hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代型補助人工心臓用メカニカルシールのための低摩擦発現タンパク膜創成

H30年度においてはタンパク膜形成過程におけるアルブミン及びフィブリノーゲンの経過観察を行う.この際環境温度および基材の形状をパラメータとし,それぞれがタンパク膜の形成形態,およびタンパク質の分布に及ぼす影響を明らかにする.・温度の影響タンパク質は温度により熱変性し,凝集することが知られている.ここでアルブミンとフィブリノーゲンの熱変性温度は異なることから,周辺環境の制御により一方のタンパク質のみを変性させる事が可能であると考えられる.・形状の影響タンパク膜は基材上の凹部形状を起点として形成され,摩擦係数を増大させることが既に知られている.またメカニカルシールを用いた実験系においてはレーザー起因の微細周期構造の創成により血液中における低摩擦が発現し,薄く均一なタンパク膜が形成される.すなわちタンパク膜の形態およびこれにより発現する摩擦係数は基材上の形状により支配されることから,任意に形状を制御した基材を用いて摩擦試験を行うことでタンパク質の形成機構を推定可能であるといえる.以上の実験的考察によって得られた事実を元に,メカニカルシールしゅう動面に低摩擦発現タンパク膜を創成するための最適設計を提案する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
超伝導トンネル接合を用いた核反跳検出器の開発

暗黒物質の最も有力な候補と考えられているニュートラリーノは、素粒子の標準理論の枠組みを越える理論である超対称性理論が存在を予言する未知の素粒子である。ニュートラリーノとの弾性散乱により検出器物質中の原子核は反跳を受けるので高感度な核反跳検出器によって暗黒物質を検出することができる。本研究課題ではこの暗黒物質ニュートラリーノの直接検出をめざし超伝導体を用いた新しいタイプのボロメーターの開発を行った。暗黒物質ハローに対する地球の相対運動により、ニュートラリーノによる原子核反跳の方向は大きな異方性を持つと考えられ、もしこの異方性を検出することができれば暗黒物質探索実験の感度は大幅に向上する。開発中の新型ボロメーターは、検出器物質表面に多数配置した超伝導トンネル接合素子(STJ)で原子核反跳により生じる高エネルギーフォノンをとらえ原子核反跳の異方性を検出することを目的としている。すなわち、検出されるフォノンのタイミングや強度を測定することで、弾性散乱の反応点および原子核反跳の方向を再構築する。作製したSTJ素子はアルミニウムトラップ層を持ったニオブ接合であり、6keVのX線に対するエネルギー分解能は20μmm角、100μmm角、200μmm角の素子サイズに対して、それぞれ41eV、58eV、65eVとなった。これは既存の半導体検出器のエネルギー分解能の理論限界を2倍から3倍上回る性能であり、核反跳エネルギーを精度良く測定することができることを示唆している。またSTJ素子信号の時定数は1μsec以下であり、原子核反跳によるフォノンのタイミング測定も十分可能であることを確認した。同時にSTJの読み出し回路として超伝導量子干渉素子(SQUID)を用いたプリアンプの開発も行い、6keVのX線からの信号の読み出しに成功した。暗黒物資の有力な候補であるニュートラリーノとの弾性散乱により検出器物質中の原子核は反跳を受ける。したがって高感度な核反跳検出器によって暗黒物質を検出することができる。現在開発中の新型ボロメーターは、検出器物質表面に多数配置した超伝導トンネル接合素子(STJ)で原子核反跳により生じる高エネルギーフォノンをとらえ原子核反跳の異方性を検出することを目的としている。平成11年度は高感度なSTJ素子の作製に成功した。これは既存の半導体検出器のエネルギー分解能の理論限界を2倍から3倍上回る性能である。一方、100MHzFADCを用いた高速な波形の取り込みを実現し、詳細なオフライン解析を行い、STJ素子の上部電極と下部電極からの信号を効率よく識別することでSTJ素子の両電極からのスペクトルを分離することが可能になった。こういった高速な波形解析法の確立は、原子核反跳によって生じたフォノンをSTJによって検出する際に非常に有用である。
ジルコン結晶を用いたウラン・トリウム・ヘリウム放射年代測定法

昨年度測定した丹沢トーナル岩複合岩体のウラン・トリウム・ヘリウム年代の継続的な測定を行うとともに、ウラン・トリウム・ヘリウム年代と比較研究を行う為、同岩体のフィッショントラック法、アルゴンアルゴン法による年代測定を進めた。同岩体は第三紀以降水平・垂直方向に急激な変動を被った南部フォッサマグナ地域に産出する最大の深成岩体であり、低温熱年代学的手法としてのウラン・トリウム・ヘリウム放射年代測定法の長所を最大に生かすことの出来る研究対象の一つである。研究の結果、同岩体を対象に当時行われたカリウムアルゴン法を始めとする放射年代測定法に比べて遥かに精度・確度ともに高いと期待できるウラン・トリウム・ヘリウム年代を得ることが出来た。同岩体はより若いとは言いがたい面があるけれども、この結果から、本研究の目的の一つであったジルコンを用いた際の精度の高さがはっきりと明らかになった。また、閉鎖温度が比較的低いことから、野外調査から予測された局所的な加熱イベントを検出することにも成功した。ウラン・トリウム・ヘリウム年代値と、それ以外の放射年代値とを組み合わせた同岩体の冷却履歴解析の結果、同岩体の冷却履歴は従来考えられていた第四紀における急激な冷却の可能性を否定し、逆に第四紀の冷却はそれ以前に比べて緩やかであったことを示唆する。このことは南部フォッサマグナ地域の最近の変動を理解する重要な鍵となるであろう。カリフォルニア工科大学に5週間にわたって滞在し、修士課程においてカリウムアルゴン法を用いて詳細に年代を決定した4試料についてウラントリウムヘリウム法の予察的な測定を行った。これにより本年代測定法を利用する上で必要な試料準備・測定装置の操作・測定後のデータ処理や潜在的な問題点について理解を深めることが出来た。測定結果については概ね満足できる数値が得られているものの、主にデータの不足からさらなる測定の必要がある。これに関連して、ジルコン結晶におけるウランの不均一な分布は本年代測定法において大きな誤差を生じるが、従来のウラン分布測定法は全て破壊検査であり、本年代測定法と併用はできない。この点について、最新の分析機器による非破壊検査の可能性を、従来の中性子照射と化学的エッチングを利用したウラン分布測定との比較を通して模索中である。また、応用例として琵琶湖湖底ボーリングコア試料の利用を検討しており、そのための予備実験として琵琶湖周辺の地上堆積物中から火山灰試料の採取を行うとともにInternational Continental Scientific Drilling ProgramのLake Biwa and Lake Suigetsu Drilling Project Workshopにおいてウラントリウムヘリウム法を用いた精密年代測定の提案を行った。これはまたアルゴンアルゴン法を併用し、ジスコン結晶を用いたウラントリウムヘリウム法の信頼性向上をも目指すものである。本年度は昨年に引き続き基礎的なデータ収集を主とした。まず7月にはカリフォルニア工科大学において昨年度からの継続研究としてウラントリウムヘリウム年代値の充実と、その補正に必要な全岩ウラントリウム比並びに同位体比の測定を行い、未だ予察的な内容ではあるものの8月のGoldschmidt Conference 2003においてその結果を発表した。このテーマに関してはさらにデータを充実させるべく追加のサンプリングを行なった。3月に再びカリフォルニア工科大学において一部の測定を終え、現在は残りの測定が進行中である。さらに基礎研究としては、未だ明確には明らかになっていないジルコンにおける本年代測定法の閉鎖温度を決定するため進行中のジルコン中のヘリウムの拡散速度測定プロジェクトに試料提供を行い、この分野の先端研究に寄与している。応用面では熱年代学的応用として南部フォッサマグナに分布する深成岩の一つである丹沢深成岩体について、その低温度領域での冷却史の解明を目指す研究を開始した。既に第一次のサンプリングを行ったが、本岩体は複数の貫入と地域ごとの異なる上昇史の可能柱が指摘されており、この点に対応すべく広範な地域から数多くの試料を得ることになった。これらのサンプルも現在ウラントリウムヘリウム年代の測定を進行中である。昨年度模索していた、ジルコン結晶中のウラン分布を非破壊状能で測定する可能性については、少なくとも容易ではないことは明らかになった。これは依頼分析を通しての研究であり、十分なデータを得ることは費用の面から現実的ではなく、残念ながらいったん中断とした。

