hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベックウィズ・ヴィーデマン症候群の遺伝子異常と腫瘍発生リスクに関する研究

ベックウィズ・ヴィーデマン症候群(BWS)は、過成長・巨舌・臍ヘルニアを三主徴とするインプリンティング疾患で、小児期に腫瘍を高頻度に合併する。本研究では、腫瘍発生リスクが高い遺伝子異常タイプを明らかにするため、腫瘍合併症例について5種類の遺伝子異常(KνDMR1低メチル化(LOM)、H19DMR高メチル化(GOM)、11番染色体父性片親性ダイソミー(patUPD)、CDKN1C遺伝子変異、11番染色体構造異常)を解析した。腫瘍合併35例中3例で異時性に二つの腫瘍が発生したため合計の腫瘍数は38となった。主な腫瘍は、肝原発腫瘍(肝芽腫9、血管腫6、肝癌1)が42%と最も多く、次いで副腎13%、Wilms腫瘍11%、横紋筋肉腫5%、神経芽腫5%であった。遺伝子解析が可能であった23例(腫瘍数25)の末梢血DNAの解析結果は、KνDMR1-LOM20%、H19DMR-GOM12%、patUPD40%、CDKN1C変異4%、11番染色体短腕部分トリソミー4%であった。一方、BWS全症例165例について、遺伝子異常タイプ別の腫瘍発生頻度を調べたところ、KνDMR1-LOM 10%、H19DMR-GOM25%、patUPD27%、CDKN1CC変異8%、11番染色体短腕部分トリソミー14%であった。KvDMR1-LOM群とpatUPD群の間で、腫瘍発生頻度に有意差(χ2検定、p=0.038)を認めた。以上の結果から、patUPDは腫瘍発生リスクが最も高い遺伝子異常であることが示唆された。
ゼブラフィッシュ初期発生における背側オーガナイザー形成機構の解明

ゼブラフィッシュにおける尾の形成には背側オーガナイザーとは独立に尾のオーガナイザーが腹側周縁領域に存在することが示唆されている。さらにBMP、Nodal、Wntシグナルの協調的な働きによって尾オーガナイザー活性を模倣できることが示されていた。我々の同定したwnt3aはwnt8と共に胚盤周縁ならびに尾芽において発現しており、神経管の前後軸のパターニングあるいは尾の形成に関与しているのではないかと考えられた。そこでアンチセンスモルフォリノオリゴ(MO)によるノックダウン実験をおこなった。その結果、Wnt3a/8が協調して神経管の前後軸形成に関与していることが明らかとなった。さらにWnt3a/8は腹側に発現するホメオボックス遺伝子vox/vent/vedを介して背側オーガナイザー領域を規定していることが明らかになった。また、Wnt3a/8欠損胚では、尾の形成が著しく阻害されていた。そこで我々は、尾の形成に重要なホメオボックス遺伝子cdxに着目した。ゼブラフィッシュcdx4変異体及びノックダウン胚では、尾の形成不全が報告されている。我々は、cdx4と同様に後方組織に発現するodx1aを新たに同定した。wnt3a/8MO導入により原腸胚後期から体節形成期におけるcdx1a/4の発現領域が減少した。MOによる機能阻害実験により、cdx1a/4がfgf3/8やhoxa9a, hoxb7aの発現を協調して制御して尾の形成に関与することが明らかとなった。さらにCdxla/4によるhox遺伝子の発現誘導にはfgfシグナルが必須であることが解った。以上の結果は、Wnt3a/8シグナルがCdxla/4の発現を介して後方組織の形成に重要な役割を果たしていることを示している。また、ゼブラフィッシュE-カドヘリンが初期発生における形態形成運動に重要な役割をしていることを明らかにした。魚類における背側オーガナイザーは、母性Wnt/β-カテニンシグナルが活性化されることによって将来の背側に誘導されると考えられている。オーガナイザーは、ホメオボックス遺伝子bozozokとved/vox/ventとの括抗作用とNodalシグナルによって形成される。さらに、背側オーガナイザーからの抗BMP、抗Wntシグナルによって中枢神経系や脊索などの背側組織が誘導される。本研究では、母性効果突然変異体tokkaebi(tkk)の解析と責任遺伝子を同定することによって母性背側決定因子の本態に迫ることを目的とした。tkkホモ変異体メスから得られる胚は、頭部神経などの背側組織に著しい欠損を持つ腹側化胚の表現型を示した。tkk胚は、β-カテニンの背側細胞核への蓄積、Wnt/β-カテニンシグナルの直接の標的遺伝子であるbozozokの発現が欠損または著しく減弱していた。括性型β-カテニンRNAの導入によって腹側化の表現型の回復が見られたことより、母性Wnt/β-カテニンシグナルに異常があると考えられた。さらにWnt/β-カテニンシグナルのうち、細胞内コンポーネント(GBP、Dsh、ドミナントネガティブGSK3、ドミナントネガティブAxin)の過剰発現によってtkk表現型の回復が見られたが、Wntリガンド(wnt3a,wnt8)ならびにレセプターfrizzledでは見られなかった。以上の結果により、tkk遺伝子はβ-カテニンの安定性を制御する複合体(Axin、GSK3、APC)の上流あるいはパラレルに機能すると考えられた。

tkkは染色体16番にマップされ、現在ポジショナルクローニングによって原因遺伝子の同定を行っている。また、bozozokあるいはvedの下流で機能する遺伝子の検索、オーガナイザー形成に異常のある変異体の単離を行っている。ゼブラフィッシュにおける尾の形成には背側オーガナイザーとは独立に尾のオーガナイザーが腹側周縁領域に存在することが示唆され、BMP、Nodal、Wntシグナルの協調的な働きによって尾オーガナイザー活性を模倣できることが示されていた。我々の同定したwnt3aはwnt8と共に胚盤周縁ならびに尾芽において発現しており、神経管の前後軸のパターニングあるいは尾の形成に関与しているのではないかと考えられた。そこでアンチセンスモルフォリノオリゴ(MO)によるノックダウン実験をおこなった。その結果、Wnt3a/8が協調して神経管の前後軸形成に関与していることが明らかとなった。さらにWnt3a/8は腹側に発現するホメオボックス遺伝子vox/vent/vedを介して背側オーガナイザー領域を規定していることが明らかになった。また、wnt3a/8欠損胚では、尾の形成が著しく阻害されていた。そこで我々は、尾の形成に重要なホメオボックス遺伝子cdxに着目した。ゼブラフィッシュcdx4変異体及びノックダウン胚では、尾の形成不全が報告されている。我々は、cdx4と同様に後方組織に発現するcdx1aを新たに同定した。wnt3a/8MO導入により原腸胚後期から体節形成期におけるcdx1a/4の発現領域が減少した。MOによる機能阻害実験により、cdx1a/4がfgf3/8やhoxa9a,hoxb7aの発現を協調して制御して尾の形成に関与することが明らかとなった。さらにCdx1a/4によるhox遺伝子の発現誘導にはfgfシグナルが必須であることが解った。以上の結果は、Wnt3a/8シグナルがCdx1a/4の発現を介して後方組織の形成に重要な役割を果たしていることを示している。
堆肥から分離した新規な難培養性好熱細菌における異種細菌間相互作用の解明

