hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2-メチルナフタレンの形状選択的メチル化触媒の設計

本研究の目的は、メタノールを用いた2-メチルナフタレンのアルキル化により2,6-ジメチルナフタレンを選択的に合成できる触媒を設計することである。触媒のスクリーニングの結果、MFI構造を有するゼオライトが最も有望でありることが判明した。さらに、MFI構造を有するメタロシリケートの一部が高成績を示したので、さらに多くのメタロシリケートの合成を行うとともに、合成したメタロシリケートの修飾による有効細孔径の微調節(局所的な細孔微空間の調節も含む)、固体酸強度の制御、ゼオライト結晶外表面の不活性化を行った。各種のメタロシリケートの中ではフェリシリケートが高い選択性を示した。フェリシリケート結晶の外表面を不活性化したものはさらに高い選択性を示したが、選択性(生成ジメチルナフタレン中の2,6-異性体の分率)は56%にしか達しなかった。各種メタロシリケート、およびそれらを修飾した触媒の選択性を調べた結果から、2-メチルナフタレンのメチル化により選択的に2,6-ジメチルナフタレンを選択的に合成するためには、次のような触媒設計指針が重要であることがわかった。すなわち、MFIゼオライト構造を有するメタロシリケートで、酸強度は弱く、結晶外表面が不活性で、しかも有効細孔径が狭まっていない触媒が有効である。このことは、結晶外表面を不活性化した酸強度の極めて弱いメタロシリケートが有効であることを示唆しており、酸化物等による修飾は酸強度を弱めても同時に有効細孔径を狭めてしまうために不適当であることを示している。本研究の目的は、メタノールを用いた2-メチルナフタレンのメチル化により2,6-ジメチルナフタレンを選択的に合成できる触媒を設計することである。本年度では、触媒のスクリーニングの結果、MFI構造を有するゼオライトが最も有望であったので、MFI構造を有するゼオライト(メタロシリケートも含む)に焦点を当て、修飾による有効細孔径の微調節、固体酸強度の制御、ゼオライト結晶外表面酸点の不活性化を行い、触媒設計の基本方針を提案した。有効細孔径の微調節は、含浸法による酸化物の添加により行った。この方法により細孔の微調節はできるが、同時に酸強度も変化してしまう。MFI構造を有する各種メタロシリケートを水熱合成およびアトムプランティング法により調製した。これらのメタロシリケートの細孔径はほとんど同じであるが、酸強度はメタルの電気陰性度に依存して変わるので、酸強度だけの影響を調べることができる。ゼオライト外表面酸点の不活性化の効果は、分子径が大きすぎて細孔に入ることができない2,6-ジメチルキノリンを用いた被毒により明らかにした。調製した触媒の活性と選択性を測定した結果、(1)ゼオライト外表面酸点を選択的に被毒すると、2,6-ジメチルナフタレンを始めとするβ,β′-ジメチルナフタレンへの選択性が飛躍的に増大する、(2)酸化物での修飾によりMFIゼオライトの有効細孔径を狭めると、2,6-ジメチルナフタレンへの選択性は低下し、2,7-ジメチルナフタレンへの選択性が増加し、(3)MFIゼオライトの固体酸性が弱ければ弱いほど2,6-ジメチルナフタレンへの選択性は増大することなどがわかった。以上の触媒設計の基本方針に基づき、平成7年度では、高性能触媒の開発と精密な触媒設計の指針を提出する予定である。昨年度行った触媒のスクリーニングの結果、MFI構造を有するゼオライトが最も有望でありることが判明した。

さらに、MFI構造を有するメタロシリケートの一部が高成績を示したので、さらに多くのメタロシリケートの合成を行うとともに、合成したメタロシリケートの修飾による有効細孔径の微調節(局所的な細孔微空間の調節も含む)、固体酸強度の制御、ゼオライト結晶外表面の不活性化を行った。各種のメタロシリケートの中ではフェリシリケートが高い選択性を示した。フェリシリケート結晶の外表面を不活性化したものはさらに高い選択性を示したが、選択性(生成ジメチルナフタレン中の2,6-異性体の分率)は56%にしか達しなかった。各種メタロシリケート、およびそれらを修飾した触媒の選択性を調べた結果から、2-メチルナフタレンのメチル化により選択的に2,6-ジメチルナフタレンを選択的に合成するためには、次のような触媒設計指針が重要であることがわかった。すなわち、MFIゼオライト構造を有するメタリシリケートで、酸強度は弱く、結晶外表面が不活性で、しかも有効細孔径が狭まっていない触媒が有効である。このことは、結晶外表面を不活性化した酸強度の極めて弱いメタロシリケートが有効であることを示唆しており、酸化物等による修飾は酸強度を弱めても同時に有効細孔径を狭めてしまうために不適当であることを示している。
小麦アレルギーの原因となるグリアジンをコードする遺伝子の同定

パンコムギの種子貯蔵タンパク質において小麦アレルギーの原因となるタンパク質の抗体反応を定量するシステムを確立し、実際に抗体反応量の異なるコムギ系統を選抜した。一方で、種子貯蔵タンパク質の中でアレルギーの原因ともなるα/β-グリアジンをコードする多重遺伝子が座乗する領域のゲノム解析を行い、ゲノム中で高度に重複する様式を推定し、重複した遺伝子が個別に発現調節されていることを明らかにした。当初計画では、既製のキットを用いることで抗原としてのグリアジンを定量する予定であったが、既製品ではアレルゲンとなるグリアジンを特異的に区別して定量することは困難であるとの判断から、ペプチド抗体を作製することにした。EST解析によるα/β-グリアジン発現遺伝子の網羅的解析と同様に、ω-グリアジン発現遺伝子の塩基配列情報および発現パターンを網羅的に収集した。塩基配列をもとにアミノ酸配列を推定した。アレルゲンとなることが報告されているα/β-グリアジンおよびω-グリアジンのアミノ酸配列を収集し、コムギアレルギーのエピトープとして報告されているアミノ酸配列を特定した。これをもとに、エピトープのアミノ酸配列のみを抗原とした3種のペプチド抗体を委託作製した。ペプチドを抗原とするELISA解析から、十分な力価をもった抗体作製に成功したと考えられた。作製した抗体を用いて免疫ブロット解析を行うため、システムの確立を進めた。α/β-グリアジン遺伝子が座乗する6群染色体およびω-グリアジン遺伝子が座乗する1群染色体のナリーテトラソーミック系統の完熟種子から、全タンパク質またはグリアジンを含む分画のタンパク質抽出法を検討した。これらのタンパク質を、SDS-PAGEまたは2次元電気泳動により分離し、各ナリーテトラソーミック系統のプロファイルを比較した。以上のシステムを適用し、作製したペプチド抗体を用いた免疫ブロット解析を行い、アレルゲンとなるグリアジンの検出が可能かの検討を進めている。コムギ種子貯蔵タンパク質であるグルテニンおよびグリアジンのアレルギーのエピトープとして報告されているアミノ酸配列をもとにペプチドを合成し、3種類のポリクローナル抗体を作製した。まず、抗体の特異性を調査するため、コムギ種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子が座乗する1群および6群の染色体異数体系統の種子を用いた。完熟種子の胚乳から全タンパク質を抽出し、SDS-PAGEで分離後、作製した抗体による免疫プロットを行った。抗原・抗体反応量をイメージスキャナーにより測定したところ、3種の抗体それぞれで特異的な反応が確認できた。次に、アレルゲンの量が異なるコムギ系統を探索するため、約170系統の多様なコムギを入手し同様に免疫プロットを行った。3種の抗体それぞれで反応の程度が異なる系統を得ることができた。抗体に反応するタンパク質とそのタンパク質をコードする遺伝子との関連を調査するため、α/β-グリアジン遺伝子を含むゲノミックBACクローンの約600kbの塩基配列を解析した。グリアジン遺伝子はゲノム中で高度に重複しているが、その重複の単位は一定ではないことが明らかになり、遺伝子の近傍にはレトロトランスポゾンやトランスポゾンが蓄積していることが示された。重複したグリアジン遺伝子コード領域およびその近傍の塩基配列の置換率から、ゲノム断片が重複した時期を推測した。さらに遺伝子の発現量を、ESTデータベースの配列の一致するESTの頻度から示した。これらの結果、比較的新しく重複したグリアジン遺伝子で既知のシス配列が同様であっても、遺伝子発現量が異なることが示唆された。以上から、アレルゲンとなるコムギ種子貯蔵タンパク質は、コードする遺伝子の重複が頻繁に生じており、遺伝子発現量やタンパク質量に複雑な多様性をもたらしていることが明らかになった。
大正・昭和期における農村女性の労働負担、育児と母子保健からみた乳児死亡

