hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
底生有孔虫類の遺伝的分化機構の解明：生態的な要因が遺伝的集団の分化に与える影響

本研究では,岩礁地性底生有孔虫(Elphidium crispum,Pararotalia nipponica)を対象とし,生態的な要因が遺伝的分化機構に影響を及ぼすことを検証するものである。地理的隔離や宿主の環境応答が,地域集団の形成に関与することは広く知られている。しかし,宿主の資源利用の違いや環境中から獲得する内生微細藻類の環境応答が,宿主の遺伝的分化に寄与する可能性については不明な点がある。岩礁地性底生有孔虫は,岩礁地の石灰藻の葉上に生息し,遊走子を放出する有性生殖様式を持つ。このため,類似した地理的隔離による遺伝的分化を経ていれば,類似した遺伝的分化パターンを示すはずである。一方,宿主や内生生物の生態的な影響による集団の維持機構が存在したのであれば,異なる遺伝的分化パターンを示す可能性がある。宿主の分子系統地理学的解析では,ITS領域を解析した結果,両種間で遺伝的分化パターンが大きく異なることが示された。E.crispumは,少なくとも3つの地域集団(サブクレード)に明瞭に分かれ,分岐パターンは高い信頼度で支持された。一方,P.nipponicaは,ほぼ同一の塩基配列を持ち,地域集団に相当するクレードは存在しないことから,現在も遺伝的な交流が継続的に生じていると考えられる。さらに,次世代アンプリコン解析を用いて,内生生物の葉緑体16S rRNAの遺伝的多様性解析を行った結果,珪藻由来の葉緑体を保持していることが明らかとなった。解析した2種の有孔虫の至適生息条件は,それぞれ水温20°C,塩分35であるが,両種とも10°C,25でも生存できるため,日本海における最終氷期の低温・低塩分環境でも集団の維持が可能であったと推測できる。両種は生活様式や生殖様式が類似しているものの,餌資源の利用形態が異なるため,内生生物の獲得の有無が集団の維持に大きな影響を及ぼした可能性が高い。平成30年度は,平成29年度末に明らかになった4つの問題点について解析を行った。1)異なる遺伝的分化パターンは,分析数を増やしても同じようなパターンを示し,一般性があるのか,2)どのくらいの規模の遺伝的集団を形成し,種間でその規模が異なるか,3)細胞内の微細藻類の遺伝的多様性がどの程度存在するか,4)細胞内の微細藻類には種特異性はあるのか,緯度方向で獲得する珪藻種に違いはあるのか,に着目した。29年度に行った解析に加え,合計131個体,431配列(E. crispum:79個体,259配列, P. nipponica:52個体,172配列)の遺伝子配列データを取得し,両種の遺伝的分化パターンが大きく異なることを示した(1)。また,E. crispumと類似した遺伝的分化パターンを持つ岩礁地性底生有孔虫Planoglabratella opercularisと比較した結果,前者の方が遺伝的な集団の規模や過去の遺伝的交流の規模が広い可能性が推察された。遊走子の分散能力は,遺伝的集団の規模に関係している可能性が高い(2)。さらに,次世代シーケンサーを用いたアンプリコン解析から細胞内の微細藻類の遺伝的多様性を各11個体(11地点)で比較した(3,4)。また,アミノ酸窒素同位体比分析に基づく栄養段階推定から,両種の栄養依存形態が異なることを主筆論文1編としてEcology and Evolutionに出版した。また,4編の関連共著論文と,14件の共同発表を含む学会発表を行った。主筆論文として出版した成果は,本研究課題において,環境変化に伴う宿主の集団の維持機構が,餌の獲得様式に関与する可能性を示す証拠として重要な位置づけとなる。以上の研究の進捗と関連研究論文の出版・成果公表から,当初目標を十分に達成できていると判断した。宿主有孔虫の分析については,これまでの実験によりデータを集積できているが,まだ空白地域が残されている。このため,最終年度は,1)宿主有孔虫について,空白地域を補完する遺伝子データを取得する計画である。また,2)細胞内内生生物の遺伝的多様性解析については,次世代シーケンサーを用いたアンプリコン解析を行ったが,E. crispum,P. nipponicaともに,現時点では,綱までの同定しかできておらず,今後,科(もしくは属)まで,配列データから同定し,個体内(細胞内)の遺伝的多様性および地域間の変異の存在を明らかにする必要がある。また,3)細胞内内生生物の多様性解析については,各地点1個体ずつしか解析できておらず,地理的な差異や細胞内の多様性については,十分に解析することができていない。このため,平成31年度は,個体数と地点数を増やして解析を行う予定である。以上の解析に加え,内生生物の多様性解析で明らかになった珪藻(属)種については,環境耐性をデータベース・文献から調査する予定である。これらの解析により,宿主の集団の維持メカニズムと遺伝的分化機構の関係を解明することができる。また,宿主の遺伝的分化パターンと環境耐性・宿主の栄養段階推定から得られた栄養依存様式とを統合する。このことによって,餌資源の利用形態や内生生物(共生藻類や盗葉緑体)の存在形態が,底生有孔虫類の遺伝的集団の成立を促し,遺伝的分化パターンの違いとなって顕在化していることを示す。