環境中には培養が容易ではない細菌種が多数存在する。その要因の一つとして,細菌間の相互依存性がある。そこで,堆肥中に生息する細菌相互作用下でのみ増殖する新規な細菌種を分離し,その特性を明らかにすることによって,堆肥製造時に機能する微生物の制御を目的として研究を行った。これまで,堆肥から分離した新規な細菌Sは,異種細菌との共存培養下で増殖する増殖最適温度60°Cの中等度好熱細菌であり,多様な多糖類を分解する能力を有しているため,堆肥製造時に重要な役割をもつことを見出した。本研究では,この新規な細菌種の生態を明らかにするため,堆肥中におけるPCR-DGGE法による群集構造解析法およびリアルタイム定量PCR法を検討した。DGGE解析により堆肥中の細菌Sの分布を調査するため,細菌S特異的プライマーをいくつか作製した。これらのプライマーセットを検討した結果,DGGE用の細菌S特異的プライマーとしてF3/R1を決定した。このプライマーセットを用いて,数種類の堆肥についてDGGE解析を行ったところ,細菌Sの存在を確認することが可能であり,多くの堆肥中には細菌Sと近縁の細菌種が分布していることが明らかとなった。次に,リアルタイムPCR法に使用する細菌S特異的プライマーを検討した結果,プライマーセットF3/R2を用いることで,堆肥中における細菌Sの増殖量を定量することが可能となった。このリアルタイムPCR法を用いて,細菌Sが分解可能な多糖類を加えた堆肥中での細菌Sの増殖を調べた結果,そのDNA量が約10倍に増加していたことから,細菌Sがこの多糖を資化増殖していることが推測された。環境中には多種多様な細菌種が生息しているが,この中には培養が容易ではない細菌種の存在も知られている。その要因の一つとして,細菌間の相互依存性が考えられている。本研究は,堆肥中に生息するこのような細菌相互作用下でのみ増殖する新規な細菌種を分離し,その特性と分類を明らかにすることによって,堆肥製造時に機能する微生物の制御を目的として行われた。本研究において,活性汚泥堆肥の平板培養プレート(60°C培養)上に大きなコロニー(細菌A)の周囲に存在する小コロニー(細菌B)を見出した。この細菌Bの純粋分離を試みたが,単独で増殖させることが困難であった。そこで,細菌Aと共存して培養したところ,細菌Bの増殖が確認された。さらに,細菌Aの培養液を添加した培地での増殖も可能であり,細菌Bを純粋分離することに成功した。16S rDNA配列による系統解析の結果,細菌Aは既知のGeobacillus stearothermophilusと判明した。一方,細菌BはBacillales目に属しているが,既知の細菌種の中で最も近縁であるThermobacillus xylanilyticusとの相同率が89%しかなく,新規な細菌種であることが推察された。細菌Bは,増殖の最適温度が60°Cにある中等度好熱細菌であり,多様な多糖類を分解する能力を有しているため,堆肥製造時に重要な役割をもつことが示唆された。細菌Aが細菌Bの増殖を促進する要因として,(1)pH調節作用(細菌Bの増殖pHは8.5付近の狭い範囲),(2)抗酸化物質の産生作用(細菌Bは活性酸素に感受性)、(3)NH_4^+産生作用(細菌Bの増殖はNH4+要求性)を明らかにした。
ヴォルガ・ドイツ人と大飢饉-1921-22年を中心に-

1.【飢謹の原因】1921-22年にヴォルガ地方を襲った大飢饉の原因としては、たしかに同時期の大旱魃があるが、それと同時に、第一次世界大戦中からの反ドイツ人意識・行動、十月社会主義革命(1917年)直後から内戦期の赤軍・白軍双方による厳しい食料徴発、そして旱魃期の適切な政策の欠如と輸送の不備などがあり、飢饉は単なる自然災害ではなく、人工的災害でもあった。この指摘は学問的に非常に重要であると考える。(研究成果報告書:論説1、論説2)2.【飢謹の実情】厳しい食料徴発にドイツ人農民は抵抗し、ときに暴動を起こしたが、それらは悲劇的結果を招くだけで、1921年早々から住民のほとんどが悲惨な飢餓に苦しめられ、それぞれの村では日々何人、何十人もの餓死者が出た。住民はドイツやアメリカに住む親類・知人に多数の手紙を書き、窮状を報告し、救援を訴えた。少しでも条件のよい土地へ避難・疎開する人の数も増加した。援助は国内からも行われたが、それよりも大きな役割を果したのが外国の支援組織(ドイツ、アメリカ、国際組織)と個々人(親類・知人)による援助(食糧・現金の輸送、現地での給食、医療)であった。飢饉は1923年に一応終息するが、1924年には住民は再び飢饉に襲われる。飢饉の実情に関する以上の解明は従来にない研究であるといえる。(論説1、論説2、資料1、資料2)3.【国外脱出】飢餓状況から逃れるために大量の住民が国外(主としてドイツ)へ脱出したが、途中で倒れ死ぬ者も多かった。幸運にも脱出行を続けることができた者は、そのほとんどは何日もかけて鉄道でポーランドとの国境に近いミンスクに集結したが、合法的に国境を越えることができたのは僅かで、不法に国境を越える者がいた一方、その途中で発見されて銃殺・逮捕・送還されるという悲劇も起こった。国外脱出の具体的様相についての以上の解明は従来にない研究といえる。(論説2)1.【飢謹の原因】1921-22年にヴォルガ地方を襲った大飢饉の原因としては、たしかに同時期の大旱魃があるが、それと同時に、第一次世界大戦中からの反ドイツ人意識・行動、十月社会主義革命(1917年)直後から内戦期の赤軍・白軍双方による厳しい食料徴発、そして旱魃期の適切な政策の欠如と輸送の不備などがあり、飢饉は単なる自然災害ではなく、人工的災害でもあった。(論説2)1.具体的作業平成17年8月21日から9月4日までドイツ(フランクフルト大学図書館、バイエルン国立図書館、ミュンヘン大学図書館、外国関係研究所図書館、ドイツ・ロシアドイツ人協会)に、同年12月16日より同月24日までアメリカ(ネブラスカ州歴史協会図書館、ネブラスカ大学図書館、アメリカ・ロシアドイツ人歴史協会図書館)に、平成18年3月11日より同月21日までロシア(ロシア国立図書館、国立サラトフ文書館、ペンザ教育大学図書館)に出張・史料蒐集。関連文献を購入。蒐集した史料・文献のこれまでの分析からとくに以下の成果を得た。2.成果(1)1921-22年にヴォルガ地域を襲った大飢饉--それはロシア全域に及んだ--の原因を解明するための基礎研究として、第一次世界大戦・社会主義革命・内戦という激動期にヴォルガ・ドイツ人が置かれていた厳しい状況、とりわけ彼らに対する食糧徴発の実態について貴重な新しい情報を得た。この情報はとりわけロシア人の新しい研究による。(2)大飢饉のときの実際の天候、穀物の不作状況などについて貴重な新しい情報を得た。この情報はとりわけ当時の雑誌・新聞に掲載された記事の分析による。

