hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄損傷の電気生理学的機能評価法の確立と薬効評価

本研究では、1)脊髄損傷に有効な薬物がまだないことから、すでに臨床で使用されている医薬品から有効な薬物を探索すること、2)脊髄損傷における神経の障害とその再生を、神経電気生理機能のレベルで評価できる系を確立すること、3)探索された薬物が神経電気生理機能のレベルで、脊髄損傷の予防・治療に有効であるかを明らかにすることを目的とした。糖尿病治療薬ピオグリタゾンが、運動障害の回復を促進し、慢性痛の発現を抑制すること、さらに電気生理学的評価により、脊髄運動系における下行性セロトニン神経の機能障害を予防または回復することが示された。本邦の脊髄損傷の患者は10万人以上にのぼるが、有効な薬物はなく、受傷直後にステロイド大量療法が行われるがさほど有効ではない。そこで、本研究では、脊髄損傷を神経機能のレベルで評価できる系を確立し、薬物の薬効評価を行うことを目的としている。脊髄損傷のモデル動物を用いて、行動評価の他に、神経誘発電位を指標として、脊髄内の神経回路、上行性・下行性の神経連絡の回復を測定できる系の開発を目指した。1)ラットの脊髄背面に重りを落下して作製した脊髄損傷モデルにおいて、損傷後、経日的にラットを麻酔・脊髄を露出し、単シナプス反射電位を記録し、脊髄内抑制の強度についても研究した。損傷によりシナプス前抑制が増強しており、この増強はセロトニン前駆物質の投与により減弱したことから、下行性セロトニン神経のシナプス前抑制への抑制が、脊髄損傷により低下することが示唆された。2)損傷ラットの重度と軽度のモデルにおいて、重度のものほど脊髄セロトニン含量の低下が見られた。また重度のモデルほど、選択的セロトニン取り込み阻害薬による単シナプス反射抑制が大きく、重傷度、セロトニン含量、抑制作用に相関が見られた。3)マウスのモデルにおいてPPAR-γアゴニストが、機械的痛覚過敏の発症を完全に抑制した。さらに、損傷28日後に投与したギャバペンチンとプレギャバリンは神経因性疼痛を緩解した。脊髄損傷の患者は10万人以上にのぼるが、有効な治療薬はない。本研究では、脊髄損傷を神経機能のレベルで評価できる系を確立し、薬物の薬効評価を行うことを目指す。1)マウスにおける誘発筋電図法による機能評価マウスの脊髄背面に錘を落し作製した脊髄損傷モデルにおいて、経日的に運動評価を行い、誘発筋電図法により脊髄反射電位を記録した。マウスにおいてM波、H波およびF波が記録できた。損傷によってH/M比、F/M比が増加し、反射経路や脊髄運動ニューロンの興奮性が高まっていることが示された。抑制過程を意味するH波のrate depressionは損傷において減少した。これらの変化は、最終的には脊髄運動ニューロンの興奮性が高まっていることを示し、この方法が治療薬の評価に有用であると考えられた。2)マウスにおけるスタチン系薬物による運動機能の回復スタチン系薬物には抗炎症や神経再生の作用があることが示されているので、アトルバスタチンとシンバスタチンの脊髄損傷改善効果を運動機能と痛覚機能を指標として評価した。両者は脊髄損傷後28日間の経口投与により、運動機能を著明に改善した。一方、損傷後に発症する神経障害性疼痛に対しては、アトルバスタチンのみが著明な改善効果を示し、シンバスタチンは無効であった。今回、行動評価において活性が強い薬物を見出したので、今後、電気生理学的評価を行う予定である。3)ラットにおける脊髄反射電位測定による機能評価平成20年度の研究で、ピオグリタゾンはマウスの脊髄損傷において運動機能を回復させることを見出している。本年度はラットで運動評価と神経機能評価をおこなったが、セロトニン神経系の再生との関連は明らかではなかった。4)ギャバペンチンとプレギャバリンが脊髄損傷後の痛みを抑制することを見出した。本邦の脊髄損傷の患者は10万人以上にのぼるが有効な治療薬はない。本研究は、脊髄損傷を治療する薬物を臨床に用いられている医薬品から探索し、候補薬による脊髄損傷からの回復が下行性セロトニン神経の再生によるか否かを電気生理学的な手法によって明らかにすることを目指している。1.平成21年度の研究で、高脂血症治療薬アトルバスタチンは脊髄損傷後の運動機能障害と神経障害性疼痛を改善した。さらに同用量のシンバスタチン(5および10mg/kg, p.o.、28日間投与)は運動機能障害を改善したが、疼痛の改善効果はまったく見られなかった。本年度は低用量のシンバスタチン(0.1および1mg/kg)を評価し、0.1mg/kg群で運動機能改善効果と神経障害性疼痛改善効果が示された。1mg/kg群は運動機能は改善したが、痛覚改善効果は弱く、1mg群は非損傷マウスへの投与で神経障害性疼痛を生じた。

2.平成20年度の研究でマウスの脊髄損傷を改善した糖尿病治療薬ピオグリタゾンを用いて、ラットの脊髄損傷改善効果を調べるとともに、セロトニン神経機能の回復を電気生理学的に評価した。28日間の投与で、運動機能障害と神経障害性疼痛は改善した。下行性セロトニン神経線維の機能を脊髄単シナプス反射電位に対するセロトニン前駆物質の作用を調べることにより評価した。その結果、セロトニン神経機能の回復が示され、運動機能の回復にはセロトニン神経再生の関与が高いことが示唆された。3. C線維刺激後の脊髄後角長期増強のメカニズムを研究した。3年間の研究で、3つの治療薬候補を見出し、ピオグリタゾンの改善効果にセロトニン神経の回復が伴うことが示された。
T細胞受容体レパートリーと機能的T細胞サブセットから見た歯周疾患の特性

