hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海洋深層水取水管の流力弾性問題に関する研究

本研究では洋上で大規模に海洋深層水を取水する施設を想定し,そこで用いられる海洋深層水取水管の挙動を精度良く推定することを目的としており,水槽実験,理論解析,数値シミュレーション等を行うことにより,取水管の渦励振動現象の発生条件判定方法を検討するとともに,取水管エレメントに働く流体力を精度良く推定するための数値モデルを開発し,管内流の影響も含めた取水管の挙動について考察した.フレキシブルパイプ模型を用いた静水中の強制を行った結果,非対称な渦放出に伴い強制外力方向に対して垂直に運動する現象が現れる環境条件が実験データベースより判定可能であること,パイプ下端の軌跡が8の字を描くときに振動振幅が大きくなることなどを明らかにした.剛体円柱を用いた水槽実験の結果を基に,取水管の各エレメントから放出される渦の位置を,そのエレメントの揺れ止まりからの移動距離の関数として表し,瞬時瞬時の流体力を推定することのできる双子渦モデルを開発した.また,このモデルを用いて取水管全体の挙動を推定した結果,Kc=8以下で精度良く挙動推定ができることを明らかにするとともに,このモデルが非制限的な運動にも対応できることを確かめた.海洋深層水取水管の挙動解析を行う場合に重要となる管内流の影響について,理論的,実験的に調べた結果,管内流の影響は,内部流体の運動量の変化,管内摩擦,内部圧力の減少,取水口における反力の4つの硬化によって表されることを明らかにした.また,その内取水口における反力の影響が最も大きいことを確かめた.本研究では洋上で大規模に海洋深層水を取水する施設を想定し,そこで用いられる海洋深層水取水管の挙動を精度良く推定することを目的としており,水槽実験,理論解析,数値シミュレーション等を行うことにより,取水管の渦励振動現象の発生条件判定方法を検討するとともに,取水管エレメントに働く流体力を精度良く推定するための数値モデルを開発し,管内流の影響も含めた取水管の挙動について考察した.フレキシブルパイプ模型を用いた静水中の強制を行った結果,非対称な渦放出に伴い強制外力方向に対して垂直に運動する現象が現れる環境条件が実験データベースより判定可能であること,パイプ下端の軌跡が8の字を描くときに振動振幅が大きくなることなどを明らかにした.剛体円柱を用いた水槽実験の結果を基に,取水管の各エレメントから放出される渦の位置を,そのエレメントの揺れ止まりからの移動距離の関数として表し,瞬時瞬時の流体力を推定することのできる双子渦モデルを開発した.また,このモデルを用いて取水管全体の挙動を推定した結果,Kc=8以下で精度良く挙動推定ができることを明らかにするとともに,このモデルが非制限的な運動にも対応できることを確かめた.海洋深層水取水管の挙動解析を行う場合に重要となる管内流の影響について,理論的,実験的に調べた結果,管内流の影響は,内部流体の運動量の変化,管内摩擦,内部圧力の減少,取水口における反力の4つの硬化によって表されることを明らかにした.また,その内取水口における反力の影響が最も大きいことを確かめた.本研究では,(1)定常流中および振動流中における渦励振動問題に関する研究の現状と問題点の整理,(2)内部を水が流れる水中線状構造物の模型実験,を行った.(1)定常流中および振動流中における渦励振動問題に関する研究の現状と問題点の整理定常流中および振動流中における渦励振動問題に関する研究の現状をレビューし,動的挙動の解析における間題点の整理を行った.その結果,定常流中の渦励振動に対しては,ハンギングオフ状態での3次元運動に関する現象の解明が遅れていること,渦励振動軽減装置についてはアイデアの提案段階のものが多く,系統的な流体力学的解析はあまり行われていないことなどがわかった.また,振動流中の渦励振動に対しては,現象そのものが体系的に整理されておらず、推定制度の良い流体力解析方法も開発されていないことがわかった.(2)内部を水が流れる水中線状構造物の模型実験深層水取水管の特徴である大量の水が管内を流れる問題を明らかにするために,定常流中および波浪中における流れの可視化,流体力の計測,構造物の挙動の計測を行った.その結果,管内流の影響としては,内部流体の摩擦、内部流体が曲率のある経路を流れるときの運動量変化,内部流体が管とともに運動するときのコリオリの効果,取水口での反力が挙げられ,そのうち取水口での反力が最も重要であることがわかった.また,渦励振動問題については,特にハンギングオフ状態での取水管の特徴として,8字運動するモードが卓越して現れることがわかった.本研究では,洋上で大規模に海洋深層水を取水する施設を想定し,そこで用いられる海洋深層水取水管の挙動を精度良く推定することを目的としており,水槽実験,理論解析,数値シミュレーション等を行うことにより,取水管の渦励振動現象の発生条件判定方法を検討するとともに,取水管エレメントに働く流体力を精度良く推定するための数値モデルを開発し,管内流の影響も含めた取水管の挙動について考察した.フレキシブルパイプ模型を用いた静水中の強制動揺実験を行った結果,非対称な渦放出に伴い強制外力方向に対して垂直に運動する現象が現れる環境条件が実験データベースより判定可能であること,パイプ下端の軌跡が8の字を描くときに振動振幅が大きくなることなどを明らかにした.剛体円柱を用いた水槽実験の結果を基に,取水管の各エレメントから放出される渦の位置を,そのエレメントの揺れ止まりからの移動距離の関数として表し,瞬時瞬時の流体力を推定することのできる双子渦モデルを開発した.

また,このモデルを用いて取水管全体の挙動を推定した結果,Kc=8以下で精度良く挙動推定ができることを明らかにするとともに,このモデルが非制限的な運動にも対応できることを確かめた.海洋深層水取水管の挙動解析を行う場合に重要となる管内流の影響について,理論的,実験的に調べた結果,管内流の影響は,内部流体の運動量の変化,管内摩擦,内部圧力の減少,取水口における反力の4つの硬化によって表されることを明らかにした.また,その内取水口における反力の影響が最も大きいことを確かめた.
眼内血管新生における血管新生抑制因子の発現解析と治療効果の検討

