hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ空孔で構築する機能性金属錯体ポリマーのナノ結晶の研究

金属ナノ微粒子に代表されるナノサイズの集合体は、量子サイズ効果により、ユニークな電気特性、光吸収、発光特性、および磁性を示すことが知られており、近年特に注目を浴びている。元々量子化された分子、特にd電子由来の特異な光学的・磁気的挙動を有する遷移金属錯体の結晶をナノメートルサイズで制御し、なおかつ規則的に基板上に固定することができれば、結晶中や規則配向させた結晶間での相互作用を大きく反映した量子効果が現れるはずであり、その状態での物性は非常に興味深い。本年度は、孤立分子とバルク結晶の間にある「ナノサイズの結晶」およびその配列体の構築法について、再現性の確立を目的として、数十数百nmで均一なハニカム構造を形成するポーラスアルミナを電極として、細孔の中に金属錯体であるプルシアンブルーのナノ結晶を形状、サイズを揃えてつくり、その物性を明らかにするとともに、ポーラスアルミナの溶解による、ナノ結晶の自己立脚型集積構造の作成を行い、その物性を調べた。実験は、まず、細孔径50nm、細孔長500nmで規則配列したポーラスアルミナにAuスパッタリングを行い、「界面上に細孔が配列したAu電極」を準備した。プルシアンブルーは、Au電極上に化学凝集を起こすことが知られていることから、凝集量と細孔体積を加味して種々の反応時間(230分)において化学凝集を行い、細孔内に取り込まれたプルシアンブルーを、SEM測定、顕微UV-Vis吸収測定、顕微IR測定などにより観察した。SEM像より、プルシアンブルーは、細孔内に取り込まれて結晶成長していることが確認された。金電極上にプルシアンブルーのナノ結晶をピラー状に固定化するために、酸処理によりポーラスアルミナを溶解したが、酸濃度、温度、時間により、ピラーの安定性が大きく変化することが、SEM像より明らかになった。プルシアンブルーのナノ結晶が細孔内で成長し、細孔形状に合わせてナノロッド(50×数100nm)を形成し、酸処理によって、細孔周期と同じナノピラーを作成できることを見出した意義深い知見である。また、顕微UV測定からは、プルシアンブルーのd - π吸収帯が50nmと顕著なblueシフトを示し、かつブロードな吸収帯として観測された。これについて、放射光を用いたXPS測定などを行うことで、1つのナノピラーは現時点で多結晶体であること、鉄イオンの価数が、通常のバルク結晶とは異なる比率で存在していることを、複数回の実験から再現性をとるとともに、確認した。このことは、プルシアンブルーがナノ結晶内においてバルク結晶とは異なる電子状態にあることを示しており、量子サイズ効果によるものだと結論付けられる。
ミヤコグサの土壌イオンストレス耐性遺伝子の探索とデータベース構築

ダイズ等の作物の生産性を高めるための一つの解決策は、環境から受けるストレスに対する耐性を向上させることです。そのためには、どのような耐性機構が働いているか、遺伝子レベルで突き止めることが重要です。この研究では、マメ科のモデル植物がストレスに応答してどのような遺伝子を発現させているか、悪い土壌環境から受けるストレスを中心にDNAチップを使って解析しました。データは一般公開を目的としています。根は養分・水分を吸収する装置である。そのため、植物の環境抵抗性を向上させるためには、根のイオン耐性を理解する必要がある。また、イオンの吸収・転送にも根のイオン耐性が関与するため、この形質は土壌汚染重金属の除去や可食部の重金属含量を低下させる品種改良には必要不可欠に結びついている。これまでに、シロイヌナズナを中心として進められているゲノム科学研究から、植物の根のイオン耐性には、ゲノムワイドの遺伝子発現が関与するとともに、耐性システムには特異的なものと、ジェネラルなものが存在すると考えられている。この解明には、比較ゲノム研究を進める必要があるため、本研究では整備が遅れているマメ科植物で、イオン応答性遺伝子の特定を目的として、マイクロアレイ解析を実施するとともに、そのデータ解析に必要なデータベース・解析プラットフォームの構築を目的とした。マイクロアレイに関しては、シロイヌナズナなどと類似の遺伝子発現が観察され、種を超える耐性遺伝子が存在する可能性が明らかとなった。データベース構築に関しては、マイクロアレイのアノテーテーション整備に準拠して、マイクロアレイチップの情報を付与することができた。尚、シロイヌナズナを用いた解析では、品種間差表現型による階層的クラスタリングが可能であることが明らかとなった。この手法は、次年度に行う、品種との耐性と耐性遺伝子の関係を解析する基盤技術として使用できることが明らかとなった。ストレス耐性植物を育種するためには、耐性に関与する遺伝子や障害に関わる遺伝子を特定することの意味は大きい。そのためには、ゲノムワイドな解析が可能なマイクロアレイデータを集積し、遺伝子発現ネットワークを解明することが有効であると考えられる。この研究では、不良土壌における生産性低下の原因となるイオンストレス応答を中心とする根の遺伝子発現を解析するために、ミヤコグサの根から抽出したRNAを用いて、オリゴcDNAアレイ解析を行っている。本年は、イオンストレスに加えて、リン酸欠乏ストレスに関するサンプルを調整して時間変化を含めてアレイデータを集積した。これらのデータは、次年度からデータベースへの公開する予定である。さらに、異なるイオン処理を行ったサンプルから、意味のある遺伝子情報を抽出する手法と、ネットワーク解析との整合性など、基本的な解析技術を開発するために、すでに多くのデータが公開されているシロイヌナズナのデータを用いて解析した。その結果、特異的応答を示す遺伝子群にはすでに機能が報告されている遺伝子(例えばアルミニウム耐性に関わるリンゴ酸輸送タンパク質や、銅耐性におけるメタルチオネイン合成タンパク質など)が見出されるとともに、全てのイオンストレスに共通する遺伝子には、活性酸素生成やカルシウムシグナルに関わる遺伝子が存在することが明らかとなった。これらの手法を用いて、次年度はミヤコグサ遺伝子発現のデータベースを構築すると共に、基本的な解析結果を公表するめどが立った。養分・水分を吸収する装置である根は、イオンの吸収・転送の機能を持ち、土壌汚染重金属の除去や不良環境耐性と、その耐性が結びついている。このような現象は、一つの遺伝子が関与するわけでなく、数多くの遺伝子が関与する。これには、植物ホルモンなどによる制御や、分化・細胞死などのプログラミングされている制御などが関わっていると考えられる。シロイヌナズナやイネなどでは既に、遺伝子発現に関して精力的にトランスクリプトーム解析のデータが集積されている。ここでは、シロイヌナズナの知見を踏まえ、マメ科植物のミヤコグサにおいて、遺伝子発現データを集積することを目的とした。昨年までに行った、イオン処理、植物ホルモン処理、リン酸欠乏処理に加えていくつかのストレスに関してデータを獲得し、順次かずさDNA研究所のKappa Viewerデータベースに公開することが可能となった。試験的に非公開の形で動作確認を行い、操作性に問題がないことを確かめた。さらに、アルミニウムイオンストレスに関しては経時的なデータも集積し、全てのアレイが凡そ100データとなり、ネットワーク解析が実用的に可能になったため、金平糖アルゴリズム解析により遺伝子発現ネットワークモジュールを検出した。これらについては、プロモーター領域のシーケンスが公表されているものに関しては、シス配列を推定した。これらのデータを今後は、Kappa-view及びPPDBにおいて、2010年中には一般向けに公表する準備が整った。
地形プロセス，地形発達，空間情報の融合による表層崩壊の時空間解析へ向けた新展開

