hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カンキツ園の土壌管理における樹皮およびおがくずの利用に関する研究

1.樹皮中の抑制物質の消失による堆肥化促進について樹皮やおがくずを短期間で良質な堆肥にできるようにするために、カラタチの生育を阻害するフェノ-ル物質や縮合性タンニンを多量に含むヒノキ樹皮を用いて、これらの抑制物質を除去する方法について調査した。抑制物質の除去方法としては、(1)木材腐朽菌の利用、(2)酸処理、(3)アルカリ処理、(4)熱分解、を用いた。その結果、(1)におけるトリコデルマ、カワラタケ、スエヒロタケ、カイガラタケなどの菌ではヒノキ樹皮の腐朽は難しかった。また、(2)の酸処理でもヒノキ樹皮中の抑制物質を除去できなかった。しかし、(3)および(4)による方法では樹皮中の生育阻害物質を消失させることが可能であった。特に、(3)における生石灰(0.1%)、消石灰(0.1%)および水酸化ナトリウム(0.01N)溶液での除去方法は非常に有効であり、これらで処理したヒノキ樹皮のマルチングはカラタチやカンキツ樹の生育に悪影響を及ぼさなかった。今後、実用化に向けての研究を進める必要がある。2.樹皮およびおがくずによる炭の作製とそれらの効果について樹皮やおがくずを炭にすれば、抑制物質の問題は解消される。そこで、数種類の樹皮炭やおがくず炭を作製して無機分析を行うとともに、これらの炭施用がカンキツ樹の生育、養分吸収、並びにVA菌根形成に及ぼす影響も調査した。その結果、いずれの炭もpHが高く(pH8程度)、P、Kなどの無機養分を含んでいた。外材(米ツガ樹皮など)の炭では塩分が含まれており、ECが高かった。いずれの炭施用(2トン/10a相当まで)においてもカンキツ樹の生育、養分吸収、並びにVA菌根形成が良好となった。特に、土壌中のリン含量を少なくした処理区においても炭施用区では葉内のリン含量は高かった。しかし、4トン/10a相当になると樹の生育が阻害される傾向がみられた。
沿岸域における細粒懸濁物の動態解明に基づく物質循環像の新展開

沿岸域の潮汐や水温塩分の鉛直分布など、沿岸域に特徴的な物理現象をシミュレート可能な3次元流動モデルに、細流土砂の輸送プロセスを模擬するための新たなシミュレーションモデルを結合した。モデルの再現性の検証には、観測結果に加えて、細流土砂の影響を強く受ける、放射性セシウムの分布についての観測結果を用いて、検証した。最終的には、沿岸域の細流土砂の輸送シミュレーションを行った、これにより河川からの流入の影響や、温暖化に伴う、細流土砂の輸送の変化、また細流土砂の輸送に伴う生態系への影響の把握を行い、細流土砂を含む沿岸域の物質循環を定量的に明らかにした。本研究においては、新たな細粒懸濁物のためのモニタリングシステムを開発し、これによる観測網を構築・運用することで、細粒懸濁物について、これまでよりも詳細な情報を得ると同時に細粒懸濁物に関連した物質循環メカニズムを解明することを目的としている。本年度はモニタリングシステムの開発の一環として、長期運用可能なインターバルカメラを開発して、これを実海域において運用した。インターバルカメラについては、長期間小さな電力で安定的な撮影をするためのシステムを構築した。また、レンズにマクロレンズを使用することで、画角の向上につとめた。これらを海底に長期間設置すると、機器の錆が問題となるため、ケースについても、新たにアクリルを用いて開発した。アクリルケースは、2重のOリングと、シリコンによって防水性を高めた。さらに窒素を充填することで、防錆性を高めた。また通常の単2電池で動作するようにすることでメンテナンス性も高めた。海底で長期間の撮影をする上では、生物付着による画像の劣化も問題となるが、これを解決するために、ワイパーシステムを新たに開発した。ワイパーには当初、潮汐流を利用して回転するスクリューのような形状のものを利用したが、それでは生物付着を防止する能力が弱く、画像に写り込む場合もあったため、サーボーモーターを用いた、自動車のワイパーと同様の形式とすることで、生物付着を長期間防ぐワイパーシステムを構築した。これら一連の改良をしたシステムについて実海域において検証している。本年度はモニタリングシステムの開発の一環として、長期運用可能なインターバルカメラを開発して、すでにこれを実海域において運用しており、概ね順調に進展している。一方で、インターバルカメラを実際に運用する上では、当初の予想よりも生物付着による画像の劣化が問題となったため、新たにこれを解決するためのワイパーシステムを開発し、生物付着を長期間防ぐシステムを構築した。このシステムを現在実海域にて検証している。本年度は病気療養中のため、進捗は少なかったものの、機器開発において大きな進展があった。申請当初は水中インターバルカメラを作成し、細粒土砂を海底で記録する予定であったが、新たに開発した浮力式鉛直移動装置により、水柱全体において細粒土砂を記録することが可能になった。次年度にこの新規開発機器を現地で利用することで、細粒土砂について、有用で新しい知見が得られるものと期待される。次年度にこの新規開発機器を現地で利用することで、細粒土砂について、有用で新しい知見が得られるものと期待される本研究では新たに水中インターバルカメラシステムを開発して、これにより得られた画像の解析結果から、細流土砂の濃度や粒径の時間変化をモニタリンクした。開発した水中カメラシステムは、河川河口の河床や、沿岸域の海底に設置して、長期間連続でこれを運用することて、細流土砂に関する測定結果を蓄積する。さらにこれらを流速や水質の測定結果を組み合わせることで、細流土砂の輸送を高い頻度でモニタリンクすることを可能にして、河川から沿岸への急激な細流土砂の輸送過程や、それらの沿岸における輸送過程を明らかにすることを目的した。初年度に水中カメラを開発して、これを比較的アクセスの容易な河口部に設置することでモニタリングシステムの開発およびシステムの改良を行った。これら2年間の観測から、すでに観測結果が蓄積されていることから、これらの結果の解析や、細流土砂の輸送プロセスをモデル化することに重点を置いた。具体的には、沿岸域の潮汐や水温塩分の鉛直分布など、沿岸域に特徴的な物理現象をシミュレート可能な3次元流動モデルに、細流土砂の輸送プロセスを模擬するための新たなシミュレーションモデルを結合した。細流土砂については、河口からの流入および河床や海底での巻き上げなどについて、現地観測結果に基づいてモデル化を実施した。モデルの再現性の検証には、上記の観測結果に加えて、細流土砂の影響を強く受ける、放射性セシウムの分布についての観測結果を用いて、検証を行う。最終的には、開発したシミュレーションモデルを用いて、沿岸域の細流土砂の輸送シミュレーションを行った、これにより河川からの流入の影響や、温暖化に伴う、細流土砂の輸送の変化、また細流土砂の輸送に伴う生態系への影響の把握を行い、細流土砂を含む沿岸域の物質循環を定量的に明らかにした。

