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海溝型巨大地震の広帯域強震動予測のための震源モデル構築に関する研究

本研究課題を開始するにあたって,周期帯別の震源インバージョンを用いた震源特性の分析にくわえ,強震動生成域の規模依存性やその特徴が見えてきたことから,海溝型地震の震源モデル構築に必要な,既往地震の震源特性が整理されてきている.また,強震動の生成に密接に関係しているサイト増幅特性を評価することも予定通り進んでいるため,こういった評価を行った.周期数秒0.1秒程度の地震被害に直結する周期帯域の強震動生成に係る震源モデル(強震動生成モデル)について,平成27年度までに,強震動生成域の大きさと求められた応力パラメタの関係を再現できる震源モデルを作成した.このモデルは,観測から得られている震源特性を表現することの出来るモデルであることを確認した.2011年東北地方太平洋沖地震時の強震観測点でのサイト特性評価を継続した.大加速度を観測した地点においては,強震時に地盤の非線形挙動を起こしている可能性があり,弱震動記録や微動記録との比較を継続した.2016年に発生した熊本地震やニュージーランド・カイコウラ地震では,地表地震断層近傍で強震記録が得られた.これらの加速度記録は強震の影響によって地震計が傾くことで加速度記録の基線がずれるため,そのまま積分をした速度波形,変位波形は信頼できない.適切な基線補正を行うことにより,より信頼度の高い速度波形,変位波形を得ることができた.これによって,地表地震断層近傍での変位の様子を明らかにすることができた.得られた変位は,震源断層そのものの動きと地震動の影響が含まれており,分離することができないが,熊本地震本震においては,断層近傍特有の変位の特徴から,断層破壊を直接的に求めることができた.また,カイコウラ地震では,最大速度は熊本地震で得られた記録より小さいものの,最大変位量は逆に大きく,これらに加えて,1999年台湾・集集地震の震源近傍強震動記録等も含めて検討すると,地表地震断層の(近似的な)最大すべり速度の多様性を示していることがわかった.震源断層モデル化のため,観測された(近似的な)最大すべり速度とすべり量との関係を今後整理していく.2011年東北地方太平洋沖地震,同日の茨城沖地震,2003年十勝沖地震の僅か3例であるが,深さ方向に生成される地震動の周期特性があることがわかった.このことと,不均質震源モデルの応力降下量パラメータのばらつきの特徴を含めた,広帯域地震動予測のための震源モデルのプロトタイプを構築できた.また,観測強震動の特性から,より信頼度の高い震源特性を引き出すためのサイト増幅特性評価,震源モデル構築のためのすべり速度の多様性についての観測情報を整理し,モデル化に適用することを進めることができていることから,このような評価を行った.2016年には熊本地震,ニュージーランド・カイコウラ地震といった大地震が発生し,地表地震断層の近傍で貴重な強震記録が得られてその分析から,震源断層モデルパラメータの「幅」について,直接的に知る重要な手がかりを得ることができたと考えている.地震被害に直結する周期帯域の強震動生成に係る震源モデル(強震動生成モデル)について,既往のプレート境界地震の解析結果を踏まえ,不均質震源断層モデルを構築した.このモデルの特性は,既往の震源モデルの特徴を再現することができる.2011年東北地方太平洋沖地震時の強震観測点のサイト特性を継続した.大加速度を観測した観測地点において,小地震時のサイト特性と比較をして,本震時の非線形地盤応答が生じていた可能性を指摘した.2016年熊本地震,ニュージーランド・カイコウラ地震や,地表地震断層近傍で得られた強震記録を解析し,震源近傍強震動特性の分析を行った.
小腸上皮細胞における糖・アミノ酸輸送能とPHiおよびCaiとの関連

小腸繊毛組織における上皮細胞のNaと糖やアミノ酸との共輸送活性には、上皮細胞内pHおよびCa濃度の意動に応じてそれぞれの活性調節がなされているものと想像される。in situの細胞動態を追究する前段階の作業として、ニワトリ小腸粘膜より単離した上皮細胞(エンテロサイト)の懸濁系を材料として主に蛍光プローブ法により、pHiの調節に関係する種々のイオン輸送系の基本的性質を調べた。pHiの測定はアクリジンオレンジの蛍光変化を指標して実施した。120mMNa^+を主体とする30°Cの生理的メジウム条件の下で、エンテロサイト膜にNa^+/H^+交換輸送系が存在しており、有意に機能している思われる知見が得られた。重炭酸イオンを含まない条件下においても、細胞外液のアニオンを全て硫酸イオンに置きかえた場合、細胞内塩素イオンに由来するcl^-の外向き勾配に駆動されるpHiの上昇が観察された。種々の阻害剤を用いた実験から、このpHi上昇は、Cl^+/OH^-(またはHCO_3^-)交換輸送系のはたらきによるものを判定した。同じく阻害剤の実験から、上に述べたNa^+/H^+およびCl^-/OH┣D1-(HCO┣D23┫D2┣D1-┫D1)交換輸送系の作動のみでは説明できないpHi上昇などの変化を見出した。これは腎尿細管細胞の膜において近年見出されてきているNa┣D1+┫D1依存性Hco┣D23┫D2┣D1-┫D1/Cl┣D1-┫D1交換輸送系と同様のものであろうと考えられる。以上の如く、少なくとも3種のpHi調節に関与する輸送系の存在することをニワトリの単離エンテロサイトにおいて確認した。絨毛という組織構築下における共輸送活性とpHiとの関係を探る前準備として,ニワトリより単離した小腸上皮細胞の懸濁系を用いてpHi調節に関わるイオン輸送系の基本的な性質を調べ,以下の知見を得た.(1)Na/H交換輸送系が存在し,生理的なメディウム条件下で有意に機能している.(2)重炭酸イオンを添加していないメディウム中にあっても,メディウム中のClイオンの硫酸イオンへの置換による外向きCl勾配に駆動されたpHiの上昇が認められた.各種の輸送阻害剤の影響から, Cl/OH(HCO_3)交換輸送活性によるものと判定された.(3)輸送阻害剤を用いた実験から, Na/HおよびCl/OH(HCO_3)輸送系の働きだけでは説明できないpHi変化を見いだし,それが近年腎上皮細胞でも存在が確認されつつあるNa依存性HCO_3/Cl交換輸送によるものである可能性を示した.以上のことから,本研究に用いたニワトリ小腸上皮細胞には,少なくとも3つのpHi調節にかかわるイオン輸送系が存在することが想定される.
チュープリンのリン脂質過酸化物による劣化機構と各種還元性ビタミンによる回復効果

