hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオサイエンス研究・教育の現状に関する調査研究

本研究班は、バイオサイエンスの研究・教育推進の基盤整備に資する為に、平成2、3、4年度にわたって以下の項目について実施した。(1)わが国のバイオサイエンスに関する大学や研究機関における、研究・教育体制の充実と整備を図る為の研究教育動向調査を行った。(2)組換えDNA実験技術研究に関するわが国における業績および学術政策について歴史的に取りまとめを行った。(3)学術審議会のバイオサイエンス部会における検討に資する為に、国内外のDNA研究と教育に関する動向調査を青木班員と大山氏が協力して行った。(4)日本の遺伝子研究施設の研究活動の実態調査と、各大学、研究機関における遺伝子研究施設間の研究連絡のためのネットワークを作成した。(5)バイオサイエンス研究・教育の将来に向けての方針と方策の作成のプランをたてた。(6)バイオサイエンスと関連したバイオテクノロジーの普及のためのバイオサイエンストレーニングコースの検討と準備を行った。特に筑波大学と基礎生物学研究所におけるバイオサイエンストレーニングコースの準備のための支援を1986年以来引き続いて行ってきた。(7)日本における組換えDNA実験技術に関するガイドラインの変遷の記録を行った。特にガイドラインのついて、1979年に遡って13年間の記録を、飯野徹雄班員を中心にまとめた。(8)自然界において、DNA操作によって作成された動植物が放出された場合の安全性について検討した。(9)ヒノゲノムの研究の進展と、ヒトの遺伝子病の解析の進展によって可能になったヒト遺伝子病の遺伝子治療の基礎的研究の安全性について検討した。また遺伝子解析のための実験動物の研究についても検討した。以上9項目については、渡辺、青木、飯野の3班員を中心として各班員との研究連絡のもとで行った。本研究は、バイオサイエンスの研究、教育推進の基盤整備に資する為に、1.わが国におけるバイオサイエンスに関する大学や研究機関における、学部や大学院の研究・教育体制の充実と発展を図るための研究教育の動向調査。2.組換えDNA実験技術の新たな展開に関する調査研究。3.学術審議会バイオサイエンス部会における検討に資する為の基礎デ-タの収集と整理。特にヒトゲノムに関する研究推進に関する資料収集。4.わが国における組換えDNA実験技術の安全性の確保に関する検討資料の整備と資料作成等を行うことを主な目的として行った。以上の目的を達成する為に、以下の項目について実施した。1.わが国におけるバイオサイエンスに関する大学や研究機関の研究発展に伴う安全確保体制、実験実施施設及び設備の整備の向上に適応した安全指針の改正の為の資料収集と検討を行った。組換えDNA実験の安全審査や承認手続きを簡素化する為の資料収集と検討を行った。自然界で遺伝子交換があると考えられる生物間で組換え体を作製または増殖する実験を、実験指針の対象に含める為の資料を収集、整理した。2.バイオサイエンスに関する研究者、技術者、大学院生、学部学生の養成を図る為のモデルカリキュラムと、大学研究教育体制の資料作成及び研究の企画を支援体制の整備と資料作成を行った。岡崎市の基礎生物学研究所及び筑波大学を会場として、バイオトレ-ニングコ-ス開催を実現し、参考資料を供することができた。3.組換えDNA実験技術の新たな展開に関する調査と、研究設備と施設の調査を各大学に行き行った。4.ヒトゲノムの研究実施の為の設備、施設の資料作成と検討を行った。5.自然界において、組換えDNA実験技術によって作成された動植物が放出された場合の安全性について検討し資料作成を行った。以上の5項目について、班員の連絡をとりつつ調査研究を行った。本研究は、バイオサイエンスの研究・教育推進の基盤整備に資する為に、(1)わが国におけるバイオサイエンスに関する大学や研究機関における、研究・教育体制の充実と整備を図る為の研究教育動向調査と検討、(2)組換えDNA実験技術の新たな展開と開発に関する調査研究、(3)学術審議会バイオサイエンス部会における検討に資する為の基礎デ-タの収集と整理、またヒトゲノムプロジェクトの研究推進に関する資料収集と整理、(4)わが国における組換えDNA実験技術の安全性の確保に関する検討資料の整備と資料作成、(5)新しい生命操作技術の開発に伴う新しい実験技術の検討と調査、等を行うことを主な目的として行った。以上の各項目事項を達成するために、以下のような事柄を実施した。(1)わが国におけるバイオサイエンスに関する大学や研究機関の研究発展に伴う安全確保の体制として、実験実施施設及び設備の向上に適した安全指針の改正の為の資料収集と検討を行った。組換えDNA実験の安全審査や承認手続きを簡素化するための資料収集と検討を行った。DNA操作によって組換え体と作成または増殖する実験を、実験指針の対象に含める為の資料の収集と検討を行った。cDNAによってもたらされる実験結果のデ-テの取扱いに関する検討を行った。(2)バイオサイエンスと関連した、バイオテクノロジ-の普及のためのバイオトレ-ニングコ-スの検討と準備の技援体制作りの検討を行った。筑波大学におけるバイオトレ-ニングコ-スの課題と実施に関する検討と調査を行った。(3)ヒトゲノムの研究実施の為の設備と施設の検討を行った。(4)自然界において、DNA操作によって作成された動植物が放出された場合の安全性について検討した。(5)新しい生命操作技術の開発による新技術の安全性と取扱いについて検討した。以上の5項目について、渡辺、青木、飯野を主な連絡の中枢として、各班員との連絡のもとで行った。本研究は、バイオサイエンスの研究・教育推進の基盤整備に資する為に、3年目のまとめを中心として以下の項目について実行した。

