hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テロメア伸長酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現調節機構

これらの結果は、KLF2がhTERTプロモーターに結合して、hTERTの発現を抑制していることを示唆している。この見解は、我々が以前にhTERTプロモーター変異体で得た結果を支持するものである。hTERTプロモーターの新規エレメントにはCpG配列が2個ある。それらの配列のDNAメチル化を調べた。正常ヒトT細胞では、これらの配列にメチル化は認められなかった。他方、ヒトT細胞株、JurkatとKit225、では2つのCpG配列ともメチル化されていた。成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-1)感染細胞株では、CpG配列がメチル化されているものと、されていないものの2つのグループに分かれた。現在、メチル化の有無と細胞株の性質の関連について調べている。当初計画した実験のほぼすべてについて結果を得ることができており、順調に進展していると考えている。それに加え、DNAエレメントのメチル化とKLF2の結合に関し新しい知見が得られ、研究の展開を拡大している。当初計画した実験の80%について結果を得ることができており、順調に進展していると考えている。研究計画は順調に推移していて、原申請通りにエピジェネティクの解析実験を進めるとともに、予想に反して患者末梢ATL細胞ではエレメントのメチル化が認められなかったことにも着目して実験を進める。具体的には、宮城県がんセンター研究所と共同研究で、HTLV-1感染細胞株の内でメチル化と非メチル化が混在する細胞株から、メチル化株と非メチル化株をクローン化してそれぞれの免疫不全マウスでの造腫瘍能を解析する。併せて、それぞれの細胞株でのhTERTとKLF2の発現も調べる。特にhTERTプロモーター新規エレメントのDNAメチル化が、どのようにKLF2のエレメントへの結合に影響を与えるかを注意深く解析する。これによりがん細胞でのhTERTの恒常的発現の機構の解明につながる。研究計画は順調に推移していて、原申請通りに実験を進める。これによりがん細胞でのhTERTの恒常的発現の機構が判る可能性がある。研究の進展に伴い、研究費の主たる使用は、1.細胞培養、2.DNAメチル化の解析、3.クロマチンのエピジェネティクの解析、4.hTERTとKLF2の発現解析の実験に用いる試薬・器具類になる。研究の進展に伴い、研究費の主たる使用は、1.各種細胞の培養、2.DNAメチル化の解析、3.クロマチンのエピジェネティクの解析の実験に用いる試薬・器具類になる。
トランジット惑星系の観測による惑星形成理論の検証と新たな惑星探査

本研究の目的はトランジット惑星系の観測を通じて,惑星の形成・進化に対して観測的制限を加える事である。この目的のため,昨年度は以下の2点を中心に研究を行った。(1)これまで行ってきた研究を継続し,すばる望遠鏡での分光観測とケプラー望遠鏡による測光観測を組み合わせて,星の自転軸傾斜角という量を推定した。トランジット惑星系では,星の自転軸傾斜角は星の自転軸と惑星の公転軸の関係について示唆を与える。全部で約30天体を解析したが,その結果として約5天体については星の自転軸と惑星の公転軸が優位にずれている可能性があるという示唆が得られた。この発見はサイズの小さい惑星の起源・進化を議論する上で数少ない機会を与える。(2)これまでに引き続きトランジット惑星系のロシター効果の観測を行った。今回新たな試みとして,惑星が複数トランジットする系に対して初めてロシター効果の測定を実施した。ケプラー宇宙望遠鏡が発見した惑星系候補天体「KOI-94」に対してロシター効果の観測を実施し,結果として木星型惑星KOI-94.01の公転軸と中心星の自転軸が約10゚の範囲内でよく揃っている事を示した。これは複数惑星系に対する初のロシター効果の検出である。さらにロシター効果の観測を計画しているうちに,ケプラー宇宙望遠鏡の公開しているアーカイブ測光データの中で,「惑星同士の食」という極めて珍しい天体現象を発見した。これは2つの惑星が同士のトランジットをし,その最中に惑星同士が光球面上で重なり合うという現象である。この現象自体非常に珍しいものであるが,この「惑星同士の食」の測光データのパターンの測光解析から2つの惑星の公転軸が非常によく揃っている事も突き止めた。これは複数惑星系の進化を議論する際に重要な制限となる。昨年度は,(1)ケプラー望遠鏡の測光とすばる望遠鏡での分光を組み合わせた星の自転軸傾斜角測定や,(2)ロシター効果の観測,に関しては当初予想していた通りの進展が得られたが,その研究の過程で「惑星同士の食」を発見した事は当初の計画になかったものであり,期待以上の成果であった。本研究テーマの目的は,トランジット惑星系(恒星の前面を惑星が通過して食を起こす太陽系外惑星系)でロシター効果(食が起こる最中の星のスペクトルの吸収線の変化)を観測する事により惑星の軌道傾斜角()を測定し,理論的に予言されるの統計的分布と比較する事で惑星形成理論に対する観測的な検証・制限を与える事である。これまで30個程度の惑星系でロシター効果は観測されてきたが,厳密な意味で惑星形成理論との比較を行うためにはサンプル数が未だ少なく,まずはサンプル数を増やす事が重要である。昨年度はいくつかのトランジット系(TrES-4,XO-4,HAT-P-11)に対してすばる望遠鏡を用いてロシター効果を観測し,惑星の軌道傾斜角を測定した。特に惑星系HAT-P-11に対して行った観測では,海王星サイズの惑星に対して初めてロシター効果を検出する事に成功し,さらに結果として惑星の軌道公転軸と中心星の自転軸は大きくずれている事が分かった。ロシター効果に関しては今後も様々な軌道の惑星系に対して継続的な観測を行い,軌道傾斜角の中心星依存性などを調べる事を目標にしている。一方,昨年度はロシター効果の理論的なモデル化に積極的に取り組んだ。これまで観測された視線速度の変動からロシター効果をモデル化する際には,トランジット中に予想される星の模擬スペクトルを用いたシミュレーションを行う必要があり,シミュレーションには非常に多くの時間と手間がかかるという問題があった。昨年度取り組んだ研究では,トランジット中の吸収線の形状を精密にモデル化する事によってロシター効果による視線速度変動を解析的に計算し,実際の観測データの解析にかかる時間を大幅に短縮する事に成功した。私の研究の目的は,トランジット惑星系の観測によって惑星系の持つ基本的な性質を調べ,惑星形成・進化モデルに観測的な制限を与える事である。2011年度の主な研究成果は以下の2点が挙げられる:1)前年度に引き続き,ロシター効果の観測を行った。ロシター効果はすでに40個以上の惑星系に対して測定されているが,惑星形成・移動理論を絡めた統計的な議論を行うにはまだサンプル数として不十分である。我々は主にすばるなどの大口径望遠鏡の特色を生かした観測を継続しており,学術論文として発表したXO-3,XO-2という惑星系に加えて,HAT-P-16など天体の観測も行い解析が完了している。今後も様々な軌道の惑星系に対して継続的な観測を行う。2)2011年度はこれまでにない新たな取り組みとして,ロシター効果以外の方法論を用いて星の自転軸と惑星の公転軸のなす関係を調べる研究を試みた。特に私はケプラー望遠鏡による観測に着目し,アーカイブ・データの解析を行った。ケプラーで取得された星のライトカーブのうち,黒点による明るさの変動を持つものだけを取り出して解析し,その変動周期から星の自転周期を求めた。一方,一般に星を分光観測することにより,吸収線幅から星の射影自転速度(星の赤道面での自転速度のうち,我々の視線方向成分)を求める事が出来る。そこで私は新たにケプラーで検出されたトランジット惑星候補天体のうち黒点による周期変動を示す約15天体に対して分光観測を行い,射影自転速度を求めて星の自転周期と比較した。