歯周炎におけるT細胞の役割を明らかにするため病変部に浸潤するT細胞の発現するサイトカインのmRNA発現をRT-PCR法で、T細胞のクローナリティをRT-PCR-SSCP法で解析し、更に代表的な歯周病関連細菌であるPorphyromonas gingivalis抗原で歯周炎患者末梢血を刺激した時のクローナリティの変化も解析した。その結果、平均のmRNA発現量はIFN-γでは末梢血が歯肉組織に比較して有意に高く、逆にIL-10では末梢血に比較して歯肉組織で高いという結果になった。個々の症例で比較した場合、IFN-γでは全てのケースで末梢血で発現が高かったが、IL-10においては多くの症例では末梢血、歯肉組織で違いがなかったものの7例で炎症歯肉組織中での高い発現が認められた。IL-12p35mRNA発現には差がなかったが、p40mRNAはIL-10と同様、6例の歯肉組織において末梢血と比較して発現が増強されていた。IL-13は平均の発現量に違いはなかった。RT-PCR-SSCP解析の結果、未刺激末梢血では全ての患者のほとんどのVβファミリーでスメア-のパターン即ちポリクローナルなT細胞集団であることが示されたが、抗原刺激によりほとんどのVβファミリーで明らかなバンドが出現するようになった。末梢血中でバンドとして検出された場合にはスメア-となる場合もあった。歯肉炎患者と歯周炎患者では明らかな相違は認められなかったが、歯周炎患者で刺激後に出現するバンドの数が多い傾向があった。SSCP解析においては1本のバンドはCDR3領域の塩基配列が均一なT細胞クローンをあらわす。即ち歯周炎患者のT細胞レパトアは歯周病原性細菌に対して高い反応性を持ち、タイプ2のサイトカインプロフィールを持つことが示唆された。歯周炎罹患歯肉組織中に浸潤しているT細胞の特性を解明する一環として逆転写PCR法を用いて歯周炎非罹患組織と同一患者の末梢血のTCR Vβレパトアについて比較した。歯周炎罹患部位の歯肉組織は歯周外科処置等に採取し、また同時に末梢血も採取し単核細胞画分を得た。これらの組織および細胞からAGPC法を用いてRNAを抽出し、random hexamerとM-MLV逆転写酵素でcDNAを合成した後、TCR Vβレパトアを解析するために20種類のVβプライマーと1種類のCβプライマーを用いてPCRを行い、産物をアガロースゲル電気泳動後各レパトアの発現率を画像解析にて分析した。その結果、末梢血のTCRレパトアは患者間で類似したパターンを示したが、その中でもVβ5.1、Vβ5.2-3、Vβ6、Vβ7、Vβ8、Vβ13.2-3、Vβ14遺伝子の使用頻度が高かった。歯周炎罹患組織における発現パターンは個人差が比較的大きかったものの末梢血のそれと類似しており、これらの遺伝子ファミリーは歯周炎組織においても高い発現頻度を示したものがみられ、特にVβ6は歯周炎組織において末梢血と比較して有意に高い発現頻度を示した。一方Vβ16では逆に歯周炎病変部で末梢血よりも発現が有意に低下していた。これらのことから歯周炎罹患組織におけるTCRレパトアは末梢血のそれと比較して個人差が大きかったことから抗原認識に違いがあり、歯周炎局所において特定のTCRVβを発現する細胞のenrichmentあるいはdepletionが生じていることが示唆された。

今年度は歯周炎におけるT細胞の応答が抗原特異的反応によるものかどうかを検索するために歯周炎病変部に浸潤するT細胞のクローナリティを調べた。成人性歯周炎患者10名より歯周外科処置時に炎症歯肉を採取し、同時に末梢血を分離した。全RNAを抽出した後、cDNAを合成し、20種類のVβファミリー特異的なセンスプライマーと1種類のCβ特異的アンチセンスプライマーを用いてPCRを行った。single strand conformation polymorphism(SSCP)解析のためにPCR産物は熱変性後非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってナイロン膜に転写した。ビオチン標識したCβインターナルプローブを用いて検出を行った。その結果、末梢血では全ての患者のほとんどのVβファミリーでスメア-のパターン即ちポリクローナルなT細胞集団であることが示されたが、一方炎症歯肉組織ではほとんどのVβファミリーで明らかなバンドとして検出された。SSCP解析においては1本のバンドはCDR3領域の塩基配列が均一なT細胞クローンをあらわす。即ち炎症歯肉組織においては抗原特異的なT細胞がオリゴクローナルに集積していることが明らかになった。これまでのRT-PCRとsingle strandconformation polymorphism(SSCP)解析を用いた研究から歯周炎組織に浸潤するT細胞は抗原特異的に集積していることを明らかにしてきた。病変部におけるクローンの集積が歯周病原性細菌に対する応答の結果であるかどうかを明らかにするために代表的な歯周病原性細菌であるPorphyromonas ginagivalis抗原で末梢血を刺激した時に見られるT細胞のクローナリティの変化をSSCP法で解析した。成人性歯周炎患者10名、歯肉炎患者10名より末梢血を分離した。全RNAを抽出した後、cDNAを合成し、20種類のVβファミリー特異的なセンスプライマーと1種類のCβ得意的アンチセンスプライマーを用いてPCRを行った。SSCP解析のためにPCR産物は熱変性後非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってナイロン膜に転写した。その結果、未刺激末梢血では全ての患者のほとんどのVβファミリーでスメア-のパターン即ちポリクローナルなT細胞集団であることが示されたが、抗原刺激によりほとんどのVβファミリーで明らかなバンドが出現するようになった。末梢血でバンドとして検出された場合にはスメア-となる場合もあった。歯肉炎患者と歯周炎患者では明らかな相違は認められなかったが、歯周炎患者で刺激後に出現するバンドの数が多い傾向があった。即ち歯周炎患者のT細胞レパトアは歯周病原性細菌に大して高い反応性を持つことが示唆された。
不良糖タンパク質分解に係る小胞体エンドマンノシダーゼの化学的解析

