hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋細胞の発生分化とその制御機構

心筋特異的ホメオボックス遺伝子であるCSXは心臓分化・発生のうえで重要な遺伝子である。昨年度CSXによりANP、CKBの遺伝子活性が上昇する事を報告した。今年度はANPのプロモーター解析を行った。ANPレポーター遺伝子の転写活性はCSX、またジンクフィンガーモチーフを持つGATA4により亢進するが、同時に発現すると著名な活性亢進がみられた。またCSXとGATA4は蛋白質レベルで会合していることが明らかとなった。前年度、IL-6関連サイトカインはgp130-JAK-STAT系、あるいはMAPK系の活性化を介して心筋肥大をもたらしうることを確認した。今年度この系であるLIFは肥大のみならず心筋保護効果をも持っていることを明らかにした。これはLIFがSTAT1を介してbcl-Lの発現を誘導することによることが示唆された。心筋リモデリングにおける分子機構を検討した。昨年度リモデリングにおける非心筋細胞の関与を検討するため心筋細胞と間質細胞を分離して培養できる系を確立した。そこでアンギオテンシンII、TGFkbataが非心筋細胞を刺激し非心筋細胞が分泌するエンドセリンが心筋からのANP、BNP分泌に影響を与える心筋細胞の肥大をもたらすことを発見した。心筋線維化において細胞接着シグナルであるオステオポエチンが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。心筋小胞体カルシウム遊離チャネル(RYR2)は興奮収縮連関に重要な役割を果たしている。前年度、RYR2遺伝子の5'上流調節領域の単離および発現調節機構の解明を試みた。今年度はそのcis elementの同定した。さらに結合する蛋白質を精製した。本研究は心筋細胞の負荷適応機能を心筋の発生過程における組織特異的遺伝子発現およびその制御の面から解析することを目的とする。筋小胞体CaATPaseとその調節蛋白質ホスホランバン遺伝子の発現比が筋小胞体Ca取り込み能を規定することからその分子メカニズムを明らかにするため両蛋白質の相互作用部位を部位特異的変異を導入することにより同定した。心筋特異的に発現するホメオボックス遺伝子(Csx)のホモログをヒト心筋より単離しヒト染色体上の位置を決定した。ヒトCsxは3つのスプライシングフォームが存在し、心臓にのみ発現していた。またその遺伝子はヒト染色体上5q34に存在していた。心筋の発生と機能を解析するため、CreリコンビネースがloxP配列を認識する事を利用して同方向、同位置に遺伝子を導入あるいはコンディショナルに遺伝子をノックアウトする技術を開発している。まずloxP配列を持つES細胞を樹立した。ハムスターBNPcDNAの構造を決定し、心筋症ハムスターのおける発現を検討したところ肥大型のBIO14.6では3倍に、拡張型のBIO53.58では4倍の亢進がみられた。RIAを用いて血中BNP濃度は両者とも7倍以上に上昇しヒト心疾患と同様の変化を示し、心筋症ハムスターがヒト心疾患BNPの病態生理学的意義の検討に有用なモデルとなりうることが明らかになった。心筋においてレニン-アンギオテンシン系は大きな役割を果たしている。今回今まで報告されているアンギオテンシン変換酵素とは異なる酵素を精製した。さらにレニンの発現については健常心では心室内にその発現を検出できなかったがDCM、OMI心筋ではレニンmRNAの存在をとらえることができた。低酸素刺激において心筋細胞でIL-6の発現が亢進する事を明らかにした。さらにこの遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子上流に組み込みその遺伝子発現メカニズムを検討したところ、NF-kBおよびNF-IL6結合領域が重要な働きをしていることが示唆された。ヒトCSXゲノムDNAを単離しエクソン・イントロン構造を決定し、た。deletion mutantを作成し責任領域を決定したところ、-110bp付近の20bpが重要であることがわかった。またCSXによりANP、CKBの遺伝子活性が上昇する事がわかった。前年度、gp130とその受容体のノックアウトマウスにおいて心筋肥大が見られることを明らかにした。今年度はその情報伝達機構を検討した。まずleukemia inhibitory factor (LIF)刺激下のgp130活性化機構を検討した。LIF刺激後、心筋gp130は早期にリン酸化され、JAK1および2、STAT3のチロシンリン酸化が観察された。またMAPキナーゼも活性化された。以上によりIL-6関連サイトカインはgp130-JAK-STAT系、あるいはMAPK系の活性化を介して心筋肥大をもたらしうることを確認した。心筋リモデリングにおけるレニン・アンギオテンシン系の役割を検討した。アンギオテンシノーゲン、レニン、アンギオテンシン変換酵素の存在を心筋で証明した。さらにこの系の抑制がリモデリングを抑制し、心機能改善につながることを見いだした。またリモデリングには心筋細胞のみならず線維芽細胞が関与していることが明らかになっている。そこで今年度は両細胞を分離して培養できる系を確立した。そこで非心筋細胞が分泌する因子が心筋からのANP、BNP分泌に影響を与え心筋細胞の肥大をもたらすことを発見した。さらに両細胞の相互作用にエンドセリンが関与していることが明らかになった。

心筋小胞体カルシウム遊離チャネル(RYR2)は興奮収縮連関に重要な役割を果たしている。本年度ではRYR2遺伝子の5′上流調節領域の単離および発現調節機構の解明を試みた。一連のdeletion mutantを作製し、初代培養心筋細胞中における転写活性を検討した。-89から-84領域と-74から-66領域が転写調節領域と考えられた。これらの転写調節領域は、報告されている転写因子の結合配列とホモロジーを示さなかった。この正の調節領域は心筋特異的でないが-209から-90領域には骨格筋においてRYR2遺伝子を発現させない負の調節領域の存在が示唆された。心筋特異的ホメオボックス遺伝子であるCSXは心臓分化・発生のうえで重要な遺伝子である。昨年度CSXによりANP、CKBの遺伝子活性が上昇する事を報告した。今年度はANPのプロモーター解析を行った。ANPレポーター遺伝子の転写活性はCSX、またジンクフィンガーモチーフを持つGATA4により亢進するが、同時に発現すると著名な活性亢進がみられた。またCSXとGATA4は蛋白質レベルで会合していることが明らかとなった。前年度、IL-6関連サイトカインはgp130-JAK-STAT系、あるいはMAPK系の活性化を介して心筋肥大をもたらしうることを確認した。今年度この系であるLIFは肥大のみならず心筋保護効果をも持っていることを明らかにした。これはLIFがSTAT1を介してbcl-Lの発現を誘導することによることが示唆された。心筋リモデリングにおける分子機構を検討した。昨年度リモデリングにおける非心筋細胞の関与を検討するため心筋細胞と間質細胞を分離して培養できる系を確立した。そこでアンギオテンシンII、TGFkbataが非心筋細胞を刺激し非心筋細胞が分泌するエンドセリンが心筋からのANP、BNP分泌に影響を与える心筋細胞の肥大をもたらすことを発見した。心筋線維化において細胞接着シグナルであるオステオポエチンが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。前年度、RYR2遺伝子の5'上流調節領域の単離および発現調節機構の解明を試みた。今年度はそのcis elementの同定した。さらに結合する蛋白質を精製した。
製品のスペックとデザインを革新するための技術開発戦略とその有効性の評価

