hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語句構造文法に基づく効率的な構文解析の研究

本研究では、文法理論に内在する機構、特に、その制約の記述法に重点をおいて、計算機処理に適した文法記述体系の開発を試みた。そのために、文法理論を計算機上に実装していくための、効率的な文法記述法を開発し、それに基づいて、中規模のワークステーション上に論理型プログラミング言語による構文解析システムを試作し、それに、日本語句構造文法の中核的な部分を実装した。平成3、4年度には、文法的事項に付随する制約の一般的な記述法を重点的な研究対象とし、言語学的に要請される文法的制約を、自然な形で計算機処理機構に効率よく実現する方法について研究を進めた。以上を受けて、4年度には、構文解析機構そのものと、構文解析器が用いる文法記述とを分離して開発・記述し、その参照の手続きを明確化することに努めた。さらに、4、5年度には、トップダウンアルゴリズムによる構文解析プログラムを、ボトムアップアルゴリズムを用いたプログラムに書き直す作業を行い、文法記述と、その計算機上での実現との間の乖離を最小限にするためのツールをいくつか開発した。以上の結果、文の構造を表現する方法を本研究で提案するような多重的な素性表示にすることにより、形態的な表示と意味的な表示を統一的に扱うことができるのみならず、そのような表示に基づく構文解析も容易に実現可能であるということが明らかになった。文法的制約の記述に関しては、当初、連続的なコストという考え方をとり入れた制約というものに立脚する方針を採用することも検討したが、論理型プログラミング言語という、離散的な概念を中心として設計されている言語の中でどのように表現するべきかという問題については満足のいく解決法が得られなかった。この問題については、別の研究テーマとして新たに取り組みたい。本研究では、文法理論に内在する機構、特に、その制約の記述法に重点をおいて、計算機処理に適した文法記述体系の開発を試みている。そのために、文法理論を計算機上に実装していくための、効率的な文法記述法を開発し、それに基づいて、中規模のワ-クステ-ション上に論理型プログラミング言語による構文解析システムを試作し、それに、日本語句構造文法の中核的な部分を実装することを目ざしている。平成3年度の設備費によって、理有設備であったワ-クステ-ションに、ハ-ドディスク、テ-プドライブ、トランシ-バ-の増設を行なった。さらに、シリアルポ-トを拡張し、高速モデムを購入して、外部からのアクセスの便宜を図った。これは、代表者、分担者に加えて、研究協力者によるプログラミング環境を改善するのに役立った。その上で、論理型プログラミング言語による構文解析プログラムの設計に着手し、それに日本語句構造文法の一部を実装することを検討した。具体的には、以前に試験的に作成した、トップタウンアルゴリズムによる構文解析プログラムを、ボトムアップアルゴリズムを用いたプログラムに書き直す作業を行なった。日本語句構造文法による日本語文法の記述は、中核的な部分はすでにほぼ完成しているが、どこまで広い言語現象を取り扱うべきかという点に考慮の余地が残っている。今年度に重点的な研究対象としたのは、文法的制約を自然な形で計算機処理機構に効率よく実現する方法についてであり、文法的事項に付随する制約の一般的な記述について研究を進めた。また、従来の離散的、記号的な制約に加えて、連続的な制約という考え方を取り入れる理論的方法論の有効性が明らかになった。これを論理型プログラミング言語の中でどのように表現するべきかということが来年度以降の課題である。そのために、文法理論を計算機上に実装していくための、効率的な文法記述法を開発し、それに基づいて、中規模のワークステーション上に論理型プログラミング言語による構文解析システムを試作し、それに、日本語句構造文法の中核的な部分を実装している。

平成3年度の設備費による、ワークステーションの周辺機器の増設を踏まえて、平成4年度にはもっぱらソフトウェア環境の整備を行なった。その上で、論理型プログラミング言語による構文解析プログラムの設計を行ない、それに日本語句構造文法の一部を実装した。前年度に着手した、トップダウンアルゴリズムによる構文解析プログラムを、ボトムアップアルゴリズムを用いたプログラムに書き直す作業を継続し、さらに、文法記述と、その計算機上での実現との間の乖離を最小限にするためのツールをいくつか開発した。平成4年度に重点的な研究対象としたことは、文法的事項に付随する制約の一般的な記述法である。言語学的に要請される文法的制約を、自然な形で計算機処理機構に効率よく実現する方法について研究を進めた。さらに、最近の理論の進展の早さに追随しやすいように、構文解析機構そのものと、構文解析器が用いる文法記述とを分離して開発・記述し、その参照の手続きを明確化することに努めた。特に、文法記述に柔軟性をもたせつつも、構文解析の効率を落とさないための前処理的手法を一部とり入れた。文法的制約の記述に関しては、連続的なコストという考えをとり入れた制約というものに立脚する方針を採用したが、論理型プログラミング言語という、離散的な概念を中心として設計されている言語の中でどのように表現するべきかという問題は依然として未解決である。本研究では、文法理論に内在する機構、特に、その制約の記述法に重点をおいて、計算機処理に適した文法記述体系の開発を試みた。そのために、文法理論を計算機上に実装していくための、効率的な文法記述法を開発し、それに基づいて、中規模のワークステーション上に論理型プログラミング言語による構文解析システムを試作し、それに、日本語句構造文法の中核的な部分を実装した。最終年度の平成5年度は、今までに得られた知見を総合的に実現するための環境の整備を行ない、合わせて今までの研究成果のまとめを行なった。まず、前年度に着手した、トップダウンアルゴリズムによる構文解析プログラムを、ボトムアップアルゴリズムを用いたプログラムに書き直す作業を継続し、さらに、文法記述と、その計算機上での実現との間の乖離を最小限にするためのルーツをいくつか開発した。その上で、言語学的に要請される文法的制約を、自然な形で計算機処理機構に効率よく実現する方法を重点的に研究した。本年度には、文の構造を表現する方法を本研究で提案するような多重的な素性構造にすることにより、形態的な表示と意味的な表示を統一的に扱うことができるのみならず、そのような構造に基づく構文解析も容易に実現可能であるということが明らかになった。文法的制約の記述に関しては、当初、連続的なコストという考え方をとり入れた制約というものに立脚する方針を採用することも検討したが、論理的プログラミング言語という、離散的な概念を中心として設計されている言語の中でどのように表現するべきかという問題については満足の行く解決法が得られず、この問題については、本年度内では実現を見なかった。
細胞膜における能動輸送系の構造、機能および分子機構の統一性と多様性

