hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大気汚染・水質汚濁現象を統合した都市環境制御

本研究の目的は,相互に独立して進歩してきた大気汚染・水質汚濁制御を現象論的・制御論的に統合して,総合的な都市環境制御の成熟をはかることであり, 3年間の研究期間にほぼ次のような成果を得ることができた.1.まず,気象予報システムの発展動向を調査して,メソミクロの大気および降雨現象が関係する本課題の目的はまだ十分に意識されていないこと,したがって本研究を雲物理学雲化学的にすすめることの意義を再確認した.ただし,これに応じて必要となる降雨・気象観測密度はAMeDASではまだ不十分で,観測点の最適配置の問題はむしろ今後に残された.2.大気拡散モデルだけでは汚染物の時空間的地表面源供給量分布を得られないので,メソスケールの海陸風に関する計算機流体力学によるシミュレーション手法をほぼ完成させ,これへのSO_x, NO_xの地表面沈着モデルの組込みも行った.一方,速度論型の微量有害化学物質多相環境運命予測モデルの開発に関連して,大気・水・土壌中濃度の相互関係を定式化し,これに対してもメソ気象モデルの適用が必要なことを見出した.3.上記の多相運命モデルに関する雨天時流出のデータの分析によって,ケモグラフの特性を化学物質の土壌平衡吸着常数の差異で説明することに成功し,従来のポリュートグラフの取扱いを格段に発展させた.4.流域土地利用特性に対した降雨情報の予測が可能になるという前提のもとに,浸水被害を実時間的に最小化するDP型の都市雨水流出制御戦略をDDMによって定式化し,一方この前提があいまいな場合のポンプ場での雨水汚濁制御法として,ファジー制御が有効なことを明らかにした.5.酸性雨形成現象に伴う雨滴の汚染ガス吸収反応を,雨滴内外での物質移動,雨滴内の酸化反応として詳細にモデル化し,大気と雨滴の化学工学的諸特性相互間の種々の関係を導いた.本研究の目的は,相互に独立して進歩してきた大気汚染・水質汚濁制御を現象論的・制御論的に統合して,総合的な都市環境制御の成熟をはかることであり, 3年間の研究期間にほぼ次のような成果を得ることができた.1.まず,気象予報システムの発展動向を調査して,メソミクロの大気および降雨現象が関係する本課題の目的はまだ十分に意識されていないこと,したがって本研究を雲物理学雲化学的にすすめることの意義を再確認した.ただし,これに応じて必要となる降雨・気象観測密度はAMeDASではまだ不十分で,観測点の最適配置の問題はむしろ今後に残された.2.大気拡散モデルだけでは汚染物の時空間的地表面源供給量分布を得られないので,メソスケールの海陸風に関する計算機流体力学によるシミュレーション手法をほぼ完成させ,これへのSO_x, NO_xの地表面沈着モデルの組込みも行った.一方,速度論型の微量有害化学物質多相環境運命予測モデルの開発に関連して,大気・水・土壌中濃度の相互関係を定式化し,これに対してもメソ気象モデルの適用が必要なことを見出した.3.上記の多相運命モデルに関する雨天時流出のデータの分析によって,ケモグラフの特性を化学物質の土壌平衡吸着常数の差異で説明することに成功し,従来のポリュートグラフの取扱いを格段に発展させた.4.流域土地利用特性に対した降雨情報の予測が可能になるという前提のもとに,浸水被害を実時間的に最小化するDP型の都市雨水流出制御戦略をDDMによって定式化し,一方この前提があいまいな場合のポンプ場での雨水汚濁制御法として,ファジー制御が有効なことを明らかにした.5.酸性雨形成現象に伴う雨滴の汚染ガス吸収反応を,雨滴内外での物質移動,雨滴内の酸化反応として詳細にモデル化し,大気と雨滴の化学工学的諸特性相互間の種々の関係を導いた.1.寝屋川北部流域における雨水流出抑制施設の効果をタンクモデルによって予測し、土地利用状況などを考慮しながら、各施設の効果,経済性,環境への影響等を多基準分析し、貯留・浸透容量の流域内配分について知見を得た。また、流域下水道一河川システムにおける雨水流出過程の実時間制御をDDMによって最適化する方法について検討し、実行可能な制御方式を提案した。つぎに化学平衡論に基づく運命予測モデルの検定・検証を行ない、環境中化学物質濃度のオーダーを推定し、環境リスクに関して化学物質の順位づけを行った。2.メソスケール気象モデルに関して、前年度までに二次元を対象に、山岳などの地形を任意に境界条件として与えること、人工廃熱の効果を含めた地表面熱収支モデルにより地表面温度を求めること、大気安定度に応じた乱流拡散係数を与えることなどを完了したが、本年度はこれに大気汚染物質の移流,拡散,光化学反応による変質,乾燥沈着による除去等の過程を組み込み、主要な大気汚染物質の濃度計算を行った。また大気流動については三次元への拡散を行い、大阪平野を対象としたシミュレーションを試み、定性的にはほぼ妥当な結果を得た。大気汚染物質濃度計算の三次元への拡散および降雨モデルは次年度の課題である。3.化学反応から酸性雨について検討し、次の知見を得た。雨水酸性化の二大原因物質はS【O_x】、N【O_x】由来のS(【vI】)、N(【V】)、とである。S(【VI】)の寄与が支配的で、S(【VI】)の大半は雲粒や雨滴が3吸収したS【O_2】ガスの【H_2】【O_2】、【O_2】によるS(【IV】)→S(【VI】)の液相酸化過程で生成する。

N(【V】)の寄与の程度は明らかでないが、N【O_2】ガスの気相反応で生成したHN【O_3】ガスの吸収がN(【V】)の主たる成因である。従って雨滴中のS(【VI】)は、S【O_2】ガス吸収→滴内液相酸化反応、N(【V】)はN【O_2】気相反応→HN【O_3】ガス吸収、という過程をモデル化すればよい。ガス吸収量と滴内反応時間とに対する影響因子である雨滴の粒怪分布について検討の必要がある。
運動遅滞児の運動発達過程と親子関係の研究

