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最小次数と連結度が相互作用するグラフと偶グラフの研究

クローフリーグラフの2因子は一般に連結度の仮定無しに、最小次数条件のみから得ることができる.本研究では、Ryjacek閉包を使って、グラフの構造を表す2因子の問題を線グラフ及びそのプレイメージグラフの問題に置き換え、その構造の解析を行った。グラフ理論において最も重要な不変量である最小次数と連結度がグラフの構造に与える作用の研究。特に最近注目されている線グラフやその基グラフの偶グラフの研究を行う。有名なThomassenの予想「4連結線グラフはハミルトンサイクルを持つ」はR如acek閉包を使うことにより線グラフの一般化であるclaw-nleeグラフについてのMatthewsとSumnerの予想「4連結claw・hleeグラフはハミルトンサイクルを持つ」と同値であることがRyjacekによって示されている。ハミルトンサイクルは連結成分が1個の2因子である。2因子の存在は、連結度を仮定することなく最小次数条件のみでその存在が保証される。即ち、「最小次数4以上の線グラフは2因子を持つ」が成り立つ。Ryjacek閉包は2因子に対しても利用することが出来、この主張は線グラフをclaw憤eeグラフに置き換えても成り立つ。従って、2因子の研究も線グラフについて行えば十分である。線グラフはその元の基グラフから定義されるので、ハミルトンサイクルや2因子の問題は基グラフの問題に置き換えることが出来る。具体的には、基グラフが支配的な連結偶グラフや偶グラフを持てば、ハミルトンサイクルや2因子を持つ。従って偶グラフの構造の研究が重要である。また線グラフの連結度は基グラフのessential辺連結度に置き換えられる。ハミルトンサイクルは連結成分が1個の2因子なので、Thomassenの予想の解決に対して、2因子の連結成分数の上限の研究が重要である。本研究者は既に2005年にロンドン大のJackson教授と共同研究を行い、最小次数4以上の2連結や3連結のclaw・freeグラフの2因子の連結成分数の上限を、偶グラフの研究を行うことによって示している。その証明の本質的な部分はペテルセンの定理「2辺連結3正則グラフは2因子を持つ」の一般化である。本研究では、この研究を発展させ、Thomassenの予想の解決、更に新しい予想や問題の発見を行い、その解決を行う。偶グラフと線グラフ及びclaw-freeグラフの関係について研究行った。claw-freeグラフに関する最も有名な予想は、Matthews and Sumnerによる「4連結claw-freeグラフはハミルトンサイクルを持つ」である。4連結claw-freeグラフの最小次数は必ず4以上になることは容易に分かる。最小次数4以上のclaw-freeグラフは2因子を持つことは、江川・太田の結果及びChoudum and Paulrajの結果から容易に得られる.ハミルトンサイクルは性分数が1つからなる2因子である。ゆえに最小次数4以上のclaw-freeグラフの2因子の成分数の最小数を決定することは興味深い問題である。1991年、Faudree教授らはその上限は、6|G|/(d+2)以下であることを示した(但し、dは最小次数)。さらにGould教授とJacobson教授は、最小次数dが(4n)^{2/3}以上あれば、上限は|G|/dまで下げられること示した。しかし上限|G|/dは強すぎる。事実、本研究者は任意のd≧4に対して、最小次数dのclaw-freeグラフで、任意の2因子の成分数が|G|/dより真に大きくなる例を構成した。特に、d=4の時は、成分数の下限が5|G|/18以上あるグラフを構成した。しかしこれらの下限|G|/dや5|G|/18が最良な成分数の上限であるかどうかは自然な問題だ。この問題に対して、11月にイギリス・ダーラム大学を訪問しBroersma教授及びPausulsm博士と共同研究を行い、d=4の場合の上限が(5|G|-14)/18であることを示した。更に帰国後、一般の場合を示すことに成功した。すなわち以下の主張を証明した。「最小次数d≧4のclaw-freeグラフは成分数が高々(|G|-3)/(d-1)個からなる2因子を持つ。」またこれらの結果をアメリカ・マイアミで開催される38th Southeastern International Conference on Combinatorics, Graph Theory, and Computingで発表した。東京理科大学の江川教授と、次数条件と2因子について共同研究を行った。具体的には、任意に指定された独立点集合Sに対して、その頂点がそれぞれ異なる成分に含まれるような2因子の存在を保証するOre型次数条件σの最良な下限値を示した。即ちσがn+|S|-1以上有れば所望の2因子で、一つの成分を除いて全て三角形になるものが存在することを示した。得られた結果は論文にまとめられ、既に国際専門誌に投稿済みである。またパリ大を訪問しBondy教授とこの結果を更に一般化し、Brandtらの結果を拡張する問題の解決を試みた。またアメリカ・メンフィス大学のFaudree教授を訪問し、Claw-freeグラフについて共同研究を行った。具体的には、本研究者が行った2因子についての研究を進展させた。一般にClaw-

freeグラフは最小次数が4以上あれば2因子の存在が保証される。Faudree教授との共同研究では、指定された独立点集合Sの各頂点がそれぞれ異なる成分に含まれるような2因子の存在に対する研究を行い幾つかの結果を得た。そのつを紹介する。本研究者は以下のような予想を上げた。「最小次数5以上のClaw-freeグラフは、適当な2因子が存在し、各成分はSの頂点を高々一つずつ含む」。この予想の解決を得ることは出来なかったが、条件を弱め、最小次数7以上のライングラフならば予想は正しいことを示した。Claw-freeグラフはライングラフの一般化されたグラフである。当該研究年度には主に二つの研究を行った。まず第一に、中国・北京理工大及びチェコ・西ボヘミア大を訪問し、Ryjacek閉包で有名なRyjacek教授やXing教授と共同研究を行い、Claw-freeグラフに対する新しい閉包を発見し、ある条件を充たすclaw-freeグラフに対しては、2因子の存在がその新しい閉包によって定まる線グラフの2因子の存在と同値であることを示した。claw-freeグラフの頂点xの隣接点全体N(x)が誘導する部分グラフ<N(x)>は高々2個の連結成分からなる。特に、成分数が一つの時、それをクリークに置き換える操作を可能な限り繰り返して得られるグラフをRyjacek閉包と呼ぶ。一方、claw-freeであることから、<N(x)>が二つの連結成分からなる場合、それぞれの連結成分はクリークである。そこで、xが長さが5以下の誘導サイクルに含まれるとき、<N(x)>をクリークに置き換えることを繰り返すことによって新しい閉包が得られる。明らかにこの閉包はRyjacek閉包の一般化になっており、さらにKelmansの定理よりこの閉包が唯一つ定まることが分かる。共同研究では、この閉包によっても2因子の存在は保存されることを示した。また容易にこの閉包が線グラフになっていることを示すことが出来る。2因子の存在の保存は、その線グラフの基グラフが支配的システムを持つことが保存されることを示すことによって証明される。またRyjacek教授とは、昨年度アメリカ・メンフィス大のFaudree教授らとの共同研究で得られた予想についての議論を行った。Ryjacek教授はそれらの予想に対する重要な極値グラフを示し、予想の最小次数の下限が最良であることが示された。低連結クローフリーグラフの構造を解析するために、2因子と独立点集合による支配の研究を行った。またRyjacek閉包を一般化して、2因子への応用を可能にする研究を行った。2008年度のアメリカ・メンフィス大のFaudree教授らとの共同研究によって、クローフリーグラフが十分に大きい最小次数を持ち、位数が独立数に比べて十分に大きければ、任意の最大独立点集合Sに対して、適当な2因子が存在し、その各サイクルがSの頂点を一点ずつ含む(つまりSを分割する)ように取ることが出来ることを示した。
細胞骨格が細胞質の構造化にはたす役割の解明

