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天然繊維および無機微粉末により強化された熱可塑性複合材料に関する研究

非木質系リグノセルロースはマテリアル利用を試みる際、原料としての取り扱いが困難とされている。これは貯蔵時の劣化が早く安定性に不安があることや接着剤との結合阻害が生じることなどが問題となるためである。本研究では非木質系リグノセルロース繊維(特に竹繊維)を熱可塑性樹脂複合材料に利用する際の課題を検討することを目的とした。本年度の成果をまとめると以下のようになる。(1)竹繊維を微細化し、高密度ポリエチレン、カップリング剤(マレイン酸変性ポリエチレン)およびナノクレイを混合した竹ポリエチレン複合材料を作製する手法を確立した。(2)カップリング剤およびナノクレイの混合比率を変化させて複合材料の作製を行った。(3)作製した竹ポリエチレン複合材料について基礎物性試験(曲げ、引張り、衝撃試験)を行い、基礎物性に及ぼすカップリング剤およびナノクレイの効果について検討を行った。ポリエチレン単体に比べ、竹繊維を混合することで強度が増加した。このことは竹繊維がプラスチック複合材料において優れた充填剤であることを示唆している。(4)複合材料におけるナノクレイの影響をより詳しく検討するためにエックス線回折測定を行い、ナノクレイの結晶構造の変化について検証した。非木質系リグノセルロースは、マテリアル利用を試みる際、原料としての取り扱いが困難とされている。貯蔵時の劣化が早く安定性に不安があることやバインダーとの結合阻害を生じることなどが課題とされている。本研究では、非木質系リグノセルロース繊維を熱可塑性樹脂複合材へ利用する際の課題を検討することを目的とした。本年度の成果を取りまとめると以下のようになる。(1)天然繊維や無機物のナノパーティクルによる強化熱可塑性複合物の文献のレビューを完成させた。(2)天然繊維(本件度は竹を用いた)と3種類のプラスチック(HDPE、PP、PVC)、カップリング剤(MAPE、MAPP)共重合体とナノクレイを含む原料収集作業を完了した。(3)原料調整の準備作業を完了した。天然繊維を微細化して、異なるメッシュサイズ(20、50と、80のメッシュ)条件下で節い分けを行った。(4)一般的なプラスチック(例えばPVC、PP、HDPE)の種類と天然繊維微粉の種類とサイズが複合物の物性に及ぼす影響を力学および熱化学的な手法で検証した。また、次年度に向けて、(1)カップリング剤開発のためのプラスチックと天然繊維の相互作用の検討、(2)ナノパーティクルによる性能強化、(3)押し出し製法の最適化が課題であることを明らかにした。
ヒト歯根膜幹細胞シートを用いた歯周組織の再生

1)PDLSCの培養および評価:抜去歯の根面より歯根膜組織を採取し、Trypsin-EDTAにて酵素処理を行った。酵素処理により得られた歯根膜細胞の中で、コロニーを形成し増殖してくる増殖活性の高い細胞をperiodontal ligament stem cells(PDLSC)と仮定し、実験に使用した。PDLSCは、骨芽細胞分化誘導培地にて培養後ALPの発現及びRT-PCRにて遺伝子発現について検討を行った。2)PDLSCシートの作製:酵素処理により得られたPDLSCを用い、温度応答性培養皿上にて3週間培養し作製した。3)ヌードラット下顎骨大臼歯根面に作製した欠損への細胞シートの移植実験の前段階としてシートをヌードラットの皮下に入れた象牙質の板上に重層させて移植:ヌードラットF344NJc1-rnu/rnu 5週齢オスを用いて実験群にPDLSCシートを設置、コントロール群にはperiodontal ligament cells(PDL)シートを設置し復位縫合。5週間の観察期間を設けた。4)組織観察:術後観察期間の後、脱灰組織切片を作製、ヘマトキシリンエオジン染色およびアザン染色を行い光学顕微鏡下にて組織観察を行った。5)結果・考察:本パイロット実験においては象牙質の板面にしめる新生セメント質%および新生歯根膜線維%、また新生セメント質厚さの項目について実験群およびコントロール群について有意な差は認めれなかった。組織の脱灰組織切片を作製の行程において移植シートが象牙質板からはがれてしまう部分が認められたため正確な評価にいたらなかったと考察される。ただし実験群において層板状の石灰化したセメント質様構造と,そこから直角に伸び出した歯根膜線維の形成が観察された部位も多く認められたことから今後脱灰組織切片作製の改善点を検討しヌードラット下顎骨大臼歯根面に作製した欠損への細胞シートの移植実験を行いPDLSC細胞シートを用いた歯周組織の再生について検討を行う予定である。
Foxp2が制御するマウス超音波音声機能および行動機能に関する研究

