hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトヘルペスウイルス6のコードするケモカインとケモカイン受容体の機能解析

突発性発疹患児から分離したHHV-6B HST株の全塩基配列を決定した。その結果、U83がケモカインホモログ、U12とU51がケモカイン受容体ホモログであった。さらに、U1102株やZ29株と比較した結果、HST株のU83はシグナルペプチドを有しているのに対して、U1102株のU83は有しておらず、分泌されないことが明かとなった。HST株のU12はケモカイン受容体として機能しているのに対し、Z29株のU12はtruncateしており、生物活性を有した蛋白合成は行われない。このことから、in vitroでのウイルスの増殖にU12とU83は必須ではないことが明かとなったが、病原性やin vivoでの局在性に関わっている可能性も示唆された。HST株のU83がコードしている蛋白の機能解析を行った結果、ウイルス感染の後期に発現し、培養上清にシグナルペプチドが切断された蛋白としてに分泌されること、さらにその切断部位を明かにした。U83とFcとの融合蛋白を発現、精製し、シグナル伝達に対する機能解析に用いた。その結果、単核球のcell lineであるTHP-1に対して細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させることとそのシグナル伝達がTHP-1細胞のchemotaxisに関与することを明かにした。以上の結果から、U83は感染細胞内でウイルス粒子が完成後、感染可能な未感染の単核球細胞をchemotaxisにより誘導し、感染細胞から未細胞へ直接感染し、広がっていくことが予測された。U12発現細胞でのRANTESによる細胞内のCa^<2+>濃度の上昇はIP3を介したものであることが明かとなった。HHV-6感染細胞ではその感染後期にインテグリン関連蛋白が誘導されてくること、U12発現細胞において、細胞凝集が認められた。U12はGiを介してシグナル伝達を行っていないことも明らかにした。以上のことから、U12のシグナル伝達はGqやG_<16>といった本来ケモカイン受容体が用いているGiとは異なるG蛋白を用いて、IP3以外のシグナル伝達系も存在することが示唆された。さらに、このシグナル伝達によりインテグリン関連蛋白が誘導されてくることが予測された。この結果、U83がケモカインホモログ、U12とU51がケモカインレセプターホモログであった。さらに、variant AのU1102株やvariant BのZ29株と比較した結果、HST株のU83はシグナルペプチドを有しているのに対して、U1102株のU83はシグナルペプチドを有しておらず、分泌されないことが明かとなった。HST株のU12は既に報告したように7回巻く貫通型のG-protein coupled receptorであるケモカインレセプターとして機能しているのに対し、Z29株のU12はtruncateしており、生物活性を有したタンパクの合成は行われない。

このことから、in vitroでのウイルスの増殖にU12とU83は必須ではないことが明かとなったが、病原性やin vivoでの局在性に関わっている可能性も示唆された。HST株のU83がコードしているタンパクの機能解析を行った結果、ウイルス感染のlateに発現し、培養上清にシグナルペプチドが切断されたタンパクとしてに分泌されること、さらにその切断部位をが明かにした。U83とFcとの融合タンパクを発現、精製し、シグナル伝達に対する機能解析に用いた。その結果、単核球のcell lineであるTHP-1に対して細胞内カルシウム濃度を上昇させることが明かとなった。さらに、そのシグナル伝達はTHP-1細胞のchemotaxisに関与することが明かとなった。以上の結果から、U83は感染細胞内でウイルス粒子が完成後、感染可能な未感染の単核球細胞をchemotaxisにより誘導し、感染細菌の近傍に集め、感染し、広がっていくことが予測された。U12発現(K562)細胞を用いてSRE,ERK,CREB,IP3の活性あるいは濃度をRANTESの添加時と添加してない時で比較した。その結果、コントロールに比べ、RANTESの添加により合成量が増加したのはIP3のみで、SREやCREBは全く活性化されなかったし、ERKのリン酸化の差も認められなかった。1998年に報告したU12を介したRANTESからの細胞内のCa^<2+>濃度の上昇はケモカインからの古典的なシグナル伝達系であるIP3を介したものであることが明かとなった。しかし、Ca^<2+>濃度の上昇は非常に低いものであった。HHV-6感染細胞ではその感染後期に細胞表層にインテグリン関連タンパク質が誘導されてくることがFACSを用いた実験より明らかになった。また、U12発現(K562)細胞において、細胞凝集が認められた。一方、CCR-5の場合、RANTESに対するシグナルとして二相性を示し、低濃度では、古典的なシグナル伝達系がGiを介して作用する。しかし、1μMを超える濃度を添加した時、G_<16>とチロシンキナーゼを介したNFkBの活性化とさらにインテグリン関連タンパク質の誘導が報告された。さらに、U12はGiを介してシグナル伝達を行っていないことを明らかにした。以上のことから、U12を介してのシグナル伝達もGqやG_<16>といった本来ケモカインレセプターが用いているGiとは異なるGタンパク質を用いて行い、古典的なシグナル伝達系以外のシグナル伝達の存在が示唆された。さらに、このシグナル伝達の結果、インテグリン関連タンパク質が誘導されてくることが予測された。
自己免疫寛容を誘導するNF―κB活性化シグナル制御機構の解明

免疫寛容の成立に必須である自然発生型の制御性T細胞は胸腺で分化する。しかし胸腺内における制御性T細胞分化の分子基盤は不明な点が多い。これまでにNF-κBを活性化するシグナルが胸腺内の制御性T細胞の分化に関与することが明らかとなったが、その活性化を誘導する分子機構は不明であり、本研究はその解明を目指した。本年度は特に、シグナル伝達因子であるTRAF6が、胸腺細胞においてどのような機構で制御性T細胞の分化を決定するのか検討した。TRAF6欠損マウスより胸腺細胞を調製し、PMAとIonomycinで処理したところ、NF-KB活性化の指標であるIκBαのリン酸化が野生型に比べてほとんど起きないことが判明した。さらにJNKやp38などMAPK経路もほとんど活性化しなかった。また胸腺細胞に抗CD3抗体および抗CD28抗体を処理してT細胞抗原受容体を活性化させたところ、野生型では誘導されるIκBαのリン酸化やJNKのリン酸化もTRAF6欠損細胞ではほとんど起きなかった。一方、T細胞抗原受容体複合体でシグナルを伝達するPLCγなどの活性化は全く異常がなかった。以上の結果は、TRAF6はT細胞抗原受容体のシグナルを伝達することでNF-κBやMAPKの活性化を制御する因子であることを示唆している。NF-κBの活性化は制御性T細胞の分化に必須である。すなわちTRAF6は胸腺細胞で機能してNF-κBの活性化を誘導することで制御性T細胞への分化を決定する因子であることが強く示唆された。現在、その標的因子の候補をマイクロアレイなどにより同定することを目指し、それらの条件検討を行っている。これまでにNF-κBを活性化するシグナルが胸腺内の制御性T細胞の分化に関与することが明らかとなったが、その活性化を誘導する分子機構は不明である。国内の他のグループは、CD40が制御性T細胞の産生または維持に寄与することを報告した。一方申請者は、胸腺細胞内のTRAF6が制御性T細胞の分化に寄与すること、さらにReGeptor activator of NF-κB(RANK)が胸腺内制御性T細胞の分化においてCD40と重複して機能するとの予備的結果を得た。本研究は胸腺内での制御性T細胞分化におけるRANK/CD40およびTRAF6のシグナルの役割解明を目指す。本年度はまずRANKとCD40が胸腺のどの細胞であるかを免疫組織学的に解析した。その結果、ほとんどのRANKとCD40は胸腺髄質に発現しており、さらに髄質の上皮細胞と樹状細胞であることがわかった。従って胸腺細胞で固有のTRAF6の欠損はRANKとCD40のシグナル異常では説明できず、RANK/CD40による制御性T細胞の分化制御と分けて研究を進めることにした。そこでまず胸腺細胞でTRAF6の上流で機能するレセプターを検討した。T細胞抗原レセプタ-(TCR)刺激依存的なシグナルの異常をTRAF6欠損胸腺細胞で検討したところ、TCR刺激依存的なIkBaの活性化やJNKの活性化がTRAF6欠損胸腺細胞ではほとんど起きなかった。一方でERKやAktの活性化はTRAF6欠損により若千上昇した。これらの結果は胸腺細胞ではTRAF6はTCRシグナルの下流で機能することで制御性T細胞の分化を制御することを強く示唆している。
つつが虫病リケッチア感染における一酸化窒素の役割に関する研究：敵か味方か？

