hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メディシナルフラワーを素材とした潰瘍性大腸炎治療物質の開発

本研究では、メディシナルフラワー(薬用花)を素材とし潰瘍性大腸炎に対して有効と判断される化合物の開発を目的とした。本研究成果として、キンモクセイ花部、サザンカ花部、アッサム種茶花、ワスレグサ花部(金針花)、ボタン花部、シャクヤク花部およびラン科デンファレ花部などの薬用花から150種類以上の化合物を単離した。その中で特に、トリテルペン類やカフェ酸誘導体に有意な好中球様細胞における脱顆粒抑制作用あるいは一酸化窒素産生抑制作用が認められ、それらの構造と活性に関する知見を得た。また、トリテルペン誘導体maslinic acidについて、一部作用機序について明らかにすることができた。本研究では、応募者の研究室で保有している植物資源ライブラリーの中からメディシナルフラワー(薬用花)を厳選・探索資源とし、ヒト急性前骨髄性白血病(HL-60)細胞由来の好中球様細胞における脱顆粒抑制作用や遊走能抑制作用など主に好中球様細胞を用いた評価系により潰瘍性大腸炎に対して有効と判断される成分の探索を行う。また、発見した活性成分から活性発現の必須構造などの構造と活性相関を解析するとともに作用メカニズムの解析を行い潰瘍性大腸炎の治療薬としての候補物質を提案することを目的とする。今年度は,キンモクセイ(Osmanthus fragrans var. aurantiacus)花部から数種の新規成分を含むトリテルペン、メガスチグマンなど計73種の成分を単離した。得られた成分について、好中球様細胞におけるfMLP刺激下のβ-hexosaminidase遊離抑制作用(脱顆粒抑制)作用を検討したところ,トリテルペン類[arujunolic acid、maslinicacid、dammarolic acid、3-O-trans-caffeoyltormentic acid]が有意な抑制作用を示すことを見出すとともに構造と活性に関する知見が得られた。また、得られたトリテルペン類は一酸化窒素産生抑制活性を示すことが明らかになった.一方、イランイランノキ(Cananga odorata)花部から新規セスキテルペン類を、金針花daylily (Hemerocallis fulva var. kwanso、H. flava、H. minor花部)から希な構造であるピロール環を有する新規グルタミン誘導体を単離,構造決定した。さらに、アッサム種茶花、ボタン花部およびシャクヤク花部から新規トリテルペン配糖体、モノテルペン配糖体などを単離した。本研究では、植物資源ライブラリーの中からメディシナルフラワー(薬用花)を厳選・探索資源とし、ヒト急性前骨髄性白血病(HL-60)細胞由来の好中球様細胞における脱顆粒抑制作用など主に好中球様細胞を用いた評価系により潰瘍性大腸炎に対して有効と判断される成分の探索を行う。また、発見した活性成分から化学修飾した誘導体や関連化合物の活性を比較検討し、活性発現の必須構造などの構造と活性相関を解析するとともに作用メカニズムの解析を行い潰瘍性大腸炎の治療薬としての候補物質を提案することを目的とする。数種のメディシナルフラワーのエキスが、ヒト急性前骨髄性白血病(HL-60)細胞由来の好中球様細胞における脱顆粒抑制作用およびNO産生抑制作用を示すことなどを見出した。また、キンモクセイ(Osmanthus fragrans var. aurantiacus)花部から得られたモノテルペンを有する新規クマル酸成分を基盤とし、種々の桂皮酸誘導体を合成した。さらに、カテコール構造を有する桂皮酸誘導体などに有意なNO産生抑制作用を見出すとともに構造活性相関に関する知見を得た。金針花、デンファレ花部およびヘンナ花部などのメディシナルフラワーから様々な成分を単離することができた。以上から、平成27年度の当初計画はおおむね順調に進展しているといえる。本研究では、メディシナルフラワー(薬用花)を探索資源とし、ヒト急性前骨髄性白血病(HL-60)細胞由来の好中球様細胞における脱顆粒抑制作用など主に好中球様細胞を用いた評価系により潰瘍性大腸炎に対して有効と判断される成分の探索を行う。また、活性成分から関連化合物を合成しそれらの活性比較を行い、構造活性相関を解析するとともに作用メカニズムの解析を行い潰瘍性大腸炎の治療薬としての候補物質を提案することを目的とする。今年度は、チャ花部のトリテルペン配糖体分画から脱配糖体化を進めアシル化トリテルペンへと導き、それらを用い誘導体合成を行うとともに昨年度に引き続きキンモクセイ花部からトリテルペン成分を単離し、トリテルペン誘導体に関して好中球様細胞の脱顆粒抑制作用の検討を行った。その結果、トリテルペン骨格の23位に水酸基が存在すると活性が増強することや6位の水酸基の存在は活性を減弱させることなど構造活性相関に関する知見を得ることができた。また、活性化合物であるトリテルペンmaslinic acidのシグナル伝達に及ぼす作用を検討したところ、10ー30μMの前処置において、p38 MAPKのリン酸化抑制およびERK1/2のリン酸化抑制が認められその作用機序にp38 MAPKおよびERK1/2までの系のリン酸化抑制が一部関与していることが示唆させた。さらに、maslinic acidなどを主要成分とするムラサキフトモモ種子の抽出エキスにマウス耳介におけるPMA誘発ミエロペルオキシダーゼ活性上昇および浮腫に対する抑制作用を認められた。

