hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミジンコ個体群の遺伝的組成の季節変化、経年的変化

本研究では、ミジンコを対象にCRISPR/Casを用いた遺伝子導入技術の確立と2Aペプチドを用いた共発現システムの構築を目指した。これまでに、Cas9 mRNAの注射によるミジンコの遺伝子破壊技術は確立されていた。ところがその効率は8%と低く、そのためCRISPR/Casを用いた遺伝子導入は難しいと考えられてきた。近年、Cas9タンパク質とgRNAの複合体を注射することで、遺伝子破壊、遺伝子導入効率を上げる手法がセンチュウなどで確立された。そこで私は、この手法をミジンコに用いることで高効率な遺伝子破壊と、遺伝子導入が可能になるのではないかと考えた。その結果、遺伝子破壊効率は40%となり、Cas9 mRNAの注射に比べて、効率は5倍上昇した。その上、約1%の効率で標的配列に非相同末端結合修復により遺伝子導入を行うことができた。Cas9タンパク質を用いたゲノム編集は今後ミジンコにおける遺伝子機能解析の基盤になると期待される。続いて、外来遺伝子導入後のスクリーニング手法の開発のため、2Aペプチドを用いた共発現システムの構築を目指した。昨年度までの研究でミジンコにおける2Aペプチドの機能は確認できたが、切断効率については判明していなかった。そこで今年度は、切断効率を視覚化するため、2Aペプチドの前後のタンパク質を異所的に発現させることを目指した。2Aの上流と下流で、細胞膜局在シグナルを付加した赤色蛍光タンパク質と核局在シグナルを付加した緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドを設計し、これを鋳型としてin vitroでmRNA合成した。このmRNAを注射し、過剰発現させた。その結果、細胞膜が赤色、核が緑色に染まった。また、mCherry、GFP像を重ねても、共局在を示唆する黄色のシグナルをほとんどの細胞で検出できなかった。つまり、2Aペプチドの高効率な切断効率が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。性はどのように決まっているのか?古くから我々を魅了してやまないこの謎は、外部環境に応じて性を変化させる環境性決定生物において、モデル生物の不在のために未解決のまま残されていた。近年、オオミジンコが環境性決定のモデルとして確立しつつあり、オス産生は幼若ホルモンにより誘導される、doublesex1(Dsx1)遺伝子の発現がオス産生に必須であるということが明らかになった。ところが、幼若ホルモンとDsx1遺伝子をつなぐ分子機構は未だ不明である。そこで本研究は、環境性決定のモデル生物であるオオミジンコを対象に、Dsx1遺伝子の上流の発現制御を明らかにすることを目的とした。研究にあたって、まず幼若ホルモンが結合する領域を調べた。幼若ホルモンは、Metと複合体を形成し、その後DNAに結合する。そこで、Hisタグを融合したMet遺伝子をゲノムに組み込んだ遺伝子組み換えミジンコを作製し、anti-Hisタグ抗体を使用したクロマチン免疫沈降法でMet-DNA複合体を回収しようと考えている。ミジンコへの遺伝子導入の可否を確認するためには、遺伝子導入時に同時に蛍光を発する遺伝子を入れておく必要がある。複数のプライマーを使用することでもその問題の解決は図れるが、その場合導入するプラスミドの配列長が長くなり、遺伝子導入が難しくなる。以上を踏まえた上で、2Aペプチドを用いた共発現システムを利用することが最良の選択だと考えられたが、ミジンコにおけるその機能は不明であった。そこで今年度は、ミジンコにおける2Aペプチドの機能を調べた。まず、ミジンコの全身で機能するEF1a1プロモーターの制御下でGFP-2A-mCherryが発現するようなプラスミドを設計し、それをミジンコに導入した。その結果、蛍光顕微鏡により緑色と赤色の蛍光を確認することができた。これは、ミジンコにおいて2Aペプチドが機能していることを示唆している。本研究の目的は、環境性決定のモデル生物であるオオミジンコを対象にDsx1遺伝子の上流の発現制御を明らかにすることである。この分子機構が判明すれば、性決定機構の普遍性や進化の解明に繋がると考えられる。Dsx1遺伝子の上流の発現機構を解明するために、性決定期に分泌される幼若ホルモンの応答配列を調べることにした。幼若ホルモンは、Metと複合体を形成し、その後標的配列に結合する。そこで、Hisタグを融合したMet(His-Met)遺伝子を発現する遺伝子組み換えミジンコを作製し、anti-Hisタグ抗体を使用したクロマチン免疫沈降法でMet-DNA複合体を回収しようと考えている。His-Met遺伝子の導入を判別するために、蛍光タンパク質を同時に導入する必要がある。そこで、2Aペプチドに着目した。2Aペプチドはリボソームのトランスフェラーゼ活性を阻害し、ポリペプチド鎖の連結を抑える。これにより、上流と下流の遺伝子が共発現する。ところが、生物種によって2Aペプチドの切断効率が低いことも知られているため、ミジンコにおける2Aペプチドの機能と活性を調べた。切断活性を調べるため、2Aの上流と下流で異なる蛍光タンパク質遺伝子を発現させ、蛍光顕微鏡下での観察とWestern Blot法を行うことにした。まず、ミジンコの全身で機能するEF1a1プロモーターの制御下で細胞膜が赤色、核が緑色に染まるプラスミド(Myr-mCherry-2A-H2B-GFP)を設計した。この遺伝子を導入した遺伝子組み換え個体を作製し、蛍光顕微鏡で観察したところ赤色と緑色の蛍光を確認することができた。

