hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特発性心室細動症候群に対する網羅的遺伝子解析

2014年度末までに突然死をきたす循環器疾患のDNAサンプル収集は順調で約250人のサンプルが集まっている。そのうち次世代シーケンサーにて遺伝子解析が完了したものは約100症例で、現在までおおむね順調に進展している。特徴的な心電図所見を呈する特発性心室細動を新たなチャネル病として確立させ、さらに心室細動の発生機序と病態を解明し、新しい治療法を探索する。また若年発症や家族発生が認められる完全右脚ブロックを呈する心室細動症例の解析から、健常集団において完全右脚ブロックを呈する症例、さらに全くの健常集団に解析対象を拡大することにより、例えば人間ドック等で遺伝子解析を行うことで将来の心臓突然死のリスクを計算することを目標とする。循環器病学今後さらに50サンプルの解析を終了した時点で、塩基多型、遺伝子変異を含めた解析結果をまとめる。また遺伝子変異の同定された家族性ブルガダ症候群および特発性心室細動症例は同研究室内のiPS細胞チームとの協力において疾患特異的変異iPS細胞を作成し細胞レベルでの表現型の検討を行う。次世代シークエンサーの試薬購入にあたり当初の計画より割安で購入することが出来たため。効率的な調達の結果として残額が生じた。次年度の実験試薬類の購入に充てる。試薬などの消耗品に充てる予定である。
フォノン工学

本研究プロジェクトの最終年度である今年度は,THz波光源の高効率化・高出力化のため,GaP結晶の光導波路およびフォトニック構造によるTHz波の閉じこめ効果,結晶冷却によるTHz波吸収の低減,端面損傷回避による高エネルギー励起を検討・実現するとともに,GaPやSi,さらにGaNなどの半導体結晶や溶液試料のフォノンに関する知見を得た.また,通信波長帯光デバイスおよび周期分極反転結晶を用いた差周波THz波発生では,MHzオーダの狭スペクトル特性を有する連続THz波発生を実現した.さらに,GaAsタンネットダイオードにおいては,走行層厚みの最適化とともに,共振器構造としてWR-1.2(492900GHz),WR-1.0(5901100GHz),WR-0.8(7381400GHz)を検討した.GaAs分子層エピタキシーにて作製したエピ構造を組み込みWR-1.0の共振器構造にて,室温における基本波CW発振706GHzを実現した.この値はこれまでの共鳴トンネルダイオードの712GHz(基本波による世界最高発振周波数)に迫るものである.また,WR-0.8の共振器構造を用いたタンネットにおいても発振動作が確認されており,1THz以上の発振の可能性を示唆する結果を得た.THz帯のコヒーレントラマン分光については,誘導ラマン利得分光システムにおいて,励起レーザの高繰り返し化および光学系アライメントの徹底によるエネルギー効率化を図った.さらに,コヒーレント反ストークスラマン分光計においては高安定な共焦点型配置を検討し,生体分子(水溶液,生体粉末)について0.951THzの超広帯域にわたる振動スペクトルを取得し,さらに偏光解析により低周波領域(2-15THz域)の生体分子振動の強い共鳴を見出し,THz帯振動についての新たな知見を得た.本研究プロジェクトは,テラヘルツ(THz)帯のフォノンをアクティブに制御・活用した小型・高性能のTHzデバイスを創出し,THz帯の物性情報を収集するとともにTHz帯の超高速光通信や物質制御等に応用し新学際領域を創成することを目的としている.本年度はまずフォノンを介した非線形光学効果に基づくTHz波発生(THz波パラメトリック分光)に対する研究を進め,本研究グループで育成した有機非線形光学結晶DASTを用いた差周波混合により,0.210THzにおよぶ広帯域周波数可変性をもつコヒーレントTHz波の発生を実現した.さらに,擬似位相整合を用いた高効率な非線形波長変換技術(光パラメトリック発振)を用いて,生体試料で損失の小さい1μm帯のコヒーレント・アンチストークスラマン(CARS)分光システムの構築を進め,THz帯中赤外域の動作を確認した.次に,高効率なラマン増幅・分光に対する研究として,テーパー構造を有するGaP-AlGaP導波路を作製して導波路光損失率と増幅率を測定し,導波路構造の最適化を行った.また,GaPAs-GaPヘテロエピタキシャルの成長条件を開発してGaPAsGaP導波路を試作し,導波路光損失率と自然ラマン散乱特性を評価した.さらに,THz差周波発生のための要素技術と光学測定系を検討・構築した.一方,THz電子デバイスに対する研究としては,GaAsの分子層エピタキシーにおける不純物添加のメカニズムを検討し,300°C程度の成長温度で高濃度不純物添加を実現した.この方法を用い,微細なタンネットダイオード構造(P+/n+/n-/n+)を作製して共振器(Jバンド:220-325GHz)内に設置し,室温で,320GHz,-12dBmの基本モードCW発振を実現した.本研究プロジェクトは,テラヘルツ(THz)帯のフォノンをアクテイブに制御・活用した小型・高性能のTHzデバイスを創出し,THz帯振動情報の取得,THz帯の超高速光通信,物質状態の制御等に応用することにより,新しい学際領域を創成することを目的としている。本年度は,新たにインストールしたTHz波パラメトリック分光装置を糖類や蛋白質等の生体分子に応用し,THz帯に固有の振動ピークを新たに検出した.これにより,THz帯が新しい指紋領域として利用できる可能性をもつことを見出した.さらに,非線形光波長変換技術を駆使して,生体試料で低損失な0.8μm帯のコヒーレント・アンチストークスラマン(CARS)分光システムの新たに構築し,水に溶けた生体高分子の振動スペクトルを超広帯域(THz帯中赤外域)に検出することに成功した.また,ラマン増幅・分光の研究として,GaP半導体結晶に入射する近赤外光の位相整合条件を満たすことにより,フォノンを介する差周波混合に基づくテラヘルツ波発生に成功した.GaP結晶に入射する2、つの光の角度を平行からわずかにずらすことにより,波長可変なテラヘルツ波が0.3-7.5THzの広帯域において発生し,これを物質のTHz分光に応用した.一方THz電子デバイスの研究としては,GaAsの分子層エピタキシーを用いて,走行層50nm,75nmおよび100nmのタンネット構造を作製し,Jバンドの共振器内に設置し高出力(室温連続発振で320GHz,0.8mW)を実現した.