ウラン・トリウム・ヘリウム年代値と、それ以外の放射年代値とを組み合わせた同岩体の冷却履歴解析の結果、同岩体の冷却履歴は従来考えられていた第四紀における急激な冷却の可能性を否定し、逆に第四紀の冷却はそれ以前に比べて緩やかであったことを示唆する。このことは南部フォッサマグナ地域の最近の変動を理解する重要な鍵となるであろう。
ADAMTS13の基質認識・切断に対する細胞外環境の効果

ADAMTS13は、血漿中のvon Willebrand因子(VWF)を高ずり応力下で切断することでVWFマルチマーの分子量を調節し、血小板血栓形成を制御している。ADAMTS13活性の欠失は細小血管における血小板血栓形成を引き起こすため、血栓性血小板減少性紫斑病の原因となる。我々はADAMTS13のディスインテグリン様(D)ドメイン、TSP1(T)ドメイン、Cys-rich(C)ドメイン、スペーサー(S)ドメインから構成される領域ADAMTS13-DTCS(Arg287-Ala685)の立体構造をX線結晶構造解析法により決定した。DTCS組み換え体はCHO-Lec細胞の分泌発現系を用いて調製し結晶を作製した。次いで、SPring-8においてX線回折強度データを取得し、立体構造を決定した。その結果、(1)Dドメインはディスインテグリン様の立体構造ではなく、アミノ酸配列の相同性が低いCドメインと同一の立体構造を形成していること、(2)Tドメインの立体構造はthrombospondin type-1 repeatとよく一致すること、(3)Sドメインは10本のβストランドからなる2層のアンチパラレルなβシートからなる構造単位であることが明らかになった。決定した立体構造を基にしてアミノ酸変異を導入し、変異ADAMTSI3-MDTCS(Ala75-Ala685)組換え体の活性をFRETS-VWF73を用いて測定した。その結果、D、C、S各ドメイン上に、空間的に隔たりながらも直線状に並んだ、少なくとも3か所のエキソサイトの存在を同定した。以上より、ADAMTS13は、DTCS領域に存在する複数のエキソサイトで、ずり応力等でほどけたVWFを広範囲で認識するし、VWFへの特異的な親和性を高めていると考えられた。血小板血栓は内皮下層のコラーゲンや接着蛋白質フォンビルブランド因子(VWF)により活性化される。VWFは超巨大ホモポリマーとして血管内皮細胞から分泌される。この巨大分子は血小板凝集能が極めて高く、通常、血中に存在するメタロプロテアーゼADAMTS13により適度な大きさに低分子化され、血中に循環する。先天性もしくは後天性にADAMTS13活性が欠損すると、超高分子量VWFが血中を循環することとなり、微小血管に血小板血栓が形成され、血栓性血小板減少性紫斑病を呈する。このように、血漿中のADAMTS13はVWFの限定分解を通して血小板血栓の形成を抑制している。ADAMTS13は、1427アミノ酸残基から成り、N末端より、シグナル配列、プロ配列、メタロプロテアーゼドメイン(M)、ディスインテグリンドメイン(D)、トロンボスポンジン1I型リピート(T)、Cys-リッチドメイン(C)、スペーサードメイン(S)、7回のTリピート、2つのCUBドメインから構成される。これまでの私達の研究から、MDTCSはほぼ活性を保持しているものの、MDTは活性が著減し、CSドメインがプロテアーゼ活性の発現に重要であることが判明していた。ADAMTS13の厳密な基質認識機構を明らかにするため、ADAMTS13のDTCS領域を動物培養細胞で発現させ、X線アミノ酸残基287-685立体構造解析を行うこととした。本年度は、CHO Lec細胞を用いてDTCS領域を細胞外へ分泌させる糸を構築し、X線構造解析にむけてDTCS領域の大量発現を試みた。培養上清に分泌したDTCS領域は硫安沈殿で回収し、Niカラムで精製後、TEVプロテアーゼにてC末端のHis-タグを切断し、さらにイオン交換カラムにて精製した。これにより、培養上清20リットルから約6mgのDTCS領域を精製することができた。この精製標品を用いてX線立体構造解析を行う。

以上より、ADAMTS13は、DTCS領域に存在する複数のエキソサイトで、ずり応力等でほどけたVWFを広範囲で認識するし、VWFへの特異的な親和性を高めていると考えられた。
Tリンパ球依存性胸腺微少環境構築機構

