hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海底鉱物資源開発のための鉱物処理システムの開発

海底熱水鉱床の開発を促進するため、採掘した鉱石を海底において粉砕し、有用鉱物を選別する海底鉱物処理(海底選鉱)の概念を考案した。海底選鉱の要素技術である粉砕及び浮選について、海底選鉱への適用可能性を明らかにした。本研究の成果を元に海底選鉱を実用化できれば、採掘した鉱石の全量を揚鉱するという従来の海底熱水鉱床開発方式と比較して、開発コストの低減が可能となると期待される。我が国の排他的経済水域には、海底熱水鉱床、コバルトリッチクラスト、メタンハイドレートなどの未開発の海底鉱物・エネルギー資源が賦存することが知られている。本研究の目的は、海底熱水鉱床などの海底鉱物資源の開発を促進するため、これらの鉱物を海底において粉砕・選別し、有用鉱物のみを回収するとともに、不要な岩石等を海底に処分するための基盤的な技術を開発することである。当該年度は、微粉砕した鉱石から有用鉱物を選別する技術の基礎的な検討を実施した。具体的には、微粉砕した鉱石を分散した水中に空気を圧入し、有用鉱物のみを気泡表面に付着させて選別する、浮遊選鉱(浮選)と呼ばれる手法を、高圧水中条件に適用するための基礎的な実験を実施した。本研究では、陸上の選鉱場で広く使用されているカラム浮選と呼ばれる浮選方式の適用を想定し、カラム浮選機を模擬した実験装置を製作し、海上技術安全研究所の高圧タンクを用いて水深1001000m相当の海底における浮選の模擬実験を実施した。実験では、実験装置内にあらかじめ微粉砕した原鉱を含む液体(パルプ)を充填し、最大で水深約1000m相当の高圧環境下において高圧空気を圧入し、カラム内に微細な気泡流を発生させた。その結果、カラムの上端部にフロス(泡沫)層が発生し、これがカラムから溢出することにより鉱物を分離することができた。実験から得られた精鉱の分析により、精鉱中の有用元素の品位は原鉱と比較して大きく向上したことが確認された。以上の結果から、高圧水中での浮選により有用鉱物のみを選別することが可能であると示唆された。具体的には、採取した鉱石を海底で微粉砕した後、鉱石微粒子をスラリー化してカラム型装置に投入し、空気圧入により発生させた気泡表面に有用鉱物のみを付着させて選別する、浮遊選鉱(浮選)と呼ばれる手法を高圧水中条件に適用することをめざし、基礎的な要素技術の研究を実施している。当該年度は、水中条件におけるボールミル粉砕の効率を予測するため、離散要素法(Distinct Element Method(DEM))を用いた粉砕シミュレーションを行うとともに、模擬鉱石試料を用いた予備的な粉砕実験を実施し、シミュレーション結果と実験結果との比較を行った。シミュレーションでは、ミル内に充填された粉砕用鉄球の運動を解析し、エネルギー散逸を計算することにより、粉砕効率の評価を行った。シミュレーションの結果、ボールミルの一般的な回転数条件では、鉄球がミル内で完全に水没した条件での粉砕(水没粉砕)における粉砕効率は、陸上において通常実施される湿式粉砕(粉砕試料をぬらす程度の水分のみを添加して行う粉砕)と比較して10%程度低下することが示された。この計算結果は実験結果と概ね一致し、ボールミル粉砕の効率推定に対して離散要素法による数値シミュレーションが有効な手法であることが示された。また、効率は低下するものの、水没状態でのボールミル粉砕が可能であることが示唆された。我が国の排他的経済水域には、海底熱水鉱床をはじめとする非在来型エネルギー・鉱物資源が賦存することが知られている。海洋基本計画及び海洋エネルギー・鉱物資源開発計画において、海底鉱物資源開発のための研究開発が求められている。我々は、海底熱水鉱床の開発を推進するため、海底で採掘した鉱物をその場で粉砕し、有用鉱物を分離する「海底選鉱」を提案し、技術開発のための基礎的研究を実施した。本年度は、陸上鉱山で広く実施されているボールミルを用いた鉱石粉砕技術を海底選鉱に適用することを検討した。ボールミルを模擬した小型の水中粉砕実験装置を製作し、大気圧及び水深1000mに相当する高圧水中条件下において模擬鉱物の粉砕実験を実施した。模擬鉱物としては珪砂を使用した。粉砕条件としては、湿式粉砕に加えて、ボールミルが海中に設置された状況を想定し、ミル容器内部が外部から流入した海水で満たされた状態での粉砕(水没粉砕)をも実施した。実験のパラメータとして、ボールミルの回転数を臨界回転数の70130%の範囲で変化させた。

実験で得られた試料の粒度分析により、高圧水中条件下においても大気圧条件下と概ね同程度の粉砕性能が示された。以上の結果から、ボールミル粉砕が海底選鉱に適用可能であることが示された。また、海底選鉱を実海域で実施するためには、技術的、経済的な実現可能性とともに、法的規制や環境保全との適合性、利害関係者との合意形成などの課題をも検討する必要がある。本年度は、これらの課題を社会的受容性というキーワードでまとめ、関連する法的規制や環境影響評価を中心として調査を行い、調査結果の取りまとめを行った。本研究では、初年度及び第2年度にかけて海底鉱物処理システムを構成する要素技術(粉砕技術及び浮選技術)の検討を行うこととしている。本年度までにこれらの基礎的な検討が実施できており、研究はおおむね順調に進展したと評価される。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はおおむね順調に進展しており、研究計画に特段の変更を行う必要はない。今後は、これまでの検討結果を元に、海底鉱物処理システムの概念設計および経済性等の評価を実施する。また、環境影響評価を始めとするシステムの社会的な受容性についても検討を行う。
サゴ澱粉抽出残渣の飼料化に関する基礎研究

