hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大豆蛋白質による高コレステロール血症の予防効果について

1.ラットの血漿中コレステロール濃度におよぼす大豆蛋白質投与の影響を検討するため, 4週齢SD系雄ラットを全卵蛋白質群,カゼイン群,大豆群に分け, 20%蛋白レベル, 10%ラードの飼料で60日間飼育した.実験期間を通じて大豆群の血漿中コレステロールとリン脂質濃度はカゼインや全卵蛋白質群に比較し低い傾向を示し,成長期ラットにおいて大豆蛋白質による高コレステロール血漿の予防効果を認めた.2.高コレステロール食(1%のコレステロールと0.25%のコール酸ナトリウムを添加)を投与し,高コレステロール血症,脂肪肝を発症させたラットを用いて,食餌蛋白質の違いが,血中,肝中脂質の回復過程にどのように影響するか検討した.大豆蛋白質を摂取するとカゼインに比較し糞中への脂質と中性ステロールの排泄量が有意に多く,高コレステロール血症を予防し,コレステロールを含まない飼料に切り替えたとき,高コレステロール血症と肝肥大からの回復もカゼイン群より速い傾向を示した.3.健康な成人男子10名に蛋白質レベル0.8g/kgとしその1/6を米, 2/6を卵黄, 3/6をスキムミルクあるいは大豆蛋白質とし2週間投与した.コレステロールの摂取量は約1.3g/日.スキムミルク食では,血漿総コレステロール, LDL-コレステロール濃度,動脈硬化指数が実験食開始前の値より有意に高値を示した.一方, SPI食では実験期間を通じて変化を示さなかった.しかし糞中排泄中性ステロール量は両食事間で有意な差とはならなかった.ラットにおいても,健康な成人においても,大豆蛋白質を摂取すると,カゼインのような動物性蛋白質に比較し,高コレステロール血漿を予防し,動脈硬化指数も低く保つことができた.それは,ラットでは大豆蛋白質を摂取すると体外へのステロール排泄が促進されるためであることを示した.成人ではその機構を明らかにすることはできなかった.1.ラットの血漿中コレステロール濃度におよぼす大豆蛋白質投与の影響を検討するため, 4週齢SD系雄ラットを全卵蛋白質群,カゼイン群,大豆群に分け, 20%蛋白レベル, 10%ラードの飼料で60日間飼育した.実験期間を通じて大豆群の血漿中コレステロールとリン脂質濃度はカゼインや全卵蛋白質群に比較し低い傾向を示し,成長期ラットにおいて大豆蛋白質による高コレステロール血漿の予防効果を認めた.2.高コレステロール食(1%のコレステロールと0.25%のコール酸ナトリウムを添加)を投与し,高コレステロール血症,脂肪肝を発症させたラットを用いて,食餌蛋白質の違いが,血中,肝中脂質の回復過程にどのように影響するか検討した.大豆蛋白質を摂取するとカゼインに比較し糞中への脂質と中性ステロールの排泄量が有意に多く,高コレステロール血症を予防し,コレステロールを含まない飼料に切り替えたとき,高コレステロール血症と肝肥大からの回復もカゼイン群より速い傾向を示した.3.健康な成人男子10名に蛋白質レベル0.8g/kgとしその1/6を米, 2/6を卵黄, 3/6をスキムミルクあるいは大豆蛋白質とし2週間投与した.コレステロールの摂取量は約1.3g/日.スキムミルク食では,血漿総コレステロール, LDL-コレステロール濃度,動脈硬化指数が実験食開始前の値より有意に高値を示した.一方, SPI食では実験期間を通じて変化を示さなかった.しかし糞中排泄中性ステロール量は両食事間で有意な差とはならなかった.ラットにおいても,健康な成人においても,大豆蛋白質を摂取すると,カゼインのような動物性蛋白質に比較し,高コレステロール血漿を予防し,動脈硬化指数も低く保つことができた.それは,ラットでは大豆蛋白質を摂取すると体外へのステロール排泄が促進されるためであることを示した.成人ではその機構を明らかにすることはできなかった.昨年は、白ネズミに分離大豆蛋白質(以下SPIと略す)を投与すると、カゼインに比較し、糞中への脂質やステロールの排泄量が多くなり、血漿中コレステロール濃度を低下させることを確認した。本年度は健康な成人男子について、SPIに高コレステロール血症の予防効果があるかどうか、又そのメカニズムについて検討した。男子学生5人に実験期間を2週間とし、スキムミルク食、次いで日常食をはさんだ後、SPI食を投与した。エネルギーは43Kcal/Kg、蛋白質0.8g/Kg(総蛋白質の1/2はスキムミルク、もしくはSPI、1/3は卵黄、1/6は米に由来)とした。おもに卵黄由来のコレステロール摂取量は、23mg/Kgで通常の食事の約3倍とした。尿と糞は全実験期間通じて採取し、血液は早朝空腹時に採取し、以下の結果を得た。1.血漿中総コレステロール濃度は、スキムミルク食投与後有意な上昇を示した。卵黄由来のコレステロールを大量摂取しているにもかかわらず、SPI食では、投与前と差がなく、大豆蛋白質を摂取することにより、高コレステロール血症の予防効果を認めた。血漿中HDL-コレステロール、トリグリセリド濃度は、スキムミルク食、SPI食とも変化を示さなかった。2.SPI食の糞中排泄脂質量は、スキムミルク食よりも高い傾向を示し、中性コレステロール、コレステロール排泄量は、スキムミルク食より有意に高かった。以上の結果から、大量のコレステロールを摂取する時、同時に分離大豆蛋白質を摂取すると、スキムミルク食に比較し、体外への中性コレステロールの排摂量を増加させ、血漿中コレステロール濃度の上昇を予防していると推測される。

このような栄養実験では、食前歴の影響が大きいので、次年度はSPI食を先に投与後、スキムミルク食を投与し、分離大豆蛋白質の、高コレステロール血症を予防する効果について、さらにそのメカニズムについて再度検討する予定である。
最重度平衡障害に対する感覚代行治療‐実用化に向けた効果メカニズムの解明

