hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクセス行列モデルにおける安全問題の研究

M.Soshi, M.Maekawa, E.Okamoto,"TheDynamic-Typed Access Matrix Model and Decidability of the Safety Problem".また,アクセス制御の解析を進めていく過程で,ネットワーク環境において,送信者受信者の身元情報へのアクセスを制御する問題(匿名性問題)について,そのモデル化および解析方法について新たな知見を得,決定的(確定的)手法によって,匿名性制御を行うことが困難(NP完全以上)になることを示した.この成果について,以下の論文を情報処理学会に現在投稿中である.北澤,双紙,宮地「現実的な匿名通信プロトコルにおける匿名性基準の提案及び評価」.さらに,以上と同様にして,悪意ある結託ユーザが攻撃する場合のアクセス制御や,さまざまなアクセス構造をビジュアルな手法によって実現するアクセス手法についても知見を得た.以上の最も一般的な形がアクセス行列における安全問題であることは言うまでもない.
電源コードの半断線に起因する火災防止手法確立と現場適用性の検討

電源コードの半断線(導体素線の一部が切断された状態)は、電気設備火災の主原因のひとつである。電源コードの上に重量物が置かれた場合や、電源コードを繰り返し曲げ伸ばしした場合などに半断線が生じる。しかしながら、電源コードの絶縁被覆には損傷が認められないことが多く、外観による判別は難しい。地震発生時の外力により電源コードが半断線状態になって停電すると、これが原因で復電直後に火災が発生する事例も報告されている。地震活動が活発化しており、また、高齢化が進む現状において、半断線に起因する火災の未然防止技術確立が強く要望されている。昨年度は電源コードの絶縁被覆に切り込みを入れて半断線状態を模擬し、実験室で発火現象を再現した。本年度は、絶縁被覆に損傷のない現場での状況を再現するため、電源コードの曲げ試験により作製した半断線試料に通電して実験・検討を行った。さらに、半断線状態から導体素線全てが断線する現象とその検出法の検討も実施した。1.絶縁被覆に損傷のない半断線試料に通電すると、発火する現象を実験室で再現した。通電45分、休止15分のサイクルを繰り返すと、最初はサイクル数とともに半断線部の最高到達温度と抵抗値が徐々に高くなり、あるサイクル数でこれらが急増してやがて発火に至った。2.マイクロフォーカスX線CTシステムで得られた半断線部の導体素線の状況から、最高到達温度が上がると絶縁被覆が軟化して導体素線を締め付ける力が弱くなり、導体素線がばらけて素線同士の接触が悪化して抵抗値が増加すると推測した。3.絶縁被覆を除去して導体素線1本のみを残した半断線試料に通電すると、発光を伴うアークが発生して断線した。この際に電圧波形に歪みが生じるため、歪んだ電圧波形と正弦波波形との瞬時電圧の差が±6Vを超える時間の和を逸脱時間と定義し、逸脱時間と閾値との比較により断線を検出できる可能性を示した。以下に示す成果が得られ、当初計画を概ね達成できたため。1.電源コードの曲げ試験により絶縁被覆に損傷を生じない半断線試料を作製できることを示し、現場の状況に近い状態での実験・検討を可能にした。さらに、この試料の発火現象および可燃物への着火を実験室で再現した。2.半断線試料への繰り返し通電により、半断線箇所の温度上昇および抵抗上昇を確認した。抵抗上昇を、導体素線同士の接触状態と関連付けて説明した。3.素線断線時の現象を検討し、アークが発生して素線が断線する際の電圧波形の歪みに基づく逸脱時間を提案した。逸脱時間により素線断線を検出できる可能性を示した。研究を発展させ、火災未然防止手法を提案してその実現可能性を検討する。1.電源コードの曲げ試験により作製する半断線試料を用い、今年度得られた結果の再現性を確認するとともに可燃物への着火メカニズムを検討する。2.抵抗値や逸脱時間に基づく火災未然防止手法を検討する。必要に応じて他の特徴量の検討も行い、その妥当性を評価する。3.火災未然防止手法を提案し、現場適用性を検討する。4.3年間の研究成果を取り纏め、実用化に向けた課題を明確にする。電源コードの導体素線の一部が切断され、導通状態にある素線数が減少した状態を半断線という。半断線は電気設備火災の主原因のひとつであり、コードの曲げ伸ばしなどの外力により生じるが、絶縁被覆には損傷が認められず外見では認識できないことが多い。地震発生時の外力により半断線が生じた状態で停電すると、復電直後に火災が発生する事例も多く報告されている。高齢化が進行し、地震活動が活発化している現状において、半断線に起因する火災被害を最小限に止める技術を開発することは極めて重要である。今年度は、半断線に起因する可燃物着火を実験室で再現し、着火メカニズムを検討することを目的とした。100Vの汎用電源コードの導体素線30本のうち24本を人為的に切断した半断線試料を作成して実験を行った。半断線部の上に可燃物を乗せ、45分間の通電・15分間の無通電(サイクル)を断続的に繰り返した。半断線部付近の温度を赤外線サーモグラフィで測定し、導体抵抗を電圧および電流から求めた。着火状況のビデオ撮影も実施した。得られた成果を箇条書きで示す。1.半断線に起因する可燃物の着火を再現できた。通電により素線温度が上昇し溶断する際に生じる放電あるいは飛散する素線により、可燃物に着火すると推定される。2.半断線部の温度および導体抵抗はサイクル数とともに上昇し、最終的には一定値になった。最高到達温度が300°C程度になることもあった。可燃物への着火直前には導体抵抗が20%程度低下する現象が再現性良く確認され、火災未然防止のための特徴量になる可能性がある。3.酸化銅(I)がまず素線表面に生成され、サイクル数が増えると素線内部でも生成されることをラマンスペクトルにより明らかにした。素線の酸化進行により有効断面積が小さくなり、導体抵抗が増加すると考えられる。着火直前の導体抵抗低下の理由は不明であり、検討を進めている。以下に示す通り、当初計画を概ね実施できたため。

