hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境センサー遺伝子を用いた胎児発育を促進する子宮環境メカニズムの解明

本研究では、Period1-luciferase遺伝子操作ラット実験モデル(Period1「ピリオド・ワン」は時計遺伝子)を用い、胎児の成長発達を促進する子宮環境とそのメカニズムを明らかにすることが最終目的である。本研究においては、子宮内環境を時計遺伝子にて評価するためのシステム開発を行った。本研究の目的は、Periodl-1uciferase遺伝子操作ラット実験モデル(Period1「ピリオド・ワン」は時計遺伝子)を用い、胎児の成長発達を促進する子宮環境とそのメカニズムを明らかにすることが目的である。特に子宮環境の日内変動が胎児発達に与える影響に注目し、(1)サーカディアン変動のある子宮環境、(2)サーカディアン変動のない子宮環境の2群を設定し、2つの子宮環境が胎児の成長に与える影響およびメカニズムの解明を行う。本研究では第一のステップとして、妊娠子宮がサーカディアンな環境であるか否かを評価するために、Period1遺伝子操作ラットを用いた妊娠母体モデルを作成した。昨年度は予定通り、(1)「妊娠子宮がサーカディアンな環境であるか否か」の検討を終了し、明暗サイクル環境下で飼育したラットの妊娠子宮において、Period1遺伝子の発現を指標として、妊娠初期末期まで継続的に約24時間周期のサーカディアン・リズムが存在することを明らかにした(特許出願案件)。本年度は、脳生物時計「視交叉上核」を取り除いた妊娠母体ラットモデルを作成し、サーカディアン変動のない子宮環境を構築した。このモデル動物を用い、サーカディアン変動のない子宮環境にて発育したラット胎児の生物時計の機能、成長発達の評価を(1)胎児視交叉上核のPeriodl遺伝子の発現、(2)胎仔の体重・臓器重量の増加、(3)各種成長関連因子の経時的変化を指標に行った。本研究の目的は、Period1-luciferase遺伝子操作ラット実験モデル(Period1「ピリオド・ワン」は時計遺伝子)を用い、胎児の成長発達を促進する子宮環境とそのメカニズムを明らかにすることが目的である。特に子宮環境の日内変動が胎児発達に与える影響に注目し、1サーカディアン変動のある子宮環境、2サーカディアン変動のない子宮環境の2群を設定し、2つの子宮環境が胎児の成長に与える影響およびメカニズムの解明を行う。具体的には、妊娠7日目(満期23日)に全身麻酔下の母獣の頭蓋骨の一部に穴を開け、脳組織破壊用電極を挿入する。精密位置測定器(ステレオ・タキシック)ガイドライン下に電極先端を視交叉上核に固定させ、電流焼却により生物時計(視交叉上核)を破壊した。この操作により、妊娠母体の子宮・その他の器官のPeriod1リズムおよび行動リズムからサーカディアン・リズムが消失した。以上のように本年度は予定通り、1「妊娠子宮がサーカディアンな環境であるか否か」の検討を終了し、明暗サイクル環境下で飼育したラットの妊娠子宮においてPeriod1遺伝子の発現に約24時間周期のサーカディアン・リズムが存在することを明らかにした(特許出願案件、特願2010-52778)。本年度は予定通り、1「妊娠子宮がサーカディアンな環境であるか否か」の検討を終了し、明暗サイクル環境下で飼育したラットの妊娠子宮において、Period1遺伝子の発現を指標として、妊娠初期末期まで継続的に約24時間周期のサーカディアン・リズムが存在することを明らかにした(特許出願案件)。来年度は、脳生物時計「視交叉上核」を取り除いた妊娠母体ラットモデルを作成し、サーカディアン変動のない子宮環境を構築する。このサーカディアン変動のない子宮環境にて発育したラット胎児の生物時計の機能、成長発達の評価を1胎児視交叉上核のPeriod1遺伝子の発現、2胎仔の体重・臓器重量の増加、3各種成長関連因子の経時的変化を指標にして行う。
地球温暖化による降水量変化予測の排出シナリオ依存性

全球気温変化1°Cに対する全球平均降水量の変化率(降水量感度)には、モデル間で大きな不確実性があり、活発に研究が行われてきた。本研究は、MIROC3.2大気海洋結合モデルを用いて、数値実験を行うことで、降水量感度が温室効果ガスとエアロゾルの排出シナリオに明瞭に依存することを示した。その原因を調べるために、MIROC3.2モデルを用いて、温室効果ガスとエアロゾルによる影響を切り分ける感度実験を行った。その結果、炭素性エアロゾルの排出量の違いが降水量感度の排出シナリオ依存性をもたらしていることが分かり、さらにそのメカニズムを明らかにした。大気海洋結合モデルを用いた地球温暖化予測実験において、温室効果ガス濃度とエアロゾル排出量のシナリオ(排出シナリオ)が異なると、単位気温変化あたりの全球平均降水量変化率が変わることが近年しめされてきた。しかし降水量変化率が何故排出シナリオに依存するのかは明らかになっていない。本研究では、降水量変化率が排出シナリオに依存する要因を解明することを目的とする。平成20年度は、エアロゾルの第1種、第2種間接効果を陽に扱うことのできる大気海洋結合モデル(MIROC3.2)を用いて、「気候変動に関する政府間パネルの排出シナリオに関する特別報告(IPCC SRES)」のA2とB1の2種類の排出シナリオに沿った人為起源外部要因切り分け実験を行った。切り分けた外部要因は、(1)二酸化炭素などの温室効果ガスの濃度変化、(2)炭素性エアロゾルの排出量変化、(3)硫酸性エアロゾルの排出量変化、(4)対流圏と成層圏のオゾン濃度変化の4種類である。また全ての外部要因を2000年条件で固定した2000年固定実験を行った。全ての実験について、3から10メンバーのアンサンブル実験を行い、内部変動の影響を小さくした。これらの実験を統計的に解析することで、外部強制力に対する応答の線形性が保たれていることを確認した。これによって、降水量変化率の排出シナリオ依存性には、強制力-応答関係の非線形性は、重要な役割を果たしていないことがわかった。大気海洋結合モデルを用いた地球温暖化予測実験において、温室効果ガス濃度とエアロゾル排出量のシナリオ(排出シナリオ)が異なると、単位気温変化あたりの全球平均降水量感度が変わることが近年しめされてきた。しかし降水量感度が何故排出シナリオに依存するのかは明らかになっていない。本研究では、降水量感度が排出シナリオに依存する要因を解明することを目的とする。昨年度は、エアロゾルの第1種、第2種間接効果を陽に扱うことのできる大気海洋結合モデルを用いて、外部要因(温室効果ガス、硫酸性エアロゾル、炭素性エアロゾル、対流圏・成層圏オゾン)を個別に与えた数値実験を行い、どの外部要因が降水量感度の排出シナリオ依存性をもたらすかを明らかにするための準備を行ってきた。本年度は、昨年度に実行した数値実験結果を分析し、温室効果ガスとエアロゾルの強制力に対して、それぞれ気温が1°C変化したときの降水量感度が異なることを示した。排出シナリオごとに温室効果ガスとエアロゾルによる放射強制力の割合に差があるため、降水量感度に排出シナリオ依存性が生じている。さらに、温室効果ガスとエアロゾルで降水量変化率が異なる原因を、地表面熱収支、および大気大循環論的な視点から明らかにした。また、エアロゾルの第2種間接効果による降水量に対する影響を定量的に診断する新手法を開発した。その結果、炭素性エアロゾルによる降水量減少のうち、約1/3が第2種間接効果による瞬時影響(フィードバックを含まない影響)であることも明らかになった。これらの成果は、外部強制力に対する降水量応答を理解する上で、新たなフレームワークを提供している。
脳における蛋白質の老化異常とカルボキシメチル化反応

