hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難測定核種カルシウム４１を高エネルギー加速器質量分析により超高感度で検出する試み

通常の分析手法ではその検出さえも困難な長寿命放射性核種カルシウム41 (Ca-41:半減期10.3万年)について、高エネルギー加速器質量分析(Accelerator Mass Spectrometry: AMS)による高感度検出法の開発を試みた。本研究では、フッ化カルシウム(CaF2)試料の調製方法を確立して、試験測定によりCa-41のAMS測定による検出手法を確認した。K-41等の妨害同重体を前処理により削減することが出来れば、Ca-41のAMSによる高感度検出が可能であることを確認した。通常の分析手法ではその検出さえも困難な長寿命放射性核種カルシウム41 (Ca-41:半減期10.3万年)について、大型タンデム加速器を用いた高エネルギー加速器質量分析(Accelerator Mass Spectrometry: AMS)による超高感度検出法の開発を試みる。Ca-41は原子力関連施設などからの放射性廃棄物におけるクリアランス評価対象核種であるが、検出が困難なことから未だその評価手法は確立されていない。また、Ca-41は炭素14(C-14:半減期5,730年)年代測定法を補う、新たな年代測定指標となる可能性を有している。本年度はCa-41標準試料の準備とCaF2試料の作製を行った。標準試料として、Ca-41/Ca=1.155 E-10の標準溶液より一定量分取し、48%フッ化水素酸を加えてCaF2を生成させ、遠心分離によって上澄み液と分けた。これを超純水で洗浄、遠心分離した後に、その沈殿を石英管に移し電気炉にて500°Cで乾燥させた。得られたCaF2は10 mg程度であった。試料によってはパイロットビームとして塩化ナトリウムまたはフラーレンを乾燥前に加えた。Ca-41ビームとしては、CaF3-を想定して、荷電変換によりCa5+(荷電変換効率:30%,加速電圧6 MV)で検討を行った。粒子検出器に関しては、Ca-41用ガス検出器の開発を進めており、粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いて、イソブタンガス中(0.4 mg/cm2)での粒子エネルギー損失計算を行った。通常の分析手法ではその検出さえも困難な長寿命放射性核種カルシウム41 (Ca-41:半減期10.3万年)について、大型タンデム加速器を用いた高エネルギー加速器質量分析(Accelerator Mass Spectrometry: AMS)による超高感度検出法の開発を試みた。また、Ca-41は炭素14(C-14:半減期5,730年)年代測定法を補う新たな年代測定指標となる可能性を有している。本研究では、AMS測定の為のフッ化カルシウム(CaF2)試料の調製方法を確立して、試験測定によりCa-41の検出手法を確認した。標準試料(CaF2)については、Ca標準溶液に48%フッ化水素酸を加えてCaF2を生成させ、AMS測定用のCaF2試料を作製した。Ca-41検出用の多極型ガス検出器の開発を行い、粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いて、イソブタンガス中での粒子エネルギー損失計算による最適なガス圧力(0.4 mg/cm2)を推定した。AMS測定では、加速電圧8 MVでのCa-41加速試験を実施した。試料はCaF2+ZnO+Agを用いた。Csスパッタリング負イオン源からは、CaF3-ビーム(20 nA)を得ることに成功し、荷電変換によりCa-41(価数5+)を43.3 MeVまで加速して検出を試みた。加速電圧制御用のパイロットビームとしては、Zn-66(価数8+)を用いた。核種検出の試験結果として、最終的にはK-41の影響が大きく、2次元測定スペクトル上の粒子識別は出来なかった。しかし、K-41等の妨害同重体を試料前処理により削減することが出来れば、Ca-41のAMS測定による高感度検出が可能であることが分かった。本研究課題の研究成果については、現在、筑波大学で開発中の6 MVタンデム加速器質量分析装置に適用する予定である。通常の分析手法ではその検出さえも困難な長寿命放射性核種カルシウム41 (41Ca:半減期10.3万年)について、大型タンデム加速器を用いた高エネルギー加速器質量分析(Accelerator Mass Spectrometry: AMS)による超高感度検出法の開発を試みる。41Caは原子力関連施設などからの放射性廃棄物におけるクリアランス評価対象核種であるが、検出が困難なことから未だその評価手法は確立されていない。また、41Caは炭素14(14C:半減期5,730年)

年代測定法を補う、新たな年代測定指標となる可能性を有している。本年度はCaF2とCaH2から生成される負イオンに着目し、パイロットビームの探索とAMSの試験測定を行った。市販のCaF2とCaH2の試薬にパイロットビームとして用いるいくつかの化合物を重量比1:1で混ぜ合わせ、負イオン源に装填した。CaF2とZnOを混ぜ合わせた試料からは14 nAの40Ca19F3-と23 nAの66Zn16O2-(41Ca19F3のパイロットビーム)、CaH2とMgOとTiH2を混ぜ合わせた試料からは4 nAの40CaH-と2 nAの26Mg16O-(41CaHのパイロットビーム)を引き出せた。粒子検出器に関しては、41Ca用ガス検出器の開発を進めた。長寿命放射性核種Ca-41の加速器質量分析の為に標準試料の準備を行った。特に試料前処理法を検討して、CaF2試料作製方法を開発した。また、Ca-41用ガス検出器の開発を進展させた。粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いて、Ca-41とK-41のエネルギー損失差について検討を行い、Ca-41を検出できる目処がついた。また、Csスパッタリングイオン源からのCaF3-ビームとして、14 nAを得た。長寿命放射性核種カルシウム41の加速器質量分析の為に標準試料の準備を行った。また、試験測定用の試料について、各種の化合物を用いてイオン加速試験を実施した。イオン源からの負イオン生成では、CaH-の加速が実施できた。また、CaF3-イオンの利用も見込めることがわかった。試料化学処理法の開発研究では、CaF2とCaH2の2種類の試料作成の可能性を見出すことが出来た。また、設計を行った41Ca用ガス検出器では、イソブタンガス中の41Caと41Kのエネルギー損失差の計算結果より、41Caを高感度で検出できる目処がついた。平成25年度前半は、東京大学タンデム加速器でのCa-41加速試験を実施する。Ca-41のAMS測定試験は、筑波大学で設計開発を進めている6 MVタンデム加速器で実施予定である。現在、Ca-41検出の為の多段電極型のガス検出器の開発を進めており、粒子・重イオン輸送計算コードPHITSのシミュレーション結果を元にCa-41のAMS測定による高感度検出法の実現を目指す。試料前処理法の開発では、測定の妨害となるK-41の除去方法を開発する。最終的に天然試料から測定試料用のCaF2を作成する手法を確立する。今後、大型タンデム加速器を用いた高エネルギー加速により、41Caの検出を試みる。加速器については、筑波大学タンデム加速器が震災により損壊した為、東京大学タンデム加速器を使用する予定である。その為、本年度実施予定だった加速器を用いた実験は、次年度に繰り越しとなった。筑波大学タンデム加速器は更新を予定しており、2014年に稼働を開始する。41CaのAMS最終試験測定は筑波大学の新タンデム加速器で実施予定である。現在、41Ca検出の為に多段電極型のガス検出器の設計・開発を進めている。最終年度に、41CaのAMS測定による高感度検出法を実現する。本年度は筑波大学の加速器が東日本大震災の影響で使用出来なかった為に、イオン源によるビーム生成試験と試料前処理方法の開発を主に実施した。その為、測定関係の経費については、翌年度以降に繰り越して使用する。
高度な社会行動評価系樹立を目指したハタネズミ遺伝子変換系の開発

