hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水銀を用いないエキシマ領域の紫外線による感染根管治療の確立

材料表面に様々な機能を付与することができる表面改質技術は重要であり,産業的に技術応用されているエキシマランプによる歯質表面の光表面改質について検討した.歯の歯冠部および歯根部ともにエキシマランプ照射によるぬれ性の向上が確認され,エキシマランプによるUV光照射は,歯質表面改質に有用であることがわかった.また,エキシマランプ照射後の歯質の強度特性を評価したところ,エキシマランプによるUV光照射は,象牙質において強度変化は確認されず,歯質自体の強度に影響を与えないことが明らかとなった.本研究の目的は、水銀を用いないエキシマランプ光照射により根管内微生物の殺菌と根管内の象牙質強化を両立できることを明らかにし、超高齢社会で歯の保存を主体にした根管治療に対する新たな予防・治療方法の可能性を探ることである。申請者は、水銀を用いないエキシマ領域紫外線照射装置の小型化に成功している。また、歯牙および硬組織のナノレベルでの構造解析法(ナノインデンテーション法)を確立し報告している。さらに、骨などの硬組織に注目し、光照射により発生するラジカルがコラーゲン架橋を増強することを明らかにした。このことから、光照射による根管内殺菌と象牙質強化が可能であるという仮説を立てた。本研究では、エキシマランプ光による根管内殺菌効果と機序を解明し、照射に伴う根管内歯質強化の可能性を検証する。平成27年度は計画通りに、試作エキシマランプを用いたUV照射による殺菌効果を行った。臨床分野での応用を視野に入れ,口腔内細菌の殺菌を検討した.Enterococcus faecalis, Streptococcus mutansの2菌種に対しエキシマUV光を照射したところ、効果が表れた。具体的には、プラスチックディッシュ上にメンブレンを配置し,E. faecalisまたはS. mutansをスポットし細菌感染試験サンプルとした。それぞれ、種々の波長の光照射を行い、光照射後はメンブレンを細菌捕集用として用いた。ぞの結果、エキシマUV光は、短時間で強い殺菌効果が得られた。また、エキシマUV光は低圧水銀UV光と同程度の殺菌効果が得られるものであった。エキシマランプ光の感染根管に対する有効性を評価し、根管内象牙質に対する影響を分子およびナノレベルで解明するために、(1)(3)の項目を3年間に亘り解明することを計画していた。(1)ファイバーによるエキシマランプ光の導引と微小領域光強度の測定。(2)エキシマランプ光による殺菌性と根管内象牙質の分子およびナノレベルでの歯質改質メカニズムを解明する。そのために、まずin vitroの実験系で特に次の2点を明らかにする。1根管内細菌培養寒天培地へのエキシマランプ光の照射による細菌数の変化および遺伝子解析、2ラット(又は牛歯)の根管内象牙質へエキシマランプ光照射による強度およびコラーゲン架橋の解析。(3)上記、(1)および(2)を、ラットの感染根管モデルを作製し、エキシマランプ光の殺菌性および象牙質硬化性の両立性があるかin vivoの実験系で検証する。平成27年度は、試作エキシマランプの特性およびUV照射による殺菌効果を明らかにでき、計画通り順調に経過していると考えている。本研究の目的は、水銀を用いないエキシマランプ光照射により根管内微生物の殺菌と根管内の象牙質強化を両立できることを明らかにし、超高齢社会で歯の保存を主体にした根管治療に対する新たな予防・治療方法の可能性を探ることである。また、歯牙および硬組織のナノレベルでの構造解析法(ナノインデンテーション法)を確立し、報告している。前年度において、試作エキシマランプを用いたUV照射による殺菌効果を行った。臨床分野での応用を視野に入れ,口腔内細菌の殺菌を検討したところ、エキシマUV光は、短時間で強い殺菌効果が得られることが明らかとなった。すなわち、エキシマUV光は低圧水銀UV光と同程度の殺菌効果が得られるものであった。今年度は、照射に伴う歯質強化の可能性を検証するために、歯質の歯根象牙質の着目し、歯根象牙質の構造解析を行った。その結果、歯冠部と歯根部では物性は大きく異なり、また、加齢により、歯質の構造および強度は変化することが明らかとなった。エキシマランプ光の歯根象牙質に対する有効性を評価し、歯根象牙質に対する影響を分子およびナノレベルで解明するために、下記の項目を解明することを計画していた。(1)エキシマランプ光による殺菌性と根管象牙質の分子およびナノレベルにおける歯質改変メカニズムの解明(2)歯根象牙質へのエキシマランプ光照射による強度および構造解析前年度において、試作エキシマランプの特性およびUV照射による殺菌効果を解明した。今年度では、歯根象牙質の強度の基準値を明らかにしており、順調に進展していると考えている。

本研究の目的は、水銀を用いないエキシマランプ光照射により、超高齢社会で歯の保存を主体にした根管治療に対する新たな予防・治療方法の可能性を探ることである。既に、水銀を使用しないエキシマ領域紫外線照射装置の小型化に成功している。また、歯牙および硬組織のナノレベルでの構造解析法(ナノインデンテーション法)を確立し、報告している。本研究では、エキシマランプ光による根管内殺菌効果と機序を解明し、照射に伴う根管内歯質強化の可能性を検証する。前年度までに、試作エキシマランプを用いたUV照射による殺菌を行った。臨床分野での応用を視野に入れ、口腔内細菌の殺菌を検討したところ、エキシマUV光は、短時間で強い殺菌効果が得られることが明らかとなった。また、照射に伴う歯質強化の可能性を検証するために、歯質の歯根象牙質の着目し、歯根象牙質の構造解析を行った。その結果、歯冠部と歯根部では物性は大きく異なり、また、加齢により、歯質の構造および強度は変化することを明らかにした。今年度は、エキシマランプ光照射象牙質の構造および強度の検討を行った。エキシマ光を照射した歯根象牙質の接触角測定を行ったところ、エキシマ光照射は、従来の感染根管治療法と比較して、ぬれ性の向上が確認された。また、超微小硬度測定によるナノレベルでの硬さおよび弾性率測定により、エキシマランプ光照射象牙質表層の強度は変化しないことが明らかとなった。材料表面に様々な機能を付与することができる表面改質技術は重要であり,産業的に技術応用されているエキシマランプによる歯質表面の光表面改質について検討した.歯の歯冠部および歯根部ともにエキシマランプ照射によるぬれ性の向上が確認され,エキシマランプによるUV光照射は,歯質表面改質に有用であることがわかった.また,エキシマランプ照射後の歯質の強度特性を評価したところ,エキシマランプによるUV光照射は,象牙質において強度変化は確認されず,歯質自体の強度に影響を与えないことが明らかとなった.平成28年度以降は、in vitroでのエキシマランプ光による殺菌性と根管内象牙質の分子およびナノレベルでの歯質改質メカニズムの解明を進めていく予定である。特に1根管内細菌培養寒天培地へのエキシマランプ光の照射による細菌数の変化および遺伝子解析、2ラット(又は牛歯)の根管内象牙質へエキシマランプ光照射による強度およびコラーゲン架橋の解析を中心に行う。それらは、原子間力顕微鏡(AFM)を併用したナノインデンテーション法にて天然象牙質と比較することで可能である。ナノインデンテーション法は、サンプル表面に圧子を低加重で段階的に作用させ、表面に形成された圧痕(インデント)と荷重ー負荷曲線から、微小領域の硬さと弾性係数を測定することが可能である。また、顕微ラマン分析を行い、象牙質強度の指標でもあるコラーゲンン架橋の解析を行える。主に、架橋の主体であるアミドIおよびアミドIIの強度の比から架橋度を明らかにし、ナノインデンターで求めた物理的強度との相関を求める。また、エキシマランプ光照射時間との関係を明らかにし、最適な強度を得るのに最適な照射時間を検索する。平成29年度以降は、エキシマランプ光による殺菌性と根管内象牙質の分子およびナノレベルでの歯質改質メカニズムの解明を進めていく予定である。特に牛歯および人歯における歯根象牙質へのエキシマランプ光照射による強度変化およびコラーゲン架橋の解析を中心に行う。
グルコース欠乏環境におけるグルコース輸送体の細胞膜局在を制御する分子機構の解明