分離細胞骨格に結合する可溶性成分を同定するために、アクチン、中間径線維を中心に免疫吸着体の調製法を検討し、免疫沈殿の対象とする分子が、構造を保ったまま分離沈殿させることが可能な方法を確立した。このため、免疫吸着体は遠心分離を使用せずに対象とする免疫吸着体に結合した抗原抗体産物を分離することが必要である。この目的のため、ガラスビーズ、アクリル樹脂、ニトロセルロース紙を担体として検討した。抗体と担体の結合には化学架橋試薬(グルタアルデヒド,EDC、スベルイミド)を使用した。検討した条件下では、アクリルアミドゲルに抗体をEDC架橋した吸着体、アクリル樹脂を活性化後抗体をEDCまたはスベルイミドで架橋した免疫吸着体が今回の実験には非特異的な吸着も少なく有用であった。また、タンパク質をドットブロットしたニトロセルロース膜も簡便なサーベイには有効であった。上記の方法を用いて、ニワトリ胸筋培養細胞及び筋原綿維の可溶性分画から、デスミンを含む構造体の分離を試みた。筋に特異的な中間径線維デスミンは筋原線維の外周を包む3次元網目構造を形成しているが、ホモゲナイズ等の機械的刺激で筋原線維より遊離して可溶性分画に検出される。この可溶性分画を抗デスミン抗体-アクリル樹脂免疫吸着体と反応させてデスミン線維と共存する分子種の同定を行った。骨格筋の可溶性分画はフォスフォリラーゼ、クレアチンカイネースを中心に10種以上のタンパク質が含まれ、デスミン量は総可溶性成分の2%以下である。この分画からデスミン免疫吸着体によりデスミン(MW 52k)のほか、分子量25kと分200kのタンパク質が分離された。これらの成分が、中間径線維を筋のZ-線につなぐsnapping proteinであるかを現在検討中である。さらに、アルドラーゼを指標として、アクチン免疫吸着体と共沈する分画の同定を行っている。本年度は、結合成分のなるべくすくない、分離細胞骨格の調製法およびその特性の検討を中心に実験を行っている。ニワトリ初期胚より調製した骨格筋筋管細胞および線維芽細胞を培養基質より剥離し、デタ-ジェント処理した後ショ糖密度勾配遠心により細胞骨格を分離し実験の基本モデルとした。デタ-ジェントとしては、Triton X-100のほか、ジキトニン(0.05%)が有効であった。また、20%sucroseをクッションとして遠心することにより核を除去することが可能となった。I分離細胞骨格の基本的性質電子顕微鏡および蛍光抗体観察によれば、分離細胞骨格はマイクロフィラメント、中間径線維そして微小管の3次元的網目構造より構成されている。2次元電気泳動及びイムノブロットの結果β・γ-アクチン、チューブリン、ビメンチン(線維芽細胞)が分離細胞骨格の約80%を占めていることが明らかになった。チ-ブリンの含量は形態観察から推量されるより高い。分離細胞骨格における微小管の存在状態については、いくつかの問題点が存在すると考えられる。II分離細胞骨格線維の特性(1)無細胞蛋白合成系との反応から、分離細胞骨格にmRNAが結合していることが示された。特異的に発現しているタンパク質があるかを検討中である。(2)分離細胞骨格を96穴プレートに固定化し、分離細胞骨格の内在性酵素活性の定量を試みている。(3)「可溶性分画」の指標酵素の一つとしてaldolaseとの相互作用を現在解析中である。
地域社会における中国帰国者の境界文化の実証的研究

本研究は、地域社会における中国帰国者の境界文化の実証的研究とその比較研究を目指したものである。研究期間中は複数の地域に住む中国帰国者とその支援者を対象に、アンケート調査と聞き取り調査を行った。その結果、日本の地域社会で生きる中国帰国者の生活実態に関する理解を深めただけではなく、地域の差異を確認することもできた。これらの結果は、中国帰国者研究だけではなく、地域における共生社会の構築にとっても示唆的なものである。本研究の目的は、地域社会における中国帰国者の境界文化の実証的研究と、その比較研究を行うことにある。そのため、日本社会で生活する中国帰国者をめぐる地域社会での包摂と排除をエスニック関係という視点から解明することや、地域社会における中国帰国者の境界文化の実態把握を目標に調査活動を行う。本年度は研究計画の初年度にあたり、交付申請時の計画とおりに、日本各地の中国帰国者コミュニティに関する予備調査を中心に調査活動を行ってきた。具体的には、各地域のキーパーソンとなる人に聞取り調査を行ったほか、その進捗状況を踏まえたうえで、J地域に焦点を定め、同地域の中国帰国者団体の協力を得て、中国帰国者当事者に対してアンケート調査を実施した。現在、以上の調査で得られたデータを集計・分析しつつ、日本への永住・定住を選択した理由、来日後の変化、中国帰国者への帰属意識、地域社会での適応状況、家庭内と家庭外での言語使用、社会ネットワークの変化、家族関係の変容、中国との関係やアイデンティティの志向などについて考察作業を試みている。また本年度中に、これらの調査成果を参照しつつ、研究報告を計7回行ったほか、論文を1本公表した。本年度は研究計画の最終年度に当たるため、調査地域をJ地域に焦点を定めて、アンケート調査に関する補充調査を行いつつ、地域での聞き取り調査を行った。また比較検討のために、F地域での調査にも取り組んだ。現在、昨年度の調査成果と分析成果を踏まえて、中国帰国者の日本への永住・定住を選択した理由、来日後の変化、中国帰国者への帰属意識、地域社会での適応状況、家庭内と家庭外での言語使用、社会ネットワークの変化、家族関係の変容、中国との関係やアイデンティティの志向に関する考察および比較検討作業を進めている。本年度中はこれらの調査成果を参照しつつ、研究報告を7回行ったほか、論文を3本公表した。達成度が遅れている理由は以下の通りである。第一に、2011年10月より京都大学より長崎大学に所属先が変わったため、研究開始時期が遅れたこと第二に、京都を拠点に研究調査スケジュールを計画していたが、長崎に移って来たため、調査地への距離が遠くなったこと24年度が最終年度であるため、記入しない。上述したような理由で、現在研究調査が遅れている。当初の研究計画とおりに研究が進まなかったときの対応として、次年度は、調査予定地域と調査目標人数を縮小し、特定の地域に焦点を絞って、研究調査をおこなう予定である。また質問紙を用いた半構造化されたインタビュー調査との併用で対処していく予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
情報の海に物理制約を付与するセマンティック・センサネットワークに関する研究