大正・昭和戦前期における乳児死亡率の高さの原因を農村女性の労働負担などから検討した。得られた結果のうち、とくに強調すべきは次の2点である。昭和期に入っても大正期と同様、授乳頻度が低く乳児の乳汁摂取量不足は改善されなかったが、それを補うために練乳や牛乳よりも衛生管理の容易な粉乳が使用されるようになったこと、そして、そのことが「栄養不良」を回避させ、昭和期の急速な乳児死亡率の低下をもたらした可能性があることである。乳児の生死は母体の健康状態、養育条件等の影響を強く受けるため、乳児の死亡率はその地域の経済・教育や保健医療の水準を反映する指標とされる。この乳児死亡と、母体の健康状態や育児、母子保健、医療、さらにそれらに影響を与える社会・経済環境との関係を歴史的に検討することは、人間の生存とそれを制約する社会との関係を理解するために重要な課題である。本研究はこのような問題意識に基づき、大正・昭和期の農村を対象として次に示す仮説を立てた。それは「大きい女性の労働負担」→「低い授乳頻度→母乳不足」→「発育不良」(栄養不良)→「宿主の抵抗力<病原体の感染力」→「高い新生児期以降の乳児死亡率」という因果関係で労働負担と死亡率とが結ばれるというものである。本年度はこの仮説検証の準備という位置づけである。仮説は、村ごとの新生児期以降死亡率の高低が育児(衛生・栄養)に関するデータ、社会経済環境のうちとくに女性の労働負担に関するデータと母子保健(医療や看護を含む)に関するデータによって説明できるか確かめることによって検証される。そのためには、これらに関するデータを用意する必要がある。分析のためのデータ収集とその入力が本年度の主な作業である。まず、大正期の農村保健衛生実地調査報告書(約100村分)に記載されている新生児期以降の死亡に関するデータと栄養に関するデータを入力した。また耕地面積を労働負担の代理変数とみなし、この耕地面積および衛生・母子保健に関するデータについては収集された保健衛生調査実地報告書に含まれていないため、上述の約100村が属す郡の統計書をできる限り収集し、必要なデータを入力した。そして分析可能なデータベースを作成した。本研究はこのような問題意識に基づき、大正期の農村を対象として次に示す仮説を立てた。「大きい女性の労働負担」→「低い授乳頻度→母乳不足」→「発育不良」(栄養不良)→「宿主の抵抗力<病原体の感染力」→「高い新生児期以降の乳児死亡率」という因果関係で労働負担と死亡率とが結ばれるというものである。この仮説をさらに展開して、「栄養不良の改善」→「宿主の抵抗力>病原体の感染力」→「新生児期以降死亡率の低下」という因果関係で昭和期の新生児以降の乳児死亡率を説明する仮説を立てた。本年度は、この仮説を構成する要素のうち「授乳頻度」と「栄養不足の改善」について、1939-40年に調査された『農山漁村母性及乳児の栄養に関する調査報告書』(恩賜財団大日本母子愛育会愛育研究所保健部編、愛育研究所、南江堂、1944年)を分析し、次の結果を得た。大正期から昭和期に「授乳頻度」が変化したか検討したところ、1930年代の農村では大正期と同じくいくつかある授乳方法の選択肢に変化はなかった。このことから1930年代における「授乳頻度」は大正期のものと同様低くかったと判断した。低い授乳頻度により1930年代においても生じていたと推測される「母乳不足」に対しては、母乳だけで育てる期間を短くしたり、大正期によく利用された練乳だけでなく牛乳さらにはより安全性の高い粉乳を使用したりして、「栄養不良」を回避したことを明らかにした。本研究はこのような問題意識に基づき、昭和戦前期の農村を対象として次に示す仮説を立てた。大正期と同様「大きい女性の労働負担」が存在していたにもかかわらず、「栄養不良の改善」→「宿主の抵抗力>病原体の感染力」→「新生児期以降死亡率の低下」という因果関係によって新生児以降の乳児死亡率低下が説明されるという仮説である。

この仮説を構成する要素のうち前年度においては1930年代の農村では粉乳利用によって「栄養不良の回避」が実現されていたことを明らかにした。本年度は、まず1939-40年に調査された『農山漁村母性及乳児の栄養に関する調査報告書』(恩賜財団大日本母子愛育会愛育研究所保健部編、愛育研究所、南江堂、1944年)によって全国の農村における粉乳利用状況を明らかにした。次いで、1938年の『昭和十三年全国道府県郡市区町村別出産・死亡・死産及乳幼児死亡統計』(厚生省社会局、1941年)に記載された農村別の新生児期以降死亡率と粉乳利用データを使って回帰分析を行い、農村別新生児期以降死亡率の高低を粉乳の利用の有無によって説明できることを示した。あわせて、耕地面積を女性の労働負担の代理変数と考え、地域ごとの耕地面積の大小が死亡率の高低を説明することも示した。したがって、昭和に入っても女性の労働負担は大きいままであったが、「栄養不良の改善」→(「宿主の抵抗力>病原体の感染力」)→「新生児期以降死亡率の低下」という因果関係による説明の妥当性を検証できたといえる。研究計画に示した資料を適切にデジタル化する作業を行うことのできる人員の十分な確保が難しかった。このことが原因となり、データ分析用のデータベース作成作業が遅れた。その結果、分析対象のデータがなかなか揃わず上述の評価となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度が本研究の最終年度となるが、部分的であっても、データセットが揃ったところから、順次分析をはじめるようにする。このことにより、これまでの「やや遅れている」状態が改善し、研究計画どおりの「順調」さらには「当初の計画以上」の成果を出したい。
シグナルセンターとしての師部機能の解明

