hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イヌの変性性脊髄症における神経変性メカニズムの解明と抗体療法の前臨床試験

本研究の目的は、犬の変性性脊髄症(DM)の原因を明らかにし、新しい治療法を開発することである。DMに罹患した犬の脊髄を用いた病理検査の結果から、病変形成の初期段階からミクログリアと呼ばれる炎症細胞が多数出現していることが明らかになった。ミクログリアは神経細胞に対して障害性のサイトカインを産生していると考えられ、そのためミクログリアの活性化を抑える治療法が有効であると考えられた。本研究では、DMの原因遺伝子から産生される異常蛋白に特異的に結合する抗体を作製した。神経細胞死を引き起こすミクログリアの活性を抑え、DMの進行を止める抗体療法の確立を目指している。本研究の目的は,変性性脊髄症(DM)における神経細胞死の分子病態メカニズムを解明し、活性型ミクログリアの制御に着目したDMに対する分子標的治療の有効性を明らかにすることである。H24年度は計画を一部変更し、イヌ変異型SOD1蛋白特異的モノクローナル抗体の作製を開始した。野生型および変異型(E40K)リコンビナントイヌSOD1蛋白をそれぞれマウスに免疫し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを33株作製した。これら33株から、イヌ変異型SOD1蛋白特異的抗体産生クローンをELISA法により5株選択した。それぞれのモノクローナル抗体を用いて、イヌ野生型および変異型SOD1遺伝子導入培養細胞に対する免疫染色により、イヌ変異型SOD1蛋白に対し特異性の高いモノクローナル抗体産生クローン2株が得られた。また、SOD1遺伝子型が正常型ホモ接合体、ヘテロ接合体、変異型ホモ接合体を有する剖検脊髄を使用し、抗体の特異性の検証を開始した。モノクローナル抗体作製時に得られたポリクローナル抗体による免疫染色では、変異型ホモ接合体症例の脊髄神経細胞内にはSOD1陽性の凝集体様構造物が検出され、変異型SOD1蛋白の凝集がDMの病態発生に関与している可能性が示された。DM剖検脊髄からのミクログリアの分離と培養は手法がまだ確立されていないため、H25年度に引き続き継続する。H24年度はDM症例の剖検および病理組織学的検査を11例実施し、組織学的知見の蓄積を行っている。これらの情報は、抗体療法を実施する際の非治療群の情報として活用される。また、これらの症例からの脊髄および脳組織はH25年度以降に行う抗体のスクリーニングや病態解明の解析に使用する。H25年度は計画を一部変更し、H24年度に作製したイヌ変異型SOD1蛋白特異的モノクローナル抗体のスクリーニングを継続し、ミクログリアの活性化を制御可能な抗体の検索を行なった。H24年度にELISA法により選抜した5抗体のうち、イヌ変異型SOD1蛋白に対する特異性が高いと判断されたモノクローナル抗体をイヌ野生型および変異型SOD1遺伝子導入培養細胞およびDM剖検症例脊髄組織の免疫沈降およびWestern blottingにより解析した。これらの抗体にはリニアおよびコンフォメーショナルなエピトープが含まれることが示された。また、DM剖検症例の免疫組織化学的解析では、変異型SOD1蛋白が神経細胞以外にもアストロサイトやミクログリアに蓄積していることが明らかとなった。このことは、グリア細胞が神経変性に深く関与していると考える根拠となり、ミクログリアの活性化を抑制することで、神経変性を制御できる可能性を示している。H25年度はDM症例の剖検および病理組織学的検査を12例実施し、組織学的知見の蓄積を行っている。一方、DM剖検症例脊髄からのミクログリアの分離と培養技術は確立できていないため、H26年度に引き続き継続する。本研究の目的は、変性性脊髄症(DM)における神経細胞死の分子病態メカニズムを解明し、活性型ミクログリアの制御に着目したDMに対する分指標的治療の有効性を明らかにすることである。H26年度は、DM剖検例の脊髄組織における活性型ミクログリアの分布および神経障害因子の産生について解析を行なった。DMの脊髄では、神経変性に先立ち、活性型ミクログリアが出現し、神経障害因子の産生が認められた。脊髄病変において、活性型ミクログリアと活性型アストロサイトが集蔟するが、変異型SOD1タンパクは変性神経細胞と活性型アストロサイトに高度に蓄積していることが明らかとなった。また、本研究で作製した犬変異型SOD1タンパク特異的抗体を用い、DMの初期病態を反映すると考えられるSOD1へテロ接合体の脊髄組織を解析した結果、変異型SOD1タンパクは変性神経細胞には蓄積せず、集蔟した活性型アストロサイトに蓄積することが明らかになった。また、ごく初期の脊髄変性病変においても、活性型ミクログリアの集蔟が認められた。

このことから、DMにおける神経変性の初期病態において、アストロサイトへの変異タンパクの蓄積と活性型ミクログリアの集蔟が重要であると考えられる。一方、H26年度に計画していた活性型ミクログリア制御に用いる犬変異型SOD1タンパク特異的抗体の選出と同抗体のイヌキメラ化、実験犬およびDM症例における安全性試験は、DM由来ミクログリアの培養系の確立が難航したため、目標達成には至らなかった。ミクログリア培養系の代替案として、iPS細胞を用いたDM疾患特異的神経細胞およびミクログリア培養系の確立を今後計画している。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医臨床神経病学26年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度はDM症例からのミクログリアの分離を行い、DM病態発生における活性型ミクログリアの役割について検討する予定であったが、技術的な問題から分離法はまだ確立できていない。そのため、計画の一部を変更しイヌ変異型SOD1蛋白特異的モノクローナル抗体の作製を開始した。現在までに変異型蛋白に対し特異性の高い抗体が得られており、H25年度以降の研究に活用できると思われる。H25年度はDM症例からのミクログリアの分離を行い、DM病態発生における活性型ミクログリアの役割について検討する予定であったが、技術的な問題からDM症例からのミクログリアの分離法はまだ確立できていない。そのため、計画の一部を変更しイヌ変異型SOD1蛋白特異的モノクローナル抗体の特性解析を進めた。現在までに変異型蛋白に対し特異性の高い抗体が得られており、それらの一部にはSOD1のミスフォールディングにより生じるコンフォメーショナルエピトープを認識している可能性がある。また、脊髄の免疫組織学的解析では、アストロサイトやミクログリアに蓄積する変異蛋白の存在を証明することができたため、ミクログリアの活性化制御による我々の治療戦略を後押しする重要なデータが得られた点では、大きく前進したと言える。現在までに取り組んでいるDM剖検脊髄からのミクログリアの分離はH25年度も継続する予定である。分離法が確立できない場合には、イヌキメラモノクローナル抗体の作製を進め、早期に実験犬に対する髄腔内投与の安全性試験を開始できる準備にとりかかる。現在までに取り組んでいるDM剖検脊髄からのミクログリアの分離はH26年度も継続する。分離法が確立できない場合には、DM症例からの疾患特異的iPS細胞の樹立とミクログリアの分化誘導も視野に入れている。また、イヌキメラモノクローナル抗体の作製を進め、早期に実験犬に対する髄腔内投与の安全性試験を開始する。臨床例に対する安全性試験は症例数と観察期間を減らし、予備試験として実施する予定である。物品費に計上した予算の一部端数が生じた。H26年度の物品費に充当する。
英語における結果表現の語彙・構文論的分析