加えて、昨年度に引き続いてキンモクセイ花部からクマル酸成分、サザンカ花部、椿花部、ボタン花部、シャクヤク花部などからアシル化フラボノール配糖体を単離するとともに桂皮酸誘導体合成を行い一酸化窒素産生抑制作用に対する構造活性相関に対する知見を得た。本研究では、メディシナルフラワー(薬用花)を素材とし潰瘍性大腸炎に対して有効と判断される化合物の開発を目的とした。本研究成果として、キンモクセイ花部、サザンカ花部、アッサム種茶花、ワスレグサ花部(金針花)、ボタン花部、シャクヤク花部およびラン科デンファレ花部などの薬用花から150種類以上の化合物を単離した。その中で特に、トリテルペン類やカフェ酸誘導体に有意な好中球様細胞における脱顆粒抑制作用あるいは一酸化窒素産生抑制作用が認められ、それらの構造と活性に関する知見を得た。また、トリテルペン誘導体maslinic acidについて、一部作用機序について明らかにすることができた。応募者の研究室で保有している数種のメディシナルフラワーのエキスが、ヒト急性前骨髄性白血病(HL-60)細胞由来の好中球様細胞における脱顆粒抑制作用を示すことなどを見出した。また、キンモクセイ(Osmanthus fragrans var. aurantiacus)花部から得られたトリテルペン類が好中球様細胞におけるfMLP刺激下のβ-hexosaminidase遊離抑制作用(脱顆粒抑制)作用を示すことを明らかにするとともに構造活性相関について有用な知見を得ることができた。また、数種のメディシナルフラワーから多様な成分を単離することができた。以上から、平成26年度の当初計画はおおむね順調に進展しているといえる。メディシナルフラワーを素材として用い、引き続き活性成分の探索を継続して実施する。また、平成26年度および27年度に得られた有用な成分であるトリテルペン類[arujunolic acid、maslinic acidなど]、カテコール構造を有する桂皮酸誘導体およびアシル化フラボノール配糖体の化学誘導体をさらに進め、有望な化合物を開発する。また、金針花、デンファレ花部およびヘンナ花部などから得られた種々の成分について活性評価を行う。強力な作用を示した化合物について、in vivo試験を検討するともに関連遺伝子発現や情報伝達系への影響の検討や標的タンパク質の解明研究を行う。天然物化学、生薬学平成26年度に絞り込んだメディシナルフラワーを素材として用い、引き続き活性成分の探索を継続して実施する。また、平成26年度に得られた成分については、活性を評価するとともに活性成分の化学誘導などを行い構造活性相関の解明を進め、より有効な物質の開発を行う。また、有望な成分およびその誘導体については、作用メカニズムの解明研究を進める。
鉄筋拘束条件下にある高強度コンクリート中の構造欠陥の検証

高強度コンクリートは,硬化体の密度が高く乾燥収縮量が小さい反面,自己の水和に基づく内部乾燥によって自己収縮することが知られている。この自己収縮に起因して,微細なひび割れが鉄筋による拘束条件によって鉄筋周辺に生じる可能性があり,もし,この微細なひび割れが存在すれば,付着の劣化による構造挙動の変化,かぶり厚さの低減による耐久性の劣化が懸念される。昨年度は,高強度コンクリートの自己収縮に起因する微細なひび割れが発生するかどうかを,溝切り鉄筋を埋設し,材齢1日より,着色アルコールを溝に流し,ひび割れ発生を検証する法を開発し,実際にひびわれが鉄筋周囲にひびわれが入ることが明らかとなった。本年度は,鉄筋拘束供試体の鉄筋ひずみを検証対象として,増分型3次元クリープ解析を行ったところ,鉄筋ひずみは想定される小さくなった。つまり,ひびわれを想定しないで生じる理想状態の応力と実際の応力では大きな隔たりが生じることが解析的に明らかになった。そこで,この原因が鉄筋周囲のひび割れ発生に基づく付着の劣化によるものであると仮定し,水和継続中の部位のひびわれを既往の破壊エネルギーを用いた有限要素スメアードひび割れモデルの概念を発展させ,時間依存性ひび割れモデルとして提案した。このモデルを用いて,様々な鉄筋比の試験帯を用いて検証したところ良い一致を見た。本モデルは,過去に生じた最大ひび割れ幅と引張強度の進展に依存して,ひび割れた部位であっても剛性が水和によって進展するというモデルである。付着の影響とひびわれの影響がいまだ混在しているモデルではあるが,鉄筋周囲のコンクリート要素という適用範囲を考えれば,十分に実用的なモデルであると考えられる。本年は,高強度コンクリートの自己収縮に起因する微細なひび割れが発生するかどうかを,溝切り鉄筋を埋設し,材齢1日より,着色アルコールを溝に流すことで検証を行う手法をまず,開発した。この手法によれば,水和過程中にコンクリートが微細なひび割れが生じた場合には,負圧によってアルコールがひび割れ部に浸透する手法によって微細ひび割れの検出が可能となる。しかも,アルコールがセメントと大きく反応しないため,セメントの水和条件を大きく変えることなく,継時的にひび割れを監視できることが大きな特徴である。実験にあたり,供試体は鉄筋の付着を考慮し120cm,鉄筋はD32のものに5mm×4mmの溝をつけたものとした。鉄筋比は7.54%としている。コンクリートは,水粉体比,30%,23%,15%としたもの,水粉体比15%のものは,さらに膨張材・収縮低減剤を用いたものを作成した。材齢10日時点の供試体においては,水粉体比15%のもののみ,微細なひび割れが検出され,他の水粉体比,膨張材・収縮低減剤を混和したものに関しては,ひび割れは検出されていない。現在,引き続き,同様な供試体で長期材齢の実験を行っている。また,どうように鉄筋にゲージをはり,自己収縮による拘束応力がどのように発現するかに関して,異なる鉄筋比3種類でも同条件で検討を行っている。
細胞外環境を感知してＮｏｔｃｈシグナルの強弱を制御しうる翻訳後修飾の解析

Notch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾は、細胞外環境を感知してNotchシグナル強弱の調節機構を制御し、血管の発生を司る翻訳後修飾であるという仮説を実証することが本研究の目的である。本研究目的を実証するには、大きく分けて3つの研究課題を実施する必要性がある。課題A:細胞外O-GlcNAc修飾が血管の発生や機能維持を制御しているのかを遺伝子欠損マウスを用いて生物学的に解析する必要性がある。課題B:細胞外O-GlcNAc修飾によるNotchシグナルの調節機構を遺伝学的な解析と生化学的な解析で解明する必要性がある。課題C:グルコサミン投与によるNotch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾の増減がNotchシグナルや血管の発生、血管の機能維持機構をどのように制御しているかを生化学・組織学的な解析で明らかにする必要性がある。本年度は課題B及び課題Cについて実施した。下記に本研究で得られた研究成果を示す。課題B:昨年度、細胞を用いたリガンド結合実験より、EOGTはDelta-like 1 (DLL1)、もしくはDLL4を介したNotch1との相互作用とNotchシグナルの活性化を制御することを明らかにした。そこで本年度は、O-GlcNAc修飾がどのようにNotch1受容体とリガンドとの相互作用を制御しているかを明らかにする為に、質量分析装置を用いてNotch1受容体上のO-GlcNAc修飾サイトの同定を試みた。その結果、少なくともmouse Notch1 EGF1-36には7個のO-GlcNAc修飾サイトが存在することを見出した。また、O-GlcNAc glycanの構造が各EGFドメインにより異なることが分かった。課題C:グルコサミン投与によるNotch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾の増減がNotchシグナルに与える影響を調べる為に、Notchシグナルプロモーターアッセイとリガンド結合実験を実施した。その結果、グルコサミン投与によりNotchシグナルとリガンド結合能が亢進していることを見出した。昨年度、細胞を用いたリガンド結合実験より、EOGTはDelta-like 1 (DLL1)、もしくはDLL4を介したNotch1との相互作用とNotchシグナルの活性化を制御することを明らかにした。また、グルコサミン投与によるNotch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾の増減がNotchシグナルに与える影響を調べる為に、Notchシグナルプロモーターアッセイとリガンド結合実験を実施した。当該年度末に応募資格を喪失することにより、終了年度となる為、記載しない。本年度は課題A及び課題Bについて実施した。課題A: EOGTは網膜血管の血管内皮細胞に高発現し、血管内皮におけるEOGTの欠損は、血管形成や網膜血管のintegrityの異常が観察された。このような異常は、Notch1やRbpjの異常によっても観察され、Eogtとの遺伝学的相互作用を示した。また、in vitroの実験結果と一致して、Jagged1ではなくDll4の変異において見られるマウスの表現型に一致した。課題B:細胞を用いたリガンド結合実験より、EOGTはDelta-like 1 (DLL1)、もしくはDLL4を介したNotch1との相互作用とNotchシグナルの活性化を制御することを明らかにした。一方で、Jagged1を介したNotchシグナルには明らかな異常を認めなかった。Notchシグナルは血管形成に重要な役割を果たすことが知られている。平成28年度は、EOGT欠損マウスを用いて細胞外O-GlcNAc修飾の生物学的意義を主に解析をした。その結果、細胞外O-GlcNAc修飾は血管内皮細胞において血管形成を制御していることを明らかにした。また、EOGTはNotch1と遺伝的相互作用を示すことをEOGT/Notch1 2重変異体マウスにおいて明らかにした。

