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年少者日本語教育における日本語教材、教授法および教育行政システム構築に関する研究

本研究は日本語を第二言語として学ぶ子どもたちへの日本語教育に関する教材、教授法、および教育行政システムの構築について研究したものである。本研究では、川上が開発した「JSLバンドスケール」を使って、これらの子どもたちの日本語能力の把握と、その結果をもとにどのような教材を、どのような方法を使って日本語指導を行うかについて研究を行った。また、その成果を踏まえ、教育行政とどのように連携し、これらの子どもへの日本語教育を行うかについても研究を行った。その結果は、著書、『「移動する子どもたち」と日本語教育-日本語を母語としない子どもへのことばの教育を考える-』(川上郁雄編、2006・明石書店)として刊行した。また、教育行政との連携としては、2007年度、東京都目黒区教育委員会および三重県鈴鹿市教育委員会と早稲田大学日本語教育研究科の間で協定を結んだ。その内容は、「JSLバンドスケール」を使って、JSL児童生徒の日本語能力を把握することと、そのことをもとに日本語指導を進める専門的教員として「日本語教育コーディネーター」を配置することである。これらは、2008年度からスタートし、成果が期待されるところである。本年度は、3年前から開発している「JSLバンドスケール」を使って、JSL児童生徒の日本語能力の把握を行った。主に東京都新宿区内の小中学校に在籍するJSL児童生徒を対象とした。特に、新宿区立大久保小学校では、2004年7月のパイロット調査および11月、2005年2月に継続調査を行い、JSL児童の日本語能力の把握を行った。この調査は日本語能力を把握するだけでなく、把握した結果をもとに学校の教員等との協議を行い、どのような指導を行うのがよいかを検討することも目的としており、大学と学校の連携の可能性を検討した。この「JSLバンドスケール」の検討と普及をかねて、「JSLバンドスケール・ネットワーク」を立ち上げ、3回の検討会を行った。ここには、都内だけでなく、千葉、名古屋、神戸、広島からも教員、研究者を招待し、研究を行った。その検討と討議は「JSLバンドスケール」の開発にとって有益であった。また仙台市では宮城教育大学で「現職教育講座」を研究分担者の市瀬とともに実施した。仙台、宮城県のJSL児童生徒とその指導を行っている教員等との協議も有益なものであった。さらに、2005年2月には、川上・市瀬はオーストラリアのESL教育を調査するためにシドニーを訪問し、シドニー工科大学のジェニファー・ハモンド教授をはじめ、研究者および教育機関を訪ね、これまでの研究成果を入手するとともに、日本におけるJSL児童生徒の日本語教育について多くの示唆を得た。来年度は、これらの成果を踏まえて、さらに研究を続けていきたいと考えている。昨年度からの継続として「JSLバンドスケール」に関する調査および研究を中心に、学校現場の課題の追求と現状に必要な教授法および教材の検討を行った。本年度は主に以下の研究活動を行った。1)研究会...7月、11月に宮城教育大学を会場に宮城県内のJSLの子どもたちに関わる関係者による研究協議を行った。2)研究集会...11月および2月に「年少者日本語教育学を考える会」と合同で研究集会を行った。いずれも100人を超える参加者があった。3)調査研究A...新宿区立大久保小学校における研究協議に川上が助言者として参加し、課題について小学校の教職員と協議を重ねた。また同時に、「JSLバンドスケール」(小学校編)を使った日本語能力把握の調査を実施した。4)調査研究B...神奈川県立愛川高校に在籍するJSL生徒の日本語能力について、「JSLバンドスケール」(中学・高校編)を使った調査を行った。調査結果は報告書としてまとめ、高校側へ提供するとともに、高校での講演会および報告会を実施した。5)海外調査...オーストラリアのESL教育および日本語教育について現地調査を行った。また、その際、2007年に行う国際研究集会に招聘する関係者と協議を行った。6)研究成果発表...日本語教育学会春季大会ではパネルセッション「年少者日本語教育の4領域から「ことばの力」を捉える-「書くこと」を例に-」に参加、ジャンル・アプローチについて発表した。また日本語教育学会秋季大会ではシンポジウムで「バンドスケール評価」について発表した。

昨年度からの継続として「JSLバンドスケール」に関する調査および研究を中心に、学校現場の課題の追究と、教授法および教材の検討を行った。本年度は主に以下の研究活動を行った。1.研究会...7月、11月、3月に宮城教育大学、東北大学において、宮城県内、および東北地区のJSL児童生徒の日本語教育について研究協議を行った。また、東京では、11月に「年少者日本語教育学を考える会」を行った。JSLの子どもとして成長した方を招聘し、その話を聞き、研究協議を行った。2.調査研究...9月に新宿区内の中学校、また神奈川県立高校で、さらに、10月から11月には目黒区の小中学校に在籍するJSL児童生徒の日本語能力の調査を、「JSLバンドスケール」を使って行い、その報告書を作成した。3.成果発表と国際研究集会...5月に日本語教育学会春季大会(東京外国語大学)で「高校レベルのJSL生徒の日本語教育の実態とその背景にあるもの-「JSLバンドスケール」による調査を踏まえて」、また8月に日本語教育国際研究大会(ニューヨーク・コロンビア大学)でパネル「言語マイノリティの子どもたちへの言語教育を考える:日本とアメリカの現状を踏まえて」を開催し研究成果を発表した。さらに、2月にオーストラリアおよびアメリカからESL教育の専門家を招聘し、国内のJSL教育の専門家とともに、国際研究集会「「移動する子どもたち」を言語教育-ESLとJSLの教育実践から」を開催し、研究成果にもとづく研究協議を行った。この国際研究集会には日本全国から400名の教育関係者や一般市民が参加した。本研究は日本語を第二言語として学ぶ子どもたちへの日本語教育に関する教材、教授法、および教育行政システムの構築について研究したものである。本研究では、川上が開発した「JSLバンドスケール」を使って、これらの子どもたちの日本語能力の把握と、その結果をもとにどのような教材を、どのような方法を使って日本語指導を行うかについて研究を行った。また、その成果を踏まえ、教育行政とどのように連携し、これらの子どもへの日本語教育を行うかについても研究を行った。その結果は、著書、『「移動する子どもたち」と日本語教育-日本語を母語としない子どもへのことばの教育を考える-』(川上郁雄編、2006・明石書店)として刊行した。また、教育行政との連携としては、2007年度、東京都目黒区教育委員会および三重県鈴鹿市教育委員会と早稲田大学日本語教育研究科の間で協定を結んだ。その内容は、「JSLバンドスケール」を使って、JSL児童生徒の日本語能力を把握することと、そのことをもとに日本語指導を進める専門的教員として「日本語教育コーディネーター」を配置することである。これらは、2008年度からスタートし、成果が期待されるところである。
新しい数学基礎教育のための Precalculus 教科書作成