栄養環境に応じた糖輸送体の細胞表面局在制御は、細胞の増殖や、糖尿病やガン等の疾病に関与する。本研究では低グルコース環境での増殖に必須である分裂酵母六炭糖輸送体Ght5の細胞表面局在に必要な遺伝子群を探索し、小胞輸送やシグナル伝達に機能する25遺伝子はGht5-GFPの表面局在を通じて低グルコース環境での増殖に機能することを明らかにした。また、ヒト培養細胞において、GRP78等の小胞体シャペロンは高グルコース環境では糖輸送体GLUT1の表面局在に必要であったが、グルコース枯渇環境では不要であった。以上の結果から環境グルコース濃度により複数回膜貫通蛋白質の輸送機構が調節されることが明らかとなった。本研究は、エネルギー源・炭素源として重要なグルコースを細胞内に取り込むグルコース輸送体の発現・細胞内局在を制御する進化上普遍的な分子機構の解明を目指す。研究室では2-3%グルコースを含む培養液で培養する分裂酵母がグルコース欠乏(0.08%)環境で増殖するためにはグルコース輸送体Ght5が必要十分であった。本年度は、先行研究により見出されていたグルコース欠乏環境で増殖できない分裂酵母LGS変異体細胞内で、Ght5-GFPの細胞内局在を観察した(LGS=Low Glucose Sensitive)。野生型細胞では、グルコース欠乏環境ではGht5の発現が亢進し細胞表面により強く局在するようになる。本研究では51遺伝子に変異を有する70個のLGS変異体を用いて高グルコース(2-3%)環境、グルコース欠乏環境におけるGht5-GFPの細胞内局在を観察した。この結果、51遺伝子のうち25遺伝子がGht5-GFPの細胞表面局在に必要であった。これらの25遺伝子は、タンパク質リン酸化、細胞骨格、小胞輸送、タンパク質分解に関与していた。例えば小胞輸送に機能するアダプタータンパク質の変異体ではGht5-GFPタンパク質は、グルコース欠乏環境においてのみ正常に細胞表面に局在せず、細胞質中で塊として観察された。このようなGht5の局在異常は、変異体細胞のグルコース欠乏環境での増殖欠損を説明できるものと考えられる。次年度以降は、本研究の成果を元に、Ght5タンパク質の細胞表面局在に必要なプロセスの調節を明らかにすることによって、グルコース欠乏環境における細胞の生存戦略を明らかにしていく。さらに、分裂酵母での結果を手がかりに、ヒトのグルコース輸送体においても細胞内局在の調節機構を探索する。本研究では分裂酵母およびヒト細胞を用いて、グルコース欠乏環境でのグルコース輸送体Ght5の細胞膜局在を制御する分子機構を解明するものです。初年度に当たる27年度は、分裂酵母Ght5の細胞内局在に影響を与えるLGS変異体の探索を中心に実施しました(LGS = Low Glucose Sensitive, 0.08%以下グルコースで増殖できない変異体)。本年度の解析によって、Ght5がグルコース欠乏環境において細胞表面に発現するために必要な主要なプロセスが明らかとなり、次年度以降の研究計画を予定通り実施できる状況にあると考えています。分裂酵母が0.1%以下の低グルコース濃度で増殖するためには、8つの糖輸送体(Ght1-8)のうち、Ght5だけが必須である。低グルコース環境で発現誘導されたGht5が細胞表面に局在することが増殖に必要であることから、Ght5の細胞表面局在を保障・促進する分子機構を追求している。本年度、Ght5カルボキシ末端寄りのセリン残基(Ser536)はリン酸化されることを見出し、そのアラニン置換体(S536A)を発現する変異細胞は低グルコースでの増殖に欠損を示すだけでなく、Ght5(S536A)-GFP融合蛋白質は細胞表面局在に欠損を示し、Ser536リン酸化の生理的な重要性を見出した。一方、Ser536のアスパラギン酸(S536D)、グルタミン酸置換体(S536E)は、低グルコース環境での増殖や細胞表面局在に欠損を示さなかった。Ser536前後のアミノ酸配列から、Ser536は糖代謝を調節するTORC2(Target Of Rapamycin Complex2)経路によってリン酸化されると予想された。実際、TORC2関連因子の一つKsg1(PDK-like/ホスホイノシチドトリスリン酸依存キナーゼ様キナーゼ)の変異細胞でSer536リン酸化が減退していた。また、TORC2の下流に位置するGad8/Akt様キナーゼの変異細胞でのSer536リン酸化の減退は、完全培地でのみ観察された。次に、小胞体、ゴルジ体を経て細胞表面にGht5が発現するために必要な細胞内輸送機構に欠損を示す変異株におけるGht5 Ser536リン酸化を検討した。興味深いことに、これらの変異体では、S536リン酸化は顕著に減退していたことから、Ser536残基はGht5が細胞表面に局在してからリン酸化されると予想された。これは、Ksg1/PDK1を活性化させるPI3が細胞質側の細胞膜で生成することと矛盾しない。本研究の目的は、分裂酵母が低グルコース環境で増殖するために必須なGht5の細胞表面への局在化を制御する分子機構の解明である。本年度、Ght5の細胞表面への局在化に機能するリン酸化