本研究では、前庭覚に代わる感覚(舌触覚)を通じてバランス情報を伝達することを目的に開発された前庭代替装置を用いて、重症化した平衡障害に対する治療を試みた。バランス機能は全11例でよくなって、日常の生活支障度や歩行の状態はそれぞれ改善を示した。感覚代行技術を用いた本装置は、機能が廃絶された前庭を代替する働きを有し、触覚ととおした三叉神経入力が前庭中枢の可塑性を変化させた可能性がある。前庭障害が一側の場合、前庭代償によりめまい・平衡障害は徐々に改善していく。しかし、両側の機能が廃絶されると、もはや代償機転は作働せず平衡障害は存続して改善の期待はできなくなり治療に難渋する。そこで今回、前庭覚に代わる感覚(舌触覚)を通じてバランス情報を伝達することを目的に開発された前庭代替装置を用いて治療を試みた。本装置は頭位の傾きを感知する加速度計を包埋した微小電極(100個)アレイとプロセッサーから構成され、加速度計からの情報をプロセッサーで電気信号に変換して電極に送るしくみになっている。本年度は、本機器の有用性を確かめるために両側前庭障害3例を対象に、患者の舌表面に電極アレイを置いて、舌の触覚で信号がセンターリングされるようにバランストレーニングを試行した。治療評価には日常のバランス支障度を表すDizziness Handicap Inventory (DHI)と動的な体平衡機能を測定するSensory Organization Test (SOT)を用いた。バランスパフォーマンスは3例ともよくなり、DHIは平均72.7から16.7に、SOT scoreは平均37から54.7に、それぞれ改善を示した。感覚代行技術を用いた本装置は、機能が廃絶された前庭を代替する働きを有し、前庭中枢の可塑性を変化させた可能性がある。この効果メカニズムに平衡覚と触覚のクロスモダリティが関与すると考えられる。本年度は、舌の電気刺激により前庭神経核のニューロン活動を記録した。舌電気刺激が1および5mAでは反応はみられなかったが、1mAで潜時の長い誘発スパイクが認められた。現在、記録数を増やして検討中であるが、舌刺激により前庭神経核のニューロンが影響を受けることが示唆される。このことから、舌を用いた感覚代行技術は、機能が廃絶された前庭を代替する働きを有する可能性がある。両側の前庭機能が廃絶されると、平衡系の回復機構(代償機転)は作働せず平衡障害は存続して改善の期待はできなくなり治療に難渋する。本年度は、本機器の有用性を確かめるために両側前庭障害7例を対象に、患者の舌表面に電極アレイを置いて、舌の触覚で信号がセンターリングされるようにバランストレーニングを試行した。治療評価には日常のバランス支障度を表すDizziness Handicap Inventory(DHI)と動的な体平衡機能を測定するFunctional Gait Assessment (FGA)を用いた。バランスパフォーマンスは7例ともよくなり、DHIは平均58.7から38.4に、FGAスコアは平均12から23に、それぞれ改善を示した。感覚代行技術を用いた本装置は、機能が廃絶された前庭を代替して前庭中枢の可塑性を変化させる可能性が考えられた。そこで次に、この効果発現メカニズムを調べるために、舌先より2cm後方を電気刺激(0.5mA,50Hz)し、回転刺激により誘発される前庭神経核(VN)ニューロン反応に対する影響を調べた。検討した11個のニューロンのうち3個が抑制、2個が増強、5個が変化なかった。VNニューロン活動は舌刺激すなわち三叉神経により制御されている可能性が示唆された。以上より、前庭代替装置の作用メカニズムに平衡覚と触覚のクロスモダリティが関与すると考えられる。記録電極の不正確さにより、前庭神経核のニューロン細胞の記録が進まないから。

新規購入するなど、記録電極を変更して改善を図りたい24年度が最終年度であるため、記入しない。舌刺激を実際に臨床に応用して、バランストレーニングを行って、平衡障害に対する効果を調べる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
好中球の活性化における細胞内情報伝達-真のセカンドメッセンジャーを求めて-

好中球のスーパーオキサイド産生酵素であるNADPHoxidaseが細胞内でどのようなシグナル分子により活性化/不活性化されるのかについて検討し,前者についてはホスファチジン酸(PA),後者についてはスペルミンが有力な候補であることを示した。PAについてはこれが細胞膜を通過しにくいことから,好中球を電気穿孔して膜透過性を高めておいて検討した結果、次の事が明らかになった。1)PAによる活性化はCa^<2+>非依存性であること,2)活性化能は、PAのアシル基の短いものほど高いこと,3)短鎖のPAではわずか数μMで十分な活性化を引き起こすこと,4)至適濃度での活性化の程度は、生理的活性とほぼ同じレベルであること,5)PAがジアシルグリセロールに変化せずに活性化を引き起こすこと,などである。これらの結果は,PA自身が細胞内でセカンドメッセンジャーとして機能している事を強く示唆した。スペルミンについてはこの細胞性ポリアミンがNADPHoxidaseを顕著に阻害することを,細胞レベル,無細胞レベル両方で示した。無細胞活性化に対するスペルミンの影響について詳細に検討した結果,次の事が明らかになった。1)阻害は10数μMのオーダーで起こること,2)代謝経路でスペルミンの前駆体にあたるアミン類では殆ど阻害しないこと,3)スペルミンは細胞質ゾル中のタンパク成分に作用していること,などである。そこで,3)について詳しく検討したところ,スペルミンは細胞質ゾル中の酵素サブユニットに作用することを見いだした。したがってスペルミンは酵素サブユニットに結合して酵素複合体の形成を妨げると思われた。以上の結果からスーパーオキサイド産生は好中球の休止期においてスペルミンにより抑制され,刺激時にはホスファチジン酸のレベルの上昇により活性化されることが示唆された。本年度は主にホスファチジン酸(PA)による好中球の活性化について検討を行なった。電気穿孔して膜透過性を高めた細胞に各種PAを加え検討した結果、次の事が明らかになった。^<1)> i)PAによる活性化はCa^<2+>非依存性であること、ii)活性化能は、PAのアシル基の短いものほど高いこと、iii)短鎖のPAではわずか数μMで十分な活性化を引き起こすこと(ジデカノイルPAのEC_<50>は3μM)、iv)至適濃度での活性化の程度は、生理的活性(例えばfMLPによる)とほぼ同じレベルであること、などである。さらに今回明かになった中で最も重要な知見は、PAによる活性化がDG非依存性であることである。この事実は、PA自身が細胞内でセカンドメッセンジャーとして機能している事を、強く示唆するものである。なお、当初の計画では、5年度は、スペルミンの阻害メカニズムを検討する予定であったが、以下の理由によってPAによる活性化の検討を先に行った。その理由は一つに、このアイデアにおける海外の研究者との競争が激しくなり速やかに実行する必要が生じたこと、もう一つは、スペルミンの阻害機構を解明する上で、活性化機構の問題は避けて通れない問題であると判断したからである。結果的にはPAによる活性化機構を世界に先駆けて発表することができた。^<1)>今回の研究結果をもとに、今後さらに好中球内細胞伝達の本質に迫りたい。本年度は、好中球のNADPHoxidase(O_2^-生成酵素)の活性化に対するスペルミンの効果について検討した。スペルミンはSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)による酵素の無細胞活性化を強く阻害することが明かになった(IC_<50>=18μM)。