以上の研究により,有孔虫における新たな地域集団の形成機構を提示することで,本課題を達成することができると考えている。研究の成果は,学会等で公表するとともに,国内外の研究者と議論を行い,論文として取り纏める予定である。本研究では,日本沿岸に生息する岩礁地性底生有孔虫を対象とし,特に,日本海の閉鎖といった地理的隔離の影響に加え,内生生物の生態的な要因が遺伝的集団の形成やその地理的分布の形成に寄与したことを,1)分子系統地理学的視点(宿主と内生生物の遺伝的多様性),2)生態学的視点(宿主や内生生物の環境応答),3)同位体生態学的視点(宿主の餌資源利用形態)から明らかにし,生態学的要因と地球科学的要因を統合することで,有孔虫の遺伝的分化機構を明らかにするものである。29年度は,日本列島沿岸に生息する二種の岩礁地性底生有孔虫(Elphidium crispumおよびPararotalia nipponica)について,A)宿主有孔虫の分子系統地理学的解析を中心に解析を行うとともに,一部の試料について,内生生物の遺伝的多様性解析を予察的に行った(研究内容1に関連)。地域集団の識別は,E. crispumの場合は核のSSU rRNA遺伝子が有効であり,P. nipponicaでは,リボソーム遺伝子のスペーサー領域であるITSが有効であった。これらの遺伝子領域を用いて解析したところ,これまで予察的に得られていた両種の遺伝的分化パターンの違いが,明らかに異なることが明確化できてきた。また,内生生物の葉緑体16S rRNA遺伝子領域の解析では,異なる環境に生息する珪藻種(やそれに由来する葉緑体)をそれぞれ持つことが明らかになってきた。また,B)宿主の餌資源利用形態の違いをアミノ酸窒素同位体比分析および栄養段階推定から明らかにし,TEMによる細胞内の微細構造観察および内生生物の遺伝子同定の結果と併せて,微小生息空間内の餌資源利用形態の違いを見いだすとともに,上述の2種間の資源利用形態が大きく異なることを示すことができた。Bについては,結果を取り纏め査読雑誌に修正原稿を投稿した(研究内容2に関連)。平成29年度は,当初目標を2項目(天然試料を用いた群集解析から宿主有孔虫の環境耐性(特に塩分耐性)を見出すこと,有孔虫2種の分子系統地理学的解析)を設定し,各項目の分析を目標とした。研究の当初計画では,天然試料の群集解析を行い,現在の海洋環境における塩分勾配から,上記2種の塩分耐性が宿主だけではなく,細胞内微細藻類の獲得に影響を及ぼすと推測したため,この試料を採取し,群集解析を行うことを想定していた。しかし,予定していた期間に荒天となるなど,試料の採取が困難であった。このため,31年度に行う予定にしていたアミノ酸窒素同位体比分析に基づく栄養段階推定と微小生息空間内における餌資源利用形態の解析を進めた。当初計画通りに進まない面もあったが,前倒して分析することで論文投稿(現在修正原稿を投稿済み)に至るなど大きな進展があり,当初目標を十分に達成できていると判断した。本研究では,岩礁地性底生有孔虫(Elphidium crispum,Pararotalia nipponica)を対象とし,生態的な要因が遺伝的分化機構に影響を及ぼすことを検証するものである。地理的隔離や宿主の環境応答が,地域集団の形成に関与することは広く知られている。しかし,宿主の資源利用の違いや環境中から獲得する内生微細藻類の環境応答が,宿主の遺伝的分化に寄与する可能性については不明な点がある。岩礁地性底生有孔虫は,岩礁地の石灰藻の葉上に生息し,遊走子を放出する有性生殖様式を持つ。
多価アルコールからアリル化合物の高収率一段合成を可能とする新規触媒反応場の開発

本研究の目的は,直鎖多価アルコールから二重結合を有するアリル化合物の直接合成を可能とする触媒反応プロセス開発を行うことである.ジルコニアやアルミナを含有する酸化鉄触媒にカリウムを担持させることで,グリセリンからアリルアルコール生成量を増加させることに成功した.また,水素供与体である蟻酸を多価アルコールと併給することでアリル化合物収率が向上することを明らかにした.さらに,開発触媒はバイオディーゼル合成時に副生する粗製グリセリンからのアリルアルコール生成に対して有効であることを明らかにした.本研究では,直鎖多価アルコールから,二重結合を有するアリル化合物の直接合成を可能とする触媒反応プロセス開発を実施する.触媒としては,酸化鉄(Fe2O3)を基材とし,酸化活性の向上を目的とした成分(MOx:ジルコニアなど)と塩基性の賦与を目的とした成分(アルカリ金属)を担持した触媒を開発する.平成24年度の成果により,酸化鉄系触媒を用いるとグリセリン水溶液の反応では,水素移行反応によりアリルアルコールが得られることを見出している.さらに,水素供与体であるギ酸を反応系に併給するとギ酸由来の活性水素種により水素移行反応が促進され,アリルアルコール収率が向上した.さらに,触媒にKを担持すると触媒酸点上で進行する副反応の脱水反応が抑制されることが分かった.そこで,平成25年度は本触媒をグリセリン以外の多価アルコールからの有用化学物質の合成に適用した.グリセリンは炭素数3であるため,反応原料として新たに炭素数2のエチレングリコール(2つの水酸基)と炭素数4のエリスリトール(4つの水酸基),そして芳香族としてカテコールを用いた.また,触媒として酸性制御の観点からK-ZrO2-FeOxの他にK-FeOx,K-Al2O3-FeOx,K-TiO2-FeOxを調製して研究に用いた.エチレングリコールとギ酸の混合物を原料とした場合,期待されるように主生成物としてエチレンが水素移行反応により得られた.K-Al2O3-FeOxを用いた場合,最も高いエチレン収率が得られた.これは,Al2O3による水素スピルオーバーによって水素が効率的に使用されたためと考えられる.エリスリトールとギ酸の混合物をK-Al2O3-FeOxを触媒として反応をすると,水素移行反応によりエリスリトールからはブタジエンが,カテコールからはフェノールが高い収率で得らることに成功した.本研究の目的は,直鎖多価アルコールから二重結合を有するアリル化合物の直接合成を可能とする触媒反応プロセス開発を行うことである.ジルコニアやアルミナを含有する酸化鉄触媒にカリウムを担持させることで,グリセリンからアリルアルコール生成量を増加させることに成功した.また,水素供与体である蟻酸を多価アルコールと併給することでアリル化合物収率が向上することを明らかにした.さらに,開発触媒はバイオディーゼル合成時に副生する粗製グリセリンからのアリルアルコール生成に対して有効であることを明らかにした.本研究では,直鎖多価アルコールから,二重結合を有するアリル化合物の直接合成を可能とする触媒反応プロセス開発を実施する.触媒としては,酸化鉄(Fe2O3)を基材とし,酸化活性の向上を目的とした成分(MOx:ジルコニアなど)と塩基性の賦与を目的とした成分(アルカリ金属)を担持した触媒を開発する.ZrO2-FeOxおよびK担持ZrO2-FeOxを用いて30wt%試薬グリセリン水溶液を反応させた.ZrO2-FeOxと比較し,K担持ZrO2-FeOxでは触媒の固体酸性質に由来するグリセリンの脱水により進行する反応経路やアルデヒド生成が抑制され,アリルアルコール収率が大幅に増加した.グリセリンへの水素添加経路を検討するため,アリルアルコール以外の各反応中間体を反応系に添加してグリセリンの転換反応を実施した.その結果,アリルアルコール収率は26mol%-C程度であり,グリセリンのみを供給した場合と同程度であったことから,中間体からの水素供与反応は進行していない.一方,ZrO2-FeOx触媒は水分子を分解し,水素活性種を生成する.従って,水分子由来の水素活性種が触媒表面からグリセリンに供給された結果,アリルアルコールが生成したと考えられる.上記の検討から,触媒表面上に水素原子を生成させることによりアリルアルコール収率の向上が期待される.そこで,水素を容易に生成するギ酸を反応系に添加した検討を行った.無触媒でのグリセリンとギ酸の反応後は,水素とアリルアルコールはほとんど生成しなかった.一方,同原料をK担持ZrO2-FeOx上で反応させた場合,添加したギ酸濃度の増加に伴いアリルアルコール収率が約36mol%-Cまで増加した.これは,ギ酸由来の水素原子が触媒表面上に供給され,グリセリンの脱水反応が促進したためと推測される.平成24年度は次の事項について研究を実施した.(1)アルカリ金属担持MOxーFe2O3触媒開発Fe2O3の酸化活性の向上を目的とし,第二添加成分を検討した.第二成分(MOx)としてZrO2,CeO2,Al2O3,TiO2のそれぞれの硝酸塩をFe硝酸塩の混合水溶液から共沈法によりMOxーFe2O3触媒を調製した.また,カルボン酸吸着能は,触媒の塩基性に起因するため,担持量を変えてKを添加することで塩基性を触媒に付与した.

