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東アジア近世儒学思想における評価基準としての「二程子」像の総合的研究

本研究は、北宋の程顥・程頤兄弟が後世に投げかけた諸問題について、東アジアの思想連動を捉える視座から総合的に考察しようとするものである。以下の4点について検討した。1.程氏兄弟の事実性の究明。/2.『四書集注』の「程子」の検討、『朱子語類』「程子之書」の解読。/3.南宋末元・明、及び朝鮮朝における「二程子」の語られ方の検討。/4.日本の江戸時代における「二程子」像の検討。ただし当初の計画が不十分で、遺憾ながら、形ある成果の発表には至っていない。本研究は、北宋における程顥、程頤とその思想の事実性究明の密度を高めることにより、南宋・元・明の思想家がその主観の中で思想評価基準として用いている「二程子」評価を近現代側から客観化することで、東アジアの近世儒学思想連動の様態を、思想の理念面から客観的に評価する指標を構築することを目指すものである。平成25年度は、程氏兄弟の事実性について中心的に究明することを課題とし、「程子」の事跡に関する近代の研究で基本的なものとして尊ばれている姚名達『程伊川年譜』を批判的に検討し、この「年譜」前後からの近代の研究の知見を加味し、同時代の社会・政治状況も一望できるようにした二程の新年譜を作成することを目指した。ただし、検討のための必要作業量が膨大になったためと、下記の「11.現在までの達成度」に述べた理由とのために、26年度以降計画の内容も含めての試行的な探査にとどまり、新「年譜」の完成には至らなかった。この新「年譜」の作成は研究の基礎となるものなので、以後の研究期間も含めての完成をめざすこととしたい。本研究計画遂行のために、これまでの科研費補助金研究で不十分であった電子テキスト検索を活用する体制を構築すべく、電子テキスト検索用コンピュータに特化して使用できる、ウインドウズXP以後のOSのコンピュータにパソコンを更新し、また電子テキストを整備した。設備備品費、消耗品費の相当部分はこの整備のための費用にあてた。本研究は、北宋における程顥、程頤とその思想の事実性究明の密度を高めることにより、南宋明の思想家が主観の中で思想評価基準として用いる「二程子」評価を近現代側から客観化する。そのことで東アジアの近世儒学思想連動の様態を思想の理念面から客観的に評価する指標を構築することをめざす。平成26年度は、下記「11.現在までの達成度」に述べた理由のため、主として25年度の課題を検討しつつ26年度の課題の遂行に入った。ただし25年度の当初課題を研究全体の前提としており、成果の発表は27年度以降になる。その他、後の年度の計画分の内容について先行的に取り組んだものもある。すなわち、25年度当初課題の二程の新「年譜」作成をめざして、清・池生春『明道先生年譜』『伊川先生年譜』と民国・姚名達『程伊川年譜』とをつきあわせる作業を進めた。なお未完成である。この新「年譜」作成は研究全体の基礎となるものなので、以後の期間も含めての完成をめざす。関連して、26年度課題の南宋・朱熹の程子像を検討する基礎として、かつて「集刊東洋学」に37回にわたって共同掲載した東北大学朱子語類研究会の『朱子語類』本朝人物篇訳注の電子テキスト化を図った。これは朱熹の北宋像をうかがう素材となり、また二程新「年譜」作成に資するものでもある。27年度中に整備し、28もしくは29年度頃に刊行する所存である。また、27年度計画の実施の準備として朝鮮朝時代に釜山で刊行された中国明代の程子像を示す貴重資料を写真撮影した。さらに、28年度の課題を先取りすることになるが、日本の江戸から明治にかけての儒学言説の社会的位置の転換について、先方の要請により、中国社会科学院哲学研究所倫理学研究室の国際ワークショップで講演をした。研究費の相当部分は、これらの電子テキスト化のためのソフト費、資料の撮影費、講演のための中国語翻訳謝金の費用にあてた。本研究は、北宋における程顥、程頤とその思想の事実性究明の密度を高めることにより、南宋明の思想家が主観の中で思想評価基準として用いる「二程子」評価を近現代側から客観化し、東アジアの近世儒学思想の連動様態を思想の理念面から評価する指標を構築することをめざす。平成27年度は、下記「11.現在までの達成度」に述べた理由のため、なお25、6年度の課題を検討しつつ年度課題の遂行に入った。ただし25年度課題を研究全体の前提とし、その成果発表は28年度以降になる。その他、28年度計画分の内容について先行的に取り組んだものもある。すなわち、25年度課題の二程の新「年譜」作成をめざして、清・池生春『明道先生年譜』『伊川先生年譜』と民国・姚名達『程伊川年譜』とをつきあわせる作業を進めているが、なお未完成である。この新「年譜」作成は研究の基礎となるので最終28年度も含めての完成をめざす。

関連して、26年度課題の南宋・朱熹の程子像を検討する基礎となる、かつて「集刊東洋学」に37回にわたり共同掲載した東北大学朱子語類研究会『朱子語類』本朝人物篇訳注の電子テキスト化を図った。これは朱熹の北宋像をうかがう素材となり、二程新「年譜」作成に資するものでもある。28年度中に整備し、29ないし30年度頃に公表する所存である。また、28年度計画実施の準備として日本江戸時代に書かれた古賀精里『崇程』自筆本という貴重資料を写真撮影した。さらに、28年度課題の先取りになるが、中国社会科学院哲学研究所倫理学研究室の国際ワークショップで講演した、日本の明治における儒学言説の社会的位置の転換に関する論文を中国の研究誌に公表した。また、関連する講演を北京の日本学研究センターでおこなった。研究費の相当部分は、これらの電子テキスト化のためのソフト費、資料の写真撮影費にあてた。当初の申請書の「平成25年度の計画」欄に、「本応募者は、平成25年度までは本務校大学の評議員、副研究科長の職務を負う。大学及び部局の諸事務繁多により、研究時間が不足するおそれがある」と述べ、25年度はまさに研究時間が不足する事態に結果的に陥った。加えて平成26、27年度も本務校大学の評議員、部局副研究科長の役目が継続することになり、27年度も研究時間不足の事態は継続した。当初の研究計画に対し三分の一程度の探査にとどまっている。この役目の任期は27年度までなので、困難が予想されるが28年度は可能な限り回復に努めたい。本研究は、北宋における程顥、程頤とその思想の事実性究明の密度を高めることにより、南宋明の思想家が主観の中で思想評価基準として用いる「二程子」評価を近現代側から客観化し、東アジアの近世儒学思想の連動様態を思想の理念面から評価する指標を構築することをめざす。4年間という前年度までの本研究期間全体にわたり、本務校の評議員、副研究科長の職務を負い、大学及び部局の諸事繁多により研究時間が不足してしまったため、平成28年度は、前年度以前の課題をなお検討しつつ年度課題の遂行に入った。特に25年度課題を研究全体の基礎前提とするのでこれは継続し、その成果発表は29年度以降になる。すなわち、25年度課題の二程の新「年譜」作成をめざして、清・池生春『明道先生年譜』『伊川先生年譜』と民国・姚名達『程伊川年譜』とをつきあわせる作業を進めている。この新「年譜」は研究の基礎となるので、最終28年度も含めての完成をめざしたが、なお未完成である。関連して、26年度課題としてあげた南宋・朱熹の程子像を検討する前提となり、朱熹の北宋像をうかがい二程「年譜」作成に資する、かつて「集刊東洋学」に37回にわたり共同掲載した東北大学朱子語類研究会『朱子語類』本朝人物篇訳注を前年度に電子テキスト化し、28年度も整備中であったが、これは29ないし30年度以降に公表する所存である。また、28年度計画の日本江戸時代に書かれた古賀精里『崇程』の解析も、27年度に撮影した自筆本と近代の翻刻本と突き合わせつつ検討中であり、興味深い内容であるが、成果をまとめる段階には至っていない。本年度が最終年度であったが、研究全体が遺憾ながら全く未完成であり、成果発表は29年度以降になる。このことに鑑み研究の継続をはかるため、本研究の基礎的重要問題に若干重なる、南宋初における「二程子」像のあり方の究明をおこなう科研費研究を新たに申請した。本研究は、北宋の程顥・程頤兄弟が後世に投げかけた諸問題について、東アジアの思想連動を捉える視座から総合的に考察しようとするものである。以下の4点について検討した。1.程氏兄弟の事実性の究明。/2.『四書集注』の「程子」の検討、『朱子語類』「程子之書」の解読。/3.南宋末元・明、及び朝鮮朝における「二程子」の語られ方の検討。/4.日本の江戸時代における「二程子」像の検討。ただし当初の計画が不十分で、遺憾ながら、形ある成果の発表には至っていない。
鳥類の頚髄の特殊化に関わる運動神経群の発生の解明