これは、ミジンコにおいて2Aペプチドが機能していることを示唆している。ところが、2Aペプチドの活性が低いと上流と下流の融合タンパク質が形成され、本来の局在を示さないことが先行研究により知られている。そこで現在、1)細胞膜と核における蛍光タンパク質の局在確認、2) Western Blot法を用いた2Aペプチドの切断効率の定量化を行っている。遺伝子組み換え個体を作製するためのマイクロインジェクション技術の習得に予定よりも時間を要したため。本研究では、ミジンコを対象にCRISPR/Casを用いた遺伝子導入技術の確立と2Aペプチドを用いた共発現システムの構築を目指した。これまでに、Cas9 mRNAの注射によるミジンコの遺伝子破壊技術は確立されていた。ところがその効率は8%と低く、そのためCRISPR/Casを用いた遺伝子導入は難しいと考えられてきた。近年、Cas9タンパク質とgRNAの複合体を注射することで、遺伝子破壊、遺伝子導入効率を上げる手法がセンチュウなどで確立された。そこで私は、この手法をミジンコに用いることで高効率な遺伝子破壊と、遺伝子導入が可能になるのではないかと考えた。その結果、遺伝子破壊効率は40%となり、Cas9 mRNAの注射に比べて、効率は5倍上昇した。その上、約1%の効率で標的配列に非相同末端結合修復により遺伝子導入を行うことができた。Cas9タンパク質を用いたゲノム編集は今後ミジンコにおける遺伝子機能解析の基盤になると期待される。続いて、外来遺伝子導入後のスクリーニング手法の開発のため、2Aペプチドを用いた共発現システムの構築を目指した。昨年度までの研究でミジンコにおける2Aペプチドの機能は確認できたが、切断効率については判明していなかった。そこで今年度は、切断効率を視覚化するため、2Aペプチドの前後のタンパク質を異所的に発現させることを目指した。2Aの上流と下流で、細胞膜局在シグナルを付加した赤色蛍光タンパク質と核局在シグナルを付加した緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドを設計し、これを鋳型としてin vitroでmRNA合成した。このmRNAを注射し、過剰発現させた。その結果、細胞膜が赤色、核が緑色に染まった。また、mCherry、GFP像を重ねても、共局在を示唆する黄色のシグナルをほとんどの細胞で検出できなかった。つまり、2Aペプチドの高効率な切断効率が示唆された。本研究の肝であった、ミジンコにおける2Aペプチドの機能を確認することができたので、本研究は当初の計画以上に進んでいると判断できる。レポーター遺伝子とHisタグを融合したMet遺伝子を導入した"GFP-2A-HisMet"遺伝子組み換えミジンコを作製し、anti-His抗体を使用したクロマチン免疫沈降法を用いて幼若ホルモン応答配列を特定しようと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
バイオテクノロジーによる有用物質生産の工学的基盤

この総合研究では関連諸分野のうち特に重要な以下の4研究項目を選択し、工学的基盤となりうる技術をグループ内で徹底的に討論し、さらに全員の成果報告会をしながら重点領域研究の申請のための準備を行った。研究項目A「動植物細胞工学」では、動物細胞培養による有用物質生産システムの開発および人工臓器の開発を研究した。また植物細胞においては、細胞器官の分化とその培養工学的研究、物質生産系の確立、さらには人工種子製造へと発展させた。研究項目B「微生物機能化学」では、微生物が環境を認識しその情報を処理して多様的に適応応答する機能を解明した。また高活性生体触媒の創成、微生物活動を直接に計測するバイオセンサーの開発、高性能バイオリアクターの開発を行った。研究項目C「培養・分離プロセス工学」では、大規模な分離精製工程にスケールアップするための問題点を明らかにし、大規模高度分離精製の新手法を開発した。さらに培養・分離プロセスを統合した新規バイオリアクターの開発も行った。研究項目D「バイオ知識工学」では、バイオプロセスの上流から下流までを対象に知識工学を活用し、生産分離システム設計、コンピューター制御システムおよびバイオプロセスの状態認識・診断システムを確立した。
神経特異的スプライシング因子、NSSRの機能解析と遺伝子破壊マウスの表現型解析

神経で発現する遺伝子の多くが選択的スプライシングによってその機能が調節される。神経でのスプライシング制御機構を明らかにするため、マウス脳より神経特異的に発現するスプライシング因子を検索し、新規SRタンパク質、NSSR1および2を単離した。これら二種のタンパク質は同一ゲノムから選択的スプライシングによって生成されるが、NSSR1はGluR2遺伝子exon 14のskippingに抑制的に、一方、NSSR2は促進的に働く事が明らかとなった。NSSRタンパク質の機能をより詳細に解析するため、酵母two-hybrid系によるscreeningを行った。NSSR2にはTra2βあるいはSRP30cが結合した。COS細胞を用いたpull-downassayでも共沈する事が示された。また、spliceosomeの構成因子であるU1-70Kタンパク質とも結合する事が明らかとなった。従って、NSSRタンパク質はこれらタンパク質と供にspliceosomeを構成し、機能していると推定された。スプライシング因子はこれまで互いにSR部位で結合していると考えられてきた。しかし、NSSR2ではSR部位がtruncateされて不完全であるため、他の部位が互いの結合に関与している事が示唆された。RNA結合部位を他のRNA結合配列に交換しても、NSSR1は神経特異的スプライシングを促進し、逆にNSSR2は抑制する事も明らかとなり、スプライシングの制御はSR部位を含むC末端側によって行われていると推定された。NSSRは網膜や嗅組織での発現が多く認められることから、感覚神経におけるスプライシングへの関与が強く示唆される。さらに、生理的機能を調べる目的で遺伝子破壊マウスを作成した。Nullマウスは一見正常であり、外見上の差異は認められなかった。感覚器官を中心により詳細な行動解析が必要であり、今後の課題となった。神経に発現する多くの遺伝子が選択的スプライシングによる制御を受けることが明らかとなっている。神経特異的なスプライシング制御機構解明の第一歩として、神経に特異的に発現する新規スプライシング因子であるNSSR1および2の機能を解析するため、遺伝子破壊マウスを作成した。第一エクソンを含む約16kbのNSSRゲノム遺伝子を単離し、制限酵素マップを作成した。マップに基づき、第一エクソンとその周辺をNeoカセットと組み換えるターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によってES細胞に導入し、遺伝子が組み換えられた細胞を選択した。組み換えES細胞をブラストサイトにマイクロインジェクションして生殖細胞にトランスミットしたキメラマウスを作成し、最終的に一系統のheteroマウスを得た。Heteroマウスを交配したところhomoマウスが誕生した。Homoマウスは一見正常であり、行動解析も含めた今後の解析が必要であると考えられた。一方、神経でのスプライシング機構におけるNSSR遺伝子の役割を明らかにするため、NSSR1あるいは2に結合するタンパク質の検索を行った。SR部位が破壊されているNSSR2をbaitにしたscreeningでASF/SF2、Srp20、tra2βといったSRタンパク質が単離された。従来、SRタンパク質はお互いにSR部位で結合すると考えられており、興味深い知見であった。また、NSSR2はscaffold結合因子BやRNA結合タンパク質とも結合した。またNSSR1、2は共に70K-U1snRNPと結合することも明らかとなった。これらの結果は、NSSRタンパク質が他のSRタンパク質と協調して神経でのスプライシングの調節を行っている事を示唆した。
酵母Rhodotorulaにおけるカロテノイド生合成の光誘導機構の解明:初期光化学反応へのアプローチ

