hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サイトカイン連鎖による肝再生不全発症機序の解明とその制御による治療法の開発

エンドトキシン(リポポリサッカライド; LPS)によって惹起される肝再生不全モデルを用い、その機序について以下の点を解明できた。2.ノックアウトマウスを用いた実験から、上記の系におけるTNF-αの責任受容体はTNFR-1であり、TNFR-2とFasは関与しなかった。3.TNF-αによって肝線維化が惹起されるが、セカンド・メッセンジャーとしてheat shock protein (HSP)も関与する。ただしHSPの作用には2面性がある。4.現在、臨床試験が進行中の新規化合物(NIK-333)はTNF-α陽性オーバル細胞の出現と星細胞の活性化を何れも抑制した。星細胞の活性化は肝線維化を誘導するとともに再生不全も惹起する。従ってNIK-333には臨床的有用性が期待できる。以上により、サイトカイン連鎖による肝再生不全発症機序について一定の知見を得、この機序を制御することによる治療法の開発についても候補化合物の有用性を基礎的に証明できた。肝再生不全の病態を、特に肝再生を強力に抑制するサイトカインtransforming growthfactor-β(TGF-β)の活性化機序の面から解明しました。またプロテアーゼ阻害剤を用いたTGF-β活性化抑制剤の開発を展開し、臨床導入を目指しています。(1)肝星細胞におけるTGF-β活性化に関わるプロテアーゼの解明我々が確立したLPSによる肝再生不全モデル(Gastroenterology 2002)を用い、LPS刺激により引き起こされるサイトカイン連鎖のメカニズムを解明し、plasma kallikreinがTGF-β活性化に関わる重要なプロテアーゼであることを明らかにしています。また、細胞間でのサイトカインネットワークの解明に取り組み「TNF-α刺激により肝星細胞上でのuPAレセプターの表出誘導」機序の解明に努めています。さらにプロテアーゼ阻害剤によるTGF-β活性化の抑制、肝再生の促進薬の開発を進めています。(2)臨床例での病態特異的なTGF-β活性化機序Kallikreinで特異的に切断されるTGF-βのアミノ酸部位を決定し、その残基を認識する抗体を作製し、免疫組織化学的手法を用いて劇症肝炎におけるTGF-β活性化機序を臨床例で明らかにしました。従来の研究から継続して、標的細胞としては肝星細胞を対象とした。またサイトカインについてはTNF-αを新たに検討対象とした。その結果、以下の2点を解明することが出来た。1.TNF-αに対する細胞側の受容体にはTNFR-1、TNFR-2の二種類がある。TNFR-1、TNFR-2それぞれ、ならびに両者のノックアウト・マウスを用いた実験から、エンドトキシンによって惹起される肝障害・再生不全の情報はTNFR-1のみを経由し、TNFR-2には依存しないことを明らかにできた。またTNFRと同一ファミリーに属する受容体であるFasもこのモデルでは関与しなかった(Shimizu S, Moriwaki H, et al. Liverinjury induced by lipopolysaccharide is mediated by TNFR-1 but not by TNFR-2 or Fas in mice. Hepatol Res 2005;31:136-42)。従来の研究から継続して、肝障害・再生・瘢痕形成(線維化)の過程におけるサイトカインの役割について検討を行い。、以下の2点にっいて結論を得た。
低酸素環境に潜むCML幹細胞の動態解明に基づく革新的な分子標的治療法の開発

チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は慢性骨髄性白血病(CML)患者の予後を劇的に改善したが、治療抵抗性および薬剤中止後の再発という大きな課題が残されている。その原因の一つはCML前駆細胞を連続的に生み出すCML幹細胞である。CML幹細胞は低胞酸素環境でBCR-ABL非依存性に生存するためBCR-ABLのみを標的にする戦略では殲滅は期待できない。これまでの研究において、我々は転写因子C/EBP βの発現がCML幹細胞を枯渇させる方向に働くことを見出した。低酸素環境に潜むCML幹細胞の動態解明に基づき、CML幹細胞の殲滅を目指した分子標的治療法を開発するための研究を引き続き行った結果、BCR-ABLを介さずC/EBPβの発現を増強してGo期にあるCML幹細胞を細胞周期に導入させ、BCR-ABL依存性の増殖相に誘導すれば、TKIの標的にできると考えられた。スクリーニングの結果、インターフェロンα(IFNα)がSTAT5を介してBCR-ABL非依存性にC/EBPβの発現を上昇させることをin vitroで見出した。IFNαは、これまでにもCMLの治療に持ちられて来ており、一部の症例で著効を示すが、その作用機序は不明であった。IFNαが実際にin vivoでCML幹細胞の枯渇に作用するかについて検討するため、WT骨髄細胞に、レトロウイルスを用いてBCR-ABLを遺伝子導入し、放射線照射したマウスに骨髄移植し、1次レシピエントに対してIFNを投与した後に骨髄を採取し、フローサイトメトリーによるCML幹細胞数の測定、2次レシピエントでのCML発症や生存を観察した。その結果、確かにin vivoにおいてもIFNαが投与群で、2次レシピエントの生存期間が延長し、CML幹細胞を枯渇させ得ることを確認した。チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は慢性骨髄性白血病(CML)患者の予後を劇的に改善したが、治療抵抗性および再発という大きな課題が残され、その原因はCML幹細胞が残存していることにある。CML前駆細胞を連続的に生み出すCML幹細胞は低酸素環境でBCR-ABL非依存性に生存しTKIの標的となると考えられ、BCR-ABLを標的にする戦略では低酸素環境に潜むCML幹細胞の殲滅は期待できない。本研究では「幹細胞性」を有する低酸素適応CML細胞株ではC/EBPβの発現低下を認めた。その結果、インターフェロンα(IFNα)がSTAT5を介してBCR-ABL非依存性にC/EBPβの発現を上昇させることをin vitroで見出した。IFNαが実際にin vivoでCML幹細胞の枯渇に作用するかについて検討するため、WTおよびC/EBPβKOマウスの骨髄細胞に、レトロウイルスを用いてBCR-ABLを遺伝子導入し、放射線照射したマウスに骨髄移植し、1次レシピエントに対してIFNを投与した後に骨髄を採取し、フローサイトメトリーによるCML幹細胞数の測定、2次レシピエントでのCML発症や生存を観察した。その結果、確かにin vivoにおいてもIFNαがC/EBPβの発現を上昇させることで、CML幹細胞を枯渇させ得ることを確認した。インターフェロンα(IFNα)がSTAT5を介してBCR-ABL非依存性にC/EBPβの発現を上昇させることをin vitroで見出すとともに、IFNαが実際にin vivoでCML幹細胞の枯渇に作用するかについて検討した結果、確かにin vivoにおいてもIFNαがC/EBPの発現を上昇させることで、CML幹細胞を枯渇させることを確認した。In vivoの検討及びそのメカニズムの解明の一部分は、次年度に実験を予定していたものである。