ヒトコンドロモジュリン(ChM-I)とヒトテノモジュリン(TeM)の相同するC末端機能ドメインcDNA断片を哺乳類細胞に分泌型タンパクとして遺伝子発現する発現ベクターに遺伝子組み換え操作にて組み込みを行い、さらにアデノウイルス用のベクター構築を行った。ヒト血管内皮細胞ならびにヒト網膜色素上皮細胞を培養し、ウイルス感染による遺伝子導入を行い、血管内皮細胞に対するヒトChM-IおよびヒトTeM相同機能ドメインの血管新生抑制効果を証明した。ヒトChM-IおよびヒトTeM機能ドメインは、2種の血管内皮細胞において、細胞の接着作用、遊走作用、細胞増殖、さらに管腔形成、すなわち血管新生に関わる細胞機能の各段階をすべて有意に抑制した。とりわけ、ヴィトロネクチンを介する細胞接着を抑制することにより、ヒトChM-IおよびヒトTeMと細胞接着因子であるインテグリンファミリ(αvβ3、αvβ5)との関わりが示唆された。また、ウイルスベクターによって血管内皮細胞ならびに網膜色素上皮細胞に遺伝子導入して得られた培養上清を用いて、血管内皮細胞の増殖抑制、遊走抑制効果を測定したところ、両細胞から得られた培養上清とも抑制効果を有する効果が得られた。動物実験においては、メラノーマ腫瘍株にヒトChM-IおよびヒトTeM機能ドメインを自己分泌する遺伝子導入を行い、マウス皮下に注入する腫瘍増殖実験では、遺伝子導入された腫瘍株での固形腫瘍の増殖が著しく抑制され、また、各腫瘍塊における血管侵入数の評価において、上記分泌タンパクの遺伝子導入株では、侵入した新生血管数が有意に減少した。ヒトコンドロモジュリン(ChM-I)とヒトテノモジュリン(TeM)の相同するC末端機能ドメインcDNA断片を哺乳類細胞に分泌型タンパクとして遺伝子発現する発現ベクターに遺伝子組み換え換作にて組み込みを行い、さらにアデノウイルス用のベクター構築を行った。また、動物実験においては、メラノーマ腫瘍株にヒトChM-IおよびヒトTeM機能ドメインを自己分泌する遺伝子導入を行い、マウス皮下に注入する腫瘍増殖実験では、遺伝子導入された腫瘍株での固形腫瘍の増殖が著しく抑制され。また、各腫瘍塊における血管侵入数の評価において、上記分泌タンパクの遺伝子導入株では、侵入した新生血管数が有意に減少した。このことから、ヒトChM-IとヒトTeMは新生血管の抑制を介する抗腫瘍効果を有することが示唆された。以上のことから、ヒトChM-IとヒトTeMの相同する機能ドメインを含む低分子分泌型ペプチドを作成することにより、新たな抗腫瘍薬、抗血管新生薬の開発の可能性が示唆された。前年度で構築に成功したヒトコンドロモジュリン(ChM-I)とヒトテノモジュリン(TeM)の相同するC末端機能ドメインcDNA断片を分泌型タンパクとして遺伝子発現する発現ベクターに遺伝子組み換え操作にて組み込みを行い、アデノウイルスベクターとして哺乳類動物細胞に遺伝子導入するベクターをP2レベルで作成を完了した。ウイルスベクターによって血管内皮細胞ならびに網膜色素上皮細胞に遺伝子導入して得られた培養上清を用いて、血管内皮細胞の増殖抑制、遊走抑制効果を測定したところ、両細胞から得られた培養上清とも抑制効果を有する効果が得られた。また、両細胞から得られた培養上清とも、ChM-IならびにTeMのC末端ペプチドを分泌タンパクとして含有することをウエスタンブロット法にて確認できた。

また遺伝子導入した血管内皮細胞をラミニン、ビトロネクチン、タイプIコラーゲンでコートした培養ディッシュならびにダブルチャンバにて接着および遊走実験を行ったところ、ビトロネクチンコート上で有意に接着と遊走が抑制されたことから、インテグリリンαvβ3ならびにαvβ5ファミリーの関与が示唆されました。しかし、細胞表面での両インテグリリンの発現変化を見出すことはできなかった。なお、現段階において、ChM-IならびにTeMを検出する抗体の作成には至ったが、ELISA法による検出感度レベルの精度には至っておらず、患者からの検体採取による硝子体内ならびに前房水内でのChM-IならびにTeMのタンパク発現レベルの測定にまだ着手しておりません。ただし、糖尿病網膜症患者のうち、血管新生を併発する症例における抗血管内皮増殖因子(VEGF)に対する中和抗体の硝子体内投与により、著しく新生血管の活動性が抑制されたことから、VEGF刺激に対するChM-IならびにTeMの抑制効果を評価することで、眼内でのChM-IならびにTeMの有効性が示唆されている。
海溝型巨大地震の地震動特性と耐震設計への応用

1.チリ中央部の強震観測点の地盤調査1985年チリ地震(M7.8)の際に良好な記録が得られたチリ中央部の強震観測点9地点において常時微動のアレイ測定を行った.アレイ測定から表面波の伝播速度を求め、これを満足するような地盤の速度構造を逆問題として解いた.その結果、各地点で深さ30m100mに至るS波速度構造が推定できた.また,強震アレイ観測が展開されているサンチアゴ市内での地盤性状を把握するために約30地点で常時微動測定を行った.その結果、常時微動の水平・上下スペクトル比で強震記録にみられる地盤特性をおおむね説明できること、常時微動の長周期領域でみられる卓越周期と基盤深度の間には強い相関がみられ堆積地盤のS波速度が600m/s程度と推定されること、などを確認した.これらの結果と既存の地盤調査とあわせて、チリ中央部の強震観測地点の地盤情報を充実させた.2.強震記録のデータベース化海溝型地震による強震記録を中心とした強震記録のデータベースを作成した.チリの強震記録については、1985年チリ地震(M7.8)の強震記録を中心として100成分強のデータを収集し、整理した.日本の強震記録については、1994年北海道東方沖地震(M8.1),1994年三陸はるか沖地震(M7.6),1995年兵庫県南部地震(M7.2)など最新の地震による強震記録を含む500成分を越えるデータを収集・整理した.これらにより,地震規模の大きな地震の記録や電源近傍での記録が充実した強震記録のデータベースが作成できた.同時に、わが国の強震観測点の地盤情報および上述のチリ中央部の強震観測点の地盤情報のデータベースも作成した.3.海溝型巨大地震の強震記録の解析作製したデータベースを利用して,地震動の基本的な特性値として,最大振幅,応答スペクトルなどを計算し,これらの特性と地盤条件、電源距離、電源メカニズムとの関係について検討した.その結果,(1)周期が長くなる程地盤条件の影響をより強く受け、地盤の平均S波速度で地盤の影響を簡便かつ定量的に評価できること,(2)電源深さが深くなる程,振幅が大きくなり、輝源での応力降下量が振幅に及ぼす影響が大きいこと、(3)海洋プレートでの地震の方が大陸プレートでの地震よりも振幅が大きくなり、テクトニックな環境が振幅に及ぼす影響が無視できないこと、(4)カルフォルニアの地震による結果は大陸プレートでの地震による結果とはほぼ一致するが、海洋プレートでの地震による結果とはあまりよく対応しないこと、(5)振幅のマグニチュード依存性は周期が長くなる程強いこと、(6)海洋プレートでの地震の場合には距離減衰が小さい場合があること、が指摘できた.4.海溝型巨大地震の地震動の特性評価上述の結果を踏まえて、海洋型巨大地震の地震動特性の内、最大加速度および最大速度の簡便な予測式を提案した.予測式では、地震規模、断層距離、震源深さ、地盤の平均S波速度をパラメータとした.得られた結果は、震源深さの影響が大きく、震源の深い地震については従来の距離減衰式では過小評価することがわかった.また,海溝型巨大地震を対象として入力地震動を設定する場合の注意点として、(1)カリフォルニアの地震による結果をそのまま用いると過小評価する恐れが強いこと、(2)長周期成分が卓越しやすく、その結果地盤の影響を強く受けやすくなり、地盤の評価がより重要になること、(3)震源が深い地震でも、大きな地震動を生ずる恐れがあり、無視できないこと、(4)距離減衰が小さいために距離が離れていても振幅がほとんど減衰しない場合があること、を指摘した.1.チリ中央部の強震観測点の地盤調査1985年チリ地震(M7.8)の際に良好な記録が得られたチリ中央部の強震観測点9地点において常時微動のアレイ測定を行った.アレイ測定から表面波の伝播速度を求め、これを満足するような地盤の速度構造を逆問題として解いた.その結果、各地点で深さ30m100mに至るS波速度構造が推定できた.また,強震アレイ観測が展開されているサンチアゴ市内での地盤性状を把握するために約30地点で常時微動測定を行った.その結果、常時微動の水平・上下スペクトル比で強震記録にみられる地盤特性をおおむね説明できること、常時微動の長周期領域でみられる卓越周期と基盤深度の間には強い相関がみられ堆積地盤のS波速度が600m/s程度と推定されること、などを確認した.これらの結果と既存の地盤調査とあわせて、チリ中央部の強震観測地点の地盤情報を充実させた.2.強震記録のデータベース化海溝型地震による強震記録を中心とした強震記録のデータベースを作成した.チリの強震記録については、1985年チリ地震(M7.8)の強震記録を中心として100成分強のデータを収集し、整理した.日本の強震記録については、1994年北海道東方沖地震(M8.1),1994年三陸はるか沖地震(M7.6),1995年兵庫県南部地震(M7.2)など最新の地震による強震記録を含む500成分を越えるデータを収集・整理した.これらにより,地震規模の大きな地震の記録や電源近傍での記録が充実した強震記録のデータベースが作成できた.同時に、わが国の強震観測点の地盤情報および上述のチリ中央部の強震観測点の地盤情報のデータベースも作成した.

