hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
記憶形成のメカニズム解明の基盤となるショウジョウバエ嗅覚記憶中枢の発生機序の解明

【背景と目的】キノコ体はショウジョウバエの脳における嗅覚学習記憶の中枢である。脳高次機能を担う神経回路の構築機構の理解という点から、その形態形成を制御する因子の機能を解析することは重要である。本研究ではキノコ体で発現する遺伝子sickieに着目した。変異体の表現型の解析を端緒に、中枢神経系の発生を制御する因子群との相互作用を調べることで、分子機能の解明を目指した。【研究成果】sickieのmRNAは神経に分化して間もない細胞集団で発現し、Sickieは神経軸索に一過的に顕著に検出された。RNAi阻害を誘導したキノコ体では、神経軸索束の形成異常が観察された。遺伝子欠失変異体でも同様に、キノコ体軸索束の形成が阻害される表現型が見られた。変異体条件下で、キノコ体特異的にsickieを発現させると、軸索束の形成異常がレスキューされた。次に、Sickieはアクチン結合性のタンパクに保存されているドメインをもつことから、アクチン重合を制御する他因子との相互作用の検証を行った。線虫のsickieホモログと結合することが既知なアクチン制御因子としてabiが知られていたため、その表現型を解析した。ショウジョウバエのabi変異体では軸索束が過剰に長く、sickieとは逆の表現型を示した。この異常はsickieとabiのヘテロ2重変異体においては抑制された。さらに、sickieの表現型はabiを同時に強制発現することで相乗的に亢進したことから、これらの因子は遺伝学的に相互作用することが示唆された。以上より、sickieはキノコ体神経の軸索形成に必要であり、アクチン重合のダイナミクスを制御する因子と相互作用することで、アクチン細胞骨格の制御に関わり、中枢神経系の軸索形成に寄与している可能性がある。キノコ体はショウジョウバエの脳に左右一対ずつ存在する巨大な神経線維束である。この構造に異常がある遺伝子の変異体では、嗅覚に依存した記憶が正常に形成されないことが知られている。本研究においては、記憶形成のメカニズム解明のための物理的基盤として、まずはキノコ体の発生機序の分子基盤の解明を目指している。はじめに、pBGay-Gal4/UASエレハンサートラップスクリーニングによりキノコ体で発現し、その形態形成を制御するような遺伝子の同定を試みた。約1500系統のスクリーニングの結果、160個の発現候補遺伝子がリストアップされた。その後ISHにより、キノコ体で実際に発現の確認される6遺伝子を同定した。次にこれら候補遺伝子に関し、RNAiによるキノコ体特異的遺伝子ノックダウンを行った。野生型のキノコ体の神経軸索は、脳前方まで投射した後、正中線側と背側に分岐した神経東を形成することが知られているが、キノコ体特異的sickieノックダウンを行った個体においては、脳の前方まで投射してきた後に、背側や正中線側まで伸長しきれなかったり、背側、正中線側のどちらかに偏って投射したりするなどの異常が観察された。キノコ体の形態形成におけるsickieの分子レベルでの機能の解明の足がかりとするため、各種データベースを用いた配列解析を行った。またcDNAクローニングを行い、sickieには少なくとも3つのアイソフォームが存在することが明らかになった。さらに詳細な解析を進めるため、FLP/FRT mediated deletion法により、sickie特異的な遺伝子欠失系統を作成した。この変異体の表現型を解析したところ、RNAiの場合と同様な異常が観察された。これらから、sickieはキノコ休を形成する神経細胞の軸索の投射・伸長に重要な役割をもつ遺伝子であることが示唆された。キノコ体はショウジョウバエをはじめとする節足動物の脳に存在し、一対の巨大な神経線維束を形成する。この構造に異常がある変異体では、嗅覚に依存した記憶が正常に形成されないことが知られている。pBGay-Ga14/UASエンハンサートラップスクリーニングという独自の手法を用いることで、キノコ体で発現し、その形態形成を制御するような遺伝子の同定を試みた。その後、in situハイブリダイゼーションにより、キノコ体でsickieという遺伝子の発現を確認した。既存の遺伝子欠失変異体が存在しなかったため、新規にsickie遺伝子の欠失系統を作製した。このsickie遺伝子欠失変異体のキノコ体における表現型を解析したところ、RNAiによるノックダウンのときと同様な異常が観察された。また、この異常は外来的にsickie遺伝子をキノコ体で発現させることで軽減されることが明らかになり、sickieがキノコ体の発生に必須であることが強く示唆された。sickieタンパク質の細胞内局在を明らかにするため、抗sickie抗体を作成し、免疫組織染色を行った。発現パターンの解析の結果、sickieは投射・伸長中、あるいは投射・伸長を完了して間もないキノコ体神経細胞の軸索で特異的に発現することが示唆された。MARCM法を用い単一神経細胞レベルでの変異体の表現型解析を行ったところ、軸索の投射・伸長・分岐のどのステップにも異常が見られることがわかった。また、軸索で機能することが知られている既知の遺伝子との遺伝学的解析により、相互作用しうる候補遺伝子を幾つか同定した。

今後は、他の遺伝子変異体との遺伝学的な相互作用のより詳細な解析や、生化学的な実験等により、sickieと遺伝学的/物理的に相互作用する因子を明らかにし、神経軸索の投射伸長の基本的メカニズムの一端の解明を目指したい。【背景と目的】キノコ体はショウジョウバエの脳における嗅覚学習記憶の中枢である。脳高次機能を担う神経回路の構築機構の理解という点から、その形態形成を制御する因子の機能を解析することは重要である。本研究ではキノコ体で発現する遺伝子sickieに着目した。変異体の表現型の解析を端緒に、中枢神経系の発生を制御する因子群との相互作用を調べることで、分子機能の解明を目指した。【研究成果】sickieのmRNAは神経に分化して間もない細胞集団で発現し、Sickieは神経軸索に一過的に顕著に検出された。RNAi阻害を誘導したキノコ体では、神経軸索束の形成異常が観察された。遺伝子欠失変異体でも同様に、キノコ体軸索束の形成が阻害される表現型が見られた。変異体条件下で、キノコ体特異的にsickieを発現させると、軸索束の形成異常がレスキューされた。次に、Sickieはアクチン結合性のタンパクに保存されているドメインをもつことから、アクチン重合を制御する他因子との相互作用の検証を行った。線虫のsickieホモログと結合することが既知なアクチン制御因子としてabiが知られていたため、その表現型を解析した。ショウジョウバエのabi変異体では軸索束が過剰に長く、sickieとは逆の表現型を示した。この異常はsickieとabiのヘテロ2重変異体においては抑制された。さらに、sickieの表現型はabiを同時に強制発現することで相乗的に亢進したことから、これらの因子は遺伝学的に相互作用することが示唆された。以上より、sickieはキノコ体神経の軸索形成に必要であり、アクチン重合のダイナミクスを制御する因子と相互作用することで、アクチン細胞骨格の制御に関わり、中枢神経系の軸索形成に寄与している可能性がある。
電場・温度場の下での液体内の気泡の挙動に関する研究