本年度の研究成果として、論文の学会誌掲載が一本と学会誌投稿中が一本で、学会発表が国内で二件と海外にで一件である。本研究ではデジタルカメラにおける製品の意味の革新戦略を技術的な観点と消費者ニーズから多面的に分析した。近年、デザインに対する注目が増しているが、デザインの戦略的な分析は主に定性分析によって行われてきた。そこで、本論文ではデザインを「ものの意味を与えること」と定義し、さらに製品の意味と技術の関係を明らかにすることで、技術的な観点から定量的に戦略を明らかにする。しかし、製品の意味は消費者によって創出されるものであるため、価格.comのレビューデータを用いて、消費者のニーズからも分析を加えた。結果として、デジタルカメラでは国内の普及率が低い段階からスペックと意味に関する技術開発が同時並行的に行われていることがわかった。さらに、自社の技術開発資源に依存して、意味に関する技術開発の程度に違いがあることがわかった。今までスペック重視またはデザイン重視といった企業の姿勢を定性的に評価することはできたが、本結果によりそれを定量的に評価できることが示唆された。実務的インプリケーションとしては、競合の戦略の評価が公示されている特許情報で分析できること、またトップが自社の技術開発の方向性を決めることに貢献できる。デザインを高めるために、審美的印象と記号的解釈に関する技術開発を行えば良いということを示唆しているため、デザイン開発の効率を高めることができる可能性がある。学術的インプリケーションは、理論的にはデザインマネジメントの分野で議論されてきた意味に関する概念をテクノロジー・マネジメント分野(MOT)に取り入れることで、意味が技術によって変化させることができる可能性を示唆したことである。方法論的には、製品の意味の革新戦略を特許によって定量的に評価できる可能性を示したことである。26年度が最終年度であるため、記入しない。
窒化鉄薄膜を用いた高効率スピン源の開発

理論研究によれば、Fe_4Nはいわゆるハーフメタルではないが、その電気伝導度のスピン偏極率は-1であり、小数スピンの電子が伝導を担っている。また、Fe_4N/MgO/CoFeBの構造を有する強磁性トンネル接合(MTJ)では、室温で最大-75%のインバースTMR効果が観測されており、Fe_4N中での少数スピン伝導がその起源と考えられている。また、平成21年度までの研究により、Fe_4N薄膜で観測される負のAMR効果は、伝導電子の負のスピン分極を反映したものであることが明らかとなっている。そこで、本年度は、引き続きFe_4N単結晶薄膜のAMR効果ならびにFe_4N/MgO/CoFeB-MTJの電流誘起磁化反転(CIMS)について検討を行った。スパッタ法により、MgO単結晶基板上に100nm厚のFe_4N単結晶膜を作製しAMR効果の結晶方位依存性を調べた。その結果、AMR比は電流を[100]方向に流した場合に低温で負に大きく増大するのに対して、[110]方向に流した場合には増大は見られないことが判った。これは、Fe_4Nの軌道磁気モーメントが磁化結晶方位依存性をもつとする理論計算の結果を勘案し、スピンー軌道相互作用を介して軌道磁気モーメントがAMR効果に影響を及ぼした結果であることが示唆された。Fe_4N/MgO/CoFeB-MTJのCIMSは、正のスピン分極を有する強磁性層を両電極とした通常のCoFeB/MgO/CoFeB-MTJのそれとは異なり、亀流方向と磁化反転の方向が逆転するインバースCIMS効果を示すことが判った。また、本インバースCIMS効果はFe_4Nをフリー層とした場合に観測されており、従来の理論では説明できない現象であることも併せて明ちかとなった。また、Fe_4N/MgO/CoFeBの構造を有する強磁性トンネル接合では、室温で最大-75%のインバースTMR効果が観測されており、Fe_4N中での少数スピン伝導がその起源と考えられている。本研究では、伝導電子のスピン分極が磁気伝導特性に及ぼす効果を調べるために、Fe_4N薄膜のAMR効果について検討を行った。スパッタ法により、熱酸化膜付Si基板上にMgO(2nm)/Fe(5)/Fe_4N(50)の膜構成でFe_4N薄膜を形成した。MgOおよびFe層は配向制御層である。比較試料として、MgO(2nm)/Fe(55)の膜構成でFe薄膜を形成した。Fe_4NならびにFe薄膜は基板面に平行に(001)配向しており、膜面内での結晶配向はランダム配向であった。全温度範囲でFe薄膜が正のAMR効果を示すのに対して、Fe_4N薄膜では負のAMR効果が観測されることが判った。二流体モデルに基づくCampbellとFertらの理論を拡張してAMR比の定式化を行い解析した結果、AMR比が負になるのは少数スピンによる電気伝導が支配的な場合に限られることが判った。すなわち、実験により得られたFe_4N薄膜の負のAMR効果は、理論予測された少数スピン伝導の証拠であることが明らかとなった。
特異的ケミカルラベル化によるタンパク質複合体の超高解像度可視化