修飾(Ser536)を見出し、そのリン酸化欠損変異体Ght5(S536A)-GFPは細胞表面局在に欠損を示すだけでなく、低グルコース環境での増殖に欠損を示した。この発見により、本研究の焦点はGht5 Ser536のリン酸化制御とその生理的な機能に絞ることができ、次年度に目指す論文発表に必須な内容の骨子ができたと言える。分裂酵母細胞が低グルコース(0.1%以下)環境で増殖するために必要な分裂酵母糖輸送体であるGht5の細胞表面局在を制御する分子機構の解明が本研究の目的である。前年度に見出したGht5蛋白質Ser536残基のリン酸化の役割について追求した。低グルコース環境で培養したTORC2欠損変異細胞(tor1欠失、PDK1/ksg1変異、Akt/gad8変異)において、Ght5 Ser536リン酸化の低下が認められたがリン酸化を欠失する変異体は見いだせなかった。また、分裂酵母キナーゼ欠失株ライブラリーを用いてSer536リン酸化を網羅的に検出したが、当該リン酸化を欠失する変異細胞は見つからなかった。これらの結果からGht5 Ser536リン酸化の役割のさらなる追求は困難だと考えられる。Ght5蛋白質の細胞内局在を制御する分子機構を理解するためには、遺伝学的手法等の異なるアプローチが今後必要になるだろう。本研究は低グルコース環境に対する進化上保存された応答機構の解明も目的とするので、低グルコース環境に対するヒト培養細胞の応答についても解析した。グルコース枯渇によって細胞内総膜画分に増量することが明らかとなったGRP78等の小胞体シャペロンは、高グルコース環境においてはGLUT1糖輸送体やNa+/K+ ATPaseといった複数回膜貫通蛋白質の細胞表面局在に必要であったが、意外なことに、グルコース枯渇環境では必要ではなくなった。その一方で、上皮成長因子受容体(EGFR)やアミノ酸輸送体構成因子CD98といった1回膜貫通蛋白質は、GRP78や環境グルコース濃度に依存することなく細胞表面に局在した。この結果は、酵母だけでなくヒトにおいても細胞内小胞輸送等の細胞機能が環境グルコース濃度に応じて調節を受けることを示している(論文投稿準備中)。栄養環境に応じた糖輸送体の細胞表面局在制御は、細胞の増殖や、糖尿病やガン等の疾病に関与する。本研究では低グルコース環境での増殖に必須である分裂酵母六炭糖輸送体Ght5の細胞表面局在に必要な遺伝子群を探索し、小胞輸送やシグナル伝達に機能する25遺伝子はGht5-GFPの表面局在を通じて低グルコース環境での増殖に機能することを明らかにした。また、ヒト培養細胞において、GRP78等の小胞体シャペロンは高グルコース環境では糖輸送体GLUT1の表面局在に必要であったが、グルコース枯渇環境では不要であった。以上の結果から環境グルコース濃度により複数回膜貫通蛋白質の輸送機構が調節されることが明らかとなった。本課題の目的である、グルコース輸送体Ght5の細胞膜局在を制御する分子機構の解明に向けて研究を進める。具体的には、グルコース欠乏環境における分裂酵母Ght5の蛋白質相互作用および翻訳後修飾を、アフィニティー精製、質量分析によって見出すことで、分子レベルの仮説(例えば、「キナーゼXによるGht5のリン酸化がGht5の細胞表面局在に必要」等)を生成する。
網膜神経システム機能形成とニュウラルネット情報処理機構に関する国際共同研究

A.グループ:九州工業大学情報工学部制御システム工学教室:安井湘三(代表者)、八木哲也(分担者)、古川徹生(協力者)山田雅弘(協力者、工業技術電子技術総合研究所)Bグループ:米国ロックフェラー大学神経生物学教室およびコーネル大学医学部視覚科学研究所:Cグループ:米国ロンドン大学インペリアルカレッジ生物学科:Dグループ:米国カリフォルニア大学デービス校動物生理学科:(1)色覚と明暗順応に関係する網膜2次ニューロン受容野サイズの可塑性制御(A、Cグループ)ギャップ結合を介して互いにカップルする鯉網膜の水平細胞は広い受容野をもつが、上記の機構をHI型水平細胞がもつことを今回明らかにした。これはAとCのグループがこれまで数年にわたって蓄積した研究結果のひとつの帰結といえる。ここで主役を演じるのは短波長感受性の錐体視細胞からHI細胞への特異型のシナプスである。すなわち、これは符号反転性ではあるが通常の抑制性ではなく伝達物質が後膜gmの減少をもたらすタイプであり、長波長錐体からの通常の興奮性(non-MNDA)シナプスと対比される。さらに、問題のシナプスはAPB(2-amino-4-phosphonobutyrate)および暗順応により阻害される。以上から、光は視細胞を過分極し伝達物質放出量の減少を起こすことを考え合わせれば、明順応時における短波長刺激の受容野は長波長に比べて狭いはずである。この予測は今回実証された。水平細胞シンシチアムの空間定数はギャップ結合抵抗Rgと膜抵抗Rmで決まるが、本モデルではRmが可変となる。これは、ドーパミンによるRgの修飾による周知の機構とは異なる新しい横方向の信号伝達路といえる。(2)人工ニューラルネットワークによるトップダウン研究(Aグループ)ランダムに結合した網膜様の3層BP型ニューラルネットワーク(NN)に明暗パターンの左右方向の移動を検出する機能を学習により獲得させ、その結果NN内部に発現した回路構造を解析し、あわせて生体における速度検出の神経機構と比較検討した。これは、前年度の中心周辺拮抗型受容野の自己形成を発展させた成果である。(3)人工網膜の試作(A、Bグループ)前年度に引き続き、(1)の結果を参考にしながら明/暗順応の状態に応じて可塑性をもつ画像処理用空間フィルタの開発を進めた。本年度は特に標準正則化問題と関連させてネットワークのアーキテクチャ開発を行い新しいタイプのチップの試作に成功した。(4)単離培養系による実験研究(A、B、C、Dグループ)培養系における神経回路再構築の試みは、膜電位感受性色素を用いたシナプス結合の機能テストを含めて主としてBグループが行ったが、網膜への本格的な応用に向けては今後解決するべき問題が多く残っている。一方、AとDのグループはin vitro網膜介在ニューロンについて、成長に伴う形態形成の過程を画像記録し、同時にそれらの細胞生理をパッチクランプ法に基づいて調べた。とくに、Aはニスタチンの技術を確立しその利用による予備的実験を行った。これらのデータの多くは目下詳細に解析中であるが、その主な内容は以下の通りである。AはBとの共同実験の結果も一部参考にして、視細胞にあるCa依存性Kチャンネルの役割を究明するために等価電気モデルを使って調べている。Dは神経節細胞を対象に伝達物質受容に伴うイオン膜透過のCa依存性を解明しつつある。(Cグループ)興奮性および抑制性アミノ酸伝達物質の受容体が金魚網膜から抽出したmRNAに因りxenopus oocyteに発見したことを電気生理的に示した。このうち、APBに対する効果は、単離水平細胞においてAグループが(4)の関連で記録したものと同様であった。APBについて、これらと(1)の結果との関係を解明することは残された課題である。(6)ニューラルネット不要経路の自立淘汰と隠れた素子の共有に関する計算論的研究(Aグループ)ニューラルネットワークの応用に際して、個々のタスクに対して最小規模の回路構造を事前に知ることは、経済性、ローカルミニマムの回避、タスク自体の理解と洞察、モジュール化、計算論的脳研究などの観点から重要である。この問題についてシナプス荷重の相互抑制に基づく原理を考察し、例題に対して良好なテスト成績を得た。また、この原理を多出力3層NNに応用することで隠れ層の共有化にも非常に有効であることを示した。一方、本研究では双極細胞受容野の可塑性、とくにその明暗順応あるいはSN比に依存する側面を実験および計算論に基づいて究明してきた。双極細胞受理野の周辺部は水平細胞に由来するので(1)および(3)の成果とも関連し、本アルゴリスムの応用も導入した今後の進展が期待される。

