hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
韓国の科学カリキュラムにおけるＳＴＥＡＭの運営と授業の実際に関する分析

研究期間全体をとおして,大きく分けて3つの研究の知見を得ることができたので,それぞれについて以下に記載する。1韓国の科学カリキュラムに関する各種の文献をとおして,たとえば国家的カリキュラム『教育課程』から,「創意融合型人材」の育成の方針や探究活動中心の成就基準が認められた。また,教科書や書籍をもとにした創意性とSTEAMの分析から,特に中学校段階のSTEAMの題材について把握できた。2STEAMの理論と実際について,韓国の大学教員インタビューから,韓国では教材の作成をもとにしてその理論と実践を結びつける研究が盛んに行われていることが分かった。STEAMの実際について,渡韓して複数の小学校や中学校を訪問して調査を行ったところ,探究の過程を重視しつつ,その過程自体を児童・生徒を評価する対象としていることが分かった。たとえば,慶尚南道のある初等学校は粉塵教育の先導学校で,地域社会の課題解決のために各教科で培った能力を融合する学習がSTEAMの一環として行われており,その1授業内の複数の場面で評価が行われていた。また,教育フェスタの参加から,さまざまなSTEAM先導学校における取り組みを把握することができた。3韓国の中学校科学教科書に記載のあるSTEAMの題材を改変し,日本における実践の試行を行った。大学の授業科目内で教員養成段階の学生に対して,進化単元に関連した「未来生物のデザイン」を行った。未来の環境に関しては半数が温暖化・乾燥と予想し,対象の生物はほとんどが動物であった。発表時間の調整を行えば,日本の中学校の1授業時間(45分間)でも実施可能であることがわかった。学生は,最初は遊び感覚で活動に参加していたが,説明などを詳細に行わせることによって,進化の学習から学術的に思考することができるようになることがわかった。平成28年度は大きく分けて3つの研究に着手し,それぞれから知見を得ることができたので,以下に記載する。1日本と韓国の科学カリキュラムについての文献として,韓国の国家的教育カリキュラム『教育課程』を分析し,また,科学教育政策に関する文献の調査・分析を行って考察した。『教育課程』の総論では,新カリキュラムで標榜する「創意融合型人材」の育成についての明確化と詳細な解説が見られ,科学領域では学習量が20%程度削減されつつも,その育成に寄与する探究活動中心の授業展開になる成就基準が定められていた。2韓国のSTEAMの理論と実践に関する調査分析を行った。忠清南道公州市の国立公州大学校師範大学(学部)の生物教育教員にインタビュー調査を行ったところ,これまでSTEAMの理論にもとづきつつ各種の科学教材が作製されてきたが,現在ではそれらの教材を理論と実践を密接に関係付ける研究が展開されていることがわかった。また,STEAMの理論に関して文献を調査したところ,STSやSTEMの特性と比較してSTEAMの特性を明らかにしたものが多く,それらから,STEAMでは教科の融合の形態を採りながらも,各教科の要素がより独立的かつ特徴的に表出されていることがわかった。STEAMに関しては市販の問題集も見られ,その分析から,英才教育へのアプローチとして不可欠なものになっていることがわかった。3韓国の中学校科学における通常の学習内容に関する分析では,天安市雙龍中学校を訪問して科学の授業を分析した。この学校は,自由学期制での科学授業は独自の科学実験書を作成して行っており,実験を中心とした授業展開によって探究の結果を得て,それをもとに原理について学び,さらに関連項目を調べる授業展開になっていた。実際の授業では,教師による演示実験,生徒実験,結果の導出,そして,それらをまとめる形式となっていた。「カリキュラムの文献分析」「STEAMの理論と実践に関する調査分析」「中学校科学における通常の学習内容に関する分析」の3つの研究方法に則って研究を展開した。それぞれの進捗状況と総合的な進捗状況から,本年度の研究はおおむね順調に進展していると判断した。「カリキュラムの文献分析」では,web上の文献,本国や渡韓での購入で入手できた文献,渡韓の際に高等教育機関等を通じて入手した文献をもとに分析を行った。これにより,国家的カリキュラム『教育課程』の直接的な分析のみでなく,様々な観点(たとえば,取り組まれているプロジェクト)からの分析にまで展開することができた。しかし,時期的な課題で,新しい科学カリキュラムについて両国とも本格的な公開に達しておらず,最終的な結論の部分では来年度以降の課題とする必要があった。「STEAMの理論と実践に関する調査分析」では,韓国の高等教育機関の教員の情報提供や文献の分析から,現在のSTEAMの特性のみを分析するのでなく,教科を融合した教育の変遷の観点からもSTEAMの特性を明確化できた。しかし,高等教育機関附属学校でSTEAMに関する授業を分析することを想定していたが,時期および高大連携の関係から実現できなかった。なお,これについては,公立中学校における自由学期制の科学授業を分析することができた。STEAMと自由学期制の授業は枠組みが異なるが,現行カリキュラムでも取り組まれている「創意融合型人材」の育成という点で類似しており,STEAMの基礎となる授業展開を分析できたととらえている。「中学校科学における通常の学習内容と科目融合型学習内容の連関に関する分析」では,上記の授業分析を含めて韓国の科学教育の特色を分析することができた。その結果を日本と韓国の二国間の比較として考察できたが,渡韓の時期的な課題から諸外国との比較に発展させることができなかった。平成29年度は大きく分けて4つの研究を展開し,それぞれについて知見を得ることができたので,以下に記載する。

