hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
被災地域のネットワーク化と持続的な文化的支援の可能性

文化人類学・民俗学2015年年度は、研究調査を継続しつつ、その整理と検証を行なう予定である。気仙沼市と七ヶ浜町には、各々34回の現地調査にむかい、インタビューと参与観察を実施する。そこでは、最終的に村落単位ではたちゆかない地域社会が、どのように再組織化されていくのか、どのようなネットワーク化が、地域社会の文化復興に寄与しうるのかについて検討していくことになる。同時にそのような新たな地域ネットワークを対象とするための文化人類学・民俗学的な視点の再構築のための検証を行なう予定である。初年度の調査の開始時期が、当初の予定よりも遅れたため、調査回数と参加者の計が予定よりも少なくなった。そのため、前年度分の調査費を繰り越しせざるを得なかった。今年度には、昨年度に予定していた調査についても補足的に行なうため、2年間でのフィールドワークの合計としては、当初の計画通りになる予定である。
蝸牛神経損傷の分子生物学的病態解析

近年、神経外傷の研究においても、分子生物学的手法による検討がなされている。しかし、聴神経鞘腫摘出術などにおいて経験されるような外傷性蝸牛神経損傷の分子生物学的病態解析と蝸牛神経変性防止策の検討は行われてこなかった。これは、外傷性蝸牛神経損傷を定量的に評価しうるモデルの確立されていなかったことに大きな原因があった。我々は、本研究費補助期間中に、定量的評価可能な外傷性蝸牛神経損傷モデルを完成させた(本様式項目11参照)。このモデルを用いて、外傷性蝸牛神経変性過程には、一次的損傷によるnecrosisに加えてapoptosisによる蝸牛神経変性が起こっている可能性があることが明らかになった。Apoptosisが惹起される原因には種々のものがあるが、neurotrophinsの欠乏はその一因となりうる。そこで上記のモデルを用いて、損傷蝸牛神経に対する種々のneurotrophins(NGF,BDNF,NT-3)の局所投与の効果についても検討した。その結果、これらのneurotrophinsの単独投与のみでは、蝸牛神経変性を防止できないことなどが判明した(本様式項目11参照)。現在、apoptosisに関与するcaspase inhibitorの蝸牛神経変性防止効果についても検討を進めている。近年、神経外傷の研究においても、分子生物学的手法による検討がなされるようになってきているが、その対象は大脳や脊髄損傷に限られてきたきらいがあり、蝸牛神経損傷を対象とした分子生物学的実験的検討はほとんどないのが現状であった。そこで我々は、独自に開発確立した定量的蝸牛神経変性モデルを用いて、新たに研究を始めようとした。一般に、神経系が外力によって損傷されたとき、一次的な効果としてaxonのmechanicalな断裂などが生じるが、その後、programmed cell deathとしてのapoptosisの過程が引き起こされることが次第に知られるようになってきている。そこで、蝸牛神経損傷において、apoptosisの過程がどのように働いているかをまず検討しようとした。すなわち、ラットの小脳橋角部において第8脳神経幹を露出し、独自に開発した神経圧迫装置によって圧迫損傷を作成し、主としてTunel法による検討を始めている。その結果、蝸牛神経圧迫損傷後一週間から10日前後に、apoptosisの過程がmaximumに働くようになるという知見を得ている。今後は、これらの検討をさらに深め、蝸牛神経変性過程の分子生物学的過程を明らかにする。
磁気圏尾部探査衛星ジオテイル搭載低エネルギープラズマ観測器による磁気衝撃波の解析

地球磁気圏は地球固有の双極子磁場と太陽から流れ出すプラズマ流である太陽風が相互作用することによって形成されている。この太陽風との相互作用による磁気圏形成のモデルとしてリコネクションモデルと呼ばれるものが考えられているが、このモデルによると磁気圏尾部においてX-type neutral lineと呼ばる特徴的な磁場構造が存在する。その存在の有無を調べることはリコネクションモデルを検証する上で非常に重要である。X-type neutral lineが磁気圏尾部に存在する場合、X-type neutral lineを囲む磁気圏尾部のプラズマシートとローブの境界(plasma sheet boundary layer)はslow mode shockとなることが理論的に予測されている。本研究では地球磁気圏尾部のプラズマシートとローブの境界を地球磁気圏尾部探査衛星ジオテイル搭載低エネルギープラズマ分析器を用いて観測し、この境界がslow-mode shockであるかどうかを調査した。その結果、プラズマシートとローブの境界のうち約10パーセントが1次元slow-mode shockであることが判明した。このことからX-type neutral lineの存在が示されたといえる。slow-mode shockと判定できなかった残りの約90パーセントの境界については、slow-mode shockを判定する時に仮定したshockの一次元性や定常性が成立していないことが考えられる。このことからX-type neutral lineが定常的に存在しているという従来の描像よりはむしろX-type neutral lineが不安定かつ動的な性質を持っていると考えるべきであることが明らかとなった。
ATLにおけるDNA脱メチル化剤を用いた新規治療法開発の基盤研究

