hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞マイクロレオロジー測定装置を用いた静脈性血栓症の新規診断システムの開発

深部静脈血栓症や肺塞栓症などの原因の一部は、血液凝固関連因子の先天性異常症によることが知られているが、患者の多くは後天性要因である長期臥床や肥満、運動不足などによる血液流動性の低下が原因になると主に考えられている。前年度に施行した研究結果から、LPSなどの炎症性メディエーターの刺激により単核球細胞表面上に組織因子(TF)の発現が観察され、血球細胞、特に単核球の活性化に起因する血液流動性の低下が観察された。そこで今年度は、細胞マイクロレオロジー測定装置を用いて、微小血管での血液流動性動態と血球細胞、特に血小板の活性化による血液凝固の活性化との関係を明らかにし、血栓症に対する検査診断法の確立と、その治療薬の開発に向けた基礎的研究を行った。クエン酸採血した末梢血をLPSあるいはADPで刺激し、全血の血液流動性を測定した結果、添加した刺激物質の濃度依存的な血液流動性の低下が観察された。LPS刺激による血液流動性の低下は、抗TF活性中和抗体により回復したが、ADP刺激による血液流動性の低下は回復しなかった。また、LPSおよびADP刺激に伴う血液凝固の活性化を、トロンビン-アンチトロンビン複合体(TAT)の形成を指標に評価したところ、ADP刺激ではTATの上昇は観察されなかったものの、LPS添加ではそ濃度依存的なTATの産生の上昇が観察された。以上の結果から、血液流動性低下のメカニズムはLPSとADPとの刺激で異なる可能性が示唆された。また、血液流動性の低下による血栓塞栓症の発症を抑制することを目的に、血流改善薬のスクリーニングを施行した。その結果、ヘパリンなどの抗凝固物質やシロスタゾールなどの抗血小板薬は、LPS誘導性の血液流動性低下を著明に抑制したものの、ADP誘導性の血液流動性低下を上記の抗凝固薬は抑制しなかった。以上の結果から、血液流動性の低下の原因として、凝固因子や血小板の活性化が関与し、そのメカニズムによって使用する薬物を厳密に選択する必要があることが示唆された。エコノミークラス症候群などで知られる深部静脈血栓症や肺塞栓症などの原因の一部は、血液凝固関連因子の先天性異常症によることが明らかになっているが、患者の多くは後天性要因である長期臥床や肥満、運動不足などによる血行障害(血流の低下)が原因になると主に考えられている。そこで本研究では、最近開発された細胞マイクロレオロジー測定装置(MC-FAN)を用いて、微小血管での血流動態と血球細胞(白血球、血小板など)の活性化による血液凝固の活性化との関係を明らかにし、血流低下に起因すると推定されている静脈性血栓症に対する新規な検査診断法を確立するとともに、その治療薬の開発に向けた基礎的な研究を行った。細菌感染などにより白血球(特に単核球)が活性化され、細胞表面に凝固活性化因子の組織因子(TF)が発現されることが示唆されている。そこでまず、LPS、TNFα等の既知のTF発現誘導因子で活性化した末梢血中の単核球を全血中に添加し、血流に及ぼす活性化白血球の影響をMC-FANにて検討した。クエン酸採血した末梢血をLPSおよびTNFαで刺激し、全血の血液流動性を測定した結果、添加した刺激物質の濃度依存的な血液流動性の低下が観察された。また末梢血より単離した末梢血単核球の細胞表面上のTF活性をクロモジェニックアッセイにて解析した結果、刺激物質の濃度依存的なTF発現量の上昇が観察された。この血液流動性の低下は、抗TF活性中和抗体により、完全に回復した。また、LPS刺激に伴う血液凝固の活性化を、トロンビン-アンチトロンビン複合体(TAT)の形成を指標に評価したところ、添加したLPSの濃度依存的なTATの産生の上昇が観察された。以上の結果から、血液流動性は、TF発現に伴う血液凝固の活性化に依存しており、ヘパリンなどの抗凝固薬が血流低下の改善に有効である可能性が示唆された。現在、各種抗凝固物質の血液流動性に及ぼす影響を検討する一方、血小板凝集の及ぼす血液流動性への影響を解析している。

また、LPSおよびADP刺激に伴う血液凝固の活性化を、トロンビン-アンチトロンビン複合体(TAT)の形成を指標に評価したところ、ADP刺激ではTATの上昇は観察されなかったものの、LPS添加ではそ濃度依存的なTATの産生の上昇が観察された。以上の結果から、血液流動性低下のメカニズムはLPSとADPとの刺激で異なる可能性が示唆された。また、血液流動性の低下による血栓塞栓症の発症を抑制することを目的に、血流改善薬のスクリーニングを施行した。その結果、ヘパリンなどの抗凝固物質やシロスタゾールなどの抗血小板薬は、LPS誘導性の血液流動性低下を著明に抑制したものの、ADP誘導性の血液流動性低下を上記の抗凝固薬は抑制しなかった。以上の結果から、血液流動性の低下の原因として、凝固因子や血小板の活性化が関与し、そのメカニズムによって使用する薬物を厳密に選択する必要があることが示唆された。
19世紀前半のフランスにおける文学と科学

今年度は諸々の事情から、当初考えたとおりに研究テーマを広げることができず、19世紀ロマン主義の終焉とそれに続く実証主義の台頭との関係を探る、という総括的なテーマに関しては、国内外の資料を収集するにとどまり、予定していた論文にまとめるには至らなかった。しかしそれに代わって、これまでにすでに調査済みであった歴史家ミシュレの著作を詳細に再検討した。そして19世紀初頭に動物学の進歩に貢献したジャン=バチスト・ラマルクの学説と、ミシュレの言説との間の関わり方について考察した。ラマルクは、ダーウィンより先に「生物は長い時間の間に進化する」という考えに到達していたが、その説明の過程はダーウィンのものとは大きく異なっている。彼の言説は浪漫派的な、感情重視という特徴を備えており、ミシュレはこのラマルク説から、全面的なインスピレーションを受けていたと考えられる。その影響は、自然誌的な著作に限らず、彼の歴史的著述に方法にも及んでいる。これらの事実を、霊を挙げながら説明し、論文にまとめ、紀要『人文学報』に掲載した。19世紀の浪漫主義的精神が、どのように科学から影響を受けてきたかの一例を示すことができたのではないかと思う。今年度は19世紀後半のフランスにおいて、科学界及び社会全体に対し多大な影響力を持っていた科学者マルスラン・ベルトロと、浪漫派の国民的歴史家ジュール・ミシュレとの関係について、これまでの調査をまとめる作業を行った。この二人の人物の交流関係を調査することによって特に明らかになったことは、まず交流の初期の段階では、年下のベルトロがミシュレの思想に影響を受け、それを引き継ごうとしているという事実である。ミシュレはそれを心から歓迎し、特に科学者の化学における成果に対して、惜しみない賞賛の言葉を送った。科学者が文学的な言説から影響を受け、その思想を自らの研究成果に適用しようとした例は、この時期における化学と文学に関わりの、重要な一面を示唆するものであると思われる。1860年頃には、化学という近代的な分野においても、なお化学がむしろ文学に「従属」するような状況があったのである。しかし、1860年代の半ばになると、彼らは交流をほとんど絶ち、その書物の中で互いの存在について触れることがなくなる。これは、ミシュレとベルトロ、またベルトロの友人でもあったルナンが、思想的に反目しあった結果である。彼らの離反の根底には、一言で言えば実証主義的精神と浪漫的精神の乖離があることは明白である。具体的には、ミシュレの精神重視の思想に対するベルトロの無神論や近代性の思想が、直接齟齬をきたす理由となった。彼らの離反は、この時期に特徴的だった科学と宗教の乖離のモデル、あるいは精神・感情に対して科学が優位になる瞬間の、精神のひとつのモデルになるのではないかと思われる。以上のテーマをフランス文学会で発表し、審査の結果学会誌にフランス語で掲載されることとなった。しかしこのとき書ききれなかった事が多かったため、加筆・訂正をしたものを日本語で紀要『人文学報』に掲載した。
イノシトール・ポリリン酸における神経変性疾患の病態生理機構の解明