表層崩壊がいつ,どこで発生するかを予測することは,近年頻発する土砂災害の予測のために必要不可欠な地形学的課題である.本研究では,近年豪雨によって土砂災害が生じた西日本の山地・丘陵地に複数の対象地域を設定し,地形学の多様な手法を組み合わせて,崩壊の発生条件や発生履歴を明らかにする.さらに,空間情報技術によりこれらの成果を結びつけ,豪雨に伴う地形変化の実態を多角的に分析し,表層崩壊の発生場所の予測に有益な情報を導出することを試みる.表層崩壊がいつ,どこで発生するかを予測することは,近年頻発する土砂災害の予測のために必要不可欠な地形学的課題である.本研究では,近年豪雨によって土砂災害が生じた西日本の山地・丘陵地に複数の対象地域を設定し,地形学の多様な手法を組み合わせて,崩壊の発生条件や発生履歴を明らかにする.さらに,空間情報技術によりこれらの成果を結びつけ,豪雨に伴う地形変化の実態を多角的に分析し,表層崩壊の発生場所の予測に有益な情報を導出することを試みる.
高速点火ターゲット用低密度材料とそのカプセル技術の開発

本研究はレゾルシノールとホルマリン(RF)重合時に反応体の比率と反応条件を変化した、低ポリマー濃度ゲル化を実現する。今までそのRFエアロゲルの最も低い密度は0.037g/ccであると算出できた。高粘度溶液はO/W/SOエマルジョン方法により薄膜カプセルが必要である。従来のレシノル、フォルムアルデヒド(RF)が使われてきたが、溶液としての粘度に限界があり、カプセルの壁厚は50-100μmとなった。反応体の比率の変化によりゲル化中O/W/SOエマルジョン製造最適な粘度(9×10^<-5>m^2/s)のRF溶液を得る。この高粘度RF溶液を使用して、カプセルの壁厚は20μmとなった。高速点火基礎実験用ターゲットの壁厚要求を満足させる。ゲルは超流体CO_2乾燥により溶媒アセトンを抽出し、エアロゲルとする。反応体比率と異なって、高分子チェーンがクロスリンク構造形成時に従来のRFエアロゲルにより小さくサイズ均一な孔があった。平均孔径は80±10nmである。以前のRFの平均孔径は120±10nmである。新20μmRFカプセルシェルの小さく多孔質構造は高速点火基礎実験の液体重水素と三重水素燃料担持へ応用する。エアロゲルターゲットの低密度化ために乾燥に収縮のメカニズムが明らかにした。収縮の制御ためにダブルネットワークゲル(DNゲル)が高速点火基礎実験用ターゲットの製造へ応用する。ダブルネットワークゲルがレゾルシノールとホルマリン(RF)重合時に直鎖の高分子Carrageenanゾルを入って、RFゲル化の後でカルシウムイオン(Ca^<2+>)外から浸透によりCarrageenanゲル化を実現する。そのダブルネットワークゲルに直鎖の高分子Carrageenanを含む、強度がシングルネットワークRFにより高くなる。エアロゲルが多孔質構造壊れずに強度の高いものになって、収縮の制御ができた。また、ダブルネットワークゲルの場合、生じた亀裂の周辺の応力が分散され、多孔質構造の均一性を高まる。ダブルネットワークゲルが高速点火基礎実験の液体重水素担持へ応用して、ウェイジターゲットを製造した。本研究は2,4,6-トリヒドロキシ安息香酸/ホルムアルデヒド(PF)(フェノール-ホルムアルデヒド樹脂に化学的性質が似ているポリマー)重合体をまずエマルジョン法より薄膜カプセル化し、後カプセルをゲル化する。2,4,6-トリヒドロキシ安息香酸/ホルムアルデヒド(PF)は通常の樹脂レゾルシノールとホルマリン(RF)類似した、2,4,6-トリヒドロキシ安息香酸とホルマリンを塩基性で重合させる。2,4,6-トリヒドロキシ安息香酸はホルマリンと重合時に直鎖高分子を形成させ、水素結合架橋により直鎖高分子チェーンがクロスリンク構造を形成させる。そのため高粘度PF溶液を合成できる。高粘度PF溶液はO/W/SOエマルジョン方法により薄膜カプセルが必要である。触媒NaOHの濃度制御により40時間を経てO/W/SOエマルジョン製造最適な粘度(9×10^<-5>m^2/s)のPF溶液を得る。この高粘度PF溶液を使用して、カプセルの壁厚は17μmとなった。PFゲルは超流体CO_2乾燥により溶媒アセトンを抽出し、エアロゲルとする。RFのゲル化のメカニズムと異なって、多孔質構造はRFエアロゲルのにより十分に小さくサイズ均一な孔があった。ゲル化を実現する。平均孔径は32±10nmである。RFの平均孔径は120±10nmである。PFカプセルシェルの小さく多孔質構造は高速点火基礎実験の液体重水素と三重水素燃料担持へ応用する。乾燥に収縮のメカニズムが明らかにした。極性の異なる有機溶媒に置換して、PFエアロゲルの収縮とナノ構造の制御ができる。密度は0.142g/ccであると算出できた。高速点火基礎実験用ターゲットの低密度要求を満足させる。

エアロゲルターゲットの低密度化ために乾燥に収縮のメカニズムが明らかにした。収縮の制御ためにダブルネットワークゲル(DNゲル)が高速点火基礎実験用ターゲットの製造へ応用する。ダブルネットワークゲルがレゾルシノールとホルマリン(RF)重合時に直鎖の高分子Carrageenanゾルを入って、RFゲル化の後でカルシウムイオン(Ca^<2+>)外から浸透によりCarrageenanゲル化を実現する。そのダブルネットワークゲルに直鎖の高分子Carrageenanを含む、強度がシングルネットワークRFにより高くなる。エアロゲルが多孔質構造壊れずに強度の高いものになって、収縮の制御ができた。また、ダブルネットワークゲルの場合、生じた亀裂の周辺の応力が分散され、多孔質構造の均一性を高まる。ダブルネットワークゲルが高速点火基礎実験の液体重水素担持へ応用して、ウェイジターゲットを製造した。
高圧凍結技法によるラット単離胃底腺粘液・漿液流動動態の組織化学的研究