2017年度の結果から、DNA脱メチル化剤としてデシタビンに比べてアザシチジンがより強くATLの原因ウイルスであるHTLV-1感染細胞株に対して、抗腫瘍効果を発揮したため、2018年度はデシタビンに重点を置いて研究を行った。ゲノムDNA全体のメチル化の指標として用いられるLINE1領域のDNAメチル化をパイローシーケンス法により解析したところ、HTLV-1感染細胞にデシタビンを4日間処理した際の増殖抑制活性はその細胞の基底状態のLINE1メチル化状態に依存しないことが明らかとなった。この結果はゲノム全体のDNAメチル化状態ではなく、より局所的なDNAメチル化状態がHTLV-1感染細胞の生存・増殖に重要である、というこれまでの臨床検体を用いた解析結果から得られた仮説を支持すると考えられる。抗腫瘍効果と相関するDNAメチル化領域の探索のため、デシタビンの誘導体を用いた遺伝子発現マイクロアレイ解析を実施し、DNA脱メチル化に伴い発現が回復する遺伝子群を抽出した。その中には腫瘍抑制因子やT細胞の増殖を制御する因子が含まれており、現在、TaqMan法による確認作業を進めている。また、いくつかの因子についてはレンチウイルスによりHTLV-1細胞株に導入し、表現型を解析する予定である。慢性型ATL患者由来の末梢血単核球を免疫不全マウスの腹腔に移植することで腫瘍細胞の生着が確認された。現在、デシタビンの誘導体を用いてその抗腫瘍効果を検討している。これからの結果からHTLV-1感染細胞においてDNAのメチル化亢進異常はその生存に重要な役割を担っており、DNA脱メチル化による発揮される抗腫瘍効果はATLの治療や発症予防につながることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)で認められるDNAメチル化状態の異常に注目し、DNA脱メチル化剤を用いた新規治療法の開発を目指し、その基礎的データの蓄積を行う。はじめに、ATLに対するDNA脱メチル化剤の抗腫瘍効果をin vitroで検討した。ATLの原因ウイルスであるHTLV-1感染細胞株及び、ATL細胞株にデシタビンを処理したところ、細胞株毎に異なる感受性を示し、アポトーシスの誘導とともに細胞増殖を抑制した。アザシチジンは細胞毎で比較的均一な増殖抑制効果を示す一方、その作用はデシタビンに比べて弱い傾向を示した。また、DNAのメチル化状態の指標としてLINE-1領域のメチル化をバイサルファイト処理-パイロシークエンス法で調べたところ、デシタビンはアザシチジンに比べて強くLINE1のメチル化を減少させた。遺伝子発現データベース解析から、ATL細胞においてDNAメチル化亢進により遺伝子発現が抑制されていると予想される遺伝子をいくつか選び出し、発現量をreal-time PCRで測定したところ、予想通りデシタビンで強く発現量が回復した。また、高度免疫不全マウスへのHTLV-1感染細胞株の皮下移植モデルにおいて、デシタビンは皮下移植腫瘍の増殖を抑制した。アザシチジンとデシタビンはどちらもDNA脱メチル化剤として知られているが、ATL細胞(HTLV-1感染細胞)に対するDNA脱メチル化を介した細胞増殖抑制作用についてはデシタビンがより強いことが明らかとなった。現在、我が国ではアザシチジンのみが承認薬として使用されている。昨年度の結果は、DNAの脱メチル化を介した抗腫瘍効果を期待する場合、デシタビンがより適していることを示唆するものであり、今後の研究方針にも大きな意義を持つと考える。当初の計画では、初年度では培養細胞株と臨床検体を用いて、DNA脱メチル化剤の抗腫瘍効果を検討する予定であったが、臨床検体を用いた解析については、研究に掛かる書類申請・採択に時間を要し、昨年度中には実施できなかった。培養細胞株を用いた解析から、実験系は確立されているため、実験が開始できれば、計画の遅れは取り戻せると考える。一方、平成30年度に予定していた、抗腫瘍効果と相関するDNAメチル化領域の探索については遺伝子発現データベースを利用し、いくつかの候補遺伝子を抽出できた。初年度中に、脱メチル化剤処理により遺伝子発現が回復することが確認でき、当初の計画より進んでいる。第二世代DNA脱メチル化剤であるグアデシタビンについても検討する予定であったが、購入を予定したメーカーが取り扱いを停止しており、代替メーカーも見当たらず、検討できていない。グアデシタビンはデシタビンのプロドラッグであり、薬理作用はデシタビンと同様であると考えられるが、化合物が入手でき次第解析を行う。

抗腫瘍効果と相関するDNAメチル化領域の探索のため、デシタビンの誘導体を用いた遺伝子発現マイクロアレイ解析を実施し、DNA脱メチル化に伴い発現が回復する遺伝子群を抽出した。その中には腫瘍抑制因子やT細胞の増殖を制御する因子が含まれており、現在、TaqMan法による確認作業を進めている。また、いくつかの因子についてはレンチウイルスによりHTLV-1細胞株に導入し、表現型を解析する予定である。慢性型ATL患者由来の末梢血単核球を免疫不全マウスの腹腔に移植することで腫瘍細胞の生着が確認された。現在、デシタビンの誘導体を用いてその抗腫瘍効果を検討している。これからの結果からHTLV-1感染細胞においてDNAのメチル化亢進異常はその生存に重要な役割を担っており、DNA脱メチル化による発揮される抗腫瘍効果はATLの治療や発症予防につながることが期待される。HTLV-1キャリアやATL患者さんのPBMCに対するデシタビン、アザシチジンの抗腫瘍効果について、in vitro,あるいはPDXマウスモデルを樹立してin vivoで検討する。どちらの実験においても昨年度中に培養細胞株を用いた解析で抗腫瘍効果を認めており、同様の実験系を用いる予定である。この時、PBMC中のATL細胞(HTLV-1感染細胞)に対する抗腫瘍効果の解析については、脱メチル化剤処理により細胞表面タンパク質の発現も変化し得ることが明らかになったため、細胞表面タンパク質を指標にした解析に加え、pro-viral loadをreal-time PCRで解析する方法も取り入れる。ATL細胞において脱メチル化剤により遺伝子発現が回復する遺伝子について、昨年度中に候補遺伝子群がいくつか見出されたため、本年度はその機能解析等を行い、実際にATL細胞の増殖・生存に寄与し、ATLの病態の進行に関与しているか検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
社会保障構造改革下における生存権の規範的意味と社会福祉行政の法的統制に関する法理論

平成10年度は、主に、ドイツ介護保険に関する法的問題について、日本の介護保険と比較する見地から検討を行った。また、ドイツ各地の市福祉事務所に赴き、介護保険をはじめ社会福祉行政について、行政組織改革、ケース検討、運用状況を中心にヒアリングを行った。平成11年度は、前年度の研究より得られた知見をもとに、日本の介護保険を含む社会福祉行政について、昨今の基礎構造改革を中心に検討した。必要に応じて地方自治体の社会福祉担当職員に対して、改革の進展状況と運用実態についてヒアリングを行った。以上の研究より、ドイツのように「介護保障法」という観点から、生存権の介護保障側面の理論体系化をはかるべきであること、従って介護保険法の射程には限界があり、生活保護法や社会福祉各法に基づく給付によって補完されるのであって、両者は一体として介護保障法を構成すること、さらに社会福祉基礎構造改革は、従来国家が負っていた給付義務を費用助成義務に代えるという公的責任の内容の根本的な改変であることなどが明らかとなった。これら得られた知見,考察結果は、11.に掲記した業績にまとめた。本研究テーマについて、本年度はまず、生存権の具体化である生活保護法の課題に取り組んだ。即ち、保護率の低位性とホームレスの増大という矛盾に典型される生活保護の硬直化にかかわる運用上の問題を取り上げ、その解決方向、地方自治体の保護実施責任論を軸に、法的視角から考察した。その成果は、昨年5月の社会保障法学会で報告し、本年5月発行の学会誌に掲載予定である。次に、社会保障行政において近年進展している情報化にかかわる法的論点について、個人情報保護条例にみる個人情報の開示の現状と課題という観点から、いくつかの自治体へのヒアリングを基に、検討を行った。その成果は、「ジュリスト」10月1日号に掲載した。さらに、9月には、比較法研究の対象であるドイツ社会福祉行政について、ブレーメン市、ブラウンシュバイク市等の福祉事務所で、要援護者に対する処遇に関する行政手続、社会福祉の専門性を反映させた組織体制および公と民の連携のあり方、また近年進んでいる地方自治体の行政改革による影響を中心に、ヒアリングを実施した。その報告書は今年度中に出す予定である。第4に、介護保険法の施行に向けて、生存権を具体化する介護保障請求権の内実を明らかにするという観点、より詳しく言えば、従来の老人福祉法の措置制度からサービス実施をめぐる法律関係がどのように変容するかという視点から、介護保険に基づくサービスに関する法的問題点を考察した。その成果は、「賃金と社会保障」3月上旬号に掲載予定である。本年度は主として、個別制度の法的論点について、ヒアリングや一時資料等をつうじて、運用の現状を踏まえた具体的な検討を行ってきた。来年度は、ドイツの社会福祉法制との比較検討をさらに進めることで、社会保障法および社会福祉分野での行政法に係る理論構築の足がかりとすることを考えている。
ヒト癌幹細胞の同定と生体内機能解析システムの構築