本年度では、昨年度までに開発した高い反応性を有するヘリックスD2型ペプチドタグを組み込んだ膜タンパク質に対するラベル化実験ならびに電子顕微鏡での可視化について検討を行った。ラベル化による可視化を目指す標的タンパク質としては、カリウムイオンチャネル(Kv2.1)ならびにGABA受容体サブユニット(GABAa-gamma2)の二つを選択した。両タンパク質にタグを導入した変異体をHEK293細胞あるいはIn uteroエレクトロポレーション法によりマウス胎児の脳内に発現させた後、凍結割断法により発現タンパク質を含む膜レプリカを作製した。これに対して、ビオチンを有する亜鉛錯体型のプローブ部を反応させた後電子顕微鏡を用いて観察を行った。様々な検討を行ったところ膜レプリカ上のペプチドタグのシステイン残基が酸化により失活する可能性が明らかとなり、この酸化に失活を抑制するためのレプリカ作製ならびに保存条件の探索が必要であった。その結果、一重項酸素阻害剤であるアジ化ナトリウムがシステイン残基の酸化失活に有効であることを明らかとした。今後、さらなる検討を進めることでタグ導入タンパク質の効率よいラベル化を達成することを目指す。また、電子顕微鏡での可視化応用を目指したヒスタグに対するリアクティブタグ法の開発を新たに進めた。今年度は特にヒスタグに対して強い親和性を有するNi錯体プローブのデザインと機能評価を行った。その結果、従来のNi-NTA (nitoriloacetic acitd)型プローブに比べて16倍以上の強い親和性(Kd = 24 nM)を有するNi-IDA (iminodiacetic acid)型のプローブを見いだすことに成功した。このNi-IDA型プローブを用いて細胞表層に発現させたヒスタグ導入ブラジキニン受容体の蛍光バイオイメージグに成功した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度では、タンパク質ラベル化のための新しい技術としてのリアクティブタグ法の開発を中心に研究を進めてきた。特に新しく見いだしたD2タグ系のタグ配列最適化に注力した。この検討においては、従来のペプチドを用いたタグ配列の最適化を当初行い、その後に、より効率的にタンパク質上で最適化評価が可能な新しい手法を確立した。このタンパク質を用いた手法は、大腸菌において大量発現可能なマルトース結合タンパク質(MBP)上にPCR法を用いて異なる配列を有するペプチドタグを導入し、このタグ導入MBPと蛍光色素を有する亜鉛錯体型蛍光プローブとのラベル化反応速度をゲル電気泳動後にゲルイメージャーにより評価する手法である。この手法は、従来まで実施してきた手動による固相ペプチド合成により得たペプチドを用いたラベル化評価法に比べて、より簡便かつ多くのタグ配列の評価を可能とする優れた手法である。本年度は、このMBPタンパク質を用いた評価法開発のため多くの時間を費やしたたため、当初予定していた研究計画の期間内での実施が困難となり、研究期間の半年間の延長が必要となった。しかしながら、このMBPタンパク質を用いた評価法を用いることで、最終的に高い反応性を有するペプチドタグ配列を見いだすに至った。具体的には、まずペプチドを用いた検討により、天然タンパク質であるグルタレドキン様配列を持つアルファヘッリクス形成型D2タグを見いだした。その後にMBPタンパク質を用いた評価法により、網羅的な評価を行い、天然タンパク質であるチオレドキシン様配列を持つアルファヘッリクス形成型D2タグを見いだした。このチオレドキシン配列型D2タグは、グルタレドキン型D2タグと比較して3倍早いラベル化速度を示し、タグ導入MBPタンパク質をわずか10分程度で50%のラベル化が可能であった。

MBPタンパク質を用いた新しいペプチドタグ評価法を確立し、これを用いて早いラベル化反応速度を示すチオレドキシン配列型D2タグを見いだすことができたことは予想外の大きな成果といえる。一方で、このタグを用いた電子顕微鏡によるタンパク質の可視化については、準備は進めているものの十分な検討はできておらず翌年度に持ち越すこととなった。また、ヒスタグを用いたタンパク質ラベル化法についても着手してはいるものの十分な検討ができていない。25年度が最終年度であるため、記入しない。新たに見いだしたチオレドキシン配列型D2タグを用いて電子顕微鏡による膜発現タンパク質の一分子可視化の検討を進める。一方でD2タグ系とは異なるヒスタグを用いたタンパク質ラベル化法についても今後検討を進める。
醤油醸造業における産業革命期の研究

日本産業革命の研究は、多くの実証的・理論的成果があるが、1960年代の到達点が大石嘉一郎編『日本産業革命の研究』とされる。197080年代の研究動向としては、産業革命に関わる日本国内市場をどう見るかという点が問題となり、この観点よりなされた研究成果が山口和雄編『近代日本の商品流通』である。そのなかで特に国内市場の発展を追求するためには、在来産業ことに醸造業の研究が不可欠と指摘されている。(林玲子「銚子醤油醸造業の市場構造」)今回は、このような研究状況の課題に応えるべく、在来醸造業の典型である醤油醸造業について、明治期から大正・昭和初期にかけての歴史的変革を明らかにするため、野田・銚子・龍野・小豆島・児島・志度等で関係史料の収集を行った。その成果の一部は、次のようなものである。1備前醤油は、天保年間にすでに「十二水」(大豆・小麦の合計量の十二割の水を混入する)という水分の多い諸味で醸造された。また、白米を甘酒化し、これを諸味に混入すれば「十三水」が可能であるとする。龍野円尾家とほぼ同様で、江戸末期の備前・龍野醤油造りが発展した背景には、この技術的先進性がある。2志度では、明治38年、大豆粕使用による原価低廉化策に成功した。3湯浅では、明治42年以前に醤油速成法が考案され、1ヵ年余を要した醤油諸味醸造がわずか2ヶ月以内に短縮され、しかも従来より良質の醤油が生産された。4明治20年代に技術革新をスタートさせた野田醤油は、やがて流通面の支配にも乗り出し、大正15年、従来の成行販売や指値委託をやめ値極取引を行い、運賃を会社負担とし、価格を全国同一にするなど、「醤油界に大衝動」を与えた。大正15年は、画期的な年である。
シリカナノフルイディックチャネルを用いたバイオセンサーの研究

