hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動学的分析に基づいた疼痛リハビリテーションの効果検証

具体的には,日常生活動作や痛みの改善が,順調に認められる患者と停滞もしくは大きな改善が認められない患者との間に運動学的指標として評価している,運動速度や運動の躊躇,開口幅に差が認められた.また,これらの要因と痛みの慢性化に運動時痛や運動恐怖が関連し,慢性化の原因である可能性が示されている.本研究の目的は.1術後患者が示す運動恐怖を運動学的解析によって,臨床現場で簡便かつ正確に判定できる評価システムを構築し,2慢性疼痛を発症させる要因を明らかにするとともに,3慢性疼痛を発症させないための新たなリハビリテーションを構築することである.まず,術後患者が示す運動恐怖を運動学的解析によって,臨床現場で簡便かつ生活に判定できる評価システムの構築ができたため,術後患者が示す運動学的特徴を評価し解析できている.さらに,慢性疼痛を発症させる要因を明らかになりつつあり,最後の目的である新たなリハビリテーション開発に取り組んでいる.そのため,当初の計画以上に進展していると思われる.しかしながら,痛みの慢性化は様々な要因が関係しており,世界的にも効果的なリハビリテーションは不明確なままである.そのため,新たなリハビリテーションの開発の効果検証には時間を要する可能性がある.現在は,当初の計画通り,または計画以上に進展している.そのため,今後は統計解析から明確な痛みの慢性化に関わる要因を検討し,新たなリハビリテーション開発に取り組む.そして,これらの効果検証を行いたい.新たなリハビリテーションの効果検証においては,今まで評価してきた手指タッピングタスクから得られる運動学的特徴を焦点に当て,リハビリテーションを実施していく.そうすることで,術後1ヶ月や2ヶ月後の運動機能ならびに日常生活動作の改善が通常よりも早期に得られる可能性がある.
クマはなぜ冬眠できるのか？　ー冬眠中のエネルギー代謝機構の解明ー

本研究ではツキノワグマにおいて冬眠期に生じる代謝機構の変化を明らかにすることを目的し、肝臓・骨格筋・脂肪におけるエネルギー代謝関連遺伝子の発現解析を行った。この結果、冬眠中は糖新生に関与する酵素の遺伝子発現量が肝臓で増加し、一方ですべての組織において解糖および脂肪合成に関わる遺伝子発現量が低下することが明らかとなった。冬眠中の血糖値は活動期と同程度に維持されており、ケトーシスなどの代謝障害は生じていなかった。このようにクマは各組織における代謝様式を調節することで冬眠中に効率良くエネルギーを産生する仕組みを有していることが明らかとなった。クマ類は冬眠期間中、一切の摂食・摂水を行わず、体脂肪を唯一のエネルギー源として長期にわたる絶食期間を乗り切る。本研究では、ツキノワグマにおける冬眠期間中のエネルギー産生・消費メカニズムに焦点を当て、冬眠期に生じる代謝機構の変化を明らかにすることを目的し、平成24年度は肝臓・骨格筋・脂肪におけるエネルギー代謝関連遺伝子の発現量の解析を行った。クマを麻酔により不動化し、バイオプシー法により肝臓、骨格筋、脂肪を採取した。各組織の採材は活動期である6月、過食期である11月、冬眠期である3月に実施した。各組織よりmRNAを抽出し、各月におけるエネルギー代謝関連遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCR法を用いて比較した。この結果、肝臓においては脂肪合成酵素の遺伝子発現が11月に上昇すること、また冬眠期においては糖新生に関与する酵素の遺伝子発現量が増加し、解糖および脂肪合成に関与する遺伝子発現量が減少することを明らかにした。また、本成果を国際学会(International Hibernation Symposium)および海外学術誌(2編)において発表した。脂肪や骨格筋においても同様に、過食期における脂肪合成酵素群の増加、冬眠期における糖代謝・脂肪合成酵素群の減少が認められた(現在解析中)。このようにクマは各臓器における代謝様式を季節的に調節することにより、秋に効率良く脂肪を蓄積し、冬眠中においては体脂肪を用いて効率良くエネルギーを産生することが明らかとなった。クマ類は冬眠期間中、一切の摂食・摂水を行わず、秋に蓄えた体脂肪を唯一のエネルギー源として長期にわたる絶食期間を乗り切る。本研究ではツキノワグマにおける冬眠期間中のエネルギー産生・消費メカニズムに焦点を当て、冬眠期に生じる代謝機構の変化を明らかにすることを目的し、冬眠中の血液生化学値ならびに肝臓・骨格筋・脂肪におけるエネルギー代謝関連遺伝子の発現量の解析を行った。飼育下のクマに麻酔処置を施し採血を行った後、バイオプシー法により肝臓・骨格筋・脂肪を採取した。各組織の採材は活動期である6月、過食期である11月、冬眠期である1・3月に実施し、各月におけるエネルギー代謝関連遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCR法を用いて比較した。この結果、過食期では肝臓および脂肪において脂肪合成に関わる酵素遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。一方冬眠期においては、糖新生に関与する酵素の遺伝子発現量が肝臓で増加し、解糖および脂肪合成に関わる遺伝子発現量が減少した。また平成25年度に骨格筋および脂肪についてサンプル数の拡充を行った結果、両組織共に冬眠中に解糖や脂肪合成に関わる酵素の発現量が低下することを明らかにした。冬眠中の血糖値は活動期と同程度に維持されており、脂質代謝関連成分の軽度な増加は生じるものの、ケトーシスなど脂質代謝の亢進に伴う代謝障害は生じていなかった。このようにクマは各臓器における代謝様式を季節的に調節することにより、秋に効率良く脂肪を蓄積し、冬眠中においては体脂肪を用いて効率良くエネルギーを産生する仕組みを有していることが明らかとなった。本研究では、ツキノワグマにおける冬眠期間中のエネルギー産生・消費メカニズムに焦点を当て、冬眠期に生じる代謝機構の変化を明らかにすることを目的し、平成23年度は以下の研究を実施した。1.肝臓・骨格筋バイオプシー法を用いた脂質代謝・糖代謝に関わる代謝酵素の発現解析クマを麻酔により不動化し、バイオプシー法により肝臓および骨格筋組織を採取した。採取した組織よりRNAを抽出後、リアルタイムPCR法を用いてエネルギー代謝に関わる遺伝子群の発現量を解析し、活動期および冬眠期の遺伝子発現様式を比較した。この結果、肝臓では冬眠中、糖新生に関わる酵素(ピルビン酸カルボキシラーゼなど)やβ酸化、ケトン体産生に関わる遺伝子(脱共役蛋白質IIなど)の発現量が増加し、一方で解糖系や脂肪合成に関与する酵素群(グルコキナーゼ、脂肪酸合成酵素など)の発現量が減少することが分かった。

