hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正常並びに病的子的内膜における性ステロイドホルモン受容体の分析

:酵素免疫学的測定法(EIA)法を用いて測定したヒト正常子宮内膜の細胞質ER(ERc)および核ER(ERn)値をゲル瀘過法によって同一組織で同時に測定した値とを比較した結果,両測定法によるレセプター値(濃度)はよく相関し,ERc,ERnおよび総値の相関係数は,それぞれ,0.950,0.908及び0.950であった.2.ヒト子宮内膜細胞細片におけるエストロゲン受容体の免疫組織化学的証明の検討:子宮内膜のER量を,治療前に免疫織化学的に検出する方法を検討した.キュレッテージで採った内膜組織細片を,スライドグラス間に挾んで軽く圧し,このスライドグラスを固定後,所定のPAP法で免疫染色した.一定の条件下で,バックグランドは着手せず明瞭な陽性染色が得られた.3.単タローン抗体を用いた人子宮内膜プロゲステロン受容体の測定: 1)プロゲステロン受容体の固相法による酵素免疫学的測定法の検討ー特に緩衝液と吸着の影響.固相法による酵素免疫学的測定法(EIA)キットによるプロゲステロン受容体(PR)の測定に及ぼす要因について,種々の検討を加えた結果,受容体試料の作製時の緩衝液に1%BSAに加えた溶液で検量線・試料を希釈することにより緩衝液の影響なく測定できることがわかった.2)EIA法とゲル瀘過法値.種々の状態のヒト子宮内膜で,EIA法とゲル瀘過法で測定されたプロゲステロン受容体値は両者で相関することが分った.1.単クローン抗体を用いた人子宮膜プロゲステロン受容体測定:正常並びに病的(子宮内膜症)子宮内膜におけるプロゲステロン受容体PR値を、固相法による酵素免疫学的測定法(EIA)とLH20ゲル濾過法によって比較した結果、両測定値が相関を示す場合と不一致の場合があった。従って、PRーEIAキットの人子宮内膜組織への適用には尚検討を要するものと判断される。2.病的人子宮内膜組織におけるエストロゲン受容体の検討とタモキシフェン負荷試験:1)内膜癌組織におけるエストロゲン受容体の免疫組織化学的所見は、正常子宮内膜組織の所見と基本的に同じで、腺上皮および間質細胞の核に陽性であった。2)抗エストロゲン剤の手術前后の組織片での受容体を検討した結果、明らかに効果が認められた。このことは、ゲル濾過法による受容体の測定結果を裏付けるものであり、受容体の免疫組織化学的検出は必要組織が少量で可能であることなどの点から子宮内膜癌のホルモン反応性予知試験上でも有用性が大きいことが分った。3.エストロゲン受容体メッセンジャーDNA(ERmRNA)の証明の試み:ERの量的調節機構を明らかにする目的で、E標的器官におけるERーmRNA量の存在を検討した。すなわち、ラット子宮および下垂体よりグアニジンーホットフェノール法によりRNAを精製し、ERcDNAを用いたノザンブロット法にて、両組織に約6.6kbのERーmRNAを検出したが、さらに検討中である。
経営資源としての知的財産権をめぐる経営戦略の分析(日本の製造業中心に)

本研究調査によると、明確な知的財産権戦略を打ち出している企業の業種形態は電機、機械に集中し、独立した知的財産関連部署を有する組織も圧倒的に大企業に偏ることが明確になった。また、金融、証券業界においても、近年、知的財産権の担保化の問題とからみ、知的財産権の技術・資産価値の評価を行う部署の設立が確立されつつあるということが分かる。しかし、近年構想されている知的財産権の流通市場構築にあたってのイニシャティブをとったのが大企業であることからも明らかなように、経営資源としての知的財産権の位置づけを明確にしているのは、一部のベンチャー企業を除いて大企業に極度の偏りを有しているように思われる。勿論、中小企業経営者とのインタビューを通して、特許や実用新案といった具体的に権利化できる知的財産権と関わる電機、機械業界、特にハイテク関連企業においては中小企業の経営資源としての知的財産権に対する認識の高さを実感するに至ったが、それ以外の業態、権利化が難しいノウハウや、技術を営業秘密といった形で保有する業界においては、依然として、知的財産権問題は「大企業に特有な問題」、「米国系企業の経営戦略」との認識レベルに留まっているように思えた。今後の研究展開としては、企業規模では中小企業に属しながらも、その技術水準の高さを盾に大企業との提携に乗り出すベンチャー企業の知的財産権戦略の実証的研究を考えている。なお、研究代表者は本研究のテーマにも関わる内容で1996年度『企業の多国籍化と技術移転-ポスト雁行形態の経営戦略-』(千倉書房)を著し、総合研究大学院大学に博士論文として提出し、1997年1月の一般公開発表(於国際日本文化研究センター)には、本研究のテーマに関しての発表も行っている。
顎関節滑液中の細胞を用いた顎関節破壊の分子生物学的解析

1)顎関節より採取された滑液中細胞の単離、培養に成功し、これらの細胞から骨吸収能を有する破骨細胞の誘導系を確立した。これらの細胞をビタミンD3やPGE2の刺激下で培養することによりTRAP陽性の多核巨細胞が形成され、象牙切片上の培養では吸収が認められた(走査電顕にて確認)。また、この滑液中細胞から培養にて増殖する線維芽細胞様細胞を継代培養し、その表現形を同定。ヒト線維芽細胞マーカー、ビメンチン陽性、マクロファージ、樹状細胞マーカー陰性であり、滑膜由来の線維芽細胞である可能性が示唆された。これらの細胞と健常人末梢血単球との共培養でも破骨細胞を誘導し、滑液中線維芽細胞様細胞の破骨細胞分化支持能が証明された。これにより、顎関節滑液中には破骨細胞前駆細胞、破骨細胞形成支持細胞の存在が明らかとなり、顎関節症における関節破壊、変形などの病態形成に大きく関与していることが示唆された。(以上論文投稿中)2)顎関節症患者の関節滑膜を採取、培養し、それらの細胞の表現形を同定した。これらの細胞は、ヒト線維芽細胞マーカー、ビメンチン陽性、マクロファージ、樹状細胞マーカー陰性であり、滑膜由来の培養線維芽細胞であることを確認した。また、これらの細胞も健常人末梢血単球との共培養で象牙切片の吸収能を有する破骨細胞を誘導し、顎関節滑膜細胞の破骨細胞分化支持能を証明した。以上のことより、顎関節内では破骨細胞前駆細胞、破骨細胞形成支持細胞が存在し、病状の変化による液性因子等の相互作用から顎関節疾患における骨変形や病態形成に関与していることが示唆された。本研究の目的は、顎関節内障患者から採取した関節滑液中の細胞を単離しin vitroにてその性状や細胞画分を調べ、培養により破骨細胞への分化を検討する。また、滑膜組織からの培養滑膜細胞における破骨細胞分化、支持能の有無を調べる。この破骨細胞誘導系を確立し、顎関節内障における関節破壊、骨変形メカニズムを詳細にすることにより、病態解明の一助とすることである。実験に用いたサンプルは九州歯科大学口腔外科外来、手術室で行われたパンピングマニプレーション、顎関節鏡視下手術、顎関節開放手術に際し得られた滑液、滑膜組織を用いた、まず、滑液中の細胞を単離し、得られた細胞をウシ血清を含んだ培養液中で培養した。これらの培養細胞に液性因子(cytokine, growth factor等)を添加し、4週間培養することにより、多核巨細胞への分化、誘導が認められた。さらに形成された多核巨細胞はTRAP染色にて陽性であり、象牙切片や人工骨(Osteologic)上にて吸収窩を形成したことにより破骨細胞としての表現型、機能を有することが確認できた。これまでの報告では、破骨細胞形成には骨芽細胞や線維芽細胞などの間葉系細胞に発現するRANKLが必須といわれているが、今回の培養系においても線維芽細胞様の付着細胞の増殖が認められ、これらの細胞を単離、継代培養し、刺激を加えると、RANKLの発現が認められ、破骨細胞形成支持能を有することが明らかとなった。今後は、これらの細胞の表現型をさらに詳細に検討するとともに顎関節滑膜細胞における破骨細胞形成支持能についても評価を行っていく。
新たな運動適応機構の解明