Goldberg (1995)の主張とは異なり、結果表現は基体となる動詞が他動詞か自動詞かにより区別されるべきである。前者では動詞に後続する名詞句がforceの受け手であるが、後者ではそうなっていない。また、結果表現は様々な意義がネットワーク構造を成していることも判明した。この事実を捉えるためには、抽象度の低いレベルの構文により結果表現を取り扱うべきである。Goldberg(1995)は、He hammered the metal flat(He hammered the metal)のように動詞がもともと目的語を取れるタイプの結果表現と、He laughed himself silly(^*He laughed himself)のように動詞が目的語を取れないタイプとを統一的に説明できるとしている。しかし他動詞に基づく結果表現と自動詞に基づく結果表現を詳しく調べてみると、両者はやはり区別すべきことが判明した。2.一方、自動詞に基づく結果表現では、目的語位置に生じる物体はforce-recipientになっていない。例えばHe cried his eyes outにおいて、彼は目に一切触れていなくてもよいのだから、forceを伝達しようがない。一年目の研究から、He laughed his head offのような自動詞に基づく結果表現はHe wiped thetable cleanのような他動詞に基づく結果表現と異なり、目的語位置に生じる物体がforce-recipientになっていないことが判明した。しかし、ではどのように動詞の表わす事象と結果状態が関連しているかを調べていった結果、思いがけないことが分かってきた。1.He laughed his head offにおいて、大笑いするとheadが揺れるためにhis head offという結果状態が引き起こされると捉えている。つまりbody-internal motionにより結果状態が引き起こされていることになる。ここまでは一年目の研究からもある程度予測出来る範囲であった。2.ところがHewondered his head offやHe shouted his head offのように、厳密にはこの説明をそのままあてはめられない実例が多数見つかった。これらの例は、「頭を激しく動かす」→「頭を使う」、「頭を激しく動かす」→「大声を出す」のような語用論的知識に基づく拡張用法であると考えられる。そしてV one' s head offという結果表現は、語彙項目と同じように多義ネットワークを成していることになる。これはつまり、結果表現も語彙項目と同じように長期記憶に蓄えられていることを意味する。使用依拠(usage-based)モデルの考え方を突きすすめれば、これは寧ろ当然のことであり、語彙・構文論的アプローチの妥当性を裏付けてくれる。しかしGoldbergをはじめとして、多くの学者が使用依拠(usage-based)モデルの見方を採用していると言いながらも、この事実とは相いれない主張をしてきている。この発見は、従来の結果表現に対する見方に根本的な修正を迫るものである。従来の結果表現に対する見方に根本的な修正を迫るような発見があった。語彙・構文論的アプローチの根本的な考え方を支持する発見であることから、その方向性が正しいことが確認出来ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの成果を踏まえて、さらに他のタイプの結果表現にも、これまでに明らかになったことが当てはまるかどうかを検証していきたい。
皮膚免疫応答の制御による、食物アレルギーの感作抑制と免疫療法への応用

経皮感作による食物アレルギーモデルにおいて、皮膚炎症の増強または軽快が、既に発症した食物アレルギー症状に与える影響について検討を行った。経皮感作を行い、抗原を経口負荷しアレルギー症状の誘発を確認した後、皮膚炎症状を増悪させるアジュバント(MC903)の塗布、もしくは皮膚炎治療としてステロイド(DEX)を一定期間塗布し、その後2回目の経口抗原投与により誘発される食物アレルギー症状の推移を比較検討した。MC903塗布継続群では、表皮肥厚と真皮の細胞浸潤を認め、皮膚炎増強が確認され、2回目の経口抗原投与で誘発症状の増強を認めた。非感作部位に機械刺激を行った皮膚炎症群でも、2回目の誘発症状が増強された。皮膚炎増強群では血清中mmcp-1が、経口抗原投与前後とも高値を示し、マスト細胞の活性化持続が、抗原への反応増強に作用している可能性が考えられた。また腸管粘膜では好酸球浸潤の増加がみられた。ステロイド塗布群では、皮膚炎症状の軽快とともに2回目の誘発症状増強が軽減され、mmcp-1の低下と皮膚・腸管粘膜の好酸球浸潤の減少がみられた。皮膚炎増強群皮膚のmRNA発現について解析した結果では、Mcpt8やTSLP、IL-4の増強を認め、好塩基球やTh2サイトカインの関与が示唆された。各群の測定ではTSLPはMC903塗布継続で増強を認めたが、mcpt8、IL-4、IL-3はDEX前塗布により増強が抑制された。経皮感作による食物アレルギーモデルでは、食物アレルギー発症後の皮膚症状が、その後の経口投与による誘発症状の推移に影響を与える可能性が有ると考えられた。その機序として皮膚炎症局所における好塩基球が、腸管のマスト細胞活性化や好酸球浸潤に関与している可能性が示唆された。皮膚症状への治療介入が食物アレルギーの誘発症状の軽減につながる可能性が考えられた。上記の結果について論文を作成し発表した。これまでに作成した経皮感作による食物アレルギーモデルマウスにおいて、皮膚症状への介入が既に発症した食物アレルギーの誘発症状の推移に影響を与えることが証明できた。アジュバント塗布による皮膚炎のみでなく、抗原非感作部位への機械的刺激でも同様に食物アレルギー症状の増強を認め、またアトピー性皮膚炎などの治療に用いるステロイド塗布では皮膚炎症状の軽快とともに、誘発症状も軽減が認められた。機序についての解析では、皮膚炎増強群において経口抗原投与前後ともにmmcp-1の上昇がみられ、皮膚では表皮肥厚と真皮の好酸球を含む細胞浸潤を認め、また腸管粘膜の好酸球浸潤増加がみられた。ステロイド介入群では、皮膚炎症の抑制の他、腸管好酸球浸潤の減少と、血清mmcp-1上昇の抑制が認められた。さらに皮膚のmRNAの解析では、皮膚炎増強群でTSLPやIL-4のTh2サイトカインの他、好塩基球に特異的とされるMcp8の増強がみられ、各群についてrealtime PCRで測定を行い、TSLPはMC903継続の皮膚炎群で増強し、mcpt8、IL-4、IL-3はDEX前塗布で増強の抑制が確認された。皮膚炎症状の増強が食物アレルギー症状に影響を及ぼす機序として、局所の好塩基球が、腸管粘膜の好酸球やマスト細胞の活性化に作用している可能性を見出すことができた。経皮感作食物アレルギーモデルにおいて、アジュバント塗布により皮膚炎症と食物アレルギー誘発症状が増強されたものと、ステロイド塗布でこれが軽減されたものにおいて、皮膚局所と腸管粘膜のmRNA発現についてさらに解析を進める。すなわち、皮膚炎増強や治療介入により皮膚局所で変化がみられる因子を見出すとともに、あわせて変化がみられる腸管粘膜のmRNAについても検索していく。消化管指向性のホーミングにかかわる接着分子やケモカインレセプター発現制御に関わる因子についても評価を行う。発現量の増加がみられた因子の産生を抑制する阻害剤を用いることで、誘発症状が抑制されるかを検討し、経皮感作による食物アレルギーの発症や増強予防につながる標的分子を明らかにしていく。さらに標的分子を抑制する薬剤とともに経皮抗原感作を行うことで、抗原特異的な免疫療法効果が得られるかを検証する。免疫療法効果が得られた場合、経口免疫寛容の成立・維持に中心的役割を果たすとされる腸間膜リンパ節のリンパ球サブセットをフローサイトメトリーで解析し、制御性T細胞等の誘導について評価するとともに、in vitroで再刺激をして培養し、抗原特異的なIL-4、IL-10、IFNγ等のサイトカイン産生パターンの変化を解析する。さらに血清中の抗体価やサイトカイン等について合わせて検討し、免疫療法の治療効果モニタリングに利用可能なバイオマーカーの同定を試みる。実際の臨床においても応用可能かを検討していく。これまでに樹立した経皮感作による食物アレルギーモデルを用い、皮膚炎症の増強、または軽快が、既に発症した食物アレルギー症状に与える影響について検討を行った。経皮感作を成立させ、経口抗原負荷でアレルギー症状の誘発を確認した後、皮膚炎症状を増悪させるアジュバント(活性化ビタミンD3アナログ:MC903)の塗布や機械的刺激を行い、もしくはアトピー性皮膚炎の治療に用いるステロイドを一定期間塗布し、その後2回目の経口抗原投与により誘発される食物アレルギー症状の推移を比較検討した。MC903塗布を継続した群では、表皮の肥厚と真皮に好酸球を含む細胞浸潤を認め、皮膚炎症状の増強が確認された。さらに2回目の経口抗原投与では誘発症状の増強を認めた。非感作部位への機械刺激による皮膚炎症群でも2回目の誘発症状は増強された。

