hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫細胞における遺伝情報の収納と発現

ゲノムの高次構造は厳密に制御されており、その核内収納は転写制御と密接に関係している。本研究では、昆虫細胞におけるDNAメチル化機構とその制御について、カイコDNAメチル基転移酵素群の諸性質を明らかにし、DNAメチル化により制御を受ける遺伝子を同定した。また、染色体のループ形成に関与し、染色体を別々のドメインに分割することで、ループ外からのエンハンサー作用や、ヘテロクロマチンの無秩序な広がりを抑えるカイコインシュレーター遺伝子群を同定し、その構造と機能解析を行った。カイコDNMT1と2については、バキュロウイルス発現系を用いた組換えタンパク質を発現・精製した。その結果、カイコDNMT1が、ヘミメチル化DNAに対する強いメチル基転移活性を持つが、非メチル化DNAに対しては活性を示さないことを明らかにした。また、カイコDNMT1は、メチル基供与体の有無に関わらず、DNAと多様な複合体を形成すること、メチル基供与体依存的な複合体形成は、亜鉛やマンガンなどの重金属イオンにより促進されることを見出した。一方、カイコDNMT2については活性を確認できなかった。また、DNMT遺伝子を阻害したカイコ培養細胞のRNA-Seqデータを詳細に解析した結果、カイコapterous遺伝子の発現制御、もしくは、スプライシングが影響を受けている可能性が示唆された。カイコインシュレーター候補であるCTCF、CP190についてInsect-two-hybrid systemを用いて相互作用解析を行ったところ、CTCF、CP190間の相互作用が確認された。また、CP190同士での相互作用も見られた。さらに蛍光タンパク質を付加したCTCFとCP190のカイコ培養細胞内での局在を調べたところ、両タンパク質は核内で共局在していることが確認された。また、CP190のN側のBTBドメインのみを有する遺伝子を発現させたところ、CP190、CTCF両方の局在が大きく変化した。CP190のC側のドメインはインシュレーターの局在の調節に重要だと推察できる。また、両遺伝子を阻害したカイコ培養細胞のRNA-Seqを行った結果、いくつかの遺伝子においてmRNAの発現量の有意な変化が見られた。前年度までに昆虫細胞におけるDNAメチル化機構とその制御について、カイコDNAメチル基転移酵素軍の諸性質を明らかにし、DNAメチル化により制御を受ける遺伝子を同定した。本年度は、特に、染色体のループ形成に関与し、染色体を別々のドメインに分割することで、ループ外からのエンハンサー作用や、ヘテロクロマチンの無秩序な広がりを抑えるカイコインシュレーター遺伝子群の構造と機能解析を行った。まず、カイコCTCF、CP190遺伝子に加え、ZW5、BEAD32、FAB8、GAGA遺伝子を同定した。これらのインシュレーター機能を解析するために、エンハンサーブロッキング活性を指標としたインシュレーターアッセイ法の構築を行った。このアッセイシステムのUAS部位に、転写活性化因子GAL4-ADや同抑制因子GAL4-Giantをテザリングするとその転写が増減することから、アッセイ系としては機能することが確認できた。そこで、GAL4-CTCFやGAL4-CP190をテザリングしたところ、上流のエンハンサー活性を40%程度抑制することができたことから、インシュレターとして機能していることが示唆された。次に内在性遺伝子のエンハンサーブロッキング活性を指標としたアッセイ系を構築するために、CRISPRiシステムの導入を試みた。まず、遺伝子抑制システムの構築のためにdCAS9-Giant発現ベクターを構築し、核内15遺伝子を標的とするpU6-sgRNAプラスミドの作製を終了した。その内、アポトーシス抑制遺伝子を標的としたCRISPRiをカイコ培養細胞を用いて行ったが、RNAi法と比較してアポトーシス誘導活性は低かった。CRISPRiによる遺伝子抑制の効率化を目的に、現在、dCAS9-Giant発現ベクターの改良を行っている。本年度の成果として、カイコDNMT1がヘミメチル化DNA特異的にメチル基転移酵素活性を有していることが分かった。この結果は、昆虫で初めてDNMT-1の生化学的特性を示しただけでなく、DNMT-3を持たない生物種においても、DNMT-1は維持型メチル化酵素としての機能を有していることを証明できた。また、DNMT1機能阻害細胞のRNA-Seqデータ解析も順調に進んでおり、Sashimi plot法による解析結果から、今後の研究の進展に不可欠な標的遺伝子を見出すことができた。また、CTCFとCP190が協調して機能していることが示され、またこれらは核内に不均一に共局在していたが、Ago2, Rad21, Rec8など他生物での相互作用が報告されている因子との相互作用は確認されなかったことから、更なる検討が必要であると思われる。CTCFと相互作用すると予想される他のインシュレーターについてもカイコBEAFとModの単離に成功した。

現時点での問題は、CTCFとCP190遺伝子に対するRNAi誘導効率が極めて不安定であることで、これらの機能阻害法の検討が必要である。我々が開発しているSoaking RNAi法は極めて有用でほとんどの遺伝子を効率良く機能阻害できることから、カイコインシュレーター遺伝子群は非常に特異的で、なぜ誘導効率が低いのかについては興味が持たれる。昆虫分子遺伝学DNAメチル化につては、まず、本年同定したカイコapterous遺伝子について、DNAメチル化と遺伝子発現、スプライシングとの関連を解析する。特に、バイサルファイト法を用いて、転写制御領域、遺伝子内部のイントロン領域についてDNAメチル化の有無とDNMT1機能阻害時のメチル化の変化について詳細に解析する。また、カイコDNMT1と2については、機能阻害が細胞増殖にはほとんど影響を与えなかったことから、DNAメチル化部位を認識・結合しDNMTをリクルートする酵素MBDについて構造と機能に関する解析を行う。CTCF、CP190については、これらがカイコ細胞においてインシュレーターとして機能しているか否かを調べるためにUAS-GAL4システムとルシフェラーゼレポーターアッセイを組み合わせたエンハンサーブロッキングアッセイを構築し、解析する。また、CTCF以外の因子についても同様の解析を行う。また、インシュレーター機能阻害タンパク質のRNAi誘導効率の向上に向けて、RNAi関連遺伝子を過剰発現するBmN4SID1細胞を樹立する。
火災臭と生活臭の定性・定量測定に基づくニオイマップの作成