赤色酵母Rhodotorula minutaにおけるカロテノイド生合成は光によって制御を受ける。この酵母R.minutaに近紫外光を照射すると、菌体の紫外光域の吸収スペクトルに変化が生じた(260300nmの波長域では吸収が低下し、260nmより低波長域では吸収が増加した)。このスペクトル変化が菌体のどの部位で生じているかを調べた結果、その主要な変化は細胞膜画分で生じていることを認めた。細胞膜に近紫外光を照射すると、菌体で観察されたと比較的よく似たスペクトル変化が生じた(260300nmの波長域で、265、272、282、295nmにピークを持って、吸光度が減少し、260nmより低波長域では、230nmにピークを持って、吸光度の増加が生じた)。この細胞膜で生じるスペクトル変化をもたらす物質の変動について、細胞膜構成成分の定量を行った結果、エルゴステロールが光化学分解を受けることを見いだした。この細胞膜エルゴステロールの光化学反応とR.minutaにおけるカロテノイド生合成の光制御との関係を明らかにするために、エルゴステロールの光分解についての作用スペクトルを測定した。その結果、エルゴステロールの光分解の作用スペクトルは赤色酵母R.minutaにおけるカロテノイド生合成の光誘導についての作用スペクトルと極めて近似していることが認められた。これらの結果から、赤色酵母Rhodotorula minutaにおけるカロテノイド生合成の光制御には細胞膜エルゴステロールの光化学反応が深くかかわっており、エルゴステロールが光受容体として機能すると共に、光化学反応の基質となっていると推察した。赤色酵母Rhodotorula minutaにおけるカロテノイド生合成の速度と量は270450nmの光によって厳密に制御される。本研究は、この光生物現象の初発過程である光化学反応を分子レベルで明らかにすることを最終目標として開始された。本年度は、(1)光化学反応の進行を直接反映するシグナルを見いだし、(2)そのシグナルを指標として、光化学反応の生じている部位を決定することを目的とした。(1)菌体に近紫外光を照射すると、菌体の紫外光吸収スペクトルに微細な変化(260300nmの波長域での吸収の減少と230nm近辺での吸光度の増加)が生じることに着目し、280nmでの吸光度を指標として、光照射と吸光度変化との関係について詳細な検討を行った。その結果、吸収スペクトルの変化は温度に依存しない光化学反応の進行を直接反映していること、変化量と光量の間に相反則が成立すること、光量ー効果曲線が指数関数直線となることなどを認めた。(2)菌体を破砕して、細胞壁、細胞膜および細胞質を分画し、光照射による吸収スペクトルの変化を調べた結果、細胞膜に特徴的な変化(260300nmの波長域で、265、272、283、295nmにピ-クをもって減少)が生じることを見いだした。そこで、この細胞膜画分で起きるスペクトル変化について、280nmでの吸光度の減少量を指標として、作用スペクトル求めた。得られた作用スペクトルは、既に測定済みのカロテノイド生合成の作用スペクトルに極めて近似しており、細胞膜で起きる光化学反応がカロテノイド生合成の光誘導に深く関わっていることを強く示唆した。次年度は細胞膜での光化学反応について、分子レベルでの検討を行う予定である。1.酵母Rhodotorula minutaにおけるカロテノイド生合成の光誘導にかかわる光化学反応への手掛かりを得るために、その光化学反応の進行を直接反映するシグナルの検出を行った。その結果、菌体に長波長紫外光(UV-A,UV-B)を照射すると、紫外光領域の吸収スペクトルに微細な変化(260300nmでの吸収の低下と230nm近辺の吸収増加)が生じることを見いだした。

そして、その変化量は光量に依存すること及び酸素の存在によってその変化が増強されることを明らかにした。2.光照射による吸収スペクトル変化が細胞のどこで起きているかを確かめるために、細胞を細胞壁、細胞膜、細胞質に分画し、それぞれの画分に光照射を行って調べた結果、上記の吸収スペクトル変化は細胞膜で生じていることを明らかにした。3.この吸収スペクトルの変化は、酵母細胞膜構成成分であるエルゴステロールの光化学反応による分解によって生じていることを明らかにした。また、リポソームを用いての再構成膜のモデル実験においても、エルゴステロールが光化学反応によって分解されることを確認した。4.細胞膜エルゴステロールの光分解についての作用スペクトルを測定した結果、その作用スペクトルは、カロテノイド生合成の光誘導の作用スペクトルと極めて近似していることを認めた。5.上記の結果に基づいて、酵母Rhodotorula minutaにおけるカロテノイド生合成の光誘導にかかわる光受容体はエルゴステロールであり、この光受容体自身が光化学反応の基質となっていると推察した。そして、この光生物現象は細胞膜での光化学反応によるエルゴステロールの分解を起点として、それによって生じる細胞膜の高次構造変化が細胞膜に存在する酵素の活性に影響を及ぼし、その結果としてセカンドメッセンジャーが生成されるものと推察した。
ケミカルジェネティクス法で新規同定したGreatwallキナーゼ標的候補の解析