1.ラット単離胃底腺を作製し形態観察を行なった結果、試料作製時のコラゲナーゼ処理等によって単離胃底腺の多くが峡部付近で分断されることが判明した。そこで、コラゲナーゼ処理等を必要としない単離胃粘膜モデルの開発に着手し、より生体の胃粘膜に近い組織形態を保ちながらヒスタミン等の試薬に速やかな反応性を示す「ラット単離胃粘膜モデル」の新規開発に成功した。微細形態保持に優れる高圧凍結技法を応用し、このラット単離胃粘膜モデルにおけるヒスタミン刺激壁細胞の動態を解析した結果、従来の化学固定法では捉えられなかった「細管小胞が頂上膜に融合する像」を明確に捉えることに成功し論文報告した。このラット単離胃粘膜モデルでは副細胞や主細胞などの形態も良好に保たれており、胃粘膜研究の新たな実験モデルとして更なる応用が期待される。2.胃底腺壁細胞は摂食後の酸分泌状態と、食間から食前にかけての休止状態を繰り返すが、酸分泌状態から休止状態へ移行する「酸分泌後回復期壁細胞」の動態は不明な点が多い。我々は上記1.ラット単離胃粘膜モデルの応用により酸分泌後回復期壁細胞モデルを確立した。これは24時間絶食後のラットに再摂食させて胃酸分泌を刺激し、単離した胃粘膜小片を酸分泌抑制剤であるシメチジンを添加した培養液中で処理するものである。高圧凍結技法を応用して回復期壁細胞の形態変化やプロトンポンプの局在変化を経時的に解析した結果、免疫組織化学における抗プロトンポンプ抗体陽性反応が頂上膜から細胞内へと移行する所見や、抗プロトンポンプ抗体で標識される多重膜構造が壁細胞内に形成され、後にライソゾーム内で処理される形態像が電顕レベルで明らかとなり、論文報告した。この酸分泌後回復期壁細胞モデルの確立により、酸分泌状態から休止状態へ移行する壁細胞の形態変化や、プロトンポンプを有する細胞膜動態の解明が加速されるものと期待される。1.ラット単離胃底腺を作製し形態観察を行なった結果、単離された胃底腺の多くが試料作製時のコラゲナーゼ処理等によって、腺の一部で分断されることが判明した。そこで、我々はコラゲナーゼ処理等を必要としない単離胃粘膜モデルの開発に着手し、より生体の胃粘膜に近い組織形態を保ちながら、ヒスタミン等の試薬に速やかな反応性を示す「ラット単離胃粘膜モデル」の開発に成功した。そして、ヒスタミン刺激壁細胞の動態を解析した結果、従来の化学固定法では捉えられなかった「細管小胞が頂上膜に融合する像」を高圧凍結技法の良好な微細形態保持によって明確に捉えることに成功した。このラット単離胃粘膜モデルでは副細胞や主細胞などの形態も良好に保たれており、胃粘膜研究の新たな実験モデルとしてさらなる応用が期待される。2.動物試料に高圧凍結を施す際に、従来は主に既製のアルミニウム製キャリアが使用されてきたが、アルミニウムの強度で2,100barの高圧に耐えるためには少なくとも100μmの厚さを必要とし、ラット胃底腺を試料とした我々の経験では平均して40-50μmの硝子様凍結深度を得るにとどまっていた。そこで、強度に優れたステレンスの特性に着目し、厚さ10μmのステレンス箔から作製した直径3mmのプレートを組み合わせたキャリアを独自に考案した。試用の結果、10μmのステンレス製プレートは2,100barの高圧にも耐えて変形せず、平均して70-80μm、胃底腺表層部では120μmを超える硝子様凍結深度が得られたため、「ステンレス箔を用いた新たなサンプルキャリアの開発」として論文報告した。今後、高圧凍結技法による動物試料の微細形態解析がさらに促進されるものと期待される。高圧凍結技法を応用して回復期壁細胞の形態変化やプロトンポンプの局在変化を経時的に解析した結果、免疫組織

化学における抗プロトンポンプ抗体陽性反応が頂上膜から細胞内へと移行する所見や、抗プロトンポンプ抗体で標識される多重膜構造が壁細胞内に形成され、後にライソゾーム内で処理される形態像が電顕レベルで明らかとなり、論文報告した。この酸分泌後回復期壁細胞モデルの確立により、酸分泌状態から休止状態へ移行する壁細胞の形態変化や、プロトンポンプを有する細胞膜動態の解明が加速されるものと期待される。
チロシンホスファターゼPTPεCのがん抑制機構

細胞の増殖・癌化およびがんの浸潤・転移においてタンパク質のリン酸化を介したシグナル伝達が重要な役割を果たしていることが明らかにされてきた。本研究は、がん細胞の増殖・転移に関わるシグナル伝達に対するプロテインホスファターゼの作用を解析し、それにより、がん細胞シグナル伝達の未知の制御機構を明らかにし、新たな抗癌剤や治療プロトコールの開発に向けての基礎的データを得ようとするものである。まず、チロシンホスファターゼPTPεCが、in vivo環境において、白血病細胞の増殖あるいは転移を抑制することを発見したので、その分子基盤の解明を目指した。野生型または不活性変異型PTPεCトランスジェニックマウスの作製・解析を行ったが、PTPεCの発現が高いマウスは、残念ながら、系統を維持することができなかった。野生型または不活性変異型PTPεCを構成的に発現させた細胞株を用い、PTPεC結合分子の生化学的精製を行い、いくつかのチロシンリン酸化タンパクが、不活性変異型PTPεC特異的に結合することが分かった。また、1型Ser/Thr残基特異的プロテインホスファターゼ、PP1によるRafキナーゼ制御機構について解析を行った。細胞内において、PP1とRaf-1が複合体を形成しており、増殖因子やTPAによるRaf-1キナーゼの活性化にPP1が重要であることを明らかにした。PP1は、Raf-1のSer43およびSer259のリン酸化を抑制してRaf-1の活性化に関わることを示唆する結果を得た。B-Rafの活性化にも、PP1が重要であることが示唆された。
三次元カルベン錯体を基盤とした多機能性動的球状集合体の創出