1文献をとおして,韓国の科学教育において求められる創意性とSTEAMの両面について分析した。特に初等学校科学では,教科書にそれらの明記はないが,3・4学年で基礎探究活動が,5・6学年で統合探究活動が区分されて明記されており,それぞれは「探究の技能」と「科学的な手続き」に基づいていたことから,中学校段階の創意性やSTEAMにつながるものととらえることができた。2STEAMに依拠した教育の実際について,韓国慶尚南道のある初等学校を訪問し,「粉じん教育」の授業の分析を行った。これは,単元の中で理科の要素として科学的に空気中の粉じんを分析し,それをもとにして粉じんについての対策を練ったり,粉じんに対する注意喚起のポスターづくりを行ったりするものであった。この例のように,科学科,社会科,芸術科など科目融合を行った授業が展開されていることがわかった。3韓国釜山広域市を訪問して,開催されていた教育フェスタに参加した。そこでは,STEAMに取り組んできた先進的な学校(先導学校)などがブースを構えており,児童・生徒の授業における成果物を分析した。それらは科学を基本的なテーマとしつつも,成果物としては設計や芸術の方面に展開されていたことから,上述2に加えて,STEAMで求める能力,STEAMでの授業展開を実際的に理解することができた。4上記13から派生する形で,韓国の科学教員養成について,文献での分析を行った。近年の国家的カリキュラムの改訂により,高等学校に総合理科的な「統合科学」の科目が新設されたことは,科学の教員養成や教員研修に多大な影響を及ぼしていることがわかった。「カリキュラムの文献分析」「STEAM教育の授業の実際」「STEAM教育の取り組みとその成果物」「科学教員養成」の3つの観点から研究を展開した。それぞれの進捗状況と総合的な進捗状況から,本年度の研究はおおむね順調に進展していると判断した。「カリキュラムの文献分析」ではweb上の文献,本国や渡韓での購入で入手できた文献をもとにして分析し,それを教科書分析の基礎資料として用いることができた。しかし,時期的な課題として,新しいカリキュラムに沿った科学教科書は日本と韓国の両方でまだ入手不可能であったため,最終的な結論の部分では来年度以降の課題とする必要があった。「STEAM教育の授業の実際」および「STEAM教育の取り組みとその成果物」では,1時限の授業や児童・生徒の成果物からSTEAM授業の実際を読み取ることができた。これは,昨年度までの本研究で明らかにしてきたSTEAMの理論的な側面が,実際の授業にどのように反映されているのかをとらえるために有意義なものであった。同一単元の中でどのような授業展開が行われており,その中で1つの授業がどのように位置づけられているのかについては,今後の課題となる。「科学教員養成」については,これまでの教員養成カリキュラムや教員任用試験の歴史の中で,中等学校科学教師がどのように養成されているのかがわかった。また,「統合科学」の科目の新設に伴う方案も明らかにすることができた。
ヒト悪性黒色腫におけるLOHの解析

当初の研究計画では手術で得られた腫瘍組織から細胞を分離・培養(初期培養)し,得られた細胞からDNAを抽出,遺伝子解析を行う予定だった。しかし症例のほとんどは日本人に多い末端黒子型黒色腫であったことから,培養中の真菌や細菌の混入が多く,実際は申請時に計画で示した方法でのsamplingは非常に困難だった。そこで,平成10年度からは手術後に作成したホルマリン固定・パラフィン包埋ブロックから切片を作成し,ここから実態顕微鏡下に肉眼的に腫瘍細胞の豊富な部分を回収し,DNA抽出Kit(DEXPAT^R,TaKaRa)を用いてDNAの抽出を行った。標本から抽出したDNAサンプルを用いて,chromosome17q(nm-23H-1)領域におけるヘテロ接合性の消失(LOH)について解析した。なお,平成10年12月までに解析した症例は10例である。<対象><結果および今後の展望>今回の解析でchromosome 17q領域(nm-23H-1)におけるヘテロ接合性の消失は2例のみ観察された。今後は症例数を増やして統計解析を行うと共に,nm-23領域の遺伝子変化と臨床的予後の関連や他の因子(遺伝子異常)との関連,さらにはいくつかの遺伝子異常を組み合わせた場合の予後との関連について検討していきたい。手術で得られた腫瘍組織から細胞を分布・培養し、得られた細胞からDNAを抽出、chromosome 9pおよびchromosome 17q(nm-23H-1)領域におけるヘテロ接合性の消失(LOH)について解析中である。しかし、本年度は症例数が少ないため、データを公表するに至らず、今回は培養細胞を用いてp16gene(chromosome9p21)の変異を検討したので報告する。なお、計画ではLOHの解析を予定していたが、培養細胞に対応する正常DNAが得られなかったため遺伝子変異を解析した。<対象>6種類の培養細胞について解析を行った。その内訳は移動能が高いことが確認されているcell line 3種(RU,AN,EP)と、移動能が前者に比べて低いことが確認されているcell line3種(LH,WK,MC)である。<方法および結果>当初の研究計画では手術で得られた腫瘍組織から細胞を分離・培養(初期培養)し,得られた細胞からDNAを抽出,遺伝子解析を行う予定だった。
代謝活性に基づく頭頸部癌の画像診断学的研究

平成16年度同様に,群馬大学口腔外科を受診した頭頸部癌を有する症例に対して、当院のPET関連施設(サイクロトロンなど)を使用し今研究のデータの集積を行った.昨年度同様に,同意の得られた症例を対象とし,治療前後に^<18>F-FAMT・^<18>F-FDGによるPET検査を行った.平成16年度の実績は,合計86件であった.このうちFDGが70件,FAMTが16件であった.撮像後の癌病巣への集積を画像角斬システムで分析し,SUV(standardized uptake value)などの客観的指標を用いて数値化することにより,データの集積を行った.さらに,X線CTやMRIなど、他の画像検査を実施した症例に関しては,導入させていただいた画像解析のコンピューターを用いて処理し,PET画像と他の画像を綿密に比較することで,病巣の位置と範囲の対比を行い,より正確な位置と数値が得られるように工夫した。平成17年度は合計98件であり,このうちFDGが82件,FAMTが17件であった.平成16年度の症例と加えて検討している.症例の中には手術を行ったものがあり、病理医と連携をとり,病理組織学的な診断をも考慮して,得られた画像情報と腫瘍の浸潤形式および浸潤度などについて,これらの関連性を含めた検討,分析した.国内外の文献をできる限り参照し,研究の方向性については随時確認した.現在までのデータからは,頭頸部領域の悪性腫瘍において,FAMTの有用性が明らかになってきているが,さらに検討を加え,得られた収集データを基に研究成果を発表すべく準備中である.群馬大学口腔外科を受診した頭頸部癌を有する症例に対して、当院のPET関連施設(サイクロトロンなど)を使用し今研究のデータの集積を行った.最近はPETの重要性が注目されており,他の疾患での利用頻度も増えて,PET施設の検査の飽和状態が症例の収集を難しくしている.平成16年度は,今研究の対象症例のデータの収集が主題であり,これを増やせるよう努力した.対象は同意の得られた症例で,理解が得られ,同意の得られた範囲で治療前後に^<18>F-FAMT・^<18>F-FDGによるPET検査を行った.平成16年度の実績は,FDGが70件,FAMTが16件であった.撮像後の癌病巣への集積を画像解析システムで分析し,SUV (standardized uptake value)などの客観的指標を用いて数値化することにより,データの集積を行った.さらに,X線CTやMRIなど、他の画像検査を実施した症例に関しては,導入させていただいた画像解析のコンピューターを用いて処理し,PET画像と他の画像を綿密に比較することで,病巣の位置と範囲の対比を行い,より正確な位置と数値が得られるように工夫した。症例の中には手術を行ったものがあり、病理医と連携をとり,病理組織学的な診断をも考慮して,得られた画像情報と腫瘍の浸潤形式および浸潤度などについて,これらの関連性を含めた検討,分析した.国内外の文献をできる限り参照し,研究の方向性については随時確認した.しかし,海外への発表をする予定であったが,本年度中に行うことは現段階でのデータの集積状況ではまだ不十分と考え,さらなるデータ集積が必要であることを考慮し本年度の発表は断念した.平成16年度同様に,群馬大学口腔外科を受診した頭頸部癌を有する症例に対して、当院のPET関連施設(サイクロトロンなど)を使用し今研究のデータの集積を行った.昨年度同様に,同意の得られた症例を対象とし,治療前後に^<18>F-FAMT・^<18>F-FDGによるPET検査を行った.平成16年度の実績は,合計86件であった.このうちFDGが70件,FAMTが16件であった.撮像後の癌病巣への集積を画像角斬システムで分析し,SUV(standardized uptake value)などの客観的指標を用いて数値化することにより,データの集積を行った.さらに,X線CTやMRIなど、他の画像検査を実施した症例に関しては,導入させていただいた画像解析のコンピューターを用いて処理し,PET画像と他の画像を綿密に比較することで,病巣の位置と範囲の対比を行い,より正確な位置と数値が得られるように工夫した。平成17年度は合計98件であり,このうちFDGが82件,FAMTが17件であった.平成16年度の症例と加えて検討している.症例の中には手術を行ったものがあり、病理医と連携をとり,病理組織学的な診断をも考慮して,得られた画像情報と腫瘍の浸潤形式および浸潤度などについて,これらの関連性を含めた検討,分析した.国内外の文献をできる限り参照し,研究の方向性については随時確認した.現在までのデータからは,頭頸部領域の悪性腫瘍において,FAMTの有用性が明らかになってきているが,さらに検討を加え,得られた収集データを基に研究成果を発表すべく準備中である.
糖-タンパク質間水素結合のタンパク質の安定化に対する寄与とその評価