イノシトールリン酸は、生体内に広く存在し、様々な生命現象を引き起こす。しかし、さらに高次のリン酸基を有するイノシトール6リン酸(IP6)や7リン酸(IP7)に関しては十分に解明されていない。このIP6、IP7、IP6をIP7にリン酸化する酵素であるイノシトール6リン酸キナーゼ(IP6K)と神経変性疾患との関連を研究してきた。特にIP6Kは中枢神経系に多く存在し、神経細胞死を促進することを明らかとした。しかし、生体内のIP6、IP7を定量的に測定することは不可能であったが、我々はその測定法を確立した。そこで、イノシトールポリリン酸の新たな神経変疾患病態メカニズムの解明につき検討する。
WASPファミリー蛋白によるアクチン細胞骨格制御機構の解明

前年度までの成果により、N-WASPがCdc42によって活性化されArp2/3complexを介した素早いアクチン重合を誘導して糸状仮足形成などに関わることを突き止めていた。糸状仮足は神経発生時において、神経細胞の先端部の成長円錐と呼ばれる部分において顕著に観察される構造であるので、N-WASPと神経発生の関連について調べた。まずN-WASPの野生型および各種変異体を神経発生のモデルとして頻繁に用いられるPC12細胞に発現させた。その結果、変異型のN-WASPはNGE(神経成長因子)やcAMP刺激による神経突起形成を顕著に抑制した。ここで用いた変異体はN-WASPの上流の制御因子であるCdc42との結合を欠くもの、そして下流の標的であるArp2/3complexを活性化できないものである。ゆえにPC12細胞の神経突起形成においてCdc42、N-WASP、Arp2/3complexというシグナル伝達系が欠かせない働きをしていることが分かった。一方、新しいWASPファミリー蛋白として見出したWAVEに結合する蛋白を調べ、その結果IRSp53という蛋白を見出した。WAVEにはWAVE1、2、3の三つのアイソフォームがあるが、IRSp53はそのSH3ドメインを介してWAVE2に特異的に直接結合した。さらにN末部においてRhoファミリーの一つRacとも直接結合した。その結果Rac/IRSp53/WAVEという三者の蛋白複合体が形成され、IRSp53が「アダプター」としてRacへWAVE2を運んでいることを明らかにした。またその結果Arp2/3complexが強く活性化され、Rac活性化時のラッフル膜形成(膜の波打ち現象)に関与していることを突き止めた。まず、N-WASPがアクチン重合を誘導するメカニズムとして、アクチン重合核形成誘導因子Arp2/3complexを活性化することを明らかにした。N-WASPのC末部にはアクチンを制御するVCA領域があるが、そのうち最もC末部に位置するCA領域がArp2/3complexに、そしてV領域が単量体のアクチンとそれぞれ直接に結合した。このとき、Arp2/3complexの持つアクチン重合核形成能が極めて顕著に上昇し、in vitroでのアクチン重合のスピードを促進した。このVCA領域はWASPや後述するWAVEにも存在しており、WASPファミリー蛋白はArp2/3complexの制御因子群であることが示唆された。さらに全長のN-WASP蛋白ではこのVCA領域がマスクされており、普段はArp2/3complexを活性化できないが、Cdc42やPIP2の添加によりそれが解除されVCA領域単独のものと同程度の活性が観察され、N-WASPの機能制御に関わる重要な知見を得た。次に他のWASPファミリー蛋白としてデータベース中に機能不明のcDNAクローンを見つけ、それをWAVEと名付けた。この他にも、そのWAVEとよく似た蛋白を更に2つ見つけ出しそれらをまとめてWAVE1、2、3、と命名した。これらWAVEsはWASPやN-WASP同様Arp2/3complexを活性化するVCA領域を持っていたが、Cdc42との結合領域はなかった。実際、変異体発現による解析からWAVEsはCdc42の下流でなくRac下流において機能し、ラッフル膜形成に関与する蛋白であることを明らかにした。
極低温からの熱容量測定による機能性セラミックスの原子空孔生成エントロピーの決定