特に,Kを担持したZrO2-FeOx触媒は固体酸性質が抑制されることで酸性活性点由来のグリセリンの脱水により進行する反応経路やアルデヒド生成が抑制され,アリルアルコール収率が大幅に増加させることに成功した.(2)触媒性能最適化(エチレングリコール,グリセリンからのアリル化合物合成)ZrO2-FeOx触媒は水分子を分解し,水素活性種を生成する.そのため,水分子由来の水素活性種が触媒表面からグリセリンに供給された結果,アリルアルコールが生成したと考えられる.そこで,水素を容易に生成するギ酸を反応系に添加し,更にギ酸の分解能を促進する塩基性を触媒に付与したK担持ZrO2-FeOxを用いた結果,ギ酸濃度の増加に伴いアリルアルコール収率が約36mol%-Cまで増加した.この様に,触媒の塩基性と酸化能の両面で触媒を設計することでアリルアルコール収率が向上できることを見いだした.上記より,当初の目標を概ね達成したものと判断する.平成24年度の成果を基に,平成25年度は次の事項について研究を進める.1)グリセリン,エリトリトールからのアリル化合物を合成:平成24年度の結果から得られるアルカリ金属担持MOxーFe2O3触媒を用い,多価アルコール(グリセリンなど)からアリル化合物の選択合成を実施する.平成24年度では触媒組成の最適化が中心であったが,平成25年度は反応条件の最適化を中心に検討する.本反応系では,メタノールから生成する蟻酸がアリル化合物収率向上のために不可欠である.従って,次の2点を中心に検討を進める.触媒上での蟻酸吸着量を向上させるためには,メタノール添加量を大きくする必要がある.一方,メタノールの酸化反応は,Fe2O3の格子酸素を使用する反応である.そのため,Fe2O3触媒上での過剰量メタノールの酸化により,Fe2O3触媒の結晶構造変化と触媒構造が崩壊する可能性がある.そこで,メタノールと多価アルコールの濃度比がアリル化合物収率に及ぼす影響を明らかにする(中坂担当).また,メタノールの酸化を促進するには,反応温度を上昇させる必要があるが,その場合,生成蟻酸の脱離とメタノールの完全酸化が予測される.さらに,過剰な反応は触媒の劣化(Fe2O3の還元によるFe3O4生成,触媒の構造変化)を引き起こす可能性がある.そこで,反応温度の影響を明らかにする(多湖担当).2)BDF製造時に副成する粗製グリセリンからのアリル化合物合成:粗製グリセリンには,水,アルカリ金属,メタノールが含まれている.従って,上記検討で得られるアルカリ金属担持MOxーFe2O3触媒は,粗製グリセリンに対し有効に作用すると期待できる.原料に不純物として含まれるアルカリ金属は,反応中に触媒表面に吸着し,触媒の塩基性の維持に寄与すると期待される(増田担当).平成24年度の研究成果により、グリセリンに蟻酸を添加することでアリルアルコール周露角工場の可能性を見いだした。そこで、平成25年度では蟻酸のグリセリンへの添加量の影響を調べる。そこで、蟻酸の購入経費として平成24年度から平成25年度への繰越金の10,488円を活用する。
近世初期・前期の近世軍書における生成・展開と流布についての基礎的研究

日本近世初期前期に成立した近世軍書における生成・展開と流布についての基礎的研究として、平成24年度26年度の3年間、申請書の「研究計画・方法」に記したことに従い、1,作品の流布に関する調査、2,作品の内容に関する考察という2つの視点から、全国の図書館・文庫所蔵の軍書についての内容・書誌調査を行い、データベース化した。成果として、関東の戦乱を記した『北条記』や『鎌倉管領九代記』等についての諸本調査結果や歴史書・文芸書としての位置づけについて報告した。「近世初期・前期の近世軍書における生成・展開と流布についての基礎的研究」について、2年目である本年度は、去年に引き続き、1,作品の流布に関する調査、2作品の内容に関する考察について、以下のような調査分析を行った。1,作品の流布に関する調査については、書誌調査を行い、昨年度作成した近世軍書作品のデータベースを増補させた。データとして加えたのは、主に関東地方に関する軍書類である。書誌調査については、『鎌倉管領九代記』と内容上の影響関係があり、特に多くの異本が存する『北条記』関連書や、関東甲信地方の軍書を集中して行った。具体的には『北条記』『北条五代記』『北条五代実記』『相州兵乱記』『甲陽軍鑑』『鎌倉北条九代記』『鎌倉管領九代記』『鎌倉物語』『東乱記』『豆相記』『関侍伝記』『後太平記』等である。調査したのは、内閣文庫・国会図書館・岡山大学附属図書館・広島市中央図書館、豊橋中央図書館・筑波大学附属図書館・玉川大学図書館・静嘉堂文庫・国文学研究資料館等の所蔵本である。そこで書誌調査とともに、デジタルカメラによる撮影を行った。2,作品の内容に関する調査については、1で調査したことをもとに、内容調査を行い、系統付けを行った。平成22年に『東京学芸大学紀要』63集に、「『北条記』(『東乱記』『小田原記』について」という論文をまとめ、『北条記』関連書の分類を行った。そのことをふまえ、さらに諸本の前後関係を考察するために、諸本の内容比較調査を行った。特に『北条盛衰記』(江西逸志子著、寛文一三板)を中心とした諸本の生成過程を考察し、1月の仮名草子研究会で口頭発表を行った。これについてはなお現在も考察中である。近世初期・前期の近世軍書における生成・展開と流布についての基礎的研究として、初年度である平成24年度においては、「研究計画・方法」に従い、1,作品の流布に関する調査、2,作品の内容に関する考察について、以下のような調査分析を行った。1,作品の流布に関する調査(1)『戦国軍記事典群雄割拠篇』『戦国軍記事典天下統一篇』『室町軍記総覧』等をてがかりに、室町・戦国期に成立した軍記300作品をリストアップし、書名・成立刊行年・著編者・諸本・概要の一覧を作成した。(2)関東の戦乱を記した軍書であり、江戸期の文芸作品にも大きな影響を及ぼした『北条記』とその関連軍記・軍書(『後北条記』『中古日本治乱記』『関東合戦記』等)について、平成24年度以前より進めてきた諸本調査・書誌調査を継続して行い、データベース化した。『北条記』には異本や関連軍書が多数あり、書誌調査により諸本の系統付けを行った。また、内閣文庫本には多くの軍記・軍書類が所蔵されており、それらの諸本の撮影を行い、画像資料としてデータ化した。2,作品の内容に関する調査(1)『北条記』とその関連軍記・軍書について、梗概をまとめ、データとして入力した。『北条記』は諸本によって本文に異同があるため、六巻本『北条記』を中心に、五巻本・十巻本・九巻本の本文異同が分かるように概要をデータとして入力した。(2)室町・戦国軍記における関東の戦乱を記した『鎌倉管領九代記』が、『北条記』や『甲陽軍鑑』等の軍記に拠りながら歴史を記していることについて考察し、『近世文藝』98号(日本近世文学会)に論文としてまとめた(平成25年7月刊行予定)。「近世初期・前期の近世軍書における生成・展開と流布についての基礎的研究」について、最終年度である平成26年度においては、「研究計画・方法」に従い、1,作品の流布に関する研究、2,作品の内容に関する考察について、以下のような研究を行った。1,作品の流布に関する研究...(1)近世軍書についての参考書『戦国軍記事典群雄割拠篇』『戦国軍記事典天下統一篇』『室町軍記総覧』(和泉書院)等を手がかりに、室町末近世前期に成立した軍書300作品について、書名・成立刊行年・著編者・本の体裁・諸本系統の一覧を、前年度に継続して作成・整備させた。(2)関東の戦乱を記した軍書で近世期の文芸に大きな影響を及ぼした『北条記』について、前年度に継続し、諸本調査を行った。