小胞体糖タンパク質品質管理において、フォールディング促進とフォールディングチェックを担うCNX/CRTサイクルは中心的な役割を担っている。しかしこれまで、フォールディング不良品糖タンパク質が本サイクルから離脱して分解機構へと向かう経路は不明であった。これに対し、我々は以前に多様な糖鎖プローブと小胞体画分を駆使した精密解析によって、小胞体内には本経路の駆動力を担うエンドマンノシダーゼ活性が存在することを発見した。本研究課題では[1] Golgiエンドマンノシダーゼのノックアウト細胞を作成し、小胞体エンドマンノシダーゼ活性がGolgiエンドマンノシダーゼ由来ではないことを明確にした。[2]小胞体エンドマンノシダーゼ活性を担う活性本体の同定に取り組み、本酵素活性が800 kDaのタンパク質複合体によって発現し、その構成要素として脂質の加水分解に機能すると考えられているカルボキシルエステラーゼを含むことを明らかにした。[3]種の異なる複数のマウスやラット肝臓組織において、いずれも小胞体エンドマンノシダーゼ活性が存在することを示した。[4]鶏卵卵黄より簡便に抽出した糖鎖を基に、小胞体エンドマンノシダーゼの新規合成基質を開発した。[5]小胞体エンドマンノシダーゼ活性を選択的に阻害する化合物を開発した。以上の成果によって、これまでの常識を覆す小胞体エンドマンノシダーゼが関与する糖タンパク質分解機構が存在することを明確にした。また今後の小胞体エンドマンノシダーゼ研究の発展に資する合成基質や阻害剤など、研究を支える技術基盤を確立した。小胞体エンドマンノシダーゼ活性の本体を探索すべく、分取ゲル電気泳動装置を用い、BlueNative-PAGEで分画したフラクションについて、活性および抗Golgi-endomannosidase抗体との反応性に基づき、絞り込みを行った。候補フラクションについて、MS-MSイオンサーチにより解析したところ、驚くべきことに、脂質の加水分解を担うCarboxyesterase 1D (Ces1D)が小胞体エンドマンノシダーゼ活性の本体である可能性が高まった。またCes1Dはレクチン様分子シャペロン「カルレティキュリン」と複合体を形成している可能性を見出した。現在、合成糖鎖基質およびリコンビナントCes1Dとカルレティキュリンを用いたエンドマンノシダーゼ活性の検証に取組んでいる。一方、本酵素に選択的に作用する糖鎖リガンド部と疎水性パッチを有する多点認識型の阻害剤開発に取り組み、その化学合成を達成するとともに、本化合物が多点認識効果によって高い阻害能と選択性を有することを明らかにした。また本阻害剤の設計には他の小胞体内グリコシダーゼに耐性をもつ工夫を施したが、目論見通り、これらのグリコシダーゼに耐性を示すことも分かった。さらに本酵素に対する小分子基質の化学合成に取り組み、設計した化合物の合成を完了した。現在、小胞体エンドマンノシダーゼに対する反応性の検証に取組んでいる。最後に糖鎖を2本有する第二世代基質の合成についても初期的な検討に取り組み、糖鎖をリンカーを介して2本連結したプロトタイプ化合物の合成を達成した。小胞体エンドマンノシダーゼの活性本体の同定に成功したともに、本研究の鍵化合物となる小分子基質や阻害剤の合成を完了できたため。また阻害剤についてはその効果も検証し、選択的かつ効率的に本酵素活性の阻害が可能であることを実証ずみである。小胞体エンドマンノシダーゼ活性の本体を探索する試みを通して、本酵素活性を司るタンパク質複合体が800 kDa程度であることを見出した。またその構成要素の主成分としてエステル加水分解酵素Ces1Dとレクチン様分子シャペロンCRTが含まれることを明らかにした。リコンビナントCes1Dと疎水性アグリコンを有する糖鎖基質の直接反応では、エンドマンノシダーゼ活性は検出されなかったが、Ces1Dと本糖鎖基質が有意に相互作用することが分かった。また、Ces1Dと糖鎖部のみを有するリガンドとの結合は相対的に弱いことも明らかとなった。これらは、Ces1Dが複合糖質の糖鎖部とアグリコン疎水性の双方を認識して結合することを示している。以上の知見を基に、エンドマンノシダーゼ活性に関わるコンポーネントを特定すべく、現在、アフィニティ精製用のリガンド合成に取り組み、リガンド部の合成を完了した。さらに昨年度合成に成功したGlc-Man2糖と疎水性パッチをリンカーで連結した多点認識型阻害剤の構造を基に、Glc-Man-Man3糖と疎水性パッチをリンカーで連結した小分子基質を合成したが、本化合物は小胞体内のエンドマンノシダーゼ活性によっては切断されなかった。そこで、現在、糖鎖部を伸長した4糖構造の小分子基質の合成に取り組んでいる。一方、糖鎖を二本有する第二世代の基質合成に関しては、鶏卵から単離精製したGlc1Man9GlcNAc2を活用し、リンカーで連結した化合物の合成を達成し、その量産体制を整えつつある。小胞体エンドマンノシダーゼの活性複合体の主要コンポーネントとして、Ces1DとCRTが含まれることを明らかにした。また、基質の結合に糖鎖部と疎水性アグリコン部の双方が関与していることも明らかにした。さらに、本酵素活性を制御する阻害剤の合成に成功している点や、複合体同定に資するアフィニティーカラムの合成および第二世代基質の合成に先鞭をつけた現状に鑑み、おおむね順調に進展しているものと評価している。

しかしこれまで、フォールディング不良品糖タンパク質が本サイクルから離脱して分解機構へと向かう経路は不明であった。これに対し、我々は以前に多様な糖鎖プローブと小胞体画分を駆使した精密解析によって、小胞体内には本経路の駆動力を担うエンドマンノシダーゼ活性が存在することを発見した。本研究課題では[1] Golgiエンドマンノシダーゼのノックアウト細胞を作成し、小胞体エンドマンノシダーゼ活性がGolgiエンドマンノシダーゼ由来ではないことを明確にした。[2]小胞体エンドマンノシダーゼ活性を担う活性本体の同定に取り組み、本酵素活性が800 kDaのタンパク質複合体によって発現し、その構成要素として脂質の加水分解に機能すると考えられているカルボキシルエステラーゼを含むことを明らかにした。[3]種の異なる複数のマウスやラット肝臓組織において、いずれも小胞体エンドマンノシダーゼ活性が存在することを示した。[4]鶏卵卵黄より簡便に抽出した糖鎖を基に、小胞体エンドマンノシダーゼの新規合成基質を開発した。[5]小胞体エンドマンノシダーゼ活性を選択的に阻害する化合物を開発した。以上の成果によって、これまでの常識を覆す小胞体エンドマンノシダーゼが関与する糖タンパク質分解機構が存在することを明確にした。また今後の小胞体エンドマンノシダーゼ研究の発展に資する合成基質や阻害剤など、研究を支える技術基盤を確立した。合成した阻害剤をアフィニティーカラム化し、本酵素の複合体形成の可否について検証する。また本阻害剤を蛍光標識化し、小胞体エンドマンノシダーゼの細胞内局在解析を行う。さらに合成した基質群を用いて、疾患細胞内における本酵素活性の変化を解析する。合成したアフィニティーカラムを用いて、小胞体エンドマンノシダーゼの複合体コンポーネントの全容を明らかにする。また本酵素の細胞内局在解析や疾患との関連についても解析する。必要物品を支出後に端数が生じたが、少額のため次年度使用とした。本年度使用額と合算し、試薬消耗品の支出に充てる。
馬鈴薯澱粉と小麦粉との混合粉におけるレオロジー・テクスチャー特性

