hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エボラウイルス感染に関わる宿主因子の網羅的同定

エボラウイルスの増殖に関わる宿主因子を網羅的に同定することを目的として、遺伝子組み換え技術により作出した無毒化エボラウイルスを用い、宿主因子探索系の構築を試みた。しかし、宿主因子の探索・同定に最適と考えられたヒト由来KBM7細胞株は、エボラウイルスに感受性を示さず、ウイルス感染に必要な未同定の宿主因子が発現していないことが示唆された。一方、ハムスター由来CHO細胞は無毒化エボラウイルスに感受性を示したことから、今後はCHO細胞を基盤として研究を遂行することが期待できる。エボラウイルスは、ヒトを含む霊長類に重篤な出血熱(エボラ出血熱)を引き起こすウイルスである。中央・西アフリカ諸国で散発的な流行を繰り返しており、最近では2007年にウガンダで新たなアウトブレイクが起こった。さらに、その高い致死率(5090%)と凄惨な病状から、生物兵器としての使用も危惧されている。しかし、ウイルスの取り扱いがBiosafety Level 4(BSL4)実験施設に制限されていることが基礎研究を行う上での障害となっていることもあり、効果的な予防・治療法は未だ確立されていない。本研究では、エボラウイルス感染に対する効果的な予防・治療法の確立を目指して、エボラウイルス増殖過程に重要な役割を果たし、なおかつ抗ウイルス薬の標的となり得る宿主因子を、BSL4施設よりも危険レベルの低いBSL3実験施設で網羅的に探索・同定することを目的として研究を行っている。レトロウイルスベクターを用いて、染色体数が約半数(低2倍性、hypodiploid)のヒト白血球由来KBM7細胞株に、エボラウイルスタンパク質VP30を強制発現させた。さらに、この細胞株のエボラウイルスに対する感受性を向上させるため、エボラウイルス侵入増強宿主因子として知られるAxlも強制発現させることで、KBM7-VP30+Axl細胞株を樹立した。今後、VP30欠損エボラウイルス(EbolaΔVP30-Neoウイルス)を人工合成し、EbolaΔVP30-Neoウイルスの感染によりKBM7-VP30+Axl細胞が完全に死滅することを確認する。一方、KBM7-VP30+Axl細胞の染色体上で機能遺伝子を"捕捉"する遺伝子ツールとして、Dr. Thijn R. Brummelkamp (Whitehead Institute)からGene-trap用レトロウイルスベクターを分与していただいた。今後、このベクターを改良し、より効率的で網羅的な宿主因子のmutagenesisを可能とするGene-trap用レンチウイルスベクターを作出するエボラウイルスは、ヒトを含む霊長類に重篤な(致死率5090%)出血熱を引き起こす病原体で、中央・西アフリカ諸国で散発的な流行を繰り返しているほか、その凄惨な病状から、生物兵器としての使用も危惧されている。しかし、ウイルスの取り扱いがBiosafety Level 4(BSL4)実験施設に制限されていることが基礎研究の妨げとなっており、効果的な予防・治療法は確立されていない。そこで、エボラウイルス感染に対する予防・治療法の確立を目指して、エボラウイルス増殖過程に重要な役割を果たし、なおかつ抗ウイルス薬の標的となり得る宿主因子を、BSL4施設よりも危険レベルの低いBSL3実験施設で網羅的に探索・同定することを目的として研究を行った。VP30遺伝子を欠損させた組換えエボラウイルス(EbolaΔVP30-Neoウイルス)は、VP30蛋白質を強制発現させた培養細胞でのみ限定的に増殖することが報告されている。そこで、染色体数が約半数(低2倍性、hypodiploid)のヒト白血球由来KBM7細胞をもとに、VP30蛋白質強制発現細胞を樹立した。この細胞に、EbolaΔVP30-Neoウイルスを接種したが、ウイルスの増殖は確認できなかった。次に、このVP30蛋白質強制発現細胞のエボラウイルスに対する感受性を高めるため、エボラウイルス侵入増強宿主因子として知られるAxlも同時に強制発現させた。しかし、このVP30蛋白質・Axl強制発現KBM7細胞も、EbolaΔVP30-Neoウイルスに対する感受性は示さなかった。これらの結果から、KBM7細胞には、エボラウイルスの感染・増殖をサポートする未同定の宿主因子が発現していないことが示唆された。最近Caretteらは、KBM7細胞が、エボラウイルスのエンベロープ蛋白質GPを被った水泡性口内炎ウイルスに対して低感受性であることを報告しており(Carette et al.,Nature,2011)、本研究結果と一致する。一方、ハムスター由来の低2倍性細胞であるCHO細胞にVP30蛋白質を強制発現させたところ、EbolaΔVP30-Neoウイルスの増殖が確認された。今後はCHO細胞を基盤としてMutagenesisを行うことにより、研究を遂行することが期待できる。
放射線等で生じる、異常な付加体が付くゲノム切断端から付加体を除去する機序の解明

放射線などの環境要因や内的要因から自然発生するゲノム切断の多くは切断端が化学修飾された「汚い」切断であり、発がん性の強いDNA損傷である。この「汚い」ゲノム切断の修復はまず切断端を「きれい」(3′末端に水酸基、5′末端にリン酸基が付いた状態)にする必要があるが、分子機構の多くが不明である。そこで本研究では切断端の異常な化学修飾の除去を測定するバイオアッセイを開発する。申請者はDNAのもつれを解消するDNAトポイソメラーゼ(Top2)がしばしば触媒に失敗して「汚い」DNA切断を作ることに着目した。Top2によるDNA切断を一過的に誘導することで「汚い」切断を「きれい」な切断にする機構を解明する。
2次元スピン-フェルミオン模型の磁性と金属絶緑体転移の理論

La_<2-X>Sr_XCuO_4等の銅酸化物系の低ホール濃度領域において、局在的な反強磁性秩序と金属絶緑体転移が実験的に観測されている。我々はこの問題に関連し、低ホール濃度における反強磁性的な相関が強い方面からのアプローチとして、スピン-フェルミオン模型の次のような基本的な物性を明らかにした。(1)反強磁性相内においてマグノンとフェルミオンの束縛状態が形成されることが摂動論の不安定性により予想されていたが、我々は基底状態からのアプローチによりその存在を明らかにし、磁性不純物が希薄な系におけるスピンとフェルミオンの局在的な束縛状態とは対照的に、この束縛状態が波数kによって指定される非局在的なものであることを示した。スピンとフェルミオンの相互作用J_Kが反強磁性的な場合には束縛状態はsinglet成分を含むものになり、強磁性的な場合はtriplet成分のみのものになるということや、3次元の場合に束縛状態ができるためのJ_Kの最小値の大まかな値などの新しい結果が得られた。(2)スピン-ポーラロン状態に関連し、マグノンを媒介にしたフェルミオン間の相互作用を調べ、さらに、その有効相互作用を媒介にした超伝導について、それまでの理論では考慮されていなかったtwo magnon exchangeの寄与も含めるなど系統的な研究を行い、このような超伝導が実際に観測される可能性を議論した。two magnon exchangeの寄与は定性的にも無視できず、低ホール濃度においてはこの寄与により、tripletの対称性の対が形成されることなどがわかった。
地域防災のＩＣＴ活用アクティブラーニングパッケージの開発と教員養成における展開