すなわち、これは符号反転性ではあるが通常の抑制性ではなく伝達物質が後膜gmの減少をもたらすタイプであり、長波長錐体からの通常の興奮性(non-MNDA)シナプスと対比される。さらに、問題のシナプスはAPB(2-amino-4-phosphonobutyrate)および暗順応により阻害される。以上から、光は視細胞を過分極し伝達物質放出量の減少を起こすことを考え合わせれば、明順応時における短波長刺激の受容野は長波長に比べて狭いはずである。この予測は今回実証された。水平細胞シンシチアムの空間定数はギャップ結合抵抗Rgと膜抵抗Rmで決まるが、本モデルではRmが可変となる。これは、ドーパミンによるRgの修飾による周知の機構とは異なる新しい横方向の信号伝達路といえる。(2)人工ニューラルネットワークによるトップダウン研究(Aグループ)ランダムに結合した網膜様の3層BP型ニューラルネットワーク(NN)に明暗パターンの左右方向の移動を検出する機能を学習により獲得させ、その結果NN内部に発現した回路構造を解析し、あわせて生体における速度検出の神経機構と比較検討した。これは、前年度の中心周辺拮抗型受容野の自己形成を発展させた成果である。(3)人工網膜の試作(A、Bグループ)前年度に引き続き、(1)の結果を参考にしながら明/暗順応の状態に応じて可塑性をもつ画像処理用空間フィルタの開発を進めた。本年度は特に標準正則化問題と関連させてネットワークのアーキテクチャ開発を行い新しいタイプのチップの試作に成功した。(4)単離培養系による実験研究(A、B、C、Dグループ)培養系における神経回路再構築の試みは、膜電位感受性色素を用いたシナプス結合の機能テストを含めて主としてBグループが行ったが、網膜への本格的な応用に向けては今後解決するべき問題が多く残っている。一方、AとDのグループはin vitro網膜介在ニューロンについて、成長に伴う形態形成の過程を画像記録し、同時にそれらの細胞生理をパッチクランプ法に基づいて調べた。とくに、Aはニスタチンの技術を確立しその利用による予備的実験を行った。これらのデータの多くは目下詳細に解析中であるが、その主な内容は以下の通りである。AはBとの共同実験の結果も一部参考にして、視細胞にあるCa依存性Kチャンネルの役割を究明するために等価電気モデルを使って調べている。Dは神経節細胞を対象に伝達物質受容に伴うイオン膜透過のCa依存性を解明しつつある。(Cグループ)興奮性および抑制性アミノ酸伝達物質の受容体が金魚網膜から抽出したmRNAに因りxenopus oocyteに発見したことを電気生理的に示した。このうち、APBに対する効果は、単離水平細胞においてAグループが(4)の関連で記録したものと同様であった。APBについて、これらと(1)の結果との関係を解明することは残された課題である。(6)ニューラルネット不要経路の自立淘汰と隠れた素子の共有に関する計算論的研究(Aグループ)
マルチドメイン構造二重ラセン分子の合成と複合的機能