本研究は、宇宙ステ-ションなどの微小重力場を利用した材料製造技術に関連する基礎的研究であり、材料融液中の混入した気泡(あるいは非混合異種液滴)を表面張力差あるいは電場を利用して移動させ、融液外の除去する技術の開発を目的とする。1Gの重力加速度が作用する地上においては、融液中の混入した気泡は浮力を受けて上昇し、液体外に排出される。しかし微小重力場においては、気泡はそのまま液体中に静止している。これは、融液を凝固させて材料を製造する際に障害となる。微小重力場において液体中の気泡を除去するには、浮力以外の力に頼る必要があり、その一つとして表面張力差の利用が考えられる。液体の表面張力が、液体の温度あるいは濃度(ただし多成分系の場合のみ)によって変化する現象(マランゴニ効果)を利用し、液体中に温度匂配あるいは濃度匂配を与えれば、気泡と液体の界面に流動が生じて気泡は表面張力の小さい方に向かって移動するはずである。本研究ではまずこのような現象についての理論的解析および実験観測を行った。しかし、実用的見地から見ると、表面張力差による気泡の移動は、作用する力が微弱なために緩慢であり過ぎる。そこで本研究では、さらに外部から電場を印加することにより、液体内の気泡に作用する電気流体力学(EHD)的効果を利用し、より迅速に気泡を移動させる方法を検討した。2年間の研究で得られた成果は次のとおりである。(1)地上実験により、温度匂配のある液体中での微小気泡の移動および変形の様子の観測を行った。移動速度については理論値との一致を確認した。(2)落下搭を用いて、短時間の微小重力実験を行い、理論値との比較を試みた。(3)直流電場の印加による気泡の移動現象を観測した。微小重力下での材料融液中に混入している気泡あるいは液滴を除去する方法の一つとして、本年度は、融液に温度勾配を与えた場合に気・液(気泡の場合)界面あるいは液・液(液滴の場合)界面に生ずる界面張力の不均一分布による力を利用して気泡(液滴)を移動させる方法について基礎的実験を行った。材料融液を模擬する試験流体としてシリコ-ン油を用い、これを満たした直方体容器の上下壁面(水平に設置)の間に温度差をつけ、シリコ-ン油に注入した単一空気泡の挙動を顕微鏡およびCCDカメラを通してCRTモニタ-画面上に写して観測した。まず、温度勾配を与えないで行った予備実験によって、液体中を浮力の作用によって上昇する空気泡の終端速度が理論的予測値にほぼ一致することを確認した。次に、容器の上下壁面間に下方壁から上方壁に向かって低下するような温度勾配を与えた場合について実験を行い、空気泡表面に作用する表面張力分布の作用によって、気泡の上昇速度が抑えられること、数値的には、気泡の移動速度は低速度気泡に対する理論的予測値におおよそ一致することがわかった。実測値と理論的予測値の差異の原因は、主として液体の諸物性値の温度変化および液相・気相間の吸収・放出による気泡径変化によるものと推測されるが、確認は次年度に行う予定である。また、落下塔を利用して擬似微小重力実験、また、電場を利用した気泡(あるいは液滴)の除去実験なども次年度に行いたいと考えている。

本研究は、宇宙ステ-ションなどの微小重力場を利用した材料製造技術に関連する基礎的研究であり、材料融液中に混入した気泡(あるいは非混合異種液滴)を表面張力差あるいは電場を利用して移動させ、融液外に除去する技術の開発を目的とする。1Gの重力加速度が作用する地上においては、融液中に混入した気泡は浮力を受けて上昇し、液体外に排出される。しかし微小重力場においては、気泡はそのまま液体中に静止している。これは、融液を凝固させて材料を製造する際に障害となる。微小重力場において液体中の気泡を除去するには、浮力以外の力に頼る必要があり、その一つとして表面張力差の利用が考えられる。液体の表面張力が、液体の温度あるいは濃度(ただし多成分系の場合のみ)によって変化する現象(マランゴニ効果)を利用し、液体中に温度勾配あるいは濃度勾配を与えれば、気泡と液体の界面に流動が生じて気泡は表面張力の小さい方に向かって移動するはずである。本研究ではまずこのような現象についての理論的解析および実験観測を行った。しかし、実用的見地から見ると、表面張力差による気泡の移動は、作用する力が微弱なために緩慢であり過ぎる。そこで本研究では、さらに外部から電場を印加することにより、液体内の気泡に作用する電気流体力学(EHD)的効果を利用し、より迅速に気泡を移動させる方法を行い成果を得た。昨年度に引き続き本年度は次のような研究を行い成果を得た。(1)温度勾配のある液体中での微小空気泡の移動速度の測定を地上重力下で行い、理論値との一致を確認した。(2)落下塔を用いた微小重力実験を行い、理論値との一致を確認した。(3)直流電場を印加することによる、液体中の気泡の移動現象を確認した。
イオン交換樹脂を原料とした新規機能性ナノ炭素材料「カーボンナノスフィア」の合成