平成29年度においては、先行するCalculus教科書作成プロジェクトと合同の編集会議を、2回の日本数学会秋季分科会(山形大)及び年会(東京大)に加えて、大阪(8月)及び富山(2月)の計4回、それぞれ1泊2日の日程で開催した。Precalculus教科書作成プロジェクトにおいては、編集責任者(藤本)による金沢工業大学での長年に亘って蓄積された講義資料(予習ノート、演習課題、小テスト)に基づいて第1章第4章の原稿素案の作成に努めた。基礎数学について、我が国においても既にいろいろな教科書が出版されているが、数学の教科書の記述においては、数学者による文体は必ずしも一般学生、特に初年次学生にとって読み易いとは言えない。透明感のある論理的な文章は数学書にとっては大切な要素ではあるが、それのみでは一般学生は違和感を感じ、また具体的な応用例とinteractしない。いろいろな応用例題を扱いながら、学生が「自然な感覚で読み進めることが出来る」ような教科書は、外国の書物においては良書が多いが、日本ではあまり書かれてこなかった。日本の数学専攻の理学部及び大学院における教育が数学研究者育成に重点が置かれ、応用や教育の側面についてのトレーニングが軽視されてきた結果であると思われる。我々のCalculus教科書と共に、真に学生の為の教科書を目指している。また、我が国ではPrecalculusをリメディアル教育と称して、補習的に扱う傾向にあるが、諸外国のように正規の数学基礎教育科目として定着させ、順次的カリキュラム構築の礎としたい。先行するCalculus教科書の第III巻の執筆、第I,II巻の校正作業と並行する形で進めている関係で、Precalculusの方が後手に回される傾向があったことは否めない。また、研究分担者には国立公大の教員が多く、Precalculus(基礎数学)を実際に担当した教員が少なく、執筆の手掛かりがつかめない編集委員が見られる。次年度においては、編集責任者(藤本)が全体を通して執筆・編集する予定で、前期は第14章、後期は57章を仕上げる予定である。近年、社会の国際化と大学の大衆化に対応する為に、我が国の大学教育は「質保証」に向けた変革を迫られている。日本数学会の下部組織である「工学系数学基礎教育研究会」ではH25年度より科研費プロジェクト「新しい工学系数学基礎教育のためのCalculus教科書作成」において、国際標準に準拠した論理的思考力と応用力養成を重視した教科書作成を進めてきた。しかし、推薦入学者が増加する傾向の中で、大学入学時点において数学基礎力がこの標準コースを受講する基準に満たない学生が一定の割合で存在する。このような状況において、卒業生の質を保証する評価法を取り入れた順次性のある世界標準の教育システムを再構築する必要がある。この科研費プロジェクトでは、この様な学生層及び広く工学以外の専攻や文系の学生をも対象に、大学数学の立場から数学の基礎的な知識と論理的思考力・応用力を養成する本格的なPrecalculusコースの教科書作成を目的としている。この教科書の特色は次の通りである。1.高校数学の復習という立場でなく、正規の科目として大学数学入門という立場から大学数学の考え方や論理的思考に慣れさせ、現在作成中の標準Calculus教科書への接続に留意する。2.高校までの暗記型の学習から大学の論理的思考力による自ら考える自立型学習に変換を促す。3.諸分野への豊富な応用例を用いて、学習の動機付け、概念の説明や応用例題・演習を数学の学習の流れの中に無理なく融合させ、数学とその応用に興味を持たせる。我々教科書編集委員会のメンバーはそのまま先行するCalculus教科書プロジェクトの編集委員を兼ねている。この為、初年度においてはCalculus教科書を完成させることに重点を置いたために、Precalculus教科書の執筆が遅れ気味になったことは否めない。Calculus教科書は本年度秋に出版の予定であるので、本年度後半からPrecalculus教科書の執筆に専念できると思われる。先行するCalculus教科書作成プロジェクトにおいて、既に世界各国の数学基礎教育カリキュラムと教科書を調査済みであるので、主なPrecalculus教科書を科研費や校費を用いて購入した。現在、各編集委員は担当のPrecalculus教科書の章を執筆中である。

また、我が国ではPrecalculusをリメディアル教育と称して、補習的に扱う傾向にあるが、諸外国のように正規の数学基礎教育科目として定着させ、順次的カリキュラム構築の礎としたい。先行するCalculus教科書の第III巻の執筆、第I,II巻の校正作業と並行する形で進めている関係で、Precalculusの方が後手に回される傾向があったことは否めない。また、研究分担者には国立公大の教員が多く、Precalculus(基礎数学)を実際に担当した教員が少なく、執筆の手掛かりがつかめない編集委員が見られる。各章の執筆担当は以下の通りである。第1章数と式の計算(藤本)、第2章関数とグラフ(藤本)、第3章指数関数と対数関数(堤)、第4章三角関数(井上)、第5章微分積分入門(柳)、第6章確率と統計(藤本)、第7章ベクトルと行列・行列式(戸田)本年度、研究代表者の藤本は教育義務のない研究職にある為に多目に分担している。また、各章の執筆者によって執筆スタイルの差異が見られることが予想されるので、編集責任者(藤本)が全体を通して書き直す作業が必要になる。この機会に一気に教科書編集のペースを上げたい。出版社はCalculus教科書と同じく共立出版で、平成30年度の出版を目指している。次年度においては、編集責任者(藤本)が全体を通して執筆・編集する予定で、前期は第14章、後期は57章を仕上げる予定である。春と秋の日本数学会において開催する「工学系数学基礎教育研究会」の講演者旅費を予定していたが、春の学会は東京開催であった為にこの為の旅費を使わずに残った。また、物品購入を予定して次年度に繰り越した部分もある。ほぼ予定通りに使用した。少額が残ったが、次年度に使用する予定。平成29年度の研究会講演者旅費や物品購入費として繰越す予定。Calculus教科書の先行試用のために、「スタンダード微分積分」(1変数微分積分の応用)(第II巻)のWORD原稿が共立出版社から300部限定出版された。
鼻副鼻腔手術における重畳表示型ナビゲーションシステムの研究

