hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1、2-不斉誘導反応による鎖状化合物の立体制御

シャ-プレス不斉試薬を用いる第二アリルアルコ-ルのエポキシ化による速度論的光学分割は光学活性エポキシアルコ-ルおよびアリルアルコ-ルの合成法として有用な反応である。我々は、ヘテロ原子を置換基として有する第二アリルアルコ-ルの速度論的光学分割を行なったところ、従来にない高い効率で分割がおこることを見出した。さらに、我々はシャ-プレス不斉試薬が第二フリルアルコ-ルおよび第二チエニルアルコ-ルの酸化反応を経由する光学分割にも有効であることを見出し、従来合成法のなかったフリルアルコ-ルおよびチエニルアルコ-ルの光学活性体の効率的合成法の開発に成功した。これら生成物はヘテロ原子団、フリル基あるいはチエニル基の反応特性を活用するところにより、有用なキラルビルディングブロックになると考えられる。そこで我々は第二アルコ-ルの不斉中心を利用して不斉誘導により不斉中心を増やすこと、そして、生成物のヘテロ原子団、フリル基やチエニル基の反応特性を利用して、有用生理活性化合物それ自体、あるいはその合成中間体を合成することを検討した。その結果、α-ヒドロキシカルボン酸、ビニルエポキシド、1-ビニル-1、2-ジオ-ル、α、β-ジアルコキシアルデヒド、γ-ラクトンの光学活性体を合成することに成功した。当初計画したβ-アミノアルコ-ルやβ-ハロゲノアルコ-ルの光学活性体の合成に関しては必ずしも満足のいく結果は得られていないが、現在さらに検討中である。また、本反応は大量合成も可能な方法であり、特に、ヘテロ原子置換アリルアルコ-ルの光学活性体の大量合成は興味深く、現在その可能性を検討中である。vic-ジオール, β-アミノアルコール, β-ハロゲノアルコール等,隣接した炭素上に水酸気とヘテロ原子団が存在する骨格は天然物中に多く見られ,またこれらの化合物は合成中間体として大変有用である.本研究は,これらの化合物の一般的合成法を確立する目的でカルボニル基のα位にヘテロ原子団を有する光学活性カルボニル化合物と有機金属化合物との付加反応を検討し,高立体選択性の発現する系を見い出すことにある.本年度は以下の点を明らかにした.1.光学活性なβ-アミノアルコールの合成原料となる光学活性なα-アミノアルデヒドの合成に成功した.すなわち,アリルアルコールの不斉エポキシ化反応(^tBuOOCH, Ti(O^iPr)_4, L-(+)-DIPT)で得られるエポキシアルコール(光学純度95%ee以上)にTi(O^iPr)_4存在下,第二級アミンを反応させると位置選択的にエポキシドの開環がおこり, 3-アミノー1, 2-ジオールが生成した.このジオールを酸化的に切断して, α-アミノアルデヒドを収率よく合成した.なお,アリルアルコールの不斉エポキシ化反応の際,酒石酸エステルのD体あるいはL体を用いることにより,目的のα-アミノアルデヒドの両鏡像体が合成できた.2.上で合成したα-アミノアルデヒドにグリニャール試薬を反応させると高立体選択性(>ZO:1)でsyn型付加物が合成できることを見い出した.さらに,このsyn型化合物を酸化して得られるα-アミノケトン化合物をNaBH_4を用いて還元するとanti型付加物が>ZO:1の立体選択性で得られた.次年度以降は,本年度の成果を基にしてエフェドリン,コンヒドリンなどのアルカロイドの合成を行なう.

また, α-アルコキシアルデヒド, α-ハロゲノアルデヒドの合成法を確立し,このものと有機金属化合物との立体選択的な付加反応の条件を見い出す.前年度において、我々は、α-N、N-ジベンジルアミノプロパナールとEtMGBrとの反応が高立体選択的に進行し、シン型のアミノアルコールを与えること、さらにこの化合物を酸化して生じたα-アミノケトンをNaBH_4で還元すると、この場合にも反応は高立体選択的に進行し、アンチ型のアミノアルコールが生成することを見い出した。本年度はこの反応の立体選択性が、(1)窒素原子上の保護基を変えた場合、(2)フロパナールの他に、一般のアルカナールを用いた場合、(3)求核試薬として用いているグリニャール試薬の種類を変えた場合にも成立するかどうかを検討した。しかし、高い立体選択性の発現する系は、現在までのところ得られてない。たとえば、α-N、N-ジエチルアミノプロパナールとE+MgBrとの反応では、シン対アンチの比が約1:1のアミノアルコールの立体異性対の混合物を与えた。一方、α-N、N-ジベンジルプロパナールとPhMgBrとの反応では、立体選択性はシン:アンチ=6:1であった。次に、本研究ではα-トリメチルシリルブテノライドと求核試薬との1、2-不斉誘導反応を行った。すなわち、このブテノライドにMe_2CuLiを反応させると、アンチの立体化学を有する1、4-付加物が高立体選択的に生成した。この生成物をLiAlH_4で還元し、続いてピーターソン脱離を行うと、アンチの立体化学を有するβ-メチルホモアリルアルコールが高収率で生成した。フルフラ-ルとカステルエノラ-トの付加反応によって大量に合成した3-(2-フリル)-3ヒドロキシプロピオン酸エステル(1)をシャ-プレス不斉エポキシ化反応を用いて速度論的光学分割をおこない、1の光学活性体を合成した。1に塩基を作用させアルキル化させたところ、1に存在するヒドロキシル基によって高選択的に1.2-不斉誘導され、ヒドロキシル基とアルキル基がアンチ型の立体配位を有したプロピオン酸エステル誘導体(2)が高収率で得られた。化合物2に、塩基を作用させエステルエノラ-トとした後更にアルキル化させたところ、このアルキル化も高選択的に進行し、立体配位の決った4級炭素の構築が可能であることを見出した。得られた4級炭素を持つ化合物は、エステル基およびフリル基という炭素鎖を伸長できる官能基を有しており、種々の応用が可能であることを明らかにし、生理活性化合物合成の中間体を合成した。化合物2きのヒドロキシル基を酸化しケトン体に変えた後、1.2-不斉誘導反応をおこなうことを計画し、2の酸化条件を種々検討したが、収率が悪く、このプロジェクトは断念した。抗生物質チェナマイシン合成の鍵中間体を合成することを目的として、化合物1からエノラ-トを発生させた後、ヘテロ原子置換基を導入することを次に試みた。この研究は、未だ途上であるが、収率よく反応する条件を見出すに至っており、今後更に研究を続けることを予定している。また、この知見を化合物2に適用することも予定している。
切断肢の内部組織構造と義肢の制御に関わる研究

