hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Snailの細胞内局在制御機構とがん転移

本研究は、その細胞内局在ががんの転移性に重要な意味を持つSnailを対象として、亜鉛イオンおよびimportinαによる細胞内局在制御機構の詳細を分子レベルで明らかにし、その成果をがん細胞における転移性を判断する指標作りにつなげていくことを目的としている。ここまでの研究により、Snailの核内輸送はimportin β1によって担われるが、核移行シグナル受容体であるimportinαがimportin β1と競合的にSnailに結合することにより、Snailの核移行効率を低下させることを明らかにした。このimportinαによるSnailの核局在制御機構は、生細胞内におけるSnailタンパク質の安定性に重要な役割を担っていることも判明した。核輸送因子であるimportinαがある種のタンパク質の核移行を直接阻害するという現象は、当該分野のみならず、広くインパクトを与えるものである。また、Snailは亜鉛結合部位を複数持ち、この領域が核移行に必須である。そこで、この領域に変異を導入し、亜鉛の結合を阻害させると核移行活性が大幅に減少することを見い出した。細胞内の亜鉛は細胞膜上に存在する亜鉛トランスポーターによって調節されていることから、A549細胞において、亜鉛トランスポーターのひとつであるZIP6/Liv1をsiRNAを用いてノックダウンさせると、Snailの細胞内タンパク量が減少し、細胞の移動性も低下することが分かった。現在、亜鉛トランスポーターの発現量とSnailの発現量・細胞内局在等との相関関係を検討中である。本研究は、その細胞内局在ががんの転移性に重要な意味を持つSnailを対象として、亜鉛イオンおよびimportin αによる細胞内局在制御機構の詳細を分子レベルで明らかにし、その成果をがん細胞における転移性を判断する指標作りにつなげていくことを目的としている。ここまでの研究により、Snailはそのzinc finger domainが核移行シグナルとして機能し、importin β1がそれを認識して核へ輸送することを明らかにした。一方で、核移行シグナル受容体であるimportin αもまた、Snailのzinc finger domainを直接認識して結合することを見出したが、importin αはimportin β1と競合的にSnailに結合することにより、Snailの核移行効率を低下させることが判明した。このような阻害効果はin vitroだけでなく生細胞中でも観察されたことから、実際の細胞内で何らかの意味を持っていることが示唆された。そこで、impartin αを細胞に強制発現させると内在性のSnailタンパク質量が低下すること、そしてこのSnail蛋白質量の低下はプロテアソーム系による分解促進によるものであることを明らかにした。さらに、内在性のimportin αをsiRNAでノックダウンさせると内在性のSnailタンパク質量が増加することも確認した。以上のように、importin αによるSnailの核移行阻害およびSnailタンパク質の安定性維持の分子機構が明らかになったことから、各種がん細胞におけるimportin α発現量とSnailの発現・細胞内局在の相関関係を現在検討中である。
明治期私立法律学校教育の相似と相違─講義録・講師履歴・学生資料の比較分析

本研究では、共同研究者各員の専門領域である高等教育史及び日本近代史の知見を活かし、関係大学アーカイヴズや機関で所蔵する講義録・教員履歴資料・学生資料を分析し、班別に分析作業にあたる。研究の遂行を通して、法律学校間の教育内容には相似点が多数あったが、継受した法律等により部分的に相違(特色)があったとの仮説を実証的かつ段階的に解明する。
ドッキング・サイトを介したストレス応答情報伝達経路の活性化と特異性維持の分子機構

ヒトのp38 MAPキナーゼ経路は、様々な物理化学的ストレスによって活性化されるストレス応答情報伝達経路の一つであるが、アポトーシスの誘導や細胞周期制御にも関与しており、この経路の機能異常が癌などの疾患を引き起こすことが示唆されている。我々はp38経路の活性化の分子機構を明らかにするため、p38経路のMKK6 MAPKKにおけるMAPKKK(MTK1、ASK1)との特異的ドッキング・サイトをtwo-hybrid法により探索した。キナーゼ・ドメインの外側に位置するC末端のわずか20アミノ酸をMKK6から欠失させたところ、MTK1、ASK1のいずれのキナーゼ・ドメインとも結合がみられなくなった。そこでMTK1及びASK1との結合に重要なアミノ酸残基を調べるために、MKK6のC末端領域を4アミノ酸ずつ系統的にアラニンで置換して、two-hybrid法によってMTK1、ASK1に対する結合能を調べた。その結果、MKK6のC末端28アミノ酸(a.a.307-334)がドッキング・サイトとしてMTK1、ASK1との結合に関与することがわかった。この領域はαヘリックスの形成が予測され、ミスセンス変異による解析からV324、F327、V328、I331のアミノ酸が結合に重要であることがわかった。またドッキング・サイト変異型MKK6に結合できるようになったMTK1の抑圧変異として、Q1352R、K1371E、G1424Vを単離した。いずれもMTK1キナーゼ・ドメインのNローブ内の変異であり、NローブでのMKK6との結合が示唆された。これまで不明であった動物細胞MAPKKのMAPKKKドッキング・サイトを本研究において新たに発見できたことは、今後のp38経路の活性化、シグナル特異性決定の機構解明に大きく貢献すると考えられた。
ラットモデルを用いたHTLV‐ITAXの生体内での機能解析

