hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゼブラフィッシュを用いた模様形成機構の分子的解明

動物の皮層模様が反応拡散によってつくられることを分子レベルで理解するために、哺乳類の皮層模様形成のモデルとしてLemniscomys barbarus(シマクサマウス、ゼブラマウス)を使い分子レベルでの解析を行った。このプロジェクトを始めた当初は、この動物は、ペットショップなどで容易に入手することができたが、昨今、生産地アフリカでのペストの患者の急増を受けて、媒介動物としてのげっ歯類の移動禁止措置がとられるようになった。結果、非常に入手困難な動物になってしまった。この動物は、国内で扱える模様のある哺乳類としては最小で扱い易く、比較的安価である。しかし、繁殖、系代に関してはまた不透明な点も多く、今後の課題として残された。試みたこととしては、哺乳類の模様形成原理を調べるためには、どうしてもその模様がつくられる時期の胚が必要となる。実際、シマウマなどの大型哺乳類における妊娠育成中の胚を入手することは非常に、倫理的にも、技術的にも困難なことを考えると、この動物は哺乳動物の模様形成機構を調べる上において、非常に重要な基盤となるモデルになりうる生物と私は位置づけている。そこで、交配させ、その胚を生育させようとしたが、胚を入手するところまでには至らなかった。また、成体でも毛の再生することを利用し、模様が再生する過程を遺伝子発現とともに観察することにした。注目すべき分子として、私はアグーチシグナルに着目し、その解析を行っている。この分子の働きは、毛の毛胞に一過的に発現することにより、発現にあわせて、その場にいる色素細胞内でのユーメラニン合成経路からフォアメラニン合成経路へと切り替えられる。これは一本の毛の中での話しだが、このゼブラマウスの場合は、体表を覆う分布にその偏りが模様形成に深く関わるものではないかと考え、その局在と定量解析を進めている。研究計画であるトランスポゾンを利用した模様変異のスクリーニングは進行中であるが結果はまだ出ていない。現段階で、反応拡散モデルに相当する候補分子としてα-MSH、agouti分子に注目している、どちらも皮膚に分布し、細胞外に分泌されるシグナル分子である。まず、agouti分子についてさまざまな模様のある動物で、遺伝子レベル、タンパクレベルでの存在様式を調べるために、モデルを選び、その分布に迫ろうとしている。モデルに使用したのは、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ゼブラマウスである。この解析を始めたころは、ヒト、マウスでagouti遺伝子の存在が確認されており、マウスにおいては毛の周期に同期するように発現していることが確認されている。そこでDegenerated PCR法を用い、まだ確認されていなかったゼブラフィッシュ、ニワトリなどでクローニングを試みたもののなかなかうまくいかなかった。ゲノムやESTのデータが更新された中に、ゼブラフィッシュのagoutiらしいものがあることを黒川博士(養殖研)から情報を提供していただいた。その配列をもとに、ゼブラフィッシュの尾ひれから黒い領域と黄色い領域とで遺伝子の発現レベルで差があるのかreal-time PCRを用い測定したところ、黄色い領域は黒の領域と比べ5倍以上の発現量があることが確認できた。現在、どの細胞がagoutiを産生しているのか解析中である。また、この分子が機能しているのか、反応拡散としての分子としての役割を担っているのかを評価するために、トランスジェニックゼブラフィッシュの作成を準備中である。また、ニワトリでもESTのデータベースによってagoutiが確認でき、その配列から、どこで発現しているのか、遺伝子レベルの解析を行っている。現在のところAgoutiシグナルはマウスにおいて一本の毛の中での色素細胞の分化転換の分子だと考えられているが、動物の模様を反映するように発現しているのであるならば、広く色素細胞の分化転換・決定(細胞運命決定)に働いているのではないかと考えられる。
「自分のことばによる説明」が学習理解を促進する過程

自分の言葉による説明が物事の理解を促す過程,必要な教師の働きかけを明らかにする。小学6年生の授業観察,1年生の作文,幼稚園5歳児の保育観察を行った。言語による説明には,発達段階独特の壁がある。幼児期には,感情をコントロールして言語を用いること,低学年では,話し言葉を書き言葉に変換すること,高学年では,感情的・身体的な知識を言語的・自覚的知識へ変換することに壁がある。教師の働きかけとして,幼児期には,子どもの感情を和らげ言語を用いる機会,小学校的学年では,書きたいという思いを高められるような経験,高学年では,クラス全体への説明を通して,自分の理解状態を自覚できる機会の提供が必要だろう。本研究では,授業中の児童による説明活動が学習理解を促す過程及び,理解深化に必要な教師の働きかけや授業構造を明らかにすることを目的とする。小学1年生6年生を対象に,以下5点の検討を試みる。(1)学習理解には「自分のことばによる説明」が必要であることを明らかにする。(2)学年・教科別に説明の壁の特性を明らかにする。(3)混乱から理解深化へ進展するために必要な教師の働きかけや授業構造を明らかにする。(4)授業での非発言者の理解深化過程を明らかにする。(5)授業での理解過程と学力・学習意欲・学校適応へのつながりとを明らかにする。本年度は,小学校46年生の算数,理科の授業観察を通して,主に(2),(3)の検討を試みた。観察結果から,以下の点が見出された。説明の場面として,大きく3つの場面によって児童の説明が異なる。説明場面として,場面I:クラス全体へ説明することが求められる場面,場面II:教師の指示により説明の時間が設けられたうえで,少人数の友だち同士で説明する場面,場面III:友だち同士やグループ単位での活動の中で自然発生的に説明する場面に分類することができた。場面IIIでは,言語以外の説明ツール(教科書,実験道具,筆記用具)を用いることが多く,また,言語としては,「これ」「それ」等の代名詞も多用され,文章としては不完全な説明が多かった。また,非説明者とのやり取りが頻繁にみられた。場面IIでは,言語以外の説明ツールとしては,自身の描いた図や教科書やプリントの図を指さすことが多用されたが,言語による説明が主となる。非説明者は,説明者の説明を最後まで聞くことが多かった。場面Iでは,説明は主に言語によりなされ,黒板に書かれた図などは,補足的に用いられる。場面IIや場面IIIで理解できていると推測される児童も,場面Iで十分な説明ができるとは限らないため,どのスタイルの説明が理解を反映しているのかをされに検討する必要がある。本研究では,子どものことばによる説明活動が,環境や学習に対する理解を促す過程及び,理解深化に必要な教師の働きかけや授業構造を明らかにすることを目的とする。本年度は,幼児期にその対象を広げ,幼児期における言語化を促す教育環境について考察した。また,言語化を促すことで,幼児が環境に対する理解をどのように深めていくのかを考察した。幼稚園での観察:2週間に1回,幼稚園5歳児クラスでの保育活動を観察した。観察観点は,以下のとおりである。(1)どのような時に言語化が促されるのか。(2)子どもの言語化への欲求がどのような文脈や場面で高まるのか。(3)子どもの言語化への欲求が高まった際に,どのような環境や教師の働きかけがあれば,それらの欲求が満たされるのか。(4)言語化が子どもの物事に対する理解を深める場面にはどのようなものがあるのか。(5)言語化により理解が深まった際の子どもの反応はどのようなものか。(6)言語化がうまくできなかった際の子どもの反応はどのようなものか。言語化への欲求が高まる場面として,遊びが盛り上がっている,子どもが夢中になって遊んでいる,何かになりきって遊んでいる場面が観察された。これらの場面に,教師が介在し,その思いや考えを説明できるような,感情を適度にやわらげる働き,必ず自分の意見も聞いてもらえるという安心感を子どもが得られるような共感的態度や状況づくりが可能なとき,言語化が促される。また,お帰りの時間等,今日一日を振り返り,言語化する場面は,フォーマルな形での言語表現の土台を形成する役割をになう。物事の理解に直接つながる言語表現の場面は多くないが,言語により,自分の思いや感情を表現することで,遊びに夢中になっているあまりに生じやすくなるトラブルを回避できる場面がみられた。このことは,遊びをスムースに発展させることを可能とし,遊びを通しての学びを可能とするだろう。H23年度1年生80名を対象とした予備的な調査を修正し,小学1年生の特に書き言葉による表現力がどのように発達し,また,学習されていくのかを検討した。