本研究では,固体であるイオン交換樹脂を原料とし,触媒金属イオンをイオン交換で高濃度・高分散担持させてから熱処理することによって,直径35 nmの一様な球形かつ中空状の構造を有する新規なナノ構造炭素「カーボンナノスフィア」を合成することに成功した。カーボンナノスフィアのBET表面積は1000 m2/g前後に達し,電気二重層キャパシタの電極材料として使用したところ,作成した電極は高速充放電特性に優れることが明らかになった。カーボンナノチューブなどのナノ構造炭素は、炭素電極のアーク放電や炭化水素ガスのCVD等の気相反応プロセスで合成されている例が多いが、本研究では、固体であるイオン交換樹脂を原料とし、触媒金属イオンをイオン交換で高濃度・高分散担持させてから熱処理することによって新規なナノ構造炭素を合成することを目指している。本年度は、様々な樹脂や金属を原料に用いて得られる炭素の構造を調べ、特異な構造を有するナノ構造炭素を製造できるかどうかを検討した。スルホン酸基を有する強酸性陽イオン交換樹脂(SK)、カルボキシル基を有する弱酸性陽イオン交換樹脂(WK)に、Ni^<2+>、Fe^<2+>、Cu^<2+>、Co^<2+>をそれぞれイオン交換した後、75150μmに粉砕した樹脂を気流層型熱分解装置により1100°Cで熱分解した。この装置では迅速に試料を昇温(約800°C/s)することができる。WKにFe^<2+>、Cu^<2+>、Co^<2+>をイオン交換担持し熱分解を行った場合、直径が50100nmほどのカーボンプラツクが生成したが、Ni^<2+>を担持したWKからは、直径35nmの一様な球形かつ中空状の特徴的なナノ構造炭素が生成した。また、SKにNi^<2+>を担持した試料では、形や大きさにややばらつきのある球形、中空のナノ構造炭素が確認された。SKにCu^<2+>を担持した試料では、特徴的な構造は見られなかったが、Fe^<2+>を担持した試料では、Ni^<2+>を担持したWKから得られたナノ構造炭素に比べ小さい、23nmの楕円体形の中空構造を有するナノ構造炭素を確認できた。このように原料樹脂種や担持する金属種によって、単位構造の大きさや形の異なるナノ構造炭素を製造できることがわかった。また、これらのナノ構造炭素はいずれも、1000m^2/g前後の大きいBET表面積を有しており、様々な用途に活用できる可能性が示唆された。カーボンナノチューブなどのナノ構造炭素は、炭素電極のアーク放電や炭化水素ガスのCVD等の気相反応プロセスで合成されている例が多いが、本研究では、固体であるイオン交換樹脂を原料とし、触媒金属をイオン交換で高濃度・高分散担持させてから熱処理することによって新規なナノ構造炭素を合成することを目指している。昨年度は、イオン交換樹脂に種々の金属イオンをイオン交換担持した後、迅速熱分解することにより中空球状のナノ構造を有する炭素材料、カーボンナノスフィアの製造に成功し、原料樹脂種や交換する金属カチオン種によって、単位構造のサイズや形状の異なるカーボンナノスフィアが得られることを明らかにした。本年度は、本法により得られるカーボンナノスフィアの収率、特性に与える原料イオン交換樹脂の官能基種や架橋度、担持するカチオン種の影響を検討するとともに,応用例として電気二重層キャパシタ電極への適用の可能性を検討した。Ni2+を担持した弱酸性陽イオン交換樹脂から得られるカーボンナノスフィアの炭素収率は、わずか4%であったのに対して、金属を担持した強酸性陽イオン交換樹脂から得られるカーボンナノスフィアの炭素収率は40%にも上った。また、架橋度が高い樹脂を原料とすることにより、構造や特性にほぼ影響を与えず炭素収率を改善できることが分かった。カーボンナノスフィアから作製した電気二重層キャパシタ電極の静電容量を調べたところ、低電流領域では静電容量は小さいが、高電流領域では活性炭等を使用した電極よりも静電容量が大きく、高速充放電特性に優れていることが明らかになった。表面積は活性炭のほうが大きいが、活性炭は細孔が主にミクロ孔であり、高速なイオン拡散に必要なメソ孔がほとんどないのに対して、カーボンナノスフィアはミクロ孔だけでなく、メソ孔も存在するという特徴を有しているため高速充放電特性に優れていると考えられた。
小脳失調の評価

平成9年度にはデジタイザーを用いて筆圧ペンでの筆圧データー値の特性を測定し、筆圧データをコンピューターで表示するプログラムを作り、デジタイザーから筆圧データ値が表示されるようにするための基礎的検討をした.その結果は、入力筆圧と出力筆圧の関係は筆圧の感触を調節するように、段階づけでの設定が可能であり、その関係を変換するように設定が可能であり、その際の書字も記録が可能であることであった.しかしながらその際の筆圧を連続的に記録することが不可能であり、入力と出力の関係からみた書字の筆圧の絶対値と書字の様相の連続記録を可能とするプログラムが必要であり、その結果が先に待たれることとなった.そこで平成10年度では健常者での筆圧の巧みな調節可能であることのダブレットドライバーでの筆圧値の観察からの証明を明らかにし、失調患者でのその巧緻性の喪失の予測から、入力時の筆圧が絶対値で大きく変化することの予想を筆圧連続観察記録装置の開発する必要性を認識して、その実現によって運動失調症の各種疾患での比較検討と経過追及を目指したがへいせい10年度内ではそのプログラム作りが未だ間に合わないことが明らかとなった.そこで平成10年度は柳本真市らの協力を得て、上肢機能の評価をビジュアルC_<++>から開発されたイメージスキャナーによって、被験者の線分および円図形を追跡描画してパソコン記憶装置にとりこみ、原図形からの被験者が追跡した偏位を処理した.その結果、脊髄小脳変性症では正常対照に比して3-7倍の増加がみられ、とくに線分試験での終末偏位が著明に増加していた.平成9年度にはデジタイザーを用いて筆圧ペンでの筆圧データー値の特性を測定し、筆圧データをコンピューターで表示するプログラムを作り、デジタイザーから筆圧データ値が表示されるようにするための基礎的検討をした.その結果は、入力筆圧と出力筆圧の関係は筆圧の感触を調節するように、段階づけでの設定が可能であり、その関係を変換するように設定が可能であり、その際の書字も記録が可能であることであった.しかしながらその際の筆圧を連続的に記録することが不可能であり、入力と出力の関係からみた書字の筆圧の絶対値と書字の様相の連続記録を可能とするプログラムが必要であり、その結果が先に待たれることとなった.そこで平成10年度では健常者での筆圧の巧みな調節可能であることのダブレットドライバーでの筆圧値の観察からの証明を明らかにし、失調患者でのその巧緻性の喪失の予測から、入力時の筆圧が絶対値で大きく変化することの予想を筆圧連続観察記録装置の開発する必要性を認識して、その実現によって運動失調症の各種疾患での比較検討と経過追及を目指したがへいせい10年度内ではそのプログラム作りが未だ間に合わないことが明らかとなった.そこで平成10年度は柳本真市らの協力を得て、上肢機能の評価をビジュアルC_<++>から開発されたイメージスキャナーによって、被験者の線分および円図形を追跡描画してパソコン記憶装置にとりこみ、原図形からの被験者が追跡した偏位を処理した.その結果、脊髄小脳変性症では正常対照に比して3-7倍の増加がみられ、とくに線分試験での終末偏位が著明に増加していた.平成9年度の研究では、本研究の目的である上肢機能の評価のためにその前提となる基礎的研究を行った.脊髄小脳変性症には多くの疾患が含まれ、本邦に多いオリーブ橋小脳萎縮症を中心とする弧発性小脳運動失調症と本邦に多いSCA6とMJDなどの遺伝性運動失調症について、筆圧を研究の主眼として上肢運動失調の検討を行うことを来年度の最終目的とする.そのためにその基礎として、デジタイザーを用いて筆圧ペンにかける圧力と筆圧データ値の特性を測定し、各タブレットと筆圧ペンの特性を測定し、筆圧データをコンピュータで表示するプログラムを作り、デジタイザからの筆圧データ値が表示されることが可能となることを目指した.本年度では、在来のタブレットドライバーについての筆圧に関して、既に開拓され、市販されているソフトとその機能についての検討をした.即ち、その結果は次の如くであった.入力筆圧と出力筆圧の関係は、筆圧の感触を調節するように、段階づけて設定可能である.また、その関係を変換するように設定が可能であり、その際の書字も記録可能である.しかしその際の筆圧を連続的に記録することは現状では不可能であり、入力と出力の関係もみながら書字に際しての筆圧の絶対値と書字の実態についての連続記録を可能とするプログラムが必要であり、来年度の目標とする.本年度の研究から健常者では筆圧を巧みに調節することが可能であることがタブレットドライバーでの筆圧値の観察から明らかにされたが、運動失調では、失調の程度が軽度および中等度では、運動の巧緻性が失われるので入力に際しての筆圧の程度とその絶対値が大きく変化することが予想され、筆圧運続観察記録装置の開発の必要性がさらに明らかにされた.平成9年度にはデジタイザーを用いて筆圧ペンでの筆圧データー値の特性を測定し、筆圧データをコンピューターで表示するプログラムを作り、デジタイザーがら筆圧データ値が表示されるようにするための基礎的検討をした.