ATLの発症過程にはウイルス蛋白Taxが重要な役割を果たしている。Taxはウイルスと感染細胞の増殖を促進する一方で、CTLの標的にもなっていることから、ATL発症機序の理解には、Taxによる癌化機構と宿主側の抗Tax免疫応答にいて対照的に研究する必要がある。本研究では、Taxを標的にしたsiRNAを用いて、Taxの発現が生体内での免疫応答や細胞増殖におよぼす影響を解析した。Taxに対するsiRNA発現ベクター(pEGFP-1/siTax)は、マウスU6 RNAプロモーターを組み込んだpEGFP-1に挿入し作製した。はじめにpEGFP-1/siTaxの効果をマウス細胞株EL4より作製したEGFP-Tax融合蛋白発現細胞EL4/Gax細胞において解析し、本ベクターがTaxの発現を抑制することを確認した。次に、pEGFP-1/siTaxをラットHTLV-I感染T細胞株FPM1.BPに導入し、Tax発現低下細胞の樹立を試み、発現が60%低下しているサブクローン(FPM1B-siTax27)を得た。一方で、40クローン得たpEGFP-1/siTax導入細胞において、60%以上Tax発現が低下した細胞は確認できず、ある程度のTax発現が感染細胞の増殖に必要であることが示唆された。さらに、FPM1B-siTax27細胞はコントロール細胞と比較してヌードラットでの腫瘍形成・転移能が著しく低下している一方で、Tax特異的CTLに対する感受性も低下していることが確認された。この結果は、Taxの発現抑制により、HTLV-I感染T細胞が生体内での生存に不利になる一方で、宿主免疫系からのエスケープという有利な形質を獲得することを示している。本モデル系は、ATL発症過程での感染細胞と宿主免疫系との相互作用の一端を再現している可能性が示唆され、ATL発症機序の解明、予防法の開発に有用であると考えられた。HTLV-Iによる腫瘍化にはウイルス蛋白Taxが深く関与していると考えられている。一方、ATL細胞の多くはTaxの発現か欠損していることも知られており、ATL発症過程におけるTaxの役割については不明な点も多い。本研究では、ラットHTLV-I感染T細胞にTaxを標的にしたsiRNAを導入し、TAXの発現低下が感染細胞に及ぼす影響をラットモデルで解析した。EGFP、およびTaxに対するヘアピンsiRNA発現ベクター(それぞれ、pEGFP-1/siEGFP、およびpEGFP-1/siTax)は、相補的合成オリゴヌクレオチトをアニールし、マウスU6 RNAプロモーターを組み込んだpEGFP-1に挿入することで作製した。はじめにpEGFP-1/siEGFP、およびpEGFP-1/siTaxの効果をマウスリンパ腫細胞株EL4より作製したEGFP発現細胞EL4/EGFP、およびEGFP-Tax融合蛋白発現細胞EL4/Gax細胞において解析し、本ベクターがEGFP、およびTaxの発現を抑制することを確認した。次にpEGFP-1/siTaxをラットHTLV-I感染T細胞株FPM1.BPに導入し、Taxの発現が低下しているサブクローン(FPMIB-siTax27)を得た。この細胞はコントロール細胞と比較してヌードラットでの腫瘍形成能、および転移能が著しく低下している一方で、Tax特異的CTLに対する感受性も低下していることが確認された。

この結果は、TAXの発現抑制により、HTLV-I感染T細胞が生体内での増殖転移能を失うという感染細胞の生存に不利な変化を起こす一方で、宿主免疫系からのエスケープという有利な形質を獲得することを示すものと考えられる。本モデル系はATL発症過程での感染細胞の動態の一端を示している可能性が示唆され、ATL発症機序の解明、予防法の開発に有用であると考えられた。ATLの発症過程にはウイルス蛋白であるTaxが重要な役割を果たしている。Taxはウイルスと感染細胞の増殖を促進する一方で、CTLの標的として宿主の免疫応答にも関与している。このことから、HTLV-IによるATL発症機序の理解には、Taxによる感染細胞の癌化機構とウイルスに対する免疫応答を中心とした宿主側の発癌防御機構について対照的に研究することが重要である。本研究では、ラットHTLV-I感染T細胞にTaxを標的にしたsiRNAを導入し、Taxの発現が生体内での免疫応答や細胞増殖におよぼす影響を解析した。Taxに対するヘアピンsiRNA発現ベクター(pEGFP-1/siTax)は、マウスU6 RNAプロモーターを組み込んだpEGFP-1に挿入し作製した。はじめにpEGFP-1/siTaxをラットHTLV-I感染T細胞株FPM1.BPに導入し、Tax発現低下細胞の樹立を試み、発現が60%低下しているサブクローン(FPM1B-siTax27)を得た。一方で、40クローン得たpEGFP-1/siTax導入細胞において、60%以上Tax発現が低下した細胞は確認できず、ある程度のTax発現が感染細胞の増殖に必要であることが示唆された。さらに、FPM1B-siTax27細胞はコントロール細胞と比較してヌードラットでの腫瘍形成・転移能が著しく低下している一方で、Tax特異的CTLに対する感受性も低下していることが確認された。この結果は、Taxの発現抑制により、HTLV-I感染T細胞が生体内での生存に不利になる一方で、宿主免疫系からのエスケープという有利な形質を獲得することを示している。本モデル系は、ATL発症過程での感染細胞と宿主免疫系との相互作用の一端を再現している可能性が示唆され、ATL発症機序の解明、予防法の開発に有用であると考えられた。
原子力分野への応用を目的とした自由電子レーザー技術の基礎研究

東大原子力工学研究施設35MeVライナックで、自由電子レーザー特性に大きな影響を与える電子ビームパラメータの測定を行った。パルス平均のエネルギ分散は約2%であったが、パルス内で時間とともにピーク強度が減少し低エネルギ側にサブピークが成長するなどのスペクトルゆらぎが見られた。ビームダイナミクスを評価するコードを開発して検討した結果、この原因はクライストロン出力の約1%の出力変動にあることが知られた。周期数10,周期4cmのウィグラ磁石をライナックに設置し、電子ビームから生ずる自由電子レーザー自発放射光のスペクトル測定及び写真撮影を行った。中心が黄で外側にゆくにつれ波長が長くなり赤へ変化するリング状の放射スペクトルが観測された。さらに外側では2倍高調波である青・緑のリングが見られた。スペクトル測定結果は中心波長490nm,半値幅112nmであった。これらの結果を自発放射光発生メカニズムに基づく一様拡がりに加えてエネルギ分散・エミッタンス・磁場精度等に起因する非一様拡がりを考慮して評価し、理論値と良く一致すること及び自由電子レーザー性能の評価において考慮する必要があることを確認した。粒子シミュレーションに基づく自由電子レーザー解析コードを開発した。これを用いて実際のビームパラメータをとり込んだ発振計算を行い、ビームパラメータの増幅率に与える効果及び立ち上がりから飽和に至る過渡過程の特性を検討した。エネルギ分散の効果は飽和までの時間の増加となってあらわれ、パルス内でレーザー発振させるためには増幅率等の設定にこの過渡過程を考慮する必要のあることが知られた。以上のとおり、各種の実験・測定及び開発した解析コードによる検討を行い、自由電子レーザーの原子力分野への応用に係る基礎特性とその可能性を明らかにした。
糖タンパク質の構造グライコミクスを展開するためのデータベースの構築

1.糖鎖構造決定を支援するデータベースの開発糖タンパク質の構造生物学研究を行うためには、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列に加えて、糖鎖の配列・結合様式を異性体の違いも含めて明らかにしておくことが必要である。我々は、この目的を実現するために、多次元HPLC法による糖鎖プロファイリング解析の一層の効率化をはかり、HPLCデータと質量分析データを統合したWEBアプリケーション"GALAXY"を開発してインターネット上での公開を開始した。2.多次元HPLCデータの拡張硫酸転移酵素およびフコース転移酵素の遺伝子を導入したLS12細胞株を用いて硫酸化糖鎖の大量発現を行い、その構造解析に着手した。本年度は当該細胞膜画分より得られた約20種類のアシアロ硫酸化糖鎖について質量分析法を駆使した構造解析を行い、それらの多次元HPLCデータを収集した。3.安定同位体標識を利用した糖鎖の構造解析In vitroにおける糖転移酵素反応を利用して分岐鎖の各非還元末端残基に選択的に安定同位体標識を施したピリジルアミノ化糖鎖のアイソトポマーを調製し、MS/MSスペクトルにおいて観測されるフラグメンテーションパターンを解析した。この方法を用いることによって糖鎖のフラグメントイオンを曖昧性なく同定することが可能となり、分岐構造を有する糖鎖のグリコシド結合における開裂のしやすさの違いなどを系統的に解析する基礎を築くことができた。
早産におけるプロゲステロンの標的遺伝子の同定と機能解析

