hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非正規職員を題材とした公務労働関係法の日独比較研究

日本においては、民間部門のみならず、公務部門においても非正規雇用が拡大している。公務部門における非正規雇用者は、公務員法による十分な保障を享受できず、また労働法による保護からも排斥され、いわば「法の狭間」に置かれているのが現状である。他方、ドイツにおいても非正規類型の公務労働従事者が存在するが、その法体系は、公務員法と労働法の相互関係の中で機能しており、「法の狭間」は生じていない。本研究は、上記のような異同を踏まえ、比較法的見地を交えつつ、「非正規」類型の公務労働従事者に焦点を当て、公務員に関する法構造を分析するものである。非正規雇用は、民間部門のみならず、公務部門においても多くの問題を生じている。本研究は、非正規公務員を題材として、日独公務員法の比較研究を行い、その基本原理と展開を明らかすることによって、労働法と公務員法の「法の狭間」に落ちているともいわれている日本の「臨時・非常勤職員」の理論的課題を解明し、その雇用保障の在り方を検討するものである。平成27年度においては、日独非正規公務員に関する実態やその法制度の分析を中心に研究を進め、日本型公務員法制とドイツ型公務員法制双方における憲法を頂点とした法体系を踏まえ、それら公務員の「制度」的側面と「労働者」的側面の関係性という観点からの分析を行った。具体的には、日本法については、戦後公務員法体系の展開を踏まえた「一元的」公務員法制の意義とその中での非正規公務員の位置付け・展開を中心に、ドイツ法については、「複線型」公務員法制、とりわけ公法上の官吏と私法上の公務被用者の区分の意義とその中での非正規公務員の位置付け・展開を中心に研究を進め、双方の展開過程の類似性・対照性の明確化を試みた。研究遂行に際しては、国内での文献研究・調査のほか、2015年7月末から9月下旬までの約2か月間、ドイツ・ボン大学に客員研究員として滞在し、ドイツ法の研究調査および実態解明のためのインタビュー調査を敢行した。このような研究の中で、「臨時・非常勤職員」の退職手当請求に関する判例を題材とした分析を行い、「地公法における特別職・一般職の区分と『非常勤職員』による退職手当請求」(労働法律旬報1841号48ー55頁)として公表したほか、ドイツにおける非正規公務員の実態分析の紹介を「公勤務における非典型雇用関係ーそれは本当に存在するのか?」(日独労働法協会会報16号41ー66頁)において行っている。国内では、ほぼ計画通りに日独双方の文献研究を遂行したほか、研究会報告も実施し、研究者のみならず実務家との意見交換も行った。また、非正規公務員を組織する労働組合などへの聞き取り調査も行っている。ドイツでの現地調査においては、日本国内の研究者はもとより、ボン大学のヴァルターマン教授やドイツ経済社会科学研究所(WSI)のザイフェルト博士の計らいもあり、ノルトライン・ヴェストファーレン州において、研究者、労働組合、官庁、職員委員会および労働裁判所の裁判官に対するインタビュー調査を実施したほか、フランクフルトにおいて、現在では民営化されているドイツ鉄道の機関士を中心に組織するドイツ機関士組合(GDL)やドイツ最大の産別労働組合である金属産業労組(IG Metall)などへの聞き取り調査も実施することができた。平成28年度には日独公務員の法制度に関する研究を更に発展させた。第一に、日本法研究では、現行法の枠組みにおいて公務員法と労働法双方に関連し、「非正規」公務員の増加によって新たな問題を生じさせている境界事例に取り組んだ。その中では、地方公務員における、公務員法の適用がある一般職と公務員法の適用がなく労働関連法規の適用がある特別職の区分や「混合組合」(公務員法の適用下にある者と労働組合法の適用下にある者がともに組織する労働組合)の理論的課題を明らかにした。前者の研究成果として「地方公務員における一般職・特別職の区分と『非常勤職員』への年休に関する虚偽告知を理由とした損害賠償」(日本労働法学会誌129号127ー136頁)を、後者の研究成果として「混合組合の法的地位に関する検討」(労働法律旬報1864号18ー32頁)、「混合組合と不当労働行為ー大阪府・府労委(泉佐野市・チェック・オフ)事件」(判例地方自治417号52ー55頁)を公表している。第二に、ドイツ法研究では、昨年度に取り組んだ公法上の官吏(Beamte)と私法上の公務被用者(Arbeitnehmer im oeffentlichen Dienst)の区分の意義を踏まえ、双方の法制度の基本理念がその法的地位にいかに帰結しているかの解明に取り組んだ。その中では、制度的観点による雇用保障と労働法的観点による雇用保障の異同・相互関係を明らかにし、身分的区分を設けつつも労働法的保障を下限とし、担うべき機能に着目しながら相関的に展開してきた点を捉え、日本の公務員の法的地位の硬直的理解に起因した「非正規」公務員問題へのあるべき対処に関する示唆を得た。現在、これら研究成果の公表を「ドイツ公勤務者の法的地位に関する研究(1)(2)」(名古屋大学法政論集271号1ー32頁、同273号・6月発行予定。以後、続刊予定)において随時行っている。

他方、ドイツにおいても非正規類型の公務労働従事者が存在するが、その法体系は、公務員法と労働法の相互関係の中で機能しており、「法の狭間」は生じていない。本研究は、上記のような異同を踏まえ、比較法的見地を交えつつ、「非正規」類型の公務労働従事者に焦点を当て、公務員に関する法構造を分析するものである。引き続き、平成27年度と同様に研究計画を遂行し、その中では、公務員の「労働者」的側面を現行法制においていかに把握すべきか、という観点に焦点を絞っていく。また、これまでの研究を踏まえ、集団的労使関係および個別的労使関係双方の観点から、非正規公務員に関する研究成果を随時公表していく予定である。とりわけ、非正規公務員の個別的労使関係に関しては、日独の比較研究を踏まえ、従来の日本における理解を批判的に検討していく。また、民営化をめぐる議論に関しても、典型的公務員像との関係に焦点を絞りつつ、検討を進める予定である。社会法学
腫瘍壊死因子可溶性レセプターを用いた重度変形性顎関節症治療の試み

