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敗血症予後改善に向けたリンパ球機能維持戦略

本研究は、敗血症で生じるリンパ球アポトーシスによる免疫能の低下を抑制することによって、敗血症の予後を改善することを目的として計画されたものである。リンパ球のアポトーシスを抑制して機能を維持するためには、本研究ではレンチウィルスシャトルベクターを用いたプラスミドの作成が必須である。当初は、研究代表者の留学先からの援助のもと、プラスミドの作成は可能であるとの見込みであったが、現在の研究室の環境ではプラスミドの作成が困難であり、研究が進んでいないのが現状である。本研究において必須である、プラスミドの作成に難渋しているため、研究が進んでいないのが現状である。2019年4月より、研究代表者の所属先が東海大学医学部に変更となった。新しい環境において、他の研究室の協力のもと、プラスミドの作成が可能かどうか模索していく予定である。困難な場合は、研究を断念することも視野にいれなくてはならない。目覚ましい医学の進歩にも関わらず、敗血症の死亡率はいまだに高い。近年、高炎症反応に引き続いて起こる免疫能の低下が2次感染を引き起こし患者予後に影響することが指摘されるようになり、免疫能を維持する治療法の確立に目が向けられるようになった。特に、敗血症では早期からTリンパ球を中心とした免疫担当細胞のアポトーシスが生じていると言われている。当研究室ではこの点に着目し、敗血症で生じるリンパ球のアポトーシスを抑える治療法が敗血症患者の予後を改善するとの考えのもと、これまでの研究にてβ遮断薬の投与が正常Tリンパ球の数を維持することを見出した。本研究では、リンパ球のミトコンドリアに存在するカリウムチャネルであるKv1.3がリンパ球アポトーシスに関与していることに着目し、Kv1.3を不活化することがリンパ球のアポトーシスを抑え、敗血症の予後を改善できるのでないかという発想に至った。実際には、ミトコンドリアに存在するKv1.3を不活化するためのプラスミドを作成し、そのプラスミドによってKv1.3が不活化されたリンパ球を移植することによって、敗血症予後を改善できるかを検討する予定であった。しかし、研究としてはまだ準備段階である。理由としては、材料の調達や技術的な面も含めて本研究室にてプラスミドを作成することが思うように進んでいないためである。場合によっては、リンパ球アポトーシスを抑制する手段を変更したうえで今後の研究を進めていくことを検討中である。昨年度は、研究に費やす時間を思うように取れなかったため、まだ準備段階である。上述したように、アポトーシスに耐性のリンパ球を作成するためのプラスミドの作成に難渋している。今年度より本格的に進めていく予定であるが、上記の理由により、アポトーシスに耐性のあるリンパ球を作成する方法を変更したうえで研究を行うことを現在検討中である。研究方法の変更については、申請者がかつて留学していた研究室の教授に相談中である。昨年度は思うように研究が進まなかったことが、次年度使用額が生じた最大の理由である。本年度では、プラスミドを作成するのであればその費用やフローサイトメトリー購入の資金に使用したい。研究の遂行に必要なプラスミドの作成が進まず、研究が滞っていたため。今年度は、場合によってはプラスミドの作成を、研究費を使用して業者に依頼することも考えている。
誤訳・難解訳の分析による翻訳過程の認知科学的研究

本研究では,日本語と英語の間の翻訳にみられる誤訳・難解訳のデータを,言語学・心理学・情報処理の関連分野から分析し,異言語間の語彙体系と文法体系・意味体系の相違による誤訳・難解訳の認知プロセスの解明を図った.本研究では,特に,直訳と意訳の認知プロセス,誤訳・直訳・意訳の評価基準,翻訳の基盤となる日・英語の言語的フレームの違いなどの問題を考察しながら,次の手順によって,翻訳の認知プロセスの明確化を試みた:1.語彙レベルから文法レベルの記号系の対応関係, 2.二言語間の認知枠の違いとズレ, 3.翻訳にかかわる心理的な要因, 4.情報処理の視点からみた記号系の変換プロセス, 5.文法と語用論の双方の観点からみた日・英語の形成レベルと意味レベルの対応関係.これまでの翻訳のプロセスに関する研究は,主に文学的なテクストの翻訳の問題が中心となっており,日常言語の談話や会話分をも含む,広い意味での口語的なテクスト一般の翻訳のプロセスの体系的な研究は,本格的にはなされていない.本研究の意義は,言語学・心理学・情報科学の関連分野の総合的な観点から,以上の1から5の側面に関する翻訳プロセスの研究を通して,記号処理にかかれる人間の認知のメカニズムの一端を明らかにした点にある.本研究では,日本語と英語の間の翻訳にみられる誤訳・難解訳のデータを,言語学・心理学・情報処理の関連分野から分析し,異言語間の語彙体系と文法体系・意味体系の相違による誤訳・難解訳の認知プロセスの解明を図った.本研究では,特に,直訳と意訳の認知プロセス,誤訳・直訳・意訳の評価基準,翻訳の基盤となる日・英語の言語的フレームの違いなどの問題を考察しながら,次の手順によって,翻訳の認知プロセスの明確化を試みた:1.語彙レベルから文法レベルの記号系の対応関係, 2.二言語間の認知枠の違いとズレ, 3.翻訳にかかわる心理的な要因,4.情報処理の視点からみた記号系の変換プロセス, 5.文法と語用論の双方の観点からみた日・英語の形成レベルと意味レベルの対応関係.これまでの翻訳のプロセスに関する研究は,主に文学的なテクストの翻訳の問題が中心となっており,日常言語の談話や会話分をも含む,広い意味での口語的なテクスト一般の翻訳のプロセスの体系的な研究は,本格的にはなされていない.本研究の意義は,言語学・心理学・情報科学の関連分野の総合的な観点から,以上の1から5の側面に関する翻訳プロセスの研究を通して,記号処理にかかれる人間の認知のメカニズムの一端を明らかにした点にある.これまでの翻訳のプロセスの研究は、文学作品の翻訳を中心とする文化論的な考察が主流を占めており、ソース言語とターゲット言語の二言語間の文法構造と意味構造にどのような対応関係があるのか、また翻訳文の読みやすさや解釈の難易度をどのように評価するかといった問題にかかわる実際の翻訳の認知的プロセスの具体に関する実証的な研究は本格的にはなされていない。本研究では、日本語と英語の間の翻訳にみられる誤訳・難解訳データを、言語学・心理学・情報処理の観点から解析プロセスに基づいて分析し、二言語間の語彙体系と文法体系・意味体系の相違による誤訳・難解訳の認知プロセスの具体を明らかにした。特に本年度の研究では、次の点を明らかにした。1.誤訳・難解訳をひき起こす要因は、従来から指摘されているような文法構造の相違だけでなく、語彙体系の背後にある言語文化的な知識のギャプがその重要な要因となる。2.二言語間の翻訳プロセスの具体をみる限りでは、従来の二言語の共有する普遍意味構造を媒介とするピボット方式の翻訳は、人間の翻訳プロセスとしては強すぎる。3.従来のモノ的・コト的な構文に基づく翻訳の方略には限界がある。実際の翻訳のプロセスには、二言語間のテクストを特徴づける認知のスキーマの変換が重要な役割をになう。以上の知見を踏まえ、次年度の研究では、とくに二言語間の(1)テクスト・談話の慨念構造のズレ、(2)言語対象の背景的知識のズレに焦点を置き、認知プロセスの観点からみた誤訳と難解訳の原因のプロトタイプの抽出とスキーマの変換の明確化を試みる。
グルタミン酸輸送体の機能・局在調節と異種シナプス間拡散性クロストークの生理的連関