本研究の目的は、(1)チューブリンにリン脂質過酸化物を作用させた時のチューブリンの劣化機構を、機能と構造の両面から解明し、(2)脂溶性および水溶性還元剤の添加が、劣化したチューブリンの機能を回復させるかどうかを検討する事であった。(1)については、チューブリンにリン脂質過酸化物を添加すると、チューブリンのGTPase活性が、リン脂質過酸化物の濃度依存的に低下させられた。このリン脂質過酸化物により劣化させられたチューブリンの構造を検討したところ、疎水性残基の露出が観察され、また、ヒスチジン残基が影響を受けていることが示唆された。つまり、リン脂質過酸化物が、チューブリンの立体構造に影響を与えていた。本年度は、(2)の劣化したチューブリンの機能回復効果を検討するために、チューブリンに還元剤としてアスコルビン酸(AsA)を添加して実験を行った。AsAをはじめから添加したチューブリンのGTPase活性は、リン脂質過酸化物に影響を及ぼされなかった。あらかじめチューブリンにAsAを添加した後でリン脂質過酸化物を添加しても、GTPase活性阻害は認められなかった。ところが、チューブリン溶液中にリン脂質過酸化物を添加すると、チューブリンのGTPase活性は低下した。このことは、チューブリンと脂質過酸化物との反応性の早さを示唆するものである。リン脂質過酸化物添加により低下させられたチューブリンにAsAを加えると、リン脂質過酸化物添加により観察された構造変化が、蛍光スペクトル測定および紫外吸収スペクトル測定から、回復する事が確認された。以上のことにより、リン脂質過酸化物により劣化させられたチューブリンの機能及び構造は、AsAの添加により回復する事が確認された。なお、グルタチオン、システインでは回復効果は認められなかった。本研究の目的は、(1)チューブリンに脂質過酸化物を作用させた時の、チューブリンの劣化機構を、機能と構造の両面から解明し、(2)脂溶性および水溶性還元剤の添加が、劣化したチューブリンの機能を回復させるかどうかを検討することである。本年度は、(1)のチューブリンのリン脂質過酸化物による劣化機構を中心に検討を加えた。過酸化物生成の確認は、吸光度233nmでの吸収増大によった。脂質過酸化物の純度検定は、HPLCによる210nmでの紫外吸収検出に加え、電気化学検出により行った。紫外吸収と電気化学検出の結果を組み合わせることによって、チューブリンとリン脂質過酸化物の相互作用実験に、毎回一定量の脂質過酸化物の添加が可能となった。チューブリンは、重合して微小管を形成するときGTPase活性を発現する。そこで、リン脂質過酸化物をチューブリンに作用させた時のGTPase活性を測定した。チューブリンのGTPase活性は、過酸化物の濃度に依存して低下させられた。チューブリンの劣化機構を検討するために、蛍光および紫外吸収スペクトルの測定を行った。蛍光分析の結果、励起スペクトルのブルーシフトが観察され、疎水性残基の表面への出現が確認された。このことにより、チューブリンとリン脂質過酸化物が相互作用し、チューブリンの立体構造に影響を与えていることが明らかになった。また、チューブリンにリン脂質過酸化物を加えた時の紫外吸収スペクトルの変化を、差スペクトル法でも検討した。その結果、低波長(紫外部)側の吸収に変化がみられた。このことは、チューブリンのヒスチジン残基が影響を受けたためと考えられる。今後はアミノ酸残基への影響や立体構造変化について、より詳細に検討を行う予定である。
重原子標識脂質を導入した膜タンパク質構造解析技術の開発

膜タンパク質の機能発現には周辺脂質が必要不可欠であり、周辺脂質の構造と機能の解明も重要である。膜タンパク質の結晶化は、膜脂質を除去し界面活性剤で膜タンパク質を可溶化させる方法が一般的であるが、膜タンパク質の不活性化が問題となる。本研究では、より生体膜に近いバイセルに着目し、モデル膜タンパク質としてバクテリオロドプシン(bR)を用いた。その結果、臭素をアシル鎖末端に導入した新規Br-DMPCバイセルを用いた結晶化に初めて成功し、従来法では不明瞭であったbR周辺に存在する脂質の構造を決めることができた。さらに異なる脂質を取り入れた新規バイセルにおいてもbR結晶化に成功した。膜タンパク質は、脂質二重膜の中で脂質との相互作用によって初めて機能が発揮される。それにも関わらず、X線構造解析に必須となる結晶化の際には、界面活性剤で脂質二重膜を取り除き、脂質分子の不在による構造の不安定化を認識しながら半ば強引に可溶化、精製、結晶化および構造解析を行ってきており、現在もそれが主流となっている。それ故に、膜タンパク質の結晶化における脂質の重要性は十分検討されてこなかった。対照的にバイセルを用いた結晶化法は、脂質二重膜中の構造を反映した形で膜タンパク質を再構成することができる。従って、従来の界面活性剤に取り囲まれた不自然な状態と比べると大きく構造が安定化される。しかし、これまでにバイセルで結晶化された膜タンパク質は5例程度しかなく、しかもバイセルの調製には脂質DMPCとDHPCしか活用されていない。本研究では、これらの問題を解決するため、独自に開発してきたタンパク質の新規結晶化技術である溶液撹拌法と新規バイセルを用いた脂質制御による膜タンパク質の安定化技術を組み合わせることで、全く新しい膜タンパク質結晶化技術の開発を行った。本年度は次の実験を行った。膜タンパク質の基本構造の一つである7回膜貫通ヘリックス構造を持つバクテリオロドプシン(bR)をモデル膜タンパク質として使用するため、好塩菌の培養および紫膜の精製を行った。それらのサンプルを用いててバイセル結晶化を実施したところ、5種類の新規バイセル(DMPC/CHAPSO, SM/CHAPSO,DMPC/OTG, DMPC+DMPG/CHAPSO, DMPC+DOPG/CHAPSO, DMPC+Cholesterol)においてbR結晶を得ることに成功した。さらに溶液撹拌法を適用することでbR結晶のクラスター化を緩和し、DMPC/CHAPSOバイセルを用いたbR結晶において高分解能(1.2Å)の回折点を観測した。それ故に、膜タンパク質の結晶化における脂質の重要性は「分検討されてこなかった。従って、従来の界面活性剤に取り囲まれた不自然な状態と比べると犬きく構造が安定化される。しかし、その適用例は現在までに5例と極めて少ない。本研究では、これらの問題を解決するため、新規バイセルを用いた脂質制御による全く新しい膜タンパク質結晶化技術の開発を行った。また、解析に必要な位相問題を解決するため、重原子で標識化された脂質によって調整されたバイセルを用いて、構造の安定化と同時に、脂質の重原子によって位相問題を解決する技術開発を行った。臭素(Br)原子で標識化したBr-DMPCとCHAPSOを用いて、先で開発した高品質結晶化技術を適用し、bR/Br標識バイセル結晶を取得することに成功した。具体的には、シンクロトロン放射光を用いたX線吸収微細構造測定によってBr標識脂質の存在を初めて確認した。また、同時にX線回折データを取得し、差フーリエ図によってBr原子位置を観察することに成功した。生物学本年度の研究目標は、1膜タンパク質bRの発現と精製を行うこと。2長鎖リン脂質と界面活性剤の種類、混合比、濃度を変化させることで形や大きさの異なる新しいバイセルを作製すること。そして、それらの新規バイセルを用いてbRを再構成し、結晶化スクリーニング実験によって新規バイセルの特性に応じた最適な結晶化条件を探索することであった。最終年度では、重原子で標識化された脂質によって調整されたバイセル(重原子標識バイセル)を用いて、膜タンパク質bRの結晶化を行う。さらに、脂質の重原子によって位相問題を解決することを目標とする。

