hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
100万ニュートリノ反応検出によるチャーム粒子解析

CHORUS実験の標的原子核乾板に蓄積されている約100万ニュートリノ反応の反応点近傍、数ミリの範囲を位置の分解能サブミクロンで解析しチャーム粒子付事象、2万例を検出しその中にエキゾティックなチャーム粒子の探索・解析を目的とする。本研究では10cmx10cmの全スキャン範囲における本物飛跡の飛跡検出効率を維持しつつノイズ飛跡を拾わない開発・条件出しを行い反応点の選び出し方法の確立まで終了した。本研究課題で達成した大面積のスキャンによる飛跡選び出しによりCHORUS実験に蓄積された全ニュートリノ反応を検出・チャーム粒子付事象を解析する目処がついた。CHORUSの原子核乾板は面積72cm*36cm*厚み790ミクロンの物を36枚を積み重ねたモジュールを単位として、全体で32モジュール、1152枚の標的乾板である。その標的乾板の直下にファイバートテッカーと標的乾板の橋渡し役のインターフェイス乾板がある。本研究は解析反応数を上げるためにインターフェース乾板(32枚)の全面積を全角度でスキャンすることから始まる。19年度は、名古屋大学F研にてOPERA実験に向けて開発されてきた高速スキャンシステム(SUTS)で薄型フィルムをスキャンしてきた。そこで得られるトラックは位置情報、角度情報、飛跡の濃さの情報をもっている。得られる飛跡候補の中には本物の飛跡のみではなく単なるランダムノイズ的なフェィクトラックも存在する。主なノイズ源は乾板中に存在するランダムフォグ及び環境γ線及びβ線による低エネルギーの電子による飛跡である。スキャンする面積が今までのスキャン(1mm*1mm程度)と比べ物にならないほどの大きさ(10cm*10cmでテスト)になるために確実にノイズを落とす事が重要である。現在のスキャンは乳剤の上面と下面の両方をスキャンして1時闇に25cm2の速度である。そこから吐き出される大量のデータのシグナル/ノイズの分離の解析を行ってきた。その結果ノイズの分離はまだ改良の余地はあるがインターフェース乾板のスキャン/データストレージには充分であることを確認した。本年度、本格的にインターフェイス乾板をスキャンする予定である。過去の解析でニュートリノ反応点を原子核乾板中で検出した反応数は20万反応である。これは過去の解析ではファイバートラッカー(TT)で予想した場所の周辺(半径1ミリ)のみのスキャンしかできなかった等スキャンの能力に限界があった事による。その為、TTの予測精度が悪い反応であった場合、あるいは乾板の端2cm程度の領域はスキャンの効率が悪いという事で未検出のままである。実際CHORUSの原子核乾板標的には100万ニュートリノ反応が蓄積されている。これを解析しきる事が本研究の目的である。本研究では面積を10cm*10cm程度の面積のデータ取りを1単位として全角度、全面積の飛跡情報をコンピューターのディスク上に蓄積する。TTの予測に依らない飛跡検出、及び乾板の端ギリギリまで飛跡を見つけ出す事が肝心である。本年度はOPERAフィルムをシステマティックにスキャン・処理する事で2.大面積で得られる飛跡集団のアライメントソフトウエアーの整備。を系統的に行った。この結果、乾板の端の数mmのところまで乾板の中心部分と比べ飛跡の検出が遜色なく出来る事を示した。またCSで見つかった全飛跡情報をTTの情報中から検索してその飛跡がどのイベント由来の飛跡であるかの検索ルーチンを構築した。CHORUS実験の標的乾板中の飛跡は主にビームライン上流での他の実験によるμ粒子及び地上実験であるがための宇宙線の蓄積である。解析すべき肝心のニュートリノ反応からの2次粒子は蓄積された飛跡の0.1%でしかない。ニュートリノ反応からの飛跡は標的乾板モジュール中から発生して下流につき抜ける。一方上流からのビームμ、及び宇宙線は標的乾板モジュールの最上流から最下流までを完全に突き抜ける。この違いを利用してスキャンに掛かる労力を減らす。つまりモジュールの最上流と最下流の2枚のみを全面スキャンし、この2枚でつながる飛跡は解析対象外する。ここでの選別の良し悪しがその後のスキャンの負荷を左右する。そこで検出効率を可能な限りあげるR&Dを行った。また一般に検出効率を上げようとするとランダムに蓄積される自然放射能(ベータ線飛跡)、及びランダムなノイズによるフェイク飛跡を見つける割合が多くなる。見つかった飛跡の角度、場所及び飛跡の濃さを使い十分にバックグランドを落として高い検出効率(約98%)で検出できる条件を確立した。反応解析すべき飛跡の選び出しが出来た段階まで来たが反応点、崩壊点解析はやり残してしまい、当該年度で終了する事はできなかった。
難治性ニューロパチーの軸索‐髄鞘間相互作用からみた病態機序の解明