サゴ澱粉生産の展開に際し解決しておかなければならない重要課題の一つに澱粉抽出残渣の有効利用法の開発がある.本研究はサゴ澱粉抽出残渣の飼料化を目的としている.排出されるサゴ澱粉抽出残渣は,1)水分含量70%以上,2)残存澱粉量が多い(3050%),3)窒素含量が極めて少ない(<0.5%),4)腐敗しやすいという性質がある.これらの性質をふまえて保存性を向上させ,不足する窒素源を補強し,かつ消化性の向上を計るために,残渣のアンモンニア処理,尿素を添加したサイレージ調製をガラス瓶法で行った.また,対照としてサイレージ調製も行った.さらに,残渣を培地とし糸状菌を培養することによるタンパク質付与が可能化どうか検討した.1.アンモンニア処理:水分70%,アンモンニア添加量3%,温度25°Cおよび30°Cで処理し,6週まで経時的に取り出し,pH,アンモンニア含量,総窒素量,消化性,4-メチルイミダゾール(4-MI)量を定量した.結果は25°Cおよび30°C処理区で大差なく,アンモンニアにより残渣の腐敗が防止された.残渣の消化性が向上した.また,残存澱粉量は15%減少したが,総窒素量が3.2%となり,残渣に不足する窒素の補強ができた.4-MIの生成量は1.3ppm以下で問題なかった.2.サイレージ調製:水分70%,温度25°Cおよび30°Cで処理し,6週まで経時的に取り出し,pH,有機酸生成量,残存澱粉量,消化性を定量した.結果は25°Cおよび30°C処理区で大差なく,1週目からpH4以下となり腐敗菌の増殖が押さえられた.生成された有機酸は乳酸が約7.5%と多く,酢酸や酪酸は1%程度であった.残存澱粉は約30%減少したが,良好なサイレージが得られた.消化性の向上は認められなかった.3.尿素を添加したサイレージの調製:尿素添加量6%,尿素分解菌源(米糠または大豆植物体)0.5%,水分70%,温度30°Cで処理した.尿素は2週までに含量2%程度にまで分解された.アンモンニアは約3%含まれるようになった.pHは初期に8.0まで上昇したがその後6.8まで下がった.澱粉含量は約25%低下した.消化性は向上しなかった.腐敗は認められなかった.この方法では初期のpH上昇が不十分で腐敗は認められなかったが期待に反しアンモンニア処理のような効果が得られなかった.4)糸状菌培養:Chalara paradoxaおよびTrichoderma virideをツアペック培地で水分含量70%とした残渣で培養することを試みた.菌の増殖が悪く,総窒素の増加は認められなかった.サゴ澱粉生産の展開に際し解決しておかなければならない重要課題の一つに澱粉抽出残渣の有効利用法の開発がある.本研究はサゴ澱粉抽出残渣の飼料化を目的としている.排出されるサゴ澱粉抽出残渣は,1)水分含量70%以上,2)残存澱粉量が多い(3050%),3)窒素含量が極めて少ない(<0.5%),4)腐敗しやすいという性質がある.これらの性質をふまえて保存性を向上させ,不足する窒素源を補強し,かつ消化性の向上を計るために,残渣のアンモンニア処理,尿素を添加したサイレージ調製をガラス瓶法で行った.また,対照としてサイレージ調製も行った.さらに,残渣を培地とし糸状菌を培養することによるタンパク質付与が可能化どうか検討した.1.アンモンニア処理:水分70%,アンモンニア添加量3%,温度25°Cおよび30°Cで処理し,6週まで経時的に取り出し,pH,アンモンニア含量,総窒素量,消化性,4-メチルイミダゾール(4-MI)量を定量した.結果は25°Cおよび30°C処理区で大差なく,アンモンニアにより残渣の腐敗が防止された.残渣の消化性が向上した.また,残存澱粉量は15%減少したが,総窒素量が3.2%となり,残渣に不足する窒素の補強ができた.4-MIの生成量は1.3ppm以下で問題なかった.2.サイレージ調製:水分70%,温度25°Cおよび30°Cで処理し,6週まで経時的に取り出し,pH,有機酸生成量,残存澱粉量,消化性を定量した.結果は25°Cおよび30°C処理区で大差なく,1週目からpH4以下となり腐敗菌の増殖が押さえられた.生成された有機酸は乳酸が約7.5%と多く,酢酸や酪酸は1%程度であった.残存澱粉は約30%減少したが,良好なサイレージが得られた.消化性の向上は認められなかった.3.尿素を添加したサイレージの調製:尿素添加量6%,尿素分解菌源(米糠または大豆植物体)0.5%,水分70%,温度30°Cで処理した.

尿素は2週までに含量2%程度にまで分解された.アンモンニアは約3%含まれるようになった.pHは初期に8.0まで上昇したがその後6.8まで下がった.澱粉含量は約25%低下した.消化性は向上しなかった.腐敗は認められなかった.この方法では初期のpH上昇が不十分で腐敗は認められなかったが期待に反しアンモンニア処理のような効果が得られなかった.4)糸状菌培養:Chalara paradoxaおよびTrichoderma virideをツアペック培地で水分含量70%とした残渣で培養することを試みた.菌の増殖が悪く,総窒素の増加は認められなかった.サゴ澱粉生産の展開に際し解決しておかなければならない重要課題の一つに澱粉抽出残渣の有効利用法の開発がある.本研究はサゴ澱粉抽出残渣の飼料化を目的としている.排出されるサゴ澱粉抽出残渣は,1)水分含量70%以上,2)残存澱粉量が多い(3050%),3)窒素含量が極めて少ない(<0,5%),4)腐敗しやすいという性質がある.これらの性質をふまえて保存性を向上させ,不足する窒素源を補強しかつ消化性の向上を計るために,本年度は残渣のアンモンニア処理をガラス瓶法で行った.また,対照としてサイレージ調製も行った.水分70%,アンモンニア添加量3%,温度25°Cおよび30°Cで処理し,6週まで経時的に取りだし,pH,アンモンニア含量,総窒素量,澱粉含量,消化性,4-メチルイミダゾール(4-MI)量を定量した.結果は25°Cおよび30°C処理区で大差なく,以下のようであった.1)pHは0週で10以上であったが,その後徐々に低下し6週で約8となった.2)アンモンニア含量は0週2.7%からわずかに減少し6週で2.5%となった.3)乾燥物の総窒素量は0週で1%から6週まで増加し約3,2%となった.4)澱粉含量は6週で初期含量の85%になった.5)低消化性繊雑の残存量は0週で28.0%から徐々に減少し6週で約26.5%となった.6)4-MIの生成量は1.3ppm以下であった.添加されたアンモンニアでpHが上がり,残渣の腐敗が防止された.アンモンニアと繊維素との反応によって残渣の消化性が向上した.また残渣に不足する窒素の補強ができた.アンモンニア添加により生じる毒性物質4-MIの生成量は1.3ppm以下で問題なかった.対照として行ったサイレージ調製でも良好な生成物が得られた.両方法は実用化実験へ展開可能であると考えている.サゴ澱粉抽出残残渣渣の飼料化の際の問題点の一つに窒素源の補強がある.前年度,残渣をアンモニア処理することで成果が得られた.しかし,アンモニア処理はサゴ澱粉抽出残渣が排出される東南アジアの澱粉生産現場の状況から考えると,アンモニアの毒性のため,種々の問題を生ずる恐れがある.そこで,本年度は残渣に有用微生物を繁殖させることの可能性および尿素を添加したサイレージ法を検討した.Chalara paradoxaおよびTrichoderma virideIFO 3117をツアペック培地50mlて回転振盪培養して生育させた菌体を,同培地で水分70%になるように調整した残渣粉末に加え,時々ふり混ぜながら30°Cで7日間培養した.容器は綿栓をした三角フラスコを用い,無殺菌で行った.窒素量が増加したか否かはケールダール法で総窒素量を定量し判断した.その結果,両菌とも対照に比べほとんど総窒素量の増加は認められなかった.菌の生育に必要な微量成分の不足を考慮し,米糖0.1%を添加した実験を行ったが総窒素量がわずかに増加したとはいえ有効であるとの判断に至らなかった.尿素を添加したサイレージの調製は以下のように行った.尿素添加量6%,尿素分解菌源(米糖または大豆植物体)0.5%,水分量70%,温度30°Cで処理し,8週間まで経時的に取り出して,先ず水分量,pHおよびアンモニア量を分析した.次いで55°Cで一晩通風乾燥し,水分量,総窒素量,残存尿素量,残存澱粉量,および消化性を定量分析した.尿素は2週までに含量2%程度にまで分解された.アンモニアは約3%含まれるようになった.このためpHが8.0まで上昇した.
考古地磁気法を利用した低頻度メガリスク災害解明のための分析手法開発に関する研究