1.電源コードの半断線に起因する可燃物への着火現象を実験室で再現できた。2.半断線を人為的に導入した電源コード試料を用いて種々の実験を行った。実際の半断線状態を模擬するため、電源コードの曲げ試験により半断線を導入した試料を作成し実験を現在進めているが、可燃物への着火を再現できる見込みである。3.当初予定していなかったレーザラマン分光分析を行い、導体素線内の酸化銅(I)の生成に伴う酸化進行により導体抵抗が増加するとことを説明した。4.可燃物への着火直前の導体抵抗減少が、火災未然防止の特徴量となる可能性を示した。電源コードの半断線(導体素線の一部が切断された状態)は、電気設備火災の主原因のひとつである。電源コードの上に重量物が置かれた場合や、電源コードを繰り返し曲げ伸ばしした場合などに半断線が生じる。しかしながら、電源コードの絶縁被覆には損傷が認められないことが多く、外観による判別は難しい。地震発生時の外力により電源コードが半断線状態になって停電すると、これが原因で復電直後に火災が発生する事例も報告されている。地震活動が活発化しており、また、高齢化が進む現状において、半断線に起因する火災の未然防止技術確立が強く要望されている。昨年度は電源コードの絶縁被覆に切り込みを入れて半断線状態を模擬し、実験室で発火現象を再現した。本年度は、絶縁被覆に損傷のない現場での状況を再現するため、電源コードの曲げ試験により作製した半断線試料に通電して実験・検討を行った。さらに、半断線状態から導体素線全てが断線する現象とその検出法の検討も実施した。1.絶縁被覆に損傷のない半断線試料に通電すると、発火する現象を実験室で再現した。通電45分、休止15分のサイクルを繰り返すと、最初はサイクル数とともに半断線部の最高到達温度と抵抗値が徐々に高くなり、あるサイクル数でこれらが急増してやがて発火に至った。2.マイクロフォーカスX線CTシステムで得られた半断線部の導体素線の状況から、最高到達温度が上がると絶縁被覆が軟化して導体素線を締め付ける力が弱くなり、導体素線がばらけて素線同士の接触が悪化して抵抗値が増加すると推測した。3.絶縁被覆を除去して導体素線1本のみを残した半断線試料に通電すると、発光を伴うアークが発生して断線した。この際に電圧波形に歪みが生じるため、歪んだ電圧波形と正弦波波形との瞬時電圧の差が±6Vを超える時間の和を逸脱時間と定義し、逸脱時間と閾値との比較により断線を検出できる可能性を示した。以下に示す成果が得られ、当初計画を概ね達成できたため。1.電源コードの曲げ試験により絶縁被覆に損傷を生じない半断線試料を作製できることを示し、現場の状況に近い状態での実験・検討を可能にした。さらに、この試料の発火現象および可燃物への着火を実験室で再現した。2.半断線試料への繰り返し通電により、半断線箇所の温度上昇および抵抗上昇を確認した。抵抗上昇を、導体素線同士の接触状態と関連付けて説明した。3.素線断線時の現象を検討し、アークが発生して素線が断線する際の電圧波形の歪みに基づく逸脱時間を提案した。逸脱時間により素線断線を検出できる可能性を示した。次に示す実験・検討を行い、研究を継続し発展させる。最終的には半断線に起因する火災の未然防止手法を提案し、実用的観点から評価を行う。1.実際に近い半断線状態を再現するため、電源コードの曲げ試験により半断線を導入した試料を用いて可燃物への着火を再現し、着火メカニズムを検討する。2、導体抵抗低下が、火災未然防止のための特徴量になるか見極める。3.着火時には電圧波形の歪みが観測されている。
中等教育期における運動不振生徒の筋出力調節能力に関する研究

■研究目的スポーツや運動を苦手とし、体育の授業における学習場面においてもなかなか技能の向上がみられない生徒の運動制御を検討することを目的に、運動不振生徒の筋出力調節能力を検討した。■研究方法神戸大学附属中等教育学校の体育授業で実施した各単元のスキルテストの評価がAもしくはB、かつ学期末評価における運動技能の達成度が60-90%の生徒をControl群、前者の評価がすべての単元においてC、かつ後者の評価が30%に満たない生徒をTarget群とし、各群8名(17±0.6歳)を無作為に抽出した。各被験者は前方に設置された視覚刺激に可能な限り素早く反応し、0%MVC(maximum voluntary contraction ;最大随意筋力)から50%MVCまで出力を増加させるGeneration課題と、100%MVCから50%MVCへと出力を減少させるRelaxation課題の2種の出力調節課題を行った。各被験者の発揮張力について、要求した出力レベルに対する恒常誤差(CE)、絶対誤差(AE)および変動誤差(VE)を算出し、筋出力調節の正確性を評価した。これらのデータに基づき、各課題および群間の誤差を比較した結果、以下の2点が明らかとなった。■研究成果Generation、Relaxationの各課題で要求した出力レベルの変化量は、両課題ともに50%MVCであったにも関わらず、ControlおよびTargetの両群において、GenerationよりもRelaxationで出力が小さく(p<0.001)、恒常誤差が大きかった(p<0.001)。このことから、出力調節の正確性について、出力を増加するよりも、減少する方が課題の難易度が高いことが明らかとなった。また、ControlおよびTargetの群間比較においては、Relaxationにおいてのみ群間に有意な差が認められ、TargetはControlよりもさらに出力レベルが小さく(p<0.001)、絶対誤差が大きい結果が得られた(p<0.001)。以上の結果から、運動不振の生徒はそうでない生徒と比較して、より難易度の高い「一定の出力を保持した状態」から出力を減少する際の正確性が低く、MVCに対する主観的な筋出力レベルの“ズレ"が大きい可能性が示唆された。
非自己排除機構の解析とステルスＴ細胞作成による抗原受容体改変Ｔ細胞療法の汎用化