さらに高周波数域である400-500GHzの周波数帯(導波管WR2.2)の共振器構造を試作し,タンネットの発振を確認した.400-500GHz帯の検出では,これまでの導波管内でのハーモニックミキサーあるいは定在波測定とは異なり,シリコンボロメータおよびファブリペロー干渉計を用いた光学的測定システムを初めて採用した.本研究プロジェクトでは,テラヘルツ(THz)帯のフォノンを制御・活用した小型・高性能THzデバイスを創出し,新しい応用展開に基づく新学際領域の創成を目的としている。昨年度までに,開発した周波数可変THz波光源やコヒーレントラマン分光システムを用いて生体分子を中心にTHz帯分光情報の収集を進め,新しい特徴的な振動ピークを見出しつつある.今年度は,まず新たな非線形光学材料(GaP,GaSe,ZnGeP_2等の半導体結晶および有機非線形結晶DAST)を用いた差周波発生(DFG)を検討し,超広帯域(サブTHz20THz)局波数可変のナノ秒パルスTHz波発生を実現した.また,高効率動作を目的とする導波路型半導体(GaP系)についても,DFG-THz波発生を確認し,ピーク周波数の導波路サイズ依存性を観測した.さらに,連続(CW)THz波発生を目的とする半導体電子デバイス(分子層エピタキシー技術に基づくTUNNETTダイオード)については,走行層距離や共振器構造の最適化設計・製作を行い,210510GHzの室温CW発振を実現した.光波からのアプローチとしては,ピコ秒パルス動作・CW動作の双方が可能な,半導体レーザーと光ファイバー増幅器に基づく高出力2波長光源システムを独自に開発し,周期分極反転LiNbO_3結晶中でのDFGにより,1-2THz領域において周波数可変で高繰り返し(100MHz)のピコ秒パルスTHz波発生とCW-THz波発生に成功した.一方,ラマン効果を利用したTHz帯振動分光の研究としては,誘導ラマン利得分光(ストークス光増幅)によってベンゼン等の液体分子や糖水溶液のスペクトル測定を行い,THz帯振動バンドを観測した.また,既に構築したコヒーレント・反ストークスラマン分光(CARS)システムを用いて,偏光特性利用した液体試料の計測を行い,液体試料で問題となる非共鳴バックグランドを低減した,コントラストの高いピーク検出に成功した。さらに,強誘電体超格子構造の周期に依存した特異なフォノンの振る舞いを,THz帯振動のCARS測定によって初めて見出した.本研究プロジェクトでは,テラヘルツ(THz)帯のフォノンを制御・活用した小型・高性能のTHzデバイスを創出と応用展開に基づく新学際領域の創成を目的としており,今年度は,まずTHz波光源の性能向上への検討として,GaP結晶中のフォノン・ポラリトンを用いたTHz波発生では,100200μm程度の断面サイズを有する導波路構造を用いてフォノンを閉じ込め,高効率なTHz波発生を実現した。さらに,THz波発生の高効率化について結晶の物性(成長法や冷却効果)との関係を明らかにした。また,1.5μm帯の超高速光制御デバイスおよび周期分極反転結晶を用いた差周波THz波発生では1.5THz付近の連続THz波発生を実現し,光ファイバ接続の小型モジュール化を行った。さらに,有機結晶DASTを用いたTHz波発生では光注入型光パラメトリック発生を用いた狭スペクトルTHz波発生,およびガルバノ制御光パラメトリック発振器(OPO)を用いた広帯域・高速波長可変のTHz波発生を実現した。また,GaAsの分子層エピタキシーを用いて作製したタンネットダイオードは,室温連続発振で650GHzまでの高周波化を実現した。この発振器は独自の矩形導波管型共振器構造を用いており,WR-1.5(393750GHz),WR-1.2(492900GHz)を用いた。
キメラ抗体を用いた肺小細胞癌の画像診断と治療法の開発

1.モノクロ-ナル抗体による画像診断イメ-ジングの期間を短縮するために抗体をFab'に切断し、これにテクネシウム99mを標識した。テクネシウム標識モノクロ-ナル抗体をヒトに投与した場合、24時間以内に血中クリアランスは5%以下となり、主に腎で排泄された。これを用いて、ヒトの肺小細胞癌患者の癌病巣の画像診断を行ったところ、約90%の病巣が検出可能であった。又、新たにこの方法で発見される病巣も5ー10%あった。我々は更に100名の肺小細胞癌患者について画像診断を行ったところ、この方法により未治療の肺小細胞癌患者のステ-ジングが可能であった。2.キメラ抗体による肺小細胞癌の治療^<131>Iで標識したモノクロ-ナル抗体を用いて、ヌ-ドマウス移植ヒト肺小細胞癌の治療を行った。その結果、300μCi以上の^<131>I標識抗体の投与により、腫瘍の増殖抑制および縮小効果が得られた。この結果をヒトに応用するために^<131>I標識モノクロ-ナル抗体の肺癌患者への投与を行った。ガンマ-シンチグラフィ-によりヒトにおいても腫瘍部位に^<131>I標識抗体の集積が確認された。今後、^<131>I標識抗体の投与量を増大する予定である。又、ヒトマウスキメラ抗体を作成し、テクネシウムと同様の構造をもつβーemitterであるレニウムを標識し、ヒト肺小細胞癌患者の治療を行ったが、100mCiまででは効果は認められなかった。抗体の結合量を増やすために、Tはとー2の認識する抗原蛋白およびcDNAを分離し、新しく異なるエピト-プ対する抗体の作成を行った。これら同一の抗原蛋白に対する多種の抗体に^<131>Iやレニウムを標識することにより腫瘍局所へeffective doseの大量の放射線照射が可能と考えられる。1.モノクロ-ナル抗体による画像診断ヌ-ドマウス移植肺癌を用いた動物実験により、^<131>I標識モノクロ-ナル抗体が投与後4日目以後には腫瘍のイメ-ジングが可能であることが判明した。イメ-ジングの期間を短縮するために抗体をFab'に切断し、これにテクネシウム99mを標識した。又、新たにこの方法で発見される病巣も5-10%あった。我々は更に、この方法により未治療の肺小細胞癌患者のステ-ジングが可能かどうか、約100名の肺小細胞患者について画像診断を行った。現在、その結果について分析中である。2.モノクロ-ナル抗体による肺小細胞癌の治療^<131>Iで標識したモノクロ-ナル抗体を用いて、ヌ-ドマウス移植ヒト肺小細胞癌の治療を行った。