本研究は,実世界情報による情報爆発に対処するべく,各物体の属性や関係を単位として実世界情報へアクセスするセマンティク・センサネットワークを構築した.セマンティク・センサネットワークは、実世界情報を提示するコンピュータシステムだけでなく,センサ情報も用いるロボットやインテリジェントルームも視野に入れている.研究対象のセンサネットワークは,物体に無線センサノードが取り付けられた物である.物体とセンサの組み合わせで物体の情報が直接取得できるので,物体の情報を容易に獲得できる利点がある.このセンサネットワークを構築する際の課題は次の通りである.(a)センサデータと環境情報へのアクセス方法:ロボットに代表されるシステムは、環境情報を提示する際にアクチュエータ制御も必要なのでセンサデータと環境情報の双方を同時取得できる枠組みが必要となる.(b)物体とセンサの組み合わせへの対処:センサデータを解釈し環境情報を抽出する際にセンサデバイスと物体の取り付け関係の情報が必要となるが、取り付け関係情報の準備のコストが高い。(c)抽象的な環境情報の取得方法:複数のアプリケーションに共有可能な環境情報を提供できる必要がある。以上の課題に対してセマンティク・センサネットワークでは次の機能を持っている.(i)センサデータとメタデータのセットによるデータ管理:センサデータとメタデータ(物体の属性・状態等)をセットで管理し一括アクセスを可能とした。(ii)RFIDタグを用いたクラスとインスタンスの管理:物体に取り付けられたRFIDをセンサ取り付け時に読み込ませ、物体のクラス定義から自動的にセンサデータとメタデータのセットを生成可能とした。(iii)メタデータ上の動的な推論による環境情報の取得:論理表現の採用で一般性の高い環境記述の形式を用意した。推論による環境情報の取得も可能である。
神経分化に伴って誘導される転写因子のリン酸化酵素とシグナル伝達経路の研究

NGFI-B(Nur77)はステロイドレセプターのスーパーファミリーに属するリガンド未知のオーファンレセプターである。PCl2細胞を神経成長因子(NGF)で刺激し神経分化を誘導したときに一時的に誘導されリン酸化されることが知られている。我々はNGFI-Bリン酸化酵素としてPC12細胞をNGFで刺激した際に活性化されるNGFI-B kinaseIを報告した。NGFI-B kinaseIはNGFI-BのSer350をリン酸化することにより標的DNA配列のNBREに対する結合活性を減少させる。本研究ではNGFI-B kinaseがラット脳で発育の過程で発現し、胎児脳と生後数週令の脳では分子種が異なることを見い出した(胎児型:約90kDa、adult型:約50kDa)。またadult型NGFI-B kinase(p50NGFI-B kinase)をラット脳(8-10週令、約60g)より精製した。N末端のアミノ酸配列および免疫化学的性質からp50NGFI-B kinaseはProtein kinaseC(PKC)βのC末端フラグメントでカルシウムイオンおよびリン脂質による調節を受けない活性型であることが明らかになった。さらに、PKCβの2種のisoformに対する抗体でラット脳から免疫沈降した酵素はNGFI-BのSer350をカルシウムイオン、リン脂質非依存的にリン酸化した。実際、PKCβはin vitroでカルパインによって切断されregulatory domainを欠いた活性型に限定分解されることが示されており、p50NGFI-B kinaseは生理的にも脳内で働く可能性が考えられる。これらの結果からNGFI-Bは多様なリン酸化酵素により調節され、生後脳ではPKCβの限定分解による活性化も重要であることが示唆された。.ラット脳(8-10週令、約60g)よりNGFI-B kinase Iを精製した。100,000xg上清をDEAE-Sephacel,Phenyl-Sepharose,Bio ScaleQ20,Superose6,NGFI-B327(O)-Sepharose(アフィニティークロマトグラフィー)によって約544倍に精製した。分子量は52kDaであった(p52NGFI-B kinase)。精製標品をSDS-PAGEで電気泳動後、PVDF膜にエレクトロブロッティングし、マイクロシークエンスによりN末端のアミノ酸配列を決定した。その結果、p52NGFI-B kinaseのN末端は、QGTKAPEXKTANTであり、この配列はプロテインキナーゼC betaの312残基めからに一致した。そこで、p52NGFI-B kinaseがプロテインキナーゼC betaのフラグメントであるか否かを調べるために、ウエスタンブロッティングを行った。プロテインキナーゼC beta1及びプロテインキナーゼC beta2のC末端抗体(Santa Cruz社)によって、p52NGFI-B kinaseは認識されたが、プロテインキナーゼCのhinge region(292-317残基)に結合するモノクロナル抗体(Santa Cruz社)では認識されなかった。これらの結果はp52NGFI-B kinaseがプロテインキナーゼC betaのC末端フラグメントであることを示唆している。これはプロテインキナーゼC betaのN末端側の調節ドメインを欠いたキナーゼドメインに相当し、従って、カルシウムイオンおよびホルボールエステルによる調節をうけない活性型であると考えられる。.一方、胎児型NGFI-B kinase Iはin gel assay法で分子量約95kDaを示し、一部自己リン酸化された。その活性はE16-E18でピークとなり脳の発達と関連していると考えられた。アミノ酸の部分

配列を決めるために、ラット胎児16日(E16)脳の100,000xg上清をDEAE-Sephacel,Phenyl-Sepharose,BioScaleQ20,Superose6,NGFI-B327(O)-Sepharose(アフィニティークロマトグラフィー)によって精製している。
異種動物由来物を用いない再生医療用ヒト細胞培養システムの構築