これまで運動の適応機構は運動刺激に対する生体全体あるいは組織の変化として捉えられてきた。そこで、本実験では骨格筋の運動に対する適応機構として、組織間のコミュニケーションと細胞間のコミュニケーションに焦点を絞り、研究を行った。今回の実験では、筋肥大に伴い、身体全体から幹細胞の供給をうけ、筋肥大や再生に深くかかわる機構が存在していること突き止めた。すなわち、細胞の供給系としての新たな運動適応機構が存在することがほぼ明らかになった。筋肥大誘導実験で、単核球が4-8日目に増加することが明らかになった。これらの成分には多能性幹細胞や全細胞系統の造血前駆細胞などが数多く含まれていることから、成熟白血球性分を削除して、残った単核球がどのような挙動を示すのかを観察した結果、この未熟な細胞群は骨格筋肥大誘導により血液から急激に減少することが判明した。骨格筋肥大に伴い筋組織の中には多くの浸潤細胞が負荷後2日目ころから血液から筋組織に移行したものと考えられる。さらにCD34+細胞である造血幹細胞や多機能幹細胞を除いた細胞群も筋肥大誘導後急激に減少を示した。これらの細胞群にはSP細胞など未分化な多機能幹細胞が数多く含まれている。この結果も骨格筋肥大に貢献している可能性が考えられる。血液中のSP細胞は運動負荷に伴い増加することが示された。このように未分化な多機能幹細胞が骨格筋肥大誘導によって動員されることが明らかになった。さらに細胞間のコミュニケーションにおいてはNotchシグナル伝達系に着目して研究を行った。文献的研究でその概要とその役割の重要性について示した。また著者らの研究では報告書には示していないがガンマーセクレターゼインヒビターの投与によって筋肥大が誘導されたことから、細胞間での情報のやり取りが筋細胞成長の制御機構に重要な役割を果たしていること推測された。本実験では新たな骨格筋肥大機構の運動生理学的意義を明らかにするために実験を行った。今回行った実験は次のようである。1)従来、骨格筋の肥大に伴い内分泌系物質や成長因子の挙動について着目されていたが、今回はテノトミー法で筋肥大を誘導し、細胞間の情報伝達系の役割について検討した。特に受容体であるNotchとリガンドであるDeltaに着目した。実験はddy系マウス雄を使い、右脚腓腹筋を切断し、残りのヒラメ筋、足底筋に代償性の負荷を加えた。実験は、対照群とNotch伝達系の阻害剤であるγセクレターゼを投与した群に分けた。テノトミー一週間後、ネンブタール麻酔下で屠殺し、筋を取り出し、筋の重量を測定した。NotchとリガンドであるDelta、Pax7,Myogenine等の消長について検討した。その結果、テノトミーによって骨格筋の肥大は誘導され、しかしながらγセクレターゼを投与した群の肥大量は対照群に比較して統計的に有意であった。このことから細胞の増殖と分化に何らかの違いがあることが想定され、サテライト細胞のマーカーであるPax7や筋分化の指標であるMyogenineの比較を行った。その結果、組織学的に大きな違いが観察された。2)骨格筋肥大に伴うNotchシグナル伝達系の関与の有無について検討した。まず最初に、実験はNotchシグナル伝達系発現の時期を検討するためにトレーニング開始から一日後、二日後、1週間後に設定した。ウエスタンブロット法により解析した発現の有無とその時期を解析した結果、すべての時期でNotchの発現が観察された。3)脂肪組織に含まれる幹細胞の役割を検討するためにトレーニング実験を行った。現在解析中である。

これまでの運動の適応機構を鑑みると多くは組織内の変化として捉えられてきた。各細胞における代謝や脂肪組織・骨格筋組織の増減などである。骨格筋肥大についてみると、筋細胞の肥大と増殖がその主な機構として捉えられ、筋細胞肥大を誘導する内分泌系・神経系や組織内での成長因子などの働きに関する研究が主であった。すなわち生体は神経系や内分泌系などに制御され、さらに組織内の液性因子によって調整されるというものである。今回の実験では筋肥大に伴い、身体全体から幹細胞の供給をうけ、筋肥大や再生に深くかかわる機構が存在していることを示したものである。すなわち、細胞の供給系としての新たな運動適応機構が存在することがほぼ明らかになった。実験では単核球が4-8日目に増加することが明らかになった。これらの成分には多能性幹細胞や全細胞系統の造血前駆細胞などが数多く含まれていることから、Lin抗体を用いてほとんどの成熟白血球性分を削除して、残った単核球がどのような挙動を示すか観察した結果この未熟な細胞群は骨格筋肥大誘導により血液から急激に減少することが判明した。このことは血液から他の組織に移行したことが考えられる。骨格筋肥大に伴い筋組織の中には多くの浸澗細胞が負荷後2日目ころから観察されている。従って、少なくとも多機能幹細胞などの血液から筋組織への移行が示唆される。さらにCD34+細胞である造血幹細胞や多機能幹細胞を除いた細胞群も筋肥大誘導後急激に減少を示した。これらの細胞群にはSP細胞など未分化な多機能幹細胞が数多く含まれている。この結果も骨格筋肥大に貢献している可能性が考えられる。血液中のSP細胞は運動負荷に伴い増加することが示された。このように未分化な多機能幹細胞が骨格筋肥大誘導によって動員されることが明らかになった。
アクリロニトリルの接触水和反応によるエチレンシアンヒドリンの選択的合成