この研究では運動遅滞児(運動能力テストを実施して下位25%の者)の運動発達過程と養育態度について,運動優良群(上位25%の者)と比較して検討した結果,次のことが明らかとなった.歩行運動(自由に歩く,階段の登り降り等11項目)では項目通過率を80%でみた場合,運動遅滞群と運動優良群に大きな発達差はみられなかった.走運動(直線走,競争走等5項目)では競争走において運動遅滞群が1年の発達の遅れをみたが,その他では差はみられなかった.跳躍運動(単純上下跳躍,片足連続跳躍,縄跳び,スキップ等8項目)で両群に有意な差のみられる項目をみると,階段(2,3段)からの飛び降りは2歳5月以前,片足連続跳びは3歳11月以前,高度1mからの飛び降りおよび縄跳びは4歳5月以前の各年齢において通過率が低い.鉄棒運動(単純身体振動,前回り下り,足抜き回り等6項目)の可能(開始)年齢は両群とも4歳以降であったが,単純身体振動運動以外は1年1年半の発達の遅れがみられ,有意であった.以上のことから運動遅滞群は歩・走などの平面移動運動では特に発達遅滞はみられないが,上下運動の加わる跳躍,鉄棒運動などで発達遅滞がみられるようになり,年齢的には2歳半3歳以降目立つようになるといえるだろう.次に運動遅滞児の養育態度についてみると,消極的拒否の態度が運動遅滞群が有意に強く,厳格の態度では運動遅滞群は強いものからほとんど問題のない者まで分散しているのに対し,優良群は4160パ-センタイルを境界として度数が両極に分かれるという結果を得た.干渉および盲従の態度ではやや運動遅滞群が強いという結果であった.矛盾の態度については優良群に強いという結果がえられたが,積極拒否,期待不安,溺愛,不一致の態度には差はみられなかった.以上のことから,幼児期の運動は遊びの中で行われるものであり,親の子供に対する接し方はさまざまな子供の活動に大きく影響していると推測される.この研究では運動遅滞児(運動能力テストを実施して下位25%の者)の運動発達過程と養育態度について,運動優良群(上位25%の者)と比較して検討した結果,次のことが明らかとなった.歩行運動(自由に歩く,階段の登り降り等11項目)では項目通過率を80%でみた場合,運動遅滞群と運動優良群に大きな発達差はみられなかった.走運動(直線走,競争走等5項目)では競争走において運動遅滞群が1年の発達の遅れをみたが,その他では差はみられなかった.跳躍運動(単純上下跳躍,片足連続跳躍,縄跳び,スキップ等8項目)で両群に有意な差のみられる項目をみると,階段(2,3段)からの飛び降りは2歳5月以前,片足連続跳びは3歳11月以前,高度1mからの飛び降りおよび縄跳びは4歳5月以前の各年齢において通過率が低い.鉄棒運動(単純身体振動,前回り下り,足抜き回り等6項目)の可能(開始)年齢は両群とも4歳以降であったが,単純身体振動運動以外は1年1年半の発達の遅れがみられ,有意であった.以上のことから運動遅滞群は歩・走などの平面移動運動では特に発達遅滞はみられないが,上下運動の加わる跳躍,鉄棒運動などで発達遅滞がみられるようになり,年齢的には2歳半3歳以降目立つようになるといえるだろう.次に運動遅滞児の養育態度についてみると,消極的拒否の態度が運動遅滞群が有意に強く,厳格の態度では運動遅滞群は強いものからほとんど問題のない者まで分散しているのに対し,優良群は4160パ-センタイルを境界として度数が両極に分かれるという結果を得た.干渉および盲従の態度ではやや運動遅滞群が強いという結果であった.矛盾の態度については優良群に強いという結果がえられたが,積極拒否,期待不安,溺愛,不一致の態度には差はみられなかった.以上のことから,幼児期の運動は遊びの中で行われるものであり,親の子供に対する接し方はさまざまな子供の活動に大きく影響していると推測される.
DNA結合蛋白質スライディングにおけるGroove-trackingの1分子検証

RNAポリメラーゼは、まずDNAに非特異的に結合してDNA上を1次元的に拡散(スライディング)し、効率よくプロモータに到達し、結合する。この時DNAのgrooveに沿ってらせん状に回転しながら移動するのか(groove tracking)、らせん軸に平行に移動するのか不明であった。我々は、回転の検出が可能なDNA1分子操作による測定系を立ち上げ、groove trackingの存在を証明した。プロモータを含まないDNAフラグメントをミクロンサイズのビーズに国定し、その表面を微小蛍光ビーズでマークし、DNAフラグメントのねじれ回転をビーズの回転として測定できるようにする。DNAフラグメントを結合した蛍光マーク付きビーズを光ピンセットで保持し、ガラス表面に固定したRNAポリメラーゼをDNAでなぞる。DNAとRNAポリメラーゼの接触頻度を上げるために、ビーズに結合していない方の自由端に最強結合配列を導入し、RNAポリメラーゼを介してガラス表面に固定した。groove trackingしている場合には、ビーズの回転が蛍光により観察できる。測定により、DNAの回転によると考えられる蛍光の動きを観察した。competitorとしてRNAポリメラーゼの非特異的複合体形成を阻害するヘパリンや、プロモータ配列を有する短いDNAフラグメントを加えると、回転が妨げられ、不規則な動きが増加するという、groove trackingを支持する結果が得られた。RNAポリメラーゼが、細胞中にDNAより圧倒的に多量に存在するRNAにトラップされずにDNAに親和性を示すのは、2本鎖DNAの特徴である、らせんを認識し、groove trackingしているためかもしれない。DNA結合蛋白質であるRNAポリメラーゼが、プロモータに結合する過程でDNA上をスライディングすることが知られている。このとき、DNAのらせんに沿って動く(groove-tracking)ことを検証するために、DNA1分子操作の手法を用いたアッセイ系を構築した。RNAポリメラーゼをガラス表面に固定し、1本のDNAをなぞりながら動かし、そのときのDNAの回転を検出する、これが実験系のストラテジーである。ガラスを一定速度で動かしたとき、両者の相対的な並進運動により、groove-trackingに伴う回転があれば、DNAの一端に固定したビーズが回転する。微少な蛍光ビーズを1つ貼り付けておくと、蛍光顕微鏡下で、DNAの回転を蛍光ビーズの動きとして検出することができる。DNAは水溶液中では、糸鞠状になったり、ほぐれたりという動きをしている。このアッセイでは伸展した状態でなければ、固定されたRNAポリメラーゼ分子に接触できない。そこで、DNAを伸展させるために、ビーズに結合していない方の自由端に強く結合する配列を加え、RNAポリメラーゼを介してガラス表面に固定した。ステージを約10nm/secで動かすと、時計回り、反時計回りの混ざった赤道面上に限られた回転が得られた。DNAのないビーズで同様の実験を行ったところ、蛍光ビーズは一面上に限られずランダムに動き、ビーズが回転ブラウン運動をしていることを示した。これらの結果は、DNAがRNAポリメラーゼと相互作用することにより回転していることを示している。以上のように、我々の実験結果は、RNAポリメラーゼがgroove-trackingしながらDNAのらせんに沿ってスライディングする事を示す。昨年度構築したDNAの回転を検出する1分子実験系を用いて、RNAポリメラーゼがスライディングする過程における.Groove-trackingを検証する実験を行った。実験系の概要は以下の通りである。RNAポリメラーゼをDNA結合活性を維持してガラスに固定した。ビーズに一端を固定したDNAの自由端を結合し、ビーズをDNAでtetherした、ビーズをガラスから一定の高さに光ピンセットで保持し、ガラスを一定速度で動かすことで、ガラス上のRNAポリメラーゼに対して、DNAをなぞった。その際のビーズの動きを微小蛍光マーキングにより観察、記録した。蛍光マーキングの動きを解析し、回転運動を検出するための2つの指標を定義し、算出した。一つは、蛍光マーキングの分布から得られるdelta-Rで、ビーズの動きに回転軸があることを示す指標である。