富山県と新潟県の遺跡の発掘により検出された液状化現象に伴う噴砂を考古地磁気法により分析した結果、中世の時代の地震など、古文書で知られる地震に対する噴砂が確認でき、当時の地震の規模や影響範囲が検討できた。また、古文書にない弥生時代の地震の年代を決定することができた。以上のように、考古地磁気法を利用することにより、古文書にも記されていない古くて大きな地震による液状化の発生を推定することができ、低頻度メガリスク災害の解明に向けた糸口を明らかにすることができた。さらに、大規模な深層崩壊の規模を推定する可能性も示唆された。前年度までの文献調査に加え,富山県各地での遺構,遺跡での磁気調査により,富山県内での液状化を伴う大きな地震の頻度や発生地域を,既往の方法より高い精度で分類することができるようになってきた.一方,これらの地震に対する地盤の影響を特定するために進めてきた,地盤特性との関連に関する研究では,標準貫入試験データから求めた新しい地盤の特性値を用いることで,新潟県での地震による河川堤防の被害と土質構成の関連性をより良く表現できることが明らかになり,現在河川堤防以外のデータとの比較を進めている.また,河川堤防の水分量測定に関して,新たに石川県の梯川右岸堤防において,10点の計測を始め,土壌水分と河川水位,降雨量との関係を調べており,局所的な豪雨などに対する堤防安全性の検討につなげる予定である.さらに次年度は,新潟での検証結果をもとに,富山県,石川県のボーリングデータを用いた地震時のハザードマップの作成を目指し,堤防などの安全性も含めたより広範囲の災害に対する検討を実施する予定である.富山県と新潟県の遺跡の発掘により検出された噴砂を研究した、噴砂の残留磁化が当時の地磁気方向を記録していることを確かめて、過去の地磁気変動と対比して年代を調べた。調査の結果、中世の時代の地震など、古文書で知られる地震に対応する噴砂が確認でき、当時の地震の規模や範囲が検討できた。また、古文書のない弥生時代の地震の年代を決定することができた。考古地磁気法により過去の液状化を伴うような大きな地震の発生個所や頻度がある程度特定できたため、それらの地震動による、より広域な被害の推定を行うための手法の検討を行った。すなわち、地盤構成と地震被害の関係について、特に新潟県中越地震での被害を検証し、表層地質データとボーリングデータを用いた指標について検討した。この検討結果より、地盤災害の主要因として地下水の影響が大きいので、地域における土壌水分変化の特性を検討する必要性が明らかとなった。そこで、土壌水分を多点で測定してリアルタイムでデータを取得するシステムを構築し、被害推定の精度向上を図る体制を整えた。水分計は河川堤防や、地滑りが懸念される斜面にも設置しており、今後、水分量変化と地盤変状の関係について詳細な分析を行うことが期待できる。一方、国土交通省により掘削されたボーリングコアについて磁化研究を行った結果、近傍地域での深層崩壊で流れ込んだ堆積層が判別でき、大規模な深層崩壊の規模を推定する糸口を明らかにすることができた。理科年表に示されている貞観地震以来十数回の地震についての文献調査を行い、そのうち新潟県では貞観地震での液状化が広範囲に及んだことが明らかになってきた。一方で、地球電磁気の研究手法による調査では、富山県の常願寺川護岸工事に伴う露頭において,認められた洪水性の堆積物と推測される堆積物について磁気物性も含めた研究を実施した結果、安政飛越地震に伴う立山カルデラ崩壊物の可能性も示唆された。また、富山県高岡市の考古遺跡で実施された発掘調査により,地震時の液状化の痕跡である噴砂痕が見つかり、磁気物性による年代研究から、地震は8世紀より古く従来,富山県では知られていない地震の可能性も示された。このように,北陸地方でもこれまで知られていなかった地震が過去に発生していることが確認された.そして,砂質土による河川堤防では,降雨状況によっては地震時に液状化による機能不全が生じる可能性を明らかにできた.新潟県では2004年の中越地震、2007年の中越沖地震と液状化履歴が分かっており、特に河川の堤防点検データでは標準貫入試験による地下の土層構造も分かっていることから、液状化の発生の可能性の高い土質構成や分布についての現状を把握することを、土質サンプルの採取に先立って実施した。この結果、現在の土質構成における液状化発生の可能性を把握できた。現在、それぞれの研究は独立的に行われているが、次年度以降過去の履歴と現状を照らし合わせて、ハザードマップの作成へとつなげる予定である。

計画の3つの大きな項目のうち,1文献調査,2.磁気探査を利用した過去の地震調査,は概ね終了し,3.液状化発生の高い地域の土質構成,もデータの入手はほぼ完了し,現在整理を進めており,あとは最終年度に総合的な見地からのハザードマップの作成を行う段階であり,おおむね順調な進捗状況と言える.ただし,今年度加える予定だった白山の大規模地滑りについては進捗状況が必ずしも十分ではなかったので,次年度も引き続き検討する予定である.計画の3つの大きな項目である、1.文献調査、2.磁気探査などを利用した過去の地震調査、3.液状化発生の高い地域の土質構成、についていずれも一定の成果を挙げているため。次年度は,これまでの成果をGIS上にて融合し,ハザードマップを完成させる予定である.主に,地震動による被害に対するものになるが,巨大地滑りや局所的豪雨の影響をできるだけ取り入れられるように検討を行う予定である.研究計画どおり、信濃川流域での考古磁気的な調査をさらに進めるとともに、近年の地震での被害領域などを照らし合わせて、ハザードマップ作成を試みる。また、液状化による被害の大きさ(変形の度合い)についての予測可能性についての検討を行う予定である。新たに、白山の別当谷の崩落に関する調査を加える予定である。計測機器関連の消耗品が当初予定していたよりも若干安く購入できたので、その差額分を次年度の計測機器関連消耗品に充当する予定である。計測機器関連消耗品以外では、研究打ち合わせ、現場計測、資料収集などの旅費を使用する予定である。年度末に計画していた出張が,諸般の事情により実施できなくなったのでやむなく次年度繰り越しとした。したがって,新年度早々に予定していた出張に出かける計画をしている.その他については,当初に予定していた通りに研究費を執行する計画である.
高齢者悪性胸膜中皮腫に対する治療選択の最適化をめざした基盤構築