具体的には、臭素(Br)原子で標識化したDMPCとCHAPSOを用いて、先で開発した高品質結晶化技術を適用し、bR/Br標識バイセル結晶を取得する。次に、シンクロトロン放射光を用いたX線吸収微細構造(XAFS)測定によってBr標識脂質が結晶中に取り込まれていることを確認する。また、同時にX線回折実験により結晶の品質を確認することによって重原子標識バイセルの有効性を検証する。さらに、それらの回折強度データによる結晶構造解析によって、異常分散を用いた差フーリエ図からBr原子に位置を特定する。
カルコゲン合金の物性

(1)液体As-Te混合系(10,20,33,40at.%As)について、電気伝導度、ホール係数及び磁気抵抗の測定を行った。電気伝導度及びホール係数の測定から、高温500°C近傍で系は半導体から金属へ転移すること、As濃度の増加によりこの転移温度が高温側ヘシフトすることが明らかになった。また、高温高圧下における電気伝導度を測定し、加圧により電気伝導度が増加することを見出した。磁気抵抗△ρ/ρは半導体領域では0で、温度上昇に伴って金属化が始まると△ρ/ρが出始める(その符号は正)。△ρ/ρを電気伝導度σの関数としてプロットすると、Asの濃度及び温度に無関係に△ρ/ρはσでスケールされる1つの曲線上に乗る。これらの結果から、金属化した系の伝導は鎖間のTeを経由すると結論される。液体As-Te混合系(10,20,33,40at.%As)の構造について、中性子回折実験及びEXAFS測定を行い、検討した。中性子回折実験から得られた構造因子S(Q)のQ=1.5Å-1近傍に弱いFSDPが見出された。FSDPの出現は-Te-As-As-Te-あるいは-Te-As-Te分子状のクラスターの存在を示唆する。また、全対分布関数g(r)の第1ピーク解析から得られたAs-Te混合系の部分分布関数gTe-Te(r)は、液体Teのg(r)と類似していることが明らかになった。また、Asに近接するTeの配位数はほぼ1.8で、Te-Asボンドが強いために温度変化が小さい。一方、Teに近接するTeの配位数は温度上昇により急激に減少する。温度上昇によりTe-Teボンドの熱的切断が容易に起こり、鎖長が短縮することを示唆する。EXAFS測定からは、500°C近傍で3配位のAs原子と2配位のTe原子からなるネットワーク構造が崩壊し、As原子が2配位、Te原子が1配位で鎖端原子となる1次元鎖状構造へ転移することを見出した。さらに、中性子回折の解析結果をもとに、EXAFSデータからTe-Teボンドについて検討した。Te-Teボンドに長・短2種類が存在すると考えると、短いTe-Teボンドの配位数は温度上昇に伴って減少する。また高温領域において、長いTe-Teボンドの配位数が増加することが明らかになった。これらの結果から、液体As-Te混合系の半導体-金属転移は、2次元ネットワーク構造から1次元鎖構造への構造想転移と鎖端のTe原子の出現が関係すると結論される。(2)平成11-12年度に渡って、セレンにおける圧力誘起相転移と電子状態について密度汎関数法を用いた研究を行った。常圧相から最高圧相に渡って一通りの結晶構造において電子状態計算を終了し、圧力印加による電子状態変化と原子構造変化の概要を明らかにした。各々の相では、すくなくとも単位胞内の原子位置の最適化を行い、より現実的な電子状態を求めた。波動関数の各原子軌道への射影成分を計算することにより原子間の結合状態や孤立電子対を議論した。特に重要な成果は、これまで明らかにされなかったSe-I(六方晶)相から、Se-II(単斜晶)相への構造相転移時の構造変化のモデルを提案したことである。Se-I相の孤立電子対が相転移によって一部消滅してSe-II相に転移して行くことがわかった。さらに圧力を加えられた状態のSe-III(高圧単斜晶)相では、残りの孤立電子対も消滅し、完全に金属的電子状態になった。次に、Se-IV(斜方晶)相からSe-V(三方晶)相への2次の相転移を電子状態の点からも正当化できるSe-IV相の構造モデルを提案した。提案した構造モデルの原子配置は、X線回折実験の結果とも矛盾せず、高圧下ので実験データが限られている中で、原子位置の最適化計算を組み合わせることで単位胞内の原子位置を特定し空間群の決定に至った。

また、全対分布関数g(r)の第1ピーク解析から得られたAs-Te混合系の部分分布関数gTe-Te(r)は、液体Teのg(r)と類似していることが明らかになった。また、Asに近接するTeの配位数はほぼ1.8で、Te-Asボンドが強いために温度変化が小さい。一方、Teに近接するTeの配位数は温度上昇により急激に減少する。温度上昇によりTe-Teボンドの熱的切断が容易に起こり、鎖長が短縮することを示唆する。EXAFS測定からは、500°C近傍で3配位のAs原子と2配位のTe原子からなるネットワーク構造が崩壊し、As原子が2配位、Te原子が1配位で鎖端原子となる1次元鎖状構造へ転移することを見出した。さらに、中性子回折の解析結果をもとに、EXAFSデータからTe-Teボンドについて検討した。Te-Teボンドに長・短2種類が存在すると考えると、短いTe-Teボンドの配位数は温度上昇に伴って減少する。また高温領域において、長いTe-Teボンドの配位数が増加することが明らかになった。これらの結果から、液体As-Te混合系の半導体-金属転移は、2次元ネットワーク構造から1次元鎖構造への構造想転移と鎖端のTe原子の出現が関係すると結論される。(2)平成11-12年度に渡って、セレンにおける圧力誘起相転移と電子状態について密度汎関数法を用いた研究を行った。常圧相から最高圧相に渡って一通りの結晶構造において電子状態計算を終了し、圧力印加による電子状態変化と原子構造変化の概要を明らかにした。各々の相では、すくなくとも単位胞内の原子位置の最適化を行い、より現実的な電子状態を求めた。波動関数の各原子軌道への射影成分を計算することにより原子間の結合状態や孤立電子対を議論した。特に重要な成果は、これまで明らかにされなかったSe-I(六方晶)相から、Se-II(単斜晶)相への構造相転移時の構造変化のモデルを提案したことである。Se-I相の孤立電子対が相転移によって一部消滅してSe-II相に転移して行くことがわかった。さらに圧力を加えられた状態のSe-III(高圧単斜晶)相では、残りの孤立電子対も消滅し、完全に金属的電子状態になった。次に、Se-IV(斜方晶)相からSe-V(三方晶)相への2次の相転移を電子状態の点からも正当化できるSe-IV相の構造モデルを提案した。提案した構造モデルの原子配置は、X線回折実験の結果とも矛盾せず、高圧下ので実験データが限られている中で、原子位置の最適化計算を組み合わせることで単位胞内の原子位置を特定し空間群の決定に至った。以下の研究成果を得た。(1)液体Se_<20>Te_<80>,Se_<30>Te_<70>及びSe_<40>Te_<60>(測定温度範囲400550°C)についてEXAFS測定を再度試み、転移点近傍の局所構造変化を検討した。その結果Te-Teボンドが熱的に切断されやすく、Se濃度の増加と共に、高温でTeは鎖のターミネーターとなる傾向があることを得た。(2)液体As-Te混合系(20,30,40at.%As)のEXAFS測定を行い、500°C近傍で3配位のAs原子と2配位のTe原子からなるネットワーク構造が崩壊し、As原子が2配位、Te原子が1配位で鎖端原子となる1次元鎖状構造へ転移することを見出した。この混合系で怒る半導体から金属への転移がこの相転移に関係することを明らかにした。(3)液体Se-Teについて磁気抵抗の測定を行った。半導体領域(100Ω^<-1>cm^<-1>以下)では磁気抵抗は観測されないが、金属化が始まる100Ω^<-1>cm^<-1>以上になると正の磁気抵抗が出現する。
気相共鳴ラマン分光法を用いたミオグロビンヘムの動的構造変化の観測とその理論的解明

