hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダイヤモンドpn接合に基づく高耐圧デバイスに関する研究

本年度(平成23年4月平成23年9月)は前年度の成果をもとに、ダイヤモンドpn接合のキャリア輸送過程を明らかにすべく、容量電圧(CV)特性、順方向電流立ち上がり付近の電圧電流(IV)特性を精査した。また二次イオン質量分析(SIMS)によりpn接合の不純物プロファイルを測定し電気測定結果とあわせてキャリア輸送特性を考察した。なお、研究計画に記載したpin接合の形成による電気特性改善の試み、電極特性評価に関しては、JSPSフェローの採用期間が平成23年9月までであった上に平成23年3月11目の震災の影響で実験を十分にできず、pin接合の形成までにとどまり、電気特性に関する十分な結果を得られなかった。SIMS評価に於いて、n型層のリン濃度は1E19/cm3程度、p型層のホウ素濃度は3E17/cm3程度、膜厚はそれぞれ1ミクロン程度で、pn接合界面の不純物プロファイルは極めて急峻であることが分かった。これはCV測定から得られた1/C2プロファイルの直線性と一致し、さらに求められる拡散電位とその温度依存性からは良好なジャンクション形成ができているといえる。一方、低電圧領域(オン電圧手前の領域)の指数関数的電流増加は2段階の立ち上がりを見せた。理想因子はそれぞれ室温から700Kの範囲で124および52程度に変化し、不完全な接合界面での理想的とは言えない電荷輸送が見られた。1E19/cm3のドナー濃度を持つn型層では電子のホッピング伝導が支配的であり、最近接のドナー間をそのエネルギー準位に於いてホッピングしていると考えられる。従って電子の状態密度は伝導帯底ではなくギャップ内のドナー準位付近に局在していると仮定した場合、界面での電子注入過程に於いて深い電子捕獲準位に捕獲される過程が介在しやすくなり、電子のトンネリングが関与する電荷輸送に至ると考えられる。本年度(平成21年9月平成22年3月)はメサ型ダイヤモンドpn接合の電気特性を表面状態と関連させて評価した。また、高精度の耐圧特性測定に実験系の改良が必要となり、真空排気系の整備等を行った。電子デバイスとして萌芽的ステージにあるダイヤモンドでは、パッシベーション技術など、デバイス形成の要素技術が確立していない。ダイヤモンドのメサ構造加工時に形成される欠陥、黒鉛化によるリーク電流の発生はデバイス高耐圧化に深刻な影響を与える。実験では、真空中での加熱黒鉛化により劣化したダイヤモンドダイオードを、水素プラズマによる水素化、大気中加熱による酸化処理を行い、その電気特性を評価した。水素化によって、表面層であるn型ダイヤモンド表面のパッシベーションによる表面伝導抑制が期待されたが、整流特性の改善は見られなかった。酸化処理では±20V程度のダイオード駆動電圧領域で著しい特性改善が見られた。これは基本的にホウ素ドープp型半導体表面および、メサ断面に露出したpn接合界面近傍の酸化によりリーク電流の原因となる欠陥準位がパッシベートされたことによると考えられる。しかし、ダイオード逆方向の耐圧特性は改善されず、高耐圧化にはドーピング構造、膜厚などの最適化が重要であることが示唆された。本年度(平成22年4月平成23年3月)はダイヤモンドpn接合の高品質化を試み、その電気特性の詳細な評価を行った。前年度の成果をもとに、特に酸化処理による高品質化を達成したダイヤモンドpn接合に関して順方向電流特性の詳細な評価を行った。実験には真空排気系を強化(本年度予算による)した高真空プローバチャンバーを用い、250Kから700K程度の温度領域で電圧印加電流測定、容量周波数特性、容量電圧特性の測定と数値解析を行った。その結果、ダイオード電流の立ち上がり特性は2種類の成分を含むことが分かった。この電流特性の温度依存性から、これらはDeep levelを介したトンネリングによることが分かった。また、2成分はそれぞれ異なる有効質量の電子によるものと考えられ、フィッティング結果は有効質量の報告値、mt*=0.306m0、ml*=1.81m0と良好な一致を示した。ここから現状ではpn接合界面において深い欠陥準位等を介したトンネリングがキャリア輸送を支配しており、結果としてLED発光効率の低下(他の研究課題にて実施中)原因となっていることが推測された。また、CV特性で観測された室温付近での高周波レスポンス低下にもn型ダイヤモンドが高抵抗であることと共に、深い準位を介したキャリア輸送が関係していると考えられる。

これはCV測定から得られた1/C2プロファイルの直線性と一致し、さらに求められる拡散電位とその温度依存性からは良好なジャンクション形成ができているといえる。一方、低電圧領域(オン電圧手前の領域)の指数関数的電流増加は2段階の立ち上がりを見せた。理想因子はそれぞれ室温から700Kの範囲で124および52程度に変化し、不完全な接合界面での理想的とは言えない電荷輸送が見られた。1E19/cm3のドナー濃度を持つn型層では電子のホッピング伝導が支配的であり、最近接のドナー間をそのエネルギー準位に於いてホッピングしていると考えられる。従って電子の状態密度は伝導帯底ではなくギャップ内のドナー準位付近に局在していると仮定した場合、界面での電子注入過程に於いて深い電子捕獲準位に捕獲される過程が介在しやすくなり、電子のトンネリングが関与する電荷輸送に至ると考えられる。
2型自然免疫における小腸刷子細胞受容体の機能解明と食品への応用展開

小腸刷子細胞は、アレルギー性疾患や寄生虫感染に対する2型免疫応答の始動において、センサーとして重要な働きをする。本研究では、小腸刷子細胞の頂端部に局在することを研究代表者自らが発見したオーファン受容体Xの生理機能を解明し、アレルギー性疾患や肥満・糖尿病の予防や治療に繋げることを目的とする。
マウス歯・顎顔面頭蓋の成長発育における母体要因の影響の検索