アミドヘリセンおよびエチニルヘリセンオリゴマーという二種類の性質の異なる二重ラセン分子を連結したマルチドメイン化合物が、塩の添加・除去によって伸縮するこれまでに例のない有機ゲルを形成した。また、ヘリセンを担持したシリカナノ粒子がエチニルオリゴマーの二重ラセン状態のみを認識、吸着して沈殿した。これを用いて系内の二重ラセン会合-解離の平衡を会合形成にシフトさせた。二種類のヘリセンオリゴマーの性質、機能の融合によって新たな機能を開発し、またヘリセン分子の分子認識能を拡張して新しい現象を見出した。アミドヘリセンオリゴマーとエチニルヘリセンオリゴマーを連結したジドメイン化合物と、擬鏡像異性体エチニルヘリセンオリゴマーを様々な有機溶媒中で混合し、ゲル形成を検討した。ピリジンなどの極性溶媒と、トルエンなどの低極性溶媒では異なる性質のゲルを与えた。CD、UV測定の結果から、前者(タイプA)ではアミドドメインがランダムコイルで存在しており、後者(タイプB)ではラセン二量体会合を形成していた。アミドドメインの構造状態によって、ゲルの性質が変化することが分かった。また、ピリジン溶媒のゲルでは、過塩素酸リチウムを添加することで体積比25%まで収縮を起こした。収縮ゲルは上清を除き、溶媒を加えて加熱冷却すると同体積のゲルに戻った。タイプAゲルではアミドドメインのランダムコイルにリチウム塩が作用して、ゲルが収縮したと考えている。また繰り返しゲル化を起こしたことから、収縮したゲルは強固であり、ゲル本体の化合物の流出は起きていない。従って、本研究の目的である可逆的な形態変化が本系において可能と考えられる。ヘリセンの分子認識能を拡大する目的で、表面に光学活性ヘリセンを担持したシリカナノ粒子を用いて、エチニルヘリセンオリゴマーの構造状態認識を行った。二重ラセン状態のオリゴマーはランダムコイルに比べて1/10程度の時間で沈殿し、二重ラセンオリゴマーのみ吸着した。また、二重ラセンーランダムコイルの平衡溶液にナノ粒子を加えると、50%が二重ラセン状態で沈殿として得られた。ナノ粒子表面のヘリセン分子によって、分子の形状を認識し、吸着できることがわかった。さらに一方の形状の分子が沈殿として除かれることで、溶液中の会合解離の平衡をシフトできることがわかった。以上に加えて、ジドメイン化合物は擬鏡像異性オリゴマー間において4分子間会合体を精密に形成し、さらに熱などの要件で構造変化できることが分かった。アミドヘリセンオリゴマーの性質や機能を調べることで、エチニルオリゴマーと連結したマルチドメイン化合物での機能をさらに拡張できると考えた。そこでアミドオリゴマーが比較的極性の高い分子であることから水系への応用を検討することにした。単分子膜作成装置を用いて、水面上にアミドオリゴマーのクロロホルム溶液を展開して分子膜を作製した。これを石英板に移し取り、CDやAFMなどの解析を行った。得られた膜ではオリゴマーが二重ラセン構造を形成し、さらにラセン軸を水面に垂直にして二重ラセン単位が横方向に集積した分子膜を形成することが示唆された。これまでオリゴマーの二重ラセン会合構造を水面を利用して集積できる可能性がある。なお、オリゴマーがランダムコイルに解離するDMSOおよびTHF溶液を用いた際はオリゴマーが水中に析出し、膜を形成しなかった。またアミドヘリセンオリゴマーはこれまで鎖状オリゴマーについて調べていたが、環状型オリゴマーでも分子膜などの高次構造を形成すると考え、環状3量体を合成した。CD、1H-NMRよりDMSOのような高極性溶媒中では単分子で溶解し、クロロホルムなどの低極性溶媒中では分子間会合を形成することが示唆された。本研究全体を通して、アミドヘリセンオリゴマーとエチニルヘリセンオリゴマーという二種類の二重ラセン分子を用いて、塩の添加、除去によって伸縮する有機ゲルや、シリカナノ粒子に担持したヘリセンに二重ラセン状態を認識させ、会合解離の平衡をシフトさせるという新しい現象を見出すことができた。加えて、検討の余地があるものの、アミドヘリセンオリゴマーの膜形成や環状オリゴマーへの展開などさらなる機能開発が期待できる。有機合成化学計画していたDMSO添加のゲルに対して、有機溶媒の種類によって性質の異なるゲルを見出し、広範な条件で本研究が実行できることを示した。また実際にアミドドメインの会合ー解離の構造状態に応じてゲルの性質も変化していることが分かった。さらにリチウム塩のような無機塩とアミドオリゴマーの間に相互作用を起こすことを実験的に示し、これによってゲル収縮を起こすという予想外の結果を出した。これまでにヘリセン担持シリカナノ粒子表面では不斉アルコールの速度論的光学分割ができることを報告していたが、今回初めて、オリゴマー分子の吸着および沈殿形成を起こした。

オリゴマー間で構造認識することに加え、ヘリセンシリカ粒子表面を用いて、分子の形状を認識できることを示した。さらに沈殿形成によって溶液中の会合解離の平衡をシフトするという新規な手法が得られた。本研究の目的の動的な動的形態変化の基盤となるデータに加え、新規な性質のゲルおよび平衡移動の方法論を見出したことから、当初の計画以上に進展したと考えている。水系溶媒中でオリゴマーの構造変化および形態変化ができるようになれば、さらに多様な物性を展開できる。塩添加によるゲル収縮において、水との二層系で塩を除去する方法で可逆的な形態変化を検討する。当初の計画に挙げた層側の種類、pH、塩濃度の調節によって、拡散・除去の時間を制御する方法を調べる。アミドドメインの性質、機能のさらなる検討として、界面での集合形成を検討する。シリカ表面での特徴的な分子認識をオリゴマーの集合体で見られるか調べる。ジドメイン、トリドメイン化合物に応用し、機能の合成を起こした界面膜、ミセル、ゲルなどの形態の動的制御にすることを目指す。当該年度では、予想よりも試薬の購入費が安価で済んだため全体の5%ほど経費を残した。次年度に更に高額の試薬を用いることを予定し、効率的な研究運営のため残額を含めて次年度に使用することを希望した。本研究ではオリゴマーの性質解明およびゲル形成の検討において多数の溶媒、反応試剤の検討を要する。また各種測定に用いる高純度溶媒を購入する。また次年度は研究報告および情報収集を目的に学会参加を計画しており、その旅費に充てる。
細胞トモグラフィーによる分子標的治療効果相関マーカーの探索

課題(1):蛍光3次元トモグラフィーによる腫瘍標本のマルチチャンネル解析:胃癌延べ145症例について、文書による同意取得後末梢血10mLを採取し、末梢循環腫瘍細胞(CTC)の同定とHer-2、FGFR2遺伝子増幅を解析した。Her2は126例、FGFR2は95例についてCTCを検出し遺伝子増幅の有無の判定が可能であった。これは同時に実施した先行技術であるVeridex社の手法におけるCTC検出率54%と比較して有意に高く、さらにより高精度なFISH法により遺伝子増幅症例を識別することを可能にしたことで、癌の分子標的治療の発展とともに期待が高まっている"Liquid biopsy"による腫瘍の遺伝子異常解析を可能する上で重要な研究成果である。課題(2):イメージングデータと臨床予後の相関解析:次年度以降に向けて分担研究者(松阪)を治験責任医師として、課題(1)の手法を使用し原発Her2陰性でCTCにおいてHer2遺伝子増幅の検出された胃癌症例を対象に抗Her2抗体治療を実施する臨床研究を開始した。既に乳癌においては同様な臨床試験が欧米で開始されているが、胃癌に関しては本研究が世界で最初となり非常に意義深いと考える。課題(3):3次元培養による腫瘍幹細胞の表現型と薬剤感受性に関する検討:大腸癌、胃癌、乳癌の胸・腹水、外科切除検体より腫瘍細胞を精製しスフェロイド培養により長期間の維持培養を実施した。培養に供した検体は延べ148検体であり、そのうち十分な大きさのスフェロイド培養塊を形成した32検体については、フィブリンクロットを作成した後FFPE標本を作成した。本標本は次年度以降、組織マイクロアレイ(TMA)の作成を予定しており、その後の解析はTMAを用いて実施する予定である。本年度の研究実施計画に従い、下記3項目の研究課題において研究を実施した。本年度の研究実施計画にしたがい、予定した研究を遂行し、十分な症例数の解析を実施した。研究計画は3つの課題からなり、以下各課題について進捗を説明する。