本研究は、Greatwallキナーゼ(Gwl)によるM期進行制御の分子標的の解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した15個のGwlのリン酸化基質候補の中で、特に染色体との相互作用が示唆される1つの候補タンパク質に着目して解析を行った。前年度までに、基質候補の遺伝子をクローニングし、in vitroでGwlの基質となることやそのリン酸化部位を2カ所同定していた。また、この基質候補の断片タンパク質を細胞に微小注射すると、M期進行に異常がみられたことから、GreatwallのM期進行制御の分子標的の可能性が高いと考えた。平成30年度は、Greatwallによる2カ所のリン酸化部位に対して作成した抗リン酸化抗体を用いて、in vivoでGwl依存的にリン酸化が起きるかを明らかにすること、ならびに、このリン酸化がM期進行制御にいかなる役割を持つかを明らかにすることを目指した。作成した抗体により基質候補がin vivoでM期にリン酸化されることが確認できた。しかし、Gwlに依存しているかは、Gwl活性の阻害に用いた活性中和抗体や、Gwlが局在する細胞核を除去する方法を試したが、持ち込みの中和抗体や検出感度が低い問題により、本年度中に依存性を示すまでに至らなかった。M期進行制御への役割は、Gwlによるリン酸化を受けない変異体mRNAの全長の発現では量が少なく影響が見られなかったが、断片では染色体分離異常が見られた。また、初年度に見出したCdk1によるリン酸化については、リン酸化部位の候補を複数箇所見いだし、Cdk1とGwlとの2つのキナーゼの連携や役割の解析準備が進んだ。本研究は、GwlによるM期進行制御の分子標的解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した15個のGwlのリン酸化基質候補の中で、染色体との相互作用が示唆される1つのタンパク質について、Gwlの標的候補として特に着目して解析している。初年度は、この標的候補について以下のことが判明した。まず、このGwl標的候補の遺伝子をクロン化し一次配列情報を得た。これをもとにリコンビナントタンパク質を大腸菌で発現させて精製した。この精製リコンビナントタンパク質をGwlで処理するとリン酸化された。つまり、標的候補は少なくともin vitroでのGwlの基質であることが判明した。そこで、さらにこのリン酸化部位の同定を目指して、部位解析用の変異体を複数準備している。また、リコンビナントタンパク質を抗原として、標的候補のin vivoにおけるリン酸化解析を行うための抗体作成を行った。ウサギに免疫して、予想分子量のバンドを認識する抗体を得た。このバンドを内在性タンパク質とみなし、間期とM期の状態を比較すると、M期にリン酸化されていた。現在、このリン酸化がGwlに依存するかを調べている。Gwl活性が低い状態にすると、標的候補のリン酸化は低下する予備的結果を得た。この時、標的候補はGwl非依存的なリン酸化も受けており、それはCdk1によることを新たに見いだした。当初予想していなかったCdk1とGwlによるリン酸化制御ネットワークの存在が示唆された。今後の機能解析では、Gwlによる標的候補リン酸化だけでなく、Cdk1によるリン酸化の組み合わせも考慮する必要が出てきた。GwlによるM期進行制御の分子標的としてケミカルジェネティクス法を用いて新規同定した候補タンパク質について、遺伝子をクロン化し、これをもとにリコンビナントタンパク質を調製し、これをGwlによりリン酸化することに成功した。これにより、標的候補はin vitroで、確かにGwlの標的であることを明らかにした。さらに内在性タンパク質を認識する抗体を調製し、内在性タンパク質がM期にリン酸化の修飾を受けることを明らかにしたが、この細胞内でのリン酸化がGwlに依存するかの確証は次年度に持ち越した。しかし、この細胞内でのリン酸化解析を通じて、基質候補がCdk1によるリン酸化も受けることを新たに見いだした。これにより当初予想していなかったCdk1とGwlによる新規基質の制御ネットワークが存在する可能性が出てきた。本研究は、GwlによるM期進行制御の分子標的解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した15個のGwlのリン酸化基質候補の中で、特に染色体との相互作用が示唆される1つの候補タンパク質に着目して解析を行った。初年度に候補タンパク質がin vitroで基質となることを明らかにしたことから発展させ、本年度はin vivoにおいてGwlの基質であるかどうかやGwlによるリン酸化部位を調べ、以下の結果を得た。1.初年度に作成した候補タンパク質の抗体を用いて、内在性の候補タンパク質がM期にGwl依存的にリン酸化されるかを調べたところ、電気泳動での移動度の変化を指標とした解析では、Cdk1キナーゼに依存的なリン酸化が移動度に大きく影響しており、Gwlの有無による移動度の違いは明確には検出できなかった。2.リン酸化部位と予測される部位をアラニンに置換した候補タンパク質の変異体と野生型を基質にして、in vitroでのGwlによるリン酸化部位を2箇所同定した。3.同定したリン酸化部位を含む断片ペプチドとそのリン酸化部位をアラニンに置換した変異断片ペプチドを細胞内で発現させたところ、断片ペプチドではM期の移動度の差が観察され、Gwlのリン酸化部位がM期細胞内でリン酸化されることを明らかにできた。これらより、現在着目し解析しているGwlのM期進行制御の分子標的候補は、実際にGwlのM期の分子標的である可能性が高まり、細胞内におけるGwl依存性とこれらリン酸化の生理的意義を解析することがさらに重要となった。

ケミカルジェネティクス法を用いて新規同定したGwlによるM期進行制御の分子標的候補について、初年度に遺伝子をクロン化し、リコンビナントタンパク質を用いてGwlによりin vitroでリン酸化することに成功していた。また内在性タンパク質を認識する抗体を調製し、内在性タンパク質がM期にリン酸化の修飾を受けることを明らかにしていた。本年度は、in vitroでのリン酸化部位を2箇所同定し、さらに候補タンパク質断片のこれらの部位が細胞内でリン酸化されることを明らかにした。細胞内での解析を行う際、当初断片ではなく全長を基質にして試みていたため可溶性精製タンパク質が得られず研究計画が多少遅れたが、その後断片ペプチドを用いたことで解析が順調に進み、全体としてはおおむね順調に進展している。本研究は、Greatwallキナーゼ(Gwl)によるM期進行制御の分子標的解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した15個のGwlのリン酸化基質候補の中で、特に染色体との相互作用が示唆される1つの候補タンパク質に着目して解析を行った。このGwlの新規基質候補について、初年度から3年目までの解析により下記の結果を得た。1)基質候補の遺伝子をクローニングして大腸菌で発現させた部分断片は、in vitroでGwlにより確かにリン酸化された。2)発現させたタンパク質断片を抗原に作成した抗体は、細胞内の基質候補をウエスタン解析で認識した。M期に電気泳動の移動度変化を伴うリン酸化修飾を受けた。このリン酸化には、M期の主制御キナーゼであるCdk1も関与した。3) In vitroでのGwlによるリン酸化部位の候補部位をAlaに置換する方法で、リン酸化部位候補を2カ所同定した。4) 2カ所のリン酸化部位をAlaに置換した断片を細胞内に注射するとM期進行に異常を示すものが見られた。5)リン酸化候補部位に対する抗リン酸化抗体を作成したところ、in vitroでGwlによりリン酸化した基質を特異的に認識した。6)内在性の基質候補もM期にリン酸化を受けることが抗リン酸化抗体を用いたウエスタン解析から示唆された。こうした結果は、Gwlの新規基質候補が、確かにGwlの基質であることを示しており、また、特に4)の結果は、そのリン酸化がM期進行制御に関わることを示唆している。本研究は、Greatwall (Gwl)がM期進行を制御する際の分子標的の解明を目指し、ケミカルジェネティクス法を用いて同定した新規基質候補について解析を行い、当初はおおむね順調に進展してきた。しかし、やや遅れが生じたのには大きく2つの理由がある。1) Gwlの新規基質候補がM期の主制御キナーゼであるCdk1によってもリン酸化されることが示唆され、Gwlのリン酸化の役割を明らかにするために、Cdk1によるリン酸化についても解析する必要が出てきたことがあげられる。解析が複雑化したことで時間を要するようになる一方で、Gwlに加えてM期の主制御キナーゼの関与も明らかになったことは、新規基質のリン酸化制御については当初予期していなかった発見となっている。
生体の機械的特性を計測するためのマイクロ鉗子機構の開発

