hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子どもと環境に対する包括的支援モデルの構築‐小学校臨床における新たな視点の導入‐

研究の目的は日本の小学校環境-物理的環境、人的環境-と心の健康について個別支援研究、全体支援研究、連携システム研究と比較文化研究を通して考察し、日本の子どもの心の健康支援に対する提言を行うことである。結果は、フィンランドとの二国間比較研究を通して、日本の子どもの自尊感情、学校満足感が低いこと、と友人関係は良好であること、子どものアセスメント技法としての投影法の基礎研究、アセスメントのみでなく援助技法として用いることの提示などの成果を得ることができた。これらの成果は図書3編、論文10編、国内学会29編、国際学会14編として発信した。これらの成果をまとめて来年度には図書を刊行予定である。1)個別支援研究子どものロールシャッハ法によるアセスメント研究として、幼稚園中学生までを対象として収集した一般児データの解析を実施し、一部を学会誌に発表し、一部を「子どものロールシャッハ反応-形態水準と反応内容-」(金剛出版)として刊行した。また生理学的研究では、一般児と発達障害児(PDD)を対象として心理検査遂行時の脳活動および眼球運動の比較研究を行い結果の一部を日本心理学会および日本ロールシャッハ学会で発表した。2)全体支援研究テスト・バッテリーによるアセスメントと支援研究として、愛知県および静岡県の小・中学生一般児童および特別支援学級児を対象として、質問紙、SCTおよび描画法による子どものメンタルヘルス調査を実施した。対象は小2,4,6および中学2年生で、約2800名である。2010年度に本データを集計、成果発信予定である。3)子どもを取り巻く環境の共同相互連携支援システムの構築環境の共同支援システムに関する調査として、フィンランドTurku市の小学校3校、児童養護施設とTurku大学児童精神科病棟の実地調査を行った。結果の一部は、2010年7月の日本学校心理学会で発表予定である。4)現代の日本社会・文化に生きる子ども像とその環境の解明日本とフィンランドの子どものメンタルヘルスに関する国際比較研究を、フィンランド共同研究者と計画し、日本のデータは既に収集済みである。フィンランドのデータは2010年度中に収集し解析を行う予定である。1)個別支援研究子どものロールシャッハ法によるアセスメント研究として、子どもの公共反応の特徴と子どもを母集団とした基準による形態水準の再評価研究を実施し成果は、来年度国内外学会および論文発表予定。またNIRSを用いて発達障害児の心理検査遂行時の脳活動について研究を実施し、成果は国際学会で発表した。現在投稿準備中である。2)全体支援研究一般小中学生および特別支援学級児、外国籍児と通常学級における担任が気になる児童を対象とした大規模なメンタルヘルス調査結果の分析を進めた。成果の一部を「中間報告書」として冊子にまとめ、調査協力校の全教員に配布し(約400部)、現在、教員からの成果に対する現場の声や成果を教育指導に生かす方法についての意見を集約中である。成果の一部は来年度学会発表、論文投稿予定。3)子どもを取り巻く環境の共同相互連携支援システムの構築2回目のフィンランドにおる小学校調査を実施し、スクールカウンセラーによる学校支援の実際や特別支援教育における通常学級との連携について調査した。結果は来年度学会で発表予定。4)現代の日本社会・文化に生きる子ども像とその環境の解明日本とフィンランドの子どものメンタルヘルスに関する国際比較研究において、フィンランドの小中学生のデータを収集し、現在日本のデータとの比較分析中である。成果の一部は来年度国内外学会において発表予定である。1)個別支援研究子どものロールシャッハ法によるアセスメント研究として、子どもの公共反応の特徴と子どもを母集団とした基準による形態水準の再評価研究を実施し成果を論文化(印刷中)した。またNIRSを用いて発達障害児の心理検査遂行時の脳活動について研究を実施し、成果を英語学会誌に論文化(印刷中)した。成果の一部を国内学会および国際学会において発表した。またうち1本を論文化、2本を投稿中である。3)子どもを取り巻く環境の共同相互連携支援システムの構築3回目のフィンランドにおける小学校および中学校調査を実施し、特に中学校環境の実際や地域における子どもを支える環境について調査し結果の一部は国内学会で発表した。4)現代の日本社会・文化に生きる子ども像とその環境の解明日本とフィンランドの子どものメンタルヘルスに関する国際比較研究において、収集したデータの評定、分析作業を継続して進めた。成果の一部は国内外学会において発表した。以上の1)から4)について、今年度は13本の国内学会、3本の国際学会発表を行い、3本を論文化(うち1本英語査読誌、1本国内査読誌、1本査読なし雑誌)2本を投稿中であり積極的な成果発信を行った。

来年度はこれらの知見に現在分析中の成果を合わせ、日本の小学校における一般児童、学校で気になるとされる児童、のメンタルヘルスの特徴を明らかにし、その背景としての学校環境や地域の環境について日本の文化・社会という視点から、より健康な心の発達促進への支援について検討する予定である。またその一部を来年度には図書として刊行する予定である。1)個別支援研究:子どものロールシャッハ法によるアセスメントおよび援助技法としての研究成果を図書sとして刊行した(松本真理子他編著「児童青年期に活きるロールシャッハ法」金子書房)2)全体支援研究:一般小中学生および特別支援学級児、外国籍児と通常学級における担任が気になる児童を対象とした大規模なメンタルヘルス調査結果の分析を進めた。成果の一部を国内学会および国際学会において発表した。また3本を学会誌において発表した。3)子どもを取り巻く環境の共同相互連携支援システムの構築:フィンランドにおける小学校および中学校調査を実施し、特に中学校でのキャリア教育の実際を通して子どもの健康な発達を支える環境について調査、スクールサイコロジストへのインタビューを通して、いじめ対策やサイコロジスとの機能について調査した。結果の一部は国内学会で発表予定である。4)現代の日本社会・文化に生きる子ども像とその環境の解明:日本とフィンランドの子どものメンタルヘルスに関する国際比較研究における成果を図書として刊行した(松本・ケスキネン編著「フィンランドの子どもを支える学校環境と心の健康」明石書店)以上の1)から4)について、今年度は2編の著書、3編の論文、10本の国内・国際学会によって成果発信を行った。来年度は5年間の成果による提言を報告書・図書として広く発信する予定である。1)個別支援研究:子どものロールシャッハ法によるアセスメント研究として、子どもの公共反応の特徴と子どもを母集団とした基準による形態水準の再評価研究を実施し成果を論文化した。またNIRSを用いて発達障害児の心理検査遂行時の脳活動について研究を実施し、成果を英語学会誌に論文化した。2)全体支援研究:一般小中学生および特別支援学級児、外国籍児と通常学級における担任が気になる児童を対象とした大規模データによるメンタルヘルス調査結果の分析を進めた。成果は国内学会および国際学会において発表した。そのうち3編を論文化(うち1編は英文誌)、1本を投稿中である。3)子どもを取り巻く環境の共同相互連携支援システムの構築:4回目のフィンランドにおける小学校および中学校調査を実施し、特に中・高校生へのインタビュー調査を行った。成果は国際学会において発表予定である。4)現代の日本社会・文化に生きる子ども像とその環境の解明:日本とフィンランドの子どものメンタルヘルスに関する国際比較研究において、収集したデータの評定、分析作業を継続して進めた。成果の一部は国内外学会において発表した。
ハイドロキシアパタイトの特異的陽, 陰両イオン交換反応による非晶質化に関する研究