多細胞生物の組織構築は、細胞間の密なコミュニケーションを通して初めて可能になると考えられる。近年のシロイヌナズナ分子遺伝学を用いた解析から、植物の組織構築においても複雑な細胞間コミュニケーションネットワークが必要であることが分かってきた。しかし、細胞間コミュニケーションシステムの分子実体が示された例は極めて少ない。維管束は師部、前形成層・形成層、木部からなる組織で、動物の血管、神経系同様、栄養と情報を伝達する組織として重要である。私たちは、これまで木部細胞分化をin vitro培養系及びシロイヌナズナ・イネの突然変異体を用いて解析してきた。そして、細胞外因子により、木部道管細胞分化が促進されたり抑制されたりすることを、世界に先駆けて明らかにしてきた。その過程で、師部が維管束組織構築のシグナルの受け手としても発信地としても機能していることを見出した。このような状況の下、私たちは師部を中心にしたシグナル伝達系を明らかにすることで、師部とそのまわりの細胞との細胞間相互作用、ひいては植物の組織構築における細胞間相互作用の基本的原理を明らかにしようと考えた。本研究は、3つの方向性をもって進められた。1つは私たちが2006年に単離同定した小ペプチドTDIFが師部で合成され分泌されるという事実をもとに、師部の維管束分化における役割を明らかにしようというものである。2つめは、私たちが同定した、イネの横走維管束形成に関与し、師部で発現するレセプターキナーゼCOE1の機能解析を進めることで、師部のシグナルセンター機能を解析しようとするものである。3つめは、これらとはまったく異なる新たな挑戦的な方法で師部関連因子を同定しようというものであり、ここには、師部分化系の開発、師部分化関連転写因子の網羅的同定などが含まれた。すべてがうまくいったわけではないが、3方向からのアプローチにより、師部のシグナルセンターとしての働きが明確に示された。特に、師部が幹細胞維持のためのニッチ細胞として働くという発見は、今後の植物の分裂組織構築研究の展開上極めて重要であると考える。本研究は、これまで全く明らかになっていない植物の師部組織における細胞間シグナルセンターとしての役割を明らかにすることを目指している。そのために、本年度は、1)師部の分子マーカーの同定、2)そのマーカーを用いた師部を構成する細胞の性格付け、3)師部によるシグナル受容の例としてのCOE1受容体の機能解析、4)師部細胞からのシグナル発信の例としての師部分泌性TDIFの機能解析を行った。1)ヒャクニチソウを用いたアレイ解析と師部関連転写因子導入植物体でのアレイ解析から得られたデータをもとに、師部関連遺伝子を10種程度推定した。これらのマーカーラインを作成または他の研究者から分与してもらい、発現を調べた結果、2種のマーカーラインが師部マーカーとして使えることが明らかとなった。2)これらの発現を詳細に調べ、1つは未成熟師部の、他の1つは師部伴細胞に局在することが明らかとなった。3)イネCOE1に対するシロイヌナズナホモログの解析を行い、師部に発現することを明らかにした。師部形成におけるオーキシンの関与を明らかにするために、シロイヌナズナ発生初期の葉を用いて、オーキシンの流れと維管束分化初期細胞を鮮明に観察する方法を開発した。

4)TDIF過剰発現体と外からのTDIF投与による詳細なTDIF機能解析の結果、TDIFは木部細胞分化の抑制だけでなく前形成層細胞の分裂促進に働くことが明らかになった。また、このTDIFシグナルは細胞内で2つに分岐することが示唆された。本研究は、これまで全く明らかになっていない植物の師部組織における細胞間シグナルセンターとしての役割を明らかにすることを目指している。そのために、本年度は、1)師部の分子マーカーを用いた師部分化系系の開発、2)師部によるシグナル受容の例としてのCOE1受容体の機能解析、3)師部細胞からのシグナル発信の例としての師部分泌性TDIF/CLE41ペプチドの機能解析、4)師部形成制御転写因子の同定を行った。まず、1)シロイヌナズナの単離葉肉細胞を用いた単細胞培養系の確立を目指した。そして、葉肉細胞の培養と細胞分裂の誘導に成功した。しかし、現時点では師部分化誘導には成功していない。2)3つの異なるcoe1アリルを用いて、維管束形成とブラシノステロイド作用の解析を行った。そして、イネブラシノステロイドシグナル系とCOE1シグナル系が一部でクロスしていることが明らかにした。その結果を、Plant Journal誌に発表した。3)CLE41の機能欠損変異体を用いて、内生のTDIFシグナルの働きを解析した。そして、CLE41由来のシグナルが実際に植物内で、維管束幹細胞の維持に働くことが明らかとなった。4)すでに作成してある維管束関連転写因子ライブラリーを用いて、師部分化特異的発現を示すCLE41遺伝子の発現を制御する転写因子の同定を試みた。具体的には、転写因子とCLE41::CUS認をタバコ葉に導入し、その相互作用を解析した。その結果、あるDOFタンパク質がCLE41遺伝子の転写活性を制御しうることが明らかとなった。私たちは師部を中心にしたシグナル伝達系を明らかにすることで、師部とそのまわりの細胞との細胞間相互作用、ひいては植物の組織構築における細胞間相互作用の基本的原理を明らかにしようと考えた。本年度は以下のテーマについて研究を行うとともに、それをまとめた小冊子を作成した。1.COE1(LRR-RLK)受容体の機能解析:COE1機能を知るために、連絡脈の間隔に異常をもっcoel変異体と野生型イネに対するオーキシンとブラシノステロイド添加実験を行った。また、ブラシノステロイド受容体に変異を持つd61変異体の解析と野生型イネへのブラシノステロイド添加実験を行った。これらの結果から、COE1は師部においてシグナルを受容し、その近傍での連絡脈形成の阻害を促進する。一方で、オーキシンシグナルとブラシノステロイドシグナルはその下流にあるCOE1を正に制御することで連絡脈の形成間隔を制御するというモデルを提示した。2.CLE41機能の解明:12アミノ酸からなるペプチドシグナル分子TDIFをコードし師部特異的に発現する遺伝子の機能解析を行った。この遺伝子の突然変異体では、前形成層細胞で発現する受容体TDRの変異体と同じように前形成層異常という表現型を示したことから、師部でつくられるTDIFが細胞間シグナルとして前形成層細胞の発生運命を制御していることが遺伝学的に確かめられた。3.師部形成に関与すると考えられるCLEペプチドの発現解析を行った。
過疎地域における廃校・空き家を活用した地域主導型福祉サービスネットワークの構築