本研究では、まず、鶏胚の頚髄特異的なアポトーシスを起こす運動神経(MN)がFoxp1の発現によって識別できることを見いだした。次いで、Foxp1陽性MNはアポトーシスを免れると四肢筋を支配する外側運動柱運動神経(LMC-MN)様に分化することを明らかにした。しかし、Foxp1には、直接アポトーシスを誘導する作用は認められなかった。さらに、通常上腕部領域で発現するHox遺伝子の異所性発現は、アポトーシスを防ぎ、Foxp1陽性MNをLMC-MN様に分化させることを明らかにした。これらの結果は、頚髄ではLMC-MNと相同のMNがHox依存的なアポトーシスによって除去されることを示唆する。ニワトリ胚の脊髄運動神経の発生について、頚髄に特有な細胞群に着目し、以下の2点の研究を行った。(1)頚髄のみに存在し4-5日胚でアポトーシスにより消失する未知の細胞群の実態を解明する目的で、抗アポトーシス遺伝子Bcl-2を利用したアポトーシス抑制実験を行った。エレクトロポレーション法によりBcl-2を頚髄に過剰発現させアポトーシスを抑制した後、運動神経サブタイプマーカーの発現を調べたところ、本来頚髄には存在しない四肢支配運動神経のマーカーであるRaldh2、Lhx1の発現が見られた。一方、交感神経節前神経のマーカーpSmad1/5/8の発現は確認できなかった。さらに、免疫組織化学により、軸索におけるRaldh2の発現も調べたところ、アポトーシス抑制後、Raldh2を発現している運動神経の軸索は、頚髄の前根を通り、前枝に伸長していることがわかった。以上の結果から、頚髄でアポトーシスを起こす細胞群は、体軸筋や交感神経幹に投射する神経ではなく、四肢を支配する運動神経と相同であることが示唆された。(2)軸索を後根から出し僧帽筋を支配するdorsal motorneuron (dMN)の発生制御に関与している分子の機能解析を行った。microRNA-9 (miR-9)は多くの神経細胞の発生過程でその機能が解析されているが、dMNの発生に関わる機能は知られていない。miR-9の過剰発現後、dMNマーカーであるPhox2bによりdMNの局在を調べたところ、正常な発生過程で見られる脊髄内の腹側から背側への移動が起こっていないことがわかった。今後はmiR-9の標的の中で、特にdMNの発生を制御している分子を特定し、機能解析を進める。アポトーシスを起こす細胞群の解析については、概ね研究計画通りに進んでいるが、dMNの発生機序に関する解析では、軸索の走行の検証などがまだ行われておらず、やや遅れている。平成28年度は、主に鳥類の頚髄に特異的に認められる発生早期に一過性に現れ細胞死によって消失してしまう運動神経細胞群について研究を行った。これまでの研究から、この細胞群はFoxp1陽性を示すこと、Bcl2の強制発現により不死化すると、Raldh2やLhx1といった外側運動神経核(四肢を支配する運動神経群)のマーカーを発現することが明らかとなっている。28年度は、(1)この細胞群の細胞死や分化にFoxp1がどのようにかかわっているか、(2)不死化された運動神経群の投射先の決定について研究を進めた。Foxp1の強制発現や発現抑制によって、Foxp1は、細胞群の外側運動神経核への分化を促進するものの、細胞群の細胞死そのものには影響を及ぼさないことが定量的に明らかとなった。不死化された運動神経細胞群の投射先は、脊髄神経の腹側枝の腹側端に達していることが神経標識法およびRaldh2の免疫組織化学法によって確認された。これらの結果を受けて、細胞死に影響を与えるFoxp1以外の分子の探索を開始した。Foxp1は神経系の吻尾軸における分化を決定するHox転写因子群との関係が深いことから、細胞死の分布とHox転写因子群の分布の関連を調べたところ、HoxC6の発現が頚髄下部から頚膨大部で認められることが分かった。さらに、細胞死を検出する活性型Casp3に対する免疫染色やTUNEL法との二重標識法で詳細にHoxC6発現の分布を調べると、細胞死の分布と相補的なパターンを示すことが明らかとなり、HoxC6が細胞死の抑制に関与している可能性が示唆された。そこで、HoxC6を頚髄中部に異所性に強制発現させたところ、細胞死が抑制された。この結果は、細胞死の制御にHox遺伝子が関与している可能性を示唆している。以上の結果は、論文にまとめ年度末に投稿した。今年度は主に細胞死を起こす運動神経細胞群についての研究に進展が見られ、一応の結果を論文投稿までまとめることが出来た。平成28年度末の段階で、鳥類の頚髄に特異的に認められる発生早期に一過性に現れ細胞死によって消失してしまう運動神経細胞群について以下のことが明らかとなっていた。(1)この細胞群はFoxP1陽性を示すが、FoxP1そのものは細胞死影響を与えないこと、(2)Bcl2の強制発現により不死化すると、外側運動神経核(四肢を支配する運動神経群)のマーカーを発現し、その軸索は脊髄神経腹側枝の腹側端に達していること、(3)細胞死の分布とHox転写因子群の分布の関連を調べたところ、HoxC6の発現は、細胞死の分布と相補的であり、HoxC6の強制発現によって細胞死が抑制されること。