フィードフォワード抑制回路(顆粒細胞-分子層介在ニューロン-プルキンエ細胞)を介した小脳情報処理プロセスにおいて、異種シナプス間拡散性クロストークが担う生理的役割を明らかにするため、顆粒細胞-介在ニューロン間興奮性シナプス伝達の特性を調べている。その過程で、顆粒細胞(上向性線維)の2回連続刺激に伴い、介在ニューロンから記録される興奮性シナプス後電流(EPSC)の2回目EPSCの振幅値と減衰時定数が、一過性に増大する現象を見出した(ペアパルス増強)。予備的に実施した薬理学実験の結果から、(1)振幅増大はシナプス小胞の放出確率と放出多重性の増大、(2)減衰時間増大は放出多重性増大に伴いシナプス外領域に拡散した伝達物質グルタミン酸の蓄積により引き起こされたと推定している。しかし、EPSCの振幅や減衰時間が、神経伝達物質の放出多重性・拡散性の変化を介したシナプス前性機構によって制御されるという現象はこれまで報告がなく、その分子基盤や生理的な意義は全く不明である。こうした背景に基づき、神経活動に依存してEPSCキネティクスが変化するメカニズムを追究すると共に、EPSC減衰時間の制御にグルタミン酸輸送体が関わる可能性について検討を行った。はじめに、EPSCキネティクスを初期相、ピーク相、減衰相に分けて詳しく解析した。2回目EPSC(刺激間隔:30ミリ秒)では、刺激からEPSC開始までの反応潜時が1回自EPSCよりも顕著に短縮していた。一方、EPSC開始点からピークまでの到達時間は延長していた。さらに、二重指数関数を適用して、EPSC減衰相を急速減衰成分(τ_<fast>)と緩徐減衰成分(τ_<slow>)に分けて解析し、減衰時間のペアパルス増強はτ_<slow>の構成比率(%_<slow>)の増大によって惹起されていることを明らかにした。また、グルタミン酸輸送体阻害薬TBOAは、τ_<slow>と%_<slow>を共に増大させて、減衰時間のペアパルス増強を昂進した。一方、AMPA受容体の低親和性競合阻害薬γ-DGGは、%_<slow>を減少させて減衰時間のペアパルス増強を減弱した。こうした観察結果から、連続刺激による多重性放出促進に伴い顆粒細胞終末から大量に放出されたグルタミン酸は、輸送体タンパク質による回収を逃れて近傍のシナプスやペリシナプス領域に存在するAMPA受容体に低濃度で作用することにより、EPSC減衰時間の増大を引き起こしたと結論した。下オリーブ核から小脳への登上線維からシナプス間隙外に拡散した興奮性神経伝達物質(グルタミン酸と推定)は、介在ニューロンのAMPA型グルタミン酸受容体を活性化することにより、介在ニューロン-プルキンエ細胞間のGABA作動性伝達にシナプス前抑制を引き起こすことを報告した。この小脳異種シナプス間拡散性クロストークにおいて、グルタミン酸輸送体が担う役割をスライスパッチクランプ法により検討した。【1.ニューロン型グルタミン酸輸送体の長期増強が異種シナプス抑制におよぼす影響】これまでに、小脳異種シナプス抑制には、プルキンエ細胞特異的グルタミン輸送体EAAT4の発現量に依存した逆行性制御機構が存在することを見出している。このニューロン型輸送体による逆行性制御の分子的基盤を追究するため、プルキンエ細胞に惹起したグルタミン酸輸送体増強が異種シナプス抑制におよぼす影響を観察した。登上線維に高頻度刺激(5Hz、30秒)を付与すると、プルキンエ細胞において(1)AMPA受容体が仲介するシナプス後電流は長期抑圧を、(2)グルタミン酸輸送体電流(synaptic transporter current)は長期増強を引き起こした。一方、輸送体増強に伴い、異種シナプス抑制は顕著に減弱した。プルキンエ細胞のグルタミン酸輸送体は、細胞外の余剰グルタミン酸を回収する役割のみならず、シナプス活動に依存して回収機能を変化させることにより、伝達物質の拡散過程に影響をおよぼすシナプス可塑性制御因子としての役割も担っていることを示唆する結果である。【2.エタノールによる異種シナプス抑制阻害】小脳異種シナプス抑制は、エタノールにより用量依存的(25100mM)に阻害されることを発見した。しかし、エタノール(50mM)は、登上線維のシナプス小胞放出確率ならびに放出多重性に有意な影響をおよぼさなかった。また、AMPA灌流投与に伴う介在ニューロンのGABA放出抑制にも無効であった。エタノールの異種シナプス抑制阻害作用は、登上線維の伝達物質放出過程や前シナプス性AMPA受容体の阻害などではなく、登上線維伝達物質がシナプス間隙から介在ニューロン終末に拡散する過程の阻害により惹起されたと考えられる。予備的に実施した薬理学実験の結果から、(1)振幅増大はシナプス小胞の放出確率と放出多重性の増大、

(2)減衰時間増大は放出多重性増大に伴いシナプス外領域に拡散した伝達物質グルタミン酸の蓄積により引き起こされたと推定している。しかし、EPSCの振幅や減衰時間が、神経伝達物質の放出多重性・拡散性の変化を介したシナプス前性機構によって制御されるという現象はこれまで報告がなく、その分子基盤や生理的な意義は全く不明である。こうした背景に基づき、神経活動に依存してEPSCキネティクスが変化するメカニズムを追究すると共に、EPSC減衰時間の制御にグルタミン酸輸送体が関わる可能性について検討を行った。はじめに、EPSCキネティクスを初期相、ピーク相、減衰相に分けて詳しく解析した。2回目EPSC(刺激間隔:30ミリ秒)では、刺激からEPSC開始までの反応潜時が1回自EPSCよりも顕著に短縮していた。一方、EPSC開始点からピークまでの到達時間は延長していた。さらに、二重指数関数を適用して、EPSC減衰相を急速減衰成分(τ_<fast>)と緩徐減衰成分(τ_<slow>)に分けて解析し、減衰時間のペアパルス増強はτ_<slow>の構成比率(%_<slow>)の増大によって惹起されていることを明らかにした。また、グルタミン酸輸送体阻害薬TBOAは、τ_<slow>と%_<slow>を共に増大させて、減衰時間のペアパルス増強を昂進した。一方、AMPA受容体の低親和性競合阻害薬γ-DGGは、%_<slow>を減少させて減衰時間のペアパルス増強を減弱した。こうした観察結果から、連続刺激による多重性放出促進に伴い顆粒細胞終末から大量に放出されたグルタミン酸は、輸送体タンパク質による回収を逃れて近傍のシナプスやペリシナプス領域に存在するAMPA受容体に低濃度で作用することにより、EPSC減衰時間の増大を引き起こしたと結論した。
骨基質のリン酸化タンパクと骨形成機構に関する研究