プロゲステロン(P)はその受容体(PR)を介して作用する。陣痛時には、子宮のPR応答性低下がおこる。早期に陣痛発来する自然早産では、「子宮のPR応答性の早期減弱」が病因に関与する可能性があり、PRの標的遺伝子が正期産子宮と比べ低下していると推測される。我々は早産におけるPRの標的遺伝子を探索した。ヒト子宮内膜細胞由来のIshikawa細胞を用いて、Pを添加し、発現が上昇した15遺伝子のうち、PRに制御されるTRIM22を新規PR標的遺伝子として同定した。正期産と早産の脱落膜細胞を分離培養し、P添加で変化する遺伝子をRNA-seqで抽出し、早産特異的に変化する遺伝子は385遺伝子存在した。黄体ホルモン(プロゲステロン、P)はその受容体(PR)を介して働き、子宮にはPRが強く発現していることが知られている。陣痛時に血中P濃度は変化せず、子宮のPR応答性低下が起こっている。早期に陣痛発来する自然早産では、「子宮のPR応答性の早期減弱」が病因に関与している可能性がある。早産子宮ではPRの標的遺伝子が正期産子宮と比べ低下していると推測される。早産・正期産の胎盤(卵膜)に付着した脱落膜から分離培養したヒト子宮内膜細胞を用いて、P添加によるmRNA発現の変化をRNA-seqで、PRの転写ターゲットを免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)で解析し、早産におけるPRの標的遺伝子を見出したいと考えて研究を行った。正期産と早産の経腟分娩胎盤の卵膜から子宮脱落膜細胞を分離培養し、P添加で増加するtranscriptをRNA-seqで抽出し、一方でPRの転写調節のターゲットを免疫沈降シーケンシングで抽出した。これらのデータを合わせて、早産検体で低下しているP応答遺伝子群を抽出した。現在、これらのP応答遺伝子のうち、早産に関わる機能を有するものを抽出するため、個別の遺伝子の機能解析を行っている。本研究により、早産の機序としてのP応答性低下とそのメカニズムの解明の糸口を見出した。生殖生理学
線維芽細胞を用いたメチル水銀の毒性リスク評価

本研究において、マングースの初代肝細胞培養法を確立した。最適培地を決定するために3種の培地(DMEM、RPMI-1640、William's E)を用いて比較検討した結果、William's E培地が最適であった。PAS染色と超微形態観察により、マングース由来の細胞は肝実質細胞であることが確認された。マングース肝組織中Hgの分布をAMG染色法で調査した結果、多くのHgは肝小葉中心に存在していた。このことは、Hgが滑面小胞体に存在している可能性を示唆している。本研究結果は、Hg高蓄積野生動物種のHg解毒機構の解明とHgに対するハイリスクアニマルの特定に有効な知見になると考えられた。マングースとラットの初代肝細胞を用いて、24時間のMTTアッセイによる水銀毒性試験を実施した。マングースは肝臓に水銀を比較的高レベルに蓄積していることから、水銀の解毒機構が存在していると考えられ、ラットと比べ水銀耐性が高いことを予想。メチル水銀、塩化水銀(無機水銀)、亜セレン酸のマングースにおけるIC50(μM)は、4.24、41.8、31.6となった。一方ラットは、それぞれ4.74、29.1、150となり、3種すべてにおいてマングースを上回った。すなわち、マングースはラットと比べ、メチル水銀、無機水銀、亜セレン酸毒性に弱いという結果となった。そこで、肝臓中総水銀レベルが毒性試験に及ぼす影響を調査するため、肝臓中総水銀レベルとIC50との関係を解析したところ、メチル水銀と無機水銀は有意な関係がみられなかったが、亜セレン酸毒性において、肝臓中総水銀レベルが高いとIC50が低い傾向がみられた。水銀高蓄積種の肝臓において、水銀とセレンのモル比はおよそ1であることが知られている。セレンは閾値が狭く、毒性の比較的高い必須元素である。肝臓中総水銀レベルが高いと亜セレン酸のIC50が低いという本研究結果は、水銀の高蓄積とともに体が認識するセレンの体内保持量の上昇が、何らかの形で亜セレン酸毒性を強めている可能性が推測された。鯨類などの野生高等動物は、化学汚染物質を高蓄積している一方で、実験動物よりも毒性に脆弱である。さらに近年メチル水銀暴露によるヒトを対象とした疫学調査や実験動物を用いた研究から、繁殖や胎児の発育や神経発達への影響が懸念されている。そのため、生態系保全や生物種存続のためにも海棲哺乳類を含む野生動物種の水銀毒性評価は重要である。しかし、野生動物種を用いた水銀毒性のin vivo研究は困難で、比較生物学的な毒性影響評価に関する研究例は現在のところ皆無である。そこで本研究は、海棲哺乳類を含む野生動物種の水銀毒性に対するリスク評価法の確立を目指し、初代培養細胞が評価ツールとして有効かどうかを検証することを目的としている。ジャワマングースとラットの初代培養肝細胞へのMTTアッセイ法を用いたメチル水銀毒性の比較試験において、予想に反し、ジャワマングースにおいてラットよりも50%致死濃度(IC50)は、有意に低いことが明らかとなった。このことはつまり、メチル水銀に対する細胞毒性に関して、ラットよりもジャワマングースの方が脆弱であることが示唆された。また、ジャワマングース肝臓中総水銀濃度と同一個体由来の初代肝細胞MTTアッセイの結果(IC50)との関係を解析したところ、亜セレン酸毒性に関して、肝臓中総水銀濃度が高い個体ほど、IC50が低いことが明らかとなった。このことは、肝臓中総水銀濃度が高いほど、セレンに対する毒性が強まる可能性を示している。これまで、セレンは水銀毒性を軽減する物質であることが多く報告されてきたが、本研究結果により、肝臓中総水銀レベルが高い個体においては、より高いセレンの暴露が、健康影響を引き起こす可能性も論じる必要性があることを明らかにした。申請時と採択時の所属が変わり、新たな環境でのセットアップに時間がかかったことと、共同研究者である琉球大学農学部小倉剛先生の急逝が研究の遅れに繋がったと考える。今後の研究の推進方策として、研究計画の変更が余儀なくされる。これまでジャワマングースの検体を供給してくれた琉球大学との協力体制の再構築が必要となる。メチル水銀の細胞による取り込み量を調査した結果、水銀高蓄積野生動物であるジャワマングースの細胞内分子応答研究の前段階として、他地域に生息するジャワマングースの水銀蓄積特性を明らかにする研究に着手する。水銀分析装置(120万円)、消耗品(60万円)、交通費・宿泊費(40万円)、図書費(10万円)、その他(20万円)に使用予定。
ポリアミン蓄積はスポーツ心臓の不整脈の誘因か？