臍帯血中の造血幹細胞をその性質(自己複製能、造血再構築能)を保持したまま体外で増幅できれば、従来の移植細胞量の制限がなくなり、体重の重い成人の白血病治療など様々な治療に応用できる。また、ヒトES細胞の応用に関しては、まだ臨床応用可能な培養法の確立さえできていない状況である。最終年度では、ES細胞培養も含めて異種動物由来物を用いない培養系の確立を目指した検討を行った。1.新しい不死化ヒトストローマ細胞の創出を行った。がんセンターとの共同研究で新たにテロメラーゼ遺伝子を導入した細胞を得、クローニングを行い、造血幹細胞増殖支持能のあるクローンを見出した。ただ、現在までのクローンでは、増殖能が高すぎるため、化学的に固定化して用いる必要があると考えられた。2.造血支持能のあるナース細胞を脂肪細胞へ形質転換すると支持能が消失することから、支持能の有無による発現タンパク質の解析を二次元電気泳動で行い、その差が明らかとなった。現在、DNAチップにより詳細な遺伝子解析を行っている。今後、増殖支持能に関係する遺伝子やタンパク質を明らかにして、それを使ったナース細胞に代わる人工基材の作成を行う。3.サルES細胞をヒト羊膜上皮細胞をナース細胞として使って培養できるようにした。霊長類ES細胞を、医療廃棄物として捨てられていた胎盤から得た細胞で培養できることを示した。4.マウスES細胞を様々な培養基材上で培養して、その特徴的な増殖挙動を明らかにすることができた。化学固定したナース細胞でもES細胞培養が可能であることを明らかにしたので、今後は霊長類ES細胞への適用を行ってゆく。臍帯血幹細胞移植では移植細胞量に制限があり、体重の重い成人例では生着不全や移植後血球回復が遅延する例が報告されている。そのため臍帯血中の造血幹細胞をその性質(自己複製能、造血再構築能)を保持したまま体外で増幅できれば、課題を乗り越えることができる。我々はこれまで造血サイトカインの組み合わせに加え造血を支持できるストロマ細胞と共培養する系が、増幅に有効であることを報告してきた。安定した培養装置として開発する目的で、生きたストロマ細胞を固定して用い、その増幅効率を検討した。ヒト臍帯血単核球から免疫磁気ビーズ法を用いてCD34^+細胞を純化し、15002500個/ウェルで培養に用いた。テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化したヒト骨髄ストロマ細胞(札幌医大濱田博士より供与)の単層培養を24ウェルプレートに作成し、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド溶液で530分間固定し、よく洗浄した後培養に用いた。サイトカインとしてSCF、TPO、FLを各10ng/ml濃度で組み合わせ添加した。培養2週、3週後に細胞の一部を回収し、細胞数およびコロニー前駆細胞数を測定した。一部の実験では回収細胞のCD34^+細胞比率も算定した。培養2週目の細胞数と前駆細胞数は共に生きた(非固定)ストロマ群で最大であり1000倍以上増幅した。サイトカイン単独群では100倍程度であり、グルタールアルデヒド固定ストロマ群ではその中間の値を示した。パラフォルムアルデヒド固定ストロマ群ではサイトカイン単独群と同等であった。培養2週目の細胞中のCD34^+細胞率は生きたストロマ群で10%程度に維持されていたが、固定ストロマ群およびサイトカイン群では12%まで低下していた。膀帯血中の造血幹細胞をその性質(自己複製能、造血再構築能)を保持したまま体外で増幅できれば、従来の移植細胞量の制限がなくなり、体重の重い成人にも白血病治療など様々な治療に応用できる。昨年度は、固定化ストロマ細胞の効果について実験系の確立とその評価を中心に研究を行った。

本年度は、昨年度の継続と、新しい体外増幅法、分化制御について検討を行い、その実績を以下にまとめる。(1)テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化したヒト骨髄ストロマ細胞の単層培養を24ウェルプレートに作成し、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド溶液で530分間固定し、よく洗浄した。この上に、ヒト膀帯血単核球から免疫磁気ビーズ法を用いて純化したCD34陽性細胞を播種し、サイトカインであるSCF、TPO、FLを添加して培養した。培養2週、3週後に細胞の一部を回収し、細胞数およびコロニー前駆細胞数を測定した。グルタールアルデヒド固定ストロマ群で最大の効果が得られた。そしてこの効果がストロマ細胞をCD34陽性細胞との直接接触による寄与が高いこともわかった。さらに、この固定化細胞は長期間の冷蔵保存が可能であることがわかった。(2)サイトカインであるトロンボポエチン、ストロマ細胞に含まれていると考えられるmKirr、Notchリガンドを光固定化した基板を調製し、その上でのCD34陽性細胞の培養を行ったが、現在のところ、効果的な結果は得られていない。現在、固定化のためのマトリックスや固定化方法、さらに担体に基板ではなく、微粒子や水溶性高分子を用いる方法について検討中である。(3)CD34陽性細胞から分化によって好中球を調製する方法について検討した。この培養好中球と、末梢血に含まれる好中球との機能比較を生体外で行ったところ、培養好中球では貪食能は高かったが、遊走能は低かった。現在、動物実験により詳しい解析を行っている。臍帯血中の造血幹細胞をその性質(自己複製能、造血再構築能)を保持したまま体外で増幅できれば、従来の移植細胞量の制限がなくなり、体重の重い成人の白血病治療など様々な治療に応用できる。また、ヒトES細胞の応用に関しては、まだ臨床応用可能な培養法の確立さえできていない状況である。最終年度では、ES細胞培養も含めて異種動物由来物を用いない培養系の確立を目指した検討を行った。1.新しい不死化ヒトストローマ細胞の創出を行った。がんセンターとの共同研究で新たにテロメラーゼ遺伝子を導入した細胞を得、クローニングを行い、造血幹細胞増殖支持能のあるクローンを見出した。ただ、これまでのクローンでは、増殖能が高すぎるため、化学的に固定化して用いる必要があると考えられた。2.造血支持能のあるナース細胞を脂肪細胞へ形質転換すると支持能が消失することから、支持能の有無による発現タンパク質の解析を二次元電気泳動で行い、その差が明らかとなり、DNAチップにより詳細な遺伝子解析を行った。3.サルES細胞をヒト羊膜上皮細胞をナース細胞として使って培養できるようにした。霊長類ES細胞を、医療廃棄物として捨てられていた胎盤から得た細胞で培養できることを示した。4.マウスES細胞を様々な培養基材上で培養して、その特徴的な増殖挙動を明らかにすることができた。グルタルアルデヒドで化学固定したナース細胞でもマウスES細胞培養が可能であることを明らかにした。さらに化学固定した細胞は冷蔵保存後も活性を保持していることが明らかとなった。
途上国都市スラムにおける衛生行動の変容促進を目的とした介入方策に関する研究

