hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
終末糖化産物アプタマ-を用いた糖尿病血管症の治療戦略

終末糖化産物(AGE)の作用をブロックするDNAアプタマーを作成し、当該アプタマーを糖尿病モデル動物に持続投与することで、タンパク尿の排泄が抑えられるとともに、腎臓や網膜の炎症が改善され、糖尿病細小血管障害が抑制されること、ならびにバルーン障害後の血管の再構築が抑制され、大血管障害に対しても保護的に作用することが見いだされた。AGE?アプタマーは、糖尿病血管症に対する新しい治療戦略となりうるかもしれない。本研究では、終末糖化産物(Advanced Glycation End-products、以下AGE)に特異的に結合し、その生物活性を中和できる修飾化AGE-アプタマーを作成し、糖尿病モデル動物に投与して、当該アプタマーの血管合併症への有効性を検討し、将来の臨床応用への可能性を模索しようとするものである。本年度は、既報のSELEX法でAGEアプタマーならびにコントロールアプタマーの調整を行った。具体的には、AGE-アプタマー<TAACTCACTCCATACTCACTTGCTGATTCGCCAACAACACACCCTTTAAACAGTCCC>をフォスフォロチオエート化し、アプタマーの安定化修飾を行った。同時にスクランブル配列をもつ安定化コントロールアプタマーも作成した。次いで、8週齢の肥満2型糖尿病モデル動物であるKKay/Taマウス腹腔内に各投与量AGE-アプタマーをオスモティックポンプを用いて持続的に投与し、血中ならびに腎組織中のAGEレベルをコントロール動物レベルにまで抑制できるAGEアプタマーの至適投与量を決定した。血中ならびに腎組織中のAGEレベルの計測は、816週齢の間、ELISA法ならびにwestern blot法で行った。結果として、AGE-アプタマー3μMをオスモティックポンプを用いて持続的にKKay/Taマウスに投与することで、血中ならびに腎組織中のAGEレベルをコントロール動物レベルにまで抑制できることが見いだされた。8-16週齢の肥満2型糖尿病モデル動物であるKKay/Taマウス腹腔内に3μMのフォスフォロチオエート型終末糖化産物-アプタマー(Advanced Glycation End-products、以下AGE-アプタマー、以下AGE-アプタマー)あるいはコントロールDNAアプタマーを投与し、経時的に糖尿病腎症に及ぼす当該AGEアプタマーの効果について、非糖尿病コントロールマウス、コントロールDNAアプタマー投与糖尿病マウスと比較検討した。その結果、3μMのAGE-アプタマーの投与により、1)BUN、クレアチニンで評価される腎機能の低下が有意に抑制されること、2)アルブミン尿の排泄量の増加が有意に抑えられ、尿中8-OHdGなどの酸化ストレスマーカーの排泄量も低下すること、3)腎組織学的にメサンギュウム領域の拡大や糸球体の硬化病変が抑制されること、4)腎糸球体領域におけるCTGF等の硬化病変を引き起こす増殖因子の発現が抑えられることなどが見いだされた。AGEアプタマーの投与により、KKay/Taマウスの血糖値、血圧値、脂質値等の代謝系のパラメーターは何ら影響を受けなかったが、血中並びに腎糸球体領域のAGEレベルがコントロールマウスのレベルにまで抑制された。以上のことから、AGE-アプタマーは、AGEと結合しその代謝、排泄系を促進することで作用をブロックし、糖尿病腎症の進展に保護的に作用するものと考えられた。8週齡の雄、1型糖尿病モデルラットの腹腔内に0.136 μg/20 gbody weightのフォスフォロチオエート型終末糖化産物ーアプタマー(Advanced Glycation End-products、以下AGE-アプタマー、以下AGE-アプタマー)あるいはコントロールDNAアプタマーを持続的に投与し、経時的に糖尿病網膜症と血管リモデリングに及ぼす当該AGEアプタマーの効果について、非糖尿病コントロールマウス、コントロールDNAアプタマー投与糖尿病マウスと比較検討を行った。その結果、AGE-アプタマーの投与により、1)バルーン障害後の血管リモデリングが抑制されること、2)尿中8ーOHdGなどの酸化ストレスマーカーの排泄量も低下すること、3)網膜におけるVEGF, MCP-1等の血管透過性や炎症を惹起する因子の遺伝子の発現が抑えられることなどが見いだされた。AGEアプタマーの投与により、1型糖尿病モデルラットの血糖値、血圧値、脂質値等の代謝系のパラメーターは何ら影響を受けなかったが、バルーン障害部位や網膜領域におけるAGEレベルがコントロールラットのレベルにまで抑制された。さらに、AGEによる血管内皮障害もAGEアプタマーにより抑えられることが見いだされた。以上のことから、AGE-アプタマーは、AGEと結合しその代謝、排泄系を促進することで作用をブロックし、糖尿病血管症の進展に保護的に作用するものと考えられた。当初の予定では、23年度中に腎症の他、網膜症の評価も合わせて行うこととなっている。現在網膜症への効果について、実験が進行中で、計画は、おおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後は、網膜症に対するAGE-アプタマーの効果について検討した後、バルーン障害による血管リモデリングへの当該アプタマーの作用についても、計画どおり解析を進める予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
発生プログラムの発現とその調節

重点領域研究「発生プログラム」は3か年の研究期間を予定して本年度に成立した。本研究の目的は、この重点領域研究の推進を総括することにある。『高次体制の形成・再生の制御とその因子』及び『分化の調節性と形態を誘導する因子』をそれぞれ課題とする2つの計画研究に加え、18課題の公募研究を以って本重点領域研究は組織された。計画研究の分担研究者及び公募研究代表者の相互の連携を図りつつ研究を推進した。成果の詳細は、『重点領域研究「発生プログラム」平成元年度研究成果報告書』としてとりまとめ、平成2年3月に刊行された。O脊椎動物の組織細胞の分化形質発現を安定化し、組織の修復再生時の細胞の脱組織に直接関与すると考えられる細胞表面分子の存在が確認された。O細胞接着分子カドヘリンが組織や器官の構築過程に基本的な細胞選別現象に、不可欠な役割を演じていることが、生体系ではじめて実証された。O細胞の分化形質発現に必須な細胞種特異的遺伝子の発現制御にかかわる細胞内外諸因子の実体とその機能とを、具体的に探究するための基礎的知見が確率された。O脊椎動物の体軸決定因子の存在が実験的に示された。これらは、本研究の本年度における特筆すべき成果の一部である。これらの成果を含めて本重点領域研究全体として、既に60編を超える欧文原著論文が国際学術雑誌によって公表されている。本研究組織にあっては、平成元年6月に、重点領域研究「発生プログラム」の成立の背景と目的とを広く公に問うための公開シンポジウムを、また、平成2年3月には、漸進な遺伝子操作技術の研究への積極的導入を図るためのワ-クショップを、それぞれ開催し大きな成功を収めた。また、3か年間という限られた期間内に具体的な成果と研究目的を達成するため、平成2年度では、本年度の成果を踏えた実現可能な共同研究の組織化と推進を、特に重要視した研究計画を立てて実施する。
ケテニルラジカルの分子内求核捕捉による複素環構築法の開発