これにより星の自転軸が我々の視線方向に対してどの程度傾いているか(星の自転傾斜角)を推定した。トランジット惑星を持つ系では惑星の軌道公転軸は我々の視線方向に対してほぼ垂直であるため,星の自転傾斜角の測定は惑星の公転軸と中心星の自転軸の関係を表す指標となる。解析の結果,我々はいくつかの系で星の自転軸と惑星の公転軸がずれている証拠を発見した。本研究の目的はトランジット惑星系の観測を通じて,惑星の形成・進化に対して観測的制限を加える事である。この目的のため,昨年度は以下の2点を中心に研究を行った。(1)これまで行ってきた研究を継続し,すばる望遠鏡での分光観測とケプラー望遠鏡による測光観測を組み合わせて,星の自転軸傾斜角という量を推定した。トランジット惑星系では,星の自転軸傾斜角は星の自転軸と惑星の公転軸の関係について示唆を与える。全部で約30天体を解析したが,その結果として約5天体については星の自転軸と惑星の公転軸が優位にずれている可能性があるという示唆が得られた。この発見はサイズの小さい惑星の起源・進化を議論する上で数少ない機会を与える。(2)これまでに引き続きトランジット惑星系のロシター効果の観測を行った。今回新たな試みとして,惑星が複数トランジットする系に対して初めてロシター効果の測定を実施した。ケプラー宇宙望遠鏡が発見した惑星系候補天体「KOI-94」に対してロシター効果の観測を実施し,結果として木星型惑星KOI-94.01の公転軸と中心星の自転軸が約10゚の範囲内でよく揃っている事を示した。これは複数惑星系に対する初のロシター効果の検出である。さらにロシター効果の観測を計画しているうちに,ケプラー宇宙望遠鏡の公開しているアーカイブ測光データの中で,「惑星同士の食」という極めて珍しい天体現象を発見した。これは2つの惑星が同士のトランジットをし,その最中に惑星同士が光球面上で重なり合うという現象である。この現象自体非常に珍しいものであるが,この「惑星同士の食」の測光データのパターンの測光解析から2つの惑星の公転軸が非常によく揃っている事も突き止めた。これは複数惑星系の進化を議論する際に重要な制限となる。昨年度一年間はロシター効果の継続的な観測と精密な理論的モデル化に加えて,ケプラー望遠鏡の測光観測データを用いた星の自転傾斜角測定というテーマで研究を行い,結果を学術雑誌に投稿するなどある程度の研究成果を上げることはできた。ただ作業効率という点で未だに課題が残っている。今後は様々なテーマに触れて研究の幅を広げる事を意識しつつ,研究のスピードアップにも努めたい。昨年度は,(1)ケプラー望遠鏡の測光とすばる望遠鏡での分光を組み合わせた星の自転軸傾斜角測定や,(2)ロシター効果の観測,に関しては当初予想していた通りの進展が得られたが,その研究の過程で「惑星同士の食」を発見した事は当初の計画になかったものであり,期待以上の成果であった。今後も引き続きロシター効果とケプラー測光を用いた星の自転傾斜角測定に努める。ロシター効果の観測についてはある程度サンプルがたまってきたので(50個程度),中心星依存性などを統計的に議論していきたいと考えている。ケプラー測光を用いた自転傾斜角測定では,星の射影自転速度を見積もる際星の微分回転の有無によって自転傾斜角の測定結果が大きく影響を受ける。
アジアの文化財の伝統的製作・修理技法の詳細調査と国際修理プロジェクトへの応用

初年度である今年度は、情報収集を兼ねて多角的に調査を開始した。タイでは、国立の伝統文化財部で現在行われている王室の御座船の修理方法や伝統的人形劇の人形、漆工品、色ガラスを多用した木製品、布製品、石造彫刻等の製作・修理技法のほか、寺院の壁画の修理技法について調査を実施した。インドネシアでは伝統的な影絵であるワヤン・クリの製作技法や機織りによるイカットの製作技法、伝統的な青銅製品(ゴング)の製作技法についての聴き取り調査を実施した。ミャンマーではこの地域に特有な性質をもつ漆工品の調査を行い、ベトナムでは伝統的木製品の修理のための調査のほか、藕糸の製作技法に関する調査を行った。また国内に存在するアジア地域に関連する文化財についても積極的に調査を進めた。中国式寺院の独特な様式をもつ仏像や金工品や、国内で保有しているアジア地域と関連する染織品(藕糸を使用したと考えられる絵画やインド更紗)、韓国の伝統的絵画(綿布に書かれた絵画)の修理方法についての調査、響銅(佐波理)の製作痕の調査、インドネシアのガムランの音色にかかわる構造などについての詳細調査を実施したほか、出土した茶入などの陶器についても製作技法を解明するためにCTによる詳細な構造調査を行った。このほか、修理技法と係る基礎研究としては、アジア地域で伝統的技法に多用されてきた灰汁について文書の修理への利用を念頭に、成分分析と修理対象となる紙に対する影響調査を行った。これまで九州国立博物館や研究分担者が展示や研究協力を通じて良好な関係を結んできたアジアの諸国の文化財関係者を通じて、初年度から現地での調査を順調に進めることができた。現地の担当者から現場で詳細な聴き取り調査をすることによって、現在採用されている製作技法、修理技法のみならず、以前行われていた方法についても調査をすることができ、現時点の課題も理解することができた。また、国内に存在するアジア地域に関連する文化財について詳細に調査を開始することによって、製作技法についてこれまで知られていない貴重な情報も得られた。昨年度に多角的にアジアの各地域の文化財に関わる調査を開始したので、その調査結果を通じて要点や問題点、さらに深めるべき課題を整理したうえで、重要と考えられる製作技法、修理技法についてより詳細な調査を実施する。これとあわせ、昨年度は実施できなかった分野についても、重要な課題を掘り出すための基礎調査はひきつづき行う。国内の工芸品の製作技法の特質とそのほかの地域の対応する工芸品の製作技法についても対比させながら、気候に応じた材料の違い、完成品の特質の違いについて考察を加える。また、国内のみならずアジア地域でも共通に用いられてきた伝統的材料について、材料としての利点や特質を調査するため、ひきつづき分析を実施する予定である。
大腸菌外膜タンパクTolCの輸送機能に関する研究