(3)大飢饉のときのヴォルガ・ドイツ人の飢餓・餓死状況について貴重な新しい情報を得た。この情報はとりわけ彼らが当時ドイツやアメリカに書き送った手紙の分析による。(4)ヴォルガ・ドイツ人が当時ドイツやアメリカに書き送った手紙の紹介を中心とする論文「ヴォルガ河に鳴り響く弔鐘--1921-22年飢饉とヴォルガ・ドイツ人」(平成18年秋発行予定の日露論文集『20世紀ロシアの農民(仮題)』(奥田央編、社会評論社)に掲載)を執筆した。1.具体的作業(1)1920-30年代にヴォルガ地方在住のドイツ人がアメリカ在住の親類に書き送った手紙(旧字体ズュテーリン文字の手書き、コロラド州在住Paul Flitzer氏所蔵)17通をEike Grossmann氏の助力により現代ドイツ語文字に翻字し、解読した。(2)平成18年8月13日から29日までドイツ(ミュンヘン大学図書館、バイエルン国立図書館、外国関係研究所図書館、バーデン・ヴュルテンブルク州立図書館、シュトゥットガルト大学図書館)とスイス(チューリヒ大学図書館、チューリヒ市立図書館)に出張して収集した関連資料および日本で購入した外国語文献を分析した。2.成果(1)1921-22年の大飢饉の背景(第一次世界大戦、社会主義革命、内戦)と現実(食糧徴発、飢饉、飢餓)について新たに貴重な情報を得、平成17年度の研究成果をさらに深化させた。この情報はとりわけ当時の資料--新聞・雑誌(Unsere Whtschaft、Der Wolgadeutsche、Wolgadeutsche Monatshefte等)掲載記事、アメリカへの手紙(上記)、政府側のスイス人活動家ErnstDerendingerの著作等--の分析による。(2)平成17年度に書いた草稿に加筆し、論文「ヴォルガ河に鳴り響く弔鐘--1921-22年飢饉とヴォルガ・ドイツ人」(奥田央編『20世紀ロシア農民史』社会評論社、253-289ページ、平成18年11月)を公表した。(3)ヴォルガ・ドイツ人女1生アンナ・ヤネッケの手記(1930年代?執筆、タイプ原稿)を分析して、飢饉・飢餓を生き抜いた彼女の人生を紹介する論文の執筆を進めた。(4)ヴォルガ・ドイツ人の外国への手紙(飢饉時)を資料集にまとめる作業を進めた。研究課題「ヴォルガ・ドイツ人と大飢饉-1921-22年を中心に」に関連する図書をノースダコタ大学図書館内の《Germans from Russia Heritage Collection》から購入し、その図書の分析をも踏まえ、平成18年度に分析を開始していたヴォルガ・ドイツ人女性アンナ・ヤネッケの半生について、論文「ヴォルガ・ドイツ人女性アンナの生の軌跡-戦争・革命・飢餓・国外脱出」(鈴木健夫編『地域間の歴史世界-移動・衝突・融合』早稲田大学出版部、平成20年3月所収)を執筆した。この論文は、「クラーク」の烙印を押されたヴォルガ・ドイツ人家族に生まれた-女性が不慮の事故に遭遇しながらも第一次世界大戦・社会主義革命・内戦を生き抜き、そして大飢饉のなかを1921年から1922年にかけてドイツに脱出していく姿を彼女自身の手記(1937年刊行)によって明らかにしたものであり、その飢饉時のヴォルガ・ドイツ人の地域および人々の状況が生々しく伝えられていると考える。また、ヴォルガ・ドイツ人が1921-22年の飢饉時にドイツやアメリカに悲惨な飢餓状況を報告し救援を求めて書き送った手紙を資料集としてまとめる作業をした。この手紙から当時の歴史的現実が浮き上がってくる。他に、サラトフ大学のゲルマン(A.A.ГepMaH)教授とプレーヴェ(И.P.ПлeBe)
口腔細菌による発がんリスク要因の探索とその対策について

ピロリ菌による胃がんや腸内細菌叢の変化による大腸がんのように慢性細菌感染症ががん発症リスクに関わることが明らかにされている。口腔慢性細菌感染症(う蝕や歯周病)も全身健康や心臓疾患、肺炎、糖尿病などの重篤な疾患にも深く関係していることが明らかになってきている。近年、口腔がん、食道がん、大腸がんの病巣から各種口腔細菌種が分離され特定の口腔細菌種ががん発生にも関わるのではないかとの知見が集積されている。本研究では新しい高感度で簡便な細菌変異原性試験を駆使して、変異原性を有する口腔細菌種を特定する。そのメカニズムを明らかにし、細菌種の検出方法また除菌方法について検討し、発がんリスク軽減に繋げる。
神経変性疾患の進行メカニズムの解明と早期診断法の探索

アルツハイマー病やパーキンソン病は進行性の神経変性疾患であり、いまだ根治的療法が確立されていないという課題がある。本研究では上記疾患の“進行過程"に着目し、その分子メカニズム解析と早期診断マーカーの探索を目的とする。神経変性疾患脳内で認められる特徴的な変化である“異常タンパク質蓄積病理の脳内伝播"に着目し、我々が確立した動物モデルを用いてそのメカニズム解析を行う。アルツハイマー病で蓄積するタウ、パーキンソン病で蓄積するαシヌクレインについて平行して解析することにより、両疾患の進行メカニズムの類似性・相違性も明らかにしたい。
旧法期における地方先進型土地区画整理事業に関する計画史的研究