リポポリサッカライド(LPS)処理および一酸化窒素(NO)産生剤NOR5の添加により、マウスマクロファージ系Raw264.7細胞で、つつが虫病リケッチア(以下、リケッチア)の増殖が促進された。マクロファージ内で、主に殺菌に働くはずのNOが、逆にリケッチアの増殖に関与しているということが示された。マイクロアレイにより、LPSおよびNOR5処理後に、同じ発現パターンをもつ遺伝子の中から、リケッチアの増殖促進に関連する遺伝子候補として絞り込むことに成功した。今後、リケッチアの増殖促進関連遺伝子を特定するための基盤を構築できた。本研究では、マクロファージにおける一酸化窒素によるリケッチア増殖促進メカニズムの解明を目的とした。実際に、リポ多糖(LPS)およびNO発生剤により、マウス由来マクロファージ系Raw264.7細胞において、リケッチア感染が促進される現象について、そのメカニズムの解明を計画した。しかし、研究を進めるにつれ、LPS刺激による増殖促進効果が減弱していることが明らかになり、データを蓄積する上で大きな障害となった。そこで、原因を究明するために、Raw264.7細胞を、LPS処理によるリケッチア増殖促進を指標に、サブクローニングを行ったところ、LPS刺激により顕著に増殖促進する群、ほとんど増殖促進しない群およびその中間群に分けられた。つまり、LPS刺激に反応の異なる細胞群が混在することが明らかになり、これら細胞群の割合の変化が結果に影響したのだということが推定された。そこで、LPS刺激によりリケッチアの増殖促進効果が顕著であったクローンをいくつか選択して、LPS刺激およびNO発生剤処理に対するリケッチアの増殖促進効果について比較・検討した。最終的に、最も反応が良かったクローン(S3ー3)のをその後の解析に使用することにした。このRaw264.7_S3-3細胞を用いて、現在、別のNO発生剤、NOのレセプターであるsoluble guanylyl cyclaseの刺激剤および促進剤の影響について、検討している。今後は、LPS刺激およびNO発生剤処理によるRaw264.7_S3-3細胞の遺伝子発現についても解析し、リケッチアの増殖促進に関連する遺伝子を絞り込むことを計画している。研究に使用する予定だったRaw264.7細胞が、LPS刺激による増殖促進効果が減弱していることが明らかになり、その原因究明と解決にかなりの時間を費やしたため。リポポリサッカライド(LPS)処理したマウスマクロファージ系Raw264.7細胞で,一酸化窒素(NO)の産生が顕著に誘導されているにも関わらず,つつが虫病リケッチア増殖が促進された.一方で,NOの産生が誘導されていない未処理のRaw264.7細胞では,増殖は促進されなかった.次に,NO産生剤NOR5をRaw264.7細胞に加えたところ,リケッチアの増殖が促進された.以上から,マクロファージ内で,主に殺菌に働くはずのNOが,逆にリケッチアの増殖に関与しているということが示された。これらの研究成果が,Microbial Pathogenesisに掲載された。また、LPS、NOドナーおよびNOの受容体である可溶性グアニリルシクラーゼの阻害剤処理Raw264.7細胞でリケッチアの増殖が顕著に促進されたことから,これらの試薬処理Raw264.7細胞における4時間および24時間後の遺伝子(mRNA)の挙動を、マイクロアレイにより解析した。これらの3つの異なる試薬による処理にもかかわらず同じ発現パターンをもつ遺伝子に注目し、リケッチアの増殖促進に関連する遺伝子として絞り込んだ.これらのうち3つの遺伝子の発現がどの試薬の処理によっても顕著に上昇し,9つの遺伝子の発現が顕著に減少していた.マウスにおけるリケッチア感染へのLPSおよびNOドナーの影響について検討する予定であったが,これまでに報告があった方法では正確に感染の程度を評価できないことが明らかとなった.そこで、あらたにマウスにおいてリケッチア感染の程度を評価する系を確立しなければならなくなったため。リポポリサッカライド(LPS)処理したマウスマクロファージ系Raw264.7細胞で、一酸化窒素(NO)の産生が顕著に誘導されているにも関わらず、つつが虫病リケッチア(以下、リケッチア)の増殖が促進された。一方で、NOの産生が誘導されていない未処理のRaw264.7細胞では、増殖は促進されなかった。次に、NO産生剤NOR5をRaw264.7細胞に加えたところ、リケッチアの増殖が促進された。以上から、マクロファージ内で、主に殺菌に働くはずのNOが、逆にリケッチアの増殖に関与しているということが示された。LPSをマウスの腹腔に接種して24時間後に、リケッチアを感染させたところ、未処理対象と比較して、4匹中1匹が早く死亡した。LPSの投与量やリケッチアの感染量の検討し、効果をさらに検証する必要がある。Raw264.7細胞のサブクローニングにより得られたLPSによる増殖促進効果が高かったクローン(S3-3)を用いて、NO産生剤NOR5処理をおこなったところ、リケッチアの増殖が顕著に促進された。これらの試薬によって処理した細胞における4時間および24時間後の遺伝子(mRNA)の挙動を、マイクロアレイにより解析した。

