hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性腎障害時の肝膜輸送体・薬物代謝酵素の系統的な活性変動の解析と予測法開発

肝消失型薬物の一部は、血漿中からの消失が慢性腎障害時に遅延する。そこで、OATP1B1阻害作用を有する生体内化合物を探索したところ、6-OH indoleはOATP1B1を阻害した。血漿中6-OH indole濃度は、腎障害患者において、正常腎機能患者よりも血漿中濃度が高かった。この化合物によるOATP1B1阻害作用は持続的であり、プレインキュベーション時のみに添加した際にも阻害作用を有した。さらに、本化合物は、ヒト初代培養肝細胞でestrone 3-sulfateの細胞内取り込みを阻害した。本化合物は、慢性腎障害時に血液中に蓄積してOATP1B1の機能阻害を引き起こすことが示唆された。この原因として、申請者らは、慢性腎障害患者の血漿中に存在する尿毒素に、一部の肝膜輸送体や薬物代謝酵素の機能を直接阻害またはmRNA発現量を低下させる作用があることを報告した。阻害作用の程度はいずれも比較的弱かったことから、本研究では、既知の尿毒症物質以外の阻害作用を有する化合物を探索した。まず、既知の尿毒症物質との構造類似化合物群に関して、HEK293/OATP1B1細胞を用いて肝膜輸送体OATP1B1阻害作用をスクリーニングしたところ、OATP1B1の阻害作用を有する化合物を確認した。本化合物の血漿中濃度をLC-MS/MSで測定したところ、高度に腎機能が低下した患者群において、正常な腎機能の患者群よりも血漿中濃度が高かった。この化合物によるOATP1B1阻害作用は持続的であり、プレインキュベーション時のみに添加した際にも阻害作用が確認された。さらに、本化合物は、ヒト初代培養肝細胞においてもestrone 3-sulfateの細胞内取り込みを阻害した。本化合物は、慢性腎障害時に血液中に蓄積することでOATP1B1の機能阻害を引き起こすことが示唆された。そこで、OATP1B1の慢性腎障害時の活性変化を定量的に予測可能な血漿中バイオマーカーを同定すべく、メタボローム解析によるOATP1B1の生体内基質の探索を開始した。HEK293/OATP1B1をマウス肝臓組織画分とインキュベーションし、細胞ライセートをLC-TOF-MSで測定し、OATP1B1阻害剤の非存在下で高いシグナルを示したイオンを同定した。現在、化合物標品を用いた輸送活性を評価中である。本研究でOATP1B1の阻害作用を有する新たな尿毒症候補化合物が見つかった。また、次年度に予定していたOATP1B1生体内基質の探索を開始しており、既に候補化合物が同定されており、今後も研究計画の達成が期待できる。前年度に同定した生体内化合物によるOATP1B1の持続的な阻害作用様式を検討した。この化合物は、HEK293/OATP1B1細胞への[3H]E3Sの取り込みを、濃度依存的かつPre-incubation時間依存的に阻害した。Direct InhibitionにおけるIC50は、14.7 μMであり、既知のOATP1B1阻害作用を有する尿毒症物質の一つであるIndoxyl Sulfate (4.8 mM)よりも、100倍以上強力にOATP1B1を阻害した。3時間まではPre-incubation時間依存的に阻害が強まったが、3時間以降は阻害が強まる傾向はなかった。Cyclosporin Aは、OATP1B1をPre-incubation時間依存的に阻害するが、その阻害活性は30分以上のpre-incubationでは強まらなかったことから、Cyclosporin Aよりは遅いPre-incubation時間依存性を有していた。Direct Inhibitionでは、HEK293/OATP1B1での[3H]E3Sの取り込みに対するKmおよびVmaxが増加し、Long-lasting Inhibitionでは、Kmが増加しVmaxは変化しなかった。Pre-incubationによる阻害は、3時間で回復したことから、Long-lastingな阻害は可逆的であった。OATP1B1細胞膜表面ビオチン化の結果、本化合物はOATP1B1の細胞膜上での発現量および総発現量を変化させなかった。HAタグで標識したOATP1B1の免疫染色においても、6-OH indoleはOATP1B1の細胞膜上への発現局在は変化させなかった。OATP1B1の阻害機構には、OATP1B1の細胞膜局在変化は関与しないことが示唆された。本化合物は、肝細胞に発現する薬物代謝酵素P450で代謝されて生成することから、肝細胞内および肝細胞近傍では全身循環血よりも高濃度で存在する可能性があり、肝細胞の内部からOATP1B1を阻害することも考えられ、慢性腎障害時におけるOATP1B1の阻害作用に関して更なる検討が必要である。

本化合物は、慢性腎障害時に血液中に蓄積してOATP1B1の機能阻害を引き起こすことが示唆された。膜透過や薬物代謝等の機能変化と遺伝子発現の変化の両方を検討できる最も生理的な実験系として、初代培養ヒト肝細胞を用いる。40余名より採取した慢性腎障害患者血漿とともに培養後、肝膜輸送体および薬物代謝酵素のプローブ基質をカクテル添加し、基質の取り込みまたは代謝活性を評価することで、慢性腎障害時の膜輸送体、薬物代謝酵素の活性変化を系統的に解明する。肝膜輸送体または薬物代謝酵素の活性変化を定量的にモニターできる血漿中のバイオマーカー化合物を、膜輸送体発現系または薬物代謝酵素組み換えタンパク質発現系を用いて同定する。さらに、同定されたバイオマーカー候補化合物の濃度を、慢性腎障害患者血漿と健常人ヒト血漿で比較し、その妥当性を検証する。薬物治療学
Apobec2による褐色脂肪の制御と生理的意義の解明

