hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソニフィケーション(情報の可聴化技術)を用いた疼痛治療デバイスの開発

本研究は「痛みと音」に着目し、痛みを「音」で把握できるデバイスを作成する元となるデータを取得した。数種類の生体除法モニターの痛みによる変化を検討した結果、パルスオキシメーターを用いて測定可能な末梢循環の指標「Perfusion Index(PI)」が最も鋭敏であった。音による痛みの変化を音の快不快、主観的痛みの強度、Perfusion Indexを組み合わせて解析した。Perfusion Indexは若年者ではきわめて反応性の良い指標であるが、高齢者では大きな変化が見られない可能性があること、不快音に対する反応に比べ、快を誘導する音の反応に個人差があることが明らかになった。さらに、ペインクリニック患者においてはコントロール条件の主観的痛み強度が健康被験者に比し高く、音による誘導を受けにくい可能性も示唆された。本研究の目的は「痛みと音」に着目し、痛みを「音」で把握できるデバイスを作成すると共に、「音」で鎮痛を誘導する機器の開発を目標とする。そのために情報を音に変換する技術(Sonification)を用いる。1.痛みを伴う身体的状況を、様々な生体モニターから取り出した情報を音に変換する技術(Sonification)を用いて、治療者のみならず患者にとって痛みに有利な状況を客観的に容易に判断できる機器を開発する。2.痛みをやわらげる音の研究を行い、上記技術と連動させ、音による理学療法の可能性を探る。であった。昨年度は痛みを伴う状況把握が可能な生体信号の分析を行い、各種モニターの中から末梢循環の指標であるPerfusion Indexが有用な信号であることを明らかにした。この知見を昨年7月の日本疼痛学会で発表した。さらに、その信号を音に変換するサンプルサウンドの検討を行い、音による理学療法を念頭に痛みを催す可能性の高い音、鎮痛に結び付けられる可能性の高い音を検討した。検討した結果、それぞれ1種類ずつの音を見出した。これらが本当に鎮痛を誘導できるか否かについて検討するための実験を計画した。本研究については情報の可聴化技術の世界的第一人者であるドイツのビーレフェルド大学、ハーマン博士の助言を得て行われており、1か月に1度のペースで研究の進捗状況をテレビ会議で行った。本年は熱刺激による痛み刺激を昨年度に見出した候補の音と組み合わせそれらの組み合わせにより主観的な痛みとPerfusion Indexがどのように変化するあの検討を行い、その結果を来年度の国際神経障害性疼痛学会で発表予定であり、その学会におけるプロシーデイングの投稿を行った。であった。本年度は痛みを伴う状況把握が可能な生体信号の分析を行い、各種モニターの中から末梢循環の指標であるPerfusion Indexが有用な信号であることを明らかにした。この知見は本年7月の日本疼痛学会で発表予定である。さらに、その信号を音に変換するサンプルサウンドの検討を行った。さらに、情報をリアルタイムに取り出す工夫を行い、現在バイオフィードバックのプログラム作業に着手している。さらに、音による理学療法を念頭に痛みを催す可能性の高い音、鎮痛に結び付けられる可能性の高い音を検討した。これらが本当に鎮痛を誘導できるか否かについて検討するための実験のプレリミナリーな段階まで終了した。本研究については情報の可聴化技術の世界的第一人者であるドイツのビーレフェルド大学、ハーマン博士の助言を得て行われており、3月に来日され、今後のプロトコールの確認作業を行った。本研究の目的は「痛みと音」に着目し、痛みを「音」で把握できるデバイスを作成すると共に、「音」で鎮痛を誘導する機器の開発を目標とし、そのために情報を音に変換する技術(Sonification)の第一人者っであるハーマン博士の助言を得ながら達成する予定であった。この点について本年度は痛みと様々なモニター機器をの信号の関係を詳細に検討し、痛みを反映する生体信号を把握することができた。その信号の痛みによる変動についてのデータ解析結果を来年度の日本疼痛学会で発表予定である。

2.痛みをやわらげる音の研究を行い、上記技術と連動させ、音による理学療法の可能性を探る。この点については、音による鎮痛の誘導に関し、ドイツからハーマン博士を招いて詳細な討論を行うことができた。その結果、快、不快を誘導する音をこれまでの研究成果から導き出し、痛み刺激と音による鎮痛の誘導の関係の新たなプロトコールを立てることができた。そのプログラムのプレリミナリーな検証はすでに検証している。痛みより鋭敏に変動する信号ついて、リアルタイムに取り出し可能となった。現在ハーマン博士がバイオフィードバックのプログラム中である。鎮痛を導く音、痛みに伴う信号の変化を組み合わせ、来年度中に生体信号を察知し鎮痛に導く機器のプロトタイプができるものと考えている。1.バイオフィードバックの検証ペインクリニック外来に受診した患者のうち催眠療法を行うことを希望した患者でこの研究に同意された方に対し、まず、催眠のかかりやすさに関するスコアリングを行う。(大学院生安達が担当)患者に対し催眠療法を行う。催眠療法による効果判定をVisual Analogue Scale(VAS)を用いて行う。(大学院生安達が担当)催眠療法による効果の出やすい患者、出にくい患者2群に分け、モニターを装着し、自分のデータが音に変換されている状況を聞きながら、催眠状態を誘発する。それぞれに自分の状態を音で把握しその音色が良くなるように自分の状態を保つように指示する。催眠療法単独の効果と、バイオフィードバックを合わせた効果を比較し、その効果についての検討を行う。(中江・大学院生安達が担当)2.音による鎮痛の誘導の可否の検討痛みを抑制させる音を痛みに不利な状況で鳴らすプログラムを行う。ボランテイアに対し実験的痛みを加え痛みの評価を持続的VASで行い、(1)のプログラムで疼痛閾値が下がることを検証する。音による鎮痛が可能かどうかの検証を広くボランテイアを募って行う。さらに、バイオフィードバックプログラムを作成し、実際に機能するかどうかボランテイアで検証する。さらに、生体信号の変化から鎮痛を導く機器のプロトタイプを開発する。そのプロトタイプの検証もボランテイアで行う。これらの成果を国際学会で発表の後、論文投稿を行う。バイオフィードバックの実証・音による鎮痛の誘導の実証のため、広告をだし、広くボランテイアを集める(約30万円必要)。さらに、ボランテイアに謝金を支払う(一人1回4000円必要)。昨年度の成果を日本疼痛学会で発表予定(2名参加)、さらに、国際学会(ヨーロッパ)でも発表を予定している。論文校正・投稿費用にも充てる。音の検証のためのプログラムの作成・アンケート調査にも充てる。プロトタイプの作成費用にも充てる。
ポリコーム複合体PRC2の使い分けによって可能となるエピゲノムパターン