IFNαが実際にin vivoでCML幹細胞の枯渇に作用するかについて検討するため、WTおよびC/EBPβKOマウスの骨髄細胞に、レトロウイルスを用いてBCR-ABLを遺伝子導入し、放射線照射したマウスに骨髄移植し、1次レシピエントに対してIFNを投与した後に骨髄を採取し、フローサイトメトリーによるCML幹細胞数の測定、2次レシピエントでのCML発症や生存を観察した。その結果、確かにin vivoにおいてもIFNαがC/EBPβの発現を上昇させることで、CML幹細胞を枯渇させ得ることを確認した。従来の研究成果から、BCR-ABL及びIFNαによるC/EBPβの転写レベルでの発現上昇には、いずれもSTAT5の活性化を伴っていることが明らかとなっている。したがって、STAT5によるC/EBPβの発現制御について検討した。細胞株を用いて、クロマチン免疫沈降した産物を次世代シーケンスで解析したところ(ChIPseq)、マウスC/EBPβ遺伝子のコーディング部位の3'遠位部にSTAT5の結合配列が二箇所並んでいる部位にSTAT5がBCR-ABL依存性またはIFNα刺激依存性に集積することが明らかとなった。この部位にはBCR-ABL及びIFNα依存性にH3K27Acが集積したことから、エンハンサー機能を持つことが予想された。そこで、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集技術を用いて、当該部位の配列の削除したり、阻害したりすることによってBCR-ABL及びIFNα依存性のC/EBPβの発現上昇が抑制されたことから、今回同定した部位が機能的なエンハンサーであることが明らかとなった。このようにC/EBPβの発現上昇に関わる分子メカニズムを明らかにすることができた。さらに実際のヒト慢性骨髄性白血病でどうかという疑問に答えるために、慢性期慢性骨髄性白血病患者の骨髄もしくは末梢血から分離CD34陽性白血病幹細胞を含む細胞分画でもIFNαによるC/EBPβの発現上昇が確認されており、マウスと同様のメカニズムが作用している可能性が強く示唆された。チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は慢性骨髄性白血病(CML)患者の予後を劇的に改善したが、治療抵抗性および薬剤中止後の再発という大きな課題が残されている。その原因の一つはCML前駆細胞を連続的に生み出すCML幹細胞である。CML幹細胞は低胞酸素環境でBCR-ABL非依存性に生存するためBCR-ABLのみを標的にする戦略では殲滅は期待できない。これまでの研究において、我々は転写因子C/EBP βの発現がCML幹細胞を枯渇させる方向に働くことを見出した。低酸素環境に潜むCML幹細胞の動態解明に基づき、CML幹細胞の殲滅を目指した分子標的治療法を開発するための研究を引き続き行った結果、BCR-ABLを介さずC/EBPβの発現を増強してGo期にあるCML幹細胞を細胞周期に導入させ、BCR-ABL依存性の増殖相に誘導すれば、TKIの標的にできると考えられた。スクリーニングの結果、インターフェロンα(IFNα)がSTAT5を介してBCR-ABL非依存性にC/EBPβの発現を上昇させることをin vitroで見出した。IFNαは、これまでにもCMLの治療に持ちられて来ており、一部の症例で著効を示すが、その作用機序は不明であった。
細胞接着の乳腺上皮細胞の増殖・分化における機能,その失調と乳癌の発症機構

癌遺伝子の候補EMS1遺伝子は,ヒト乳癌の15%で遺伝子増幅による発現の亢進がみられる。その産物はSrcチロシンキナーゼの基質cortactinのヒト相同タンパク質である。我々はショウジョウバエの解析から,cortactinが上皮細胞では細胞間接着装置で機能することを示す結果を得ている。細胞間接着は,細胞の増殖,分化をを制御する細胞間シグナル伝達にも関与する。cortactinの脱制御により細胞間接着の機能が損なわれることが,癌細胞の異常増殖,浸潤・転移に関与する可能性がある。これを検討するために,マウス乳腺上皮由来の培養細胞株HC11に,野生型および欠夫変異型cortactinの組み換え遺伝子を導入した。免疫染色法および蛍光タンパク質EYFPとの融合タンパク質の観察により,cortactinが細胞間接着部位に濃縮されることが判明した。予備的知見ながら,野性型cortactinを過剰に発現する細胞で運動性の上昇が示唆された。これらの結果は,ほ乳類の上皮細胞においてもcortactinが細胞間接着装置で機能し,その脱制御が癌細胞の浸潤・転移に関与する可能性を支持する。欠失変異型cortactinの解析から,細胞間接着部位への濃縮に,アクチン繊維結合に関わる37アミノ酸の反復領域が重要であることが示された。また新規の型を含め,この反復領域の異なるイソ型cortactinが少なくとも5種あることを見いだした。各イソ型はアクチン繊維との相互作用に違いがあり,それらの発現のバランスにより細胞間接着の機能が調節されている可能性が示唆される。cortactinはSrcチロシンキナーゼの基質として見いだされたアクチン繊維結合タンパク質である。ヒト相同タンパク質は乳がんの原因遺伝子と考えられるEMS1にコードされる。我々はマウスとハエでcortactinが細胞接着装置の裏打ちタンパク質ZO-1に結合することを見いだした。cortactinは多細胞生物に必須の細胞接着を担う分子の1つで,細胞の増殖・分化を制御する,細胞間シグナル伝達に含まれる可能性もある。本研究はcortactinの機能をマウス乳腺上皮組織由来の培養細胞で検討し,乳癌発症機構の解明を目指すものである。本年度研究実績(1)免疫染色より,上皮性培養細胞HC11において,cortactinが細胞間接着部位でZO-1と共存する事を明らかにした。(2)HC11細胞でcoractinを強制発現する系を構築した。cortactinは幾つかの特徴的なドメイン構造を有する。37アミノ酸を単位とする,6.5回の反復配列は,アクチン繊維結合に必須である。反復が5.5回,4.5回のイソ型の存在も報告されている。C末端のSH3ドメインは,ZO-1等とのタンパク質間相互作用に関わる。反復配列の異なるイソ型(6.5,5.5,4.5回型)に加え,反復配列,SH3ドメインの欠失変異型cortactinを発現する組み換え遺伝子を構築し,HC11に導入した。各イソ型,変異型の細胞内局在を検討する為に,cortactinをGFPとの融合タンパク質として発現する組み換え遺伝子も構築済みである。来年度は,これら組み換え遺伝子導入細胞の,運動性,接着性,分化能を比較検討し,coractinの細胞接着,シグナル伝達系への関与とその樹能にせまる。予備的知見ながら,各イソ型cortactinを過剰に発現する細胞では運動性が上昇する傾向が認められている。
アフリカ熱帯林への貨幣経済浸透に伴う経済的不平等の拡大と住民の平等主義規範の相克