タンパク質水溶液に糖を添加し凍結乾燥すると,タンパク質は糖によって形成されたアモルファス構造に包埋され,その結果,タンパク質の安定性が顕著に向上する.この糖によるタンパク質安定化機構についてはこれまで多くの研究がなされているが,依然未解明な点が多く,実際の安定化操作の改善に繋がる知見は乏しい.そこで本研究では糖としてスクロース,マルトース,トレハロース,マルトトリオース,および平均分子量1500,6000のデキストラン,タンパク質として牛血清アルブミン(BSA)を様々な割合で含有する糖-タンパク質凍結乾燥資料を作成し,試料中におけるタンパク質の構造保持の度合いを比較した.タンパク質の構造保持度はフーリエ変換赤外分光分析計(FT-IR)を用いて二次構造を解析することにより評価し,各種糖アモルファスの物理的特性は示差走査熱量計(DSC)を用いて分析した.また,タンパク質安定化作用との密接な関係が注目されている糖-タンパク質間水素結合を水分収着特性から定量し,タンパク質の構造保持度との関係について検討を加えた.その結果,タンパク質の構造保持度をαへリックスの含有率を指標として評価した場合,構造保持の度合いはスクロース>マルトース>トレハロース>マルトトリオース>デキストラン1500>デキストラン6000の順となり,スクロースを用いた場合,糖添加量が1g/g-BSAのとき水溶液中の値とほぼ一致した.各種糖アモルファスのガラス転移温度(Tg)を測定した結果,Tgが低い糖ほどタンパク質の構造保持度が高いことが分かった.これはTgが低い糖アモルファスほど糖分子の構造柔軟性が高く,タンパク質との相互作用が形成され易いためと考えられる.また,糖-タンパク質間水素結合の形成度を評価した結果,糖-タンパク質間水素結合の形成度は構造保持の度合いと大略傾向は一致することが明らかになった.目的糖アモルファス中でタンパク質の安定性は顕著に向上する.本研究はこの糖のタンパク質安定化機構を解明し,タンパク質安定化操作を合理化することを目的とする.平成10年度は糖-タンパク質材料におけるタンパク質の包埋状態を解析するため,その第一段階として,糖アモルファスによるタンパク質包埋量の評価を行った.方法と結果糖としてトレハロース,タンパク質として牛血清アルブミン・BSAを用い,糖-タンパク質材料を凍結乾燥により作成した.糖アモルファスによるBSA包埋量は次のように評価した.まず,様々な割合で糖を含有する糖-タンパク質凍結乾燥試料を作成し,一定RH下における各試料の糖基準の含水率(W_S,糖1gを含む試料の水分含量)を測定した.ここで,W_SをBSA添加量(C_B)に対してプロットすると,その傾き(dw_S/dC_B)は試料中におけるBSAの含水率に対応する.タンパク質の水和量は糖アモルファスに包埋されると減少することから,C_Bが低い領域ではdw_S/dC_BはBSAのみの含水率よりも低い値を示すが,BSAが過剰になり糖アモルファスの包埋能を越えるとBSAのみの含水率と一致するようになる.つまり,w_SはC_Bに対して二本の直線を示すことになる.そこでdw_S/dC_Bが変化するときのC_Bから糖アモルファスのBSA包埋量を評価した.その結果,RH23%以上ではw_SはC_Bに対して二本の直線で近似でき,C_Bが高い領域ではdw_S/dC_BはBSAのみの含水率と一致することが確認できた.ここで各RHでのBSA包埋量は0.2(RH23%),0.5(RH33%),0.8(RH43%)g/g-糖となり,RHの上昇とともにBSA包埋量が大きくなることが分かった.水分子は糖アモルファスを可塑化することから,水分収着に伴いが糖アモルファスの柔軟性が増し,タンパク質包埋能が上昇したものと推測される.タンパク質水溶液に糖を添加し凍結乾燥すると,タンパク質は糖によって形成されたアモルファス構造に包埋され,その結果,タンパク質の安定性が顕著に向上する.この糖によるタンパク質安定化機構についてはこれまで多くの研究がなされているが,依然未解明な点が多く,実際の安定化操作の改善に繋がる知見は乏しい.そこで本研究では糖としてスクロース,マルトース,トレハロース,マルトトリオース,および平均分子量1500,6000のデキストラン,タンパク質として牛血清アルブミン(BSA)を様々な割合で含有する糖-タンパク質凍結乾燥資料を作成し,試料中におけるタンパク質の構造保持の度合いを比較した.タンパク質の構造保持度はフーリエ変換赤外分光分析計(FT-IR)を用いて二次構造を解析することにより評価し,各種糖アモルファスの物理的特性は示差走査熱量計(DSC)を用いて分析した.また,タンパク質安定化作用との密接な関係が注目されている糖-タンパク質間水素結合を水分収着特性から定量し,タンパク質の構造保持度との関係について検討を加えた.その結果,タンパク質の構造保持度をαへリックスの含有率を指標として評価した場合,構造保持の度合いはスクロース>マルトース>トレハロース>マルトトリオース>デキストラン1500>デキストラン6000の順となり,スクロースを用いた場合,糖添加量が1g/g-BSAのとき水溶液中の値とほぼ一致した.各種糖アモルファスのガラス転移温度(Tg)を測定した結果,Tgが低い糖ほどタンパク質の構造保持度が高いことが分かった.

