会での研究成果の発表を行う。具体的には、データ解析のためのコンピュータ・ハードディスク(設備備品費)、画像・脳波解析ソフトウェア(消耗品費)の購入と、研究成果発表のための旅費(外国旅費・国内旅費)、学術論文投稿費用を予定する。
低分子量GTP結合蛋白質RalおよびRalGAPの発癌・癌浸潤・転移における役割

我々は低分子量ヒトの発癌・癌悪性化に重要であるGTP結合蛋白質Ralの抑制性制御因子GAPを世界に先駆けてRalGAPを同定し、RalGAPの発現低下が膀胱癌悪性化に重要であることを報告した。本研究では以下研究を発展させた:(1)腸炎および炎症性大腸発癌におけるRal及びRalGAPの重要性について明らかにした(2)Ral結合リン酸化酵素を同定し解析中である(3)膀胱がんにおけるRalGAP発現低下メカニズムがDNAメチル化等エピジェネティックな機序によることを見出した(4)RalGAP-cKOマウスを導入し組織特異的にRalGAP-KOマウスを作成している(5)Ralに関する総説を発表した低分子量GTP結合蛋白質Ralが種々のがんの浸潤・転移に重要な働きをしている報告が相次いでいる。Ralの抑制性制御因子RalGAPは我々が世界に先駆けて同定し(J Biol Chem, 2009)、さらにRalGAPの発現低下が膀胱癌の浸潤・転移に密接に関わっていることを最近報告した(Oncogene, 2012)。本研究ではこれまでのRalおよびRalGAPに関する研究を発展させ浸潤性膀胱癌はじめ種々のがんにおけるRalGAPの発現低下の分子機構を明らかにする。またRalおよびRalGAPが制御する癌の浸潤・転移のメカニズムを明らかにする。さらに抗アポトーシスに重要なRalBに対して、RalAは形質転換に重要である。我々はRalA特異的に結合するキナーゼを見いだしており、それを同定する。このように本研究ではRalにフォーカスして研究を進め、がんの理解を深め、がん化・がん悪性化の診断・治療に貢献することを目的としている。本年度はまずRalGAP発現状況を数種類の膀胱癌細胞株および前立腺癌細胞株にて評価し、RalGAP遺伝子のメチル化およびアセチル化の遺伝子発現における役割を解析した。現在、論文発表に向けさらに解析を進めている。RalAに結合するキナーゼを精製し、同定した。現在、そのキナーゼについて生化学的・細胞生物学的に解析を進めている。さらに、RalGAP遺伝子KOマウスではRalの活性化が亢進するが、そのマウスに炎症性腸炎や炎症性大腸癌を誘導し、Ralの炎症や癌の発症・進展への役割を解析している。低分子量GTP結合蛋白質Ralが種々のがんの浸潤・転移に重要な働きをしている報告が相次いでいる。Ralの抑制性制御因子RalGAPを我々は世界に先駆けて同定した(JBC, 2009)。RalGAPの発現低下が膀胱癌の浸潤・転移に密接に関わっていることを最近報告し(Oncogene, 2013)、さらに、その原因について、転写因子およびエピジェネティクスの側面より追求してきた。悪生型膀胱癌細胞株では、DNAメチル化の亢進がRalGAPの発現低下の原因となっているようである。現在、さらに研究を進めている。また、Ral結合リン酸化酵素を同定し、現在解析中である。さらに、前立腺癌の進展におけるRalおよびRalGAPの役割について共同研究を進めている。また、炎症性腸疾患モデル、炎症関連大腸癌モデルにおいてもRalの活性化は、その症状に大きく影響しているようであり、論文化に向けて研究を進めている。平成26年度にはFLOXシステムによるRalGAPコンディショナル遺伝子破壊マウスを導入し得た、現在、順調に増殖しており、今後はこのマウスを用いて、個体レベルでralおよびRalGAPの癌化・癌悪性化における役割を個体レベルで明らかにしていきたい。また、本研究で準備したRal関連の遺伝子等を用いて、予後不良の循環器系疾患、慢性肺血栓塞栓性肺高血圧症の血小板においてRalが活性化していることを見出した。本研究ではこれまでのRalおよびRalGAPに関する研究を発展させるべき、研究を進めた。