進行悪性胸膜中皮腫のシスプラチン+ペメトレキセド療法、およびその代替療法であるカルボプラチン+ペメトレキセド療法において、治療継続に問題となりうる化学療法誘発性の消化器毒性(悪心・嘔吐)の発症予測について検討を行った。ペメトレキセドを併用薬とする上記2つの化学療法レジメンは、他の第3世代抗がん剤とのプラチナ併用療法と比較して消化器毒性が強い傾向があることが明らかとなった。2015年度は研究の第一段階として、高齢者悪性胸膜中皮腫の化学療法における重篤な毒性の発現頻度、毒性出現により治療中止に陥る頻度を同定するコホート研究を計画していた。計画に従い、中皮腫症例のコホート研究を倫理審査承認のもと実施し、これまでに中皮腫症例コホート50例の臨床データを集積した。さらに中皮腫治療のkey drugにおける消化器毒性プロファイルを評価する目的で、肺癌症例コホートについても集積し、中皮腫症例コホートと併せて解析を実施した。すなわち高度催吐リスク群に分類されるシスプラチン、中等度催吐リスク群に分類されるカルボプラチン、および併用薬のペメトレキセドについてPatient Reported Outcomeに基づく消化器毒性調査を実施し解析した。研究成果として、悪性胸膜中皮腫の標準治療であるシスプラチン・ペメトレキセド療法は、非小細胞肺癌の標準治療の一つであるシスプラチン・ビノレルビン療法と比較して、悪心、嘔吐、救済治療いずれも認めないTotal control rateが有意に低いことが示された。両治療ともシスプラチンを含む高度催吐リスク群であるが、特に中皮腫治療のkey drugであるペメトレキセドとの併用療法は、特に消化器毒性が問題となる可能性があることが示唆されている。また別研究では、カルボプラチン併用療法における予防的制吐療法に関して、高齢者では、PS不良例で失敗率が有意に高いことが示された。さらに治療選択肢の少ない中皮腫における2次化学療法の有効性、忍容性についても解析している。研究成果としてシスプラチン・ペメトレキセドre-challenge療法について世界肺癌学会、肺癌学会総会で発表を行った。初年度のこれらの基礎となる複数の検討をもとに、バイオマーカーに基づく消化器毒性予測、毒性による治療中止と関連する臨床背景因子の同定を行う。これまでの進捗状況について、当初計画していた中皮腫症例のtest cohort作成のためのデータ集積は50例まで進捗しており、さらに症例数を増やしていく予定である。消化器毒性に関連する研究に関しては、より大規模な症例数での検討を行うため、当初の計画に追加して、悪性胸膜中皮腫と同様にシスプラチン、カルボプラチンベースの化学療法を用いる肺癌コホートにおけるデータ集積も行った。これらのコホートに関しては、薬剤部と共同でPatient Reported Outcomeに基づく消化器毒性調査を実施している。得られたデータをもとに、本研究の第一段階である高齢者悪性胸膜中皮腫の化学療法における毒性(特に消化器毒性)の出現頻度とその特徴について多面的な解析を完了した。これらの解析に基づき、研究成果の公表としては、国際学会を含む複数の学会で発表を完了しており、現在臨床データによる消化器毒性に関する解析結果については論文発表に向けて作業中である。今後実施する消化器毒性に関連するbiomarkerの探索研究についても、薬剤部と共同して準備を整えており、関連する臨床dataも過不足なく収集する体制が整っている。以上の状況から現在までの研究の進捗状況としてはおおむね順調に推移していると評価する。2016年度は研究の第二段階として、高齢者悪性胸膜中皮腫の化学療法における重篤な毒性の発現頻度、毒性出現により治療中止に陥る頻度およびこれらのイベントに優位に関連する臨床背景因子を同定するコホート完成を計画していた。計画に従い、中皮腫症例のコホート研究を倫理審査承認のもと実施し、これまでに中皮腫症例コホート60例の臨床データを集積した。さらに、中皮腫治療のkey drugにおける消化器毒性プロファイルを評価する目的で、肺癌症例コホートについても集積し、中皮腫症例コホートと併せて解析を実施した。2016年度の研究成果として、特に忍容性の問題からシスプラチンが使用できない高齢者にとってその代替となりうるカルボプラチンにおける制吐治療失敗のリスクについて解析を行った。我々はカルボプラチンbaseの化学療法を行った85例の悪性胸膜中皮腫を含む胸部悪性腫瘍疾患を対象とした多変量解析を実施し、以下の結果をえている。カルボプラチンbaseの化学療法における制吐治療失敗の原因としてカルボプラチンAUC(area under curve)よりも、体表面積当たりの投与量が有意に関連しており、多変量解析においても有意な因子であった。2017年2月にNational Comprehensive Cancer Networkの予防制吐ガイドラインでは、カルボプラチンのAUCにより催吐リスクを分類する改訂がなされているが、我々の検討からはAUCより体表あたりの投与量が催吐リスクをより正確に予測できる可能性が示唆されている。これらの結果は悪性胸膜中皮腫の最適化に有用な情報と考えられる。また治療選択肢の少ない中皮腫における2次化学療法の有効性、忍容性についてはプラチナ製剤・ペメトレキセドre-challengeによる2次化学療法の有効性と安全性dataについて論文化にむけて投稿準備中である。これまでの進捗状況に関して、胸膜中皮腫症例のコホート集積は60例まで進捗している。

胸膜中皮腫でkey drugとなるカルボプラチンの消化器毒性に関する検討としては、臨床背景因子として体表あたりのカルボプラチン投与量が有意なリスク因子であることを同定した。さらに高齢者で問題となる発熱性好中球減少症に関して、ドセタキセル治療をうけた171症例の検討において年齢65歳以上、前治療における発熱性好中球減少が有意なリスク因子であることを明らかにした。化学療法に伴う消化器毒性、発熱性好中球減少は高齢患者において治療継続に影響する有害事象であり、これらと関連する臨床背景因子を同定し、特に悪性胸膜中皮腫における化学療法の適切な治療選択に役立てるための有用な情報がこれまでの検討で得られており、おおむね研究課題は順調に推移していると判断する。高齢者悪性胸膜中皮腫の化学療法における重篤な毒性の発現頻度、毒性出現により治療中止に陥る頻度を解析するためのコホートを作成し、各種検討を行った。化学療法に関する消化器毒性に関しては、悪性胸膜中皮腫以外の胸部悪性腫瘍(肺癌、胸腺腫瘍)においてプラチナ製剤を含む化学療法を施行された患者コホートも用いて、消化器毒性出現に関するリスク因子の検討を行った。特にカルボプラチンを選択して治療する場合の、予防制吐薬の選択について、患者背景リスクによる治療選択に関する有用な情報を本研究で得た。また治療選択肢の少ない2次治療においては、プラチナ製剤+ペメトレキセド併用療法re-challengeの有効性と安全性解析を実施した。さらに、悪性胸膜中皮腫でも選択されるカルボプラチン+ペメトレキセド療法は、カルボプラチン+パクリタキセル療法を対照として比較検討すると、好中球減少は少ないものの、血小板減少が多く、悪心嘔吐の頻度も高いことからこれらの毒性に関するモニタリング、予防的制吐治療の適切な選択が必要であることが示唆された。当該研究実施中に悪性胸膜中皮腫に対する新規抗がん剤としての血管新生阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤の開発がすすめられている。今後実地臨床でもこれらの新規薬剤が使用可能となりえるが、悪性胸膜中皮腫患者は、アスベスト吸入による胸膜病変、肺病変を合併していることも多い。これらの薬剤に関しての高齢悪性胸膜中皮腫患者の忍容性予測も必要となってくることが予想され、本研究結果をもとにさらに次なる課題に取り組む予定である。進行悪性胸膜中皮腫のシスプラチン+ペメトレキセド療法、およびその代替療法であるカルボプラチン+ペメトレキセド療法において、治療継続に問題となりうる化学療法誘発性の消化器毒性(悪心・嘔吐)の発症予測について検討を行った。ペメトレキセドを併用薬とする上記2つの化学療法レジメンは、他の第3世代抗がん剤とのプラチナ併用療法と比較して消化器毒性が強い傾向があることが明らかとなった。本研究の第2段階として、validationを目的とした観察研究開始準備中である。validation cohortでは、これまでに集積した悪性胸膜中皮腫のtest cohortの解析において、毒性による治療中止と関連するリスク因子についての再現性の検証を行う予定である。また薬剤部と協同して消化器毒性の評価システムの稼働を継続している。
機能欠損インテグリンが誘導する細胞機能抑制機構の解析