又、テクネシウムと同様の構造をもつβ-emitterであるレニウムを標識したモノクロ-ナル抗体を用いたヒト肺小細胞癌患者の治療についても開始した。今後、用量を増大して効果についての検討を行う予定である。従来、我々は肺小細胞癌に出するモノクロ-ナル抗体に^<131>Iを標識しこの抗体の免疫シンチグラフィ-での有用性及び抗腫瘍性を検討してきた。又、抗体に^<99m>Tcを結合し、この抗体を用いて肺小細胞癌患者のイムノシンチグラフィ-を試み、その画像診断における有用性を明らかにした。本年度はこの抗体に^<131>Iを結合させ、肺癌患者に投与し肺小細胞癌の^<131>I標識抗体による治療に使用することを目的にその安全性と実用性を検討した。対象は各種組織型の肺癌患者で、患者には甲状腺の被爆を予防するため、あらかじめ600mg/dayのヨ-ドカリを10日間服用させた。精製したモノクロ-ナル抗体を^<131>Iで標識し、抗体はヒトアルブミンを含んだバッファ-に溶解した。標識した抗体はミリポアフィルタ-で滅菌し、5mCiの^<131>I標識モノクロ-ナル抗体(Specific activity 3mCi/mg protein)を静脈内投与した。1,4,7日後ガンマシンチカメラで全身を撮影した。抗体はヒト肺癌に対するマウスモノクロ-ナル抗体であるが、特別な副作用は認められなかった。又、ガンマシンチグラフィ-では良質な腫瘍画像を描出し、効率よく腫瘍細胞に結合していると考えられ、これらの結果より^<131>I標識モノクロ-ナル抗体はヒトの肺癌のミサイル療法に使用可能と思われる。しかし、マウスでの^<131>I標識抗体の有効投与量は300μCiであることから、ヒトでは500mCi程度の投与が必要となると推定される。大量の^<131>I標識抗体の投与は重篤な骨髄障害を引き起こすと考えられるため骨髄移植の併用や、又血中の不用な抗体を血漿交換などで早期に除去するなどの技術的問題を克服する必要があると考えられる。本年度は肺癌に対するモノクロ-ナル抗体TFS-2に放射性同位元素を結合させ、タ-ゲッティングによる放射線治療を行うため、TFS-2の抗原を分離し、又そのcDNAクロ-ニングを行い、これらを用いてTFS-2に対する新規なモノクロ-ナル抗体を多種類作成し、これらに放射性同位元素を標識し、小細胞癌の治療法を完成させることを目的とした。TFS-2はテクネシウム標識により、小細胞癌や非小細胞癌の組織に選択的に集積することがImaging studyで判明した。又、^<181>Iや^<186>Re等の治療用アイソト-プと結合させることにより動物実験ではヌ-ドマウス移植腫瘍を縮小させることが判明している。しかし、人体に^<181>Iや^<186>Reを標識したTFS-2を投与した場合はeffective doseにまで投与量を増大させることができず、治療効果は得られなかった。そこで我々はTFS-2の認識する抗原を分離しTFS-2が認識するepitopeとは異なるepitopeを認識する新たな抗体を多種類作成し、これらを^<181>Iや^<186>Reで標識し、カクテルにして患者に投与することにより小細胞癌に対するeffective doseを得ることが可能と考えた。その結果、TFS-2をセファロ-スに結合させたアフィニティカラムを用いてヒト肺小細胞癌組織よりTFS-2の認識する抗原を精製した。抗原は分子量約40,000と33,000の2種類のバンドとして得られた。
移植治療用細胞の遺伝的不安定性の指標となるマーカーの探索

細胞治療用細胞の品質管理について効率的かつ定量的な検査法を検討することが本研究の目的である。DNA傷害に関連したマーカー発現に着目し、フローサイトメーター(FCM)あるいは免疫蛍光染色により細胞表面マーカー、細胞接着因子、増殖因子受容体、細胞周期関連蛋白の動態を解析した。γ線照射により細胞増殖が抑制され細胞と核が肥大化したことに加えγ-H2AXが過剰発現した。しかしデジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)によりγ線を照射した生細胞を観察したところ、細胞サイズに関する指標のみ変化があり、DNA傷害に関連したマーカーは大幅に上昇はしなかった。これよりDHMは細胞品質管理に有用であることが示された。移植治療用細胞の効率的かつ定量的な検査法を模索して、DNA傷害に関連したマーカーについて検討することが目的である。1)酸化ストレス刺激細胞モデルの作製患者の同意のもとドナーから骨膜片を採取して組織片培養により細胞をシート状のまま増幅した。直径が40-60 mmになった時点で分散させ実験に供した。ヒト骨膜細胞に対して、X線、γ線、紫外線(UVA or UVC)、あるいはH2O2で酸化ストレスを与えた。染色体検査(Karyotype test)とCGH (Comparative Genomic Hybridization)法により、染色体異常(コピー数の欠失・過剰)を直接検出した。最も重要なモデル細胞は、検出可能な程度のDNA傷害を引き起こすレベルのストレスを与えることによって、ほとんどの細胞が生存して、一定期間後に再び増殖活性を示すものであり、その条件を見極めた。2)DNA・染色体以外のキャラクタリゼーション平行して、細胞の増殖/生存とγ-H2AXの核内集積(foci形成)からDSBsを評価してスクリーニングした。フローサイトメーター(FCM)あるいは免疫蛍光染色(IF)により、細胞表面マーカー(CD73など)、細胞接着因子(integrinなど)、増殖因子受容体(EGFRなど)、細胞周期関連蛋白(p21, cyclin Dなど)の動態を解析した。FCMにより細胞および核の体積(Electronic volume)を計測評価した。原子間力顕微鏡(AFM)により単一細胞レベルで細胞接着力を計測評価した。接着力は増殖活性の低下や細胞の老化と相関して強くなる傾向があった。βガラクトシダーゼ染色やリン酸化Rbタンパクの発現より生存細胞の老化度を評価した。培養骨膜細胞に対して、様々な酸化ストレスを与えた場合、親和性の高い抗体が利用できるリン酸化H2AX(γ-H2AX)とp53の発現を鋭敏に検出できること、特に酸化ストレスが大きい場合は1週間以上にわたって検出できることを発見した。これより酸化ストレス刺激細胞モデルの作成については成功した。このモデルを用いてDNA傷害の解析として染色体検査(Karyotype test)とCGH (Comparative Genomic Hybridization)法により、染色体異常(コピー数の欠失・過剰)を直接検出した。DNA・染色体以外のキャラクタリゼーションとして細胞の増殖/生存とγ-H2AXの核内集積(foci形成)からDSBsを評価してスクリーニングした。さらにフローサイトメーター(FCM)あるいは免疫蛍光染色(IF)により、細胞表面マーカー(CD73など)、細胞接着因子(integrinなど)、増殖因子受容体(EGFRなど)、細胞周期関連蛋白(p21, cyclin Dなど)の動態を解析した。次にFCMにより細胞および核の体積(Electronic volume)を計測評価した。1、酸化ストレス刺激細胞モデルの作製:ヒト骨膜細胞に対して、X線、γ線、紫外線あるいはH2O2で酸化ストレスを与えた。染色体検査とCGH(Comparative Genomic Hybridization)法により、染色体異常を直接検出した。最も重要なモデル細胞は、検出可能な程度のDNA傷害を引き起こすレベルのストレスを与えることによって、ほとんどの細胞が生存して、一定期間後に再び増殖活性を示すものであった。2、DNA・染色体以外のキャラクタリゼーション:細胞の増殖/生存とγ-H2AXの核内集積(foci形成)から二重螺旋の破壊を評価してスクリーニングした。フローサイトメーター(FCM)あるいは免疫蛍光染色(IF)により、細胞表面マーカー、細胞接着因子、増殖因子受容体、細胞周期関連蛋白の動態を解析した。βガラクトシダーゼ染色やリン酸化Rb(retinoblastoma protein)の発現より生存細胞の老化度を評価した。3、デジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)による非接触的細胞品質評価の試み:細胞の品質管理についてヒト骨髄由来・脂肪組織由来間葉系(MSC)および骨膜細胞にγ線を照射し、生細胞をDHMで観察し、形態的指標を数値化した。さらにDNA修復タンパクをFCMで評価した。40種以上の評価指標のなかで唯一、細胞サイズに関する指標のみ有用であった。MSCは骨膜細胞に比べてγ線に対する感受性が高いこと、DNA修復タンパクの持続的発現亢進が認められなかったことから、DHMは細胞品質管理に有用であることが示された。

