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電界による界面反強磁性スピン反転

低消費電力・高速スピントロニクスデバイスへの応用を目指して、強磁性層/電気磁気反強磁性(Cr2O3)層積層膜における、電界誘起界面スピン制御について検討した。主な成果として、これまでバルク(鉱物)でのみ観測されてきたCr2O3の電気磁気効果を、全薄膜系にも適用可能とすることが出来、さらに、界面Crスピンと交換結合した強磁性スピンを反転出来ることを示した。これらの成果は、Applied Physics Lettersを始め、当該分野の一流学術雑誌に掲載されており、また、日本金属学会第12回村上奨励賞等として、国内外で評価されている。絶縁性反強磁性体であるα-Cr2O3(0001)薄膜を用いて、電界効果による界面磁性の制御に関する研究を行った。α-Cr2O3(0001)薄膜に電界印可可能な素子作製、ならびにa-Cr2O3薄膜の単結晶化を可能にする導電性下地層の探索について、重点的に研究を行った。前者に対しては、微細加工技術を駆使することで、α-Cr2O3(0001)薄膜を組み込んだ素子のサイズを40 μm以下とすることで、良好な絶縁性を確保できることを明らかにし、また、本素子に対して電界印加が可能であることが分かった。さらに、この素子に対して電流印加による界面磁性の反転が可能であることを見出した。本成果については、電流効果・電界効果の双方の観点からそのメカニズム界面を進めており、論文投稿、学会発表を準備している。後者については、α-Cr2O3層の下地層として、α-V2O3層を用いることで、フルエピタキシャルな単結晶薄膜が作製できることを見出した。本成果は、2014年春の応用物理学会において報告済みであり、現在、放射光を用いた詳細な構造解析を進めている。本構造解析が完了次第、論文投稿を行う。また、本研究の遂行に際して、α-Cr2O3と強磁性層界面に約1原子層のPt層を挿入することで、交換磁気異方性が高温領域で再発現する、特徴的な現象を見出した。本成果については、2013年12月にApplied Physics Expressに掲載済みであり、また、2014年春の応用物理学会においても報告済みである。研究代表者らが見出した膜面垂直方向の交換磁気異方性と垂直磁気異方性の共存が可能なPt/Co/Cr2O3/Pt薄膜に対して、電界による交換磁気異方性の制御を主な目的として研究を行った。平成26年度は、Cr2O3層に電界印加可能なマイクロドットならびにHall素子形状に、細加工法によって加工した試料に対して、電界による交換磁気違異方性の反転に関する研究を中心に研究を行った。主な成果として、Cr2O3層の電気磁気効果に立脚して、電界による交換磁気異方性の方位反転を達成した。この成果は、これまで鉱物(バルク)のみで観測されてきた効果を全薄膜素子に対して達成したことを意味しており、デバイス応用上意義が大きい。また、達成された交換磁気異方性の方位反転は、温度履歴をともなう電気磁気冷却による反転に加えて、温度を一定として電圧トリガーによる等温反転においても観測された。交換磁気異方性反転のメカニズムの解明に向けて、等温反転条件の温度依存性とパルス電圧を用いた交換磁気異方性の方位反転のダイナミクスに関する研究も行った結果、交換磁気異方性の方位反転が電圧によって誘起された磁化の磁場下での振る舞いによって説明することが出来ることを見出した。これらの結果は、国際会議で招待講演を行うと共に、Applied Physics Lettersに掲載決定している。今後は、交換磁気異方性反転の可逆的な効果を検証すると共に,交換磁気異方性反転の低エネルギー化に向けた研究も合わせて推進する。低消費電力・高速スピンデバイスへの応用を目指して、強磁性層/電気磁気反強磁性層(Cr2O3)積層膜の電界によるスピン制御について検討した。主な成果として、これまでバルクでのみ観測されてきたCr2O3の電気磁気効果を、Cr2O3薄膜において観測することが出来た。また、Cr2O3の電気磁気効果を用いて、電気磁気冷却法、ならびに等温反転法のいずれの方法においても、界面Crスピンを反転できること、さらに、界面Crスピンと界面交換結合した強磁性スピンを反転させることが出来ることも示した。これらの結果は、全薄膜系において、界面スピンを電界によって制御できることを示した先駆けとなる。さらに、等温反転法において、Cr2O3層に印可する電圧をパルス電圧とすることで、界面スピンをダイナミックに反転出来ることを、世界に先駆けて示した。これらの成果に加えて、反強磁性スピンの反転過程が、反強磁性磁区生成と磁壁伝搬によることを示唆し、これらを支持する第一段階の成果として、放射光実験を行うことにより、放射光の元素選択制を利用した強磁性磁区と反強磁性磁区の独立観察することで、強磁性磁区と反強磁性磁区が空間的に対応していることを明らかにした。

これらの成果は、Applied Physics Lettersを始め、当該分野の一流学術雑誌に掲載されており、また、日本金属学会第12回村上奨励賞等として、国内外で評価されている。本課題の主眼である全薄膜素子に対する交換磁気異方性の電界反転を達成した。特に、電気磁気冷却による交換磁気異方性反転に加えて、電界トリガーによる交換磁気異方性の等温反転、交換磁気異方性反転に必要なエネルギーの閾値とその温度依存性、また、パルス電圧による反転も達成した。27年度が最終年度であるため、記入しない。ナノ材料、スピントロニクス交換磁気異方性の等温反転条件の定式化と低エネルギー化を目指して、交換磁気異方性の可逆的反転素子の開発を進める。具体的には、作製した同一素子に対する電気磁気効果係数の定量評価、交換磁気異方性の可逆反転時のエネルギー積の温度依存性をベースとして、交換磁気異方性の極性反転の微視的起源である反強磁性スピン反転条件の定量的指標を明らかにする。当初予定していた、電界印加可能なα-Cr2O3薄膜の作製に成功し、また、α-Cr2O3薄膜の単結晶化のための最適な下地層の選定も完了した。これらの研究項目は、本研究課題開始時の予定とほぼ一致しており、このことから、おおむね順調に進展していると考えている。交換磁気異方性のパルス電圧発生のために、パルス電圧発生器の購入を予定していたが、当初予想よりも高額であったため、自作装置により対応した。この結果、性能は既成品よりも劣るが、今年度の実験の範囲では支障のないスペックの装置を作製出来たため、若干の余裕が出来たため。平成25年度に作製に成功した電界印加型素子に対して、電界による交換磁気異方性の反転を目指す。また、単結晶化に成功した薄膜を用いて、単結晶薄膜に対する電界効果を検討することで、電界効果の本質的な起源を明らかにすることを目指す。平成27年度は、当初予定のパルス電圧発生器を導入して、より高精度な研究を進める。平成25年度の当初予定では、本研究の主要な計測装置である磁気光学Kerr装置用の専用試料ホルダの設計、作製を予定していたが、本ホルダの設計を申請者自身で行うことで予算の削減と行った。また、平成25年度に得られた結果を踏まえて、当初予定していた改良機能に加えて、ベクトル磁化測定が可能な高機能が有効であるとの結論に至ったため、当初平成26年度に予定していた改良機能に、ベクトル磁化測定機能を上乗せすることで、平成26年度予算と合算して使用することとした。平成25年度の繰り越し額に関しては、平成26年度の請求予算と合算して、上記の改良を行う。具体的には、平成26年10月までの設置を目指して、磁気光学Kerr効果にベクトル磁化測定機能を付与する性能改良を行う。
光受容タンパク質の薄膜パターン形成による高機能視覚情報デバイスの創製