微細作業において生体を扱うマイクロ鉗子機構を用いて,液圧駆動を利用することで把持力および変位を推定し,生体の機械的特性を計測できるマイクロ鉗子の開発を目的とする.本機構の実現により,取得したデータの解析により機械的特性から病理的因子を抽出することで,機械的特性の変化と病理的変化の因果関係の解明にも繋がり,生体の病理的変化を捉える“触診が可能なマニピュレータシステム"の実用化が望める.微細作業において生体を扱うマイクロ鉗子機構を用いて,液圧駆動を利用することで把持力および変位を推定し,生体の機械的特性を計測できるマイクロ鉗子の開発を目的とする.本機構の実現により,取得したデータの解析により機械的特性から病理的因子を抽出することで,機械的特性の変化と病理的変化の因果関係の解明にも繋がり,生体の病理的変化を捉える“触診が可能なマニピュレータシステム"の実用化が望める.
心臓特異的ミオシン軽鎖キナーゼの活性制御機構の解明と治療への応用

培養心筋細胞に対して周期的に圧力負荷を与えるシステムを開発した。培養ラット心筋細胞に対して、100kPaと300kPaで周期的に圧負荷を8時間加えて、サルコメアの再構築が促進されることを確認した。さらにcMLCKをsiRNAでノックダウンした心筋細胞ではサルコメアの再構築が抑制され、アデノウイルスでcMLCKを再発現することでサルコメアの再構築がrescueされた。以上より、力学的負荷におけるサルコメアの再構築にcMLCKが重要な役割を担っていることが明らかとなった。cMLCKの結晶構造解析のため、Sf21細胞を用いてcMLCKを、また大腸菌を用いて結合蛋白質であるカルモジュリンの大量精製を行った。cMLCKについては全長では単分散しないため、N末端を削除しながら、活性を保持しつつ単分散を得られる条件を同定できた。カルモジュリンと結合した複合体での単分散条件も同定でき、結晶化条件検討まで進むことが出来た。約1000条件での結晶化条件検討を試みたが、結晶化を得ることが出来なかった。よって、現在は精製した蛋白質からタグを除去してから単分散および結晶化条件を検討することとしている。cMLCK遺伝子を組み込んだAAV9ベクターの作製にも取り組み、培養細胞およびマウスに投与する程度のAAVウイルスの作製が完了した。重症心不全患者の心筋サンプルからRNAを抽出して、心臓のミオシン調節軽鎖のリン酸化に影響する遺伝子(MYLK3, MYPT1, MYPT2)の発現を検討した結果、MYPT1およびMYPT2の発現が増加していることが明らかになった。培養心筋細胞に対する圧力負荷システムを構築できた。cMLCKとカルモジュリンの共結晶に向けた精製は順調に進んでいる。AAV9ベクターの必要量の精製を終了した。ヒト重症心不全患者の心筋でのミオシン調節軽鎖リン酸化に関与する遺伝子の発現を検討できた。以上より、計画通り進んでいる。cMLCKとカルモジュリンの共結晶構造解析を進めていく。心不全モデル(マウス、ラット)を作製してAAV9によるcMLCKによる治療効果を検討する。ヒト不全心でのミオシン調節軽鎖リン酸化の程度を測定する。cMLCKの分子内活性制御機構の検討については、CaM結合ドメインを平滑筋型または骨格筋型のCaM結合ドメインと入れ替えたキメラcMLCKを作成した。これらを用いてcMLCK活性への影響を検討した結果、骨格筋型CaM結合ドメインを有するcMLCKキメラでは活性に変化はなかったが、平滑筋型のCaM結合ドメインを有するcMLCKキメラで活性の変化を認めた。培養心筋細胞に進展刺激を加えると、培養心筋細胞のサルコメアの再構築が促進されるが、cMLCKをsiRNAでノックダウンした心筋細胞細胞ではサルコメアの再構築が抑制された。さらに、ノックダウンした心筋細胞をcMLCKをアデノウイルスでrescueするとサルコメアの再構築がrescueされた。また、現在、培養心筋細胞に圧負荷をかける装置を完成させた。圧負荷におけるcMLCKの役割に関する実験も開始している。cMLCKを阻害する義天然ペプチド8種類(L1L6, D1, D2)の中で、L3は100 nMの濃度で約50%の阻害活性を有していた。また、L3は平滑筋型および骨格筋型cMLCKへの作用は認めなかったことから、cMLCK特異的な活性modulatorであった。cMLCKの結晶構造解析に関しては、現在、活性を保持したままN末端を少しずつ削っていき、単分散を得られる条件を調べている。cMLCKのregulatorydomainのキメラ作成により活性制御機構の一端を解明できた。力学的負荷によるcMLCKのサルコメア構成での役割を解明できた。cMLCK活性をmodulateする擬天然ペプチドを同定できた。以上より、計画通り順調に進展している。重症心不全患者の心筋サンプルからRNAを抽出して、心臓のミオシン調節軽鎖のリン酸化に影響する遺伝子(MYLK3, MYPT

1, MYPT2)の発現を検討した結果、MYPT1およびMYPT2の発現が増加していることが明らかになった。培養心筋細胞に対する圧力負荷システムを構築できた。cMLCKとカルモジュリンの共結晶に向けた精製は順調に進んでいる。AAV9ベクターの必要量の精製を終了した。ヒト重症心不全患者の心筋でのミオシン調節軽鎖リン酸化に関与する遺伝子の発現を検討できた。以上より、計画通り進んでいる。圧負荷におけるcMLCKおよびcMLCKのN末端の役割について検討する。cMLCK活性をmodulateする擬天然ペプチドの酵素学的検討を行う。cMLCKの結晶構造解析に向けて、単分散および結晶化条件を検討する。AAVによる遺伝子デリバリーシステムを構築すると同時に、遺伝型心筋症マウスモデルを導入する。また、心筋症患者におけるMLC2vのリン酸化状態を検討する。cMLCKとカルモジュリンの共結晶構造解析を進めていく。心不全モデル(マウス、ラット)を作製してAAV9によるcMLCKによる治療効果を検討する。ヒト不全心でのミオシン調節軽鎖リン酸化の程度を測定する。施設利用料の支払い等の為。X線結晶構造解析用の結晶化が上手く行かず、次年度も改めて結晶化条件検討用の蛋白質を精製する必要があるため、次年度使用額が生じた。
低酸素環境下における作物挙動と適応反応性に関する基礎的研究