とくに全国図書館等所蔵の『北条記』関連本のマイクロフィルムを多く所蔵する国文学研究資料館にて諸本調査を行い、情報をデータベース化した。(3)『北条記』を板本化した唯一の軍書『北条盛衰記記』(寛文十三年序)について、玉川大学図書館・駒沢大学図書館・日本大学図書館等の所蔵本について書誌調査を行った。その結果、諸本によって大幅な板木の修訂が行われていることがわかった。2,作品の内容に関する研究...(1)上記の参考書等を手がかりに、近世軍書諸作品の内容と特徴、軍書史における位置づけについて整理し、データベース化した。(2)『北条記』については、諸本によって異同が大きいため、本文をデータ化し、比較を行った。(3)『北条盛衰記』についても、諸本によって大幅な修訂が行われているため、本文でデータ化し、内容比較を行い、修訂の意図について考察した。(4)近世軍書と室町時代物語や仮名草子などの文芸作品との関わりについて考察した。以上の研究を、博士論文としてまとめ、提出・受理された。日本近世文学25年度は、1,作品の流布に関する調査については、『鎌倉管領九代記』とその関連軍記・軍書類についての書誌調査を行うことが課題であった。それらについての書誌調査については、首都圏を中心に概ね調査を終え、データベース化も行った。2,作品の内奥に関する調査については、同じく『鎌倉管領九代記』とその関連軍記・群祖類についての内容調査を行うことが課題であった。『鎌倉管領九代記』については、本年度7月に『近世文藝』98号に論文が掲載された。また『鎌倉管領九代記』をめぐる軍書類の考察については、『北条記』関連書との内容考察を、研究会での口頭発表等を行いつつ現在も行っている。交付申請書に掲載した「研究の目的」の達成度については、以下のとおりである。(1)「作品の流布に関する調査」について、『戦国軍記事典』等に記載される軍記・軍書については、書名・著編者・成立刊行年・巻冊等の書誌的な事項をリスト化し、入力した。また『北条記』関連軍記・軍書の諸本調査については、『戦国軍記事典』等に掲載される諸本についての書誌調査を行い、より具体的な事柄をデータ化した。(2)「作品の内容に関する調査」について、『北条記』の異本調査を行い、六巻本『北条記』の概要をデータとして入力し、さらに異本・類書についても、六巻本『北条記』と相違する内容をデータ化し、異本相互の内容の比較ができるようにした。(1)(2)の総まとめとして、室町軍記から近世軍書・仮名草子への展開という視点から、論文「『鎌倉管領九代記』の歴史叙述の方法」をまとめ、『北条記』の後世への影響について考察した。今後は、今年度に引き続き、『北条記』関連書についての1書誌調査と2内容分析を行う。考察の結果は、今年度中に論文として投稿する。また、『鎌倉管領九代記』『北条記』等の関東地方の軍書だけではなく、『浅井物語』等の関西地方の軍記についても調査を始める。それに当たっては、軍書としてのみならず、仮名草子としての性格についても考察したい。今後は、今年度に引き続き、近世軍書について、1書誌調査と2内容分析を行う。1諸本調査については、まず、『北条記』『鎌倉管領九代記』の周辺書(『後太平記』『関東合戦記』『中古日本治乱記』『甲陽軍鑑』『北条五代記』等)に重点を置きながら、各図書館・文庫の諸本の書誌調査とデータ化を継続して行う。『北条記』関連の書には多くの写本があるため、それぞれの本が有する書誌的な性格を調査し、相互の影響関係を明らかにし、系統付けを行う。
口腔扁平上皮癌の浸潤界面における細胞競合現象のプロテオーム解析