細胞増殖因子ポリアミンがスポーツ性心肥大時の心機能と構造に与える影響を調べるために運動負荷を与えた群と与えない群のラットにプトレシンを経口投与し心機能と構造を比較した。プトレシンの経口投与は運動負荷を与えないと心筋中のプトレシン濃度を大きく上昇させるが明らかな心肥大は起こさないこと、運動負荷と共にプトレシンを投与すると心筋中のプトレシン濃度の上昇が抑制されることが明らかになった。主要臓器中のプトレシン濃度も概ね心筋と同様の振る舞いを示した。摂取されたプトレシンは運動負荷により体内の他の臓器に蓄積されたのではなく体外に排泄されるか代謝されることで過剰な心肥大を抑制している可能性が示唆された。1)心肥大時に増加するポリアミンの心筋細胞の興奮性に対する作用心肥大時に増加する細胞増殖因子ポリアミンが心筋の興奮性にどのような影響を及ぼすかを調べるための単離心筋細胞を用いて細胞外液にポリアミンを添加したときの心筋興奮性の変化を解析した。単離心筋細胞を浸す人工細胞外液にスペルミン1mM10mMを添加し、細胞内カルシウム濃度を蛍光カルシウム指示薬fluo4を用いて調べたところ、1単離心筋細胞の細胞内カルシウム濃度の増加および2自発的なカルシウムトランジェント頻度の増加が観察された。またこのときの膜電位変化を膜電位感受性色素であるDi-4 ANNEPSを用いて観察したところ、スペルミン添加による膜電位の変化は観察されなかった。これより、細胞外液に添加したスペルミンは、細胞外からのカルシウム流入によるのではなく、心筋細胞内筋小胞体からのカルシウム放出により細胞内カルシウム動態の変化を誘発する可能性が示唆された。2)心肥大時に増加するポリアミンの心筋細胞の興奮性に対する作用の生体実験に向けての予備実験ポリアミンの心筋興奮性に対する作用を生体内で検出するための予備実験として、運動負荷前の心電図を動物(ラット)から再現性良く採取する方法を検討するとともにポリアミン調整食のポリアミン濃度や摂取量を検討した。1)運動負荷により心肥大を起こした動物から心電図を取得して異常の有無を検出する実験を推進する予定であったが、新規に導入した操作性のよい心電図測定装置を実験に用いることとなったため、パラメータの設定や、心電図データを再現性良く取得する方法を検討するとともに、CT画像測定による心肥大の評価方法も入念に検討したため、本格的な実験の実施は来年度に繰り越しとなった。2)27年度に予定していた運動負荷による心肥大経過と興奮性についての動物実験を28年度に予定していたポリアミン調整食を与えた際の心肥大経過と興奮特性を調べる実験とを同時に行うことに計画を変更したため、ポリアミン調整食の濃度の検討などに今年度は時間を費やした。3)単離心筋細胞へのスペルミン添加の実験においてこれまでに想定していたカリウムチャネルの他に、スペルミンがカルシウム感受性受容体刺激により細胞内メッセンジャー系を介して膜電位の関与なしに細胞内カルシウム動態を修飾する可能性が見出された。この知見はポリアミンの心臓に対する効果が心電図で検出されるもの以外にも顕れることを示唆する重要なものであり学問的にも価値が高いためこの現象についてのポリアミン濃度ー効果関係や作用の時間経過などの探求に時間をかけた。1.特殊(低ポリアミン含有)飼料摂取下でポリアミン無しまたは有の水を与えた群のそれぞれを、更に運動負荷無しまたは有の亜群に分け9ー10週飼育した。運動負荷群には回転車輪付きケージにより自発運動を行わせた。この間、体重、摂餌量、摂水量、走行距離を数日おきに記録するとともに、CT撮影を実験前と後に行い心肥大の程度と脂肪量を評価した。また動物を循環系に影響の少ないとされる吸入麻酔剤にて麻酔し、胸部誘導心電図を測定した。ラットの体重を実験開始時に対する比率で評価したところ、運動群のうちでポリアミン摂取群がポリアミン非摂取群に比べて実験終了時(9週間後)の体重が有意に減少していた。おもしろいことに、非運動群では、ポリアミン摂取群とポリアミン非摂取群では実験前後での体重増加の割合には違いが見られなかった。また、この体重の違いの原因を調べるために腰部CT像により体脂肪量を評価したところ、特に運動群においてポリアミン非摂取群の体脂肪率の平均値に比べて摂取群では少なかった。このことから、ポリアミン摂取群では運動時に動員されるいずれかのシグナル経路を活性化することにより有酸素的代謝を促進し脂質からのエネルギー合成が進むものと推測した。また、心電図ではスポーツ性心肥大者に特徴的とされる早期脱分極と類似の波形が運動群で観察されたがポリアミン摂取の有無による違いは現段階では認められなかった。2.1.で実験に供したラットについて実験前と後に頬部より採血し、血中ポリアミン濃度を測定したところ、血液中のポリアミン濃度は、非運動群ではポリアミン摂取によって数倍に増加していたが非運動群では変わりがなかった。このことも運動負荷がポリアミン代謝シグナルに影響を与えることを示唆した。これらの結果は体力医学会およびポリアミン学会で発表した。ポリアミン代謝阻害剤投与下での運動負荷実験は28年度初めの計画見直しにより29年度に先送りとしたが、それ以外の条件下での運動負荷実験は順調に実施することができた。