PHが3.04.0の各種イオン濃度のSnCl_2水溶液(200cm^3)とHAP(0.5g)との反応特性を種々検討した結果,水溶液中からのSn^<2+>イオンの除去量とHAP(ハイドロキシアパタイト)中から液中に遊離したCa^<2+>イオンのモル比がSn^<2+>イオンの原液濃度の増加とともに大きくなり原液濃度2.5mmol/200cm^3の時に1.0に近くなることが判明した.この結果よりSn^<2+>イオンの濃度が低い場合はH^+イオンによるCa^<2+>の溶出もてるためSn^<2+>/Ca^<2+>のモル比が1.0より小さくなり, Sn^<2+>イオンの濃度が2.5mmol/200cm^3程度(この値は試料HAP中のCa^<2+>イオンのモル数の約半分である)になると液中のSn^<2+>とアパタイト中のCa^<2+>イオンとのイオン交換反応が支配的になったものと考えられる.反応後にpHが増加することより液中のCl^-イオンとHAP中のOH^-イオンの間でH^+イオンの手助けにより陰イオン交換が同時に起こり, OH^-イオンが遊離したものと解釈される.つぎにこのSn^<2+>イオン除去後のHAPの構造変化を粉末X線法,赤外吸収法により検討した結果, Sn^<2+>イオンの除去量の増加に伴い,反応生成物は非晶質化することが判明した.すなわち, HAPはpH=3.0のような酸性領域でもSn^<2+>イオンおよびCl^-イオンとH^+イオンの手助けにより陽,陰イオン交換し,安定な非晶質体を生成することが判明した.なお,類似の現象は対陰イオンがFイオンの場合にも見出された.この結果は,同一条件の同族イオンであるPb^<2+>イオン系の場合安定なPb^<2+>含有アパタイトを生成する結果や他の2価の陽イオン系ではHAPが溶解してしまう結果とまったく異なりきわめて興味深い.また,一般にアパタイトはアルカリ性領域で安定であるとされているが,このアパタイト非晶質体は酸性領域では安定であるがアルカリ性領域では不安定であるという興味ある特性を有することも判明した.今後この非晶質アパタイトの生体内での反応特性を検討する予定である.PHが3.04.0の各種イオン濃度のSnCl_2水溶液(200cm^3)とHAP(0.5g)との反応特性を種々検討した結果,水溶液中からのSn^<2+>イオンの除去量とHAP(ハイドロキシアパタイト)中から液中に遊離したCa^<2+>イオンのモル比がSn^<2+>イオンの原液濃度の増加とともに大きくなり原液濃度2.5mmol/200cm^3の時に1.0に近くなることが判明した.この結果よりSn^<2+>イオンの濃度が低い場合はH^+イオンによるCa^<2+>の溶出もてるためSn^<2+>/Ca^<2+>のモル比が1.0より小さくなり, Sn^<2+>イオンの濃度が2.5mmol/200cm^3程度(この値は試料HAP中のCa^<2+>イオンのモル数の約半分である)になると液中のSn^<2+>とアパタイト中のCa^<2+>イオンとのイオン交換反応が支配的になったものと考えられる.反応後にpHが増加することより液中のCl^-イオンとHAP中のOH^-イオンの間でH^+イオンの手助けにより陰イオン交換が同時に起こり, OH^-イオンが遊離したものと解釈される.つぎにこのSn^<2+>イオン除去後のHAPの構造変化を粉末X線法,赤外吸収法により検討した結果, Sn^<2+>イオンの除去量の増加に伴い,反応生成物は非晶質化することが判明した.すなわち, HAPはpH=3.0のような酸性領域でもSn^<2+>イオンおよびCl^-イオンとH^+イオンの手助けにより陽,陰イオン交換し,安定な非晶質体を生成することが判明した.なお,類似の現象は対陰イオンがFイオンの場合にも見出された.この結果は,同一条件の同族イオンであるPb^<2+>イオン系の場合安定なPb^<2+>含有アパタイトを生成する結果や他の2価の陽イオン系ではHAPが溶解してしまう結果とまったく異なりきわめて興味深い.また,一般にアパタイトはアルカリ性領域で安定であるとされているが,このアパタイト非晶質体は酸性領域では安定であるがアルカリ性領域では不安定であるという興味ある特性を有することも判明した.今後この非晶質アパタイトの生体内での反応特性を検討する予定である.
三量体GTP結合蛋白質による細胞骨格制御

私達は以前、三量体G蛋白質Gi2が胎生期脳の脳室周辺に選択的に局在することを見いだし、神経前駆細胞の機能との関連を示唆した。胎仔の脳室に百日咳毒素(PTX)を注入すると、大脳皮質の細胞数とBrdU陽性細胞数の有意な減少が見られ、Gi2は神経前駆細胞の増殖を促進すると考えられた。胎仔脳より分離した神経前駆細胞を用いて、どの受容体刺激で細胞増殖が起こるかを検討した。脳の発生初期に発現しているG蛋白質共役型受容体を刺激し、[^3H]チミジンの細胞への取り込みを測定すると、エンドセリン(ET)で有意な促進が見られ、培養皿をフィブロネクチン(FN)でコートしておくと、さらに強い[^3H]チミジンの取り込み促進が見られた。これはET-B受容体を介する反応であった。ETによる細胞増殖を検討すると、FN存在下で有意に細胞数が増加したが、非存在下では見られなかった。一方、下流の反応を検討すると、ERKのリン酸化がETにより顕著に増加した。ETによるERKのリン酸化はFNの有無に影響を受けなかったので接着とは無関係と考えられる。ETによるDNA合成、細胞増殖、ERKのリン酸化の促進はいずれも、PTXで細胞を前処理しておくと部分的に抑制されたことより、GiだけでなくPTX非感受性G蛋白質も関与していると考えられる。一方、私達が見いだしたHeLa細胞におけるGq/11が誘導するアポトーシスの分子機構について検討し、2つの経路が関与して相加的にアポトーシスを誘導しているという結論を得た。ひとつはIRS-1に特異的と推定されるチロシンホスファターゼが活性化され、生存シグナルの中心的分子であるAktのリン酸化が低下することによると考えられる。もうひとつは、Rhoが活性化されることにより、アポトーシスが起こるとものであるが、Aktの活性型は両経路によるアポトーシスを抑制した。三量体G蛋白質による細胞骨格制御機構を明らかにすることを目的にし、HeLa細胞におけるGq/11が誘導する接着斑様構造形成のメカニズムを検討した。活性化型Gα11による接着斑様構造の形成は、カスパーゼによりRhoキナーゼ(ROCK-I)が切断されて活性化されたためであることが明らかになったので、Gαq/11によるカスパーゼの活性化機構を追求した。Bcl-2の過剰発現でROCK-1の切断が阻害されたのでミトコンドリア系細胞死シグナルの関与が示唆された。Aktの活性化型を発現してもカスパーゼの活性化が抑制された。インスリン刺激によりAktのリン酸化が増加するが、この増加はGq/11刺激で抑制された。Gq/11によるAktの活性化抑制についてさらに検討し、次の2つの経路の関与が明らかになった。ひとつは、インスリン受容体の基質、IRS-1のリン酸化のGq/11による減少で、チロシンホスファターゼの関与が示唆された。もうひとつはRhoを介する経路で、これにはRhoキナーゼの関与は認められなかった。2つの経路の阻害はどちらも部分的な効果しか示さないが、orthovanadateとRhoドミナントネガティブ体を同時に作用させると、Gq/11によるAktのリン酸化抑制およびROCK-Iの切断はほぼ完全に消失した。これらの結果は両経路が独立なものであること、Gq/11により同時に活性化されることを示している。