「きな臭いニオイ」などのニオイの変化により、煙や熱の発生より早い段階で火災に気づくことがある。人はニオイを火災発生の判断に使っており、ニオイは火災科学の重要な要因の1つとなっている。これまでに、木材やプラスチック材料が酸化熱分解する際には、ニオイが強くなり、またニオイの質が変化することが明らかとなっている。一方で、室内には調理時や芳香剤などの様々なニオイ(生活臭)があり、ニオイを指標とした火災感知に生活臭が及ぼす影響の範囲は解明されていない。本研究は、ニオイ測定装置を用いて、調理時や芳香剤等の生活空間のニオイを定性・定量時に測定し、木材やプラスチック材料等の酸化熱分解時に発生するニオイとの違いを明らかにする。さらに、ニオイによる火災感知を目指した、生活臭と混同しない火災臭のニオイ基準を作製する事を目的とする。一定のニオイガスを作成することができる、アロマオイルを対象に実験を行った。各種アロマオイルを約1ppm程度のガスに調整し、におい識別装置で測定を行った。また、果物から発生するニオイの計測を行った。果物から発生するニオイは、グレープフルーツなどの外皮のあるものは、外皮と果肉の部分を分け、それぞれ室温(23°C程度)で測定を行った。その結果、アロマオイルの柑橘系のニオイとされているものは、外皮のニオイに高い類似性が見られたことより、ニオイが近いことが分かった。一方で、果肉の部分は花のアロマオイルのニオイに類似性が高く出現した。木材やプラスチック系材料の酸化熱分解時には、アルデヒド系の物質が発生することが明らかとなっている。これらのニオイと室温でのアロマオイルや果物のニオイでは、ニオイの質が異なることが明らかとなった。今回の測定では、ニオイ調整しやすいアロマオイルを用いて測定を行った。今後は洗剤など、身近なニオイの発生源となるものについて検討する必要がある。今年度は、一定のニオイガスを作成することができる、アロマオイルを対象としており、計画通り進んでいる。また、果物やアロマオイルと、火災時に発生する「きな臭いニオイ」は、明らかに異なると感じる。しかし、アロマオイルや果物には、強いニオイがある事から、芳香族系を中心とした物質の混合の可能性が高い。そのため、火災の指標となる可能性が高い、アルデヒド系の物質も含まれている可能性があり、その点に着目して研究を進めてきた。これまで、火災と認識するニオイの測定では、天然高分子材料の木材および合成高分子材料のプラスチック材料を対象に研究を行ってきた。来年度は、食品の調理時のニオイを対象としていく予定であり、野菜や果物の酸化熱分解時のニオイ変化や、肉や魚などのタンパク質を含む材料の酸化熱分解時のニオイに着目した実験を進めていく予定である。
超音波とNMRによる高温超伝導体の磁束ダイナミックス相転移の研究

超伝導体内を伝播する超音波は、これによって引き起こされた磁束運動と結合し、磁束状態を反映した種々の変化が音速と減衰係数に現れる。また、超音波やNMRは、超伝導転移、構造相転移、磁気転移等種々の相転移に対してもそれぞれ特徴ある振舞いが観測され、相転移研究の有力な手段となっている。本研究はLa_<185>Sr_<015>CuO_4単結晶について、結晶格子系のc_<11>、c_<33>、c_<44>、(c_<11->c_<12>)/2モードの超音波の音速と減衰係数の温度依存性を一定磁場中で、磁場方向、磁場強度を変えた測定を行い、独立な3種類の磁束の運動方向すべてについて磁束格子の弾性定数を求めることに成功した。結果は酸化物高温超伝導La_<185>Sr_<015>CuO_4の磁束格子は通常の超伝導体の場合に比し70%軟化していることを見いだした。さらに、その温度依存性をThermally Assisted Flux Flow(TAFF)モデルによって解析し、磁束の各運動方向に対するピン止めエネルギーU_<ij>を導出した.すなわち、結晶のc方向の磁束をa方向に動かすCA motionでU_<CA>(0K,14T)=25K、a方向の磁束をc方向に動かすACmotionでU_<AC>(0K,14T)=972K、a方向の磁束をb方向に動かすAB motionでは、U_<AB>(0K,14T)=201Kと求められた。また、磁場依存性はU_<AC>についてはH^<-0.25>、U_<CA>についてはH^<-1.5>と求められた。この結果は2次元的な磁束構造を大きさの順序はU_<AC>>>U_<AB>>U_<CA>と、U_<AC>がずばぬけて大きいという結果を得、磁束が超伝導のオーダーパラメターの小さな層間にトラップされるという本質的ピン止めの存在を検証した。また、超音波の場合、磁場方向と独立に磁束の運動方向を指定できる利点を生かし、c面から角度θ傾いた磁場配向における本質的ピン止めに有効なピン止めエネルギーU_<AC>(0,θ)を求めた。U_<AC>(0,θ)は予想に反して強いθ依存性を示し、θ30°で約1/10に減少する。特にθの小さいところ角度依存性に対してはU_<AC>(0,θ)=U_<AC>(0,0)(1-2ξ_<ab>tanθ/a_c)で表される強い角度依存性を説明するモデルを提案した。

特にθの小さいところ角度依存性に対してはU_<AC>(0,θ)=U_<AC>(0,0)(1-2ξ_<ab>tanθ/a_c)で表される強い角度依存性を説明するモデルを提案した。
臨床膵島移植成功へのブレイクスルー:NKT細胞を標的にした新規治療法開発