平成30年度は、本プロジェクトが開発してきたICT活用防災教育支援教材を用いた協力校の授業実践を平成28・29年度に引き続いて支援し、当該年度一学期に小学校1校、2・3学期に中学校1校において当教材に含まれるコンピュータソフト及び評価シートの稼動・適用実績を蓄積し、ソフトウェアでは主に作業インターフェイスの改革・改良を進め、評価シートでは主に信頼性・妥当性の検証から評価項目の改善と入れ替えを進めてきた。それと共に、本プロジェクトは学校教員のためのアクティブラーニング支援を主目的とするため本教材の教員養成への展開を想定し、実際の現職教員を対象とした講習会を夏季に教員免許状更新講習選択講座として企画・実施した。当講座には30人の小・中・高等学校教員が参加し、児童生徒の防災学習と同様にタブレット型コンピュータを用いた防災マップ作りを体験し、その指導方針と活動手順を学んだ。教室での事前学習後、屋外に出ての地域の安全・危険情報の取材(現場の撮影)から、教室に戻っての取材情報を活用したマップ制作、そして発表と討論、及び成果の評価まで一連の学習活動のパッケージとして参加教員においてその習得・運用に問題は見られず、結果として概ね好評であった。講習後のアンケートではほぼ全員が「よい」または「だいたいよい」と回答した。本プロジェクトの成果を載せたHPの記事により協力校以外の小学校からの引き合いもあり、防災教育におけるICT活用アクティブラーニングを支援する有効な教材として関心をいただいた。最終的に本プロジェクトの成果物はWebサイトにおいて閲覧または入手可能とする(URLは備考欄または成果報告参照)。ただしタブレット型コンピュータに装着するソフトウェア(地域取材のためのインターフェイス)は著作権の関係があり要相談となる。防災学習評価のための統計分析プログラムは無償でダウンロードできる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、本研究が最終成果物として予定する防災教育アクティブラーニング・サイトで提供する地域防災教育教材の制作とソフトウェアの開発を行った。防災教育教材の情報基盤のプロトタイプとして、2014年に発生した長野県神城断層地震の災害アーカイブを構築した。これは次年度からの防災教育実践における教材として活用する予定である。また、他方で実際にアクティブラーニングによる防災教育実践を支援するためのソフトウェアを開発し、実証試験としての授業実践を企画・実施した。この授業は児童自身による防災教材の作成活動であり、同ソフトウェアは児童の学年段階や学習内容にあわせて教師側で任意にセッティングを操作・変更でき、児童の学習と教師の指導の両用の支援ソフトとしての機能をもたせた。具体的には、当該ソフトはオフラインで活用可能なipad用防災マップ作成支援アプリであり、Web-GIS基盤のeコミマップを活用して、ある地点で撮影した画像等に地理的位置情報をその時点で付加することができる。実際に長野県内の小学校において3年生を対象に社会科・総合的な学習の時間で、このソフトを実装したipadを児童自身に携帯させて郊外に出て自由に地域を取材し、現場で撮影した画像と児童自身のコメント(文字入力)を教室に持ち帰り、コンピュータ画面上で地域防災マップの制作活動を行った(画面上のマップの撮影地点に当の画像が自動的に格納される)。これにより児童の当該ソフトの使用中のログデータ、及び操作性・効率性等のアンケートデータを学習情報・評価情報として得た。このデータをもってソフトウェアの改良・改善と防災教育授業の評価方法の開発研究を行った。平成28年度は本プロジェクトの実施1年目に当たり、主たる達成目標として、(1)児童用の知識習得・自学用eラーニング教材の開発、(2)アクティブラーニング・サイトの構築、(3)教師用のアクティブラーニング支援教材の開発、及び(4)診断的・形成的・総括的評価手法を含むアクティブラーニングパッケージの開発を挙げていた。結果として、サイトの基本設計(上記2)を実現し(実際のプログラミングは経費が大きいので次年度も設計の更新を進めてから発注することにした)、また児童用・教師用の両用教材として使える防災マップ作成支援ソフトウェアの開発(上記1,3)を実現した。そして、当該ソフトウェアの実証試験として小学校の授業で使用した際に、参加した児童の学習情報・評価情報を得ることができたので、このデータを利用しアクティブラーニングパッケージの開発に必要となる防災学習の評価方法の研究(上記4)を行うことができ、次年度から同パッケージの具体的な設計と制作に見通しをもつことができた。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。本研究プロジェクトは、防災教育の今日的必要性と重要性に鑑み、学習者中心のアクティブラーニングとICT活用を特徴とする防災教育教材及び機器を開発し、パッケージとして学校教育実践に提供することを目的とするものである。平成29年度は、前年度に引き続いて地域防災教育教材の制作とソフトウェアの開発・改良を継続した。そして、小学校・中学校の協力校において教材及び関連するICT機器とソフトウェアの実証試験を目的とした授業実践を企画・実施した。具体的には、ソフトウェアはWeb-GIS基盤のeコミマップを活用した地域防災マップ作成支援アプリであり、これをタブレット型コンピュータ(以下、COM)に搭載した。児童生徒が当該COMを校外実習に持ち出して現場で操作し、地元地域の安全地帯・危険箇所を撮影すると地理的位置情報が自動的に画像に付加され、また簡単なコメント入力ができるものであり、特に今年度は、これらの撮影画像や入力テキストを教室に持ち帰りCOMの画面上で整理し、プレゼン資料まで作成して成果発表できるように機能向上を図った。授業実践は小学校に加えて、新たにインターフェイスを新規追加して中学校においても実施し、機器とソフトウェアの操作性・効率性を検証した。