DNA傷害に関連したマーカー発現に着目し、フローサイトメーター(FCM)あるいは免疫蛍光染色により細胞表面マーカー、細胞接着因子、増殖因子受容体、細胞周期関連蛋白の動態を解析した。γ線照射により細胞増殖が抑制され細胞と核が肥大化したことに加えγ-H2AXが過剰発現した。しかしデジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)によりγ線を照射した生細胞を観察したところ、細胞サイズに関する指標のみ変化があり、DNA傷害に関連したマーカーは大幅に上昇はしなかった。これよりDHMは細胞品質管理に有用であることが示された。1)マーカー分子の探索を行う計画である。(1)DNA傷害マーカーと分類されている抗体を用いて、Western blot法あるいは免疫蛍光染色(IF)により、マーカー分子の発現を評価する。文献等で目星をつけながらも、膨大な数の市販品のなかから、特異性が高く、DNA修復後もその痕跡を示すようなマーカーを見つける。経済的なサンプリング・キットなどを積極的に活用する。(2)前項のFCMなどによるキャラクタリゼーションで変化の認められた表面マーカーなどについても、さらに長期間にわたって追跡評価する。(3)メチル化DNAをDNAアレイにより網羅的に解析し、DNA傷害や細胞老化と関連のあるサイトを絞り込む。(4)DNA傷害から回復し、再び増殖活性を示すようになった細胞について、集中的に検討する。2)日本再生医療学会などでの研究成果発表歯周病学次の研究が本年度行われていない。1)マーカー分子の探索:(1)DNA傷害マーカーと分類されている抗体を用いて、Western blot法あるいは免疫蛍光染色により、マーカー分子の発現を評価する。市販品のなかから、特異性が高く、DNA修復後もその痕跡を示すマーカーを見つける。サンプリング・キットなどを積極的に活用する。(2)前項のFCMなどによるキャラクタリゼーションで変化の認められた表面マーカーについても、さらに長期間にわたり追跡評価する。2)各種学会での研究成果発表:研究成果は、日本再生医療学会、日本バイオマテリアル学会、日本歯周病学会等で発表するとともに、論文として国際的な学術誌に投稿する。消耗品費として、各種抗体類、細胞・培養関係試薬類、プラスチック器具類、研究成果発表として国内学会出席費用、その他としてCGH(Comparative Genomic Hybridization)法委託解析費用、メチル化DNA委託解析費用、英文雑誌投稿料に使用する計画である。
p53誘導因子によるウイルス感染防御の分子機構

p53はがん抑制遺伝子として重要であるが、ウイルス感染防御における役割についてはよく解っていない。我々は、p53がFbw7βを誘導してウイルス感染防御にはたらく事を見いだした。Fbw7には3つのアイソフォームが存在するが、Fbw7βが強力にウイルス感染防御に作用することを明らかにした。本研究の成果は、新たな抗ウイルス剤の開発につながる可能性がある。p53がウイルス感染防御に関与していることを明らかにした。さらに、その分子機構を検討したところ、p53により誘導されるFbw7βが必須であった。Fbw7βは、p53依存性の発ガン抑制に重要であることは良く知られているが、ウイルス感染防御における役割については、現時点では不明な点が多い。本研究の目的は、Fbw7βにより誘導される、ウイルス感染防御の機構の解明と、その分子基盤を明らかにすることである。Fbw7には3つのアイソフォームが存在する。そこで、Fbw7により誘導される抗ウイルス作用が、Fbw7βだけが有する機構か否について検討するため、Fbw7の各アイソフォームの発現ベクターをFbw7機能欠損細胞に導入し、種々のDNA(HSV-1)、RNAウイルス(VSV)を感染させた後、細胞増殖能および、細胞内でのウイルスの増幅能を解析した。Fbw7βを遺伝子導入した細胞では、ウイルス感染により誘導される細胞死がほとんど認められなかった。細胞内でのウイルス増幅は遺伝子レベル、タンパクレベルの両方で抑制されていた。また、他のアイソフォームではFbw7βに比べて、抗ウイルス効果は減弱していた。Fbw7により誘導されるウイルス増幅の抑制は、ウイルス核酸の種類に関係なく認められ、Fbw7βがもっとも強いことが示された。申請者らは、p53がウイルス感染防御に関与していることを明らかにした。Fbw7βは、F-box型のユビキチンリガーゼで、c-mycやcyclinEなどの細胞周期を正に制御する分子群を負に制御することから、発ガン抑制因子と注目されている。Fbw7βは、p53依存性の発ガン抑制に重要であることはよく知られているが、ウイルス感染防御における役割については、現時点では不明な点が多い。Fbw7は標的分子に結合、ユビキチンし、プロテアソーム系を用いて分解することで生物学的活性を発揮する。平成23年度は、Fbw7βにより誘導される抗ウイルス機構に関与する分子を同定するために、Fbw7βのN末端側にHaloTagを付加したプラスミドを作製した。293T細胞にHaloTag融合Fbw7βを強制発現させた後、HaloTag Beadsを用いて、プルダウンし、その産物を質量分析器にかけ、Fbw7βと相互作用するタンパクをいくつか同定した。現在、プロテオーム解析により得られた結果をもとにしてFbw7βと相互作用する因子に対するsiRNAを作製し、細胞に導入してウイルス感染防御効果を検討している最中で、ポジティブな結果を得ている。
原子核系およびサブ原子核系におけるクラスター的様相の研究の企画