変形性顎関節症患者11名(患者群)と健康被験者(対照群)10名の顎関節滑液中のsTNFRs濃度と,患者群におけるOAレベル,顎関節部の疼痛,開口量との関連を検討した.2.両群ともにsTNFR-I濃度は,sTNFR-II濃度より有意に高かった.3.sTNFR-I濃度は,OAレベルと正の相関があり,sTNFR-II濃度は,咀嚼時疼痛と負の相関,開口量と正の相関があった.変形性顎関節症の病態におけるsTNFRの役割を検討するため,変形性関節症にけるTNFR発現とサイトカインによるsTNFR産生に対する影響を調べた.1.変形性膝関節症モデルの膝関節軟骨におけるTNFR発現は,対照側,患側いずれの組織においてもTNFR-I,II陽性細胞が認められ,患側で高発現していた.2.ラット膝関節軟骨細胞へのIL-1β,TNFα刺激後における,tnfr発現量とsTNFR濃度を定量した結果,tnfr-I発現は,刺激による影響を受けず,tnfr=II発現は,刺激24時間後に無刺激時の約12倍となり,sTNFR-I濃度は,刺激48時間後に有意な上昇がみられるも,無刺激時の約2倍で,sTNFR-II濃度は,約5倍となった.以上より関節軟骨細胞では,TNFR-Iは恒常的に,TNFR-IIは炎症性サイトカインによる影響を受け発現し,両者はsheddingにより可溶型として細胞外へと遊離してくることがわかった.滑液データとあわせて考えると,sTNFR-II濃度が高いほど症状が緩やかであった点から,なかなか症状の緩解しない重症の変形性顎関節症患者では,このsTNFR-II産生のメカニズムになんらかの異常がある可能性があり,この場合エタネルセプトのような分子標的治療薬の関節腔内注入療法の効果が期待できるのではないかと考える.変形性顎関節症患者11名(患者群)と健康被験者(対照群)10名の顎関節滑液中のsTNFRs濃度と,患者群におけるOAレベル,顎関節部の疼痛,開口量との関連を検討した.2.両群ともにsTNFR-I濃度は,sTNFR-II濃度より有意に高かった.3.sTNFR-I濃度は,OAレベルと正の相関があり,sTNFR-II濃度は,咀嚼時疼痛と負の相関,開口量と正の相関があった.変形性顎関節症の病態におけるsTNFRの役割を検討するため,変形性関節症にけるTNFR発現とサイトカインによるsTNFR産生に対する影響を調べた.1.変形性膝関節症モデルの膝関節軟骨におけるTNFR発現は,対照側,患側いずれの組織においてもTNFR-I,II陽性細胞が認められ,患側で高発現していた.2.ラット膝関節軟骨細胞へのIL-1β,TNFα刺激後における,tnfr発現量とsTNFR濃度を定量した結果,tnfr-I発現は,刺激による影響を受けず,tnfr=II発現は,刺激24時間後に無刺激時の約12倍となり,sTNFR-I濃度は,刺激48時間後に有意な上昇がみられるも,無刺激時の約2倍で,sTNFR-II濃度は,約5倍となった.以上より関節軟骨細胞では,TNFR-Iは恒常的に,TNFR-IIは炎症性サイトカインによる影響を受け発現し,両者はsheddingにより可溶型として細胞外へと遊離してくることがわかった.滑液データとあわせて考えると,sTNFR-II濃度が高いほど症状が緩やかであった点から,なかなか症状の緩解しない重症の変形性顎関節症患者では,このsTNFR-II産生のメカニズムになんらかの異常がある可能性があり,この場合エタネルセプトのような分子標的治療薬の関節腔内注入療法の効果が期待できるのではないかと考える.有痛性の非復位性関節円板前方転位および変形性顎関節症患者11名(患者群)と健常被験者(コントロール群)10名より採取した顎関節滑液を用い、滑液中のsTNFRs濃度の測定と比較、ならびに患者群におけるOA level、顎関節部の疼痛(安静時、咀嚼時)、開口量(無痛最大、自力最大、強制最大)との関連を検討した。1)sTNFRs濃度の測定と比較2.両群ともにsTNFR-I濃度は、sTNFR-II濃度より有意に高かった。2)患者群におけるsTNFRs濃度とOA level、疼痛、開口量との相関関係1.sTNFR-I濃度は、OA levelと正の相関があったが、疼痛や開口量とは有意な相関はなかった。2.sTNFR-II濃度は、OA levelと有意な相関はなかったが、咀嚼時疼痛と負の相関があり、いずれの開口量とも正の相関があった。以上の結果は、顎関節腔内の炎症性サイトカインやマトリックスメタロプロテアーゼ濃度の上昇が、二次的に細胞膜上TNFRをsheddingし、sTNFRs濃度を上昇させるといった基礎研究データを裏付ける結果となった。すなわち炎症巣では局所での炎症寛容性を確立するために非常に巧妙な生体防御機構が働いている可能性がある。また、sTNFR-I濃度は顎関節における炎症や退行性変化の既往と関連があり、sTNFR-II濃度は、患者の日常生活で支障を来す疼痛や開口障害と関連があることが示唆された。

さらに顎関節滑液中のsTNFRs量の不足状態は変形性顎関節症の発症、進行の促進と関係があり、逆に過飽和状態であれば,この疾患の発症、進行は阻止できる可能性があると考えられた。つまり過飽和状態をつくりだせれば、今後の変形性顎関節症治療への応用が可能になると考えられた。1.モノヨード酢酸(MIA)を用いて変形性膝関節症モデルを作製し,TNFR発現に関して免疫組織化学的検討を行ったところ,対照側,MIA注入側いずれの組織においてもTNFR-IおよびTNFR-II陽性細胞が認められたが,MIA注入側の方が陽性細胞が多数認められた.2.ラット膝関節軟骨細胞を用い,IL-1βおよびTNFα刺激後における,tnfr発現量をreal-time PCR法で,細胞培養上清中に遊離したsTNFR量をELISA法で定量した結果,tnfr-I発現量は,IL-1βやTNFαによる影響をほとん受けなかったが,tnfr-II発現量は,刺激24時間後で無刺激時の約12倍となった.sTNFR-I濃度は,刺激48時間後に有意な上昇が認められたが,その程度は無刺激時の約2倍にとどまった.sTNFR-II濃度は,刺激48時間後には無刺激時の約5倍となった.以上の結果より関節軟骨細胞では,TNFR-Iは恒常的に発現しておりTNFR-IIは炎症性サイトカインによる影響を受け発現してくる.さらに両者はsheddingによりsTNFRとして細胞外へと遊離してくることがわかった.昨年度報告した変形性顎関節症患者の滑液中のsTNFR-II濃度が患者の日常生活で支障をきたす疼痛や開口障害と関連があるといった結果をあわせて考えると,変形性顎関節症において,特にsTNFR-IIの産生は炎症性サイトカインの影響を受け,関節軟骨細胞膜上にTNFR-IIが増加発現し,さらにsTNFR-IIとなって滑液中に遊離してくることが示唆された.しかし,なかなか症状の緩解しない重症の変形性顎関節症患者では,このsTNFR-II産生のメカニズムになんらかの異常がある可能性があり,この場合,エタネルセプトのような分子標的治療薬の関節腔内注入療法の効果が期待できるのではないかと考える.
赤核脊髄路細胞における変性と修復の分子機構に関する研究