炎症性機転を主因とする脱髄性末梢神経疾患において、治療への抵抗性や難治化に軸索障害の合併が関与する可能性が指摘されている。本研究は軸索脆弱性をきたすメカニズムに軸索-髄鞘間相互作用の破綻の関与を推定のもと、代表的な構成要素であるTAG-1のノックアウトマウスに実験的自己免疫性神経炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)を誘導し、臨床・電気生理学的、免疫組織学的な解析を試みた。その結果、軸索-髄鞘間相互作用の異常が、炎症性脱髄に伴う軸索脆弱性に関連するとともに、臨床的にも重症化をもたらす可能性が明らかとなった。免疫介在性ニューロパチーにおける治療抵抗性や難治化には軸索障害の関与が指摘されている。本研究は難治性症例に対する治療標的の探索と軸索脆弱性メカニズムの解明を目指した。以上より軸索ー髄鞘間相互作用の破綻が脱髄に伴う軸索脆弱性に関与するとともに、免疫介在性ニューロパチーの難治化の主因かつ治療標的となり得る可能性が強く示唆された。1)脱髄性ニューロパチーにおけるaxon-glialinteraction関連分子群の軸索障害病変惹起への関与とその機序の解析脱髄性ニューロパチーとして慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーとパラプロテインを伴うニューロパチーの症例から採取した生検神経をときほぐし標本とし、形態学的・免疫組織学的解析を施行した。CIDPは多様な臨床像を示す症候群としての特徴から今のところ均質な結果は得ていないが、IgM gammopathy、とくに抗MAG抗体陽性のニューロパチーは発症年齢や性差はもとより遠位優位型・感覚優位型の臨床像など共通の病態が期待される。これまでの解析から抗IgM抗体と抗MAG抗体の共存と同部位におけるparanode-juxtaparanodeの構造的変化、電顕によるニューロフィラメント密度の変化から軸索障害の有無を評価した。現在はCIDPの臨床的多様性に対応した変化の有無を解析するため、typical CIDPにあたる症例の蓄積を試みている。2) TAG-1ノックアウトマウスへのexperimental autoimmuneneuritis(EAN)惹起による軸索障害機序の検討脱髄性ニューロパチーのモデとしてEAN惹起マウスを作成しつつある。C57BL/6マウスのTAG-1をノックアウトし、免疫組織学的・western blottingによりノックアウトを確認した。TAG-1は神経系への特異的な発現が指摘されているが、ノックアウトマウスでは出生時より顕著な体重減少を呈する。さらにP0蛋白を構成する抗原ペプチドを2種類作成し、アジュバントとともに免疫誘導を行っている。脱髄性ニューロパチーは脱髄に引き続き軸索ー髄鞘間の相互作用を通じ再髄鞘化機転に移行することから、末梢神経形成期に表現型に影響するTAG-1ノックアウトマウスは本研究に有用と考えられる。1)脱髄性ニューロパチーにおけるaxon-glialinteraction関連分子群の軸索障害病変惹起への関与とその機序の解析ヒトサンプルを用いた免疫組織学的解析として、Na channel、Kv channel、CNTN等の特異的分布が指摘される分子の検出が安定して可能となっている。抗MAG抗体陽性のパラプロテインを伴うニューロパチーは臨床像が比較的均質なこともあり、一定の予想に対応した結果が得られつつある。ただしCIDPは、typical CIDPとatypical CIDPの間では臨床像ならびに治療反応性も異なることが指摘されており、病態の異なる亜型が解析対象に紛れ込む危険が高いと考えられる。また施設の特性上神経生検を施行する症例にatypical CIDPが占める割合は高いと考えられ、typical CIDPのサンプルは不足している。当施設では多くのCIDP症例が来院・治療を受けていることから、この問題は一定の時間さえ確保できれば解決が可能と考えられる。またatypical CIDPは一部に難治化の傾向が予想されることから、atypical CIDPのなかでも共通の臨床像を有する症例の蓄積が果たされた場合には、難治性ニューロパチー自体の病態解明につながる可能性が期待できる。2) TAG-1ノックアウトマウスへのEAN惹起による軸索障害機序の検討すでにTAG-1ノックアウトマウスを確保した。これは出生直後より高度の体重減少をきたすなどの臨床表現型は研究の目的に合致している。その反面、繁殖効率の低さとEAN惹起効率の低さは問題である。今までの経験からTAG-1-/-同士の交配では妊娠・出産は確認できず、必要なTAG-1-/-個体の確保には+/-同士の交配からの選別が必要である。また出生後も体格面で正常マウスより不利であり、脱落するTAG-1-/-ホモ個体は多い。1)脱髄性ニューロパチーにおけるaxon-glialinteraction

関連分子群の軸索障害病変惹起への関与とその機序の解析抗MAG抗体陽性のパラプロテインを伴うニューロパチーについて、さらに症例を蓄積して結果の裏付けを行っていく。またCIDPに関してはtypical CIDPだけでなく、DADSやMADSAMニューロパチーなど、いわゆるatypical CIDPの臨床的特徴に対応させた解析を行っていく。さらに過去に我々が報告した、TAG-1 SNPと治療反応性の関連性の結果を確認するため、SNPハプロタイプと治療反応性、さらに生検神経の免疫組織学的解析を連結し、共通するaxon-glial interactionの変化の有無について確認する。2) TAG-1ノックアウトマウスへのEAN惹起による軸索障害機序の検討前述のように、TAG-1-/-の出生直後から持続する発育不良と、繁殖効率の低さ、さらにEAN惹起効率の低さを解決するためには、十分な数の実験動物を確保する必要がある。そこで、人工授精で得た受精卵をもとに必要個体の確保を試みる。これらに前述のP0ペプチドをアジュバントとともに免疫、賦活しEANが誘導されたTAG-1ノックアウトマウスを解析するのが本研究の目的であり、機能解析や形態学的・免疫組織学的解析に加え、電気生理学的特徴を解析する。仮に電気生理学的に脱髄を示唆する所見が得られたならば、sciatic nerveを採取し、axon-glialinteractionにかかわる分子群の発現変化を解析する。さらにEANによる脱髄誘導以外にも、より慢性進行性の特性を有するB7-2-/- NODマウスの入手を試み、成功した際にはTAG-1ノックアウトマウスと交配することで脱髄発現後の軸索障害への影響を解析する。1)脱髄性ニューロパチーにおけるaxon-glialinteraction関連分子群の軸索障害病変惹起への関与とその機序の解析ヒト生検神経を対象にした形態学的・免疫組織学的解析を症例を蓄積しながら継続するために、適宜必要な抗体の補充を行う。またSNPハプロタイプ解析については、過去の報告で用いた質量解析による候補SNPのジェノタイピング以外にも、次世代シークエンサーを用いたより詳細・効率の良いジェノタイピングにより新規SNPや変異の検出を試みる。次世代シークエンサーは当施設では共通実験機器として利用できるか検討しており、稼働に伴う試薬の負担のみが実際の必要経費であることから本研究費で賄うことが可能である。2) TAG-1ノックアウトマウスへのEAN惹起による軸索障害機序の検討用いる実験動物が繁殖効率・EAN惹起効率ともに低いことから、通常の繁殖方法では必要な数の実験動物の確保が困難である可能性がある。そこでTAG-1-/+同士、-/+とwild typeの組み合わせにより得た受精卵から人為的かつ同時期に出生させる。この手技により同じ週齢の実験動物の確保を目指す。当施設動物実験部門と学外受託先との共同で系統の維持と必要マウスの確保のために研究費を使用する。
光受容の分子機構

光生物学の目標は、光捕獲の量子過程から最終的な生物学的反応が現れるまでの長い反応鎖を一連の素過程に分けて解析し、生命現象に対する光の作用を統合的に理解することである。重点領域研究「光受容の分子機構」は、昭和62年度より三ケ年間光受容関連タンパク質、光受容膜、更には光受容細胞などの各階層的構造で起こる素過程について、分子生物学や細胞生物学で開発された新技術を導入して、光受容関連分子の構造のみならず、光受容膜の高次構造形成過程やその機能まで解析することを目的として、研究を推進した。第4年度の成果報告の取りまとめに当り、本研究代表者および分担者は、本重点領域研究の推展状況を正確に把握し、その成果を厳正且つ的確に理解し、計画研究および公募採択による研究成果を取りまとめる案について検討し、それを実施することを目的として活動した。本研究は、研究代表者および16名の研究分担者とから構成されている。全分担者が参加した班会議を平成2年7月と10月、および平成3年2月の三回開催し、第一回会議では本年度の事業計画を検討し各班員の役割分担を決定した。第二回会議では、成果刊行の実施方法として、本重点領域研究によって国際専門誌に出版された約150編の原著論文を複製し3分冊に製本して、国内・外の関係者に各500部を頒布する実施案を打ち合わせた。12月には東京・学士会館で日本光生物学協会と共催の公開シンポジウムを開催し、「光合成」、「光調節」、「光感覚および光傷害」の進展を著しい十数件の課題について班員が講演を行い、百余名が参加した。
ダイバータ板への高Z材料の応用