2つの異なる試薬による処理にもかかわらず同じ発現パターンをもつ遺伝子の中から、パスウェイ解析や機能解析によりリケッチアの増殖促進に関連する遺伝子候補を絞り込んだ。この中から他の細菌の感染増強との関係が報告されているPPARG遺伝子について、CRISPR/CAS9のシステムにより、マウス繊維芽細胞(L-929)のノックアウト(KO)細胞を作製に成功した。同じ方法を用いて、Raw264.7細胞では、KO細胞を作出できなかったため、条件検討が必要なことが示唆された。KO細胞でのリケッチアの増殖を検討し、PPARG遺伝子を増殖促進因子として検証する予定である。リポポリサッカライド(LPS)処理および一酸化窒素(NO)産生剤NOR5の添加により、マウスマクロファージ系Raw264.7細胞で、つつが虫病リケッチア(以下、リケッチア)の増殖が促進された。マクロファージ内で、主に殺菌に働くはずのNOが、逆にリケッチアの増殖に関与しているということが示された。マイクロアレイにより、LPSおよびNOR5処理後に、同じ発現パターンをもつ遺伝子の中から、リケッチアの増殖促進に関連する遺伝子候補として絞り込むことに成功した。今後、リケッチアの増殖促進関連遺伝子を特定するための基盤を構築できた。全体的な遅れをとり戻せるように、スケジュールの適宜変更・修正をするものの、本来の研究計画に沿って推進数予定である。リケッチアの増殖促進に関連する遺伝子については、遺伝子操作の手法を用いて,Raw264.7細胞への遺伝子の過剰発現およびノックアウトを行い,リケッチア増殖への影響を検討する.また、マウス実験については,リケッチア感染の程度を評価する新しい系を確立し、リケッチア感染へのLPSおよびNOドナーの影響について検討する。リケッチア学年度末納品等にかかる支払いが平成28年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成27年度分についてはほぼ使用済みである。マウス実験が、研究計画通りいかず、遅れが生じたため.上記のとおり。マウス実験について、リケッチア感染の程度を評価する新しい系の確立に研究費を使用し、遅れているが研究計画どおりに,リケッチア感染へのLPSおよびNOドナーの影響について検討する。
巨大磁気抵抗磁性体のナノ構造制御と低次元物性に関する研究

巨大磁気抵抗磁性体のナノ構造制御の基礎検討として、ペロブスカイト型Mn酸化物(LaCa)_<n+1>Mn_nO_<3n+1>系における層数n=2,3,∞のエピタキシャル薄膜の微細構造、次元性と磁気伝導物性の関係を調べた。そこでは、層数nすなわち次元性の低下に伴い、電気抵抗率、強磁性転移温度(T_c)、磁気抵抗(MR)効果などに系統的な変化が生じることを見出した。特に、低次元系のn=2では、3次元系に比べ低磁場で発現するMR効果が著しくエンハンスされること、2次元的な強磁性スピン秩序と異方的な電子伝導の導入が、MR効果の制御に有効であることを明らかにし、この物質系の巨大磁気抵抗効果の機構解明および応用の両面から重要な知見を得た。また、巨大磁気抵抗磁性体では、電子系-スピン系-格子系が密接な相互作用を及ぼしあうことに着目し、基板との格子不整合による歪みが磁気伝導物性に及ぼす影響について調べた。格子整合性の異なる各種の基板上に成長した薄膜の物性評価から、格子不整合の大きさとその符号に依存して、T_cやMR効果が大きく変化することを見出した。例えば、正の格子不整合では、T_cの低下とMR効果の増大が見られること、特に低次元系のn=2では、格子歪みの影響をより強く受けることなどを明らかにした。一方、透過電子顕微鏡による微細構造観察から、薄膜ドメイン構造、欠陥が格子不整合歪みの大きさと強い相関を持つことも明らかになった。以上の結果は、格子不整合歪みが、この物質系の低次元物性を制御するための新しいパラメーターとなることを強く示唆している。さらに、巨大磁気抵抗磁性体の持つ高スピン分極率に着目し、強磁性層(F2)/絶縁層(I)/強磁性層(F1)の積層構造を作製し、リソグラフィー技術により微細形状に加工して、トンネル型接合素子を形成した。F1=Mn酸化物(n=∞)、I=SrTiO_3、F2=Co、Feの組み合わせにおいて、トンネル型磁気抵抗(TMR)効果の符号が反転する現象と非対称バイアス電圧効果を見出した。それらは、接合の界面構造に依存した。強磁性層(F2)のバンド構造、スピン分極率を反映しており、符号まで含めた磁性体スピン分極率の定量的解析、および新しいスピンデバイスの実現に向けて、重要な指針となる。本年度は、巨大磁気抵抗磁性体のナノ構造制御の基礎検討として、ペロブスカイト型Mn酸化物(LaCa)_<n+1>Mn_nO_<3n+1>系における層数n=2,3,∞のエピタキシャル薄膜を作製し、微細構造(次元性)と磁気伝導物性の関係を調べた。この結果、層数nの低下すなわち次元性の低下に伴って、電気抵抗の増大、強磁性転移温度の低下、磁気抵抗効果の増大など、系統的な物性変化が生じることを見出した。

特に、低次元系のn=2では、3次元系のn=∞に比べ、低磁場での磁気抵抗効果が著しくエンハンスされ、準2次元的な強磁性スピン秩序と異方的な電気伝導の導入が、磁気抵抗効果の改善に有効であることを明らかにし、この物質系の巨大磁気抵抗効果の機構解明および応用の両面から重要な知見を得た。また、巨大磁気抵抗磁性体では、電気伝導、スピン秩序、格子歪みが相互に密接に影響しているため、薄膜と基板との格子不整合による歪みが薄膜の磁気伝導物性に及ぼす影響について検討した。格子不整合の異なる各種の基板上に作製したエピタキシャル薄膜の特性評価から、格子不整合の大きさとその符号に応じて、強磁性転移益度や磁気抵抗効果が大きく変化することを見出した。すなわち、正の格子不整合の場合には、強磁性転移温度の低下と磁気抵抗効果の増大が、負の格子不整合の場合には、強磁性転移温度の上昇と磁気抵抗効果の減少が見られることが分かった。特に、低次元系のn=2では、3次元系に比べ、格子歪みの影響が強く現れるといった興味深い結果も得られている。以上の結果は、格子不整合歪みが、この物質系の物性を制御するための新しいパラメーターとなることを意味している。さらに、巨大磁気抵抗Mn酸化物のスピン偏極率が百%という特徴を生かせば、トンネル型磁気抵抗素子をはじめとする各種の高性能スピンデバイスの実現が期待できる。ここでは、Mn酸化物を用いた強磁性体/絶縁体/強磁性体積層構造のトンネル型磁気抵抗素子の作製を検討した。リソグラフィー技術を用いて微細構造に加工することにより、明瞭なトンネル型磁気抵抗効果を示す素子を得ることに成功し、積層型スピンデバイスへの応用の可能性を示した。本年度は、巨大磁気抵抗磁性体のナノ構造制御の基礎検討として、ペロブスカイト型Mn酸化物(LaCa)_<n+1>Mn_nO_<3+1>系における層数n=2,3,∞のエピタキシャル薄膜を作製し、微細構造(次元性)と磁気伝導物性の関係を調べた。この結果、層数nの低下すなわち次元性の低下に伴って、電気抵抗の増大、強磁性転移温度の低下、磁気抵抗効果の増大など、系統的な物性変化を生じることを見出した。また、巨大磁気抵抗磁気体では、電気伝導、スピン秩序、格子歪みが相互に密接に影響しているため、薄膜と基板との格子不整合による歪みが薄膜の磁気伝導物性に及ぼす影響について検討した結果、格子不整合の大きさとその符号に応じて、強磁性転移温度や磁気抵抗効果が大きく変化することを見出した。さらに、巨大磁気抵抗Mn酸化物の高いスピン偏極率に着目し、Mn酸化物を用いた強磁性体/絶縁体/強磁性体積層構造のトンネル型磁気抵抗素子の作製を検討した。
超音波エラストグラフィを用いた筋硬度定量法の確立と筋コンディション評価への応用