ヒト言語障害変異に対応する変異Foxp2(R552H)-ノックイン(KI)ホモマウスはプルキンエ細胞の発達異常とシナプス形成不全に関連する運動性障害を有する。本研究はFoxp2(R552H)-KIを用いて、USV(言語)障害の原因を探索する。また、小脳プルキンエ細胞に特異的にMycTagをつけた正常Foxp2[Foxp2-トランスジェニック(Tg)マウス]をFoxp2(R552H)-KIホモマウスのプルキンエ細胞に発現させ、言語障害、発育障害、運動障害、致死の回復を調べることで、小脳機能および機能相互間の関係を明らかにする。Foxp2(R552H)-KIマウスとFoxp2-Tgマウスと交配させたハイブリッドマウス、正常マウス、Foxp2(R552H)-KIマウスについてハイブリッドマウスのUSV、行動機能、致死の回避などを解析した。その結果、ホモ仔マウスは、親マウスから乳をもらえないことによる餓死を防ぐことはできなかったものの、USV障害についてはヘテロマウスおよびホモマウスでUSVの回復が認められた。ヒトの言語能力獲得に必要な脳域としてBroca領域(言語領域)特定されている。しかし、ヒト言語獲得の分子機構は不明であり、その解明には、非侵襲性な方法による解析とともに分子生物学、生理学アプローチを基礎とした神経回路の解析および言語障害の病因の解析を基盤とした分子機構の解析が必要であり、ヒト以外の動物実験系が必須である。動物はヒトと同様な言語を持たないとされているものの、マウスには言語に類似した超音波領域(USV)でのコミュニケーション能力を有しているという報告がある。そこで申請者は、ヒト言語障害の変異遺伝子FOXP2(R553H)に対応したマウスFoxp2(R552H)を導入したマウスモデル(Foxp2(R552H)-ノックイン(KI)マウス)を作成した。本研究はヒト言語障害遺伝子変異を導入したFoxp2(R552H)-KIマウスの機能障害の解析を基盤として、USV(言語)能力獲得に必要な分子機構を明らかにすることを目的する。解析を通して、マウスUSVとヒト言語が脳で共通の分子機構をもつことを明らかにしてきた。さらに、Foxp2(R552H)KIマウス脳における神経細胞でのFoxp2(R552H)の局在を調べたところ、正常マウスでFoxp2は核に存在し、変異マウスでは一部以外の細胞質にも存在した。Foxp2(R552H)KIマウスと正常マウス脳で発現する遺伝子の解析し、Foxp2が制御するUSV(言語)関連遺伝子候補を数個見出した。現在、これらの遺伝子について解析中である。また、小脳プルキンエ細胞に特異的なPcp/L7プロモーターを用いてC末端にMycTagをつけた正常Foxp2を発現させたマウスを作成した。このマウスについて解析中である。ヒト言語障害変異に対応する変異Foxp2(R552H)-ノックイン(KI)ホモマウスは小脳発達障害を示し、生後1週間以内は異常を示さないが、その後USV障害とプルキンエ細胞の発達異常とシナプス形成不全に関連する運動性障害をもつとともに、母親の育児放棄で授乳されない状態により、生後3-4週間で餓死する。仔マウスは超音波領域(Ultrasonic Vocalization;USV)で母親とコミュニケーションをとる。マウスFoxp2は、ヒトFoxp2との相違が少なく、ポリグルタミンのグルタミン残基が1つ少ない他、アミノ酸置換が2箇所存在する。本研究はFoxp2(R552H)-KIマウスの機能障害の解析を基盤として、USV(言語)能力獲得に必要な分子機構を明らかにすることを目的としている。これまでの解析を通して、Foxp2のフォークヘッド領域が持つ転写制御機構はヒト言語とマウスUSVに関与しており、マウスとヒト脳において共通の分子機構をもつことを見出してきた。本年度(平成22年度)は、Foxp2(R552H)-KIマウスおよび正常マウス脳で発現する遺伝子について解析し、Foxp2が制御するUSV(言語)

関連遺伝子の候補を5つ見出し、関連遺伝子の確認に免疫染色、プルダウン解析、免疫沈降などの生化学的、細胞分子生物学的手法を用いて行なった。さらに作製した正常Foxp2を小脳に発現させたFoxp2-トランスジェニックマウス(Tg)マウスを用い、小脳プルキンエ細胞でFoxp2により制御する遺伝子の解析を行ない、数種の候補遺伝子を得た。またFoxp2(R552H)-KIマウスのC57BL/6Jへのバッククロスを10世代まで行なった。次年度に、Foxp2-Tgマウスと交配させ、解析する予定である。Foxp2はFoxp family以外にも、CtBPなどのCo-repressorと複合体を形成している。平成23年度は、前年度Foxp2(R552H)-KIマウスおよび正常マウス脳で発現する遺伝子について解析し、Foxp2が制御するUSV(言語)関連遺伝子の候補の中の1つであるCNTNAP2のmRNAがFoxp2(R552H)-KIマウスで増加していることが明らかとなり、小脳プルキンエ細胞のCTBPに関与していることが示唆された。Foxp2-cerebellum-Tg(Mycタグ付加)マウス小脳でFoxp2と結合している内在性タンパクを固定化したmyc抗体のカラムを利用して分離した。現在N末端解析、TOFF-MS解析により小脳プルキンエ細胞内でFoxp2に結合しているタンパク質の同定を試みている。またC57BL/6Jへの10世代までバッククロスを行なったFoxp2(R552H)-KIマウスとFoxp2-Tgマウスと交配させたハイブリッドマウス、正常マウス、Foxp2(R552H)-KIマウスについてハイブリッドマウスのUSV、行動機能、致死の回避などを解析した。その結果、ホモ仔マウスは、親マウスから乳をもらえないことによる餓死を防ぐことはできなかったものの、USV障害についてはヘテロマウスおよびホモマウスでUSVの回復が認められた。さらに小脳プルキンエ細胞の発達とデンドライト形成について、カルビンジェン、シナプトフィシン、受容体の抗体を用いて、免疫染色解析を行ったところ、小脳発達不全についても回復傾向を示した。
植物ゲノム上のエピジェネティック状態の動きをハイスループットで検出する手法の開発