今までアクリロニトリル(I)の水和によるアクリルアミド合成の触媒および反応機構について研究して来た。この実績を基に同じ水和反応でも触媒が異なればエチレンシアンヒドリン(II)が生成する。特に塩基性触媒では(II)ばかりでなく、一旦生成した(II)が原料の(I)と反応してビス(2ーシアノエチル)エ-テル(III)を生成する。さらにアクリルアミドまでも(量は少ないが)生成し、分析が非常に面倒になる。本研究ではその分析法をまず確立し、ついでどのような触媒と反応操作で選択的に(II)を生成するのかを目的として研究した。まず分析方法であるが、FIDガスクロマトグラフを用い、カラムとしてジエチレングリコ-ルアジペ-ト+りん酸・クロモゾルブが反応物、生成物の分離にすぐれていること、さらに内部標準物質としてエチレングリコ-ル・モノエチルエ-テルが最適であることを見出した。水酸化ナトリウム水溶液を触媒として水和反応を行い、生成物を分析する際、この反応混合溶液をガスクロマトグラフに直接導入するとカラムばかりでなく検出器まで破損してしまう。塩酸で中和してから挿入すればよいが、そのときには塩が生成し、カラムが損傷をうける。そこでガラスウ-ルを1015cmつめたカラムを分離カラムの挿入端側につなぎ、そこに塩が析出するようにしてカラムの保護が出来た。水酸化ナトリウムを触媒とする均一触媒反応では分析に面倒な点があったので、マグネシアやカルシアのような固体塩基触媒で反応を行った。しかし難溶性の固体塩基触媒の一部が水にとけ反応を促進するということがわかった。したがって均一触媒を固体上に固定し分析を容易にする試みとして、ナトリウム化合物を固体塩基触媒にド-プした触媒を用い、反応物と触媒が接触している時間を種々調節して、副反応生成物である(III)の生成を抑える方法を検討している。
異なる細菌感染に対応した細胞応答機構の解明

GASを内包したオートファゴソームであるGcAV (GAS containing Autophagosome like Vacuole)とリソソームとの融合に必要なタンパク質として、細胞内小胞輸送に関与するとされているSNAREタンパク質群のうちVAMP8とVti1bを同定した。P.g.については細胞内のエンドサイトーシス経路を利用し、細胞内へと侵入する。一部のP.g.はリサイクリング経路を利用して細胞外へと脱出し他細胞へと再侵入を図る。歯周病原因菌の一つであるグラム陰性菌Porphyromonas gingivalis(以下P.g.)の主要な病原因子として報告されている。P.g.はエンドサイトーシスを介して細胞内に侵入し、多種多様な細胞機能傷害を引き起こす。しかし、P.g.の細胞内挙動については未解明な部分が多い。我々はP.g.が細胞内殺菌機構から逃れるために細胞外脱出と細胞への再侵入を繰り返し、結果として歯周病の慢性化を引き起こす可能性を示した。P.g.の細胞外脱出はリサイクリング経路と呼ばれる、エンドソームからリサイクリングエンドソームを経由した細胞内輸送経路を利用していること、さらにRab11、RalA、エクソシストコンプレックスのノックダウンによりP.g.の細胞外脱出が阻害されたことから、これら因子がP.g.の細胞外脱出には必須であることを示した。Group A Streptococcus(以下GAS)は咽頭・扁桃炎などの軽度の疾患から壊死性筋膜炎などの重篤な感染症の原因菌である。細胞質内へと侵入したGASはオートファゴソームにより捕獲され、その後オートファゴソームとライソソームとの融合により分解、殺菌される。我々はGASを内包したオートファゴソームであるGcAV (GAS containing Autophagosome like Vacuole)とライソソームとの融合に必要なタンパク質として、細胞内小胞輸送に関与するとされているSNAREタンパク質群のうちVAMP8とVti1bを同定した。さらに我々は、これらのSNAREタンパク質は対細菌機構としてのオートファジーだけではなく、飢餓で誘導されるオートファゴソームとライソソームとの融合にも関与していることを示した。GASについて;Group A Streptococcus(以下GAS)は咽頭・扁桃炎などの軽度の疾患から壊死性筋膜炎などの重篤な感染症の原因菌である。我々はGASを内包したオートファゴソームであるGcAV(GAS contaning Autophagosome likevacuole)の形成がSyntaxin 17のノックダウンにより著しく阻害されることを見出した。またGASの細胞内生存率がコントロール細胞と比較して顕著に上昇していることから、Syntaxin17はGcAV形成の必須因子であることが明らかとなった。Syntaxin17は細胞内小胞輸送に関与するとされているSNAREタンパク質群に属し、小胞体への局在が明らかにされてはいるが、その機能は殆んど解明されていない。以上の結果は、機能未知のタンパク質であったSyntaxin 17が、細胞の対細菌感染機構として重要な機能を保持していることを示す知見であると思われる。P.g.について;歯周病原因菌の一つであるグラム陰性菌Porohyromonas gingivalis(以下P.g.)の主要な病原因子として報告されている。P.g.は細胞内分解機構であるオートファジーを利用し、細胞内での殺菌機構から逃れることが報告されている。我々はオートファジー欠損細胞内でのP.g.の生存率が減少することを見出した。さらに興味深いことに感染初期の段階で特定のユビキチン関連タンパクと高頻度に共局在を示したことからP.g.は細胞内への侵入後、ユビキチン化、オートファジー機構による認識を経て細胞内分解機構から逃れている可能性が示された。これはP.g.がオートファジー機構を利用し、細胞内に生存し続けることで歯周病の慢性化を引き起こす可能性を示した重要な知見であると考えられる。歯周病原因菌の一つであるグラム陰性菌Porphyromonas gingivalis(以下P.g.)は主要な病原因子として報告されている。我々は昨年度、P.g.が細胞内殺菌機構から逃れるために細胞外脱出と細胞への再侵入を繰り返し、結果として歯周病の慢性化を引き起こす可能性を示した。、P.g.の細胞外脱出はリサイクリング経路と呼ばれる、エンドソームからリサイクリングエンドソームを経由した細胞内輸送経路を利用していること、さらにRab11、RalA、エクソシストコンプレックスのノックダウンによりP.g.の細胞外脱出が阻害されたことから、これら因子がP.g.の細胞外脱出には必須であることを示した。以上の研究を進める上で、P.g.の更なる生存戦略として我々はP.g.の細胞内生存率がオートファジー欠損細胞内において上昇していることを見出した。オートファジーは細胞内に侵入した病原性細菌を捕食する、細胞内殺菌機構も担っている。