超音波エラストグラフィは、外力によって組織内部に生じた変位や弾性波の速度に基づいて組織弾性を計測する画像法である。超音波エラストグラフィは外力の種類によって分類されるが、本研究ではStrain elastographyおよびShear wave elastographyを用いた。Strain elastographyを用いた研究では、2種類の参照体を用いた筋硬度の定量法の妥当性および信頼性を明らかにし、筋硬度と併せて筋形状が測定できることを示した。Shearwave elastographyを用いた研究では、筋の弾性と筋や皮下脂肪の厚さの関係や筋の弾性と関節柔軟性の関係を検討した。本研究の目的は超音波エラストグラフィを用いて筋硬度を定量する方法を確立し、その方法を運動による筋コンディション変化の評価に応用することである。超音波エラストグラフィは外力によって弾性体内部に生じた変位や弾性波の速度を観測および計測する画像技術であるが、外力の種類によってStrain elastography、Shear wave elastography、Trainsient elastography、ARFI elastographyに大別される。平成24年度は主としてStrain elastographyを用いたが、平成25年度はShear wave elastographyを用いて筋硬度の測定を行った。まずは、高い再現性でShear wave elastographyを用いた筋硬度の測定が実施できる測定条件や被検筋を検討した。その検討結果に基づき、31名の一般成人男性を対象にShear wave elastographyを用いた筋硬度の測定を実施し、様々な筋の標準的な筋硬度の値を求めた。また、筋硬度と併せて筋厚や皮脂厚、羽状角を測定し、それらの関連についても検討を行った。今後は、一般成人男女および様々な競技種目の男女選手を対象にShear wave elastographyを用いた筋硬度の測定を行い、筋硬度に対する先天的および後天的な要因の影響を検討する。また、運動による疲労あるいは損傷によって筋コンディションを変化させ、筋コンディション変化の評価における超音波エラストグラフィによる筋硬度測定の有用性を検討する。本研究の目的は超音波エラストグラフィを用いて筋硬度を定量する方法を確立し、その方法を運動による筋コンディション変化の評価に応用することであるが、今年度は方法の確立に取り組んだ。申請者らは2種類の参照体を用いることで、超音波エラストグラフィによって筋硬度を定量する方法を考案していた。そこで、2種類の参照体の硬さや厚さを様々なものに変え、測定に最適な参照体の組み合わせを検討した。その結果、硬さ30kPa、厚さ5mmの参照体の上に硬さ7kPa、厚さ10mmの参照体を重ねる組み合わせが最適であることが明らかになった。そのような組み合わせの参照体を用いて、硬度既知の様々な参照体の硬度を測定し、この方法の妥当性および再現性を明らかにした。筋コンディションの変化を評価する場合、筋硬度と併せて他の筋コンディション指標を測定することが望ましい。筋コンディション指標である筋形状(筋厚、羽状角および筋束長)は、超音波エラストグラフィの歪み画像と並んで表示されるBモード画像によって分析することができる。しかし、歪み画像を得るために筋に加えられる軽度の圧迫によって、Bモード画像の画質が低下したり、筋厚を過小評価したりする可能性がある。そこで、歪み画像と並んで表示されBモード画像から筋形状を分析し、それらの妥当性および再現性を検討した。その結果、単独で取得したBモード画像に比べて歪み画像と並んで表示されるBモード画像の方が、筋形状を分析した際の再現性が有意に低かった。しかし、両画像から得られた筋形状の値そのものには有意差がみられなかった。これらの結果から、歪み画像と並んで表示されるBモード画像の分析から得られる筋形状は、低い再現性を示すものの、妥当な値であることが示された。つまり、超音波エラストグラフィを用いて、筋コンディションの指標である筋硬度と筋形状を同時に測定できる可能性が示唆された。本研究の目的は超音波エラストグラフィを用いて筋硬度を定量する方法を確立し、その方法を運動による筋コンディション変化の評価に応用することであった。今年度はまず基礎的検討として、筋硬度と関節柔軟性の関係を検討した。52名の一般成人男女を対象に、腓腹筋内側頭の弾性(筋硬度)を超音波エラストグラフィによって測定し、足関節柔軟性の指標として受動的関節スティフネスを関節角度と受動トルクの関係から求めた。底屈30°、底背屈0°および背屈20°において筋硬度と関節スティフネスの関係を検討したが、すべての関節角度において両者の間に有意な相関がみられなかった。このことから、関節柔軟性の個人差は筋硬度の個人差に起因するものでないことが示された。次に応用的検討として、繰り返しの筋力発揮による筋硬度の変化を検討した。