これらの研究成果はeLifeに掲載されており(*Sawaguchi, *Varshney, *Ogawa et al., 2017, eLife *equal contribution)、また、日本分子生物学会やNotch Meetingで招待講演演者として発表する機会を得た。現在、細胞外環境の変化に応答して細胞外O-GlcNAc修飾が変動することを見出しており、細胞外環境に応答した細胞外O-GlcNAc修飾の変化によりNotchシグナルが制御させる可能性について解析を進めている。上記のように、期待通りの研究の進展があり、今年度以降も継続的に成果が得られることが期待できる。Notch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾は、細胞外環境を感知してNotchシグナル強弱の調節機構を制御し、血管の発生を司る翻訳後修飾であるという仮説を実証することが本研究の目的である。本研究目的を実証するには、大きく分けて3つの研究課題を実施する必要性がある。課題A:細胞外O-GlcNAc修飾が血管の発生や機能維持を制御しているのかを遺伝子欠損マウスを用いて生物学的に解析する必要性がある。課題B:細胞外O-GlcNAc修飾によるNotchシグナルの調節機構を遺伝学的な解析と生化学的な解析で解明する必要性がある。課題C:グルコサミン投与によるNotch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾の増減がNotchシグナルや血管の発生、血管の機能維持機構をどのように制御しているかを生化学・組織学的な解析で明らかにする必要性がある。本年度は課題B及び課題Cについて実施した。下記に本研究で得られた研究成果を示す。課題B:昨年度、細胞を用いたリガンド結合実験より、EOGTはDelta-like 1 (DLL1)、もしくはDLL4を介したNotch1との相互作用とNotchシグナルの活性化を制御することを明らかにした。そこで本年度は、O-GlcNAc修飾がどのようにNotch1受容体とリガンドとの相互作用を制御しているかを明らかにする為に、質量分析装置を用いてNotch1受容体上のO-GlcNAc修飾サイトの同定を試みた。その結果、少なくともmouse Notch1 EGF1-36には7個のO-GlcNAc修飾サイトが存在することを見出した。また、O-GlcNAc glycanの構造が各EGFドメインにより異なることが分かった。課題C:グルコサミン投与によるNotch受容体上の細胞外O-GlcNAc修飾の増減がNotchシグナルに与える影響を調べる為に、Notchシグナルプロモーターアッセイとリガンド結合実験を実施した。その結果、グルコサミン投与によりNotchシグナルとリガンド結合能が亢進していることを見出した。昨年度、細胞を用いたリガンド結合実験より、EOGTはDelta-like 1 (DLL1)、もしくはDLL4を介したNotch1との相互作用とNotchシグナルの活性化を制御することを明らかにした。
ドイツとスイスにおける「動きのある学校」の成果と課題について