本研究では、分化途上のTリンパ球が胸腺微小環境の構築に必須であることに着眼した胸腺上皮細胞刺激因子の同定を行うとともに、胸腺上皮特異的機能分子の発現を指標にした皮質上皮細胞と髄質上皮細胞の分岐機構の解析を開始した。その結果、まず、正の選択をうけた幼若Tリンパ球に発現されるRANKLが髄質上皮細胞の強力な増殖因子であることを明らかにした。また、胸腺髄質上皮細胞の産生するCCR7ケモカインによる幼若Tリンパ球の髄質移動が、組織特異的自己抗原に反応性を示すTリンパ球の負の選択に必要であることを明らかにした。更に、胸腺髄質上皮細胞の産生するケモカインXCL1による胸腺内樹状細胞の髄質中央部への誘引が、胸腺における制御性T細胞の産生に重要であるとともに、自己免疫疾患原因分子のひとつAireによって制御されることを明らかにした。加えて、胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現される胸腺プロテアソームによるタンパク質分解が、CD8陽性T細胞の効率よい正の選択をひきおこすペプチド-クラス1MHC複合体の産生に必要であることを明らかにした。併せて、胸腺皮質上皮細胞と胸腺髄質上皮細胞の分岐機構の解明に挑むため、皮質上皮細胞特異的Cre発現マウスとCCL21発現髄質上皮細胞を蛍光検出するマウスの作製を進めた。本研究は、Tリンパ球の胸腺内分化選択機構の分子理解を目標にした独自の研究成果に基づき、分化途上のTリンパ球が胸腺微小環境の構築に必須であることに着眼した胸腺上皮細胞刺激因子の同定を行い、更に胸腺上皮特異的機能分子の発現を指標にした皮質上皮細胞と髄質上皮細胞の分岐機構の解析へと進むことで、Tリンパ球レパトア選択を担う胸腺微少環境の多段階構築機構を分子レベルで解明することを目的とする。初年度の平成20年度には、正の選択をうけた幼若Tリンパ球を髄質へと誘導するCCR7ケモカインの産生と、全身の臓器に発現される多種多様な自己遺伝子を発現して自己分子への免疫寛容を誘導する核内因子AIREの産生を指標に、機能的な髄質上皮細胞の分化および増殖を定性的および定量的に評価する技術を確立した。そのうえで、正の選択をうけた幼若Tリンパ球から産生されるサイトカインと髄質上皮細胞に発現されるサイトカイン受容体について、マイクロアレイ解析データをもとに網羅的に組み合わせ解析を行い、更にノックアウトマウスを用いた機能解析を行うことで、正の選択をうけた幼若Tリンパ球に発現されるRANKLが髄質上皮細胞の強力な増殖因子であることを明らかにした。また、RANKLと同じくTNFファミリーに属するCD40Lにも同様の作用があることを明らかにした。更に、ガンマデルタ型の胸腺Tリンパ球もRANKLやCD40Lを発現する細胞であるものの髄質上皮細胞に対する関与は著明ではないことを明らかにした。胸腺髄質と胸腺皮質の形成を制御する因子の全容解明に向けて解析を続ける予定である。本研究は、Tリンパ球の胸腺内分化選択機構の分子理解を目標にした独自の研究成果に基づき、分化途上のTリンパ球が胸腺微小環境の構築に必須であることに着眼した胸腺上皮細胞刺激因子の同定を行い、更に胸腺上皮特異的機能分子の発現を指標にした皮質上皮細胞と髄質上皮細胞の分岐機構の解析へと進むことで、Tリンパ球レパトア選択を担う胸腺微少環境の多段階構築機構を分子レベルで解明することを目的としている。平成21年度の成果としては、まず、胸腺髄質上皮細胞の産生するCCR7ケモカインによる幼若Tリンパ球の髄質移動が、組織特異的自己抗原に反応性を示すTリンパ球の負の選択に必要であることを明らかにした。このとき併せて、胸腺内を動き回る樹状細胞が髄質上皮細胞に提示される組織

特異的自己抗原を皮質に運んで提示することによって、自己抗原反応性Tリンパ球の排除を行うことも明らかになった。また、胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現される胸腺プロテアソームによるタンパク質分解が、CD8T細胞の効率よい正の選択をひきおこすペプチド-クラス1MHC複合体の産生に必要であり、その結果として有用Tリンパ球レパトアの形成と有効なウイルス感染防御に必要であることを明らかにした。更に、胸腺微少環境構築機構の解析を進め、胎生期胸腺の形成には神経冠由来間葉系細胞に発現される転写因子MafBをはじめ、KIAA1440,TRRAP,SKIV2L2といった因子が必要であることを明らかにした。本研究は、Tリンパ球の胸腺内分化選択機構の分子理解を大きな目標に、分化途上のTリンパ球が胸腺微小環境の構築に必須であることに着眼した胸腺上皮細胞刺激因子の同定を行い、更に胸腺上皮特異的機能分子の発現を指標にした皮質上皮細胞と髄質上皮細胞の分岐機構の解析へと進むことで、Tリンパ球レパトア選択を担う胸腺微小環境の多段階構築機構を分子レベルで解明することを目的とした。平成22年度の研究成果としては、まず、胸腺髄質上皮細胞の産生するケモカインXCL1による胸腺内樹状細胞の髄質中央部への誘引が、胸腺における制御性T細胞の産生に重要であるとともに、自己免疫疾患原因分子のひとつAireによって制御されることが明らかになった。また、胸腺皮質上皮細胞に特異的に発現されるβ5t鎖を含む胸腺プロテアソームによるタンパク質分解が、CD8T細胞の効率よい正の選択をひきおこすペプチドークラス1MHC複合体の産生に必要であり、その結果として有用Tリンパ球レパトアの形成と有効な生体防御に必要であることが明らかになった。更に、胸腺プロテアソーム構成鎖β5tの遺伝子座にCreを組換えることで皮質上皮細胞特異的に遺伝子を改変させるマウスの作出をほぼ完了するとともに、ケモカインCCL21の遺伝子座に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組換えることでCCL21を発現する髄質上皮細胞特異的に蛍光検出するマウスの作製を進めた。これら新たな材料を用いることで今後、胸腺皮質上皮細胞と胸腺髄質上皮細胞の分岐機構の解明に挑む。
ナノデバイス・センサ構築のための機能性ナノアレイシートの開発