ダイズの湿害は農業上重要な障害だが、その発生メカニズムには不明な点が多い。本研究では、水耕栽培法により過湿土壌の一様態「低酸素」を人工的に再現し、経験的に圃場耐湿性が既知な多種ダイズ品種を1ヶ月間栽培、その反応性を詳細に調査した。その結果、低酸素反応性と圃場耐湿性とに密接な関係性を検出し、湿害発生の主な理由の1つが低酸素であることを確認した。更に圃場耐湿性が弱い品種の中には、低酸素環境によって葉面積や細根の減少、根における吸水能力の減衰などの特徴的な反応を見出した。圃場耐湿性が特徴的なダイズ品種を、低酸素ストレスを負荷しながら温室または実験室内の培養器内(in vitro)で水耕栽培し、低酸素ストレスに対する耐性の評価を行った。ダイズの各種形態形質について分散分析を行った結果、処理の影響または処理×品種の交互作用に有意性が認められた形質が、高温条件では根部形質に多くみられたのに対し、低温条件では地上部形質に偏った。外環境温度による低酸素負荷処理が及ぼす形質種の変化について更に解析を進めるため、処理の影響が有意だった形質での処理間比(低酸素区/対照区)を用い、試験年次別で主成分分析を行った。両温度条件ともに2主成分が抽出され、高温条件では二次根長が、低温条件では葉面積が、寄与率がより高い第1主成分の中でも最も因子負荷量が大きい形質として検出された。これら2形質は、圃場耐湿性「弱」品種では低酸素負荷処理で低下する傾向だったのに対し、圃場耐湿性「強」品種では処理の影響は認められなかった。これら今年度の結果から、試験期間中の気温、またはそれに伴う対照区での溶存酸素量が、低酸素負荷処理に対するダイズ実生の反応性を変動させうる可能性が示唆された。ただし、耐湿性が弱いとされる一部品種では、低酸素負荷時に細根の綾化や葉面積の縮小等の形態反応が共通してみられ、ダイズの低酸素反応性と耐湿性との関連性が確認された。これらの情報は、次年度から予定している低酸素または冠水条件下における水動向の調査並びに水動向に影響を及ぼすタンパク質、アクアポリン発現の調査の基礎情報として重要である。ダイズ湿害の主な要因の1つである種子発芽段階での低酸素耐性(冠水耐性)について試験した。湿害耐性が極端に異なるダイズ品種を、低酸素ストレスを負荷しながら水耕栽培し、湿害に対する耐性の評価を行った。予備試験において特徴的な湿害耐性を示した2品種、ハヤヒカリとトヨムスメは、発芽率や根伸長を尺度とした湿害評価の結果、ハヤヒカリに比べトヨムスメにおいて、有意な湿害感受性が検出された。更に、両者の吸水過程を精査したところ、トヨムスメでは、その能動吸水能に比べて過剰な受動吸水による水の流入が生じている傍証が得られた。本現象の根源を調査する目的で、種皮単体(透水コンダクティビティの調査)、子葉単体(吸水に伴う裂開程度の調査)または種皮/子葉の相互作用(種皮/子葉間隙消長の調査)に関する精査を行ったが、トヨムスメにおける湿害感受性を説明するに至らなかった。そこで、品種間の微細構造差異についての調査を行ったところ、実体顕微鏡もしくは光学顕微鏡レベルでは検出できなかったが、Cryo-SEMを用いた種皮裏面の観察において、湿害感受性のサンプルのみに、直径10μmほどの窪状構造および直径1μm程の孔隙構造が確認された。これらの生体構造が受動吸水時にどのように機能しているのかについては不明だが、湿害感受性に何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられる。これら形態構造的な差異の他に、水の流入を制御する水チャンネルの影響も考えられる。これらの情報は、今後予定しているin vitroでのダイズ実生の耐湿性アッセイ系のための基礎情報として重要である。とりわけ、ダイズの低酸素順応過程において、実生の段階でその関わりが予想される「根域水チャンネル(アクアポリン)」の役割が、発芽の段階においても想起され、生育段階に関わらない共通の環境適応機構が存在する可能性が考えられた。今年度得られた結果は、ダイズ作における過湿傷害発生過程を解明するための礎的な意義がある。圃場耐湿性が特徴的なダイズ品種を、窒素ガスの封入処理によって低酸素ストレスを根域に負荷しながら実験室内の培養器内(in vitro)で水耕栽培し、低酸素ストレスに対する耐性の評価および品種間での比較を行った。

低酸素ストレス負荷後のダイズ植物体における各種形態形質(各種乾物重、根の形態的特徴)について、低酸素区と対照区の値を比較し、低酸素耐性(過敏対抗型:低酸素区>対照区、鈍感型:低酸素区<対照区)と低酸素感受性(反応型:低酸素区<対照区、過敏衰退型:低酸素区≪対照区)とに分類した。その結果、従来いわれている圃場耐湿性のカテゴリーにほぼ合致した。これらの結果から、本実験の栽培手法は、ダイズの圃場耐湿性の簡易サーベイ法として十分使用できることがわかった。低酸素ストレス負荷後のダイズ植物体における根のコンダクティビティ(透水しやすさ)を測定したところ、低酸素耐性が過敏衰退型の品種では、低酸素ストレス負荷時にコンダクティビティが一貫して減少傾向にあることがわかった。これらの結果から、低酸素ストレスの負荷が根の透水抵抗を上昇させ、ダイズ植物体の養水分吸収を妨げ、低酸素負荷による乾物重減少や根の形態変化を引き起こしている可能性が予想された。現在これらの結果を受けて、ダイズ根圏への低酸素ストレス負荷と根のコンダクティビティとの関連性について更に調査するため、ストレス負荷時における根に局在する水チャンネルタンパク質(アクアポリン)の発現動向をウェスタンブロッティングにて探っている。研究対象としているダイズ湿害は、生理・形態的な現象が複雑に絡み発生しており、当初初発原因の1つの考えていた浸透物質の消長についてはネガティブな評価が得られるなど、現象解明に向けての進展という意味合いではやや遅れてる感は否めない。次年度の最終年度において、現象の根幹に辿り着くべくタンパク質分析に専心し、遅れを取り戻せればと考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの成果から、ダイズ湿害の発生には、発芽・実生の様々な生育段階において、植物体内への水の出入りに関する動向が重要と考えられ、低酸素環境はそれらの動向に関しトリガー的な役割を果たしているもの推測される。生理的または微細形態的な傍証においては、生体内への水の出入りに直接的に関与する因子が見当たらず、今後は、生体膜上(原形質膜および液胞膜)に存在する水チャンネルの役割に着目し、研究を推進する。また、残された研究期間を鑑み、当初遺伝子発現レベルでのアッセイを予定していたが、より重要な「水動向の作用点」である遺伝子産物のタンパク質そのもの(アクアポリン)の消長に焦点をあてて研究を進めるよう変更する。
ＭＯＣＶＤ法による遷移金属ダイカルコゲナイドの成長技術開発とフォトニクス機能探索