本研究では、主にドイツの「動きのある学校」並びに「動きのある幼稚園」について検討をした。平成25年度は「動きのある学校」を支援する学校外の組織との関係について検討をしてきた。平成26年は、「動きのある幼稚園」を訪問し、そのプログラムについて検討をした。平成27年度は、「動きのある学校」を主導的に研究しているエッカート・バルツ氏と、「動きのある幼稚園」を主導的に実践しているレナーテ・ツィマー氏の両名を招聘し、同プロジェクトの成果と課題について検討をした。成果としては、幼稚園や学校の経営の柱に運動が大きく寄与している点であり、課題としては、財政基盤や実証的研究の不足などであった。平成25年度は、ドイツの「動きのある学校」プロジェクトに関わって、ドイツの小中学校のプログラムを調査することに留まらず、学校外組織との連携について調査をしてきた。具体的には、「動きのある学校」と保護者会や教育委員会、保険組合、地域スポーツクラブ等の学校外の組織がどのような関係しているのかについて調査をした。また、この取り組みの成果をどのように検証しているのかについて調査をした。平成25年度の成果は、研究代表者並びに研究分担者共に渡独し、各分担地域を調査してきた。その成果の一例としてノルトライン・ヴェストファーレン州の結果(要点)を以下に示す。1,同州における「動きのある学校」は、スポーツや健康といった問題のみならず、州の教育改革の一活動として位置づけられている。具体的には、学校プログラム活動(Schulprogramm)といった考え方の一つの取り組みとして位置づけられている。2,教育委員会や保険組合、スポーツクラブとの連携は盛んに行われてはいるものの、財政的な援助はわずかであり、教育委員会からの補助金はほとんどない状態である。そのため、取り組みに向けての予算を確保する上で、学校長を中心として学校外の諸組織を訪問し、協賛金を得るような形をとっている。たとえば、アルミニといった卒業生の会があるが、そこからも金銭面の援助を受けている。また、地元大手企業や保険会社に学校長が訪問し、児童生徒達が健康であることのメリットを訴え、協賛金を得る活動をしている。このように「動きのある学校」プロジェクトを推進していくにあたり、ドイツ全体の教育改革の動向や、プロジェクトを維持するための財政基盤や人的基盤などについて基礎的な調査を実施してきた。平成26年度は「動きのある学校」といった小中高等学校段階に留まらず、その前提となる幼児期の運動にまで対象を広げ調査を行った。具体的には、「動きのある幼稚園」として、幼児期の動きづくりや体つくりを積極的に推進している園を訪問し、子どもにとって動くことの重要性や方法等について聞き取り調査を行った。その際には、ニーダーザクセン州にあるオスナブリュック大学のレナーテ・ツィマー教授が積極的に指導している幼稚園を訪問し、その実態調査を行った。レナーテ・ツィマー教授は、幼児期の運動の重要性を訴えており、子どもの発達、健康、環界の理解等への影響を検討している。今回の調査では、二つの幼稚園を訪問した。一つは、大学に隣接する幼稚園で、園舎内に様々な遊具やロープ等を多く配置し、子どもが日常生活をしながら自然と動きたくなるような仕掛けがなされていた。もう一つは、「遊びとスポーツ」という名の幼稚園で、隣接するスポーツクラブと協同しながら、毎日45分間の運動プログラムを実施していた。いずれの幼稚園も、子どもが日常的に多くの動きができるような仕掛けが見られており、生き生きと動き回る姿が見られていた。これらの取り組みに関わっては、財政的な基盤が重要であり、特にスポーツクラブとの協同を行っている幼稚園では、受益者の負担額が大きなものとなっていた。本研究の最終年度にあたる平成27年度では、二人のドイツ人研究者を我が国に招聘し、彼らとの情報交流を通じて、本研究の主題に迫っていった。一人は、ヴッパータル大学のエッカート・バルツ氏(Eckart Balz)であり、もう一人は、オスナブリュック大学のレナーテ・ツィマー氏(Renate Zimmer)である。バルツ氏は、9月に開催された日本スポーツ教育学会第35回記念国際大会のキーノートスピーカーとしても登壇してもらい、ドイツの「動きのある学校」についての概要紹介と、その成果について講演をしてもらった。「動きのある学校」についてはドイツ国内で大きく拡がりつつも、その成果を実証的に検証している研究論文が少ない点や、「動きのある学校」それ自体が、ドイツの終日制学校や学力テストの問題などをはじめとした教育界における大きな潮流の中で翻弄されている様子が報告された。一方、ツィマー氏は、2月に開催された日本体育大学における公開セミナーにおいて、「動きのある幼稚園」と題して、幼児期から小学校期までに園や学校において運動を取り入れていくことの大切さについて講演をしてもらった。子ども達にとって、身体は世界を獲得していくための手段であり、運動をしていくことで言語や認識能力等が活性化していくと報告された。加えて、運動を大きな教育の柱に据えている幼稚園の活動を紹介してもらった。本研究の最終年にあたり、「動きのある学校」が、小学校から高等学校に留まらず、幼稚園といった幼児期にまで拡がりを見せており、園や学校において様々な試みがなされて下り、それを支える組織も多様化している点が確認できた。また、ドイツの教育界の大きな変革の中で、「動きのある学校」の意味づけも少しずつ変化している様子が確認できた。課題としては、実証的研究の不足と教員研修システムの構築などがあげられた。

本研究では、主にドイツの「動きのある学校」並びに「動きのある幼稚園」について検討をした。平成25年度は「動きのある学校」を支援する学校外の組織との関係について検討をしてきた。平成26年は、「動きのある幼稚園」を訪問し、そのプログラムについて検討をした。平成27年度は、「動きのある学校」を主導的に研究しているエッカート・バルツ氏と、「動きのある幼稚園」を主導的に実践しているレナーテ・ツィマー氏の両名を招聘し、同プロジェクトの成果と課題について検討をした。成果としては、幼稚園や学校の経営の柱に運動が大きく寄与している点であり、課題としては、財政基盤や実証的研究の不足などであった。ドイツの「動きのある学校」「動きのある幼稚園」に取り組んでいる地域として、ニーダーザクセン州、ノルトライン・ヴェストファーレン州、ザクセン州と行った三地域をあげることができるが、いずれの州においても主導的役割を持つ大学教授や教員達との関係をこの二年間で深めることができ、常に新しい情報を取得できる体制になっているからである。スポーツ教育学平成27年度は、本プロジェクトの最終年である。そのため、我が国での国際学会において、有力な研究者達を招聘し、シンポジウムを企画していく予定である。同シンポジウムを通じて、動くことが子どもにとってどのような意味をもたらすのか、また我が国で子どもを日常的に動かすための方策としては、どのようなものであるかについて議論を深めていく予定である。平成25年度は、当初目標としていた現地調査に加えて、次年度以降に研究交流を進める人的繋がりができた年であり、概ね順調に進んでいる。平成25年度並びに26年度について、計画に従って研究は概ね進んでいるが、最終年である平成27年度に国際学会を実施することが決まっており、海外研究者の招聘に向けて資金を繰り越していたからである。平成26年度は、前年度に進めてきたことを引き続き継続する。具体的には、ドイツにおける他州の状況把握をすると共に、情報を得られるネットワークを拡げていくなかで、ドイツ全体の動向を確認していく必要がある。平成27年度は、まとめの年として、ドイツの有識者を招聘し、学校教育における「運動(動き)」の役割と位置づけについて、我が国の研究者と議論し、今後の我が国の学校教育の施策に対して議論ができるように進めていく予定である。平成27年度は最終年度ではあるが、上記の通り国際学会においてキーノートレクチャーやシンポジウムを実施する予定であり、海外研究者を我が国に招聘する予定である。そのため、その招聘にあたり多額の資金を必要とする。繰り越しを行った理由は、平成27年度に本研究に関わってドイツ人研究者を我が国に招聘する予定であり、その予算を事前に確保しておく必要があったからである。ドイツの「動きのある学校」プロジェクトが、我が国の学校教育を考える上で、一つの視点をあたえることは間違いなく、そのためには、研究のまとめの年にあたる平成27年度に我が国の研究者がドイツ人研究者とが情報を交流できるようにしていくことが必要不可欠であり、その予算を確保する必要がある。平成27年度のドイツ人研究者招聘に向けて繰り越しておく必要がある。
リハ実施は移植神経幹細胞の生着率・分化に影響し、脳卒中後の麻痺回復を促進するか

