hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天皇制の成立・展開における律令法の意義

なお、本研究は、公式令の分析を通じて、日本における律令文書行政の整備・実施に関する構想と目的を解明し、その上で現存する文書から実際の運用状況を検討するという研究目的に則して進めたものである。牒は、養老公式令によると、官人個人が諸司に宛てる文書式である。しかし、実際には令の規定から逸脱し、個人のみならず官司間文書として、上行・下行・互通など多種多様に用いられてきた。従来の研究は、これを唐制の影響と説明してきた。実際に中国の牒は、現存の唐公式令では官司内下行文書、宋代の『司馬氏書儀』では官司間の上行・下行・互通文書と規定される。しかし、日本の牒の実例は、発給者や機能・書式など中国の規定と必ずしも同一ではなく、日本令と藍本たる唐令の規定の違いなど疑問も残る。そこで本研究では、(1)日唐令文の分析から、大宝令と藍本たる唐永徽令の牒式条を復原する、(2)牒の特異性を明かにし、牒の本来的な機能とそこから派生した機能という視角から、牒の多様化について論じる、の2点を課題として考察した。その結果、(1)大宝令と唐永徽令の牒式は、養老令と同様に個人の牒の規定であること、(2)上行・下行・互通いずれの形式も取る点が牒の特異性で、これは本来の牒が官人個人から官司に宛てた文書で、その地位・所属によっていずれの形式も取り得る点に基因すること、個人の牒がその所属する官司の意志を伝える官司発給文書として用いられるなど、個人文書としての牒の柔軟性・利便性がその機能を拡大させ、多種多様な様式を派生させることになったと考えられることが判明した。このような機能拡大は日唐双方で見られるが、書式に鑑みるに、日本の官司文書の牒は唐制の直接の導入ではなく、個人文書の牒から日本独自に派生した可能性が高い。すなわち、公式令や唐制を藍本とする令規定や文書式であっても、日本的特質や独自性は見出し得るのであり、律令法や文書行政自体の特質と、日本的な特質とを意識して分析する視角が必要となる。
分子鎮長の制御されたブロック共重合体の新合成法の開発

アルミニウムポルフィリン錯体(右図)は、種々のモノマ-のリビング重合を引き起こし、分子量の良く揃ったポリマ-を与える。本研究は、本研究は、リビング重合の開始剤としてのアルミニウムポルフィリン錯体の幅広い適応性を利用し、ブロック鎖長の制御された新規なブロック共重合体の合成を目的とする。本研究により以下の成果が得られた。(1)リビング重合開始剤としてのアルミニウムポルフィリン錯体の広い適用性を利用することによりポリメタクリル酸エステルとポリエ-テルやポリエステルからなる新規なブロック共重合体が合成された。また、ビニル系のブロック共重合体としては、ポリメタクリル酸エステルとポリアクリル酸エステル、ポリメタクリロニトリルからなるブロック共重合体も合成された。これらはいずれも分子量の良く揃ったものであり、モノマ-の仕込み量により分子量の大きさを制御可能であった。(2)亜鉛のNー置換ポルフィリン錯体を開始剤として用いることにより、ポリエ-テルとポリチオエ-テルからなる分子量分布の狭いブロック共重合体が合成された。(3)ルイス酸として崇高い有機アルミニウムを添加することにより、アルミニウムポルフィリン錯体によるメタクリル酸エステルの重合反応をリビング性を犠牲にすることなく飛躍的に加速できることを見い出した。また、同様に、環状エ-テルであるエポキシド、環状エステルであるラクトンの重合反応においても著しい加速効果が観測された。更に、これらの高速で進行するリビング重合を利用すると、分子量の極めて大きな(場合によっては100万以上)ポリマ-を分子量のばらつきなく合成できることも見い出した。従って、今後の展開において異なるモノマ-の高速リビング重合を連続的に行なうことにより、超高分子量を有する構造明確なブロック共重合体が設計できるものと期待される。高分子材料のニ-ズは、近年よりファインな分野にまで拡大している。特に、ブロック共重合体(異なる構造の高分子鎖が連結し,一本の高分子鎖となったもの)は,その特異な物性のために,医用材料、薬理活性高分子、フォトレジスト材料、機能性塗料の基本材料として注目されている。本研究では,金属ポルフィリン錯体を重合開始剤とするリビング重合を利用し,個々の鎖の長さが制御された新しいブロック共重合体の合成を目的としている。本年度の研究では,右図のアルミニウムポルフィリン錯体を用い,メタクリル酸エステルとアクリル酸エステルよりなるブロック共重合体を個々のブロック鎖の長さが厳密にそろった形で合成することに成功した。個々のブロック鎖長は,夫々のモノマ-の反応量を変えることで自在に制御することが可能であった。重合反応の順番は,はじめにメタクリル酸エステルを重合させ,次にアクリル酸エステルの重合を行なう方法,あるいは,その逆の順番でも問題なくブロック共重合体が生成した。両モノマ-のランダム共重合を試みたが,アクリル酸エステルの重合反応がきわめてはやい時期に終了し,その後、メタクリル酸エステルがゆっくりと重合していくことがわかった。本年度の研究では、ルイス酸として嵩高い有機アルミニウムを添加することにより、メタクリル酸エステルの重合反応をリビング性を犧牲にすることなく飛躍的に加速できることを見い出した。更に、これらの高速で進行するリビング重合を利用すると、分子量の極めて大きな(場合によっては100万以上)

ポリマ-を分子量のばらつきなく合成できることも見い出した。従って、異なるモノマ-の高速リビング重合を連続的に行なうことにより、超高分子量を有する構造明確なブロック共重合体が設計できるものと期待される。
小学校教員の英語発話能力向上を支援する：地域の枠を越えたブレンド型研修の試み

本研究は、地域の枠を越えて、国内各地の小学校教員の英語発話能力と指導スキル向上を、ICTと対面講習を併用した「ブレンド型研修」で支援してその効果を検証する。初年度は、研修ウェブサイトを構築し、2年目は、ICT研修とブレンド型研修を実施(発音ソフトは両方で使用)して効果を比較する。3年目は、都内教員対象、4年目・5年目は、各地の小学校教員対象に研修を実施し効果的な音声研修のあり方を検討する。
氷床コアの微小部気体分析法の開発