オートファジー欠損細胞においてP.g.の細胞内生存率が増加するという現象は、言い換えればP.g.はオートファジーを利用して細胞内で生き延びていることを示している。さらに我々は、P.g.の細胞内での生存に関与している可能性がある、2種類のタンパク質を同定した。これら二種類のタンパク質は、オートファジー関連タンパク質として既に同定されていることから、P.g.が細胞内で生き延びるために、オートファジーを積極的に利用していることが明らかとなった。今後、新たに同定したタンパク質とP.g.の細胞内生存戦略についてさらに検討を加える予定である。GASの細胞内侵入細菌の分子基盤について詳細な解析を実施し、その成果を現在投稿中である。今後はP.gingivalisとオートファジーとの関連性について調べる予定である。具体的には細胞内に侵入したP.gingivalisを初期段階で認識する細胞側因子(特にユビキチン化関連タンパク質)に着目し、P.gingivalisがどのようにオートファジーを利用し細胞内で生存を維持しているのかについて今後の研究を展開していく予定である。
雪上を長距離滑走した土砂崩落現象のメカニズムと発生条件の解明

2011年3月12日の長野県北部地震では雪に覆われた斜面で岩石なだれが発生し通常より長距離拡散した.しかし,メカニズムも発生条件も不明であった.申請者らは観察事実を収集し,それを基礎に2つの実験を行った.第1は3.0kg以下の岩石を模型雪斜面上に落下させる実験であり,第2は6tの岩石と土を50m長の雪斜面に落下させる実験である.第1の実験では硬い雪上では長距離運動が実現したが,軟らかい雪上や,岩石に雪や水が運動中に付加されてもその長距離の運動につながらない可能性が明らかになった.第2の実験では,一部で雪の圧縮により硬い雪が形成され,その上に岩石と土が載って雪上を移動する状況が観察された.当該年度は昨年に引き続き雪上に土砂を流下させることを想定して傾斜土層を作成し,実験を行った.さらに北海道内各地において雪上を土砂が長距離移動するような類似現象が発生していないか,北海道北部および東部の山間地を調査した.この調査では,北海道内においても,雪上を滑走する土砂現象が発生していることを確認した.しかし,長野北部地震で発生したような低い摩擦角を持つ長距離の雪上土砂移動現象は発見できなかった.北海道各地で発見された雪上の土砂移動現象は,みかけの摩擦角が大きく,斜面途中で止まっているものが多いが,それらの滑走面にある雪は長野県や新潟県地域と比較して性質が異なる.それに着目して雪質による雪上の岩石の滑走距離についても実験を行った.これによって得られたことは,比較的固く締まった雪上では長距離滑走が発生し,柔らかい雪層では,通常の砂斜面よりも,むしろ滑りにくくなることである.この硬い雪面は雪と岩石の接触でも形成される可能性がある.つまり,雪上で長距離の土砂移動が発生するか否かは多分に積雪環境に依存することを示唆している.また雪と岩石の衝撃圧力の程度が非常に重要であると考えられるということは,野外での簡単な実験や現地観察の結果からも明らかになった.以上のような観察結果をまとめ,さらに2011年の長野北部地震で発生した現象も併せて考察しYamasaki et al. 2013などの誌上で研究結果を公表した.現在も土層実験は引き続き実施中であり,今後さらに詳しい発生条件に関する知見が得られるものと考えられる.2011年3月12日の長野県北部地震では雪に覆われた斜面で岩石なだれが発生し通常より長距離拡散した.しかし,メカニズムも発生条件も不明であった.申請者らは観察事実を収集し,それを基礎に2つの実験を行った.第1は3.0kg以下の岩石を模型雪斜面上に落下させる実験であり,第2は6tの岩石と土を50m長の雪斜面に落下させる実験である.第1の実験では硬い雪上では長距離運動が実現したが,軟らかい雪上や,岩石に雪や水が運動中に付加されてもその長距離の運動につながらない可能性が明らかになった.第2の実験では,一部で雪の圧縮により硬い雪が形成され,その上に岩石と土が載って雪上を移動する状況が観察された.2011年3月12日に長野県栄村を震源として発生した震度6強の地震において,ほとんど乾燥した小規模土砂崩壊が雪上を長距離滑走し,破壊的な災害となった例が確認された.初年度(平成24年度)は,まず始めに崩壊土砂の長距離移動が確認された災害発生域の複数地点を再び調査し,地形・地質的な共通点等について再確認した.また,雪上に土砂を流下させることを想定して傾斜土層を作成し,積雪強度や傾斜角,温度を変えた実験を行った.現地調査の結果では,新潟県および長野県の防災担当者および平成23年3月12日の災害発生直後に網羅的に調査を行った技術者にもヒアリングを実施し,現象の全体像の解明を行うとともに,複数箇所のデータを取得した.その結果,被災域の複数箇所で,雪上を滑走する移動現象が生じたことも明らかになったが一方で,その流動性は規模に大きく依存する可能性が高いことも明らかなった.それらの結果は,Yamasaki & Nagata (2012)などに結実し,地球惑星科学連合大会,雪氷研究大会,地震時地すべり国際会議等にて発表を行った.また,傾斜土層による実験は現在も進行中であるが,現地の観察結果と相違するデータも得られ,現在のところ十分な解釈が得られていないため,今後も引き続き実験を行う予定である.一方で,土砂の長距離流下条件には温度環境や積雪履歴に依存する積雪層強度が大きく働いている可能性を示唆しているという結果も得られた.本年度は最終年度であり,これまでの実験および野外調査の取りまとめを行った.結論から言えば,実験では本研究が目的とした長距離流動現象は再現することはできなかったが,野外調査と実験結果の組み合わせによる検討により,その緒はつかめたと考えている.判明した点は以下である.1.流下中に個々に分離した岩石に混入する雪は岩石の可動性を低下させ,長距離の運動には結びつかないと考えられる.2.流下中に熱移動や摩擦熱などで形成された水は,雪層が透水性能を持つ限りは直ぐに雪層に浸透してしまうために岩石の流動性に影響しない可能性が高い.3.個々の運動する岩石の粒子が大きいほど長距離流動し,小さい岩石では移動しにくい.これは,雪層自体が変形することによる緩衝能力が顕著であるためと考えられる.