高度好塩菌から得られる光受容タンパク質バクテリオロドプシン(bR)は動物の視物質に類似した機能を有し、bRに光を照射すると時間微分応答の光電流が得られる。本研究課題ではbRタンパク質をインクジェットプリンタにより基板上に直接パターン形成し、かつ膜厚コントロールを行う技術を開発することを目的とする。さらに、このパターン形成技術を用いて視覚野にある単純型細胞の機能を模倣するガボールフィルタ空間特性を取り入れた光センサーを構築し、高機能視覚情報デバイスの研究開発を行う。従来のデジタルシステムでは画像と空間フィルタのたたみ込み演算に膨大な処理と時間を要していたが、bRセンサー自身で演算が可能となり、リアルタイム性を必要とするロボットの運動制御、IoTにおける高機能センサーとしての応用が期待できる。本年度は、2次元ガボール関数の実部(cos型)を興奮領域9層と抑制領域6層で、虚部(sin型)を興奮領域8層と抑制領域8層で多値化したガボールフィルタ型光センサーの設計と作製を行った。作製した光センサーにプロジェクタを用いてスリット状の光を照射走査しながら光電流を測定した結果、cos型とsin型ガボール関数の特徴を示す信号が得られた。また、レーザー光(波長568nm)を強度変調して照射し、自動ステージで光センサーを動かしながら得られた信号をロックインアンプで検出するシステムを構築した。これにより、設計したガボール関数と実験結果の比較評価を詳細に行うことができた。これらの研究成果については、国内の学会等で発表報告した。2018年度材料技術研究協会討論会においては、口頭講演奨励賞を受賞した。2次元ガボール関数の実部(cos型)を興奮領域9層と抑制領域6層で、虚部(sin型)を興奮領域8層と抑制領域8層で多値化したガボールフィルタ型光センサーを順調に作製することができた。作製した光センサーを評価した結果、設計したガボール関数にほぼ近い特性が得られていることが分かった。開発したガボール型光センサーの各種パラメータに対する評価と最適化を行い、改良と小型化及びアレイ化の検討を行う。得られた実験データの分析と最終成果のまとめを行い、研究成果を国内学会・国際会議等にて報告するとともに、研究成果の投稿を行う。本年度は本研究の初年度であり、インクジェットプリンタを使用してbR薄膜のパターン形成を行うために、bR溶液の濃度やインクジェットの吐出条件の最適化を行った。作製したbR薄膜については、位相差顕微鏡等で設計通りに積層パターンが形成されていることを確認した。さらに、110回の印刷塗布による薄膜の積層化をして各光応答セルを作製し、それらの光応答電流を測定した結果、15回の印刷回数においては再現性良く光電流が比例して増加することが示された。この方法を用いることにより任意の膜厚で自在なパターニングが可能であり、ガボールフィルタ(cos型)の興奮領域と抑制領域に対応するパターンを片方の基板と対向する基板に印刷し、基板を対向させたパイポーラ型構造の光応答セルを作製して光電流応答の評価を行った。得られた研究成果については、学会、国際会議等で発表報告した。インクジェットプリンタの吐出条件の最適化を行い、bR薄膜の重ね塗り積層回数と光電流応答特性の相関を検証した。その結果、5回程度の積層までは線形に光電流が増加し、再現性があることが確認された。さらに、興奮領域5層と抑制領域3層で設計したガボールフィルタ型光応答セルの作製と評価を順調に進めることができた。

また、レーザー光(波長568nm)を強度変調して照射し、自動ステージで光センサーを動かしながら得られた信号をロックインアンプで検出するシステムを構築した。これにより、設計したガボール関数と実験結果の比較評価を詳細に行うことができた。これらの研究成果については、国内の学会等で発表報告した。2018年度材料技術研究協会討論会においては、口頭講演奨励賞を受賞した。2次元ガボール関数の実部(cos型)を興奮領域9層と抑制領域6層で、虚部(sin型)を興奮領域8層と抑制領域8層で多値化したガボールフィルタ型光センサーを順調に作製することができた。作製した光センサーを評価した結果、設計したガボール関数にほぼ近い特性が得られていることが分かった。位相測定のためのガボールフィルタの設計とシミュレーションを行う。得られた設計パラメータを用いて、sin型とcos型のガボールフィルタ型光応答セルを作製し、各セルの光応答の基本特性の評価を行う。次に、両セルに動画像を照射して光電流応答のデータを取得し、データ解析によって位相を抽出すると共に入力画像の位相との対応を評価する。開発したガボール型光センサーの各種パラメータに対する評価と最適化を行い、改良と小型化及びアレイ化の検討を行う。得られた実験データの分析と最終成果のまとめを行い、研究成果を国内学会・国際会議等にて報告するとともに、研究成果の投稿を行う。(理由)論文投稿を行ったが、本年度中に論文受理に至らなかったので論文掲載費用分を繰り越すこととした。(使用計画)次年度、論文掲載費用として使用する計画である。(理由)実験で使用する透明電極基板等の消耗品を購入予定であったが、予想していたほどは消耗しなかったため購入を次年度に繰り越すこととした。(使用計画)次年度、透明電極基板等の消耗品費用として使用する計画である。2018年度材料技術研究協会討論会口頭講演奨励賞受賞長谷川裕之、佐野由佳、笠井克幸、山田俊樹、田中秀吉、岡田佳子、大友明「インクジェット法によるバクテリオロドプシン視覚情報処理デバイスの作製」受賞年月日:2018年12月1日
巨大リポソーム膜における膜蛋白質複合システム機能の再構成

