hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小孔アレイと微小電極アレイを用いた細胞共培養と細胞外電位計測

まず、SiN膜の片面に64個のAu製の微小電極(一辺約50μm)を8×8のマトリックス状に形成し、各電極からデバイス外周部のボンディングパッドに向けてAu製の電気配線を形成した。次に、配線を避けるように、複数の微小孔(直径12μm)を電極アレイ付近のみに形成した。さらに、電極の表面積を拡大し容量性インピーダンスを低減させるために、電解メッキにより電極表面に白金黒膜を形成した。デバイス製作と電極インピーダンスの評価を繰り返すことで、ばらつきの小さい低インピーダンスの電極を形成する製作条件を導出した。交付申請書の研究実施計画に記載した二つの技術の構築、すなわちSiN多孔膜を挟んだ神経細胞とアストロサイトの共培養技術の構築、及びSiN多孔膜への微小電極アレイ形成による細胞外電位計測デバイス製作技術の構築を達成し、当初目標としていた成果を得ることができたため。直径約3μmの微小孔をアレイ状に有する厚さ約1μmの窒化シリコン製の多孔膜を製作した。この裏面にコラーゲン、表面にラミニンを修飾した後に、裏面にアストロサイト、表面に神経細胞を順次培養し、多孔膜を挟んだ共培養を行った。微小孔アレイを通じた細胞間コミュニケーションの効果を定量的に評価するために、微小孔ピッチを数μmから数10μmの範囲で変更して共培養を行い、神経細胞のシナプスに局在する膜タンパク質(小胞型グルタミン酸トランスポータ1)を免疫染色法により蛍光染色した後に、各微小孔ピッチにおけるシナプス数をカウントし比較を行った。その結果、微小孔ピッチを50μmまで大きくするとシナプス数が少なくなり(すなわち神経細胞の活性が低くなり)、微小孔ピッチを20μm以下にすることで神経細胞の活性を高めることができることが分かった。また、窒化シリコン多孔膜上に1辺約300μmの矩形ウェルのアレイ構造を形成し、各ウェル底面(多孔膜表面)に単一の神経細胞を、多孔膜裏面に多数のアストロサイトを培養することで、単一神経細胞を長期培養する技術を構築した。さらに、窒化シリコン膜の片面に1辺約50μmの微小電極を8×8個のマトリックス状に形成し、細胞外電位を計測するためのデバイスを製作した。まず、微小電極アレイ上にラット海馬スライスを設置し、薬剤刺激を行いながらスライスの電位を計測することで、本デバイスの性能を評価するとともに計測環境を構築した。次に、微小電極アレイ形成面にラミニンを修飾し、神経細胞とアストロサイトを順次播種して共培養を行った。神経細胞の細胞外電位を計測した後に、神経細胞のβ-Tubulin IIIを蛍光染色することで、微小電極上への神経細胞の接着状態を評価した。交付申請書の研究実施計画に記載した二つの課題、すなわち窒化シリコン多孔膜を挟んで神経細胞とアストロサイトを共培養し多孔膜の微小孔ピッチが細胞活性に与える影響を定量的に評価すること、及び微小電極アレイを形成した窒化シリコン膜上で細胞外電位を計測する技術を構築することに成功し、当初目標としていた成果を得ることができたため。シリコン基板を加工することで角型のマイクロウェルをアレイ状に製作し、各ウェルの底面(一辺300μm)に多数の微小孔(直径3μm)を有する窒化シリコン(SiN)製の自立膜(厚さ1μm)を形成した。この膜の裏面にコラーゲンを、膜表面にラミニンを修飾し、膜裏面に大量のアストロサイトを、膜表面に単一の神経細胞を順次播種し、SiN多孔膜を挟んだ共培養を行った。単一神経細胞は、微小孔を通じてアストロサイトと相互作用しながら成長し、軸索を伸展させて自身の樹状突起とシナプスを形成する。
覚醒ラツトにおける中枢内神経ペプチドに対する自律神経応答と腎・循環動態

覚醒ラツトの側脳室(i.c.v.)へペプチドを投与し、心血管系パラメ-タと共に直接記録した腎交感神経活動(RSNA)の変化を調べた。1)アンギオテンシンII(AII)は血圧(AP)の上昇を伴って心拍数(HR)とRSNAを抑制した。RSNAの抑制反応は動脈圧受容器の除神経を行ったラツト(SAD)でも認められた。AII(i.c.v.)によるナトリュム利尿反応は腎臓の除神経により有意に減弱した。RSNAは腎臓尿細管でのナトリュムの再吸収を促進することが知られているので、中枢性AIIは腎交感神経活動を抑制してナトリュム排泄に対して促進的に働いていることが示唆された。またSADラットではAIIによる飲水量が正常ラットに比べて増加した。この結果は圧受容器がAIIによる飲水行動の制御に係っていることを示唆する。2)心房性ナトリュム利尿ペプチド(ANP)の単独投与ではAP,HR,RSNAと腎血流に有意な変化を与えなかった。しかしANP前投与でAIIによる昇圧反応が減弱した。AIIによる徐脈とRSNA抑制反応はANP前投与で影響を受けなかった。3)エンドセリンー3(ETー3)はAPを上昇させ、HRとRSNAを抑制した。またETー3により回転運動が生じた時にはHRとRSNAは逆に増加した。このようにETー3の中枢作用には多様性が窺われた。4)インタ-ロイキン1β(1Lー1β)はサイトカインの一つであるが,最近その中枢作用が明らかになりつつある。1Lー1βの静脈及び側脳室内投与により体温上昇に先行してAP,HRとRSNAの一過性の増加反応が見られた。これらの反応はいずれもインドメサシンで消失した。また1Lー1β投与により血中ACTHと共にノルアドレナリン濃度も増加した。覚醒ラツトを用いて、脳室内(i.c.v.)に投与した循環系関連ペプチドの心血管系と自律神経活動に及ぼす効果を調べた。1).アンギオテンシンII(AII):AII(10ng)によって、血圧(AP)の上昇を伴って心拍数(HR)と腎交感神経活動(RSNA)は抑制された。動脈圧受溶器の除神経を行ったSADラツトでは、HRはむしろ増加したがRSNAの抑制反応は尚認められた。麻酔ラツトにおいて見られるAII(i.c.v.)による尿ナトリウム排泄の促進反応は予め両側腎臓の除神経を行うと有意に減弱した。RSNAは直接腎臓の尿細管でのナトリウムの再吸収を促進することが知られているので、本結果より中枢内AII系は腎交感神経を抑制して尿ナトリウム排泄に対して促進的に働いていることが示唆された。またAIIによる飲水量は正常ラツトに比べてSADラツトでは有意に増加した。したがって圧受溶器からの入力はAllによる飲水行動の制抑に関っていることが示唆された。2).心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP):ANP(40pgー4ug)によって、AP,HR,RSNAと腎血流は有意な変化を示なかった。しかしANPはAII(i.c.v.)による昇圧作用を減弱させた。AII(i.c.v.)による徐脈とRSNA抑制反応には影響を与えなかった。3).エンドセリン(ET):ETー3(10ー50pmol)によってAPの上昇、HRとRSNAの減少が認められた。