4.雪層の硬度が極めて大きくなると,その低い摩擦係数により長距離運動が実現する可能性がある.さらに,複数の文献調査と各地での調査の結果,長距離運動現象は規模が大きいほど発生する可能性が高まるものの,長距離流動が発生した2011年長野北部地震で崩壊した数十万立法メートル程度の土量では,比較的短距離で停止する場合も多くあることも判明し,雪上の長距離流動は雪層の性質に強く左右されていることが明確になった.以上の研究成果について学会発表2件を予定している.現在のところ受理には至っていないが近日中に本研究で得られた成果を公表する予定である.一方で,実験スケールと実験に用いた雪層の現実性に問題があり,より現実に近い現象の解明にはより大型で野外の天然雪層を用いた実験が必要であることも明らかになった.現在,研究グループにおいて,別の大型予算を獲得し,より実際の現象に近い大きさの実験を行うことにした.今後はより大きなスケールの実験に移行し解明への取り組みを引き続き行う予定である.地盤工学当初の想定以上に現象の全体像を把握する情報が多数得られているために,研究期間内に多くの成果を公表できる公算が高まったため,区分を(1)とした.当初の想定以上に現象の全体像を把握する情報が多数得られているために,研究期間内に多くの成果を公表できる公算が高まったため,区分を(1)とした.引き続き傾斜土層での実験を継続すると共に,その知見を元に研究グループ全員と共に再度現地調査を実施する予定である.これは昨年度予定していたが実施ができなかった.これにより,現地データと傾斜土層で得られたデータとの相違点を解明し,発生条件の詳細な解明に取り組んでいく計画である.特に,積雪層の性質は日本全国で異なり,積雪層の強度,平滑性により雪上での土砂の流動性が異なっていると考えられるために,北海道内で得られたデータを元に全国で特に雪層に関して引き続き調査をしていく予定である.さらに,本年度は研究成果の取りまとめを行う.今後の推進方策としては,引き続き傾斜土層での実験を継続すると共に,その知見を元に研究グループ全員と共に再度現地調査を実施する予定である.これには再度の地形調査も含まれる.また,これにより,現地データと傾斜土層で得られたデータとの相違点を解明し,発生条件の詳細な解明に取り組んでいく計画である.特に,積雪層の性質は日本全国で異なり,積雪層の強度,平滑性により雪上での土砂の流動性が異なっていると考えられるためにこのデータも全国的に引き続き調査をしていく予定である.傾斜土層での実験成果は現時点でデータを整理中であるが,引き続き得られたデータからメカニズムに関わる点を整理していくとともに追加実験を冬季にかけて行う予定である.本年度はその論文の公表も予定している他,さらに北海道内を中心に積雪層の強度性状に関するデータの収集を開始し,北海道内でのリスクマップづくりの足がかりを得たいと考えている.購入物品が予定よりも安価に購入できたため,少額の次年度使用額が生じた。本年度は上記の方策に鑑み,第一に研究グループ構成員の現地調査旅費を計上した.また,土層実験関連の消耗品などの予算を計上した.該当なし
ゲームソフト産業のオープン・イノベーション化と日本企業の競争優位性の再構築戦略

本研究の目的は、オープン・イノベーション化が進む中で、日本企業が国際競争力を維持するためにはどうするべきなのか、ゲームソフト産業を対象とした調査によって解明を図ることである。ソーシャルゲーム開発企業の調査では、アップデートによって品質を継続的に作り込んでおり、開発マネジメントにおける組織能力が確認できた。福岡市の家庭用ゲームソフト開発企業クラスターの調査においては。汎用的な開発支援ソフトを使いこなすノウハウが確認できた。以上から、日本企業がこれまで強みとしてきた組織能力により、オープン・イノベーション化の中で利用可能となった企業製の汎用技術を使いこなす企業の優位性が明らかになった。今年度(平成25年度)は、研究の基礎を固めるために既存研究の整理、国内の企業調査、産業資料の収集を行った。研究を進めるにあたっては、コンテンツ産業研究会のメンバーと協力し、定期的な会合で討議を重ねることにより、多面的な視座を取り込んだ理論構築を行った。具体的な研究成果の概要は、次のとおりである。第一に、以前に調査を行った福岡市のゲーム開発企業の集積事例に対し、本研究における問題意識に基づき分析を行い、コンテンツ産業研究会メンバーとの共著論文「Platform paradox」として発表した。本研究においては、標準的なゲームエンジンやミドルウェア(開発支援ソフト)が登場し、世界的な開発環境の画一化が進む対抗策として、産業集積による地域的な競争優位性の構築が有効であることが確認された。第二に、ゲームソフト開発企業に対するインタビュー調査を行った。調査にあたっては、現在のゲームソフト市場がスマートフォン向けゲームアプリにシフトしつつある実情を受け、スマートフォンアプリ開発企業も対象に含めることとした。スマートフォンアプリ開発企業に対する調査からは、サービス開始後も継続的にコンテンツを作りこみ続ける改善能力・組織能力といった、日本企業の特性に親和的な競争優位性が確認された。研究の成果は、一橋大学IIRサマースクールにおいて、コンテンツ産業研究会のメンバーとの共同報告「革新的イノベーションを実現するマネジメントの探求ーソーシャルゲームの事例に基づく考察」として発表した。本研究は、平成26年度以降も継続し、より精緻化されたものとして論文化する予定である。第三に、現在の国内ゲームソフト開発企業の実態について把握するために、プラットフォーム企業およびゲーム開発企業がウェブサイトで公開している資料等を情報源とし、産業資料の入手・整理に着手した。本年度は、所属研究機関の変更に伴いゲーム開発企業の多くが集積している東京地域への移動・調査が困難となったため、研究実施計画当初の方針を修正し、調査対象を絞り込み重点的に調査することとした。具体的な研究活動としては、第一に、他のコンテンツ産業研究者との共同研究プロジェクトに参画し、スマートフォン向けゲームアプリの開発企業を対象として、製品開発戦略、開発の組織体制について複数回のヒアリング調査を実施した。スマートフォン向けゲームアプリ市場は近年大きく成長しており、注目される市場である。そして、スマートフォン向けアプリ開発においては、OSやブラウザ(プラットフォーム)が整備されることで参入の障壁が下がり、多くの企業が活発に製品の開発・提供を行うようになる「オープン・イノベーション化」が進展している。ヒアリング調査からは、同市場で成功するためのマネジメントとして、欧米企業によってプラットフォームが整備されて開発条件が標準化する中で、同質化を避けるために、組織能力を高めて「面白さ」「ユーザーインターフェースの快適性」という品質を作り込み、競争力を獲得する日本企業の戦略が確認された。研究活動の第二としては、他のコンテンツ産業研究者とのゲーム産業に関する研究会に参加し、ゲーム産業について経営学・経済学の視座からどのように分析をするべきなのか、知見の交換を行った。この中で、本研究について他の研究者から意見をいただき、研究の精緻化を図った。今後の研究の展開としては、上述の調査研究および議論の蓄積をもとに論文化を行い、広く社会へ成果の公開を目指したい。経営戦略論ゲーム開発企業を対象としたインタビュー調査を進める中で、26年度の研究を進めるための、ゲーム開発企業関係者およびコンテンツ産業研究会メンバーとの協力関係の構築を進めることが出来た。上記のインタビュー調査に付随し、ゲーム業界関係者から、ゲーム開発活動の先端的事例を分析するのであれば、家庭用ゲーム機用ゲーム開発活動のみを対象とした調査でなく、スマートフォン用ゲームアプリ開発活動も対象とするべきであるとの指摘を受けた。これに従い、研究対象を家庭用ゲーム機用のゲーム開発企業から、スマートフォン用ゲームアプリ開発企業まで含める修正を行った。スマートフォン用ゲームアプリ開発企業を対象とした予備的なインタビュー調査からは、競争優位性につながる企業活動の一端が判明した。研究目的を達成するための一定の手がかりが得られ、研究対象の修正は大いに意義があったといえる。一方で、研究対象を修正した結果、研究計画の変更が必要となり、当初予定していた産業データの収集、複数企業を対象としたインタビュー調査の実施といった活動まで達成することが出来なかった。以上を勘案し、現在までの達成度について「やや遅れている」の評価とした。スマートフォン用ゲームアプリ開発企業に関して、25年度と同様にコンテンツ産業研究会メンバーと連携し、インタビュー調査を継続する。