NY-ESO-1特異的なTCR遺伝子をsiTCRベクターで導入した後にベータ2ミクログロブリンに対するCRISPR-Cas9によってゲノム編集し、MHC class Iの発現を失った「ステルスT細胞」の作成に成功した。「ステルスT細胞」は抗原特異的にマルチファンクション性を示し、NY-ESO-1陽性ヒト腫瘍を接種した免疫不全NOGマウスに輸注すると腫瘍の成長が抑制され、「ステルスT細胞」は十分な抗腫瘍効果を維持していることが明らかとなった。以上より、非自己細胞を用いたがんに対するT細胞輸注療法の実用化の可能性が示された。1.輸注細胞のMHC発現抑制技術の開発:非自己細胞を輸注した際の宿主免疫系による拒絶を原弱させる目的で、輸注細胞のβ2ミクログロブリンの発現を抑制し、T細胞のMHC class IをMHCのタイプに関わらずに発現低下させることを目指した。ヒトT細胞のMHC class I発現抑制を可能する為に、ヒトβ2ミクログロブリンに対するCRISPR-Cas9システムのコンストラクトを作成した。ガイドRNAを2種作成し、プラスミドベクターに組み込むことに成功した。2.受容体改変T細胞を用いた、非自己排除評価系の確立と非自己排除因子の解明:重度免疫不全NOGマウスに受容体遺伝子改変ヒトリンパ球を輸注するインビボ評価系を用いた。NY-ESO-1抗原陽性のヒトメラノーマ細胞株を接種したNOGマウスに内因性TCR遺伝子発現抑制レトロウイルスベクターにより非自己反応性を減弱させつつNY-ESO-1特異的TCR遺伝子を導入したヒトT細胞を輸注した。腫瘍細胞の拒絶にはCD8陽性T細胞が関与すること、移植片対宿主病(GVHD)の発症にはCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞の療法が関わることが明らかとなった。GVHDはCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞いずれの場合も内因性TCR遺伝子発現抑制レトロウイルスベクターにより非自己反応性を減弱させると発症が抑制可能であることが明らかとなった(2015ヨーロッパがん免疫療法学会(CIMT)総会他にて発表)。3.細胞内抗原を認識可能なキメラ抗原受容体の作成:細胞内抗原を認識可能なメラ抗原受容体の作成を目指した。ファージディスプレイライブラリー法を用いて組換えHLA-A2402分子と細胞内がん抗原WT1由来ペウチドとの複合体に結合するscFv抗体をスクリーニングし、目的の複合体を特異的に認識する抗体WT#213を取得した。「輸注細胞のMHC発現抑制技術の開発」と「受容体改変T細胞を用いた、非自己排除評価系の確立と非自己排除因子の解明」について予定通りに研究が進み、さらに新たながん認識抗原受容体遺伝子として細胞内抗原を認識可能なキメラ抗原受容体の作成にも成功している。1.ゲノム編集技術を用いた輸注細胞のMHC発現抑制技術の開発:非自己細胞を輸注した際の宿主免疫系による拒絶を減弱させる目的で、輸注細胞のβ2ミクログロブリンの発現を抑制し、輸注細胞のMHC class IをMHCのタイプに関わらずに発現低下させることを目指した。ヒトβ2ミクログロブリンに対するCRISPER/Cas9システムのガイドRNA2種類をCRISPER/Cas9システムと共にヒトT細胞株に導入し、効率よくMHC class I発現を低下させうることを確認した。2種類のうちより効率が良いと考えられたガイドRNAを選択し、レンチウイルスベクターを作成した。レンチウイルスベクターはCMVプロモーターとEF1-αプロモーターの2種類を作成した。これらのレンチウイルスベクターを感染させることによって、ヒトT細胞やヒト肝細胞株等の様々な細胞においてMHC class I発現を低下させうることを確認した。2.受容体改変T細胞を用いた、非自己排除評価系の確立と非自己排除因子の解明:内因性TCR発現を抑制して非自己細胞反応性を減弱させたると共に腫瘍抗原特異的TCRを発現させたT細胞を作成した。これらのT細胞が導入TCRによって抗原特異的に反応する際のマルチファンクション性を検討したところ、これらのT細胞はIFNγ、TNFα、CD107a(細胞障害性顆粒産生指標)を同時に発現するマルチファンクション性を持つことが明らかとなった。マルチファンクション性の高い細胞は輸注療法の際に良好な効果を示すことが示唆されている。したがって、非自己反応性を抑えつつ輸注療法の際に良好な効果を示すT細胞が作成可能ということが示された。また、本技術を用いた骨髄移植後再発のATL患者に対するTCR遺伝子改変ドナーリンパ球輸注療法の医師主導治験がH29年度から開始されることになった。「ゲノム編集技術を用いた輸注細胞のMHC発現抑制技術の開発」と「受容体改変T細胞を用いた、非自己排除評価系の確立と非自己排除因子の解明」について極めて順調に研究が進行した。さらに、また、本技術を用いた骨髄移植後再発のATL患者に対するTCR遺伝子改変ドナーリンパ球輸注療法の医師主導治験がH29年度から開始されることになった。腫瘍に対するT細胞の輸注療法ははこれまで患者自身のT細胞の利用に限られ、その制限が有効性と汎用性を阻んでいる。本研究では、申請者らが独自開発した内因性TCRの発現を抑制するsiTCRベクターを利用した非自己T細胞による宿主傷害抑制に加え、宿主から排除されにくいステルスT細胞化し、多くの患者に提供可能なOff-th e shelf細胞製剤開発の基盤確立を目指す。平成29年度には以下の研究実績が達成された。

1.ゲノム編集技術を用いた輸注細胞のMHC発現抑制を開発した。ベータ2ミクログロブリンに対するガイドRNAを持ったCRISPR-Cas9をデザインし、これをレンチウイルスベクターにてヒトT細胞に感染させた。ベータ2ミクログロブリンの発現欠損により、MHC class Iの発現を失うリンパ球の作成に成功した。これらのリンパ球を非自己のリンパ球と混合培養すると、非自己のリンパ球に認識されなくなり、非自己のリンパ球が増殖したり、インターフェロンガンマを産生したりする反応が起こらなくなった。NY-ESO-1特異的なTCR遺伝子をsiTCRベクターで導入した後にベータ2ミクログロブリンをCRISPR-Cas9によってゲノム編集しMHC class Iの発現を失った「ステルスT細胞」の作成に成功した。これら「ステルスT細胞」をNY-ESO-1陽性ヒト腫瘍を接種した免疫不全NOGマウスに輸注すると腫瘍の成長が抑制され、「ステルスT細胞」は十分な抗腫瘍効果を維持していることが明らかとなった。2.近交系マウスを用いて同種骨髄移植後に悪性腫瘍に対して抗原特異的T細胞療法をドナー由来の同種非自己T細胞により治療する動物実験系を樹立した。樹立した系を用いて、非自己T細胞の輸注療法の際のGVHD発現には内因性TCRの発現の程度と前処置が影響を与えることが明らかとなった。NY-ESO-1特異的なTCR遺伝子をsiTCRベクターで導入した後にベータ2ミクログロブリンに対するCRISPR-Cas9によってゲノム編集し、MHC class Iの発現を失った「ステルスT細胞」の作成に成功した。「ステルスT細胞」は抗原特異的にマルチファンクション性を示し、NY-ESO-1陽性ヒト腫瘍を接種した免疫不全NOGマウスに輸注すると腫瘍の成長が抑制され、「ステルスT細胞」は十分な抗腫瘍効果を維持していることが明らかとなった。以上より、非自己細胞を用いたがんに対するT細胞輸注療法の実用化の可能性が示された。1.輸注細胞のMHC発現抑制技術の開発:平成27年度の研究を発展させ、β2ミクログロブリン発現抑制CRISPR-Cas9をヒトT細胞株に遺伝子導入し、MHC class Iの発現低下を確認し、効率が良かったCRISPR-Cas9を用いてレトロウイルスベクターを作成する。作成したCRISPR-Cas9レトロウイルスベクターを感染させることでヒト末書血リンパ球に効率良くMHC class I発現欠失を誘導することを確認する。siTCRベクターによる腫瘍特異的TCR遺伝子導入と組み合わせて、内因性TCR抑制、MHC classI欠失、腫瘍特異的TCR陽性の、受容体改変ステルスT細胞が作成可能であることを示す。2.受容体改変T細胞を用いた、非自己排除評価系の確立と非自己排除因子の解明:平成27年度の研究を発展させ、内因性TCR発現を抑制して非自己反応性を減弱させたT細胞が反応する際のマルチファンクション性について解析する。
プレストレスの導入によるCFRP板接着工法の高性能化と疲労き裂補修の設計法の構築