これと並行して、児童生徒の学習達成目標の評価のため防災に関する自己効力感及び災害自体と被災に伴う感情処理の知能を評価するためのテスト項目開発に取り組むと共に、同じく前年度に引き続き、長野県を中心とした断層帯や活断層に関する調査知見を発掘・収集し、防災教育に用いる教材内容の充実を図った。平成29年度は、開発したアクティブラーニング用ソフトウェアと学習機器について小中学校をフィールドとした実証研究を行い、それらを含む防災教育教材パッケージの運用実績を蓄積し、その効果のエビデンスを得ることを目標としていた。今年度、小学校に加えて新たに中学校での授業実践を行うことができ、開発ソフトと機器の安定した作動と操作性を確認した。また、同授業実践において児童生徒を対象とした防災教育評価アンケートを実施し、評価情報を蓄積し評価アンケートのバージョンを更新した。同じく教材パッケージの内容として地域の地質・地層関連の知見を収集し学習用トピックのバリエーションを増やした。さらに、これらの実践と成果を公開するインターネットサイトを立ち上げた。以上の成果に基づいて、最終年度(平成30年度)における教師用アクティブラーニング支援教材の設計・制作と、それを用いた教員対象の講習事業が見込めることにより、「おおむね順調に進展している」と判断した。平成30年度は、本プロジェクトが開発してきたICT活用防災教育支援教材を用いた協力校の授業実践を平成28・29年度に引き続いて支援し、当該年度一学期に小学校1校、2・3学期に中学校1校において当教材に含まれるコンピュータソフト及び評価シートの稼動・適用実績を蓄積し、ソフトウェアでは主に作業インターフェイスの改革・改良を進め、評価シートでは主に信頼性・妥当性の検証から評価項目の改善と入れ替えを進めてきた。それと共に、本プロジェクトは学校教員のためのアクティブラーニング支援を主目的とするため本教材の教員養成への展開を想定し、実際の現職教員を対象とした講習会を夏季に教員免許状更新講習選択講座として企画・実施した。当講座には30人の小・中・高等学校教員が参加し、児童生徒の防災学習と同様にタブレット型コンピュータを用いた防災マップ作りを体験し、その指導方針と活動手順を学んだ。教室での事前学習後、屋外に出ての地域の安全・危険情報の取材(現場の撮影)から、教室に戻っての取材情報を活用したマップ制作、そして発表と討論、及び成果の評価まで一連の学習活動のパッケージとして参加教員においてその習得・運用に問題は見られず、結果として概ね好評であった。講習後のアンケートではほぼ全員が「よい」または「だいたいよい」と回答した。本プロジェクトの成果を載せたHPの記事により協力校以外の小学校からの引き合いもあり、防災教育におけるICT活用アクティブラーニングを支援する有効な教材として関心をいただいた。
高速空気流シミュレーションを用いた高効率高性能インターレース加工プロセスの開発

本研究では、少ないエネルギで効果的かつ高効率高品質を有するインターレース加工プロセスを計算機シミュレーションの利用により構築することを目的として、研究の遂行を行った。得られた結果を以下にまとめる。(1)インターレーサ内のモノフィラメントを円柱と見立てた計算モデルにより、この1本の円柱に高速の一様分布空気流を衝突させた場合の円柱まわりの流速、圧力、密度、および抵抗などをTVDスキームにより計算した。円柱周りの衝撃波の状態は一様分布空気流速により大きく変化することがわかった。また、抵抗係数は流速の増加と共に増加した。また、形状抵抗係数は摩擦抵抗係数に比べると格段に大きいことが認められた。(2)平行平板間に細い円柱を置く計算モデルを考え、TVDスキームにより計算を実施した。細い円柱に対する抵抗係数はマッハ数1以上ではマッハ数を増加してもほとんど増加しない結果が得られ、流速を上げすぎることは糸の運動に対して効果的でないことがわかった。また、インターレーサの形状にも最適値が存在することが明らかになった。(3)糸道管内にある静止した1本の円柱に作用する空気抵抗を実験的に検討した。力の時間平均値が大きな勾配をもつ噴流境界や時間的な変動の激しい噴流対壁と噴流境界の交わる付近で、フィラメントの相対的位置を変化させる作用が大きくなり、効果的なインターレース加工が実現できることがわかった。(4)以上の結果を総合的に考察した結果、高性能高効率インターレース加工プロセスを行うための指針として、(i)インターレース加工を行う際の空気流速には、ある最適値が存在し、過剰に空気流速を増加させてもエネルギに対するインターレース糸生成の効率はよくないことが示唆された。(ii)インターレース加工の是非を左右するフィラメントに作用する空気抵抗にはインターレーサの形状が大きく寄与する、などの知見が得られた。高効率高性能なインターレース加工プロセスを構築することを最終目的として,まず,インターレーサ内におけるフィラメント運動の計算モデルを構築することを試みた.そこで,モノフィラメントを円柱と見立て,この1本の円柱に高速の一様分布空気流を衝突させた場合の円柱まわりの流速,圧力,密度,および抵抗などをTVDスキームによりシミュレーションした.その結果,超音速一様分布空気流を衝突させた場合,円柱より上流側に離脱衝撃波が形成されるとともに,円柱表面からも斜め衝撃波が形成された.遷音速一様空気流を衝突させた場合,円柱より上流側に形成される離脱衝撃波は円柱より遠ざかった.亜音速一様分布空気流を衝突させた場合,離脱衝撃波は形成されない.円柱表面から形成される斜め衝撃波は,超音速一様分布空気流の場合に比べて円柱の上流側に移動し,かつ弱くなることが認められた.抵抗係数は流速の増加と共に増加した.形状抵抗係数は摩擦抵抗係数に比べると格段に大きいことが認められた.また,流路中に挿入した1本の円柱に衝突する高速空気噴流による抵抗に関する実験を行い,噴流境界付近や流路壁面近傍で糸は開繊しやすいことが示唆された.今後は,円柱を流路中に入れた,よりインターレーサ内の流れ域に近い境界条件の下で,流速,圧力,密度などや抵抗についてシミュレーションにより検討する.また,流路中に挿入した1本の円柱に作用する抵抗に関する実験結果との比較をすることにより,シミュレーション法の妥当性を確かめる.本年度は、高効率インターレース加工プロセスの構築を計算機シミュレーションで実施するため、インターレーサ内における空気の流動およびモノフィラメントに作用する空気抵抗を明らかにすべく研究を実施した。得られた成果は以下の通りである。(1)本研究室で開発した高解像度

風上差分法(TVD)によるインターレーサ内高速空気流シミュレーションプログラムを用いて、モノフィラメント糸を円柱に見立てて、一様空気流中におかれた円柱に作用する空気抵抗を計算機シミュレーションにより求めた。その結果、抵抗係数は空気の流速/音速で表されるマッハ数に比例して増加するが、摩擦抵抗係数は抵抗係数に比べて小さく、糸は空気摩擦による影響はほとんど受けず、流速の方向に運動することが示唆された。しかし、インターレーサ内の流れにより近い平行平板内におかれた細い円柱に対する抵抗係数はマッハ数1以上ではマッハ数の増加と共に減少した結果が得られ、流速を上げすぎても糸の運動に対する効果が見られないことがわかった。以上のシミュレーション結果から、効率よくインターレース加工を行うための最適な空気流の速度が存在することが示唆された。(2)インターレーサ内に存在するモノフィラメントを、糸道管内にある静止した1本の円柱と仮定し、その円柱に作用する空気抵抗を実験的に検討した。その結果、力の時間平均値が大きな勾配をもつ噴流境界や時間的な変動の激しい噴流対壁と噴流境界の交わる付近で、1本1本のフィラメントに空間的あるいは時間的に異なった力が作用し、フィラメントの相対的位置を変化させる作用が大きく、インターレース加工に効果的であることがわかった。
高温超電導浮上直流モータの開発と制振に関する研究