ウズラ骨髄骨基質の酸性リン酸化タンパクと基質の石灰化との関連性を微細構造学的、免疫組織化学的ならびに生化学的、分子生物学的に調べた。微細構造学的に石灰化過程を観察すると、石灰化開始領域に0.5μm程度の球状構造が存在し、その分布は石灰化球の分布と類似していた。一方stains-all染色で青色に染色される領域と石灰化領域のパターンもよく一致していた。stains-all染色で青色に染まるタンパクを同定するために骨髄骨基質からミネラル相を調製し、SDS電気泳動を行って生化学的に調べた結果、このタンパクは分子量は約60KDでアミノ酸組成、配列がニワトリのオステオポンチンと高い類似性を示した。このリン酸化タンパクは皮質骨に比較して骨髄骨に多量に存在した。分子生物学的にウズラのオステオポンチンmRNAを部分的にクローニングし、石灰化過程での発現量を調べると、石灰化の進行に伴ってオステオポンチンmRNAの発現量が増加していた。ミネラル相から得られたタンパクおよびそのタンパクのアミノ酸配列の一部からペプチドを合成し、それぞれを抗原としてウサギを用いてポリクロナール抗体を作製し免疫組織化学的に骨髄骨基質における局在を調べた。タンパクを抗原として得られた抗体の局在は骨基質ならびに骨構成細胞に認められた。ペプチドから得られた抗体の反応は破骨細胞に陽性および弱陽性反応が骨芽細胞に観察された。以上の結果から、骨髄骨基質にはオステオポンチンが多量に存在し、骨基質形成に伴って増加することが明らかとなった。また、基質における蓄積パターンが基質石灰化のパターンと類似することからオステオポンチンと石灰化の関連性が示唆された。骨組織に存在するリン酸化タンパク、特にオステオポンチン(OPN)に着目してオステオポンチンと石灰化の関連性を生化学的ならびに微細構造学的に調べること目的とした。実験材料にはニホンウズラの骨髄骨を用いた。まず始めに基質の石灰化を調べた。ウズラのオスにエストロジェンを投与して骨髄骨の形成を誘導し、微細構造学的に石灰化過程を観察すると、約0.5μm程度の石灰化球が形成され、それらが融合して石灰化が進行する部位と、基質表層から深部に向かって一様に石灰化する部位が認められた。したがって、骨髄骨基質の添加的石灰化には二様式あることが強く示唆された。リン酸化タンパクを青色に染めるstains all(SA)染色を行って、組織学的に石灰化過程を観察すると、石灰化球と一致すると考えられるSAで青色に染まる球状構造が認められた。次に、これらの組織学的に観察される石灰化様式とOPNの関連性、特に石灰化過程におけるOPNの局在を免疫組織化学的に調べることを目的として、約200羽の産卵ウズラから骨髄骨を採取し、4Mグアニジンでミネラル相を調整した。このミネラル相から可溶化される60KD付近のバンドはアミノ酸組成から、OPNであると考えられるので、このタンパクを精製しウサギを用いてポリクローナル抗体を作製した。現在この抗体を用いて石灰化とOPNの局在を免疫組織化学的に検索を行っている。また、今回の生化学的検索の結果、コンドロイチナーゼとケラタナーゼで骨基質を消化した後に電気泳動を行うと45KD付近にSA可染性の新たなリン酸化タンパクのバンドが出現し、新たなリン酸化タンパクの可能性が示唆されるので現在検索中である。今後、光顕、電顕的に石灰化に伴うOPNの局在を明らかにしたいと考える。さらに、新たに認められた45KDのリン酸化タンパクの同定を行う。骨組織に存在するリン酸化

タンパク、特にオステオポンチン(OPN)に着目してオステオポンチンと石灰化の関連性を生化学的ならびに組織学的に調べること目的とした。前年度に得られた所見をもとに、骨基質石灰化過程におけるOPNの局在を免疫組織化学的に調べた。骨髄骨のミネラル相から可溶化される60KD付近のタンパクがアミノ酸組成からOPNと考えられるので、N末端から13残基のペプチドを合成し、ポリクロナール抗体を作製した(s-A)。また、このタンパクを精製して全タンパクを抗原としたポリクロナール抗体も作製した(w-A)。w-A抗体を用いて光顕免疫組織化学を行って観察すると、骨髄骨基質全体が陽性反応を呈した。また、骨形成過程を調べると、石灰化領域に類似した部位が陽性反応を呈した。骨構成細胞を観察すると、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞共に陽性であった。特に、骨形成の活発な時期の骨芽細胞は強陽性を呈した。一方、皮質骨基質は陰性であった。s-Aは抗体価が低く免疫組織化学に応用出来なかった。w-A抗体の特異性をウェスタンブロットを行って調べた結果、OPN以外のタンパクと考えられるバンドにもわずかに反応がみられた。以上の結果を総合すると、一般にOPNの機能は単一ではないと考えれており、骨組織においては石灰化との関連性はむしろ低いと考えられている。しかしながら、今回用いたW-A抗体は厳密には特異性に乏しい点があるものの、光顕レベルでの免疫組織化学的観察、Stains-all染色およびvon Kossa染色による組織学的観察結果から、骨髄骨基質は皮質骨に比較して多量のOPNを基質中に含み、石灰化に関連して蓄積することが強く示唆された。今後は特異性の高い抗体を作製し、OPNの局在を電顕免疫組織化学的に検索し、骨組織形成、特に石灰化とOPNの関連を微細構造学的に検索する必要があるものと考える。
超免疫不全マウスを用いた膠芽腫に対する免疫細胞化学療法の開発