ローズベンガル血栓性梗塞による脳卒中モデルを用いて運動麻痺の回復を検討している。ES細胞から分化誘導させた神経幹細胞を移植し、移植後の麻痺回復に及ぼす影響とグリア細胞の機能連携を検討し、脳卒中後の麻痺回復を促進するかの課題を考えた。また、脂肪組織由来間葉系幹細胞をモデル作成後1日後および3日後に大腿静脈より投与し、麻痺の回復スピードの変化をコントロール群と比較し、さらにPIT作成後9日目に脳を取り出し、脳切片を蛍光顕微鏡での観察をおこなった。この2つの手法とも、麻痺の回復を促進させることはなく、脳への取り込みも認められなかった。中枢神経障害からの機能回復にリハビリテーションが重要であることに関しては、基礎実験や臨床現場において確認されてきた事実であるが、移植細胞の生着や分化に及ぼすリハビリテーションの実施効果に関して、現時点ではエビデンスが不足している。本年度は神経幹細胞移植の至適条件の検討を実施した。実験には体重約150gのF344系雄ラットを用いた。脳卒中非移植群(n=7)と脳卒中移植群(n=7)に分けた。すべての動物に対して、右感覚運動皮質にRose Bengal血栓性梗塞を作成した。脳梗塞作成1日後に神経幹細胞(100万個/個体)を静脈投与した。移植神経幹細胞の培養マウスES細胞から神経幹細胞への分化誘導および神経幹細胞の培養は、独自に開発したNeural Stem Sphere(NSS)法で行なった。すなわち、フィーダー細胞上で培養した未分化なマウスES細胞の塊(コロニー)を、実体顕微鏡下でガラスキャピラリーを使用して単離した。コロニーを非接着性ディッシュに移し、アストロサイト条件培地の中で浮遊培養して神経系細胞への選択的分化誘導を行い、神経幹細胞を含む球状の細胞集合体(NSS)を形成させた。浮遊培養4日目のNSSを接着性のディッシュに移し、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)存在下で数日間培養して、NSSの周囲に神経幹細胞を増殖させ、NSS周囲に遊走した神経幹細胞だけを回収し、bFGF存在下で増殖させ、均質な神経幹細胞を調製した。細胞は凍結保存し、移植時に、解凍して培養を再開し、1mlのDMEMに懸濁し、動物に移植した。脳卒中非移植群にはvehicle 1mlの静注処置のみを行った。移植1日後から免疫拒絶を防ぐため、cyclosporine A(10mg/kg/day,ip)を材料採取まで投与した。神経幹細胞移植の至適条件の検討を実施した。マウスES細胞から神経幹細胞への分化誘導および神経幹細胞の培養は、Neural Stem Sphere(NSS)法で行なった。細胞は凍結保存し、移植時に、解凍して培養を再開し、1 mlのDMEMに懸濁し、動物に移植した。脳卒中非移植群にはvehicle 1 mlの静注処置のみを行った。移植1日後から免疫拒絶を防ぐため、cyclosporine A(10mg/kg/day, ip)を材料採取まで投与した。右感覚運動野皮質の損傷により生じた左下肢麻痺は、Beam-walking scoreで評価をした。脳卒中非移植群と脳卒中移植群とも損傷作成後約10日で麻痺は改善した。また、麻痺の回復スピードは、両群間に統計学的優位差を認めなかった。よって、さらに神経幹細胞移植の至適条件の検討をする必要がある。Rose Bengalを用いて右感覚運動野皮質の損傷させるPIT(Photochemically Induced Thrombosis Causing Focal Cerebral Ischemia)モデルの左下肢麻痺の回復は、Beam-walking scoreで評価をすると、ほぼ均一に10日で麻痺は改善することがわかっている。この麻痺の回復のスピードを改善する為に、PIT作成後、神経幹細胞移植を施行したが、麻痺の回復スピードは、統計学的優位差をもって改善を認めなかった。

よって、今回は、脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)をモデル作成後1日後および3日後に大腿静脈より投与し、麻痺の回復スピードの変化をコントロール群と比較し、さらにPIT作成後9日目に脳を取り出し、脳切片を蛍光顕微鏡での観察をおこなった。株式会社シームスから提供されたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を乳酸リンゲル液(ハルトマン溶液)1mLに5x106個濃度で懸濁してモデルラットに静注した。MSCはあらかじめPKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit(Sigma:MINI26)で細胞標識をおこなった.シクロスポリン(10mg/kg per day)をMSC投与1週間前から、投与後観察期間中継続投与した.コントロール群と同様、左下肢麻痺は、Beam-walking scoreにて評価をおこなった。また、PIT作成後9日目にヘパリン生食で脱血後,リン酸緩衝4%パラホルムアルデヒドで還流固定し,脳を摘出した.振動刃ミクロトームを用いて40μmの切片を作成し,蛍光顕微鏡で観察した。MSCをPIT作成後1日後および3日後に静注したが、コントロール群と比べ両群とも麻痺の回復スピードは、統計学的優位差を認めなかった。また、脳切片を蛍光顕微鏡で観察したところ,損傷半球,健常半球いずれにおいても標識されたMSCは観察されなかった。
バソプレシン及び類似神経ペプチドによる学習・記憶増強効果の細胞内情報伝達系路解明

バソプレシン,その代謝断片や代謝断片類似ペプチド(以下バソプレッシン類)の記憶増強作用についての細胞内作用機序の検討を行った。動物行動実験のマウス受動回避学習課題では:グルタミン酸作動性神経活動を司る,NMDA receptorや代謝型グルタミン酸受容体のagonistやantagonistを用い記憶保持能力の検討を行うと,バソプレシン類の記憶保持増強能力はantagonistの作用とお互いに成績が拮抗し,agonistでは増強と憎悪の両方の結果を認めた。これらはバソプレシン類の記憶増強効果がグルタミン酸作動性神経の受容体を介してその作用を出現させる示唆である。それ故,グルタミン酸作動性神経活動による,逆行性神経伝達物質とバソプレシン類との関係を検討した。逆行性伝達物質のアラキドン酸の代謝産生に関与する酵素シクロオキシゲナーゼ(COX)の抑制が記憶にどの様な影響を与えるかを検討した。Morris WaterMazeとPassiveavoidancetestにおける課題獲得後non-specific COX inhibitorを投与すると課題の成績低下が生じた。これはspecific COX-2 inhibitorにおいても認められたが,specific COX-1 inhibitorでは認められなかった,それ故COX-2活動が記憶形成に重要と考えた。また,COX-3のspecific inhibitorとされているアセトアミノフェンの記憶に対する検討でも,glutamatergic神経活動に関与するのは,COX-2であった。Real time PCRではMorris Water Maze終了後2時間以内でCOX-2のmRNAの低下があり,バソプレシン類の増強効果は内因性COX2抑制状態ではその効果を減弱させたことから,バソプレシン類の記憶増強効果は細胞内COX-2の活動が重要である事が示唆された。バソプレシン,その代謝断片及び合成類縁ペプチド(以下バソプレッシン類と略す)は記憶の増強効果があることが,動物行動実験の受動回避学習課題と空間認知課題であるMorris Water Mazeにおいて示された。このバソプレッシン類はホスホリパーゼC(PLC)やプロテインキナーゼC(PKC)を活性化する事で記憶の増強効果を示していたが,本研究において,PLCよりも,下流の情報伝達経路もバソプレシン類の作用出現に関与している事を示唆した。つまり,PLCは細胞内カルシウムの濃度上昇を引き起こしPKCの活性化に関与するが,バソプレッシン類はこの作用ばかりではなく,PLA_2によって作動されるアラキドン酸代謝経路に関与する。つまり,PLA_2は,アラキドン酸の代謝を促進し以降,シクロオキシゲナーゼ(COX)がプロスタグランジンの産生を促す,要の酵素である。本研究ではバゾプレシン類のPKC以外の細胞情報伝達系解明のため,このアラキドン酸代謝経路の一部であるCOXの阻害薬であるインドメタシン,NS-398,アセトアミノフェン,ピロキシカム投与で,記憶の減弱効果を検討した。バソプレシン類の記憶増強効果はCOXの阻害薬である,インドメタシンによって減弱された。そこで,COX-1の特異的阻害薬であるピロキシカムとバソプレシン類の併用で検討を試みたが,バソプレシン類の効果の減弱は認められなかった。一方,COX-2の特異的阻害薬であるNS-398との併用ではバソプレシン類の減弱効果が認められた。また,COX-3の検討もアセトアミノフェンを使って行った。アセトアミノフェンがCOX-3を特異的に阻害する濃度では記憶の減弱効果が認められなかった。これらのことはバソプレッシン類の中枢作用はアラキドン酸代謝経路を介する可能性があり,COX-2が細胞内情報伝達系路に関与している可能性が示唆された。