近年の生体分子の気相分光は、ESI法を利用した安定で非破壊的な気化法の確立に伴い、飛躍的な進歩がみられる。現在では分子量が約1000程度のペプチドに対して、ESI法と赤外分光法を組み合わせるアプローチが主流となっているが、タンパク質レベルの大自由度系にこれを適用するには未だ十分な分光法となっていない。そこで本研究では大自由度系に適用可能な新たな気相分光法として、液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いた気相蛍光/ラマン分光装置を開発した。具体的には、これまで用いていたイオントラップ/加速電極部に設置されているリング電極上部に得られた蛍光/ラマン散乱光を集めるレンズ、プリズム、コリメーターレンズを設置した。また光ファイバー、フィードスルー、ロングパスフィルターを介して、これらの光を分光器(ホトマル検出)に導入した。この装置を用いてヘムタンパク質として知られるミオグロビン2価正イオンの共鳴ラマンスペクトルを気相で測定することに成功した。本研究では、pH7.0の中性条件とpH2.1の酸性条件で調整した試料溶液を用いて、気相共鳴ラマンスペクトルと水溶液中での共鳴ラマンスペクトルの比較を行った。一般的にpH 7.0の水溶液では、ミオグロビンヘムの鉄原子は3価の高スピン状態(S=6)となり、6配位型の構造となる。しかし、気相中ではヘム中の鉄原子が入射レーザー光による光還元のため、2価の低スピン状態、6配位型の構造となることが明らかになった。一方、pH2.1の酸性条件のミオグロビンは、水溶液中ではポルフィリン環との配位のみの4配位型構造を形成することが知られており、この状態ではタンパク質のアミノ酸残基との配位結合が欠損した状態(変性状態)になることが分かっている。しかし、気相中ではヒスチジン残基との配位結合が回復し、天然状態に近い構造へ変化することが明らかになった。これまで気相分光を用いた生体分子の構造解析は、エレクトロスプレーイオン化法で孤立気相化させた分子の赤外分光を行い、量子化学計算との比較により行う手法が一般的であった。この手法は分子の微細構造を精密に議論する点に優れている一方、たんぱく質レベルの巨大分子には適応が難しい点が問題視されてきた。本研究ではこの点を克服するため、分子量が1万を超えるたんぱく質を非破壊的に気化し、その分子構造を議論する新たな手法として液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いた共鳴ラマン分光法を提案した。この手法の最大の特徴は、たんぱく質中に存在する特徴的な発色団に着目し、その周囲の振動情報を部分的に抜き出すことで、巨大な自由度を持つたんぱく質の機能に直結する振動スペクトルが高感度に得られる点にある。また量子化学計算との併用により、得られたスペクトルから分子構造に関する詳細な議論が可能になる。昨年度は、本研究で主に使用する液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いた共鳴ラマン分光装置の開発と量子化学計算機の導入に注力した。装置開発では、イオントラップ電極部に新たにレンズ、プリズムを設置し、トラップ電極内で発生したラマン散乱光が光ファイバー、フィードスルーを介して分光器に導入されるよう改良を行った。トラップしたイオンからの光信号を確認するため、色素分子をトラップしてその蛍光の観測を行い、十分な信号が得ることを確認した。また量子化学計算機を新たに導入し、Gaussian09のインストールや計算機のパフォーマンスチェック、計算条件の検討などを行った。昨年度は本研究で主に使用する液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いた共鳴ラマン分光装置の開発と量子化学計算機の導入を最大の目標にしていたが、いずれも一定の成果に到達することができた。装置開発では、イオントラップ電極を新たに設計し、平凸レンズ、直角プリズム、コリメータレンズが固定できるよう改良を行った。またコリメータレンズで集光された光は光ファイバーに導入され、フィードスルーを介して真空中から大気中へと光が誘導される設計とした。大気中に取り出した光は、再び光ファイバーに導入され、分光器に導入されホトマルで検出される。この新たに設計したイオントラップ電極が想定通り機能するかどうかを確認するため、蛍光色素として有名なローダミン6Gを用いてその気相イオンの蛍光信号の観測を試みた。その結果、水溶液での蛍光スペクトルと類似した波長領域にピーク(548 nm)が観測されただけでなく、新たなピーク(566 nm)も観測され、気相固有の蛍光スペクトルが測定された。観測された新たなピークは、分散蛍光が溶媒の消失に伴いシャープに観測された結果と考えられる。本年度は共鳴ラマン信号の観測までには至らなかったが、蛍光スペクトルが問題なく測定できることが確認できたため、後は実験条件の最適化のみで共鳴ラマン信号の観測が十分可能であると考えている。また量子化学計算機の導入に関しては、大自由度系の計算に適した仕様にするため、CPU、メモリーをカスタマイズし、計算実行部にSSDを採用した。Gaussian09のインストールや計算機のパフォーマンスチェックを行い、汎用の密度汎関数法で70原子程度の構造最適化計算が10時間以内で終了する計算レベルの検討を行った。現状ではB3LYP法やM06-2X法が有効な計算レベルと考えている。以上のことから昨年度に予定していた研究計画は概ね順調に進んでいると考えている。