高齢者通所介護施設ネットワークの典型地域を抽出し、サービスの機能と利用圏分担に関するシステム評価をおこなった。施設の使われ方調査により、利用者が受けるサービスと施設の機能分担の詳細を明らかにした。施設の利用圏と送迎方法・所要時間の実態調査により、各施設の利用圏分担の実態を明らかにした。過疎地域自治体では、広域基幹施設整備が進められたものの、小規模施設が整備されていない地域も多い。基幹施設と小規模施設の整備により、介護サービスの多様化・水準向上と、施設連携による効率的運営が期待される。そこで、社会福祉事業団方式による広域連携型の施設ネットワークモデルを構想・提案した。(1)中国地方の公立小中学校統廃合データベース構築と廃校の管理運用調査:「学校一覧」資料をもとに、1950ー2010年の60年間の学校毎の児童数・職員数・クラス数の年別変化、新設・廃校データを作成し、県・自治体を単位とした廃校状況を整理した。学校間の統廃合プロセスと廃校運用に関するデータベースを整理した。廃校施設の管理運用状況の基本情報を基に、高齢者や子育て支援のための地域福祉施設として活用されている事例を整理した。(2)高齢者通所介護施設のデータベース構築と立地特性分析:既存収集資料を基に介護保険制度導入前後の高齢者福祉施設の量的整備動向を比較し、自治体毎の通所介護施設整備水準を整理した。過疎地域の自治体を対象に、施設の建築概要・施設規模・サービス機能と運営主体・運営形態に関する資料収集・整理を行い、自治体を単位とした設置時期を含めた施設立地特性と運営形態の関係分析を行った。(3)中四国地方の放課後学童保育施設のデータベース構築と地域特性分析:中国・四国地方を対象に個別施設データベースを構築し、自治体単位の設置方式の特徴と整備水準を整理した。(4)山口県における子育て支援施設のデータベース構築と立地特性分析:山口県内の1995年以降に設立された全子育て支援施設を対象に、運営主体・運営方式・設置施設・立地条件・利用形態に関するデータベース構築を行い、地方県における施設整備の推移と現況を整理し、自治体の学校区を単位に施設立地特性と整備水準を明らかにした。H26年度は、(1)中国地方3県の全公立小学校の1959年から2010年までの学校数・児童数推移と廃校の発生状況を整理した。また廃校施設の高齢者福祉施設としての活用事例調査をもとに、高齢者通所介護施設・グループホーム・生活支援ハウスとして活用されている複合型施設の使われ方調査により、学校施設を福祉施設として利用する可能性を明らかにした。成果は論文4編にまとめ投稿中・公表済である。(2)高齢者通所介護の広域基幹施設と小規模施設群のネットワーク運営事例や、社会福祉法人と社協の連携・分担型等の先進的事例を選定し、施設間の機能・利用圏分担のネットワークの成立条件・効果と運用システムを明らかにすることを目的に、山口県萩市と周防大島町を対象に、施設整備の歴史的経緯を整理した上で、各施設の運営方式に関する聞取り調査及び施設平面図・家具配置図の実測調査を行い、予備的使われ方調査を実施した。調査対象の約半数が未調査で、H27年度に継続調査を行う予定である。(3)山口県の中山間地域における子育て支援施設を対象に、統計データ整理とアンケート調査を行い、1日利用組数の推計をもとに6施設を典型事例として抽出し、利用者アンケート調査を実施し、施設の利用実態と利用圏域の分析を行った。論文執筆中である。(4)山口市の「地域子育て支援事業」の支援を受けた5施設を対象に、日常的使われ方調査及び講習・イベント時の地域組織の運営支援に関する調査をもとに、地域主導型の施設運営の有効性を検証した。現在論文2編を執筆中である。(5)中国地方の放課後学童保育先進都市である宇部市を対象に、全施設の設立経緯・運営方式に関するヒアリング調査及び施設平面図・家具配置図の実測調査を行い、学童保育施設の整備の経緯と現状の全体像を把握した。論文1編にまとめる予定である。高齢者通所介護施設のネットワーク構築事例調査:広域基幹施設と小規模施設群のネットワーク運営事例や、社会福祉法人と社協の連携・分担型等の先進的事例を選定し、施設間の機能・利用圏分担の実態調査と施設利用・使われ方調査により、ネットワークの成立条件・効果と運用システムネットワークの成立条件・効果を明らかにした。過疎地域自治体の放課後学童保育施設の利用特性調査:菊川町の先進事例に加え、未整備校区の多い四国地方の過疎地域自治体を対象に取組み事例調査を実施し、廃校・民家等を活用し地域組織と学校が連携し施設運営を行う方式の成立条件を明らかにした。過疎地域の子育て支援施設の利用調査:山口県では「元気子育て支援センター事業」が2008年に創設され45施設が開設されている。萩市を対象に全施設の整備プロセス・運営方式・利用状況調査を実施し、典型地域での事業評価を行った。「地域型ひろば設置支援事業」の運営調査:山口市では地域組織が主体となり民家活用型施設を設置し地域と連携した運営方式を取り入れている。5施設を対象に、(1)屋外環境を含めた施設の使われ方、(2)地域人材を活用した講座、(3)地域施設や農地を利用した年間イベントの企画・運営と利用実態調査を行い、地域組織による民家を活用した子育て支援施設の地域との連携・協力体制とその効果を整理した。H27年度は萩市、周防大島町を対象に高齢者通所介護施設のネットワーク構築事例調査を実施した。