植物の核ゲノムでは、外来からのDNAの挿入などによって、新たな遺伝子や転写領域が生じる場合がある。本研究では、このメカニズムを解明する為、植物ゲノムに多数のレポーター遺伝子を導入し、それらのエピジェネティックな状態を大量に観測する新しい基盤技術の開発に取り組み、原型となる実験系を確立することができた。また、本研究の過程で、外来DNAの挿入に伴う転写領域の出現が、多くの場合、ゲノム中に内在するプロモーターによるものではなく、未知の転写活性化メカニズムによって引き起されていることが明らかになった。植物の核ゲノムでは、配列のシャッフリングや外来DNAの挿入によって、新たな転写領域が生じることがある。この現象には+1ヌクレオソームと呼ばれる特殊なクロマチンが関与すると考えられてきたが、その詳細なプロセスはよくわかっていない。本研究では、この問題を解明する為に、様々なモデル遺伝子を植物ゲノムにランダム挿入し、挿入箇所近傍のクロマチンを高速かつ大量に解析する実験系(ChIP-TRIP法)の開発を行っている。ChIP-TRIP法は、TRIP法と呼ばれる次世代シーケンサーを用いたレポーター遺伝子の網羅的発現解析法に基づいている。TRIP法は、動物培養細胞に対して用いられる方法であるため、植物でChIP-TRIP解析を行う為には、最初に、植物を対象としたTRIP実験系を確立する必要がある。初年度は、1) TRIP法をシロイヌナズナT87培養細胞の解析用に改変するとともに、2)レポーター遺伝子挿入領域のクロマチンDNAを精製する実験系の確立を行った。(1)では、T87培養細胞にプロモーター欠損型レポーターコンストラクトを形質転換し、約15,000系統の形質転換細胞を得ることに成功した。次に、次世代シーケンサーMiSeqを用いて、約4,000種のレポーター遺伝子の挿入位置と転写レベルを決定した。その結果、レポーター遺伝子の転写レベルは、挿入位置周辺に存在する遺伝子やプロモーター等の配列構造や、ヘテロクロマチン化の影響をほとんど受けず、いずれの領域でも、挿入されたレポーター遺伝子数の約3割が転写されることが明らかとなった。(2)では、認識配列の長い制限酵素と特殊なアダプターオリゴDNAを用いて、レポーター遺伝子周辺領域のクロマチンDNAを精製する実験系の確立を試みており、現在、精製条件の検討を進めている。植物の核ゲノムでは、外来DNAの挿入などによって新たな転写領域が出現することがある。この現象にはエピジェネティックな制御が関わっていると考えられてきたが、詳細なメカニズムは分かっていない。本研究では、バーコードと呼ばれる十塩基程度の配列を付加したプロモーター欠損型レポーター遺伝子を、植物ゲノム中の様々な領域に導入し、その周辺のクロマチン状態を次世代シーケンサーで並列的に解析する手法(ChIP-TRIP法)の開発を行った。初年度は、プロモーター欠損型レポーター遺伝子が導入された約16,000系統のシロイヌナズナT87培養細胞を作製し、そのうち4,504系統について、レポーター遺伝子の位置と転写レベルを決定した。また、これらレポーター遺伝子のクロマチン状態を解析する手法の検討を行った。その結果、意外なことに、導入されたレポーター遺伝子の約3割(1,355箇所)が転写能を獲得しており、その中には、プロモーターの無い領域や、ヘテロクロマチン領域に挿入されたものも多く含まれていた。最終年度は、レポーター遺伝子の転写活性化の要因を明らかにする為、野生型細胞のRNA-Seq実験によるレポーター遺伝子挿入箇所の挿入前転写状態の解析を行った。また、転写能を獲得したレポーター遺伝子の転写開始点の解析も行った。その結果、非転写領域内に挿入されたレポーター遺伝子も十分な頻度で転写能を獲得できることが明らかとなった。また、レポーター遺伝子の転写の開始位置(5'非翻訳領域の長さ)が、既存の遺伝子に比べて非常に多様であることが示唆された。一方、レポーター遺伝子のクロマチン状態の解析では、アダプターオリゴDNAを用いたクロマチン濃縮による方法に代えて、アンプリコンシーケンス法の検討を行った。その結果、レポーター遺伝子の5'末端領域におけるヒストンH2A.Zの局在レベルの解析が可能であることが示された。ChIP-TRIP法は4つのステップで構成されている。具体的には、1) TRIPレポーターコンストラクトを導入した多数の形質転換植物の作製、2)次世代シーケンサーを用いたレポーター遺伝子の挿入位置の決定と発現解析、3)レポーター遺伝子挿入領域のクロマチンの精製、4)精製クロマチンを用いたChIP-Seq解析である。この内(4)は、一般的なChIP-Seq法で行われる為、(1)から(3)までの実験法を確立することが非常に重要である。初年度は(1)と(2)について、実験系を確立することができた。特に、T87培養細胞を用いることで、約15,000系統という当初の想定以上の数の形質転換系統を作出し、そのうち約4,000系統の形質転換体についてレポーター遺伝子のマッピングと発現解析を行うことができた。

解析系統数については、今後も拡張を続ける予定である。また(3)については、特殊なアダプターオリゴDNAを用いて、レポーター遺伝子挿入領域のクロマチンDNAを精製・濃縮する方法を新たに開発中である。これまで、クロマチンが結合していない精製DNAを用いたモデル実験では精製が成功しており、レポーター遺伝子が挿入されていない領域に比べて最大25倍の濃縮率を実現している。現在はこの条件を基に、クロマチンDNAの精製条件の最適化を進めている。植物分子生物学初年度は、シロイヌナズナT87培養細胞を用いた植物版TRIP実験系の確立と、ChIP-TRIP解析へ向けたクロマチン精製法の検討を行った。その結果、多数の形質転換細胞の作製と、次世代シーケンサーを用いた形質転換細胞の発現解析を実現することが出来た。また、クロマチン精製法の検討については、精製方法の基本骨格が確立でき、細かな精製条件を検討する段階まで到達することが出来た。今後はこの精製方法を確立し、修飾ヒストンやヒストンバリアントについて、解析を行う。一方、レポーター遺伝子の発現解析から、植物核ゲノムにおける新規挿入配列の転写メカニズムについて、新しい知見が得られた。これまで、新規に挿入された外来配列が転写される為には、そのような配列が、既存のプロモーターの下流やユークロマチン領域のような転写領域に挿入される必要があると考えられてきたが、本研究の結果から、非転写領域に挿入された場合でも、同様の確率で転写されることが示唆された。今後は、より詳細かつ信頼性の高い解析を行う為に、リファレンスデータとなる野生型T87培養細胞のRNA-Seq、ChIP-Seqのデータを拡充する必要がある。そこで2015年度は、(1)レポーター遺伝子挿入領域のクロマチンDNA精製条件の最適化、(2) ChIP-TRIP解析によるレポーター遺伝子挿入領域のヒストンの解析、(3)レポーター遺伝子挿入領域の転写開始点マッピング、(4)野生型T87培養細胞のRNA-Seq、ChIP-Seq解析を行う。そして新規挿入配列の転写・クロマチン制御について、統合的な解析を行う。
サブスタンスP受容体を標的とした新規アルコール依存症治療薬の探索と脳機能画像評価

