hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低体重出生児の角層バリア機能についての検討

満期分娩児およびNICU入院中の低出生体重児を対象として、在胎期間、双胎、子宮内発育不全の有無、アトピー素因の有無を調査し、その上で(1)正常新生児、(2)双胎による低体重出生児、(3)母体の基礎疾患により子宮内発育遅延がある低体重出生児にわけ、経時的にエバポリメーターを用いた経表皮水分喪失量(TEWL)の測定を行った。生後1,7,28日後にはテープストリッピング法による角質細胞間脂質のサンプリングも行った。TEWLの測定値(平均値、単位は全てg/m^2/h)は下記のごとくであった。生後1日後3日後7日後14日後28日後正常新生児(n=30)10.6 16.0 12.9 7.2 10.7双胎による低体重出生児(n=7) 6.3 8.9 10.0 6.9 21.0子宮内発育不全がある7.8 14.9 10.1 7.9 11.5低体重出生児(n=30)われわれが使用した機器での成人健常人での基準値は5g/m^2/hであり、測定した新生児ではいずれも高い値を示し、未成熟な角層のバリア機能を反映する結果と考えた。正常新生児に比較して低出生体重児では角層のバリア機能はより未成熟で、TEWL値も高い傾向にあると予想したが、双胎による低体重出生児では生後1,3日後、子宮内発育不全がある低体重出生児では、生後1日後の値がむしろ低値であった。TEWL値は心機能や循環血漿量などほかの要因にも影響された結果と考えた。角質細胞間脂質量との明らかな相関は見い出せなかった。今回対象とした児をを長期経過観察し、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患を発症したか否かによりTEWL値、角質細胞間脂質量に差があったかどうかをretrospectiveに検討する予定である。満期正常分娩児およびNICU入院中の低体重出生児を対象として、在胎期間、双胎、多胎、子宮内発育遅延の有無、アトピー素因の有無などの背景を調査する。その上で(1)正常新生児、(2)多胎などによる低体重出生児、(3)母胎の基礎疾患などにより子宮内発育遅延がある低体重出生児にわけて、エバポリメーターを用いた経表皮水分喪失量の測定を行った。その測定値(平均値、単位は全てg/m^2/h)は、正常新生児7.9多胎などによる低体重出生児11.6子宮内発育遅延がある低体重出生児13.2であった。アトピー素因の有無によっては、現在のところ差がなかった。低体重出生児で、正常新生児より高い傾向にあるが現在のところ統計的に有意な差は出ていないものの、満期(40週)以前の児の未熟な角層バリア機能を示唆する結果と考える。同時に、非侵襲性な測定方法であるテープストリッピング法により、角質細胞間脂質のサンプリングを行っているが、セラミド定量については、現在のところ測定中で結果は出ていないものの、今後も、測定対象数を蓄積し、出生後の経時的な臨床所見と合わせ、分類した6群間において生後三日後、一週間後、二週間後、一ヶ月後で経表皮水分喪失量、角層間脂質の推移をまとめ、臨床と経表皮水分喪失量、セラミド量について症例を蓄積し検討していく予定である。
卵巣癌における間質細胞・間葉系幹細胞による免疫抑制機構の解明と克服法の開発

がん微小環境における間葉系幹細胞(MSC)の免疫学的役割を解析した。マウス腫瘍組織中には、骨髄MSCと同様のマーカーを発現する間質細胞が存在し、マーカーを発現していない細胞と比較し、VEGF、IL10、COX2、MCP-1など免疫抑制分子が高発現していた。また、がん所属リンパ節中にもMSCが存在し、他のリンパ節中のMSCに比べ、MHC class IIの発現が低かった。さらにヒト腫瘍組織中にも、骨髄MSCと同様のマーカーを発現する間質細胞が存在した。以上より担癌生体では、腫瘍局所や所属リンパ節内でMSCが免疫抑制を誘導している事、MSCが免疫抑制解除のための治療標的となりうることが示唆された。本研究では、癌間質の由来の一つとされる骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)に着目し、間質細胞と免疫細胞、癌細胞の三者の相互作用を分子・細胞レベルで解析し、癌微少環境における間質細胞の意義を腫瘍免疫学的見地から解明することを目的とする。MSCとしては、PDGFR&#61537;+, Sca1+細胞(PαS細胞)を用いて解析を行った。本年度は、昨年度樹立したマウスモデルを用いて、腫瘍浸潤MSC (Tumor infiltrating PαS (Ti-PαS))を単離し解析した。癌細胞をdsRED遺伝子で蛍光で標識し、この腫瘍をGFPマウスに皮下移植すると、腫瘍組織内より、GFP+, dsRED-, CD45-, TER119-, PDGFR&#61537;+, Sca1+細胞をとしてTi-PαSが単離できた。GFP+, dsRED-, CD45-, TER119-で、PDGFR&#61537;+, Sca1+以外の分画をTi-nonPαSとしてTi-PαSと性質を比較した。Ti-PαSはTi-nonPαSに比べ、増殖が速く、一細胞からのクローン樹立効率が、有意に優っていた。また、培養をしていない新鮮な状態での、両者の遺伝子発現をRT-PCRで解析した。その結果、いくつかの免疫抑制因子の発現がTi-PαSでTi-nonPαSに比べ数倍高発現していることが分かった。以上より、がん組織の間質にあるPαS細胞は、免疫抑制分子の産生を通して、免疫抑制的な腫瘍微小環境の構築に関与している可能性が示唆された。また、本マウスモデルにおいて、腫瘍の所属リンパ節でもPαS細胞の存在が確認できたことから、PαS細胞はがん免疫応答を惹起するのに重要なセンチネルリンパ節においても何らかの免疫抑制を誘導している可能性が示唆された。MSCとしては、マウスではPDGFRα+, Sca1+細胞(PαS細胞)を用いて解析を行った。本年度は、昨年度単離した、腫瘍浸潤MSC (Tumor infiltrating PαS (Ti-PαS))の性質を解析した。Ti-PαSではTi-nonPαSに比べ、VEGF、IL10、COX2などの免疫抑制分子が数倍高発現していることが分かった。また、マウスリンパ節内に存在するPαSについて解析したところ、腫瘍の所属リンパ節内のPαSは、それ以外のリンパ節内のPαSに比べて、MHC classIIの発現が減少していることが分かった。次にヒトの腫瘍組織内、および末梢血中のMSCを、二つの表面マーカーで定義される細胞分画をFACSで測定することで、解析した。健常人及び担癌患者3症例の末梢血では、MSCは検出されなかったが、腫瘍組織内では8症例中4症例でMSC様の細胞が検出された。そのうち1症例は腫瘍の約0.3%をMSC様の細胞が占めていた。以上より、がん組織の間質および、腫瘍所属リンパ節内にあるMSCは、マウスでは、免疫抑制分子の産生を通して、免疫抑制的な腫瘍微小環境の構築に関与しており、さらにヒトの腫瘍組織においてもMSCが存在し、何らかの免疫抑制に関与していることがが示唆された。本年度はがん微小環境中のMSCを単離するためのマウスモデルを二つ考案し作製を試みた。