また山口県下の社会福祉協議会による高齢者通所介護施設の整備状況調査と下関市、平生町を対象に事例調査を実施した。また地域組織が主体となり民家活用型施設を設置し地域と連携した運営方式を取り入れている5施設を対象に、(1)屋外環境を含めた施設の使われ方、(2)地域人材を活用した講座、(3)地域施設や農地を利用した年間イベントの企画・運営と利用実態調査を行い、地域組織による民家を活用した子育て支援施設の地域との連携・協力体制とその効果を整理した。以上、本研究課題はおおむね順調に進展している。高齢者通所介護施設ネットワーク調査(施設の利用者特性(年齢・介護度・利用回数・居住地)、施設の使われ方調査、施設の利用圏構成と送迎方法・所要時間の実態調査)を基に、サービスネットワークの機能分担・利用圏分担に関するシステム評価を行った。過疎地域自治体では、広域基幹施設整備が進められたものの小規模施設が未整備な地域も多く、基幹施設と小規模施設の整備により介護サービスの多様化・水準向上と施設連携による効率的運営が期待され、地域特性に対応した基幹施設とサテライト型施設による連携型施設ネットワークモデルの有効性を検証・提案した。また平成の町村合併による広域自治体における、社会福祉事業団による高齢者福祉サービスの広域展開の有効性をあきらかにするとともに、社会福祉法人運営の既存通所介護施設との連携が課題であることを指摘した。過疎地域の子育て支援施設の利用調査および山口市の「地域型ひろば設置支援事業」による施設運営調査結果を基に、地域主導型運営システムの過疎地域への展開可能性に関し検討した。出張ひろばの開設、指導者育成、施設開設支援を行う山口方式(地域主導型整備・運営システム)の「協働」型施設の有効性を明らかにした。また放課後学童保育施設の利用特性調査をもとに、地域の多様な人材の協力による「地域塾」の開催が、夏休みの終日保育期間においては子供の1日の遊びの中で特に有効であることを明らかにした。高齢者通所介護施設ネットワークの典型地域を抽出し、サービスの機能と利用圏分担に関するシステム評価をおこなった。施設の使われ方調査により、利用者が受けるサービスと施設の機能分担の詳細を明らかにした。施設の利用圏と送迎方法・所要時間の実態調査により、各施設の利用圏分担の実態を明らかにした。過疎地域自治体では、広域基幹施設整備が進められたものの、小規模施設が整備されていない地域も多い。基幹施設と小規模施設の整備により、介護サービスの多様化・水準向上と、施設連携による効率的運営が期待される。そこで、社会福祉事業団方式による広域連携型の施設ネットワークモデルを構想・提案した。本研究は、地域の廃校や空き家の民家等の既存建築ストックを活用した、高齢者・子育て支援のための地域福祉拠点整備と施設ネットワーク構築方法論の提案及び過疎地域における自立的な地域主導型の施設整備・運営システムの構築を目的としている。(1)小中学校の廃校活用に関しては、これまでに中国地方5県の全公立小学校の学校数・児童数推移と廃校の発生状況を整理した。また廃校活用に関しては、複合型高齢者福祉施設の使われ方調査により、福祉施設として利用する可能性を明らかにした。
口腔粘膜に蓄積する稀少ゲノム異常・エピゲノム異常の同定とリスクマーカーへの応用

ゲノム異常は、正常組織においても蓄積しており、その蓄積ががん化のリスクと関わっている可能性がある。しかし、正常組織における突然変異の頻度は非常に低く、これまで、正確な測定が不可能であった。次世代シークエンサーの登場により、高深度な解析は容易になったが、低頻度の変異を解析するには、シークエンシング時のエラーとの区別が必要であり困難であった。連携研究者の国立がん研究センター研究所の牛島博士と山下博士は、稀少な突然変異の測定を可能にした(特願2015-199342)。本研究は、その新規突然変異解析法を用いて非がん口腔粘膜に蓄積する口腔がんリスクを反映する稀少突然変異を探索・同定することを目的として行っている。口腔がん患者の非がん部(高リスク)口腔粘膜、および、タバコなどの発がん因子に曝露歴のある非がん患者の口腔粘膜(中リスク)、曝露歴のない非がん患者の口腔粘膜(低リスク)の組織サンプルの採取を行っている。健常人の口腔粘膜(低および中リスク)に関しては、口腔がんや口腔前がん病変以外の疾患で東京大学医学部附属病院口腔顎顔面外科・矯正歯科を受診した患者のうち、同意が得られた者から、頬粘膜の細胞を擦過することにより採取を行っている。口腔がん患者の非がん部粘膜は、口腔がんの手術と同時に採取を行っている。健常人の口腔粘膜(低および中リスク)に関しては、同意取得が困難な場合もあるが、口腔がん患者の非がん部粘膜は、手術とともに順調に採取できている。健常人の口腔粘膜(低および中リスク)に関しては、同意取得が困難な場合もあるが、おおむね順調に採取できている。口腔がん患者の非がん部粘膜は、同意取得が比較的容易で有り、手術とともに順調に採取できている。引き続き、口腔がん患者の非がん部(高リスク)口腔粘膜、および、タバコなどの発がん因子に曝露歴のある非がん患者の口腔粘膜(中リスク)、曝露歴のない非がん患者の口腔粘膜(低リスク)の組織サンプルの採取を行う。サンプルが集まり次第、新規突然変異解析法を用いて変異解析を行うがんにおけるゲノム異常は、一見正常に見える組織においても蓄積しており、そのレベルが発がんのリスクと関わっている可能性がある。しかし、非がん組織における突然変異の頻度は非常に低く、正確な測定が不可能であった。連携研究者の国立がん研究センター研究所エピゲノム解析分野の牛島博士と山下博士は稀少突然変異の測定を可能にした(特願2015-199342)。本研究では、その新規突然変異解析法を用いて非がん口腔粘膜に蓄積する口腔がんリスクを反映する稀少突然変異を探索・同定することを目的としている。現在、口腔がん患者の非がん部(高リスク)口腔粘膜、および、タバコなどの発がん因子に曝露歴のある非がん患者の口腔粘膜(中リスク)、曝露歴のない非がん患者の口腔粘膜(低リスク)の組織サンプルの採取を行っている。

引き続き、口腔がん患者の非がん部(高リスク)口腔粘膜、および、タバコなどの発がん因子に曝露歴のある非がん患者の口腔粘膜(中リスク)、曝露歴のない非がん患者の口腔粘膜(低リスク)の組織サンプルの採取を行う。サンプルが集まり次第、連携研究者の国立がん研究センター研究所エピゲノム解析分野の牛島博士と山下博士が開発した新規突然変異解析法を用いて変異解析を開始する。サンプルが集まり次第、新規突然変異解析法を用いて変異解析を行う次年度使用額が生じた理由希少突然変異解析を行う実験費用を残したため。また、参加する予定であった国際学会への参加を行わなかったため。使用計画希少突然変異解析を行う実験費用とする。国際学会にて発表を行うため旅費、参加費とする。理由:希少突然変異解析を行う実験費用および論文掲載費用を残したため。使用計画:論文掲載料。実験費用に用いる。
糖鎖の多元的認識ベクターの開発と細胞選択的な薬物送達への展開