アダマンタン誘導体とイミダゾリウム塩またはベンズイミダゾリウム塩を連結した三脚性配位子群を合成し、酸化銀との反応により高収率で三次元カルベン錯体群を構築した。単結晶X線構造解析により、ねじれたらせん状の三次元構造であった。これらの錯体は非極性溶媒中で静電相互作用および溶媒効果により、球状集合体を生成した。また、カルベン金錯体を作製し、同様の条件下ではサイズの小さい球状集合体が形成していた。低温にすると球状集合体のサイズが増大し、凍結乾燥によりファイバーへと形態変化することが分かった。さらに、長鎖アルキル基を導入した三次元錯体からは、極性溶媒中でベシクルを生成することを明らかにした。本研究は、対イオン・金属交換、ゲスト分子添加などの外部刺激に応じて構造や機能が変化する多機能性動的球状集合体の創製を目的としている。イミダゾリウム塩を有する多座有機分子と多様な金属による三次元錯体群を構築する。これらを基盤として、球状集合体を形成させる。従来の球状集合体にはない高次構造や特異な機能・物性を探索する。これまでに、イミダゾリウム塩を有する三置換アダマンタンを合成し、酸化銀との反応により三次元錯体を得た。また、金属交換を通じてAu錯体へと誘導した。この金属が異なる三次元錯体は、サイズの異なる球状集合体を形成する。初年度は、より大きなかご型やカプセル型錯体の合成、これを構成単位とする球状集合体の構築を通して、形状・サイズの構造・物性制御を検討した。1.より大きな三次元錯体を構築するために、イミダゾリウム塩を有する三置換アダマンタン配位子をさらに伸長した配位子を合成した。これと酸化銀との反応によりAg錯体を高収率で得た。これを混合溶媒に溶かし、走査型電子顕微鏡(SEM)、動的光散乱(DLS)測定を行った。その結果、直径約200 nmの球状集合体が生成した。2.三次元錯体のイミダゾリウム塩の置換基の効果を調べるために、エチル基にかえて長鎖アルキル基を導入した。この配位子から、同様に錯体を高収率で得た。この錯体から条件によって球状集合体の他に、長鎖アルキル基の影響によってファイバーを生成する。3.形状の異なる三次元錯体を構築するため、新規カプセル型錯体の構築を行った。折れ曲がり部位をもつ三置換アダマンタン配位子を合成し、酸化銀との反応によりカプセル型錯体を構築した。これを混合溶媒に溶かし、SEM・DLSの測定を行ったところ、直径約300 nmの球状構造が生成した。本研究は、外部刺激・環境に対応して構造や機能が変化する多機能性動的球状集合体の創製を目的としている。多座有機分子と多様な金属による有機金属結合からなる三次元錯体群を構築する。これらが自己集合した球状集合体について、従来の球状集合体にはない高次構造や特異な機能・物性を探索する。これまでに、多種多様な三座配位子からサイズや形状の異なる三次元錯体を構築した。また、側鎖に置換基を導入した錯体、対イオンの異なる錯体の作製に成功している。これらの三次元錯体群は、各種有機溶媒中で錯体の構造・化学特性に対応してサイズの異なる球状集合体を形成した。本年度は、ベンズイミダゾリウム塩をもつ配位子からの三次元錯体の構築と三次元錯体群からなる分子集合体の作製とその動的挙動・相転移を調査した。1.ベンズイミダゾリウム塩をもつ三座配位子を合成した。これと酸化銀との反応により三次元錯体を高収率で得た。単結晶X線構造解析により、ねじれた三次元錯体であることを明らかにした。これを混合溶媒に溶かしたところ球状集合体の生成を確認した。イミダゾリウム塩からなる三次元錯体の球状集合体と比較して、アセトニトリル/トルエン中では球状集合体のサイズは小さかった。2.イミダゾリウム塩をもつ三座配位子から形成された三次元錯体の結晶化過程を調べた。アセトニトリル/ジオキサンから錯体の単結晶が得られる。結晶化までの経時変化について、走査型電子顕微鏡を用いて調べたところ、単結晶の生成までに球状集合体を経由することが分かった。3.有機溶媒中にカーボンナノチューブを加え、三次元錯体を滴下したところカーボンナノチューブが分散した。さらに三次元錯体を加えたところ、カーボンナノチューブが溶解した。これは、カチオン性の三次元錯体とカーボンナノチューブ間の静電的な相互作用に由来すると思われる。これまでに、アダマンタン骨格をもつ多種多様な三座配位子からサイズや形状の異なる三次元カルベン錯体を構築した。また、側鎖に多様な置換基を導入した、対イオンの異なる錯体の作製に成功している。これらの三次元錯体群は、各種有機溶媒中でカルベン錯体の構造・化学特性に対応してサイズの異なる球状集合体を形成した。さらに、CNTやπ系有機分子と相互作用することを示した。本年度は、以下の項目について実施した。1.トリフェニルメタンをイミダゾリウム塩で連結した剛直な骨格を有する三脚性配位子を合成した。

これと酸化銀との反応により三次元錯体を高収率で得た。これを混合有機溶媒に溶かし、走査型電子顕微鏡(SEM)測定を行ったところ、サイズの小さい球状集合体および無定形の凝集体の生成を確認した。トリフェニルアダマンタンとイミダゾリウム塩を連結した配位子からなる三次元錯体の球状集合体のほうがサイズが大きく、明確な球状構造であった。すなわち、三次元錯体中のアダマンタン部位が球状集合体の生成に重要であることが示唆された。2.トリフェニルメタンとイミダゾリウム塩をメチレン基で連結した柔軟な骨格をもつ三脚性配位子を合成した。これと酸化銀との反応によりカルベン錯体を高収率で得た。3.トリフェニルアダマンタンとイミダゾリウム塩をメチレン基で連結した柔軟な骨格をもつ三脚性配位子を合成した。酸化銀との反応からカルベン錯体を高収率で得た。これを混合有機溶媒に溶かし、SEM測定を行ったところ、剛直な骨格を有する三次元錯体からの球状集合体のサイズとほぼ同等であった。したがって、球状集合体のサイズや安定性は、三次元構造より静電相互作用などの弱い相互作用が重要であることが示された。アダマンタン誘導体とイミダゾリウム塩またはベンズイミダゾリウム塩を連結した三脚性配位子群を合成し、酸化銀との反応により高収率で三次元カルベン錯体群を構築した。単結晶X線構造解析により、ねじれたらせん状の三次元構造であった。これらの錯体は非極性溶媒中で静電相互作用および溶媒効果により、球状集合体を生成した。また、カルベン金錯体を作製し、同様の条件下ではサイズの小さい球状集合体が形成していた。低温にすると球状集合体のサイズが増大し、凍結乾燥によりファイバーへと形態変化することが分かった。さらに、長鎖アルキル基を導入した三次元錯体からは、極性溶媒中でベシクルを生成することを明らかにした。本年度は、構造・化学特性が異なる三次元錯体と球状集合体ライブラリーを用いて、外部刺激・環境(温度、溶媒、金属・対イオン、ゲスト分子添加)に応じた球状集合体の構造転換などの動的挙動を検討した。1.三次元錯体および球状集合体において、N-ヘテロ環部位や側鎖置換基、対イオンの影響、2.球状集合体を経由した単結晶への相転移、3.温度変化による球状構造から他の集合体への形態変化、4.ゲスト分子添加による球状集合体のサイズ、安定性の改変や形態変化、に着目して研究を行った。1.に関して、ベンズイミダゾリウム塩をもつ三座配位子に変えても同様にねじれたらせん様の三次元錯体であった。混合溶液中では、ベンズイミダゾリウム塩をもつ三座配位子から生じた三次元錯体の球状集合体の方がサイズは小さかった。2.に関して、アセトニトリル/ジオキサン混合溶媒中で、球状集合体を経由した単結晶への相転移が観測された。ほかの溶媒も同様に行ったが、単結晶へと相転移する溶媒はなかった。この結果から、ジオキサンの配位性や固体におけるパッキングに影響を及ぼしていると思われる。3.に関して、三次元錯体群を極性が低い混合溶媒に溶かし、低温にすると球状集合体のサイズが変化し、そしてネットワーク凝集体へと形態変化した。凍結乾燥するとファイバーへと形態変化することが示された。4.カチオン性の三次元錯体からなる球状集合体によって、カーボンナノチューブを分散・溶解できることが分かった。アダマンタン部位の効果を調べるために環状分子を構築した。各種溶媒中で中空球状・ネットワーク集合体を形成することから、アダマンタンの脂溶性が分子集合体の生成に重要であることが分かった。
階層構造を有するエラスチン由来人工細胞外マトリックスの構築