昨年度までにナノフルイディックダイオード、ナノフルイディックトランジスタの基本的な特性について理論的、実験的に確認したが、本年度はこれらを組み合わせたナノフルイディック集積回路を設計し、一度に多くの生体分子の分離、検出ができるバイオセンサーに応用することに取り組んだ。はじめにナノフルイディック集積回路の実現に向けて理論計算を行った。数十ナノメートルの流路幅をもつシリカナノチャネルのT字型分岐部において、イオンや分子の流れが外部電場を制御することにより変調できることを明らかにした。さらにT字型シリカナノチャネルを複数組み合わせた流路を提案し、イオンや分子が分離、分配される条件を明らかにした。また、直径数ナノメートルのシリカナノチャネルを対象とし、外部電場を与えた場合にその内部を流れるイオン流について、非平衡分子シミュレーションにより解析した。代表長さが数十ナノメートルの流路においては、主に静電気力によるイオン流の制御に取り組んだが、数ナノメートルの流路においては、静電気力の他に、双極子モーメント、分子間力等でイオン流を制御することが可能になるため、それらの効果を明らかにすることに主に取り組んだ。特に、シリカナノチャネルの表面の一部を様々な分子で修飾するにより、電流-電圧特性が大きく変化することを明らかにした。これらの研究成果は様々な多孔質ガラス材料をバイオセンサーに応用することができることを示している。本研究の目的は、シリカナノフルイディックチャネル内部でイオン、分子の移動制御と検出を簡易に行う方法を確立し、バイオセンサーに応用することである。本年度は、静電気力に着目し、イオン、分子の移動を制御することに取り組んだ。具体的にはナノフルイディックダイオード(シリカチャネルの壁面に荷電粒子を付着させることにより、シリカチャネル壁面の電荷を左右で反転させたシステム)を製作し、チャネルの両端に電位差を与えることにより流れるイオン流の大きさを測定した(電流-電圧特性曲線)。昨年度までに、電位勾配の向きによりイオン流を制御できる、すなわち半導体のダイオードの同じ整流作用がナノフルイディックダイオードにもあることを理論的に示したが、本年度は、実験により検証することができた。また、溶液の濃度が高くなり、デバイ長さがチャネル幅に対して極端に小さくなった場合、あるいは、溶液の濃度が低くなり、デバイ長さがチャネル幅よりも大きくなった場合には整流作用がなくなることを明らかにした。特に溶液の濃度が低い場合において、実験により得られた電流-電圧特性曲線は理論的な予測とは一致せず、水の加水分解、表面特性等を考慮しなければならないとの結論に至った。さらに、ナノ流体力学の関連する研究として、ナノ流体電池の性能予測を行った。ナノ流体電池とは、圧力差によって電解質水溶液がナノ流体チャネルを流れる時に、イオンの静電遮蔽効果がある場合に、対イオン(チャネルの壁面と反対符号の電荷を持つイオン)のみがチャネルを通過し、イオン流が発生するという現象を応用したものであり、機械仕事から電気仕事へのエネルギー変換装置である。具体的には、イオン濃度、表面電荷密度、チャネルのサイズ、あるいは媒体の物性値等をパラメータとして性能予測を行い、機械-化学-電気のエネルギー変換について考察した。
スギ花粉特異的長期生存型B細胞の形成機構および維持機構の解明

IgE抗体を介して病態が惹起される気管支喘息やアレルギー性鼻炎などの新しい治療戦略として抗IgE抗体療法が期待され、各臨床試験におけるその有効性についても高く評価されている。その一方で、アレルゲン感作後の抗原特異的IgE陽性細胞の分化経路や感作発症後の長期に及ぶ抗原特異的IgE抗体価の維持機構についての詳細は明らかになっていない。本研究において、これまでの長期生存型抗体産生細胞の維持に関する研究とIgE産生細胞に関する研究成果を踏まえ、抗原免疫後に誘導される抗原特異的IgE産生細胞の分化経路およびIgE産生細胞の局在を明らかにし、長期生存型IgE産生細胞を直接抑制する新しい免疫療法の確立を目指した。花粉症は花粉がヒトの鼻などの粘膜に付着して鼻炎などの症状を引き起こし、発症後は毎年の花粉飛散時期において症状を繰り返す代表的な季節性の一型アレルギー疾患である。花粉が引き起こすアレルギー反応の要因には主に花粉を排除するために抗体産生を誘導する体液性免疫応答機構と、一度認識した抗原に対する防御機能を長期間維持するための免疫記憶機構が関与していると考えられている。そのため、抗原特異的な長期生存型B細胞の形成機構および維持機構が解明できれば、アレルギー反応の主要因となる長期生存型B細胞からのIgE産生経路を特異的に抑制せすることができ、花粉症発症の予防策になりうるのではないかと考えられる。本年度は、まずスギ花粉症者を対象に花粉飛散期前、中および後におけるスギ花粉特異的IgE陽性B細胞の経時的変化を調べた。またOVA抗原誘導性アレルギー性鼻炎モデルマウスを作製し、抗原暴露により誘導された抗原特異的IgE産生細胞の局在場所を経時的に解析した。その結果、花粉症者の末梢血においてスギ花粉特異的IgE陽性B細胞は花粉飛散期前、中および後のいずれの点においても存在が認められ、さらに花粉飛散期後においてスギ花粉特異的IgE陽性B細胞数が著しく増加していることがわかった。また、アレルギー性鼻炎モデルマウスの解析から、アレルギー性鼻炎の発症後から主に頸部リンパ節に抗原特異的IgE産生細胞が認められ、さらに発症後においても数は減少しているものの、局在が認められた。以上の結果から、花粉症においてスギ花粉特異的IgE陽性B細胞は何らかの機構において長期間維持されており、またアレルギー性鼻炎の誘導により産生された抗原特異的IgE陽性B細胞は主に頸部リンパ節で産生される可能性が示唆された。スギ花粉症はIgE抗体を介して誘導される季節性のI型アレルギー疾患である。このような発症機序に深く関与する抗原特異的IgE抗体は血清中での半減期が2-3日と他のサブクラス抗体に比べても非常に短いのにも関わらず、スギ花粉症患者では花粉飛散期以外の時期においても血清中にスギ花粉特異的IgE抗体価が維持されている。この長期に渡る特異抗体維持機構は、長期生存型抗体産生(Long-lived Plasma)細胞が中心的な役割を担っていると考えられている。しかしながら、これらの細胞の分化経路についての詳細はまだ完全には明らかになっておらず、特にIgEクラスのLong-lived (LL-)Plasma細胞については、その存在さえも不明である。昨年度の研究から、花粉症者の末梢血においてスギ花粉特異的IgE陽性B細胞はアレルギー患者では高親和性IgE抗体を産生するLL-Plasma細胞が優先的に分化誘導されており、その結果血中の高いIgE抗体価が維持されている可能性を推察した。また、アレルギー性鼻炎モデルマウスの解析から、アレルギー性鼻炎の発症後から主に頸部リンパ節に抗原特異的IgE産生細胞が認められたが、LL-Plasma細胞の主な局在場所として報告されている骨髄にはIgEのLL-Plasma細胞が認められなかった。これらのことから何らかの機序でIgEのLL-Plasma細胞が分化維持されることがアレルギー疾患の病因ではないかと推察した。そこで、遺伝子操作マウスで血清中に高いIgE抗体価を有するIL-21のレセプター欠損(IL-21R-KO)マウスを免疫して経時的に、骨髄中のIgEのPlasma細胞やLL-Plasma細胞についてELISPOT法で解析したところ、どちらのマウスにおいても検出できなかった。しかし、予想に反してIL-21R-KOマウスではIgG1のLL-Plasma細胞も全く検出できなかった。この結果から、IL-21がLL-Plasma細胞の分化に重要であることが強く示唆されたため、IL-21におけるLL-Plasma細胞の産生機構およびIgEのLL-Plasma細胞の分化経路について詳細に解明している。
腹膜透析被嚢性腹膜硬化症の機序解明と予防薬開発