心電図および摘出した心筋の形態から評価した心機能や構造には現在のところポリアミン投与による差は検出できていないが、血液中のポリアミン濃度に各群間で大きな差が見られたことから、外来性に投与したポリアミンは、体の各部位での必要に応じた厳密な濃度コントロール下にあることが示唆され、ポリアミンによる心臓の構造・機能変化は重要ではあるが微妙なものである可能性が考えられる。更に詳細な解析は29年度に持ち越されはしたが、動物実験によるデータ取得については概ね順調に進捗したといえる。一方単離心筋細胞でのカルシウム、膜電位測定については、対照動物での外来性ポリアミン負荷によるデータは蓄積することができたが、運動負荷後の動物から摘出した心筋細胞についての実験は先送りとなった。まず昨年度に行った運動性心肥大に対するプトレシン経口摂取の効果を調べる実験後に採取した心筋標本のウェスタンブロッティング解析により、心肥大や不整脈、ポリアミン・エネルギー代謝との関連が示唆されるタンパク質(Kir2.1、COXIV、カルシニューリン、ODC,MAPK、コラーゲン)発現量を測定したところ、プトレシン投与による有意な違いは認められなかった。また、同実験で採取した全身の主要臓器についてポリアミン含量をHPLCで測定した結果、運動により血清への蓄積が抑制された摂取プトレシンは、体内のいずれの臓器でも増加していないことがわかり、経口摂取されたプトレシンは運動により積極的に体外に排泄されていると考えられた。これらのことより、外来性に投与したプトレシンにより心筋内プトレシン濃度が増加しただけでは心肥大や不整脈を起こすシグナルは動かないこと、運動とプトレシン投与が同時に行われた場合には、プトレシンが適切な範囲となるように運動とリンクした代謝調節が行われ、病的心肥大や不整脈が抑制される機構があることが示唆された。続けて、本年度はより価数の多いスペルミジン、スペルミンおよびポリアミン合成阻害剤DFMOをラットに経口摂取させた際の効果を調べた。DFMO1%を摂取させると、成長に伴う体重の増加が著しく減少したが、体重あたりの心体重には大きな変化はなかった。一方、体重あたりの腹膜周囲脂肪重量は、DFMO1%投与により著しく減少した。また、電子顕微鏡像では、DFMO投与群で筋線維の崩壊や異常ミトコンドリア構造が多く観察された。DFMOは、間接的に核酸合成を阻害することとポリアミンによる直接的なタンパク合成促進作用を抑制する結果、全身の筋タンパクや脂肪の合成を押さえるが、循環機能を維持するために必要な最低限の心筋タンパク量は確保されると考えられた。細胞増殖因子ポリアミンがスポーツ性心肥大時の心機能と構造に与える影響を調べるために運動負荷を与えた群と与えない群のラットにプトレシンを経口投与し心機能と構造を比較した。プトレシンの経口投与は運動負荷を与えないと心筋中のプトレシン濃度を大きく上昇させるが明らかな心肥大は起こさないこと、運動負荷と共にプトレシンを投与すると心筋中のプトレシン濃度の上昇が抑制されることが明らかになった。主要臓器中のプトレシン濃度も概ね心筋と同様の振る舞いを示した。摂取されたプトレシンは運動負荷により体内の他の臓器に蓄積されたのではなく体外に排泄されるか代謝されることで過剰な心肥大を抑制している可能性が示唆された。1)動物を用いた運動負荷/ポリアミン調整食摂取による心肥大と興奮性変化の経過観察動物を、対照群、高ポリアミン食摂取群、運動群、高ポリアミン食摂取+運動群にわけて、1クール毎に各群3匹ずつ2か月間飼育する。
昆虫は親子間で時刻情報を伝えるか

真社会性昆虫であるトビイロケアリと亜社会性昆虫であるタガメ、さらに社会性をもたないナガメにおいて時刻情報が親子間で伝えられるかどうかを検討した。トビイロケアリでは、女王もワーカーも条件によっては概日活動リズムを示したが、明暗サイクルを経験したワーカーが恒常条件におかれた同巣の女王に時刻情報を伝達するという結果は得られなかった。タガメでは父親の卵保護行動に概日リズムが見られたが、その行動が子世代の孵化時刻に大きな影響を与えている証拠は得られなかった。一方、ナガメでは何らかの形で母親が卵に時刻情報を伝達しているという証拠が得られた。【トビイロケアリ】婚姻飛行後、女王が単独でコロニーを創設するトビイロケアリにおいて、婚姻飛行時に女王を採集して、実験室で歩行活動を記録した。未交尾で翅をつけている女王は明暗サイクルに同調し恒常条件下で自由継続する明瞭な概日リズムを示したが、既交尾で翅を落とした女王は明暗サイクル下でも恒常条件下でも明瞭なリズムを示さず1日中活動をする傾向にあった。しかし、このようにしてコロニーをつくった女王を十分な日数が経過してからコロニーから取り出すと半数近くが自由継続リズムと明暗サイクルへの同調性を示した。したがって、交尾後女王の活動に周期性が見られなくなったのは、概日リズムという機構を喪失したのではなく、女王のみが卵や幼虫の世話をするときには1日中はたらかなければならないことによるマスキング効果であると推定された。また、ワーカーと女王の活動を別々に記録できる装置を完成させた。【タガメ】業者より購入したタガメを用いて、父親による保護行動と卵の孵化リズムの関係を調べた。父親の保護行動が概日リズムの支配下にあり、夜間に卵塊に水を供給していることがわかっていた。そこで、人工的に決まった時間にだけ給水する装置を作製し、父親から隔離した卵塊に対して明期のみまたは暗期のみ給水を行った。その結果人工給水の時間によって孵化時刻が若干ずれる結果が得られた。しかし、明暗サイクルの影響を強く受けていることから、父親の行動がどのくらい孵化時刻に影響しているのかはさらに検討する必要がある。【トビイロケアリ】前年度の実験結果と、開発した活動リズム記録装置を用いて以下の実験を行った。トビイロケアリの婚姻飛翔後の女王を採集し、実験室でコロニーを創設させた。女王の子世代のワーカーが一定数に達した段階で、1匹の女王を恒常条件(25°C全暗)下の飼育ケースに入れ、同時に入れた10匹のワーカーのみ、明暗サイクルがあり餌を入れたケースとの間で移動可能な装置において、女王とワーカーそれぞれの歩行活動を記録した。その結果、およそ半数の女王において、10日間の実験期間の前半または後半に約24時間の有意な周期性が確認された。ワーカーを入れた飼育ケースについても同様に、およそ半数で約24時間の有意な周期性が検出された。【タガメ】前年度の結果から父親が卵塊に給水することが孵化時刻に影響する可能性が指摘されたので、今年度はまず卵塊からばらばらにした卵を使って卵自体の孵化リズムを調べた。25°Cにおいて明暗条件から全暗に移し、卵自体に概日孵化リズムがあるかどうかを調べたが、同一卵塊に由来するものでも卵の孵化時刻はばらつき、明瞭なリズムはみられなかった。卵塊の一斉孵化には卵同士の接触が必要である可能性が高い。次に給水の孵化に対する影響を知るために、給水と卵サイズの変化の関係を調べた。常時給水/周期的給水の各条件において、卵の体積は日齢にしたがって徐々に増加したが、給水条件によって卵体積の変化は認められず孵化との関係は明らかではなかった。さらに、自然条件下において父親の保護行動の様子と卵の孵化を観察したところ夜間と午前にのみ孵化がみられた。【トビイロケアリ】既交尾女王においては活動の周期性がほとんど失われていることが明らかになったので、ワーカーが時刻情報を女王に伝えるかどうかという実験には、周期性を回復した女王を使う必要があることがわかった。それがわかったのが遅い時期であったためにワーカーと女王の活動を別々に記録できる装置を効率的に使うことができず、実験はやや遅れ気味である。【タガメ】実験室でのアクシデントによってタガメが大量に死んだことによりかなりの実験が無効になってしまい、年間一世代の昆虫で秋には休眠に入るために、これを回復できなかった。そのために今年度の実験結果が少ない。動物生理学【トビイロケアリ】女王がリズムを回復する条件が明らかになり、ワーカーと女王の活動を別々に記録できる装置が完成したので、今後は計画通り進めることが可能になった。研究協力者として実験の主力であった大学院生が就職したが、連携研究者の中村圭司とその研究室の学生に協力してもらうことが決まっている。