前回(平成16年度)の報告において,バソプレシン,その代謝断片及び合成類縁ペプチド(以下バソプレッシン類と略す)は記憶の増強効果があることが,動物行動実験の受動回避学習課題と空間認知課題であるMorris Water Mazeにおいて示されたが,本年度はこの記憶増強効果と近年記憶保持や成立に関与するとされる,Retrograde neurotransmitter(逆行性神経伝達物質)との関与を検討することにより,本ペプチド類の記憶増強メカニズムの作用機序解明の一端とした。(1)行動実験モデルとしては,逆行性神経伝達関与のモデルとして,プロスタグランジンE2(PGE2)欠乏を想定し,シクロオキシゲナーゼ(COX)抑制薬(NSIADs)投与したマウスを使い,Morris Water MazeとPassiveavoidancetestで評価すると,non-specific COX inhibitorのindomethacinやCOX-2 specific inhibitorのNS-398で課題の低下があることから,PGE2欠乏は記憶形成に関与することが窺えた。また,それを裏付けるため(2)生化学実験としてSYBERGreen系を用いたReal time PCRではMorris Water Maze終了後2時間以内でCOX-2のmRNAの低下が認められることから,PGE2が記憶形成に関与しているモデルを想定製作した。このモデルにバソプレシンやバソプレシン類を投与すると,step-through type課題の向上が認められた。この結果は我々が前回報告した,バソプレシンやそのバソプレシン類縁物質が従来のアセチルコリン作動性神経を介したものだけではなく,グルタミン酸作動性神経を介し,記憶増強効果があると考えられるものである。
ヤップ出身者の脱領域的公共圏の民族誌的研究

本研究はミクロネシア連邦ポンペイ島,米国グアム島のヤップ出身者のアソシエーションの民族誌調査に基づき,移民と母社会が国家を超えた脱領域的公共圏を構成していると指摘し,アソシエーションの活動による民族アイデンティティの生成,リーダーシップの生成,募金活動による社会的連帯の生成について報告した。1986年のミクロネシア連邦の成立の前後から,政府成立による公的雇用機会の拡大や自由連合協定による米国移民が,ヤップ州離島出身者に州都コロニア,連邦首都ポンペイ島,またグアム島を始めとする米国での生活の道を開いた。20年を経で,ヤップ離島出身者は移民先のアソシエーションを通じ母社会と密接な関係を保ち,脱領域的な公共圏を生み出している。2008年度の研究では,ポンペイ島とグアム島在住者の情報を収集し,両島在住のヤップ離島出身者のアソシエーション活動への参与観察とメンバーの生活状況調査を実施した。現在のポンペイ島とグアム島の離島出身者のアソシエーションは,ヤップ本島出身者のアソシエーションの一部として存在している。ポンペイ島の離島出身者の属するアソシエーションはYap Men and Women Organization(YMWO)であり,グアム島のオレアイ環礁出身者のアソシエーションであるWoleaiOrganizationofGuam(胃00G)はグアム島のヤップ州出身者のアソシエrションの下部組織である。ポンペイ島でもグアム島でも,離島出身者の集住地区は存在せず,人々は分散して居住しており,公共の場所やメンバーの住居でアソシエーションの会合は開催される。YMWOもWOOGも政治的な活動よりも,社交的な活動を中心として活動している。アソシエーションの会合の議事録とそれに基づくインタビューによれば,Y囲0の主な活動は,メンバーの葬儀の援助,YapDayの実施,基金調達,役員の選出であった。WOOGの主な活動は月例会の開催,基金調達,クリスマス,イースター,感謝祭の機会のメンバー内での会食の実施,会則の制定と役員の選出であった。この中で基金調達活動はアソシエーションの活動を評価する重要な基準となっている。基金調達活動による現金の集積では,出身島填アイデンティティが喚起され,移民と母社会の関係が強化されることが確認された研究代表者は,平成21年8-9月にミクロネシア連邦ヤップ島,米国グアム島に4週間滞在し,在外ヤップ人協会の規約の収集,役員のインタビュー,協会成員の世帯調査を行った。平成22年3月にはポンペイ島に約2週間滞在しポンペイ島で実施される「ヤップの日」の参与監察を実施した。調査の期間中,ヤップ島,グアム島,ポンペイ島で在外ヤップ人の葬儀の参与観察を実施し,ヤップ人協会に関するマスメディア資料を収集した。ポンペイ島のヤップ出身者協会の最大の年間活動は3月に開催される「ヤップの日(Yap Day)」の当地での開催である。「ヤップの日」では伝統舞踊が演じられ,バーベキューと同時に伝統料理が振る舞われ,「ヤップの日」の成功が母社会・ホスト社会の双方での在外協会成員のアイデティティの承認の機会であることが確認された。「ヤップの日」の運営組織であるヤップ人協会はヤップ本島と離島の出身者共通の組織であるが本離島の序列,年長者/若者の序列が様々な場面で意識される一方,協会はポンペイ州でのNPO法人としての認証を求めており,協会の異種混交的性格が確認された。在外ヤップ州出身者にとって葬儀は協会活動とは区別される重要な協同の機会である。今年度の調査期間中,グアム在住のヤップ州離島出身者の死が,グアム島での仮葬儀と贈与交換,遺体のヤップ島への搬送,ヤップ島ての仮葬儀と贈与交換,出身島嶼への遺体の搬送と葬儀と贈与交換という複雑な葬送慣行を生み出していることが確認された。また遺体に関する葬送慣行とは別に,近親に死者が出た世帯は,死が生じた場所にかかわらず,その任居でカトリック教のロザリーをが死後9日間催し,これが広範な親族結集の機会となっていることが確認された。これらの新たな葬送慣行に関する経済的負担に備えるため,ヤップ州出身者はさまざまな相互扶助の組織を立ち上げており,ヤップ人協会も相互扶助の重要な担い手であることが確認された。研究代表者は,平成22年8-9月にミクロネシア連邦ヤップ島,ポンペイ島,米国グアム島に4週間滞在し,各地の在外ヤップ人アソシエーションの規約,活動記録の収集,役員のインタビュー,協会集会への参与観察を行った。またグアム島においてグアム政府ミクロネシア問題事務所で担当官に,自由連合締結以降のグアム政府のミクロネシア移民政策についての聞き取り調査を行った。グアム島に存在するアソシエーションには,ヤップ州全体,ヤップ本島個別地区,ヤップ州個別離島と,複数のアソシエーションが存在する。アソシエーション活動の集会の開催と募金活動を中心とし,活発なアソシエーションは募金のために時にNPO法人登録を行う。募金活動は単なる寄付の集積だけではなく,洗車,清掃,昼食販売などの経済活動からの利益を集積し,アソシエーションに活動にあてる。本研究はこのような募金活動を解明することでアソシエーションによる市場経済の贈与経済への流用過程を明らかにした。