既設鋼橋でしばしば発生する疲労き裂の補修対策として,軽量で材料特性にも優れた,CFRP (炭素繊維強化樹脂)板を予め緊張して接着するための装置を開発した.疲労試験を行って,開発した装置を用いることで,疲労き裂の補修効果が飛躍的に向上することが確かめられた.さらに,実験的,解析的な検討を行って,CFRP板接着によって補修された疲労き裂の余寿命予測や補修設計法を提案した.既設鋼橋でしばしば発生する疲労き裂の補修対策として,軽量で材料特性にも優れた,CFRP (炭素繊維強化樹脂)板を予め緊張して接着するための装置を開発した.疲労試験を行って,開発した装置を用いることで,疲労き裂の補修効果が飛躍的に向上することが確かめられた.さらに,実験的,解析的な検討を行って,CFRP板接着によって補修された疲労き裂の余寿命予測や補修設計法を提案した.平成22年度には,まず,狭隘な施工環境にも適用可能なプレストレス導入装置の開発を行った.CFRP板には,実構造物の補修・補強工法で多用される汎用品(高強度タイプ,幅50mm,厚さ1.2mm)を用いた.CFRP板にプレテンションを導入するための専用治具を製作し,板厚9mm,幅50mmの平鋼板に対して,その導入量をパラメータとして実験的に検討を行った.その結果,安全かつ簡便に,平鋼板に圧縮応力を導入できることが確かめられた.また,引張試験結果からは,導入量の増大にともなって引張強度が低下するものの,平鋼板には最大で80MPaの圧縮応力が導入できることを確認した.一方,プレストレス量の時間依存性については,室温で約1ヶ月間,計測して検討した結果,その低下はほとんどないことが確かめられた.さらに,CFRP板接着による疲労き裂補修の設計法の構築に向けて,これまでに得られた疲労試験結果を参照して,疲労寿命の推定を試みた.面外ガセット溶接止端部から発生した疲労き裂に対して,スリット加工して接着補修された積層CFRP板等を忠実にFEM解析モデルで再現し,線形破壊力学に基づいた検討,および,パリス則に基づいたき裂伝播解析を行った.その結果,CFRP板の接着位置やその積層化が,き裂先端の応力拡大係数の低減効果に及ぼす影響を定量的に示すことができた.また,積層数を5層とした場合には,積層CFRP板の負担する応力が実験値に比べて低くなり,その算定に課題が残されたものの,疲労寿命の推定結果からは,実験結果を,実用上十分な精度で,安全側に評価できることが確かめられた平成23年度には,はじめに,主に2つの観点から前年度に開発したプレストレス導入装置の改良を行った.まず,小型油圧システムを新規に導入することで,CFRP板へのプレテンションの導入作業を安全かつ確実に行うことができるようになるとともに,作業効率を飛躍的に向上させることができた.また,プレストレス導入装置からCFRP板を簡便に脱着できるシステムを新たに開発した.これにより,プレストレス導入時に問題となっていた,接着端のはく離抵抗強度の低下についても,大幅に改善されることが確かめられた.これらのプレストレス導入装置の改良により,実構造における狭隘部への接着補修にも十分対応できるものと考えられる.次に,CFRP板接着による疲労き裂補修の設計法の構築に向けて,動的な繰返し荷重の作用下でCFRP板を接着し,その接着特性,および,養生中,硬化後の疲労き裂の進展挙動を検討した.さらに,FEM解析プログラムを用いて応力拡大係数を求め,線形破壊力学に基づいたき裂進展解析を実施して,補修後の疲労き裂の進展を実験結果と比較するとともに,公称応力の低減を考慮した評価式から算出される応力拡大係数および疲労寿命との対比から,公称応力の低減効果と架橋効果の定量的な評価を試みた.その結果,疲労き裂は,接着の直後から硬化が完了するまで,わずかに進展するものの,硬化時間は数時間であり,供用下における実働荷重を踏まえると,実用上は問題ないといえた.また,架橋効果は,公称応力の低減効果と比べると小さく,今回の検討の範囲では,応力拡大係数の低減率では510%程度であることなどが確かめられた.平成24年度には,開発した簡便なプレストレス導入装置を疲労き裂の補修に適用して,その効果を実験的に検討した.さらに,典型的な合成鈑桁橋のき裂補修に対して,提案した補修法の妥当性と有用性を解析的に検討した.その結果,以下ような成果が得られた.(1)プレストレスを導入したCFRP板接着による疲労き裂の補修効果の検証補修対象は平鋼板の中央貫通き裂(初期き裂長さ12mm程度)であり,予めプレテンションが導入されたCFRP板を疲労き裂に接着して補修を行い,硬化後にプレテンションを解放して,鋼板(幅100mm,厚さ9mm)に圧縮応力(60MPa相当)を導入することができた.さらに,応力範囲を変えた疲労試験を行って,プレストレス導入による補修効果を検討した.その結果,プレストレスを導入しない場合に比べて,疲労寿命が飛躍的に増大すること,また,応力範囲によっては疲労限となることもわかり,開発した工法は,き裂補修に十分適用できることが確かめられた.(2) CFRP板接着工法の設計法の構築

ストップホール穿孔とCFRP板接着を併用する補修法の実構造への適用性を明らかにするために,鋼桁面外ガセット溶接部を模した試験体に基づく補修効果を弾塑性FEM解析により検討するとともに,実橋への適用を想定して,鋼合成鈑桁橋の全橋3次元FEM解析モデルを作成して,提案する補修法と設計式による評価の妥当性と有用性を検証した.まず,実験的に確かめられた補修効果を解析的に検証した結果から,応力集中係数と剛性比をパラメータとする簡便な設計評価式を提案した.さらに,全橋モデルで疲労き裂の再発生が予想される箇所において,提案する補修法による応力低減効果を検討した結果,横構斜材軸力による面外曲げ応力に対しても有意な効果が認められるとともに,提案した設計評価式は,実構造の補修効果の推定に十分適用できることが確かめられた.東日本大震災の影響に伴う実験設備の安全性および電力抑制の観点から,疲労試験など,継続時間が長い実験については,一定期間(平成23年4月9月),休止していたため,研究の進捗にやや遅れが生じている.24年度が最終年度であるため、記入しない。上記の理由により,実験的な検討にやや遅れがみられることから,最終的な目標が達成できるように,試験片の寸法や補修対象とするき裂モデルの見直しを行って,実験の効率化を図るとともに,これまでの疲労試験データの再整理を含め,解析的な検討を併用しながら,研究開発を推進していく予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
中枢神経修復過程におけるミクログリアの役割と補体の関与についての実験的研究

