hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
土壌環境下における放線菌有用機能の発現制御ネットワークの解明

また興味深いことに、放線菌ゲノム上に存在する複数の抗生物質生産遺伝子群の発現がキチン存在下で誘導されるという新知見を得ることができた。一方、寒天培地に供試菌S.coelicolorと共にインディケータ細菌として枯草菌を共に添加し、枯草菌の生育阻止円を指標としたS.coelicolorの抗生物質生産検出のための実験系を確立した。このアッセイ系を用いて、土壌と海砂を添加した場合の、枯草菌の生育阻止能と青色抗生物質アクチノロージンの生産を比較したところ、生育阻止円の大きさはさほど変わらないものの、土壌を添加した場合にアクチノロージンの生産性が大幅に増大することが明らかとなった。昨年度、放線菌ゲノム・マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析で、土壌中で生育している放線菌において、キチンによる転写の誘導が認められた8つの抗生物質生産関連遺伝子群について、それぞれ複数の遺伝子の発現を検出するための特異プライマーを設計・合成し、土壌で生育している放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)株からRNAを抽出、得られたmRNA中のこれら遺伝子の転写量を定量RT-PCRを用いて測定した結果、土壌中で生育しているA3(2)株でこれら遺伝子は例外なくキチンの添加によって発現が誘導されることが確認された。特にCryptic polyketide合成関連遺伝子群のポリケタイド合成遺伝子ckpIは、キチンにより百数十倍もその発現量が増大することが明らかとなった。さらに、放線菌抗生物質のキチンによる生産量増大は、土壌抽出液を添加した寒天培地上でも確認され、キチンを含む寒天培地に土壌抽出液を入れた場合に、青色抗生物質であるアクチノロージンンの生産の増加が認められ、土壌の可溶性画分に放線菌の抗生物資生産を誘発する物質が存在することが明らかとなった。また、抗生物質生産を制御することが知られている転写因子DasRの遺伝子破壊株と野生株をキチン存在下土壌中で生育させ、それぞれのゲノムにコードされている遺伝子の発現をマイクロアレイを用いて網羅的に比較解析した結果、dasR遺伝子の破壊によって総計690個の遺伝子の発現が影響を受けることが明らかとなった。中でも土壌で生育中にキチンによって転写誘導がかかる抗生物質生産関連遺伝子群の発現がdasR遺伝子破壊株で高まることから、dasRがこれら遺伝子群の発現を負に制御していることが明らかとなった。滅菌土ばかりでなく非滅菌土(生土壌)でも複数のキチナーゼ遺伝子及びトランスポーター遺伝子などの発現がキチンによって誘導されることが確認され、論文としてFEMS Microbiology Ecologyに発表した。また、土壌中で生育している放線菌から抽出したRNAを放線菌ゲノム・マイクロアレイで発現解析を行い、世界に先駆け土壌環境下で生育している微生物における網羅的な遺伝子発現解析に成功した。また、土壌における放線菌抗生物質生産を検出するバイオアッセイ系が確立され、今年度当初の計画を達成し、世界でも例を見ない土壌環境下で生育する放線菌の抗生物質生産誘導メカニズム解析のための基盤が確立された。さらにその過程で、複数の抗生物質生産遺伝子群の発現がキチン存在下で誘導されるという新知見を得ることができた。また、これまでの土壌からの核酸抽出技術や土壌における微生物キチナーゼ遺伝子の発現に関する複数の研究成果を公表することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。
EHECのSubABの標的臓器の解明とその迅速検出法

蛍光色素で標識した精製SubABを作製した.この毒素の標的臓器は上部消化管であると推察された.臨床分離株大腸菌におけるSubAB産生株の出現頻度について解析した.使用したEHEC29株中、全株がStxを産生しており、2株だけがsubAB遺伝子を保有し、かつSubAB毒素を産生してた.SubAB産生株を効率良く迅速に検出するためのキット作製には、SubAB毒素の特異的酵素活性による検出法が有効と結論された.蛍光色素で標識した精製SubABを作製した.この毒素の標的臓器は上部消化管であると推察された.臨床分離株大腸菌におけるSubAB産生株の出現頻度について解析した.使用したEHEC29株中、全株がStxを産生しており、2株だけがsubAB遺伝子を保有し、かつSubAB毒素を産生してた.SubAB産生株を効率良く迅速に検出するためのキット作製には、SubAB毒素の特異的酵素活性による検出法が有効と結論された.SubABの精製は,SubAB発現用プラスミドを導入した大腸菌BL21(DE3)を培養後,得られた菌体破砕上清からNi-NTAアガロースカラムを用いて精製した。精製したSubABは,SDS-PAGEにより純度を確認した。毒素活性は,Vero細胞に対する細胞障害活性を指標にして確認した。0.01ng/ml-10μg/mlのSubABを作用させた結果,24時間で0.1μg/ml以上を加えたVero細胞において空胞化が観察され,0.1ng/ml以上48時間で細胞死が観察された。次に致死毒性を確認するために,マウス(ddY♂5w齢)に腹腔内投与したところ,5μg/body以上で致死的であった。死亡したマウスの剖検から,腹水の貯留、上部消化管に出血や拡張所見が確認された。蛍光標識SubABの作製は,750nmの蛍光強度を有する蛍光色素(Alexa Fluor750)を用いて行った。蛍光標識SubABの毒素活性は,Vero細胞に対する細胞障害活性及びマウス(ddY♂5w齢)に対する致死活性を測定して行った。蛍光標識SubABの細胞障害活性は,未標識SubABの毒性とほぼ同程度であり,24時間時点で0.1μg/ml以上の濃度でVero細胞に対する空胞化がみられた。又0.1ng/ml以上48時間で細胞死が観察された。マウスにおける致死活性でも,蛍光標識SubAB10μg/body腹腔内投与で致死的であった。蛍光標識SubABのマウス生体内動向は,BERTHOLD社製NightOWL LB981を用いて行った。マウスの自家蛍光を極力除去するための条件作りを進めた結果,Research Diets社製D10001AIN-76A Rodent dietの餌を使用すると自家蛍光を減少させることができた。この餌を用いて飼育したマウス(ddY♂5w齢)に蛍光標識したSubABを投与する計画である。(1)蛍光色素で標識した精製SubABを作成した。この蛍光標識毒素はちゃんと毒性を保持していた。この毒素の標的臓器を特定する為,これをマウスの腹腔に投与したところ、全例で上部消化管に出血が観察された。この毒素の標的臓器は上部消化管であると推察された。(2)臨床分離株大腸菌におけるsybAB遺伝子の保有率およびSubAB産生株の出現頻度について解析した。実験方法は、次の3つの手法を用いた。(1)SubAB遺伝子のPCRによる検出法。(2)SubAB毒素の抗体による検出法。(3)SubAB毒素の酵素活性による検出法。使用した臨床分離株のEHEC29株中、全株がStxを産生していた。この中で、2株だけがSubAB毒素を産生しており、検出頻度はStxを産生しているEHECの約7%であった。ETEC、CTEC、EAEC、EPECではStx及びSubAB毒素産生は観察されなかった。(3)SubAB産生性EHECを効率良く迅速に検出するためのキット作成には、SubAB毒素の酵素活性による検出法が有効であると結論された。(4)SubABの毒性を阻害する物質のスクリーニングをVero細胞を用いて行った。SubAB毒素と同じAB5型のStxやコレラ毒素に対して強い阻害活性を有するポリフェノール系のHPやAPは、SubABには全く阻害効果を示さなかった。この結果は極めて興味深く、SubABの特異的な性状を示す一因かも知れない。現在、阻害物質のスクリーニングを継続中である。
試作ピエゾセンサーによる機器安全保持のためのひずみモニタリング方法

