hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アラゴナイト型炭酸カルシウムのホッキ貝殻により膨張を付与したモルタルの耐久性評価

アラゴナイト型炭酸カルシウムであるホッキ貝殻の有効利用に関する研究である。ホッキ貝殻を1000°Cで焼成した酸化カルシウムをセメントに置換してモルタルおよびコンクリートを作製した。このとき,酸化カルシウムと水との反応により,セメント硬化体が膨張する。焼成ホッキ貝殻混入モルタルの膨張量は,石灰系膨張材の原料と同じ成分であるカルサイト型炭酸カルシウムの貝殻を使用したモルタルより大きくなる。これは,焼成ホッキ貝殻と水の反応により,水酸化カルシウムが形成されると同時にアラゴナイト型炭酸カルシウムがモルタル内に生成されるためである。アラゴナイト型炭酸カルシウムを焼成したホッキ貝殻は,水との反応により先祖返りでアラゴナイト型炭酸カルシウムを再構成したものと考えられる。アラゴナイト型炭酸カルシウムは棒状の結晶構造であり,この結晶を生成に起因して膨張が大きくなったと推察される。焼成ホッキ貝殻粉末をセメントに置換して作製したモルタルの内部組織評価を反射電子像の画像解析にて実施した。焼成貝殻粉末を混入したモルタルは,酸化カルシウムの水和により水酸化カルシウムが増大し,膨張により粗大毛細管空隙の割合が多くなる。このモルタルの膨張をJIS A6202の拘束膨張試験器具により拘束すると,水酸化カルシウムの割合が増大し,粗大毛細管空隙の割合が減少する。この膨張特性をコンクリート材料に適用する場合,静的破砕剤,ケミカルプレストレストコンクリート,収縮低減剤などの利用方法が想定される。静的破砕剤およびケミカルプレストレストコンクリートとして利用する場合には,膨張力が重要となる。そこで,膨張力を測定する試験法,およびケミカルプレストレストによる強度の増大を確認する試験方法について確立した。実用化のためには膨張応力を評価することが重要であることを示した。本研究はアラゴナイト型炭酸カルシウムであるホッキ貝殻を粉砕して1000°Cで焼成した粉末をセメントに置換してコンクリートを作製すると膨張が発生する機構を利用した研究である.焼成した貝殻は酸化カルシウムであるが,アラゴナイト型炭酸カルシウムのホッキ貝殻とカルサイト型炭酸カルシウムのホタテ貝殻では,膨張特性が異なり,アラゴナイト型に起因する貝殻の方が大きな膨張を示す.今年度の実験では,コンクリートに混入することによる膨張特性の把握,および耐凍害性に及ぼす影響について検討を行った.耐凍害性を与えるためには,表層コンクリートを炭酸化することが有用であり,炭酸カルシウムを増量させる手段として,焼成貝殻を混入した水酸化カルシウム増量コンクリートを作製した.異常膨張が発生しない範囲で焼成貝殻の混入率を決定するために,膨張率の測定を実施した.その結果,セメント置換率が3%程度であれば異常な膨張が発生しないことがわかった.この配合により作製した水酸化カルシウム増量コンクリートについて,実環境を模擬した条件による凍結融解試験を行った.その結果,一定期間,気中乾燥させることにより,表層部の炭酸化が進行し,表面はく離の抑制が確認された.また,温度コントロール制御機能を有した空気槽中で疲労試験を実施する試験装置において,セメント系材料で凍害の評価を行うための予備的検討を行った.試験治具の作製が終了し,普通モルタルを両端固定条件で一定速度で温度低下を行ったときの過冷却による温度応力のデータを得ることが可能となった.次年度は,焼成貝殻で膨張を付与したモルタルによるデータ収集を行う予定である.既往研究では焼成貝殻をモルタルに混入していたが,コンクリートに混入した場合の膨張特性を把握することができた.また,凍結融解試験による効果を把握するとともに,温度コントロール可能な疲労試験機を使用した凍害評価の準備も進行しており,当初計画通りに研究が進行している.アラゴナイト型炭酸カルシウムであるホッキ貝殻の有効利用に関する研究である。研究計画に従い,温度コントロール可能な疲労試験機による凍害評価法の確立と焼成貝殻粉末混入モルタルの耐凍害性評価を実施する.

また,反射電子像の画像解析による内部組織評価によるアラゴナイト型とカルサイト型で膨張特性が異なる理由について検討を行う.温度コントロール可能な疲労試験機であるアスファルト用試験機の多機能寒冷地材料試験機について,セメント系材料にて試験を実施するための治具等製作費を計上していたが,当初計画より安価に作製が可能となったため,次年度に繰り越すこととした.使用計画では超音波測定装置の購入を計上しており,当該年度配分金額では不足するため,その購入費用として次年度繰り越し分を当てる予定である.
肝類洞内皮細胞および癌細胞由来リンパ球制御物質の探索