人工モデル細胞構築技術へ資するため、組換え膜蛋白質複合体提示したバキュロウイルス(AcNPV)と人工ベシクルとの融合技術を基礎に、情報伝達に与る膜蛋白質複合システムを巨大リポソーム膜へ再構成する方法を確立することを目的とした。18年度は、野生型出芽ウイルス出芽エンベロープ(BV)と巨大リポソーム(GUV)との融合の基本条件を明らかにしている。本年度の研究では、この条件を利用して「古典的」な情報伝達系をモデルに選び、その構成膜蛋白質を巨大リポソーム膜へ再構成すること、即ち巨大プロテオリポソームを作製することを、実験目標として計画した。そして、(1)各蛋白質(受容器であるアドレナリンβレセプター、CRFレセプター、TSHレセプター等のGPCR;伝達器である促進性G蛋白質各サブユニット;効果器としてアデニル酸シクラーゼ)の遺伝子を導入した組換えバキュロウイルス(AcNPV)を作製し、(2)各組換えAcNPV出芽ウイルス(BV)の精製とWB・酵素解析による各蛋白質提示の確認を行い、そして(3)BV-GUV融合によるプロテオリポソーム化を共焦点顕微鏡単一GUV解析により確認した。特に(3)においては、GUV膜上における各膜蛋白質構成因子の存在を、抗GPCR抗体、蛍光標識GTPアナログ、及び蛍光標識フォルスコリンによる特異的蛍光染色により慎重に確認しており、これによって上記の目標が達成されたと思われる。本研究でモデルとしたGs共役系は、再構成をはじめ研究に歴史があり知見が抱負である。したがって、下流伝達経路のさらなる構築や、情報伝達機能のアッセイ手法の改良が可能であると期待される。本研究は、外部環境からの刺激に応答する人工モデル細胞の構築をめざし、膜蛋白質複合システムを人工ベシクル膜へ再構成する方法を確立することを目的とする。素材として細胞サイズ(10-10μm)の巨大リポソームを選び、その膜へ情報伝達に与る膜受容体等を発現した出芽バキュロウイルス(BV)を融合させ、これら蛋白質機能を再構成することを計画した。本研究では、三重大工・吉村らが開発した、BVの組換え膜蛋白質提示能とpH依存性膜融合誘起蛋白質gp64の活性を利用する新規プロテオリポソーム作製技術を基本技術として用いており、比較的再構成が難しい7回膜貫通蛋白質の取扱にも適していると考えられる。モデルとして、アデニル酸シクラーゼ活性化に関与する三量体G蛋白質共役型受容体(GPCR)とその周辺を再構成することを目標とした。本年度は、巨大リポソームに対する条件確立のため、野生型出芽ウイルスエンベロープと巨大リポソームの融合条件を共焦点顕微鏡観察により詳細に検討した。その結果、エンドソーム内環境に近いpH5付近の酸性条件下、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルグリセロールを含むリポソーム膜に対して、BVが融合することが分かった。また、飽和/不飽和脂質リポソームのコレステロール含有量を変え融合活性を調べた結果、リポソーム膜の流動性が高くなるほど、gp64の融合誘起活性が高くなると分かった。一方、融合後、リポソーム膜とエンベロープの混合は脂質脂肪鎖種に影響されることから、膜の相状態と関連していることが示唆され、効率的な膜蛋白質の機能再構成を実現するための有用な情報が得られた。GPCRであるTSHRを発現したBVについて、本条件による巨大プロテオリポソームの調製を試み、抗体染色によってリポソーム膜上への提示を確認した。次年度は、受容体・伝達器・効果器の各機能の再構成を目標とする。
鉄還元性多環芳香族化合物分解細菌の探索

自然界から採取したサンプルからヘテロ環を有する芳香族化合物であるカルバゾール、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェンいずれかを唯一の電子供与体、炭素源、エネルギー源として利用し、酸化鉄(III)を唯一の電子受容体として嫌気条件下で生育できる微生物を取得した。ヘテロ環を有する多環芳香族化合物分解能力を持つ鉄還元細菌を取得するため、カルバゾール、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェンを唯一のエネルギー源・電子供与体とし、不溶性の酸化鉄を唯一の電子受容体となるよう調製した培地に自然界から採取した土壌、河川やダムの底泥、下水などを植種源として添加し、嫌気条件下で集積培養を行った。不溶性の酸化鉄は還元されると磁鉄鉱に変化し、黒色化して磁性を有するようになるので、培養後、磁鉄鉱の形成を磁石で確認できたサンプルについては、その一部を新しく調製した培地に植え継いだ。この植継作業を最低4回繰り返し、カルバゾール、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、それぞれ34、20、4種の基質資化性鉄還元菌を含むサンプルを得た。現在、これらのサンプルについて、それぞれの基質を含む寒天プレート上に播種し、そこに形成されたシングルコロニーから、鉄還元性の基質分解菌の単離作業を行っている。これまでのところ、カルバゾールを電子供与体としたサンプルからは、シングルコロニーの周りにクリアゾーン(カルバゾールの低水溶性を利用して白濁した寒天プレートを用いており、カルバゾールが分解されると透明になる)を形成するものが得られている。これまで嫌気的にカルバゾールを分解する微生物の単離例は無いため、本研究により得られた株が新規代謝系及び新規遺伝子・酵素を持つ可能性が高い。また、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェンについても嫌気的な分解代謝系の研究例はなく、本研究で得られている分解菌(叢)から別の嫌気性分解代謝経路とそれ関わる新規遺伝子・酵素が見出される可能性がある。ヘテロ環を有する多環芳香族化合物分解能力を持つ鉄還元細菌を取得するため、カルバゾール(CAR)、ジベンゾフラン(DF)、ジベンゾチオフェン(DT)のいづれかが唯一のエネルギー源・電子供与体、不溶性の酸化鉄(III)が唯一の電子受容体となるよう調製した培地に自然界から採取した土壌、河川やダムの底泥、下水などを植種源として添加し、嫌気条件下で集積培養を行った。不溶性の酸化鉄の還元が確認されたサンプルを新しい培地へ4回以上植え継いで集積培養を行った後でも十分な鉄還元が確認されたサンプルは、CAR、DF、DTそれぞれ22、3、2サンプルであった。これらのサンプルについて、寒天プレート(市販の栄養培地や酢酸を電子供与体とする培地など)に播種し、そこに形成されたコロニーから、鉄還元性の基質分解菌の単離作業を行った。ここでは、CAR、DF、DTにおいて、それぞれ19、1、2サンプルにおいて、寒天プレートを用いてコロニーを形成させることに成功した。シングルコロニーを上記集積培養で用いた培地に接種し、酸化鉄の還元を観察することで、単離した株が基質分解能力と鉄還元能力を持つのかどうかを検証した結果、CAR、DF、DTそれぞれ10、1、1株で鉄の還元が観察された。CAR分解性鉄還元菌のうち旺盛に生育できる一株をMCO1株と命名し、その16S rRNA配列を決定したところ、Desulfovibiro属細菌と100%の同一性を示した。MCO1株はCARを含む寒天プレート(CARは水溶性が低いため白濁する)においてコロニーの周りにクリアゾーンを形成するため、CAR分解性を持つことが示された。本研究では、嫌気的にCAR、DF、DTを電子供与体として利用する微生物を単離することに成功した。このような能力を持つ菌株の単離例はこれまでに報告されていないため、それらの株が新規代謝系及び新規遺伝子・酵素を持つ可能性が高い。
アジ化物代謝系の分子機能解析