抗アポトーシスに重要なRalBに対して、RalAは形質転換に重要であるが、我々はRalA特異的に結合するキナーゼを見いだし、現在解析中である。また、悪性膀胱がんでのRalGAP発現低下の一因は、CpGアイランドのDNAメチル化であることを見出し、現在、さらに解析を進めている。また、我々の発見したRalGAPに重点を置いたralの関する総説(5.R. Shirakawa*, H. Horiuchi (2015) RalGTPases: Crucial mediators of exocytosis and tumorigenesis. (a review) J Biochem (Tokyo) 157, 285-299)を誌上発表した。なお、昨年導入できたRalGAPコンディショナルKOマウスは、順調に生育しており、今後組織特異的遺伝子KOマウスを作成し、RalおよびRalGAPの個体レベルでの役割を解明すべく、研究を進めていく計画である。本研究では以下研究を発展させた:

(1)腸炎および炎症性大腸発癌におけるRal及びRalGAPの重要性について明らかにした(2)Ral結合リン酸化酵素を同定し解析中である(3)膀胱がんにおけるRalGAP発現低下メカニズムがDNAメチル化等エピジェネティックな機序によることを見出した(4)RalGAP-cKOマウスを導入し組織特異的にRalGAP-KOマウスを作成している(5)Ralに関する総説を発表した概要に記載したように研究はおおむね順調に進んでいる。平成26年度にはRalGAPコンディショナルKOマウスを導入することができ、来年度にはこのマウスを用いて、癌化、癌進展に対するRalGAPの役割を明らかにしたい。また、現在、炎症性大腸炎、炎症性大腸癌モデルを用いた解析が順調に進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。生化学、腫瘍生物学、血栓止血学現状の研究を続けるとともに、来年度にはこのマウスを用いて、癌化、癌進展に対するRalGAPの役割を明らかにする。また、現在、炎症性大腸炎、炎症性大腸癌モデルを用いた解析が順調に進んでいるが、導入したRalGAPコンディショナルKOマウスを用いて研究をさらに進め、完成させる。概要に記載したように、研究は順調に進行している。遺伝子破壊マウスの解析等、平成27年度に、集中して予算が必要となる可能性が出てきたため、節約して用いたため。現状の研究を続けるとともに、平成26年度にはRalGAPコンディショナルKOマウスの導入を目指し、特に個体レベルでの発癌・癌進展におけるRalおよびRalGAPの役割を明らかにしていく計画である。すべての予算を用いて、遺伝子破壊マウスの解析等を集中的に進める。平成25年度に計上した備品費の内、浸透培養機149万円は購入したが、純水作成装置および大型冷蔵庫について本予算から購入しなかったので、次年度使用額が生じた。本年度は、顕微鏡等の機器が必要となる見込みであり、それらに充てる計画である。
細胞の極性形成における膜リン脂質の役割

細胞を構成する膜はリン脂質の二重層から成っているが、二つの層ではリン脂質の組成が異なる。モデル生物として出芽酵母を用い、リン脂質層間移行の仕組み及びその役割を解析した。細胞膜におけるリン脂質層間移行に関連する新たな因子や、膜の流動性に関与する膜タンパク質を同定することに成功した。また、細胞内小器官エンドソームでリン脂質の層間移行を担うフリッパーゼDrs2の機能と小胞形成との関係をRcy1が仲介している可能性を示すことに成功した。出芽酵母をモデル細胞として、私たちはこれまでに、通常細胞膜の内層に偏って存在するボスファチジルエタノールアミン(PE)の外層への移行(プロップ)と外層へ露出したPEが再び内層に移行する動き(フリップ)が極性形成の制御に関与していることを示唆する結果を報告してきた。本研究では、このことをさらに詳細に解析するために、PEのプロップあるいはフリップに関与する因子の探索を試みた。細胞膜PEフリッペースの調節サブユニットの変異株(lem3Δ)はPEに特異的に結合するペプチドDuramycinに感受性になる。