癌幹細胞の機能を詳細に解析するためには、生着効率の高い異種移植システムが不可欠である。従来型の免疫不全マウスでは十分なヒト細胞の生着が得られないため、我々は、SIRPA遺伝子多型に基づくマクロファージ寛容を導入した次世代免疫不全マウスB6.Rag2nullIL2RγnullSIRPANOD/NOD(BRGS)を樹立した。この系を用いることで、(1)成熟B細胞腫瘍である慢性リンパ性白血病において造血幹細胞レベルに異常が見出されること、(2)骨髄性白血病幹細胞の生存・自己複製強化にTIM-3/galectin-9のautocrine loopが重要な働きを担っていることを明らかにすることが出来た。平成22年度は、次世代ヒト細胞異種移植システムを含む癌幹細胞解析のシステム構築を進めた。従来の異種移植に用いられてきたIL-2Rγnull-NOD/SCID(NOG)マウスの問題点は、繁殖力が弱くラインの維持が難しい点であった。我々は、C57/BL6バックグランドとすることで繁殖力の問題を解決し、かつNOGラインを越える異種免疫寛容の獲得を目的としたシステム開発を目指した。マクロファージ上に発現するSIRPAとそのリガンドであるCD47との結合は自己認識に重要な役割を担っているが、我々はNODライン特有の異種移植片寛容のメカニズムがSIRPA遺伝子多型にあることを突き止めた(Nat Immunol 8 ; 2007)。即ち、ヒトCD47とレシピエントマウスSIRPAの結合強化によりNODバックグラウンドを超える異種移植寛容の獲得が可能と考えられた。我々は、C57/BL6バックグランドでRag2およびIL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2nullIL2RγnullSIRPANOD/NOD(BRGS)ラインを樹立した。このBRGSマウスではT細胞のリークがなく、NOD型SIRPAを持つためにNOD/SCIDと比較して良好なヒト造血細胞生着が認められた。また、B6バックグラウンドであることの利点として、高い生存・繁殖力も確認された。このように、従来型より高効率の次世代異種移植プラットホーム開発に成功し、これを用いた癌幹細胞アッセイを開始した。現時点で、骨髄性およびリンパ性白血病の高い生着キメリズムが安定して得られることを確認している。このように、当初予定した平成22年度研究計画は遅滞なく達成された。平成22年度研究で樹立したB6.Rag2nul11IL2Rγnu11SIRPANOD/NOD(BRGS)マウスは当初の予定通り順調に繁殖している。BRGSマウスをもちいた異種移植におけるヒト造血細胞の生着効率は、NOGマウスと同等以上の結果が得られた。以下に示す造血器腫瘍の異種移植マウスモデルの確立と治療標的分子抽出に向けた平成23年度研究を行った。Ph-ALL(minorBCR-ABL)患者骨髄細胞をCD34+CD38-CD19+、CD34+CD38+CD19+、CD34-CD38+CD19+の3分画に純化してBRGSマウスに移植した。CD34-CD38+CD19+分画では移植による白血病の継代ができなかったが、前二者では3代にわたる継代が可能であり、Ph-ALLの白血病幹細胞はCD34+CD19+分画に濃縮されていることが明らかとなった。得られたヒトPh-ALLモデルマウスにダサチニブを2週間投与し、Ph-ALL幹細胞分画における遺伝子発現の変化を網羅的に解析した。ヒト正常ProB細胞(CD34+CD19+)およびダサチニブ非投与のPh-ALL幹細胞分画を比較対照とすることで、ダサチニブ治療抵抗性に関わる分子の探索を行った。現在、抽出した分子の機能解析を進めている。(2)骨髄異形成症候群(MDS)病期進行に伴う幹細胞特性の変化我々は急性骨髄性白血病幹細胞特異的に高発現する細胞表面分子TIM-3を同定し、抗TIM-3抗体による分子標的治療の開発を進めてきた。TIM-3は正常造血幹細胞および病初期のMDS幹細胞には発現しないが、病期進行に伴って幹細胞分画における発現が高まることを見出した。抗TIM-3抗体投与によって、正常造血をスペアしつつMDSクローンを排除できる可能性を示す知見と考えている。現在、BRGS異種移植系をもちいた検証を進めている。慢性骨髄性白血病(CML)や骨髄異形成症候群(MDS)において、病期進展により急性骨髄性白血病(AML)に移行することが知られているが、その分子メカニズムは明らかでない。

AML幹細胞に特異的に発現するTIM-3は、慢性期CMLや病初期MDSの腫瘍性幹細胞では発現を認めないが、両疾患の病期進展に伴って発現が亢進することを見出した。TIM-3の機能に関してGalectin-9を介した細胞内シグナルを解析したところ、NF-kBシグナルの増強とb-cateninの核内移行を確認した。TIM-3の発現亢進が腫瘍性幹細胞の増殖および生存強化に関与している可能性があり、更なる検証実験を進めている。平成26年度研究では、急性骨髄性白血病(AML)に移行することが知られている骨髄異形成症候群(MDS)や骨髄増殖性腫瘍(MPN)に関して、病期進展の分子メカニズムを明らかにする研究を行った。我々はAML白血病幹細胞に特異的に高発現する分子TIM-3を同定し、TIM-3を標的としたモノクローナル抗体治療により、in vivoでヒトAML白血病幹細胞の根絶が可能であることを報告している(Kikushige et.al, Cell Stem Cell 7, 2010)。MDS症例においても病期進行に伴い、TIM-3陽性の異常表面形質を有するCD34陽性CD38陰性造血幹細胞が増加することを見出した。つまり、MDSからAMLへの病期進展の過程で、TIM-3が何らかの機能を有している可能性が考えられた。TIM-3のリガンドとしてこれまでに最も解析が進んでいるgalectin-9に注目し、galectin-9刺激によるTIM-3 signalingの下流にNF-kBおよびβ-catenin経路が活性化することを見出した。特にβ-catenin経路の活性化に関しては、慢性骨髄性白血病(CML)の病期進行においてその活性化が重要な役割を担うことが知られている。TIM-3がCML白血病幹細胞の機能分子である可能性を考え、病期ごとにCD34陽性CD38陰性造血幹細胞分画内のTIM-3陽性細胞の割合を評価したところ、MDS同様にchronic phaseからblast crisisへ病期進行するのに伴ってTIM-3の発現が上昇することを見出した。すなわち、TIM-3はMDSやCMLの病期進行過程で高発現し、NF-kBおよびβ-catenin経路を活性化することで白血病幹細胞の増殖に寄与する機能分子であると考えられた。(1)免疫不全マウスの更なる改良による異種移植の効率化平成22年度研究で樹立したB6.Rag2nullIL2RγnullSIRPANOD/NOD(BRGS)マウスは当初の予定通り順調に繁殖している。BRGSマウスをもちいた異種移植におけるヒト造血細胞の生着効率は、NOGマウスと同等以上の結果が得られ、今年度論文報告した(Blood 121, 840-848, 2013)。しかし、BRGSマウスを用いてもなお、顆粒球系細胞および赤血球の再構築は不十分であった。平成24度研究においては、特に顆粒球系細胞の効率的な再構築を目指した改良型BRGSマウスを作製した。顆粒球系細胞の増殖をサポートする重要なサイトカインであるIL-3は、ヒトとマウスで交差しないことが明らかとなっており、このことがBRGSを含む異種移植系における顆粒球再構築能の低下に繋がっている可能性があった。今年度新たに作製したヒトIL-3ノックインBRGSマウスでは、この点が克服されている。
脳障害患者などに関わる腹壁筋低緊張と姿勢障害の病態解明