褐色脂肪組織は脂肪酸と糖のエネルギーを消費することで、恒温動物の体温維持に寄与している。申請者は、AID/Apobecファミリーの1つであるApobec2が褐色脂肪組織の代謝制御に関係すると仮説を立てた。これまでの研究から、Apobec2を欠損したマウスでは体脂肪が減少しており、おそらく褐色脂肪組織における脂質代謝亢進によるものと考えた。長期間の高脂肪食摂取試験を行った結果、Apobec2欠損マウスでは、野生型マウスよりも体重と肝臓重量が軽く、脂肪滴の蓄積が軽減されていた。脂肪重量には変化は確認されなかった。また、Apobec2欠損により、高脂肪食により誘導される一部の血液成分の増加が抑制されていた。この結果は、Apobec2欠損による代謝亢進が高脂肪食給餌による代謝異常を軽減したことを意味する。そこで次に、Apobec2欠損により誘導される代謝亢進を細胞レベルで確認するため、細胞外フラックスアナライザーを用いたエネルギー代謝解析を行った。これまでに、マウスより単離した初代培養筋芽細胞および褐色脂肪組織由来の間質血管細胞群を用いてエネルギー代謝解析を行ったが、初代培養細胞の分化の程度が異なるため、正確な測定が困難であることがわかった(Apobec2欠損マウス由来の筋芽細胞は野生型由来の筋芽細胞よリも分化が早いことがわかっている)。そのため、代替法として、細胞株に対するsiRNAを用いたノックダウンおよび過剰発現を用いてApobec2と代謝の関係を細胞レベルで調べている。現在までの研究により、Apobec2欠損が高脂肪食給餌による肝臓への脂肪蓄積や脂質代謝異常を抑制する結果を得ている。この現象が、Apobec2欠損により骨格筋または褐色脂肪から分泌された何らかの因子によるものか否かは定かではない。Apobec2が直接的に細胞のエネルギー代謝に関与することを示すため、2年目の計画では、細胞外フラックスアナライザーを用いエネルギー代謝の解析を実施した。当初、遺伝子欠損マウス由来の初代培養細胞に対し代謝解析を行う予定であったが、Apobec2欠損により分化の程度が変化するため、細胞株を用いることで正確に代謝測定を行うことにした。これまでにsiRNAを用いたノックダウンの効率および発現プラスミドの確認を行っている。Apobec2欠損による代謝亢進が、高脂肪食給餌による代謝異常を軽減する可能性を見出している。今後は、Apobec2が筋細胞、褐色脂肪細胞のエネルギー代謝を直接的に調節するか否か、正確に解析したい。そのため、細胞株に対する遺伝子ノックダウンまたは過剰発現により、Apobec2とエネルギー代謝との関係を明らかにする。また、RNA-seqにより網羅的に関連する遺伝子の特定を行いたい。近年、多くの哺乳類が、機能的褐色脂肪組織を有することがわかったが、その分化や熱産生の制御機構は未解明のままである。申請者は、AID/Apobecファミリーの1つであるApobec2が褐色脂肪組織における代謝性熱産生を制御すると仮説を立てた。本研究では、この仮説について細胞および生体レベルで検証する。初年度の計画に基づき、Apobec2欠損が脂肪の表現型に及ぼす影響について精査した。褐色脂肪組織の形態を観察するため、パラフィン切片のHE染色を行うと、Apobec2欠損マウスでは、野生型マウスに比べて小さな脂肪滴を有することがわかった。透過型電子顕微鏡による超微細構造の観察からも、Apobec2欠損マウスの褐色脂肪組織では小さな脂肪滴が確認され、更にミトコンドリアの膨潤が観察された。呼吸交換比の測定を行うと、Apobec2欠損マウスは野生型よりもエネルギー消費量および脂肪酸化が有意に高い値を示した。一方で、褐色脂肪組織における熱産生や脂肪分化に関連する遺伝子発現をqPCRにて定量したが、野生型とApobec2欠損型で変化は見られなかった。そこで、ミトコンドリアの異常を細胞レベルで確認するため、初代培養褐色脂肪細胞を用いた。JC-1プローブを用いてミトコンドリアの脱分極状態を観察すると、Apobec2欠損マウス由来の褐色脂肪細胞の多くのミトコンドリアが脱分極していることがわかった。初年度の研究から、Apobec2欠損は褐色脂肪組織のミトコンドリアの異常を引き起こすことが明らかになった。現在、褐色脂肪のミトコンドリア異常が、エネルギー代謝に与える影響について検討している。研究結果は、Apobec2が褐色脂肪組織の活性化やミトコンドリアにおけるエネルギー代謝制御に関与することを示すものである。現在までの研究により、Apobec2欠損が褐色脂肪組織の活性化やミトコンドリアの異常を引き起こすエビデンスを得た。一方で、qPCRの結果から、Apobec2欠損は熱産生や脂肪分化に関連するマーカー遺伝子発現に影響しなかったことから、未知の作用機序により褐色脂肪組織の活性化を引き起こしている可能性が考えられる。初年度の計画では、細胞外フラックスアナライザーを用いて培養褐色脂肪細胞のエネルギー代謝測定を予定しており、現在までに解析条件を確立した。今後、Apobec2が発現している筋細胞や褐色脂肪細胞について、検証したい。褐色脂肪における熱産生や分化の機構については、未解明な部分が多いため、本研究により新たな機構が発見される可能性を期待している。

褐色脂肪組織は脂肪酸と糖のエネルギーを消費することで、恒温動物の体温維持に寄与している。申請者は、AID/Apobecファミリーの1つであるApobec2が褐色脂肪組織の代謝制御に関係すると仮説を立てた。これまでの研究から、Apobec2を欠損したマウスでは体脂肪が減少しており、おそらく褐色脂肪組織における脂質代謝亢進によるものと考えた。長期間の高脂肪食摂取試験を行った結果、Apobec2欠損マウスでは、野生型マウスよりも体重と肝臓重量が軽く、脂肪滴の蓄積が軽減されていた。脂肪重量には変化は確認されなかった。また、Apobec2欠損により、高脂肪食により誘導される一部の血液成分の増加が抑制されていた。この結果は、Apobec2欠損による代謝亢進が高脂肪食給餌による代謝異常を軽減したことを意味する。そこで次に、Apobec2欠損により誘導される代謝亢進を細胞レベルで確認するため、細胞外フラックスアナライザーを用いたエネルギー代謝解析を行った。これまでに、マウスより単離した初代培養筋芽細胞および褐色脂肪組織由来の間質血管細胞群を用いてエネルギー代謝解析を行ったが、初代培養細胞の分化の程度が異なるため、正確な測定が困難であることがわかった(Apobec2欠損マウス由来の筋芽細胞は野生型由来の筋芽細胞よリも分化が早いことがわかっている)。そのため、代替法として、細胞株に対するsiRNAを用いたノックダウンおよび過剰発現を用いてApobec2と代謝の関係を細胞レベルで調べている。現在までの研究により、Apobec2欠損が高脂肪食給餌による肝臓への脂肪蓄積や脂質代謝異常を抑制する結果を得ている。この現象が、Apobec2欠損により骨格筋または褐色脂肪から分泌された何らかの因子によるものか否かは定かではない。Apobec2が直接的に細胞のエネルギー代謝に関与することを示すため、2年目の計画では、細胞外フラックスアナライザーを用いエネルギー代謝の解析を実施した。当初、遺伝子欠損マウス由来の初代培養細胞に対し代謝解析を行う予定であったが、Apobec2欠損により分化の程度が変化するため、細胞株を用いることで正確に代謝測定を行うことにした。これまでにsiRNAを用いたノックダウンの効率および発現プラスミドの確認を行っている。呼吸交換比の測定から、Apobec2欠損がマウス生体レベルで代謝を亢進するエビデンスを得られたが、これが特定の組織に由来するか否か、はわかっていない。Apobec2を高発現する組織(褐色脂肪組織、骨格筋、心筋)由来の細胞に対し、細胞外フラックスアナライザーを用いてエネルギー代謝の測定を行う。特に、解糖やミトコンドリアの呼吸に変化があるか否か、検証する。細胞レベルでの代謝亢進が確認できたら、高脂肪食給餌による食事誘導性肥満により、マウス生体レベルでApobec2欠損が抗肥満作用を発現するか検証する。Apobec2欠損による代謝亢進が、高脂肪食給餌による代謝異常を軽減する可能性を見出している。今後は、Apobec2が筋細胞、褐色脂肪細胞のエネルギー代謝を直接的に調節するか否か、正確に解析したい。
低酸素/再酸素、グルコース除去によるNaチャネル遺伝子発現変動と細胞応答の修飾