もう一つの指標は、蛍光マーキングの位置の時間変化を調べることにより得たRotational Indexで、同方向の回転運動の程度を示す。本実験の他に、コントロール実験として、(1)DNAがない場合、(2)RNAポリメラーゼとDNAの相互作用を妨げるcompetitorを入れた場合、(3)ガラスを停止した場合、について実験を行い、2つの指標を比較した。その結果、competitor存在下ではビーズの回転が抑えられ、ランダムな動きが増加することから、RNAポリメラーゼとDNAの相互作用による回転を検出していることが確認できた。また、本実験は、ガラスを停止させた場合に比べて、回転運動が多くなった。この差は、ガラスを動かして、RNAポリメラーゼとDNAの相対的動きを加えることにより生じたと考えられ、Groove-trackingによる回転を検出していると示唆される。
成熟促進技術開発のための魚類の初期卵成長機構解析

ウナギでは、性分化以前からのエストロゲン処理は雌化および卵巣形成ばかりではなく、初期卵成長促進効果があることが示唆された。一方、前卵黄形成期の卵母細胞の成長はアンドロゲン処理により促進されることが確認された。チョウザメでは、卵径約100μmから約400μmまでの卵成長には数年あるいは10数年を要するが、この時期の卵成長はエストロゲンあるいはアンドロゲン依存ではなく、体成長依存であることが示唆された。これまで、アンドロゲン処理された未成熟雌ニホンウナギにおいて、前卵黄形成期の卵母細胞の成長が促進されることが明らかになっている。そこで本研究では、未熟なウナギにアンドロゲンである17α-メチルテストステロン(MT)を経口投与することにより、初期卵成長を促進し、投与終了後の卵成長を追跡した。その結果、投与終了時にはMT処理群の卵径は対照群に比べて有意に高値を示したが、その後は対照群の卵母細胞は成長を続けたのに対し、MT処理群の卵母細胞は急速に退行した。従って、MT投与による初期卵成長促進効果は常にMTが存在している必要があり、投与終了後にその効果は失われることが明らかになった。次に、チョウザメの初期卵成長の分子機構解析を目的として、アムールチョウザメ脳下垂体の成長ホルモン(GH)cDNAクローニングを行なった。その結果、得られたGH cDNAは全長1123bpであり、214アミノ酸残基をコードする642bpの翻訳領域を含んでいた。塩基配列から推定されるアミノ酸塩基配列を他魚種のGHと比較した結果、ロシアチョウザメと97%、ニホンウナギと65%、コイと44%の相同性を示し、分子系統樹においても魚類GHと同一のクラスターを形成した。得られた配列をもとに、大腸菌発現系により組換えタンパク質を作製後、家兎に免疫してチョウザメGH特異抗体を作製した。本抗体は、アムールチョウザメだけではなく、ベステルチョウザメのGH産生細胞も特異的に検出できることが明らかになった。本年度は、ウナギ、イトウおよびチョウザメを用いて、エストロゲン(エストラジオール-17β; E2)およびアンドロゲン(17α-メチルテストステロン; MT)処理が初期卵成長に及ぼす影響を調べた。シラスウナギ(性分化前)を5ヶ月間E2処理して雌化した個体を用いて、さらに4ヶ月間E2処理を継続する群と未処理群とを比較した。その結果、E2処理群は未処理群より生殖腺体指数が高く、卵径も大きくなった。また、E2処理群の卵母細胞中の油球数も増加傾向にあった。従って、シラスウナギへのエストロゲン処理は雌化ばかりではなく、卵成長促進効果があることが示唆された。次に、イトウ2年魚(性分化後)を用いて、E2およびMTを4ヶ月間経口投与した。その結果、MT処理により雄の精子形成は促進されたが、E2処理による雌の卵成長は促進されなかった。また、ベステルチョウザメ2ヶ月魚(性分化前)を用いて、E2およびMTを昨年度から継続して18ヶ月間経口投与した。その結果、E2処理では雌化に加えて若干の卵成長促進効果が、MT処理では雄化に加えて明確な精子形成促進効果が認められた。さらに、本年度は絶滅種ミカドチョウザメの人為繁殖に国内で初めて成功し、孵化前後より孵化後2ヵ月まで、脳下垂体および生殖腺形成過程を観察した。脳下垂体に関しては、孵化前後からその原基は確認され、成長とともに濾胞状から扁平状構造へと形態は変化した。成長ホルモン(GH)の発現は孵化前後からすでに認められた。生殖腺に関しては、孵化後1ヵ月の個体で生殖隆起が観察されたが、生殖細胞は組織観察では確認できなかった。2ヵ月の個体においては未分化生殖腺が形成され、生殖腺内に少数の生殖細胞も確認された。本年度は、ウナギ、イトウおよびチョウザメを用いて、エストロゲン(エストラジオール-17β;E2)およびアンドロゲン(17α-メチルテストステロン;MT)処理が初期卵成長に及ぼす影響を昨年に引き続き調べた。その結果、ウナギでは、E2処理は約100μmまでの卵母細胞の成長を促進することが示唆された。イトウ2年魚(性分化後)を用いて、E2およびMTを12ヶ月間経口投与した結果、E2およびMT処理による卵成長促進効果は認められなかったが、脳下垂体の濾胞刺激ホルモン(FSH)および黄体形成ホルモン(LH)の発現が促進された。特に、E2によるLH発現誘導は顕著であった。また、ベステルチョウザメ2ヶ月魚(性分化前)を用いて、E2およびMTを18ヶ月間経口投与した後、さらに通常餌で12ヶ月間飼育を継続した。しかし、E2およびMT処理では卵成長促進効果は認められなかった。次に、チョウザメの初期卵成長の分子機構解析を目的として、アムールチョウザメ脳下垂体のFSHおよびLHのcDNAクローニングを行なった。

得られた配列をもとに、大腸菌発現系により組換えタンパク質を作製後、家兎に免疫してそれぞれの特異抗体を作製した。本抗体は、アムールチョウザメだけではなく、ベステルチョウザメのFSHおよびLH産生細胞も特異的に検出できることが明らかになった。さらに、本年度はカルーガとアムールチョウザメの天然交雑種カラムの人為繁殖に国内で初めて成功し、孵化後6ヵ月まで、脳下垂体および生殖腺形成過程を観察した。その結果、脳下垂体の成長ホルモン(GH)発現は孵化前後からすでに認められたが、FSHおよびLH発現は孵化後6ヵ月まで検出されなかった。生殖腺に関しては、孵化後6ヵ月には、生殖腺上皮に陥入がみられるタイプと、陥入がないタイプの2型の生殖腺が観察された。この上皮の陥入は卵巣分化の開始を意味することから、孵化後6ヵ月前後が生殖腺の形態的性分化開始期であると考えられた。
フラストレーション系反強磁性体におけるスピン揺動