ポリコーム群複合体PRC2は、ヒストンH3の27番目のリジンをメチル化することで、発生・分化の過程で決定される遺伝子発現パターンの確立・維持を行う。しかし多種多様な遺伝子領域を見分けて制御するのか、また他のクロマチン制御因子とどのように協調しているのかなど、PRC2がどのように制御されているかの詳細な分子メカニズムはまだよくわかっていない。本研究では、昆虫細胞を用いた再構成系によりPRC2構成因子間の分子的相互作用の実体を明らかに、どのようにPRC2複合体が形成されるのかを明らかにした。ポリコーム群複合体PRC2は、遺伝子発現抑制のエピジェネティックマークであるヒストンH3の27番目のリジンのメチル化(H3K27me3)を行うことで、発生・分化の過程で決定される細胞種特異的な遺伝子の発現パターンの維持を担う。PRC2による発現抑制の代表例には、X染色体の不活性化やHOX遺伝子群の制御が知られている。しかし、PRC2がどのようにして多種多様なゲノム領域を制御することができるのか、H3K27me3とは排他的に存在する別のエピジェネティックマークヒストンH3の9番目のリジンのメチル化(H3K9me)との関係など、PRC2の制御メカニズムは未だ不明な点が多い。これまでの解析によって、PRC2に含まれる構成因子を明らかにし、構成因子を使い分けることでPRC2はさまざまな複合体として細胞内に存在するという知見を得ている。そこで本年度は昆虫細胞発現系を使った再構成系を確立し、PRC2複合体の成り立ちの全貌を明らかにすることを試みた。その結果、新規因子を含む全14種類のPRC2構成因子に対して、それぞれの間の1対1の結合関係性を明らかにすることができた。さらに変異型、欠失型の構成因子を使いPRC2構成因子それぞれのどの領域が、その結合関係に必要であるかを明らかにした。これによって異なる構成因子からなるPRC2複合体がどのように形成されるのかの知見を得ることができた。計画していたPRC2の各構成因子を任意の組み合わせで複数発現させ、部分複合体を再構成する昆虫細胞発現系を構築できた。この系に使うことで各構成因子間の直接的な結合の有無を調べ、PRC2がどのような分子間相互作用で成り立っているかを明らかにできた。さらに部分欠失型の構成因子をつかうことで、どの領域がその結合に必要であるかを明らかにした。また活性に必要なコア複合体の構成因子を共発現させ、できた複合体精製することでヒストンH3を基質にメチル化活性を測定することができた。ポリコーム群複合体PRC2は、遺伝子発現抑制のエピジェネティックマークであるヒストンH3の27番目のリジンのメチル化(H3K27me3)を担うことで、発生・分化の過程で決定される細胞種特異的な遺伝子の発現パターンの維持を行っている。しかし、PRC2がどのようにして多種多様なゲノム領域を制御することができるのか、他のエピジェネティックマーク(例えばPRC2とは別の分子経路で制御され、H3K27me3とは排他的な抑制型のヒストンH3の9番目のリジンのメチル化H3K9me3)との協調性、排他性など、PRC2の制御メカニズムは未だ不明な点が多い。そこで、構成因子を使い分けることでPRC2はさまざまな複合体として細胞内に存在するという知見を基にこの問題に取り組んでいる。本年度は、これまで昆虫細胞発現系を用いた再構成系によって同定したPRC2構成因子間の1対1の相互作用の関係、およびその結合に必要な領域の知見を発展させ、それぞれの構成因子間の結合に必要なアミノ酸残基を同定した。さらに、そのアミノ酸残基が、実際にヒト細胞の中で機能していることを明らかにすることができ、再構成系における解析が成り立っていることがわかった。これによってPRC2複合体がどのように成り立っているかが明らかになっただけでなく、PRC2構成因子間の特定の相互作用を人為的に失わせることで、ある特定のPRC2複合体を失わせた時に起こる表現型の解析が可能となった。ヒト細胞内でPRC2構成因子間の相互作用に必要なアミノ酸を同定できたことで、PRC2複合体がどのように成り立っているかが明らかになった。またPRC2構成因子をノックダウンした時に起こるヒストン修飾への影響についてChIP-seq法を用いて解析を進めている。しかし、PRC2がどのようにして多種多様なゲノム領域を制御することができるのか、他のエピジェネティックマーク(例えばH3K27me3とは排他的に存在する別の抑制型のヒストンH3の9番目のリジンのメチル化H3K9me3)との協調性、排他性など、PRC2の制御メカニズムは未だ不明な点が多い。本年度は、昨年度に同定したPRC2が構成因子を使い分けるのに必要なPRC2内の領域についてさらに解析を進めた。

その結果、排他的にPRC2コアに結合する構成因子は、PRC2内で結合領域を共有していること、しかしその結合に必要なアミノ酸残基はそれぞれの構成因子によって特異的なものが存在することを明らかにした。最近PRC2全体の3次元構造が明らかになり、同定したアミノ酸残基について構造学的な解釈が可能となってきたため、PRC2の構造の中でどのような位置に存在するのか、また進化的保存性について解析を進めている。また、本研究課題で開発した質量分析器によるタンパク質相互作用解析のための情報解析系を用いて、クロマチン機能に関わる新たなタンパク質相互作用を見いだし、論文として発表した。ポリコーム群複合体PRC2は、ヒストンH3の27番目のリジンをメチル化することで、発生・分化の過程で決定される遺伝子発現パターンの確立・維持を行う。しかし多種多様な遺伝子領域を見分けて制御するのか、また他のクロマチン制御因子とどのように協調しているのかなど、PRC2がどのように制御されているかの詳細な分子メカニズムはまだよくわかっていない。本研究では、昆虫細胞を用いた再構成系によりPRC2構成因子間の分子的相互作用の実体を明らかに、どのようにPRC2複合体が形成されるのかを明らかにした。生化学的手法については、これまでに決定したPRC2構成因子間の相互作用に必要な領域に変異を導入していく。これら変異タンパク質を、ヒト細胞で発現させたときに形成されるPRC2複合体を調べることで、ある特定のPRC2複合体のみが形成できないような変異を同定する。これまで得られた構成因子間の相互作用結果を確認するのに役立つだけでなく、PRC2複合体間の機能的違いを明らかにするための材料とすることができる。また異なる構成因子を持つPRC2複合体間で活性がどのように異なるのかを調べる。生物学的な機能解析については、ChIP-seq解析系を用いて、PRC2構成因子がゲノムのどの領域に局在しているのか、それらとPRC2が担うH3K27me修飾部位との関係を明らかにする。またRNA-seqを用いて、各構成因子をノックダウンした際の遺伝子発現の変動を調べ、影響を受ける遺伝子とPRC2構成因子やヒストン修飾との関係を調べていく。生化学的解析によって得られた知見に基づいて、ChIP-seq, RNA-seq法を用いてPRC2複合体間の機能の違いについて解析を行っていく。分子生物学PRC2の機能解析にあたって特定の機能だけ失われた変異体を利用することが有用だと考え、まず生化学的に構成因子間の直接的相互作用を明らかにし、複合体形成に必要な構成因子内のアミノ酸配列を特定するということを行った。そのため最も費用のかかる次世代シーケンサーによる解析を次年度以降にすることにしたため。研究遂行にあたり生化学的解析を優先しているため、費用のかかる次世代シーケンサーによる解析の一部を次年度以降にすることにしたため。PRC2のゲノム上での局在を明らかにするためのChIP-seq法や、PRC2各構成因子変異時における遺伝子発現を明らかにするためのRNA-seq法というような次世代シーケンサーを用いた解析に使用する。PRC2のゲノム上での局在を明らかにするためのChIP-seq法というような次世代シーケンサーを用いた解析に使用する。
カテコールアミンによる延髄リズムジェネレータの調節