(1)組換えDNA実験技術研究に関するわが国における業績および歴史的学術政策の取りまとめを行った。(2)国内外のDNA研究動向を過去15年間について取りまとめた。(3)日本の遺伝子研究施設の研究活動の実態調査と、各大学における遺伝子研究施設間の研究連絡のためのネットワークを作った。(4)バイオサイエンス研究・教育の将来に向けての方針と方策の作成のプランをたてた。(5)日本における組換えDNA実験技術に関するガイトラインの変遷の記録を作成した。文部省の学術審議会特定研究の一つであったバイオサイエンス部会運営のための資料を本研究班は過去3年間にわたってまとめてきたが、これを過去12年に遡って飯野徹雄班員を中心にしてまとめた。(5)に関する件についても、DNAに関する研究の推進にともなって改正を行ってきた実験指針について、初期にたてた研究者による自主的規制の精神を今日まで継続するために、表面にでただけの記録をまとめるだけでなく、その背景の多くの記録についても、飯野班員を中心として、文部省の学術国際局研究助成課の協力を得てまとめた。(1)(2)(5)については、1冊の報告書として出版される予定。(3)項目の実施として、本年度も基礎生物学研究所および筑波大学の遺伝子研究施設のスタッフを中心として、バイオテクノロジーとしての新技術修得を目的として、バイオトレーニングコースを公開実施した。本研究班はそのトレーニングコース実施のための資料作成と実験準備を支援した。ヒトゲノムの研究の進展と、ヒトの遺伝子病の解析の進展にともなって可能になったヒト遺伝子病の遺伝子治療の基礎的研究の安全性について検討した。また遺伝子解析のための実験動物についても検討した。本研究班は、バイオサイエンスの研究・教育推進の基盤整備に資する為に、平成2、3、4年度にわたって以下の項目について実施した。(1)わが国のバイオサイエンスに関する大学や研究機関における、研究・教育体制の充実と整備を図る為の研究教育動向調査を行った。(2)組換えDNA実験技術研究に関するわが国における業績および学術政策について歴史的に取りまとめを行った。(3)学術審議会のバイオサイエンス部会における検討に資する為に、国内外のDNA研究と教育に関する動向調査を青木班員と大山氏が協力して行った。(4)日本の遺伝子研究施設の研究活動の実態調査と、各大学、研究機関における遺伝子研究施設間の研究連絡のためのネットワークを作成した。(5)バイオサイエンス研究・教育の将来に向けての方針と方策の作成のプランをたてた。(6)バイオサイエンスと関連したバイオテクノロジーの普及のためのバイオサイエンストレーニングコースの検討と準備を行った。特に筑波大学と基礎生物学研究所におけるバイオサイエンストレーニングコースの準備のための支援を1986年以来引き続いて行ってきた。
看護師のワーク・ライフ・バランス（WLB）に関する調査研究

単身看護師のWLB実現度および単身看護師の労働条件の現状を明らかにすることを目的とし、病院に勤務する女性看護師15,025名を対象にした、無記名自己記入式質問紙調査のデータを分析した。単身看護師は、より過重な労働条件を強いられ、心身共に疲弊しており、WLBを実現しにくい現状にあることが示された。今後の看護組織においては、働く者全ての福利厚生を目指すWLB本来の理念に立ち返り、家庭役割のある看護師だけでなく、単身看護師のニードも考慮した包括的なWLB施策を整備していく必要があることが示唆された。一般企業を対象とした国内外の先行研究より、ワーク・ライフ・バランス施策に関する様々な取り組みが組織の構成員の福利に有用であることが明らかになった。しかし看護組織においては専ら出産・育児支援が中心であり、出産・育児期以外の看護師を対象とした先行研究はほとんど見当たらない。次年度は上記のレビューをもとに、看護組織における出産・育児期以外の看護師のワーク・ライフ・バランス施策に関して調査していく。対象施設の選定や調査日程の調整のため。一般企業を対象とした国内外の先行研究からは、ワーク・ライフ・バランス施策に関する様々な取り組みによって、組織の構成員や組織そのものに有効なアウトカムがもたらされることが明らかになっている。一方で、看護組織においては出産・育児支援施策が中心であり、出産・育児期以外の看護師のワーク・ライフ・バランスに着目した先行研究はほとんど見当たらなかった。過去に収集したデータをもとに再分析したところ、出産・育児期以外の看護師は、出産・育児期の看護師よりも、残業時間や夜勤回数が多く、ワーク・ライフ・バランス実現度が低いことが明らかになった。出産・育児期以外の看護師は、看護組織のワーク・ライフ・バランス支援施策の恩恵を受けておらず、出産・育児支援のしわ寄せとして労働条件が過酷になっていることが示唆された。調査施設と日程調整が難航し、新たなデータ収集ができていない。【背景】日本の看護師に対する現行のワーク・ライフ・バランス(work-life balance:以下WLB)施策は、出産・育児支援を中心として家族役割のある者の福利が最優先されており、単身看護師(母親・妻役割のない看護師)に業務等の皺寄せが生じている可能性があった。【目的】本研究は単身看護師のWLB実現度および単身看護師の労働条件の現状を明らかにすることを目的とした。【方法】病院に勤務する女性看護師15,025名を対象に、無記名自己記入式質問紙調査を実施した。【結果】単身看護師を非単身看護師と比較した結果、単身看護師は「WLB満足度」が有意に低かった(p<0.001)。また、心身のストレス反応(抑うつ度および身体的疲労度)は単身看護師が有意に強かった(いずれもp<0.001)。さらに、労働条件について比較した結果、単身看護師は非単身看護師よりも日勤回数、日勤時間数、日勤残業時間数、夜勤回数、夜勤時間数、夜勤残業時間数の全ての条件が有意に多かった(全てp<0.001)。【考察】単身看護師は、より過重な労働条件を強いられ、心身共に疲弊しており、WLBを実現しにくい現状にあることが示された。対象施設と具体的な調整をすすめ、データ収集していく予定。調査施設と交渉し、データ収集を行なっていく。看護管理学調査を実施できていないため。データ収集できなかったため、関連経費を使っていないため。今年度分の調査費用として繰り越す。データ収集に関連する諸経費として使用する予定。
役割演技の経路探索実験による状況論的な都市空間の評価手法の研究

人間が都市空間の中で経路を選択しながら目的地へと移動するプロセスである経路探索について、状況に埋め込まれた行為(situated action)と捉える状況論的な考え方から分析するための基礎的研究を行った。経路探索の状況に関して、まず人間と都市空間との関係の緊張度によって分類し、緊張の高い「避難」と、低い「散策」の状況を区別し、それらに対して日常的状況を区別する。日常的状況については、さらに人間が都市空間に対して示す習熟度の高い順に、「通い」、「探索」、「探査」と区別することとする。この分類に従って、日常的状況について過去に行ってきた経路探索実験にもとづくプロトコル分析の方法を厳密にした、これによって、迷いと発見を含んだ問題解決としての経路探索の特徴を、浅いプランニング、豊富な情報が外部から獲得できること、とりあえず行動によって状況が打開されること、語られないプロセスが多くあることが、明確に指摘された。当初予定した、状況ごとに被験者が様々な役割を演じる実験は実行することはできなかった。しかし、多様に設定することの可能な役割にもとづいて行う実験に関して、どのような視点から評価するべきかを次のように明確化することができた。1)迷いと発見はどのような場所で生じるか、2)行動のプラン作成はどのようになされるか、3)どんな情報によって確認するか、4)どのようなとりあえず行動を利用するか、5)どのような内容を発言するか、あるいは逆にどのような内容は発言しないか。これらの評価基準にたって、役割演技の経路探索実験を組織することではじめて、都市空間の評価手法に適用可能な知見を引き出すことができるものと思われる。同時にこれらの基準は、すでに行ってきた経路探索についての計算論的モデルの評価に利用できる。
口腔粘膜扁平上皮癌の化学療法効果と間質反応に関する免疫組織化学的研究