昭和63年度に原子核系およびサブ原子核系のクラスター的様相に関する第5回国際会議(第5回クラスター国際会議と略称)を日本で開催することになっており、本研究はこの会議に備えて研究内容面に関して特に必要な企画等の準備を行ってきた。組織委員会に設けられたプログラム委員会では今後とり上げるべき課題を広く検討した。また昭和62年1月12日から14日に至る3日間原子核研究所で行なわれた「核物理におけるクラスター的様相」の研究会では100人近い研究者が出席してこの分野の今後について広く検討した。添付したのはこの報告書である。その結果次の諸課題をとりあげるのが適当であることになった。1軽い核および重い核におけるクラスター構造2分子共鳴、高励起高スピン分子状態3直接反応におけるクラスター的様相4原子核衝突におけるクラスター生成5エキゾティック崩壊、核分裂および核融合6クラスター・ダイナミックスの微視的理論7有限温度、非平衡過程におけるクラスター現象8ハイパー核におけるクラスター的様相9サブ原子核系におけるクラスター的様相10原子核合成と天体物理学昭和63年度に原子核系およびサブ原子核系のクラスター的様相に関する第5回国際会議(第5回クラスター国際会議と略称)を日本で開催することになっており、本研究はこの会議に備えて研究内容面に関して特に必要な企画等の準備を行ってきた。1軽い核および重い核におけるクラスター構造2分子共鳴、高励起高スピン分子状態3直接反応におけるクラスター的様相4原子核衝突におけるクラスター生成5エキゾティック崩壊、核分裂および核融合6クラスター・ダイナミックスの微視的理論7有限温度、非平衡過程におけるクラスター現象8ハイパー核におけるクラスター的様相9サブ原子核系におけるクラスター的様相10原子核合成と天体物理学
トランスアミドソームによるGln-tRNA(Gln)合成反応の多分子協調機構

トランスアミドソームによるアミルアシルtRNA(Gln-tRNA^Gln,Asn-tRNA^Asn)の間接合成経路における多分子協調機構を解明するため,黄色ブトウ球菌と緑膿菌由来のトランスアミドソームの各構成因子6個の大量調製を行い,2種類のトランスアミドソームを再構し,結晶化を試みた結果,緑膿菌由来のAsn-tRNA^Asnトランスアミドソームの構造解析に成功した.得られた結晶構造は,生化学実験と一致して,tRNA^Asn:ND-AspRS:GatCAB=2:2:2の割合で構成され,tRNA^Asnのアクセプターステムが,ND-AspRSの活性部位に位置していたことから,tRNA^Asnがアミノアシル化される前の状態と言え,この後,アクセプターステムがアミノアシル化(ミスチャージ)され,GatCABの活性部位に向かってフリップすることで,トランスアミデーション反応が起こると考えられる.トランスアミドソームによるアミルアシルtRNA(Gln-tRNA^Gln,Asn-tRNA^Asn)の間接合成経路における多分子協調機構を解明するため,黄色ブトウ球菌と緑膿菌由来のトランスアミドソームの各構成因子6個の大量調製を行い,2種類のトランスアミドソームを再構し,結晶化を試みた結果,緑膿菌由来のAsn-tRNA^Asnトランスアミドソームの構造解析に成功した.得られた結晶構造は,生化学実験と一致して,tRNA^Asn:ND-AspRS:GatCAB=2:2:2の割合で構成され,tRNA^Asnのアクセプターステムが,ND-AspRSの活性部位に位置していたことから,tRNA^Asnがアミノアシル化される前の状態と言え,この後,アクセプターステムがアミノアシル化(ミスチャージ)され,GatCABの活性部位に向かってフリップすることで,トランスアミデーション反応が起こると考えられる.本研究はGln-tRNA^<Gln>の間接合成経路の多分子協調機構に注目して研究を進めている.間接合成経路ではND-GluRSにより一旦誤った組み合わせのGlu-tRNA^<Gln>が合成され,次いでこのGlu-tRNA^<Gln>はGatCABの働きによりアミド化され,正常なGln-tRNA^<Gln>に変換される.この反応経路において,一時的ではあるが誤った組み合わせのGlu-tRNA^<Gln>が合成されるため,誤翻訳の危険性がある.現在,この誤翻訳を防ぐために間接合成に関与する3つの因子,tRNA^<Gln>,ND-GluRSおよびGatCABが3者複合体トランスアミドソームを形成すると考えられているが,未だその存在は報告されていない.今年度本研究では,tRNA^<Gln>,ND-GluRSおよびGatCABからなるトランスアミドソームを同定するために,各因子の調製を行った.ND-GluRSとGatCABに関しては大腸菌発現系を用いて大量調製し,その後クロマトグラフィーにより高純度に精製した.tRNA^<Gln>の調製は一般的に行われるin vitro transcriptionではなく,大腸菌発現系を用いて大量調製した.次に本研究では高純度に精製したtRNA^<Gln>,ND-GluRSおよびGatCABを用いて複合体形成実験を行った.複合体の確認にはゲル濾過分析およびゲルシフトアッセイを用いた.その結果,ND-GluRSとGatCABの2者では複合体を形成しなかったが,さらにtRNA^<Gln>を加えることにより3者複合体の形成が確認された.この結果から,Gln-tRNA^<Gln>の間接合成経路におけるトランスアミドソームの形成を明らかにすることに成功した.本研究はGln-tRNA^<Gln>の間接合成経路の多分子協調機構に注目して研究を進めている.間接合成経路ではND-GluRSにより一旦誤った組み合わせのGlu-tRNA^<Gln>が合成され,次いでこのGlu-tRNA^<Gln>はGatCABの働きによりアミド化され,正常なGln-tRNA^<Gln>に変換される.この反応経路において,一時的ではあるが誤った組み合わせのGlu-tRNA^<Gln>が合成されるため,誤翻訳の危険性がある.現在,この誤翻訳を防ぐために間接合成に関与する3つの因子,tRNA^<Gln>,ND-GluRSおよびGatCABが3者複合体トランスアミドソームを形成する昨年度本研究では,大腸菌発現系を用いてtRNA^<Gln>,ND-GluRSおよびGatCABからなるトランスアミドソームを大量調製し,その後クロマトグラフィーにより高純度に精製した.そして,ゲル濾過分析およびゲルシフトアッセイを用いトランスアミドソームの形成を明らかにすることに成功した.今年度は引き続きトランスアミドソームの結晶化を進めるとともに,古細菌由来トランスアミドソームにも注目して研究を遂行した.その結果,古細菌由来トランスアミドソームの大量調製ができ,初期結晶を得ることができた.また,古細菌由来GatCABの立体構造を明らかにすることにも成功し,真正細菌由来GatCABとの構造比較から,古細菌由来GatCABに特有の反応機構を解明することができた.

