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独吟百韻分析による宗祇連歌の多面的新研究

本年度は昨年に引き続き、宗祇の句集『宇良葉』の末尾に付された三百韻のうち、『春日左抛御前法楽独吟百韻』に関し、伝本調査及び訳注をすすめた。伝本調査では、百韻の形で流布している伝本の調査をすすめ、大阪天満宮蔵本、天理図書館本を校異に加えた。訳注に関しては、第75句までの注釈をなした。注釈を通して、古今集、万葉集などから宗祇が引き、特有の用い方をする語句の抽出が出来、さらに三島千句との語句・表現の類似、近い時期の千句である表佐千句との類似などの特徴をあぶりだすことができた。この科研費研究の前になした心敬連歌の研究で把握した心敬の連歌の特徴との相違も浮き彫りになり、こうした点は後の連歌界を宗祇流に染めていく宗祇連歌のあり方を論ずる際の指標となると思われる。研究対象である宗祇自撰句集『宇良葉』は、これまで孤本とされていたが、高岡市立中央図書館の清水家文書中に『宇良葉』の一本があることがわかった。この高岡市立中央図書館本に関して原本の調査をなし、櫻井本と比較研究し、櫻井本とは直接の書承関係のない伝本であると結論した。これについて伝本比較の論と、翻刻を発表した。高岡市立中央図書館本を見出し位置づけたことで、これまで孤本として扱われ、そのために研究が進んでこなかったともいえる櫻井本を相対的な視点でとらえることができ、さらに加賀前田家領内での宗祇連歌書の伝播に関しても視野を広げることができた。昨年度よりお願いし、お許しのあるときに拝見させていただいている小松天満宮の連歌関係書と、前田家との関係もさらに考察の必要があり、今後につながる多くの問題点を見つけ出すことができた。『春日左抛御前法楽独吟百韻』の訳注は順調に進み、また『宇良葉』の高岡市立中央図書館本を研究し紹介することができた。『春日左抛御前法楽独吟百韻』の訳注をすると共に、『夢想連歌』『本式連歌』の順に調査、訳注に進む。これら独吟百韻は宗祇の人生の記念碑的な百韻であり、検討を通じて、宗祇の人生の各時期における連歌の様相を明らかにする。研究開始年度である本年度は、宗祗句集『宇良葉』に存する三種の宗祇独吟百韻のうち、『春日左抛御前法楽独吟百韻』に関しての翻刻・訳注を進めた。『宇良葉』は孤本であるが、本年度は『宇良葉』本体の調査はかなわず、百韻の形で独立で流布している伝本を各地で調査した。その結果、句集以外に単独で流布する百韻の伝本調査により、天理本など八種類の伝本の本文を把握し、その校異をあげ、本文の比較検討もなしながら、訳注をなした。訳注の段階で、宗祇の他の独吟百韻、千句との句の発想の類似を多くあげることができ、句によっては句集の自注も参照可能であることを考えると、宗祇の場合は、訳注で、より正確な句意へアプローチしていくことががかなり可能であることがわかった。また、同時に、百韻の製作意図に関しても研究を進めた。『宇良葉』には、『春日左抛御前法楽独吟百韻』に関し短い製作事情の説明の左注があるのみであるが、春日社末社左抛社への奉納動機は、まだ考究の余地が多くあるため、宗祗における左抛社奉納の動機、意図、状況と中世における左抛明神の様相などについて調査考察し、「春日の末社左抛考」を著した。さらに、次に訳注にとりくむ予定の『夢想之連歌百韻』に関しても、伝本調査に着手した。『宇良葉』の『夢想之連歌百韻』には、長文の製作事情説明の注があり、個別に伝来している百韻で、こうした注の有無・校異を見つつ、注と本文の基礎的な整理にとりかかっている。2017年秋には、研究分担者奥田名誉教授が渡米の折、UCバークレーのホートン教授に、研究の進展状況を伝え、今後のやりとりに関して合意を得た。今年度なす予定であった『春日左抛御前法楽百韻』の訳注は順調にすすんでいる。

この高岡市立中央図書館本に関して原本の調査をなし、櫻井本と比較研究し、櫻井本とは直接の書承関係のない伝本であると結論した。これについて伝本比較の論と、翻刻を発表した。高岡市立中央図書館本を見出し位置づけたことで、これまで孤本として扱われ、そのために研究が進んでこなかったともいえる櫻井本を相対的な視点でとらえることができ、さらに加賀前田家領内での宗祇連歌書の伝播に関しても視野を広げることができた。昨年度よりお願いし、お許しのあるときに拝見させていただいている小松天満宮の連歌関係書と、前田家との関係もさらに考察の必要があり、今後につながる多くの問題点を見つけ出すことができた。『春日左抛御前法楽独吟百韻』の訳注は順調に進み、また『宇良葉』の高岡市立中央図書館本を研究し紹介することができた。ひきつづき、『春日左抛御前法楽独吟百韻』の訳注を進め、その伝来状況に関して、独立に流布する百韻の伝本調査から明らかにする。『夢想之連歌』、『本式連歌』の調査、訳注に順次入っていき、これら製作時期の違う独吟百韻の詳細な検討を通じて、宗祇の人生の各時期における連歌の様相を明らかにする。『春日左抛御前法楽独吟百韻』の訳注をすると共に、『夢想連歌』『本式連歌』の順に調査、訳注に進む。これら独吟百韻は宗祇の人生の記念碑的な百韻であり、検討を通じて、宗祇の人生の各時期における連歌の様相を明らかにする。本年度、UCバークレーのホートン教授を招聘、もしくは研究代表者の渡米を考えていたが、多忙のためいずれもかなわなかった。次年度に招聘もしくは渡米実現の際に使用する予定。本年度アメリカでの会議開催予定が未開催、次年度可能な際に使用予定。
放射線医学手法による骨折予知を目的とした骨脆弱度定量法の開発

放射線医学的手法を用いての骨折予知法の開発に関する検討を行った。まず超音波発生装置を用い水槽中に踵骨をおき超音波の伝達速度を計測した。また同時に超音波の減衰率をも各波長の超音波につき求めた。これらのパラメーターは骨密度との関連が文献的に示されている。同一例につき単X線吸収測定装置(SXA)を用いて同一部位の骨密度(BMD)を求め超音波のパラメーターが骨塩量と関連あるかどうか検討した。この両者の測定値間には各々相関係数0.756(vs伝達速度),0.720(vs減衰率)(いずれもp<0.001)と有意の相関を認め,超音波測定の有効性を示唆する成積を得た。次に踵骨の超音波測定が2重X線吸収測定装置(DXA)を用いた、全身骨密度、腰椎骨密度、あるいは大腿骨頸部骨密度とどの様に相関するかを約200名の症例について検討した。超音波の伝導速度とこれらの値との間には0.540-0.829の相関を認めた。これらの結果は超音波を用いた踵骨の測定が全身骨や大腿骨、腰椎など他の骨の骨密度の指標になり得ることを示唆している。超音波による測定は手技上末梢骨に限らざるを得ないが大がかりなDXA装置でなくともまたX線を用いなくとも骨量の評価が可能なことを示しており、マススクリーニングや一般臨床の手段としての超音波装置の可能性を示しているものと考えられた。超音波のパラメーターは骨の質に依存しており、単なる骨塩量とは異なるものである。骨強度を骨塩量と超音波によるパラメーターとどちらがより正確に示すかが興味深い検討課題であり、摘出骨を用いてin vitroにて検討中である。また、臨床例において骨折率とどちらがよく相関するかも検討中であるが現時点では結論はでていない。今後の検討を続けていく予定である。
ステロイド類生合成修飾酵素を活用した有用物質生産系の構築