本研究では、既存の治療方法では根治が難しい膠芽腫に対する新規治療の確立を目指して行っている。免疫細胞であるγδT細胞とbisphosphonateとの併用療法により、マウスに対する膠芽腫細胞株移植実験において、抗腫瘍効果を認めた。また、NK細胞と抗癌剤temozolomideの併用実験では、TMZ感受性株では相加効果が、TMZ耐性株ではNK細胞のみ抗腫瘍効果が得られた。NK細胞、γδT細胞ともに新規治療の有望な治療となりうる可能性がある。膠芽腫は標準治療である手術、放射線療法、化学療法に抵抗性の予後不良の腫瘍であり、新たな治療法が切望されている。一方で膠芽腫に対する免疫療法として細胞傷害性細胞(キラー細胞)、とりわけγδT細胞やNK細胞と呼ばれるHLA(Human leukocyte antigen)非拘束性キラー細胞を用いた免疫細胞療法が注目されている。これらの細胞を用いた免疫細胞療法と既存の化学療法を融合させた免疫細胞化学療法は膠芽腫に対する治療効果を改善させる可能性がある。本研究は膠芽腫に対するγδT細胞およびNK細胞の治療効果を確認するとともに、既存の化学療法を融合させた際の治療効果を検討することを目的とする。ヒト末梢血より免疫細胞を分離し、骨粗鬆症薬で第3世代の窒素含有Bisphosphonateであるミノドロン酸とInterleukin-2等の存在下で2週間増幅培養することで90%以上の純度でγδT細胞が得られた。重度免疫不全マウスであるNOGマウスの皮下にヒト膠芽腫細胞株U87MGを移植することで皮下腫瘍が形成された。U87MG移植NOGマウスの腹腔よりγδT細胞とミノドロン酸を投与し、腫瘍体積を比較することで抗腫瘍効果を確認した。その結果、γδT細胞ならびにミノドロン酸単独では抗腫瘍効果は認められなかったが、双方を投与することで非常に強い抗腫瘍効果が認められた。以上の結果より、ミノドロン酸とγδT細胞を組み合わせた免疫細胞化学療法は膠芽腫に対する治療効果を改善させる可能性がある。次年度はNK細胞とアルキル化剤であるテモゾロミドや血管新生阻害剤であるベバシズマブを併用した場合の抗腫瘍効果を検証する予定である。本研究は既存の治療に抵抗性を有する膠芽腫に対する新たな免疫細胞療法(γδT細胞およびNK細胞)の治療効果を確認するとともに、既存の化学療法との融合させた治療効果を検討をする。特にγδT細胞に対してBisphosphonateがキラー活性を強力に誘導されるため、NOGマウスを用いた膠芽腫モデルでその強力な抗腫瘍効果を検討した。また膠芽腫細胞株移植NOGマウスに現在標準的に実施されつつある抗がん剤Temozoromide(TMZ)、血管新生阻害剤bevacizumab(BEV)の併用治療とともにNK細胞を投与することでより強い膠芽腫退縮効果を検討した。前年度では、膠芽腫細胞株U87MGをNOGマウスの皮下に移植し、その後対照群、Bisphosphonate投与群、γδT細胞投与群、共投与群に分け、腫瘍体積の変化を検討した。結果、移植後7週で共投与群でのみ優位に腫瘍形成が抑制されていた。以上より、BisphosphonateとγδT細胞との併用療法は膠芽腫治療に有用である可能性が示唆された。今年度は、我々の確立している高純度な培養法で得られたNK細胞とアルキル化剤であるTMZとの併用療法における膠芽腫対する効果を検討した。TMZ感受性株に対する併用療法は、抗腫瘍効果は相加効果が得られた。一方、TMZ耐性株ではNK細胞にのみ抗腫瘍効果が得られた。現在、膠芽腫細胞株を皮下に移植して、in vivoでのNK細胞とTMZの併用療法の治療効果を検討中である。平成26年度はγδT細胞を用いた膠芽腫に対する免疫細胞化学療法について、平成27年度はNK細胞を用いた膠芽腫に対する免疫細胞化学療法を膠芽腫細胞移植NOGマウスを用いて評価する予定であった。これまでにγδT細胞を用いた免疫細胞化学療法について、γδT細胞とBisphosphonateを併用することで膠芽腫細胞移植NOGマウスに対して著明な抗腫瘍効果が確認されており、臨床応用に向けた明確な情報が得られた。脳腫瘍これまでに高純度なNK細胞を効率的に増幅できる培養法を確立している。本培養法で得られたNK細胞は、これまでに報告のあるLAK(Lymphokine-activated killer)療法に用いられたLAK細胞より強い膠芽腫細胞に対する増殖抑制効果やキラー活性を有している。今後は、本NK細胞とアルキル化剤であるテモゾロミドや血管新生阻害剤であるベバシズマブを併用した場合の膠芽腫細胞移植NOGマウスに対する抗腫瘍効果を検証する予定である。実験がおおむね順調に推移し、次年度の計画が若干前倒しになったため。平成27年度はNK細胞を用いた免疫細胞化学療法の検証を実施する。
リビングラジカル乳化重合の開発

交換連鎖移動機構のリビングラジカル重合(LRP)を乳化重合系や分散重合系などの不均一重合系に移すと、特定の条件下ではラジカル寿命の延長と交換移動頻度の増大が理論的に予測される。つまり、均一系重合に比べて高分子量で分子量分布が狭く、末端活性率の高いポリマーが得られると考えられる。これらの予測の検証を交換連鎖移動剤としてクミルジチオベンゾエートを用いたメチルメタクリート(MMA)およびスチレンの乳化重合および分散重合を行った。特に分散重合において注目すべき結果が得られた。すなわち、水相溶媒、分散剤、温度などの重合条件の最適化を行った結果、MMA系ではそれぞれ、水/エタノール(1/3)、ポリアクリル酸、70°Cの条件において、数平均分子量が約10万の分子量分布のよく制御された高分子量体の合成に成功し(高分子量化の実現)、さらに、低重合率より分子量分布の極めて狭い(分子量分布指数M_w/M_n1.1)ポリマーの生成を認め(分子量分布の制御性の向上)、理論の予測を実証することができた。しかしながら、生成ポリMMA粒子の一部は融着し、粒子の分散化は現在の検討課題である。一方、スチレン系では、水/メタノール(1/3)(水相溶媒)、ポリビニルピロリドン(分散剤)、70°Cの条件下で、ポリスチレンの分子量分布を制御するとともに、融着のない粒径(典型的には約2μm)のほぼ均一なポリスチレン粒子を得ることに成功した。粒径は分散剤濃度により制御可能であった。いずれのモノマーにおいても、重合は短時間で完了し、予測どおり、粒子内のラジカル濃度が均一系に比して極めて高いことが確認された。また、MMA系では、非極性相としてヘキサンを、分散剤としてスチレン-ブタジエンブロック共重合体を用いた逆相分散重合も試みた。粒子の分散化の問題は残るものの、上述の順相系と同様に、LRPの性能向上を示す良好な結果を得た。交換連鎖移動機構のリビングラジカル重合(DT-LRP)を乳化系に移すと、正味のラジカル寿命の延長と交換移動頻度の増大が理論的に予測される。つまり、均一系に比べて高分子量で分子量分布が狭く、末端活性率の高いポリマーが得られるはずである。本研究の目的は、この予測を実験的に検証することによりLRP法の性能の向上を図るとともに、LRP法と工業的に極めて重要な合成法である乳化重合法を両立させるための基礎的知見を集積することである。この種の研究にはモデル重合系の選択とその反応速度論的理解が不可欠である。この観点から、DT機構の重合系と考えられるポリスチレン-ヨウ素(PS-I)およびPS-SC(CH_3)S(RAFT)系の均一系における重合機構を詳しく調べた。その結果、両系の活性化(不活性化)反応はともにDT-機構が支配的であることを確認するとともに、後系の移動速度定数が前系のそれより30倍以上大きいことを明らかにした。次年度以降の研究で、不均一系(乳化系)での重合との相違を反応速度論的に解明する予定である。