一つ目のモデルでは、まず、GFPマウスより骨髄MSC (PDGFRα+, Sca1+)を、野生型マウスより骨髄細胞を採取し、野生型マウスに骨髄移植しMSC由来の細胞のみがGFPで標識されたキメラマウスを作製した。このマウスにマウス卵巣がん細胞を皮下移植したところ、2-3週間後に腫瘍局所にGFP陽性細胞を認めた。このことから、骨髄由来のMSCが癌局所に移動していることが分かった。二つ目のモデルでは、まず、マウス癌細胞株にdsRED遺伝子を導入し、癌細胞を蛍光で標識した。この腫瘍をGFPマウスに皮下移植し、腫瘍組織内のGFP+, dsRED-, CD45-, TER119-, PDGFRα+, Sca1+細胞を腫瘍浸潤MSCとして単離することを試みた。この際MSCを染色する抗体の蛍光標識の様々な組み合わせを検討した結果、APC-Cy7標識-抗CD45抗体、APC-Cy7標識-抗TER119抗体、PC-7標識-抗Sca1抗体、APC標識-抗PDGFRα抗体で染色することにより、腫瘍組織内よりPDGFRα+, Sca1+細胞を単離、培養する事に成功した。このモデルにより、腫瘍組織内の間質にも骨髄でのMSCと同様のマーカーで染色される細胞集団が存在することが証明された。今後、これら二つのマウスモデルを用いて、がん局所のMSCの遺伝子プロファイルを網羅的に解析し、性質を解明、がんの悪性形質にどのように影響を与えるかを解析する。平成24年度は、昨年度確立したマウスモデルで、実際に腫瘍中のMSC(Ti-PαS細胞)をがん細胞のコンタミネーションがほとんどない状態で単離し、解析することに成功した。単離したTi-PαSは、培養を経ない新鮮な状態でも、培養した状態でも解析可能であり、今後このモデルを用いて、がん局所のMSCの性質をさらに解明、がんの悪性形質にどのように影響を与えるかが可能である。平成23年度は、卵巣癌腫瘍中のMSCを分離解析するためのさまざまマウスモデルを検討し、2つのモデルを確立することができた。これらのモデルを用いて、平成24年度はがん局所のMSCの性質に関して、研究を進めていくことができる。平成25年度以降の研究は、樹立したマウスモデルにおいて、分離した腫瘍浸潤MSCの性質を以下の実験を行い解析していく予定である。1.Ti-PαS細胞または、所属リンパ節のPαS細胞の発現遺伝子をGene Chipを用いて網羅的に解析し、骨髄MSCもしくは、Ti-nonPαS細胞集団、または他のリンパ節のPαS細胞と比較することにより、腫瘍組織におけるPαSの性質を解析する。また、Ti-PαSのMSCとしての多分化能も検討する。3.Ti-PαSが抗腫瘍免疫に与える影響をin vivoで評価する。上記マウスモデルにおいて分離した腫瘍浸潤MSCとマウス卵巣癌細胞株を混合してマウスに皮下移植し、Ti-PαSが癌細胞の増殖、及び、抗腫瘍免疫応答に与える影響を評価する。4.ヒトでの評価。ヒト卵巣がん組織または、卵巣がん患者の末梢血より二つのマーカーで腫瘍浸潤MSCを分離し、その性質を解析する。平成24年度以降の研究は、平成23年度に確立した2つのマウスモデルにおいて、分離した腫瘍浸潤MSCの性質を以下の実験を行い解析していく予定である。1.腫瘍浸潤MSCの発現遺伝子をGene Chipを用いて網羅的に解析し、骨髄MSCもしくは、腫瘍内のPDGFRα+, Sca1+以外の細胞集団と比較することにより、腫瘍浸潤MSCの性質を解析する。また、本モデルで分離された腫瘍浸潤MSCのMSCとしての多分化能も検討する。
伴侶動物としてのウマの社会的知性を探る：個体から集団までの多階層的アプローチ

本研究では飼育下・野生下ウマを対象に、他者への「行動の同調」と「心的状態の理解」に着目し、個体から集団までの多階層的視点からウマの社会的知性を検証することを目指している。飼育下ウマにおいては、解決不可能課題を用いてヒトの心的状態に対するウマの理解能力を検証する実験を行った。ウマが自身では空けられない桶にエサを隠す過程を見ていた(餌場所の知識がある)ヒトと見ていなかった(餌場所の知識がない)ヒトが存在する中で、ウマが各ヒトの知識状態を識別し、その後の行動を変えるかを、2つの実験によって検証した。実験1では、エサを隠すのを見ていたヒトに対して、ウマはより多くの要求行動を示した。つまりウマは2人のヒトが同時に存在する場合でも各ヒトの知識状態の違いを見分け、それぞれに対する行動を変えることが分かった。この結果は既に論文を投稿して、現在査読後の再校正をしている。実験2は現在実施中で、より複雑な状況を設定し、知識のある・ない実験者2人が選んだ(指差しをした)桶のうち、どちらを選ぶか(どちらのヒトの情報を利用するか)を検証している。野生下ウマにおいては、2018年57月にかけて野外調査を行い、社会構成や行動を観察した。現在、調査中に採取した糞を用いた遺伝子解析と、ドローンで撮影したウマ群の映像を用いた動きの解析を進めている。ウマの動きの解析では、ドローン映像と動作解析ソフトを用いることで、オスによるハーディング行動(メスを牧羊犬のように追う行動)時の群内各個体の動きの軌跡を描くことに成功した。また群が動く際の個体間のインタラクションを検証したところ、オス-メス間からメス-メス間へと、2段階のインタラクションが生じていることが分かった。この成果に関する論文は既に執筆して投稿中であり、さらにオスに反応するメスの動きのモデルに関する論文も現在執筆中である。飼育下ウマにおけるヒトの知識状態に対するウマの理解に関する実験は、フランス国立農業研究所のレア・ランサデ博士らの協力により、ほぼ予定通りに進んでいる。1つの目の実験は既に完了し、2つ目の実験も進んでいる。野生下ウマにおける行動・遺伝データの収集および血縁度や群れの動きの解析は、ポルト大学CIBIOおよび奈良先端科学技術大学院大学の池田和司教授らの協力により、予定通りに進んでいる。またこれらの研究の成果は、国内外の学術雑誌や学術図書における執筆、国内外の学会やシンポジウムにおける発表を通して、公表した。以上から、本研究は順調に進展しているといえる。飼育下ウマにおいては今後も発展させた実験を継続していき、他者の心的状態に対するウマの理解能力をさらに検証していく予定である。ただ現在、実験補助者を確保しづらい状況にあるため、実験補助者を広く募集する方法を検討している。野生下ウマにおいては、今後も毎年、ウマの出産・繁殖期に野外調査に出向いて、社会行動に関するデータ収集をする。社会関係や群構成と関連付けながら、個体群れレベルまでの行動の同調特性にかんする研究を進めていく予定である。