氷床コアには過去約20万年にわたる大気組成の情報が気泡あるいは空気分子をゲストにもつクラスレート水和物として保存されており、それらの大きさはほとんどがlmm以下の非常に微小なものである。この微小部に含まれる大気組成の情報を正確に解釈するためには、まず、その情報を読み取る分析手法に信頼性がなくてはならない。本研究では、気泡からクラスレート水和物に遷移するプロセスとそれに伴う気体分別に注目し、空気の主成分であるN_2,O_2の組成比を局所的に測定することを目的としてその測定手法の確立を目指した。顕微ラマン散乱法については、結晶異方性などクラスレート水和物特有の問題を解決し、氷床における気体分別過程を明らかにするなどの成果を得ており、微小部気体分析法として十分な性能を有することを立証できた。特に、個々のクラスレート水和物内におけるN_2/O_2比の分布を測定できるようになったことの意義は大きい。また、顕微ラマン散乱法は、微量な気体の組成分布を非破壊で分析する方法としても極めて有効である。しかし、その精度にはなお改良の余地があると考える。ラマン散乱スペクトルのデータの信頼性向上を図るため、ガスクロマトグラフ/質量分析計を用いた気体の定量分析を行うシステムの開発を行った。これによって、ラマン散乱データの信頼性向上に役立つ見直しを得た。さらに測定を繰り返し、システムにも改良を加えながら、より優れた微小部気体分析法に発展させる予定である。本年度の研究実施計画に基づいて、項目毎に成果概要を説明する。(1)微小部加熱装置の設計・製作:既設の顕微ラマン散乱測定装置に自動走査機能と微小部加熱機能を付加する改造を行った。本研究の目的達成のためには、数ミクロンの位置分解能でラマンスペクトルを自動走査測定することが必要であり、まずこの機能について検討を行った。その結果、一つのクラスレート水和物でも中心部と周辺部では、組成が違うことが見出されており、従来にない高精度な測定を自動的な行えるようになった。この点においては、初期の目的以上の成果を得た。微小部加熱については、ヘリウムネオンレーザーを測定光学系と同軸で照射する装置を完成させた。現在測定を繰り返しているが、十分な効果が得られていない。まだ光学系に改良の必要がある。(2)気体分析装置の設計・製作:微小なクラスレート水和物の解離によって発生する微量な気体を分析するという困難な測定を目指しており、試行を繰り返している。上記(1)の成果で述べたように、個々のクラスレートの内部でも気体組成に分布があること、およびラマン散乱強度がクラスレート水和物結晶の方位によって変化することを見出している。これらは、いずれも新たな研究成果であるが、微小部の気体分析という本研究の目的には、新たな課題となっている。当面は、クラスレート内部の組成分布の詳細を平均化することで目的を達成する考えである。氷床コアには過去約20万年にわたる大気組成の情報が気泡あるいは空気分子をゲストにもつクラスレート水和物として保存されており、それらの大きさはほとんどが1mm以下の非常に微小なものである。本研究では、気泡からタラスレート水和物に遷移するプロセスとそれに伴う気体分別に注目し、空気の主成分であるN_2,O_2の組成比を局所的に測定することを目的としてその測定手法の確立を目指した。

しかし、その精度にはなお改良の余地があると考える。ラマン散乱スペクトルのデータの信頼性向上を図るため、ガスクロマトグラフ/質量分析計を用いた気体の定量分析を行うシステムの開発を行った。これによって、ラマン散乱データの信頼性向上に役立つ見直しを得た。さらに測定を繰り返し、システムにも改良を加えながら、より優れた微小部気体分析法に発展させる予定である。
自由境界の形状の時間的変化について

本研究は、自由ないし移動境界問題の中で典型的なヘレショウの流れに焦点をあて、ポテンシャル論的方法、複素解析的方法を主に用いて、近年の非線形偏微分方程式の理論や粘性解の理論を取り込みつつ、古典的な方法では得られなかった流れの形状の時間的変化の特性を明らかにすることを目指すものである。流れの初期領域の境界上に角があり、その角の内角が0度から360度のときまでの詳しい研究を行った。初めに90度と360度が特別であることを明らかにし、次に90度の場合は、停留点と層流点を分けるよい条件を見出し、最後に360度の場合は、内部問題と外部問題を解決し、得られた調和測度の評価を用いて、まずベキ関数で記述される場合に層流点であるための十分条件を得、次により一般な場合に層流点であるための十分条件を調べ、一般的な十分条件を示すことが出来た。各分担者は、この研究成果を得るにあたり様々な貢献を為したが、各分担者の個別の研究にも成果をあげた。それらのいくつかを簡単にまとめると以下の通りである。◇岡田:数値調和解析の研究として、特にスプライン関数や、ウェイヴレットを用いた選点法による関数近似評価を証明し、偏微分方程式の数値計算に応用した。◇倉田:非有界領域における典型的な非線形楕円型境界値問題の非自明な正値解の存在問題において、領域の幾何学的性質が重要であるが、漸近的にいくつかの筒上領域を持つような非有界領域での解の存在定理を証明した。◇高桑:非線形楕円型方程式の研究で重要な役割を果たしているPohozaevの恒等式の偏微分方程式系への拡張を考え、その応用としてユークリッド空間の有界領域での調和写像とP-調和写像の解の一意性を示した。◇石井:ハミルトン・ヤコビ方程式に対する周期的均質化における収束速度を解析し,更に緩和現象の定式化とその発現について十分条件を与えた.◇望月:振動型ポテンシャルを伴うシュレディンガー作用素に対する固有関数の増大度の評価とスペクトル表現および摩擦項を伴う古典的波動伝播問題に対する解の減衰や、スペクトル・散乱理論の研究を行った。本研究は、自由ないし移動境界問題の中で典型的なヘレショウの流れに焦点をあて、ポテンシャル論的手法、複素解析的方法を主に用いて、近年の非線形偏微分方程式の理論や粘性解の理論を取り込みつつ、古典的な方法では得られなかった流れの形状の時間的変化の特性を明らかにすることを目指すものである。本年度は、流れの初期領域の境界上に角があり、その角の内角が全角(=360度)のときの詳しい研究を行なった。それは、内角がそれより小さい場合については今までの研究によりほぼ正確な記述が出来るようになったのに対して、この場合は全く異なり、研究成果がほとんど無いためである。この場合は、停留点ではないが必ずしも層流点でなく、いくつかのタイプに分かれる。層流点であるためのよい十分条件を導くため、その準備として調和測度の評価を行なった。各分担者は、この研究成果を得るにあたり種々の貢献をしたが、各分担者の個別の研究にも成果をあげた。・石井:海岸の石の摩耗のFireyによる数学モデルの一般化を研究し、解の存在と一意性を示した。