本研究課題では、癌細胞への選択的な薬物送達を目指し、細胞膜のプロテオグリカンを認識して高効率に細胞内へ移行する膜透過性アルギニンペプチドに、癌細胞膜に高発現しているトランスフェリン受容体に対して親和性が高いペプチド配列を組み込むことで、新しい薬物送達ベクターを創製した。このベクターは受容体依存的に細胞内へ取り込まれ、サイトゾル及び核内へ移行することが観察された。また、生理活性を有するタンパク質にベクターに組み込んだ場合にも、受容体依存的な活性上昇が確認された。運びたい生理活性物質を、運びたい細胞に選択的に送達させる技術は、ドラッグデリバリー研究分野のみならず、創薬化学及びケミカルバイオロジーを含めた様々な分野で必要性が高い。本研究課題は、癌細胞選択的な薬物送達を目指し、細胞膜上の糖鎖を認識し高効率に細胞内へ移行する膜透過性アルギニンペプチドに、癌細胞に高発現している受容体に結合するペプチドを配列中に組み込むことで、新しい薬物送達ベクターを創出することが目的である。癌細胞に高発現しているトランスフェリン受容体(TfR)を標的とし、ファージディスプレー法によって見出されたTfRに親和性の高いペプチド配列(TfRbp)と、膜透過性アルギニンペプチドとの結合体(TfRbp-R)を調製することで、TfRターゲティングの可能性に関して検討を行なった。蛍光ラベルしたTfRbp-Rの細胞内移行性を、共焦点顕微鏡を用いて検討した結果、ヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞において、血清含有培地を使用した場合でも、TfRbp-R(5μM)は高効率に細胞膜を通過し、サイトゾルへ短時間(10分)で移行することが観察された。一方で、TfRbp配列のみの場合では、細胞内移行量が低く、しかもエンドソーム内にトラップされており、TfRbp-Rの場合と比較してサイトゾルへ移行したペプチド量が低い様子が観察された。また、siRNAを用いてTfRの発現量を抑制することによって、TfRbp-Rの細胞膜透過性は著しく減少したことから、ペプチドがTfR依存的に細胞膜を通過していることが確認された。本研究結果は、膜透過性アルギニンペプチドを用いて、特定の受容体標的化が可能であることを示唆するものである。本研究課題では、癌細胞への選択的な薬物送達を目指し、細胞膜のプロテオグリカンを認識して高効率に細胞内へ移行する膜透過性アルギニンペプチドに、癌細胞膜に高発現している受容体に対して親和性が高いペプチド配列を組み込むことで、新しい薬物送達ベクターを創製することを目的としている。ファージディスプレイ法によって見出された、癌細胞に高い発現が認められるトランスフェリン受容体(TfR)に対して親和性の高いペプチド配列(TfRbp)と、膜透過性アルギニンペプチドの一種であるオクタアルギニン(R8)との結合体(TfRbp-R8)を調製した。血清含有培地で10分間、TfRが細胞膜に高発現しているヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞にペプチドを取り込ませた結果、蛍光標識したTfRbp-R8(5μM)が細胞膜を高効率に通過し、サイトゾル及び核内へ移行することを共焦点顕微鏡観察にて明らかにした。一方、TfRbpのみの場合では、エンドソーム内にトラップされてしまい、細胞膜透過はほとんど観察されなかった。また、リボソーム不活化タンパク質であるsaporinをストレプトアビジン化したタンパク質(128kDa)と、ビオチン修飾したTfRbp-R8の複合体について、siRNAでTfRをノックダウンしたHeLaに対する細胞毒性を検討した結果、TfR依存的に顕著な細胞毒性を誘発することが示された。本研究結果は、上記ハイブリッドペプチドを用いることで、TfRを標的とする薬物送達への応用が可能であることを示唆するものである。
経済統計・政府統計の理論と応用からの提言

1.本研究プロジェクトでは、近年の日本経済・社会の理解にとってますます重要になっている経済統計・政府統計における重要課題について、主に統計学的な立場から技術的・制度的側面における問題を具体的に検討することを目的としている。今年度も多くの論文公刊と国際学会での研究報告が行われた。2.経済統計・政府統計の直接的話題に関しては、(1)家計貯蓄率についての諸統計間の乖離の問題について、(2)統計制度の国際比較について、(3)小地域統計の理論と応用、(4)人口学からの人口減少社会の評価、などについて成果が得られた。経済データの分析手法に関しては、(5)パネル・データ・モデルの統計的推論、(6)ファイナンス・データにおけるボラティリティーの計測法、などについて知見が得られた。3.年度末に行われた研究コンファレンスでは、本プロジェクトの最終年度であり、全ての報告はプロジェクトのメンバーによって行われた。経済統計・政府統計に関して、(1)複数回答を用いた標本調査における問題と対策、(2)人口資産の観点からみた人口減少・超高齢化社会の課題について、(3)無業高齢者の貯蓄・消費行動の分析、(4)匿名化の統計的評価方法について、また、経済データの分析手法に関しては、(5)多変量経済データへのトレンド・季節性への統一的アプローチについて、などについて報告が行われた。これらの内容は、東京大学大学院経済学研究科附属・日本経済国際研究センター(CIRJE)研究報告書シリーズのCIRJE-R-25「経済統計・政府統計の理論と応用2019」として掲載された。4.本プロジェクトの総括にあたり、経済統計・政府統計の問題を含んだ現代日本における統計全般について、その実情、活用状況、ならびに改革の課題について、各分野の専門家の論考からなる図書が編集・刊行された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.本研究プロジェクト「経済統計・政府統計の理論と応用からの提言」では近年の日本経済・社会の理解にとってますます重要になっている経済統計・政府統計における重要な課題について、主に統計学的な立場から技術的側面・制度的側面における問題を具体的に検討することを目的としている。2.2015年度は、(1)小地域統計と政府統計への応用、(2)家計調査などの政府統計の質の向上と応用の問題、(3)匿名化と開示リスクの理論と応用、(4)標本調査の設計に関する問題などのテーマについて一定の成果を得た。3.経済データの分析手法に関しては、(1)動的パネルデータの分析、(2)観測上の誤差の問題で若干の知見を得た。4.年度末に開催された研究コンファレンスでは、政府側からは現在政府統計の重要課題となっている(1)2次統計の利用の現状と課題、(2)人口統計と地方創生との関連についての報告があった。研究者側からは、(3)マクロデータとミクロデータの統計的融合への接近法、(4)匿名データの開示リスクの問題、(5)新しい季節調整法X-13ARIMA-SEATSに関する問題、(6)小地域統計推計の統計的問題と応用、などが報告された。5.上記の研究コンファレンスの具体的内容は、東京大学大学院経済学研究科付属・日本経済国際研究センター(CIRJE)研究報告書シリーズCIREJE-R-21「経済統計・政府統計の理論と応用2016」に掲載した。本研究プロジェクトは、10名のメンバーからなり、各メンバーの専門分野は経済統計・政府統計のさまざまな分野であるが、以下の「研究発表」で示されているように、多数の学術論文公刊ならびに研究報告(特に国際学会での研究報告)が活発に行われ、概ね順調に進んでいる。年度末の研究集会では、外部からの報告とメンバーの報告が行われ、統計学研究者、政府統計関係者、ならびに経済統計・政府統計の利用者という三種の異なるグループから多数(50名以上)が参加し、三者が一堂に会して議論をする貴重な場となった。1.本研究プロジェクト「経済統計・政府統計の理論と応用からの提言」では近年の日本経済・社会の理解にとってますます重要になっている経済統計・政府統計における課題について、主に統計学的な立場から技術的・制度的側面における問題を具体的に検討することを目的としている。多くの論文公刊と国際学会での研究報告が行われた。2.平成28年度は、(1)匿名化されたデータの個体識別可能性に関する測度の閾値をエビデンスから統計的に求める方法の提案、(2)景気動向調査に関するいくつかの実験、(3)小地域統計に関するモデルにおける予測の理論と応用、(4)経済センサス活動調査とSNAの関係、(5)人口学の観点からみた少子化問題、などについて新しい成果を得た。3.経済データの分析手法に関しては、(1)動学的パネルデータモデルにおける検定についての提言、(2)新しい死亡率予測方法の従来の方法との比較、などに関して知見を得た。4.年度末に行われた研究コンファレンスでは、政府側からは(1) SNA統計におけるベンチマーキング及び季節調整の問題、メンバー側からは、(2)景気指標としての消費統計について、(3)世帯別の貯蓄率の問題、(4)自記式標本調査における問題、(5)経済データ間の因果性の測定に関する問題、(6) SNA統計における誤差の修正方法、などについて報告が行われた。5.上記の研究コンファレンスの内容は、東京大学大学院経済学研究科付属・日本経済国際研究センター(CIRJE)研究報告書シリーズにCIRJE-R-23「経済統計・政府統計の理論と応用2017」として掲載した。