オキシトシン(OXT)とオキシトシン受容体(OXTR)は病理生理学的に自閉症(ASD)と密接な関わりを持ち、多くの臨床研究はOXTが有効なASD治療薬で有る可能性を示している。ASD関連の神経薬理学研究には適切な新規動物モデルの開発が待たれており、社会性の高い平原ハタネズミをこうした研究に適合させるため遺伝子KOやKI技術の開発が待たれていた。そこで遺伝子KOやKI平原ハタネズミ開発をふまえ、受精卵の安定的調製技術、IVF(体外受精)技術、胚盤胞までの体外培養技術等を開発した。これらはOXTR遺伝子のKO平原ハタネズミ開発などを通じて脳科学、精神薬理学や行動神経科学領に貢献するだろう。1Prairie vole(米国産平原ハタネズミ:以後Voleと省略)iPS細胞の開発とマウス・Vole種間キメラ形成の試み:生殖系列への移行が可能なVole iPS(v.iPS)細胞の樹立Vole繁殖が不調の為に、新鮮な胎児由来繊維芽細胞の供給が難しい状況が続いた。この為、成獣より繊維芽細胞を得て、hTERT、変異CDK4、CyclinD1の導入による不死化を図った。この結果、恐らく世界で初めVole由来不死化繊維芽細胞を得た。この不死化VEFに対し、3因子法、4因子法、及び6因子法を用い、v.iPS細胞の樹立を計った。マウスiPS細胞が樹立できる条件で、v.iPS細胞の樹立に至っていない。v.iPS細胞樹立に付加的に必要と思われる因子・条件は不明である。マウス、及びヒト由来のiPS細胞樹立用転写因子が、Vole細胞初期化では上手く機能しない可能性を検討している。一方、本研究では、東京大学医科学研究所で3因子法により得られたVole iPS細胞株があり、これをDmrt7(-/-)雌x Dmrt7(+/-)雄の交配により得た受精卵(胚盤胞)へ導入し、種間キメラ作成に依るマウス精巣でのVole精子造成に取り組んだ。この結果雄個体が何匹か得られており、現在その精巣精子DNAの遺伝子型解析を準備している。2CRISPR/Cas9法による遺伝子破壊・変換Vole作成ベクターの作成:此の研究申請時には想定していなかった実験手法だが、昨年くらいから原核・真核を問わない有効な遺伝子変換法として急速に普及しつつある極めて有力な方法であり、遺伝子KO,ノックインVole作成に有効と思われ、CRISPR/Cas9法によるVoleの遺伝子変換に着手した。当該法は極めて迅速でまた有効な為、26年度は当該方法を優先して遺伝子変換・KO Voleの作成に取り組む予定とする。1平原ハタネズミ(Voleと略称)iPS細胞の開発とマウス・Vole種間キメラ形成の試み:3胚葉分化能は、以前3因子導入により得たVole.iPS-like細胞のSCIDマウス腎被膜下移植により確認したが、本株に染色体異常が確認され、以後の実験への使用を停止した。新たにVole胎児繊維芽細胞にm3O(改善型Oct3)、mSox2、mkfl4、c-Myc、mLin28m、Nanogの6因子を導入しviPS-like細胞株を樹立した。本株はALP(+)、分化マーカーのSSEA-1,-3,-4(+)であり、生殖系列細胞へ貢献する可能性やキメラ個体形成能が期待される。本iPS-like細胞の3胚葉分化能は確認していない。種間キメラ形成は、旧来のv.iPS細胞で行ったが、作製には至っていない。並行してCRISPR/Cas9法によるOXTR (オキシトシン受容体)KO Vole作製を開始、大きな前進が得られた(2参照)。2相同組み替えを利用した、OXTR KO v.iPS細胞とOXTR遺伝子欠損Voleの樹立等に必要なOXTR KOベクター作成とOXTR KO vole作製の実施:米国ハタネズミ研究Consortiumが公開したVole全ゲノムDNA塩基配列からv.OXTR遺伝子塩基配列を得た。OXTR遺伝子破壊Vole作製はCRISPR/Cas9システムにより行う事とし、別に樹立した不死化Vole繊維芽細胞のOXTR遺伝子破壊に取り組み、これを確認した。次に、キメラを経ず直接Vole受精卵にCRISPR/Cas9法を適用、現在まで2匹のOXTR KO候補産仔を得たが、OXTR遺伝子の破壊確認には至っていない。CRISPR/Cas9実験を優先し、Dmrt(-/-)マウスに依るVole精子形成実験は中断している。

行動神経科学、大脳生理学新規ハタネズミiPS細胞樹立と、ハタネズミiPS細胞を利用したハタネズミ・マウス間種間キメラ形成によるハタネズミ精子の作成計画は、当初予定していたよりは遅延している事は否めない。しかし、世界で初めての不死化ハタネズミ繊維芽細胞の樹立にこぎつけ、今後ハタネズミに関する研究でハタネズミ由来の細胞が使用できるようになった事は大きな成果である。ES細胞やiPS細胞中の遺伝子を相同組み替えを利用して破壊し、或いは所定の遺伝子を挿入する旧来の方法に比べ、ここ数年で急速に開発が進んでいるZinc Finger Nuclease法、TALEN法やCRISPR/Cas9法は、極めて迅速な遺伝子変換手法である。TALEN法とZinc Finger Nuclease法は、人工ヌクレアーゼの設計に時間がかかり、またZinc Finger Nuclease法は企業に注文するため有料であるが、CRISPR/Cas9法は、切断ベクターの設計が短時間に出来、又必要な合成DNA等のコストも小さいのでCRISPR/Cas9法を中心に、IO電子変換Vole作成を進めていく。この技術では、受精卵の細胞質にin vitroで転写したRNAを注入する技術が必要だが、この技術はES細胞を用いた遺伝しKOマウス作成の場合のES細胞injectionと異なる技術のため、この技術に精通した経験者からの技術習得を必要とする可能性もある。Voleの遺伝子変換・KO作成をゴールとし、新たな方法であるCRISPR/Cas9法を導入し、極めて速いスピードでの実験進行を目論んでいる。発表されているVoleドラフトゲノム配列databaseから最初の標的と考えているオキシトシン受容体遺伝子配列を得ており、CRISPR/Cas9法によるノックインベクター設計は終わった。また、一時期不調であったVoleの飼育に関しては植物性飼料を含む動物園用(像用)の固形飼料を導入したところ、Voleの繁殖が順調になると言う好結果を得ており、更にVoleの飼育と繁殖に適した飼料の検討を行う。到達度の欄で説明した様に、使用飼料の問題と、繁殖・飼育担当者の不適切な対応から、一時的に此の研究で一番大事である実験材料・生物資産であるハタネズミ繁殖が危機的な状況となり、各研究への材料供給が停止しかかった。この為、各実験の進行もほぼ停止状態となった。このハタネズミは、北米産であり、国内での繁殖実績も殆ど無く、又業者からの購入も不可能であり、当該研究室での繁殖回復を待つ以外に方法がなかった。幸い、繁殖担当者の交代と、複数担当者責任制の導入、植物性飼料への変更が功を奏し、25年度後半には再び繁殖が再開した。現在はハタネズミ個体数は順調に回復・増加し、iPS細胞樹立のための新規繊維芽細胞供給や、CRISPR/Cas9法への受精卵供給、同じく同法に於ける疑妊娠ハタネズミ供給へのめども立ちつつあり、26年度には研究を全面的に進められる情況が整いつつある。新規に導入した植物性成分を含む固形飼料は、像等の動物園での草食動物飼育用の特殊なものであり、通常の齧歯類用の物に比べ高額である。また、ハタネズミの順調な繁殖を立て直し、さらに研究推進に充分なハタネズミ個体を供給する態勢を確保する為にも、専用大型齧歯類ケージの更なる購入が必要となりる。
半側空間無視を有する患者の食事時の姿勢調整ケアの開発