H24年度小学1年生70名を対象に,作文の観点別評価,構造評価を行った。1学期に書かれた作文をすべて文字入力し,文字数をカウントした。各月を上旬と下旬に分け,各時期で最も文字数の多い作文を抽出し,全体的評価,流れ,感情表現,詳細記述の観点で評価を行った。構造評価として,ばらばら型,羅列型,前後型,時系列・順序型,包括型,深まり型の6つの型に分類した。分析の結果,1年生の5月に量的な増加が急激に生じ,その後,観点別評価得点が上昇する傾向がみられた。評価得点は, 4月時点から個人差が大きく,安定していた。合わせて,1学期末に担任教師2名による児童評価を,好奇心探究心,主体性,自立性,自律性,伝え合う力,社会性,協同性,先を見通す力,集中性,学業面での適応の心配,学校生活面での適応の心配の観点から行った。教師による児童評価と作文の量的評価(文字数)との関連はみられなかったが,作文の全体評価とは,弱いながら正の相関がみられた時期もあった。作文の全体評価と教師の児童評価との関連が見られる傾向にあり,作文の量と教師の児童評価との関連は安定していないことから,書き言葉による表現の質が,学校生活全般にかかわる適応上の問題とも関連している可能性が示唆された。一方,文字数は,教師による児童評価との関連が安定していなかったが,その増加が,質的な変化の前に生じる傾向がみられたことから,作文の量的な変化も,質的な変化のベースとなることが推測される。さらに,作文の観点別評価の個人差が安定していることから,1年生以前のことばにかかわる力や体験も,小学校以降の自分のことばでの表現力に影響を与えるのではないかと考えられる。健康上の理由。25年度が最終年度であるため、記入しない。H23年度の小学校高学年の授業中の説明活動と,1年生の作文の分析をあわせることで,小学生における自分のことばによる表現のあり方と,学習との関連の位置側面を明らかにすることができた。また,日本心理学会第76回大会において,上越教育大学研究紀要第32巻,成果の一部を公表することができた。授業中の説明場面において,特性の異なる場面が見出された。それぞれの説明場面における説明と児童生徒の理解状態との関連をさらに明らかにしたい。研究対象として,これまでは,小学4年生以上を中心に検討したため,今後は,小学3年生以下を対象とした研究も開始したい。さらに,授業中に説明を行わない児童の理解状態,言語能力についての把握が困難であったため,今後は,ノートや作文等を通して,書き言葉による言語表現と理解深化や学校適応との関係を明らかにしたい。本年度および次年度以降の研究成果を日本心理学会等で発表したい。小学校高学年において,自分のことばによる説明活動が学習理解に関わる可能性が示唆された。また,小学校低学年(1年生)において,作文の質が,教師による児童評価と関連する可能性が示唆された。さらに,小学1年1学期において,すでに作文による表現のあり方に個人差が見られ,それが安定していることも示された。これらの結果から,小学校入学以前における言語活動の重要性が推測される。
グレリンの肺癌化学療法における副作用抑制効果の検証