課題(1):蛍光3次元トモグラフィーによる腫瘍標本のマルチチャンネル解析:胃癌は他の癌腫に先駆け、解析手法を確定することができたため、本年度100例を超える症例の解析を実施した。大腸癌に関しては、外科手術中に、切除腫瘍、末梢血、門脈血を採取し、原発腫瘍、末梢血CTC、門脈血CTCのそれぞれについて、蛍光トモグラフィー解析を実施し、特定のタンパク質の発現の差異とその意義について解析を開始した。本年度は50症例について検体の採取と保存を実施した。標識とトモグラフィ解析は、次年度以降実施を予定する。多発性骨髄腫に関しては、臨床上有用なt(4:14)によるFGFR3の転座について、蛍光トモグラフィによる解析を開始し、本年度は19例について解析を終了した。課題(2):イメージングデータと臨床予後の相関解析:本年度は当課題は実施を予定していなかったが、課題(1)の進捗が胃癌において著しかったことから、CTCによるHer2増幅症例に対する前向き臨床試験を実施するに至った。課題(3):3次元培養による腫瘍幹細胞の表現型と薬剤感受性に関する検討:これまでのわれわれのものをを含めた検討により、臨床検体由来腫瘍のスフェロイドは、増殖が極めて遅く、十分な直径を有するスフェロイドの形成には、概して数ヶ月を要することが示されている。本年度は早い時期から検体の収集を開始し、既に32症例のFFPEブロックを作成した。蛍光イメージングによる解析はさらに症例を蓄積し、スフェロイドマイクロアレイを作成後、他検体を同時に実施することを予定しており、検体収集は順調に推移している。平成24年度は、代表研究者が国外の施設での研究留学を行うことが決定したため、代表研究者の研究計画を予定通り実施することが困難となる。これに伴い、実施計画通りの研究実績の達成は難しくなることが想定されるため、科学研究費助成を廃止する。ただし、本研究計画自体は分担研究者、研究支援人員により継続して遂行を予定する。科学研究費助成を廃止し、研究助成による研究費を使用しない。
上流ORFが関与する細胞環境感知機構の解明とゲノム育種への応用

mRNAの5′非翻訳領域に上流ORF (uORF)と呼ばれる小さなORFが存在し、そこにコードされるペプチドが自身を翻訳したリボソームの機能に影響を与えることによって翻訳を制御する場合がある。研究代表者はこれまでに植物において、ストレス、栄養状態、細胞分化状態など様々な細胞内環境に応答した翻訳制御に関与するuORFペプチドを見出した。本研究は、uORFペプチドが細胞内環境を感知してリボソーム機能を制御する未知の機構を明らかにすることを目的とする。さらに、作物において翻訳を抑制するuORFをゲノム編集を用いて破壊することにより、有用な形質を持つ作物の作出を目指す。
高性能住宅向け採暖システムの開発と評価

本研究では,住生活の省エネルギー化を目的に寒冷地の高性能住宅で使用する採暖装置の開発と評価を実施した.具体的には1.kinectセンサーを利用した住宅内の人追従システムの開発を実施し,2.採暖器具使用時の生理・心理反応測に関する被験者実験を行い,分析を行い,さらに3.高性能住宅の温熱環境の実測と熱環境解析を以下のような項目で実施した1パッシブ換気住宅と床下チャンバーエアコン方式の住宅の企画と実測.2吸収日射量分布を考慮した住宅の温熱環境解析.3GISデータを利用した高性能住宅の温熱環境解析.4PCMと太陽熱集熱装置の組み合わせによる換気予熱装置の開発と評価平成24年度の実績を下記に示す.1.高性能住宅向け採暖器具の開発:住宅内でkinectセンサーを利用して人体位置の把握を行うためには,高い位置から俯瞰で室内画像を撮影する必要がある.そのため,通常のkinectセンサーの利用と異なり,センサーから取得された座標値を空間座標に変換する必要が生じる.このアルゴリズムについて開発を行い,H24空気調和衛生工学会北海道支部学術講演会にて発表した.また,もう一つの手法として,あらかじめ俯瞰画像において範囲を定めておき,その範囲に人が侵入してきた際に人がいると判断し,熱入力を行う手法がある.その方法に関して,第14回DSPS教育者会議にて発表した.2.採暖器具使用時の生理・心理反応測定:被験者実験により,実験住宅における床採暖システム使用時の被験者の生理心理反応の基本特性を把握した.その結果,吸湿発熱素材の衣服の有無による生理反応の違い,また男女差による床温感以外の生理心理反応の違いはあまり明確ではないことが分かった.この理由として,実験時間が30分と短いことや,同じ姿勢を続けたために不感蒸泄が少なかったことなどが影響していると考えられる.また床温を23°C一定にするために,低気温になるほど床採暖システムの発熱量を大きくする必要があるため,接触面からの熱流が一定ではなかったことも影響していると考えられる.以上の成果は日本建築学会北海道支部研究報告会にて発表する予定である.3.採暖器具を用いた際の高性能住宅の温熱環境の熱環境解析:釧路高専の実験住宅の熱環境解析を実施した.その際に,日射の人体への影響を見込むことで暖房エネルギーの削減やガラスの選択基準が変わることを示した.この成果に関しては日本建築学会大会,日本建築学会北海道支部研究報告会で発表予定である.本研究では,住生活の省エネルギー化を目的として,高性能住宅の環境下で省エネルギー採暖手法を用いて熱取得を行うための採暖装置の開発を実施した.その内容は,ウェブカメラを利用した人追従システム,採暖器具,携帯端末を利用したコントローラーを住宅内のデータサーバーと無線LANを用いて接続した装置)の開発と,その生理・心理的評価,また,それを設置した高性能住宅の温熱環境評価である.具体的に実施した項目を以下に示す.1.高性能住宅向け採暖器具の開発:1kinectセンサーを用いた住宅内での人体の追従システムの開発を実施した.a.カスタマイズ手法の開発:カメラから得られる情報と人が住宅内のどの位置にいるのかを対応させるシステムの開発を行った.2.採暖器具使用時の生理・心理反応測定:熱伝導を利用した採暖器具について,床暖房に関する知見を応用し,採暖器具の制御機構に必要な情報を得ること,また,省エネルギー運転手法の開発に向けた試みを実施した.具体的には,採暖器具を用いた際の生理・心理反応に関する被験者実験,また,それに日射が加わった場合の被験者実験を行った.3.高性能住宅の温熱環境の実測と熱環境解析:1パッシブ換気住宅と床下チャンバーエアコン方式の住宅の企画と実測を行い,積雪寒冷地である北海道でもエアコン一台での暖房が可能であることを示した,2吸収日射量分布を考慮した住宅の温熱環境解析をradiance(照明解析のソフトウェア)とコントロールボリューム法を用いて実施し,ダイレクトソーラーゲインの設計手法に関して検討を実施した.3GISデータを利用した高性能住宅の温熱環境解析を実施し,住宅を建設する場所とダイレクトソーラーゲイン手法の関係に関して検討をじっしした.4PCMと太陽熱集熱装置の組み合わせによる換気予熱装置の開発と評価を実施した.本研究では,住生活の省エネルギー化を目的に寒冷地の高性能住宅で使用する採暖装置の開発と評価を実施した.具体的には1.kinectセンサーを利用した住宅内の人追従システムの開発を実施し,2.採暖器具使用時の生理・心理反応測に関する被験者実験を行い,分析を行い,さらに3.高性能住宅の温熱環境の実測と熱環境解析を以下のような項目で実施した1パッシブ換気住宅と床下チャンバーエアコン方式の住宅の企画と実測.2吸収日射量分布を考慮した住宅の温熱環境解析.3GISデータを利用した高性能住宅の温熱環境解析.4PCMと太陽熱集熱装置の組み合わせによる換気予熱装置の開発と評価Iパッシブ換気と床下チャンバー方式のエアコンを併用した高性能住宅の企画と実測:採暖による熱取得を行うとしても最低限の室温の確保は必要である.そこで,高性能の空調機器が必要となるが,エアコンは安価で汎用性の高い機器であるが,寒冷地での普及はあまり進んでいない.本研究では,日本で冬季の外気温が最も低い,北海道道東地域においてパッシブ換気と組み合わせたエアコンの床下チャンバー方式について実測と数値解析によって、その特徴の把握と評価を行った。II吸収日射量の分布を考慮した住宅の温熱環境

