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麻ひ性貝毒を生産する渦鞭毛藻の毒生合成調節の分子機構

本手法については国際学術雑誌に掲載され、国内学会にて報告した。【3.渦鞭毛藻有毒種及び無毒種の生合成中間体とSxtA】A. tamarense以外の渦鞭毛藻におけるSxtAの発現と初期中間体の存在を確認するため、国内で麻痺性貝毒生産種として代表的な2種(Gymnodinium catenatumとAlexandrium catenella)及び非生産種としてAlexandrium属のA. insuetumと非Alexandrium属のProrocentrum triestinumを中間体及び麻痺性貝毒の一斉分析と免疫染色によるSxtA4発現解析に供した。2種の有毒種から推定生合成中間体であるInt-A', Int-C'2、シャント化合物であるCyclic-C'及び抗SxtA4ペプチド抗体と反応するタンパクが検出され、無毒種からはいずれも検出されなかった。SxtA4タンパク発現と毒の生産能の関連性が示唆された。本成果は国内学会にて報告した。当初の計画からは予期しなかった知見が得られ、それがさらに予想外の方向へと大きく進展したため。【1.麻痺性貝毒生合成酵素の局在性の差異】免疫染色のプロトコールの改良により、生合成初期の反応を触媒するSxtA4タンパクの細胞質への漏出を抑制してよりオルガネラに収束した像を得ることに成功した。さらにその次の段階の反応を触媒する酵素SxtGの抗ペプチド抗体によっても免疫染色し、SxtA4とは異なる部位に存在することを初めて見出した。麻痺性貝毒の生合成の反応場が段階ごとに異なるのではないかということは我々が初めて提唱する説である。以前報告した代謝阻害剤コルヒチンによる毒生産抑制作用のメカニズムはこれまで全く不明であったが、今回得られた結果から生合成酵素が存在する小胞のリクルート阻害作用によるのではないかという新たな麻痺性貝毒生合成抑制機構を提唱することができた。【2.カラムスイッチングHILIC-MS法による一斉分析法の開発】麻痺性貝毒とその生合成中間体は極性やチャージが異なるため、従来は一斉分析が困難であった。これまでは中間体用と麻痺性貝毒用の異なる前処理法を施した試料を別々に調製し、異なる手法で分析して定量分析する必要があった。今回渦鞭毛藻の粗抽出液から中間体と麻痺性貝毒が一斉定量分析可能となったことで、生合成研究が一段と迅速に遂行できるようになった。【3.渦鞭毛藻有毒種及び無毒種の生合成中間体とSxtA】昨年度はA. tamarenseの有毒株と無毒株のみで比較していた。今年度はさらに別種の有毒種(A. catenellaとG. catenatum)と無毒種(A. insuetumとP. triestinum)においてもその麻痺性貝毒及び生合成中間体の存在とSxtA4タンパクの存在が一致するということを確認し、SxtA4タンパクの存在と毒生合成反応の進行の関連が示唆された。【1.麻痺性貝毒生合成酵素及び麻痺性貝毒の免疫染色による検出】渦鞭毛藻の麻痺性貝毒生合成の初発の反応を触媒する酵素(SxtA)の抗ペプチド抗体(抗SxtA4抗体)による免疫染色法を確立した。麻痺性貝毒を生産する種の渦鞭毛藻にのみ、SxtA4が存在すること、SxtA4は細胞内オルガネラに局在することが示唆された。本手法を生合成経路で次の反応を触媒するアミジノトランスフェラーゼ(SxtG)に対する抗ペプチド抗体(ウサギ由来抗SxtG抗体)による免疫染色に応用し、SxtGははSxtA4とは異なる局在を示すことを見出した。
帝政期ロシアの教員集団と帝国社会の再編

二年間の研究を通じて、教育制度改革とロシア社会の変化の関係性を明らかにした。とくに、(1)ロシア社会が当初に構想していた教育改革は、皇帝を中心として身分制度を維持しながら、各身分=職能の範囲での道徳的資質を高めようとする、有機的な世界観に基づくものであったこと、(2)そうした有機的秩序にもとづく発展という考え方を変化させ、身分よりも教育資格に重きを置くような教育制度に転換したのは、専門職者としての意識を高めた教員集団であったこと、という二点を重点的に明らかにした。この研究は、ロシア社会が近代的に変容していく際の具体的なプロセスを明らかするとともに、その特徴も指摘することとなった。(1)19世紀中葉の「大改革」に、ロシアの教員集団が、自らの専門職者としての地位をどのように確立しようとしたのか、その戦略の解明を目指した。研究の結果、ロシアの教員集団は、西欧諸国の専門職者のように国家から自律的な集団として自らを規定し、その発展をめざしたのではなく、むしろ、古い身分制社会から自律的であるために、半ば官僚として国家行政機構のなかで保護されながら専門職者としての地位を確保しようとしたことを明らかにした。この研究成果によって、ロシアの教員集団は、(1)古い身分制社会と対立関係にあったこと、(2)自らの使命を古い身分制社会を変化させることにあると考えていたこと、(3)それを実現するために、国家からの保護を必要としたこと(国家官吏としての地位を確保し、国家行政機構内に専門職者集団の団体組織を形成しようとしたこと)、などを明らかにした。これらの成果は、変化のエージェントとしての教員集団が、国家と社会に対してどのような考え方をもっていたのかを明確した。この成果は英文論文としてActa Slavica Iaponicaに掲載された。(2)また、『歴史と地理』には、上述の研究成果を、西欧の19世紀史というより大きな文脈のなかで再検討する論考を発表した。そこでは、専門職者といったような近代社会を構成する要素は、ロシアでは、実際には古い専制体制によって生み出され、専制君主の国家機構のなかで保護されながら発展していったことを指摘した。そして、旧体制ロシアの特長は、西欧諸国が産業革命と市民革命によって政治・社会制度を激変させている時代に、自らの体制を維持したまま柔軟に近代化に対応していった点にある、という観点を提示し、19世紀ロシアの近代化の特質を解明する第一歩とした。(1) 10月に名古屋で行った学会報告のために書いた論文では、19世紀中葉「大改革」期に社会で起こった教育運動や教育論議を分析した。この研究を通して、(1)この「大改革」期に、すべての身分に対して教育を行うべきだとする考え方や運動が広がったこと、(2)しかし、あくまで身分=職能の区分を維持したまま、その範囲内で道徳的資質を高めることをめざすものであったこと、(3)教育改革の必要性は、危機感から生じたものではなく、皇帝と政府の呼びかけに熱狂的に応じたものであったこと、などを明らかにした。結論として、改革の初期において、社会では、皇帝を中心として各身分が自らの職能の範囲内での資質の向上をめざすという有機的な世界観が大勢を支配していたことを明らかにした。(2) 11月にフィラデルフィアで行った学会報告のために書いた論文では、19世紀中葉「大改革」期における女子教育の在り方を明らかにした。そこでは、女子教育が発展した背景には、外部の移ろいやすい世界で生きる男性よりも、将来母となって家庭に残る女性を教育することで、道徳的向上が見込まれ、安定的な身分の再生産が果たせる、という認識が存在したことを論じた。この二つの研究から、「大改革」期初期のロシア社会では、身分制を維持した上で、それぞれの道徳的資質を高め、皇帝を中心とした有機的社会を発展させるような教育改革がめざされていたことを明らかにした。これにより、専門職者としての教員集団と対峙する当時の社会の特質が鮮明なものとなった。
非文字知社会と中世の時間・暦・交通通信・流通に関する研究