現在の臨床膵島移植では1人の糖尿病レシピエントの治療に23人分のドナー膵臓が必要である。我々は移植早期(24時間以内)に発現する自然免疫拒絶反応による移植膵島破壊がこの問題の本質であると考え、本研究課題を遂行した。その結果、NKT細胞、好中球、炎症性サイトカインが関与する拒絶反応の機序と制御法を明らかにすることができた。本研究成果は臨床膵島移植の成績向上に大きく寄与すると考えられる。膵島移植の現在の最も重要な課題は一人の糖尿病レシピエントの治療成功に2-3回の膵島移植、すなわち2-3人分のドナー膵臓を必要とする事が挙げられる。この問題に関して、先の研究で我々は生着に伴う移植直後の障害に着目し、ナチュラルキラーT細胞が移植膵島障害に必須の役割を担っている事を見出した。更には膵島移植局所(肝臓内)に好中球が集積し、NKT細胞依存性に炎症性サイトカインを産生し膵島障害を惹起していることが明らかになった。本研究では、我々が見出した移植早期膵島障害のメカニズムに基づき、NKT細胞を標的にした、臨床応用可能な移植後膵島障害を制御する新規治療法を開発することを目的にし、以下の結果を得た。#1.NKT細胞機能に関与する血液凝固関連生理活性物質の検索凝固作用あるいは抗凝固作用を有する血液凝固関連生理活性物質がNKT細胞を介した移植後膵島障害を増強あるいは軽減する作用を有するか、マウス膵島移植モデルでスクリーニングを行った。その結果NKT細胞機能を抑制する幾つかの候補物質を見いだした。現在、詳細を解析中である。#2.炎症性サイトカインの役割解析NKT細胞自身が炎症性サイトカインを産生、またNKT細胞依存性に活性化される肝内集積好中球が炎症性サイトカインを産生する事を考慮し、炎症性サイトカインに対す抗体の効果を検討した。その結果、抗インターフェロンγ抗体、抗TNF-α抗体、IL-1β抗体の投与で移植膵島障害が制御でき、マウスでは1匹のドナーより2匹のレシピエントへの膵島移植が実現できた(Transplantation, in press).動物実験で得られたNKT細胞を介した移植膵島障害制御法が臨床応用できるかどうかを検証するために、外科的切除ヒト肝組織より単核球を単離し、NKT細胞を含めた解析を開始した。本研究の目的は臨床膵島移植で現在最も問題となっている移植膵島障害について,その機序を解明し新規治療法を開発することにある。先の我々の研究でNKT細胞が移植膵島障害に必須の役割を担っていることが判明しており,本研究ではNKT細胞を標的にした治療法開発を試みた。平成18年度の研究では血液凝固関連物質がNKT細胞に対し抑制作用を有することが判明し,平成19年度の研究ではその機序,ならびに臨床応用可能な物質を探索した。その結果,移植膵島障害を惹起する新規責任物質の同定に成功した。本物質は膵島移植に伴い,レシピエント血中に増加し,肝臓内に単核球を集積させ,好中球,NKT細胞に直接的に作用し,炎症性サイトカイン産生を増強し,移植膵島を破壊することが判明した。現在,新たに見出され移植膵島障害の機序を標的にした治療法を評価している。サルの実験では予備実験としてサル肝臓よりリンパ球の単離が可能かどうか,その場合はフローサイトメトリーで解析できるかどうかを検討した。その結果,十分に実験ができることが判明し,その方法論をヒトの外科的切除肝臓に応用し,ヒト肝臓リンパ球の解析を行った。その結果,ヒト肝臓内はCD4T細胞が少なく,CD8T細胞が優位であることが判明した。現在,NKT細胞につき解析するとともに,膵島障害を明らかにするin vitroの実験系を構築している。膵島移植の現在の最も重要な課題は一人の糖尿病レシピエントの治療成功に2-3回の膵島移植、すなわち2-3人分のドナー膵臓を必要とする事が挙げられ、今後の膵島移植の発展にはこの問題の解決が必須となっている。先に我々は移植後早期(24時間以内)に発現する移植膵島障害の制御によりone donor to one recipientの膵島移植を達成できることをマウス実験系で明らかにした。その機序としてNKT細胞を介した好中球からのIFN-γ産生により移植膵島が障害されることが判明した。平成20年度研究はその上流経路としてNKT細胞活性化機序の免疫学的メカニズムを明らかにした。その結果、敗血症で致死因子として近年注目されているHMGB1が炎症性サイトカインとして移植膵島障害に必須の役割を担っていることが判明した。特筆すべきは膵島自身が豊富にHMGB1を含有し、そのHMGB1が移植後に移植部位である肝内に放出され、自然免疫(炎症)反応を惹起し、移植膵島を破壊するメカニズムが明らかになった点にある。

今回の知見は今後、臨床膵島移植でone donor to one recipientの達成に向けて、臨床応用可能な新たな移植膵島障害制御法の開発に極めて重要な基盤情報となる。更に前臨床実験としてサルを用いて移植部位の検索を行い、検討中である。また、外科的切除肝臓より単核球を単離し、ヒト肝臓免疫担当細胞の解析を行った。特にHMGB1刺激で各細胞集団がどのように反応するか、現在検討中である。
冷たい暗黒物質モデルにおけるMissing Satellite問題の統計的検証

現在広く用いられている標準的な宇宙論モデルは大局的な宇宙の物質分布を極めてよく再現するが、銀河のような小さなスケールではいくつかの問題が指摘されている。その一つがMissing Satellite問題というもので、天の川銀河の衛星銀河の数が予測される数よりもずっと少ないというものである。現在までこの問題は天の川銀河とアンドロメダ銀河でのみ観測的に検証されているが、本研究ではそれら以外の銀河を多く観測することで、この問題を統計的に検証することを目標としている。
光照射したチオシリケート発光材料におけるEu発光中心の局所状態観察

不完全4f電子殻を有するEuやDy, Er, Ybなどの希土類元素をドープした蛍光体材料は、様々な光源および液晶ディスプレイに利用されている。Euをドープしたチオシリケート(BaSi2S5 : Eu、Ba2SiS4 : Eu)は、高い発光効率の可視光ルミネッセンスを示し、Siを含むのでシリコンフォトニクス材料としても注目されている。本研究では、Eu含有チオシリケートの光照射下におけるEu原子の励起状態と準安定状態における電子配置及びその生成メカニズムを内部転換電子メスバウアー分光と放射光メスバウアー分光を応用して解明する。
共働き家族の住居とライフステージに関する研究

現在、結婚、出産、子供の成長・独立、両親との同居などによる家族のライフステージの変化が1つの住宅でなされることが多いため、その変化に伴って柔軟に住宅の空間構成の組み替えができることが必要である。また女性が結婚後も安心して仕事を続けられるような真の男女共同参画社会を実現するため、今後の住宅では、各家族員が無理なく家事・育児などを分担できるような空間構成が求められる。このような背景から、本研究では、特に結婚後も働く女性を対象とし、住まい方、空間に対する意識、家族観、仕事観などが、ライフステージ、勤務形態などによる影響を受けるかを明らかにすることを目的としている。なお本研究では、ライフステージを乳幼児期(06歳)、学童期(712歳)、学生期(1318歳)、青年期(19歳以上)の4つに分類する。平成14年度は、東京圏に居住する単世帯を対象とし、アンケート調査を実施した。配布数509件、回収数293件、有効回答数225件である。調査内容は、共働き女性の生活の実態(家事・育児の夫婦間における役割分担、家事行為とその使用空間、家事の外部サービス利用など)、家事・育児・仕事に対する意識、現在の住まいへの意見などである。家族属性の概要は平均世帯人数3.86人、平均子供人数1.86人、夫の平均年齢42.7歳、妻の平均年齢40.3歳、長子の平均年齢11.9歳である。本年度は主に夫婦間における家事・育児役割分担に関してライフステージによる分析を行った。その特徴は下記の通りである。1)ライフステージを問わず、夫、妻ともに行っている行為は、掃除関連の行為であり、その割合は8割以上である。その他、特に乳幼児期世帯において、夫が妻同様に育児関連の行為を行う傾向が顕著である。2)食事関連の行為(準備、後片づけ)、洗濯関連の行為は、いずれのライフステージでもほぼ妻が行っている。ただし乳幼児期世帯の夫の場合は、「夕食の後片づけ」(8割弱)をよく行っている。
精神疾患由来幹細胞からの中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)の解析