【タガメ】今年度はアクシデントに注意して実験を遂行するばかりではなく、高温・長日条件で休眠を回避させて、野外の繁殖シーズン以外にも繁殖させるようにして実験期間を長くする予定である。予期せぬアクシデント等によって、実験の進行がやや遅れており、その結果として「物品費」がかなり残ってしまった。連携研究者との共同研究を推進するために、活動リズム記録装置を追加で作製し、研究打ち合わせを緊密に行う。そのために「旅費」と「物品費」を本来の2年目の予定額よりも多く使用して、実験の後れを取り戻す。
血球系細胞分化における核小体の役割とその分子機構の解明

本研究は、細胞分化における核小体の役割を明らかにすることが目的である。ヒト血球系培養細胞およびマウス造血幹細胞において、細胞分化を誘導した結果、rRNA転写が抑制され、核小体タンパク質MYBBP1Aが核小体から核質へと移行し、血球系細胞分化のマスターレギュレーターであるc-Mybと相互作用し、その転写活性を阻害することが明らかとなった。さらに、人為的にrRNA転写のみを阻害した結果、上記機構が作動し、細胞分化が誘導されることが明らかとなった。以上の結果から、血球系細胞分化において、細胞分化に伴うrRNA転写の抑制は、細胞分化促進に働くことが明らかとなった。核小体は核内構造体の一つであり、リボソームRNA(rRNA)の転写とリボソーム構築が行われる場として知られている。増殖中の細胞においてrRNAは活発に転写されている。それ故、rRNAの転写制御は細胞増殖を左右する重要な機構であり、細胞分化にも密接に関係している。一般的に未分化な多能性幹細胞や前駆細胞は増殖能が高く、rRNAの転写も活発である。逆に終末分化した細胞は増殖能が低く、rRNAの転写も低く抑えられている。このように、分化におけるrRNA転写の変化についてはよく調べられている。しかし、rRNA転写の変化が分化に与える影響を報告している論文はほとんど無い。我々はこれまでに、核小体タンパク質の一つであるMYBBP1AがrRNAの転写依存的に核小体に局在していることを明らかにした。MYBBP1Aはc-Mybの転写活性を負に制御する因子であり、c-Mybは造血系の細胞分化に働く重要な転写因子である。以上のことから、我々は、造血系細胞分化において、分化に伴うrRNA転写の低下がMYBBP1Aの局在変化を促し、c-Mybの転写活性を制御することで、結果的に正常な細胞分化が誘導されると仮説を立てた。これを検証するため、マウス造血幹細胞およびヒト白血病細胞株K562細胞を用いて、巨核球分化誘導をかけた際のrRNA転写、MYBBP1Aの局在、c-Mybの転写活性を解析した。その結果、分化に伴いrRNA転写は低下し、MYBBP1Aは核小体から核質に局在が変化し、c-Mybの転写活性は抑制されることが明らかとなった。MYBBP1Aの分化に与える影響を調べるため、分化誘導時にMYBBP1Aのノックダウンを行った結果、c-Mybの転写抑制は部分的に解除され、巨核球への分化が抑制された。以上の結果から、血球系細胞において、細胞分化に伴うrRNA転写抑制は、分化促進に働くことが明らかとなった。ヒト白血病細胞株K562細胞をPMA (Phorbol Myristate Acetate)で処理し巨核球に分化させると、リボソームRNA (rRNA)の転写が抑制されることが明らかとなった。また、分化誘導時における核小体内のRNA量を測定した結果、rRNA転写抑制に伴って、核小体内RNA量も減少していることが明らかとなった。これまでに我々は、核小体に局在するタンパク質の一つであるMYBBP1Aが、核小体内のRNA量依存的に核小体に局在していることを明らかにしている。このことから、K562細胞においてMYBBP1Aの局在を解析した結果、分化誘導前には核小体内に局在していたMYBBP1Aが、核小体内RNA量が減少する分化誘導後には、核小体から核質に局在を変化させていることが明らかとなった。MYBBP1Aは転写因子c-Mybと結合し、c-Mybの転写活性を抑制することが報告されている。分化誘導後において、MYBBP1Aとc-Mybとの結合を解析した結果、両者の結合が確認され、さらにc-Mybの転写活性を測定するレポーター解析から、MYBBP1Aがc-Mybの転写活性を抑制していることが明らかとなった。最後に、巨核球分化におけるMYBBP1Aの役割を明らかにするため、分化誘導時にMYBBP1Aのノックダウンを行った結果、c-Mybの転写抑制は部分的に解除され、巨核球への分化が抑制された。以上の結果から、血球系細胞において、細胞分化に伴うrRNA転写抑制は、MYBBP1Aによるc-Mybの転写活性制御を介して、分化促進に働くことが明らかとなった。ヒト白血病細胞株K562細胞を用いて、目的としていた、1分化の過程でrRNA転写が抑制され、核小体内のRNA量が減ることでMYBBP1Aが核小体から核質に移行すること、2核質に移行したMYBBP1Aはc-Mybに結合し、その転写活性を制御することで血球系細胞の分化に影響を与ることを証明することができた。

以上の点に関しては計画以上の進行具合である。しかし、予定していたMYBBP1Aのコンディショナルノックアウトマウスの作製がまだ成功しておらず、この点に関しては計画より遅れている。我々は、rRNA転写に必須の因子であるTIF-IAをノックダウンすることにより、DNA損傷等の細胞ストレスを与えることなく、rRNA転写のみを特異的に抑制することができる実験系を開発している(Kuroda T, et al., EMBO J., 2011)。この方法を用いることにより、rRNA転写抑制が巨核球分化に与える影響を純粋に解析することができる。そこで、TIF-IAノックダウンがMYBBP1A、c-Mybおよび巨核球分化に与える影響を解析する。K562細胞は癌細胞であり、分化誘導剤として用いたPMAは人工的な化合物であるため、今回の条件で明らかにした分子機構が正常細胞で機能しているとは限らない。そのため、より生理的な条件での証明が必要である。そのため今後、正常なマウス生体から造血幹細胞を単離し、サイトカインを用いて巨核球分化を誘導した時における核小体の挙動とMYBBP1Aの機能を確かめる。また昨年度に引き続き、MYBBP1Aのコンディショナルノックアウトマウスの作製を行う。該当なし
テトラエチニルシランの合成と物性