一方、脳の発達時には神経前駆細胞が増殖、移動、分化という過程を経て神経細胞新生が起きる。三量体G蛋白質のうち、Gi2が神経前駆細胞の多い部位に局在することを見つけているので、この分子種の神経細胞新生との関わりを検討した。まだ、予備的な実験結果であるが、Gi2を介して細胞増殖が促進されることを見いだした。さらに、細胞骨格や運動の制御についても、低分子量G蛋白質Racを活性化して細胞伸展や運動を促進していることを示す結果を得ている。私達はこれまでに、Gi2が胎生期脳の脳室周辺に選択的に局在することを見いだし、神経前駆細胞の機能との関連を示唆した。胎仔の脳室に百日咳毒素(PTX)を注入すると、大脳皮質の細胞数およびBrdU陽性細胞数の有意な減少が見られた。これらの結果より、Gi2は神経前駆細胞の増殖を促進すると考えられた。ラット胎仔脳より分離した神経前駆細胞を用いて、どの受容体刺激で細胞増殖が起こるかを検討した。脳の発生初期に発現しているG蛋白質共役型受容体を刺激し、[^3H]チミジンの取り込みを測定すると、エンドセリン(ET)で有意な促進が見られ、培養皿をフィブロネクチン(FN)でコートしておくと、さらに強い取り込み促進が見られた。ETによる細胞増殖を検討すると、FN存在下でのみ有意に細胞数が増加した。下流の反応を検討すると、ERKのリン酸化がETにより顕著に増加した。ETによるERKのリン酸化はFNの有無に影響を受けなかったので接着とは無関係と考えられる。ETによるDNA合成、細胞増殖、ERKのリン酸化の促進はいずれも、細胞をPTXで前処理しておくと部分的に抑制されたことより、GiだけでなくPTX非感受性G蛋白質も関与していると考えられる。HeLa細胞におけるGq/11が誘導するアポトーシスの分子機構について、昨年度チロシンホスファターゼが関与する経路でAktのリン酸化が阻害されるためであること、さらにRhoを介する経路もAktのリン酸化を抑制するためという2つの経路を考えた。しかし、今年度の研究で、Rhoの活性化はAktのリン酸化を制御することなく、アポトーシスを起こすという結果を得た。機構は不明であるが、Aktの活性型はRhoによるアポトーシスを抑制した。結論としてはGq/11はチロシンホスファターゼとRhoAをそれぞれ活性化し、2つの経路が相加的にアポトーシスを誘導する。
血管平滑筋細胞におけるエリスロポエチンの情報伝達に関する検討

我々はこれまでエリスロポエチン(EPO)誘発性高血圧の発症機序を培養血管平滑筋細胞や透析患者などで検討してきた。また、抗血小板薬が誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)を誘導して、NO産生を刺激して直接血圧低下をもたらしたり、血管平滑筋のアポトーシスを誘導して血管のリモデリングを介して血圧低下を惹起する可能性を報告してきた。本研究においては、血管平滑筋細胞におけるエリスロポエチンの情報伝達系をさらに深く掘り下げて検討して、高血圧の発症機序を解明したいと考えた。平成1314年度は、EPOの血管平滑筋細胞の増殖刺激作用に対するcAMP-protein kinase A系の影響を,EPOの情報伝達の各stepにおいて検討した。これらの結果は、cAMPはEPOによるMAPK系の活性化を抑制するが、この抑制作用はRaf-1のレベルかその上流で調節される可能性を示している。またこれらの結果はcAMPの刺激薬は、エポによる直接作用に対して防御的に作用する可能性を示している。平成15年度は、透析患者の末梢血から,血管内皮細胞の前駆細胞を分離して、EPO受容体のサブタイプ(完全長型と細胞内領域欠損型)の分布をPolymerase Chain Reaction法を用いて検討する予定であったが、結果はnegativeだった。従って、今回は透析患者において心血管系合併症が多いことの原因を検索する目的でこれら血管内皮細胞の前駆細胞数と機能を透析患者と年齢を合致させた健常対象者で比較検討した。結果は、末梢血のCD34陽性細胞、AC133陽性細胞いずれも透析患者は健常対照者に比べて減少していた。また、in vitroで培養しても透析患者ではこれら血管内皮細胞の前駆細胞数は減少していた。血中のVEGF濃度は両者で有意差は見られなかった。以上から、結論として循環血液中の血管内皮前駆細胞は減少していて、このことが透析患者では血管新生が障害され心血管系合併症が多いことに関連する可能性がある。この報告は平成13年から平成15年の3年間,文部省より助成を受けた科学研究費補助金(基盤研究(C)(2))の研究成果の概要である.我々はこれまでエリスロポエチン(EPO)誘発性高血圧の発症機序を培養血管平滑筋細胞や透析患者などで検討してきた。この報告は平成13年から平成15年の3年間,文部省より助成を受けた科学研究費補助金(基盤研究(C)(2))の研究成果の概要である.平成13年度は,Epoの血管平滑筋細胞における作用を明らかにするために,EpoのMMPs産生及び活性化に対する影響について検討する予定であったが,結果はnegativeだった。従って,Epoの血管平滑筋細胞の増殖刺激作用に対するcAMP-protein kinase A系の影響を,Epoの情報伝達の各stepにおいて検討した。結果はrHuEpo添加によりDNA合成は促進した。cAMP刺激薬のForskolinの前処置により,DNA合成は抑制されたが,cAMPのantagonistであるRp-cAMPによりその抑制は相殺された。rHuEpo添加によりElk-1のリン酸化の亢進が時間依存性に認められ,そのpeakは5minであった。FKの前処置によりElk-1のリン酸化は抑制され,Rp-cAMPにより抑制は解除された。MEK, MAPKそれぞれのリン酸化もrHuEpoにより促進されるが,FKによるリン酸化の抑制を認めた。Protein kinase Cに依存するRaf-1-MEK-MAPKの活性化と,cAMPによる活性化抑制の関係を検討した。

PKCのactivatorであるphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)添加によりMAPKのリン酸化の増強が認められた。FKの前処置によりPMAによるMAPKのリン酸化は抑制された。結論としてVSMCにおいてcAMPの上昇は,主にPKCによるRaf-1の活性化を阻害することで,rHuEpo誘導性のRaf-MEK-MAPK系の活性化を阻害する可能性が示唆された。cAMPを上昇させる抗血小板薬の,Epo誘発性血圧上昇の抑制効果の一部は,この機序による可能性がある。培養血管平滑筋細胞におけるエリスロポエチン(エポ)誘発性増殖に対するcAMPの調節作用本年度は、透析患者の末梢血より血管内皮細胞の前駆細胞を得て、エポの受容体のsubtypeの分布を決定する予定であったが、技術的な問題があり前馳細胞を得る事が出来なかった。従って、本年は培養血管平滑筋細胞におけるエポ誘発性増殖に対するcAMPの調節作用を検討したのでその結果を報告する。我々はすでにエポが血管平滑筋細胞において増殖作用を有し、MAPK系がその重要な役割を果たしている事を明らかにしてきた。一方、細胞内cAMP濃度の上昇は逆に血管平滑筋細胞において増殖抑制作用を有する事を明らかにした。従って、我々はcAMPの刺激薬はエポによるMAPK系の活性化を抑制するとの仮説を立てこれを検討した。血管平滑筋細胞をエポに曝すとDNA合成が刺激された。cAMP刺激薬のフォースコリンやシロスタゾールはエポによるDNA合成を減弱した。逆にAキナーゼの抑制薬のRp-cAMPはフォースコリンによるDNA合成やMAPKの抑制を解除した。エポとPMAはMEKとMAPKのリン酸化を刺激した。フォースコリンはこれらのリン酸化を抑制した。Cキナーゼの抑制薬はMEKとMAPKのリン酸化を抑制した。さらに、フォースコリンはRaf-1を259セリンのリン酸化を促進した。これらの結果は、αへMPはエポによるMAPK系の活性化を抑制するが、この抑制作用はRaf-1のレペルかその上流で調節される可能性を示している。またこれらの結果はcAMPの刺激薬は、エポによる直接作用に対して防御的に作用する可能性を示している。本年度は透析患者の末梢血から,血管内皮細胞の前駆細胞を分離してEPO受容体のサブタイプ(完全長型と細胞内領域欠損型)の分布をPolymerase Chain Reaction法を用いて検討する予定だったが結果はnegativeだった。血管内皮前駆細胞が虚血組織において血管新生を促進することが知られている。従って、今回は透析患者において心血管系合併症が多いことの原因を検索する目的で、これら血管内皮前駆細胞数とその機能を透析患者と年齢を合致させた健常対照者で比較検討した。血管内皮前駆細胞はCD34陽性ないしはAC133陽性単球細胞に含まれるが、これらはflow cytometryにて定量した。また、末梢血の血管内皮前駆細胞はin vitroにおいて培養しても検討した。さらに、患者と対照者において血中のVEGFを測定して比較検討した。結果は、末梢血のCD34陽性細胞、AC133陽性細胞いずれも透析患者は健常対照者に比べて減少していた。また、in vitroで培養しても透析患者ではこれら血管内皮前駆細胞数は減少していた。
象牙芽細胞内における無機物質の動態とその石灰化への関連

1.組織化学による石灰化の研究:1)骨様象牙質には8種の小胞がみられ、直径0、3μmを境にして、これより小型の小胞内にはアパタイト様結晶が出現する。2)石灰化部位を脱灰して組織化学的検索をした結果、石灰化初期にはアルカリ性フォスファタ-ゼ活性がみられることから、リン酸イオン供給が行われているのだろうと推測された。3)従来、非コラ-ゲン性石灰化と考えられていた部位をよく調べると、コラ-ゲン性石灰化過程に続いて、コラ-ゲン線維の解離が行われていることが分かった。これによりコラ-ゲンの吸収により有機質に乏しい硬組織に改変されてゆく過程が明らかとなった。2.透過型電顕で観察された切歯切縁部の毛細血管:1)7080μmの高さをもつ象牙芽細胞の部位では毛細血管網の血管はほとんどが有窓型であった。2)30μm高の象牙芽細胞の部位において、毛細血管網の内皮はしだいに窓を消失する。3)切縁端の歯髄は石灰化することなく終わり、口腔内に開く。このあたりに好中球が著しく多くみられ、露髓部からの細菌感染に備えているらしい。3.走査電顕で観察された切歯歯髓血管:1)幹動脈の平滑脈の平滑筋は2層以上存在し、平滑な外表面のものと、凹凸の著しいネジのような表面を示すものとがあった。2)毛細血管の周細胞は数本の短い突起を有し、末端は枝別れして内皮に付着していた。3)細静脈の周細胞は血管の長軸方向にかなり長い一次突起を伸ばし、そこから多数の二次突起を血管の輪状方向に派出していた。4)幹静脈の周細胞はクモ型を呈し、突起を四方に伸ばし、全体として疎な網目を作り静脈を包んでいる。1.歯の石灰化に必要な無機物質は体液により象牙芽細胞なり、象牙前質に運搬されるのは当然である。この運搬を媒介しているのが毛細血管であり、歯髄周辺部のこの血管は象牙芽細胞の石灰化への関与を示す。すなわち、象牙芽細胞の位置を基準として考えると、位置も、また内皮細胞の形態も相関して変化するという事実を明らかにしてきた。しかし、研究材料であるラット切歯の切縁部ではどのようになっているのか不明であったから、本年度内に一応明らかにした。それによると、象牙芽細胞は再び石灰化に関する機能が低下してくる(細胞の丈が7080μm)と考えられる状態では毛細血管の内皮は殆んど有窓型となり、さらに石灰化能力完全消失と考えられる部位(細胞丈が30μm)では窓が消失し、形質膜小胞もみられなくなる。以上のように象牙芽細胞の石灰化機能と毛細血管の透過能は見事に相関していることを明らかにした。研究分担者:仙波、田畑2.ラット切歯石灰化の初期の一時期に骨様象牙質が出現する。脱灰して調べると、1μm径程度の球状形態が見える。アルカリフォスファテ-ズ活性は陽性であるから、この球状物は本来石灰化の場であったと考えられる。それでは何が石灰化の誘導物となったのか。組織化学的に多糖類やコラ-ゲン線維などについて球状物質の石灰化要因を調査してきた。