【背景と目的】大腸菌外膜タンパクTolCは、抗生物質や胆汁酸の排出に関わるのみならず、病原大腸菌においては細胞溶解毒素や耐熱性エンテロトキシン(ST)のような病原因子の菌体外分泌にも関わっている機能タンパクである。従って、TolCの輸送機能について研究することは、大腸菌におけるTolCを介した菌体外輸送メカニズムの解明につながるばかりではなく、抗生物質に対する菌の感受性を高めたり、病原大腸菌においては病原因子の放出を抑える上でも重要な知見をもたらすものと考える。このような背景から本研究では、TolCの輸送機能に重要とされる機能ドメインを同定し、その部位がいかなる様式で輸送機能に関わるのかを明らかにすることを目指した。【研究成果】14年度から15年度の研究において、TolCの構成アミノ酸を部位特異的に変異して機能に及ぼす影響を解析した。その結果、TolCの3位及び412位に局在するLeu残基がTolCの輸送機能に重要であることを突き止めた。また、この部位の残基は疎水性アミノ酸で構成されていることがTolCの機能発現に必要であることも明らかにした。立体構造をとった際の両残基のα炭素間距離は7.45Åと極めて隣接していたことから、両残基の疎水性相互作用がTolCのチャネルの開閉を制御しているのではないかと推定した。そこで、さらに16年度においてはTolCのさらなる機能ドメインを明らかにする目的で、他のグラム陰性菌(サルモネラ菌及び腸炎ビブリオ菌)が産生するTolC遺伝子もクローニングし、大腸菌TolCとの一次構造の違いから、いかなるドメインが輸送機能に影響するのかを同定した。その結果、新たに大腸菌TolCの198位から214位に至る構成アミノ酸領域がTolCの輸送機能に関わるドメインであることを提唱した。このドメインは、TolCと協調的に機能してチャネルの開閉を制御するアクセサリータンパク質の作用部位と考えており、現在この仮説を起点に更なる研究を展開している。大腸菌外膜タンパクTolCは、種々の抗生物質の排出のみならず、溶血毒素やコリシンVなどの毒性物質の放出にも関わるチャネルタンパクである。研究代表者らは毒素原性大腸菌が産生する耐熱性エンテロトキシン(ST)も、TolC依存的に外膜を通過することを見い出し、TolCが下痢原性大腸菌の病原性を成立する上でも重要であることを報告してきた。しかしながら、TolCの機能に必要とされる部位およびその役割については不明である。そこで、本年度はTolCの輸送機能に必要とされる部位を同定し、その部位の役割について追求することを目的に検討し、以下の知見を得た。部位特異的変異法を用いて検討した結果、TolCの3位および412位のLeu残基がその輸送機能に重要であることが明らかとなった。さらに検討を進めた結果、3位と412位のLeu残基は、ともに疎水性側鎖を有することが機能の発現に必要であると思われた。両残基は極めて接近した位置に局在していることから、両残基を含むドメインはTolCチャネルの開閉に関与しているのではないかと考え、その開閉に関わる因子としてTolCと協調的に機能するタンパクの関与を予想した。そこで次に、TolCと輸送装置を構築する因子との相互作用について解析した。In vitro転写翻訳系を利用して解析した結果、薬剤排出においてTolCと協調的に機能するAcrA

タンパクとTolCとの相互作用を支持する成績を得た。現在、3位と412位が変異したTolCを発現させてAcrAタンパクとの相互作用の解析を試みている。一方、ST分泌においてはTolCは直接STと相互作用する可能性もあるので、in vitro翻訳系を用いて同様に検討を進めた。その結果、STとTolCとの相互作用を示す結果は得られなかった。従って、STの分泌においてはTolCと協調的に機能する第三の因子が存在するものと考え、現在更なる検討を進めている。大腸菌外膜タンパクTolCは、種々の抗生物質の排出のみならず、溶血毒素やコリシンVなどの毒性物質の放出にも関わるチャネルタンパクである。研究代表者らは毒素原性大腸菌が産生する耐熱性エンテロトキシン(ST)も、TolC依存的に外膜を通過することを見い出し、TolCが下痢原性大腸菌の病原性を成立する上でも重要であることを報告してきた。昨年度までの実績において、TolCの3位および412位のLeu残基がその輸送機能に重要であることを明らかにし、さらにこれらのLeu残基は、ともに疎水性側鎖を有することがTolCの機能発現に必要であることも明らかにした。両者の残基間の距離は、XtalView softwareによる測定結果では、α-炭素間で7.45Å,δ-炭素間で4.15Åと算出され、極めて接近している。このようなことから、これらのアミノ酸部位はTolCのチャネル開閉を制御するドメインとして機能している可能性が考えられた。既にTolCが薬剤排出系として機能する場合では、TolCと協調的に働く因子の存在が知られている。しかしながら、ST分泌においてはそのような因子の存在はまだ報告されておらず、またそのような因子とTolCの機能ドメインとの関係も未知な点が多い。そこで、本年度はSTの分泌過程においてTolCと協調的に機能する因子の同定を試みることにした。既に、薬剤排出系においてTolCと協調的に機能する因子(AcrAB,AcrAD,EmrKY,MdtABC,YhiUV)がSTの分泌に関与しているのか否かを調べた。その結果、これらの因子がそれぞれノックアウトされた菌株においてもSTは野生株と同様に菌体外へ分泌されていた。この結果は、上記因子がTolCを介したSTの分泌には関与しないことを示している。現在、TolCと協調的に機能するその他の既知の因子についても、ST分泌に関与するのか否か検討を進めている。また、Flitrx panning kitを用いてSTと相互作用する可能性をもった蛋白質の同定も進めており、この方向からもST分泌に関与する因子について解析してゆきたいと考えている。【背景と目的】大腸菌外膜タンパクTolCは、抗生物質や胆汁酸の排出に関わるのみならず、病原大腸菌においては細胞溶解毒素や耐熱性エンテロトキシン(ST)のような病原因子の菌体分泌にも関わっている機能タンパクである。従って、TolCの輸送機能について研究することは、大腸菌におけるTolCを介した菌体外輸送メカニズムの解明につながるばかりではなく、抗生物質に対する菌の感受性を高めたり、病原大腸菌においては病原因子の放出を抑える上でも重要な知見をもたらすものと考える。そこで本年度は、TolCの輸送機能に重要とされる機能ドメインを同定し、その部位がいかなる様式で輸送機能に関わるのかを明らかにすることを目的に研究を遂行した。【結果と考察】
電子顕微鏡法によるテロメア超構造の解析