脾臓細胞培養中に産生されるIFN-γを指標に肝類洞内皮細胞および癌細胞培養上清中の免疫制御因子の同定を目差した。肝類洞内皮細胞はマグネットビーズを使い、90%以上に精製する事に成功した。また乳がん細胞4T1に移植により、培養脾細胞のIFN-γ産生が一過的に増加しその後減少すること、そして4T1培養上清によってさらに減少することを発見した。この因子の同定を進め、G-CSFとM-CSFを見いだした。CT26細胞分泌因子は10 kDaよりも小さいことからLC-MSによるメタボローム解析を進め、癌進行との関わりが報告されているPGE2を見いだした。このアッセイ系により様々な活性因子の同定が期待される。前年度までにガン細胞のCT26.WTと4T1の培養上清中に特徴的な免疫抑制活性が存在することが判明した。そこで本年度はこれら因子の単離同定に注力した。CT26.WT細胞培養上清は逆相クロマトグラフィーによる分析に成功し、二つの溶出分画に活性が認められることが判明していたことから、液体クロマトグラム質量分析法(LC-MS)による受託解析を実施した。その結果を各分画の活性の有無と比較することで限られた数の候補因子を挙げることに成功した。しかしながら、今回のLC-MS解析は多検体かつ網羅的解析に適した方法を取ったため、引き続き高品質の差分解析が必要と判断された。また化学組成情報は得られたものの、物質の推測に至らない未知因子も含まれていた。一方、4T1培養上清中に含まれる活性因子を限外濾過膜でまず分画した結果、分子量30から100 kDaの間に活性が認められることが明らかとなった。このように大きな分子であることから、この活性因子はタンパク質であることが推測された。そこでイオン交換カラムによる精製を進めた結果、ある程度の精製、濃縮が達成できたものの単一のタンパク質とはまだ言える状況では無く、少なくとももう一段階の精製方法を組み入れる必要があると考えられた。そこでこのイオン交換カラムにて回収した精製産物を、308個のサイトカインを同時に評価できるプロテインアレイにて解析した結果、特定のタンパク質が濃縮されていることが明らかとなった。しかし、ここで使用したプロテインアレイもまた網羅解析用のため、そのタンパク質が確かに濃縮精製されているかどうかの確認を改めて実施必要があると判断された。本年度は種々の細胞が混在している状態である肝非実質細胞分画での免疫抑制活性を検証した。しかし実験の結果、想定したレベルの活性が観察できなかった。この理由の一つにはやはりクルードの細胞集団であることが原因であろうと考え、マグネットビースを使い肝類洞内皮細胞(LSEC)の純度を高めることを試みた。内皮細胞特異的表面抗原であるCD144、およびCD146に対する抗体を用い検討した結果、ビオチン標識抗CD144抗体とアビジンマグネットビースとを組み合わせることで、90%程度までLSECの純度を高めることに成功した。大腸ガン細胞CT26.WTの培養上清中の活性を限外濾過フィルターと透析膜を使って解析した結果、活性因子の分子量が3,000よりも小さいことが予想された。そこで逆相クロマトグラフィーによる分画精製を実施した。CT26.WT細胞培養上清は分画分子量10,000の限外濾過フィルターとC18逆相カートリッジにて前処理を施した。このサンプルを凍結乾燥後、C18逆相カラムODP-40を使用しアセトニトリルの濃度勾配にて溶出し、各分画を分取した。この分取画分について脾細胞培養システムで検証した結果、大きく分けて二つの溶出分画に活性が認められた。この時点で前処理後サンプルに対しおよそ50 100倍(培養上清に対し1000倍以上)程度に活性が濃縮されていることが判明した。またこれらの活性サンプルを種々の酵素で処理した結果、ペプチダーゼに一部感受性であることが明らかになった。これらの結果よりガン細胞から分泌される免疫抑制因子は少なくとも一部はペプチドであることが示唆され、この因子の同定に大きく近づいたと考えられる。最終年度は特に乳がん細胞4T1が分泌する免疫抑制性因子の単離、同定に注力した。イオン交換とゲル濾過クロマトグラフィーに加え、種々のカラムでの検討も行ったが、単離には至らなかった。飛行時間質量分析計(TOF-MS)を使用してSDS-PAGE後のゲル抽出からタンパク質の同定を試みたが、活性因子の同定には至っていない。恐らくは分泌量が少なく、検出、同定に十分な量が回収できていないためと考えている。既報の論文等を参考に、予想される因子の検証も実施した。GM-

CSFはインプットしたリコンビナントが活性を示さなかった。G-CSFはリコンビナントが活性を示し、ウェスタンブロッティングにて実際に分泌されていることを確認した。しかし精製過程の分画物に、G-CSFではないより強い活性分画があることが判明した。これらのことから最も疑われたGM-CSF、G-CSFの関与は、少なくとも独自開発したアッセイシステムで見いだされる活性因子としては否定された。この他に、昨年度の部分精製物のプロテインアレイ解析で上位に検出された因子も、リコンビナントによる検証で否定されている。これに加え、4T1担がんマウスにおける腫瘍の進行と脾細胞及びIFN-γ産生を解析し、原著論文として報告した。上記成果はがんと免疫に関わる未知因子の発見につながる重要な成果であるが、もう一歩のところで同定に至らず、大変残念な思いである。本申請書では腫瘍細胞に加え、初代培養細胞となる肝類洞内皮細胞由来因子の探索も想定していたが、上記のより喫緊と考えられた課題を優先し、結果、研究コンセプトの妥当性を確認する段階で終了した。このことは申請段階から想定済であった。また他の腫瘍細胞CT26由来因子は昨年度のLC-MS解析の結果を踏まえ、本年度後半加わった国費留学生と共に取り組んだが、精製過程の再現性確認、最適化で終了となった。分子細胞生物学当初計画において、本年度は単離精製した肝類洞内皮細胞(LSEC)の培養上清からイオン交換クロマトグラフィーによる免疫制御因子の単離精製を実施する予定であった。ただし当初からガン細胞由来因子の解析と同時進行し、より見込みのある方に注力することを想定していた。実際のところ、本年度に入ってからCT26.WT細胞由来因子に加え、4T1細胞由来因子の解析も大きく進展したことから、これらガン細胞を使った研究を優先した。CT26.WT由来因子に関しては、LC-MSと逆相クロマトグラフィー分画物の活性とを比較区検討することで、未だ同定には至っていないもののいくつかの候補ペプチド性因子を挙げることができた。4T1細胞由来因子では分子量分画が成功し、タンパク質であることがほぼ間違いない状況にまで至った。イオン交換の前にもう一段階の精製手法を取り入れれば、その後ゲル濾過クロマトグラフィーによる単離まで見込める状況にある。ただし本年度はプロテインアレイまで実施し、すでに候補因子を大きく絞り込めた段階至っている。LSEC培養上清の免疫抑制活性の検証については未単離状態の非実質細胞分画では明確(十分に高い)な抑制活性は観察できなかった。そこでLSEC特異的表面抗原に対する抗体とマグネットビーズを使いLSECの純度を高めることを目指した。この結果90%程度までLSECの純度を高めることに成功した。しかし無血清条件でのLSEC培養とその培養上清の免疫抑制活性の検証には至っていない。CT26.WT細胞培養上清中の免疫抑制活性の精製濃縮は、逆相クロマトグラフィーを使うことで大きく進展した。これまでに限外濾過フィルターによる分子量の推測は試みていたのだが、おそらくは実験操作中のロスのために安定な結果が得られていなかった。しかし透析により活性が消失するという現象がしばしば観察されたことから、これらを組み合わせて検証を続けた結果、分子量1,000 3,000よりも小さいことを示唆するデータが得られてきた。
ハイブリッド酸化チタンナノチューブ光触媒の創製