本研究の目的は、高融点金属であるタングステンやモリブデン(これらの金属は原子番号が大きいので高Z材と総称する)をITERをはじめとする実際の核融合炉のダイバータ部分で、プラズマ対向材として使う事が本当に可能かどうか、またどのように高Z材を発展あるいは展開させれば使用可能になるかを明らかにする事である。本年度得られた成果は以下の通りである。(1)米国サンディア研究所の直線型プラズマ装置で重水素放電中のターゲット近傍のバルマー系列の発光を測定し、ターゲット材料(チタン、ニッケル、銅、モリブデン、タンタル、タングステン)の質量数が増えるにその発光強度が増加することを見いだしたことをうけて、実際のトカマク装置に炭素とタングステンを一対にしたリミタを挿入し実際にプラズマがターゲットの影響を受けていること世界で初めて明瞭に示した。(2)リミッタ表面からの不純物の発生プロセスを計算機シミュミレーションした。実際に独国ユーリッヒにあるプラズマ実験装置TEXTORでの磁場、電場および幾何学的形状を考慮に入れてプラズマ対向壁で発生した不純物の挙動を追跡した。周辺プラズマでイオン化された後、磁場の存在により才差運動するため、特に原子番号が大きい不純粒子ほど発生した場所の近傍に再堆積するため、壁で発生した高Z不純物のほとんどが再堆積し、懸念されていた高Z不純物によるプラズマの汚染がほとんど起こらないことが理論的にも確認できた。(3)TEXTORに黒鉛にタングステン被覆したリミタを持ち込み、60%以上のプラズマ・壁相互作用がそこで起こる様な条件でプラズマ放電実験い、現在のプラズマ装置では高Z材料がプラズマ対向壁として使用可能であることを実証した。またWの形状としてはブロックを加工するのではなくCVDあるいはPVD被覆が適当であることを示した。(4)3年間の研究により、高Z材はダイバータに利用可能であることが示されたため、国際熱核融合炉ITERにおいてもとりいれられる事となった。(1)低エネルギー水素イオン源で発生させた水素イオンを高Z材料(タングステン、モリブデン)に照射し、水素の反射、ターゲットでの水素の蓄積、スパッタリングなどプラズマ材料相互作用に必要な基礎データを蓄積した。また粒子エネルギー分析装置を導入し、反射あるいはスパッタリング粒子のエネルギーまたは速度分布の測定が可能になるようにした。(2)実際に独国ユーリッヒにあるプラズマ実験装置TEXTORにタングステンおよびモリブデン製のリミッタを持ち込みプラズマ放電実験を行った。その結果高密度のオーム加熱プラズマではリミッタから放出されたタングステンやモリブデンが不純物としてプラズマ中心に集まり、プラズマを著しく不安定にさせる事を見いだした。しかしこの不安定性は、中性粒子加熱あるいはICRH加熱によりプラズマに鋸歯状振動が発生すると起こらなくなった。(3)リミッタ表面からの不純物の発生プロセスを計算機シミュミレーションした。磁場の存在により周辺プラズマでイオン化された不純物は才差運動するため、原子番号の大きい不純粒子は発生した場所の近傍に再堆積することを明らかにした。

本研究の目的は、高融点金属であるタングステンやモリブデン(これらの金属は原子番号が大きいので高Z材と総称する)をITERをはじめとする実際の核融合炉のダイバータ部分で、プラズマ対向材として使う事が本当に可能かどうか、またどのように高Z材を発展あるいは展開させれば使用可能になるかを明らかにする事である。本年度得られた成果は以下の通りである。(1)米国サンディア研究所の直線型プラズマ装置で重水素放電中のターゲット近傍のバルマー系列の発光を測定し、ターゲット材料(チタン、ニッケル、銅、モリブデン、タンタル、タングステン)の質量数が増えるにその発光強度が増加することを見いだした。これはプラズマがターゲットの影響を受けていること非常に明瞭に示した画期的な実験結果である。(2)独国ユーリッヒにあるプラズマ実験装置TEXTORタングステンおよびモリブデン製のリミッタを持ち込みプラズマ放電実験を継続した。実際のプラズマ装置でもプラズマ対向壁の質量により、プラズマからの水素粒子や不純物粒子の反射が大きく異なる事を示すのに成功した。(1)および(2)の結果は粒子およびエネルギーバランスの観点からみると、高Z材料は低Z材料よりもプラズマズマ閉じこめに有利である事を示唆している。(3)リミッタ表面からの不純物の発生プロセスを計算機シミュレーションした。プラズマ対向壁で発生した不純物が周辺プラズマでイオン化された後、磁場の存在により才差運動するため、特に原子番号が大きい不純粒子ほど発生した場所の近傍に再堆積することを明らかにした。また、実際のプラズマ装置でもシュミレーションによりそれが起こっていることを示した。(1)米国サンディア研究所の直線型プラズマ装置で重水素放電中のターゲット近傍のバルマー系列の発光を測定し、ターゲット材料(チタン、ニッケル、銅、モリブデン、タンタル、タングステン)の質量数が増えるにその発光強度が増加することを見いだしたことをうけて、実際のトカマク装置に炭素とタングステンを一対にしたリミタを挿入し実際にプラズマがターゲットの影響を受けていること世界で初めて明瞭に示した。(2)リミッタ表面からの不純物の発生プロセスを計算機シミュミレーションした。実際に独国ユーリッヒにあるプラズマ実験装置TEXTORでの磁場、電場および幾何学的形状を考慮に入れてプラズマ対向壁で発生した不純物の挙動を追跡した。周辺プラズマでイオン化された後、磁場の存在により才差運動するため、特に原子番号が大きい不純粒子ほど発生した場所の近傍に再堆積するため、壁で発生した高Z不純物のほとんどが再堆積し、懸念されていた高Z不純物によるプラズマの汚染がほとんど起こらないことが理論的にも確認できた。
蛋白質翻訳調節因子NAT1の機能解明