1.ピエゾケーブルを使用したひずみモニタリング方法の研究ピエゾケーブルを利用したひずみ測定方法を開発した。従来の「ひずみゲージ」が抵抗線を利用したのに対して、本研究で開発した方法は、ピエゾケーブルをゲージ素線として利用した。実験結果から、ピエゾケーブルをひずみゲージと同じようにしてひずみ測定ができることが判明した。(機械学会、非破壊検査協会発表)2.ピエゾケーブルを用いた自動車用ハブボルトの軸力検出モニタリング本研究は、自動車のハブボルトの軸力検出にピエゾケーブルを利用した研究である。すなわちハブボルトにピエゾケーブルを挿入し、ハブボルトの軸力を検出する事ができることを実験的に明らかにした。(機械学会、非破壊検査協会発表)3.プラント用フランジ継ぎ手へのピエゾフィルムを利用したひずみモニタリング法の研究化学プラントに多数使われているフランジ継手への応用研究である。継手部の締結強度の信頼性を、ピエゾフィルムを用いてモニタリングする。フランジの締結部へ、ピエゾフィルムをはさみ締結強度をピエゾフィルムの圧電性から検出する。実験結果からフランジの締結強度をピエゾフィルムを利用することにより可能であることがわかった。4.ピエゾケーブルを利用したボルト継手の締結健全性モニタリング方法ボルト継手の締結強度のモニタリングにピエゾケーブルを用いた研究である。せん断継手、引張継手の2種類のボルト継手に応用し、締結強度を部分的に検出する事がわかった。1.ピエゾケーブルを使用したひずみ測定によるひずみモニタリング方法の開発(1)ピエゾケーブルを使用したボルトの軸力検出モニタリングボルト頭部にケーブル挿入穴をあけ、その中ヘピエゾケーブルを挿入する。ボルトに作用する軸力を、ピエゾケーブルが検出できることを立証実験を行った。ボルトに作用する負荷は、(1)ボルト軸力、(2)せん断力が作用する場合を調べた。その結果(1)ボルト軸力は、負荷振幅の大きさに比例して大きくなる。(2)せん断負荷は、一定以上の大きさの負荷振幅になれば急激に出力電圧が大きくなる。(非破壊検査Vo1.56.No.3掲載)(2)ピエゾケーブル単体でのひずみ検出モニタリングピエゾケーブル単体を、ひずみ検出センサーとして試作した。実験的にひずみ測定が可能か調べた。実験は、試験片に市販の抵抗線箔ひずみゲージと試作ケーブルを併用して取り付け比較した。その結果、ケーブル長と負荷周波数が、出力電圧に影響を及ぼすことがわかった。(機械学会、非破壊検査協会、研究発表講演会発表)2.ピエゾフィルムを利用したひずみ測定によるひずみモニタリング方法の開発圧電フィルムを利用して圧電フィルムひずみゲージを試作し、ひずみ測定が可能なことを実験で検証した。実験は、帯板中央円孔試験片を用い引張試験を行った。その際の応力集中部のひずみ分布を測定した。試作圧電フィルムひずみゲージと従来の抵抗線箔ひずみゲージとは、近い値が得られ試作圧電ひずみゲージの有効性が示された。(機械学会講演発表)1.ピエゾケーブルを使用したひずみモニタリング方法の研究ピエゾケーブルを利用したひずみ測定法を開発した。実験結果からピエゾケーブルをひずみゲージと同じようにしてひずみ測定ができることが判明した。

フランジの締結部へ、ピエゾフィルムをはさみ締結強度をピエゾフィルムの圧電性から検出する。実験結果からフランジの締結強度をピエゾフィルムを利用することにより可能であることがわかった。(非破壊検査協会発表)4.ピエゾケーブルを利用したボルト継手の締結健全性モニタリング方法ボルト継ぎ手の締結強度のモニタリングにピエゾケーブルを用いた研究である。せん断継手、引張継手の2種類のボルト継手に応用し、締結強度を部分的に検出する事がわかった。
クリプトスポリジウム症の効果的な治療に関する研究