能動輸送タンパク質の構造、機能、輸送の分子機構に関する統一性と多様性を解析するためには、できるだけ多くの能動輸送系について解析する必要がある。幸い、代表者および分担者はこれまでに多数の輸送系を発見し、解析してきた。9年度、10年度で以下のような成果を得た。1)代表者のグループはイオンと共役する能動輸送系のうち、Na+/メリビオースシンポートとNa+/セリンシンポート系を中心に解析した。すでに代表者らの研究室ではこれらの系について生化学面、遺伝子面からかなり詳細な解析を行っており、その成果をふまえ、上記2つの輸送タンパク質について大量発現、大量精製法を確立した。カチオンと共役する輸送系の構造上および輸送メカニズム上の共通性(統一性)と多様性を明らかにすることが主目的の一つであるが、この研究により高次構造解析への道が拓かれた。2)これまでに解析してきたシンポート系とアンチポート系について、ホモロジー解析やモチーフ解析を通じ、イオン共役あるいは基質認識に関与する領域あるいはアミノ酸残基を明らかにした。特にいくつかのものについてはキメラ体の構築、部位特異的変異などの手法により多数の変異体を作成し、解析した。3)いくつかの新たな輸送系について遺伝子クローニングを行い、構造と機能の関係を解析した。ウィルソン教授のグループ、コニングス教授のグループもそれぞれがこれまでに解析してきた能動輸送系について同様の解析を進めた。また、当方がウィルソン教授の研究室およびコニングス教授の研究室を訪問して共同研究と研究討議を行った。代表者らはナトリウムイオンと共役するシンポータ、ナトリウムイオン、プロトンおよびアニオンと共役するアンチポ-タ、プロトン排出や薬物排出を行うATP駆動型トランスポータについて解析した。ウィルソン教授、コニングス教授のグループもそれぞれ興味深い輸送系について研究を進めた。本研究では、これらのグループが共同して、一件多様に見える各種能動輸送系の根底に存在する基本的分子構造と輸送の分子機構や、各系の特徴を決める構造的特性を明らかにすることを目指している。能動輸送系の構造、機能、輸送の分子機構に関する統一性と多様性を解析するためには、できるだけ多くの能動輸送系について解析する必要がある。幸い、代表者および分担者はこれらまでに多数の輸送系を発見し、解析してきた。9年度は、以下の点を中心に解析を行った。1)イオンと共役する能動輸送系のうち、代表者のグループはカチオンと基質のシンポート系について解析した。すでに代表者らの研究室ではいくつかの細菌のカチオン/メリビオースシンポート系についてかなり詳細な解析を行っている。カチオンと共役する輸送系の構造上および輸送メカニズム上の共通性(統一性)と多様性を明らかにすることが主目的の一つなので、カチオン/メリビオースシンポート系、他のカチオン/基質シンポート系について特に構造面からの解析を中心に進めた。2)それらの輸送タンパク質を精製し、生化学的性質を詳細に解析した。3)これまでに解析してきた輸送系について、コンピューターによるホモロジー解析やモチーフ解析を通じ、イオン共役あるいは基質認識に関与する領域あるいはアミノ酸残基を明らかにしつつある。10年度は、以下のような成果を得た。

2)これまでに解析してきたシンポート系とアンチポート系について、ホモロジー解析やモチーフ解析を通じ、イオン共役あるいは基質認識に関与する領域あるいはアミノ酸残基を明らかにした。特にいくつかのものについてはキメラ体の構築、部位特異的変異などの手法により多数の変異体を作成し、解析した。3)いくつかの新たな輸送系について遺伝子クローニングを行い、構造と機能の関係を解析した。ウィルソン教授のグループ、コニングス教授のグループもそれぞれがこれまでに解析してきた能動輸送系について同様の解析を進めた。また、当方がウィルソン教授の研究室を訪問して共同研究を行った。また、コニングス教授の研究室を訪問し研究討議を行った。
視交叉上核から室傍核領域への時刻情報伝達機構の解明

体内時計の中枢である視交叉上核がどの様に室傍核領域に情報を伝えているのか検討するために、Per2::lucノックインマウスの脳組織片を用いた組織培養系において発光振動を測定した。同一組織片において視交叉上核と室傍核領域の発光振動は逆位相であった。室傍核領域のみを培養すると発光振動は数日で減衰消滅したが、視交叉上核と共培養すると室傍核領域に安定した発光振動が現れた。さらに回復した発光振動は視交叉上核の発光振動と逆位相であった。これらの所見は共培養によって視交叉上核と室傍核領域の概日リズムが同期したこと、また個体に存在する視交叉上核と周辺領域の同調に必要な情報伝達機構が再構成されたことを示唆する。哺乳類の体内時計の中枢は視交叉上核である。しかしながら視交叉上核の時刻情報がどの様に周辺脳領域に伝わり、脳領域の時計を制御しているのか未だ明らかにされていない。申請者は組織培養下における視交叉上核と室傍核領域の時計遺伝子の振動を、発光測定系を用いることで同時に測定することを可能とした。さらに申請者は室傍核領域の単独培養では時計遺伝子の振動は消失するが、そこに視交叉上核を移植して共培養することで室傍核領域の振動が回復することに成功した。そこで本研究では申請者が開発したこの技術を用いて、視交叉上核がどの様に室傍核領域の時計を制御しているのかという時刻情報伝達機構について明らかにすることを目的とする。時刻情報伝達機構にはグリア細胞による情報伝達または神経連絡のどちらが重要であるか検証するために、視交叉上核組織片移植後、振動が回復した組織に対して免疫染色を行った。その結果、室傍核領域組織片と視交叉上核組織片の間にはグリア細胞が増殖して組織間を結合していることがわかった。そこで、時刻情報伝達機構にはグリア細胞が重要であるかと考え、移植実験の際にグリア細胞の増殖を抑制する処理を行った。その結果、室傍核領域の時計遺伝子の振動は回復しなかった。これらのことから時刻情報伝達機構にはグリア細胞が重要な役割を果たしていると考えられる。また、時刻情報伝達機構における電気シグナルの関与を検証するために、多平面電極上で室傍核領域組織片を培養し、そこへ視交叉上核組織片を移植して培養を行った。その結果、時計遺伝子の振動と同様に、電気活動の振動は室傍核領域と視交叉上核では逆位相であることが確認できた。このことは、電気活動及び時計遺伝子振動に対して同様の機構によって時刻情報の伝達が行われている可能性を示唆している。哺乳類の体内時計中枢は脳内視床下部の視交叉上核である。しかしながら視交叉上核が刻んだ時刻情報がどの様に周辺脳領域に伝わり脳領域の時計を制御しているのかは未解明である。これを解明するために、まず視交叉上核による室傍核領域への概日振動制御機構を解明することにした。そのために時計遺伝子Per2のプロモータにルシフェラーゼを連結したPer2::lucノックインマウスの脳組織片を用いた組織培養系において発光振動を測定した。その結果、視交叉上核と室傍核領域を含む同一組織片において視交叉上核と室傍核領域の発光振動は逆位相であった。一方、室傍核領域のみを培養すると発光振動は数日で減衰消滅したが、視交叉上核と隣接して共培養すると室傍核領域に安定した発光振動が現れた。この回復した発光振動は視交叉上核と逆位相であった。これらの結果は、共培養によって視交叉上核による室傍核領域への概日振動制御機構が再構成されたことを示唆する。言い換えると、再構成されたネットワークの中に概日振動制御機構を担う因子が存在することを示唆する。そこで、この組織共培養系における振動再構成を用いて概日振動制御機構を担う因子の同定を試みた。まず視交叉上核共培養により室傍核領域の振動が回復した時、それらのスライスに免疫染色を行った。その結果、視交叉上核スライスと室傍核領域スライスの間はグリア細胞で埋め尽くされていること、また視交叉上核から室傍核領域へ軸索が伸長していることが確認された。次に軸索伸長が起こらないようにした状態で視交叉上核と室傍核領域を共培養すると、室傍核領域の振動は回復しなかった。また透析膜を室傍核領域と視交叉上核間に挟みこみ、液性因子は通過するが物理的接触は阻害した状態にすると、室傍核領域の振動は回復しなかった。