本研究では、原理が単純でしかも容易に高速回転が得られる直流モータに着目し、この駆動方法を高温超電導浮上モータに応用した高温超電導浮上直流モータを開発し、このモータの磁場及び運動解析、さらに駆動原理の解析、これらを基にした制振方法の開発を目的としている。この目的を達成するため平成18年度には既存の軸を有する回転系を浮上回転系へと移行する事を計画し、これに伴う設計及びモデルによる検討を行い実際に浮上回転系の試作を行った。この結果、本直流モータは、駆動コイルに対する磁束の方向に極めて敏感に反応し、従来有軸系にて構成していた磁気回路構成を非接触・浮上系で再現することが困難であり、実現性が非常に低いことが判明した。しかしながら、本研究を行う課程で、浮上用に用いる厚み方向に磁化された単純な円盤形磁石の表面磁束密度を正確に測定解析した結果、永久磁石製作時の微少な磁気勾配を発見し、これを用いて非接触・浮上系における駆動を実現し、さらにこの駆動方法を拡張させることを考え、(1)浮上用永久磁石の外周上方に安定した多極化磁束領域を創出することに成功、(2)これを用いた3相同期モータの開発に成功し無制御で高速回転域まで(6000[rpm])の駆動に成功、(3)センサーコイルの電磁誘導を用いた非常に簡便なアクティブダンパ系の開発(4)(3)を用いて共振時の触れ回り振動を1/6程度に低減させることに成功等の成果を得ることができた。従って平成19年度は高温超電導浮上直流モータの開発より派生した同期モータの開発並びに解析および制振について学会発表並びに論文投稿を行った。しかしながら本直流モータは、駆動コイルに対する磁束の方向に極めて敏感に反応し、従来有軸系にて構成していた磁気回路構成を変更することが困難であることが判明した。このためこの磁気回路構成を浮上系にて応用した場合、磁気回路と回転体磁石との吸引力が超電導浮上によるピン留め力に勝り、磁気回路と回転体が吸着してしまった。そこで、回転体を多角形とし、磁気回路構成の自由度を上げることによってこの問題を解決することとした。このため研究計画に遅延が生じているが、現在モデル作成及び解析を実行中である。また試作段階での磁気回路構成を検討する中で浮上用に用いる厚み方向に磁化された単純な円盤形磁石の外周上方に多極化した磁束領域を創出することに成功し、これを用いた3相同期モータの開発に成功し無制御で高速回転域まで(約6000[rpm])の駆動に成功し、さらに非接触の簡単な磁気ダンパによる共振時振動の制振も実現された。従って平成18年度は高温超電導浮上直流モータの開発より派生した同期モータについて研究発表を行った。
エンドソームを起点とするシグナル発信機構の解明

刺激により細胞膜上で活性化した受容体チロシンキナーゼ(RTK)は、エンドサイトーシスによってエンドソームに集積し、リソソームへと運ばれ分解される。この時、受容体の一部は細胞膜にリサイクルされ、リソソームによる分解を免れる。最近の研究から、同じ活性化した受容体が細胞膜とエンドソームからとで異なるシグナルを発信し、異なった細胞応答を引き起こすことが明らかとなってきた。我々は、RTKの1つ上皮成長因子受容体(EGFR)に注目し、エンドソームを起点とするEGFRシグナルの制御機構の解明を目指している。昨年度までの解析から、ROCOファミリーキナーゼの1つLRRK1が、小胞体(ER)-エンドソームコンタクトサイト上で、EGFRの脱リン酸化・不活性化に重要なことを明らかにした。またLRRK1は、EGFRのエンドソーム内腔への取り込みにも重要である。これらのステップを制御することでLRRK1は、エンドソーム膜上から発信されるEGFRシグナルを負に制御していることを明らかにした。エンドソームを起点とするシグナル発信機構の解明を行うにあたり、EGFRシグナルと、それを制御するLRRK1キナーゼとの関係に注目して解析を進めてきた。その結果LRRK1が、ER-エンドソームコンタクトサイト上で、EGFRの脱リン酸化・不活性化に重要なことを明らかにできた。また現在、エンドソーム上でLRRK1と相互作用する分子をいくつか同定しており、これらの分子との関係を中心にさらなる解析を進められる状況にある。これまでの解析から、ER-エンドソームコンタクトサイト上で、LRRK1がEGFRの脱リン酸化・エンドソーム内腔への取り込みに重要なことを明らかにしてきたが、その制御機構については不明なままである。現在、LRRK1がコンタクトサイト形成に重要な分子や、EGFRを脱リン酸化するフォスファターゼと相互作用していることを見出している。そこでこれらの分子との関係に注目し、LRRK1によるエンドソーム上でのEGFRシグナルダウンレギュレーション機構の解明を行う。さらに、LRRK1によるEGFR細胞内トラフィック制御を数理モデル化し、重要なファクターが何か抽出する作業を進める。
家族性血小板血症の発症機序の分子生物学的解明