ステロイドやトリテルペノイド化合物の骨格修飾に関与する酸化酵素群を数多く同定することは、有用物質生産へ向けた重要な生合成マシナリーツールを提供することにつながる。糸状菌Aspergillusfumigatusが生産するヘルボール酸は、プロトステロール骨格が高度に酸化修飾された構造を有しており、本生合成遺伝子クラスター内の酸化酵素群を機能解析することで骨格修飾に関与する酵素遺伝子を多数同定することが可能である。これまでに、クラスター内のシトクロムP450酸化酵素(P450)であるCYP5081A1、ならびにデヒドロゲナーゼ(AfuSDR)の機能解析に成功しており、各々プロトステロールの29位メチル基の酸化および3位水酸基の酸化を行っていることが判明している。そこで、クラスター内の他のP450遺伝子の機能解析を試みた。クラスター内の残り3種類のP450遺伝子、CYP5081B1、C1、D1を各々pESCベクターに導入し、プロトスタジエノール合成酵素(AfuOSC)との酵母共発現系の構築を行った。さらに、P450の活性を高める目的で、A. fumigatus由来の2種類のP450還元酵素(CPR1、CPR2)のクローニングを行い、OSCや各々のP450との共発現系の構築を行った。これら酵母の発現誘導を種々検討したが、目的のプロトスタジエノールの酸化産物の検出は認められなかった。次に各P450とCPR遺伝子を大腸菌の系で発現させるべく、pET21aベクターに組み込み、大腸菌BL21(DE3)codonplus株を形質転換した。誘導条件を種々検討し、各々の最適条件にて発現誘導を行い、目的タンパク質の可溶性画分への誘導に成功した。さらに、トリテルペンの構造多様性の生成要因を探索するべく、トリテルペン合成酵素の生成物特異性を決定するアミノ酸残基の同定も行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、クラスター内のシトクロムP450酸化酵素(P450)であるCYP5081Al、ならびにデヒドロゲナーゼ(AfuSDR)の機能解析に成功しており、各々プロトステロールの29位メチル基の酸化および3位水酸基の酸化を行っていることが判明している。そこで、両酵素が同時に機能することで、ヘルボール酸へ向けたC29脱メチル化を触媒しているのではないかと予想された。CYP5081A1およびAfuSDRを、プロトスタジエノール合成酵素であるAfuOSCと共に共発現を行うべく、選択マーカーの異なる2種類の酵母発現ベクターpESCに各々導入し、3遺伝子共発現系を構築した。形質転換酵母を誘導培養の後、ヘキサン抽出画分のGC-MS解析を行ったところ、3遺伝子発現体にのみ特異的なピークが観測され、MSスペクトルより脱メチル化産物の分子量に相当するm/z 410のイオンが見られた。さらにフラグメントイオンを詳細に検討したところ、本化合物が脱メチル化産物であることが強く示唆された。さらに、クラスター内の他のP450遺伝子の機能解析を行うべく、各々のクローニングと酵母発現ベクターへの導入を行った。

さらに、トリテルペンの構造多様性の生成要因を探索するべく、トリテルペン合成酵素の生成物特異性を決定するアミノ酸残基の同定も行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。酵母での3遺伝子共発現系の構築により、脱メチル化体とみられる産物の検出に初めて成功することができたため、今後の他のP450遺伝子の共発現解析への展開が可能となった。クラスター内の他のP450遺伝子の機能解析を進めていく。その際、酵母での発現において活性の低下が懸念されるため、P450への電子伝達系のパートナーであるP450還元酵素遺伝子の取得と、共発現も行っていく。
唾液腺における水チャネルの神経性調節機構と老性動態

神経伝達物質による耳下腺管腔膜におけるAQP5増量の機序及びその加齢変化を追究することを目的に実験を行い、下記のような成果を得た。1.8週齢ラット耳下腺切片をアセチルコリン(ACh)と反応後細胞分画し、管腔膜AQP5量をウェスタンブロッティングで測定した後デンシドメーターで解析すると、管腔膜のAQP5は約3倍の増量が認められた。この増量は、AChがM3-ムスカリン受容体を刺激後、ホスホリパーゼCの活性化、IP3受容体およびリアノジン受容体の活性化を経て、[Ca^<2+>]iが上昇したためとの結論を得た。2.耳下腺切片をエピネフリン(Epi)との反応によって、管腔膜のAQP5は約2倍の増量が認められ、これは、α1-アドレナリン受容体を介していた。3.8週齢、104週齢ラット耳下腺切片を用いてM3-ムスカリン作動薬又はα1-アドレナリン作動薬と反応させ管腔膜AQP5量を測定すると、M3-ムスカリン作動薬では8週齢ラットで3倍、104週齢ラットで2倍の管腔膜AQP5の増量が認められ、α1-アドレナリン作動薬では8週齢,104週齢ラットとも2倍の管腔膜AQP5の増量が認められた。4.IP3受容体とリアノジン受容体の加齢変化をウェスタンブロッティングで測定したところ、両受容体に加齢変化は認められなかった。5.[Ca^<2+>]iの加齢変化を、8週齢、104週齢ラット耳下腺遊離細胞にFura-2を取り込ませて、蛍光光度計を用いて測定したところ、老性低下が認められた。35のことから、M3-ムスカリン作動薬による耳下腺管腔膜におけるAQP5増量の老性低下は、[Ca^<2+>]iのM3-ムスカリン作動薬による上昇の老性低下に起因するものと推察された。各種刺激に伴う水チャネル・アクアポリン-5(AQP5)の細胞内移動、構造変化や機能変化の機序を明らかにし、唾液分泌におけるAQP5の役割を解明する目的で、本年度は下記の成果を得た。1) AQP5の細胞内局在ラット耳下腺管腔膜(APM)、基底膜(BLM)、細胞内顆粒膜(ICM)をSDS-PAGEに供し、ニトロセルロース膜に転写後、抗AQP5抗体を用いてウエスタンブロッティングにてAQP5の局在を検索したところAPMとICMにおいてその局在が認められ、BLMには認められなかった。2)刺激に伴うAQP5の細胞内移動耳下腺切片をアセチルコリン(ACh)、ピロカルピン(Pilo)、エピネフリン(Epi)と加温振盪し、上述の方法で解析するとAChでは反応開始後15秒でAQP5はICMよりAPMへ移動しAPMにおけるAQP5の量が対象群より5倍上昇し、5分後には元のレベルに戻っていた。ところが、このAQP5のAPMにおける量はPiloでは3分後に4倍に増加し、30分後でも対象群より3倍の増量を認めた。Epiでは3分後に2倍に増加して、10分後には減少傾向を認めた。そして、この移動にはM3-ムスカリン受容体とα1-アドレナリン受容体を介する情報伝達機構が関与していた。