皮膚炎増強群ではマスト細胞の活性化マーカーとされる血清中mmcp-1が、経口抗原投与前、後ともに高値を示し、マスト細胞の活性化が維持され抗原への反応性が増強している可能性が考えられた。腸管粘膜では好酸球浸潤の増加もみられた。ステロイド塗布群では、皮膚炎症状の軽快とともに2回目の誘発症状増強が軽減され、mmcp-1の低下と皮膚・腸管粘膜の好酸球浸潤の減少がみられた。経皮感作による食物アレルギーモデルでは、食物アレルギー発症後の皮膚症状が、その後の経口投与による誘発症状の推移に影響を与える可能性が有ると考えられた。その機序として皮膚炎症状が、局所だけでなく、腸管におけるマスト細胞や好酸球等にも影響を与えている可能性が示唆された。皮膚炎増強群の皮膚におけるmRNA発現についてGeneChipを用いて網羅的に解析した結果では、Mcpt8やTSLP、IL-4等の増強を認め、好塩基球やTh2サイトカインの関与が示唆された。今後さらに解析を進め、免疫学的機序について解明していく方針としている。これまでに確立した経皮感作による食物アレルギーモデルマウスを用い、皮膚症状への介入が、一度発症した食物アレルギーの誘発症状推移に影響を及ぼすことが確認できた。すなわち、アジュバントや機械的刺激による皮膚炎症の増強に伴い、経口投与時にみられる即時型アレルギー症状の増強を認めたが、ステロイド治療を施したものでは、皮膚炎症状が改善されたのみでなく、同時に誘発症状増強の軽減が得られた。機序については、皮膚局所と腸管の組織変化を観察するとともに、血清中因子について解析を行った。皮膚炎増強群において経口抗原投与前、後ともにmmcp-1の上昇がみられ、また皮膚局所では表皮の肥厚と真皮の細胞浸潤、好酸球浸潤を伴う皮膚肥厚の増強を認め、さらに腸管でも好酸球浸潤の増加を認めた。ステロイド介入群では、皮膚炎症の抑制のみならず、腸管の好酸球浸潤の減少と、血清mmcp-1上昇の抑制が認められた。皮膚炎症の持続は局所のみならず、腸管の好酸球やマスト細胞にも影響を及ぼす可能性が示唆された。29年度は、研究中断期間であったため研究は実施していない。30年度以降は、産前産後休暇および育児休業取得による補助事業期間延長申請を行い、研究計画を実施する予定である。経皮感作による食物アレルギーモデルにおいて、皮膚炎症の増強または軽快が、既に発症した食物アレルギー症状に与える影響について検討を行った。経皮感作を行い、抗原を経口負荷しアレルギー症状の誘発を確認した後、皮膚炎症状を増悪させるアジュバント(MC903)の塗布、もしくは皮膚炎治療としてステロイド(DEX)を一定期間塗布し、その後2回目の経口抗原投与により誘発される食物アレルギー症状の推移を比較検討した。MC903塗布継続群では、表皮肥厚と真皮の細胞浸潤を認め、皮膚炎増強が確認され、2回目の経口抗原投与で誘発症状の増強を認めた。非感作部位に機械刺激を行った皮膚炎症群でも、2回目の誘発症状が増強された。皮膚炎増強群では血清中mmcp-1が、経口抗原投与前後とも高値を示し、マスト細胞の活性化持続が、抗原への反応増強に作用している可能性が考えられた。
銅基形状記憶合金の集合組織制御に関する研究