我々が、世界に初めて報告した血小板増多因子トロンボポエチンの受容体c-mpl遺伝子変異による家族性血小板増多症につき、膜貫通領域にある本変異Asn505がいかにシグナル活性化をおこし、疾患発症に関わったのかについて、本研究で検討した。結果、以下の点を明らかにした。本変異Asn505は、リガンド非依存性にc-mplの二量体形成を誘導し、下流のシグナルSTAT5,ERK1/2をリン酸化(活性化)させ、細胞増殖を誘導すること、C-mpl二量体形成に細胞外ドメインに存在するジスルフィド結合の関与があるかについて、細胞外ドメインの欠失体でも、二量体は形成されシグナルは活性化されること。さらに、自律性二量体形成能に関わる分子間力を検討するため、Asn505部位の様々な変異体を形成し、二量体形成、シグナル活性化につき検討したところ、アミノ酸として強い極性を有する残基(Asp, Gln, Glu等)にのみ自律性活性化能があることから、水素結合が本シグナル活性化の必須である二量体形成のための分子間力であることを明らかにした。弧発性血小板増多症20例の解析でc-mpl変異の有無を検討した結果、本Asn505変異はなく弧発性血小板増多症にはAsn505変異の関与性は示さなかった。以上の実験結果を得たが、これにより、受容体の膜貫通領域にあるAsn505変異遺伝子変異によりシグナル活性化が起きるメカニズムとして、これまで報告されていたジスルフィド結合の形成の他に、水素結合を分子間力として二量体形成がおき、活性化反応が引き起こされる機序を同定するに至った。我が国でも数家系しか報告のない貴重な家族性血小板血症を見出し、その病因を分子生物学的に明らかにすべく、血小板産生に関わる既知の分子の変異の有無をスクリーニングした結果、血小板増多因子トロンボポエチン(TPO)のレセプターであるc-mpl遺伝子内膜貫通ドメインにアミノ酸置換を伴うSer505Asn変異を見出した。本活性化変異候補Asn505が機能的に直接にFET患者の血小板増多を惹起しているかどうかを明らかにするために、本変異アレルを含むc-mpl cDNAをBAF/3細胞へ発現導入し、本来もつBAF/3細胞のサイトカイン(IL3)依存性増殖が非依存性となること、細胞内シグナルであるERK1/2とSTAT5がサイトカイン(IL3)非依存性に燐酸化されていることを見出し、本変異Asn505は細胞内シグナル活性化をひきおこし細胞の自律性増殖を惹起していることを示し、本FET発症の責任遺伝子異常である事を証明した。次にAsn505変異の機能解明として、c-mp1レセプターの自律性の多量体(二量体)形成能の実験を進め、cross linking法を用いて検討した結果、変異体ではligand非存在下でも多量体(二量体)形成し、細胞増殖、そして細胞内シグナル活性化を誘導していることを明らかにした。また、変異部位を様々な塩基に置換した変異体を作成し、二量体形成能、細胞内シグナル活性化について検討したところ、Asnを含めて極性の強いアミノ酸残基を有する変異体において二量体形成とシグナル活性化が確認できた。以上より、Asn505は、アミノ酸残基として有するその強い極性に伴う水素結合力により二量体を形成し、細胞内シグナルを活性化し、巨核球増生、そして血小板増多症を成立させていることを示すことができた。

本変異Asn505は、リガンド非依存性に(C-mplの二量体形成を誘導し、下流のシグナルSTAT5,ERK1/2をリン酸化(活性化)させ、細胞増殖を誘導すること。C-mpl二量体形成に細胞外ドメインに存在するジスルフィド結合の関与があるかについて、細胞外ドメインの欠失体でも、二量体は形成されシグナルは活性化されること。自律性二量体形成能に関わる分子間力を検討するため、Asn505部位の様々な変異体を形成し、二量体形成、シグナル活性化につき検討したところ、アミノ酸として強い極性を有する残基(Asp, Gln, Glu等)にのみ自律性活性化能があることから、水素結合が本シグナル活性化の必須である二量体形成のための分子間力であること。弧発性血小板増多症20例の解析でc-mpl変異の有無を検討した結果、変異はなく弧発性血小板増多症にはc-mpl遺伝子変異は関係していないこと。以上の実験結果を得たが、これにより、受容体の膜貫通領域にある遺伝子変異によりシグナル活性化が起きるメカニズムとして、これまで報告されていたジスルフイド結合の形成の他に、水素結合を分子間力として二量体形成がおき、活性化反応が引き起こされる機序を同定するに至った。
形式言語E-LOTOSで記述されたマルチメディアシステムの実装法

本研究では,形式記述言語E-LOTOSの時間制御構文を従来のLOTOSに採り入れた言語(時間拡張LOTOSと呼ぶ)で記述された実時間システム仕様を実時間スレッド機構を用いて実装するためのコンパイラを作成し,マルチメディアアプリケーションの開発への応用を行った.作成したコンパイラは,我々が開発してきた時間制約を含まないLOTOS仕様のコンパイラの実装法に基づき,与えられた動作仕様をイベントの逐次処理・選択・その反復から成る部分動作式に分割し,各部分動作式を実時間スレッド機構の一つのスレッドに割り当て,スレッド間の共有変数領域を用いて,マルチランデブなどの並列プロセス間におけるインタラクションを実現する.各スレッドはイベントの時間制約から実行開始時刻,デッドラインを計算,設定し,全体として早いデッドラインを設定したスレッドが先にスケジュールされるよう制御する.時間制約が指定されたイベント間のマルチランデブでは,それらのイベントが時間制約を全て満たすようにスレッドを制御する機構や,複数のマルチランデブを時間制約に従って優先的にスケジュールする機構などを考案し,実装した.また、動画の各フレームや指定した時間分の音声データの読込み,デコード,再生などを行うプリミティブを作成し,各プリミティブを時間拡張LOTOS仕様中にイベントとして記述し利用できる機構をコンパイラに実装した.時間拡張LOTOSでは,システムをイベントとその実行順序のみを指定した主プロセスと,それらのイベントの実行時間間隔に対する制約(および代替処理)などを指定した別プロセスから構成し,関連するイベントを同期実行させるという制約指向記述スタイルが利用できる.本研究では,この方法で,典型的なマルチメディアアプリケーションの記述を試み,QoS制御や複数メディア間の同期制御の追加,変更が容易であることを示した.動画再生アプリケーションの記述・実装実験より,記述工数の面で有利だが同期のオーバヘッドを要する制約指向スタイルの時間拡張LOTOS仕様から,本コンパイラにより実用的なスピードで動作する目的コードが生成可能なことを,C言語で同じものを開発した場合との比較により,確認した.本研究では,まず,E-LOTOSの時間構文およびいくつかのフロー制御構文を取り入れた時間拡張LOTOSを定義し,時間拡張LOTOSで記述された実時間システムの動作仕様から,等価な同期タイムオートマトン群を導出する方法を提案した(電子情報通信学会英論文誌(A),1999年掲載予定,にて発表).また,この方法に基づいた導出系を作成した.次に,同期タイムオートマトン群の実装法を考案した.複数のタイムオートマトンが並行実行される場合に,各タイムオートマトンのアクションを時間制約どおりに実行できるようにするため,EDF(Earliest Deadline First)スケジューリングを持った実時間スレッド機構を設計,開発した(RTCSA'98にて発表).各タイムオートマトンは一つのスレッドに割り当て実現する.実時間スレッド機構上で,複数スレッドの間にアクションの同期実行が指定されている場合に,複数の時間付ランテブ(同期実行されるアクションの組)間の優先度制御や排他制御を行う機構,各スレッドが指定の時刻までにランデブが実行できる状態に到達するための制御機構などを考案した(DiCoMo'98ワークショップにて発表).さらに.時間拡張しOTOSの持つマルチランデブ機構を利用してシステムを制約指向スタイルで記述することにより,資源の動的な割当てを指定したマルチメディア分敗システムのQoSシナリオなどを容易に記述できること,実装実験により,シナリオに指定した通りのQoS制御を実現できることなどを確認した(DPS'98ワークショップにて発表).本年度に得られた成果を,IFIPの国際会議FORTE/PSTV'99に投稿した.平成11年度は,引き続き,考案した手法に基づいて時間拡張しOTOSコンパイラの設計開発を行い,より実用的なマルチメディアシステムを記述,実装し,提案手法の有効性を評価する予定である.また,最終結果は,IEEE TransactionやComputer Network and ISDN Systemsなどの英文雑誌に投稿する予定である.本研究では,形式記述言語E-LOTOSの時間制御構文を従来のLOTOSに採り入れた言語(時間拡張LOTOSと呼ぶ)で記述された実時間システム仕様を実時間スレッド機構を用いて実装するためのコンパイラを作成し,マルチメディアアプリケーションの開発への応用を行った.作成したコンパイラは,我々が開発してきた時間制約を含まないLOTOS仕様のコンパイラの実装法に基づき,与えられた動作仕様をイベントの逐次処理・選択・その反復から成る部分動作式に分割し,各部分動作式を実時間スレッド機構の一つのスレッドに割り当て,スレッド間の共有変数領域を用いて,マルチランデブなどの並列プロセス間におけるインタラクションを実現する.各スレッドはイベントの時間制約から実行開始時刻,デッドラインを計算,設定し,全体として早いデッドラインを設定したスレッドが先にスケジュールされるよう制御する.時間制約が指定されたイベント間のマルチランデブでは,それらのイベントが時間制約を全て満たすようにスレッドを制御する機構や,複数のマルチランデブを時間制約に従って優先的にスケジュールする機構などを考案し,実装した.また、動画の各フレームや指定した時間分の音声データの読込み,デコード,再生などを行うプリミティブを作成し,各プリミティブを時間拡張LOTOS仕様中にイベントとして記述し利用できる機構をコンパイラに実装した.時間拡張LOTOSでは,システムをイベントとその実行順序のみを指定した主プロセスと,それらのイベントの実行時間間隔に対する制約(および代替処理)などを指定した別プロセスから構成し,関連するイベントを同期実行させるという制約指向記述スタイルが利用できる.本研究では,この方法で,典型的なマルチメディアアプリケーションの記述を試み,QoS制御や複数メディア間の同期制御の追加,変更が容易であることを示した.動画再生アプリケーションの記述・実装実験より,記述工数の面で有利だが同期のオーバヘッドを要する制約指向スタイルの時間拡張
急性腎不全におけるエイコサノイドの病態生理的意義