ラット脊髄損傷モデルでは圧迫後、急速に血液脳関門の破綻と組織の部分的崩壊が起こり、古典的および非古典的径路の双方で補体が急速に活性化されることを明らかにした。そして、血清補体依存性のミクログリアの活性化、membrane attack complexにより広範な細胞障害が誘起され、これが壊死病巣形成に主要な役割を演じることが明らかとなった(Watanabe T et al 1999)。非古典的補体経路の活性化は抗体非依存性であり、特に髄鞘蛋白崩壊産物は非古典系を強力に活性化する。実験的脊髄損傷では、損傷後数時間は病変が損傷部位のごく近傍に限局している。しかしその後、二次的組織障害」によって病巣は約3日間拡大する。そこで補体を血中から枯渇させると、病巣形球に抑制的に働くであろうことが想定された。つまり、この系を強力に抑制することによって、二次的細胞死を抑制することが可能と考えた。CVF(コブラ蛇毒)により補体を消費性枯渇させた状態で、脊髄損傷ラットを作成すると、ED-1を指標としたミクログリアの活性化は著明に抑制された(Kumagai T et al 2001)。かつ、脊髄損傷範囲を定量すると、明らかな病巣形成の抑制効果が認められた。以上の実験的事実から、補体枯渇により脊髄外傷病変を抑制することが可能であり、この観点から脊髄損傷の臨床的治療法を開発する必要があると結論した。引き続き,CVF投与24時間後のラット脊髄を用い,第11胸髄レベルで動脈瘤クリップによる挫滅損傷を作製し,術後24時間で潅流固定し,損傷部位を含めた頭尾側の脊髄縦断パラフィン切片を作製した.損傷中心より頭尾側3.5mm幅で,浸潤マクロファージ及び活性化ミクログリアをED-1免疫染色で同定し,コントロール(CVF投与なし)群と陽性細胞数を比較した.その結果陽性細胞は補体涸渇群にて有意に減少していた.その減少の程度は損傷部近傍でより顕著に認められた.また病変部位をastrocyte-free areaという観点からとらえ,同様のモデルにて抗GFAP染色を用いて検討した結果,病変部位が有意に縮小していることを確認した.以上の結果より,脊髄損傷早期のマクロファージの病変部位への浸潤およびミクログリアの活性化に対し,また病変の広がりそのものに対し,血清補体が大きく関与していることが示された.ラット脊髄損傷モデルでは圧迫後、急速に血液脳関門の破綻と組織の部分的崩壊が起こり、古典的および非古典的径路の双方で補体が急速に活性化されることを明らかにした。
腎発生及びＣＡＫＵＴでの活性酸素と細胞接着のシグナルクロストークとそ役割解明

先天性腎尿路奇形(CAKUT)の病態には、尿管芽分岐やネフロン形成の腎発生の基本的現象が密接に関与している。本研究では、尿管芽分岐やネフロン形成部位でNADPHオキシダーゼとその産物である活性酸素が検出され、阻害実験から尿管芽分岐やネフロン形成が抑制され低形成・異形成腎の病態に関与する可能性があることが判明した。この機構には細胞増殖、遊走、アポトーシス等の細胞機能と接着関連分子・MAPキナーゼ等のリン酸化シグナル伝達が密接に関与していることが判明した。以上から、NADPHオキシダーゼ由来の活性酸素は尿管芽分岐とネフロン形成に重要な役割を果たしていると考えられる。本研究の目的は、先天性腎尿路奇形(CAKUT)の病態に密接に関わる尿管芽分岐やネフロン形成という腎発生の基本的現象と増殖、遊走などの細胞機能が接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来活性酸素(ROS)により直接的、又は接着関連分子-ROSシグナル伝達のクロストークにより間接的に制御されているかを検討することである。平成24年度は平成23年度から継続しているNADPHオキシダーゼ-ROSシグナル解析についてNADPHオキシダーゼ阻害による接着分子の共通シグナル経路についての研究の整理を行った。この段階で、ROSによる直接的な影響が、腎発生に重要であることが判明した。また、FAKとパキシリンのリン酸化シグナルも重要であり、特にFAKに関しては、Y397のリン酸化に始まり多くのチロシン残基がリン酸化をうけシグナル伝達に関わり、間接的な影響がある可能性が推測された。次に、接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来ROSのシグナルがいかに関わっているかを調べるために、腎臓内の多種類の細胞から、メサンギウム細胞に着目し、ROS誘導接着分子Hic-5に焦点をあて関連性を検討した。我々は、Hic-5欠損マウスを入手し、この腎臓よりメサンギウム細胞を樹立した。現在Hic-5欠損によるメサンギウム細胞のネフロンの形成に関する接着分子の役割を検討している。現段階で、Hic-5を制御することにより、他の細胞接着分子FAKやパキシリンのリン酸化が活性化していることを確認しており、Hic-5を糸口にFAK、パキシリンなどの接着分子とROSの関連性を培養実験で確認していく方向である。最終的に、メサンギウム細胞を中心としたネフロン形成だけでなく、尿細管上皮細胞の形成過程への間葉系細胞の関与にも研究を進めていき、尿管芽分岐やネフロン形成の異常から生じるCAKUTの発症と進展を制御しうる治療法開発へすすめる。平成23,24年度に施行したNADPHオキシダーゼ-ROSシグナル解析についてNADPHオキシダーゼ阻害による接着分子の共通シグナル経路についての研究成果から、ROSによる直接的な影響とFAKとパキシリンのリン酸化の影響の両方が腎発生に重要であること、特にFAKに関しては、多くのチロシン残基のリン酸化が重要であることが判明した。平成25年度は、接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来ROSのシグナルへの影響を調べるために、腎臓細胞のうちメサンギウム細胞に着目し、ROS誘導接着分子Hic-5に焦点をあて細胞機能への影響を検討した。Hic-5欠損メサンギウム細胞のネフロンの形成への接着分子の役割を検討するため、Hic-5欠損マウスを入手し細胞を樹立した。Hic-5を制御することにより、他の細胞接着分子FAKやパキシリンのリン酸化が活性化していることが判明した。一方、Hic-5はFAKやパキシリンと異なり細胞増殖の制御に関わることが明らかとなった。これらより、腎臓発生において、FAKやパキシリンは、尿管芽増殖・分岐へと、Hic-5は、特に間葉系細胞でネフロン形成や糸球体構成細胞及び尿細管上皮細胞の分化等に関与する可能性が指摘された。NADPHオキシダーゼ-ROSシグナルと接着分子は協調して尿管芽分岐やネフロン形成に関与し、NADPHオキシダーゼ-ROSシグナルと接着分子のクロストーク機構に介入する治療法はCAKUTの発症と進展を制御するために有用な可能性がある。