このことより、クマは冬眠中、エネルギー代謝における中心的な役割を担う肝臓の代謝因子の発現量を協調的に調節することで血糖値を保ち、脂肪より効率良くエネルギーを産生していることが明らかとなった。2.安定同位体トレーシング法を用いた冬眠中の代謝動態の解明本研究項目では、安定同位体で標識されたエネルギー関連物質(グルコースなど)を体内に投与し、その血中代謝動態を明らかにすることを目的としている。本研究では安定した麻酔状態を長時間維持することが必要となるため、本年度は麻酔薬の選定および投与量の条件検討を実施した。これにより、塩酸チレタミンおよび塩酸ゾラゼパムの混合薬(ゾレチル)の単独投与、もしくはアセプロマジンとの併用により、心肺機能への悪影響を伴わずに安定した麻酔の導入および維持を行うことができることを明らかとした。当初から予定していた肝臓・骨格筋の採取に加え、脂肪の採材を追加したことにより、エネルギーの産生器官である肝臓、貯蔵器官である脂肪、消費器官である骨格筋について、エネルギー代謝の季節変化を総合的に考察することが可能となった。一部の成果はすでに海外学術誌において発表済みであり、平成25年度は2報を報告する予定である。このように、研究は順調に進展しているものと判断できる。二項目に大別される研究項目のうち、「肝臓・骨格筋バイオプシー法を用いた脂質代謝・糖代謝に関わる代謝酵素の発現解析」については肝臓および骨格筋の採材および解析をおおむね完了することができた。また「安定同位体トレーシング法を用いた冬眠中の代謝動態の解明」については麻酔プロトコールを確立するなど、次年度に向けた準備を完了することができた。このため、研究は順調に進展しているものと判断した。脂肪および骨格筋におけるサンプリングと遺伝子発現量の解析を継続して行い、成果を取りまとめて海外学術誌に投稿する予定である。また、これまでの成果から冬眠中のエネルギー代謝様式は個体の繁殖状態(妊娠や授乳など)によって影響を受けることが明らかとなりつつある。平成25年度はこの点についても研究を発展させ、繁殖活動が個体の体温や血中のエネルギー関連物質濃度に如何に影響を与えるのかを明らかにする予定である。「肝臓・骨格筋バイオプシー法を用いた脂質代謝・糖代謝に関わる代謝酵素の発現解析」については、骨格筋の採材数を拡充する必要がある。このため、2012年6月および2013年1月、3月(冬眠中)にサンプリングを実施する。また本年度採取したサンプルを用いた遺伝子発現解析を行う予定である。「安定同位体トレーシング法を用いた冬眠中の代謝動態の解明」については、冬眠期前に予備実験を実施し、使用するトレーサーおよび安定同位対比の解析手技を確立する予定である。確立した手技を用いて、冬眠中(1月および3月)に本実験を実施する予定である。阿仁クマ牧場における試料の採材に際し、他大学の研究者および現地関係者の協力が得られたため、実験に同行する人員を一部削減できた。このため、約13万円を節約することが可能となった。次年度は脂肪および骨格筋における遺伝子発現量の解析を完了させるため、試料採材のための旅費・消耗品費(阿仁クマ牧場への往復、および現地宿泊費、計6回を予定)として約40万円を、遺伝子解析の消耗品として約35万円、血中成分の生化学分析のための消耗品費として20万円を使用予定である。
PGE_2活性化マスト細胞の細胞外マトリックスへの可逆的な接着機構とその生理的意義

本年度の研究実施計画に基づいて、以下の研究成果を得た。1.マスト細胞のフィプロネクチンへの接着反応のメカニズムの解析:マスト細胞のPGE2刺激によるフィプロネクチンへの接着反応は、細胞膜にある2つのPGE2受容体のEP4とEP3を介して惹起されていることがわかった。それぞれの受容体を介する接着反応の細胞内シグナルを解析したところ、EP4受容体を介するシグナルはcAMP-PKA系であるが、EP3受容体のそれはPLC-Ca^<2+>-PKC系であることを証明した。両反応の発現は、時間軸で異なり、前者は5-6時間頃、後者は15時間頃に顕著となる。どちらの系でも、フィプロネクチンへの接着反応はミオシン短鎖キナーゼによるミオシンのリン酸化とそれによるインテグリンーフィプロネクチンの会合促進によることがわかった。2.フィプロネクチン接着マスト細胞の乖離反応のメカニズムの解析:PGE2刺激で惹起したフィプロネクチン接着マスト細胞は、Ca^<2+>-カルモジュリン系を介して乖離反応を起こしていることがわかった。さらに、この乖離反応はミオシン短鎖キナーゼ活性に依存しており、リン酸化ミオシンで乖離することを証明した。In vitro系において、マスト細胞がフィプロネクチン以外の疎水性/親水性残基に結合することを見いだした。3.アレルギーモデルマウスにおけるマスト細胞のマトリックスへの接着反応の解析:マウス背部皮下に空気嚢を作成し、その嚢腔内にマスト細胞を封入し、PGE2刺激により嚢腔周辺の結合組織のフィプロネクチンやラミニンに接着するマスト細胞数を定量するというin vivo細胞接着実験系を初めて作成することに成功した。PGE2は、アゴニスとおよびアンタゴニストを用いた実験系により、EP4受容体を介してin vivoでは接着を促進することを明らかにした。今年度の研究実施計画に基づいて、以下のような研究成果を得た。1.マスト細胞のフィブロネクチンへの接着反応のメカニズムの解析:PGE2刺激によるmastocytoma P-815細胞(P-815細胞)のフィブロネクチンへの結合反応はEP4受容体-アデニル酸シクラーゼ活性化によるcAMPの生成に引き続く2段階の反応で進行することがわかった。第一段階は接着開始期にはたらくcAMP-PKA依存性反応で、第二段階は接着維持期にはたらくcAMP-非依存性Epac-Rap1依存性反応であることを解明した。2.フィブロネクチン接着マスト細胞の乖離反応のメカニズムの解析:PGE2によるP-815細胞接着反応の維持期のメカニズムとして、細胞外Ca^<2+>の細胞内への取込促進とその結果と思われる細胞質Ca^<2+>濃度の持続的な高レベル維持が重要な役割を果たしていることを明らかにした。この際にはたらくカルシウムチャネルは電位依存性チャネルではなく、store-operated Ca^<2+>チャネルであり,とくに阻害剤SK&F 96365感受性のチャネルを介してCa^<2+>の細胞内流入が起こることも明らかにした。SOCチャネルは複数に存在しているが、La^<3+>,Gd^<3+>により接着反応は全く阻害されないことから、従来の報告にない新規タイプのSOCチャネルの関与が予測される。3.アレルギーモデルマウスの皮膚におけるマスト細胞のECMsへの接着反応の解析:P-815細胞を移植できるマウス株(CDF1)の背部皮下組織において空気嚢炎症モデルを作成した。ついで、空気嚢内に移入したP-815細胞が結合組織層ECMsへ移行し接着するかを測定した。