口腔扁平上皮癌・上皮内癌が非癌上皮との間に形成する明瞭な上皮内界面が、病理組織標本上でしばしば観察される。この癌-非癌界面は生体内での細胞競合現象の場であると仮説を立て、検証した。病理組織標本の検討で、界面に面する癌組織にアポトーシスや硝子体、細胞傷害との関連を示唆する組織・細胞変化を認めた。病理組織標本から選択採取した癌・非癌組織それぞれの界面近接・非近接組織を材料に、LC-MS/MSによるプロテオーム解析を行ったところ、癌あるいは非癌界面近接組織で特異的発現増減を示す7分子を同定した。以上より、これらの分子が、癌細胞が敗者となりうる細胞競合現象メカニズムに関わっている可能性が示唆された。癌-非癌部界面における細胞競合現象をはじめとした細胞間相互作用をタンパク質発現動態から解析することを目的に、とくに明瞭な界面を形成した口腔扁平上皮癌(SCC)・上皮内癌(CIS)10例を選択し1界面から遠位の癌組織、2界面に直接する癌組織、3界面に直接する非癌組織、4界面から遠位の非癌組織の各4区域40試料をケラチン(K) 13・K17免疫組織化学(IHC)併用下でレーザーマイクロダイセクション(LMD)法にて分取して、それらを液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法でプロテオーム解析した。その結果、癌部(区分1+2)で4,035タンパク質(3,138遺伝子)、非癌部(区分3+4)で2,812タンパク質(2,236遺伝子)が同定され、SCC・CIS細胞における発現タンパク質の多彩性が確認された。emPAI法を用いて定量比較を行うと、非癌部に比べ、癌部でK17の増加(11倍)とK13の減少(69倍)がみられ、K13/K17相互増減を口腔SCC・CISの診断補助手段としてきた有用性が再検証されたと同時に、LMD法による試料採取が正確に行われていたことが確認された。また、114分子・9分子が、それぞれ癌部・非癌部特異的タンパク質として同定された。ついで、癌部と非癌部の隣接・遠位2区分間を比較したところ、ladinin-1、interleukin-1 receptor antagonistなど7分子の増減がみいだされた。これらの特定された分子の癌・非癌部特異的発現状況は口腔SCC・CIS組織標本と培養HSC-2細胞においても検証され、これらの分子群が癌-非癌細胞間相互作用に関連する可能性が示唆された。現在、報文を作成中である。癌-非癌界面を含む組織標本のプロテオーム解析では、レーザーマイクロダイセクションを用いて領域選択的に解析を行うことで、癌-非癌界面に関連したタンパク質発現状況を網羅的に同定・把握できた。また、同定されたタンパク質から癌-非癌細胞間相互作用に関連すると思われるタンパク質候補の抽出を行い、病理組織標本および口腔がん由来培養細胞株での検証を行うことができた。口腔扁平上皮癌SCC・上皮内癌CIS症例200例から明瞭な側方進展界面を形成したCIS 55界面・SCC 57界面、合計112界面を抽出し、形態学的検索および免疫組織化学による検索を行った。とくに明瞭な界面を形成した10例を選択し1界面に直接する癌組織、2界面に直接する非癌組織、3界面から遠位の癌組織、4界面から遠位の非癌組織の各4区域をレイザーマイクロダイセクション(LMD)法で分取して、それらを液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法でプロテオーム解析した。emPAI法による定量的解析で、界面特異的蛋白質を選択し、組織切片と口腔扁平上皮癌由来細胞株HSC-2で、それらの発現状態を確認しladinin-1、interleukin-1 receptor antagonistなど、数種の界面特異的な増減傾向を示すタンパク質分子を見出した。複数のタンパク質が癌-非癌界面組織において増減することが見出された。これらの結果をまとめた報文は、国際雑誌に投稿・受理された(Abe T, et al. Exp Mol Pathol 2017; 102(2): 327-336.)。上記のタンパク質が組織学的な形態変化および細胞競合現象をはじめとした細胞間相互作用に関連しているかを、主に培養細胞を用いたin-vitro実験系で検証を行った。口腔扁平上皮癌細胞株(HSC-2)を用いて, siRNA法による遺伝子発現抑制によりタンパク質の機能解析を行ったところ、ladinin-1を抑制することで、扁平上皮癌細胞において細胞増殖が抑制された。ladinin-1抑制下では培養初期の接着には影響がみられず、cleaved-caspase 3陽性細胞率の増加が免疫細胞化学法によりみいだされたことから、ladinin-1の抑制によってアポトーシスによる細胞死が促進される可能性が示唆された。プロテオーム解析により同定された癌組織および癌界面に特異的なタンパク質の候補の機能解析により、細胞死との関連性の検証を進めることができた。口腔扁平上皮癌(SCC)・上皮内癌の病理組織標本を用いた病理形態学的検討およびプロテオーム解析により、癌-非癌界面組織で特異的な発現増減を示す7タンパク質が同定された。これらのタンパク質の機能を、主に培養細胞を用いたin-vitro実験系で検証した。口腔SCC細胞株HSC-2、-3、-

4各細胞株を用いて、癌界面組織で特異的な発現増加を示すタンパク質のうちladinin-1(LAD1)の発現をsiRNA法により抑制したところ、細胞の増殖が有意に抑制された。特にHSC-2では,他の細胞株に比べて増殖抑制が顕著であった。LAD1抑制HSC-2細胞における細胞死を検討したところcleaved-caspase 3免疫細胞化学法・TUNEL法で、陽性細胞が有意に増加していた。この結果から、LAD1抑制による増殖抑制がapoptosisの亢進によることが示唆された。apoptosisの亢進が培養細胞の足場への接着障害による可能性も考えられたが、LAD1発現抑制HSC-2細胞で、細胞播種後2時間までの初期接着に影響はみられなかった。また、LAD1の細胞遊走における機能を検討するため、wound healing assayを行ったところ、scratch面の閉鎖率が有意に減少したことから、LAD1の抑制により細胞遊走が阻害されることが明らかとなった。さらにLAD1の細胞内局在を詳細に検討すること目的に、免疫蛍光法を用いた超解像顕微鏡(構造化照明顕微鏡)観察を行ったところ、LAD1陽性は葉状仮足基部のactin arcおよびactin cortexに一致して認められ、actin線維の重合・脱重合過程に関連する可能性が示唆された。口腔SCC細胞においてLAD1はactin分子調整を介し、癌細胞の生存・遊走を制御する可能性が示され、癌-非癌界面での細胞生存に関連する可能性が見出された。口腔扁平上皮癌・上皮内癌が非癌上皮との間に形成する明瞭な上皮内界面が、病理組織標本上でしばしば観察される。この癌-非癌界面は生体内での細胞競合現象の場であると仮説を立て、検証した。病理組織標本の検討で、界面に面する癌組織にアポトーシスや硝子体、細胞傷害との関連を示唆する組織・細胞変化を認めた。病理組織標本から選択採取した癌・非癌組織それぞれの界面近接・非近接組織を材料に、LC-MS/MSによるプロテオーム解析を行ったところ、癌あるいは非癌界面近接組織で特異的発現増減を示す7分子を同定した。以上より、これらの分子が、癌細胞が敗者となりうる細胞競合現象メカニズムに関わっている可能性が示唆された。選択された候補タンパク質に関して、より多数例かつ癌-非癌界面の明らかでない症例に検索対象を拡張して、病理組織標本上での検討を行い、in-vivoでの発現特性を明らかにする。また、培養細胞株を用いて、これらのタンパク質・遺伝子発現状態もより詳細に検討し、発現抑制・強制発現実験による細胞機能試験を行う予定である。異なる細胞株の共培養条件で、候補タンパク質の細胞間相互作用における機能的関連についても検討を行う予定である。同定された候補タンパク質のin-vitroにおける機能試験をより詳細に進め、異なる細胞株の共培養条件下での検討などを含め、細胞間相互作用における機能解析を進める予定である。また、免疫組織化学を用いた組織標本上での発現についてもより多数例での検討を行い、臨床病理学的因子との関連性の検討を進める予定である。病理学当初の予定よりも効率的に試料収集・解析が行えたため、レーザーマイクロダイセクション必要物品やタンパク質質量分析のためのタンパク質精製等に関わる物品費用が抑えられた。プロテオミクスで同定された癌-非癌組織
我が国の中等教育における国際科学教育の評価と今後の方向性の考察

本研究の目的は、中等教育における国際科学教育のモデルを提唱・普及させることにある。スーパーサイエンスハイスクール(SSH)事業においても、国際的に活躍できる理系人材の育成は一つの柱として重視されている。これまで取り組んできた国際科学フェアや国際共同課題研究の教育的効果を分析するとともに、海外でそれらの取り組みを調査、比較検討し、効果的な国際理系人材育成のあり方を提案するものである。
P. gingivalisの新たな病原性因子ORF PGNU-0748の解析