真核生物の染色体末端に存在するテロメアは、テロメアDNAと様々なタンパク質から構成され、染色体の安定化、保護に関わっている。出芽酵母のテロメアDNAに結合するRap1および緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合させたRap1を単離精製し、電子顕微鏡による観察と電子線トモグラフィー法による三次元構造解析、蛍光顕微鏡法による高分解能画像解析から、Rap1がフィラメント状の複合体を形成することを明らかにした。基盤C真核生物の染色体末端は、テロメアとよばれる特徴的な繰り返し配列をもつDNAと様々なタンパク質から構成される。テロメアは染色体の正常な分配に必須であり、テロメアを欠いたDNA末端どうしの異常な融合による染色体の不安定化は細胞死や発ガンの原因となる。正常な体細胞では、種や細胞ごとにある一定の範囲内にテロメア長が保たれている。この制御機構については、テロメアDNAと関連タンパク質から構成される複合体の超構造がテロメア長制御に重要な役割を担っているというモデルが提案されている。本研究では、モデル生物として研究がもっとも進んでいる出芽酵母のテロメアDNAと関連蛋白質Rap1、Rif1、Rif2との複合体の再構成および電子顕微鏡法等によるテロメア超構造の解析を行う。同時にRap1分子の単粒子像解析を進め、DNAに結合時と非結合時のRap1の構造の違いからテロメア長調節機構に関わるRap1の機能を明らかにし、テロメア長制御機構の解明を目指す。染色体末端に存在し、染色体安定化に重要な役割を果たすテロメアは、繰り返し配列からなるDNAと様々なタンパク質が複合体を形成し、その長さは種や細胞ごとにある一定の範囲内に保たれている。出芽酵母では、Rap1タンパク質およびRap1に結合したRif1、Rif2タンパク質がテロメア長制御に関わっていると考えられている。そこで、本研究では、テロメアDNAとRap1複合体の構造解析進めている。本年度は、主にRap1精製法の改良とRap1複合体の電子顕微鏡観察を行った。タンパク質分解酵素阻害剤、Niキレートカラム等の検討を行った結果、精製初期段階の純度を改善することができたこ精製されたRap1をゲルろ過カラムにかけると単一ピーク画分として分離されてくるが、このピークの前半に相当する画分を電子顕微鏡で観察すると、長さの異なるフィラメント状の複合体がたくさん存在していた。精製したRap1溶液に混在するDNAの影響を排除するためにDNAaseを使ってDNAの切断処理を行っても同様な複合体は観察された。これまでにRap1がフィラメント状の複合体を形成することは報告されておらず、テロメア長調節機構についての新しい知見につながる可能性がある。今後は、この複合体の構造を低温電子顕微鏡法を使って生理的な状態下で解明する予定である。本年度に引き続きテロメアDNAとRap1複合体の形成条件の検討および電子線トモグラフィー法による構造解析も進める。真核生物の染色体末端に存在するテロメアは、高度な繰り返し配列からなるテロメアDNAとその結合タンパク質から構成され、テロメア配列の長さは種や細胞ごとにある一定の範囲内に保たれている。出芽酵母では、テロメア長が約350bpに保たれており、この長さ制御に関わっているのが、Rap1、Rif1、Rif2タンパク質である。本研究では、テロメア長調節に関わるテロメアDNAとテロメア結合タンパク質Rap1複合体の構造解析を電子顕微鏡法により進めている。本年度は、前年度に引き続きRap1精製法の改良と電子線トモグラフィー法を行うためのソフトウエアの導入、氷包埋試料調製、クライオ電子顕微鏡操作等、電子顕微鏡法を行うためのセットアップを進めた。精製したRap1タンパク質を電子顕微鏡観察すると長さの異なるフィラメント状の複合体が存在していた(前年度報告)。このフィラメント状の複合体は、Rap1のみから形成されるフィラメントなのかあるいは、超微量タンパク質の共雑なのかを明らかにするためにRap1フィラメントの形成能について検討した。これまでの精製法では、すでに溶液中にフィラメント状の構造体が含まれていたが、精製初期段階において超遠心(30,000xg, 60分)を行うことにより、フィラメント状の構造体を除くことができた。単分散したRap1を確認後、様々な条件下でフィラメント形成実験を行ったところ、37°Cに放置するとフィラメント状の構造体を形成することがわかった。しかし、このフィラメントが生理的に機能する構造体であるのか熱によるタンパク質変性状態(アミロイド状繊維)なのかはわかっていない。アミロイド線維はクロスβ構造に富み、X線回折において特徴的な4.7Åの層線を示すので、X線繊維回折法を使ってRap1フィラメントの性質を明らかにした後、電子線トモグラフィー法による構造解析を進める。染色体末端に存在するテロメアの制御には、出芽酵母では、Rap1、Rif1、Rif2タンパク質が関わることが知られている。本研究では、テロメア長調節に関わるテロメアDNAとRap1複合体の構造解析を電子顕微鏡法により進めている。

本年度は、テロメアDNAとRap1がin vitroにおいて独立に結合し、隣接する分子の結合状態に影響を受けないこと、また、単離精製したRap1は直径110-130Aのリング状構造をとること等を明らかにし、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のBlackburn教授らとの共同研究としてJournal of Biological Chemistry誌に発表した(JBC 2010)。Rap1は非常に分解しやすく、これまで精製法の改良を進めてきた。昨年度までの研究から、単分散した分子、凝集体、および繊維状のものが、精製したRap1溶液中に含まれることが、明らかになっている。そこで、この繊維状構造がRap1から形成されていることを確かめるために、GFPを融合させたrap1プラスミドを作製、発現系を構築し、C末端側にGFPを融合させたRap1を精製した。この試料を電子顕微鏡観察したところ、Rap1-GFPの融合蛋白質からなると考えられる繊維状の複合体が多く観察された。同時に蛍光顕微鏡観察も行ったが、この繊維に相当すると思われる構造を確認するには至らなかった。次に、テロメアDNAを加えて繊維のin vitro再構成実験を試みたが、繊維形成の促進はみられなかった。今後は、テロメアDNAの長さ、配列等を変えて様々な反応条件で再構成実験を進める。また、高分解能蛍光顕微鏡による観察を行う予定である。出芽酵母のテロメア制御に関わるタンパク質Rap1とテロメアDNAの複合体は、Matotらにより小角散乱、X線結晶構造解析、NMR解析を組み合わせた手法により溶液中での構造が報告された(Nucleic Acids Research 2011)。Rap1分子は、長さ230Aの細長く伸長した形状であり、DNAのらせん軸に対して垂直方向に伸長して形状でDNAと結合していた。この結果は我々がこれまでに電子顕微鏡(EM)で観察してきた構造(約130Aのドーナッツ型)とは異なっていた。そこでより高い分解能でRap1-DNA複合体の三次元構造解析を進めることが重要となり、Rap1とRap1結合部位を4つ持つテロメアDNAの複合体のEM像(負染色像)のデータ収集を行い、単粒子像解析法による構造解析を進めた。これまでにEM観察から精製したRap1溶液中に繊維状の分子を見出してきたが、この繊維状分子がRap1から形成されているのか同定できていなかった。そこで精製した試料のMALDI-TOF MSによるPMF(Peptide mass fingerprinting)分析を行った。この結果、精製したRapl溶液中には、Rap1分子の他にRap1分解物と大量発現に用いた大腸菌由来のシャペロンDnaKがわずかに混在していることがわかった。これまでにDnaKが繊維状の複合体を形成するという報告はされていないので、我々がEM観察した繊維状分子はRap1である可能性が高い。また、C末端側にGFPを融合させたRap1をEM観察するとRap1同様に繊維状分子が存在していた。
内湾域に棲息する小型甲殻類を用いた内分泌攪乱物質影響評価に関するプロトコルの開発