本研究の目的は、先天性腎尿路奇形(CAKUT)の病態に密接に関わる尿管芽分岐やネフロン形成という腎発生の基本的現象と増殖、遊走などの細胞機能が接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来活性酸素(ROS)により直接的、又はROSー接着関連分子シグナル伝達のクロストークにより間接的に制御されているかを検討することである。平成23年度は器官培養を用いて、ROSの産生とその産生機構であるNADPHオキシダーゼが尿管芽分岐やネフロン形成に関わっているかを明らかにすることに焦点をあてて研究を進めた。第一に、ラット胎児より胎生13-14日の腎臓を摘出し器官培養を行いROSや接着分子の役割を検討した。ROS抑制に抗酸化剤NADPHオキシダーゼ阻害剤を用いて検討したところ、尿管芽の分岐やネフロン形成が抑制された。これには、リン酸化MAPキナーゼなどの増殖、遊走のシグナル分子とcaspase3などにより誘導されるアポトーシスが関わっていることが判明した。さらに、増殖や遊走が活性化している部位では、NADPHオキシダーゼの発現とROS産生が亢進していることも明らかとなった。同時に、尿管芽分岐とネフロン形成に関わる増殖、遊走など細胞機能に接着分子が果たす役割を調べたところ、FAKとパキシリンのリン酸化シグナルが重要であることも判明した。これらの結果から、接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来ROSは密接に関連している可能性が推測された。現在、NADPHオキシダーゼ-ROSシグナル解析についてNADPHオキシダーゼ及びROS阻害によるMAPキナーゼ、PI3K-Akt経路などについて検索しており、ROSの腎発生に関わる直接的シグナル経路と接着関連分子とのクロストークを介する間接的シグナル経路を追跡している。本研究がおおむね順調に経過している理由として、二点あげられる。一点は、平成24年度で、平成23年度から継続しているNADPHオキシダーゼ-ROSシグナル解析について、NADPHオキシダーゼ阻害によるシグナル経路に関して整理が完了した点である。ROSによる直接的な影響、特にMAPキナーゼを介するシグナル伝達が、腎発生に重要であることが判明した。また、FAKとパキシリンのリン酸化シグナルもMAPキナーゼを中心としたシグナル伝達が重要であり、接着分子のシグナルは直接的および間接的、どちらも影響する可能性が推測された。これらのことを現在論文として整理する方向で進めている。二点目として、接着関連分子やNADPHオキシダーゼ由来ROSのシグナルがいかに相互に関わっているかを調べるために、培養実験に着手したことがあげられる。腎臓内の多種類の細胞から、メサンギウム細胞に着目し、ROS誘導接着分枝Hic-5に焦点をあて関連性を検討している。我々は、Hic-5欠損マウスを入手し、この腎臓よりメサンギウム細胞を樹立した。現在Hic-5欠損によるメサンギウム細胞のネフロンの形成に関する接着分子の役割を検討しているが、Hic-5を制御することにより、他の細胞接着分子FAKやパキシリンのリン酸化が活性化していることをすでに確認しており、ROSにより誘導される分子が細胞接着シグナルに影響していることを明らかにした点が重要であると考えている。以上から、接着分子とROSシグナルには関連性があることが推測され、さらに研究を発展させることが可能となっている。平成23年度は、器官培養を用いて、ROSとROS産生機構NADPHオキシダーゼの発現が尿管芽分岐やネフロン形成に関わっているかを焦点をあてて研究を行った。実際には、当初の計画どおりラット胎児より胎生13-14日及び胎生18日の腎臓を摘出し器官培養による研究を進めた。
細胞癌化抑制能を有するアントシアニンの細胞シグナル伝達経路の解明

アントシアニンは抗酸化作用を始め多くの生体調節機能が報告されているが、その分子作用機構には不明の点が多い。本研究は分子生物学的手法および遺伝子網羅的な解析手法を用いてアントシアニンによる細胞癌化の信号伝達経路、標的分子および下流の遺伝子の発現制御を解析した。その結果、アントシアニンが少なくともプロティンキナーゼMEK1と直接的に結合し、MAPKの伝達経路を抑制し、細胞炎症・癌化を制御することが明らかとなった。アントシアニンは抗酸化・抗腫瘍作用を始め多くの生体調節機能が試験管内や動物実験で報告されている。しかし、分子レベルでの機能解析が少なく、その作用機構については不明の部分が多い。特に、細胞外のアントシアニンがどのように細胞核内の遺伝子に影響を与えて調節機能を果たしているか、いわゆるアントシアニンの細胞シグナル伝達系路に関しては不明の点が多い。本研究は、1)アントシアニンと細胞癌化に関わる受容体との作用を解析し、細胞膜受容体との結合の有無を明らかにする;2)細胞癌化に関わる細胞質内のシグナル分子を解析し、アントシアニンの細胞質内での信号伝達経路等を明らかにする。平成18年度は、アントシアニンと細胞癌化に関わる受容体との作用について解析を行った。アントシアニンは、ブルーベリーから精製したデルフィニジン3一ガラクト一ス(Dp3-Gal)を実験材料として使った。細胞は、炎症・癌化研究に優れた細胞モデル系マクロフアージ様細胞を用いた。Dp3-Galは、リボ多糖体(LPS)で誘導したマクロファージ活性を濃度依存的に抑制した。LPSは、細胞膜受容体Toll-like receptor4(TLR4)と結合し、細胞内のシグナル系を活性することが知られているので、そこで、TLR4に対してDp3-GalとLPSとの競合結合の有無について調べた。その結果、TLR4に対して、Dp3-GalとLPSとの競合結合作用が見られなかった。したがって、Dp3-Galが細胞膜受容体TLR4を介さず、細胞内のシグナル経路を制御することが示唆された。これからアントシアニンが細胞内のシグナル伝達分子に対する作用を解析していきたいと思う。本研究は、アントシアニンによる細胞癌化抑制の分子機構を明らかにするために、1)アントシアニンと細胞癌化に関わる細胞膜受容体TLR4との作用を解析し、TLR4との結合の有無を明らかにする;2)細胞癌化に関わる細胞内のシグナル伝達分子を解析し、アントシアニンの細胞内での信号伝達経路等を明らかにする。内容1)は、すでに平成18年度で明らかにしたように、デルフィニジン3-ガラクトース(Dp3-Gal)は、細胞膜受容体TLR4を介さず、細胞内のシグナル経路を制御することが示唆された。したがって、平成19年度は、内容2)、即ちアントシアニンの細胞内シグナル伝達経路に対する作用を解析した。リポ多糖体(LPS)で活性化したマウスマクロファージ様細胞において、異なるDp3-Gal濃度および時間で処理を行い、その後細胞を回収した。得られたタンパク質をPAGEで分離し、メンブレンに移した。特異的な細胞内シグナル分子の抗体を用いて化学免疫反応を行い、細胞内シグナル分子のリン酸化などを検出した。その結果、Dp3-Galは、リポ多糖体(LPS)で活性化したマクロファージにおいてNF-kBの活性化を抑制した。その上流の細胞内シグナル伝達経路を解析すると、Dp3-GalがさらにIKKやTAK1のリン酸化を抑制した。したがって、Dp3-Galが細胞膜受容体TLR4を介さず、細胞内のシグナル伝達経路TAK1/IKK/NF-kBを阻害し、細胞炎症や癌化を抑制することが示唆された。これからアントシアニンが細胞内のシグナル伝達分子と結合するかどうかさらに解析していきたいと思う。本年度は、アントシアニンによる細胞癌化抑制の分子機構を明らかにするために、Delphinidin(Dp)およびその配糖体Delphinidin-3-sambubioside(Dp-Sam)の分子標的の同定を行った。DpおよびDp-3-SamはTPA誘導性細胞形質転換を抑制した。そのシグナル伝達系および転写因子を解析したところ、Dp-3-SamはMAPKシグナル伝達を抑制していることが分かった。また、pull-down assayによって、DpおよびDp-3-SamはMEK1と直接的に結合し、そのリン酸化を抑制していることを明からにした。その結合力についてDpがDp-3-SamよりMEK1への親和力を高く示した。これらの結果より、アントシアニンであるDpおよびDp-3-Samはプロティン・キナゼーMEK1を分子標的とし、TPA誘導性細胞形質転換を抑制したことが明らかにされた。
老年者の痴呆とJCウイルスー治療の可能性のある痴呆ー