3) AQP5の細胞内移動と情報伝達系M3-又はα1-作用薬によるAQP5の細胞内移動はTMB-8、ネオマイシン、ダントロレンで抑制されたが、H-7では抑制されなかった。従って、この移動には細胞内貯蔵部位よりCa^2が遊離され[Ca^<2+>]iが上昇して惹起されることが示唆された。4)耳下腺AQP5の加齢変化8、104週齢ラット耳下腺切片をAChで加温振盪するとAPMのAQP5量は各々4倍、2倍、Epiでは両者とも2倍上昇し、刺激に伴ってAQP5のAChに対する反応性が老化に伴って著しく低下することが認められた。各種刺激に伴うアクアポリン-5(AQP5)の細胞内移動、構造変化や機能変化の機序を明らかにし、唾液分泌におけるAQP5の役割を解明する目的で研究し、下記の成果を得た。1)AQP5の細胞内局在ラット耳下腺管腔膜(APM)、基底膜(BLM)、細胞内顆粒膜(ICM)をSDS-PAGEに供し、ニトロセルロース膜に転写後、抗AQP5抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検索したところAPMとICMにおいてAQP5の局在が認められ、BLMには認められなかった。2)刺激に伴うAQP5の細胞内移動耳下腺切片をアセチルコリン(ACh)、エピネフリン(EPi)と加温振盪し、上述の方法で解析するとAChでは反応開始後15秒でAQP5はICMよりAPMへ移動した。ところが、EPiでは1分後に最大に達して、10分後には減少傾向を認めた。そして、この移動にはM3-ムスカリン受容体とα1-アドレナリン受容体を介する情報伝達機構が関与していた。3)AQP5の細胞内移動と情報伝達系M3-又はα1-作用薬によるAQP5の細胞内移動はU-73122、TMB-8、ダントロレンで抑制されたが、H-7、GF 109203Xでは抑制されなかった。4)AQP5の細胞内移動に関与する因子AChやEPiによるAQP5の細胞内移動はCytochalasin DやTubulozole-Cで阻害され、この移動への細胞骨格の関与が示唆された。神経伝達物質による耳下腺管腔膜におけるAQP5増量の機序及びその加齢変化を追究することを目的に実験を行い、本年度は下記のような成果を得た。1.8週齢、104週齢ラット耳下腺切片をM3-ムスカリン作動薬又はα1-アドレナリン作動薬と反応後細胞分画し、管腔膜AQP5量をウェスタンブロッティングで測定した後、デンシドメーターで解析すると、M3-ムスカリン作動薬では8週齢ラットで3倍、104週齢ラットで2倍の管腔膜AQP5の増量が認められ、α1-アドレナリン作動薬では8週齢,104週齢ラットとも2倍の管腔膜AQP5の増量が認められた。2.Endoplasmic reticulum membraneおよびMicrosomal membraneを調製し、inositol-3-tris-phosphate(IP3)受容体とリアノジン受容体の老性変化を、各々の抗体を用いたウェスタンブロッティング法で測定したところ、両受容体に老性変化は認められなかった。また、[3H]IP3の結合実験の結果からもこの受容体に老性低下は認められなかった。3.8週齢、104週齢ラット耳下腺切片をコラゲナーゼとヒアロニデースで処理して遊離細胞を調製し、Fura-2を取り込ませた後、[Ca^<2+>]iの加齢変化を蛍光光度計を用いて測定したところ、老性低下が認められた。13のことから、M3-ムスカリン作動薬による耳下腺管腔膜におけるAQP5増量の老性低下は、[Ca^<2+>]iのM3-ムスカリン作動薬による上昇の老性低下に起因するものと推察された。そして、[Ca^<2+>]iのM3-ムスカリン作動薬による上昇の老性低下は(IP3)受容体やリアノジン受容体の老性低下のためではなかった。
脳虚血における骨髄由来単球・マクロファージと自然免疫受容体(TLR4)の関与

自然免疫受容体[=TLR]ファミリーの中でTLR4は、骨髄由来単球・マクロファージ[= MMφ](中枢神経系ではマイクログリア[= MG])等の貪食能を持つ細胞の細胞膜表面に発現し、炎症反応を引き起こす事が知られている。近年脳虚血の病態機構に各種炎症性サイトカインを含む免疫系の及ぼす影響の重要性が認識されるようになっている(Nat Med.17:796-808, 2011)。中枢神経系で炎症反応を制御する中心的な細胞はMGであり、一般の免疫系とは異なる免疫応答を形成するとされ、骨髄由来のMMφの働きに関してはあまり検討されてこなかった。そこで本研究はTLR4ノックアウトマウス(KO)とその骨髄キメラマウス、更に初代培養細胞を用いて、MMφとMGが自然免疫受容体(TLR4)を介して脳虚血に及ぼす影響を詳細に検討した。具体的には、致死量の放射線を投与したTLR4 KOマウスのwild typeに、TLR4 KOマウスのhomo又はwild typeの骨髄を移植し、骨髄キメラマウスを作成する。作成した骨髄キメラマウスに脳虚血負荷を与えて、MMφでのTLR4の発現が虚血障害を増悪させるかどうかを検討した。その結果、脳梗塞量はwild typeの骨髄を移植した場合には510+-72.2 mm3であった。一方homo typeの骨髄を移植した場合には358+-48.8 mm3で有意に減少した。またニューロンとMMφとのco-cultureでは、hypoxia負荷をかけた場合、TLR4 KOマウスのwild typeから誘導したMMφと共培養したときのみ、NOが産生され神経細胞死が誘導された。以上の結果から従来脳虚血とはあまり関係がないと考えられていた骨髄が、自然免疫受容体(TLR4)を介して重要な役割を果たすことが明らかとなった。TLR4ノックアウト( = KO)マウスを用いて作成した骨髄キメラマウスに、脳虚血負荷を与えて脳虚血障害の程度を検討した。方法としては、致死量の放射線(9Gy)を投与した雌のTLR4ノックアウト(= KO)マウスに、雄のTLR4 KOマウスのhomo type又はwild typeの骨髄を移植し、骨髄キメラマウスをそれぞれ作成した。骨髄移植が成功しているかどうかを調べる為に、実験終了後骨髄を採取し、PCRにて雄特有の遺伝子パターンを確認した。作成した骨髄キメラマウスに脳虚血負荷(中大脳動脈永久閉塞)を与えて24時間目での脳梗塞量の程度を検討した。その結果、wild typeの骨髄を移植した時に比して、homo typeの骨髄を移植した場合、平均21.1%の梗塞量の減少が見られた。また、TLR4 KOマウスのhomo typeとwild typeから初代培養神経細胞やグリア細胞、骨髄由来単球・マクロファージを採取し、それぞれ,LipidAやLPS負荷による影響を検討した所、TLR4 KOマウスのwild typeでは24時間以内にNO、IL-6、TNF-alphaの発現を認めたが、homo typeでは全く認めなかった。以上のことより、脳虚血障害のうち、20%は骨髄由来の炎症系細胞がTLR4を介して関与していることが、明らかとなった。またその作用機序にNO、IL-6、TNF-alphaといった炎症関連因子が関与している可能性も明らかとなった。また、TLR4 KOマウスのhomo typeとwild typeから初代培養アストロサイト、マイクログリア、骨髄由来単球・マクロファージを採取し、それぞれ,LipidAやLPS負荷による影響を検討した所、TLR4 KOマウスのwild typeでは24時間以内にNO、IL-6、TNF-alphaの発現を認めたが、homo typeでは全く認めなかった。更に、TLR4 KOマウスのhomo type又はwild type由来の初代培養神経細胞に低酸素障害を与え、その後それぞれのマウス由来のマイクログリアの共培養してやると、TLR4 KOマウスのhomo type由来の神経細胞に比して、wild type由来の神経細胞での細胞障害が大きくなる傾向がみられた。自然免疫受容体[=TLR]