我々が開発した重畳表示型ナビゲーションを改良し精度を約1mmまで向上させた。レジストレーション方法をタッチ式とし、不適切なレジストレーション点は自動的に削除されるように改良した。1回/2ヶ月の頻度で臨床実験を施行し、重畳表示型ナビゲーションのデータを多く蓄積した。斜視硬性内視鏡における手術では、単眼ではあるが位置情報取得のための弯曲したプローベを使用し、上顎洞や前頭洞内における多くの臨床実験データを蓄積した。しかしながら斜視鏡に複眼のCCDを組み込むことは難しく、複眼の斜視硬性内視鏡の開発は困難であった。今後も複眼の斜視硬性内視鏡の開発を継続していく予定である。1)現在の重畳表示型ナビゲーションをより良いシステムに改良術中の難点としてナビゲーションとしての精度が、誤差が3mmとまだまだ大きい難点があった。しかしながらレジストレーション方法を顔表面をなぞるタッチ式に変更したことで、誤差が減少され誤差1mmまで改善した。2)複眼の斜視硬性内視鏡を開発単眼の斜視硬性内視鏡による臨床実験を施行し、斜視鏡による立体ナビゲーションシステムのデータを蓄積した。当年においては、斜視鏡に複眼のCCDを組み込むことはまだ困難であった。1)現在の重畳表示型ナビゲーションをより良いシステムに改良術中の難点として立体グラフィックモデルの遠近立体感が乏しいことがあったため、立体グラフィックモデルに格子線を入れ、以前より遠近立体感の向上を試みた。さらにナビゲーションとしての精度が、誤差が3mmとまだまだ大きい難点があった。そのため誤差が生じている原因と考えられるリファレンスポイントを削除することにより誤差の減少を試みた。まだ誤差1mmまでは向上していないが以前より誤差を少なくすることができた。1)現在の重畳表示型ナビゲーションをより良いシステムに改良レジストレーション方法を、顔表面をなぞるタッチ式とし、不適切なレジストレーション点は自動的に削除されるように改良した。これにより誤差が減少されナビゲーションとしての精度を向上させた。2)斜視鏡下手術における位置情報取得のためのプローブを作成サブモニターにて手術操作部位の位置情報が得られるナビゲーションも併用しているが、今までは直のプローブしかないため上顎洞や前頭洞内における手術操作部位の位置情報は得られないでいた。本年度、弯曲したプローベ(弱弯および強弯の2種類)を作成することにより、上顎洞や前頭洞内の手術操作部位の位置情報が得られるようになった。3)複眼の斜視硬性内視鏡を開発単眼の斜視硬性内視鏡による臨床実験を施行し、斜視鏡による立体ナビゲーションシステムのデータを蓄積した。本研究は、我々が開発した重畳表示型ナビゲーションシステムを発展させ、斜視硬性鏡においても内視鏡下鼻副鼻腔手術をより安全に施行できるようにすることを目的としている。重畳表示型ナビゲーションは、隔壁の奥の構造が透過表示され、病変・危険部位の位置が直感的に把握できるようになっている。本研究成果により、内視鏡下鼻副鼻腔手術における手術操作の的確さを飛躍的にあげ、手術時副損傷を減少させることが期待できる。本年度では1回/2ヶ月の頻度で臨床実験を施行し、複眼直視硬性内視鏡における重畳表示型ナビゲーションのデータを多く蓄積した。斜視硬性内視鏡における手術では、単眼ではあるが昨年度に作成した位置情報取得のための弯曲したプローベ(弱弯および強弯の2種類)を使用し、上顎洞や前頭洞内における多くの臨床実験データが蓄積できた。毎回、高次元医用画像工学研究所にてカンファレンスを行い、実験結果からの改良点などを話し合い、フィードバックしながら重畳表示型ナビゲーションを改良し精度も向上した。レジストレーション方法を、顔表面をなぞるタッチ式とし、不適切なレジストレーション点は自動的に削除されるように改良された。研究当初のステレオナビゲーションの術中誤差は34mmであったが現在は約1mmまで向上している。そのため最終目標である斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験は施行できていない。単眼の斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験は施行できており、複眼の斜視硬性内視鏡が開発できればすぐに重畳表示型ナビゲーションを導入できる状況である。そのうえで、これまでの研究成果を論文として報告する予定である。

今後も複眼の斜視硬性内視鏡の開発を継続していく予定である。1回/2ヶ月の頻度で臨床実験が施行できており、着実に重畳表示型ナビゲーションの臨床実験によるデータを蓄積できている。毎回、高次元医用画像工学研究所にてカンファレンスを行い、実験結果からの改良点などを話し合い、フィードバックしながら重畳表示型ナビゲーションを改良している。着実に重畳表示型ナビゲーションの改良は進み精度も向上しているが、斜視鏡に複眼のCCDを組み込むことはまだ困難であり、複眼の斜視硬性内視鏡の開発ができていない。そのため最終目標である斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験が施行できないでいる。単眼の斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験は複数回施行できており、複眼の斜視硬性内視鏡が開発できればすぐに重畳表示型ナビゲーションを導入できる状況となっている。鼻科学複眼の斜視硬性内視鏡を開発し、斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験を施行する。そのうえで、これまでの研究成果を論文として報告する。重畳表示型ナビゲーションの改良、臨床実験という点では、順調である。しかしながら複眼の斜視硬性内視鏡開発という点においては、やや遅れている。平成26年度の時点で斜視鏡に複眼のCCDを組み込むことができず複眼の斜視硬性内視鏡の開発ができなかった。そのため最終目標である斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験が施行できず、次年度使用額が生じてしまった。平成26年度は複眼の斜視硬性内視鏡を開発し、実際の患者において臨床実験を施行する。さらにこれまでの研究成果を論文として報告する。平成25年度はコンピュータ処理速度をあげ、手術操作に影響しないようタイムラグを減少させる。その上で、平成26年度までに複眼の斜視硬性内視鏡を開発し、実際の患者において臨床実験を施行する。平成27年度に複眼の斜視硬性内視鏡を開発し、斜視硬性内視鏡による重畳表示型ナビゲーションの臨床実験を施行する。複眼の斜視硬性内視鏡の開発において、開発が難航しておりまだ完成していない。そのため必要となる予定であった物品の購入も止まっている。複眼斜視硬性内視鏡開発の進展があり次第、物品購入を進める。そして本年度内に、これまでの成果について論文として報告をする。また新しい知見、意見などを取り入れるために海外の学会にも積極的に参加し、意見交換をする。
AM-RAMP2 系による肝臓脂質代謝制御とメタボリックシンドロームにおける意義