その結果は、入力筆圧と出力筆圧の関係は筆圧の感触を調節するように、段階づけでの設定が可能であり、その関係を変換するように設定が可能であり、その際の書字も記録が可能であることであった.しかしながらその際の筆圧を連統的に記録することが不可能であり入力と出力の関係がらみた書字の筆圧の絶対値と書字の様相の連続記録を可能とするプログラムが必要であり、その結果が先に待たれることとなった.そこで本年度では健常者での筆圧の巧みな調節可能であることのタブレットドライバーでの筆圧値の観察からの証明を明らかにし、失調患者でのその巧緻性の喪失の予測から、入力時の筆圧が絶対値で大きく変化することの予想を筆圧連続観察記録装置の開発する必要性を認識して、その実現によって運動失調症の各種疾患での比較検討と経過追及を目指したが、本年度内ではそのプログラム作りが未だ間に合わないことが明らかとなった.そこで本年度は柳本真市らの協力を得て、上肢機能の評価をビジュアルC++から開発されたイメージスキャナーによって、被験者の線分および円図形を追跡描画してパソコン記憶装置にとりこみ、原図形からの被験者が追跡した偏位を処理した.その結果、脊髄小脳変性症では正常対照に比して3-7倍の増加がみられ、とくに線分試験での終末偏位が著明に増加していた.
係数励振によるセミアクティブダンパの時間遅れ改善

一般的にセミアクティブダンパは抵抗力を制御できることが利点となっているが,その抵抗力が変化する際に必ず立ち上がり時間の時間遅れが生じる.そのため,どんなに優れた制御手法を用いても,その機械的な遅れのため振動制御の効果を充分に発揮できないのが問題である.仮に,その時間遅れを早くすることができれば,より効果的な振動制御が可能である.そこで本研究では,その時間遅れを早くするために係数励振を用いた方法を提案するものである.電磁抵抗型ダンパを用いて,その指令信号を励振させて,立ち上がり時間を測定した.実験から,係数励振をした際の時間遅れは,従来のステップ応答時に比べて改善できることが明らかになった.振動抑制装置(セミアクティブダンパ)は,制御時に信号を送ってから機械的性質が変わるまで立ち上がり時間の遅れが必ず生じる.本研究では,この機械的な時間遅れの改善を目的に,係数励振を利用することでメカニカルに改善を図るものである.2012年度は,電磁抵抗型のセミアクティブダンパを設計し装置を製作した.加えて,リレー回路を用いたコントローラを用いて,加振実験によって装置単体の抵抗力特性および時間遅れを調べた.なお,装置の製作は研究代表者と本学院生および学生が当学内工作工場において,および実験は同院生および同学生が担当した.リレー回路を用いた直流モータ,三相ブラシレスモータ,同期・非同期交流モータを試したがどれもあまり改善傾向が見られなかった.そこで2013年度は,電流制御器を用いて実験を行った.まず,ダンパが目標通りの定常応答を実現するかを確かめるために,等速加振において係数励振を用いた場合および比較のためステップ入力時,オーバーシュート入力時の抵抗力の立ち上がり時間を測定した.加えて,一次遅れ系を考慮したシステムを考え理論式の導出を行った.それらの結果から,既存のステップ応答時よりある程度の改善が図られたことを確かめた.一般的にセミアクティブダンパは抵抗力を制御できることが利点となっているが,その抵抗力が変化する際に必ず立ち上がり時間の時間遅れが生じる.そのため,どんなに優れた制御手法を用いても,その機械的な遅れのため振動制御の効果を充分に発揮できないのが問題である.仮に,その時間遅れを早くすることができれば,より効果的な振動制御が可能である.そこで本研究では,その時間遅れを早くするために係数励振を用いた方法を提案するものである.電磁抵抗型ダンパを用いて,その指令信号を励振させて,立ち上がり時間を測定した.実験から,係数励振をした際の時間遅れは,従来のステップ応答時に比べて改善できることが明らかになった.振動抑制装置(セミアクティブダンパ)は,制御時に信号を送ってから機械的性質が変わるまで立ち上がり時間の遅れが必ず生じる.本研究では,この機械的な時間遅れの改善を目的に,電磁抵抗型セミアクティブダンパを開発し,係数励振を利用することでメカニカルに改善を図るものである.2012年度は,まず電磁抵抗型セミアクティブダンパの減衰力理論式から小規模モデルの設計パラメータを決定し試作装置を製作した.リレー回路を用いたコントローラを応用し,加振実験によって装置単体の抵抗力特性および時間遅れを調べた.なお,装置の製作は研究代表者と本学院生および学生が当学内工作工場において,および実験は同院生および同学生が担当した.直流モータに代わって,三相ブラシレスモータ,同期・非同期交流モータを試したがどれもあまり変化が見られなかった.加えて,発電機端子間の電流値を外部信号(コンピュータからの電圧値)によって変化させて,回路の抵抗値を変化させるリレー回路を製作した.それによって,ダンパの減衰係数を変えることが確認できた.交流モータから出力される電圧量は,正弦波状になるため,その平滑化にコンデンサ(二次系となるため時間遅れはさらに増加すると予想されたため)を使わずに係数励振を試みた.次の段階として,抵抗力測定実験を行った.ダンパおよびコントローラが目標通りの応答感度を実現するかを確かめるために,三角波加振においてON/OFF制御時の抵抗力の時間遅れを測定した.また正弦波状変位を加え,そのときの荷重と変位の履歴曲線を測定し,減衰係数を調べた.また,シミュレーションとして時間遅れを考慮した一自遅れ系に本システムが取り付けられた場合の数値計算を行った.制御手法は分担研究者と共に協議した.それらの結果を検討した結果,既存の方法よりある程度の改善が図られたことを確かめた.振動抑制装置は(セミアクティブダンパ)は,振動制御時などにコンピュータ側から信号を送った時点から,その装置の機械的性質(例えばここでは減衰性能)が変わるまでに時間のずれが生じる.これを立ち上がり時間の遅れと言う.本研究では,この機械的な時間遅れの改善を目的として,係数励振を利用することで改善を図るものである.平成24年度より研究を開始した.まず,電磁抵抗型のセミアクティブダンパを設計し製作した.加えてリレー回路を用いたコントローラによって時間遅れの測定実験を行った.直流・交流モータなど種々のモータを試したがあまり改善傾向が見られなかった.そこで平成25年度は,電流制御器を用いて時間遅れの改善を試みた.まず,ダンパが目標通りの定常応答を実現するかを確かめ,次に等速度時における係数励振を用いた場合の時間遅れを測定した.また,比較のためにステップ入力時,オーバーシュート入力時などの場合も行った.これらの結果を理論づけるために,ダンパを1次遅れ系と見なして理論解析したものの,実験との整合性が合わなかった.