ファミリーの中でTLR4は、骨髄由来単球・マクロファージ[= MMφ](中枢神経系ではマイクログリア[= MG])等の貪食能を持つ細胞の細胞膜表面に発現し、炎症反応を引き起こす事が知られている。近年脳虚血の病態機構に各種炎症性サイトカインを含む免疫系の及ぼす影響の重要性が認識されるようになっている(Nat Med.17:796-808, 2011)。中枢神経系で炎症反応を制御する中心的な細胞はMGであり、一般の免疫系とは異なる免疫応答を形成するとされ、骨髄由来のMMφの働きに関してはあまり検討されてこなかった。そこで本研究はTLR4ノックアウトマウス(KO)とその骨髄キメラマウス、更に初代培養細胞を用いて、MMφとMGが自然免疫受容体(TLR4)を介して脳虚血に及ぼす影響を詳細に検討した。具体的には、致死量の放射線を投与したTLR4 KOマウスのwild typeに、TLR4 KOマウスのhomo又はwild typeの骨髄を移植し、骨髄キメラマウスを作成する。作成した骨髄キメラマウスに脳虚血負荷を与えて、MMφでのTLR4の発現が虚血障害を増悪させるかどうかを検討した。その結果、脳梗塞量はwild typeの骨髄を移植した場合には510+-72.2 mm3であった。一方homo typeの骨髄を移植した場合には358+-48.8 mm3で有意に減少した。またニューロンとMMφとのco-cultureでは、hypoxia負荷をかけた場合、TLR4 KOマウスのwild typeから誘導したMMφと共培養したときのみ、NOが産生され神経細胞死が誘導された。以上の結果から従来脳虚血とはあまり関係がないと考えられていた骨髄が、自然免疫受容体(TLR4)を介して重要な役割を果たすことが明らかとなった。提出した研究計画に従い、概ね順調に計画が進んでいる。提出した研究計画に従い、in vivoで得られた結果をin vitroの系で確認していく。前年度の研究で、初代培養アストロサイトとマイクログリア細胞はTLR4がKOされると、急性期(24時間以内)ではLPSに反応しないことが明らかとなった。そこで今年度では、TLR4 KOマウスのhomo typeとwild typeから採取した初代培養神経細胞に低酸素負荷を加えた後、TLR4 KOマウスのhomotypeとwild typeから採取した骨髄由来マクロファージやマイクログリアと共培養を行う実験を継続していく。その際両者をmixして共培養する方法と、culture insertを用いて、同じwellで培養するが、両者を別々で培養する方法を合わせて検討する。これにより、骨髄由来マクロファージやマイクログリアが直接障害ニューロンに作用するのか、それとも液性因子を介して関与するのかを明らかとしていく。提出した研究計画に従い、順調に計画が進んでいる。研究は予定通り進んでいる。今回1回のin vitro実験で有意な結果を得ることが出来た。このため追加実験をする必要がなく、40万程度の余剰金ができた。具体的には、TLR4 KOマウスのhomo typeとwild typeから採取した初代培養神経細胞に低酸素負荷を加えた後、TLR4 KOマウスのhomo typeとwild typeから採取した骨髄由来マクロファージやマイクログリアとの共培養を行う。
高緯度域の海洋酸性化と温暖化に対する植物プランクトン多様性の生態系機能の解明

昇温や海洋酸性化の複合的な環境変化生態系サービスに及す影響を把握することは重要な課題である。本研究において昇温や海洋酸性化の複合的な環境変化に対する生物多様性の変化を調査した結果,天然環境における植物プランクトンは,さまざまなニッチを持った植物プランクトンが共存していること,環境変化によって特定のニッチを持った種あるいは分類群が卓越し得ることが明らかになった。すなわち,環境変化は多様性を低下させ,さらなる環境ストレスにさらされた場合に生産性を維持するための生態系の頑強性が低下することを示唆している。人間活動に伴い,大気の二酸化炭素濃度は上昇し続けている。この二酸化炭素濃度の上昇速度は,過去数千万年の地球史における自然変動では見られなかったほど急速であるため,生物環境に与える影響が懸念されている。二酸化炭素のような温室効果のあるガスの濃度上昇は,気温の上昇(温暖化)にも寄与しうる。さらに,二酸化炭素は地球表面の約7割を占める海に溶け込んでおり,海水の酸性度が上昇(海洋酸性化)していることも最近明らかになってきた。すなわち,将来の海は現在と比較して温暖で酸性度の高い環境になることが予測されている。しかしながら,複合的な環境ストレスが海洋生物に与える影響に関する知見は極めて限られている。本研究で対象とする生物は主に植物プランクトンとした。海洋の植物プランクトンの生産は,ほぼ全ての海洋動物のエネルギー源となるだけでなく,我々人類が呼吸で使用する酸素の約半分は彼らの光合成によって生産されたものである。人間活動による環境ストレスが,植物プランクトンに何らかの影響を与えることがあれば,その影響は海洋生態系のみならず,人間の活動にも直結しうるため,知見を充足させる必要のある喫緊の課題である。2015年度の本申請研究では,学術研究船「白鳳丸」KH15-01次および海洋地球研究船「みらい」MR15-03次航海に乗船し,それぞれの航海において,1回の船上培養実験を行った。培養での実験条件は,温暖化,海洋酸性化並びに複合的な影響を解明するため,各要員を組み合わせた設定で行った。春期の親潮域(学術研究船「白鳳丸」KH15-01次航海)および北極海(海洋地球研究船「みらい」MR15-03次航海)で調査を行う研究船に乗船し,1回ずつ船上での培養実験を予定通り行った。試料の分析も予定通り進んでおり,一部の成果についてはESSAS annual meeting 2015 (2016年3月中旬)および日本海洋学会の春季大会(2016年3月下旬)で口頭発表,Ocean ScienceMeetingでのポスター発表を行った。また,2016年5月にオーストラリアで行われる,海洋酸性化に関する国際シンポジウムでも「白鳳丸」KH15-01航海で得た結果を用いて口頭発表を行う予定であり,順調に進展している。人類活動に伴って大気に放出されたCO2は,温室効果をもつだけでなく,海水に溶け込むことでpHを低下させている。この海洋環境の変化が生態系サービスに及す影響を把握することは重要な課題であるが,昇温と海洋酸性化の複合影響に関する知見は著しく不足している。本研究では海洋生態系の基盤である植物プランクトンを対象とし,昇温や海洋酸性化の複合的な環境変化に対する生物多様性の変化を調査することで,将来の海洋生態系サービス機能の変化の可能性を見いだすことを目的とする。天然プランクトン群集を用いた培養実験を,冬季の西部亜寒帯北太平洋で1回(学術研究船「白鳳丸」KH15ー01次航海(2015年3月)),夏季の西部北極海で2回(海洋地球研究船「みらい」MR15ー03(2015年9月)およびMR16ー06次航海(2016年9月))行った。冬期のKH15ー01次航海で行った実験では,温暖化と酸性化の相乗作用により,小型の植物プランクトンが比増殖速度を加速させていた一方で,大型である珪藻の比増殖速度が低下した。西部北極海で行った2回の実験では,温暖化によりほぼ全ての植物プランクトン分類群の比増殖速度が上昇していたが,2015年の実験では,昇温条件下において珪藻の多様性の低下がみられた。これらの結果から,天然環境における植物プランクトンは,さまざまなニッチを持った植物プランクトンが共存していること,環境変化によって特定のニッチを持った種あるいは分類群が卓越し得ることが明らかになった。本研究成果から,海洋生態系の持続可能な利用を考える上では,人為起源の環境じょう乱を可能な限り低減させることが重要だと結論付けられる。現在までに得られたデータからは,海洋酸性化のみの環境