飼育下ウマにおいては今後も発展させた実験を継続していき、他者の心的状態に対するウマの理解能力をさらに検証していく予定である。ただ現在、実験補助者を確保しづらい状況にあるため、実験補助者を広く募集する方法を検討している。野生下ウマにおいては、今後も毎年、ウマの出産・繁殖期に野外調査に出向いて、社会行動に関するデータ収集をする。社会関係や群構成と関連付けながら、個体群れレベルまでの行動の同調特性にかんする研究を進めていく予定である。リングホーファー萌奈美「好きなことを仕事に!動物行動学者としての生き方」、帝塚山学園小学校における第6回外部講師講演会、奈良、2019年2月リングホーファー萌奈美「DNAと動物行動学」、大阪女学院高校におけるiCeMsキャラバン、大阪、2019年3月
有機・無機ハイブリッド型バイオセンシング材料の創製

バイオセンシング技術とは抗原抗体反応や酵素反応といつた生体関連物質が有する特異的分子識別能を利用したセンシング技術である。バイオセンサーは検体をそのまま使用することができるため、事前処理や複数の工程が必要である従来の化学的分析にくらべ、高速かつ少量での分析が可能となる。本研究では,タンパク質吸着性の高い有機・無機ハイブリッド材料の新規合成法の開発と解析法の検討を行った。低濃度のサンプルを検出するために、生体親和性を担う官能基にアミノ基を選択した。アミノ基を有するAPTMSを主原料とし、アミノ基を高密度に有する新規材料の作製を目指した。材料の高機能化のためTEOSを導入し,タンパク質検出能を維持したまま,耐水性を有する材料を得ることができた。また,薄膜表面を加工するために,表面インプリントを行なうことができた。バイオデバイスは,システムの微細化と製造工程の簡素化が同時に求められているため,表面インプリントによる加工は,デバイスの加工法として非常に有望である。本試料はインプリントにより表面加工が容易に行えるため,表面加工を行う為に何重もの行程を要するガラス基板よりも加工性に優れていると言える。また,表面プラズモンを利用したタンパク質検出デバイスの創製も行っている。また,これまでに有機無機ハイブリッド材料を得る手法として無溶媒アルコール縮合法(si-OR+P-OH→si-O-P+ROH)を開発してきた。しかしながら,出発物質がケイ素アルコキシド(有機修飾アルコキシシラン)であったために,用いることのできる元素が制限されるという問題もあった。本研究では,用いることのできる元素の選択肢を広げるために,出発物質として有機修飾ケイ酸とホウ素アルコキシドを選択し,ホウケイ酸塩系有機-無機ハイブリッドガラスの無溶媒合成と反応プロセスの解明に成功した。得られた材料は,格段に耐水性に優れるものであった。また,種々の金属アルコキシドを添加することにより,耐水性がさらに向上することを見出した。バイオセンシング技術とは,抗原抗体反応や酵素反応といった生体関連物質が有する特異的分子識別能を利用したセンシング技術である。有害タンパク質あるいは病気の目印となるバイオマーカー等の検出を主な目的としている。この技術を用いて実際に検出を行うデバイスがバイオデバイスであり,その例として生体関連物質を検出する目的で使用するバイオチップ,センシングに必要な一連のプロセスをチップ上で実現するマイクロ流路等がある。これらのデバイスに求められている特性として,システムの微細化,高感度化,そして安価な作製コストという機能が挙げられる。こうした背景から,デバイス構成材料に求められる機能として,高い加工性,高いタンパク質吸着能,そして簡便な作製法が挙げられると考えた。本研究では,APTMSとTEOSを用いて有機-無機ハイブリッド材料を作製し,耐水性と熱処理に伴う構造変化,そしてタンパク質吸着特性を評価した。本研究では,APTMSとTEOSを出発原料とする薄膜を作製し,耐水性と構造変化,タンパク質吸着特性の評価,および表面加工を行なった。耐水性が向上する熱処理条件を決定したところ,APTMS:TEOS=8:2の系では140 °Cで48時間, APTMS:TEOS=5:5では140 °Cで12時間となった。熱処理に伴う構造変化を測定したところ,140°Cで熱処理を行うと重合度が増加した。また,長時間の熱処理によりアミノプロピル基がアミドに変性した。今回作製した薄膜は,APTMSの単分子膜よりも,タンパク質を強く吸着した。表面インプリントの手法を用いてパターンを転写し,表面加工を行ない試料表面をパターニングできることを確認した。

近年、タンパク質などの生体分子を高速かつ高感度に分析するバイオセンシングシステムが盛んに研究されている。しかし、簡便・安価・高感度という点をすべて満たしているとは言えないのが現状である。そこで我々は材料そのものの機能化により解決することを考えた。具体的には、有機高分子材料の生体親和性・加工性、無機材料の耐熱性・耐候性といった特徴を併せ持つ有機-無機ハイブリッド材料の利用を検討した。当研究室では、アルコキシシランを原料としたゲル膜から自己組織的に起こるロールアップ現象を発見した(マイクロロール)。マイクロロールは幾重にも巻重なった形状であり、中空形状や有機-無機ハイブリッド材料の特性を活かすことで小型流路などへの応用を現在検討している。本研究では、マイクロロール内表面に生体分子を固定化することで、簡易作製可能なバイオセンシングデバイス材料の作製を最終目標とする。まずは、マイクロロールの形状制御、機能性付与を目指した。SEM観察により、外形は約80μmで幾重にも巻き重なっていることがわかった。また、マイクロロールのIRスペクトルより、NH2変角振動に帰属できる16201650 cm-1にピークが現れた。よって、本手法によると、アミノ基により表面修飾されたマイクロロールの作製が可能であることがわかった。これらは、バイオセンシングデバイスとして応用可能であることを示している。有機無機ハイブリッドをベースとするタンパク質吸着材料の開発に成功した。この材料は,表面加工が容易であり,かつ高いタンパク質吸着能を有する。具体的には,原料として,アミノ基の静電引力によりタンパク質を吸着可能な3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APTMS)を選択した。APTMSは,ガラス基板の表面にアミノ基を導入する目的で使用されるシランカップリング剤であり,基板表面のシラノールと結合し,単分子膜を形成する[1, 2]。また,耐水性を向上させるために,分子量を増加させることのできるテトラエトキシシラン(TEOS)を選択した。上記2成分を原料として,ゾルゲル法により,バイオデバイス構成材料を志向した有機-無機ハイブリッド材料を作製した。加工性に関しては,ゾルゲル法により作製するため,ゲル状態でのエッチングや,表面へのインプリントが可能となった。しかしながら,今回作製した薄膜は,APTMSの単分子膜よりも,タンパク質を強く吸着したものの,感度向上が不十分であるため,今年度に到達することを計画している。計画以上に親展しており、特記事項無し。タンパク質検出感度の向上を目指し,従来までに作製してきた材料と,金ナノ粒子のコンポジット化を試みる。また,複数の生体関連物質を別個に導入し、入り口側と出口側に光ファイバをカップリングさせ、物質変化をリアルタイムに観察することなどを試みる。例えば、抗原と血清を同時に導入し、生体反応によって生成したIgG(immunoglobulin G、免疫グロブリンG)を観測することを考えている。
人類進化モデルにおけるプロバイオテックスの効果