そこで最終年度である平成26年度は,理論をさらに改善するために1次遅れ系から2次遅れ系に改め,その計算を行い,その妥当性を確かめた.工学これまでに,理論式の導出,および検証実験を終えている.理論式の導出においては,ダンパの減衰力立ち上がり挙動を一次遅れ系と仮定し、係数励振をした場合の定常応答理論式を求めた.また,その理論式から係数励振した際の励振振動数および振幅の最適条件を求めることができた.次に,それらを検証するため,理論から得られた条件にダンパを調整し,減衰力立ち上がり時間測定実験を行った.本実験は当学研究室内のサーボ型疲労試験機を用いて行った.実験の結果,係数励振をした場合の立ち上がり時間は,係数励振していないステップ応答時の立ち上がり時間に比べて半分程度早くなることがわかった.また励振のタイミング(位相)においても最適値があることがわかった.以上から概ね計画通りに遂行し,成果が挙がっていると言える.初年度の計画において、装置の設計、製作および時間遅れ測定実験は終えている.またそれらの結果から,各種モータの試行やリレー回路方式などから,時間遅れに関して概ね予想通りの結果が得られているので,順調に進展していると言える.しかし,まだ時間遅れの抜本的な改善に向けて,係数励振を用いた方法は,数度実験は行っているものの,理論通りの結果が得らず,試行錯誤の段階であり,初期の計画においては満足のいく結果ではない.2014年度は最終年度となるため,最終確認と成果発表を行う予定である.解析の妥当性を検証するためにこれまで一次遅れ系としたものを二次遅れ系と仮定し,係数励振をした場合の定常応答理論式を検討する.その際の最適条件を導出したい.理論から得られた励振条件を変えて再度実験する際に,精度良く計るために高速バイポーラ電源を用いて,より細かなサンプリング周期での立ち上がり時間を測定する.また,ある程度の研究成果が得られたので,日本機械学会機械力学・計測制御部門講演会Dynamics & Design Conference 2014,および計測自動制御学会の国際会議SICE 2014に講演発表する予定である.2013年度は初年度の実験およびシミュレーション結果から,制御理論を検討した上で実際に一自由度振動系に本装置を取り付けて振動実験および解析を行う.時間遅れについて所定の性能が得られない場合は,当該年度も引き続いてモータの選定と係数励振の活用方法(振動数など)を試行する.本システムの有効性および実現可能性を確かめるために,三次元振動台(当大学振動実験解析棟内)を用いて,本システムを取り付けた小規模な一自由度振動モデルの地震応答実験を行う.実地震波(代表的な地震波4種類程度)を入力し,加速度および変位を測定する.得られたセンサ信号はデジタルシグナルプロセッサを介してコントローラにフィードバックされる.制御手法についてはシミュレーションで用いた手法(前述の二値切替制御など)を使う.また,地震波の最大入力加速度を変えて比較検討する.解析は有限要素法や数値演算ソフトウェアを用いて数値計算を行う.それらの値を実験結果と比較し,その誤差はおよそ10%以内を目標とする.その際に簡略化したモデルを用いた場合と実モデルとの誤差を検証する.また,FFTアナライザーで時間遅れおよび応答スペクトルを測定し,本システムの性能評価を行う.主な問題点は1実現可能性について(耐荷重の大型化)
オートファジー誘導による悪性グリオーマ治療抵抗性克服の試み

悪性グリオーマ細胞は、抗癌剤や放射線に対して抵抗性である。この病態の大きなメカニズムが悪性グリオーマ細胞のアポトーシス抵抗性にある。一方、第二のプログラム細胞死と言われるオートファジーは、悪性グリオーマの細胞死のメカニズムとして重要である。われわれは、薬理学的手法を用いて培養グリオーマ細胞にオートファジーが誘導可能かどうかを検討した。その結果、アポトーシス阻害剤やオートファジー促進剤で悪性グリオーマ細胞にオートファジーの誘導が生じることを明らかにした。この方法は治療抵抗性の悪性グリオーマにおける新たな戦略と考えられた。培養グリオーマ細胞株を細胞障害性のある放射線やtemozolomideあるいはcisplatinなどの抗癌剤に暴露させ、その後に生じる細胞死にアポトーシスとオートファジーがどのように関与しているのかを調べた。放射線照射やtemozolomide作用後の培養グリオーマ細胞にHoechst 33258染色を行うと、細胞核の断片化は観察されず、アポトーシスの発生はみられないと判断された。一方、cisplatin作用後の細胞では、Hoechst 33258染色にて細胞核の断片化が観察され、アポトーシスの発生が観察された。またAcridine orangeによる染色を行うと、放射線照射やtemozolomide、cisplatin作用後のいずれの細胞にもオートファジーにみられるオートファゴゾームの細胞質内発生が多数観察された。すなわち培養グリオーマ細胞株においては、放射線やtemozlolomide作用後の細胞死は、オートファジーであるがcisplatinのような薬剤はアポトーシスとオートファジーによる細胞死を同時に生じさせると考えられた。オートファジー阻害薬である3-methyl adenineやbafilomycinで細胞を前処理すると放射線や抗癌剤暴露後にアポトーシスを示す細胞が増えた。一方、アポトーシス阻害薬であると同時にNF-kB阻害剤でもあるpitavastatinの前処理を行うとcisplatin作用後にオートファジーによる細胞死が増えアポトーシスが減少した。すなわちグリオーマ細胞においては、アポトーシスとオートファジーのいずれの細胞死の経路もとりうると言える。アポトーシスとオートファジーの二つの細胞死の分子シグナル伝達経路の間でクロストークが存在している可能性がある。アポトーシスとオートファジーは、形態が全く異なる細胞死のメカニズムである。そこで培養グリオーマ細胞株を放射線やtemozolomideあるいはcisplatinなどの抗癌剤に暴露させ、その後に生じる電子顕微鏡所見を観察した。放射線照射やtemozolomide作用後の培養グリオーマ細胞には、細胞核の断片化やクロマチンの濃縮は観察されず、アポトーシスの発生はみられないと判断された。一方、cisplatin作用後の細胞では、細胞核の断片化が観察され、アポトーシスの発生が観察された。また放射線照射やtemozolomide、cisplatin作用後のいずれの細胞にもオートファジーにみられるオートファゴゾームの細胞質内発生が多数観察された。以上の結果から培養グリオーマ細胞株においては、放射線やtemozolomide作用後の細胞死は、オートファジーであるがcisplatinのような薬剤はアポトーシスとオートファジーによる細胞死を同時に生じさせると考えられた。すなわちグリオーマ細胞においては、アポトーシスとオートファジーのいずれの細胞死の経路もとりうると考えられた。したがってアポトーシスとオートファジーの二つの細胞死の分子シグナル伝達経路の間でクロストークが存在している可能性がある。培養グリオーマ細胞株を放射線やtemozolomideあるいはcisplatinなどの抗癌剤に暴露させ、その後に生じる形態学的変化と生化学的変化を観察した。放射線照射やtemozolomide作用後の培養グリオーマ細胞には、電子顕微鏡では細胞核の断片化やクロマチンの濃縮は観察されず、アポトーシスの発生はみられないと判断された。イムノブロットでは、LC3の朝照が見られた。以上の結果から培養グリオーマ細胞株においては、放射線やtemozolomide作用後の細胞死の様式は、オートファジーであるがcisplatinのような薬剤はアポトーシスとオートファジーによる細胞死を同時に生じさせると考えられた。