本研究は切断肢と義肢(義手と義足)の適合評価とソケットの設計に関する研究である。具体的には、切断肢(以下、断端と称す)の内部組織構造、すなわち筋組織と脂肪組織の量と比率が断端の体積、形状および粘弾性に関与する重要な因子と考え、それらに基づく義肢ソケットの設計、および義肢の制御との関係を明らかにすることである。断端のMRIまたは超音波画像をもちいて断端の解剖学的評価行い、断端の成熟過程と成熟した断端に対するソケットデザインの提案および力の伝達効率等の義肢の制御効率との関係とを明らかにすることにより、客観的な義肢の適合評価を行うことを最終目的とする。断端の内部組織(筋、脂肪)構造や硬さの変化は、切断者の活動量(義足でいえば歩行量等)や切断からの年数にも依存すると予想される。これらの調査により、断端の成熟の定義と、それに至る機序を明らかにすることができる。また、断端の硬さは断端の内部組織構造と関連することは容易に推測できる。したがって明らかにすべきことは、1断端内部の筋・脂肪組織比率と切断からの期間、年齢、切断高位等の因子との関係2筋・脂肪組織比率と断端の硬さ(いわゆる粘弾性)との関係3筋・脂肪組織比率と断端の硬さの切断後からの変化を観察することによる断端の成熟機序の解明となる。一方、MRI画像データから断端の内部組織構造が把握できれば、それらと断端の粘弾性を関連付け、更にソケット装着による断端の形状変化と関連付けることが可能である。その結果、断端の形状からどの程度変化させれば適合しうるソケット形状となるかが推測可能となり、新たなソケット形状の設計手法が提案できることとなる。さらに、断端内部組織構造と断端の筋力および歩行動作解析から得られるパラメータをスコアとし、適合したソケットを有する義肢とそうでない義肢で比較することにより、義肢の適合評価を行うことができる。1切断者を対象にした画像データ収集と解析:片側大腿切断者11名と片側大腿片側下腿切断者2名、両側大腿切断者2名の計15名の大腿切断者の近位部の断面画像を取得し、筋・脂肪の面積を算出、反対側との比較や年齢及び切断歴との関係を求めた。その結果、反対側に比べて断端は萎縮し、主に筋の萎縮が著しいこと、筋の萎縮は筋によって大きく異なること、萎縮の割合は年齢や切断歴と負の相関があることを明らかにした。これらの結果を日本義肢装具学会誌に論文投稿し、受理された。2断端の筋力および歩行能力といった義肢制御能力と義肢の適合評価項目の選定とプロトコルの確立:断端の筋力計測手法の妥当性と再現性について、大腿切断者6名を対象として験者間差および再現性の確認を行った。その結果、験者間差はほぼ無く、再現性については屈曲・内転・外転については再現性有りの結果を得た。ただし伸展方向については被験者間の差が大きかった。対象者をさらに増やして確認する。3画像データと粘弾性分布に基づくソケットの設計の製作:これまでMRIの画像は臥位の姿勢で取得していたが、実際の義足ソケットは立位で荷重をかけるものであり。立位時のMRI画像の取得が望まれていた。金沢大学の協力により、大腿切断者1名の立位MRIの画像を取得した。臥位での画像との比較により、近位と遠位部に軟部組織の形状の違いが認められた。MRI画像についてはさらに被験者を増やし軟部組織の変化に関与する因子を明らかにする。筋力計測の妥当性については被験者を増やしてより一般性の高い結果を得た後に論文化する。また、筋力と軟部組織構造、歩行機能との関係を明らかにする。縦型MRIの画像データよりソケット形状とと断端変形量との関係から、ソケット設計因子を把握する。

一方、MRI画像データから断端の内部組織構造が把握できれば、それらと断端の粘弾性を関連付け、更にソケット装着による断端の形状変化と関連付けることが可能である。その結果、断端の形状からどの程度変化させれば適合しうるソケット形状となるかが推測可能となり、新たなソケット形状の設計手法が提案できることとなる。さらに、断端内部組織構造と断端の筋力および歩行動作解析から得られるパラメータをスコアとし、適合したソケットを有する義肢とそうでない義肢で比較することにより、義肢の適合評価を行うことができる。MRI画像による内部組織構造の解析は順調に進んでおり、内部組織構造と断端の硬さやソケット形状との関係も見いだしつつある。大腿切断者15名(片側切断者11名、両側切断者4名)のMRI画像を取得した。MRIより断端内部組織構造として筋・脂肪組織を定量した。片側大腿切断者においては非切断側である健側と断端で断端内部組織構造を比較し、片側大腿切断者と両側大腿切断者とで断端を構成する筋の断面積を比較した。片側切断者全てにおいて、断端は健側よりも萎縮し、萎縮率は年齢や切断歴と負の相関を示した。特に、断端内にある筋の中でも失われた膝関節に作用していた大腿四頭筋は大きく萎縮していた。一方、内転筋群の萎縮は小さかった。また、歩行量の少ない両側大腿切断者は片側切断者に比べて大殿筋が萎縮していた。次に、健常者と片側大腿切断者の大腿部(以下、健側)ならびに断端の硬さを押し込み反力計で計測し、硬さに影響すると考えられる軟部組織厚との関係を明らかにした。健常者における脂肪組織厚と硬さとの関係には有意な負の相関があった。切断者の健側と断端における脂肪組織厚と硬さとの関係は、それぞれ弱い負の相関と正の相関が見られた。筋組織厚と硬さの関係は、すべてのグループにおいて負の相関が見られた。断端の筋組織厚と軟部組織の硬さの関係には有意な相関があった。この結果、MRIによる組織構造解析から断端の硬さを推測できる可能性が見いだされた。さらに、大腿ソケットに対して、断端の横断面内において組織がどのように変形して収納されているのかを、軟部組織(筋組織、脂肪組織)の量と断端の弾性を因子として定量的に考察したところ、ソケット形状を表す値として軟部組織の圧縮率を算出し、それと軟部組織と弾性との関係を回帰式で定量的に表し、ある程度臨床と合致する結果が得られた。本研究は切断肢と義肢(義手と義足)の適合評価とソケットの設計に関する研究である。具体的には、切断肢(以下、断端と称す)の内部組織構造、すなわち筋組織と脂肪組織の量と比率が断端の体積、形状および粘弾性に関与する重要な因子と考え、それらに基づく義肢ソケットの設計、および義肢の制御との関係を明らかにすることである。断端のMRIまたは超音波画像をもちいて断端の解剖学的評価行い、断端の成熟過程と成熟した断端に対するソケットデザインの提案および力の伝達効率等の義肢の制御効率との関係とを明らかにすることにより、客観的な義肢の適合評価を行うことを最終目的とする。断端の内部組織(筋、脂肪)構造や硬さの変化は、切断者の活動量(義足でいえば歩行量等)や切断からの年数にも依存すると予想される。これらの調査により、断端の成熟の定義と、それに至る機序を明らかにすることができる。また、断端の硬さは断端の内部組織構造と関連することは容易に推測できる。したがって明らかにすべきことは、1断端内部の筋・脂肪組織比率と切断からの期間、年齢、切断高位等の因子との関係2筋・脂肪組織比率と断端の硬さ(いわゆる粘弾性)との関係3筋・脂肪組織比率と断端の硬さの切断後からの変化を観察することによる断端の成熟機序の解明となる。
１分子力学測定によるタンパク質の動的微細構造の探索