本研究プロジェクトは、11名のメンバーからなり、各メンバーの専門分野は経済統計・政府統計の様々な分野であるが、以下の「13.研究発表(平成28年度の研究成果)」で示されるように、多数の学術論文公刊ならびに研究報告(特に国際学会での研究報告)が行われ、概ね順調に進んだ。年度末の研究コンファレンスでは、実際の統計作成者と研究メンバーの研究報告が行われ、多数(50名前後)が参加し、各報告後には活発な議論が行われた。統計学研究者、政府統計関係者、経済統計・政府統計の利用者など三者が一同に会して議論をする貴重な場となった。1.本研究プロジェクト「経済統計・政府統計の理論と応用からの提言」では近年の日本経済・社会の理解にとってますます重要になっている経済統計・政府統計における重要課題について、主に統計学的な立場から技術的・制度的側面における問題を具体的に検討することを目的としている。多くの論文公刊と国際学会での研究報告が行われた。2.経済統計・政府統計の直接的話題に関しては、(1)標本調査における回答時間からみた回答特性、(2)個人消費関連統計の比較、(3)貯蓄率における高齢化の影響、(4)小地域統計の理論と応用、(5)経済データ間の因果関係の計測、などについて新しい成果を得た。経済データの分析手法に関しては、(6)パネルデータモデルの統計的推論、(7)ファイナンス・データにおけるボラティリティーの計測法、などに関して多くの知見を得た。3.年度末に行われた研究コンファレンスでは、経済統計の作成者からは(1)サービス産業における価格と生産性の計測の問題点、経済統計の利用者からは(2)住宅統計の問題点と住宅政策への影響、(3)資産の統計に関して世代間移転推計の問題点、(4)消費税増税をめぐる認識ラグとそのEBPM (Evidence Based Policy Making)への影響について、本プロジェクトのメンバーからは、(5)世帯別の貯蓄率の問題、(6)自記式標本調査における問題、などについて報告が行われた。本研究コンファレンスの内容は、東京大学大学院経済学研究科付属・日本経済国際研究センター(CIRJE)研究報告書シリーズのCIRJE-R-24「経済統計・政府統計の理論と応用2018」として掲載した。本研究プロジェクトは、12名のメンバーからなり、各メンバーの専門分野は経済統計・政府統計の様々な分野であるが、以下の「研究発表」で示されるように、多数の学術論文公刊ならびに研究報告(特に国際学会での研究報告)が行われ、概ね順調に進んだ。年度末の研究コンファレンスでは、プロジェクト・メンバーを中心として、経済統計の作成者、ならびに経済統計・政府統計に密接した利用者の研究報告が行われ、メンバーを含めて多数の研究者(50名前後)が参加し、各報告後には活発な議論が行われた。統計学研究者、政府統計関係者、経済統計・政府統計の利用者など三者が一堂に会して議論をする貴重な場を提供することができた。1.本研究プロジェクトでは、近年の日本経済・社会の理解にとってますます重要になっている経済統計・政府統計における重要課題について、主に統計学的な立場から技術的・制度的側面における問題を具体的に検討することを目的としている。今年度も多くの論文公刊と国際学会での研究報告が行われた。
ストレス防御系の破綻としての癌発生に関する研究

外界からの様々なストレス刺激はDNAを直接、間接に傷害し、それに対し生体細胞は防御システムを持っている。こうした防御システムの破綻が細胞の悪性変化を引き起こすと考えることができる。たとえば、p53蛋白はこの防御機構の1つとして働き、細胞周期を停止させ、DNA修復酵素を働かせたり、DNAの変異の大きい細胞をアポトーシスで排除していると考えられている。私達はストレス刺激で活性化されるGADD蛋白が細胞の増殖、細胞死に与える影響を研究している。特に機能のわかっていないGAD34とこれと結合するzfp148に興味をもち、その機能解析を遺伝子欠損マウスでおこなっている。DNA傷害ストレス刺激で発現が増強されるGADD34. GADD153の遺伝子発現調節とその上流のシグナル伝達系を検索した。アルキル化剤(MMS)でMEK. JNKを介してCRE領域に結合するc-junがGADD34の転写に関与すること(Gene 2004),酸化ストレスでAP-1を介して、GADD153が上昇すること(Red.Rep 2004)を見い出した。細胞傷害性ストレス刺激はまた、p53を介して、p21/WAF1(p21)発現を上昇させ、細胞周期を停止させる。そこで、DNA傷害性ストレス刺激によるGADD34のp21/WAF1発現への影響を調べた。DNA障害性ストレスを与えるアルキル化剤投与でのp21の発現を調べたところ、GADD34欠損マウス細胞ではp53のリン酸化およびp21の発現が低下することを見い出した。p53のリン酸化はp53の安定化や転写活性に大きく影響するがGADD34はタンパク質脱リン酸化酵素の一つであるPP1をp53から引き離すことでp53の脱リン酸化に影響を与えその転写活性を高める作用を持つことを明らかにした(FEBS lett 2004)。
P糖蛋白陽性の多剤耐性癌に対するアンチセンスP糖蛋白オリゴヌクレオチドの効果