ストレスが植物プランクトン群集に与える影響は小さいことが示された。しかしながら,温暖化と海洋酸性化の複合ストレス環境下では,小型の植物プランクトンが増加する現象が見られた。このことは,動物プランクトンや魚へのエネルギーの転送効率の低下,並びに,海洋による大気二酸化炭素の吸収効率の低下を示唆している。今後は粒状物質の分析により,光合成によって取り込まれた炭素の動態について分析・解析を進めることで,環境ストレスの複合化が生態系にどのようなインパクトを与えうるのか精査する。生物海洋学
リスクベースデザインのためのフェーズフィールド法と組織自由エネルギー理論の融合

材料の組織の安定性を自由エネルギーの視点から明らかにする「組織自由エネルギー理論」と、場の関数として与えられた状態変数の時間発展を明らかにする「フェーズフィールド法」を融合させて、金属材料の複雑な組織変化を定量的に予測することを目的として、金属材料の中で最も複雑な組織を示すフェライト系耐熱鋼を対象とし研究を進め、これまでに(i)Fe-C-Cr-Co-W-Mo系における炭化物、金属間化合物のTTP(Time-Temperature-Precipitation)図の作成、(ii)Fe-C-Cr-W系におけるLaves相の析出形態変化のシミュレーション、(iii)鉄の加工組織の回復・再結晶過程のフェーズフィールド法によるシミュレーション、等を行ってきた。その過程で、材料の組織変化に伴う組織自由エネルギー値の変化が定量的に求めることができれば、組織形態の変化を時系列的に得ることができることがわかった。この観点でマルテンサイト組織の組織自由エネルギーの定量化を行った結果、組織エネルギーに対して結晶粒やマルテンサイトパケット境界などに起因する界面エネルギーの割合が1割程度と小さいく、マルテンサイト相の組織エネルギーの大部分は歪エネルギーであることがわかった。さらに、その歪エネルギーは焼戻し処理でほぼ80%が開放され、クリープなどに伴うその後のエネルギー変化は2J/mol程度であることもわかった。このような小さなエネルギーを駆動力として組織変化を生じるためには、フェライト粒の不均一生成が不可欠であることが示唆され、この不均一生成が長時間クリープ強度の非線形的な劣化と密接に関連するものと考えられる。以上の研究から、リスクベースデザインのためには組織自由エネルギーを精度よく見積ることが最も重要であり、それによりフェーズフィールドシミュレーションが容易になるとの結論を得た。様々な組織の安定性を自由エネルギーの視点から明らかにする「組織自由エネルギー理論」と、場の関数として与えられた状態変数の時間発展を明らかにする「フェーズフィールド法」を融合させて、金属材料の複雑な組織変化を定量的に予測することが本研究の目的である。この目的のために、金属材料の中で最も複雑な組織を示すフェライト系耐熱鋼を対象とし研究をすすめている。本年度に得られた結果を以下に示す。(2)鋼に用いることができる組織自由エネルギーパラメータを決定するために、Fe-C-Cr-W系を用いて金属間化合物であるLaves相の析出形態変化をシミュレートし、その結果をFe-C-Cr-Co-W系の鋼で観察されるLaves相形態と比較検討して、用いたパラメータの評価を行った。(3)鋼の組織形態の変化をフェーズフィールド法により予測するための第一歩として、鉄の加工組織の回復・再結晶過程をフェーズフィールド法によりシミュレートし、SEM/EBSD法で行った再結晶実験の結果と比較検討をした。その結果、シミュレーションでは、内部組織変化を表す新たなフェーズフィールド変数を今後考慮する必要があることがわかった。これらの結果を踏まえて、次年度以降「組織自由エネルギー理論」と「フェーズフィールド法」の融合を目指す。様々な組織の安定性を自由エネルギーの視点から明らかにする「組織自由エネルギー理論」と、場の関数として与えられた状態変数の時間発展を明らかにする「フェーズフィールド法」を融合させて、金属材料の複雑な組織変化を定量的に予測することを目的として、昨年度、金属材料の中で最も複雑な組織を示すフェライト系耐熱鋼を対象とし研究を進めた。その結果、(i)Fe-C-Cr-Co-W-Mo系における炭化物、金属問化合物のTTP (Time-Temperature-Precipitation)図を作成した。(ii)Fe-C-Cr-W系におけるLaves相の析出形態変化をシミュレートした。(iii)鉄の加工組織の回復・再結晶過程をフェーズフィールド法によりシミュレートした。