原子間力顕微鏡を用いて、ポリペプチド鎖1分子の力学、粘弾性測定を行い、その動的構造と機能の相関について研究を行った。ポリグルタミン酸、ポリリジンなどでは、一分子力学測定からは、定まった構造をもたない、柔らかい構造を取っていることが分かり、一方で、ポリプロリン鎖では、これまでの予想どうり、他のポリペプチド鎖とは異なり、非常に硬い構造を取ることが判明した。天然変性タンパク質(ペプチド)は通常明確な構造を持たないとされるため、従来の分光法ではその構造の検出が難しく、その構造に関する知見は乏しい。NMRによる解析が有力とされるが、NMRでの測定条件ではタンパク質試料濃度が高いために凝集が起こることが問題であった。そこで凝集の起こり得ない、1分子を基板に固定した状態で、分子を掴み、その力学的挙動や、動的粘弾性を調べることで、天然変性タンパク質1分子の微細な動的構造を探ることが有力である。そのためには、まずは構造が単純であるモデル分子の測定結果を収集し、その結果を基にして、構造未知の分子の構造について議論することが必要である。構造が単純である分子(モデルペプチド)として、構造をもたない、あるいは規則的な構造をもつとされるポリリジン、ポリプロリン、ポリグリシン、ポリグルタミン酸をについて、測定を行うことにした。1分子を原子間力顕微鏡の探針部で首尾よく引っ張るためには、分子を基板へ部位特異的に化学固定することが重要である。本年度は、アミノカップリング反応を利用し、ペプチドのN末、C末部を基板へ化学固定する条件検討を行った。またポリプロリンは、他のペプチド鎖と大きく異なり、非常に大きな弾性を持つ(硬い)。分子の硬さと、実際に引っ張る分子の長さの関係性を調べることで、ポリプロリンの単位長さあたりの硬さを決定することが出来、その硬さはβシートで構成される球状タンパク質と同等であることを見出した。1分子粘弾性測定による天然変性タンパク質の微細構造を探るためには、まず構造が有る程度解明されているモデル分子に関して、その力学特性、および粘弾性情報を収集し、それを基にして、対象とする分子の構造を議論しなければならない。そのため、最初にモデル分子としてホモポリペプチドを選んだ。具体的には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリプロリン、ポリグリシンを選び、これらを原子間力顕微鏡を用いて、1分子力学測定が可能であるかどうかの条件検討を行った。その結果、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポロプロリンに関しては、実際に1分子フォースカーブ測定に成功し、それぞれのポリマーが持つ力学特性についての知見を得た。ポリリジンは中性付近では構造を取らない、ランダムコイル状態を取るとされており、実際にその力学曲線は、ミミズ鎖モデルで再現することが出来、硬さを表す持続長は非常に小さい、すなわち構造を持たない事が示唆された。グルタミン酸は、酸性においてはαへリックス構造を取るとされているが、中性pHでは構造をほとんど取らないとされている。実際に中性でのその力学曲線はポリリジンと同様で、構造をほとんど取っていない事が分かった。ポリプロリンに関しては、C末を基板へ化学結合させる事で1分子測定が可能となった。これまでポリプロリンはその一部が、シス型のコンパクトなへリックスI状態をとり、250pN辺りでトランス型のへリックスII型が見られるという報告が有るが、我々の測定結果はこれとは全く異なり、転移は起こらず、その代わり、これまでのどの分子にもない、非常に硬い構造を高い張力まで保持する、極めて優れた弾性体である事を発見した。ポリグリシンに関しては、その水への溶解度の低さから、未だ測定に適切な条件を見つける事が出来ていない。最終年度である26年度では、ポリプロリンの一分子力学測定から、ポリプロリンが非常に硬い構造を取ることを確認した。またその力学曲線の解析から、単位長さ辺りの弾性を測定した。またポリプロリンはその構造から、他の分子と相互作用する官能基を持たない分子であり、実際に、一分子力学測定においても、基板やカンチレバー先端部への非特異的吸着は、他の分子に比べて著しく低いことが分かった。これらのことから、ポリプロリンは、これまでの蛍光FRET実験などが示していたように、剛直な構造を取り、他の分子と相互作用を起こさない、特異な機能を持った分子であることが分かった。また今回の研究では、この分子の金基板への共有結合による固定化に成功した。本研究では、一分子力学測定を行うために非常に長いポリプロリン鎖を使用したが、短いペプチド鎖でこの固定化を行えば、非特異吸着の防ぐ新しい表面改質の手法としての可能性を持っている。さらに、側鎖と主鎖で交互にペプチド結合を繰り返す非常に珍しい構造を持った、ポリγグルタミン酸と、通常のポリペプチドであるポリLグルタミン酸について、その一分子力学解析を行った。その結果どちらもミミズ鎖モデルに従った力学曲線を示し、ポリグルタミンの分子鎖は柔らかい構造を持つことが分かった。