貴金属担持では前年度パラジウムを用いて確立した手法を用い、光媒体特性を向上させる白金担持をアノード酸化により作製した酸化チタンナノチューブ上へ行うと、分散担持せずチューブ径より大きな析出物が生成するだけであった。そこで溶液にアンモニアを加えpH、白金イオンの価数を制御することで、白金ナノ微粒子を分散担持することができることが分かった。さらに白金を担持することで酸化チタンナノチューブの光応答性が向上することが明らかとなった。アノード酸化チタンナノチューブに、アンモニア中で熱処理を行うことで可視光応答性を付与することに成功したが、一方で腐食性のアンモニアガスを使用するため基板を損傷する、後のハイブリッドプロセスに影響を及ぼすことが問題であった。そこで腐食性ガスを使用しない新たな窒素ドーブ方の探索を行った。その結果、アノード酸化に用いるTi基板に予め窒素を含有させ、それをアノード酸化する方法を見出した。アーク溶解によりTi-N合金を作製しアノード酸化することで窒素ドーブされた酸化チタン層が形成し可視光応答性を得ることが出来たが、アーク溶解により作製したTi-N合金の組織が不均一なために形成したナノチューブ層の形態には場所による不均一性が確認された。この形態の不均一性は合金組織の均一性を向上させることにより改善され、また、この手法は後のハイブリッドプロセスに影響を及ぼさないため、本手法は新規窒素ドーブ手法として期待されうるといえる。実用を目指した研究として、酸化チタンナノチューブ層の形成を大面積の基板へ行うこと、ナノチューブ層形成時間の短縮に関する検討を行った。その結果、基板の縁近傍はエッジ効果が見られるものの、それ以外の箇所ではある程度均一なナノチューブ層が形成できることが明らかとなった。また溶液に加えるフッ化物の種類を変えることでナノチューブ形成時間の大幅な短縮に成功した。アノード酸化により作製した,ナノチューブ状の形態を有する酸化チタン膜上に下記の光触媒特性向上因子を分散付与させるために,ナノチューブ形態と各プロセスの制御因子との関係を調査した結果,以下のことが分かった.1)貴金属粒子の担持本研究では,浸漬法,光析出法の2つの担持方法を検討した.浸漬法では,使用する水溶液の濃度が高いほど,またナノチューブ層が厚いほど,多くのパラジウム粒子が析出した.ある臨界浸漬時間までは浸漬時間が長くなるとともにパラジウム粒子数は増加したが,臨界浸漬時間以上では析出する粒子の数は変化しなくなった.析出したパラジウム粒子の直径は浸漬条件,ナノチューブの形態によらず約10nmであった.熱処理により結晶構造をアノード酸化直後のアモルファスからアナターゼもしくはアナターゼとルチルが混在した構造へ変態させてもパラジウム担持量は変化しなかった.一方,光析出法では,アモルファス酸化チタンナノチューブ上にはパラジウム粒子は析出しなかったが,アナターゼもしくはアナターゼ/ルチル構造のナノチューブへはパラジウム粒子は析出した.パラジウム粒子の数は光照射時間によらず一定であったが,粒子径は照射時間の増加と共に大きくなった.またアナターゼの方がアナターゼ/ルチル構造よりもパラジウム析出速度は大きいことが分かった.2)アパタイト生成アパタイト生成は酸化チタンがナノチューブ状の形態を有することにより促進され,その生成速度はナノチューブが長いほど大きくなることが分かった.またナノチューブが同様の形態を有した場合でもアノード酸化に使用する水溶液によってアパタイト生成速度が変化することを明らかにした.さらにアパタイト生成速度を上げるには熱処理によりアナターゼもしくはアナターゼ/ルチル構造へ結晶構造を変化させることが必要であることが確認された.本研究成果は学術雑誌に投稿する予定である.貴金属担持では前年度パラジウムを用いて確立した手法を用い、光媒体特性を向上させる白金担持をアノード酸化により作製した酸化チタンナノチューブ上へ行うと、分散担持せずチューブ径より大きな析出物が生成するだけであった。
ミトコンドリアを標的とする多重型・多機能性エンベロープ型ナノ構造体の開発

本研究は、蛋白質をミトコンドリア(MT)へ送達するための新規送達システムの開発を目的とした。研究戦略は、蛋白質をコアとするナノ粒子(直径100nm以下)を形成し、細胞膜とMT膜を突破するためにエンベロープを多重構造にする(多重型MEND)。最外層にはオクタアルギニンを、中間層にはMT targeting signal(MTS)を付加し、ナノ粒子のままMT内へ送達するシステムを開発する。1)蛋白質を封入したMENDの構築:これまで、多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)に遺伝子を封入する方向を確立してきたが、本研究では、蛋白質を封入する方法を確立することに成功した。本MENDは、マクロピノサイトーシスで細胞内へ導入後、封入したGFPを細胞質中に放出可能であることが明らかと成った。2)R8-MENDによるミトコンドリアへの送達システムの開発:オクタアルギニン(R8)修飾したMENDはマクロピノサイトーシスにより細胞内へ取込まれ、細胞質中へ脱出し、ミトコンドリアへGFPを送達可能であることが明らかとなった。3)MTS結合エンベロープ体の構築:まず、脂質誘導体-MTSの合成を行った。合成は困難を極めたが、純度の高い合成品を得ることに成功した。エンベロープ化したナノ粒子に脂質誘導体一MTSを導入し、MTS結合エンベロープ体を構築した。MTS結合型多重型MENDにより、選択的なミトコンドリア送達が可能となった。研究目的:本申請研究は、蛋白質をミトコンドリア(MT)へ送達するための新規送達システムの開発を目的とする。研究戦略は、蛋白質をコアとするナノ粒子(直径100 nm以下)を形成し、細胞膜とMT膜を突破するために、エンベロープを多重構造にする(多重型・多機能性ナノ構造体:多重型MEND)。最外層にはオクタアルギニンを、中間層にはMT targeting signal (MTS)を付加し、ナノ粒子のままMT内へ送達するシステムを開発することを最終目的とする。平成17年度の研究概要A)単離ミトコンドリア膜との結合能・融合能の評価(1) MTS結合エンベロープ体のMT膜結合能の評価:単離したMTとの結合アッセイを行った。(2) MTS結合エンベロープ体のMT膜融合能の評価:単離したMTとの膜融合アッセイ(FRET法による)を行った。両評価方法をスクリーニング系として用いることで、MTへの親和性が高く、MT膜との融合活性の高いMTS結合エンベロープ体を探索した。B)多重型MENDの構築多重型MENDの構築方法を確立した。構築原理は、基本的にこれまでのMEND同様に、コアとなる凝縮化核酸粒子を脂質膜でコートするのであるが、リポソームの膜融合を利用した。すなわち、1)静電的相互作用によって凝縮化させ正に帯電させた凝縮化核酸ナノ粒子を調製し、2)負電荷脂質を含む小さい一枚膜リポソーム(SUV)を、凝縮化核酸ナノ粒子に静電的に結合させることでナノ粒子表面を覆い、3)酸性化や多価カチオン添加によってSUV同士の膜融合を誘起することで二枚膜を形成させ、ナノ粒子をコートする。4)DMEND表面に正電荷を付与するため、ステアリル化オクタアルギニン(STR-R8)を添加し表面をR8ペプチドで修飾する。5)正に帯電したDMENDに、負電荷SUVを添加し、2と同様に表面をSUVで覆う。このときのSUVとして、2のSUVと異なる脂質組成を有するものを用いることが可能である。6)3と同様にSUV同士の膜融合を誘起し、DMENDをさらに二枚膜でコートする。(特願2005-10998)本研究は、蛋白質をミトコンドリア(MT)へ送達するための新規送達システムの開発を目的とした。
がんの悪性化とがん微小環境変化を誘導するエクソソームを標的とした治療法の開発