1.本研究は我が国の住宅地計画の歴史的展開を明らかにする上で、旧法期土地区画整理事業における標準設定型計画理論の成立過程及び具体的な先進的事業事例との関係について知見を得るため、街区、画地の規格統一の視点から、(1)内務省及び土地区画整理研究者によって提案された街区標準と画地標準の特徴とその根拠、(2)地方先進地域であった福岡県の事業事例における街区、画地の計画実態を計画史的に考察することを目的としている。2.我が国の街区、画地に関する計画論は一部の内務官僚や技術者によってのみ行われていたが、その内容は街区や画地の辺長の標準を設定する点に止まっており、こうした計画理論水準で我が国の土地区画整理の計画理論である標準設定型計画理論が確立したと考えられる。3.全国有数の事業実績を残す福岡県は、土地区画整理の地方化において先導的な位置にあり、事業推進の要因として(1)「福岡県土地区画整理奨励規定」や駐在制度による福岡県の積極的な推進力、(2)本来は土地区画整理事業を業務としない都市計画福岡地方委員会職員による換地設計等の事業研究の成果、(3)長期にわたって駐在した熟達した実務技術者の存在、以上の3点を明らかにした。福岡県の具体的な計画は、1つの街区、画地の辺長の標準を基本的単位としている点で標準設定計画理論と同様であり、特に街区短辺の標準化が重視されていた。一方、画地の計画では現実的な換地設計がの関係で標準化の意図は相対的に低い位置を占めていた。このため、事業実施過程に伴い画地レベルの大きな計画変更が行われ、街区と画地の計画的乖離が生じていることが明らかとなった。1つの街区、画地の形状が重視される標準設定型計画理論が、現在の画一的な住宅地設計の基本的理論となっていると考えられ、本研究の成果は新たな計画理論(ポストスタンデ-ディゼイション)への転換を図る上で、基礎的な知見として重要である。1)旧法期における福岡県の土地区画整理事業のうち、換地確定図及び組合資料が得られた23組合を対象として区画形質及び街区・住区の形態的特性を分析した。これにより当時の土地区画整理事業は地形や都市計画道路等の与条件に対応した柔軟な計画となっていることが明らかとなった。さらにまた、各組合の標準画地・街区は計画区域ごとに共通した値を設定しているが、これは全国的標準と大きく異なっていることが明らかになった。2)先進的な事業展開を可能とした背景について委員会技師へのヒアリング調査及び研究雑誌等の歴史的資料により考察した。この結果、事業推進の要因として、(1)県土地区画整理奨励規定及び駐在制度等の制度的、且つ、組織的な整備、(2)地方委員会職員による換地処分等の実務的研究とその成果の実現を可能にする熟達した駐在員の存在等を明らかにした。3)23組合のうち典型的計画事例である福岡市西部土地区画整理事業を対象として組合設立、設計変更、換地確定時の各計画図及び組合資料より、計画変更過程の実態を分析し、次の2点を明らかにした。(1)組合設立時の計画において画地・街区及びその配置は標準化を強く意識したものとなっている。(2)事業が遂行するに従って画地レベルの計画変更に加えて区画道路、街区レベルの変更が行われている。4)従前・後の画地面積、地目及び所有状況により換地計画段階の計画変更要因を分析した。

これによって西部の計画変更における計画的理念(規格統一)に対する事業実務の優位性を明らかし、これが「計画技術体系」の未成熟に依拠していることを指摘した。また、具体的検討として区画整理後も田・畑の地目が残されており、地目によって画地面積に差異が生じているを示した。加えて、住宅地計画の考慮の反映の結果、計画の自由度が高い街区において画地面積は標準画地120坪の整数倍に収束し、標準画地の最小単位化による計画が行われている等を明らかにした。1.旧法期における福岡県の土地区画整理事業のうち、組合設立時の計画図が得られた16組合を対象として画地と街区の形状及び配列方法を分析し、全国的な計画基準である土地区画整理設計標準との比較を行った。この結果、街区形状は長辺90120m、短辺4050mに統一されており、特に画地の奥行が決定される街区短辺において強い統一性がみられた。このような街区は土地区画整理設計標準に比べて、短辺長の深い街区となっており、福岡県独自の標準の存在が考えられる。一方、画地形状をみると二列背割型を基本とする整然とした計画となっているが、間口長は各組合によって異なった値となっており、福岡県で統一された標準はなかったと考えられる。2.旧八幡市に位置する互いに隣接した8つの組合を対象として、1で分析した組合設立時の計画図と換地処分時の計画図を比較するため、土地所有との関連に注目し街区と画地の形態的変化を分析した。この結果、戦前に事業が完了した組合では街区の変化はみられないが、戦後まで事業が引き続いた組合では大規模な企業所有地が確保されており、大きな計画変更が行われている。このため、組合設立時において統一されていた街区形状が戦後では異形状の街区が塊状に配置されており、その後の健全な市街化という点で疑問を残す結果となっている。また、換地処分時の画地形状は8つ組合ともに大小の規模の画地が混在した不規則な画地割となっており、事業の遂行にともなって、規格の統一化よりも換地設計が優先されたと考えられる。3.戦前の街区、画地の計画案について分析した結果、これらに関する計画論は相対的に遅れていた。従って、街区及び画地の計画に関しては街区や画地の辺長や規模の標準を設定する点に止まっており、こうした計画理論水準で我が国の土地区画整理の計画理論である標準設定型計画理論が確立したと考えられる。
実験動物用マイクロＸ線ＣＴによるＢｍａｌー１遺伝子ノックアウトマウスの解析

哺乳類において恒常的な概日リズムは,視交差上核にあるペースメーカーによって制御されているが,末梢の細胞も概日リズムを持ち,Bmal-1遺伝子を含む時計遺伝子のグループが制御因子の1つであることが知られている。また, Bmal-1ノックアウトマウスでは,腫骨腱をはじめ,肋軟骨,椎間板,膝関節周囲靭帯などに異所性骨形成が起こるとされていることが解明されている。しかし,下顎頭の形態変化の継時的観察についての報告はない。本研究は, Bmal-1遺伝子をノックアウトしたマウスでは,下顎頭にも老化現象が現れていること示し、概日リズムが下顎頭形態変化に影響があることを示した。Bmal-1遺伝子ノックアウトマウスの全身的異所性石灰化のメカニズムを解明するために,初年度は過去に計時的観察を行ったBmal-1遺伝子ノックアウトマウス(KO)および野生型のコントロールマウス(CL)のリガク社製実験動物用マイクロX線CT(μCT)による撮影データの解析を行った。撮影には,KOおよびCL雌雄各5匹,計20匹を使用した。撮影システムとして日本大学歯学部1号館に設置されているμCTを用い,週齢6週齢から開始して,1日目,3日目,7日目に撮影を行い,以後25週齢まで,毎週1回撮影を行った。撮影に際しては導入と覚醒が迅速なイソフルランを使用した吸入麻酔を行い,マウスの侵襲を最小限にするよう留意した。撮影条件は90kV,200μA,撮影時間は17秒とした。撮影部位については過去に石灰化の報告がある,両側踵骨腱部,腰椎椎間部,胸骨周囲部および両側膝関節部に加えて,両側顎関節部とした。画像再構成はi-ViewR(モリタ)を使用した。ベントバルビタール腹腔内過剰投与による安楽死後ホルマリン固定保存していた屠体について,今年度,90kV,200μA,撮影時間は2分での撮影を行った。撮影後,KOおよびCL雌雄各1匹,計4匹について,病理組織学的資料の作成を行った。染色法は,ヘマトキシリン・エオシン染色(HE)染色およびコッサ染色の二種類とした。コッサ染色はリン酸カルシウム塩と炭酸カルシウム塩のみを黒く染色でき,石灰化の状態を把握できた。HE染色では石灰化部に骨芽細胞の存在確認ができた。μCTおよび病理組織検査にて,過去に報告がない顎関節部の石灰化を改めて確認した。また,今後,μCTのデータ解析の信頼性を向上する目的でμCT読影経験のないラオス診断医にi-ViewRの使用法について説明を行った。μCT画像診断の信頼性の調査のため,病理組織切片をゴールドスタンダードとするにあたり,HE染色とコッサ染色の二種類の標本作製を行った。μCT画像診断の信頼性の担保のため,27年度にラオスの歯科放射線科医との共同研究を開始した。方法としては,病理組織像をゴールドスタンダードとして,μCT画像を診断してもらい,日本人(我々)のデータと比較するものであるが,初年度は,i-ViewRの使用法を理解してもらうためのレクチャーを行った。サンプル画像の判定結果は我々の判定結果とほぼ同じであり,マイクロCT画像の国による読影診断には差があまりなく,信頼性の高い画像であると言えると考えている。Bmal-1遺伝子ノックアウトマウスの骨構造を解明するために,28年度はBmal-1遺伝子ノックアウトマウス(KO)および野生型のコントロールマウス(CL)のリガク社製実験動物用マイクロX線CT(μCT)による撮影データの解析を新規に行った。撮影には,筋肉KO週齢10ヶ月を4匹,CLを4匹,全身KO週齢7ヶ月を6匹,CLを5匹,全身KO週齢2ヶ月を3匹,CLを2匹の計24匹を使用した。撮影システムとして日本大学歯学部1号館に設置されているμCTを用いた。撮影条件は90kV,200μA,撮影時間は60秒とした。撮影部位については過去に骨形態変化の報告がある,両側顎関節部に加えて,顎関節部との比較を対象とし,人体でも骨構造の変化がみられやすい両側下顎骨下縁を対象とした。ホルマリン固定保存していた屠体について,今年度,90kV,200μA,撮影時間は2分での撮影を行った。撮影後,全身KO週齢7ヶ月から3匹,CLから1匹,計4匹について,病理組織学的資料の作成を行った。コッサ染色はリン酸カルシウム塩と炭酸カルシウム塩のみを黒く染色でき,顎関節部においてCLと比較したKOの変形を視覚的に把握できた。HE染色ではCLと比較したKOの骨リモデリングに関与する細胞数の変化を確認できた。μCTおよび病理組織検査にて,顎関節部の骨形態変化を改めて確認し,下顎骨下縁部に変化をきたさないことを新たに確認できた。