老化など経時的変化によって生じる細胞内損傷蛋白質の修復機能研究は細胞生物学分野において重要のみならず、急速に高齢化社会を迎えつつある我が国の高齢者の健康維持という面からもその基礎的研究として重要なものと考えられる。我々は蛋白質カルボキシメチル化反応を中心に老化損傷蛋白質修復機構を研究してきたが、本反応の中心をなす蛋白質カルボキシメチル基転移酵素(PCM)については不明な点が多かった。今回我々は本酵素cDNAを得て、その構造を明らかにすると共にPCM遺伝子についても成果を得ることができた。以下にその要点を記した。1.ラット脳cDNAライブラリ-より2種のクロ-ン(0.8kb、1.6kb)を得た。2.両者の全塩基配列を決定し比較したところ、短鎖の配列は長鎖の一部に完全に一致した。翻訳領域は227個のアミノ酸からなり、分子量24,600の蛋白質をコ-ドすることが分かった。3.このcDNA翻訳領域をプロ-ブとしてRNAブロット解析を行うと3.4kb、2.0kb、1.3kb、の3種が観察された。一方3′側非翻訳領域をプロ-ブとした場合2.0kbのバンドしか認められなかった。これはcDNAストップコドン下流250b付近にあるボリA類以配列が転写を終結させるよう働き、1.3kb RNAが生成するものと考えられる。しかし、3.4kbの長鎖RNAの性質については現在まだ不明である。4.遺伝子DNAブロット解析の結果、本PCM遺伝子は単一であろうと考えられた。5.遺伝子ライブラリ-をスクリ-ニングして2種のクロ-ンを得、解析の結果5個のエクソンを確認できたが、cDNAの5′、3′両端に相当するエクソンは見つかっていない。しかし既にこの領域を持つと思われるクロ-ンは得ているので、PCM遺伝子全構造の解析も遠くない時期に可能と思われる。蛋白質のカルボキシメチル基転移酵素(PCM)は、Sーアデノシルメチオニンのメチル基を基質蛋白質のカルボキシル残基に転移する反応を触媒している。真核細胞の本酵素は分子量25,000のモノマ-構造を持ち、基質特異性は広い。生理的には、加齢などにより蛋白質中に生じたDーアスパラギン酸やイソアスパラギン酸を正常状態に復帰させるため働いていると考えられているが、明確ではない。我々は本酵素の構造を明らかにするため、ヒト赤血球PCMの部分アミノ酸配列から作った合成オリゴDNAプロ-ブとして、ラット脳cDNAライブラリ-からPCMに対応するcDNAクロ-ンを拾いだした。その結果、0.8Kbと1.6Kbのインサ-トDNAを持つ2種のクロ-ンが得られた。塩基配列決定結果から、短鎖DNAは長鎖DNAの5′側に含まれることが判り、更にラット脳PCMは分子量24,700、227個のアミノ酸からなると推測された。今回得られたcDNAから予測されるラット脳PCMのアミノ酸配列と、最近、ヒト及びウシ赤血球PCM蛋白質から得られたアミノ酸配列とを比較すると、両者とも90%以上という一致が見られ、本酵素は遺伝的に極めて保存された構造を持つことが判った。本cDNA中の蛋白質をコ-ドする領域のDNAをプロ-ブとしてノザンブロット解析を行った所、3種の長さの異なるRNAの存在が明らかとなった。次いで、ラットゲノムDNAを各種制限酵素処理後サザンブロット法による解析を行い、ゲノム中のPCM遺伝子について検討したところ、偽遺伝子の可能性をも含めて複数遺伝子の存在を示唆する結果を得た。

そこで我々はサザンブロットの結果に基づき、ゲノムDNAライブラリ-を作成した。cDNAをプロ-ブとしてスクリ-ニングを行い、5Kbのインサ-トを持つクロ-ンを得た。現在詳細を検討している。ラット脳cDNAライブラリ-より得られた蛋白質カルボキシメチル基転移酵素(PCM)cDNAの翻訳領域にプロ-ブとして用い、ラット脳poly(A)RNAのノザンブロット解析を行ったところ、長さの異なる3種のRNA(3.4kb、2.0kb、1.3kb)'の存在が明らかになった。一方、3'側非翻訳領域をプロ-ブとした場合2.0kb RNAのみが現われた。PCM cDNAのストップコドンの下流にはATTAAAやAAGAAAというポリA類似配列があることから、PCM遺伝子の転写が部分的に終了してしまうため1.3kb RNAが出現すると考えられる。3.4kb RNA出現の機構については現段階では不明である。また、ラット遺伝子DNAのサザンブロット解析を行ったところ、cDNAの翻訳領域、3'側非翻訳領域をプロ-ブとした場合、複数のバンドが観察されたが、5'側非翻訳領域をプロ-ブとした場合には単一のバンドを与えることから、本PCM遺伝子は単一であろうと予測される。そこで、上記プロ-ブを用い、ラット遺伝子ライブラリ-をスクリ-ニングして2種の陽性クロ-ンを得た。それらのクロ-ンに含まれる遺伝子DNA断片をサザンブロット解析、制限酵素地図作成、エクソン付近の塩基配列解析などを行うことにより、PCM遺伝子をコ-ドする5個のエクソンの存在を確認した。しかしcDNAの5'端及び3'端に相当する塩基配列を持ったクロ-ンを見出せなかったので、再度λEMBL3にラット遺伝子DNAを組込んだライブラリ-を構築し、前と同様の方法でスクリ-ニングしたところ、5'側1個、3'側で多数の陽性クロ-ンを拾い出せた。現在までに得られたPGM遺伝子断片をつないでいった結果から判断して本遺伝子は少なくとも40Kbp以上の長さがあるように思われる。中でも3'側のプロ-ブに用いた領域はミトコンドリア遺伝子中の4NDー4LND領域と96%の類似性を示すところなので、ミトコンドリアの細胞内進化との関連で興味深い。
部分的内耳切断時の内耳保護に関する基礎的研究