黒質線条体系ドーパミン神経細胞(A9)及び中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)の分化・誘導に関わる因子のSDIA(Stromal cell Derived Inducing Activity)法を用いて検討した。SDIA法による継代培養にてドーパミン神経細胞による分化・誘導を様々な期間で検討した結果、約3週間にてOtx2とSox6が発現することを見いだした。Otx2とSox6が重複して発現している細胞は認められなかった。SDIA法によるドーパミン神経細胞による培養は約3週間にて黒質線条体系ドーパミン神経細胞(A9)と中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)に分化・誘導されると考えられた。本研究においては最終的にはiPS細胞を用いた解析を行う予定であるが、ヒトiPS細胞の増殖は遅く、得られる細胞数はある程度限定的である。そのため、中脳皮質辺縁系ドーパミン神経細胞への分化誘導の条件の予備検討をまずマウスES細胞で行い、その上でヒトiPS細胞を用いた検討を行う方針に変更した。マウスES細胞をセルバンクより入手し、iPS細胞とは異なる試薬を用いた培養系において継代培養を確認した。分化誘導を抑制する因子であるLIFを自己分泌する組換えSNLフィーダー細胞を用いたマウスES細胞はヒトiPS細胞と比較して増殖速度が速いことから、継代培養等の条件を変更する必要であった。また健常者およびADHD患者由来の複数のiPS細胞を作成し、解析に必要な経代培養を行っている。従来の方法であれば採血後すぐにiPS細胞の作成を開始する必要があったが、それでは患者と研究者のスケジュールの調整が困難であることが少なくなく、症例を増やす上で大きな障害となっていた。しかし、近年、凍結保存した単核球からiPS細胞を高い効率で作成することが可能になったため、症例を順調に増やすべく、凍結保存した単核球からiPS細胞を作成する新たな手法を導入した。研究計画で予定していたヒトiPS細胞は分化誘導実験に用いるには培養実験における種々の条件の制約が大きいことから、より扱いやすいマウスES細胞を用いてドーパミン神経への分化誘導実験にて検討を行う方針に変更したが、マウスES細胞を用いた実験は順調に進んでおり全体的には概ね順調に進展していると思われる。黒質線条体系ドーパミン神経細胞(A9)及び中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)の分化・誘導に関わる因子の検討の比較対象としてES細胞からドーパミン神経細胞を高効率に作成することができるSDIA(Stromal cell Derived Inducing Activity)法を用い、マウス由来のフィーダー細胞であるPA6細胞とES細胞の共培養によるドーパミン神経細胞の作成を行った。SDIA法による継代培養にてドーパミン神経細胞による分化・誘導を様々な期間で検討した結果、約3週間にてOtx2とSox6による免疫染色を行ったところOtx2とSox6が発現することを見いだした。転写制御因子であるOtx2とSox6は、Sox6は黒質線条体系ドーパミン神経(A9)の起始核である黒質緻密部に選択的に発現し, Otx2は中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)の起始核である腹側被蓋野に選択的に発現することが報告されていることから、SDIA法によるドーパミン神経細胞による培養は約3週間にて黒質線条体系ドーパミン神経細胞(A9)と中脳皮質辺縁系ドーパミン神経(A10)に分化・誘導されると考えられた。マウスES細胞から作成したドーパミン神経細胞の性質のキャラクタライズ(中脳皮質辺縁系ドーパミン神経細胞と黒質線条体ドーパミン神経細胞)を行い、その上で、GSK3β阻害薬やLmx1aなど各種転写因子のsiRNAによるノックダウンなどの手法を用いて、中脳皮質辺縁系ドーパミン神経細胞の効率的な作成法を開発する。精神医学研究計画で予定していたヒトiPS細胞は分化誘導実験に用いるには培養実験における種々の条件の制約が大きいことから、より扱いやすいマウスES細胞を用いてドーパミン神経への分化誘導実験にて検討を行う方針に変更したため、次年度使用額が変わった。より扱いやすいマウスES細胞を用いてドーパミン神経への分化誘導実験を実施し、最終的にはiPS細胞を用いた解析を行う計画である。
肝細胞の代謝制御におけるオートファジーの意義-KO細胞の網羅的メタボローム解析

肝細胞の代謝制御に関するメタボローム解析に先立ち、まずは正常肝及び病的肝(脂質代謝異常に基づく脂肪肝・非アルコール性脂肪肝炎・糖尿病など)における再生肝のオートファジーの役割を明らかにした。具体的には、Cre-loxPの遺伝子ノックアウト手法を用いて、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを作成した。その後、同マウスを用いた肝切除後の肝再生を利用して肝細胞の代謝におけるオートファジーの意義について検討を行った。その際、脂肪肝マウスモデルを用いて比較検討を行った。結果として、db/dbマウスはコントロールマウスと比較して、(1)有意に肝切除後の生存率が低く、肝再生率の遅延を認めた。(2)肝再生時における血清ALT値は有意に高かった。(3)オートファゴソーム数は有意に少なく、AP関連タンパク質であるAtg5の発現低下を認めた。以上の結果より、脂肪肝部分切除後においてオートファジーの機能が低下している可能性が強く示唆された。さらに、機能解析の一助としてNrf2と呼ばれる細胞内レドックスの主な制御因子に注目した。Nrf2はantioxidant elements(ARE)の転写因子であり、細胞内代謝の改変によりNADPH産生を亢進させ、細胞内ROSの制御に利用することが知られている。本研究においては、肝癌細胞株を用いた実験系において、肝癌細胞の遊走能はNrf2抑制によって低下し、Keap1抑制によるNrf2活性化で亢進した。さらに、Nrf2抑制によって非接着培養での生存率が低下した他、単細胞からのスフェロイド形成能はNrf2抑制によって低下し、Keap1抑制によるNrf2活性化で亢進する結果であった。以上、本研究は、病的肝の再生時のオートファジーの役割解明につながるとともに、Nrf2-Keap1シグナルとの深い関わりが示唆された。我々は、オートファジーノックアウト細胞の網羅的メタボローム解析によって肝細胞の代謝制御におけるオートファジーの意義を検討する前段階の実験として、まずは正常肝における再生肝のオートファジーの役割を明らかにした。具体的には、Cre-loxPの系を用いて、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを作成した。さらに、70%肝切除時の再生肝を経時的に採取し、肝重量体重比、BrdU取り込み率、細胞周期調節蛋白質CyclinD1の活性、細胞周期S期への移行、血清ALT値などを比較検討することで、オートファジーの役割を明らかにすることができた。結果としてはまず、電子顕微鏡及びウエスタンブロットによる検討によって、正常肝においてオートファジーは術後1日目をピークに高発現していることが判明した。さらに、オートファジーKOマウスにおいて核の増殖能の低下(BrdU取り込み率の低下)、障害蛋白質の蓄積(p62蛋白質の蓄積)、肝機能の低下(AST/ALT値の上昇、血清アルブミン値の低下)を術後早期に認めた。その一因としては、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少、CyclinDの低発現)や、肝組織中ATPの低下、細胞老化(cell senescence)の促進が考えられた。以上の結果より、脂肪肝部分切除後においてAtg5の発現低下によりオートファジー機能が低下している可能性があり、病的肝の再生時のオートファジーの役割解明につながるとともに、さらなる研究課題としてのメタボローム解析によりオートファジーを中心とした肝細胞の代謝制御の検討に役立つ重要な基礎実験となると確信している。上記の通り、正常肝における再生肝のオートファジーの役割を明らかにすることができた。具体的には、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを用いることで、肝再生時にオートファジーが核の増殖能の低下(BrdU取り込み率の低下)、障害蛋白質の除去(p62蛋白質)、肝機能の維持(AST/ALT値、血清アルブミン値)に強く関わることが示された。予想外にも、それらの原因として、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少、CyclinDの低発現)や、肝組織中ATPの低下、細胞老化(cell senescence)の促進が考えられたことが、本研究による新規発見であるとともに、病的肝における再生遅延の機序解明に深くつながると考えられた。我々は、オートファジーの制御を利用した肝再生治療実用化を目的として、まずは正常肝及び病的肝(脂質代謝異常に基づく脂肪肝・非アルコール性脂肪肝炎・糖尿病など)における再生肝のオートファジーの役割を明らかにした。同マウスを用いた肝切除後の肝再生を利用して肝細胞の代謝におけるオートファジーの意義について検討を行った。