近年の生体分子の気相分光は、ESI法を利用した安定で非破壊的な気化法の確立に伴い、飛躍的な進歩がみられる。現在では分子量が約1000程度のペプチドに対して、ESI法と赤外分光法を組み合わせるアプローチが主流となっているが、タンパク質レベルの大自由度系にこれを適用するには未だ十分な分光法となっていない。そこで本研究では大自由度系に適用可能な新たな気相分光法として、液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いた気相蛍光/ラマン分光装置を開発した。具体的には、これまで用いていたイオントラップ/加速電極部に設置されているリング電極上部に得られた蛍光/ラマン散乱光を集めるレンズ、プリズム、コリメーターレンズを設置した。また光ファイバー、フィードスルー、ロングパスフィルターを介して、これらの光を分光器(ホトマル検出)に導入した。この装置を用いてヘムタンパク質として知られるミオグロビン2価正イオンの共鳴ラマンスペクトルを気相で測定することに成功した。本研究では、pH7.0の中性条件とpH2.1の酸性条件で調整した試料溶液を用いて、気相共鳴ラマンスペクトルと水溶液中での共鳴ラマンスペクトルの比較を行った。一般的にpH 7.0の水溶液では、ミオグロビンヘムの鉄原子は3価の高スピン状態(S=6)となり、6配位型の構造となる。しかし、気相中ではヘム中の鉄原子が入射レーザー光による光還元のため、2価の低スピン状態、6配位型の構造となることが明らかになった。一方、pH2.1の酸性条件のミオグロビンは、水溶液中ではポルフィリン環との配位のみの4配位型構造を形成することが知られており、この状態ではタンパク質のアミノ酸残基との配位結合が欠損した状態(変性状態)になることが分かっている。しかし、気相中ではヒスチジン残基との配位結合が回復し、天然状態に近い構造へ変化することが明らかになった。本年度は、ヘムたんぱく質の一つであるミオグロビンの共鳴ラマン散乱光の観測を行い、気相でのミオグロビンの構造を議論する。この時、気相中でのヘム構造の光吸収が水溶液中と異なっていることが予想されるが、これは既にミオグロビンの可視-紫外光解離スペクトルの測定により確認済みである。そのため、この気相ミオグロビンの吸収帯(400 nm付近)にレーザー光の波長を固定し、分光器の波長掃引とホトマルの電圧の最適化を行えば十分に共鳴ラマン散乱光の観測が可能であると考えている。またこのヘムたんぱく質中に内包されるヘム構造と、遊離したヘムの共鳴ラマン散乱光を比較することにより、ヘム構造を取り囲むポリアミノ酸のケージがヘム構造にどの程度影響を与えているのかを議論する。上記の測定が終わり次第、イオントラップの時間を段階的に変えながらミオグロビンの共鳴ラマン散乱光の観測を行う。これにより、ミオグロビンが気相単離される過程でどのように構造変化するのかを時間分解測定することが可能である。この時、イオントラップはナノ秒レベルの時間制御が容易にできる点から、気相ミオグロビンのナノ秒時間分解共鳴ラマンスペクトルの測定は十分可能である。この測定を通して、ミオグロビンが孤立化する過程で生じる構造変化の動的過程を実験的に明らかにする。さらに得られた共鳴ラマンスペクトルが意味する分子構造情報を詳細に議論するため、量子化学計算を用いた振動解析を行う。この時、ミオグロビンは巨大な生体分子であるため、実際に振動解析を行う部位は、ヘム構造とその周辺のアミノ酸残基のみになる。
動物ミトコンドリアtRNAの特異構造と機能の相関

動物ミトコンドリア(mt)では一部特殊な遺伝暗号が使われ、その解読に関わるtRNAも特異構造をもつことが、遺伝子の塩基配列解析から明らかにされている。これを実験的には証明するため、mtのtRNAを単離し、翻訳系の構築を目指すことが本研究の目的である。1.ハイブリタイセーション法によるmt・tRNAの検出---特定のmt.tRNA遺伝子の塩基配列に相補的な15-20<merのDNAプローブを合成し、それによってmt.tRNAをハイブリダイゼーション法で検出するアッセイ法を詳細に検討し、個々のtRTNA最も効率的な領域を特定した。この検出法は一般のtRNAにも適用可能な汎用性があるが、現在までウシ肝臓、心臓、キヒトデやブタ回虫のmt.tRNAの検出に成功した。3.ウシmt、tRNAのアミノアシル化反応--ウシ肝臓からPhe、Ser洋のアミノアシル-tRNA合成酵素(ARS)を部分精製し、各tRNAのアミノアシル化活性を調べた。どの場合も一般のtRNAの場合とそれほど変わらず異常構造を持つtRNAも正常にアミノアシル化されることが確認された。mt.ARSは細胞質や他のバクテリア由来のtRNAをもアミノアシル化でき広い基質特異性を示した。
モデル動物と患者遺伝子検体の解析に基づく周産期心筋症の病態解明と革新的治療法開発

これまでに我々は、心臓ホルモンである心房性および脳性ナトリウム利尿ペプチド(ANP・BNP)の共通の受容体Guanylyl Cyclase-A(GC-A)の遺伝子欠損マウス(GC-A-KO)が産褥期、特に授乳期に周産期心筋症様の心機能低下を伴う顕著な心肥大・心線維化を呈する事を明らかにしてきた。また、そのメカニズムとして、GC-A-KOでは授乳により血漿アルドステロン濃度が著増し、心臓局所においてインターロイキン-6を介した炎症反応が亢進することを見出した。本年度は、GC-A-KOにおける授乳誘発性心肥大が、授乳期間中に抗インターロイキン-6受容体抗体を投与することにより抑制可能か否かについて検討を行った。また、動物実験と並行して、周産期心筋症患者ゲノム(22症例分)におけるナトリウム利尿ペプチド関連遺伝子(特にGC-A)の遺伝子多型解析を実施した。野生型マウスでは、産後直後および授乳1週目に抗インターロイキン-6受容体抗体あるいはラットIgG抗体(対照群)を腹腔内投与しても、授乳2週目における授乳誘発性心肥大に有意な変化は認めらなかった。ところが、GC-A-KOではラットIgG抗体投与群に比し、抗インターロイキン-6受容体抗体投与群で授乳誘発性心肥大が抑制される傾向が認められた(P=0.064)。一方、遺伝子多型解析の結果、周産期心筋症患者ゲノムではGC-A遺伝子におけるCT・二塩基繰り返し遺伝子多型(日本人の本態性高血圧との関連の可能性が示唆される遺伝子多型)、塩基配列の挿入/欠失および一塩基多型は認められなかった。当初の研究計画通りに実施できており、GC-A-KOにおける授乳誘発性心肥大が抗IL-6受容体抗体の投与により抑制され得る可能性を見出すことができた。また、周産期心筋症患者ゲノムを用いた遺伝子多型性解析に着手し、一定の成果を得ることができた。これまでの研究の結果、GC-A-KOの授乳誘発性心肥大に心臓局所におけるIL-6の発現亢進が関与している可能性、およびGC-A-KOの授乳誘発性心肥大に対して抗IL-6受容体抗体投与が有効である可能性が示唆された。今後は、周産期心筋症患者ゲノムを用いたナトリウム利尿ペプチド関連遺伝子の遺伝子多型解析をさらに推進し、内因性ナトリウム利尿ペプチド系の機能異常/低下が周産期心筋症の原因因子であるか否かを明らかにするとともに、周産期心筋症の発症予測および新規治療法開発へとつなげたいと考えている。これまでに我々は、心臓ホルモンである心房性および脳性ナトリウム利尿ペプチド(ANP・BNP)の共通の受容体Guanylyl Cyclase-A(GC-A)の遺伝子欠損マウス(GC-A-KO)が、産褥期、特に授乳期に周産期心筋症様の心機能低下を伴う顕著な心肥大・心線維化を呈することを明らかにしてきた。また、そのメカニズムとして、GC-A-KOでは授乳によって血中アルドステロン濃度が著明に上昇することを明らかにし、その上昇した末梢血中アルドステロンが中枢へ移行して中枢(脳)のミネラルコルチコイド受容体(MR)を介して心肥大を惹起する可能性を見出した。本年度は、アルドステロン/MR経路の活性化に伴う炎症・酸化ストレスの増加がGC-A-KOの授乳期心肥大の原因であるか否かを明らかにするため、授乳期心肥大が最も顕著な授乳2週目のGC-A-KOおよび同時期の野生型マウス(WT)の心臓組織を用いて遺伝子発現解析を行った。WTに比し、GC-A-KOでは授乳によって心筋内の炎症性サイトカイン、特にインターロイキン-6 mRNA発現の有意な上昇を認めた。一方、GC-A-KOに出産直後から2週間に亘ってラジカルスカベンジャーであるTempolを飲水投与したが、授乳期心肥大の有意な抑制効果は認められなかった。以上のことから、GC-A-KOにおける授乳期心肥大にアルドステロン/MR経路を介した酸化ストレスの関与は低いと考えられた。その一方、GC-A-KOの授乳期心肥大に心臓局所における炎症が関与している可能性が示唆された。当初の計画通りに研究が実施できており、GC-A-KOの授乳期心肥大発症に酸化ストレスの関与は否定的だが、心臓局所における炎症が関与している可能性を見出すことができたから。