フラストレーション系反強磁性体における相転移、スピン秩序、スピンの動的揺動を解明するために、主として核磁気共鳴法によりスペクトルとスピン格子緩和時間を測定し、理論的解析を行った。1.ハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体RbNiCl3の実験的研究(1)0.2Kのわずかの温度域で中間相が存在し、逐次相転移をすることを明確に確認した。(2)NMRスペクトルの分離を電気四極子相互作用の2次摂動で説明できることを示した。(3)低温相のスピン秩序構造およびスピン間相互作用について新しいモデルを提案した。(4)各相における緩和時間の測定から、フラストレーション系磁性体に特徴的な緩和を明らかにした。2.容易軸異方性を持つハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体CsNiBr3の緩和時間の測定と理論的解析(1)常磁性相、成分無秩序相、三角スピン配列相の各相における緩和時間を測定した。(2)低温相において、三角格子反強磁性体に特有な三角スピン配列のスウィング揺動が存在し、この揺動の2マグノン過程が核スピン緩和に寄与していることを理論的に明らかにした。(3)常磁性相における核スピン緩和機構を解析し、相互作用の競合による揺動の特質を明らかにした。3.かごめ格子反強磁性体RFe3(OH)6(SO4)2 (R=NH4,Na)の磁性とスピン揺動の実験的研究(1)かごめ格子反強磁性体で初めて逐次相転移を発見した。(2)^1H核と^<23>NaのNMR共鳴磁場スペクトルを測定し、各相におけるスピン構造を考察した。(3)フラストレーション系かごめ格子反強磁性体に特徴的な緩和を見いだし、理論的考察を行った。1.三角格子反強磁性体のモデル物質としてRbNiCl_3の単結晶をBridgman法で合成し、特に加熱真空引き等前処理を慎重に行うことにより良質で大型の単結晶を得た。2.ハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体の逐次相転移、スピン秩序構造、スピンの動的揺動を明らかにするために、核磁気共鳴法によりRbNiCl_3の共鳴磁場スペクトルとスピン格子緩和時間の測定を行った。(1)核磁気共鳴法の特質を利用した巧みな実験方法により、0.2Kのわずかの温度域で中間相が存在し、逐次相転移をすることを明確に確認した。(2)NMRスペクトルは測定全温度域で3本に分離することを見いだし、磁場、角度依存性からそれらは電気四極子相互作用によることを解明し、2次摂動まで考慮すると厳密に実験を説明できることを示した。(3)低温相のスペクトルの実験から、スピン秩序構造およびスピン間相互作用について理論的検討を行い、スピン成分間の相互作用の大きさが異なるという新しい相互作用モデルを提案した。(4)常磁性相におけるスピン格子緩和時間の測定から、常磁性相においてもフラストレーション系磁性体に特徴的な緩和が見られることを明らかにした。(5)低温相におけるスピン格子緩和時間の温度、磁場、共鳴ピーク依存性を詳細に測定し、4K以下において緩和時間が長くならず、異常に大きな揺らぎが存在することを見いだした。^3Heクライオスタットを用いた0.4Kまでの測定でもこの異常が続き、この緩和機構、揺らぎがいかなるものであるかは今後の課題である。3.ハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体CsNiBr_3のスピン格子緩和時間を測定し、特に、低温相における120°スピン配列での特異な低エネルギー揺らぎの緩和への寄与を解明した。

1.前年度測定を行ったハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体RbNiCl_3のNMR共鳴磁場スペクトルとスピン格子緩和時間の理論的解析を行い、スピン間相互作用について新しいモデルを提案し、また、各相におけるフラストレーション効果による特異な揺らぎを明らかにした。2.弱い容易軸異方性を持つハイゼンベルグ型三角格子反強磁性体CsNiBr_3の緩和時間の測定と理論的解析(1)CsNiBr_3は2つ転移点を持ち、常磁性状態から成分無秩序状態(中間相)を経て三角スピン配列状態(低温相)へ逐次相転移をする。各相におけるスピン格子緩和時間の温度依存性、磁場依存性を測定した。(2)低温相において、低エネルギー励起として三角格子反強磁性体に特有な三角スピン配列のスウィング揺動が存在し、この揺動の2マグノン過程が核スピン緩和に寄与していることを理論的に明らかにした。(3)常磁性相における核スピン緩和機構を明らかにするとともに、相互作用の競合による揺動の特質を明らかにした。3.かごめ格子反強磁性体RFe_3(OH)_6(SO_4)_2(R=NH_4,Na)の磁性とスピン揺動の実験的研究(1)SQUID磁束計を用いて帯磁率の測定を行い、かごめ格子反強磁性体で初めて逐次相転移をすることを発見し、この相転移が磁気的なものであることをx線回折と核磁気共鳴法で確認した。(2)^1H核と^<23>NaのNMR共鳴磁場スペクトルを測定し、中間相、低温相におけるスピン構造の解明を行った。核種によって特徴的な共鳴スペクトルが観測され、その解析を行った。(3)スピン格子緩和時間の測定を行い、フラストレーション系かごめ格子反強磁性体に特徴的な緩和を見いだし、理論的考察を行った。
ヒト化抗PAD4抗体を用いた関節リウマチ治療へ向けての基礎検討