脳障害後に見られる腹壁筋の低緊張状態や姿勢障害などの病態を明らかにするために、その運動制御メカニズムを調べた。まず、腹壁筋運動ニューロンから細胞内記録をとり、脊髄反射機構の性質を電気生理学的に解析した。その結果、同名筋由来のIa群求心性線維刺激においてのみ単シナプス性の興奮性シナプス後電位が観察された。さらに、腹壁筋運動ニューロンへの前庭入力様式を解析した。その結果、前庭神経核の刺激から、同側・対側ともに約20%から興奮性シナプス後電位が観察された。腹壁筋は独特の脊髄反射機構があり、その運動ニューロンの2割ほどは前庭神経核からの入力を受けていることが示唆された。実験にはネンブタール麻酔下の成ネコを用いた。外腹斜筋支配神経の外側枝、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経の内側枝を剖出し、双極カフ電極を装着し、電気刺激できるようにした。第6胸髄から第3腰髄の間で椎弓切除を行い脊髄背面を露出させ、硬膜を切開し、パラフィンによるオイルプールを作った。末梢神経刺激による後根電位を記録するために銀ボール電極を後根入口部に置いた。手術終了後筋弛緩剤を投与し人工呼吸で動物を維持した。麻酔はネンブタールの持続注入により行った。その後、ガラス管微小電極を胸髄・腰髄後索に刺入して単一細胞より細胞内記録をとった。外腹斜筋支配神経の外側枝、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経の内側枝を刺激することにより、それぞれ同名筋運動ニューロンを同定した後、後根電位の刺激閾値をもとにI群線維だけが刺激される刺激強度を確定した。その刺激強度を変えてガラス管微少電極で細胞内記録を行い膜電位を解析した。その結果、腹壁筋運動ニューロンから、同名筋由来のIa群求心性線維刺激において興奮性シナプス後電位が観察された。異名筋由来のIa群求心性線維刺激において興奮性シナプス後電位はほとんど観察されなかった。しかし、後根電位から計測した興奮性シナプス後電位の潜時から、その入力は単シナプス性であると思われるが、これまでに確認されている後肢筋のそれとは若干潜時が遅かった。このような神経回路は、腹壁筋独特の運動コントロールと関係があると考えられた。昨年度、外腹斜筋支配神経(外側枝)、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経(内側枝)を刺激することにより、それぞれ同名筋運動ニューロンを同定した後、後根電位の刺激閾値をもとにI群線維だけが刺激される刺激強度を確定し、その刺激強度を変えてガラス管微少電極で細胞内記録を行い膜電位を解析した。その結果、後根電位から計測した興奮性シナプス後電位の潜時から、これまでに観察された後肢筋のそれとは若干潜時が遅かった。その点をさらに調べるために、追加実験を行った。さらに、I群線維から腹壁筋運動ニューロンへの入力が単シナプス成果どうかを調べるために、Iaフィールド電位をとり解析した。第6胸髄から第3腰髄の間で椎弓切除を行い脊髄背面を露出させ、ガラス管微小電極を胸髄・腰髄後索に刺入した。外腹斜筋支配神経(外側枝)、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経(内側枝)を刺激することにより、運動ニューロン近傍からIaフィールド電位をとり、後根入口からの潜時を解析した。その結果、それらの入力は単シナプス性であることが明らかとなった。以上、腹壁筋運動ニューロンから、同名筋由来のIa群求心性線維刺激において単シナプス性の興奮性シナプス後電位が観察された。このような神経回路は、腹壁筋独特の運動コントロールと関係があると考えられる。26年度は、外腹斜筋支配神経(外側枝)、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経(内側枝)を刺激することにより、それぞれ同名筋運動ニューロンを同定した後、後根電位の刺激閾値をもとにI群線維だけが刺激される刺激強度を確定し、その刺激強度を変えてガラス管微少電極で細胞内記録を行い膜電位を解析した。その結果、腹壁筋運動ニューロンから同名筋由来のIa群求心性線維刺激において単シナプス性の興奮性シナプス後電位が観察された。その結果をSociety for Neuroscience AnnualMeeting (Chicago 2015.10)で報告した。27年度は、腹壁筋運動ニューロンから細胞内記録をとり、脳幹を刺激して膜電位を解析しその下行路の様態を調べた。まず、腹壁筋支配神経を剖出し、双極カフ電極を装着し電気刺激できるようにした。腹壁筋運動ニューロンへ記録電極を刺入するために、第6胸髄から第3腰髄の間で椎弓切除を行い脊髄背面を露出させた。前庭神経核を電気刺激するための電極を刺入するために、脳幹部背面を露出させた。前庭神経が刺激できるように正円窓に銀ボール電極を植えた。手術終了後、ガラス管微小電極を胸髄・腰髄後索に刺入して単一細胞より細胞内記録をとった。