虚血/低酸素などによる神経細胞障害時に、細胞質Ca^<2+>濃度|Ca^<2+>|iが上昇することは知られているが、|Ca^<2+>|i上昇と電位依存性Na^+チャネル細胞膜発現に関連して、以下のことが培養副腎髄質クロマフィン細胞での検討から得られた。Sarco(endo)plasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase(SERCA)の阻害薬DBHQによる急速・一過性の|Ca^<2+>|i上昇は、細胞膜Na^+チャネル発現量を変動させないが、SERCA阻害薬thapsigarginによる中程度・比較的長期の|Ca^<2+>|i上昇は、cPKCαとcalpainを活性化しNa^+チャネルinternalizationを促進した。さらに、Ca^<2+>イオノフォアA23187による高濃度・長期の持続的|Ca^<2+>|i上昇は、Na^+チャネルmRNAレベルを低下させた。|Ca^<2+>|i上昇パターンの違いが、異なる機序により、Na^+チャネル細胞膜発現量をdown-regulationさせた。一方、Ca^<2+>/カルモジュリンにより活性化されるホスファターゼcalcineurinの活性を抑制すること(Na^+チャネルinternalization低下、externalization促進)、神経保護作用を有し|Ca^<2+>|iを減少させる局所麻酔薬を添加することにより、細胞膜Na^+チャネル発現量が増加した。以上これまで細胞障害時に生じる|Ca^<2+>|i上昇とNa^+チャネル細胞膜発現とに焦点をあて研究を進めてきた。引き続き、低酸素状態で培養した細胞での検討を行っているところである。それから、生体組織に対してグルコース供給がストップすると、ケトン体が主要なエネルギー源に切り替わるが、ケトン体acetoacetate添加によってインスリン受容体mRNAレベルが減少する反面、Na^+チャネル細胞膜発現には影響を認めなかった。虚血/低酸素などによる神経細胞障害時に、細胞質Ca^<2+>濃度[Ca^<2+>]iが上昇することは知られているが、[Ca^<2+>]i上昇と電位依存性Na^+チャネル細胞膜発現に関連して、以下のことが培養副腎髄質クロマフィン細胞での検討から得られた。Sarco(endo)plasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase(SERCA)の阻害薬DBHQによる急速・一過性の[Ca^<2+>]i上昇は、細胞膜Na^+チャネル発現量を変動させないが、SERCA阻害薬thapsigarginによる中程度・比較的長期の[Ca^<2+>]i上昇は、cPKCαとcalpainを活性化しNa^+チャネルinternalizationを促進した。Ca^<2+>イオノフォアA23187による、さらに高濃度・長期の持続的[Ca^<2+>]i上昇は、Na^+チャネルルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを低下させた。[Ca^<2+>]i上昇パターンの違いが、異なる機序により、Na^+チャネル発現量をdown-regulationした。一方、Ca^<2+>/カルモジュリンにより活性化されるホスファターゼcalcineurinの活性をcyclosporin A(CsA)で抑制すると、細胞膜Na^+チャネル発現量が増加した。これは、Na^+チャネルのinternalization rateが、CsA処理細胞(t1/2=20.3h)では、対照細胞(t1/2=13.7h)と比較して、低下していたことと、CsA処理により、トランスGolgi網から細胞膜へのNa^+チャネル輸送が促進されていたことによる。以上これまで細胞障害時に生じる[Ca^<2+>]i上昇とNa^+チャネル細胞膜発現とに焦点をあて研究を進めてきた。現在、低酸素状態で培養した細胞での検討を行っているところである。

それから、生体組織に対してグルコース供給がストップすると、ケトン体が主要なエネルギー源に切り替わるが、ケトン体acetoacetate添加によってインスリン受容体mRNAレベルが減少する反面、Na^+チャネル細胞膜発現には影響を認めなかった。
アルツハイマー病関連蛋白による未知の核内転写制御機構の解明

平成17年度には、PS1のカドヘリン切断によるシナプス制御の機序を細胞レベルで解明するという計画をたてていたが、計画通り、N-カドヘリンの切断により、これまで知られていなかったシグナル伝達が制御されているということを明らかにすることができた。この結果を踏まえて、N-カドヘリンの段階的切断(ADAM10→PS1)の詳細な切断部位を同定し、その変異プラスミドを作成したところ、その変異により切断が生じず、それがシグナル伝達に影響を与えていることを見出した。そこで、この変異をノックインしたノックインマウスを作成することにより、PS1及びADAM10によるN-カドヘリンの切断がin vivoでどのような意義を持つかを検討する段階に入っている。これまでのところ、ADAM10とPS1によりそれぞれ切断されない変異を確定し、現在それをもとに、ターゲッティングベクターの構築が終了し、それをES細胞にトランスフェクションを行った。これらの2系統の変異につき、PCRでスクリーニングを行ったところ、それぞれ、陽性のクローンを得ることができ、さらにキメラマウス作成を目指して、実験が行われている最中である。さらに、細胞系の実験より得られた変異プレセニリンの結果を解析し、プレセニリンの機能の詳細を解明し、別のアプローチよりトランスジェニックマウスを作成する予定である。プレセニリンPS1は家族性アルツハイマー病の原因遺伝子であるが、プレセニリンが種々の基質蛋白を切断することにより、これらの蛋白の細胞内成分が遊離し、核へ移行し、核内で情報伝達を制御している可能性が指摘されている。本研究では、プレセニリンによって切断が制御される蛋白質の機能的意義の詳細について、特に、N-cadherinに焦点をあてて検討した。(1)PS1により切断される基質:PS1はγセクレターゼの主要構成要因としてAPP、LRPなどを基質に持つ。われわれは、LTPに必須のシナプス蛋白であるN-cadherinがPS1により切断され、この切断断片が核へ移行することを見出した。現在は、ヒト培養細胞より蛋白を抽出し、2次元的に分画化した生化学的にスクリーニングにより、このN-cadherinの切断断片が制御するシグナル伝達系の詳細を解析中である。さらに、PS1の他の基質であるAPP,LRPについては、抗体アレイ、DNAアレイ、及びgel shift motility assayにより、結合因子をスクリーニングしている最中である。(2)CTF2が制御するbeta-cateninの代謝の解析:さらにわれわれはN-cadherinの切断断片CTF2は、核へ移行した後、beta-cateninの転写をupregulateし、Wntシグナル伝達系を活性化することを見出した。この制御作用の機序を特定し、これがtauのリン酸化にかかわっているかどうかを現在評価中である。(3)N-cadheriの切断のin vivoにおける意義の検討:N-cadherinのPS1による切断により、Wnt signalingが制御されることがわかったため、切断されないN-cadherinをノックインしたマウスを作成することにより、in vivoにおける機能を推定する。このマウスにおいてシナプスの変性を呈する表現型が期待され、アルツハイマー病の神経変性のモデルになりうる可能性がある。これについては、今後の解析結果が待たれる。AD原因遺伝子であるプレセニリンPS1はγセクレターゼの主要成分として、さまざまな基質を切断し、シグナル伝達を制御していることが近年の研究より明らかにされてきた。申請者は、PS1シグナル伝達における未知の機能に着目し、PS1による基質の切断が、生理的・病理的にどのような意味を持つのかと言う点を明らかにしようと考えている。平成16年度において申請者らは、シナプス蛋白であるN-cadherinがPS1の基質の一つであることを明らかにし、神経伝達物質の刺激に応じてPS1により切断されることを明らかにしてきた。平成17年度は、それをさらに推し進めて、特にN-cadherinとその相互作用蛋白であるcateninを中心に、PS1によるシナプス関連蛋白の転写制御について検討し、PS1による膜蛋白(N-cadherin)切断という現象が記憶の基盤をなすシナプス可塑性に与える影響を細胞生物学的に検討した。