・高桑:特異点を持つ調和写像の特異点の近くでの一階微分の特異点集合からの距離関数を用いた評価を得た。・倉田:いくつかの楕円型作用素のディリクレ第一固有値の最小化問題を研究し、対称性の破れなどの現象を見い出し、その最適化に付随する自由境界の滑らかさや形状を研究した。本研究は、自由ないし移動境界問題の中で典型的なヘレショウの流れに焦点をあて、ポテンシャル論的方法、複素解析的方法を主に用いて、近年の非線形偏微分方程式の理論や粘性解の理論を取り込みつつ、古典的な方法では得られなかった流れの形状の時間的変化の特性を明らかにすることを目指すものである。本年度は、流れの初期領域の境界上に角があり、その角の内角が全角(360度)のときの詳しい研究を昨年度に引き続き行った。昨年度に得られた調和測度の評価を用いて、層流点であるための十分条件を新しい折り返し可能定理に帰着できた。つまり、内部問題を解決した。現在は、外部問題の解決に向けて種々の準備を行っているところである。各分担者は、この研究成果を得るにあたり様々な貢献を為したが、各分担者の個別の研究にも成果をあげた。それらのいくつかを簡単にまとめると以下の通りである。◇望月:無限遠の近傍だけで効果的な摩擦項を伴う波動方程式について、解のエネルギーは時間とともに減衰することを示した。◇石井:Hamilton-Jacobi方程式の不連続な粘性解に対する新しい比較定理を確立した。岩石の磨耗の数学モデルについて、境界がグラフで与えられる場合についてその一意存在を証明した。◇高桑:Euclid空間の有界領域上の非線形楕円型方程式系の解の一意性をPohozaevの恒等式を用いて証明した。◇倉田:obstacleの形をあらかじめ球と指定しての固有値の最適化問題を考え、いくつかの領域に対しては最適な球(obstacle)の位置を決定づけた。◇肥田野:半線形波動方程式の時刻が無限大にいたるときの漸近挙動を散乱問題と自己相似性の観点から考察した。またこの2つの関係も調べた。昨年度は得られた調和測度の評価を用いて、層流点であるための十分条件を新しい折り返し可能定理に帰着できた。今年度は、折り返し可能定理の条件を満たすように測度を変形できること、すなわち、外部問題を解決した。◇倉田:非有界領域上での典型的な非線型楕円型境界値問題の解が存在する新しい非有界な領域のクラスを1つ提唱し,領域の幾何学的性質と可解性との関連についての新しい結果を示した。◇高桑:Euclid空間の領域上での調和写像、p調和写像の境界値問題に対して自明な境界条件を満たすのは自明な解のみであることを示した。
生物分子マシンの作動原理を理解する：共振現象による計測と制御

タンパク質や核酸等から成る生物のナノマシンは、水溶液中で、熱運動を利用して正確に作動する。この仕組みは未解明である。この問題の難しさは、(1)どの程度問題を掘り下げれば一般的な解明と言えるのか?(2)どう実験的に検証するのか?という点である。本研究では、転写複合体をモデルとし、(1)この問題を活性化エネルギーの概念で説明できない化学反応機構の問題として捉え、(2)活性化エネルギーよりも十分に小さく、室温の熱揺らぎ程度のエネルギーを持つ電磁波であるテラヘルツ(THz)光を照射し、その生化学反応への波長依存的な効果を統計的に評価する新技術を開発し、実験的な検証を試みた。具体的には、0.1THz光源と5THz光源を用いて、微量水溶液中の転写複合体試料に、基質添加と同時に高強度THz光を90秒照射した。試料の平均温度上昇は室温から0.3°Cに留めた。転写反応の主要過程(転写開始、一時停止、終結、読み誤り)へのTHz照射の影響を高感度に検出するために、ハイスループットDNAシーケンシング(HT-seq)法を利用した方法を新たに開発した。また、試料の水温だけを上昇させる対照実験を行い、熱的効果との違いを徹底的に検証した。開発した新技術を用いて、特定波長のTHz光照射は、温度上昇とは質的に逆の影響を複数の転写過程に与えるという新知見が得られた。THz照射実験において、保科宏道上級研究員(理研)と田中真人主任研究員(産総研)の協力を得た。また、5THz光源として、大阪大学産業科学研究所の磯山悟朗特任教授らが開発した自由電子レーザーを用いた。0.1THz光源として、産総研・計量標準総合センター保有のクライストロンを用いた。一般的に、THz光と生体高分子の直接的相互作用が生物機能を変化させるかどうかを実験的に検証することは容易ではない。分光的な検出を試みる場合、THz領域のスペクトル変化から生体高分子運動の微視的な情報を読み解き、さらにその情報を生物機能と結びつける必要がある。一方、THz光による効果を生物学的な変化の側から調べる場合、熱的効果との分離を含め、THz光照射と生物学的な変化の直接的な因果関係を特定するための工夫に加え、得られた現象の分子機構を推定する工夫が必要である。本研究では、分子機構の理解が進んだ生物ナノマシンである転写複合体の水溶液試料にTHz光を照射し、その機能変化を100万以上の核酸分子を1塩基分解能で扱えるHT-seq法を用いて解析した。この方法であれば、RNAポリメラーゼにより転写される莫大数のRNA分子の変化を高感度で検出でき、かつ結果を統計的に評価することが可能である。得られたHT-seq実験プロファイルを既知の分子機能情報と照合すれば、転写反応において、THzが影響を与えたであろう分子過程をある程度絞り込むことができる。本研究で開発したTHz光照射HT-seq検出により観察されたのは、温度上昇から期待される転写伸長反応の促進というよりむしろ、伸長反応一時停止の促進であった。この過程には活性化エネルギーが無く、熱揺らぎが支配的であることが知られている。本研究から、THz光による生化学反応への効果を、水を介した熱的な効果から分離できる可能性が新たに示唆された。上述した新知見を、海外および国内における複数分野の学会と招待講演で発表し、研究成果を国際的に発信した。以上が、現在までの進捗が順調と評価した理由である。初年度の研究では、転写反応のハイスループット観測において、THz光照射による効果を熱的効果と分離し得るかどうかに重点を置いた研究を行なった。2年目以降は分子機構に迫る研究を展開するため、THz光照射条件(周波数、パルス幅、ピークパワー等)を変えた計測を行う。THz光と生体高分子の直接的相互作用についての微視的な情報を得るには、より狭い領域で周波数依存性を調べる必要がある。また、THz光の転写反応への効果をHT-seq法を用いて高感度に検出する場合、実験中のわずかな室温変化による影響をTHzの影響と誤認する可能性がある。このため、試料セルおよび反応試薬類の温度を厳密にコントロールするための温調設備を導入する。得られた現象が、THz光と転写複合体との直接的な相互作用に起因する場合、その構成分子である核酸あるいはタンパク質において、THz光の励起状態が十分に長い時間断熱的に保たれることが期待される。しかし、そのような現象の報告例はない。期待されるようなTHz光と生体高分子の相互作用を直接観測するためには、ナノフォトニクス分野の技術・概念や分光法を取り入れた新しい観測系の構築が必要になり、今後の課題である。さらに、機構論からテラバイオロジー(テラヘルツ領域のゆらぎ運動から生物機能を理解する新しいバイオロジー)へと展開していくため、細胞を用いた実験を行う。具体的には、メンブレン上に重なりを抑えて吸着させた大腸菌あるいは酵母を試料としてTHz光照射を行い、細胞内のゲノムワイドな転写変化やゲノムDNAの運動変化に基づいたエピジェネティック変化等をHT-seq法および遺伝学的手法を用いて調べる。