部分的内耳破壊に対する内耳機能の変化とその保護について、主に電気生理学的手法を用いて解明をおこなった。(1)内リンパにおいて音伝達に重要な役割を果たすカリウムイオンは、外側半規管の破壊では変化が認められなかったが、前庭まで破壊した場合に濃度の低下が認められ、内耳破壊時の聴力低下の原因として示唆された。(2)内外リンパの急激な漏出を防止することにより、前庭開放時の蝸牛機能をある程度温存する可能性が示唆された。内耳破壊に対する内耳機能特に内リンパ液の病態生理の解明のため、本年は、外側半規管、半規管膨大部、前庭破壊に対する内リンパ電位(EP)、カリウム(K+)並びにカルシウム(Ca2+)濃度の測定を行った。測定はハートレーモルモットを用いて蝸牛の第二回転よりダブルバレルを用いて測定を行った。外側半規管の破壊並びに外リンパ液の吸引ではEP、K+、Ca2+ともに変化を認めなかった。半規管膨大部の破壊ではEPの低下は認めなかったが、K+の一時的な低下を認めたCa2+はほとんど変化を認めなかった。前庭破壊では、EPの永続的な低下並びにK+の一時的な低下、Ca2+の一時的な上昇を認めた(学会並びに論文発表)。これまでの報告でも外側半規管の破壊では聴力が温存され、前庭破壊においては、永続的な聴力低下をきたすことは聴性脳幹反応(ABR)や我々が過去に報告したEPの測定による動物実験、さらに様々な神経耳科手術における臨床報告により知られており、内外リンパ液の破綻が内耳破壊における聴力低下の原因として示唆されると考えられてきたが、内リンパにおけるイオン濃度の変化についてはいまだ解明されていなかった。今回我々の結果により、内リンパにおいて音伝達に重要な役割を果たすK+の低下が前庭破壊において認められ、外側半規管の破壊において認めなかったことは、これまでの仮説を支持するものと考えられた。本年は前年の結果を踏まえ、部分的な内耳破壊に対する蝸牛保護機能の検討を行った。前庭開放にて内リンパ電位の永続的な低下、並びにカリウム濃度の一時的な低下を来たすことが昨年度の研究により明らかとなったため、前庭開放時に、人工外リンパ液、人工内リンパ液、蒸留水のそれそれの液体を用いて急性期における内耳保護の可能性を内リンパ電位、並びにカリウム濃度を指標として検討した。内リンパ電位並びにカリウム濃度の測定においてはハートレーモルモットを用いて、蝸牛の第二回転よりダブルバレル電極を用いて測定を行った。前庭開放はepitympanic bulla経由にてドリルによって行った。いずれの群においてもコントロール群と比較し内リンパ電位の低下を有意に抑えることができたが、各群での有意な差は認められなかった。カリウム濃度は人工内リンパ群において他の群と比較してやや高い傾向が認められたが、測定終了時の濃度には各々の群において有意な差を認めなかった。このことから、急性期においては、用いる液体のイオン濃度にかかわらず液体を障害部位周囲に十分に満たすこと、すなわちリンパ液の急激な漏出を防止することが、前庭開放時の蝸牛機能をある程度温存することに最も寄与する可能性が示唆された。今後は今回の急性期の検討のみならず、慢性期における蝸牛機能並びに組織学的な検討をに行い、将来的な臨床応用に向けてさらなる研究を行っていくことが重要であると考えられた。今年度は、前年度までの実験結果において、半規管並びに半規管膨大部への侵襲では、内リンパ電位(EP)並びに内リンパイオン濃度(K+,Ca2+)の変化は軽微であったが、前庭開放において不可逆的な変化が認められること、また前庭開放時に何らかの液体を満たすことによってEPの低下がある程度抑えられることなどを踏まえて、さらに前庭開放時における蝸牛保護の検討を行った。実験はハートレーモルモットを用いて、前庭開放直後にbone waxにてリンパの漏出を抑えた群、並びに前庭開放を30分間継続した群を用いて行った。蝸牛機能は聴性脳幹反応(ABR,tone burst:8000,16000,32000HZ)の測定で評価した。前庭開放直後にbone waxにてリンパ漏出を抑えた群は全ての周波数において30分間継続した群と比較して有意にABRの閾値上昇を抑えることができた。このことは前年度の実験と同様に、急性期においては、リンパ液の急激な漏出を防止することが前庭開放時の蝸牛機能温存に最も寄与する可能性が示唆された。また、臨床的検討として中耳真珠腫における半規管瘻孔の検討を行った。真珠腫母膜の完全除去においても92%と良好な術後聴力(35/38例)であり、過去の報告と比較しても遜色ない良好な結果であった。

さらに術後の聴力予後について、半規管瘻孔の大きさ(今回の検討では3mm)が最も重要な因子の一つであることがわかった。昨年度までの内耳への器質的な内耳破壊につづいて、今年度は薬剤を用いた内耳破壊、内耳毒性に対する検討をおこなった。実験はハートレーモルモットを用いて、抗生剤“ダプトマイシン"の内耳毒性を検討した。蝸牛機能はABR(tone burst: 4000Hz,8000Hz, 16000Hz, 32000HZ)の測定で評価した。ハートレーモルモットの鼓膜に経鼓膜換気チューブ(高研Dタイプ)を留置し、ABRにて聴力を測定した。聴力測定後、留置した鼓膜換気チューブ経由で鼓室内にダプトマイシン0.1mlを1日2回投与した。鼓室内投与は1週間行った。鼓室内投与終了から一週間後(最初の鼓室内投与から2週間後)に、ABRにて聴力を測定し、鼓室内投与前のABRでの各周波数の閾値と比較し、統計学的に検定した。陰性コントロールは生理食塩水の鼓室内投与群、陽性コントロールはゲンタマイシンの鼓室内投与群とし、各群とも同様に鼓膜換気チューブを留置し、1日2回1週間の鼓室内投与を行った。結果として、ダプトマイシンの鼓室内投与群は陰性コントロール群と比較して、16000Hzにおいて有意な閾値上昇がみられた。その他の周波数では有意な閾値上昇はみられなかった。このことにより、ダプトマイシンの鼓室内投与による蝸牛への耳毒性が示唆された。形態学的に有毛細胞の評価、内リンパ電位(EP)などの電気生理的評価が今後必要と思われる。また、ハートレーモルモットをもちいて人工内耳疑似電極挿入に対する蝸牛機能の変化を検討した。電極挿入を想定した種々の条件で蝸牛に操作を加え、内耳機能をEPにて評価した。鼓室階への吸引操作ではEPに変化はみられなかったが、疑似電極を蝸牛軸方向に挿入すると有意なEPの低下がみられた。聴力温存を目的とした人工内耳の電極挿入については、より慎重な挿入が求められることが示唆された。方法が確立しており、既に論文も刊行されている。更なる研究の進行に努力していく。24年度が最終年度であるため、記入しない。前庭開放時に必要である内耳障害を有効に予防できる方策の探求が鍵である。現時点の方法をさらに進化させるべく研究を行っている。
トラフグの卵成熟誘導を応用したクサフグの早期採卵技術の確立