これはTgが低い糖アモルファスほど糖分子の構造柔軟性が高く,タンパク質との相互作用が形成され易いためと考えられる.また,糖-タンパク質間水素結合の形成度を評価した結果,糖-タンパク質間水素結合の形成度は構造保持の度合いと大略傾向は一致することが明らかになった.
植物のオ-キシン応答反応における分子的基礎(オ-キシン輸送担体の同定と構造解析)

植物細胞の伸長生長や細胞分裂および細胞分化を調節する生体内微量成分として,オ-キシンを含む数種の植物ホルモンが見いだされている。しかしながら,植物におけるホルモン受容と応答のメカニズムについては,植物生理における重要性にもかかわらず,現在においてもほとんど解明されていない。そこで本研究では,オ-キシンに対する細胞の受容過程の解析を試みた。植物細胞には細胞内局在性やオ-キシン特異性の異なる数種のオ-キシン結合部位が存在する。これらはオ-キシン受容体の他にオ-キシンの細胞間輸送に関与する輸送担体におよびオ-キシンの合成分解を触媒する酵素なども含まれているものと思われる。これらオ-キシン結合部位の機能を明らかにするためには,それぞれを単離精製し構造解析を行なう必要がある。そこで本研究では,トウモロコシの細胞膜画分より精製したオ-キシン結合タンパク質の構造解析をcDNAクロ-ニング法を用いて行った。また,双子葉植物と単子葉植物におけるオ-キシン結合タンパク質の性質を比較することにより,このタンパク質が原形質膜におけるオ-キシン受容体として機能する可能性を示した。さらに,この可能性を検討するために,変異遺伝子導入による植物細胞のホルモン応答性への影響を調べることを計画し,この実験に適した植物材料としてアラビドプシスより本タンパク質をコ-ドする遺伝子のクロ-ニングも行った。さらに,オ-キシン作用の本質と考えられるオ-キシンの細胞間輸送に関与する輸送担体の細胞膜からの可溶化条件および精製法について検討した。植物におけるホルモン受容と細胞応答の機構については、その重要性にもかかわらず、現時点では、ほとんど解析されていないと言える。この機構を分子レベルで明らかにすることが、植物生理学のみならず育種学においても要望されている研究課題である。そこで、私は、植物ホルモンの一つとして、古くからその生理作用面についての研究が活発に行われてきたオ-キシンについて、その初期応答反応過程を解明すべく研究を進めている。オ-キシン作用においては二つの機構に分割する必要があるかもしれない。一つは、オ-キシンの細胞への直接作用、すなわち、ホルモン受容体を介する細胞の応答反応機構。第二は、植物組織におけるオ-キシン濃度勾配の形成機構である。オ-キシンは植物組織内において極性的に移動することが知られている。この極性移動の結果生じるオ-キシン濃度勾配が、植物の屈性現象や頂芽優先現象などと深く関わっていることが指摘されている。オ-キシン輸送は、いわゆる通導組織を利用して移動するのではなく、細胞間での移動によると考えられている。ここで興味あることは、このオ-キシン輸送機構がどにょうにして極性を示すのか、輸送過程にどのような調節が行われているのか、更に、輸送系が単にオ-キシンの細胞間移動の機能しか持たないのか、それとも、輸送と共役してオ-キシン情報を細胞内に伝達するオ-キシン受容体の機能も持つのか、という疑問点が残されている。そこで、私は、現在、オ-キシンやオ-キシン輸送阻害剤の結合活性を指標にして、オ-キシン受容体、オ-キシン輸送蛋白質の単離精製、ならびに、その遺伝子の構造解析を行っている。これらはオ-キシン受容体の他にオ-キシンの細胞間輸送に関与する輸送担体およびオ-キシンの合成分解を触媒する酵素なども含まれているものと思われる。これらオ-キシン結合部位の機能を明らかにするためには,それぞれを単離精製し構造解析を行う必要がある。

そこで本研究では,トウモロコシの細胞膜画分より精製したオ-キシン結合タンパク質の構造解析をcDNAクロ-ニング法を用いて行った。また,双子葉植物と単子葉植物におけるオ-キシン結合タンパク質の性質を比較することにより、このタンパク質が原形質膜におけるオ-キシン受容体として機能する可能性を示した。さらに,この可能性を検討するために,変異遺伝子導入による植物細胞のホルモン応答性への影響を調べることを計画し,この実験に適した植物材料としてアラビドプシスより本タンパク質をコ-ドする遺伝子のクロ-ニングも行った。さらに,オ-キシン作用の本質と考えられるオ-キシンの細胞間輸送に関与する輸送担体の細胞膜から可溶化条件および精製法について検討した。
神経精神疾患におけるNMDAおよびシグマ受容体の役割