ところが、GC-A-KOではラットIgG抗体投与群に比し、抗インターロイキン-6受容体抗体投与群で授乳誘発性心肥大が抑制される傾向が認められた(P=0.064)。一方、遺伝子多型解析の結果、周産期心筋症患者ゲノムではGC-A遺伝子におけるCT・二塩基繰り返し遺伝子多型(日本人の本態性高血圧との関連の可能性が示唆される遺伝子多型)、塩基配列の挿入/欠失および一塩基多型は認められなかった。当初の研究計画通りに実施できており、GC-A-KOにおける授乳誘発性心肥大が抗IL-6受容体抗体の投与により抑制され得る可能性を見出すことができた。また、周産期心筋症患者ゲノムを用いた遺伝子多型性解析に着手し、一定の成果を得ることができた。本年度の結果、GC-A-KOの授乳期心肥大に心臓局所におけるインターロイキン-6(IL-6)の発現亢進が関与している可能性が示唆されたことから、今後は授乳中のGC-A-KOに抗IL-6受容体抗体を投与することで、GC-A-KOにおける授乳期心肥大に対する抑制効果が得られるか否かを検討する予定である。また、GC-A-KOにおける授乳期心肥大への交感神経活性化の関与を明らかにしたいと考えている。動物実験と並行して、周産期心筋症患者ゲノムの遺伝子解析も進める予定である。これまでの研究の結果、GC-A-KOの授乳誘発性心肥大に心臓局所におけるIL-6の発現亢進が関与している可能性、およびGC-A-KOの授乳誘発性心肥大に対して抗IL-6受容体抗体投与が有効である可能性が示唆された。今後は、周産期心筋症患者ゲノムを用いたナトリウム利尿ペプチド関連遺伝子の遺伝子多型解析をさらに推進し、内因性ナトリウム利尿ペプチド系の機能異常/低下が周産期心筋症の原因因子であるか否かを明らかにするとともに、周産期心筋症の発症予測および新規治療法開発へとつなげたいと考えている。当初、GC-A-KOにおける授乳期心肥大に酸化ストレスが関与することを想定して実験計画を立案していたが、授乳期GC-A-KOへのTempolの投与実験によりそれが否定されたため、酸化ストレスに関する追加検討を行う必要性がなくなった。加えて、周産期心筋症患者ゲノムにおけるナトリウム利尿ペプチド関連遺伝子多型の検討に使用する試薬が、無料で入手できたため。次年度に繰り越す資金は、主に周産期心筋症患者ゲノムの遺伝子多型解析用試薬の購入に充てる予定である。今年度は予定していた動物実験が順調に進んだため、研究計画時に比べて研究費の支出を抑えることができた。次年度に繰り越した研究費は、周産期心筋症患者ゲノムの遺伝子多型解析用の試薬購入費に充てる予定である。
国際ペンクラブと世界文学史の相関――日中印外交と英連邦史、欧州史

2016年度は研究会を3回行った後、2017年1月28日、インド・ハイデラバードから、ハイデラバード英語外国語大学(EFLU)のタリク・シェーク助教授を招聘し、インド側の史資料に基づく討議を行った(於東京外国語大学本郷サテライト3階セミナー室)。成果の新規性と重要性は目覚しく、研究会ではこのタリク・シェーク発表は改めて英語圏で発表したいという結論に至った。また目野は江口眞規に、2017年2月、ブリティッシュ・ライブラリー(BL)での一次資料クロスチェックを依頼し、多面的な成果を得た。2017年度には、モハンマド・モインウッディンと岡和田晃2名を、資料調査のためインド派遣。この日程が、日印友好交流年行事のデリー・ネール両大学の日印文学研究国際会議の9月16日と重なった。彼らはここに参加し、在インド日本大使館関係者や国際交流基金職員、デリー大学教員や大学院生と学術交流を行えた。この年も、関西大学の増田周子に口頭発表を依頼した研究会を開催。また、目野が2017年9月24日、第7回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会で「1954年ロンドンにおける亡命ペン作家作品集刊行に至るまでの国際ペンクラブ・ロンドン本部と欧州史」発表を行った。2018年78月、タリク・シェークにBLでの一次資料クロスチェックを依頼。この時、彼は先の東京での研究会発表に基づき、BL内で講演、好評を博す。9月、目野が評論家の夏葉薫を伴いEFLU出張。本件共同研究の成果についてセミナーを行い、インドで成果と知見を共有。2019年1月27日、東京外国語大学本郷サテライトで、タリク・シェーク他を招き国際研究集会(使用言語は英語)。3月には目野が、「戦前期日本ペン倶楽部と戦前期中国ペン倶楽部」発表(第10回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会)。さらにここまでの成果を単著にまとめ、3月、鼎書房より刊行した。2016年度は、2016年7月16日、2016年10月22日、2017年1月28日の3回、共同研究会を行い、研究討議、研究の方向性の検討を重ねた。7月と10には研究会の方針調整と討議、1月にはハイデラバード英語外国語大学からハイデラバード英語外国語大学のタリク・シェーク助教授をインドから招聘して、新資料の読解を含む研究報告を依頼した。また2月には、秋田県立大学の江口真規助教に、本件テーマに関する資料調査のため、イギリス・ロンドンのブリティッシュ・ライブラリーへの出張を依頼した。上記研究会と出張調査により、大きく3点の研究上の成果・進捗があった。1.本共同研究は、2010年から2012年の科研費共同研究によって発見された大量の新資料を、整頓・討議・解釈・クロスチェックしつつ論文化をはかるものである。2012年までに発見された新資料のうち、ベンガル語資料が混ざるために5年間未調査のままであったベンガルペン資料群の内容が、タリク・シェーク発表によって初めて明らかにされた。それによって、現在までの日印交流の基礎となる19301940年代親日的ベンガル知識人グループの、インド国内の動向の一部が新たに解明された。2.江口真規助教のブリティッシュ・ライブラリー調査によって、これまで全く注目されてこなかった親日的インドペンクラブ会員、スディンドラナート・ゴーシュの1930ー1950年代ロンドンにおける動向が、初めて調査され始めることとなった。現時点ではまだ新資料発見の段階であり、成果発表は、2017年後半以降になされる。3.共同研究討議の熟成により、現在のインドの大学教員たちとの交流事業が活性化し始めた。この活性化した状況を、そのまま2017年の研究交流につなげていく。これまで未調査だった新資料群の解明・クロスチェックのための新たな資料調査の成功など、おおむね順調に進展している。2017年には、共同研究者であるモハンマド・モインウッディン阪大助教と岡和田晃の2名によるデリー資料調査出張を依頼し、新しい資料を入手できた。彼らはこの出張の際、2017年の日印友好交流年記念事業として開催されたデリー大学・ネール大学合同の学会に参加、講演も行い、予想以上に発展的な成果をえた。研究代表者は、第7回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会(9月24日、同志社大学今出川キャンパス良心館305教室)において、「1954年ロンドンにおける亡命ペン作家作品集刊行に至るまでの国際ペンクラブ・ロンドン本部と欧州史」という考察を口頭発表してきた。ここで、第二次世界大戦後の国際連合やUNESCO、国際連合難民高等弁務官事務所の成立に際して、1930年代末から1950年までの国際ペンクラブと国際連盟との人的交流が大きな役割を果していた点を資料から論証した。これらの成果発表、また2017年2月(前年度)の江口真規のロンドン出張成果発表を、2017年11月に研究会を開催して行った。ロンドン出張で江口が複写・書写してきた資料のうち、フランス語分については翻訳家に翻訳業務を発注。翻訳結果の一部は2017年度末に提出された。残部の翻訳と料金支払いは2018年度となった。