3.海溝型巨大地震の強震記録の解析作製したデータベースを利用して,地震動の基本的な特性値として,最大振幅,応答スペクトルなどを計算し,これらの特性と地盤条件、電源距離、電源メカニズムとの関係について検討した.その結果,(1)周期が長くなる程地盤条件の影響をより強く受け、地盤の平均S波速度で地盤の影響を簡便かつ定量的に評価できること,(2)電源深さが深くなる程,振幅が大きくなり、輝源での応力降下量が振幅に及ぼす影響が大きいこと、(3)海洋プレートでの地震の方が大陸プレートでの地震よりも振幅が大きくなり、テクトニックな環境が振幅に及ぼす影響が無視できないこと、(4)カルフォルニアの地震による結果は大陸プレートでの地震による結果とはほぼ一致するが、海洋プレートでの地震による結果とはあまりよく対応しないこと、(5)振幅のマグニチュード依存性は周期が長くなる程強いこと、(6)海洋プレートでの地震の場合には距離減衰が小さい場合があること、が指摘できた.4.海溝型巨大地震の地震動の特性評価上述の結果を踏まえて、海洋型巨大地震の地震動特性の内、最大加速度および最大速度の簡便な予測式を提案した.予測式では、地震規模、断層距離、震源深さ、地盤の平均S波速度をパラメータとした.得られた結果は、震源深さの影響が大きく、震源の深い地震については従来の距離減衰式では過小評価することがわかった.また,海溝型巨大地震を対象として入力地震動を設定する場合の注意点として、(1)カリフォルニアの地震による結果をそのまま用いると過小評価する恐れが強いこと、(2)長周期成分が卓越しやすく、その結果地盤の影響を強く受けやすくなり、地盤の評価がより重要になること、(3)震源が深い地震でも、大きな地震動を生ずる恐れがあり、無視できないこと、(4)距離減衰が小さいために距離が離れていても振幅がほとんど減衰しない場合があること、を指摘した.強震観測点の地盤調査については,チリ中央部にある強震観測点のうち,強い地盤特性を持つと考えられる比較的軟弱な観測点を含む数地点で,常時微動のアレイ測定を行い,深層地盤のS波速度構造の推定を行った.各地点の地質学的な情報や既往の研究成果の収集も進めた.また,1993年釧路沖地震の強震記録が得られた観測点の地盤調査も行った.強震記録のデータベース化については,1945年から1981年までチリで得られた強震記録36成分について整理し,データベースとしてまとめた.日本の海溝型地震による強震記録の収集を運輸省港湾技術研究所,建設省建築研究所,京都大学,北海道大学,東京大学など各機関の協力により進めた.その結果,北海道において1962年から1978年にかけて得られた約140成分の強震記録および1983年日本海中部地震,1987年千葉県東方沖地震などの約500成分の強震記録についてデータベース化を行った。このデータベースを用いて,地震動の最大速度振幅について計算したところ,地盤の平均S波速度が遅い観測点ほど大きな値が得られる傾向にあること,観測記録から地盤の影響を取り除いて計算された硬質地盤上での最大速度の距離減衰は非常にまとまりがよいこと,最大速度値の地震規模依存性には非線形性がみられること,最大速度値が飽和し始める距離に地震規模依存性がみられること,得られた値はカリフォルニアの地震の強震記録から期待される値に比べて有意に大きいこと,がわかった.強震観測点の地盤調査については,前年度チリ中央部の9点で行った常時微動のアレイ測定の逆解析を行い,各地点において深さ30100mまでのS波速度構造を推定した.さらに,サンチャゴ市内を中心として常時微動測定を行い,主として水平動と上下動のスペクトル比に基づいてより広域での地盤特性の調査を行った.
抗菌ペプチドカテリシジンに着目したアトピー性皮膚炎の新しい治療法の開発