エラスチンは血管、靭帯、皮膚などに多く含まれる細胞外マトリックスタンパク質であり、組織の弾力性保持に重要な役割を果たしている。エラスチン分子の特徴的な繰り返しアミノ酸配列を模したポリペプチドはエラスチン由来ポリペプチド(ELP)と呼ばれ、自己集合性と優れた力学特性を持つため、生体材料として有用である。本研究では、天然エラスチン組織に見られるファイバー状組織体を形成しうる新規なELPの開発と、それを利用した生体模倣人工細胞外マトリックス(artificial Extracellular Matrix, aECM)の作製を目的とした。昨年度までに、天然エラスチン分子の二種類の疎水性ドメインの偏った分布を模倣したブロックELPを新たに開発し、これが水中で温度刺激、あるいは、有機溶媒の添加によって自己集合して数珠状構造を有するナノファイバーを形成することを報告した。本年度は、得られたファイバーを利用してaECMの構築を進めた。ブロックELPの温度応答性に起因してファイバーが低温で分解する問題点を解決するために、架橋可能な配列を付加した新規なブロックELPを作製した。架橋剤を用いて反応を行うことにより、ファイバーの分解が抑制され、広い温度範囲で利用可能なナノファイバーが調製できた。さらに、ヒト真皮のECM構造に倣ったaECMを、ゼラチンとELPナノファイバーの混合分散液を電界紡糸することにより作製した。作製したaECMの引張試験の結果から、ELPナノファイバーの添加がaECMの弾性率を低下させることがわかった。ELPナノファイバーがaECMの力学特性を制御しうる有用な構成要素であることが示された。また、作製したaECMは細胞毒性を示さないことを確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。エラスチンは、血管や皮膚に含まれるタンパク質であり、組織の弾力性保持に重要な役割を果たす。エラスチンの示す低弾性率や復元性は、エントロピー弾性を示すエラスチンモノマー分子が自己集合し、高度に架橋した階層構造を形成することで発現する。近年、エラスチンのその力学特性、自己集合性から、エラスチン由来ポリペプチド(ELPs)が化学的や遺伝子工学的手法などにより作製され、生体適合性や優れた力学特性などを示す代替材料として期待されている。しかしながら、これらのポリペプチドから天然エラスチンに見られる集合構造を得るのは未だに困難である。本研究の目的は構造の制御されたエラスチン由来ブロックポリペプチドからなる集合体をビルディングユニットとして、生体に見られるような階層構造を持つ再生医療のための足場材料を構築することである。本年度では、温度や有機溶媒といった因子が作製したエラスチン由来ブロックポリペプチドの自己集合過程にどのように影響を与えるかを詳細に調べた。まず、温度刺激の効果について調べた結果、作製したブロックポリペプチドが水中で、45°C、1週間放置すると、自己集合により均一かつ柔軟なナノファイバーが形成する現象を見出した。一方、単独の各構成ブロックは同じ条件下で粒子と短いフィブリルしか形成しないことから、天然エラスチン分子を単純化したブロック構造の重要性が示された。そして、自己集合過程について原子間力顕微鏡(AFM)により、作製したELPsが高温で初めてナノサイズの粒子を形成する現象が観察された。時間が経つと、粒子と粒子がさらに相互作用して、数珠状のナノファイバーが形成する。この集合体は今までのELPsの自己集合の報告例と違い、別の集合体を形成した。このファイバーは長時間水中でよく分散するため、材料作製プロセスにおいて有用であると考えられる。また、有機溶媒である2,2,2-Triflouroethanolの添加重を変えることにより、ナノファイバーや粒子を作り分けることができ、水中における自己集合の系と比べるとファイバー形成がより促進される。今後、これらのナノファイバーの力学特性の評価とともに、ナノファイバーをビルディングユニットとして組み立て、生体材料を構築すると考えている。エラスチンは血管動脈をはじめ、靭帯、皮膚などに多く含まれる細胞外マトリックスタンパク質であり、組織の弾力性保持に重要な役割を果たしている。本研究では新規なエラスチン由来ポリペプチドを作製し、それが形成する集合体構造を制御することにより、天然エラスチンの特色である低弾性率と引張りに対するすぐれた復元性を有する足場材料を構築することを目的とする。昨年度までに、天然エラスチン分子の二種類の疎水性ドメインの偏った分布を模倣したELPを新たに開発し、これが水中で温度刺激によって自己集合して数珠状構造を有するナノファイバーを形成することを報告した。本年度は、ペプチドの二次構造の変化を誘導する有機溶媒である2,2,2-Trifluoroethano1 (TFE)がELPの自己集合にどのような影響を与えるかを系統的に調べた。その結果、TFEの濃度が10-30%の範囲において、水中でのファイバー形成と類似した数珠状のナノファイバー形成が見られた。この濃度範囲においてはTFEの濃度が高いほど、ファイバー形成が促進されることもわかった。集合体の二次構造もTFEの添加量によって制御が可能であった。得られたファイバーは溶媒中によく分散し、取り扱いが容易であることから、バイオマテリアルの構築に向けて有用な素材が作製できたと言える。