高齢化社会の進行は、関節リウマチ(RA)患者数の顕著な増加率としても現れている。このため早期治療法を確立することは喫緊の課題の一つである。早期ターゲットタンパク質、PAD4に対するマウスモノクローナル抗体(MoAb)をPAD4の構造解析を基に作成し、関節リウマチモデルマウス、D1CCマウスにおいて、関節炎治療を行い顕著な治療効果が得られた。そこでマウスMoAbを親和度で凌ぐ新たなニワトリMoAb(ヒトMoAb化が可能)を得た。本研究では「ニワトリMoAb抗体がD1CCマウス関節炎に対し治療効果を示す」ことを明らかとした。「RA早期治療法実用化」に向けた基礎データの取得およびその特許化が進んだ。日本の高齢化社会の進行は、関節リウマチ(RA)患者数の顕著な増加(増加率約1.5万人/年)としても現れている。そこで早期ターゲットタンパク質の一つPAD4に対するマウスモノクローナル抗体(MoAb)をPAD4の構造解析を基に作成し、関節リウマチモデルマウス(D1CCマウス:オリエンタル酵母工業より販売中)において、関節炎治療を行ったところ顕著な治療効果が得られた(国内特許取得中、実施権交渉予定)。今回マウスMoAbを親和度で凌ぐ新たなニワトリMoAb(ヒトMoAb化も可能)得た。本申請では、「ニワトリMoAb抗体がD1CCマウス関節炎に対し治療効果を示すのか否か」について検討し、「RA早期治療法実用化」に向けた基礎データを取得を目指す。日本の高齢化社会の進行は、関節リウマチ(RA)患者数の顕著な増加率(約1.5万人/年)としても現れている。そこで早期ターゲットタンパク質の一つPAD4に対するマウスモノクローナル抗体(MoAb)をPAD4の構造解析を基に作成し、関節リウマチモデルマウス(D1CCマウス:オリエンタル酵母工業より販売中)において、関節炎治療を行ったところ顕著な治療効果が得られた(国内特許取得中、実施権譲渡予定)。今回マウスMoAbを親和度で凌ぐ新たなニワトリMoAb(ヒトMoAb化が可能)を得た。本申請では、「ニワトリMoAb抗体がD1CCマウス関節炎に対し治療効果を示すのか否か」について検討し、「RA早期治療法実用化」に向けた基礎データの取得およびその特許化等を目指す。平成27年度の目標は以下の内容である。ニワトリ抗体の絞り込みおよび動物実験に必要な抗体を生産する。1.ニワトリ抗体の乖離定数を測定する。目的:有効なニワトリ抗体の絞り込みを行う。・結合実験および阻害実験から有用な抗体を絞り込み、ビアコアを用いPAD4に対する乖離定数を測定する。動物実験に対し、より最適と考えられる抗体を選び出す。実験のポイント:抗体によっては、結合が強く全く乖離が見られないものもあるが、この様な場合非特異的な結合も強すぎるため必ずしも生物製剤に利用できない事がある。この様に結合等の親和度だけでなくおのおのの抗体が持つ特徴を分析し、動物実験に最適と考えられる抗体を選択する必要がある。2.ニワトリ抗体の大量生産目的:選択されたニワトリ抗体(マウス抗体化済み)を生産する。・各抗体は、リコンビナントタンパク質の形となる為、大量培養の際の細胞上清からの精製になる。各抗体の必要量は、約16mgで、この他にコントロールとしてアイソタイプコントロール抗体が同じく16mg必要となる。実験のポイント:大量培養時の抗体産生量により投与量、投与期間等の変更が必要な場合がありうる。上記項目に対して、基礎的なデータ取得を行うことができた。【目的】関節リウマチの治療法は、大きな進歩を遂げている一方、さらなる早期治療法を確立することは重要な課題の一つである。そこで関節炎早期のバイオマーカー、抗CCP抗体に着目し、シトルリン化タンパク質産生の原因と考えられるPAD4が関節リウマチ進行に対しどの様に関与するか、シトルリン化酵素活性阻害型の抗PAD4抗体を作成し検討した。【方法】PAD4の構造解析データを基に、酵素活性領域を同定し、この領域をターゲットとするモノクローナル抗体作成をおこなった。ニワトリにおけるPAD4相同遺伝子は同定されていない。そこでニワトリを利用したファージディスプレイによりクローン選択し、親和性およびシトルリン化酵素阻害活性の高いPAD4酵素活性阻害型抗PAD4抗体作成を試みた。またニワトリ抗PAD4抗体を関節リウマチモデルマウス(D1CCマウス:オリエンタル酵母工業(株)より販売)に投与し、その関節炎治療効果を検討した。【結果】ニワトリ由来抗体は、これまでの研究で得られたマウス抗体と比較するとターゲット領域のややN末側を認識し、抗体親和性は、約10倍上昇した。さらに抗PAD4抗体投与による関節炎治療効果も確認できた。【結論】ニワトリ抗PAD4モノクローナル抗体は、マウス抗PAD4抗体より親和性、シトルリン化酵素活性阻害が、ともに高かった。またD1CCマウスにおける関節炎を効果的に抑制した。PAD4は関節炎早期における治療標的となりうる。

早期ターゲットタンパク質、PAD4に対するマウスモノクローナル抗体(MoAb)をPAD4の構造解析を基に作成し、関節リウマチモデルマウス、D1CCマウスにおいて、関節炎治療を行い顕著な治療効果が得られた。そこでマウスMoAbを親和度で凌ぐ新たなニワトリMoAb(ヒトMoAb化が可能)を得た。本研究では「ニワトリMoAb抗体がD1CCマウス関節炎に対し治療効果を示す」ことを明らかとした。「RA早期治療法実用化」に向けた基礎データの取得およびその特許化が進んだ。平成26年度の目標は以下の項目である。ニワトリPAD4抗体による阻害効果、関節炎抑制効果を検討する。各ニワトリ抗PAD4抗体(マウス抗体化済み)における生化学的な特徴として、PAD4結合度、特異度およびPAD4活性阻害度を検討する。1結合度測定1、目的:PAD4に対する特異度の検討、およびビアコア測定の基礎データを取得する。・hPAD4, mPAD4をELISA plateに結合させ、抗PAD4抗体の結合強度を検討する。2結合度測定2、目的:PAD2に対する特異度を検討する。・hPAD2, mPAD2をELISA plateに結合させ、抗PAD2抗体への結合がない事を検討する。3活性阻害測定、目的:PAD4活性阻害度を検討する。・PAD4によるシトルリン化活性を各ニワトリ抗体がどの程度の阻害効果を持つのか検討する。以上各項目について基礎的なデータ取得を得ることができた。初年度、次年度共に当初計画通り実験が遂行できている。各抗体の生化学的な特徴が把握できかつ抗体の大量生産がほぼ確立できた。平成28年度は、ニワトリ抗PAD4抗体をD1CCマウスに投与し関節炎抑性効果を検討する。免疫学初年度は、当初計画通り実験が遂行でき、各抗体の生化学的な特徴についての情報が得られた。平成27年度は、各抗体の大量精製及び得られた抗体を用いて動物実験を行い、関節炎抑制の有無について検討する。最終年度において抗体の投与実験があり、動物飼育費、血清解析、組織学的解析等必要な費用へより多くの予算を割り振る事とした。このため27年度における予算を最終年度に繰り越し、より有効に予算を利用できる様変更した。最終年度において動物飼育費、血清解析、組織学的解析等に対し繰り越した予算を使用する予定です。
超小型自律稼動磁力計の基礎開発