○研究目的:フグ類は、形態進化を研究する上で興味深い形質を備えている。なかでもクサフグは、すでに全ゲノム配列が決定されているトラフグTakifugu rubripesと近縁種であるが、産卵期が限定されるため生きた胚を用いた実験をできる期間が限られてしまい、実験動物として利用するのが難しい動物である。常時、卵や精子の提供が可能であれば、実験発生学の研究における貢献が期待される。今回の研究では、トラフグ養殖において確立している水温と日長をコントロールし、産卵期以外でも卵成熟させる技術をクサフグに応用し、水槽飼育下において産卵期以外に卵および精子成熟が可能であるかを検討する。○研究方法:個体の採集は、臨海実験所隣接の荒井浜(相模湾)に産卵に来た個体の捕獲および船上からの釣獲により行った。採集した個体は、温度調節できる循環型の角水槽および円形水槽にタイマー付きの蛍光灯を設置し飼育した。個体の成熟状況は、触診により判断した。○研究結果:2010年11月11日から1°Cずつ水温を下げ、11月19日に13°Cに設定した。その後、1°Cずつ上げていき、12月8日に21°Cに設定後はその水温にて飼育を続けた。2011年1月26日に触診し、成熟度の確認を行った。円形水槽で飼育していた5個体のうち1個体は、ごく微量の精子を確認することができた。また、2011年3月18日には得られた精子を光学顕微鏡にて観察した。精子に少量の海水を加えることで精子が泳いでいる姿も観察することができた。これは、自然成熟よりも2ヶ月早く成熟させることができたということを示しており、クサフグにおいても水温調節による早期成熟が可能であり、今後の実験発生学研究への貢献が期待される。
バイオインターフェイス構築への蛋白質工学的展開

本研究では、医薬開発、ナノ材料への応用の著しい加速を可能にする技術基盤の構築を目的に、特に生体免疫系では特異的抗原性が発現し難い、細胞表面抗原、工学材料表面に焦点を絞り、特異的抗体分子の人工選択とその機能評価を進めた。結果、新たに取得した抗体の人工組換えや精密機能解析に基づき、医用への展開が期待できる複数の非天然型抗体分子の構築や、蛋白質間、あるいは蛋白質と工学材料間のバイオインターフェイスとして機能する抗体分子の構築に成功した。本研究では、1.抗体の分子認識能による安定な人工選択、2.人工的分子形態の創製、3.選択された抗体の高効率な調製系の構築、という三つの基盤に基づいて、抗体医薬開発、ナノ材料への応用を可能にする技術基盤の構築を目標としている。特に、細胞表面抗原、工学材料表面に焦点を絞り、特異的認識抗体分子の人工選択とその機能評価に基づき、応対の人工組換えによる、蛋白質や細胞間と工学材料間のバイオインターフェイスの人工設計の基盤構築を目指している。本年度の研究成果は以下の通りである。1.ヒト抗体分子の選択と調製:(1)細胞表面抗原:アポトーシス関連因子Trail受容体、癌関連抗原EGF受容体について、生細胞を用いたヒト抗体の人工選択ならびにヒト型化抗体の親和性向上を目指した。EGF受容体特異的ヒト型化抗体528の構造・物理化学的解析を行い、ヒト型化による親和性低下に関する新規な知見を得た。(2)工学材料:SPR法を用いた選択法を整備し、蒸着金表面特異的抗体の選択に世界で始めて成功し、その機能評価研究を開始した。(3)人工選択により調製した生分解性プラスチック特異的抗体について、その結晶構造を明らかにし、抗原との界面に存在すると考えられる部位にAla置換を導入、PHB吸着蛋白質との認識能の類似性を指摘、またHot-Spotの存在を示した。2.分子形態の構築と利用:CD16特異的抗体3G8可変領域の遺伝子工学的調製を行い、CD3特異的抗体OKT3との融合によるDiabodyを作製、その機能評価を行った。EGFR特異的抗体528とOKT3の一本鎖抗体を、ヒト抗体可変領域に置き換えたscFv-Fcを構築し、その顕著な細胞障害性を観察した。3.(2)で選択したPHB特異的抗体、蒸着金表面特異的抗体とモデル抗体によるDiabodyを作製し、材料表面への標的分子の特異的集積を試みた。1.ヒト抗体分子の選択と調製:(1)ヒト細胞表面抗原;TRAIL、EGFRなどの、がん関連抗原特異的な抗体の取得を目指して、セルソーターを用いた高効率選択系の確立を目指した。またADCCに寄与するCD16に対する抗体取得に向けて、新たにCD16安定発現CHO細胞株を樹立した。ヒト型化により親和性が低下した抗EGFR抗体528に関しては、VHのHot-Spotと考えられるCDR中の残基に無作為導入を行い、ファージ提示法により親和性が向上したクローンの選択に成功した。(2)工学材料;前年度取得した抗金表面抗体の安定性向上に向けてgerm lineには見られない残基へ部位特異的変異導入を行った。またファージ提示法により単離したマテリアル認識ペプチドをCDRに移植した抗体を新たに作製し、バイオインターフェイス分子としての展望を示した。2.人工的分子形態の構築と利用:当研究室で構築したCD3とEGFRを認識するdiabodyの高機能化を目指して、複数の非天然型人工抗体を構築した。いずれも従来のdiabodyを凌駕する効果を示し、今後の人工的分子形態の創製に重要な知見を与えた。3.抗体の高効率な調製系の構築:大腸菌高密度培養、及び動物細胞遺伝子増幅系に着手し、分子サイズ、形状に特化させた高効率調製法の整備を開始した。