代表的な外国産及び国産の強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉に一定の馬鈴薯澱粉を配合し、これらの配合粉のレオロジー・テクスチャー特性について、ラピッドビスコアナライザー(RVA)及び示差走査熱量計(DSC)を用いて解明した。また、得られたレオロジー・テクスチャー特性値と供試した小麦粉のタンパク含量、アミロース含量との関連性について解析を行った。供試した小麦粉中のタンパク含量は、9.0-13.2%、アミロース含量は21.2-27.2%にそれぞれ分布していた。RVA最高粘度は、アミロース含量の低い中力粉(ホクシン)と馬鈴薯澱粉との混合粉において明らかに高かった。RVA粘度上昇温度は、中力粉(ホクシン)と馬鈴薯澱粉との混合粉では若干低い値となった。それに対し、混合粉における供試小麦粉のタンパク含量は、混合粉のRVA最高粘度、粘度上昇温度にほとんど影響を与えないことが確認された。各種小麦粉から分離した澱粉のDSC糊化ピーク温度、糊化エンタルピーは、それぞれ58.8-61.0°C、9.6-11.0J/gであった。それに対し、馬鈴薯澱粉の糊化ピーク温度、糊化エンタルピーは、それぞれ67.7°C、20.8J/gであった。混合粉でのDSCによる熱糊化特性の結果をみると、いずれにおいても小麦澱粉及び馬鈴薯澱粉由来の2つのピークがみられた。混合粉での小麦澱粉及び馬鈴薯澱粉の糊化ピーク温度は、グルテンの存在しないそれぞれの分離澱粉と比較して若干高いことが判明した。糊化エンタルピーは馬鈴薯澱粉添加量を増加させるにつれて上昇したが、小麦粉の種類が異なっても大きな影響はなかった。北海道の代表的な小麦品種である「キタノカオリ」から得られた小麦粉と代表的な馬鈴薯品種である「紅丸」から得られた澱粉を用い、これらの混合粉のレオロジー・テクスチャー特性について検討した。まず、供試した小麦粉及び馬鈴薯澱粉の基本的特性について評価した。アミロース含量、リン含量、メジアン粒径の結果をみると、小麦粉では、27.2%、1138ppm、59.5μmであり、馬鈴薯澱粉では、23.6%、599ppm、44.4μmであった。8%小麦粉懸濁液のラピッドビスコアナライザーによる最高粘度は、89RVUであり、加熱過程中の粘度低下を示すブレークダウンは、36RVUであった。ファリノグラフによる小麦粉の生地物性を検討したところ、生地の形成速度を示すピーク時間は、21.8分であった。次いで、小麦粉に馬鈴薯澱粉を10-50%の割合で配合し、得られた混合粉のレオロジー・テクスチャー特性についてラピッドビスコアナライザーを用いて調べた。その結果、馬鈴薯澱粉を10%混合したときは、最高粘度が110RVU、ブレークダウンが38RVUであったのに対し、50%混合したときは、最高粘度が240RVU、ブレークダウンが80RVUとなり、両指標値とも馬鈴薯澱粉の添加により明らかに上昇した。したがって、小麦粉に馬鈴薯澱粉を混合することで、効率的に粘度を上昇させることが可能であった。ファリノグラフによるピーク時間は、馬鈴薯澱粉を10-30%加えた場合でも加えない場合とほぼ同様の値となり、馬鈴薯澱粉を小麦粉に30%まで混合しても生地の形成には大きな影響がないことが示唆された。なお、馬鈴薯澱粉を40%以上混合した場合では、生地形成がほぼ不可能となった。北海道の代表的な小麦新品種である「キタノカオリ」から得られた小麦粉にリン含量の異なる3種の馬鈴薯品種[「農林1号」、「紅丸」、「エニワ」]から得られた澱粉をそれぞれ混合し、これらの混合粉の粘度・熱糊化特性について、ラピッドビスコアナライザー(RVA)及び示差走査熱量計(DSC)を用いて解析した。馬鈴薯澱粉のリン含量は、「エニワ」が878ppmと「農林1号」(541ppm)や「紅丸」(599ppm)と比べて明らかに高かった。RVA特性、DSC特性の結果をみると、RVA最高粘度、RVAブレークダウン、DSC糊化ピーク温度の値は、他の2品種より明らかに高かったが、DSC糊化エンタルビーは、3品種の間で明確な差異が認められなかった。馬鈴薯-小麦粉混合粉の最高粘度、ブレークダウンは、馬鈴薯澱粉添加量を増加させるにつれて高くなり、特に高リン型の「エニワ」澱粉を添加したときは、他の低リン型を添加したときに比べて上昇度が高かった。DSCによる熱糊化特性の結果をみると、いずれの混合粉も大体において単一の糊化ピークがみられたが、「エニワ」混合粉では「エニワ」澱粉の添加量が少ないときのみ、澱粉糊化ピークが2つみられ、低い方の小ピークは小麦粉中の澱粉に由来するものと考えられた。

「エニワ」混合粉の糊化ピーク温度は、「農林1号」混合粉及び「紅丸」混合粉に比べ、いずれの添加量においても高い値を示した。糊化エンタルピーは、馬鈴薯澱粉添加量を増加させるにつれて上昇したが、添加する馬鈴薯澱粉の違いによっては大きく影響されなかった。小麦澱粉のアミロース脂質複合体に起因すると考えられる100°C付近のピークは、馬鈴薯澱粉添加量を増加させるにつれて明らかに小さくなり、これも添加する馬鈴薯澱粉の違いによっては大きく影響されなかった。代表的な外国産及び国産の強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉に一定の馬鈴薯澱粉を配合し、これらの配合粉のレオロジー・テクスチャー特性について、ラピッドビスコアナライザー(RVA)及び示差走査熱量計(DSC)を用いて解明した。また、得られたレオロジー・テクスチャー特性値と供試した小麦粉のタンパク含量、アミロース含量との関連性について解析を行った。供試した小麦粉中のタンパク含量は、9.0-13.2%、アミロース含量は21.2-27.2%にそれぞれ分布していた。RVA最高粘度は、アミロース含量の低い中力粉(ホクシン)と馬鈴薯澱粉との混合粉において明らかに高かった。RVA粘度上昇温度は、中力粉(ホクシン)と馬鈴薯澱粉との混合粉では若干低い値となった。それに対し、混合粉における供試小麦粉のタンパク含量は、混合粉のRVA最高粘度、粘度上昇温度にほとんど影響を与えないことが確認された。各種小麦粉から分離した澱粉のDSC糊化ピーク温度、糊化エンタルピーは、それぞれ58.8-61.0°C、9.6-11.0J/gであった。それに対し、馬鈴薯澱粉の糊化ピーク温度、糊化エンタルピーは、それぞれ67.7°C、20.8J/gであった。混合粉でのDSCによる熱糊化特性の結果をみると、いずれにおいても小麦澱粉及び馬鈴薯澱粉由来の2つのピークがみられた。混合粉での小麦澱粉及び馬鈴薯澱粉の糊化ピーク温度は、グルテンの存在しないそれぞれの分離澱粉と比較して若干高いことが判明した。糊化エンタルピーは馬鈴薯澱粉添加量を増加させるにつれて上昇したが、小麦粉の種類が異なっても大きな影響はなかった。
「返還」をめぐる台湾・香港・沖縄の比較研究:国民統合とアイデンティティを中心に

16年度においては、前年度で提起した「辺境東アジア」という概念を固め、台湾、香港、沖縄のそれぞれの国民統合・アイデンティティ問題の特徴を探ってきた。具体的に、まず、沖縄、台湾、香港、沖縄、そしてマカオも加え、民族・国家をめぐる住民のアイデンティティの国際アンケート調査を行った。文化的帰属意識、すなわちエスニック・アイデンティティの調査結果から、地元意識の強い順は、台湾・沖縄・香港・マカオとなり、また政治的・国家的帰属意識、すなわちナショナル・アイデンティティについては、地元の政治的自立を強く求める順は、台湾・香港・沖縄・マカオになっている。さらに後者を左右する最大な変数は、「自立能力」であることも調査から得られた。次に、台湾、香港、沖縄のそれぞれの実証研究も展開した。その成果は、17年2月28日に出版された拙著にまとめられている。この本は、三地域の共通点を「帰属変更」・「祖国復帰」・「アイデンティティ」というキーワードに表現し、「辺境東アジア」地域のダイナミックなアイデンティティ・ポリティクスを考察している。今後も、この方向でさらに探求していきたい。15年度においては、予定通り、台湾・香港・沖縄それぞれの「返還」・「祖国復帰」に関する一次と二次資料の調査と整理を行った。また集めた資料などに基づき、新たな論文「『辺境東アジア』:新たな地域概念の構築」を執筆し、日本国際政治学会誌『国際政治』(第135号、2004年3月)に掲載されました。15年度の研究成果を凝縮したこの論文で得た知見は次の通りである。(1)本稿は、台湾・香港・沖縄を包括して「辺境東アジア」という概念を正式提起した。この概念の提起と構築の目的には、21世紀の東アジア地域の安定に不可欠の国家システム・地域システムの再構築に積極的なヒントを与えることにある。(2)「辺境東アジア」の概念提起は、台湾・香港・沖縄の特徴、すなわち三地域が有している三つの共通点に基づいている。i)この三つの地域は前近代ないし近代において東アジアの国家・地域観念である伝統的中心・辺境を基にした華夷システムの中で、「辺境」と位置付けられてきた。ii)これらの地域は、近代以来、二度ないし三度にわたりその主権もしくは政治的帰属が変更されたり、異民族の植民地的支配を受けたりした経験をもっている。iii)このような近現代における主権・帰属の変更が行われて以来、この三つの地域は、共にその主権国・宗主国との関係でアイデンティティをめぐる問題を抱えてきている。来年度は、「辺境東アジア」という概念を固め、台湾、香港、マカオ、沖縄それぞれの国民統合・アイデンティティ問題を探っていく予定である。
高精度温度制御システムによる最下部マントルの実験岩石学