アドレノメデュリン(AM)は、血管拡張作用をはじめ多彩な生理作用を有する内因性ペプチドである。AMの受容体活性調節タンパクであるRAMP2ヘテロノックアウトマウスの高脂肪食投与による肥満誘導モデルの解析と、脂肪細胞特異的なRAMP2ノックアウトマウスの作成・解析を行い、AM-RAMP2システムが脂質代謝制御とメタボリックシンドロームの発症および脂肪細胞の分化に関与することを示した。アドレノメデュリン(AM)は、血管拡張作用をはじめ、抗酸化作用、抗炎症作用、抗動脈硬化作用など多彩な生理活性を有する内因性ペプチドである。近年、動脈硬化および心血管疾患発症の原因としてメタボリックシンドロームの関与が注目されているが、メタボリックシンドロームの発症や病態におけるAMの意義は明らかでない。本研究では、AM-RAMP2システムによる肝臓脂質代謝制御とメタボリックシンドロームにおける意義を解明し、新たな治療法開発への展開をはかることを目的とした。平成24年度は、AMの受容体活性調節タンパクであるRAMP2に着目し、RAMP2floxedマウスと脂肪細胞特異的aP2Creマウスを交配して、脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスを新たに作成し、AM-RAMP2システムの脂肪細胞特異的な生理作用について解析を行った。普通食投与時において、脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して、体重の増加と白色脂肪組織重量の増加が認められた。また、白色脂肪細胞の肥大と白色脂肪組織への炎症性細胞浸潤の増加が見られた。白色脂肪組織の遺伝子発現解析より、脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスでは脂質代謝関連遺伝子の発現低下が認められた。以上の結果より、AM-RAMP2システムが脂肪細胞の脂質代謝制御に関与している可能性が示唆され、さらに詳細なメカニズムを解明することによりAM-RAMP2システムが治療法の有用な標的となるか明らかになると考える。アドレノメデュリン(AM)は、血管拡張作用をはじめ、抗酸化作用、抗炎症作用、抗動脈硬化作用など多彩な生理活性を有する内因性ペプチドとして注目されている。近年、動脈硬化および心血管疾患発症の原因としてメタボリックシンドロームが注目されているが、メタボリックシンドロームの発症や病態におけるAMの意義は明らかでない。本研究では、AM-RAMP2システムによる肝臓脂質代謝制御と、メタボリックシンドロームにおける意義を解明し、新たな治療法開発への展開をはかることを目的とした。平成23年度は、AMの受容体活性調節タンパクであるRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)を用いて、高脂肪食(脂肪含量32%)投与による肥満誘発モデルを作成した。RAMP2+/-は、野生型マウスと比較して、白色脂肪細胞の肥大と白色脂肪組織への炎症細胞浸潤の亢進が見られ、褐色脂肪細胞における脂肪蓄積が増加していた。さらに、RAMP2+/-は野生型マウスと比較して、インスリン抵抗性を示し、血中アディポネクチンの低下とレプチンの上昇を示した。またRAMP2+/-において、肝臓の炎症性サイトカインの増加と脂肪肝の増悪が観察された。以上の結果より、AM-RAMP2システムが、肝臓の脂質代謝制御とメタボリックシンドロームの発症に関与している可能性が示唆された。さらに詳細なメカニズムを解明することで、AM-RAMP2システムが治療法の有用な標的となるか明らかになると考える。RAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)を用いて、高脂肪食投与による肥満誘発モデルの解析を行った。RAMP2+/-は、野生型マウスと比較して、体重が増加し、インスリン抵抗性を示した。また、白色脂肪細胞の肥大と白色脂肪組織への炎症細胞浸潤の亢進が見られ、褐色脂肪細胞では脂肪蓄積が増加していた。さらに、RAMP2+/-は野生型マウスと比較して、脂肪肝の増悪が見られた。以上の結果より、AM-RAMP2システムが、肝臓の脂質代謝制御とメタボリックシンドロームの発症に関与することを明らかにした。平成24年度は、RAMP2+/-の高脂肪食投与実験の解析をさらに進めるとともに、脂肪細胞特異的aP2CreマウスとRAMP2floxedマウスを交配し、脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスを新たに作成して、AM-RAMP2システムの脂肪細胞特異的な生理作用について解析を行う。普通食投与時の脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスの表現型と機能解析を行い、さらに高脂肪食投与での変化についても検討する。新たに作成する脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスの飼育管理費、餌購入費に使用する。作成した脂肪細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスの表現型および病態学的解析を行うための試薬、抗体、消耗品の購入に使用する。また、分子生物学的解析および細胞生物学的解析を行うための試薬、細胞培養液、ディッシュなどの消耗品の購入に使用する。加えて、本研究課題で得られた研究成果を学会で発表するための旅費として使用する。
農林体験の内容及び時間的濃度が青少年の環境認識・景観認識・連帯意識に及ぼす効果

平成14年度は大学生を主とする1825歳の青年層を、平成15年度は高校生を被験者として試験調査を行い、それぞれの結果を分析するとともに、相互に比較検討した。試験調査はいずれも福岡県八女郡黒木町笠原地区の農林地及び農林業体験交流施設「四季菜館」を宿泊拠点とした。調査条件は共に、体験期間の異なる、「日帰りコース」、「1泊2日コース」、「2泊3日コース」の3条件で、被験者と日にちを違えて行った。また、実施に際してはいずれのコースとも、それぞれ半数ずつを、スギ・ヒノキ林の間伐のみの「単一作業」グループと、間伐に稲刈りや間伐材を用いた山道の階段工等を組合わせた「複合作業」グループに区分して行った。全ての被験者に対して、一連の体験作業プログラムの開始時と終了時にアンケート調査を行った結果、年齢層や体験時間、作業内容の差異にかかわらず、ほとんど全ての被験者が、このプログラムに参加したことや農林作業を体験したことに満足し、また、農林業や農山村の景観に対する認識が深まることや、考え方が変化することが明らかとなった。未知の参加者とごく自然に会話し、友達になれたとの回答も多数見られた。体験時間が長いほど、より農山村や農林業に対する興味やこだわりを持つ傾向が見られ、また、滞在期間を長いと感じなくなることも分かった。さらに、単一作業よりも、複合作業の方が疲労感の少ないことや農林業に対する興味がより高まる傾向が見られた。一方、青年層と高校生では以上の点に大きな差異はなかったが、高校生のほうが体力や興味の持続の点で、やや幼い傾向が観察された。本研究の結果から、農林作業を体験し、現場で生の情報に接することによって、青少年の農山村環境や農林業に対する認識が高まることや、他人との連帯を感じる喜びを得ること、今後の保全活動への参加意欲等も高まることなどが把握できた。このような農林体験プログラムを大学及び高校教育へどのように応用するのか、また、NGOの協力による支援・遂行システムのあり方等が、今後の課題として残された。さらに、中学生や小学生高学年への体験教育としての可能性、ならびに、その際の作業内容及び時間配分の適切性についても、追加の試験調査が必要と考えられた。本研究では、都市部に居住する農林業体験のない18歳から25歳までの青年を研究対象として間伐や階段工、稲刈り等の作業を体験させ、その体験期間、ならびに作業内容の違いにより、環境認識及び景観認識の深さ、そして充実感や連帯感等の波及効果の差異を把握するため、試験作業と共に前後のアンケート等の調査を実施した。調査方法は、体験期間の差異として、(1)日帰り、(2)1泊2日、(3)2泊3日の3区分を設定し、また、(2)及び(3)については、単一作業条件(間伐作業)と複数作業条件(間伐、稲刈り、階段工など)の2条件を設けた。被験者の募集は2002年6月から10月までチラシやポスター等により学内外に行い、(1)9名、(2)26名、(3)22名の被験者が得られた。調査時期は気候的に作業の行いやすい2002年10月11月の土日祭日に実施した。調査の結果として、まず同時掲載で被験者募集を行ったにもかかわらず、条件(1)は極めて少ない応募しか得られなかった。