光学的測定法と幼若ラット摘出延髄脊髄ブロック標本を組み合わせることにより、ドーパミンは新生児呼吸神経回路のペースメーカー神経群の同期活動を脱同期させることにより呼吸リズムの著しい変調を起こすことが分かった。またその原因はリズムを生成するPre-Iニューロンであることがわかった。胎児性呼吸神経回路の活動はアドレナリン存在下において安定化するのに対し、アドレナリン阻害剤存在下では不安定になることが確認された。1.呼吸におけるドーパミンの役割生後0-1日齢のラットから得られた延髄脊髄ブロック標本に対し、ドーパミン及びその拮抗阻害剤を還流液中に添加し、その際の呼吸性神経活動を電気生理的手法、光学的記録法、免疫組織学的手法を用いて解析した。その結果、ドーパミンはドーパミンD4受容体を発現しているPre-Iニューロンを脱分極させ、同期したPre-Iニューロンの神経活動を脱同期させることが分かった。さらに呼吸リズムがドーパミンによって抑制されることは、この呼吸リズムを制御しているPre-Iニューロンの脱同期によることであることが確かめられた。これらのことは自律性神経活動としての呼吸と、能動的神経活動としての呼吸の切り替えがどのように行われているかを明らかにする上で重要な知見であると考えられる。2.呼吸中枢発達におけるアドレナリンの関与胎生15-17日齢及び生後0-1日齢のラットから得られた延髄脊髄ブロック標本に対し、アドレナリン及びその拮抗阻害剤をを還流液中に添加し、その際の呼吸性神経活動を電気生理的手法用いて解析した。その結果、アドレナリンは呼吸中枢の発達段階において非呼吸性の横隔神経活動を抑制し、呼吸性の横隔神経活動を促進することが明らかになった。また、アドレナリン拮抗阻害剤によって生後0-1日齢のラットブロック標本の呼吸性神経活動の安定性が損なわれることを確認した。これらのことはアドレナリンが生後の安定した呼吸性活動の維持に重要な役割を担っていることを示唆するものである。平成18年度研究において胎生期アドレナリンの呼吸中枢制御様式の解析を実行し、論文発表したため、その延長線上における研究として、平成19年度はアドレナリンによるGABAを介した呼吸抑制があるのかないのかという問題に取り組んだ。アドレナリンの呼吸リズムに対する抑制反応はGABAを介した反応であることは、我々の以前の研究から示唆されている(Arata, et. al., 1998)が、その直接的な証拠は示していない。これを実行するにあたり、まずはGABAの呼吸に対する直接関与を調べた。GABA合成酵素であるGAD欠損マウスおよびGABA/glysineトランスポーター(VGAT)欠損マウスに対し、胎生14日(E14)、胎生15日(E15)及び18日(E18)の個体から延髄脊髄ブロック標本を作製し、呼吸性ニューロンに対してパッチクランプ電極を用いて、各マウス延髄脊髄標本に対し細胞内記録し、野生型マウスとノックアクトマウス間で呼吸活動に差があるのか検討し、IPSPの数がどのように変化するのか調べた。その結果、GAD欠損マウスおよびVGAT欠損は野生型マウスと比べ顕著な呼吸活動の抑制が見られ、通常条件下では呼吸性活動が観察されなかった。この呼吸性活動はGAD欠損マウスにおいては呼吸賦活物質であるサブスタンスPの投与により回復したが、VGAT欠損マウスにおいてはサブスタンスP投与によっても呼吸性活動の観察は見られなかった。これらの結果からGABA及びglysineは呼吸性神経活動の維持に直接的に関与しており、発達期の呼吸性活動の維持に必須の要素であることが初めて示された。本研究結果はNeuroscience誌に投稿受理され掲載された。平成20年度はこれまで用いてきた幼弱ラット橋-延髄摘出ブロック標本に小脳部位を付加した小脳-橋-延髄摘出ブロック標本を作成し、アドレナリン存在下、非存在下でC4神経根から観察される横隔神経発射すなわち呼吸活動をトリガーとして標本表面に現れる神経活動を光学的測定法により観察した。その結果、アドレナリン存在下においてはC4神経根から観察される呼吸性活動の周期が増大するのと同時に、延髄腹側部に見られる呼吸活動部位の広さ、膜電位変化の割合の増大が確認された。続いてその活動変化と小脳活動に関連が存在するか確認するための準備実験を行った。摘出ブロック標本還流下、小脳表面及び下オリーブ各部位を刺激電極を用いて人為的に電気刺激すると、平行繊維及び途上繊維由来の小脳表面のプルキンエ細胞活動が光学的測定法を用いて観察できることが確認された。現在これら準備実験の結果を基に、引き続きアドレナリン存在下、非存在下の呼吸性活動に関連した小脳活動の差異を確認中である。また、免疫染色学的手法を用いることにより、どのアドレナリン受容体が呼吸性神経回路を構成する神経細胞に発現しているのか検討した。抗PNMT抗体を用いて橋-延髄部位の切片を免疫化学染色法により染色したところ、C1部位に強いシグナルが確認された。
イオンサイクロトロン不安定性による構造形成のシミュレーション研究