免疫不全患者における下痢症の原因原虫として深刻な病害をもたらすクリプトスポリジウム症を効果的に治療可能な薬剤シーズを見いだすことを目的に、候補化合物による抗クリプトスポリジウム効果スクリーニング方法を培養細胞感染モデルの利用により確立した。これにより、アデノシンアナログの一部に明らかなクリプトスポリジウムの増殖抑制効果を見いだし、また、類似化合物である既存抗がん剤の一部に同様の効果を確認した。日和見感染症として時に死をもたらしうるクリプトスポリジウム症には、効果的な治療法が存在しない。そこで、既に特許取得済みのアデノシンアナログによる抗クリプトスポリジウム作用をベースに新規薬剤開発のシーズ探索を実施する。本年度は、クリプトスポリジウムの培養系における増殖率評価を定量リアルタイムPCR法により評価可能とし、複数のアデノシンアナログによる抗クリプトスポリジウム効果スクリーニングを実施した。また、効果のあったアデノシンアナログについては、アデノシルホモシステイン加水分解酵素S-adenosyl-1-homocysteine hydrolase(SAHH)に関する酵素学的阻害反応解析を実施した。本研究で開発した定量リアルタイムPCR法は、SYBRGreenを用いたインターカレーター法による簡便法のため、費用対効果に優れる。また、以上の評価によってその効果が期待される化合物としてnepianocin A (NPA)および2-fluoroadenosine(2FA)の各アデノシンアナログを評価したが、NPAは濃度依存的に培養クリプトスポリジウム増殖を抑制(50%有効濃度EC_<50>=139μM)したものの、その効果は、マラリア原虫(EC_<50>=0.20μM)やHIV(EC_<50>=0.001-0.1μM)に対する効果よりも低く、クリプトスポリジウムの薬剤抵抗性を確認することとなった。また、NPAは組換えクリプトスポリジウムSAHHの活性を競合的に阻害(K_i=0.395μM)することも明らかになった。一方、2FAは、クリプトスポリジウムの細胞培養系では効果を示したが、詳細解析により、宿主細胞への毒性がこの効果をもたらしている可能性が示唆され、また、SHAAに対する阻害効果は認められなかった。次年度以降は、本年の成果を踏まえ、アデノシンアナログの中でも、抗がん剤に着目し、その効果解析を実施予定である。腸管奇生原虫クリプトスポリジウムは、水道水を介したアウトブレイクの原因となる他、日和見感染においては時に誌の原因ともなるが、現在まで、免疫不全に合併したクリプトスポリジウム症を治癒する治療法は知られていない。そこで本研究では、ゲノムデータによって明らかになったクリプトスポリジウムの含硫アミノ酸および核酸代謝をターゲットとして、クリプトスポリジウム症の治療に利用可能な新薬の開発を目指す。これまでの研究では、アデノシンアナログの一部に抗クリプトスポリジウム作用を見いだし、その作用機序をS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素に対する効果を基準として解析してきたが、さらに今年度は、臨床に新たな治療法を提供することを念頭に、既に使用されている抗がん剤の中で、特にアデノシン類似化合物に注目し、抗クリプトスポリジウム作用のスクリーニングを実施した。抗がん剤cladribine, clofarabine, cytarabine, gemcitabineのクリプトスポリジウムの増殖に対するEC_<50>は、それぞれ5.44μM,0.585μM,3.17μM,and 1.07μMと、唯一の承認薬であるニタゾキサニドEC_<50>=50.2μMを超える効果を示した。一方、pentostatinおよびara-Gでは有意な効果を認めるなかった。以上の結果は、既存関連薬剤を用いたクリプトスポリジウム症治療のためのトライアルが効果を上げる可能性があることを示唆しており、特に、上記の薬剤と、ニタゾキサニドやパロモマイシンなどの従来使用されてきた抗クリプトスポリジウム薬によるコンビネーションには、効果をあげる可能性があると考えられた。初年度に確立したリアルタイムPCRを用いたクリプトスポリジウムの培養細胞内における増殖定量評価法を用いた感染・増殖阻害スクリーニングを、今年度も継続的に実施した。成果の概要は以下の通り。今年度は、主に卵黄抗体(鶏卵抗体)のクリプトスポリジウム感染阻止効果についてスクリーニングを実施した。クリプトスポリジウムP15組換えタンパク質により作成した抗P15IgY抗体を10mg/ml濃度で使用した場合、培養系において約38%のスポロゾイトの侵入阻止を見ることが判明。P23IgY抗体を同濃度で使用した場合には、約76%の侵入阻止効果を認めた。同濃度のP15およびP23IgY抗体をコンビネーションで使用すると約87%の侵入阻止効果を認めた。局所において卵黄抗体のこれほどの高濃度を生体内で維持することは、現実に使用する場合には問題となりうるが、スポロゾイトの侵入前に抗スポロゾイト抗体が実際に感染を阻止しうる可能性を明らかにすることができた。

本研究で確立したクリプトスポリジウムの細胞侵入効率および侵入後の増殖レベルの定量的評価法は、クリプトスポリジウム治療法の確立を目指した研究に極めて有用であり、幅広いプロトコルに応用可能である。初年度の基礎研究にもとづいて実施した今年度の抗がん剤スクリーニングで、既存の抗クリプトスポリジウム薬を超える効果をみたことから、引き続きスクリーニングを継続し、これら高効果薬剤によるコンビネーション治療を試みることで、新たな治療法を提供できる可能性があり、計画はおおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。既に使用されているパロモマイシン、ニタゾキサニドに加え、他の原虫で用いられているメトロニダゾール、クロロキン、アルベンダゾールなどの抗原虫薬と、抗がん剤を含めた多剤併用療法の可能性を評価する。当初は培養系における評価から開始し、多剤での効果について従来薬を超える高い効果(約10倍を想定)をみた場合には、SCIDマウスのクリプトスポリジウム症モデルにおける治療トライアルを実施し、in vivoでの効果を確認していく。
表面下に存在するドーパントのSTM-バリアハイトイメージングによる観察

STM(走査トンネル顕微鏡)を用いてシリコン表面近傍のドーパントを原子ナノスケールで直接観察することに成功した.STM観察を行なうためには原子オーダーで平坦な表面を得る必要があるが,本研究では弗化アンモニウム溶液を使用したウエットエッチングの方法で,観察に適した平坦な水素終端シリコン表面を作成し試料として使用した.この方法では,高い温度によるアニーリング無しで,表面清浄化を行なうことが可能であるため,表面近傍のドーパントプロファイルの変化を回避することができる.研究の結果,表面近傍のドーパントをSTMで直接観察できることが明らかになった.比較的高濃度にひ素ドープされたシリコンウエハーを用いて観察を行なった結果,シリコンの表面近傍のドナー(ひ素原子)は電流一定STM像において明るいスポットとして観察されることが明らかになった.このSTM像での明るいコントラストは帯電したドナー(ひ素原子)の形成する静電ポテンシャルによる局所的なバンドベンディングであると考えられ,その広がりは半導体中での静電遮蔽距離に依存している.STM観察による表面近傍のドーパント濃度の測定の結果,観察される濃度はウエハー自身の濃度の数分の一程度であることが明らかになった.これはウエットエッチング時に半導体内に侵入する水素原子によるドーパントの不活性化が原因であると考えられる.STM-バリアハイトイメージング法では,STMによる表面形状の観察と同時に,表面でのポテンシャル計測を行なうことができると考えられる.我々は種々の吸着系でこのようなポテンシャル計測が可能なことを明らかにし,さらに表面下に存在するドーパントにもこの方法を適用した.測定の結果,STMによって観察されるドーパント近傍でのポテンシャル低下は1.5eV程度であることが明らかになった.半導体デバイスの微細化に伴い,ナノスケールでのドーパント分布の不均一,およびドーパント分布の不均一の結果として静電ポテンシャルの不均一がデバイス特性に大きく影響を与えることが問題になっている.このような問題に対して本研究の結果はドーパント分布および局所的なポテンシャルの直接観察に簡便な方法を与えるものである.本研究ではSTM-バリアハイトイメージングでシリコン表面のsub surfaceに存在しているドーパントを検出することを目的とした。通常、シリコン清浄表面は超高真空中での加熱によって作成するが、この場合表面のドーパントが偏析、あるいは表面から脱離してしまう恐れがある。また、清浄表面では表面に存在する結合相手の無い結合(ダングリングボンド)により、フェルミレベルがピンニングされている場合が多く、この場合sub-surfaceのドーパントの影響を捉えることは困難になるものと予想される。このことから本研究では試料加熱を一切行わず、試料を平坦化できるウェットエッチングによる水素終端表面を作成し、バリアハイトイメージングにより、Sub-surfaceのドーパントの影響を検出することを目的としている。水素終端面では大きな表面状態が存在しないため、フェルミレベルのピンニングを避けて実験を行うことができる。平成13年度は、高ドープのシリコンウエハーの水素終端化を試みた。STMの走査範囲は数十nm×数十nm程度が標準であり、この範囲にドーパントを見出すためには、高ドープの試料が必要である。本年度は比抵抗が0.001ΩcmのAsドープ程度の試料を用い水素終端表面を作成した。STM観察の結果表面には特徴的な三角形のエッチピットが観測され、一部原子分解能での測定も可能であったが全般に欠陥が多く、表面下のドーパントを観測するには至っていない。現在のところ標準的なエッチングプロセスを採用しているが、一つの可能性として、エッチング過程がドーパント濃度に大きく依存している可能性もあり、現在、エッチング条件の確立を急いでいる。また、本年度はAu再構成表面でのバリアハイトイメージングも試み、表面の歪に関連した、バリアハイト変化を検出することに成功し、バリアハイトイメージングによって表面の電荷移動の様子を捉えられることを確認した。STM(走査トンネル顕微鏡)を用いてシリコン表面近傍のドーパントを原子ナノスケールで直接観察することに成功した.STM観察を行なうためには原子オーダーで平坦な表面を得る必要があるが,本研究では弗化アンモニウム溶液を使用したウエットエッチングの方法で,観察に適した平坦な水素終端シリコン表面を作成し試料として使用した.この方法では,高い温度によるアニーリング無しで,表面清浄化を行なうことが可能であるため,表面近傍のドーパントプロファイルの変化を回避することができる.研究の結果,表面近傍のドーパントをSTMで直接観察できることが明らかになった.比較的高濃度にひ素ドープされたシリコンウエハーを用いて観察を行なった結果,シリコンの表面近傍のドナー(ひ素原子)は電流一定STM像において明るいスポットとして観察されることが明らかになった.このSTM像での明るいコントラストは帯電したドナー(ひ素原子)の形成する静電ポテンシャルによる局所的なバンドベンディングであると考えられ,その広がりは半導体中での静電遮蔽距離に依存している.STM観察による表面近傍のドーパント濃度の測定の結果,観察される濃度はウエハー自身の濃度の数分の一程度であることが明らかになった.これはウエットエッチング時に半導体内に侵入する水素原子によるドーパントの不活性化が原因であると考えられる.STM-バリアハイトイメージング法では,STMによる表面形状の観察と同時に,表面でのポテンシャル計測を行なうことができると考えられる.我々は種々の吸着系でこのようなポテンシャル計測が可能なことを明らかにし,さらに表面下に存在するドーパントにもこの方法を適用した.測定の結果,STMによって観察されるドーパント近傍でのポテンシャル低下は1.5eV程度であることが明らかになった.