しかもこのような阻害は他の細胞性ポリアミン(スペルミジン、プトレッシンなど)ではほとんど見られなかった。また、スペルミンを酵素活性化後に加えた場合には阻害が見られないこと、酵素のNADPHに対するK_mはスペルミンにより影響されないことなどから、スペルミンは酵素そのものではなく活性化のステップを阻害するという事実が明かになった。さらに阻害のメカニズムを検討するために、加える細胞質ゾル、形質膜、SDSの量を変えて検討を行った結果、細胞質ゾルの量を増やした場合、スペルミンによる阻害が緩和されることがわかった。そこで細胞質ゾル中に阻害緩和因子が含まれていると考え検討した結果、これがタンパク性の因子であることが明かになった。またこれに関連して、スペルミンによる阻害はセミリコンビナント系(細胞質ゾルの代わりに遺伝子工学で発現させた細胞質因子[p47,p67,およびrac]を加えたもの)に対してもほぼ同様の阻害効果を示したことから(IC_<50>=15μM)、スペルミンはこれらの細胞質因子のどれかに作用していると思われた。そこで前述の無細胞活性化系にこれらの成分蛋白を一種ずつ加えてみたところ、p47またはracを加えた時にスペルミンによる阻害が緩和される事がわかった。したがって、スペルミンはこれらの細胞質因子に作用することによりNADPH oxidaseの複合体形成を妨げるものと考えられた。スペルミンは好中球細胞内にかなりの濃度で存在することから、生理的条件でスペルミンがNADPHoxidaseの活性化を制御している可能性が示唆された。本年度は,NADPHoxidase(O_2生成酵素)の活性化に対するスペルミンの効果について,そのメカニズムについて検討した。昨年度の研究でスペルミンがSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)による酵素の無細胞活性化を強く阻害すること,またスペルミンの作用する標的が細胞質ゾル由来のタンパク成分であることが明らかになった。そこで本年は,そのタンパク成分が何であるかを明かにするため,より単純化した系-セミリコンビナント系-を用いて検討した。セミリコンビナント系とは無細胞活性化において細胞質ゾルの代わりに遺伝子工学で発現させた細胞質因子(p47,p67,およびrac)を加えて酵素を形成させるものである。セミリコンビナント系でスペルミンは無細胞系とほぼ同様の強さでNADPHoxidaseを阻害した(IC_<50>=13μM)。このことはスペルミンの標的が酵素のサブユニット蛋白であることを示すものであった。そこでこれら個々のサブユニットを予めスペルミンで処理してから,セミリコンビナント活性化を行ってみたところ,p67が最も影響を受けSDSによる活性化の程度は著しく低下した(IC_<50>は前処理濃度で0.3mM)。次いでp47が影響を受け(IC_<50>=1.1mM),racは殆ど影響を受けなかった。このことからスペルミンはサブユニットのうちp67およびp47に主に作用することが明かになった。一方racをGTP-γ-Sで活性化する前にスペルミンと処理したところ活性化は顕著に阻害された。これらのことから,スペルミンはこれらの酵素サブユニットに作用することでNADPHoxidase複合体の形成を妨げるものと考えられた。
歯根膜幹細胞と幹細胞ニッチのストレス応答の組織学的解析

組織幹細胞は一般に正常組織では分裂頻度が低くDNA標識が長期間残存する。BrdUを用いてこの様なLabel retaining cell(BrdU-LRC)のマウス歯根膜での分布を調べたところ、血管周囲やセメント質近傍に多く分布していた。またBrdU-LRCは臼歯再植による歯周組織侵襲に対し再植1日後には増殖を開始したことから、組織再生に寄与する可能性が示唆された。さらにBrdU-LRCはコラーゲンゲル培養によって効率的に増殖することが見出された。成体幹細胞は正常組織ではゆっくりとしか分裂せず、DNA標識が比較的長期間残存すると言われている。本年度は、この様なLabel retaining cell(LRC)の標識残存期間、歯根膜における分布、マーカー分子の発現、ならびに歯根膜修復過程での増殖を調べた。歯周組織の細胞を標識するための5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)投与条件を検討した。第一臼歯の歯根が形成される生後1115日目のICRマウスに1日2回、50μg/g体重のBrdUを皮下注射した。ブアン液で灌流固定を行い、モース液で脱灰した後、常法通りにパラフィン包埋切片を作製した。2N HC1(37°C、90分)でDNAを変性させた後、BrdU標識細胞を免疫組織化学法によって検出したところ、BrdU投与終了直後では、歯根膜細胞の約40%がBrdUで標識された。BrdU投与終了後210週のBrdU標識の残存を調べたところ、標識細胞の割合は2週で7.3±4.5%、4週で5.5±2.7%まで減少したが、その後10週までは4%前後を推移した。これらのBrdU-LRCは、歯根膜中の血管周囲や歯のセメント質近傍に多く分布した。また多重免疫染色の結果、BrdU-LRCはα-smooth muscle actin, platelet-derived growth factor-βなどを発現していた。BrdU投与終了4週後に上顎第一臼歯を抜歯し、再植後のBrdU-LRCの挙動を調べた。Proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)との多重免疫染色の結果、定常状態ではこれらのBrdU-LRCは増殖していなが、再植後13日でBrdU-LRCはPCNA陽性となったことから、BrdU-LRCが再植後の歯根膜の組織修復過程に寄与する可能性が示唆された。メスで剥離したマウス臼歯歯根膜を培養皿に付着させた後out growthしてくる細胞、あるいは組織をcollagenase, dispase, trypsinなどの酵素処理することによって得られる細胞は、組織量に対して得られる細胞数が少なく、また増殖能が非常に低かった。一方、抜去した歯を直接collagenゲル中で培養すると、歯根膜(PDL)細胞は高い増殖能を維持できることが明らかとなった。マウス1匹分の全臼歯12本を約1カ月培養することにより10^6個以上のPDL細胞が得られた。成体幹細胞は正常組織ではゆっくりしか分裂せず、DNA標識が比較的長期間残存すると言われている。本研究では、この様なLabel retaining cell(LRC)のマウス歯周組織での分布や組織侵襲に対する動態を5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)の残存をマーカーとして追跡している。しかしマウス歯根膜は組織量が少なく、細胞の機能解析には多数の個体を必要とするため、BrdU-LRCの分離は困難であった。そこで本年度は歯根膜組織の培養法について検討した。ICRマウスの上下顎臼歯を抜去し、直接collagenゲル中に包埋して1,3,5,7日間培養した後、酵素処理によってゲル中の歯根膜由来細胞を解離し、プラスチックシャーレに播種した。単層培養下での増殖速度を比較したところ、ゲル培養の期間に依存して増殖速度、ならびにコロニー形成細胞の出現頻度が有意に増加した。次に、生後1116日の間、BrdUを50mg/kg体重で1日2回皮下投与し、その後4週間飼育したICRマウスから臼歯を摘出し、同様にゲル培養した。1,3,5,7日後にゲルごとホルマリン固定し、パラフィン包埋切片を作製して組織学的に観察したところ、歯根膜のBrdU-LRCはゲル中で増殖を再開することが確認できた。その結果、培養13日ではPCNA陽性のBrdU-LRCが検出できたが、35日後には分裂によりPCNA陽性細胞からBrdUが検出できなくなった。以上の結果、コラーゲンゲル培養法は、歯根膜に分布するBrdU-LRC、すなわち幹細胞様細胞を効率的に培養する方法として有用であることが明らかとなった。
中年期における自我同一性再構成に関する研究-「個としての自己」と「関係の中にある自己」の観点から-