半側空間無視患者への食事時の姿勢調整ケアは確立していない。本研究は半側空間無視患者が食事を認識し安全に摂取するために正面位へと誘導して保持するケアプログラムを開発することを目的とした。実態調査を行ったところ姿勢調整は様々で逆の効果をもたらす方法を行っていることが明らかになった。先駆的に取り組む病院の看護師、言語聴覚士による半側空間無視患者への食事援助場面を観察した後インタビューを行い食事時の姿勢調整ケア要素を抽出して構造化を図った。それは患者の無視症状と認知機能の判断指標と食事摂取量を増やすための代償期と訓練期別のアルゴリズムからなる。今後ケアプログラムの有効性の検証を図っていく。本研究は、半側空間無視を有する患者の食事時の姿勢調整ケアのプログラムを開発することを目的とし、平成25年度は、半側空間無視を有する患者に関する病態および治療、ケア、リハビリテーションに関する文献検討、質問紙による実態調査、摂食・嚥下ケアのエキスパートのもとでの研究者の研修、姿勢調整ケアの効果を測定するための動作分析システム機器を用いた模擬患者へのプレテストの実施を行った。文献検討では、医学中央雑誌Web版を用いて、半側空間無視と食事、摂食、嚥下等のキーワードにて全年検索(1984-2013)し、検索された533件について、タイトルと抄録を素読して78件に絞り込み、それらを病態像、治療、ケア・リハビリテーションの観点から分類し、内容分析を行った。結果、病態の特徴として、予後が良好の場合と不良の場合の2分に明確に分かれること、治療やリハビリテーションの近年の動向を把握した。食事姿勢に関する文献は近年においてわずかにある程度で改めて研究の意義が見出された。専門職者への質問紙を用いた実態調査は、当初計画になかったが、文献上では具体的な食事姿勢ケアや無視症状へのかかわりが不明確であるために実施した。半側空間無視を有する患者に関わる専門職者から219件の回答を得た。結果、食事時に「無視側から関わる」「非無視側からかかわる」との回答に分かれ、方法の工夫で「正面位がとれるポジショニング」が記載されているものの、多様であって方法が確立していないことが示唆された。研究者の研修では、3例の半側空間無視患者の治療療養過程を観察するとともにケアに参加することができた。さらには、所属大学にて模擬患者を対象に車椅子上での食事姿勢を撮影し、三次元動作解析をプレテストとして行い、測定上の課題を明らかにした。これらの研究および研修活動をもとに、平成25年度の課題である食事姿勢ケアの要素を抽出する。本研究は、半側空間無視を有する患者の食事時の姿勢調整ケアのプログラムを開発することを目的としている。平成26年度は、食事時の姿勢調整「ケア要素の抽出」のために、観察法とインタビュー法を用いた質的記述的研究を行った。研究協力病院および所属大学の倫理審査委員会の承認を得たのち、病院の場で、実際に半側空間無視を有する患者に、摂食嚥下ケアおよびリハビリテーションに関わる看護師、言語聴覚士、作業療法士が食事時に行っているケアとリハビリテーションの場面を観察して記述し、その後、なぜその行動をとったのか、成果をどのように評価しているか等についてインタビューを行ったものである。患者対象者を56名とし、入院した時点で同意を得て研究を行ったが、半側空間無視を有する症例はもともと稀であるため、5名の患者対象への専門職スタッフからのデータを得るために2014年8月から2015年3月前半までの7か月間を要した。そのため、現在「ケア要素の抽出」のためのデータ分析中である。中間分析を行い、その内容については、看護技術のエビデンス検証に詳しい者らによる研究会にて検討してもらい、助言を得た。現時点では、「食事を認知し食べる動作へと誘導する(代償)」「適切な食事姿勢のために正面位へ誘導する(リハビリ)」ことをケア・リハビリテーションの目的とし、そのために頭頸部の可動制限を含む安定性確保、顔面位の誘導、体幹安定保持などの姿勢調整を行っていることが分かった。引き続き、データの分析を行い、専門家からの助言を得て、プログラム案を検討する予定である。一方で、平成25年に行った半側空間無視に関連するケア・リハビリテーションの文献の検討とアンケート調査の結果を併せて比較し類似するケア要素についてカテゴリ化を行ってそれを論文としてまとめた。この結果は、「ケア要素の抽出」に参考になるものである。本研究の目的は、半側空間無視(以下USN)を有する患者の食事時の姿勢調整ケアプログラムを開発することである。姿勢調整ケアとは、半側空間無視患者が食事を認識し安全に摂取するために正面位へと誘導し保持するための一連のケア行為を意味するとした。平成27年度は26年度に観察法とインタビュー法により抽出したケア要素を分析し、「枕を用いて非無視側への頸部回旋を制限する」「安定した正面位食事姿勢に調整する」「不必要な刺激を減らす」など、7つのケア行為カテゴリと「正面位がとれるための訓練」「食事の認識促進のための無視側からのアプローチ」など、4つの意味・理由づけのカテゴリを抽出した。この結果は2つの学会と1つの研究会にて発表し、その際に摂食・嚥下ケアに詳しい看護職者10名からスーパーバイズを受けた。これらをもとに急性期からのUSN患者の正面位食事姿勢調整ケアプログラム(UHEPCPと略す)を作成した。特徴はUSN患者の無視症状と認知機能の判断指標と代償期・リハビリ期別のアルゴリズムである。