Porphyromonas. gingivalisの新たな病原性因子PGNU-0748遺伝子の全長および部分領域をクローニング(同じ塩基配列を持つDNA分子を選び出し、増やすこと)し、どの領域のリコンビナント蛋白に活性があるのか検討した。また、得られたリコンビナント蛋白を用いてポリクローナル抗体を作製した。そしてgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化がどの領域に対するポリクローナル抗体で抑制されるのか検討した。その結果、上流領域のリコンビナント蛋白を用いて作製したポリクローナル抗体はgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化を抑制することが明らかになった。PGNU.0748遺伝子の全長および部分領域をHis tagを付与した発現ベクターにクローニングした。IPTGを添加して大腸菌に発現させた後、ニッケルカラムを用いてリコンビナント蛋白を抽出した。得られたリコンビナント蛋白をHis tag検出キットおよびマウスポリクローナル抗体(P.gingivalis gingipain完全欠損株より精製した画分を用いて作製)を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、PGNU-0748にコードされているタンパクであることを確認した。その結果、全長および上流、中流、下流編の部分領域のリコンビナント蛋白を得ることができた。現在、得られたリコンビナント蛋白で7.19レポーター細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を刺激し、どの領域に応答するか検討している。そしてgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化がどの領域に対するポリクローナル抗体で抑制されるのか検討している。現在までに上流領域のリコンビナント蛋白を用いて作製したポリクローナル抗体はgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化を抑制することがわかっている。今後、リコンビナント蛋白を用いてモノクローナル抗体を作製し、リコンビナント蛋白およびgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化がどの領域に対するモノクローナル抗体で抑制されるか検討を行う予定である。PGNU_0748遺伝子の全長および部分領域をHis tagを付与した発現ベクターにクローニングした。得られたリコンビナント蛋白をHis tag検出キットおよびマウスポリクローナル抗体(P.gingivalis gingipain完全欠損株より精製した画分を用いて作製)を用いたウエスタンブロッティング解析を行い、PGNU_0748にコードされているタンパクであることを確認した。その結果、全長および上流、中流、下流の部分領域のリコンビナント蛋白を得ることができた。得られたリコンビナント蛋白で7.19レポーター細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を刺激し、どの領域に応答するか検討した。その結果、上流領域のリコンビナント蛋白を用いて作製したポリクローナル抗体はgingipain完全欠損株による7.19細胞の活性化を抑制することがわかった。今後、リコンビナント蛋白を用いてヒト歯周組織由来の歯肉繊維芽細胞、歯肉上皮細胞、歯根膜細胞への影響を解析する。上記細胞をリコンビナント蛋白で刺激し、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-αなどのサイトカイン産生量をELISA法にて測定する予定である。
ブタクサ花粉アレルギーモデルを用いたHLA機能制御分子の探索

本研究課題はHLA機能を制御できる新規薬物の開発を目的としている。HLA機能を抑制できる低分子化合物を、新規スクリーニング法にて探索した。HLA-DQ6およびDQ8に対してin silico drug discovery法にて探索を行った。結合性の高い化合物を市販化合物データベースにある約600万化合物から絞り込みを行い、親和性の高い化合物が各HLAともに49種類ずつ判明した。生体内で実際にHLA機能抑制能を示すかどうかHLA-DQ6およびDQ8トランスジェニックマウスを用いたブタクサ花粉アレルギーモデルを用いて研究を引き続き行う。HLAをターゲットとしたアレルギー治療法の開発に努めていく。本研究課題はアレルギーを引き起こすブタクサ花粉に関して、そのペプチドの生体内でのT細胞への抗原提示を阻害する低分子化合物の同定を目指すものである。平成26年度は、研究の第1段階として、HLA機能抑制低分子化合物をin silico解析により特定した。対象HLAとアミノ酸相同性の高いHLAのX線構造の探索を、PDB code:2NNAの構造をもちいおこなった。次に、統合計算化学ソフトウェアにより、分子結合部位の予測をおこなった。さらに、Alpha Site Filter法によるpre-screeningをおこない、大規模化合物データベース(5,909,712化合物)から可能性の高い化合物の抽出し、ASEDockを用いたdocking計算をおこない、これにより更に結合する可能性の高い化合物の絞り込みをおこなった。その後、研究の第2段階として、実際のマウス細胞を用いて候補低分子化合物のin vitroスクリーニングをおこなった。まずはBALB/cマウスにたいし、H2-A(Major Histocompatibility Complex,BALB/cマウスのMHCクラスII分子)におけるin silicoスクリーニングの結果をもちい、BALB/cマウスに対してブタクサ花粉による免疫をおこなった。その脾臓細胞を用いて、IL-4のELISpotアッセイと3H標識チミジンの取り込みによるT細胞増殖試験による候補低分子化合物のin vitroスクリーニングをおこなった。ブタクサ花粉アレルギーをモデルとして、HLA機能を抑制できる低分子化合物を、新規スクリーニング法にて探索している。研究の土台となる新規化合物の探索を完遂することができた(1時スクリーニング)。in silico drug discovery法にて、市販されている約500万化合物から、HLA結合化合物を抽出した。PDB code:2NNAの構造を採用して、対象HLAとアミノ酸相同性の高いHLAのX線構造の探索を行った。続いて低分子結合部位の予測を行い、結合予測部位に結合する低分子のin silico探索を行った。HLA-DQ8およびHLA-DQ6に関して、結合性の高い化合物を市販化合物データベースにある約600万化合物から絞り込みを行い、そこから更に、相互作用エネルギーをドッキングソフトウェアASEDockにて求めた。親和性の高い化合物が各HLAともに49種類ずつ判明した。今後生体内で実際にHLA機能抑制能を示すかどうかHLA-DQ6およびHLA-DQ8トランスジェニックマウスを用いてスクリーニングをしていく(2次スクリーニング)。現在、新規HLAクラスIIトランスジェニックマウスの作製に手間取っており、研究に遅れが出ている。速やかに新規HLA-DQ6およびHLA-DQ8トランスジェニックマウスを作製していく。現在これらのコンストラクトを作製しており、速やかに当研究室にて受精卵前核に顕微授精を行っていく。この作業には精通しており、業務委託がいらない為、新規に多くの研究費を費やす必要がない。引き続きこれまでにないHLAをターゲットとしたアレルギーの抑制という治療法の開発に努めていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究の第1段階であるHLA機能抑制低分子化合物のin silico解析を、H2-A、HLA-DQ6、HLA-DQ8にたいしておこなった。in vitro解析に関してはBALB/cマウスのH2-Aにおけるin silicoスクリーニング(1次スクリーニング)までをおこなった。in silicoスクリーニングの結果得られた候補化合物に関し、実験を行ったが、実際にアレルギー反応を抑えるという結果はまだ得られていない。化合物は水に難溶性のものも多く、至適濃度の調整など実験系の構築を現在行っている状態である。また、以前の研究によりブタクサ花粉抗原に対する強いT細胞応答が認められるHLA-DQ6およびHLA-DQ8に関して、他施設より入手したHLA-DQ6およびHLA-DQ8トランスジェニックマウスの繁殖に時間がかかっている状態である。今後実験系の構築を急いで行っていく。また現在HLA-DQ6およびHLA-DQ8トランスジェニックマウスの自身による作製もおこなっている。