アジ化物は、アジ化ナトリウム混入事件で知られるように、極めて猛毒性の高い物質である。多方面で利用されている化合物ではあるが、その多くが毒性や爆発性を有する上に処理技術が不十分であるため、利用が敬遠される傾向にある。一方で、天然アジ化物も存在し、生物によるアジ化物分解が行われているものと予想されるが、どのように生合成・生分解されるかについての報告は全く無く、その代謝(およびそれに関わる酵素および遺伝子)は未解明である。本研究では、アジ化物の分解に関わる酵素をタンパク質・遺伝子レベルで解析し、これらの物質を効率よく分解する条件を検討し無害化するシステムを構築することを目的とした。昨年度、アジ化物分解活性が最大となる最適培養条件を決定したアジ化物分解菌についてさらに解析を行った。アジ化物分解活性が最大となる最適条件で培養して得られた菌体を用いてアジ化物分解酵素の精製を行った。菌体を破砕し、無細胞抽出液を調製した時点でアジ化物分解活性は確認できたが、その活性は低く、菌体破砕によりアジ化物分解酵素が不安定になる可能性が考えられた。従って、無細胞抽出液を大量に調製し、そこからアジ化物分解活性を指標に、酵素精製を開始した。無細胞抽出液を硫酸アンモニウムで分画した後、疎水クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを組み合わせてアジ化物分解酵素の精製を試みているが、現在、SDS-PAGE上で単一バンドになるレベルまで精製するに至っていない。既にスクリーニングに成功しているアジ化物分解微生物についてそれぞれ培養を行い、大量の菌体を取得した。このアジ化物分解微生物を用いてアジ化物を基質とした溶液中で休止菌体反応を行った。遠心により菌体を取り除くことで反応を中止した反応溶液を高速液体クロマトグラフィーを用いたカラム操作で分離した結果、新たなピークが出現することを確認できた。このピークは反応時間を長くすると増加するだけでなく、この基質であるアジ化物のピークの減少に伴って増加することから反応産物と予想された。アジ化物を分解する微生物の同定を試みる実験を行った結果、グラム陰性菌であることが判明した。昨年度、アジ化物分解菌としてスクリーニングされた中で最適株として選んだ菌株についてさらに解析を行った。本菌株のアジ化物分解活性の上昇、および菌体量の増加を目的として培地中の炭素源、窒素源の検討を行った。検討した多くの炭素源でアジ化物分解活性は減少する傾向が確認されたが、菌体量の増加が認められた炭素源もあった。その中でアジ化物分解活性は高いままで、菌体量を増加させることが可能となった炭素源を最適炭素源と決定した。検討した多くの窒素源の中でアジ化物分解活性と菌体量の双方とも向上する窒素源は見つからなかったが、アジ化物分解活性が上昇した窒素源を最適窒素源と決定した。さらに、誘導剤の検討を行い、アジ化物分解活性を示す酵素は誘導酵素と示唆される結果を得るとともに、アジ化物分解活性が最大となる最適培養条件を決定した。

菌体を破砕し、無細胞抽出液を調製した時点でアジ化物分解活性は確認できたが、その活性は低く、菌体破砕によりアジ化物分解酵素が不安定になる可能性が考えられた。従って、無細胞抽出液を大量に調製し、そこからアジ化物分解活性を指標に、酵素精製を開始した。無細胞抽出液を硫酸アンモニウムで分画した後、疎水クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを組み合わせてアジ化物分解酵素の精製を試みているが、現在、SDS-PAGE上で単一バンドになるレベルまで精製するに至っていない。
脳血管攣縮に伴う活性化される遺伝子の分子生物学的研究

くも膜下出血における最も重篤な合併症の一つである脳血管攣縮の発生機序を明らかにするために、平成7年度より、分子生物学的手法を用い脳血管攣縮に伴い活性化される遺伝子の検索を行った。すなわち、ラットくも膜下出血モデルを作製し、その脳血管に発現するmRNAをディファレンシャルディスプレイ法を用い、経時的に比較検討した。ディファレンシャルディスプレイ法は、PCR法を用い二つの異なる状態の細胞あるいは組織間の遺伝子発現の変動を迅速に比較検討する方法であり、一方にのみ発現する遺伝子を単離することが可能な極めて有力な方法である。ラットモデルを用いた結果ではday7に最も強い脳血管撮影上の脳血管攣縮が出現した。この脳血管より全RNAを経時的に抽出し、逆転写酵素でcDNAを合成、10塩基のランダムプライマーとoligo dTプライマーを用いPCRを行い、アクリルアミドゲル上のバンドとして比較検討した。その結果、約9,600の異なるバンドが得られ、そのうち約3%のバンドで発現量の明らかな変化を認めた。このなかで、血管攣縮の程度と強い相関のみられた遺伝子群についてその塩基配列を検討したところ、その一つがhemoglobinの代謝に関与する酵素であることを明らかにできた。現在、この成果について論文作成中であり投稿予定である。脳血管攣縮はくも膜下出血における最も重篤な合併症の一つであり、その発生機序を解明することが脳神経外科領域での緊急課題であるにもかかわらず、その成因についてはほとんど不明なのが現状である。脳血管攣縮の発生機序を明らかにするためには、脳血管の構成細胞内でのシグナル伝達に伴う遺伝子発現の制御とその異常を明らかにすることが極めて重要であるが、脳血管攣縮発症の早期に生じる脳血管の遺伝子レベルでの変化についてはほとんど報告されていない。そこで、平成7年度より、分子生物学的手法を用い,脳血管攣縮に伴い活性化される遺伝子の検索を開始した。すなわち、くも膜下出血動物モデルの脳血管のmRNAを経時的に比較検討し、脳血管攣縮に伴い発現する遺伝子を明らかにするために、ディファレンシャルディスプレイ法を用いた検討を行った。今年度の実験では、くも膜下出血動物モデルを作成し、その脳血管より全RNAを抽出、逆転写酵素でcDNAを合成、10塩基のランダムプライマーとoligo dTプライマーを用いPCRを行い、アクリルアミドゲル上のバンドとして比較検討した。その結果、遺伝子発現が脳血管の状態により変化することが明らかになった。現時点では、脳血管攣縮に伴い発現量の変化する遺伝子群の本体は明らかになっておらず、現在、どのような遺伝子群であるかを検討している。くも膜下出血における最も重篤な合併症の一つである脳血管攣縮の発生機序を明らかにするために、平成7年度より、分子生物学的手法を用い脳血管攣縮に伴い活性化される遺伝子の検索を開始した。しかし、この方法では数多くの未知あるいは既知の遺伝子群が同定されてくる。そこで、サルやイヌに較べ遺伝子の検索が多くなされているラットを用いるのがより実際的であると考え、今年度の実験では、新たにラットの2回出血モデルを開発した。このモデルではday7に最も強い脳血管撮影上の脳血管攣縮が出現する。その結果、約2,700の異なるバンドが得られた。このうちday1においては13のバンドで発現量の明らかな増加を認めた。一方、17のバンドでは発現量の著明な減少を認めた。また、day7においては発現量の増加したバンド61、減少したもの18を確認できた。現在、これらのバンドの遺伝子配列を明らかにし、どのような遺伝子群であるかを検討しているところである。