時間法や航海技術を非文字知(民衆知・暗黙知)の視点で調査・分析した。時間には季節(日の出・日の入り)に無関係の絶対時間(定時法)と季節によって変わる相対時間(不定時法)とがある。不定時法が自然発生的で多用された。航海技術については、地形や潮流を知悉した航海術や漁撈法を調査・分析した。中世紀行文に記された港津発着の時間を手がかりに、当日の潮流、潮力、人力、風力を分析した。前近代日本社会は文字による社会ではあったが、反面文盲illiteracyが多く、非文字社会の側面も濃厚に持っており、文字によらない知識によって人々の多くが行動していた。法制度社会に対する不文律、制定暦日に対する農事暦などがその代表的なものと考える。非文字知は経験知・「暗黙知」The tacitdimensionと表現されることもあり、ときに民衆知とも表現される。本研究では文字のない世界から前近代、とりわけ中世社会を分析する。文献資料に依存する歴史学がもっとも不得手な分野が非文字の世界である。前近代社会総体の真のありかたを知るために、「非文字知(経験知)」の世界を追跡することは、歴史学には不可欠の作業であるし、有効な視点である。本研究では分析の対象を時間・暦・交通通信・流通とする。非文字知社会を考えるに際し、まず航海術の具体を考えた。最初に国会図書館にあるレトロ海図の複写を収集した。9/2に九州大学・六本松地区にて研究集会。趣旨説明・収集レトロ海図の検討結果についての報告をし、文禄慶長役の倭城が立地した朝鮮半島南岸の海がきわめて浅いこと、とりわけ順天城や馬山城周囲が浅く、大型艦船の停泊方法の具体を考えた。つづいて東大史料編纂所にて収集した船に関する用語と用例の検討を行った。竹田和夫氏より「力者」について、服部が「中世国家の貨幣発行権」について報告を行った。翌9/3能古島漁協関係者から瀬・ます網について聞き取り調査。2/17に九州大学・六本松地区にて第2回研究集会。服部が問題提起(「歴史読解における潮流知識・平家物語ほかを素材に」)ののち、九大応用力学研究所・柳哲雄教授より報告「列島周辺の海流・潮流と歴史学」があって、日本近海の潮流(主流・反流)、季節風などをふまえつつ、遣明船の航路を具体的に検討した。つづいて服部が問題提起(「最近の中世銭貨をめぐる研究動向」)を行い、下関市立大学・桜木晋一教授より「中世銭貨の諸問題」について報告があり、コメント・討論を行った。翌2/18に服部が「データベースによる「刻・点」の時間記述例」について報告し、宮廷内では漏刻を使用しての陰陽寮による厳密な時間管理があったこと、地方でも寺院が同様に、点までの時間管理に当たったことを報告、井上聡氏より「中世の流通社会」についての報告があって、遠隔地であっても為替による送金が可能であった武士団におけるシステムの具体が示された。この間流通に関した記述の多い、金沢文庫文書の紙背文書の整理作業を史料編纂所で行うとともに、これまで集積した非文字知資料である地名のデータベース化・地図化作業を行っている。交通・潮流非文字知社会を考えるに際し、前年に続きまず航海術の具体を考えた。中世の旅行記録『後高倉院厳島御幸記』『言継卿記』『島津家久上京日記』から出発時間、到着時間などを確認し、それを季節・月齢にあわせて潮流シミュレーションを行った(宮庁関係HP利用)。伊勢湾の場合、うまく潮流に乗った場合でも、日記の記載時間どおりに渡海するには、潮流のノット数のみでは大幅に不足することがわかった。その分、風力・漕力が重視されていた。また潮流にうまく乗り切れていないのではないかという事例も少なからずあった。瀬戸内海は伊勢湾よりは相当に潮流は激しい。2月に行った研究会では潮流の複雑さが背景にあって、その知識体系が水軍海賊の存在基盤になったという意見が出された。時間香時計の所在調査を実施。寺院や博物館で多数を確認。つぎに時間への関心差・意識差を示すものとして、日記ごとの記載差を明らかにした。京都で書かれた室町期の貴族日記(後法興院記)では時間の記述がほとんど気象、天変地異ばかりであること、その理申は何日か前に陰陽師(安部・武部氏)から災異の起こる可能性のある時間を通知してくるので、実際と合致したか否かに強い関心があった。同じ時期ではあるが、京都ではなく和泉の山村で記された『政基公旅引付』の場合はそうした陰陽師の通知が来なかった可能性があって、何時に人が来たという記載が多く、気象記載は少ない。また何刻のみではなく、何点まで書いている。宿泊所に近接する寺(円満寺)で時間がわかった。

鹿児島で書かれた『上井覚兼日記』では、時間の記事は人の到来に限られていて、陰陽道の影響はなかった(楠瀬慶太報告)。地名地図地名地図(佐賀)を刊行し、土佐の山村を対象とした楠瀬『新韮生槇山風土記』を刊行した。時間について中国でも日本でも相対時間、つまり昼時間の均分で行われる時刻制度(不定時法)の方が初現的・自然発生だったと考えた。絶対時間の測定は絶対時計である水時計(漏刻)で行われる。正確さが求められる中、皇帝が管理する絶対時間の登場で、相対時間は表面上では絶対時間(定時法)と交代する。昼夜を問わず会議があった貴族社会では絶対時間が採用され、夜間時刻も測定された。一般社会ではどうか。相対時間(不定時法)と絶対時間(定時法)の両立に香時計が使用された可能性を考えた。香の燃える時間は絶対時間ながら、目印(こま)を操作することによって相対時間が測定できた。航海技術について夜間の航海について。高倉院厳島御幸記を見ると、貴族が乗った船は夜間航海を避けている。キリシタン宣教師も日本では夜の航海はしないと書いているが、実際には暗くなってからの到着事例はある。遣明船などの遠洋航海では当然に夜間航海した。この場合、北極星を初めとする星座の運行と観察が大きな役割を果たしたが、研究集会においてさまざまな民間信仰にそれが残されているという報告を受けた。潮流長崎県生月島での現地調査。手こぎ船時代、平戸本島・生月島間では潮流が逆の場合でも航海することが必要とされた。沿岸流(反流)と時間帯による潮位と進入可能域について、さまざまな海中地名が記憶されていることがわかり、民衆知として報告した。中世『言継卿記』には伊勢湾横断・南下、三河湾横断の時刻を記した記事がある。これを現代潮位と比較した場合、潮流のみでは圧倒的に不足で、風や人力に大きく依拠していたことを明らかにした。非文字知(民衆知・暗黙知)のひとつに、地形や潮流を知悉したうえでの航海術や漁撈法がある。平戸における海の民衆知を別記論文にて公表した。海の瀬・かじかけ(暗礁)の所在と日々変わる潮流の知識が漁師ら海民の知恵だが、それは中世の海賊・水軍の知恵でもある。民衆知でもあるが、軍事機密でもある。中世の文献史料(アルメイダ、源通親、大和田重清、山科言継らの紀行文)によって、中世の航海術を検討した。潮流のみでは目的地に時間内に到着できない。逆流にさしかかる時間帯もアゲンストで航海を続けている。人力、風力に依拠した。櫓の数によるが交代要員も四名以上いた。複数の櫓があるから、必ず声を出して前後の櫓を交互に操作した。佐賀県地名地図電子化を推進できたが、とくに海の地名、海中地名の収集を重視した。作成した地名地図と文献史料とを対比させる作業が可能になった(地図は別途公刊予定)。伊能忠敬はこの海岸部の測量日誌を残しているが、かれが書き残した地名は、現在使われていない。旧字表記によっている。しかし伝承地名として残されており、収集でき電子地図化もした。伊能忠敬は豊臣秀吉の文禄慶長の役における諸大名の陣跡について記述もしているのだが、忠敬の認識と現在定着している陣跡比定とは異なるものが多い。福島正則陣は従来陣と認識されていない山だったようで、この山には陣地名があった。時間に関しては「中世日本の宇宙構造論に関する覚書」(別途公刊予定)を得た。古代の宇宙認識、キリシタン史料に見る宇宙認識からその構造を明らかにする。
環境中に生息する抗生物質耐性細菌の動態・生理に関する研究