酸化物系機能性セラミックスは,導電体として用いられ,産業界にとって重要な材料として応用が広がっている.様々なドーパントの添加と,それに伴う酸素イオン空孔(V^<●●>_O)や侵入型酸素欠陥(O^"_i)の導入によって,これらの機能特性が変化する.本研究では,SOFCのカソード候補材料であるLa_XSr_<1-X>MO_<3-δ>(M=Fe, Co),および液晶ディスプレイの透明電極ITOについて,絶対零度付近から高温までの定圧熱容量(C_p)測定を行い,V^<●●>_OあるいはO^"_iの導入に伴う,相転移や格子振動状態の変化を検討した.また,La_XSr_<1-X>MO_<3-δ>については,極低温のC_pの測定結果からデバイ温度(Θ_D)を決定し,そのΘ_Dに基づいてデバイ関数から定容熱容量(C_v)のを求め,V^<●●>_Oの導入に伴う格子振動状態の変化を検討した.ITOでは,In^<3+>をSn^<4+>(Sn^●_<In>)で置換すると増加した正の電荷を補償するためO^"_iが形成される.C_p測定の結果,Sn^●_<In>とO^"_iが短範囲に規則して,振動のエントロピーが減少することが分かった.この短範囲規則化が,バンドギャップ中のSn^●_<In>準位とO^"_i準位を縮退させ,可視光の吸収を防ぎ,高い透明性と伝導性を兼備させていることが判明した.酸化物系機能性セラミックスは,導電体として用いられ,産業界にとって重要な材料として応用が広がっている.様々なドーパントの添加と,それに伴う酸素イオン空孔(V^<●●>_O)や侵入型酸素欠陥(O^"_i)の導入によって,これらの機能特性が変化する.本研究では,SOFCのカソード候補材料であるLa_XSr_<1-X>MO_<3-δ>(M=Fe, Co),および液晶ディスプレイの透明電極ITOについて,絶対零度付近から高温までの定圧熱容量(C_p)測定を行い,V^<●●>_OあるいはO^"_iの導入に伴う,相転移や格子振動状態の変化を検討した.また,La_XSr_<1-X>MO_<3-δ>については,極低温のC_pの測定結果からデバイ温度(Θ_D)を決定し,そのΘ_Dに基づいてデバイ関数から定容熱容量(C_v)のを求め,V^<●●>_Oの導入に伴う格子振動状態の変化を検討した.ITOでは,In^<3+>をSn^<4+>(Sn^●_<In>)で置換すると増加した正の電荷を補償するためO^"_iが形成される.C_p測定の結果,Sn^●_<In>とO^"_iが短範囲に規則して,振動のエントロピーが減少することが分かった.この短範囲規則化が,バンドギャップ中のSn^●_<In>準位とO^"_i準位を縮退させ,可視光の吸収を防ぎ,高い透明性と伝導性を兼備させていることが判明した.ITOは,In_2O_3とSnO_2からなる固溶体で,携帯電話やパソコンの液晶ディスプレイの透明電極として使用されている.ドーパント,SnO_2の添加により,バンドギャップ中Sn^<4+>レベルやIn^<3+>空孔レベルを導入し,電気伝導度を高めている。しかしながら,これらの不純物準位は可視光を吸収する原因となるため,これらの電子配置を調べる必要がある.電子配置は,配位子場分裂に依存することからSn^<4+>イオンとIn^<3+>空孔の配置と直接関係がある.本年度の研究では,ITO固溶体について,イオンや空孔の配置を与える熱力学量,混合のエントロピー,Δ_<mix>S,を検討した.2,5,7および10mol%のSnO_2を含有するITO固溶体を,焼結法により作製した.まず,絶対零度付近(3K)から,熱容量,C_p,の測定を緩和法によって行い,直接,熱力学第3法則に基づき,基準状態を純In_2O_3とSnO_2とする,混合のエントロピー,Δ_<mix>S_<298>,を決定した.比較のため,金属イオンサイトをIn^<3+>,Sn^<4+>およびIn^<3+>空孔がランダム配置する理想状態の配置のエントロピー,Δ_<mix>S_<ideal>,を計算し,実験結果と比較した.SnO_2の添加量が増加しても,Δ_<mix>S_<298>は,Δ_<mix>S_<ideal>から大きく偏倚し,ほとんど変化しないことが分かった.この原因は,添加したSn^<4+>およびIn^<3+>空孔が自己組織化により規則化し,配置のエントロピーが増加しないためであると推測する.この規則化が,バンドギャップ中の浅い位置での不純物準位の縮退をもたらし,可視光の吸収が起こらず,その結果,ITOは,相矛盾する特性,すなわち,高い透明性と伝導性を兼ね備えると結論した.

ITOは,In_2O_3とSnO_2からなる固溶体で,携帯電話やパソコンの液晶ディスプレイの透明電極として使用されている.ドーパント,Snは,InサイトにSn^・_<In>として置換する.また,電荷補償のため,侵入型酸素欠陥(O^"_i)が形成されている.これらは,バンドキャップ中に,Sn^・_<In>ドナー準位やO^"_iアクセプター準位を形成する。これらの不純物準位が,電気伝導性を与えている.しかし,これらの不純物準位は,可視光の吸収原ともなるため,これらの電子配置を調べる必要がある.電子配置は,配位子場分裂に依存することから,Sn^・_<In>とO^"_iの配置と直接関係がある.前年度の研究では,ITO固溶体のSn^・_<In>とO^"_iの存在状態を熱力学的に検討するため,絶対零度付近(3K)から室温まで,熱容量,C_<p'>の測定を緩和法によって行い,298Kにおける混合のエントロピー(Δ_<mix>S_<298>)を決定した.本年度は,2種類のITO固溶体,In_<0.388>Sn_<0.010>O_<0.602>およびIn_<0.383>Sn_<0.014>O_<0.603>のC_pを,1350Kまで決定した.この高温C_pには,本申請研究において導入の特殊な熱流束安定型装置を用いた.本年度の高温C_pと前年度の低温C_pとを組み合わせ,熱力学第3法則に基づき,基準状態を純In_2O_3とSnO_2とするΔ_<mix>Sを決定した.Δ_<mix>Sは,高温まで,負の値を示すことが分かった.この理由は,Sn^・_<In>とO^"_iが短範囲に規則して,振動のエントロピーが減少するためである.ITOは,スパッタリングや蒸着法により,ガラス基盤上の薄膜として製造されている.この成膜過程は,運動エネルギーの高い高温状態から低い低温状態への変化とみなすことができる.Δ_<mix>Sが高温まで負の値であることは,成膜過程においてもSn^・_<In>とO^"_iが短範囲に規則化し易いと解釈できる.この短範囲規則化が,バンドギャップ中のSn^・_<In>準位とO^"_i準位を縮退させ,可視光の吸収を防ぎ,高い透明性と伝導性を兼備させていると結論する.La_XSr_<1-X>FeO_<3-δ>はSOFCのカソード候補材料である.この物質では,La^<3+>をSr^<2+>(Sr'_<La>)で置換すると減少した正の電荷を補償するため酸素イオン空孔(V^<・・>_o)が形成される.このV^<・・>_oは,導電率や磁気転移点などの物性値と密接に関係がある.本年度,La_XSr_<1-X>FeO_<3-δ>について,絶対零度付近から高温までの定圧熱容量(C_p)測定を行い,V^<・・>_o導入に伴う磁気転移点や構造相転移点の変化を検討した.また,極低温のC_pの測定結果からデバイ温度(Θ_D)を決定し,そのΘ_Dに基づいてデバイ関数から定積熱容量(C_V)を求め,V^<・・>_oの導入に伴う格子振動状態の変化を検討した.なお,試料組成は原子の総数1モル,すなわち,La_<0.2>Fe<0.2>O_<0.6>, La_<0.144>Sr_<0.062>Fe_<0.206>O_<0.588>およびLa_<0.105>Sr_<0.105>Fe_<0.211>O_<0.579>と表記した.標準状態の物質La_<0.2>Fe_<0.2>O_<0.6>では,約750Kにおいて磁気転移,また,約1260Kにおいて構造相転移が起こることが分かった.V^<・・>_oを導入したLa_<0.144>Sr_<0.062>Fe_<0.206>O_<0.588>およびLa_<0.105>Sr_<0.105
鉱物中の放射線損傷量をどう見積もるか?ラマン分光法とFT法を用いた研究