チンパンジーの口腔細菌叢をピロシーケンシング法で網羅的に解析すると、ヒトとは異なりベイヨネラ科が大部分を占めた。う蝕原因菌と考えられるストレプトコッカスについては、モンキーおよびヒトとは異なる固有の細菌を発見し、Streptococcustroglodytaeと命名した。口腔細菌は宿主の進化と同時に進化していることが分かり、チンパンジー口腔の研究がヒト口腔疾患の改善をもたらすのではないかと考えられた。チンパンジーはヒトと遺伝子が98.8%の相同性を示すにも関わらず、その寿命は約40年である。チンパンジーは歯を磨かないヒトモデルとして、口腔内細菌叢と口腔内状態、健康状態および寿命影響の関連を検討する絶好のモデルと考えられる。本研究は(1)チンパンジー口腔細菌叢のピロシーケンシング法による網羅的な解析(2)プロバイオテックス摂取による常在菌および病原菌変動の解析と口腔衛生状態の関連性(3)プロバイオテックス摂取の寿命への影響。以上の結果から、ヒトにおける口腔細菌叢の健康、寿命への影響を推定するモデルを作製することを目的とする。本年度の研究実施計画は(1)である。方法として、京都大学霊長類研究所で飼育されているチンパンジー(32歳メス)を健康管理の際、麻酔下で、滅菌された歯ブラシを用いてブラッシング歯垢を採取した。歯垢細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV6領域をPCR法にて増幅し、Roche454シーケンサーにて遺伝子配列を得た。遺伝子情報はThe Ribosomal Database Project Server等を用いて解析した。そ結果、19,331の16S rRNA遺伝子のV6領域のアンプリコンが得られた。これらのシーケンスをグルーピングすると280 OTUs(operational taxonomic unit)に分けることが出来た(3% cutoff)。分類の結果、最も多いphylumがFirmicutes(86.3%)で、次いでTM7(7.2%)、Synergistes(1.8%)であった。その他Fusobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Proteobacteriaのphylumが検出された。このことから、チンパンジー口腔からPyrosequencing法により未発表あるいは培養されない細菌が多数検出できた。本方法はT-RFLP法等よりも遥かに有用と考えられた。我々は、人類進化モデルとしてチンパンジーの口腔内細菌叢と口腔疾患および寿命の関連について京都大学霊長類研究所と共同研究をしている。本年度は5頭(9-27歳)のチンパンジー口腔内細菌叢についてピロシーケンス法を用い解析した。その結果、(1)3%cut offで207から856のoperational taxonomic units(OTUs)が得られ、今までに報告されていない細菌が多数存在する可能性が示唆された。(2)ヒトの口腔内優勢菌種はStreptococcusである。一方チンパンジーではStreptococcusが0.3-11%であるのに、Veillonellaが6-81%を占め、ヒトと優勢菌種が異なるデータが得られた。(1)の結果を確認するため、う蝕原因菌のStreptococcusについて培養法で菌種を確認した。チンパンジーの口腔内から得られたS.mutans類似菌を分離し、この菌の分類学的位置付けを明確にした。細菌の菌種の定義の一つに、基準菌株と16SrRNA遺伝子の相同性が97%以下であると独立した菌種と認められる。この菌はS.mutansが最も近縁な菌種であり、その基準株との塩基配列類似度が96.4%を示し、新菌種としてStreptococcus troglodytaeと命名した(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.Epub ahead of print)。今後、この細菌とヒトう蝕原因菌であるS.mutansの性状および遺伝子を詳細に比較、検討することにより、う蝕成因のメカニズム解明、う蝕原因菌の伝播様式の解明に役立つものと思われる。また、(2)の結果を培養法などによりVeillonellaが優先菌種であることを確認すると共に、Veillonellaが亜硝酸を産生する特徴があることから、プロバイテックスと亜硝酸による作用について検討を加え、寿命との関連を考察したい.チンパンジーは遺伝学的に最もヒトに近縁の動物で、人類進化モデルとしてその研究は多くの重要な情報を得ることが出来る。本課題ではチンパンジーの口腔細菌叢を網羅的に解析し、ヒト口腔衛生への寄与について考察することである。本年度はこの研究課題の最終年度であるが、1.ピロシーケンシング法により得られた新菌種の存在の可能性、および2.多量のVeillonella科の存在についてのデータの信憑性を確認するため、先ずう蝕と最も関連するミュータンスレンサ球菌群について、培養法により詳細に検討した。その結果、我々が新菌種を提案したS. troglodytaeが4個体から(36%)およびS. dentirousettiが3個体から(27%)分離された。

ヒトから分離されるS. mutansが1個体から(9%)分離されたが、S. sobrinus、およびモンキーから分離されるS. dawnei、S. macacaeは分離されなかった。このことから、チンパンジー口腔にはヒトあるいはチンパンジー程進化が進んでいないモンキーとは異なる固有の細菌群が存在することが本研究で判明し、報告した(印刷中)。細菌学的検索と同時に行われた、う蝕、歯周病などの口腔内診査の結果は極めて良好であったことから(Momoi et al.)、現在、S. troglodytaeはS. mutansと病原性が異なるのか、whole genome sequencingによる病原因子の遺伝子検索を行っている。また、Veillonella科の口腔環境への関与などについて、プロバイオテックス作用の中心となる乳酸産生等との関連を含め引続き検討中である。ピロシーケンス法を用る口腔内細菌叢の解析が非常に高精度で簡便に得られ、新しい知見が得られた。プロバイオテックスの効果については次年度の課題とする。24年度が最終年度であるため、記入しない。チンパンジーを用いたプロバイオテックスの摂取効果を調べることは、さらに十分なin vitroでの実験が必要と思われる。チンパンジーから得られた新菌種S.troglodyteaとヒトう蝕原因菌であるS.mutansの性状および遺伝子を詳細に比較、検討することにより、う蝕成因のメカニズム解明、う蝕原因菌の伝播様式の解明を検討し、最終的にヒト口腔細菌叢の寿命と関係を考察したい。
細胞骨格繊維系の動的性質に関する研究