自然環境中における抗生物質耐性菌の動態を知ることは,抗生物質耐性菌のさらなる拡大を防ぐうえで重要である.本研究では河川における抗生物質耐性遺伝子の分布,および河川に生息する細菌の抗生物質に対する応答について検討し,以下の知見を得た.1.猪名川および神崎川より河川水を採取し,20種類のテトラサイクリン耐性遺伝子の検出を試みた.その結果,汚染の少ない地点ではtet遺伝子は検出されず,下流域では培養試料から6種類が検出された.とくに汚染の進行した地点では13種類のtet遺伝子が検出できた.2.βラクタマーゼ遺伝子を検出するためのPCRプライマーをデザイン・作成し,河川におけるβラクタマーゼ遺伝子の分布を調べた.その結果,河川には多様なβラクタマーゼ遺伝子をもつ細菌が存在し,本研究で作成したPCRプライマーが,自然環境中における本遺伝子の動態を知るうえで有効であった.3.バイオフィルム形成の足場としてガラスビーズを用いたマイクロコズムを作成し,水圏環境中のテトラサイクリン耐性菌の挙動を調べた.その結果,抗生物質存在下では,バイオフィルム中の細菌群集の多様性は,浮遊細菌群集より高く,バイオフィルム形成の足場を与えることで,細菌群集の多様性の増加が促進されることが示された.このことから,バイオフィルムの形成は,多様な細菌種に,抗生物質に対する耐性と生残の機会を与え,より多様な群集構造の形成に寄与したと考えられる.自然環境中における抗生物質耐性菌の動態を知ることは,抗生物質耐性菌のさらなる拡大を防ぐうえで重要である.本研究では河川における抗生物質耐性遺伝子の分布,および河川に生息する細菌の抗生物質に対する応答について検討し,以下の知見を得た.1.猪名川および神崎川より河川水を採取し,20種類のテトラサイクリン耐性遺伝子の検出を試みた.その結果,汚染の少ない地点ではtet遺伝子は検出されず,下流域では培養試料から6種類が検出された.とくに汚染の進行した地点では13種類のtet遺伝子が検出できた.2.βラクタマーゼ遺伝子を検出するためのPCRプライマーをデザイン・作成し,河川におけるβラクタマーゼ遺伝子の分布を調べた.その結果,河川には多様なβラクタマーゼ遺伝子をもつ細菌が存在し,本研究で作成したPCRプライマーが,自然環境中における本遺伝子の動態を知るうえで有効であった.3.バイオフィルム形成の足場としてガラスビーズを用いたマイクロコズムを作成し,水圏環境中のテトラサイクリン耐性菌の挙動を調べた.その結果,抗生物質存在下では,バイオフィルム中の細菌群集の多様性は,浮遊細菌群集より高く,バイオフィルム形成の足場を与えることで,細菌群集の多様性の増加が促進されることが示された.このことから,バイオフィルムの形成は,多様な細菌種に,抗生物質に対する耐性と生残の機会を与え,より多様な群集構造の形成に寄与したと考えられる.抗生物質は医療のみならず畜産・養殖の現場で幅広く用いられている.野外での抗生物質使用は,自然環境中の抗生物質耐性菌の増加を招き,さらに遺伝子伝播により新たな耐性菌が出現する.したがって,自然環境中における抗生物質耐性菌の動態を知ることは,抗生物質耐性菌のさらなる拡大を防ぐうえで重要である.本年度は,河川に生息する細菌が保有するテトラサイクリン耐性遺伝子の多様性と生息環境の関係について検討し,以下の知見を得た.1.兵庫県および大阪府下を流れる猪名川および神崎川より表層水を採取し,20種類のテトラサイクリン遺伝子の検出を試みた.人間活動による汚染がほとんどないと考えられる猪名川源流付近の試料からはいずれのテトラサイクリン遺伝子も検出できず,そこから約20km下流の都市郊外の住宅地域に位置する地点においてはtetD遺伝子のみを検出した.さらに15km下流の周辺は住宅,工場,商業施設が存在する5地点の河川試料からtetA, B, C, D, E, Yの6種類を検出した.また,汚染がより進行していると考えられる神崎川下流の試料からはtetA, B, C, E, G, H, L, M, 0, Q, Y, Zの12種類の耐性遺伝子を検出した.したがって,人間活動による汚染の進行に伴い,生息する細菌が有するテトラサイクリン遺伝子の多様性が高くなると考えられる.2.1.で述べた猪名川下流域の5地点において,河川の表層水および河床に形成されたバイオフィルムを採取し,存在するテトラサイクリン遺伝子を比較したところ,各地点において表層水よりバイオフィルム中の細菌のほうが,多様なテトラサイクリンを有していることがわかった.抗生物質は医療のみならず畜産・養殖の現場で幅広く用いられている.野外での抗生物質使用は,自然環境中の抗生物質耐性菌の増加を招く.さらに遺伝子伝播により新たな耐性菌が出現することから,自然環境中における抗生物質耐性菌の動態を知ることは,抗生物質耐性菌のさらなる拡大を防ぐうえで重要である.本年度は,河川水を用いたマイクロコズムを作成し,抗生物質に対する細菌群集の応答を検討した.またβラクタマーゼの系統解析を行うとともに,本遺伝子検出用PCRプライマーの作成・有効性評価を行い,以下の知見を得た.1.作用機序の異なる3種類の抗生物質(ナリジクス酸,テトラサイクリンおよびアンピシリン)をそれぞれ単独に加えたマイクロコズム中の細菌群集構造の変化を調べた.その結果,いずれのマイクロコズムにおいても細菌数に顕著な差は認められなかったが,群集構造は大きく異なった.2.水圏におけるテトラサイクリン耐性菌の挙動についてバイオフィルム形成との関係を調べた.