コッサ染色はリン酸カルシウム塩と炭酸カルシウム塩のみを黒く染色でき,顎関節部においてCLと比較したKOの変形を視覚的に把握できた。HE染色ではCLと比較したKOの骨リモデリングに関与する細胞数の変化を確認できた。μCTおよび病理組織検査にて,顎関節部の骨形態変化を改めて確認し,下顎骨下縁部に変化をきたさないことを新たに確認できた。両側下顎骨下縁部位の撮影の追加により,病理切片の作成に遅れが生じているため,最終年度は早い時期に病理切片を作成し,画像所見と比較して結果を出す予定である。また,μCT画像診断の信頼性の担保のため,27年度にラオスの歯科放射線科医との共同研究を開始した。方法としては,病理組織像をゴールドスタンダードとして,μCT画像を診断してもらい,日本人(我々)のデータと比較するものであるが,28年度は,i-ViewRの使用法を理解してもらうためのレクチャーを行った。サンプル画像の判定結果は我々の判定結果とほぼ同じであり,μCT画像の国による読影診断には差があまりなく,信頼性の高い画像であると言えると考えている。29年度は,28年度に撮影されたものと同様の筋肉KO週齢10ヶ月を4匹,CLを4匹,全身KO週齢7ヶ月を6匹,CLを5匹,全身KO週齢2ヶ月を3匹,CLを2匹の計24匹を使用した。撮影条件は90kV,200μA,撮影時間は2分でμCTを用いて撮影した。解析部位は両側顎関節部に加えて,人体では下顎角に相当する部位を対象とした。画像再構成はi-ViewR(モリタ)を使用した。下顎角相当部の画像にて,KOではμCT画像上で,骨外形に変化があることを新たに発見した。μCT画像で変化を認めた箇所を組織学的に検討するために,去年度病理標本の作製を行った4匹を除く,24匹中20匹の顎関節部及び下顎角部の病理標本作製を行った。染色法は,ヘマトキシリン・エオシン染色(HE)染色およびコッサ染色の二種類とした。まとめ事業期間全体を通した結果,KOマウスでは概日リズムが下顎頭の形態変化と下顎頭周囲の石灰化に影響を与えることを示した。また,下顎角に関してはμCT画像上では形態的変化がみられるのに対し,組織学的には著変をきたさないことを新たに確認できた。今後は,下顎角と周囲筋群との関係も検討して報告する予定である。哺乳類において恒常的な概日リズムは,視交差上核にあるペースメーカーによって制御されているが,末梢の細胞も概日リズムを持ち,Bmal-1遺伝子を含む時計遺伝子のグループが制御因子の1つであることが知られている。また, Bmal-1ノックアウトマウスでは,腫骨腱をはじめ,肋軟骨,椎間板,膝関節周囲靭帯などに異所性骨形成が起こるとされていることが解明されている。しかし,下顎頭の形態変化の継時的観察についての報告はない。本研究は, Bmal-1遺伝子をノックアウトしたマウスでは,下顎頭にも老化現象が現れていること示し、概日リズムが下顎頭形態変化に影響があることを示した。我々は,Bmal-1遺伝子ノックアウトマウスの全身的異所性石灰化のメカニズムを解明することをおこなってきたが,平成28年度はさらに腹部の筋肉組織や脂肪量の変化にも着目していく方向である。その根拠はBmal-1遺伝子ノックアウトマウスの中に,明らかな腹部肥満のマウスが出現しており,そのデータの解析の必要性が出てきたことである。方法としては,腹部1cmの範囲でマイクロCT撮影をおこない,骨量,内臓,脈管,脂肪,筋肉を画像上で分離し,その詳細なデータを得る予定である。
縮合型タンニンの塩基性条件下での化学変性に関する研究