Prostanoidsは高血圧の発症、維持に関与している可能性が示唆されている。しかし、Prostaglandin(PG)I_2とThromboxane(TX)A_2の食塩感受性高血圧での役割は未だ確立していない。本研究ではPGI_2レセプター(IP)あるいはTXA_2レセプター(TP)遺伝子が食塩感受性高血圧に影響するかどうかを検討し次の結果を得た。(3)高食塩食(8%NaCl)を3週間投与するとIP(-/-)の収縮期血圧は徐々に上昇した(110±1から129±10mmHgに;P=0.005)。一方、IP(+/+)、TP(-/-)、TP(+/+)の収縮期血圧は高食塩食でも変化しなかった。以上の結果よりTPとIPは血管収縮、血管拡張作用以外の働きによりbaselineの血圧の維持に関係しており、食塩負荷時には少なくとも一部はIPによるシグナルを介した血圧の適応がなされている可能性が示唆された。また、虚血再潅流急性腎不全におけるProstanoidsの関与についての検討ではこれまで、TP antagonistの投与により腎障害が抑制されたとする報告が多いが、本研究では24時間後、48時間後のTP(-/-)(n=6)のBUNはTP(+/+)(n=5)と有意差はなかった(24時間168±46 vs 176±75mg/dl、48時間131±56 vs 136±61mg/dl)。
光散乱による血管構成蛋白質の超分子形成過程の研究

大動脈,肺,項靭帯等の弾性線維を構成する主な成分は不溶性の蛋白質エラスチンであり,これを可溶化して得られたαーエラスチンの水溶液は,体温付近の温度で超分子(コアセルベ-ト)の形成を開始する。これはエラスチン生合成における前駆体トロポエラスチンの会合・配列過程に対応した現象と見なす事ができる。本研究では,まずαーエラスチン水溶液について静的,動的光散乱及び濁度の同時測定を行い,コアセルベ-ト形成に伴う濃度の自発的な揺らぎの変化を追跡した。濁り開始温度をもってコアセルベ-ト形成開始温度Tcとした。測定は散乱角30°135°の範囲で15°毎になされた。散乱光強度の角度依存性から外挿して得られた前方散乱強度を用いてスピノ-ダル温度Tsを決定した。これらTc及びTsの濃度に対する曲線,即ち共存線とスピノ-ダル線は,0.1mg/ml,22°Cで一致した極小値を示した。この臨界点で前方散乱光強度と相関距離は発散傾向を示した。さらに臨界点付近では,45°以上の散乱角での散乱光強度に極小値が見いだされた。この極小値は,臨界濃度から離れるに従って消失した。一方,揺らぎの緩和時間は温度依存性を示すと同時に散乱角度にも強く依存した。臨界点近傍では,相転移現象に特有な臨界緩和を思わせる急激な増大が見られた。コアセルベ-ト液滴のサイズは,臨界濃度から離れた領域では,Tcまで減少傾向を示し,その後ほとんど一定になった。この事から,αーエラスチン凝集体はまず脱水収縮し,その後集合・配列過程を経ながら成長して行くと考えられる。現在,これら平衡系で得られた結果を基にして,コアセルベ-ト形成過程をさらに明らかにする目的から,外部制御パラメ-タの急激なジャンプによる非平衡状態からの緩和過程の動力学を,位相差顕鏡像の画像解析により追跡する事を計画している。
オリゴマー室温ポラリトンレーザーの実現