アソシエーションの最も重要な年間活動は3月から4月に開催される「ヤップの日」の開催であり,「ヤップの日」の費用捻出が募金活動の主要な目的である。「ヤップの日」の成功は母社会・ホスト社会の双方におけるアソシエーションの承認につながる。現在NPO法人登録されているのはヤップ州全体のアソシエーションのみである。しかしNPO法人登録は全てのアソシエーションが目指しており,法人化を目指しアソシエーション規約等を制定している。本研究では,法人化登録を目指した移民アソシエーション活動の歴史を解明することで移民の自助組織の発展を評価する見通しをえた。
癌化による肝アルドラーゼ遺伝子構造の変化と発現変換

アルドラーゼには、A(筋型)、B(肝型)、C(脳型)の3種類のアイソザイムが存在し、明確な組織特異性を示すと共に、癌化によりその遺伝子発現が変換することが知られている。これまでわれわれは正常肝ではアルドラーゼBが発現しているが3m-DABによる化学発癌肝癌ではアルドラーゼAが発現するようになりアルドラーゼBの発現量が低下することをAおよびBcDNAを用いて明らかにしてきた。本年度はこのアルドラーゼB遺伝子発現の抑制、非抑制下における同遺伝子の高次構築(クロマチン構造)が示す特徴をDNase【I】高感受性領域の面から検討すると共に、同遺伝子DNAのメチル化の面から検討して以下のような結果を得ている。(1)高感受性領域:正常肝ではアルドラーゼB遺伝子が活発に発現している。このクロマチンでは同遺伝子のそれぞれ2.6Kb(サイト【I】)、0.3Kb(サイト【II】)上流と、ポリA添加部位上流1.6Kb(サイト【III】)および下流約2.7Kb(サイト【IV】)の計4個所にDNase【I】高感受性領域がみられた。B遺伝子の発現が完全に抑制されたAH130ヘパトーマや脳ではこれらの領域はみられないが、部分的にでもB遺伝子が発現しているモーリス肝癌D5123、3me-DAB肝癌、腎などでは共通してサイト【II】の存在することが確かめられた。このことは同遺伝子の5'近傍プロモータ部分のクロマチン構築の変化が同遺伝子発現に重要であることを意味している。(2)DNAメチル化:同遺伝子およびその近傍の15個所のHha【I】サイト、Hpa【II】サイトのメチル化と同遺伝子の発現との相関を検討して、B遺伝子の発現している組織からとられたDNAでは、同遺伝子5 ́上流0.13KbにあるHha【I】サイトと、イントロン1に存在するいくつかのHpa【II】サイトが低メチル化であることが共通していた。特に5 ́上流0.13KbのHha【I】サイトはCCAAT boxに隣接していることから、同遺伝子の転写と深く関与していることが推定された。
光力学応答に基づく単一分子・ナノ粒子吸収分光法の開拓

本研究では、少数分子やナノ粒子が光を吸収することで発生する放射圧(吸収力)を高感度・高精度に測定することで、従来の光吸収量検出に基づく吸収分光とは全く異なるアプローチで極微量サンプルの吸収分光を実現する事を目指す。これまでの研究により、有機色素を含む数百nmサイズの高分子粒子に対して、光トラッピングの条件下で可視光を吸収させると、捕捉されたナノ粒子の光捕捉位置が光軸方向に数百から1ミクロン程度シフトすることを実験的に確認できていた。この時の実験パラーターに基づいて詳細に放射圧を計算し、数千から一万個の分子による光吸収が、光軸方向に数百nmのトラップ位置シフトを引き起こすことを明らかにした。得られた成果から、一般的な単一レーザービームを集光することで発生する勾配力による光トラッピング条件下では、数百から数千個オーダーの分子による光吸収を検出可能であることが明らかとなった。しかしながら、従来型の(単一集光ビームの勾配力による)光トラッピング系では吸収力による被捕捉粒子の位置変位がトラップ光及び検出光学系(即ち、集光及びイメージング用対物レンズ)の光軸方向を向くため、位置検出の精度を上げることは困難であった。少数分子・ナノ粒子系を対象とした場合、発生する吸収力はより弱くなるため、吸収力の測定には、粒子の位置変位をより高い精度で検出する必要がある。その目的のために、放射圧用レーザー光の光軸と直交する方向から被トラッピング粒子の挙動を観測可能な光学系を構築した。構築したシステムにより、イメージング面上で放射圧により粒子を並進運動させることができるようになり、より高い精度(理論的には<数nm)で粒子の位置変位を検出可能な実験系の構築することができた。研究1年目(H30年度)は、上述のように従来型の(急峻に集光されたレーザー光による勾配力に基づく)光トラッピング系において、比較的少数の分子系に対する吸収力の力学検出に成功し、この実験で得られたデータ及び放射圧理論に基づく計算により、放射圧の力学的検出結果と光吸収した分子数とを定量的に対応付けることに成功した。この結果は、分子系の光吸収と放射圧の力学測定とを結びつける重要な研究成果であり、本研究で提案する、放射圧の力学測定に基づく吸収分光の実現に向けて、その有効性を示す結果である。さらに、より高感度・高精度の光吸収力検出を目指し、放射圧発生用レーザー光の光軸と、検出(光学イメージング)用光学系の光軸とが直交した実験システムを構築した。これにより検出用のイメージング面上で放射圧により粒子を運動させることに成功し、より高精度で粒子の位置変位を検出可能な実験系を構築することができた。この成果は、より少数の分子系の吸収力検出に有効であると期待され、ほぼ期待したとおりに研究が進んでいる。故に、現時点での評価を、「(2)おおむね順調に進展している。」とした。2019年度は、初年度に構築した実験装置を用い、より微小な粒子に対して放射圧を作用させ、その位置の変位を高精度に追跡する。イメージング光学系の光軸に対して直交した平面(イメージング用対物レンズの物体面)に対して平行な方向から、ターゲット微粒子に強く共鳴する波長のレーザー光を低倍の対物レンズにより比較的緩やかに集光し試料粒子に照射する。ターゲット微粒子の分散媒には比較的高い粘性を有する溶媒を用いることで、ブラウン運動の速度を抑え、イメージングを容易にすることで、高い単一粒子追跡精度を達成できる実験系を準備する。またこの実験系に最適化された石英製の微小サンプルセルを設計、製作する。ターゲット微粒子(少数分子を含む液滴、高分子微粒子、単一量子ドット、ナノダイヤモンド等)の共鳴吸収帯のピーク波長のレーザーを用い、比較的高い強度でターゲット微粒子に光照射する。光照射下での微粒子の動的挙動(並進運動)を単一粒子追跡法により詳細に追跡し、共鳴励起下での放射圧がターゲット粒子の並進運動に与える影響を精査する。得られた実験結果を詳細に解析し、放射圧(力学)測定から検出可能な分子/ナノ粒子の吸収、即ち、放射圧下での粒子の力学測定から何個の分子の吸収まで検出可能であるかを実験的に決定し、本研究におけるアプローチの限界を探る。