エラスチン分子の特徴的な繰り返しアミノ酸配列を模したポリペプチドはエラスチン由来ポリペプチド(ELP)と呼ばれ、自己集合性と優れた力学特性を持つため、生体材料として有用である。本研究では、天然エラスチン組織に見られるファイバー状組織体を形成しうる新規なELPの開発と、それを利用した生体模倣人工細胞外マトリックス(artificial Extracellular Matrix, aECM)の作製を目的とした。昨年度までに、天然エラスチン分子の二種類の疎水性ドメインの偏った分布を模倣したブロックELPを新たに開発し、これが水中で温度刺激、あるいは、有機溶媒の添加によって自己集合して数珠状構造を有するナノファイバーを形成することを報告した。本年度は、得られたファイバーを利用してaECMの構築を進めた。ブロックELPの温度応答性に起因してファイバーが低温で分解する問題点を解決するために、架橋可能な配列を付加した新規なブロックELPを作製した。架橋剤を用いて反応を行うことにより、ファイバーの分解が抑制され、広い温度範囲で利用可能なナノファイバーが調製できた。さらに、ヒト真皮のECM構造に倣ったaECMを、ゼラチンとELPナノファイバーの混合分散液を電界紡糸することにより作製した。作製したaECMの引張試験の結果から、ELPナノファイバーの添加がaECMの弾性率を低下させることがわかった。ELPナノファイバーがaECMの力学特性を制御しうる有用な構成要素であることが示された。また、作製したaECMは細胞毒性を示さないことを確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。作製したエラスチン由来ブロックポリペプチドの水中における自己集合過程に温度や有機溶媒の効果を詳細に検討することにより、デザインしたブロックの意味を明らかにすることができた。また、得られたナノファイバーである集合体は均一かつフレキシブルで、水中においても分散性がよく、材料作製際に期待できると考えられる。昨年度までの成果を、今年度は原著論文2報、解説論文1報にまとめた。今年度はこれらの成果をもとに発展的研究を行い、作製したポリペプチドの自己集合についてさらに理解を深めることができた。また、ナノファイバー形成の効率化と、ナノファイバー分散液の組成の多様化が達成されたため、今後の応用研究が非常に進めやすくなった。得られた集合体を薄膜にし、引っ張り試験による材料の力学特性評価などを行っていく。このことにより、集合体構造・機能(力学特性)の相関を解明する。さらに、ファイバー形成に重要な役割をする(VGGVG)配列のほかにさまざまな自己集合性を示すドメインを変えて、新規なエラスチン由来ブロックポリペプチドの種類を拡張する。その他に、コラーゲンの変性体であるゼラチンとハイブリッド材料として、エレクトロスピニング手法で、生体と近い構造を構築する。
ヒト精子膜上のカルシウム依存性シグナル伝達物質h-sp-1に関する研究

平成6年度より、ヒト精巣cDNAライブラリーより分離したヒト精子に発現しかつカルシウム依存性シグナル伝達機構に関与しているヒトsynaptophysinと唯一43%のhomologyを示した遺伝子h-sp-1のコードする蛋白の性状分析をおこなってきた。平成7年度は以下の実験をおこなった。(方法)1.h-sP-1遺伝子より類推したアミノ酸配列のなかで最も抗原性の強い部分と考えられた25アミノ酸(h-sp-1のaa174-198)配列を合成した。この合成ペプチドh-sp-1(174-198)を用いて、ウサギ及びBalb/cマウスを免疫した。2.各抗血清を用いてヒト精子に対する間接蛍光染色を行い、その局在を検索した。3.受精現象に対する影響を調べるため、ヒト精子不動化試験、透明帯除去ハムスター卵へのヒト精子侵入に対する阻害作用を調べた。(結果)1.h-sp-1(174-198)に対する抗血清の反応性をELISA法にて確認した。2.ウサギ抗血清は、メタノール固定したヒト精子の頭部を染色した。3.ヒト精子不動化活性はみとめなかった。しかし、ハムスター試験で有為にヒト精子のハムスター卵への侵入を阻害した。(結論)ヒト精子に発現するh-sp-lがコードする蛋白は、ヒト精子頭部に存在していることが明らかになった。さらに、ヒト精子の卵細胞への侵入過程に関与していることが明らかになった。1.モノクロール抗体の作成当初遺伝子hsp-1を発現ベクターに組み込み大腸菌で蛋白を合成してこれを用いて抗血清及びモノクローナル抗体を作成することを予定していたが、予定していたpQEベクターを用いた大腸菌での同遺伝子蛋白の発現が成功しなった。そこで、さらに種類の異なった各種ベクター及び大腸菌をもちいてその発現を試みたが現在までのところ成功に至っていない。これは、一つにはこの遺伝子hsp-1がコードする蛋白が、大腸菌自体にとり非常に致死的な影響をもつものではないかと推察できる。そこで、上記の方法とは別に、遺伝子hsp-1のDNA配列を基に合成ペプチドを作成して、これをもちいて抗血清を作成し以後の研究を行なった。抗血清の作成に際しては、遺伝子hsp-1がコードするアミノ酸を基にcomputar analysis(hydoropathy、flexibility)を行ない、抗原エピトープの可能性が最も高い領域を推定してペプチド合成を行った。その結果174-198の位置にある25アミノ酸残基が適当と考え、これを合成し、これにKLHを結合させ、完全フロイドアジュバントと共にウサギ及びマウスに免疫した抗血清を作成した。2.抗合成ペプチドhsp-1(174-198)血清を利用した対応抗原の解析(1)抗血清を用いて、メタノール固定したヒト精子を間接蛍光抗体法にて染色したところ精子頭部を染色することが判明した。しかし、liveの精子の染色では、明らかな染色領域はみいだせなかった。(2)抗血清をもちいて透明帯除去ハムスター卵へのヒト精子進入阻止実験を行ったところ、対照抗血清(KLHのみ免疫したもの)に比べて、有意にヒト精子のハムスター卵への進入を阻害する事が明らかになった。(目的)我々はヒト精子膜抗原に対するマウス抗血清を用いてヒト精巣cDNAライブラリーを検索し、ヒト精子に発現している遺伝子h-sp-1を分離することに成功した。そして、この遺伝子は、カルシウム依存性シグナル伝達機構に関与しているヒトsynaptophysinと唯一43%のhomologyを示してた。この遺伝子h-sp-1のコードする蛋白分子の性状分析を目的として以下の研究をおこなった。(方法)1. h-sp-1遺伝子より類推したアミノ酸配列のなかで最も抗原性の強い部分と考えられた25アミノ酸(h-sp-1のaa174-198)配列を合成した。2.各抗血清を用いてヒト

精子に対する間接蛍光染色を行い、その局在を検索した。3.受精現象に対する影響を調べるため、ヒト精子不動化試験、透明帯除去ハムスター卵へのヒト精子侵入に対する阻害作用を調べた。(結果)1. h-sp-1 (174-198)に対する抗血清の反応性をELISA法にて確認した。2.ウサギ抗血清は、メタノール固定したヒト精子の頭部を染色した。3.ヒト精子不動化活性はみとめなかった。しかし、ハムスター試験で有為にヒト精子のハムスター卵への侵入を阻害した。(結論)ヒト精子に発現するh-sp-1がコードする蛋白は、ヒト精子頭部に存在していることが明らかになった。さらに、ヒト精子の卵細胞への侵入過程に関与していることが明らかになった。今後、さらに先体反応に対するカルシウム依存性シグナル伝達機構への関与について検討中である。
新たに見いだされたアルコール脱水素酵素遺伝子の生体内機能についての研究