化学療法を施行する進行肺癌患者にグレリンを投与するにあたって、血漿グレリン濃度を測定し、副作用やQOLとの関連を検討した。抗癌剤化学療法によって14日間のうちにQOLスコアが増悪した群と増悪しなかった群に分けると、QOLスコアが増悪しなかった群では、血漿アシルグレリンが有意に低く(増悪群17.0±7.9 fmol/ml vs非増悪群6.3±2.2 fmol/ml, p = 0.016)、14日間の経過を通しても同群で血漿アシルグレリン値が低い傾向にあった。本事業の初年度は進行肺癌患者における内因性グレリンを測定し、その意義を検討した。また、肺癌化学療法を施行する患者においてその副作用軽減目的にグレリンを補充する適切な時期、期間を検討するため、副作用発生に関する調査を行った。化学療法を施行した進行肺癌患者と健常人ボランティアでAIA法により血漿アシルグレリン、デスアシルグレリンを測定した。肺癌症例の背景は男性17例、女性9例、非小細胞肺癌が24例、小細胞肺癌が2例、平均年齢は63歳、平均BMIは22.8であった。健常人では血漿総グレリンが41.4fmol/mlであったのに対して肺癌患者では90.7fmol/mlと有意に上昇していた(p=0.017)。また、肺癌の有無、性別、年齢、BMIを調整して多変量解析を行うと、肺癌の有無が血漿総グレリン上昇を予測する独立した因子であった。さらに、化学療法を施行して体重が減少した患者では治療前に比べて治療後で内因性グレリン産生が増えていた。上記とは別に進行肺癌のため初回の化学療法を施行した患者33症例で抗癌剤による有害事象の有無と程度、期間を検討した。患者背景は男性25例、女性8例、平均年齢64歳、非小細胞肺癌21症例、小細胞肺癌12症例であった。1症例を除いた32症例ではプラチナ製剤が投与されていた。体重変化を検討できた28症例では27症例で体重が減少しており、平均1.7kgの減少であった。33症例中、60%以上の摂食量低下を来した症例は82%、食思不振を訴えた症例は55%、その他に筋肉痛、倦怠感、しびれ感、不眠などがあった。これらの有害事象は抗癌剤開始後2日目からの7日間に集中して生じていた。これらの検討より進行肺癌患者、特に化学療法を施行して体重が減少した患者では内因性グレリン産生が増加しており、抗癌剤投与後に薬理的量のグレリン投与が有効であると考えられた。宮崎大学医学部附属病院に入院し、化学療法を施行する進行肺癌患者11症例を対象とした。化学療法のday-1、4、8、11、14にAIA法により血漿アシルグレリン、デスアシルグレリンを測定した。また、アンケート(VASスケール)を用いて食欲、倦怠感、気力、嘔気等自覚症状の程度を評価した。化学療法前と14日後のQOLスコアをEuropean Organization Research and Treatment of Cancer(EORTC),QOL-C30で評価した。これらの自覚症状やQOLスコアとグレリン値との関連を検討した。症例の背景は、男性6例、女性5例、平均年齢は66歳、肺癌の内訳は非小細胞肺癌III期1例、IV期5例、小細胞肺癌限局型4例、進展型1例であった。抗癌剤投与から14日間に全症例で体重が減少し、平均で-2.2kgの減少を来した。血漿中アシルグレリン濃度の動態は化学療法前値の平均が8.4±2.4fmol/mlに対してday4で最低値の平均7.0±2.6fmol/mlとなり、その後はほぼ前値に戻った。EORTC QOL C-30で評価したFunctionスコアでは、抗癌剤化学療法によって14日間のうちにスコアが増悪した群と増悪しなかった群に分けると、血漿アシルグレリンが増悪しなかった群で有意に低く(増悪群17.0±7.9fmol/ml vs非増悪群6.3±2.2fmol/ml,p=0.016)、14日間の経過を通しても血漿アシルグレリン値が低い傾向にあった。これは抗癌剤副作用に対するグレリンの抗カヘキシア作用のためと考えられた。QOL増悪群ではグレリンを補充することにより、その改善を得られる可能性が示唆された。

症例の背景は、男性6例、女性5例、平均年齢は66歳、肺癌の内訳は非小細胞肺癌III期1例、IV期5例、小細胞肺癌限局型4例、進展型1例であった。抗癌剤投与から14日間に全症例で体重が減少し、平均で-2.2kgの減少を来した。血漿中アシルグレリン濃度の動態は化学療法前値の平均が8.4±2.4fmol/mlに対してday 4で最低値の平均7.0±2.6 fmol/mlとなり、その後はほぼ前値に戻った。EORTC QOL C-30で評価したFunctionスコアでは、抗癌剤化学療法によって14日間のうちにスコアが増悪した群と増悪しなかった群に分けると、血漿アシルグレリンが増悪しなかった群で有意に低く(増悪群17.0±7.9 fmol/ml vs非増悪群6.3±2.2 fmol/ml, p = 0.016)、14日間の経過を通しても血漿アシルグレリン値が低い傾向にあった。これは抗癌剤副作用に対するグレリンの抗カヘキシア作用のためと考えられた。QOL増悪群ではグレリンを補充することにより、その改善を得られる可能性が示唆された。これらの結果を受け、化学療法を実施する進行肺癌患者へヒト合成グレリン3μg/kgを1日2回、化学療法のday 2から6日間静注投与するプラセボコントロール試験を開始し、1症例に投与した。エントリーした患者はグレリン投与に伴う有害事象は認めず、安全に臨床試験を終えることができた。本研究の当初の予定では、本年度下半期にはグレリン投与の臨床試験に着手する予定であったが、東日本大震災により医療支援のため臨床研究体制を見直す必要が生じた。また、震災の影響で資材やペプチド供給、臨床試験補償保険の見積もり等にも遅れが生じたため、本来の予定よりやや研究の進捗が遅れることとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。試験薬であるグレリンの製剤化、臨床試験補償保険、効果・有害事象モニタリングなど、ヒトへのグレリン投与を行う体制が整ったため、平成24年度より臨床試験を開始する。
アジアの伝統薬学文献にみられる絵画材料の基礎的研究

研究目的:アジアの伝統薬学に関する文献には、多くの美術工芸材料についての記述が点在している。これらは、特に絵画技法材料の秘訣とされている部分を解明するための重要な情報であるが、これまで絵画材料としての総合的な研究は未発達であった。本研究は各文献より情報の抽出を行い、データベースを構築し、今後の発展的研究の基礎とすることを目的とする。研究方法と経過:古典医学書、本草書、技術書、絵画技法書等から、情報を収集し電子化した後に、入れ子状になっている引用等を整理しつつ、順次、リレーショナル型のデータベースに入力した。今後は情報の状態を最適化し、公開に向けての継続的な研究を行っていく。研究成果:通常のビッグデータからみると本研究はあまりにも規模が小さいが、その基本理念は、多分野に渡って情報が点在し、誤記や異説が入り乱れて複雑に重層化している絵画材料の文献の研究にも応用できる。断片化して点在する情報に書誌学的な検証を行い、コンピュータ上で整理する事により、紙の上の研究では見えにくかった情報の連なりが、少ない労力で浮かび上がってくるようになった。成果を活用した実例として、「ビューティサイエンス第3号」の『化粧品としての綿臙脂』があげられる。作成したデータベースを用いて、本草書と絵画技法書を組み合わせて研究し、謎の多かった綿臙脂の正体についてまとめることができた。伝統薬学の文献を、本草学や博物学をこえて、総合的な材料学の文献ととらえる事で、天然の原料を生活のあらゆる面に活用してきた先人の知恵に触れる事ができる。この手法は、紙や墨、その他の色材についても充分に応用が可能であろう。
培養人眼線維柱組織のムコ多糖合成