少数分子・ナノ粒子系を対象とした場合、発生する吸収力はより弱くなるため、吸収力の測定には、粒子の位置変位をより高い精度で検出する必要がある。その目的のために、放射圧用レーザー光の光軸と直交する方向から被トラッピング粒子の挙動を観測可能な光学系を構築した。構築したシステムにより、イメージング面上で放射圧により粒子を並進運動させることができるようになり、より高い精度(理論的には<数nm)で粒子の位置変位を検出可能な実験系の構築することができた。研究1年目(H30年度)は、上述のように従来型の(急峻に集光されたレーザー光による勾配力に基づく)光トラッピング系において、比較的少数の分子系に対する吸収力の力学検出に成功し、この実験で得られたデータ及び放射圧理論に基づく計算により、放射圧の力学的検出結果と光吸収した分子数とを定量的に対応付けることに成功した。この結果は、分子系の光吸収と放射圧の力学測定とを結びつける重要な研究成果であり、本研究で提案する、放射圧の力学測定に基づく吸収分光の実現に向けて、その有効性を示す結果である。さらに、より高感度・高精度の光吸収力検出を目指し、放射圧発生用レーザー光の光軸と、検出(光学イメージング)用光学系の光軸とが直交した実験システムを構築した。これにより検出用のイメージング面上で放射圧により粒子を運動させることに成功し、より高精度で粒子の位置変位を検出可能な実験系を構築することができた。この成果は、より少数の分子系の吸収力検出に有効であると期待され、ほぼ期待したとおりに研究が進んでいる。故に、現時点での評価を、「(2)おおむね順調に進展している。」とした。2019年度は、初年度に構築した実験装置を用い、より微小な粒子に対して放射圧を作用させ、その位置の変位を高精度に追跡する。イメージング光学系の光軸に対して直交した平面(イメージング用対物レンズの物体面)に対して平行な方向から、ターゲット微粒子に強く共鳴する波長のレーザー光を低倍の対物レンズにより比較的緩やかに集光し試料粒子に照射する。ターゲット微粒子の分散媒には比較的高い粘性を有する溶媒を用いることで、ブラウン運動の速度を抑え、イメージングを容易にすることで、高い単一粒子追跡精度を達成できる実験系を準備する。またこの実験系に最適化された石英製の微小サンプルセルを設計、製作する。ターゲット微粒子(少数分子を含む液滴、高分子微粒子、単一量子ドット、ナノダイヤモンド等)の共鳴吸収帯のピーク波長のレーザーを用い、比較的高い強度でターゲット微粒子に光照射する。光照射下での微粒子の動的挙動(並進運動)を単一粒子追跡法により詳細に追跡し、共鳴励起下での放射圧がターゲット粒子の並進運動に与える影響を精査する。得られた実験結果を詳細に解析し、放射圧(力学)測定から検出可能な分子/ナノ粒子の吸収、即ち、放射圧下での粒子の力学測定から何個の分子の吸収まで検出可能であるかを実験的に決定し、本研究におけるアプローチの限界を探る。
小脳LTD誘発時のシグナルインテグレーションをIP3可視化によって解明する

応募者はこれまでに、急性小脳スライス標本のプルキンエ細胞において、緑色蛍光たんぱく質(GFP)とプレクストリンホモロジードメイン(PHD)の融合タンパク質GFP-PHDを用いたイノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)イメージングを成功させている。具体的には、GFP-PHDのcDNAをコードするシンドビスウイルスベクターをマウス小脳に注入し、小脳スライスを作製する。感染細胞においてGFP-PHDの細胞膜及び細胞質局在を解析することで、IP_3動態が明らかになる。二光子励起顕微鏡を用いることで脳スライスのように光散乱の大きい標本でも高解像度蛍光イメージングが可能となり、樹状突起の細部においてもGFP-PHDの局在を観察できる。平成18年度に引き続き平成19年度では単一スパインレベルの観察を目指した。LTD誘発シグナルの統合が単一スパイン内で起こる可能性を考慮に入れているためである。まず、従来よりも高開口数の対物レンズを用いることで解像度を向上させた。また、従来は細胞質及び細胞膜部分に関心領域を設定し蛍光強度変化を観察するという単純な蛍光局在解析を行ってきたが、画像上の蛍光強度分布の分散値による局在の評価等より感度の高い解析法を模索した。加えてGFP-PHDのGFP部分を赤色蛍光タンパク質に変更することで、長くなった蛍光波長により散乱が抑えられ解像度が向上することが期待できるので、現在当該コンストラクトを作成している。また細胞内IP_3動態には神経伝達物質である細胞外グルタミン酸の動態が深く関与するので、これの可視化解析にも着手した。具体的には、GFP-PHDのcDNAをコードするシンドビスウイルスベクターをマウス小脳に注入し、約24時間後そのマウスを解剖し小脳スライスを作製する。平成18年度ではさらに解像度を上げ、単一スパインレベルの観察を目指した。これについては現在採用すべき方法を検討中である。