運動系の細胞の変性に対する修復には様々な機序が考えられるが、再生能力の非常に乏しい脳内の神経細胞の場合、シナプス発芽が非常に重要な役割を果していると考えられる。本研究の最終的な目的は、入力線維の損傷によって赤核脊髄細胞に起こるシナプス発芽の分子機構を明らかにすることである。赤核脊髄路細胞における発芽は、単にその変性に対する修復機構として現象面における理解が進んでいるばかりではなく、運動学習の基礎となっている可能性もあり、本研究によって運動系の制御・調節に関する理解が一段と深まることが期待される。本年度は赤核に与えた変性の結果生ずるシナプス結合の再構成のメカニズムを明らかにするために、投射線維の形態の定量的解析をおこなった。生後数カ月末満の仔ネコの大脳皮質感覚運動野を一側性に壊すと交差性大脳-赤核投射の著しい強化を起こる。この強化のメカニズムにはいくつかの可能性が考えられるが、その1つは終末領域における分子の増加である。そこで、正常ネコと皮質破壊ネコとを用いて交差性大脳-赤核投射線維の分枝の定量的解析をおこなった。線維は順行性のトレ-サ-であるPHA-Lを用いて染色し、50μmに切断した脳切片中に認められる線維断片について線維の分枝回数を計測した。その結果正常ネコでは80%のものが1度も分枝をせず、残りも殆どが3回以下の分枝を示したに過ぎなかったのに対し、大脳皮質を損傷したネコでは40%以上の線維が分枝をし、また4回以上分枝をするものが有意に増加した。したがって損傷によって生ずる投射の強化に軸索の分枝の増加が関与している可能性が考えられる。このことは、交差性の投射の強化は、投射領域における局所的な細胞間相互作用によっても起こり得ることを示唆している。
都市環境の管理に関する現行主要計画の機能・効果の分析と評価

今年度の研究課題と夫々の到達点を要約する.1.特定対象都市・川崎の現行環境施策を調査し,その体系化を行った.2.〔「地域公害防止計画」の機能・効果〕川崎市では,公害防止計画の実施により,環境汚染が改善の傾向にあるが,産業構造の変化及び都市的な経済社会活動の増大に伴い,都市・生活型公害の増大をはじめ,汚染の改善のはかばかしくない部分があり,土地利用計画を基幹とする都市型公害防止計画の体系化が必要な状況にある.3.〔環境管理計画の法理〕今後の自治体環境行政ならびに都市計画行政が,環境管理計画を根幹とした総合行政として展開されるべき必然性を持つ理由,ならびに環境管理計画の本質的特徴としての「総合性,地域性,自治性,公物管理性」などの要素につき理論的な整理を行った.4.〔環境行政における人的資源配分と財政の対応〕基本的なデータ解析を通して,本年度は環境行政を幅広い概念で,特に歳出に現れた変化から見ることが出来た.5.〔私権の制限〕都市公害防止あるいは環境保全・育成と私権の制限内容及びあり方について,基礎的考察を行った.6.〔環境政策システムの変遷とその評価〕地方自治体の環境政策,特に公害関連政策に焦点をあて,行政組織・財政・制度・施策対象などからその変遷を把握して,現行環境政策の評価基準についての考察を行った.7.〔地域地区制の都市土地利用環境制御効果〕は,川崎市のデータ収集として(1)〓密数値情報-昭和49年, 54年(2)土地利用現状図-昭和54年, 58年(3)地域・地区制図(4)用途地域,地区の指定方針を入手,分析中.8.〔道路網計画の評価〕道路網計画を網の「連絡具合」から評価するために川崎市の大きい地域で分析を行った.今年度の研究課題と夫々の到達点を要約する.1.特定対象都市・川崎の現行環境施策を調査し,その体系化を行った.2.〔「地域公害防止計画」の機能・効果〕川崎市では,公害防止計画の実施により,環境汚染が改善の傾向にあるが,産業構造の変化及び都市的な経済社会活動の増大に伴い,都市・生活型公害の増大をはじめ,汚染の改善のはかばかしくない部分があり,土地利用計画を基幹とする都市型公害防止計画の体系化が必要な状況にある.3.〔環境管理計画の法理〕今後の自治体環境行政ならびに都市計画行政が,環境管理計画を根幹とした総合行政として展開されるべき必然性を持つ理由,ならびに環境管理計画の本質的特徴としての「総合性,地域性,自治性,公物管理性」などの要素につき理論的な整理を行った.4.〔環境行政における人的資源配分と財政の対応〕基本的なデータ解析を通して,本年度は環境行政を幅広い概念で,特に歳出に現れた変化から見ることが出来た.5.〔私権の制限〕都市公害防止あるいは環境保全・育成と私権の制限内容及びあり方について,基礎的考察を行った.6.〔環境政策システムの変遷とその評価〕地方自治体の環境政策,特に公害関連政策に焦点をあて,行政組織・財政・制度・施策対象などからその変遷を把握して,現行環境政策の評価基準についての考察を行った.7.〔地域地区制の都市土地利用環境制御効果〕は,川崎市のデータ収集として(1)〓密数値情報-昭和49年, 54年(2)土地利用現状図-昭和54年, 58年(3)地域・地区制図(4)用途地域,地区の指定方針を入手,分析中.8.〔道路網計画の評価〕道路網計画を網の「連絡具合」から評価するために川崎市の大きい地域で分析を行った.
透湿度測定法に関する研究

これまで開発研究を行ってきた光ファイバ局所湿度測定装置をさらに改良し、透湿度の測定に利用する新しい測定法を提案した。この測定法の実証を主眼に実験的研究を行った。透湿度現象を純粋に材料内の透湿のみとし、見かけの拡散係数として評価できると仮定した。また迅速に測定するために従来の定常法ではなく、新しく非定常法を用いた。そのためにまず非定常一方向拡散を測定装置を試作した。この方法は水蒸気濃度変化の大きい測定が可能であり、光ファイバ局所湿度測定装置の性能を十分に利用できるものである。ガラス繊維布(GF/D)、高分子繊維紙(15THー145)および市販の不織布(FELT)について測定位置や試料の厚さを変えた測定を試み、見かけの拡散係数の値として、それぞれ2×10^<-5>、3×10^<-6>および7×10^<-7[>m^2/s]が推定された。この測定方法は原理的には極めて単純であるが装置の製作上、試料上面にステップ状にある水蒸気濃度の湿り空気を接触させるのが困難であり、実際には立ち上がりの遅れがある。また、エアポンプの強制循環によっても界面での拡散抵抗や通気の影響が懸念される。そこでガスーガスの拡散係数を測定するのによく用いられる非定常向流拡散を利用した測定装置も試作した。この方法では、水蒸気濃度の変化は前者の場合の1/2となる。高分子繊維紙(15THー145)について測定位置や試料の厚さを変えた測定を試み、見かける拡散係数の値として、ほぼ前者の場合と同程度が推定された。この測定法の確立にはもっと安定で精度の高い測定装置への改良が不可欠である。また、吸着性のある試料の取扱など残された課題はあるが、新しく提案された2種類の方法で見かけ拡散係数が測定可能であることが実証された。さらにこの測定法は基本的には光ファイバ局所湿度計の測定精度に依存するので光ファイバ局所しつど計の測定精度の向上も不可欠である。昭和62年度は新しく提案した測定法の実証を主眼に,以下の研究を行った.1.新型透湿度測定装置の試作;測定試料とその下層の乾き空気中への水蒸気の非定常拡散現象を利用した新型の透湿度測定装置を試作した.湿り空気の発生装置は光ファイバ局所湿度計の検定実験で用いたものを流用した.比較的簡単でかつ短時間で測定可能なものとなった.2.光ファイバ局所湿度計の測定精度の向上;この測定法は基本的には光ファイバ局所湿度計の測定精度に依存する.これまでの光ファイバをコア径200μmのものに,ビームスプリッタをキュービック型に変更するなど改良し,全体としてこれまでの約9倍の光強度とし, SN比や経時安定性を向上させることができた.3.データ処理プログラムの確立;測定結果は測定試料の透湿度を見かけの拡散係数として評価し, 1次元1方向の拡散方程式の理論解と対比し,その値を予測する計算機プログラムを作成した.4.実際の試料での測定;ガラス繊維布(GF/D),高分子繊維紙(15TH-145)および市販の不織布(フェルト)