その結果、P-815細胞はPGE2-EP4受容体依存性にECMsに接着することを明らかにすることができた。本年度の研究実施計画に基づいて、以下の研究成果を得た。1.マスト細胞のフィブロネクチンへの接着反応のメカニズムの解析:マスト細胞のPGE2刺激によるフィブロネクチンへの接着反応は、細胞膜にある2つのPGE2受容体のEP4とEP3を介して惹起されていることがわかった。それぞれの受容体を介する接着反応の細胞内シグナルを解析したところ、EP4受容体を介するシグナルはcAMP-PKA系であるが、EP3受容体のそれはPLC-Ca^<2+>-PKC系であることを証明した。どちらの系でも、フィブロネクチンへの接着反応はミオシン短鎖キナーゼによるミオシンのリン酸化とそれによるインテグリン-フィブロネクチンの会合促進によることがわかった。2.フィブロネクチン接着マスト細胞の乖離反応のメカニズムの解析:PGE2刺激で惹起したフィブロネクチン接着マスト細胞は、Ca^<2+>-カルモジュリン系を介して乖離反応を起こしていることがわかった。さらに、この乖離反応はミオシン短鎖キナーゼ活性に依存しており、リン酸化ミオシンで乖離することを証明した。3.アレルギーモデルマウスにおけるマスト細胞のマトリックスへの接着反応の解析:マウス背部皮下に空気脳を作成し、その脳腔内にマスト細胞を封入し、PGE2刺激により脳腔周辺の結合組織のフィブロネクチンやラミニンに接着するマスト細胞数を定量するというin vivo細胞接着実験系を初めて作成することに成功した。PGE2は、アゴニスとおよびアンタゴニストを用いた実験系により、EP4受容体を介してin vivoでは接着を促進することを明らかにした。
新しいタイプの医薬品・農薬の開発を志向する生理活性テルペン類の合成研究

1.新しいタイプの抗炎症剤の開発:細胞接着分子ICAM-1の誘導抑制活性試験において、サントニンより誘導される3-oxoeudesmano-13,6-lactone類の2,3,11位の置換基の種類および6位の立体化学を化学修飾することにより、構造と活性の相関関係を調べた。その結果、3位のカルボニル基、2位のブロム原子又は二重結合、11位のメチレン基は活性発現に大きく寄与することが分かった。6位の立体については、11-メチル体に関しては6-αが、また11-メチレン体(α-メチレン-γ-ラクトン)に関しては6-βがより活性が強いことが分かった。2α-bromo-3-oxoeudesmano-13,6α-lactoneおよび13,6β-lactoneに関してはラクトン部分がα-メチル-γ-ラクトンであるにもかかわらず強い活性を示し、ラット空気嚢炎モデル法を用いたin vivoのアッセイでも強い活性を示した。従ってこれらの化合物は抗リウマチ抗アレルギー剤として利用できる新しいタイプの抗炎症剤として大変有望であると考えられた。2.農業用殺菌剤の開発:6年度、サントニンより誘導されるeudesmano-13,6α-lactone類に関して農業用殺菌剤としての生理活性試験を行い、16種類の化合物に活性を見い出しているが、7年度対応するeudesmano-13,6β-lactoneに関して活性試験を行った所、7種類の化合物に活性が認められ、ラクトン環の立体化学の違いで全く異なった病気に効くことが分かった。3.白アリに対する殺蟻剤の開発:6年度までに得られたAB環のシス結合をしたカメシノン誘導体に関する構造相関をもとにA環部分の化学修飾を行った。殺蟻活性と構造との相関関係については現在検討中である。4.植物成長調節剤の開発:サントニンより誘導されるグアイアノリド類4種類に中程度の強さのオーキシン様活性を見い出した。サントニンを原料とし、ツベレフェリン(6)およびその関連化合物、デヒドロコスタスラクトン(10)およびその関連化合物、カメシノン(12)およびその関連化合物を合成し、以下に述べる生理活性に関する知見を得た。1)新しいタイプの抗炎症剤の開発;a)細胞接着分子(ICAM・1)誘導抑制活性についてin vitroのアッセイ系を用いた活性試験を行い1、2、3、4、5、6、7、8の化合物に活性を認めた。b)a)に述べたin vitroアッセイの結果を考慮して、マウス空気嚢モデルによるin vivoの活性試験を行った結果1および7に強い抑制活性が見られた。c)細胞傷害性T細胞(cytotoxic T cells、CTL)のキラー活性の阻害活性物質を探索し3、4、5、6、9、10、11に強い活性を認めた。以上のアッセイの結果、α-メチレン-γ-ラクトンおよびα-ハロケトン基を有するセスキテルペン類に新しいタイプの広い意味での抗炎症剤として期待できることが分かった。2)新しいタイプの農業用殺菌剤の開発;化合物3、4、5、6にイモチ病、トマト疫病、ブドウベト病に対する予防効果が認められた。3)新しいタイプの植物成長調節剤の開発;10の化合物は10ppmの濃度で185%カエナリ胚軸切片伸長活性を示し、100ppmで244%発根促進活性が認められた。

4)白蟻に対する殺蟻活性;カメシノン12およびその関連化合物の白蟻に対する殺蟻活性と構造との相関関係を調べ、13が天然のカメシノンより5倍活性が強いことを示した。・年度当初の計画に従い研究を行い、以下に述べる研究実績を得た。1.新しいタイプの抗炎症剤の開発:細胞接着分子ICAM-1の誘導抑制活性試験において、サントニンより誘導される3-oxoeudesmano-13,6-lactone類の2,3,11位の置換基の種類および6位の立体化学を化学修飾することにより、構造と活性の相関関係を調べた。その結果、3位のカルボニル基、2位のブロム原子又は二重結合、11位のメチレン基は活性発現に大きく寄与することが分かった。6位の立体については、11-メチル体に関しては6-αが、また11-メチレン体(α-メチレン-γ-ラクトン)に関しては6-βがより活性が強いことが分かった。2α-bromo-3-oxoeudesmano-13,6α-lactoneおよび13,6β-lactoneに関してはラクトン部分がα-メチル-γ-ラクトンであるにもかからわらず強い活性を示し、ラット空気嚢炎モデル法を用いたin vivoのアッセイでも強い活性を示した。従ってこれらの化合物は抗リウマチ抗アレルギー剤として利用できる新しいタイプの抗炎症剤として大変有望であると考えられた。2.農業用殺菌剤の開発:前年度、サントニンより誘導されるeudesmano-13,6α-lactone類に関して農業用殺菌剤としての生理活性試験を行い、16種類の化合物に活性を見い出しているが、今年度対応するeudesmano-13,6β-lactoneに関して活性試験を行った所、7種類の化合物に活性が認められ、ラクトン環の立体化学の違いで全く異なった病気に効くことが分かった。3.白アリに対する殺蟻剤の開発:前年度までに得られたAB環のシス結合をしたカメシノン誘導体に関する構造相関をもとにA環部分の化学修飾を行った。殺蟻活性と構造との相関関係については現在検討中である。4.植物成長調節剤の開発:サントニンより誘導されるグアイアノリド類4種類に中程度の強さのオーキシン様活性を見い出した。
ウェットプロセスを用いたサブナノ金属クラスターの自在サイズ制御