鉱物中に蓄積された放射線損傷は,鉱物の物性をコントロールしたり,年代測定を可能にする重要な情報である。本研究では,ラマン分光分析,ウランの自発核分裂飛跡観察(FT法),ウラン・トリウム濃度測定(LA-ICPMS分析およびFT法)を組み合わせる事により,推定放射線損傷量とラマン分光シグナルとの関係を数式化し,放射線損傷量の定量法を確立する事をめざすとともに,年代測定への応用や,物性変化への影響の吟味を行うことを目的としている。Nasdala et al.(2001)はラマンスペクトラの1000カイザー付近に現れるν3(SiO4)bandの半値幅(FWHM)がウラン・トリウム濃度とU-Pb年代から計算したα線量と直線関係にあることを示した。昨年度,化学組成の変化がラマンスペクトルのFWHMにどのように影響を与えるかを合成ジルコンを用いて調査したところ,3周期の元素はジルコンに入りやすく,またその濃度とFWHMは直線の関係を示すことが分かった。ただしその時の濃度は5000ppm以上必要であるが,これは天然のジルコンでは滅多にないほどの高濃度である。従って天然ジルコンのラマン分析においてあまり化学組成を気にする必要はないといえる。今年度はFT法で利用される年代標準試料の化学分析,ラマン分析を行った。もっとも多くの微量元素を含むものでも3000ppmを超えることはなかったため,ラマン分析結果に化学組成の影響を考慮する必要がなかった。ラマン分析結果は試料によって差はでなかった。また人工的に誘導核分裂によってトラックを増やした試料のラマン分析も行ったが,これも差はでなかった。したがってFT密度とラマン分析には明快な関係が見られなかった。ただしこのラマン分析は顕微ラマン分光器を利用したため,測定点の設定に影響を受けている可能性がある。Nasdala et al. (2001)はラマンスペクトラの1000カイザー付近に現れるν3(SiO4)bandの半値幅(FWHM)がウラン・トリウム濃度とU-Pb年代から計算したα線量と直線関係にあることを示した。我々は化学組成の変化がラマンスペクトルのFWHMにどのように影響を与えるかを調査するために、各試料に1種類ずつ微量元素(Lu, Ce, Nd, Ho, B, Co, Ba, Sr, As, Yb, Mn, Sc, U)を強制的に混入させた合成試料を13種類用意した。ラマン分光分析は若狭湾エネルギー研究センターで行い,化学組成の分析は金沢大学のLA-ICPMS分析装置で行った。その結果,これらの微量元素のそのうち,3周期の元素はジルコンに入りやすく,またその濃度とFWHMは直線の関係を示すことが分かった。また鉱物合成に利用した試薬起源のHfも高濃度を示したが,FWHMには影響を与えないことも分かった。3周期の微量元素量がラマン分光に影響を与えるにはその濃度は^5000ppm以上必要であるが,これは天然のジルコンでは滅多にないほどの高濃度である。
肉畜資源としての口之島野生化牛の高度利用に関する研究

口之島野生化牛と黒毛和種の交雑種(KJB)に慣行肥育を行い,発育,筋線維特性および枝肉特性を黒毛和種(JB)と比較した.KJBはJBより後躯が小さい特徴を有した.KJB最長筋の筋線維型は育成・肥育期間を通してJBよりも細い筋線維を有していた.KJBの枝肉は,JBに比べて特に歩留等級で劣るものの,脂肪蓄積はJBよりも少なく,また前肢帯部分の産肉性に優れていることが明らかとなった.本研究の成果より口之島野生化牛を利用した特徴的な牛肉生産の可能性が示唆された.本申請研究は、我が国の在来牛である口之島野生化牛(以下、野生化牛)を遺伝資源として利用することで放牧主体により生産された牛肉の高品質化が可能であるという仮説を検証する第一段階として、野生化牛と黒毛和種の間の交雑牛(以下、KJB)の慣行肥育における発育および肉質特性を検討することを目的としている。研究期間3年間(H23H25)において、慣例肥育下での(i)KJBの体重および体尺測定値の推移(ii)KJBの胸最長筋筋線維型および筋線維直径の推移(iii)KJBの胸最長筋における筋周膜および筋内膜の厚さの推移(iv)屠殺後のKJB胸最長筋における筋線維型同定、筋線維直径計測および筋内コラーゲン構築の4点に関して検討する予定である。平成23年度にKJBの流産が発生し、年度終了時点においてKJB3頭および黒毛和種2頭であったが、平成24年度出生の黒毛和種1頭を供試牛として確保し、試験牛計6頭の確保は達成された。これらの供試牛は、平成23年8月までに出生した先行牛群(KJB2頭および黒毛和種2頭)とそれ以降に出生した後行牛群の間に約9ヵ月の月齢差があるため、各々月齢に応じた同様の飼養管理を行いながら並行して試験を行っている。体重および体尺測定は予定通り全供試牛で毎月行っており、得られたデータから、KJBの初期発育特性を日本暖地畜産学会(平成24年11月)において公表した。一方、生研針による胸最長筋サンプル採取は、先行牛群で6、12、18ヵ月齢、後行牛群で6、12ヵ月齢のサンプリングが完了している。現在、その組織化学的特性を解析中である。先行牛群のうち、KJBは平成25年9月に、また黒毛和種は同年11月に27ヵ月齢を迎え、屠殺が予定されている。屠殺解体処理に関しては、既に平成24年度中に県内食肉企業に協力を打診し了承を得ている。本申請研究は、我が国の在来牛である口之島野生化牛(以下、野生化牛)を遺伝資源として利用することで、放牧主体で生産された牛肉の高品質化が可能との仮説を検証する第一段階として、野生化牛と黒毛和種の交雑種(以下、KJB)の慣行肥育における発育および肉質特性を検討した。研究期間である3年間(H23H25)において、まずKJBおよび対照となる黒毛和種の産仔を各3頭以上作出し、当牧場慣例の育成・肥育管理を行いながら(i)KJBの体重および体尺測定値の推移(ii)KJBの胸最長筋筋線維型および筋線維直径の推移(iii)KJBの胸最長筋における筋周膜ならびに筋内膜の厚さの推移(iv)屠殺後のKJB胸最長筋における筋線維型同定、筋線維直径計測および筋内コラーゲン構築の4点に関して検討する予定である。平成23年度にKJBの流産が発生したものの、平成24年度はじめにKJBおよびJB各3頭の確保は達成された。これらの供試牛は平成23年8月までに出生した先行牛群(各区2頭)と平成24年はじめに出生した後行牛群(各区1頭)で同様の飼養管理を行いながら並行して試験を行っている。平成25年度も体重および体尺測定は予定通り全供試牛で毎月行っている。また、生研針による胸最長筋サンプル採取も全供試牛で予定月齢時(6、12、18ヵ月齢)で完了し、得られたデータから、KJBの体成長および骨格筋特性を日本畜産学会(平成25年9月)および日本暖地畜産学会(平成25年10月)において公表した。平成25年度は、9月にKJB2頭、11月にJB2頭が出荷月齢27ヵ月齢に達し、予定通り県内食肉企業の協力を受け、KJB、JB各2頭の右半丸枝肉を回収し、解体試験を実施した。平成25年度終了時点で、後行牛群が24ヵ月齢を迎えており、現在後行牛群の体重、体尺測定を継続するとともに、先行牛群の解体試験から得られたサンプルを解析中である。口之島野生化牛と黒毛和種の交雑種(KJB)に慣行肥育を行い,発育,筋線維特性および枝肉特性を黒毛和種(JB)と比較した.KJBはJBより後躯が小さい特徴を有した.KJB最長筋の筋線維型は育成・肥育期間を通してJBよりも細い筋線維を有していた.KJBの枝肉は,JBに比べて特に歩留等級で劣るものの,脂肪蓄積はJBよりも少なく,また前肢帯部分の産肉性に優れていることが明らかとなった.本研究の成果より口之島野生化牛を利用した特徴的な牛肉生産の可能性が示唆された.