前年度では、研究会での議論を通して得られた科学的見地から本システムに求められる機能の整理を行った。本年度では、主に磁力計本体の試作、及び、それを用いた磁力計の地上校正試験方法・異なる温度環境下における磁力計の性能評価等の基礎データの収集を行った。また研究の一環として、現在飛翔中の「あけぼの」「GEOTAIL」で観測されている磁場データより、磁力計のオフセット・アライメントの温度変化・経年変化についての評価方法の開発、それに基づくデータ解析を実施した。先に開発・試作を行ったハイブリッドICを用いて小型磁力計の試作を行った結果、1kgを下回るものが飛翔体搭載用として製作可能である事が確認された。省電力化・一層の小型化については、使用電圧・周辺部品の選択を含めて、さらなる検討が必要と考えられる。試作したシステムを用いた地上校正試験で、感度・アライメントについて科学的要求を満たす精度の良い検定方法を確立する事が出来た。一方、今回の地上試験で確認された温度変化による影響は弱磁場計測では無視出来ない大きさである事も判明した。同じ事は、「あけぼの」「GEOTAIL」の磁場データを使った評価でも得られている。これらの衛星はスピン型姿勢安定方式であり、オフセット・アライメントの飛翔中データを用いた再評価を精度良く実施する事が可能である事が確認されたが、将来の3軸安定型の衛星、或いは、着陸船での観測では、実データを用いた評価そのものが困難と考えられる。感度・アライメント変動の軽減・飛翔時での評価方法については、今後の課題として残っている。今回の研究では、自律制御部分、着陸船で使用が考えられる打ち出し機構については概念設計の議論のみとなっている。求められる寿命・通信距離等により、磁力計以外の部分の規模は大きく変わりうる。科学目的と対応させた個々の条件でのシステムとしての規模を今後、具体的に検討していく事が必要である。平成6年度は超小型自律稼働磁力計の科学的意義を議論するための研究会を開催し、その中で科学的見地から本システムに求められる機能の整理を開始した。研究者間での議論を通して、小型磁力計による飛翔体、或いは、惑星表面での多点観測の科学的意義について充分な共通認識に至っている。また、飛翔体・地上観測等でこれまでに築かれた磁力計システムの技術の確認作業を通して、開発に関わる問題点・開発要素等を明きらかにするための概念設計を同時に進めている。その結果、これまでの技術レベルを基盤として、磁力計本体の小型・省電力化については目標とするものが十分に実現可能との結論を得ている。しかし、磁場センサー自身をコントロール部から大きく離せない制約条件の元では、微小磁場(10nT以下)を計測する観点からは、磁力計本体の磁場計測に対する影響を極力軽減する方策・それに対応した部品・構造の選択が不可欠となる。また、より一層の超小型・省電力を実現するためには、民生技術を含めたより最新の技術要素を取り込む事の検討の必要である。この場合、将来惑星探査を含めた宇宙での観測を目的とするため、環境条件・信頼性の面から個々の技術に対する評価を行って採用出来るか否を判定していく必要がある。これらの開発に先立つ諸問題点を明確にするために、各々の分野の専門家を交えた研究会を開催し検討を進めている。今後はこれらの成果をもとに、実システムとしての要素技術の検討、実観測としての応用例に基づくシステムの概念設計を行っていきたい。

前年度では、研究会での議論を通して得られた科学的見地から本システムに求められる機能の整理を行った。本年度では、主に磁力計本体の試作、及び、それを用いた磁力計の地上校正試験方法・異なる温度環境下における磁力計の性能評価等の基礎データの収集を行った。また研究の一環として、現在飛翔中の「あけぼの」「GEOTAIL」で観測されている磁場データより、磁力計のオフセット・アライメントの温度変化・経年変化についての評価方法の開発、それに基づくデータ解析を実施した。先に開発・試作を行ったハイブリッドICを用いて小型磁力計の試作を行った結果、1kgを下回るものが飛翔体搭載用として製作可能である事が確認された。省電力化・一層の小型化については、使用電圧・周辺部品の選択を含めて、さらなる検討が必要と考えられる。試作したシステムを用いた地上校正試験で、感度・アライメントについて科学的要求を満たす精度の良い検定方法を確立する事が出来た。一方、今回の地上試験で確認された温度変化による影響は弱磁場計測では無視出来ない大きさである事も判明した。同じ事は、「あけぼの」「GEOTAIL」の磁場データを使った評価でも得られている。これらの衛星はスピン型姿勢安定方式であり、オフセット・アライメントの飛翔中データを用いた再評価を精度良く実施する事が可能である事が確認されたが、将来の3軸安定型の衛星、或いは、着陸船での観測では、実データを用いた評価そのものが困難と考えられる。感度・アライメント変動の軽減・飛翔時での評価方法については、今後の課題として残っている。今回の研究では、自律制御部分、着陸船で使用が考えられる打ち出し機構については概念設計の議論のみとなっている。求めれる寿命・通信距離等により、磁力計以外の部分の規模は大きく変わりうる。科学目的と対応させた個々の条件でのシステムとしての規模を今後、具体的に検討していく事が必要である。
超大細孔を有するチタノシリケートのテンプレ合成とその結晶構造.物性

12員環以上の細孔を持つポーラス材料は、重油の分解など幅広い応用が期待でき、近年盛んに合成が試みられている。特に近年のゼオライト分野では単なるアルミノシリケート合成ではなく新規チタンシリケートやゲルマニウムシリケート合成が注目されている。本研究ではC_<12>H_<46>Ge_9N_4O_<27>(1)と[Ge_9O_<16>(OH)_4F_2](C_3N_2H_<12>).3H_2O(2),という2種類のゲルマネートを水熱条件下で合成した。化合物(1):a=9.293(2)Å,b=12.164(2)Å,c=14.564(3)Å,β=94.96(3)°,V=1640.1(6)Å^3,Z=2;化合物(2):a=12.914(3)Å,b=14.501(3)Å,c=14.502(3)Å,V=2715.7(9)Å^3,Z=4。C_<12>H_<46>Ge_9N_4O_<27>(1)はC_6H_<14>N_2を用いた水熱合成法により得られ、X線結晶学によりゲルマニウム塩1は螺旋Ge-O鎖と分子異性体を持つ。ゲルマニウム塩1の合成中にはシス-1,4'-ジアミノシクロヘキセンはシスートランス混合物から選択されていた。[Ge_9O_<16>(OH)_4F_2](C_3N_2H_<12>).3H_2O(2)はGeO_2、ピリジン、フッ化水素と構造規定剤(SDA)としてNH_2CH_2CH(NH_2)CH_3を含んだ水溶液から合成される。キラルな三次元細孔構造を有し、四面体GeO_4、正方形ピラミッドGeO_5、八面体GeO_6で構成され、a軸に沿った興味深い10員環細孔を形成する。この10員環細孔径の最小距離は約8.1Åである。また、上記の物質に関して熱安定性やイオン交換性などについても調べた。
ペプチド鎖伸長因子EF-1の超多機能性