この結果、N-cadherinはADAM10とPS1により段階的に切断され、それが同じくシナプス蛋白であるβカテニンの転写を制御することが細胞レベルで明らかになった。この結果を踏まえ、これまでのアルツハイマー病のモデルマウスで解き明かされなかったシナプス変性の解明という新規な観点から、新しいADのモデルマウスを作成するための実験を開始している。これにより、従来の仮説とは異なるシナプス脱落に関する新しい病態のメカニズムを提示し、ADの病態研究において新たな一面を切り開きたいと考えている。
加齢に伴い発症する腎症の分子生物学的解析

平成8年度は、加齢mauseを用い、すでに、筆頭研究者が発表している加齢に伴って惹起されるアミロイドーシスの発症機転について、in vivoにおけるリンパ球を用いて、検討し、平成9年度は、転写因子結合蛋白であるc-jun,c-fosに注目して、腎臓の老化の一つの形態としての腎硬化像についてin vitoroの検討を加えた。平成8年度では、老化に伴い、末消血、骨髄、脾臓におけるリンパ球サブセットに差をみとめることを発見し、この事実が、老化に伴い現れるアミロイドーシスの一因になっていると考えた。平成9年度は、まず加齢に伴い、ラットの腎糸球体において、c-fosの発現が亢進していることを明らかにした。次にその発現増加が顕著であったメサンギウム細胞にc-fosのcDNAを含むベクターをメサンギウム細胞に注入し、細胞外基質遺伝子の発現を検討した。細胞外基質の一つであるlamininn B1の遺伝子の発現が増強した。これらのことから、加齢に伴った糸球体硬化にc-fosの発現が重要な役割を果たしている可能性が示唆される。12および24カ月齢のC57BL/6J雌マウスの末梢血、脾臓、骨髄の構成細胞の異常の有無を検討するため、ガラスホモジナイザーを利用して遊離リンパ球を集め、モノクローナル抗体L3T4、B220、Mac-1により、単色膜免疫蛍光抗体染色法を行い、FACScanで解析を行った。1.末梢血:24カ月齢のマウスでは12カ月齢よりB220陽性細胞の割合が増加し、逆にMac-1陽性細胞の割合が減少した。L3T4陽性細胞については有意な増減は認められなかった。2.脾臓:末梢血同様、24カ月齢のマウスでは12カ月齢よりB220陽性細胞の割合は増加したが、Mac-1陽性細胞の割合は小リンパで減少、大リンパ球で増加傾向がみられた。L3T4陽性細胞については明らかな増減は認められなかった。3.骨髄:24カ月齢のマウスでは12カ月齢よりMac-1陽性細胞の割合の減少傾向があり、B220陽性細胞およびL3T4陽性細胞については明らかな増減は認められなかった。加齢に伴って惹起されるアミロイドーシスの発症機転には何らかの免疫異常の関与を考えている。現在この意義について検討中であり、さらに若年マウスと比較する予定である。また現在、種々の細胞外マトリックスのプローブを用いて腎臓の、SAAやSAPのプローブを用いて肝臓のノーザンブロットを行い、アミロイドーシスの発症機序に関わる物質を検索中である。加齢に伴い発症する糸球体硬化症の発症要因の一つを解析した。加齢に伴い幾つかの臓器においてc-fosの発現が亢進することが知られている。このc-fosはc-junなどとAP-1などのdimerを形成しTpa responsive element (TRE)を持つ遺伝子の発現を亢進させる。本研究では加齢に伴いラットの腎糸球体においてfosの発現が増加することを明らかにした。そのfos遺伝子の発現増加が顕著な糸球体構成細胞はメサンギウム細胞であった。次にc-fos cDNAを含む発現ベクターを構成しこれを培養メサンギウム細胞に移入して細胞外基質の発現の変化を観察した。その結果c-foscDNAを導入した細胞ではlaminin B1の発現が増加した。これに対してc-fos cDNAのantisenseを導入した場合にはlaminin B1の増加は認められなかった。またc-fos transgenic mouseから得られたメサンギウム細胞はlaminin B1の発現が亢進していた。これはTREを介して細胞外基質遺伝子laminin B1の発現を活性化したものと思われる。さらに培養メサンギウム細胞は高糖の条件下(glucose 30 mM)で培養するとC-fOSの発現が増加した。この結果は糖尿病を含めた高血糖は糸球体硬化症を憎悪させる要因となることを示唆している。よつて本研究の結果は加齢に伴った糸球体硬化にc-fos発現が重要な役割を果たしている可能性を示唆している。
基質により多様に変化するセルロソーム構成酵素のフォーカスドプロテオーム解析