本申請研究は、我が国の在来牛である口之島野生化牛(以下、野生化牛)を遺伝資源として利用することで放牧主体により生産された牛肉の高品質化が可能であるという仮説を検証する第一段階として、野生化牛と黒毛和種の間の交雑牛(以下、KJB)の慣行肥育における発育および肉質特性を検討することを目的としている。研究期間である3年間(H23H25)において、まずKJBおよび対照となる黒毛和種の産仔を各3頭以上作出し、当牧場慣例の育成・肥育管理を行いながら(i)KJBの体重および体尺測定値の推移(ii)KJBの胸最長筋筋線維型および筋線維直径の推移(iii)KJBの胸最長筋における筋周膜ならびに筋内膜の厚さの推移(iv)屠殺後のKJB胸最長筋における筋線維型同定、筋線維直径計測および筋内コラーゲン構築の4点に関して検討する予定である。平成23年度前半に分娩予定であったKJBの流産が発生したため、供試牛獲得が大幅に遅れたものの、現在までに、KJB3頭(平成23年6月出生2頭、平成24年3月出生1頭)および黒毛和種2頭(平成23年8月出生2頭)の産仔を得ており、毎月の体重測定、体尺測定を行っている。平成23年中に得られていない供試牛(黒毛和種1頭)に関しては、平成24年度前半には確保する予定となっている。頭数不足により統計解析には至らないものの、KJBの体重曲線は野生化牛と黒毛和種の中間で推移し順調な発育を示している。現在、体尺測定から得られたデータをもとに各個体の体重に対する各部位の相対成長率を解析中である。また、6か月毎に行う予定である生研針による胸最長筋サンプル採取も生後6か月齢(KJB:12月、黒毛和種:2月)で第1回目を無事終了しており、現在、凍結切片作成および組織化学的染色を行いその特性を解析中である。平成23年度に供試牛の流産が発生したものの、平成24年度には全ての供試牛の確保を完了した。しかし、供試牛全6頭のうち、平成23年8月までに出生した先行牛群4頭(KJB2頭および黒毛和種2頭)とそれ以降に出生した後行牛群2頭(KJB1頭および黒毛和種1頭)の間に約9ヵ月の月齢差が生じており、全体的な研究の進行は当初の予定より9ヵ月間遅延していると言える。この供試牛の月齢差を短縮することは不可能であるが、先行牛群と後行牛群を並行して調査することで可能な限りスムーズな研究遂行を行っている。経時的な作業が必要となる供試牛の体重、体尺測定データおよび胸最長筋サンプル採取は先行牛群および後行牛群ともに予定通り既定月齢で行っており、データおよびサンプル採取に欠損ならびに遅延はない。現在、採取した胸最長筋サンプルの凍結切片作成、組織化学的染色、免疫組織化学的染色を進めており、当初の目的のうち(ii)KJBの胸最長筋筋線維型および筋線維直径の推移および(iii)KJBの胸最長筋における筋周膜および筋内膜の厚さの推移を解析している。これらを総合すると全体的な進捗状況は供試牛全6頭のうち2頭に9ヵ月程度の遅延があるため、やや遅れていると評価される。本申請研究の平成23年度の研究計画では、年度中旬までにKJBおよび黒毛和種の産仔を各4頭得る予定であった。しかし、KJBの流産が発生したため、年度中旬までにKJBおよび黒毛和種を各2頭得るにとどまった。あらかじめ事故発生も予想し、必要頭数以上の種付けを行っていたため、年度後半の3月にはKJB1頭を得て、統計解析に必要なKJB3頭を確保することができた。KJBおよび黒毛和種の発育および骨格筋特性を比較する本申請研究では、両供試牛の雌雄差および育成・肥育時期をそろえる必要がある。通常、鹿児島大学農学部附属入来牧場(本申請研究実施場所)では、年間を通して黒毛和種の生産を行っているため、KJBの産仔に合わせて、雌雄および出生時期を黒毛和種で調整する予定としている。現在、平成23年度後半(3月)に得られたKJB1頭の対照として適合する黒毛和種の選定を行っている。年度中旬までに必要頭数の2/3の出生にとどまった点は、当初の研究計画から若干遅延している点である。
特徴カラムの組み合わせによる物体像の表現と視覚認識