解析:寒冷地で住生活の省エネルギーを達成するためには単に断熱気密性能を向上だけではなく日射のダイレクトゲインを最大限利用するための手法を検討する必要がある.特に,高断熱高気密住宅では,冬季でも日中は日射によってオーバーヒートが生じ,換気によって温度を下げたりしなければならないような状況が生じるが,夜間になるとその性能に見合った暖房が必要となり,無暖房や採暖装置のみによる暖房が難しくなる.そこで,アイデアとしては日射吸収が行われる場所に熱容量の大きな物体を配置し、オーバーヒートの緩和と他の時間帯の暖房負荷の削減を行う戦略が考えられるが,既存の解析手法ではそのような効果を解析することはできない.本研究では照明解析ソフトであるradianceを利用し,そこから得られる輝度分布を用いて日射の吸収量を推定し内装仕上げ化をパラメータとして日射有効利用率(本研究で定義)の変化を把握した.IIIkinectセンサーを利用した住宅内の人体位置把握システムの開発:採暖装置の発熱位置を確定させるために既存のwebカメラ利用から発展させ,kinectセンサーを利用する方法を検討した.このセンサーを利用することで更に詳細な情報の把握が可能になった.平成24年度に関しては当初目標としていた,1.高性能住宅向け採暖器具の開発,2.採暖器具使用時の生理・心理反応測定,3.採暖器具を用いた際の高性能住宅の温熱環境の実測と熱環境解析を実施し,研究レポートを作成することができた.しかし,kinectセンサー,発熱機器,GUIの連携に関しては課題を残しており,次年度に引き続き開発を行う.本年度実施予定の被験者実験を実施することができなかった.H24年度に実施する予定である.平成25年度は,1.実機ベースでの検討を行う.具体的には1kinectセンサーを用いた適用範囲の拡張に関する検討(人体追従に関する不具合の発生頻度で判断),2two-nodeモデルを用いた低温やけど防止機能や省エネルギー運転機能の検討を行う.また,この手法は電気を用いた加熱を行うため,様々な手法を用いて通電時間を減らすことが省エネルギーにつながる.そのため,2.日射の人体への影響を含めた熱環境解析を行う.具体的には1波長分布を考慮した室内日射侵入量の測定,2波長分布を考慮した室内日射侵入量解析手法の作成を実施し,それらを用いて,3高性能住宅において採暖器具を用いつつ省エネルギーを達成するための条件についての解析を実施する.平成24年度は以下の研究を実施する.(1)採暖装置が成立するための高性能住宅の条件整備に向けた検討:今年度の研究((1)高性能住宅の温熱環境形成に関する研究,(2)吸収日射の分布を考慮したダイレクトゲインの最大化に関する研究)を継続する・(2)採暖装置を用いた場合の被験者実験:平成23年度に実施予定だった採暖装置を利用した際の被験者実験を実施する.(3)kinectセンサーを利用した人体位置把握システムの改良:平成23年度はkinectセンサーによる人体位置の把握を実験室において行った.平成24年度は実験住宅に設置して実施する.(3)GUIの開発:採暖装置を制御するGUIを開発する.
古原生代後期の海洋環境変動原因の解明：大規模火成活動及び超大陸形成との関連

本研究では後期古原生代に超大陸形成や大規模火成活動によって駆動される環境変化が起きていた可能性を検証する.そのためにカナダ東部に保存されている堆積物を対象とした(1)層序復元,(2)年代決定,(3)化学分析を行う.カナダ東部には約2018億年前に堆積した細粒堆積物や鉄鉱層が低変成度で多く保存されているが,一般に造山運動に伴う変形が著しく,年代の制約も十分でない.そこで精密な地質調査による層序復元および堆積年代の制約を行う.化学分析では,軽元素同位体比や元素濃度をプロキシとして海洋酸化還元状態・硫酸イオン濃度変化を復元する.また,白金族元素・希土類元素データと組み合わせ,上記仮説の検証を行う.本研究では後期古原生代に超大陸形成や大規模火成活動によって駆動される環境変化が起きていた可能性を検証する.そのためにカナダ東部に保存されている堆積物を対象とした(1)層序復元,(2)年代決定,(3)化学分析を行う.カナダ東部には約2018億年前に堆積した細粒堆積物や鉄鉱層が低変成度で多く保存されているが,一般に造山運動に伴う変形が著しく,年代の制約も十分でない.そこで精密な地質調査による層序復元および堆積年代の制約を行う.化学分析では,軽元素同位体比や元素濃度をプロキシとして海洋酸化還元状態・硫酸イオン濃度変化を復元する.また,白金族元素・希土類元素データと組み合わせ,上記仮説の検証を行う.
炎症性腸疾患の病態における腸管マクロファージ細胞内鉄動態異常の解明