これらの結果は視交叉上核による室傍核領域への概日振動制御機構には液性因子ではなく神経連絡が重要であることを示唆する。時間生物学本研究では視交叉上核から室傍核領域への時刻情報伝達機構の解明を行うために、1.時刻情報伝達機構が液性因子依存か物理的要因依存であるか明らかにする。2.時刻情報伝達物質の同定。3.物理的要因の検証の、3つの項目を軸に研究を進める。1に関して、透析膜を用いた実験を行い、液性因子または物理的要因のどちらが重要であるか検証するものであったが、透析膜を用いても完全に物理的(グリア細胞の)接触を阻害することはできなかった。しかしながら、免疫染色等の結果からグリア細胞の重要性が浮かびあがってきた。当初の予定とは異なったが、物理的要因の重要性を明らかにすることができた。2に関して、時刻情報伝達物質の同定を行うものだが、1の検証の結果、時刻情報伝達機構には物理的要因が大きく関与している可能性が示唆されたので、当初の予定通り、2の項目は行わずに3の物理的要因の検証を行った。3に関して、物理的要因の内、時刻情報伝達機構に重要なのは、グリア細胞による連絡なのか、神経連絡によるものなのか検証を行った。まず、グリア細胞の関与を検証するために、組織移植時にグリア細胞の増殖抑制処理を行った。その結果、振動の回復は観察できなかった。同様に神経連絡の関与を検証するために、移殖時に軸策伸長阻害処理を行った。これは現在検証中である。また、電気シグナルの関与については、その測定系を樹立することができた。これらのことより本研究は概ね予定通りに進展していると考えている。時刻情報伝達に重要であるのはグリア細胞であるのか、神経連絡であるのか明らかにするために、引き続きグリア細胞増殖抑制剤、軸策伸長阻害剤等を用いた検証を行う。また、なぜ室傍核領域と視交叉上核とでは振動の位相が逆位相になっているのかという疑問を解決するために、昼行性動物から採取した組織片を用いた実験を行い、位相差を作り出すのは情報の発信側(視交叉上核)なのか、情報の受信側(室傍核領域)なのか明らかにする(*夜行性動物は室傍核領域と視交叉上核の時計は逆位相。昼行性動物は室傍核領域と視交叉上核の時計は同位相)。また、グリア細胞の重要性の検証についてはギャップ結合阻害剤などを用いて、グリア細胞の何が重要であるのか掘り下げていく予定である。多平面電極を用いた電気シグナルの測定系を構築し、時計遺伝子の振動と同様に視交叉上核組織片移植後、室傍核領域の電気活動の振動は視交叉上核と逆位相であることが確認できた。この測定系を用いて、組織移殖時にグリア細胞の増殖抑制、軸策伸長阻害を行い、電気活動に対する時刻情報伝達機構にグリア細胞または神経連絡が関与するのか検証する。また電気シグナルの関与を検証するために、視交叉上核に電気刺激を与え、室傍核領域の電気活動が影響を受けるか測定する。視交叉上核と室傍核領域の電気活動は概日振動しているので、1日4時間毎の6点で刺激を与え、室傍核領域の電気活動の位相が時刻ごとにどれだけ変動したかを示す位相反応曲線を作成する。消耗品である組織培養用メンブレンは非常に高価であるので、極力再利用することに勤めた。また、研究の進展に伴い、組織培養数が当初予定より少なくなった。その結果、組織培養用メンブレンの購入費を抑えることができた。繰越分は次年度のおいて組織培養用メンブレンを購入する予定である。また、電気活動測定に用いる電極(MEDプローブ)も消耗品であり、次年度はこちらの使用数が増えることが予想されるので、MEDプローブを購入する予定である。
雪崩の災害文化の雪氷学的意義づけと防災・減災のための体系化に関する研究

雪崩危険地を多く抱える市町村に残る、地名、言い伝え、伝説、災害体験記録、慰霊碑、山林禁伐の掟など雪崩の災害文化に関しての調査研究を行った結果、平成11年度には次のような知見が得られた。江戸時代から、山林の乱伐によって集落が雪崩に襲われ被害を受けたために、集落背後の森林の伐採を厳しく禁じてきた歴史が各地に残されている。そのような災害文化も長年月経って風化してしまうと禁伐林が伐採され、そのため集落雪崩災害が再び発生していることがわかった。禁伐林の歴史は、雪崩災害発生防止には森林が有効であり、その保存・管理が大切なこと、それを忘れて伐採するといつか雪崩災害が発生することを伝えている。かって雪崩災害で多数の犠牲者が出た日を忌み日として精進したり、その日に犠牲者を弔う「講」を行ったりする行事が各地にあることがわかった。また雪崩に襲われても助かるという謂われから旧暦の11月晦日・12月朔日に団子や餅を食べる年中行事を行っている所があることもわかった。これらの行事の時期は雪崩の危険性が考えられる頃で、昔の人はこうした行事を通して雪崩を意識し警戒を喚起したものと考えられる。雪崩にまつわる伝説も各地に数多く残されており、雪崩の発生場所、雪崩埋没時の対処法、表層雪崩の恐ろしさなどを伝承している。実在の雪崩災害の話に誇張やフィクションを交えて作られたこれらの伝説は、単なる雪崩災害の事実だけよりも興味を引くため代々語り継がれ、人々の災害意識を高めてきたものと考えられる。現代では地域社会が大きく変容し、過去の貴重な災害文化が忘れ去られようとしている。本研究でも、すでに文献上でしか把握できない災害文化も多いことがわかった。こうした雪崩の災害文化を、本研究によって可能なかぎり収集し現状を把握できた意義は大きい。今後は雪崩の災害文化の体系化をさらに進め、雪崩防災・減災のための基礎的情報として活用したいと考えている。雪崩危険地を多く抱え、古くからの歴史的遺産の残されている市町村は、東北地方から山陰地方にまで広がっている。その内、特に北陸地方の県立図書館、市町村の役場などに赴き、地名、言い伝え、伝説、災害体験記録、慰霊碑、山林禁伐の掟など雪崩の災害文化に関する資料を収集した。この資料収集と同時に、地名、災害体験記録、雪崩慰霊碑、雪崩防止林など現地の状況把握が現在でも可能な災害文化については、地形・植生などの現地調査や地元住民からの聞き取り調査を実施した。その結果平成10年度に得られた知見を以下に記す。東北地方から新潟県にかけて狩猟を主な仕事として活躍したマタギと呼ばれる人々は、雪崩避けの呪文・掟、埋没者捜索方法など豊富な雪崩の災害文化を持っていたことがわかった。これは、厳冬期のカモシカ狩りが古くはマタギの狩猟の中心で、新雪表層雪崩の危険と背中合わせの行動であったことによる。石川県の手取川上流には、ノマと呼ばれる全層雪崩の発生地を示す地名が数多くある。このノマという地名は集落から谷に入って行く出入り口に認められる。これは春期、出作りの焼畑を行っている場所などに出かける際に、全層雪崩に対して注意を促す災害文化であった。雪崩慰霊碑の調査から、38豪雪の際、福井県下で下校途中の学童と付き添いの教員が雪崩に巻き込まれ死亡する事故が発生したが、近隣の学校では臨時休校にして通学時の被災を回避していたことがわかった。雪崩発生が予想される危険な状況の際にとりうる対応行動が、雪崩に関する伝承・知識の有無に左右されることを示す一例と考えられる。
脂質リン酸化酵素の細胞機能発現への寄与とその作用機序の解明