腹膜透析液による腹膜障害を軽減する薬剤としてピリドキサミンの効果を評価する研究を行っている。腎不全ラットに腹膜透析液を繰り返し腹膜透析液を注入し腹膜障害を起こしたモデルラットにピリドキサミン内服投与を行ったが、腹膜障害の程度が軽微すぎるなどの理由で十分に効果を証明することができなかった。現在、腹膜障害を起こすメチルグリオキサールをより多く透析液に追加する、ピリドキサミンの内服量を増量するなどして再実験を行っている。少人数の腹膜透析患者に対するピリドキサミンの薬物動態の検討も行ったが、ピリドキサミン内服後血中、次いで腹腔内のピリドキサミン血中濃度が上昇することを確認できた。MG濃度によるEPS発症率の評価。以下にEPSラット作成概要を示す。1.7週齢:左腎の2/3腎摘出2.8週齢(左腎処置後7日):右腎摘出3.14週齢:頭上から皮下を通して腹膜透析用のrat-o-portを挿入。翌日から14日間1日2回25ccの腹膜灌流を行う。試技間は腹腔内に液を貯留する。5.21週齢:頚静脈より採血、D/P-Urea測定の後(EPSの程度による)腹膜を採取し、ネンブタールで屠殺。腎不全の有無、腹膜透析液により以下のラットのグループを作成した。EPSの発症はGroup1:0‰Group2:30%. Group3:50‰Group4:100%であった。病理的変化を検討した。ともにEPSの発症を認めなかったが臓側腹膜(肝臓)の線維化が明らかに定量的に差を認めた。つまり、EPSの発症には、(1)AGEが腹膜に蓄積することが必要(2)AGE量と関係があること(3)腎不全であることが関わっていることの3点を指し示した。EPS発症モデルの腹膜透析液中にAGE消去もしくは補足物質であるpyridoxamine、とTM2002を注入することで、EPSの発症を抑制可能かの検討は進行中である。これまでの検討で(1)腹膜の劣化(2)線維化(3)機能低下に、AGEが関わる(4)pyridoxamineで消去できること(5)初期病変の一つとしての肝表面の変化が明らかとなった。1.平成21年度作成のGroupを、再作成した。平成22年度Group4は、完全なEPS発症モデルであることを確認した。本モデルは腎不全患者の生体内では糖・脂質に由来する反応性カルボニル化合物が蓄積し、細胞・組織蛋白の修飾が著しく亢進している事実"カルボニルストレス"という概念そして、透析合併症の発症機序としてこのカルボニル修飾に伴う種々の生理活性がこれら合併症の発症および進展に関与している可能性、さらに、カルボニルストレスが腎不全で亢進する機序として、酸化ストレスのみならず非酸化的機構、特にカルボニル消去系の重要性に基づいて作成した自然発症的なモデルである。また、その初期段階の変化が、肝表面に生じることも確認でき、これを23年度の追加研究として取り上げてある。また、直接の実験結果ではないが本研究に案を得て施行した臨床研究をまとめた。研究目的:腹膜透析療法(CAPD)は、血液透析と比較して、通院回数が少なくて済み、患者の社会復帰が容易な治療法である。しかし、腹膜透析期間が長くなってくると腹膜の変化から、除水機能が低下し、継続が困難となってくる。また、被嚢性腹膜硬化症という腸管が癒着し合って致死的な状態を起こすこともあるため、現状では7年程度で血液透析など他の治療法に変更することが多い。この変化に反応性カルボニル化合物や最終糖化産物(AGEs)が関わることが確認されており、ビタミンB6の一種であるピリドキサミンはこれらを補足消去するなどして減少させることが知られている。ピリドキサミン内服投与によって、カルボニル化合物やAGEsの減少作用や、腹膜変化の緩和作用があるかどうかを確認する。研究方法:ラットの腹腔内にカルボニル化合物であるメチルグリオキサールを加えた腹膜透析液を繰り返し注入し、腹上膜障害を起こさせる。このラットにピリドキサミン内服投与し、カルボニル化合物、AGEs、腹膜障害の改善の程度を確認する。研究成果:メチルグリオキサール5mMを加えた腹膜透析液を1日2回投与したが、腹膜障害は強くなかった。カルボニル化合物やAGEsの消去効果も確認できなかった。今回の結果を元に、メチルグリオキサール濃度やピリドキサミン内服の量やタイミングを再考し、条件を変えた実験を計画中である。
ヒト乳児と類人猿における手を用いたジェスチャーの系統比較

二年間にわたり計25名のヒト乳幼児について生後6ケ月より毎月5日間一ケ年にわたる家庭訪問を行い、乳児が母親と自由に交渉する場面をビデオに録画し、同時の音声をテープレコーダに録音した。ビデオテープより手のジャスチャーをカテゴリー化し、音声を喃語、ク-イングごとに分類したものとの対応関係を検討した。同時に本研究所および多摩動物園に飼育されているチンパンジーの集団、計20頭について、ヒト乳幼児に対して行ったのと全く同一の手法によって音声とジェスチャーのコーディングを行った。分析の結果、ヒト乳幼児ではbangingに代表される特定の反復運動だけが特異的に喃語の発生と同期し、しかも喃語発現期のごく初期にのみ生起することがわかった。この時期の音声の詳細な分析を行ってみると、(1)身体運動の同期が生ずる以前の音声は、根本的にまだフォルマント構造を形成していない。(2)身体運動と同期が見られる期間については、同期して発せられた音では各音節の長さと第一フォルマントのフォルマント周波数移行時間の長さが、同期せずに発せられた音のそれより有意に短くなる。(3)身体運動との同期がもはや見られなくなったあとの音声の音節の長さと第一フォルマント周波数移行時間は、身体運動との同期が生じた期間に、まさに同期して発せられた音のそれと近似している。ことの3点が判明した。同時にチンパンジーにおいて同様の同期がみられるのか否かを検討したところ、同期することそのものは存在することが確かめられた。ただしチンパンジーでは多音節の発生に対する、チンパンジー自体の聴覚選好が見られず、そのため多音節の発生への移行が生じないだろうと、推測される。ヒト乳児10名について、生後6ケ月より毎月5日間、一年とわたり家庭訪問を実施して乳児が母親と自由に交渉を行う場面を観察した。データはビデオに収録し、同時にテープレコーダーに音声を録音した。ビデオテープより手のジェスチャーをカテゴリー化し音声を喃語・ク-イングごとに分類したものとの対応関係を検討した結果、bangingに代表される特定のリズミックな反復運動だけが特異的に喃語の発声と同期することが判明した。またこの同期現象は、喃語発現期のごく初期にのみ見られることが分かった。初期は乳児は子音を産出するうえで、音声上のホルマントの周波数移行を迅速に行うことに、たいへんな困難を持つと想定される。その際、運動は円滑に遂行するために、身体運動との同期の助けによって、発声を賦活化していると考えられる。同時に本研究所および多摩動物園に飼育されているチンパンジーの集団、計20頭について、ヒト乳児に対して行ったのと全く同一の手法によって音声とジェスチャーのコーディングを行った。その結果、チンパンジーにおいても乳児で見られるリズミックな反復運動と全く同一の運動パターンが生起していることが、明かとなった。但し音声と時間的に同時的に生起することはまれである。チンパンジーもヒトの喃語の源初型と思われるような多音節からなる発声を行い、音声のパターンも可塑性を有している。ただ音声と身体運動の遂行が何ら有機的な関連なしに生起する点に、ヒトとの差をへだてる大きな溝があるのではないかと推測される。来年度はこの仮説をもとにヒト乳児の被険者の数を増し、個人ごとの同期する程度を音声発達のテンポとの間の相関を検討したいと考えている。昨年度にひきつづき、新たにヒト乳児15名について、生後6ケ月より毎月5日間、一ケ年にわたり家庭訪問を行い、乳児が母親と自由に相互作用を行う場面をビデオに録画し、同時にまた音声をテープレコーダに録音する作業を、実施した。