しかし、石灰化の芯になるものが細胞膜なのか、線維状構造物なのか、或は以外の何かなのかという形態学的ツメが完了しなかったので論文発表に現在のところ至っていない。ただ最近になって、より鮮明な像を得る染色法に気づいたから、近くこの仕事は一段落する予定である。研究分担者:仙波、中間1.組織化学的手法による石灰化の研究:象牙質の石灰化には三つの様式があるといわれている。ラット切歯の骨様象牙質を材料として次の結論を得た。(1)基質小胞は大きさ,外形,内容物などから8種に分類することができた。(2)小胞の直径が0.3μmを境にして,これより小型の小胞は内部にアパタイト結晶様を含有することが多いが,これにより大型のものは結晶の出現をみないまま石灰化物で充填された球状構造物となる。(3)球状構造物の基質をPTA染色で観察すると、コラ-ゲン線維束上の結晶の成長につれ線維に解離がおこり,吸収され,放射状に配列する結晶集会からなる石灰化塊の形状と一致して,網状の非コラ-ゲン性基質が形成される。(4)球状基質はルテニウム・レッドにより網状のフィラメント部分が染る。このことから,解離したコラ-ゲンが消失した後に残るプロテオグリカンの網状構造が,この球状基質を構成していると考えられる。(6)石灰化塊を脱灰したあとに観察される球状基質上には、その形成初期において,明瞭なアルカリ性フォスファタ-ゼ活性が検出され,おそらくこの領域でリン酸の供給が必要とされているのであろうと推測される。しかし,このALPase活性は石灰化塊の融合後すみやかに失われた。(7)以上のことから,骨様象牙質や管周象牙質の形成は、特殊な基質上におこる結晶沈着ではなく,通常のコラ-ゲン性石灰化の過程に続いて、コラ-ゲン線維が吸収され,有機質の少ない硬組織に改造された結果であると考えられた。研究分担者:仙波,中間2.エネルギ-分散型X線による細胞内小器官の研究はX線分析装置が故障し、修理が年度末まで行われず,今年度は結果を得るに致らなかった。研究分担者:仙波,田畑1.組織化学による石灰化の研究:本年は研究の一応のまとめとして、別項にような論文発表を行った。極く配単に結果を報継する。(1)骨様象牙質には8種の小胞がみられ,直径0.3μmを境にして、これより小型の小胞内にアパタイト様結晶が出現する。(2)石灰化したところを脱灰し、組織化学的方法で検索すると、石灰化初期にはアルカリ性フォスファタ-ゼ活性がみられ、このことから、ピロリン酸の分解とリン酸イオン供給が必要とされているのだろうとの推測がされた。(3)象牙質の硬度は一様でなく,管周象牙質は最も硬い。この場所は従来非コラ-ゲン性石灰化と呼ばれ、コラ-ゲン以外の特殊な基質により石灰化が誘起されていると考えられていた。今回の研究により、通常のコラ-ゲン性石灰化の過程に続いて、コラ-ゲン線維が吸収され,有機質の少ない硬組織に改造された結果であることが明らかとなった。研究分担:仙波,中間2.走査電顕による歯髄血管の観察:ラット切歯歯髄中の血管を塩酸コラ-ゲナ-ゼ処理により観察した。動脈は2層あるひはそれ以上の平滑筋細胞層により密に取り囲まれていた。この幹動脈の表面形態には2種類の型がみられ,一つは平滑な面で,他は凹凸の著しいネジのような面をしていた。1015μmの細動脈は12層の平滑筋細胞により密に取り巻かれていた。毛細血管には散在性に周細胞がみられ,それらは10μmにみたない短かい突起をもっていた。細靜脈は散在性に周細胞をもつが,これらは20μmを越すほどの一次突起を血管の長軸方向に伸ばし,そこから輪状方向に多数の二次突起を派出していた。幹靜脈はクモ型の周細胞が作る粗い網目により包まれ,これらは内皮細胞の作る溝の中に埋み込まれるような形態で存在していた。
高効率で安全な道路照明を設計する薄明視輝度計測ツールの開発

平成25年度平成27年度にかけて、国際照明委員会(CIE)の薄明視測光システムを実環境で使えるようにするために、(1)国際的課題である順応輝度を定義した。特にヒトの眼は、視野の局部的な部分の輝度に順応していることを明らかにした。(2)薄明視測光システムを全視野に対応できるように修正することにより、全視野対応型薄明視測光システムを開発した。(3)(1)と(2)に基づいてカメラにより取得した輝度画像から薄明視輝度の分布を算出する画像解析システムを構築した。CIE薄明視測光システムの実用化のための課題である、順応輝度を定義するために実験を行った。具体的には、(1)反応時間を正確に測定できる実験装置を制作し、その実験装置を用いて、(2)光源の分光分布と視票の背景輝度を種々変化させた条件下で被験者が視票を検出する反応時間を測る実験を行った。(1)実験装置の制作:実験装置は、視票提示装置、スイッチ、コンピュータ、照明装置から構成した。コンピュータにより、視票提示装置、スイッチ、照明装置を制御し、視票が提示されてから被験者がスイッチを押すまでの時間を反応時間として計測・記録できる。このときコンピュータ本体の時計を使うと正確な時間が測定できないために、今回、時計をコンピュータの外部に取り付けて反応時間を正確に測定できるように改良した。(2)順応輝度を定義する実験:前述の実験装置を用いて、種々の照明条件下で被験者が視票を検出する実験を行った。今回、被験者が順応している輝度が局部的な輝度によるのか平均的な輝度によるのかを求めるために、円形の照射パターンを有するスポットライトを用いて変化させるという、独創的な手法を用いた。具体的には、まず、スポットライトにより前述のそれぞれの領域(半径5度の円)を照射した。この間、被験者の目は、局部的に高い背景輝度に順応していた。つぎに、スポットライトを消灯し、その0.20.8秒後に、いずれかの偏心角の位置に視票を1秒間提示し、被験者は、その視票を検出するや否やスイッチを押した。これにより、視票の条件を変えずに、局部的な順応だけを変化させることができた。実験の結果、周辺視票の検出の反応時間は、中心視野の輝度ではなく、周辺視野の視票近傍の輝度に影響を受けることを見いだした。全視野対応型・薄明視測光システムを開発するために、(1)周辺視野の光幕輝度の関数モデルを求める実験を行い、(2)過去に行った実験データを用いてCIE薄明視測光システムの適用範囲を求める計算解析を行い、さらに、光源の分光分布と視票の提示位置を種々変化させた条件下で、被験者が視票を検出する反応時間を測定する実験を行った。(1)昨年度の実験結果から「周辺視票の検出の反応時間は、中心視野の輝度ではなく、周辺視野の視票近傍の輝度に影響を受ける」ことを見出したが、全視野対応型・薄明視測光システムを開発するためには、まず、周辺視野に位置する光源が眼球内に生じる散乱光の分布である光幕輝度関数を実験により求めることを優先すべきであることを明らかにした。このため、周辺視野に視票を提示するディスプレイ、グレア光源、制御装置、コンピュータから構成される実験装置を開発し、それを用いて実験を行った。実験では、5名の被験者に視野中心から右側水平方向に5度、10度、20度の位置に提示した視票の閾値輝度を評価してもらった。実験結果から、視野中心から水平方向の光幕輝度関数を定義した。(2)CIE薄明視測光システムの適用範囲を明らかにするために、まず、過去に行った実験データを用いて計算解析を行った。解析の結果、視票に対する反応時間は、視票が視野中心から離れるに従ってCIE薄明視測光システムにより予測できなくなることを明らかにした。このため、昨年度に開発した視票提示装置、スイッチ、コンピュータ、照明装置から構成される実験装置を用いて実験を行った。この実験では、5名の被験者に、順応輝度が0.01、0.1、1、2 [cd/m2]の条件下で5度、10度、20度、30度の偏心角の位置に提示した視票を検出してもらった。被験者の反応時間を解析した結果、計算解析の結果と同様の傾向が得られた。現在、全視野に対応できる薄明視測光システムを開発中である。最終的に全視野対応型薄明視測光システムを開発し、画像解析技術を駆使して新たに薄明視輝度分布を算出する薄明視輝度分布計測ツールを開発した。その開発のために、つぎの2つの実験研究を行った。(1)光幕輝度関数を求める実験:視野中心から右側8度に設置したグレア光源が生じる光幕輝度の分布を複数の視票の検出実験の結果に基づいて求めた。視票は、視野中心から放射状に広がった合計9箇所に設置した。ランダムステアケース法を使って視票の背景に対するコントラストを変化させた条件下で各視票の閾値コントラストを求めた。実験の結果から、視野中心からの光源の偏心角と光源から視票までの角度を変数として光幕輝度関数を構築した。(2)CIE薄明視測光システムの適用範囲を求める実験:MES2がどの範囲の視野に適用できるのかを解明することを目的として実験を行った.