ついて,測定位置や試料の厚さを変えた測定を試み,見かけの拡散係数の値として,それぞれ0.2×10^<-4>〔m^2/S〕, 0.5×10^<-5>〔m^2/S〕および0.7×10^<-6>〔m^2/S〕が推定された.測定装置の改良による測定精度の向上や吸着性のある試料の取扱など残された課題はあるが,新しく提案された方法で見かけの拡散係数が測定可能であることが実証された.以上の成果は第25回日本伝熱シンポジウムで発表予定である.昭和62年度の研究に引続き、試作した透湿度測定装置に更に検討を加え、以下の項目についての研究を行った。1.一方向拡散型透湿度測定装置の改良前年度の装置では特に立ち上がり特性の遅れを装置常数として扱い、ガラス繊維布(GF/D)、高分子繊維紙(15THー145)および市販の不織布(FELT)について測定位置や試料の厚さを変えた測定を試み、見かけの拡散係数の値として確定した。この立ち上がりの特性をなるべくステップ状に近づけるために、バイパス回路で予め湿り空気を循環させた。このようにして立ち上がり特性を改良したが見かけの拡散係数の値として、ほぼ前者の場合と同程度値が推定された。2.一方向向流拡散型透湿度測定装置の試作ガスーガスの拡散係数を測定するのによく用いられる非定常向流拡散を利用した透湿度測定装置を新たに試作し、この方法による測定の検討も試みられた。この方法では前者の問題点はないが、水蒸気濃度の変化は前者の場合の1/2となる。高分子繊維紙(15THー145)について測定位置や試料の厚さを変えた測定を試み、見かけり拡散係数の値として、ほぼ前者の場合と同程度値が推定された。以上の結果はこれらの測定法により、見かけの拡散係数の値として透湿度の測定が可能であることが実証された。安定で精度の高い測定法の確立のためには、透湿度測定装置の改良と測定法の規格化が不可欠である。また、この測定法は基本的には光ファイバ局所湿度計の測定精度に依存するので光ファイバ局所湿度計の測定精度の向上も不可欠である。以上の成果は第26回日本伝熱シンポジウムで発表予定である。
β-ヘアピンペプチドとSurvivin結合分子を融合した内用放射線治療薬剤の開発（国際共同研究強化）

本研究では、ほぼ全てのがんを対象とした治療と診断を可能とする、がん組織へ高選択的に集積するセラノスティクス薬剤の開発を目指した。そこで、最もがん特異的なタンパク質の一つであるsurvivinを標的とした薬剤開発を試みた。本年度は、これまでに我々が開発したsurvivin標的ペプチドを母体化合物として、アミノ酸12置換体、非天然アミノ酸置換体、r4r8誘導体を開発し、いくつかの化合物に関しては、これまでに開発したペプチド分子に匹敵する高親和性を示した。また、survivin結合分子を生体内で効率よくがん組織に到達させるため、カチオン性両親媒性ペプチド(CPPs)を開発し、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸とバリンなどの疎水性アミノ酸の繰り返し配列を有するペプチド分子を種々開発した。それらのペプチドの放射標識体や蛍光標識体を用いた検討を行った結果、いくつかのCPPsのがん指向性分子としての有用性が見出された。さらに、survivinを標的としたDDS薬剤への応用を目指し、マレイミドsurvivin標的ペプチドを創製した。現在様々な粒子径の金ナノ粒子への修飾と精製を種々検討中である。さらに、survivinが放射線抵抗因子の一つであることに着目し、survivin標的分子が放射線増感剤として機能しうるか検討したところ、survivin標的ペプチド(0.110 μM)をMIA-Paca-2細胞へ暴露24時間後にガンマ線照射装置にてCs-137を1-2Gy照射したところ、放射線増感剤としての効果がわずかながら確認された。今後は照射条件やペプチドの最適化、ナノ粒子の検討などを行っていく予定である。また、90Yなどの治療用放射性核種を導入した内用放射性薬剤への展開も現在検討中である。内定年度:2015本研究では、ほぼ全てのがんを対象とした治療と診断を可能とする、がん組織へ高選択的に集積するセラノスティクス薬剤の開発を目指した。そのような目的を達成するため、最もがん選択的な蛋白の一つであるsurvivin (サバイビン)を標的とした薬剤開発を試みた。前年度までに新たな結合メカニズムにてsurvivinに結合性を示すペプチド誘導体の開発に成功した。本年度はさらに高親和性、高い代謝安定性を有するペプチド誘導体の開発を行った。その結果、特殊アミノ酸を導入した7-22残基の新規ペプチド誘導体がsurvivinに強い親和性を有することを見出した。また、高親和性ペプチドにFITCを導入した蛍光性ペプチドを開発して、HeLa細胞にて細胞内への集積を評価したところ、survivin蛋白の存在部位と相関した集積を示したことから、分子プローブとしての展開が可能であることが示された。また、いくつかの高親和性ペプチドに関しては、MTTアッセイにより優れた抗腫瘍活性を確認し、治療薬としても応用であることが確認された。続いて、survivinが細胞内蛋白であることから、survivin標的分子の細胞内への透過を試み、がん細胞選択的な膜透過ペプチドの開発を試みた。既存のがん細胞へ高選択的に毒性を示すSVS-1を母体ペプチドとして、SVS-1のリシン残基をアルギニン等の塩基性アミノ酸残基に変換し、ペプチド配列の長さも検討したところ、いくつかの誘導体ではSVS-1よりもKB細胞等のがん細胞への高い取り込みを示した。従って、今後はsurvivin結合分子と連結することで、in vivoにてsurvivinへ選択的に結合できる分子へと展開できるものと期待される。Survivin蛋白に高親和性を有する新たなペプチド分子の開発を達成した。いくつかのペプチド分子に関しては、survivinの発現に相関した細胞への集積を示し、抗腫瘍活性も有することも見出された。また、がん細胞へ高効率にて集積する新たな膜透過性ペプチドの開発にも成功した。本研究ではほぼ全てのがんを対象とした治療と診断を可能とする、がん組織へ高選択的に集積するセラノスティクス薬剤の開発を目指した。本年度は、膜透過性および代謝安定性の高い新規survivin標的ペプチドの開発を目指し、アミノ酸置換体、r4誘導体、r9誘導体および環化体などのいくつかの誘導体を開発し、survivinに対して結合親和性を示す新規ペプチド分子を見出した。また、膜透過ペプチドを導入したsurvivin結合分子のがん細胞を用いた抗がん作用を評価したところ、既存の低分子化合物S12(Berezov, Oncogene, 2011)よりも高い抗腫瘍活性を有しており、survivin発現も減少したことから、survivinの退縮が抗がん活性に関与していることが示唆された。続いて、EPR効果にてがん組織への高い集積性が期待される、金ナノ粒子にマレイミドを介してsurvivin標的ペプチドを導入した新規ナノ粒子型survivin標的分子の開発を行った。今後は詳細な構造、抗がん活性、in vivoでのがん組織への集積性などを評価していく予定である。なお、Survivin標的ペプチド分子との比較およびSPECTイメージングへの展開を目指し、125I標識S12誘導体の合成および腫瘍への集積性などの評価を行ったところ、survivin陽性細胞への集積がsurvivin陰性細胞に比べて有意に取り込みが高いことが見出された。一方で、in vivoでの腫瘍への集積性やsurvivinへの選択性は不十分であり、腫瘍イメージング剤や内用放射線治療薬剤への展開にはさらなる検討が必要であることが分かった。