今年度はニッケル基超合金のリスクベース設計のための表面安定性や表面組織を調べると共に、引き続きフェライト系耐熱鋼においても、炭化物、金属間化合物の界面エネルギー評価のための粒成長速度線を求める実験を進めた。その結果、(1)ニッケル基合金の表面安定性を保持するためには少なくとも2mass%Cr以上のCrが不可欠であること、(2)Reはニッケル基合金の耐高温安定性を劣化させること、(3)複合酸化物の高温安定性はそれぞれの単一酸化物の蒸気圧から予測される高温安定性とは一致せず、NiO-Cr_20_3複合系では複合化により不安定性が増加すること、(3)炭化物、金属間化合物の成長に対してCoはそれを促進すること、(4)結晶粒やマルテンサイト組織の成長速度は界面律速から予測されるそれより小さいことが明らかとなった。これらの結果を踏まえて、次年度は組織自由エネルギーを見積るための界面エネルギー等の決定を行い、マルテンサイト組織の組織自由エネルギーを見積るとともに、その組織変化をフェーズフィールド法によりシミュレートする。材料の組織の安定性を自由エネルギーの視点から明らかにする「組織自由エネルギー理論」と、場の関数として与えられた状態変数の時間発展を明らかにする「フェーズフィールド法」を融合させて、金属材料の複雑な組織変化を定量的に予測することを目的として、金属材料の中で最も複雑な組織を示すフェライト系耐熱鋼を対象とし研究を進め、これまでに(i)Fe-C-Cr-Co-W-Mo系における炭化物、金属間化合物のTTP(Time-Temperature-Precipitation)図の作成、(ii)Fe-C-Cr-W系におけるLaves相の析出形態変化のシミュレーション、(iii)鉄の加工組織の回復・再結晶過程のフェーズフィールド法によるシミュレーション、等を行ってきた。その過程で、材料の組織変化に伴う組織自由エネルギー値の変化が定量的に求めることができれば、組織形態の変化を時系列的に得ることができることがわかった。この観点でマルテンサイト組織の組織自由エネルギーの定量化を行った結果、組織エネルギーに対して結晶粒やマルテンサイトパケット境界などに起因する界面エネルギーの割合が1割程度と小さく、マルテンサイト相の組織エネルギーの大部分は歪エネルギーであることがわかった。さらに、その歪エネルギーは焼戻し処理でほぼ80%が開放され、クリープなどに伴うその後のエネルギー変化は2J/mol程度であることもわかった。このような小さなエネルギーを駆動力として組織変化を生じるためには、フェライト粒の不均一生成が不可欠であることが示唆され、この不均一生成が長時間クリープ強度の非線形的な劣化と密接に関連するものと考えられる。以上の研究から、リスクベースデザインのためには組織自由エネルギーを精度よく見積ることが最も重要であり、それによりフェーズフィールドシミュレーションが容易になるとの結論を得た。
多重水素結合無機-有機複合モジュールを用いた一次元階層構造の構築

本研究は、材料化学において改めて注目されている一次元性階層構造を、無機-有機複合モジュールをビルディングブロックとし、特異的な多重水素結合を結合的相互作用として用いて構築する物質創製研究である。特殊な水素結合を組み込んだ階層構造の相互作用系研究は現在までほとんど知られていない。そこで本研究では、多重水素結合一次元性階層構造の合理的合成法の確立と合成された化合物群のキャラクタリゼーションを行った。本研究は、材料化学において改めて注目されている一次元性階層構造を、DNAに倣った多重水素結合を埋め込んだ無機-有機複合モジュールをビルディングブロックとして構築する物質創製研究である。そこで本研究では、上記多重水素結合金属錯体-有機物モジュールを用いて一次元性階層構造を構築する。さらに、得られた低次元性物質の物性を検討するとともに、集積体の酸化還元を行うことで電導性と水素結合の量子融解状態を発現させ、電子移動とプロトン移動がカップルした多重機能を発現する素子の構築を目指す。本年度は、テトラヒドロジオキソピラジンジカルボニトリル(H_2tdpd)を配位子とする金属錯体と特異的な酸化還元特性をもつ機能性置換基を導入したメラミン誘導体をパートナーとして得られる、AAA-DDDあるいはAAAA-DDDD多重水素結合により繋がれた金属錯体-有機物ハイブリッドモジュールを用いて、一次元階層構造を構築した。これらモジュールは、平面性が高く、上下の配位座が空いているため、配位結合、スタッキングにより集積(積層)していた。そこで、これら複合モジュールを用い、金属錯体とパートナーの特殊な酸化状態を達成するために電解合成により"ポリメリック"な集積化を検討した。得られた一次元階層構造のIR、ラマン分光測定等を行い、多重水素結合のキャラクタリゼーションを行った。23年度は、一次元階層構造の構築を行った。申請者はこれまでに、銅(II)とテトラヒドロジオキソピラジンジカルボニトリル(H_2tdpd)とメラミン誘導体を用いて、AAA-DDDタイプの三重水素結合により繋がれた金属錯体-有機物ハイブリッドモジュールの合成に成功している。23年度は、この合成法を参考にして酸化還元が可能な様々な金属イオン(コバルト、ニッケル、マンガン)とメラミン誘導体を用いて出発モジュールを合成した。水を溶媒としニッケル(II)を金属イオンとして用いた場合、上下に水が配位したモジュールが得られた。このモジュール上の配位水は、温度上昇に伴いメラミン誘導体の置換基の運動に連動して脱離することが明らかになった。さらに、これらモジュールをピラジンあるいはビピリジンで架橋した一次元鎖錯体の構築に成功した。また、メラミン誘導体を用いない場合、金属(II)-tdpd錯体がピラジンあるいはビピリジンで架橋された一次元鎖錯体が溶媒を介した多重水素結合で結ばれた集積体の構築に成功した。遷移金属錯体をビルディングブロックとした金属錯体集積体は、複合化された階層構造と単一の金属錯体にはない量子的性質を持つことから、多面的な化学特性を持つことができる。一方、水素結合は生体を構成する重要な相互作用であるとともに、自己組織化の主要な相互作用として多くの分野で注目されている。また、水素結合により連結された化合物は、そのプロトン移動を介した物性発現、あるいは電子移動とプロトン移動が競合することによる新しい物性発現が期待される。従って、水素結合を補助的相互作用とする金属錯体階層構造設計は新たな機能性物質構築につながると考えられる。H2tdpdを配位子とする金属錯体と特異的な酸化還元特性をもつ機能性置換基を導入したメラミン誘導体、あるいはメレムをパートナーとして得られる、AAA-DDDあるいはAAAA-DDDD多重水素結合により繋がれた金属錯体-有機物ハイブリッドを用いて、一次元階層構造を構築する。これらモジュールは、平面性が高く、上下の配位座が空いているため、配位結合、スタッキングにより集積することが予想される。そこで、これら複合モジュールを用い、金属錯体とパートナーの特殊な酸化状態を達成するために電解合成により“ポリメリック"な集積化を図った。

得られた一次元階層構造の伝導性、磁性、誘電性、IR、ラマン分光測定等を行い、水素結合の関与した物性発現機構を検討した。銅以外の金属イオン(コバルト、ニッケル、マンガン)を用いた出発モジュールの合成に成功したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は、有機無機複合モジュールをビルディングブロックとする一次元階層構造とその酸化あるいは還元体の構築を行う。複合モジュールの特殊な酸化状態を達成するため電解合成を試みる。その際、金属イオン、メラミン誘導体、メレムの酸化還元電位に相当する電位により電解合成を行う。
胆汁酸メタボローム解析システムの構築