その結果,バイオフィルムを形成することにより,多様な細菌種がテトラサイクリンに対する耐性を獲得することがわかった.3.GenBankに登録された約400種類のβラクタマーゼの系統解析を行った.その結果,本遺伝子の多様性は極めて高く,その起源は単一ではないことが示された.さらに本遺伝子を標的とした48種類のPCRプライマーセットをデザインし,13種類について特異的な遺伝子検出のためのPCR条件を決定した.さらに作成したPCRプライマーを用いて,河川水試料を解析したところ,クラスA, BおよびDに属するラクタマーゼ遺伝子を検出した.
微分位相顕微法を用いた触媒反応過程の原子分解能観察

本研究では,微分位相コントラスト法を用いてグラフェンエッジと不純物単原子間の化学反応を原子分解能で観察し,不純物原子を介した触媒反応によるグラフェンの分解・成長過程を明らかにすることを目的としている.昨年度に引き続き,低加速電圧(80 kV)での電子顕微鏡を用いて,単層あるいは複層グラフェンの原子分解能観察を行った.単層グラフェンエッジは加熱した状態でも,電場観察を高い精度で実施するには不安定であったため,電子線による照射損傷を用いて,2層グラフェンにホールを形成させた.形成したグラフェンエッジ領域を観察したところ,エッジ領域に属する炭素原子は欠陥のないグラフェン領域の炭素原子よりも強い電場を示すことが分かった.エッジ領域ではダングリングボンドが形成されており,配位数が少ないため(通常は3配位),電場強度が局所的に増強されていることが明らかとなった.また,単層グラフェン中における代表的な不純物元素であるシリコン単原子の周囲に形成された原子電場についても観察を行った.シリコン原子は単層グラフェン中では,3配位(単原子空孔)および4配位(二原子空孔)が存在するが,これらの配位数と対称性を反映したシリコン原子電場が局所的に形成されていることが明らかとなった.これはシリコンー炭素原子間に形成されている共有結合を反映していると考えられる.したがって,電場を観察することは間接的ではあるものの,化学結合に関する情報が得られることが明らかとなった.得られた研究成果は論文および国内外の学会において発表した.不純物であるシリコン単原子やグラフェンエッジに属している炭素単原子からの原子電場が欠陥のない単層グラフェン中の炭素原子とは異なる電場強度や分布を示すことが明らかとなった.観察された原子電場像の妥当性を明らかにするため,第一原理計算を用いて安定構造を決定した.得られた安定構造に基づき,実験と同じ光学条件(加速電圧,収束角,検出器の角度範囲など)での原子分解能電場像の計算を行った.原子電場の計算像は実験像をよく再現しており,局所に形成された共有結合がシリコン原子電場の異方性を反映していると考えられる.すなわち,3配位では3回対称場,4配位では4回対称場が形成されていることが明らかとなった.単原子電場の強度分布(形状)については,実験と計算において良い一致が見られたものの,電場強度の絶対値についてはおよそ2倍程度の差(実験値が理論値を下回る)が見られた.このような不一致は次のような原因が考えられる:(1)残留収差などの実験の不完全性,(2)計算に用いているポテンシャルが現実とは異なる.微分位相コントラスト法では明視野領域を用いるため,残留収差(レンズの不完全性)の影響を強く受ける.実際に,3回非点の影響を大きく受けており,電場強度が小さく計測されたものと考えられる.2つ目の原因を検証するには,実験を完全な条件で実施するか,残留収差を正しく見積もる計測法を考える必要がある.今後はより高い精度での実験を目指す.静的な単層グラフェンや欠陥領域からの原子電場を計測できることがこれまでの研究により明らかになった.本年度は,本研究課題における主題である動的観察へと展開する予定である.これまでの実験では,電子ドーズ(電流量)抑制した実験条件で複数枚の画像を取得し,これらの画像の位置合わせを行い重ね合わせることで,信号雑音比の改善を行ってきた.したがって,時系列に沿ったデータ・セットはすでに得られる実験環境の整備は完了している.動的観察を実現するための最大の課題は,電子ドーズと信号雑音比にある:低い電子ドーズ下では信号が雑音に埋もれてしまう一方で,高電子ドーズ下では試料ダメージにより観察が困難となる.これまでの実験から,300-400度の高温下では室温よりも試料ダメージを抑制できるため,電子ドーズ量を増やせることが分かっている.したがって,高温下で多くの電子ドーズを用いて,信号雑音比を改善し,動的観察を実施する.また,得られた実験像のノイズ除去も昨年度より検討しており,情報処理に基づいた画像の回復も行う.シリコン以外にも多くの遷移金属元素がグラフェン中に存在していることがこれまでの実験からも明らかとなった.困難ではあるものの,単原子からの電子エネルギー損失分光は可能であり,元素種も特定できる.触媒性を示す遷移金属では配位環境により価数が変化するが,動的な電場観察を行うことにより,触媒活性と配位環境の関連性を明らかにする.また,得られた成果は論文として取りまとめ,国内外に発表する予定である.本研究では,微分位相コントラスト法を用いてグラフェンエッジと不純物単原子間の化学反応を原子分解能で観察し,不純物原子を介した触媒反応によるグラフェンの分解・成長過程を明らかにすることを目的としている.これを達成するため,本年度はグラフェンエッジ(ホール)の炭素原子が形成する電場の直接観察を試みた.低加速電圧(80 kV)の電子プローブを用いてもエッジの炭素原子の結合が切られ安定に観察できない.そこで,加熱ホルダーを用いて200 - 300°Cの低温で加熱するとグラフェン上での表面拡散が促進され,80kVの電子プローブでも安定してグラフェンエッジの観察が可能であることが明らかになった.原子分解能での観察を安定に行うために,加熱ホルダーの電源の安定化を行い実際に500°C以下であれば原子分解能観察が可能であることを確認した.