インテグリンαvβ3あるいはαvβ5は血管構成細胞や腫瘍細胞に発現しており、血管新生、止血栓形成、腫瘍細胞の増殖・浸潤・転移に重要な分子と考えられている。本研究ではαv鎖の新規機能部位を同定すると共に機能を欠損したαvインテグリンが誘導する細胞機能抑制機構を解析することにより血管構成細胞や腫瘍細胞の制御方法の開発を目指している。【αv鎖におけるリガンド結合部位の解析】我々はすでにαv鎖内のTyr178がリガンド結合に必須の残基であることを明らかにしている。最近、環状RGDfVペプチドとαvβ3の結晶構造解析が報告され、RGDfVのArg側鎖がαv鎖内のTyr178に加え、複数の残基と近接していることが示された。しかしながら,これらの残基のリガンド結合能への影響に関しては不明であり、Arg側鎖と近接する3本のループの構成残基に関して系統的にAla置換し、リガンド結合機能への影響につき検討した。これにより、Tyr178に加え、新たにAsp218がリガンド結合に必須の残基であることが明らかとなった。一方、結晶構造解析においてリガンドと塩橋結合すると考えられたAsp150はAla置換により塩橋結合を破壊した状態においてもリガンド結合能を保持していた。また、興味あることにTyr178と立体構造上、対面に位置し、リガンドと近接するAla215を芳香族残基のTyrあるいはPheに置換すると、リガンド結合能が増加した。さらに、Tyr178を他の芳香族残基、Pheに置換してもリガンド結合能は低下せず、TyrのOH基ではなくベンゼン環がリガンド結合に関与(cation-πinteraction)していると考えられた。【機能欠損インテグリンにより誘導される細胞機能抑制効果の解析】機能欠損αv鎖(Tyr178Alaαv)の過剰発現は親株細胞(野生型αvβ3を発現させた293T細胞)細胞接着機能を抑制した。このドミナントネガティブ効果誘導のメカニズムを解析するために、αv鎖の細胞内領域を削除した変異体および細胞外領域をCD25に置換した変異体を作製した。さらに、β3鎖の細胞外領域をCD25に置換したキメラ蛋白を作製した。αvの細胞内領域を有するCD25(CD25/cyto αv)あるいはβ3の細胞内領域を有するCD25(CD25/cyto β3)の過剰発現は同量のempty vectorをトランスフェクションした時に比して、細胞接着機能の抑制効果を示したが、その程度はCD25/cyto β3でより強く認められた。これらの成績は、リガンド類似抗体でモニターした内因性αvβ3の発現量に明らかな低下を認めなかったことから、Tyr178Alaαvβ3が誘導する細胞接着抑制効果は両鎖の細胞内領域が関与していると推察された。

これらの成績は、リガンド類似抗体でモニターした内因性αvβ3の発現量に明らかな低下を認めなかったことから、Tyr178Alaαvβ3が誘導する細胞接着抑制効果は両鎖の細胞内領域が関与していると推察された。インテグリンαvβ3あるいはαvβ5は血管構成細胞や腫瘍細胞に多数発現しており、病的血管新生、病的血栓形成、腫瘍の増殖・浸潤・転移に重要な分子と考えられている。従って、これらのインテグリンの機能を制御することは血管病や悪性腫瘍の新たな治療法として有用と考えられる。本研究ではαv鎖の新規機能部位を同定すると共に機能を欠損したαvインテグリンが誘導する細胞機能抑制機構を解析することにより血管構成細胞や腫瘍細胞の制御法の開発を試みるものである。【αv鎖におけるリガンド結合部位の解析および機能欠損インテグリン発現細胞株の樹立】我々はすでにαv鎖内のTyr178がリガンド結合に必須の残基であることを明らかにしているが、昨年、環状RGDfVペプチドとαvβ3の結晶構造が報告され、環状ペプチド内のArg側鎖がαv鎖内のTyr178に加え、複数の残基と近接していることが明らかにされた。しかしながら、これら残基のリガンド結合機能への影響は不明であり、Arg側鎖と近接する3本のループの構成残基を系統的にAlaに置換することにより機能への影響を検討した。リガンドとして、重鎖超可変領域内にRGD配列を有するリガンド類似抗体(WOW-1 Fab)および生理的リガンドの1つであるフィブリノーゲンFBG)を用いた。WOW-1 FabおよびFBGはTyr178Alaαvβ3に加へAsp218Alaαvβ3にも全く結合せず、αv鎖内のTyr178と共にAsp218がリガンド結合に必須の残基であることが明らかになった。現在、これらの機能欠損αvβ3を発現する細胞株を樹立中である。【機能欠損インテグリンにより誘導される細胞機能抑制効果の解析】機能欠損αv鎖(Tyr178Alaαv)の発現が親株細胞の有する細胞接着能に対し、トミナントネガディブ効果を誘導するメカニズムを解析するために、細胞内領域を削除した変異体および細胞外領域をCD25に置換した変異体を作製し抑制効果への影響を検討したが、明らかな変化を認めず、膜貫通領域および細胞外領域が抑制効果誘導に関与していると考えられた。また、β3鎖の関与についてもαv鎖同様に変異体を作製し検討する予定である。さらに、機能欠損αvβ3の細胞内局在を解析するためにC末端側にGFPを融合した変異体を作製中である。インテグリンαvβ3あるいはαvβ5は血管構成細胞や腫瘍細胞に発現しており、血管新生、止血栓形成、腫瘍細胞の増殖・浸潤・転移に重要な分子と考えられている。本研究ではαv鎖の新規機能部位を同定すると共に、機能を欠損したαvインテグリンが誘導する細胞機能抑制機構を解析することにより、血管構成細胞や腫瘍細胞の制御方法の開発を目指している。【αv鎖におけるリガンド結合部位の解析】我々はXiongらによる環状RGDfVペプチドとαvβ3の結晶構造解析の報告に基づき、αv鎖内のリガンドに近接する3本のループの構成残基に関して系統的にAlaに置換し、リガンド結合機能への影響につき検討した。これにより、Tyr178に加え、新たにAsp218がリガンド結合に必須の残基であることが明らかとなった。一方、結晶構造解析においてリガンドと塩橋結合していると考えられたAsp150はAla置換により塩橋結合を破壊した状態においてもリガンド結合能を保持していた。
量子井戸レーザにおけるサブピコ秒光パルスの発生技術に関する研究