我々は、タンパク質生合成において、中心的な役割を果たすペプチド鎖伸長因子EF-1が4種類のサブユニット(αββ'γ)から構成され、EF-1αはaa-tRNAのリボソームへの結合反応を触媒し、EF-1ββ'γ(EF-1βおよびEF-1β')は、GDP/GTP交換反応促進因子であること等を明らかにしてきた。EF-1γは機能が不明であったが、本研究において、大腸菌で発現したEF-1γが、glutathione S-transferase活性を保有することを明らかにし,酵素化学的諸性質を明らかにした。さらに、EF-1各サブユニットとGFPとの融合遺伝子をタバコBY-2細胞に導入し、細胞内局在性を追求した結果、テストした3サブユニット(EF-1α、EF-1βおよびEF-1γ)は、間期の細胞では細胞質のアクチンフィラメント上に局在し、分裂期の細胞では、EF-1αおよびEF-1γは、染色体の分離に関与する紡錘体上に局在することを明らかにした。間期の細胞におけるEF-1α、EF-1γおよびアクチンの繊維状構造は、低温ストレス(0°C30分)により消失し、エネルギー源の存在下での保温(25°C、110分)で回復した。また、カイコEF-1βをもちい、GDP/GTP交換反応に関与する部位を明らかにした。これらの成果は、細胞骨格形成、細胞増殖、ガン化、アポトーシス等へのEF-1各サブユニットの関与を解明する突破口になるものと期待され、本研究の目的を十分達成したと考えられる。我々は、タンパク質生合成過程で中心的な役割を果たす、ペプチド鎖伸長因了EF-1(elongation factor 1)が4種類のサブユニット(αββ'γ)より構成されており、EF-1αはアミノアシル-tRNAをリボソームに結合させる因子であり、EF-1ββ'γはこの結合反応により生じた不活性型のEF-1α・GDPから活性型のEF-1α・GTPを再生する因子であることを明らかにしてきた。本研究では、イネのEF-1αまたはγサブユニットの細胞内局在性を明らかにするため、両遺伝子の末端にGFP(green fluorescent protein:緑色蛍光タンパク質)遺伝子を融合させ、タバコBY-2細胞中で発現して観察した。その結果、間期の細胞では、両融合タンパク質の蛍光はアクチンフィラメントの局在と一致することが明らかになった。これらの細胞を0°C、2時間処理すると融合タンパク質の繊維状構造およびアクチンフィラメントが消失し、グルコース存在下で25°Cで数分間保温すると両繊維が回復することが明らかとなった。また、融合タンパク質の繊維状の構造は、アクチンフィラメントを破壊するサイトカラシンDで消失することから、融合タンパク質はアクチンフィラメントに結合していると推定している。我々は、動植物のペプチド鎖伸長因子EF-1が、4種類のサブユニット(αββ'γ)から構成され、EF-1αはaa-tRNAのリボソームへの結合反応を触媒し、EF-1ββ'γ(EF-1βおよびEF-1β')は、結合反応でリボソームから遊離したEF-1α・GDPからEF-1α・GTPを再生するGDP/GTP交換反応促進因子であること等を明らかにしてきた。近年、EF-1の各サブユニットは、本来のタンパク質生合成以外に、細胞骨格形成、細胞増殖、ガン化、アポトーシス、シグナル伝達、核機能、RNA合成の制御などに関与するものと推定される成果が各方面から報告されている。本研究は、これらの研究を背景とし、EF-1の多機能性の分子機構を明らかにすることを目的とし、EF-1各サブユニットの細胞内局在性を明らかにするとともに、それらの局在性に対する寒冷シグナル応答について解析した。EF-1γは発見以来その機能が不明であったが、大腸菌で発現したEF-1γが、glutathione Stransferase(GST)活性を保有することを明らかにし、酵素化学的諸性質を詳細に解析した。

さらに、EF-1各サブユニットとGFPとの融合遺伝子をタバコBY-2細胞に導入し、細胞内局在性を追求した結果、4サブユニットとも、間期の細胞では細胞質のアクチンフィラメント上に局在することを明らかにした。大変興味深いことに、分裂期の細胞では、EF-1αおよびEF-1γは、染色体の分離に関与する紡錘体上に局在することを明らかにした。低温等の寒冷ストレスによる局在性の変化も明らかにした。これらの成果は、伸長因子の新たな機能を明らかにする突破口になるものと期待され、本研究の目的を十分達成したと考えられる。
クロマグロの環境刺激に対する反応行動発現モデルの構築

高速遊泳や高深度への潜水が可能となるよう特化したクロマグロは,太平洋を横断回遊するといった高い適応能力を持つ一方で,狭い空間内では生残・飼育が困難であるという適応特化の極端な両面を併せ持っている。このクロマグロは近年その資源量の減少が世界的に重大な問題となっており,資源の回復と維持のための方策の実施が急務である。そのため,種苗生産から沖合域での浮沈式大型生簀による飼育に至るまでの完全養殖技術の確立が望まれている。そこで,本研究ではクロマグロの刺激受容特性を生理学的,反応行動を行動学的に調べ,外的刺激により対象魚がどのような反応行動を創発するのか,数理行動モデルによる統合解析を実施した。高速遊泳や水深数百メートルに及ぶ潜水が可能となるよう特化したクロマグロは,太平洋を横断回遊するといった高い適応能力を持つ一方で,狭い空間内では生残・飼育が困難であるという適応特化の極端な両面を併せ持っている。このクロマグロは近年その資源量の減少が世界的に重大な問題となっており,資源の回復と維持のための方策の実施が急務となっている。これらの実現には,特化の著しい本種の行動特性の把握に留まらず,環境刺激によって本種がどのような行動を発現するのかを明らかにしなければならない。そこで,本研究ではクロマグロの刺激受容特性を生理学的,反応行動を行動学的に調べ,刺激反応行動の数理モデルを構築することで統合化し,外的刺激により対象魚がどのような反応行動を創発するのか,その行動誘発機構の解明を目的として研究を実施した。本年度は沖合養殖生簀で養成されている全長30cmから150cmにおよぶ孵化後数ヶ月から3年の養成クロマグロを対象として実験を行った。行動モニタリングでは,ステレオカメラを用いた光学的手法による各個体の3次元位置座標の時系列モニタリングを中心として,バイオテレメトリー手法を用いた計測を併せて実施し,生簀内の様々な環境に遭遇したときのクロマグロの行動を記録した。これらから,当該魚の行動特性として3次元的な空間の利用特性および複数個体間の行動の相互作用・同調性を求めた。同時に生簀の環境モニタリングにより,照度・水温・溶存酸素量・流速および生簀網地の吹かれを測定した。さらに,引き続き実施しているクロマグロの視認能力および刺激受容の特性に関する研究の結果を併せて,これらの結果を数理行動モデルによる統合解析を実施している。高速遊泳や深度数百メートルに及ぶ潜水が可能となるよう特化したクロマグロは,太平洋を横断回遊するといった高い適応能力を持つ一方で,狭い空間内では生残・飼育が困難であるという適応特化の極端な両面を併せ持っている。さらに,引き続き実施しているクロマグロの視認能力および刺激受容の特性に関する研究の結果を併せて,これらの結果を数理行動モデルによる統合解析を実施した。近年クロマグロは資源量の減少が世界的に重大な問題となっており,資源の回復と維持のための方策の実施が急務となっている。そのため,種苗生産から沖合域での浮沈式大型生簀による飼育に至るまでの本格的な完全養殖技術の早急な確立が望まれている。