1.化学療法前後におけるIV型、VII型コラーゲンの分布様式と組織学的効果との関連対象41例の生検組織における分布様式はIV型、VII型コラーゲンともに、Group A:癌胞巣に連続性の線状反応がみられるもの(7/41,17.1%)、Group B:癌胞巣の線状反応に断裂がみられ、胞巣周囲にリンパ球が集族し胞巣内にリンパ球浸潤がみられるもの(14/41,34.1%)、Group C:癌胞巣の線状反応に断裂がみられ、胞巣内にリンパ球浸潤のみられないもの(20/41,48.8%)に分類された。なお、癌胞巣周囲に集族し胞巣内に浸潤するリンパ球の大部分はCD5陽性T細胞であり、症例によってCD4、CD8陽性T細胞の浸潤程度が異なっていた。CD16陽性細胞は癌間質に散在性に浸潤するのみであった。上述の分布様式と組織学的効果との関連をみると、有効例はGroup A:(5/7,71.4%)、Group B:(10/14,71.4%)、Goup:(2/20,20.0%)であった。さらに、これらの症例の大部分は化学療法後もGroup Cと判定され、発育先端部の生存癌細胞に基底膜の変化がみられた。2.化学療法前後におけるI型、III型、V型、VI型コラーゲンの分布様式と組織学的効果との関連対象41例の生検組織における分布様式はGroup 1:I型、III型、V型、VI型コラーゲンの染色程度が強く、リンパ球浸潤の程度が弱いもの(5/41,12.2%)、Group 2:リンパ球浸潤の程度が強く、コラーゲンの染色程度が弱いもの(24/41,58.5%)、Group 3:コラーゲンの染色程度、リンパ球浸潤の程度ともに弱いもの(12/41,29.3%)に分類された。これらの分布様式と組織学的効果との関連をみると、有効例はGroup 1:(2/5,40.0%)、Group 2:(14/24,58.3%)、Group 3:(1/12,8.3%)であった。さらに、化学療法後にGroup 1であった症例は21例(51.2%)で、いずれもコラーゲンの増生を認め、21例中14例が有効例であった。これに対し、Group 3は9例全例が無効例であった。
単一次元鎖磁石におけるGlauberダイナミクスの磁気相関制御と理論解明

単一次元鎖磁石のスピン反転ダイナミクスについては、その詳細な緩和過程は未だ不明な点が多い。例えば、単分子磁石の一次元相関問題、フェリ磁性鎖におけるスピンダイナミクス機構、ヘテロスピン系におけるスピン反転の理論、Glauberダイナミクスとスピン波の境界、などである。本研究では、多様な単一次元鎖磁石を合理的且つ系統的に設計し、その定量的・定性的な磁化緩和挙動の解析を行うことにより、Glauberダイナミクス機構に基づくスピン反転ダイナミクスの解明を行った。単一次元鎖磁石における磁化緩和の鎖内相関(相関長効果)を立証するために、単一次元鎖磁石に非磁性ユニットをドーピングし一次元鎖の有限長を任意にコントロールすることにより平均有限長における磁化緩和挙動を系統的にモニターし、磁化緩和現象の変換をとらえることを試みた。[Mn(5-TMAMsalen)M(CN)_6](M^<III>=Fe^<III>,Cr^<III>)のM^<III>をCo^<III>でドーピングした系[Mn(5-TMAMsalen)M_<1x>Co_x(CN)_6]について検討を行い、有限鎖長と磁化緩和との相関を明らかにすることに成功した。これらのドーピングにより、磁化緩和は無限鎖緩和から有限鎖緩和へ変換することが系統的に立証された。J_1及びJ_2で連結した一次元鎖磁石の磁化緩和は、その両交換相互作用に依存するはずである。[Mn^<III>-Ni^<II>-Mn^<III>]系一次元鎖で、J_2=0の二量化した系を見出した。この化合物の磁化緩和は、完全に二量体として振る舞うΔcF=2|D|S_2か、弱いJ_2で支配されたΔ_<DSF>=8J_2S^2+2|D|S^2のどちらかであることを示した。このような一次元鎖内相関の機構により系統的に磁化緩和現象が立証された例は世界で初めてである。Mn(III)-TCNQラジカルのフェリ磁性鎖は、数年来研究され、その磁化緩和現象は鎖間の相互作用によるスピン・グラス的挙動であると報告されてきた。しかし、結晶溶媒を含まない安定な一次元鎖[【Mn^<III>(5-TMAMsaltmen)TCNQ](ClO_4)_2を見出し、その磁化緩和現象が単一次元鎖磁石挙動であることを初めて示した。同様な化合物を系統的に設計でき、また、Mn(III)イオンを他の異方性金属に換えることも可能であるため、この系で鎖内相関と磁化緩和現象の系統的な調査を実施できよう。また、鎖内相関の強い単一次元鎖磁石の磁化緩和挙動の定量的取り扱いができる可能性もある。磁気相関の強い単一次元鎖磁石(SCM)、すなわち、Ising限界を超える相関を有する一次元鎖における磁化反転ダイナミクスは、一般にGlauberダイナミクスとして理解される磁化反転機構で説明がつかない。現在までに幾つかの化合物例が報告されているが、このような機構の違いに言及した例はほとんどない。このようなIsing限界を超えるような単一次元鎖磁石を系統的に設計し、Glauberダイナミクス機構と比較検討することは、単一次元鎖磁石全般の磁化反転ダイナミクスを統一的に解明する手がかりとなる。このような系を構築するため、[Mn^<III>(5-TMAMsalen)]^<3+>と[M^<III>(CN)_6]^<3-> (M^<III>=Co^<III>, S=0; Fe^<III>, S=1/2; Mn^<III>, S=1; Cr^<III>, S=3/2)との交互一次元鎖を合成し、同一構造を有するSCMのシリーズになることを突きとめた。このうち、Mn-Fe及びMn-Mnは強磁性SCM、Mn-Crはフェリ磁性SCMであり、これらの磁化反転機構が一般的なGlauber機構で説明できないことを見出した。また、極めて強い相互作用で連結したMn^<III>-radical交互鎖のシリーズである[Mn^<III>(5-TMAMsaltmen)(TCNQR_x)] (CIO_4)_2(R_x=H_4, F_2, CL_2, Br_2)を合成し、全ての化合物でSCM挙動を確認すると共に、磁化緩和現象が幅広い磁区形成エネルギーで説明できる可能性を示すことに成功した。未だ統一的な磁化反転機構の解明は行われていないが、このような例を数多く見出すことによって、近い将来解明できると思われる。現在までにMn^<III>_2M系強磁性型単一次元鎖磁石、Mn^<III>M系ヘテロスピン単一次元鎖磁石などの幾つかの化合物を見出し、その磁化緩和現象について解明してきた。