途上国の都市スラムの共同トイレ利用者は、下痢症などの高い感染リスクにさらされていることが指摘されているが、リスク低減のためには、排便後の水洗、ならびに手洗いの励行など、スラム住民の衛生行動の変容が必須である。本研究では、これまでに、排便後の水洗、手洗い、食前の手洗い、ならびに家庭内での飲料水の貯留状況を対象に、衛生行動の実態ならびに衛生行動を規定する要因について、質問紙による量的調査を行った。その結果、排便後の水洗については、高い頻度で行っているとする回答者とそうでない回答者で、トイレの汚さへの不満、他人の視線、後の利用者への配慮といった意識的な要因において、有意な差がみられた。さらに、水洗・手洗い用水の確保といった物理的要因においても有意な差がみられるとともに、衛生に関する知識量の多寡においても有意な差がみられた。手洗いに関しては、生活環境が感染しやすい脆弱な状況にあると感じている回答者は、排便後、食事前の手洗いを励行している傾向がみられた。また、上記の物理的要因の状況とその対応策を議論したフォーカスグループディスカッション(FGD)において積極的発言をした参加者を対象に行った個別インタビューに基づく質的調査からは、対象スラムにおいて、その罹患頻度の低下から、感染性下痢症リスクの認知レベルが低下している可能性が見いだされた。スラム住民の健康に関わる関心は、非感染性疾患に向けられている。下痢症に対する低い認知レベルと、衛生行動が伴わず、糞便に起因する感染源となっている共同トイレの状況との間には、乖離があると言わざるを得ない。このほか、衛生行動の変容に関わる物理的要因の解消によるトイレの清潔さの改善ならびに共同トイレ利用者の行動変容を促す効果について調査するため、8室のトイレをもつ共同トイレの各室に手洗い設備を導入した。変容が求められる衛生行動について、その規定要因に関する調査を実施し、その結果から、行動変容を促すために必要な介入について有益な知見を得ることができた。一方、FGDにおいて積極的な発言をした住民へのインタビューに基づく質的調査から、以前と比べて下痢症の罹患頻度が低下したことから、下痢症認知レベルの低下が示唆されたが、糞便汚染源であるトイレの状況、排便後の手洗いに必要な水源や設備の不足している状況との間に乖離があるとみることができることから、認知レベル向上と改善意思形成のための介入の必要性があることが分かった。2019年度において、衛生行動を変容しようとしたときの物理的制約解消による衛生行動ならびにリスク低減効果を分析するが、そのための準備としてスラムトイレに手洗い設備を導入した。都市スラム共同トイレに新たに導入された手洗い設備を利用することにより、利用者が排便後の水洗や手洗いにおいて、行動変容がどの程度進むかについてモニタリングをしていくとともに、トイレ周りで利用者が接触する箇所に付着する大腸菌濃度について、この設備を導入していないトイレと比較し、こうした設備導入による下痢症リスク削減効果を計測する。一方、新たなスラムにおいて啓発活動を実施し、下痢症リスク認知の向上を意図した啓発活動を実施し、啓発活動を受けた住民が、衛生行動の変容のために、物理的制約の解消を含めて自ら問題を見出し、解決策を提案する参加型啓発プロセスを適用し、住民が共助的活動により衛生行動を主体的に変容させていく能力向上の程度を評価する。手洗い設備の導入と参加型の啓発活動による衛生行動の変容を促進する効果ならびに感染性下痢症リスク削減効果を総合的に評価する。

一方、FGDにおいて積極的な発言をした住民へのインタビューに基づく質的調査から、以前と比べて下痢症の罹患頻度が低下したことから、下痢症認知レベルの低下が示唆されたが、糞便汚染源であるトイレの状況、排便後の手洗いに必要な水源や設備の不足している状況との間に乖離があるとみることができることから、認知レベル向上と改善意思形成のための介入の必要性があることが分かった。2019年度において、衛生行動を変容しようとしたときの物理的制約解消による衛生行動ならびにリスク低減効果を分析するが、そのための準備としてスラムトイレに手洗い設備を導入した。都市スラム共同トイレに新たに導入された手洗い設備を利用することにより、利用者が排便後の水洗や手洗いにおいて、行動変容がどの程度進むかについてモニタリングをしていくとともに、トイレ周りで利用者が接触する箇所に付着する大腸菌濃度について、この設備を導入していないトイレと比較し、こうした設備導入による下痢症リスク削減効果を計測する。一方、新たなスラムにおいて啓発活動を実施し、下痢症リスク認知の向上を意図した啓発活動を実施し、啓発活動を受けた住民が、衛生行動の変容のために、物理的制約の解消を含めて自ら問題を見出し、解決策を提案する参加型啓発プロセスを適用し、住民が共助的活動により衛生行動を主体的に変容させていく能力向上の程度を評価する。手洗い設備の導入と参加型の啓発活動による衛生行動の変容を促進する効果ならびに感染性下痢症リスク削減効果を総合的に評価する。調査対象スラムに前年度設置した手洗い設備の支払い日が年度をまたいでしまったために生じた繰越金である。
準モンテカルロ点集合の新評価指標