地球などの磁場を持つ惑星の極地方で観測されるオーロラは,電離層で磁力線に沿って加速された高速の電子が大気の窒素,酸素等を電離することによって発生する.この高速電子の生成機構解明のため、代表者らは、自己無撞着な開放系2-1/2次元静電粒子シミュレーションコードを開発し,大規模なシミュレーションを実行することによって,電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性によってV字型の静電電位構造が形成されることを世界で始めて実証することに成功していた.この電位差及び電位構造の系の大きさ及び電流分布に対する依存性を調べるシミュレーションを行い,沿磁力線電位差は不安定性によるイオンサイクロトロン波の成長に伴って増加しやがて飽和するが、この電位上昇は系が磁力線方向に長いほど長く続き,最終的に到達する電位差も大きくなることから,現実的な系の長さではオーロラ電子加速を説明しうる電位差となりうることを示した.また電流分布の幅を変化させたシミュレーションから電位構造の幅は電流領域の幅で決まっていることを明らかにした.加えて、イオン音波及び静電イオンサイクロトロン波が.ともに不安定となるパラメータ領域でもシミュレーションを行い波の不安定性による成長並びに電位構造の形成を調べた。いくつかのパラメータによるシミュレーションを行った結果から、このパラメータ領域においてもイオンサイクロトロン波が優勢になることが示された。さらに磁化プラズマ3次元粒子シミュレーションコードを開発し、予備的なシミュレーションを行った。オーロラの発生に関与する高速電子が電離層上層の静電電位差によって生成されているという仮説を多くの観測結果が支持している.さらに沿磁力線電位差を伴うV字型の電位構造とイオンサイクロトロン振動数近傍の信号が同時に観測されていることから,電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性は,オーロラ電子の生成を担う沿磁力線電場生成機構の有力な候補と考えられている.これまでの自己無撞着な開境界をもつ2-1/2次元静電粒子シミュレーションによる研究で,電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性によって引き起こされる異常抵抗により沿磁力線電位差が生成されることを示すとともに,電流分布に空間的不均一性がある場合にはその電位構造は,V字型となることを実証した.そのシミュレーションで直接に得られた電位差は小さいものであるが,系の長さに比例して沿磁力線電位差が大きくなるならば,実際のオーロラ電子加速領域の長さに相当する長さの系では,オーロラ電子の加速を説明するのに十分な電位差が得られる可能性のあることを指摘した.この電位差及び電位構造の系の大きさ及び電流分布に対する依存性を調べるシミュレーションを行った.沿磁力線電位差は不安定性によるイオンサイクロトロン波の成長に伴って増加しやがて飽和する.この電位上昇は系が磁力線方向に長いほど長く続き,最終的に到達する電位差も大きくなる.このことから,現実的な系の長さではオーロラ電子加速を説明しうる電位差となりうることが期待される.また電流分布の幅を変化させたシミュレーションから電位構造の幅は電流領域の幅で決まっていることを明らかにした.地球などの磁場を持つ惑星の極地方で観測されるオーロラは、磁力線に沿って加速された高速電子が大気中の窒素、酸素等を電離することによって発生する。多くの観測結果からこの高速電子は沿磁力線電場によって生成されていると考えられているおり、その沿磁力線電場の生成機構に関しては多くの研究が行われている。さらに、電離層においてイオンサイクロトロン周波数近傍の振動が頻繁に観測されていることやV字型の電位構造の存在を示唆する衛星観測が報告されたことから、電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性がオーロラ電子の生成を担う電位構造形成の原因である可能性が高いとされてきた。これまでの開放系粒子シミュレーションモデルを用いた大規模シミュレーションにより電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性によりV字形の電位構造が形成されることを実証し、さらに現実の宇宙空間における電子加速領域の大きさではオーロラ電子の加速に十分な電位差になりうることを示してきた。これらは静電イオンサイクロトロン波のみが不安定で、イオン音波は不安定でないパラメータ領域でのみシミュレーションを行ってきた。ところが、最近の衛星観測で大域的な電位構造に重なってより空間スケールの小さい電位構造が存在していることを示唆する結果が得られている。

これらの関係を明らかにする目的でイオン音波及び静電イオンサイクロトロン波がともに不安定となるパラメータ領域でシミュレーションを行い波の不安定性による成長並びに電位構造の形成を調べた。いくつかのパラメータによる予備的なシミュレーションを行った結果から、このパラメータ領域においてもイオンサイクロトロン波が優勢になることが示された。しかしながら、現在のところ電位構造に関しては明確な結果は得られておらず、さらに詳細なシミュレーションが必要と考えられる。地球などの磁場を持つ惑星の極地方で観測されるオーロラは、磁力線に沿って加速された高速電子が大気中の窒素、酸素等を電離することによって発生する。多くの観測結果からこの高速電子は沿磁力線電場によって生成されていると考えられているおり、その沿磁力線電場の生成機構に関しては多くの研究が行われている。さらに、電離層においてイオンサイクロトロン周波数近傍の振動が頻繁に観測されていることやV字型の電位構造の存在を示唆する衛星観測が報告されたことから、電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性がオーロラ電子の生成を担う電位構造形成の原因である可能性が高いとされてきた。これまでの開放系粒子シミュレーションモデルを用いた大規模シミュレーションにより電流駆動静電イオンサイクロトロン不安定性によりV宇形の電位構造が形成されることを実証し、さらに現実の宇宙空間における電子加速領域の大きさではオーロラ電子の加速に十分な電位差になりうることを示してきた。これらは静電イオンサイクロトロン波のみが不安定で、イオン音波は不安定でないパラメータ領域でのみシミュレーションを行ってきた。ところが、最近の衛星観測で大域的な電位構造に重なってより空間スケールの小さい電位構造が存在していることを示唆する結果が得られている。いくつかの例から、このパラメータ領域においてもイオンサイクロトロン波が優勢になることが示された。さらに磁化プラズマ3次元粒子シミュレーションコードを開発し、シミュレーションを行った。
プルシャンブルー類似体へのナトリウムイオンインターカレーション

マンガンおよびコバルトプルシャンブルー薄膜を作製し、これらの材料がナトリウムイオン二次電池セル内で高い容量と起電力を示すことを見出した。さらに、Naイオン濃度の関数としてホスト格子の構造および遷移金属の価数を決定し、充放電プロセスにともなう構造・電子状態の変化を明らかにした。これらのデータは、放射光X線回折および放射光X線吸収実験により得た。本研究により、配位高分子化合物が次世代二次電池であるナトリウムイオン二次電池正極材料として有効であることが示された。我々のこれまでの研究で、プルシャンブルー類似体薄膜はLiイオン二次電池の正極材料として由棒であることが分かっている。特に、プルシャンブルー類似体はナノポーラスな構造を有しているため、(1)Liイオン拡散係数が大きいだけでなく、(2)Liイオン挿入に対してホスト格子が編んで、であるとい利点がある。本研究では、プルシャンブルー類似体が次世代二次電池であるNaイオン二次電池の正極材料としての特性を下記らかにすることを目的としている。まず、マンガンプルシャンブルー類似体薄膜を作成し、Naイオンターカレーション特性を調べた。放電容量は109mAh/g、Na金属に対する平均電圧3.4V、そして、良好なサイクル特性を示した。このことより、マンガンプルシャンブルー類似体薄膜は、Naイオン電池の正極材料として有望であると考えられる。特に、Na体は直接合成が可能であるため、実用性の見地からは、マンガンプルシャンブルー類似体はNaイオン二次電池に使われるべきである。さらに、Naイオン挿入に伴うホスト格子の電子状態をex situのX線吸収分光折で調べた。マンガンプルシャンブルー類似体は二つのプラトー(3.6Vと3.2V)を示す。第一プラトーはマンガンの還元に対応し、第二プラトーは鉄の還元に対応する。この還元サイトの同定は、Liイオン二次電池の場合と同じである。さらに、Naイオン挿入に伴うホスト格子の構造をex situのX線粉末回折で調べた。第一プラトーでは格子定数が急激に増大したが、第二プラトーでは格子定数はほぼ一定であった。第一プラトーでの格子定数の変化は、Mnイオン還元に伴うイオン半径の増大に起因する。1マンガンプルシャンブルー類似体とコバルトプルシャンブルー類似体の固溶体薄膜を作製し、電気化学特性、ホスト構造、遷移金属の価数と固溶比およびrイチウムイオン濃度に対して決定した。2ニッケルプルッシャンブルー類似体薄膜がイオン半径の大きなルビジウムを2秒という高速でインターカレートすることを見出した。3プルシャンブルー類似体薄膜のリチウムイオン電池およびナトリウムイオン電池特性の総合的なreviewを執筆した。4マンガンプルシャンブルー類似体薄膜とコバルトプルシャンブルー類似体薄膜がリチウムイオン電池の正極材として優れた性能を示すことを見出した。また、ホスト構造、遷移金属の価数と固溶比およびナトリウムイオン濃度に対して決定した。5マンガンプルシャンブルー類似体薄膜が著しいレート特性を示すことを明らかにした。また、レート特性の膜厚依存性を調べ、その原因を考察した。本研究費で柴田恭幸研究員を雇用した。成果報告を見てわかるように、充分な成果(原著論文、発表、知財)を挙げた。また、柴田恭幸研究員は第26回応用物理学会論文奨励賞を受賞した。固体物理学、エネルギー科学予想通り、プルシャンブルー類似体がNaイオン二次電池の正極材料としての良好な特性を示したため。また、Naイオン二次電池に関する、実験ノウハウが充分に蓄積されているため。1.コバルトプルシャンブルー類似体のNaイオン二次電池の正極材料としての特性を明らかにする2.鉄サイトを他の遷移金属に置換した材料を合成し、そのNaイオン二次電池の正極材料としての特性を明らかにする3.同一材料において、Na拡散係数とLi拡散係数の値を決定するH25年度は人件費を支払い研究を進める予定であった。が、その必要がなくなった。(熱心な大学院生が在籍していたため、研究が予定以上に進んだ。)H26年度は、科学研究費補助金を用いて研究員を雇用し、研究をさらに推進する。
アザ電子環状反応を基盤とする実践的アルカロイド構築法の開発