哺乳類の個体の成長発育においては、個体固有の遺伝子の影響に加えて出生前母体効果である母体の子宮内環境と出生後母体効果である母体の哺乳・育児能力などが影響していると考えられる。本研究目的は、マウスの歯・顎顔面頭蓋の成長発育におけるこれらの母体効果の影響を解明することにある。まず4系統の近交系マウス(DDD,C3H,C57BL,DBA)をレシピエントとして用いた受精卵移植実験より、(i)新生児マウスの歯・顎顔面の大きさは、産児数が大きくなるほど小さくなり、妊娠期間が長いほど大きくなる傾向が認められた。(ii)母親マウスの系統は、新生児マウスの歯・顎顔面の大きさに対して有意な影響を及ぼしていた。(iii)歯・顎顔面の大きさに対する産児数と妊娠期間の影響を統計学的に除去して検討したところ、遺伝的に均一なDDD/Qdjの受精卵から生まれた新生児マウスの歯・顎顔面の大きさに有意な系統間差を認めた。この結果は、胎児マウスの歯・顎顔面の子宮内成長に、母体の子宮内要因が出生前母体効果として重要な役割を果たしていることを示唆した。次に実験動物として大型の近交系マウス(DDD/Qdj)と小型の近交系マウス(C57BL/Qdj)の2系統を用いた里親飼育実験より、(iv)育てた母親マウスの系統は、新生児マウスの体重の出生後の成長変化の過程において有意な影響を及ぼしていた。(v)遺伝的に均一な新生児マウスを、自家飼育群及び里親飼育群としてC57BL母親マウスとDDD母親マウスに分けて哺育させたところ、DDD母親マウスが哺育した新生児マウスの体重は、C57BL母親マウスが哺育したそれより大きくなる傾向にあった。この結果は、新生児マウスの出生後の成長に育ての母親マウスの影響が、出生後母体効果として重要な働きをしていることを示唆した。本研究の主たる目的は、マウスの歯・顎・顔面頭蓋の成長育における母体の影響のうち出生後母体効果の影響の大きさを解明することにある。そこで、実験動物として大型の近交系マウス(IAI)と小型の近交系マウス(C57BL)の2系統を用いて次のような実験を行なっている。(1)それぞれの系統で、仔マウスの産出を行っている。(2)産出された仔マウスを2系統間で交換して、里親飼育を行なっている。(3)これら仔マウスの出生直后からの頭部の成長発育の様子を、頭部X線規格写真撮影装置にて経時的に観察している。(4)顎顔面頭蓋分析システムにより、各仔マウスの顎顔面頭蓋の形態を分析中である。(5)得られた仔マウスの顎顔面形態について、自家飼育仔マウス群と里親飼育仔マウス群で比較検討し、出生後母体効果の影響の大きさを解明している。現在4組のペアについての分析を行なって以下のような結果を得た。(1)2系統の仔マウスの、出生后の体重変化における育ての親マウスの影響は、哺乳期間である5日齢10日齢で最大に有意であった。(2)仔マウスの体重の成長変化において、性差は離乳期である20日齢前後からみられるようになってきた。(3)自家飼育仔マウス群と里親飼育仔マウス群の間では、有意な体重差が哺乳期間において著しくみられた。そしてその群差は、離乳後もしばらくの間みられた。以上より、仔マウスの生後の成長に、育ての母親マウスの影響が重要な働きをしていることが示唆された。

実験は現在も進行中であり、顔面頭蓋骨についての分析も行なっている。個体の成長発育は、個体固有の遺伝子とその発育環境との影響を受けている。そして、哺乳類の個体発育においては、母親の影響も大きいと言われている。この母体の影響は、大きく分けて出生前母体効果としての母体の子宮内環境と、出生後母体効果としての母体の哺乳・育児能力などが考えられる。本研究目的は、マウスの歯・顎・顔面頭蓋の成長発育における出生前母体効果の影響に加え、さらに出生後母体効果の影響をも解明することにある。そこで、実験動物として大型の近交系マウス(DDD/Qdj)と小型の近交系マウス(C57BL/Qdj)の2系統を用いて次のような実験を行っている。(1)それぞれの系統で、新生児マウスの産出を行い、新生児マウスのうちの半数を2系統間でそれぞれ交換して、里親飼育および自家飼育を行っている。(2)これら新生児マウスの出生直後からの体重の成長発育の様子を経時的に観察し、出生後母体効果の影響を検討した。(3)また、このようにして得られた新生児マウスの顎顔面頭蓋についても、自家飼育新生児マウス群と里親飼育新生児マウス群との間で顎顔面頭蓋分析システムにより比較検討し、出生後母体効果の影響の大きさを検討中である。現在6組の母親マウスから産出された新生児マウスの分析を行ない次の結果を得た。(4)育てた母親マウスの系統は、新生児マウスの体重の出生後の成長変化の過程において有意な影響を及ぼしていた。(5)遺伝的に均質化された新生児マウスを、自家飼育群及び里親飼育群としてC57BL母親マウスとDDD母親マウスに分けて育てさせると、DDD母親マウスが育てた新生児マウスの体重は、C57BL母親マウスが育てたそれより大きくなる傾向があった。このことは、新生児マウスの体重の出生後成長に対して、DDD母親の育児発育環境は、C57BL母親マウスのそれより、良好な環境であることを示唆している。以上より、新生児マウスの生後の成長に、育ての母親マウスの影響が重要な働きをしていることが示唆された。現在、顔面頭蓋についての分析および母乳成分の分析も検討中であり、結果は逐次刊行予定である。
リポ蛋白糸球体症に関わるアポ蛋白異常の腎局所における組織化学的検討

リポ蛋白糸球体症(LPG)の病因と考えられる異常アポ蛋白Eが腎局所においてリポ蛋白血栓を形成する状況を、電子顕微鏡(電顕)観察に、免疫電顕法、樹脂ブロックにおける脂肪染色法などを併用することで明らかにし、同時に、このような異常症での糸球体毛細管内の脂肪顆粒と血漿リポ蛋白所見の関係について検討した。1.対象:ApoE Sendaiを有するLPGの他に、18個のアミノ酸残基欠損型および3個のアミノ酸残基欠損型のアポE異常を有するLPGのそれぞれの腎生検標本を対象とした。また、ApoE Sendai組み換えウイルスベクターを注入したアポEノックアウトマウスにおけるLPG実験モデルの腎標本についても検討を行った。2.アポ蛋白Eの免疫組織学的検討:LPG腎生検凍結標本および実験モデル摘出腎凍結標本において、抗アポE抗体を用い酵素抗体法を行った後、エポン樹脂包埋ブロックを作製し、電顕観察を行った。その結果、糸球体毛細管腔内に見られるいわゆるリポ蛋白血栓において、脂肪滴の周囲にアポEの沈着が観察された。3.エポン包埋樹脂連続切片を用いた脂質染色と電顕観察による検討:LPGのリポ蛋白血栓内で観察される脂肪滴の性状をより明確にするために、電顕観察を行った超薄切切片の連続切片にズダン染色を行った。その結果、糸球体のリポ蛋白血栓は不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドが主体であることが示唆された。この結果は、動物実験モデルでも同様であったが、ブロック作製時のp-フェニレンジアミン処理でより詳細な検討ができた。4.糸球体毛細管内脂肪顆粒と血漿リポ蛋白異常:脂肪顆粒の大きさと血漿やそのHDL分画におけるトリグリセリド/コレステロール比が相関し、その小型化とともに病態が進行することを示した。以上の結果から、異常アポEによるリポ蛋白血栓の実態を組織化学の面から解明することができた。1. In situ hybridization法によるアポ蛋白EmRNAの局在の検討:リポ蛋白糸球体症の患者において認められるApo Eの遺伝子配列異常については、従来のApo E Sendaiのほかに、新たに3種類の異常が我々の共同研究で発見され、その多型性が明らかとなった。その結果、in situ hybridization法によるapo E mRNAの局在についてもそれぞれを対象にする必要があり、現在さらに検討中である。平成11年度中にはその局在を明らかにできるものと考えている。2.アポ蛋白Eの免疫組織学的検討:新しいApo E異常を呈するリポ蛋白糸球体症の標本について、アポ蛋白の糸球体への沈着状況を螢光抗体法、酵素抗体法にて検討し、新たな知見を得た。平成11年度には、さらに、その詳細を明らかにする。3.超微形態法による検討:糸球体におけるリポ蛋白血栓の形成の詳細を検討するため、リポ蛋白血栓内、および毛細管係蹄壁、メサンギウム周囲におけるリポ蛋白構造物の詳細を電子顕微鏡にて観察した。初期の段階で、メサンギウム周囲や係蹄壁にも、リポ蛋白血栓と類似の構造が観察されたが、リポ蛋白血栓に観察されるような指紋状の構造は明らかでなく、管腔内に突出するにつれ、そのような構造が形成されることが明らかとなった。さらに、脂肪粒子が小型化するとともに、臨床的には尿蛋白が増加し、腎障害を増すことが示された。