その結果は第12回日本RNA学会年会および第60回日本結晶学会年会にて発表を行った本研究は,トランスアミドソームによるアミルアシルtRNAの間接合成経路における多分子協調機構の解明を目指している.一昨年度にtRNA(Gln),ND-GluRS,GatCABからなるGln-tRNA(Gln)の間接合成トランスアミドソームと,tRNA(Asn),ND-AspRS,GatCABからなるAsn-tRNA(Asn)の間接合成トランスアミドソームの構造が発表されたが,いずれも,アーティファクトの可能性を排除できないため,アミノアシル化(ミスチャージ)とトランスアミデーション反応の間に起こるtRNAの動きが明らかにされておらず,多分子協調機構の謎は残っている.私達は,緑膿菌由来のAsn-tRNA(Asn)間接合成トランスアミドソームの構造解析に向け,各構成因子tRNA(Asn), ND-AspRS, GatCABの大量調製を行い,ゲルシフトアッセイによりトランスアミドソームの再構成を確認することができた.結合実験から得られたトランスアミドソーム形成条件に基づき,結晶化を試みた結果,3.7Å分解能の構造解析に成功した.得られたトランスアミドソーム構造は,生化学実験と一致して,tRNA(Asn):ND-AspRS:GatCAB = 2:2:2の割合で構成されていた.その構造では,tRNA(Asn)のアクセプターステムが,ND-AspRSの活性部位近傍に位置していたことから,得られた構造はtRNA(Asn)がアミノアシル化される前の状態と言え,この後,アクセプターステムがアミノアシル化(ミスチャージ)され,GatCABの活性部位に向かってフリップすることで,トランスアミデーション反応が起こると考えられる.今後は,他の2種類の結晶構造と比較しながら,多分子協調機構を提案し,さらに,変異体を用いた生化学実験により検証を行い,詳細な反応機構を明らかにする.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
粒子分散強化複合材料による振動エネルギーの制御

高分子材料(PVDF)に圧電粒子(PLZT、PZT)と導電粒子(カーボンブラック:CB)を分散させた複合材料は、外部振動を圧電粒子により電気エネルギーに変換し、さらにCB粒子による導電路の抵抗によってジュール熱として散逸させることで振動を急速に制動することができる。次の主要な結果が得られた。(1)複合材料の減衰時間は材料の導電率を変化させることによって連続的に変えることができる。(2)最大の制振効率は特定の導電率(PVDF/PLZT/CB系の時CB体積分率6.5%)の時得られ、この時インピーダンスの整合条件を満たしている。(3)圧電・導電効果に基づく制振効率は複合材料の弾性率の増大と共に増大する。(5)複合材料の制振効率はPLZTなどの圧電粒子とCBの分散状態に依存し、圧電粒子の体積分率は50%以上が望ましい。(6)本実験では、試料の屈曲振動モードを用いたため、圧電効果によるエネルギー変換の効率は小さい。縦振動モードなどを利用できる方法で減衰特性をさらに向上させることができよう。
貴金属担持半導体粒子の構造とγ線照射で誘起される触媒反応の標識化合物による追跡

対象とした触媒物質は、TiO_2,ZrO_2,Y_2O_3,γ-Al_2O_3,α-Al_2O_3,SiC,TiBaO_3である。受け入れのままの粉末材料に加え、超音波化学的還元法でAu,Pt,Pdを担持したものも対象に加えた。試料の材料評価として、X線回折と透過電子顕微鏡観察を行った。γ線誘起触媒の活性の評価のため、粒子材料を蒸留水中とともにパイレックスガラス製バイアル中に入れアルゴンガスを通じて脱気してから密閉状態で^<60>Coγ線を室温照射した後、バイアル内の自由空間に滞積した水素ガスをガスクロで測定した。懸濁状態を保つために照射中も撹拌を行った。純水だけを同条件で照射し水の放射線分解による水素ガスも測り、これに対する相対値で各々の粒子材料の水素発生の活性を比較・評価した。太陽光の有効利用のため紫外線を対象とする光触媒反応で高い活性を示すチタニアはγ線触媒活性は低く、γ-,α-Al_2O_3が高い活性を示した。また、貴金属の担持の効果は調べた範囲内ではγ線触媒活性を下げ、放射線分解で発生するレベルの水素も出さなくする逆反応を示唆する組み合わせも見出した。これらの結果は、γ線と紫外線光量子の触媒作用の違いを示唆するもので、今後の研究課題を多く摘出することができた。当初の目的のひとつは、重水素で標識された分子を含む溶媒水を使い発生水素の同位体比率を質量分析器で分析し触媒の素過程の情報を得ることだったが、流用予定の質量分析器が使用不能となったため、この実験は行えなかった。しかし、超音波還元法による貴金属コロイドの担持実験の副産物として、PdとAuの同時還元により合金超微粒子ではなく、Auの核にPdの殻を持つ構造の数nm級の超微粒子を得て高分解能電子顕微鏡観察でこれを確認するという予期せぬ成果を挙げた。本研究の目的は、重水あるいは重水素で標識された有機物分子(メチルアルコール、エチルアルコールなど)を添加した軽水を溶媒としてγ線照射実験を行い、発生する水素中の重水素と軽水素の同位体比率を質量分析装置で分析し、γ線に誘起された触媒反応の素過程に関しての情報を得ることである。今年度は、別目的の既設装置を改造した。四重極質量分析器の排気系を、γ線誘起触媒作用で発生した大気圧のガス試料を導入できるように、それぞれがターボ分子ポンプを付帯持つ高真空槽と低真空槽をオリフィスで接続し作動排気装置とした。また低真空槽にはニードルバルブを設けたので、本目的に必要な性能を持つ装置となった。現在は、装置の調整と校正を行いつつある。また、この装置にガス試料を効率良く回収・移送できるようなγ線照射用のガラス製容器も設計し、試作検討中である。貴金属イオンの超音波化学的還元法で、触媒作用を増進させる可能性のある貴金属コロイドを調製した。sodium tetrachloroaurate(III)dihydrateとsodium tetrachloropalladate(II)をそれぞれ単独に還元する場合と混合して還元する場合、を比較検討した。透過電子顕微鏡を用いた観察の結果、8nmほどのサイズのコロイドがどちらかの場合も生成することが判った。また、混合して同時還元を行った場合は、溶液中のイオンの吸光度測定結果によると、まず金が還元され次にパラジウムが還元された。