また回転を示す運動障害が認められる場合にはHRとRSNAは逆に増加した。ETー3は中枢内で神経ペプチドとして働いていることが示唆され、またその中枢作用に多面性が認められた。免疫関連細胞から産生される種々のサイトカインは本来の免疫調節以外に中枢作用を有することが明かとなってきた。インタ-ロイキン1β(ILー1β)の作用としては発熱、ACTH分泌、摂食抑制や徐波睡眠誘起作用などが知られている。しかし神経系と分疫系の連関において重要な役割を担っている自律神経系に対するILー1βの作用はまだ十分明かでない。そこでILー1βの心・血管系と腎交感神経活動(RSNA)に対する作用を調べた。ILー1βの静脈及び側脳室内投与により体温上昇に先行して血圧上昇、心拍数増加、RSNAの亢進が認められた。今回用いた濃度(i.v.,100ng;i.c.v.,5ng)ではこれらの反応の潜時は静脈内投与のほうが脳室内投与より短かった。また持続時間は約20ー30分と1過性であった。プロスタグランジン合成阻害剤であるインドメサシン(10mg/kg,i.v.)投与により静脈及び脳室内投与のILー1βによる反応はいずれも完全に消失した。またプロスタグランジンE_2(PGE_2)の側脳室投与によってもILー1βと同様な反応がみられたが、それらの潜時はILー1βより短かった。さらにILー1β投与15分後血中ノルアドレナリンレベルはACTHとともに有意に上昇し、90分後にコントロ-ルレベルに戻った。このノルアドレナリンおよびACTH増加反応もインドメサシンの前投与で消失した。これらの結果よりILー1βは脳内PGE_2系を介して全身の交感神経系を亢進させることが明かとなった。この促進作用はILー1βによる体温上昇や脳による免疫系調節に関与しているものと思われる。今回の結果はILー1βによりRSNAは抑制されるとのこれまでの報告と異なっているが、麻酔の有無あるいは種差によるのかもしれない。
アストロサイトによる神経同期活動の制御とその機能の解明

アストロサイトが発達期と成熟期で、神経細胞の活動にどのような影響を及ぼすのかを調べた。発達期には、アストロサイトの活動が神経細胞の同期活動を制御していることが示唆された。アストロサイトの活動が消失したマウスでは、視覚野の神経細胞の機能的成熟が阻害されることが示された。成熟期では、アストロサイトの活動は神経細胞の同期活動に抑制的な効果があることが示唆された。また、神経細胞の同期活動がアストロサイトの活動を惹起すること、さらに神経細胞の活動パターンとよく一致した血流変化をもたらすことを示した。大脳皮質の発達期には、皮質上を伝播する同期活動が見られ、神経回路の成熟に役立っている可能性が考えられている。このような発達期の神経細胞の同期活動の役割を解明するため、神経細胞にカリウムチャンネル(Kir2.1)を遺伝子導入した。これにより、発達期の皮質の自発的な神経細胞の同期活動が著しく抑制された。Tet-Off系を用いて、誕生直前から生後2カ月まで神経細胞にKirを発現させて活動を大きく抑制し、その後それらの細胞を調べたところ、反応性、方位選択性が正常に形成されていた。従って、方位選択性の形成は神経活動に依存しないと考えられた。一方、方位選択性の形成後に、最適方位が再構成される過程があるが、この過程は神経細胞の同期活動の抑制により阻害されたため、神経細胞の同期活動に依存すると考えられた(投稿中)。この過程にアストロサイトが関与しているかを検証するために、発達期の大脳皮質の神経細胞とアストロサイトの細胞体の活動の同時観察を開始した。その結果、アストロサイトの細胞体のCa活動には2種類あり、神経細胞の同期活動に同期した速い活動と、同期していない遅い活動が観察された。さらに、アストロサイトの突起の活動は細胞体と独立に発生しているという報告があるため、飯野班により開発されたアストロサイトにYC-Nano50を発現するマウスを使って、突起における活動の観察を開始した。その結果、発達期のマウスのアストロサイトの突起において、細胞体とは独立に、より高頻度の活動が観察されているが、神経細胞の同期活動との対応についてはこれからの課題である。このアストロサイトのカルシウム濃度を抑制するために、カルシウムのバッファーであるBAPTA, AMを用いた。これをクモ膜上に投与すると、アストロサイトに選択的に取り込まれると考えられる。この操作により神経細胞の同期活動が選択的に減少することが観察された。アストロサイトの突起部分におけるカルシウム濃度の上昇を、Lck-GCaMP6f、またはYC-Nano50(Kanemaru et al., 2014)を用いて計測した。上述のような細胞体でのカルシウム上昇も観察されたが、遥かに頻繁に突起部分におけるカルシウム上昇が観察された。とくに突起の末端部においてカルシウム上昇が多く見られた。このようなアストロサイトの突起の活動が、神経細胞の最適方位の再構成に関与しているかどうかを検証するために、神経細胞の方位選択性の変化を開眼後数日間にわたって長期的に観察する系を開発した。生後すぐに、AAVを用いてGCaMP6sを神経細胞に導入すると、開眼時にはGCaMP6sの発現が神経細胞に十分に見られ、同一細胞群の方位選択性の変化を数日間追跡することが可能になった。これにより、一部の神経細胞では、開眼後に方位選択性が変化することが細胞レベルで確認された。このような神経細胞の方位選択性の変化に、アストロサイトが関与しているかどうかを検証するために、in vivoでアストロサイト内のCa2+濃度を制御する系として、DREADDを用いた系を開発した。神経細胞の同期活動が見られる生後10-15日にアストロサイトのCa濃度を制御するためには、生後直後にウイルスを感染させる必要がある。したがって、0日齢のマウスの一次視覚野にAAV8-GFAP-hM3D(Gq)-mCherryやAAV8-GFAP-hM4D(Gi)-mCherryを感染させる方法を開発し、アストロサイトにDREADDを導入した。さらに、同時にAAV5-GfaABC1D-Lck-GCaMP6fを感染させることにより、Ca2+感受性蛍光タンパクを導入した。これらのマウスを1014日齢で二光子カルシウムイメージングを行ったところ、Gq-DREADD、Gi-DREADDのいずれをastrocyteに発現させたものでも、CNO投与後に細胞内Ca2+濃度の振動的な上昇が観察された。幼若期にIn vivoでアストロサイトのCa濃度を制御する系を開発し、その神経活動への影響を検証した。in vivoでアストロサイトのカルシウム濃度を制御するために、DREADDを用いた系を開発した。AAV2/8とアストロサイト特異的なGFAPプロモーターを用いて、アストロサイトにhM3D(Gq)もしくはhM4D(Gi)を発現させた。CNOをマウスの腹腔に投与すると、前者はGqシグナルを活性化し、後者はGiシグナルを活性化する。神経細胞の同期活動が観察される生後10-14日にアストロサイト内のカルシウム濃度を制御するためには、生後直後にウイルスを感染させる必要がある。従って0日齢のマウスの一次視覚野にこれらのウイルスを感染させる方法を開発し、生後10-14日にこれらのDREADDが発現していることを確認した。