ポリγグルタミン酸は、納豆のネバネバの主成分であること、また、泥水の様な汚染された水に溶かすことで、凝集、水質を改善する作用が有ることが知られているが、そのメカニズムや、構造に関しては全く知られていない。本研究成果をさらに調べることで、ポリγグルタミン酸の構造やダイナミクス、そして水質改善のメカニズムを解明できると期待される。生物物理学25年度中にモデルペプチドの測定を終え、天然変性タンパク質の測定を行う予定であったが、モデルペプチドの測定条件の決定に時間を費やしたこと、また、ポリプロリンが特異的な力学特性を示したことから、この分子の詳細な測定を進めることに方針を変更し、ポリプロリンへリックスIとIIの構造について、その単位長さ当たりの固さを定量する実験を行い、これに時間を要したために、本題である天然変性タンパク質の測定に取り掛かることができなかった。さらに、モデルペプチドとして選んだペプチドの固定化に関して、それぞれのアミノ酸の種類によって条件が異なり、その最適化に時間を要した。さらに、1分子粘弾性測定のために必要な磁化カンチレバーの作成に関しても、顕微鏡に設置された電動ステージが故障したために作成ができていない(26年4月の異動後に修理完了済)。また私的理由として、25年度末に所属していた大学での任期が終了するため、次年度以降も研究を続けるための就職活動に大きく時間を取られたことが大きな理由である。また時期ポジションが決定後も、研究室の移設に伴う作業の負担が大きく、25年度後半はほとんど研究が進めることが出来なかった。24年度はモデルペプチドの測定条件を探すことはほぼ達成できたが、これらの粘弾性測定にはまだ至っていない。これはポリプロリン、ポリグリシンの1分子測定条件を見つける事に時間がかかったためであり、ポリプロリンに関しては、化学修飾を行う事で好条件を見つける事が出来、さらにその物性がこれまでのどの分子にも見られなかったものであるため、この事項を単独で論文として現在まとめている段階であり、本研究目的からは少々逸脱するが、1分子力学測定の貴重な成果として評価できると考える。また、天然変性タンパク質の測定に関しては、未だ着手できていない。しかしこれは、モデルペプチドでの1分子測定の条件を充分検討してからでないと、同様の問題に遭遇すると思われるため、初年度のホモポリペプチドの条件検討は必須であった。これを活かし、25年度では、天然変性タンパク質の配列を調製し、その1分子力学測定を実現できるようにしたい。研究室移設は26年4月に終了した。今後はポリプロリン以外のペプチドの力学測定、粘弾性測定を進める。粘弾性測定には、25年度で開始できなかった、磁気励振による方法を用いる。この方法は、力学測定用の柔らかいカンチレバー先端に、10マイクロメートル程度の磁気ビーズを接着し、これを磁場コイルからの外部磁場によって振動させ、その振幅と位相から、引っ張っている1分子の粘弾性情報を抽出する方法である。モデルペプチドの測定を終え、構造と力学、粘弾性の関連性、相関についての解析を進め、次に天然変性タンパク質配列を持ったペプチド鎖、タンパク質の測定に取り掛かる。天然変性タンパク質の測定のためには、凝集の起こらない低濃度で、分子を基板へ、化学修飾や、物理吸着を利用して固定する必要がある。固定に成功したら、実際に天然変性タンパク質1分子の力学、粘弾性測定を行い、力学、粘弾性の情報を収集する。
糖タンパク質糖鎖の酵素的導入による生体認識配糖体創製のための基盤構築

糖鎖遊離酵素遺伝子の高発現系の構築とその精製に成功し、高純度の糖鎖遊離酵素の供給基盤を構築した。組換え糖鎖遊離酵素は、各種糖タンパク質からN結合型糖鎖を遊離し、糖鎖分析への有用性が示唆された。また、遊離糖鎖を転移し、生体認識配糖体合成が可能となった。変異導入糖鎖遊離酵素を作成し、酵素分子の機能領域を調べた。さらに、X線立体構造解析のために組換え糖鎖遊離酵素の結晶化に成功した。1、糖鎖遊離酵素遺伝子の大腸菌での発現系の構築クローニングした同酵素遺伝子をプラスミドに挿入し、大腸菌の形質転換体を作成した。また、アフィニティー精製や発現タンパク質の可溶化促進のためのタグ遺伝子を付加し、その発現系も構築した。さらに、同遺伝子のうち、活性に必要な領域の発現系も構築した。その結果、酵素分子中の一部領域を除いた遺伝子を発現する大腸菌の発現系を構築することができた。また、アフィニティー精製のためのタグや可溶化促進タグ遺伝子を付加した発現系も構築することができた。そして、様々な発現誘導条件を検討したところ、特定の誘導条件下で可溶性の状態で発現した。こうして、安定的に酵素を生産する基盤を構築することができた。2、発現酵素の精製法の確立アフィニティークロマトグラフィーによる精製のために、溶出条件などの諸条件を検討し、アフィニティータグの付加した発現酵素の大腸菌かちの最適な分離精製法を検討した。その結果、アフィニティーカラムには吸着しなかった。このため、同タグを付加しない酵素を発現させ、その精製法を検討したところ、2段階のカラムクロマトグラフィーによって高い回収率で精製酵素票品を得ることに成功した。こうして、精製した酵素を迅速に得ることができるようになり、高純度の酵素を糖鎖の遊離や糖鎖転移による生体認識配糖体の合成に利用する基盤が出来上がった。また、同酵素の立体構造解析に必要な結晶を調製するために必要な量の精製酵素標品を得ることができるようになった。1、組換え糖鎖遊離による糖タンパク質からの糖鎖遊離糖タンパク質プロテオミクス研究に際して、大腸菌で発現した組換え糖鎖遊離酵素を用いて各種糖タンパク質から糖鎖構造特異的に糖鎖を切り出すために、組換え酵素の発現と精製を行った。その結果、精製の過程で発現酵素の安定性が低下することを見出した。そこで、誘導条件を検討することによって、精製の過程を通じて安定な酵素を発現することができ、これを分離精製することができた。精製した発現酵素は各種糖タンパク質からコンプレックス型糖鎖を容易に遊離することを明らかにした。このとき、糖タンパク質の高次構造の変化によって酵素の糖鎖遊離作用が変化することを見出した。また、体液や細胞などの生体試料に精製酵素を作用させたところ、これらに存在する糖タンパク質から糖鎖を遊離することを見出し、生体試料の糖鎖分析への利用の可能性が示唆された。2、糖鎖遊離酵素遺伝子への変異導入PCRの反応条件を変えることによって糖鎖遊離酵素遺伝子にランダム変異を導入した。そして、変異導入酵素の糖タンパク質からの糖鎖遊離作用を調べた。その結果、様々な変異導入遺伝子が得られた。これらを発現させたところ、糖タンパク質からコンプレックス型糖鎖を遊離する活性の低下した変異導入酵素が得られた。また、結合する糖鎖の多い糖鎖タンパク質からより早く糖鎖を遊離すると考えられる変異酵素が得られた。また、インバースPCRによって同遺伝子に欠失変異を導入し、様々な欠失を導入した酵素の発現系を構築することができた。これらの変異酵素の構造と特異性の解析から酵素分子の機能領域を明らかにすることが可能となった。1、組換え糖鎖遊離酵素の結晶化とX線結晶構造解析大腸菌で発現した組換え糖鎖遊離酵素の立体構造を明らかにするために、組換え発現糖鎖遊離酵素の結晶化とX線結晶解析を行った。その結果、精製した発現酵素を用いて様々な結晶化条件を検討したところ、いくつかの条件において形状の異なる酵素の結晶を得ることに成功した。得られた結晶化条件をもとに、さらに結晶化条件を検討し、測定に適すると考えられる複数の単結晶を得ることに成功した。これらの結晶のX線結晶解析を行ったところ、立体構造を決定するために適した結晶であることが明らかとなった。このため、得られた結晶を用いてさらに構造解析を行うことによって、組換え発現糖鎖遊離酵素のX線結晶構造解析による立体構造が解明されるものと期待できる。2、糖鎖遊離酵素遺伝子への変異導入と変異酵素の機能解析糖鎖遊離酵素遺伝子に様々な欠失変異を導入し、欠失導入酵素の発現系を構築するとともに変異酵素を発現し、各種欠失変異酵素の糖タンパク質からの糖鎖遊離作用を調べた。その結果、糖鎖遊離酵素のC末端領域が、基質となる糖タンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。