1.研究目的の第1点は、2つの存在様式(個としての自己・関係の中にある自己)を組み込んだ自我同一性の概念化と、それを基にした自我同一性再構成の検討である。まず、従来の自我同一性研究において不十分であった関係性の側面をとらえるために、昨年度の本助成によって作成したGrotevant & Cooper(1981)の自我同一性地位面接の翻訳版のうち、対人関係的領域(友情、異性との関係、性役割)に焦点を当てた。次に、先行研究の知見を整理し、これらの領域に存在様式の視点を加えて概念化した。これを基に、面接項目を改訂して予備調査を行なった(対象は日本人と英国の大学生)。その結果、自我同一性における関係性の側面は、女性であり日本人である対象者にとってきわめて重要でありながら、彼女らはこれを明確化できないことが明らかになった。このため現在、西洋的自我を前提とした概念と面接法を日本人に適用するための修正を行なっている。これは日本人り自我同一性研究全般に関わる問題なので、今年度から来年度にかけて慎重に修正を行ない、本研究の本来の目的に使用し得る方法を確立する予定である。2.研究目的の第2点である、存在様式の観点から見た青年期から成人期までの自我同一性発達については、先行研究と昨年度までに収集したデータの分析とから、次のような結果を得た(杉村,印刷中ab)。(1)女性の場合、青年期の自我同一性形成においては関係性の側面が重視され、成人期の自我同一性発達でもこの側面と関連した自我同一性危機が起こる。(2)この成人期の自我同一性危機は、ライフコースにより内容が異なる。子育てと仕事を両立している女性では、育児期に母親同一性(関係性を重視)と職業同一性(個としての自己を重視)との間で葛藤が体験される。専業主婦では、中年期における子育ての軽減とともに、関係性から個としての自己への移行に伴う深刻な自我同一性危機が起こる。
破骨細胞の機能変化に対応するpH変動の可視化

すべての細胞活動に細胞内の限られた領域が酸性環境に置かれることが必須の条件となっている。骨吸収を行う破骨細胞では細胞内、外の酸性化がその細胞活動と見事に調和している。アクリジンオレンによる生体染色では限られた条件での細胞内酸性化領域を可視化することができる。しかし今回のDAMP(3-(2,3-dinitorianilino)-3'-amino-N-methyldipropylamine)を用いた研究では生きた破骨細胞の細胞膜は自由に通過し細胞内の酸性化領域に集積し化学固定後はその場所に固定化され、一方細胞外の骨吸収窩においても吸収骨面上にDAMPの集積不動化が同様におこりDAMPに含まれるDNP基の抗体を用い、蛍光物質をラベルして顕微鏡下で可視化することができた。ガラス面または骨面上で培養した破骨細胞では酸性化領域の分布が異なっていた。ガラス面上で培養したとき破骨細胞は刷子縁を形成することはないため細胞内の均一に分布するゴルジ野を含む小管-細管系のオルガネラに蛍光が分布するが骨面上に培養した破骨細胞では刷子縁をもち骨吸収窩に蛍光が局在していた。それに対して背側細胞質では骨に面した細胞質に比べて明らかに蛍光強度が弱く、分布領域が減少していた。骨面で培養した破骨細胞でも休止期にあるものはガラス面上で培養した破骨細胞の蛍光強度、分布領域に類似していた。破骨細胞のpHのホメオスタシスに関与するプロトンATPaseと炭酸脱水酵素の関わりをみるためそれぞれの阻害剤であるバフィロマイシン、アセトアゾラミドをも用いた実験では明らかに酸性領域のpHが上昇した。以上のように破骨細胞の機能動態とp変動が同調していることが明らかとなった。生後まもないウサギの長管骨から破骨細胞を分離しガラス面、骨面上で1-4日間培養したものを研究材料に供した。骨面上で分離培養した破骨細胞は形態的にはin vivo状態と同様で骨面側では吸収窩を形成しまたその細胞側では刷子縁と明帯構造が形成されていた。しかしガラス面上で培養したものは刷子縁を欠くもののその他の細胞学的特徴は備っていた。この様な培養細胞の酸性領域を可視化するために50μMの濃度のDAMPを取り込ませた。この種の物質は細胞が生きている時には自由に細胞膜を通過して細胞内外の酸性領域に集積する性格をもっている。細胞を固定するとイオンが自由に移動することができなくなり集積したDAMPにはハプテンとしてのDNP基を含むことを利用して一次抗体として抗DNPでラベルし、次いで二次抗体としてIg-Gと蛍光色素の複合体をラベルして蛍光顕微鏡下で可視化することができた。従来酸性領域を顕微鏡で可視化するために試薬としてアクリジンオレンジが用いられてきたがこれらは生体細胞のみに応用可能でありまた細胞外の酸性領域を観察するには不敵であった。DAMPは細胞を固定した後可視化できることまた細胞外の酸性領域の証明も出来ることがわかった。ガラス面上で培養した破骨細胞では細胞内にのみ蛍光部位が証明された。骨面上で培養された破骨細胞では細胞内のみならず吸収窩に相当する細胞外の部位も強い蛍光を示した。ガラス面上で培養した細胞は細胞質内によく発達した小管構造を有しこの構造が酸性領域であると考えられ、細胞内の酸性領域は骨面上で培養したものより広範囲に蛍光強度も強いものであった。このような蛍光観察は通常の蛍光顕微鏡でも可能であったが共焦点レーザー顕微鏡ではさらに精度を高めて解析することができた。