Nrf2はantioxidant elements(ARE)の転写因子であり、細胞内代謝の改変によりNADPH産生を亢進させ、細胞内ROSの制御に利用することが知られている。本研究においては、肝癌細胞株を用いた実験系において、肝癌細胞の遊走能はNrf2抑制によって低下し、Keap1抑制によるNrf2活性化で亢進した。さらに、Nrf2抑制によって非接着培養での生存率が低下した他、単細胞からのスフェロイド形成能はNrf2抑制によって低下し、Keap1抑制によるNrf2活性化で亢進する結果であった。以上、本研究は、病的肝の再生時のオートファジーの役割解明につながるとともに、Nrf2-Keap1シグナルとの深い関わりが示唆された。これまでの検討において、上記の通り正常肝における再生肝のオートファジーの役割を明らかにすることができた。具体的には、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを用いることで、肝再生時にオートファジーが核の増殖能の低下(B rdU取り込み率の低下)、障害蛋白質の除去(p62蛋白質)、肝機能の維持(AST/ALT値、血清アルブミン値)に強く関わることが示された。予想外にも、それらの原因として、p21蛋白質に起因する細胞周期の遅延(細胞周期G2やS期の減少、CyclinDの低発現)や、肝組織中ATPの低下、細胞老化(cell senescence)の促進が考えられたことが、本研究による新規発見であるとともに、病的肝における再生遅延の機序解明に深くつながると考えられた。これらの結果をふまえ、今後は正常肝のみにあらず病的肝(特に、大量肝切除後、脂質代謝異常に基づく脂肪肝・非アルコール性脂肪肝炎・糖尿病など)における再生時(肝細胞増殖時)の機能解析の一助としてメタボローム解析を行うことで、オートファジーの役割解明を深く研究するとともに、病的肝における再生率回復を図るための重要な基礎研究を継続していく予定である。肝細胞の代謝制御に関するメタボローム解析に先立ち、まずは正常肝及び病的肝(脂質代謝異常に基づく脂肪肝・非アルコール性脂肪肝炎・糖尿病など)における再生肝のオートファジーの役割を明らかにした。具体的には、Cre-loxPの遺伝子ノックアウト手法を用いて、肝特異的にオートファジー関連遺伝子(Atg5)のノックアウト(KO)マウスを作成した。その後、同マウスを用いた肝切除後の肝再生を利用して肝細胞の代謝におけるオートファジーの意義について検討を行った。その際、脂肪肝マウスモデルを用いて比較検討を行った。結果として、db/dbマウスはコントロールマウスと比較して、(1)有意に肝切除後の生存率が低く、肝再生率の遅延を認めた。(2)肝再生時における血清ALT値は有意に高かった。(3)オートファゴソーム数は有意に少なく、AP関連タンパク質であるAtg5の発現低下を認めた。以上の結果より、脂肪肝部分切除後においてオートファジーの機能が低下している可能性が強く示唆された。さらに、機能解析の一助としてNrf2と呼ばれる細胞内レドックスの主な制御因子に注目した。
イオン液体構成イオンの会合性と溶媒間移行特性の解析