実験にはホワイトLEDとオレンジLEDの2光源を用い,照明下0.012 cd/m2の明所視背景輝度の下での視票検出実験を行った.実験結果から偏心角ごとにプルキンエ現象の程度を調べた.その結果,偏心角5度は中心視野と同様に扱うことができること、周辺視野の偏心角10度15度の範囲ではMES2と反応時間との間に高い相関がありMES2が適用できることを明らかにした。一方、偏心角25度についてはMES2の想定より高い輝度で明所視レベルに移行することが明らかになったため,偏心角25度の周辺視野の領域についてMES2の修正を試みた.最後にそれぞれの実験結果を考慮し明視輝度評価技術を開発した。写真測光技術と行列計算ソフトを用い,写真測光技術で得た「明所視輝度画像」を「薄明視輝度画像」に変換することで,空間を視覚的に評価する技術開発を行った.平成27年度の計画は、薄明視輝度分布計測ツールを完成させることであった。具体的に、この計測ツールは、カメラ、コンピュータ、画像解析ソフト、画像解析プログラム、表示装置から構ソフトにより撮影・取得した輝度画像から薄明視輝度分布に変換するものである。今回、計画段階で述べられていた構成の計測システムを構築することができた。また、それに必要な光幕輝度関数の構築と計測システムをより幅広い視野に適応できるように修正した。このため、「おおむね順調に進展している」と判断した。平成25年度平成27年度にかけて、国際照明委員会(CIE)の薄明視測光システムを実環境で使えるようにするために、高効率で安全な道路照明を設計するための薄明視輝度分布計測ツールを開発することを目的として、(1)国際的課題であるCIE薄明視測光システムに必要な順応輝度を定義した。すなわち、周辺視野内に視標とグレア光源が存在する場合、その視標を検出するときの順応輝度は、グレア光源によって視標に重畳する光幕輝度に視標近傍の背景輝度を加えた輝度と定義できることを明らかにした。(2)現行のCIE薄明視測光システムが偏心角20度より大きな視野範囲に適用できないことを明らかにしたため、その範囲にも適応できるように測光システムを改良した。(3)(1)と(2)に基づき、全視野対応型・薄明視測光システムを構築した。さらに、撮影した輝度画像から薄明視輝度分布を算出する薄明視輝度分布計測ツールを開発した。このツールのアルゴリズムは次の通りである。1明所視輝度の取得:写真による輝度測光により、明所視輝度の分布を取得する。2順応輝度の計算:明所視輝度の画像から光幕輝度を計算する。また、明所視画像の各画素の輝度と光幕輝度を加算して順応輝度を決定する。3薄明視輝度分布の計算:順応輝度(明所視)分布から薄明視輝度の分布を求める。画素毎に薄明視輝度を計算する。平成25年度平成27年度にかけて、国際照明委員会(CIE)の薄明視測光システムを実環境で使えるようにするために、(1)国際的課題である順応輝度を定義した。特にヒトの眼は、視野の局部的な部分の輝度に順応していることを明らかにした。(2)薄明視測光システムを全視野に対応できるように修正することにより、全視野対応型薄明視測光システムを開発した。(3)(1)と(2)に基づいてカメラにより取得した輝度画像から薄明視輝度の分布を算出する画像解析システムを構築した。今年度、全視野対応型・薄明視測光システムを開発するためには、まず、周辺視野に位置する光源が眼球内に生じる散乱光の分布である光幕輝度関数を実験により求めることを優先すべきであることを明らかにした。
ストロマトライトの生物起源に関する定量的評価のための幾何学的形状解析法の研究