このなかで、血管攣縮の程度と強い相関のみられた遺伝子群についてその塩基配列を検討したところ、その一つがhemoglobinの代謝に関与する酵素であることを明らかにできた。現在、この成果について論文作成中であり投稿予定である。
超新星残骸における宇宙線加速限界の直接測定

超新星残骸における衝撃波加速は電荷に比例した加速限界を予言する.超新星残骸で達成可能な最高エネルギーは典型的に,陽子で60TeV (10の12乗電子ボルト)と見積られている.一方,宇宙線スペクトルの地上観測では,3000TeV付近で冪の折れ曲がり"knee"が見られる."knee"は陽子の加速限界と捉えられており,地上からの観測に基づく理解と,超新星残骸モデルは整合的ではない.本研究では5年間のCALETデータを用いて,100 TeV領域に至る陽子・ヘリウムスペクトルを決定することで,上記の不整合を解決する鍵であり未検出の場合も重要な結果となる,電荷に比例する加速限界の検出を目指す.超新星残骸における衝撃波加速は電荷に比例した加速限界を予言する.超新星残骸で達成可能な最高エネルギーは典型的に,陽子で60TeV (10の12乗電子ボルト)と見積られている.一方,宇宙線スペクトルの地上観測では,3000TeV付近で冪の折れ曲がり"knee"が見られる."knee"は陽子の加速限界と捉えられており,地上からの観測に基づく理解と,超新星残骸モデルは整合的ではない.本研究では5年間のCALETデータを用いて,100 TeV領域に至る陽子・ヘリウムスペクトルを決定することで,上記の不整合を解決する鍵であり未検出の場合も重要な結果となる,電荷に比例する加速限界の検出を目指す.
簡易NCによるプリント基板加工装置の製作と教育への活用

プリント配線パターンを基板上に作る方法のなかで、プリント基板加工機による生基板からパターンを削り出す方式は、低コスト、短時間加工が可能で、試作・少量基板の作製に最適である。本研究は、パソコン制御によるプリント基板加工装置を安価に製作し、教育に活用することを目的とする。製作した装置は、まずパソコン用基板CADソフトを用い、回路図またはプリント配線パターンを描き、パターンデータ(数値データ)を得る。次に作成した制御ソフトを用い、パターンデータを元に、製作した加工機を制御し、切削と穴あけをし、プリント配線板を作る。加工機本体は、X、Y、Zの各軸を台形ねじ型アクチュエータで作り、Z軸には小型電気ドリルを取り付けてある。各軸はステッピングモータで制御する。モータの駆動に専用の駆動用ICを使用することにより、制御ソフト、回路とも簡略化でき、細かい制御が可能である。加工範囲は150mm×100mmである。制御ソフトは、パターンデータを本装置用のNCデータに変換し、穴あけ用と切削用に分け、さらに穴あけ用は穴の径ごとに分離し、各NCデータのファイルを作る。次にNCデータを読込み、X、Y、Z軸用ステッピングモータの制御信号を作り加工機を制御する。ファイルごとにエンドミル、ドリルを交換しながら繰り返す。既存の物品を使用したり、手作りすることにより、プリント基板加工装置を安価に製作した。また、本装置を学生が自由に使用できるように、装置の取扱い説明書を作成し、電子回路の作製に利用した。今後も、卒業研究やものづくり教育などで本装置を活用する。
看護師を対象とした高規格シミュレータを用いた小児急変対応の遠隔教育法の開発

本研究では、看護師を対象に、小児重症急変患者を想定したシミュレーションを用いた実習を、高規格シミュレータを用い、インターネット回線でのテレビ会議システムを介して、指導者(ファシリテーター)が遠隔から指導を行うことでの教育効果を示すことを目的としている。高規格シミュレータは、マネキンの各種バイタルサインの表示や異常音を含めた呼吸音・心音の再現、脈拍触知・体動や痙攣の再現も可能であり、より実臨床に近い教育環境を整えることができる。初年度は、本シミュレータが遠隔でも操作ができるよう、設定を行うとともに、インターネットを使用した実習における技術的な問題点の抽出を行った。2年目は引き続き、高規格シミュレータの遠隔での操作環境の整備を行った。さらに、事前実習として、高規格ではない乳児用マネキンを用いた看護師向けシミュレーション実習を、直接教育群11名、遠隔教育群11名を対象に行った。シミュレーションを用いた乳児心停止症例への対応のテストにおける、「反応をみる」「人を呼ぶ」「救急カートを手配する」「除細動器を手配する」「院内急変コールの発動」「呼吸の確認」「脈の確認」「胸骨圧迫開始」「換気開始」「胸骨圧迫を行っている時間の合計」「モニター装着」「AEDパット装着」「モニター確認」「除細動(AED)実施」の各項目について、実習前・後、直接教育群・遠隔教育群で比較を行った。直接・遠隔教育群ともに実習後の成績に有意な差はなく、遠隔教育でもシミュレーション教育の有用性が示唆された。高規格シミュレータを遠隔操作することによって実習を行っていく予定であったが、遠隔操作の整備に技術的に改善すべき点があり、十分整っていない。高規格シミュレータの遠隔操作が確実に実行できるようにし、最終年度は直接教育群・関節教育群ともに実習ならびに評価を行う。本研究では、看護師を対象に、小児重症急変患者を想定したシミュレーションを用いた実習を、高規格シミュレータを用い、インターネット回線でのテレビ会議システムを介して行うことの効果を示すことを目的としている。高規格シミュレータは、各種バイタルサインの表示や異常音を含めた呼吸音・心音の再現、脈拍触知・体動や痙攣の再現も可能であり、より実臨床に近い教育環境を整えることができる。。また、申請者らがこれまで行ってきた医師向けの小児蘇生プログラムを基に、看護師に施行する場合の問題点を抽出し、看護師向け小児蘇生教育プログラムを検討を行った。初年度にシミュレーションを用いた実習を行う予定であった。初年度はテスト実習のみを施行することができた。直接教育群・遠隔教育群ともに、シミュレーションを用いた実習を進めていく。実際の実習での使用物品の購入を次年度分と合わせて行うため遠隔操作を行うためのPCならびに関連機材の購入を予定しているため
リン酸化プロテオミクスを用いた新規血管新生因子の同定