本研究では抗菌ペプチドの一種であるカテリシジンがアトピー性皮膚炎(AD)の病態を改善する効果を持つか否かについて検討を行った。ADモデルNC/Ngaマウスを用いて解析を行った結果、マウスカテリシジンmCRAMPの皮膚炎およびかゆみに対する作用は認められなかったが、皮膚バリア機能を改善する作用を持つことが明らかになった。カテリシジンはフィラグリンからの天然保湿因子産生に関与するプロテアーゼの発現を上昇させることで角層水分量を増加させていることが示唆された。アトピー性皮膚炎(AD)における難治性のかゆみは、不眠や就労障害の原因となり患者のQuality of Life(QOL)を著しく障害する。AD病変部では、神経伸長因子nervegrowthfactor(NGF)の発現亢進に加えて、神経反発因子semaphorin3A(Sema3A)の発現が低下することで表皮内神経が稠密化する。この稠密化は外部からのかゆみ刺激に対する受容増加に繋がるため、ADの末梢におけるかゆみ過敏の一因であると考えられている。またAD病変部は、表皮角化細胞における抗菌ペプチドの産生が誘導されないために、易感染性である。最近、我々は表皮角化細胞におけるSema3A発現が抗菌ペプチドの一種であるカテリシジンによって増加することを見出した。そこで、本研究では抗菌ペプチドカテリシジンを用いた止痒効果と抗菌作用を有する新しいAD治療薬の開発を目指す。平成28年度は慢性ドライスキンモデルマウス(AEWマウス)のかゆみに対するカテリシジンの予防効果について検討を行った。AEWマウス作製時にカテリシジン配合軟膏を塗布した結果、対照群と比較してかゆみ行動の抑制は認められなかったが、NGFの発現低下およびバリア機能の改善(経皮水分蒸散量の減少、pHの減少、角層水分量の増加)が認められた。これらの結果から、カテリシジンはドライスキンの誘発を防ぐことが示唆された。現在、皮膚のバリア機能を正常に保つために重要なプロテアーゼやタイトジャンクション構成タンパク質等の発現を検討し、バリア機能を改善するメカニズムについて解析を行っている。平成28年度の研究では、抗菌ペプチドであるカテリシジンがバリア機能の改善効果(経皮水分蒸散量の減少、pHの減少、角層水分量の増加)を持ち、ドライスキンの誘発を防ぐことが示唆された。ほぼ予定通りに研究は進行している。平成29年度はADモデルNC/Ngaマウスに対するカテリシジンの治療効果について検討を行った。皮膚炎スコアが5以上のADモデルNC/Ngaマウスにカテリシジン配合軟膏を塗布した結果、対照群と比較して皮膚炎およびかゆみ行動の抑制は認められなかったが、バリア機能の改善(角層水分量の増加)が認められた。皮膚のバリア機能を正常に保つには、フィラグリンからの天然保湿因子産生に関与するプロテアーゼの発現が重要であり、それらの異常がドライスキンやADの発症素因の1つになる。そこで、皮膚におけるそれらのプロテアーゼ(ブレオマイシン水解酵素、カルパインI、カスパーゼ14)の発現を定量的Real-time PCRにより比較した結果、ブレオマイシン水解酵素およびカルパインIの発現がカテリシジン配合軟膏塗布群において増加していた。これらの結果から、カテリシジンはドライスキン改善効果を持つことが示唆された。平成28年度の研究成果を踏まえ、平成29年度はADモデルNC/Ngaマウスのかゆみに対するカテリシジンの治療効果について検討を行う予定である。本研究成果の学会発表および論文化も予定している。かゆみ科学、分子発生学必要に応じて研究費を執行したため、端数が生じた。上記の理由から、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め当初予定通りの計画を進める。
慢性副鼻腔炎の白血球浸潤の解明と炎症との関連性の解析

好中球の浸潤と好酸球の浸潤部位において、炎症の初期段階で起きていると考えられるrolling、接着に関与する接着分子を解明し、それらの違いがわかれば発症要因の解明や今後の治療方法の解明の一助となる可能性があると考えた。また、ECRSのポリープ中に高発現するタンパク質が炎症のどの機序に関与するかを解明することで、易再発性、炎症の遷延化、治療抵抗性といった特徴的な病態の解明につながる可能性がある。さらにそれらの情報が臨床重症度と相関しているかを探ることで、治療戦略が広がる可能性もある。
化合物半導体ナノワイヤ気相選択成長における積層不整の第一原理的研究と結晶構造制御

化合物半導体ナノワイヤに用いられる代表的な物質であるガリウムヒ素について、主要な結晶面(-1-1-1)の原子構造を、第一原理計算とよばれる極めて信頼性の高い理論計算手法により検証した。高温相(√19×√19相)に関する従来の構造に誤りがあることを指摘し、エネルギー安定性の観点から正しい構造を提唱した。さらに、このような表面構造や、他のV族元素の吸着がガリウムヒ素のナノ構造に大きく影響する可能性を予測した。近年、ナノメートルオーダーの微細な構造をもつ物質(ナノ物質)が新たな電子デバイス・エネルギー変換材料として注目されている。本研究では、半導体ナノワイヤなど新規ナノ物質の結晶構造を制御する指針を得るため、原子レベル表面構造とナノ構造の関係を、非経験的な理論計算(第一原理全エネルギー計算)により明らかにする。今年度は、V族元素(アンチモン、ビスマス)の表面吸着を通して原子層積層欠陥を制御する可能性について、代表的な化合物半導体であるGaAsを例に調べた。まず、結晶中と同じ周期を持つ理想的な(-1-1-1)表面(1×1相)について、表面のヒ素原子をSbやBiに置換した場合、積層欠陥の入りやすさがどのように変化するのか、全エネルギー計算により調べた。その結果、As、Sb、Biの順に原子半径が大きくなるに従って、積層欠陥が入りやすくなることがわかった。特に、SbやBiでは、正常な結晶構造よりも積層欠陥が安定になるという逆転がみられた。これは、原子半径と積層欠陥の安定性との深い関連性を示しており、ナノ構造制御の観点から興味深い結果である。反対に、2×2トライマー終端構造などで吸着ヒ素をSbやBiに置換した場合、積層欠陥の安定性にはほとんど変化が見られなかった。吸着原子は結晶格子の外側に位置するので、原子の大きさからくる効果が小さくなったものと考えられる。以上の結果から、V族元素吸着が積層欠陥に与える影響は、吸着により生じる表面構造により大きく変わるので、V族元素の導入方法を詳細に検討することが、構造制御を実現する上で重要になると考えられる。
結晶化のメソタイムスケールダイナミクス