微生物などの生体触媒を利用したバイオマスの効率的な分解は、ホワイトバイオテクノロジーの実用化に向けて大きな課題となっている。そこで、高い分解活性を示す酵素超複合体「セルロソーム」の有用な分解機構を明らかにするため、プロテオミクス手法を取り入れ独自開発した分析システムにより、酵素郡の網羅的解析を試みた。様々な培養条件で生産された酵素群の測定結果より、Clostridium cellulovoransは、基質に応じて生産する酵素を最適化していることを解明した。微生物などの生体触媒を利用したバイオマスの効率的な分解は、ホワイトバイオテクノロジーの実用化に向けて大きな課題となっていることから、高い分解活性を示す酵素超複合体「セルロソーム」が注目されている。そこで、この有用な分解機構を明らかにするため、プロテオミクス手法を取り入れ独自開発した分析システムにより、いつ、どこで、どの酵素が働いているのかを各酵素の総量と量比からの分類を試みた。本研究では、セルロソーム関連タンパク質の分離測定技術と実バイオマスを含む多種類の基質条件での培養法の確立が必須である。分離測定技術に関しては、モノリスカラムを用いた液体クロマトグラフィーによる高性能タンパク質分離システムの構築と解析法の開発を行った。分離媒体として、独自に開発したモノリスカラムを使用することにより、既存法と比較して、モノリスカラムの特徴である高い空隙率を利用した高速分離を達成した。その結果、従来法では、アフィ二ティー精製が必要であったが、本研究では、精製の必要がなく、培養液中に含まれる酵素群を網羅的に解析できる系の開発に成功した。さらに、この系を応用し、基質をとセロビオース、ペクチン、セルロース、キシラン等の標準物質、又は、稲藁、古紙等の実バイオマスとした条件で、各々培養をし、結果的に各条件で生産された酵素群の定量的な測定を行なった。その結果、Clostridium cellulovoransは、基質に応じて生産する酵素を最適化していることを解明した。また、これらの定量的な情報を多変量解析に供し、気質に応じて生産量が劇的に変化する、特徴的な酵素群の特定にも成功した。これらの実験データを応用し、システム生物学などとの融合により、更に効率的な新規バイオマス利用システム構築を目指すことが可能となった。この背景から、高い分解活性を示す酵素超複合体「セルロソーム」が注目されているが、その分解機構は不明な点が多い。そこで、プロテオミクス手法を取り入れ独自開発した分析システムにより、セルロソームを構成する各酵素の定量的な測定を行い、いつ、どこで、どの酵素が働いているのかを各酵素の総量と量比から分類し、効率的な分解機構を明らかにし、生体触媒の実用的な応用のための、微生物機能の基礎情報を蓄積する。目的を達成するにあたり、本研究では、多種類の基質での培養条件下で生産されたセルロソーム構成酵素を定量的に測定する必要があるので、培養液からのセルロソーム精製技術とタンパク質分離測定技術の確立が非常に重要である。培養条件は、基質の種類と濃度の膨大な数の組合せが考えられるが、先ず、培養条件を固定したモデルケースを構築し、精製、分離、測定技術を確立した。具体的には、液体クロマトグラフィーによる高性能タンパク質分離システムの構築と解析法の開発を行った。分離媒体として、既存の粒子充填カラムに代わり、独自に開発したモノリスカラムを使用し、既存法と比較して高速なタンパク質分離を達成した。この特徴を利用したオンライン二次元液体クロマトグラフィーシステムを構築した結果、ハイスループットな系を完成した。また、実バイオマスを含む多種類の基質条件での培養を行い、上述で確立した技術によりフォーカスドプロテオーム解析を実行し、得られた測定データ解析から、各酵素を分類し、基質との相関から分解機構を考察する。これらの実験データを応用し、例えば、システム生物学など他分野との融合により、更に効率的な新規バイオマス利用システム構築にも期待できる。分離測定技術に関しては、液体クロマトグラフィーによる高性能タンパク質分離システムの構築と解析法の開発を行った。分離媒体として、独自に開発したモノリスカラムを使用し、様々なタンパク質を分離した結果、既存法と比較して、モノリスカラムの特徴である高い空隙率を利用した高速分離を達成した。さらに、オンライン二次元液体クロマトグラフィーシステムへと展開し、ハイスループットな系を完成した。また、培養法に関しては、基質の種類と濃度の膨大な数の組合せが考えられるが、第一に、基質濃度を固定したモデルケース構築を目指す。基質を稲藁、古紙等の実バイオマスとセルロース、キシラン等の結晶性基質とグルコース、セロビオース等の可溶性基質の3つに分類した。実バイオマスの成分は多成分の混合物であり、またバラツキも大きいので複雑であるので、分解機構を考察するためにシンプルな培養法を検討した。

具体的には、単一成分の可溶性基質を用いたモデルケースを確立し、開発したシステムによるプロテオーム解析を行なった結果、セルロソーム関連タンパク質の検出に成功した。現在までに、基礎的なセルロソーム関連タンパク質の測定技術を確立できたので、次に、実バイオマスを含む多種類の基質条件での培養を行い、確立した技術によりフォーカスドプロテオーム解析を実行し、得られた測定データ解析から、各酵素を分類し、基質との相関から分解機構を考察する。本研究では基質を実バイオマス、結晶性基質、可溶性基質の3つに分類する。分解機構を考察するうえで、シンプルな条件から段階的に複雑系に移行した方が効率的であるという観点から、単一成分の可溶性基質を用いたモデルケースを構築する。さらに最終的には、多変量解析により様々な因子を数値化する予定なので、培養液中の糖濃度等の測定法も確立し、モデルケースを構築する。モデルケースの構築により得られた情報を参考に実バイオマス条件でのセルロソーム構成酵素の測定を行い、タンパク質の総量、量比等の情報を蓄積する。また、分解産物である単糖等、育成状態を示す情報も合わせて蓄積する。更に、経時的な変化情報も蓄積するために、育成状態情報を参考に、サンプル採取時間を複数点(基質分解初期、中期、後期等)に増やす。得られた測定データは、主成分分析により各酵素の時間依存因子を抽出し、セルロソームの多糖類分解機構を検討する。以上の解析から、基質特異性、経時変化等、各因子を数値化し、複雑な実バイオマスの分解をシンプルなモデルケース混合系から再現、確認する。さらに、可溶性基質、結晶性基質の混合比を調整することにより、各因子の数値を調整し、目的の実バイオマスを効率的に分解できる培養条件が予想できるようになる。また、これらの実験データを応用し、例えば、システム生物学など他分野との融合により、更に効率的な新規バイオマス利用システム構築を目指すことも可能となる。本研究では、検出器として質量分析計を用いるが、これの運用には専用の試薬が必要であり、液体クロマトグラフィーでの測定と併せて、条件検討を含め非常に使用頻度が高くランニングコストがかかる。本研究では、微生物を培養する必要があるので、培養関連試薬が必要となり、さらに、これを評価するために質量分析計の使用頻度が多くなることが予想される。タンパク質定量試薬に関しては、通常のランニングコストに加え、別途、単価の高い質量分析用の安定同位体ラベル化試薬が必要となる、本研究で十分に分離されたタンパク質の定量性を示す際には必須な手法となる。また、本研究の研究成果を社会・国民に発信するために、国内外の学会で、専門的な研究成果を発表し、積極的な情報交換を行う予定である。
Prunus属植物からのトランスポーサブルエレメントの単離と果樹育種への利用