これらを実施するには,高速遊泳や高水深への潜水が可能となるよう特化し,太平洋を横断回遊するといった高い適応能力を持つ一方で,狭い空間内では生残・飼育が困難であるという適応特化の極端な両面を併せ持つ本種の行動特性の把握に留まらず,環境刺激(光強度,空間サイズ,水深,水温,流れ)を受けることによって,本種がどのような行動を発現するのかを明らかにしなければならない。そこで,本研究では申請者らが明らかにした視覚に依存した行動をするクロマグロが環境変化という外的刺激を受けたときに創発する反応行動の数理モデルの構築を試みている。種苗生産されたクロマグロ幼魚から沖合の浮沈式生簀で飼育されている性成熟した親魚に至るまでの成長段階の供試魚を用いて,環境刺激に対する反応行動の誘発メカニズムを成長段階別に調べた。生簀内で自由遊泳する魚群の遊泳行動をステレオ・ビデオカメラにより撮影・記録し,個体の3次元位置座標を抽出することで,3次元の運動解析を行った。この時の環境刺激は照度,水温,流れ,養成空間の変化を伴っている。そのため,行動モニタリング結果から得られた行動特性と環境パラメータとの関係を表す行動モデルを導くための準備は順調に進んでいると考えている。種苗生産されたクロマグロ幼魚から沖合の浮沈式生簀で飼育される性成熟した親魚に至るまでの成長段階の供試魚を用いて,環境刺激に対する反応行動の誘発メカニズムを成長段階別に調べた。クロマグロの行動および刺激反応行動発現時の外部環境データは,多くのケースについて,詳細なデータが取得できたと考えている。これらの取得したデータを解析し,環境刺激により誘発された反応行動の数理モデルの構築を試みる。クロマグロの行動および行動発現時の外部環境データを引き続き詳細にモニタリングする。行動と環境のモニタリング・ケースを増加させ,できるだけ詳細で大量のデータ取得を目指す。こうして取得したデータを解析し,環境刺激により誘発された反応行動の数理モデルの構築を試みる。取得した実験データは,環境刺激により誘発された養成クロマグロの反応行動の数理モデル構築に向けて,順次解析予定である。解析結果は国際学会や学術雑誌での発表を予定している。クロマグロ行動実験と養成環境のモニタリング実験を引き続き実施予定である。次年度も高知県柏島の沖合に設置された浮沈式沖合生簀でのモニタリング実験を予定している。取得したデータは,環境刺激により誘発された反応行動の数理モデル構築に向けて,順次解析予定である。
フシコプラジン類生合成に関する網羅的遺伝子解析と効率的物質生産システムの確立

苔類コハネゴケより見いだした新規フシコプラジン類は、強い動物細胞分化誘導活性等を有することから、フシコクシン/コチレニン類の作用機序の解明や構造活性相関に新たに重要な視点を与える化合物と言える。しかし、コハネゴケは成長が遅く、フシコプラジン類の蓄積は微量であり、生産性のケモタイプが3種存在して採取が難しいことから、安定した供給方法の構築が急務である。本研究では、フシコプラジン類の生合成酵素遺伝子群を明らかにするために、網羅的な遺伝子発現解析手法を用いて、テルペン環化酵素やP450酵素等の候補遺伝子を見出すことに成功した。また、それら生合成酵素の機能解析を異種生物での発現により行った。申請者らが苔類コハネゴケより見いだしたフシコッカンジテルペノイド類は、強い動物細胞分化誘導活性等を有することから、フシコクシン/コチレニン類の作用機序の解明や構造活性相関に新たに重要な視点を与える化合物と言える。しかし、コハネゴケは成長が遅く、蓄積は微量であり、生産性のケモタイプが3種存在して採取も難しいことから、安定した供給方法の構築が急務である。本研究はコハネゴケが蓄積するフシコッカンジテルペノイド類の生合成に関わる酵素遺伝子群を網羅的に明らかにすることを目的としている。前年度はケモタイプCからはテルペン環化酵素遺伝子断片をはじめ、P450酵素遺伝子、アセチル基転移酵素遺伝子等の生合成酵素遺伝子候補が得られたが、ケモタイプAに関しては満足なテルペン環化酵素遺伝子断片が得られなかったことから、今年度はポリアデニル鎖を持たないmRNAを得て、次世代シーケンサーによるシーケンスを実施した。ケモタイプBに関しては当初はフシコカンジテルペノイドが見出されていなかったが、ケモタイプCのテルペン環化酵素遺伝子候補とよく類似した遺伝子が得られたため、改めてフシコッカンジテルペノイドの精査を行ったところ、ケモタイプB独自の微量新規フシコッカンを得ることができた。また、前年度から引き続きテルペン環化酵素酵素遺伝子の全長配列を決定し、大腸菌内で環化産物を蓄積する発現系を用いて機能解析を行った。セスキテルペン炭化水素を環化産物とする酵素遺伝子は得ることができたが、環化産物の得られない環化酵素遺伝子候補がそれぞれのケモタイプにあったことから、これらがフシコッカン骨格を構築する酵素遺伝子と推察された。現在、それぞれのレアコドンを改変した遺伝子配列を構築して機能解析を進めているところである。申請者らが苔類コハネゴケより見いだした新規フシコプラジン類は、真核生物に普遍的に存在する14-3-3タンパクとシグナル伝達系タンパクとの会合を制御することで動植物に対して様々な活性を示すフシコクシン/コチレニン類と類似した母骨格構造を持つ。フシコプラジン類の置換基が従来の構造活性相関と相反するにも関わらず強い動物細胞分化誘導活性等を有することから、フシコプラジン類はフシコクシン/コチレニン類の作用機序の解明や構造活性相関に新たに重要な視点を与える化合物と言える。しかし、コハネゴケは成長が遅く、フシコプラジン類の蓄積は微量であり、生産性のケモタイプが3種存在して採取も難しいことから、安定した供給方法の構築が急務である。本研究はフシコプラジン類の生合成に関わる酵素遺伝子群を網羅的に明らかにすると共に、モデル苔類のゼニゴケにおいて生合成経路の再構築にこれらの酵素遺伝子群を用いることにより、フシコプラジン類の効率的生産システムを確立することを目的とする。当年度は次世代シーケンサーを用いて、新鮮なコハネゴケのケモタイプACを材料としたmRNA配列解析を行うと共に、得られるcDNA断片配列のアセンブルとアノテーションおよび生合成酵素遺伝子候補の絞り込みを計画した。所定のサンプル調製を行い、illumina GAIIxによる配列取得とアダプター配列などの削除を行った。100bp cDNA断片配列は各種アセンブルソフトウエアを用いて二次アセンブルまで行い、それぞれのケモタイプごとにスーパーコンティグを作成した。得られたスーパーコンティグはLocal BLASTによってアノテーションを行い、テルペン環化酵素遺伝子、P450酵素遺伝子、アセチル基転移酵素遺伝子等の遺伝子配列候補を抽出できた。これらについて進化系統樹解析および発現量解析により候補遺伝子の絞り込みを検討した。当年度は次世代シーケンサーを用いて、コハネゴケのケモタイプACを材料としたmRNA配列解析を行うと共に、得られるcDNA断片配列のアセンブルを計画していたが、次世代シーケンサー付属のサンプル調製機器およびシーケンスデータ取り込みとアセンブルに用いるコンピューターサーバーの相次ぐ故障により、予定していた研究計画からはやや遅れる結果となった。