今回、Mn^<III>_2Cu^<II>S=7/2強磁性単一次元鎖磁石を合成し、その磁化緩和現象を解析したところ、シンプルな単一スピン反転によるGlauberダイナミクスでは説明できない磁化緩和現象を見出した。この化合物は、[Mn^<III>-Cu^<II>Mn^<III>]反強磁性S=7/2をスピンユニットとして、弱い強磁性的相互作用で連結された一次元鎖である。以前に報告したMn^<III>_2Ni^<II>S=3単一次元鎖磁石のSの大きさとスピンユニットの異方性(D)が異なることで解釈されるはずだが、異なる点として、スピンユニットが二量化したJ_1とJ_2の交互鎖を形成している点がある(J_1>J_2)。この場合、スピン反転機構は理論的にはJ2に縛られたダブルスピン反転により解釈できるが、実際に、J_1とJ_2の平均(シングルスピン反転)で考えるよりも、J_2のダブルスピン反転で取り扱う方が実験データをよく再現することが明らかとなった。今後強磁場EPR等の測定により磁化反転機構の解明を行う。
近世木版絵図史料の使用痕分析に関する基礎的研究

近世木版絵図は利用者と社会の要求に応えて、容易にその表現を変化させるという特徴があった。江戸絵図は図としての正確性と情報量が反比例する関係にあり、江戸城がその調整の空間として用いられていることがわかった。また、利用者は絵図上にその行動の痕跡を残している場合が少なくない。幕末期の江戸絵図の一部を、当時と近似した技術と素材で復元することに成功し、書き込み・折り目などの現れ方を実験する研究を続行している。木版江戸絵図の復元実験昨年度から繰越となっていた木版江戸絵図の復元は、当初、引き受け可能な美術系大学関係者、あるいは木版画製作者の承諾を得られず難航したが、さいわい12月に至って、浮世絵職人グループから協力を得ることが出来た。ただし、江戸絵図の細密な木彫り技術は現在の職人の予想を超えるものであることも同時に判明、企図を変えない範囲で一部を省略する復元方法を選択し、すべての工程を終えた。復元した絵図に書き込む実験については、絵図が十分に枯れるのを待ってから実施する予定である。(補助事業完了時期:平成23年1月31日)近世の木版絵図に所蔵者が移動経路等を墨で書き込んでいる事例を分析していくための手法や観察手段を見いだすことに、本研究の第一の目的がある。まず当時の技法を用いて江戸絵図を部分的に復元することに取り組み、本年度末に無事この過程を終えることができた。携わった彫り師・刷り師からは、浮世絵とは違う、江戸絵図独自の技術的特徴があることが指摘され、その経験を聞き取ることができた。第二に木版江戸絵図の分析を蓄積して、近世都市民の江戸都市空間に対する認識をあぶり出すことに取り組んできた。この点については、特に江戸城に関する認識の特徴と変化を見いだすことができ、東京大学史料編纂所主催のシンポジウムで報告を行った(経費は東京大学による)。今回の使用痕分析の対象としている絵図においても、所蔵者が江戸城内やその近辺に立ち寄っていることは確実であり、分析のひとつの視座を得られたと考えている。第三に東北地方に所在する近世絵図史料の状況把握と撮影を含む調査を進め、今後の絵図研究の基盤を築くという狙いがあった。こちらについては仙台市内において順調に成果を上げたものの、秋田県内の調査時に東日本大震災が発生し、調査を中断せざるを得なかった。また、撮影した絵図を投影し、分析するために用いるプロジェクターが急遽必要となり、本年度の予算を23年度に一部繰り越し、対応することにした。東日本大震災の影響で本年度は平成23年10月まで研究を執り行うことができず、その後一部経費を繰り越しつつ、作業を進めていたものの、平成24年9月に発症した病気のため、平成24年10月から25年3月まで病気休暇を取って治療に専念せざるを得なかった。そのため、本研究を構成する各研究については以下のような成果を上げつつも、完成には至っていない。1『分間懐宝御江戸絵図』の一部を復元し、書き込み等で使用痕の現れ方を確認する実験的研究については、復元までは終え、木版職人の聞き取りなどによって、木版絵図の技術に関する全体像が明らかとなった。だが書き込み等により色のにじみなどを把握する実験は中断せざるを得なかった。2同絵図の所蔵者と考えられる土佐藩士に関する研究は高知市における前年度の調査により史料分析を進めることができ、当該藩士の家系・居所・役職・幕末における動きの概要が明らかとなった。また当人が報告に関与したと考えられる藩文書の所在を把握でき、追加調査が必要となったがそれは果たせなかった。3江戸絵図全体の歴史過程については、江戸城に関する描写に軸をおいて時期区分を明らかにし、論文で報告するとともに分析の基盤を確立することができた。4東北地方における絵図史料調査については、平成22年度までのデータについて整理を行ったが、本年度における新しい発見・調査はなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。
卵白リゾチームの翻訳後修飾による高機能化

本研究では、リゾチームをモデル蛋白質として用い、酵母発現系で意図的に翻訳後修飾を利用して、グリコシル化、リポフィル化のための分子設計を行い、耐熱性、乳化性などの物性機能改変、抗菌性などの生理機能の改変、アレルゲン性の低減化などを試み、食品受容性及び健康保全性を備えた安全な食品蛋白質の開発を図るための分子設計基盤を確立することを目的とした。初年度では酵母発現系により、リゾチームcDNAにAsn-X-Thr/SerのN-型糖鎖付加配列を導入し、糖鎖長の異なるオリゴまたはポリマンノシル化リゾチームを作製し、糖鎖長の機能に及ぼす影響、特にアレルゲン性低減化に及ぼす影響を調べ、アレルゲン性が著しく低減化できることを明らかにした。また、酵母S.cerevisiaeで発現させるとマンノースが約300残基程度結合したポリマンノシル化リゾチームが得られるが、酵母Pichia Pastorisで発現させると他の真核生物と同様のマンノースが9-12残基結合したオリゴマンノシル化リゾチームが得られることが明らかになった。次年度はリゾチームのN--末端側にミリスチル化シグナル配列を導入し、リポフィル化を行い、物性改変、抗菌機能の改変を図った。リゾチームのN-末端にミリスチル化シグナル配列(Met^1-Gly^2-X^3-X^4-X^5-Ser/Thr^6-)を導入するようにcDNAを改造し、酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、リポフィル化リゾチームを調整した。酵母にはN-ミリスチルトランスフェラーゼが存在するために、ミリスチル化リゾチームの発現が期待できるが、小胞体に移行しないので、サイトゾルでの蛋白質合成中にミリスチル化されたリゾチームが得られたが、フォールディングがうまくいかず、抗菌活性の改変は成功しなかった。現在、フォールディングがうまくいくシステムを検討している。リポフィル化と同様の抗菌性の改変を目的として、疎水性ペプチド(Phe-Phe-Val-Ala-Pro)をC末端に融合したH5リゾチームを作成し、大量に発現、分泌することを明らかにした。これらの遺伝子修飾リゾチーム遺伝子を植物に導入し、抗菌性の強化されたタバコの作成に成功した。本研究では、リゾチームをモデル蛋白質として用い、酵母発現系で意図的に翻訳後修飾を利用して、グリコシル化、リポフィル化、リン酸化のための分子設計を行い、耐熱性、乳化性などの物性機能改変、抗菌性などの生理機能の改変、アレルゲン性の低減化などを試み、食品受容性及び健康保全性を備えた安全な食品蛋白質の開発を図るための分子設計基盤を確立することを目的とした。そのために、10年度は酵母発現系により、糖鎖長の異なるオリゴまたはポリマンノシル化リゾチームを作製し、糖鎖導入によるリゾチームならびに高機能化変異体を大量発現を試みた。この結果、糖鎖認識配列Asn-X-Thr/Serを49位または19位に糖鎖が結合するように、デザインされたリゾチームは極めて熱安定型であり、酵母での分泌量も野生型の5倍量多いグリコシル化リゾチームを発現した。また、リゾチームのC末端にPhe-Phe-Val-Ala-Proのペンタペプチドを融合するようにデザインし、抗菌性をグラム陰性菌に抗菌性を示すようにした抗菌性強化リゾチームもグリコシル化により多量に発現させることに成功した。さらに、リゾチームのアレルゲン性低減化に糖鎖付加が効果があることも明らかにした。すなわち、野生型リゾチームとグリコシル化リゾチームを腹腔内投与により、生じるリゾチームIgEを比較検討したところ、グリコシル化により、IgEの産生量は著しく抑制されることが示された。以上の結果から、蛋白質の翻訳後修飾を利用したグリコシル化は蛋白質の機能を改変するのに有効な手段であることが示された。リゾチームのN-末端にミリスチル化シグナル