がんの進展の過程(EMT、浸潤、移動)および抗がん剤耐性の獲得におけるエクソソームの役割が注目を集めているが、口腔扁平上皮がんのエクソソームの性質、取り込み、機能などについては不明な点が多く残っている。一方で、エクソソームの形成や取り込みには、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)が関与していることが報告されている。本研究では口腔扁平上皮がんのEMTを誘導するエクソソームに着目し、EMTにおけるHSPGを介したエクソソームの取り込みやそのエクソソームの機能について明らかにすることを目的とした。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデルとして、エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光タンパク質として発現させた口腔扁平上皮がん細胞株を作製した。さらに、昨年度に確立されたエクソソームの精製法を用いて、TGF-βで処理した細胞から分泌されているエクソソームを精製し、EMTの誘導能を検討した。その結果、TGF-β処理した細胞から調製したエクソソームは口腔がん細胞の運動能を促進するとともにがん細胞の運動に重要な働きを持つEMTマーカーの発現上昇を引き起こした。すなわちエクソソームを取り込むことで、口腔がん細胞がEMTを実行する可能性が示唆された。TGF-β刺激により産生されたエクソソームと、TGF-β非依存的に産生されたエクソソームの機能を比較するために、CRISPR-Cas9のシステムを用いてTGF-βシグナルに必須な転写因子Slugを欠失させた口腔扁平上皮がん細胞株を作成した。EMTを誘導した細胞由来のエクソソームを用いて、エクソソームの取り込みを検出する実験系の確立に取り組んだ。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル(エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光標識した細胞)を樹立するうえで、発現ベクターの作成及び細胞株樹立に時間がかかった。現在、蛍光標識されたエクソソームを用いて、がん微小環境構成因子に与える作用の検討を行なっている。さらに、TGF-βで処理した際に分泌されているエクソソームを用いたEMTの誘導実験にあたって安定な結果を得るために、至適な条件の検討に時間がかかった。エクソソームの取り込みにおいてHSPGの役割について検討するために、細胞表面のHSPGの発現を変化させた細胞モデルが必須となっている。これまでの報告ではエクソソームの取り込みにはHSPGのヘパラン硫酸鎖が重要な役割を持つことが示威されている。そこで、口腔がん細胞においてHSPGの糖鎖部位の生合成過程で重要な酵素、EXT1遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がん細胞株の作製を行なっている。今後、以下の実験を行う。1昨年度で樹立した蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル(CD63-Kusabira Orangeを発現している口腔扁平上皮がん細胞)を用いて、エクソソームががん微小環境を構成する細胞(がん細胞及び内皮細胞)に対する作用及び微小環境構成因子の発現に対する作用を検討する。2HSPGの糖鎖部位の生合成過程で重要な酵素、EXT1遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がん細胞株を樹立する。3蛍光標識されたエクソソームのEXT1欠損細胞株への取り込み実験を行なう。4Slug遺伝子をノックアウトした口腔扁平上皮がんSAS細胞において、TGF-βで処理した際分泌されているエクソソームを用いて、それらのエクソソームのEMT誘導能を検討する。本研究では、上皮扁平口腔がんの浸潤・転移において上皮間葉移行(epithelial-mesenchymal transition; EMT)を誘導するエクソソームに着目し、EMTにおけるHSPGを介したエクソソームの取り込みについて明らかにするために以下の実験をおこなった。具体的には、種々の口腔扁平上皮がん細胞(HOC313、HOC313-LM、SAS、HSC4細胞株など)を用いて、EMTを誘導し、EMTマーカーの発現に与える効果を検討した。EMTを誘導した細胞からエクソソームを精製し、そのエクソソームのキャラクタリゼーションを行なった。結果、エクソソームのマーカー分子としてCD63、TSG101、ALIXを検出することができた。また、HSPGの各細胞における発現及びエクソソームにおける局在を解析することができた。詳しい解析を行なったところ、EMTを誘導することで、SASやHSC4細胞由来のエクソソームに局在しているHSPGの種類が変化した。通常状態がん細胞において、EMTを誘導したがん細胞由来のエクソソームがどのように取り込まれるのかについても検討した。結果、EMTを誘導したがん細胞由来のエクソソームは、通常細胞由来のエクソソームより効率的に取り込まれた。また、このエクソソームの取り込みにより、通常状態の細胞の運動が促進された。一方、悪性度が異なる口腔扁平上皮がん細胞(HOC313及びHOC313-LM)を用いた実験系で、悪性化とTGF-βとEMTの関与について検討した。その結果、悪性度が高いHOC313-LM細胞をTGF-β1処理したところ、細胞の運動能が亢進することを発見した。TGF-βシグナルとRHOシグナルは口腔がん悪性化の様々なステップにおいて多様な作用を果たすことが示唆された。口腔扁平上皮の上皮間葉移行を誘導するエクソソームを調整するうえで、適切な細胞株を選択するのに時間を要した。

具体的には、当初、口腔扁平上皮がん細胞に常的活性化型TGF-β受容体遺伝子(ALK5-CA)を導入し、自動的にEMTを誘導させる予定であったが、AKL5-CAを発現させたところ、細胞の増殖に影響を与え、実験には不適であることが判明した。そこで、EMTの誘導の手法として、通常の細胞にTGF-βを添加する方法に切り替え、その至適な条件の検討を行なった。さらに、質量分析を用いてエクソソームのタンパク成分を解析するにあたって、試料調製の条件検討が必要であったため、遅れが発生した。現在、種々の口腔扁平上皮がん細胞に対してEMTを誘導し、試料の調整を行なっている。さらに、EMTを誘導した細胞由来のエクソソームを用いてエクソソームの取り込み実験の試験系を確立するために、蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル(蛍光標識されたエクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光標識する)が必須となっているが、その細胞の作製にも遅れが発生した。現在、蛍光標識されたCD63-GFPおよびCD63-KusabiraOrangeタンパク質を発現している悪性度の高い口腔扁平上皮がん細胞株および悪性度の低い口腔扁平上皮がん細胞株を作製中である。がんの進展の過程(EMT、浸潤、移動)および抗がん剤耐性の獲得におけるエクソソームの役割が注目を集めているが、口腔扁平上皮がんのエクソソームの性質、取り込み、機能などについては不明な点が多く残っている。一方で、エクソソームの形成や取り込みには、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)が関与していることが報告されている。本研究では口腔扁平上皮がんのEMTを誘導するエクソソームに着目し、EMTにおけるHSPGを介したエクソソームの取り込みやそのエクソソームの機能について明らかにすることを目的とした。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデルとして、エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光タンパク質として発現させた口腔扁平上皮がん細胞株を作製した。さらに、昨年度に確立されたエクソソームの精製法を用いて、TGF-βで処理した細胞から分泌されているエクソソームを精製し、EMTの誘導能を検討した。その結果、TGF-β処理した細胞から調製したエクソソームは口腔がん細胞の運動能を促進するとともにがん細胞の運動に重要な働きを持つEMTマーカーの発現上昇を引き起こした。すなわちエクソソームを取り込むことで、口腔がん細胞がEMTを実行する可能性が示唆された。TGF-β刺激により産生されたエクソソームと、TGF-β非依存的に産生されたエクソソームの機能を比較するために、CRISPR-Cas9のシステムを用いてTGF-βシグナルに必須な転写因子Slugを欠失させた口腔扁平上皮がん細胞株を作成した。EMTを誘導した細胞由来のエクソソームを用いて、エクソソームの取り込みを検出する実験系の確立に取り組んだ。蛍光標識されたエクソソームを分泌する細胞モデル(エクソソーム膜上に特異的に発現するタンパク質CD63を蛍光標識した細胞)を樹立するうえで、発現ベクターの作成及び細胞株樹立に時間がかかった。現在、蛍光標識されたエクソソームを用いて、がん微小環境構成因子に与える作用の検討を行なっている。さらに、TGF-βで処理した際に分泌されているエクソソームを用いたEMTの誘導実験にあたって安定な結果を得るために、至適な条件の検討に時間がかかった。
PI3-kinase結合タンパク質PITKAPによる細胞プライミングの分子機構