(1)細胞質分裂:収縮環の形成には蛋白質リン酸化と低分子量G蛋白質rhoが関与していることが示唆された。(2)in vitro運動系:トロポミオシン-トロポニンはアクトミオシン相互作用におけるエネルギー変換効率を高めることが分かった。キネシン頭部の特定部位を基質に固定化し、キネシン頭部だけでも微小管を滑走させることを見いだした。(3)アクチン機能:テトラヒメナと粘菌のキメラアクチンを作製し、アクチンの機能部位を調べた結果、38-83アミノ酸配列がDNaseI結合を担うことが分かった。(4)細胞膜裏打ち構造:アンチセンスDNA法により、エズリン・ラディキシン・モエシン(ERM)がアクチン繊維の構築に関与していることを示した。またERMは細胞膜蛋白質CD44と直接結合することを示した。(5)分裂装置:微小管安定化剤であるヘキシレングリコールは3%未満では中期紡錘体を大きくし、染色体運動を遅める作用をした。(6)色素細胞運動:白色素胞の運動がモーター蛋白質と微小管の相互作用で起こることを示した。また黒色素胞の色素顆粒凝集に先立つCaイオン濃度の上昇を観察した。(7)脳微小管:抗チューブリン抗体E3B8のエピトープが全てのα-チューブリンアイソタイプに共通の432-452のアミノ酸配列領域に存在することを明らかにした。(8)微小管の動的性質:微小管はMAPS結合位置で脱重合相から重合相へスイッチすることが示された。MAPSのこの微小管安定化能はMPFによるリン酸化で消失した。22SダイニンはATP感受性結合をし、微小管を安定化することが分かった。(9)中間径繊維:ウシ脊髄のニューロフィラメントにはタイプ2A蛋白質フォスファターゼが結合しニューロフィラメントの構造維持に働いていることが分かった。細胞質分裂期の中間径繊維キナーゼの候補としてCa-CaM依存性キナーゼが考えられた。(1)細胞質分裂:分裂周期におけるミオシン軽鎮リン酸化活性を調べ、Ca非存在下での活性が中期で最大、分裂期で最小になるように変動することを見いだした。(2)invitri系アクチン繊維:純粋F-アクチンに対してトロポミオシン・トロポニンを加えるとミオシン上を滑走する速度の増大が認められた。(3)細胞接着装置:カドヘリンと共存する220KDaの細胞膜裏打ち蛋白質のCDNAを単離し、その構造を決定した。(4)分裂装置:ヒトデ卵母細胞と卵に中心体を顕微注入し、形成される星状体の大きさを調べた。成熟分裂時では小さく、卵割時では大きかったので、分裂装置の大きさは細胞質により細胞周期依存的に決定されることが分かった。(5)色素胞:色素胞内のCa濃度と運動性反応を同時に測定できる2波長顕微分光測光装置を自作し、色素果粒凝集に先立って細胞内Ca濃度が上昇することを示した。またアトロピンによる色素果粒の拡散効果が、細胞質に影響することにより起こることを示した。(6)脳発生:ラットの胎児脳ではα-チューブリンのみを認識し、成熟脳ではα-,β-チューブリンを認識する抗体を得た。この抗体は両チューブリンに共通する翻訳後修飾部位を認識すると考えられる。

(7)微小管安定性:微小管の動的不安定性に対するMAP-2の影響を調べた。MPFによりリン酸化されたMAP-2存在下では脱重合相が優先し、脱リン酸MAP-2では速い速度の重合相への回復は起こりにくかった。未処理MAP-2では重合相と脱重合相の相互変換が繰り返された。一方、微小管結合蛋白質ダイナミンがGTP依存的にアクチン繊維を束化することを見い出した。低密度のキネシンによる微小管の運動を促進することも分かった。(8)中間径繊維:ニューロフィラメントH鎮をリン酸化する酵素としてタウキナーゼIIを同定した。各種中間径繊維に対するcdc2キナーゼのリン酸化部位を決定した。(9)アクチン遺伝子:細胞性粘菌とテトラヒメナのキメラアクチンを作製した。(1)細胞質分裂:収縮環の形成には蛋白質リン酸化と低分子量G蛋白質rhoが関与していることが示唆された。(2)in vitro運動系:トロポミオシン-トロポニンはアクトミオシン相互作用におけるエネルギー変換効率を高めることが分かった。キネシン頭部の特定部位を基質に固定化し、キネシン頭部だけでも微小管を滑走させることを見いだした。(3)アクチン機能:テトラヒメナと粘菌のキメラアクチンを作製し、アクチンの機能部位を調べた結果、38-83アミノ酸配列がDNaseI結合を担うことが分かった。(4)細胞膜裏打ち構造:アンチセンスDNA法により、エズリン・ラディキシン・モエシン(ERM)がアクチン繊維の構築に関与していることを示した。またERMは細胞膜蛋白質CD44と直接結合することを示した。(5)分裂装置:微小管安定化剤であるヘキシレングリコールは3%未満では中期紡錘体を大きくし、染色体運動を遅める作用をした。(6)色素細胞運動:白色素胞の運動がモーター蛋白質と微小管の相互作用で起こることを示した。また黒色素胞の色素顆粒凝集に先立つCaイオン濃度の上昇を観察した。(7)脳微小管:抗チューブリン抗体E3B8のエピトープが全てのα-チューブリンアイソタイプに共通の432-452のアミノ酸配列領域に存在することを明らかにした。(8)微小管の動的性質:微小管はMAPS結合位置で脱重合相から重合相へスイッチすることが示された。MAPSのこの微小管安定化能はMPFによるリン酸化で消失した。22SダイニンはATP感受性結合をし、微小管を安定化することが分かった。(9)中間径繊維:ウシ脊髄のニューロフィラメントにはタイプ2A蛋白質フォスファターゼが結合し、ニューロフィラメントの構造維持に働いていることが分かった。細胞質分裂期の中間径繊維キナーゼの候補としてCa-CaM依存性キナーゼが考えられた。
非平衡強相関系・超伝導体の理論