液体から固体への相転移においては、運動のタイムスケールと秩序の距離相関が大幅に変化する。相転移の進行する界面では、タイムスケールの大きなギャップを埋めるような、中間的時間尺度の特徴的な運動や、中間的距離尺度の特徴的な空間構造が観察される。我々は、このような中間的な尺度の空間構造を特徴付ける方法として、構造をフラグメント分割し、フラグメントのデータベースを作成して、予断なしに局所構造を識別分類する手法を研究した。過冷却水の水素結合ネットワークの構造(トポロジー)の特徴を抽出する方法として、ネットワークを多面体様フラグメント(擬多面体)に一意的に分割する手法を考案した。この手法により、結晶のような明らかな秩序構造をもっていない場合(低密度水、低密度非晶質など)でも、局所構造の特徴を直接識別分類でき、類似の相(高密度水など)と明確に区別することに成功した。この手法を、シリコンや水、あるいはメタンハイドレートの核生成と結晶化プロセスに適用することで、融液状態から、どのようにして局所的秩序が形成され、それが結晶の長距離秩序につながっていくのかを、余すところなく観察できることを示した。我々の行った過冷却水の均一核生成過程の場合、初期に出現する核は、少数種類の非晶質状のフラグメントを多く含む非晶質核であると推定された。メタン水溶液からメタンハイドレートの結晶が成長する場合には、12面体型ケージが速度論的にまず急激に増加し、あとからそれらに隣接する形で14面体型ケージがゆっくり増加することが観察された。本研究では、均一核生成結晶化の微視的過程を包括的に解明することを目標としている。前年度までの研究で、分子数512分子以下、温度230K前後、伸張された環境下で水の均一核生成を再現することができた。本年度はより精度の高い計算を目指しつつ、結晶化過程を解析する新しい手法の開発を行ってきた。水分子の運動の中から、速い「振動的」な成分をとりのぞき、本質的な構造変化を抽出する新しい手法として、水素結合の結合相手を列挙したうえで、このラベル列に対し、ある時間幅で多数決フィルタを施す、つまり、時区間内で最も長時間結合している相手を、時区間中央での結合相手とみなす、という手法を提案した。また、核生成初期に形成されていると考えられる準安定な様々な局所構造を見つけだし、分類する方法として、inexact graph matching法と非計量多次元尺度法を組み合わせた解析手法を提案した。今年度は、これまでの条件と異なる条件化での結晶化を再現することはできなかったが、より分子数の多い系で均一核生成に向かう軌道を複数えることができたので、今後、上記の解析手法を援用して詳しい解析を行う予定である。核生成が起こる前の過冷却水では、水素結合の寿命の分布は数ps数nsときわめて広くなっており、構造変化が空間的時間的に不均質に起こる。われわれはこの原因が、水素結合ネットワークの局所構造の違いにあると考え、局所ネットワークトポロジーを比較分類する新しい手法を開発した。この手法を用い、過冷却水の水素結合ネットワークを、水十数分子からなる部分ネットワーク(フラグメント)に細分し、これらの部分ネットワーク構造の出現頻度を、核生成以前、核生成初期、結晶成長期などのさまざまな時期、あるいはさまざまな熱力学条件下で比較することにより、核生成初期に現れる非晶質的構造や、結晶成長前後でのネットワーク構造変化を詳細に調べた。その結果、核生成初期に特異的に増加するフラグメントが存在すること、そのフラグメントは既知の氷晶構造のいずれとも異なるトポロジーを持ち、長距離秩序を形成しえないこと、このフラグメントに属する水分子の結合エネルギーは、平均的に比べて3kJ/mol程度安定であることがわかった。そのようなフラグメントは核生成以前にも液体のいろんな場所に生成消滅しているが、核生成初期に、ある場所に凝集して長寿命な水素結合からなる「固い」領域を作り上げ、それを足場として内部に結晶構造が生成されることがわかった。我々は、液体から固相が均一核生成により形成される微視的過程を明らかにすることを目標としている。計算機シミュレーションによる、過冷却水からの均一核生成過程のごく初期に形成される核について、それを形成する水素結合ネットワークの部分ネットワークトポロジーを網羅的に抽出しデータベース化する手法を考案した。この手法を用いた結果、核生成の初期に、非晶質的な構造を持つ数種類のフラグメントが増加することがわかった。これらのフラグメントは、水素結合が形成する六員環のみならず、五員環や七員環をふくんでいるものの、結合角が正四面体型に近いために、単体では結晶のフラグメントと同等に安定な構造であるが、結晶のような長距離秩序を形成することはできないため、核生成の初期、あるいは固液界面に特有の過渡的な構造であると考えられる。過冷却水とよくにた温度密度特性を示す過冷却液体Siのシミュレーションを行い、液液相転移の再現、均一核生成から結晶化に至る過程で生まれる局所構造の詳細な解析を行った。水の場合とはちがい、過冷却液体シリコンにはすでに結晶様構造のフラグメントが多数存在し、結晶化はそれらを核として進行することがわかった。また、モデルシリコン原子の相互作用パラメータを人為的に変化させたところ、わずかな変化で液液転移温度は大きく変動することがわかった。このことは、Siの(おそらくは水も)液液共存温度がきわめて微妙なバランスの上に成り立っていることを示唆している。

相転移の進行する界面では、タイムスケールの大きなギャップを埋めるような、中間的時間尺度の特徴的な運動や、中間的距離尺度の特徴的な空間構造が観察される。我々は、このような中間的な尺度の空間構造を特徴付ける方法として、構造をフラグメント分割し、フラグメントのデータベースを作成して、予断なしに局所構造を識別分類する手法を研究した。過冷却水の水素結合ネットワークの構造(トポロジー)の特徴を抽出する方法として、ネットワークを多面体様フラグメント(擬多面体)に一意的に分割する手法を考案した。この手法により、結晶のような明らかな秩序構造をもっていない場合(低密度水、低密度非晶質など)でも、局所構造の特徴を直接識別分類でき、類似の相(高密度水など)と明確に区別することに成功した。この手法を、シリコンや水、あるいはメタンハイドレートの核生成と結晶化プロセスに適用することで、融液状態から、どのようにして局所的秩序が形成され、それが結晶の長距離秩序につながっていくのかを、余すところなく観察できることを示した。我々の行った過冷却水の均一核生成過程の場合、初期に出現する核は、少数種類の非晶質状のフラグメントを多く含む非晶質核であると推定された。メタン水溶液からメタンハイドレートの結晶が成長する場合には、12面体型ケージが速度論的にまず急激に増加し、あとからそれらに隣接する形で14面体型ケージがゆっくり増加することが観察された。
内在性水素生産複合微生物系による牛糞バイオマスからの水素エネルギー回収法の研究