当初予定よりも遅れているが、まずはBalb/cマウスを用いての基礎的実験系において手法を確立し、実際のアレルギー性結膜炎モデルにおいてもその効果をみていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に遅れが生じたため。平成25年度繰越金は、25年度にに購入できなかった試薬の購入に充てる。平成26年度分に関しては低分子試薬の購入、トランスジェニックマウスの作製費用。アッセイに必要な試薬の購入に充てる。
難治性自己免疫疾患に対する新しい幹細胞移植療法の開発

難治性自己免疫疾患に対する自己造血幹細胞移植療法の最適化を目的とした。CD34純化自己造血幹細胞移植または非純化移植を施行した強皮症19例を対象に、純化群、非純化群を比較したところ、純化群ではウイルス感染症をより高頻度に認めたものの、有効性においては優れていた。強皮症患者リンパ球における遺伝子発現プロファイルは健常人と異なっていたが、純化移植群では非純化群に比し移植後、より健常人に近い遺伝子発現プロファイルを示した。以上より、難治性自己免疫疾患に対しては純化移植を選択すべきと考えられた。当施設において難治性自己免疫疾患23例(強皮症19例、皮膚筋炎3例、ウェケナー肉芽腫症1例)に対し、自己末梢血幹細胞移植を施行し、有効性と安全性について確認してきた。これまで本療法の移植片としては、純化CD34陽性細胞か非純化CD34陽性細胞を用いてきたが、本研究ではCD34陽性細胞+制御性T細胞を移植片とする造血幹細胞移植を開発することが目的である。本年度はまず、移植片としてCD34陽性細胞+制御性T細胞を用いることの妥当性を検討するため、自己末梢血幹細胞移植を施行した自己免疫疾患患者の制御性T細胞の回復につき解析した。自己造血幹細胞移植後、CD8陽性T細胞は速やかに回復したが、CD4陽性T細胞の回復は遅延し、移植3年後でも治療前の1/2以下にとどまった。CD4陽性T細胞の内訳を見てみると、回復したのは大部分がメモリーT細胞でナイーブT細胞の回復は抑制されていた。制御性T細胞はCD25陽性T細胞に含まれるため、CD25陽性T細胞に着目して検討したところ、自己造血幹細胞移植後、CD25陽性細胞の回復は長期間にわたり抑制されていた。次に制御性T細胞に特異的なマーカーであるFoxP3を用いて検討したととろ、CD4陽性FokP3陽性細胞の回復は移植3年後でも抑制されていることが明らかになった。自己造血幹細胞移植後の制御性T細胞の回復遅延は、移植後の原疾患の増悪や新しい自己免疫疾患の発症と関連する可能性があるため、是正されることが望ましい。以上本年度の研究により移植片としてCD34陽性細胞+制御性T細胞を用いることの妥当性が明らかになった。当施設において難治性自己免疫疾患23例(強皮症19例、皮膚筋炎3例、ウェゲナー肉芽腫症1例)に対し、自己造血幹細胞移植を施行し、有効性と安全性について確認してきた。これまで本療法の移植片としては、純化CD34陽性細胞または非純化造血幹細胞を用いてきたが、非純化造血幹細胞移植(非純化移植)では移植片に自己反応性T細胞と制御性T細胞が含まれているため、原疾患に対する有用性について純化CD34陽性細胞移植(純化移植)と比較することは有意義である。本年度は純化移植と非純化移植の強皮症に対する有効性と安全性について、比較検討した。対象は純化移植が11例(男3、女8)、非純化移植が8例(男1、女7)で平均年齢はそれぞれ52.3±7.5歳、55.5±5.5歳であった。純化移植群では輸注したCD34陽性細胞が4.7±2.6x10^6/kg、CD3陽性細胞が0.011±0.012x10^6/kgで非純化移植群では輸注したCD34陽性細胞が7.6±10.7x10^6/kg、CD3陽性細胞が45.6±28.1x10^6/kgであった。有害事象では純化移植群においてアデノウイルス膀胱炎や帯状庖疹、サイトメガロウイルス感染などのウイルス感染をより高頻度に合併していたが、いずれも抗ウイルス薬にてコントロール可能であった。有効性について、純化移植群では非純化移植群に比較し移植1、12か月後において、皮膚硬化の改善が有意に優れていた。免疫学的再構築の解析では、移植後のCD4陽性細胞の回復やTh1/Th2バランスの変化について両者間で差を認めなかった。以上、純化移植において原疾患に対する有効性が優れていることより、自己反応性リンパ球を除去する意義が確認された。当施設において難治性自己免疫疾患23例(強皮症19例、皮膚筋炎3例、ウェゲナー肉芽腫症1例)に対し、自己造血幹細胞移植(自己HSCT)を施行し、有効性と安全性について確認してきた。本研究の目的である最適な造血幹細胞移植療法の開発にあたり、昨年度強皮症患者に対するCD34純化自己HSCTの臨床効果が非純化自己HSCTに比し優れている事を明らかにした。

本年度は強皮症患者に対する自己HSCT後のリンパ球における遺伝子発現プロファイルの変化を純化及び非純化自己且SCT間で比較する事を目的とした。強皮症患者(移植前、純化自己HSCT後、非純化自己HSCT後)または健常人由来のリンパ球をT細胞5分画(CD4ナイーブ、CD4メモリー、CD8ナイーブ、CD8セントラルメモリー、CD8エフェクターメモリー)、B細胞3分画(ナイーブ、メモリー、plasmablast)に分けフローサイトメトリーを用いたソーティングにより各分画を回収した。各々の細胞集団よりRNAを調製、逆転写後、cDNAアレイを用いて、強皮症患者のリンパ球の遺伝子発現プロファイルを健常人と比較した。両者で発現量に2倍以上差がある遺伝子に着目すると、リンパ球各亜分画において800から1500遺伝子が抽出された。これらの遺伝子について、自己HSCT施行後の強皮症患者では健常人と自己HSCT施行前強皮症患者との中間の遺伝子発現プロファイルを呈し、更に純化自己HSCT施行強皮症患者は非純化自己HSCT施行患者に比し健常人により近い遺伝子発現プロファイルを呈した。本研究により強皮症患者リンパ球各亜分画において健常人とは遺伝子発現プロファイルが異なる事が明らかになった。強皮症患者において臨床効果が優れる純化自己HSCT後に遺伝子発現プロファイルがより正常化する事は、強皮症に対し純化自己HSCTを選択する理論的根拠となる。
トマト黄化えそウイルスのゲノム複製とmRNA転写機構に関する生化学的研究