本研究ではトポロジカル物質、量子スピン系、強相関電子系(モット絶縁体)、量子色力学(QCD)真空など様々な量子状態が強力なレーザー光の元でどのような非平衡相転移をみせるのかを分野横断的に理論研究した。対象は多彩ではあるが、背景となるアイデアは「フロッケ・エンジニアリング」(=振動外場による制御)と共通している。様々な物質は高速に振動する外場の元では熱せられると同時に外場のない状態とは異なる力を感じる(直感的な比喩としてはヘリコプターは回転翼の力で上向きの力を静的に得る)。逆にこの性質を利用することで通常では存在できない望ましい性質を物質に発現させることが可能となる。(a-1)電子格子結合:強い電場によって駆動された電子系の長時間での振る舞いを理解するためにはフォノンとの結合による緩和現象を考慮する必要がある。フォノンの効果を理論モデルに取り込むことは一般には容易ではない。まず、初年度は電子相関を無視した電子・フォノン系におけるフォノン緩和の問題をニューヨーク大学のA. Mitra教授らとともに研究した。特に、二次元ディラック電子系やグラフェンを対象として、円偏光レーザーの連続照射によって実現する非平衡電子分布に着目した。フロッケの方法とマスター方程式を組み合わせた手法を援用し、光誘起ホール効果の量子化の問題を解析し結果を2編の論文にまとめた。(a-2)磁性の光制御:レーザーを磁性体に照射することで新たな量子多体状態を実現する方法を探ることも本課題の目標である。この目標に向け、佐藤(青学)、S. Takayoshi (NIMS)とともに量子スピン模型の解析を行い、結果を論文にまとめ投稿した。時間依存FLEXコードの完成:ハバードモデルに代表される強相関模型の時間発展を調べるために揺らぎ交換近似(FLEX)に基づくアプローチは有効である。この計算を行うfortranコードを完成させることは平成26年度の目標であったが、平成27年5月現在も継続中である。その他(ハドロン、素粒子物理との比較):同じく強相関系であるハドロン(QCD)の研究者との協力による学際研究を始めたが、これは予想外に大きな成果があった。物性分野で知られている励起子モット転移の概念がハドロン相の崩壊(ハゲドロン転移)を理解するのに有効であることが示された。関連論文を6本投稿した(2本出版済み、2本アクセプト)。昨年度の査読論文の掲載は8本であった。(a-1)電子格子結合:強い電場によって駆動された電子系の長時間での振る舞いを理解するために電子・フォノン結合によって安定化される定常状態の定式化を昨年度より行った。これはニューヨーク大学のA. Mitraおよび、学生のH. Dehghaniとの共同研究であり、2015年度に成果がPRB誌に出版された。特に電子が外部から照射されたレーザー光によって励起され、かつ、1体スペクトルがトポロジカルに非自明な状態にあるとき、フロッケ・トポロジカル絶縁体の非平衡定常状態として重要な問題である。また、関連する論文をM.A. Sentefらスタンフォード大学のグループと共同でNat. Com.誌に発表した。(a-2)磁性、スピン流の光制御:レーザーを磁性体に照射することで新たな量子多体状態を実現する方法を探ることも本課題の目標である。特にマルチフェロ物質ではスピン自由度を電場を使って直接制御できるので、様々な応用が可能である。この目標に向け、佐藤(茨城大学)、高&#134071;(ジュネーブ大学)とともに量子スピン模型の解析を行い、光によるスピン流生成についての結果を投稿した。2015年度には東京大学からドイツのマックスプランク研究所(PKS, CPfS)、および、大阪大学理学系研究科(招へい研究員)へ異動となり、従来の研究に加えて新たな研究の方向性を模索中である。特にメタマテリアル増強を用いたレーザー・物質制御に大いに興味を持っている。(a-1)電子格子結合:ここ2年の研究でマスター方程式を通じたフォノン緩和は大変有効な研究手法であることが分かった。特にフロッケ状態の非平衡定常状態の計算においては現在最強の手法といえる。一方、電子相関がある場合にはグリーン関数法との併用が不可欠であり、これが今後の課題となる。(a-2)磁性の光制御:現在は「超高速スピントロニクス」の黎明期にある。量子磁性体をレーザーで制御する可能性について理論的に調べたが、特にマルチフェロ物質とプラチナ電極の界面は大変有望な組み合わせであることが理論的に分かった。ピコ秒単位で制御できるスピンカレントの生成について今後実験グループとの協力が必要となる。また、上記の2テーマを横断する話題として、昨年度より前野(京大)らと共同研究を行ってきたCa2RuO4の電場下の非線形伝導現象についての理論解析も成果をあげており近く論文を投稿予定である。最終年度となる2016年度においては主にレーザーによって駆動された強相関物質において生じるエキゾチックな量子現象について理論的に調べた。特に「超高速スピントロニクス」とよばれる、レーザーを用いてスピン流を駆動する現象に関しては新しいメカニズムを提案することができた。具体的にはスピン軌道相互作用などに起因して強い電場・スピン結合を有する物質(マルチフェロ)において、レーザーを照射することで可能なDM相互作用の制御を通じてスピンを「ひねる」ことができる。この「ひねり」をうまく空間的に制御するとスピン流が流れるのである。本研究内容はPhys. Rev.Lett.誌に公表された。

そのほか、電子が強いクーロン力によって動きが凍結されているモット絶縁体において、円偏光レーザーを照射するとスピンのスカラーカイラリティを誘起できることも分かった。スカラーカイラリティはスピン版のトポロジカル状態を誘起するのに重要な役割を果たす秩序であり、時間反転対称性が破れていることが特徴である。光学過程としては逆ファラデー効果と同じ次数(電場の2次)の現象であるので、実験的には既存のプラットホームで実証が可能な効果である。もうひとつの重要な成果は光誘起ワイルフェルミオンの発見と理論的な理解である。これは3次元ディラック物質にレーザーを照射することで実現されるトポロジカル状態である。また、これらの研究成果を国際会議にて発表し、広く周知することもできた。本研究ではトポロジカル物質、量子スピン系、強相関電子系(モット絶縁体)、量子色力学(QCD)真空など様々な量子状態が強力なレーザー光の元でどのような非平衡相転移をみせるのかを分野横断的に理論研究した。対象は多彩ではあるが、背景となるアイデアは「フロッケ・エンジニアリング」(=振動外場による制御)と共通している。様々な物質は高速に振動する外場の元では熱せられると同時に外場のない状態とは異なる力を感じる(直感的な比喩としてはヘリコプターは回転翼の力で上向きの力を静的に得る)。逆にこの性質を利用することで通常では存在できない望ましい性質を物質に発現させることが可能となる。ハドロン物理の理論家との学際的研究は予想外の進展を見せている。一方で、予想していたこととはいえ数値計算はコードの複雑さのためまだ完成をしていない。次に各項目ごとに達成度を説明する。(a-1)電子格子結合:マスター方程式を通じたフォノン緩和は大変有効な研究手法であることが分かった。特にフロッケ状態の非平衡定常状態の計算においては現在最強の手法といえる。一方、電子相関がある場合にはグリーン関数法との併用が不可欠であり、これが今後の課題となる。(a-2)磁性の光制御:量子磁性体をレーザーで制御する可能性について理論的に調べたが、かなり強力なレーザーを照射すれば反強磁性体を含めて自由にコントロールすることができると結論づけた。時間依存FLEXコードの完成:繰り返しになるが、ハバードモデルに代表される強相関模型の時間発展を調べるために揺らぎ交換近似(FLEX)に基づくアプローチは有効である。この計算を行うfortranコードを完成させることは平成26年度の目標であったが、平成27年5月現在も継続中である。この点において達成度は低くなる。その他(ハドロン、素粒子物理との比較):ハドロン(QCD)の研究者との協力による学際研究を始めた。まず、新しい非平衡のシミュレーション方法である確率量子化法を場の理論模型に適用した。また、ゲージ・重力対応による「強相関系の非平衡ダイナミクス」の研究を橋本(阪大)らと継続しているが、物性分野の概念(励起子モット転移)と素粒子分野の概念の間に「辞書」ができはじめた。これを元に両分野の研究を俯瞰すると新しい見方が可能になりとても興味深く感じている。
非線形破壊力学を応用した水田における亀裂進展予測手法の開発