これは、農林業体験が無くても、日帰りでは物足りないという意識が働いたものと推察され、宿泊型に人気がある事を示している。一方、被験者の68%が女性であり、また、79%が学生であった。農林業体験の有無については、58%が「ない」と答え、「ある」と答えた者も、そのほとんどが、小・中学校でのイモ掘り、稲刈り程度に過ぎなかった。アンケート調査の解析からは、体験期間の長いほど環境や景観認識及び充実感、ならびに連帯感が深まり、また、単一作業では充実感は深まるが環境認識に広がりは少なく、一方、複数作業では個々の作業時間や成果が少ないため、前者と比較し充実感は低いが環境認識は広がる傾向がみられた。全体的に農林作業体験に対して好評や満足感をもっており、都市部に生活する青年に対し農林業体験の機会を与えることと、その内容にかかわる効果について知見が得られた。平成15年度は高校生を被験者として行い結果を分析するとともに、前年度に行った1825歳の青年層を対象とする結果と比較検討した。試験調査は前年度同じく、福岡県八女郡黒木町笠原地区の農林地及び農林業体験交流施設「四季菜館」を宿泊拠点とし、調査条件も同様とした。いずれも40人の募集定員に対して、「日帰りコース」40名、「1泊2日コース」18名、「2泊3日コース」25名の応募となったことから、それぞれ半数ずつを、スギ・ヒノキ林の間伐のみの「単一作業」グループと、これに稲刈りや間伐材を活用した山道の階段工を組合わせた「複合作業」グループに区分して行った。いずれのグループも、一連の体験作業のプログラムの開始と終了時にアンケート調査を行った結果、体験時間や作業内容の差異にかかわらず、過半数の被験者がプログラムに参加したことや農林作業を体験したことに満足し、また、農林業や農山村の景観に対する認識が深まることや、変化することが明らかとなった。さらに、体験時間が長くなるほど、より農山村や農林業に対する興味やこだわりを持つ傾向が見られ、また、滞在期間を長いとも感じないことが分かった。また、単一作業よりも、複合作業の方が疲労感の少ないことや農林業に対する興味がより高まる傾向が見られた。一方、青年層と高校生では以上の点に大きな差異はなかったが、高校生のほうが体力や興味の持続の点で、やや幼い傾向が観察された。本研究の結果から、農林作業を体験し、現場で生の情報に接することによって、青少年の農山村環境や農林業に対する認識が高まることや、他人との連帯を感じる喜びを得ること、今後の保全活動への参加意欲等も高まることなどが把握できた。このような農林体験プログラムを大学及び高校教育へどのように応用するのか、また、NGOの協力による支援・遂行システムのあり方等が、今後の課題として残された。さらに、中学生や小学生高学年への体験教育としての可能性、ならびに、その際の作業内容及び時間配分の適切性についても、追加の試験調査が必要と考えられた。
生体試料中の酸化・還元物質の影響を受けない超高感度検出法の開発とその発展性の検証

過酸化水素を高感度に検出するための色素と金属の組合せ、また、それをより高感度に反応させるための至適条件を見出すことに成功した。ただし、目標とした測定感度は現行の検出技術の1540倍ほどにとどまり,目標とする100倍程の感度には到達できなかった。今後、更に感度を追求し、本法の高感度検出技術の有用性、応用性について検証を行う。高感度検出系の構築pH49までのレンジにおいて緩衝液を作成し各種金属(11種類)およびこれらと配位結合可能な金属キレータ(8種類)を用いて検出対象である過酸化水素との反応性について検討した。結果、現在までに幾つかの金属とそのキレータの間において過酸化水素を検出可能な組み合わせを見出すことができている。そのモル吸光係数は現行法の過酸化水素検出法である4-アミノアンチピリン-POD検出系と比べ約3倍ほどの感度を持っていた。引き続き組み合わせの検索を行うとともに構築した組み合わせのさらなる最適条件を見出し、実酵素を用いた検出の可能性について検証を行う。当初予定していた検出可能な金属と金属キレータの組み合わせについては目処が立った状況であるが、最終目的とする感度の面においてまた期待する値が得られていない。反応におけるさらなる至適条件を見出すことによりさらなる高感度化を目指す。また、当初予定していた再現性や定量検出可能限界などの基礎的な性能評価についても検証を行うことで本研究の目的である、新しい検出技術構築を目指す。過酸化水素の高感度検出系の構築を目指してpH,モル濃度の異なる様々な緩衝液を選択・作成し,これらを用いて各種金属・金属キレーターのそれぞれの濃度を変えながら過酸化水素と反応させ,より高感度に発色する組み合わせについて検討を行ってきた。その結果、前年度までに見出した金属・金属キレーターの組み合わせよりもさらに高感度に過酸化水素を検出可能な組み合わせを見出すことができた。この組み合わせは、従来の検出感度のおよそ10倍の感度を持つ。検出にあたり目的物質である過酸化水素が測定環境において不安定であっては、検出そのものが難しくなることを踏まえ、過酸化水素の安定性について検証を行った。その結果、反応環境は酸性側が至適な環境であるが、その環境においても測定対象である過酸化水素を検出するのに必要な時間内において十分な安定性を持つことが確認ができた。これらの条件をもとにして、本測定系の再現性、直線性などの基礎的な性能評価を行った。結果、いずれの基礎的性能評価においても問題なく、過酸化水素溶液を検体に用いた水溶液ベースにおける基礎的性能評価は良好であった。しかし、生体試料中には反応を妨害する物質が多く存在する。その代表的な物質が還元性を示すアスコルビン酸やビリルビンである。これらを用いて本法における妨害試験を行った。結果、これら還元性を示す物質により反応の妨害を大きく受けることが判明した。ある程度は予想の範囲内のことではあったが、その影響の回避策に現在苦慮しており、現時点での課題である。前年度までの検討において感度面においてまだ不十分な点が課題として残っていたが、さらに高感度に過酸化水素が検出可能な金属と金属キレータの組み合わせを見出すに至った。また、検出環境における測定対象部物(過酸化水素)の安定性も確認でき、本法における基礎的性能評価を得るに至った。しかし、生体試料中に含まれる還元物質の影響試験において、アスコルビン酸、およびビリルビンの影響を大きく受ける結果となった。この点を解消する方法を現在模索中であるが、解決には至っていない。現在,臨床検査領域における生体試料分析には,数多くの酸化酵素が用いられ,生成した過酸化水素,4-Aminoantipyrine,トリンダー試薬をペルオキシダーゼ(POD)により酸化縮合させ生成物の呈色程度を利用して検出する方法が用いられている。そのため試料中の酸化・還元物質の影響を強く受け,特に尿を試料とする際には測定に大きな影響を受けるなどの問題がある。そこで,本研究では,直接,過酸化水素(H2O2)を定量することにより,これら問題を回避し,かつ,金属および界面活性剤の添加により現行法のPOD発色法よりもさらに高感度に分析可能な新しい検出系技術の開発を試み,その技術応用の可能性について探索・検討をおこなってきた。その結果、本研究の目的を達するための色素と金属の組合せ、またはそれを反応させるための反応条件を見出すことに成功した。またH2O2の反応安定性試験では、検討した広い範囲のpH環境下において本反応が有効であることを確認できた。このことは、幅広いpH環境にて酸化酵素から生成される過酸化水素を適切にとらえることを意味している。ただし、目標とした測定感度は現行の検出技術の1550倍ほどにとどまり,目標とする100倍程の感度には到達できないかった。なお、研究期間中にSan Diegoにて行われたAmerican Association for Clinical Chemistry(2017)で学会発表を行った。