アルコール依存症はうつ病など他の精神障害との合併も多く、わが国のメンタルヘルスの最重要課題の一つである。しかしながら、その治療は心理社会的な治療が中心で、薬物療法としては嫌酒薬や対症的な抗不安薬の使用にとどまり無効な場合があり、新しい作用機序の薬物の導入を含む新たな治療法の開発が望まれていきた。サブスタンスP(SP)は、タキキニンと総称される神経ペプチドで神経伝達物質として機能する。SPとその受容体であるNK1受容体は、情動行動、ストレス反応の制御に関連し、うつ病、不安障害などの精神疾患の病態との関連が示唆されてきた。このSP-NK1受容体系がアルコールの過剰摂取に関与する脳内のストレス系、報酬系のプロセスを調節し、アルコール依存性の有用な治療標的となる可能性が示された。NK1受容体拮抗薬はアルコール依存性に関与する飲酒渇望(alcoholcraving)プロセスに特異拮抗作用を示す可能性がある。本研究では、報酬機能におけるSP-NK1受容体系の関与を明らかにする目的で、機能的核磁気共鳴画像(fMRI)検査を用いてNK1受容体拮抗薬の報酬機能に対する効果を調べた。すなわち、健康被験者を対象に、刺激呈示によって報酬予測を誘発するための脳賦活をfMRI検査を用いて客観的に評価する方法の標準化を行った。その上で、健康被験者を対象に、NK1拮抗薬aprepitantの報酬機能への作用を調べた。その結果、健康被験者において、報酬予測に伴う脳賦活に対してaprepitantが抑制効果を持つことが明らかになった。この結果から、NK1受容体拮薬は飲酒渇望が抑制しアルコール依存症の治療薬となる可能性が示唆された。最近、このSP-NK1受容体系がアルコールの過剰摂取に関与する脳内のストレス系、報酬系のプロセスを調節し、アルコール依存性の有用な治療標的となる可能性が示された。同報告によると、NK1受容体拮抗薬はアルコール依存性に関与する飲酒渇望(alcohol craving)プロセスに特異拮抗作用を示すことから、アルコール依存症の新しい治療薬になる可能性があるという。われわれはこれまで、陽電子断層撮像(PET)用NK1受容体用リガンド[18F]FE-SPA-RQを開発し、サルおよびヒトでNK1受容体の画像化に成功した。そこで、PET検査と機能的核磁気共鳴画像(fMRI)検査によって、アルコール依存症患者のNK1受容体機能変化とNK1受容体拮抗薬の飲酒渇望に対する効果を調べ、アルコール依存症の飲酒渇望症状におけるSP-NK1受容体系の関与を明らかにする研究を計画した。今年度は、健康被験者を対象に、刺激呈示によって飲酒渇望を誘発するための脳賦活試験の標準化を行った。その上で、NK1拮抗薬aprepitant飲酒渇望に伴う脳賦活への作用を調べる予備試験を実施した。SPとその受容体であるMK1受容体は、情動行動、ストレス反応の制御に関連し、うつ病、不安障害などの精神疾患の病態との関連が示唆されてきた。

われわれはこれまで、陽電子断層撮像(PET)用NK1受容体用リガンド[18F]FE-SPA-RQを開発し、サルおよびヒトでNK1受容体の画像化に成功した。そこで、PET検査と機能的核磁気共鳴画像(fMRI)検査によって、アルコール依存症患者のNK1受容体機能変化とNK1受容体拮抗薬の飲酒渇望に対する効果を調べ、アルコール依存症の飲酒渇望症状におけるSP-NK1受容体系の関与を明らかにする目的で、健康被験者を対象に、刺激呈示によって飲酒渇望を誘発するための脳賦活試験の標準化を行った。その上で、NK1拮抗薬aprepitantの飲酒渇望に伴う脳賦活への作用を調べた。その結果、健康被験者においても飲水渇望に伴う脳賦活に対してaprepitantが抑制効果を持つことを確認した。サブスタンスP(SP)は、タキキニンと総称される神経ペプチドで神経伝達物質として機能する。SPとその受容体であるNK1受容体は、情動行動、ストレス反応の制御に関連し、うつ病、不安障害などの精神疾患の病態との関連が示唆されてきた。このSP-NK1受容体系がアルコールの過剰摂取に関与する脳内のストレス系、報酬系のプロセスを調節し、アルコール依存性の有用な治療標的となる可能性が示された。同報告によると、NK1受容体拮抗薬はアルコール依存性に関与する飲酒渇望(alcohol craving)プロセスに特異拮抗作用を示すことから、アルコール依存症の新しい治療薬になる可能性があるという。昨年度に引き続き今年度は、飲酒渇望症状におけるSP-NK1受容体系の関与を明らかにする目的で、機能的核磁気共鳴画像(fMRI)検査を用いてNK1受容体拮抗薬の飲酒渇望に対する効果を調べた。すなわち、健康被験者を対象に、刺激呈示によって飲酒渇望を誘発するための脳賦活試験の標準化を行った上で、NK1拮抗薬aprepitantの飲酒渇望に伴う脳賦活への作用を調べた。この結果から、NK1受容体拮薬によって飲酒渇望が抑制されることが明かになった。飲水渇望に伴う脳賦活に対してNK1拮抗薬が抑制効果を持つことを確認できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。アルコール依存症患者を対象とした研究を予定している。
光電子・逆光電子分光によるチタン酸化物単結晶のフィリング型金属絶縁体転移の研究

ペロブスカイト型構造をもつY_<1-x>Ca_xTiO_3は、xの値により、Ti 3dバンドのフィリングを制御することができ、モット絶縁体YTiO_3(x=0)から金属相を経てバンド絶縁体CaTiO_3(x=1)に移行する。特にx=0.39では、約150Kで急峻な金属-絶縁体転移を起こす(高温側:絶縁体、低温側:金属)。Y_<1-x>Ca_xTiO_3単結晶(x=0.39)について、Ti 3p-3d共鳴光電子・逆光電子分光を行い、価電子帯および伝導帯におけるTi 3d部分状態密度、すなわち、電子相関で分裂した下部・上部ハバードバンドの名残りを観測した。両者の差U_<eff>の値は、低温になるにしたがい増加することが分かった。Ti 3d電子間の相互作用Uがほとんど原子内で決まっていることを考えると、このことは、低温でTi 3dのバンド幅が広くなることを示している。逆光電子スペクトルの帰属をすすめるために、O 1s軟x線吸収分光実験を行い、両者を比較した。その結果、逆光電子スペクトルで観測された上部ハバードバンドの低エネルギー側に、光電子スペクトルのコヒーレント部分に対応する成分が存在することが示唆された。この成分は、金属-絶縁体転移に密接に関与していると推察されるが、その確認は今後の逆光電子分光装置の高分解能化をまたねばならない。価電子帯については数千eVの励起光を用いた光電子分光実験を行った。数十eVの励起光で測定したスペクトルに比べ、下部ハバードバンドが0.3eV程度浅い方向にシフトする。このことは、結晶内部では、表面に比べて、電子相関の効果が若干少ないことを示す。また、Ti 2p内殻スペクトルには、金属化に伴い、新たな構造が出現した。この構造は、最近La_<1-x>Sr_xMnO_3の金属相におけるMn 2p内殻スペクトルで観測されたwell screened stateに対応していると考えられる[1]。ペロブスカイト型構造をもつY_<1-X>Ca_xTiO_3は、xの値を変えることによって、Ti 3dバンドのフィリングを制御することができ、モット絶縁体YTiO_3(X=0)から金属相を経てバンド絶縁体CaTiO_3(x=1)に移行する。x=0.37は絶縁体、x=0.41は金属で、x=0.39では、約150Kで急峻な金属-絶縁体転移を起こす(高温側:絶縁体、低温側:金属)。本研究では、Y_<1-X>Ca_xTiO_3単結晶(x=0.39)を育成し、Ti 3p-3d共鳴逆光電子分光により、伝導帯におけるTi 3d部分状態密度、すなわち、電子相関で分裂した上部ハバードバンド(の名残り)を観測した。測定に際し、清浄試料表面はダイヤモンド・ファイルを用いたやすりがけにより得た。共鳴スペクトルから非共鳴スペクトルを引くことにより、非占有Ti 3d部分状態密度を得ることに成功した。