半導体デバイスの微細化に伴い,ナノスケールでのドーパント分布の不均一,およびドーパント分布の不均一の結果として静電ポテンシャルの不均一がデバイス特性に大きく影響を与えることが問題になっている.このような問題に対して本研究の結果はドーパント分布および局所的なポテンシャルの直接観察に簡便な方法を与えるものである.
骨髄微小環境の老化は多発性骨髄腫の治療標的になりうる：細胞老化と個体老化の接点

多発性骨髄腫の進展において,骨髄内で骨髄腫細胞が間葉系幹細胞(BMMSCs)と密接にクロストークすることが重要であることが知られていた。研究代表者(兼平)は,BMMSCsがリゾホスファチジン酸(LPA)と呼ばれる脂質メディエーターからの刺激により,その表現型を劇的に変化させること,そして,LPA受容体サブタイプ1(LPA1)と3(LPA3)のシグナルが,BMMSCsの細胞老化をそれぞれ正と負に調節することで、骨髄腫細胞増殖をそれぞれ負と正にレギュレートすることを見出した。本研究は,これまでに知られていた,多発性骨髄腫の発症率・重篤度が加齢ともに上昇するという現象に明確な根拠を与えたものである。具体的内容)本研究課題では、骨髄微小環境の老化と多発性骨髄腫進展の関係を明らかし、治療法開発への糸口を探ることを目指した。骨髄微小環境を構成する細胞として、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell; MSC)が報告されているため、ヒト初代培養MSCをin vitro、in vivo両方の実験で用いた。また骨髄腫細胞は、ヒト骨髄腫細胞株(IM-9、OPM-2、RPMI-8226)を用いた。興味深いことに、骨髄腫細胞からの刺激により、MSCはAutotaxin(ATX)と呼ばれる分子の産生が亢進した。ATXはリゾホスファチジン酸(LPA)と呼ばれる生理活性物質を産生する酵素であるため、MSCのLPAシグナルが多発性骨髄腫進展を制御すると予想した。siRNAによりMSC上のLPA受容体サブタイプ3(LPA3)をノックダウンしたところ、MSCは細胞老化に特徴的な表現型を呈した。更に、ヒト骨髄腫細胞株とsiLPA3-MSCを混合して免疫不全マウスへ皮下接種したところ、control-MSCに比べ、有意な腫瘍サイズの増大を認めた。意義ならびに重要性)これまでの実験により得られた結果は、LPAシグナルが骨髄微小環境の老化と多発性骨髄腫進展を結びつける"key"であることを示している。これまで不明であったが、多発性骨髄腫の患者の血清LPA濃度は健常人の約3倍であることが報告されている。このことから、LPAシグナルを標的とすることで、新たな多発性骨髄腫の治療が可能になるものと期待される。骨髄腫細胞からの刺激によりMSCのATX産生が亢進すること、そしてLPA3ノックダウンによりMSCが細胞老化の表現型を呈し、多発性骨髄腫の進展を促進することをin vivoで証明できたことは大きな進展であった。残念なことに、細胞老化を呈したMSCが多発性骨髄腫の進展を促進する分子メカニズムの解明には至っていない。本年度は、昨年度明らかにした、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell;MSC)におけるリゾホスファチジン酸(Lysophosphatidic acid;LPA)シグナルと多発性骨髄腫の進展の関係について、さらに詳細に解析した。昨年度は、LPA受容体サブタイプ3(LPA3)をノックダウンしたMSCが細胞老化に特徴的な表現型を呈し、マウス皮下腫瘍モデルにおいて多発性骨髄腫の進展を促進させることを明らかにした。本年度は新たに、LPA受容体サブタイプ1(LPA1)をノックダウンしたMSCが細胞老化へ抵抗性を示し、多発性骨髄腫の進展を抑制することを明らかにした。そして、同等の腫瘍抑制効果がLPA1アンタゴニストの全身投与によっても得られることを確認した。この結果は、LPA1とLPA3のシグナルのバランスが、MSCの細胞老化をそれぞれ正と負に調節していることに加え、多発性骨髄腫の進展も制御しているという新たな概念を提唱するものであり、これまで不明であった「多発性骨髄腫の発症率は加齢とともに増加する」という疑問に対し、明確な根拠を与えるものと思われた。間葉系幹細胞におけるLPA1とLPA3の発現量は圧倒的にLPA1が高いこと、そして、多発性骨髄腫の患者の血清LPA濃度は健常人の約3倍であるという事実から、LPA1のシグナルが多発性骨髄腫の進展に重要であるという可能性が示唆された。本研究により得られた知見は、これまでバラバラに認識されていた、「多発性骨髄腫の進展」、「間葉系幹細胞」、ならびに「加齢」という概念を「リゾホスファチジン酸シグナルによる細胞老化」という共通項により説明できるという点で、非常に独創的であると考えられる。そして、リゾホスファチジン酸シグナルを標的とした多発性骨髄腫の新たな創薬の可能性も示唆するものである。これまでに,多発性骨髄腫進展における骨髄間葉系幹細胞(MSCs)の役割,特に,リゾホスファチジン酸(LPA)とよばれる脂質メディエーターの受容体サブタイプ1(LPA1)とサブタイプ3(LPA3)が,MSCsにおいて相反する機能を有し,多発性骨髄腫の進展をそれぞれ正と負にレギュレートすることを明らかにしてきた。特に,MSCs上のLPA1をsiRNAによるノックダウンすることで,MSCsの細胞老化が抑制され,多発性骨髄腫の進展が抑制された。逆に,LPA3をノックダウンすることで,MSCsの細胞老化が促進され,多発性骨髄腫の進展が促進された。これらの結果は,これまで不明であった,多発性骨髄腫の発症率が加齢に伴って上昇するメカニズムの一端を分子レベルで解明したものであり,その意義は大きいと考えらえた。