スルホンとアルデヒドとを出発原料に用い、新たに開発した二重脱離反応を利用して、ベンゼン環上にシリルエチニル基を有するフェニレンーエチニレンを合成した。シリル基を脱保護した後に、得られた末端アセチレンをグリニャール試薬あるいはアルキルリチウムでアセチリドに変換し、これを塩化ケイ素化合物と反応させることで、様々なアルキルエチニルシランを合成することに成功した。また、四塩化ケイ素を用いて同様の反応を行ったところ、テトラエチニルシランを得ることができた。また、ケイ素上に置換したフェニレン-エチニレンは二重脱離反応だけでなく薗頭反応でも合成することができるが、反応後に遷移金属触媒由来の着色成分を除くのが困難なことがしばしば見受けられた。ここで得られたフェニレンーエチニレンは溶液中でも固体状態でも強い蛍光を発することが分かった。蛍光材料としてデバイスを作成したところ高いホール輸送能をもつことが分かった。また、他のフェニレンーエチニレンを合成してスペクトル測定を行ったところ、充分なπ共役長を持つフェニレンーエチニレンが高い蛍光量子収率を示すことが分かった。この特徴を利用してシロールの2,5位にフェニレン-エチニレンを置換したところ高い蛍光量子収率を持つシロール誘導体を合成することができた。シロールは電子輸送剤として利用できる有用な有機材料であるが、蛍光量子収率が低く、実用的な発光材料として利用することが出来なかった。一方、アリーレン-エチニレンを導入したシロールではこうした欠点を改良することが出来た。末端アセチレンをグリニャール試薬あるいはアルキルリチウムでアセチリドに変換した後、これを四塩化ケイ素と反応させることで、テトラエチニルシランを合成する手法を確立した。また、アルキルシリルクロリドやアリールシリルクロリドを用いた反応を行うことで、望むアルキル(エチニル)シランやアリール(エチニル)シランを合成することに成功した。さらに、スルホンとアルデヒドとを出発原料に用いて様々なタイプのフェニレン-エチニレンを合成し、これを用いてテトラエチニルシランを合成した。ここで得られたエチニルシラン誘導体は何れも空気中で取り扱い可能な白色粉末あるいは無色の液体であった。合成したエチニルシラン誘導体の紫外可視吸収スペクトルを測定した。ケイ素上に置換したフェニレン-エチニレンの数が増えるにつれて、吸収強度は増大し、吸収極大波長は長波長ヘシフトした。吸収極大の長波長シフトは、フェニレン-エチニレン発色団どうしがアセチレンのπ結合を介してケイ素上で共役し共役系が拡張したことを示している。また、ab initio計算より、炭素-ケイ素結合の反結合性軌道がこの共役系の拡張にに有効に作用していることが示唆された。溶液中で蛍光測定を行ったところ、長い共役系を持つフェニレン-エチニレンシランで蛍光が観測された。蛍光においても、アセチレンのπ結合を介した共役系の拡張が見られ、ケイ素上のフェニレン-エチニレン発色団が増えるにしたがって、吸収強度の増大、吸収極大の長波長シフトが観測された。また、シリル基上のフェニレン-エチニレン発色団が増えるにしたがって、蛍光量子収率が増大した。スルホンとアルデヒドとを出発原料に用い、新たに開発した二重脱離反応を利用して、ベンゼン環上にシリルエチニル基を有するフェニレン-エチニレンを合成した。

また、四塩化ケイ素を用いて同様の反応を行ったところ、テトラエチニルシランを得ることができた。また、ケイ素上に置換したフェニレン-エチニレンは二重脱離反応だけでなく薗頭反応でも合成することができるが、反応後に遷移金属触媒由来の着色成分を除くのが困難なことがしばしば見受けられた。合成したエチニルシラン誘導体の紫外可視吸収スペクトルを測定したところ、ケイ素上に置換したフェニレン-エチニレンの数が増えるにつれて、吸収強度は増大し、吸収極大波長は長波長ヘシフトした。次に、溶液中で蛍光測定を行ったところ、長い共役系を持つフェニレン-エチニレンシランで蛍光が観測された。蛍光においても、ケイ素上のフェニレン-エチニレン発色団が増えるにしたがって、吸収強度の増大、吸収極大の長波長シフトが観測された。これらの研究の過程で、充分なπ共役長を持つフェニレン-エチニレンが高い蛍光量子収率を示すことが分かった。この特徴を利用してシロールの2,5位にフェニレン-エチニレンを置換したところ高い蛍光量子収率を持つシロール誘導体を合成することができた。
環境・生態データの統計科学的解析およびその基礎理論の研究