ヒトのゲノムに見いだされたアルコール脱水素酵素遺伝子ADH6の産物は、これまでに同定されているアルコール脱水素酵素のアイソザイムの構造との比較からクラスIアイソザイムに近縁の新たなクラスに属することが推測された。SunとPlappの分子進化学的な解析によれば、この新しいクラスの遺伝子は、約630万年前にI、II、IIIの3つのクラスが分岐した後、約520万年前にクラスIとの共通祖先遺伝子から分岐したものと算定され、このことからこれら4つのクラスの遺伝子はすべての脊椎動物に存在する(あるいは、かつて存在していた)と推定されている。マウスにおいてADH6に相同な遺伝子の発現分布を明かにすることは、その生体内での役割を解明する重要な手がかりになると考えられる。マウスの諸臓器から分離したRNA10mugについて、ヒトcDNAクローン(A8)をプローブとしたノーザンブロットハイブリダイゼーション法を行い、発現の組織分布を調べた。肝、腎、心臓、脳、胸腺、精巣には発現を検出できなかった。また、副腎において18sリボゾームRNA付近に薄いバンドが見られたが、これがADH6相同遺伝子の発現を示すものであるかはさらに検討を要する。一方、同一の反応条件でヒトのクラスIcDNAクローン(pADHbeta14)をプローブとした場合には、肝、副腎、腎にこの順の強さで単一の大きさのバンドが認められ、心臓、脳、胸腺、精巣には発現を検出できなかった。以上によりマウスのADH6相同遺伝子は、クラスI遺伝子とは異なる発現様式を示し、それゆえに特異な役割を果たしていることが示唆された。
トクヴィルと20世紀の政治理論-自由民主主義の形成についての思想史的研究-

本研究の目的は、20世紀の政治理論、特にいわゆる自由民主主義の形成とトクヴィルの政治思想との関連を冷戦の終結と「新たな」資本主義の世界化という今日の状況において再考することを目的としている。すなわち、「新自由主義」の主導する経済のグローバライゼーションは新たな貧困や格差を世界大で意識化させ、アメリカの「帝国化」はアメリカのデモクラシーの見直しを迫り、民主化の課題が自由主義圏を越えて旧社会主義圏はもとより、非西洋の全域に拡がろうとしている。欧米の自由民主主義国においては、共和主義、コミュニタリアニズム、多文化主義、市民社会論といった立場からする自由主義の相対化が試みられ、非西洋地域においては、中国、インドのような経済発展の著しい諸国において経済発展と政治的民主化の跛行性が種々の問題を生み、他方では、ラテンアメリカのいくつかの反米左翼政権に見られるように、アメリカの帝国的支配とグローバライゼーションに対する新たな挑戦がなされている。これら現代の理論的実践的諸問題とトクヴィルの理論や分析との関連を問い、トクヴィルの政治思想そのものの読み直しを試みた。以上の問題意識の下に行った2年間の研究を通じて確認された主な知見を以下に列挙する。(1)冷戦の終結とソ連社会主義の崩壊は社会主義に対する自由民主主義の勝利を明らかにしたが、アメリカの覇権の下に進むグローバライゼーションは、アメリカ・モデルの世界化をもたらしたわけではなく、それへの種々の反発を生み、宗教勢力の政治的影響力の増大、格差と不平等の拡大、「社会資本」の減衰と公共生活の縮小といった近年のアメリカに際立つ傾向は、トクヴィルのアメリカ観の再考を促している。(2)トクヴィルがナポレオンの遺産を念頭に19世紀フランスに発した警告は今日の状況において米国の「軍産複合体」の分析にヒントを与え、20世紀後半以降のアメリカの「帝国化」を考える材料となる。(3)今日、非西欧世界に広がる民主化の課題を考察する上で、明治以来の日本の近代化とデモクラシーの問題をトクヴィルの視点から分析することは有益な視座を提供する本研究の目的は、20世紀の政治理論、特にいわゆる自由民主主義の形成とトクヴィルの政治思想との関連を冷戦の終結と「新たな」資本主義の世界化という今日の状況において再考することを目的としている。(3)今日、非西欧世界に広がる民主化の課題を考察する上で、明治以来の日本の近代化とデモクラシーの問題をトクヴィルの視点から分析することは有益な視座を提供する(研究会)第1回(06年7月4日)報告:「デューイの政治思想におけるアメリカ例外論の振幅と持続」討論:古矢旬。第2回(06年12月11日)報告:松本礼二「啓蒙と全体主義再考-Zeev Sternhell, Les anti-Lumieres du XVIIIe siecle a laguerre froide (Fayard, 2006)をめぐって」。前者においては20世紀のアメリカニズムの諸問題、後者においては全体主義と啓蒙の関係を検討した。どちらも、18,9世紀の歴史的経験を20世紀がどう解釈したかという問題であり、トクヴィル復興がどちらの論点にも関係している点で、本研究の課題と密接に関わるテーマである。(スペースの都合上、研究代表者の研究実績と研究成果のみ記す。)研究代表者はまたトクヴィルのデモクラシー論の現代的妥当性を検討し、その成果を2007年度日本政治学会において「政治思想における古典の力『アメリカのデモクラシー』を題材に」と題して研究発表を行い、この報告は雑誌『思想』1009号(2008年5月)に掲載された。

また、米国のトクヴィル研究者Aurelian Craiutu氏の要請によって執筆した英語論文"Tocqueville and Japan"は2009年度出版予定のACraitu & S.Gellar(ed.)Conversations with Tocqueville(Lexington Press)に収録される。また、研究代表者は明治期日本におけるトクヴィル受容の検討のために、大分県中津および熊本県水俣市に出張し福澤諭吉と徳富蘇峰の資料調査を行った。最後に、研究代表者は『アメリカのデモクラシー』の全訳を完成させた(岩波文庫、第一巻上、下2005年11、12月、第二巻上、下、2008年3、5月)。本研究の成果は訳者解説に生かされている。
藻食魚ハクレンの消化管内からのアオコ分解微生物の分離

霞ヶ浦内水面水産試験場より入手したハクレンの消化管内容物を材料にして、アオコの代表的菌種であるMicrocystisviridisに対する殺活性を示す微生物、M.viridis細胞壁成分を資化できる微生物の検索を行った。その結果、多数の細菌を分離することに成功した。それらについて16S rDNA解析による菌種の同定を行ったところ、Aeromonas属細菌が大半を占めていたが、他の属の細菌も分離されていることが明らかとなった。また、M.viridisに対して殺活性を示した細菌は、すべて細胞壁成分の資化能も有していた。殺活性を示したAeromonas属細菌14株について、培養上清の殺活性を検討した結果、すべての株が構成的に殺活性物質を培養液中に産生していることが明らかとなった。また、培養上清の加熱処理によって殺活性が消失したことから、殺活性物質はタンパク質(溶藻酵素)であるものと推定された。また、すべての株の培養上清が、M.viridis以外のアオコ形成藻類であるM.aeruginosaやPhormidium tenueに対しても殺活性を示した。殺活性が最も高かったA.hydrophila B13株の培養上清から溶藻酵素の精製を試み、イオン交換、ゲルろ過により、SDS-PAGEで単一バンドとなるまで精製できた。その結果、アオコ溶藻酵素は、分子量約24kDaの単量体であることが明らかとなった。
成体肝幹様細胞の分化特異的発現遺伝子のcDNA Subtraction法での解析