我々は実験動物において1)従来の抗うつ薬や抗不安薬に抵抗性を示す恐怖条件付けストレス反応,2)ヒトにおいて精神分裂病様症状を引き起こす非競合的N-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体拮抗薬のphencyclidine(PCP)による精神分裂病陰性症状様作用および潜在学習障害作用,3)薬物依存,4)一酸化窒素合成酵素阻害剤および非競合的NMDA受容体拮抗薬による学習・記憶障害,に対するシグマおよびNMDA受容体関連化合物の作用を調べ,以下の知見を得た.1.シグマ1受容体に親和性を有する神経ステロイドのdehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS)およびpregnenolone sulfateは,シグマ1受容体を刺激することによってマウスにおける恐怖条件付けストレス反応を緩解し,逆に神経ステロイドの中でもprogesteroneは,シグマ1受容体拮抗作用を有していることを見出した.恐怖条件付けストレス反応の発現には,脳内DHEAS含量の低下および神経細胞のアポトーシスが関与していることを見出した.またDHEASは,恐怖条件付けストレスによる神経細胞のアポトーシスに対して保護作用を有していることが示唆された.2.PCP連続投与によって惹起される精神分裂病陰性症状様作用の発現には,前頭前皮質のドパミン作動性神経-セロトニン作動性神経-グルタミン酸作動性神経系の機能障害が関与していることを見出した.さらに,PCP連続投与マウスにおいてマウス間の社会性障害およびPCP急性投与マウスにおいて潜在学習障害が認められ,これらの障害の発現にもグルタミン酸作動性神経系の機能障害が関与していることを見出した.3.PCPの弁別刺激効果は,シグマ受容体でなくNMDA受容体を介して発現していることを見出した.また,モルヒネの依存形成に対するDHEASの抑制作用はシグマ1受容体を介するERKカスケードが関与している可能性が示唆された.4.一酸化窒素合成酵素阻害剤や非競合的NMDA受容体拮抗薬のdizocilpineによるマウスやラットの空間記憶障害は,シグマ1受容体を刺激することによって改善されることを見出した.また,シグマ1受容体は,空間記憶に関与していることが示唆された.我々は実験動物において1)従来の抗うつ薬や抗不安薬に抵抗性を示す恐怖条件付けストレス反応,2)ヒトにおいて精神分裂病様症状を引き起こす非競合的N-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体拮抗薬のphencyclidine(PCP)による精神分裂病陰性症状様作用および潜在学習障害作用,3)薬物依存,4)一酸化窒素合成酵素阻害剤および非競合的NMDA受容体拮抗薬による学習・記憶障害,に対するシグマおよびNMDA受容体関連化合物の作用を調べ,以下の知見を得た.1.シグマ1受容体に親和性を有する神経ステロイドのdehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS)およびpregnenolone sulfateは,シグマ1受容体を刺激することによってマウスにおける恐怖条件付けストレス反応を緩解し,逆に神経ステロイドの中でもprogesteroneは,シグマ1受容体拮抗作用を有していることを見出した.恐怖条件付けストレス反応の発現には,脳内DHEAS含量の低下および神経細胞のアポトーシスが関与していることを見出した.またDHEASは,恐怖条件付けストレスによる神経細胞のアポトーシスに対して保護作用を有していることが示唆された.2.PCP連続投与によって惹起される精神分裂病陰性症状様作用の発現には,前頭前皮質のドパミン作動性神経-セロトニン作動性神経-グルタミン酸作動性神経系の機能障害が関与していることを見出した.さらに,PCP連続投与マウスにおいてマウス間の社会性障害およびPCP急性投与マウスにおいて潜在学習障害が認められ,これらの障害の発現にもグルタミン酸作動性神経系の機能障害が関与していることを見出した.3.PCPの弁別刺激効果は,シグマ受容体でなくNMDA受容体を介して発現していることを見出した.また,モルヒネの依存形成に対するDHEASの抑制作用はシグマ1受容体を介するERKカスケードが関与している可能性が示唆された.4.一酸化窒素合成酵素阻害剤や非競合的NMDA受容体拮抗薬のdizocilpineによるマウスやラットの空間記憶障害は,シグマ1受容体を刺激することによって改善されることを見出した.また,シグマ1受容体は,空間記憶に関与していることが示唆された.1.恐怖条件付けストレス反応における内因性ニューロステロイドの役割我々はこれまでにシグマ受容体に親和性を有するニューロステロイドのdehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS)が恐怖条件付けストレス反応を緩解することを報告している.そこで,内因性のニューロステロイドが恐怖条件付けストレス(CFS)反応にどのような役割を果たしているかを調べた.CFS反応を呈したマウスの血清中DHEAS含量は、非ストレス群と比較して有意に減少し、CFS反応の発現に内因性DHEASレベルの減少が関与している可能性が示唆された。また、非妊娠雌性マウスおいて、DHEASは雄性マウスの場合と同様にCFS反応を緩解したが、妊娠マウスにおいてはその緩解作用は認められなかった。非妊娠時と比較して妊娠時の血漿中DHEASの含量は減少しており、逆に、血漿中progesteroneの含量は増加していることが報告されている。さらに、我々は、DHEASによるCFS反応の緩解作用がprogesteroneにより拮抗されることを報告している。

従ってこれらの報告から、妊娠マウスの脳内ではおそらくDHEAS含量が減少しており、逆にDHEASの作用を抑制するprogesteroneの含量が増加しているため、DHEASの緩解作用が見られなくなったものと考えられる。一方、fluorocitrateにより脳内グリア細胞を破壊し、ニューロステロイドの産生を阻害したマウスにおいて、CFS反応に対するDHEASの作用を検討したところ、DHEASの緩解作用は消失した。これはおそらく、fluorocitrateによりグリア細胞を破壊するとニューロステロイド、すなわちDHEASの産土および含量が減少したため、DHEASの緩解作用が消失したものと考えられる。以上の結果より、CFS反応の発現あるいは緩解に脳内DHEASレベルの変化が深く関わっていることが示唆された。2.実験的健忘に対するカッパーオピオイド受容体およびシグマ受容体の役割マウスに一酸化炭素を負荷すると自発的交替行動の障害が認められ、この障害はカッパーオピオイド受容体作動薬のdynorphin A(1-13)を投与することにより改善された.このdynorphin A(1-13)の改善作用は、シグマ受容体拮抗薬のNE-100の0.5mg/kgを併用投与することにより増強する傾向を示したが,1.0mg/kgの併用投与により拮抗される傾向を示した.また、マウスにムスカリン受容体拮抗薬のスコポラミンを投与すると自発的交替行動の障害が認められ、この障害はdynorphin A(1-13)を投与することにより一酸化炭素負荷による障害の場合と同様に改善された.しかし、このdynorphin A(1-13)の改善作用は、NE-100の併用投与により影響されなかった。以上の結果より、一酸化炭素負荷誘発健忘に対するdynorphin A(1-13)の改善作用にシグマ受容体が調節的に関与している可能性が示唆された。1.恐怖条件付けストレス反応における脳内ニューロステロイドの役割我々はこれまでにシグマ受容体に親和性を有するニューロステロイドのdehydroepiandrosterone sulfate(DHEAS)が恐怖条件付けストレス(CFS)反応を緩解すること、CFS反応を呈したマウスの血清中DHEAS含量は、非ストレス群と比較して有意に減少していたことを報告している。そこで、ストレス反応を呈したマウスの脳内ニューロステロイドの役割を調べた。脳内ニューロステロイド含量は、共同研究者のDr.Tanguiの研究室にて測定した。その結果、CFS反応を呈したマウスの脳内DHEAS含量は、非ストレス群と比較して有意に減少していた。また、DHEASの代謝酵素である3beta-hydroxysteroid dehydrogenase(HSD)を阻害するtrilostaneを連続投与しておいたマウスにおいて、CFS反応は認められなかった。以上の結果から、CFS反応の発現に脳内DHEASレベルの変化が深く関わっていることが示唆された。2.κ-オピオイド受容体とσ-受容体を介する記憶の調節
各種ウイルスベクターを用いてのソリゾーム病の中枢神経障害の遺伝子治療の開発研究