換金作物栽培の浸透に伴い生計経済、社会文化変容がみられるカメルーン東南部の狩猟採集民バカ・ピグミーの社会を主たる対象に、隣接して居住する漁撈農耕民バクウェレ社会との民族集団間関係を視野に入れつつ、平等主義的な社会規範を保ちつついかに市場経済に適応しようとしているかについて検討した。得られた研究成果は、学術雑誌論文6件、学会発表21件、共著書5件として発表した。また、これまでの研究成果を学位申請論文『カメルーン東南部における農耕民=狩猟採集民関係ー市場経済浸透下のエスニック・バウンダリーの動態ー』にまとめ、2014年3月に京都大学大学院アジア・アフリカ地域研究研究科から博士学位を取得した。カメルーン共和国の継続調査地と隣接するコンゴ共和国では、カメルーンとは異なる貨幣経済の浸透状況がみられる。2012年12月中下旬にかけて、コンゴ共和国に渡航し、比較の観点から首都ブラザビルを拠点に現地調査を行った。1990年代後半から2000年まで続いた内戦後、流通インフラの復旧が著しく遅れているコンゴ共和国北部では、カメルーンのような換金作物の栽培拡大という形ではなく、むしろ都市部における動物性蛋白質の需要拡大と市場価値の高騰に呼応した野生獣肉及びコンゴ川産淡水魚の商業取引拡大といった形で、貨幣経済化の浸透が進んでいる。そこで商品としての燻製淡水魚の熱帯林から都市までの商品連鎖に着目して調査を行った。年度後半は、海外研究者との研究交流による情報交換にも力を入れた。別財源による出張も含めて、2013年1月には米国・ワシントン州立大学人類学部、2013年2月にはフランス・リヨン第2大学言語ダイナミクス科学研究室、2013年3月にはフランス・パリ国立自然史博物館環境人類学研究室、ならびにベルギー王国・ブリュッセル自由大学社会学研究所をそれぞれ短期訪問し、中央アフリカ共和国、ガボン共和国で熱帯林地域住民を対象にインテンシブな研究を継続している海外研究者と情報交換を行った。これにより、代表者が調査しているカメルーンとコンゴにおける経済的不平等への住民の対応事例を、コンゴ盆地北西部全体の文脈の中に位置づけることができた。今後、特に長期継続調査を行っている米国ならびにフランスの研究グループとは、本研究課題に関連した共同研究を本格的に開始する予定である。得られた研究成果の一部は、共著書1冊と学術雑誌論文2本(いずれも和文)として刊行したほか、国際会議における発表2件(2012年5月にフランス・モンペリエで開催された第13回国際民族生物学会講演)と国内学会における発表3件を行った。2013年度は、現地調査は行わず、前年度までの現地調査により得られた資料整理を進めるとともに、成果を取りまとめ、学術論文8報(うち査読付き欧文論文3報)、事典執筆2報、短報10報等として発表した。2013年6月には、リバプール大学(イギリス)で開催された第10回世界狩猟採集民会議(The 10th Conference on Hunting and Gathering Societies)に参加し、カメルーン東南部におけるバカ・ピグミーとムスリム商業民の関係について口頭発表を行った。2013年8月には、同じくマンチェスター(イギリス)で開催された国際人類学民族学連合(IUAES)大会において、カメルーン東南部のバカ・ピグミー社会における換金作物栽培の導入にともなう社会階層化の実態と人々の対応について報告した。2013年11月には、本プロジェクトの研究成果を含むこれまでの研究成果をまとめて、京都大学大学院アジア・アフリカ地域研究研究科に博士学位申請論文『カメルーン東南部における農耕民=狩猟採集民関係ー市場経済浸透下のエスニック・バウンダリーの動態ー』を提出し、審査の結果、博士(地域研究)の学位を授与された。2011年度前半は、これまでの調査により明らかになった狩猟採集民バカによるカカオ園経営の実態と平等主義規範の関係について、文献調査を加えつつ考察を行い、その結果を国際学術誌であるAfrican Study Monographsに投稿、査読の上論文掲載された。また2011年7月にはオーストラリアのパースで開催されたIUAES中間大会にて本研究課題について口頭発表を行った。その他本研究課題に関連する内容の英文学術論文を2本執筆し投稿、これらは現在査読中である。和文学術論文を2本執筆(うち1本は共著)し、それぞれ現在印刷中である。以下、現地調査によりあらたに得られた知見を記す。調査地ドンゴ村の農耕民バクウェレ人の定住集落では、親族間における呪術/邪術騒ぎが以前から絶えなかった。しかし、これまでの観察では隣接居住する狩猟採集民バカ人の間からは、農耕民によって邪術にかけられることによる不幸は頻繁に言及されるものの、バカ人がバカ人を邪術にかけたという言説が聞かれることは殆どなかった。2011年12月、旧知の友人であり、インフォーマントでもあったドンゴ村のあるバカ人壮年男性M氏が急死したという知らせを受けた。