社会の高度化に伴い、将来の重要光技術として超高速光通信(100GHz以上)や超高速光情報処理(数ピコ秒)に対する期待が高まりつつある。その際半導体レーザにおける超短光パルス発生技術が重要な役割を果たすことは疑いがない。しかし、これまで半導体レーザ単体からの光パルスとしては10ピコ秒程度のパルス幅にとどまっていた。ところが最近本研究者らは、量子井戸レーザ(100〓程度の厚さの半導体超薄膜を有するレーザ)から1.3ピコ秒という最短の光パルスを発生させることに成功した。これは、2次元電子ガスが微分利得という物理量を増大させているためと考えられるが、まだ完全に解明されたとはいえない。本研究では、われわれの最近の成果をふまえ、量子井戸レーザにおいて1ピコ秒以下の光パルスの発生を目的とする。まず量子井戸構造における光パルスと2次元電子ガスとのサブピコ秒領域の相互作用を理論的・実験的に明らかにした。特に、半導体量子井戸構造の構造パラメータとパルス幅の関係についてストリークカメラを用いて詳細に明らかにすると共に、このような振舞いを理論的に解析した。その結果、量子井戸の数の減少に伴い利得の平坦化効果が生じ、パルス幅が広がることが示された。さらにストリークカメラの前に分光器を置くことにより時間分解スペクトルを測定することに成功した。これらの観測結果は、既にのべた利得の平坦化によるスペクトルの広がりを明確に示しており、量子井戸レーザにおけるピコ秒ダイナミックスを、理解するうえできわめて貴重なデータを提供した。われわれの成果は、量子井戸レーザにおけるサブピコ秒パルス発生技術の可能性を示唆しており、本研究の当初の目的を十分達することができたと考えられる。
意思決定の化学物質的基礎付け

昨年度から、ホルモンや神経伝達物質と、経済行動との関係を調査している。本年度のプロジェクトとして、女子短大生80人程度を被験者として、彼らにグルコースを経口投与することで、テストステロン濃度を意図的に下げ、それによってリスク行動が変化するかを確かめた。テストステロン濃度の高さは、女性においてリスク選考を高めているという報告があるためである。その結果、被験者の唾液中のテストステロン濃度は有意に下がったものの、その濃度とリスク選好には相関は見られなかった。しかし、これは30分程度の間隔をおいて計測したものでしかないため、テストステロン濃度の変化が神経作用を十分に発現するには、あまりに短時間だったと考えられる。また36名の大学院生集団を被験者として、経済行動の質問票に答えてもらうと同時に、その唾液によってテストステロンを、血液採取によって、トリプトファン体内濃度の代理変数として血中セロトニンを計測した。これによってセロトニンと主要な経済行動の分析を行った。これまでにセロトニンの高さは、時間選好に影響しており、より持久的になるという報告がなされてきた。しかし我々の実験では、これは確認できなかった。血中のセロトニン濃度と、リスク選好、時間選好、独裁者ゲームの分配、美人投票ゲームの予想、など主要な経済行動の変数との関係はまったく見いだせなかった。しかし唯一、独裁者ゲームのペアの相手に、金銭分配権を譲るという行為は、高いセロトニンと相関していた。あるいはこれは、精神的な安定の度合いが、対人的な配慮となって現れているのかもしれない。平成21年度の研究では、まず本研究の開始前より行っていた、1)テストステロンを中心とした生理化学物質と、リスク回避などの相関調査、また同物質が美人投票ゲームのレベルK推測に及ぼす影響についての実験調査について、日本経済学会で報告した。本年度の研究計画では、生理化学物質とリスク選択の実験調査について被験者数を拡大した実験によりデータの蓄積に努め、分析精度を高める予定となっていた。しかし実際に実験解析を行っていた最中に、本研究に非常に近接した内容を大規模に扱った論文がSapienza etal.(PNAS, Sep.2009)により報告された。なお、彼らの結果は、我々の初期の予想と一致して、テストステロンはリスク選好と強い正相関を持つというものであった。これを受け当初の予定を修正した。生理化学物質に関する関連論文の文献調査をし、神経伝達物質であるセロトニン(これらの物質は採血によってのみ計測可)とリスク選好や利他行動などの経済行動の相関を調査する実験を行うために、歯科インプラント治療前後の選択行動変化の調査と絡めた形で、採血を伴う実験の申請を実験倫理審査委員会に提出した。しかし、採血によって万一事故が発生した場合の対応計画が不備であるとの指摘をうけ、保留の扱いとなった。このため、実験の実施に伴う傷害保険契約の対応や、リスク選好と歯科治療その他の医療行為との関係の考察など、来年度の採血実験に向けた整備を行った。
双晶形成に基づく集合組織変化を活用した易成形性マグネシウム合金の創出