申請者は、ラット甲状腺由来正常細胞FRTL-5を甲状腺刺激ホルモンTSHで前処理しておくことによって細胞の運命・性質・方向性が決定づけられ(プライミングと呼ぶ)、IGF-Iによって誘導される細胞増殖が相乗的に増強されることを明らかにしてきた。さらに、TSHによるプライミングの分子機構を解明していく過程で、PI 3-kinaseと結合する新規タンパク質、PITKAPの精製、同定に成功した。このタンパク質を発現抑制するとTSHによるプライミング効果が認められなくなったため、PITKAPが細胞のプライミングに必須な機能を果たしていることが明らかとなった。また、Srcの阻害剤であるPP1やPP2で処理するとcAMP依存的なPITKAPのチロシンリン酸化およびp85 PI3Kとの結合が阻害された。cAMPによってSrcが活性化されることも併せると、FRTL-5細胞では、cAMPによってSrcが活性化され、同時にPITKAPの発現量が増加、PITKAPはSrcによってチロシンリン酸化され、その結果p85 PI3Kが結合することによって、PI 3-kinaseが活性化されることが明らかとなった。現在、PITKAPのノックアウトマウスの作製を進めており、今後はノックアウトマウスも使って、個体レベル、細胞レベルでのPITKAPの機能解析を進めていきたい。申請者は、ラット甲状腺由来正常細胞FRTL-5をIGF-Iで刺激しても生理活性である細胞増殖はほとんど誘導されないが。甲状腺刺激ホルモンTSHで前処理しておくことによって、IGF-Iによって誘導される細胞増殖が相乗的に増強されることを明らかにしてきた。他のIGF-I標的細胞でも同様な現象が認められることから、IGF-Iは生理活性を発揮するためのホルモンであり、TSHなどのトロピックホルモンが細胞の運命・性質・方向性を決定づけること(プライミングと呼ぶ)によって初めて、IGF-Iが組織特有の機能を発揮することが可能になる、と考えられた。そこで、本研究ではPITKAPが甲状腺細胞をプライミングする分子機構を解明し、さらに、ノックアウトマウスを作製することで動物個体での機能を解明することが目標である。本年度はPITKAPの細胞内での局在について検討を加えた。まず、PITKAPの細胞内での局在を免疫染色によって解析した。その結果、PITKAPは細胞内でアクチン繊維とよく共局在することが明らかとなった。次にアクチンとの結合を検討したところ、PITKAPはC末端側の領域で繊維状アクチンと結合することが明らかとなった。さらにPITKAPはアクチンと結合することによってアクチン繊維の束化を促進する活性を有することが明らかになった。最後にアクチンと結合し、アクチン束化促進活性に必要なPITKAPのC末端領域を欠いた変異体の細胞内局在を観察したところ、アクチン繊維とは共局在しないことがわかった。今後はアクチンとの結合がPITKAPのIGF-I生理活性増強活性における生理的意義について検討を加えていきたい。申請者は、ラット甲状腺由来正常細胞FRTL-5をIGF-Iで刺激しても生理活性である細胞増殖はほとんど誘導されないが、甲状腺刺激ホルモンTSHで前処理しておくことによって、IGF-Iによって誘導される細胞増殖が相乗的に増強されることを明らかにしてきた。他のIGF-I標的細胞でも同様な現象が認められることから、IGF-Iは生理活性を発揮するためのホルモンであり、TSHなどのトロピックホルモンが細胞の運命・性質・方向性を決定づけること(プライミングと呼ぶ)によって初めて、IGFが組織特有の機能を発揮することが可能になる、と考えられた。さらに、TSHによるプライミングの分子機構を解明していく過程で、PI3-kinaseと結合する新規タンパク質、PITKAPの精製、同定に成功した。

そこで、本研究ではPITKAPが甲状腺細胞をプライミングする分子機構を解明し、さらに、ノックアウトマウスを作製することで動物個体での機能を解明することが目標である。本年度はPITKAPをチロシンリン酸化するキナーゼについて検討を加えた。まず、Srcの阻害剤であるPP1やPP2で処理して、PITKAPのチロシンリン酸化を測定した。その結果、PP1、PP2ともにcAMP依存的なPITKAPのチロシンリン酸化およびp85 PI3Kとの結合が阻害された。また、共免疫沈降法によってSrcとPITKAPの結合が検出された。さらに、Srcの活性がcAMP処理によって増加することも明らかとなった。これらの結果から、FRTL-5細胞では、cAMPによってSrcが活性化され、同時にPITKAPの発現量が増加、PITKAPはSrcによってチロシンリン酸化され、その結果p85 PI3Kが結合することによって、PI3-kinaseが活性化されることが明らかとなった。現在、PITKAPのノックアウトマウスの作製を進めており、今後はノックアウトマウスも使って、個体レベル、細胞レベルでのPITKAPの機能解析を進めていきたい。我々は、ラット甲状腺由来正常細胞FRTL5を甲状腺刺激ホルモンTSHで前処理しておくことによって、細胞になんらかのプライミングが起こり、IGFIによって誘導される細胞増殖が相乗的に増強されることを明らかにしてきた。さらに、TSHによるプライミングの分子機構を解明していく過程で、PI3kinaseと結合する新規タンパク質、PITKAPの精製、同定に成功した。このタンパク質を発現抑制した際にプライミング効果が失われることから、PITKAPが細胞のプライミングに必須な機能を果たしていることが明らかとなった。本年度はPITKAP遺伝子が臓器特異的に欠損したマウスを作成するため、LoxP切断部位を導入したターゲティングベクターを構築した。LoxP配列はマウスのPITKAP遺伝子のinitiation codonを含むExonを欠失するように挿入した。LoxP導入マウスの作製は既に完了し、現在は全身にCreを発現するマウスと上記LoxP導入マウスを交配し、全身のPITKAP遺伝子をノックアウトしたマウスを作製を試みている。このマウスの発生・成長・成熟・老化・内分泌指標・および臓器の発達などの表現型を調べ、PITKAPをノックアウトしたために起こった変化を特定する予定である。顕著な表現型が観察されなかった場合には、給餌制限や低タンパク質食、高脂肪食などの負荷をかけて、同様な指標を調べるとともに、時期特異的、臓器特異的なコンディショナルノックアウトマウスの作製を進め、特に甲状腺における機能に注目して解析を進めていく予定である。PITKAPにはPI3K結合ドメイン以外にもアクチン結合ドメインが存在している。
幹細胞の維持に不可欠なシグナルが幹細胞ニッチェで局所的に活性化される仕組みの解明