新規survivin標的分子を見出し、既存の低分子薬剤よりも強い抗腫瘍活性があることを見出した。また、金ナノ粒子にsurvivin結合分子を導入した新たなDDS製剤の開発に着手した。本研究では、ほぼ全てのがんを対象とした治療と診断を可能とする、がん組織へ高選択的に集積するセラノスティクス薬剤の開発を目指した。そこで、最もがん特異的なタンパク質の一つであるsurvivinを標的とした薬剤開発を試みた。本年度は、これまでに我々が開発したsurvivin標的ペプチドを母体化合物として、アミノ酸12置換体、非天然アミノ酸置換体、r4r8誘導体を開発し、いくつかの化合物に関しては、これまでに開発したペプチド分子に匹敵する高親和性を示した。また、survivin結合分子を生体内で効率よくがん組織に到達させるため、カチオン性両親媒性ペプチド(CPPs)を開発し、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸とバリンなどの疎水性アミノ酸の繰り返し配列を有するペプチド分子を種々開発した。それらのペプチドの放射標識体や蛍光標識体を用いた検討を行った結果、いくつかのCPPsのがん指向性分子としての有用性が見出された。さらに、survivinを標的としたDDS薬剤への応用を目指し、マレイミドsurvivin標的ペプチドを創製した。現在様々な粒子径の金ナノ粒子への修飾と精製を種々検討中である。さらに、survivinが放射線抵抗因子の一つであることに着目し、survivin標的分子が放射線増感剤として機能しうるか検討したところ、survivin標的ペプチド(0.110 μM)をMIA-Paca-2細胞へ暴露24時間後にガンマ線照射装置にてCs-137を1-2Gy照射したところ、放射線増感剤としての効果がわずかながら確認された。今後は照射条件やペプチドの最適化、ナノ粒子の検討などを行っていく予定である。また、90Yなどの治療用放射性核種を導入した内用放射性薬剤への展開も現在検討中である。ナノ粒子等にsurvivin標的ペプチド分子を結合させ、90Yなどの治療用放射性核種、68Gaなどの診断用放射性核種、近赤外蛍光分子などを種々導入することで、新たながん選択的なセラノスティクス薬剤へと展開していく。金ナノ粒子は、光音響イメージングやラマンイメージングなどに用いることができる。そこで、今後はsurvivin標的分子を搭載した金ナノ粒子にさらなる腫瘍指向性膜透過ペプチドなどを修飾し、90Yなどの放射性核種を導入することで、イメージングと治療を同時に可能とするセラノスティクス製剤へと展開していく予定である。併せて、Survivinを標的としたさらなる親和性、選択性、代謝安定性の向上したペプチドミメティクスの開発を引き続き行っていく。
複雑な振動流下における三次元ウェーブリップルの自己組織化に関する実験的研究

本課題においては,海底や地層中に見られる,規則的パターンを示す三次元ウェーブリップルについて,水理実験を通した研究を行った.特に二次元振動流場を模式的に再現する二次元振動板装置を開発し,定常二次元振動流や非定常一次元振動流の下で発達するリップルの形成プロセスや形成条件を明らかにした.本課題においては,海底や地層中に見られる,規則的パターンを示す三次元ウェーブリップルについて,水理実験を通した研究を行った.特に二次元振動流場を模式的に再現する二次元振動板装置を開発し,定常二次元振動流や非定常一次元振動流の下で発達するリップルの形成プロセスや形成条件を明らかにした.平成19年度には,株式会社西日本流体技研の協力の下,本研究遂行の要である二次元振動板装置の設計・製作が行われた.この装置は,直径1mの振動板を,直交する二方向(X,Y方向)にそれぞれ振動させる装置であり、移動床を設置した振動板を水中で振動させることで,波が引き起こす振動流下におけるベッドフォームの自己組織化を模式的に再現ことができる.X,Y方向それぞれについて,コンピュータ制御により,単振動(各振動運動の周期・振幅およびX,Y運動の位相差をコントロール可能),もしくは任意波形の振動運動を発生させることができ,さまざまなX-Y運動を組み合わせにより,複雑な二次元振動流を模した振動運動をおこすことが可能である.これまでの予備実験により,実験に適した振動条件(振動運動の加速度の上限)を明らかにした.また,円運動下では稜線が六角形網目を示すリップルマーク(いわゆるinterference ripple)が形成されることが明らかになり,現在,リップルの三次元性と楕円運動の軌道の長径短径比の関係,およびリップル稜線の網目サイズと振動特性の関係について検討を行っている.また,平行して,このような三次元リップルの形成が二次元的な振動運動に依存していることを示すため,複雑な一次元振動流下におけるベッドフォームについて実験を行った.波と流れの進行方向が平行な複合流ベッドフォームについて検討し,その結果,一次元振動運動下においては,流れの特性に応じて断面形状やサイズは変化するものの,三次元パターンを示すリップルは形成されにくいことを示した.こちらの研究結果については,2007年11月開催の日本地形学連合2007年秋季大会にて公表したほか,2008年4月開催の国際ワークショップMARID2008において公表する予定(講演要旨受理済)である斜め重複波下で形成されるベッドフォームについて重点を置き,二方向振動板実験をおこなった.実験では,砂床上の水深20cmの条件下で平滑な砂床(粒径0.2mm,厚さ2cm)を振動させ,リップルを発達させた.二方向の振動の位相差をπ/2で一定,両者の周期を1.0-2.5sで等しくし,各振動の全振幅を0-12cmの範囲で組み合わせることで,短径/長径比が異なる楕円運動を発生させた.実験の結果,リップルの三次元性は楕円運動の短径/長径比に依存し, 2/5以下で二次元リップル, 3/5以上でinterference rippleが形成されることが明らかになった.また,円運動により形成されるinterference rippleのサイズを解析したところ,円軌道の直径とリップルサイズには,単純な比例関係は成り立たないことを明らかにした.貧砂状況における実験では,円運動下で必ずしも三次元リップルが形成されないことが明らかになった.この場合,リップルフィールドは,波峰線のオリエンテーションが異なる,いくつかの領域に区分される.各領域の波峰線オリエンテーションは,振動板縁辺の影響を受ける傾向が見られた.平成19年度に開発した二方向振動板装置について,装置の概要を筑波大学陸域環境研究センター報告で公表した.また,二次元振動運動下で形成されるベッドフォームとの比較を目的に,一次元振動流下におけるリップル変形実験,複合流実験をおこなった.その成果の一部を国際学会で公表し,論文として投稿した.本年度は(1)直交する二成分の正弦振動の周期が等しい場合について,ベッドフォームの三次元性と楕円軌道の長径・短径比の関係を明らかにすること,(2)振動周期が異なる場合について,特徴的な三次元パターンを見いだすことを目的とした二方向振動板実験をおこなった.実験の結果,以下が明らかになった.(1)規則的三次元リップルの発達には各振動成分がリップル形成に十分な速度(ψ〓2,ここにψはモビリティーナンバー)を有する必要性がある.(2)(1)の条件を満たし,かつ振動周期が比較的近い場合にはinterference ripple(IR)が発達する.特に円軌道の振動によりIRが発達する場合,リップル波峰で囲まれる領域の直径は,円軌道の直径の1/3となる傾向がみられる.(3)(1)の条件を満たし,かつ各振動周期が異なる場合にはladder-back ripple(LBR)が形成される.この場合,リップル波峰は各振動成分と直交し,各波長は各振動成分の軌道直径の約2/3となる.これらの実験結果から,三次元リップルの形成は,干渉波下で生じる複雑な二次元振動流に起因し,特にLBRの形成には周期の異なる波の干渉が重要であることが示された.申請者の知る限り,LBRの形成に成功した研究はこれまでになく,今後の三次元リップル研究の基礎を成すものと期待する.
星間物質中の減速衝撃波の自己重力不安定とそれに対する磁場の影響の研究