科学の広範な分野において、高次元空間上の積分の数値計算があらわれる。モンテカルロ法が有効な手段だが、N点サンプルをとった時の誤差のオーダーはNの-1/2乗で大きい。準モンテカルロ法はこれを改良し、空間内に超一様に配置されたN点をサンプルとすることで誤差を減らす手法である。本研究では、「点集合の超一様性の評価指標」として、(1)誤差評価に直結し、(2)指標自体の計算が高速、なものを開発した。さらに、次元が高い時にも有用に働くように、微分感受性パラメーターを導入した。点集合はホームページ上に公開した。また、数値実験により、本点集合が既存のアルゴリズムより優位であることを実験的に示した。研究代表者は、斎藤睦夫氏とKyle Matoba氏との共同研究により、準モンテカルロ法点集合のための高速計算可能な指標Walsh Figure of Merit(WAFOM)を開発した。(論文はMathematics of Computationに2014年に掲載。)芳木との共同研究で、実際にこの指標が小さい(したがって数値積分において有利な)点集合が存在することを、確率的手法で証明した。(論文は2013年にProceedings of MCQMCに掲載。)オーストラリアニューサウスウェールズ大学J. Dick氏との共同研究により、MacWilliams型反転公式を使ったデジタルネットのt値を高速に計算するアルゴリズムを開発した。論文はSIAM Journal of Discrete Mathematicsに掲載されている。このアルゴリズムを使い、多くの点集合に対してそのWAFOMとt値を計算し、どちらが準モンテカルロ積分誤差を小さくするかについての実験を行った。その結果、高階偏導関数のノルムが小さいような被積分関数に対しては、WAFOMで選ばれた点集合の方が、t値で選ばれた点集合よりも高速に真の積分値に収束することを確かめた。被積分関数を多項式関数、指数関数や三角関数などに選び実験すると、WAFOMを使って探索された点集合は、通常の準モンテカルロ法での収束の限界であるO(1/N)を超えた高速な収束を見せている(Nは点の個数)。研究代表者は、斎藤睦夫氏とKyle Matoba氏との共同研究により、準モンテカルロ法のための高速計算可能な指標を開発した。この指標はWalsh Figure of Merit(WAFOM)となづけた。有限体線形空間の部分空間Pを点集合として準モンテカルロ積分をするのだが、この際にPの直交空間から0を除いた各元Aにたいし、2をマイナスμ(A)乗した実数を総和としてWAFOM(P)は得られる。数値積分誤差は、点集合の指標であるWAFOM(P)と、非積分関数の暴れ具合をあらわすノルムとの積で抑えられることも証明した。このようにして選ばれた点集合が実際にAsian Optionの数値計算において有効であることを示した。また、指導学生芳木との共同研究で、実際にこの指標が小さい(したがって数値積分において有利な)点集合が存在することを、確率的手法で証明した。この分野の権威であるオーストリアのHarald Niederreiter教授を招へいし、討論することにより、高速なt値計算アルゴリズムを得ることができた。また、指導学生鈴木航介氏との研究で、Niederreiter-Jingにより構成された(t,m,s)-ネットをinterlacingすることで、低WAFOM点集合が構成できることも示された。モンテカルロ法に用いられる疑似乱数発生法で、GPUに適合した高速なMersenne Twister for GPUを斎藤睦夫氏と開発しホームページ上で公開した。論文はACM TOMS誌に受理されている。Walsh Figure of Merit (WAFOM)は、Josef Dickの先行研究に基づき研究代表者らが導入した準モンテカルロ積分(QMC)を行うためのデジタルネット点集合Pに対してその評価値を与える関数であり、そのWAFOM値WAFOM(P)が小さければ積分誤差が比例して上から抑えられるというKoksma-Hlawka型不等式が成立している。研究代表者は、東京大学博士課程学生芳木武仁氏、修士課程学生大堀龍一氏らとの共同研究で、次の結果を得た。(1)WAFOM値の高速算法:ある多変数指数関数をPでQMC積分した際の積分誤差は、WAFOM(P)とほぼ比例する。したがって、低WAFOM点集合を探索するには前者を求めればよい。2011年に代表者が提案した離散フーリエ変換を用いるアルゴリズムではビット演算が必要だったが、前者の計算は実数演算だけで済むためにずっと高速に計算できる。実験により10倍を超える高速化が実現されている。(2)微分感受性パラメータ付WAFOMの導入。被積分関数の変数の数(次元)が大きくなると、Pを動かしてもWAFOM(P)は動きにくくなる。次元が20程度では、WAFOM値の小さい点集合を求めることが非常に困難であった。そこで、WAFOM値が動きやすくなるようにパラメータcを導入した。cが小さくなるとWAFOM値は動きやすくなり、高い次元でも低WAFOM点集合が見つかるようになる。払われるコストは、「被積分関数の高階導関数のノルムが増大するときに、積分誤差が増大しやすくなる」ことである。次元と点集合のサイズに対し、どのようにcを定めると良いかを定式化し、そのようなcを求めるアルゴリズムを提唱し、実装してその有効性を確認した。科学の諸分野で、高次元空間上の関数の積分値を精度よく近似計算する必要が起きる。

モンテカルロ法が一般的計算手段だが、N点サンプルをとった時の誤差のオーダーは1/√Nである。準モンテカルロ法とは、空間内に超一様に配置されたN点をサンプルとすることで誤差のオーダーを1/N近くに減らす手法である。2013年に研究代表者はより高次の誤差収束O(N^{ーClog(N)})を実現するような点集合評価基準Walsh Figure of Merit(WAFOM)と、その高速計算法を発表した。本年度においては、Walsh Figure of Meritに「微分感受性パラメター」を導入することで、より高次元な空間上定義された非積分関数に対しても誤差収束が高速であるようなWAFOM点集合を構成した。さらに、それを多変量正規分布の累積度数関数に使用して、実際におおくの既存の数式処理ソフトウェアよりも数十倍高速であることを示した。成果は、2015年7月にオーストリア・リンツにて開催された国際会議10th IMACS Seminar on Monte Carlo Methodsにて口頭発表した。科学の広範な分野において、高次元空間上の積分の数値計算があらわれる。モンテカルロ法が有効な手段だが、N点サンプルをとった時の誤差のオーダーはNの-1/2乗で大きい。準モンテカルロ法はこれを改良し、空間内に超一様に配置されたN点をサンプルとすることで誤差を減らす手法である。本研究では、「点集合の超一様性の評価指標」として、(1)誤差評価に直結し、(2)指標自体の計算が高速、なものを開発した。さらに、次元が高い時にも有用に働くように、微分感受性パラメーターを導入した。点集合はホームページ上に公開した。また、数値実験により、本点集合が既存のアルゴリズムより優位であることを実験的に示した。パラメータ付WAFOMを小さくすることによって探索された点集合は、指数関数・三角関数・有理関数など多くの関数で、実際に数値積分誤差を小さくすることが計算機実験で確認された。点集合Pのサイズ(サンプルサイズ)をNとしたとき、次元が4程度ではNのマイナス2乗、次元が10程度でも被積分関数によりNのマイナス1.3乗といったオーダーでの誤差の減少が観測された。従来のQMC積分の目標が「誤差をNのマイナス1乗にする」と言うものだった点を鑑みるに、この成果は「目標を超えた結果を得る」ことに成功したと言える。ここには数学的に不正確な点がある:従来のQMC積分の目標は、「有界変動関数」という広いクラスの関数に対して数値積分誤差を減らすことにあり、その場合の上限はNのマイナス1乗×logNの正冪乗であることが証明されているため、Nのマイナス1乗を目標とせざるを得なかったのである。それに対しWAFOMが対応する被積分関数は、「その高階導関数のノルムの増大度が、微分の階数の指数関数で押さえられている」ような狭いクラスの関数であるからである。したがって、実用上重要なことは、後者のような狭いクラスの関数の中に、工学的応用上重要な関数がどのくらい入るかを示すことにある。
DNA合成期の最初に複製される複製単位の構造