生体内にはいろいろな組織に幹細胞が存在しており、それら幹細胞の未分化維持あるいは分化機構にはニッチェが重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。そこで我々は、幹細胞ニッチェにおいて、幹細胞の未分化維持に関わる因子がどのように局所的に活性化されているのかについて、その分子機構を明らかにしていきたいと考えた。ショウジョウバエの系はこのような幹細胞ニッチェに関する研究を進めていく上で非常に魅力的な系を提供してくれる。まず幹細胞及び幹細胞ニッチェを同定できること、そして幹細胞の未分化状態と分化状態を抗体染色などで容易に区別できること。そして何よりも幹細胞のマーキングシステムが可能であり、その未分化状態あるいは分化状態とトレースできることにある。ショウジョウバエの雄生殖幹細胞において、われわれなどがBMP-Smadシグナル、JAK-STATシグナルなどが幹細胞の未分化維持に不可欠な役割をしていることを明らかにしてきたが、まだ不明なことも多く、さらに詳細な解析が必要であった。今回の研究においてBMP-SmadシグナルのリガンドであるDpp/Gbbに関しては幹細胞ニッチェに特異的に局在するものもあるが、そうでないものも多く、リガンドの特異的な局在以外の要因が重要であることが明らかとなった。またJAK-STATシグナルに関しても、従来は生殖幹細胞の維持に必要且つ十分と考えられていたが、実は間接的な作用が生殖幹細胞の維持に不可欠であることを今回はじめて見出すことができた。さらに幹細胞ニッチェという概念をより一般化するために培養細胞の系を用いて、その妥当性を検討した。幹細胞の未分化維持機構及びその分化制御機構にニッチェとよばれる微少環境が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。しかし多くの場合、生体内での幹細胞を同定することは容易ではなく、幹細胞及びそのニッチェも同定できていないまま、研究が行われていることが多い。ショウジョウバエ雄生殖細胞の系では、生殖幹細胞、及びニッチェが明確に同定でき、非常に魅力的な系を提供している。ハエの精巣の先端にはハブと呼ばれる特殊構造が存在し、生殖幹細胞は通常ハブへのコンタクトが不可欠である。例えば、生殖幹細胞に不可欠な因子であるJAK-STATシグナルを活性化するリガンドであるUnpairdはハブで強く発現が見られる。このようにハブが生殖幹細胞の未分化維持に直接関与していることは明らかである一方、他のニッチェの構成要素についてはその直接的な関与は今まで明らかにされていなかった。今回、我々はハブ以外のニッチェ構成要素がが生殖幹細胞の維持に直接関与していることを見出した。突然変異体では生殖幹細胞が減少し、またハブ以外の体細胞だけでその遺伝子を発現(レスキュー)させることにより、生殖幹細胞の維持に対して効果を確認することができた。今後、このシグナルの上流及び下流を解析し、その全体像を明らかにしていきたい。またBMP-Smadシグナルの標的遺伝子としてbamがあるが、BMP-SmadシグナルがBamの遺伝子発現を抑えることが生殖幹細胞の未分化維持に十分であるのかどうかについては今まで不明であった。BMP-Smadシグナル変異体にbamの突然変異体を加えるレスキュー効果は部分的にとどまり、BMP-Smadシグナルがbam以外にも未分化維持に関与していることが明らかとなった。今年度はbamの遺伝子の発現抑制以外に、BMP-Smadシグナルがどのように幹細胞の未分化維持機構に関与しているのか明らかにしていきたい。幹細胞の未分化維持機構及びその分化制御機構にはニッチェとよばれる微少環境が重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。ショウジョウバエの生殖幹細胞の系では、生殖幹細胞、及びニッチェが明確に同定でき、非常に魅力的な系を提供している。

ハエの卵巣、精巣の先端にはそれぞれキャップ細胞、ハブと呼ばれる特殊構造が存在し、生殖幹細胞は通常これらの構造へのコンタクトが不可欠である。今回、我々はハブ以外のニッチェ構成要素であるシスト細胞が生殖幹細胞の維持に直接関与していることを見出した。さらに詳細に調べた結果、生殖幹細胞の維持に既知のシグナル、例えばJAK/STATシグナルあるいはBMP-Smadシグナルは生殖幹細胞の未分化維持に直接関与していることを我々などが明らかにしたが、それとは異なる新規の機構により維持されている可能性が極めて強くなった。現在も、さらにその詳細を明らかにすべく解析を進めている。またニッチェにおいて生殖幹細胞は競争的な状態であり、分化した生殖幹細胞は速やかにニッチェから追い出されることを見出した。さらにショウジョウバエでの生殖幹細胞ニッチェのコンセプトさらにその中にある厳密なシステムの構築の必要性などのを発展させ、ES細胞の未分化維持においても新たな知見を見出すことに成功した。
統計力学的手法による適応信号処理の解析的研究