複素環化学の発展に伴い、機能発現が期待される化合物の合成を指向した新しい複素環構築法の開発が求められている。本研究では、含窒素複素環化合物であるラクタム環骨格の新規な構築法に着目した。特に、ラジカル種を用いる一酸化炭素の導入法の潜在性を活用し、中間体として生成するα,β-不飽和型のアシルラジカル種の求電子性を利用した新規なラクタム環化合物の合成手法を開発することを目的とした。本研究では、アシルラジカルによる分子内イミンC-N二重結合に対するendo型の環化反応について検討を行った。実際に、一酸化炭素加圧下、トリブチルスズヒドリドをラジカルメディエータとするラジカル反応を行った。その結果、系中でα,β-不飽和型のアシルラジカルが生成し、これより、6員環ラクタムが良好な収率で得られた。また、出発基質として、オキサゾリン部位を持つアルキンを用いて、6-endo型環化反応を行ったところ、同様に、オキサゾリンの窒素上での環化が起こり、双環性ラクタムが良い収率で得られた。一般にexo型のラジカル環化反応の例が数多く報告されているのに対して、endo型が選択的に進行するラジカル環化の報告例は少ない。本研究で見出したこれらの反応例では、6-endo型環化の駆動力としてイミン窒素やオキサゾリン窒素とアシルラジカルのカルボニル炭素との極性相互作用の関与が示唆される。さらに、本反応を天然アルカロイド(R)-(-)-coniineの形式合成に適用することに成功した。特に、ラジカル種を用いる一酸化炭素の導入法の潜在性を活用し、中間体として生成するα,β-不飽和型のアシルラジカル種の効率的な分子内求核型捕捉に基づく新規なラクタム環化合物の合成手法を開発することを目的とした。ラジカル反応でありながら強い極性相互作用の支配を受ける反応例を考察し、ラジカル種の求核付加による捕捉を駆動力とする新しい環化反応を着想した。本研究では、まずアミノ基による分子内求核攻撃による新しいラクタム環構築法について検討した。ケテンはアミンによる求核付加を受けることは良く知られているが、対応するケテニルラジカルにおいても同様な求核付加反応が生起することを期待した。すなわち、α,β-不飽和アシルラジカルがα-ケテニルラジカル構造をとることを活用することにした。実際に、末端にアミノ基を有するアセチレンを用い、一酸化炭素と反応させると、α-メチレンラクタムとα-スタニルメチレンラクタムの2種類の生成物が得られた。このことは、反応系中で、α-ケテニルラジカルを発生させ、続く、アミノ基のケテン炭素への分子内求核付加が起こっていることが示唆される。また、α-メチレンラクタムの生成は、環化した後、生成した1-ヒドロキシアリルラジカルから1,4水素移動が起こり、続いて、トリブチルスズラジカルがβ-脱離して得られると考えられる。本反応の適用範囲を検討したが、5員環から8員環までのラクタム環が効率良く反応が進行した。
光質による形態形成反応を利用した園芸作物の生育制御技術の開発

人体に有害とされている硝酸イオンは,植物体内でアンモニウムイオンへと還元される。NO_3-N中断処理を行う際に人工光源による補光を行えば,急速に葉内の硝酸イオンの濃度が低下する可能性がある。本試験では,人工光源を利用した葉菜類の収量ならびに品質制御のための基礎的知見を得ることを目的として,NO_3-N中断処理後のホウレンソウの生育と硝酸イオン含有量に補光が及ぼす影響について調査した。材料および方法:試験には,ホウレンソウ品種`オ-ライ'((株)キタイ種苗)を供試した。定植後28日目からNO_3-N中断処理と補光処理を行った。NO_3-N中断処理区における補光処理は,東芝製陽光ランプ,黄色光ランプ,青色光ランプ,紫外線蛍光灯を使用した。処理開始後,植物体地上部を採取し,含有成分について調査した。結果および考察:硝酸イオン濃度は,NO_3-N中断処理後,日数が経過するにつれて減少したが,その減少の程度は補光区で大きくなる傾向を示した。処理開始後2日目に葉柄では,補光区平均の硝酸イオン濃度が無補光区の85%,葉身の場合54%となって共に無補光区との差が最も大きくなり,光源の種類によって異なる部分があるものの補光が,葉内の硝酸イオン濃度の減少を促進するように作用したことが示された。しかし,処理開始後4日目には,補光区と無補光区の差はなくなった。本試験の結果は,一時的ではあるものの夜間補光が葉内の硝酸還元酵素などの活性を高め,NO_3-N中断処理後の硝酸イオン濃度低減を促進した可能性を示唆している。しかし,葉内の硝酸イオン濃度があるレベルに達すると窒素代謝が抑制され,硝酸イオン濃度の減少が停止することも示された。今後は,この反応が光強度依存性であるか確認し,また,硝酸還元酵素の活性が補光中にどのように変化するか調査する必要がある。
情報通信技術を活用した子宮頸がん予防のヘルスリテラシー向上に関する研究

現在、我が国では子宮頸がんワクチンの積極的勧奨が国から止められており、自治体や教育委員会によるワクチン接種の啓発活動が消極的となっている。本研究は、若者のコミュニケーションツールである情報通信サービス(FacebookかTweeter, LineのSNS非公開グループか一方通行Webなど)を利用することで情報共有のコミュニティが形成され、参加者相互のインターアクションによりヘルスリテラシーが向上、ワクチン接種の行動変容につながることを科学的に検証する。
腸管上皮細胞を標的とした新規ディフェンシン・デリバリーシステムの開発