降温にしたがい、Ti 3dピークの強度が減少し、高エネルギー側にシフトする。同様に測定した光電子スペクトルには下部ハバードバンド(の名残り)が観測されるが、両者の差U_<eff>の値は、低温になるにしたがい、増加することが分かった。Ti 3d電子間の相互作用Uがほとんど原子内で決まっていることを考えると、このことは、低温でTi 3dのバンド幅が広くなったことを示している。現在劈開装置の整備をすすめており、今後劈開表面に対して逆光電子スペクトルを測定する予定である。また、x=0.39をはさんで両側のx=0.37、x=0.41についても、光電子スペクトルも含めて、同様な測定を行う。ペロブスカイト型構造をもつY_<1-x>Ca_xTiO_3は、xの値により、Ti 3dバンドのフィリングを制御することができ、モット絶縁体YTiO_3(x=0)から金属相を経てバンド絶縁体CaTiO_3(X=1)に移行する。特にX=0.39では、約150Kで急峻な金属-絶縁体転移を起こす(高温側:絶縁体、低温側:金属)。Y_<1-x>Ca_xTiO_3単結晶(x=0.39)について、Ti 3p-3d共鳴光電子・逆光電子分光を行い、価電子帯および伝導帯におけるTi 3d部分状態密度、すなわち、電子相関で分裂した下部・上部ハバードバンド(の名残り)を観測した。両者の差U_<eff>の値は、低温になるにしたがい増加することが分かった。Ti 3d電子間の相互作用Uがほとんど原子内で決まっていることを考えると、このことは、低温でTi 3dのバンド幅が広くなることを示している。逆光電子スペクトルの帰属をすすめるために、O 1s軟x線吸収分光実験を行い、両者を比較した。その結果、逆光電子スペクトルで観測された上部ハバードバンドの低エネルギー側に、光電子スペクトルのコヒーレント部分に対応する成分が存在することが示唆された。この成分は、金属-絶縁体転移に密接に関与していると推察されるが、その確認は今後の逆光電子分光装置の高分解能化をまたねばならない。価電子帯については数千eVの励起光を用いた光電子分光実験を行った。数十eVの励起光で測定したスペクトルに比べ、下部ハバードバンドが0.3eV程度浅い方向にシフトする。このことは、結晶内部では、表面に比べて、電子相関の効果が若干少ないことを示す。また、Ti 2p内殻スペクトルには、金属化に伴い、新たな構造が出現した。この構造は、最近La_<1-x>Sr_xMnO_3のMn 2p内殻スペクトルで観測されたwell screened stateに対応していると考えられる[1]。
ペクチン分解酵素群を利用した食品加工副産物からの有用オリゴ糖生産法の開発

植物を原料とした食品製造後には加工副産物が大量に発生するが、その有効利用は十分ではなく、高付加価値化技術の開発が求められている。本研究では副産物中の主成分であるペクチンおよびヘミセルロースを、酵素分解することで、23種のオリゴ糖(OL)を調製し、それらの生理機能を評価した。腸内環境の改善が期待できるプレバイオティクス作用についてはアラビノキシロ-OL、アラビノ-OL、キシロ-OLで良好な結果が認められた。マクロファージ様細胞を用いて、免疫賦活作用および抗炎症作用を検討した結果、前者はメトキシ化不飽和ガラクチュロン酸(ΔGalA)-OLで、後者はフリーなΔGalA-OLで高活性が認められた。食品加工産業から発生する非可食部分はペクチンやヘミセルロースなどの非セルロース系糖質を豊富に含んでいる。これらは複雑な構造を有するヘテロ分岐多糖であることが多く、また植物種により構造が異なることから、様々な用途の新規機能性物質素材に変換できる可能性を秘めている。本研究では食品廃棄系バイオマスを原料として、酵素法により様々なオリゴ糖を調製し、それらの機能性評価を行うことで、バイオマス高度利用化の可能性を模索する。本研究の最終目標は廃棄系バイオマスからの有用オリゴ糖生産であるが、平成25年度においては、化学構造が均一なオリゴ糖を獲得するために、構造が既知な市販細胞壁多糖を基質として用いて、本研究室保有の各種糖質分解酵素で処理し、限外濾過や活性炭カラムなどにより一連のオリゴ糖を精製した。ペクチンは糖鎖構造の異なる7領域から構成されているが、本研究では5領域に焦点を絞り、オリゴ糖の調製を行った。ホモガラクチュロナン領域から2種、ラムノガラクチュロナン領域から3種、I型アラビノガラクタン領域、II型アラビノガラクタン領域、分岐アラビナン領域からそれぞれ1種のオリゴ糖を獲得した。また、ヘミセルロースからはキシロオリゴ糖、グルクロノキシロオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖の3種を、さらに、3種のフェルロイルオリゴ糖も調製し、計14種のオリゴ糖を獲得した。得られたオリゴ糖のプレバイオティクスとしての利用可能性を探るために腸内細菌による資化性を評価した。その結果、アラビナン系、キシラン系、およびII型アラビノガラクタン系オリゴ糖において優れた有用菌選択増殖活性が認められた。食品加工副産物中に多量に含まれるペクチンおよびヘミセルロースは多様な糖鎖構造を持つことから、構成糖や結合様式の異なる様々なオリゴ糖の生産原料となり得る。これまでに植物由来オリゴ糖の機能性については数多くの報告例があるが、ほとんどの研究は様々なオリゴ糖の混合物で評価されており、構造を特定した純粋なオリゴ糖での研究例は少ない。本研究では構造既知のオリゴ糖を調製し、それらが有する機能性を網羅的に評価することで、食品バイオマスの高度利用化の可能性を検討することを目的としている。本研究グループ所有の種々の糖質分解酵素を用いてペクチンおよびヘミセルロースを分解し、19種のオリゴ糖を調製した。各オリゴ糖についてヒト腸内細菌を用いた資化性試験を行ったところ、ガラクトオリゴ糖やアラビノオリゴ糖、キシロオリゴ糖に善玉菌選択増殖活性が認められた。次にこれらのオリゴ糖に焦点を絞り、成人の便を用いた混合培養系でのオリゴ糖添加による優占菌種変化をリアルタイム-PCRにより分析した。その結果、アラビノオリゴ糖とキシロオリゴ糖に良好なプレバイオティクス作用が認められた。次にマウスマクロファージ様細胞を用いて免疫賦活作用および抗炎症作用を検討した。各種オリゴ糖で細胞を処理した場合に産生されるNO量を指標に評価したところ、メチルエステル化された不飽和ガラクチュロン酸(ΔGalA)オリゴ糖に免疫賦活活性が認められた。一方、抗炎症作用についてはフリーなΔGalAオリゴ糖に最も強いNO産生抑制効果が確認された。さらに、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を評価したところ、フリーなGalAオリゴ糖に本活性が認められた。食品廃棄系バイオマスは木質系バイオマスと比べ、ヘミセルロースおよびペクチン含量が高い特徴を持つ。これらの糖質は多様な構造を有するヘテロ多糖であることから、酵素による選択的な分解ができれば、構成糖や結合様式の異なる様々なオリゴ糖の生産原料となり得る。ヘミセルロースやペクチン由来オリゴ糖の機能性に関する報告例は数多くあるが、それらの殆どは様々なオリゴ糖の混合物で評価されており、構造を特定した純粋なオリゴ糖での研究例は少ない。本研究では構造既知のオリゴ糖を調製し、それらが有する機能性を評価することで、バイオマスの高度利用化の可能性を検討することを目的としている。これまでに本研究グループでは反応特性の異なる数多くのヘミセルロースおよびペクチン分解酵素の獲得に成功しており、これらを用いて種々の植物由来多糖を分解することで、23種のオリゴ糖を調製した。各種オリゴ糖について、ヒト腸内細菌を用いた資化性試験および成人便を用いた混合培養系での優占菌種変化を検討した結果、プレバイオティクス作用はアラビノキシロオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、キシロオリゴ糖などの中性糖で良好な結果が得られた。次にマウスマクロファージ様細胞を用いて、NO産生量を指標に免疫賦活作用および抗炎症作用を検討した。