デンドリマー内部で精密にサイズ制御されたサブナノ金属クラスターの調製を溶液中で行った。Divergent-Convergent法によりベンジルエーテルデンドロンを導入したポリアミンデンドリマーは、デンドロンの世代数増加につれてより強固な内部空孔が形成され、内部でサブナノPd4クラスターが調製できる。一方、末端を嵩高いアルキル基で修飾した逆ミセル状のデンドリマーは、内部アミノ基がプロトン化されることでRh5クラスターアニオンの対カチオンとして機能し、サブナノRhクラスターを安定化できる。このデンドリマー内包Rhクラスターは、芳香族ニトロ化合物の選択的還元反応に優れた触媒活性を示すことを見出した。本申請課題研究では、ナノ空孔を有するカプセル状高分子であるデンドリマーを用いてウェットプロセスにより、1nm以下のサブナノスケールで構成原子数を精密に制御した種々の金属クラスターを作り分ける精密合成法の開発を目的とした。本年度は、1デンドリマー内部に取込Pd(II)イオン数や還元条件を制御することで、1nm付近のPdクラスターの選択的合成を行った。また、平成26年度計画としていた2Rhカルボニルクラスターを前駆体とするRh5カルボニルクラスターの調製を行った。さらに、3デンドリマー内部へのCu錯体種の固定化と触媒反応への応用を検討した。1Pd(II)イオンの取込方法および、Pd水溶液とデンドリマー溶液との攪拌、抽出法を再検討し、新たに逐次添加による精密なクラスター調製を行った。これらの調製したPdクラスターは高輝度放射光施設を利用したX線吸収微細構造解析によるクラスターサイズの検討を行った。また、逐次添加法によりサブナノからナノ領域でクラスターサイズを精密に制御できると期待される結果が得られた。2Rhカルボニルクラスターを用いCO及び水の存在下、デンドリマー内部でRhカルボニルクラスターアニオンの選択的合成に成功した。プロトン化された骨格内部アミノ基をカウンターカチオンとするデンドリマー内部でのクラスターアニオンの生成はこれまでに報告がない。生成したRh5クラスターは、in situでのIR分析及びESI-MSにより同定した。本法は種々の遷移金属クラスター錯体が知られており、デンドリマー内部での相互変換を利用したクラスターサイズの精密制御法として極めて有望である。3Cuイオンを内包したデンドリマーによる選択的炭素ー炭素結合形成反応の開発に成功した。デンドリマー内部で近接したCu種を形成することで高効率・高選択的な反応が可能なることを見出した。本年度は、1デンドリマー内部に取込Pd(II)イオン数や還元条件を制御することで、1nm付近のPdクラスターの選択的合成を昨年度に引き続き行った。また、2Rhカルボニルクラスターを前駆体とするRh5カルボニルクラスターの調製と選択的還元反応への応用を行った。さらに、3デンドリマー内部への複核Cu種の固定化と触媒反応への応用を検討した。1Pd(II)イオンの取込方法および、Pd水溶液とデンドリマー溶液との攪拌、抽出法を再検討し、新たに逐次添加による精密なPdクラスター調製を行い、電子顕微鏡観察から生成したクラスターサイズの検討を行った。その結果、サブナノサイズのクラスターを核として、逐次的にクラスター成長させることで、ナノ領域でクラスターサイズを自在制御できることを見出した。2Rh6クラスター錯体を前駆体として用い、ポリアミンデンドリマー内部でRh5クラスターアニオンの選択的合成を行った。さらに、このRh5クラスター種を触媒とする水性ガス変換反応条件下での、芳香族ニトロ化合物の還元反応に高活性を示すことを見出した。3Cu複核種を内包したポリアミンデンドリマーによる高選択的酸化カップリング反応に成功した。デンドリマーのナノ空孔では、単核のCu種から自己組織化的に近接複核Cu種を形成する。このデンドリマーCu複合体は高選択的な酸化的C-Cカップリング反応の触媒となることがわかった。触媒化学研究成果概要に述べたように、1Pdクラスターおよび2Rhクラスターの2点についての成果が得られた。当初計画に挙げたPdクラスターについては、調製法の検討は順調に進んでおり、XAFSや質量分析による解析に着手しているが分析法を確立するために条件検討を行っているため、触媒反応の検討は次年度の課題となる。一方、平成26年度計画に掲げていたPd以外の元素を用いたサブナノクラスター合成では、Rhクラスターの選択的調製法に成功した。

また、Rh種については、赤外分光法や質量分析による解析に成功し、触媒反応への検討を行っている段階である。また、3デンドリマー内部へのCu種の取込みに成功し、高選択的な炭素ー炭素結合形成反応の触媒となることを新たに見出した。したがって、総合的に見て研究課題はおおむね順調に進行していると考えている。当初計画で平成25年度に行う予定であったPdクラスターの触媒反応性の検討へと展開する。現在検討中である質量分析およびXAFS解析を行い、最終的には高分解能STEMによる観察を行う。触媒反応に関しては水素化、H-D交換などを検討する。すでに成果のでているRhクラスターについては、引き続き触媒反応検討を行う。また、当初計画どおりRhクラスターのサイズ選択的調製法の確立と他元素とくにRuやFeクラスターの調製と触媒反応性の検討を行う。質量分析や赤外分光法、触媒反応性評価は、既存の設備を用いて行う。XAFS実験については、高輝度光科学研究センターの利用、高分解能電子顕微鏡は、本学超高圧電子顕微鏡センターの設備を借用する予定である。最終的な高分解能HAADF-STEM観察については外部への分析依頼を予定している。本年度予定したPdクラスターの触媒反応性評価を次年度に行うことにしたため、触媒反応性評価に用いる試薬、同位体ガス、分析用ガスなどの消耗品購入費用を次年度へと繰り越した。また、クラスターサイズの最終確認用の高分解能HAADF-STEM観察については外部への分析依頼費用が本年度は不要となったため、次年度使用額が生じた。触媒反応性評価に用いる、試薬類、同位体ガス、分析用ガス、高分解能TEM観察用グリッドなどの消耗品を購入する。また、クラスターサイズの最終確認用の高分解能HAADF-STEM観察については外部への依頼分析を行うが、これらの実験は次年度のできるだけ早い時期に行い、それに伴い繰越金額を使用する予定である。
樹木木部細胞におけるアクチンフィラメントの三次元ネットワークに関する研究