配列(Met^1-Gly^2-X^3-X^4-X^5-Ser/Thr^6-)を導入するようにcDNAを改造し、酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、リポフィル化リゾチームを調整した。酵母にはN-ミリスチルトランスフェラーゼが存在するために、ミリスチル化リゾチームの発現が期待できるが、小胞体に移行しないので、サイトゾルでの蛋白質合成中にミリスチル化されたリゾチームが得られたが、フォールディングがうまくいかず、抗菌活性の改変は成功しなかった。現在、フォールディングがうまくいくシステムを検討している。リポフィル化と同様の抗菌性の改変を目的として、疎水性ペプチド(Phe-Phe-Val-Ala-Pro)をC末端に融合したH5リゾチームを作成し、大量に発現、分泌することを明らかにした。これらの遺伝子修飾リゾチーム遺伝子を植物に導入し、抗菌性の強化されたタバコの作成に成功した。本研究では、リゾチームをモデル蛋白質として用い、酵母発現系で意図的に翻訳後修飾を利用して、グリコシル化、リポフィル化のための分子設計を行い、耐熱性、乳化性などの物性機能改変、抗菌性などの生理機能の改変、アレルゲン性の低減化などを試み、食品受容性及び健康保全性を備えた安全な食品蛋白質の開発を図るための分子設計基盤を確立することを目的とした。初年度では酵母発現系により、リゾチームcDNAにAsn-X-Thr/SerのN-型糖鎖付加配列を導入し、糖鎖長の異なるオリゴまたはポリマンノシル化リゾチームを作製し、糖鎖長の機能に及ぼす影響、特にアレルゲン性低減化に及ぼす影響を調べ、アレルゲン性が著しく低減化できることを明らかにした。また、酵母S.cerevisiaeで発現させるとマンノースが約300残基程度結合したポリマンノシル化リゾチームが得られるが、酵母Pichia Pastorisで発現させると他の真核生物と同様のマンノースが9ー12残基結合したオリゴマンノシル化リゾチームが得られることが明らかになった。次年度はリゾチームのN--末端側にミリスチル化シグナル配列を導入し、リポフィル化を行い、物性改変、抗菌機能の改変を図った。リゾチームのNー末端にミリスチル化シグナル配列(Met^1-Gly^2-X^3-X^4-X^5-Ser/Thr^6-)を導入するようにcDNAを改造し、酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、リポフィル化リゾチームを調製した。酵母にはN-ミリスチルトランスフェラーゼが存在するために、ミリスチル化リゾチームの発現がが期待できるが、小胞体に移行しないので、サイトゾルでの蛋白質合成中にミリスチル化されたリゾチームが得られたが、フォールディングがうまくいかず、抗菌活性の改変は成功しなかった。
キサンチン酸化還元酵素における阻害剤の作用の研究―「鍵と鍵穴」のドグマを超えて

XORはキサンチンを尿酸にする酵素であり、過剰な尿酸の蓄積は痛風の原因となる。XORは細菌からヒトまで存在し、3次元構造は全ての生物種で酷似していて同じ反応機構により尿酸生成を行う。しかし、日本で開発された痛風治療薬febuxostatは、哺乳類XORを阻害するが、細菌XORを阻害しないことが酵素学的実験からわかった。このことは、阻害剤と酵素の静的な3次元構造(いわゆる鍵と鍵穴)では簡単に理解できないことを意味しているが、動的な視点に着目し、分子動力学計算を行うことによって説明することに成功した(Sci. Rep. 2, 331; DOI:10.1038/srep00331 (2012))。阻害剤febuxostatが、哺乳類のXORには効くがバクテリアのXORには効かないという実験事実を示し、その差異の原因が、本来の基質と結合する酵素側鍵穴部分の活性部位アミノ酸の影響ではなく、酵素の鍵穴の入り口付近のアミノ酸の違いにあることを分子動力学計算によって指摘した(Sci. Rep. 2, 331; DOI:10.1038/srep00331 (2012))。それを受けて、XORのアミノ酸置換モデルにfebuxostatが結合した結合モデルに対して、MM-PBSA法やGB-SA法を用いて結合自由エネルギーを計算し、阻害作用を議論している。一方で、反応の前後の状態だけから自動的に反応経路を計算する手法であるstring法やパスサンプリング法の開発を、研究分担者の藤崎が行い、パスサンプリング法を発展させ、簡単なリガンド結合の系を例にして計算することに成功した(PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002555-1-12)。今後、XORとfebuxostatの系にも適応させる目途がついた。XORの生体中での機構は、補酵素モリブドプテリンが、基質キサンチンと共有結合で結合して電子を奪うが、阻害剤FYX-051は、キサンチンと同様、モリブドプテリンと共有結合すると同時に、febuxostatのように鍵穴を埋め尽くすという、2つの阻害方法を伴っている。このFYX-051がモリブドプテリンに共有結合をして、電子が奪われる際の化学反応の機序に関して、研究分担者の岡本は、X線結晶構造解析を基にしてそのモデルを提唱した(Current Pharmaceutical Design2013;19:2606-14)。阻害剤側の重要な部位を明確にすること等、FYX-051とfebuxostatを比較しながら研究を進めるために意義のある研究結果である。XORはキサンチンを尿酸にする酵素であり、過剰な反応による尿酸の蓄積は痛風の原因となる。しかし、日本で新規開発された痛風治療薬febuxostatは、哺乳類酵素は阻害するが、細菌酵素を阻害しないことが分子動力学計算と酵素学的実験から申請者らにより実証された(Sci. Rep. 2, 331; DOI:10.1038/srep00331 (2012))。この阻害作用の違いの原因を検討した結果、本来の基質と結合するXOR側鍵穴部分活性部位アミノ酸の影響ではなく、XORの鍵穴入り口付近の幾つかのアミノ酸の違いによるものではないかとの仮説が浮かび上がった。そこで、阻害作用の違いに影響を及ぼすと考えられるアミノ酸を、別のアミノ酸に置換したモデルを計算機上で作成し、そのモデルに対して分子動力学計算を行って上述した仮説の妥当性を確認している。計算量が膨大で現在も計算進行中である。阻害剤febuxostatに加え、阻害剤BOFに関しても阻害作用機構の研究を始めた。BOFは薬としてまだ認可されておらず、哺乳類XORに対してはfebuxostatより若干阻害作用が弱く、細菌XORに対してはfebuxostatよりも若干阻害作用が強い性質を持つ。まず、BOFが結合したウシXORの結晶構造が岡本らにより決定された(論文発表の準備中)。分子動力学計算の結果、ウシXORに関しては3次元構造の変化はない一方、細菌XORに関しては、BOFがXORから外れる動きと共役して、XORのチャンネルを形成している1つのペプチドループが、外部にゲートを開けるような動きを示した。このループの動きに関しては、学術的に重要な内容を含んでいるので、現在発表を準備している。キサンチン酸化還元酵素(XOR)は、キサンチンを水酸化して尿酸に変換する酵素であり、その過剰な反応は痛風の原因となる。