また、この脂肪の小型化は、血中におけるリポ蛋白の組成、とくに血清トリグリセリド、VLDL-トリグリセリド、HDL-トリグリセリドの増加と関係深いことが明らかとなった。リポ蛋白糸球体症の病因と考えられる異常アポ蛋白Eが腎局所においてリポ蛋白血栓を形成する状況を、電子顕微鏡(電顕)観察に、免疫電顕法、樹脂ブロックにおける脂肪染色法などを併用することで明らかにした。1.対象:Apo E Sendaiを有するリポ蛋白糸球体症の他に、18個のアミノ酸欠損型および3個のアミノ酸残基欠損型のアポE異常を有するリポ蛋白糸球体症のそれぞれの腎生検標本を対象とした。また、Apo E Sendai組み換えウイルスベクターを注入したアポEノックアウトマウスにおけるリポ蛋白糸球体症実験モデルの腎標本についても検討を行った。2.アポ蛋白の免疫組織学的検討:リポ蛋白糸球体症腎生検凍結標本および実験モデル摘出腎凍結標本において、抗アポE抗体を用い酵素抗体法を行った後、エポン樹脂包埋ブロックを作製し、電顕観察を行った。その結果、糸球体毛細管腔内に見られるいわゆるリポ蛋白血栓において、脂肪滴の周囲にアポEの沈着が観察された。3.エポン包埋樹脂連続切片を用いた脂質染色と電顕観察による検討:リポ蛋白糸球体症のリポ蛋白血栓内で観察される脂肪滴の性状をより明確にするために、電顕観察を行った超薄切切片の連続切片にズダン染色を行った。その結果、糸球体のリポ蛋白血栓は不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドが主体であることが示唆された。この結果は、動物実験モデルでも同様であった。さらに、アミノ酸欠損型異常アポEを有する症例では、この種のリポ蛋白を有する動脈硬化が観察された。以上、当初予定したIn site hybridization法による検討は、それに適した検体が得られず見送ったが、今年度の結果から、異常アポEによるリポ蛋白血栓の実態を組織化学の面から解明することができた。
進行性パーキンソン病マーモセットモデルの作成および評価系の開発

Parkinson's Disease(PD)は厚生労働省の特定疾患の指定難病であり、本邦では今後も増加が予想される。無動、筋強剛、振戦を主症状とし、治療はL-dopa剤の補充療法しかない。治療研究が進展しない原因に病態を反映した霊長類PDモデルがないことがある。本研究はマーモセットを用いてヒトPDの発症起点と同じPDモデルを作成する。αsynucleinが神経細胞内に凝集体を形成し、神経変性を引き起こすため、この凝集体を用いたPDモデルを作成する。新規開発MarmoDetectorによる動作解析、生化学、病理学的解析で治療薬効果判定システムを作成し、新規薬剤の評価系への臨床応用をすすめる。
極低摩擦生体類似摺動組織の形成および機能評価技術の構築

本研究では,軟骨細胞を足場材に播種し培養する過程において,足場材表面にガラスローラーを接触させ転がり滑り運動を与えることにより,足場材内部に歩行時の軟骨組織内部と類似の複数応力成分からなる不均一な力学場を再現し,関節軟骨類似の極低摩擦特性を示す高機能摺動組織を形成させる手法を探究した.また形成された摺動組織表面の摩擦特性を高精度に評価するための試験システムを合わせて開発した.ここでは,組織表面の摩擦係数を計測すると共に,組織内部の細胞に生じる機械的歪みを定量可能とすることにより,細胞が経験する力学的負荷と形成される組織構造およびその力学的機能との関連を定量的に議論することを目指した.足場材に軟骨細胞を播種した培養組織試験片に対し,試験片表面とローラーの摺動による力学的負荷を加えながら培養する,「摺動負荷培養装置」を開発した.本研究では,足場材内部に摺動による不均一な応力場を形成し,内部の個々の軟骨細胞が曝される応力場と,その細胞が周囲に形成する組織構造との関係を明らかにすることを目指している.そのためこの装置では,ガラス製ローラーと接触する矩形の培養組織試験片の幅を,ローラー幅よりも小さくし,ローラーとの接触により培養組織試験片内に生じる応力分布が,線接触に関するヘルツの接触理論により記述可能な二次元的なものとなるようにした.培養組織試験片を浸漬した培養皿は試料ステージ上に固定し,ガラスローラーに対しこの試料ステージを上下させることにより,試験片上面とローラーとを接触させ初期押し込みを与える.またローラーの往復回転と試料ステージの前後動をそれぞれ独立したサーボモーターで行うことにより,滑り率=0の純転がりから滑り率=1の純滑りまで,滑り率の異なる摺動を培養組織試験片に加えることが可能である.摺動負荷培養装置の製作と平行し,1MPa程度の実用的機械的強度を持った培養組織を得るための高細胞密度培養技術の検討を行った.まず,足場材であるアガロースゲルのアガロース濃度を従来の2 wt%から1 wt%まで希薄化し,初期細胞濃度1億cells/mlでの高細胞密度培養における細胞生存率と組織形成を検討した.その結果,3週間の培養において,組織試験片中心部における著しい生存率低下が認められた.このため,アガロースを足場材として高細胞密度培養を行うには,繰り返し圧縮変形あるいは流体圧によるパフュージョン効果により物質輸送を促進する必要があると判断された.また高細胞密度培養に充分な数の軟骨細胞を安定して確保するため,細胞源の変更を検討開始した.本年度は,当初の計画に従い「顕微鏡視野下摩擦・変形特性評価システム」の開発を行った.導入した横河電機(株)製共焦点画像取得システムを既存の倒立方顕微鏡に設置し,さらに顕微鏡観察ステージ上に設置する小型摩擦・変形評価システムの構築を目指した.導入した共焦点画像取得システムは共焦点光学系にニポウディスク方式を採用し,高フレームレートのCMOSカメラと組み合わせることで共焦点画像を高速に取り込むことが可能である.これにより,培養組織およびその内部に有る培養軟骨細胞の変形について,その動的挙動を比較的高い時間解像度で観察することが可能である.小型摩擦・変形評価システムでは,ガラスボトム培養皿に満たした培地に浸漬した培養組織に対し,摩擦測定機構と連結された圧子を押しつけ,さらに圧子を接線方向に往復動させる.その際,培養組織表面で生じる摩擦力を計測すると共に,組織内に生じる歪みの分布,および内部の軟骨細胞に生じる歪みを共焦点観察により取得し,培養組織内に構築された荷重支持や摩擦低減といった力学的機能の発現程度を評価することを目的とする.このうち,現状では未だ力学的強度の低い培養組織表面に生じる微小な摩擦力を計測する摩擦測定機構の開発が最も難易度が高いため,本年度はまず圧子と培養組織を接触させ,往復動させる運動機構の開発を先行して完了させた.そのシステムを用い,培地に浸漬した培養組織に圧縮とせん断の両変形を与える実験を実施し,取得した共焦点画像から,組織内に生じるマクロスケールの歪み分布と,個々の細胞に生じるマイクロスケールの歪みを定量する方法を確立した.また摺動負荷培養実験も継続して実施しており,本年度は全培養期間における摺動負荷の負荷時間および負荷時期の影響を検討し,組織形成の促進に最適な培養条件を探索した.平成27年度の計画の内,顕微鏡視野下摩擦・変形特性評価システムの開発については,概ね予定通りに遂行することが出来た.培養組織と圧子を接触させ両者間で滑り摩擦を生じさせる,2つのサーボモータによる二軸の精密運動機構を,倒立方蛍光顕微鏡の観察ステージ上に構築した.また実際に培養組織の二軸変形試験を顕微鏡視野下で実施し,取得した共焦点画像から,組織内のマクロスケールの歪みと組織内部の細胞に生じるマイクロスケールの歪みを定量する手法を確立した.残る摩擦測定機構についても,基本設計を終え主要なセンサーや電子部品等の選定を終えており,現在部品の調達と組み立てを進めている.