一般成人男性1名に10回6セットの等速性膝伸展運動を最大努力で行なわせ、運動前後の大腿直筋の筋硬度および筋厚、等尺性膝伸展トルクを測定した。その結果、運動後に大腿直筋の筋硬度および筋厚は増加し、膝伸展トルクは減少した。繰り返しの運動によって関節トルクは減少し、パンプアップによって筋厚および筋硬度は増加したと考えられた。さらに、筋損傷による筋硬度の変化を検討するため、一般成人男性1名に20回10セットのカーフレイズを行なわせ、運動前後の腓腹筋内側頭の筋硬度および血漿クレアチンキナーゼ活性値を測定した。その結果、クレアチンキナーゼ活性値および底背屈0°で測定した筋硬度は運動3日後に増加したが、底屈30°で測定した筋硬度はそのような変化を示さなかった。このような応用的検討から、超音波エラストグラフィを用いて測定した筋硬度によって筋コンディション変化の評価できる可能性が示唆された。スポーツ科学平成24年度の途中に使用する超音波エラストグラフィをStrain elastographyからShear wave elastographyに変更した。そのため、平成2425年度に実施した超音波エラストグラフィを用いた筋硬度の測定は基礎的なものに留まり、研究の進展は計画よりも遅れてしまった。しかし、本研究の実施期間が平成26年度まで延長され、超音波エラストグラフィを用いた筋硬度の測定を筋コンディション変化の評価に応用する段階まで研究を進められるようになった。つまり、平成26年度中には申請時に記載した目的を達成することができるものと思われる。エラストグラフィとは、外力によって弾性体内部に生じた変位や弾性波の速度を観測および計測する画像技術である。加える外力の種類によって超音波エラストグラフィは、Strain elastography、Shear wave elastography、Trainsient elastography、ARFI elastographyに大別される。今年度の前半はStrain elastographyを用いて筋硬度の測定を行っていたが、今年度の後半からShear wave elastographyを用いて筋硬度の測定を行うこととした。Strain elastographyは超音波プローブを通じて検者が加えた圧迫を外力として利用する方法であるため、検者の手技による外力が測定の妥当性や再現性に影響を及ぼす。また、申請者らが考案したStrain elastographyによって筋硬度を定量する方法は、2種類の参照体を重ねて皮膚上に置き、その上から超音波プローブによる圧迫を加える方法であるため、より高いレベルの手技が必要となる。一方、Shear wave elastographyは超音波プローブが誘発するせん断波を外力として利用する方法であるため、外力が測定の妥当性や再現性に影響を及ぼすことはない。
グループ内ピアアセスメントに基づく能力測定のための実用的手法の提案

本研究では,(1)グループ内ピアアセスメントに利用可能な項目反応モデルについて検討する(2)グループの構成方法による能力測定精度への影響を検討する(3)グループの構成方法を実際場面へ適用して評価する,の三つを行うこととしている。2018年度は,主に(2)に関してシミュレーション研究を行って検討を進め,それに基づいて準備をして(3)を行うことを予定していた。しかしながら,研究代表者が他に関与している研究活動における実査とその準備,また,各種の報告に関する業務にかける時間が予想以上に多くなってしまったため,当初の予定のようには研究を進めることができなかった。(2)については,昨年度の研究活動の結果に基づき,段階反応モデルをベースのモデルとして利用することを決めてシミュレーションの準備を進めていたが,実用場面を念頭に入れてモデルの推定法について検討するなかで,当初予定していたものとは別の推定法についても利用の可能性を探ることとした。そして,そのために使用するプログラムの作成を進めた。なお,予定の変更が生じたことにともない,改めて検討内容に関する文献を確認して情報収集を行うと同時に,研究会等への参加を通して意見交換を行うこととした。これらの活動を通して得られた知見の一部は2018年度に公刊された書籍に収められた。(3)については,(2)の検討を反映して行うため,2018年度は進めることができなかった。次年度の実施に向けて,実際上の制約等の整理から取り組むこととしたい。研究代表者が他に関与している研究活動に関する業務にかける時間が予想以上に多くなってしまったため。プログラムをなるべく早く完成させてシミュレーション研究を終わらせ,実際場面への適用の準備を進める。平成29年度は,グループ内ピアアセスメントに利用可能な項目反応モデルについての検討を行い,グループの構成方法による能力測定精度への影響の検討に着手した。まず,一点目については,高等教育における授業内の活動や評定の実践,グループ内ピアアセスメントで得られる(評価者×被評価者×課題)の形式のデータに適用可能な項目反応モデルについて,文献や学会参加等を通して意見交換や情報収集を行った。そして,高等教育段階ではルーブリック等を利用した段階的な評定が採用される場面が多くなってきていることから,段階反応データに対する項目反応モデルに絞ってモデルの検討をすることとした。また,(評価者×被評価者×課題)のデータに適用可能な項目反応モデルとして,評価者の厳しさや評定段階間での一貫性を組み込んだモデルが近年に複数提案されており,情報コミュニケーション技術の利用が進む現状を鑑みた上でそれらの中から本研究で主に扱うモデルを決定した。そして,二点目に関しては,能力測定に影響を与える,グループ構成に関する要素を整理し,シミュレーション研究の準備を進めた。これについては,引き続き次年度に取り組むこととした。一つ目の検討に時間を要したが,想定の範囲内で計画が進められている。シミュレーション研究を進め,それに基づいて実際場面への手法の適用を行う。調査出張の回数が予定より少なくなったため。来年度の調査研究費として使用する予定である。また,物品の購入も予定より少なく済んだため。次年度の調査研究費として使用する予定である。
Ⅲ型ナトリウム－リン酸共輸送担体Ｐｉｔ－１のリン酸再吸収への関与

III型ナトリウム-リン酸共輸送担体であるPit-1は、ユビキタスに発現しており、無機リン酸の細胞内輸送に関わる共輸送担体であるが、その機能については不明な点が多い。筆者らは、細胞外無機リン酸シグナルとリン酸利尿因子であるFGF23により惹起されるシグナルが、Pit-1とFGF受容体を介して下流のカスケードを共有することを明らかにした。今回、ヒトのX染色体優性低リン血症性くる病のモデルであるHypマウスから骨芽細胞、骨細胞を単離し、Hypマウスにおける骨芽細胞、骨細胞における出生後のPit-1の発現レベルの増加は、血清リン値の低下に伴った代償的作用であることが示唆された。III型ナトリウム-リン酸(Na+/Pi)共輸送担体であるPit-1/Slc20a1は、ユビキタスに発現しており、無機リン酸の細胞内への輸送に関わる共輸送担体であるが、その機能については不明な点が多い。研究者らは細胞外無機リン酸応答性の分子機序について解析を行い、Pit-1が細胞外無機リン酸応答性に関与すること、さらにリン酸利尿因子であるFGF23により惹起されるシグナルと細胞外無機リン酸シグナルが、PiT-1とFGF受容体(FGFR)を介して下流のシグナルを共有することを明らかにした(Yamazaki M. et al. J Cell Biochem, 2010, Kimata M. et al. Bone, 2010)。リン酸トランスポーターであるPit-1を介するシグナル伝達にリン酸の細胞内流入が必要であるのかという点や、FGFRとの間に介在する分子機序が興味の持たれるところであり、はじめにこの点について、野生型ヒトPiT-1発現ベクターを構築し解析を行った。ヒト胎児腎臓由来細胞株であるHEK293細胞を使用し、導入した野生型hPiT-1の発現を確認したところ、糖鎖付加などによる翻訳後修飾を受け、より成熟した分子として形質膜に発現していることが確認できた。また、RIを用いたPi uptake assayにより野生型hPiT-1が機能的に発現していることも確認した。さらに、リン輸送能を欠くPiT-1変異体hPiT-1[S128A] (Beck L, et al. J Biol Chem, 2010)発現プラスミドを構築し、Pi uptake assayによりhPiT-1[S128A]が予測通りリン酸輸送能を欠いていることを確認した。今後、リン酸輸送能を欠くこの変異体が細胞外無機リン酸シグナル応答性に与える影響について検討する予定である。当該年度は産前産後の休暇および育児休業の取得に伴い研究を中断した。中断期間:平成25年1月19日から平成26年3月31日「補助事業期間延長承認」日本学術振興会承認日:平成25年6月3日III型ナトリウム-リン酸共輸送担体であるPit-1は、ユビキタスに発現しており、無機リン酸の細胞内輸送に関わる共輸送担体であるが、その機能については不明な点が多い。筆者らはマウス軟骨細胞株やヒト胎児腎臓由来細胞株を用いて、Pit-1が細胞外無機リン酸応答性に関与し、細胞外無機リン酸シグナルとリン酸利尿因子であるFGF23により惹起されるシグナルが、Pit-1とFGF受容体を介して下流のカスケードを共有することを明らかにした。今回、ヒトのX染色体優性低リン血症性くる病のモデルで、Phex遺伝子に変異を有し高FGF23血症を呈するHypマウスを用いて解析を行った。20週齢の野生型マウスおよびHypマウスの長管骨を微細化し、コラゲナーゼによる消化とEGTAによる脱灰を反復することにより骨芽細胞と骨細胞を単離し、リン代謝関連遺伝子の発現の検討をした。Fgf23は野生型マウス、Hypマウスともに骨細胞での発現が骨芽細胞と比較し有意に高く、また、Hypマウスの骨細胞では野生型マウスより発現が増加していた。Pit-1の発現は、Hypマウスにおいて、骨芽細胞、骨細胞ともに野生型マウスより有意に高く、また骨細胞では骨芽細胞より発現が増加していた。同じくIII型ナトリウム-リン酸共輸送担体であるPit-2は、野生型マウス、Hypマウスの骨芽細胞、骨細胞において発現が低かった。さらに、野生型、Hypマウス胎児の血清リン値に差は認められず、胎児長管骨においてもPit-1の発現量に差はなかった。これらのことから、20週齢HypマウスにおけるPit-1の発現レベルは、出生後の血清リン値の低下に伴って代償的に増加したことが示唆された。小児科学III型Na+/Pi共