ゲノム上にランダムに変異を挿入したlem3Δ株の中から、Duramycinに対する感受性が緩和された株を探索し、細胞極性形成及び細胞質分裂に関与していることが知られている機能因子群、RAMネットワークの変異を得た。そのうちの一つであるsog2-1変異について詳細な解析を行った。PEに特異的に結合するプローブを用いた顕微鏡観察から、lem3Δ変異で増加する外層に露出するPEは、sog2-1変異により減少すること、また、lem3Δ細胞で見られる過剰な極性化も緩和されることがわかった。一方、ABCトランスポーターがPEフロップを触媒すると考えられているが、出芽酵母ではABCトランスポーターのPdr5、Yorl、Snq2がフロッペース活性を持つことが示唆されていた。lem3Δ変異にこれら3つの因子の変異を導入すると、Duramycin感受性が部分的に緩和され、さらに細胞膜上に存在する残りの5つのABCトランスポーターの変異も合わせて導入すると、Duramycin感受性はより強く緩和された。このことから、これらのABCトランスポーターがPEのプロップにおいて重複した機能を持つことを明らかにした。sog2-1変異をこれらのABCトランスポーターの変異と合わせてlem3Δ細胞に導入すると、Duramycin感受性を相乗的に強く抑圧したことから、Sog2はABCトランスポーターとは別の機構を介してPEのプロップに関わっていることを示唆する結果を得た。これまでの研究から、細胞膜におけるホスファチジルエタノールアミン(PE)およびホスファチジルセリン(PS)の外層-内層間の移行が極性形成の制御と関わっていることを見いだしている。また、ABCトランスポーターに属するPdr5、Yor1、Snq2がPEの外層への移行(フロップ)に、Sog2を含むRAMネットワークと呼ばれる因子群がPEとPS両者のフロップに関与することを見いだしている。本年度は、PSの移行について重点的に解析を行った。細胞膜のPE,PSの内層への移行(フリップ)を触媒するフリッペースの調節サブユニットの変異株(lem3Δ)は、PSに特異的に結合する薬剤Papuamide B(Pap B)に感受性になる。このことを利用して、PSの移行に関与する因子の探索を行った。1.lem3Δ株のPapB感受性を緩和する新たな変異、2.lem3Δ株のPapB感受性を過剰発現で緩和する遺伝子、3.lem3Δ株のPapB感受性を過剰発現でさらに悪化させる遺伝子、の探索を行った。1の探索では、RAMネットワークの因子の変異が単離され、RAMネットワークがPSの移行に関与することが再度確認された。2および3の探索ではそれぞれ、これまでにほとんど解析されていない膜タンパク質をコードする遺伝子が同定された。これらの因子はいずれも細胞膜に局在していることがわかっており、細胞膜におけるPSの層間移行に関与していることが強く示唆される。今後これらの因子の機能を詳細に解析する。これまでに、出芽酵母において、細胞膜におけるホスファチジルエタノールアミン(PE)およびホスファチジルセリン(PS)の外層-内層間の移行が極性形成の制御と関わっていることを見いだしている。昨年度までに、細胞膜のリン脂質フリッペース調節サブユニットの変異株(1em3Δ)のPapuamideB感受性を過剰発現で緩和する遺伝子の探索を行い、細胞膜に局在する膜タンパク質をコードするSFK1遺伝子を同定した。今年度は、このSFK1の機能について解析を行い、以下のことを明らかにした。1)SFK1変異株(sfk1Δ)では、リン脂質アナログNBD-リン脂質の細胞膜でのフリップ活性が野生型株より上昇しており、またこのフリップ活性はATP非依存的な活性を含んでいる。2)1em3Δ変異により生じる過剰に極性化した形態異常は、SFK1遺伝子の過剰発現でも、sfk1Δ変異のどちらによっても抑圧される。