星の形成には外的な作用によって星間雲を自己重力不安定にすることが必要と考えられている。この外的な作用のひとつとして、OB型星の電離領域の膨張がある。これにより星間雲には衝撃波が発生し、それが星間雲を圧縮して高密度層を作りそこで星形成が連鎖的に引き起こされていると考えられている。この過程では、衝撃波とそれによって出来た高密度層が流体力学的不安定、熱力学的不安定、自己重力不安定によって様々に分裂収縮する過程が起きている。最近、衝撃波が減速していることによる不安定性の重要性が指摘されている。従来、これらの不安定性の解析には、おもに線形解析が行われてきた。線形解析によると、自己重力不安定が重要となる時間は衝撃波と高密高層の変化の時間と同程度であることが示され、衝撃波や高密度層の構造の変化を考慮した不安定性の非線形解析が必要と考えられる。このことから、本研究ではス-パ-コンピュ-タ-を用いて系統的にこれらの過程による衝撃波の不安定性を非線形解析によって明らかにした。また、従来よく調べられていなかった減速高密度層の不安定性に対する磁場の影響の線形解析も行った。その結果、以下のことが明らかになった。電離領域の膨張により形成された衝撃波では、それを通りぬけたガスには〓射冷却がきき、衝撃波の後ろには非常に密度の高い層が出来る。この高密度層の構造を分解できるほどよい分解能の数値計算を行うことで、高密度層が減速系であることに由来した不安定によって重力不安定が影響される様子が明らかになった。数値計算の結果から、揺らぎの成長の仕方と波長の関係を示した。特に、従来の理解よりも高密度層の自己重力不安定性の成長が減速に由来した不安定性によってかなり加速されることが明らかになった。また、この過程に対する磁場の影響も明らかにした。これらは、星形成過程の理解に大きな影響を与える結果であり、論文として投稿中である。
弦理論の局在問題への応用

アンダーソン局在の易動度端での臨界現象はくり込み群方程式で示されるようにその理論的扱いは場の理論と深く関係している。弦理論は二次元での共形場理論と関係しているが、ここでは弦理論による散乱振巾公式を使って、局在のくり込み群方程式を決定できることを具体的に示し、5次の項まで計算した。また電気伝導度の多重モーメントのゆらぎもデイラトン及び質量場のくり込みで説明できることを示した。二次元重力と結合した物質場は、ストリングの振舞いを表わすが、これをマトリックス模型で表現し、その臨界現象を調べた。特に中心電荷が1以上の場合について摂動展開によりストリング感受率を数値的に求めた。この問題はランダム表面上の多重イジング模型と同等であることも判明した。また、二次元で強磁場下、量子ホール効果状態でのアンダーソン局在を2バンド不純物散乱の場合に厳密に解いて、バンド中心で非局在であることが判かり、電気伝導度の値を得た。また、二次元強磁場下での電子のエッジ状態の相関関数を、マトリックス模型の手法で計算し、二次元重力の理論との関係を調べた。弦理論はボゾンの場合、臨界次元は26次元であるが、非臨界次元の振舞いに興味が持たれている。一方、弦理論は二次元重力が物質と結合した場合も含み、これはランダム表面上に物質を置いた、ランダム表面上の相転移の問題と密接に関係している。マトリックス模型に基づいて、ランダム表面上のnイジング模型を考え、その場合のストリング感受率を研究した。この場合、相転移点で中心電荷はC=n/2となり、C>1の場合を容易に実現できる利点がある。摂動計算により、宇宙項に関して展開を行ない、8次までの摂動級数の結果から臨界指数を導出した。特にC>1の場合は、ストリング感受率は正の値になり興味ある結果が得られた。C=3の場合は、この模型がボゾンを表わすにもかかわらず、三次元イジング模型の比熱の臨界指数と同じ値を与えることが判明した。現在、フェルミオンの場合も考察中で今後更に研究を進めてこの関係を明らかにしたい。イジング模型に磁場がある場合も考察し、臨界指数及びスケーリング則を研究した。ギャップ臨界指数とストリング感受率との関係式を考察し、数値的にこの関係式がC>1で破れることを見い出した。弦理論では、タキオン及びディラトンの凝縮が重要となるが、これがマトリックス模型でどの様に影響するのか明らかにすることが重要である。また超対称性のマトリックス模型の実現も重要で、特にアンダーソン局在との関係で、局在長に対する臨界指数と二次元重力に現れる臨界指数との間の関係を今後明らかにしたい。また、くり込み群の手法によるストリング感受率の計算を行ない、定量的にも弦理論を理解し、局在問題への応用をはかりたい。昨年の続きで、さらにマトリックス模型に関する相転移およびマトリックス模型に基づいたメソスコピックゆらぎのユニバーサリテイを調べた。マトリックス模型は相転移点でストリングを表わす。多重マトリックス模型を導入し、中心電荷cが1以上を摂動展開で調べた。この多重マトリックス模型はランダム表面上に置かれたイジング模型と等価で多重性は独立なイジングスピンの種類に相当する。イジングスピンに磁場がある場合も調べ、自発磁化が消失する点から相転移点を求めた。通常の三次元イジング模型とこの多重マトリックス模型の比熱の臨界指数が誤差範囲で一致することからこの関係を研究した。摂動展開の他に、コンピューターを使ったシミュレーションによりマトリックス模型での結合定数の臨界点を求めた。また、この計算により、二重スケーリング則を確かめた。メソスコピックゆらぎのユニバーサリテイに関して、磁場下での二次元電子系の相関関数をランジュバン方程式に基づいたシミュレーションから求め、そのエッジ状態のユニバーサリテイの研究を行った。この問題も複素数を行列要素とするマトリックス模型に帰着するので前述の手法を適用し研究を行った。
自己免疫性肝炎I型,II型,III型,IV型に関する研究