2012年1月から2月にかけて現地調査を行い、聞き取りを行った結果、彼の死をめぐって、これまでとは異なる言説と解釈がバカ人、そして近隣農耕民の間で得られた。すなわち、他のバカ人による邪術によって、M氏は亡くなったというのである。一連の言説空間の変化と、彼と親族集団が抱えていたカカオ園経営とそこから得られる金銭的不平等をめぐる対立の関連について検討を行った。2012年の夏季にカメルーン共和国にて予定していた現地調査を行うことができなかったため、予定を変更した。コンゴ共和国に渡航して調査を行い、カメルーンの調査地で継続観察を行っている状況について、異なる角度から検討する視点を得た。また、海外研究者との情報交換により、本研究課題の貢献しうる、より大きな問題枠組みについて気づくことができた点で大変有意義であった。国内では前年度に収集したデータの整理・分析を着実に進めるとともに、本研究課題の成果を盛り込んだ論文を刊行することができた。本研究の目的は、平等主義的な社会を営んでいるとされてきたアフリカ狩猟採集民社会の一つであるバカ人を主な対象に、換金作物栽培の浸透によりもたらされた経済的不平等の実態を記載するとともに、私有財産の発生への社会の対応を分析することにより富の蓄積と社会的平等の両立の可能性について考察することにあった。研究初年度である今年度は、前年度までの予備的調査により明らかになったバカ人によるカカオ栽培と現金使用経済の実態、過去数十年間のカカオの国際価格の変動がカメルーンの熱帯林地帯辺境に位置する調査地の土地利用に及ぼした影響をカカオ園面積の実測調査に基づいて記載・分析した単著論文を刊行した。また、カカオ栽培により得られた現金の主要な用途を占めていると看取された飲酒と喫煙について、共著論文を執筆した。現地調査では、当初自給用焼畑の悉皆計測を行い、カカオ園の分布と併せて地理情報学的な分析を行う予定であったが、調査地において本研究に関わる重要な出来事ーバカ人の大規模カカオ園所有者の急死ーが発生したため、それにフォーカスした調査に切り替えた。これまで近隣農耕民社会によりもたらされる災いとされてきた呪術や邪術が、経済的不平等の発生と拡大を背景にバカ人社会内部で実践されるようになってきていることが明らかになった。これは、日常的な移動により〈近接者への分配〉規範から例外を作ったり、近隣農耕民や商業民にカカオ園を一時的に貸し出すことにより、親族内での所有に関わる葛藤を棚上げするなど、富の蓄積に対して当該社会においてこれまでに見られてきたのとは異なる質の対応であった。今後、これを平等主義規範の維持か変容かという問題との関連して慎重に検討してゆくことが求められる。今年度得られた本研究課題の理論的な分析見通しを踏まえて、早期にカメルーンに渡航して補足調査を行う。年度後半では、これまでに収集したデータの整理・分析を行い、論文執筆および学会発表を行って研究成果の発信に努めたい。本研究課題は、現地社会で現在まさに進行中のプロセスを扱っており、状況は常に変化している。当初仮説の検証とともに、新しい状況の丁寧な記載とそれへの柔軟な対応が求められる。
高等教育における女性の学びと教育の環境構築に関する日米の比較研究

本研究は、高等教育における女性学生の学びや成長の経験を理論的・実証的に探究することを目的とした。社会・人文科学を専攻する日米の博士後期課程在籍女性学生及び若手研究者を対象にした実証的研究と、女性たちの学びや成長についての認識を考察するための理論的探究をおこなった。高等教育機関は、言説と社会制度への不適合の感覚をもつ女性たちの制度的な受け皿としてあり、また、高等教育での学びは、そのような女性たちに既存の言説では語りえない言葉(言説)を開発するためのツールを提供するものとしてあることを明らかにした。高等教育機関での学びは、女性のエイジェンシーを表現することを可能にするツールをとして捉えられうる。1.インタビューの実施とデータ分析インタビュー実施のためのアメリカへ渡航し、8名とのインタビューを実施した(於:ニューヨーク市およびノース・キャロライナ州チャペル・ヒル)。また、日本では4人とのインタビューを実施した。昨年度と合わせ、合計で29名とのインタビューを実施することができた。本調査によって得られたデータの分析を進めた。2.理論的考察の実質化を目指した調査の分析と批判的考察、研究知見の発表本研究では、社会科学・人文科学を専攻する日米の博士後期課程在籍女性学生、若手研究者にインタビューを実施し、実証的な観点から以下のことを明らかにした。(1)後期課程で学ぶ(学んだ)アメリカの女性たちは、高等教育に実際的価値を見出しているのに対し、後期課程に学ぶ(学んだ)日本の女性たちは、高等教育の価値を具体的明瞭な言葉で表現することができない。(2)後期課程進学した日本の女性たちは社会一般の通年や既存の社会制度との不適合の感覚を共通してもっている。(3)後期課程の学びや、研究者としての活動は社会の中に自己を位置づけ自分自身の言葉を生成させていくための女性のエイジェンシーの何らかのはたらきと考えられる。また、本研究では理論的観点から以下のことを明らかにした。(1)女性学では「言葉」の問題は女性の自己形成都のかかわりから重要な問題として位置づけられてきた。(2)ジョン・デューイが理論化する「言葉を絶するもの」を、日本の女性たちの格闘ーことばにならないものを言葉にしようとする格闘ーとのかかわりで高等教育の学びの中に理論化し直すことができる。(3)リュス・イリガライの差異の哲学から解釈可能な教育関係は、既存の言説に規定された教育関係とは異なる教育関係を想像する手がかりを与えてくれる。以上の、実証的・理論的研究の成果によって、高等教育の学びを、女性のエイジェンシーを表現することを可能にするツールとしてとらえるための分析枠組みの構築に帰結した。1.教師と学生の教育的関係についての理論的考察教師と学生の関係性について理論的考察を行い、その成果を以下の学会等で発表した。リュス・イリガライ主催の国際セミナー(2011/6/13-18、ブリストル大学)にて"How to enable another: Rethinking power through Irigaray's love"という発表を行った。また、日本デューイ学会(2011/10/1-2、関西学院大学)では、「反省的思考と棲みかへの帰還ー自己形成の観点からのデューイとイリガライの対話の試み」、教育哲学会(2011/10/15-16、上越教育大学)では、「リュス・イリガライの際の倫理学における承認の概念ー教えることへの示唆」という発表を行った。いずれの発表でも、エネイブリング・パワーや成長の概念の精緻化を念頭に、自己と他者との関係性あるいは教育的関係性の中で自己の変容や成長がどのようにして起こるのか理論的に考察した。リュス・イリガライ主催国際セミナーの成果は、リュス・イリガライが編集する本に論文としてContinuumより2013年に出版される予定である。2.インタビュー調査の下準備と予備調査の実施2011年12月に名古屋大学教育学部倫理審査委員会に研究計画書、研究参加同意書、質問票を提出し、倫理審査を受け、調査実施の許可を得た。日本人女性学生と女性教員に対して半構造化された形式を採用したインタビューを10件実施(2012/1/14、2/13、2/14、3/13、於:お茶の水女子大学、2012/3/11、於:名古屋大学)、同様の形式で、アメリカ人女性学生と女性教員へのインタビューを8件実施した(2012/1/27-2/10、於:ニューヨーク州立大学バッファロー大学)。インタビュー後、日本およびアメリカでのインタビューの書き起こしを行い、また分析を開始した。本年度半ばに前職を辞し、現在の職についたため、理論研究面で一時研究を中断せざるを得なかった。また、実証研究面でも日本で目標にしていたインタビュー数を確保できなかった。