哺乳類細胞染色体DNAでは、30から200Kbの複製単位(レプリコン)に分割されて、それらが群をなしてS期の間に逐時的に複製すると考えられているが、レプリコンとしての構造が明かにされているものはない。ここでは薬剤を用いた同調法により、S期最初に複製するレプリコンの構造を明かにする事を目的としている。既にS期初期に同調する方法を用いて、この時に複製しうるDNA断片(約4Kb以下)を5種類クローン化している。そのうち1つについては3つのゲノミッククローンで全長約60Kbの領域をクローン化した(E1-7H領域)。DNA合成開始時近傍に細胞を同調する方法を用いて、このE1-7H領域内の6ヶ所のBamHIまたはHind III断片の複製量を比較した所、約20Kb離れた2つのDNA断片の複製量が多くその間に複製量の下がる領域があったが、外側の領域ではそれ程複製量が下がらなかった。もしレプリコンが30から200Kbの領域で単一の複製開始点を持ち両方向に複製が進行するならば、1つ複製量の高い制限酵素断片があればその周囲30から200Kbの領域ではその断片から離れるにつれて複製量が下がるはずである。従ってこのモデルでは現在得られている結果を説明できない。現在の結果から推測すると、S期初期に複製するレプリコンは小さく10から20Kb程度であるかまたは複数個の複製開始点を持つことになる。このE1-7H領域で得られた結果がこの領域に特有なものかあるいはS期初期に複製する領域に共通したものであるのかを調べるため、これとは独立したE3-H1領域(約50Kb)のクローン化を行い現在検討中である。我々はS期初期に複製する複製単位の制御機構を調べるため、薬剤を用いる同調法をラット培養細胞に用いて、S期初期に複製するDNA領域のクロ-ン化を試みた。細胞を増殖刺激後一晩ヒドロキシウレア存在下で培養すると数十から百kbの新生鎖が蓄積し、約1%の鋳型DNAが複製される。複製された領域を取り出してクロ-ン化を行った。現在5個のクロ-ン(4kb以下)がS期初期に複製される事が確認された。一方PCNA遺伝子などはこの時期に複製されなかった。この事はS期初期に複製しうる複製単位とそうでない複製単位の区別がある事を意味する。しかしS期初期に複製するものも、約10%の鋳型DNAが複製されるまでS期を進行させても約半数の細胞で複製されるにとどまった。この事はすべての細胞で同事に複製が開始されていない事を示唆する。またS期初期に複製されるクロ-ンについて、ヒドロキシウレアとアフィディコリンを併用して、DNA合成開始時に同調する方法を用いて複製した事が確認されるまでの時間を比較した結果、クロ-ン間で差が見られた。もしこれがクロ-ン化された領域とその複製単位の複製開始点との距離の違いを反映するならば、それぞれのゲノミッククロ-ンを取れば、複製開始点を決定できる。通常のゲノミックライブラリ-では5個のクロ-ンそれぞれ約百万個スクリ-ンしても対応するものが取れなかった。そこでS期初期に複製する領域のゲノミックライブラリ-を下因子ベクタ-と大腹菌DH10Bを用いて作製し、数万個スクリ-ンした結果、すべてのクロ-ンに対し、1050kbのゲノミッククロ-ンを得ている。この事は現在得られているクロ-ンは、通常の方法ではクロ-ン化が困難な領域である事を示唆している。現在、それぞれのクロ-ンの制限酵素地図の作製とシングルコピ-領域の検索を行っている。

哺乳類細胞染色体DNAでは、複製単位(レプリコン)が群をなして逐時的に複製すると考えられているが、レプリコンとしての構造が明らかにされているものはない。ここでは薬剤による同調法を用い、S期最初に複製するレプリコンの構造を明らかにする事を目的としている。既にヒドロキシウレア単独を用いた同調法で全ゲノムの約1%が複製された時に複製可能なレプリコン由来のDNA断片(約4kb以下)を5種類クローン化している。S期初期に複製したDNAよりゲノミックライブラリーを作製し、それより現在得ているクローンのうち1つのものについて3個のゲノミッククローン(全長約60kb)を分離した。このうち約40kbの領域から6ヶ所プローブとして使用可能なDNA断片を決めた。アフィディコリンとヒドロキシウレアを併用した同調法を用いて新生鎖を約20kb以下の状態まで伸長させ、それぞれのプローブの認識する制限酵素断片の複製した量を比較した。その結果40kbの領域中、中央やや左よりの部分で多くその両脇では少なくなるが、右端の部分で再び多くなった。この事は複製開始が効率良く起る領域と悪い領域がこの40kb中にある事を示す。またレプリコンのサイズは50200kbだと考えられている事から、もし複製開始点が中央左よりと右端に存在するならば、約20kbという例外的に小さなレプリコンを単離した可能性と、2ヶ所開始点を持つレプリコンの一部を単離した可能性が考えられる。この点を検討するために右側に隣接したゲノミッククローンの単離を進めている。またこのような構造がS期初期に複製するレプリコンに共通したものかを調べるため、他のクローンのゲノミッククローンの単離も進めている。哺乳類細胞染色体DNAでは、30-200Kbの複製単位(レプリコン)に分割されて、それらが群をなしてS期の間に遂時的に複製すると考えられているが、レプリコンとしての構造が明かにされているものはない。ここでは薬剤を用いた同調法を用い、S期最初に複製するレプリコンの構造を明かにする事を目的としている。既にS期初期に同調する方法を用いて、この時に複製しうるDNA断片(約4Kb以下)を5種類クローン化している。そのうち1つについては3つのゲノミッククローンで全長約60Kbの領域をクローン化した(E1-7H領域)。DNA合成開始時近傍に細胞を同調する方法を用いて、このE1-7H領域内の6カ所のBamIIIまたはHindIII断片の複製量を比較した所、約20Kb離れた2つのDNA断片の複製量が多くその間に複製量の上がる領域があったが、外側の領域ではそれ程複製量が下がらなかった。もしレプリコンが30-200Kbの領域で単一の複製開始点を持ち両方向に複製が進行するならば、1つ複製量の高い制限酵素断片があればその周囲30-200Kbの領域ではその断片から離れるにつれて複製量が下がるはずである。従ってこのモデルでは現在得られている結果を説明できない。現在の結果から推測すると、S期初期に複製するレプリコンは小さく10-20Kb程度であるかまたは複数個の複製開始点を持つことになる。このE1-7領域でえられた結果がこの領域に特有のものであるのかを調べるため、これとは独立したE3-H1領域(約50Kb)のクローン化を行い現在検討中である。
サイクロオキシゲナーゼ選択的阻害剤の胎児循環への影響