JCウィルスは免疫能の極度に低下した状態でのみ発病し、痴呆や神経症状を呈するprogressive multifocal leukoencephalopathy(PML)の原因として知られている。このJCウィルスは、PML以外の脳ではほとんど認められないとされていた。我々は近年、免疫学的に明らかな異常のない老年者脳に、JCウィルスのDNAおよび蛋白が存在することを免疫組織化学的方法およびin situ hybridization法により証明した。その後63歳100歳の連続剖検例33例から99部位の脳組織を採取し、polymerase chain reactionおよびSouthern blot hybridizationによりJCウィルスDNAの存在率を検索した。この33例は2人の病理医により詳細に検討されたが1例もPML例はなかったが、10例の15部位でJCウィルスDNAが陽性であった。この10例中4例を選択し電子顕微鏡にウィルスの存在を検索した。in situ hybridizationでも陽性であった1例は、グリア細胞の核内に結晶構造を有する約のウィルス粒子および線維構造を認めた。パポバウィルスVP_1に対する抗体を用い免疫電顕を行ないパポバウィルスであることを確認した。結晶構造をなさない粒子は主に核内、時に細胞質内にも認められた。他の3例では明らかな結晶構造を持つ細胞は認められなかったが、2例ではばらばらのウィルス粒子を、1例ではウィルス粒子と思われるものを有する細胞が存在した。以上よりPMLのない老年者脳にJCウィルスが存在することは確実であると考えている。尿に存在するJCウィルスとPML脳のJCウィルスの構造は一部異なることが報告されている。PMLのない老年者脳に存在するJCウィルスの構造がどのようであるか、痴呆との関連も含め検討中である。またJCウィルスのポリペプタイドの一部を合成し、それを用いて特異抗体を作製中である。なお、ウィルス結晶を認めた例は、原因不明の痴呆例であり、痴呆との関係も示唆された。
光線パラメータに基づく3次元空間情報の新しい圧縮方式の研究

研究実施計画に従って研究を遂行し,これまでに以下の結果を得た.1.デジタルカメラと回転ステージを組み合わせた光線群データ取得装置を開発した。2.光線空間データの自己相関は、物体の表面テクスチャ、表面反射特性、物体形状の3つに依存する。特に、オクルージョン領域が自己相関に影響を与えることが3次元画像特有の性質であることを確認した。3.2次元画像符号化方式を光線群データに適用し、以下の知見を得た。(1)DCTのような変換符号化ではローカルな特徴だけを見ているので、グローバルなオクルージョンの影響は比較的受けにくい。(2)視差補償予測符号化におけるイントラブロックの発生は、視点移動に伴うオクルージョンを反映する。(3)DCT符号化では被写体の位置、特に原点からの距離が大きくなるにつれて符号化性能が劣化する。予測符号化では距離の違いによる影響は見られない。(4)各符号化方式とも、同じ視域であれば眼数が多くなるにつれて符号化効率が上がる。逆に、眼数を固定して視域を減少した場合も符号化効率が上がる。4.物体の光線情報得るために最低限必要な撮影回数・撮影位置を見いだす問題を「カメラ配置問題」として定式化した。この枠組みのもとで、物体形状が与えられた時、全ての点の観測が可能なカメラ配置を一つ求めるアルゴリズムを見いだした。5.オクルージョンの情報から光線空間データを再構成する手法を開発した。6.オクルージョンなど既存の2次元画像情報圧縮方式では用いられない情報の積極的な利用が、新しい3次元画像情報圧縮方式の開発へのブレークスルーになり得るとの見通しを得た.研究実施計画に従って研究を遂行し,これまでに以下の結果を得た.1.デジタルカメラと回転ステージを組み合わせた光線群データ取得装置を開発した。6.オクルージョンなど既存の2次元画像情報圧縮方式では用いられない情報の積極的な利用が、新しい3次元画像情報圧縮方式の開発へのブレークスルーになり得るとの見通しを得た.
完全水添油脂が示す脳卒中病態モデル改善作用のメカニズムに関する研究

本研究では、菜種油(キャノーラ油)を完全水添処理して得られる完全水添菜種油(FHCO)が、脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に対して、致死性脳卒中の発症を予防するメカニズムを検討するとともに、その有効性を他の系統、動物種にも応用できるかを明らかにすることを目的とする。今年度の検討では、以下の1)3)について検討を行った。1) FHCO摂取によるSHRSPの病態改善作用を遺伝子発現から検討するために、肝臓のmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法により解析を行った。実験群は、コントロール群、FHCO摂取群、FHCOにドコサヘキサエン酸(DHA)を添加した3群を設定した。脂肪酸合成に関連する酵素の発現は、FHCO摂取群で低下し、DHAを添加することでさらに低下する傾向が認められた。一方でコレステロール合成関連酵素は、FHCOを摂取した2群で、どちらも増加した。2)上記の実験動物を用いて、肝臓での脂肪酸とステロールの蓄積量を検討した。その結果、脂肪酸の総量は減少し、各脂肪酸の組成も、それぞれの代謝酵素発現の結果を反映した結果となったが、コレステロール含量は、酵素発現の結果とは異なり、低下していた。これはSHRSPラットが臓器中に植物ステロールを蓄積しやすい性質を持つため、これを排泄すべく、排泄酵素が亢進したため、コレステロール量も減少したと考えられたが、検討したいくつかの酵素では差が認められず、さらなる検討が必要である。3)酵素の反応性を検討する実験や、培養細胞への影響を確認する実験も検討を試みたが、まず、FHCOそのものを水溶液の系に溶解させることが大変難しく、溶解させたとしても、それを維持したり、他の影響が大きかったりする影響で、はっきりとした結果を得ることはできなかった。菜種油(キャノーラ油)をはじめとした特定の油脂を脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に摂取させると、その寿命が著しく短縮する。ところが、菜種油を完全水添処理した油脂(FHCO)をSHRSPに摂取させると、致死性の脳卒中の発症が抑制され、様々な病態改善作用が観察された。FHCOを摂取したSHRSPの各臓器における脂質含量を調べた結果、SHRSPの病態を促進すると考えられている植物ステロール(PS)の蓄積量が減少し、FHCOには含まれていない22:6ドコサヘキサエン酸(DHA)の蓄積量が増加している。本研究では、先に挙げた2点の脂質成分変化に着目して、FHCO摂取によるSHRSP病態改善作用のメカニズムを解明することを目的とする。今年度の検討においては、FHCOを摂取したラットにおける糞便中の脂質含量変化について検討を行った。FHCO群の糞便中脂肪酸含量は、他の2群と比較して12.127.0倍に有意に上昇した。糞便排泄量の増加と併せて考えると、FHCO群は最大40倍近くもFAを排泄したことになる。FHCO群の糞便中FAのうち90%以上が飽和脂肪酸で、不飽和脂肪酸の割合は小さかった。また、実験飼料中のPS含量はCanとFHCOではほとんど変わらないが、FHCO群のPS組織蓄積量はCan群の20%以下であった。しかし、FHCOにおける糞便重量当たりのPS含量は減少傾向で、糞便量の増加を加味しても、PS排泄量は1.32.2倍の増加であった。そのため、PS組織蓄積量の減少は、排泄だけでなく、代謝・分解が亢進している可能性がある。本計画では研究代表者とその所属研究室の学生で進める予定をしていたが、該当年度では配属の学生が1名もいなかったため、多くの実験を進めることができなかった。その代わり、必要な機器類の準備、いくつかの分析系の確立等を進めることができ、また、次年度では学生配属があったので、随時、計画された実験を行う予定である。1)FHCO摂取によるSHRSPの病態改善作用はドコサヘキサエン酸(DHA)を含んだ普通飼料に配合することで観察していた。DHA臓器蓄積が病態改善の一因である可能性を考えると、DHAを含まない飼料で飼育すると改善作用は確認されないと考えられた。しかし、AIN-93Gをベースとした飼料にFHCOの未添加した群と、FHCOとDHAを添加した群とでは、どちらも有意な血圧降下作用を示したことから、少なくてもFHCOそのものでも病態改善の一部を示す可能性が示唆された。しかし、DHA投与群では、FHCO単独処理では認められなかった脂質合成の調整作用などが観察されており、さらなる詳細な検討が必要と考えられる。2)FHCO摂取の長期摂取が安全か、また、他のラット系統に対しても有効かを明らかにするために、Wistarラットに対して摂餌実験を行った。その結果、植物ステロールの蓄積を抑えるなど、SHRSPに摂取させた時と類似の結果を得られることができたが、実験期間中に体重量が対照群より増加したことなど、相違する結果も観察された。3)FHCOは摂食量が増加するにもかかわらず体重減少が観察されるため、メタボリックシンドローム関連の疾患予防・治療に有効な可能性がある。