樹木木部細胞の形態形成機構を明らかにする目的で、セルロースミクロフィブリルの堆積方向や堆積場所を制御すると考えられている細胞骨格(表層微小管やアクチンフィラメント)の木部分化中の配向変化を間接蛍光抗体染色法と共焦点レーザ走査顕微鏡法を組み合わせて観察した。木部細胞分化中の両者の関連性を明らかにするためには、同一試料上で両者の配向を調べる必要がある。そこで、針葉樹の樹幹形成層領域から試料採取後、凍結切片を作製し、まずアクチンに対するマウス一次抗体と微小管に対するラット一次抗体で抗体染色した。さらに、異なる蛍光試薬で標識された抗マウス二次抗体と抗ラット二次抗体で処理し、切片の二重染色を行った。次に、共焦点レーザ走査顕微鏡の励起光波長を変えて表層微小管像とアクチンフィラメント像を別々に作成し、これをコンピュータ上で重ね合わせ像として再構築することにより、木部細胞中の両者の立体的な位置関係を直接明らかにすることが可能となった。その結果、分化中仮道管の表層微小管は一次壁形成中、二次壁形成中共に連続的に配向変化するのに対し、アクチンフィラメントは仮道管長軸にほぼ平行に配向し、木部分化中における配向変化は認められなかった。これらの結果は、植物培養細胞で得られているアクチンフィラメントの配向が表層微小管の配向変化に先行して変化し表層微小管の配向を制御するという知見とは異なり、樹木木部細胞の細胞壁形成中には両者の配向に直接的な関係は認められないことを示唆している。本研究の結果は、韓国で行われた国際木材解剖学会で発表した。セルロースミクロフィブリル(CMF)の堆積方向や堆積場所は、植物細胞の形態を決定する上で、重要な要因である。CMFの配向は、これまでの多くの報告から、細胞骨格である表層微小管が制御していると考えられている。一方、表層微小管自体の配向や局在がどのように制御されているかについては知見が充分ではなく、培養細胞を用いたモデル実験の結果からアクチンフィラメントの関与が示唆されているが、よりインタクトな植物細胞において表層微小管とアクチンフィラメントが密接な関係を保ちながら、共に配向や局在を変化させるという実験的な証拠は得られていない。そこで本研究では、針葉樹分化中木部細胞におけるアクチンフィラメントや表層微小管の配向や局在を、間接蛍光抗体染色法と共焦点レーザ顕微鏡法を組み合わせて連続的に観察した。観察には、アカマツおよびイチイの樹幹試料を用いた。分化中仮道管内のアクチンフィラメントは、太い束状の形態をもち、細胞内での分布密度は粗であった。配向性は良くなく、折れ曲がって見えるものも認められた。アクチンフィラメントは、形成層細胞においては仮道管軸に対してほぼ平行に配向し、細胞拡大帯(一次壁形成中)から二次壁形成中の仮道管においてもその主配向は変化せず、仮道管軸に対してほぼ平行であった。さらに分化が進んだ仮道管では、ランダムながら仮道管軸に対して水平方向に配向するアクチンフィラメントも認められた。これらの配向は、仮道管分化中に連結的に変化する表層微小管の配向とは異なっており、アクチンフィラメントと表層微小管の配向に直接的な関連性は認められなかった。一方、束状のアクチンフィラメントより細く短いアクチンフィラメントが細胞全体に存在していた。形成中の壁孔領域では、配向性をもたないアクチンフィラメントの集合体が観察され、一方表層微小管は壁孔縁に沿って円形の束を形成し円形の束の内側では表層微小管が認められないことから、アクチンフィラメントの集合体が表層微小管の局在を制御している可能性が示唆された。
iPS細胞とRNAiを用いた新規解析戦略の確立とそれを用いたHTT遺伝子機能探索

ハンチンチン(Htt)遺伝子の機能や役割についてはよく分かっていない。本研究は、多能性幹細胞とRNAiを組み合せた新しいアプローチによって、その解明につながるデータの取得を目指した。Httを抑制するsiRNA・shRNAの設計を完了し、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いたshRNA発現AAVの構築も完了した。そしてshRNA発現AAVをマウスES細胞に感染させHttのノックダウンを試みたが、導入効率の低さが原因で目的を達成することができなかった。従来法による導入も試みたが、強力な抑制を誘導することができなかった。今後はCRISPR/Cas9を採用した新規戦略で目的達成を目指したいと考えている。ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン(HTT)遺伝子のノックアウトマウスは8.5日胚までに胚性致死となるが、そのHTT遺伝子の胚発生過程における役割や細胞内での機能については全くわかっていない。本研究は、人工多能性幹細胞(iPS細胞)とRNAiノックダウン法を組合せた新しいアプローチによってHTT遺伝子の胚発生過程での役割や細胞内の機能についてその解明の突破口となる新規データの取得を目的とする。本年度は、まずHTT遺伝子発現抑制のためのsiRNAの設計とそれに基づくshRNA発現ベクターの構築を行った。ヒトHTT遺伝子とマウスHtt遺伝子の共通配列をターゲットにsiRNAを設計し、それをヒトHeLa細胞に導入して誘導されるRNAiのノックダウン効果をRT-qPCR法によって解析した。そのスクリーニングの結果、強いノックダウン効果を示すsiRNAを決定することができた。次にそのsiRNAの配列を基にshRNAを設計しshRNA発現ベクターを構築した。上記と同様の手法により強いRNAiノックダウン効果が誘導されることを確認した。そして、その構築したshRNA発現ベクターを用いてアデノ随伴ウイルス(AAV)へのパッケージングを行った。iPS細胞に関してはその培養手法の指導を受け、iPS細胞培養に向けての準備を行った。ハンチンチン(HTT)遺伝子のノックアウトマウスは8.5日胚までに胚性致死となるが、そのHTT遺伝子の胚発生過程における役割や細胞内での機能については全くわかっていない。本研究は、多能性幹細胞(ES細胞、iPS細胞)とRNAiノックダウン法を組合せた全く新しいアプローチによって今までわからなかったHTT遺伝子の胚発生過程の役割や細胞内機能の解明の突破口となる新規データの取得を目的とする。本年度は、前年度までに構築したshRNA発現ベクターからアデノ随伴ウイルス(AAV)へのパッケージングと精製作業を行い、得られたshRNA発現AAVを用いて内在性Htt遺伝子発現抑制効果の確認を行った。多能性幹細胞の培養に関しては、培養技術の習得と練習を兼ねて先ずはマウスES細胞の培養を行いiPS細胞培養に向けての準備を行った。ハンチンチン(Htt)遺伝子のノックアウトマウスは8.5日胚までに胚性致死となるが、そのHtt遺伝子の胚発生過程における役割や細胞内での機能については全くわかっていない。本研究は、多能性幹細胞(ES細胞、iPS細胞など)とRNAiノックダウン法を組合せた新しいアプローチによって、今までわからなかったHtt遺伝子の胚発生過程の役割や細胞内機能の解明につながる新規データの取得を目標とした。Htt遺伝子をRNAiノックダウンするためのsiRNA・shRNAの設計と評価を完了し、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いたshRNA発現AAVの構築も完了した。そのshRNA発現AAVを用いてマウスES細胞に感染させ、内在性Htt遺伝子のRNAiノックダウンを試みた。しかしながら、いろいろな条件を試してみたが、構築したshRNA発現AAVのES細胞への導入効率が極めて低いという結果に終わった。そこで従来法による発現抑制も試みた。合成siRNAをリポフェクションによって導入してみたが、強力な遺伝子ノックダウンの結果を得ることができなかった。当初の研究計画・予想よりも極めて困難な実験であることが分かった。しかし、本研究推進中に、ゲノム編集技術の目覚ましい発展にともない新たな打開策の可能性も見えてきた。今後はCRISPR/ Cas9システムを新規に採用した戦略で目的達成を目指していきたいと考えている。shRNA発現AAVの構築は完了することができた。多能性幹細胞の培養に関してはiPS細胞よりも比較的培養が安定しているマウスES細胞を用いて先ずは培養技術の習得を行った。分子生命科学Htt遺伝子の発現抑制方法について、当初の計画ではRNAi技術を使って遺伝子ノックダウンすることを考えていたが、最近のCRISP/Cas9システムの実用性の向上と高い成功率を考えると、RNAiシステムよりもCRISP/Cas9システムを使って遺伝子ノックアウトした方がよいと考えている。来年度はその点を含めて検討していきたいと考えている。本研究計画の重要なツールであるshRNA