1.人眼線維柱組織の器官培養法は当教室ですでに確立されているので、生化学的な分析の手法の確立のために家兎眼において、(1)線維柱組織および隣接組織でのムコ多糖(GAG)の分析を行い、(2)次いで培養線維柱組織でのGAGの生合成をradioisotope(RI)を用いて分析した。2.この手法により培養人眼線維柱組織でのGAGの生合成の分析を行い、(1)同一眼で部位差のないこと、(2)左右眼で差のないこと、(3)4×4mmの大きさの組織片で分析ができることを報告した。3.次にsteroid hormonc(dcxamcthasone,DX)の投与によりGAGの生合成にどのような変化が起こるのかを調べ、(1)DX投与でRIの取り込み総量が減少すること、(2)radioautographyでもこの結果を確認したこと、(3)GAGの成分ではchondroitin sulfate(CS)の割合が減少することを報告した。4.またCS投与による変化を調べ、(1)3Hーglucosamineの取り込みではCS,heparan sulfate(HS)の割合の増加とhyaluronic acidの減少、(2)35Sーsulfateの取り込みではCS,HSの増加とdermatan sulfateの減少が起こることを報告した。5.他方GAGはタンパクと結合して存在していることから、人眼線維柱組織でのタンパクの分析もSDSーPAGEを用いておこなった。そして(1)30本以上のタンパク質のバンドが得られ、(2)同一眼での部位差のないこと、(3)3週間以内の培養ではバンドに変化の見られないこと、(4)隣接組織とは相異があることを報告した。6.現在は培養人眼線維柱組織でのGAGおよびタンパクの生合成が、各種の薬剤の投与によりどのように変化するかを研究中であり、今後これらの結果を報告していく予定である。培養人眼線維柱組織におけるムコ多糖合成を調べるまえに、正常人眼線維柱組織のムコ多糖分析をしておく必要がある。その前段階として、家兎眼線維柱組織のムコ多糖の分析をおこなった。これは第55回中部眼科学会で口演した。その内容は、家兎眼線維柱組織のムコ多糖全体としての電気泳動パタ-ンは、他の眼組織の中でも、強膜・虹彩・毛様体とは比較的似ていたが、酵素消化法を用いてムコ多糖の各成分を調べてみると、相異がみられ、各成分の比は、ヒアルロン酸が9.5%、コンドロイチン硫酸が25.2%、デルマタン硫酸(及び少量のケラタン硫酸・ヘパラン硫酸が含めて)が65.2%であった。次いで、正常人眼線維柱組織についても、家兎眼の場合と同じ分析を行なっている所である。組織培養法とRI(^<35>S-sulfate及び^3H-glucosamine)を用いてのムコ多糖合成の分析についても、まず培養家兎眼線維柱組織におけるRIの取り込み量にもとづいて、ムコ多糖の産生量の分析をおこなっており、電気泳動のパタ-ンについては、培養前のパタ-ンに似ていること、そして合成ムコ多糖の各成分比については、やはり培養前の各成分比に近い所もあるが、培養条件等でかなり異なることもあることを認めており、これらについては、近々報告する予定である。培養人眼線維柱組織についても、RIの取り込み量によるムコ多糖合成の分析を始めており、この分析方法が確立すれば、予定通り今後各種の薬剤等が人眼線維柱のムコ多糖合成にどのような影響を与えるか分析することが可能となる。

平成2年度においては、Radio Isotope(RI)を用いての培養線維柱組織の研究が行なわれ、次に示すような成果が得られた。1.まず、前年度に一部始められていた培養家兎眼線維柱組織にRI( ^3Hーglucosamineと^<35>Sーsulfate)を取り込ませてムコ多糖の生合成を調べる実験は、第94回日本眼科学会において発表した。その主な内容は、(1)家兎眼線維柱組織においては、培養を始めてからの期間によって合成するムコ多糖の成分が変化すること、少くとも1週間以上は前培養すべきこと、(2)RIの投与期間は2日以上必要なこと、(3)1眼を8等分した小さい組織片でも、分割しない大きな組織片と同様の結果が得られること、(4)器官培養した線維柱組織は、培養前の組織のムコ多糖成分と類似した合成成分割合を持ちうること、などである。2.次いで正常人眼線維柱組織について、上記と同じ手法によりムコ多糖の合成について調べ、第56回中部眼科学会において発表した。ここでは、(1)人眼においても1眼を8分割した小さい組織片でムコ多糖の生合成をしらべることができること、(2)各組織片毎の結果に大きな差がないこと、(3)家兎眼とは異なった生合成パタ-ンを示したことなどを示した。3.更に2と同じ手法で、副腎皮質ステロイドを培地に加えてどのような相異がおこるのかを調べ、第56回中部眼科学会において発表した。ここでは、ステロイド投与によりムコ多糖全体の合成量が変化することを示した。以上のように、この研究は順調に進んでおり、現在は更に各種の薬剤等がどのような影響を線維柱組織に及ぼすのかを調べている所である。平成三年度においては、前年度にひき続き、ラジオアイソト-プを用いての培養人線維柱組織の研究が行われ、以下のような成果が得られた。培養人線維柱組織に関して、前年度と同じ手技によりムコ多糖合成に対する薬剤の影響を検討し第95回日本眼科学会において発表した。ここではムコ多糖合成能に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響を検討し、コンドロイチン硫酸投与により、培養人線維柱組織のムコ多糖の合成能に変化が生じ、コンドロイチン硫酸の成分割合がコンドロイチン硫酸非投与群に比して有意に増加することが判明した。更に、ムコ多糖はタンパクと結合して存在しているので,糖タンパクとしての分析も必要であり,そのために一部、タンパクの分析も行なった。正常屍体摘出眼から線維柱組織を切り出し,SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動法,銀染色法,デンシトメトリ-を用いた手法によりタンパク質分画を染色し,泳動図の各バンドを定量し,同一眼及び異なる眼から得られたタンパク分画はほぼ同一のパタ-ンを示すことを第95回日本眼科学会において発表した。また、線維柱組織におけるタンパク合成への副腎皮質ホルモンの影響を検討するため、培養人線維柱組織にステロイドホルモンを加え、ラジオアイソト-プを使用して、電気泳動法、デンシトメトリ-,ラジオオ-トグラフィ-,酵素抗体法等の手法を用いて検討中である。以上のように平成三年度においては、培養人線維柱組織のムコ多糖合成能に対する薬剤の影響を実証し、更にタンパク質合成能に関しても検討した。
木材流通の適正化と流通機構の再編に関する総合的研究