平成30年度は,骨髄腫細胞が,MSCsに対しLPA合成酵素であるオートタキシン(ATX)の産生を誘導する機序の解明を試みた。骨髄腫細胞とMSCsを共培養することで,MSCsはIL-6をはじめ,骨髄腫細胞の増殖を正にレギュレートする様々なサイトカインの産生を亢進することが明らかとなった。残念なことに,骨髄腫細胞に由来するサイトカイン産生促進因子(群)を同定するには至らなかったが,骨髄腫細胞が放出するDAMP(Damage-associated Molecular Pattern)の一種と,MSCs上のToll-like receptor 4を介して行われることが推察された。以上の点から,骨髄腫細胞が自身が生育しやすい環境を整備するため,MSCsの表現型を変化させるメカニズムの一端が明らかとなった。多発性骨髄腫の進展において,骨髄内で骨髄腫細胞が間葉系幹細胞(BMMSCs)と密接にクロストークすることが重要であることが知られていた。研究代表者(兼平)は,BMMSCsがリゾホスファチジン酸(LPA)と呼ばれる脂質メディエーターからの刺激により,その表現型を劇的に変化させること,そして,LPA受容体サブタイプ1(LPA1)と3(LPA3)のシグナルが,BMMSCsの細胞老化をそれぞれ正と負に調節することで、骨髄腫細胞増殖をそれぞれ負と正にレギュレートすることを見出した。本研究は,これまでに知られていた,多発性骨髄腫の発症率・重篤度が加齢ともに上昇するという現象に明確な根拠を与えたものである。今後は、細胞老化を呈したMSCが多発性骨髄腫の進展を促進する分子メカニズムを解明する。加えて、加齢とともに起こる骨髄微小環境の変化とLPAシグナルの関係を明らかにする予定である。これまでに、リゾホスファチジン酸産生酵素であるオートタキシン(ATX)が、主に間葉系幹細胞から産生され、さらに興味深いことに、骨髄腫細胞からの刺激により産生が亢進されることを明らかにした。今後は、骨髄腫細胞に由来するATX産生促進因子の同定を試みる。この因子が同定されることで、これまで不明であった、腫瘍細胞が間葉系幹細胞を腫瘍関連間葉系幹細胞へコンバートするメカニズムの一端が明らかになると思われる。血液内科学実験用マウスを購入する予定であったが、飼育スペースの関係で購入できなかったため。研究室の移動等で、研究活動を一時中断しなければならなかったため。実験用マウスを購入する。マウスを購入する。
超音速軸流速度翼列の過渡特性及びフラッタ

超音速航空機のエンジンの一つの革新的な構想として超音速軸流速度ファンエンジンがある.このエンジンのファン翼列は超音速軸流速度であるために従来の亜音速軸流速度での翼列とは全く空気力学的特性が異なり,とくにその翼列の超音速作動状態への始動といった超音速固有の過渡特性及び高負荷条件下でのフラッタが実現の成否を決定づける問題点となることから,本研究では,数値流体力学的手法による数値計算及び二重線形理論による種々のパラメータについての非定常空力解析により,超音速軸流速度ファン翼列のフラッタ及び過渡特性を次のように解明した.・二次元非定常圧縮性気体に対するレイノズルズ平均ナヴィエ・ストークス方程式をTVDスキームを用いて差分法で解く翼列の非定常空力解析コードの開発を行い,二次元超音速軸流速度翼列の過渡特性及びフラッタ特性の数値計算解析を行った.・直線翼列モデルに対する二重線形理論によるフラッタ特性解析コードを作成して,二次元超音速軸流速度翼列のフラッタ特性の二重線形理論による解析を行った.・二重線形理論による解析計算結果をデータベース化して,超音速軸流速度翼列の過渡特性及びフラッタ特性の各種パラメータへの依存性を明らかにした.超音速航空機のエンジンの一つの革新的な構想として超音速軸流速度ファンエンジンがある.このエンジンのファン翼列は超音速軸流速度であるために従来の亜音速軸流速度での翼列とは全く空気力学的特性が異なり,とくにその翼列の超音速作動状態への始動といった超音速固有の過渡特性及び高負荷条件下でのフラッタが実現の成否を決定づける問題点となることから,本研究では,数値流体力学的手法による数値計算及び二重線形理論による種々のパラメータについての非定常空力解析により,超音速軸流速度ファン翼列のフラッタ及び過渡特性を次のように解明した.・二次元非定常圧縮性気体に対するレイノズルズ平均ナヴィエ・ストークス方程式をTVDスキームを用いて差分法で解く翼列の非定常空力解析コードの開発を行い,二次元超音速軸流速度翼列の過渡特性及びフラッタ特性の数値計算解析を行った.・直線翼列モデルに対する二重線形理論によるフラッタ特性解析コードを作成して,二次元超音速軸流速度翼列のフラッタ特性の二重線形理論による解析を行った.・二重線形理論による解析計算結果をデータベース化して,超音速軸流速度翼列の過渡特性及びフラッタ特性の各種パラメータへの依存性を明らかにした.
ギリシャ・クラシック期の身体表現の美術解剖学的考察