胆汁酸の各種抱合体の標品を用いて、HPLC分離条件を確立した。また、低エネルギーCIDによるプロダクトイオンの生成パターンを精査し、各抱合型胆汁酸の開裂の特徴を整理した。得られたデータを基にプリカーサーイオンスキャンあるいはニュートラルロススキャンを駆使して抱合形式ごとに胆汁酸メタボロームをフォーカシングする手法を構築した。さらにコレステロール代謝に異常を来す疾患患者の尿を分析し、それぞれの疾患に特徴的な胆汁酸代謝物を解析できることが明らかとなった。ヒトにおける主要胆汁酸およびそれらのグリシン抱合体、タウリン抱合体、硫酸抱合体、N-アセチルグルコサミン抱合体の標品を用いて、HPLC分離条件に付き検討した。その結果、酢酸アンモニウムとメタノールの混液を用いるリニアグラジエント溶出により、各種抱合型胆汁酸を効率的に分離できることが判明した。次に、各種標品を用いて、トリプルステージ四重極型質量分析法によるCIDの特徴を精査するため、各種CID条件下におけるフラグメントパターンを調べた。その結果、グリシン抱合体およびタウリン抱合体においては、側鎖アミノ酸に由来するm/z74およびm/z124のイオンをそれぞれ生成することが判った。硫酸抱合体においては、硫酸基部分に由来するm/z97を強く生成し、N-アセチルグルコサミン抱合体では、質量差203のニュートラルロスを生じることが明らかとなった。これまでの結果を踏まえ、横軸が保持時間、縦軸がm/z、ピークの強度を等高線表示することにより、各種抱合型胆汁酸の二次元マップ化を試みた。次いで、m/z97のプリカーサーイオンスキャンにより抽出されたピークを先の二次元マップに重ね合わせることにより、硫酸抱合型胆汁酸を容易に特定できることが判明し、同様の手法でグリシン抱合型、タウリン抱合型胆汁酸についてもフォーカシングできることが判った。さらに、質量差203のニュートラルロススキャンにより、N-アセチルグルコサミン抱合体についてもフォーカシング可能であることが判明し、本法が未知の抱合型胆汁酸の同定に有用であることが示唆された。まず、グルクロン酸抱合体のフォーカシングにつき検討し、3位水酸基および24位カルボキシル基のどちらに結合した場合でも、グルクロン酸部分に相当する176Daのニュートラルロススキャンでフォーカシング可能なほか、24-グルクロニドはm/z175のプロダクトイオンも生じることから、抱合形式を明確に識別できることも明らかとなった。これまでの成果をもとに、本法による各種抱合型胆汁酸のフォーカシング性能の検証を試みた。その結果、プリカーサースキャンやニュートラルロススキャンを駆使することにより、多種類の抱合型胆汁酸混合物による複雑なマップから、それぞれの抱合体を選択的に抽出したマップを作成可能であることが判った。次に、健常人、3β-HSD欠損症患者、およびNiemann-Pick病type C患者尿を用いてそれぞれの抱合型胆汁酸マップを作成し、比較検討した。その結果、m/z97のプリカーサースキャンによりフォーカシングしたマップを解析すると、健常人に比べて両疾患患者の尿中に多量でかつ多種類の硫酸抱合型胆汁酸類が存在することが判明した。特に、硫酸抱合とアミノ酸抱合などの複数の抱合代謝を受けた胆汁酸類が数多く存在しており、それぞれのフォーカシングマップを重ね合わせることにより、マルチ抱合体を容易に特定することが可能であった。一方、3β-HSD欠損症患者尿中には、ステロイド骨格中に二重結合を一つ有する硫酸抱合体が強く観測され、それらが酵素欠損により蓄積した3β-sulfooxy-Δ5系の胆汁酸類であることが推測された。Niemann-Pick病type C患者の場合はさらに複雑で、3β-sulfooxy-Δ5系の胆汁酸類のほかに、7β位がN-アセチルグルコサミンで抱合され、かつ側鎖末端がグリシンあるいはタウリンにより抱合された多重抱合型胆汁酸類が高濃度で存在することが明らかとなった。以上、タンデム質量分析法を駆使することにより、抱合型胆汁酸のメタボローム解析が可能であることが明らかとなり、本研究の成果が各種疾患との関連の精査に役立つものと期待される。
前駆細胞のM期に始まる破骨細胞分化:増殖・分化切り換え点における細胞周期逸脱機構

破骨細胞は大型で多核の細胞であり、単核の前駆細胞どうしが細胞融合して形成されることが分かっている。造血幹細胞に由来する破骨細胞プロジェニターはRANKL等の破骨細胞分化因子で構成される骨微小環境下、分裂を繰り返しながら真の破骨前駆細胞になっていくのであるが、細胞周期のどの時期から破骨細胞へ分化するか不明であった。筆者等はラット破骨細胞が特異的に発現する膜表面分子Kat1抗原を見出し既に数編の論文を報告している。本研究に於いて、Kat1抗原の発現等を指標として破骨細胞分化の過程を形態学的に追跡したところ、細胞分裂中の破骨細胞プロジェニターの片方の細胞のみが本抗原を発現するようになることを見出した。抗Kat1抗原モノクローナル抗体は中枢神経系の細胞であるアストロサイトにも反応した。そこでラットアストロサイト細胞株である、RCR-1細胞の細胞周期をコルセミド処理によりM期に同調させたところ、多数の細胞分裂期のアストロサイトが本抗原分子を発現することが分かった。染色パターンを解析したところ、破骨細胞プロジェニターの場合と同様、M期後期の片方の細胞のみが染色される、という所見が高頻度に観察された。アストロサイトの分化に於いても細胞周期のM期に細胞分化が開始するようである。Kat1抗原分子がM期に於ける破骨細胞プロジェニターの分化を方向付ける因子の特異的レセプター分子である可能性も考えられたので、本抗原分子の実態解明を行い本抗原分子がレクチンのひとつGalectin3に関連性の高い分子であることが示された。本研究計画に含まれる、分裂中の破骨細胞プロジェニターを顕微鏡下でKat1陽性部分と陰性部分に分けて回収する作業は技術的に極めて困難であったので、M期に同調したRAW-D細胞のcDNAライブラリーの作成を検討中である。本研究により、M期を標的とした、骨吸収制御が可能になるものと思われる。本研究では増殖する破骨細胞プロジェニターがM期になって分裂する細胞の片割れのみが破骨細胞に特異的なマーカーであるKat1抗原を持つようになり、破骨細胞の前駆細胞へと分化していくメカニズムを解析することと、細胞周期を制御する分子と細胞分化への切り換え機構を明らかにしていくことを目的としている。これらの機構を解析する手始めとして、Kat1抗原分子の分子解析を行なった。ラット骨髄細胞を調整し、マクロファージ及び骨髄ストロマ細胞をセファデックスG10カラムで除去し、得られた非付着性骨髄細胞を50ng/ml TNFα及び20ng/mlのRANKLの存在下、4日間培養した。得られた細胞を温和に作用する界面活性化剤CHAPSを含む緩衝液にて可溶化し、抗Kat1抗原モノクローナル抗体を結合させたセファロース4Bカラムを用いてアフィニティー・クロマトグラフィーを行なった。抗原を吸着させた後、CHAPSを含む緩衝液で十分に洗浄を行い、トリクロル酢酸を用いて抗原の溶出を行なった。溶出フラクションを凍結乾燥し12%SDSゲル電気泳動を行なった。銀染色後、抗原のバンドを切り出し、アセトニトリルで脱水、アセトアミド化を経て、トリプシン消化を行った。消化されたペプチドをトリクロル酢酸/アセトニトリルを用いた溶媒で回収し、質量分析用のコンテナにプールした。スピードバック・コンセントレーターを用いて濃縮後、質量分析計LCQにて測定を行なった。その結果、複数の抗原分子の侯補分子が得られた。