これと並行して、当初予定していた産業データの整理を進め、インタビュー調査をとおして得られた個別企業の活動の背後にある、産業構造の影響について考察する。その上で、ゲーム産業において有効と思われる競争行動について仮説を導出し、広範な企業を対象としたアンケート調査によりこれを検証する。以上の作業により、オープン・イノベーション化が進んだ状況においてどのように競争優位性を構築するべきか、一般に適用できる知見を導出し、学会での報告・ジャーナルへの投稿によって成果を広く公開することを目指す。研究の現在までの達成度でも述べたが、ゲーム業界関係者から、ゲーム開発活動の先端的事例を分析するのであれば、家庭用ゲーム機用ゲーム開発活動のみを対象とした調査でなく、スマートフォン用ゲームアプリ開発活動も対象とするべきであるとの指摘を受け、研究対象を拡大した。この結果、当初予定していた産業データの収集の対象および使用する資料の再検討が必要となり、予算を次年度以降に繰り越すこととなった。調査対象の拡張に対し、新たに必要となる資料の選定を早急に行い、保留していた資料購入を実行に移すこととする。
新奇ビラジカル化合物の創成とその物性探求

近年、多環芳香族炭化水素の化学が、飛躍的な発展を遂げている。曲面π共役化合物、非局在型一重項ビラジカルなど、興味深い新奇物質が創成されてきている。しかし多くの場合、それらの合成には多段階合成が必要である。本研究では、飛躍的な発展を続ける遷移金属触媒反応を用いることで、この問題を解決しようと考えた。本研究は、多環芳香族炭化水素を遷移金属触媒反応により直接官能基化し、新奇構造の創成と物性発現を目指すものである。注目したのは、ヘキサベンゾコロネン(HBC)である。HBCの電子構造は、π拡張されたベンゼンに近似されるため、基礎化学的な観点から興味深い。さらにHBCは、その優れた平面性から、超分子材料としての応用が期待されている。本研究ではまず、HBC骨格に対する直接修飾法を検討した。検討の結果、イリジウム触媒によるC-H活性化反応を用いることにより、HBC骨格に対して、位置選択的にボリル基を導入することに成功した。これは、HBC骨格に対する直接ホウ素化の初めての例である。また、得られたボリル体を酸化することで、π拡張キノン体、テトラカルボニル体の合成に成功した。前者のπ拡張キノン体は、磁気物性測定により、一重項ビラジカル性が確認されている。これは、HBCに対する直接ホウ素化から、わずか3ステップで、閉殻分子を一重項ビラジカルに変換できたことを意味する。さらに、ボリル体を足掛かりとすることで、HBC骨格に対して様々な置換基の導入することに成功した。さらに、テトラカルボニル体に対する修飾法を確立し、歪んだπ平面を持つHBCの合成に成功した。多様な官能基の導入や平面性の制御を、合成経路の後半で可能にすることは、Late-stageの観点から合成化学的に有用である。以上のように、本研究は遷移金属触媒反応を用いた直接修飾法の確立が、多環芳香族炭化水素における新奇構造や物性発現において重要な貢献をすることを示すものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。ヘキサベンゾコロネン(HBC)骨格を用いたπ拡張ジイミンの合成に成功した。25年度は、para型、ortho型の2種類のπ拡張ジイミンの合成に成功し、いずれも^1H NMRのブロード化が観測された。これは、ラジカルの生成を示唆するものである。HBC骨格を用いたπ拡張キノンは、酸素上に置換基導入できないことから、物性変化の自由度、安定性の制御に問題があった。π拡張ジイミンでは、窒素上の置換基を変更することで、物性の制御が期待できる。25年度は、窒素上にメシチル、メシル、トシル基を持つpara体、ortho体の合成に成功した。その結果、メシル基を導入したπ拡張ジイミンは、メシチル体に比べて安定性の向上が確認された。一方、トシル基を導入したortho型のπ拡張ジイミンでは、超原子価ヨウ素を用いた酸化の際、ベンゼン環とヘキサベンゾコロネン骨格で縮環が起きることが、MSスペクトルから確認された。この化合物は、他のπ拡張ジイミン体と同様に、^1H NMRがブロード化し、ラジカルの発現が示唆された。次に、この化合物の還元を行なったところ、還元体であるジアミン体の生成が^1H NMRにより確認された。このことは、トリフェニレン型のジイミン骨格を保持した縮環体の生成を示唆するものである。現在、合成に成功した各種π拡張ジイミン体のX線結晶構造解析を検討している。さらに、ESRやSQUIDといった磁化率測定、電気化学測定によるHOMO-LUMOギャップの考察を進めている。これらは、π拡張ジイミンが、非局在型一重項ビラジカルか否かを判断するためのものである。

さらに、テトラカルボニル体に対する修飾法を確立し、歪んだπ平面を持つHBCの合成に成功した。多様な官能基の導入や平面性の制御を、合成経路の後半で可能にすることは、Late-stageの観点から合成化学的に有用である。以上のように、本研究は遷移金属触媒反応を用いた直接修飾法の確立が、多環芳香族炭化水素における新奇構造や物性発現において重要な貢献をすることを示すものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。目的化合物であるpara型、ortho型のπ拡張ジイミンの合成に成功し、その物性を明らかにした。しかし、これらの化合物の結晶性が非常に悪く、X線結晶構造解析の成功には至っていない。一重項ビラジカルの研究においては、X線結晶構造解析による結合長の議論が非常に重要な位置を占める。早急に問題解決を行っていきたい。π拡張ジイミンのX線結晶構造を得る。さらに、ESRやSQUIDによる磁化率測定から、ビラジカル性の存在についての確証を得る。問題は、化合物の不安定性である。したがって、グローボックスを用いた実験手法の改良を今後も行っていきたい。
減数分裂における高次クロマチン構造の確立機構の解明

生殖細胞では体細胞分裂から減数分裂への切り替えに伴って、減数分裂仕様に特化されたクロマチン構造の再構築が起きている。DNAメチル化、ヒストン修飾による半保存的に非ゲノム情報複製を行う体細胞とは対照的に、この再構築は減数分裂直前にむしろその構造を解消するように働くと推定される。本研究では、減数分裂期のクロマチン構造の解析を通して、生殖細胞系列と体細胞系列の非ゲノム情報複製に関わる様式の違いを明らかにする。
c-mos産物の生理機能と細胞がん化機構の解析