本研究は、酵素阻害機構から学んだ不斉アザ電子環状反応を、多置換ピペリジンを核構造としたアルカロイド類の新たな合成戦略として確立しようとするものである。まず、(1)ワンポット不斉アザ電子環状反応を様々な基質に対して高い立体選択性で実現するためには、イソプロピル基を有した7-イソプロピルーシスーアミノインダノール(A)の簡便な供給が必要となる。2-イソプロピルフェノールを原料としナザロフ反応を鍵として、中間体の精製を極力必要としないAの合成法を確立した。次いで、(2)大量供給が可能となったキラル窒素供給源であるAを用い、前年度までに一部成功した3置換ピペリジン誘導体の高立体選択的ワンポット不斉アザ電子環状反応の一般性を検討した。その結果、様々な置換様式を持つインドール化合物も含め8例において望む結果を得、そのためにはキラル窒素供給源としてのAの必要性および基質に嵩高いt-ブチルエステルを用いることが本質的であることを発見し、その一般化に成功した。この合成法を用いて、以前に行った(-)-コリナンテイドールのより効率的全合成を完成させた。この過程において、(3)構造を一部変化させることにより、ピペリジン環状の置換基の立体化学を制御できる新たな手法を見出した。一方、(4)3置換ピペリジンを核とするインドールアルカロイド、20-エピウレインの全合成を達成した。これは、同様なワンポット反応で得られる中間体において、Aに存在する水酸基の隣接基効果を利用した定量的な1,4-付加反応の実現に基づいている。これらの一方で、(5)金属触媒によるアザ電子環状反応促進効果を検討した。これは、キラル金属触媒による不斉アザ電子環状反応開発への第一歩である。検討の結果、中間体のアザトリエンを観測できる反応系を構築できた。しかし、金属触媒による反応促進効果を認めるに到っておらず、さらに検討が必要である。多置換シクロヘキサンが多様な天然有機分子の単位構造であると同様に、多置換ピペリジンは、インドールを含む多様なアルカロイドの単位構造と位置づけられる。しかし、立体化学を制御した効率よい合成法は確立されていると言えない。申請者らは、加水分解酵素阻害機構解明から学んだ素早いアザ電子環状反応を基盤として、不斉転写基として働くキラル窒素供給源を開発し、軌道の回転選択性を実現することにより高選択的不斉アザ電子環状反応を実現している。これは、アザトリエンを段階的に形成させた後、キラルアミンと反応させたものである。このような背景の下、本年度は以下の、3項目について成果をあげることができた。(1)ワンポット反応による立体選択的2,4,6-置換ペリジン不斉合成の実現:鎖状オレフィンおよび様々な複素環を持っビニルメタル、アルデヒド基を持つビニルヨウ素化合物、キラル窒素供給源の三者を「混ぜて加熱する」だけの操作により、2ヶ所での立体化学を制御しながら4ヶ所での結合形成に成功した。ここで複素環として、ベンゼン、チオフェン、キノリン、2位置換インドール、3位置換インドール化合物で実現させた。(2)ピペリジン2,4,6位での立体制御:不飽和エステルが存在する4位において、また、アミノアセタールを形成している6位において、前者は2種類の還元反応により、後者はアルキル化剤の選択により各々立体制御に成功した。(3)これらの結果を基にして、2,4,6-置換ピペリジンを基本骨格とするインドリチジンアルカロイド、デンドロプリミンの不斉合成を達成した。さらに、5-および7-エピデンドロプリミンの立体選択的不斉合成も実現することができた。今後、アルカロイド合成における新規合成戦略へと展開したい。多置換キラルシクロヘキサンが多様な天然物の単位構造であるのと同様に、多置換キラルピペリジンは、インドールを含む多様なアルカロイドの基本的な単位構造と位置づけられる。特に後者は、特徴ある医薬品のファーマコアーとして最近大きな注目を集めているが、立体化学を制御した不斉合成法は未だ確立されているとは言えない。我々は先に、sp^3不斉を基軸として軌道の逆施的回転の方向を制御することにより、不斉6π-アザ電子環状反応を開発している。すなわち、3置換ビニルヨウ素化合物、芳香環を持ったビニルスズ化合物、独自に開発した光学活性なアルキルアミノインダノール誘導体の三者からアザトリエンを形成させ、これの不斉アザ電子環状反応を経て2,4,6-置換ピペリジンの立体選択的不斉合成を実現した。これら研究のさらなる展開として、今年度は以下の成果を得た。(1)4置換ビニルヨウ素化合物とインドール環を持ったビニルスズ化合物から、インドール環の2位および3位にアザトリエンを形成させ、その不斉アザ電子環状反応における立体選択性を検討した。その結果、インドールの2位にアザトリエンがついた場合は3位の場合と異なり、1位置換基の影響が不斉アザ電子環状反応の立体選択性に大きく影響することを明らかにした。この様な知見の下に、3カ所での立体化学を制御した不斉アザ電子環状反応を実現し、2,4,5,6-置換ピペリジン誘導体の立体選択的合成に成功した。