そのため,摩擦測定機構の開発についても,平成28年5月中には完了の予定である.摺動負荷培養実験についても,ほぼ計画通りに実施した.今年度は培養後の組織について,コラーゲン繊維およびプロテオグリカン含有量の定量を行い,摺動負荷培養を行った培養組織では,ローラと接触する接触部よりも,ローラとは接触しない非接触部においてコラーゲンおよびプロテオグリカンの含有量が高くなっていることが明らかとなった.また組織構造の形態的特徴についても,培養組織内のコラーゲン繊維およびプロテオグリカンを形成する成分であるケラタン硫酸を免疫抗体染色法により蛍光染色し,共焦点蛍光顕微鏡により観察することで評価した.前年度から継続する検討課題である,高弾性率培養組織形成のための高細胞密度培養法については,本年度は細胞腫として株化した軟骨細胞前駆細胞の使用を検討した.しかし,現在用いている培養環境では,十分な細胞生存率を得ることと適切な分化誘導を行うことが困難であった.そのため実験に使用する細胞腫について再検討することとした.本年度は,まず「顕微鏡視野下摩擦・変形特性評価システム」の開発を完了した.力学的強度の低い培養組織表面の摩擦特性を評価するには,微小荷重下において高精度な摩擦測定が可能な計測機構が必要となる.本研究では,厚さ0.2 mmのステンレス薄板を用いて2軸カンチレバーを構成し,2軸方向の変位をそれぞれレーザー変位計により高精度に測定することで,試料に与えられる微小荷重と表面で生じる微小摩擦を測定可能とした.また剛性の低いカンチレバーに対する運動用モータによる振動ノイズの影響を回避するため,計測機構と駆動機構の分離・再配置を行った.共焦点レーザー顕微鏡による画像からの組織内部歪み分布の定量には,画像相関法を用いることとした.完成したシステムを用い, 1週から3週まで静置培養した培養軟骨モデルについて,摩擦の評価と組織内歪み分布の定量を行った.まず荷重負荷後の応力緩和挙動から,培養と共に弾性率が上昇し,透水係数は小さくなることを確認した.また摩擦試験の結果,モデル表面の摩擦係数は培養と共に上昇したものの,組織内の歪み分布には明確な影響が認められなかった.これは,静置培養ではコラーゲンを主とする軟骨様組織が均一に形成されたためであり,摩擦を抑制する表層が形成されず,組織形成と共にせん断抵抗が増加し摩擦が上昇したと考えられる.摺動負荷培養実験についても継続して実施した.本年度は再生軟骨モデル試料に対する摺動負荷用ローラの初期押し込み量を変化させた評価を行った.弾性変形を仮定した接触解析により,初期押し込み量を試料厚さの10%から30%まで変化させた際の試料内応力状態を求め,実験結果と比較した.その結果,初期押し込み量の増加と共に試料表面近傍では接線方向の応力振幅が増加し,それによりコラーゲン線維およびグリコサミノグリカンの産生量が増加することが,比色定量と組織観察の両者から確認された.本研究では,軟骨細胞を足場材に播種し培養する過程において,足場材表面にガラスローラーを接触させ転がり滑り運動を与えることにより,足場材内部に歩行時の軟骨組織内部と類似の複数応力成分からなる不均一な力学場を再現し,関節軟骨類似の極低摩擦特性を示す高機能摺動組織を形成させる手法を探究した.また形成された摺動組織表面の摩擦特性を高精度に評価するための試験システムを合わせて開発した.ここでは,組織表面の摩擦係数を計測すると共に,組織内部の細胞に生じる機械的歪みを定量可能とすることにより,細胞が経験する力学的負荷と形成される組織構造およびその力学的機能との関連を定量的に議論することを目指した.平成26年度の計画の内,摺動負荷培養のための力学負荷培養装置の開発については,予定通りに完了し,足場材としてアガロースを使用した培養組織試験片を用いた予備実験を開始することができた.3週間の培養を目標とした予備実験では,繰り返し摺動による試験片の損傷も見られたことから,現在,損傷を起こさずに3週間程度の培養が可能な負荷条件の検討を進めている.また同様に,強度面からの足場材料の検討も進めている.
音響放射圧の高周波数超音波トラッキングによる皮膚のスマート・エイジング評価