覚醒下のサルの高次視覚野から複数の特徴カラムの神経活動を同時に計測できる技術(多電極アレイ)を確立し、それによって、サルに物体像が提示されたときに物体像の特徴カラムの組み合わせによる表現が密から疎に変化することを明らかにした。また、この研究に付随して、特定の物体カテゴリーの特徴を表現しているカラムが集まった構造が高次視覚野にあることを新たに見出した。私たちは、これまでの研究で、麻酔下の動物において視覚的に提示された物体像は下側頭葉視覚連合野ITにコラムの組み合わせとして表現されることを明らかにした。さらに、提示した物体像を単純にすると、活動していたカラムの一部が消失することから、ITのそれぞれのカラムは物体像に含まれる図形特徴を表していて、物体像はこのような図形特徴カラムの組み合わせとして表現されることが示唆された。本プロジェクトでは、覚醒下の動物が物体像を認識する過程で、このような図形特徴の組み合わせによる物体像の表現はどのような役割を担っているかに取り組んでいる。その第一ステップとして、本年度は、複数のカラムの活動を覚醒動物から記録することを可能にする多電極アレイの技術を確立した。ITは前部(TE)と後部(TEO)に分けられる。当初、処理の段階としては一番先のTEへのインプラントを試みたが、TEの周辺の海綿骨は大変柔らく、電極アレイを安定に維持することが困難であった。この問題を解決するために、骨の再生を促す技術の開発を進めている。この課題については、現在も検討を進めている。一方、後部TEOは海綿骨を露出することなく電極アレイを安定にインプラントすることに成功し、物体像に対して引き起こされるカラムのパターンを行動動物から記録することに成功した。麻酔下の動物の研究との関連性を明らかにするために、同一動物の物体像に対する物体像に対する反応を覚醒下と麻酔下で比較する研究を行った。また、別の動物において物体像を認識するタスクのデザインとでトレーニングが完了した。麻酔下の動物を用いたこれまでの研究で、物体像は下側頭葉視覚連合野ITに複数のコラムの興奮を引き起こすこと、その物体像を単純にすると、活動していたカラムの一部が消失することがわかった。これらの研究から、ひとつひとつのカラムは物体像に含まれる図形特徴を表現していて、物体像はこのような図形特徴カラムの組み合わせとして表現されることが示唆された。本プロジェクトでは、覚醒下の動物が物体像を認識する過程で、このような図形特徴カラムの組み合わせによる物体像の表現はどのような意味を持つかに取り組む。そこで、カラム応答を覚醒動物から記録するための電極アレイ技術を開発し、それを用いて認識課題遂行中のカラム応答を記録する。その過程において本年度は以下の成果を上げた。1.ITの上を覆う骨は海綿骨で柔らかく電極アレイを固定することがきわめて難しいという問題があった。電極アレイの構造上の問題を解決することで、この問題を解決した(J.Neurosci.Methods誌に投稿中)。2.覚醒下のカラム応答の持つ役割の解明の一歩として、電極アレイによる神経活動を覚醒と麻酔下で行い両者の比較検討を行った。その結果、時間平均の発火応答をベースにした物体像に対する応答は麻酔下と覚醒下においてほぼ同じであること、しかし、応答の時間経過をみると、覚醒時の応答には刺激選択性の低い早い成分と刺激選択性の高い遅い成分があるのに対し、麻酔下においてはそのような時間的な区分がはっきりしなかった。さらに動物数を増やして検討することが必要であるが、麻酔下でみられるコラムの応答は覚醒下において早い応答と遅い応答に分離して観測されることが明らかになった。本研究で得られた高次視覚野(TE野)についてのこれまでの成果をまとめ、Journal of Neuroscience誌に投稿し、現在Review中である。この論文において、図形特徴を符号化するコラムの組み合わせとして物体像が表現されているという考え方と、物体像のカテゴリーを表すコラムより大きな構造体(パッチ)が物体像(特に「顔」)を符号化しているという考え方の2つを結びつける新しい構造体としてモザイクが高次視覚野に存在することを示した。一つのモザイクはパッチに対応し、物体像カテゴリーを表現している。一つのモザイクは、複数のコラム(モザイクを構成する個々のピース)から構成され、一つ一つのコラムは物体像の中にある図形特徴を表している。このようなモザイク構造に関して、われわれは、物体像に対する応答を高密度に記録し解析することで実験的な証拠を得た。人は行動の目的によって物体像のカテゴリーの情報が必要になったり、あるいは、個々の物体像を特定するために図形特徴の情報が必要になったりする。本研究から、高次視覚野の異なる空間スケールの構造体の情報にアクセスすることで、目的に応じた視覚情報を取り出すことが可能にしていることが明らかにされた。電極アレイの開発が予想以上に難しく、行動課題遂行中の動物からの記録をまだ開始できていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。下側頭葉視覚連合野はTE野とTEO野に区分される。

電極アレイからの記録はTEO野においては比較的容易なので、TEO野を研究の対象として進め、時間的な余裕があればTE野に取り組むことにする。また、新しい問題として、麻酔下と覚醒下で時間経過が異なることが分かった。本研究は麻酔下の応答特性をもとに計画されているので、麻酔下と覚醒下でどのように応答に違いがあるかを明らかにしておかなければならない。この問題にも、本計画の中で取り組んでいく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
非営利企業のファイナンスとガバナンス

非営利企業における権限分配のあり方(ガバナンス)および資金調達の方法(ファイナンス)について、営利企業のそれを参照しながら検討し、非営利企業の事業の内容と、事業体のなかで労働・金銭などの出資財産が占める重要度によって、課題が全く違うことを指摘した。また、会社法におけるいくつかの判例につき、非営利法人における問題の共通点と相違点とを考察した。平成20年度前半は、在外研究のメリットを生かして政治経済学の視点からする営利法人について分析し、研究実績においてはその知見を非営利企業に活かすことを試みた。また、平成20年度後半においては、金融のほか農業や医療などの分野において同様の知見を活かすことを提唱し、研究会等で発表を継続した。実績の公刊は遅れており、交付申請書において平成20年度中に発表予定とした非営利企業のガバナンスと法人-信託に関する分析論文は、現時点で本年度の原稿提出予定であり(トラスト60研究叢書所収予定・平成21年3月原稿締切)、また、平成20年度まで学術創生プロジェクト(現在科研(A)「持続性確保に向けたガバナンス改革と政策プロセスマネジメント」として継続中)の一環として、共同研究を進めてきた非営利法人ガバナンス一般に関する研究成果(共著書として出版予定)も、各メンバーのスケジュール調整が難しく、凍結されている。そのため、直接に非営利企業についての分析をタイトルとした研究実績はとくにない。もっとも、端的にはコーポレートガバナンスを題材とするものの、2008年度前半の研究の知見を活かすものとして、オーストラリアの研究者との共著になるCorporate governance in the 21st century : Japan's gradual transformationが出版されている。研究者は同書において1つの章を担当し、中小企業のガバナンスの在り方を規定する社会の変化、社会の一部としての法の影響、これを反映した現在の中小企業の活動状況および今後の展望について分析を行った。その意義は、会社のガバナンスを法的視点からのみとらえがちな日本の法学を超えた分析枠組みを、外国への紹介という場を通じて実現するところにある。このような手法をとることで、ガバナンスの抱える問題点や、営利性や事業の効率性の有無とガバナンスの関係を記述しやすくなる。上記2つの原稿においても、同様の視点が分析に活かされている。本年度は、会社法に関連する評釈などを行いつつそのファイナンス・ガバナンスがどの程度非営利法人に共通する要素を含むかについて考察を行った。アメリカでは非営利法人かどうかは選択で決まる部分があり、会社と実質的に同じ仕組みでのガバナンスが可能であるが、資金の返還を行わない点では両者は本質的に異なる。ガバナンスの点からは、下記11の二件目に記載した判例が取り扱う墓地開発などは、株式会社でない形態で行われることが多く、本取締役会決議は非営利法人理事会決議と基本的に類似性格を持つものである。非営利法人には小規模なものが多く、また研究の主たる関心となっている資産とくに不動産の価値の寄与度の大きな会社については、その寄付者が経営に参画していることが通常であることから、理事会の決裁を経ない重要な決定を行って法人を破綻に追いやることが非常に強く懸念される。その意味で、本件判決は非営利法人ガバナンスと関連が深く重要性があるものと考えられる。ファイナンスの点からは、同一件目の判例が取り扱う名簿閲覧の形での出資者ガバナンスが注目される。会社法においては、「権利の乱用」にわたる閲覧請求は認められないとし、これらと、より具体的な拒絶事由である競争関係にある場合との関係が議論される。非営利法人においては、競争関係は観念しにくいところから、こうした概念の扱いと意義を確認する意味が認められる。第3件目については、出資者の裾野を広げるという効果は、会社におけるような出資単位のアレンジメントでは達成しにくいことが明らかとなったと思われる。
因子つきリーマン面のモジュライのグラスマン埋込