1.原木流通では,先づ,素材生産担当者による山元土場で樹材種・材質によって等級選別された上で原木市売市場で再び選別されるという二重の選別構造により国産材は広域流通・錯綜流通していく.国産材流通上,市売市場の位置は量的・機能的に高くなっている.しかし,間伐材小径木生産の増大のもとで市場経営は圧迫を受けている.市売市場の社会的意義を促進していく上で,流通と加工部門を直結させた流通経路の短縮化,小径木仕訳の簡略化が課題であり,市場機能の分化,物流機能の自動制御化・ハイテク化,情報機能の強化及び小径材の場外流通のシステム化の方向が検討されよう.2.製材産地は,戦前型と戦後型,全国産地型と地方産地型に類型化されるが,それほど目立たない小規模の生産地が存在することを明らかにした.兵庫県の場合,全国-地方銘柄,あるいは全国産地-地方産地という分業図式から外れた空白の分野で生じている新しい方向であること指摘した.3.遠隔地産地の宮崎県・熊本県を事例にして製品流通の再編形態の1つとして共同販売形態の実態と仕組みを分析した.木材の共同販売は数多くのタイプがあり組織形態からみると同一業種によって構成される地域横断型と生産,加工,流通に係わるものが垂直的に結びついた地域縦断型共販組織に大別できる.前者は在来型であり,構成員間の信頼,コスト概念,製品規格の統一と平準化が発展条件であり,後者は新興型であり,加工木材分野の進出,コンビナート型産地形成等により需要の多様化と個別化更には拡大策として果すべき役割は大きい.4.産地形成及び木材流通の再編の一形態として「産直住宅」を位置づけたが,住宅自体が銘柄化するためオルガナイザーの役割は極めて大きい.5.地域の木材産業関連業者の市場行動は政策当局の理念と必ずしも整合していない.整合問題の解決はむずかしい.1.原木流通では,先づ,素材生産担当者による山元土場で樹材種・材質によって等級選別された上で原木市売市場で再び選別されるという二重の選別構造により国産材は広域流通・錯綜流通していく.国産材流通上,市売市場の位置は量的・機能的に高くなっている.しかし,間伐材小径木生産の増大のもとで市場経営は圧迫を受けている.市売市場の社会的意義を促進していく上で,流通と加工部門を直結させた流通経路の短縮化,小径木仕訳の簡略化が課題であり,市場機能の分化,物流機能の自動制御化・ハイテク化,情報機能の強化及び小径材の場外流通のシステム化の方向が検討されよう.2.製材産地は,戦前型と戦後型,全国産地型と地方産地型に類型化されるが,それほど目立たない小規模の生産地が存在することを明らかにした.兵庫県の場合,全国-地方銘柄,あるいは全国産地-地方産地という分業図式から外れた空白の分野で生じている新しい方向であること指摘した.3.遠隔地産地の宮崎県・熊本県を事例にして製品流通の再編形態の1つとして共同販売形態の実態と仕組みを分析した.木材の共同販売は数多くのタイプがあり組織形態からみると同一業種によって構成される地域横断型と生産,加工,流通に係わるものが垂直的に結びついた地域縦断型共販組織に大別できる.前者は在来型であり,構成員間の信頼,コスト概念,製品規格の統一と平準化が発展条件であり,後者は新興型であり,加工木材分野の進出,コンビナート型産地形成等により需要の多様化と個別化更には拡大策として果すべき役割は大きい.4.産地形成及び木材流通の再編の一形態として「産直住宅」を位置づけたが,住宅自体が銘柄化するためオルガナイザーの役割は極めて大きい.5.地域の木材産業関連業者の市場行動は政策当局の理念と必ずしも整合していない.整合問題の解決はむずかしい.1.丸太商品は用途の汎用性と共に市場の汎用性を持ち、そのため広域流通や買い手間の錯綜した競争構造が形成されていること。(1)スギ丸太では、買い手間に径級別分化傾向が顕徴にみられる一方、価格形成要因分析からみた商品分化は進んでいない。(2)ヒノキ丸太では、径級別商品分化が進み、それぞれ分化した商品ロット内で買い手間競争が展開される構造を有している。2.マツ材の流通構造は、優良大径材の顕徴な減少・マツクイムシ被害等による資源の劣弱化のなかで、地域、用途によって需給バランスが不安定であり、従来の域産域消性が薄れ、広範な流通経路を形成している。特に、マツクイムシ被害は撹乱要因となっており、被害の移動とともに変化している。被害木の価格低下が山元での立木売上げ所得の低下に大きく影響している反面で、加工業者では原料木を安価に入手している。また、被害木はその使用価値以上に低く価格形成されることが多く、素材生産業者や加工業者の利潤に転化している場合が多い。3.木材流通の合理化、流通経路の短縮や流通マージンのカット等が叫ばれるなかで、原木市売市場の流通機能が見直されている。静岡県天竜,三重県松阪,岐阜県東濃,徳島県三好,高知県嶺北,大分県日田や宮崎県都城地域等では市場流通量が増大している。しかし、林業振興の観点から原木市場の配置上、市場の集荷・販売圏の広がりの問題、規模の問題等を内抱している。4.産地間競争・産地の活性化の重要な手段として共同販売方策と産直住宅方策の具体的な検討をすすめている。

前者では宮崎県・熊本県などの地場需要をあまり期待できない遠隔地型産地や「新」製品の共同生産・共同販売に取り組んでいる天竜産地等を調査研究した。後者として、林材一体かつ自治体のバックアップによる産直住宅の盛んな岐阜県や愛知県の事例を調査している。
神経細胞の死と生存を決定するミトコンドリア遺伝子発現制御メカニズム