大気中の窒素酸化物や水中の酸素等の時間的・空間的濃度分布を知ることは環境を理解する上で重要と考えられます。また、鳥の飛翔行動や森林の更新の理解は生態系を把握する上で大切です。本課題では、データに基づいて環境・生態を理解するにはどのように数理的モデルを構成すればよいのかについて研究を行い、環境・生態に関係する実データの統計的解析も合わせて行いました。本課題で、代表者と分担者は、環境・生態を表現するデータの統計科学的取扱い(環境・生態データサイエンス)に焦点を当て、環境・生態データの多くが時間的・空間的に変動が大きく、また再現性に乏しいことを考慮し、環境・生態データのよりよい取扱い・解釈のための統計的モデル化と解析を目的として研究を進めた。環境・生態データの中には、風の方位観測値のような角度のデータや風向と風速もしくは風向とオキシダント濃度観測値のような角度を含むデータが得られる場合が多々あるので、角度を含む観測値の統計学(方向統計学)の研究は重要である。本年度の方向統計学に関する成果を二つ記述する。Abe et al.(2009)では、角度データのモデル化としての円周上の分布において、1979年にPapakonstantinouにより提案された分布についてパラメータ空間を修正して分布を再定義した。本分布は確率密度関数の頂上付近で平坦もしくは急傾斜の性質を持つので、そのような性質を持つデータに適合が良い。論文では、三角モーメント等の分布の特性量を求めるとともに、パラメータの推定法を研究した。Faravani et al.(2009)では、植物の枝分かれパターンの方向解析を行った。離散分布論も環境・生態データのモデル化の一つとして重要であると考えられる。負の二項分布は、ポアソン分布パラメータのガンマ分布混合として生成されることから、環境・生態において虫等のカウント数の分布として使用されてきた。One et al.(2009)では離散分布について研究し、負の二項分布を特別な場合として含む非心負の二項分布のさらなる一般化を行い、分布の諸性質やパラメータの推定・検定について議論を行っている。適用例として、雷雨の回数データへの適合が調べられた。本課題で、代表者と分担者は、環境、生態を表現するデータの統計科学的取扱い(環境・生態データサイエンス)に焦点を当て、環境・生態データの多くが時間的・空間に変動が大きく、また再現性に乏取扱い・解訳のための統計的モデル化と解析を目的として研究を進めた。本年度の方向統計学に関する成果を三つ記述する。直線上のt-分布は検定統計量の分布としてだけではなく、現在では正規分布よりも裾の重い対称分布モデルとしての重要な役割を持つ。Abe et al.は立体射影のアイディアの下に円周上のt-分布と呼べる分布を提案し、分布の性質を調べ、球面上の分布も構成した。Pewsey etal.は円周上の統計学でよく知られているvon Mises分布を頂上付近で平坦もしくは急傾斜となるように拡張したBatschelet分布において性質を調べ、氷河期カールデータへの適合を調べた。また、Shieh et al.では、バクテリアゲノムの遺伝子位置データへ応用するため、一般化されたvon Mises分布を周辺分布として持つ2変量分布モデルを提案して、分布の性質やパラメータの推定・検定を議論するとともにデータ解析を行なった。環境には社会的環境と自然的環境があり、生態と密接に関係する。環境保全や自然保護、資源ごみのリサイクル、汚染物質排出量削減など環境・生態へのさまざまな切り口・接近法がある中で、環境・生態現象の観測と共に現象を表現するデータの統計科学的取扱い(環境・生態データサイエンス)に焦点を当てて研究を行った。環境・生態データを得ること自体意義深いのは当然であるが、本研究では環境・生態データの多くが時間的・空間的に変動が大きく、また再現性に乏しいことを考慮し、環境・生態データのよりよい取扱い・解釈のための統計的モデル化と解析を目的とした。本年度は3年計画の最終年度に当たり、代表者および分担者の研究の本年度の概要は以下の通りである。1.清水:角度データの非対称モデルとしてのBatschelet分布について性質を調べ、氷河期の山のカール角度データに応用した。2.柏木:東京湾水質の長期変動について検討するためにベイズ型季節変動モデルを構築した。3.栗原:空間の位相的構造を階層的に表現できるエシェロン解析を利用し、樹木の生態や森林の更新を反映した同位相をもつ近隣樹木群で構成される領域に基づくパッチ検出法について提唱した。4.西井:自己回帰成分を持つ時系列データの回帰モデルにおいて、罰則および重み付き最小2乗法による母数推定のGIC基準を求め、車両運転装置に応用する装置を開発した。

5.金藤:化学物質のリスクトレードオフ解析や東京湾等の閉鎖性海域での底層溶存酸素の水生生物への影響評価と底層溶存酸素基準の評価法に関する研究を行った。6.大西:鞍点等式の概念がモデル選択・モデル平均に有用であることを明らかにした.7.福地一:日本及びアジア地域における降雨強度の時空間相関特性を求めた。
濾胞樹状細胞の貪食機構を介した液性免疫応答制御機構の解明

濾胞樹状細胞(FDC)はリンパ節の濾胞内に存在し胚中心の形成および液性免疫応答に必須の細胞である。新規FDC単離法を用いた解析の中からFDCは自身が産生するMFG-E8とαvインテグリンを介してアポトーシス細胞を貪食することを見いだした。さらにFDCによるアポトーシス細胞の貪食に伴ってFDCからのIL-6やCXCL-13の産生が制御されていることが示唆された。FDC特異的αvインテグリン欠損マウスを作成して、胚中心形成や液性免疫応答を検討したが、コントロールマウスとの間に有意差は認められず、FDCによるアポトーシス細胞の貪食を介した液性免疫制御機構への関与を明らかにすることはできなかった。申請者らはFDC単離法を確立し、従来不可能であった細胞単位での解析の中からFDCがアポトーシス細胞を貪食することを見いだした。アポトーシス細胞の貪食に伴って貪食細胞の活性化は制御されるが、申請者は胚中心においてFDCの活性化がアポトーシスB細胞の貪食を介して制御されるという仮説を立て、これを検証することを目的とした。単離FDCがMFG-E8/αvインテグリン経路を介してアポトーシス細胞を貪食するをことをin vitroの共培養の系で確認した。さらに、抗原免疫後のマウス脾臓から経時的にFDCを単離してスライドガラス上に固定化した後、DNAの断片化を検出するTUNEL染色を行ったところ、免疫後の脾臓FDCの細胞質内にはナイーブマウスの脾臓FDCに比較してTUNELのシグナルが著しく増強することを見いだした。また、単離FDCをアポトーシス細胞と共培養した後のサイトカイン、ケモカインの産生について検討したところ、一部のサイトカイン、ケモカインは共培養に伴ってその産生が変化することを見いだした。貪食細胞の活性化はアポトーシス細胞の貪食に伴って制御される事が知られているが、申請者は胚中心形成においてFDCの活性化がアポトーシスB細胞の貪食を介して制御されるという仮説を立て、これを検証することを目的とした。単離FDCがMEG-E8/αVインテグリン経路を介してアポトーシス細胞を貪食することをin vitroの共培養の系で確認した。さらに、抗原免疫後のマウス脾臓から経時的にFDCを単離してスライドガラス上に固定化し、断片化DNAをTUNEL染色したところ、免疫後の脾臓FDCの細胞質内にはナイーブマウスの脾臓FDCに比較してTUNEL染色シグナルが著しく増強することを見いだした。また、単離FDCをアポトーシス細胞と共培養したところ、一部のサイトカイン、ケモカインの産生が共培養に伴って変化することを見いだした。胚中心形成におけるFDCによるアポトーシス細胞貪食の意義を明らかにするために、放射線照射後のαVインテグリン欠損マウスへ野生型骨髄細胞を移入して、FDC特異的αVインテグリン欠損マウスを作製した。このマウスを抗原で免疫して胚中心形成、および抗体産生応答を検討したが、野生型マウスとの間に大きな変化は認めなかった。胚中心形成に伴ってFDCがアポトーシス細胞を貪食していること、その結果、FDCからのサイトカイン、ケモカインが制御されていることを示すデータが得られた。免疫学FDCによるMFG-E8/αvインテグリン経路を介したアポトーシス細胞の生理的意義を明らかにする目的でCre-loxpシステムを用いたconditional gene targeting法、および骨髄移植法を駆使して、FDC特異的αvインテグリン欠損マウスを作製する。このマウスをNPハプテン付加抗原で免疫後、胚中心の形成やNP特異的抗体の産生量、および抗体の抗原親和性成熟について検討を行い、FDCによるアポトーシス細胞の貪食、排除の消失が胚中心形成、抗体産生、抗原親和性成熟に及ぼす影響を検討する。