種菌を添加せずに牛糞内在性の水素生産細菌を活用した乾式牛糞水素発酵では最適発酵温度が60度であることを明らかにして、その発酵温度において700mL-水素/kg-牛糞の水素が発生した。また、牛糞から集積された高度好熱嫌気性の水素生産細菌群(最適増殖温度>65度)は連続培養系において、非常に高い水素発生収率(3.32mol/mol-グルコース)を示すことが判明し、特異な代謝特性を持つことが分った。近年の資源循環・環境負荷低減に向けた取組から、牛糞なのどの廃棄物系バイオマスから資源・エネルギー回収の重要性が高まっている。本課題は新しい資源回収法として、牛糞から水素回収(水素発酵)法の研究が目的である。地球温暖化に対する懸念から新しいエネルギー生産技術として、微生物を利用した水素発酵が注目されている。水素は、燃料電池の燃料として利用した場合、水のみを発生するクリーンなエネルギー源である。牛糞は、発酵原料としての有機物を含有している。更に、牛糞には多種多様な水素生産細菌群が元々存在している。本課題は、その内在性水素生産細菌群に初めて着目・利用して、新しい水素発酵法の検討と菌叢解析を含む水素生産メカニズム解明が目的である。本年度は、牛糞に水などを一切添加せず低い水分状態でそのまま発酵させる、所謂、乾式発酵と呼ばれている方式での水素発酵を検討した。また、その発酵に関連した菌叢変移をDGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)法で解析した。200gの無希釈牛糞(TS=15%)を625mLのガラス容器に投入して、ガス層を窒素に置換・密閉後、37°Cから75°Cで嫌気培養して水素発生量を定量した。その結果、牛糞乾式発酵の至適温度は60°Cであることが分かった。その60°C乾式発酵の糞から水溶性副産物を抽出し、それをガスクロで解析した。その結果、60°C牛糞乾式発酵の水溶性副産物として主に酢酸と酪酸が生成されていた。60°C発酵後と発酵前の牛糞からDNAを抽出して、一般細菌用のプライマー(GC-357F,517R)を用いて16S遺伝子のV3領域をPCR増幅した。そのPCR産物をDGGE法で解析した。その結果、水素生産菌であるClostridium cellulosiに類似した細菌が検出され、水素生産に関与する可能性が示唆された。Colstridium cellulosiは、その名の様にセルロースを分解して生育する嫌気性好熱細菌である。従って、その検出された細菌は、牛糞中の繊維分を分解して水素を発生させていると考えられる。また、本乾式発酵は繊維分解の結果、固形分が低減され牛糞処理にも貢献できると期待される。これまでの研究から牛糞に元々内在している水素生産細菌を利用して水素発酵が可能であり、その水素発生の温度ピークは60°Cと75°Cに2つ存在することを明らかにした。そこで牛糞を種汚泥、グルコースを基質とした集積培養を60°Cと75°Cで試みて、集積される細菌種の菌叢とその水素発酵特性を解析した。乳牛の糞と尿を混合して蒸留水で希釈したスラリーを調整した。そのスラリーを60°Cと75°Cで前培養を4日間行った。その後、グルコースを基質とした人工培地で5-6回の連続バッチ培養(2日間間隔)で集積培養した。その60°Cと75°C培養で集積された細菌群のDGGE解析の結果、60°C培養では一本のバンド、75°C培養では3本のバントに集積されていた。DGGEバント解析の結果、60°Cと75°C培養ではそれぞれThermoanaerobacterium thermosaccharolyticumとCaldanaerobacter subterraneusに高い相同性を示す細菌が優占化していることが分かった。リアクター体積当りの水素発生量(mmol/L)は60°Cと75°C培養で差はなかったが、菌体当りの水素発生量(mmol/g-VSS)は75°C培養の方が多かった。グルコース分解率は、60°C培養の方が高かった。グルコース1モル当りの水素発生量(水素収率、mol/mol-glucose)は、75°C培養の方が高く、2.65であった。この収率は、報告されている値と比較して高く、本研究条件では、高度高温条件は高収率な水素発生に有利であると考えられた。中温菌や至適増殖温度を45-60°Cに持つ中度好熱嫌気性細菌による水素発酵は、様々な研究例が報告されている。しかし、至適増殖温度が65°C以上に持つ高度好熱細菌の発酵特性は殆ど研究されていない。これまでの研究から、牛フンに高度好熱細菌が存在している知見を既に得ている。

そこで、その細菌の集積培養を試みて、得られた細菌群を人工培地での連続培養系で詳細に検討して、高度好熱細菌群の代謝特性を解明することを目的とした。牛フンから75°Cで嫌気的な連続バッチ培養で集積された高度好細菌群を使用した。グルコース(5g/L)を基質とした人工培地を用いてその細菌群を完全混合槽型のバイオリアクター(培地2L,気相1L)(写真1)で嫌気的に75°Cで連続培養した。培地の滞留時間(HRT)を順次2, 1, 0.67, 3日と変化させ、発酵パターンの変化を測定した。その結果、全てのHRTで水素発生が観られ、主要な可溶性代謝産物は酢酸であった。菌体あたりの水素発生量は1.96-4.15L-H_2/g-VSS/dであった。これは、中温菌や中度好熱細菌の一般的な値である0.4-5.0L-H_2/g-VSS/dと比較して同程度である。リアクター体積当りの水素発生量は0.72-1.22L-H_2/L/dであり、一般的な値の3.0-20L-H_2/L/dと比較して低い。これは、集積された高度好熱細菌群の菌体密度が低いことを意味している。HRT 3 dで最大水素収率、3.32mol-H_2/mol-glucoseが得られた。これは、中温菌や中度好熱細菌の一般的な値である0.8-2.5mol-H_2/mol-glucoseと比較して非常に高い。集積された高度好熱細菌群はグルコースから菌体への変化率が低いために、結果としてグルコースから代謝産物への変換率が高まり、高い収率を示すと考えられる。これらの発酵特性は、高度好熱細菌独特の特徴と考えられた。これまでの研究から牛糞に元々内在している水素生産細菌を利用して水素発酵が可能であり、その水素発生の温度ピークは60°Cと75°Cに2つ存在すること、さらにその温度での発酵に関与すると推測される細菌叢をDGGE法で解析した。これらの結果から牛糞からの水素発酵の基礎条件は明らかになったものの、牛糞のみを原料とした水素発酵ではその発生量が少なく、実用化に向けた課題として残された。そこで、牛糞に含まれている水素生産細菌を種菌として活用し、食品系残渣と牛糞を混合したものを原料として用いることで水素発生量の増加を目的とした連続水素発酵の試験を実施した。食品残渣や食品加工場からの廃液を想定した模擬人工残渣(10g/Lセルロース、2.1g/Lマルトース一水和物、1.2g/L NaH_2PO_4,4.4g/L Na_2HPO_4,1g/Lペプトン、2g/L酵母抽出液)を使用した。牛糞の水素発酵では75°Cよりも60°Cの方が水素発生量が多いので、発酵温度は60°Cに設定した。滞留時間(HRT)を0.4-5.0日に設定して各HRTにおける水素発生量を定量した。HRTを1.2日に設定して連続培養を開始したところ、順調に水素の発生(230-290mL/L/d)が認められた。HRTを1.0日にシフトしたところ水素発生量(301-390mL/L/d)はやや増加した。次にHRTを5日にシフトさせたところ、水素の発生は停止してメタンが発生した。メタン菌等の水素消費細菌をウォッシュアウトするためにHRTを短く(1.0日)させたが水素発生は回復しなかった。HPTをさらに短く(0.4日)させたところ水素生産が復活した。このことより、牛糞を種汚泥とした水素発酵では水素生産細菌の増殖速度は水素消費細菌よりも早く、HRTを短く設定することで水素消費細菌を不活化させつつ水素生産が可能であることが分った。
持続型農業の生産性向上のための土壌管理に関する研究