【目的】ミトコンドリア機能異常は、ミトコンドリア内酵素活性変化およびミトコンドリア遺伝子の発現変化あるいは損傷に起因すると考えられる。しかしながら、グルタミン酸誘発性神経細胞傷害におけるミトコンドリア遺伝子発現変化の関与については十分に解析されていないのが現状である。したがって、本研究ではグルタミン酸刺激によるミトコンドリア遺伝子の発現変化について解析した。【方法】培養12日目のddYマウス大脳皮質由来初代培養神経細胞に100μMグルタミン酸を15分間暴露し、洗浄後に培養を一定時間継続した。神経細胞死は、MTT還元活性およびヘキスト33342染色法により解析した。ミトコンドリアmRNAおよびミトコンドリアDNAの変化は、それぞれノザンブロット法およびサザンブロット法により解析した。ミトコンドリア電子伝達系の一つであるNADH脱水素酵素(複合体I)活性が測定された。【結果】グルタミン酸処理後4時間からMTT還元活性の有意な低下がみられ、24時間では約40%まで低下した。また、本処理後6時間から著明な細胞核の凝集が確認された。このような条件下で、ミトコンドリアmRNAの発現変化を解析したところ、NADH-ユビキノン酸化還元酵素サブユニット(ND1およびND6)が処理後6時間以降で著明に減少することが判明した。しかしながら、シトクロムc酸化酵素サブユニット(CO1)には有意な変化はみられなかった。一方、ミトコンドリアDNAは少なくとも処理後12時間までは著変は認められなかった。また、複合体I活性は処理後2時間以降に著明な低下が観察された。【考察】大脳皮質由来初代培養神経細胞において、グルタミン酸暴露は神経細胞傷害に先だってミトコンドリア機能を低下させるとともに、ND1およびND6 mRNAの発現量を著しい減少させることは明らかとなった。有機スズのトリメチルスズ(TMT)は、ヒトおよびゲッ歯類において神経変形および行動異常を引きおこすことが知られる。我々は、TMTがマウス海馬歯状回顆粒細胞に選択的な神経細胞死を誘発することを既に報告した。本研究では、TMT誘発性神経細胞傷害におけるミトコンドリア機能の関与を解明する目的で、TMT投与マウスの海馬ミトコンドリアDNAの変異について解析した。ddY系雄性マウスにTMT(2.8mg/kg)を腹腔内投与し、一定時間経過後に海馬から全DNAを調製した。ミトコンドリアDNAの検出は特異的なプライマーを用いたPCR法により行い、PCR産物について塩基配列を解析した。TMT投与後、6時間、16時間および24時間に調製した海馬全DNAについて、ミトコンドリアDNAの中でNADH-ubiquinone oxidoreductaseサブユニット(ND1およびDN6)、cytochrome bおよびcytochrome coxidaseサブユニット(COI、COIIおよびCOIII)の領域をPCR法で増幅したところ、ND1およびDN6領域のPCR産物の著しい減少がみられることが判明した。これらに対して、cytochrome bおよびCOI、COIIおよびCOIIIの領域のPCR産物は著変を示さなかった。ND1およびDN6領域のPCR産物の塩基配列を決定したところ、それぞれ33箇所および20箇所の変異がみられることが明らかとなった。以上の結果より、TMTは海馬ミトコンドリア遺伝子の変異を誘発することが明らかとなり、TMT誘発性神経細胞傷害にミトコンドリア遺伝子の変異に基づくミトコンドリア機能障害が関与する可能性が推察される。

しかしながら、グルタミン酸誘発性神経細胞傷害におけるミトコンドリア遺伝子発現変化の関与については十分に解析されていないのが現状である。したがって、本研究ではグルタミン酸刺激によるミトコンドリア遺伝子の発現変化について解析した。【方法】培養12日目のddYマウス大脳皮質由来初代培養神経細胞に100μMグルタミン酸を15分間暴露し、洗浄後に培養を一定時間継続した。神経細胞死は、MTT還元活性およびヘキスト33342染色法により解析した。ミトコンドリアmRNAおよびミトコンドリアDNAの変化は、それぞれノザンブロット法およびサザンブロット法により解析した。ミトコンドリア電子伝達系の一つであるNADH脱水素酵素(複合体I)活性が測定された。【結果】グルタミン酸処理後4時間からMTT還元活性の有意な低下がみられ、24時間では約40%まで低下した。また、本処理後6時間から著明な細胞核の凝集が確認された。このような条件下で、ミトコンドリアmRNAの発現変化を解析したところ、NADH-ユビキノン酸化還元酵素サブユニット(ND1およびND6)が処理後6時間以降で著明に減少することが判明した。しかしながら、シトクロムc酸化酵素サブユニット(CO1)には有意な変化はみられなかった。一方、ミトコンドリアDNAは少なくとも処理後12時間までは著変は認められなかった。また、複合体I活性は処理後2時間以降に著明な低下が観察された。【考察】大脳皮質由来初代培養神経細胞において、グルタミン酸暴露は神経細胞傷害に先だってミトコンドリア機能を低下させるとともに、ND1およびND6 mRNAの発現量を著しい減少させることは明らかとなった。
細胞分裂期に生じる中間径フェラメントリン酸化へのcdc2キナーゼ、suc1の関与

細胞分裂期(核分裂期と細胞質分裂期)に生じる中間径フィラメントのリン酸化の生物学的意義と遂行する蛋白質キナーゼについて研究している。1).核分裂期に作動する中間径フィラメントキナーゼとして我々はcdc2キナーゼである可能性を報告してきた。本年度の研究でこの点をより明らかにするため、ビメンチンのcdc2キナーゼ特異的リン酸化部位のリン酸化状態を脱リン酸化状態と識別して認識するマウスモノクローナル抗体の作成に成功した。2).この抗体は核分裂期にある細胞の中間径フィラメントと特異的に反応し、他の時期の中間径フィラメントとは反応しなかった。このことは我々の仮説が正しかったことを示している。3).in vitroでのリン酸化部位解析の結果より、細胞質分裂期に活性化される中間径フィラメントキナーゼの候補の1つとしてCa^<2+>カルモジュリン依存性キナーゼIIが浮かびあがった。現在この点を明らかにするために、中間径フィラメント蛋白質のカルモジュリン依存性キナーゼII特異的リン酸化部位のリン酸化状態を認識できるマウスモノクローナル抗体の作成をしている。
チトクロームPー450を中心とした薬物代謝酵素遺伝子発現と化学発癌

1.P450、アセチルトランスフェラーゼ(AT)の遺伝子構造とその発現調節:メチルコラントレン(MC)で誘導されるハムスター肝P450MCI(IA2)(芳香族アミンなどの代謝)、MCII(IIA)(アフラトキシンの代謝)のcDNAの全塩基配列、ラット肝の培養により誘導されP450(Mー1)抗体と反応する新しいP450のcDNA塩基配列、癌原性アリルアミンの代謝に重要なATー1のcDNAの塩基配列を決定した。ラットP450IA1遺伝子の誘導的発現に関与する基本的転写因子(BTE)に結合する蛋白のcDNAを分離し、56KDaの分子量を決定した。ヒトP450humanー2のcDNAを酵母内で発現し、この蛋白はベンツピレンとメフェニトインの代謝活性が強いことを確かめる。P450IA1遺伝子に属するイヌとサルのcDNAを分離し、酵母内で発現すると、変異原の活性化能のテストでベンツピレンへの感受性はなかった。2.P450、グルタチオンSートランスフェラーゼ(GST)の蛋白の精製とその特質:P450II掛C遺伝子に属すが、アフラトキシンB_1の活性化に関与するイヌP450D1とラットP450maleと、活性化能の低いカニクイザルP450MKー1とヒトP450HMー2とに分かれ、P450IIIAに属するサルP450MKー2、ヒトP450HMー1も共に低かった。ジアルキルニトロサミンの活性化には、アルキル基の種類によりP450IIE1とP450IIC12への依存性が異なっている。発癌剤アリルメタノールの硫酸エステルを不活性化する新しいGSTを分離精製した。3.ヒト遺伝子多型性:P450IA1遺伝子でII型制限酵素Mspー1、P450IIE1遺伝子でMspー1、Rsaー1、Draー1、P450IIIA遺伝子でEcoRー1部位にRFLPが認められた。4.将来への展望:癌原性化学物質の代謝に関与する新たなP450遺伝子の同定を試み、ヒトでのRFLPと遺伝的素因との関連をみる。
意思決定と管理会計・原価計算システムの役割期待に関する研究