外腹斜筋支配神経(外側枝)、腹直筋・内腹斜筋・腹横筋支配神経(内側枝)を刺激することにより、それぞれ同名筋運動ニューロンを同定した。また、タングステン微小電極を脳幹部背面から刺入し前庭神経核を電気刺激した。また銀ボール電極を刺激することにより前庭神経を電気刺激した。それにより腹壁筋運動ニューロンの細胞内記録を行い膜電位を解析した。その結果、前庭神経核を電気刺激することにより、同側の腹壁筋運動ニューロンから一部小さな興奮性シナプス後電位が観察された。銀ボール電極を刺激することにより前庭神経を電気刺激した。しかし、今年度当初は脳幹部位の刺激方法がうまくいかず、実験が滞った。電極等を工夫して記録がとれるようになったのは後半からである。その結果、前庭神経核を電気刺激することにより、同側の腹壁筋運動ニューロンから一部小さな興奮性シナプス高電位が観察された。しかしながら、結果をまとめるにはデータが不足している。したがって、28年度にも研究が継続できるように延長申請を行った。28年度に追加の実験と解析およびそれらのまとめを行う予定である。27年度は、腹壁筋運動ニューロンから細胞内記録をとり、脳幹を刺激して膜電位を解析しその下行路の様態を調べたようとした。しかし、タングステン微小電極を脳幹部背面から刺入し前庭神経核を電気刺激した時に、脳幹部位の刺激方法がうまくいかず、実験が滞った。前庭神経刺激電極や脳幹刺激電極の試作を繰り返し、後半において適切に刺激ができるようになった。28年度は、腹壁筋運動ニューロンから細胞内記録をとり、脳幹を刺激しその入力を調べる追加実験と解析及び結果をまとめることを目標にした腹壁筋支配神経を剖出し、双極カフ電極を装着し電気刺激できるようにした。腹壁筋運動ニューロンへ記録電極を刺入するために、第6胸髄から第3腰髄の間で椎弓切除を行い脊髄背面を露出させた。前庭神経核を電気刺激するための電極を刺入するために、脳幹部背面を露出させた。前庭神経が刺激できるように正円窓に銀ボール電極を植えた。タングステン微小電極を脳幹部背面から刺入し前庭神経核(ダイテルス核)を電気刺激した。さらにタングステン微小電極を脳幹部背面から刺入し内側縦束(MLF)を電気刺激した。ガラス管微小電極を胸髄・腰髄後索に刺入して単一細胞より腹壁筋運動ニューロンの細胞内記録を行った。腹壁筋運動ニューロンから安定した細胞内記録が得られることによって、前庭神経刺激電極や脳幹刺激電極を用い電気刺激を行い、細胞内記録の膜電位を解析した。その結果、前庭神経の刺激からはほとんど膜電位の変化は観察されなかったが、前庭神経核(ダイテルス核)の刺激から、同側・対側ともに約20%から興奮性シナプス後電位が観察された。内側縦束(MLF)の刺激からは、対側からはほとんど変化は観察されなかったが、同側から約20%から興奮性シナプス後電位が観察された。脳障害後に見られる腹壁筋の低緊張状態や姿勢障害などの病態を明らかにするために、その運動制御メカニズムを調べた。まず、腹壁筋運動ニューロンから細胞内記録をとり、脊髄反射機構の性質を電気生理学的に解析した。その結果、同名筋由来のIa群求心性線維刺激においてのみ単シナプス性の興奮性シナプス後電位が観察された。さらに、腹壁筋運動ニューロンへの前庭入力様式を解析した。
4次元ファイバ-空間と曲面の写像類

数年前より継続していた研究がようやく一区切りがつき,「種数の高いリ-マン面の特異ファイバ-の位相形は,そのまわりのホモトピ-的モノドロミ-で決定される」という定理の詳しい証明がほぼ完成した。すでに,約300枚の手書き原稿を用意した。この定理の厳密な証明の副産物として,「代数的に有限な曲面写像類」(ニ-ルセン,1944)の共役類の完全な不変量が得られた。この結果によって見直すと,ニ-ルセンの主定理には一部修正すべき所のあることがわかった。以上の結果を利用して4次元ファイバ-空間の位相を調べるためには,「普通ファイバ-空間」の構造を調べることが必要である。この方向は,タイヒミュ-ラ-理論及びデリ-ン・マンフォ-ドのモジュライ空間のコンパクト化理論と関連する。研究分担者による関連する成果について述べる。河澄響矢はリ-マン面上の複素解析ベクトル場のコホモロジ-の計算方法を見出した。これは,モジュライ空間のコホモロジ-に関係する。また中島啓はALE空間上の反自己双対接統のモジュライ空間のホモロジ-の計算公式を発見した。坪井俊はゴトビオン・ベイ不変量の定義に関する研究を行い,十分一般的な結果を得た。また,深谷賢治は,フレア-・ホモロジ-理論について詳しい研究を行い,2つの3次元ホモロジ-球面M_1,M_2に対して,M_1とM_2の連結和M_1#M_2とM_1およびM_2のフレア-・ホモロジ-を結びつけるスペクトル系列を構成し,いくつかの例について計算を行なった。
共役リノール酸(CLA)による皮膚疾患の改善と予防

CLA由来脂肪肝の緩和物質の発見CLAの経口摂取は抗肥満効果を有するが、げっ歯類において脂肪肝を誘導することが報告されている。本研究においてアラキドン酸(ARA)油脂およびCLA油脂を4週間マウスに自由摂取させ、CLA起因性脂肪肝をARAが抑制するか否か検証した。ARA+CLA群の肝臓重量および肝臓脂質量(中性脂肪および総コレステロール)はCLA単独群に比して有意に減少したため、ARAはCLA由来の脂肪肝を改善することが明らかになった。さらにARA+CLA群は内臓脂肪の蓄積を抑制したことから、CLA特異的機能である抗肥満作用はARAとの同時摂取においても持続することを実証することができた。さらにARAによる脂肪肝の緩和は、ARAからの産生物質である肝臓中プロスタグランディン(PG)E_1よりPGE_2量の増加が大きく関与していた。本研究はCLAの有用性を高めることができ、CLA誘導性脂肪肝の発症メカニズムの解明につながった。一方、四塩化炭素(CCl_4)が誘導する脂肪肝をARAが抑制するか否かについても検証した。CCl_4およびARA油脂をマウスに単回経口投与し、24時間後の肝臓脂質量を測定した。ARAはCCl_4由来の肝臓中性脂肪量の増加を緩和することができなかったが、肝臓保護作用が確認されている肝臓PGE_2の産生量はARA+CCl_4群において増加していた。本研究によりCLAおよびCCl_4由来の脂肪肝は発症メカニズムが異なることが示唆された。皮膚炎はますます増加傾向にあり、深刻な問題となっている。本研究では、摂取油脂の種類により皮膚炎を緩和・予防することが可能か否かを調べることを目的とし、共役リノール酸(CLA)またはリノール酸(LA)をマウスに投与した。アラキドン酸から合成されるロイコトリエンB,(LTB,)は皮膚の痒みの発症要因の一つであることが明らかにされてきた。一方、LTB_4合成を抑制する効果が、CLA投与後の肝臓、内臓脂肪および脾臓において認められている。そこで妊娠期に摂取したCLAまたはLAが、授乳期の母親または乳仔の皮膚LTB_4量に与える影響を検証した。8週齢の雌マウスを3群に分け、それぞれの群に市販飼料、1%LA混合飼料、1% CLA混合飼料を交配前から出産後2週間与えた。これらの雌マウスと同週齢の雄マウスと交配した後、0、1、2週目の乳仔の皮膚および産後2週目の母マウスの皮膚を採取し、皮膚のLTB_4量を測定した。結果として、母マウスと0および1週目の乳仔の皮膚のLTB_4量には油脂の影響がみられなかった。しかし、2週目の乳仔において、対照群よりLA群は有意に高いLTB_4量を含有していた。一方、CLA群は対照群およびLA群の中間値を示し、両群との間に有意な差はなかった。結論として、LAの経口摂取により乳仔期の皮膚LTB_4量は増加することが明らかになった。しかし、LAの構造異性体であるCLAの経口摂取においては母仔の皮膚中LTB_4量に影響を与えなかった。本研究から、母親が摂取したCLAは乳仔の皮膚炎の発祥要因にならないことが明らかになり、CLA摂取の主たる目的である抗肥満および抗腫瘍作用に負の要因をもたらさないことが判明した。この事実は、CLAのサプリメントとしての有用性を高める結果となった。
喉頭癌および鼻腔癌におけるヒトパピローマウィルスによる発癌機序に関する研究