チオフェン/フェニレン・コオリゴマー分子をドープしたポリメチルメタクリレートを活性媒質として、銀-銀型プラナー微小共振器と誘電体多層膜-誘電体多層膜プラナー微小共振器において励起子ポラリトン共振器モードを光反射スペクトル、発光スペクトルに確認した。微小共振器では発光寿命のパーセル効果が見られた。ポリメチルメタクリレート微小円筒共振器では、レーザー光励起によりウィスパーリングギャラリーモードによるレーザー発振が観測された。<チオフェン/フェニレン・コオリゴマー微少円筒共振器のレーザー発振>チオフェン/フェニレン・コオリゴマー、2,5-bis(4-biphenylyl)-thiophene(BP1T)分子を0.07mol%含む屈折率1.49のポリメチルメタクリレートにドープして溶解し、これから糸を引いて急冷して直径が31μmと36μmの微少円筒を作成し、パルスレーザーで励起すると円筒媒質と大気との境界面で全反射しながら周回し、円周の長さが光共振器モード波長の整数倍となるウィスパリングギャラリーモード(WGM)によるレーザー発振を示した。励起光源として、Nd:YAGレーザーの第三次高調波(355nm)を用い、室温で微少円筒を光励起すると、低励起ではBP1T分子の波長430nm付近の幅広い発光バンドが観測されるが、励起強度が閾値以上では7,8本のほぼ等間隔の狭いピークが幅広い発光バンドに重なって発光するスペクトルが得られた。微小円筒中の電磁波定在波を波動方程式の固有値問題として求めると、円筒断面内の動径方向の次数lと方位角方向の次数mで(l,m)と特徴づけられるWGMの共振波長が得られる。計算によれば、直径36μmの円筒では(1,373)から(1,382)までのモード、直径31μmの円筒では(1,323)から(1,330)までのモードが観測された等間隔のピークとよく一致し、WGMと同定できる。BP1T結晶マイクロリングからのWGM室温レーザー発振について既に報告したが、新たな成果は極めて簡便な作成法によって作成したBP1T分子をドープしたポリマー微少円筒共振器のWGM室温レーザー発振に特徴がある。微少共振器に挿入したチオフェン/フェニレン・コオリゴマーの光学特性チオフェン/フェニレン・コオリゴマー分子を屈折率1.49のポリメチルメタクリレートにドープした薄膜層を活性層とし、金属銀(Ag)薄膜を用いたAg-Ag型微少共振器、あるいは誘電体多層膜ミラー(DBR)を用いたDBR(Ta2O5/SiO2)-DBR(TiO2/SiO2)型微少共振器、DBR(TiO2/SiO2)-DBR(TiO2/SiO2)型微少共振器を作成し、室温で反射スペクトル、発光スペクトルを微少共振器と観測方向との角度の関数として研究した。活性層の厚みが120nmと薄いときには1次の単一モードが反射スペクトル中の窪みとして500nm付近に観測され、活性層の厚みが1000nmと厚いときには2次から8次に至る高次の複数のモードが380nmから1500nmに至る波長領域に反射スペクトル中の窪みとして観測された。これらのモードの光子エネルギーは微少共振器と観測方向との角度の増加にほぼ比例して増加し、共振器光学モードの角度依存性の理論式と一致することから共振器光学モードとして同定できる。発光スペクトル中にも反射スペクトル中の窪みが見える波長位置に、微少共振器中にない場合に見られる発光スペクトルに比べてはるかに細い幅をもつピークが観測された。発光ピークの線幅とピーク位置から共振器のQ値を導くとAg-Ag型微少共振器で50、DBR(TiO2/SiO2)-DBR(TiO2/SiO2)型微少共振器で170となり、微少共振器の効果が確認された。発光の寿命は微少共振器中のチオフェン/フェニレン・コオリゴマーでは450-460psで、微少共振器中にない場合560psと比較して20%程度短くなりパーセル効果が観測された。チオフェン/フェニレン・コオリゴマー分子を含む3種類の微少共振器を作成して共振器閉じ込め効果を確認したのでおおむね順調に進展していると言える。チオフェン/フェニレン・コオリゴマー結晶薄膜を含む微少共振器作成は、膜厚および膜質の制御に困難が予想されるので、チオフェン/フェニレン・コオリゴマー分子を含む高Q値微少共振器の作成とその評価を進めた後に取り組みたい。平成23年度は共振器作成に必要なスパッターターゲットやポリマー等にストックがあり、材料費を多く要さずに研究を進めることができた。
洪水規模に着目した河川高水敷土壌環境の形成機構に関する研究

洪水流による高水敷土壌環境の形成機構に関する現地観測,数値計算を実施した.現地観測では,礫床河川高水敷を対象として,洪水前後の高水敷土壌中栄養塩・有機物量,高水敷表層土壌粒度分布,高水敷植生分布および粒径別土壌中栄養塩・有機物含有量の計測を行った.観測の結果,高水敷土壌中の栄養塩や有機物は,粒径の小さな土壌に多く含有されていること,観測対象とした洪水時には,高水敷土壌中から粒径の小さな土壌が流出し,その結果,高水敷土壌中栄養塩量が減少したことが示された.現地観測の結果に基づき,洪水流による高水敷土壌栄養塩変化を予測する数値計算モデルを構築した.本モデルは,複数の粒径に対する浮遊砂の輸送計算を行い,洪水前後の堆積浮遊砂量の変化に,各粒径の土壌中栄養塩含有率を掛け合わすことによって,土壌中栄養塩量の変化を予測するものである.流れ場の解析には水深平均されたReynolds方程式を用い,浮遊砂輸送の解析には,水深平均浮遊砂濃度の輸送方程式を用いている.また,基礎方程式系は,実河川を対象とした数値計算が実施できるように,一般曲線座標系で記述されている.本数値計算モデルを用いて,観測された洪水流を対象とした数値計算を実施した結果,洪水前後の高水敷土壌中の栄養塩量の増減をおおむね再現することが出来た.異なるピーク流量の洪水流に対して数値計算を実施した結果,本計算対象河川の場合,洪水のピーク流量が約500m^3/sよりも小さい場合,高水敷土壌の栄養塩量が部分的に増加し,500m^3/sよりも大きな洪水では,高水敷全体で栄養塩量の減少が生じることが明らかになった.洪水流による高水敷土壌環境の形成機構に関する現地観測,数値計算を実施した.現地観測では,礫床河川高水敷を対象として,洪水前後の高水敷土壌中栄養塩・有機物量,高水敷表層土壌粒度分布,高水敷植生分布および粒径別土壌中栄養塩・有機物含有量の計測を行った.観測の結果,高水敷土壌中の栄養塩や有機物は,粒径の小さな土壌に多く含有されていること,観測対象とした洪水時には,高水敷土壌中から粒径の小さな土壌が流出し,その結果,高水敷土壌中栄養塩量が減少したことが示された.現地観測の結果に基づき,洪水流による高水敷土壌栄養塩変化を予測する数値計算モデルを構築した.本モデルは,複数の粒径に対する浮遊砂の輸送計算を行い,洪水前後の堆積浮遊砂量の変化に,各粒径の土壌中栄養塩含有率を掛け合わすことによって,土壌中栄養塩量の変化を予測するものである。流れ場の解析には水深平均されたReynolds方程式を用い,浮遊砂輸送の解析には,水深平均浮遊砂濃度の輸送方程式を用いている.また,基礎方程式は,実河川を対象とした数値計算が実施できるように,一般曲線座標系で記述されている。本数値計算モデルを用いて,観測された洪水流を対象とした数値計算を実施した結果,洪水前後の高水敷土壌中の栄養塩量の増減をおおむね再現することが出来た.異なるピーク流量の洪水流に対して数値計算を実施した結果,本計算対象河川の場合,洪水のピーク流量が約500m^3/sよりも小さい場合,高水敷土壌の栄養塩量が部分的に増加し,500^3/sよりも大きな洪水では,高水敷全体で栄養塩量の減少が生じることが明らかになった.洪水流による高水敷土壌環境の形成機構に関する現地観測,数値計算を実施した.現地観測では,礫床河川高水敷を対象として,洪水前後の高水敷土壌中栄養塩・有機物量,高水敷表層土壌粒度分布,高水敷植生分布および粒径別土壌中栄養塩・有機物含有量の計測を行った.観測の結果,高水敷土壌中の栄養塩や有機物は,粒径の小さな土壌に多く含有されていること,観測対象とした洪水時には,高水敷土壌中から粒径の小さな土壌が流出し,その結果,高水敷土壌中栄養塩量が減少したことが示された.現地観測の結果に基づき,洪水流による高水敷土壌栄養塩変化を予測する数値計算モデルを構築した.本モデルは,複数の粒径に対する浮遊砂の輸送計算を行い,洪水前後の堆積浮遊砂量の変化に,各粒径の土壌中栄養塩含有率を掛け合わすことによって,土壌中栄養塩量の変化を予測するものである.流れ場の解析には水深平均されたReynolds方程式を用い,浮遊砂輸送の解析には,水深平均浮遊砂濃度の輸送方程式を用いている.また,基礎方程式系は,実河川を対象とした数値計算が実施できるように,一般曲線座標系で記述されている.本数値計算モデルを用いて,観測された洪水流を対象とした数値計算を実施した結果,洪水前後の高水敷土壌中の栄養塩量の増減をおおむね再現することが出来た.異なるピーク流量の洪水流に対して数値計算を実施した結果,本計算対象河川の場合,洪水のピーク流量が約500m^3/sよりも小さい場合,高水敷土壌の栄養塩量が部分的に増加し,500m^3/sよりも大きな洪水では,高水敷全体で栄養塩量の減少が生じることが明らかになった.
癌抗原特異的T細胞受容体遺伝子を用いた新たなNKT細胞養子免疫治療の構築