伸張・整列固定したDNA上への選択的金属化が可能となり、再現性良く金属ナノアレイシートを作成する事が出来た。作製された金属ナノアレイシートをAFMおよびSNOMを用いて観察したところ、近接場光と強い相互作用を示すことが確認された。またシートの別基板へ転写印刷が可能であり、異なる金属ナノアレイの集積が可能となった。またDNAに強く結合可能な金および銀ナノ粒子を新規に合成し、DNAに対する相互作用を評価した。これらナノ粒子はいずれもDNAと強く結合し、また伸張・整列固定させたDNAに沿って1次元集合させることができた。DNA上に沿って1次元集合した金・銀ナノ粒子のプラズモン共鳴ピークは長波長側にシフトし、観察される散乱光も長波長シフトした。この結果はDNA上に結合した金属ナノ粒子間において強い局在プラズモンカップリングが発現していることを示しており、DNA上に沿ったエネルギー移動が可能であることが分かった。またDNA上の特定塩基配列上に様々な生体分子を固定する技術"バイオナノバーコード技術"を確立する事が出来た。本年度は、1種類のペプチドをDNAの任意位置に結合可能なモデル系の構築を行い、その結合形成の確認を行った。この技術は、DNA上に配置する生体分子の種類によって、タンパク質問、タンパク質-リガンド間相互作用の解析を実現するのみならず、抗体やペプチドの配置により、アレルゲン検査やエピトープマッピングに適用可能である。様々な機能性分子で修飾されたDNAを作成し、これらを伸張・整列固定しナノセンサーのセンシング部位を構築し、その機能評価を行う。まず様々な機能性分子をDNA上の特定位置に結合させるために、DNAの塩基配列を設計・合成する。様々な機能性分子が結合したDNAを基板表面上に伸張・整列固定し、AFMおよびSNOMを用いて観察する。基板表面上にアレイ化されたDNAと電極部位を接続し、その光・電気応答を観測する。本年度は基板表面上にアレイ化したDNA上へ様々な機能性物質の結合を試みた。はじめにDNAと強い親和性を示す金ナノ粒子を新規に調製し、これをアレイ化したDNA上に沿って結合させ、金属ナノアレイの調製を行った。AFMによりDNA上に結合した金ナノ粒子の様子を鮮明に観測できた。またこの金属ナノ粒子上に局在する近接場光の可視化もSNOMにより可能となった。またこれら金属ナノアレイの電気特性を評価するために、導電性AFMを用いて、形状像と電流イメージ像の同時取得も試みたが、現時点において明確な電流イメージを検出するには至らなかった。この理由として調製された金属ナノアレイの金属析出が離散的であり、電気を流すための十分な導電パスが形成されていないことが考えられる。一方でDNA上の特定塩基配列上に様々な生体分子を固定する技術"バイオナノバーコード技術"を確立する事を試みた。この結果、1種類のペプチドをDNAの任意位置に結合可能なモデル系の構築を行い、その結合形成が可能である事を確認した。
ペリセントロメア特異的エピゲノム編集技術の開発と新規ヒト大脳発生モデルへの応用

近年、ヒト大脳発生を模倣した3次元in vitroモデル「大脳オルガノイド」が報告された。これはヒト大脳発生の詳細な分子機構の解明を可能とする先進的な技術であるが、現状の作成法では、脳回(脳のしわ)や大脳皮質の6層構造は完全には再現できず、また霊長類に特徴的に見られる大脳皮質構造も形成されない。さらに、DNAメチル化パターンの網羅的解析が行われ、胎児脳と比較した結果、大脳オルガノイドにおいて、本来メチル化を受けているセントロメア近傍領域(ペリセントロメア)が未知の機構により脱メチル化され、低メチル化状態に誘導されていた。この状態は精神遅滞を伴うICF症候群と共通する表現型であり、現状の大脳オルガノイド作成法では正常な大脳発生を再現できていない可能性がある。そこで、本研究課題では、DNAメチル化異常を解消した大脳オルガノイドの作成を目的とした。本年度は、ペリセントロメア結合因子でありICF症候群の原因遺伝子であるZBTB24に着目し、DNAメチル化への関与を解析した。HEK293T細胞においてZBTB24のノックダウンを行い、ゲノム全体のメチル化レベルの評価をメチル化感受性制限酵素を用いて実施した。しかし、ZBTB24のノックダウンに伴うDNAの低メチル化の誘導は観察されなかった。今後、ヒト神経幹細胞における過剰発現を行い、分化時の低メチル化を救済できるかを検討する。一方、DNAの脱メチル化に関してアスコルビン酸(ビタミンC)の関与が報告されている。そこで、ヒト神経幹細胞においてアスコルビン酸添加を行った結果、低メチル化の誘導が確認された。アスコルビン酸は大脳オルガノイドだけでなくin vitro神経分化誘導時に添加する試薬の一つであることから、分化時の異常な低メチル化の原因の一つであることが示唆された。2018年度は、実施計画の一つであるZBTB24のDNAメチル化への関与などの機能解析を実施した。その結果、予想に反してZBTB24ノックダウンでは、DNAのメチル化への影響がないことが明らかになった。一方、DNAの脱メチル化を亢進することが報告されているアスコルビン酸について検討を行なった結果、確かにヒト神経幹細胞のDNAの低メチル化を誘導することが明らかになった。この検討をもとに、ヒト神経幹細胞から大脳オルガノイドを誘導した結果、未分化な神経幹細胞と比較し、DNAのメチル化が促進されていることが分かった。今後この新たな培養法を基盤に研究を進めていく予定である。以上のように、ZBTB24の役割に関して予想に反した結果を得たが、新たな方針の元、これまでにない大脳オルガノイド培養法の確立につながり、研究を進展させることができた。今後、ZBTB24の過剰発現による役割の検討の継続、および、ヒト神経幹細胞を利用した新規大脳オルガノイドにおける、次世代シークエンサーを用いたペリセントロメア領域のメチル化レベルの評価を中心に行う。また、本研究課題を基課題にした国際共同研究強化(A)が採択されたため、創薬を志向した培養法の確立へと発展させていく。