対象物に1MHzの音響放射圧アプリケーターにより微小な変位を生じさせ、その変位を中心周波数120MHzの高周波数超音波の位相差トラッキングで計測することで、計測対象の粘弾性特性を計測する手法を開発した。3層構造を有する人工皮膚における本手法の有用性を実証し、皮膚のスマート・エイジング評価が可能になることが示された。皮膚のエイジングによるたるみやシワには、真皮におけるコラーゲンの量や質の変化が大きく関わっている。したがって、皮膚のスマート・エイジング評価には、表皮と真皮を判別しうる解像度で真皮の弾性を非侵襲的に計測する方法の開発が必要である。本研究では、音響放射圧によって皮膚組織に微小なひずみを発生させ、組織の変位を中心周波数120MHzの高周波数超音波の位相差トラッキングによりナノレベルの解像度で定量解析し、ひずみの伝搬速度の2乗が組織弾性に比例することを利用して、真皮の弾性計測法を確立することである。平成22年度は、1.1台のワークステーションで、高周波数パルスの発生・音響放射圧パルスの発生・それぞれの発信の制御・データ取得・データ解析などの全てを行うことができるような計測システムの設計、2.振動子を取り囲むような凹面型デザインの音響放射圧を与えるアプリケーターの設計、3.せん断応力測定に必要なパルスの強度・周波数・持続時間(パルス数)などの検討、4.高周波数超音波送受信にかかわるパルサー/レシーバーの設計、などの基礎的検討を中心として研究を開始した。さらに、5.繰り返し周波数1000Hzで受信した超音波の位相差トラッキングにより皮膚ファントムの厚さ・ひずみ率計測を行うアルゴリズムの確立を行った。直径5cmの半球状のPZT製超音波振動子(中心周波数1MHz)の中央に直径5mmの穴をあけたものを音響放射圧発生用のアプリケータとし、中央の穴に中心周波数100MHzのPVDF製超音波振動子を同軸に通して微小変位の測定を行った。微小振動取得用振動子には2000Hzで50Vppの電気信号を印加し高速デジタイザカードにより信号を取得した。高周波数超音波128パルスに1回25Vppで7波のバースト波を発生させ音響放射圧とした。人工皮膚のBモード像、Mモード像、1ラインの速度変化を示すことにより、Bモード像では1層目:強化フィルム層、2層目:補強メッシュ層、3層目:スポンジ層が観察された。表面のシリコン位相変位は約180度で、100MHzの超音波の波長が15ミクロンなので音響放射圧による約7ミクロンの変位が計測可能であった。各層の最高速度は1層目:50mm/sec、2層目:22mm/sec、3層目:44mm/sec、それらの速度差から算出したひずみ率は1層目:1.0、2層目:0.4、3層目:1.4となった。高周波数超音波の位相差解析により、音響放射圧による人工皮膚の振動計測が可能であった。算出したひずみ率はBモード像の高輝度部位で高く、低輝度部位で低かった。また、皮膚の粘弾性は皮脂腺分布と密接に関連があることが示された。本研究では、音響放射圧によって皮膚組織に微小なひずみを発生させ、組織の変位を中心周波数120 MHzの高周波数超音波の位相差トラッキングによりナノレベルの解像度で定量解析することで、真皮の弾性計測法を確立することを研究目的とした。直径5 cmの半球状のPZT製超音波振動子(中心周波数1 MHz)の中央に直径5 mmの穴をあけたものを音響放射圧発生用のアプリケータとし、中央の穴に中心周波数100 MHzのPVDF製超音波振動子を同軸に通して微小変位の測定を行った。微小振動取得用振動子には2000 Hzで50 Vppの電気信号を印加し高速デジタイザカードにより信号を取得した。高周波数超音波128パルスに1回25 Vppで7波のバースト波を発生させ音響放射圧とした。

高周波数超音波の位相差解析により、音響放射圧による人工皮膚の振動計測を行い、レーザードップラー法にてその精度を検証した。さらに、得られた時間-変位カーブにVoigtモデルを適用し、組織の粘弾性を算出した。3層構造を有する人工皮膚組織では、補強メッシュ層では弾性が高く、スポンジ層では相対的に弾性が低く粘性が高いことが示された。本手法による真皮の粘弾性計測は、臨床皮膚科学および化粧品や美容施術の効果判定に有用であることが示された。研究計画に記載した、音響放射圧による皮膚組織の層ごとの弾性率を計測に成功した。さらに、既存の弾性計測装置や三次元超音波顕微鏡による検討で、皮膚の弾性が皮脂腺分布に影響されることが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は順調に進捗しており、今後も研究計画に沿って遂行していきたい。さらに、アレイ型の超音波振動子を用いることで、皮膚表面に平行な方向の音響放射圧を検出するなどという研究に発展させたい。
ベッド上からの転落予知センサの開発と実用化に向けた検証