本年度の研究成果は以下の通りである。1.ヒト抗体分子の選択と調製:(1)ヒト細胞表面抗原;CDR移植法と全合成法を用いて、抗CD16抗体3G8のヒト型化を行い、前年度樹立したヒトFc受容体(CD16)安定発現CHO細胞株を用いた最適化にも着手した。一方、VHの親和性の回復に成功したヒト型化抗EGFR抗体のVLに関しても、生細胞パニングなどにより親和性の向上に成功した。(2)工学材料;ランダム変異と高温下での選択により、金表面特異的抗体の安定化に成功した。またマテリアル認識ペプチドのCDR移植により構築した酸化亜鉛特異的抗体に関しても無作為変異導入法による親和性成熟に成功した。(3)得られた抗体の分子認識能の解析;ヒト型化528の結晶構造解析に成功し、ヒト型化前との比較検討により、親和性の低下に関する知見を得た。2.人工的分子形態の構築と利用:昨年度に引き続き、複数のCD3とEGFRを標的とした非天然型二重特異性抗体の開発を進め、極めて高活性の分子形態の創出に成功した。また金表面特異的抗体を用いたdiabodyの金基板上での生体分子との架橋効果を確認するなど、バイオインターフェイス分子構築に向けて大きく前進した。3.抗体の高効率な調製系の構築:dhfr遺伝子増幅系を利用した新規、動物細胞用発現ベクターを構築した。本研究では1、抗体の分子認識能による安定な人工選択、2、人工的分子形態の創製、3、選択された抗体の高効率な調製系の構築、という三つの基盤に基づいて、抗体医薬開発、ナノ材料への応用を可能にする技術基盤の構築を目標としている。特に、細胞表面抗原、工学材料表面に焦点を絞り、特異的認識抗体分子の人工選択とその機能評価に基づき、応対の人工組換えによる、蛋白質や細胞間と工学材料間のバイオインターフェイスの人工設計の基盤構築を目指している。1、ヒト抗体分子の選択と調製:(1)ヒト細胞表面抗原;ヒト型化抗EGFR抗体528に、さらに数カ所の変異を組み合わせることで、またヒト型化抗CD16抗体の最適化に関しても、網羅的な変異体の作製と機能評価により、それぞれヒト型化前と同等の親和性の実現に成功した。(2)工学材料;ペプチドCDR移植によるマテリアル認識抗体作製技術の一般化に向けて、シングルドメインで機能するラクダ抗体へ酸化亜鉛認識ペプチドを移植し、詳細な機能解析を行った。(3)、得られた抗体の分子認識能の解析;ヒト型化528変異体の精密機能解析により親和性の向上に寄与した因子の考察を深め、またCDR領域の置換により、金表面特異的抗体の認識にCDR3が重要であることを明らかにした。2、人工的分子形態の構築と利用:高親和性化528に基づく変異導入により、前年度までに構築した非天然型二重特異性抗体の高機能化に成功、さらにヒト型化528scFvを、ストレプトアビジンを介して四量体化させることで、親和性の向上と新たに細胞傷害活性を発揮することを明らかにした。新規バイオインターフェイス分子の開発に向けては金表面特異的抗体を用いたdiabodyの金ナノ粒子の架橋効果を観察すると共に、金基板への蛋白質分子の固定化に成功した。
19世紀英国の芸術家集団による恊働的実践―「古代人たち」から「エトラスカンズ」へ

19世紀ヨーロッパでは、危機的な社会・政治状況の下で各地に結成された芸術家兄弟団が芸術規範に挑んだ新しい芸術を恊働して生み出そうとする動きが見られた。本研究はイギリス19世紀の兄弟団「古代人たち」(1820-30年代)、ラファエル前派兄弟団(1848-50年代)、エトラスカンズ(1860-80年代)を研究対象とし、彼らが恊働して制作した「プリミティヴ」な絵画及び唯美主義的絵画の共通性と差異、兄弟団が抱えた矛盾、グループ間の繋がりを明らかにし、彼らの集団的な芸術実践のありようを考察した。またイギリスのレディング大学名誉教授J. B. Bullen氏を招聘し、本研究課題に関わる講演会を開催した。平成26年度は、芸術家集団「古代人たち」(The Ancients)の恊働性についての研究調査を開始した。関連文献を狩猟したほか、S.パーマーらの作品の調査を行った。調査は、筑波大学、ロンドンのナショナル・アート・ギャラリー、ヴィクトリア&アルバート博物館、テイト、ナショナル・ギャラリー等で行った他、今後の調査のためにオクスフォードのアシュモリアン博物館に作品に関する調査を申請した。平成27年度の研究として予定していたラファエル前派兄弟団に関する調査研究も行い、研究成果を論文「ラファエル前派の中世風絵付け家具における「無骨な」テクノロジーデザインとマテリアリティのあいだ」にまとめ、『ロンドンーアートとテクノロジー』(山口惠里子編、竹林舎、2014)に発表した。『ロンドンーアートとテクノロジー』は、20名(山口を含む)の執筆者による論文集で、19世紀ロンドンのアートシーンをアートとテクノロジーの関係から描出したものであり、産業革命後にテクノロジーが急激に進展し、共同体に基づく社会から「近代的」個人によるアトム化された社会へと人びとの営みのかたちが急変していくなかで、芸術家が恊働的実践に作品制作の拠り所を求めた背景を追究している。本書に、上記論文と序論を執筆したほか、A.グリーヴ氏のロセッティ論を翻訳した。本書にはT.バリンジャー氏の論文の翻訳も含まれる。翻訳の過程でグリーヴ氏、バリンジャー氏らとの情報交換を行った。『イギリス文化事典』(丸善出版、2014)に4項目(「ダンテ・ゲイブリエル・ロセッティ」「ウィリアム・モリス」「ロンドン・ナショナル・ギャラリー」「アーツ・アンド・クラフツ運動」)を執筆、さらにラファエル前派と関わりがあった画家にも言及した論文「乳房に恵まれるーヨーロッパにおける授乳するマリア像」を『乳房の文化論』(淡交社、2014)に発表した。交付申請書では本年度はラファエル前派兄弟団に関する研究調査を行う計画だったが、昨年度にラファエル前派兄弟団に関する調査を前倒しして行い、研究成果を、編著『ロンドンーアートとテクノロジー』(竹林舎、2014)に発表したため、本年度は昨年度に研究調査を行った「古代人たち」の調査を続行し、論文にまとめた。本論文は平成28年度に出版予定である。「古代人たち」に関する調査は主としてイギリスのアシュモリアン博物館、フィッツウィリアム博物館、大英博物館、ヴィクトリア・アンド・アルバート博物館、テイト・ブリテンで行った。「古代人たち」に関する文献も、上記美術館・博物館、およびナショナル・アート・ライブラリー(ロンドン)で収集した。イギリスのブライトンにあるアーカイヴThe Keepで研究調査を行い、ジョン・ロックウッド・キプリングに関する論文を執筆した。この論文も平成28年度に出版予定である。平成27年11月4日、5日には筑波大学にJ. B.ブレン教授(レディング大学名誉教授)を招聘し、公開学術講演会とセミナーを開催した。"The British Art World Turned UpsideDown: The Pre-Raphaelite Revolution"と題された講演会(4日)では、ブレン教授に、ラファエル前派兄弟団に関する講演をしていただいた。"Victorian Artsits and the Spiritual World"と題したセミナーでは、心霊主義がラファエル前派兄弟団のD. G.ロセッティ、彼の友人アンナ・メアリ・ハウイットとJ. M.ホイッスラーに及ぼした影響についてブレン教授にご講演いただいた。『ヴィクトリアン・ダンディーオスカー・ワイルドの服飾観と「新しい女」』(佐々井啓著)の書評を執筆、『オスカー・ワイルド研究』14号に掲載された。主たる研究対象としたラファエル前派兄弟団と「古代人たち」に関する論文をそれぞれ執筆した。ジョン・ロックウッド・キプリングも、ラファエル前派の芸術家たちと深い関係があることから、キプリング論もラファエル前派に関連した論文となっている。また、「古代人たち」とラファエル前派との関連も明らかになり、現在この両者をつなぐ論文を執筆している。平成26年度は1820-30年代にイギリスのパストラルの風景画を再生させたサミュエル・パーマーを中心とする芸術家グループ「古代人たち」、平成27年度はロンドンで反アカデミーを唱えて結成されたラファエル前派兄弟団について研究したが、その成果をふまえて平成28年度は、イギリス19世紀後半に「エトラスカンズ」と呼ばれた芸術家グループについての調査研究を行った。調査はイギリスのヴィクトリア・アンド・アルバート博物館、ナショナル・アート・ライブラリー、アシュモリアン博物館、レイトン・ハウス・ミュージアム、ハワード・キャスル等で行った。「エトラスカンズ」は、イタリア人画家ジョヴァンニ・コスタの周囲に集まったイギリス人芸術家グループで、ローマを中心にして新しい風景画の制作に取り組んだ。