縮合型タンニンの高度利用法の開発は低利用樹皮の資源化のための必須条件であり、林業関連分野の活性化に貢献する重要課題である。しかし、タンニン分子の諸特性から、その多価フェノール特性を十分に活用した利用法は確立していない。本研究では、縮合型タンニンを反応性の均質な多価フェノールオリゴマーに変換することを目的として、塩基性条件における変性挙動と変性物の求核性の変化をホルムアルデヒド(HCHO)との反応性を指標として解析した。さらにGTase阻害性に与えるアルカリ変性の影響についても検討し、以下の結果がえられた。1.縮合型タンニンの調製と構造解析:合成タンニンの適正な調製条件の選定と、重合体の生長機構を明らかにした。また、カテキン酸を高収率で調製した。次いで、タンニン質の呈色反応による性状分析の問題点を指摘し、新たに燐モリブデン酸法および核交換法導入による総合的特性解析法を提示した。2.縮合型タンニンのアルカリ変性挙動:縮合型タンニンのアルカリ変性挙動を追跡した結果、苛酷な条件程フェノール性の低下やカルボニル基の増大傾向が認められると共に、緩和な温度条件でも異性化のみならず、キノイド型構造への変換やB-環要素の破損を伴うことなどの新知見をえた。3.アルカリ変性タンニンとHCHOとの反応性:HCHOとの反応挙動を追跡した結果、緩和な条件でえられた変性物は、フェノール性が減少しているにも拘らず反応性の低下が認められなかった。4.変性タンニンのDSCによる付加・縮合・硬化反応の追跡:タンニン質を高反応性ノボラックとみなす必要があるため、加熱下での一連の反応をDSCによって解析することとし、その妥当性を明らかにした。次いで、DSCでHCHO水溶液としたアルカリ変性物の求核性を追求し、塩化性溶液による処理はタンニン質のの反応性向上手段として有用であることを認めた。5.アルカリ変性タンニンのGTase阻害活性:アルカリ変性物のGTase阻害活性は未変性物より低下しており、B-環の水酸基パターンが著しくGTase活性を阻害することを確認した。縮合型タンニンの高度利用化を推進するためには、(イ)タンニン質純度の不明確性、(ロ)タンニン構造の複雑性、(ハ)高分子量成分の存在、(ニ)リジッドな立体構造および(ホ)構成核の不均質な反応性、などの諸問題を解決する必要がある。本研究は、タンニン質の塩基性条件での変性挙動と変性物の求核性を解明して、樹皮タンニンを反応性の均質な多価フェノールオリゴマーに変換するための基礎資料を得ることを目的としている。本年度の検討結果は以下の通りである。1.縮合型タンニン試料の調製と構造解析重合度および水酸基パターンの異なる縮合型タンニン試料を数種の樹皮から調製し、またタキシフォリン・フスチンから3,4-ジオール体を合成し、さらにカテキンを末端単位とたシアニジン型・フィセチニジン型タンニンオリゴマーを調製した。また、核交換法・メチル化核交換法と従来法の組合せによって解析することによって、その水散基パターンおよび複素環開環度などのフェノール特性を明確に推定しうることを明かにした。

2.縮合型タンニンのアルカリ変性挙動(I)1.で調製した樹皮タンニンに対して1.25モル/100g試料以下のNaOH添加条件での変性挙動を追求した。その結果、単量体モデルによる既往の報告とは異なり、天然タンニンはアルカリ常温処理でもB-環の破壊を伴うこと、またアルカリ変性挙動は試料タンニンの水酸基パターンや重合度によって相違すること、などが明かとなった。さらに、同一試料から調製した変性物の場合、バニリン-塩酸法および燐モリブデン酸法による測定値と、核交換法によって定量したA-環およびB-環存在量との間には密接な関係のあることを見出した。本研究は、タンニン質の塩基性媒体中での反応挙動を解析し高機能性物質へと変換することを目的としているが、上記媒体処理によって構成核の一つであるA-環の一部が破壊され、分子全体の反応性と屈曲性の向上が期待される。本年度の検討結果を以下に集約する。1.縮合型タンニンのアルカリ変性挙動(II)常温アルカリ処理によって生成されるカルボニル基の分布状態と分子量との関連性を追跡するため、分子量分画物の性状を解析し、これらの変性は分子量の差異とは関係がないものと推定された。2.示査走差熱量測定(DSC)による付加・縮合・硬化反応解析手法の開発タンニン質とホルムアルデヒド(HCHO)との反応生成物には、安定したメチロール化物はえられず、メチレン化による高分子物に変性される。このことから、タンニン質を高反応性のノボラック型樹脂とみなした樹脂調製法の開発が論理的であることが明らかとなったため、付加・縮合・硬化の一連の反応をDSCによって追跡することとし、モデル物質による反応エンタルピー変化測定の妥当性を明らかにした。3.変性タンニンのDSCによる付加・縮合・硬化反応の追跡DSCとHCHO水溶液を用いてアルカリ変性物の求核性を追求し、塩基性溶液による処理はタンニン質の反応性向上手段として有用であることを認めた。4.アルカリ変性タンニンのGTase阻害活性アルカリ変性物のGTase阻害活性は未変性物より低下しており、B-環の水酸基パターンが著しくGTase活性を阻害することを確認した。
単語認識における遺伝アルゴリズムの応用

本研究では,連続発生された音声を自動的に音韻が変化する部分を検出してさらにそれぞれのセグメントの音の認識を行なうための方法について考察した.音声は16kHzでサンプリングし,それを10次の自己回帰モデルで表現し,それをもとにナイキスト周波数までを等間隔に分ける周波数を10個選択し,その周波数でのスペクトルを特徴ベクトルとした.音声の変化点は従来行なわれているように固定の大きさの窓を設けてその中で同定を行ない,窓をずらして特徴ベクトルの変化点を検出するのではなく,遺伝的アルゴリズムにより音素の切れ目を設定し,それにより区分化されたデータよりLevinson-Durbin法により自己回帰モデルを計算した.優れた切れ目であればそこで生成したモデルとデータの適合度が高くなり,切れ目が悪ければ1つのモデルで表現することが困難であることから適合度が悪く,誤差が大きくなるという原理である.この誤差の2乗和を元にしてそれの逆数を適合度と定義し,遺伝的アルゴリズムを繰り返す.遺伝的アルゴリズムは個体数を10個とし,各個体は切れ目の数ほど整数からなる要素を持つ.通常遺伝的アルゴリズムでは2進数が用いられるが,ここでは個体の長さを短くするためにこのようなコードを用いた.繰り返しは20回行なった.実験では,まず母音各10個ずつを使って3層の階層型ニューラルネットで学習し,認識モデルを作成した.これは他のデータを使っても90%以上の正解率を得る優れたモデルであった.次に,/おはよう/と,母音以外の音韻を含む音をこのアルゴリズムにしたがって7個の区間に分け,それぞれの特徴ベクトルを認識させたところ,耳で聞いて音の変化点と思われる点でほぼ分割された.また,/は,/よ/の部分ではモデルにない子音が含まれているためあいまいな認識結果を得た.本研究では,連続発生された音声を自動的に音韻が変化する部分を検出してさらにそれぞれのセグメントの音の認識を行なうための方法について考察した.音声は16kHzでサンプリングし,それを10次の自己回帰モデルで表現し,それをもとにナイキスト周波数までを等間隔に分ける周波数を10個選択し,その周波数でのスペクトルを特徴ベクトルとした.音声の変化点は従来行なわれているように固定の大きさの窓を設けてその中で同定を行ない,窓をずらして特徴ベクトルの変化点を検出するのではなく,遺伝的アルゴリズムにより音素の切れ目を設定し,それにより区分化されたデータよりLevinson-Durbin法により自己回帰モデルを計算した.優れた切れ目であればそこで生成したモデルとデータの適合度が高くなり,切れ目が悪ければ1つのモデルで表現することが困難であることから適合度が悪く,誤差が大きくなるという原理である.この誤差の2乗和を元にしてそれの逆数を適合度と定義し,遺伝的アルゴリズムを繰り返す.遺伝的アルゴリズムは個体数を10個とし,各個体は切れ目の数ほど整数からなる要素を持つ.通常遺伝的アルゴリズムでは2進数が用いられるが,ここでは個体の長さを短くするためにこのようなコードを用いた.繰り返しは20回行なった.実験では,まず母音各10個ずつを使って3層の階層型ニューラルネットで学習し,認識モデルを作成した.これは他のデータを使っても90%以上の正解率を得る優れたモデルであった.次に,/おはよう/と,母音以外の音韻を含む音をこのアルゴリズムにしたがって7個の区間に分け,それぞれの特徴ベクトルを認識させたところ,耳で聞いて音の変化点と思われる点でほぼ分割された.また,/は,/よ/の部分ではモデルにない子音が含まれているためあいまいな認識結果を得た.
生きる力を醸成する12ヶ月生活改善のための教育プログラム