クローン病は、全消化管を侵す難治性の炎症性肉芽腫性疾患である。病因はいまだ不明のため根治的治療は確立されていないが、腸管の自然免疫と獲得免疫の破綻がクローン病の病態であると考えられている。ディフェンシンは上皮細胞や血液細胞中に含まれる抗菌ペプチドで自然免疫の主なエフェクター分子である。我々は、ヒトディフェンシンHD-5の腸管上皮へのデリバリーシステムの開発と安全性の検討を行うことを研究の目的としている。Dextran sulfatesodium(以下DSS)を投与したマウスは主に大腸に化学的障害をきたし、腸炎モデルとして用いられている。この腸炎モデルマウスを用い、ディフェンシンの抗炎症作用について検証した。7日間3%DSSを飲水投与させた腸炎モデルマウスに、HD-5,proHD-5の投与を行った。1群は2.5mg/kgのペプチドを0.01%酢酸50μ1に加えて6,8,10日目に腹腔内投与した。この投与濃度は、腸管細菌濃度から算出した。また、もう1群はカテーテルを用い、同濃度のペプチドを0日目に投与した群と、8日目に投与した群に分けて注腸した。また、病理学的検証を行うため、9日目にマウスをサクリファイスし、腸管をPBSで洗浄、10%ホルマリンで固定した。ペプチド投与群とコントロール群との生存率の比較と、病理学的な検証を行った。HD-5を投与したDSSマウスは明らかに生存率が延長した。ProHD-5投与群では明らかな生存率の延長は見られなかった。病理学的検証では、DSSにて腸管上皮は著明な炎症をきたしていたが、HD-5投与群では炎症の程度が軽減されていた。また、経口にて同濃度のHD-5,proHD-5の投与を行い、同様の検討を行ったが、コントロール群に比べて生存率の上昇は認められなかった。まず、ヒト腸管上皮細胞に対するディフェンシンのサイトカイン刺激作用を検討した。ヒト腸管上皮細胞モデルとして大腸癌細胞株SW480,HT-29,Caco2を培養し、小腸の抗菌活性の大部分を担っているヒトディフェンシンHD-5を導入した。24時間の培養後、上皮細胞のサイトカイン分泌能を抗体アレイを用いて検討した。他の大腸癌細胞株に比べHT-29においてIL-8やGROといったサイトカインの分泌が最も認められた。ELISA法によりHD-5は濃度依存性にIL-8発現を誘導し、そしてそれは6時間後に最大になることをが分かった。また、HD-5は前駆体のproHD-5として腸管上皮のPaneth細胞から分泌され、トリプシンにより活性化されるという特徴があるが、我々はこのことの生理学的意義も明らかにすることとした。まずpro-HD5の精製を行い、各種菌に対する抗菌活性を測定しHD-5と比較した。この結果、proHD-5はHD-5と同様、抗菌活性を有することを明らかとした。proHD-5,HD-5ともに腸管上皮細胞モデルである大腸癌細胞株に対しては、生理的濃度である100μg/mlまで細胞毒性は認めなかった。しかし、proHD-5にはHD-5のようなIL-8の誘導作用はなかった。IL8は炎症に最も重要なサイトカインの一種であるが、これらの実験結果から、proHD-5は活性化を受ける前から抗菌活性を保持し最近感染防御に関与し、そしてproHD-5からHD-5への活性化の過程がIL-8を介した獲得免疫機構の調節に大きく関わっていると考えられた。

ペプチド投与群とコントロール群との生存率の比較と、病理学的な検証を行った。HD-5を投与したDSSマウスは明らかに生存率が延長した。ProHD-5投与群では明らかな生存率の延長は見られなかった。病理学的検証では、DSSにて腸管上皮は著明な炎症をきたしていたが、HD-5投与群では炎症の程度が軽減されていた。また、経口にて同濃度のHD-5,proHD-5の投与を行い、同様の検討を行ったが、コントロール群に比べて生存率の上昇は認められなかった。
TIRF可視化解析による2相性インスリン分泌機構の解明

グルコース刺激による膵β細胞からのインスリン分泌は2相性を示す。この2相性インスリン分泌機構を明らかにする目的で、初代培養膵β細胞内insulinをGFP標識した標識顆粒システムと全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を組み合わせたinsulin顆粒動態の可視化解析法(TIRF imaging法)を用いて解析により以下を明らかにした。(1)分泌第1相では、形質膜上にdocking穎粒の貯蔵プールよりfusionが観察され,分泌第2相では形質膜から約500nm内部に存在する細胞質内穎粒プール貯蔵プールより形質膜へ供給された顆粒の短時間のdocking/fusionが選択的に観察された。このように2相性インスリン分泌を担っている顆粒の細胞内貯蔵プールの実態を明らかにした。(2)神経synapseのactive zone構成蛋白質(CAZ蛋白質)であるELKSが膵β細胞に存在し,insulin顆粒のdocking/fusionを調節していることを見出し、ELKSはsyntaxin1と共にinsulin顆粒のexocytosis部位を規定しており、分泌第1相のdocking/fusionを調節していることを示唆した。(3)分泌第1相におけるfusion部位はSyntaxin1A(Synt1A)の局在と一致したが、第2相ではSynt1Aとは異なる部位でfusionが観察された。そこでSynt1A欠損(Synt1AKO)マウスを作成し詳細な解析を行った。その結果、SyntlAKOβ細胞では第1相を担うpreviouslydocked granulesが激減し、そこからのfusionが見られなかったが、第2相を担うnewcomersのfusionは保たれていた。すなわち、第1相はSynt1A依存性、第2相はSynt1A非依存性であり、異なった開口放出機構により2相性分泌機構が構成されていることを明らかにした。この2相性インスリン分泌機構を明らかにする目的で、初代培養膵β細胞内insulinをGFP標識した標識顆粒システムと全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を組み合わせたinsulin顆粒動態の可視化解析法(TRF imaging法)を用いて解析を行った。(1)insulin分泌第1相では予め形質膜上にdockingしている顆粒からのfusionが見られ,分泌第2相では細胞内から新たに供給されて形質膜上にdockingした顆粒からのfusionが観察された。この分泌第1相、第2相における顆粒の細胞内部における動態を入射角可変式全反射蛍光顕微鏡(v-TIRFM)で解析したところ、細胞内部には形質膜にドッキングしている顆粒プールと形質膜から約500nm内部に存在する細胞質内プールの2つの顆粒貯蔵プールがあり、分泌第1相では前者の顆粒プールより、一方分泌第2相では後者の顆粒プールより形質膜へ供給された顆粒のfusionが観察された。このようにv-TRFMを用いて2相性インスリン分泌を担っている顆粒の細胞内貯蔵プールの実態を明らかにした。(2)神経synapseのactive zone構成蛋白質(CAZ蛋白質)であるELKSが膵β細包に存在しinsulin顆粒のdocking/fusionを調節していることを見出し、ELKSはsyntaxinlと共にinsulin顆粒のexocytosis部位を規定しており、分泌第1相のdocking/fusionを調節していることを示唆した。2型糖尿病モデルGKラットではグルコースに対するインスリン分泌不全の成因の一つにt-SNAREタンパク質の異常によるinsulin exocytosisの阻害が示唆されている。