果樹育種においては古くから枝変わり突然変異が実用的に利用されているが、そのメカニズムについては明らかになっていない。ところで花モモやウメの源平咲き系統は1個体中にピンク花をつける枝と白花をつける枝を持つが、これはトランスポゾンによって誘起される枝変わり突然変異と考えられる。本研究では源平咲き系統の花モモからトランスポーザブルエレメントの単離を試みるとともに、花色発現が変異する機構の解明を試みた。花色は野生型がピンクを示し、アントシアニン合成系の構造遺伝子あるいは制御遺伝子ヘトランスポーザブルエレメントが挿入されると白くなると考えられたので、非放射性サザンブロット法により花色の異なる枝間でDNAレベルの多型の検出を試みた。本研究においてはじめて花モモのCHS、CHI、F3H、DFR、ASの各遺伝子クローンを得、プローブとして用いた。PAL,UFGT,MybならびにMyc様転写因子の各遺伝子はマーチン博士より分譲されたキンギョソウ由来のクローンを用いた。その結果CHSとDFRをプローブとした時に枝間で多型が認められた。またCHS、CHI、F3H、ASの各遺伝子はゲノム中に1ないし数コピー、PALならびにDFR遺伝子はこれらよりもややコピー数が多いと推定された。サザンブロット法で得られた多型を詳細に解析するために花モモのピンク花の花弁由来のゲノミックライブラリーを作成し遺伝子のスクリーニングを行った。DFR遺伝子については3次スクリーニングまで行い6クローンについて構造解析中である。Prunusu属植物では分子マッピングの他には分子生物学的解析の報告が多くないが、本研究によりPrunusu属植物でも分子生物学的手法が十分適用できることが明らかになった。今後の解析により異なる枝間でのCHSとDFR遺伝子の違いが解明され、ひいてはトランスポーザブルエレメントの単離と果樹育種への応用につながるものと考える。本研究はウメと花モモの源平咲き系統から花色発現の変異に関与しているトランスポ-ザブルエレメントを単離し、その構造と転移機構、宿主側遺伝子の発現に対する制御機構を明らかにすることを目的とする。【今年度の成果】源平咲き系統の花色発現の異なる枝(1.ピンク花のみをつける、2.白地にピンクの斑点の入った白花が中心で一部にピンク花やピンクのセクター花をつける)とウメの白色花系統、ピンク花系統、赤色花系統の葉からの全DNA抽出方法を検討した。Reiter R.S.(1992)のCTAB法(Murray & Thompson 1980の変法)に改変を加え、タンパク質や多糖類の混入の少ないDNAを得た。これらに対しアントシアニン合成系酵素のCHS、DFR、UFGTの遺伝子をプローブとしてFGI法(非RI標識)ならびにRI標識したプローブを用いてサザンハイブリダイゼイションを行った。しかしこれまで良好なシグナルは検出されていない。現在(1)DNAの制限酵素処理の方法の改良と(2)ウメとモモのDNAを鋳型としてPCR法によりアントシアニン合成系遺伝子を増幅してプローブとして利用することを検討中である。DFRとANSについてはPCR産物が得られたが、花色の異なる系統間でサイズの違いは検出されていない。【今後の計画】1、PCR法で増幅したフラグメントのシークエンスを行い、アントシアニン合成系遺伝子であることを確認した後、プローブとして利用する。この方法で構造遺伝子とその近傍に挿入されているトランスポゾンの検出を試みる。2、トランスポゾンが構造遺伝子のプロモーター領域あるいは制御遺伝子中に挿入されている場合を想定し、花色発現の異なる枝や系統ごとにつぼみの各発育段階におけるアントシアニン合成系遺伝子の発現をmRNAレベルで調査する。

また既知の制御遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼイションを行う。【本研究の目的】ウメや花モモの源平咲き系統は1個体中にピンク花をつける枝と白花をつける枝を持つ。本研究ではこれらの花色変異に関与していると考えられるトランスポゾンを単離し、その構造と転移機構、植物の花色遺伝子の発現に対する制御機構を明らかにすることを目的としている。【成果と今後の計画】花モモの花色の異なるそれぞれの枝(ピンク花、白花)とウメの白花系統「甲州小梅」から抽出した全DNAを鋳型としてPCR法によりアントシアニン合成系遺伝子群を増幅した.DFR遺伝子のプライマーを用いて得られた増幅産物をクローニングし塩基配列を調べたところ、鋳型として用いたDNAがピンク花由来か白花由来かに関係なく、どのクローンもバラのDFR遺伝子と82%以上のホモロジーを示した。またANS遺伝子のプライマーを用いて得られた増幅産物もクラブアップル(リンゴの台木系統)のANS遺伝子と88%以上の高いホモロジーを示した。このようにして得られた花モモのDFR遺伝子とANS遺伝子のクローンをプローブとして用い、非RI標識によるサザンハイブリダイゼイションを行ったところ、両方のプローブでそれぞれ花モモの花色の異なる枝間で多型と見られるシグナルが検出された。このことはDFR遺伝子とANS遺伝子の中か近傍にトランスポゾンの挿入や切り出しによる多型が生じている可能性を強く示唆している。現在花モモの花色の異なる各枝についてジェノミックライブラリーを作成し、DFR遺伝子とANS遺伝子の単離を試みている。今後は全塩基配列を決定し花色変異に対するトランスポゾンの関与を明らかにするとともにトランスポゾンの単離と構造解析を試みる。さらにDFRとANS遺伝子以外のアントシアニン合成系遺伝子群を単離しこれらをプローブとしてサザンハイブリダイゼイションを行い花色変異に対応する多型の有無を確認する。またRtPCR法を用いて蕾の発育に伴うアントシアニン合成系遺伝子群の発現の変化を調べる。ウメや花モモの源平咲き系統は1個体中にピンク花をつける枝と白花をつける枝を持つ。これらの花色変異に関与していると考えられるトランスポゾンの単離を目的として研究を行ってきた。花色の異なる枝間のDNAレベルでの変異を検出するために、各々の枝から抽出した全DNAを用いてサザンハイブリダイゼイションを行った。プローブにはアントシアニン合成系の構造遺伝子と調節遺伝子を用いた。CHS,CHI,F3H,DFR,ASの各遺伝子はウメと花モモから単離、クローニングしてプローブとした。またPAL,UFGT,MybならびにMyc様転写因子の各遺伝子はキンギョソウ由来のクローンを用いた。その結果、CHSをプローブとした時に枝間でハイブリダイゼイションパターンに差異が認められたが、その他のプローブでは顕著な差異は認められなかった。現在差異の認められた枝の間でトランスポゾン様の断片の挿入、切り出しの可能性を調べるためにCHS遺伝子の構造解析を行っている。
産業・技術融合化に関する産業組織論的研究