粘土質水田において、乾燥亀裂は圃場の排水性に大きな影響を及ぼしている。特に暗渠へ向かう水の流れは、数センチの亀裂の深度の違いに大きく左右されることが明らかとなっている。本研究は、このような亀裂の重要性を鑑み、土・水連成解析と破壊力学の知見を応用した水田における亀裂進展シミュレーションモデルの開発を目的とした。第一に、非線形破壊力学パラメーターの一つである亀裂先端開口角(CTOA)のサクション圧密履歴への依存性を解析した。破壊特性の評価法としては、3点曲`げで試験を適用し、亀裂先端を記録した画像から、画像解析によってCTOAを査定した。圧密サクションの増加に伴い、CTOAは減少すること、また、圧密後再飽和させた試料では、再飽和前よりCTOAはさらに小さくなることを明らかにした。次に、曲げ試験によって測定されるCTOAが、乾燥収縮によって生じる亀裂のCTOAと等価かどうかを検証するため、モデル土層を用いてサクションの負荷による亀裂の進展を観察した。その結果、曲げ試験とサクションにより収縮の間にCTOAの著しい違いは認められなかった。そこで、CTOAをサクションに依存する亀裂進展の支配パラメータと位置づけ、亀裂進展シミュレーションモデルを構築した。プログラムは、非線形弾性を構成式とした土・水連成解析プログラムを中心として、亀裂先端の開口変位(CTOA)により亀裂進展の有無を各ステップ毎に判定し、CTOAが限界値を超えたときに、亀裂先端部の接点の拘束を解放することで亀裂の進展を表現するものである。3点曲げ試験によって実測したCTOAの値を用いてシミュレーションを行うと、亀裂先端部の有効応力や間隙水圧は妥当な範囲に収まった。また、このシミュレーションモデルにほ場で実測したパラメータや諸条件を入力すると、実測した亀裂の深度におおよそ一致する結果が得られた。第一に、海外研究協力者とともに、スコットランド作物研究所において取得した粘質土に関する3点曲げ試験のデータを詳細に解析し、亀裂先端開口幅(CTOA)およびJ積分値の水分状態依存性を検討した。亀裂安定成長期のCTOAは、その定義によらず、段階的なサクション圧密により徐々に低下する傾向が見られた。また、サクション圧密した試料を再吸水させることで、さらにCTOAは低下することが確認された。一方、亀裂安定成長期の単位亀裂成長量に対するJ積分の変化率dJ/daは、サクションが10kPaから20kPaに増加すると増加し、再吸水により大きく減少することが観測されたが、CTOAに比べ増減の傾向が不明瞭であった。CTOAとdJ/daの間には、降伏応力をパラメータとした関係が金属では認められるが、軟弱な土壌試料では、これらを関連づけて議論するのは困難であることが示唆された。第二に、水稲耕作田において、夏期の落水後に作土下部および耕盤を採取間隔をあけて多数採取し、その排水・吸水過程の保水特性を測定した。また、テンシオメータによる亀裂周辺部におけるサクション分布の連続観測、発生した亀裂の深度の観測などを行い、シミュレーションモデルの実行や検証に必要なデータの蓄積を図った。これらの野外試験によって得られた成果のうち、特筆すべき点は、保水特性の急激な変化についてである。落水直後とその10日後の同一箇所での保水特性を比較すると、乾燥によるサクション圧密の効果(採取時サクションより湿潤側の水分の消失)だけではなく、より低水分側の微細な間隙の水分の消失が同時に起こっていたことを明確に示す結果が得られた。すなわち、還元状態の強い土壌の乾燥収縮では、乾燥収縮の際、収縮特性(圧密特性)そのものの変化が短期間に進行することが明らかになった。亀裂進展予測モデルの重要なパラメータである、「圧縮指数」を評価する上で、この知見は重要な意味を持っている。

第一に,骨格の変形については非線形弾性,透水挙動については透水係数の間隙比依存性を考慮した有限要素法による土・水連成解析プログラムをベースに,土壌の乾燥亀裂進展シミュレーションモデルを作製した。このモデルは,既存の切り欠けから乾燥の進行に伴って亀裂が進展する挙動を力学的なモデルによりシミュレートするものである。プログラムでは,亀裂先端の開口変位(CTOA)により亀裂進展の有無を各ステップ毎に判定し,CTOAが限界値を超えたときに,亀裂先端部の接点の拘束を解放することで亀裂の進展を表現した。3点曲げ試験によって実測したCTOAの値を用いてシミュレーションを行うと,亀裂先端部の有効応力や間隙水圧は妥当な範囲に収まった。一方,大きなCTOAを与えると,進展すべき亀裂が進展しなくなるため,亀裂先端の有効応力や間隙水圧は不自然な値となることが確認された。このことから,骨格の変形特性や透水係数が与えられれば,亀裂進展時のCTOAの値には一定の上限が課せられることが明らかになった。第二に,圧縮荷重によって圧密した直方体状の粘質土試料の中央部に切り欠けを設けた後,両側面をセラミックフィルターに圧着し,フィルターに負圧を与えることにより試料の水分を吸引して亀裂を進展させた。亀裂の進展はデジタルカメラでインターバル撮影し,得られた亀裂画像を解析して亀裂進展時のCTOAを求めた。また上記試験と同一サクションに調整した直方体試料の中央に切り欠けを設けた後,曲げ荷重により亀裂を進展させ(3点曲げ試験),CTOAを同様の画像解析により測定した。その結果,水分の吸引によって誘起された亀裂進展時のCTOAは,曲げ試験によって得られた値の約1.5培程度となり完全には一致しなかった。曲げ試験によるCTOA測定のあり方(変形速度依存性)や,現象の3次元性(試料内部での塑性拘束)の取り扱いに課題を残した。粘土質水田において、乾燥亀裂の下方への進展は圃場の排水性に大きな影響を及ぼしている。特に暗渠へ向かう水の流れは、数センチの亀裂の深度の違いに大きく左右されることが明らかとなっている。本研究では、このような亀裂の重要性を鑑み、土・水連成解析と破壊力学の知見を応用した水田における亀裂進展シミュレーションモデルの開発を進めてきた。本年度は、既に作成した亀裂進展シミュレーションモデルの有効性を評価するために、粘土質水田において、乾燥時の亀裂の進展とそのときのマトリックポテンシャルの鉛直分布の変化を実測した。また、数値シミュレーションに必要な土壌各層の収縮特性を測定した。2点の亀裂調査点における本年度夏期の亀裂観測直前のマトリックポテンシャルの最低値は、15cm深で-72kPaおよび-64kPa、20cm深で-52kPaおよび51kPa、30cm深で-25kPaおよび-33kPaであった。このとき、亀裂は深いもので30cm、浅いものでも25cmに達していた。このような条件下での亀裂進展を昨年構築したシミュレーションモデルを用いて再現することを試みた。
関節リウマチの発症早期に対する治療法としての温熱療法の開発に関する検討