さらに、同時に、AAV2/5を用いて、GfaABC1D - Lck-GCaMP6fをアストロサイトに導入し、2光子イメージングによりin vivoで観察したところ、CNO投与後に、アストロサイトの細胞内のカルシウム濃度が振動的に上昇することが確認された。これはhM3D(Gq)、hM4D(Gi)をどちらでも観察され、両者ともアストロサイトにおいてはカルシウム活動を亢進させることがわかった。アストロサイトのカルシウム濃度を亢進させたときに、神経細胞の同期活動に影響が見られるかどうかを検証するため、上記と同様にAAV2/8とGFAPプロモーターを用いてアストロサイトにhM3D(Gq)もしくはhM4D(Gi)を導入し、AAV2/1とhSynapsinプロモーターを用いて神経細胞にGCaMP6sを導入し、CNOを腹腔投与してアストロサイトのCa活動を亢進させたときに、神経細胞の同期活動を2光子イメージングで観察したところ、同期活動の頻度が亢進することが観察された。(A)過去3年の研究により、本研究に必要な技術が揃いつつある。In vivoでアストロサイトのCa imagingを行う系を開発し、アストロサイトのCa活動を計測した。OGB-1, AMとSR101を用いて、アストロサイトの細胞体でのCa活動を観察することが可能になったのみならず、GECIであるLck-GCaMP6fやYC-Nano50を用いて、アストロサイトの突起での活動を計測することが可能になった。さらに、In vivoでアストロサイトのCa濃度を制御する系を開発し、その神経活動への影響を検証した。BAPTA-AMを用いた方法に加え、DREADDによる制御が可能になり、アストロサイト特異的にCa濃度を制御することが可能になった。これらにより、アストロサイトのCa濃度が、神経細胞の同期活動に影響を与えることが明らかにされつつある。(B)過去3年の研究により、本研究のターゲットとすべき、同期活動が神経細胞の機能発達に果たす役割が明らかになった。仮説として、アストロサイトによって制御される発達期の同期活動が神経細胞の機能的成熟に重要であることを検証しようとしているが、この発達期の同期活動が神経細胞の機能発達のどの側面に重要であるかを明らかにした。さらに、この機能的発達を細胞レベルで継時的に追跡する系を開発した。(C)今後、(A), (B)を組み合わせて、仮説の検証に取り組む。(A)の系を用いてアストロサイトのCa濃度を制御したときに、(B)の神経細胞の機能発達にどのような影響が現れるかを検証する。技術開発と、観察系の開発に時間を要したが、それらがほぼ終了したので、これから目的の仮説の検証に入る。従って、おおむね計画は順調に進んでいる。マウスV1における神経細胞とアストロサイトの活動を同時に観測するために、赤色のカルシウム指示蛍光タンパクであるRCaMP2を神経細胞に、cyto-GCaMP6fをアストロサイトに、AAVを用いて発現させ、無麻酔下の成体マウスでin vivo二光子カルシウムイメージングを用いて両者のカルシウム活動を観測したところ、複数のアストロサイトで同期する活動が観測された。視覚刺激を与えない時のアストロサイトと神経細胞の活動の関係を解析したところ、アストロサイトの同期活動がおこり始める数秒前に、神経細胞の同期的な大きな自発活動がみられることが見出された。
原始中性子星でのダイナモ作用と超新星爆発の理論的研究

II型超新星爆発について磁場を考慮した3次元数値シミュレーションを行い、査読論文にまとめた。この3次元シミュレーションにより、適当な強さの磁場があると、親星の回転軸方向に磁気流体ジェットが放射されることが初めて示された。また捻れた磁場がアルフヴェン波として上空を伝播する過程が、原始中性子星の形成(バウンス)から磁気流体ジェットの放出までの時間差を律速していることも明らかにした。さらに親星が回転軸に対して傾いた磁場をもつと、原始中性子星が回転軸に対して傾いた磁場をもつと、原始中性子内部に向きが周期的に反転する磁場構造が現れることや、ジェットとは垂直方向に遅いアウトフローが放出されることも見いだした。また磁気流体力学シミュレーションの数値技法の改良でも成果を挙げた。従来の方法で衝撃波を鮮明に捉えようとすると(1)平衡状態を長時間計算すると偽の加熱が発生する。(2)衝撃波面が座標軸と平行になる領域で不自然なこぶ(カーバンクル)が発生する。これらの問題点は、源泉項や数値粘性の計算法を変えることにより解消されることを示した。開発した数値シミュレーションコードは並列型のスーパーコンピュータで高速に動作することも確認した。II型超新星超新星爆発について磁場を考慮した3次元シミュレーションについて,査読論文にまとめ,国際会議で発表した。これまでの2次元シミュレーションでは軸対称性が仮定されていたため,磁場が回転軸に対して傾いている場合が扱えなかった。私達のシミュレーションにより,親星の磁場が回転軸に対し傾いている場合でも,回転軸方向にジェットが放出されることが確かめられた。また磁場が傾むいている場合,向きが動径方向に周期的に変化する磁気反転層が形成されることも新たに見いだされた。さらに原始性子星形成からジェット放出までの時間は,捻られた磁場がアルフベン波により上空に伝わるまでの時間とほぼ等しいことも示された。このため初期磁場が弱い場合でも長い時間磁場が捻られるため,ジェットのエネルギーはほとんど初期磁場の強さに依存しないことが示された。このシミュレーションでは,累積的な数値誤差による偽の加熱や,衝撃波面の数値的に歪み(カーバンクル)といった問題が発生したので,これらに対する独自の解決策を開発した。この方法についても,数値シミュレーションを主題とする国際集会で発表するとともに査読論文にまとめた。親星が自転に対して傾いた磁場をもつII型超新星爆発の3次元数値シミュレーションを学術雑誌に発表するとともに、国際会議で発表した。この分野では初の3次元シミュレーションにより、回転軸方向に磁気流体ジェットが放出されることや、不安定な構造の磁気反転層が形成されることを示した。またこれに関連し、磁気流体力学シミュレーションでの衝撃波の計算法に関する技術論文も学術雑誌に発表した。さらに高空間分解能のシミュレーションを行うため、シミュレーションコードの開発を行った。空間分解能を上げるのは、磁気回転不安定や対流不安定による短波長の乱れた流れを追跡するためである。これらの乱流は、ダイナモ効果や熱輸送により、超新星爆発に影響を与える可能性が指摘されている。空間分解能を上げると計算時間がかかるので、高速な並列型スーパーコンピュータで実行可能な形にコードを改訂した。また高密度ガスの状態方程式についても、Shenらのより現実的な状態方程式を採用するように書き換えている。まだコード開発の段階であるが、64CPUの並列計算機を使い、実効的な空間分解能を60%改善させた計算ができるようになった。また従来のコードより堅固で、長時間進化のシミュレーションも可能になったことも確認した。これはSASIとして知られる定在衝撃波の不安定性も研究対象にできることを意味する。利用できる計算機CPUを8倍ほど増やせる見込みなので、従来に比べ1次元方向で150%、体積や質量では10倍ほど高い空間分解能を達成できると予想している。
食細胞NADPHオキシダーゼの活性化におけるSrcホモロジー3領域の役割