痛風治療薬として日本で新規開発された阻害剤(フェブキソスタット)は、哺乳類には確かに効くがバクテリアには効かないという実験結果を示し、理論計算からその原因を説明した(Sci. Rep. 2, 331; DOI:10.1038/srep00331 (2012))。このことは、実施計画前半部分に関する成果であり、研究目的であった、XORの阻害作用の解明(フェブキソスタットの場合)を正に果たしたものである。具体的には、本来の基質と結合する酵素側鍵穴部分の活性部位アミノ酸の影響ではなく、酵素の鍵穴の入り口付近のアミノ酸の違いが重要な影響していることを明らかにした。鍵穴の形状は、種の違いによってほとんど同じであり、ファブキソスタットは哺乳類に対してもバクテリアに対しても、鍵穴の空間を埋めるようにコンタクトしていて、現在のドッキングソフトウェアでも両者の違いを見出せなかった。生体反応で良く言われる、いわゆる「鍵と鍵穴」のような静的な描像では説明するのが困難な現象であり、動力学計算を通してはじめて、その現象を理解することが可能であった。このことは「鍵と鍵穴」のドグマを超える内容であり、学術的な意義がある。また、この研究結果で新たにわかった知見は、今後の製薬に対する示唆も与えている。すなわち、フェブキソスタットのように、バクテリアには効かないが人には効くという他の病気を治療する薬があれば、人にとって有用である腸内細菌には効かないが病気そのものには効くという薬の開発可能性を物語っている。また、逆に、バクテリアには効くが、本来人間に備わっている酵素には効かない薬の開発可能性も同時に物語っていて、そのような薬は、人に直接害を及ぼすバクテリアを殺すのに有効であろう。フェブキソスタットは、哺乳類には効くが、バクテリアには効かないことに関して、従来のドッキングソフトウェアでは、その違いを明らかにすることはできなかったが、分子動力学計算を行うことによって、実験事実を再現することが出来た。その違いの原因に対して、幾つかのアミノ酸残基の原因であることの予測は出来ているが、結論には至っていない。酵素と阻害剤の結合自由エネルギーを精度良く量的に計算することに対する困難にぶつかっている。しかし、別のアプローチである、string法やパスサンプリング法の開発に関して、簡単なリガンド結合の系を例にして計算することに成功した。XORの補酵素部分と共有結合をすると同時に、フェブキソスタットのようにXORの鍵穴を埋め尽くすタイプの阻害剤であるFYX-051の電子伝達に関わるモデルを、X線結晶解析から提出することができ、フェブキソスタットと比較しながら研究を進めていくための重要な結果が得られた。すなわち、阻害作用における阻害剤側の重要な部位を特定するための重要な結果が得られたということである。細菌、鳥、哺乳類に対して、フェブキソスタット、Y-700、BOFなどの阻害剤に関して、分子動力学計算に基づいて、まだ実験事実と類型的に比較できていないが、その準備は着実に進行している。当初の計画通り、平成23年度において、バクテリアと哺乳類のキサンチン酸化還元酵素に対する阻害剤(フェブキソスタット)の阻害効果の違いに関して、分子動力学ソフトウェアであるAmberを利用してその原因を説明することができ、一流のジャーナルに掲載することができた。ただし、研究計画において記述した、熱力学的に重要な相互作用に関して定量的な議論をするに至っていない点がある。
ナノ-マイクロ制御構造・空間を有するモノリス型分離デバイスの創製