その結果、免疫賦活活性はメトキシ化不飽和ガラクチュロン酸(ΔGalA)オリゴ糖において、抗炎症作用はフリーなΔGalAオリゴ糖において最も高い活性が認められた。その他の機能性評価としてアンジオテンシン変換酵素阻害活性、ガン細胞のアポトーシス誘導作用、肥満細胞を用いたアレルギー抑制作用についても検討したが、強力な活性を示すオリゴ糖は認められなかった。植物を原料とした食品製造後には加工副産物が大量に発生するが、その有効利用は十分ではなく、高付加価値化技術の開発が求められている。本研究では副産物中の主成分であるペクチンおよびヘミセルロースを、酵素分解することで、23種のオリゴ糖(OL)を調製し、それらの生理機能を評価した。腸内環境の改善が期待できるプレバイオティクス作用についてはアラビノキシロ-OL、アラビノ-OL、キシロ-OLで良好な結果が認められた。マクロファージ様細胞を用いて、免疫賦活作用および抗炎症作用を検討した結果、前者はメトキシ化不飽和ガラクチュロン酸(ΔGalA)-OLで、後者はフリーなΔGalA-OLで高活性が認められた。最終年度までに予定していた機能性評価項目については概ね終了したので、来年度はさらに評価項目を広げる。当初の研究計画においては、初年度に食品加工副産物を原料として、様々なタイプのオリゴ糖を獲得する予定であったが、化学構造が均一なオリゴ糖を大量に獲得することが困難であり、現在は市販細胞壁多糖を基質として用いている。最終年度となる平成27年度では、これまでの研究結果より有用性の認められたオリゴ糖に焦点を絞り、それらの効率的な生産法の開発を目指す。酵素利用学これまでに得られたオリゴ糖の機能性評価を引き続き行う。次年度の評価項目としてはガン細胞のアポトーシス誘導作用と肥満細胞を用いたアレルギー抑制作用を新たに行う予定である。また、本年度の研究において機能性が認められた免疫賦活活性や抗炎症活性については、それらの作用メカニズムを分子レベルで解析するとともに、より強力な活性を有する関連オリゴ糖を調製したいと考えている。さらには有用性が認められたオリゴ糖に関しては、バイオマスからの効率的な回収方法を検討する予定である。当初計画では食品加工副産物から化学的処理により抽出した多糖に対して、酵素分解を行うことによりオリゴ糖を獲得する予定であった。しかしながら、最終目標であるオリゴ糖の構造に基づいた機能性評価を行うには、化学構造が均一なオリゴ糖を大量に獲得する必要があるため、予定を変更して構造が既知な市販細胞壁多糖を基質として用いた。その結果、オリゴ糖の獲得および腸内細菌資化性試験など平成26年度に予定していた実験を前倒しで遂行することができた。当初の計画において、本年度に恒温振盪機の購入を予定していたが、学内共通機器を使用することで対応できたため、次年度使用額が発生した。これまでに得られたオリゴ糖の機能性評価を引き続き行う。本年度のプレバイオティクス試験において優れた有用菌選択増殖活性が認められたオリゴ糖については動物実験によりその有用性を検証する予定である。また、免疫賦活活性やアンジオテンシン変換酵素阻害活性など、他の機能性評価も行う予定である。さらに、有用性が認められたオリゴ糖に関しては、バイオマスからの効率的な回収方法を検討する予定である。次年度使用額については、老朽化の進んでいる備品購入に充てる予定である。
アルツハイマー病危険因子アポEアイソフォームの高次構造異常と機能異常