本研究では,大学生に自立した生活を確立させることを目的に生活改善プログラムを開発することを目的とした。このプログラムは,家庭科の全領域から12テーマを抽出して構成している。学生は1ヶ月に1つのテーマを実践し,報告書を提出する。プログラム実施期間は,2015年10月から2016年9月である。ここでは,2人の学生の1年間の取組の報告書から,2人の生活改善の達成状況を明らかにした。その結果,女子学生の生活管理能力と生活創造力は伸びていた。特に,時間や金銭の管理に大きな学びがあった。男子学生は部屋の掃除または人間関係を築くことの喜びを感じるようになり,生活技術力と人間関係力の項目が高くなった。本研究では、大学生の健全な生活観を育成すること、自立した生活を確立させることを目的に生活改善プログラムを開発・試行し、最終的には、自分自身の力でこの生活改善プログラムが実行できるような普及啓発資料を作成・配布することを通して、生活の重要性を広く社会に啓蒙することである。そのために、今年度は具体的に3つの計画を実施した。一つ目は生活改善プログラムの開発である。家庭科の教科書並びに資料を参考に、家庭科の全領域、12項目から構成された1年間のプログラムを開発した。大学生に規則正しい日常生活を送ることの大切さを実感させ、社会人としての望ましい生活態度を育てるために、適切なプログラムの内容であったと考える。二つ目は被験者の募集である。ホームページを立ち上げるとともに、チラシを作成し、協力していただいた10大学の生協、キャリヤセンター、学生会館などに置いてもらい、被験者を募った。三つ目はプログラムの施行である。被験者には、添付メールで課題と報告書の書式を送付し、月の終わりに提出してもらった。また、プログラムが継続できるように、アドバイスや励ましの言葉を各被験者に対して送った。被験者の報告書からは、プログラムの有効性や修正点などを得ることができた。なお、プログラムの結果については、ホームページ上に「参加者の声」として、匿名で毎月掲載し、他の被験者の活動を知ることができるように配慮した。さらに、普及啓発資料を作成するために、デザイナーと打ち合わせを重ね、ノートの形式や内容、大まかなデザインについて決定した。3つの研究実施計画の順に、それぞれに関する達成度について報告する。生活改善プログラムは、家庭科の全領域の内容である衣生活、食生活、住生活、家族・家庭生活、消費生活、環境を網羅し、基本的な生活習慣が確立できるようにした。まだ、多少の修正点はあるが、完成度はかなり高いものになっている。被験者については、当初の数は見込めなかったが、1年間プログラムが継続でき、この研究に非常に関心が高く、積極的に意見を述べる男女数名を得ることができた。プログラムの実施は、当初計画したよりも3カ月早い平成27年10月より行うことができた。被験者が記載しやすいように、報告書の形式を決め、また、被験者の学びが充実するように、その月の「学びのポイント」を作成した。被験者からは、毎月必ず報告書は届き、記載内容も充実しており、プログラムの有効性を感じる。また、普及啓発資料のための修正点を得ることができている。返信するときは、終了した月の「学びのポイント」と次の課題を添付した。「学びのポイント」は被験者からも好評である。本研究は、大学生の健全な生活観を育成すること、自立した生活を確立させることを目的に生活改善プログラムを開発・試行し、最終的に、自分自身の力でこの生活改善プログラムが実行できるような普及啓発資料を作成・配布を通して、生活の重要性を広く社会に啓蒙することである。一つ目はプログラムの施行である。1年間のプログラムのため、2015年10月から2016年9月まで行われた。最終月まで実行してくれた被験者は少なかったが、それでも数名が継続してくれ、「1年間を振り返って」を含む、毎月の報告書を得ることができた。なお、プログラムの結果については、ホームページ上に「参加者の声」として、匿名で毎月掲載した。また、被験者の報告書から、プログラムの有効性や修正点などを得ることもできた。三つ目は普及啓発資料の作成である。被験者の報告書から、プログラムの問題点を得ることができたので、それを踏まえプログラムを修正し、原稿を完成させた。現在、デザイナーが作成中で、2017年4月には初校が出来上がる予定である。生活改善プログラムの施行に関しては、当初の被験者数は見込めなかったが、この研究に非常に関心が高く、積極的に意見を述べる男女数名が1年間プログラムを継続してくれた。被験者からは、貴重なデータを得ることができた。研究成果の発表に関しては、計画通りに、国際家政学会(韓国大会)で発表し、各国の研究者と交流を図ることができた。また、研究結果を論文にまとめ、北海道教育大学紀要に投稿することができた。普及啓発資料の作成に関しては、プログラムの内容の他に、「学びのポイント」を加えるなど、当初の資料よりも充実したものが原稿として出来上がった。これに、デザインを加えると、さらに良いものができると思われる。完成度はかなり高いものになっている。