産業・技術融合化といっても、3つの段階がある。第1は、異業種交流といった単純なものである。第2段階としては、技術開発で、これは現状ではかなり進展している。そして、第3の異業種連携事業という段階は、もっとも高度なものであるが、今のところ余り進んでいない。全体的にみると、融合化の成果は必ずしも高くないようにも思われる。しかし、それは「共同事業によって得られた成果」に限定してのことである。とくに商品開発、連携事業が簡単に成果が上るようなものではないことは、むしろ当然といえよう。しかし、融合化には別にもう1つの効果がある。それは、異業種交流によって得られた情報資源を利用して、参加企業がそれぞれの経営活動の中で付加することのできた成果である。この効果は決して少ないものではない。むしろ、ここに現在の時点における融合化事業の現実的成果があるとの見方も可能である。この調査研究の中でも次のような成果が確認された。(1)生産性の向上、品質の改善等により、企業経営の安定化に寄与した。(2)融合化組織への参加によって、情報収集の範囲が拡大・強化された。(3)参加企業の本来的な取扱い製品の販売増加に寄与した。(4)個別企業レベルのみならず、企業集団全体としての活性化への動機づけがなされ、これを契機に地場産業に連帯意識が育った。以上の指摘に明らかなように、融合化の進展は、産業組織の活性化と新しい産業システム形成の原動力となっている。更に中小企業政策の今日的、究極的狙いともいうべき「中小企業者の意識改革」の水準にも新分的に到達し始めている」と結論することができる。本年度は、異業種間協同組合を対象に融合化事業における先進的事例の実態調査ならびに分析をおこなった。調査対象は西日本地域を中心に10組合を抽出し、それぞれ核となった融合化事業の実態把握につとめた。これによって異業種連携事業の今日の段階における生産力的意義をかなり解明することができたと思う。ただ、融合化の展開の歴史がまだ浅いこと、そういう状況の中で、融合化の効果が上がっているものを調査対象にせざるをえないこともあって、調査対象組合には技術開発型、商品開発型の融合化事例が殆どであった。反面、産業組織論的により重要な意味をもつと思われる経営管理機能融合型、あるいは生産システム融合型といったより高次な段階のものの事例検出は不充分にとどまった。これらの融合化事例の実態掌握は、次年度における重点課題とたいと考えている。他方、以上のような実態調査と平行して、本年度の研究は融合化政策の政策論的検討をも課題としており、中小企業庁、中小企業団体中央会、商工中金、商工会議所などにおいて融合化策に対する取組み、位置づけ等、広汎な分野の資料収集を実施した。この点に関しては、更に産業構造の転換ないしは、そこにおける企業行動の日本的特質との関係で、政策論的検討を深める必要がある。次年度においては、以上のことを念頭において、外部資源の活用、あるいは地域ネットワーク型の組織化の展開と企業展開の新しい事例の検討を進めたいと考えている。このような理論的アプローチを加えることによって、当初の課題を達成することができると思う。融合化組織事例について、前年度に引き続き調査、分析をおこなった。ただし、今年度は、より高次元の融合化事例に重点をおいた。そして融合化の発展段階別の問題点、効用等の究明につとめた。ここでは、交流段階と事業化段階について得られた知見を要約的に述べておく。(1)開発段階は、技術融合化の成否がまさに問われる。しかし、実際には、交流段階から開発段階への上昇は、容易でないようである。開発行孝そのものの難しさにとどまらず、資金上の調達方法、商品販路の確保により多くの困難がある。

この解決のためには、開発経費ならびにリスクの負担の方法を内部的に工夫、整備していくことが先決となるが、それだけではない。融合組織化の制度的整備と並んで、投資、金融面を含んだ支援体制の確立が望まれるようである。(2)次に、事業化段階の問題点としては、次のようなものがある。そこにおける中心的問題は、事業化を「共同事業」(組合事業)としておこなうのが、適切かどうかという点である。開発までは、なるほど組合形態によって進めるのに比較的障害は少ない。しかし、事業化となるとそうはいかない面が多々、存在するように思われる。たとえば、調査事例についてみても、生産・事業化については「専門社会」を設立する方向で、組織形態の見直しを試みているケ-スが少なくない。また、組合と法人会社の二重組織を試みているところもあった。このように、事業化段階までを組合組織で一律的に考えるのが妥当かどうか、今後検討を要するところであろうと思われる。
分子系及び半導体系光触媒の動的機能に関する実験・理論解析