輸送担体であるPit-1の機能について、野生型PiT-1およびリン酸輸送能を欠くPiT1変異体を使用した解析を進めているため。またマウスを使用したin vivoでの解析も予定しているため。平成25年度は産前産後の休暇および育児休業の取得に伴い研究を中断した。中断期間:平成25年1月19日から平成26年3月31日今後、リン輸送能を欠くPiT-1変異体を使用し、細胞内へのリン輸送と細胞外無機リン酸シグナル応答性との関連について検討する予定である。また、マウスにリン酸利尿因子であるFGF23組換え蛋白を投与し、in vivoにおいてもFGF23と細胞外無機リン酸が、Pit-1とFGFRを介して下流のカスケードを共有する機構が存在するかどうかについても検証する。また、マウスを使用し、食事からのリンの影響による腎臓でのPit-1の発現および局在変化についても検討する。無機リン酸の細胞内輸送に関わるIII型ナトリウムーリン酸共輸送担体であるPiT-1の機能については不明な点が多い。よってヒト野生型PiT-1およびリン酸輸送能を欠くPiT-1変異体PiT-1[S128A]を使用し、細胞内へのリン輸送と細胞外無機リン酸シグナル応答性との関連について検討する予定である。またマウスを使用し、食事として摂取したリンが腎臓でのPit-1の発現および局在変化について与える影響について検討する。産前産後の休暇および育児休業による研究中断:平成25年1月19日から平成26年3月31日当該年度は産前産後の休暇および育児休業の取得に伴い研究を中断したため。中断期間:平成25年1月19日から平成26年3月31日研究遂行のための物品費、研究成果を学会で発表するための国内外の旅費および論文として発表するための経費として使用する。
不均一系触媒による超臨界二酸化炭素中の高効率化学品合成の開発

【二酸化炭素化学固定化】本研究員らは,連続流通式反応装置を用いて,N,N'-ジメチルエチレンジアミンと二酸化炭素から1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノンが生成する反応を超臨界二酸化炭素中で行い,高表面積を有するメソポーラスシリカが高活性・高選択性・長寿命を示すことを見出した.この研究成果は,文明社会の廃棄物であり,地球温暖化を引き起こす二酸化炭素の有用物質への化学変換であり,グリーン・サスティナブルケミストリーという観点から重要であると考えられる.【酸化物による二酸化炭素吸蔵(未公表のため詳細な記述は不可)】本研究員らは,ある酸化物が,ある条件下で二酸化炭素と接触させると大量の二酸化炭素を吸蔵することを見出した.この発見は,火力発電所などから排出される燃焼ガスからの二酸化炭素の分離および二酸化炭素回収貯留(CCS)という観点から重要であると考えられる.【総説の発表】超臨界二酸化炭素は,不燃性であるため特に酸化反応に対して理想的な反応物である.同じく,不燃性の反応場として水溶媒や超臨界水も注目されているが,水は反応性が高く,しばしば副反応を引き起こし,さらに脱圧だけで取り除ける二酸化炭素とは対照的に反応後の分離に手間がかかる.本研究員らは二酸化炭素媒体中での触媒的酸化反応に関するこれまでの研究を総説にまとめ,化学系の雑誌で最もインパクトの高いアメリカ化学会の総説誌Chemical Reviewsに投稿し,受理された.この総説は,今後,同分野の研究に従事する化学者の大きな助けになると期待される.【触媒反応】本研究員らは、スルホン酸基を有する酸性樹脂であるAmberlyst[○!R]15へPd粒子を担持させた触媒が、超臨界二酸化炭素中の有機化合物の連続流通式水素化に対し、ユニークな活性・選択性および長寿命を示すことを見出した。本触媒、1%Pd/Amberlyst-15,はC=C結合水素化に対しては従来から汎用されている1%Pd/Cと同等ないしより高い活性を示すのに対し、C=O結合水素化に対しては1%Pd1Cよりもずつと低い活性を示す。また、この触媒は酸性であるために、C=C結合水素化および酸触媒反応から成る多段階合成反応を一段階で促進する性質も持つ。実際、本研究員らは、1%Pd/Amberlyst-15がクロトンアルデヒドから工業的に重要な2-エチルヘキサナールを、C=C結合水素化、アルドール縮合、C=C結合水素化を経て一般階で効率良く与えることを見出した。EXAFS,XPS,一酸化炭素をプローブ分子として用いるDRIFT赤外分光法および金属分散度の測定から、活性点はプロトンが付加したPd原子であると結論した。この活性点は金属・酸両方の性質を有するため、"ハイブリッド"サイトとして機能することを提案した。【分光】最近、高圧CO_2下の液体が"CO_2-Expanded Liquids"(CXLs)として注目されている。CXLsには大量のCO2が溶け込んでおり、温度・圧力を変化させることにより物理・化学的性質を変化させることができるので、反応媒体としての活用が期待されている。本研究員らは、ATR-IR分光用高圧反応セルを使用して、高圧CO_2下で膨張した様々なイオン性液体中の分子間相互作用を調べた(論文投稿中につき詳細な内容の記述は不可)。【総説の作成】本研究員らは、2007年半ばまでに発表された超臨界流体中での固体触媒を用いる有機化合物の水素化研究を総説にまとめて発表した。【二酸化炭素化学固定化】本研究員らは,連続流通式反応装置を用いて,N,N'-ジメチルエチレンジアミンと二酸化炭素から1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノンが生成する反応を超臨界二酸化炭素中で行い,高表面積を有するメソポーラスシリカが高活性・高選択性・長寿命を示すことを見出した.この研究成果は,文明社会の廃棄物であり,地球温暖化を引き起こす二酸化炭素の有用物質への化学変換であり,グリーン・サスティナブルケミストリーという観点から重要であると考えられる.【酸化物による二酸化炭素吸蔵(未公表のため詳細な記述は不可)】本研究員らは,ある酸化物が,ある条件下で二酸化炭素と接触させると大量の二酸化炭素を吸蔵することを見出した.この発見は,火力発電所などから排出される燃焼ガスからの二酸化炭素の分離および二酸化炭素回収貯留(CCS)という観点から重要であると考えられる.【総説の発表】超臨界二酸化炭素は,不燃性であるため特に酸化反応に対して理想的な反応物である.同じく,不燃性の反応場として水溶媒や超臨界水も注目されているが,水は反応性が高く,しばしば副反応を引き起こし,さらに脱圧だけで取り除ける二酸化炭素とは対照的に反応後の分離に手間がかかる.本研究員らは二酸化炭素媒体中での触媒的酸化反応に関するこれまでの研究を総説にまとめ,化学系の雑誌で最もインパクトの高いアメリカ化学会の総説誌Chemical Reviewsに投稿し,受理された.この総説は,今後,同分野の研究に従事する化学者の大きな助けになると期待される.
高精度シス配列予測に基づく植物の不良土壌適応戦略の解明