平成30年度は、H2829年度に得られた知見を活用し、汎用合金(AZ31合金)よりも底面集合組織が形成しにくく、優れた室温成形性を示すMg-Ca合金(Mg-0.5mass%Ca合金)を対象として、曲げ引張り加工法が集合組織形成及び室温成形性に及ぼす影響を調査した。そこでは、厚み1mmのMg-Ca合金焼鈍材を供試材として利用した。曲げ引張り加工に利用した金型の曲げ角度は45度、パンチの曲率半径は5mmとした。上記の金型に供試材をセットした後に速度100mm/minで曲げ引張り加工を行った。潤滑は機械油を利用した。加工後の試料に焼鈍(623K, 15min)を実施した後、パス回数毎に板材を表裏反転させる加工を6回行った。比較材として、曲げ引張り加工を行わないMg-Ca合金の特性の評価を行った。上記板材の底面集合組織をXRDにより評価したところ、曲げ引張り加工を実施しない比較材に関しては、(0002)面がRD-TD面に配向する典型的な底面集合組織が確認された。一方、曲げ引張り加工を実施したMg-Ca合金には、c軸がRD方向に3050度傾く集合組織が観察された。以上の結果から、Mg-Ca合金に関しても汎用Mg合金(AZ31合金)と同様に、曲げ引張り加工により集合組織の分布および強度を制御可能であることを確認した。さらに、上記Mg-Ca合金の室温エリクセン試験を実施した結果、比較材の室温エリクセン値は4.6であり、曲げ引張り加工を行ったMg-Ca合金の室温エリクセン値は5.1であった。このことから、Mg-Ca合金に関しても、曲げ引張り加工により集合組織を制御することにより、室温成形性を改善することが可能であることを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、Mg合金へのCa添加が圧延材の組織や室温成形性に及ぼす影響について系統的に調査を行った。Mg-Xmass%Ca合金(X=0.010.3)および純Mgインゴットを高周波炉により溶製し、押出加工の後に、均質化処理した試料を出発材とした。厚み5mmから1 mmまで高温での焼鈍と温間での圧延を繰り返し行い、圧延後に焼鈍を行った。圧延材の組織・集合組織を評価するとともに、圧延材より円形状のブランクを切り出し、エリクセン試験により室温張出し成形性を評価した。圧延材の底面集合組織を調査した結果、Ca濃度の増加に伴い集合組織強度は低下し、Mg-0.01%Ca合金の集合組織強度は約20であるのに対し、Mg-0.1%Ca合金の集合組織強度は約4まで低下した。また、上記合金の組織観察の結果、Caを0.3%以上添加すると比較的微細な粒径(35μm)になるが、0.1%以下の添加では結晶粒径に大きな差が現れないことが確認された(粒径:約50μm)。上記合金の室温エリクセン試験を実施した結果、Ca濃度が0.01から0.05%の範囲ではMg-Ca合金は純Mgとほぼ同じエリクセン値を示した。一方、Ca濃度を0.1%に設定すると著しく高いエリクセン値(7.1)が得られた。次に、汎用Mg合金(AZ31:Mg-3mass%Al-1mass%Zn合金)圧延材を対象として、曲げ引張り加工を実施し、曲げ引張り加工が板材の集合組織形成に及ぼす影響を確認した。一連の実験の結果、曲げ引張り加工時の金型形状(曲げ半径等)を最適化することにより、加工方向に傾いた特定の極が集合組織に現れることを確認した。Mg-Ca合金の組織と室温成形性の関係を明らかにするとともに、曲げ引張り加工によりMg合金の集合組織の形成を制御できることを汎用マグネシウム合金を用いて確認を行った。平成29年度は汎用マグネシウム合金(AZ31B:Mg-3mass%Al-1mass%Zn-0.5mass%Mn)と対象として、曲げ引張り加工法が集合組織形成及び室温成形性に及ぼす影響を系統的に調査した。供試材としては厚み1mmの完全焼き鈍し材を利用した。加工後の試料に焼鈍(623K, 15min)を実施した後に同様の加工(同一方向の加工)を行い、加工回数が集合組織形成に及ぼす影響を調査した。曲げ引張り加工前の試料は(0002)面がRD-TD面に配向する集合組織を示した。一方、複数回の曲げ引張り加工を行うと、c軸がRD方向に約2540度傾く集合組織が形成された。なお、7回以上の加工を行うと、集合組織の大きな変化は確認されなくなった。7回の曲げ引張り加工を行った試料のエリクセン値は6.7であり、曲げ引張り加工前の試料のエリクセン値(4.7)よりも優れた値を示した。次に、曲げ引張り加工の加工方向が集合組織形成等に及ぼす影響を調査した。

その結果、1回目の曲げ引張り加工に供した後に、板材を表裏反転させて(前後反転させずに)金型に設置し、2回目の加工に供する操作を6回繰り返す加工を採用すると、集合組織の形成に変化が現れることが分かった。具体的には、加工方向を変えない場合と同様に、c軸がRD方向に約2540度傾く集合組織が形成されるが、(0002)面の集積が低下する傾向が確認された。上記の加工を行った試料のエリクセン値は7.0であり、底面集合組織の分布および強度を制御すると、室温成形性を効果的に改善することが分かった。H28年度までに、Mg-Ca合金の組織と室温成形性の関係を明らかにするとともに、H29年度までに、曲げ引張り加工によりMg合金の集合組織の形成を制御するための条件を導出しているため。平成30年度は、H2829年度に得られた知見を活用し、汎用合金(AZ31合金)よりも底面集合組織が形成しにくく、優れた室温成形性を示すMg-Ca合金(Mg-0.5mass%Ca合金)を対象として、曲げ引張り加工法が集合組織形成及び室温成形性に及ぼす影響を調査した。そこでは、厚み1mmのMg-Ca合金焼鈍材を供試材として利用した。曲げ引張り加工に利用した金型の曲げ角度は45度、パンチの曲率半径は5mmとした。上記の金型に供試材をセットした後に速度100mm/minで曲げ引張り加工を行った。潤滑は機械油を利用した。加工後の試料に焼鈍(623K, 15min)を実施した後、パス回数毎に板材を表裏反転させる加工を6回行った。比較材として、曲げ引張り加工を行わないMg-Ca合金の特性の評価を行った。上記板材の底面集合組織をXRDにより評価したところ、曲げ引張り加工を実施しない比較材に関しては、(0002)面がRD-TD面に配向する典型的な底面集合組織が確認された。一方、曲げ引張り加工を実施したMg-Ca合金には、c軸がRD方向に3050度傾く集合組織が観察された。以上の結果から、Mg-Ca合金に関しても汎用Mg合金(AZ31合金)と同様に、曲げ引張り加工により集合組織の分布および強度を制御可能であることを確認した。さらに、上記Mg-Ca合金の室温エリクセン試験を実施した結果、比較材の室温エリクセン値は4.6であり、曲げ引張り加工を行ったMg-Ca合金の室温エリクセン値は5.1であった。このことから、Mg-Ca合金に関しても、曲げ引張り加工により集合組織を制御することにより、室温成形性を改善することが可能であることを明らかにした。引き続き、汎用合金を用いて曲げ引張り加工がマグネシウム合金の集合組織形成に及ぼす影響を調査し、集合組織が改質する好適な条件を導出する。得られた条件をMg-(Zn)-Ca合金等に適用し、曲げ引張り加工が組織・集合組織形成に及ぼす影響を明らかにする。H29年度までに抽出した曲げ引張り加工の条件を利用し、また、H28年度に組織と室温成形性を明らかにしているMg-Ca系合金等を対象として、曲げ引張り加工が上記合金の組織と室温成形性に及ぼす影響を明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Sox9コンディショナルノックアウトマウスを用いた胆道閉鎖症の病因・病態解析