このような実験条件下において微分位相コントラスト法を用いてグラフェンエッジの観察を行ったところ,単層領域とは異なる強い電場がホールの方向に向かって形成されていることが明らかとなった.このような強い電場は周囲の原子が欠損しダングリングボンドの形成が大きく関与していることが予想される.得られた実験結果をより定量的に評価するために,今後は第一原理計算および電子顕微鏡像の理論計算を行う予定である.また,次年度以降は,ホールに加えて原子空孔や不純物近傍に形成される電場の原子レベルでの観察を行う.グラフェンエッジを安定に観察することは想定していたよりも容易に実現した.これは加熱ホルダーの電源安定化が大きく作用している.単層グラフェンは炭素原子が投影方向にひとつしかなくかつ軽元素であるため,その原子電場は極めて小さい.したがって,高感度な分割型検出器でもその原子電場はノイズに埋もれて検出が困難であると考えていた.しかし,低温加熱下でグラフェン欠陥が安定することが分かり,電子ドーズを大幅に増やせることとなった.これにより,信号強度を増幅させることができ,実際に炭素単原子の電場観察も可能になりつつある.実験は概ね順調に進展しているため,次年度以降は理論解析を中心に行うこととする.特に,第一原理計算と原子分解能像の組み合わせを行っている研究例はほとんどなく,実験で得られた像解釈には必須となる.従来の孤立した原子のポテンシャルを用いた場合と第一原理計算から得られたポテンシャルの違いが計算像に反映された場合にのみ,化学結合などの情報が得られることとなる.本研究では,微分位相コントラスト法を用いてグラフェンエッジと不純物単原子間の化学反応を原子分解能で観察し,不純物原子を介した触媒反応によるグラフェンの分解・成長過程を明らかにすることを目的としている.昨年度に引き続き,低加速電圧(80 kV)での電子顕微鏡を用いて,単層あるいは複層グラフェンの原子分解能観察を行った.単層グラフェンエッジは加熱した状態でも,電場観察を高い精度で実施するには不安定であったため,電子線による照射損傷を用いて,2層グラフェンにホールを形成させた.形成したグラフェンエッジ領域を観察したところ,エッジ領域に属する炭素原子は欠陥のないグラフェン領域の炭素原子よりも強い電場を示すことが分かった.エッジ領域ではダングリングボンドが形成されており,配位数が少ないため(通常は3配位),電場強度が局所的に増強されていることが明らかとなった.また,単層グラフェン中における代表的な不純物元素であるシリコン単原子の周囲に形成された原子電場についても観察を行った.シリコン原子は単層グラフェン中では,3配位(単原子空孔)および4配位(二原子空孔)が存在するが,これらの配位数と対称性を反映したシリコン原子電場が局所的に形成されていることが明らかとなった.これはシリコンー炭素原子間に形成されている共有結合を反映していると考えられる.したがって,電場を観察することは間接的ではあるものの,化学結合に関する情報が得られることが明らかとなった.得られた研究成果は論文および国内外の学会において発表した.不純物であるシリコン単原子やグラフェンエッジに属している炭素単原子からの原子電場が欠陥のない単層グラフェン中の炭素原子とは異なる電場強度や分布を示すことが明らかとなった.観察された原子電場像の妥当性を明らかにするため,第一原理計算を用いて安定構造を決定した.得られた安定構造に基づき,実験と同じ光学条件(加速電圧,収束角,検出器の角度範囲など)での原子分解能電場像の計算を行った.
キサンチン酸化酵素における活性酸素生成の分子機構とその病態における役割

キサンチン酸化酵素はモリブドプテリン・非ヘム鉄・FADを補欠分子族とする特異な複合フラビン酵素である。この酵素は生体内ではNADを電子受容体とする脱水素酵素であるが、哺乳類由来の酵素は酵素蛋白部分の修飾により容易に酸素を電子受容体とする酸化酵素型へ変換し活性酵素を生成する。しかし、鶏の酵素はこのような変換をしない。この酵素の構造上の解析についてはヒト、ラット由来の酵素のアミノ酸配列はすでに決定している。この酵素の機能解析は脱水素酵素から酸化酵素への変換機構を含め、われわれはすでに多くの研究があるが、本研究において1)パルスラジオリシスによる分子内電子伝達機構および2)部位特異的変異による解析を試みた。3)また結晶について筑波高エネルギー研究所においてデータの収集をおこなった。4)また鶏肝臓酵素の全一次構造とその変換しない理由の検討した。鶏においては脱水素酵素型/酸化酵素型の変換に関与するSH基は一つはアルギニンに、一つは同一で保存されていた。したがってSH剤による修飾で変換しない理由はS-S結合ができないためと説明できる。また精製酵素を用い蛋白分解酵素の作用点およびその結果得た酵素の機能解析をおこなった。その結果フラビン周囲の構造は酸化酵素型に変換されているにもかかわらず、分子内電子伝達がおこっていないために酸化酵素活性が出現しないことが判明した。5)また肝臓におけるこの酵素の病態における役割の検討をおこなった。
リゾリン脂質制御に基づく新規脳血管保護法の開発

血管や免疫系など多様な生理作用を示すリゾリン脂質の中から、スフィンゴシン1ーリン酸(S1P)とリゾホスファチジン酸(LPA)に焦点を当て、血液脳関門(Blood-Brain Barrier、BBB)に与える影響を検討した。S1Pはin vitroでBBBのバリアー機能を低下させ、この低下作用には、タイトジャンクション(TJ)構成タンパク質であるZO-1とoccludinの発現低下が関与することが判明した。また、これまでの検討で、in vitro BBB modelに低酸素負荷を行うとS1Pシグナルが亢進し、BBB機能を低下させることが判明しいる。そこで、マウスの脳梗塞モデル(MCAO model)を用いたin vivoでの検討を行った。MCAO処置マウスではS1Pの産生酵素であるSphk1と、細胞外輸送担体であるABCA1の発現が亢進しており、S1Pの産生が亢進していると考えられた。S1P細胞外輸送担体であるABCA1の阻害作用を持つプロブコールを用いて、MCAOに対すS1Pシグナル抑制による保護効果を検討したところ、MCAOによる脳梗塞巣やBBB脆弱性はプロブコールの投与により抑制された。脳梗塞後のS1Pシグナルの抑制はBBBの保護につながると考えられる。S1Pに加え、LPAの内皮細胞のバリアー機能への影響をin vitroで検討した。内皮細胞にLPAを負荷するとバリアー機能の指標である経内皮電気抵抗が減少し、TJタンパクであるclaudin-5の発現の乱れが観察された。また、バリアー機能の低下はROCK阻害時であるY27632により阻害された。また、内皮細胞にはLPA6受容体が発現しており、LPA6に対するsiRNAを用いた検討により、LPAのバリアー機能にはLPA6受容体が関与していることが判明した。以上の事からLPAはBBB機能を負に調節することが示唆された。S1PおよびLPAのBBB機能に対する作用をin vitroで検討し、S1PやLPAシグナルの亢進がBBB機能を低下させることを発見した。また、虚血再灌流障害においてS1Pのシグナルを抑制することがBBB保護につながることをin vivoでも確認した。更に、脳血管保護効果を持つ薬剤候補として既存薬であるプロブコールを発見したため。これまで同様の評価を継続する。更にこれまで蓄積したデータを取りまとめ成果の発表を行う。血管や免疫系などで多様な生理作用を示すリゾリン脂質の中から、スフィンゴシン1ーリン酸(S1P)とリゾホスファチジン酸(LPA)に焦点を当て、血液脳関門(Blood-Brain Barrier、BBB)に与える影響を検討した。BBB構成細胞である、脳毛細血管内皮細胞、ペリサイトおよびアストロサイトにおいて、S1PおよびLPA受容体の発現をPCR法で検討した。それぞれの受容体には複数のサブタイプが知られており、各BBB細胞においても複数の受容体が発現していた。S1PおよびLPAの内皮細胞のバリアー機能への影響を調べるために、内皮細胞の単層培養系モデルをin vitroで作成し、バリアー機能の指標である経内皮電気抵抗(TEER)を測定した。S1PとLPAは共にTEERを減少させ、バリアー機能を低下させることが判明した。この時、S1PはLPAに比べTEERの減少作用が強かった。また、S1Pのバリアー機能の低下には、タイトジャンクション構成タンパク質であるZO-1とoccludinの発現低下が関与していた。BBBの機能維持には内皮細胞だけでなくペリサイトやアストロサイトとの相互作用が重要である。S1PおよびLPAの受容体は内皮細胞だけでなく、アストロサイトやペリサイトにも発現しており、BBBの機能調節に影響すると考えられる。そこで、内皮細胞とペリサイトまたはアストロサイトとの共培養モデルを作製し、S1Pのバリアー機能への影響を検討した。S1Pのバリアー機能低下作用は内皮細胞単独よりもペリサイトとの共培養系で増強した。S1Pの生体内での作用は、内皮細胞への直接作用とペリサイトを介した間接作用があると考えられた。S1PとLPAのBBBバリアー機能への影響を検討し、バリアー機能の低下作用があることが判明した。また、これまで報告されていないS1Pの脳ペリサイトへの作用を見出した。