西洋美術の原点にある古代ギリシャの身体表現を、美術解剖学の立場から考察した。考察にあたり、ギリシャ・クラシック期のパルテノン・フリーズ彫刻の12神の立体模型を、東京芸術大学の大学院生とともに作成し、構造と形態の分析を行った。完成した立体模型を、平成24年11月から平成25年5月まで、約半年間、大英博物館の教育的展示<パルテノン・ナウ>にて展示した。また、平成25年7月に、ベルリン自由大学の学会にて、平成26年1月にシカゴの全米考古学会にて研究発表を行い、これらの研究成果の公表及び研究に対する議論によって、今後の古代ギリシャの身体表現の研究の基盤作りを行うことができた。大英博物館で、パルテノン・フリーズ彫刻の立体模型を平成24年11月25年5月まで6か月間展示し、25年6月、立体模型は同博物館の資料として正式に収蔵されることが決まった。平成25年7月、ベルリン自由大学で開催された国際学会「東アジアにおけるギリシャ・ローマ文化の受容」において、「現代日本の美術大学におけるパルテノン彫刻の受容」と題する研究発表及び、模型の展示を行った。古代ギリシャの文化の受容に関して、西洋近代の認識が明治時代の日本へ流入し、それが現代の東京芸術大学における復元研究へとつながることを論じた。平成25年7月29日8月9日まで、文星芸術大学(宇都宮)のギャラリーにて、「ギリシャ美術の教育と制作と研究展」と題し、パルテノンの神々の立体模型と、現代作家や学生の作品を並置する展示を行った。近代ヨーロッパの美術教育の指導法(とくに古代彫刻の石膏デッサンの訓練)が、日本では美術教育の基礎として脈々と受け継がれ、現代の造形活動の原動力の一つであることを検証した。平成26年1月3日、全米考古学会大会(シカゴ)にて、「パルテノン・フリーズの神々の立体復元」と題した発表を行った。古代ギリシャの空間認識と身体表現についての日本での研究成果を、欧米の学界へ発信する重要な機会となった。今後、より大型の復元模型の制作も視野に入れ、さまざまな専門知識を持つ人材と共同研究に向けて協議を進めた。今年度は全体として、研究成果の発信に努め、その結果、今後の研究の基盤を確実にすることができた。パルテノン・フリーズ彫刻の神々の立体模型(工業用粘土で作成)をシリコンで型取りし、ポリエステル樹脂製の模型を作成した。さらに細部の作り込みを行った。この神々の立体模型を、大英博物館の「パルテノン・ナウ」の一環として、同博物館にて展示した(平成24年11月)。大英博物館で展示中のパルテノン・フリーズ彫刻の神々の立体模型を、型取りし、第2バージョンとして東京芸術大学のアートプラザにて展示し、広く社会へ公開した(平成25年1月2月)。パルテノン・フリーズ彫刻の立体模型を作成するにあたり、ギリシャ・クラシック期の身体表現を美術解剖学的に分析した。その結果、これまで見過ごされてきたクラシック期の身体の構造と表現の一端を明らかにした。加えて、パルテノン・フリーズ彫刻に先立つクラシック前期の主要彫像の身体構造図を作成し、画像データを準備し、神々の立体模型と合わせて、平成25年度の7月に、ドイツ、ベルリン自由大学開催の学会にて研究発表をおこなうための基礎資料を作成した。申請書に記載した「研究の目的」の、大英博物館での立体模型の展示、および本学展示スペースでの展示を行うことができた。大英博物館の主任学芸員イアン・ジェンキンス氏の手厚い協力、および本学の助手と大学院生の高度な技を駆使した模型制作があって、これら2つの重要な展示が実現したと認識している。平成25年7月に、ベルリン自由大学にて開催の学会で、立体模型の展示及び研究発表を行うため、さらにギリシャ・クラシック期の身体表現の解剖学的分析を進める。また、学内で助手及び院生らと研究会を実施し、制作を担当者と知識を共有し、さらに議論を行う機会を増やすことを考えている。平成25年7月のベルリン自由大学にての展示、および78月に、文星芸術大学のギャラリーにて巡回展示を行う予定で、そのための立体模型の修正と、第3、第4バージョンの作成を進める(白色およびカラーバリエーション)。ギリシャ・クラシック期の身体表現に関する研究資料を収集する。
地球型惑星の大気形成:惑星形成過程における混合大気の寄与

地球型惑星は原始太陽系星雲ガス(ネビュラガス)の中で形成した可能性が高いことが惑星形成理論および観測からわかっている。微惑星の衝突合体によって惑星が現在の月サイズよりも大きくなると、周囲のネビュラガスを重力的に捕獲し始める。また、微惑星に含まれている揮発性成分が脱ガスするのも惑星が月サイズ以上になってからである。脱ガスは地表面付近で起こるため、大気の混合を考慮しなければ、脱ガス成分の大気を下層、ネビュラガス成分の大気を上層とした2層大気が惑星の初期には形成されたはずである。原始太陽系星雲ガスが散逸するときに、上層のネビュラガス成分の大気は散逸し、下層の脱ガス成分の大気が生き残ることが定性的にわかるが、2層の混合によってネビュラガス成分が生き残ってしまう可能性もある。混合を考慮し、大気の構造を数値的に解くプログラムを作成した。その結果、惑星が火星サイズ程度の場合、対流は地表面付近で起こっており、その領域は薄く、脱ガス大気とネビュラ大気の混合があまり起こらないことがわかった。一方、惑星が地球サイズ程に成長すると、対流層が厚くなり、必然的に2層の混合が大規模に起こることがわかった。ネビュラガスには、大量の希ガスが含まれており、量的にも同位体組成的にも、現在の地球大気のものとは異なっている。そのため、地球サイズの惑星では、混合によって混ざってしまったネビュラガス成分が、何らかのメカニズムで失われる必要がある。そのメカニズムとして、太陽UVによる大気の散逸を考えた。惑星形成時の太陽EUVが現在の100倍程度強いことと、惑星大気が分子量の小さな水素大気を主体とすることから、大規模な水素大気の散逸が起こる。そして散逸する水素分子に引きずられて分子量の大きな希ガスも散逸し、現在の地球大気中の希ガス量まで減少させることが可能であることがわかった。観測および惑星形成理論によると、地球型惑星は原始太陽系星雲ガス(ネビュラガス)の中で形成した可能性が高い。したがって、混合を考慮しなければ、脱ガス成分の大気を下層、ネビュラガス成分の大気を上層とした2層大気が惑星の初期には形成されたはずである。まず、2層の混合が起こらない場合について考え(混合プロセスの詳細については、2年目に行う)、2層大気の熱構造を数値的に解くプログラムを作成した。その結果、火星サイズの惑星では、脱ガス大気の総量によって、表面状態が異なることがわかった。脱ガス成分の大気量が多いと、全球的なマグマオーシャンが形成され、高温となる。一方、脱ガス成分の大気量が少ないと、表面温度が約700K程度となりマグマオーシャンが形成されない。地球サイズの惑星では、脱ガス大気の総量によらず、地表面温度が約2000K程度の高温に維持されつづけることがわかった。このプログラムで計算された結果の一部は、2005年に発表したNatureの論文中で用いた。次に、脱ガス大気の総量および組成について調べた。これらは、微惑星中に含まれる揮発性元素の量・組成と、脱ガス大気と惑星表面の相互作用によって決まる。微惑星中に含まれる揮発性元素については、始原的隕石をベースにパラメータとして与え、脱ガス大気と惑星表面(マグマオーシャン)の化学相互作用について調べた。その結果、金属鉄・酸化鉄バッファーによってH_2/H_2Oモル比が10程度になることがわかった。また、H_2Oのマグマオーシャンへの溶融によって大気中のH_2O量が微惑星中の揮発性元素量にあまり関係なく一定量になることがわかった。原始太陽系星雲ガスが散逸するときに、上層のネビュラガス成分の待機は散逸し、下層の脱ガス成分の大気が生き残ることが定性的にわかるが、2層の混合によってネビュラガス成分が生き残ってしまう可能性もある。まず、2層大気の熱構造を数値的に解くプログラムを作成し、対流が起こっている場所を調べた。その結果、惑星が火星サイズの場合、対流は地表面付近で起こっており、その領域は薄く、脱ガス大気とネビュラガス大気の混合があまり起こらないことがわかった。一方、惑星が地球サイズ程に成長すると、対流層が厚くなり、必然的に2層の混合が起こることがわかった。これは、惑星サイズが大きくなるほど、大気が分厚くなり、放射で熱を捨てにくくなることが原因である。以上の結果は原始太陽系星雲ガスの物理条件にはほとんど依存しないこともわかった。ネビュラガスには、大量の希ガスが含まれており、量的にも同位体組成的にも、現在の地球大気のものと異なっている。