さらにプログラム内容と経過に関して安全であり適用可能性が高いものであるかについては、摂食機能療法に積極的に取り組んでいる東名厚木病院の脳神経外科医師、看護師、言語聴覚士に見てもらい、修正を加えた上で一端、完成させた。次にUHEPCPの効果を臨床的に検証するために、東名厚木病院の協力を得て、看護師、言語聴覚士に使用してもらい、5名のUSN患者に適用してその効果をビデオカメラによる動作分析から検証することとした。しかし、USN患者が希少であるため、予定した研究期間中に協力の同意が得られたのは2名のみであった。そのため引き続き事例分析を行いつつ、継続して検証データを得る予定である。一方、平成25年度に行った模擬患者へのテーブルの形状別食事姿勢の三次元動作解析の結果についてまとめ論文を作成した。半側空間無視患者への食事時の姿勢調整ケアは確立していない。本研究は半側空間無視患者が食事を認識し安全に摂取するために正面位へと誘導して保持するケアプログラムを開発することを目的とした。実態調査を行ったところ姿勢調整は様々で逆の効果をもたらす方法を行っていることが明らかになった。先駆的に取り組む病院の看護師、言語聴覚士による半側空間無視患者への食事援助場面を観察した後インタビューを行い食事時の姿勢調整ケア要素を抽出して構造化を図った。それは患者の無視症状と認知機能の判断指標と食事摂取量を増やすための代償期と訓練期別のアルゴリズムからなる。今後ケアプログラムの有効性の検証を図っていく。平成26年度は「ケア要素の抽出」を行い、専門家からのスーパーバイズを受けて修正しケアプログラム案を作成する予定であった。しかし、半側空間無視を有する患者が、平成26年度は思いのほか少なく、5か月程度の予定でデータ収集を行う予定であったことが、7か月かかってしまった。そのためデータの分析が十分でないことと専門家からのスパーバイズを十分に受けられていないのが現状である。ただし、平成25年度の文献検討と質問紙調査の結果を併せてまとめ、論文にすることができたことはよかったと考える。基礎看護学早急にデータの分析を行った後、専門家(脳神経専門医、摂食・嚥下リハ認定士、作業療法士の資格をもつ大学教授)にスーパーバイズを受けて、ケア要素の抽出内容を洗練化させる予定である。その後、ケアプログラム案を作成し、それを、あらためて臨床現場にて実施してもらって、そのプログラムの効果を検証する予定である。研究当初予定していなかったが、文献検討と研究者の研修では半側空間無視患者へのケア、リハビリテーションの現状が明らかにできなかったため、専門職者への質問紙実態調査を行う必要があり、所属大学倫理審査委員会の承認を得て、実態調査を行った。そのため、時間を要した。しかし、このことで現場での実態がより明らかになったとともに、姿勢調整ケアプログラム開発の課題が明らかになったので実態調査は有効だったと考えている。平成26年度に予定していたデータ収集のための旅費および学会発表のための旅費の使用が予定よりも少なかった。その理由は、対象患者が少なかったことや専門家からのスパーバイズを得る機会が持てなかったこと、学会発表が東京新宿であり所属の大学から近距離であったためによる。
遺伝子介入による腫瘍の放射線治療法開発の基礎的研究

Rad51遺伝子は、放射線やアルキル化剤等によるDNA二重鎖切断の組換え修復に関与している。これまでの実験の結果、Rad51遺伝子が細胞の増殖に必須であることを明らかにした。この成果に基づき、マウスの培養細胞系において、Rad51遺伝子のアンチセンスDNA導入により、放射線感受性が増大することが明らかとなっている。従って、Rad51遺伝子のsiRNAをがん細胞に導入して、その遺伝子発現をRNAi(RNA interference)の機構により抑制することで、がん細胞の放射線に対する感受性を高め、低線量でのがん治療あるいは耐性がんの克服が可能と考えられる。マウステラトカルシノーマF9細胞に、Rad51遺伝子の配列を含むsiRNAをトランスフェクションして1日後にX線を照射し、細胞の放射線感受性を検討した。MTTアッセイにより、細胞毒性を調べた結果、Rad51-siRNAを導入した場合、X線に対する感受性が増加した。このような増感効果は2Gyからみられた。さらに、抗癌剤シスプラチンについてもその感受性が増加することが明らかとなった。MTTのOD値を50%に減少させるシスプラチン濃度は、0.4μMから、0.2μMと1/2に減少した。X線やDNA二重鎖切断する抗癌剤治療においてRad51遺伝子のRNAiによる抑制は増感効果をもたらすことが明らかになった。さらに、Rad51遺伝子の発現をRNAiで抑制したF9細胞にX線とシスプラチンの両方の処理を行った場合、相加的であるが、有効であることがわかった。(1)これまで、シチジンに特異的な反応性を示すアルキル化剤2-amino-6-vinylpurineを基にしたオリゴマーの合成を開発し、スルフォキサイドを組み込んだオリゴマーが効率良く、また選択性を損なうことなくシチジンとクロスリンクを形成することを見出している。生理的条件下で高い反応性を有するオリゴマーの開発を検討した結果、2-aminopurineの6位にビススルフォキシエチル基を導入した化合物が、高い安定性を持ちながらも、高い反応性を示すことを見出した。このオリゴマーはシチジンとの高い選択性も維持しながら、中性条件下で高い反応性を持つことから、今後標的分子のRad51遺伝子の発現阻害への展開が期待できる。(2)S-oligoのアンチセンス、morpholinooligoのアンチセンスや新規オリゴマーの培養細胞系(マウスのテラトカルシノーマ細胞F9、NIH3T3、m5S細胞など)での効率的導入法を検討し、X線照射の条件について、効果的な線量/照射方法につき検討を進めている。(3)X線のような低LET放射線の生物学的影響としては、間接作用すなわちラジカル等によるDNA損傷が大きな割合を占める。従って、酸化ストレスに応答して細胞死を回避する経路に関与する遺伝子についても、Rad57遺伝子と同じく放射線照射と組み合わせた遺伝子介入法の適用となると考えられ、そのような遺伝子候補についても、同様な検討を行う準備を進めている。これまでの標的遺伝子組換え実験の結果、Rad51遺伝子が細胞の増殖に必須であることを明らかにした。この研究成果に立脚して、マウスの培養細胞系において、Rad51遺伝子のアンチセンスDNA導入によって、放射線感受性が増大することが明らかとなっている。従って、Rad51遺伝子のsiRNAをがん細胞に導入して、その遺伝子発現RNAi(RNA interference)の機構により抑制することで、がん細胞の放射線に対する感受性を高め、低線量でのがん治療あるいはがんの克服が可能と考えられる。(1)マウステラトカルシノーマF9細胞に、Rad51遺伝子の配列を含む短鎖二重鎖RNA(siRNA : short interefering RNA)をLipofectamine2000導入した。1-2日後、ウエスタンプロットにより、Rad51蛋白質の量は、コントロールsiRNAを導入したり、siRNAを導入しない場合に比較して、約16%に減少した。アクチン等の蛋白質の量には変化がないことから、Rad51が特異的に発現抑制されたと考えられる。