1.研究の背景および目的血管平滑筋細胞遊走は、血行障害による傷害臓器再生のための機能的な血管新生において重要な役割を果たす。申請者は過去に平滑筋ミオシン軽鎖リン酸化酵素(MLCK)が血管平滑筋細胞遊走を制御する事を発見した実績を持つ。申請者の教室で血管平滑筋の異常収縮のシグナル分子として発見されたスフィンゴシルポスホリルコリン(SPC)は血管平滑筋細胞遊走も引き起こす事が近年報告されている。本研究はリン酸化プロテオミクスの手法を用いてSPCおよびMLCKによる血管平滑筋細胞遊走のシグナル伝達の全容を明らかにし、臓器再生のための血管新生の新たな治療法の標的分子を見出す事を目的とするものである。2.研究実績(1)方法1)ヒト冠状動脈平滑筋細胞(CASMCs)をSPCで刺激し、チロシンリン酸化される蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体RC20によるウェスタンブロット法でスクリーニングした。2)これらの蛋白をRC20による免疫沈降法で抽出し、SDS-PAGEにて分離後、PVDF膜に転写してクマシーブリリアントブルーで染色して蛋白バンドを切り出し、PVDF膜上で蛋白の還元-Sアルキル化処理を行ったのち、プロテアーゼ(Achromobacter Protease I)で消化した。上記の方法は、従来知られているゲルを銀染色した後にトリプシンで蛋白をゲル内消化する方法より、消化効率が優れていた。3)消化ペプチドをzipChipC18で脱塩後、タンデム型質量分析計(MALDI-TOF-MS/MS, LC-MS/MS)を用いペプチドマスフィンガープリントを行いゲノム情報に基づき分子を同定した。(2)結果SPC刺激後にチロシンリン酸化される蛋白が複数認められ、その分子量からp40およびp200と命名した(特許申請の都合上明記できない)。チロシンリン酸化レベルの時間経過は、p40は刺激後5分で最大となり、p200は刺激後30分から60分において最大となった。タンデム型質量分析計による同定では、P40は、phospholipid-binding protein, G-proteinと相互作用する蛋白、および機能未知の蛋白分子が候補として挙げられた。P200は細胞骨格や細胞運動に関連する既知の蛋白であった。チロシンリン酸化のp200の機能に対する影響の報告は無く、p200のチロシンリン酸化が、p200の機能の新規の制御機構である可能性が示唆された。申請者の教室で血管平滑筋の異常収縮のシグナル分子として発見されたスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)は血管平滑筋細胞遊走も引き起こす事が近年報告されている。2.本年度の研究実績(1)方法1)ヒト冠状動脈平滑筋細胞(CASMCs)をSPCで刺激し、チロシンリン酸化される蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体RC20によるウェスタンブロット法でスクリーニングした。3)消化ペプチドをZipChipC18で脱塩後、タンデム型質量分析計(MALDI-TOF-MS/MS,LC-MS/MS)を用いペプチドマスフィンガープリントを行いゲノム情報に基づき分子を同定した。(2)結果1)RC20によるクエスタンブロットにより、SPC(30μM)刺激5分後にチロシンリン酸化される蛋白が認められ、p40と命名した。2)p40をタンデム型質量分析計で同定した結果、phospholipid-binding Protein, G-proteinと相互作用する蛋白、および機能未知の蛋白分子が候補として挙げられた。2.研究実績(1)方法1)ヒト冠状動脈平滑筋細胞(CASMCs)をSPCで刺激し、チロシンリン酸化される蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体RC20によるウェスタン

ブロット法でスクリーニングした。2)これらの蛋白をRC20による免疫沈降法で抽出し、SDS-PAGEにて分離後、PVDF膜に転写してクマシーブリリアントブルーで染色して蛋白バンドを切り出し、PVDF膜上で蛋白の還元-Sアルキル化処理を行ったのち、プロテアーゼ(Achromobacter Protease I)で消化した。上記の方法は、従来知られているゲルを銀染色した後にトリプシンで蛋白をゲル内消化する方法より、消化効率が優れていた。3)消化ペプチドをzipChipC18で脱塩後、タンデム型質量分析計(MALDI-TOF-MS/MS, LC-MS/MS)を用いペプチドマスフィンガープリントを行いゲノム情報に基づき分子を同定した。(2)結果SPC刺激後にチロシンリン酸化される蛋白が複数認められ、その分子量からp40およびp200と命名した(特許申請の都合上明記できない)。チロシンリン酸化レベルの時間経過は、p40は刺激後5分で最大となり、p200は刺激後30分から60分において最大となった。タンデム型質量分析計による同定では、P40は、phospholipid-binding protein, G-proteinと相互作用する蛋白、および機能未知の蛋白分子が候補として挙げられた。P200は細胞骨格や細胞運動に関連する既知の蛋白であった。チロシンリン酸化のp200の機能に対する影響の報告は無く、p200のチロシンリン酸化が、p200の機能の新規の制御機構である可能性が示唆された。
情報の科学・技術の仕組みを体験的に学べる教材ソフトウェアの開発に関する研究