初年度において見出した組み合わせの基礎的性能評価を行うとともに、構築した組み合わせのさらなる最適条件を見出し、実酵素を用いた実験を行うことで、より現実的な過酸化水素検出の可能性についての検証を行う予定である。また、検出対象である過酸化水素の各種水溶液環境(特に反応溶液pHを中心に)の違いによる安定性に関する検証をおこなう。そして、実試料検体測定を想定した、生体試料中に存在する妨害物質に対する影響の有無について合わせて検証を行う予定である。生体試料中に含まれる還元物質の影響回避策をさらに検討するとともに、実試料測定に向け、酸化酵素から得られる過酸化水素が本測定系に適応可能かどうかの検証を行う予定である。その段階で、現在使用されている測定試薬との相関試験などを行う予定にしている。臨床化学当初国際学会へのエントリーを予定していたが、昨今の世界情勢の危険性を鑑みてエントリーを取りやめたことにより支出予定に差異が生じた。繰越分に関してはH28年度において国際学会へのエントリーを予定している。
カルシウムシリサイド半導体のSi表面上エピタキシャル成長

本研究は、環境適応型オプトエレクトロニクス材料としてカルシウムシリサイドに注目し、Ca_2Siなど定比化合物の結晶性薄膜をSi(111)表面にエピタキシャル成長させる条件を見つけることをめざしている。2年間を通じたAES実験、MIES実験によって、低温での固相反応に基づくCa_2Si成長の可能性が実証された。第2年度はSi(111)表面上に蒸着されたCaとSi(111)基板の低温固相反応における表面最外層電子状態変化を分析するという方角から表面に形成される物質相の構造の解析を行った。主な手法は準安定原子誘起電子分光法MIESである。以下に結果を要約する。1.Si(111)表面に蒸着された数原子層Caと基板Siの反応(温度依存牲):(1)温度200-300°Cで成長した化合物のMIESスペクトルにCa_2Siの特徴が現れた。即ちSi-3sバンドの狭帯域化、これはSi-3s電子がCa-Si結合に関与しなくなることを意味する。2.Ca/Si(111)表面の高温アニーリングによる超構造:アニーリングによりCa吸着量を減じていくに従って順次2×1,5×1,擬3×2超構造が現れた(LEED観察)。基板の微斜面性とアニーリング電流に影響されて単ドメイン化され傾向にある。3.各超構造に対応するMIES測定:MIESスペクトルのピーク構造を、その超構造の基本要素と考えられるSiジグザグ鎖構造やhoneycomb構造の電子状態と対応付けた。本研究は、環境適応半導体材料としてカルシウム-シリコン化合物に注目し、直接遷移型であるCa_2Siの結晶性薄膜をSi表面にエピタキシャル成長させる方法を見つけることをめざす。初年度はSi(111)表面上Ca-Si初期界面の固相反応をオージェ電子分光AES、準安定原子誘起電子分光MIES、X線光電子分光XPSと低速電子線回折LEEDで分析し、表面に形成される物質相の構造の解析を行った。1.Si(111)表面に吸着した一原子層以下のCaが作る超構造:アニーリングによりCa吸着量を減じていくに従って順次2×1,5×1,3×1超構造が現れた。基板の微斜面性に影響されて、周期が大きいほど単ドメイン化されている。各構造に対応するMIESスペクトルを測定した。2.Si(111)表面に蒸着された数原子層Caと基板Siの反応(温度依存性):温度200-300°Cで成長化合物のAESスペクトル(Si-LVV)にCa_2Siの特徴(Si-3sの局在性に由来するピーク)が現れた。MIESとXPSの結果もこのAES結果と一致した。3.Si(111)表面にCaとSiを混合吸着させた層での反応:温度200-300°Cの範囲でCa_2Si類似の化合物が成長した。更に高温ではSiの割合が多い化合物(CaSi,CaSi_2に近い物質相)が成長した。但しこれらシリサイド結晶に対応するLEED回折像は得られなかった。今後、低温固相反応の精密実験でCa_2Si結晶成長の条件を探索すること、バッファー層或いはサーファクタントを用いた成長の試み、また成長したCaシリサイドの表面酸化に関する実験を行う。
成長ホルモン補充療法と機能的矯正装置を併用した新規矯正歯科治療法の確立

ターナー症候群などの先天疾患を有する患者は、成長ホルモン分泌不全による低身長を示し、その改善のためヒトリコンビナント成長ホルモン製剤を用いた成長ホルモン補充療法を行う。これらの先天異常は頭蓋顎顔面の形態や機能異常を示し、顎骨や咬合の発育制御を目的とした顎整形的な矯正歯科治療が必要となる場合が多いが、未だ治療法は確立されていない。本研究は、ヒトリコンビナント成長ホルモン療法中の患者に対する機能的矯正力の有効性を検討し、これらの詳細な機序や併用による下顎頭成長における促進効果を明らかにすることによって、効率的で確実性の高い新規矯正歯科治療法を確立することを目指して行う。
脳神経系発生における紡錘系チェックポイントの役割

妊娠14日のICRマウス終脳より、bFGF存在下で神経上皮細胞cell line(ICRNSC12)を確立した。この細胞を用い、はじめに3種類の紡錘糸形成阻害剤(Nocodazole, Taxol, Monastrol)の分化誘導能について検討した。神経細胞への分化については形態およびEGFP発現を指標にした。その結果、Nocodazoleは速やかに細胞のapoptosisを誘導したが、他の2剤についてはapoptosisの誘導は少なかった。特にMonastrolではapoptosisの誘導はほとんど認められなかったため、72時間暴露して神経系への分化について観察したが分化は認められなかった。紡錘糸チェックポイントはanaphase-promoting complex(APC)と呼ばれるubiquitin ligaseの機能を抑制して、APCの基質であるmitosis特異的蛋白の分解を抑制することにより、分裂後期以後の細胞周期の進行を抑制している。APC基質のひとつにGemininとよばれる蛋白が存在するが、この蛋白はDNA複製抑制作用を持つと同時に神経系初期発生において神経板形成領域の決定に作用すると考えられている。この作用はBMPシグナルの抑制作用によって達成されると考えられている。そこで神経系への分化抑制因子であるBMP4存在下でmonastrolによる分裂中期停止の効果について検討した。その結果monastrolを24時間暴露後にはEGFRの発現は増強し、monastrol暴露後、monastrol、BMP4無添加培地に戻した場合対象に比べ形態的にも神経系への分化が促進されていることがわかった。さらに紡錘糸形成チェックポイントのひとつのコンポーネントであるMad2をRNAi法でknock-downすると、この分化効果は失われることがわかった。このことは脳形成において紡錘糸形成チェックポイントが何らかの役割を担っている可能性を示唆している。現在in vivoで実際に紡錘糸形成チェックポイントが脳形態形成に関与しているかを確認するため、マウス全胚培養法を用いた研究を開始したところである。
悪性黒色腫におけるPD-1関連免疫抑制とケモカイン受容体関連転移修飾