X線回折は金のパターンしか示さず、金の核コアとパラジウムのシェルからなる複合構造が示唆されたので、電界放射型電子銃式高分解能透過電顕で詳しい観察を行ったところ、実際にその構造が確認された。この結果についての論文は受理され印刷中である(J.Phys.Chem.)。対象とした触媒物質は、TiO_2,ZrO_2,Y_2O_3,γ-Al_2O_3,α-Al_2O_3,SiC,TiBaO_3である。受け入れのままの粉末材料に加え、超音波化学的還元法でAu,Pt,Pdを担持したものも対象に加えた。試料の材料評価として、X線回折と透過電子顕微鏡観察を行った。γ線誘起触媒の活性の評価のため、粒子材料を蒸留水中とともにパイレックスガラス製バイアル中に入れアルゴンガスを通じて脱気してから密閉状態で^<60>Coγ線を室温照射した後、バイアル内の自由空間に滞積した水素ガスをガスクロで測定した。懸濁状態を保つために照射中も撹拌を行った。純水だけを同条件で照射し水の放射線分解による水素ガスも測り、これに対する相対値で各々の粒子材料の水素発生の活性を比較・評価した。太陽光の有効利用のため紫外線を対象とする光触媒反応で高い活性を示すチタニアはγ線触媒活性は低く、γ,α-Al_2O_3が高い活性を示した。また、貴金属の担持の効果は調べた範囲内ではγ線触媒活性を下げ、放射線分解で発生するレベルの水素も出さなくする逆反応を示唆する組み合わせも見出した。これらの結果は、γ線と紫外線光量子の触媒作用の違いを示唆するもので、今後の研究課題を多く摘出することができた。当初の目的のひとつは、重水素で標識された分子を含む溶媒水を使い発生水素の同位体比率を質量分析器で分解し触媒の素過程の情報を得ることだったが、流用予定の質量分析器が使用不能となったため、この実験は行えなかった。しかし、超音波還元法による貴金属コロイドの担持実験の副産物として、PdとAuの同時還元により合金超微粒子ではなく、Auの核にPdの殻を持つ構造の数nm級の超微粒子を得て高分解能電子顕微鏡観察でこれを確認するという予期せぬ成果を挙げた。
HTLVの感染と予防に関する基礎的並びに臨床的研究

ヒトにおけるHTLV-Iの感染経路として輸血感染,母児感染,夫婦感染の3通りが疑われており、これらの感染経路を遮断することがATLの予防対策上最も重要である。そこでウサギを用いてHTLV-Iの感染経路と予防法を検討した。1.HTLV-Iの輸血感染:HTLV-Iは20mlの輸血によりウサギからウサギに容易に感染したが、血漿の輸注によっては感染しなかった。又X線照射(6,000ラド)した血液を直ちに輸血した場合にもウイルス感染は成立したが、X線照射した血液を1-2週間4°Cに保存後輸血した場合にはウイルス感染は成立しなかった。日本では輸血によるHTLV-I感染が最も主要な感染ルートであるが、抗体陽性血を排除することにより輸血用血液が不足するならば、X線照射した保存血の使用が考慮される。2.HTLV-Iの経口感染:雄ウサギ由来のHTLV-I産生細胞を雌ウサギに週2回経口投与したところ、4匹中1匹が8週後にウイルス抗体陽性となり、このウサギからHTLV-Iが分離された。3.HTLV-Iの母児感染:4匹のHTLV-I感染ウサギ(雌2匹,雄2匹)と4匹の非感染ウサギの間でそれぞれ妊娠させ、2匹の感染ウサギから7匹の子ウサギが生れ、2匹の非感染ウサギから5匹の子ウサギが生れた。前者の7匹中4匹が6-13週後にウイルス抗体陽性となったが、後者の5匹は抗体陰性のままであった。抗体が陽転した4匹すべてからHTLV-Iが分離された。更に感染ウサギから生れた5匹の子ウサギを生直後に屠殺し、脾細胞を短期培養し、培養細胞についてウイルス抗原の検出を試みたが、全て陰性であった。これらの結果はHTLV-Iの母児感染が子宮内感染でなく、母乳を介しておこることを強く示唆する。最近私共はHTLV-Iが56°C30分の加熱により不活化されることを見出したが、この方法はヒトでの母乳感染の予防に応用出来るであろう。
夏型過敏性肺炎の診断用ELISAキットの開発とその有用性の検討

夏型過敏性肺炎は我が国の過敏性肺炎の70%強を占める重要なアレルギー性呼吸器疾患である。われわれは本症の血清診断キットの開発のため、本症の原因抗原であるトリコスポロン・アサヒに特異的な単クローン抗体(D8)を用いたサンドイッチELISAシステムを開発した。すなわち単クローン抗体を吸着したELISAプレート同菌の培養上清を反応させ、トリコスポロン・アサヒ特異的抗原を結合させた。さらにこのプレートに被験血清を反応させ、結合した検体中の抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン特異的抗体と発色基質で検出した。このシステムを用いて、夏型過敏性肺炎患者206例、各種呼吸器疾患(肺癌、特発性間質性肺炎、膠原病性間質性肺炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支喘息)66例、成人健常者128例の抗トリコスポロン・アサヒ抗体を測定した。その結果、無症正診率92.8%、有症正診率88.8%、診断効率90.8%との結果を得た。以上の成績より、本診断キットは夏型過敏性肺炎の血清診断として有用であることが確認できた。なお、本診断キットを日常診療において使用することを加納にするために、株式会社シノテストとの共同開発として、「トリコasahiiチェック」として中央薬事審議会に製造承認を申請中である。これまでの我々の研究から、夏型過敏性肺炎患者の血清中にはTrichosporon asahii、T. mucoidesに対する抗体が高力価で存在することが分かっている。夏型過敏性肺炎の診断キットの開発のため、夏型過敏性肺炎の原因抗原に特異的な単クローン抗体(D8)を用いてサンドイッチELISAシステムを開発した。即ち、単クローン抗体を吸着したELISAプレートにT asahii培養上清を反応させ、T asahii特異的抗原を結合させた。更にこのプレートに血清を反応させ、結合した検体中の抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンクラス特異的抗体と発色基質(4-アミノアンチピリン)で検出した。このシステムを用いて、夏型過敏性肺炎(58例、1.483±1.041)、他疾患患者(肺癌、間質性肺炎、気管支喘息、喘息、肺炎、サルコイドーシス、合計24例、0.028±0.050)、正常対照者(10例、0.012±0.048)の血清中の抗T asahii抗体価(IgG、IgA)を測定したところ、有意差をもって(p<0.002)夏型過敏性肺炎患者血清中の抗T. asahii抗体価(IgG)が高く測定できることが判明した。今後、更に症例を増やして測定し、陽性、陰性の閾値を決定する予定である。他疾患患者で抗体価の高い血清の抗T. asahii抗体のIgGサブクラスについての検討も行う。また、ELISAプレートが凍結乾燥した状態で保存できるかの検討も行うこれまでの我々の研究から、夏型過敏性肺炎患者の血清中にはTrichosporon asahii,T.mucoidesに対する抗体が高力価で存在することが分かっている。1.このシステムを用いて、夏型過敏性肺炎(65例、2.432±1.371)、他疾患患者(肺癌、間質性肺炎、気管支喘息、肺炎、サルコイドーシス、合計118例、0.073±0.190)、正常対照者(34例、0.018±0.032)の血清中の抗T asahii抗体価(IgG、IgA)を測定したところ、有意差をもって(p<0.002)夏型過敏性肺炎患者