そこで、肥満モデルマウスとして、C57BLKS/J Iar -+Leprdb/+Leprdbマウスを用意し、これに対する痩身作用、血糖値減少作用を期待したが、残念ながら特筆すべき有効性は観察されなかった。1)投稿論文の作成・報告が遅れており、急ぎ作成をしている。2)長期飼育の動物実験で、一部、失敗があった。3)冷却遠心機が故障してしまい、修繕に時間がかかってしまった。4)培養細胞の実験系確立に時間がかかっている。本研究では、菜種油(キャノーラ油)を完全水添処理して得られる完全水添菜種油(FHCO)が、脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に対して、致死性脳卒中の発症を予防するメカニズムを検討するとともに、その有効性を他の系統、動物種にも応用できるかを明らかにすることを目的とする。今年度の検討では、以下の1)3)について検討を行った。1) FHCO摂取によるSHRSPの病態改善作用を遺伝子発現から検討するために、肝臓のmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法により解析を行った。実験群は、コントロール群、FHCO摂取群、FHCOにドコサヘキサエン酸(DHA)を添加した3群を設定した。脂肪酸合成に関連する酵素の発現は、FHCO摂取群で低下し、DHAを添加することでさらに低下する傾向が認められた。一方でコレステロール合成関連酵素は、FHCOを摂取した2群で、どちらも増加した。2)上記の実験動物を用いて、肝臓での脂肪酸とステロールの蓄積量を検討した。その結果、脂肪酸の総量は減少し、各脂肪酸の組成も、それぞれの代謝酵素発現の結果を反映した結果となったが、コレステロール含量は、酵素発現の結果とは異なり、低下していた。これはSHRSPラットが臓器中に植物ステロールを蓄積しやすい性質を持つため、これを排泄すべく、排泄酵素が亢進したため、コレステロール量も減少したと考えられたが、検討したいくつかの酵素では差が認められず、さらなる検討が必要である。3)酵素の反応性を検討する実験や、培養細胞への影響を確認する実験も検討を試みたが、まず、FHCOそのものを水溶液の系に溶解させることが大変難しく、溶解させたとしても、それを維持したり、他の影響が大きかったりする影響で、はっきりとした結果を得ることはできなかった。1 FHCOを含んだ実験飼料の摂取でFHCOには含まれないDHAの組織中含量が増加したということは、油脂混合前の基礎飼料に含まれているわずかなDHA(0.10.2%)の取り込みが上昇している可能性がある。この原因を解明するために、FHCOと他の食用油を膵リパーゼ等で加水分解した後、胆汁酸等を添加してミセル形成の度合いを、吸光度法、DLS法などを用いて検討する。2 FHCO摂取によるSHRSP臓器PS含量の減少における、ステロール輸送の各種トランスポーター発現変化、並びに、ステロール代謝に関与する酸化還元酵素の発現影響を調べるために、FHCO実験食を摂取したSHRSPを用意し、臓器(小腸、肝臓など)におけるトランスポーターや代謝酵素の発現をRT-PCR法などにより検討を行う。1)昨年度の実験で得られた結果を分子レベルで確認するために、ラット培養細胞の系を用いて、DHAやPSなどを特定の条件で添加して、ターゲット分子の発現、相互作用や細胞内運命を調べることで、分子的メカニズムを解明する。
ホヤ卵の後極に局在するRNA群の局在機構と機能の網羅的解析

我々はホヤ卵内において胚の前後軸形成・不等分裂などに必須とされている植物極側後方の領域に局在するRNAを数多く単離し、その局在経路の違いからそれらがtypeIとtypeIIのふたつのグループに分類されることを明らかにした。本研究では、これらのRNAの局在を担う配列を絞り込み、その領域に結合する因子を単離することによって、ホヤの卵や胚におけるRNAの局在に関わる分子機構を明らかにするとともに、さらに卵内に局在する多数のRNAが発生過程における機能を解析するために、局在RNAに対するモリフォリノオリゴを網羅的に注入して機能欠損個体を作製し、解析することが目的である。標識した合成RNAの未受精卵への顕微注入実験から、局在にはtypeI・typeIIともに3'UTRが必要十分であることが分かった。つぎにその結果得られたそれぞれの配列に共通して見られる構造を検索すると共に、その配列に結合する因子を生化学的及び分子生物学的手法を駆使して単離し、その性状を明らかにしつつある。さらに、局在RNAが見られるCABという領域におけるRNA-タンパク質複合体の存在様式を電子顕微鏡レベルで解析して、RNAの局在機構についての知見を得た。一方、局在RNAが発生過程で担う役割を明らかにするべく、5'UTRに対するモルフォリノオリゴを網羅的に卵に顕微注入して機能欠損個体を作製し、組織分化や形態形成に果たす役割を解析している。