本研究は、炎症環境下における腸管マクロファージ細胞内の鉄動態を解析し、細胞内鉄制御機構の異常と炎症性腸疾患の病態との関連を明らかとすることを目的とした。DSS誘発大腸炎モデルマウスにおいて、腸管マクロファージ細胞内のferritinは、細胞外鉄輸送タンパクであるferroportin-1の発現亢進を伴い、一過性に増加した。マウス骨髄由来マクロファージを用いた検討では、Ferroportin1のknock downによりLPS刺激後のIL-12p40分泌量が低下した。IL-12p40の低下はferroportin-1の発現を制御する転写因子Nrf2を介した間接的結果である可能性が考えられた。1.炎症環境下における腸管マクロファージ(Mac)細胞内の鉄動態を把握するため、C57BL/6(WT)マウスにDSSを投与して急性腸炎モデルを作成した。腸炎急性期の腸管Mac細胞内では、ferritin, ferroportin-1の発現が蛋白レベルで亢進していたが、qPCRの結果、Slc40a1(ferroportin-1)の発現は腸炎急性期に一過性に上昇し、腸炎回復期には低下することが明らかとなった。同様の検討を、T細胞移入慢性腸炎モデルを用いて行った。腸管Mac細胞内への鉄蓄積持続が予測されたが、予想に反して腸管Mac細胞内のferritinは腸炎マウスにおいて低下していた。さらに、Slc40a1発現は腸炎マウスにおいて低下し、ferroportin-1の転写調節因子であるNfe2l2の発現は亢進していた。これらの結果の解釈するためには、今回検討した解析時期(T細胞移入7週後)よりもさらに早期の段階から、鉄関連分子の動態を評価する必要がある。2.Mac細胞内の鉄蓄積がサイトカイン産生能に与える影響について、Slc40a1 knock down(KD)骨髄由来マクロファージ(BMM)を用いて検討を行った。Ferrous sulfate 100μMを培地に加え、overnight incubation後にLPS刺激を行った。KD-BMMでは炎症性サイトカインの発現亢進が予想されたが、予想に反してKD-BMMではIl12b発現の低下が見られた。Il12bの発現低下はFS添加の有無に関わらず確認されたことから、この結果が細胞内鉄濃度に依存的な変化であるかどうかの検討を要すると考えている。3.ヒト検体を用いた解析については、既に潰瘍性大腸炎の患者2名の手術検体よりCD33陽性Macを単離し、凍結保存している。今後も検体集積予定である。Rag2欠損マウスを用いたT細胞移入慢性腸炎モデルにおいて、当初の予想と反した結果が得られた。すなわち、当初の予想では、慢性炎症環境下では腸管マクロファージ(Mac)細胞内には(急性期に見られた)鉄蓄積が持続すると推測していたが、予想に反してferritin発現は低い事が分かった。当施設での予備的検討において、Rag2欠損マウスに野生型T細胞を移入した後、7週間でほぼ確実に腸炎が生じ得る事が分かっていたため、同時期の解析を行ったが、これよりも早期の段階から経時的に鉄関連分子の動態を評価する必要が生じた。さらに、既報(Zhang Z et al. Blood 2011)と異なり、Slc40a1の欠損はマクロファージにおける炎症性サイトカインの発現を亢進させず、むしろ低下させる結果が得られた。鉄非添加下に培養したknock downマクロファージにおいても同様の結果が得られたことから、この結果が細胞内鉄蓄積による変化であるのか、あるいは鉄非依存的な変化であるのかを評価する必要が生じた。これらの予測外の結果から、遺伝子欠損マウス(Slc40a1, Nfe2l2)の購入、Rag2欠損マウスとの交配は延期とした。このため、現在までの進捗状況はやや遅れている。炎症性腸疾患は再燃と寛解を繰り返す原因不明の腸管炎症性疾患である。炎症環境下において、細網内皮系細胞であるマクロファージの細胞内に鉄が蓄積する事は以前から知られているが、腸炎に伴い腸管マクロファージ細胞内の鉄濃度がどのように変化するのかは、全く分かっていない。本研究では、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎モデルマウスを用いて、腸管マクロファージ細胞内鉄動態の評価を行い、腸炎が腸管マクロファージ細胞内の鉄動態に与える影響を検討した。デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎モデルマウスにおいて、腸管マクロファージ細胞内の鉄貯蔵タンパクferritinは、細胞外鉄輸送タンパクであるferroportin-1の発現亢進を伴い、一過性に増加することが分かった。次に、ferroportin-1の欠損による細胞内鉄濃度の増加が、マクロファージに与える影響を検討した。マウス骨髄由来マクロファージ(Bone marrow-derived macrophage, BMM)を作成し、shRNAによるFerroportin1のknock downを行った。鉄供給科にBMMを培養し、lipopolysaccharide (LPS)による刺激を行った結果、Ferroportin1のknock downによりBMMからの炎症性サイトカインIL-12p40の分泌量が低下することが分かった。

IL-12p40の発現低下は、ferroportin-1の発現を制御する転写因子Nrf2を介した間接的結果である可能性が考えられるため、今後検討を要する。本研究は、炎症環境下における腸管マクロファージ細胞内の鉄動態を解析し、細胞内鉄制御機構の異常と炎症性腸疾患の病態との関連を明らかとすることを目的とした。DSS誘発大腸炎モデルマウスにおいて、腸管マクロファージ細胞内のferritinは、細胞外鉄輸送タンパクであるferroportin-1の発現亢進を伴い、一過性に増加した。マウス骨髄由来マクロファージを用いた検討では、Ferroportin1のknock downによりLPS刺激後のIL-12p40分泌量が低下した。IL-12p40の低下はferroportin-1の発現を制御する転写因子Nrf2を介した間接的結果である可能性が考えられた。急性腸炎モデルでの追加検討を行いつつ、慢性腸炎モデルでの経時的な鉄関連分子の評価を行う。Western blottingによるferroportin-1の検出には、一定量のタンパク量を要するため、複数匹のマウスからCD11b陽性腸管マクロファージを単離しても検出に十分なタンパク量の確保が難しく、このため今後はFACSによる評価も検討する。マクロファージ細胞内鉄とサイトカイン産生能とのin vitroにおける関連評価については、鉄キレート剤を用いた追加実験を予定している。これにより、得られた結果(Slc40a1 knock downによるLPS刺激後のIl12b発現低下)が鉄依存的な現象であるかどうかを明らかとする。さらに、最近Nrf2がマクロファージにおける炎症性サイトカイン発現をdirectに抑制するという報告(Kobayashi EH et al. Nat Commun 2016)が見られるため、Slc40a1がNrf2発現に与える影響も検討する予定である。これらの結果の進捗を見つつ、当初予定していた遺伝子欠損マウスの購入、Rag2欠損マウスとの交配を進める。ヒト検体についてはこのまま集積を続ける。炎症性腸疾患炎症環境下における腸管マクロファージ細胞内の鉄動態の把握、またマクロファージ細胞内の鉄蓄積がサイトカイン産生能に与える影響の検討、において、当初予定していた結果と反する結果が得られたため、追加検討を行っている。このため、当初計画していた遺伝子欠損マウス(Slc40a1, Nfe2l2)の購入を延期した。差額が生じた最たる理由はこれによるものと考える。実験の進捗を見つつ、当初予定していた遺伝子欠損マウスの購入を進める。