本研究対象であるジアシルグリセロール(DG)キナーゼは,膜受容体活性化時にセカンドメッセンジャーであるDGをリン酸化して,生理活性物質であるホスファチヂン酸を生成する.我々はブタ脳80kDaキナーゼ,更にブタ胸腺の同じ酵素に対する家兎抗体を調整し実験した.1)ブタ各種組織に存在するDGキナーゼの免疫学的検討-ブタ肝,心,腎,脾,胸腺,血小板のキナーゼを,イムノブロット,免疫沈降の手段で解析した.我々が先に精製した80kDaキナーゼの組織間分布は意外に限定されており,特に胸腺に多い他,脾にも存在したが,他の組織では殆ど検出できなかった.ゲルロ過により可溶性キナーゼは見かけ上280, 120, 80kDaの三つの分子サイズを示し,この中で80kDaの酵素のみが抗体と反応した.血小板は80kDaキナーゼは存在せず120kDa酵素が主であった. 280kDaキナーゼはリンパ組織に多い.その他の生化学的検討の結果からも,組織により分子量と抗原性の異ったキナーゼが存在することを初めて示した.2)DGキナーゼのプロティンキナーゼCによるin vitroリン酸化-この二つのキナーゼは刺激細胞でほぼ同時期に活性化され,反応機序も類似している.ブタ胸腺より二つの酵素を高度精製して使用した.両者ともSDS-電気泳動上80kDaの分子量を示した.DGキナーゼはC-キナーゼの良い基質でありモル当り1モルのリン酸化を受ける.プロティンキナーゼAによるリン酸は極く弱い.二次元電気泳動,プロテアーゼ分解により二つのプロティンキナーゼはDGキナーゼの類似のサイトをリン酸化することが分った.リン酸化によりDGキナーゼは活性化又は安定化される.3)ヒト末梢リンパ球,ヒト系培養細胞のDGキナーゼの免疫学的検討-家兎抗キナーゼ抗体は,ヒトリンパ球, JURKAT cells,HL-60等の細胞に存在する85kDaキナーゼと交叉する.現在細胞レベルでのDGキナーゼのリン酸化を免疫沈降で検討中である.本研究対象であるジアシルグリセロール(DG)キナーゼは,膜受容体活性化時にセカンドメッセンジャーであるDGをリン酸化して,生理活性物質であるホスファチヂン酸を生成する.我々はブタ脳80kDaキナーゼ,更にブタ胸腺の同じ酵素に対する家兎抗体を調整し実験した.1)ブタ各種組織に存在するDGキナーゼの免疫学的検討-ブタ肝,心,腎,脾,胸腺,血小板のキナーゼを,イムノブロット,免疫沈降の手段で解析した.我々が先に精製した80kDaキナーゼの組織間分布は意外に限定されており,特に胸腺に多い他,脾にも存在したが,他の組織では殆ど検出できなかった.ゲルロ過により可溶性キナーゼは見かけ上280, 120, 80kDaの三つの分子サイズを示し,この中で80kDaの酵素のみが抗体と反応した.血小板は80kDaキナーゼは存在せず120kDa酵素が主であった. 280kDaキナーゼはリンパ組織に多い.その他の生化学的検討の結果からも,組織により分子量と抗原性の異ったキナーゼが存在することを初めて示した.2)DGキナーゼのプロティンキナーゼCによるin vitroリン酸化-この二つのキナーゼは刺激細胞でほぼ同時期に活性化され,反応機序も類似している.ブタ胸腺より二つの酵素を高度精製して使用した.両者ともSDS-電気泳動上80kDaの分子量を示した.DGキナーゼはC-キナーゼの良い基質でありモル当り1モルのリン酸化を受ける.プロティンキナーゼAによるリン酸は極く弱い.二次元電気泳動,プロテアーゼ分解により二つのプロティンキナーゼはDGキナーゼの類似のサイトをリン酸化することが分った.リン酸化によりDGキナーゼは活性化又は安定化される.3)ヒト末梢リンパ球,ヒト系培養細胞のDGキナーゼの免疫学的検討-家兎抗キナーゼ抗体は,ヒトリンパ球, JURKAT cells,HL-60等の細胞に存在する85kDaキナーゼと交叉する.現在細胞レベルでのDGキナーゼのリン酸化を免疫沈降で検討中である.ジアシルグリセロールキナーゼは細胞アゴニスト刺激時にprotein kinase Cと共役して活性化される。これ迄本酵素は粗標品の活性測定により検討されてきたが、我々は精製酵素に対する特異的な家兎抗体調製に成功し、初めて免疫学的検討を加え、以下の知見を得た。1)脳膜画にも可溶性酵素と免疫学的に同一の酵素蛋白が存在する。2)免疫組織染色でニューロンのみに検出された。3)肝由来のキナーゼと交差せず、グリア細胞を免疫染色出来ないこと等から、組織・細胞によるキナーゼの多様性が存在する。3)Sn-2型のモノアシルグリセロールをリン酸化するが、Sn-1型の基質は殆ど利用しない。従って細胞刺激時に本キナーゼはジアシルグリセロールに関してprotein kinase Cと競合する上に、Sn-2モノアシルグリセロールに関してリパーゼとも競合し、細胞機能発現に関与していることが強く示唆される。