地球全マントル領域にわたる実験岩石的研究を可能にするため、ダイヤモンドアンビルセル(DAC)による精密に温度制御された高圧実験を行うことを目的としている。これを応用し、マントル鉱物の相転移およびマントル物質の融解実験について熱力学的に信頼性の高いデータを取得し、未だ整合性を得られていないまたは解明されていないマントル深部における物質分化を明らかにする。そこでホウ素添加導電性ダイアモンド(BDD)を発熱体として用いた内部抵抗加熱式DAC(BDD内熱DAC)の技術開発を行っている。昨年度までに50GPa, 3600Kまでの高温高圧実験を可能にし,進捗を技術論文としてまとめることができた。しかしながら現状では試料室構成が極めて複雑であるため、熟練が必要となっている。再現性の高い実験を目指し、これまでの複雑な試料室構成から、より単純なものにデザインを変更することで実験準備と試料充填の簡素化を目指す。このため、BDD電極プリントを単結晶ダイアモンドアンビル上に施す手法を進めており、この作業行程の50%を終えている。また、近年川井型マルチアンビルプレスを用いた高温高圧実験の圧力発生領域が著しく拡大されているが、50GPaを越える圧力領域で高温の圧力較正点が確立されていない問題がある。この較正点になり得る酸化物もしくは金属の相転移境界を精密に決定することはこれをBDD内熱DACの応用として最適である。これに先駆け、レーザー加熱DACを用いた予備実験を開始した。30年度までに50GPa,3600KまでのBDD内熱DACを用いた高温高圧実験を可能にし、進捗を技術論文としてまとめることができており、ルーチン化に向けた技術開発も進めている。これと平行して、この技術の応用を見据えた予察的実験を進めている。現在、鉄硫黄化合物および鉄リン化合物(Fe2S、Fe2P、Fe3P)の相平衡関係についてレーザー加熱DACと放射光X線を用いて進めている。BDD内熱DACの試料充填の簡素化と再現性の向上を目指し、引き続きBDD電極プリントを単結晶ダイアモンドアンビル上に施す作業を進める。これにより、100GPaを越える圧力においても利用可能になることが期待される。次年度はレーザー加熱DACにより鉄化合物および酸化物の相平衡関係を決定し、さらにこれをBDD内熱DACを用いて精密決定する、地球全マントル領域にわたる実験岩石的研究を可能にするため、ダイヤモンドアンビルセル(DAC)による精密に温度制御された高圧実験を行うことを目的としている。本年度は(1)加熱テストを重ね、BDDのボロン添加量の最適化し加熱効率を向上させた。さらに(2)実験の再現性の向上、試料充填の簡素化、加熱効率向上のため、試料室およびガスケット構成を最適化した。ガスケットはタングステン箔に絶縁層を挟み込む三層構造にし、内部ガスケットにサファイア単結晶を用いた。以上より5W未満の高い加熱効率で3600Kまでケイ酸塩を加熱することができた。また、大型放射光施設SPring-8におけるX線回折において、BDD発熱体によりマントル鉱物が合成されたことをを確認し、その回収試料のEPMAおよびSIMS分析により鉱物中に発熱体からのボロン拡散がないことを確認した。有限要素法による数値シミュレーションも組み合わせることで、さらに試料内の温度勾配を減少させたセル構成を考案した。現状の結果を技術論文としてまとめ出版し、本技術の有用性を示した(Ozawa et al., 2018, High Pressure Research)。50GPa, 3600Kまでの高温高圧実験を可能にし,進捗を技術論文としてまとめることがでいた。一方で、再現性向上とさらなる高圧下における実験を行うためにはさらなる技術開発が必要である。また、導入予定である温度測定・試料観察システムは、現在その設計を行っている。

この較正点になり得る酸化物もしくは金属の相転移境界を精密に決定することはこれをBDD内熱DACの応用として最適である。これに先駆け、レーザー加熱DACを用いた予備実験を開始した。30年度までに50GPa,3600KまでのBDD内熱DACを用いた高温高圧実験を可能にし、進捗を技術論文としてまとめることができており、ルーチン化に向けた技術開発も進めている。これと平行して、この技術の応用を見据えた予察的実験を進めている。現在、鉄硫黄化合物および鉄リン化合物(Fe2S、Fe2P、Fe3P)の相平衡関係についてレーザー加熱DACと放射光X線を用いて進めている。現状の技術では、試料室構成が極めて複雑であるため、熟練が必要となっている。再現性の高い実験を目指し、これまでの複雑な試料室構成から、より単純なものにデザインを変更することで実験準備と試料充填の簡素化を目指す。このため、BDD電極プリントを単結晶ダイアモンドアンビル上に施す手法を導入する。また、これにより高圧発生についても容易に行えることが期待される。これと同時に内熱DACに特化した温度測定・試料観察システムの構築にも引き続き取り組む。BDD内熱DACの試料充填の簡素化と再現性の向上を目指し、引き続きBDD電極プリントを単結晶ダイアモンドアンビル上に施す作業を進める。これにより、100GPaを越える圧力においても利用可能になることが期待される。次年度はレーザー加熱DACにより鉄化合物および酸化物の相平衡関係を決定し、さらにこれをBDD内熱DACを用いて精密決定する、
液体のダイナミクスから観たイオンナノ流体の機能解明

液体に数体積%のナノ粒子を分散させたナノ流体は純液体に比べて熱伝導率が高いことが報告されており、その応用として熱交換機やエンジンのラジエータ、マイクロエレクトロニクス機器の性能の向上が期待されている。本研究ではナノ流体を構成する液体分子のダイナミクスを中性子・X線散乱により測定し、ナノ流体の熱伝導率や粘性率といったマクロな量を液体分子のミクロな運動から説明することを試みる。その結果、ナノ流体の熱伝導率を向上する機構が分子論的に明らかになり、高い熱伝導率ならびに低い粘性率を持つ高機能なナノ流体の設計指針を提案する。
ヒトおよび類人猿における第4乳臼歯咬合面の固有形態