以前より当施設では、NKT細胞の強力な抗腫瘍効果を利用した、進行期肺癌症例に対するNKT細胞免疫治療の臨床研究を施行し報告してきた。しかし、未だ強力な治療効果が得られた症例は少なく、更に効果的な治療法の確立が大きな課題であった。その一つの理由として、NKT細胞を活性化する癌抗原が不明であるという点が挙げられる。これを解決するために、本研究では癌(メラノーマ)抗原に特異的なT細胞受容体(TCR)をNKT細胞に遺伝子導入することで、NKT細胞の特徴を解析し、かつ癌(メラノーマ)抗原に特異的に抗腫瘍活性を示すNKT細胞を構築した。当施設では、NKT細胞の強力な抗腫瘍効果を利用した、進行期肺癌症例に対するNKT細胞免疫治療の臨床研究を以前より施行している。しかし、未だ強力な治療効果が得られた症例は少なく、更に効果的な治療法の確立が大きな課題である。一方、現在では抗原特異的なT細胞受容体(TCR)を遺伝子導入したT細胞を用いた養子細胞療法においては、非常に強い抗腫瘍活性と臨床効果の得られた症例が数多く報告され注目されている。本研究では、抗原特異的なTCRをレトロウィルスを用いて遺伝子導入したNKT細胞を構築し、強力な抗腫瘍活性を持った有効なNKT細胞治療を確立することを目的としている。導入するTCR遺伝子としてメラノーマ抗原を認識するTCRを用い、メラノーマ抗原特異的TCR遺伝子導入NKT細胞を作成することを目標とした。ただNKT細胞はヒトの末梢血中の非常に少ない細胞群のため、まずは予備実験として平成26年度はNKT細胞を様々な条件でvitroで増殖させる実験を行い、その結果αガラクトシルセラミドで刺激した樹状細胞を末梢血と共培養することでNKT細胞を効率よく増殖させる培養のプロトコールを確立した。平成27年1月、NKT細胞への遺伝子導入を確立するために細胞増殖能評価実験を行っていたが、予想外にNKT細胞が増加しなかった。本研究遂行上、まずはNKT細胞を増殖させることが本実験には必要不可欠であり、そのため使用する試薬を変更して再度同実験を行い、要因を見極めることが必要であたったため、2ヶ月程度の遅延が生じた。末梢血中のNKT細胞に導入するTCR遺伝子としてメラノーマ抗原(チロシナーゼ)を認識するTCR(TIL 1383I TCR)を用い、TIL 1383I TCR遺伝子導入NKT細胞を作成した。このNKT細胞の発現数はFACS(flow cytometry )を用いて計測し、その抗腫瘍活性については細胞内サイトカイン染色を用いて評価した。その結果、TIL 1383I TCR遺伝子を導入したNKT細胞は、チロシナーゼを提示している抗原提示細胞とチロシナーゼ抗原を発現しているメラノーマ腫瘍細胞によって特異的に活性化されインターフェロンγを産生する事がわかった。また、導入する遺伝子に不活性化CD34カセットを組み込むことで、磁気ビーズを用いてTIL 1383I TCR遺伝子導入NKT細胞を選択的に回収する事ができ、より純度の高いTIL 1383I TCR遺伝子導入NKT細胞群を回収することができた。今後このNKT細胞を用いることで、より抗原特異的な養子免疫療法として確立できると考えられる。平成27年度は、メラノーマ抗原特異的TCRをレトロウィルスを用いてNKT細胞に遺伝子導入し、そのメラノーマ抗原特異的TCR遺伝子導入NKT細胞がもつ抗腫瘍効果を検証する実験を行う予定である。更にこの抗原特異的TCR導入NKT細胞をクローニングし株化することを予定している。また、レトロウィルスを用いたTCR遺伝子導入の際に起こるTCR鎖のミスペアリングを解決するために、導入するTCR遺伝子を改変し、ミスペアリングを減少させることでより効率的なTCR遺伝子の導入と予測不能な自己抗原反応の危険性を防ぐTCRの作成を図る。そして最終的には肺癌に特異的な抗原を認識するTCRを確立した後、NKT細胞に遺伝子導入することを目標にしている。27年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学27年度が最終年度であるため、記入しない。