メラノーマ細胞のケモカイン受容体を網羅的に調べたところ,進行が早い例において腫瘍細胞にCCR5が強く発現していることが分かった。そのため,腫瘍細胞にCCR5のリガンドであるCCL3, 5の添加をし,細胞内サイトカイン染色にて確認したところTGF-βやIL-10などの抑制性分子の産生が増強した。かつ腫瘍細胞そのものがCCL5を産生していることを見いだした。かつCCL5の添加により腫瘍細胞の増殖能が亢進することも確認できた。以上の結果より,メラノーマ細胞にCCR5が発現することは,そのリガンドにより増殖能を亢進させるのみならず,抑制性分子の発現を促し,さらにautocrine的に産生してその作用を増強することで腫瘍の進展に寄与する可能性を見いだすことができた。1.ケモカイン受容体腫瘍細胞を原発巣や転移巣において解析すると,一部の細胞においてCCR5の発現がかなり強く見られる例がある。CCR5の機能,発現の意義について検討を開始した。すると,CCR5のリガンドであるCCL3,5に対して腫瘍細胞が遊走能を持つこと,また,これらのケモカインで処理することで腫瘍細胞からの免疫抑制性サイトカインであるTGF-βの産生が促進された。また,抑制性受容体であるPD-L1はこの系において変動しなかった。このことよりCCR5発現が腫瘍微小環境における免疫抑制のメカニズムに関与する事が示唆された。また,皮膚転移のある群においてCCR4が高く,in-transit転移を起こした群においてCXCR4の発現が高かった。このことよりケモカイン受容体の発現が転移様式に相関している可能性が示唆された。2.腫瘍浸潤細胞の解析腫瘍浸潤細胞を培養して解析すると,局所において進行度が高い例においてT細胞におけるPD-1発現が強い傾向にあった。これは11の項で示している論文報告にあるように,PD-1の末梢血における発現は進行例において高い傾向にあったことと合致するデータと思われる。3.悪性黒色腫細胞の培養株化できた腫瘍はなかったが,腫瘍細胞を1-2代継代培養することが可能であった。項目1に示したように,ケモカイン受容体の解析やPD-L1発現についての検討を行うことができた。悪性黒色腫の免疫抑制は多くの現象が複合的に重なって生じる。その結果腫瘍の進行や転移を招く。この現象を腫瘍細胞からの抑制性サイトカインの産生,抑制性分子の発現,ケモカインレセプターの発現パターン,そして浸潤細胞の特徴や機能など網羅的に調査することを目的とした。手術で得られた悪性黒色腫の組織を一部採取し,collagenaseで処理し,PD-L1発現やケモカイン受容体の発現,および腫瘍浸潤細胞のPD-1染色を行い,フローサイトメーターでその強度を確認する。特に,ケモカインレセプターに関してはCCR1-10,CXCR1-5の全てを網羅的に調査した。その結果,腫瘍の増大が早く急速に予後不良になる例において,得られた腫瘍細胞にCCR5が強く発現していることが見いだされた。そのため,CCR5の発現が免疫学的に何らかの意義がある可能性に着目した。すると,CCR5発現している細胞は癌幹細胞マーカーであるCD133を発現していることが認められた。CD133を発現するメラノーマ細胞株であるWM-115細胞を用いて検討したところ,CCR5のリガンドであるCCL3,5の添加をし,細胞内サイトカイン染色にて確認したところTGF-βやIL-10などの抑制性分子の産生が増強した。
う蝕細菌由来の可逆性歯髄炎動物モデル確立による炎症歯髄創傷治癒メカニズムの解明

申請者らはこれまでに、歯髄創傷治癒機転の解明を目指した研究を展開してきた。しかし、実際の臨床で覆髄の適応となるう蝕由来の可逆性炎症歯髄では、健全歯髄とは細胞構成および細胞外環境が大きく異なるため、従来の研究で用いられてきた健全な歯および歯髄を対象とした評価モデルでは十分とは言えない。そこで本研究では、申請者らが確立したラット覆髄モデルと、う蝕分野で確立されているラットう蝕モデルを組み合わせることで、細菌由来の可逆性歯髄炎動物モデルを確立し、さらに、確立した動物モデルで、近年注目されている幹細胞による免疫調節機能に焦点を当てた可逆性炎症歯髄に特有の創傷治癒メカニズムの解明を目的とする。
活性酸素種によるラット培養大脳皮質神経細胞・アストロサイトの細胞死機構の解析