可視光照射下で高活性水素発生を示す不均一系光触媒について時間分解XAFSを実施した。当該サンプルはTiO6八面体で構成された面間にCuが配置された結晶構造を持つ。パルスレーザーを用いてバンドギャップを励起したところ、Cu K端の高エネルギー側への化学シフトがナノ秒スケールで観測されたことから、バンドギャップ励起によってCuサイトからTiO6面内への電荷移動が起こったと考えられる。吸収端の化学シフトと同時にEXAFS構造も大きく変調することから、基底状態のO-Cu-O構造も電荷移動によって、大きく歪むこと示唆される。現在、理論計算と連携して、この構造変化の可視化を試みている。金属タンパク質の化学反応をより詳細に理解するため、X線回折で結晶全体の構造を捉えると同時に、X線発光分光によって活性中心金属の電子状態を観測する装置の開発をXFEL施設にて進めている。構造解析に加え、X線分光測定により複数の金属サイトにおける経時的な酸化還元反応を同時に観測することで、光化学反応を構造化学的に理解し、PSIIの時分割構造解析との連携を目指している。水素生成用と酸素生成用の二種類の光触媒を用いるZスキーム型光触媒について、第一原理計算を用いてCu3VS4のバンド端の位置を評価する手法を開発し、Cu3VS4は水素生成能を持つという実験結果を支持する結果を得た。trans(Cl)-Ru(bpy)(CO)2Cl2、[Ru(bpy)2(CO)2]2+とそれらの誘導体は、高い活性とプロトンからの水素生成よりもCO2還元に対する高い選択性のために広く使用されており、現在までに多数の反応機構が提案されているが、コンセンサスは得られていない。そこで密度汎関数理論B3LYP法を用いて、CO2還元生成物の選択性を合理的に説明できる妥当な反応メカニズムを提案した。本研究では、放射光とXFEL施設において回折・散乱・吸収・発光といった時間分解X線測定を応用して、領域内において活発に共同研究を実施していくことで、高度な知識ネットワークを有機的に融合させ、天然-人工光合成研究の架け橋となるような共同研究を領域内で展開することを目標としている。現在まで、薄膜,溶液,粒子懸濁液、単結晶と行った領域内で取り扱われている多様な形状のサンプルにX線測定システムを対応させることで、計画班間共同研究を5件、公募班との共同研究を6件実施してきており、当初の計画は概ね順調に進展している。人工の光合成系材料を取り扱うC班とは、新規に合成された金属錯体光触媒や半導体光触媒について、活発な共同研究を展開しており、固有のサンプル条件に特化した計測システムを構築することができている。領域内において計測を担うB班の中での共同研究も、公募班が合流してから一段と進んできており、領域内研究の有機的な融合に貢献している。領域内で研究されている天然光合成システムや、新規に開発された人工光合成系の光触媒サンプルに対して、異なる波長領域における先端的な動的プローブを相補的に利用し、それらの光化学反応を多角的に理解する試みが実施されている。加えて、天然の光合成系を取り扱うA班との共同研究も平成30年度から新たに開始された。光合成蛋白質の機能を理解するために領域内で展開されているXFELを用いたシリアルフェムト秒時間分解構造解析に、X線分光学的手法を加え、活性中心金属周りの電子状態変化の情報も同時計測する試みであり、複雑な蛋白質の反応をより正確に深く理解することが可能となると考えられる。時間分解X線測定装置において、更に多くの領域内共同研究を遂行するために、嫌気環境下での測定等について、今後早急に対応していく予定である。半導体光触媒系については、時間分解XAFSによるキャリアトラップサイトの動的構造解析を実施し、欠陥構造の電子状態及び光吸収過程の高精度第一原理解析と連携して、欠損と光触媒活性との関連を明らかにしていく。またキャリアダイナミクス等、フェムト秒の時間分解能が必要な場合はXFELを利用して研究を進め、密度汎関数法に基づいた多体摂動論的手法を用いる欠陥構造における無輻射遷移過程の数理解析と連携し、欠陥にトラップされた正孔キャリアの無輻射遷移過程と光触媒活性との関連を明らかにする。金属錯体光触媒系については、領域内の異なるプローブを相補的に利用し、領域内で合成された材料の光励起構造を包括的に可視化して、その活性特性を構造的視点から議論する。天然光合成との共同研究に関しては、XFELにおいてフェムト秒構造解析とフェムト秒X発光分光測定の同時計測の準備を進め、構造変化と酸化還元反応との相関について議論していく。平成29年度は天然光合成系における光励起状態の構造変化を分子動画によって可視化するために、まず、KEKのパルス放射光施設PF-ARにおける時間分解X線実験専用ビームラインNW14Aを利用してサンプル条件、プローブX線の実験条件、ポンプレーザー光の励起条件等、詳細な実験条件を求めると同時にピコ秒スケールの局所構造解析を行なった。一般的に生物系溶液サンプルの濃度は低いため、これまで限られた系でしか時間分解X線測定は行われてこなかったが、本研究ではこの困難を克服するために、検出器を多素子化して高効率測定システムの構築を行なった。この検出器系の高度化によって、天然光合成系に関連したモデルサンプルにおいて過渡的なX線シグナルを検出することに成功し、局所的な構造・電子状態変化をピコ秒の時間スケールで追跡することに成功した。

次に、PF-ARで得られた実験条件を使い、ドイツ、韓国からXFELにおける時間分解X線測定の専門家を招聘することで、播磨のXFEL施設において天然光合成系のモデルサンプルにおいて、局所的な電子状態変化をフェムト秒の時間スケールで可視化することに成功した。さらには、C02班と連携し、放射光を用いたXAFS測定を実施することで、新規光触媒材料の局所構造解析、化学状態分析を行なった。ここでは、光触媒反応中の局所構造や化学状態の遍歴を調査するためにXAFSビームラインの実験ハッチの中に光反応環境を作り、実際の光触媒反応下においてXAFS測定を行うin-situ XAFSを行い、その反応ダイアグラムについて構造的な視点から知見を得ることに成功した。X線シグナルが弱い、天然光合成系や低濃度人工光合成系サンプルを対象にした時間分解測定システムがつくばの放射光ビームラインにおいて完成し、本領域における多様なサンプルに適応した測定環境が順調に整ってきているため。加えて、播磨のXFEL施設において、韓国とドイツとの国際共同研究によって、フェムト秒の時間スケールで局所的な電子状態変化を観測するシステムが構築され、天然光合成系や領域内で開発された新規光機能サンプルにおいて、光触媒反応の初期過程における原子内電子遷移、電荷移動、項間交差、等の電子状態変化を可視化することが可能となったため。さらには放射光XAFSビームラインにおける光反応下のin situ XAFSにおいても活発に共同研究を実施できているため。可視光照射下で高活性水素発生を示す不均一系光触媒について時間分解XAFSを実施した。当該サンプルはTiO6八面体で構成された面間にCuが配置された結晶構造を持つ。パルスレーザーを用いてバンドギャップを励起したところ、Cu K端の高エネルギー側への化学シフトがナノ秒スケールで観測されたことから、バンドギャップ励起によってCuサイトからTiO6面内への電荷移動が起こったと考えられる。吸収端の化学シフトと同時にEXAFS構造も大きく変調することから、基底状態のO-Cu-O構造も電荷移動によって、大きく歪むこと示唆される。現在、理論計算と連携して、この構造変化の可視化を試みている。金属タンパク質の化学反応をより詳細に理解するため、X線回折で結晶全体の構造を捉えると同時に、X線発光分光によって活性中心金属の電子状態を観測する装置の開発をXFEL施設にて進めている。構造解析に加え、X線分光測定により複数の金属サイトにおける経時的な酸化還元反応を同時に観測することで、光化学反応を構造化学的に理解し、PSIIの時分割構造解析との連携を目指している。水素生成用と酸素生成用の二種類の光触媒を用いるZスキーム型光触媒について、第一原理計算を用いてCu3VS4のバンド端の位置を評価する手法を開発し、Cu3VS4は水素生成能を持つという実験結果を支持する結果を得た。trans(Cl)-Ru(bpy)(CO)2Cl2、[Ru(bpy)2(CO)2]2+とそれらの誘導体は、高い活性とプロトンからの水素生成よりもCO2還元に対する高い選択性のために広く使用されており、現在までに多数の反応機構が提案されているが、コンセンサスは得られていない。そこで密度汎関数理論B3LYP法を用いて、CO2還元生成物の選択性を合理的に説明できる妥当な反応メカニズムを提案した。