アポEは、神経細胞でのコレステロール代謝恒常性維持に中心的役割を果たしているタンパク質である。本研究では、アポEの遺伝子多型(アイソフォーム)の一つであるアポE4がアルツハイマー病発症を引き起こす分子機構の解明を目的として、アポEアイソフォームによる脳内コレステロール代謝調節機能の異常を、アイソフォーム間での高次構造変化とそれによる細胞膜脂質や細胞表面糖鎖との相互作用変化などの機能異常に基づいて解析を行った。本研究では、アポEアイソフォームの一つであるアポE4がアルツハイマー病発症を引き起こす分子機構の解明を目的として、アポEアイソフォームによる脳内コレステロール代謝調節異常を、アイソフォーム間でのコンフォメーション変化(構造異常)とそれによる機能異常(細胞膜脂質や細胞表面グリコサミノグリカンとの相互作用変化)に基づいて解析する。本年度はまず、神経細胞毒性を示すことが報告されているC末端欠損アポE4変異体を作製し、それらの立体構造や水溶液中での会合構造、人工細胞膜に対する結合親和性等を野生型であるアポE3と比較評価した。その結果、C末端ヘリックス部位を段階的に欠損することで、水溶液中でのアポE分子の会合構造が破壊され、脂質膜結合が促進されることが明らかとなった。特にアポE4では、C末端アミノ酸273-299残基を削除することで完全に単量体化し、疎水性ヘリックス部位(アミノ酸261-272残基)の露出に伴って非常に強い脂質結合性を示した。さらに、アポE4に特異的なN末-C末ドメイン間の塩橋形成による相互作用(ドメイン間相互作用)がC末ドメイン構造に与える影響を調査するため、C末ドメインのみにトリプトファンを有する単一トリプトファン変異体W@264を作製し、トリプトファン蛍光の環境依存性やダイナミクスを詳細に解析した。その結果、アポE4のC末ドメインは、アポE3、に比べてより水相に露出した環境にあることが明らかとなり、その会合構造との関連が示唆された。本研究では、アポEアイソフォームの一つであるアポE4がアルツハイマー病発症を引き起こす分子機構の解明を目的として、アポEアイソフォームによる脳内コレステロール代謝調節異常を、アイソフォーム間での構造変化とそれによる細胞膜脂質や細胞表面グリコサミノグリカン(GAG)との相互作用変化に基づいて解析する。平成20年度は、前年までに設計・作製したアポEアイソフォーム変異体の機能評価を中心に研究を展開した。C末端部位を段階的に欠損したアポE3及びE4変異体apoEΔ273-299、Δ261-299、Δ251-299などの細胞膜脂質粒子やヘパラン硫酸・コンドロイチン硫酸などへの結合過程の速度論的ならびに熱力学的解析を行ったところ、アミノ酸273-299残基部位はタンパク質高次会合状態を調節することで、また260-272残基部位は強い疎水性相互作用を介して、それぞれアポEのGAG結合能並びに脂質膜可溶化能にとって重要な部位であることが明らかとなった。また、マウス神経培養細胞からの脂質搬出能をアポEアイソフォーム及びそのC末欠損変異体間で比較評価したところ、中枢神経系でのアポEの脂質輸送機能にとってN末ドメイン間のジスルフィド結合を介した多量体化が重要であり、この際、多量体化によってN末ドメインを介したGAG結合性が著しく増強されることを見出した。以上の結果から、アポE4アイソフォームによる脳内脂質輸送機能の異常は、N末ドメイン多量体化能の欠損並びにC末ドメイン会合性の低下による細胞表面GAGとの相互作用異常などが原因であることが示唆された。
マイクロバンチング不安定性の起源を探る電子ビームの縦方向位相空間の直接観測

チェレンコフ光の放出角度の電子速度依存性を利用し、独自に考案したTurtle-Back Mirrorとよぶ非線形ミラーによって線状焦点に分光収束させ、低エネルギー電子の縦方向位相空間を精密測定手法の確立することを目指した。研究では、測定システム全体に渡って光学追跡計算を行ない、運動量2.4MeV/cの電子ビームに対して1.15keV/cの運動量分解能、0.74psの時間分解能で縦方向位相空間を観測できることが分かった。一方、試作したTurtle-Back Mirrorの全体的な鏡面形状は満足されたが、大きい表面荒さが分解能を相当に損なうことから、大幅な改良が必要なことが分かった。本研究は、電子バンチ内の電子分布の揺らぎが自らのコヒーレント放射によって増幅されるとされている、マイクロバンチング不安定性の起源を実験的に明らかにすることを目的として、入射器ビームの縦方向位相空間の電子分布の直接観測手法を確立することを目的としている。一般に電子銃から引き出される電子ビームのエネルギーは、直流型熱陰極電子銃では500keV以下、熱陰極高周波電子銃では23MeVである。光陰極を用いる高周波電子銃では5MeV程度の高エネルギーであるが、3MeV以下程度のエネルギーの場合、電子の速度は光速に比べて有為に遅い。この特性を活かした縦方向電子位相君間分布を直接観測するシステムが、本研究における開発目標であるこのシステムは真空中に置かれた屈折率の小さいエアロジェルフィルムを電子ビームが通過する際放出するチェレンコフ光を測定する。電子の速度が光速に達していない場合、チェレンコフ光の放出角は速度に強く依存するため、光の放出角度と観測時間を同時計測することによって、電子ビームの縦方向位相空間を知る事ができる。本研究ではリアルタイム的に観測が可能であるように、連続的な放出角で放たれるチェレンコフ光を直線上に収束して、放出角度を位置情報に転換し、この直線収束像をストリークカメラで観測するものである。チェレンコフ角度を直線化するために、独自に考案したTurtle-Backミラー(亀甲羅鏡)と命名した非線形反射鏡を用いるが、この鏡面設計および光輸送方式を綿密に行なった。亀甲羅鏡は大ざっぱな研磨が可能であることは工学メーカーとの議論で分かったが、その面精度およびラフネスについては本年度においては確認することが出来なかったが、4f収束システムを採用したストリークカメラまでの改良後の輸送系はビームトレース計算の結果非常に良い分解能を持ちうる事が分かった。本研究では、電子バンチ内の電子分布の揺らぎが自らのコヒーレント放射によって増幅されるとされている、マイクロバンチング不安定性の起源を実験的に明らかにすることを目的として、入射器ビームの縦方向位相空間の電子分布の直接観測手法を確立することが当初目標であった。通常行なわれるような放射光あるいは遷移放射の観測で電子ビームの特性を測定する方法では、2MeV程度あるいはそれ以下の入射器ビームでは可視域近くの光が放出されないために非常に測定が困難である。一方、エアロジェルなどの屈折率が小さい薄膜からのチェレンコフ光は可視域波長も多く放出され、またその放出角度と荷電粒子の速度に強い相関があるため、放出角度を放出時間を同時に測定すれば縦方向位相空間を直接観測することになる。研究では独自に設計した非線形反射鏡を製作して、放出角度の情報を位置情報に変換する光学系を開発している。この非線形反射鏡の形状が球面と放物面を組み合わせたものであるが、この鏡面の製作が著しく難しいことが分かった。技術的に大きな問題はないが、研究で要求する鏡面サイズと精度を得るには特殊な研磨装置から開発しなくてはならないことが、専門メーカーとの議論で判明した。通常の製造法では精度が悪く、必要とする角度ー位置分解能が得られない。従って、より簡便に製造できる大きさの鏡面形状を計算し直す作業を行なった。この光学系は真空の外に置く仕様にしたが、これによって高時間分解能のストリークカメラとの組み合わせで電子銃で制せされたビームの縦方向位相空間の直接観測を、より効率的に行なえると考えている。本研究は、電子バンチ内の電子分布の揺らぎが自らのコヒーレント放射によって増幅されるとされている、マイクロバンチング不安定性の機嫌を探ることを目的として、電子銃からの電子ビームの縦方向位相空間を直接測定する特殊なビーム診断システムを確立する開発研究である。電子銃からの電子ビームのエネルギーは一般に直流型では数100keV、高周波電子銃でも2、3MeVであり、電子の速度は光速に比べて僅かに遅い。チェレンコフ放射の放出角度が荷電粒子の速度(運動量)に依存するので、光の放出角度と放出時間を精度良く測定することができれば縦方向位相空間を知ることができる。