研究代表者は,大場清と共同で,Strebelの2次微分の理論に相当するものを,1次微分に対して構築してきた.まず,Gauss平面上の平行・等長なスリットの対(井桁と名づける)からRiemann面をつくることを考えた.その結果明らかになったことは,この構成がmoduliを局所的には記述できること,はさみ合同の問題(Hilbertの第3問題)との関連,種数1の場合にどのように拡張すればmoduli全体を記述できるか,であった.一般の種数の場合にどのような拡張をおこなえばよいかがつぎの課題であったが,Giddings-Wolpertと中村によるバンド分解のアイデアや,Boedigheimerの理論を受けて,1次微分を極のまわりから「標準的に」積分していく方法を開発した.それはつぎのような筋である.1次微分はRiemann面上に,零点と極を除いて,affine構造を誘導する.このときさらに直線の傾きも大域的に意味をもつ.そこで零点と極,零点と零点を結ぶ,実軸に平行な半直線,線分をRiemann面上に引くことにより,バンド分解が得られる.その結果得られるデータは,ribbon graph上のcycleやcocycleである.これを稲妻列と名づけた.この稲妻列から元のRiemann面が再現される.ribbon graph上のcycle,cocycleは,3次元多様体の量子不変量,3次元双曲多様体,また数体を幾何的に記述するGrothendieckのDessinの理論にも現れる.井桁はスリットを平行移動ではりあわせるものだが,180度まわしてはる方法(反平行井桁)も考えられる.これはむしろ2次微分の理論である.(Strebelのものとは異なるが.)この場合も同様に,moduliの局所的記述が可能である.さらに反平行井桁は,超楕円曲線の記述に適していることがわかる.本研究は,大場清氏(お茶の水女子大学理学部)との共同研究である.リーマン面上の1点に2位の極をもつ有理型微分,すなわちダイポールの,積分の多価性を位相幾何的に記述することによって,リーマン面のモジュライの非自明なサイクルを可視化し,森田・マンフォード特性類を理解することを目標として研究を開始した.平成10-11年度は,ダイポールのモジュライの佐藤グラスマン多様体への埋込について調べることを課題としている.これは「森田・マンフォード特性類の分類空間は何か」という問題意識に促されてのことであった.平成10年度はこの研究の基礎を固める作業を行った.第一に,リーマン面上の有理型微分の積分の多価性を「帯分割」のアイディアにより系統的に記述することに成功した.このアイディアの本質的な点は,積分値の偏角を固定して有理型微分の積分路を指定するところにある.これにより,平成9年度幾何学シンポジウムで発表した,有理型微分の「線型ポアンカレ双対」の構成をより簡潔かつ透明にすることができる.特にダイポールの場合に限定すると,そのモジュライが「区間置換型平行2n辺形」の配位空間によって分岐的に被覆されることが証明される.このとき超楕円曲線上の不変ダイポールが「対辺型平行2n辺形」にちょうど対応していることも明らかになった.また,「帯分割」により,我々の研究とベーディッヒハイマー氏やギディングズ氏・ウォルパート氏の仕事との関連もより明解になった.第二に,射影構造のダイポールによる定式化に成功した.これにより,射影リーマン面のモジュライを周期写像のシンプレクティック・リダクションとみなすことができる.研究代表者は,大場清と共同で,Strebelの2次微分の理論に相当するものを,1次微分に対して構築してきた.まず,Gauss平面上の平行・等長なスリットの対(井桁と名づける)からRiemann面をつくることを考えた.その結果明らかになったことは,この構成がmoduliを局所的には記述できること,はさみ合同の問題(Hilbertの第3問題)との関連,種数1の場合にどのように拡張すればmoduli全体を記述できるか,であった.一般の種数の場合にどのような拡張をおこなえばよいかがつぎの課題であったが,Giddings-Wolpertと中村によるバンド分解のアイデアや,Boedigheimerの理論を受けて,1次微分を極のまわりから「標準的に」積分していく方法を開発した.それはつぎのような筋である.1次微分はRiemann面上に,零点と極を除いて,affine構造を誘導する.このときさらに直線の傾きも大域的に意味をもつ.そこで零点と極,零点と零点を結ぶ,実軸に平行な半直線,線分をRiemann面上に引くことにより,バンド分解が得られる.その結果得られるデータは,ribbon graph上のcycleやcocycleである.これを稲妻列と名づけた.この稲妻列から元のRiemann面が再現される.ribbon graph上のcycle,cocycleは,3次元多様体の量子不変量,3次元双曲多様体,また数体を幾何的に記述するGrothendieckのDessinの理論にも現れる.井桁はスリットを平行移動ではりあわせるものだが,180度まわしてはる方法(反平行井桁)も考えられる.これはむしろ2次微分の理論である.(Strebelのものとは異なるが.)この場合も同様に,moduliの局所的記述が可能である.さらに反平行井桁は,超楕円曲線の記述に適していることがわかる.
性決定元祖遺伝子の双方向進化.精巣および卵巣決定.