先カンブリア時代のストロマトライトの縞状構造を3次元的に決定する試料準備方法とデータ解析手法の開発に取り組んだ。その結果、解析に使用したストロマトライト岩石試料の縞模様は、鉛直方向にほぼ一定の厚さを示すのに対して、法線方向には円錐状の縞状構造の頂上部分で最大となる厚さ分布を示すことが明らかとなった。こうした縞状構造の厚さ分布は、シアノバクテリアなどの微生物の皮膜に砂泥が付着して形成されたというストロマトライトの生物起源説を支持する結果となった。先カンブリア時代のストロマトライトという堆積岩は、シアノバクテリアなどの微生物の皮膜に砂泥が付着してできたものであり、生命の初期進化を探る重要な物証とされてきた。しかし近年、その堆積構造が非生物性起源であるという可能性が排除できないとする議論が数学的モデルによって提起された。こうした中で、三角錘状のストロマトライトの縞状構造に着目することによって、ストロマトライトが生物性であるのか、非生物性であるのかを決定する重要な根拠となり得ることが最近報告された。この研究によると、無機化学的形成モデルでは、海水と接触する部分で縞が成長するため一枚の縞は、どこでも縞の垂直方向に一定の厚さになるように成長する。一方、ストロマトライトの成長モデルでは、上方から降り積もる堆積物がバイオマットにより固定されるため、縞の厚さは縞の斜面部分では薄くなり、重力方向に均一な厚さを持つようになる。本研究は、この二つのモデルのどちらが妥当であるかを明らかにするために、ストロマトライト断面の画像データを用いて、縞状構造の幾何学的形状を数値的に定量評価する手法を確立することを目指す。本年度は生物顕微鏡BX5IN-33P-0(オリンパス株式会社)を導入し、広視野かつ高解像度の画像データを取得するために、以下の改良を行なった。(1)広視野Cマウントアダプタに200万画素CCDカメラを付加する。(2)2.5倍および5倍といった低倍率対物レンズを用いた場合にも、照野面全体を均一に照明するために、極低倍用コンデンサを装備する。低倍率から高倍率までの研磨薄片画像データを取得した結果、どの倍率の画像においても輝度むらの少ないものであった。研究対象のストロマトライト岩石試料については、数mmスケールの縞状構造を広範囲にカバーする切断面画像が得られるようになり、今後系統的に研究を遂行する準備が完了した。ストロマトライトという堆積岩は、シアノバクテリアなどの微生物の皮膜に砂泥が付着して形成されたものであり、生命の初期進化を探る重要な物証とされてきたが、最近になって生物作用で形成されたどうかを巡り、議論が巻き起こっている。こうした議論の中心は、ストロマトライトの縞状構造の幾何学的形状に対する見方にある。鉛直方向にどこでも縞の厚さが同じ場合には、微生物の皮膜に上から沈降してきた砂泥が付着し形成されたという生物起源を支持する証拠のひとつとなりうる。一方、無機化学的に沈殿した場合には、海水と接触する部分で縞が成長するため、一枚の縞はどこでも縞に対して垂直方向に一定の厚さになるように成長する。ストロマトライトめ形状に関する研究は、これまで、ある特定の向きの露頭の風化面や薄片試料を観察し、縞状構造の厚さ分布の特徴を定性的に記載していたにすぎない。これに対して、本研究は、三次元的に縞状構造の厚さを定量的・数値的に評価する手法を開発し、実際にドーム状ストロマトライト試料の解析を行った。三角錐状の縞状構造は、成層構造とは異なり、鉛直方向と法線方向で異なる厚さを示す。このため、その画像データを三次元的に取得する必要がある。まず、ストロマトライト岩石試料を等間隔に数枚に切断し、試料切断面の元素分布の画像を走査型蛍光X線分析顕微鏡により取得した。得られた元素分布画像を基に、2方向の縞の厚さを決定する画像解析アルゴリズムを構築した。結果、解析したストロマトライトの縞模様は、鉛直方向にほぼ一定の厚さを示すのに対して、法線方向には、円錐状の縞状構造の頂上部分で最大となり、頂上部から離れるに従って一定の値を示すことが明らかとなった。こうした縞の厚さ分布は、解析したストロマトライトが、生物作用の関与によって形成されたことを支持する結果となった。
ミトコンドリア機能可視化による脂肪酸受容体の機能解析

本研究において、Green Fluorescent Proteinを利用したpHセンサーをよりミトコンドリア測定に適した性能に改良した。このミトコンドリアpHセンサーはインスリノーマ細胞においてミトコンドリアマトリックスに局在していることを電子顕微鏡にて確認した。また、各種インスリン分泌刺激に応じミトコンドリアpHが変化することを確認し、不飽和脂肪酸受容体刺激によるミトコンドリアpHの変化がブドウ糖負荷とは異なることを見いだした。さらに、不飽和脂肪酸受容体を内因性に発現している細胞を用い、細胞内カルシウム変化を指標として各種化合物・不飽和脂肪酸を用い、GPR40・GPR120受容体の薬理学的特性を検討した。今年度は、1.)カルシウム反応を指標とした不飽和脂肪酸受容体内因性発現細胞におけるGPCR40並びにGPCR120の情報伝達系の解析、2.)GPR40ならびにGPR120安定細胞の作出。3.)GFP融合GPR40ならびにGPR120安定細胞の作出を行った。具体的には、内因性発現細胞と報告されているGPR40(インスリノーマ、腸管由来細胞)並びにGPR120(腸管由来細胞)の株化細胞を利用し、各種不飽和脂肪酸刺激によるカルシウム反応における薬理学的特性並びに情報伝達機構の薬理学的解析を、当教室に保有する顕微カルシウム測定装置を利用して行った。これら細胞のカルシウム反応性は、培養条件・外液のグルコース濃度・温度に大きく影響され、これら一般的条件の検討と各種情報伝達遮断薬を利用した検討により情報伝達関連分子の絞り込みが現在進行中である。一方安定発現細胞の作成は、HEK293細胞にクローニング済みの受容体遺伝子の導入をおこない、安定発現細胞の作出をおこなった。安定発現細胞におけるリガンド応答性も内因性発現細胞と同様な薬理学的解析が進行中である。我々が解析を行っている受容体は、新しい受容体でありその細胞内情報伝達の子細は不明である。内因性細胞では、生理的な機能を解析するには有利な系ではあるが、モデルとして受容体-・細胞内伝達機構を解析するには不利である。現在作成中の安定発現細胞の作出はこの問題点を解消し不飽和脂肪酸受容体の機能解析を進行させることが期待でき、内因性細胞との機能比較により不飽和脂肪酸受容体の細胞生理的意義をより明らかにすることが可能にすると考えている。内因性不飽和脂肪酸受容体発現細胞を利用して、不飽和脂肪酸受容体の薬理学的検討を今年度は重点的に行った。近年、メタボリックシンドロームや糖尿病治療の関連受容体と興味が持たれ各種薬理学的ツールが本課題開始後に新規開発されるようになってきた。これら新規不飽和脂肪酸受容体刺激薬を用い、内因性受容体発現細胞であるmin6細胞やSTC1細胞並びに受容体安定発現細胞を用い、カルシウム反応性を指標に受容体機能の薬理学的検討を現在遂行中である。これら薬理学的検討の成果として、前述の新規リガンド以外に、耐糖能改善薬であるPPARγ受容体刺激薬の一部が交差反応を示すことを見いだし、京都大学のグループとMolecular Pharmacologyに報告を行った。内因性リガンドである不飽和脂肪酸は本研究テーマの三量体G蛋白結合受容体のみならず、他の受容体のリガンドとなることが知られており代表的な受容体としてPPARγ受容体がある。PPARγ受容体刺激薬は現在臨床的に糖尿病治療薬として利用されているが、副作用を含め多彩な作用が知られており、現在上奏されている薬物間でも作用に差があることが知られていた。本研究の成果は、今後より子細な検討が必要であるが、メタボリックシンドロームや糖尿病の治療におけるPPARγ受容体刺激薬の副作用発現のメカニズムのみならず薬物選択の指標並びに治療法選択に有益な情報を提供する物と考えている。一方のテーマであるミトコンドリア機能可視化については、光学系の高度化並び安定に測定をするための検討を現在安定発現細胞を利用して遂行中である。前年度の受容体発現安定細胞を元とした、不飽和脂肪酸受容体の薬理学的検討の継続を行い。また平行して本研究の主題であるGFPを利用した水素イオンプローブによるミトコンドリア機能の可視化研究を行った。不飽和脂肪酸受容体はその種類により、炭素鎖の長さによる選択性の違いが知られている。また不飽和鎖のはいる位置ならびcis体trans体などの多様性を有している。薬理学的検討においては、天然に存在する不飽和脂肪酸の炭素鎖の長さ、不飽和度ならびに光学異性体を系統的に用い、各種不飽和脂肪酸受容体間での薬物特性に関して検討を行った。対象として、本研究で作成した不飽和脂肪酸受容体安定発現HEK293細胞ならびに不飽和脂肪酸受容体GPR40を内因性に発現しているmin6細胞並びに、不飽和脂肪酸受容体GPR120発現細胞であるSTC1細胞を用い、受容体刺激により引き起こされるカルシウム反応を指標に、比較検討を行った。