ベッド上で療養している患者の転落事故は年々増加している。しかし現在の転落防止策は、転落事故の予兆を目的とした研究の取り組みは少ない。本研究は、ベッド上で療養生活を過ごす患者の体動変化を継時的に捉え、転落の予兆に繋がる異常体動を事前に把握し、危険予知・防止につなげるための新たな観察手法の提案を目的とした。本研究により、ベッド上における臥床位置や体動を、ベッドに装着された4脚の加圧状態の変化によりとらえることが可能である示唆された。さらに、投影重心の非線形解析の結果から、ベッドからの転落の予兆を捉えることの可能性も示唆された。27年度は、「圧力センサおよび重心変動解析装置の測定精度および信頼性に関する基礎研究」を実施した。当該研究では、これまでの研究において確立してきた非線形時系列解析の手法を用いて開発したシステムを用いて実験を行う。ベッドの4脚の下に設置した圧力線センサから、Blutoothを通じてPCに表示されたリアルタイムの重心位置を時系列上に表す。取得した重心データは、X軸・Y軸に分けて表示され、それぞれ軸ごとにの移動した軌跡が蓄積されて表示される。これらのデータ取得後に計算された結果は、面積軌跡長・パワースペクトル・ゆらぎの大きく3つの大項目があり、スペクトル解析・カオス解析・DFA解析などの非線形時系列解析を用いて、結果を算出して、再現性の検証を行った。解析結果の再現性に課題がある。複数の解析方法による組み合わせの判断が必要となっている。現段階では、当初計画に加えて新たな分析方法を加えた手法の取り組みを行うことで、課題の解決が可能なものと考えている。患者の離床情報は、看護師の把握するべき患者安全情報において特に上位である。27年度では「圧力センサおよび重心変動解析装置の測定精度および信頼性に関する基礎研究」を行った。28年度では「療養者に対する重心軌跡の分析による転落予防効果の検証」について、健康人を模擬対象としたシミュレーション実験によって検証を行った。実験および解析は以下の手法で行った。1スペクトル解析によるパワースペクトル値:時系列データに対してスペクトル解析を行った。パワースペクトルは、3種類に注目して重心の動きの周波数を分解した。その結果、対象者の重心の動きの周波数は、離床に関しての相関性が存在していることが示された。2DFA解析によるゆらぎ指数:ゆらぎの項目では、ゆらぎ指数1、ゆらぎ指数2という2種類の指数を算出した。ゆらぎ指数はDFA法を用いた解析により算出される指数である。しかし、本研究では重心の動きがDFA解析による離床・転落に関する予備動作につながる関係性は把握できなかった。3カオス解析によるリアプノフ指数:リアプノフ指数は、重心の動きをカオス解析することで、算出される指数である。指数の値が大きければ測定しているデータが不安定でカオス的であることを示しており、ゆらぎ指数と合わせて、重心動揺の特性を表す指標として検討を行った。本研究の結果では、転倒転落リスクにつながる僅かな指標となることが示唆された。さらに本年度は、DFAで得られなかった転倒転落の予兆に関して、危険な行動をSupport Vector Machine(SVM)にて機械学習させることで、状態を推定し、予防を行う試みを行った。その結果、マイクロ平均における適中率は90.6%、適合率は86.0%、再現性は86.0%であり、判別システムの精度は高いと考えられた。今後は、SVMによるさらなる検討の必要性が示唆された。28年度は、実際の病棟や在宅で療養する対象者に対して実施し、臨床での装置の応用可能性について検討する予定である。評価指標は以下のとおりである。1スペクトル解析によるパワースペクトル値:時系列データに対してスペクトル解析を用いて算出し、パワーLow(0.02-0.2Hz)、パワーMiddle(0.2-2.0Hz)、パワーHigh(2.0-10Hz)の3種類に重心の動きの周波数を分解し、重心の動きの周波数と離床に関してどのような相関性が存在しているのかという点について検討を行う。2DFA解析によるゆらぎ指数:ゆらぎ指数はDFA法を用いた解析によって算出する。重心の動きについては、DFAを用いて解析した例がないため、本研究により、離床・転落に関する予備動作にどのような特性があるのかということについて明らかにする。3カオス解析によるリアプノフ指数:リアプノフ指数は、重心の動きをカオス解析することで、算出される指数であり、とても似ているが全く異なる2つの軌道が、時間経過によりどの程度違ったものになるかを測る尺度である。指数の値が大きければ測定しているデータが不安定でカオス的であることを示しており、ゆらぎ指数と合わせて、重心動揺の特性を表す指標として検討を行う。看護学、人間工学
C-S-Hの共存作用に基づくエトリンガイトの膨張性評価手法の構築

硬化コンクリート中において、エトリンガイトと呼ばれるセメント水和物が二次生成した場合、硬化体の膨張劣化が生じる。エトリンガイトの二次生成と膨張機構に関しては、根本的なメカニズムが十分に解明されていないが、研究代表者はケイ酸カルシウム水和物(C-S-H)の存在がエトリンガイト二次生成を促進することを明らかにした。本研究では、硫酸イオンと反応してエトリンガイトに変化するモノサルフェートおよびC-S-Hを純薬合成して混合した単純な系を用いて、C-S-Hがエトリンガイト二次生成を促進するメカニズムの詳細を明らかにする。また、膨張量を実験的に評価することによって、膨張性状を評価する手法の構築を行う。本年度は,硫酸イオン存在下でエトリンガイトへと変化するモノサルフェートにC-S-Hが共存した場合における,エトリンガイト二次生成の促進現象について,化学組成およびAl結合状態に着目した検討を行うことにより,そのメカニズムを明らかにした.具体的には,モノサルフェートおよび,化学組成であるCaO/SiO2モル比が異なるC-S-H,水酸化カルシウム,非晶質シリカ,ケイ酸アルミン酸カルシウム水和物(C-A-S-H)などの共存物質を純薬合成によって作製した.その後,合成モノサルフェートにC-S-HやC-A-S-Hなどの各種共存物質を質量比1:1として混合し,硫酸ナトリウム水溶液を用いて練り混ぜを行った.練り混ぜ後の試料は,粉末X線回折(XRD)によりエトリンガイト量を定量し,また27Al-NMR測定によって試料中のAlの存在形態を評価した.その結果,C-S-Hが共存した場合では,エトリンガイトの二次生成量が顕著に増大した.しかし,水酸化カルシウムや非晶質シリカを単独で共存させた場合や,その両者をC-S-Hと同様の化学組成で混合して共存させた場合では,エトリンガイトがほとんど二次生成しなかった.このことから,エトリンガイトの二次生成は,CaおよびSiを単純に共存させても促進されないことが明らかとなった.また,C-S-Hを共存させた試料の27Al-NMR結果から,練り混ぜによって4配位のAlを有するC-A-S-Hが形成されたことを確認した.初めから合成C-A-S-Hを共存させた場合では,C-S-H共存の場合と比較してモノサルフェートの消費が抑制された一方で,エトリンガイト二次生成量は同等であった.以上の結果から,エトリンガイトは4配位のAlから二次生成しやすく,C-S-Hは構造中にAlを置換して4配位Alを形成することによって,エトリンガイトの二次生成を促進すると考えられた.C-S-Hの共存がエトリンガイトの二次生成を促進する現象は,1エトリンガイトが4配位Alから生成されやすいこと,2C-S-Hは構造中のSi鎖にAlを置換して4配位Alを形成することに起因していることを見出し,エトリンガイトの二次生成メカニズムの一端を明らかにすることができたため.令和元年度は,合成モノサルフェートに合成C-S-H等の各種物質を共存させ,硫酸ナトリウム水溶液によって練り混ぜを行い,硬化した後の膨張量(体積変化)を測定することによって,C-S-H等の共存物質が二次生成したエトリンガイトの膨張性状に及ぼす影響を明らかにする.また,その際のエトリンガイトの二次生成量の定量および,二次生成した際の結晶形態の観察を行う.上記の検討結果および,平成30年度の結果を踏まえ,各種物質が共存した際のエトリンガイトの二次生成による膨張性状を予測する手法の構築を行う予定である.硬化コンクリート中において、エトリンガイトと呼ばれるセメント水和物が二次生成した場合、硬化体の膨張劣化が生じる。本年度は,硫酸イオン存在下でエトリンガイトへと変化するモノサルフェートにC-S-Hが共存した場合における,エトリンガイト二次生成の促進現象について,化学組成およびAl結合状態に着目した検討を行うことにより,そのメカニズムを明らかにした.具体的には,モノサルフェートおよび,化学組成であるCaO/SiO2モル比が異なるC-S-H,水酸化カルシウム,非晶質シリカ,ケイ酸アルミン酸カルシウム水和物(C-A-S-H)などの共存物質を純薬合成によって作製した.その後,合成モノサルフェートにC-S-HやC-A-S-Hなどの各種共存物質を質量比1:1として混合し,硫酸ナトリウム水溶液を用いて練り混ぜを行った.練り混ぜ後の試料は,粉末X線回折(XRD)によりエトリンガイト量を定量し,また27Al-NMR測定によって試料中のAlの存在形態を評価した.その結果,C-S-Hが共存した場合では,エトリンガイトの二次生成量が顕著に増大した.