さらに、アメリカでのインタビューについても、名古屋大学大学院教育発達科学研究科の研究倫理委員の承認を十分だとみなしてもらえず、当初予定していた研究機関でのインタビュー実施ができなかった。そのため、調査地を変更せざるを得ず、インタビュー数の確保が不十分であった。他方、理論研究成果、実証研究成果について、合計で5件の国際学会への発表論文を執筆し、申し込みを行い、うち2件が採択された(1件は現在査読中)ことについて、研究知見の社会への還元という観点で進展があったと考える。理論的考察と実証研究面での予備調査をほぼ計画通りに実施することができたため。1.実証研究の分析・整理インタビュー数について最低でも40件を目標にしているため、本年度、アメリカ人女性5名、日本人6名とのインタビューを実施したい。また、これまで得たデータの分析をすすめる。2.実証研究と理論研究の統合実証研究で得られた知見に基づいて、研究代表者が博士論文で提示した概念であるエネイブリング・パワーが、教員と女性学生の教育行為のやり取りの中でどのような形態をとって循環しているのかを理論的に研究する。エネイブリング・パワーという概念の妥当性も含め、Women's Studies以外の学問分野への適用可能性や、日本の高等教育で教育行為が行われる環境においても適用可能なのかどうかを批判的に考察する。その成果を報告書にまとめる。1.インタビュー本調査の実施本年度実施した予備調査の初期の知見をもとに、調査実施計画を精査し改良を加える。アメリカへの渡航を予定し(2012年12月)20人程度とのインタビューを実施する。日本でも同様の形式で20人程度とのインタビューを実施する(随時)。インタビューデータの書き起こしの後、予備調査と理論的考察の連携によって得られた知見を、本調査から得たデータに照らして見直し、分析をより深める。2.理論的考察の実質化を目指した本調査の文先と批判的考察予備調査の初期に得られた知見について学会にて批判的に考察するため、国際学会(American Educational Research AssociationあるいはThe Association for the Study of Higher Education)への発表申し込みを行う(2012年5月と7月)。審査を受けた後、申し込みが認められれば2013年に発表となる。本調査の分析を進め、高等教育機関における教育的関係と女性の学びの形成に関するテーマを整理し、理論的考察を実質化する。分析・整理されたデータから生じる幾つかのテーマに関しては、日本の学会において発表および投稿を行う。高等教育や自己形成に関する図書を購入し、理論的考察をすすめる。また、インタビューや、国際学会での発表にともなう旅費、テープ起こし、報告書作成などに研究費を利用する計画である。また、インタビュー実施に伴う旅費、テープ起こしなどに研究費を利用する計画である。
唾液腺における傍細胞系水輸送のリン酸化・脱リン酸化制御

ラット顎下腺灌流標本を用いて,ニューロキニンAおよびピロカルピン刺激唾液分泌を測定し,ルシファーイエローを用いた傍細胞系輸送との関連を検討した。ニューロキニンAおよびピロカルピン刺激による唾液分泌は細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に依存しており,傍細胞系輸送もそれに共役することから,カルシウム系によるリン酸化・脱リン酸化の関与が示唆された。一方,ラット顎下腺由来培養細胞において,インスリン様成長因子I(IGF-I)の存在下でタイト結合タンパク質の発現と局在が認められたことから,傍細胞系の維持にIGF-Iが関与することが示唆された。さらに, PI3キナーゼ阻害剤によりIGF-Iの効果が抑制されることから, PI3キナーゼによるリン酸化制御が関わることが示唆された。唾液腺における水やイオン分泌には、腺房細胞の基底側から腺腔側への細胞を経由する経細胞輸送系と、細胞間を経由する傍細胞輸送系が関わっている。本研究は、ラット顎下腺灌流標本を用いて、傍細胞輸送の調節を明らかにすることが目的である。本年度は、ラット顎下腺灌流標本における傍細胞輸送系の関与を検討した。ラット顎下腺灌流標本を作成し、神経伝達物質であるニューロキニンA(NKA)と口腔乾燥症治療に用いられるピロカルピンによる水分泌を測定した。NKAは用量依存的に水分泌を促進したが、灌流液からカルシウムイオン(Ca^<2+>)を除くと水分泌は低下し、またCa^<2+>を戻すことにより分泌が回復することから、Ca^<2+>依存性の分泌であることが確認された。灌流液に細胞膜非透過性のルシファーイエロー(LY)を加えたところNKA刺激に伴ってLYが分泌液中に検出されたことから、NKAによる水分泌に傍細胞輸送も関わることが明らかとなった。ピロカルピン刺激では、NKAと同様に用量依存的な水分泌が惹起されたが、NKAと比較してピーク値に達する時間が遅く、また、刺激を中止した後のコントロールレベルへの戻りも遅いことから、ピロカルピンの効果は遅延的なものと考えられた。さらに、高濃度のピロカルピンによる水分泌は、刺激後に刺激中よりも増加することが認められ、この増幅現象はムスカリン性受容体アンタゴニストにより抑制されること、また灌流液からCa^<2+>を除くことにより抑制されることから受容体活性化やCa^<2+>動態に関与することが示唆された。ピロカルピンによるLYの分泌は、水分泌と一致して起こることから、この機序にも傍細胞輸送の制御が関わることが明らかとなった。唾液腺における水やイオン分泌は、腺房細胞の基底側から腺腔側への水・イオン輸送が関与する。この輸送系は、細胞内を経由する経細胞輸送系と、細胞間を経由する傍細胞輸送系から構成される。本研究は、ラット顎下腺における傍細胞系輸送の制御についての検討を行った。灌流顎下腺標本のを用い、蛍光色素であるルシファーイエローを灌流することにより傍細胞輸送系の関与を検討する実験系を確立した。この実験系において、神経伝達物質のニューロキニンA(NKA)による傍細胞輸送系の促進を明らかにした。同様の方法で唾液促進剤であるピロカルピンの効果を検討したところ、NKAとは異なった応答時間の長い反応が認められた。この効果は他のM3アゴニストのセビメリンでも認められたことから、M3受容体を介するものであることと考えられた。しかし、水分泌に伴った細胞内Ca^<2+>動態や酸素消費に関しても同様な効果が認められたことから、受容体での制御が関与すると推測された。一方、傍細胞輸送系を維持するラット顎下腺由来の培養細胞(SMIE細胞)を用いた実験系においても検討を行ったところ、ウシ胎児血清に成長因子の一つであるIGF-I阻害剤を加えると傍細胞輸送に関わるタイト結合の構造と機能が失われた。またウシ胎児血清の代わりにIGF-Iを用いると傍細胞輸送機能の維持が認められたことから、傍細胞系維持にIGF-Iの制御が重要であることを明らかにした。この機能はPI3キナーゼ阻害剤により阻害されることから、PI3キナーゼを介したリン酸化が重要であることが示唆された。唾液腺における水やイオン分泌は、腺房部での基底側から腺腔側への水・イオン輸送が関与する。この輸送は、腺房細胞内を経由する経細胞輸送系と、細胞間を経由する傍細胞輸送系とで制御される。本研究では、ラット顎下腺灌流標本を用いて、傍細胞輸送系の制御について検討を行った。特に、平成22年度に認められたM3ムスカリン性受容体であるピロカルピンによる効果を詳細に検討した。