ビデオテープより手のジェスチャーをカテゴリー化し、音声を喃語・ク-イングごとに分類したものとの対応関係を検討した結果、昨年と全く同じようにbangingに代表される行程の反復運動だけが特異的に喃語の発声と同期し、しかも喃語発現期のごく初期にのみ生起することが分った.そこで本年度はだらにこの時期の音声の詳細な分析を試みた.分析の結果、(1)身体運動の同期が生ずる以前の音声は、根本的に未だフォルコント構造を形成していない、(2)身体運動と同期が見られる期間においては、同期して発せられた音では各音節の長さと第一フォルコントのフォルコント周波数移行時間の長さが、同期せずに発せられた音のそれよる有意に短かくなる.(3)身体運動との同期がもはや見られなかったあとの音声の音節の長さと第1フォルコントのフォルコント周波数移行時間は、身体運動との同期が生じていた期間に、まさに同期して発せられていた音のそれと近似していることの3点が判明した.同時にチンパンジーにおいて同様の周期が見られないか否かを検討したところ、同期自体は有在することが確かめられた.但しチンパンジーでは多音節の発声に対するチンパンジー自体の聴覚選好が見られず、そのため、多音節発声への移行が生じないのだろうと推測された。
人工湧昇流構造物による海況変化

200海里時代を迎え、沿岸漁業の再開発は焦眉の社会的課題となってきている。愛媛県と五洋建設(株)は生産性の低い沿岸沖合い漁場を再開発するために、瀬戸内海豊後水道東部海域水深50mの海域に、高さ10m幅20mの衝立て状の人工湧昇流構造物を設置し、強い潮流がこの構造物に衝突し、湧昇することで、海底近くの未利用の栄養塩を有光層内に持ち込み、植物プランクトンの増殖を測ることを試みた。1987年の構造物設置前と1988年の構造物設置後の海洋観測結果の比較から以下のことが明らかとなった。1)M_2分潮流の振幅と鉛直乱れ成分が増加した。2)低温で栄養塩濃度の高い底層水が有光層まで湧昇した。3)小潮時にのみ植物プランクトン濃度は増加した。大潮時には鉛直乱れが大きくなるために、高い栄養塩濃度にも関わらず、植物プランクトンは有光層にとどまることができないで、有効に増殖できないものと考えられる。4)動物プランクトン濃度は増加せず、底棲生物は減少した。5)魚群探知機による観測の結果から、流速が速い時には構造物周辺に魚群が蝟集していて、構造物は湧昇効果のみならず、漁礁効果も発揮していることがわかった。6)上記1)2)の観測結果は鉛直2次元数値モデルによって、良く再現された。
骨髄間質細胞培養系新規担体と培養骨膜を組み合わせた骨再生法の開発

骨欠損の修復ではドナーへの外科的侵襲が大きいという問題がある。そこで細胞接着性に優れた新規な担体を用いた新しい骨再生法の有用性を検討し、除去骨と同じ骨形態を再生することを目的とした。新しい骨再生のためには骨髄間質細胞培養システム、新細胞担体の開発、新技術による培養骨膜の精製が必須と考えられる。そこで足場としての有用性を確認するために、ウサギの頭蓋骨に円筒状のチタンメッシュを置き、増殖因子やサイトカインを多く含む血小板フィブリンをフィルム状にして挿入し、新しいゼラチンスポンジの代用品として使用できるかどうかを検討したが、著しい新しい骨再生は観察されなかった。骨欠損の修復は再建外科における重要課題の一つであるが、ドナーへの手術侵襲が大きいために患者の負担を強いることが多く、また欠損前の元通りの顎形態に再現することが非常に難しいという問題点が挙げられてきた。そこで本研究では、細胞接着性に優れる新規担体を用いた自家骨髄間質細胞培養系と自家培養骨膜を組み合わせる新しい骨再生法の有用性を検討し、摘出骨と同形態の骨を再生させることを目標としている。そのためには1骨髄間質細胞培養系に加えて、2新規細胞担体の開発、3新技術による培養骨膜の精製の3つを柱とした再生医学的手法への取り組みを課題としており、まずはチタンメッシュのスキャホールドとしての有用性を確認するために動物実験を行った。実験動物としてはウサギを用い、その頭蓋骨にチタンメッシュを円柱状に加工して植立し、非脱灰研磨標本を作製して、月単位で経時的に組織学的観察を行った。次にスキャホールドと同時に自己の血小板や白血球由来のPDGF-AB(血小板由来増殖因子)、TGF-β(トランスフォーミング増殖因子)、IGF-1(インスリン様成長因子)、EGF(表皮増殖因子)、VEGF(血管内皮細胞成長因子)などの成長因子やサイトカインを多く含み、軟組織および硬組織の組織修復を促進する多血小板フィブリン(Platelet-rich fibrin; PRF)を膜状に加工し、新規ゼラチンスポンジの代替として活用できるかを検討するために、ウサギ頭蓋骨に植立したチタンメッシュ内にPRFを膜状に加工したものを設置し、非脱灰研磨標本を作製して、月単位で経時的に組織学的観察を行った。初代骨髄間質細胞を担体である新規ゼラチンスポンジに播種して一定条件下で骨芽細胞へ分化誘導する作業と自家培養骨膜の作製において大きな遅れを認めている。その一方で、ウサギにおける顎骨欠損モデルの作製は順調に進んでおり、ウサギ頭蓋骨に植立したチタンメッシュ内に成長因子やサイトカインを多く含む多血小板フィブリン(PRF)を膜状に加工し、ある意味では自家培養骨膜の代替として使用できるPRF膜を用いた組織学的な経過観察において十分な結果を得ている。これまでの臨床での結果から1壁4壁性であれ、周囲に骨壁があることが重要であり、平坦な骨面に凸型に骨を造成することが最も困難と思われる。今回、われわれはそのような究極の条件下、すなわちウサギの頭蓋骨の平坦な部位に移植骨なしの骨造成が可能かどうかを検証し、もし可能であればどのような条件が必要かを実験で確認することとした。ウサギの頭蓋骨を左右に分け、両者の骨表面には骨を再生させる空間を作るべく、チタン製の円柱状の枠を設置することとし、これを同じくチタン製のネジを用いて骨面に固定する方法を考案した。しかしながら、チタン製円柱枠のサイズが大きい場合にはウサギの頭部の皮膚に褥瘡が生じてしまうため、円柱の直径と高さの調整を行う必要があった。次に培養骨膜の作製ができるまでの期間を利用し、また実験系全体としてのコントロール作成の意味も含めて、先のチタン製円柱内の組織を経時的に観察した。すなわち予定通りにウサギ頭蓋骨左右にチタン製円柱を設置し、骨表面には骨幹細胞が誘導できるようにドリルで骨孔を開け、一方には多血小板フィブリンを充填し、他方は何も挿入せずに、その両者を比較検討することとした。多血小板フィブリンは同じウサギの耳介静脈から血液を採取し、遠心分離機によりオペ直前に作成した。チタン製円柱設置後、1カ月、2カ月、3カ月、6ヶ月の経過観察期間をおいてからチタン製円柱内の組織を取り出し、HE標本を作製して光学顕微鏡下で観察を行った。すると両者ともチタン製円柱の高さの25%程度までは骨形成がみられたが、両者に違いを見出すことはできなかった。多血小板フィブリンが骨再生時の早い段階で役割を果たしている可能性も考え、チタン製円柱設置後の2週間後、1カ月後、2カ月後においてチタン製円柱内の組織を採取し、オステオカルシンによる免疫染色を行った。しかしながらその結果においても左右での違いを見出せなかった。培養骨膜の作製においてコンタミなどがみられ、実験室の環境改善を余儀なくされたため、多大な時間を費やす結果となった。また、同時に行っていたウサギの実験においては、使用予定であったゼラチンスポンジが強度的に脆弱であったため、これを補う必要があり、頭蓋骨にチタン製円柱枠を設置する方法を提案した。しかしながらチタン製円柱枠のサイズが大きいと頭部の皮膚の褥瘡ができて感染を生じてしまうため、その直径や高さを調整する必要があった。ウサギの骨形成過程を観察するうえにおいてはチタン製円柱枠設置後少なくとも6ヶ月間は必要と考えたため、その期間を通じて褥瘡ができないサイズを調整するために、こちらも多くの時間を費やす必要があった。