a.抗LKM1抗体陽性症例は、我が国ではC型慢性肝炎の2.5%にみられた。これらはAIH IIbに属するが、各種臨床検査所見、HCV-genotype,HLAタイピングなどの検討から通常のC型慢性肝炎と大差ない。またAIH IIa症例は今回の調査では、大阪市大第三内科の1例で、本邦では極めてまれな疾患と思われた。なお、抗LKM1抗体の対応抗原には、heterogeneityが明らかになった。b.抗LKM1抗体陽性C型慢性肝炎の治療法について検討した。注目すべきはインターフェロン有効症例はいずれもEnomotoらの報告のようなC型肝炎ウイルス遺伝子NS5領域に変異の多い、いわゆる変異株をもっていることが明らかになった。従ってLKM1抗体陽性C型慢性肝炎も通常のC型慢性肝炎と同じように加療して良いことが判明した。c.約500例の慢性肝疾患について抗SLA抗体、III型症例を検討したところ、AIH疾患の約6%に検出された。健康正常人ではいずれも陰性であり、抗SLA抗体は肝疾患とくにAIH特異性のある自己抗体と思われた。その陽性症例の臨床的特徴についてはANA陽性AIHと差はない。抗SLA抗体の対応抗原に関する検討から4252KD反応バンドを認め、これらはサイトケラチン8や18に相当するものと考えられた。しかしながら個々の症例でblot像が異なり、今後、対応抗原の解析が必要と思われた。d.平滑筋抗体陽性症例つまりAIH IV型については、小児の症例ではしばしば陽性であるが、成人例は稀であった。これらの臨床的特徴については、症例数を増し検討する必要があろう。結び我が国ではAIH I型が主体であるが、まれにII,III,IV型が存在する。しかし、II、III型の他にもANA陰性のAIHが存在し、これら症例の早期診断と治療についても今後の研究が望まれる。I.教室ならびに関連病院における自己免疫性肝炎(AIH)II型、III型の症例の集積につとめた。a.AIH II型は、前年度の報告と同じように、C型慢性肝炎の2.5%にみられた。これらはヨーロッパグループのAIH IIbに属するが、抗LKM1抗体陽性C型慢性肝炎としてとらえた方がよいように思う。AIH IIaは当科では発見されず、本邦では極めてまれな疾患といえよう。b.AIH III型症例は、約500例の慢性肝疾患について抗SLA抗体を測定、検討したところ、AIH疾患の中から2例(約6%)発見された。(厚生省特定疾患難治性の肝疾患調査研究班会議で報告、1996)従って、わが国でも欧米で報告されているAIH III型が存在することが判明した。II.抗LKM1抗体陽性C型慢性肝炎について、その抗体の対応抗原側から解析したところ50KD以外に、10KD、55KDにも肝マイクロソームと反応する抗体がみられ、抗LKM1抗体のhepetogenecityが明らかになった。III.今回発見されたAIH III型症例の臨床像は従来のAIH I型と変わらず、またHLA検索でもDD4であった。ただ、既往歴、家族歴に慢性関節リウマチがみられた。今後、症例を追加し、検討が必要と思われるが、AIH III型の独立性については疑問である。最近、自己免疫性肝炎(AIH)には自己抗体によってI型(抗核抗体陽性)、II型(LKM1抗体陽性)ならびにIII型(抗SLA抗体陽性)に分類されつつあり、IV型(平滑筋抗体陽性)の存在も古くから指摘されている。

しかしわが国ではAIH II,III型症例の実態は明らかでなく、従ってその治療法も確立されていない。昨年はII型症例が慢性C型肝炎の3%に認められること、これらの中にはC型肝炎ウイルス遺伝子のNS5領域の変異が多い症例があり、これらはインターフェロンに有効であることなどを報告した。今年も症例を増し追試を行った。今年はIII型症例に主力をおいた。まず、各施設からAIH症例、78例を集めて、Mannsらの方法でAnti-SLAを検討した。その5%に陽性症例が認められたがその他の肝疾患463例ではB型肝炎の1.4%のみであった。健康正常人ではいずれも陰性であり、Anti-SLAは肝疾患とくにAIHに特異性のある自己抗体と思われた。これら陽性症例の臨床的特徴を検討したところいずれも中年女性でHLAタイプはI型と同じDR4をもち、その他、Anti-SLA陰性AIH症例群との間に特に差は見いだせなかった。また、5症例中2症例にステロイドホルモン療法を施行したところいずれも有効であった。Anti-SLAはAIHに特徴的な自己抗体と思われるが、臨床的にはANA陽性AIHと差はなく、AIH III型は独立疾患とは思えない。抗SLA抗体の対応抗原に関するWestern blotによる検討から4252KDに反映バンドを認め、これらはサイトケラチン8や18に相当するものと考えられた。しかしながら個々の症例でblot像が異なり、今後、対応抗原の解析が必要と思われた。平滑筋抗体陽性症例つまりAIH IV型については、成人例が稀に存在するが、これも症例数を増し検討する必要があろう。
レーザーマイクロダイセクション法による樹木細胞壁の形成機構の局所解析