ピロカルピンは用量依存性に唾液分泌を促進したが、刺激を停止した後にも持続した唾液分泌が認められた。高濃度のピロカルピン刺激では、刺激中よりも刺激後の分泌促進が大きくなった。この状態の腺房細胞には形態的な変化もなく、また、水チャネルの一つであるアクアポリン5(AQP5)の局在にも変化は認められなかったことから、細胞障害によるものではないことが考えられた。灌流液中のカルシウムイオンを除去するとピロカルピンによる唾液分泌は抑制された。ピロカルピン刺激時における細胞内カルシウムイオン動態や酸素消費量においても唾液分泌にリンクした持続反応が認められた。蛍光色素であるルシファーイエローを灌流することによる傍細胞系輸送系へのピロカルピンの効果においても、分泌にリンクした反応が認められた。これらのことから、傍細胞輸送系特有の制御よりは受容体刺激による一連の細胞内シグナルが傍細胞輸送系機能と共役していることが示唆された。一方で、細胞実験により、腺房細胞機能の減弱とタイト結合タンパク質のクローディン3の発現低下の関連が示唆されたことから、クローディン3の唾液腺傍細胞輸送系への関与が考えられた。
変異FLT3チロシンキナーゼ遺伝子導入による白血病モデルマウスの樹立

今日悪性腫瘍細胞における遺伝子変異と病態解明が飛躍的に進歩し、その腫瘍化や進展・維持に関与する分子を標的とした新たな治療法の開発が注目されている。白血病においては、急性前骨髄性白血病におけるレチノイン酸やBCR/ABL転座を持つALLや慢性骨髄性白血病に対するImatinibが画期的な治療効果をもたらすことは周知の通りである。FLT3遺伝子変異は成人AMLの約3割に認められる予後不良因子であることから、変異FLT3を分子標的とした治療法の開発は、多くの難治性白血病患者に福音をもたらすことは間違いない。しかし、変異FLT3遺伝子のもたらす生体内での作用機序およびFLT3特異的阻害剤の評価においては、変異FLT3遺伝子導入による白血病モデルマウスの樹立が必要である。本研究においては、変異FLT3導入トランスジェニックマウスと血液幹細胞への変異FLT3遺伝子導入骨髄移植モデルマウスの作製を試みた。変異FLT3遺伝子をSR-α、β-actin、cathepsin-Gの3種類のプロモーター下流に組み込みトランスジェニックマウスの作製を試みた。SR-αプロモーターによる変異FLT3遺伝子導入は、遺伝子発現マウスを誕生させることが可能であったが、生殖器細胞における高発現のために正常生殖機能が障害され、継代可能な系統を樹立することができなかった。一方、β-actin、cathepsin-Gプロモーター下での発現においては、変異FLT3遺伝子発現マウス系統が樹立可能であった。これらの系統においては、変異FLT3 mRNAの発現は継代維持されるものの充分な蛋白発現が得られなかった。しかし、一部の系統においては、著明な肝脾腫を伴うCLL様の病態を発症した。血液幹細胞への変異FLT3導入移植モデルマウスにおいては、骨髄増殖性疾患の発症が報告されているものの、本来臨床的には特異的に認めるAMLの発症を認めていない。したがって、変異FLT3遺伝子発現量の調節と発現させる血球細胞lineageを厳密に管理した上での発現がAMLモデルマウスの作製には重要と考えられる。変異FLT3による血液幹細胞への影響を調べるため、1)トランスジェニック(Tg)マウスモデル、2)レトロウィルスを用いたマウス血液幹細胞への変異FLT3遺伝子導入による骨髄移植モデルによるアプローチを行った。1)Tgマウスモデル:FLT3/ITD遺伝子を3種類のプロモーター遺伝子に組み替えTgマウスを作製した。1,発現活性の高いSRalphaプロモーターFLT3/ITDは遺伝子の導入された親マウスを作製したが、継代可能なマウスの系統が得られなかった。これは導入遺伝子が生殖組織に発現し正常な機能を妨げられたためマウスの系統が得られなかったと考える。2,幅広いマウス個体組織での影響を調べるためハウスキーピング遺伝子であるベータアクチンプロモーター遺伝子の下流にFLT3/ITDを組み替え、親マウスを作製した。現在、遺伝子の確認された1系統のマウス系統が得られておりFLT3/ITDのmRNA,蛋白レベルでの発現の確認を行っている。3,癌遺伝子産物である変異FLT3による生殖組織への悪影響を避けるため、造血前駆細胞である前骨髄芽球で発現することが確認されており、PML/RAR alpha Tgマウスで白血病モデルが確立された実績のあるカテプシンG遺伝子の下流にFLT3/ITDを組み替え親マウスを作製した。現在、Tg遺伝子が組み込まれたマウスの系統が少なくとも3系統とれている。現在、FLT3/ITDのmRNA,蛋白レベルでの発現の確認を行っている。

同時にキナーゼ領域に遺伝子異常があるFLT3点突然変異遺伝子をカテプシンG遺伝子の下流に組み替え親マウスを作製している。2)骨髄移植モデル:レトロウィルスプロモーター遺伝子の下流にFLT3/ITD、FLT3点突然変異遺伝子を組み替え、マウス血液幹細胞への変異FLT3遺伝子を導入した。ネオマイシン耐性株はFLT3蛋白を発現しており、その表現形をコロニーアッセイ法、骨髄移植モデルで検討している。尚、FLT3/ITDの骨髄移植モデルはハーバード大のグループにより骨髄増殖性疾患を引き起こすことが報告された(Blood.2002Jan 1;99(1):310)。FLT3遺伝子変異は成人AMLの約3割に認められる予後不良因子であることから、変異FLT3を分子標的とした治療法の開発は、多くの難治性白血病患者に福音をもたらすことは間違いない。しかし、変異FLT3遺伝子のもたらす生体内での作用機序およびFLT3特異的阻害剤の評価においては、変異FLT3遺伝子導入による白血病モデルマウスの樹立が必要である。本研究においては、変異FLT3導入トランスジェニックマウスと血液幹細胞への変異FLT3遺伝子導入骨髄移植モデルマウスの作製を試みた。変異FLT3遺伝子をSR-α、β-actin、cathepsin-Gの3種類のプロモーター下流に組み込みトランスジェニックマウスの作製を試みた。SR-αプロモーターによる変異FLT3遺伝子導入は、遺伝子発現マウスを誕生させることが可能であったが、生殖器細胞における高発現のために正常生殖機能が障害され、継代可能な系統を樹立することができなかった。一方、β-actin、cathepsin-Gプロモーター下での発現においては、変異FLT3遺伝子発現マウス系統が樹立可能であった。これらの系統においては、変異FLT3 mRNAの発現は継代維持されるものの充分な蛋白発現が得られなかった。しかし、一部の系統においては、著明な肝脾腫を伴うCLL様の病態を発症した。しかし、clonalな腫瘍性増殖は認められなかったことより、FLT3遺伝子異常が白血病発症において充分条件では無い可能性が示唆された。血液幹細胞への変異FLT3導入移植モデルマウスにおいては、骨髄増殖性疾患の発症が報告されているものの、本来臨床的には特異的に認めるAMLの発症を認めていない。したがって、変異FLT3遺伝子発現量の調節と発現させる血球細胞lineageを厳密に管理した上での発現がAMLモデルマウスの作製には重要と考えられる。
光応答性ポリマー電極による液晶の光配向制御