F9細胞にRad51 siRNAを導入して、1日培養後X-線を照射して、MTTアッセイにより、細胞毒性を調べた結果、siRNAを導入しない場合やコントロールsiRNAを導入した場合に比較して、Rad51 siRNAを導入するとX-線に対する感受性が増加した。このことは、Rad51 siRNAが癌細胞の放射線治療において増感効果をもたらすと期待できる。現在、F9細胞をマウスに移植し、X-線照射におけるRad51 siRNAの腫瘍増殖の抑制作用を検討中である。(2)2-アミノ-6-ビニルプリン関連誘導体を含むDNAと、蛍光性物質およびペプチドなど各種分子とDNAとの結合体の効率的な合成に成功し、2-アミノ-6-ビニルプリン関連誘導体の有用性を示し。合成した結合体の中で、蛍光標識およびアルギニン2重ラベル体を用いてヒトがん細胞への取り込みを調べ、非結合体のものより効率良く細胞に取り込まれることを明らかにした。また、代謝安定化されることが分かっているポリエチレングリコールと天然型DNAとの結合体も容易に合成できることが分かった。Rad51遺伝子は、放射線やアルキル化剤等によるDNA二重鎖切断の組換え修復に関与している。これまでの標的遺伝子組換え実験の結果、Rad51遺伝子が細胞の増殖に必須であることを明らかにした。この研究成果に立脚して、マウスの培養細胞系において、Rad51遺伝子のアンチセンスDNA導入によって、放射線感受性が増大することが明らかとなっている。従って、Rad51遺伝子のsiRNAをがん細胞に導入して、その遺伝子発現をRNAi(RNA interference)の機構により抑制することで、がん細胞の放射線に対する感受性を高め、低線量でのがん治療あるいは耐性がんの克服が可能と考えられる。(1)マウステラトカルシノーマF9細胞に、Rad51遺伝子の配列を含むsiRNAをトランスフェクションして1日後にX線を照射し、細胞の放射線感受性を検討した。MTTアッセイにより、細胞毒性を調べた結果、Rad51-siRNAを導入した場合、X線に対する感受性が増加した。このような増感効果は2Gyからみられた。さらに、DNAに結合した後、DNAを切断することが知られている抗癌剤、シスプラチンについてもその感受性が増加することが明らかとなった。MTTのOD値を50%に減少させるシスプラチン濃度は、0.4μMから、0.4μMと1/2に減少した。X線やDNA二重鎖切断する抗癌剤治療においてRad51遺伝子のRNAiによる抑制は増感効果をもたらすことが明らかになった。さらに、Rad51遺伝子の発現をRNAiで抑制したF9細胞にX線とシスプラチンの両方の処理を行った場合、相加的であるが、有効であることがわかった。このように、RNAi法は、培養している癌細胞には、放射線、抗癌剤ともに有効であった。今後、個体レベルでの実験について検討する必要がある(2)3本鎖形成オリゴ
衛星センサーおよびゾンデによるエアロゾル性状の空間分布測定

対流圏エアロゾルの観測に適した気球搭載型粒子計数装置を開発した。この装置を用いて福岡上空の大気エアロゾルの成層圏までの鉛直分布観測,偏光解消度観測を含む3波長ライダーによる光学特性の観測を実施し,その比較解析を行ってきた.福岡上空の境界層から成層圏までのエアロゾルの粒径分布・濃度その変動についての情報を得ている.これまでのところ,ライダーによって観測される自由対流圏の偏光解消度の高い層が粒径数マイクロメータ程度の巨大粒子をふくむエアロゾル群として存在していること,自由対流圏の非球形粒子を含むエアロゾル層が,相対湿度が70%を超えるような比較的湿った状態になっていることが多いことなどが明らかになった.無人航空機を用いて,中央九州高原部のエアロゾル鉛直分布観測を久住高原で,中国大陸から輸送されてくる混合層および自由対流圏最下層のエアロゾルの粒径分布観測およびサンプル回収を北部九州雷山および唐津湾上空で行った.北部九州で春季に採取したエアロゾル粒子のSEM-EDXの組成分析により個別粒子の存在状態の解析を行った.これらの知見と,衛星からのリモートセンシング情報の解析結果との比較検討を行っている.その結果,これまでに,日本上空に輸送されてくるまでの間に鉱物粒子と海塩成分と内部混合した変質粒子が,雲過程を経ないで形成されるのは,混合層が発達するとともに,混合層温度が海面温度より低い状態にあることが明らかになった.この結果から,海面による加熱と水蒸気,海塩粒子にともなう海上霧の形成が鉱物-海塩混合粒子形成を促進する重要な条件になっていることが示唆された.対流圏エアロゾルの観測に適した気球搭載型粒子計数装置を開発した。この装置を用いて福岡上空の大気エアロゾルの成層圏までの鉛直分布観測,偏光解消度観測を含む3波長ライダーによる光学特性の観測を実施し,その比較解析を行ってきた.福岡上空の境界層から成層圏までのエアロゾルの粒径分布・濃度その変動についての情報を得ている.これまでのところ,ライダーによって観測される自由対流圏の偏光解消度の高い層が粒径数マイクロメータ程度の巨大粒子をふくむエアロゾル群として存在していること,自由対流圏の非球形粒子を含むエアロゾル層が,相対湿度が70%を超えるような比較的湿った状態になっていることが多いことなどが明らかになった.無人航空機を用いて,中央九州高原部のエアロゾル鉛直分布観測を久住高原で,中国大陸から輸送されてくる混合層および自由対流圏最下層のエアロゾルの粒径分布観測およびサンプル回収を北部九州雷山および唐津湾上空で行った.北部九州で春季に採取したエアロゾル粒子のSEM-EDXの組成分析により個別粒子の存在状態の解析を行った.これらの知見と,衛星からのリモートセンシング情報の解析結果との比較検討を行っている.その結果,これまでに,日本上空に輸送されてくるまでの間に鉱物粒子と海塩成分と内部混合した変質粒子が,雲過程を経ないで形成されるのは,混合層が発達するとともに,混合層温度が海面温度より低い状態にあることが明らかになった.この結果から,海面による加熱と水蒸気,海塩粒子にともなう海上霧の形成が鉱物-海塩混合粒子形成を促進する重要な条件になっていることが示唆された.平成14年度は、(1)紫外波長域の衛星センサーから対流圏エアロゾルの光学的性質を導出するためのアルゴリズム開発と、(2)対流圏エアロゾル観測に適した気球等に搭載できる計量粒子計数装置の開発、光学特性試験等を行った。(1)紫外域衛星センサーによる対流圏エアロゾル観測手法開発紫外域センサーであるGOMEによって得られた、アフリカ上空の砂塵に対するデータの事例解析を、TOMSセンサーの利用から提案されている「直接法」に基づいて行い、直接法アルゴリズム適用上の問題点を整理した。その結果、直接法によりエアロゾルのタイプの識別や平均粒径、光学的厚さを求めることができるが、平均粒径がダストにしては小さすぎる。また光学的厚さが場所によっては経験的に知られているよりも厚い傾向があるなど、定量性に関しては問題があることが明らかになった。また、地表面アルベドの影響は、紫外センサーに関しても無視できない影響があることが判明した。(2)ゾンデ搭載粒子計数装置の開発と観測粒子形状の判定を目的として、光軸交角90度の光学系について非球形粒子と球形粒子による散乱光の偏光特性の比較実験を行い、散乱光の偏光比が形状依存性が大きいことが明らかになった。また、対流圏のエアロゾル粒径分布を計測することを目的として、巨大粒径領域の粒径分布計測も可能な気球搭載エアロゾル計数装置を開発した。GPSの搭載、全信号のシリアルデジタルデータ送信による簡素な受信システムへの対応などを実現し、高性能で汎用性の高いシステムの開発が完了した。さらに、2002年12月に無人小型航空機搭載した光散乱式粒子計数装置による、エアロゾルの粒径分布の鉛直分布観測を行い、境界層内外のエアロゾル濃度、粒径分布の違いの観測に成功した。(1)紫外域センサーによる対流圏エアロゾル観測手法開発直接法をGOMEのデータに適用することにより、おおまかなエアロゾルタイプの全球分布の特徴を捉えることが可能になった。また、直接法を用いた解析における誤差を見積もった結果、光学的厚さを見積もる上ではエアロゾル層高度、粒径を見積もる上ではGOMEピクセル内角度差が最も大きな誤差要因となることが分かった。