そこで、t-SNAREタンパク質のinsulin exocytosisへの調節機構を明らかにするために、正常マウスおよびsyntaxin1A欠損マウスより膵β細胞を調製し、インスリン顆粒をGFP標識し、以下のinsulin顆粒動態可視化解析(TIRF imaging解析)を行なった。(1)分泌第1相でのインスリン顆粒fusion部位はTAT融合Cy3標識抗体を用いたTwo-color TIRF解析により、syntaxin 1Aクラスターの局在と一致したが、分泌第2相ではsyntaxin 1Aクラスターの局在とは異なる部位でfusionが観察された。(2)syntaxin 1A欠損マウスから調製したβ細胞では第1相を担うpreviouslydocked granulesが激減し、そこからのfusionが見られなかったが、第2相でのnewcomersのfusionはwild typeと同様に観察された。(3)syntaxin 1A欠損β細胞にsyntaxin 1Aをアデノウイルスを用いて発現させると、previously docked granulesの数が正常値まで回復すると共に、分泌第1相が回復した。このことから、分泌第1相ではsyntaxin 1A依存性、分泌第2相ではsyntaxin 1A非依存性であることが明らかとなった。以上の結果より第1相と第2相におけるインスリン顆粒開口放出機構は共通の分子機構ではないことが強く示唆された。グルコース刺激における細胞膜直下のCa^<2+>上昇と2相性インスリン開口放出の関係を明らかにする目的で、GFP標識したインスリンの開口放出とFura RedによるCa^<2+>イメージングの同時測定をtotal internal reflection fluorescence(TIRF)顕微鏡下で行なった。高グルコース刺激を行なった時の分泌第1相では、[ca^<2+>]_iでは急激に上昇し、それに伴って、刺激前より予めドッキングしている顆粒であるpreviouslydocked granulesからのフュージョンが主に引き起こされた。一方、分泌第2相では[Ca^<2+>]_iではゆっくりと上昇し、newcomers(細胞内貯蔵プールから供給される顆粒)からのフュージョンが主に観察された。高KCl刺激(40mM)では分泌第1相と同様に急激な[Ca^<2+>]_i上昇が観察され、previously docked granulesからのフュージョンが主に引き起こされた。一方、低KCl刺激(20 mM)では緩徐な[Ca^<2+>_i上昇が見られ、newcomersからのフュージョンが選択的に観察された。このように[Ca^<2+>]_i上昇のパターンがフュージョンする顆粒のタイプを決定していることが示唆される。このようにグルコースによって引き起こされる2相性の[Ca^<2+>]_i上昇はフュージョンする顆粒のタイプを決定し、その結果、2相性インスリン分泌が形作られていることが示唆された。
遺伝性血液疾患の病因解析

1.宮地はわが国で最初の超不安定ヘモグロビンHbToyamaを、【^3H】標識ロイシンで患者網赤血球からグロビン鎖を合成して解析し、單一アミノ酸置換部位を決めることに成功した。今井は宮地から提供されたHbHimeji、川崎医大原野ら提供のHbMitoについてヘモグロビンの酸素結合能の詳細な検討結果を報告した。2.今村はわが国でのサラセミア(ヘテロ接合)の頻度は予想外に高くて約0.1%であることを示すとともに、1例のβサラセミア症例の遺伝子解析を行い、第2イントロンの654番のシトシンがチミンに置換したために異常なmRNAが産生されることにより発症することを明らかにした。3.田中はピルビン酸キナーゼのラットL型遺伝子の全塩基配列を決定した。今後ヒトL型遺伝子の塩基配列が決められると、ピルビン酸キナーゼ欠乏による遺伝性溶血性貧血例の遺伝子レベルでの病因の解析につながるので、成果が期待される、三輪はピリミジン-5′-ヌクレオチダーゼ(P5N)異常による遺伝性溶血性貧血につき検討し、まづ正常P5Nに2種があることをクロマトグラフィーによる明確な分離で明かにし、P5N異常症ではそのうちの1つのアイソサイム(【I】型)の構造変異によることを示す成績を得た。4.中尾は赤血球から脂肪層を除いた裏打ち構造(骨格タンパク)を得る努力をし、膜をトリトン処理したのちトリトンを除去すると、生理的条件イオン強度下で、カルシウムイオンで収縮ATPで膨張する裏打ち構造を得ることに成功した。今後膜の分子構築を明らかにするうえに重要なものとして注目される。八幡は膜脂質異常が主体と考えられる高ホスファチジルコリン溶血性貧血、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)欠乏症、βリポタンパク欠乏症の脂質異常についての分析成績を報告した。わが国で高ホスファチジルコリン溶血性貧血は6家系8例の夛きにおよんでいることも明らかとなった。
キノコにおけるレクチン遺伝子の発現の調節機構の解明とその生物学的意義

1。ヒイロキチャワンタケ・レクチン(AAL)cDNAの塩基配列。AALの全塩基配列を決定した結果、AALはProをN末端とし、TrpをC末端とする312残基よりなり、Proの前にMet残基1つしかないのでシグナル配列がないこと等が明らかとなった。2。AALの蛋白質化学的性質。判明した全アミノ酸配列を解析して、AALの分子内に6回の繰り返し配列が存在することが認められた。円偏光二色性スペクトルの測定から、AALの二次構造としてαーヘリックス、βーシ-トの含有量はきわめて少ないことが認められた。3。AALの結晶化と解析。AALの結晶化に取り組み、六方両錐体の結晶を得た。X線回析を行ない、結晶の諸定数を決定した。4。子実体形成過程におけるAALの出現。子実体から再生させた菌糸と野生の子実体から粗抽出液を調製し、レクチン活性を調べたところ、菌糸では全く活性が見られず、子実体で活性が認められた。オクテロニ-法で調べると、子実体の抽出液だけが沈降線を形成した。mRNAを検出したところ、やはり菌糸には認められなかった。これらのことは、レクチンの遺伝子発現は子実体形成と関連していることをうかがわせる。5。AAL遺伝子の存在形態。菌糸および子実体の双方から抽出・精製した高分子DNAについてサザン・ハイブリダイゼ-ションを行なったところ、子実体には陽性のバンドが認められたが菌糸では認められなかった。このことは、菌糸の染色体DNAにはAAL遺伝子は存在しない事を示している。菌糸におけるAAL遺伝子の存在形態について検討している。1。2。3。4。5。1。子襄菌ヒイロチャワンタケのレクチン[Aleuria aurantia Lectin (AAL)]についてAALについては既にcDNAを得、大腸菌で発現に成功している[FEBS Let.250.153(1989)]。そこでAALcDNAの塩基配列を決定した[J.Biochem.,107,190(1990)]。更に大量に得られたAALより結晶を得て高次構造の解明を可能にすると共に、AALの蛋白質化学的性質を明らかにした[BBA,1076,187(1991)]。一方A・aurantiaでは、菌糸にはレクチンはほとんど存在せず、子実体を形体して初めて遺伝子が発現されることを、血球凝集反応による活性レベル、イムノ・ブロッティングによる蛋白質レベル、cDNAをプロ-ブとするmRNAのレベルで明らかにした。さらにAALcDNAをプロ-ブとするレクチン遺伝子の解析を行なったところ、菌糸と子実体ではAAL遺伝子の存在状態に違いがあることが示唆され、これが遺伝子発現の違いを反映している可能性が示された[農化誌、65、272(1991)]。2。担子菌タモギタケのレクチン[Pleurotus cornucopiae Lectin(PCL)]についてPCLについては、まずレクチンの精製・単離を行ない、レクチンを単一にまで精製した。このレクチンは分子量16、000のサブユニットの4量体として存在しており、その血球凝集活性は単糖では阻害されないが、ムチンによって強く阻害それる。またこのレクチンも子実体の形成と共に出現することが示された[投稿準備中]。またタモギタケにはレクチンを含まない株が存在することを発見し、その株にはレクチンに類似した蛋白質の含まれていることを明らかにした[農化誌、65、272(1991)]。1。ヒイロチャワンタケ・レクチン(AAL)cDNAの塩基配列。