適応信号処理の挙動を統計力学的手法を用いて理論的に明らかにした。特に、音を音で消す技術であるアクティブノイズコントロールについて、一次経路が時間的に変化するモデルの解析、一次経路に実データを用いる場合の解析、二次経路の推定誤差の影響、固有値解析に基づく定常二乗平均誤差の解析、ステップサイズの上限に関する解析、マルチチャネル型に関する予備的解析などについて網羅的かつ系統的に取り組んだ。研究の開始にあたって、まず、解析の対象となるモデルを設定した。そのモデルに基づき、システムの動的ふるまいを少数の巨視的変数で記述した。ここで巨視的変数としては、適応フィルタ係数ベクトルと未知システムの類似度を扱う。適応フィルタのタップ長が十分長い条件において成り立つ自己平均性に基づき、巨視的変数のダイナミクスを記述する連立微分方程式を決定論的な形で導出した。このとき、二次経路(二次音源スピーカからエラーマイクロホンを含む伝搬系)の影響により適応フィルタ係数ベクトルの中には過去のタップ入力ベクトルの影響が入っているので、この相関を注意深く取り扱う必要がある。導出される決定論的連立微分方程式にはいくつかのサンプル平均、すなわち入力に関する期待値が含まれることになるのでこれを解析的に計算した。これらのサンプル平均を連立微分方程式に代入し、解析的、あるいは数値的に解くことにより、巨視的変数のダイナミクスを理論的に求めた。さらに、その結果を用いて、二乗平均誤差を理論的に計算した。その際、入力の相関関数を導入することにより、参照信号が白色である場合だけでなく、有色である場合も含む理論を構築することができた。以上の理論の結果は、並行して行う計算機実験の結果と比較することにより検証した。その際、一次経路のタップ入力ベクトルのノルムを表す新たな巨視的変数を導入することにより、一次経路が時間的に変化する場合の予備的な解析を実行することができた。また固有値解析を適用することにより定常状態の解析を行い、ステップサイズの上限に関する議論を行うことができた。解析においては、適応フィルタのタップ長が十分長い条件において成り立つ自己平均性に基づき、巨視的変数のダイナミクスを記述する連立微分方程式を決定論的な形で導出した。導出される決定論的連立微分方程式にはいくつかのサンプル平均、すなわち参照信号に関する期待値が含まれることになるのでこれを解析的に計算した。具体的には以下の結果を得た。(1)真の二次経路は未知であるので、一般的にその推定値を用いることになる。よって、推定誤差が二乗平均誤差に与える影響を調べることはきわめて重要である。計算機実験との比較により、導出された理論は二次経路推定誤差の影響を定量的に予測できることを検証した。(2)能動騒音制御においては一般的には一次経路は時間的に変化する。このような時変な一次経路の場合について、前年度の予備的検討に基づき解析した。その結果、一次経路の各要素に乱数が重畳されるような単純なモデルの場合、初期においてはステップサイズに最適値が存在するものの、時間の経過とともに実用的な最適値は消滅することが明らかになった。(3)実験室での測定により得られた現実の一次経路の特性を相関として取り込むことにより理論を拡張することに成功した。

(1)能動騒音制御においては一般的には一次経路は時間的に変化する。時変で、かつ、ノルムが一定に保たれるような一次経路のモデルを新たに提案し、解析した。その結果、二乗平均誤差を解析的に求めることに成功し、誤調整と追随遅れのトレードオフによりステップサイズに最適値が存在することを明らかにした。(2)二乗平均誤差の初期現象速度と適応速度定数の二種類の評価尺度を導入することにより、適応速度に関する解析と議論を行った。(3)参照マイクロフォン、二次音源スピーカ、エラーマイクロホンのいずれか、あるいはすべてが複数存在する能動騒音制御はマルチチャネル型と呼ばれる。このマルチチャネル型能動騒音制御のふるまいに関して予備的な検討を行った。平成27年度は、(1)参照信号が非常に長い相関を有する場合、(2)一次経路が時間的に変化する場合、(3)一次経路が非線形性を有する場合の解析など、より現実的で複雑なモデル化を含む場合の解析を計画していた。これらのうち、(2)についてはノルムが一定に保たれるモデルの提案により、重要な知見を得ることができた。(1),(3)については十分な進展があったとは言えないが、その代わりに適応速度の解析やマルチチャネル型の解析で一定の結果を得ることに成功した。本研究のこれらの進展から、おおむね順調に進展していると言える。平成27年度までの4年間を研究期間とする研究に引き続き,能動騒音制御の統計力学的解析を進めた.具体的には適応速度の解析やマルチチャネル型能動騒音制御の解析を進め,複数の国内会議や国際会議で発表した.適応信号処理の挙動を統計力学的手法を用いて理論的に明らかにした。特に、音を音で消す技術であるアクティブノイズコントロールについて、一次経路が時間的に変化するモデルの解析、一次経路に実データを用いる場合の解析、二次経路の推定誤差の影響、固有値解析に基づく定常二乗平均誤差の解析、ステップサイズの上限に関する解析、マルチチャネル型に関する予備的解析などについて網羅的かつ系統的に取り組んだ。平成26年度は、(1)一次経路が時間的に変化する場合の解析、(2)実験的に得られた一次経路の場合の系のふるまいを理論に取り込む解析、(3)二次経路が現実的なインパルス応答を有する場合の解析など、より現実的で複雑なモデル化を含む場合の解析や(4)定常状態の解析を計画していた。これらのうち、(1)については単純なモデルに限定されているものの、重要な知見を得ることができた。(2)については理論の拡張に成功することができた。(4)についても定量的な結果を得ることに成功した。これまで4年間の研究により、統計力学的手法を用いた能動騒音制御の解析を十分な程度に達成することができた。そこで得られた知見に基づき、今後はより現実的で複雑なモデルの解析に取り組む予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
人口エピディディモソーム(ARTEPS)技術の開発と精子受精能獲得機構の解明

近年、哺乳動物の精子の機能的成熟に於けるepididymosome(EPS)の役割が注目されている。本研究では、EPSによって精子に供給されるアルドース還元酵素(AR)に着目してcapacitation(CPN)のメカニズムを解析し、ARが細胞質型NADP+イソクエン酸脱水素酵素と共にCPNに伴ってチロシンリン酸化されて、前者は活性上昇、後者は活性低下を来す事により精子内ROSレベルを調節してCPNを担っている事を明らかにした。また、EPSによる機能タンパク質の精子への供給不全が精子成熟不全の一因と考え、人工EPSによる精子へのタンパク質供給システムの開発を試みた。本申請研究では、精子capacitation (CPN)の分子機構の解明、及び、水溶性(脂質膜非透過性)タンパク質をブタ精子にデリバリーするシステム(ARTEPS; ARTificial EPididymosome技術)の確立を目指した。[CPNの分子機構の解明]CPNの詳しい分子メカニズムは不明な点が多いが、ROSレベルの上昇と機能タンパク質のチロシンリン酸化が重要であると考えられている。本研究では、先ず、aldose reductase (AR)とIDPcをCPNに伴いチロシンリン酸化されるタンパク質として新たに同定した。更に、精子のARは成熟過程で体細胞から付与される外来タンパク質であることが明らかとなった。また、ARの特異的阻害剤を用いた実験結果より、CPNに伴いARがチロシンリン酸化を受け活性化することで、CPNに深く関係するhyperactivationとROSレベルの上昇が起こることが示唆された。一方、IDPcはCPNに伴って活性が低下することが判明した。以上の結果から、ARとIDPcのチロシンリン酸化による活性変化が、NADPHを介した抗酸化ストレス系の働きを低下させ、ROSレベルの上昇の誘導に深く関わっていることが推察された。[ARTEPS技術の開発]精子は精巣上体由来の因子がエピディディモソーム(EPS)とよばれるリポソーム小胞によって供給されることで成熟精子となる。この生理的仕組みを模倣して、人工のエピディディモソーム(ARTEPS)による精子へのタンパク質のデリバリーシステムを開発し、人為的に任意の機能を精子に付与できる新しい技術を生み出そうと試みた。そこでまずは、脂質組成の異なる市販のリポソーム化薬剤(COATSOME EL series)数種へARを導入し、その後、調整したリポソームをブタ精子に導入した。[CPNの分子機構の解明]初年度は、CPN特異的チロシンリン酸化タンパク質として新たに同定したaldose reductase (AR)と細胞質型NADP+依存性イソクエン酸脱水素酵素(IDPc)がCPNを引き起こす鍵因子の一つであることを報告した。しかし、実際に精子のどこに局在するAR及びIDPcがその役割を果たしているのかは明らかにしていなかったので、本年度は、先ずそこを明らかにすることとした。解析の結果、AR、IDPc共に鞭毛に局在するタンパクがCPNに伴いチロシンリン酸化を受け、活性を変化させていることが明らかとなった。加えて、その活性変化がNADPHレベルの低下、グルタチオンサイクルの低下、ROSレベルの上昇、CPN及び超活性化運動の誘起に深く関わっていることが示唆された。本年度は、初年度に開発した技術を用い、先ずは、精子にAR及びIDPcを導入し、運動性の解析を行うことを試みた。当初の計画通り、AR及びIDPcを人為的に精子に導入し、また、運動性の解析は行うことには成功した。今後は、導入後の精子で人工授精を行うなどして受精能力の解析を行っていく予定である。精子のcapacitation (CPN)の分子機構の解明に関しては、当初の予想を上回る成果を上げ、CPNにおける新たなROS産生系を示せた。本研究で、CPN特異的にチロシンリン酸化されるタンパク質として新たに同定したaldose reductase (AR)とIDPcの機能解析から、両者のチロシンリン酸化による活性変化によって、精子内のNADPHレベルが制御され、それが生理的なROSレベルの調節に結びついて、精子の種々の活性が調節されている可能性が強く示唆された。更には、チロシンリン酸化したARとIDPcが精子の鞭毛に局在することも明らかとなり、両者は精子がCPNを起こした時に認められる運動性の変化であるhyperactivationにも密接に関与している可能性が示唆された。