次いで、(2)確立した2,4,5,6-置換ピペリジン誘導体合成法を用いて、一炭素の増炭、インダノール基の除去、プンメラー反応によるC環の構築、官能基変換を経て、(-)-コリナンテイドールの不斉全合成を達成した。さらに、(3)分子内6π-アザ電子環状反応によるピリジン環形成について検討し、基礎的な知見を得ている。本研究は、加水分解酵素阻害機構の解明から学んだ6π-アザ電子環状反応を発展させ、新たな効率よいアルカロイド合成戦略へ展開し、これを確立しようとするものである。すなわち、前年度までに速度論的支配の下に、sp^3不斉を基軸として軌道の逆旋的回転の方向を制御することにより、立体選択的不斉6π-アザ電子環状反応を実現している。本年度はこれを、(1)3置換オレフィンを含む2種類の基質、キラル窒素源、カップリング触媒の4者をワンポットで混ぜ加熱することで、熱力学的支配の下に軌道の逆旋的回転の方向を規制した結果として、2ヶ所での立体化学を制御しながら4ヶ所での結合形成を一挙に実現することに成功した。生成物はキラルピペリジン等価体であり、これから2,4,6-置換ピペリジンの不斉合成を行っている。次いで、(2)原料の1つであるビニルスタナン化合物を、ビニルビススタナンを用いて非常に効率よく供給する合成法を確立した。このように新たに開発した合成法を用いて、(3)インドールアルカロイドである7-エピデンドロプリミンの極めて効率よい不斉全合成を達成した。またさらに、(4)4置換オレフィンを原料として用いたワンポット不斉アザ電子環状反応に成功し、3ヶ所での立体化学を制御しながら4ヶ所での結合形成を一挙に行うことができた。これは嵩高いエステル基と、嵩高いキラル窒素供給源を用いた成果である。しかし、まだその一般性については今後の検証が必要であり、またコリナンテイドールの不斉全合成への適用を図りたい。一方、ワンポット合成法の展開として、(5)窒素源としてメタンスルホニル基を用い2種類の基質、カップリング触媒の4者を混ぜて加熱することにより、イミン形成、Stilleカップリング、アザ電子環状反応、アミン塩基の添加による芳香環化の4種の反応をワンポットで行った。これは2-アリールピリジンの新しい効率よいワンポット合成法である。今後この合成法を固相合成へと発展させたい。本研究は、酵素阻害機構から学んだ不斉アザ電子環状反応を、多置換ピペリジンを核構造としたアルカロイド類の新たな合成戦略として確立しようとするものである。まず、(1)ワンポット不斉アザ電子環状反応を様々な基質に対して高い立体選択性で実現するためには、イソプロピル基を有した7-イソプロピルーシスーアミノインダノール(A)の簡便な供給が必要となる。2-イソプロピルフェノールを原料としナザロフ反応を鍵として、中間体の精製を極力必要としないAの合成法を確立した。次いで、(2)大量供給が可能となったキラル窒素供給源であるAを用い、前年度までに一部成功した3置換ピペリジン誘導体の高立体選択的ワンポット不斉アザ電子環状反応の一般性を検討した。その結果、様々な置換様式を持つインドール化合物も含め8例において望む結果を得、そのためにはキラル窒素供給源としてのAの必要性および基質に嵩高いt-ブチルエステルを用いることが本質的であることを発見し、その一般化に成功した。この合成法を用いて、以前に行った(-)-コリナンテイドールのより効率的全合成を完成させた。
水晶発振子と高感度蛍光顕微鏡を組み合わせた単分子DNA電気泳動法の研究

本研究では、DNAの分子量を測定する方法として、新たに水晶発振子と高感度蛍光顕微鏡を組み合わせたDNA1分子の電気泳動の超微量直接観察法を開発することを目的とした。今年度の実験では、高感度蛍光顕微鏡によるDNAの超微量直接観察法の確立と水晶発振子への電気泳動用電極の加工法の検討を行った。1.カチオン性界面に固定化されたDNA分子の電気泳動を確認するために、ガラスを基板とした、くし形電極上に、カチオン性脂質ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイドの気水界面単分子膜1層をラングミュアー-ブロジェット法により累積した。2.1kbpから100kbpのDNAフラグメントの希薄水溶液から、修飾くし形電極上に静電相互作用によりDNAを固定化した。3.固定化しDNA孤立分子を、蛍光色素YOYOで染色して、画像処理装置を組み合わせた高感度蛍光顕微鏡で観察した。さらに原子間力顕微鏡による観察も行った。4.くし形電極に数ボルトから数十ボルトの静電圧を印可して、DNA分子の陽極への移動を観察した。水溶液の塩強度およびpHを種々変化させてもDNA分子の移動は観察されなかった。おそらく、単分子膜表面の4級アンモニウムとDNAのリン酸の結合が強すぎるためと考察される。そのためDNAの界面への結合を弱くする、例えば、単分子膜に非イオン性脂質を添加してカチオン密度を下げる、もしくは4級アンモニウム塩脂質の代わりに1級アミン脂質を使用する、ことが改善策として期待される。5.水晶発振子上に、電気泳動用電極を金のスパッタリング法により作製を試みた。しかし、このために入手した水晶発振子基板の直径が、1.5cmと小さかったために電気泳動用電極の作製は困難であった。スパッタリング法による電極作製には直径は3cm以上必要であることがわかった。
２０１０年夏のロシアブロッキングの成因，予測可能性と日本の猛暑への影響の解明