本研究は成体肝臓に存在する幹細胞様細胞を用い、Laser Capture Microdissection、RNA増幅(T7 Adapter Ligation PCR Amplification, TALPAT法)とSupression Subtractive Hybrydization(SSH)法によってその分化特異的発現遺伝子を網羅的に探索することを可能にし、それらの遺伝子解析から肝幹細胞分化の分化機序を模索することを目的とする。本研究では成体肝幹細胞様細胞株培養系(Kano et al., In Vitro Cell.Dev.Biol.,2004)を用いた解析を試みた。肝実質細胞と成体肝幹細胞様細胞株培養系の幹細胞様コロニーから採取し、TALPAT法で増幅した各mRNAの間でSSHを行い幹細胞様細胞特異的発現遺伝子が増幅できた。増幅した遺伝子に対し、Differential Screeningを行い39個の幹細胞様細胞差異的発現遺伝子を得て配列解析し、29種の遺伝子配列を明らかにした。さらにSSHのサンプル母集団であるTALPAT産物をプローブに用いて、reverse Northern Blottingを行い、幹細胞様コロニーでの差異的発現を確認した。その結果から幹細胞様コロニーでの発現が高く、実質細胞との発現差が顕著である4-5遺伝子を選択して、肝幹細胞様細胞を分離する画分である肝非実質細胞の第一継代目の凝集塊とヒト肝がん細胞株(Ishiyama et al., Cancer Sci.,2003)での発現をRT-PCR法で解析した。その結果第一継代目の凝集塊での発現が確認されこの画分中に幹細胞様細胞が高頻度で存在することが示唆された。またヒト肝がん細胞株で株の性質による発現差異が確認でき、これらの遺伝子が肝がんのマーカー遺伝子として発症機構研究や診断に利用できる可能性が示唆された。本研究は成体肝臓に存在する幹細胞様細胞を用い、Laser Capture Microdissection (LCM), RNA増幅(T7 Adapter Ligation PCR Amplification, TALPAT法)とcDNA Subtraction法によってその分化特異的発現遺伝子を網羅的に探索することを可能にし、それらの遺伝子解析から肝幹細胞分化の分化機序を模索することを目的とする。本研究では当研究室で分離、樹立した成体肝幹細胞様細胞株培養系を用いた解析を試みた。この培養系はsingle cell cloneの培養系であるが、自発的な表現型の変化が示唆されるため、厳密な解析のためには幹細胞様細胞コロニーに限局して遺伝子を抽出する必要があった。そこでLCMを用い幹細胞様細胞コロニーを選択的に採取し、totalRNAを抽出した。抽出した微量totalRNAから網羅的発現遺伝子解析を可能にするため、TALPAT法によりmRNAを増幅した。同様にTALPAT法で増幅した肝実質細胞mRNAとこのサンプル間でSupression Subtractive Hybrydizationを行い幹細胞様細胞特異的発見遺伝子が増幅できた。増幅した遺伝子に対し、TA Cloning, Differential Screeningを施行し39個の解析候補幹細胞様細胞特異的発現遺伝子を得た。現在これらの遺伝子配列の解析が進行中であり、胎児期と新生児期に関与すると考えられる興味深い遺伝子も同定されている。今後はこれらの遺伝子群に関し、他の肝幹細胞様細胞での発現を定量的Real time RT-PCRで確認すること、成体ブタ肝組織とヒト正常肝、肝腫瘍を含む肝疾患病理標本を用いIn situ hybridizationによりその発現解析を行う予定である。本研究は成体肝臓に存在する幹細胞様細胞を用い、Laser Capture Microdissection、RNA増幅(T7 Adapter Ligation PCR Amplification, TALPAT法)とSupression Subtractive Hybrydization (SSH)法によってその分化特異的発現遺伝子を網羅的に探索することを可能にし、それらの遺伝子解析から肝幹細胞分化の分化機序を模索することを目的とする。

本研究では成体肝幹細胞様細胞株培養系(Kano et al.,In Vitro Cell. Dev. Biol.,2004)を用いた解析を試みた。肝実質細胞と成体肝幹細胞様細胞株培養系の幹細胞様コロニーから採取し、TALPAT法で増幅した各mRNAの間でSSHを行い幹細胞様細胞特異的発現遺伝子が増幅できた。増幅した遺伝子に対し、Differential Screenigを行い39個の幹細胞様細胞差異的発現遺伝子を得て配列解析し、29種の遺伝子配列を明らかにした。さらにSSHのサンプル母集団であるTALPAT産物をプローブに用いて、reverse Northern Blottingを行い、幹細胞様コロニーでの差異的発現を確認した。その結果から幹細胞様コロニーでの発現が高く、実質細胞との発現差が顕著である4-5遺伝子を選択して、肝幹細胞様細胞を分離する画分である肝非実質細胞の第一継代目の凝集塊とヒト肝がん細胞株(Ishiyama et al., Cancer Sci., 2003)での発現をRT-FCR法で解析した。その結果第一継代目の凝集塊での発現が確認されこの画分中に幹細胞様細胞が高頻度で存在することが示唆された。またヒト肝がん細胞株で株の性質による発現差異が確認でき、これらの遺伝子が肝がんのマーカー遺伝子として発症機構研究や診断に利用できる可能性が示唆された。
非免疫系抗腫瘍性因子による新たな卵巣癌治療法開発への基礎的検討に関する研究

卵巣癌では、Cisplatinを中心とした化学療法の導入により、かなりの患者が寛解に至るようになった。しかし、長期予後の改善までには至らず、再発時に有効な化学療法もない。1988年米原らによって開発された抗ヒトFasモノクローナル抗体は細胞にapoptosisを誘導する働きがあり注目されている。apoptosisをきたしつつある細胞は、放射線感受性が増し、また、薬剤耐性を容易にするという報告があり、癌細胞にapoptosisを誘導することは、現在までの癌治療の欠点を補い得る可能性がある。フローサイトメトリーによる検討では、卵巣癌株12例におけるFas抗原の発現頻度は、66.7%(8/12例)であった。内訳は漿液性嚢胞腺癌由来株10例中8例が、陽性であり、粘液性嚢胞腺癌及び明細胞腺癌由来株の各々1例は陰性であった。また、漿液性嚢胞腺癌由来株のNOS2と、そのADM、CDDP、SN-38、VP-16に対する各耐性株のFas抗原の発現は、親株及び各耐性株(ADM耐性株を除く)においては、陽性であった。しかし、ADM耐性株においては、その発現が消失していた。耐性株作成過程における長期のADM投与がFas抗原の発現を抑制したのかもしれない。抗Fas抗体による細胞障害活性を、MTTアッセイにて検討した。Fas抗原を発現していない細胞株においては細胞障害性は認められなかった。また、Fas抗原陽性細胞8例中1例においては、Fas抗原を発現しているにもかかららず、抗Fas抗体により細胞障害を受けない細胞株が認められた。これに関しては新たにFas抗原に変異がないか検討する予定である。Fas抗原を発現している他の7株においては抗Fas抗体1μg/mlの濃度における細胞障害活性は、41.198.9%であった。また、抗Fas抗体による細胞死は、DNAを抽出し電気泳動をしたところladder patternが認められ、apoptosisであることが確認された。