光応答性液晶配向膜で表面処理したポリマー電極による液晶の光配向変化について検討した。光応答性配向膜にはベンゾフェノン構造を有するポリイミドを,液晶には強誘電性液晶(FLC)とネマチック液晶(NLC)を用いた。まず,光応答性配向膜によるFLCの配向変化挙動を調べた。セルギャップが2μmの液晶セルに分極反転が起こらない閾値以下のバイアス電界を印加し表面安定化状態(双極子が同一方向へ揃った状態)をとらせた後,高圧水銀ランプの366mの光を照射した。その結果,FLCの光分極反転に基づく配向変化が観察された。また,光応答性配向膜によるFLC応答時間を,レーザーパルス光照射(355nm,10ns)によるプローブ光(633nm)の透過光量の時間分解測定を行うことによって評価した結果,液晶配向変化は約200μsで完了することが明らかとなった。さらに,実用性の高いNLCを用いても液晶光配向制御が可能であることを見いだした。セルギャップが5μmの液晶セル中にNLCを封入することによって測定用のサンプルを調製した。直交した二枚の偏光板の間に液晶セルを置き,光照射によるプローブ光の透過光量変化を測定することにより液晶の配向変化挙動を評価した。まず,透過光量(T)と印加電圧(V)の関係を,光照射下と未照射下において調べた。得られたT-V曲線から,配向変化が誘起される閾電圧は光照射下と未照射下とでは著しく異なり,光照射下では閾電圧が低下した。次に,未照射下においてホモジニアス配向が保持されている4.5Vにバイアス電圧を設定し,光照射による透過光量変化を調べた。光照射すると直ちに透過光量は減少し,ホモジニアス配向からホメオトロピック配向へと変化することが明らかとなった。
歯周病の発症と進行に関する遺伝的素因の家系調査による研究

目的歯周病の病態の解析のモデルとして、遺伝的要素が大きく影響している早期発症型歯周炎患者の家系調査をおこない、各々について一般臨床検査、細菌検査、各種宿主生体防御機能検査の面から調べた。方法:研究計画・方法に記載のとおり2.好中球機能検査において、母親、兄、弟の好中球の走化能が低下していた。3.リンパ球機能検査において、母親、娘、弟のT4/T8比が低下していた。5.被験者のHLAクラスII抗原のDrw52とDQlが共通であった。2.この家族において好中球の走化能の低下は歯周病易発症性のリスク因子の1つである可能性がある。3.T細胞のT4/T8比の低下はもう1つのリスク因子と考えられる。
分子エンジニアリングした植物糖転移酵素によるアンチオキシダント安定化に関する研究

多くの植物種に広く分布するフラボノイド、アントシアニン、カテキン等のポリフェノール類は、強力な抗酸化活性をもち、活性酸素や種々のオキシダントで引き起こされる疾病を予防する機能を有することが、個体、細胞、分子レベルで明らかにされ、注目されている。また、植物体内ではこれらの抗酸化物質が、環境ストレスに応答して生産され植物体自体の保護に関わっている。そこで薬用植物における抗酸化物質生産能力を遺伝子エンジニアリングにより改良しすることにより、抗酸化物質を高生産あるいは安定に含有するトランスジェニック薬用植物薬用植物を作出すれば、オキシダント耐性となり大気汚染の深刻な地域での栽培も可能になると考えられる。また、このような抗酸化物質を豊富に含む植物を摂取することで酸化に起因する疾病を予防することが期待される。また、アントシアニンは、配糖化によって分子の安定性と水溶性が増加する。そこで本研究では、アントシアニン特異的な糖転移酵素を分子エンジニアリングして導入したトランスジェニック植物における抗酸化物質生産能力の改良を最終的な目標として、これまでにクローニングされた植物由来の糖転移酵素遺伝子を用いてこれらの組み換えタンパク質の基質特異性および配糖化部位特異性に関する詳細な解析を行った。さらに、アントシアニン生合成に関与する糖転移酵素をはじめとする触媒酵素遺伝子郡の統合的発現制御には、転写制御因子であるMycホモログ、Mybホモログならびに機能の詳細の不明な制御因子WD40因子が関与することが知られている。そこで本研究では、これらの制御因子を分子エンジニアリングに応用することも視野に入れ、アントシアニン生産の高発現しているアカジソからアントシアニン生合成の制御因子、成分変種特異的に発現する新規Myc遺伝子およびWD40ホモロゲ遺伝子、を単離し、コードされるタンパク質の機能解析を行った。アカジソとアオジソの葉から単離したpoly(A)^+RNAから3種のone-base anchored oligo(dT)primer(H-T11G,H-T11A,H-T11C)を用いてcDNAを作製した。このcDNAを鋳型としてcDNAの作製に用いたone-base anchorcdoligo(dT)primerと8種の任意13merプライマー(H-AP18)を用いてPCR増幅を行った。PCR産物をシークエンスゲル電気泳動により分離し、33クローンのアカジソ特異的増幅断片を単離した。これらをプローブとして用いて、アカジソ特異的に発現する5クローンのcDNAを単離した。このうちクローンp3R4のcDNAインサートは460アミノ酸からなるポリペプチドをコードし、このアミノ酸配列は3GTを含むグルコシル転移酵素類と低い相同性を示した。さらにp3R4をプローブとしてバーベナ(Verbena hybrida)の花弁由来のcDNAライブラリーからp3R4と相同性の高いcDNAクローンpSHGT8を得た。次に、これらのcDNAにコードされるタンパク質の生化学的機能を同定するために、酵母発現系を構築した。酵母抽出液中の組換えタンパク質は、UDP-glucose存在下anthocyanidin 3-O-glucosideをanthocyanidin 3,5-O-diglucosideに変換した。このことからp3R4とpSHGT8にコードされるタンパク質は5-GTであることが明らかになった。また、サザンブロット解析の結果、5-GT遺伝子はアカジソとアオジソのゲノム中にそれぞれ2コピー存在することが示された。またノーザン解析の結果、アカジソの葉にのみ5-GT mRNAの蓄積が認められ、アオジソの葉には認められなかった。また、光照射によってシソのアントシアニン生合成に関与する他の構造遺伝子と同調的に誘導された。このことから、シソにおいて5-GTと他の構造遺伝子が共通の制御因子によって発現制御をうけている可能性が示唆された。