銅基形状記憶合金は安価であるが、疲労強度特性が悪く実用上の障害となっている。そこで、この合金の集合組織をコントロ-ルし、各結晶粒の方位を整えたシャ-プな集合組織を得ることによって、これを改善しようとするのが本研究の目的である。まず、β相銅基合金(bcc構造)を対象に、任意の塑性加工を与えたときに発達する変形集合組織を予測する理論の定式化とその計算機シミュレ-ション・プログラムの開発を試みた。多結晶体の各結晶粒に指定される変形テンソル成分のいくつかの束縛が弱められるという「Relaxed Taylorモデル」にもとづく結晶回転を求める問題を、制約付きの非線最適化問題を考え、回転テンソルφjiを一義的に求め得る数学的技法の定式化と、それにもどつく集合組織予測計算機プログラムの開発に成功した。開発したプログラムは任意の塑性加工パラメ-タを入力すれば、極点図の形で出力できるものであり、銅基形状記憶合金の集合組織制御を行う上での重要な情報を提供するものであることが確認された。本研究では、つぎに、12%Al、5%NiおよびMnとTiを少量含む銅基形状記憶合金のインゴットを作製し、これを600°Cと900°Cの熱間圧延を行ったときの集合組織発達過程をX線極点図を測定することによって詳細に検討した。その結果、600°Cで熱延したさいに、高圧下率において比較的シャ-プな集合組織が得られ、粒界破壊の防止に有効な整合粒界頻度が多少高い試料が得られることが判った。しかし、鮮鋭な単一成分で構成されるような集合組織をもつ試片を作り出すプロセスに関しては明確な解明が得られなかった。本研究では、まず、銅基β相合金(bcc構造)の変形集合組織とそれが変態することによって発達する形状記憶合金の変態集合組織の形成を、古典的Taylorモデルを拡張した新しい結晶塑性論に基づき定量的に予測する電子計算機プログラムの開発を試みた。その結果、合金の各結晶粒の変位勾配テンソルのいくつかが指定され、かつそれらの変位勾配テンソル成分に適合するような変態バリアント選択則を仮定すればそれらパラメータを入力として、銅基β相合金の変形及び変態集合組織を定量的極点図の形でシミュレートできることがわかった。つぎに、Cu-14%Al-4%Ni合金のブロックから、熱間圧延用素板を切り出し、初期集合組織の極点図をX線で正確に決定した。その後これを出発点として、各熱延過程中の各段階で発達する変形集合組織を実測した。本研究で開発した集合組織予測プログラムに、実験で採用した各種の加工パラメータを入力してシミュレーショトされた集合組織と、実測された各変形段階における集合組織を比較した結果、比較的良い一致がみられることが判明し、開発した予測プログラムの有効性を確認することができた。ただし、計算機シミュレーション及び実験で得られた集合組織はかなり鮮鋭ではあるが、一定結晶軸を中心とした回転分散を有する、いわゆる線維組織的なものである。本研究では、合金の各結晶粒の方位をそろえ、対称性の高い整合粒界の存在頻度を大きくすることを目指している。そのためには、単一方位成分で構成される集合組織の発達する加工及び熱処理条件を見い出す必要がある。現在、例えば、圧延加工では板の幅方向のひずみを考慮すると、集合組織が単一の方位成分で構成されるようになることを示唆する結果が得られているが、この辺の問題につき、さらに次年度くわしく検討する予定である。

まず、β相銅基合金(bcc構造)を対象に、任意の塑性加工を与えたときに発達する変形集合組織を予測する理論の定式化とその計算機シミュレ-ション・プログラムの開発を試みた。多結晶体の各結晶粒に指定される変形テンソル成分のいくつかの束縛が弱められるという「Relaxed Taylorモデル」にもどづく結晶回転を求める問題を、制約付きの非線最適化問題を考え、回転テンソルφjiを一義的に求め得る数学的技法の定式化と、それにもとづく集合組織予測計算機プログラムの開発に成功した。開発したプログラムは任意の塑性加工パラメ-タを入力すれば、極点図の形で出力できるものであり、銅基形状記憶合金の集合組織制御を行う上での重要な情報を提供するものであることが確認された。本研究では、つぎに、12%Al、5%NiおよびMnとTiを少量含む銅基形状記憶合金のインゴットを作製し、これを600°Cと900°Cの熱間圧延を行ったときの集合組織発達過程をX線極点図を測定することによって詳細に検討した。その結果、600°Cで熱延したさいに、高圧下率において比較的シャ-プな集合組織が得られ、粒破壊の防止に有効な整合粒界頻度が多少高い試料が得られることが判った。しかし鮮鋭な単一成分で構成されるような集合組織をもつ試片を作り出すプロセスに関しては明確な解明が得られなかった。
部位特異的突然変異をもちいたpH変動による筋収縮Ca感受性変化の分子機構の解明

横紋筋収縮のCa感受性は酸性pHで低下するが、その感受性は筋肉のタイプにより異なり、心筋>骨格筋速筋>骨格筋遅筋の順であることが知られている。我々はこれまでの研究において、独自に開発した筋原繊維内トロポニンサブユニット分子交換法をもちいて、骨格筋速筋と骨格筋遅筋の間にみられる酸性pH感受性の違いがトロポニンによってもたらされていることを明らかにした。本研究では、さらに各種筋肉におけるトロポニンサブユニットのアイソフォームのpH感受性における役割を明らかにするとともに、異なるpH感受性を与える分子内の部位あるいは領域を特定することによって、pHによる筋収縮Ca感受性修飾の分子機構を明らかにすることを目的にした。そのためには、各種筋肉のトロポニンサブユニットの部位特異的ミュータントを作成する必要があると考え、トロポニンサブユニットcDNAクローニングをおこなってた。これまでにニワトリ速筋トロポニンT・I・Cサブユニット、ヒト心筋トロポニンT・I・Cサブユニットに対するcDNAのクローニングに成功した。今回の研究によって、pH感受性にはトロポニンTは関係せず、トロポニンIとCの両方が関与していることが明らかになった。トロポニンCには心筋と速筋の2種類のアイソフォームがあるが、心筋アイソフォームは速筋にものより高い酸性pH感受性を与えるとが明らかになった。一方、トロポニンIには心筋、速筋と遅筋の3種類があるが、pH感受性に関しては心筋と速筋のあいだに差はなく、遅筋アイソフォームはそれらに比べて低いpH感受性を与えるというユニークな性質をもつことが明らかになった。現在ひきつずき、これまでに得られている心筋と速筋のトロポニンCcDNAを使ったミュータジェネシスにより、これらの異なるpH感受性を与える分子内の部位あるいは領域の特定を行っている。脊椎動物横紋筋(心筋および骨格筋速筋・遅筋)収縮のCa_<2+>制御は細い繊維上に周期的に分布する特異的なタンパク質であるトロポニン(Tn)によってなされている。Tnは三つの異なるサブユニット(T,I,C)からなり、Ca_<2+>がTnCに結合するとアクチン-ミオシン相互作用に対するTnIの抑制作用が源弱し、TnTとの共同作用によりCa2+濃度依存的に収縮が惹起される。従来の研究から、横紋筋収縮のCa2+感受性は酸性pHで低下すること、またそのCa_<2+>感受性低下の大きさは筋肉の種類によって異なり心筋>骨格筋速筋>骨格筋遅筋の順であることが知られている。我々はこれまでに独自に開発した筋原繊維内TN分子交換法を用いて、骨格筋の速筋と遅筋および心筋の間に見られるアシドーシス感受性の違いがどのTnアイソフォームに依存しているかをすでにあきらかにした(投稿準備中)。さらに、Tnサブユニットの様々な部位特異的ミュータントを作製し、酸性pHによる筋収縮Ca_<2+>感受性変動におけるTnサブユニットの分子内特定部位の役割を明らかにするため、各種筋肉TnサブユニットのcDNAクローニングをすすめている。ひきつずき残りのTnサブユニット、特にpH感受性において重要な役割りをになっていることが明らかになった遅筋TnIのクローニングを試みる予定である。横紋筋収縮のCa感受性は、酸性pHで低下するが、その感受性は筋肉のタイプにより異なり、心筋>骨格筋速筋>骨格筋遅筋の順であることが知られている。我々はこれまでの研究において、独自に開発した筋原繊維内トロポニンサブユニット分子交換法をもちいて、骨格筋速筋と骨格筋遅筋の間にみられれる酸性pH感受性の違いがトロポニンによってもたらされていることを明らかにした。