本研究では、大学生の健全な生活観を育成すること、自立した生活を確立させることを目的に生活改善プログラムを開発・試行し、最終的には、自分自身の力でこの生活改善プログラムが実行できるような普及啓発資料を作成・配布することを通して、生活の重要性を広く社会に啓蒙することである。そのために、具体的に3つの計画を実施した。一つ目は、家庭科の教科書並びに資料を参考に、家庭科の全領域、12項目から構成された1年間の生活改善プログラムを開発し、2015年10月から2016年9月まで施行した。「1年間を振り返って」を含む、毎月の報告書を得ることができた。プログラムの結果については、ホームページ上に「参加者の声」として、匿名で毎月掲載した。また、被験者の報告書から、プログラムの有効性や修正点などを得ることもできた。三つ目は、被験者の報告書から、プログラムの問題点を得ることができたので、それを踏まえプログラムを修正し、デザイナーの下、ノート型の普及啓発資料を作成し、90大学に送付した。数大学から問い合わせも来た。本研究では,大学生に自立した生活を確立させることを目的に生活改善プログラムを開発することを目的とした。このプログラムは,家庭科の全領域から12テーマを抽出して構成している。学生は1ヶ月に1つのテーマを実践し,報告書を提出する。プログラム実施期間は,2015年10月から2016年9月である。ここでは,2人の学生の1年間の取組の報告書から,2人の生活改善の達成状況を明らかにした。その結果,女子学生の生活管理能力と生活創造力は伸びていた。特に,時間や金銭の管理に大きな学びがあった。男子学生は部屋の掃除または人間関係を築くことの喜びを感じるようになり,生活技術力と人間関係力の項目が高くなった。今後の推進方策について述べる。このまま、プログラムを継続すると、平成28年9月末には終了予定である。その後、被験者の報告書から結果を分析・考察する。それを基にプログラムの修正などを行い、デザイナーとの打ち合わせを重ね、普及啓発資料の記載内容を平成28年度内に決定する。平成29年度は、普及啓発資料を作成し、修正を重ね、印刷する。平成29年10月頃を目途に、各大学に配布する予定である。研究交流および成果公表の推進方策としては、平成28年度はIFHE(国際家政学会)の世界大会(2016年8月、韓国大田にて開催)において成果を公表し、研究交流をする。平成29年度は、関連の国内学会での成果公表と、論文として投稿する。現在、論文を投稿中なので、印刷までに修正等があると考えられる。普及啓発資料については、原稿はデザイナーに挙げているので、この後、修正を重ね、平成29年8月中に印刷する。10月頃を目途に、各大学に配布する予定である。家庭科教育次年度使用額が生じているが、極少ない値である。次年度の研究費の使用については以下のように計画している。1)普及啓発資料作成のための会議費および旅費(デザイン委託者が東京のため)2)IFHE(国際家政学会)の2016年度大会に参加のための参加費及び旅費3)調査結果分析や普及啓発資料作成の際の経費(研究補助者への謝金含む)
ライブセルイメージングによるMPN発症分子間相互作用の可視化

骨髄増殖性腫瘍(Myeloproliferative Neoplasm; MPN)の治療に用いられるJAK2阻害薬をはじめとした薬物は、血球数のコントロールや全身症状を改善するが、当該疾患を根治できないため、MPN発症メカニズムの理解に基づく分子標的薬の開発が求められている。これまでに申請者らは、変異型CALRが、サイトカイン受容体c-MPLに結合し、受容体を恒常的に活性化することで、MPNを引き起こすことを明らかにした。しかし、変異型CALRによるTPO受容体c-MPLの活性化メカニズムの詳細は不明である。本研究では、変異型CALRと蛍光タンパク質Venusのキメラタンパク質を作成し、ヒト巨核球系細胞株UT-7/TPO(TPO依存性)に発現させることで、TPO非依存的な増殖を示すことを確認した。ライブセルイメージングを用いた解析から、野生型CALRは小胞体に局在しているのに対し、変異型CALRはゴルジ体に局在することを明らかにした。変異型CALRの局在は、フレームシフト変異によって野生型CALRの持つ小胞体滞留シグナルKDELの欠損によると考え、野生型CALRからKDELを除去したところ、その多くは小胞体に局在していた。このことから、変異型CALRのゴルジ体への局在のシフトはKDELの欠損だけによらないことがわかった。さらに、c-MPLと蛍光タンパク質CFPのキメラタンパク質を作成したところ、キメラタンパク質を発現させたBa/F3細胞のTPO依存的な増殖が見られた。これらの変異型CALRとc-MPLのキメラタンパク質が本来の機能を保持していることから、変異型CALRによる腫瘍化発症メカニズムの解析に役立つツールができた。これらを用いて、細胞内のどこでこれらのタンパク質が相互作用し、どこでc-MPLを活性化するかを明らかにすることで、MPN治療に大きく貢献できるといえる。これまでに、CALRと蛍光タンパク質Venusを融合させたキメラタンパク質を作成し、ヒト巨核球系細胞株UT-7/TPOに発現させたところ、変異型CALRを発現させた細胞では、サイトカイン非依存的に増殖が見られた。同様に、c-MPLとCFPのキメラタンパク質を発現させた細胞では、TPO反応性を示し、本来の機能をもつキメラタンパク質を合成することができた。野生型CALRは小胞体に局在しているのに対し、変異型CALRはゴルジ体に局在していることがライブイメージングと免疫染色の結果から明らかになった。この局在の変化が腫瘍化に寄与するかもしれないと考え、野生型CALRのカルボキシル末端にあるER滞留シグナルKDELを除去することで、小胞体からゴルジ体へと局在をシフトさせることを試みた。しかし、野生型CALRからKDELを除去しても、ゴルジ体には一部しか局在せず、その多くはERに局在していた。また、TPO非依存的な増殖も見られないことがわかった。次に、変異型CALRではC末端に塩基性アミノ酸を多く含む点に着目し、野生型CALRのC末端の酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸へと置換させたところ、やはり局在は小胞体であり、腫瘍原性も示さなかった。以上から、変異型CALRの腫瘍化は、KDELの欠損やアミノ酸の電荷の変化によらないことがわかった。次に、野生型と変異型のCALRの局在の違いは、小胞体からゴルジ体へのタンパク質の輸送に関与すると考え、ブレフェルディンA(BFA)処理後にライブイメージングを行ったところ、野生型CALRではほとんど変化が見られなかった一方で、変異型CALRの局在は、ゴルジ体から小胞体へとシフトした。以上の結果から、野生型と変異型CALRの局在は、KDELやCドメインの電荷チャージではなく、小胞体とゴルジ体間のタンパク質の輸送の違いによって引き起こされることがわかった。上述の通り、野生型CALRが小胞体に局在するのに対して、変異型CALRはゴルジ体に局在することがわかっている。この局在の違いが、腫瘍原性に寄与する可能性がある。そこで、小胞体とゴルジ体間のタンパク質の輸送速度を比較するために、蛍光消光後回復(FRAP:fluorescence recovery after photobleaching)を用いて、野生型CALRと変異型CALRの輸送速度を検証する。さらに、小胞体とゴルジ体間のタンパク質の輸送以外にも、局在の違いを生じさせる可能性を検証する。これまでに申請者らは、野生型CALRに比べて、変異型CALRは細胞内における蓄積量が顕著に低いことを確認している。この結果から、変異型CALRは細胞内でプロテアーゼやオートファジーのはたらきによって、積極的に分解されている可能性があると考えた。この可能性を検証するために、プロテオソーム阻害剤MG132や、オートファジー阻害剤クロロキンでそれぞれ処理することによって、細胞内における蓄積量や、局在に違いが見られないかをそれぞれ検証する。これまでに申請者らは、変異型CALRは、TPO受容体c-MPLと相互作用することによってc-MPLを活性化することを明らかにしてきた。しかし、これらが細胞のどこで相互作用するかを明らかにするために、Forster共鳴エネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer; FRET)の検出することを試みる。