本研究グループが開発したシス配列予測法は、マイクロアレイデータなど網羅的な遺伝子発現情報をもとにプロモーター領域に濃縮するオクタマー配列を算出することでシス配列を予測する。この方法で予測したシス配列のみからなる合成プロモーターを作成し、そのプロモーターの発現プロファイルを観察することで、特定のプロモーターを指定せずに機械的にシス配列を同定することができる。本研究課題においては、保有するアルミニウム(Al)、塩化ナトリウム、カドミ二ウム、銅などの土壌ストレス処理を行ったシロイヌナズナのマイクロアレイデータを用いてシス配列を選抜し、合成プロモーターを作出した。しかし、本研究課題初年度に一足先に作出していた単独のシス配列をもつ合成プロモーターの解析では、発現が極めて弱いプロモーターしか作出できなかった。そのため、選抜したシス配列同士の共局在性を情報学的に考慮して、シス配列をコンビネーションで持つ合成プロモーターを共同研究者と63コンストラクト作成した。最終的にはシングルエレメントの合成プロモーターと合わせて100個以上のコンストラクトを作成した。平成26年度から27年度にかけては植物への作成したコンストラクトの組換えと、シングルコピーで挿入された植物体の選抜を行った。そのため、平成27年度においては、ほぼすべての組換え植物体の作成とライン化を終了することができた。さらに、これら作成した植物体を用いてAlと塩化ナトリウムストレスへの応答性を確認した。その結果、少なくともAlストレスで応答する7個の合成プロモーターと8個の塩化ナトリウムストレスで応答するコンビネーションの合成プロモーターの作出に成功した。さらにストレス強度や時間的に異なる発現プロファイルを示す合成プロモーターが作出できており、この結果は異なるトランス因子により制御されるシス配列が同定できていることを強く示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.シス列予浪プログラムのアップデート次世代シークエンサーを用いた転写開始点の網羅的な解析を行い、24,956遺伝子の転写開始点を同定した。この転写開始点データからプロモーター領域を決定した。同定したプロモーター配列をシス配列予測プログラム(yamamoto, et al., 2011)にアップデートした(14,960→24,956遺伝子)。このアップデートにより今まで対象にできなかった遺伝子の情報も予測に反映されるようになり、プロモーター解析において対象にできる遺伝子数が飛躍的に増加した。2.リンゴ酸トランスポーターALMT1のプロモーター上のシス配列同定による転写制御機構の解析植物のAlストレス耐性に必須なリンゴ酸トランスポーター遺伝子の転写制御メカニズム解明のため、上記アップデートを行ったシス配列予測法を用いて解析した。プロモーター上に8個の領域がシス配列として予測された。予測した配列を置換したプロモーターを植物体に組換えて機能検証した結果、7個がシス配列としての機能を持っことが分かった。シス配列の中には、基本転写を制御する領域、根端での発現に関わる領域、Alストレス誘導を担う領域、非ストレス条件下での転写抑制の領域が含まれていた。現在、結合する転写制御因子の探索など詳細な機能解析を行っている。3.合成プロモーターによるシス配列の大規模同定シス配列予測法により共同研究者とともにアルミニウム、カドミウム、銅、塩類集積ストレスなどの土壌ストレスのマイクロアレイデータからシス配列をコンビネーションも含め100個ほど予測し、単純な合成プロモーターを設計した。現在、レポーター遺伝子と結合させ、組換えを行っている。1.リンゴ酸トランスポーターALMT1の転写制御機構の解析本研究課題で提案した高精度なシス配列予測をもちいて、シロイヌナズナのアルミニウム誘導性リンゴ酸トランスポーターALMT1 (ALuminum activated Malate Transporter 1)遺伝子のシス配列の同定を行った。昨年度までの報告として8つのシス配列を予測したこと、予測シス配列の置換プロモーター組換え体を用いた機能解析の結果、7つのシス配列が機能を持つことを報告した。本年度は、このALMT1プロモーター上のシス配列に結合する転写因子としてSTOP1(Sensitive TO Proton rhyzotoxicity1 )とCAMTA2(CAlModulin-binding Transcription Activator 2 )を同定することに成功した。また、STOP1の結合領域は従来報告されていたコンセンサスよりも長い塩基を認識していることも同定した。2.同定したシス配列を用いた合成プロモーターの開発とAlストレス耐性品種の開発ALMT1遺伝子で解析したシス配列も含め、様々な土壌ストレスのマイクロアレイデータから予測したシス配列をもつ合成プロモーターを共同研究者と100個程度設計した。コンストラクトの作成は終了し、一部組換え体も得ることができている。ただし、単純な1つのシス配列だけでは活性が高いものはあまり得られておらず、複数のシス配列をコンビネーションで持つ組換え体の解析を中心に行っている。また、ALMT1プロモーターの根端での特異的なAl誘導性を用いて、アルミニウム耐性植物体の作成を行っている。実際には細胞膜の電荷を調整するような複数の遺伝子をALMT1プロモーターにつないだコンストラクトを作成し、植物に組換えを行った。この中のいくつかのラインは若干アルミニウム耐性を獲得した。現在は複数の機能遺伝子を同時にALMT1プロモーターで発現させることで、更なる耐性獲得を試みている。同時に合成プロモーターを用いて機能遺伝子を目的に合わせて発現するような組換え体も計画中である。