2010年夏季にロシア上空で出現した長寿命のブロッキング高気圧の維持メカニズムと予測可能性について解析を行った。その結果、このブロッキング高気圧の維持には、次の2つの異なるメカニズムが重要であることが明らかになった。まず、ブロッキングの予測精度が明瞭に悪化した7月下旬では、ブロッキングの上流側に存在した気圧の谷に伴う対流圏上層での水平発散が最も重要であった。一方、8月初旬では、ユーラシア大陸西部の対流圏上層に存在する気候学的な水平収束場に高気圧性偏差が重畳することで生ずる渦度強制が重要であった。これらの2つの維持メカニズムは、このブロッキングに特有のものであることも示された。2010年夏にロシアで生じた長寿命ブロッキングの形成・維持・減衰メカニズムと予測可能性の解明を目指し,以下の研究を実施した.1.気象庁作成のJRA-25/JCDAS再解析データセットを用いて,2010年夏にロシアで生じた長寿命ブロッキングの形成・維持・減衰メカニズムについて解析した.特に,準定在性ロスビー波(低周波擾乱)がブロッキングの形成・維持に果たした役割を定量的に分析した.2.ヨーロッパ域及びロシア域でブロッキングが発生していた2010年7月から8月までの期間について,気象研究所大気大循環モデル(AGCM)を用いて以下の仕様でアンサンブル予報実験を実施した.まず,積分初期時刻は6時間毎とし,実際の海面水温分布をAGCMに与える.また,時間積分の期間は初期時刻より40日間とした.これら一連の積分結果から,初期時刻が5日間毎の20ランを一つのアンサンブル予報として取り扱い,毎週1回しか実施されない気象庁1ヶ月アンサブル予報を補完するデータセットを作成した.この予報実験結果を解析することにより,2010年夏のロシアでの長寿命ブロッキング発生期間における予測可能性の変動を明らかにした.3.ブロッキング発生期間で特にブロッキング発生領域の予測可能性が低かった期間について,気象庁1ヶ月アンサンブル予報の全メンバーの予測結果を用いた詳細な解析を行った.この解析では,Takemura and Mukougawa (2010)で用いた解析手法を用いて,ブロッキングの予測に影響を与えた初期擾乱を求めた.その結果,ブロッキング領域のすぐ上流のイタリア付近での低気圧性循環の強さがブロッキング強度と統計的に有意に関連していることが示された.また,両者の関係が有意な期間は数日以内でありごく短期間であることも示された.本研究では、JRA-25/JCDAS再解析データ、気象庁現業1か月アンサンブル予報データ、及び、気象研究所/気象庁統一大気大循環モデルによるハインドキャスト予報実験データなどの解析により、2010年夏季にロシア域で発生した長寿命ブロッキングの形成維持メカニズムと予測可能性の解明を目指している。今年度は、まず、ロシアブロッキング期間中における詳細な予測可能性変動を明らかにすることができるように、気象研究所のスーパーコンピュータシステムに、育成モード法(Breeding of Growing Mode(BGM) method)プログラムを新たに移植し、BGM法で得られた初期摂動を用いて、一日毎に初期時刻を変えて、アンサンブル再予報実験を実施できる気象研究所アンサンブル予報システム(MRI-EPS)の作成に取り組み、年度内に完成することができた。この完成した、MRI-EPSの動作試験を実施するため、成層圏突然昇温現象を引き起こした2009年の顕著な冬季のブロッキング事例について再アンサンブル予報実験を実施し、MRI-EPSが正しく動作することを確認した。また、2001年10月から2013年3月までの期間について、MRI-EPSを用いて、毎日25モードの初期摂動を作成した。一方、2010年6月1日から8月15日までの期間について、海面水温を平年値で与えて予報実験を6時間毎に実施し、海面水温偏差がロシアブロッキングの維持や予測可能性に与える影響について解析しうる予報データの整備を完了した。本年度は、最も高度場偏差の大きかったロシアブロッキング(2010年7月下旬2010年8月中旬)に着目し、その持続メカニズムと予測可能性を明らかにするために、JRA-25/JCDAS再解析データ、気象庁現業1か月アンサンブル予報データ、及び、気象研究所/気象庁統一大気大循環モデルによるハインドキャスト予報実験データを用いて詳細に解析し、次の結果を得た。(1)7月末のロシアブロッキング持続期の予測精度が、その前後の時期と比べ特に悪化することが分かった。このような持続期における予測精度の顕著な悪化は、ブロッキングの予測可能性に関する先行研究では示されていない。従って、2010年夏季のロシアブロッキングの予測可能性変動は特異であったことが分かる。

(2)7月末のロシアブロッキングの発達には、その上流域において降水に伴う非断熱加熱により強化された対流圏上層での水平発散が重要な役割を果たしていたことが示唆された。(3)8月上旬にロシアブロッキングは再発達したが、この時期のロシアブロッキングの維持・強化には、夏季の気候場のユーラシア大陸西部(ギリシャ付近)における対流圏上層の強い収束域に、ブロッキングに伴う負の相対渦度偏差が存在したことにより生じた、渦管の伸張に伴う負の渦度強制が最も重要であることが示された。このブロッキング維持メカニズムは、2010年夏季のロシアブロッキングに特有なものであることも、他のブロッキング事例との比較から明らかになった。ロシア域のブロッキングの予測可能性について今年度予定していた解析をほぼ実施することができた.また,気象研究所AGCMを用いたアンサンブル予報実験も一部期間を除き実施することができた.25年度が最終年度であるため、記入しない。2010年夏季にロシアで生じた長寿命ブロッキングの特異な維持機構について解明することができた。また、北大西洋海面水温分布(SST)を平年値で与えて予報実験を実施できるように、気象研究所大気大循環モデル(AGCM)を改変することができた。(1)今年度実施できなかった2010年6月中を初期値とするアンサンブル予報実験を今年度と同じ実験設定で実施する.(2)移動性高低気圧などの高周波変動成分についても解析を行い,高周波変動成分がロシア域ブロッキングの形成・維持に果たす役割を明らかにする.25年度が最終年度であるため、記入しない。北大西洋海面水温偏差がロシアブロッキングの形成維持に果たす役割の解明を明らかにするため、北大西洋海面水温分布を平年値で与えてアンサンブル予報実験を実施し、その結果を詳細に解析する。
最終分化細胞の前駆細胞への転換-幹細胞を標的としない組織再生の試み-

p53およびRBがん抑制遺伝子によって制御される経路は、最終分化細胞の分化と増殖抑制に重要な役割を担っている。そこで本研究は、最終分化細胞の脱分化と再増殖を誘導するため、これらの二つのがん抑制経路におけるARID(AT-rich interaction domain) DNA結合タンパク質DRIL1およびDRIL2の役割を解析した。その結果、(1) DRIL1はp53と協調的に働いて細胞周期停止に関与するp21/WAF1の転写活性化を活性化すること、(2) DRIL1およびDRIL2はE2F標的遺伝子の転写活性化と細胞増殖において重要な役割を担っていること、さらに(3) DRIL2の発現が骨分化に必要であることが分かった。さらに最終分化細胞の脱分化と再増殖を誘導するためには、DRIL1あるいはDRIL2をノックダウンに加えて、p53およびRBの機能を抑制する必要があることが示唆された。以上の知見は、最終分化細胞の前駆細胞への転換において重要な知見をもたすと考えられる。最終分化をした細胞は細胞周期のGO期に不可逆的に停止しており、もはや分裂しないと考えられている。この様な細胞の性質の変化に関与しているエピジェネティックによる遺伝子発現の制御を改変する手法は知られていない。そこで本研究は、組織中の最終分化した細胞の増殖能を活性化し、盛んに分裂する前駆細胞に転換させることを試みる。具体的には、核マトリクス結合因子DRIL1の発現を一過性にコントロールすることにより、最終分化細胞におけるエピジェネティックな増殖抑制制御を解除し、増殖能の高い前駆細胞に転換することを目指す。DRIL1の機能解析を中心におこなった結果、DRIL1の過剰発現によってp53およびRB癌抑制遺伝子に制御されている遺伝子群の活性化が起こることが分かった。この事実は、DRIL1が最終分化細胞の増殖抑制や細胞死に関与している遺伝子の発現制御関与していることを示唆している。そこでsiRNAあるいはshRNAを発現するアデノウイルスベクターを用いてDRIL1の発現を抑制(ノックダウン)し、p53およびRB標的遺伝子の発現変化を調べたが、有意な変化は認められなかった。一方、DRIL1と類似したDRIL2がDRIL1と同様の機能をもっていることを示唆する結果が得られた。このことは本研究の目的を達成するためには、DRIL2の発現を抑制する必要があることを示唆している。そこで今後、DRIL2をノックダウンする系を確立し、クロマチンと核内高次構造との相互作用およびゲノムのエピジェネティックな修飾の変換についての検討をおこなう予定である。最終分化をした細胞は細胞周期のGO期に不可逆的に停止しており,もはや分裂しないと考えられている。昨年度までの結果から、本研究の目的を達成するためには、DRIL1と類似したDRIL2の発現も抑制する必要があることが示唆された。そこで今年度はsiRNAを用いてDRIL2をノックダウン(KD)する系を確立し、増殖抑制やアポトーシスに関与しているp53癌抑制遺伝子の機能に対する効果を検討した。その結果、(1)DRIL2のKDによってアポトーシス関連p53標的遺伝子の発現が転写レベルで抑制された。(2)さらにDRIL1とDRIL2の両方をKDすると、DNA傷害によるアポトーシスが明らかに抑制されることを見出した。以上の結果から、DRIL1とDRIL2はp53の機能に重要な役割を担っていること、本研究の遂行のためにはDRIL1とDRIL2を両方KDする必要があることが明らかとなった。現在、DRIL1、DRIL2単独およびその両方に対するsiRNAをヒト正常細胞に導入した後、種々の幹細胞培養条件下で培養し、未分化幹細胞あるいは前駆細胞への分化転換が起きるかどうかを調べている。本研究は、核マトリクス結合因子DRIL1の発現を一過性にコントロールすることにより、最終分化細胞におけるエピジェネティックな増殖抑制制御を解除し、増殖能の高い前駆細胞に転換することを目的としている。