破骨細胞細胞内外の酸性化はプロトンポンプATPaseを介して生じると考えられておりこの種のATPaseの特異的な抑制剤であるバフイロマイシンは明らかにDAMPによる蛍光強度を減弱させた。また炭酸脱水素酵素の抑制剤であるアセトアゾラミドの添加によっても酸性領域の蛍光強度が減弱した。この様な所見は脱炭酸酵素で生じるプロトンとプロトンポンプATPaseの関係を示すものといえる。平成7年度の研究計画として光学顕微鏡レベルの酸性領域の顕微鏡による可視化という目標はおおむね達成された。平成8年度では電子顕微鏡による酸性領域の可視化とその定量化の研究につなげていきたい。酸性領域のpHを可視化するために用いられるアクリジンオレンジによる生体染色ではガラス又は骨面上で培養した破骨細胞の細胞質が染色された。しかし生体染色では細胞の酸性pHは可視化できても細胞外の可視化は不可能で,DAMPを用いるとそれを取り込んだ細胞はもちろんその物質は化学固定により不動化され免疫染色することにより細胞内,外の低pH領域が染色され可視化できることが判った。破骨細胞は細胞によりその染色程度は異なり,骨面上で培養し吸収窩を形成した細胞ではその細胞質とともに細胞外の吸収窩が染色されpHが酸性領域であることが可視化できた。プロトンポンプや炭酸脱水素酵素の抑制剤(バフィロマイシン,アセトアゾラミド)の処理では細胞外の低pH化はほとんど消失するが細胞内の変化はわずかであった。破骨細胞の機能変化に対応してpH変動することが証明できた。また破骨細胞の細胞質にはDiOC6(3)をプローベとした検索で小管構造が充満しておりそれらの構造が細胞内の低pH領域であると考えられた。それらの小管構造は従来の化学固定法では小管構造の断裂,変形を引き起こし大部分が小胞構造となるが急速凍結固定法の観察結果からそれらは連続した小胞管状構造で破骨細胞の機能と密接に関係する小器官であることが判明した。
ビタミンB6の抗腫瘍作用に関する基盤研究

ビタミンB6の抗腫瘍作用が他の臓器と比べて何故に大腸において顕著に現れるのか検討した結果,ビタミンB6摂取量に対する大腸のB6代謝物濃度の感受性が特に高いことで説明できることを示した。さらに,ビタミンB6に応答する遺伝子を動物や細胞レベルの実験で解析した。その結果,マスト細胞や細胞傷害性T-細胞に関連する遺伝子群の発現変動や細胞保護作用に関連する遺伝子群の発現変動を見出し,これらが抗腫瘍作用につながることを示唆したビタミンB6の抗腫瘍作用が他の臓器と比べて何故に大腸において顕著に現れるのか検討した結果,ビタミンB6摂取量に対する大腸のB6代謝物濃度の感受性が特に高いことで説明できることを示した。その結果,マスト細胞や細胞傷害性T-細胞に関連する遺伝子群の発現変動や細胞保護作用に関連する遺伝子群の発現変動を見出し,これらが抗腫瘍作用につながることを示唆した1)ビタミンB6(B6)の抗腫瘍作用が何故に大腸で顕著に現れるのかという疑問を解明するために、マウス各組織のB6代謝物(pyridoxal 5'-phosphate : PLP)と食餌B6量との関連性について調べた。その結果、食餌B6量に最も顕著に応答する組織が消化管(小腸、大腸、胃)であり、ついで脾臓、肺、腎臓、脳の順であった。意外なことにこれまで最もよく研究されてきた肝臓や筋肉については変動は少なかった。一般に、PLP濃度の低い組織ほどPLP濃度の変動は大きかった。この結果は、何故にB6が大腸がんの発症と密接な関係にあり、他の臓器のがんとの関連性が少ないのかという疑問を説明している。3) B6によるオートファジー抑制機構にmTORやCa channelの関与の可能性を検討した結果、これらの可能性を支持する証拠は得られなかった。1)ビタミンB6の大腸癌抑制作用と遺伝子発現:ミトコンドリア機能が発がんと密接に関連することから、B6摂取により大腸のミトコンドリア関連遺伝子の発現をDNA microarrayで調べた。その結果、ミトコンドリア関連遺伝子の発現が上昇する因子と抑制される因子と両者とも多数見出され、ミトコンドリア機能との一定の関連性は見出されなかった。一方、B6摂取によるラット大腸の抗腫瘍の標的であるHSPのタンパク質発現やmRNA解析した。その結果、HSP群の中で、HSP70及びHSP32のタンパク質発現が特異的に減少することが示されたが、mRNA量とは無関係であった。2)ビタミンB6のオートファジー抑制作用の解析:B6によるオートファジー抑制機構に関しては、AktやmTOR、ERK、JNKなどの因子の関与を調べた。その結果、Beclin1のタンパク質発現の抑制が関与していることを示した。さらに、B6のオートファジー抑制作用にCaチャネルが関与する可能性がCaチャネルの修飾因子を用いた実験により示唆された。3)ビタミンB6摂取に応答する各組織ビタミンB6代謝物の解析:食餌へのB6(ピリドキシン)添加の各臓器のB6代謝物の変動について網羅的に解析した。その結果、B6摂取の増加により筋肉と心臓を除く多くの組織において、PLP濃度が増加したが、小腸と脂肪組織の増加が最も顕著であった。次に変動が顕著であったのは大腸、脾臓、肺、胃のPLPであり、その他の組織は変動が少なかった。さらに興味あることに、小腸と大腸のピリドキシンの濃度は、B6摂取に伴った非常に顕著に増加していた。このことは、消化管のPLP濃度の変動が大きいのは、直接消化管に餌のB6が取り込まれ、そこでPLPに変換されたことを示唆しており、食餌B6量の影響を受けやすい理由が説明できた。1)ビタミンB6に応答する大腸がん細胞の遺伝子解析ビタミンB6に応答する結腸がん細胞HT29の遺伝子発現について、DNA microarray、及びRreal-time PCRを用いて解析した。その結果、発がん促進に関わることが報告されている遺伝子として、CSTA(cystatin A)、DDIT3、p21、GADD45B、VDR、及びIGFBP1の発現増大を示した。一方、発がん抑制に関わるとされる遺伝子として、NOX-1の著しい発現抑制を見出した。同様な発現変動が結腸がん細胞Caco-2細胞でも見られた。これらの遺伝子の中でも特に、Cystatin AとNOX-1の発現変動が著しく、近年、新しい炎症性機構として注目されているインフラマソームとも密接に関連している。そこで、インフラマソームについても調べたところ、ビタミンB6がNLRP1、及びNLRP3の遺伝子発現を抑制することが見出された。これまでに、ビタミンB6の抗腫瘍作用の機構として炎症抑制の関与を示唆しているが、その炎症抑制機構の一端として、インフラマソームの抑制の可能性を示したことになる。2)ビタミンB6摂取の大腸・腸内環境への影響の解析前年度に引き続き、腸内の発がんに関連する因子について検討を行った。その結果、発がん促進因子S1P(sphingosine 1-phosphate)の濃度がビタミンB6摂取により減少することを明らかにした。一方、腸内細菌叢に関しては、意外なことにLactobacillusがビタミンB6摂取により減少していた。3)ビタミンB6のリンパ管新生に対する影響の解析これまでに、ビタミンB6の血管新生抑制作用を報告してきたが、Ex Vivoリンパ管新生アッセイ系を開発したので、それに対する影響も調べた。
近代天皇制における女性の社会的位置について