本研究は、さらに各種筋肉におけるトロポニンサブユニットのアイソフォームのpH感受性における役割を明らかにするとともに、異なるpH感受性を与える分子内の部位あるいは領域を特定することによって、pHによる筋収縮Ca感受性修飾の分子機構を明らかにすることを目的にしている。そのために、各種筋肉のトロポニンサブユニットの部位悔いてき特異的ミュータントの作成する必要があると考え、現在トロポニンサブユニットcDNAクローニングをおこなっている。これまでにニワトリ速筋トロポニンT・I・Cサブユニット、ヒト心筋トロポニンT・I・Cサブユニットに対するcDAのクローニングに成功している。これまでの研究によって、pH感受性にトロポニンTは関係せず、おそらくトロポニンIとCの両方が関与していることが明らかになった。(トロポニンCには心筋と速筋の2種のアイソフォームがあるが、心筋アイソフォームは速筋アイソフォームより高い酸性pH感受性を与える。一方、トロポニンIには心筋、速筋と遅筋の3種があるが、酸性pH感受性に関しては心筋と速筋のあいだに差はなく、遅筋アイソフォームはそれらに比べて低いpH感受性を与えるというユニークな性質をもつ。)。そこで今後、得られている心筋と速筋トロポニンCのcDNAを使ってミュータジェネシスをおこなうとともに、まだ成功していない遅筋トロポニンのサブユニットのcDNAクローニングを試みる予定である。横紋筋収縮のCa感受性は酸性pHで低下するが、その感受性は筋肉のタイプにより異なり、心筋>骨格筋速筋>骨格筋遅筋の順であることが知られている。我々はこれまでの研究において、独自に開発した筋原繊維内トロポニンサブユニット分子交換法をもちいて、骨格筋速筋と骨格筋遅筋の間にみられれる酸性pH感受性の違いがトロポニンによってもたらされていることを明らかにした。本研究では、さらに各種筋肉におけるトロポニンサブユニットのアイソフォームのpH感受性における役割を明らかにするとともに、異なるpH感受性を与える分子内の部位あるいは領域を特定することによって、pHによる筋収縮Ca感受性修飾の分子機構を明らかにすることを目的にした。そのためには、各種筋肉のトロポニンサブユニットの部位特異的ミュータントを作成する必要があると考え、トロポニンサブユニットcDNAクローニングをおこなってた。これまでにニワトリ速筋トロポニンT・I・Cサブユニット、ヒト心筋トロポニンT・I・Cサブユニットに対するcDNAのクローニングに成功した。今回の研究によって、pH感受性にはトロポニンTは関係せず、トロポニンIとCの両方が関与していることが明らかになった。トロポニンCには心筋と速筋の2種類のアイソフォームがあるが、心筋アイソフォームは速筋にものより高い酸性pH感受性を与えるとが明らかになった。一方、トロポニンIには心筋、速筋と遅筋の3種類があるが、pH感受性に関しては心筋と速筋のあいだに差はなく、遅筋アイソフォームはそれらに比べて低いpH
II-VI/III-V族化合物半導体ヘテロ接合界面歪および欠陥の評価

半導体材料中にはいろいろな欠陥が存在しているが,化合物半導体を考えると,特に格子欠陥やヘテロ接合界面領域に存在する欠陥および界面歪などが重要である.本研究では,これらヘテロ界面近傍に局在する欠陥や界面歪を, 3d遷移金属不純物ルミネッセンス法という分光学的手法によって評価することを目的としている.この方法は,すでにGaAs結晶中の総視的評価においてその有用性が確認されており,本研究では, GaAs結晶基板上にOMVPE法でエピタクシャル成長させたZnS_xSe_<1-x>/GaAs:Crヘテロ接合に適用し,その界面領域に存在する歪の測定を行い, S組成依存性を詳しく調べた.試料としてS組成の異なる一連のZnS_xSe_<1-x>/GaAs:Crヘテロ接合を作成し,ヘテロ界面におけるGaAs中のCrに対する発光スペクトルを測定した.この結果,格子不整合の正,負にかかわらずCr発光線のピーク位置は高エネルギー側にシフトし,また線幅が増大していることがわかった.これらの実験結果は, GaAs基板結晶に圧縮性の2軸性応力が加わっていることを示しており,両半導体の格子定数における不整合によって生じる歪ではないことが明らかになった.実験データの解析より, ZnS_xSe_<1-x>/GaAsヘテロ界面には,従来より云われている格子不整合による歪ではなく,両半導体の熱膨脹係数の違いによって生じる歪が存在することが明らかとなった.即ち, GaAs基板上にZnS_xSe_<1-x>をエピタクシャル成長するときの成長温度から室温ならびに発光測定温度(4.2K)まで冷却すると,エピ膜の方が相対的に収縮し, GaAs基板には2軸性応力が加わるものと考えられる.このようなGaAs基板上の圧縮性の2軸応力の存在を考えると,一連の実験データがうまく説明できることがわかった.従って,エピ膜は単純なコヒーレント成長していないといえる.半導体材料中にはいろいろな欠陥が存在しているが,化合物半導体を考えると,特に格子欠陥やヘテロ接合界面領域に存在する欠陥および界面歪などが重要である.本研究では,これらヘテロ界面近傍に局在する欠陥や界面歪を, 3d遷移金属不純物ルミネッセンス法という分光学的手法によって評価することを目的としている.この方法は,すでにGaAs結晶中の総視的評価においてその有用性が確認されており,本研究では, GaAs結晶基板上にOMVPE法でエピタクシャル成長させたZnS_xSe_<1-x>/GaAs:Crヘテロ接合に適用し,その界面領域に存在する歪の測定を行い, S組成依存性を詳しく調べた.試料としてS組成の異なる一連のZnS_xSe_<1-x>/GaAs:Crヘテロ接合を作成し,ヘテロ界面におけるGaAs中のCrに対する発光スペクトルを測定した.この結果,格子不整合の正,負にかかわらずCr発光線のピーク位置は高エネルギー側にシフトし,また線幅が増大していることがわかった.これらの実験結果は, GaAs基板結晶に圧縮性の2軸性応力が加わっていることを示しており,両半導体の格子定数における不整合によって生じる歪ではないことが明らかになった.実験データの解析より, ZnS_xSe_<1-x>/GaAsヘテロ界面には,従来より云われている格子不整合による歪ではなく,両半導体の熱膨脹係数の違いによって生じる歪が存在することが明らかとなった.即ち, GaAs基板上にZnS_xSe_<1-x>をエピタクシャル成長するときの成長温度から室温ならびに発光測定温度(4.2K)まで冷却すると,エピ膜の方が相対的に収縮し, GaAs基板には2軸性応力が加わるものと考えられる.このようなGaAs基板上の圧縮性の2軸応力の存在を考えると,一連の実験データがうまく説明できることがわかった.従って,エピ膜は単純なコヒーレント成長していないといえる.
酵母細胞におけるカルシウムイオンによる細胞機能の調節