昨年度の結果に伴い今年度は過去の症例についてはパラフィン切片によるp16の免疫染色とin situ hybridization法によるHPV (human papilloma virus)の同定に関して症例数を増やして検討を加える予定であったが、その後の検討でISH法でのvirusの同定の結果が不安定であることが判明(通常過去の報告でもp16が過剰発現し免疫染色で陽性となる症例ではHPVが同定されることがほとんどだが、p16陽性例でもISHでvirusが同定されない)し、条件を変更し実験を行ってきたが安定した結果が得られるには至っていない。このため試薬を変更し現在検討中である。ISH法による分析が困難と判断された場合はパラフィンブロックからのDNA抽出によるPCR法での検討を予定している。新鮮例についてのPCR法によるvirusの同定およりtypingについては対象を頭頸部全体に広げて検討を行っており症例数が集まりつつあるが、陽性例は中咽頭癌に多く、鼻腔、喉頭に関してはまだまとまった解析が行えるほどの結果は得られていない。しかしながら現在までの有用な結果として、診断のつかない頸部の嚢胞性病変に関して術中迅速診断にて扁平上皮癌(すなわち原発不明頸部リンパ節転移と診断)と診断された3例に関して嚢胞の内溶液からHPV16が検出され、うち1例で後に原発巣が中咽頭前壁(舌根)と診断されている。この知見は当初の鼻腔、喉頭というところからはやや離れたものではあるが、同じ頭頸部癌に関しての臨床において頸部嚢胞性病変の診断および原発不明癌の原発巣検索において重要な所見と考えられ、これについてもあわせて今後症例を増やして検討する予定である。鼻腔、喉頭癌におけるHPVの関与およびその発癌機構を明らかとするため、本年度はまず過去の治療症例におけるパラフィン切片からin situ hybridazation法によるHPVの同定、およびHPV関連発癌において過剰発現することが知られているp16の発現を免疫染色法にて確認する方法を確立した。ISH法によりvirusのtype別のprobeを使用することによりvirusのtypingも同時に可能となった(probeはtype6,11,16,18,33,35と乳頭腫や発癌に関与している大部分のtypeを網羅している)。当初の研究計画にあったパラフィンブロックからのDNA抽出によるPCR法によるHPVの同定については現在のところDNA抽出の過程での手技が確立できていないが、新鮮例などDNAが抽出できる検体に関してはPCR法によってvirus DNAの同定およびtypingが可能になった。この方法においては理論的には擦過によって得られる程度の細胞からもDNAの検出が可能であり、放射線化学療法などを行い手術検体として十分な組織量が得られない症例についても披見者の負担なく検査が可能となっており、現在新鮮例についてもこの方法により検出を行い症例を蓄積し臨床成績との関連を検討している段階である。また正常の鼻腔や扁桃などからも検体採取が可能となったため、HPVの健常人における罹患率やHPV関連発癌症例の病変以外の部位におけるHPVの同定や感染率などを調査することが可能となり、HPVの感染の疫学的調査、発癌の頻度や感染から発癌にいたるまでのrisk factorといった重要な問題が明らかにできると考えられる。本年度はこれらにつきさらに症例数を蓄積し結果の解析を行う予定である。
非コードRNA（T-UCR）を介した細胞老化と大腸がんの悪性化の調節機構