内湾域に棲息する小型甲殻類を用いた内分泌攪乱物質影響評価に関するプロトコルの開発を目的として、本年度は、大阪湾から採集したトゲワレカラCaprella scauraの孵化した幼体を用い、45日間の低濃度のノニルフェノール(4-nonylphenol)の慢性毒性実験を行った。暴露期間中の生残率はコントロールでは97%であったが、1および10μg/Lでは80%、100μg/Lでは24%まで低下し、1000μg/Lでは実験開始2日目で0%になり、いずれの実験区もコントロールとの間に有意差があった。100μg/Lでの生残率は孵化後5-10日の期間にII齢またはIII齢の時期に急激な低下が認められ、約10日後には実験開始時のほぼ50%になった。以上より、45日間のノニルフェノール暴露による生残率の減少を引き起こす最小影響濃度(LOEC)は1μg/L以下と推定され、ノニルフェノールはメダカに関する毒性影響(環境省2001)の最低値の約1/10の濃度に相当した。また、トゲワレカラのマイクロサテライトマーカー座の開発を行った。トゲワレカラの全DNA配列におけるマイクロサテライト領域の割合も、昨年、解析を行ったマギレワレカラと同様に0.4%と極めて少なく、GA/CTタイプが最多で約50%を占めた。また、3つのマイクロサテライトマーカー座において多型を示す増幅断片が得られ、日本各地の6地点から採集したトゲワレカラの多様性解析を実施した。その結果、大都市近郊の大阪湾等ではアリル数が5.0と低く、環境ホルモンや埋め立て等の生息地の改変により、トゲワレカラの遺伝的多様性が低下していることが明らかになった。以上より、トゲワレカラは、内分泌攪乱物質の影響評価に適した海洋生物であり、バイオアッセイのモデル生物として有望であることが明らかになった。内湾域に棲息する小型甲殻類を用いた内分泌攪乱物質影響評価に関するプロトコルの開発を実施するために、まず、第一段階として、内湾域に棲息するワレカラ類の飼育方法に関する実験を実施した。その結果、これまでのワレカラ類の飼育実験のように野外から採集した紅藻類を用いなくても、付着基質としてテフロンシートを使用すれば完全飼育が可能であることが判明した。そこで、内湾域に棲息するワレカラ類のうち優占種であるトゲワレカラCaprella scauraの飼育実験を行った。その結果、20°Cの世代期間が31日であること、雌は成熟後も死亡するまで7-10日間隔で脱皮を繰り返すが、雄は死亡前は40日以上も脱皮せず最終齢があることが明らかになった。次にトゲワレカラを用いトリブチルスズ(TBT)の影響評価に関する実験を実施した。孵化後の幼体を20°Cで0100ng TBTCl/Lの3段階のTBT濃度に暴露したところ、10ng及び100ng TBTCl/L区で生残率が低下することが判明した。また、瀬戸内海等の内湾域に棲息するワレカラ類のうち最も大型になるマギレワレカラCaprella decipiensを用い、マイクロサテライトマーカー座の開発を行った。マギレワレカラの全DNA配列におけるマイクロサテライト領域の割合は0.4%と極めて少なく、GA/CTタイプが最多で約50%を占め、哺乳類、魚類等で最も多いとされるGT/CAタイプは少なかった。また、6つのマイクロサテライトマーカー座において多型を示す増幅断片が得られ、ワレカラ類の集団解析に有効であると考えられた。以上より、トゲワレカラは、内分泌攪乱物質の影響評価に適した海洋生物であり、バイオアッセイのモデル
神経発生・再生における神経幹細胞の分化を制御する分子メカニズムの解析

神経発生過程においては、神経幹細胞から厳密にコントロールされたタイミングでまずニューロンが産生され、続いてグリア産生が起こる。このニューロン産生からグリア産生に至る過程において神経幹細胞は刻々とその性質を変化させる。この変化は転写因子や細胞外因子に対する受容体の発現変化などが想定されているが、幹細胞を選択的に回収する手段がなく、性質の変化を解析することは困難であった。bHLH型転写因子であるHes遺伝子はこれまで、神経幹細胞に強く発現しており、神経分化を抑制し神経幹細胞の維持に関与していることが示されている。本研究では、Hesプロモーター下に半減期の短いEGFPをつなぐことにより神経幹細胞を可視化したトランスジェニックマウスを用いて、神経幹細胞の性質を制御する分子メカニズムの解析を行う。このトランスジェニックマウスでは、脳室周囲帯の未分化な細胞でのみEGFPの発現が認められており、非対称分裂時には幹細胞としてとどまる娘細胞のみがマークされる。このトランスジェニックマウスから様々な発生段階の神経幹細胞を選択的に回収し、マイクロアレイ等を用いて遺伝子発現の網羅的解析を行い、刻々と変化する幹細胞の性質を制御する遺伝子および因子の探索を行う。神経幹細胞の増殖・分化メカニズムが分子レベルで明らかにされれば、神経発生機構および再生機構の解明に大きな前進をもたらすものとなる。現在、幹細胞増殖期、ニューロン産生期、グリア産生期のそれぞれの発生段階のトランスジェニックマウスより選択的に細胞を回収し、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子の網羅的解析中である。各発生段階に特異的であると考えられるいくつかの候補遺伝子があげられ、これら候補遺伝子の発現パターンの解析および、in utero electroporation法を用いて強制発現させ各遺伝子のin vivoにおける機能を引き続き解析中であり、各発生段階における神経幹細胞の性質の特徴および機能因子の解明を目指している。bHLH型転写因子であるHes遺伝子はこれまで、神経幹細胞に強く発現し、神経幹細胞の維持に関与していることが示されている。このトランスジェニックマウスから様々な発生段階の神経幹細胞を選択的に回収し、マイクロアレイ等を用いて遺伝子発現の網羅的解析を行い、刻々と変化する幹細胞の性質を制御する遺伝子および因子の探索をを行う。さらに、このトランスジェニックマウスを用いた神経損傷モデルを作成し神経再生機構を解明することで、成体内在性幹細胞からの組織再生の手法を確率を目指している。現在・幹細胞増殖期・ニューロン産生期、グリア産生期のそれぞれの発生段階のトランスジェニックマウスより選択的に細胞を回収し、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子の網羅的解析を進行中である。いくつかの各発生段階に特異的であると考えられるいくつかの候補遺伝子があげられ、これら候補遺伝子の発現パターンを解析している。さらに、in utero electroporation法を用いて強制発現させ各遺伝子のin vivoにおける機能を引き続き解析中である。今後さらに、このトランスジェニックマウスを用いた神経損傷モデルを作成し神経再生機構を解明することで、成体内在性幹細胞からの組織再生の手法の確率を目指している。