生理活性物質に対する細胞機能の応答現象は生理学上非常に重要な課題であり、特に外界刺激と応答の共役物質であるカルシウムイオンの重要性が指摘されてきた。本研究ではカルシウムイオンの細胞機能の調節機構における役割を明らかにするために酵母細胞を用いて遺伝生化学的研究を行なった。カルシウムイオンの結合蛋白質であるカルモジュリンを酵母細胞より精製し、抗体を作製することができた。この抗体を用いて免疫学的手法により、細胞周期におけるカルモジュリン量の変動を測定したところ、G2期が5M期にかけて増加し、細胞分裂後もと戻ることを明らかにした。細胞内のカルモジュリンの局在を間接蛍光抗体法で調べた結果、カルモジュリンの大部分は細胞内のアクチンと分布が同じであり、アクチンフィラメントに結合しているものと考えられる。これらの結果からカルモジュリンは細胞複製において、細胞骨格形成の制御に重要な役割をはたしていることがわかった。一方カルモジュリンの特異的阻害剤として知られているフルフェナジンに感受性および耐性突然変異株を多数分離し遺伝学的解析を行なった。その中でフルフェナジン耐性温度感受性株は制限温度下では、細胞は細胞周期のG2期で停止するが、培地中に過剰なカルシウムイオンを加えると細胞増殖が回復することがわかった。この結果はG2期にカルシウムイオンを介してカルモジュリンによって制御されている機構が働き、細胞周期はG2期からM期へと進行していくものと考えられる。以上の結果を総合するとカルシウムイオンは何らかの刺激によって細胞質へ動員され、カルモジュリンに結合し、細胞内骨格系に作用し、その構造変化をもたらし、細胞周期を制御しているものと考えられる。
金銀パラジウム製インレーに代わる電子レンジの4分間加熱で作る焼成インレー

1)パラジウム金属の高騰による金銀パラジウム合金の代用合金開発と2)電子レンジと電磁波吸収体の応用による鋳造操作を必要としない金属製修復物の作製(30分以内で完成)を本研究の目的として行ってきた。平成15年度装飾用に市販されている銀粘土(粘度と水)が、電子レンジの4分加熱で焼成ができることがわかった。また、YAGレーザによる表層金合金化、金粉末の塗布、低溶ガラスの圧接により、純銀でも鋳造用金銀パラジクム合金の耐変色性試験(JIS)に適合するほど向上することがわかった。平成16年度銀の粉末を0.7g、銅の粉末を0.15g、鉄の粉末0.15gとメチルエチルケトン0.20gをアマルガムミキサーで練和後、電子レンジで4分間焼成すると、圧縮強さは169MPaとなった。練成充填材のアマルガムに匹敵する強度まで向上した。今年度17年度は、焼成収縮率の改善を目的として実験を行った。銀粘土に含まれている銀の融点は965°Cであるが、これ以上の温度に数秒曝すことにより、表面のみ焼成して外形を整え、後にメーカー指示の焼成スケジュールにより、焼成を完了する二段焼成することにより、焼成収縮率を改善できると考えた。1)市販銀粘土を用いた収縮改善スタンダード(三菱マテリアル)とPMC(三菱マテリアル)については二段焼成では収縮率の改善がみられなかった。しかし、PMC3(三菱マテリアル)については1300°C5秒、後に750°C3分焼成することにより、2.5%まで収縮を抑えることができた。2)粒径1.5,2.5,5μmの銀粉末を用いた収縮改善○焼成させた試料を見てみると銀を添加させると、焼結後の試料が黄変していた。さらに銀添加量が30%を超えると焼結後の試料は銀色になっていた。○銀粉末の粒径1.5μmの焼成条件は700°C7分であった。同様に、銀粉末2.5μmと5μmは、800°Cと850°C7分であった。○二段焼成することにより、焼成収縮率を改善することができた。よって、金銀パラジウム合金の代用合金開発と2)電子レンジと電磁波吸収体の応用による鋳造操作を必要としない金属修復物の作製(30分以内で完成)することができることが分かった。金銀パラジウム合金の代用合金、また従来の鋳造方法を見直し、新しい修復用合金とインレーの作製方法について研究を行っている。電子レンジで焼成することにより金属を焼結させ、金属製修復物を鋳造操作無く短時間(30分以内)に作製することを考えた。今年度は1)金属粉末を電子レンジの加熱で焼成できるか?2)耐変色性を向上させる表面改質法はなにか?について実験を行った。1.金属粉末を電子レンジの加熱で焼成できるか?装飾品作製用として市販されている銀粘土(アートクレイ、相田化学工業)を用いた。