発現AAVを初年度に構築することができた。よって、ほぼ計画通りの達成となったと考える。研究は順調に進んでおり、来年度(H26年度)における研究計画の変更は考えていない。
口腔レンサ球菌Anginosus groupの溶血毒に関する研究

成人性歯周炎患者12例中5例、健常者30例中10例の歯周縁下プラークからβ溶血を示す菌株を検出した。レンサ球菌同定用のStreptogramで15菌株中13菌株は7桁コード0110434を示し、S.anginosus NCTC10713のコードに近似していた。また、この13菌株中12菌株がラテックス凝集反応でG群抗血清と反応した。これら分離菌株はS.anginosusと考えられ、本菌はヒト口腔に広く分布することが示唆された。BHI,Todd HewittbrothよりもGAM brothで溶血活性が強く発現し、培養上清に認められ、本溶血毒は菌体外産生性であった。溶血毒の精製は、H-2菌株の遠心上清から60%硫安飽和画分を得て、これをQ-Sepharose,Sepharose S-300によるゲル濾過し、次いでHydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーによって行った。この精製溶血毒をSDS-PAGEで純度を調べると5060KDaの範囲にDiffuseな蛋白質バンドを示した。精製成績は回収率33.6%で625倍に精製できた。溶血毒の等電点はIsoelectric focusingによって調べたところpI4.2であった。また、本溶血毒はTrypsin,Chymotrypsin,Proteinase Kなどの処理および70°C、10分処理で失活した。本溶血毒の作用至適pHは7.5で2-Mercaptoethanol(ME),Dithiothreitolなどの還元剤によって23倍上昇した。S.anginosus溶血毒は、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギおよびモルモットの血球に対して同程度に溶血した。また、S.anginosus NCTC10713の菌株から精製した溶血毒の諸性状もH-2菌株のそれと極めて近似していた。精製した両溶血毒の各10Uを供試してBALB/Cマウスの腹腔マクロファージからのサイトカイン誘導能をELISA法で測定したところ、TNF-αおよびIL-6をといずれの溶血毒も誘導した。また両溶血毒はアポトーシス活性を示した。口腔レンサ球菌群は,口腔常在菌叢の中で最も優勢で,プラーク形成や齲蝕病因に関連し,とりわけMutans groupの研究が多い。一方,Anginosus groupは,ヒトの臓器や組織に感染を引き起こすこと,また近年,食道癌との関連性からも注目されている。本研究は,成人性歯周炎患者の口腔からもしばしば検出されるβ溶血を示すレンサ球菌を分離して菌種の同定を行いこの溶血毒について調べた。【方法】歯周病患者の歯肉縁下プラークから分離した5菌株の性状は,レンサ球菌同定用のストレプトグラムおよびラテックス凝集反応で調べた。溶血毒の産生性は,H-2菌株を供試し,活性の測定はヒツジ血球を用い常法に準じて吸光度(540mn)で行った。

溶血毒は,GAM brothで嫌気培養の遠心上清から得た硫安飽和画分を,イオン交換,ゲル濾過,Hydroxyapatiteカラムクロマトで精製した。【結果・考察】供試菌株は,いずれもストレプトグラムの7桁コードが1110434でS,anginosusの性状と近似し,またラテックス凝集反応ではG群抗血清と反応した。本溶血毒の産生性は,BHI,Todd HewittbrothよりGAM brothが著明で,溶血活性は培養上清に強く認められ菌体外産生性であった。溶血毒は最終のHydroxyapatiteクロマトでSDS-PAGEで分子量5065kDa部位にdiffuseな蛋白質バンドを示した。水溶血毒の等電点が4.0で溶血活線性は,dithiothreitol,2-mercaptoethanol(ME)などの還元剤によって23倍上昇し,酸化溶血毒(H_2O_2)はMEの添加で回復した。また,本活性は,トリプシン,キモトリプシンなどプロテアーゼ処理によって消失し,易熱性であった。作用至適pHは7.5で,ヒトおよび各種動物の赤血球を同程度に溶血した。健常者口腔にβ溶血を示すレンサ球菌S.anginosusの分布状況を明らかにし、また本菌から精製した溶血毒についてサイトカイン誘導能およびアポトーシス活性を明らかにする。方法:健常者(本学学生)30例の歯肉縁下プラークよりβ溶血を示すレンサ球菌を分離して昨年度と同様Streptogramおよびラテックス凝集反応によって菌種同定を行う。標準菌株S.anginosusu NCTC10713の溶血毒の産生性および本溶血毒の精製を行いすでに精製している溶血毒の諸性状と比較検討する。これら精製溶血毒を用いて本溶血毒のサイトカイン誘導能およびアポトーシス活性を調べる。結果・考察:健常者の歯肉縁下プラーク30例中から明らかにβ溶血を示すレンサ球菌10菌株が得られた。10菌株中8菌株がStreptogram7桁コードが0110434でこのうち6菌株がG群抗血清と凝集した。これらの性状は、S.anginosus NCTC10713と極めて近似することからS.anginosusが健常者の口腔にも広く分布されることが示唆された。S.anginosus NCTC10713菌株の溶血毒産生性は、H-2菌株同様にGAM brothで著明に産生したが本菌の溶血毒は培養24時間で殆どの活性が消失する傾向にあった。本菌からの溶血毒を昨年度のH-2株同様に精製してその性状を調べたがH-2株の諸性状とと近似していた。
フラクタル上の確率過程の研究