白血球のひとつである好中球は、微生物の侵入に対してその局所に速やかに集まり、微生物を認識・貧食し殺菌する。この好中球による殺菌には、NADPHオキシダーゼという酵素により生成される活性酵素(強力な殺菌剤として働く)が重要な役割を果している。活性型NADPHオキシダーゼの形成には、二つの細胞質因子p47とp67が移行して細胞膜に存在するシトクロームb_<558>(gp91とp22の二つのサブユニットから成る)と相互作用することが必要であるがその分子機構は殆ど解っていなかった。p47とp67はそれぞれ分子内にSrcホモロジー3領域(SH3)を有しており、このSH3を介する蛋白質間相互作用がNAPHオキシダーゼの活性化において必須であることを我々は既に示していたが、更に、(1)p47のSH3とp22の結合は、p22細胞質領域のプロリン・リッチ領域を介しておこり、高親和性でかつ極めて特異的なものであること(投稿準備中)、(2)p47のN末端領域にはBem1p(酵母のシグナル伝達蛋白質)の一部と相同性をもつ全く新しいドメインが存在し、このドメインがNADPHオキシダーゼの活性化に必須であること(未発表)、(3)p67は自身のSH3によりp47のC末端部分のプロリン・リッチ領域に結合し、この相互作用もオキシダーゼ活性化に必要であること(投稿中)等を見いだした。また、休止時の細胞ではp67はp40と結合していることが知られていたが、(4)p40は、p67と結合することによりp67を不活性型にしている、即ちNADPHオキシダーゼの活性化を抑制していること(投稿中)、(5)この結合は奇妙なドメイン間の全く新しいタイプの蛋白質間相互作用によるものであり(投稿中)、更に(6)この新しいタイプの蛋白質間相互作用が酵母のシグナル伝達系でも重要な役割を果たすこと(未発表)を見いだした。
海洋天然物による血小板、筋細胞に対する興奮作用の機構解明

21世紀に向けた新しい医薬品資源を開発する目的で、海洋天然物の薬理学的、生化学的および化学的研究を行った。海洋由来の微小生物の大量培養によって得られたモノアシルグリセロール類が血小板機能を抑制することを見出した。また、ポリケチドのテオネゾライド-Aは血小板凝集に先立って起こる形態変化(shape change)を特異的に引き起こし、血小板活性化の初期の情報伝達を解析するためのツールとして有用であることを示した。一方、ゾ-ザンテラトキシン-A(ZT-A)は外液Ca^<2+>依存的な血小板凝集を引き起こすが、その細胞情報伝達系を詳細に検討したところ、チロシンリン酸化、ホスホリパーゼC-γ2、プロテインナーゼCの活性化を引き起こし、それがさらにmitogen-activatedprotein kinase(MAPK)を活性化し、細胞質ホスホリパーゼA_2の活性化を通してトロンボキサンA_2の生成が引き起こされることを明らかにした。ZT-Aの作用発現機構はアラキドン酸カスケード活性化薬のモデルとなるものと思われる。一方、プチロマイカリン-Aは特異的にATP結合部位と競合し、Na^+,K^+-ATPaseおよびCa^<2+>-ATPaseの阻害薬となることを示した。また、骨格筋筋小胞体からカフェインより1000倍強力にCa^<2+>遊離を引き起こすメチルブロモユ-ジストミンは平滑筋においては細胞膜直下のCa^<2+>の遊離作用を有し、細胞内Ca^<2+>のコンパートメントを研究していくためのツールとして有用であることを示した。以上のように、血小板および筋細胞の細胞情報伝達の解析を通して、いくつかの新しい天然物が特有の作用を現すことを見出し、それらが細胞情報伝達研究における薬理試薬として有用であること、また、医薬品開発のためのリ-ド化合物として有用であることを示した。我々がカリブ海産のホヤから発見したCa^<2+>遊離試薬eudistomin Dの誘導体9-methyl-7-bromoeudistomin D(MBED)の作用を回腸ならびに門脈平滑筋で検討したところ、MBEDはこれらの平滑筋の収縮を引き起こさず、平滑筋細胞の細胞膜に存在する、Ca^<2+>で活性化を受けるK^+-チャネル(BKチャネル)の活性を著しく変化させた。この知見からMBEDが、平滑筋の細胞膜近傍に存在する筋小胞体と、平滑筋の収縮を引き起こすCa^<2+>を供給する筋小胞体とを区別する初めての試薬であることが明らかとなった。一方、骨格筋のリアノジンレセプター(Ca遊離チャネル)を精製し、^3H-MBED結合を検討したところ、高親和性の特異的結合が見られた。従って、MBEDの結合部位が骨格筋Ca^<2+>遊離チャネル蛋白質上に存在する事が初めて証明された。現在、リアノジンレセプターをクローニングし、ミュータントレセプターを作成して、MBED結合部位が一次構造上のどこに存在するかを検討している。沖縄産海綿Theonellasp.から単離した新規ポリケタイド、Theonezolide-A(TZ-A)は、低濃度で小さな血小板凝集とともに、その著しい形態変化を引き起こした。この形態変化を引き起こす作用は外液のCa^<2+>の有無に依存しなかったが、凝集は外液のCa^<2+>を必要とした。