動物種に関係なく存在すると考えられる第2乳臼歯の歯冠における固有の形態的特徴,いわゆる「第4乳臼歯の顔」を抽出することを目的として,ヒトと大型類人猿(ゴリラ,オラウータン,チンパンジー)の第4乳臼歯歯冠の基本形態を第1大臼歯と比較した。材料は京都大学霊長類研究所,日本モンキーセンター,イギリス自然史博物館に保管されている類人猿の骨格標本より印象して作製した石膏模型,昭和大学歯学部に保管されている日本人男性の石膏模型である。肉眼観察およびノギスによる計測(歯冠近遠心径および頬舌径,トリゴニッドおよびタロニッドの近遠心径および頬舌径)を行った。画像解析の方法は以下の通りである。デジタルカメラ(Canon : Power Shot 600)で撮影した咬合面観の画像をTWINインターフェイス経由(Adobe Systems Inc.: PhotoShop ver 3.0.5J)でパソコンに取り込んだ。ディスプレイ上でこの画像をトレースし(Deneba System Inc.: Canvas ver 3.5J),各臼歯の歯冠外形を作図した。作図した第4乳臼歯の外形を第1大臼歯と近遠心径が同じになるまで拡大して,両者を重ね合わせて比較した。上・下顎ともに第4乳臼歯は第1大臼歯と比べて頬舌的な咬頭頂間距離が短縮していた。上顎では歯冠指数(近遠心径と頬舌径の比率)は両者の間で違いがみられなかった。上顎第4乳臼歯は第1大臼歯に比べて舌側2咬頭の発達は悪いが,メタコーンは発達が良かった。下顎では第4乳臼歯は頬舌的に圧平されていた。以上の結果は第4乳臼歯の歯冠が第1大臼歯と比べて原始的な形質を保持していることと,第1大臼歯ほどには臼歯化していないことに関係していた。
MATH-2転写因子トランスジェニックマウスの気分障害疾患モデル動物としての検討

気分安定薬(リチウム、カルバマゼピン)は双極性障害の気分を安定させる根本的治療である。従って気分安定薬の共通するメカニズムが双極性障害の基本的病態に関わっていると考えられる。気分安定薬の共通する機構として、ノルアドレナリン、セロトニンなどの神経伝達物質の分泌を調節しているGAP-43のリン酸化が亢進していた。さらにリチウム慢性投与のラット大脳皮質でのイムノブロットによるGAP-43の定量では、リチウム投与5週後では55%と有意に増加していた。GAP-43のRNA量も蛋白量と同様に、4週後、5週後では蛋白量とほぼ同程度増加し、5週投与後では51%有意に増加していた。そこで、GAP-43の発現を調節している転写因子の同定をゲルシフトアッセイにて行った結果、bHLH (helix-loop-helix)転写調節因子であるMATH-2がGAP-43のプロモターのE-boxと結合しGAP-43の転写を調節していることが判明した。GAP-43発現変化をルシフェラーゼアッセイにて測定した結果、MATH-2転写因子は、他の転写因子と比較して、GAP-43発現を最も調節していた。実際にMATH-2遺伝子導入後、GAP-43蛋白レベルは約3倍増加していた。また、リチウム5週投与後にMATH-2蛋白量は対照群の約4倍に有意に増加していた。リチウム長期投与後の免疫染色では、大脳皮質III層の外顆粒細胞層、海馬CA1CA3でMATH-2の増加が著明であった。特に海馬では対照群は、核内均一にMATH-2が染色されるのに対して、リチウム投与群では核小体、核膜にMATH-2の局在が変化していた。MATH-2をαCaM Kinase II promoterとcis-TRE promoterを用いトランスジェニックマウスを作成した。オープンフィールド試験にて行動を観察した結果は、特に雄トランスジェニックマウスにおいて試験開始後10分後に行動が過活動になっていた。ゼロメイズ試験では雄トランスジェニックマウスにおいてopen armに出る時間が長く、closed armに存在する時間が減少していることが観察された。従って、MATH-2過剰発現したトランスジェニックマウスでは行動が過活動になり、さらに不安な刺激に対しては脱感作されやすいことが示された。従ってMATH-2過剰発現したトランスジェニックマウスが躁病モデルマウスになりうる可能性が示唆された。

そこで、GAP-43の発現を調節していうる転写因子の同定をゲルシフトアッセイにて行った結果、bHLH(helix-looP-helix)転写調節因子であるMATH-2がGAP-43のプロモターのE-boxと結合しGAP-43の転写を調節していることが判明した。GAP-43発現変化をルシフェラーゼアッセイにて測定した結果、MATH-2転写因子は、他の転写因子と比較して、GAP-43発現を最も調節していた。実際にMATH-2遺伝子導入後、GAP-43蛋白レベルは約3倍増加していた。また、リチウム5週投与後にMATH-2蛋白量は対照群の約4倍に有意に増加していた。リチウム長期投与後の免疫染色では、大脳皮質III層の外顆粒細胞層、海馬CA1CA3でMATH-2の増加が著明であった。特に海馬では対照群は、核内均一にMATH-2が染色されるのに対して、リチウム投与群では核小体、核膜にMATH-2の局在が変化していた。MATH-2をαCaM Kinase II promoterとcis-TRE promoterを用いトランスジェニックマウスを作成した。cis-TRE promoterを用いた方は、さらにテトラサイクリン投与によりMATH-2遺伝子の発現を調節できるトランスジェニックマウスを現在作成中である。αCaM Kinase II promoterの方は現在行動解析中である。最後にリチウム長期投与後の大脳皮質を用い、プロテオミクス的解析を行った。Ion-trap型ESI-MSによる質量分析を施行し蛋白質を同定した。リチウム5週間投与後、リン酸化eEF2(elongation factor 2)が二次元電気泳動にて増加を認めた。イムノブロット法では、eEF2蛋白量は変化していなかったが、リン酸化eEF2抗体での検出ではリチウム5週間投与後増加していた。従ってeEF2のリン酸化のみが亢進していた。気分安定薬(リチウム、カルバマゼピン)は双極性障害の気分を安定させる根本的治療である。従って気分安定薬の共通するメカニズムが双極性障害の基本的病態に関わっていると考えられる。気分安定薬の共通する機構として、ノルアドレナリン、セロトニンなどの神経伝達物質の分泌を調節しているGAP-43のリン酸化が亢進していた。さらにリチウム慢性投与のラット大脳皮質でのイムノブロットによるGAP-43の定量では、リチウム投与5週後では55%と有意に増加していた。GAP-43のRNA量も蛋白量と同様に、4週後、5週後では蛋白量とほぼ同程度増加し、5週投与後では51%有意に増加していた。そこで、GAP-43の発現を調節している転写因子の同定をゲルシフトアッセイにて行った結果、bHLH(helix-loop-helix)転写調節因子であるMATH-2がGAP-43のプロモターのE-boxと結合しGAP-43の転写を調節していることが判明した。
活動阻害要因を考慮した地震火災対策の動的ペトリネットシミュレーションの開発