AALの全塩基配列を決定した結果、AALはProをN末端とし、TrpをC末端とする312残基よりなり、Proの前にMet残基1つしかないのでシグナル配列がないこと等が明らかとなった。2。AALの蛋白質化学的性質。判明した全アミノ酸配列を解析して、AALの分子内に6回の繰り仮し配列が存在することが認められた。円偏光二色性スペクトルの測定から、AALの二次構造としてαーヘリックス、βーシ-トの含有量はきわめて少ないことが認められた。3。AALの結晶化と解析。AALの結晶化に取り組み、六方両錐体の結晶を得た。X線回折を行ない、結晶の諸定数を決定した。4。子実体形成過程におけるAALの出現。子実体から再生させた菌糸と野生の子実体から粗抽出液を調製し、レクチン活性を調べたところ、菌糸では全く活性が見られず、子実体で活性が認められた。オクテロニ-法で調べると、子実体の抽出液だけが沈降線を形成した。mRNAを検出したところ、やはり菌糸には認められなかった。これらのことは、レクチンの遺伝子発現は子実体形成と関連していることをうかがわせる。5。AAL遺伝子の存在形態。菌糸および子実体の双方から抽出・精製した高分子DNAについてサザン・ハイブリダイゼ-ションを行なったところ、子実体には陽性のバンドが認められたが菌糸では認められなかった。このことは、菌糸の染色体DNAにはAAL遺伝子は存在しない事を示している。菌糸におけるAAL遺伝子の存在形態について検討している。
リズム運動に関与する交叉性脊髄介在ニューロンの発達

胎生後期のラット脊髄摘出標本へのセロトニンの投与によって腰髄前根に歩行運動様のリズミックな発射活動を誘発することができる。このようなセロトニンによって誘発されるリズムは出生一週間前の胎生15.5日には左右で同期したパタンをとるが、胎生18.5日には新生仔期と同様の左右交代性のパタンに変化する。前年度の研究によって、左右のリズムが同期している時期において、すでに交叉性ニューロンがリズム形成回路網の左右の結合を担っていることが示された。しかしながら、発達期の左右のパタンの変化がどのようなメカニズムによって起こるのかは明らかになっていない。今回我々は、同期したリズムが見られる胎生15.5日の標本を用いて、正中部で灌流槽を二分し、片側のリズム形成回路網から対側運動ニューロン群への入力について調べた。片側脊髄にセロトニンを灌流投与したところ、投与側と同期したリズムが対側前根にも誘発された。また、片側灌流槽へのCa^<2+>を除去した状態での薬物投与により、個々の交叉性ニューロンを直接興奮させたところ、対側前根にセロトニン投与時と同様のリズム活動が誘発された。これらの結果から、片側脊髄のリズム形成回路網は交叉性ニューロンを介して対側の運動ニューロンに興奮性に結合していることが示唆された。さらに、対側のリズムは対側脊髄へのビククリンやストリキニンの投与によって抑制されたことから、交叉性の興奮性シナプス入力はGABA_A受容体およびグリシン受容体を介していることが示唆された。
軟質粒子と硬質粒子を複合析出させたハイブリッド鋼の創製

前年度までに、軟質Cu粒子と硬質炭化物粒子を複合分散させたモデル合金を作製し、ハイブリッド化の有効性を証明することができ、実際に汎用の共析鋼(Fe-0.8%C)にCuを添加した材料の創製に成功した。本年度では、ハイブリッド鋼の強化理論の確立を目的とした。ハイブリッド鋼の強化理論の確立のためには、それぞれの粒子が単独で存在する材料での強化理論の把握が必要である。降伏強度に関しては、過去に多くの検討がなされており、加工硬化に関しても、硬質粒子が分散した材料においては多くの報告があるが、軟質粒子が分散した材料の加工硬化理論は十分な検討がなされていなかった。そこで、本研究では、まず軟質粒子分散鋼の加工硬化理論の確立を行うため、様々な分散状態の軟質Cu粒子分散フェライト鋼の引張変形挙動および転位密度変化を系統的に調査した。その結果、従来の硬質粒子で適用されている加工硬化理論に対して、粒子自身が塑性変形することを考慮することで、軟質粒子が分散した材料の加工硬化を定量的に評価することができることを明らかにした。この結果を踏まえ、次いで、フェライト基地中に硬質VC粒子と軟質Cu粒子を複合析出させたハイブリッド鋼を創製し、引張試験を行うことで、ハイブリッド鋼の強化機構を検討した。その結果、降伏強度については、両粒子による強化量の加算では説明できず、各粒子の分散状態を総合的に評価することが必要であることがわかった。また、加工硬化については、単独状態での加工硬化理論から求められる転位密度を加算することで定量化が可能であることを明らかにした。申請者はこれまで軟質Cu粒子と硬質炭化物粒子がそれぞれ単独で分散した材料において、これら両粒子が機械的性質に及ぼす影響の相違について報告してきた。本研究では、これら軟質Cu粒子と硬質炭化物粒子を複合分散させたハイブリッド鋼の創製を目的としており、平成21年度は、(1)ハイブリッド化の有効性の検討、(2)パーライト型ハイブリッド鋼の創製を行った。(1)フェライト母相中に同程度の粒子径の軟質Cu粒子と硬質炭化物粒子が同時に分散するように合金設計した鋼を作製し、機械的性質を調査した。そして、それぞれの粒子を単独分散させた試料の機械的性質と比較した。降伏強度と引張強度に関しては、単独分散鋼と比較して著しく強化されており、その強化量は加算的であった。一方、加工硬化率は硬質粒子分散鋼と同様に大きな値を示しており、延性も大きく低下していなかった。すなわち、軟質Cu粒子と硬質粒子を同時に分散させることができれば、高強度、高加工硬化率、高延性を有した材料を創製することが可能であることが明らかとなった。(2)上記の結果を踏まえて、共析鋼(Fe-0.8%C)にCuを添加した材料を作製し、溶体化処理後共析変態処理することで、パーライト組織中のセメンタイトとは独立にナノCu粒子を析出させた。この材料について機械的性質を調査したところ、通常のパーライト鋼の強度と比べて大きく降伏強度・引張強度ともに増加しており、その強化量は上記と同様に加算的であり、加工硬化率も汎用パーライト鋼と同等であった。また、本鋼を伸線加工したところ、従来のピアノ線の強度を上回る超高強度ハイブリッドピアノ線が得られた。この結果より、ハイブリッド鋼が実用的にも有効であることが明らかとなった。
洞房結節細胞のCav1.3-TRPM4機能連関と持続性内向き電流の分子機構の解明