S1P細胞外輸送担体であるABCA1の阻害作用を持つプロブコールを用いて、MCAOに対すS1Pシグナル抑制による保護効果を検討したところ、MCAOによる脳梗塞巣やBBB脆弱性はプロブコールの投与により抑制された。脳梗塞後のS1Pシグナルの抑制はBBBの保護につながると考えられる。S1Pに加え、LPAの内皮細胞のバリアー機能への影響をin vitroで検討した。内皮細胞にLPAを負荷するとバリアー機能の指標である経内皮電気抵抗が減少し、TJタンパクであるclaudin-5の発現の乱れが観察された。また、バリアー機能の低下はROCK阻害時であるY27632により阻害された。また、内皮細胞にはLPA6受容体が発現しており、LPA6に対するsiRNAを用いた検討により、LPAのバリアー機能にはLPA6受容体が関与していることが判明した。以上の事からLPAはBBB機能を負に調節することが示唆された。S1PおよびLPAのBBB機能に対する作用をin vitroで検討し、S1PやLPAシグナルの亢進がBBB機能を低下させることを発見した。また、虚血再灌流障害においてS1Pのシグナルを抑制することがBBB保護につながることをin vivoでも確認した。更に、脳血管保護効果を持つ薬剤候補として既存薬であるプロブコールを発見したため。これまで同様の評価を継続する。更にBBB構成細胞間の相互作用におけるS1PおよびLPAの作用を検討する。更にこれまで蓄積したデータを取りまとめ成果の発表を行う。概ね計画通りに使用したが、小額の端数が生じた。繰越使用額が小額のため、次年度に使用する。
環境コミュニティー形成によるジャカルタの溜め池評価と持続可能な維持管理手法の提案

最終年度は溜池の物理環境要素と生態系(特にトンボ類)との関係を明らかにするため,現地調査により得た水質項目に加え,溜め池面積や護岸の長さ・複雑さなど物理的特徴を加え,クラスター分析を行った.トンボは水田等の水際で産卵を行い,幼少期はヤゴとして水中に暮らす.成虫になってからは昼間の暑い時間は水際周辺の樹林の影で休息し,朝や夕方に水際で捕食する.ゆえに,水域と陸域の両者における環境の健全性を検討するには最適な指標と考えられる.調査対象である9つのため池を対象としてクラスター分析(ウォード法,ユークリッド距離)を行い,それぞれの類似点・相違点を明らかにした.その結果,9つの溜め池は大きく3つに分類され,トンボの生息種類と比較したところ,護岸周囲長と護岸の複雑さの両者が満たされることがトンボの多様性維持には重要ではないかと考えられた.生態系保全機能については水深や護岸植生,指標生物であるトンボの飛行範囲を考慮した周辺の土地利用等のデータを追加することにより,トンボの生息種数の多様性と環境要因についてのより詳細な解析が行えると考えられるため,今後それらのデータの蓄積を行っていく必要がある.生物多様性に関しては,データの収集に高い専門性と時間が必要で,チョウやトンボ,鳥などの特定の生物種を嗜好するコミュニティとの連携を図り,WEBベースでのデータ収集を進めることが今後必要となると考えられる.溜め池インベントリの作成とデータ収集システムについては,公開したばかりであるため公開後の反応を見ていく必要があるが,そのようなユーザー目線での評価を取り入れることが求められる.本年度はこれまで調査を行ってきたジャカルタの10箇所のため池について、洪水緩和機能、水質浄化機能に関する調査を行った。洪水緩和機能については,はじめに対象溜め池の面積、集水面積、流出口の水理構造といったデータの収集・整理を行い,流出解析モデルの構築・適用のためのデータ作成,再構成を行った.準備したデータセットをもとにカーブナンバー法と水田貯留モデルを用いてため池への流入量を算出した.溜め池からの流出量は流出口の水理構造に基づき堰の公式,あるいはマニング式を用いて計算した.これらより算出された流入量と流出量の最大値から洪水ピークカット率を算出し,洪水緩和機能を評価した.その結果すべての溜め池でピークカットが見られた.多くのため池は15%以上の洪水緩和機能を発揮したが、2009年崩壊事故を起こしたGintungにおいては緩和機能は小さかった。また,流出口の堰幅が狭いほど,もしくは,集水面積に対する溜め池面積が大きいほど洪水ピークカット率が大きくなる傾向がみられた.水質浄化機能を評価するために,現地調査により溜め池の流入・流出口において採水をし,窒素やリン等の栄養塩について水質分析を行った.その結果,ジャカルタのほとんどの溜め池で雨季・乾季共に浄化作用が見られた.また,全窒素では滞留時間が短い雨季と比べて,滞留時間の長い乾季において浄化率が高かった.特に乾季のGintungでは浄化率が91%を示し,高い浄化機能が見られた.これらの成果については2016年11月にバリで開催された第17回世界湖沼会議において発表した。当初の計画どおり、初年度は洪水緩和機能と水質浄化機能について効果を定量的に評価し、それらを世界湖沼会議にて研究発表することができた。よって、本研究はおおむね順調に進展していると評価できる。本年度はため池の維持管理に必要なマンパワーの不足を補うための住民参加の促進,予算の不足を補うCSR(企業の社会的責任)による保全活動の援助資金の確保を目的として,溜め池認証制度の検討・提案を行った.共同研究者の既往研究データを統合化し,自然・水質・生物多様性・地域文化・歴史の5項目による評価指標を検討した.溜め池管理の現業機関である公共事業省・環境森林省・国立環境研究所を訪問し,コンセプトの提案と評価結果の事例提示を行った.提案内容に対して意見を収集した結果,9割以上の行政担当者および研究者が本制度は溜め池環境の改善に有用であると答えた.一方で,生物多様性の指標が分かり辛いとされ,種数を問うのではなく,代表種の写真を提示しそれが存在するか・しないかを問う形式に改善を行った.つぎに溜め池インベントリの作成とデータ収集システムの検討を行った.ジャカルタ近郊には300以上の溜め池が存在し,認証評価に必要なインベントリ収集を行政や研究者のみで行うには限界がある.そこで,WEBベースでのインベントリ収集システムの作成・公開を行った.使用するソフトには,1フリーソフトであること,2テキストや画像データを地図上に空間的に表現可能であること,3インターネット環境さえ整っていれば誰でも書き込むことができるといった点からGoogleEarthを選定した.現地調査および共同研究者の協力により公開用のサンブルデータを整理し,データを入力・公開した.当初の計画どおり、本年度は洪水緩和機能や水質浄化機能、生物多様性などの評価項目を統合し、ため池認証制度のコンセプトを提案した。また、現地の行政担当者に認証制度のコンセプトを説明し、おおむね理解を得ることができた。最終年度は溜池の物理環境要素と生態系(特にトンボ類)との関係を明らかにするため,現地調査により得た水質項目に加え,溜め池面積や護岸の長さ・複雑さなど物理的特徴を加え,クラスター分析を行った.