これらの誤差を小さくするには、エアロゾルの高度分布情報の取得、空間分解能の優れたセンサを使用することが有効なことを確認した。(2)ゾンデ搭載機器によるエアロゾル特性の高度分布の観測前年度に開発した気球搭載粒子計数装置を用いて、2003年5、6、8、10、12月、2004年3月に計7回、高度約30kmまでのエアロゾル粒径分布を観測した。ライダーとの同時観測として実施し、晴天時の自由対流圏のエアロゾル分布の季節的変動を把握することができた。また、それぞれの時期に特徴的に現れるエアロゾル層について、起源による粒径分布の特徴の違い、共存する水蒸気量の違いがあることなどを明らかにした。2003年6月に無人航空機による境界層内外のエアロゾル鉛直分布の観測、サンプリングを行った。混合層の発達に伴う混合層と自由対流圏の境界におけるエアロゾルの混合過程を10m程度の高度分解能で捕らえた。(3)光学粒子計数装置の非球形粒子に対する応答特性の検討光軸交角60度と90度の光学系の非球形粒子に対する応答特性を、実験的に発生した単分散非球形粒子を用いて検討した。塩化ナトリウム粒子に対する応答特性はそれぞれ異なった特徴を示した。偏光成分分析と併用することで非球形粒子を含んだエアロゾル群の粒径分布を導くことが有効な手法となることを確認した。春季に気球搭載式微粒子計数装置による福岡上空の大気エアロゾルの鉛直分布観測を偏光解消度観測を含む3波長ライダーとの同時観測として実施した.前年度までの観測と総合して,福岡上空の境界層から成層圏までのエアロゾルの粒径分布・濃度その変動についての情報を得ている.これまでのところ,ライダーによって観測される自由対流圏の偏光解消度の高い層が粒径数マイクロメータ程度の巨大粒子をふくむエアロゾル群として存在していること,自由対流圏の非球形粒子を含むエアロゾル層が,相対湿度が70%を超えるような比較的湿った状態になっていることが多いことなどが明らかになった.また,成層圏エアロゾル濃度とその分布状態が,赤道上空のQBOと呼ばれる風系の変化と対応して変動している可能性が示されている.無人航空機観測によって,中国大陸から輸送されてくる混合層および自由対流圏最下層のエアロゾルの粒径分布観測およびサンプル回収を行っている.SEM-EDXによって回収したサンプルの個別粒子の組成解析を行っている.これまでの解析からは,混合層内の鉱物粒子は,日本上空に輸送されてくるまでの間に半分以上が海塩成分と内部混合した変質粒子となっていること,その変質が雲過程を経ないで起きている可能性があることなどが示されている.また,強い勢力をもった移動性高気圧中心部では混合層形成が困難になり,特異なエアロゾル鉛直分布が形成されることもわかってきている.これらの分布状態,粒子の存在状態に関する知見と,衛星からのリモートセンシング情報の解析結果との比較検討を始めている.春季に行ってきた気球搭載式微粒子計数装置による福岡上空の大気エアロゾルの鉛直分布観測を偏光解消度観測を含む3波長ライダーとの同時観測結果の解析の解析を行ってきた.福岡上空の境界層から成層圏までのエアロゾルの粒径分布・濃度その変動についての情報を得ている.これまでのところ,ライダーによって観測される自由対流圏の偏光解消度の高い層が粒径数マイクロメータ程度の巨大粒子をふくむ
70〜300μm帯連続波長可変、ゲルマニウム遠赤外レ-ザ-の試作

1)ラメラ-格子干渉鏡による単一波長発振予定どおりラメラ-格子型干渉鏡を作成し、凹面鏡と組合せて共振器を形成することらより単一波長発振に成功した。2)キャパシティブメッシュ反射鏡による単一波長発振キャパシティブメッシュをシリコン単結晶基板上に作製し、凹面鏡と組み合わせて光共振器を形成することにより単一波長発振に成功した。3)ヘテロダイン検波による高分解能波長スペクトル測定スペクトラムアナライザ-をパルスモ-ドで使用することにより発振光のセルフビ-ト信号の高時間分解(0.1μsec)、高波長解(1MHz)による測定に成功し、発振線幅が4MHZ以下と、きわめて鋭いことを初めて明らかにした。このことは発振線の線幅自身が4MHz程度と、きわめて鋭いことを示しており、今後の応用上大変重要である。4) Voigt配置による発振特性の改善光共振器の光軸に対して磁場を垂直に加えたVoigt配置でのレ-ザ-発振に他のグル-プに先がけて初めて成功した。このことにより発振波長領域の拡大、長波長発振の強度の増大、発振の電場、磁場域の拡大等、発振特性の顕著な改善を見た。以上をまとめるに、機械的同調により発振波長を全域にわたって連続に可変とするには未だ至っておらず、本研究で試作したレ-ザ-には未だ実用上不充分な点が残されている。しかし、上記したようにレ-ザ-発振の基本的な点で大きな改善を成し遂げることができた。当初の計画どうり研究は順調に進んでいる。1)アルミニウムを純粋なシリコン単結晶板上に等間隔の格子状(g=600μm)に蒸着して金属グリッド鏡(G)とし、それに厚さ25μmのTPXフィルムを介してシリコン板に金属蒸着して作成した平面反射鏡(M)を厚着することによりLameller格子型干渉鏡を作成した。この干渉鏡をゲルマニウムレ-ザ-ロッドの一端にシリコングリ-スで接着し、またロッド他端には凹面鏡をシリコングリ-スで接着することにより、学共振器を形成させた。この配置下でのLameller格子による干渉効果により最低次の共鳴線(波長81μm)の単一波長発振に成功し、かつ発振波長が電場や磁場により変化しないことを確かめた。2)インダクチブメッシュをマスクにして純粋シリコン単結晶板上にアルミニウムのキャパシチブメッシュ(格子間隔25μm)を作成し、その反射鏡と凹面鏡との組合せによっても計算による予想位置(91μm)に単一波長発振線を得ることが出来た。発振波長が電場や磁場により変化しないことを1)と同様に確かめた。3)スペクトラムアナライザ-をパルスモ-ドで使用することにより発振光のセルフビ-ト信号の高時間分解(0_0 1μsec)、高波長分解(1MHz)による測定に成功し、発振線幅が4MHz以下と、きわめて鋭いことを初めて明らかにした。今後、Lameller型の配置の研究をさらに進め、機械的同調により波長掃引を試みる予定である。1)ラメラ-格子干渉鏡による単一波長発振昨年に引き続き、異なる電場磁場領域における発振特性を調べてより詳細な結果を得た。また、以前のGe結晶(5×4mm^2)より大きな断面(6×5mm^2)を持つGeレ-ザ-ロッドによる発振を試みて成功した。よりスポットサイズの大きなレ-ザ-発振を得て連続波長可変とする試みを今後行う上で重要な進展となった。2)キャバシティブメッシュ反射鏡による単一波長発振昨年に引き続いてより詳細な実験を行った。3)Voigt配置による発振我々のグル-プ及び外国のどのグル-プにおいても現在までのGeレ-ザ-の発振は、Feraday配置において行われてきた。