近代天皇制国家における女性の社会的位置は、一般に男性より下位におかれることが多く、たとえば職業、学業、その他の分野において、女性の活躍する場は限定されていた。しかしながら、女性の社会的能力は、そうした時代にあっても十分な可能性を有したものであった。十全な社会的活躍の場が保障されなかった女性たちにとって、天皇制国家の官僚システムに連動した職務や活動の舞台は重要なものであった。本研究は、そうした社会的な制限下にあった女性たちが、天皇制システムの中で、自らの可能性をどのように実現しえたのか、また、逆には、天皇制システムが女性の可能性をどのように制限し、かつ発展させていたのかを追究した。とりわけ、女官に焦点をあて、天皇の「付属物」的な存在としてみなされがちな女官やそれに類似する女性の機能が、時代の制限下の中で、女性の能力発揮の場として提供されていたかを明らかにした。具体的には、「『明治婦人録』に見る独立婦人」をテーマとして、明治期の女性の主たる職業や社会的活動の種類と、それに従事した具体的な女性名、およびその統計的処理をした。その際、宮中に関係する女性の全容把握につとめ、女性全体の中で宮中関係女性がどういう位置にあるかを検討した。また、補論として「『華族画報』に見る華族女性」を調査し、華族家における女性の動態把握につとめた。さらに、「近代の宮廷女性一覧」を作成し、女官などの宮廷女性の人物誌としてまとめた。その際、『日本近代女性人名辞典』、『平成新修旧華族家系大成』を基本的文献として、近代の女官の総体把握につとめた。本年度(2000年度)は、資料の収集と、いくつかの現地調査を行った。また、来年度に刊行される論文と書籍の執筆を行った。資料の収集は、現在入手しうる女官および女性史関係の資料や書籍を入手、整理した。女官関係では、古代から現代までの主要論文および基本資料を可能な範囲で入手、その整理と分析をした。とくに明治時代以降の時期の女官論を集めて、『女官』を執筆、来年度の六月に刊行予定である。『女官』では、『牧野伸顕日記』、『河井弥八日記』、『奈良武次日記』、『入江相政日記』、『徳川義怒日記』のほか、国会図書館所蔵の「牧野伸顕関係文書」などの資料を、入手した女官関係文献とともに整理分析した。女性史関係では、『明治天皇紀』を整理分析して、明治天皇と皇后美子の社会援助事業についてまとめ、来年度三月に「明治天皇の社会事業と軍事援護」と題して『静岡精華短期大学紀要』に掲載予定である。明治天皇のみならず、皇后や女官たちが、どのような社会事業と軍事援護をなしたのかを整理したものである。この間、『近代日本の上流階級』、『大正天皇』、『椿の局の君』などの著書も刊行され、近代天皇制と女官に関する研究が新しい段階に入ってきた感がある。とりわけ社会史的な手法は来年度からのより積極的にとりいれたい方向である。現在、家族制度関係文献を収集中であり、天皇制国家における家族のあり方、女性の位置について整理中である。本年度(2001年度)は、収集史料、文献、現地調査をもとに、いくつかの成果をまとめた。また、来年度に向けての文献整理や執筆準備をしている。史料や文献は、女性史、家族史、婚姻史などをはじめ、天皇制、皇族関係、国外の王政に関するものなどを集めた。また、国内、国外で放映された天皇制や王政に関するビデオなども収集した。本年度の成果としては、女官については『ミカドと女官』(恒文社21)をまとめ、近代における女官制度と女官たちの生活について論述した。また、『雅子妃とミカドの世界』(小学館)をまとめ、現代における皇室と女性のあり方について整理した。

来年度は、『皇室を支えた女性たち』(仮題)、『家宝の行方』(仮題)、『昭和天皇とその家族たち』(仮題)を執筆する予定であり、その史料文献収集と、現地調査を行う計画である。また、王政や家族制度の国際比較のため、中国、韓国、ロシアなど旧王政はじめ、現在存在する世界の王室についての情報を整理中である。そして、王家のみならず、貴族制度や、一般国民の家族形態および婚姻関係などを分析検討し、日本の天皇制と女性との関係についてさらなる考察をくわえる予定である。なお、来年度は「王政と戦争と女性」という新しいテーマを設定し、その理論的考察を深めたいと思っている。本年度(平成14年度)は、蒐集資料をもとにいくつかの論稿を発表した。前年度までに執筆した『ミカドと女官』(恒文社21)、『雅子妃とミカドの世界』(小学館)に加えて、新たに『四代の天皇と女性たち』(文藝春秋社新書)を執筆した。現在、上記の論稿の執筆に利用した資料や諸文献を整理して、近代天皇制における女性の社会的位置について、まとめの報告書を作成しようとしているところである。基礎作業として、近代の歴代皇后、女官らの経歴などのデータベース化、諸外国の王室と女性の関係について論じた文献や諸資料のリストなどの作成を進めている。そのほか、新聞や雑誌の切り抜きも再整理している。なお、現在刊行中の『梅若実』日記に、宮中女官たちの能楽鑑賞の記録が残されており、そうした新しい情報も加筆する予定である。こうした基礎作業をふまえて、来年度は『近代天皇制における女性の社会的位置』という報告書をまとめたい。本年度(平成15年度)は、平成12年度から継続して収集した資料に基づき、「近代天皇制における女性の社会的位置について」の考察と分析を行った。その詳細は、文部科学省研究振興局学術研究助成課又は日本学術振興会研究事業部研究助成課に提出予定の「科学研究費補助金研究成果報告書」に記すが、簡略に示せば、近代日本における職業と社会活動のうち、著名な女性達が担った主な職種と社会的肩書きについてまとめ、それが近代日本社会全体に占める割合と性格について述べた。なお、平成12年から平成15年にかけて、「近代天皇制における女性の社会的位置について」というテーマに関連する論考をいくつかまとめてきたので、以下に列挙する。(1)「明治天皇の救済事業と軍事援護」『静岡精華短期大学紀要9号』平成13年1月(2)『ミカドと女官』恒文社21平成13年5月(3)『雅子妃とミカドの世界』小学館平成14年1月(4)「日清・日露戦争と華族」『月刊歴史読本5月号』新人物往来社平成14年3月(5)『四代の天皇と女性たち』文藝春秋社平成14年10月
超微細気泡（ナノバブル）を用いた保存処理方法の構築