NAT1は翻訳開始因子の一つであるeIF4Gと相同性を有する蛋白質で、新しい癌抑制遺伝子の候補である。我々は以前、RNAエディティング酵素であるAPOBEC1をトランスジェニックマウスの肝臓で過剰発現させると肝細胞癌を誘導することを報告したが、その肝臓で異常にエディティングされているmRNAとしてNAT1(novel APOBEC1 target #1)を同定した。NAT1のmRNAのエディティングは複数の停止コドンを生み出し、結果としてNAT1蛋白質をほぼ完全に消失させた。eIF4Gは他の翻訳開始因子であるeIF4AやeIF4Eと結合し、それらの機能を統合しているが、NAT1はeIF4Aに結合するがeIF4Eには結合しないことがわかった。またNAT1を過剰発現させると蛋白質合成を抑制した。そこで、NAT1は、eIF4Aへの結合をeIF4Gと競合する結果、蛋白質合成をを抑制するというモデルを提唱した。今回、我々は遺伝子ノックアウトによりNAT1の生体内での機能を検討した。NAT1+/-マウスは外観や生殖能力は正常で、1年以上経過しても腫瘍の多発は認められなかった。一方、NAT1-/-マウス胚は原腸形成期に致死であった。NAT1-/-ES細胞は正常の形態を示し、予想に反して蛋白質合成や増殖速度も正常であった。一方、NAT1-/-ES細胞はフィーダー細胞除去やレチノイン酸刺激による分化が抑制されていた。さらに、NAT1-/-ES細胞ではレチノイン酸により変化する遺伝子発現の大部分が抑制されていた。またレチノイン酸応答配列からの転写も抑制されていた。これらの実験結は、NAT1は全般的な蛋白質合成の抑制因子ではなく、初期発生や細胞分化に関与する特定遺伝子の発現制御因子であることを示唆した。平成10年度までの研究でNAT1がマウス初期発生および胚性幹(ES)細胞の分化において必須の役割を果たしていることを明らかにした。平成11年度はその機序を遺伝子レベルで解析した。具体的にはレチノイン酸により誘導されるES細胞の分化においてNAT1がどのような役割を果たしているかを検討した。正常ES細胞をレチノイン酸で刺激すると形態的な分化とともに増殖速度の低下をきたした。一方、NAT1遺伝子破壊ES細胞においてはこの両者とも抑制されていた。次に、レチノイン酸刺激に伴う遺伝子発現の変化をノーザンブロットとDNAチップにより解析した。正常ES細胞においてはレチノイン酸により多くの遺伝子発現が誘導され、oct3など少数の遺伝子発現が低下した。NAT1遺伝子破壊細胞においてはレチノイン酸による遺伝子発現変化の大部分が抑制されていた。抑制の程度は遺伝子により異なり、完全に抑制されるものからほとんど影響をうけないものまであった。さらにこの遺伝子発現の抑制がどのレベルでおこっているかを検討するために、レチノイン酸応答配列を持ったルシフェラーゼレポーター遺伝子をES細胞に導入した。正常ES細胞においてはこのレポーター遺伝子発現はレチノイン酸により20倍以上増強されたが、NAT1遺伝子破壊細胞においては増強の程度が有意に小さかった。以上の実験結果より、NAT1は分化関連遺伝子群の発現を転写レベルで制御していることが明らかとなった。
中庭型空地の環境性能評価基準に関する研究

本研究は、建築物群に囲まれた空地(オープンスペース)における環境基準を検討するための基礎的研究として、空地内部の日照環境、採光環境及び開放性に関する調査を下記の通り行なった。環境評価指標として、天空率、天空比、日射量を用いた分析・調査を行ない、以下の成果を得ることができた。1.空地タイプごとの形態特性と環境との関係に関する分析東京都における総合設計制度等で計画された公開空地の実態調査を行ない、中庭型空地を含む複数の空地タイプごとに、周辺の建築物の形状、配置、方位と空地地面上の日射量分布との関係をシュミレーションにより検討した。結果として、空地モデルごとの容積率、空地率、街区の方位ごとの形態特性と直達日射量を考慮にいれた日照環境との関係を示す基礎データが得られた。住宅団地における空地の開放性環境に関する調査調査対象とした住宅団地において、公園、広場等の空地に対し、魚眼レンズを用いた現地天空率、天空比等の調査により、各空地の環境指標値を測定した。その後、各空地において被験者による感覚尺度をアンケート調査し、環境指標値と開放感等の感覚との相関を調べた。その結果、囲み型空地における閉鎖性や快適感は、天空写真より得られる天空率に空地を取り囲む建築壁面の幅等を考慮にいれた指標値と相関が高く、その指標値(ここでは視感天空率と呼ぶ)により、説明できることを示した。本研究は、空地の環境評価に関する一連の研究の内、日照、採光、開放性に限定した上記指標値をモデル的に求めるシュミレーション手法の作成、実測方法の構築、更に心理値との相関を調査した作業をもとに、調査結果を建築物に囲まれた空地の環境性能を評価する基礎資料としてまとめた。
腫瘍血管の動的透過性(Nano eruption)の解明とその制御

我々は高分子ナノミセルを用いたドラッグデリバリーシステム(DDS)について研究を行っておりその過程で腫瘍血管が一過性に破綻しDDSが腫瘍組織に噴出する動的透過経路(Nano eruption)を発見した。本研究はDDSを腫瘍組織へ効率的に送達させるNano eruptionの促進と抑制の条件の解明を目的とする。TGF-β阻害薬、クロロキン、セレコキシブ、サリドマイド等を本研究の対象としてNano eruptionの制御と発生機序に迫る。
遺伝子融合による百日咳.ジフテリア.破傷風組換え抗原を用いた新PDTワクチンの開発

百日咳(P)、ジフテリア(D)、破傷風(T)はワクチンにより完全な予防が可能である感染症であるが、今尚多くの子供達、特に開発途上国ではワクチンの接種を受けられない為にこれらの疾患で苦しんでいる。また一方先進工業国に於いても既存クチンの副作用並びに益々増える接種ワクチンの種類、回数に対する対策を求められており、PDTワクチンを中心に更に多くの疾患に対するワクチンを同時投与可能な形のワクチンの開発が望まれている。日本は佐藤らの百日咳防衛抗原の研究成果を基に百日咳毒素を中心にした無細胞ワクチンを開発、1981年、世界に先駆けて導入し、百日咳毒素(PT)がジフテリア毒素(DT)、破傷風毒素(TT)と同様に必須防衛抗原である事を明らかにして来た。それ以来PTの防御抗原性と毒性との関係に関する研究が急進展した。本研究の目的は、遺伝子並びに蛋白質工学の技術を最大限に活用して百日咳、ジフテリア、破傷風(P、D、T)の3種融合単独ワクチンの構築をめざすとともに、蛋白毒素の毒性と防御抗原性を担う構造を解明する事にある。これらの成果の上にたち、PT,DT,TTの必要かつ十分な防御抗原性を持った融合蛋白分子を産生する遺伝子の構築と発現系を確立し、そのPDTを中心に他のワクチン抗原を組み合わせた単独多価ワクチンの可能性をも検討し、21世紀にはPDT融合抗原を基にした安全有効なワクチンを世界の隅々まで安価に安定供給できる体制を支援するための基礎を築くべく共同研究を進めてきた。これまでに得られた結果の概要は1.百日咳破傷風融合抗原の発現PTのS1(ADPリボシラーゼ欠損変異)にN末側に、破傷風毒素の免疫防御抗原性を示す事が知られているフラグメントC(TC)を末側に発現させる融合遺伝子を大腸菌に組み込みPT融合抗原(p75抗原)を作製した。75抗原はS1とTCの両抗原性を備えた単一分子であり、マウス及びモルモットに免疫原性を示した。抗体はTTに対して強い毒素中和能を示したが、PTのCHO細胞集合活性に対しては中和能を示さなかった。p75免疫マウスは百日咳菌強毒株による脳室内攻撃に対しては産生抗体価に見合う防御活性を示した。以上の結果は二つの異なる遺伝子の直接融合により発現された融合タンパク質はその構成両抗原の立体構造に質的に大きな変化を起こさなかった事を示唆しているが、p75は抗PT抗体産生能が低く免疫原性の強化が課題として残った。p75の免疫原性を高めるために、p75抗原の産生並びに精製の条件の再検討をすると共に根本的には融合遺伝子の特に百日咳毒素のサブユニットの遺伝子構築も含めて発現系の検討を継続する。2.百日咳破傷風ジフテリア融合抗原の発現S1-TTc遺伝子の上流、下流或いは中間にDT遺伝子を挿入し、3種の抗原性を備えた抗原分子を発現させ、免疫原性並びに抗体の毒素中和活性を検討した。DTの防御抗原性を担う構造としてはCドメインとTドメインの間のループ(186Cys-201Cys)の14ペプタイド並びにBフラグメント部分が知られているのでこれらの遺伝子をS1及びTC遺伝子と結合させ融合抗原を発現させた。大腸菌で産生されたS1-TC-DB融合抗原p115は抗S1モノクローナル抗体1B7及び抗TT,抗DT抗体と結合したが一部切断された抗原も検出され、p75に比較して可溶性融合抗原としても安定性にまだ問題を残している。叉更に融合遺伝子の発現系として大腸菌のみならず他の系も検討し、産生抗原の可溶化の検討、防御活性の検討を進めている。3.百日咳破傷風ジフテリアC型肝炎ウイルス(PTDHCV)融合抗原の発現p75或いはp115の融合遺伝子にHCVのE1,E2/NS1の遺伝子を融合し、バキュロウイルスに組込ませ昆虫細胞(SF)で発現させる計画で融合遺伝子の作出を試みたが、HCVの防御抗原に関する基礎データが不十分な状況であるとの判断に基づき一時中断する事とした。