このニューロン産生からグリア産生に至る過程において神経幹細胞は刻々とその性質を変化させる。この変化は転写因子や細胞外因子に対する受容体の発現変化などが想定されているが、幹細胞を選択的に回収する手段がなく、性質の変化を解析することは困難であった。bHLH型転写因子であるHes遺伝子はこれまで、神経幹細胞に強く発現しており、神経分化を抑制し神経幹細胞の維持に関与していることが示されている。本研究では、Hesプロモーター下に半減期の短いEGFPをつなぐことにより神経幹細胞を可視化したトランスジェニックマウスを用いて、神経幹細胞の性質を制御する分子メカニズムの解析を行う。このトランスジェニックマウスでは、脳室周囲帯の未分化な細胞でのみEGFPの発現が認められており、非対称分裂時には幹細胞としてとどまる娘細胞のみがマークされる。このトランスジェニックマウスから様々な発生段階の神経幹細胞を選択的に回収し、マイクロアレイ等を用いて遺伝子発現の網羅的解析を行い、刻々と変化する幹細胞の性質を制御する遺伝子および因子の探索を行う。神経幹細胞の増殖・分化メカニズムが分子レベルで明らかにされれば、神経発生機構および再生機構の解明に大きな前進をもたらすものとなる。現在、幹細胞増殖期、ニューロン産生期、グリア産生期のそれぞれの発生段階のトランスジェニックマウスより選択的に細胞を回収し、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子の網羅的解析中である。各発生段階に特異的であると考えられるいくつかの候補遺伝子があげられ、これら候補遺伝子の発現パターンの解析および、in utero electroporation法を用いて強制発現させ各遺伝子のin vivoにおける機能を引き続き解析中であり、各発生段階における神経幹細胞の性質の特徴および機能因子の解明を目指している。
エピゲノム変化による肥満・インスリン抵抗性の解明

生活習慣病発症には遺伝的素因とともに、環境因子が大きく関与する。環境からの刺激はDNAメチル化やヒストン修飾などのエピゲノムとして記憶される。我々は、脂肪細胞における研究から、エピゲノム修飾酵素が形成する新規のクロマチン構造を発見し、これが前駆脂肪細胞の未分化性を維持すること、また、寒冷刺激を感知するエピゲノム酵素複合体の発見し、環境変化に対する初期応答にはエピゲノム修飾酵素の翻訳後修飾が鍵となることを明らかにした。1.JHDM2a欠損肥満マウスの概日周期と睡眠解析---体外受精によって各グループ十分にN数を確保したJHDM2a-/-マウス実験によるwheel runtestや各臓器でのアレイ解析からJHDM2aは概日周期への関与はほとんどないとの結論に達した。一方これらのMEF細胞を用いH3K9,H3K4などのピストン修飾のChlPSeqから新たなRNAを同定した。2.エピゲノム変化と3T3-U脂肪細胞分化の解析:SETDB1に対するモノクロナル抗体の作製、およびこれを用いた3T3-L1前駆脂肪細胞でのChIP Seqに成功した。H3Kl9のトリメチル化された領域とSETDB1の局在する領域が確認された。このためには高機能抗体の作製とコバリスによる断片化が功を奏した。JMJD1aによるChIP Seqも3T3L-1細胞で開始した。またフラックスアナライザーを用いた解析でSETDB1のノックダウンで脂肪細胞の形質を獲得することが明らかとなった。3.ターゲッテドプロテオミクスによるJHDM2Aの蛋白複合体解析JHDM2a全長蛋白をSf9細胞で発現し、免疫し得られたモノクロナル抗体でのショットガンプロテオミクスに成功した。低酸素やcAMP刺激などの条件化でえられる蛋白群を同定した。4.Setd5のピストン修飾機能解析ST2細胞でのosteoblasto genesisが確認された。ノックアウトマウス作製については、コンストラクト作製、ES細胞トランスフェクション終了し、キメラマウスまで進んだ。抗体作製しChIPSeqを行う所まで到達した。SETD5の酵素活性についてはいまだ解明できていない。環境変化がどのようにしてエピゲノム修飾につながるか?」エネルギー消費を担うJHDM2AはPKAシグナルでリン酸化されスイッチON1エネルギー消費は、寒冷あるいは飢餓時に活性化される交感神経系を介したPKA (プロテインキナーゼA)シグナルによって促進される。このことから、PKAによるJHDM2Aの翻訳後修飾、すなわちリン酸化修飾が細胞内エネルギー制御の一端を担っていると考えた。キナーゼ特異的リン酸化部位予測ソフトウェアを用いた解析によって、JHDM2Aの2ヵ所のセリン残基がPKAコンセンサス配列に合致し、これらの配列は動物種を超えて保存されていた。native JHDM2Aを免疫沈降し翻訳後修飾プロテオミクス解析によって、それらセリン残基がリン酸化修飾を受けていることを発見した。この結果をもとにGST融合JHDM2Aタンパク質を用いたin vitroPKAアッセイを行ったところ、このリン酸化部位が265番目のセリン残基であることを同定した。我々は、これをもとにリン酸化ヒトJHDM2A抗体の作製を試みた。S265リン酸化ペプチドをマウスに免疫し、イムノブロッティングで内在性のリン酸化JHDM2Aを検出可能な抗体を得た。2JHDM2AのS265A変異体はUCP1発現にinactive。次いでこのリン酸化の意義を検討した。内在性JHDM2Aをノックダウンさせた不死化褐色脂肪細胞に外来性ヒトJHDM2AのPKAリン酸化セリン残基のアラニン変異体S265Aを発現させたところ、交感神経刺激(PKAシグナル)によって増強する脱共役蛋白質UCP1の発現が抑制されることを見出した。これより、PKAシグナルによるJHDM2Aのリン酸化は、褐色脂肪組織でのUCP1による熱産生すなわちエネルギー消費に重要な役割を担っていることを見いだした。JHDM2Aがβアドレナリンの刺激を受け、Aキナーゼ(PKA)によってリン酸化を受けることを見出した。このリン酸化により、SWI/SNFクロマチンリモデラー蛋白質と核内受容体PPARγとが複合体形成することを見出した。PPARγは遠位のエンハンサー領域に結合しており、PKA依存的に遠位エンハンサーがプロモーターに近接することを見出した。このようなメカニズムによりエンハンサー上のPPARγやC/EBPαやβが転写活性に寄与することを発見した。また、JHDM2Aの高感度モノクローナル抗体、リン酸化抗体の作製に成功し、ChIP Seqやプロテオミクス解析に供した。H3K9メチル化酵素SETDB1についても、同様に高感度モノクローナル抗体作製からChIP Seqに成功し、SETDB1がC/EBPαに結合して転写を抑制することそして、その結合様式として、DNAのメチル化を認識することを見出した。SETD5についても、同様に抗体を作製し、ChIP Seqを行い脂肪細胞分化抑制の標的となる遺伝子を探索した。またノックアウトマウスを樹立した。H25年度の結果を得るにはH24年度当初計画にあったSetd5の遺伝子局在をChiP-seqにて解析するデータが不可欠であり、その解析には抗体精製に当初予定以上時間が掛かった。この遅れをH25年前半にかけ実施した。。SETD5の高感度