しかし,水酸化カルシウムや非晶質シリカを単独で共存させた場合や,その両者をC-S-Hと同様の化学組成で混合して共存させた場合では,エトリンガイトがほとんど二次生成しなかった.このことから,エトリンガイトの二次生成は,CaおよびSiを単純に共存させても促進されないことが明らかとなった.また,C-S-Hを共存させた試料の27Al-NMR結果から,練り混ぜによって4配位のAlを有するC-A-S-Hが形成されたことを確認した.初めから合成C-A-S-Hを共存させた場合では,C-S-H共存の場合と比較してモノサルフェートの消費が抑制された一方で,エトリンガイト二次生成量は同等であった.以上の結果から,エトリンガイトは4配位のAlから二次生成しやすく,C-S-Hは構造中にAlを置換して4配位Alを形成することによって,エトリンガイトの二次生成を促進すると考えられた.C-S-Hの共存がエトリンガイトの二次生成を促進する現象は,1エトリンガイトが4配位Alから生成されやすいこと,2C-S-Hは構造中のSi鎖にAlを置換して4配位Alを形成することに起因していることを見出し,エトリンガイトの二次生成メカニズムの一端を明らかにすることができたため.令和元年度は,合成モノサルフェートに合成C-S-H等の各種物質を共存させ,硫酸ナトリウム水溶液によって練り混ぜを行い,硬化した後の膨張量(体積変化)を測定することによって,C-S-H等の共存物質が二次生成したエトリンガイトの膨張性状に及ぼす影響を明らかにする.また,その際のエトリンガイトの二次生成量の定量および,二次生成した際の結晶形態の観察を行う.上記の検討結果および,平成30年度の結果を踏まえ,各種物質が共存した際のエトリンガイトの二次生成による膨張性状を予測する手法の構築を行う予定である.
悪性脳腫瘍の手術時における留置用オキシセルロース-抗癌剤複合体の開発

抗癌剤を長時間、高濃度で腫瘍細胞に滞留させ、脳腫瘍の化学療法改善を計るため、オキシセルロース-アドリアマイシン、オキシセルロース-シスプラチン複合体を調製した。オキシセルロースは組織吸収性の止血剤であり、脳外科的手術時には止血の目的で脳内に留置する等安全性が保証された材質故、これにアドリアマイシン、シスプラチンを化学結合あるいは吸着により結合させ複合体を試製した。次いで本複合体のIN VITRO,IN VIVOにおける除放性、毒性、抗腫瘍特性を検討した。その結果オキシセルロース-アドリアマイシン複合体ではIN VITRO溶出試験において比較的良好な除放性(12時間で約50%、24時間で約80%溶出)が得られ、さらにホリ乳酸のコーティングによる長期除放性(2日で10-20%溶出)の可能性も認められた。また抗腫瘍効果(S-180担癌マウスに対する延命効果の改善)でもアドリアマイシン単独より勝れていることが観察された。そこでさらにラット、犬での毒性試験を行ったが、特筆すべき毒性は認められなかった。以上の結果、臨床使用可能と考えられたので、脳腫瘍手術時に脳内留置し術後の再発防止効果を検討した。投与後脳脊髄液中アドリアマイシンは半日から数日にわたり高濃度を保ち、持効性が期待された。再発防止効果については径過観察中であり、近く統計処理の予定である。ボリ乳酸をコーティングしたオキシセルロース-アドリアマイシンについては毒性試験を行っているが、安全性の確認ができ次第、臨床使用を計画している。またオキシセルロース-シスプラチン複合体も調製したが、毒性が綱く、その原因を究明中である、抗癌剤を長時間、高濃度で腫瘍細胞に滞留させ、脳腫瘍の化学療法改善を計るため、オキシセルロース-アドリアマイシン、オキシセルロース-シスプラチン複合体を調製した。またオキシセルロース-シスプラチン複合体も調製したが、毒性が綱く、その原因を究明中である、
統合失調症モデル動物におけるセロトニン5-HT2A受容体イメージング

現在使用されている統合失調症治療薬の多くがドーパミン受容体だけでなく、セロトニン受容体(特に5-HT2A)に対しても遮断作用を有している。しかし、統合失調症の病態発現におけるセロトニン受容体の役割についてはほとんど明らかにされていない。そこで本研究では統合失調症のモデル動物を用いて、陽性症状様の行動異常と陰性症状様の行動異常がそれぞれ顕著な状態において、5-HT2A受容体の放射性マーカーであるF18-altanselinを使用したPETおよびautoradiography計測を実施し、症状に関連した5-HT2A受容体結合能(分布)変化が生じるのかを検討する。
シュートの成長制御の分子機構

植物の体は細胞壁により形が定められた細胞の積み重ねによって構築されているので、各器官の形態は個々の細胞の形に特に大きく依存している。RSGは塩基性領域ロイシンジッパー(bZIP)構造を持つ新しい転写因子で、シュートの成長を調節する。植物体における転写因子RSGの機能を探るため野生型RSGの機能を阻害するドミナントネガティブ型RSGをタバコ個体で発現させた。この形質転換タバコは茎の節間成長が著しく阻害され、対照植物に比べて背丈が1/7程度となった。本研究ではRSGを中心とした転写制御系がどのようにして、シュートの成長を制御するのかを明らかにすることを目的とした。形態学的解析の結果、ドミナントネガティブ型RSGによるシュートの成長阻害は細胞伸長の抑制に起因する事が明らかになった。細胞伸長の方向は植物固有の構造である表層微小管によって規定されると考えられている。対照植物の表層微小管は細胞の伸長方向に垂直に整然と配向しているのに対し、形質転換植物では表層微小管の構造が完全に破壊されランダムに分布し、一部の細胞では表層微小管の断片化が観察された。RSGは表層微小管の構造制御を介して細胞伸長ひいては茎の伸長を制御していると考えられる。遺伝子の秩序正しい発現調節には転写因子間の相互作用が重要である。RSGと相互作用するタンパク質群をtwo-hybrid法によりクローン化し解析した。RSGBP1は、14-3-3と呼ばれるファミリーに属する。14-3-3は標的タンパク質のリン酸化されたセリンと結合してその機能を調節するので、RSGの活性の制御にはリン酸化が関与すると考えられる。もう一つのタンパク質RSGBP2はRSGとbZIP領域において相同性を示す新しいbZIP型転写因子であった。RSGBP2も酸性アミノ酸に富む領域などを持っているのでRSGと同様、転写の活性化因子と考えられる。
臓器非特異的な自己免疫疾患患者のT細胞が認識する自己抗原エピトープの解析