1.イオン液体塩の液液分配:一連の1-アルキル-3-メチルイミダゾリウムイオン([RMelm]+)の塩について,イオン対および構成イオンのジクロロメタン/水間分配定数(K_D)を決定した。陽イオンのK_Dはアルキル鎖長とともに増大し,陰イオンの場合も[BF_4]-<[PF_6]-<[Pic]-<[NTf_2]-の順にモル体積が大きくなるにつれてK_Dが増大した。また,イオン対のK_Dについても,その陽イオン・陰イオン依存性はイオン自身のK_Dの序列と一致した。このようなK_Dのイオン種依存性は,正則溶液論を用いて定量的に説明された。また,サイズの近い[RMeIm]+とテトラアルキルアンモニウムイオン([R_4N]+)とを比較すると,これらのイオンのK_Dはほぼ等しいにもかかわらず,イオン対のK_Dは[RMeIm]+>[R_4N]+であった。これより,[R_4N]+に比べて[RMeIm]+のほうが,水中でのイオン対生成に伴うイオンの脱水和が大きいことが示された。2.低極性溶媒中におけるイオン対の二量化:液液抽出法を用いて,低極性溶媒中における種々のイオン液体のイオン対二量化定数(K_<dim>)を求めた。ジクロロメタン中での[RMeIm][NTf_2]塩のK_<dim>値は,同じ溶媒中で電気伝導度法によって求められたイオン対生成定数(K_IP)に比べて4桁も小さいことが示され,イオン対-イオン対間の相互作用がイオン対を構成する陽イオン-陰イオン間の相互作用よりも著しく弱いことがわかった。また,クロロベンゼン中でサイズの近い8種類の陽イオンの[NTf_2]塩についてK_<dim>を求めた。その結果,陽イオン種によるK_<dim>の変化は,概ねK_IPの変化とは逆の傾向を示した。さらに,K_<dim>の序列はイオン液体自身の粘度の序列に一致することから,イオン対-イオン対間相互作用がイオン液体の粘性に深く関わっている可能性が示された。1.ジクロロメタン中におけるイオン対生成定数:アルキル鎖長の異なる一連の1-アルキル-3-メチルイミダゾリウムイオン(RMeIm^+)およびテトラアルキルアンモニウムイオン(R_4N^+)と数種の陰イオン{PF_6^-,TFSI^-(bis(trifluoromethylsulfonyl)imide),Pic^-(picrate)}との塩について,ジクロロメタン中におけるイオン対生成定数K_<IP,o>(25°C,無限希釈)を,電気伝導度法により決定した。R_4N塩では陽イオンのアルキル鎖長が増すにつれてK_<IP,o>が低下したが,RMeIm塩ではアルキル鎖長の影響はほとんどみられなかった。また,RMeIm塩のK_<IP,o>はR_4N塩の値に比べてかなり大きいことがわかった。このようなRMeIm塩の特徴を考察するため,分子軌道法(DFT法)を用いてイオン対の最安定化構造を計算した。その結果,次のような知見が得られた:(1)R_4N塩の場合は,陰イオンが陽イオンのアルキル鎖の隙間から中心のN原子に近づいており,アルキル鎖長の増大に伴いイオン間距離が長くなる;(2)RMeIm塩では,陰イオンは陽イオンのイミダゾリウム環に接近しており,アルキル鎖長が変化してもイオン間距離はほとんど変化しない;(3)陽イオンと陰イオンの電荷中心間の距離は,R_4N塩よりもRMeIm塩のほうが短い。以上より,ジクロロメタン中でのイオン対生成におけるRMeIm塩とR_4N塩との違いは,静電的相互作用の観点からイオン対の構造に基づいて説明できることがわかった。2.水中におけるイオン対生成定数:水中におけるRMeIm塩及び1-アルキルピリジニウム塩(RPy塩)のイオン対生成定数K_<IP,w>(25°C,無限希釈)を,キャピラリー電気泳動法により決定した。K_<IP,w>の値は,陽イオンのアルキル鎖が長いほど大きく,また陰イオン依存性においても概して嵩高いイオンほど大きくなる傾向が見られた。これはジクロロメタン中でのイオン対生成で見られる傾向とは異なることから,イオンの水和の寄与に帰着された。アルキル鎖長が等しいRMeIm^+とRPy^+のK_<IP,w>値は互いに近く,水中でのイオン対生成においてこれらの陽イオン間の違いはほとんどないことがわかった。

また,サイズの近い[RMeIm]+とテトラアルキルアンモニウムイオン([R_4N]+)とを比較すると,これらのイオンのK_Dはほぼ等しいにもかかわらず,イオン対のK_Dは[RMeIm]+>[R_4N]+であった。これより,[R_4N]+に比べて[RMeIm]+のほうが,水中でのイオン対生成に伴うイオンの脱水和が大きいことが示された。2.低極性溶媒中におけるイオン対の二量化:液液抽出法を用いて,低極性溶媒中における種々のイオン液体のイオン対二量化定数(K_<dim>)を求めた。ジクロロメタン中での[RMeIm][NTf_2]塩のK_<dim>値は,同じ溶媒中で電気伝導度法によって求められたイオン対生成定数(K_IP)に比べて4桁も小さいことが示され,イオン対-イオン対間の相互作用がイオン対を構成する陽イオン-陰イオン間の相互作用よりも著しく弱いことがわかった。また,クロロベンゼン中でサイズの近い8種類の陽イオンの[NTf_2]塩についてK_<dim>を求めた。その結果,陽イオン種によるK_<dim>の変化は,概ねK_IPの変化とは逆の傾向を示した。さらに,K_<dim>の序列はイオン液体自身の粘度の序列に一致することから,イオン対-イオン対間相互作用がイオン液体の粘性に深く関わっている可能性が示された。
ジチオカルバモイル化およびチオホスホリル化の新方法開発

ジチオカルバモイル化及びチオホスホリル化の新方法の開発をめざしジチオカルバモイルスルフェニルハロゲニド及びチオホスホリルスルフェニルハロゲニドの合成を検討した結果、以下に示すような結果が得られた。1.亜鉛ビス(ジチオカルバメイト)及びジフェニルチンビス(ジチオカルバメイト)とN-ハロスクシンイミド(特にN-ブロモスクシンイミド)との反応からは目的とするジチオカルバモイル化剤であるチオカルバモイルスルフェニルブロミドの合成、単離はむつかしいと考えられた。原因はチオカルバモイルスルフェニルブロミドが熱的に極めて不安定な為と考えられた。今後、かさ高い置換基を導入することにより安定なチオホスホリルスルフェニルハロゲニドの合成を検討する。2.0、0′-ジアルキルチオリン酸スズエステルと臭素もしくはN-ブロモスクシンイミドとの反応から親電子性チオホスホリル化剤であるO,O'-ジアルキルホスホリルスルフェニルブロミドが合成できることを明らかにした。得られた0、0'-ジアルキルホスホリルフェニルブロミドは熱的に不安定で単離することは極めてむつかしいとみられたが芳香族誘導体は0°C以下で安定であり親電子性チオホスホリル化剤として十分使用可能と考えられた。今後、熱的安定性がより大きいとみられる芳香族誘導体0、0'-ジアリ-ルホスホロスルフェニルクロリドの合成方法の確立、及びそれらのスペクトルを明らかにすると共に、さらに出発化合物としてスズエステル以外にビス(0、0′ージアリ-ルホスホロイル)セレニド及びテルリド等のハロゲン化についても検討を進める必要がある。
食欲抑制作用を示すN-アシルエタノールアミンの生合成・生理機能解析