そこで、平成29年度は、Hox転写因子群と細胞死との関係に着目し研究を進めた。その結果、頚髄に続く頚膨大部においてHoxC6の発現をsiRNAによって抑制しても、細胞死を誘導することはできないことが明らかとなった。これは、頚膨大部以下で発現している他のHox転写因子群も細胞死抑制作用を持っている可能性を示唆するものと考えられた。そこで、頚膨大部以下で発現しているHoxA6, A7, C8の頚髄における強制発現を行ったところ、いずれも細胞抑制作用が認められた。これに対して、頚髄で本来発現しているHoxA4, C4, A5, C5の強制発現によって、細胞死は抑制されなかった。さらに、頚髄においてHoxC6を強制発現させても、頚髄におけるHoxA4やC5の発現は影響されないことも明らかとなった。これらの結果は、Hox4-5のパラログは細胞死の実行に対して許容的であるのに対して、Hox6-8のパラログは細胞死を抑制する作用を持つことを示しており、頚髄の細胞死の起こる範囲に関してHox転写因子群が関わっていることが明らかとなった。以上の結果は平成29年末発行のDevelopment誌に掲載された。本研究では、まず、鶏胚の頚髄特異的なアポトーシスを起こす運動神経(MN)がFoxp1の発現によって識別できることを見いだした。次いで、Foxp1陽性MNはアポトーシスを免れると四肢筋を支配する外側運動柱運動神経(LMC-MN)様に分化することを明らかにした。しかし、Foxp1には、直接アポトーシスを誘導する作用は認められなかった。さらに、通常上腕部領域で発現するHox遺伝子の異所性発現は、アポトーシスを防ぎ、Foxp1陽性MNをLMC-MN様に分化させることを明らかにした。これらの結果は、頚髄ではLMC-MNと相同のMNがHox依存的なアポトーシスによって除去されることを示唆する。今後は、アポトーシスを抑制した後、残存した運動神経の軸索と、頚部の筋前駆細胞との関連を調べる計画である。特に、アポトーシスを起こす細胞は四肢支配運動神経との相同性が確認されたので、主に上肢筋などに分化するLbx1陽性細胞に着目する。Lbx1陽性細胞は頚部にもわずかに存在するものの、その詳細はよくわかっていない。申請者の研究室では、すでにchick Lbx1の抗体の作製に成功しており、また、Raldh2の免疫組織化学で軸索の走行が追跡できることもわかったので、今後はRaldh2とLbx1の抗体を併用した免疫組織化学的解析を詳細に行う。また、dMNの発生に関しては、まだ未解析であるmiR-9過剰発現後の軸索の走行を調べる。さらに、miR-9の標的とされている遺伝子の中から、in situ hybridizationや免疫組織化学により、dMNに発現が見られる遺伝子を絞り込む。その後、その遺伝子の機能解析に進む計画である。今年度は、投稿した論文に対する査読意見に対応して細胞死に関する研究を補充すると共に、もう一つの本研究のテーマである頚髄に特異的に認められる背側運動神経(dMN:僧帽筋を支配する運動神経で後根を通って軸索を伸ばす運動神経群)の発生とmiR-9との関係について解析を進める。mir-9過剰発現後のdMNの分化マーカの発現、軸索走行、細胞移動について詳細に解析し、異常が起きているかどうか明らかにする。もし、それらに異常が認められた場合は、その責任分子について解析を進める予定としている。神経解剖学、発生学
動物の移動およびワクチン接種が牛ウイルス性下痢症の導入リスクに与える影響

牛ウイルス性下痢症(BVD)対策の基本は持続感染牛の早期摘発淘汰であるが、公共牧場の使用や市場取引を含む複雑な動物移動およびワクチン接種政策という日本特有の課題が本疾病の国内での制御を難しくさせており、また、これら課題がBVD拡大およびその対策に与える影響に関する包括的な報告は無い。そこで申請者は、動物移動およびワクチン接種が日本におけるBVD拡大およびその対策に与える影響を調べるために、1)動物の導入に起因する農場内BVDリスクの定量、2)動物導入元の種類がBVDリスクに与える影響、および3)導入先農場のワクチン接種率が動物移動によるBVDリスク軽減に与える影響、の3点について明らかにする。
新しい周波数チェインによる超高精度光周波数測定システムの実現

多重量子井戸構造の分布反射帰還形、波長1.5μm半導体レーザに電気的負帰還制御をほどこすことにより発振スペクトル線幅250Hzを実現した。このレーザを主レーザとして用い、注入同期法により高パワー半導体レーザの高コヒーレント化、周波数安定化ができた。中間周波数発生のために光周波数コム発生器を開発した。すなわち、ファブリ・ペロー共振器中に電気光学結晶を納めてマイクロ波変調信号を加え、主レーザの変調を行い、周波数スパン4THzにわたり変調側波帯を発生させた。摂氏310度に温度制御したリチウムナイオベート結晶に波長1.5μm半導体レーザと波長1.06μmヤグレーザとの光を照射し、両レーザの和周波数信号を発生させた。この波長は0.63μm、パワーは0.7μWであった。この信号を周波数安定化ヘリウムネオンレーザ光と混合し光位相同期ループを構成した。その結果、位相誤差分散0.05radian^2が得られ、良好なホモダイン光位相同期の実現を確認した。以上により周波数測定システムの第一次周波数標準としてのヘリウムネオンレーザ、第二次周波数標準としての波長1.5μm狭線幅半導体レーザとの間の周波数チェインが実現した。また、第二次周波数標準と被測定レーザとを結ぶ光周波数コム発生器も実現した。推定される周波数測定確度は1x10^<-10>が確保でき、今までにない超高確度での周波数測定が可能となることを確認した。この周波数測定システムの応用として波長0.65μmのカルシウムスペクトル線を周波数基準とし、9個の半導体レーザを用いた波長0.61.3μmにわたる周波数チェインを提案し、第二高調波、和周波などの発生を行った。FM分光法を用いた電気的負帰還制御を考案し、波長1.5μm半導体レ-ザのスペクトル幅を狭窄化した。その結果、本研究開始前の値、250Hzの約1/3の値、すなわち80Hz、が達成された。MOCVD法により広ストライプ・多モ-ドの高出力半導体レ-ザを製作し、これに上記の狭スペクトル幅半導体レ-ザの光を注入し、注入同期法により単一モ-ド化した。その結果、注入先パワ-0.8mW以上で副モ-ドパワ-抑圧度30dBを実現した。速度選択的光ポンピング法を用いてこの高出力半導体レ-ザの周波数をルビジウム原子の吸収スペクトルに高精度で安定化することができた。ヘテロダイン法による光周波数測定のための局部発振器として使うために光周波数コムジェネレ-タを開発した。これはファブリ・ペロ-共振器内に電気光学位相変調器を設置したものである。変調器の変調周波数をファブリ・ペロ-共振器の自由スペクトル域の2倍の値に設定すると高効率位相変調が可能になる。これによりファブリ・ペロ-共振器に入射する狭スペクトル線幅半導体レ-ザの光を変調した結果、多数の変調側波帯が発生した。第400次の側波帯がS/N値17dBで測定された。この結果より測定可能な側波帯の周波数範囲は1.7THzに及ぶことがわかった。基準周波数との位相同期を行うために非線形光学結晶を用いて和、差周波数を発生させる必要があるので、その結晶の設計製作を行った。LiNbO_3結晶を用いた場合、結晶温度580度にすれば良いことがわかった。さらにこのような和、差周波数発生に必要なTi:A1_2O_3レ-ザ及び半導体レ-ザ励起YAGレ-ザの発振周波数制御を行い、良好な結果を得た。以上の結果により本研究を次年度も継続することにより当初の目標が達成できる見通しを得た。