当初、リピードシスモデルを使用する予定であったが、共同研究者によるモデルマウスの作成が遅れたため、既に我々の施設で飼育している、リピドーシスと同じリソゾーム蓄積症であるムコ多糖症VII型のモデルマウスを利用して、その欠損酵素であるbeta-glucuronidaseを発現するアデノウイルスベクターをモデルマウス脳室内に投与した。投与後、30日まで脳内における遺伝子発現を検討した。遺伝子の発現は脳室上衣細胞、血管内皮細胞に限られていた。30日まででは脳実質細胞(神経細胞、グリア細胞など)への感染は認められなかった。結果として脳室上衣細胞の病理学的所見は著しく改善された。またGaucher病、異染性脳白質変性症の脳神経障害の治療目的でそれぞれの欠損酵素であるglucocerebrosidase、arylsulfatase Aを発現するアデノウイルスベクターを作成した。両ウイルスはともに10^<10>程度のタイターであった。またこれらの組み換えウイルスは伴に患者より培養した線維芽細胞の酵素欠損を矯正した。ゴーシェ病、スライ病をはじめとするリソゾーム病においては進行性の中枢神経症状を呈するものがあるが、現在のところ有効な治療法がないのが現状である。遺伝子治療が有力な治療法として考えられているがリソゾーム病においてはその臨床表現型に差異がありどのような症例が遺伝子治療の対象になるか明確にすることが重要であり、また中枢神経に目的とする遺伝子が効率よく導入するシステムを開発することが極めて大きな課題である。本年度は日本人ゴーシェ病35例の遺伝子変異、臨床症状を検討し欧米人に比較して日本人のゴーシェ病は重症で進行性であることを明らかにした。従って、日本人ゴーシェ病の多くは遺伝子治療の対象となりうることが示唆された。また、酵素補充療法を施行した急性神経型日本人ゴーシェ病症例においてその病理学的変化を検討し、中枢神経系親和性ベクターを用いた遺伝子治療の必要性を明らかにした。さらに、スライ病の動物モデルに対してレトロウイルスベクターにグルクロニダーゼを組み込み、ヒト臍帯血より分離、精製した造血幹細胞(CD34陽性細胞)を標的臓器として遺伝子治療を試みた。導入効率はCFU-GMで平均66.8%、LTCIC(long-term culture initiating cell)では20%と50%であった。グルクロニダーゼ活性は5週間正常レベルを維持していた。少数の造血幹細胞への遺伝子導入にもかかわらず酵素活性が十分上昇したことはリソゾーム病における遺伝子治療の可能性を示唆するものであった。また、酸素補充療法を施行した急性神経型日本人ゴーシェ病症例においてその病理学的変化を検討し、中枢神経系親和性ベクターを用いた遺伝子治療の必要性を明らかにした。常レベルを維持していた。
ULF帯磁場データのフラクタル解析による地震に伴う地圈内電磁気的変動過程の解明

地球上では、至る所で地震が発生しており、日本においても大地震が発生し、重大な損害が出ている。このように地震が多発する我が国では、地震に対する研究は不可欠であり、昔から力学的手法で地震の研究が行われてきたが、数日後の地震発生を予知することは大変困難であるとされている。一方、近年注目されているのが、電磁気的手法を用いて地震を予知する方法である。地震及び火山活動に伴う地震電磁気現象は、下はDC・ULF帯から上はVHF帯まで様々な周波数帯で観測されているが、私はこの観測分野の中でULF帯磁場データ及びVHF帯電磁雑音データに注目した。ULF帯の電磁波のデータを用いた研究では、まず従来行われてきたイベントに対して再び解析を行い、新たな見地を加えた。そして、新たなイベントに対してフラクタル解析を用いてULF帯磁場データから地震前兆現象を検出することを試みた。その結果、従来のイベントにおいてはより詳細なフラクタル的特性の変化を明らかにすることが可能となった。また、新たなイベントにおいては、従来行われてきた手法では検出不可能であった地震に先行する前兆を検出することが可能となった。また、VHF帯電磁雑音データの解析では、VHF帯電磁雑音データのフラクタル的特性に注目することで、その発生要因を推定する手法を提案した。この解析の結果、地震に先行する異常を検出した。以上より、従来では検出困難であった地震に先行する電磁気的異常の検出が可能となった。この結果は、地圏内での非線形プロセスの理解に大きく貢献し、ひいては地震電磁気環象の発生原因を解明する一助となると信じる。また、将来の地震の短期予知の実現へ大きく寄与すると考えられる。私の研究目的はULF帯磁場データを用いた地震予知を実現させることである。地震に関連したULF帯磁場データの解析は様々な方法が行われてきた。その中で、私は今までのULF帯磁場データの研究では分からなかった地震の発生プロセス、即ち地圏内での非線形組織化プロセスをフラクタル解析によって明らかにすることが現時点での目的である。昨年度は、地震に伴う地圏内の電磁気的変動を多く検出してきた。始めに、グアム地震の時に取得されたULF帯磁場データに対し、フラクタル解析を適用し、他の研究結果との比較を行った。その結果、地震の前においてフラクタル解析の結果と同様な結果が得られた。よって、より地震とULF帯磁場データのフラクタル次元の変化とが関連があることが強まった。次に、VHF帯磁場雑音データにフラクタル解析を適用することで地震前の変動を検出した。本研究では、宮城県で観測されたVHF帯電磁雑音データをもちいて、2005年宮城県沖地震との関連性を調査した。その結果、地震の数日前においてVHF帯電磁雑音データのフラクタル次元に変動が検出された。このことより、このフラクタル次元の変化と2005年宮城県沖地震との関連性が推察できる。この2005年宮城県沖地震に関連した研究成果を日本大気電気学会研究発表会及び電磁情報通信学会研究発表会において発表を行った。
ナノギャップ電極を用いた単一及び少数結合型ハーフメタル・ナノ微粒子の物性計測