これらの成果の上にたち、PT,DT,TTの必要かつ十分な防御抗原性を持った融合蛋白分子を産生する遺伝子の構築と発現系を確立し、そのPDTを中心に他のワクチン抗原を組み合わせた単独多価ワクチンの可能性をも検討し、21世紀にはPDT融合抗原を基にした安全有効なワクチンを世界の隅々まで安価に安定供給できる体制を支援するための基礎を築くべく共同研究を進めてきた。これまでに得られた結果の概要は1.百日咳破傷風融合抗原の発現PTのS1(ADPリボシラーゼ欠損変異)にN末側に、破傷風毒素の免疫防御抗原性を示す事が知られているフラグメントC(TC)を末側に発現させる融合遺伝子を大腸菌に組み込みPT融合抗原(p75抗原)を作製した。75抗原はS1とTCの両抗原性を備えた単一分子であり、マウス及びモルモットに免疫原性を示した。抗体はTTに対して強い毒素中和能を示したが、PTのCHO細胞集合活性に対しては中和能を示さなかった。p75免疫マウスは百日咳菌強毒株による脳室内攻撃に対しては産生抗体価に見合う防御活性を示した。以上の結果は二つの異なる遺伝子の直接融合により発現された融合タンパク質はその構成両抗原の立体構造に質的に大きな変化を起こさなかった事を示唆しているが、p75は抗PT抗体産生能が低く免疫原性の強化が課題として残った。p75の免疫原性を高めるために、p75抗原の産生並びに精製の条件の再検討をすると共に根本的には融合遺伝子の特に百日咳毒素のサブユニットの遺伝子構築も含めて発現系の検討を継続する。2.百日咳破傷風ジフテリア融合抗原の発現S1-TTc遺伝子の上流、下流或いは中間にDT遺伝子を挿入し、3種の抗原性を備えた抗原分子を発現させ、免疫原性並びに抗体の毒素中和活性を検討した。DTの防御抗原性を担う構造としてはCドメインとTドメインの間のループ(186Cys-201Cys)の14ペプタイド並びにBフラグメント部分が知られているのでこれらの遺伝子をS1及びTC遺伝子と結合させ融合抗原を発現させた。大腸菌で産生されたS1-TC-DB融合抗原p115は抗S1モノクローナル抗体1B7及び抗TT,抗DT抗体と結合したが一部切断された抗原も検出され、p75に比較して可溶性融合抗原としても安定性にまだ問題を残している。叉更に融合遺伝子の発現系として大腸菌のみならず他の系も検討し、産生抗原の可溶化の検討、防御活性の検討を進めている。3.百日咳破傷風ジフテリアC型肝炎ウイルス(PTDHCV)融合抗原の発現p75或いはp115の融合遺伝子にHCVのE1,E2/NS1の遺伝子を融合し、バキュロウイルスに組込ませ昆虫細胞(SF)で発現させる計画で融合遺伝子の作出を試みたが、HCVの防御抗原に関する基礎データが不十分な状況であるとの判断に基づき一時中断する事とした。百日咳毒素(PT)は、S1-S5の5種の異なるサブユニットから成る6量体である。中でもS1はPTの酵素活性と共に防御抗原性を担っている重要なサブユニットである事をモノクローナル抗体を用いた解析で明らかにしてきた。百日咳ジフテリア破傷風融合抗原作製を目的とした本プロジェクトにおいて、本年度の実験では百日咳抗原としてS1を、破傷風抗原としてガングリオシド結合性を保持し、且つ免疫防御抗原性をも持っているフラグメントC(TC)を選んだ。S1遺伝子はADP-リボシラーセ活性を発現しない変異を入れ、TC遺伝子上流に融合させた。即ちN末側に百日咳、C末側に破傷風抗原が発現されるような融合遺伝子を作出し、大腸菌で発現させた。産出された融合抗原はPAGE,ELISA、ゲル内沈降反応でPTとTCの両抗原性を備えた単一分子である事が確認された。そこで本融合抗原を用いてマウスを免疫し、抗体産生能を確認すると共にPT及び破傷風毒素(TT)に対する毒性中和活性、防御活性を測定した。
「一国・二制度」構想と香港・マカオ・台湾の将来