3、組換え糖鎖遊離酵素の免疫化学的性質の解析精製した組換え発現糖鎖遊離酵素を抗原として、同酵素に対する抗体を調製した。得られた抗体を用いた免疫化学的検出法によって、組換え発現糖鎖遊離酵素と構造的に類似した酵素が存在することを見出した。また、得られた抗体を用いて、組換え発現糖鎖遊離酵素の探索法を構築し、生体試料中の類似酵素の検出を行った。そして、この方法は、同酵素と特異性の類似した酵素のマススクリーニングに利用できることが明らかとなった。
樹状細胞を用いたp53ペプチドワクチンの基礎的研究

頭頸部扁平上皮癌ワクチンの開発を目的として、抗腫瘍活性の高いキラーT細胞を誘導できるp53タンパクのペプチド抗原の同定を試みてきた。これまで癌細胞上のHLA-A2.1に結合するp53の野生型ペプチドから3次元構造を考慮したアナログペプチドを多数作成し、その中で結合親和性の高いペプチドを選択した。健常人の抹消血単核球を分離し、IL-4,GMCSFを用いて樹状細胞を誘導し更に新しいp53のアナログペプチドをパルスした樹状細胞を用いてCD8 T細胞を刺激し種々のサイトカインを加えて培養しCTLの誘導を試みた。高い抗腫瘍効果を示すキラー細胞を誘導するアナログペプチドはいくつか同定され、その構造について詳細に検討した。すでに確立されているマウスの扁平上皮癌モデルに対してin vitroでp53アナログペプチドあるいはp53野生型ペプチドをパルスした樹状細胞を用いて誘導したCTLを投与し抗腫瘍効果を比較検討したところ、新しいp53アナログペプチドを用いて誘導したCTLを投与されたラットで、より強く腫瘍が縮小する傾向を認めている。現在、効果的な投与方法について検討している。最終的には、癌ワクチンの臨床応用を視野に入れている。我々は、頭頸部癌を認識し、抗腫瘍活性の高いキラーT細胞を誘導できる癌ワクチンの開発を目的として、p53タンパクのペプチド抗原の同定を試みている。これまで癌細胞上のHLA-A2.1に結合するp53の野生型ペプチドを選択し、そのアミノ酸配列をコンピューターグラフィクスを用いて3次元構造を構築した。アシカー領域のアミノ酸は固定し、それ以外のアミノ酸を1つずつ他のアミノ酸に置換し、3次元構造を確認しながら、HLA class Iに結合する全く新しい数百個のアナログペプチドを作成した。そのなかからおよそ20個のペプチドを選択しBinding Assayを施行し、結合親和性の高いペプチドを絞り込むことができた。現在は、健常人の末梢血からリンパ球を採取し、単核球を分離しIL-4,GMCSFを用いて樹状細胞を誘導している。この樹状細胞に新しいp53のアナログペプチドあるいは野生型のペプチドをパルスし、CD8 T cellに種々のサイトカインを加えて培養し、7日毎に同様の樹状細胞で刺激しCTLの誘導を試みている。どのペプチドから高い抗腫瘍効果を示すキラー細胞が誘導されるか検討中である。
慢性肝疾患、肝細胞癌における細胞外マトリックス分解酵素に関する研究-

慢性肝疾患および肝細胞癌患者で血清および肝組織中の細胞外マトリックス分解酵素MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-9を検討し下記の成績を得た。1.血清MMP-1およびMMP-1/TIMP-1複合体濃度は慢性肝炎の組織学的壊死炎症の程度と密接に関連して減少した。臨床では血清MMP-1は活動性と非活動性肝炎の鑑別に有用であった。2.血清MMP-2濃度は肝硬変および肝硬変合併肝癌で著明な高値を示した。肝組織中のMMP-2濃度は硬変肝で増加しており、血清MMP-2上昇は肝組織由来と考えられた。臨床では血清MMP-2は慢性肝炎と肝硬変との鑑別に極めて有用であった。なお、ザイモグラムおよびカラムクロマトで血清中のMMP-2はproMMP-2/TIMP-2であることが示された。肝癌での血清MMP-2は肝硬変と、更に肝癌の治療前後で差を認めなかった。3.血漿および肝組織中のMMP-9濃度は、MMP-2とほぼ同様な変動を示したが、肝硬変診断能はMMP-2に比べてやや劣っていた。カラムクロマトでは血漿および肝組織とも分子量95kDaに一峰性のピークとして描出された。(現在投稿中)4.血清MMP-3濃度は女性に比べて男性で約2倍高い値を示したが、性別に関係なく、慢性肝炎および肝硬変で著明に減少した。なお、血清MMP-3は病型間で差はなく、肝組織所見との関連も認められなかった。肝組織中のMMP-3濃度は非硬変肝と硬変肝で変わらなかった。血清MMP-3は臨床的には有用性は少ないが、肝線維化病態を考える上で興味ある成績と思われる。なお、血清のカラムクロマトでは分子量60kDaに大きなピーク(proMMP-3)と25kDaに小さなピーク(活性型MMP-3)を認めた。慢性肝疾患および肝細胞癌で血清中の各種細胞外マトリックス分解酵素の臨床的意義を検討し、現在までに血清MMP-1(間質コラゲナーゼ)、MMP-2(ゼラチナーゼA)について下記の様な成績を得て、投稿準備中である。血清MMP-1濃度は、我々が先に酵素活性で得た成績と同様に、慢性肝疾患において肝病変の進行とともに減少し、肝線維化病態ではMMP-1によるマトリックス分解が低下していることが示された。血清MMP-1は組織学的肝の壊死炎症の程度と密接に関連しており、臨床的には活動性と非活動性肝炎の鑑別に有用であった。一方、肝細胞癌では血清MMP-1が肝硬変レベルのものと著明な高値のものに分かれた。後者は一般に腫瘍径5cm以上の症例で、血清結合識関連マーカーが高値を示し、腫瘍内の組織学的線維成分が減少していたことより、肝癌での血清MMP-1は腫瘍の浸潤発育の評価に利用できる可能性が示唆された。血清MMP-2濃度は、慢性肝炎では健常者と変わらなかったが、肝硬変および肝細胞癌では著明な高値を示した。肝硬変と肝癌で血清MMP-2に差はなく、肝癌での上昇は基礎肝病変である肝硬変によるものと思われる。血清MMP-2の上昇が硬変肝での増加によるかを剖検肝を用いて検討した。