骨欠損の修復は再建外科における重要課題の一つであるが、ドナーへの手術侵襲が大きいために患者の負担を強いることが多く、また欠損前の元通りの顎形態に再現することが非常に難しいという問題点が挙げられてきた。そこで本研究では、細胞接着性に優れる新規担体を用いた自家骨髄間質細胞培養系と自家培養骨膜を組み合わせる新しい骨再生法の有用性を検討し、摘出骨と同形態の骨を再生させることを目標とした。その実現のために1骨髄間質細胞培養系に加えて、2新規細胞担体の開発、3新技術による培養骨膜の精製の3つを柱とした再生医学的手法への取り組みを課題とした。そこで、まずチタンメッシュのスキャホールドとしての有用性を確認するために動物実験を行った。実験動物としてはウサギを用い、その頭蓋骨にチタンメッシュを円柱状に加工して植立し、非脱灰研磨標本を作製して、月単位で経時的に組織学的観察を行った。次にスキャホールドと同時に自己の血小板や白血球由来のPDGF-AB(血小板由来増殖因子)、TGF-β(トランスフォーミング増殖因子)、IGF-1(インスリン様成長因子)、EGF(表皮増殖因子)、VEGF(血管内皮細胞成長因子)などの成長因子やサイトカインを多く含み、軟組織および硬組織の組織修復を促進する多血小板フィブリン(Platelet-rich fibrin; PRF)を膜状に加工し、新規ゼラチンスポンジの代替として活用できるかを検討するために、ウサギ頭蓋骨に植立したチタンメッシュ内にPRFを膜状に加工したものを設置し、非脱灰研磨標本を作製して、月単位で経時的に組織学的観察を行った。その結果、有意な骨造成を観察することができなかった。骨欠損の修復ではドナーへの外科的侵襲が大きいという問題がある。そこで細胞接着性に優れた新規な担体を用いた新しい骨再生法の有用性を検討し、除去骨と同じ骨形態を再生することを目的とした。新しい骨再生のためには骨髄間質細胞培養システム、新細胞担体の開発、新技術による培養骨膜の精製が必須と考えられる。そこで足場としての有用性を確認するために、ウサギの頭蓋骨に円筒状のチタンメッシュを置き、増殖因子やサイトカインを多く含む血小板フィブリンをフィルム状にして挿入し、新しいゼラチンスポンジの代用品として使用できるかどうかを検討したが、著しい新しい骨再生は観察されなかった。Platelet-rich fibrinを骨形成におけるスキャホールドとして有用性を検討するために「Guided Bone RegenerationにおけるPlatelet-rich fibrinの有用性」というタイトルでウサギの動物実験モデルを作製し、当大学の動物倫理委員会の承認を受けた。本実験では、スキャホールドとしての有用性を検討するために、培養骨膜やコラーゲンメンブレンではなくチタンメッシュを加工し使用している。現在19匹へチタンメッシュ留置を施行しており、1匹死亡、2匹は既に検体摘出(1検体はすでに標本スライドとしている)、16匹飼育中となっている。予定として、4月に5匹、5月に7匹、6月に4匹検体を摘出予定である。インプラントを埋入する際、下顎管や上顎洞が近接する症例では長いインプラント体を使用することはできない。しかしながらインプラント長はわれわれの以前の研究結果から10ミリ以上は必要と考えており、そのためにはインプラント埋入前に骨造成を行う必要がある。
非一様時空における光の伝播と観測的宇宙論