中国が国家統一の問題を武力の行使によってではなく、平和的な手段で解決するために考え出したのが「一国・二制度」構想である。この構想はそれぞれ英国、およびポルトガルの植民地であった香港とマカオに適用され、二地域とも平和的に中国に統一され、中国の「特別行政区」となっている。しかし、香港、マカオともに「高度の自治」を享受しているとはいえ、民主化が達成されていない中国の意向の下で、社会の安定が強調され、民主化の発展は制限を受けている。一方、中国にとって統一の最終目標である台湾は、総統を直接選挙で選出できるほどの民主化を達成しており、中国の提案する「二国・二制度」を受け入れることはきわめて難しく、逆に中国人としての意識よりも台湾人アイデンティティーが急速に深まっている。本研究では、国家統一のための「一国・二制度」構想の限界を示すとともに、国家統一のための条件として、民主化、および基本的人権の問題がますます重要になってきていることを指摘しようとするものである。平成12年度においては、研究テーマに関する資料収集を中心的に行った。まず、書籍については、「一国・二制度」構想の理論的枠組みに関する論文を中心に収集した。これにより、中国の香港・マカオに対する基本姿勢だけではなく、台湾問題についての基本方針を明らかにすることが可能になった。ついで、海外での資料収集にも着手し、香港の中文大学亜太研究所、および米国の国立公文書館を訪問した。香港では、2000年9月に、返還後二度目の立法会選挙が実施されたが、資料の収集とともに、選挙の動向についても観察した。選挙結果は、いわゆる民主派と呼ばれる勢力が苦戦を強いられたのに対し、親中派政党が党副主席の腐敗スキャンダルにもかかわらず、勢力を拡大した。香港の住民に高度の自治を認めた「一国・二制度」構想は大枠では機能しているものの、返還前と比べて、規制により言論・集会・宗教の自由が脅かされるようになり、最高裁判所が判決が政府によって覆されるという事態も生じている。台湾がこの構想に基づいて、統一の話し合いに応じるは難しいように思われる。そして、中文大学亜太研究所では、日本で入手困難な雑誌・新聞などの閲覧を行った。また、米国では、メリーランド州にある国立公文書館を訪問し、台湾問題をめぐる米中関係に関する資料を閲覧した。中国の国家統一の最終目標である台湾の問題は、結局米中関係の問題となる。米国の台湾への武器売却は「一国・二制度」構想の大きな障害となっており、今後も大きな問題となる可能性が高い。滞在期間が短かったために、資料を十分に収集できなかったが、次回の訪問に期待したい。本年度は、2000年9月10日に実施された香港特別行政区弟二期立法会選挙を分析し、民主派勢力に取って代わり、着実に勢力を拡大する親中派政党の姿を明らかにした(季報国際情勢No.72)。また、今年9月と12月に、それぞれ実施されたマカオ返還後の最初の立法会選挙と、台湾の立法院選挙の現地調査を行った。マカオの立法会選挙は返還前と様変わりした。選挙違反の摘発が功を奏したため、比較的クリーンな選挙となり、一議席しかとれないと思われていた民主派が得票率を延ばし、二議席を確保するという番狂わせが起こった。しかし、全体の議席数からすれば、親中派勢力が圧倒的優位にあるため、行政長官主導の政治に全く変化は見られない。また、台湾の立法院選挙は、与党の民進党と、最大野党の国民党との争いと見られたが、民進党が議席数を延ばしたのに対し、国民党、ならびに新党は大きく議席数を減らした。代わって、もう一つの野党である親民党が躍進し、李登輝前総統が新しく設立した台連も健闘した。香港・マカオと違って、民主化が着実に発展している台湾では、選挙の度にその政治地図が大きく塗り替えられる傾向にある。本研究は、中国が「一国・二制度」構想の対象地域としている香港、マカオ、台湾という三地域の選挙を比較することによって、統一の可能性のヒントを得ようとするものである。「一国・二制度」構想は中国の平和的国家統一の戦略であり、この構想の適用対象は香港・マカオ・台湾の三地域である。香港とマカオはすでにイギリス、およびポルトガル両政府によってそれぞれ中国に返還され、中国の特別行政区となった。香港は董建華政権の二期目となったが、返還前とは異なり、経済の低迷、財政赤字の増大に苦しんでいる。

また、董政権は目下「国家安全法」の制定に取り組んでおり、これはこれまで香港住民が享受してきた自由を大きく阻害する危険性を持っている。このように、香港は中国との一体化に向けて、大きく変貌しようとしている。一方、マカオについては、すでに返還前から中国の政治的コントロール下にあり、大きな変化はない。そういった意味で、中国の「一国・二制度」構想は香港とマカオに対してはうまく適用されているということができる。そして、統一の最終目標である台湾に対しても、中国の統一に向けての攻勢は依然として続いている。台湾の企業は経済的不況の中で大挙して中国に進出し、投資や工場の移転を積極的に進めている。そのため、中台間の経済における相互依存は大きくなり、もはや台湾の経済は中国なしでは存続できないほどのレベルにまで達している。その結果、財界の圧力もあり、陳水扁政権は「三通」の開放を迫られている。しかし、経済における相互依存関係にもかかわらず、政治的には、中台関係にほとんど進展は見られない。中国の「一国・二制度」構想が台湾でそのまま受け入れられる可能性は、陳水扁政権においてははもちろんのこと、「国・親連携」を強める野党が次の選挙で政権を取ったとしても、ほとんどあり得ない。「一国・二制度」構想は、一党独裁の中央政府が中央政府であり、民主化した台湾政府が地方政府になることを想定しており、このような前提が変化しない限り、中台関係に変化が現れることはないだろう。今後、「天安門事件」の再評価や、中国国内の民主化がどの程度進んでいくかといった点が、中台間に変化をもたらす要因となろう。
海運業界における運航自動化が社会ネットワークに及ぼす影響

本研究では、社会ネットワークの関係構造が事故の防止あるいは発生に及ぼす影響に焦点をあて、海運業界における運航自動化の進展が社会ネットワークの関係構造に及ぼす影響を解明すべく、研究を進めている。研究実施の初年度である2018年度は、理論研究に主軸を置き、先行研究のレビューおよび事例研究を通じて、社会ネットワークの関係構造が創出する組織的不正のリスクを分析するとともに、高信頼性組織化のために求められる社会ネットワークの関係構造を組織間学習の視点から考察した。社会ネットワークの関係構造がどのようなリスクをもたらしうるのかを明らかにするために、組織的不正に焦点をあて、組織的不正は、組織内で不正のトライアングルが連鎖する社会ネットワークの関係構造が構築されることで生じることを明らかにした。また、社会ネットワークが事故を未然に防止し、高信頼性組織化を図るためには、協調的な組織間学習が求められることを明らかにした。上述した研究内容のうち、社会ネットワークの関係構造が創出する組織的不正のリスクに関して分析を行った研究成果は、国内学会で発表した。また、高信頼性組織化のために求められる社会ネットワークの関係構造に関する考察は、国際学会での発表という研究成果に繋がった。以上のように、2018年度の研究を通じて、社会ネットワークの関係構造が創出するリスクの解明および社会ネットワークが高信頼性組織化するために求められる条件の解明が進められた。2018年度の研究では、理論研究に主軸を置き、先行研究のレビューおよび事例研究を通じて、社会ネットワークの関係構造が創出する組織的不正のリスクを分析するとともに、高信頼性組織化のために求められる社会ネットワークの関係構造を組織間学習の視点から考察した。これらの研究内容は、国内学会および国際学会での発表という研究成果を残した。以上のように、2018年度においては、社会ネットワークの関係構造が創出するリスクの解明、および社会ネットワークが高信頼性組織化するために求められる条件の解明を進めることができたが、他方で、次年度に実施する、過去の海難事故の事例研究を通じた社会ネットワークの関係構造と事故の関係に関する研究、に向けた準備という点では課題を残していることから、研究達成度は「おおむね順調に進展している」と自己評価した。本研究は、5年の期間をかけて、海運業界における運航自動化の進展が社会ネットワークの関係構造に及ぼす影響に関する研究を行う。研究実施の2年目である2019年度は、先行研究のレビューを通じて、自動化が社会ネットワークに及ぼす影響に関する理論的枠組を構築するとともに、過去の海難事故の事例研究を通じて、社会ネットワークの関係構造と事故の関係に関する分析を行う。以上の研究を通して、海運業界における船舶運航の自動化の影響について、社会ネットワークの観点から分析を試みることで、運航自動化がもたらすリスクを管理し、安全性と効率性を向上させるためには、どのような条件が求められるのかについて探究していく。