本研究では、転写複合体をモデルとし、(1)この問題を活性化エネルギーの概念で説明できない化学反応機構の問題として捉え、(2)活性化エネルギーよりも十分に小さく、室温の熱揺らぎ程度のエネルギーを持つ電磁波であるテラヘルツ(THz)光を照射し、その生化学反応への波長依存的な効果を統計的に評価する新技術を開発し、実験的な検証を試みた。具体的には、0.1THz光源と5THz光源を用いて、微量水溶液中の転写複合体試料に、基質添加と同時に高強度THz光を90秒照射した。試料の平均温度上昇は室温から0.3°Cに留めた。転写反応の主要過程(転写開始、一時停止、終結、読み誤り)へのTHz照射の影響を高感度に検出するために、ハイスループットDNAシーケンシング(HT-seq)法を利用した方法を新たに開発した。また、試料の水温だけを上昇させる対照実験を行い、熱的効果との違いを徹底的に検証した。開発した新技術を用いて、特定波長のTHz光照射は、温度上昇とは質的に逆の影響を複数の転写過程に与えるという新知見が得られた。THz照射実験において、保科宏道上級研究員(理研)と田中真人主任研究員(産総研)の協力を得た。また、5THz光源として、大阪大学産業科学研究所の磯山悟朗特任教授らが開発した自由電子レーザーを用いた。0.1THz光源として、産総研・計量標準総合センター保有のクライストロンを用いた。一般的に、THz光と生体高分子の直接的相互作用が生物機能を変化させるかどうかを実験的に検証することは容易ではない。分光的な検出を試みる場合、THz領域のスペクトル変化から生体高分子運動の微視的な情報を読み解き、さらにその情報を生物機能と結びつける必要がある。一方、THz光による効果を生物学的な変化の側から調べる場合、熱的効果との分離を含め、THz光照射と生物学的な変化の直接的な因果関係を特定するための工夫に加え、得られた現象の分子機構を推定する工夫が必要である。本研究では、分子機構の理解が進んだ生物ナノマシンである転写複合体の水溶液試料にTHz光を照射し、その機能変化を100万以上の核酸分子を1塩基分解能で扱えるHT-seq法を用いて解析した。この方法であれば、RNAポリメラーゼにより転写される莫大数のRNA分子の変化を高感度で検出でき、かつ結果を統計的に評価することが可能である。得られたHT-seq実験プロファイルを既知の分子機能情報と照合すれば、転写反応において、THzが影響を与えたであろう分子過程をある程度絞り込むことができる。本研究で開発したTHz光照射HT-seq検出により観察されたのは、温度上昇から期待される転写伸長反応の促進というよりむしろ、伸長反応一時停止の促進であった。この過程には活性化エネルギーが無く、熱揺らぎが支配的であることが知られている。本研究から、THz光による生化学反応への効果を、水を介した熱的な効果から分離できる可能性が新たに示唆された。上述した新知見を、海外および国内における複数分野の学会と招待講演で発表し、研究成果を国際的に発信した。以上が、現在までの進捗が順調と評価した理由である。初年度の研究では、転写反応のハイスループット観測において、THz光照射による効果を熱的効果と分離し得るかどうかに重点を置いた研究を行なった。2年目以降は分子機構に迫る研究を展開するため、THz光照射条件(周波数、パルス幅、ピークパワー等)を変えた計測を行う。
低頻度Driver Oncogene変異陽性肺がんの標的療法開発と耐性機構研究