本研究では,既に広く利用されているがその仕組みについてはあまり知られていないような情報技術を取り上げ、その仕組みを体験的に分かり易く学習するための教材ソフトウェアとして、公開鍵暗号の仕組みを学ぶための教材、画像のデジタル化学習支援教材、データベースの情報処理過程の可視化教材、CPUの仕組みを学ぶための教材、入出力機器の取り扱いについて学ぶためのソフトウェア他を開発し、それぞれの教材の有効性を確認した。本研究は、情報科学や情報技術の仕組みを体験的に学べる教材ソフトウェアの開発を目指している。本年度は以下の4つのテーマを取り上げた:1. p2pネットワークの仕組みを学ぶためのソフトウェア、2.入出力機器の取扱い、3.公開鍵暗号の仕組み、4. CPUの仕組み。1.については、作成するソフトウェアの外部仕様をほぼ確定し、試作を始めたところである。2.については、LilyPad Arduinoのシミュレータを作成し、PENでプログラムを作成できるようにした。3.については、公開鍵暗号の仕組みを学ぶための教材を作成した。4.については、CPUの動作の仕組みを学ぶためのソフトウェアを作成した。昨年度より引き続いて研究開発中のテーマについての成果を述べる: 1.p2pネットワークの仕組みを学ぶためのソフトウェアについては、Chordアルゴリズムに基づいて動作するp2pネットワークのシミュレーションが可能になった。2.入出力機器の取り扱いについて学ぶためのソフトウェアについては、PENからLilyPad Arduinoを制御できる仕組みを実装し既に実際の授業で使用している。3.公開鍵暗号の仕組みを学ぶための教材については、新たな教材を開発し授業で試用した。4.CPUの仕組みを学ぶための教材については、昨年度の有していたプログラムサイズの制約を取り除いた。今年度は新たに以下のテーマについて教材・ソフトウェアの研究開発を行った:5.データベースの情報処理過程の可視化教材の作成:学生に馴染みのあるコンビニのPOSシステムを取り上げ、商品の管理方法等を可視化する教材を開発した。6.画像のデジタル化学習支援教材の作成:任意の画像に対して、解像度と階調を変換でき、見え方や容量を観察できる教材を開発した。7.フローチャートに基づくプログラミング学習環境の構築:画面上でフローチャットを作成することでプログラムに変換できるソフトウェアを実際の授業で使用し、その有用性を明らかにした。8.ブロック型プログラミング学習環境の構築:ブロックを並べることでプログラムを作成できるプログラミング学習環境を開発した。本学習環境では、必要なブロックを学習段階に応じで徐々に増やせる仕組みを実現しており、初学者に易しい学習環境を提供している。以上のように、情報の科学的理解を深める様々な教材・ソフトウェアを開発した。開発途中のものもあるが、一部は実際の授業で利用してその有効性を確認している。テーマによって進捗に違いがあるが、「研究実績の概要」欄に挙げた8つのテーマについてそれぞれ、概ね順調に進行していると考えている。以下、各テーマ毎の進捗状況を記す。1.Chordアルゴリズムの動作を確認できるようになったが、まだ安定して動作するようにはなっていない。2.ソフトウェアおよびコースウェアが完成しており、既に授業で利用している。3.今年度、教材の設計から見直して、新たな教材を作成した。まだ完成の段階には達していないが授業で試用してみた。4.昨年度有していた制約を取り除いたので、授業で使用できる段階に達したと考えている。5, 6については、教材が開発できたばかりであり、授業での使用に耐えうるかの検討が必要と考えている。7.については、既に完成していたソフトウェアを用いて実験授業を行い、その有効性を確認し、論文として発表したので、このテーマについは完了と考えている。8.新たな初学者向けプログラム学習環境を構築し、その有効性を確認するための実験授業を実施した。ソフトウェアそのものの改良が必要であり、引き続き研究・開発を継続する予定である。昨年度より引き続いて、以下のような情報の科学的理解を深める様々な教材・ソフトウェアを開発した。(1)ブロック型プログラミング学習環境の構築:昨年度開発したブロックを並べることでプログラムを作成できるプログラミング学習環境oPENにArduinoを制御するためのブロックを追加し、さらに、Arduino Simulatorを実装した。これによって、従来よりも初学者に易しい学習環境で「計測と制御」の学習が可能となった。(2)入出力機器の取り扱いについて学ぶためのソフトウェア:我々のグループが開発したブロック型言語を採用したoPENにArduino Simulatorを追加して、oPENでArduinoのプログラムを開発できるようにした。(3)公開鍵暗号の仕組みを学ぶための教材: PKI体験ページ、HTTPS学習ページ、RSA暗号体験ページ等を追加するなど、Web教材を改良した。また、文系大学生数名に対して評価実験を行った。(4)CPUの仕組みを学ぶための教材:北海道大学の一年生後期の選択科目「情報学II」(受講者25名)において、一コマ(90分)の授業で使用してもらった。アンケートの結果から、コンピュータの基本原理に関する理解度、興味、今後の意欲などが向上していることが確認できた。(5)データベースの情報処理過程の可視化教材:昨年度開発した、学生に馴染みのあるコンビニのPOSシステムを取り上げ、商品の管理方法等を可視化する教材について、よりわかりやすくなるようにユーザインタフェースに改良を加えた。また、高校生および大学生数名に対して、評価実験を行い、教材の有効性を確かめた。

本研究では,既に広く利用されているがその仕組みについてはあまり知られていないような情報技術を取り上げ、その仕組みを体験的に分かり易く学習するための教材ソフトウェアとして、公開鍵暗号の仕組みを学ぶための教材、画像のデジタル化学習支援教材、データベースの情報処理過程の可視化教材、CPUの仕組みを学ぶための教材、入出力機器の取り扱いについて学ぶためのソフトウェア他を開発し、それぞれの教材の有効性を確認した。1.については、外部仕様がほぼ完成しており、一部試作を開始しており、ほぼ予定通りの進捗である。今後実装を行う。2.についてはLilyPadシミュレータが完成しており、当初の目標以上に進んでいる。次年度で改良に努める。3.については、WEB教材を作成しており予定通りの進捗である。教員が十分な説明を行なった上で利用する補助教材となっている。4.については、一応利用可能な教材が出来ているが、10行までのプログラムしか記述できないなど、制約がきついので、今後は、より広範囲で利用できるものに改良していく予定である。現在、8つのテーマについて並行して研究を進めているが、さらに、23の新たなテーマについて、実現可能性を検討する予定である。そのうえで、当初の研究計画に記したように、最終的には、46程度のテーマに絞って、実用的な教材開発を目指したい。情報工学今年度は、前年度の結果を引き継ぎ、各テーマで研究を進める。1.については、Chordの実装を進めてプログラムの完成を目指す。2.については、試用を重ねることで、改良に努める。3.については、一応教材として完成しており、さらに改良を行うかどうかを含めて検討する。4.については、命令数を増やし、動作するプログラムの行数も増やして、作成できるプログラムのクラスを拡大する。本務が忙しく、当初予定していた国際会議や研究会に参加できなかったことから旅費が当初計画より少なくなってしまった。また、ソフトウェア開発を支援してくれている人が多忙だったため、十分な開発時間を確保することができず謝金が当初計画より少なくなってしまったため。当初予定していた研究動向調査のための国際会議への参加を、多忙のため取りやめせざるをえなくなったため、余剰金が生じた。研究成果の発表、および、新たなテーマの検討のための国際会議・研究会等に参加する旅費として使用したい。また、昨年度のソフトウェア開発の遅れを取り戻すため、ソフトウェア開発支援のためのアルバイト謝金を増額したい。今年度、最新の研究動向調査のための国際会議の旅費として使用する。
軸索再生の分子機構-神経突起伸長抑制因子レセプターの役割-