心臓の拍動リズムはわずかに存在するペースメメーカーの自発的な電気的興奮による。本プロジェクトは、この電気活動を生み出す重要な膜電流、持続性内向き電流(Ist)の分子機構を明らかにすることを目的としている。従来、Istはナトリウム電流であると考えられている。しかしながら、最近我々は、L型カルシウムチャネル(LTCC)がIstの発生に不可欠であることを明らかにする一方、LTCCがナトリウム電流を発生する仕組みを明らかにする必要が出てきた。これまでに、カルシウム蛍光測光とパッチクランプ法を用いて、細胞内カルシウムイオンの動態とIstの関連、また種々の薬剤に対するIstの応答を検討してきた結果、細胞内カルシウム依存性活性化を示すTRPM4チャネルがLTCCと機能的に連関しIstを発生させる可能性が示唆された。今年度は、本仮説を直接的に検証する目的で、TRPM4遺伝子欠損マウスを用いた実験を遂行した。TRPM4遺伝子欠損マウスは、フランスのCNRS, InsermならびにMontpellier大学の研究協力者から入手し、実験はフランスに赴いて行なった。TRPM4マウスの心臓ペースメーカー領域である洞房結節から細胞を単離し、ホールセルパッチクランプ法によりIstの有無を検討した。結果、TRPM4遺伝子欠損マウスにおいてもLTCC遮断薬に感受性を示すナトリウム電流、すなわちIstが明確に記録された。また、その電流密度も野生型マウスの記録ととほとんど差がないことが明らかとなった。以上の結果より、TRPM4はIstの発生に関与しないと考えられた。この研究成果は、FAOPS2019(第96回日本生理学会)で報告した。本プロジェクトにおいて最も重要な実験であるノックアウトマウスを用いた検討を遂行することができた。結果は期待に反するものではあったが、次のステップに進む重要な手がかりとなった。TRPM4の関わりはないものの、Istと細胞内Ca動態との間に強い相関が見られている。この点に着目し、細胞内Caにより制御される他のチャネルや起電性トランスポーターの関与を検討してみる。また、IstがL型CaチャネルのCa/Naの透過性で説明できるか検討を行う予定である。心臓の洞房結節細胞で記録される持続性内向きNa電流(Ist)は、心拍リズムの形成に寄与すると考えられているが、この電流の発生に関わる分子メカニズムは明らかでない。これまでの研究で、L型Caチャネル(Cav1.3)がIstの誘発に関与すること判明しているが、CaチャネルがどのようにしてNa電流を発生するかは依然として不明である。本研究では、洞房結節細胞においてCav1.3とCa活性化型NaチャネルであるTRPM4が機能的に連関する可能性を検討する。今年度は、パッチクランプ装置を共焦点顕微鏡と組み合わせた実験システムを構築し、Istと細胞内Ca動態の同時測定を遂行した。Ca蛍光指示薬を導入した単一の洞房結節細胞に脱分極刺激を与えると、Istが活性化するとともに、細胞内Ca濃度の持続的な上昇が認められた。Istと細胞内Ca濃度の変化は、膜電位依存性がほぼ一致し、いずれもCaチャネル遮断薬で抑制された。しかしながら、細胞外のCa濃度の減少は、Istの大きさに影響を与えなかったが、細胞内Ca濃度は大きく減少した。これらの結果から、細胞内Caが少なくとも部分的にはIstの発生に関与する可能性が考えられた。さらに、本年度、フランスに渡り、INSERMのDemion博士からTRPM4ノックアウトマウスを用いた共同研究の打ち合わせを行なった。今後、当該マウスを用いてIstとTRPM4の関係を直接的に検討する予定である。当初の計画通り、今年度は、パッチクランプ装置を共焦点顕微鏡と組み合わせた実験システムを構築し、膜電流と細胞内Ca動態を同時測定できるようになった。本年度は、共焦点顕微鏡の移設を伴う学内の改修工事があり、少なからず実験の進捗に影響があったが、実験データも十分に集まりつつあり、おおむね順調に進展している。

この研究成果は、FAOPS2019(第96回日本生理学会)で報告した。本プロジェクトにおいて最も重要な実験であるノックアウトマウスを用いた検討を遂行することができた。結果は期待に反するものではあったが、次のステップに進む重要な手がかりとなった。本年度、確立した膜電流と細胞内Ca動態の同時測定を引き続き行い、IstとTRPM4チャネルの関連を検討していく。とくに、細胞内の局所のCaを精度良く測定できる方法の開発につとめ、Istの活性化に関与するCa画分を明らかにしたい。さらに、フランス、INSERMのDemion博士、ならびにCNRSのMangoni博士との共同研究を推し進め、TRPM4ノックアウトマウスを用いてIstとTRPM4の関係を直接的に検証していきたい。TRPM4の関わりはないものの、Istと細胞内Ca動態との間に強い相関が見られている。この点に着目し、細胞内Caにより制御される他のチャネルや起電性トランスポーターの関与を検討してみる。また、IstがL型CaチャネルのCa/Naの透過性で説明できるか検討を行う予定である。大学の改修工事で本研究で使用している実験装置(共焦点顕微鏡)の移設があり、実験の進捗に少なからず影響があった。それにともない、研究費の使用ペースも遅延した。プロジェクトの進行そのものは概ね順調に進行しているが、本年度に購入予定であったパッチクランプ実験装置の消耗品の一部の選定に時間がかかり、来年度に導入が持ち越されたため次年度使用額が生じている。
核酸医薬のデリバリーの為の高分子ミセル型ナノキャリアの開発