トマト黄化えそウイルス(TSWV)のゲノム複製・mRNA転写機構の詳細は未解明な部分が多く,両反応に関与する植物側因子も殆ど同定されていない.前年度までに,TSWV感染植物体より精製したウイルスビリオンRNP(ゲノムRNAとN・Lタンパク質の複合体)とBYL(脱液胞化タバコ培養細胞抽出液)とを混合したところ,ウイルスのmRNA転写活性が検出され,またその活性付与因子は,40-60%飽和硫酸アンモニウム(硫安)では殆ど沈殿せず,80%飽和硫安によって沈殿する画分に含まれることを明らかにした.今年度は,さらに当該因子の精製を進めるため,転写活性を指標にして,BYLの各種クロマトグラフィーによる分画を試みた.その結果,80%飽和硫安沈殿画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し,続いてゲル濾過クロマトグラフィーに供した場合に,ほぼ単一因子にまで精製を進めることに成功した.そしてウェスタン解析を行った結果,当該因子が宿主の翻訳伸長因子eEF1Aであると強く示唆された.eEF1Aがプラス鎖RNAウイルスの複製反応に寄与しているとの報告は数例存在するが,マイナス鎖RNAウイルス転写反応への寄与を示唆する結果は,動物ウイルスである水泡性口内炎ウイルス(Vesicular Stomatitis Virus)に次いで2例目であり,またTSWVの属するブニヤウイルス科では,初めてである.以上の結果は,現在論文投稿準備中である.トマト黄化えそウイルス(TSWV)をマルバタバコに機械接種し,感染葉からTSWV粒子を精製した.TSWV粒子は,ウサギ網状赤血球抽出液(RRL)と混合すると転写活性を示すとの報告があるが,研究開始当初,TSWV粒子を植物細胞抽出液である脱液胞化タバコ培養細胞抽出液(BYL)と混合しても,転写活性を検出することはできなかった.そこで,RRLに含まれる各成分をBYLに添加したところ,EGTAを添加した場合にRRLと同程度の転写活性を検出することができた.転写反応の開始には細胞由来のmRNAが必要であることが知られているが,BYL由来のRNAとEGTAをTSWV粒子と混合しても転写活性は検出されなかった.このことから,BYLに含まれるmRNAに加えて未知のタンパク質性因子がTSWV粒子内のビリオンRNPに転写活性を付与することが示唆された.また,TSWVビリオンRNPのウイルス側構成因子であるN,Lタンパク質の性状を解析するために,各ウイルスタンパク質を試験管内翻訳系で発現させることを計画した.まず,TSWVゲノムの内,Lタンパク質(RNA依存RNAポリメラーゼ)をコードするRNA-LとNタンパク質(ゲノムRNAと結合)をコードするRNA-Sについて配列を決定し,試験管内翻訳用mRNAを作製した.各タンパク質について各種試験管内翻訳系を用いて合成を試みたところ,Nタンパク質についてはRRL,BYL共に合成が検出されたが,Lタンパク質(分子量:330-kDa)については,BYLを用いた場合のみ,微弱ながら検出することに成功した.今後,さらなる翻訳効率の改善を試みる.また,これら人工的に合成したN,Lタンパク質とTSWVゲノムRNAを用いて,ビリオンRNPを試験管内で新規構築する試みも行う.トマト黄化えそウイルス(TSWV)のゲノム複製・mRNA転写機構の詳細は未解明な部分が多く、両反応に関与する植物側因子も殆ど同定されていない。前年度までに、TSWV感染植物体よりウイルスビリオンRNP(ゲノムRNAとN・Lタンパク質の複合体)を精製し、BYL(脱液胞化タバコ培養細胞抽出液)と混合したところ、ウイルスmRNA転写活性が検出されることを見いだした。今年度はBYL中に含まれる成分を分画し、mRNA転写活性を与える植物側因子の同定に向けて解析をおこなった。具体的には、BYLを硫酸アンモニウム(硫安)による塩析によって分画し、それぞれの画分を限外濾過膜でバッファー交換した。その後、各画分をTSWVビリオンRNPに混合し、転写活性解析に供した。その結果、硫安の60%飽和条件でBYL中のほとんどのタンパク質が沈殿したが、転写活性を与える成分は60%飽和では沈殿せず、80%飽和で沈殿する画分に含まれることが明らかとなった。さらに興味深いことに、この画分は転写活性だけでなく、複製活性も促進させることが示唆された。両活性の促進効果が、単一の因子に由来するのか、別因子として分離可能であるのかは現時点では明らかでなく、今後さらに当該因子の分画を試みる予定である。TSWVビリオンRNPを人為的に構築する計画については、RNP構成因子であるNタンパク質、Lタンパク質を試験管内合成させることには成功した。しかし現在のところ、これらの因子を試験管内合成したTSWVゲノムRNAと共に混合しても、複製・転写活性は検出されておらず、特にLタンパク質について量的・質的な問題がある可能性が高い。今後は、Lタンパク質のみについては、感染粒子からの回収を行うか、直接細胞内にmRNAを導入して合成を試みるなどの工夫をおこなう必要があると思われる。トマト黄化えそウイルス(TSWV)のゲノム複製・mRNA転写機構の詳細は未解明な部分が多く,両反応に関与する植物側因子も殆ど同定されていない.前年度までに,TSWV感染植物体より精製したウイルスビリオンRNP(ゲノムRNAとN・Lタンパク質の複合体)とBYL(脱液胞化タバコ培養細胞抽出液)とを混合したところ,ウイルスのmRNA転写活性が検出され,またその活性付与因子は,40-60%

飽和硫酸アンモニウム(硫安)では殆ど沈殿せず,80%飽和硫安によって沈殿する画分に含まれることを明らかにした.今年度は,さらに当該因子の精製を進めるため,転写活性を指標にして,BYLの各種クロマトグラフィーによる分画を試みた.その結果,80%飽和硫安沈殿画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し,続いてゲル濾過クロマトグラフィーに供した場合に,ほぼ単一因子にまで精製を進めることに成功した.そしてウェスタン解析を行った結果,当該因子が宿主の翻訳伸長因子eEF1Aであると強く示唆された.eEF1Aがプラス鎖RNAウイルスの複製反応に寄与しているとの報告は数例存在するが,マイナス鎖RNAウイルス転写反応への寄与を示唆する結果は,動物ウイルスである水泡性口内炎ウイルス(Vesicular Stomatitis Virus)に次いで2例目であり,またTSWVの属するブニヤウイルス科では,初めてである.以上の結果は,現在論文投稿準備中である.