中枢神経系に損傷が生じた場合、ヒトをはじめとする高等脊髄動物ではほとんど再生が起こらない。この原因は、ニューロンに存在する可能性と、グリア等軸索を取り巻く環境にある可能性とが考えられる。近年になってオリゴデンドロサイト由来のニューライト伸長抑制因子の研究が注目を浴びている。これらの蛋白を認識するモノクローナル抗体の投与により、成長円錐がオリゴデンドロサイトに遭遇すると縮退・回避する。この反応もこの抗体によって抑制されることが示された。このことから、成長円錐にはオリゴデンドロサイトの抑制因子を認識するレセプターが存在するものと考えられる。そこで、本研究では単クローン抗体法を用いてこのレセプターを同定することにより、中枢神経系における再生のメカニズムの解明に迫った。研究のストラテジーとして単クローン抗体法を用い、以下に述べる機能的スクリーニング法を採用した。ニワトリ胚より後根神経節を取り出し、培養を行い、成長円錐のみを分離後、ホモゲナイズし、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーを用いて成長円錐に特異的な成分を分離した。成長円錐の膜分画をすでに確立された方法により精製し、成長円錐の特異的成分を選別し、これを抗原としてマウスを免疫した。脾臓を取り出し、ハイブリドーマを作成した。各クローンの生産する抗体を成長円錐に投与し、縮退を生じさせる効果のあるクローン及びそれを阻止するクローンを選別した。我々はこれまでの研究において、成長円錐の行動をタイムラプスビデオによって解析するシステムを開発し、本研究においてもこのシステムを効果的にスクリーニングに用いた。中枢神経系に損傷が生じた場合、ヒトをはじめとする高等脊椎動物では殆ど再生が起こらない。この事実は脊椎損傷による運動機能麻痺障害の原因となっており、軸索の再生を促進する手段を開発する様々な試みがなされてきた。近年になってオリゴデンドロサイト由来のニューライト伸長抑制因子の研究が注目を浴び、これらの蛋白を認識するモノクローナル抗体の投与により、成長円錐がオリゴデンドロサイトに遭遇すると縮退・回避するが、この反応もこの抗体によって抑制されることが示された。ニワトリ胚より後根神経節を取り出し、培養をおこない、成長円錐のみを分離後、ホモゲナイズし、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーを用いて成長円錐に特異的な成分を分離した。成長円錐の分離の方法については確立されているので、これを用いて成長円錐の膜分画を精製し、成長円錐の特異的成分を選別し、これを抗原としてマウスを免疫した。また、我々はこれまでの研究において、成長円錐の行動をタイムラプスビデオによって解析するシステムを開発し、これを効果的に用いてきた。本研究においても基本的にはこのシステムをスクリーニングに用いた。中枢神経系に損傷が生じた場合、ヒトをはじめとする高等脊椎動物ではほとんど再生が起こらない。この原因は、ニューロンに存在する可能性と、グリア等軸索を取り巻く環境にある可能性とが考えられるが、近年になってオリゴデンドロサイト由来のニューライト伸長抑制因子の研究が注目を浴びている。これらの蛋白を認識するモノクローナル抗体の投与により、成長円錐がオリゴデンドロサイトに遭遇すると縮退・回避するが、この反応もこの抗体によって抑制されることが示された。そこで、本研究では単クローン抗体法を用いてこのレセプターを同定することにより、中枢神経系における再生のメカニズムの解明を迫った。

研究のストラテジーとして単クローン抗体法を用い、以下に述べる機能的スクリーニング法を採用した。ニワトリ胚より後根神経節を取り出し、培養をおこない、成長円錐のみを分離後、ホモゲナイズし、電気泳動又はカラムクロマトグラフィーを用いて成長円錐に特異的な成分を分離した。成長円錐の膜分画をすでに確立された方法により精製し、成長円錐の特異的成分を選別し、これを抗原としてマウスを免疫した。脾臓を取り出し、ハイブリドーマを作成した。各クローンの生産する抗体を成長円錐に投与し、縮退を生じさせる効果のあるクローン及びそれを阻止するクローンを選別した。我々はこれまでの研究において、成長円錐の行動をタイムラプスビデオによって解析するシステムを開発し、本研究においてもこのシステムを効果的にスクリーニングに用いた。
細胞外寄生細菌の細胞内センサーによる認識機構の解明

細胞外寄生細菌である口腔連鎖球菌S. mutans , S. gordoniiならびにS. sanguinisは、A/Jマウス由来樹状細胞XS-106に菌量依存的にIL-1bの産生を誘導する活性を有していた。S. sanguinisのIL-1b産生誘導活性はcaspase-1ならびにNLRP3依存的であった。本研究により、口腔連鎖球菌はマウス樹状細胞にNLRP3インフラマソームを活性化し、IL-1bの産生を誘導することが示唆された。本研究では、細胞外寄生細菌である口腔レンサ球菌S. mutans (Sm), S. gordonii (Sg),ならびにS. sanguinis (Ss)がどのようなメカニズムで細胞内センサーnucleotide-binding oligomerization domain 2(NOD2)に認識され、また、どのようなメカニズムでインフラマソームを活性化するのかを明らかにすることを目的とする。HEK293細胞を用いたNF-kBルシフェラーゼ法で、SmならびにSgの野生株、リポタンパク質欠損株は共にNOD2を介してNF-kBを活性化した。このことから口腔レンサ球菌体の構成成分が何らかのメカニズムでHEK293細胞の細胞質に取り込まれ、細胞内のレセプターであるNOD2で認識されていることが示唆された。そこで、細胞内のセンサーであるインフラマソームの活性化を検証した。Sm、SgならびにSsの生菌、熱処理した死菌ならびに菌体培養上清はマウス樹状細胞(XS-106細胞)からのIL-1bの産生を誘導した。Ssにより誘導されるIL-1bの産生は、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤であるクロロプロマジン、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンD、pan-caspase阻害剤であるZ-VAD-FMKならびにcaspase-1と4の阻害剤であるz-YVAD-FMKにより抑制された。XS-106細胞のcaspase-1をRNAiによりノックダウンすると、Ss刺激によるIL-1bの産生は抑制された。さらに、これら口腔レンサ球菌による刺激はXS-106細胞に細胞死を誘導した。これらのことから、口腔レンサ球菌はクラスリン依存的にXS-106細胞の細胞内に取り込まれ、インフラマソームを活性化し、pyroptosisを誘導する耐熱性の菌体構成成分を有していることが示唆された。本研究では、細胞外寄生細菌である口腔連鎖球菌S. mutans (Sm), S. gordonii (Sg)ならびにS. sanguinis (Ss)がどのようなメカニズムで細胞内センサーであるインフラマソームを活性化し、IL-1bの産生を誘導するのかを明らかにすることを目的とする。Sm, SgならびにSsの生菌、熱処理した菌体(100°Cで5分間)ならびに菌体培養上清は、A/Jマウス由来樹状細胞(XS-106細胞)に菌量依存的にIL-1bの産生を誘導する活性を有していた。SsのIL-1b産生誘導活性はpan-caspaseならびにcaspase-1阻害剤であるz-VAD-fmkならびにz-YVAD-fmkで阻害され、さらにcaspase-1のmRNAのノックダウンにより抑制された。SsのIL-1b産生誘導活性はNLRP3特異的siRNAを安定発現するXS-106細胞において有意に低下した。さらに、Ssによる刺激でreactive oxygen species(ROS)が産生され、また、ROSの阻害剤(N-acetylcysteine)でIL-1bの産生が抑制された。さらに、Ssによる刺激はXS-106細胞にネクローシス様の細胞死を誘導した。以上の結果から、Ss菌体はマウス由来樹状細胞にNLRP3インフラマゾームを活性化し、IL-1bの産生ならびに細胞死を誘導することが示唆された。これまでの研究で、口腔レンサ球菌はクラスリン依存的にマウス樹状細胞(XS-106細胞)の細胞内に取り込まれ、インフラマソームを活性化し、pyroptosisを誘導する耐熱性の菌体構成成分を有していることが示唆され、学会発表を行った。今後、より詳細なメカニズムを明らかにしていく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。インフラマソーム活性化のメカニズムを明らかにするため、各種NOD-like receptors(NLRs)をノックダウンし、本活性化に関与しているNLRsを調べる。また、ATP、活性酸素やapoptosis signal-regulatingkinase 1の関与を明らかにすることで、口腔レンサ球菌によるインフラマソームの活性化のメカニズムを分子レベルで解明する。In vivoにおいて、口腔レンサ球菌によるインフラマソームの活性化におけるTLR2