樹木形成層における細胞壁形成の分子機構を明らかにすることを目的とし、細胞試料の局所採取および微量発現遺伝子の定量解析の方法について検討した。樹木形成層内の細胞拡大領域および細胞分裂領域それぞれから細胞試料を採取でき、発現遺伝子を抽出することができた。さらに、その遺伝子発現量を高精度で定量することができた。得られた結果から、樹木細胞壁形成に関連するタンパク質の発現構成比は形成層内で変動することが示され、このことが細胞壁形成の分子機構に影響を与えると考えられた。平成23年度は、スギにおいて発現するチューブリンの塩基配列およびアミノ酸配列の解析、ならびにレーザーマイクロダイセクション(LMD)法を利用したスギ形成層帯の遺伝子発現定量解析の方法の検討を行った。スギでは、5つのα-チューブリン遺伝子と4つのβ-チューブリン遺伝子が存在することが明らかとなった。α-チューブリン遺伝子の塩基配列をもとに翻訳配列と立体構造予測を行った結果、5つのアイソフォームの間で82番目のアミノ酸が互いに異なり、かつこのアミノ酸はチューブリン分子の外側に配置していると予測された。これらより、82番目のアミノ酸をエピトープとするモノクローナル抗体を用いることで、スギ形成層の分化過程におけるα-チューブリンのアイソフォームの発現とその局在を視覚的に明らかにできると考えられた。β-チューブリン遺伝子のうち2遺伝子は同じアミノ酸配列をコードしていたことから、このアイソフォームは3つであることが分かった。一方、この3つのアイソフォームの間でアミノ酸配列の相同性は非常に高かったことから、抗体を用いたβ-チューブリンのアイソフォームの発現解析は困難であると考えられた。56月にかけて形成層帯を含むスギ・ブロック試料を採取・急速凍結し、凍結ミクロトームを用いて凍結切片を作製した。これを凍結乾燥したのち、LMDを用いて形成層細胞試料を回収した。LMDによる細胞試料回収条件として、パルス周波数を230Hz程度とし、切削速度を遅くすることで、試料損傷を低減することができた。また、ビーム口径については、少なくとも10μm程度の大きさが必要であった。回収された細胞試料から全RNAを抽出し、18SrRNAの発現を確認した。以上より、LMD法を採用することでスギ形成層細胞のチューブリン遺伝子の局所的な発現解析が可能であると考えられた。平成25年度は、スギ形成層内での各チューブリン遺伝子の局所的な遺伝子発現解析を行い、特に新たな遺伝子発現定量解析方法として、デジタルPCRによる微量遺伝子発現解析を行った。形成層内を細胞分裂領域および細胞拡大領域の2領域に分け、それぞれからレーザーマイクロダイセクションにより細胞試料を採取し、全RNAを抽出した。cDNA合成の後、これらが単独に区画化されるようドロップレットで内包した。この状態でPCRを行い、遺伝子発現の絶対量を測定した。形成層細胞試料の採取については、細胞分裂領域および細胞拡大領域とも40枚の凍結乾燥切片(20μm厚)から行った。従来の定量PCR解析では、この細胞量では十分な精度でチューブリン遺伝子の発現量を検出することができなかったが、デジタルPCRによる発現解析を行ったことで、高精度でかつ絶対定量により遺伝子発現解析を行うことができた。チューブリン遺伝子の発現量は、細胞分裂領域から細胞拡大領域に移行すると相対的に増加した。α-チューブリン遺伝子間での発現量比は、細胞分裂領域と細胞拡大領域の間で異なり、細胞拡大領域で発現量が増加する遺伝子があった。β-チューブリン遺伝子間についても、細胞分裂領域と細胞拡大領域の間で発現量比が異なることが明らかとなり、細胞拡大領域で発現量が著しく増加する遺伝子があった。これらの結果から、樹木形成層の分化ステージによって、チューブリン遺伝子の発現量が異なることが示唆された。さらに、分化ステージによってチューブリン遺伝子間の発現量比が変化し、このことが微小管の配向変換に関与していることが示唆された。平成24年度は、「スギ・αーチューブリンモノクローナル抗体の作製と表層微小管の免疫染色観察」および「スギ形成層帯内での各チューブリン遺伝子の局所的な発現定量解析」について検討を行った。スギ・αーチューブリン遺伝子の塩基配列をもとに翻訳配列と立体構造予測を行った結果、5つのアイソフォームの間で82番目のアミノ酸が互いに異なること、このアミノ酸は単一のチューブリン分子の外側に配置していることが明らかとなった。これらを考慮に入れ、さらにヒトの微小管と微小管結合タンパク質の結晶構造解析データを参照し、スギ・αーチューブリンが微小管を構成している場合の立体構造について詳しく解析した。その結果、82番目のアミノ酸は、微小管の管状構造の内側に配置していることが明らかとなった。微小管の断面の内径や抗体の大きさなどを考慮に入れ検討した結果、抗体が微小管内部に侵入することは困難であり、免疫染色観察が不可能であることが分かった。以上を受け、免疫染色観察によるスギ・αーチューブリンアイソフォームの発現の識別については断念した。人工気象室で生育させたスギ苗木から形成層試料を採取、急速凍結した後、凍結ミクロトームで形成層を含む凍結切片を作製した。

これを凍結乾燥した後、レーザーマイクロダイセクション(LMD)を用いて、形成層部分のみを局所的に回収した。これから全RNAを抽出し、定量PCR法で18S rRNAの発現量について調べた。その結果、現状の方法では遺伝子発現の定量解析に十分な全RNA量を抽出できておらず、検量線の精度が低かった。方法の改善として、より適切な厚さの凍結切片から形成層試料を回収すること、それに必要なレーザーマイクロダイセクションの条件について検討する必要があることなどが示唆された。本研究課題の解析の対象であるスギ・チューブリンについて、その塩基配列およびアミノ酸配列を同定することができた。また、LMD法によるスギ形成層帯のチューブリン遺伝子の発現解析の方法について,細胞試料採取などの方法を定めることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の解析対象であるスギ・チューブリンについて、その遺伝子発現解析を十分な精度で行うことができなかった。これは、解析に必要な細胞の回収量を定めるのに時間を要したことによる。一般に、LMD法により細胞試料を回収するためには、検鏡に供する程度の薄さの切片が適しているとされる。一方、解析対象とする細胞の形成層内の位置範囲を定め、そこから多くの核酸を抽出する場合には、縦断面の凍結切片を使用し、またその厚さを大きくするのが効果的であると考えられる。縦断面切片からLMDで形成層試料を局所的に回収する際には、細胞壁を切削する必要があり、そのためには、レーザーの出力やパルス周波数を大きくする必要がある。しかし、これらの設定値を大きくすると、細胞試料の焦げつきや損傷が多くなり、結果的に有効な細胞試料の回収量が減少することとなった。適切な縦断面の切片厚さとLMDによる切削条件の関係を定めることに時間を要し、これが高い達成度を得られなかった原因と考える。また、微小管の構造解析結果を受け、免疫染色法によるスギ・αーチューブリンアイソフォームの発現の識別を断念した。高等生物の間ではチューブリンの構造の相同性はかなり高いと考えられるため、ヒトのチューブリンに関する構造解析の結果は十分に参考になると考えられた。スギ・チューブリンの構造はアイソフォーム間で想定以上に類似性が高かったこと、微小管表面部分の構造的特徴の把握に時間が掛かったことが、高い達成度を得られなかったもうひとつの原因と考える。平成23年度までに得られた成果を基礎として、平成24年度は、スギ形成層帯におけるチューブリン・アイソフォームの発現の局所解析を進める。実験試料としては、立木から採取した形成層試料に加え、人工気象室で生育させるスギ苗木から採取したものを用いる。これにより、形成層細胞の分化および成熟の過程を人為的に制御しながら効果的に試料を採取することができ、細胞壁形成とチューブリン・アイソフォームの発現の時系列的な関係を定量的に明らかにできる。