中間周波数発生のために光周波数コム発生器を開発した。すなわち、ファブリ・ペロー共振器中に電気光学結晶を納めてマイクロ波変調信号を加え、主レーザの変調を行い、周波数スパン4THzにわたり変調側波帯を発生させた。摂氏310度に温度制御したリチウムナイオベート結晶に波長1.5μm半導体レーザと波長1.06μmヤグレーザとの光を照射し、両レーザの和周波数信号を発生させた。この波長は0.63μm、パワーは0.7μWであった。この信号を周波数安定化ヘリウムネオンレーザ光と混合し光位相同期ループを構成した。その結果、位相誤差分散0.05radian^2が得られ、良好なホモダイン光位相同期の実現を確認した。以上により周波数測定システムの第一次周波数標準としてのヘリウムネオンレーザ、第二次周波数標準としての波長1.5μm狭線幅半導体レーザとの間の周波数チェインが実現した。また、第二次周波数標準と被測定レーザとを結ぶ光周波数コム発生器も実現した。推定される周波数測定確度は1×10^<-10>が確保でき、今までにない超高確度での周波数測定が可能となることを確認した。この周波数測定システムの応用として波長0.65μmのカルシウムスペクトル線を周波数基準とし、9個の半導体レーザを用いた波長0.61.3μmにわたる周波数チェインを提案し、第二高調波、和周波などの発生を行った。
陸上植物有性生殖における核膜融合の鍵メカニズム

被子植物の有性生殖で観察される3回の核融合では、核膜同士が直接融合することで2つの核が融合する。われわれは、シロイヌナズナ有性生殖過程の核膜融合因子としてGex1を見いだした。本研究は、有性生殖過程の核膜融合の分子機構と、その初期発生における意義の解明を目指し、1)Gex1と複合体を形成する因子の同定、2)Gex1内腔側領域の構造と機能の解析、3)核融合過程を調節する低分子化合物の探索、4)基部陸上植物ゼニゴケを用いた、進化の観点からの核融合機構の解析、5)初期胚発生に対する受精時の精核融合の意義の解析、を行う。
血小板細胞の構成論的理解による心筋梗塞発症メカニズムの理解と制御法の開発

心筋梗塞などの血栓性疾患の発症に血小板細胞は必須の役割を演じる。血流による血管壁損傷部位への血小板の運搬と接着、接着部位から局所的に開始される細胞内活性化シグナル伝達とエネルギー代謝の連成、活性化血小板から生理活性物質の局所放出とその物質拡散におよぼす血流の影響、活性化血小板膜上のおける凝固系の活性化など血栓イベント発症における血小板の生理機能をコンピューターシミュレーターを用いて構成論的に理解する。血小板細胞接着現象は膜糖蛋白GPIbとvon Willebrand因子の結合のみにより仲介される。両蛋白質と周囲の水分子を構成する全原子の運動から、両分子の接着構造、接着力を予測する。冠動脈内にて血小板細胞とフィブリンにより心筋梗塞の原因となる冠動脈血栓が形成されるメカニズムには未知の部分がある。血栓の成長速度に及ぼす因子として、血管壁の性状、血流などの寄与が想定されているが、これらの定量的寄与は不明である。平成24年度には流体力学、移流拡散などの基礎方程式から血小板細胞シミュレーターを作成した。作成した血小板細胞シミュレーターの生物学的妥当性の検証のために精緻な生物学的定量実験を行なった。刺激を受けた血小板は、細胞内に蓄積したADP/ATPなどの生理活性物質を局所放出する。ADP、トロンビンなどの刺激を受けた単一の血小板細胞からのADP/ATP放出量を時間的に精度高く計測した。実証実験の結果を再現可能なシミュレーションモデルを作成した。血管内皮損傷部位における単位時間当たりの血小板の接着数、接着した血小板細胞の流体力による受動的形態変化などの定量情報を実証実験により取得した。その結果から血小板接着モデルを作成した。血小板の接着における赤血球の寄与の重要性を示した。血小板細胞の代謝、シグナル動態に注目し、各種活性化物質による血小板刺激後の血小板細胞内カルシウムイオン濃度、リン酸化シグナル蛋白の細胞内局在を時間的、空間的に精度高く計測した。これらのシグナル動態を反映する血小板細胞活性化モデルを作成した。モデルからコンピュータープログラムを作成し、パラメーターを変化させて仮想的実験を行なった。今後の研究の発展のための基盤を整備した。冠動脈の動脈硬化巣破綻部位の閉塞血栓にて心筋梗塞が発症する。「血小板細胞」の集積とフィブリン形成の同時進行により冠動脈を閉塞する血栓が惹起される。血小板活性化と凝固系活性化を連成する概念的モデルを作成した(Goto S, et al. Clin Cardiol, 2014 )。その概念的モデルに基づき、血管壁損傷部位周囲の「血小板細胞」濃度、プロトロンビン濃度、フィブリノーゲン濃度、トロンビン濃度、フィブリン濃度、活性化「血小板細胞」濃度と血流の影響を連成計算するソフトウエアを作成した。また、「血小板細胞」を流体に曝露した時の、「血小板細胞」周囲の血流変化が凝固因子濃度におよぼす影響を定量計算する基盤モデルおよびソフトウエアを開発した。本ソフトウエアには流体力学、移流拡散などの基礎方程式と化学反応式の連成により構成されている。冠動脈の動脈硬化巣破綻部位における血栓の成長に寄与する血小板細胞活性化速度、トロンビン産生/消失速度、フィブリン産生速度などの定量的寄与は不明である。開発したプログラムにより、これら未知の速度をパラメーターとして2倍、3倍などに増加させた場合、血管壁内腔方向への血栓の成長にはトロンビン産生/消失速度の寄与が大きなことを示唆した。「血小板細胞」が血管壁損傷部接着時の周囲血流を計算した。活性化血小板上にて産生されたトロンビンは「血小板細胞」下流側にて最大濃度が高くなることを示した。血管壁損傷部位への「血小板細胞」接着と血流の関係の定量化を目指す実証実験を多数施行した。von Willlebrand因子とGPIbαの相互作用により仲介される血小板細胞の接着であっても、接着後の時間、集積した血小板細胞など多くのパラメーターにより接着力が影響を受けることを示した。冠動脈閉塞血栓の形成における血小板細胞の構成論的理解とその制御を目指す5年間の研究計画の3年目として、コンピューターによるシミュレーション研究を遂行した。血流条件下の血小板細胞と血管壁の接着に寄与する血小板膜糖蛋白GPIbαと血管壁の受容体蛋白von Willebrand因子(VWF)の接着を分子動力学計算の手法を用いてモデル化した。GPIbαのN末端側とVWFのA1 domainの液相における接着構造を結晶構造に水分子を配置して作成した。X軸方向に両分子間の距離を2Å毎移動させて、全アミノ酸が作り出す力場としてのpotential of mean forceを計算した。計測値をフィッティングした上で、カーブを微分して接着力を算出した。2014年度の研究により、血小板の初期接着を担うVWF/GPIbαの結合力は60 pN程度であることを示した。原子間力顕微鏡を用いて計測した実証実験経過と矛盾がなかった(Tomimatsu H, et al. J Atherosclerosis and Thrombosis, in press)。血小板と凝固系の関係を示す定性的モデルを2014年度に公開した(Goto S, etal. Circulation, 2015)。本モデルに基づいた定量的基盤モデルも作成した。流体下の血小板形態変化を考慮しない血小板接着活性化モデル計算結果を公表した(Tomita A, et al