前年度2月の江口のロンドン調査は「ほぼ英語、まれにフランス語」で公文書や書簡を書いているベンガル知識人スディンドラナート・ゴーシュに関するものであった。11月の研究会では、ベンガル語と英語のわかる研究者をロンドン派遣して、さらに調査してはどうかという意見が出た。モハンマド・モインウッディンおよび岡和田晃の共同研究者2名のデリー史資料調査出張の日程が、ちょうど日印友好交流年のイベントであるデリー大学・ネール大学の日印文学研究のカンファレンスの9月16日前後と重なった。そのため、彼らはここに参加でき、在インド日本大使館書記官や国際交流基金職員、デリー大学教員や大学院生たちと、学術交流を行えた。さらに彼らから、デリーでの調査のためのツテを得られるなど、相互に有益な関係を構築できた。このことで、本共同研究がインドのジャパノロジストたちに関心を持たれ、有意義な対インド文化・学術発信を果たす結果となった。2016年度は研究会を3回行った後、2017年1月28日、インド・ハイデラバードから、ハイデラバード英語外国語大学(EFLU)のタリク・シェーク助教授を招聘し、インド側の史資料に基づく討議を行った(於東京外国語大学本郷サテライト3階セミナー室)。成果の新規性と重要性は目覚しく、研究会ではこのタリク・シェーク発表は改めて英語圏で発表したいという結論に至った。また目野は江口眞規に、2017年2月、ブリティッシュ・ライブラリー(BL)での一次資料クロスチェックを依頼し、多面的な成果を得た。2017年度には、モハンマド・モインウッディンと岡和田晃2名を、資料調査のためインド派遣。この日程が、日印友好交流年行事のデリー・ネール両大学の日印文学研究国際会議の9月16日と重なった。彼らはここに参加し、在インド日本大使館関係者や国際交流基金職員、デリー大学教員や大学院生と学術交流を行えた。この年も、関西大学の増田周子に口頭発表を依頼した研究会を開催。また、目野が2017年9月24日、第7回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会で「1954年ロンドンにおける亡命ペン作家作品集刊行に至るまでの国際ペンクラブ・ロンドン本部と欧州史」発表を行った。2018年78月、タリク・シェークにBLでの一次資料クロスチェックを依頼。この時、彼は先の東京での研究会発表に基づき、BL内で講演、好評を博す。9月、目野が評論家の夏葉薫を伴いEFLU出張。本件共同研究の成果についてセミナーを行い、インドで成果と知見を共有。2019年1月27日、東京外国語大学本郷サテライトで、タリク・シェーク他を招き国際研究集会(使用言語は英語)。3月には目野が、「戦前期日本ペン倶楽部と戦前期中国ペン倶楽部」発表(第10回世界文学・語圏横断ネットワーク研究集会)。さらにここまでの成果を単著にまとめ、3月、鼎書房より刊行した。1.2012年度までに発見された資料のうち、手付かずになっているものはまだ多いので、これを整頓し、内容を発表していく。2.1のうち、特に東ヨーロッパと中国に関して整頓と公開にとりくむ。3.これまでの研究成果の活字化をはかる。4.インドの大学との日本との研究交流を、より活性化する。「英語だけではなく、ベンガル語もわかる研究者にロンドン調査を依頼し、2012年までに入手していた新資料のクロスチェックの最終段階にはいる」、「成果を今年度中に活字化して発表する」、「シンポジウムを開催して、成果を国民一般に発表する」の三点を行う。2017年1月下旬タリク・シェーク助教授の東京長期にかかる経費、2017年2月下旬
髄膜腫の浸潤・進展の研究-血管新生因子・組織線溶物質・細胞接着因子の発現について

<はじめに>髄外腫瘍である髄膜腫に脳浮腫を伴うメカニズムは古くから種々の因子等との相関が報告されてきた。今回我々は内頸動脈からの栄養血管の存在と腫瘍内VEGF濃度の2つの因子と脳浮腫との相関を検討した。<材料と方法>腫瘍の部位を前頭葉に限定し、内頸動脈系からの栄養血管がある7症例についてのみVEGFの腫瘍内濃度と脳浮腫の程度とを検討した。脳浮腫の程度は以前報告したMRI画像を用いた方法で測定した。VEGFは腫瘍組織内より抽出したmRNAをノーザンブロッティングにより、組織内βアクチンとの比で定量した。また内頸動脈系からの栄養血管がない3例についても同様な検討を行った。<結果>内頸動脈系より栄養血管がある7症例では、腫瘍内VEGF濃度と脳浮腫の程度に今までの結果より高い相関(r=0.9)をみとめた。これに対し、内頸動脈系より栄養されない3症例では3症例とも腫瘍内VEGFが高いにもかかわらず、脳浮腫は伴っていなかった。<考察>髄膜腫に伴う脳浮腫は腫瘍内で産生されるVEGFによって引き起こされることが考えられた。内頸動脈系からの栄養血管の存在は腫瘍と周囲脳組織を隔てるクモ膜の破綻を意味し、腫瘍内のVEGFが周囲脳組織に影響を及ぼすには、腫瘍と脳組織の間のクモ膜の破綻が必要であると考えられた。腫瘍・脳組織間のクモ膜の破綻には腫瘍内で産生される組織線溶系物質が関与していると考え、数種の組織専用系物質と脳浮腫の相関を検討したが、有意差はなかった。
脳内アセチルコリンの動態に関する研究ーin vivo dialysisによる検討