3)1em3Δ変異株で見られる、PEの芽の先端部での外層への蓄積は、SFK1遺伝子の過剰発現により消失し、sfk1Δ変異により、芽の先端部のみでなく、細胞全体で観察されるようになる。4)sfk1Δ変異は、1em3Δ変異株の種々の薬剤の生育許容濃度を著しく低下させる(より感受性にする)。5)sfk1Δ1em3Δ二重変異株は、野生型株に比べ細胞膜の流動性が高い。これらのことから、SFK1遺伝子産物Sfk1は、細胞膜においてフリッペースと関連して機能し、膜の性質変化(流動性や透過性)を制御する因子である可能性が示唆された。本研究で得られた知見は、リン脂質の層間輸送が膜の物性に関与するということも示唆しており、膜の物性と極性形成についての関わりを今後さらに明らかにする手がかりとなると期待される。
関数体上のディオファントス問題とタイヒミュラー空間に関する研究

タイヒミュラー空間の応用として、関数体上のディオファントス問題、リーマン面の正則族に関連することを研究し、研究代表者は次のような成果を得た。(1)ある種の小平曲面から誘導される、種数2の閉リーマン面の正則族の正則切断を完全に決定した。また、楕円関数によって、この正則族の定義方程式を具体的に求めた。従って、この定義方程式のディーオファントス問題の解をすべて求めたことになる。(3)リーマン面の正則族(M,π,S)に対して、2次元複素多様体Mの普遍被覆空間虚の形を決定する問題を考察し、(i)Mは強擬凸領域と双正則同値にならない、(ii)Mは一般には多重円板と双正則同値にならいことを証明し、また多重円板と双正則同値同値になるための必要十分条件も与えた。(4)負型の擬周期写像が任意に与えられたとき、それをモノドロミーを持つ穴開き単位円板Δ^*={0<|t|<1}上のリーマン面の正則族(M,π,Δ^*)を構成した。これはMatsumotoとMontesinosの別証明であるが、このような正則族のすべてを統一的に構成する方法になっている。リーマン面の正則族のモノドロミーの大域的な研究に関連して、研究代表者は次のような研究成果を得た。(2)上の(1)の結果を一般の次元に拡張することができた。これに関する論文は、Journal of Knot Theory and Its Ramificationsに掲載されることが決まっている。(3)リーマン面の正則族(M,π,3)に対して、2次元複素多様体Mの普遍被覆空間M^^の形を決定する問題を考察した。主結果としては、(i)M^^は強擬凸領域と双正則同値にならない、(ii)M^^は一般には多重円板と双正則同値にならず,また多重円板と双正則同値同値になるための必要十分条件も与えたことが挙げられる。この成果はKodai Math.J.に投稿中である。(4)負型の擬周期写像が任意に与えられたとき、それをモノドロミーを持つ穴開き単位円板Δ^*={0<|t|<1}上のリーマン面の正則族(M,π,Δ^*)を構成する問題を考察した。構成できることはMatsumotoとMontesinosによって証明されているが、そのようなもの全部を統一的に構成する方法が得られた。リーマン面の正則族のモノドロミーの研究に関連して,次のような研究成果を得た.(1)解析的有限な(g,n)型の双曲的リーマン面Sに対して,2元複素多様体B={(x,y)∈S×S|x≠y},3元複素多様体M={(x,y,z)∈S×S×S|x≠y,y≠z,z≠x},および射影π:M→Bを考えれば,B上の(g,n+2)型のリーマン面の正則族(M,π,B)が得られる.この正則族のモノドロミーのタイプをBersとThurstonによる方法で完全に分類することができた.(2)上の(1)の結果を一般の次元に拡張することができた。(3)リーマン面の正則族(M,π,S)に対して、2次元複素多様体Mの普遍被覆空間M^^の形を決定する問題を考察した.主結果としては,(i)M^^は強擬凸領域と双正則同値にならない,(ii)M^^は一般には多重円板と双正則同値にならず,また多重円板と双正則同値同値になるための必要十分条件も与えたことが挙げられる.(4)穴開き円板上のリーマン面の正則族のモノドロミーは負型の擬周期写像になるが,逆に,負型の擬周期写像が与えられたとき,それをモノドロミーに持つ,リーマン面の正則族が存在するという定理(松本-Montesinosの結果)の新しい証明を与えた.この証明法によれば,このようなリーマン面の正則族全体の構造を解析することもできる.この証明法の論文は執筆中である.