そのため、地球サイズの惑星では、混合によって混ざってしまったネビュラガス成分が、何らかのメカニズムで失われる必要があることがわかった。大気散逸メカニズムとして有力なのは、太陽UVによる大気の散逸、および太陽風による大気の剥ぎ取りなどが考えられる。地球型惑星は原始太陽系星雲ガス(ネビュラガス)の中で形成した可能性が高いことが惑星形成理論および観測からわかっている。微惑星の衝突合体によって惑星が現在の月サイズよりも大きくなると、周囲のネビュラガスを重力的に捕獲し始める。また、微惑星に含まれている揮発性成分が脱ガスするのも惑星が月サイズ以上になってからである。脱ガスは地表面付近で起こるため、大気の混合を考慮しなければ、脱ガス成分の大気を下層、ネビュラガス成分の大気を上層とした2層大気が惑星の初期には形成されたはずである。原始太陽系星雲ガスが散逸するときに、上層のネビュラガス成分の大気は散逸し、下層の脱ガス成分の大気が生き残ることが定性的にわかるが、2層の混合によってネビュラガス成分が生き残ってしまう可能性もある。混合を考慮し、大気の構造を数値的に解くプログラムを作成した。その結果、惑星が火星サイズ程度の場合、対流は地表面付近で起こっており、その領域は薄く、脱ガス大気とネビュラ大気の混合があまり起こらないことがわかった。一方、惑星が地球サイズ程に成長すると、対流層が厚くなり、必然的に2層の混合が大規模に起こることがわかった。ネビュラガスには、大量の希ガスが含まれており、量的にも同位体組成的にも、現在の地球大気のものとは異なっている。そのため、地球サイズの惑星では、混合によって混ざってしまったネビュラガス成分が、何らかのメカニズムで失われる必要がある。そのメカニズムとして、太陽UVによる大気の散逸を考えた。惑星形成時の太陽EUVが現在の100倍程度強いことと、惑星大気が分子量の小さな水素大気を主体とすることから、大規模な水素大気の散逸が起こる。そして散逸する水素分子に引きずられて分子量の大きな希ガスも散逸し、現在の地球大気中の希ガス量まで減少させることが可能であることがわかった。
欧州統合と憲法学-主権国家・国民国家の動揺と憲法理論の再構築-

本研究は、マーストリヒト条約による欧州統合の進展が欧州連合加盟諸国(とくにドイツ)の憲法秩序にどのような影響を与えているのかについて解明しようとするものである。本年度は、先ずヨーロッパ市民権の発展と現状について検討を加え、特にEU市民に対する地方選挙権の付与に伴う国内法の整備に関わる諸問題を考察した。その成果の一部は、論文「EU市民の住民投票への参加の合憲性」において公表した。この論文はEU市民がマーストリヒト条約によって保障された地方選挙権に加えて、各地方公共団体の実施する住民投票に参加することが憲法上許容されるかどうかに関するドイツの学説の動向を明らかにするものである。さらに、本年度はマーストリヒト条約によって導入された経済・通貨同盟の法的構造および欧州単一通貨の導入が国内の憲法秩序に与える影響について検討を加えた。その成果の一部は、論文「欧州通貨同盟と国家主権」において公表した。この論文は、欧州単一通貨の導入により通貨高権に関わる諸権限が加盟国から欧州共同体に移譲された結果、加盟国は通貨政策権限を失うが、こうした権限の喪失が加盟国の国家主権を侵害することにならないのかという論点について一定の解答を与えたドイツ連邦憲法裁判所1993年10月21日判決を考察したものである。そして、この論文では、連邦憲法裁判所がドイツの「国家性」(国家主権)を保持するために、EU条約およびその附属議定書についてかなり強引な解釈を施したことが明らかにされた。欧州統合がドイツの憲法秩序に与える影響について,欧州統合の深化に対してドイツの国家機関がどのような国内法上の対応を行ったか,という観点から分析を加えた。ます,ドイツはマーストリヒト条約を批准するに際して憲法である基本法を改正したので,「ドイツ憲法の<ヨーロッパ>条項」と題する論文(石川明・櫻井雅夫編『EUの法的課題』(第5章)129頁192頁)において,基本法改正,とくに基本法23条の成立過程をこの条項の起草作業を行った連邦議会・連邦参議院合同憲法委員会の議事速記録を資料として解明するとともに,基本法23条に含まれる解釈上の論点を検討した。つぎに,ドイツ連邦憲法裁判所は,1993年10月12日の判決において,マーストリヒト条約の批准は基本法に違反しないと判断し,また,1998年3月31日の決定において,ドイツの欧州通貨同盟への参加を合憲であると判断した。そこで,「ドイツ連邦憲法裁判所のマーストリヒト判決」と題する論文(石川・櫻井編前掲書(第6章)193頁226頁)において,1993年判決の内容を紹介するとともに,この判決の主任裁判官を務めたキルヒホフ教授の論文を下敷きにして,この判決を検討し,この判決においては「国家の最終責任性」の確保という視点が重要な役割を果していたことを明らかにした。さらに,「欧州単一通貨(ユーロ)導入の合憲性」と題する論文(自治研究75巻5号)において,1998年判決を紹介・検討し,基本法の解釈に関しては,1998年判決は1993年判決を忠実に踏襲していることを明らかにした。
歯周病原性プラークにおける栄養共生機構の解明