ツチガエルの性連鎖遺伝子SOX3(哺乳類の雄決定遺伝子SRYの元祖遺伝子)の卵巣決定機能を解析した。対立遺伝子W-SOX3とZ. SOX3の5'上流領域にそれぞれに特異的な2種類のエレメントを同定した。ZW雌の未分化生殖線ではW-SOX3の発現が特に高く、CYP19やFOXl2の性的二型発現開始に先んじて発現した。ZZの受精卵へW-SOX3遺伝子を導入し、生殖細胞への導入個体を得たが、卵巣分化は誘導されなかった。哺乳類の精巣決定遺伝子SRYはSOX3遺伝子か進化したことが知られている。ツチガエルの1つの地域集団は雌ヘテロ(ZZ/ZW型)の性決定機構を有し、SOX3遺伝子がZW性染色体に存在すること、しかも、性決定期にはZW幼生の生殖腺で強く発現することから、SOX3遺伝子の卵巣決定機能が示唆されている。そこで、本年度は、ツチガエルSOX3遺伝子のゲノム構造、とくにZ-SOX3とW-SOX3間で調節領域の比較解析を行った。ゲノムサザン解析の結果、BamHI酵素で切断した場合、SOX3遺伝子を含む12kbpの断片が切り出されることが判明したので、ZW雌のBamHI-12kbpDNA断片をファージベクターλFixに導入してゲノムライブラリーを作成した。Sox3DNAプローブでスクリーニングした結果、W-SOX3を含むクローンを2個、Z-SOX3を一個得た。制限酵素地図からSOX3遺伝子の5'上流3.5kbpを含むことがわかったため、塩基配列を決定し、ZとW遺伝子間の違いを調べた。その結果、ZとWともに上流300bpの配列はほぼ完全に一致していたが、約1kb上流ではW-SOX3に2種類の7塩基のエレメントが存在し、しかも両者はお互いにほぼ完全なパリンドローム構造を示した。一方、Z-SOX3ではその部分が完全に欠失していた。また、約0.5kbp上流では、逆にZ-SOX3だけに特異的な35塩基の配列が2種類存在した。これらの配列がZとW-SOX3発現の違いを誘導している可能性が示唆される。そこで、トランスジェネシスによる解析を行うため、得られた断片を利用して導入コンストラクトを作成した。SOX3遺伝子は哺乳類の精巣決定遺伝子SRYの元祖遺伝子として知られるが、ツチガエルのZZ/ZW型性染色体をもつ1つの地域集団では、SOX3がZW性染色体上に存在し、しかもZW幼生の生殖腺で強く発現する。このことから、哺乳類とは逆に卵巣決定機能が示唆されている。そこで、本年度は、ツチガエルSOX3遺伝子の発現について、とくに発生に伴う生殖腺での発現解析を中心に行った。ZW集団の新潟と金沢の2つの集団を用いて、SOX3遺伝子を中心に10個の性分化関連遺伝子の発現を定量的PCRで解析した。その結果、ツチガエルの生殖腺の性分化指標マーカーとしてCyp17とCyp19遺伝子があるが、SOX3の雌での高発現はこの2つの遺伝子の雌雄差発現が開始する以前に起こり、それぞれより2日4日早く開始していた。ただし、金沢ではSOX3が15日目に一度雄での高い発現を示した。次に、XX/XY型性染色体をもつ浜松の集団で同様の遺伝子解析を行ったところ、SOX3は発生の早い時期(15-19日)には雌で発現が高く、Cyp19開始の16日目より先行していたが、20-24日目には逆に雄で発現が高いという2面的発現を示した。以上の結果から、SOX3はツチガエルにおいて、卵巣、精巣の両方の性分化に関与していることが示唆された。なお、W-SOX3 Promoter+EGFPのトランスジェニックガエルを作成したところ、ふ化後の腹部にシグナルが観察されたが、生殖腺には目立ったシグナルが見られなかった。哺乳類の精巣決定遺伝子SRYは、SOX3遺伝子から進化したことが知られている。ツチガエルのZZ/ZW型性染色体をもつ1つの地域集団では、このSOX3がZW性染色体上に存在し、しかもZW幼生の生殖腺で強く発現する。そこで、本年度は、ツチガエルSOX3遺伝子を受精卵に導入するトランスジェネシスの実験を行い、SOX3遺伝子の機能を調べた。プロモーターはツチガエル自身のSOX3遺伝子の5'上流約3kbを用い、導入手法にはゼブラフィッシュやアフリカツメガエルで導入効率の高いメダカのトランスポゾンTol2mRNAを供導入する方法と、もう一つのMeganuclease法を併用した。受精卵に導入した後、生殖腺の観察は変態後に行った。W-SOX3遺伝子が導入されたZZ個体を1個体得た。生殖腺の外部形態は精巣であり、組織切片においても精巣構造が確認された。

ただし、生殖腺の周辺部は卵黄状の細胞質をもつ細胞が確認され、卵巣化の様相も観察されたが、明確な同定はできなかった。さらに、生殖細胞のみに遺伝子が導入されたZZ2個体を得たが、これらは典型的な精巣構造を示した。また、W-SOX3をXY集団の受精卵に導入したところ、生殖細胞のみに導入されたXY6個体を得たが、いずれも正常な精巣構造を示した。一方、Y染色体にあるY-SOX3をXX受精卵に導入したところ、1個体のXXを得たが、これは正常な卵巣構造を示した。以上の結果から、W-SOX3とY-SOX3は、少なくとも生殖細胞に導入された場合は、いずれも遺伝的な性を変更する機能を示さず、それぞれ卵巣決定および精巣決定機能を有していないと予想される。しかし、体細胞への導入個体を得ていないため、結論を導くのは現時点ではむずかしい。正確な機能解析の結果を知るため、F1の調査が必要である。
臨床応用を見据えた幼少期ストレス由来脳機能異常に対するエピゲノム治療研究

deadCRISPR-Cas9を用いた配列特異的DNAメチル制御システムは用いる遺伝子の巨大さが原因となり、生体への遺伝子導入としてよく用いられているAAVでは使用できなかった。本研究では配列特異的DNAメチル制御システムを改良し、AAVで利用可能なように再構築した上で、AAVのマウスへのinjectionによる、活動個体でのDNA配列特異的な人為的DNAメチル化制御が行動に与える影響の評価を行った。マウスNeuro2A細胞を用いたin vitroでの検証ではCas9とDNAメチル化酵素のDnmt3Aとメチル化補酵素Dnmt3Lの組合せにより高効率の配列特異的DNAメチル化制御を、さらにTet2遺伝子の酵素部位を用いることで配列特異的DNA脱メチル化についても高いDNA脱メチル化効率を実現できるAAVにパッケージング可能範囲で機能するDNAメチル化制御システムが構築できたことが分かった。さらに一般に用いられている精製プロトコルを用いても10^14 copies/ml以上の高いタイターをもった機能的AAVが得られた。これらのAAVをマウス海馬にインジェクションし、シナプス可塑性制御因子BDNFのプロモーターのDNAメチル化制御を行った結果、in vivoでのDNAメチル化制御のAAVは十分な感染効率を示し、脳内で配列特異的DNAメチル制御システムを機能していることを示唆するデータを得た。また、さらなる検証が必要な段階ではあるものの、海馬におけるBDNFプロモーターのDNAメチル化が活動依存的な遺伝子発現制御に関わっており、BDNFプロモーター特異的なDNAメチル化制御によって行動に影響を与える事を示唆するデータを得ている。そのため、本研究の目的であったエピゲノム治療の前段階としての活動個体におけるDNAメチル化制御システムの検証はほぼ達成できていると考えられる。
呼吸法の動物モデル確立とその意志動力学への応用

意志力を強化させうる東洋の伝統的な瞑想・訓練法の中心にある深い呼吸、すなわち低速度の呼吸法について、動物モデルを活用してその生物学的意義を明らかにし、意志力の神経メカニズムの解明に迫る。本研究では、伝統的訓練法の核をなす呼吸法をマウスが実行できるシステムを作製し、呼吸法が意志力に与える影響を解析し、意志力の調節モデルを確立する。前回の公募研究の中で、マウスの呼吸速度を自由行動下に測定するシステムを立ち上げ、意志に関わる行動異常を示すマウス系統で呼吸パターンの異常を見出している。本研究ではそれらのマウスの意志力の回復も目指す。