高等生物のゲノムにのみ100%保存された、超保存領域より転写される機能性RNA (T-UCR)の発現異常は、がん化など細胞内恒常性の破綻の新たなリスクファクターとなる可能性がある。本研究では、選択的スプライシング因子SR様タンパク質の一つTransformer 2-beta (TRA2B)遺伝子領域より生成されるT-UCR、TRA2β4を介した大腸がん悪性化メカニズムの解明を目的とした。大腸がん細胞の核に高発現するTRA2β4はSp1を阻害することでp21を減少させ、細胞老化が低下し細胞増殖を亢進させた。T-UCRはステムループを形成し配列依存的に大腸がん悪性化に関与することを見出した。これまでSRSF遺伝子を介したRNAプロセシング異常と発がん及び癌悪性化機構について研究し、大腸がんで高発現するスプライシング調節因子SR(Ser/Arg)蛋白質(SRSF3)は、酸化ストレス下でHIPK2のスプライシングパターンを変化させ、p53の活性化を抑制することを見出した。また、大腸がん細胞は、長い3'UTRをもつBCL2 mRNAスプライスバリアントを選択的に誘導して細胞死を抑制する機構が存在することを見出した(Kuwano et. al., Cell Death & Differ., 2015)。また、UCRより転写されるTRA2β4 mRNAは、エクソン2に中途ストップコドン(premature stop codon: PTC)を持つPTCバリアントであるが、大腸癌細胞の核に局在し、ナンセンスRNA分解システムによる分解を免れていることを見出した。さらに、TRA2β4をノックダウンした大腸癌細胞株において、細胞増殖の低下とβ-ガラクトシダーゼ陽性の細胞老化の誘導が確認できた。TRA2β4がステムループ構造を形成し、転写因子Sp1とp21遺伝子(CDKNA1)プロモーターとの結合を競合阻害することで、p21の誘導を低下させ、細胞老化を阻害するメカニズムを新たに見出した(Kajita et. al., Oncogenesis, 2016)。平成27年度において、当初計画した通り細胞内RNAの局在の可視化ツールとしてMSベクターシステムを構築できた。さらに、大腸癌細胞HCT116においてTRA2β4およびエクソン2変異体の過剰発現細胞を樹立し、細胞増殖、薬剤耐性能や浸潤能が変化することを見出した。また、TRA2β4は大腸癌細胞の核に局在し、ナンセンスRNA分解システムによる分解を免れていること、TRA2β4をノックダウンした大腸癌細胞株において、細胞増殖の低下とβ-ガラクトシダーゼ陽性の細胞老化の誘導が確認できた。TRA2β4がステムループ構造を形成し、転写因子sp1とp21遺伝子(CDKNA1)プロモーターとの結合を競合阻害することで、p21の転写を低下させ、細胞老化を阻害するメカニズムを新たに見出し、報告することができた(Oncogenesis, 2016)。ヒトのSRSF遺伝子ファミリーは、マウス以上の高等生物のゲノムに100%保存された超保存領域(Ultraconserved region: UCR)が組み込まれており、UCRを含む転写産物(Transcribed-UCR)を生成する。これまでの研究において、SRSF様ファミリーのひとつ、Transformer 2 beta (Tra2 beta)遺伝子より生成されるTranscribed-UCRであるTRA2-beta 4は、(1)ヒト大腸がん組織で高発現していること、(2)超保存領域内にステムループを形成し、様々なRNA結合タンパク質と相互作用をすること、(3)細胞周期のインヒビターであるp21の転写を抑制し、がん細胞の増殖を亢進させること、を見出し報告した(Oncogenesis, 2016)。また、野生型TRA2-beta 4及び機能配列の変異型TRA2-beta 4を安定過剰発現させたHCT-116大腸がん細胞株を樹立し、抗癌剤耐性能や浸潤能などがん悪性化の表現型がRNAの配列依存的であることを見出した。さらに、動物実験では、ヌードマウス腫瘍移植実験によってTRA2-beta 4による腫瘍形成能の増大を観察した。これらの結果より、進化の過程で高等生物にのみ組み込まれた超保存領域は、非コード領域であるのにも関わらず、転写されたRNA産物は核内に蓄積し、その二次構造を介してがん悪性化の新しいパスウェイの一端を担う可能性が示唆された。平成26年度においては、異常分子(中途終止コドンpremature termination codonsを持ったtranscribed UCRs転写産物)の蓄積の結果生じる細胞恒常性の破綻のメカニズムの解析を目標に実験を計画した。主な研究としては、以上の計画のうち、1の安定過剰発現株の樹立に関しては、細胞増殖および軟寒天培地を用いた足場非依存性増殖の解析は完了し、次のステップであるヌードマウスへのゼノグラフト実験に移行している。

2の次世代シークエンス実験においては、細胞の選定後、現在シークエンス解析を行っている。PTCをコードするがナンセンスRNA分解システムにより分解されず、非コードRNAとして働くT-UCRのさらなる機能解析を進めるため、LS-MS質量分析を用いた結合タンパク質の網羅的解析を行っている。これまでに4種類のT-UCR結合タンパク質を同定しており、それぞれ、TRA2β4の核内局在及びスプライシング調節に重要であることを見出している。今後は、大腸癌の悪性化メカニズムをin vivoモデルで検討するため、既に樹立したT-UCR安定過剰発現細胞株のヌードマウス移植実験を進めている。腫瘍組織をサンプリング後、次世代シークエンス解析を行いT-UCRによる浸潤や転移能の変化に伴う遺伝子発現パターンを解析し、T-UCRの生理的意義の解明を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学平成27年度は、当初の計画の通り以下の2点を中心に行う。1ビオチン化RNAフラグメントを用いたクロマチンアイソレーション、を行いビオチンラベルしたtranscribed UCRsと相互作用する因子の同定を行う。核内で機能性RNA分子として、クロマチン修飾因子やヒストン修飾因子との結合し、エピジェネテックな制御を行う可能性を検討する。2in vivo RNAトラッキングシステムを用いたtranscribed UCRsの動的作用の検討、を行う。RNAファージ由来MS2ヘアピン構造を利用したRNAタグ及び蛍光たんぱく質を組み込んだMS2結合タンパク質を用い、タイムラプス蛍光顕微鏡により、細胞内でのRNAのリアルタイムな局在を解析する。また、MS2結合タンパク質を用いた免疫沈降により、細胞内でT-UCRsと相互作用する因子を同定する。次年度使用額が、差額として約5万5千円程生じたが、これはリアルタイムPCR用試薬であるライフテクノロジー社Taqman probeキットをマニュアルの半量にスケールダウンし解析することで、節約することが可能になったことが主な理由である。前年度の差額約5万5千円は、実験を予定している次世代シークエンス用のRNA精製カラムを追加し、実験のn数を加増するために使用する、もしくは、実験を迅速に進めるためのカラー遠心チューブの導入に使用予定である。
層状ケイ酸塩イオン交換体のイオン記憶特性と交換イオンの局所構造との関係

すぐれたイオン記憶特性を持つ無機イオン交換体の代表として、まずナトリウム形合成四ケイ素フッ素雲母を試料として選んだ。合成フッ素雲母、特にナトリウム形テニオライトNaMg_2LiSi_4O_<10>F_2・2H_2OはK^+、Rb^+、Cs^+、ならびにNH^+_4に対して特に高いイオン記憶特性を示すことがわかっている。1.これらのイオンと層間Na^+がイオン交換したテニオライトの粉末X線回折には、最大交換率に達していない試料ではナトリウム形2水層のピークが現われた。このピークは交換量が増大するにつれ小さくなっていった。一方、交換量が増えるにしたがい交換イオン、たとえばRb^+と交換した場合はルビジウム形の無水層のピークが現われて来ており、最大交換率に達すると001面反射では他のピークはなくなり、この無水層のピークだけとなった。これらのことより、合成フッ素雲母ではイオン交換反応が可能な層間イオンは2水層中にあるものだけであり、無水層中の残留Na^+は交換できないことがわかった。2.Rb^+、Cs^+、Sr^<2+>、Ba^<2+>、Ni^<2+>、Co^<2+>とイオン交換させたテニオライトやヘクトライトNa_<1/3>Mg_<8/3>Li_<1/3>Si_4O_<10>F_2・2H_2OのX線吸収スペクトルを高エネルギー物理学研究所放射光実験施設において測定した。そのX線吸収微細構造の解析結果より、テニオライトとRb^+を交換反応させるときのように非常に高い選択性を示す組み合わせの場合のみ、かなり低交換率のときから最大交換率にいたるまで、交換イオンは水和しない形で層間に入っていることが明らかになった。3.X線吸収微細構造は特定の元素周囲の局所構造を解析するのには有力な手段であるが、雲母の層構造全体の解明には適当ではない。そこで粉末X線回折のパターンを更に解析し、層構造の変化についての知見を得るためのRietveld解析プログラムの検討を行った。その結果、オンラインソフトとして得られるソフトウェアが最適であると判断し、そのプログラムそのものや使用説明を得るためにLANとの接続を行った。
植物の高機能化を志向した昆虫由来エリシターとその情報伝達系の物質的基盤