北海道内の畑圃場を対象として土壌のWater-thermal Regimeの時間的・空間的変動性を検討するとともに、Water-thermal Regimeによる土層改良効果の評価を行い、持続型農業を展開するための土壌管理技術の確立に向けた有用な知見が得られた。積雪寒冷地の北海道に多くみられる畑圃場の問題点の一つは、水みち効果をもつマクロ間隙が非常に少ないために土壌の容気量・熱容量(地温)の確保が制限され、春期の地温上昇の遅れ、降雨や潅水後の根圏域の過湿状態の長期化などを通じて生産性が低下することである。また土壌水分環境は一筆圃場内においても時間的・空間的変動が認められ、地形や人為(土壌管理)を考慮した解析によりそれらの変動特性を明らかにした。2.土層改良工法「有材心破」の提案安定なマクロ間隙を形成する土層改良工法として、畜産・林産廃棄物のコンポスト処理産物であるバーク資材を透水ゾーンとした「有材心破」を提案した。有材心破の土層改良効果を水分動態・地温変動などから評価し、有材心破は作物生育に必要な容気量はもちろんのこと容水量や熱容量の確保も可能であること、また根圏域の拡大による土壌構造の安定化にも寄与することを明らかにした。3.持続型農業の生産性向上のための土壌管理(総括)良好な土壌環境を基盤とした持続型農業を展開するためには、作物生育に必要な容気量・容水量・熱容量が確保できる土壌構造の整備(土層改良)、保全(土壌管理)が不可欠である。大型農業機械の踏圧の影響を受けやすいマクロ間隙を保全するような土壌構造の安定化を図る上で、Conservation Tillageを基軸とした土壌管理を提案した。北海道の畑圃場において適正な土壌管理技術を確立するために、土壌中の水分・熱環境の時間的・空間的変動性について検討し、土壌の物理的機能を制御・保全する視点から土層改良について評価した。低地土および重粘土の畑圃場においては、主として耕耘作業によって形成された堅密で排水機能に劣る土層の存在のために、作物根の活動の場である根圏域が耕耘管理土層(Apl層)内に限定されかつその物理性は容気量の不足した過湿状態が長期間継続することが認められた。そしてこのことが圃場の生産性の制限因子となっているため、この土壌物理環境を改良する目的でバ-ク資材を用いた有材心破を実施した。その結果、根圏域土壌において過湿状態を呈する時間が1/41/10まで減少し、余剰水の排除と容気量の確保が容易な土壌となった。一方、保水性が問題となる粗粒火山灰上の圃場において、間隙組成に富むバ-ク資材を客土混層することで作物に必要な容水量を保持する土壌、つまり土壌の保水機能が向上したことが土壌水分の経時観測から明らかになった。また褐色森林土の改良山成畑工により造成された単一傾斜畑において土壌水分の空間変動性について検討した。土壌水分の経時測定から降雨により土壌表面に供給される水分は、土壌中の再配分の過程で傾斜方向へ水移動が生じていることが認められた。その結果としてのApl層の土壌水分の空間変動は、ある時期に採取した実測値の結果からは、標高と弱い正の相関関係にあり異方性を示していたが、変動幅が小さく特異な水移動との明瞭な関係を見いだすことはできなかった。したがって、傾斜畑における土壌水分の空間変動性を明らかにするためには、時間的な変化つまり土壌水分移動の各段階に関連付けて評価しなければならならことが今後の課題として示された。

北海道の畑圃場において、土壌の水分・温度環境の時間的・空間的変動性を検討し、土壌管理による土壌の物理的機能の制御・保全に関して、以下に要約する知見と今後の検討課題が得られた。積雪寒冷地の北海道において、土壌の物理的機能の適正な発現を阻害する主要な制限因子として「水みち効果」をもたらすマクロ間隙が極めて少ない間隙構造があげられる。そのため降雨や潅水後に根圏域の過湿状態が長時間継続し、容気量不足(飽和度0.8cm^3/cm^3以上)に起因する生育停滞や不良、生産性の低下が引起こされている。容気量不足すなわち排水不良はまた春期の地温上昇を妨げる。このような根圏域土壌の劣悪な間隙構造は主として不適切な耕耘管理によりもたらされたものであるが、容気量不足の改善方法として提案した「バーク資材利用有材心破」の有効性を水分動態や地温変動から確認した。次年度では、「有材心破」の効果を維持するための耕耘管理、「有材心破」に対応した水管理(主として施設農業)について検討する。また傾斜畑における土壌物理生の時間・空間変動について人為作用と地形作用との関係から検討した。畝立てや機械走行による人為作用により形成された畝と畝間では、土壌水分や容積密度といった土壌物理性には有意な差が認められた。そして作付け直後の5月に認められた地形の影響と思われる斜面下方に向かって容積密度が減少するといったトレンドは、時間の経過により8月の時点では見られなくなり、距離に依存しないつまり地形の影響のないランダム分布となっていた。北海道内の畑圃場を対象として土壌のWater-thermal Regimeの時間的・空間的変動性を検討するとともに、Water-thermal Regimeによる土層改良効果の評価を行い、持続型農業を展開するための土壌管理技術の確立に向けた有用な知見が得られた。積雪寒冷地の北海道に多くみられる畑圃場の問題点の一つは、水みち効果をもつマクロ間隙が非常に少ないために土壌の容気量・熱容量(地温)の確保が制限され、春期の地温上昇の遅れ、降雨や潅水後の根圏域の過湿状態の長期化などを通じて生産性が低下することである。また土壌水分環境は一筆圃場内においても時間的・空間的変動が認められ、地形や人為(土壌管理)を考慮した解析によりそれらの変動特性を明らかにした。2.土層改良工法「有材心破」の提案安定なマクロ間隙を形成する土層改良工法として、畜産・林産廃棄物のコンポスト処理産物であるバーク資材を透水ゾーンとした「有材心破」を提案した。有材心破の土層改良効果を水分動態・地温変動などから評価し、有材心破は作物生育に必要な容気量はもちろんのこと容水量や熱容量の確保も可能であること、また根圏域の拡大による土壌構造の安定化にも寄与することを明らかにした。3.持続型農業の生産性向上のための土壌管理(総括)良好な土壌環境を基盤とした持続型農業を展開するためには、作物生育に必要な容気量・容水量・熱容量が確保できる土壌構造の整備(土層改良)、保全(土壌管理)が不可欠である。大型農業機械の踏圧の影響を受けやすいマクロ間隙を保全するような土壌構造の安定化を図る上で、Conservation Tillageを基軸とした土壌管理を提案した。
遺伝子工学的手法によるウイルス検出法に適した水中ウイルス濃縮法の開発