1-フェニルエチルヨウ素(PE-I)を交換連鎖移動剤、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を開始剤、ナトリクム硫酸ドデシルを界面活性剤とするスチレンの乳化重合(70°C)では、AIBN濃度が比較的低い場合(約10^<-2>M)に均一系重合に比べて分子量分布指数(PDI)の小さいポリマーが得られ、理論の予測が定性的に実証された。ただ、PDIの低下の程度がごく僅かであること、ならびにPE-I濃度やAIBN濃度と重合結果(分子量、PDI、重合率)の間に一義的な関係を欠く面が多く、両相への試薬の分配などに関する詳しい検討が必要である。スチレン/エタノール/水混合系に交換連鎖移動剤としてクミルジチオベンゾエート、開始剤としてAIBN、界面活性剤としてポリアクリル酸を用いる不均一重合を試みた(70°C)。所定時間後、粒径(典型的には約1μm)のほぼ均一なポリスチレン粒子が得られた。GPC解析によると、このポリマーのPDIは極めて小さいものの主ピークの2倍の分子量に相当する位置に小さいが顕著な(2分子停止に由来する)副ピークを有しており、予測どおり、粒子内のラジカル濃度が均一系に比して極めて高いことが示唆された。交換連鎖移動機構のリビングラジカル重合(LRP)を乳化重合系や分散重合系などの不均一重合系に移すと、特定の条件下では、均一重合系に比べて、ラジカル寿命の延長(生成高分子の高分子量化)と交換移動頻度の増大(分子量分布の制御性の向上)が理論的に予測される。これらの検証を交換連鎖移動剤としてクミルジチオベンゾエートを用いたメチルメタクリレート(MMA)およびスチレンの分散重合系で行った。水相溶媒、分散剤、温度などの重合条件の最適化を行った結果、MMA系では、それぞれ、水/エタノール(1/3)、ポリアクリル酸、70°Cの条件において、数平均分子量が約10万の分子量分布のよく制御された高分子量体の合成に成功し(高分子量化の実現)、さらに、低重合率より分子量分布の極めて狭い(分子量分布指数M_w/M_n1.1)ポリマーの生成を認め(分子量分布の制御性の向上)、理論の予測を実証することができた。しかしながら、生成ポリMMA粒子の一部は融着し、粒子の分散化は現在の検討課題である。一方、スチレン系では、水/メタノール(1/3)(水相溶媒)、ポリビニルピロリドン(分散剤)、70°Cの条件下で、ポリスチレンの分子量分布を制御するとともに、融着のない粒径(典型的には約2μm)のほぼ均一なポリスチレン粒子を得ることに成功した。粒径は分散剤濃度により制御可能であった。いずれのモノマーにおいても、重合は短時間で完了し、予測どおり、粒子内のラジカル濃度が均一系に比して極めて高いことが確認された。また、MMA系では、非極性相としてヘキサンを、分散剤としてスチレン-ブタジエンブロック共重合体を用いた逆相分散重合も試みた。粒子の分散化の問題は残るものの、上述の順相系と同様に、LRPの性能向上を示す良好な結果を得た。
大腸菌における小分子RNAの作動原理の解明

SgrSをモデルとしてHfq結合性sRNAの作動原理についての研究を行い、以下の点を明らかにした。(1)SgrSの14塩基領域(168-181)が安定な塩基対形成および翻訳阻害に必要な最小領域である。(2)RNase E内の711-750領域がHfq結合領域で、この場所はRhlB結合領域と重なっている。(3)sRNAの転写終結シグナルのポリU配列がHfq結合部位として働く。(4)sRNAのHfq結合モジュールは、Rho因子非依存性ターミネーターおよびヘアピン構造直前の内部Uリッチ配列からなる。(5)Hfq結合モジュールを基盤にした任意の遺伝子ノックダウン系の構築に成功した。解糖系の阻害が大腸菌グルコーストランスポーター遺伝子(ptsG)の発現を転写後段階で抑制することの発見を契機とした一連の研究により、この制御にRNA結合タンパク質HfqとsRNAの1つSgrSが関与していること、SgrSはHfqを介してRNase Eと複合体を形成しptsG mRNAとの塩基対形成により翻訳の抑制とRNase Eに依存したmRNA分解を引き起こすことなどを明らかにし、原核生物におけるsRNAによる遺伝子発現制御の原理を理解するための研究を先導してきた。本研究の目的は、(1)SgrSが標的であるptsG mRNAを特異的に認識する機構、(2)Hfqが塩基対形成を促進する分子機構、(3)SgrS/Hfq/RNaseE複合体によるptsG mRNA分解の分子機構と生理機能、(4)代謝ストレスがSgrSの転写を誘導する機構に焦点を当てsRNAの作動原理の解明を目指すことである。平成21年度は、目的(1)と(2)に沿った研究を行い以下の成果を得た。1)ptsG mRNAの翻訳開始領域に相補的な種々の長さの合成RNAを用い、ptsG mRNAとの塩基対形成反応をゲルシフト法により解析した。また、試験管内での翻訳抑制能を解析した。この結果SgrSの14塩基領域が安定な塩基対形成および翻訳阻害に必要な最小領域であることを明らかにした。この成果は、SgrSによるptsG mRNAの特異的認識機構を解明する上で重要な鍵となる。2)SgrSの転写終結シグナルとなるステムループ領域、およびそれに続くポリU配列に変異を導入させたSgrS変異体の解析を行い、SgrSのポリU配列がSgrSによるptsGの抑制機能に重要であることを明らかにした。また、SgrSの転写終結配列の5'側の、ステムループ構造を形成する領域も重要であることを明らかにした。これらの結果はsRNA作用におけるHfqの役割を解明する上で重要な手掛かりとなる。解糖系の阻害が大腸菌グルコーストランスポーター遺伝子(ptsG)の発現を転写後段階で抑制することの発見を契機とした一連の研究により、この制御にRNA結合タンパク質HfqとsRNAの1つSgrSが関与していること、SgrSはHfqを介してRNase Eと複合体を形成しprsG mRNAとの塩基対形成により翻訳の抑制とRNase Eに依存したmRNA分解を引き起こすことなどを明らかにし、原核生物におけるsRNAによる遺伝子発現制御の原理を理解するための研究を先導してきた。本研究の目的は、(1)SgrSが標的であるptsG mRNAを特異的に認識する機構、(2)Hfqが塩基対形成を促進する分子機構、(3)SgrS/Hfq/RNaseE複合体によるprsG mRNA分解の分子機構と生理機能、(4)代謝ストレスがSgrSの転写を誘導する機構に焦点を当てsRNAの作動原理の解明を目指すことである。平成22年度は、主に目的(2)と(3)に沿った研究を行い以下の成果を得た。1) SgrS変異体の解析を行い、SgrSの220-227ntのポリU配列がHfqの結合部位として働き、SgrSによるptsG mRNAの抑制機能に必須であることを明らかにした。2)SgrS以外のsRNAも同様にそれらの転写終結シグナルのポリU配列がHfq機能に必須であることを明らかにした。3)RNase EのC末端欠失変異株を用いた解析により、RNase E/Hfq間の相互作用領域を明らかにした。また、RNase E/Hfq複合体及びRNase E/RhlB複合体は細胞内において競合関係にあることを示した。