研究代表者藤田岳彦は以下について調べた。複素多様体上では等角不変な拡散過程が存在しholomorphic diffusionと呼ばれている。論文では.複素次元が2の場合にケーラー性と対称なholomorphic diffusionの存在性が同値であることを示し.また.対称なholomorphic diffusionが存在しないような多様体の例を挙げた.また.同様の問題を複素次元が3以上の場合について調べた。これらの研究は等角構造とフラクタルの関連を調べるうえにおいても基本的な結果であると思われる。分担者の山崎昌男は.Morrey空間とBesov空間の両方の考え方を組み合わせて.Morrey空間を基礎とするBesov空間というものを構成し.その性質を調べ.その結果をNuvier-Stokes方程式に応用した。これらを名古屋大学の小薗英雄氏との共同研究として.C.R.Sci.Acad.Parisに発表した。分担者の宮地晶彦は.主にCp^αという関数空間の性質を研究した。与えられた関数を2つの関数の積に分解する因数分解の問題やC^α_P(Ω)の関数をC^α_P(R^n)の関数に延長することに関する結果をMathematica Japonicaに発表した。分担者の永島孝は主に第1階古典述語論理系およびそれを拡張した一種の無限述語論理系についての研究を行った。古典述語論理については.函数概念の扱いを研究し.その成果の一つとしてスコーレムの定理の新しい証明をHitotsubashi J.Arts Sci.に発表した。
導電性高分子被覆した高エネルギー密度有機硫黄正極に関する研究

輸率の高いアニオンを利用することにより、急速充放電が期待される高エネルギー密度化(高電圧×高容量)を見据え高電圧作動する電子供与型の有機硫黄材料の開発を行う。しかし、電極材料として利用するには解決すべき課題として、電子伝導性が低いため導電助剤を多く必要とするため電極全体当たりでの容量が低いこと、充放電時における有機電解液への溶出(分解)がある。本研究では、導電性高分子を正極に被覆(複合)することで課題を解決する。
合成ハイドロキシアパタイトへのタンパク質および細菌の吸着、付着に関する研究

う蝕や歯周疾患発症の共通因子である歯垢の形成は、歯表面へのタンパク質および細菌の吸着・付着現象であり、歯、タンパク質および細菌表面の物理化学的特性や静電気的相互作用が大きく影響すると考えられる。この研究では、まずエナメル質の主成分である合成ハイドロキシアパタイト(HAp)、タンパク質および細菌のzeta電位(Mobility)の測定法を確立するとともに、HApへのタンパク質の吸着現象を物理化学的に解析した。また細菌については、XPSを用いて表面元素分析をするとともに、AFMを用いて形態分析を行い、その結果と界面電気化学的特性との関連性について考察した。その結果、次に示す知見を得た。1.HApだけでなく生体コロイドとしてタンパク質や細菌表面についてもzeta電位の測定が可能であった。また、沈降性の高いHAp系の試料は測定時間の短いPen-Kem社製の装置が適しているのに対し、粒径が小さいタンパク質ならびに粒子の静止を判断するのが困難である細菌については光散乱型の大塚電子社製およびMalvern社製の装置が適していることがわかった。2.フッ化物およびフッ素系界面活性剤の処理によって、HApやエナメル質の表面特性が変化し、その変化がHApへのタンパク質の吸着現象に大きく影響を及ぼした。HApへのタンパク質の吸着は他の吸着現象とは異なり、HApの疎水化がわずかな場合には吸着は減少するが、疎水化が極端になると、逆に吸着は増加した。3.口腔内細菌表面のzeta電位はpH5.09.0の間ではほとんど変化せず,負の電位が大きい細菌と、電位が0付近の細菌の2種類に分別できた。また細菌表面のzeta電位の大きさは,細菌表層のリン化合物の存在および針状突起物の長さやなめらかさに影響を受けることが示唆された。今年度(平成元年度)はタンパク質、細菌および合成ハイドロキシアパタイト(HAp)のzeta電位の測定条件を確立し、それぞれのzeta電位の値を明らかにした。タンパク質については等電点の異なる6種類のタンパク質を用いて、1/30Mリン酸緩衝液中でzeta電位を測定した。その結果、分子量が7200程度のサケプロタミンをはじめ、実験に供したすべてのタンパク質が測定可能であることが確認でき、それぞれのタイトレ-ションカ-ブを得ることができた。細菌についてはpH7.0の1/30Mリン酸緩衝液中でS.mutansHS-6のzeta電位を測定し、TSBY培地で培養した場合が-20.6mV、HIB培地が培養した場合が-20.3mVの値を得た。これらの値はpenーKem社製の電気泳動装置を用いて測定した結果と比較すると、わずかに負の電位が低くなっている。しかし、大塚電子社製のzeta電位計を用いた測定結果は、van Gils plotsの左右対称性の乱れや測定値のばらつきが小さく、細菌に関しては、pen-kem社製の装置よりも正確な情報が得られることが示唆された。一方、HAPはタンパク質や細菌に比べると非常に沈降性が高く、タンパク質や細菌と同じ測定条件ではvan Gils plotsの左右対称性がセルの壁面付近で乱れる傾向にある。現在のところ、HAPの洗浄を10回行い、分散比をHAP10mgに対して、1/30Mリン酸緩衝液50mlにし、測定前に周波数28KHzの超音波で1分間処理した試料については、左右対称のvan Gils plotsが得られている。この条件下でのHAPのzeta電位の値は-33.9mVであり、penーkem社製の装置を用いた測定結果-34.8mVに近似している。HAPについては、今後さらに詳細な測定条件を設定し、HAPのzeta電位に対する超音波の影響についても検討していく予定である。

来年度はこれらの値をもとにして、タンパク質のHAPへの吸着現象およびタンパク質吸着HAPへの細菌の付着現象を界面電気化学的に解析していく。今年度はまずフッ化物(NaF,APF,SnF_2)溶液処理による合成ハイドロキシアパタイト(HAp)の表面性状の変化がタンパク質の吸着現象にどのような影響を及ぼすかについてZeta電位的に解析した。その結果,NaFおよび0.01%FーAPF溶液でHApを処理してもゼ-タ電位に変化はなく,タンパク質の吸着被覆率および吸着自由エネルギ-もタンパク質の種類を問わず変化がないことがわかった。しかし,0.1%Fおよび0.9%FーAPFでHApを処理すると,負のZeta電位が小さくなり,それに伴ってタンパク質の吸着被覆率および吸着自由エネルギ-は低くなり,タンパク質の吸着を阻害していることがわかった。この傾向はとくに塩基性タンパク質であるプロタミンで顕着であった。一方,SnF_2溶液でHApを処理すると,負のゼ-タ電位は大きくなり,それに伴ってタンパク質の吸着被覆率は低タンパク質濃度から高くなり,吸着自由エネルギ-も大きくなった。すなわち,SnF_2溶液の処理によってタンパク質の吸着が促進されることが確認された。次に口腔内細菌の荷電特性を解明するため,1/30Mリン酸緩衝液中で5種類のStreptococciのゼ-タ電位を測定した。その結果,pH7.0の溶液中で菌種により,約1mVから約-25mVまでの幅広い値をとることがわかった。また溶液pHを変化させ,各細菌の等電点を求めたところ,S.mutans BHT<S.mutans K-1<S.cricetus HS-6<S.mutans OMZ175<S.sobrinus6715の順に高くなることがわかった。さらに培養時間や培地の種類などの培養条件が細菌のゼ-タ電位にどのような影響を及ぼすかについて検索したが顕著な差異ま認められなかった。以上のことから,歯表面の荷電状態が獲得被膜の形成に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。また,生体コロイドとして,細菌のゼ-タ電位の測定が可能であることが確認された。
癌細胞の悪性化形質獲得における活性酸素の影響