ツメガエル卵成熟と細胞がん化におけるMosの機能経路に関し、次のような成果を得た。1.ツメガエル卵成熟を負に制御するプロテインホスファターゼ2Aが、Mosによる卵成熟開始に対しても負に働くことを明らかにした。2.これまでの他のグループの報告と異なり、Mosの卵細胞分裂抑制因子(CSF)としての活性のためにcdk2キナーゼは不要であることを示した。3.MAPキナーゼファミリーの特異的阻害タンパクであるCL100を用いて、Mosの下流に(古典的MAPキナーゼ以外の)MAPキナーゼ関連経路が存在することを示唆した。4.NIH3T3細胞のがん化において、Mosの下流でMAPキナーゼがc-Fosの他にFra-1やFra-2もリン酸化し、かつ安定化させることを明らかにした。5.しかしながら、c-Fosの場合と異なり、リン酸化・安定化されたFra-1,Fra-2のみではNIH3T3細胞をがん化できないことを示した。1.卵減数分裂におけるMosの機能とシグナル伝達卵成熟(減数分裂)においては、第1(M1)および第2(MII)減数分裂の間にDNA合成はない。本研究では、ツメガエル卵成熟におけるDNA合成の欠如(あるいは抑制)へのMosの関与を調べた。c-mos mRNAのアンチセンスDNAあるいは抗Mos抗体を卵核胞崩壊(GVBD)時の卵に注入すると、MI後に核膜が形成され、DNAが合成された。すなわち、MI/MII転移におけるDNA合成の抑制にMosが関与していることが判明した。生物学的には、MI後の核膜形成やDNA合成は成熟卵の単為発生的賦活化と見なせる。したがって、卵成熟におけるMosの機能の生物学的意義は「単為発生の抑制」にあると考えられた。同様な結論が、他のグループとの共同研究で、c-mos欠損マウスを用いても得られた。さらに、ツメガエル卵成熟の開始におけるMAPKカスケードの役割について調べた。優性不能型Mek1(MAPKキナーゼの一種)やMAPKの特異的ホスファターゼとされるCL100を用いてツメガエル卵のMAPKの活性化を完全に抑えても、卵成熟は(そのキネティクスは有意に遅れるもの)必ず起こることが明らかになった。このことから、卵成熟の誘起においては、Mosの下流経路としてMek/MAPKカスケード以外の何らかの経路も介在する可能性が示唆された。2.Mosによる細胞がん化機構の解析Mosは、Mek1を直接リン酸化することによってMAPKを活性化できる。MosによるNIH3T3細胞のがん化におけるMAPK経路の機能を解析するため、優性不能型Mek1を共発現させた。その結果、Mosによる細胞がん化が完全に抑制されることが明らかになった。さらに、野生型Mek1の過剰発現がMosのがん化能を顕著に活性化することも示された。これらのことから、Mosによる細胞のがん化にはMek1/MAPKカスケードの活性化が必要かつ十分であることが明らかになった。Mosは、M期促進因子(MPF: cdc2とサイクリンBの複合体)の活性化や安定化を通して卵成熟の開始や停止に関与する一方、体細胞で発現させるとがんを引き起こす。そして最近、Mosの下流にMAPキナーゼ経路の関与が示唆されている。本研究では、Mosによる卵成熟やプロゲステロンによる生理的な卵成熟過程でのMAPキナーゼ経路の必要十分性、およびMos/MAPキナーゼ経路によるMPFの活性化機構を明らかにすると共に、MosによるNIH3T3細胞のがん化におけるMAPキナーゼ経路の関与、およびこの経路の下流因子を探ることを目的とし、次の様なことを明らかにした。1.Mosによるツメガエル卵成熟のためにMAPキナーゼ経路が必要にして十分であることを明らかにした。2.プロゲステロンによる生理的な卵成熟では、一定以上の閾値のMosによってはじめてMAPキナーゼ経路が活性化することが判明した。3.Mos/MAPキナーゼ経路が、MPFの負の調節因子を阻害することでMPFを活性化することが示唆された。4.MOSによるNIH3T3細胞のがん化にMAPキナーゼ経路が必要にして十分であることが判明した。5.NIH3T3細胞において、Mos/MAPキナーゼ経路はc-Fosをリン酸化・安定化させることで細胞がん化を引き起こすことが強く示唆された。
近接場分光法による素励起の波動関数のイメージング

本年度は,貴金属ナノ微粒子とその集合体に関する近接場分光イメージングを継続して行った。ナノロッドやナノプレートの長波長領域におけるプラズモン共鳴を実測する目的で,近赤外域の分光測定系を完成させ,試料測定を開始したが,これに関して新たな情報を得るには至っていない。今後解析を進め,アスペクト比の大きな金属ナノ微粒子のプラズモン共鳴に関して詳細な議論が可能になるものと考えている。球状金ナノ微粒子の凝集構造に関して,昨年度に引き続き増強電場の空間分布の近接場イメージングを行った。微粒子間空隙に増強電場が集中し,ラマン活性も同じ部位に集中していることをイメージングにより明確にし,プラズモン共鳴による表面増強ラマン散乱の機構についての実験的な根拠を与えることができた。また,微粒子を二次元的に最密充填構造で敷き詰めた試料についても増強電場のイメージングを行い,充填構造の欠陥部位で電場の増強とラマン活性が顕著になるなど,これまでに全く知られていなかった特性が明らかとなりつつある。外部との共同研究により,電子ビームリソグラフィーの技術によって基板上に作成した,設計された構造を持つ金属ナノ構造体に関するプラズモンモードの観測に着手している。現在までに,これらの構造体に関してもプラズモンモードの観測が可能なこと,二光子励起確率像では多結晶状態であることを反映してやや不均一性の大きなイメージが見られることを確認している。ディスク状の構造体については,偏光を規定した近接場透過イメージにおいて,極めて特異なモードのイメージが得られることが明らかとなり,現在解析を進めている。本年度は,貴金属ナノ微粒子とその凝集体を中心として,近接場光学像の観察とその解析を行った。その結果,金属ナノ微粒子のプラズモンに関しては,近接場光学像によって波動関数のイメージを得る手法を,確立することができた。貴金属ナノロッドのプラズモンの内で低い次数のものは,共鳴波長が近赤外域になるので,1.1μmよりも長波長で透過測定を可能とする必要があり,そのための近赤外分光器を購入して,測定系を構築中である。近赤外域での実際の測定は,来年度に行う予定としている。1.1μmよりも短波長で共鳴を起こすプラズモンモードについては,近接場透過測定によるイメージの他,パルス光源を用いた近接場二光子誘起発光をモニターする二光子励起確率像によっても,波動関数の形状が直接イメージングされることを明確に示した。イメージの波長依存性から,プラズモンの分散関係が直接得られ,分散曲線がロッドの直径で決まり,長さによらないことを示した。金の三角形プレートに関しても,二光子励起確率像によって,プラズモンの波動関数が可視化され,電磁気学的なモデル計算の結果とも一致することを示した。これらの結果から,近接場測定によってプラズモンモードの波動関数のイメージングの方法を確立したと考えている。球状金ナノ微粒子の凝集構造を作成し,その周囲における電場増強分布のイメージングを,同様の方法によって行った。その結果,得られるイメージが以前からなされていた微粒子凝集構造における電場増強の理論的な予測と一致することを,初めて示した。またこの電場増強効果が表面増強ラマン散乱の主要な起源であることをも明確にした。
コガネムシに殺虫活性を有するB.popilliaeの結晶タンパク質遺伝子解析