更に候補分子のcDNAを米国の研究者から得ることができたので、現在、種々の細胞にcDNAを発現させることによって抗原分子を特定しているところである。平成14年度は本研究では避けることのできない抗原分子の特定を優先させた。分子の特定ができれば破骨細胞分化の初期過程の機構解析も分子レベルのものになると考えられる。細胞周期のM期に於いて、細胞分裂する破骨細胞プロジェニターの片割れのみが破骨細胞に特異的なマーカーであるKat1抗原を発現するようになり、この片割れのみが破骨細胞の前駆細胞へと分化していく。この細胞増殖・分化切り換え機構を解析し、細胞周期を制御する分子との関連性を解明することを本研究の目的としている。細胞周期のM期に発現する、破骨細胞の分化マーカーであるKat1抗原の実体解明を最初の目的とした。ラット骨髄細胞より形成したKat1陽性破骨細胞を界面活性剤CHAPSを含む緩衝液にて可溶化し、抗Kat1抗原モノクローナル抗体を結合させたセファデックス4Bカラムを用いてアフィニティー・クロマトグラフィーを行った。溶出画分をSDS-PAGEにより分離後、抗原のバンドを切り出し、トリプシン消化後、得られたペプチド断片について質量分析を行い、抗原分子の同定を試みた。その結果、Kat1抗原はgalectinである可能性が強く示唆された。Galectin分子がM期の細胞の膜表面に特異的に発現するという報告は過去に無く、極めて興味深い知見である。抗Kat1抗原モノクローナル抗体は、破骨細胞の他にラットのアストロサイトにも反応することがわかった。ラットアストロサイト細胞株でも反応性を確認したところ、M期の細胞が本抗体により明瞭に検出された。コルセミドを用いてM期に細胞周期を同調させたところ、多数のKat1陽性細胞が出現した。アストロサイトの分化に於いても、M期に於いて細胞増殖と分化の切り換えが起こっている可能性を示唆する結果である。ラットの破骨細胞株が確立されていないこともあり、このアストロサイト細胞株を用いて分子生物学的解析を行った。細胞生物学の教科書に記述してある、「細胞周期のG0期(通常G1期の後期との記述が多い)に入った細胞が分化する」、という一般的であるが極めて漠然とした表現を書き改めねばならない新知見が本研究によって得られるものと思われる。
関節リウマチの関節病変、骨粗鬆症および筋肉減弱症におけるミオスタチンの関与

当院外来通院中の関節リウマチ(RA)患者96名を対象に、BIA法による体組成計の測定、およびELISAによるミオスタチン、IL-6、FGFbetaの測定を行い、同時に記載された疾患活動性指標、臨床検査値を調査し、それぞれのELISA結果との相関関係について検討した。その結果、血清ミオスタチン値はRA患者の筋肉量と正の相関を、脂肪量と負の相関を、疾患活動性とは負の相関を、それぞれ認めた。このことより、血清ミオスタチン値は関節リウマチに伴う筋肉減弱症のバイオマーカーとなりうることが示唆された。これらの結果は2019年度日本リウマチ学会学術総会(2019年4月京都)のワークショップ口演にて発表を行い、現在論文作成を行っている。1つ目の横断研究は解析が進んでいるが、前向き研究のデータ収集がまだ十分行われていない状況である。横断研究の結果の論文化、および前向き研究のデータ収集を引き続き行う。[関節リウマチ(RA)患者における血中ミオスタチン、FGF2、IL-6と疾患活動性および関節病変、骨密度、体脂肪量、筋肉量についての横断的解析]実臨床でのRA患者を対象としたマイオカインに関連した研究報告は存在しない。そこで今回測定するマイオカインとして特に本研究に重要と考えられたミオスタチン以外に、ELISA測定系が安定して確立しており、かつミオスタチンとは異なる機序でRAの病態形成や、骨粗鬆症、筋肉減弱症との関連が示唆されるFGF2とIL-6を選択し、これらの因子のRAに対する臨床的意義を明確にし、RA疾患活動性や治療法(特に生物学的製剤などの抗サイトカイン治療)の与える影響について、昨年度に本研究参加の承諾を得た178例のRA患者を対象とし、以下の計画を実施中である。1血清マイオカイン測定;血清ミオスタチン、FGF2、IL-6をそれぞれ測定中である。2患者病歴および治療内容、血清採取時点の疾患活動性評価;血清CRP値、RF値、腫脹関節数、疼痛関節数、DAS、腰椎及び大腿骨頸部の骨密度(DEXA法により測定する)、身長、体重、BMI、および体脂肪量、筋肉量、除脂肪体重(bioelectrical impedance analysis (BIA法)により測定する)、病歴、合併症および治療内容;RAの病歴、既往歴と合併症、薬剤使用歴、生物学的製剤の有無と種類、ステロイド使用の有無と使用量、DMARDの種類と使用量、骨粗鬆症治療薬の有無と種類などのデータを収集中である。これらを元に、血清ミオスタチン値、FGF2値、IL-6値とRA疾患活動性、関節病変、骨密度、筋肉量、体脂肪量、および治療プロファイル、特に生物学的製剤の有無と種類、ステロイド使用の有無、骨粗鬆症治療薬の有無と種類の関連について、横断的な統計解析を行う予定である。昨年度の患者のリクルートは目標200名にわずか及ばなかったものの、概ね目標通りの患者数(178名)に達しており、外来レベルで可能な検査、及び筋肉量の測定はすでに終了しており、データ収集を行なっている最中である。血清マイオカインのELISA測定については、ELISA kitの必要数が当初の予定より多くなってしまい、一部の検体でまだ測定が行われていないが、本年度早い時期に測定を終える予定である。これらの作業が終了すれば、まず当初の目標である「関節リウマチ患者における筋肉減弱症、骨粗しょう症と、マイオカインの関与」についての横断研究を行うことができる。これについては来年度の国内外のリウマチ関連の学会での発表及び論文作成へと繋げていく予定である。また、近日中に本年度の予定である1年後の患者リクルート及びデータ取りを行う予定としており、前向き試験用のデータ収集を控えており、総合的には概ね順調に進展していると考えている。上記で示した通り、関節リウマチ(RA)患者の関節病変、RA関連骨粗鬆症、筋肉減弱症の横断的なデータ解析を行い、国内外での学会発表や論文作成を行なっていく予定である。また初年度にデータを得た症例を中心に、1年後の変化を観察し、血中ミオスタチン(もしくはFGF2、IL-6)濃度の変化がRA関節病変、骨密度や体脂肪量、筋肉量、さらに疾患活動性や治療内容と関連するかどうかを評価する。これらの検討からRA関連骨粗鬆症や筋肉減弱症の進行の危険因子を同定し、関連する知見を集積する予定である。