モノリス骨格の表層に各種機能性分子を担持させ、ポリマーモノリスの高機能化を図るとともに、モノリスカラムの特性を最大限に引き出せるシステム・装置の開発を進めた。以下に本年度の具体的な研究成果をまとめる。1)有機ポリマーモノリスを用いたタンパク質解析用オンライン酵素消化・分離計測システムの開発プロテオーム解析において高速化のボトルネックとなっているタンパク質の酵素消化に関して、モノリス担体に消化酵素を固定したマイクロリアクターモノリスを試作し、その性能を評価した。数マイクロメートルの微小流路を反応場として用いるモノリスカラム法では、バッチ式反応容器と比べて、反応効率が格段に改善され、従来比1/100の反応時間で定量的にタンパク質を消化できた。本カラム法では、10分以内に酵素消化を達成できることから、酵素消化と分離分析、さらに質量分析の各工程をオンラインで接続でき、"Just in time"でタンパク質の解析を行える。2)マイクロ固相抽出・濃縮デバイスの開発前処理の高速化、簡便化を目指して、モノリス型マイクロ固相抽出・濃縮デバイスの開発を検討した。除粒子、清澄ろ過等の前処理に汎用されている市販のシリンジフィルターを容器として用い、その内部スペースにメタクリル酸グリシジルベースのモノリス担体を調製した。その表層にエポキシ基の開環反応を利用して8-キノリノールやイミノジ酢酸を固定することにより、微量金属元素捕集用のキレート交換モノリスを作製した。本デバイスのキレート交換容量は1-2μmol/tipであり、200mLの海水に含まれる銅や亜鉛、さらに超微少量の希土類元素を定量的に捕集・回収することができた(100倍濃縮)。その結果、ICP-MSにより、これまで測定が困難であったsub-pptレベルの超微量元素を精度よく定量することに成功した。高性能な分離機能材料の創製に向けて、放射線や電子線を利用したナノ-マイクロファブリケーション技術の開発に取り組むとともに、多様なポストゲノム研究に対応可能な高性能分離計測システムの構築を図った。以下に具体的な研究成果をまとめる。1)放射線を利用したナノ-マイクロファブリケーション技術の開発γ線の線量率、照射時間、反応温度等の条件を検討し、重合度や構造が高度に制御されたモノリスポリマーを作製する条件を見出した。本法を用いることにより、一般的な熱重合に基づく手法と比較して、カラムの分離能を23倍程度向上させることができた。2)有機ポリマー製ミクロ・セミミクロモノリスカラムの開発前述の放射線重合法、また改良を加えた熱重合法により、低背圧でありながらも高い分離能と機械的耐久性を有するメタクリレート系モノリスポリマーを作製することに成功した。このモノリスカラムは2桁に及ぶ幅広い流量域で使用可能であり、低流速(通常流量)での高性能分離と高流速での超高速分離を1本のカラムで実現できる。また、カラムサイズのスケールアップにも取り組み、これまで報告されているものよりも、直径にして3倍程度大きなセミミクロスケールのモノリスカラムを作製することに成功した。これにより、一般の検出器をそのまま利用できる、また、試料負荷量を10倍にできるなど実用性・汎用性が格段に向上すると期待される。3)温度・流速グラジエント溶離HPLCシステムの構築と評価モノリスカラムは圧力損失が低く高速送液が可能である。一方、ミクロ・セミミクロサイズのカラムは熱容量が小さいという特長がある。これらの特性を分離に利用すべく、従来の濃度勾配溶離に加えて、流速や温度勾配溶離を可能とするシステムを構築し、タンパク質の高速分離に応用した。この装置を用いることにより、4種類のタンパク質を20秒以内にベースライン分離することができた。多様なポストゲノム研究に対応すべく、モノリスカラムのバリエーションの充実を図るとともに、モノリスカラムの特性を最大限に引き出せるシステム・装置の試作を試みた。1)プロテオーム解析用ミクロ・セミミクロモノリスカラムの開発プロテオーム解析への応用を視野に入れて、疎水性度の異なる逆相モノリスカラム、交換容量の異なる陽イオン交換および陰イオン交換モノリスカラムを作製した。また、カラムサイズのバリエーションも今後重要になると考え、カラム内径のスケールアップに取り組み、内径150μmのキャピラリーサイズのカラムから、潜在的ニーズの高い内径1mmのセミミクロサイズのものまで、実用的に十分な性能を有する有機ポリマー製のモノリスカラムを作製することに成功した。本モノリスカラムは流体透過性が高く、また、機械的耐久性に優れているため、通常の10倍速での送液も可能であり、10種類のタンパク質を3分足らずで良好に分離することができた。2)メタロミクス研究用無機・有機成分同時複合計測システムの開発タンパク質のおよそ40%は金属が結合した金属タンパク質であるが、そのなかには金属を身体の各部位に輸送するタンパク質もあれば、貯蔵するタンパク質、また金属が結合することによってはじめて生理機能が発揮される金属酵素もある。本研究では、そのような金属タンパク質、金属酵素の探索を目的として、モノリスカラムによりタンパク質やペプチドを分離後、無機質量分析装置(ICP-MS:誘導結合プラズマ質量分析計)と有機質量分析装置(ESI-MS:エレクトロスプレーイオン化質量分析計,MALDI-TOFMS:マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計)によりオンラインで並列に解析する複合分析システムを構築した。さらに、本分析システムを用いてヒト血清タンパク質の分析を行い、血清中微量元素の存在状態に関するデータを収集した。

モノリス骨格の表層に各種機能性分子を担持させ、ポリマーモノリスの高機能化を図るとともに、モノリスカラムの特性を最大限に引き出せるシステム・装置の開発を進めた。以下に本年度の具体的な研究成果をまとめる。1)有機ポリマーモノリスを用いたタンパク質解析用オンライン酵素消化・分離計測システムの開発プロテオーム解析において高速化のボトルネックとなっているタンパク質の酵素消化に関して、モノリス担体に消化酵素を固定したマイクロリアクターモノリスを試作し、その性能を評価した。数マイクロメートルの微小流路を反応場として用いるモノリスカラム法では、バッチ式反応容器と比べて、反応効率が格段に改善され、従来比1/100の反応時間で定量的にタンパク質を消化できた。本カラム法では、10分以内に酵素消化を達成できることから、酵素消化と分離分析、さらに質量分析の各工程をオンラインで接続でき、"Just in time"でタンパク質の解析を行える。2)マイクロ固相抽出・濃縮デバイスの開発前処理の高速化、簡便化を目指して、モノリス型マイクロ固相抽出・濃縮デバイスの開発を検討した。除粒子、清澄ろ過等の前処理に汎用されている市販のシリンジフィルターを容器として用い、その内部スペースにメタクリル酸グリシジルベースのモノリス担体を調製した。その表層にエポキシ基の開環反応を利用して8-キノリノールやイミノジ酢酸を固定することにより、微量金属元素捕集用のキレート交換モノリスを作製した。本デバイスのキレート交換容量は1-2μmol/tipであり、200mLの海水に含まれる銅や亜鉛、さらに超微少量の希土類元素を定量的に捕集・回収することができた(100倍濃縮)。その結果、ICP-MSにより、これまで測定が困難であったsub-pptレベルの超微量元素を精度よく定量することに成功した。
唾液腺主導管上皮の機能的・形態的解析VI.tuft cellの分泌能に関する研究