自律的組織における様々な意思決定を支援するべく適切なミクロ・マクロ・ループ(MMループ)を形成するために原価計算に求められる役割期待が変化していることを明らかにした。平成19年度はとくに、MMループによって、全員参加の経営を促して組織を活性化させることにも貢献できることを明らかにした。平成20年度は、会計的なMMループに着目し、財務会計と管理会計との整合性と結合部分について検討した。平成21年度は、どのような情報が組織内の意思決定に適切であるのかという観点から、近年の製品原価計算の研究動向と、マネジメント・コントロール・システムにおけるABCの位置づけに焦点を当てた。本研究では、まず自律的組織における意思決定問題やコントロール、そしてプロセスの可視化についての論点を整理し、それらの有効性を明らかにしたいと考えている。さらに、意思決定環境の変化との関連で原価計算に求められる役割期待(プロセスの可視化、活動別増分原価情報の提供、およびミクロ・マクロ・ループ)についても、文献研究および事例研究を通じて十分な検討を行う。本年度はとくに、会計的なミクロ・マクロ・ループに着目した。自律的組織では、トップ・マネジメントから中級管理者、現場管理者のみならず現場作業員に至るまでの各階層で様々な種類の意思決定が行われている様子を観察できる。そして、各組織構成員は自ら考え、行動・作業している。これは、現代の企業組織における意思決定の範囲・概念が拡大したのと同時に、意思決定をする人々の範囲が拡大したことを意味している。このような意思決定環境の変化に伴い、自律的組織における様々な意思決定を支援するべく原価計算に求められる役割期待が変化していることを指摘できる。また、従来の継続的改善活動を支援するための会計システムの不備や、トヨタにおける原価管理の進化について取り上げ、各種の意思決定を行う現場に財務情報を提供するためには、因果関係を追究した精緻で正確な原価計算システムが不可欠であることも明らかにしている。しかし、ただ日々の活動そのものや微細な改善活動の効果を測定することができるだけではなく、さらに原価計算システムは重層的なミクロ・マクロ・ループを有するトータル・システムの一翼を担うように構築される必要がある。これによって、全員参加の経営を促して組織を活性化させることにも貢献できる。本研究課題では、まず自律的組織における意思決定問題やコントロール、そしてプロセスの可視化についての論点を整理し、それらの有効性を明らかにしたいと考えている。さらに、意思決定環境の変化との関連で原価計算に求められる役割期待(プロセスの可視化、活動別増分原価情報の提供、およびミクロ・マクロ・ループ)についても、文献研究および事例研究を通じて十分な検討を行っている。とくに平成20年度は、会計的なミクロ・マクロ・ループに着目し、財務会計と管理会計との整合性と結合部分について検討した。管理会計と財務会計との整合性を分析することは、会計的なミクロ・マクロ・ループを構築する上で大きな意味をもつ。例えば長期請負工事契約下で工事進行基準を適用する場合には、個別原価計算に進捗度の概念が不可欠であることを指摘し、活動基準原価計算(ABC)を用いた活動基準分析による戦略的マネジメントの必要性を明らかにした(『会計論叢』に公表済)。その他、外国文献において、自律的組織に関する議論およびそのマネジメントに適切なミクロ.マクロ・ループに関する議論を精査した。中でもSimons(1990)およびOldman & Tomkins(1999)の見解によると、より厳しい経営環境の下では、企業家的な戦略を策定・実施している自律的組織のような組織が有効に機能することが主張されていた点は、大変興味深い。しかしながら一方では、ミクロ・マクロ・ループに関する議論が欠如していたことも指摘できる(平成21年度中に2編が刊行予定)。今後も適切なミクロ・マクロ・ループを形成するための試案を模索する必要があるといえる。本研究課題においては、自律的組織における意思決定問題やコントロール、そしてプロセスの可視化についての論点を整理し、それらの有効性を明らかにしたいと考えている。そのために、意思決定環境の変化との関連で原価計算に求められる役割期待(プロセスの可視化、活動別増分原価情報の提供、およびミクロ・マクロ・ループ)についても、文献研究および事例研究を通じて十分な検討を行った。とくに平成21年度は、どのような情報が組織内の意思決定に適切であるのかという観点から、近年の製品原価計算の研究動向と、マネジメント・コントロール・システムにおけるABCの位置づけに焦点を当てた。まず製品原価計算の研究については、組織の様々な意思決定に役立つ基礎的原価データを提供する製品原価計算システムが具備すべき要件について検討し、TDABCやLabro等の所説から有用な示唆を得ることができた(『会計プログレス』に投稿済・再査読中)。一方、自律的組織のマネジメント・コントロール・システムにおいては、適切なミクロ・マクロ・ループを形成するために、ABCがいかなる役割を期待されているのか、Cooper & Turney(1991)、Kaplan & Cooper(1998)、Simons(2005)の所説を中心に検討した。

しかしながら、それらの見解によると、自律的組織が有効に機能するために不可欠な「適切なミクロ・マクロ・ループ」を形成するための条件が十分には検討されていなかったことを指摘し、ABC情報を司る会計担当者、コミットメント、および「場」の概念が重要であることを提示した(『原価計算研究』に投稿・受理済)。
次世代シークエンサーを用いた生殖系列のエピゲノム修飾とトランスクリプトーム解析