静電的な相互作用を利用してウイルスを濃縮する方法として、陽イオンコート・酸洗浄・アルカリ誘出法を開発し、その有用性の検証を行った。陽イオンを含む液をろ過して陰電荷膜を陽イオンでコートし、擬似的な陽電荷膜として水中ウイルスの吸着に使用することを試みた。さらに、酸性溶液を通すことにより陽イオンのコートをはがし、その後アルカリ性溶液でウイルスを誘出することを試み、ウイルスの回収率をプラック法により測定した。対象としたウイルスは、ポリオウイルスのワクチン株とした。陽イオンの種類として、マグネシウムイオン、アルミニウムイオン、ポリ塩化アルミニウム(PAC)を用い、ウイルス濃縮の最適化を行った。また、精製水、水道水、河川水を対象とし、その中にポリオウイルスを投入してウイルス回収率を測定した。陽イオンとしては、アルミニウムイオンを用いた場合にウイルスの回収率がもっとも高かった。また、精製水と水道水に対しては、ウイルスの回収率は安定して60%以上であり、優れたウイルス濃縮法であることが示された。一方、河川水の濃縮においては、ウイルス回収率が10%以下から100%程度まで大きく変動した。また、アルミニウムイオンコーティングした膜は河川水で目詰まりしやすく、透過水量をあまり大きくできないわかった。陽イオンを除いた後に膜をアルカリ条件にすれば、ウイルスと膜はともにマイナスに帯電することから、ウイルスが膜から離れやすくなると考えられる。この特性を利用し、有機物を含まない誘出液を用いたウイルスの回収を試みる。平成12年度は、おもにポリオウイルスワクチン株を用いて、水中からのウイルス回収率をプラック法により定量した。陰電荷膜吸着・酸洗浄・アルカリ誘出法は、純水にMgイオンを加えた試料からのウイルス濃縮に関してはこれまでに高い回収率が得られることを確認していたが、今年は海水に対して適用した。その結果、陽イオンを添加しなくてもウイルスが陰電荷膜に効率よく吸着すること、酸洗浄によるウイルス回収率向上効果が非常に大きいこと、得られるウイルス回収率が非常に高いことがわかった。結果として、2Lの海水を10mlに濃縮し、ウイルスを80%以上回収している。この回収率は、既存のウイルス濃縮法と比べて例外的に高い回収率である。さらに、既存のウイルス濃縮法とは異なり、この手法を用いて得られたウイルス濃縮液は、溶存有機物をほとんど含まない状態で回収される。その利点を生かし、ウイルスの再濃縮を限外濾過膜を用いて行なうことを試みた。遠心分離の方向とろ過の方向が逆向きになるCentriPrep50(Amicon)を用いることにより、70%以上の回収率で、最終液量を1ml以下にする方法を開発した。1ml以下であれば、ウイルスの遺伝子を抽出する液量として適当であるので、これ以上の濃縮は必要ない。ここで開発した濃縮法により、2Lの海水を1ml以下に濃縮し、60%以上のウイルスを回収することが可能となった。ウイルス濃縮法は、濃縮後にPCRを用いてウイルスを検出することを考えれば、簡便に再濃縮できることは非常に大きい魅力であるといえる。
受精・胚発生過程で卵膜の制御にあずかるプロテアーゼ

無尾両生類の受精及び孵化の際に、卵膜(受精膜)を基質として機能するプロテアーゼにつき以下の知見を得た。(a)ニホンヒキガエルの卵が輸卵管直部を通過することによって受精可能になる際には、卵膜に対する精子の付着(結合)が増大する。この増大は、精子結合にあずかる卵膜の糖鎖が、輸卵管直部上皮から分泌されるトリプシン様プロテアーゼによって露出するためであることが明らかになった。輸卵管直部を予め縛ってからホルモン処理することにより、このプロテアーゼを大量に回収する方法を確立し、そのcDNAを得るために必要な部分的アミノ酸配列を決定した。(b)以前に得られていたcDNAあるUVS.2をプローブとして、NF stage25のツメガエル胚のcDNAライブラリーから1.8kbのインサート(XHE)を得た。XHEを構成する514アミノ酸残基にはシグナルおよびプロペプチドが含まれ、また主要425アミノ酸残基にはアスタシンファミリーに属するZnメタロプロテアーゼおよびCUBドメインが含まれるので、XHEは孵化酵素をコードすると結論づけられる。大腸菌に発現させたXHEに対する抗体は孵化酵素のもつ卵膜溶解活性を阻害し、またこれを利用した免疫組織化学は同酵素が孵化線細胞の分泌顆粒に局在することを証明した。この抗体をプローブにして孵化液から同酵素を純化する試みから、60kDaの酵素分子のうち40kDa成分がプロテアーゼ活性を、残りの成分が基質である卵膜の認識またはプロセシングに機能することを示唆する結果を得た。(1)stage 22-24のツメガエル胚の頭部片からRNAを抽出し、このなかからこれまで胚の頭部表皮に発現する遺伝子として報告されていたUVS.2のcDNAとハイブリダイズする分子を選別し、そのcDNAを得た。得られた1、802塩基からなるクロン(X-HE)は、Zn結合ドメインを含むアスタシンファミリーに属するプロテアーゼとみられる514ケのアミノ酸をコードする領域をもち、またポリAテイルももっていた。種々の発生段階の胚から得たRNAとノーザン解析を行なったところ、X-HEはst.17-18には発現していることがわかった。またUVS.2をglutathione-S transferase遺伝子と融合させて得た融合蛋白質を用いてウサギを免疫し、それを利用したウエスタン解析および免疫組織化学的観察から、胚の分泌物に含まれる抗原分子は分子量50KDであり、孵化腺細胞の分泌顆粒に局在することが証明された。(2)HCGでプライムしたヒキガエル雌の輪卵直部組織からパーコール密度勾配遠心法によりプロテアーゼを含む分泌顆粒を分離し、またヒキガエル精子を超音波処理するこにより卵膜ライシン粗分画を得た。それらをQ-SepharoseおよびSuperdex75により分画、逆相HPLCによりさらに精製して、輪卵管プロテアーゼについては66KD、卵膜ライシンンについては32KD分画を回収した。これらをリジルエンドペプチターゼ処理ののち、Edmann法によりそれぞれ約15アミノ酸残基を決定することができた。それをもとに約30塩基よりなるオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてこれら2種のプロテアーゼのcDNAをクローニング中である。(1)アフリカツメガエルのNFst.19/20の裸胚を24時間培養した飼育液(孵化液)に含まれる未受精卵卵膜を溶解する活性(孵化酵素、HE)を阻害する抗UVS. 2抗体は、60kDと少量の40kD分子を認識する。孵化液を硫安沈澱、Superdex 75によるゲル濾過Mono Qを用いたイオン交換クロマトにより部分精製したところ、60kDを含む分画はタンパク分解および卵膜溶解活性をもつものに対し、40kDのみを含む分画はタンパク分解活性はあっても卵膜溶解活性を示さなかった。

しかし、40kD分子をそれ自身は卵膜を溶かし得ない低濃度の60kD分子と混合するとつよい卵膜溶解活性が生じた。cDNAに基づく孵化酵素の一次構造からみて、60kD分子のもつ基質認識またはプロセシングによって40kD分子に含まれるプロテアーゼの卵膜溶解活性が発揮される、という推定が可能である。(2) Superdex 75によるゲル濾過、Mono Qによるイオン交換クロマトとによりアフリカツメガエル、エゾアカガエルの孵化液からそれぞれ40kD、55kDの分子を高度に精製した。両者ともArg-MCAを基質とし、EDTA, Zn^<2+>, Cu^<2+>により阻害され、Ca^<2+>により活性化される他、DFP, leupeptin, SBTI, ovomucoid, p-APMSFにより強い阻害を受けることから、トリプシン型メタロプロテアーゼとみなされる。(3)冬眠中のヒキガエル輸卵管直部の前後をあらかじめ結紮してから脳下垂体を与えて12-15時間後には直部が著しく膨潤し、その中の液を集めることにより66kDのプロテアーゼを極めて効率よく回収できることを発見した。この方法を用いてoviductinのN末端15残基のアミノ酸配列が決定された。