一方、アポトーシス阻害薬であると同時にNF-kB阻害剤でもあるpitavastatinの前処理を行うとcisplatin作用後にオートファジーによる細胞死が増えアポトーシスが減少した。すなわちグリオーマ細胞においては、アポトーシスとオートファジーのいずれの細胞死の経路もとりうると考えられた。したがってアポトーシスとオートファジーの二つの細胞死の分子シグナル伝達経路の間でクロストークが存在している可能性がある。
強磁場による選択的強磁性相誘起課程の解明

本研究の目的は、従来の方法では合成が困難であるL10-FeNiの合成を行うことである。L10-FeNiは希土類系磁石の代替品として期待されているが、規則化する時間が非常に長く数億年という時間が必要であり、隕鉄として存在している。したがって、良質な試料を合成することが困難である。一方で我々は強磁性相に磁場印加することで、ゼーマンエネルギーの利得によって、強磁性が安定化することを見出した。我々はこの現象に注目して、磁場により規則化を促進できるのではないかと考えた。従来のFeNiの合成方法に磁場中熱処理を加えることでFeNi規則化に対する磁場効果を明らかにする。
フィリピンにおけるエイズ発症と流行拡大に影響するHIV流行株増殖能の解析

ヒト免疫不全ウイルス感染症対策には、流行規模の緩和とエイズ発症阻止の2つ課題解決のために、ウイルス株の性質が、流行規模やエイズ発症に影響するとの仮説を立てた。すなわち、「増殖力の高いウイルス株に感染した個体ではエイズを発症しやすく、このような個体が、流行規模を大きくする」と考えている。この課題を検証するため、近年感染者の増加が顕著なフィリピンをフィールドとし、フィリピン保健省と感染症中央病院との新たな共同研究を始める。
上皮・内皮陥入組織における器官決定機構の解明とその制御

上皮系の陥入によって生じる器官形成のメカニズムを明らかにする為に、各器官(歯、唾液腺、肺、腎臓、毛等)の発生段階における遺伝子発現を網羅的に解析することを試みた。これまで当研究室で実施していたマイクロアレーを用いた手法に加え、遺伝子の転写活性を手法としたスクリーニングとしてCAGE法を用いて、歯、毛、および唾液腺組織での遺伝子転写量の解析を行い、新たか候補遺伝子の同定に成功した。更に切歯および臼歯から細胞を調整し、それぞれ約6000細胞を用いて、single cell RNAsequenceを行い、個々の細胞がどのような遺伝子をどの程度発現しているのかを明らかにした。昨年度から継続しているsingle cell RNAsequence解析に関して、歯の発生段階における全てのステージにおいて解析を行ない、現時点で約3万細胞における遺伝子データベースの構築を行なった。これらのスクリーニングの中で同定した新規分子について、特に歯特異的転写因子AmeloDに関しては、AmeloDが歯原性上皮細胞の幹細胞から内エナメル上皮に分化する移行時期に特異的に発現することを免疫組織学的に明らかにした。さらにAmeloD欠損マウスにおいては、歯全体が小さくなり、上皮細胞の移動に重要な役割を演じていることを明らかにした。またCAGEを用いた解析においては、歯胚特異的な転写開始点の同定に成功し、特にmRNAのみならず、microRNAの転写開始点の同定とともに、これら転写されるmicroRNAが歯胚形成過程に極めて重要な役割を演じていることを明らかにした。これまでの包括的な遺伝子スクリーニングにより、歯胚および唾液腺に発現する遺伝子群の発生段階での発現パターンを網羅的に明らかにすることができた。特にこれまで不明であった中間層、星状網の細胞における分化マーカーの同定と実際の組織内での発現パターンを明らかのすることができた。このことにより、単一の上皮幹細胞から各細胞への分化の方向性を厳密な遺伝子発現によって検討することが可能となった。また個々の分子に関しては、いくつかの分子において遺伝子改変マウスを作製し、いずれのマウスににおいてもエナメル質形成不全症を呈することを確認している。これら分子群は、主にエナメル芽細胞の分化過程において発現している分子であり、初期段階から最終分化段階まで、段階的に発現している分子を連続的に欠損させていることから、エナメル芽細胞の分化過程をより詳細に解析できる準備が整った。研究当初より進めているSox21の解析に関しては、Sox21-Anapc10-Skip2-E-cadherinという分子カスケードの同定に成功し、Sox21の欠損がどのようにして上皮ー間葉転換(EMT)に関わるかを詳細に解明することができた。これらの知見は、歯の発生のみならず、癌の浸潤や進展にも関わることから、歯の発生研究から癌抑制につながる新たな情報を提供できる可能性がでてきた。これまで作成した包括的な遺伝子データベースをより詳細に解析する必要があり、データベースの整備(大規模データの分割化)を行なうことで、より簡便なデータスクリーニング法の構築をはかる。特にデータベース管理やデータ解析の専門家を配置し、歯特異的分子の新たな同定に向けた取り組みを実施する。個々に同定した分子に関しては、siRNAや機能阻害ペプチドを用いて歯関連細胞、歯および唾液腺胚の器官培養系を用いて、発生過程に及ぼす影響を検討する。これらのスクリーニングの中で細胞分化や器官発生に影響を及ぼす分子に関しては、遺伝子改変によるノックアウト動物の作成を行なう。既にこれらのスクリーニングが完了し、遺伝子改変マウスの作成ができているAmeloDやGPR115等については、個々のマウスモデルにおける歯の表現系解析を継続するとともに、我々が既に保有するAmbn、Epfn/Sp6、Sox21欠損マウスとの掛け合わせにより、分子間相互作用を個体レベルで評価することで、歯の発生過程における役割解明を実施する。これらの知見を元に、iPS細胞やES細胞からの人為的な器官誘導法の開発に繋げる。上皮系の陥入によって生じる器官形成のメカニズムを明らかにする為に、各器官の発生段階における遺伝子発現を網羅的に解析することを試みた。更に切歯および臼歯から細胞を調整し、それぞれ約6000細胞を用いて、single cell RNA sequenceを行い、個々の細胞がどのような遺伝子をどの程度発現しているのかを明らかにした。その結果、切歯を用いた解析においては、歯原性上皮幹細胞から、内外エナメル上皮、中間層、星状網の細胞集団に加え、内エナメル状にについては分泌期および成熟期のエナメル芽細胞の分化段階に至るまで、どの細胞がどのように分化していくのかを遺伝子譜系で明らかにすることができた。また、CAGE法やsingle cell RNA sequenceを用いて同定したいくつかの遺伝子に関しては、組織内発現をin situ hybridization法や蛍光免疫染色法を用いて解析した結果、包括的な遺伝子スクリーニングの結果と一致して、各上皮組織特異的な発現を確認することができ、少なくとも歯においては、各上皮細胞の分化特異的なマーカー分子の同定に成功した。これらのデータを元に、毛の発生段階における各スクリーニングのデータベースと比較することで、上皮系の陥入器官の運命決定に関わる因子の同定を行う準備が完了した。これまで本研究室で実施していた歯胚と毛包組織との包括的遺伝子スクリーニングで得られた分子の機能解析については、Sox21、AmeloD、GPR115等を中心に細胞レベルの解析を実施した。