悪性腫瘍の多剤耐性化に伴って過剰発現するP糖蛋白(P-glyocoprotein)は細胞膜に存在して抗癌剤の排出を行う糖蛋白質で、薬剤耐性遺伝子mdrlによってコードされている。この薬剤耐性を克服するために、in vitroおよびin vivoの実験を行った。(1)in votro実験:まずmdrlアンチセンスDNAオリゴマーをS基で修飾して合成した。in vitroでmdrl antisense phosphorothioate oligomerをP糖蛋白陽性の多剤耐性マウス白血病細胞に導入すると、P糖蛋白合成が抑制されることをmRNA、蛋白レベルで確認した。すなわち、多剤耐性白血病細胞としてAdriamycin(ADR)で誘導したP388/ADR、コントロールとして抗癌剤に高い感受性のある親株P388/pを使用し、アンチセンスオリゴマーをP388/ADRに導入すると、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白特異的モノクローナル抗体C219の反応性が低下した。つまりP糖蛋白の発現が抑制された。また、多剤耐性遺伝子mdr1のmRNA発現をRT-PCR法で検討したところ、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白のmRNA発現が抑制された。さらにP388/ADRの抗癌剤に対する感受性は薬剤感受性親株と同程度までに回復していることをMTT法で確認した。(2)in vivo実験:これをBDF1マウスに腹腔内投与し、2日後にDoxorubicinを腹腔内投与すると、antisenseの投与量依存性に有意に生存期間が延長した。(3)in vivo投与によるmdr1アンチセンスDNAオリゴマーの急性/慢性毒性の検討:mdr1遺伝子は多剤耐性細胞に過剰発現されているが、中枢神経系、副腎、血球など正常細胞の一部にも微量発現されていることから正常細胞への影響を検討するためにmdr1アンチセンスDNAオリゴマーをマウスに投与した。マウスを経時的に観察することにより、臨床的には異常行動を示すものはなく、体重増加も良好であった。また、血液毒性も認めなかった。以上の結果を日本小児血液学会(1993,1994,1995年)、米国血液学会(1993,1994年)、日本癌学会(1996年)で報告した。(1)mdr1アンチセンスDNAオリゴマーを当科のApplied Biosystems社DNAシンセサイザを使用して合成した。オリゴヌクレオチドは細胞内のヌクレアーゼによって容易に分解されるので、アンチセンスオリゴマー合成時にS基で修飾し、分解されにくくした。(2)多剤耐性白血病細胞としてAdriamycin(ADR)で誘導したP388/ADR、コントロールとして抗癌剤に高い感受性のある親株P388/pを使用した。アンチセンスオリゴマーをP388/ADRに導入すると、アンチセンスDNAの用量依存性にモノクローナル抗体C219の反応性が低下した。(3)多剤耐性遺伝子mdr1のmRNA発現をRT-PCR法で検討したところ、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白のmRNA発現が抑制された。P糖蛋白陽性マウス多剤耐性白血病細胞を使用してアンチセンスP糖蛋白オリゴヌクレオチドにより多剤耐性を克服できるかどうかについて検討した。項目別に列挙すると以下のようになる。

(1)アンチセンスDNAを合成し、多剤耐性白血病細胞株P388/ADRに反応させたところ、アンチセンスDNAの用量依存性にモノクローナル抗体C219の反応性が低下した。つまりP糖蛋白の発現が抑制された。(2)多剤耐性遺伝子mdrlのmRNA発現をRT-PCR法で検討したところ、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白のmRNA発現が抑制された。(3)アンチセンス処理を行ったP388/ADRは抗癌剤に対する感受性が増強していた。(4)アンチセンスをBDF1マウスに抗癌剤とともに腹腔内投与すると担癌マウスの生存期間が延長した。悪性腫瘍の多剤耐性化に伴って過剰発現するP糖蛋白(P-glyocoprotein)は細胞膜に存在して抗癌剤の排出を行う糖蛋白質で、薬剤耐性遺伝子mdrlによってコードされている。この薬剤耐性を克服するために、in vitroおよびin vivoの実験を行った。(1)in vitro実験:まずmdrlアンチセンスDNAオリゴマーをS基で修飾して合成した。in vitroでmdrl antisense phosphorothioate oligomerをP糖蛋白陽性の多剤耐性マウス白血病細胞に導入すると、P糖蛋白合成が抑制されることをmRNA、蛋白レベルで確認した。すなわち、多剤耐性白血病細胞としてAdriamycin(ADR)で誘導したP388/ADR、コントロールとして抗癌剤に高い感受性のある親株P388/pを使用し、アンチセンスオリゴマーをP388/ADRに導入すると、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白特異的モノクローナル抗体C219の反応性が低下した。また、多剤耐性遺伝子mdrlのmRNA発現をRT-PCR法で検討したところ、アンチセンスDNAの用量依存性にP糖蛋白のmRNA発現が抑制された。さらにP388/ADRの抗癌剤に対する感受性は薬剤感受性親株と同程度までに回復していることをMTT法で確認した。(2)in vitro実験:これをBDF1マウスに腹腔内投与し、2日後にDoxorubicinを腹腔内投与すると、antisenseの投与量依存性に有意に生存期間が延長した。以上の結果を日本小児血液学会(1993,1994,1995年)、日本癌学会(1996年)、米国血液学会(1993,1994年)で報告した。
再灌流時におけるスーパーオキサイドとEDRF(NO)の相互作用と組織障害性

最終年度は心筋細胞の収縮性と細胞内Ca^<2+>へのONOO^-の影響を検討した。0.2mMONOO^-添加により、培養心筋細胞の自動拍動は、12分で弛緩状態で停止した。同時に記録した細胞内Ca^<2+>は、拍動の停止時に収縮期レベルに達し、さらに緩やかな上昇を示した。通常、心筋細胞は細胞内Ca^<2+>が収縮期レベルまで上昇するとオシレーションや拘縮を起こす。しかし、この実験では、オシレーションや拘縮もみられなかった。この結果から、ONOO^-による障害として、細胞内Ca^<2+>の上昇に加えて収縮の異常も生じることが判明した。細胞内Ca^<2+>の上昇には、細胞膜を介し細胞外からCa^<2+>が流入する場合と筋小胞体などからのCa^<2+>放出がある。両者の関与を無Ca^<2+>外液を用い検討した。無Ca^<2+>外液では、ONOO^-による細胞内Ca^<2+>の上昇が抑制され、細胞膜を介するCa^<2+>流入により、細胞内Ca^<2+>上昇が起こることがわかった。さらに細胞膜を介するCa^<2+>流入のメカニズムとして細胞膜脂質によるものとCa^<2+>チャンネルやNa^+/Ca^<2+>交換系などのCa^<2+>輸送蛋白によるものを区別する目的で細胞膜の膜流動性および過酸化脂質量を(ONOO^-添加5分後)測定した。膜流動性は、0.32±0.02×10^<-8>cm^2/secから0.32±0.02×10^<-8>cm^2/secと変化を示さなかった。また、過酸化脂質量も0.17±0.03nmol/mg proteinから0.15±0.02nmol/mg proteinと有意な変化を示さなかった。このことから、ONOO^-による細胞内Ca^<2+>の上昇には、細胞膜脂質より膜蛋白が関与すると考えられた。また細胞膜のCa^<2+>輸送蛋白についてはCa^<2+>チャンネルブロッカーであるVerapamilの影響により検討した。50μMVerapamilの前添加で、ONOO^-による細胞内Ca^<2+>の上昇は抑制された。以上よりONOO^-による細胞内Ca^<2+>上昇の機序は、Ca^<2+>チャンネルやNa^+/Ca^<2+>交換系などのCa^<2+>輸送蛋白を障害すると結論出来た。