TZ-Aによる血小板凝集作用はその用量に依存して増大したが、その作用は血小板膜の糖蛋白質IIb-IIIaへのフィブリノーゲン結合の阻害剤で消失した。また、プロテインキナーゼCやチロシンキナーゼ阻害剤によっても抑制された。ところが、形態変化はそのいずれによっても影響を受けなかった。これまで血小板の凝集の前に起こる形態変化については、詳しいメカニズムが明らかではなかったが、TZ-Aがその解析に役立つ優れたツールとなりうることが示された。21世紀に向けた新しい医薬品資源を開発する目的で、海洋天然物の薬理学的、生化学的および化学的研究を行った。海洋由来の微小生物の大量培養によって得られたモノアシルグリセロール類が血小板機能を抑制することを見出した。また、ポリケチドのテオネゾライド-Aは血小板凝集に先立って起こる形態変化(shape change)を特異的に引き起こし、血小板活性化の初期の情報伝達を解析するためのルーツとして有用であることを示した。一方、ゾ-ザンテラトキシン-A(ZT-A)は外液Ca^<2+>依存的な血小板凝集を引き起こすが、その細胞情報伝達系を詳細に検討したところ、チロシンリン酸化、ホスホリパーゼC-γ2、プロテインキナーゼCの活性化を引き起こし、それがさらにmitogen-activatedprotein kinase(MAPK)を活性化し、細胞質ホスホリパーゼA_2の活性化を通してトロンボキサンA_2の生成が引き起こされることを明らかにした。ZT-Aの作用発現機構はアラキドン酸カスケード活性化薬のモデルとなるものと思われる。一方、プチロマイカリン-Aは特異的にATP結合部位と競合し、Na^+,K^<2+>-ATPaseおよびCa^<2+>-ATPaseの阻害薬となることを示した。また、骨格筋筋小胞体からカフェインより1000倍協力にCa^<2+>遊離を引き起こすメチルブロモユ-ジストミンは平滑筋においては細胞膜直下のCa^<2+>の遊離作用を有し、細胞内Ca^<2+>のコンパートメントを研究していくためのツールとして有用であることを示した。以上のように、血小板および筋細胞の細胞情報伝達の解析を通して、いくつかの新しい天然物が特有の作用を現すことを見出し、それらが細胞情報伝達研究における薬理試薬として有用であること、また、医薬品開発のためのリ-ド化合物として有用であることを示した。
インターフェロンを使用した肝細胞癌の治療及び予防に関する基礎的研究

インターフェロン(IFN)の肝癌細胞に対する増殖抑制効果を効率よく発現させるために(1)IFNと他の薬剤との併用投与、(2)新規の薬物放出装置の利用、(3)IFNの増殖抑制作用、特に、アポトーシス(細胞死)誘導に最も重要に関連する分子の同定とその制御による効果を検討した。その結果、血管新生因子の発現を阻害する分子標的薬との併用では一定の効果があり、新規薬物放出装置の利用も今後の改良により有効である可能性が示された。IFNによるアポトーシス誘導にXAF-1、TRAILと言う分子が密に関連し、これらの調節により効果の調節が可能となる可能性が示された。1.IFN製剤とその他の薬剤との併用による肝癌細胞の増殖抑制作用の評価について:IFN-製剤(IFN-β,PEG-IFN-α2b)とチロシンキナーセ阻害剤であるAG490(10<50nM)あるいは,NF-κB阻害剤であるβ-lactone(1,5μM)を用いて併用による増殖抑制作用を13株の肝癌を用いてMTTassay法で間検討した。その結果AG490は全て,β-lactoneは,1株を除く全株で濃度依存性に肝癌細胞の増殖を抑制した。併用効果は,IFN-βとの場合,AG490は,6株で相殺,7株で軽度の相加作用にとどまった。β-lactoneに関しては,同様に相殺9株,軽度の相加作用が3株に認められたのみであった。PEG-IFN-α2bの結果も類似していち。現在薬剤の種類を増やして検討中である。2.IFN-α誘導性アポトーシス関連重要分子の検討について:アポトーシス誘導分子のNoxa,BNIP-3,XAF-1,TRAIL-R1,TRAIL-R2,TRAIL,アポトーシス阻害分子のXIAPの発現について13株で検討した。その結果,IFN-α処理によりXAF-1のmRNAの発現上昇を全ての細胞株で認めた。Noxa,BNEP-3,XIAPは,3株ずつで上昇した。蛋白レベルでは,XAF-1の発現はIFN-αにより大部分で低下し,低下しない細胞株の多くはIFN-α誘導性アポトーシス出現と相関が見られた。TRAILのmRNAの発現上昇を11株で,TRAIL-R1,-R2の発現上昇を4株,3株で認めた。蛋白レベルでもTRAILとTRAIL-Rの発現上昇をいくつかの細胞株で認めたが,必ずしもIFN-αのアポトーシス誘導性と関連しなかった。I.肝癌細胞に対するPEG-IFN-αと阻害剤(チロシンキナーゼ阻害剤[AG490]、NF-κB阻害剤[β-lactone]、COX-2阻害剤[celebrex])併用投与による増殖抑制効果のin vitroにおける追加検討。前年度の検討にCox-2阻害剤を含め更に詳細に検討した。11種類の肝癌株は、3種類の阻害剤単独接触により濃度依存性に増殖が抑制され、72時間接触後の50%増殖抑制濃度は、AG490が9.1-20.4nM、β-lactoneが3.1-64.8μM、celecoxibが12.6-39.2μMであった。本年度はPEG-IFN-αとの併用実験結果を示す。AG490との併用では、3株で相加作用、1株で相乗作用、5株で相殺作用、2株で軽度の相加あるいは相殺作用であった。β-lactoneとの併用では、6株で相加作用、3株で相乗作用、2株で相殺作用、2株で軽度の相加あるいは相殺作用であった。celecoxibとの併用では、5株で相加作用、6株で相殺作用であった。β-lactoneの併用応用の可能性が示された。II.肝癌培養細胞のIFN-α誘導性細胞周期進行停止に関与する遺伝子の検討。マイクロアレイ解析でIFNによる細胞周期進行停止に関連性が深いと思われる5種類(CDK2, cyclinD, p16, p21, p27)の細胞周期関連蛋白の発現をreal-time PCR法を用いて6種類の肝癌株において検討した。その結果、PEG-IFN-α接触48時間後では、p21の発現が全ての細胞株で、p27の発現が1株でコントロール(IFN非接触)の2倍以上に上昇した。2株において、経時的に発現を検討すると、1株では、CDK-2やCyclinDの発現が接触後6時間で上昇していた。最終年度は、蛋白レベルの変化やその蛋白の機能・役割についての検討が必要である。インターフェロン(IFN)と抗VEGFヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ(アバスチン[○!R])との併用による肝癌細胞の抗腫瘍効果についてin vitro及びin vivoで検討した。