植物は昆虫食害というストレスに対して,昆虫の摂食を忌避する物質の生産や天敵昆虫を誘引する物質の生産など様々な防御応答を示す.研究代表者は,マメコガネの食害を受けたオオイタドリが,フェニルアラニン由来のニトリルやテルペンの1種であるオシメンなど揮発成分を生産・放出することを見出した.これら揮発成分の生産・放出は,マメコガネ由来の化学成分(エリシター)により誘導されると考えられ,本研究課題ではその同定を目指して研究を進めている.マメコガネ体内から得た抽出液にエリシター活性があり,昨年度はその活性物質の構造決定を目標に精製に取り組んだ.それ自体は現在も継続中であるが,エリシター精製のための材料調達の観点から,今年度は飼育中に大量に得られるマメコガネの糞にも着目した.マメコガネ体内にエリシター活性を有する物質が存在するため,糞にもその活性物質が一部含まれると予想した.マメコガネの糞を抽出し,オオイタドリ葉に処理したところ,揮発成分の生産・放出が確認され,糞にもエリシター活性があることがわかった.また,煮沸したマメコガネ糞抽出液にもエリシター活性が認められ,マメコガネ糞に含まれるエリシター物質は熱にある程度の耐性を持つことが示唆された.マメコガネ糞にもエリシター活性が認められたことから,精製のための材料が増え,より研究を進めやすくなったと考える.現在,引き続きエリシター物質の精製を進めている.本研究課題で目標としているエリシター活性を有する物質の単離に至っておらず,目に見える形での成果が出ているわけではない.しかしながら,精製方法の検討などは進んでおり,必ずしも研究が遅れているわけではなく,全体としては順調に進んでいると捉えている.今後は,マメコガネ対内および糞を材料に,エリシター活性を有する物質の単離・精製を進め,NMRや質量分析などを用いて活性物質の構造決定を進める予定である.植物は昆虫食害に対して様々な防御応答を示す.研究代表者は,その一例として,マメコガネに食害されたオオイタドリが,アミノ酸由来のニトリルやオシメンなど揮発成分を生産・放出することを見出している.この現象はマメコガネ由来のエリシターがオオイタドリに作用し,オオイタドリのニトリル生産系など防御応答を活性化すると考えられる.そこで,まず,マメコガネからエリシターを同定することを目的に研究を進めた.今年度は,マメコガネから得た抽出物をゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し,オオイタドリ葉を分画液に浸し,揮発成分の放出量をエリシター活性の指標として,活性物質の精製を進めた.これまでにタンパク質と低分子のふたつの画分にエリシター活性を確認していた.低分子画分については,エリシター活性の見られた塩基性画分を分析したところ,プロリンやフェニルアラニン,チロシン,ヒスチジンなど複数のアミノ酸が検出された.これらアミノ酸は活性がほとんどない酸性画分からも検出された.一方,酸性画分には含まれず,塩基性画分に特有の成分もひとつ検出された.この成分をエリシターの候補としてさらに精製を進めている.エリシター活性を有するもうひとつのタンパク質画分については,硫安分画で分けたところ,6080%に活性が局在することはわかった.粗抽出液に含まれる大半のタンパク質は060%画分に分かれるため,硫安分画は精製の初期段階では有用と思われるが,エリシター活性を有するタンパク質は失活しやすいと考えられ,現在,別の精製方法についても検討中である.エリシター活性を有するタンパク質は失活しやすいと考えられ,今後,バッファーや精製方法を検討していく必要があることがわかった.活性本体の同定には至っていないものの,これではうまくいかないという部分を消していっている状況にあり,必ずしも研究が遅れているわけでもない.一方,エリシター活性を有する低分子画分については,含まれる成分分析を進めるなど一定の進歩が見られた.こちらは失活の心配が今のところなく,比較的順調に研究が進んでいると考えている.植物は昆虫食害というストレスに対して,昆虫の摂食を忌避する物質の生産や天敵昆虫を誘引する物質の生産など様々な防御応答を示す.研究代表者は,マメコガネの食害を受けたオオイタドリが,フェニルアラニン由来のニトリルやテルペンの1種であるオシメンなど揮発成分を生産・放出することを見出した.これら揮発成分の生産・放出は,マメコガネ由来の化学成分(エリシター)により誘導されると考えられ,本研究課題ではその同定を目指して研究を進めている.マメコガネ体内から得た抽出液にエリシター活性があり,昨年度はその活性物質の構造決定を目標に精製に取り組んだ.それ自体は現在も継続中であるが,エリシター精製のための材料調達の観点から,今年度は飼育中に大量に得られるマメコガネの糞にも着目した.マメコガネ体内にエリシター活性を有する物質が存在するため,糞にもその活性物質が一部含まれると予想した.マメコガネの糞を抽出し,オオイタドリ葉に処理したところ,揮発成分の生産・放出が確認され,糞にもエリシター活性があることがわかった.また,煮沸したマメコガネ糞抽出液にもエリシター活性が認められ,マメコガネ糞に含まれるエリシター物質は熱にある程度の耐性を持つことが示唆された.マメコガネ糞にもエリシター活性が認められたことから,精製のための材料が増え,より研究を進めやすくなったと考える.現在,引き続きエリシター物質の精製を進めている.

本研究課題で目標としているエリシター活性を有する物質の単離に至っておらず,目に見える形での成果が出ているわけではない.しかしながら,精製方法の検討などは進んでおり,必ずしも研究が遅れているわけではなく,全体としては順調に進んでいると捉えている.マメコガネ由来のエリシター活性を有する物質の精製を進めている.今後は,エリシターを単離・精製し,NMRや質量分析などを用いて,物質同定を進める予定である.エリシター活性を持つ塩基性画分からはアミノ酸が複数検出された.活性がほとんどない酸性画分からも同様にアミノ酸が検出されたため,アミノ酸がエリシターの本体ではないと考えられる.しかしながら,近年,アミノ酸の一種であるヒスチジンが植物の病害抵抗性を高めることが報告されている.病害と昆虫食害の違いはあるものの,各アミノ酸がエリシター活性を有するかも調べることを計画している.今後は,マメコガネ対内および糞を材料に,エリシター活性を有する物質の単離・精製を進め,NMRや質量分析などを用いて活性物質の構造決定を進める予定である.当初,学会発表のため旅費を計上していたが,発表に適した学会とスケジュールが合わず,発表を見送ったため,次年度使用が生じた.その分は,次年度に成果発表のために使用する予定である.学会発表のため旅費を計上していたが,スケジュールの都合で発表を見送ったため,次年度使用が生じた.その分は,次年度に成果発表のために使用する予定である.