. J Atherosclerosis and Thrombosis, 2015)。流体力と接着した血小板の部分的構造変化(偽足形成)の定量的関係に関する実証データを2014年度に取得した。接着モデルに血小板形態変化を導入してモデルの精緻化を目指す。代謝、活性化機能を細胞内物質拡散、細胞内化学反応として組み込んだ血小板細胞基盤モデルを作成した。細胞内にて起こる化学反応のうち、反応定数が既知の反応計算を試みた。細胞内の化学反応と試験管の化学反応の相同性が担保されていないので、本モデルについては実証実験結果との擦り合わせによる精緻化が必要である。平成27年度には、von Willebrand因子(VWF)と血小板膜糖蛋白GPIbαの結合構造予測計算が進展した。両分子はリストセチンの存在下など特殊な条件においてのみ安定するため、X線構造解析などの手法では結合構造の予測は困難であった。平成27年度には水分子存在下のVWF/GPIbαwild-typeの接着構造を予測した。さらに、臨床的にvon Willebrand病として表現型の知られているVWFのG561A, C509R, R552A mutantとGPIbαの接着構造を動的、三次元的に予測した。また、血小板型von Willebrand病として知られるGPIbαのG233V mutantとVWFの接着構造予測にも成功した。両分子の重心間距離を固定してもG233V mutantでは、計算時間の延長とともに両分子が解離した。von Willebrand病の分子を用いて水溶性構造と接着構造を予測する計算は予定通りに遂行した。血小板細胞と凝固系の相互作用の流体モデルに線溶系を組み込んだ。8ノードのスーパーコンピューターを用いて、血流、血小板細胞活性化速度、凝固系の活性化速度、線溶速度などのパラメーターを変化させた計算を施行した。血栓のサイズを規定する因子として血流の寄与が大きいことを示した。血流速度が遅い条件では血栓のサイズは線溶速度に依存することを示した。Flow chamberを用いた実証的研究により、血小板細胞の活性化を阻害した条件では、VWFに接着した血小板細胞は流体力により受動的に変形し、偽足を形成することを示した。偽足長と流速の間には正の相関関係があることを示した。エネルギー代謝とシグナル伝達を組み込んだ血小板細胞の周囲の流体条件を移流拡散として組み込んだ。活性化した血小板細胞の下流の血小板細胞における活性化の増強を構成論的に示した。平成27年度には、スーパーコンピューターを用いたvon Willebrand因子(VWF)と血小板膜糖蛋白GPIbαの結合構造予測計算を、臨床的にvon Willebrand病として知られているVWFのG561A, C509R, R552A mutantおよび血小板型von Willebrand病として知られるGPIbαのG233V mutantとVWFの接着構造予測にも成功した。VWFとGPIbαの接着構造に関する計算予測は当初の予定通りに進展した。本計算に加えて、血小板細胞活性化後の接着に重要な役割を演じる血小板膜糖蛋白
生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明

細胞の増殖のタイミングが、抑制性キナーゼであるWee1等の制御を介し、生体時計で制御されていることは周知の事実である。今回、時計遺伝子欠損マウス(CGDマウス)での肝臓再生の異常を検索することにより、生体時計の発生分化制御にかかわる時計遺伝子機構を検索した。まず、マウス肝臓の70%部分肝切除後を施行し、野生型とCGDマウスとの、再生肝の再生能力の差を検索した。そのためにサンプリング1時間前にBrdUを投与しその時点でのDNA合成をマーキングし、術後様々な時間でサンプリングした。抗Ki67抗体にて細胞周期に入った細胞を同定し、anti-BrdU抗体やEdU-Click反応でS期の細胞を同定し、これらの二重染色により、手術後各時間におけるS期細胞比率等の変動を検討した。その結果、CGDマウスと野生型マウスには、細胞増殖効率に明らかな差は認められなかった。また、部分肝切除術後の発がん性を含む病変を検索しているが、現在までには異常が認められなかった。一部のマウスに炎症性細胞浸潤が認められた。以上の所見は、肝細胞の細胞周期を1サイクル回る時間に明らかな差が無いことをあらわすが、細胞発生が異常かどうかわからない。生体成熟肝細胞では、基本的には細胞分裂を行なわないが、発生期の肝細胞は分裂する。そこで、時計遺伝子による時計遺伝子の細胞発生への関与をより詳細に検索するため、生後3週のCGDマウスの肝臓から採取した肝細胞の初代培養を用いて細胞発生異常の検索を開始した。野生型マウスから採取した肝細胞の分裂頻度は25%-30%であったが、CGDマウスも同程度であった。この分裂頻度は、単核細胞も、2核細胞も同じであった。現在さらに、初代培養細胞系を用いて、生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構を追求している。研究は順調に展開し、十分な成果を上げている。「生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明」を、肝細胞の初代培養系を用い、遺伝子改変マウスを用い、詰めの実験を行ない、成果を出す。個体を構成する数十兆個の細胞には、ほぼ全てに時計遺伝子があり細胞活動や細胞周期がリズミックに行われている。従って、生体リズムは細胞にとっても基本的な現象である。しかし、生体リズムを無視した、24時間不夜城のような社会は急速に進行してきている。その結果、リズム異常が、高血圧、発癌などの生活習慣病の要因として近年注目されてきた。生体リズムは時計遺伝子の転写・翻訳ループによって24時間リズムが刻まれている。しかるに、そのリズムがどのように発生するのか、また、時計の異常が細胞増殖に影響をあたえるのかどうかも分かっていない。今回の検索において、数兆もの全身の時計を統合する生体時計の中枢である脳の時計である視交叉上核の時計と、通常の末梢細胞の代表である肝細胞の時計とを比較して解明する。マウス視交叉上核(SCN)でリズムを打ち始めるのは、神経幹細胞からニューロンへの分化が起こった後の、胎生18日ころの生まれる直前からである。視交叉上核のニューロンの発生は、DNA合成期をマーキングする3HチミジンやBrdUを胎生13日、14日、15日、16日、17日、18日と各々の日に腹腔内投与し、投与後1時間で固定した後、抗ペプチド抗体による免疫組織化学を行い、その後BrdUの免疫二重染色とオートラディオグラフィーを行い、視交叉上核のニューロンの発生時期を特定した。また、部分肝切除術を行い、BrdUの二重染色法で、概日変動を検討した結果、細胞分裂には、時間依存性があるが、現在までのところ、DNA合成には時間依存性は認められなかった。生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明のため、肝臓を用いて検索した。まず、肝臓は肝実質細胞は、定常状態では細胞周期に入っている細胞がほとんど無い。実際細胞周期に入った細胞が発現するKi67が陽性の細胞は、肝臓では肝細胞はほとんど無く、クッパー細胞や内皮細胞が少数認められる程度である。肝実質細胞は正円型の大きな核を持ち、小型の楕円形や小円型のクロマチンに富む非肝細胞と容易に形態学的に区別できる。手術後、どのような時間帯で肝実質細胞が細胞周期に入るのか検索するため、ZTOで部分肝切除術を行い、その後28時間、36時間、40時間後のKi67とEduの標識効率を比較した。Ki67により細胞周期に入っている細胞を同定し、Eduは肝臓のサンプリング前1時間に投与し、その時点でのDNA合成期(S期)の細胞を同定する。その結果、Ki67陽性細胞は、28-40時間まで持続的に増加し続けるが、Edu細胞数は36時間がピークで、その後減少する。染色は、抗Ki67抗体にて細胞周期に入った細胞を同定し、EdU反応でS期の細胞を同定した。次に、二重染色により、手術後各時間における細胞の増殖活性を示すS期細胞比率の変動を同定する。S期細胞比率は36時間では80%に達するが、40時間では40%程度まで落ちた。従って、肝切除にて、肝細胞がGOから出て、細胞周期のS期へ移行し、その後G2に行く可能性が示唆された。