高選択的サイクロオキシゲナーゼ2(COX2)阻害剤であるセレコキシブ(Cel)のラット胎児動脈管収縮作用と腎組織変化に及ぼす影響を検討した。日齢20の妊娠ラットをコントロール群、インドメタシン10mg/kg群、Cel群(10,20,0,40,50,60mg/体重)に分け、薬剤投与24時間後に帝王切開を施行し、娩出した胎仔をドライアイス/・アセトンで急速凍結した。続いてミクロトームで作成した心血管断面を顕微鏡で観察し、動脈管(D)および主肺動脈内径(P)を計測、この比(D/P)を動脈管収縮の指標とした。さらに、胎仔ラットの腎臓を取り出し、腎尿細管の組織学的検討も行った。さらにCOX2投与前後の血中プロスタグランジン濃度阻害率と動脈管収縮および腎組織の関係を検討した。COX2の薬物血中動態は血清0.1mlを0.25mlの0.2Nリン酸で処理し、サンプルは1%水酸化アンモニウムを用いて抽出、溶離液は窒素下にacetonitrileと0.01Msodium acetateで溶解し、高性能流動クロマトグラフィーで分析した。動脈管径はCel10-20mg/kg群ではコントロル群との間に差を認めなかった。しかし、30mg/kgで収縮作用を認め、60mg/kgでは強く収縮(0.12±0.09)した。Cel30mg/kgでは、腎尿細管の壊死を認め、この腎尿細管組織変化はCel用量依存性であった。Cel血中濃度と動脈管および腎組織の障害との関係を解析の結果、Cel血中濃度の増加と腎尿細管障害と動脈管収縮は相関関係を認めた。低濃度のCel投与量(10mg/kg)でも腎尿細管障害が見られたのに対し、動脈管は30mg/kg以上で収縮し、より低投与量のCelで腎組織変化が出現する事が明らかとなった。「胎児動脈管(平滑筋)収縮機転の解明」と最近開発されているサイクロオキシゲナーゼ(COX)阻害作用、特に、COX-2レセプター阻害剤の胎児動脈管への作用が、本研究の目的である。昨年までは、胎児動脈管直径に生ずる静的張力の測定により検討を行って来たが、本年度は、微少血管灌流システムを用いた実験系を検討している。灌流系においては、微妙な温度コントロールが重要であり、この検討に時間を費やした。胎児動脈管を用いた実験は現在進行中であり、報告すべき研究・解析結果は未だ無い。胎児動脈管はサイクロオキシゲナーゼ(COX)阻害剤により収縮する。COXの2種の受容体(COX1,COX2)のうちCOX2のみを阻害するCOX2選択的阻害剤が注目されている。私たちは最近開発された高選択的COX2阻害剤であるcelecoxibについての検討を行ってきた。今回の研究では、高選択的サイクロオキシゲナーゼ2受容体阻害剤であるcelecoxibの胎児動脈管収縮作用の妊娠週数依存性及び用量依存性を検討し、さらに腎組織に及ぼす影響を検討した。方法は日齢20の妊娠ラットをコントロール群、celecoxib群に分け、薬剤投与24時間後に帝王切開し、取り出した胎仔をドライアイスアセトンを用いて全身急速凍結した。続いて、ミトクロームで作成した心血管断面を顕微鏡で観察し、動脈管内径および主肺動脈内径を計測し、この内径比を動脈管収縮の指標とした。この指標の日齢別の変化を統計学的に解析した。

また各群の胎仔腎の近位、遠位尿細管の組織学的変化を評価した。高選択的COX2阻害剤は胎仔動脈管を有意に収縮させた。また胎仔腎障害は動脈管収縮作用に比し、より低用量で出現した。高選択的サィクロオキシゲナーゼ2(COX2)阻害剤であるセレコキシブ(Cel)のラット胎児動脈管収縮作用と腎組織変化に及ぼす影響を検討した。日齢20の妊娠ラットをコントロール群、Cel群(10,20,0,40,50,60,70,80,90,100mg/体重)に分け、薬剤投与24時間後に帝王切開を施行し、娩出した胎仔をドライアイス/・アセトンで急速凍結した。続いてミクロトームで作成した心血管断面を顕微鏡で観察し、動脈管(D)および主肺動脈内径(P)を計測、この比(D/P)を動脈管収縮の指標とした。さらに、胎仔ラットの腎臓を取り出し、腎尿細管の組織学的検討も行った。動脈管径はCel 10mg/kgおよび20mg/kg群ではコントロル群との間に差を認めなかった。しかし、30mg/kgおよび40mg/kgでは有意に動脈管は収縮し、50mg/kgはさらに強い収縮作用を認めた。60mg/kgから100mg/kg群ではD/P比はそれぞれ60mg/kg(0.12±0.09)、70mg/kg(0.17±0.11)、80mg/kg(0.16±0.12)、90mg/kg(0.09±0.10)、100mg/kg(0.06±0.07)であり、50mg/kgとの間に有意差は認めなかった。また、Cel 30mg/kg投与群では、腎尿細管の壊死を認め、この腎尿細管組織変化はCel容量依存性であった。前年度の研究は、高選択的サイクロオキシゲナーゼ2(COX2)阻害剤であるセレコキシブ(Cel)のラット胎児動脈管収縮作用と腎組織変化に及ぼす影響を検討してきたが、これまでの研究ではCOX2投与前後の血中プロスタグランジン濃度の減少率(阻害率)と動脈管収縮および腎組織変化の関係も検討していなかった。本年度の研究目的は、COX2投与前後の血中プロスタグランジン濃度阻害率と動脈管収縮および腎組織の関係を検討した。COX2の薬物血中動態は血清0.1mlを0.25mlの0.2Nリン酸で処理し、サンプルは1%水酸化アンモニウムを用いて抽出、溶離液は窒素下にacetonitrileと0.OlM sodium acetateで溶解し、高性能流動クロマトグラフィーで分析した。COX2 10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kgおよび60mg/kg投与量における血中濃度は1.8μg/ml、2.4μg/ml、3.9μg/ml、4.0μg/ml、5.6μg/ml、5.5μg/mlとほぼ直線的に増加した。COX2血中濃度と動脈管および腎組織の障害との関係を解析の結果、COX2血中濃度の増加と腎尿細管障害と動脈管収縮は相関関係を認めた。低濃度のCOX2投与量(10mg/kg)でも腎尿細管障害が見られたのに対し、動脈管は30mg/kg以上で収縮し、より低投与量のCOX2で腎組織変化が出現する事が明らかとなった。なお、本年に行う予定であった妊娠兎を用いてのCOX2の胎生期動脈管に及ぼす張力変化を明らかにする実験は施行できなかった。