脳内アセルチルコリン(ACh)は、大脳皮質・海馬においては記憶・情動などの高次機能と関連し、基底核・小脳では運動機能と関連している。このような重要な脳機能に関わるAChの脳内動態を明確にすることは、基礎神経科学の分野のみならず、アルツハイマ-病をはじめとする各種変性神経疾患の病態の解明と治療にとり重要である。本研究では、脳内AChをin vivoで測定しうる方法の確立を行い、これとintracerebral dialysisの方法を組み合わせて、神経活性物質及び各種薬物のACh動態に及ぼす影響を検討した。初年度にはラット線条体あるいは海馬からのACh放出を測定する方法を確立し、その基本的性質を調べた。実験としては、脳の目的とする部位に半透膜製の透析チュ-ブを挿入しリンゲル液で潅流した。経時的に採取した潅流液中のACh量をHPLCを用いて測定した。リンゲル液単独ではACh放出量は極めて微量であり測定感度以下であったが、抗コリンエステラ-ゼを添加すると検出可能となった。また、潅流液中のACHはコリン作動性神経終末から放出されたものであることを確認した。平成1・2年度には、ACh放出に及ぼす神経ペプチド・コリン系薬物・神経成長因子などの影響を検討した。末梢投与したコレシストキニンは線条体ACh放出を増加させ、これは迷走神経を介する作用であることが示唆された。ニュ-ロテンシンは線条体ACh放出に変化を与えなかったが、ドパミンやその代謝産物の放出は増加させた。ムスカリン性ACh受容体アゴニストは線条体ACh放出を抑制したが、アンタゴニストは増加させた。LHRHは海馬ACh放出に対し変化を及ぼさなかったが、グルタミン酸の放出を低下させた。以上、脳内AChの放出様式、更に他の神経活性物質による修飾作用を検討した。本実験系はin vivoのレベルであるため薬物開発にも適しており、今後更に実験を進める予定である。脳内アセチルコリン(ACh)は、大脳皮質、海馬などに於て、記憶、情動等の高次機能と関連し、大脳基底核、小脳では、運動機能に重要な役割を果たしている。脳内AChの動態は、多様な内因性物質によって調節されているが、此の点についての研究成果は、比較的少ない。さらに、近年、アルツハイマー病をはじめとする痴呆の病態と、AChとが関連している事が指摘されている。私共の研究は、脳内AChの動態と、これに影響を及ぼすと考えられる物質との相互関連を検討することを目的とした。本年度は、当初の実施計画に基ずき、脳内AChの動態と、いく種類かの神経ペプチドとの相互関連について、ラットでin vivo dialysis実験から検討した。Wistar系ラットの線条体あるいは海馬にdialysis probeを挿入し、これに灌流液を持続的に灌流した。probe内に透析したACh量は、高速液体クロマトグラフィーとelectrochemical detectorを用いて測定し、AChの放出に及ぼす神経ペプチドの影響をみた。まず、AChとコレシストキニン(CCK)との関連についての実験では、CCK-8とその種似物質であるceroleinを用いた。CCKを末梢投与すると、線条体からのAChの放出は促進し、この促進作用は、迷走神経切断により変化した。この点から、CCKの線条AChに対する作用は、一部迷走神経を介した作用である事が示唆された。CCKの作用機序としては、脳内ドパミン(DA)系などの他のトランスミッターを介さずに、AChニューロンそのものに直接的に作用した事を明かにした。次に、ニューロテンシン(NT)とACHとの関係について同様の方法で検討した。NTは、線条体からのACh及びDAの放出を著明に刺激した。なお、ソマトスタチンは線条体のACh systemに対し影響を及ぼさなかった。これらの結果から、特定の神経ペプチドは、脳内AChの動態と深く関連している事が明らかになると共に、これらの物質が中枢神経疾患の治療剤として有望である事を示した。

末梢投与したコレシストキニンは線条体ACh放出を増加させ、これは迷走神経を介する作用であることが示唆された。ニュ-ロテンシンは線条体ACh放出に変化を与えなかったが、ドパミンやその代謝産物の放出は増加させた。ムスカリン性ACh受容体アゴニストは線条体ACh放出を抑制したが、アンタゴニストは増加させた。LHRHは海馬ACh放出に対し変化を及ぼさなかったが、グルタミン酸の放出を低下させた。以上、脳内AChの放出様式、更に他の神経活性物質による修飾作用を検討した。本実験系はin vivoのレベルであるため薬物開発にも適しており、今後更に実験を進める予定である。平成元年度は、脳内での、in vivoにおける、アセチルコリン(ACh)の放出動態の機序と、これに及ぼす各種薬物の影響について検討した。さらに、昭和63年度に引き続いて、神経ペプチドの、脳内ACh及びドパミン(DA)の放出に及ぼす影響についても検討した。そして、以下のような結果をえた。1.線条体および大脳皮質からのAChの放出は、depolarizing stimuliにより、著明に増加することが、high K^+あるいはveratridineを用いた実験から確認された。また、これらの物質で誘発されたAChの放出増加は、tetrodotoxinで抑制された。2.ムスカリニックコリナ-ジック(mACh)アゴニストであるoxotremorine,carbacholを腹腔内投与すると、線条体からのAChの放出は抑制された。一方、アンタゴニストのatropineを投与するとAChの放出は促進した。3.側脳室内にnerve growthfactor(NGF)を投与した後、3週経過したラットと、対照として生理食塩水を投与したラットとの間で、線条体からのAChの放出量に有意の差はなかった。4.生後1ケ月目のラットの線条体におけるAChの基礎放出量は0.51±0.05(n=10)、1年目のラットのそれは0.49±0.08p mol/min(n=3)であり、加齢ラットの放出量が若干減少している傾向があったが、両者の間に有意の差はなかった。6.線条体からのAChの放出に対し、chole-cystokininは促進的に作用したが、neurotensinは影響を及ぼさなかった。7.neurotensinは線条体からのDAの放出を促進した。以上の結果をまとめると、線条体あるいは大脳皮質からのAChの放出はaction potential依存性であることが明らかとなった。また、mAChアゴニスト及びアンタゴニストの投与でAChの放出動態がそれぞれ変化した所から、mAChreceptorを介してAChの放出が調整されている事が判明した。さらに、各種神経ペプチドによる放出の調整も受けていることが示唆された。尚、脳内AChの動態とNGFあるいは加齢との相関は、本研究では確認されなかった。哺乳類中枢神経系において、アセチルコリンは記憶・情動などの高次機能や運動機能と関連を有している。今年度は、脳内アセチルコリンの動態に及ぼす神経活性物質や薬物の影響について引き続いて検討を進めた。方法は、in vivo dialysisを用い、動物がfreeーmovingの状態で実験を行った。