今回、時計遺伝子欠損マウス(CGDマウス)での肝臓再生の異常を検索することにより、生体時計の発生分化制御にかかわる時計遺伝子機構を検索した。まず、マウス肝臓の70%部分肝切除後を施行し、野生型とCGDマウスとの、再生肝の再生能力の差を検索した。そのためにサンプリング1時間前にBrdUを投与しその時点でのDNA合成をマーキングし、術後様々な時間でサンプリングした。抗Ki67抗体にて細胞周期に入った細胞を同定し、anti-BrdU抗体やEdU-Click反応でS期の細胞を同定し、これらの二重染色により、手術後各時間におけるS期細胞比率等の変動を検討した。その結果、CGDマウスと野生型マウスには、細胞増殖効率に明らかな差は認められなかった。また、部分肝切除術後の発がん性を含む病変を検索しているが、現在までには異常が認められなかった。一部のマウスに炎症性細胞浸潤が認められた。以上の所見は、肝細胞の細胞周期を1サイクル回る時間に明らかな差が無いことをあらわすが、細胞発生が異常かどうかわからない。生体成熟肝細胞では、基本的には細胞分裂を行なわないが、発生期の肝細胞は分裂する。そこで、時計遺伝子による時計遺伝子の細胞発生への関与をより詳細に検索するため、生後3週のCGDマウスの肝臓から採取した肝細胞の初代培養を用いて細胞発生異常の検索を開始した。野生型マウスから採取した肝細胞の分裂頻度は25%-30%であったが、CGDマウスも同程度であった。この分裂頻度は、単核細胞も、2核細胞も同じであった。現在さらに、初代培養細胞系を用いて、生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構を追求している。11月に来日し、その後精力的に研究に取り組んでいる。研究テーマは「生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明」であるので、そのなかで、中枢も末梢も行っている。研究は順調に展開し、十分な成果を上げている。研究テーマは「生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明」であるので、当初は脳を中心に考えていたが、前駆実験の結果、末梢臓器の細胞周期が強く時計に制御されることがわかり、今後、研究テーマの中で、末梢臓器、特に肝臓を中心に研究を展開したい。肝臓を中心に、研究テーマである「生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明」を、時間特異性に注目しながら、野生型の他、Cry-null、Bmall-KO、Perl-KO.Per2-KO、PerlPer2-KOマウスで展開したい。「生体時計の発生分化制御に関わる遺伝子機構の解明」を、肝細胞の初代培養系を用い、遺伝子改変マウスを用い、詰めの実験を行ない、成果を出す。
走査型電気化学顕微鏡(SECM)を用いた生体分子極微細構造の構築

本年度は,抗体固定化法が走査型電気化学顕微鏡(SECM)のレスポンスに与える影響および局所固定化抗体の抗原捕捉能に関して検討した.パーオキシダーゼ(HRP)標識CEA抗体をガラス基板上に,物理吸着あるいは二価性架橋剤を介した化学結合により固定し,さらにサンドイッチ法によりHRP(パーオキシダーゼ)標識抗体を固定した.得られた基板を,1.0mM ferrocenylmethanol(FMA),0.5mM H202溶液(0.05 V vs Ag/AgCl)でSECM観測した.HRPはH202によるFMAの酸化を触媒するので,生成したFMA+の還元電流を計測することにより,局所領域のHRP活性を評価できる.HRP固定化領域で還元電流の探針-基板距離依存性を調べ,基板表面におけるFMA+生成フラックスを求めた.フラックスは抗体の固定化法に大きく依存し,二価性架橋剤で処理した基板を用いた場合には,疎水性相互作用により抗体を固定した場合に比べ,10倍程度HRP活性が高いことが示された.また,微小領域のみに抗体を固定した基板の抗原濃縮効果に関して,数値解析を行なったところ,例えば,半径10μmの微小円部に抗体を固定した基板では,平面基板に比べ捕捉された抗原の密度は,基板浸漬後10秒では約10倍,10分後には680倍高いことが示された.つまり,抗体局所固定化基板を使用することにより,溶液中に依存する希薄抗原を,短時間で局所濃縮できることになる.この結果は,微細加工を施した基盤の利用は,サンプル量の少量化や集積化という観点だけでなく,計測時間の短縮や検出感度の向上にも有効であることを示している.本年度は,抗体固定化法が走査型電気化学顕微鏡(SECM)のレスポンスに与える影響および局所固定化抗体の抗原捕捉能に関して検討した.パーオキシダーゼ(HRP)標識CEA抗体をガラス基板上に,物理吸着あるいは二価性架橋剤を介した化学結合により固定し,さらにサンドイッチ法によりHRP(パーオキシダーゼ)標識抗体を固定した.得られた基板を,1.0mM ferrocenylmethanol(FMA),0.5mM H202溶液(0.05 V vs Ag/AgCl)でSECM観測した.HRPはH202によるFMAの酸化を触媒するので,生成したFMA+の還元電流を計測することにより,局所領域のHRP活性を評価できる.HRP固定化領域で還元電流の探針-基板距離依存性を調べ,基板表面におけるFMA+生成フラックスを求めた.フラックスは抗体の固定化法に大きく依存し,二価性架橋剤で処理した基板を用いた場合には,疎水性相互作用により抗体を固定した場合に比べ,10倍程度HRP活性が高いことが示された.また,微小領域のみに抗体を固定した基板の抗原濃縮効果に関して,数値解析を行なったところ,例えば,半径10μmの微小円部に抗体を固定した基板では,平面基板に比べ捕捉された抗原の密度は,基板浸漬後10秒では約10倍,10分後には680倍高いことが示された.つまり,抗体局所固定化基板を使用することにより,溶液中に依存する希薄抗原を,短時間で局所濃縮できることになる.この結果は,微細加工を施した基盤の利用は,サンプル量の少量化や集積化という観点だけでなく,計測時間の短縮や検出感度の向上にも有効であることを示している.
ヒスタミンH2受容体拮抗薬の後縦靭帯骨化症に対する抑制機構の解明