マウス生殖系列におけるDNAメチル化リプログラミングの全容解明に向け、次世代シークエンサーを用いて全シトシンの包括的メチル化解析およびトランスクリプトーム解析を実施した。卵子・精子では30%および80%であったDNAメチル化は、受精後脱メチル化を受け胚盤胞では18%に減少した。着床後E7.5エピブラストでは73%に急上昇したが、その後始原生殖細胞では急速に減少しE13.5では5%以下となった。トランスクリプトーム解析は、生殖系列におけるDNAメチロームを反映した遺伝子発現調節の実態を明らかにした。本研究は生殖系列全体のDNAメチロームおよびトランスクリプトームの全貌を初めて提示した。平成22年度には、以下の研究成果を得た。イルミナ社の超高速シーケンサー:Genome Analyzer IIならびにHi-seq2000を用いて、BSS法により、マウス精子・卵子の全ゲノム包括的メチル化解析を行った。解読された約30億超のリード(36-76塩基)をマウスゲノムにマッピングした結果、カバー率はゲノム全体の80%は少なくとも1リード以上張り付き、多重度の平均は13×以上のDNAメチル化マップを作製することに成功した。ゲノム全体において、卵子は精子と比べてメチル化レベルは低く、ゲノム全体では高メチル化領域と低メチル化領域に二分されていることが明らかとなった。また、インプリント遺伝子の制御領域であり、生殖細胞でメチル化に明確な差異がみられるDMR(Differentially methylated region)のメチル化を評価したところ、精子型インプリント領域は高メチル化、卵子型インプリント領域は低メチル化を示したことから、作製したDNAメチル化マップは各シトシンのメチル化状態を正確に反映した精度の高いメチル化マップであることが証明された。このメチル化マップのプロファイルに基づき、CpGアイランドのメチル化解析を行った結果、約1000の卵子で高度にメチル化されているCpGアイランド、ならびに約600の生殖系列DMRを同定した。また遺伝子発現とメチル化の関連性について検証するため、Genome Analyzer IIを用いたmRNA-seq法により全遺伝子の発現解析を行った。卵子では、遺伝子の発現量とプロモーター領域のメチル化に明確な負の相関性(promoter methylation)がみられない一方、転写領域でのメチル化に極めて強い正の相関性(gene-bodymethylation)が見られることを初めて明らかにした。本研究は、哺乳類の雌雄生殖系列におけるエピゲノム情報のリプログラミングを解明するため、遺伝子発現制御する主要因であるDNAメチル化の全貌を生殖細胞および胚において次世代シークエンサーを用いて明らかにするために実施した。メチローム解析の結果、精子、卵子、DnmtL-K0卵子、さらにES細胞のメチロームマップを作成し329の卵子型メチル化差異領域(DMR)と349の精子型DMRを同定した。さらにmRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を実施し、マウス卵子においてmRNA転写量と遺伝子内のメチル化(Gene-bodyメチル化)に強い正の相関性を見出した(PLoS Genetics,2011)。さらに、卵子では低率ではあるがnon-CpGが存在すること、およびレトロトランスポゾンが高メチル化されていることを明らかにした。23年度から着手した胎仔始原生殖細胞におけるメチローム解析では、胎齢10.5日,13.5日および16.5日の雌雄始原生殖細胞(PGC)を用いて解析を実施した。これまでに、胎齢10.5日のPGCでは16-17%のCpGがメチル化されていたが、胎齢13.5日のPGCでは、2-3%にまで低下していることが判明した。また、雌雄PGCはほぼ同様のメチル化状態を示していた。しかし、胎齢16.5日の雄PGCでは、新規のメチル化が生じ始め、31%にまで上昇した一方、雌PGCでは変化は認められず、明確な雌雄差が形成されていた。この他、DNAはバイサルファイト法の改善に取り組み、より少量のDNAを用い、かつ精度の高い解析方法としてPBAT法が有効であることを確認した。さらに、マウス1番染色体領域に同定した新規インプリント領域(Gpr1-Zdbf2)におけるメチル化領域を見出し、また長大な新規インプリント転写産物同定した(FEBS letter 2012)。本研究は、哺乳類の雌雄生殖系列におけるエピゲノム情報のリプログラミングを解明するため、次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現制御の主要因であるDNAメチル化の包括的解析を実施した。昨年度までに、雌雄生殖細胞および始原生殖細胞におけるDNAメチロームマップを作成し、成果を報告した。さらに、受精後の脱メチル化についても検証をすすめ、受精卵および初期胚のDNAメチロームマップの作成に着手した。

また、脱メチル化に重要なDNA 5-hydroxymetylated cytosine(5hmC)を免疫染色法により検出し、成長卵子に至までに5hmCが生成されることを明らかにした(投稿中)。その他、生殖細胞のメチローム解析から明らかになった新規インプリント(GPR1-GPR1AS-ZDBF2)領域におけるlong non-coding RNAであるZbdf2lincの解析を進め、周辺のタンパクをコードするインプリント遺伝子の発現制御に関与している可能性を示した。本研究は、哺乳類の雌雄生殖系列におけるエピゲノム情報のリプログラミングを解明するため、遺伝子発現制御する主要因であるDNAメチル化の全貌を生殖細胞および胚において次世代シークエンサーを用いて明らかにするために実施した。昨年度までの研究開発により、Shotgun Bisulfite Sequencing解析の実験系の改良に成功し、10ナノグラムのゲノムDNA(マウスでは1000細胞相当)からの全ゲノム包括的DNAメチル化マップ(DNAメチローム)の作製が可能となった。この技術的革新により、胎仔始原生殖細胞、および遺伝子欠損マウスの卵子など微量サンプルからのDNAメチローム解析に目途が立ち、各解析を実行した。始原生殖細胞におけるメチローム解析では、胎齢10.5日, 13.5日および16.5日の雌雄始原生殖細胞(PGC)を用いて解析を実施した。これまでに、胎齢10.5日のPGCでは16-17%のCpGがメチル化されていたが、胎齢13.5日のPGCでは、2-3%にまで低下していることが判明した。また、一部のレトロトランスポゾンは、脱メチル化に対する抵抗性を示した。しかし、胎齢16.5日の雄PGCでは、新規のメチル化が生じ始め、31%にまで上昇した一方、雌PGCでは変化は認められず、明確な雌雄差が形成されていた。一方で、雄のX染色体上の遺伝子の多くが新規メチル化を受けておらず、染色体特異的なリプログラミング機構の存在が明らかとなった(Genome Research 2013)。また、DNAメチル基転移酵素遺伝子のノックアウトマウス卵子における解析により、卵子で蓄積するnon-CpGメチル化はDnmt3a,3Lに依存することが明らかとなった(PLoS Genetics 2013)。本研究は、哺乳類の雌雄生殖系列におけるエピゲノム情報のリプログラミングを解明するため、次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現制御の主要因であるDNAメチル化の包括的解析を全ゲノムレベルで実施した。最終年度である本年度は、受精後の初期発生過程に焦点を当て、PBAT(post bisulfite adapter tagging)法を用いて詳細なDNAメチローム解析を実施した。特に、受精後の脱メチル化過程の詳細を明らかにするため、排卵卵子、精子、受精後6時間および10時間後の前核期卵、胚盤胞およびエピブラストを解析対象にした。解析結果は良好で、全ゲノム中のCpGサイトに対しx5-15シークエンスデータを獲得し、そのゲノムカバー率は8090%であった。DNAメチル化率は、受精直後から(主に父性ゲノムと考えられる)