モノクローナル抗体を作製し、ChIP Seqを行い脂肪細胞分化抑制の標的となる遺伝子を探索した。またノックアウトマウスを樹立した。ヒストンH3の9番目のリジンにトリメチル化を行う酵素SETDB1がどのようにして脂肪細胞の分化を制御するかの解析を行った。高感度な特異性の高いモノクロナール抗体を作製し、ChIP Seqなどのエピゲノム技術を樹立し、以下のことを明らかにした。SETDB1はメチル化DNA結合タンパク質であるMBD1およびMCAF1と複合体を形成し、脂肪細胞分化のマスターレギュレーター遺伝子であるPPARγおよびC/EBPα遺伝子上に局在し、ここでH3K9トリメチル修飾を行いこの領域の転写が開始されないように抑制する。一方、これらの遺伝子は活性化ヒストン修飾であるH3K4のトリメチル化が転写開始点上流でされていて、この転写開始点を挟んで下流のH3K9と拮抗するかたちでビバレントクロマチンを形成することが示された。分化刺激でSETDB1が減少すると最終的にH3K9抑制が外れ活性化することを明らかにした(Mol Cell (2015) 60, 584)。また、ヒストンH3のジメチルリジンの脱メチル化酵素JMJD1Aに関する研究では、関連刺激を感知するリン酸化JMJD1A-SWI/SNFクロマチンリモデラー-PPARγタンパク質複合体を同定した。寒冷刺激によりJMJD1Aがリン酸化されると、PPARγを活性化して熱産生を誘導し、肥満を抑制するメカニズムを解明した(Nat Commun(2015) 6, 7052)。さらにこれらの成果をNature Reviews Molecular Cell Biology (2016, in press)でレビューをした。生活習慣病発症には遺伝的素因とともに、環境因子が大きく関与する。環境からの刺激はDNAメチル化やヒストン修飾などのエピゲノムとして記憶される。我々は、脂肪細胞における研究から、エピゲノム修飾酵素が形成する新規のクロマチン構造を発見し、これが前駆脂肪細胞の未分化性を維持すること、また、寒冷刺激を感知するエピゲノム酵素複合体の発見し、環境変化に対する初期応答にはエピゲノム修飾酵素の翻訳後修飾が鍵となることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。内分泌代謝学13次元動的クロマチン解析への進展。JHDM2Aは、低酸素状態で発現が誘導される。HIF1&#61537;が直接転写を活性化する一方、抗体作製からJHDM2aがHIF1&#61537;と複合体を形成し、JHDM2Aが足場となり、HIF1&#61537;を転写開始点に引き寄せる、クロマチンループ構造の変化を介して転写を誘導する機構を明らかにした。cAMP刺激の有無で行ったプロテオミクス解析から、JHDM2AがcAMP-PKAシグナル依存性にSWI/SNF(クロマチン構造の動的変化に関与するクロマチンリモデリング因子で, ATPの加水分解によってヌクレオソーム構造を変動させる巨大複合体)コンポーネントと複合体を形成していることを見いだした。
細胞工学的手法によるヒトを含む高等動物細胞の遺伝生理学的研究

作業内容としては、班会議で各班員の最近の研究が提示され、夫々の研究分野での世界の情況との関連が討議された。本研究班は細胞生物学に関連する幅広い分野から班員が選定されているが、この事が班会議の討議を非常に実のあるものにする事となった。次いで遺伝子、細胞を操作する新しい技術の整理と、その有効性の問題が討議されると共に、班員の夫々の研究遂行上困難な問題点とその解決策の検討が行われた。その結果として、本研究班で認識された問題の1つは、夫々の研究分野で独自の工夫がされており、その中には、他の分野で有効に利用可能なものがあるので、相互利用の場を積極的に作っていく事が研究の活性化に役立つという事であった。今迄或る現象に関係する遺伝子を選別する事が主目的のように動いてきた細胞生物学は、今や遺伝子を利用して細胞の構造・機能を解析する研究に大きく転じてきている。この世界の情勢に対応するためには、細胞を如何に利用するか、操作するか、の工夫がいよいよ大切になってきた。新しい技術の開発こそが、研究の新たな展開を可能にするもので、幅広い分野相互での技術提供が今ほど必要になってきた事は無いといえる。1つの新しい技術として提案されたものは、タンパク質の1次構造から、機能ドメインを推定し、ペプチドを人工合成して、生物現象の解析に利用してみようというものである。この方法は未だ、不確定の問題を多くはらんでいるが、結晶化してX線回折像を得ることの、とても不可能な多くの生体高分子物質の機能解析の1つの方法として、勇敢にトライしてみてよいものと思われる。遺伝子の塩基配列が多数決定し、一方ではペプチド合成も、アミノ酸20ケ程度のものは容易になりつつある現状をふまえて、新しい分野の開発も意図されるべきである。
超音波断層像デジタルサンプリングによる動的画像解析

超音波は、実時間で生体内部の様を映像化でき、動きを観察することができる。しかしながら現在のところ、動的な画像情報は十分に定量化されていない。今回、我々は、既存の超音波装置を使用し、その映像情報のデジタル化システムを構築した。また、その応用として、歯科領域に関係のある唾液腺のうちで耳下腺に注目し、既存の造影剤や生理的食塩水などを注入することで、そのデジタル画像における濃度の変化を調べた。(方法)耳下腺にカテーテルを接続し、一定の位置に超音波プローブを固定し、規格化の基で生理的食塩水、非イオン性尿路血管造影剤イオパミロン300を注入し、その超音波断層像を超音波装置に接続したVTRにて録画する。その超音波画像をパーソナルコンピュータ内に、ビデオキャプチャリングボードを介し、VTRにおけるアナログ信号をデジタル信号へ変換し蓄積する。そして、その動画像データを、画像処理用ソフトへ読み取り、耳下腺の濃度の変化を調べる。また、注入量の異なる2つの画像でサブトラクションを試みる。(結果)1)超音波VTR画像におけるアナログ信号を、デジタル信号として蓄積するシステムを構築した。2)超音波VTR像と比較して若干の画像の劣化は認めるものの、診断に耐えられる画像が得られた。また、得られた連続画像の関心領域内の濃度変化などの計測を自動化して求めることができた。3)今回のシステム構築におけるモデルとして生食、既存造影剤を、耳下腺に注入しその濃度の変化を求めたが著名な変化は示さなかった。また、サブトラクションによる画像処理を試みたが、変化の検出はできなかった。今後、唾液腺への造影剤の応用にあたっては、更なる検討が必要であると考えられる。
脂質シャペロンが寄与する脂質代謝と腎臓病の発症及び進展機序の解明

本研究では脂肪酸結合タンパク4 (FABP4)と脂肪酸結合タンパク5 (FABP5)が寄与する脂質代謝と腎臓病の関連を明らかにし、その臨床的有用性を確立する。更にFABP4が糸球体係蹄内細胞増殖や糸球体上皮細胞の形態保持などに与える影響を分子生物学的メカニズムまで掘り下げて検討し、腎機能増悪や尿タンパク出現の機序の一端を解明していく。
単分散多相エマルション滴を基材とした異形微粒子の生成と機能化