近年栄養学的に不飽和脂肪酸の構造によりメタボリックシンドロームや心疾患に対する影響が数多く報告されその分子メカニズムの解明が急がれている。これら疾患の発症メカニズムにつながる細胞生物学的知見が得られており、現在投稿準備中である。ミトコンドリア機能可視化検討に関しては、光学系の至適化ならびミトコンドリアでの蛍光の充分に明るい安定細胞が得られこれらを用いることにより現在各種正常刺激によるプローブの評価を行っている。またミトコンドリアプローブの局在に関して、ミトコンドリアマトリックスか膜間腔かでその反応が反対方向に動くことが推定される。今回用いた局在シグナルは、マトリックスに移行することが報告されている。しかしながら、グルコース負荷による反応並びに電顕での検討では膜間腔への局在が示唆されており、より子細なプローブ局在部位の同定を現在遂行中である。
食道癌におけるマイクロRNA発現とエピジェネティクスの統合解析

この研究では食道癌をエピゲノムとマイクロRNAの両面から解析した。食道癌細胞の網羅的DNAメチル化情報を得るとともに、マイクロRNA、miR106bクラスターがp21とBim、miR210がEGFRL1、miR141がYAP1、miR593*がPLK1の発現を制御することで食道癌の増殖、細胞周期、抗癌剤感受性に関与していることを明らかにした。これらの成果は食道癌の腫瘍生物学のより深い理解に重要な知見をもたらした。本課題の目的は、食道癌におけるエピジェネティクスにより調節を受けるマイクロRNA(miR)の探索にある。課題の初年度として、まず、miRの検出系であるmiRマイクロアレイのデータの再現性と、miRプロファイリングを行った。(1)miRマイクロアレイの信頼性の検証:市場で入手可能な5種類のmiRマイクロアレイについて調査したところ、アジレント社と東レ社の製品はプラットフォーム内再現性が高く、プラットフォーム間データの一致性が高かった。また、定量的PCR法によるmiR定量データとの相関も高く、データの信頼性が高いと考えられ、今後のプロジェクトに東レ製miRマイクロアレイを使用することになった。(Sato F, et al. PLoSOne, 2009, in press)(2)食道癌関連miRの探索:食道腺癌に関連するmiRの解析を、食道正常上皮細胞、バレット上皮細胞、食道腺癌細胞株と、臨床生検標本を用い施行した。食道腺癌に於いてmiR25-93-106bクラスターの発現が亢進しており、その原因の一つとしてそのクラスターの染色体上のLocus(MCM7遺伝子領域)の増幅が関係していた。miR25-93-106bクラスターの抑制オリゴの導入は、食道癌細胞株(OE33)の増殖をin vitro,in vivoともに抑制した。また、miR93-106bは、p21,Bimを標的としている事がルシフェラーゼアッセイを用いて明らかになった。(Kan T, Sato F,et al.Gastroenterology,2009,in press.)(3)食道癌のエピジェネティクス解析:食道癌のゲノムワイドのエピジェネティクス情報は、高速シーケンサーを用いたMeDIP法を用いて取得する計画である。現在その検出系の確立を急いでいる。(2)細胞株で得られた知見は臨床標本を用いて検証しなければならない。そこで、食道扁平上皮癌86症例の正常上皮と腫瘍部のmicroRNA発現プロファイルを取得した。また、その対象症例の臨床病理学的情報もデータベース化した。(3)第1年度に取得した食道癌細胞株のmicroRNA発現情報と(1)で得られたDNAメチル化情報、更には(2)で得られた臨床標本でのmicroRNA発現情報を相関させ、詳細なBioinformaticsによる解析を施行中である。これによって、食道癌におけるエピジェネティクス制御を受けているmicroRNAを見出すことが可能になる。今後、(3)でスクリーニングされたmicroRNAについて、機能解析を行う予定である。本研究で得られた知見は、早期診断のバイオマーカー創出や、microRNA治療やエピジェネティクス治療等の新たな治療法の確立に有用と考えられる。【目的】食道癌におけるエピジェネティクス調節を受けるマイクロRNAの探索と機能解析である。【進捗】(1)食道癌細胞株18株と正常食道上皮細胞株5株のマイクロRNA発現プロファイルをマイクロアレイ法で、また、DNAメチル化情報をメチル化DNA結合蛋白質であるMBD2を用いたMIRA法と高速シーケンサーによる網羅的DNAメチル化解析によって取得した。これらの情報バイオインフォマティクスを用いてエピジェネティクス制御を受けているマイクロRNAを探索した。それにより、一連の癌細胞でDNA高メチル化で発現低下している、又は、低メチル化により発現上昇しているマイクロRNAのリストを得た。(2)食道扁平上皮癌の臨床組織標本由来RNAのプロファイル解析から、食道癌細胞において発現低下しているマイクロRNAとしてmiR-210を見出した。miR-210発現低下は、腫瘍の分化度と負の相関をしていた。miR-210は、食道がん細胞をG1期とG2/M期で細胞周期停止を誘導することで細胞増殖抑制効果を示した。また、miR-210がFGFRL1を標的にすることで細胞増殖抑制を誘導していることも、レポーターアッセイ等で示した。(3)エピジェネティクスで発現制御されているとされるmiR-141の機能解析を行った。miR-141のシスプラチン感受性株での発現は、耐性株に比較して発現減弱していた。また、miR-141はYAP1を標的にすることで、シスプラチンによるアポトーシス抑制に関わっていることが示された。

(4)食道扁平上皮癌におけるmiR-593^*発現量とPLK1発現量は、食道癌臨床標本において逆相関しており、レポーターアッセイで標的にしていることが示された。(4)これらの知見は、食道癌の生物学的な理解を深め、microRNAやエピジェネティクスを介した新規の治療法開発に有用な情報をもたらすと考えられる