(理由)2018年度は、理論研究に主軸を置いて研究を実施したことにより、調査旅費が当初の予定より少額であっため、次年度使用額が生じた。(使用計画)設備備品費:関連研究の精査のための書籍・資料入手費用、旅費:調査・研究打合せ・学会発表のための旅費、その他:英文校閲費
熱対流方程式の数学的研究

1.研究代表者は、最近数年間にわたって、時間依存領域における熱対流方程式の研究を、力学系的観点から行なってきた。平成5年度は、そのテーマに関して、さらに考察を加えて、下記の研究発表を行なった。(1)1993年8月19日(2)1993年8月25日2.研究代表者は、2次元熱対流方程式の時間周期解の研究を行なって、1993年3月に日本学士院紀要に論文を発表しているが、平成5年度は、その結果に改良を加えて、下記の研究発表をした。(1993年10月20日)なお、上記の研究に対して、さらに改良を加えた結果を近く発表の予定である。
電極反応を鍵とする「繰り返し可能なプロセス」を用いる新しい有機合成法の開発

「繰り返し可能なプロセス」とはある官能基に対して一連の反応を行い分子鎖を延長した後、延長した部分にまた同じ官能基をつくることによりこれがまた同様の反応に使用できるようなプロセスをいう。本研究では最近我々が開発した。α-アルコキシシランの電極反応を鍵反応とする新しい「繰り返し可能なプロセス」の開発を行った。α-アルコキシシランは酸、塩基、および化学的な酸化剤に対しては比較的安定であるが、ケイ素の効果により容易に電極酸化を受け対応するアセタ-ルに変換される。このことを利用して次のようなプロセスを開発した。まずアリル位に水酸基を有するビニルシラン出発原料とし、これをSharpless酸化して光学活性なエポキシドを得る。水酸基をベンジル化した後メタノ-ルでエポキシドを開環すると、β-ヒドロキシ-α-アルコキシシランが得られる。メタノ-ル中で電極酸化しアセタ-ルとし、水酸基を保護した後酸加水分解を行うとグリセルアルデヒド誘導体が得られる。続いて低原子価クロムを用いてジブロモ(トリメチルシリル)メタンと反応させ、アリル位に水酸基を脱保護することにより、出発物質に対して炭素1つ延長し、しかも末端部分が同じアリル位に水酸基をもつビニルシランである化合物が得られる。従ってこのプロセスを繰り返し行うことにより任意の長さの光学活性ポリオ-ルを得ることができる。このプロセスで用いられる反応はすべて操作が簡便で収率も比較的良好である。新たに生成する水酸基部分の光学純度も非常に高い。得られたグリセルアルデヒド誘導体を既知の誘導体に変換して施光度を測定したところほぼ光学的に純粋であり、また1サイクル後に得られたビニルシランの光学純度を光学活性カラムを用いたHPLCで測定したところ95%ee以上という結果が得られた。以上、電極反応を鍵として光学活性ポリオ-ル合成に対して効率的な「繰り返し可能なプロセス」が開発できた。
木星エウロパの氷盤-液体海洋重層構造の形成維持機構の室内実験

木星の衛星エウロパには厚い氷盤の下に液体の水の層が存在することがほぼ確実視されている。これを実験的に確かめるために、平成11年度は、冷凍実験室のなかで熱対流が氷を融解する過程、および氷層と水層の最終平衡状態を実験的に調べた。平成12年度は、種々の制約によって室内実験では十分確認できなかった部分を追試するとともに、氷.水2層構造の形成条件をパラメータを変化させることによって可能なかぎり一般性をもって導出することを数値実験によって試みた。パラメータとして、レイリー数(Ra)と上下の温度差をとった。(1)Ra=100,000の場合:上下の温度差を変えて実験すると、最終的には氷対水の厚さはおおむね1:9の状態に落ち着いた。しかし、氷と水の厚さの比が1:1になるケースも少ないながら存在した。水層の中では不規則な熱対流が活動しており、この先突然状態変化を起こすことも考えられる。(2)Ra=10,000の場合:(1)の場合と状況は変わりない。このように、不規則的に層の厚さの比が異なって出現するというカオス的状態が見られたのは興味ある結果である。詳細に追求する必要がある。木星の衛星「エウロパ」は、表面の氷地殻の下に液体の水の層が存在する可能性が高いことが探査機による磁場観測から明らかになってきた。このように氷と水の2層構造の形成理由は観測からはまだ解明されていない。このような2層構造が安定に存在できるための条件を明らかにすることを目的に、室内モデル実験と数値モデル実験を並行して実施した。室内モデル実験は、一20゚Cの冷凍庫で行われた。水を完全に凍らせた後、下方から加熱して徐々に氷を溶かせると、ある一定の厚さの割り合いで氷と水の安定な2層構造が形成されるが、加熱が強いと氷が全部融解し、一方、加熱が弱すぎると氷が拡大することがわかった。数値モデルを使い、室内実験を復元する試みもなされた。氷層には熱拡散方程式を、水層には熱対流の式を適用し、氷層と水層の境界の移動を記述する接続条件を適用した。水層下端と氷層上端の温度を固定して与えて時間積分を行うと、上下の温度差に対応して、氷層と水層の厚さの割り合いは異なるものの、安定した2層を復元することができた。しかし、温度境界条件の与えかたによっては、ほぼ全層が氷になったり水になったりする場合も存在することがあり得ることもわかった。ただ、これらのモデルはあくまでも分子粘性の効く小規模領域のものであり、現実の衛星の規模とは大きく隔たっていることに注意しなければならない。現在、条件をさらに拡大した場合の数値モデル実験を行い、特に、熱対流の非線形効果の影響を詳しく調べており、これが終わり次第論文作成に入る予定である。
抗菌薬排出蛋白質の分子機構-細菌の小型排出蛋白質を例として-