後縦靱帯骨化症OPLLに対するH2受容体拮抗薬の予防効果・治療効果を検討し、その作用点の解明とヒスタミンの石灰化に対する関与についての解明を行った。OPLLのモデルマウスであるtip toe mouse(TTWmouse)を用いた。Famotidine投与群で異所性骨化を抑制する傾向を認めた。また、ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスを交配により生まれる複合変異マウスにおけるOPLLの病態についての解析を行ったところμCTでOPLLの縮小傾向を認めたが組織切片については明らかな変化はみられなかった。後縦靱帯骨化症(OPLL)は、脊椎椎体の後縁を連結し脊柱のほぼ全長を縦走している後縦靱帯が骨化することにより、脊柱管狭窄をきたし脊髄または神経根の圧迫・障害により神経症状をおこす疾患である。本症の発症メカニズムについては未だ明らかにされておらず、治療法としては侵襲的な外科的治療が主である。本研究は、申請者が最近見出したヒスタミンH2受容体拮抗薬(H2ブロッカー)の石灰化抑制作用をさらに発展させ、H2ブロッカーがOPLLの予防・治療に対し有効であるかを検討するものである。H2ブロッカーのもつ石灰化抑制効果を分子生物学的に検証し、異所性石灰化・靱帯骨化抑制の作用点をも含めて解明する。また、生体における他の石灰沈着症・靱帯骨化症のメカニズムの解明も視野に入れている。OPLLを含め、異所性骨化症は整形外科外来において日常少なからず経験する疾病である。本研究は、これらに対する治療のうち、特に石灰化を抑制し、かつ吸収させるという効果が臨床上経験されているH2ブロッカーについての基礎的研究である。これまでの報告が臨床上の経験的報告が主であったのに対し、本研究ではin vitro実験として、石灰化させた各種細胞を用い、in vivo実験としてTTW/Jic-ICR mouseを用いることにより、ヒスタミンH2受容体拮抗薬の石灰化抑制の効果を分子生物学的に解明しようとしている。本研究のメカニズムを分子生物学的に解明することは、臨床医学で効果が認められている治療法に基礎医学・生物学的エビデンスを添えることとなる。つまり本研究が達成されれば、本治療法がエビデンスを有するものとして受け入れられ、H2ブロッカーの薬効として新たにOPLLに対する抑制効果の追加が期待される。当初平成27年度内行うと予定していた実験計画は以下のとおりであるがそれらが全て計画通りに進展しているため区分(2)を選択した。1.各種細胞(骨芽系細胞MC3T3-E1、腱細胞TTD6、軟骨系細胞ATD6など)におけるヒスタミンH2受容体の発現解析と石灰化誘導培養系における、H2ブロッカーの石灰化抑制効果の解析2.腱由来細胞株TTD6についても同様に石灰化誘導培地,石灰化誘導培地+BMP2にFamotidineを添加し、Von Kossa染色・ALP染色・遺伝子発現解析を行う。3.マウス奇形種由来細胞株ATDC5については、Famotidine存在下で、20日間Pi添加DMEMにて培養して石灰化を誘導する。上記二つの細胞株と同様に、Von Kossa染色・ALP染色・遺伝子発現解析を行う。ATDC5細胞を用いた予備検討から、ファモチジンが用量依存的にOCとCol10の発現を抑制する結果が得られている。ヒスタミンによる石灰化誘導効果の解析についてもH2ブロッカーの石灰化抑制の評価と同様にMC3T3-E1、TTD6、ATDC5を用い評価を行う。後縦靱帯骨化症は、脊椎椎体の後縁を連結し脊柱のほぼ全長を縦走している後縦靱帯が骨化することにより、脊柱管狭窄をきたし脊髄または神経根の圧迫・障害により神経症状をおこす疾患である。本研究は、申請者が最近見出したヒスタミンH2受容体拮抗薬(H2ブロッカー)の石灰化抑制作用をさらに発展させ、H2ブロッカーが後縦靱帯骨化症(OPLL)の予防・治療に対し有効であるかを検討するものである。本研究における学術的特色としては、これまでの報告が臨床上の経験的報告が主であったのに対し、本研究では、in vitro実験として、石灰化させた各種細胞を用い、in vivo実験としてTTW/Jic-ICR(ttw/ttw)mouseを用いることにより、ヒスタミンH2受容体拮抗薬の石灰化抑制の効果を分子生物学的に解明しようとする点にある。対象と方法:生後4週齢のTTW/Jic-ICR(ttw/ttw)mouse 24匹に、Famotidineを濃度

4.57 mg/L(*)で飲水に混和し、投与後4週(8週齢), 8(12), 11(15), 14(18), 17(21)で採材しμCTで後縦靱帯骨化の増減を評価する。また、組織切片についても評価する。((*)水分摂取量約3.5 mL/日・匹(20 g)famotidineのヒト最大投与量40mg/day=16.0μg/20 gから計算)。すでに予備実験を開始しており、下図に示すようにFamotidine投与群で異所性骨化を抑制する傾向を認めている。(1)ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスを交配により生まれる複合変異マウスにおけるOPLLの病態についての解析。背景と目的:ヒスタミンの後縦靭帯骨化における役割を遺伝学的に証明するため、ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスの交配により生まれる複合変異マウスにおける後縦靱帯骨化の程度について解析した。対象と方法:Histamine H2R knockout mouseとTTW mouseを交配し、(2)と同様にμCTで後縦靱帯骨化の増減を評価し、組織切片についても評価した。(2)H2ブロッカーによる石灰化抑制の作用点の解明:上記(1)の実験結果に基づき、OPLLに対するH2受容体拮抗薬の予防効果・治療効果を検討し、その作用点の解明とヒスタミンの石灰化に対する関与についての解明を行った。後縦靱帯骨化症OPLLに対するH2受容体拮抗薬の予防効果・治療効果を検討し、その作用点の解明とヒスタミンの石灰化に対する関与についての解明を行った。OPLLのモデルマウスであるtip toe mouse(TTWmouse)を用いた。Famotidine投与群で異所性骨化を抑制する傾向を認めた。また、ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスを交配により生まれる複合変異マウスにおけるOPLLの病態についての解析を行ったところμCTでOPLLの縮小傾向を認めたが組織切片については明らかな変化はみられなかった。H27年度進捗した実験結果を基に以下の実験計画を行い進展させる予定である。2.ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスを交配により生まれる複合変異マウスにおけるOPLLの病態についての解析背景と目的:ヒスタミンの後縦靭帯骨化における役割を遺伝学的に証明するため、ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスの交配により生まれる複合変異マウスにおける後縦靱帯骨化の程度について解析する。対象と方法:Histamine H2R knockout mouseとTTW mouseを交配し、1と同様にμCTで後縦靱帯骨化の増減を評価し、組織切片についても評価する。3. H2ブロッカーによる石灰化抑制の作用点の解明上記1-3の実験結果に基づき、OPLLに対するH2受容体拮抗薬の予防効果・治療効果を検討し、その作用点の解明とヒスタミンの石灰化に対する関与についての解明を行う。(1)ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスを交配により生まれる複合変異マウスにおけるOPLLの病態についての解析背景と目的:ヒスタミンの後縦靭帯骨化における役割を遺伝学的に証明するため、ヒスタミンH2受容体ノックアウトマウスとTTWマウスの交配により生まれる複合変異マウスにおける後縦靱帯骨化の程度について解析する。(2)H2ブロッカーによる石灰化抑制の作用点の解明。上記(1)ー(3)の実験結果に基づき、OPLLに対するH2受容体拮抗薬の予防効果・治療効果を検討し、その作用点の解明とヒスタミンの石灰化に対する関与についての解明を行う。
高分子マトリックス化金属固相触媒の創製