本研究では,基板上に作製した微細な流路(マイクロ流路)の分岐構造を利用し,異形微粒子の作製に関する研究を行った.互いに混ざり合わない硬化性液体と非硬化性液体をマイクロ流路に送液し,サイズの均一な(単分散)多層構造のエマルション(多相エマルション)滴を生成した後,硬化処理によって,非硬化性液体を鋳型とした形状を有する異形ポリマー微粒子を生成することができた.さらに,微粒子の高機能化を目的とした各種ナノ・マイクロ粒子の複合化,および生産量をスケールアップさせるための装置について検討した.本研究では,基板上に作製した微細な流路(マイクロ流路)の分岐構造を利用し,異形微粒子の作製に関する研究を行った.互いに混ざり合わない硬化性液体と非硬化性液体をマイクロ流路に送液し,サイズの均一な(単分散)多層構造のエマルション(多相エマルション)滴を生成した後,硬化処理によって,非硬化性液体を鋳型とした形状を有する異形ポリマー微粒子を生成することができた.さらに,微粒子の高機能化を目的とした各種ナノ・マイクロ粒子の複合化,および生産量をスケールアップさせるための装置について検討した.(1)単分散ダブルエマルション滴生成用のマイクロ流路分岐構造の製作溝加工基板としてガラス(合成石英)を選択し,反応性イオンエッチング(Deep RIE)により,幅が100-200μm,深さが100μmの微細矩形溝の加工を行った.溝を加工した基板に対し別のガラス基板を熱溶着することでマイクロ流路を形成した.過去に使用実績のあった単純なT字連結型に加え,最内相と中間相の体積比率をより柔軟に制御するための,櫛歯構造(幅20μm,ピッチ50μm,深さ100μm)付きマイクロ流路の製作を行った.(2)単分散ダブルエマルション滴の生成と異形ポリマー微粒子の調製作製したマイクロ流路を用い,外部液滴径50-150μmで,直径のCV値(=標準偏差÷平均)が5%程度の各種ダブルエマルション滴(W/O/W型,O/W/O型,O/O/W型)の生成を行った.流路外にて光あるいは熱重合処理を行い,非球形状のポリマー微粒子を調製した.最内相と中間相の流量比を変化させ,ダブルエマルション滴内部の相分離構造ならびに硬化処理後の微粒子形状の制御を行えることを確認した.(3)液一液界面エネルギーバランスとダブルエマルション滴の相分離状態の関係の解明水相あるいは有機相に添加する界面活性剤の種類および濃度を変化させ,生成されるダブルエマルション滴の相分離状態に与える影響を調べた.実験結果および界面エネルギーの計算によるシミュレーション結果との比較を行った.(1)高次多相エマルション滴生成用マイクロ流路の製作と液滴生成試験3つの分散相から構成される高次多相エマルション滴を生成するためのマイクロ流路として,幅50-200μm,深さ100μmのT字および十字の三連結型および三分散相導入型マイクロ流路をドライエッチングによりガラス基板上に製作した.制作したマイクロ流路に互いに混じり合わない3つの分散相液体を導入し,三相多重構造の多相エマルション滴の生成を行った.(2)異形ポリマー粒子への化学的非対称性の導入形状の非対称性に加え,化学的な非対称性を粒子に付加することを試みた.シリカナノ粒子,疏水化処理したシリカナノ粒子,およびはんだ粒子を硬化性モノマーにあらかじめ分散したものを分散相として用いて多相エマルション滴を生成し,硬化処理を経て,ナノ粒子が表面あるいは内部に複合化した異形ポリマー微粒子の調製を行った.(3)マイクロ流の集積化による生産量スケールアップ多数の流路を1つのガラス基板上に集積化し,多相エマルション滴および異形微粒子の生産量スケールアップを試みた.例えば15mm角の合成石英基板上に,ドライエッチングにより40個のクロスフロー型二相液滴生成部を同心円状に対称に配置し,CV値3%未満の単分散二相エマルション滴を,40倍の生産速度で生成できることを確認した.また多重管構造のチップホルダーを用いることで,チップ上の各流路に容易に流量を等配分でき,多相エマルション滴生成のスケールアップに有効であることを確認した.
異種共役ジエン間でのDiels-Alder反応の官能基選択性の制御

本研究の最終目的は、異種共役ジエン間でのDiels-Alder反応の基質選択性の制御を行うことにある。特定の共役ジエンを触媒的に活性化する手法開発の前段階として位置付けられるモデル反応として、鎖状の共役ジエンである2-メチル-1,3-ブタジエンあるいは2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンを選択して、これらをルイス酸触媒で活性化する事とした。求核剤としてはC,N-ジフェニルニトロンあるいはシクロペンタジエンを用いた。ルイス酸触媒としては、まず、通常アルケンのハロラクトン化やハロエーテル化反応の活性化に用いられるBr_2, I_2などのハロゲンを用いたが、顕著な触媒作用は観察されなかった。そこで強力な求電子イオンである非配位性の対アニオンをもつハロニウム(I_2/AgClO_4)を発生させて用いたが、やはり効果はなかった。さらに、2,4,6-lutidine-I/ClO_4などのように、ハロニウムイオンをピリジニウムイオンとして非局在化して有機溶媒に対する溶解度を高め、同時にアルケンへの反応性を高める試みも、顕著な活性効果を示さなかった。嵩高いシリルカチオンを用いて共役ジエンに求電子付加をさせ、その際生じたアリルカチオン中間体をC,N-ジフェニルニトロンあるいはシクロペンタジエンなどの求核剤で捕捉し、その結果求核剤側に生成したカチオンセンターをアリルシランが分子内攻撃して環化させる触媒反応を立案した。しかし現在まで、シリルカチオンの触媒作用を引き出すことはできていない。さらに、PhSOH, PhSeOH, PhSCl/AgBF_4などのカルコゲニウム系のルイス酸触媒、および嵩高い配位子をもつために有機溶媒中に可溶な銀(I)イオン系の触媒などの触媒作用を調べたが、やはり顕著な触媒作用は認められなかった。そこで、アリルカチオン中間体を意図的に発生させて、これに対する共役ジエンあるいはニトロンの反応性を調べた。アリルアセタートやカーボナートに0価のパラジウムを反応させてアリルカチオン中間体を発生させ、これとC,N-ジフェニルニトロンあるいはシクロペンタジエン途の反応を検討したが、特筆すべき活性化を達成することはできなかった。強い配位子であるニトロン双極子あるいは共役ジエンが2価パラジウムに強く配位して、その触媒活性を著しく低下させたものと考えている。最近、ヘテロ置換基をもつアルケンやアルキンがルイス酸触媒の配位を受けて選択性発現を起こすことが観察されてはいるが、やはり、純粋な炭化水素系基質だけでは、ルイス酸触媒の配位による効果的な活性化は極めて困難であることが明らかとなった。