この配置下ではGe内で増巾される光が磁場に平行方向に往復して光の偏光面にFaraday回転を生じるために光共振器の共鳴条件が複雑となり、発振特性に望ましくない影響を与えている可能性がある。そこで新たな試料ホルダ-系を作製して磁場を光共振器の光軸に対して直角となるVoigt配置を作って発振を試み、成功した。予期したごとく発振の電場、磁場領域が拡大して発振が容易となり、かつ長波長領域の発振強度が顕著に増大した。今後波長可変の範囲を拡大して実用に供する際の重要な基本的進歩と考えられる
一酸化炭素によるタンパク質メチル化修飾を介した糖代謝制御と細胞機能制御の解明

がん細胞は、糖代謝律速酵素であるPyruvate kinase M2(PKM2;がん細胞および幹細胞特異的なアイソフォーム)がリン酸化され、活性抑制を受けることにより、糖の利用をエネルギー産生から脂質や核酸などの産生へとシフトし、細胞増殖を促進することが明らかとなってきている。本研究では、がん細胞における細胞増殖の調節機構の1つとして、ガス状メディエーターである一酸化炭素(CO)が、PKM2を翻訳後修飾の1つであるメチル化修飾を行うことで活性を上昇させ、糖代謝の調節、および細胞増殖の抑制をおこなっている、という仮説を明らかとすることを目的とし、研究を行ってきた。本研究では、PKM2のメチル化修飾を受けるアルギニン残基の同定、メチル化修飾による活性の上昇の検証を主に行ってきた。まず、メチル化修飾を受けるアルギニン残基の同定を試みた。すると、PKM2のC末の3つのアミノ酸残基がメチル化されることが分かった。PKM2のC末領域は活性型4量体形成に必須なドメインであり、活性調節にメチル化が関与することが示唆された。次に、作成したリコンビナントPKM2のメチル化修飾による活性変化を検証した。野生型PKM2はメチル化修飾を受けることにより、約25%の活性上昇を行うことが分かった。また、メチル化修飾を受けるアルギニン残基3か所に変異を導入したPKM2では、メチル化処理による活性上昇は見られなくなった。また、メチル化PKM2特異的抗体の作成を行い、細胞内におけるメチル化PKM2の検出を試みたが、良い抗体ができなかったため、検出することができなかった。本研究結果から、PKM2がin vitroにおいてメチル化修飾を受けると活性の上昇が起こるデータを示すことができた。しかしながら、どのような機構で活性上昇が起こるのかはまだ検証段階である。
培養肥満細胞による胸腺機能回復：骨髄移植における致死的慢性GVHDの制御

造血細胞移植により難治性の血液疾患が治療できるようになって久しい。しかしながらドナーから供給された骨髄細胞による負の側面、いわゆる移植片対宿主病(GVHD)は克服されていない。我々は、慢性GVHDに対して、マウス骨髄移植モデルと用いて新規治療の開拓を目指してきた。本研究は、慢性GVHD発症の元凶とも言える胸腺機能回復に肥満細胞が重要な役割を果たしていることが示唆される研究結果を得た。我々は造血幹細胞移植の抗腫瘍効果を増強する方法としてCytokine-induced killer (CIK)細胞の臨床応用を目指しているが、動物実験では軽度の慢性移植片対宿主病(GVHD)が出現してしまう。従来は、アレルギー性疾患の元凶とされた肥満細胞であるが、我々の一連の研究から免疫抑制的な効果があることが示された。慢性GVHDにおいては、輸注したドナー由来のT細胞が胸腺組織を破壊し、その後ドナー骨髄から新たに供給されたドナーT細胞が正常に教育されないことが問題となる。胸腺組織においての肥満細胞の役割は、現時点明確な答えはないが、何らかの生理的機能は有していると推定される。27年度は、肥満細胞欠損マウスを用いて、肥満細胞の有無により胸腺細胞の機能に差異があるがどうかを検討し、将来的治療のゴールである肥満細胞療法の可能性について基礎的実験を行った。何も処理、治療を行っていない野生型マウス胸腺と肥満細胞欠損マウス胸腺細胞をFACSを用いて解析した。この状態では、両者に差異は認められなかった。次に非致死量の全身放射線照射を用いて、胸腺を萎縮させ、その後の胸腺回復過程を経時的に評価した。肥満細胞欠損マウスでは、胸腺機能の回復が遷延した。マウスの系統を変えても同様の現象がみられた。以上から、胸腺機能回復に肥満細胞の関与が推定された。現時点では、予定していた実験方法で実験が遂行できている。トラブルもなく適切なデータが得られている。我々は、造血幹細胞移植の抗腫瘍効果を増強する方法としてCytokine-induced killer (CIK)細胞の臨床応用を目指しているが、動物実験では軽度の慢性移植片対宿主病(GVHD)が出現してしまう。慢性GVHDの病態解明とその制御を目指しているが、鍵となる臓器は胸腺と考えられる。一般的には、胸腺はT細胞分化を誘導する臓器で、その構成細胞は、当然のことながらT細胞が主体となる。その中で、我々はアレルギー性疾患の元凶とされている肥満細胞が免疫調整能、T細胞の分化に重要な役割を担っていると仮定し研究を継続している。胸腺と肥満細胞について、基礎的データの収集を行った。通常の生活環境下では(移植をしない状態)胸腺のT細胞の構成比などは、野生型マウスと肥満細胞欠損マウスとの間で差異は認めなかった。放射線を非致死量照射し、経時的に胸腺細胞を解析すると、肥満細胞欠損マウスではT細胞の回復がCD8、CD4T細胞の両者ともに回復が遅延する事が判明した。このことから胸腺機能の回復に肥満細胞が深く関与していることが推定される。胸腺中の肥満細胞数をFACSで同定すると極々少量であるがしっかりと同定できた。次に、本当に肥満細胞が関与しているのか明らかにする目的で、骨髄から肥満細胞を大量に培養し放射線照射後の肥満細胞ノックアウトマウスに輸注し、胸腺機能が回復するかどうかを検討しているがこの点に関してはいくつかの技術的障壁がありその克服に向けて鋭意検討中である。野生株から肥満細胞を大量培養して肥満細胞欠損マウスに輸注を試みている。この過程で障壁があるが全体的な進捗状況は良好といえる。我々は、総結幹細胞移植の抗腫瘍効果を増強する方法としてCytokine-induced killer (CIK)細胞の臨床応用を目指しているが、動物実験では軽度の慢性移植片対宿主病(GVHD)が出現してしまう。その中で、我々はアレルギー性疾患の元凶とされている肥満細胞が免疫調節能、T細胞の分化に重要な役割をになっていると仮定し研究を継続している。低容量の放射線照射を行い、胸腺の自己回復の様子を野生型マウスと肥満細胞欠損マウスとの間で比較を行うと、CD8, CD4陽性T細胞の両者とも肥満細胞欠損マウスでは回復遅延が認められた。次に致死的放射線照射を用いて、同種移植の系で同様の実験を行った。この場合も同様に肥満細胞欠損マウスでCD8, CD4陽性T細胞の両者に回復遅延が認められた。この結果を受けて肥満細胞が胸腺機能に関与していることが濃厚となった。次にメカニズムの検討に移るために基礎的検討に移った。肥満細胞欠損マウスが基本的にはc-kit遺伝子の異常を認めているため(この遺伝子異常で肥満細胞が生成されないが)、この遺伝子産物が胸腺細胞自身にどのように関連しているのかを表腺上皮細胞も含めて検討を開始している。またIL-22と胸腺再生との関連性が方向されており、肥満細胞欠損マウスと野生型マウスとの間でのIL-22発現量の検討を開始した。