本研究の目的を達成するためには、DRIL1と類似したDRIL2の発現も抑制する必要があることを昨年度報告した。そこで今年度は、もう一つの類似した遺伝子であるDRIL3も追加し、DRIL1/2/3に特異的なsiRNAによる発現抑制あるいはアデノウイルスを用いた過剰発現をおこない、DRIL1/2/3の機能を詳細に解析した。その結果、予想外なことにDRIL3の発現を抑制することが最も効果的であることが分かった。さらに最終分化細胞の前駆細胞への転換には、細胞増殖や細胞の生存を制御している癌抑制遺伝子p53およびRBの機能制御が重要である。そこでp53およびRBがん抑制経路におけるDRIL1/2/3の機能解析をおこなった。その結果、(1)DRIL1はp53による細胞周期停止に関与するp21/WAF1の転写活性化に重要な役割を担っていること(Lestari、et al.,2012)、(2)DRIL2とDRIL3はアポトーシス誘導に関与するp53標的遺伝子の転写活性化に重要であること、(投稿準備中)。(3)RBが抑制するE2Fの標的遺伝子の転写活性化にDRIL1およびDRIL2が重要であることが明らかになった(投稿中)。最後に、DRIL2の発現抑制は骨分化を阻害すること、DRIL3の発現抑制は間葉系幹細胞の増殖を促進することが示唆された。今後さらに解析を続けることにより、最終分化細胞の前駆細胞への転換法、あるいは未分化間葉系幹細胞の長期間培養法の確立など再生医療に有用な技術開発に寄与する可能性がある。
ラットリンパ浮腫モデルにおけるリンパ管静脈吻合前後の組織圧変化と病理組織学的検討

Lewisラット後肢において、下肢の皮下組織を輪状切除し、片側のリンパ浮腫モデルを作成した。作成前および作成後2週間後に、後肢周径、体積および組織圧を測定した。リンパ浮腫モデル作成前におけるリンパ浮腫作成肢における測定値の平均値は、周径7.3±1.2cm、体積8.4±5.7ml、組織圧10.5±2.9mmHgであった。モデル作成後2週間では、周径7.2±2.1cm、体積10.4±3.8ml、組織圧12.5±3.1mmHgであった。体積および組織圧はリンパ浮腫モデル作成後に増加を認めた。平成21年度は、LEW/CrlCrljラットのオスおよびメスの後肢において、リンパ浮腫モデルを作成した。具体的内容しては、ラット下肢の皮膚、皮下腫瘍を一塊としてぐ後肢を取り囲むように全周でこれを切除した。この際、顕微鏡に集合リンパ管が確認できるものは6-Onylon糸で結紮し、後日施行する顕微鏡下リンパ管吻合の際に同定できるようマーキングをおこなった。また、この手法により、術後1週間、2週間、3週間後に後肢の周径および容積を測定し健側よりも拡大していることを確認してリンパ浮腫モデルが作成されていることを証明した。この研究成果の意義とて、平成22年度に予定している、リンパ浮腫モデルのラット後肢における顕微鏡下リンパ管静脈吻合術前後で、組圧変化と病理組織学的検討をおこなう環境が整った。すなわち、平成22年度は、本方法で作成したリンパ浮腫モデにおいて、顕微鏡下リンパ管静脈吻合術を施行し、その周囲で組織圧の変化を確認し、症状の改善程度、改善度と組圧との関連、組織圧と病理組織学的進行度との関連を分析することを予定している。本年度の研究内容の重要性としは、まず、リンパ浮腫研究のための動物モデルを確立したことである。次に、動物モデルが作成されたことで、臨床究では実施困難な侵襲的検査であるリンパ浮腫における組織圧測定および病理組織学的検査が容易となったことでる。最後に、動物モデルで顕微鏡下リンパ管静脈吻合のモデルを作成できると思われ、これまで基礎的研究がほとんなされていない顕微鏡下リンパ管静脈吻合の治療機序を解明できるものと思われる。Lew/CrlCrljフットのオスの後肢において、組織輪状除法により、リンパ腫モデルを作成した(n=20)。健側およびリンパ浮腫作成側において後肢周径、体積、組織圧を測定した。1週間後、リンパ浮腫作成側では後肢周径、容積、組織圧の増加を認めた。また、輪状切除の際に集合リンパ管を確認できたものは6-Onylon糸でマーキングし、後におこなう顕微鏡下リンパ管吻合術に備えておいた。しかしながら、こうして作成したリンパ浮腫モデルにおいて、顕微鏡下リンパ管吻合を試みたが、顕微鏡下にリンパ管を確認してリンパ管静脈吻合が可能であったのは2例のみであった。リンパ吻合後の治療効果(周径、容積、組織圧変化および病理組織学的効果)を統計学的に検討する予定であったが、母数が少ないため、組織圧および病理学的検討のみおこなった。組織圧は、リンパ浮腫作成後に有意に上昇を認めた。一方、リンパ浮腫モデルの皮下脂肪織およびリンパ管静脈吻合後の皮下脂肪織とでは病理学的に明らかな変化は認めなかった。健側およびリンパ浮腫作成前と比較すると、リンパ浮腫作成後の集計および容積は有意に増加していた。研究の意義としては、まずはラットリンパ浮腫モデルの追試を確認した。次に、ラットにおいてリンパ管静脈吻合の手技を試行した。さらに、実際の臨床においては実施困難な組織圧測定および病理細織学的検討を行い、特に組織圧はリンパ浮腫モデルにおいて上昇するという知見を得た。