ベバシズマブは、in vitroで肝癌細胞に対して直接的な増殖抑制効果を示さなかった。ヌードマウス皮下移植ヒト肝癌に対する抗腫瘍効果は、ベバシズマブ、IFN、それぞれ臨床使用量の単独投与で比較的明瞭な効果が認められた。ベバシズマブによる抗腫瘍効果は血管新生阻害を介した作用と推察された。ベバシズマブ、IFN両者の併用投与では、抗腫瘍効果の増強は不明瞭であったが、併用群で最も広範な壊死が認められた。現在、今年度の計画通り、Sorafenib(ネクサバール[○!R])の抗腫瘍効果についてin vitro及びin vivoで検討中であるが、今後、ベバシズマブを含め種々の分子標的薬とIFNの併用による肝癌に対する抗腫瘍効果の増強作用の有無に関する継続的な検討が必要である。IFN-α誘導性細胞周期停止関連分子に関しては、時間・費用の面で検討が十分行えなかった。しかし、計画外のヒアルロン酸ゲルよりなる新規のDrug Delivery System(DDS)を用いたIFN-αの放出に関する有用性の検討が可能であった。その結果、この新規DDSを使用しIFNの放出率を検討すると半減期が3倍程度延長はしているものの、初期に放出量が多く薬物の放出速度のコントロールは不十分であった。現在別の素材の新規DDSが既に開発されており、今後、IFN、分子標的薬の単独あるいは併用投与を行いこのDDSの有用性について検討を継続する予定である。
半レヴィ過程と半自己相似過程の研究

3年間の補助金の最終年度であるが、今年度も、研究課題に関係ある無限分解可能分布のいろいろなクラスの、確率積分表現の研究に多くの時間を充てた。その結果、今年度の補助金交付申請時に目標とした、タイプGクラスおよびそのサブクラス系列の確率積分表現による特徴づけ、さらに、タイプGかつ自己分解可能である分布のサブクラスとして、非常に特徴的な表現をもつ新しいクラスを見つけた。その他にもよい結果を得て、2005年11月、ミュンヘン工科大学のセミナーで専門家の前で前島が成果を発表し、大きな賞賛を得た。結果として、半レヴィ過程に関する大きな成果を得ることは出来なかったが、確率積分表現に現れる確率過程レヴィ過程を半レヴィ過程に置き換えて研究する問題は、そのセミナーでも新しい問題として提起したが、大いに関心を持たれ、新しい国際共同研究の芽になりうることがわかった。それらは主に、前島・佐藤および、前島の学生、さらには米国テネシー大学のRosinskiとの共同研究として行われた。また、補助金交付申請時に述べた新しいテーマ、一般化Ornstein-Uhlenbeck過程についても、その時間極限として得られるLevy積分と呼ばれるものについて、無限分解可能性について調べた。その結果、非常にゆるい条件のもとで自己分解可能になること、さらには、面白い例をいくつか構成することができた。これらの結果は、2006年3月にメキシコで開かれる専門国際会議で、前島が報告した。3年間の研究の結果、次のステップとして、レヴィ過程を半レヴィ過程に置き換えて表現できる無限分解可能確率変数の研究への道筋が見えてきて、無限分解可能分布のより詳しいクラス分けの展望が開かれ、半レヴィ過程の導入の意味がより明らかになりつつある。又それらとは別の問題として、前島はメキシコCIMATのPerez-Abrueと共同で、確率行列の行列式が無限分解可能になる例を見つけ、現在国際誌に投稿中である。これはもとの確率行列自身は(行列値確率変数として)無限分解可能でない例として知られているもので、その意味でも、興味深い。1.半レヴィ過程は加法過程ではあるが一般的にはセミマルチンゲールではないため、確率積分が定義できない。そこでまず加法過程がセミマルチンゲールになるための必要十分条件を、加法過程の基礎になっているその特性関数のレヴィヒンチン表現の言葉で決定した。さらに広義積分が存在する条件も、半レヴィ過程の半定常増分性の周期に関係することがわかった。それらを使って、半レヴィ過程、半定常オルンシュタイン・ウーレンベック過程、半自己相似加法過程のクラスの関係を明らかにした。2.ここ数年、前島・佐藤・渡部が精力的に研究してきた半自己分解可能分布のサブクラスについて、確率積分表現による特徴づけを試みた。自己分解可能分布の場合はその定常増分性により特性関数による証明が可能だが、半自己分解可能分布に対してはその方法が使えない。そこで、1.で述べた3過程の関係を巧妙に使うことで、その証明に成功した。3.半自己相似加法過程は、その周辺分布が半自己分解可能になることが前島・佐藤の研究で知られているが、そのような例はまだあまり見つかっていない。最近前島の学生高橋が、ランダムな環境下での拡散過程の問題の中でそのような確率過程の構成に成功した。この例をさらに発展させることによって、数理物理現象における半自己相似過程の構成が期待され、次年度取り組みたい問題のひとつである。

4.その他の課題についてはまだ結果がでるまでに至っていないが、次年度の研究につながる部分的な結果は出つつある。3年間の補助金の2年目であるが、今年度は、研究課題に関係ある無限分解可能分布のいろいろなクラスの、確率積分表現の研究に多くの時間を充てた。それらは主に、前島・佐藤が中心となって行った。今まで無限分解可能分布のクラス分けは、主にその特性関数の中に現れるレヴィ測度の言葉で表現されていたが、それは解析的アプローチである。それに対して、無限分解可能確率変数をレヴィ過程による確率積分で現せれば、それは確率論的アプローチになる。それを試み、確率積分の被積分関数の形によってクラス分けすることに成功した。それらは、計3編の論文にまとめられて、現在投稿中である。1年目の報告にも述べたが、半レヴィ過程は加法過程ではあるが一般的にはセミマルチンゲールではないため確率積分が定義できないが、佐藤の1年目の研究によって、半レヴィ過程がセミマルチンゲールになるための必要十分条件が与えられているので、レヴィ過程を半レヴィ過程で置き換えることは可能である。その結果、次のステップとして、レヴィ過程を半レヴィ過程に置き換えて表現できる無限分解可能確率変数の研究への道筋が見えてきて、無限分解可能分布のより詳しいクラス分けの展望が開かれ、半レヴィ過程の導入の意味がより明らかになりつつある。その確率積分表現の証明の中に、半自己相似加法過程が重要な役割を果たすことも分かってきて、これが3年目(最終年度)の研究に繋がることが期待される。半自己相似過程独自の問題として、出来るだけ多くの半自己相似過程をデータを通して自然界の中から見つけるという問題は依然模索中であるが、数理物理現象に現れる半自己相似過程の構成は最終年度集中的に取り組みたい問題のひとつである。3年間の補助金の最終年度であるが、今年度も、研究課題に関係ある無限分解可能分布のいろいろなクラスの、確率積分表現の研究に多くの時間を充てた。その結果、今年度の補助金交付申請時に目標とした、タイプGクラスおよびそのサブクラス系列の確率積分表現による特徴づけ、さらに、タイプGかつ自己分解可能である分布のサブクラスとして、非常に特徴的な表現をもつ新しいクラスを見つけた。その他にもよい結果を得て、2005年11月、ミュンヘン工科大学のセミナーで専門家の前で前島が成果を発表し、大きな賞賛を得た。結果として、半レヴィ過程に関する大きな成果を得ることは出来なかったが、確率積分表現に現れる確率過程レヴィ過程を半レヴィ過程に置き換えて研究する問題は、そのセミナーでも新しい問題として提起したが、大いに関心を持たれ、新しい国際共同研究の芽になりうることがわかった。それらは主に、前島・佐藤および、前島の学生、さらには米国テネシー大学のRosinskiとの共同研究として行われた。また、補助金交付申請時に述べた新しいテーマ、一般化Ornstein-Uhlenbeck過程についても、その時間極限として得られるLevy積分と呼ばれるものについて、無限分解可能性について調べた。その結果、非常にゆるい条件のもとで自己分解可能になること、さらには、面白い例をいくつか構成することができた。
IV型コラゲナーゼ阻害物質の血管新生阻害作用とその応用に関する研究