この検討をもとに、ヒト神経幹細胞から大脳オルガノイドを誘導した結果、未分化な神経幹細胞と比較し、DNAのメチル化が促進されていることが分かった。今後この新たな培養法を基盤に研究を進めていく予定である。以上のように、ZBTB24の役割に関して予想に反した結果を得たが、新たな方針の元、これまでにない大脳オルガノイド培養法の確立につながり、研究を進展させることができた。今後、ZBTB24の過剰発現による役割の検討の継続、および、ヒト神経幹細胞を利用した新規大脳オルガノイドにおける、次世代シークエンサーを用いたペリセントロメア領域のメチル化レベルの評価を中心に行う。また、本研究課題を基課題にした国際共同研究強化(A)が採択されたため、創薬を志向した培養法の確立へと発展させていく。本年度の本研究課題の初年度であり、大脳オルガノイドにおける異常なDNAの脱メチル化に深く関与すると予想されたZBTB24の役割の解明を実施した。これまでの予備的検討でZBTB24の発現低下がDNAの低メチル化を誘導することが示唆されていたため、ZBTB24のノックダウンを実施し、DNAのメチル化レベルを評価した。その結果、予想に反し、DNAのメチル化レベルに変化はなく、研究の方針の転換を余儀なくされた。そこで、文献の検索や、学会などでの情報収拾に数ヶ月を要し、そこで得た情報をもとに研究の方針を決定した。そこで、DNAの低メチル化を誘導することが報告されているアスコルビン酸(ビタミンC)に着目し、新たな大脳オルガノイドの作成に着手した。このような情報収拾に時間を要した経緯があったため、残額が生じた。
新規硫酸化ブロック多糖・オリゴ糖の合成と抗エイズウイルス作用メカニズムの解明

硫酸化多糖の作用機構は、HIVがヒト免疫細胞のT4リンパ球などに吸着・感染することを阻害する働きと推定されている。この作用機構を明らかにするために、高分子化学の立場から新規で構造明確な硝酸化多糖を合成し作用機構の解明、今までにない抗エイズ薬の開発を目指す。多糖・オリゴ糖の持つ生命機能を基礎的に解明・発展させて、高次認識糖鎖の構築を目指す。すなわち、相互作用機構は硫酸化多糖の硫酸基に由来する(-)電荷とHIVの表皮タンパクgp120の(+)電荷部位との静電的相互作用と考えられるので、最終年度では、リジンなどに由来する(+)電荷を持つアミノ酸とロイシンなど電荷にあまり関係のないアミノ酸からなり電荷密度の異なるオリゴペプチドを合成し、硫酸化多糖・オリゴ糖との相互作用を複数の分光学的方法によって詳細に検討することにより、多糖構造と機能との関係を解明する。
条件の複雑な流体の汎用的な数値解析法の基礎と工学への応用

本研究では,非長方形の解析領域,移動したり境界条件が複雑な境界,更には特殊外力下のような,条件の複雑な流体の数値解析のため,移動境界と共に変形するセルに積分型の保存則を適用し,また多種多様な境界条件を統一的に扱う「変形可能セル法」を確立し,いくつかの工学的な問題へ適用した.1.自由表面波および密度界面浪の解析:河口密度流,発電所からの温排水に関連して.斜面上の二層流体における自由表面波・密度界面波の鉛直解析を実施した.この解析で特に問題となった「開いた境界」と「微小セル」の扱いについては,一定の認識に達した(CFD JOURNAL, MOVING BOUNDARIES'95, 6th ISCFD).2.移動物体と流体の相互作用:浮体あるいは生体内外の流れ,また3.とも関連する「磁性流体中の非磁性体による磁気駆動」は,次期の課題とする.3.特殊外力下の流体:「磁性流体中の波動」を理論解析と数値解析双方で進展させた.(1)交流磁場が発生する共鳴的な表面波動の安定性解析, (2)強磁場が形成する強非線形・多価な表面波形の等角写像法による記述,などの理論解析は,数値解析・実験に指針や検証法を与える.数値解析では,「変形可能セル法」の枠組みを大きく変更することなく,交流磁場による共鳴的な表面波動の解析まで実施できた(計算力学[IV]).微小重力下の流体現象は,粘性や表面張力が相対的に重要で興味深いが,将来の課題となった.4.数値流体力学の基礎:オリジナルな部分の多い計算機プログラムの作成を強力に支援する「3次元汎用流体解析システム」を新たに構築した.このシステムは,数値解析結果の診断法や,安定性や精度のよい数値解析法に関する知識を実証的かつ系統的に蓄積するための基盤と位置づけられる.本研究では,非長方形の解析領域,移動したり境界条件が複雑な境界,更には特殊外力下のような,条件の複雑な流体の数値解析のため,移動境界と共に変形するセルに積分型の保存則を適用し,また多種多様な境界条件を統一的に扱う「変形可能セル法」を確立し,いくつかの工学的な問題へ適用した.1.自由表面波および密度界面浪の解析:河口密度流,発電所からの温排水に関連して.斜面上の二層流体における自由表面波・密度界面波の鉛直解析を実施した.この解析で特に問題となった「開いた境界」と「微小セル」の扱いについては,一定の認識に達した(CFD JOURNAL, MOVING BOUNDARIES'95, 6th ISCFD).2.移動物体と流体の相互作用:浮体あるいは生体内外の流れ,また3.とも関連する「磁性流体中の非磁性体による磁気駆動」は,次期の課題とする.3.特殊外力下の流体:「磁性流体中の波動」を理論解析と数値解析双方で進展させた.(1)交流磁場が発生する共鳴的な表面波動の安定性解析, (2)強磁場が形成する強非線形・多価な表面波形の等角写像法による記述,などの理論解析は,数値解析・実験に指針や検証法を与える.数値解析では,「変形可能セル法」の枠組みを大きく変更することなく,交流磁場による共鳴的な表面波動の解析まで実施できた(計算力学[IV]).微小重力下の流体現象は,粘性や表面張力が相対的に重要で興味深いが,将来の課題となった.4.数値流体力学の基礎:オリジナルな部分の多い計算機プログラムの作成を強力に支援する「3次元汎用流体解析システム」を新たに構築した.このシステムは,数値解析結果の診断法や,安定性や精度のよい数値解析法に関する知識を実証的かつ系統的に蓄積するための基盤と位置づけられる.本研究の目的は,非一様で変形し,かつ複雑な条件が課せられる境界によって囲まれた流体の汎用的な数値解析法を,工学における問題に適用しながら確立していくことである.このために掲げた具体的なテーマは,1.自由表面波および密度界面波の解析,2.移動物体と流体の相互作用,3.特殊外力下の流体,4.数値流体力学の基礎,である.本年度は特に,3.に関連して「磁性流体の表面波・界面波」の理論的研究と数値的研究を重点的に推進した.理論的研究では,変動磁場のもとで相互作用しながら時間変化する二層磁性流体の表面と界面に注目し,それらの変位の時間変化を記述する「normal mode方程式」に基づいて波動の分散関係・安定性ダイヤグラムを導き出し,数値的研究・実験的研究に指針や検証法を与えた.数値的研究ではこれまで,「変形可能セル法」を開発してきた.これは,境界の動きと共に変形するセルと積分型の保存則を用い,境界条件を統一的に扱う数値解析法であるが,磁性流体中の波動を扱う場合でも,大きく枠組みを変更することなく,流体解析・磁場解析・磁場作用の取り込みを行うことができた.これら成果の一部は,国際会議(5th ISCFD),欧文論文(Proc. 43th NCTAM投稿中),およびいくつかの研究集会で発表した.