地震時火災対策では,種々の活動阻害要因が作用する中での信頼性評価が必須となる.本研究では,阻害要因を制約型と切断型に分け,まず,抑止アークを活用したペトリネット表現法を開発した.そして,それらを出発点とし,その視覚性,結合性を活用することで,事前対策の有無や事後対応計画の良否等々も発想的にネットに組み込むことが可能であることを示した.次に,車社会の今日,緊急車両は一般車の渋滞の中を現場へと向かうとし,その走行阻害のペトリネット・シミュレーションシステムを具体化し,交通量が10台/分・レーン程度になれば,走行速度は計画速度の半分に低下する可能性があることを示した.以上の基礎研究を基に,金沢市における防災拠点と火災現場を設定し,出火から通報・指令・出動を経て消化に至る消防活動の動的ペトリネットモデルを開発した.火災は,風化・風横・風上への延焼拡大のネットとし,その阻止の可能性を評価するネットを構成した.阻害要因としては,まず,各走行区間での一般車による制約型阻害を前出のシミュレーションと連動化させて組入れた.地震時の制約型阻害としては,通信系の障害,沿道施設からの落下物,路面被害,切断型阻害としては,液状化に伴う橋梁破損,水利網被害を抽出し,それぞれのペトリネットモデルを結合化させた.そして,適用地域の調査を基に,交通量は早朝・深夜と日中の2ケース,風速は2m/sと10m/sの2ケースを想定し,通常時と地震時での火災延焼阻止の阻害度分析シミュレーションを実施した.その結果,切断型阻害の発生が抑止できたとしても,地震が日中に発生すれば,風速が2m/sと弱くても,一般車による緊急車両の走行阻害により大火となる危険性が高いことを明らかにし,その対策研究の重要性を指摘し,本方法の適用可能性を含め今後の課題を整理した.地震時火災対策では,種々の活動阻害要因が作用する中での信頼性評価が必須となる.本研究では,阻害要因を制約型と切断型に分け,まず,抑止アークを活用したペトリネット表現法を開発した.そして,それらを出発点とし,その視覚性,結合性を活用することで,事前対策の有無や事後対応計画の良否等々も発想的にネットに組み込むことが可能であることを示した.次に,車社会の今日,緊急車両は一般車の渋滞の中を現場へと向かうとし,その走行阻害のペトリネット・シミュレーションシステムを具体化し,交通量が10台/分・レーン程度になれば,走行速度は計画速度の半分に低下する可能性があることを示した.以上の基礎研究を基に,金沢市における防災拠点と火災現場を設定し,出火から通報・指令・出動を経て消化に至る消防活動の動的ペトリネットモデルを開発した.火災は,風化・風横・風上への延焼拡大のネットとし,その阻止の可能性を評価するネットを構成した.阻害要因としては,まず,各走行区間での一般車による制約型阻害を前出のシミュレーションと連動化させて組入れた.地震時の制約型阻害としては,通信系の障害,沿道施設からの落下物,路面被害,切断型阻害としては,液状化に伴う橋梁破損,水利網被害を抽出し,それぞれのペトリネットモデルを結合化させた.そして,適用地域の調査を基に,交通量は早朝・深夜と日中の2ケース,風速は2m/sと10m/sの2ケースを想定し,通常時と地震時での火災延焼阻止の阻害度分析シミュレーションを実施した.その結果,切断型阻害の発生が抑止できたとしても,地震が日中に発生すれば,風速が2m/sと弱くても,一般車による緊急車両の走行阻害により大火となる危険性が高いことを明らかにし,その対策研究の重要性を指摘し,本方法の適用可能性を含め今後の課題を整理した.
脱接着誘導性細胞死に伴う解糖系の抑制機構とその意義

本課題は、がん細胞の転移能と密接な関係にある「接着喪失時に誘導される細胞死(DICD)に対する抵抗性」の解明のために、DICDと糖代謝変化に注目して解析を行った。手がかりとして、正常ヒト乳腺上皮細胞にDICDを誘導した際、フルクトース6リン酸(F6P)が蓄積する事を見出した。F6Pは解糖系とヘキサミン経路の代謝物であるが、接着の喪失は解糖系の抑制を起こさなかったため、後者が抑制される結果DICDが起こる事が予想された。そこでこの経路の律速酵素の阻害剤を用いて検討した結果、その抑制は非接着状態に関わらず細胞死を誘導した。従って、ヘキサミン経路の抑制がDICDの誘導に関わる可能性が示唆された。がん細胞の代表的性質として足場非依存的増殖能があるが、その分子機構を明らかとするため、接着喪失時に正常乳腺上皮細胞(HMEC)に誘導される細胞死(anoikis)の制御機構の解析を行った。本課題では解糖系の代謝変化がanoikisに関与している可能性を調べるため、その律速段階の一つであるフルクトース6リン酸からフルクトース1,6ビスリン酸(F1,6BP)への代謝を担うホスホフルクトキナーゼ1 (PFK1)の脱接着に伴う抑制制御機構に注目して解析を行った。まず転写レベルでの制御の可能性について、3つのPFK1アイソフォームについて、脱接着によりmRNAが低下するかどうかを調べたところ、筋型と血小板型の低下が認められた。同様に、タンパク質も低下が認められるかどうかを調べたが、予想に反していずれも変化しなかった。従って、PFK1の量的変化が解糖系の抑制につながる可能性は否定された。そこで、次にPFK1の翻訳後修飾について、促進的に調節するリン酸化と抑制性のO-グリコシル化に注目して解析を行った。まずPhos-tagアクリルアミドを用いてリン酸化の変化を調べたが、脱接着によるPFK1のバンドシフトは見られなかった。また、O-グリコシル化についても変化は認められなかった。最後にアロステリックな制御機構について、活性化制御因子であるフルクトース2,6ビスリン酸(F2,6BP)の量的変化ついて検討を行った。F2,6BPによって活性化されるPPi-PFKを用いた酵素法によって細胞内のF2,6BP量を測定したが、脱接着によって全く変化を示さなかった。予定にはなかったが、PFK1の逆反応を担うフルクトースビスフォスファターゼ1の発現を調べたが変化は見られなかった。以上の結果から、PFK1の量的変化、翻訳後修飾、アロステリック制御は、いずれも脱接着により変化しないという結論を得た。がん細胞の代表的性質として足場非依存的増殖能があるが、その分子機構を明らかとするため、接着喪失時に正常乳腺上皮細胞に誘導される細胞死(DICD)の制御機構の解析を行った。メタボローム解析から解糖系の代謝変化がDICDに関与している可能性が示唆されたため、本課題ではその律速段階の一つであるフルクトース6リン酸(F6P)からフルクトース1,6ビスリン酸への代謝を担うホスホフルクトキナーゼ1 (PFK1)の脱接着に伴う抑制的制御機構に注目して解析を行った。しかし、PFK1の量的変化、翻訳後修飾、アロステリック制御は、いずれも脱接着によって変化しないという結論を得た。そこで脱接着により解糖系の抑制が起こっているかを確認するために、解糖系の最終産物であるピルビン酸を酵素法ならびにLC-MS解析により測定したが、メタボローム解析の結果と異なり脱接着による低下を認めなかった。そこで、LC-MS解析により、いくつかの解糖系代謝物について定量を行った結果、脱接着によりF6Pの量が増加することが確認できた。F6Pは解糖系の構成因子であるとともに、O-グリコシル化の糖供与体であるUDP-GlcNAcの合成に関わるヘキサミン経路の構成因子でもあることが知られている。そこでF6Pのヘキサミン経路への利用低下がDICDへ影響を及ぼすかを調べるために、律速酵素の阻害剤を用いて検討した。その結果、接着状態であっても細胞死が誘起され、その効果は脱接着時により顕著であった。この結果からヘキサミン経路の抑制は細胞死を誘導するに十分であることが示唆された。さらに、最終的なタンパク質O-グリコシル化のDICDへの影響を検討するために、O-グリコシル化酵素であるO-グルコシルトランスフェラーゼを過剰発現して解析を行った。その結果、若干ではあるがDICDが抑制される傾向が得られた。腫瘍細胞生物学平成25年度は解糖系律速段階の一つを担うPFK1の抑制的制御機構を中心に、ほぼ実地計画に従って解析を行った。