国際的な芸術活動を通して、彼らはイギリス風景画にどのような斬新さを与え、それがどのようにイギリス美術界に影響を与えたのか、さらにエトラスカンズがイタリアにおいて「ラファエル前派」を広めたプロセスについて明らかにすることを試みた(論文として発表する準備をしている)。平成26年度に行った「古代人たち」に関する調査研究を、論文「サミュエル・パーマーのパストラルにおける翳りー夢と影のヴィジョン」として発表した。また、ラファエル前派の画家たちと交流があったジョン・ロックウッド・キプリングのインドにおける教育および制作活動とイギリスでのアーツ・アンド・クラフツ運動との関連を論じた研究も発表したほか、ラファエル前派を擁護した美術評論家ジョン・ラスキンの評論をイメージ人類学との関係から論じた講演を行い、論文としても発表した。さらに、ラファエル前派の画家D. G.ロセッティについて論文を執筆した(平成29年度に刊行予定)。平成28年度には、イギリスから研究者を招聘し、講演会ないしはシンポジウムを開催する予定だったが、予定していた研究者の来日が難しくなった。そのため科研費の補助事業期間を平成29年度まで延長する申請を行い、承認された。また平成28年度中の出版を目指していたラファエル前派に関する書籍(英文)は、平成29年度中に完成する予定である。1平成29年度の研究実績。(1)ラファエル前派兄弟団の画家D. G.ロセッティに関する論文「肉をまとう魂ーD. G.ロセッティが描いた<手>について」を出版した(『イギリス美術叢書IIフィジカルとソーシャルーウィリアム・ホガースからエプスタインへ』に所収、平成29年7月)。(2)ラファエル前派兄弟団と「古代人たち」との個人的な関係と芸術上の連関が、ロセッティが出版に尽力したブレイク伝をめぐって生起したことを、論文「「古代人たち」からラファエル前派、そしてD. G.ロセッティへーA.ギルクリスト『ウィリアム・ブレイクの生涯』を媒介として」において明らかにした(『論叢現代語・現代文化』[筑波大学人文社会科学研究科現代語・現代文化専攻]19号に掲載、平成30年2月)。研究課題として挙げた芸術家グループ「エトラスカンズ」については、イギリスの図書館・美術館等における調査研究の成果を、現在、論文としてまとめている。ロセッティの芸術に関する英文による著書も執筆中である。(3)平成30年2月12日より22日までイギリスのレディング大学名誉教授であり現在オックスフォード大学ケロッグ・カレッジのVisiting FellowであるBarrie Bullen氏を招聘し、本研究課題に関わる講演会を、筑波大学、日本女子大学、中央大学駿河台記念館で開催し、国際共同研究の端緒を開いた。2補助事業期間全体の研究実績。芸術家グループ「古代人たち」
インフラマソームが繋ぐ宿主・寄生体相互関係における炎症シグナル機構の解析

今回、歯周病細菌感染マクロファージにおける炎症反応誘導時に、インフラマソームが活性化することを見出した。ヒトおよびマウスマクロファージへのファゴサイトーシスによる歯周病細菌の取り込みを確認した後、インフラマソーム関連因子であNLRP3受容体の発現とIL-1βの発現、アダプタータンパク質のASCやcaspase-1の発現を確認した。カテプシンBや活性酸素の発現が認められ、IL-1β発現への関与が明らかとなった。歯周病細菌感染マクロファージにおいて、NALP3の発現を伴うインフラマソーム活性化誘導には、カテプシンBや活性酸素が関与していることが明らかとなった。最近の研究で、炎症においてインフラマソームと呼ばれる細胞質内タンパク複合体がさまざまな生命現象において重要な役割を果たしていることが報告されているが、この複合体が関与する炎症誘導性の細胞死(ピロトーシス)のメカニズムに関しては全く不明である。今回の研究では、歯周病細菌が細胞内に侵入した後のインフラマソームの役割について、宿主微生物相互関係の観点から解明を行う。その過程で、細菌を認識する細胞質内受容体の情報伝達系およびインフラマソーム形成分子のピロトーシスにおける役割を分子レベルで明らかにすることを目的とした。歯周病細菌感染の実験系を用い、細菌感染に対して応答する宿主細胞の因子および宿主応答を促す歯周病細菌由来の病原因子について、宿主・寄生体の相互作用の観点から検証した。歯周病原性細菌感染が誘導する炎症メカニズムについて解明し、あわせて、歯周病原性細菌感染により誘導されるピロトーシスについて、宿主細胞内のシグナルを分子生物学的および遺伝工学的解析法を用いて解明した。平成25年度は、我々が確立している歯周病原性細菌感染実験系を用いて、歯周病細菌<i>Aggregatibacter actinomycetemcomitans</i>感染による宿主応答について網羅的な解析を行った。歯周病細菌感染が免疫細胞マクロファージに誘導するインフラマソーム活性化の解析、歯周病細菌侵入を認識する細胞内受容体の検索、さらにインフラマソーム活性化を誘導する歯周病細菌の病原因子の検証を行った。炎症においてインフラマソームと呼ばれる細胞質内タンパク複合体がさまざまな生命現象に於いて重要な役割を果たしていることが報告されている。今回の研究では、歯周病細菌侵入モデルを使用し、マクロファージにおけるインフラマソームの役割について検証している。その過程で、細菌を認識する細胞質内受容体の情報伝達系および細胞死について分子レベルで解析を進めた。マウスマクロファージ細胞株RAW264.7、ヒトマクロファージU937, THP-1細胞と歯周病細菌Aggregatibacter actinomycetemcomitansY4株を使用し、我々が確立した感染実験を行った。siRNAをエレクトロポレーション法で導入し、ノックダウン細胞を作成した。タンパク発現についてはウェスタンブロッティング、遺伝子発現はリアルタイムRTーPCRで、サイトカイン産生についてはELISA法で解析した。フローサイトメーターを用いて、活性酸素ならびにファゴサイトーシス活性を測定した。侵入実験後のRAW264.7細胞が、ファゴサイトーシスにより歯周病細菌を取り込んでいることを確認した。インフラマソーム関連因子であるNLRP3受容体の発現とIL-1βの発現、ならびにアダプタータンパク質のASCやcaspase-1の発現を確認した。NLRP3ノックアウト細胞において、IL-1βの発現抑制を確認した。また、歯周病細菌感染によるカテプシンBや活性酸素の発現が認められ、これらの発現阻害剤を使用したところ、IL-1β発現が抑制されることが明らかとなった。以上の結果から、歯周病細菌感染マクロファージにおいて、NALP3の発現を伴うインフラマソーム活性化が誘導され、その誘導には、カテプシンBや活性酸素が関与していることが明らかとなった。感染症学今回の研究は、宿主微生物相互関係の観点に立って、歯周病細菌が誘導するインフラマソームおよびピロトーシスのメカニズムを解析することで、歯周病細菌感染と全身疾患の関与について、分子生物学的手法で明らかにしていくものである。当該年度では、研究申請書に記載した研究計画に基づき、順次解析を進めることが出来ている。来年度に向け、ベースとなる実験結果を得ることが出来たことから、おおむね順調に経過していると評価した。【平成26年度】平成25年度の実験内容を継続・発展させるために以下の実験を行う。1歯周病原性細菌感染マウスモデルの確立:ここでは、歯周病原性細菌由来のLPSおよび凍結乾燥菌体を腹腔投与し、全身的な歯周病原性細菌感染モデルを確立する。2インフラマソーム関連因子欠損マウスの作成:平成25年度で同定した歯周病原性細菌感染に重要な因子についてノックアウトマウスを作成する。3インフラマソーム関連因子