観測的宇宙論では通常、宇宙の大域的構造として一様,等方のモデルが用いられるが、現実の宇宙は密度の大きな揺らぎがある。従ってそのような非一様な物質分布における光の伝播の研究が重要になる。本研究では、まず一般相対論に基づいて、局所的には非一様であるが平均化すると一様、等方の時空になるような時空の構成法をいくつかの方法で示した。これによって現実的な宇宙の十分より近似がえられ、それをもとに光の伝播を研究した。その結果、従来用いられていた宇宙論的な距離の公式(赤方偏移-距離関係)は、赤方偏移が大きい、すなわち非常に遠方では、かなり大きな修正を受けることが判明した。また宇宙の構造を決める重要な要素の一つである宇宙定数について、重力レンズを用いたその観測可能性を論じた。これによって数多くの重力レンズ現象の統計的性質を用いれば、宇宙定数が測定可能であること、及び宇宙の膨張速も減速率も観測可能であることが判明した。さらに宇宙における密度揺らぎの成長を近似するビルドビッチ近似について研究し、宇宙定数が存在する場合にその近似を拡張した。この近似法を用いて、非一様モデル宇宙を計算機でつくり、そこで多数の光を飛ばせて、理論的に導いた赤方偏移-距離関係を正当性を確かめる研究に着手した。現在までのところ数値計算の結果、理論的予想にほぼ一致する結果を得ている。
果樹作物における一過的RNAサイレンシング法の確立とその成熟制御因子解析への利用

ブドウにおいて一過的RNAサイレンシング手法が機能する可能性を示した。さらに、トマトを用いて成熟関連遺伝子(AP3,TM6,AGL1,GRAS)の絞込みに成功した。これらの遺伝子に関して,ブドウにおけるサイレンシングを実施したが,その成熟への関与は明確ではなかった.今後、本研究の手法を用いてブドウの成熟や品質に関わる遺伝子の解析も進展が期待され、トマトにおいて選抜した遺伝子の成熟制御の証明により、大きな成果が期待できる。本年度には、果樹作物において一過的RNAサイレンシング法の確立を試みるとともに、その技術を用いた成熟制御因子の解析を開始することを目的とし、以下の6項目に分類される研究を行った。1、既知の着色関連遺伝子を用いた一過的RNAサイレンシング用コンストラクトの作成。(1)来のRNAサイレンシング用のベクターでは果実への遺伝子導入の効率が低いことが判明した。そこで、CRISOのpHannvalベクターの一部分をアグロインジェクション用ベクターpCambia 0380に移替え、一過的RNAi専用のベクター(pCam 0380 hair-pin)を作成した。このベクターによりイチゴで予備実験をしたところ、遺伝子導入効率が向上した。(2)次に、pCam 0380hair-pinへ既知の着色関連遺伝子(ブドウCHS遺伝子、myb遺伝子など)を挿入したコンストラクトの作成に成功している。2、Gus遺伝子コンストラクトを用いた遺伝子導入方法の確立。Gus遺伝子を持つコンストラクトを果実に導入し、Gus遺伝子による青色発現により導入効率を検討した結果、80%近くの高いの導入効率が得られた。3、着色関連遺伝子コンストラクトを用いた一過的RNAサイレンシン手法グの確立。着色関連遺伝子の一過的RNAサイレンシングを試みたところ、特に、ブドウにおいて、CHS遺伝子およびmyb遺伝子いずれに関しても、着色の抑制が観察され、一過的RNAサイレンシング手法が機能している可能性が示唆された。本年度は供試個体数が少なかったので、6、で準備した個体を用いて、次年度以降において、反復数を増やして研究を進める予定である。その他、4、解析候補となる成熟制御因子の絞り込み。5、成熟制御因子(MADS-Box転写因子)解析用コンストラクトの作成。6、供試材料の大量育成(特に、超密植栽培法を用いたブドウ鉢植の準備に成功)。などを進めた。本年度には、果樹作物において一過的RNAサイレンシング法の確立を試みるとともに、その技術を用いた成熟制御因子の解析を開始することを目的とし、以下の4項目に分類される研究を行った。1)超密植栽培による鉢植ブドウの多数育成作年度までに開発したブドウにおける一過的RNAサインレンシングをより本格的に実施するためには、多数の鉢植個体が必要である。そこで、昨年度までに準備した個体に加え、岡山県農業試験場が開発した超密植栽培法を利用し、より多数の果実を付ける鉢植個体の準備を試みた。その結果、2品種合計40の鉢植着果個体の育成に成功した。2)トマトを用いた解析の候補となる成熟制御因子の絞り込み作年度までの研究により、解析の候補遺伝子が予想以上に多数存在することが分かった。そこで、トマトにおいて獲得しているVIGS法による簡易なRNAサイレンシング手法を用いて、ブドウやカンキツにおいて解析するべき因子の絞り込みを行った。その結果、新たにMADS-Box転写因子に属するAP3, TM6, AGおよびAGL1が候補因子として選抜できた。2)で絞り込まれたAP3, TM6, AGおよびAGL1に関して、ブドウのホモログ遺伝子を単離し、これらを挿入したhair-pin RNAi用のコンストラクトを作成した。4)カンキツにおけるhair-pin RNAiによる一過的RNAサインレンシング手法の確立カンキツにおいてカロテノイド合成に関わるCs-Chl1およびCs-PDS1の単離に成功した。さらに、これらの遺伝子について、hair-pin RNAiコンストラクトを作成し、RNAサイレンシングを実施した。その結果、果皮ディスクを用いた方法では不十分であり、樹上処理の必要性が明らかとなった。本年度には、果樹作物において一過的RNAサイレンシング法の確立を試みるとともに、その技術を用いた成熟制御因子の解析を開始することを目的とし、以下の3項目に分類される研究を行った。1)トマトを用いた解析の候補となる成熟制御因子の絞り込みトマトにおいて獲得しているVIGS法による簡易なRNAサイレンシング手法を用いて、ブドウやカンキツにおいて解析するべき因子の絞り込みを行った,その結果,昨年度に選抜されたMADS-Box転写因子に属するAP3,TM6,AGおよびAGL1に加えて,新たにGRASとbZipに属する転写因子が候補として選抜された.特に,GRASに関しては,これまでに成熟への関与が全く報告されていない遺伝子であり,新規性のある結果てあった.ブドウより,AP3のホモログを単離し,hair-pin RNAi用のコンストラクトを作成に成功した.3)ブドウにおける一過的hair-pin RNAiによる成熟制御因子の同定昨年度までに完成している

ブドウのR1N、TM6、AGのhair-pin RNAiコンストラクトおよび本年度2)において作成したAP3のhair-pin RNAiコンストラクトと,昨年度までに育成した鉢植個体を用い、ブドウにおける一過的hair-pin RNAiを実施し、その果実成熟への影響を調査した。その結果,いずれの遺伝子に関しても対照区と比べ,有意な成熟の遅延や促進はみられず,これら遺伝子のブドウの成熟への関与は明確ではなかった.以上より,トマトを用いて成熟に関連する遺伝子の絞り込みを行い,それらの遺伝子に関して,果樹作物ブドウにおける一過的RNAサイレンシング実施に成功したが,これらの遺伝子のブドウ成熟への関与は明確ではなかった.