肺線がんにおいては、EGFR、KRAS活性化型変異、ALK, ROS1, RET, NTRK等の融合遺伝子といったDriver Oncogeneが相次いで発見され、治療薬の開発が進められている。EGFRおよびALK陽性肺がんでは、複数の薬剤がこれまでに承認され実臨床で使用できるようになっており、ROS1融合遺伝子陽性肺がんに対してはALK阻害薬でもあるCrizotinibが承認され、実臨床で使用されている。しかし、いずれの薬剤に対しても数年以内に獲得耐性が生じることが臨床上問題である。29年度は、ERBB2のExon20挿入変異を有する細胞株を当該がん患者の胸水より樹立することに成功した。また、EGFRのExon20挿入変異の細胞株を新たに追加で樹立することに成功し、いくつかの候補薬剤とそれらに対する耐性機構の一部をIn vitroで発見した。その耐性機構の1つは薬剤の結合部位の1アミノ酸置換による変異であった。また、肺がんで非常に低頻度に見られるNTRK融合遺伝子について、現在臨床試験中の薬剤を含めて治療感受性及び抵抗性機構の解析を進め、5つの耐性変異とバイパス経路を介した耐性を発見し、さらにそれら耐性にも有効な薬剤や併用療法を発見し、論文として発表した。また、ROS1融合遺伝子陽性肺がんでは、ROS1阻害薬耐性細胞の解析から治療薬に依存して増殖するユニークな細胞の性状を明らかにすることに成功し、論文として報告した。また、EGFR変異陽性肺がんにおける新たな変異検出手法と、変異アリルの存在比率が次治療の感受性に関与する可能性を見出し、論文として発表した。各種低頻度Driver Oncogene変異を有する肺がん細胞株で現在購入ができないものについて、同意を頂いた患者検体(胸水、生検など)からの樹立に、28年度に引き続き複数成功しており、現在も引き続き作成中の細胞株も有している。また、薬剤探索用のモデル細胞としてBaF3細胞に各種Driver Oncogene(EGFRやERBB2, NTRK1融合遺伝子などと、その薬剤耐性変異株)を過剰発現させ、Driver Oncogeneに依存した細胞株の作製が順調に進んでいる。強力な変異原物質であるENUを用いたスクリーニングも28年度に引き続き実施し、新たな獲得耐性の同定にも成功するとともに、in vivoゼノグラフトモデルで投薬を続けることにより耐性腫瘍を作成することにも成功しており、耐性機構の解析を進めている。また、NTRK1陽性がんの多剤耐性変異と克服法を発見し報告することや、ROS1陽性がんの耐性細胞のユニークな特性について、EGFR変異陽性肺がんの変異アリル頻度と治療薬感受性についての論文発表等ができており、この点については予定以上の研究進捗といえる。29年度、やや予定以上の研究の進展が見られたため、引き続き下記の様に予定通り研究を進展させるとともに、予想以上の進捗のあったROS1陽性がんやEGFR陽性肺がん研究については、新規耐性機構解明、新規併用療法の検証等の研究を新たに追加して進める。(1)各種低頻度Driver Oncogene変異を有する肺がん細胞株で不足するものを29年度に引き続き収集し、患者検体からの培養株取得も、これまでの研究で培ったノウハウを結集し、培養細胞株化をする。そして、各細胞株に対応する上記各種TKI等への感受性を検討するとともに、耐性症例からはその耐性機構の解明を目指す。(2)各種低頻度Driver Oncogene産物に対する分子標的薬候補の探索のために、これまで作成してきた各Driver Oncogene (野生型と耐性変異型)を導入したBa/F3細胞を耐性変異が発見され次第作成するとともに、阻害薬候補の探索(併用療法を含む)を行う。また、引き続きENUやin vitro培養系、in vivoモデルによる耐性機構探索も行う。(3)発見した耐性克服療法から、より効果的なものを探していくとともに、併用療法の可能性を含めて検討を進めていく。また、in vivoやin vitroで樹立してきた耐性細胞の中で、どうしてもメカニズムが不明なものがいくつかあるため、プロテオームを含めて新しい手法を駆使し、メカニズムの解明ち克服法の発見に努める。肺線がんにおいては、EGFR、KRAS活性化型変異、ALK, ROS1, RET, NTRK等の融合遺伝子といったDriver Oncogeneが相次いで発見され、KRAS変異以外では数多くの治療薬の開発が進められている。EGFRおよびALK陽性肺がんでは、複数の薬剤がこれまでに承認され実臨床で使用できるようになってきたが、いずれの薬剤に対しても数年以内に獲得耐性が生じることが臨床上問題である。また、ROS1融合遺伝子陽性肺がんに対してはごく最近ALK阻害薬でもあるCrizotinibが本邦においても承認され、実臨床で使用できるようになったが、同様に獲得耐性の出現が報告されてきている。これまで応募者はALK陽性肺がんを中心に分子標的薬耐性研究を進め、数多くの新規獲得耐性機構を明らかにし報告してきたが、本研究においては、EGFR、ERBB2の比較的低頻度で見られる変異(Exon20挿入変異や耐性変異を含む)を中心に、新規治療法の探索を進めてきた。その結果、まずEGFR変異陽性肺がんの多剤耐性変異(あらゆる既存のEGFR-TKIに耐性)であるEGFR-C797S/T790M/活性型変異に対する薬剤を探索し、その治療法を発見することに成功した。これまでALK阻害薬として開発され、米国においてはCrizotinib耐性となったALK融合遺伝子陽性肺がんに対する治療薬として承認されているBrigatinibがこの多剤耐性EGFR変異に有効であり、さらに大腸がん治療薬として幅広く用いられている抗EGFR抗体を併用することで耐性を克服できることを発見し論文として報告した。

また、EGFRおよびERBB2のExon20挿入変異の細胞株を患者検体から樹立することに成功し、いくつかの候補薬剤とそれらに対する耐性機構の一部をIn vitroで発見した。研究はやや計画以上に進展しており、順調といえる。各種低頻度Driver Oncogene変異を有する肺がん細胞株で現在購入ができないものについて、一部は同意を頂いた患者検体(胸水、生検など)からの樹立に成功しており、また引き続き作成中の細胞も複数有している。また、薬剤探索用のモデル細胞として使用しているマウスBa/F3細胞に各種Driver Oncogene(各変異型EGFRやERBB2など)を過剰発現させ、Driver Oncogeneに依存した細胞株の作製が順調に進んでいる。また、一部は精製キナーゼのためのコンストラクトづくり等にも成功している。また、強力な変異原物質であるENUを用いたスクリーニングも実施し、新たな獲得耐性の同定にも成功している。また、EGFRの多剤耐性変異の克服法を発見し報告することができており、この点については予定以上の研究進捗といえる。肺線がんにおいては、EGFR、KRAS活性化型変異、ALK, ROS1, RET, NTRK等の融合遺伝子といったDriver Oncogeneが相次いで発見され、治療薬の開発が進められている。EGFRおよびALK陽性肺がんでは、複数の薬剤がこれまでに承認され実臨床で使用できるようになっており、ROS1融合遺伝子陽性肺がんに対してはALK阻害薬でもあるCrizotinibが承認され、実臨床で使用されている。しかし、いずれの薬剤に対しても数年以内に獲得耐性が生じることが臨床上問題である。29年度は、ERBB2のExon20挿入変異を有する細胞株を当該がん患者の胸水より樹立することに成功した。また、EGFRのExon20挿入変異の細胞株を新たに追加で樹立することに成功し、いくつかの候補薬剤とそれらに対する耐性機構の一部をIn vitroで発見した。その耐性機構の1つは薬剤の結合部位の1アミノ酸置換による変異であった。また、肺がんで非常に低頻度に見られるNTRK融合遺伝子について、現在臨床試験中の薬剤を含めて治療感受性及び抵抗性機構の解析を進め、5つの耐性変異とバイパス経路を介した耐性を発見し、さらにそれら耐性にも有効な薬剤や併用療法を発見し、論文として発表した。また、ROS1融合遺伝子陽性肺がんでは、ROS1阻害薬耐性細胞の解析から治療薬に依存して増殖するユニークな細胞の性状を明らかにすることに成功し、論文として報告した。また、EGFR変異陽性肺がんにおける新たな変異検出手法と、変異アリルの存在比率が次治療の感受性に関与する可能性を見出し、論文として発表した。各種低頻度Driver Oncogene変異を有する肺がん細胞株で現在購入ができないものについて、同意を頂いた患者検体(胸水、生検など)からの樹立に、28年度に引き続き複数成功しており、現在も引き続き作成中の細胞株も有している。
血管柄付骨膜弁とハイドロキシアパタイトによるハイブリッド型人工骨の研究