本研究は脳虚血・再灌流障害や老化過程に関与すると考えられるラジカル反応性の高い活性酸素種の作用メカニズムを解明することを目的としている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すことを明らかにしてきた。さらに本研究の初年度では、それぞれの細胞にH_2O_2を短時間適用し、DNA傷害修復能を反映するチミジン取り込みのメカニズムについて薬理学的手法を用いて検討し、次の結果を得てきた。H_2O_2は神経細胞ではなくアストロサイトにおいて、ウリジンではなくチミジンの取り込みを促進した。H_2O_2によるアストロサイトのチミジン取り込みの促進効果は、細胞外液と細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>の細胞質への流入に依存し、細胞内Ca^<2+>キレーターであるBAPTA-AMによって完全に抑制されることから細胞内遊離Ca^<2+>の存在を必要とした。さらに、H_2O_2短時間処置時に細胞内遊離Ca^<2+>が存在しないと、その後の細胞死が促進された。また、同処置によりDNAの断片化が観察され、H_2O_2は細胞内遊離Ca^<2+>依存的にアポトーシス様の細胞死を引き起こした。そこで本研究の2年目においては、H_2O_2によるアストロサイトのチミジン取り込みとその後の細胞死やDNAの断片化に対する細胞内Ca^<2+>貯蔵部位の詳細を検討し、リアノジン受容体、及び、IP_3受容体の活性化がこれらを促進することを明らかにした。さらに、チロシンキナーゼ情報伝達系もこれらに対して影響を及ぼすことを明らかにした。また、H_2O_2によるアストロサイトにおける障害や回復に関与する可能性のある蛋白質発現をディファレンシャル・ディスプレイ法により遺伝子レベルで検討したところ、いくつかの差異遺伝子を検出した。これらの差異遺伝子が発現量に差があるmRNAに由来するのかを現在確認するとともに、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて、シーケンシングやノーザンプロットなどを行い検討することとしている。本研究は脳虚血・再灌流障害や老化過程に関与すると考えられるラジカル反応性の高い活性酵素種の作用メカニズムを解明することを目的としている。これまでに、培養神経細胞とアストロサイトを過酸化水素(H_2O_2)で処置すると、DNA傷害を引き起こしながらそれぞれの細胞死が異なった時間及び濃度依存性を示すことを明らかにしている。本研究では初年度に、それぞれの細胞にH_2O_2を短時間適用し、DNA傷害回復能を反映するチミジン取り込みのメカニズムについて薬理学的手法を用いて検討し、以下の結果を得た。H_2O_2はアストロサイトにおいてチミジン取り込みを促進した。神経細胞ではチミジン取り込みの促進はみられなかった。両細胞ともウリジン取り込みを促進させることはなかった。脳微小血管内皮細胞では、H_2O_2短時間処置によるチミジン取り込みに変化のないことが報告されていることから、H_2O_2によるチミジン取り込みの促進は脳血液関門を構成する細胞の中でアストロサイトに特異的であると思われる。また、同処置によりDNAの断片化が観察され、H_2O_2は細胞内遊離Ca^<2+>依存的にアポトーシス様の細胞死を引き起こすことが確認された。以上の結果は、H_2O_2による中枢神経系障害においてアストロサイトはチミジン取り込みを促進するという応答を行い、この過程は、細胞内遊離Ca^<2+>の存在を必要とし、H_2O_2による細胞傷害を抑制する可能性を示唆するものである。

また、同処置によりDNAの断片化が観察され、H_2O_2は細胞内遊離Ca^<2+>依存的にアポトーシス様の細胞死を引き起こした。そこで本研究の2年目においては、H_2O_2によるアストロサイトのチミジン取り込みとその後の細胞死やDNAの断片化に対する細胞内Ca^<2+>貯蔵部位の詳細を検討し、リアノジン受容体、及び、IP_3受容体の活性化がこれらを促進することを明らかにした。さらに、チロシンキナーゼ情報伝達系もこれらに対して影響を及ぼすことを明らかにした。また、H_2O_2によるアストロサイトにおける障害や回復に関与する可能性のある蛋白質発現をディファレンシャル・ディスプレイ法により遺伝子レベルで検討したところ、いくつかの差異遺伝子を検出した。これらの差異遺伝子が発現量に差があるmRNAに由来するのかを現在確認するとともに、これらの遺伝子がどのような役割を果たしているのかについて、シーケンシングやノーザンプロットなどを行い検討することとしている。
血管狭窄病変の発症・進展における細胞増殖因子の役割に関する分子細胞学的研究-血管壁への高効率in vivo遺伝子導入による分子病態の解明と遺伝子治療の開発-

#1:大型動物モデルであるイヌにおいて、組換えアデノウイルスを用いて経皮的アプローチによる血管壁細胞への高効率遺伝子導入法を確立した。遺伝子発現期間を定量し、さらにアデノウイルスでは投与時期を選ばないこと、反復投与が有効であること、免疫感作動物でも遺伝子発現が可能であること、中和抗体の出現と遺伝子発現レベルには負の関係があることなど種々の基礎データを集積した。#2:機能抑制型H-Ras (D/N Ras)や細胞周期進行を抑制するCyclin-dependent kinase Inhibitor-p21 WAF1/Sdi1,野性型p53を発現するウイルスを作製し、培養血管平滑筋細胞に導入すると血清増殖因子による平滑筋細胞のDNA合成は完全に抑制された。バルーンで傷害を加えたラット頚動脈に導入したところ、2週間後に形成される新生内膜肥厚を有意に抑制することに成功した。#3:ニードルカテーテルを用いてイヌ心筋に遺伝子を導入できた。高レベル発現は約2週間持続した。#4:細胞内のキナーゼを欠失した変異型のTGF-βII型受容体発現アデノウイルスを作製し、培養細胞に導入するとTGF-βの多様な作用のすべてを特異的に完全に抑制できた。#5:TGF-βの細胞内信号伝達におけるRas,Racの役割を解析した。#7:凝固反応の開始因子である組織因子の特異的抑制分子(Tissue factor athway inhibitor : TFPI)遺伝子を傷害血管壁に導入するとカテコラミン負荷でも血栓が形成されなかった。#1:申請者は組換えアデノウイルスを用いて経皮的アプローチによる血管壁細胞および親近細胞への高効率遺伝子導入技術の開発に成功した。大型動物を用いてその有効性と安全性を確認し、さらに投与時期の検討や反復投与の有効性、中和抗体の出現と遺伝子発現レベルの関係など種々の基礎データを集積し、論文3編にまとめ発表した。#2:申請者は組換えアデノウイルスの作成技術を習得し、本研究遂行に必要な各種組換えアデノウイルスの作成に独自に成功した(昨年計画した組換えアデノウイルスはほぼすべて作成を終了した)。#3:細胞外マトリックスの産生を亢進するTGF-βの作用を抑制するため、ヒトII型GF-β受容体を膜貫通部直下で切断した変異型受容体cDNAを作成し組換えアデノウイルスに組み込んだ。培養細胞を用いた実験において、少量のウイルスでTGF-βの多種多様な信号伝達をいずれも完全に抑制することに成功した(論文印刷中)。血管壁のみならず、各臓器での線維性増殖性病変の遺伝子治療をめざして動物実験を開始した。#4:機能抑制型Ras遺伝子発現アデノウイルス、細胞周期進行抑制遺伝子(Cycin-dependentkinase Inhibitor-p21^<WAF1/Sdi1/Cip1>)を作成した。培養血管平滑筋細胞に導入すると、いずれのウイルスでも血清増殖因子による平滑筋細胞のDNA合成は完全に抑制された。そこでバルーンで障害を加えたラットけい頚動脈に導入したところ、2週間後に形成される新生内膜肥厚を有意に抑制することに成功した(論文投稿中)。ひき続きウサギでも確認中である。#5:組換えアデノウイルス導入法の改良を試み、ウイルス液にある種の化学物質を混入することで約3-10倍導入効果をあげることに成功した(論文準備中)。#6:ブタを用いて冠動脈への遺伝子導入の基礎実験を行なった。♯1:大型動物モデルであるイヌにおいて、組換えアデノウイルスを用いて経皮的アプローチによる血管壁細胞への高効率遺伝子導入法を確立した。♯2:機能抑制型H-Ras(D/N Ras)や細胞周期進行を抑制するCyclin-