この他の進展としては,主に1.に関連して「開いた境界」の扱いについて一定の認識に達したこと,変形可能セル法の安定性解析に道をつけたこと,手持ちの装置で数値解析結果の動画化を行ったことなどを挙げることができる.来年度以降は,「密度界面の不安定化機構」「磁性流体の表面波・界面波」を続行すると共に,「生体内外の流れ」(2.に関連),粘性や表面張力が相対的に重要な「微小重力下の流体」(3.に関連),「流体数値解析法のデータベース作成」(4.に関連)についても開始を予定している.本研究では、自由表面,密度界面など,形状が変化したり,複雑な条件が課せられる境界で囲まれた流体を想定して,その汎用的な数値解析法を開発し,いくつかの工学的な問題への応用を目指している。物理的に簡明で,様々な問題への対応が柔軟な,「変形可能セル法」に対する積分型の保存則から数値解析式を導き,これを基礎として計算機コードを作成し,以下のテーマに取り組んできた.1.自由表面波・密度界面波の,地形や流れとの相互作用.2.浮体周り,生体の外部・内部の流れのような,移動物体と流体の相互作用.3.磁場中の磁性流体や,粘性や表面張力が相対的に重要な微小重力中の流体など,特殊外力下の流体.4.数値解析結果の診断法や、安定性や精度のよい数値解析法のための,数値流体力学の基礎.1.に関連して,波動の鉛直解析に現れる様々な境界条件のうち,「開いた境界」については一定の認識に達したが(Computational Fluid Dynamics JOURNAL 3(3),pp.257-272),本年度は,傾斜面と自由表面・密度界面の交差点付近に現れる微小セルを注意深く扱うことで、より長い時間まで実用化レベルの数値解析を可能にした(MOVING BOUNDARIES'95,6th ISCFDにて発表予定).磁性流体に関しては,表面波動の数値解析法について発表を行った(5th ISCFD,Proc.of NCTAM-43,計算力学[IV]).ところで,磁性流体中の非磁性流体は,外部磁場で力を加えたり動かすことができ,アクチュエータへの応用が考えられるが,その数値解析を2.と3.の組み合わせとして検討中である.現在使用中の計算機コードは,個々の問題に依存しない部分と依存する部分とに分離できるように作成してきたが,試行錯誤を経て整理する必要を感じてきた。このため本年度から,もっと一般化やベクトル化を進めた新しい計算機コードを作り始めている.この際の記録を,4.のために役立てる.本研究では,流体の数値解析において,解析領域の形が特殊なだけでなく,境界が移動したり,そこで複雑な境界条件が課せられていたり,更には特殊な外力を受ける場合でも,条件の複雑さが負担や障害とならない数値解析法の開発と,いくつかの工学的な問題への応用を目指してきた.移動境界と共に変形するセルに積分型の保存則を適用して数値解析式を導き,ひとつの「境界方程式」で様々な境界を扱う「変形可能セル法」に基づいて,以下のテーマに取り組んできた.1.自由表面波および密度界面波の,地形や流れとの相互作用,2.浮体周り,生体の内部・外部のような,移動物体と流体の相互作用,3.磁場中の磁性流体や,粘性や表面張力が相対的に重要な微小重力中の流体など,特殊外力下の流体,4.数値解析結果の診断法や,安定性や精度のよい数値解析法の開発のための,数値流体力学の基礎.2.について大きな進展はなかった.3.と関連して発展したのは,強磁場下における磁性流体自由表面の理論解析である.この場合の表面形状は,スパイクの集合とでも言うべき特異なもので,極めて非線形性が強く多価でもあるが,等角写像法によるこのような現象の扱い方が明らかになった.現在,前年度以前の波動解析を,この立場から見直している.これらの解析はいずれ,数値解析結果の検証に利用される.
外来遺伝子侵入のリスク評価と在来資源の保全管理手法の解明:アサリをモデルとして