胆道閉鎖症(BA)における病因や病態は未だ明確ではない。近年、SOX9の胆管発生や肝再生に関する報告がある。BAは細胆管増生(DR)が特徴的であり、肝障害とDRにおけるSOX9の関与について検討した。Sox9ノックアウトマウスを利用した肝障害では、四塩化炭素による肝障害でコントロールより有意な肝機能悪化を認めた。Hydrodynamic injection法によるSOX9遺伝子導入では、肝細胞に胆管マーカーであるOsteopontinの誘導と、肝細胞マーカーであるHnf4αの消失を認めた。これらの結果は、肝障害及び肝細胞の胆管化生に由来するDRにSOX9が関与する事を示唆していると考えられる。胆道閉鎖症は周産期に何らかの機序で胆管が閉塞し、生後肝門部腸吻合術(葛西手術)が必要となる病気であり、未だ病因は明らかにはなっていない。本研究は、胆管の発生や肝再生・線維化において重要な役割を担っているとされているSox9遺伝子の胆道閉鎖症における役割を、Sox9コンディショナルノックアウトマウスを用いて解明し、胆道閉鎖症の病因や発症予知、病態の評価、病態進展の予防に資することを目的としている。今年度は、Sox9コンディショナルノックアウトマウスの作製とそのマウスの表現型解析を行った。loxPという特定DNA配列を標的とした組換え酵素Creが発現するとloxPに挟まれた配列を欠失させることのできるCre/loxPシステムを利用した。Alb(アルブミン)-CreドライバーマウスとSox9-floxedマウスを交配させ、Alb Cre/+;Sox9 flox/floxマウスを得ることで、Alb陽性細胞におけるSox9ノックアウトマウスを作製した。マウスにおけるAlbの発現は、胎生期に肝細胞と胆管細胞に分化する前の肝芽細胞の時点から発現が始まるため、免疫組織化学染色において中枢側の胆管を除くほとんどの胆管におけるSox9のノックアウトが確認された。しかし、出生後の胆管における形態学的な異常を確認することはできなかった。したがって、SOX9が直接はマウスにおける胆管の器官形成に影響しない可能性も示唆されたが、慢性肝障害時にみられる増生細胆管及びその周囲に見られる肝線維化には、SOX9が大きく寄与していることが今までの報告から推測されるので、次年度以降、SOX9コンディショナルノックアウトマウスを用いた肝障害モデルでのSOX9の機能解析を進めていく。本年度は、まずSOX9コンディショナルノックアウト(KO)マウスを用いた肝障害モデルでのSOX9の機能解析を行った。マウスは、Alb Cre/-;Sox9 flox/floxを用いて、コントロールはC57BL6Jマウスとした。四塩化炭素による肝障害では、1μl/gを週3回腹腔内投与した。3・6・10週目に比較検討した。3・6週目でKOマウスに有意なALT上昇を認めた。一方、oval細胞活性化モデルである、0.1%DDC(餌)による肝障害では、1・3週目・3週DDC投与2週休薬で検討したが、いずれも血液生化学検査で有意差は認めなかった。肝細胞性障害においてSOX9の有無の関与が示唆された。また我々は、以前胆道閉鎖症患者の肝臓で、通常胆管に発現するSOX9が肝細胞に異所性に発現している事をつきとめた。胆道閉鎖症の病理組織で見られる特徴的な所見として増生細胆管があるが、その由来は未だ分かっていない。我々は、増生細胆管が肝細胞の胆管化生に由来する可能性を考え、そこにSOX9遺伝子が関与しているのではないかと考えた。そこで、10週齢のC57BL6Jマウスの肝細胞にヒトSOX9を長期・異所性発現させるため、SOX9発現細胞にGFPも同時に発現させる事ができるバイシストロニックな発現ユニットを構築し、hydrodynamic injection法を用いた。HDI7日目にオステオポンチン(OPN)が一部の細胞に誘導され、HNF4αの発現消失を認めた。マウス肝細胞にSOX9を異所性発現させる事により、SOX9単独で肝細胞に胆管分化を誘導できる可能性が示唆された。また、OPNは細胞外マトリックスの重要な構成成分であり、線維化の重症度のバイオマーカーとして知られているが、導入されたSOX9とOPNとの関連についてもさらなる検討を行う事で、線維化の進展に関する新たな知見が得られると考えられた。小児外科当初の目的では、胆管系細胞特異的Sox9ノックアウトマウスの作製と解析を行う予定であったが、CK19-CreERT2マウスを導入することができなかったため、代用としてAlb-Creドライバーマウスを用いることとなった。

但し、障害肝におけるSox9の機能を解析するという目的を達成することに関しては問題ないため、今後はこのノックアウトマウスを用いて解析を進めるが、CK19-CreERT2マウスが導入できるように交渉を続けていく予定である。今後は、胆道閉鎖症類似病態におけるSox9遺伝子の寄与解析を行うため、Sox9ノックアウトマウスを用いた肝障害モデルマウスを作製し、肝障害時における胆管形成や線維化について、免疫染色を中心にコントロールマウスとの比較検討を行っていく。Sox9コンディショナルノックアウトマウスの作製・繁殖に時間を要したため、その後の機能解析を行う時間が当初の予定より短かくなったため。コンディショナルノックアウトマウスの飼育費及び免疫染色に使用する抗体の購入に使う予定である。
小腸幹細胞の同定とその維持・分化に関わるRNA結合蛋白Musashi-1の解析

小腸の幹細胞については、未だ不明な点が多い。RNA結合蛋白Musashi-1、転写因子Hes1は、中枢神経系幹細胞の維持や分化に重要な働きをしているが、小腸にも発現している。本研究では、小腸の幹細胞維持、再生、分化におけるMusashi-1、Hes1の役割と、Hes1 K/Oマウスについて検討した。(結果)(1)RT-PCRではMusashi-1はマウスの大脳、胃、小腸、大腸、肝、一部の小腸細胞株に、Hes1は、これらすべての臓器、細胞に発現していた。(2)免疫染色では、生後1日目マウスではいずれも幹細胞が存在する絨毛間の細胞に発現していた。7、14日目では、ともにパネート細胞(P細胞)周囲の細胞に発現が見られた。さらに21日目には、P細胞間に存在するcrypt base columnar cell(陰窩底部円柱上皮細胞、CBC)とP細胞直上のいわゆる小腸幹細胞は、Ki-67が強陽性であった。この時点では、Musashi-1、Hes1は小腸幹細胞領域とCBCにも共存していた。しかしその他の上皮細胞には認められなかった。またHes1は、Musashi-1と比べるとより絨毛側の細胞にも存在していた。(3)一方、Hes-1 K/Oマウスの出生直後のRT-PCR,免疫染色では、正常マウスに比較して、小腸内分泌細胞の転写因子Math1の発現が著明に増強していた。さらに、通常生後714日目頃から見られるP細胞が生直後から出現しており、cryptidin1、4、5の発現も早期から見られた。一方Musashi-1の発現は軽度低下していた。(考察)従来、小腸上皮幹細胞はP細胞の直上にあって、上下2方向に分化すると考えられていた。しかし今回の結果より(1)これら陰窩のMusashi-1、1Hes1陽性細胞がすべて小腸の幹細胞として機能し、そこからP細胞や上皮細胞に分化する可能性、あるいは(2)P細胞直上の幹細胞が絨毛の幹細胞であり、CBCがP細胞の幹細胞である可能性が示唆された。またHes1 K/Oマウスで、内分泌細胞やP細胞への分化が早期から見られたことから、Hes1は小腸上皮の分化を抑制しているものと考えられる。