我々は更に4)、ジアシルグリセロールキナーゼキナーゼが存在し、本酵素のセリン残基をリン酸化することを免疫沈降により証明した。我々は本酵素に対する単クロン抗体も調製したが(岩田,加納,小野,第59回生化学会発表)、抗体を大量調製出来ず、現在再クローニング中である。現在家兎抗血清を用いて検討続行中であるが、抗体は等電点泳動において、pI66.5に三つのキナーゼ蛋白を認識し、リン酸化されたキナーゼは最も酸性のキナーゼ蛋白であることが分った(山田,加納)。このことはブタ脳キナーゼにIsoformがあり、組織中に既にリン酸化された分子種が存在していることを示唆している。現在、本キナーゼとprotein kinase Cを精製中で、本キナーゼのリン酸化による調節を検索中である。又gene cloningによる本キナーゼの構造決定も実験準備中である。
有機金属化合物の電子状態とその反応性に関する理論的研究

まず,このクラスで最も高速なワークステーションを導入し,ネットワークに接続した.このワークステーションに量子化学計算プログラムGAMESS(general atomic and molecular electronic structure system)を移植し,申請者独自のルーチンを修正付加することにより計算システムを構築した.このシステムを利用し,まず,典型元素(HCa,GaSr,InBa,TlRa,ただし,希ガス元素を除く)のエネルギー的に低い電子状態のMCSCF波動関数と全エネルギーを求めた.そして,以前に決定した有効核電荷を用い,それらの電子状態におけるスピン相互作用の大きさを予測した.これらの結果を実験結果と比較検討した.アルカリ金属元素およびアルカリ土類金属元素を除けば,実験結果とかなりよい一致を示し,以前に決定した有効核電荷が有用であることが明らかになった.これらの結果は次年度中に論文発表する予定である.次に,遷移金属元素のエネルギー的に低い電子状態のMCSCF波動関数と全エネルギーを求めた.取り扱った遷移金属元素は,ScZn,YCd,La,HfHgの30個である.いずれの元素においても,多数の電子状態がエネルギー的に近接して存在するため,これらの電子状態を適切な信頼度で求めるために多くの時間を要した.さらに,これらの電子状態のスピン軌道相互作用による分裂を一電子近似のもとで計算した.計算に含めた電子状態が多数であるため,我々のプログラムでは比較的長い計算時間を要した.従って,我々のプログラムを改善し,高速化する必要があると思われる.以上の結果を実験によって求められている原子スペクトル分裂と比較検討することにより,二電子部分の寄与を見積り,現在.各遷移金属元素の有効核電荷を決定している.次年度にこれらの結果をまとめ,論文発表する予定である.さらに,それらの結果を利用し,Ti,Ru,Os,Wなどの水酸化化合物の化学反応の研究を進めていく予定である.以上の研究と並行して,高スピン化合物の設計を目的としたジラジカル系の化学反応,シリコン窒化膜成長過程,共役炭化水素における擬ヤーンテラー効果に関する研究も行い,論文投稿中である.まず,このクラスで最も高速なワークステーションを導入し,ネットワークに接続した.このワークステーションに量子化学計算プログラムGAMESS(general atomic and molecular electronic structure system)を移植し,申請者独自のルーチンを修正付加することにより計算システムを構築した.このシステムを利用し,まず,典型元素(HCa,GaSr,InBa,TlRa,ただし,希ガス元素を除く)のエネルギー的に低い電子状態のMCSCF波動関数と全エネルギーを求めた.そして,以前に決定した有効核電荷を用い,それらの電子状態におけるスピン相互作用の大きさを予測した.これらの結果を実験結果と比較検討した.アルカリ金属元素およびアルカリ土類金属元素を除けば,実験結果とかなりよい一致を示し,以前に決定した有効核電荷が有用であることが明らかになった.これらの結果は次年度中に論文発表する予定である.次に,遷移金属元素のエネルギー的に低い電子状態のMCSCF波動関数と全エネルギーを求めた.取り扱った遷移金属元素は,ScZn,YCd,La,HfHgの30個である.いずれの元素においても,多数の電子状態がエネルギー的に近接して存在するため,これらの電子状態を適切な信頼度で求めるために多くの時間を要した.さらに,これらの電子状態のスピン軌道相互作用による分裂を一電子近似のもとで計算した.計算に含めた電子状態が多数であるため,我々のプログラムでは比較的長い計算時間を要した.従って,我々のプログラムを改善し,高速化する必要があると思われる.以上の結果を実験によって求められている原子スペクトル分裂と比較検討することにより,二電子部分の寄与を見積り,現在.各遷移金属元素の有効核電荷を決定している.次年度にこれらの結果をまとめ,論文発表する予定である.さらに,それらの結果を利用し,Ti,Ru,Os,Wなどの水酸化化合物の化学反応の研究を進めていく予定である.以上の研究と並行して,高スピン化合物の設計を目的としたジラジカル系の化学反応,シリコン窒化膜成長過程,共役炭化水素における擬ヤーンテラー効果に関する研究も行い,論文投稿中である.
憲法規範における環境関連規定のあり方に関する比較法的分析

憲法における環境関連規定の在り方につき、わが国において憲法改正の動きも前提として活発な法律上の議論が行われ、さらにそれらの議論が沈静化した現状を踏まえつつ、学問的議論を比較法的に深めた。特にドイツ、フランス、その他EU諸国並びにアメリカにおける環境権規定及びこれに関する議論を詳しく分析し、その結果、環境保護について憲法的価値を認めるとしても現実には多くの限界があり、環境意識、環境保護に資する特別な訴訟制度の充実等が必要であることが確認された。(1)平成19年度においては、我が国の法学界における、「憲法の環境権のあり方」に関する論議について、研究分担者の間で作業を分担し、網羅的に検索した上で、それらをデータベース化した。(2)ドイツ、フランス、アメリカについて、邦語文献を中心としてこれまで紹介された国内文献を検索、収集し、データベース化した。また、各言語の文献検索も様々な検索システムを網羅的に使用し、上記各国における議論の動向について紹介した文献について検索し、データベース化した。また、3月7日に開催した共同研究者間の会議(一橋大学大学院法学研究科公法研究室にて開催)において、それらの文献を踏まえ、今後の憲法の環境権規定のあり方について海外の議論と日本の議論との差異、日本特有の課題等について議論し、分析を加えた上で、調査すべき領域・課題を確定した。(3)特に、フランスの議論については、岡森識晃が分析をまとめ、研究論文を作成し、3月7日開催の共同研究会において報告した。この研究論文は、本年7月に「自治研究」に掲載されることとなっている。(4)海外研究協力者との協力体制の構築については、研究代表者が平成19年7月14日から同19日までドイツ連邦共和国を訪問し、ギーセン大学法学部ランゲ教授にヒアリングを行うとともに、カッセル大学代理教授兼リューネブルク大学私講師ザンデン教授(本プロジェクトにおける研究協力者)との間において、今後の共同研究の体制について詳細な打ち合わせを行った。1.平成20年度は「憲法の環境権のあり方」に関して、独・仏・米における議論並びにそれらの国の議論と日本の議論との比較につき、研究会を7月26日、10月3日、3月14日に開催した(連携研究者の岡森識晃・甲南大学法学部准教授、小舟賢・広島修道大学准教授と寺田麻佑・大学院博士後期課程・アメリカ担当が参加)。特に10月3日の研究会は、海外研究協力者であるリューネブルク大学ザンデン教授代行を招聘し、ドイツの環境権規定のあり方・ドイツ環境法における統合的環境規制につき議論を行った。2.上記研究会の成果として、フランスにおいては、現時点で憲法院判例を通じ環境憲章の実効性が図られているとは言い難い現状にあること、ドイツにおいては、基本法の20a条に定められた環境保護規定の判例における適用の具体例に乏しく、今後の判例の展開を待つ必要があること、アメリカにおいては、環境権規定は一部の州憲法に見られるものの連邦憲法には規定がなく、一部の州憲法の改正を超えて連邦憲法へ環境権規定を導入しようとする活発な動きはみられないことが確認された。そして、日本における環境権規定をめぐる議論への示唆として、環境保護規定を置くフランス・ドイツも、アメリカの州レベルにおいても、環境保護は多くの規定を通じて確保されている点が確認された。さらに、調査研究の締め括りとして座談会を行なった(出席者:高橋・岡森・小舟・寺田、季刊環境研究157号に掲載)。日本法への示唆としては、環境関連規定が憲法上導入された欧州諸国において、それらの規定から直接に環境保護の成果が見られるとは必ずしも言い難い状況にあること、米国においても州憲法の規定にかかわらず訴訟提起に多くの問題があることを踏まえ、憲法における環境関連規定のあり方につき、今後も慎重な議論を重ねる必要があることが確認された。また、具体的に環境関連規定の導入を図る場合には、環境意識、環境保護に資する特別な訴訟制度の充実、とりわけ環境団体訴訟の制度化について多くの議論を重ねる必要があることが確認された。
血管・リンパ管新生に着眼した歯性感染症－顎骨骨髄炎移行メカニズム解明と治療法探索