血流を有する自家骨移植である血管柄付き骨移植術は、悪性腫瘍切除や外傷・骨髄炎等に起因する骨組織欠損に対する有用な再建法である。一方、骨欠損が大きい場合や複雑な形状が要求される場合には、手術侵襲による患者の負担が大きく、手術手技が複雑になることも少なくない。われわれは新たな骨再建材料として、多孔性ハイドロキシアパタイトブロック(PHAB)と血管柄付き骨膜を併用したハイブリッド型人工骨の研究・開発を行っている。本法の特徴は、代用骨としてPHABを使用し手術侵襲の軽減をはかるとともに、3次元DICOMデータや実体モデルを利用したコンピュータ・デザインによるオーダーメイド人工骨が作成でき、自由度の高い硬組織再建が可能になる。従来の自家骨を用いるliving bone transferに並ぶ新しい再建材料として血行を有するハイブリッド型人工骨の臨床応用が確立されれば、硬組織再建を必要とする患者にとって大きな福音となると思われた。本研究では、PHABと血管柄付き骨膜を組み合わせた人工骨作成に関わる基礎的な知見を得るため、血管柄付き家兎肋骨骨膜をPHAB圧着した人工骨モデルを作成し、PHAB気孔内の骨形成過程について評価・検討を行った。血行を保持した骨膜をPHABに圧着することによりブロックの気孔内で高い再現性を有する骨形成を誘導することを確認した。さらに、気孔内の骨形成が12週まで経時的に進行すること、圧着した骨膜近傍の気孔より進行すること、ならびに気孔内で最外層から骨、造血細胞島を有する脂肪、血管の豊富な線維性結合織の3層構造が形成されることを明らかとした。以上の結果より、間葉系幹細胞が骨ならびに脂肪に分化すること、ならびに気孔内への定着に際し骨膜の深い関与が示唆された。これらは、PHABと骨形成能を有する血管柄付き骨膜を組み合わせが新たな骨組織再建材料としての有用性を支侍する基礎的な知見と考える。血管柄付きハイブリッド型人工骨の開発・臨床応用に向けた基礎的な証左を得ることを目的として、家兎を用いた肋骨骨膜付広背筋弁の実験モデルを開発し、多孔性HAブロック(以下PHAB)をこの血管柄付肋骨骨膜に圧着し、PHABの生体内における経時的な組織学的変化、特に気孔内での組織形成ならびに骨膜圧着面から各気孔内の組織形成の方向性について検討を行った。組織学的には、骨膜圧着ブロックの骨膜とPHAB気孔内および隣接する気孔間において、結合組織および骨組織は連続していた。新生血管は気孔間連通部を介して各気孔間で連結し、PHAB内で網状構造を呈していた。さらに、骨膜と気孔ならびに気孔間において、血管は結合組織および新生骨を介して連続していた。骨膜圧着面からの距離と各気孔の骨形成率に関する定量解析では、この両者間に負の直線的な相関関係が認められた。気孔内での各組織分布について標本上で円として観察される気孔の断面が,気孔の中心からどのくらい離れているかを変位率として表したところ、小さな円として標本上で観察された気孔の断面では、骨が占める割合が多く、これに次ぐ大きさの気孔の断面では,脂肪の割合が高い傾向がみられた。

以上の結果より、気孔内の骨新生は,骨膜圧着面近傍より遠位に向かい経時的に進行すること、骨の新生と造血細胞と含む脂肪の形成はほぼ同時に進行すること、各気孔内に形成される組織の立体的分布は,外層より新生骨・脂肪組織・新生血管を含む線維性結合組織となること、供給に際し骨膜の関与が推測される間葉系幹細胞が気孔内に定着し,骨ならびに脂肪に分化すること,ならびに新生組織が気孔内で特定の分布を示すことが示唆された。さらに、本実験モデルにrhBMP-2を添加したPHABを用いて経時的な骨形成について検討したところ、BMPにはその促進効果が認められた(平田晶子,丸山優,林明照:rhBMP-2添加ハイドロキシアパタイトを用いた血管柄付き人工骨.形成外科2004,47:993-1000)。優れた生体親和性を有する代用骨として臨床応用されている多孔性ハイドロキシアパタイトブロック(PHAB)と血管柄付き骨膜を組み合わせた人工骨作成に関わる基礎的な知見を得るため、血管柄付き家兎肋骨骨膜をPHAB圧着した人工骨モデルを作成し、PHAB気孔内の骨形成過程について評価・検討を行った。組織学的に経時的に進行する成熟骨の形成を確認、さらに赤芽球島を有する脂肪組織の形成ならびに気孔連通部を介した毛細血管網の形成をみた。一方、筋肉圧着ブロックの気孔内には、全実験期間内で骨および脂肪の形成は認めなかった。骨膜圧着ブロックにおける骨化率は、術後4、8、12週で各々平均0.00%、2.00%、3.15%であった。12週目の各気孔の骨形成率(気孔面積に対する骨面積比)と圧着骨膜間距離についてPearsonの積率相関係数を求め、z変換により検証したところ、有意な負の相関(係数-0.279、p<0.001,n=1038)を得た。気孔内における各組織の立体的分布は、骨が半径の外側約90%以遠、脂肪は約90-80%の間に多く形成され、半径70%よりも中心側では毛細血管を含む線維性結合織から構成されていた。本研究により、血行を保持した骨膜を圧着したPHABでは、気孔内において高い再現性を有する骨形成が誘導されることを確認した。さらに気孔内骨形成が12週まで経時的に進行すること、圧着した骨膜近傍の気孔より進行すること、気孔内で最外層から骨、造血細胞島を有する脂肪、血管の豊富な線維性結合織による3層構造が形成されることが明らかとなった。以上の結果より、間葉系幹細胞が骨ならびに脂肪に分化すること、ならびに気孔内への定着に際し骨膜の深い関与が示唆された。これらは、PHABと骨形成能を有する血管柄付き骨膜との組み合わせが有用な骨組織再建材料のひとつである可能性を示唆する基礎的な知見と考える。(Hirata A, Hayahshi A, Maruyama Y : Sequential histological examination and morphometric analysisonosteogenesis in the pores of porous hydroxyapatite with attachment of vascularized periosteum.J.Jpn.Cranio-Max.-Fac.Surg.,21,259-270,2005)
逆方向結合型プロテアーゼ阻害剤の分子設計によるマラリア治療薬開発