トンボは水田等の水際で産卵を行い,幼少期はヤゴとして水中に暮らす.成虫になってからは昼間の暑い時間は水際周辺の樹林の影で休息し,朝や夕方に水際で捕食する.ゆえに,水域と陸域の両者における環境の健全性を検討するには最適な指標と考えられる.調査対象である9つのため池を対象としてクラスター分析(ウォード法,ユークリッド距離)を行い,それぞれの類似点・相違点を明らかにした.その結果,9つの溜め池は大きく3つに分類され,トンボの生息種類と比較したところ,護岸周囲長と護岸の複雑さの両者が満たされることがトンボの多様性維持には重要ではないかと考えられた.生態系保全機能については水深や護岸植生,指標生物であるトンボの飛行範囲を考慮した周辺の土地利用等のデータを追加することにより,トンボの生息種数の多様性と環境要因についてのより詳細な解析が行えると考えられるため,今後それらのデータの蓄積を行っていく必要がある.生物多様性に関しては,データの収集に高い専門性と時間が必要で,チョウやトンボ,鳥などの特定の生物種を嗜好するコミュニティとの連携を図り,WEBベースでのデータ収集を進めることが今後必要となると考えられる.溜め池インベントリの作成とデータ収集システムについては,公開したばかりであるため公開後の反応を見ていく必要があるが,そのようなユーザー目線での評価を取り入れることが求められる.次年度は、各ため池におけるインベントリーを整備するため、溜め池の深さや水面積といった幾何構造、土地利用、水質項目、トンボ生息数、利用状況などのデータを整理する。これらを自然、水質、多面的昨日、地域文化などのカテゴリー毎にチャート化し、地域住民や行政担当者に理解し易いよう整理する。ため池認証制度の導入においては、住民参加による評価指標のデータ収集が不可欠である。そこで、周辺住民を対象として認証制度に関するコンセプトを説明し、住民からの聞き取りを行うことで、より現実的な制度設計を行う予定である。現地調査実施日前後に撮影された衛星画像を購入することを計画していたが、雲の影響で良好な画像が取得できなかったため次年度使用額が生じた。インドネシア国の現地協力者であるシンティア氏が短期留学に行くことになった。シンティア氏は現地溜め池コミュニティーとの窓口となっており、3月に予定していた最終調査およびワークショップのうち、ワークショップについては開催が難しいと判断した。そこで、ワークショップを9月に延期することとしし、必要な渡航費25万円と会議費15万円の計40万円に関して事業期間の延長を申請することとした。次年度調査の際に、その前後の時期における衛星画像を購入する予定である。
サルのエイズモデルを用いた遺伝子工学によるワクチンの開発に関する基礎的研究

細胞障害性リンパ球(CTL)は、ウイルス感染の防御に有効といわれている。HIV感染ヒトには、HIV特異的CTLが存在することが報告されている。一方、HIV-1は、non-human Primatesではチンパンジーに感染するが、HIV-1感染チンパンジーの末梢血リンパ球(PBMC)にHIV-1特異的細胞性免疫が見つからないこと(personnelcommunication)、およびチンパンジー自体が実験動物として使いづらいこと(高価でかつ使用できる数が限られている)より、HIV-1特異的免疫反応などを調べるための他の動物モデルの確立が望まれている。SIVmacにHIV-1envを組み込んだキメラウイルス(SHIV)は、マカク属のサルに持続感染し、HIV-1に対する中和抗体を産生することが明らかとなっている。そこで、今回、SHIV感染マカク属サルの末梢血リンパ球のSHIV(envおよびgag)特異的細胞障害性について^<51>Cr release assayおよび^3H release assayによって調べた。その結果、(1)SHIV感染マカク属サルのPBMCは、HIV-1env特異的な細胞障害性を示した。(2)SIVmacgag特異的細胞障害性については、割合は少ないが陽性のサルがいた。(3)さらには、HIV-1env特異的細胞障害性リンパ球は、SIVmac感染アカゲザルにおけるSIVmacenv特異的細胞障害性リンパ球と同様に、CD8+CD16-、およびCD8-CD16-細胞より成り立っていることが明らかとなった。(4)また、SHIVを接種してないノーマルサルのPBMCには、env特異的な障害性を示す細胞が存在すること、そしてそのエフェクター細胞はCD4+リンパ球であることがわかった。(5)SHIV感染サルのPBMC中のこれらenvおよびgag特異的細胞障害性リンパ球の認識するエピトープについて、合成ペプタイドを用いて今後調べていく予定である。(6)これらのことより、SHIV感染マカク属サルはヒトエイズワクチンの研究、開発に、さらには、エイズの免疫病理、感染防御の研究にも利用できるよいエイズ動物モデルと思われた。
スピン軌道相互作用に基づく超高速ナノ電磁石の動作原理の開拓