自己抗原反応性T細胞が認識するエピトープを検出することを目的に以下の準備と解析を行った。1、臓器非特異的な自己免疫疾患として知られている混合性結合組織病と全身性エリテマトーデスの対応自己抗原のひとつであるUl-A RNPを大腸菌の産生するリコンビナント蛋白として準備した。2、エピトープを求めるためT細胞の認識するリコンビナント蛋白を分断した。3、さらに20アミノ酸残基数程度に短くした合成ペプチドを準備した。以上の3種類の抗原に対するT細胞の増殖反応をチミジン取り込み法により12人の患者について反応性を解析した。その結果、Ul-A RNP蛋白の209-228アミノ酸残基数の部分と262-281アミノ酸残基数の部分に対して6人の患者T細胞が反応し、T細胞エピトープと同定された。前者のエピトープはアルファヘリカル構造をとりMHCクラスII分子との親和性を持つ部分であった。後者のエピトープはすでに求めたB細胞エピトープに一致する部分を含んでいた。このことからT細胞エピトープは抗原提示細胞に依存する部位に形成されると考えられた。この成績はArthritis and Rheumatismに報告した。
動物細胞ゲノムの複製機序とその破綻により働く機能的複製制御機構に関する研究

DNAフアイバー上で未知の複製開始点を探索するために、標本DNAの変性無しでプローブDNAのハイブリダイゼーションが可能な、non-denaturing FISHを新規に開発した。これとin vivo複製標識法を用い、ヒト1番染色体q32領域内の特定領域(150-200kb)内に複製開始点が存在することを示すことができた。この手法により哺乳類染色体上の特定領域における複製開始点をDNA-分子上で解析することが可能となった。Topoisoraerase I阻害剤CPTによりDNA損傷を与えた時の複製フォーク進行制御機構を解析した。CPT処理により、複製フォークは有意に減速したが、poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)を特異的阻害剤で処理すると、有意に回復した。また、PARP-1 siRNA処理細胞でも同様に、CRT処理により減速したフォークの速度は有意に回復した。さらに、PARP-1ノックアウトDT40細胞においてもCPT処理による複製フォークの減速がられなかった。また、DNA polymeraseβノックアウトDT40細胞ではフォークの減速が回復することは無かった。これら結果より、PARP-1はCPTによるDNA複製依存的DNA損傷に応答して複製フォークの進行を制御していることがわかった。転写調節因子ElonginAの欠損は、プログラム細胞死(アポトーシス)を引き起こす。その原因がDNA複製の異常に起因すると推測し、ElonginA欠損マウス由来胎児性繊維芽細胞を用いて、DNAファイバー法とin vivo複製鎖標識法を用いて複製フォークの進行速度を解析した。その結果、ElonginA欠損細胞では複製フォークの進行が停止または大きく遅延していることを見出した。このことから、ElonginA欠損による細胞死は、複製フォーク進行異常に由来すると結論づけた。ヒトおよびマウス培養細胞を用い、当研究室で開発した手法により細胞周期S期を通した複製フォークの進行速度を解析した。複製フォークの進行速度はS期を通して大きく変化し、染色体R/Gバンド境界領域が複製するS期中期において最も速度が遅くなることを見いだした。また、その時期はマウス培養細胞ではセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域が複製する時期でもあり、実際その領域の複製フォークの進行を解析したところ、S期の他の時期よりも著しく複製フォークの進行が減速していた。そこで、この領域のDNA複製がどのような因子により制御されているのかを調べるために、ヒストンのアセチル化に注目した。通常、この領域のヒストンは低アセチル化を維持しており、非常に凝集したクロマチン構造をとっている。5-aza-2'-deoxycytidineで細胞を処理すると、セントロメア周辺ヘテロクロマチン特異的にヒストンH4のアセチル化が促進することを以前に見いだした。その系を用い、この領域の複製開始点活性化時期と複製フォーク進行速度を解析した。結果として、ヒストンH4の高アセチル化の誘導によりクロマチン構造が緩んだマウスセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域は、通常S期中期に複製開始点が活性化されるが、S期初期に活性化された。さらに、複製フォークの進行速度も同時に促進されることを見いだした。このことはすなわち、DNMT1やHDACsによりマウスセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域は低アセチル化状態を維持されるが、そのエッピジェネティックなクロマチン修飾機構がこの領域の複製開始点活性化と複製フォーク進行を制御することを示す結果となった。ゲノムDNAをtopoisomerase I阻害剤であるcamptothisin(CPT)により処理するとDNA複製依存的にDNA二重鎖切断を引き起す。DNA複製依存的二重鎖切断に応答し、複製フォークの進行を制御する因子として、poly(ADP-ribose)polymerase (PARP)に着目し研究を進めた。CPT処理により、HeLa細胞の生存率は低下したが、PARP阻害剤であるNU1025を同時に処理すると、生存率はさらに低下した。このことより、PARPはCPTによるDNA損傷に対して何らかの制御機能を持つことが予想された。そこで、CPTがDNA複製依存的にDNA損傷を与えることから、DNA複製に対するPARPの機能を解析した。In vivo複製鎖標識とDNAファイバー法によって、複製フォークの進行速度を解析したところ、CPT処理により速度は低下した。同時にNU1025を処理すると、その低下は有意に回復した。また、PARPファミリーのPARP-1に対するsiRNA処理により、PARP-1をknock downした細胞においても、CPTによる複製フォークの進行速度の低下は有意に回復した。このことにより、PARP-1がCPTによるDNA損傷に応答し、複製フォークの進行を直接的に制御していることを示唆した。また、複製fociパターン解析により、レプリコン(または複製開始点)の活性化への影響を解析したところ、CPT処理により複製開始点の活性化はATR-chk1経路によるS期チェックポイント依存的に抑制されたが、NU1025処理によってはなにも影響を受けなかった。以上の結果より、PARPはS期チェックポイントにより複製フォークの進行が保証された条件のもとで、複製フォークの進行を制御していることがわかった。

CPT処理により、複製フォークは有意に減速したが、poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)を特異的阻害剤で処理すると、有意に回復した。また、PARP-1 siRNA処理細胞でも同様に、CRT処理により減速したフォークの速度は有意に回復した。さらに、PARP-1ノックアウトDT40細胞においてもCPT処理による複製フォークの減速がられなかった。また、DNA polymeraseβノックアウトDT40細胞ではフォークの減速が回復することは無かった。これら結果より、PARP-1はCPTによるDNA複製依存的DNA損傷に応答して複製フォークの進行を制御していることがわかった。転写調節因子ElonginAの欠損は、プログラム細胞死(アポトーシス)を引き起こす。その原因がDNA複製の異常に起因すると推測し、ElonginA欠損マウス由来胎児性繊維芽細胞を用いて、DNAファイバー法とin vivo複製鎖標識法を用いて複製フォークの進行速度を解析した。その結果、ElonginA欠損細胞では複製フォークの進行が停止または大きく遅延していることを見出した。このことから、ElonginA欠損による細胞死は、複製フォーク進行異常に由来すると結論づけた。