新規マラリア治療薬を開発するために、独自の非天然アミノ酸であるアロフェニルノルスタチンを利用して基質とは逆方向に結合するマラリア原虫プラスメプシンの阻害剤を合成した。標的が局在する酸性食胞へ集積させるために塩基性補助基を導入した既存の阻害剤は優れた抗マラリア活性を有するが、クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫では阻害活性が大きく減弱した。そこで、クロロキンの化学構造の一部に類似する2-アミノエチルアミノ基を持たない塩基性補助基を導入したところ、耐性原虫に対して強力な阻害剤を獲得した。新規マラリア治療薬を開発するために、標的のマラリア原虫プラスメプシンに対してアミノ末端が基質とは逆方向に結合するアロフェニルノルスタチン(Apns)含有阻害剤を設計し、有望な化合物を獲得した。(1) Plm IとKNI-10006のX線共結晶構造より、S2'ポケットから溶媒水に伸びる2,6-ジメチルフェノキシアセチル基は更に伸長させても結合に影響しにくいと考え、4-位を種々変換した誘導体を合成した。プラスメプシンが局在する酸性食胞へ集積させるために2-アミノエチルアミノ基の塩基性補助基を導入したところ、優れた抗マラリア活性を示した。しかし、誘導体のクロロキン感受性と耐性の熱帯熱マラリア原虫を比較すると、耐性原虫では増殖阻害活性が9倍近く減弱した。この結果を2-アミノエチルアミノ基がクロロキン構造の一部に類似するために薬剤耐性機構に影響を受けたと考え、2-アミノエチルアミノ基を回避した塩基性補助基を導入した。(2)合成した誘導体は、Plm IIに対してKi値が122 nMの強い阻害活性を示した。その中にEC50値が0.26 μMと良好な抗マラリア活性を示すものを同定した。クロロキン耐性原虫に対しては、活性の減弱は13.6倍で穏やかで、活性がクロロキン感受性原虫を上回る誘導体も見られた。この結果より、本研究を実施して得られた阻害剤はクロロキン耐性機序を回避でき、薬剤耐性マラリア原虫に有効な薬剤となる可能性がある。(3) KNI-10006にアミノカプロン酸リンカーを介してビオチン結合させたPlmプローブを合成した。このプローブはリコンビナントのHIVプロテアーゼに対して強い阻害活性を維持し、ストレプトアビジンカラムを用いてアフィニティー精製ができたことから、Plmへの応用が期待できる。新規マラリア治療薬を開発するために、標的のマラリア原虫プラスメプシンに対してアミノ末端が基質とは逆方向に結合するアロフェニルノルスタチン含有阻害剤を設計し、有望な化合物を獲得した。(1)プラスメプシンIとKNI-10006との共結晶構造から得られた知見から、2,6-ジメチルフェノキシアセチル基は更に伸長できると考え、4-位を種々変換した誘導体を合成した。2-アミノエチルアミノ基の塩基性補助基は優れた抗マラリア活性を示すが、クロロキン耐性原虫に対して増殖阻害活性が減弱したことから、2-アミノエチルアミノ基を回避した塩基性補助基を導入した。また、塩基性をもたない誘導体のKNI-10125が強い抗マラリア活性を有することから、KNI-10125の化学構造に特徴的なヒドロキシメチル基に着目した誘導体を合成した。(2)合成した誘導体は、プラスメプシンIIに対してKi値が110 nMの強い阻害活性を示した。KNI-10125の構造に由来するヒドロキシメチル基を有する誘導体の中には、EC50値が3-4 μMと良好な抗マラリア活性を示すものがあり、かつ、クロロキン耐性原虫に対して12倍程度の活性減弱であった。(3)プロリンロッドのリンカーを介してビオチン結合型阻害剤を合成した。このプローブはリコンビナントのHIVプロテアーゼに対して強い阻害活性を維持した。また、様々なリンカーの誘導体についてストレプトアビジンを担持したカラムや磁気ビーズを用いてアフィニティー精製を行ったところ、ペプスタチンのプローブと比較して顕著に優れていた。これらプローブを用いるプラスメプシンへの応用が期待される。新規マラリア治療薬を開発するために、マラリア原虫固有のプラスメプシンを標的としてアミノ末端が基質とは逆方向に結合する阻害剤を合成し、比較検討として順方向に結合するペプスタチン誘導体を合成した。(1)プラスメプシンIおよびHAPとのKNI-10006との共結晶構造では、2,6-ジメチルフェノキシ基は酵素ポケットの端に位置しており、補助基を伸長しても酵素蘇我活性に影響しにくいと考えた。そこで、フェノキシ基の4-位に置換基を導入した誘導体を種々合成した。また、これまでに2-アミノエチルアミノ基の塩基性補助基を導入するとクロロキン耐性原虫に対して増殖阻害活性が減弱したことから、2-アミノエチルアミノ構造を持たない補助基の導入を行った。これらのプラスメプシン阻害活性および抗マラリア活性の測定は検討中である。(3)フェノキシ基の4-位に数個のアミノカプロン酸リンカーを伸長させてビオチンを結合させた阻害剤プローブを合成したところ、アミノカプロン酸が少ないと酵素阻害活性およびアフィニティー精製におけるタンパク回収率が顕著に下がることが分かった。この結果を踏まえてビオチンを直接結合させたプローブを開発した。本プローブは強い酵素阻害活性を示すがストレプトアビジンを添加していくと阻害活性がほぼ消失することが分かった。

本結果は阻害剤を結合させた後に取り除かれ、阻害剤のON-OFFを制御できたことを示唆しており、阻害剤の全く新しい利用法として応用できると期待される。新規マラリア治療薬を開発するために、独自の非天然アミノ酸であるアロフェニルノルスタチンを利用して基質とは逆方向に結合するマラリア原虫プラスメプシンの阻害剤を合成した。標的が局在する酸性食胞へ集積させるために塩基性補助基を導入した既存の阻害剤は優れた抗マラリア活性を有するが、クロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫では阻害活性が大きく減弱した。そこで、クロロキンの化学構造の一部に類似する2-アミノエチルアミノ基を持たない塩基性補助基を導入したところ、耐性原虫に対して強力な阻害剤を獲得した。本研究を実施して、現在までに設計した塩基性補助基を有するプラスメプシン阻害剤や塩基性補助基をもたない阻害剤の中に、nMレベルの強い酵素阻害活性を示し、良好な抗マラリア活性を示す化合物を獲得している。中にはEC50値が0.26 μMを示す誘導体も見られ、これまでに報告されたプラスメプシン阻害剤の中でも抗マラリア活性が強いと言える。また、クロロキン耐性原虫に対して同等またはそれ以上の増殖阻害活性を持つ誘導体も同定できたことから、薬剤耐性の問題を克服できた点で非常に有望である。更に、本研究で設計したビオチン結合型阻害剤はペプスタチン誘導体と比較して標的結合能力が顕著に優れており、今後のプラスメプシンへの応用が期待される。薬剤耐性マラリア原虫に対して有効な阻害剤を同定するなどの十分な成果を得ており、本研究はおおむね順調に進展していると言える。医薬品化学得られた抗マラリア活性の結果の中に、活性が大きく低下したものや予想外に優れる化合物が得られたことから、これらの誘導体とプラスメプシンとの複合体の結合モデルを構築し、阻害剤設計にフィードバックして論理的な構造最適化を行う。本研究を実施して、現在までに設計したプラスメプシン阻害剤の中に、nMレベルの強い酵素阻害活性を示し、良好な抗マラリア活性を示す化合物を獲得している。更に、ビオチン結合型阻害剤を合成し、それらが標的結合能力において機能することを確認できた。初年度に計画していた塩基性をもたない補助基を有する誘導体等の合成が一部遅れているが、薬剤耐性マラリア原虫に対して有効な阻害剤を同定するなどの十分な成果を得ており、本研究はおおむね順調に進展していると言える。初年度に検討できなかった塩基性をもたない補助基を有する誘導体や他のプローブの合成については、本年度に優先的に実施する。また、得られた抗マラリア活性の結果の中に、活性が大きく低下したものや予想外に優れる化合物が得られたことから、これらの誘導体とPlmとの複合体の結合モデルを構築し、阻害剤設計にフィードバックすることにより、論理的な構造最適化を行う。残金の979円については、消耗品の購入を検討したが金額が足りなかったため、次年度に使用することにした。次年度使用額の979円は、次年度分と合わせて3,175円の消耗品の購入に使用する。
アルドステロンによる臓器障害の分子基盤