走査型電子顕微鏡の装置内に組み込まれたカーボンナノチューブ・プローブを用いて、単一および少数のナノ微粒子をナノギャップ電極中に設置したナノ微粒子計測用デバイスを作製した。そのデバイスを用いて、マグネタイト・ナノ微粒子の導電特性を計測した結果、接触抵抗の影響が非常に大きいことがわかった。その問題を克服するために、RFマグネトロンスパッタリング法を採用し、ナノギャップ中に少数のマグネタイト・ナノ微粒子を埋め込んだ接触抵抗の小さいナノ微粒子計測用デバイスを作製する事に我々は成功した。その電気および磁気伝導特性を測定し、その輸送機構を明らかにした。これまでの研究で、研究分担者の清水および内藤は、斬新的なアイデアである斜め蒸着法を用いてわずか10nm程度まで制御可能なナノギャップ電極の作製に成功した。また、ナノ・マニュピレーション技術の高度化研究を通じて、ナノギャップ電極を利用した単一カーボンナノ,チューブの物性測定、特に熱伝導率と電気伝導率の測定に成功した。研究代表者の小堀は、マグネタイトの単一ナノ微粒子の特性を間接的に評価するために、マグネタイト・ナノ微粒子の集合体である焼結体を作製し、その物性測定を行ってきた。平成21年度の実施計画は主に、1)マグネタイト(Fe_3O_4)およびヘマタイト(α-Fe_2O_3)の単一ナノ微粒子をナノギャップ電極に架橋した計測用デバイスを作製する、2)作製したヘマタイト・単一ナノ微粒子の計測用デバイスについては、水素中熱処理還元法を用いてヘマタイトをマグネタイトに変化させ、間接的にマグネタイトの単一ナノ微粒子・計測用デバイスを作製する。さらにXRD測定をし物質の同定をする、3)作製した計測用デバイスを用いて、マグネタイト単一ナノ微粒子の電気的測定を行う、である。実施計画の1)および2)は達成されたが、3)については予想以上に接触抵抗が大きく、その解決のための試行錯誤を繰り返した。マグネタイト・ナノ微粒子焼結体場合、蒸着した金電極との接触抵抗が低いのとは対照的である。これは、今回作製した計測用デバイスのナノ微粒子-電極間の接触面積がかなり小さく、さらに大気中への暴露によって、導電性のあるマグネタイトの表面が酸化のため絶縁体であるヘマタイトで覆われている事が原因であると考えられる。単位面積あたりの接触抵抗を下げるために、1)マグネタイトの計測用デバイスを水素中で熱処理還元する、2)ナノ微粒子と金電極の重なり領域へ、FIB(Focused Ion Beam:収束イオンビーム)を用いて導電カーボンを被覆し、接触面積を増大さる、などの試みをしたが、満足できるほど抵抗の減少は得られなかった。現在、接触抵抗の1つの解決策として、マグネタイト・ナノワイヤーをナノギャップ電極に架橋し、非常に大きな金電極との接触領域を導電性物質で被覆するという試みを考えている。これまでの研究で、研究分担者の清水および内藤は、斜め蒸着法を用いて10nm程度まで制御可能なナノギャップ電極の作製に成功した。研究代表者の小堀は、マグネタイトの単一ナノ微粒子の特性を間接的に評価するために、マグネタイト・ナノ微粒子の集合体である焼結体および薄膜を作製し、その物性測定を行ってきた。平成21年度の実施計画は主に、1)マグネタイト(Fe_3O_4)およびヘマタイト(α-Fe_2O_3)の単一ナノ微粒子をナノギャップ電極に架橋した計測用デバイスを作製する、2)ヘマタイト・単一ナノ微粒子の計測用デバイスについては、水素中熱処理還元法を用いてマグネタイトに変化させ、マグネタイトの単一ナノ微粒子・計測用デバイスを作製する、である。実施計画の1)および2)は達成された。平成22年度の実施計画は、3)作製した計測用デバイスを用いて、マグネタイト単一ナノ微粒子の電気および磁気伝導測定を行う、である。3)については予想以上に接触抵抗が大きく、その解決のための試行錯誤を繰り返した。単位面積あたりの接触抵抗を下げるために、a)マグネタイトの計測用デバイスを水素中で熱処理還元する、b)ナノ微粒子と金電極の重なり領域へ、FIB(Focused Ion Beam:収束イオンビーム)を用いて導電カーボンを被覆し、接触面積を増大さる、c)RFマグネトロンスパッタリング装置を用いて、ナノギャップ領域のみにマグネタイト・ナノ微粒子を複数個付着させるなどの試みをした。a)とb)は満足できるほど抵抗の減少は得られなかったが、c)については、計測できるほどに抵抗が下がった。その試料を用いて室温で電気および磁気伝導特性の温度依存性を調べた。抵抗は室温で100kΩ1MΩ程度で、磁気抵抗の変化率はナノ微粒子焼結体と同程度であった。電極としてAuおよび強磁性体であるNiを採用した。

平成2122年度の実施計画は主に、1)マグネタイト(Fe_3O_4)の単一及び少数のナノ微粒子をナノギャップ電極に架橋した計測用デバイスを作製する、2)作製した計測用デバイスを用いて、マグネタイト単一ナノ微粒子の電気および磁気伝導測定を行う、である。1)については達成された。2)については、ナノ微粒子表面の酸化膜による接触抵抗が予想以上に大きく、その解決のための試行錯誤を繰り返した。接触抵抗を下げるために、a)マグネタイトナノ微粒子表面の酸化膜(α-Fe_2O_3)を水素中で熱処理還元してマグネタイト化する、b)ナノ微粒子と電極の重なり領域へ、FIB(収束イオンビーム)を用いて導電カーボンを被覆し、接触面積を増大させる、c)RFマグネトロンスパッタリング装置を用いて、ナノギャップ領域のみにマグネタイトナノ微粒子を複数個付着させるなどの試みをした。a)については熱処理条件の調整が難しく、b)については満足できるほど抵抗の減少は得られなかったが、c)については、試料の抵抗が計測できるほどに抵抗値が下がり、室温で物性計測をした。平成23年度の実施計画は主に、計測用デバイスの計測技術の高度化と汎用化およびナノギャップ中のナノ微粒子の基礎物性を明らかにする事である。電極として、Auおよび強磁性体であるNiを採用して、計測デバイスを作製した。c)の方法で作製した計測用デバイスを用いて計測技術の最適化および高度化を試み、その汎用化のための指針を得た。物性計測からナノギャップ中の少数のマグネタイトナノ微粒子はトンネル型磁気伝導を示す事がわかった。また、計測用デバイスはシリコン酸化物上に金属電極を蒸着して製作しているが、走査電子顕微鏡で観察すると、基板の絶縁物の影響で目的とする分解能が得られないことがわかった。本科研費で購入した原子間力顕微鏡で観察を行ったところ非常に明瞭にナノギャップ中のナノ微粒子集合体を観察することができた。これにより研究が加速され、論文を提出することができた。(現在、実績報告書に記述している論文以外にも論文を投稿中である)
タイプIII分泌機構に着眼した魚類エドワジエラ症原因細菌の病原機構の解明