銀粘土は純銀粉末、バインダーおよび水で構成され、電子レンジで焼成することにより純銀となる。硬さと顕微鏡写真から、電子レンジによる銀粘土の適性な焼成時間は4分となった。2.耐変色性を向上させる表面改質法はなにか?37°C0.1%硫化ソーダ溶液中3日間浸漬後、(1)表層金合金化(耐変色性に優れた金板を圧接後レーザー照射し、表層のみ貴金属の含有率の高い合金とする)、(2)金粉末の塗布(銀粘土の上に金の粉末を降りかけ、電子レンジで焼成する)、(3)低溶ガラスの圧接(銀粘土の上に低溶ガラスを載せ電子レンジで焼成する)した表面の明度(L*)は73.54、68.54、78.53となり、電子レンジで焼成した銀の38.74と比較して大きな値を示し、鋳造用金銀パラジウム合金(JIS)に適合するほど耐変色性は向上した。3まとめ今年度の実験結果から、電子レンジの加熱により金属を焼成する方法、かつ耐変色性を向上させる表面改質法が明確になった。よって、金銀パラジウム合金の代用合金、また鋳造操作を必要としない金属製修復物の作製が可能であることがわかった。次年度以降は、銀、銅と鉄合金の粉末やアトマイズ法により作製した粉末を電子レンジで焼成し、機械的性質を測定する。1パラジウムの高騰による金銀パラジウム合金の代用合金開発と2電子レンジと電磁波吸収体の応用による鋳造操作を必要としない金属製修復物の作製(30分以内で完成)を本研究の目的としている。昨年度の一年目において、装飾用に市販されている銀粘土(銀粉末、紙粘土と水)は、電子レンジの4分加熱で焼成ができることがわかった。また、YAGレーザによる表層金合金化、金粉末の塗布、低溶ガラスの圧接により、純銀でも鋳造用金銀パラジウム合金の耐変色性試験(JIS)に適合するほど向上することがわかった。すなわち、鋳造操作を必要とせずに、金属製修復物を作成することができる。今年度、平成16年度では、金属の粉末として歯科用金属の基本となる銀と銅の粉末を、また腐食しやすいため、あまり歯科では用いられない鉄(表層金合金化するのでこの鉄でも可能)の純金属粉末やアトマイズ法にて作製した粉末を電子レンジで焼成し、機械的性質を測定した。実験の結果、1銀、銅と鉄粉末を電子レンジで4分間焼成すると、圧縮強さは93、13と18MPaとなった。2銀の粉末を0.7g、銅の粉末を0.15g、鉄の粉末0.15gとメチルエチルケトン0.20gをアマルガムミキサーで練和後、電子レンジで4分間焼成すると、圧縮強さは169MPaとなった。練成充填材のアマルガムに匹敵する強度まで向上した。3銀、銅および鉄の各純金属粉末を混合させたものを電子レンジで焼成したものの圧縮強さは、アトマイズ法により作製した粉末を電子レンジで焼成したもののよりも大きかった。今年度の実験より、圧縮強さが大きくなる銀、銅と鉄粉末の適正な配合率は銀70%、銅15%と鉄15%であることが明確になった。来年度は、焼成物の強度を増強させるために、粉末にパラジウムを加え同様の実験を行う。また、焼成収縮を抑える方法について検討する。1)パラジウム金属の高騰による金銀パラジウム合金の代用合金開発と2)電子レンジと電磁波吸収体の応用による鋳造操作を必要としない金属製修復物の作製(30分以内で完成)を本研究の目的として行ってきた。平成15年度装飾用に市販されている銀粘土(粘土と水)が、電子レンジの4分加熱で焼成ができることがわかった。
遠隔位にある不斉を識別する不斉蛍光誘導化試薬の開発とその展開

誘導化可能な官能基から遠隔位に不斉中心を持つ光学活性化合物のエナンチオマーの識別は不可能と考えられていたが、ゴーシュ効果、CH-π相互作用を巧みに利用したカルボン酸用不斉誘導化試薬、(R)-および(S)-2A-1P-OTf(1)と(R)-および(S)-1A-2P-OTf(2)(第一世代試薬)を開発し^1H-NMRではカルボキシル基から211位まで,HPLCでは28位までの分岐脂肪酸のエナンチオマーの識別に成功した。これら試薬は単結合の自由回転をゴーシュ効果を初めとする立体有機化学的要因で規制したものであるが、この規制は高々80%であることが分かったので、試薬分子自身が100%キラルなゴーシュ立体化学をもつ試薬、(R,R)-および(S,S)-2A-CH-OH(3)(第二世代)を開発した。3は^1H-NMRでは、1、2と同じ識別能であったが、HPLCでは224位までの識別が可能であることを見い出した。また、遠隔位に不斉をもつカルボン酸類の他、アルコール類の試薬として(R,R)-および(S,S)-2A-CH-COOH(4)及び3、4、6-O-Ac-2A-2d-β-Glu-Br(5)を開発し、メチル分岐アルコール類のエナンチオマーの超高感度識別法を開発した。さらに、分子内に2箇所以上の分岐を持つ脂肪酸の全光学異性体の識別も可能であることを明らかにした。天然物の絶対構造式決定への応用として、海洋性セラミド、およびガングリオシド類の絶対配置の決定を行なった。本年度は、先ず(S)-2-(アントラセン-2,3-ジカルボキシイミド)プロピルトリフルオロメタンスルホネート[(S)-2AP-OTf(I)]及び(S)-1-(アントラセン2,3-ジカルボシキイミド)2-プロピルトリフルオロメタンスルホネート[(S)-1A2P-OTF(II)]を合成し、I、IIのメチル・エチルでキラリティーをもつメチレン鎖の異なる光学活性カルボン酸のHPLCと^1H-NMRによる不斉識別能を研究した。その結果、(1)IはC2C8位までの不斉をHPLCで識別できるフェムトモルレベルでの検出可能、(2)(R)、(S)の溶出順序はキラル中心の奇数、偶数で逆転する、(3)^1H-NMRではC2C11まで識別でき、分岐メチルのケミカルシフトの差[(R)-(S)]の+、-がHPLCと同様、奇数、偶数で逆転する、ということが分かった。これらのことから、I、IIの脂肪酸エステルは期待通リゴーシュ効果で降り曲がったコンフォメーションをとり、CH-π相互作用によりメチレン鎖がアントラセンの上に規則正しく乗っていることが分かった。次に、光学活性トランスシクロヘキサン-1,2-ジオールを原料とした(R,R)-および(S,S)-2-(アントラセン-2, 3-カルボキシイミド)シクロヘキサノール試薬(III)の合成と、D-グルコースを原料とした6-デオキシ-6-(アントラセン-2,3-カルボキシイミド)-2,3,4-O-アセチル-α-D-グルコピラノシルイミデート(IV)の合成を行なった。I、IIはコンフォメーション解析の結果、ゴーシュ型をとる確率は高々80%であることがわかった。IIIは100%ゴーシュ型であるので、I、IIよりも優れたキラル識別能が期待でき、IVはカルボン酸以外にアルコール、アミンの誘導化が可能であるので、III、IVを用いた研究を行なう計画である。