N-アシル-ホスファチジルエタノールアミン(N-アシル-PE)は生体膜リン脂質を構成する微量リン脂質として存在しており、脂質メディエーターとして知られるN-アシルエタノールアミンの前駆体として機能する。N-アシル-PEはグリセロリン脂質のアシル基をPEのアミノ基に転移するN-アシル転移酵素によって合成され、最近、細胞質型ホスホリパーゼA2ε(cPLA2ε)がCa2+依存的に同活性を示す酵素として同定された。我々の研究室ではcPLA2εの酵素活性が酸性リン脂質であるホスファチジルセリン(PS)によって上昇することをin vitroで報告していたが、細胞内においても同様に制御されるかは不明であった。これより本研究では、PSを含む種々の酸性リン脂質のcPLA2εに対する効果について細胞レベルで検討した。樹立したcPLA2ε発現細胞においてPSを合成する酵素の発現をsiRNAによってノックダウンすると、抑制の程度に応じてcPLA2εの細胞内含量がタンパク質レベルで有意に減少した。また、共焦点レーザー顕微鏡の解析より、コントロールsiRNAで処理した細胞ではcPLA2εが形質膜や細胞内小胞に局在していたが、PS合成を抑制した細胞ではcPLA2εの細胞内小胞での局在は減少し、主に形質膜に局在していた。精製した組換えcPLA2εに対する種々の酸性リン脂質の効果を検討したところ、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸やホスファチジン酸などはPSと同様にcPLA2εの酵素活性を上昇させた。以上の結果から、cPLA2εは細胞内においてもPSによって制御されており、PS以外の酸性リン脂質も同分子の制御に関与する可能性が示された。申請書に記載した内容の多くは達成でき、おおむね期待していた結果が得られた。しかしながら、一部の研究に関しては、予定していたほどは進まなかった。最近見出した知見を報告できるよう研究を進める。また、予定している研究で着手できていない部分があるので、これについても同様に進める。次年度に使用する予定である。
光合成同化産物の輸送とシグナル伝達の分子機構の解明

高等植物では光合成同化産物はスクロ-スのかたちで各器官間を移動するが、「スクロースの代謝ならびに輸送の機構」には不明の点が多い。また、光合成機能それ自体も糖によってフィードバック制御されているが、その実体、すなわち「糖センサーとシグナル伝達」の機構についても殆ど明らかではない。本研究は、スクロース、グルコースを中心とする光合成同化物質の代謝・輸送またその制御に関わる糖シグナルの認識・伝達機構の解明を目標とした。1.In situ hybridization法によるOsSUT1mRNAの分布を調べ、この遺伝子の発現が維管束篩部伴細胞に局在すること、また糖によって制御されていることを明らかにした。篩部伴細胞特異的なOsSUT1遺伝子の発現についてGUS融合遺伝子を用いた形質転換イネを作製し、詳細に解析した。2.イネ単糖トランスポーターOsMST1-5のうち、とくにOsMST3,5を中心に研究を行った。酵母発現系を用いて糖輸送速度・基質特異性の詳細を解析した。OsMST3は、グルコース以外にも広く単糖の輸送が可能であり、またエネルギー依存型であることを明らかにした。3.等電点電気泳動と新規活性染色法を組み合わせて、イネ胚における6種類のヘキソースキナーゼアイソフォーム(GK1-3,HK1,2,FK1)の同定を行った。酵素化学的解析よりHK1,2が糖センサー候補であるとの知見を得た。4種類のcDNAのうち、OsHxk1のみが糖によるα-アミラーゼ遺伝子(RAmy3D)の転写制御に関与することを証明した。
作業記憶と空間的注意の関係を探る

この研究では、空間的注意制御と作業記憶の関連性について検討することを目的とした一連の実験を行った。作業記憶を測定する検査として、特に視空間作業記憶に焦点を当てた。当初の仮説としては、能動的な制御に関係の深い作業記憶は、内発的注意制御とは関係するが、外部の事象が引き起こす外発的注意制御とは関係しないと考えた。しかし、作業記憶の成績が良い実験参加者ほど、注意の効果量(有効条件と無効条件の反応時間の差)が小さいという結果となった。平成20年度の研究では、注意の個人差と作業記憶の関係を包括的に検討することを目的に、従来の注意研究で用いられてきた複数の能動的注意課題と作業記憶との関連を検討した。実施した課題は、言語性作業記憶(リーディングスパン)課題、Posnerタイプの空間的注意課題(中心手掛法による能動的な注意移動を測定する)、vigilance課題(注意の維持を測定する)、flanker干渉課題(反応と競合する両脇のノイズ刺激による反応時間増加の程度を調べることで干渉の抑制能力を調べる)、それに課題切り替え(複数の課題間で注意を切り替える)であった。これらの相関を予備的に検討してみたところ、空間的注意の効果量(invalid RT-valid RT)と他の課題との間に有意な相関はみられず、これらの能動的注意を必要とする課題が、相互に独立であることが伺えた。唯一、相関が見られたのは、SOAが100msの時の空間的注意機能の程度(invalid RTとvalid RTの差分)とflanker課題でのノイズ刺激とターゲットの間隔が最も広い条件での干渉量が、r=-.33となった点であった。このことは、注意を素早く指示された位置に向ける能力が高いほど、両脇のノイズ刺激からの干渉を受けにくいことを示している。これは、注意の能動的移動能力の個人差を半値井下者と考えられる。ただし、課題切り替えは、装置の不具合でうまくデータが分析できなかったことが反省材料で、この実験は今年度新たに装置及び課題を改良して実施する。実験参加者に対し、Posnerタイプの空間的手がかりを用いた能動的注意課題(凝視点付近に矢印を提示することで、左右いずれに反応刺激が提示されるかを示す)と自動的注意課題(ターゲットが出る位置に置かれた四角の箱の輝度変化により注意を捕捉する)に加え、言語性作業記憶と視空間性作業記憶を測定する課題を課し、2つの作業記憶課題の成績に応じて、中央値により2つの群に分け、空間的手がかりの効果が2つの作業記憶の容量により異なるかどうかを検討した。その結果、能動的注意(内発的注意制御)では、言語性作業記憶の成績と注意の効果量(有効試行と無効試行の反応時間の差分)との間にはr=0.3程度の有意な負の相関が見られた。これは、予想とは異なり、言語性作業記憶の成績がよい被験者では能動的な注意制御はむしろ悪い(効果量が小さい)ことを意味している。これに対し、視空間性作業記憶と能動的注意での効果量との相関は有意ではなかった。また、自動的な注意の制御では、手がかり提示からターゲットの提示までの時間間隔(SOA)が短く注意の捕捉が起こるとされる条件でも、SOAが400ms以上で復帰抑制が起こるとされるSOAでも視空間性作業記憶の成績との間でやはりr=0.3程度の有意な負の相関が見られた。しかし、能動的な注意制御と異なり、言語性作業記憶との関連は見られなかった。ここでも、作業記憶の成績は、むしろ自動的な注意の効果が低いことを示している。同時に実施したStroop課題での反応エラー率と言語性作業記憶の成績が相関したことから伺える。Stroop作業でのエラー率は、作業記憶の高い実験参加者ではこれが低い実験参加者に比べて少ないことが先行研究から、また我々の以前の研究からも明らかになっている。従って、上記の空間的注意課題との相関が今回の課題や実験参加者に特異的な結果ではないものと思われる。作業記憶の個人差がStroop課題のような干渉課題の成績に関係することはよく知られているが、脳の制御システムとしては干渉課題に関わる能動的注意機能と空間的注意制御は別だとされ、空間的注意機能と作業記憶の関係はそれほど明確ではない。本年度は、この点を直接明らかにすることを目指して、作業記憶課題と空間的注意機能を調べる2つの課題(自動的注意制御と能動的注意制御課題)を同一実験参加者に対して行い、作業記憶の成績により高群と低群に実験参加者を分けた上で分析した。作業記憶課題としては、視空間課題とリーディングスパンを用いた言語性課題を用いた。事前の予想としては、視空間課題により測定した作業記憶は、空間的注意機能と同じく空間内の対象の位置に関わる処理を行っていることから、空間的注意の成績、特に有効条件と無効条件の反応時間の差を指標とする注意の効果量と関係すると考えた。