本研究では、チェレンコフ光を一点に集光する特殊な非線形光学ミラー(亀甲羅鏡)を考案した。電子ビームはエネルギー広がり(速度広がり)を持っているため、集光されたチェレンコフ光は線状に収束される。従って運動量情報は位置情報に置き換わるので、この線状像をストリークカメラで測定すれば、一つの電子バンチの縦方向位相空間分布が直接的に測定できる。前年度までに設計した4fイメージングシステムを用いた光輸送路について、レイトレースによる精密なシミュレーションによって分解能を評価した結果、中心運動量が2.4MeV/cの電子バンチについて、運動量分解能1.15keV/cおよび時間分解能0.74psが達成できることを明らかにした。この分解能は電子銃からの電子ビームの診断で十分満足できる値である。亀甲羅鏡はアルミ削りだしで試作することができた。表面の非線形形状(横方向に球面、縦方向に放物面)は概ね設計値を満足したが表面の荒さ(ラフネス)は必要とする精度の約10倍あり、期待する分解能が実現できないことが分かった。亀甲羅鏡のラフネスの改善という課題が残ったが、本研究のビーム診断コンセプトに誤りはないと結論できた。研究グループのサーバートラブルでwebページが壊れ、現在復旧中。以下のアドレスで公開予定。ビーム物理学前年度に、チェレンコフ光観測システムの分解能劣化について大きな問題を発見し、そのため計画進行が遅れた。しかしながら、新たな発想でデザインした4f光輸送システムが非常に良い分解能(運動量分解能1.2keV/c、時間分解能0.74ps)を持ちうる事を見いだし、高い性能を期待できる事が分かった。亀甲羅鏡の形状設計を終えて試作品を製造できたことから、観測システムのオフラインではあるが、性能確認テストを近々実施できる事となった。特殊な非線形鏡面を持つ反射鏡の製造が極めて困難であることが判明したため、鏡面設計を再度行なう必要がある。チェレンコフ光の放出角度に依存した直線に焦点を結ぶ反射光学系設計には、複雑なレートレース計算が必要であり、今後これに2、3ヶ月の時間を要するため、研究遂行にやや遅れが生じている。亀甲羅鏡の試作品はすでに購入しており、現在卓上での4f収束システムを構築中である。亀甲羅鏡の表面研磨状態によるラフネスが分解能に与える影響は大きいと考えられているので、表面状態の測定と実際の空間分機能の間の相関が計算どおりであるかを検証するための実験を行なう。光源は簡便なHe-Neレーザーを用い、円上のスリットによってチェレンコフ光を模造する。この性能調査実験をできるだけ早く終え、亀甲羅鏡のラフネスの上限値を明確にして、実機を製作する。また真空チャンバーおよびエアロジェルホルダー等を製作し、年度内に実際の電子銃からの電子ビーム測定試験実験を遂行する。非線形反射鏡の鏡面設計の目処は発って来ているので、早急にこれを終了し実機の製作を始める。又、当初チェレンコフ放射体であるエアロジェルを真空容器中に入れる予定だったが、破損などが起きた場合電子銃の高周波空洞を汚してしまう可能性が高い事から、これを真空容器の外に置くことにした。真空と大気の遮断は薄いベリリウム窓を用いることとした。ベリリウム窓を通過の際に電子が散乱を受けるので、これを最小限にとどめかつ真空保持が可能な厚さの評価をおこなっている。
牧畜民の空間認識と禁忌―ナミビアのヒンバ及びヘレロの土地所有問題との関連から

本研究の目的は、アフリカ南西部のナミビアに暮らす牧畜民ヒンバとヘレロの日常生活における行為と土地への表象過程を、禁忌に着目して検証することを通して、現地の論理に基づく土地の分類の仕方を解明することである。人々の生活空間の中には禁忌が存在する聖なる場所があり、近代的な法制度に基づく土地区分とズレが生じている。近年当該地域で高等裁判に発展した土地争いにおいて、法制度の整備と共に権限を与えられた伝統的権威が追い出しを正当化する現状を、内部の論理から再検討する。これらを通して、近代国家ナミビアが法制度の中で土地への帰属を通した先住権と、伝統的権威の慣習的土地権との折り合いを模索する現状を考察する。
微少流路系を用いた電気泳動と質量分析のインターフェイスによる高能率なタンパク質解析法に関する研究

電気泳動と質量分析のインターフェイスを考案するための基礎研究として、ヒト血漿タンパク質中の微量タンパク質を対象とし、現在広く用いられている電気泳動ゲルからのタンパク質/ペプチド抽出法と、引き続く質量分析法の最適化を行った。電気泳動法としては、研究代表者らが開発した非変性条件および変性条件のミクロ2次元ゲル電気泳動を用いた。その結果、現在の方法では、電気泳動終了後質量分析(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計MALDI-TOFMSによるペプチドマスフィンガープリント法およびエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析計(ESI-MS/MS)による部分アミノ酸配列決定法)を行うまでに多くの手操作のステップがあり、これらを自動化するには電気泳動の段階でできるだけゲルを使用しない方法の開発が必要と考えられる。血漿タンパク質を2次元ゲル電気泳動後質量分析によって解析するプロジェクトとしては、(1)2次元電気泳動条件の組み合わせによって検出されたヒト血漿微量タンパク質群の構造解析、(2)2次元電気泳動ゲル上のタンパク質のアルカリ溶液による直接抽出と質量測定、(3)2次元電気泳動ゲルからタンパク質をアルカリ抽出する際のペプチド結合切断部位の解明、に取り組んだ。また、(4)ヒト血漿を直接MALDI-TOFMSにかけるだけでも、いくつかの血漿タンパク質がイオン化され同定可能であることを見出した。これらの成果は、順次投稿準備中である。