2.Tubulovesicularsystemは小胞や小管から構成されているが、非常に変異が多く、各試料毎形態が異なっている。Tubulovesicularsystemの形態を明らかにする目的で電顕超薄切片の三次元再構築法を用い検討し、小胞が一部連続し超薄切片を切る角度により形態に変異が生じていることが明らかになったTubulovesicularsystemは微絨毛が伸びる時、膜の供給をしている可能性が示唆された。3.Tuft cellの分泌能を検討するため多糖類の素材であるガラクトースを^3Hでラベルし腹腔に投与し、経時的(5分、20分、2時間、6時間、24時間)に試料を取り出し、光顕および電顕によるオートラジオグラフィー法にて検討した。Tuft cellはすべての時間を通してtuft cell全体で2から3個の現像銀がゴルジ装置、グリコーゲン領域、微絨毛に観察されるのみで、主導管の主細胞である明調細胞のように数多くの現像銀は観察されなかった。Tuft cellに於いてはガラクトースは一部はグリコーゲンの素材として、又糖鎖の素材として使用され、多糖類の分泌能はないものと推測された。唾液腺主導管上皮は線条部導管と同様にイオンの修飾を行い低張の最終唾液形成に関与することが知られている。膵管、胆嚢、気管、肺胞、胃腸域に存在するtuft cellが主導管にも存在している。この細胞の機能に関しては感覚細胞説、吸収細胞説、分泌細胞説が提唱されているが、今だその機能に関しては不明である。数年に渡る研究にり吸収細胞ではないかという考えに至った。直接に分泌能を証明するためにRI物質を投与し、代謝される過程をオートラジオグラフィー法により検討した。(1)投与するRI物質を決定するために各種レクチンに対するtuft cellの染色性を調べた。(2)RI物質を投与し光顕に於いて露出の時間と、投与したRI物質が適当であったか調べた。【結果】(2)光顕オートラジオグラフィー(^3H-galactose取り込み実験)ラット7週齢(体重220g)を3匹使用した。5分後、10分後、40分後に試料を採取した。スライドグラスに標本を取り、乳剤をかけて暗箱に入れ、114週毎取りだし、現像を行い露出時間を決定した。露出時間は14週が適当であったが、投与した物質が適当でなくtuft cellに反応はみられなかった。来年度はN-actylgalactosamineでやる予定である。低張の最終唾液産生に関与することが知られている唾液腺主導管には幾つかの機能が分かっていない細胞が存在している。その一つにtuft cellがある。数年に渡る研究により分泌細胞ではないかという考えに至り、tuft cellの分泌能を証明するためにRI物質を投与し、代謝される過程をオートラジオグラフィー法により検討した。昨年度の研究によりtuft cellの小胞はレクチンのSBAに反応することが分かったので、SBAの結合糖であるGal(galactose)をトリチウムでラベルしたものを投与し光顕オートラジオグラフィー法により検討した。tuft cellに反応が少なかったので、今年度はSBAの別の結合糖であるGalNAc(N-acetylgalactosamine)を投与する予定であったが、市販されていず、作成を依頼したが、現在のところ作成が困難ということであった。3H-galactose取り込み実験を電顕オートラジオグラフィー法により詳細に検討した。【結果】ラット7週齢(体重220g)を3匹使用した。3.3mCiの3H-galactoseを腹腔内に投与後、経時的(5分、10分、40分)に主導管を切り出した。グリッドに切片をのせ、乳剤をかけ14週間冷凍庫にて露出を行った。露出終了後脱ゼラチンを兼ねて、二重染色を行い検鏡した。5分後:主導管上皮直下の毛細血管内に現像銀粒子が観察された。10分後:上皮直下の毛細血管内と一部の明調細胞のゴルジ装置や管腔直下の小胞近辺に現像銀粒子が観察された。40分後:明調細胞I型とII型の基底陥入部分、ゴルジ装置近辺、管腔直下の小胞近辺、管腔内にも観察された。

tuft cellではゴルジ装置近辺、グリコーゲン領域等に現像銀粒子が観察された。【結論】分泌能を証明するには細胞から現像銀粒子が消失することが必要で40分以上経過した試料が必要である。tuft cellが分泌能をもつことを証明するためにRI物質を投与し、代謝される過程を経時的に調べた。tuft cellの小胞や微絨毛の形質膜はSBAで反応するので、SBAの結合糖であるガラクトースをトリチウムでラベルしたものを投与し経時的に調べた。tuft cell以外の上皮の細胞(light cell type IとII, dark cell)はPNAで染まるが、これもSBAと同様に結合糖はガラクトースである。光顕、電顕によるオートラジオグラフィー法にて検討した。【方法と結果】ラット7週齢(体重220g)を5匹使用した。3.3mCiの^3H-galactoseを各ラットの腹腔内に投与後、経時的(5分、20分、2時間、6時間、24時間)後に主導管を切り出した。光顕用には35μmの切片をスライドグラスに載せ、乳剤をかけ5週間冷蔵庫で露出を行った。電顕用には80nmの切片をグリッドに載せウラン染色し、カーボン蒸着後・乳剤をかけ14週間冷凍庫で露出を行った。露出終了後脱ゼラチンを兼ねて鉛染色を行い検鏡した。5分後:ほとんど銀粒子は上皮内には観察されない。極僅かの銀粒子が上皮直下に観察された。20分後:上皮のlight cell type IとIIの数個の細胞のゴルジ装置や管腔直下の小胞付近に現像銀粒子が観察された。2時間後:ラベルされる細胞が増えてきた。6時間後:ほとんどのlight cell type IとIIの基底陥入部、ゴルジ装置付近、特に管腔直下の小胞付近や管腔内に多数の現像銀粒子が観察された。24時間後:管腔内には多数の現像銀粒子が観察されるが、細胞からは現像銀粒子は消失していた。
ビブリオ感染アユにおけるオキシテトラサイクリンの薬物速度論的研究

【目的】本研究では,実験的ビブリオ感染アユおよび健康アユにオキシテトラサイクリン(OTC)を強制経口投与し,それらの組織内濃度を高速液体クロマトグラフィ(HPLC)法によって求め,両者の体内動態を薬物速度論的に比較検討した。【方法】供試魚には平均体重54gの養殖アユを用いた。飼育を水温18.0±0.3°Cの流水水槽で行った。(1)健康魚試験区:OTCをアユ用餌料に混ぜ,麻酔した供試魚に投与量が100mg/kgになるようにカテーテルで経口投与した。(2)感染魚試験区:供試菌として静岡県水産試験場浜名湖分場より分与されたVibrioanguillarum93・12A型を用いた。OTCの供試菌に対する最小発育阻止濃度は0.1μg/mlであった。各供試魚の背部筋肉中に供試菌を10^3cells/0.1mlずつ接種した。接種後16時間に,OTC含有の餌料を投与量が100mg/kgとなるようにカテーテルで経口投与した。いずれの試験区とも投薬後,所定時間ごとに5尾ずつ取り上げ,血清,筋肉,肝臓および腎臓のOTC濃度をHPLC法によって求めた。データ解析には山岡らのプログラムMULTIを用いた。【結果】健康魚および感染魚におけるOTCの血清濃度曲線下面積(AUC)は537および217μg・h/mlであり,両者のバイオアベイラビリティに大きな差異が認められた。血清,筋肉,肝臓および腎臓におけるOTCの消失半減期は,健康魚でそれぞれ53,106,125および117時間,感染魚で63,93,107および123時間であった。また,各組織の消失時間は,健康魚で血清14日,筋肉21日,肝臓35日,腎臓26日,感染魚で血清15日,筋肉19日,,肝臓31日,腎臓30日であり,消失速度は両者で大差なかった。以上のことから,罹病魚のOTCによる薬物治療には,バアオアベイラビリティの低下を考慮する必要があると考えられた。