骨粗鬆症などに対し用いられる骨吸収抑制薬や、口のがんに対し施行される放射線照射等の医療行為が素因となる顎骨骨髄炎は、近年患者数の増加に伴い顎口腔外科領域において最も新たな治療法開発が期待される難治性疾患の一つです。本研究の目的は、近年感染の進展にも関与していることが明らかとなりつつある血管・リンパ管新生をターゲットとし、歯性感染症ー顎骨骨髄炎移行メカニズムを解明することです。
構造が明確なポルフィリン多量体を用いた巨大分子科学の創世

分子サイズが分子の性質に与える量子的な効果は、単分子と分子集合体との境界線付近に発現されることが期待されている。この分野の研究は、主に理論が先導して研究が進行してきたが、研究対象となるべき具体的な物質が存在しないため、物性に関する知見は限られていると言わざるを得ない。そこで、本研究では、有機合成化学の手法を駆使して、巨大な分子量を有する単一分子の設計・合成・物性評価を行い、分子サイズが分子の性質に与える効果を評価することを目指した。標的化合物としたポルフィリン多量体は、ポルフィリンのメソ位部分を、P-フェニレンを用いて連結させたものである。多量化は、ポルフィリン置換アルデヒドとピロールとの縮合反応によって逐次遂行した。本手法を用いて行えば、デンドリマー化合物でしばしば見出される、構造の一部が欠損したような不純物の混入を完全に防止できる。従って、物性評価には、構造が明確な物質を供する事が可能となった。即ち、アルデヒドが置換したポルフィリンを順次合成していき、単量体、5量体、21量体とし、最後に85量体を目指した。これらと並行して、ポルフィリン多量体に於いてしばしば観察される光集光機能にも注目を行い、評価を行った。ポルフィリンは、ピロールを4個含む大環状パイ電子化合物である。この分子は緑色植物の光合成を担う重要な天然由来色素として知られているのみならず、近年では種々の光機能性色素として広範な研究が行われつつある。本研究ではポルフィリン分子の性質を、より向上させる為の一手段として、多数個のポルフィリンを共有結合で連結させた多量体分子の設計と合成を行った。具体的には、p-フェニレン基でそれぞれのポルフィリン分子を連結させることにより、平面上の分子を得ることに成功した。その構造は、核磁気共鳴法と質量分析法によって明らかにした。可視紫外分光法により電子スペクトルを評価した結果、本研究で合成した分子は、座布団様の平面分子であることが明らかとなった。標的化合物としたポルフィリン多量体は、ポルフィリンのメソ位部分を、p-フェニレンを用いて連結させたものである。
共感覚から「感覚言語」へー触譜を用いた表現の理論的・実践的研究