欠損マウスにおける歯周病原性細菌侵襲による宿主応答の評価:歯周病原性細菌感染に対する炎症応答について血中サイトカインの計測により検証する。4全身疾患発症マウスにおける歯周病原性細菌が誘導するインフラマソームの役割の評価:糖尿病モデルマウスC57BLKS/Jおよび動脈硬化モデルマウスApoE欠損マウスに歯周病原性細菌感染モデルを作用し、インフラマソーム活性化による影響を検討する。糖尿病モデルおよび動脈硬化モデルについては、血中のサイトカイン量についてELISA法により評価する。また血管内皮周囲組織における免疫細胞(マクロファージM1/M2型Th1/Th2細胞、B細胞など)の組織内分布を免疫染色により観察する。
精細胞細胞質でのmRNAポリ(A)鎖伸長による遺伝子発現制御ネットワークの解析

哺乳動物精巣に特異的なポリ(A)ポリメラーゼTPAPの欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,結果として精子形成が球状精細胞の段階で停止する。今年度は,昨年度に引き続きTPAP欠損による精子形成不全の分子基盤について検討した。(1)TPAPによるmRNAポリ(A)鎖伸長機構の解析...TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。そのmRNA特異性や時期特異性を決定する機構について検討した。標的mRNAであるTRF2とTFIIAγの3'-非翻訳領域(UTR)を用いたEMSA法による競争阻害実験により,同一の因子が結合していると考えられた。TFIIAγとTRF2の3'-UTR中にはそれぞれ3つと1つのcytoplasmic polyadenylation element(CPE, UUUUU/AAU)が存在し,その結合タンパク質CPEB1には3つのパラログが存在する。CPEB2が精巣において高発現していることから,CPEB2がポリ(A)鎖伸長に関与していることが推測された。(2)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析...抗TAF10抗体を用いた精巣抽出液の免疫沈降により,神経細胞形成に関わるモータータンパク質KIF2AのスプライシングバリアントであるKIF2βとKIF2γが共免疫沈降されたが,GST-pull downアッセイの結果,両者は直接相互作用しているのではないことが判明した。また,RT-PCRと免疫沈降によりスプライシングバリアントのうち,KIF2γのみが精巣においてTAF10の細胞内輸送に関わっていることが判明した。今後,両者を仲介するタンパク質を探索する予定である。(3)TPAP欠損マウスのプロテオーム解析...TPAP欠損マウスの球状精細胞では,TAF10以外にも影響を受けているタンパク質が存在する可能性がある。そこで,野生型とTPAP欠損マウスの精巣タンパク質を二次元電気泳動により比較したところ,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではSorbitol dehydrogenaseとAdenylate kinaseが減少していた。事実,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではこれらmRNAのポリ(A)鎖伸長が不完全であった。これらのことから,いくつかのmRNAの球状精細胞における正常な翻訳にはポリ(A)鎖の伸長が不可欠であることが示唆された。哺乳動物精巣特異的ポリ(A)ポリメラーゼTPAPは,特定mRNAの球状精細胞特異的なポリ(A)鎖伸長に関与している。その欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,結果として精子形成が球状精細胞の段階で停止していた。今年度は,TPAP欠損による精子形成不全の分子基盤と特定mRNAのポリ(A)鎖伸長機構について検討した。(1)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析...TPAP欠損マウス精巣では,基本転写因子TAF10の核移行が減少していたことから,TAF10は転写活性化因子CREMの支配下にある半数体特異的遺伝子の転写に関与していることが示唆された。そこで,抗TAF10抗体を用いた免疫沈降を行なった結果,モータータンパク質KIF2AのモータードメインのC末端38アミノ酸残基を欠損する分子種(KIF2Asと命名)などいくつかのタンパク質が免疫共沈降された。TPAP欠損マウス精巣ではKIF2As mRNAレベルは野生型と同じであるがポリ(A)鎖が短くなっていること,またタンパク質量が減少していることが明らかとなった。現在,KIF2As mRNAの球状精細胞でのポリ(A)鎖伸長不全と翻訳効率の関連について検討している。(2)TPAPによるmRNAポリ(A)鎖伸長機構の解析...TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。抗TPAP抗体により,精巣特異的熱ショックタンパク質Hsp70-2が免疫共沈降した。現在,TPAPに対するその機能について検討中である。一方で,標的mRNAの1つであるTFIIAγの3'-UTRを用いたEMSA法とUVクロスリンク法により,精巣特異的な70kDaの結合タンパク質の存在を確認した。現在,結合領域の限定を行っており,その配列を用いて結合タンパク質の同定を行う予定である。また,TPAP過剰発現マウス精巣でもmRNAポリ(A)鎖は野生型と同じ長さまでしか伸長されないことから,mRNA特異性およびポリ(A)鎖をそれぞれのmRNA固有の長さで停止させる機構が存在することがより明確になった。さらに,核や卵成熟過程の細胞質でのポリ(A)鎖付加に関与するCPSF160が,他の組織と比べて精巣の細胞質に著量に存在し,TPAPと相互作用することを明らかにした。(1)TPAPによるmRNAポリ(A)