解糖系の阻害が大腸菌グルコーストランスポーター遺伝子(ptsG)のの発現を転写後段階で抑制することの発見を契機とした一連の研究により、この制御にRNA結合タンパク質HfqとsRNAの1つSgrSが関与していること、SgrSはHfqを介してRNase Eと複合体を形成しptsG mRNAとの塩基対形成により翻訳の抑制とRNase Eに依存したmRNA分解を引き起こすことなどを明らかにし、原核生物におけるsRNAによる遺伝子発現制御の原理を理解するための研究を先導してきた。本研究の目的は、(1)SgrSが標的であるptsG mRNAを特異的に認識する機構、(2)Hfqが塩基対形成を促進する分子機構、(3)SgrS/Hfq/RNaseE複合体によるptsG mRNA分解の分子機構と生理機能、(4)代謝ストレスがSgrSの転写を誘導する機構に焦点を当てsRNAの作動原理の解明を目指すことである。平成23年度は、主に目的(2)に沿った研究を行い、Hfq結合部位の解明を目指した。SgrSをモデルとして、一連の変異体解析からsRNAのHfq機能的結合に十分な最小領域の決定を行った。その結果、3'領域に存在するRho因子非依存性ターミネーター、及びU塩基に富む配列が直前に存在する内部ヘアピン構造を含む49塩基のRNAがHfqとの機能的な結合に必要であることを証明した。また、U塩基に富む配列がターミネーターヘアピンの直前にあれば、内部ヘアピン構造はHfqとの機能的な結合に不用であることも示し、H鉤結合モジュールには2つのタイプがあることを明らかにした。既存のsRNAは2つのタイプのいずれかのHfq結合モジュールをもつことから、本研究の意義は、Hfq結合モジュールの実体を初めて解明したことにある。解糖系の阻害が大腸菌グルコーストランスポーター遺伝子(ptsG)の発現を転写後段階で抑制することの発見を契機とした一連の研究により、この制御にRNA結合タンパク質HfqとsRNAの1つSgrSが関与していること、SgrSはHfqを介してRNase Eと複合体を形成しptsG mRNAとの塩基対形成により翻訳の抑制とRNase Eに依存したmRNA分解を引き起こすことなどを明らかにしてきた。本研究の目的は、1SgrSが標的であるptsG mRNAを特異的に認識する機構、2Hfqが塩基対形成を促進する分子機構、3SgrS/Hfq/RNaseE複合体によるptsG mRNA分解の分子機構と生理機能、4代謝ストレスがSgrSの転写を誘導する機構に焦点を当て原核生物におけるsRNAによる遺伝子発現制御の原理を解明することである。昨年度までの研究から、sRNAのHfq結合モジュールの実体を解明した。すなわち、典型的なHfq結合モジュールは長いpolyU配列を持つターミネーターヘアピンとU-rich配列に先導された内部ヘアピン構造からなる。また、U-rich配列がターミネーターヘアピンの直前にある場合にはターミネーターヘアピンのみでHfq結合モジュールとして機能できる。平成24年度は、以下の点を明らかにした。1)Hfq結合モジュールとして効果的なpolyU配列の長さは8以上が必要である。2)polyU配列の一部の他のヌクレオチドへの置換してもHfq結合モジュールとしての活性は保持される。3)Hfq結合モジュールの上流に種々のmRNAの翻訳開始領域に相補的な配列を持つ人工的sRNAを利用した大腸菌における任意の遺伝子ノックダウン系の構築に成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の課題の1つはHfq結合モジュールの最適化をめざすことである。
In vivo/in vitro抗酸化評価に基づく生活習慣病治療薬の適正使用

メタボリックシンドロームにおいて酸化ストレスはその病態の発症及び進展に深く関与している。そのため,新規抗酸化剤の開発研究が活発になされているが,抗酸化剤の適応を的確に有する薬剤はほとんどないのが現状である。加えて,新規抗酸化剤の処方追加は医療経済的に負担が大きいため,既存の薬剤の中から抗酸化作用を有する薬物を活用する,いわゆる育薬が実践的な対策として期待されている。そこで,現在,メタボリックシンドローム改善薬として臨床使用されている降圧薬のプレイオトロピックエフェクトとしての抗酸化作用を解析し,抗酸化作用を加味したメタボリックシンドローム治療に対する新たな治療戦略を提案することを目的とし,in vivo及びin vitroの両面から評価した。その結果,オルメサルタンがin vivoにおいて抗酸化作用を有することを初めて明らかにした。また,抗酸化作用が降圧効果よりも腎保護効果に関与している可能性が強く示唆された。種々のin vitro実験より,オルメサルタンの抗酸化作用の機序として,自身の化学構造に基づくラジカルスカベンジャー様の直接的な機序と血管内皮におけるNADPHoxidaseの活性化ルートを抑制する間接的な機序の少なくとも二つの経路の存在する可能性が示唆された。従って,高血圧でない場合にも,メタボリックシンドロームの予備軍の段階からの早期投与が有効である可能性を示す有益な知見であり,このような育薬による治療戦略の構築が有用であることを実証でできたと考える。抗酸化作用を加味したメタボリックシンドローム治療に対する新たな治療戦略を提案するために,メタボリックシンドローム改善薬として臨床使用されている降圧薬のプレイオトロピックエフェクトとしての抗酸化作用の解析を行った。アンジオテンシン変換酵素阻害薬(ACEI),アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB),およびカルシウム受容体遮断薬(CCB)について,健常人および血液透析血清を用いて酸化アルブミンによる抗酸化能評価を行ったところ, ACEIであるカプトプリル, ARBであるオルメサルタン,バルサルタン, CCBであるシルニジピンにおいてアルブミン酸化度の抑制が観察された。次に,過酸化水素による酸化反応に対する効果をアルブミン指標として評価したところ,オルメサルタンおよびCCBのシルニジピンにおいて抗酸化作用が認められた。一方,活性酸素種の1つであるスーパーオキシドに対するラジカルスカベンジ能をESRにて評価したところ,テモカプリルにおいて若干の抑制が観察された。これらの結果から,オルメサルタン,テモカプリルおよびシルニジピンにおいて作用するラジカル種は異なる可能性が考えられるが,抗酸化作用を有していることが示唆された。そこで, 5/6腎臓摘出ラットを作成し腎不全に対する臓器保護効果及び抗酸化作用を, RA系阻害薬であるオルメサルタンおよびテモカプリルで比較を行った。腎不全ラット作成後, 8週間にわたり両薬剤を経口投与したところ,どちらの薬物においても腎不全の進行が抑制されたが,オルメサルタン投与群において有意な酸化ストレスの改善が認められた。(投稿準備中)この結果は,申請者が先に報告した結果と一致しており,抗酸化作用を有する薬剤の使用が,病態の進行を抑制することが示された。前年度に引き続き,抗酸化作用を加味したメタボリソクシンドローム(Mets)治療に対する新たな治療戦略を提案するために,Mets改善薬として臨床使用されている降圧薬のプレイオトロピックエフェクトとしての抗酸化作用の解析を行った。降圧薬として汎用されているオルメサルタンにおいて試験管レベルでの抗酸化作用が認められたため,5/6腎臓摘出腎不全モデルラットに対しオルメサルタンを10mg/kgにて8週間経口投与を行った。その結果,酸化アルブミンを指標とした酸化ストレスマーカーは4週間後に有意に低下し,その効果は8週間後まで持続していた。また,血液中の抗酸化力に関しても,銅の還元能を指標としたPAO活性の有意な上昇が認められた。これらのことから,オルメサルタンの抗酸化作用がin vivoにおいても確認された。さらに,この効果は血圧低下作用とは独立していること,またオルメ