血管新生は、病的には固型腫瘍、糖尿病性網膜症および炎症等の疾病に生ずる。従って、血管新生を阻害することによってこれらの疾病の防御あるいは治療が期待できる。故に、強力かつ特異的な阻害物質の出現が待たれている。申請者は、血管新生の初期過程で酵素によって生ずる血管基底膜の破壊に着目し、これに関与するproteaseを阻害することによって血管新生が阻止できると考えた。そこで、迅速性・多量処理・定量性に富んだ血管新生測定法(CAM法)を確立し、低分子酵素阻害物質を用いて、基底膜の破壊に関与する分解酵素を解明しようとした。その結果、actinoninが、基底膜主要構成成分であるIV型コラーゲンを特異的に分解するIV型コラゲナーゼを強く阻害することによって、用量依存的に血管新生を阻止することを見出し、IV型コラゲナーゼが血管新生に重要な役割を果たしていることを示唆した。そこで、actinoninの誘導体を合成し、IV型コラゲナーゼ阻害活性と血管新生阻害活性の相関性を検討し、相関係数r=0.920で正の相関を明らかにした。次いで、構造と活性の相関性を解析し、より強力な阻害活性を示す化学構造を推定し、新たにactinonin誘導体を合成した。これら化合物は、血管新生のin vivoモデルであるdorsal air sac法では血管新生を阻止し、また腫瘍移植実験においても腫瘍の定着を阻害することが明らかになった。以上のことから、IV型コラゲナーゼは血管新生に関与する主要酵素の一つで、IV型コラゲナーゼの強力な阻害物質は有効な血管新生阻害物質であることが明らかになり、血管新生を伴う重篤な疾病に対する有力な治療薬の可能性が考えられた。従って血管新生を阻害することによって、これらの疾病を防御あるいは、治療することが期待できる。申請者は、血管新生の初期過程で酵素によって生ずる血管基底膜の破壊に着目し、これに関与するproteaseを阻害することによって血管新生が阻害できると考えた。そこで、鶏卵漿尿膜(CAM)を用いて、迅速性・多量処理・定量性に富んだ血管新生測定法(CAM法)を確立し、血管新生の初期過程である基底膜の破壊に関与する分解酵素を解明しようとした。その結果、低分子酵素阻害物質actinoninが強力に用量依存的に血管新生を阻害することを見出した。更に、actinoninは、基底膜主要構成成分であるIV型コラーゲンを特異的に分解する4型コラゲナーゼを強く阻害することを見いだし、IV型コラゲナーゼが血管新生に重要な役割を果たしていることを示唆した。今年度は更に、IV型コラゲナーゼが血管新生過程に深く関与していることを実証しようと試み、新たにactinoninの誘導体を合成し、IV型コラゲナーゼの阻害活性と血管新生阻害活性の相関性を検討した。IV型コラゲナーゼは、血管内皮細胞培養液から部分精製して実験に供した。血管新生阻害活性はCAM法によった。両阻害活性は、同様な傾向を示し、相関係数r=0.920で相関性を示した。これらの活性測定で有効であった誘導体は、内皮細胞によるin vitroの解析で、基底膜の破壊を除く他のステップには作用しなかった。以上から、IV型コラゲナーゼが血管新生に深く関与していることが明らかになった。従って血管新生を阻害することによって、これらの疾病の防御あるいは治療が期待できる。

そこで、迅速性・多量処理・定量性に富んだ血管新生測定法(CAM法)を確立し、低分子酵素阻害物質を用いて、基底膜の破壊に関与する分解酵素を解明しようとした。その結果、actinoninが、基底膜主要構成成分であるIV型コラーゲンを特異的に分解するIV型コラゲナーゼを強く阻害することによって、用量依存的に血管新生を阻止することを見出し、IV型コラゲナーゼが血管新生に重要な役割を果たしていることを示唆した。そこで、actinoninの誘導体を合成し、IV型コラゲナーゼ阻害活性と血管新生阻害活性の相関性を検討し、相関係数r=0.920で正の相関を明らかにした。次いで、構造と活性の相関性を解析し、より強力な阻害活性を示す構造を推定した。本年度は、新たにactinoninを含む強力な阻害物質を合成し、in vitroでの阻害活性を検討した後、in vivo効果を検討した。その結果、血管新生のin vivoモデルであるdorsal air sac法では血管新生を強く阻止することを示し、また腫瘍移植実験においても腫瘍の定着を阻害することを明らかにし、IV型コラゲナーゼが血管新生過程に深く関与し、IV型コラゲナーゼ阻害物質が血管新生の阻害に有効であることを示した。これらによって、血管新生を伴う重篤な疾病に対し有効な治療薬の開発の可能性が考えられた。
二官能性芳香族ジアセチレンの固相放射線重合に関する研究