本研究の目的は、E. tardaのマクロファージ内での増殖性、上皮細胞への侵入性、ゼブラフィシュへの病原性に関連しているタイプIII分泌装置遺伝子クラスター内の5つの機能未知遺伝子(escC, orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子)に着目し、宿主細胞内で結合する宿主因子を同定することにより、未知の病原性発現機構を明らかにすることである。研究を既に進めていた機能未知遺伝子orf29とorf30遺伝子が、海外のグループからの報告により1つの遺伝子(eseJ遺伝子)であること、さらにeseJが本菌の感染に重要なタイプIIIエフェクターであることが報告されたことから、報告された新たな遺伝情報に基づいてeseJ遺伝子に着目し、実験のやり直しを行った。eseJ遺伝子と結合する宿主因子を、タンパク質ータンパク質間の相互作用を検出できるYeast two-hybrid法を用いてスクリーニングする予定であったが、Yeast two-hybrid法によるスクリーニングは完了までに長い時間を要することから、比較的短期間にタンパク質ータンパク質間の相互作用を直接的に検出できるGSTプルダウンアッセイ法に変更した。今年度はGSTプルダウンアッセイ法を行うために、eseJ遺伝子をpGEX6P-1プラスミドにクローニングし、IPTG誘導することによりGST-EseJタンパク質が大腸菌内で適切に発現されることを確認した。次に、研究分担者である河東氏が2018年4月中旬から2019年3月中旬までオーストラリアへ留学して不在であったことから、海産魚を用いた感染実験の遂行は中断した。5つの機能未知遺伝子破壊変異株を用いた海産魚に対する感染実験とマクロファージ内での増殖性の検討結果については、比較的順調に進んでいるが、再現性などの実験遂行は中断している状態である。次に、研究を既に進めていた機能未知遺伝子orf29とorf30遺伝子が、海外のグループからの報告により1つの遺伝子(eseJ遺伝子)であること、さらにeseJが本菌の感染に重要なタイプIIIエフェクターであることが報告されたことから、研究計画を大きく修正し、EseJと相互作用する宿主因子の探索をGSTプルダウンアッセイで行うことに変更した。クローニングは完了したが、これからGSTプルダウンアッセイを行う予定である。5つの機能未知遺伝子破壊変異株を用いた海産魚に対する感染実験とマクロファージ内での増殖性の結果の確証実験については、研究分担者である河東氏が2019年3月末から職場に復帰していることから、再開する予定である。次に、EseJと相互作用する宿主因子の探索については、GST-EseJ融合タンパク質を精製後、宿主細胞溶解液を加えることで、GSTプルダウンアッセイを行い、EseJと結合する新規の結合宿主因子の探索を行う予定である。本研究の目的は、魚類エドワジエラ症原因細菌であるEdwardsiella tardaに関して、本菌の重要な病原因子の1つであるタイプIII分泌装置の遺伝子クラスター内に存在し、食細胞に対する抵抗性、上皮細胞への侵入性、さらにゼブラフィシュへの病原性に関与することが明らかとなっている5つの機能未知遺伝子について、分子レベルでの詳細な機能解析を行い、最終的に明らかとなった5つの機能未知遺伝子による病原性発現メカニズムを基に、本菌による魚類感染症を防止する新規抗感染症薬創製のシードとなる標的遺伝子や標的タンパク質を同定することである。当該年度では、まず5つの機能未知遺伝子について、5つの機能未知遺伝子産物がタイプIII分泌装置でE. tardaから宿主細胞内に注入された後、宿主内でそれらが結合する宿主因子の網羅的探索を開始した。研究実施計画に記載したように、5つの機能未知遺伝子のYeast two-hybrid法を行うために、5つの機能未知遺伝子を酵母発現用プラスミドにクローニングすることを行っている。それに加えて、タンパク質-タンパク質間の相互作用を直接的に検出できるプルダウン法による探索を並行して行うために、そのために必要なGST融合タンパク質発現用のプラスミドに、5つの機能未知遺伝子をクローニングすることも進めているところである。また、研究分担者の変更に伴い、5つの機能未知遺伝子破壊変異株のヒラメを用いた魚類感染実験を行うための施設面での準備も整えた。本研究課題の軸となる、5つの機能未知遺伝子と結合する標的宿主因子探索の実施に向けた準備は順調に進んでいると思われる。研究分担者の急な変更を余儀なくされたが、魚類感染実験に精通した研究分担者と施設が見つかったことからも、予定通りに研究が進められていると考えられる。当該年度では、5つの機能未知遺伝子ノックアウト株の内、orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子ノックアウト株と野生株をヒラメに腹腔内接種し、野生株投与群とノックアウト株投与群の累積死亡率に差が生じるかを経時的に調べた。その結果、orf13遺伝子ノックアウト株では病原性の著しい低下が認められ、また、orf30遺伝子ノックアウト株では病原性発現時間の遅延が認められた。

また、感染魚についてから分離したマクロファージ内での野生株およびノックアウト株の増殖性を比較しているが、現在実験を行っているところである。また、orf29とorf30遺伝子配列から推定されるペプチド断片に対するウサギポリクローナル抗体の作製を完了した。計画書に記載したヒラメ感染実験の遂行やYeast two-hybrid法に用いるクローンの完成等、ほぼ予定通りに進展していると思われる。本研究の目的は、E. tardaのマクロファージ内での増殖性、上皮細胞への侵入性、ゼブラフィシュへの病原性に関連しているタイプIII分泌装置遺伝子クラスター内の5つの機能未知遺伝子(escC, orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子)に着目し、宿主細胞内で結合する宿主因子を同定することにより、未知の病原性発現機構を明らかにすることである。研究を既に進めていた機能未知遺伝子orf29とorf30遺伝子が、海外のグループからの報告により1つの遺伝子(eseJ遺伝子)であること、さらにeseJが本菌の感染に重要なタイプIIIエフェクターであることが報告されたことから、報告された新たな遺伝情報に基づいてeseJ遺伝子に着目し、実験のやり直しを行った。eseJ遺伝子と結合する宿主因子を、タンパク質ータンパク質間の相互作用を検出できるYeast two-hybrid法を用いてスクリーニングする予定であったが、Yeast two-hybrid法によるスクリーニングは完了までに長い時間を要することから、比較的短期間にタンパク質ータンパク質間の相互作用を直接的に検出できるGSTプルダウンアッセイ法に変更した。今年度はGSTプルダウンアッセイ法を行うために、eseJ遺伝子をpGEX6P-1プラスミドにクローニングし、IPTG誘導することによりGST-EseJタンパク質が大腸菌内で適切に発現されることを確認した。次に、研究分担者である河東氏が2018年4月中旬から2019年3月中旬までオーストラリアへ留学して不在であったことから、海産魚を用いた感染実験の遂行は中断した。5つの機能未知遺伝子破壊変異株を用いた海産魚に対する感染実験とマクロファージ内での増殖性の検討結果については、比較的順調に進んでいるが、再現性などの実験遂行は中断している状態である。次に、研究を既に進めていた機能未知遺伝子orf29とorf30遺伝子が、海外のグループからの報告により1つの遺伝子(eseJ遺伝子)であること、さらにeseJが本菌の感染に重要なタイプIIIエフェクターであることが報告されたことから、研究計画を大きく修正し、EseJと相互作用する宿主因子の探索をGSTプルダウンアッセイで行うことに変更した。クローニングは完了したが、これからGSTプルダウンアッセイを行う予定である。標的宿主因子の探索に関しては、上述したようにYeast two-hybrid法だけではなく、プルダウン法による直接検出も試みる。また、標的宿主因子の探索に関しては、5つの機能道遺伝子すべてのクローニングを終わらせてから、標的宿主因子探索を開始するのではなく、クローニングを完了した遺伝子について、順次、標的因子探索のステップに移行したい。機能