しかしながらドナーから供給された骨髄細胞による負の側面、いわゆる移植片対宿主病(GVHD)は克服されていない。我々は、慢性GVHDに対して、マウス骨髄移植モデルと用いて新規治療の開拓を目指してきた。本研究は、慢性GVHD発症の元凶とも言える胸腺機能回復に肥満細胞が重要な役割を果たしていることが示唆される研究結果を得た。27年度の結果から、肥満細胞は胸腺再構成に関与していることが強く示唆された。次の段階として同種骨髄移植モデルを用いて、胸腺における肥満細胞の役割を明らかにする。同時に、最終的な目標であるCIK細胞との併用療法の基礎的実験を開始する。具体的には、肥満細胞を正常骨髄から大量に培養して、CIK細胞と混ぜ合わせた場合に、お互いの細胞機能に影響を与えないことを明らかにする。大量培養させた肥満細胞を効率的に胸腺へ誘導させる方法の開発が必要である。物理的な小手術で直接的に輸注することを含めて検討する。また本来の研究目的であるCIK細胞との併用に向けての基礎的データを収集する。造血幹細胞移植必要物品を効率的に購入したため若干の繰越金が生じた。若干の繰越金のため、来年度の実験計画に関しての多大な変更はない。予定通り、抗体の購入、消耗品の購入、動物飼育費にあてる。
核磁気共鳴法による蛋白質と揮発性麻酔薬の相互作用に関する研究ー麻酔機序に関してー

1.揮発性麻酔薬の疎水性水和を探る目的で、19FーNMRによりメトキシフルレン、ハロセン、エンフルレン、イソフルレンの水溶解度の測定を行なった。従来の溶解度デ-タの問題点を指摘し、19FーNMR法を用い、新しい方法論を確立した。研究成果を欧文雑誌に投稿し印刷中である。2.揮発性麻酔薬の溶解度の温度変化を測定し、揮発性麻酔薬の水構造への寄与を疎水性水和の立場から熱力学的解析をを行った。揮発性麻酔薬の溶解によるアイスバ-グ形成のエントロピ-とエンタルピ-を計算し、炭化水素およびハロゲン化炭化水素と比較した。研究成果は、欧文雑誌へ投稿準備中である。3.1の成果を応用し、麻酔機序研究者の便宜のために、各温度でのハロセン、エンフルレン、イソフルレンの水に対する溶解度をまとめた。4.蛋白質ー揮発性麻酔薬相互作用の立場から、揮発性麻酔薬がαーキモトリプシンの触媒作用を活性化することを発見した。そのメカニズムを、麻酔薬が疎水性相互作用を通じてアシル基の疎水性脱水和を促進する事で説明した。欧文雑誌に投稿し印刷中である。5.2で明らかになった揮発性麻酔薬の動的水和構造を明らかにする目的で、アルコ-ル分子近傍のミクロな配位分子の運動を研究した。配位水分子の運動性は溶質ー溶媒間相互作用と相関することが明らかになった。欧文雑誌に投稿中である。6.疎水性水和の動的構造と麻酔の圧拮抗との関連を検討するために高圧NMRセルを作製し現在稼働中である。19FーNMRによって各種麻酔薬の1次元スペクトルを取った。ハロセン、エンフルレン、メトキシフルレン、イソフルレン、セボフルレンの水溶液中でのスペクトルピ-クの帰属を明らかにした。また、1HーNMRの観測から水素核信号の帰属を明らかにした。シクロデキストリン水溶液のHーNMRの観測からスペクトルを取り、文献のピ-クを確認した。麻酔薬ーシクロデキストリン複合体を合成し、その複合体のスペクトルを観測した。複合体の分子間相互作用をみるために、麻酔薬、シクロデキストリン単体のスペクトルと比較したところ、化学シフトで観測される変化は非常に小さく、麻酔薬ーシクロデキストリン相互を検討するのは非常に不利であることが明らかになった。今後は、相互作用の変化に非常に敏感な緩和時間の視点から相互作用の解明を行う事にしている。高圧セルが導入されガラス金属の接合部の耐圧試験を行っている。高圧に耐え、なおかつ超強磁場で磁束を乱さない接合材料の検討を行なっている。現在、不十分ながら有力な接合剤はエポキシ樹脂であることがわかった。近く、接合技術が確立する見とおしである。耐圧性が確立された後には、実際にNMR装置に常圧下で挿入し、磁場の均一性を調整し高圧下の測定を行なう。磁場の均一度を調整するのは、このような金属性セルでは一般に非常に困難であり尚数ケ月を要するものと思われる。現有のNMR装置(共同研究室)の不具合が解決解決をみず、NMRの測定は立命館大学理工研究所で使用している。〈1〉吸入麻酔薬と蛋白質の疎水性相互作用を探る目的で、19FーNMRによりメトキシフルレン、ハロセン、エンフルレン、イソフルレンの水溶解度の測定を行なった。従来の溶解度デ-タの問題点を指摘し、新しい方法論を確立した。従来の問題点は(1)吸入麻酔薬の飽和濃度はへンリ-の法則を用いた換算値が使用され、飽和濃度を実測したものはなかった。