ほぼ全ての生物種の細胞膜には,細胞にとって都合の悪い様々な毒物を認識し,能動的に細胞外へと排出する多剤排出蛋白質が存在している.これらの蛋白質は,感染症治療の大きな障害である多剤耐性菌株の出現と密接に係わっている他,分子科学の面からも,構造上相関の無い多様な薬物の認識/排出という興味深い機能を実現している.本研究では,多剤排出蛋白質の中で,最もサイズが小さいSMR(small multidrug resistance)ファミリーに属する蛋白質の分子機構解明を目指した研究を行ってきた.様々な測定手法を適用するためには,蛋白質の高純度な精製が必要なため,SMR蛋白質の大腸菌における大量発現・精製を重要な課題と位置付けて研究を行った.融合タグを用いる方法で,大腸菌のEmrEの大量発現と融合蛋白質の精製は実現できたが,残念ながら,融合タグの分離が依然として困難であった.有機溶媒に溶けるほどのSMRの脂溶性の高さが,プロテアーゼ処理とその後の蛋白質の回収を困難にしていると考えられる.一方,これと平行して,枯草菌のEbrABの膜内トポロジーの決定と,その制御機構を明らかとする研究を行い,興味深い知見を得るに至った.これまでのSMRの研究は,主にEmrEを用いて行われてきた.膜内ではホモダイマーとして機能すると考えられているが,その膜内トポロジーについては,互いに異なる報告がされてきている.本研究では,ヘテロダイマーを形成するEbrABを用い,二つのモノマーが逆平行なトポロジーをとって,膜内に挿入されていることを明らかとした.また,塩基性残基の置換によって,ホモダイマーとしても機能するようになることを明らかとした.これらは,ヘテロダイマー型のEbrABについての結果であるが,おそらく,EmrEなどのホモダイマー型SMRも同様の性質を有すると考えられる.ヒトやマウスに見られるP糖蛋白やMRPと同様に、構造上相関の無い多くの毒物を認識し、細胞外へと排出できる膜蛋白質が、細菌類にまで広く分布していることが近年明らかにされてきた。これらの蛋白質は、化学療法における大きな障害として注目されるだけでなく、多くの薬剤を非常に高い特異性で輸送できるという一種矛盾する機能を有している点で興味深い。本研究は細菌において見出された最も小型の多剤排出蛋白質(Smr)の基質輸送機構を、主に、蛋白質自身の蛍光測定により明らかにすることを目的としている。蛋白質が内在するTrpの蛍光を測定するためには、目的蛋白質を高純度で精製する事が必須である。今年度は、そのための大量発現系及び精製系の確立を目指してきた。その結果、大腸菌のSmrであるEmrEを、T7gene10蛋白質に融合させることで、培地1Lあたり100mg以上の融合蛋白質を得られることが明らかとなった。EmrE換算では28mgにも相当し、その後の高純度精製に耐え得る十分な量である。現在、精製の最終段階を検討しており、次のステージ(活性測定、蛍光測定)へと近く進むことができると考えている。一方、アミノ酸組成が特徴的で、EmrEなど他のSmr蛋白質との比較対象として有益と考えていた好塩菌のHsmrの大量発現も試みてきたが、この蛋白質はより特殊な発現条件が必要であることが判った。膜蛋白質の分子機構を研究する上で、その膜内での存在様式(膜貫通トポロジー、多量体形成の有無及びその様式)の決定は重要であるが、Smr蛋白質ではまだ確定していない。大量発現系の構築と平行して、枯草菌のSmrの様々な変異体の作成とその活性測定を行ってきた。その結果、トポロジーを決定する一次構造部位を推定した。その部位を変異させることでトポロジーが変化するという結果を得ている。詳細は近く論文にて公表する予定である。構造上相関の無い様々な薬物を細胞外へと排出する多剤排出蛋白質は、化学療法における大きな障害として注目されるだけでなく、その機能の面からも非常に興味深い蛋白質である。本研究は細菌において見出された最も小型の多剤排出蛋白質(SMR)の基質輸送機構を明らかにすることを目的としている。分光学的測定など、物理化学的な方法を用いることが、基質輸送機構の詳細を調べるためには必須であるが、そのためには、目的蛋白質の高純度な精製が不可欠である。本研究では、様々なタグをSMR蛋白質に融合し、大量発現を実現させて、高純度な精製を行うことを目指してきた。今年度はタグとして、GST、Trx、Nus、CBD、MBP、T7gene10を、SMR蛋白質としては、大腸菌のEmrE、古細菌のHsmr、枯草菌のEbrABを用い、網羅的に融合蛋白質の大腸菌内における発現とその後の精製を試みてきた。その結果、特にNus、MBP、T7gene10を、EmrEに融合させ、かつ、20°C程度の低温下で培養した時のみ、大量発現が可能であった。HsmrとEbrABについては、いずれのタグを用いても発現は確認できなかった。大量発現したEmrEの融合蛋白質について、その後の粗精製とタグの切断を試みたが、Nusについては精製中の分解が問題であり、また、T7gene10は封入体として発現する性質のため、可溶化とプロテアーゼによる切断が非常に難しいということが判った。MBPはタグの切断までは成功した。しかし、その後のEmrE部分の回収にまだ改善が必要である。

EmrEは有機溶媒で抽出できるほど脂溶性が高い。この特殊な性質が、タグ切断後のEmrEを非常に不安定にしているのかもしれない。したがって、脂質存在下での切断など回収時の改良が必要であると考えている。ほぼ全ての生物種の細胞膜には,細胞にとって都合の悪い様々な毒物を認識し,能動的に細胞外へと排出する多剤排出蛋白質が存在している.これらの蛋白質は,感染症治療の大きな障害である多剤耐性菌株の出現と密接に係わっている他,分子科学の面からも,構造上相関の無い多様な薬物の認識/排出という興味深い機能を実現している.本研究では,多剤排出蛋白質の中で,最もサイズが小さいSMR(small multidrug resistance)ファミリーに属する蛋白質の分子機構解明を目指した研究を行ってきた.様々な測定手法を適用するためには,蛋白質の高純度な精製が必要なため,SMR蛋白質の大腸菌における大量発現・精製を重要な課題と位置付けて研究を行った.融合タグを用いる方法で,大腸菌のEmrEの大量発現と融合蛋白質の精製は実現できたが,残念ながら,融合タグの分離が依然として困難であった.有機溶媒に溶けるほどのSMRの脂溶性の高さが,プロテアーゼ処理とその後の蛋白質の回収を困難にしていると考えられる.一方,これと平行して,枯草菌のEbrABの膜内トポロジーの決定と,その制御機構を明らかとする研究を行い,興味深い知見を得るに至った.これまでのSMRの研究は,主にEmrEを用いて行われてきた.膜内ではホモダイマーとして機能すると考えられているが,その膜内トポロジーについては,互いに異なる報告がされてきている.本研究では,ヘテロダイマーを形成するEbrABを用い,二つのモノマーが逆平行なトポロジーをとって,膜内に挿入されていることを明らかとした.また,塩基性残基の置換によって,ホモダイマーとしても機能するようになることを明らかとした.これらは,ヘテロダイマー型のEbrABについての結果であるが,おそらく,EmrEなどのホモダイマー型SMRも同様の性質を有すると考えられる.