諸感覚の基盤にあり、それらに共通するような感覚ならびにそれを記述する言語があるなら、たとえある特定の感覚能力をもたない人であっても、共通の感覚言語を通し、その不在の感覚を(別様にではあるが)体験できるのではないか。本研究はこの究極目標に向けた一歩として、次の成果を達成した。ひとつは共通の感覚を記述する言語としての触譜ならびにそれにより可視化される振動触覚刺激の洗練、もうひとつは触譜と諸芸術におけるさまざまな指示法とのつながりならびに違いの明確化である。平成27年度中に行うのは、次の2点であった。すなわち(1)複数の感覚表現の生成と規則の発見、ならびに、(2)歴史的に評価の高い共通感覚可視化表現の研究、である。(1)については、主として鈴木泰博准教授が、(2)については、主として秋庭准教授が担当し、研究を進めた。以下、それぞれ概要を説明する。(1)複数の感覚表現の生成と規則の発見について。鈴木准教授ならびに研究協力者の鈴木理絵子氏は、文字テクストを、両氏によって開発された触譜(Tactile Score(R))に変換し、そのようにして生成した触譜を基に、それを身体運動(ダンス)、触覚デバイス(心臓バイブレーター、美顔器など)、音楽、グラフィックス(映像表現など)といった、さまざまな感覚に変換する試みを行ってきた。平成27年度では、その継続に加え、触譜をさらに発展させ、3次元化することが試みられた。これにより、建築に居住する居住者の身体運動、すなわち複数の感覚表現の交点そのものである身体を、取り扱うことができるようになってきたのである。この成果は、2016年3月に台北で開催した第2回台湾日本計算美学ワークショップにおいて、「Tactile Score, as a sensory language」として発表され、当地のメディアアーティストや建築家から高い評価を得た。(2)歴史的に評価の高い共通感覚可視化表現の研究について。主たる担当者である秋庭准教授は、計画に従い、荒川修作&マドリン・ギンズ作品の調査を行った。また、その思想に関連する現代のバイオメディアアート作品における記譜と身体の関係について発表した(15年10月SOMA)。また、情報の変換を行うノーテーションの成立可能性について、ヴィトゲンシュタインを援用したフランスの音楽哲学者Arboの理論を批判的に検討して、発表を行った(15年11月人工知能学会合同研究会)。学術論文の発表にまでは至らなかったものの、研究はおおむね順調に進展している。そのように考える理由は、次の通りである。第一に、感覚言語研究の最大の基盤である触譜が、この1年のあいだに、大きな進展を遂げたこと、である。個々の感覚変換を実行できることに加えて、それらの基盤となる身体運動を表現できるようになったことは、かつて哲学者たちによって根源的触覚と言われていた身体感覚(本研究の用語で言い換えるなら感覚言語)の表現可能性に、一歩近づいたことになるからである。第二に、今年度発表の機会を得なかった、(研究実施計画には記載していた)荒川修作&マドリン・ギンズによるダイアグラムについては、すでに、2016年7月に韓国ソウルで開催される国際美学会議にて研究発表を行うことが決定しており、決して進展がなかったわけではないからである。第三に、研究協力体制についても、27年度(2015年11月)には、研究協力者であるフランス在住の作曲者`音楽学者であるEric Maestri氏ならびに研究発表でも取り上げたAlessandro Arbo氏と、フランス・ストラスブールにて研究会を行うことが決まっていたが、不幸にも同月パリ等で大規模なテロが発生し、延期となった。これは当初予期していなかったことである。しかしながら、現在でも研究交流は続いており、否定的に捉える必要はない。以上より、研究は前向きに進んでいると判断している。28年度の研究は、次の2点であった。1)諸感覚の変換を行っているアーティストへの聞き取り調査を行い、感覚の変換に関して重要なポイントが何かを明らかにする。また前年度から引き続き、歴史的に重要な記譜法について考察する。2)前年度から引き続き、感覚言語の評価系構築に向けた研究を行う。この2点について、主として1)を秋庭が、2)を研究分担者の鈴木泰博名古屋大学准教授が担当し進めた。まず1)について。日本画家であり、「Telescore」プロジェクトの主催者である作家のiyamari氏にインタビューを行った。同プロジェクトは、触覚、視覚、聴覚、身体感覚を変換しながら行われるものであり、その主催者であるiyamari氏は、感覚変換のエキスパートとして取材にふさわしい対象であったためである。同時に、同プロジェクトの展示調査、さらに舞踊家石井則仁氏によるパフォーマンスの体験、さらに石井氏へのインタビューも行った。このインタビューに基づく考察、さらに触譜を用いた感覚変換との違いに関する考察は、報告書にまとめ、一部を秋庭のウェブサイトに公開している。さらに、触譜と歴史的に重要な記譜法との比較検討については、2016年6月に大韓民国ソウル国立大学で開催された国際美学会において口頭発表を行った。2)の感覚言語の評価系構築に向けた研究については、鈴木准教授が出版した「美容人工知能ーウェルビーイングのための計算美容術」(ISBN978-4-915905-81-0)にまとめられている。とりわけ、そこに記載された触質方程式、ならびに触質成分の再帰的定義が重要である。これにより、種々の触質を記述することができるようになった。

これは、2016年11月9日に慶応義塾大学日吉キャンパスで開催された人工知能学会合同研究会(ナチュラルコンピューティング)で発表されている。そのように判断する理由は、研究実績の概要にも記したように、代表者、分担者がそれぞれの作業を着実に進展させているためである。まず、代表者は、感覚変換を行っている作家にインタビューし、それに基づく考察を行った。その際、対象となったアーティストは、当初予定していたアーティストとは異なっている。しかしそれは、当初予定者がすでに触譜に基づいた作品を発表しており、触譜のさらなる展開を考えるには、別の観点から感覚変換を試みているアーティストの活動と比較する方がよいと判断したためである。結果的に、異なるアーティストへのインタビューとその考察により、これまでの触譜の展開の正当性が逆照射されることとなった。この点で、当初予定より変更はあったが、順調に進展していると判断する。また、研究分担者である鈴木准教授による感覚言語研究は、触譜からSENSONICならびに美容人工知能と呼ばれる、マスならびにパーソナライズドされたメディアの研究へと発展している。すなわち、多数の人に同じ効果的な触覚を提供する方法(マスメディアとしての感覚言語)、ならびに、いかに個別化された触覚を提供するか(パーソナライズドメディアとしての美容人工知能)、に問題が移行している。そのなかで、感覚言語の評価についても、一定の見識が蓄積されてきている。これらの点から、順調に進展していると判断する。こちらの研究についても、それを進めるなかで、当初予定されていた音楽という特定の物質に依存しない抽象的な作品ではなく、感覚言語の現実界への実装、そこでの物質性の考慮がより大きな課題となって現れてきている。この点に対応するために、(後述するように)最終年度の研究の推進方法に当初予定から多少の変更が生じているが、この変更は現在までの進捗状況の判断に影響するものではない。最終年度にあたる29年度において、研究代表者である秋庭は、2つの作業を行った。ひとつは、これまでの感覚言語を基礎に置いた触覚美学研究の成果を確認するため、触覚美学研究で得られた知見を、実際の芸術作品の解釈に適用するという作業である。この作業は、一見して異なるジャンルのものにも適用が可能であれば、それだけ触覚美学研究の基礎にある感覚言語の考えの妥当性が確認できるとの想定に基づき、種々のジャンルの芸術作品に対して行われた。具体的には、引き剥がしと呼ばれる、非常に触覚性の高い版画の手法を用いた芸術作品について、などである。もうひとつは、(当科研は29年度で終了であるが)今後さらに触覚美学研究と科学的研究との共同の進展をもたらすために、感覚言語(美的なもの)の数学的表現の可能性を探るという作業である。もちろん、秋庭は数学者でも自然科学研究者でもないため、その貢献はあくまで美学理論の観点からのものである。
口腔癌におけるSlit/Roboシグナル作用機構の解析とバイオマーカーの開発