siRNAは、標的遺伝子を特異的かつ効率的にノックダウンできることから、がん治療分野への応用が期待されているが、そのためにはsiRNAを患部まで送達し、標的細胞内で効率的に機能発現させることのできる運搬体の開発が必要不可欠である。このような背景において、当研究室では、これまでにアニオン性のsiRNAとカチオン性ブロック共重合体の静電相互作用に基づいて形成される高分子ミセル型siRNAキャリアについて研究を行ってきた。そこで本研究では、以下の2つの項目について検討を行う。(1)ポリエチレングリコール(PEG)-ポリリシン(PLys)の側鎖にアミジン基(核酸と強い親和性を示す)とチオール基(ミセル内でジスルフィド架橋を形成させる)を同時に導入し、siRNAとの間で安定なミセル型構造体を形成させる。(2)PEGの末端にがん細胞や血管内皮細胞を特異的に認識するペプチドリガンド(環状RGD)を導入し、site-specific siRNAデリバリーを目指す。本年度は、(2)の調製された架橋ミセルヘのリガンド導入とその機能評価に焦点を当てて研究を遂行した。培養細胞(Hela)の共焦点顕微鏡観察によりリガンド効果を確認したところ、リガンドなしミセルは細胞膜周辺に留まっている画像が観察されたのに対し、リガンドありミセルは細胞質(各周辺部)に速やかに集積する画像が得られた。このことから、リガンドミセルは細胞表面のレセプターを認識し、積極的に標的細胞へと取り込まれたものと考察される。さらに、架橋導入率95%のリガンドミセルは、肺転移がんモデルマウスの腫瘍組織の遺伝子発現(ルシフェラーゼ)を抑制する効果が見られた。このことから、リガンドと架橋を組み合わせたsiRNAミセルを調製することにより、効率よく腫瘍にsiRNAを導入可能なキャリアの開発が可能であることが示唆された。本年度は、まず(1)についての検討を行った。分子量12,000のPEGと分子量8,000のPLysの側鎖にトラウト試薬によりアミジン基とチオール基を導入し、siRNA内包架橋型高分子ミセルを形成させたところ、架橋無しのミセルは生理条件下で容易に解離してしまうのに対し、架橋型ミセルは解離しなかった。そして、培養細胞に対してRNAi効果を確認したところ、架橋なしミセルではほとんど効果が見られなかったのに対し、架橋ミセルでは大きな効果が見られた。さらに、架橋導入率の増大とともにミセルの血中滞留性が増層加し、架橋導入率90%近いミセルサンプルは、マウスの皮下腫瘍に対して制がん活性が確認された。今後は制がん活性条件の最適化とともに(2)の環状RGDを導入した系の確立を目指す。
林木の水分特性と耐乾性に関する生理生態学的研究

前年にひき続き、アカマツ、スギ、ハイネズ、アラカシ、ケヤキ、花棒、〓条、楊柴、樟子松をガラス室内の川砂とバーミキュライトを入れたコンクリートベッドやワグナーポットまたは野外で育てた。ポットで生育させた苗木は土壌を乾燥状態(含水率70%)から適潤状態(220%)までの4段階に調節して育てた。これら各樹種についてガラス室内と野外で生長経過を定期的に測定するとともに、光合成速度、呼吸量、蒸散量などの測定を行った。また、全国各地にできるだけ出向き、それぞれの地域に生育している樹木を対象にして各然の調査、測定を行った。どの樹種でも伸長生長、直径生長とも土壌が乾燥するほど少なくなった。スギ、アラカシでは最も乾燥した処理区ではほとんど伸長生長は認められなかったが、乾燥に強いと考えよれる〓条、アカマツではそうした乾燥による抑制は少なかった。蒸散量は湿潤な処理ほど多くなった。とくに7月頃までのケヤキで処理間の違いが著しかったが、〓条では処理による違いは僅かであった。乾燥地帯に生育する〓条の蒸散量はアカマツの810倍、ケヤキの23倍であった。最も乾燥した処理(含水率70%)のものに十分に灌水をして蒸散速度を測定してみると、最大の蒸散速度は、灌水直後(含水率220%)ではなく120180%の土壌水分条件になったときに起こり、慢性的な水ストレスが植物の水分特性に影響をおよぼしていることが示唆された。PーV曲線法でアカマツとケヤキの葉の水分特性を調べたところ、ケヤキでは処理間に特性の違いが認められたが、アカマツでは認められなかった。夏に光合成速度と気孔コンダクタンスを測定したところ、土壌含水率が20%まで低下するとどの樹種でも処理にかかわらず光合成を停止した。乾燥した土壌になるほど気孔コンダクタンスと光合成速度の関係は強くなった。乾葉1g当りの光合成速度と光飽和点の関係は樹種間で差が認められなかった。アカマツ,スギ,ハイネズ,アラカシ,ケヤキのほか,中国産の乾燥地帯に生育しているカボウ,ニンジョウ,ヤンサイ,モンゴルマツ苗木を農学部ガラス室内のコンクリートベッド(1×2m)6個と5万分の1ワグナーポット200個に定植して育てた.用土は川砂とバーミキライトを用いた.土壌中の水分を乾燥状態から適潤状態まで種々の段階に調節し,各樹種について個体の生長経過を定期的に測定した.同時に,定期的に光合成量,呼吸量,蒸散量,樹液流速度,木部圧ポテンジャルなどの測定も行った.これとは別に野外の自然条件下でも各樹種を生育させ,定期的に各種の生育調査を行った野外の自然条件下でも各樹種を生育させ,定期的に各種の生育調査を行った.また,全国各地にできるだけ出向き,それぞれの地域に生育している樹木を対象にして各種の調査,測定も行ッた.土壌水分の調整は,ポットに植栽しているものについてはポットの重量を測定することにより,また,ベッドに植栽しているものについては1日あたりのかん水量をちがえることによって行った.スギ,アカマツでは土壌含水率のちがいによる生長差(乾重)は8月以降に現れたが,アラカシ,ケヤキでは7月頃から現れた.中国産の樹種はいずれも種子から発芽させたものであるため,今のところ目立ったちがいは認められない状態である.また,各樹種について,米国ライカ社製光合成蒸散測定装置によって光合成特性を調べた結果,土壌のPF価が4を越えると光合成速度の急激な低下がみられたり,光合成速度の日変化にちがいが認められるなど,水ストレスはどの樹種での光合成能力に影響をおよぼした.中国産のどの樹種も,アラカシやアカマツにくらべて光合成速度は速かった.このほか,水ストレスとPーV曲線の形との関係や樹液流速度,蒸散量,呼吸量などとの関係についても種々調査した.来年度もさらに詳しく調査を行い,林木の水分特性と耐乾性に関する研究を格段に進展させる予定である.前年にひき続き、アカマツ、スギ、ハイネズ、アラカシ、ケヤキ、花棒、〓条、楊柴、樟子松をガラス室内の川砂とバーミキュライトを入れたコンクリートベッドやワグナーポットまたは野外で育てた。