サルタンの抗酸化効果は腎保護効果に関連することを見出した。(Kadowaki D. et al., Biol Pharm Bull. 2009)。一方,Metsは心血管疾患(CVD)および慢性腎臓病(CKD)のリスクファクターであり,さらに近年,心腎連関というCKDとCVDは相互にリスクファクターとなることが明らかにされつつある。このCVDとCKDの発症のトリガーとなる障害は,血管内皮の障害であることが示唆されている。そこで,オルメサルタンの抗酸化メカニズムを詳細に検討するために,ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて検討を行った。HHVECに傷害を惹起する刺激剤として,アンジオテンシンII, LPS,および尿毒症物質としてISおよびAOPPを用いた。これらの刺激物添加により,HUVECにおける活性酸素種(ROS)の産生が亢進するが,オルメサルタン添加によりROS産生抑制作用が観察された(投稿準備中)。これらの結果は,オルメサルタンが単なる降圧薬でないことを示唆しており,高血圧でない場合にも,Metsの予備軍の段階からの早期投与が有効である可能性を示す有益な知見である。メタボリックシンドローム(Mets)において,酸化ストレスはその病態の発症及び進展に深く関与している。さらにMetsは心疾患や腎疾患のリスクファクターでもあることが示されている。そのため,新規抗酸化剤の開発研究が活発になされているが,抗酸化剤の適応を的確に有する薬剤はほとんどないのが現状である。加えて,新規抗酸化剤の処方追加は医療経済的に負担が大きいため,既存の薬剤の中から抗酸化作用を有する薬物を活用する,いわゆる育薬が実践的な対策として期待されている。そこで,現在,メタボリックシンドローム改善薬として臨床使用されている降圧薬のプレイオトロピックエフェクトとしての抗酸化作用を解析し,抗酸化作用を加味した新たな治療戦略を提案することを目的とし,検討を重ねてきた。これまでに,アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)であるオルメサルタン(降圧薬)において,抗酸化活性がin vitroの系において認められている。そのため,今年度は細胞実験により詳細な検討を行った。Metsの特徴の1つである腎における酸化ストレス亢進をモデルとし,血管内皮細胞に尿毒症物質を添加した際の抗酸化作用を評価したところ,代表的な尿毒症物質であるインドキシル硫酸(IS)により顕著な活性酸素種(ROS)の増大が認められたが,オルメサルタンによりその上昇が抑制された。さらに興味深いことに,降圧薬の1つであるアゼルニジピン(カルシウム受容体拮抗薬)との併用により酸化ストレスのさらなる抑制が観察された。また,このメカニズムとしてROSの産生源の1つであるNADPHoxidaseの発現を抑制することが見いだされた。今回得られた知見は,抗酸化作用を考慮した降圧薬の選択に対する基礎的データを提供するものであり,最近,精力的に上市されている降圧薬の配合剤の有用性を示すものである。
運動性を示す腸管由来Lactobacillus属細菌が持つべん毛の意義

有べん毛乳酸菌の運動性や免疫学的特性を調べ、当該細菌特有の生態を探ることを目的として研究に着手した。Lactobacillus agilisの運動性欠失変異株は野生株よりもマウス腸管への定着性が低い傾向にあった。また、L. agilisの腸管由来成分に対する走化性も、腸管定着性に関与している可能性が示された。多くの有べん毛病原細菌とは異なり、L. agilisが持つべん毛の免疫学的活性は低く、炎症応答を誘導しにくいと考えられた。結論として、有べん毛Lactobacillus属細菌は宿主免疫系の過剰な刺激を避けつつ、運動性による積極的な移動により腸管粘膜への定着性を向上させているものと思われた。初年度は運動性を示す有べん毛Lactobacillus属細菌の中から適当なものを選抜し,実験モデルを検討すること,変異株を作製することが主な課題であった.1.菌株の取得と選抜について:菌株保存機関のLactobacillus agilisを4株,横浜市内の動物園などから運動性乳酸菌を4株分離した.分離株が予想外に少なく,モデルとして最適なげっ歯類由来株は分離されなかった.一方,運動性が不明瞭であったL. agilis JCM1048(トリ腸管由来)から,継代培養の過程で旺盛な運動性を示す株(BKN88)が取得された.BKN88は形質転換が可能であり,最近になって同種のべん毛関連遺伝子群がGenBankに公開されたことから,以降の検討に用いた.2.経口投与したL. agilis BKN88のマウス腸管への定着または残存性の検討: BKN88を培養し,マウス胃内へ投与したが,2日程度で大部分が排泄された.そこで,BKN88にストレプトマイシン耐性を付与し,抗生物質を含む飲水を与えながらマウスへ複数回の投与したところ,抗生物質依存的な定着が観察された.これはマウス腸管定着モデルとして有望な結果であった.3.運動性欠損変異株の作製: BKN88を元に,べん毛を保持するが,運動性は失った変異株の作製が行われた.べん毛の回転モーターに相当するタンパク質をコードする遺伝子motBを標的とし,特定のアミノ酸置換を導入したところ,運動性を持たない菌株(motB D23A)が取得された.4.フラジェリンタンパク質の同定:フラジェリン遺伝子への変異導入にあたり,BKN88の染色体上に2コピー存在するフラジェリン遺伝子の発現を解析する必要が生じた.転写産物,タンパク質の両方について調べたところ,BKN88のべん毛繊維は両方のフラジェリンにより構成されることが示唆された.Lactobacillusagilis変異株および組換え体作製:後述するフラジェリンの特性解析の結果より,L. agilisが持つフラジェリンの免疫系へのインパクトは大きくないことが予想された.そこで当初の予定を変更し,走化性のシグナル伝達に関わるcheA遺伝子を変異させることにした.蛍光タンパク質発現株の作製については,mTFP1またはtdTomatoのいずれかを発現する組換え体を作製した.蛍光は検出されたものの,安定性の問題を解決する必要があった.培養細胞を用いた運動性の評価:当初予定されていたHT-29細胞では均質な粘液層を安定的に形成させることが困難であり,実験は難航した.代替実験として,ムチンと寒天を混合した擬似的な粘液層を用いて,L. agilisが粘液層を通過することを実証した.走化性因子の探索:動物腸管内に存在すると考えられる物質への走化性を,ガラスキャピラリーを用いたアッセイにより定量的に評価した.結果として,酸や胆汁からの忌避,グルコースやN-アセチルグルコサミンなどの糖類への集積が認められた.マウスを用いた定着性試験:motB変異により運動性を失った有べん毛L. agilis変異株にストレプトマイシンおよびリファンピシン耐性を付与し,抗生物質を経口摂取させたマウスへ定着させた.経時的な糞便中の菌数と,エンドポイントにおける腸管内の菌数を計測した.抗生物質共存下において安定的な定着がみられたものの,野生株と変異株の間において明確な菌数の差異は認められなかった.フラジェリンの特性解析:L. agilisのべん毛繊維は酸や温度上昇に対して比較的安定であった.また,Caco-2細胞の刺激によるインターロイキン-8産生誘導試験により,L. agilisのフラジェリンはToll-likeレセプター5による認識が弱いことが明らかとなった.当初の計画から変更された部分や難航している実験もあるが,それらを補う新しい知見があるため,全体的には順調に進展している.具体的には、変異体作製やin vitroでの評価はやや遅れているものの,次年度の予定であったマウスを用いた定着性試験の結果の一部が既に得られていること,当初の計画には無かったフラジェリンの特性について新知見が得られたことが挙げられる.特にべん毛の特性に関する新知見については論文も発表できたことから大きな成果であったといえる.さらに,フラジェリンの免疫学的特性についてさらなる展開が期待できることから,追加の実験が進行中である.一方,マウスを用いた定着性試験の結果が予想とは異なっていたことから,仮説の再検討や,マウスまたは近縁動物由来の運動性Lactobacillus属細菌の分離を継続する必要がある.最終年度においては、ノトバイオートを用いて有べん毛Lactobacillus