糖転移酵素を分子エンジニアリングによって改変するための基礎情報を得るためにアントシアニジン3-O-グルコシル転移酵素(3-GT)ならびにアントシアニン5-O-グルコシル転移酵素(5-GT)における基質特異性ならびに反応部位特異性を解析した。シソ(Perilla frutescens)ならびにペチュニア(Petunia hybrida)から単離された3-GTcDNAと5-GTcDNAをそれぞれ酵母で発現させ、組み換えタンパク質を含む酵母祖抽出液を用いて糖転移反応をアッセイした。その結果、両方の植物由来の3-GTと5-GTタンパク質がそれぞれアントシアニジンの3位とアントシアニンの5位を特異的にグルコシル化することが明らかになった。この結果と各タンパク質の1次構造の比較から、反応部位特異性に関与するアミノ酸残基が推定された。また、シソ5-GTは、アントシアニンの3-グルコシド体、3-(p-クマロイル)-グルコシド体、3-ルチノシド体および3-(p-クマロイル)-ルチノシド体に対してそれぞれの5位をグルコシル化する活性を有した。一方、ペチュニア5-GTは、本来ペチュニアでの基質である3-(p-クマロイル)-ルチノシド体にのみ5-GT活性を示した。これらの結果から、シソとペチュニアの5-GT間で基質特異性が異なり、ペチュニア5-GTではより厳密に基質が選択されていることが明らかになった。今後、タンパク質工学的解析により3-GTならびに5-GT酵素の基質・反応部位の選択制を決定するタンパク質の構造を明らかにする予定である。多くの植物種に広く分布するフラボノイド、アントシアニン、カテキン等のポリフェノール類は、強力な抗酸化活性をもち、活性酸素や種々のオキシダントで引き起こされる疾病を予防する機能を有することが、個体、細胞、分子レベルで明らかにされ、注目されている。また、植物体内ではこれらの抗酸化物質が、環境ストレスに応答して生産され植物体自体の保護に関わっている。そこで薬用植物における抗酸化物質生産能力を遺伝子エンジニアリングにより改良しすることにより、抗酸化物質を高生産あるいは安定に含有するトランスジェニック薬用植物薬用植物を作出すれば、オキシダント耐性となり大気汚染の深刻な地域での栽培も可能になると考えられる。また、このような抗酸化物質を豊富に含む植物を摂取することで酸化に起因する疾病を予防することが期待される。また、アントシアニンは、配糖化によって分子の安定性と水溶性が増加する。そこで本研究では、アンドシアニン特異的な糖転移酵素を分子エンジニアリングして導入したトランスジェニック植物における抗酸化物質生産能力の改良を最終的な目標として、これまでにクローニングされた植物由来の糖転移酵素遺伝子を用いてこれらの組み換えタンパク質の基質特異性および配糖化部位特異性に関する詳細な解析を行った。
多種類の海藻を分解できる細菌Myt－1のキャラクタリゼーション

現在,海藻の製品化の過程で出る海藻端材や沿岸域への漂着海藻が毎年のように多量に発生しており,それらの多くが埋立・焼却処分されている。そこで,それら廃棄海藻の減容化と,それに伴って産生される単糖やオリゴ類,単細胞体の有効利用を目指して,富山湾の海底堆積物中から複数種の海藻藻体を分解し,10種類以上の多糖分解酵素を持っている新種の細菌Saccharophagus sp.Myt-1株を単離した。そこで,本申請では,shotogun法を用いた,Myt-1株が産生する多糖類分解酵素遺伝子の単離と同定,大腸菌を用いた大量発現系の構築,さらには,それらの精製とキャラクタリゼーションを目的に研究を進めた。その結果,アルギン酸リアーゼ(algMytC)遺伝子とセルラーゼ(celMytB)遺伝子をそれぞれ1種ずつ単離することができた。algMytCとcelMytBのORFはそれぞれ1,032bpと1,893bp,アミノ酸は,343残基と631残基と推定され,それぞれの予想アミノ酸配列の相同性検索を行った結果,S.degradans2-40株のalg7A,cel5Hと95.9%,98.9%の一致率を示した。次に,大腸菌を用いた両酵素の大量発現系を構築し,その発現産物の特性を調べた。その結果,AlgMytCの反応至適pHは9.0で,pH8.5-10.0でも90%以上の活性を保っており,これまでに報告されている細菌由来のアルギン酸リアーゼの中でも,高いアルカリ耐性を持つ酵素であった。一方で,CelMytBは,反応至適温度が55°Cと高く,水溶性のセルロース(CMC)だけでなく,結晶性のセルロース(Avicel)やキシランの分解活性も有していた。さらに,両酵素とも様々な界面活性剤に対しても高い耐性を示していた。これらの結果から,本研究により見出されたこれらの酵素は,化粧品,農業,食品,バイオエタノール産生など様々な産業分野に利用できることが考えられた。現在,埋立・焼却処分されている廃棄海藻が毎年のように多量に発生している。その処分にかかる費用とエネルギーを削減するため,廃棄海藻の分解による減容化に,さらには,分解に伴って産生される多糖類や単糖類,単細胞体などを,医薬品,バイオマス燃料,養殖餌料などに転換して再活用することに大きな関心が寄せられている。一方,海藻に含まれる多糖類に関しては,報告例の少ないラミナリン,フコイダン,カラギーナンなどの機能性多糖類の分解菌も含めて,さらなる分解菌の単離が産業界で望まれている。そこで,われわれは,ワカメ藻体の分解を指標として,富山湾の海水や海底堆積物から新たな海藻分解菌の単離を試みた。その結果,107株の分解菌を単離することができ,その中でもMyt-1株は褐藻,紅藻,緑藻の3種の海藻藻体を分解することができた。これまでに報告されている海藻分解菌は,単一の種類の海藻のみにしか分解活性を示さないため,本菌株が様々な種が混在していると考えられる廃棄海藻の減容化に有用であることが示された。さらに,Myt-1株が,海藻藻体の分解に関与すると思われるアルギナーゼ,セルラーゼ,アガラーゼ,カラギナーゼなど,10種類以上の酵素を産生することを明らかにした。また,ザイモグラムによる多糖分解酵素の検出やDNA-DNAハイブリダイゼーション等の結果から,Myt-1株が1988年に発見されて以来24年間,1属1種しか単離されていなかったSaccharophagus属の新種である可能性が強く示唆された。したがって,今後の研究により,新たな特性を持った多糖分解酵素が見出される可能性も非常に高い。また,海洋バイオマスの原材料として養殖・増産されつつある海藻の活用にも,本研究が大きく寄与するものと思われる。