当該研究者は既に、北海道のゴルフ場にて数種のコガネムシを採取して、そこからB.popilliae菌株(3菌株、var.Mame,var.Hime,var.Sakura)を分離し、それらのB.popilliae菌株の結晶タンバク質を解析した。各菌株の結晶タンパク質のSDS-PAGEによる解析の結果、それぞれの菌株が約80kDaのペプチドからなる結晶タンパク質を産生していることが明らかとなった。そこで、var.Mame株の80kDaのペプチドのN末端アミノ酸配列の解析(10残基)を行った。その結果、報告されている、B.popilliae由来のタンパク質との相同性は認められなかった。既に報告されている、B.popilliae由来の結晶タンパク質遺伝子(cryBP1:cry18A)に特異なオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、B.popilliae菌株のcry遺伝子の検索をPCR法を用いて行った。各種プライマーを用いてcry遺伝子検索を行った結果、これらのB.popilliae菌株が、報告されているcryBP1遺伝子を有しないことが明らかとなった。これらのB.popilliae菌株の有するcry遺伝子をクローニングするため、cryBP1遺伝子の上流域に存在するorf1に注目し、このorf1の塩基配列を基にDNAプライマーを作成した。そのプライマーを用いて、B.popilliae var popilliae株のゲノムDNAをテンプレートとして、PCR法によって約300bpの断片が増幅された。この増幅された断片を解析したところ、orf1と高い相同性が認められた。現在は、この増幅されたDNA断片の上・下流域のクローニングを進めている。当該研究者は既に、北海道のゴルフ場にて数種のコガネムシを採取して、そこからB.popilliae菌株(3菌株、var.Mame.Hime,var.Sakura)を分離し、その性状を報告した。本実験ではそれらのB.popilliae菌株の結晶タンパク質を解析した。各菌株の結晶タンパク質のSDS-PAGEによる解析の結果、それぞれの菌株が約80kDaのペプチドからなる結晶タンパク質を産生じていることが明らかとなった。まず、これらのB.popilliae菌株から遺伝子ライブラリーを作成する為に、DNAの抽出を行った。そこで、既に報告されている、B.popilliae由来の結晶タンパク質遺伝子(cryBPl)に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、B.popilliae菌株cryク遺伝子の検索をPCR法を用いて行った。各種プライマーを用いてcry遺伝子検索を行った結果、これらのB.popilliae菌株が、報告されているcryBPl遺伝子を有しないことが明らかとなった。そこで、これらのB.popilliae菌株の有するcry遺伝子をクローニングするため、cryBPl遺伝子と相同性を有しているcry2遺伝子をプローブとして、B.popilliae菌株の遺伝子ライブラリーのサザンハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。その結果、var.popilliae株において、cry2遺伝子プローブとハイブリダイゼーションのシグナルを得た。var.Sakura株においてはサザンハイブリダイゼーションのシグナルが得られなかった。そこで、B.popilliae var.popilliae株の遺伝子ライブラリーをλgtllを用いて作成した。現在その遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行うとともに、他のcry遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行っている。
ELISPOTアッセイによる母児免疫寛容検出法の確立と臨床応用に関する研究

同種造血幹細胞移植は造血器腫瘍や骨髄機能不全などの難治性疾患において治癒をもたらす治療法として確立してきた。しかし、少子化に伴い、HLA一致同胞ドナーが得られる頻度は少なく、骨髄バンクや臍帯血バンクでドナーが得られない患者も少なくない。この問題の解決策としてHLA不一致の血縁者をドナーとする移植法が検討されている。母児間免疫寛容仮説による母児間移植もそのひとつである。われわれは、この仮説に基づき母児間マイクロキメリズムを免疫寛容の指標として母児間移植を行ってきた。多くは重篤な移植片対宿主病(GVHD)を発症することなく移植が実施可能であるが、一部とくに母から児への移植において重篤なGVHDがみられることが明らかになってきた。母児間では、母は児の遺伝父HLA抗原(inherited paternal HLA antigen : IPA)に、児は母の非遺伝母HLA抗原(non-inherited maternal HLA antigen : NIMA)に寛容を獲得すると考えられる。この寛容獲得の程度を検出する方法を確立すれば、移植後のGVHDの予測も可能になると考えられる。本研究では免疫寛容の程度をドナーT細胞の患者抗原提示細胞(B細胞)に対する反応性をELISPOTアッセイを用いてIFN-γの産生量を定量化することで検出することを試みた。その結果、非活性化B細胞をstimulatorとし、CD3陽性細胞をresponderとして反応させ、ELISPOT readerで解析することにより検出可能なシステムを開発できた。CD3陽性細胞は、自己B細胞に対する反応はもっとも低く、第三者アロB細胞に対する反応はもっとも高かった。NIMAに対する反応は自己と第三者の中間の反応性示し、IPAに対する反応性は第三者アロB細胞に対する反応と同程度であった。今後、本システムを用いて実際の移植症例におけるGVHDとの関連を比較検討するprospective studyを行うことによって、本法の有用性を明確にできると考えられる。また、本法はHLA適合同胞間においてはマイナー抗原に対する反応性を検出するのにも有用と考えられ、今後実際の移植症例におけるGVHDとの関連を多数例で検討していく予定である。1.プラスミドのトランスフォーメーションと増幅HLA-A11、A0201、A2401、A33-DNA導入プラスミドをコンピテントセルへ導入し、寒天培地で培養後コロニーを採取、LB培地へ移した。培養後増幅した大腸菌よりプラスミドを回収純化した。それぞれのプラスミドの100倍近い増幅に成功し、十分量のプラスミドを得た。2.プラスミドからHLA-mRNAの作成HLA-DNA導入プラスミドを制限酵素で切断後、キットを用いてテンプレートDNAの精製とRNAの合成を行った。得られたRNAは電気泳動によって分子量を検定し、さらに純化精製した。HLA-DNAを導入したプラスミドから約1000kbの目的HLA-mRNAを得ることができた。末梢血液より単核球を分離し、IMDMに浮遊後、IL-4の存在下に放射線照射により不活性化したCD40L-NIH3T3であるfeeder cellと共培養した。約10日間の培養後MACS法による純化を行い、10mlの末梢血液から1.0x10^7程度の活性化B細胞を得ることができた。