本研究計画では、様々な細胞機能に関与するSlit/Roboシグナルについて、まだ明らかとなっていない口腔扁平上皮癌での発現様式やシグナル伝達機構を明らかにしたいと考えている。口腔粘膜上皮基底細胞層の細胞接着系の破綻によって起こる発癌、進展のメカニズムに、Slit/Roboシグナルが重要な役割を担っていることが予想される。当初の予定として掲げている検討項目、1)細胞株を用いたRobo受容体の発現検討、2)Slit誘導による増殖能や遊走能の検証、3)切除時に採取したヒト検体(癌部、非癌部、前癌病変)の組織学的、生化学的発現解析を進めている。ヒト由来口腔扁平上皮癌患者から樹立された細胞株HSQ89, HO-1-u-1, Sa3, SASを用いてROBO1の発現は抗ROBO1抗体は先端科学技術研究センター計量生物医学研究室所有のモノクローナル抗体を用いて行っている。mRNA発現は各種プライマーを設計のうえでのqRT-PCRやシークエンス解析、タンパク発現はウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫染色で検討を遂行した。さらにHSQ-89細胞株を用いてSlit誘導による遊走能の検証を行い、mRNAはいずれの細胞株も発現を認めることを確認した。また、HSQ-89細胞株ではシークエンスでROBO1との同配列の確認など終えた。一方、タンパク質レベルで発現するHSQ-89, HO-1u-1、Sa3細胞株のうち、HSQ-89細胞株について、Slit誘導による遊走能を確認するなどを行い、これらの検討より、口腔癌の代表的な細胞株において、ROBO1の発現を認めた(mRNA; 4/4,現在ヒト検体についても検討を進めているところである。これまで、細胞株には、種類によってROBO1の発現量に差があることが示され、またがん種によっても異なることは文献的にも示されているため、コントロールとなる高発現する細胞株の構築には時間を要した。これはヒト検体においても同様の傾向が示唆され、さらに抗体の特異性を担保する染色が得られにくいことも計画を阻む要因となっている。また、当教室主宰者である教授の交代があり、環境要因も研究遂行に影響している。これまでも述べてきたようにSLIT2/Robo1シグナルが、癌細胞の浸潤、転移、上皮間葉移行(EMT)、腫瘍血管新生における重要な役割を果たすことが示されてきており、浜窪らの研究により、肝細胞癌、小細胞肺癌において、A 90Yによりラベルした抗Robo1抗体による放射免疫療法(Radioimmunotherapy, RIT)の有効性が示されたこともあり、Robo1は抗体による癌治療法の標的因子としての可能性の高いものであると考えられる。そのため、本研究では、複数のHNSCC細胞株におけるRobo1の発現量を明らかにすることで標的因子としての可能性を模索し、抗Robo1抗体を用いた細胞障害活性の検討についても模索し、HNSCCに対するその有効性についても検討中である。抗Robo1抗体にサポリンを付加したイムノトキシンを用いて、Robo1を発現する頭頸部扁平上皮癌細胞株および血管内皮細胞(HUVEC)に対する効果を調べた。培養した細胞に光増感剤AlPcS2aを前投与し、650nmのLED光を照射する光化学的内在化法により、強い腫瘍細胞および血管内皮細胞殺傷効果を認めた。さらに、がん細胞株HSQ-89を移植したマウスゼノグラフトを用いた光化学的治療においても腫瘍縮小効果を認め、本手法が臨床応用可能である結果を得た。引き続きRobo1の作用を検討していく。本研究は、近年神経発生における軸索誘導分子として知られるSlit/Roboが、癌に深く関わっていることに着目し、未だ情報の少ない口腔扁平上皮癌に対して、どのように作用するかを検証することを目標としている。このため、口腔扁平上皮癌におけるSlit/Roboシグナルの系統的解析ならびに臨床検体を用いた多段階における発現様式について解析を行い、また、体液中の細胞外小胞Exosomeを回収し、遊離型Roboを検出できるかを課題として各項目を掲げて検討を進めている。Slit/Roboシグナルが悪性化予測因子として機能すれば、早期口腔癌の検出力・感度向上につながり、体液を用いた口腔がん検診への応用にも発展が期待できると考える。まずは口腔扁平上皮癌に関するRobo1の発現について、口腔癌細胞株を用いて検討を進めており、同時に学内倫理委員会の審査承認を得て(審査番号10557-(1))臨床研究も遂行中である。特に、Robo1について免疫組織学的検討を行い、悪性度によって発現様式が異なることを示唆した知見も得られている。膜貫通型タンパク質RoboがADAM10やMMP、γ-secretaseなどの切断酵素によるsheddingの修飾を受けて細胞内外へ遊離することが分かっていることから、遊離型Roboタンパク質の動態についても我々は着目しており、今後その機能についても明らかにしていきたい。また一方、実際の臨床検体(組織、血液)を対象とした免疫組織学的・生化学的検討やプロテオミクス解析、ならびに定量的RT-PCR法を用いたSlit/Roboの発現検討を行い進行中である。Robo受容体は、ヒトにおいては現在までに4種類のタイプがあることが知られているが、そのシグナル伝達についてはいくつかの経路が明らかにされてきている[Gara RK, et al.Drug Discov Today 2015, 20(1):156-164.]。

特に各サブタイプの発現パターンとE、N、P-cadherinとの相互作用の違いによって、シグナル伝達経路が異なることが分かっている。このことから、口腔癌細胞やその他の臓器由来の細胞を用いてRobo1を中心に発現パターンの解析が遂行できた。今後cadherinとの関連についても手がかりを得たい。発現検討には定量的RT-PCRのほか、タンパク質レベルでの発現様式についてウエスタンブロット法、免疫染色、フローサイトメトリーなどの検討を行い、知見を得た。Slitのうち最も研究が進んでいるSlit2についての検討を行った。Robo1-Slit2シグナルが増殖、接着、細胞死など、いづれの細胞機能に関与しているがを確認するため、化学遊走の抑制因子としての機能を持っていることが知られている知見を検証することを行った。Slit2についても口腔癌細胞に対して作用することが示唆され、引き続き種々の癌細胞との比較をしながらchemotaxisが濃度依存性にどのように変化するか確認していく予定である。当初の計画に従い、データを得ており、おおむね順調に進展していると思われる。本研究計画では、様々な細胞機能に関与するSlit/Roboシグナルについて、まだ明らかとなっていない口腔扁平上皮癌での発現様式やシグナル伝達機構を明らかにしたいと考えている。口腔粘膜上皮基底細胞層の細胞接着系の破綻によって起こる発癌、進展のメカニズムに、Slit/Roboシグナルが重要な役割を担っていることが予想されることから、当初の予定として掲げた検討項目、1)細胞株を用いたRobo受容体の発現検討、2)Slit誘導による増殖能や遊走能の検証、3)切除時に採取したヒト検体(癌部、非癌部、前癌病変)の組織学的、生化学的発現解析を進めた。まずは、ヒト由来口腔扁平上皮癌患者から樹立された細胞株HSQ-89, HO-1-u-1, Sa3, SASを用いてROBO1の発現の有無について検討を行った。細胞株は理化学研究所細胞材料開発室より入手した。抗ROBO1抗体は先端科学技術研究センター計量生物医学研究室所有のモノクローナル抗体を用いた。mRNA発現は各種プライマーを設計のうえqRT-PCRで検討し、シークエンス解析を行った。タンパク発現はウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫染色で検討した。さらにHSQ-89細胞株を用いてSlit誘導による遊走能の検証を行った。これらの検討結果から、mRNAはいずれの細胞株も発現を認めた。また、HSQ-89細胞株ではシークエンスでROBO1と同じ配列を認めた。一方、タンパク質ではHSQ-89, HO-1-u-1、Sa3の細胞株に発現を認めたが、SAS細胞株では検出できなかった。HSQ-89細胞株のSlit誘導による遊走能を確認した。これらの検討より、口腔癌の代表的な細胞株において、ROBO1の発現を認めた(mRNA; 4/4,タンパク質; 3/4)。ROBO1の発現が口腔癌の発生や浸潤・転移に関与するか,今後さらなる検討を進める.ウェスタンブロッティングを行った検討では、強制発現細胞株であるRobo1/CHOで検出される同じ位置にHSQ-89、Sa3でバンドが検出された。Robo4/CHOでは検出されなかった。