これに対し、言語性作業記憶は、流動性知能と関連するとされていることもあり、その個人差は、反応時間(これは情報処理の効率を反映すると考えられる)と関連がある可能性はあるかもしれないが、空間的注意機能とは独立であろうと予想した。得られた結果からは、自動的注意制御は視空間作業記憶とも、また、言語性の作業記憶とも関係しなかった。さらに、能動的注意制御でも、空間的作業記憶と空間的注意制御の間には関係がみられなかった。これに対し、言語性の作業記憶では、能動的注意制御での効果量が小さいという結果が得られた。これは、言語性の作業記憶の高い実験参加者は、相対的に低い実験参加者に比べ、より柔軟に注意制御ができるため、無効な手がかりにより影響されにくいためだと解釈された。以上の結果から、当初の予想とは異なり、空間的注意機能は作業記憶課題の性質によらず、作業記憶の成績からは予測されないことが判明した。
中世顕密寺院における役行者伝の包摂と正統化についての研究

中世における役行者伝の正統化という汎宗派的現象を、それを撰述あるいは所持した顕密寺院の活動と論理に照らして解明、評価するという目的で、3年間研究を進めてきた。本年はその最終年度にあたる。当初の計画では、最終年度は、研究成果の学術図書や学術雑誌への公表に重点を置く予定であったが、現状では、上記の議論が国際的に共有される方策を優先すべきだと判断してそちらに重点を移し、米国の大学で開催された国際研究会議、セミナー等で招待講演や研究発表を計3度行った。とりわけ、国際研究集会「灌頂の世界」(2019.5.7-8、カリフォルニア大学サンタバーバラ校)での発表と議論はきわめて有益で、どのような論理と方法で役行者伝の正統化が進められたのかを解明するための核心的なアイデアを得ることができた。すなわち、至聖の霊山である大峯で灌頂の儀礼が行われたのは南北朝時代以降であったが、平安時代後期から鎌倉時代後期にかけて、日本仏教の一道として修験から修験道が成立する過程で、修験の正統性を保証するために、修験が密教の付法・灌頂と連関あるいは連結することが、種々の論法でくりかえし主張された。そのひとつとして、平安時代以降、役行者の事績のいくつかがそれと深く関わると主張されたが、鎌倉時代後期までには、密教の付法・灌頂との連関・連結に関する主張のほとんどが、修験の祖師として崇拝されていた役行者の事績に結びつけられた。中世における役行者伝の正統化という現象の主な筋道は、以上のように説明できると考えた。なお、上記国際研究集会の成果は、開催校の教授により英文の学術雑誌として米国で刊行される予定である。中世における役行者伝の正統化という汎宗派的現象を、それを撰述あるいは所持した顕密寺院の活動に照らして解明、評価するという目的を達成すべく研究を始め、3年計画の初年度をおえた。初年度は、役行者の伝記、特に役行者が夢中で密教の灌頂を受けたと説く『箕面寺縁起』(承安三年1173以前撰述)の基礎研究に重点をおくと同時に、この研究成果を国際的な議論の場で報告し議論するための準備を進めた。まず、『箕面寺縁起』の基礎研究については、宮内庁書陵部蔵の原本に基づいて本文を確定し、可能な限り精確に句読点を打つところまで達したが、その成果は注釈作業をおえた後に一括して公表する予定である。また、かつて英語で公表した『箕面寺縁起』に関する概括的な論考(JJRS42-1、平成27年)の内容を見直し、日本語で公表した(就実表現文化11、平成29年)。これによって、日本文学、歴史学、宗教学等の学界で、『箕面寺縁起』に関する基礎的な情報と評価を共有できるようになり、国内における研究展開の足場を固めた。次に、国際的な議論の場での報告と議論については、日米の研究者を中心に、複数の研究領域から多角的に修験道研究のありようを見直す国際研究集会「REPOSITIONING SHUGENDO ーLITERATURE,HISTORY, ART, AND NETWORKSー」(平成29年6月19-20日、カリフォルニア大学サンタバーバラ校)を共催する準備を進めてきた。研究代表者が日本側のコーディネーターを務めるとともに、研究代表者・分担者がそれぞれ『箕面寺縁起』について報告する予定である。『箕面寺縁起』に関する研究は当初の計画通り進展しているが、関連する役行者の伝記や図像の研究は予定よりもやや遅れている。また、平成29年度の国際学会・研究集会などでの成果発表については、当初の案と異なるが、当初の案よりも充実した報告と議論の場を確保できた。中世における役行者伝の正統化という汎宗派的現象を、顕密寺院の活動に照らして解明、評価するという目的を達成すべく研究を進め、3年計画の2年目をおえた。2年目の計画の中心は、1年目に行った『箕面寺縁起』の基礎研究の成果を踏まえて、修験道の歴史と文化に関する国際研究集会を開催することであった。2017年6月19-20日、米国カリフォルニア大学サンタバーバラ校主催、本科研の共催というかたちで、同大学で国際研究集会「Repositioning Shugendo -New Research Direction on Japanese Mountain Religions-」(修験道の再配置)を開催した。本科研のメンバーのうち川崎が共同コーディネーター(全4名)を務め、川崎と仁木が発表した。報告者は14名で、うち日本研究者が6名、欧米研究者が8名であった。日本と欧米の間で修験道史研究の成果を共有すると同時に、新たな研究の方向性について議論した。この成果を学術雑誌として出版すべく、主催校の関係者が準備を進めている。また個別の成果では、『箕面寺縁起』について、仁木が、平安後期成立の幼学書『仲文章』により作文された本文のあること、作文のレベルが当代一級の学者や高僧には及ばないことを指摘した点が重要である。これに刺激を受けた他の研究者によって、平安・鎌倉期における『仲文章』受容の再検討も始まっている。これらの指摘は、同縁起の撰述に関する従来の推測、すなわち高度な知識をもつ高僧による作文という推測を覆す可能性があり、同縁起の成立事情について再検討が迫られている。