属細菌がもつ運動性の、腸管定着への関与について調べた。その結果、運動性を示す野生株が回腸粘膜深部に達している、あるいは粘膜層へ強固に接着している一方、運動性を失った変異株においてはその能力が弱いことが示唆された。この結果より、運動性は宿主腸管への定着性に影響するものと考えられた。フラジェリンの免疫学的特性の解析においては、昨年度までに明らかにされたLactobacillus agilisがもつべん毛のTLR5低応答性が何に起因するかを検討した。結果として、L. agilisのべん毛は病原体由来のべん毛において保存されているアミノ酸残基のうち3ヶ所のミスマッチがみられ、これらのアミノ酸残基を病原体由来のものと一致させることで、TLR5を介した炎症応答が強化されることが示された。初年度より継続していた動物糞便からの運動性Lactobacillus属細菌の分離について、効率化を試みた。運動性Lactobacillus属細菌において保存性の高いfliG遺伝子を標的としたプライマーを作製し、動物糞便から抽出したDNAに対してその検出を試みた。併せて軟寒天培地による培養を行い、運動性細菌の集積部位からの単離を試みた。以上により、多くのL. agilisが分離され、同菌種が比較的広い宿主域を持つことも明らかとなった。3年間の研究結果から本課題を総括すると、有べん毛Lactobacillus属細菌は宿主動物腸管において運動性を発揮することで粘膜深部へ達し、定着性を向上させることができるものと考えられる。その一方で、べん毛構成遺伝子のフラジェリンの免疫学的活性は弱く、過剰な炎症応答を誘導することは無いと考えられた。以上の特性により、運動性Lactobacillus属細菌は宿主への定着にべん毛による運動性を活用しつつ、過剰な炎症を誘導することなく宿主との共生関係を維持しているものと結論付けられた。有べん毛乳酸菌の運動性や免疫学的特性を調べ、当該細菌特有の生態を探ることを目的として研究に着手した。Lactobacillus agilisの運動性欠失変異株は野生株よりもマウス腸管への定着性が低い傾向にあった。また、L. agilisの腸管由来成分に対する走化性も、腸管定着性に関与している可能性が示された。多くの有べん毛病原細菌とは異なり、L. agilisが持つべん毛の免疫学的活性は低く、炎症応答を誘導しにくいと考えられた。結論として、有べん毛Lactobacillus属細菌は宿主免疫系の過剰な刺激を避けつつ、運動性による積極的な移動により腸管粘膜への定着性を向上させているものと思われた。取得した菌株が少なかったこと,形質転換可能な菌株がLactobacillus agilisだけであったことから,菌株のスクリーニングについては当初の予定通りに進まなかった.しかし,旺盛な運動性を示すL. agilis BKN88株が取得できたこと,BKN88の形質転換が可能であったこと,べん毛関連遺伝子群の遺伝子配列公開があったことにより,供試菌株として妥当なものを選抜することができたと考えている.また,抗生物質を利用したマウス腸管定着モデルの検討において有望な結果が得られた.
ベンチマークの解剖学

実アプリケーションの性能やアプリケーションベンチマークのスコアと、対象システムの構成要素・基本性能ごとの性能の関係を明らかにし、そのための手法を確立しようとしている。ベンチマークは、サーバから組み込み機器まであらゆる計算機システムの性能を評価するための欠かせない手段である。ベンチマークのためには、実アプリケーションやその縮小版、もしくはその挙動を模したベンチマークプログラムを実行する。しかし、逆説的に、実アプリケーションに近いベンチマークプログラムほど、システうの構成要素や基本機能ごとの性能と最終的なベンチマークスコアの関係が明らかではない。その関係を明らかにし、手法を確立する。2016年度は、網羅的なアプリケーションベンチマークと、自作マイクロベンチマーク群を用いて、両者のスコアを統計的に結びつけることを試み、一定の相関を見出すことが出来た。2017年度は、対象をデータ中心のアプリケーションに広げ、アプリケーションベンチマークとマイクロベンチマークの関係を統計的に分析した。ベンチマークによっては、複数種類のストレージデバイスにおいて良い相関が得られ、今後現れる高性能ストレージデバイスの性能を見積もることが可能となった。2018年度は、2017年度に開始したデータ中心アプリケーションを対象とした分析に引き続き取り組んだ。提案するアプローチの有効性を確認できた。課題も見えてきた。複数マイクロベンチマークのスコアが類似の傾向を示した。これは、複数のマイクロベンチマークに対して同じ性能指標(例:メモリアクセス性能)が支配的に影響することに起因する。しかし、逆説的に、実アプリケーションに近いベンチマークプログラムほど、システムの構成要素や基本機能ごとの性能と最終的なベンチマークスコアの関係が明らかではない。2016年度に取り組んだCPUの処理性能だけでなく、2017年度にはデータ中心アプリケーションとストレージについても提案アプローチの有効性を確認できた。実アプリケーション、マイクロベンチマークを充実させるとともに、上述の問題の解決を試みる。デバイスの種類の拡充、分析手法の拡充に取り組む。充足率(52%)を踏まえて執行計画を調整した結果、実験用計算機の購入を見送ることとしたため。12年目の研究成果によって研究の対象が拡がり、研究計画を3年目まで延長することとしたため。調査(学会等参加)または成果発表を目的とした執行をする予定である。