アサリ、マダイ、ニシンの遺伝的変異性を調べ、移植放流が在来集団に及ぼす遺伝的影響を評価した。現在大量に輸入されているのは日本に生息しないRuditapes bruguieriであり、アサリと形態が酷似し遺伝的分化は大きくない。鹿児島湾のマダイでは大量放流によって希少アリルが消失したが、遺伝的影響は軽微かつ湾内にとどまる。ニシンでは種苗放流の遺伝的影響は見られない。また、遺伝的分化と混合率の解析手法とソフトウェアを開発した。本研究では,外来遺伝子(在来と異なるという意味において)の侵入が在来集団に及ぼす影響やリスクを適切に評価することにより,在来集団の保全方策を解明することを目指している.今年度は,中国(金州,丹東),有明海(滑石,松雄)と不知火海(龍ヶ岳,牛深)からアサリの標本を採取し,各サンプル105個体のアイソザイム分析を行って8遺伝子座において遺伝子型を決定した.平均アリル数は、5.9から7.4の範囲にあり,標本によって特に大きな違いはなかった.平均ヘテロ接合体率は0.253から0.337で,すべての集団でホモ接合体過剰となっていた.アリル頻度において、丹東は他のどの標本とも大きく異なった(Fst=0.15-0.26).金州は日本の標本と有意に異なったが,有明海により近く(Fst=0.007-0.011),不知火海とは少し差があった(Fst=0.021-0.032).日本の標本は隣り合う地域間ではいずれも差がなかったが,地理的距離が離れると遺伝的分化は小さいが有意となった.有明海の滑石周辺にはアサリの畜養施設があり,大量の中国アサリが畜養されている.滑石の標本では,金州の混合率が0.2636±0.1000,丹東のそれは0.0834±0.0402と推定された.また,これまで中国および日本の他県からの移植実績がない松雄では,金州の混合率が0.3595±0.1083,丹東のそれは0.0444±0.0426と類似の結果が得られた.丹東の混合率の95%信頼区間の下限はいずれも0で,混合の可能性はないと考えてよさそうである.滑石の標本については,漁場から獲られたもので,中国アサリを含む可能性は極めて小さい.また,移植実績がない松雄の方が金州の混合率が大きく推定された.これらより,金州と有明海では遺伝的に近く同じアリルを共有していることがノイズになって,見かけ上中国アサリが混合しているかのような結果が得られたものと判断された.本研究では,アイソザイムを用いたが,本年待たれていたアサリのマイクロサテライトマーカーが開発されたので,これを用いることでさらに精度のよい推定が可能になることが期待される.この他,遺伝的分化と混合率の推定のための新しい推定方法を開発し,その有効性をシミュレーションで明らかにするとともに,ニシンやノコギリガザミのデータに適用した.また,種苗放流の遺伝的リスク評価の基礎となる放流効果についても,代表的な放流対象種であるクルマエビ,マダイ,ヒラメについて総括し評価した.本研究では,外来遺伝子(在来と異なるという意味において)の侵入が在来集団に及ぼす影響やリスクを適切に評価することにより,在来集団の保全方策を解明することを目指している。本年度は、昨年行った中国、北朝鮮、有明海のアサリの集団構造と中国アサリの有明海での混合率推定結果を論文として発表した。この過程で、中国および北朝鮮から輸入されているアサリは殆どがRuditapes bruguieri(中国アサリ,仮称)であり、日本のアサリR.philippinarumとは別種であることを始めて明らかにした。これらはこれまでアサリと混同されており、外来種であることから、特定外来種に指定する等特段の注意を払うべきである。なお、有明海での,中国アサリの混合率は0と推定され、今のところ生態系への侵入の可能性はないと考えてよさそうである。本研究では,遺伝マーカーとしてアイソザイムを用いたが,さらに精度の良い解析を行うため、ミトコンドリアDNAの塩基配列および昨年開発されたマイクロサテライトマーカーを用いて個体の遺伝子型を決定した。アサリのミトコンドリアDNAは性によって遺伝様式が異なることが知られており、個体によっては遺伝子型の決定が困難であった。また、マイクロサテライトマーカーについても、既存のマーカーが働かない座位があり、これら既存の高感度マーカーの実用性については来年度更に検討する予定である。さらに、代表的な集団間の遺伝的分化の指標であるFstについて、従来法では海洋生物や鳥類など遺伝子流動の大きい生物では過大推定されることを明らかにし、これを偏りなく推定する新しい方法を開発し、論文を発表した。

本研究では,外来遺伝子の侵入が在来集団に及ぼす影響やリスクを適切に評価することにより,在来集団の保全方策を解明することを目指している。本年度は、中国および北朝鮮から輸入されているRuditapes bruguieri(中国アサリ,仮称)、日本のアサリR.philippinarumおよびヒメアサリR.variegatusついて、昨年までにアイソザイム分析を行った個体と同一標本を用いて、ミトコンドリアDNAのCOXI領域の塩基配列およびマイクロサテライトマーカー4遺伝子座における遺伝子型を決定した。大量標本の分析に先立ち、ミトコンドリアDNAでは、雌雄判別した個体を用いてDoubly uniparental inheritance(DUI)を確認し、F-typeの配列を集団解析に用いることとした。また、外部形態を計測し、多変量解析を行った。その結果、中国アサリとアサリの遺伝的分化はヒメアサリとアサリの分化に比べ極めて小さいが、両種は明らかに遺伝的に異なる別種または亜種であることが明らかになった。しかし、形態ではこれらを明確に判別することはできないことがわかった。また、日本のアサリ集団内の遺伝的分化は小さく明確な集団構造は見られなかったが、地域によって遺伝的特徴が少しずつ異なっており、遺伝子流動の大きいメタ集団を形成していることが示唆された。データ解析手法については、放流前の遺伝情報がなくても放流群の混合率を推定できる方法を新たに開発した。また、昨年までに開発した集団間の遺伝的分化の指標であるFstをほぼ不偏推定できる方法について、誰でも簡単に使えるソフトウエアを作成した。これらはウェブ上から無償でダウンロードできるよう現在準備を進めている。
運動時の脂肪酸化に対する中枢インスリン作用の解明―健常人と2型糖尿病における検討