最も乾燥した処理(含水率70%)のものに十分に灌水をして蒸散速度を測定してみると、最大の蒸散速度は、灌水直後(含水率220%)ではなく120180%の土壌水分条件になったときに起こり、慢性的な水ストレスが植物の水分特性に影響をおよぼしていることが示唆された。PーV曲線法でアカマツとケヤキの葉の水分特性を調べたところ、ケヤキでは処理間に特性の違いが認められたが、アカマツでは認められなかった。夏に光合成速度と気孔コンダクタンスを測定したところ、土壌含水率が20%まで低下するとどの樹種でも処理にかかわらず光合成を停止した。乾燥した土壌になるほど気孔コンダクタンスと光合成速度の関係は強くなった。乾葉1g当りの光合成速度と光飽和点の関係は樹種間で差が認められなかった。
核磁気共鳴法を用いた運動性の解析によるリゾチームのアミロイド線維形成機構の解明

第一に、T4リゾチームのフォールディング反応を詳細に解析し、これまでの報告とは異なり、律速となる遷移状態の前に中間体は存在しないことを示した。一方、律速段階の後には中間体が一つ存在することを示し、その立体構造と運動性をNMRを用いて明らかにした。さらに20種類の変異体を作成し、野生型との安定性及びフォールディング速度の比較から、遷移状態の構造を明らかにした。以上の結果をまとめ、「Journal of Molecular Biology」誌に二本の論文として発表した。第二に、ヌクレオソームの構造とダイナミックスを、試験管内再構成系を用いて解析した。ショウジョウバエ由来の4種類のピストン(H2A, H2B, H3, H4)と、ヌクレオソーム局在化配列を12個タンデムに含む二本鎖DNAから、ヌクレオソームアレイを試験管内で再構成する実験系を確立した。再構成したヌクレオソームアレイが低濃度のMgCl_2の添加に伴い、さらにコンパクトに折れたたまった30nmクロマチン繊維を形成することを明らかにした。ピストンH2AがそのバリアントであるHtzに置換されることにより、ヌクレオソーム及び30nmクロマチン繊維の安定性が大きく変化することを見出した。ヌクレオソームを構成する(H2A-H2B)二量体、(H3-H4)_2四量体の解離について検討した。また、5SrRNA由来の146塩基対のDNAとピストン八量体から、モノヌクレオソームを再構成し、良質な結晶を得た。ヒトリゾチームのアミロイド線維形成の分子機構を明らかにすることを目的として、大腸菌によるリゾチームの大量発現系の構築、精製方法の確立、NMR測定に必要な^<13>C、^<15>N標識体の発現及び精製、測定条件の最適化、そしてシグナルの帰属のために必要な各種NMRスペクトルの測定を試みた。枯草菌由来細胞壁溶解酵素CwlCの細胞壁結合ドメイン(CwlCr)は、一次配列中に同一のアミノ酸配列を2回有する特徴的なリピート構造をしている。これまでの研究から、この繰り返し配列を入れ替えた変異体も、野生型とほぼ同様の立体構造を維持することが示唆されている。しかしながら、その構造安定性は野生型に比べ大きく低下している。そこで、CwlCrの構造安定性の分子機構を明らかにすることを目的として、繰り返し配列を入れ替えた変異体の立体構造をNMRによって決定し、野生型との詳細な比較を行うことにした。まず、大腸菌による発現系を用いて^<15>N標識体、^<13>C/^<15>N標識体の発現、精製を行った。得られた試料を用いて様々な条件下でNMRスペクトルを測定し、構造決定の条件の最適化を行った。得られたスペクトルはいずれもシグナルの分離が大変良く、構造決定が十分に可能であること、繰り返し配列を入れ替えても立体構造が大きく影響されないことを強く示唆するものであった。今後の構造解析に向けて、主鎖及び側鎖の帰属に必要な様々な多次元NMRスペクトルを測定し、それらの解析を行った。第一に、枯草菌由来の細胞壁溶解酵素Cwlcrについて、2つの繰り返し配列を置換した変異体の立体構造をNMRによって決定した。また、野生型と変異体の安定性の比較を行った。その結果、置換に伴い構造はほとんど変わらないが、安定性は大きく低下することを明らかにした。第二にT4リゾチームのフォールディング反応を解析し、以下のことを明らかにした。律速段階となる遷移状態の前に、安定な中間体が存在しないことを実験的に証明した。これは、以前に報告された結論と異なるものであり、これまで信じられてきた考えが間違っていることを明確に証明する結果である。一方、律速段階となる遷移状態の後には、少なくとも2種類の中間体が存在することを明らかにした。その一つについては、NMRによって立体構造を決定し、主鎖の運動性の解析を行った。その結果、天然状態と比較して、主鎖のトポロジーは同じであるが、側鎖のパッキングに大きな違いがあることが明らかになった。もう一つの中間体についても、フォールドしている部位、アンフォールドしている部位を、アミノ酸残基のレベルで明らかにした。さらに、20種類の変異体を作成し速度論的解析(Φ値解析)を行い、遷移状態の構造を明らかにした。また、この解析から遷移状態が変性剤の濃度に伴い移動することが明らかになった。リゾチームのフォールディングでは、低変性剤濃度下でフォールディング速度が予想値より小さくなる現象(ロールオーバー)がみられるが、このことはロールオーバーが中間体の存在ではなく、遷移状態の移動によるものであることを示している。

ショウジョウバエ由来の4種類のピストン(H2A, H2B, H3, H4)と、ヌクレオソーム局在化配列を12個タンデムに含む二本鎖DNAから、ヌクレオソームアレイを試験管内で再構成する実験系を確立した。再構成したヌクレオソームアレイが低濃度のMgCl_2の添加に伴い、さらにコンパクトに折れたたまった30nmクロマチン繊維を形成することを明らかにした。ピストンH2AがそのバリアントであるHtzに置換されることにより、ヌクレオソーム及び30nmクロマチン繊維の安定性が大きく変化することを見出した。ヌクレオソームを構成する(H2A-H2B)二量体、(H3-H4)_2四量体の解離について検討した。また、5SrRNA由来の146塩基対のDNAとピストン八量体から、モノヌクレオソームを再構成し、良質な結晶を得た。