魚類肝臓のトリプトファン代謝酵素系に関する研究

1.魚類のトリプトファン代謝機構を明かにするために、関与すると考えられるいくつかの酵素の活性と性質について観察した。2.トリプトファン代謝において、動物では主要な経路といわれるキヌレニン経路の初発酵素であるトリプトファンピロラ-ゼの活性測定法を検討し、分離精製を試みた。魚の酵素活性は低く、また不安定であった。魚の酵素は、他の動物の酵素について報告されているようなヘマチンによる活性化を示さなかった。3.同じ経路の第2段目の反応を触媒するアリルホルムアミダ-ゼをニジマスとウシの肝臓からそれぞれ60倍に精製し、特性を比較した。魚の酵素はウシの酵素にくらべて耐熱性が著しく低く、また高濃度のトリプトファンで阻害された。このことは、魚のキヌレニン経路が、トリプトファンそのものによって制御されることを示唆している。4.同じ経路の第5段に位置するヒドロキシアントラニル酸オキシゲナ-ゼ活性とその生成物を脱炭酸するアミノカルボキシムコニックセミアルデヒド脱炭酸酵素活性の比から,ニジマスでは、キヌレニン経路からNAD生成系への流れは殆んど無いか極めて少ないものと思われた。5.トリプトファンのもう1つの代謝経路であるセロトニン生成経路の初発酵素トリプトファンヒドロキシラ-ゼの活性測定法を検討し、さらにこの酵素の性質を観察した。魚類肝臓は明瞭なヒドロキシラ-ゼ活性を示し、特にニジマスとソウギョに高い活性が認められた。以上の結果から、魚類において、トリプトファン代謝の重要な経路がセロトニン生成経路であることが明かである。このことは、トリプトファン欠乏魚の病変がセロトニン投与により抑制されるとする生物学的報告例と符合するものである。魚類におけるトリプトファン代謝酵素の研究はほとんど行なわれていない。本年度は、いくつかの想定される代謝経路のうちのキヌレニン経路を探るために、その経路の第二段の反応を触媒するアリルホルムアミダ-ゼ(E.C.3.5.1.9)の特性を明かにし、また牛の酵素の諸特性と比較した。酵素を牛とニジマスの肝臓から抽出し、SephadexG・75とDEAE-Sepharose CL-6Bのカラムを用いて精製した。(1)ニジマスの肝臓から1.358U/mg(約62倍)、牛肝臓から426U/mg(約55倍)の精製標品を得た。(2)ニジマスのアリルホルムアミダ-ゼの至適pHは7.7、中性からアルカリ性側で活性の変化は少ない。一方牛酵素の至適pHは8.0、酸性ては不安定であった。(3)ニジマス酵素は37°C以上での失活が速いが、牛酵素は60°C30分でも活性が保たれた。(4)L-ホルミルキヌレニンに対するニジマス酵素のKmは0.28mM、牛の酵素のKmは0.78mMであった。(5)ニジマス酵素の活性化エネルギ-は4,7005,700Kcal/mol、牛酸素のそれは7,1007,400Kcal/molであった。(6)ニジマス酵素はトリプトファンで明らかに阻害されるのに対し、牛の酵素は逆に活性化された。この事実と、魚類肝臓のトリプトファンピロラ-ゼ(キメレニン経路の第一段反応を行う酵素)の活性が極めて低いことをわせて考えると、魚類でのトリプトファン代謝の主経路でないことが想定される。そこで、セロトニン生成経路の酵素についての観察に着手した。