Sox21に関しては、細胞内の蛋白分解に関わるAnapc10の遺伝子発現を直接制御し、上皮細胞マーカーの1つであるE-cadherinの発現調節を行っていることを見出した。AmeloDに関しては、新規の歯特異的bHLH型転写として同定したが、本分子を欠損させたマウスを作成した結果、歯の大きさが小さくなり、歯根も短くなることを発見した。in vitroの解析からAmeloDは、E-cadherinの発現を抑制する分子であり、上皮細胞の移動(migration)に関連していることを見出した。Sox21およびAmeloDに関する研究については、いずれも論文投稿まで行うことができた。一方、CAGE法やsingle cell RNA sequence等の新たな遺伝子スクリーニングにより、歯胚のおいてどの細胞がどういった譜系で分化していくのかを明らかにすることができた。歯原性上皮幹細胞から、内外エナメル上皮、中間層、星状網の細胞集団に加え、内エナメル状にについては分泌期および成熟期のエナメル芽細胞の分化段階に至るまでの遺伝子発現を1細胞レベルで明らかにすることができ、これまで特定の細胞集団でした存在しなかった細胞マーカーについても、全ての細胞において同定することに成功した。このような背景から、これまで同定していた遺伝子に関しては論文投稿まで漕ぎ着けることができ、また器官発生に関わる新たな遺伝子の同定も数十種類明らかにすることができたため、当初の計画以上に進展していると判断した。上皮系の陥入によって生じる器官形成のメカニズムを明らかにする為に、各器官(歯、唾液腺、肺、腎臓、毛等)の発生段階における遺伝子発現を網羅的に解析することを試みた。これまで当研究室で実施していたマイクロアレーを用いた手法に加え、遺伝子の転写活性を手法としたスクリーニングとしてCAGE法を用いて、歯、毛、および唾液腺組織での遺伝子転写量の解析を行い、新たか候補遺伝子の同定に成功した。更に切歯および臼歯から細胞を調整し、それぞれ約6000細胞を用いて、single cell RNAsequenceを行い、個々の細胞がどのような遺伝子をどの程度発現しているのかを明らかにした。昨年度から継続しているsingle cell RNAsequence解析に関して、歯の発生段階における全てのステージにおいて解析を行ない、現時点で約3万細胞における遺伝子データベースの構築を行なった。これらのスクリーニングの中で同定した新規分子について、特に歯特異的転写因子AmeloDに関しては、AmeloDが歯原性上皮細胞の幹細胞から内エナメル上皮に分化する移行時期に特異的に発現することを免疫組織学的に明らかにした。さらにAmeloD欠損マウスにおいては、歯全体が小さくなり、上皮細胞の移動に重要な役割を演じていることを明らかにした。
開心術前後における細胞外液量変化と組織構造変化に関する解析

周術期には、手術侵襲に基づく組織損傷や炎症機転により、体水分量の著しい再分配が生じる。例えば、組織の炎症は、毛細血管間隙や細胞膜の構造を破壊することにより、その透過性を亢進させ、術中の体液喪失を補うための輸液療法は、細胞や細胞間質における水分貯留を助長する。このような周術期体液動態の変化は、術後回復にさまざまな影響を及ぼし、したがって、その評価手段として新たなモニタリング技術が求められている。一方、生体組織の電気的特性を、多周波数におけるインピーダンスとして評価する生体インピーダンス法では、等価電気回路モデルに当てはめることにより、体液成分の動態を非侵襲的に追跡することが可能である。現在までに、同法により推定した細胞外液量が、腹部手術後の細胞外液量変化をよく反映し、細胞浮遊液モデルへの非線形適合を行うことから、体夜動態だけでなく、細胞膜を含む微細組織構造の変化に関する情報を抽出しうる可能性が示されている。今回の研究では、体液変動か大きいと考えられる人工心肺を用いた開心術前後において本法の臨床的有用性を検討することにあるが、実測による術中水分バランスとの相関では、細胞外液量の変化は体幹抵抗との相関が高く(r=0.61)、全身抵抗との相関は低い傾向(r=0.24)を示した。しかし、心拍出量維持を目的とした輸液療法や強心薬投与、あるいは体温変化によるデータ変動が大きく、いずれも有意ではなかった。また、心拍出量との相関では、心拍出量が低いほど有意な細胞外液量増大(r=-0.72)を認め、周術期においては、細胞内外における水分シフトの著しいことが示された。例えば、組織の炎症は、毛細血管間隙や細胞膜の構造を破壊することにより、その透過性が亢進し、術中の体液喪失に対して行われる輸液療法は、かえって細胞や細胞間質における水分貯留を助長することが認められている。このような体液動態の変化は、周術期管理として日常的に測定される循環動態の指標からは評価が困難なため、新たなモニタリング技術の開発が求められている。一方、生体組織の電気的特性を、さまざまな周波数におけるインピーダンスとして評価する生体インピーダンス法では、電気的等価回路モデルに当てはめることにより、体液成分の動態を非侵襲的に追跡することが可能である。現在までに、同法により推定した細胞外液量が、腹部手術後の細胞外液量変化をよく反映し、さらに細胞浮遊液モデルへの非線形適合を行うことから、体液動態だけでなく、細胞膜を含む微細組織構造の変化に関する情報を抽出しうる可能性が示されている。今回の研究では、今までの理論的解析の応用として、人工心肺を用いた開心術前後における体液動態や組織構造変化を追跡することにより、本法の臨床的有用性を確立することにあるが、実測による術中水分バランスとの相関を検討した結果、細胞外液量の変化は生体局所インピーダンスとしての体幹抵抗との相関が高く(r=0.74)、全身抵抗との相関は低い傾向(r=0.36)が認められ、開腹術前後と同様な結果が得られた。また、生体インピーダンス法に基づく細胞外液量測定は、人工心肺使用に伴って経時的に増大する傾向を示し、周術期においては、細胞内外における水分シフトの著しく生じうることが示された。