鎖伸長機構の解析...TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。そのmRNA特異性や時期特異性を決定する機構について検討した。標的mRNAであるTRF2とTFIIAγの3'-非翻訳領域(UTR)を用いたEMSA法による競争阻害実験により,同一の因子が結合していると考えられた。TFIIAγとTRF2の3'-UTR中にはそれぞれ3つと1つのcytoplasmic polyadenylation element(CPE, UUUUU/AAU)が存在し,その結合タンパク質CPEB1には3つのパラログが存在する。CPEB2が精巣において高発現していることから,CPEB2がポリ(A)鎖伸長に関与していることが推測された。(2)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析...抗TAF10抗体を用いた精巣抽出液の免疫沈降により,神経細胞形成に関わるモータータンパク質KIF2AのスプライシングバリアントであるKIF2βとKIF2γが共免疫沈降されたが,GST-pull downアッセイの結果,両者は直接相互作用しているのではないことが判明した。また,RT-PCRと免疫沈降によりスプライシングバリアントのうち,KIF2γのみが精巣においてTAF10の細胞内輸送に関わっていることが判明した。今後,両者を仲介するタンパク質を探索する予定である。(3)TPAP欠損マウスのプロテオーム解析...TPAP欠損マウスの球状精細胞では,TAF10以外にも影響を受けているタンパク質が存在する可能性がある。そこで,野生型とTPAP欠損マウスの精巣タンパク質を二次元電気泳動により比較したところ,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではSorbitol dehydrogenaseとAdenylate kinaseが減少していた。事実,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではこれらmRNAのポリ(A)鎖伸長が不完全であった。これらのことから,いくつかのmRNAの球状精細胞における正常な翻訳にはポリ(A)鎖の伸長が不可欠であることが示唆された。
教育施設の緑化計画がもたらす「まちづくり・教育」効果に関する実証的研究

本研究では学校の緑環境(動植物の生息空間としてのビオトープ空間や緑地空間)がまち(村)づくりと環境教育にどのような効果が期待できるか検証し、具体的な整備に向けた計画的指針を得たいと考えた。以上の認識が研究を進める背景であり、環境整備に関心が向けられている現在こそ取り組まなければならない、緊急な課題と位置づけた。筆者はこれまでの研究成果として物理的な緑環境の実態を踏まえ、望ましい緑環境の数量的な指針を得た。今後は、まちづくり、学校づくりのソフト面、つまり、緑環境の効果を具体的に提示し、緑環境の必然性、必要性に関する視点を示す必要があると考えた。そこで特に、生活科や総合的学習の教材としての利用、学校のみならず地域の中での緑環境としての憩いや癒し空間の効果など、施設整備計画の視点を探ることを本研究の目的とした。研究成果は第1章小・中学校の樹種、緑量、緑被率等の実態分析、/小・中学校施設の緑環境と都区部における緑化基準の比較分析、第2章小・中学校における緑環境の実態と模型シュミィレーションによる印象評価、/小・中学校の緑環境の実態と遊び場比較、第3章シンボルとしての緑環境の配置と形態について、/小・中学校と神社との隣接形態とその利用状況から見た複合利用の可能性について、/千屋小学校及び首都圏における小中学校の並木の実態について、第4章学校緑化コンクール受賞校におけるその後の活動実態について、/沿道空間としてみた小学校の緑環境の評価とその環境を利用した教育効果について、でまとめた。以上の成果は何れも日本建築学会に発表したものである。都市部市街地における学校が,地域の中で「緑のネットワークとして見た場合の位置づけ」を把握する必要から,都心部として千代田区神田地区,都市市街地として杉並区高円寺地区,方南町地区を取り上げ,景観として学校の緑や公園などが,ネットワークの視点からどのように役立つているかを検証する指標と評価軸作りを行った。一方,教育効果の実証例を全国学校緑化コンクールに入選した学校200校を対象にアンケート調査を行った。特に,学校敷地全体の緑環境をどのように教材として生かしているかを中心に分析し,まず教育実践例の整理と教育効果を裏付ける評価軸の設定を試みた。初年度であり,実態調査も十分に出来なかったため,今年度の経験も含め,次年度はより精度の高い評価軸を精査する予定である。2001年度はまず、社団法人国土緑化推進機構が主催する「全日本学校関係緑化コンクール」に入選した学校266校を対象に(過去16年間)緑化コンクールとその後の活動を追跡調査した。特に、緑環境と教育実践に焦点を当てたアンケート調査の内容とした。この結果、(1)20%の学校で緑環境を利用した教育活動の実践が停止していたが、54%の学校で継続的に続いていることがわかった。但し、維持管理やメンテナンス費用等課題も多いことが指摘された。(2)緑環境を利用した学習の教科別活用事例としては、理科・生活科・総合的な学習で顕著な傾向を示したが全教科で利用されていること、全学年で活用していることもわかった。(3)学校の緑環境がシンボルとして認知されるその形態を、緑と学校敷地の配置関係から分類すると、8パターンに類型化することができた。特に、グランド周辺に配された緑がシンボルでありまた、教育的な活用に供していることが明らかになった。エントランス周りなど独立した緑は、記念的・歴史的な意味を持つシンボルとして認識されている。つまり、雑木林など面的な緑と並木のような線的な緑、一本の松やケヤキ、カジュマルのような点的な緑の組み合わせによって学校の緑環境が存在している。最終年度では、学校の緑環境が地域環境上どのような位置に存在しているのか分析を進める予定である。

これまでの研究成果として、教育施設(小・中学校)の物理的な緑環境の実態を捉え、望ましい緑環境の指針を得、今後はまちづくり、学校づくりのソフト面、つまり、緑環境の効果を具体的に提示し、緑環境の必要性を示していく必要があるとの確信を得た.そこで、特に、生活科や総合学習の教材としての着用、学校のみならず地域の緑環境としての憩いや癒しの環境としての効果など、施設整備の視点からその計画論を探ることが本研究の目的である。そこで平成12年度、都市部市街地における学校が地域の中で「緑のネットワークとしてみた場合の位置付け」を実態として把握、また、教育効果の実証例として「全国学校緑化コンクール」で入選した学校を対象にアンケート調査を行い具体的な教育実践例を収集した。続いて平成13年度は前年度実施したアンケート対象校から、緑環境を積極的に活用している事例を継続的に調査し、教育実践と具体的空間の関係を明らかにした。研究最終年の平成14年度は、(1)具体的教育実践例の継続的実態把握から、緑環境と教育の関連性を明らかにし、また、(2)町並みからみた緑環境と学校の緑が地域空間に果たす役割について、沿道沿いの連続エレベーションを作成し、地域空間における学校の緑環境の位置づけを検証、その手法を確立した。