共培養実験を行ったところ,F. nucleatum単独培養時と比べ,共培養時ではF. nucleatum菌体内のN-アセチルオルニチンとプトレシンが顕著に増加するとともに,グルタミン酸やアラニン等のアミノ酸や,AMPやNAD+等の核酸が増加することが示された。さらに共培養時には,S. gordonii由来代謝産物としてオルニチン,アラニン,グルタミン酸等が培地中で増加するとともに,F. nucleatum由来代謝産物として酪酸が増加することが分かった。F. nucleatumの主要なエネルギー産生経路として,グルタミン酸を代謝して酪酸を産生する経路が知られている。そこでqRT-PCRを行い同代謝経路上の酵素の発現量を評価したところ,共培養時にはブチリルCoAデヒドロゲナーゼ等,複数の酵素の発現が有意に上昇することが示された。このことからS. gordoniiから供与された複数のアミノ酸がF. nucleatumの酪酸発酵能を高めることが示唆された。この知見に関し,2017年7月にValenciaで行われたFEMS 2017で発表を行い反響を得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。多様な微生物の集団である歯垢(プラーク)の歯周病原性が亢進する要因の一つとして,微生物間での代謝物を介した相互作用,すなわち栄養共生があるが,最近,口腔常在菌Streptococcus gordonii(Sg)の放出するオルニチンが歯周病関連菌Fusobacterium nucleatum(Fn)のバイオフィルム形成量を増加させることを報告した。本年度,私は二つのテーマについて研究を行った。一つ目はSgとFnの代謝物を介した細菌間相互作用に関する研究である。二菌種間の栄養共生機構についてさらに詳細に解析するために,トランスウェルを用いてSgと6時間共培養させたFnの菌体内および上清中の代謝物プロファイルを,Fn単独培養時と比較した。その結果,Sg共培養時のFn菌体内では,複数のアミノ酸濃度が有意に増加しており,さらに上清中の酪酸濃度が顕著に増加していることが示された。酪酸産生と歯周病原性プラークの高病原化との関連を示す報告が多くあることから,今回得られた結果は二菌種間の栄養共生によりプラークの病原性が亢進することを示唆している。二つ目のテーマとして,歯周病原性プラークから唾液中へと放出される細菌由来代謝物に関する研究を行った。全身的に健康な被験者の唾液を,歯肉縁上プラーク除去前後で2度採取し,これらの代謝物プロファイルの違いから細菌由来代謝物を絞り込むとともに,これらの物質と歯周病重篤度との関連性を多変量解析の手法を用いて調査した。その結果,歯周病重篤度の高い被験者の歯肉縁上プラーク中ではポリアミン代謝経路が活性化し,オルニチンやポリアミンが高い割合でプラークから唾液中へと放出されている可能性が示された。この知見に関し,2016年6月にSeoulで行われた第94回国際歯科研究学会で口頭発表を行うとともに,2017年2月付けでScientific Reportsに掲載された。口腔常在菌由来の代謝物を介した栄養共生機構についての知見を積み重ね,2菌種間の栄養共生が歯周病原性を亢進させる可能性を示した。また学会発表,論文発表による研究成果の公表も活発に行い,本年度は第一著者として原著論文と総説論文をそれぞれ一報ずつ発表した。今後は唾液を用いた臨床研究で得られた知見を踏まえつつ,代謝物を介した口腔細菌間相互作用とそれが歯周病原性バイオフィルムの高病原化に及ぼす影響について,さらに解析を進めていくとともに,論文として研究を完結させる方向で研究を進展させていくこととなる。
ＬＰＳ惹起肺水腫におけるＨＧＦによる回復機構

Lipopolysaccaride (LPS)を気管内投与すると肺血管内皮におけるHepatocyte growthfactor (HGF)遺伝子発現、蛋白発現が亢進した。マウス肺の気管支肺胞洗浄から肺胞マクロファージを単離し、LPSを添加すると上清中にIL-1β、TNF-αが誘導された。LPS気管内中投与直後に抗IL-1β抗体、抗TNF抗体を投与すると肺血管内皮のHGFの発現は抑制され、肺胞上皮のアポトーシス、肺血管透過性は抑制された。抗HGF抗体を投与すると肺胞上皮のアポトーシスは増強し、肺血管透過性は亢進した。以上より、HGFはLPS肺水腫の回復に重要な役割を担っていると考えられた。これまで、マウス摘出肺を用いたLPS惹起肺障害における肺胞上皮細胞のHGFの遺伝子発現・蛋白発現のいずれも惹起されること、また、抗IL-1β抗体、抗TNF抗体により、これらの発現が抑制されることを確認した。さらに、マウス肺から血管内皮細胞を分離培養し、HGFの添加によりアクチン細胞骨格の破壊が抑制されることが確認できた。マウス肺の気管支肺胞洗浄液中のマクロファージを単離し、LPS添加6時間後に上清中のIL-1β、TNF-αをELISAで測定したところ、LPSによりIL-1β、TNF-αが誘導されることから、これらの炎症性サイトカインが病態の発症に重要であることがわかった。これらのデータをもとに、次にHGFを阻害することによる肺胞上皮アポトーシス・肺血管透過性に及ぼす影響、肺水腫に及ぼす影響を検討した。1)組織学的検討:LPS投与後の摘出肺をTUNEL染色したところ、肺胞上皮細胞の一部にアポトーシスを来していることが確認され、抗HGF抗体によりアポトーシスが増強し、HGFによりアポトーシスが抑制された。2)アポトーシス:LPS惹起肺障害において、Bax、Bcl-2、p21、p53をRTーPCR法にて測定したところ、Baxの亢進がみられ、本機序を介するアポトーシスの誘導が示唆された。また、HGFによりBcl-2が抑制された。3)肺血管透過性:気管支肺胞洗浄液中の131Iで標識したアルブミンは、抗HGF抗体により増加した。このことから、抗HGF抗体は血管透過性を増強させることが考えられた。4) TLRシグナリングアッセイ:マウス肺からII型肺胞上皮細胞を分離培養し、LPS添加後に、さらに抗CD14抗体を添加し、蛍光酵素遺伝子に結合したNFkB反応領域(IL-8プロモータ)を用いてシグナリングを測定したが、変化はみられなかった。LPSにて肺障害マウスモデルを作成後24時間に以下の項目を検討した。また、LPS投与直後に抗IL-1β抗体、抗TNF-α抗体を投与し、その効果を検討した。肺血管内皮細胞を分離培養し、LPS、HGFを添加し、アクチン細胞骨格に対するHGFの効果を検討した。1) LPSにより肺胞上皮細胞におけるHGF遺伝子発現が亢進し、蛋白発現もみられた。抗IL-1β抗体、抗TNF抗体によりこれらHGF遺伝子発現、蛋白発現は抑制できた。2)マウス肺から血管内皮細胞を分離培養し、LPS添加24後にRhodamine-phalloidin染色を行い、蛍光顕微鏡でアクチン細胞骨格を観察したところ、HGFの添加によりアクチン細胞骨格が温存された。3)肺胞マクロファージの活性化と炎症性サイトカイン:マウス肺の気管支肺胞洗浄を行ない、洗浄液中のマクロファージを単離し、LPS添加6時間後に上清中のIL-1β、TNF-αをELISAで測定したところ、IL-1β、TNF-αが誘導された。5) 131Iで標識したアルブミンの血管内から気管支肺胞洗浄液中に漏出により肺血管透過性を検討したところ、LPS投与により亢進がみられるが、抗HGF抗体により血管透過性が増強された。LPS惹起肺障害における肺胞上皮細胞のHGFの遺伝子発現・蛋白発現を検討した。さらにLPS惹起肺障害におけるHGF発現にIL-1、TNFの関与についても検討した。LPSを気管内投与し、肺障害マウスモデルを作成した。LPS投与直後に抗IL-1β抗体、抗TNF-α抗体を気管内と静脈内に投与した。さらに肺血管内皮細胞を分離培養し、LPS、HGFを添加によるアクチン細胞骨格についても検討した。