この方法で予測したシス配列のみからなる合成プロモーターを作成し、そのプロモーターの発現プロファイルを観察することで、特定のプロモーターを指定せずに機械的にシス配列を同定することができる。本研究課題においては、保有するアルミニウム(Al)、塩化ナトリウム、カドミ二ウム、銅などの土壌ストレス処理を行ったシロイヌナズナのマイクロアレイデータを用いてシス配列を選抜し、合成プロモーターを作出した。しかし、本研究課題初年度に一足先に作出していた単独のシス配列をもつ合成プロモーターの解析では、発現が極めて弱いプロモーターしか作出できなかった。そのため、選抜したシス配列同士の共局在性を情報学的に考慮して、シス配列をコンビネーションで持つ合成プロモーターを共同研究者と63コンストラクト作成した。最終的にはシングルエレメントの合成プロモーターと合わせて100個以上のコンストラクトを作成した。平成26年度から27年度にかけては植物への作成したコンストラクトの組換えと、シングルコピーで挿入された植物体の選抜を行った。そのため、平成27年度においては、ほぼすべての組換え植物体の作成とライン化を終了することができた。さらに、これら作成した植物体を用いてAlと塩化ナトリウムストレスへの応答性を確認した。その結果、少なくともAlストレスで応答する7個の合成プロモーターと8個の塩化ナトリウムストレスで応答するコンビネーションの合成プロモーターの作出に成功した。さらにストレス強度や時間的に異なる発現プロファイルを示す合成プロモーターが作出できており、この結果は異なるトランス因子により制御されるシス配列が同定できていることを強く示唆している。まず、これまでのリンゴ酸トランスポーターの解析について予定通り本年度中に論文として発表することができた。この解析により、シス配列未知の遺伝子においても実際に高精度にシス配列が予測できることと、トランス因子の探索を行うことにより転写ネットワークを深く理解できることを確認することが出来た。また、当初の計画ではアルミニウム、カドミニウム、銅、塩類ストレスなど様々なストレスをすべて解析する予定であったが、解析する数が膨大であるため共同研究者と分担し解析を行っている。現在は、特にアルミニウムストレスに関わるシス配列の同定に力を入れ解析を行っている。上記のように、ALMT1プロモーターから当初の予定より数多くのシス配列を同定することができ、ALMT1以外のAl誘導遺伝子についてもプロモーター解析を行っているため、さらに多くのシス配列が同定できると思われる。共同研究者と分担することにより、合成プロモーターのコンストラクト作成や組換え体の作成、その機能解析ともに大きな遅れは無く進行できている。
呼吸鎖電子伝達系複合体II(コハク酸ーユビキノン還元酵素)中のb型チトクロムの機能

複合体II(コハク酸ーユビキノン酸化還元酵素)はTCA回路の酵素中唯一の膜結合性酵素であり,同時に呼吸鎖電子伝達系の初発酵素として機能している。しかし回虫など嫌気的エネルギ-代謝を行う生物においては逆反応のフマル酸還元酵素活性を示し,NADHーフマル酸還元系の末端酸化酵素として機能している。われわれはこれまでにこの複合体IIにおける酸素反応の方向性の決定要因のひとつがシトクロムbの性質に存在する点を示唆する結果を明らかにしてきたが、二年間にわたる本研究でシトクロムbと相互作用する他のサブユニットも含めより詳細に解析し以下に述べる成果を挙げた。平成元年度においてはシトクロムb成分と他のサブユニットの相互作用を調べる目的で複合体IIを解析する条件を検討し、サルコシルが有効である事を明らかにした。しかし平成2年度においてさらに実験をすすめた結果この系は哺乳類ミトコンドリアや細菌には有効であるが,回虫に系には適用が困難である事が判明した。そこで平成2年度は遺伝子の全塩基配列が明らかになっている大腸菌の<sdh>___ー遺伝子を同一細胞内の複数のプラスミドに挿入し,<in>___ー<vivo>___ーでの再構成を試みた結果,細胞質膜上に局在する複合体IIの再構成系を確立することができた。またこのシトクロムb成分に関してその構造と機能の関係を調べる目的でcDNAのクロ-ニングからその一次構造の決定を試みた。回虫筋のcDNAライブラリ-を作成し抗体によるスクリ-ニングから陽性クロ-ンをcybLおよびcybS両サブユニットについて得ることができた。また同様にしてこのシトクロムb成分と相互作用していると考えられているIpサブユニットについてヒトの酵素のサブユニットの全一次構造を決定し,鉄イオウクラスタ-の結合部位と考えられるシステインに富む3つの領域を見出した。複合体II(コハク酸-ユビキノン酸化還元酵素)はTCA回路の酵素中唯一の膜結合性酵素であり、同時に呼吸鎖電子伝達系の初発酵素として機能している。しかし回虫など嫌気的エネルギ-代謝を行う生物においては逆反応のフマル酸還元酵素活性を示し、NADH-フマル酸還元系の末端酸化酵素として機能している。申請者はこれまでにこの複合体IIにおける電子伝達の方向性の決定要因のひとつが構成成分のシトクロムbにあることを明らかにしてきたが、平成元年度はこの点をより詳細に調べる目的で研究を行い、以下の結果を得た。第1点はシトクロムb成分と他のサブユニットの相互作用を調べるため複合体IIよりシトクロムbを分離する条件を検討した結果、陰イオン性界面活性剤であるサルコシルが有効であることが判った。次年度においてはこの系を用いて再構成を中心とした研究を進めて行く予定である。第2点はこのシトクロムb成分に関し、抗体を用いてヒト肝、回虫筋のcDNAライブラリ-よりクロ-ニングを試みた。この結果両者ともに陽性クロ-ンが得られ、融合タンパク質に対する抗体の免疫ブロッティングなどから目的とするクロ-ンであることが確認された。第3点はコハク酸からシトクロムbへの電子伝達に関与する非ヘム鉄サブユニットについてそのcDNAのクロ-ニングから一次構造の解析を行った。ヒト肝のライブラリ-より得られたクロ-ンから決定した塩基配列をもとに予想したアミノ酸配列は細菌のそれと高い相同性を示した。また非ヘム鉄の結合部位と考えられるシステインに富んだ3ヶ所の領域が見出された。