その結果、肝MMP-2濃度は肝コラーゲン量と密接に関連して増加し、血清MMP-2の上昇が病変肝由来であることが示唆された。臨床的には、血清MMP-2は慢性肝炎と肝硬変との鑑別に有用であり、その診断能は血清ヒアルロン酸と同程度であった。慢性肝疾患で血清および肝組織中の細胞外マトリックス分解酵素を検討し下記の成績を得ている。1.血清MMP-1濃度は慢性肝疾患の進展とともに減少した。また、活性型MMP-1を反映するMMP-1/TIMP-1 complexも同様に減少した。血清MMP-1は組織学的肝の壊死炎症の程度と密接に関連しており、臨床的には活動性と非活動性肝炎の鑑別に有用であった。なお、肝組織中のMMP-1濃度は感度以下で検出できなかった。2.血清MMP-2濃度は、慢性肝炎では健常者と変わらなかったが、肝硬変および肝癌では著明な高値を示した。肝癌での血清MMP-2は肝硬変と差がなく、更に肝癌の治療前後で差を認めなかったことより、肝癌での上昇は基礎肝病変の肝硬変に由来するものと思われた。肝組織中のMMP-2濃度は肝コラーゲン量と密接に関連して増加し、血清MMP-2の上昇が病変肝由来であることが示唆された。臨床的には血清MMP-2は慢性肝炎と肝硬変との鑑別に極めて有用であった。コラーゲンザイモグラムでは血清中のMMP-2の大部分はproMMP-2であった。更にSephadexカラムクロマトではMMP-2は分子量90kDaに描出され、血清中ではproMMP-2/TIMP-2として存在していることが示された。なお、正常肝ではproと活性型MMP-2が同程度に存在したが、硬変肝ではproMMP-2の増加が著明であった。3.血清MMP-3濃度には性差があり男性で女性に比べて約2倍高い値を示した。男性の場合、慢性肝疾患で血清MMP-3は著明に減少し、減少率は慢性肝炎minimalで-54%、mildで-55%、moderateで-61%、肝硬変で-53%、肝癌-46%であった。各病型間では有意な差は認められなかった。血清MMP-3は肝の組織学的壊死炎症、線維化と関連が認められなかった。肝組織中のMMP-3は非硬変肝(128±49ng/g肝)と硬変肝(134±35ng/g肝)で変わらなかった。血清のカラムクロマトでは分子量60kDaに大きなピークと25kDaに小さなピークを認め、分子量より前者がproMMP-3、後者が活性型MMP-3と考えられた。慢性肝疾患での減少は肝組織中のMMP-3の変動、肝病変の程度、肝組織所見と関連がなく、臨床的有用性は少ないが、肝線維化病態を考える上で興味ある成績と考えている。慢性肝疾患で血清および肝組織中の細胞マトリックス分解酵素MMP-3とMMP-9を検討し下記の成績を得た。1.血清MMP-3濃度は女性に比べて男性で約2倍高い値を示したが、性別に関係なく、慢性肝炎および肝硬変で著明に減少した。なお、血清MMP-3は病型間では有意な差はなく、肝の壊死炎症、線維化の程度との関連も認められなかった。肝細胞中のMMP-3濃度は非硬変肝と硬変肝で変わらなかった。血清MMP-3は臨床的には有用性は少ないが、肝線維化病態を考える上で興味ある成績と思われる。なお血清のカラムクロマトでは分子量60kDaに大きなピークと25kDaに小さなピークを認め、分子量より前者がproMMP-3、後者が活性型MMP-3であった。2.血漿MMP-9濃度は、慢性肝炎では増加しなかったが、肝硬変および肝硬変合併肝細胞癌で著明な上昇を認めた。肝細胞中のMMP-9濃度は非硬変肝に比べて硬変肝で著明に増加し、更にカラムクロマトでは血漿および肝組織とも分子量95kDaに一峰性のピークとして抽出され、血漿MMP-9が肝組織中での変動を反映していることが示された。
角度情報をベースとする多自由度位置・姿勢検出法の研究

本研究では既知の2次元周期関数に従って角度が変化する目盛り(2次元角度格子と呼ぶ)と光学式の2次元角度センサを用い,2次元角度出力から角度格子とセンサの面内の相対並進変位(XY変位)と回転変位(ヨー)及び面外の回転姿勢変化(ロール,ピッチ)を分離検出できる新たな位置と姿勢の検出法を提案し,その基本特性を以下の手順で明らかした.まず,本研究に適合する光学式2次元角度センサを開発し,高速工具サーボにより製作した2次元角度格子を組み合わせることによりXとYの並進変位を独立して検出できることを示した.次に,角度センサのビームを走査し,時間方式の目盛り間内挿法を採用することにより並進変位に加え,ピッチやロールの2方向の姿勢変化を独立して検出可能なこと,さらに角度格子製作時に生ずる形状誤差を軽減可能であることを実証した.この手法では格子ピツチ間隔が位置検出誤差の原因となるが,ピッチ間隔を自律的に校正する手法を提案,適用することにより位置検出誤差を15μmから1μm程度に減ずることができた.一方,角度格子形状誤差の影響を低減する別の手法として,角度格子ピッチと同じ間隔で数十数百本の細いビームが並ぶマルチビームを角度センサの光源として用いることを提案し,その効果を確認した.最終的に上記手法を複合し,マルチビームを走査可能な角度センサを開発した.さらに,走査ビーム方式によるヨー検出手法の確立により,当初の目的である,一つのセンサで5自由度変位の検出を可能とした.また,高速工具サーボを用いた2次元角度格子の製作の面においても,2次元フーリエ変換による角度格子の評価法とその結果をフィードバックして加工誤差を減ずる手法を開発した.応用技術としてはサーフェスモータ駆動型XYθz型ステージに提案したセンサを組み込んで駆動制御実験を行い,装置の小型化・簡略化の面で本手法の有効性を確認した.本研究では既知の2次元周期関数に従って角度が変化する目盛り(2次元角度格子と呼ぶ)と光学式の2次元角度センサを用い,2次元角度出力から角度格子とセンサの面内の相対並進変位(XY変位)と回転変位(ヨー)及び面外の回転姿勢変化(ロール,ピッチ)を分離検出できる新たな位置と姿勢の検出法を提案し,その基本特性を以下の手順で明らかした.まず,本研究に適合する光学式2次元角度センサを開発し,高速工具サーボにより製作した2次元角度格子を組み合わせることによりXとYの並進変位を独立して検出できることを示した.次に,角度センサのビームを走査し,時間方式の目盛り間内挿法を採用することにより並進変位に加え,ピッチやロールの2方向の姿勢変化を独立して検出可能なこと,さらに角度格子製作時に生ずる形状誤差を軽減可能であることを実証した.この手法では格子ピツチ間隔が位置検出誤差の原因となるが,ピッチ間隔を自律的に校正する手法を提案,適用することにより位置検出誤差を15μmから1μm程度に減ずることができた.一方,角度格子形状誤差の影響を低減する別の手法として,角度格子ピッチと同じ間隔で数十数百本の細いビームが並ぶマルチビームを角度センサの光源として用いることを提案し,その効果を確認した.最終的に上記手法を複合し,マルチビームを走査可能な角度センサを開発した.さらに,走査ビーム方式によるヨー検出手法の確立により,当初の目的である,一つのセンサで5自由度変位の検出を可能とした.また,高速工具サーボを用いた2次元角度格子の製作の面においても,2次元フーリエ変換による角度格子の評価法とその結果をフィードバックして加工誤差を減ずる手法を開発した.応用技術としてはサーフェスモータ駆動型XYθz型ステージに提案したセンサを組み込んで駆動制御実験を行い,装置の小型化・簡略化の面で本手法の有効性を確認した.本研究では、既知の2次元周期関数に従って角度が変化する目盛(2次元角度格子と呼ぶ)と光学式の2次元角度センサを用いて、2次元角度出力から、角度格子とセンサとの面内の相対並進変位と回転変位及び面外の回転姿勢誤差が分離検出できる新しい位置と姿勢の検出法を提案し、その基本特性を明らかにすることを目的としている。本年度では、まず提案の手法では一組のセンサと格子により、xとyの変位を独立に検出することが可能であることを原理的に示した。また変位測定システムの中心的役割を担う角度センサを開発し、角度格子をこのセンサで測定することによりx、yの角度の独立性を確認し、面内変位検出実現の可能性を提示した。なお、2次元角度格子の形状誤差(理想的な正弦波からの偏差)が位置検出精度に影響を与える問題に対処するために、音響光学素子を用いて角度格子上を光スポットで走査し、時間方式の目盛り間内挿法を採用し、その有効性を確認した。この方法は目盛り間内挿の精度に及ぼす角度格子の形状誤差を緩和することができる。また光を走査したときの角度センサの出力から、ピッチング、ローリングなどの姿勢誤差も検出できる。この場合、角度格子の格子間隔のぱらつきが誤差要因として残るが、マルチ光源を採用することによって、その影響を低減し、位置検出精度を向上させることができた。さらに、本年度では、超精密旋削において、工具切り込み量を高速かつ精密に制御することで、2次元角度格子の創成を可能にした。また、2次元角度格子創成時における誤差要因等の考察、及び除去手法についても検討し、2次元角度格子製作の高精度化を行った。