アルドステロン(Aldo)による臓器障害の分子基盤を解明する目的で、血管平滑筋細胞(VSMC)を用いたAldo標的遺伝子の探索を行った。その結果1)VSMCにミネラルコルチコイド受容体(MR)および11βHSD2が存在する;2)AldoはMRを介してイオンチャネル、Ca関連転写因子、炎症関連、およびRAS系関連遺伝子の発現を誘導する;3)Aldoが効果を発揮するにはグルココルチコイド受容体および関連共役因子の存在が必須である、等の事実を明らかとした。初年度の研究において我々は、以下の検討を行った。1.ミネラロコルチコイド受容体(MR)を発現する細胞株の探索MR依存性転写を解析するにあたり細胞内に内因性MRを発現しているか否かを明らかにすることが重要である。そこで米国ミシシッピ大学のゴメスサンチェス教授より供与された特異性の高い抗MR抗体を用いて各種細胞株を解析したところ、神経細胞株BE(2)CがMRのみを特異的に発現、また血管平滑筋細胞株A10がMR,GRとも発現していること、さらに大腸上皮細胞株T84はMR,GRとも発現していないことを、Western Blotting法により確認した。2.MR依存性転写に影響を及ぼす細胞内グルココルチコイド代謝酵素の発現解析MRリガンドであるアルドステロンがMRを介して作用するためには、コルチゾール不活化酵素11βHSD2が同時に発現している必要がある。そこでA10細胞における11βHSD1、2の発現を検討したところ、本細胞は11βHSD2のみならず11βHSD1も同時に発現していること、またTNFαなどの炎症刺激により11βHSD1の発現は上昇、逆に11βHSD2の発現は低下することが明らかとなった。したがってA10細胞はコルチゾールを不活化しアルドステロンが特異的に作用しうる細胞内環境を有していないことが示された。また独自に開発した細胞内グルココルチコイドバイオアッセイ系を用いて評価した結果、炎症刺激は実際に細胞内でコルチゾンをコルチゾールに活性化させる方向に作用することを見出した(Tsugita M, Iwasaki Y, et al. Life Sciences83:426-432,2008)。2年目にあたる平成21年度に私どもは研究課題に関連する2編の英文原著論文を出版した。1.脳内副腎コルチコステロイド作用の分子機序:脳内にはミネラルコルチコイド(MR)およびグルココルチコイド受容体(GR)が広範に発現している。我々は、鉱質コルチコイド作用を有するコルチコステロンがラット視床下部で転写因子FosBの発現に抑制的に作用していることを、in vivoおよびin vivoの系を用いて明らかにした(Das G, Iwasaki Y, Itoi K, et al, J Neuroendocrinol 2009 ; 21 : 822-831).この結果より、脳内GR,MRは誘導型転写因子の発現を介して生体のストレス制御系に重要な役割を果たしてると考えられた。また我々は昨年、脳内におけるGR,MRの過剰刺激がグルタミン酸NMDA1受容体の過剰発現を招来し、神経細胞死を惹起することを明らかにしている(Jing H, Iwasaki Y. et al.).すなわち中枢神経系においてGR,MRは中枢神経機能維持に不可欠である反面、過剰刺激は細死亡などの臓器障害を招来することを示した。2.GRの構造機能相関:糖質コルチコイド受容体には複数のアイソフォームがあり、ステロイド抵抗性への関与が推察されているが、その分子機序は明らかでなかった。我々は主要なアイソフォームであるGRβおよびGRγが、ステロイドホルモン作用のうち主として免疫系で機能する転写抑制に対し選択的にdominant negative作用を発揮することを始めて明らかにした(Endocrinology, 2010, in press).この結果は、臨床でしばしば問題となるステロイド不応性疾患の病態解明に貢献することが期待される。平成20-21年度の本研究で私共は、アルドステロンの分子標的であるミネラルコルチコイド受容体(MR)による遺伝子転写制御は、グルコチコイド受容体(GR)を発現しない細胞では再現することができず、GRの共存、ないし何らかの転写共役因子の共存が必要であることを明らかにした(Tsugita M,Iwasaki Y, et al. Life Science 83:426)。そこで本年産は、MRのみならずGR依存性の遺伝子転写調節にも焦点を当て、以下の検討を行った。1.GRによる転写調節の分子機構GRにはGRα(野生型)のほか多くのアイソフォームが存在する。私共は各アイソフォームの発現ベクターを作成してその機能を解析した結果、GRβおよびGRγが、GRαの作用を転写抑制効果特異的に優勢阻害することを明らかにした。この成果はアメリカ内分泌学会の学会誌に公式に掲載された(ENDOCRENOLOGY 2010;151:3204-3213)。

2.MRによる転写調節の分子機構MR依存性の転写に関しては、MR単独では転写誘導効果を発揮できないことから、MRと共役する可能性のある種々の転写共役因子との相互作用に関する検討を行った。その結果(1)代表的な転写共役因子であるCBPやp300はMRの機能に影響を与えない。(2)PGC1αおよびPBC1βは、MR依存性の遺伝子転写を有意に回復させる。(3)SRC1およびSRC3は、MR依存性の転写をさらに強力に誘導させる。特にSRC3の共存効果が最も強力である。(4)この効果は、MR蛋白のN末端部分(アミノ酸15-42)に依存しており、この部分を欠落させるとMRとSRC3により転写誘導活性が消失する。以上の結果を得た。上記の成果は、研究協力者である次田が、第37回日本神経内分泌学会で発表した。