血清中の抗T.asahii抗体価(IgG)が高く測定でき、ROC曲線による解析では、AUCは0.96であった。陽性、陰性の閾値は正常対照者の平均+3SDとした。2. IgGサブクラスについて検討したところ、IgG2サブクラスの抗T.asahii抗体価を測定すると更に感度が上がることも判明した。3. ELISAプレートが凍結乾燥した状態で保存する試験で、劣化しないことも確認した。夏型過敏性肺炎は我が国の過敏性肺炎の70%強を占める重要なアレルギー性呼吸器疾患である。われわれは本症の血清診断キットの開発のため、本症の原因抗原であるトリコスポロン・アサヒに特異的な単クローン抗体(D8)を用いたサンドイッチELISAシステムを開発した。すなわち単クローン抗体を吸着したELISAプレート同菌の培養上清を反応させ、トリコスポロン・アサヒ特異的抗原を結合させた。さらにこのプレートに被験血清を反応させ、結合した検体中の抗体をペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン特異的抗体と発色基質で検出した。このシステムを用いて、夏型過敏性肺炎患者206例、各種呼吸器疾患(肺癌、特発性間質性肺炎、膠原病性間質性肺炎、肺炎、サルコイドーシス、気管支喘息)66例、成人健常者128例の抗トリコスポロン・アサヒ抗体を測定した。その結果、無症正診率92.8%、有症正診率88.8%、診断効率90.8%との結果を得た。以上の成績より、本診断キットは夏型過敏性肺炎の血清診断として有用であることが確認できた。なお、本診断キットを日常診療において使用することを加納にするために、株式会社シノテストとの共同開発として、「トリコasahiiチェック」として中央薬事審議会に製造承認を申請中である。
ファイトケミカルを応用した骨粗鬆症患者の骨代謝能改善：基盤技術確立と作用機序解明

骨粗鬆症患者においては、抜歯窩の治癒遅延等の歯科的問題が生じる。ファイトケミカルとは植物由来の化学物質の総称であり、様々な生理活性を有する物質が含まれている。我々がこれまで行った研究において、ファイトケミカルの一種であるプロアントシアニジンを経口投与することで、骨粗鬆症モデル動物(卵巣摘出ラット)の頭蓋骨に作製した骨欠損の治癒が促進することを発見した。この骨治癒促進効果は歯科臨床に応用できる可能性が高い。そこで本研究では、歯科応用に最適なファイトケミカルを選定するために、様々なファイトケミカルが骨粗鬆症モデル動物の抜歯窩(歯槽骨)の治癒に及ぼす影響を比較および評価し、その作用機序を解明する。
時代物浮世草子に基づく「世界」の記述的研究

本研究は、八文字屋本の時代物浮世草子の注釈的研究を通して、各作品の「他界」を記述しようとするものである。研究期間中に注釈的な検討を終えた作品は、『風流宇治頼政』(享保5年刊)『都鳥妻恋笛』(享保19年刊、以上二作は江島其磧の作品)『勧進能舞台桜』(延亭3年刊)『龍都俵系図』(元文5年刊)『花襷厳柳嶋』(元文4年刊、以上三作品は多田南嶺の作品と考証されている)の計5作品である。ここでは「世界」の概念規定や各作品のおける具体的な「世界」のありようについて述べる余裕はないが、作品によってその様相はさまざまであり、簡単に概括することはできないようである。たとえば、『都鳥妻恋笛』の場合、従来から近松門左衛門作の浄瑠璃『双生隅田川』(享保5年初演)に基づくとされてきたわけだが、くわしく検討してみると、両者の関係は実はそれほど深いものではなく、それよりも、謡曲「隅田川」やその系譜につらなる古浄瑠璃・説経等がはるかに密接な関係を持っていることがわかってきたのである。さらに、それに加えて、元禄歌舞伎における「隅田川」ものがいくつか関与したとみられる部分もあるし、さらに、『伽婢子』『金玉ねぢぶくさ』等の怪異小説が利用された箇所もみられるのである。この一例だけからも、時代物浮世草子作品の「世界」を記述するためには、当該作品の注釈的な研究を踏まえつつ、それぞれの「世界」の系譜を考えていく必要があることを改めて痛感したのである。以上のことをふまえ、本報告には、『勧進能舞台桜』の全注釈を収めることとし、さらに、『都鳥妻恋笛』の新出異版を発見しそれによって得られた知見に基づく発表を行なったので、それもあわせて収めることにしたのである。今年度、主たる研究対象として取り上げたのは『花襷厳柳嶋』(元文4年刊)である。この作品は従来から、作中の宝物の名前を「南鈴」としていたりする点などから多田南嶺作であることが確実視されているものだが、輪講の中で確認された、彼と交わりのあった俳人達の名前が利用されていることなども、この推測を補強する材料となるものといえる。さて、この作品における最大の問題といえるのは、前半部が元禄の赤穂浪士事件を素材にしていると考えられる点である。姉妹の敵討に至るまでの展開はまさに『仮名手本忠臣蔵』を髣髴とさせるといっていいほどなのであるが、刊行年からすると、この作品の方が『仮名手本忠臣蔵』に先行することは疑いを入れない。とすれば、本作が忠臣蔵狂言の代表作であるこの『仮名手本忠臣蔵』になにほどかの影響を与えたと考えねばならないことになるが、それをいうためには、本作以前の忠臣蔵狂言とのかかわりについてなお慎重な検討が必要がある。この点は次年度以降の課題としておきたいと思う。この他、すでに輪講を終えている『勧進能舞台桜』(延享三年刊)及び『龍都俵系図』(元文五年刊、いずれも南嶺作とされているもの)について、その成果をまとめ、それぞれ連載形式の注釈として公刊に付した。また、江島其磧作の『都鳥妻恋笛』(享保十九年刊)に関してもほぼ注釈はできあがっているのであるが、雑誌連載のかたちでは時間がかかり過ぎるので、私家版として刊行することも含め一括して公にする方法を模索中である。