H30年度は、前年度に有用性を確認したMoO2Cl2やWOCl4といった6族元素のオキシクロライド原料とH2Sを用いた独自のMOCVD法を使って、MoS2やWS2の薄膜成長技術の開発をさらに推進した。まず、MoS2の成長技術の高度化を図るため、成長核形成やライプニングなど素過程の制御を試みた。具体的には、成長圧力やH2S流量がMoS2の成長核形成に与える影響を詳細に調べ、H2S流量が比較的少ない条件下では小さな単結晶グレインが凝集した連続膜ができやすいこと、逆にH2S流量が多くなると、比較的大きなサイズの三角形ドメインがSiO2基板上に分離して形成される傾向があることを見出した。また、MoS2膜からのPL強度がH2S流量が多い条件ほど増加することを確認した。次に、MoS2と同様の実験をWS2でも行った。その結果、核形成過程における成長圧力やH2S流量の影響がWS2でも同様に観測され、一般性のある現象であることを確認した。PL強度についても、MoS2と同様にH2S流量の増加により非常に強いPL発光が観測された。なお、MoS2およびWS2の室温PLのピークはそれぞれ1.88eVと2.00eV付近にあり、中性励起子発光と解釈できる。このことは、MOCVDで成膜した2次元結晶が極めて高品質であることを示唆している。単結晶基板上のMoS2やWS2のエピタキシャル成長については、サファイア基板を大気中でアニールして表面ステップを作るための実験環境の整備を進めたほか、tetragonalな結晶構造を持つγ-LiAlO2のc軸格子定数がMoS2の格子定数の約2倍であることに着目し、この基板上にMoS2成膜実験を行うため基板の入手を完了し、実験準備を整えた。さらに、以上とは別にアルミノシリケートガラスを基板に用いた実験を行い、MoS2やWS2の単結晶ドメインサイズが数ミクロン級まで大きくなることを見出した。これは極めて重要かつ期待度の高い結果であり、今後の詳細な実験的調査が必要である。MoO2Cl2やWOCl4など遷移金属のオキシクロライド系原料ガスを用いるMOCVD成長法の有用性がさらに明らかになってきた。これに加えて、アルミノシリケートガラスを基板に用いる成長手法でも新たな進展がみられ、今後の展開に大きな期待が持てるため。2019年度は、昨年度に引き続き、遷移金属元素のオキシクロライド系原料ガスを使ったMOCVD方式のTMDC薄膜成長技術の開発を進める。特に、昨年度の研究において、多量のNa2O成分を含んだアルミノシリケートガラスを成長基板として用いることで、MoS2やWS2の成長速度が増大するとともに、単結晶ドメインサイズが大きくなる兆候を見出した。本年度は、この現象をさらに追及して再現性や制御性を確認するとともに、成長技術としての価値を見極める。また、これまでの研究で明らかになってきたMOCVD法におけるTMDCの核成長過程に関する知見をもとに、微小なTMDCの単結晶ドメインを実現し、個々の単結晶ドメインの光学特性を調べる。これにより、横方向の量子閉じ込め効果の実現可能性について検討を加える。さらに、サファイアやGaN、LiAlO2などの単結晶基板上へのMoS2やWS2の成長を行い、基板とのエピタキシャル関係について考察し、今後の展開可能性や技術的問題点を明らかにする。H29年度は、MOCVD方式に基づくTMDC薄膜成長の基礎技術の確立と適用材料範囲の拡張を目的に以下の研究を進めた。まず、MOCVD法に適したMoやWなど遷移金属元素の原料プリカーサーを見出すため、イミド・アミド系化合物とオキシクロライド系化合物の2種類の原料に着目し、成長様式や膜質の比較を行った。特に、MoとWのイミド・アミド化合物は室温で液体であり、適度な蒸気圧を持つ。そのため、MOCVD成長への適用しやすさが期待できる。手始めに、MOCVD装置内で600700°Cに保ったSiO2基板上に、N2やH2キャリアガスとともにWイミド・アミドとH2Sを供給してWS2の成膜を試みた。その結果、顕微ラマンによる評価で、層状に配向したWS2の多層膜を確認した。しかし、原料供給量や成膜時間を制御して、直接遷移型バンド構造が期待される単層WS2を成長しても顕微PLでの発光は観測できなかった。XPSでWS2膜の元素分析を行ったところ、膜内にNやCの混入が認められた。イミド・アミド化合物の分子構造内に含まれるNやCが未分解のまま不純物として取り込まれていることが膜質劣化の原因として考えられる。一方、Moのオキシクロライド系化合物であるMoO2Cl2とH2Sを使ったMOCVDでもMoS2の層状成長を確認し、単層膜からは極めて良好なPL発光を確認できた。MoO2Cl2分子内にはCやNが含まれておらず、OとSも同族元素で置換されやすいことが高品質のMoS2成長の理由として考えられる。さらに、WOCl4とH2Sを使ってWS2の2次元成長が可能であり、単層膜から極めて強いPL発光を確認した。以上のように、MoやWのオキシクロライド系原料を使ったMOCVD法の開発に成功し、その技術的な有用性を確認した。