本研究では、電流磁界ではなく、スピン軌道相互作用(SOI)を動作原理とする新しいタイプの電磁石の提案・動作実証を行い、ナノスケールでの集積化・実装が可能なコイルレス磁気デバイスエレクトロニクスの端緒を開くことを目的とする。具体的には、強磁性薄膜と重金属の接合界面における強いSOIを介して生じるスピン軌道トルク(SOT)を用いて、ランダムな多磁区構造と単一磁区構造という状態間のサブナノ秒でのスイッチングを最終目標とする。本年度は、1SOTによる多磁区状態→単磁区状態の変化を実証、2強磁性体/非磁性体界面への酸化層導入によるSOTの増強、に成功した。1については、Co/Pt系を用いてキュリー温度が室温付近(およそ370K)にある試料を作製し、350K付近において多磁区構造が安定となるような状況を作りだした。そこに直流電流を印加しながら異常ホール抵抗を測定したところ、電流強度に応じてホール抵抗が変化し、ある電流値以上では飽和するような様子が見られた。飽和状態から電流を印加したまま温度を300Kまで下げていったところ、単磁区状態になっていることがわかった。これにより、本研究目的の一部は達成されたことになる。2については、Co酸化層をCoとPtの間に挿入することで、SOTの大きさが数倍に増強されることがわかった。スピン流の注入効率はあまり変化していないことから、この結果はラシュバ効果がSOTに寄与していることを示している可能性がある。より大きなSOTを得るために界面に異種元素の挿入が有効であることを示しており、材料設計における重要な指針となる結果である。1SOTによる多磁区状態→単磁区状態の変化を実証、という研究目的の一部が達成されたのみならず、2強磁性体/非磁性体界面への酸化層導入によるSOTの増強、という結果も得られた。2については当初予定していなかった成果であり、SOTをいかにして増強するかを検討している中で得られたものである。本研究の達成において極めて重要な知見を得られたと考えている。多磁区構造から単磁区構造へのサブナノ秒スケールでのスイッチングが最終目標である。そのために、昨年度に20GHzまでの高周波電圧を印加可能な信号発生器を導入した。本年度は、高周波電流を印加しながら、異常ホール測定あるいはトンネル磁気抵抗測定を用いた実時間測定によりナノ秒領域でのSOTによる磁区構造変化を測定していく予定である。
エナメル蛋白の分子多様性の意義に関する免疫組織化学的・分子生物学的研究

エナメル蛋白であるアメロゲニンやシースプロテイン(シースリン,アメロブラスチン,アメリン)は,mRNAのスプライシングによって同一の遺伝子から異なる分子型が生じる。本研究では合成ペプチドを用いて異なる分子型を区別して認識できる抗体を作成し,エナメル蛋白の分子多様性の意義を解明することを試みた。アメロゲニンについては数種類の抗体を作成したが,いずれも特定の分子型を認識しているとはいえなかった。シースプロテインについては,同一の遺伝子から生じる2種類の分子型を区別して認識できると考えられる抗体の作成に成功し,これらの抗体を用いた免疫組織化学と免疫化学により以下の結果を得た。1.ラット切歯の基質形成期エナメル器と成熟期エナメル器を免疫化学で検索した結果,基質形成期と成熟期でアメロブラスチンは分子量56kDa,アメリンは分子量54kDaのコア蛋白として合成されるが,成熟期では54kDa蛋白の染色が56kDa蛋白の染色に比べて明らかに弱かった。この結果,成熟期ではアメリンの合成量がアメロブラスチンに比較して低下していると考えられた。2.ラット切歯の基質形成期幼若エナメル質と成熟期幼若エナメル質を免疫組織化学と免疫化学で検索した結果,アメロブラスチンとアメリンの分解様式および局在には明らかな差は認められなかったが,アメリンがアメロブラスチンよりも早く分解する可能性が示唆された。3.ブタ乳臼歯歯胚の基質形成期から成熟期初期にかけて幼若エナメル質を免疫組織化学で検索した結果,基質形成期ではエナメル質表層で短いシースリンを認識する抗体がより鮮明に小柱鞘を染色した。また,移行期から成熟期初期にかけて短いシースリンを認識する抗体の染色が,エナメル質表層でより早く弱くなった。この結果,ブタ歯胚では長いシースリンに比べて短いシースリンの分解がより早く進行すると考えられた。ラットの小柱鞘蛋白であるアメロブラスチンは、mRNAのスプライシングにより2種類の分子型がエナメル芽細胞から分泌されると考えられ、その差はN端側の15アミノ酸残基が異なるのみである。合成ペプチドを用いて、この2つの分子型(長分子型および短分子型)にそれぞれ特異的な抗体を作製し、N端特異抗体及びC端特異抗体と共に、ラット切歯のエナメル芽細胞と幼若エナメル質について免疫化学(ウエスタンブロット)と免疫組織化学を行い、以下の結果を得た。1.長分子型および短分子型は、それぞれ分子量56kDaおよび54kDaのコア蛋白として基質形成期及び成熟期エナメル芽細胞内で合成される。2.基質形成期エナメル芽細胞から抽出した蛋白のウエスタンブロットでは、56kDaと54kDa蛋白の染色性にほとんど差が認められなかった。しかし、成熟期からエナメル芽細胞から抽出した蛋白では、56kDa蛋白染色性に比べ、54kDa蛋白の染色性は弱かった。3.基質形成期および成熟期の幼若エナメル質から抽出した蛋白の低分子領域におけるウエスタンブロットは同様の染色パターンを示したが、長分子型を特異的に認識する抗体と、短分子型を特異的に認識する抗体で染色される蛋白の分子量は異なっていた。4.長分子型を特異的に認識する抗体と、短分子型を特異的に認識する抗体を用いた免疫組織化学の結果、両者の染色パターンに差は認められなかった。以上の結果、アメロブラスチンは分子量の異なる2種類の分子型として分泌されることが明らかとなり、これらは分泌後、類似した分解様式と局在を示すが、基質形成期と成熟期でその合成量に差がある可能性が示唆された。

エナメル蛋白であるアメロゲニンやシースプロテイン(シースリン,アメロブラスチン,アメリン)は,mRNAのスプライシングによって同一の遺伝子から異なる分子型が生じる。本研究では合成ペプチドを用いて異なる分子型を区別して認識できる抗体を作成し,エナメル蛋白の分子多様性の意義を解明することを試みた。アメロゲニンについては数種類の抗体を作成したが,いずれも特定の分子型を認識しているとはいえなかった。シースプロテインについては,同一の遺伝子から生じる2種類の分子型を区別して認識できると考えられる抗体の作成に成功し,これらの抗体を用いた免疫組織化学と免疫化学により以下の結果を得た。1.ラット切歯の基質形成期エナメル器と成熟期エナメル器を免疫化学で検索した結果,基質形成期と成熟期でアメロブラスチンは分子量56kDa,アメリンは分子量54kDaのコア蛋白として合成されるが,成熟期では54kDa蛋白の染色が56kDa蛋白の染色に比べて明らかに弱かった。この結果,成熟期ではアメリンの合成量がアメロブラスチンに比較して低下していると考えられた。2.ラット切歯の基質形成期幼若エナメル質と成熟期幼若エナメル質を免疫組織化学と免疫化学で検索した結果,アメロブラスチンとアメリンの分解様式および局在には明らかな差は認められなかったが,アメリンがアメロブラスチンよりも早く分解する可能性が示唆された。3.ブタ乳臼歯歯胚の基質形成期から成熟期初期にかけて幼若エナメル質を免疫組織化学で検索した結果,基質形成期ではエナメル質表層で短いシースリンを認識する抗体がより鮮明に小柱鞘を染色した。また,移行期から成熟期初期にかけて短いシースリンを認識する抗体の染色が,エナメル質表層でより早く弱くなった。この結果,ブタ歯胚では長いシースリンに比べて短いシースリンの分解がより早く進行すると考えられた。