1.量的変化の可能性PFK1の3つのアイソフォームについて、脱接着によるmRNAの発現変化をreal time RT-PCR法を用いて調べた結果、筋型と血小板型の発現が特異的に低下した。しかしながら、特異抗体を用いたwestern blotを行った結果、その低下はタンパク質レベルでは見られず、PFK1の量的変化が細胞死誘導の原因になる可能性は低いと考えられた。2.翻訳後修飾とアロステリック制御の可能性翻訳後修飾については、PFK1の活性を正に制御するリン酸化と負に制御するO-グリコシル化について検討を行った。リン酸化については全てのリン酸化を考慮することができるPhos-tagアクリルアミドを用いたバンドシフトを指標に評価を行った。その結果、PFK1抗体を用いたwestern blotでバンドシフトは観察されなかった。従って、脱接着によりPFK1のリン酸化が変化する可能性は低いと考えられた。同様にO-グリコシル化に関しても変化は認められなかった。そこで、脱接着により共有結合性の翻訳後修飾が変化し、PFK1の活性に影響を及ぼしている可能性について検討を加えた。接着状態と脱接着状態の細胞の溶解液を用いてPFK1活性を測定した結果、酵素活性に全く変化がないことが明らかになった。従って、リン酸化やO-グルコシル化を含むPFK1活性に影響を及ぼす共有結合性の翻訳後修飾は接着状態に依存して変化しないと考えられた。アロステリック制御に関しては、PFK1の活性化制御因子として知られるフルクトース2,6ビスリン酸(F2,6BP)の量的変化について検討を行ったが、やはり変化は認められなかった。以上の結果から、既存のメカニズムによるPFK1制御の可能性は限りなく低くなった。平成25年度の結果から、脱接着によるPFK1の抑制制御機構は、これまでに報告されてきたいずれのものとも異なった新規の機構である可能性が高くなった。そこで計画書に従い、TAP (Tandem affinity purification)タグをPFK1に融合した発現系をHMECに導入し、アフィニティー精製した後LC-MSを用いて、接着状態に依存して変化する相互作用因子の同定を試みる。一方で、脱接着による標的段階が現在注目しているフルクトース6リン酸からフルクトース1,6ビスリン酸(F1,6BP)への代謝とは異なる可能性も考慮に入れて、もう一度解糖系の各段階での代謝物の変化について異なる方法論で測定する。さらに、脱接着によりフルクトース6リン酸が増加していることから、ヘキサミン経路についても検討を加える予定である。関与因子が同定された場合は、平成26年度の実地計画に従い、PFK1の抑制的な制御機構が乳がん細胞で破綻しているかどうかを調べる。主に高転移型乳がん細胞株MDA-MB-231を用い、脱接着によるPFK1の抑制機構が破綻しているかどうかについて検討を行う。乳がん細胞株で当該抑制機構の破綻を確認した後、関与因子を乳がん細胞中で過剰発現もしくはRNAiにより発現抑制することで遺伝子操作を行い、anoikis感受性が回復するかどうかについて検討を行う。今年度は脱接着に応じたPFK1抑制的制御機構の解析が多少遅れたため、計画していた相互作用因子の同定を試みるまでには至らなかった。そのため、相互作用因子の同定に必要となる多量の培養器具や培地、試薬に使用を予定していた研究費を使用せずに次年度に繰り越すことになった。
低重力空間における液滴の挙動及び薄肉構造物との動的連成挙動

本研究では、低重力空間における弾性構造物と液体の動的連成挙動問題について、弾性円筒薄板とそれに付着した液体層という基本システムの連成振動問題を例に取り上げ、その振動特性を理論的に解析すると共に、地上でできる範囲内で実験を行った。本研究では、次の2つの問題に分けて研究を進めた。1.部分弾性薄肉円筒内・外面に付着した液体層と円筒の連成振動特性の理論的解析部分弾性薄肉円筒面の内側・外側に液体層が付着したモデルに対し、弾性円筒の基礎式にFluggeの式、液体には速度ポテンシャル理論を用い定式化し、連成振動特性に及ぼす表面張力、円筒形状、材料パラメータ等の影響を解明した。2.振動面上の液滴の動的挙動に関する実験液滴には蒸留水を用いた。液滴を付着させる材質を変えることで、異なる接触角を有する液滴を作った。加振機上に液滴(水)を置き、正弦波加振することで、液滴が振動面を離れる条件、又は液滴が分離する条件を明らかにした。また、接触角の異なる液滴の大振幅挙動の違いをハイスピードビデオカメラで観察し、今後の液滴の動的挙動解明の為の基礎資料とした。本研究では、低重力空間における弾性構造物と液体の連成挙動問題について、「弾性円筒薄板とそれに付着した液体」という基本システムの連成振動問題を例に取り上げ、その振動特性を理論的に解析すると共に、地上でできる範囲内で実験を行い、本問題に関する重要な基礎資料を提示することを目的とする。本年度は、「低重力空間における弾性薄板と付着液体の連成振動問題」を、実験を中心に研究を進めた。振動面上の液滴の動的挙動に関する実験液滴には蒸留水を用いた。加振機上に液滴(水)を置き、正弦波加振することで、・液滴が振動面を離れる条件、・又は液滴が分離する条件を明らかにした。また、接触角の異なる液滴の大振幅挙動の違いを、高速ビデオカメラで観察し、今後の液滴の動的挙動解明の為の基礎資料とした。I部分弾性薄肉円筒内・外面に付着した液体層と円筒の達成振動特性の理論的解析部分弾性薄肉円筒面の内側・外側に液体層が付着したモデルに対し、弾性円筒の基礎式にFluggeの式、液体には速度ポテンシャル理論を用い定式化し、連成振動特性に及ぼす表面張力、円筒形吠、材料パラメータ等の影響を解明した。II振動面上での液滴の非線形挙動に関する実験加振機上に置かれた液滴の、応答振幅が大きくなった場合の非線形挙動をハイスピードビデオを用いて観測した。