従来、抗悪性腫瘍に対する治療法として確立された温熱療法であるが、温熱による熱ショック蛋白質(heat shock protein : HSP)誘導に着目し、本効果を良性疾患である関節リウマチに応用することを目的とした研究である。培養細胞および組織レベルにおいてHSPが誘導されることをラット、マウス、ヒトにおいて証明し、さらに温熱による抗炎症作用のメカニズムにHSP誘導が関与していることを明らかにした。細胞レベルでの抗炎症作用としては、炎症反応関連遺伝子発現に重要な転写因子であるnuclearfactor-kB (NF-kB)の活性化抑制にあることを解明した。マウス関節炎モデルとしては、コラーゲン惹起免疫関節炎モデルを用いて温熱療法の有効性を確認し、そのメカニズムについても検討した。さらに、ヒトを対象とした臨床試験を実施するために、遠赤外線による全身温熱療法機器を開発、試作し、基礎的検討を終了することができた。以上のように、温熱療法に抗炎症作用があることは、細胞、組織、動物において確認することが出来たわけであり、今後、ヒトへの臨床応用が期待される結果を得ることができた。関節リウマチに対して行われている代表的な物理療法のひとつに温熱療法がある。この温熱療法は、関節の疼痛やこわばり感の緩和を目的としている。一方、われわれは、最近、温熱療法が抗炎症作用を有することを明らかとした。本研究では、関節リウマチの発症早期に対する強力な治療法としての温熱療法の開発を目的とした研究を実施した。1.温熱療法の抗炎症作用についてのin vitroでの検討ヒト血管内皮細胞やヒト末梢血単核球などの各種炎症細胞モデルを用いて、温熱処理の抗炎症作用を検討し、細胞接着分子の発現や炎症性サイトカインの産生の抑制を解する抗炎症作用を確認した。その抑制メカニズムについて、とくに、炎症の場で重要な転写因子Nuclear Factor-κBと温熱処理後誘導される熱ショック蛋白との相互作用を明らかにした。2.関節リウマチ患者の滑膜組織の構成細胞に対する温熱療法の抗炎症作用についての検討滑膜組織の構成細胞を浮遊細胞として採取して、各構成細胞(T-リンパ球、マクロファージ、繊維芽細胞、好中球など)に分離した上で、温熱処理が、各細胞群の炎症性サイトカインやMatrix Metalloproteasesの産生に及ぼす影響とそのメカニズムを検討中である。3.関節リウマチモデルマウスでの温熱療法の有効性の検討関節リウマチモデルマウスとして、コラーゲン誘発実験的関節炎モデルを用いてその実験系を確立した。さらに、温熱療法の治療効果を検討し、その有効性を確認した。現在その詳細を検討し、温熱により誘導される熱ショック蛋白がこれら抗炎症作用の中心であることを明らかにしつつある。細胞レベルでの抗炎症作用としては、炎症反応関連遺伝子発現に重要な転写因子であるnuclearfactor-kB(NF-kB)の活性化抑制にあることを解明した。
マウス遅発性脊髄障害への硫化水素吸入の治療効果

生体内ガス分子のひとつであり、かつ抗炎症効果、ラジカルスカベンジング効果、抗アポトーシス効果を有する硫化水素を用い、その吸入療法(80ppm x 5時間)による脊髄虚血後遅発性対麻痺に対する神経保護効果を検討した。その結果、脊髄虚血後72時間目の神経学的所見において、脊髄虚血後24時間目に硫化水素吸入療法を開始した吸入群で、対照群と比較し有意に改善効果が認められた(67%のマウスで遅発性対麻痺発生がなかった)。さらに、組織学的所見においても脊髄前角における正常神経細胞数が有意に多かった。また、免疫組織学的所見でも活性型カスパーゼ3の発現が有意に抑制されていた。これらのことから、硫化水素吸入療法は抗アポトーシス効果を発揮し、マウス脊髄虚血後遅発性対麻痺の発症を抑えることが明らかとなった。【具体的内容】マウス大動脈遮断モデルを用い硫化水素吸入療法による虚血性脊髄障害への効果を検討した。全身麻酔下に大動脈弓部を5分間遮断し脊髄虚血モデルを作成した。このモデルは虚血後24時間では歩行可能であるにもかかわらず48時間目には全てのマウスが対麻痺となる遅発性対麻痺モデルである。硫化水素吸入療法(H2S群)は、吸入チャンバー内(空気+硫化水素80ppm)で自発呼吸下に虚血後23時間目から5時間行った。非吸入群(C群)は空気下の自発呼吸とした。その結果、C群では10匹中10匹が48時間後に遅発性対麻痺を発症したが、H2S群では10匹中6匹が歩行可能であった。病理組織学的検討では、C群では虚血後48時間目に脊髄前角に空砲を伴う運動神経細胞損傷が認められたが、H2S群で歩行可能マウス脊髄では、脊髄前角の構造が保たれていた。さらに、活性型カスパーゼ3に対する免疫染色では、C群で虚血後30時間目から脊髄運動神経細胞が活性型カスパーゼ3陽性となったが、H2S群では活性型カスパーゼ3陽性細胞は有意に少なかった。【意義および重要性】本年度の研究結果では、脊髄虚血24時間後から80ppmの硫化水素を5時間吸入させることにより運動機能、病理組織にその予後を改善することが明らかとなった。そのメカニズムとして、活性型カスパーゼ3発現を抑制していることから、直接的あるいは間接的に虚血・再灌流後の神経細胞アポトーシスを抑制する可能性が示唆された。本研究結果の重要性には2点ある。まず、虚血再灌流の24時間後からの硫化水素吸入療法が神経細胞保護効果を示したことである。さらに、硫化水素吸入により神経細胞アポトーシスを抑制できて点です。今後、その詳細な機序に対して分子生物学的検討を行う予定である。【具体的内容】マウス大動脈遮断モデルを用い硫化水素吸入療法による虚血性脊髄障害への神経細胞保護効果に対するメカニズムについて誘導型-酸化窒素合成酵素(iNos)の関与について検討した。それぞれの群でWild typeとiNOSノックアウトマウスを用い実験を行った。その結果、C群ではWild typeおよびiNOSノックアウトマウスともに10匹中10匹が48時間後に遅発性対麻痺を発症した。H2S群では、Wild typeで12匹中7匹が歩行可能であったが、iNOSノックアウトマウスでは12匹中12匹が遅発性対麻痺を来した。【意義および重要性】本年度の研究結果では、Wild typeマウスでは脊髄虚血24時間後から80ppmの硫化水素を5時間吸入させることにより運動機能、病理組織にその予後を改善するが、iNOSノックアウトマウスでは硫化水素吸入による神経細胞保護効果が消失した。本研究結果の重要性は、硫化水素吸入に伴う脊髄運動神経保護効果には、iNOSの存在が重要であるという点である。今後、その詳細な機序に対して免疫組織学的、分子生物学的および網羅的遺伝子解析を行う予定である。硫化水素吸入による脊髄虚血後遅発性対麻痺モデルに対する脊髄神経保護効果、ならびにそのメカニズムについて検討する目的で平成24年度研究を行った。