1.悪性形質獲得における活性酸素の影響:異物に反応する宿主細胞とQR-32細胞とを移植し、増殖してきた腫瘍より樹立した18系の培養株では、元のQR-32細胞と異なり100%に悪性化進展を認めた。また、in vitroのPGE_2産生量を悪性化進展の指標とし、宿主細胞による悪性化進展の要因について解析した。その結果、この系にradical scavengerであるcatalase, mannitol添加より顕著にPGE_2産生量が抑制された。即ち宿主細胞から放出される活性酸素がQR-32細胞の悪性化進展に関与していることが示された。2.次硝酸ビスマスおよびPSK投与による悪性化進展の抑制効果:異物(ゼラチンスポンジ)とともにQR-32細胞を移植する悪性化進展モデルを用い、次硝酸ビスマス,PSKを投与し、悪性化進展への影響および腫瘍局所の内因性radical scavengerの誘導を検討した。その結果、悪性化進展率では非投与群で100%に対し、次硝酸ビスマス経口投与群では57%、PSK腹腔内投与群、経口投与群ではそれぞれ50%と各々有意な抑制を認めた。さらに各群での腫瘍組織局所の内因性radicalscavengerをImmunoblotting法およびimmunohistostain法を用い比較検討した所、次硝酸ビスマス経口投与群の腫瘍組織ではMetallothioneinが、またPSK投与群では内因性radecal scavengeであるCu/Zn-SOD, GSH-Pxtorの発現増強が認められた。Mn-SOD遺伝子導入による悪性化進展の抑制効果:活性酸素により高率に悪性化するQR-32細胞とその率が低いQR-29細胞があり、この原因として細胞内抗酸化酵素の関与が示されてきている。そこで、Mn-SODに注目し、QR-32細胞にMn-SODcDNAを導入した。その結果、悪性化進展率が60%から20%に低下し、細胞内Mn-SODが悪性化進展に深く関与していることが示された。
小胞体ＭＡＭ構造を介した脂肪滴とペルオキシソームの関連

小胞体サブドメインの一つであるMAM (mitochondria-associated membrane)が、脂肪滴とペルオキシソームの形成に関与するかどうかを調べた。脂肪滴形成は、syntaxin17などのMAM構築タンパク質の発現抑制によって抑制された。また、Rab32も脂肪滴形成に貢献していることが示唆された。Sec16Bの発現抑制は、ある種の細胞では脂肪滴形成を促し、ペルオキシソームを伸長させたが、別の細胞では脂肪滴形成を抑制し、ペルオキシソームは短くなった。以上の結果より、脂肪滴形成においてはMAMが重要な働きをし、また脂肪滴形成とペルオキシソーム形成には連携があることが示された。ペルオキシソーム膜の形成(de novo合成)および脂肪滴の形成におけるMAM(mitochondria- associated membrane:小胞体のサブドメイン)の役割を解明することを目的として研究を進め、本年度は以下の成果を得た。1.Syntaxin17(Syn17)はMAMに存在するSNAREであるが、その発現抑制によって脂肪滴形成(HeLa細胞にオレイン酸を添加)は抑制される。同様の抑制が、MAMの構築を司るPACS2の発現抑制によっても起こったが、MAMとミトコンドリアの連携(繋留)を司るmitofusin2の発現抑制では脂肪滴形成の抑制はなかった。MAM機能は、低分子量GTPaseであるRab32によっても調節されていることが知られているが、Rab32の発現を抑制すると脂肪滴の成長が抑制されて小さな脂肪滴が蓄積した。これらの結果は、脂肪滴形成にはMAMが関与するが、MAM-ミトコンドリアの連携は関係しないことを示唆している。2.マウス3T3-L1細胞は脂肪細胞へ分化することが知られているが、分化に伴いSyn17の発現量が5倍程度上昇し、またSyn17の発現を抑制すると脂肪細胞への分化が抑制された。3.Sec16Bの発現抑制は、ペルオキシソーム膜タンパク質(Pex16およびPex3)のペルオキシソームへの輸送を阻害し、また脂肪滴形成を誘導するが、すべてのペルオキシソーム膜タンパク質の輸送が阻害されるわけではなく、また細胞種によっては脂肪滴形成を阻害することが判明した。予備的な研究成果から、申請者らは、1)ペルオキシソーム膜のde novo合成と脂肪滴の合成は、小胞体のミトコンドリア接触領域(MAM)で起こり、互いに関連している。2)これらの過程に、syntaxin17(Syn17:MAMに存在するSNARE)やFis1(ミトコンドリアおよびペルオキシソームの分裂因子)が関与し、またこれらのタンパク質の局在をSec16Bが調節している、という仮説を立てた。この仮説を検証する第一歩として、本年度は以下の実験を行った。1.Sec16Bに依存したタンパク質のMAMへの局在化:その一部がMAMに存在するといわれているカルネキシンやIP3受容体について、Sec16Bの発現抑制による局在変化を調べた。カルネキシンについては、ごく一部の細胞で変化が見られたが、このタンパク質は小胞体のホメオスタシス変化によっても局在が変化するので、更なる解析が必要である。2.MAMの構築:Syn17のMAMへの局在化機構について調べた。その結果、Syn17のC末端の疎水領域(CHD)を二分するLys-254、およびCHDに続くC末端塩基性アミノ酸クラスター(+C)が重要であることが判明した。Syn17の発現を抑制すると、ミトコンドリアの形態が変化し、脂肪滴形成が抑制された。これらの変化は、Sec22b(Syn17と結合するSNARE)およびSyn18(小胞体に存在するsyntaxin)の発現抑制では起こらなかったので、SNARE活性(膜融合活性)とは異なるSyn17の機能の可能性が考えられる。ミトコンドリアの形態変化は、CHD+Cでレスキューされたが、脂肪滴の消失は全長Syn17でのみ抑制された。3.Rab32(GTPase)との関連: Rab32はカルネキシンのMAM局在を調節していることが報告されている。現在、Rab32とSyn17の結合を調べている。ミトコンドリアの形態および脂肪滴の形成におけるSyn17の関与を証明できた点は大きな前進であるが、一方、ペルオキシソーム膜のde novo合成への関与についてはまだ解析が進んでいない。また、Sec16B、Fis1、Rab32に関しては解析がやや遅れている。大きな前進と遅れている部分を総合的に判断すれば、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。1.Rab32との関連:Rab32の発現抑制、活性型および不活性型変異体の発現を行い以下の点を調べる。1)Syn17およびFis1を含む