MoO2Cl2やWOCl4など遷移金属のオキシクロライド系原料ガスを用いる新たなMOCVD成長法の開発に成功し、高品質のMoS2やWS2の2次元単層膜が形成できることを実証した。本手法は遷移金属ダイカルコゲナイドのヘテロ構造やナノ構造作製に必要となる重要な基盤技術であり、今後の研究展開に大いに貢献するためH30年度は、前年度に有用性を確認したMoO2Cl2やWOCl4といった6族元素のオキシクロライド原料とH2Sを用いた独自のMOCVD法を使って、MoS2やWS2の薄膜成長技術の開発をさらに推進した。まず、MoS2の成長技術の高度化を図るため、成長核形成やライプニングなど素過程の制御を試みた。具体的には、成長圧力やH2S流量がMoS2の成長核形成に与える影響を詳細に調べ、H2S流量が比較的少ない条件下では小さな単結晶グレインが凝集した連続膜ができやすいこと、逆にH2S流量が多くなると、比較的大きなサイズの三角形ドメインがSiO2基板上に分離して形成される傾向があることを見出した。また、MoS2膜からのPL強度がH2S流量が多い条件ほど増加することを確認した。次に、MoS2と同様の実験をWS2でも行った。その結果、核形成過程における成長圧力やH2S流量の影響がWS2でも同様に観測され、一般性のある現象であることを確認した。PL強度についても、MoS2と同様にH2S流量の増加により非常に強いPL発光が観測された。なお、MoS2およびWS2の室温PLのピークはそれぞれ1.88eVと2.00eV付近にあり、中性励起子発光と解釈できる。このことは、MOCVDで成膜した2次元結晶が極めて高品質であることを示唆している。単結晶基板上のMoS2やWS2のエピタキシャル成長については、サファイア基板を大気中でアニールして表面ステップを作るための実験環境の整備を進めたほか、tetragonalな結晶構造を持つγ-LiAlO2のc軸格子定数がMoS2の格子定数の約2倍であることに着目し、この基板上にMoS2成膜実験を行うため基板の入手を完了し、実験準備を整えた。さらに、以上とは別にアルミノシリケートガラスを基板に用いた実験を行い、MoS2やWS2の単結晶ドメインサイズが数ミクロン級まで大きくなることを見出した。これは極めて重要かつ期待度の高い結果であり、今後の詳細な実験的調査が必要である。MoO2Cl2やWOCl4など遷移金属のオキシクロライド系原料ガスを用いるMOCVD成長法の有用性がさらに明らかになってきた。これに加えて、アルミノシリケートガラスを基板に用いる成長手法でも新たな進展がみられ、今後の展開に大きな期待が持てるため。引き続き、遷移金属元素のオキシクロライド系原料ガスを使ったMOCVD方式のTMDC薄膜成長技術の開発を進める。具体的には、MoS2の成長技術の高度化を図るため、成長核形成やライプニングなど、膜形成素過程の制御を試みる。また、昨年度に開始した二硫化タングステン(WS2)の成長技術の向上と膜の特性評価を進める。さらに、MoS2を対象に単結晶基板上へのエピタキシャル成長技術の開発も試みる。これらについて、以下に示す複数の視点から研究を進める。(1)膜形成素過程の制御:遷移金属元素のオキシクロライド系原料ガスを使ったMOCVD法で、良質なMoS2膜が形成できることがわかってきた。また、成長圧力や温度で形成される単結晶ドメインのサイズが変化することもわかってきたが、まだ0.2μm程度と小さい。ドメインサイズを決定する要因を明らかにしてサイズの増大を図るため、臨界核密度やライプニングなどの成長素過程について調査する。
塗布光反応法を用いた室温動作巨大磁気抵抗薄膜の開発

平成19年度は室温巨大磁気抵抗材料の母物質であるAサイト秩序型(Sm,La)BaMn_2O_6の製膜を行った。製膜には塗布光照射法を用い、SrTiO_3単結晶基板上に有機金属溶液を塗布し、エキシマレーザを照射して結晶化を試みたところ、基板温度500度以上、還元雰囲気下でKrFレーザを140mJ/cm2以上のフルエンスで照射した時にAサイト秩序構造を待った(Sm,La)BaMn_2O_6,薄膜が形成されることを見出した。低レーザフルエンスや酸素雰囲気下ではAサイトが無秩序化したものが出来る。昨年度作製したSmBaMn_2O_6のSmサイトにLaを置換しLaBaMn_2O_6まで組成を振ることに成功し、本手法が昨年度作製したSmBaMn_2O_6だけに限らずAサイト秩序構造を待つペロブスカイト型酸化物薄膜の製膜に有効であることを示した。依然としてAサイト秩序構造をもつ本物質料は従来の熱的手法やPulsed Laser Deposition法などでは作製出来ないため、ここからも塗布光照射法の優位性が示されている。X線回折や電子顕微鏡観察によってSrTi03(001)基板上に作製した(Sm,La)BaMn_2O_6薄膜はエピタキシャル成長していることを確認した。001基板上に作製したSmBaMn_2O_6は基板格子によって構造相転移が阻害されるためバルク同様の金属絶縁体転移を示さなかったが、強磁性転移のみを示すLaBaMn_2O_6ではバルク特性を再現することができた。その結果LaBaMn_2O_6B/SrTi03(001)において室温で磁気抵抗の発現に成功し、300Kにおいて135%の磁気抵抗率を得ることが出来た。これまでのところバルクで出現した1000%の室温磁気抵抗効果はまだ得られていないが、組成及び基板方位の制御によって飛躍的に磁気抵抗特性を向上させることが出来ると期待できる。この研究成果についてChemistr of Materials及びMaterials Science and Engineering Bにおいて誌上発表を行うとともに国際会議E-MRSにおいて発表を行った。平成18年度は室温巨大磁気抵抗材料の母物質であるAサイト秩序型SmBaMn206の製膜を行った。製膜には塗布光照射法を用い、SrTio3単結晶基板上に有機金属溶液を塗布し、エキシマレーザを照射して結晶化を試みたところ、基板温度500度以上、還元雰囲気下でKrFレーザを140mJ/cm2以上のフルエンスで照射した時にAサイト秩序構造を持ったSmBaMn206va膜が形成されることを見出した。Aサイト秩序構造を持つペロブスカイト型酸化物薄膜の製膜は非常に困難でこれまで報告された例はなく、本研究成果が初めての例になる。従来の熱的手法やPulsed Laser Deposition法などでも試みられているが、Aサイト秩序構造は形成されないため本研究で用いた塗布光照射法が唯一製膜出来るキーテクノロジーとなっている。X線回折や電子顕微鏡観察によってSrTiO3(001)基板上に作製したSmBaMn206薄膜はエピタキシャル成長していることを確認し、電気特性は400K以下で半導体的振る舞いをし、バルク特性とは異なっている。これは基板方位による影響と考えられ、現在様々な基板上に作製し、比較検討を行うとともに室温で大きな磁気抵抗特性を出すために組成の最適化を行っている。この研究成果について特許出願し、現在論文は投稿中である。また、2007年3月の日本物理学会で発表を行った。

その結果LaBaMn_2O_6B/SrTi03(001)において室温で磁気抵抗の発現に成功し、300Kにおいて135%の磁気抵抗率を得ることが出来た。これまでのところバルクで出現した1000%の室温磁気抵抗効果はまだ得られていないが、組成及び基板方位の制御によって飛躍的に磁気抵抗特性を向上させることが出来ると期待できる。この研究成果についてChemistr of Materials及びMaterials Science and Engineering Bにおいて誌上発表を行うとともに国際会議E-MRSにおいて発表を行った。