文化財の保存処理で水道水内のカルシウムや塩素による問題で水の純度を注目することはあったが、水に含む気体(気泡)は注目されていない。近年、気泡は微細(マイクロバブル・ファインバブル:FB)から超微細(ナノバブル・ウルトラファインバブル:UFB)に発展し、通常の気泡と全く異なるユニークな性質を示している。このFBやUFBを含む水に注目し、文化財の保存処理への適用する研究を行った。本年度は、文化財の洗浄へ特化したFB・UFB発生装置を用いて、大型石造物における洗浄を行った。対象物は、江戸時代の石橋と昭和時代の石碑(いずれも和泉砂岩製)であり、保存処理における洗浄でUFB水を用いた。大型石造物に対する洗浄では、UFB濃度を水道水で10分の1に希釈したUFB水で洗浄を行い、通常の蒸留水(水道水希釈)に対する洗浄効果を前年度と同様に予備試験とブラインドテストで比較した。また、FB水を現地で直接発生させることで、UFB水との組み合わせ実験が可能となり、石材洗浄におけるFB・UFB水の組み合わせによる更なる洗浄効率化を検討することが可能となった。ラボレベルの洗浄では昨年度も実施した電子顕微鏡による洗浄残渣の観察だけでなく、洗浄効率の定量化に向け標準的な御影石の試験材上に人為的な汚染を付着させ、UFB水による洗浄評価を行った。現地やラボにおける洗浄試験の中で、付着物や対象物に応じてUFB水の洗浄効果が大きく変化することが明らかになった。また、株式会社IDECより提供を受けた酸素、窒素、二酸化炭素といった各種ガスを封入したUFB水により出土木製品の保存管理への変化を観察した。開始時期が冬季であったため有意な違いは観察されなかったが、観察条件を一定にした条件下で再試験を実施している。近年、気泡は微細(マイクロバブル・ファインバブル:FB)から極微細(ナノバブル・ウルトラファインバブル:UFB)に発展し、通常の気泡と全く異なるユニークな性質を示している。このFBやUFBを含む水に注目し、研究を行った。入手したUFB純水中にUFBが存在する可能性を検証するため、緑色レーザーによる散乱線の確認を行った。また、埃等の微粒子が多数存在する状況で使用するため、UFB水道水中にUFBが存在する可能性を検証するため、真空脱気装置を用いて気泡発生量を水道水と比較した。同時に、UFB発生装置に関する情報収集を行った。装置導入に向けた予備実験として、入手したFB・UFB水また簡易なFB・UFB発生バルブ装置を用いて、出土木製品の保管水への検討や石材表面に付着した汚れの除去について検討した。出土木製品の保管水は3か月経過後も藻の発生等が確認されず、引き続き経過を観察中である。一方、レンガやコンクリート片における洗浄試験の結果、通常の蒸留水や水道水を使用した場合と比較して、FB水はブラシによる磨きの回数を減少させることが分かった。石材表面への物理的な損傷を抑えた洗浄としてUFB水を使用できる可能性が示された。現在、砂岩製の試験体による洗浄試験を実施し、石材表面への影響を詳細に分析する方法を検討している。微細気泡(FB)及び極微細気泡(UFB)の発生装置選定にあたり、様々な研究者やメーカーに問い合わせ、装置の検討を行ってきた。その結果、当初想定していた旋回式の発生装置より、加圧溶解式の発生装置に利点が多かった。発展中の分野であり、加圧溶解式装置の新製品や新規の他原理装置の情報により、文化財へ適したUFB発生機器選定にはより時間を欠けるべきと判断した。そこで、足掛かりとして、FB・UFBの発生量は少ないが、安価に製造できる加圧溶解式バルブ装置に着目し、FB・UFBの発生を確かめ、文化財分野への適用へ予備実験を行った。石材の洗浄では、FB・UFB水を用いることで研磨回数を減らした洗浄が可能になるなど一定の成果が得られた。本年度は洗浄において、FB・UFB水による除去効率の改善について検討した。昨年度の予備実験や情報収集を通して、種々のFB・UFB発生原理の中から最適な方法を検討し、発生装置の開発を共同で行った。その結果、開発された文化財の洗浄へ特化したFB・UFB発生装置を用いて、石仏やモザイク壁画、文書を対象文化財として洗浄試験を行った。特に、ラボレベルから現場レベルへスケールアップを実施し、文化財修復現場での実作業への適応を試みた。修復現場では、UFBを含む水と含まない水を用いたブラインドテストを実施し、UFB水による洗浄効率の改善を作業現場で評価することに成功した。また、ラボレベルでは電子顕微鏡による洗浄残渣の観察により、FB・UFB水による文化財表面への影響に対して評価を行った。現在、顕微鏡以外の表面観察へ向けた科学的機器の活用や、洗浄効率の定量的な評価に向けた標準試験方法の確立に向けた実験を計画している。

なお、修復現場での実使用に基づくUFB発生装置改良に向けた適用事例を蓄積中である。微細気泡(FB)及び超微細気泡(UFB)の科学的な機構解明にあたり、ナノレベルの分析手法のこの1,2年における大きな進展・改良に伴い最適な分析方法確立に至っていない。一方、発生装置の共同開発を実施できたことにより、文化財洗浄に特化したFB・UFB発生装置の開発が可能となった。その結果、市販の装置で実現できなかった異なる電荷をもつUFBを作成することができ、洗浄試験対象の適用条件が拡大した。また、ブラインドテストを行うことで、ラボレベルでなく現場作業での評価が可能となり、FBやUFBを用いた洗浄の実展開に向けた試験が可能となった。目標としていた装置の導入し、実作業への展開を達成できたことから、おおむね順調に進展しているとした。文化財の保存処理で水道水内のカルシウムや塩素による問題で水の純度を注目することはあったが、水に含む気体(気泡)は注目されていない。近年、気泡は微細(マイクロバブル・ファインバブル:FB)から超微細(ナノバブル・ウルトラファインバブル:UFB)に発展し、通常の気泡と全く異なるユニークな性質を示している。このFBやUFBを含む水に注目し、文化財の保存処理への適用する研究を行った。本年度は、文化財の洗浄へ特化したFB・UFB発生装置を用いて、大型石造物における洗浄を行った。対象物は、江戸時代の石橋と昭和時代の石碑(いずれも和泉砂岩製)であり、保存処理における洗浄でUFB水を用いた。大型石造物に対する洗浄では、UFB濃度を水道水で10分の1に希釈したUFB水で洗浄を行い、通常の蒸留水(水道水希釈)に対する洗浄効果を前年度と同様に予備試験とブラインドテストで比較した。また、FB水を現地で直接発生させることで、UFB水との組み合わせ実験が可能となり、石材洗浄におけるFB・UFB水の組み合わせによる更なる洗浄効率化を検討することが可能となった。ラボレベルの洗浄では昨年度も実施した電子顕微鏡による洗浄残渣の観察だけでなく、洗浄効率の定量化に向け標準的な御影石の試験材上に人為的な汚染を付着させ、UFB水による洗浄評価を行った。現地やラボにおける洗浄試験の中で、付着物や対象物に応じてUFB水の洗浄効果が大きく変化することが明らかになった。また、株式会社IDECより提供を受けた酸素、窒素、二酸化炭素といった各種ガスを封入したUFB水により出土木製品の保存管理への変化を観察した。開始時期が冬季であったため有意な違いは観察されなかったが、観察条件を一定にした条件下で再試験を実施している。微細気泡(FB)及び極微細気泡(UFB)の発生装置に関わる知見をさらに蓄積し、文化財洗浄における発生装置の最適化を行う。また、UFBを用いることで文化財へ与える影響をマクロ・ミクロ視点から観察し、評価する。文化財の洗浄だけでなく、保管水や脱塩水といった分野への適用を目指し、発生装置の最適化を行っていく。装置の最適化にあたり、FB・UFB発生装置の研究を行う研究者と共同に、装置の改良を視野に入れた研究推進を計画する。微細気泡(FB)及び超微細気泡(UFB)の発生装置に関わる知見をさらに蓄積し、文化財洗浄における発生装置の改良を行う。装置の改良にあたり、FB・UFB発生装置の研究を行う研究者や学会と共同に、装置の改良を視野に入れた研究推進を計画する。
GLUT4の空間・時間的運命を制御するインスリン・シグナルの解明