例えば、組織の炎症は、毛細血管間隙や細胞膜の構造を破壊することにより、その透過性を亢進させ、術中の体液喪失を補うための輸液療法は、細胞や細胞間質における水分貯留を助長する。このような周術期体液動態の変化は、術後回復にさまざまな影響を及ぼし、したがって、その評価手段として新たなモニタリング技術が求められている。一方、生体組織の電気的特性を、多周波数におけるインピーダンスとして評価する生体インピーダンス法では、等価電気回路モデルに当てはめることにより、体液成分の動態を非侵襲的に追跡することが可能である。現在までに、同法により推定した細胞外液量が、腹部手術後の細胞外液量変化をよく反映し、細胞浮遊液モデルへの非線形適合を行うことから、体液動態だけでなく、細胞膜を含む微細組織構造の変化に関する情報を抽出しうる可能性が示されている。今回の研究では、体液変動が大きいと考えられる人工心肺を用いた開心術前後において本法の臨床的有用性を検討することにあるが、実測による術中水分バランスとの相関では、細胞外液量の変化は体幹抵抗との相関が高く(r=0.61)、全身抵抗との相関は低い傾向(r=0.24)を示した。しかし、心拍出量維持を目的とした輸液療法や強心薬投与、あるいは体温変化によるデータ変動が大きく、いずれも有意ではなかった。また、心拍出量との相関では、心拍出量が低いほど有意な細胞外液量増大(r=-0.72)を認め、周術期においては、細胞内外における水分シフトの著しいことが示された。
牛の遺伝性横隔膜筋症の病理発生機序に関する免疫化学的・蛋白化学的探索

初年度では遺伝性横隔膜筋症の保因牛の検索と侵淫情況を調査した.さらに,本疾患の原因蛋白の探索のために、発症牛と対照牛の横隔膜筋に対する抗体をそれぞれ作製し,異常蛋白の検出を行った.今年度は作製した抗体を用いて蛋白の精製を行った.また,同じホルスタイン牛に発生している遺伝性心筋症について病理学的・遺伝学的背景について検索した.保因牛の検索のためにホルスタイン牛213頭を検索した.このうち49頭に本疾患に特徴的なコア様構造が観察された.49頭はいずれも本疾患の家系に含まれ,保因牛の特徴であるコア様構造は病理学的に横隔膜筋症でみられるそれに一致したことから,横隔膜や心筋にコア様構造を有する症例は横隔膜筋症の保因牛であることが示唆され,広く北海道十勝に侵淫していることが明らかとなった.横隔膜筋症の原因蛋白の探索の目的で,発症牛と対照牛の横隔膜筋組織全量に対する抗体をそれぞれ作製・検索を行った.発症牛筋組織に対する抗体での免疫ブロット法では,横隔膜筋症例で約55kD,65kDに特異的に蛋白の増量がみられた.対照牛筋組織に対する抗体では横隔膜筋症例で約85kDに蛋白の欠損がみられた.これら蛋白を免疫沈降法および二次元電気泳動法により回収し,アミノ酸配列解析をエドマン分解法により行った.現在までのところこの解析は完了しておらず,蛋白の同定はできていない.一方,本疾患の本態解明の一助として同じホルスタイン牛に発生している遺伝性心筋症について病理学的,遺伝学的な調査を行った.心筋は心筋繊維の肥大と空胞変性を特徴とし,肥大した心筋繊維では筋繊維の枝分かれ像(fiber splitting)がみられた.遺伝学的に心筋症例の両親はいずれも,横隔膜筋症発症牛の共通祖先である一頭の種牛に遡れることが明らかとなった.このことから両疾患は遺伝的に重なり合う,表現型の異なる疾患である可能性が示唆された.初年度では遺伝性横隔膜筋症の保因牛の検索と侵淫情況を調査した.さらに,本疾患の原因蛋白の探索のために、発症牛と対照牛の横隔膜筋に対する抗体をそれぞれ作製し,異常蛋白の検出を行った.今年度は作製した抗体を用いて蛋白の精製を行った.また,同じホルスタイン牛に発生している遺伝性心筋症について病理学的・遺伝学的背景について検索した.保因牛の検索のためにホルスタイン牛213頭を検索した.このうち49頭に本疾患に特徴的なコア様構造が観察された.49頭はいずれも本疾患の家系に含まれ,保因牛の特徴であるコア様構造は病理学的に横隔膜筋症でみられるそれに一致したことから,横隔膜や心筋にコア様構造を有する症例は横隔膜筋症の保因牛であることが示唆され,広く北海道十勝に侵淫していることが明らかとなった.横隔膜筋症の原因蛋白の探索の目的で,発症牛と対照牛の横隔膜筋組織全量に対する抗体をそれぞれ作製・検索を行った.発症牛筋組織に対する抗体での免疫ブロット法では,横隔膜筋症例で約55kD,65kDに特異的に蛋白の増量がみられた.対照牛筋組織に対する抗体では横隔膜筋症例で約85kDに蛋白の欠損がみられた.これら蛋白を免疫沈降法および二次元電気泳動法により回収し,アミノ酸配列解析をエドマン分解法により行った.現在までのところこの解析は完了しておらず,蛋白の同定はできていない.一方,本疾患の本態解明の一助として同じホルスタイン牛に発生している遺伝性心筋症について病理学的,遺伝学的な調査を行った.心筋は心筋繊維の肥大と空胞変性を特徴とし,肥大した心筋繊維では筋繊維の枝分かれ像(fiber splitting)がみられた.遺伝学的に心筋症例の両親はいずれも,横隔膜筋症発症牛の共通祖先である一頭の種牛に遡れることが明らかとなった.このことから両疾患は遺伝的に重なり合う,表現型の異なる疾患である可能性が示唆された.様々な疾患で病理学的検索のために剖検された8ケ月齢から15歳齢のホルスタイン牛213頭について横隔膜、肋間筋、心筋を病理組織学的に検索した。このうち49頭に遺伝性横隔膜筋症に特徴的なコア様構造が観察された。49頭の年齢は様々なるものの、系統調査の結果から遺伝性横隔膜筋症の結果に含まれていた。コア様構造は好酸性均質で、筋線維の中央、あるいは散在性にみられるものの、筋線維の大小不同、中央核線維、壊死等の変性性変化は観察されなかった。組織化学的並びに免疫組織化学的にこれらコア様構造はGomori's trichrome変法では濃緑色、NADH-TR染色では陰性、抗アクチン、ユビキチン抗体に陽性を示した。また、電子顕微鏡的には比較的電子密度の高いフィラメント様物質の凝集からなっていた。以上より、これら組織にコア様構造を有する症例は遺伝性横隔膜筋症の保因牛である可能性が示唆され、広く北海道十勝に浸潤していることが明らかとなった。また、コア様構造の形成は病理学的に、遺伝性横隔膜筋症の一時的な変性である可能性が示唆された。