漸増運動負荷時にみられる最大脂肪酸化率は、運動不足やインスリン抵抗性では低いことが知られる。一方、脳内インスリン動態は、糖・エネルギー代謝に影響を及ぼし、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態は、体重減少、食事性熱産生の増加、食欲抑制をもたらす。しかし、脳内高インスリン状態が運動中のエネルギー代謝に及ぼす影響については不明であり、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態が運動時の脂肪酸化に及ぼす影響について検討した。正常体重(N群、15名)と過体重(BMI ≧25 kg/m2、O群、8名)の若年健常者に対し、インスリン(INS)またはプラセボ(PL)の2試行をランダム化単盲検交差試験として実施した。朝絶食でレギュラーインスリン(40単位)または生理食塩水を鼻腔内に投与した後、呼吸商が1.0に達するまで漸増運動負荷を実施した。間接的熱量測定の結果から、個々の対象で運動強度対脂肪酸化率の二次曲線を作成し、運動中の最大脂肪酸化率(max FOR)とその際の運動強度(FATmax)を求めた。血中グルコースおよびインスリン濃度は鼻腔内投与により変化しなかった。N群ではmax FOR、FATmaxならびに運動中の総脂肪酸化量はINSでPLに比し有意に低値を示した。O群のmax FORはN群に比し有意に小さく、鼻腔内投与による影響を受けなかった。N群では運動負荷終了時の血中アドレナリン濃度の上昇がINSにより抑制される傾向を示したが、O群ではこの効果は認められなかった。以上の成績より、鼻腔内インスリン投与は血中インスリン濃度を上昇させずに運動時の脂肪酸化を抑制した。脳内高インスリン状態は交感神経系の抑制を介して、運動時の脂肪動員を抑制する可能性が示された。一方、運動中の脂肪酸化抑制効果が過体重で消失したことから、過体重では脳内インスリン作用が減弱しているものと考えられた。本研究において、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態が運動時の脂肪酸化に及ぼす影響について検討を進めている。【方法】若年健常者9名(21.3 ±4.8 (SD)歳)に対し、ランダム化単盲検交差試験を実施した。インスリン(INS)またはプラセボ(PL)の2試行について、順番は無作為に少なくとも1週間の間隔をあけて実施した。朝絶食にてレギュラーインスリン(40単位)もしくは生理食塩水を点鼻スプレーを用いて投与したのち、漸増運動負荷試験を実施した。間接的熱量測定の結果から、個々の対象において運動強度(%peakVO2)対脂肪酸化率(mg/kg/min)の二次曲線を作成し、最もフィットする近似式から、運動中の最大脂肪酸化率(max FOR)とその際の運動強度(FATmax)を求めた。2試行間における差について、Wilcoxon検定または反復測定のtwo-way ANOVAを用いて検定した。【結果】血中グルコースおよびインスリン濃度は鼻腔内投与により変化しなかった。max FOR (2.69 ±0.19 (SE)vs. 3.24 ±0.30 mg/kg/min, p = 0.038)と運動中の総脂肪酸化量は、INSでPLに比し小さくなった。FATmaxはINSで低値となる傾向を示した。運動負荷終了時の血中ノルエピネフリン濃度はINSでPLに比し低かったが、統計学的有意差は認められなかった。血中レプチン濃度は両試行とも鼻腔内投与ならびに運動負荷の影響を受けなかった。【考察】若年健常者において、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態は、血中インスリン濃度を上昇させることなく運動時の脂肪酸化を抑制することが示唆される。今後さらに対象数を増やし、交感神経系の関与について検証を進める。初年度は若年健常者を対象とした検討を行う予定であったが、おおむね予定通りの対象者数を用いた実験を進めることができている。本研究において、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態が運動時の脂肪酸化にもたらす効果と、その効果に対する過体重の影響について検討を進めている。【方法】正常体重(N群、11名)ならびに過体重(BMI ≧25 kg/m2、O群、7名)の若年健常者に対し、インスリン(INS)ならびにプラセボ(PL)の2試行を実施した。朝絶食にてレギュラーインスリン(40単位)または生理食塩水を鼻腔内に投与したのち、漸増運動負荷試験を実施した。間接的熱量測定の結果から、個々の対象において運動強度対脂肪酸化率の二次曲線を作成し、運動中の最大脂肪酸化率(max FOR)とその際の運動強度(FATmax)を求めた。2試行間における差について、paired t検定または反復測定のtwo-way ANOVAを用いて検定した。【結語】鼻腔内インスリン投与は、血中インスリン濃度を上昇させることなく運動時の脂肪酸化を抑制した。脳内高インスリン状態は交感神経系の抑制を介して、運動時の脂肪動員を抑制する可能性が示唆された。一方、運動中の脂肪酸化抑制効果が過体重で消失したことから、過体重では脳内インスリン作用が減弱している可能性がある。平成29年度は、それまでの若年健常者を対象とした実験を進めつつ、一部、中高年を対象とした実験にも着手する予定であったが、中高年を比較対象とした場合、脳内インスリン作用に対する年齢と末梢インスリン抵抗性それぞれの影響を区別することが困難であると判断した。

このため、同年代かつ、末梢インスリン抵抗性を獲得していると想定される過体重もしくは肥満を対象とした実験を進め、脳内高インスリン状態が運動時の脂肪燃焼にもたらす効果に対する過体重の影響について検討することを試みた。漸増運動負荷時にみられる最大脂肪酸化率は、運動不足やインスリン抵抗性では低いことが知られる。一方、脳内インスリン動態は、糖・エネルギー代謝に影響を及ぼし、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態は、体重減少、食事性熱産生の増加、食欲抑制をもたらす。しかし、脳内高インスリン状態が運動中のエネルギー代謝に及ぼす影響については不明であり、鼻腔内インスリン投与による脳内高インスリン状態が運動時の脂肪酸化に及ぼす影響について検討した。正常体重(N群、15名)と過体重(BMI ≧25 kg/m2、O群、8名)の若年健常者に対し、インスリン(INS)またはプラセボ(PL)の2試行をランダム化単盲検交差試験として実施した。朝絶食でレギュラーインスリン(40単位)または生理食塩水を鼻腔内に投与した後、呼吸商が1.0に達するまで漸増運動負荷を実施した。間接的熱量測定の結果から、個々の対象で運動強度対脂肪酸化率の二次曲線を作成し、運動中の最大脂肪酸化率(max FOR)とその際の運動強度(FATmax)を求めた。血中グルコースおよびインスリン濃度は鼻腔内投与により変化しなかった。N群ではmax FOR、FATmaxならびに運動中の総脂肪酸化量はINSでPLに比し有意に低値を示した。O群のmax FORはN群に比し有意に小さく、鼻腔内投与による影響を受けなかった。N群では運動負荷終了時の血中アドレナリン濃度の上昇がINSにより抑制される傾向を示したが、O群ではこの効果は認められなかった。以上の成績より、鼻腔内インスリン投与は血中インスリン濃度を上昇させずに運動時の脂肪酸化を抑制した。脳内高インスリン状態は交感神経系の抑制を介して、運動時の脂肪動員を抑制する可能性が示された。一方、運動中の脂肪酸化抑制効果が過体重で消失したことから、過体重では脳内インスリン作用が減弱しているものと考えられた。平成29年度はひきつづき若年健常者を対象とした実験を進め、一部、中高年を対象とした実験にも着手する。しかし、平成28年度の検討結果から、対象によっては運動強度対脂肪酸化率の二次曲線について、カーブフィッティングが不良となることがわかり、一定数の対象が解析から除外される可能性があることを考慮すると、今後は当初の予定より多くの対象者数を設定する必要がある。若年健常者を対象とした実験と比較して、過体重・肥満を対象とした実験実施が依然予定件数に至っておらず、ひきつづき実験を進める。同時に運動中の血中グリセロールならびにレプチン濃度の測定・分析を進め、交感神経系ならびに内分泌学的機序の関与について検証を進める。設備費として計上していた運動負荷用自動血圧計の納入金額が当初の見積りを下回ったことと、実験被験者に対する謝金の一部は他の財源より支出したため次年度使用額が発生した。(理由)実験や生化学分析に必要な消耗品の購入費用の一部は他の財源より支出したため次年度使用額が発生した。(使用計画)過体重もしくは肥満を対象とした実験をさらに進める予定であり、これに伴い発生する謝金と血液検査委託費に充当する。