本研究では、既知の2次元周期関数に従って角度が変化する目盛(2次元角度格子と呼ぶ)と光学式の2次元角度センサを用いて、2次元角度出力から、角度格子とセンサとの面内の相対並進変位と回転変位及び面外の回転姿勢誤差が分離検出できる新しい位置と姿勢の検出法を提案し、その基本特性を明らかにすることを目的としている。本年度はまず前年度の結果を踏まえて、光走査型センサを製作し、このセンサを用いて姿勢検出実験を行った。2次元方向の姿勢(ピッチング角、ローリング角)を分離して検出することができ、それぞれの姿勢検出の繰り返し精度は約5秒であった。さらに角度センサの出力から姿勢と並進移動を分離する手法を提案した。それによって、一つの角度センサでXY2自由度の位置とピッチング、ローリング角の2自由度姿勢を同時に測定できるようになった。次に、角度格子のピッチ間隔誤差が測定精度に影響を与える問題に対処するために、ピッチ間隔を外部基準を用いずに自律的に校正する手法を提案し、位置・姿勢検出精度の向上を目指した。その結果、自律校正法で求めた格子間隔誤差を補正することによって、位置検出誤差が約15μmから1μm程度に低減することができた。また、デジタルオシロスコープを用いて、角度センサの出力波形を高速にサンプリングして、定量的に解析する手法を導入した。それによって、センサの走査周波数を最適に決めることができる。さらに、本年度では、2次元離散フーリエ変換による角度格子の形状誤差を評価する手法を確立し、実際に製作した2次元角度格子の評価に用いて、その有効性を確認した。本研究では既知の2次元周期関数に従って角度が変化する目盛り(2次元角度格子と呼ぶ)と光学式の2次元角度センサを用い,2次元角度出力から角度格子とセンサの面内の相対並進変位と回転変位及び面外の回転姿勢誤差が分離検出できる新たな位置と姿勢の検出法を提案し,その基本特性を明らかにすることを目的としている.本年度は,これまで提案した二つの手法,すなわち,2次元角度格子の形状誤差を平均化により緩和するマルチビーム法と,形状誤差を緩和すると同時にローリング,ピッチングの検出を可能とする光ビーム操作法の統合を行った.そのために,微細な格子をピエゾで往復させ,その透過光を角度格子面に投影する光学系を組合わせたマルチビーム操作型センサシステムの開発した.また,時間内内挿による位置,姿勢検出のためのデジタル信号処理システムの開発を行った.さらにヨー方向の検出方法を確立したことで一つのセンサのみで並進(XY方向),面内回転(ヨー),面外の姿勢(ロール,ピッチ)の5自由度の同時検出という当初の目的を達成した.2次元角度格子の製作にあたっては,前年度に開発した2次元フーリエ変換による角度格子評価法を加工にフィードバックし,工具コーナ半径の実験的な推定とそれに対する補正を加工プログラム作成時に組み込む手法を確立した.それにより,形状誤差のうち工具コーナ半径に起因する誤差を6nmから1nm以下へと減少し,高精度な角度格子の製作を可能とした.応用として,開発したセンサをサーフェスモータ駆動型XYθzステージに組み込み,センサ出力をもとにした駆動制御実験を行い、装置の小型化・簡略化の面での本手法の有効性を確認した.
固体ＮＭＲ距離測定による液胞型ＡＴＰアーゼとバフィロマイシンの精密複合体構造解析