第一世代の試薬として既にカルボキシル基から7位までのメチル分岐不斉をHPLCで識別できる2A1P-OTf,12位まで識別出来る1A2P-OTfを開発したが、本年度は更に遠隔位の不斉識別を期待して第二世代の試薬として光学活性な2-(アントラセン-2、3-ジカルボキシイミド)-シクロへキサノール(ACyH-OH、1)を開発した。1は期待通りカルボキシル基から17位までのアンテイソカルボン酸のエナンチオマーをHPLCで識別出来、フェムトモルレベルでの検出が可能であった。光学異性体間の溶出順序は12位までは全ての試薬とも同じ規則性であったが、1317位では規則が逆転することが分かった。1を用いてを用いて渦鞭毛藻から単利された新しいセラミドに含まれる脂肪酸の15位の分岐メチルの立体化学を(R)と決定した。*酸基から遠隔位にある不斉を識別する試薬として2、3、4-tri-O-アセチル-6-デオキシ-6-(アントラセン-2、3-ジカルボキシイミド)-α-D-グルコピラノシルブロミド(2)および2-(アントラセン-2、3-ジカルボキシイミド)シクロヘキシカルボン酸(3)を創製した。2,3ともは簡単なキラルアルコールを用いた実験では^1H-NMR,HPLC両者において良好なキラル識別能を有することを明らかとした。前年度(R,R)-及び(S,S)-2-(2,3-アントラセンジカルボキシイミド)シクロヘキサノールを開発し、2位から12位に分岐を持つアンテイソ脂肪酸の不斉識別について報告したが本年度は更に遠隔位に分岐をもつアンテイソ脂肪酸のエナンチオマー分離を検討した。興味あることに、13位より遠隔位に分岐をもつ脂肪酸は上記試薬で誘導体化するとODS(C18)カラムをでは18位までエナンチオマー分離が出来たがそれ以上は不可能であった。しかしC30カラムを用いたところ現在24位までにおエナンチオマー分離が可能であることを見いだした。また遠隔位に不斉をもつカルボン酸類の他、アルコール類の識別試薬として(R,R)-及び(S、S)-2-(2,3-アントラセンジカルボキシイミド)シクロヘキサンカルボン酸、及び3,4,6-トリ-0-アセチル-2-(ナフタレン-2、3-カルボキシイミド)-2-デオキシ-グルコピラノシル-β-ブロマイドを開発し、メチル分岐アルコールのエナンチオマーの分離研究を行なったところ、こららの試薬もカルボン酸用試薬と同様の能力が期待出来る結果を得た。更に、分子内に2箇所分岐をもつ脂肪酸の光学異性体の分離を試みたところ、シクロヘキサン試薬は2箇所の不斉中心を識別出来ることを明らかにした。
高性能担持体を用いるオンサイト処理による新規な海岸原油汚染土壌浄化法の研究開発

天然からの海水及び塩基性下で原油分解能を有する菌を用いて、この菌を担持して調製した浄化材を用いる海岸原油汚染土壌の浄化法について検討した。原油分解菌により、海水条件下で数種のPAHs(多環芳香族炭化水素)が分解できること、海岸原油(C重油)汚染土壌中のC重油が分解できること、分解菌(1種)を担持した浄化材により海岸土壌中の数種のPAHsが分解できることを見出した。さらに、2種の分解菌を担持した浄化材により海岸原油(C重油、アスファルト、A重油)汚染土壌が効率的に浄化できることを見出した。これらの結果を基に、原油分解菌を担持した浄化材を用いるオンサイト海岸原油汚染土壌浄化法を開発した。石油分解菌及び石油分解菌を担持した担持体を用いて、以下の結果を得た。(1)天然から選抜した石油分解菌によるPAHsの液体分解:海水条件下で石油分解菌(SM46)により多環芳香族炭化水素(PAHs),ベンゾ[a]ピレン(BP)(濃度20ppm)が分解できることを見出した(約30,40%分解(15,30日処理)。また、BPの分解経路も解明した。さらに、石油分解菌(NG007)による種々の塩濃度及びpH条件下で4種のPAHs混合物(アセナフテン,アントラセン,クリセン,BP)(各濃度12.5ppm)の分解を行い,全ての条件下でPAHsを分解(約8010%)出来ることを見出した。しかし、塩濃度及びpHが高くなるほど分解率の低下が見られた。(2)石油分解菌の組合せ(2種)及びその割合を明らかにした。(3)石油分解菌を担体させた担持体(浄化材)によるPAHs汚染土壌の浄化:複数の担体に石油分解菌(SM46)を担持後、BP(50ppm)汚染海岸土壌の浄化を行った。その結果、BPを分解[各々約40,60%(15,30日処理)]出来ることを見出した。また、浄化効率を高め得る一種の天然系担体を見出した。
(4)原油(C重油、1,000ppm)汚染海岸土壌の浄化の試み:担持体[石油分解菌(2種)]により、原油(C重油、1,000ppm)汚染海岸土壌が浄化[各々70%,86%(15,30日処理)]できることを見出した。また、浄化時に一種の栄養源を添加すると、浄化率が約20%増加(未添加に比べ)することも見出した。(1)石油分解菌からの担持体の作製及び浄化率を高める分解菌の組合せの検討、原油(C重油)汚染海岸土壌の浄化:数種の石油分解菌を数種の担体に担持(単独または混合)させて作製した担持体(浄化材)を用いて原油(C重油)汚染(1,000ppm)海岸土壌の浄化を行った。担体としてカッポクが最適であった。また、2種の分解菌(NG007, S133)を見出した最適割合で組合せた場合が最も高い浄化率(約80%,15日処理)であった。この浄化材を用いて原油(C重油)汚染(1,000ppm)海岸土壌が浄化(各々約83, 90%, 30, 60日処理)できた。また、浄化時の石油分解酵素の活性の経時変化も調べた。さらに、浄化時の原油(C重油)中の各成分の動態も明らかにした。(2)石油分解菌の土壌中及び土壌の種類による分解菌の成育状況:2種類の海岸土壌(砂質及び粘土質土壌)中での石油分解菌の成育を調べた結果、砂質土壌の方が分解菌の生育速度が速い(粘土質土壌の約1.31.5倍)ことを見出した。(3)浄化材を用いる原油(C重油)汚染海岸土壌の浄化条件の検討:高濃度の原油(C重油)汚染(15,000ppm)海岸土壌の浄化を行った結果、浄化率は各々約35, 40, 50%(30, 60, 120日処理)であった。浄化率を向上させるため、定期的に一種の栄養源を添加した結果、浄化率は約1.2倍1.3倍増加するとともに、分解菌の酵素活性は約1.31.5倍増加することを見出した。(4)石油分解菌によるPAHsの酵素分解:石油分解菌(SM46)からの粗酵素及び粗酵素を固定化した固定化酵素により海水条件下でベンゾ[a]ピレン(BP)(20ppm)が各々約3060%,約3080%分解(230日処理)できることを見出した。本年度の研究計画を実施し新規な成果を幾つか得た。(1)分解菌を担持させる最適の担体を見出した。(2)2種の分解菌を組合せると単独の分解菌よりも酵素活性が高くなり浄化率も高くなること、その最適組合せ割合も見出した。(3)この割合で2種の分解菌を担体に担持させて作製した担持体(浄化材)を用いて原油(C重油)汚染(1,000ppm)海岸土壌を浄化すると高い割合で浄化できることを見出した。浄化時間が長くなる程、酵素活性が低下することも見出した。