1我々は、鎖状高分子配位子と遷移金属化合物からの自己集合触媒介したトリスホスフィンを合成し、超分子錯体を生成するために種々の後周期遷移金属化合物を存在させる事で、金属を介したトリスホスフィンの集合化が起きた。この超分子錯体を、いくつかの炭素-炭素結合形成反応の触媒へ適用した。2両親媒性高分子配位子とパラジウムからなる固体触媒膜をマイクロチャネルリアクター内に調製し,有機合成反応に適用した。すなわち,ダブルY型のマイクロチャネルリアクター内にて水溶液と酢酸エチルからなる層流界面に,高分子パラジウム錯体触媒膜を調製した。この錯体触媒膜存在下,ヨードベンゼン誘導体の2-プロパノール溶液とフェニルボロン酸誘導体の水溶液での層流状態における鈴木-宮浦反応を検討した。3我々は両親媒性高分子担持Pdナノ粒子触媒の開発に既に成功している。今回、より活性が高く調製の簡便な触媒創製を行うべく、両親媒性高分子担持Ptナノ粒子触媒の開発を行った。PS-PEG-NH2とZeise塩の錯体形成後、ベンジルアルコールで還元し、Ptナノ粒子を調製した。本Pt粒子を触媒としたアルコールの酸化反応は、水中酸素雰囲気下60°Cで効率的に進行し、また触媒の再利用が可能であった。4今回、ポリピリジニウムとリンタングステン酸から新しい固相触媒の創製を行なった。ビスピリジンとジブロモアルカンから調製される両親媒性鎖状高分子ポリピリジニウムは、リンタングステン酸と自己集合し、高分子ピリジニウム-タングステン錯体を与えた。この錯体を4-アルケノールの酸化的環化反応に付したところ、有機溶媒非存在下、過酸化水素水中にてテトラヒドロフラン誘導体が高収率で生成することを見出した。我々は,すでに金属と非架橋型両親媒性高分子配位子との自己組織化により不溶性超分子錯体の創製を行い,これが高活性で再利用可能な固相触媒として種々の有機変換反応に有用であることを見出している.今回,この独自の固相触媒調製法の概念を拡張すべく,金属が多座配位子を合成するとともに,その金属が多座配位子と錯形成を行うことで,一挙に不溶性超分子錯体が生成する金属執行型固相触媒調製系の確立を目指した.すなわち,具体的には,(1)金属が高分子の合成を行ない,(2)金属がその高分子との自己集合により不溶性超分子錯体を形成させ,(3)これを金属固相触媒として機能させるという,三工程を一挙に執行するシステム系の実現を検討した.その結果Ni(cod)_<2->(ニッケルビスシクロオクタジエン)が,末端にアリールホスフィン配位子を有し,アルキル鎖で結合した対称内部アルキンのオリゴマー化を進行させ,さらに生じた多座ホスフィン配位子と自己集合し,不溶性超分子ニッケル錯体が形成することを見出した.EDS,MAS ^<31>P-NMRの測定で,錯体中でのNi(0)-ホスフィン結合と未配位のホスフィンの存在を確認することに成功した.この錯体を固相触媒としてトリイン2の分子内環化三量化に付したところ,室温中24時間で対応する環化したベンゼン誘導体3を定量的に得た.現在,様々な反応系での適用ならびに触媒の再利用についても検討しているところである.一級アルコールを求核剤としたケトンのα-アルキル化反応を,本固相触媒反応のターゲットに設定した.ケトンのα-アルキル化は通常,ハロゲン化アルキルとケトンのアルカリ金属エノラートを用いて行われるが,ハロゲン化アルキルの毒性,環境への負荷の問題,さらにはモノアルキル化の反応制御の困難さなどの問題を呈していた.ハロゲン化アルキルの代わりに一級アルコールを用いることが可能であれば,生成物は所望のα-アルキル付加体,水のみであり,グリーンケミストリー,アトムエコノミーの要件を満たす.さらに再利用可能な固相触媒の活用により,本反応系の効率の向上が図られる.検討の結果,調製された不溶性パラジウム微粒子-高分子超分子nano-Pd-Vを固相触媒とし,塩基存在下,1-octanolを求核剤とした2-octanoneのα-アルキル化を行ったところ,所望のHexadecan-7-oneが得られた.また,再利用活性の有効性が見出された.興味深いことにこの反応は,脱気することなく空気中で進行することが明らかになった.さらに触媒は,濾過などの操作により生成物に混入することなく簡便に分離回収することが可能である.1我々は、鎖状高分子配位子と遷移金属化合物からの自己集合触媒介したトリスホスフィンを合成し、超分子錯体を生成するために種々の後周期遷移金属化合物を存在させる事で、金属を介したトリスホスフィンの集合化が起きた。

今回、より活性が高く調製の簡便な触媒創製を行うべく、両親媒性高分子担持Ptナノ粒子触媒の開発を行った。PS-PEG-NH2とZeise塩の錯体形成後、ベンジルアルコールで還元し、Ptナノ粒子を調製した。本Pt粒子を触媒としたアルコールの酸化反応は、水中酸素雰囲気下60°Cで効率的に進行し、また触媒の再利用が可能であった。4今回、ポリピリジニウムとリンタングステン酸から新しい固相触媒の創製を行なった。ビスピリジンとジブロモアルカンから調製される両親媒性鎖状高分子ポリピリジニウムは、リンタングステン酸と自己集合し、高分子ピリジニウム-タングステン錯体を与えた。この錯体を4-アルケノールの酸化的環化反応に付したところ、有機溶媒非存在下、過酸化水素水中にてテトラヒドロフラン誘導体が高収率で生成することを見出した。