本研究では液胞型ATPアーゼ(以下V-ATPase)と呼ばれる酵素の特異的阻害剤であるバフィロマイシン(以下Baf)の作用機序解明に向け、両者が形成する複合体の構造を固体NMRにより解析することを目指した。本年度は前年度に引き続き脂質膜中におけるBaf誘導体の挙動解析を行った。その結果、活性の失われた誘導体は活性の保持されたものに比べて脂溶性および脂質膜への親和性が有意に低下していることが明らかとなった。さらにこれら誘導体についてNMRを用いた種々の解析を実施したところ、分子内水素結合によって形作られるBafの立体配座がBafの高い脂質膜親和性に寄与していることが示唆された。以上の結果は、Bafの特徴的な構造がV-ATPaseへの結合親和性のみならず脂質膜への親和性も向上させており、これがBafの高いV-ATPase阻害活性発現に重大な寄与を持つことを示唆している。本研究ではこれまで深く議論されることのなかった「脂質膜環境下におけるリガンド分子の挙動が生理活性に及ぼす寄与」の重要性を新たに示すことに成功している。よって本研究で確立された方法論および得られた知見は、Bafを始めとした脂溶性リガンド分子の活性発現機構をより正確に理解する一助となり、ひいては今後の生化学および創薬研究の発展に貢献するものと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では液胞型ATPアーゼ(以下V-ATPase)と呼ばれる酵素の特異的阻害剤であるバフィロマイシン(以下Baf)の作用機序解明を目指し、両者が形成する複合体の構造を固体NMRと呼ばれる測定手法により解析することを目的に設定した。本年度はその前段階としてV-ATPaseの単離精製、および脂質膜中におけるBaf誘導体の挙動解析に取り組んだので以下にその詳細について報告する。V-ATPaseの単離精製法として、(1)V-ATPaseを含む液胞膜画分の単離および(2)遺伝子操作により発現させたタグを用いたカラム精製の二種を検討した。その結果、前者に関しては活性のあるV-ATPase含有画分を単離することに成功したものの、画分中に含まれるV-ATPaseの量が固体NMR測定には不十分であったため詳細な解析には至らなかった。それに対して後者の場合では前者より高純度なV-ATPaseを得ることに成功した。またV-ATPaseの精製と並行して脂質膜中におけるBaf誘導体の挙動解析を実施した。一般に阻害剤の活性は阻害剤と標的タンパク質との結合様式によって議論されることが多い。しかしBafの結合部位は脂質膜中に位置するため、Bafの活性にはV-ATPaseとの結合様式に加えてBafと脂質間の相互作用も影響すると考えられる。そこで本研究では活性の異なるBaf誘導体を人工脂質二重膜に埋め込み、その挙動を固体NMRにより解析した。その結果、活性のある誘導体と活性のない誘導体の運動性(あるいは分子の配向)に有意な差が見られた。この結果はBafの活性発現における脂質膜親和性の寄与を実験的に示唆した初めての例であり、今後さらなる検討を重ねることでBafの活性発現機構の詳細な理解につながると期待される。本研究の目的は固体NMRを駆使してV-ATPase-Baf複合体の構造を解析することである。前述の様に、本年度において固体NMR測定に必要不可欠となるV-ATPaseの単離精製系を確立し、その量的供給の目処を立てることに成功している。V-ATPaseはその複雑さから取り扱いが困難なタンパク質の一つであり、その供給経路を確立できたことは重要な進捗といえる。また本年度は固体NMRにより脂質膜中でのBaf誘導体の挙動を解析することで、これまで詳細に解析されることのなかったBafの活性に対する脂質膜親和性の寄与を示すことにも成功している。この結果は複合体の構造情報を直接与えるものではないものの、Bafの活性発現機構を俯瞰的に理解する上で重要な知見といえる。以上より現在のところ本研究はおおむね順調に進展していると言える。

今後はV-ATPase存在下でのNMR解析を推進し、研究目的であるV-ATPase-Baf複合体の構造を決定する。具体的にはまず、昨年度から実施しているV-ATPase単離精製の条件を引き続き検討し、固体NMR測定に必要なV-ATPaseの量的供給を実現する。その後、多重標識を施したBafを用いた固体NMR測定を実施することでBafの構造情報を取得する。なお当初はV-ATPase存在下でのBafの構造情報のみを目的としていたが、昨年度の結果を受け、脂質膜中におけるBafの構造についても同様に解析することを計画している。これによりBafの活性発現機構の全体像を明らかとすることが期待される。さらに単離精製したV-ATPaseにも化学標識を施し、これと標識化Bafを用いた固体NMR測定を実施することでV-ATPase-Baf間の距離情報取得も試みる。最終的には得られた構造情報を総合したドッキングシミュレーションによるV-ATPase-Baf複合体の構造決定を計画している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
膵癌由来エキソソームによるTAMを介した腫瘍進展機構の解明

TAMは、ホスファチジルセリン(PS)により活性化されるというユニークな特徴を持ち、本研究では膵癌由来エキソソームに含有されるPSについても着目する。現時点でエキソソームに含まれるPSによる癌進展の分子機構の詳細は解明されていない。リン脂質であるPSは、TAMのリガンドに結合することでより強いTAM活性化をもたらす。PSは癌細胞および癌細胞由来エキソソームの膜表面に多く含まれることが明らかとなっている。これらの事実から新たなTAMの活性化機構として、膵癌由来エキソソームに含有されるPSの関与が予想される。当該研究の目的は、「膵癌由来エキソソームに含まれるホスファチジルセリン(PS)や、活性化TAMが膵癌の浸潤・転移を促進する増悪因子となるかを明らかにする」ことである。申請者は、これまでに膵癌培養細胞PANC-1でTAMの発現が高いこと、予後不良なヒト膵癌組織においてTAMの発現量が高いこと、またTAMの発現量依存的にEMTを誘導する転写因子の発現が上昇することをタンパクレベルで示した。RNAiの手法によりTAMの発現を低下させることで、成長シグナル因子の発現・活性が低下することを示唆するデータをin vitro/in vivoで得ている。さらにヒト膵癌切除検体においてTAMの発現の程度が独立した予後予測因子であることを示している。TAMの発現が高い膵癌細胞株PANC-1由来エキソソームをTAMの発現が低い細胞株MIAPaCa-2に処理したところ、TAMの発現量が上昇することを示した。TAMの膵癌における機能解析について、in vitro/in vivoで解析を行い、予想された結果が得られている。エキソソームの作用と膵癌細胞のTAM発現の関連を示すデータが得られているが、それによる変化が具体的に腫瘍増殖に及ぼす影響については未だ示されていない。A.エキソソーム処理した細胞株の機能および形態解析エキソソームとPSによる腫瘍進展・Tyro3発現促進を証明するために、Tyro3の過剰発現膵癌細胞株の培養培地より超遠心法を用いて精製したエキソソームや、濃度を調節(1-100μg/mL)したPS精製標品を異なる膵癌細胞、正常上皮細胞、線維芽細胞、血球細胞注3に添加する。その後、効果判定としてTyro3の発現・活性およびEMTの挙動についてそれぞれの下流シグナルの発現を含めウエスタンブロット法にて解析する。EMTに関連する細胞形態変化については免疫組織化学的手法を用いて検討する。腫瘍増殖能はMTTアッセイ、創傷治癒アッセイで評価する。B.動物実験及びTyro3 (TAM)抑制実験膵癌細胞xenograftモデルマウスに対して膵癌細胞由来エキソソームの腹腔内投与を行う。加えてエキソソームの前処理による腫瘍進展に対する影響を検討する。またTyro3をRNAiで発現抑制した膵癌細胞を作製し、Tyro3の腫瘍進展への関与をAと同様の手法で検証する。

EMTに関連する細胞形態変化については免疫組織化学的手法を用いて検討する。腫瘍増殖能はMTTアッセイ、創傷治癒アッセイで評価する。B.動物実験及びTyro3 (TAM)抑制実験膵癌細胞xenograftモデルマウスに対して膵癌細胞由来エキソソームの腹腔内投与を行う。加えてエキソソームの前処理による腫瘍進展に対する影響を検討する。またTyro3をRNAiで発現抑制した膵癌細胞を作製し、Tyro3の腫瘍進展への関与をAと同様の手法で検証する。使用数の予測が相対的につきにくい動物(マウス)使用実験の進行度、交体など使用実験の進行度によって次年度使用額(B-A)31,993円が生じた。次年度において、申請内容にある動物実験、細胞実験において次年度申請の助成金と合わせ使用する見込みである。