本研究は、種々の二官能性ジアセチレン化合物を合成し、二つの官能基や芳香核における置換基の結晶構造に及ぼす影響および結晶中の放射線重合反応の生長過程を明らかにする事を目的としている。一般に、芳香核が直接結合したジアセチレンは重合反応性が低い事が知られている。二官能性の芳香族ジアセチレンでは、片方のジアセチレン部位の重合により他方のジアセチレン部位の配列がポリマーのそれに近くなる事によって重合反応が促進される事が期待される。本年度は、1,4-および1,2-ジエチニルベンゼンと1-ブロモプロパルギルアルコールとのカップリング反応により二官能性のジアセチレン誘導体を合成し、結晶構造の解析とガンマ線照射による固相重合を行った。1,4-誘導体は二つのジアセチレン部位が重合可能な結晶構造を有し、放射線照射により黒色の有機溶媒に不溶性の固体となった。大きなπ電子共役系を有するポリマーの生成が示唆された。被照射試料のIRスペクトル解析により重合収率を求めた。また、1,4-誘導体の一方のジアセチレン部位がエチニル基に置き換わったモノマー、1-(5-ヒドロキシ-1,3-ブタジイニル)-4-ニチニルベンゼンを合成した。このモノマーは、IRスペクトルの放射線照射に伴う変化から、エチニル基とジアセチレン部位の双方で重合が進行する事が明らかになった。結晶構造からは、この二つの重合反応が結晶中の異なる軸方向に進行する事が示唆された。これらの1,4-誘導体について被照射結晶のESRスペクトルより、結晶中に生成するラジカルの同定を行った。一方、1,2-誘導体はジアセチレン部位が並行に配列しておらず、重合反応性を持たない事が分かった。
日本人ミトコンドリアDNAヘテロプラスミーの発現頻度と判定基準の確立

(1)20人の血液と毛髪(毛幹)の検査試料から11例にヘテロプラスミーが検出された。このうち血液・毛幹両方の試料に同一のヘテロプラスミーを有していたのは1例で、のこりの10例にはその割合に一箇所以上の違いが確認された。HV1領域のみでは4例、HV2領域では2例、その両方の領域では4例であった。鎖長ヘテロプラスミーを有していたのは3例でC連続と言われる部位で検出された。1塩基置換によるヘテロプラスミーについては10例の毛幹試料でそれぞれ一箇所以上の部位で検出された。(2)長野県七五三掛遺跡出土人骨のヘテロプラスミー約30002000年前と推定され、縄文時代晩期に相当する人骨の頭蓋骨2体分と下顎骨3体分について分析をおこなった。頭蓋骨はHV1で4箇所の塩基置換とC・連続で1塩基挿入、HV2でも4箇所の塩基置換とC・連続で4塩基挿入の配列を示していた。一方、2体分の下顎骨ではそれぞれ同一の配列を示し、HV1では3箇所の塩基置換、HV2では3箇所の塩基置換とC・連続での1塩基挿入、さらに248番のアデニンの欠損したcomponentと欠損していないcomponentによる鎖長ヘテロプラスミーであった。ミトコンドリアDNAのタンパクにコードしない約1000塩基程度の領域(Dループ:non-cordingregion)は高頻度多型を有していることから個人識別、特に母系同一家系の調査、研究に利用されてきた。しかしながら最近の研究から突然変異を有するミトコンドリアが混在し、その結果(1)2つの塩基のピークがかさなって検出される-塩基ヘテロプラスミー(2)塩基の挿入や欠失によって生ずる鎖長ヘテロプラスミーが報告されるようになった。この変異は世代間(母子)と個体内(血液、毛髪、臓器など)に発現するが日本人集団ではその頻度や判定法についてはほとんど明らかにされていない。今年度、得られた結果は下記のとうりである。(1)11組の母子間でHV1領域にヘテロプラスミーを有していたのは7組であった。そのうち1組は母子のヘテロプラスミーの位置と割合が完全に一致し、他の6組ではヘテロプラスミーの有無や塩基の割合に母子間での相違が明らかとなった。(2)母子3組ではHV1の16189のCとTのヘテロプラスミーの割合の相違、母子1組では169129のGとAのヘテロプラスミーが検出された。(3)同一人物の試料では血液よりも毛幹部のヘテロプラスミーが多く検出された。(4)同一試料ではHV1の16116,16124、16129、16162、等多くの部位でヘテロプラスーがあり、毛髪のみでは16116,16162,16189,16223などに検出された。(5)毛髪からのDNA抽出にはシリカビーズ法が適法であり、劣化した毛髪試料でもその有効性が確認された。
X線ラマン散乱による軽元素の局所構造解析法の開発

モザイク性の良い湾曲スーパーグラファイト(SG)を使った分光器を製作した。このSGはR=240mmのヨハン型湾曲結晶であり、モザイク性が0.2°以下のものである。(0004)反射によれば5100eV付近、(0006)反射によれば8000keV付近をカバーする。(0004)反射を利用し、長さ100mmの一次元検出器PSPCを使った場合、エネルギー幅約500eVの範囲の信号を同時に蓄積していくことが可能である。この場合分解能は分光結晶の能力よりはむしろ励起光のサイズと検出器の位置分解能との悪い方で決まる。前者は0.8mm、後者は0.2mmである。実際に弾性散乱の半値幅は6eVであった。分解能の向上のためには励起光を更に集光するかまたはスリットで絞ることが必要である。この分光器をつくば市の高エネルギー物理学研究所放射光実験施設フォトンファクトリーBL7Cに持ち込み、X線ラマン散乱の測定を行った。ダイアモンドからX線ラマンスペクトルを12時間の蓄積でS/N>100で測定することができ、従来のゲルマニウム結晶を用いた分光器に較べ、数倍効率が良いことを確かめた。また、BN粉末のNおよびLiF結晶のFの内殻Is電子によるラマンスペクトルを測定した。これは炭素より重い元素のX線ラマンスペクトルの初めての観測例である。本年度には一度しか放射光による実験のマシンタイムが得られなかったが、来年度早々2回目のマシンタイムがあり、更に研究を進める予定である。
D加群と表現論

研究代表者の堀田は、従来からのテ-マである指標の代数解析的研究すなわち指標D加群を追求する中で、青木・Gelfandの微分方程式系のD加群的取扱いを試みた。その結果、この方程式は、ト-ラスの埋込みによって、オイラ一方程式系を転移し、それをフ-リエ変換したものが主要部を占めることが分かった。このことから、この方程式系の正則性(確定特異点型であること)についての知見が得られる。関連して、小田は、ト-リック多様体の代数幾何の研究の中で、組合せ幾何学との関連で、上のGelFand学派の結果の新しい応用を見出した。さらに、石田は、ト-リック多様体のある種の不変量の計算法を具体化し、特にカスプ特異点について新しい知見を得た。これらの研究は青木・Gelfand方程式の特性多様体の構造を解明するために大きく役立つものと思われる。代数群の数論からの研究を行った佐武は、有理構造をもつ対称領域が有利点をもつ条件、およびその商空間の志村モデルの定義体との関係等を明らかにした。D加群れの表現論への応用を試みた齋藤は、ト-ラスの作用がある多様体上のホロノミ-D加群の局所化定理を得た。これによって、指標をレフシェツ型不動点定理から計算する方法が拡大されたことになる。可解格子模型とアフィン・リ一環の表現論の関連を追求してきた長谷川は、柏原・三輪が構成したBroken Zn-Symmetric modelと呼ばれる模型、すなわちYang-Baxter方程式の解を、Baxterの8頂点解に関連した代数(Sklyanin代数)を用いて体系的に導出することに成功した。