本研究の目的は,脂肪細胞において過酸化水素(H2O2)産生亢進をもたらすインスリン・シグナルを明らかにすることにより,GLUT4の空間・時間的運命,すなわち,GLUT4のインスリン感受性GLUT4貯蔵コンパートメント(GSC)へのターゲティングと蛋白寿命の制御機構を解明することにある。これまでの検討により,3T3-L1脂肪細胞においては,インスリン刺激時のH2O2産生源はNADPHオキシダーゼであるNox4であると考えられることから,30年度は,インスリンによるNox4活性化機構を明らかにする目的で,Nox4の細胞内局在,翻訳後修飾,分子間相互作用等を検討した。ショ糖密度勾配遠心法と蛍光顕微鏡法による検討により,インスリン刺激後Nox4は小胞体(ER)に局在したままで,細胞膜近傍へ集積した。インスリン依存性にNox4と結合する細胞膜標的分子候補として,脂肪細胞に大量に発現しているカベオリンとの結合を検討した。カベオリンはCaveolin Scaffolding Domain (CSD)(アミノ酸82-101)を介して,Caveolin-Binding Motif (CBM)をもつ種々のシグナル蛋白と結合する。Nox4のC端にはCBM配列(ΦXΦXXXXΦ)が存在し,免疫沈降法ではインスリン刺激によりNox4とカベオリンは共沈した。この結合はvanadate存在下でのみ見られることから,いずれかの蛋白のチロシンリン酸化に依存する結合と考えられた。チロシン残基に変異を導入したNox4 (Nox4-Y572F)を発現した脂肪細胞ではインスリンによるGLUT4分解促進作用が抑制されたことから,インスリンがNox4のY572チロシン残基をリン酸化すること,また同リン酸化がカベオリンとの結合に重要であることが想定された。所属する研究室の研究テーマが,エピジェネティクス領域になり,新しい研究室の立ち上げと,エピジェネティクス領域の研究プロジェクトにもエフォートを取られるようになったため,本研究に当初予定していた60%のエフォートが割けない状況となっていることから,若干,進捗状況に遅れが生じている。今後,Nox4 (Nox4-Y572F)とカベオリン(Cav-Y14F),およびCBM欠失変異Nox4(Nox4-ΔCBM)等の変異体を発現した脂肪細胞を用いて,両者のインスリン依存性結合に対する効果を検討する。これと平行して,東大アイソトープ総合センターの川村猛准教授に協力を依頼し,質量分析によるNox4のリン酸化部位決定にトライする。カベオリンに関してはインスリンによるリン酸化が確認されているCav-Y14F変異を用いる。結合に必要なリン酸化部位が決定した後,変異体を発現した3T3-L1脂肪細胞を用いて,インスリンによるH2O2産生に対する効果,GLUT4分解促進に及ぼす効果を検討する。H2O2産生はH2O2特異的蛍光プローブであるHyPer(Belousov et al. Nat Methods. 3: 281, 2006)を用いたリアルタイムモニタリング(Ma et al. 2014)により測定する。またNox4は構成性活性型であるという報告があることから,Nox4の翻訳後修飾以外の活性促進機構についても検討する予定である。これには,Nox4の基質となるNADPH産生,特に解糖系のペントースリン酸経路におけるグルコース6リン酸脱水素酵素(G6PDH)によるNADPHがインスリン作用に重要であるとの結果を得たので,G6PDHに対するインスリンの効果を検討する。

所属する研究室の研究テーマが,エピジェネティクス領域になり,新しい研究室の立ち上げと,エピジェネティクス領域の研究プロジェクトにもエフォートを取られるようになったため,本研究に当初予定していた60%のエフォートが割けない状況となっていることから,若干,進捗状況に遅れが生じている。今後,Nox4 (Nox4-Y572F)とカベオリン(Cav-Y14F),およびCBM欠失変異Nox4(Nox4-ΔCBM)等の変異体を発現した脂肪細胞を用いて,両者のインスリン依存性結合に対する効果を検討する。これと平行して,東大アイソトープ総合センターの川村猛准教授に協力を依頼し,質量分析によるNox4のリン酸化部位決定にトライする。カベオリンに関してはインスリンによるリン酸化が確認されているCav-Y14F変異を用いる。結合に必要なリン酸化部位が決定した後,変異体を発現した3T3-L1脂肪細胞を用いて,インスリンによるH2O2産生に対する効果,GLUT4分解促進に及ぼす効果を検討する。H2O2産生はH2O2特異的蛍光プローブであるHyPer(Belousov et al. Nat Methods. 3: 281, 2006)を用いたリアルタイムモニタリング(Ma et al. 2014)により測定する。またNox4は構成性活性型であるという報告があることから,Nox4の翻訳後修飾以外の活性促進機構についても検討する予定である。これには,Nox4の基質となるNADPH産生,特に解糖系のペントースリン酸経路におけるグルコース6リン酸脱水素酵素(G6PDH)によるNADPHがインスリン作用に重要であるとの結果を得たので,G6PDHに対するインスリンの効果を検討する。所属研究室に新任の教授が着任し,研究領域が細胞生物学からエピジェネティクス領域に変わったため,新しい研究室の立ち上げ・整備と,エピジェネティクス領域のプロジェクトにも若干のエフォートを取られたため,本研究で当初予定していたエフォートを割くことができなかったことから,初年度の計画に若干遅れが生じ,次年度への繰越が生じた。31年度は30年度に生じた研究計画の遅れを取り戻す予定である。