これらの新しい知見により、目的であるCPNの分子機構の理解が大きく進んだ。一方で、研究の進展を受けて、CPNの分子機構の研究に時間と研究費を割かれたこともあり、ARTEPS技術の確立においては最高の封入率を保証する実験条件の検討において計画に若干の遅れが認められる。研究費も適正に使用し、全体としてみれば、順調に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。生殖生化学これまでの研究から、精子がCPNを起こすためには、ROSが適切なタイミングで産生され、またそのレベルが適切に制御されていることが必要であり、精子内ARとIDPcはその調節の中枢を担っていると考えられた。そこで、両者のチロシンリン酸化部位の同定、また、それらのタンパク質をリン酸化するチロシンキナーゼの同定など更なる機能解析を進め、CPNの分子機構に対する理解を深化させていく予定である。これと並行して、精子にタンパク質を封入する際の各パラメータを操作し、より簡便に最高の封入率が得られるARTEPS技術の確立を目指す。そして、その技術を使い、精子に人為的にARやIDPcのようなCPNに深く関わると予想されるタンパク質を導入し、その後の精子の運動性や受精能力を精査していく予定である。最終的には、精子活性化不全が原因の不妊症や精子凍結保存法など臨床への応用の道を探っていく。
脳組織修復におけるミエリン糖蛋白(MAG)の遺伝子発現に関する研究

myelinーassociated glycoprolein(MAG)は分子量約100KDaのミエリン糖蛋白で、その含有量は微量であるが、免疫グロブリンス-パ-ファミリ-の一員として細胞接着に重要な分子であろうと考えられている。我々はマウスのMAGのcDNAクロ-ニングを行い,ミエリン形成に伴ってalternative splicingによる2種類のMAG分子(smallーMAG:SーMAGおよびlargeーMAG:LーMAG)の発現調節が行われていることを明かにしてきた。本研究では神経組織障害後の再生の過程において、MAGがニュ-ロン・グリア間の細胞間認識分として生物学的にどのような役割を担っているか明かにし、神経組織修復の機序の解明の一助とすることを目的として行われた。2年間の成果は次のごとくである。1)オリゴデンドログリアの代謝障害による一次性脱髄を呈するクプリゾン中毒マウスにて、ミエリン障害およびミエリン再形成のモデルを確立した。2)中大脳動脈結紮ラットにて二次性脱髄のモデルを確立した。3)LーMAG及びSーMAGそれぞれに特異なc末端のポリペプチドを合成し兎に免疫しそれぞれに特異な抗体を作製することに成功した。4)クプリゾン中毒マウスにて、LーMAG及びSーMAGに特異なcDNAプロ-ブを用いてそれぞれのmRNAの発現を定量し、ミエリン再生期にもLーMAGの発現が増加していることを確認した。5)中大脳動脈結紮ラットにて、抗MAG抗体などを用いて脳蛋白の変動を明かにした。6)遺伝性ミエリン形成不全マウスであるquakingにて、発育を通じてLーMAGが発現していないことが明かとなり、LーMAGのミエリン形成における重要性を確認した。7)ヒトMAGのcDNAクロ-ニングにも成功し、LーMAGのmRNAのみが確認され、進化上もその重要性が示唆された。これらの成果から、脳障害後の修復期におけるMAG分子の特異な発現が機能的に重要であることが明かにされた。Myelin-associated glycoprotein(MAG)は細胞間認識、特にミエリンと神経軸索との相互認識に重要な分子であり、脳損傷後のミエリン再形成に重要な役割を担っていると考えられている。この点に関して平成元年度中に達成された成果は、以下のごとくであります。1.オリゴデンドログリアの障害による一次性脱髄のモデルと考えられているクプリゾン中毒マウスを用いて、ミエリン再形成のモデルを確立した。2.未熟型および成熟型のMAGのメッセンジャ-RNAに特異な合成プロ-ブを用いて、クプリゾンモデルでのミエリン再形成期に未熟型MAGが再上昇しており、発達初期のみでなく、ミエリン再形成時にも未熟型MAGが重要であることを明らかにした。3.中大脳動脈結紮ラットを作製し、まずMAGを含めた脳蛋白の分解について検索したところ、神経細胞に特異なMAP-2蛋白とMAGが減少することを明らかにした。4.マウスMAGのcDNAクロ-ニングにより、3種のcDNAクロ-ンを得ることができたが、その中の1種はラットでも報告されていない新しい型であった。5.ヒトMAGのcDNAクロ-ニングに成功したが、6コのクロ-ンは全てラットおよびマウスでの未熟型MAGに相当するものであった。6.マウスおよびヒトのMAGのcDNAクロ-ニングから明らかにされたアミノ酸配列を基に、未熟型および成熟型MAGに特異な合成ペプチドを作製し、家兎に免疫してそれぞれに特異な抗体を作ることに成功した。