最終的には、沿岸域の細流土砂の輸送シミュレーションを行った、これにより河川からの流入の影響や、温暖化に伴う、細流土砂の輸送の変化、また細流土砂の輸送に伴う生態系への影響の把握を行い、細流土砂を含む沿岸域の物質循環を定量的に明らかにした。本年度はモニタリングシステムの開発の一環として、長期運用可能なインターバルカメラを開発して、すでにこれを実海域において運用しており、概ね順調に進展している。さらに今後は、カメラとして画像を保存するだけで無く、ビデオを保存できるように改良することで、現象の時間変化をより詳細に観測できるように工夫することが望まれる。今後は、水柱鉛直撮影装置を高精度化すると同時に、この新規開発機器を現地で利用することで、細粒土砂について、有用で新しい知見が得られるものと期待される。沿岸環境病気療養中のため、次年度使用額が生じたこと。機器開発で多額の出費となるため、次年度に使用を集中させることとした。機器開発により多額の出費が予想され、十分に利用可能である。
ラット内耳に発現するKCNE/KCNQカリウムチャネルの構造・機能解析

1)ラット内耳におけるKCNE/KCNQカリウムチャネルの構造解析生後4-6週齢のラットを用いて、免疫染色法やin situ hybridization法を中心とする形態学的な解析により、KCNE1の蝸牛血管条での発現とKCNE3の内リンパ嚢での発現を確認した。また、ラット内耳より抽出したmRNA・cDNAを用いて、RT-PCR法やreal time PCR法などの分子生物学的な手法により、内耳に発現するKCNE/KCNQカリウムチャネルの各サブユニットを検討した。その結果、蝸牛ではKCNE1-3、内リンパ嚢ではKCNE3の発現を確認した。2)メニエール病ゲノム中のKCNE/KCNQカリウムチャネル遺伝子の解析厚生省前庭研究班の診断基準からみたメニエール病確実例から、十分なインフォームド・コンセントの後、ゲノム抽出を行った。KCNE1/KCNE3カリウムチャネル遺伝子の塩基配列から、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを作成してPCR法によりその蛋白コード部分の全長を増幅し、増幅された遺伝子断片を回収の後、直接シークエンス法によりその塩基配列を決定し遺伝子変異の有無と遺伝子上の一塩基置換(SNP)について解析を行った。その結果、KCNE1遺伝子上に、112Gホモ、112Aホモ、112G/Aヘテロの3種類の遺伝的バリエーションを、KCNE3遺伝子上に198Tホモ、198Cホモ、198T/Cヘテロの3種類の遺伝的バリエーションを同定した。メニエール病確実例63例では、KCNE1遺伝子の1112Gホモが28例、112Aホモが8例、112G/Aヘテロが27例であった。非メニエール病群237例では、112Gホモが192例、112Aホモが20例、112G/Aヘテロが25例であった。112Aを少なくとも一つのアリルに有する割合は、メニエール病群において統計学的に有意に高かった(P<0.001)。メニエール病確実例63例では、KCNE3遺伝子の198Tホモが52例、198Cホモが3例、198T/Cヘテロが8例であった。非メニエール病群211例では、198Tホモが196例、198Cホモが4例、198T/Cヘテロが5例であった。198Cを少なくとも一つのアリルに有する割合は、メニエール病群において統計学的に有意に高かった(p=0.0015)。1)ラット内耳におけるKCNE/KCNQカリウムチャネルの構造解析生後4-6週齢のラットを用いて、免疫染色法やin situ hybridization法を中心とする形態学的な解析により、ラット内耳に発現しているKCNE/KCNQカリウムチャネルの発現およびその局在する部位を検討した。

その結果、KCNE1の蝸牛血管条での発現とKCNE3の内リンパ嚢での発現を確認した。また、ラット内耳より抽出したmRNA・cDNAを用いて、RT-PCR法やreal time PCR法などの分子生物学的な手法により、内耳に発現するKCNE/KCNQカリウムチャネルの各サブユニットを検討した。その結果、蝸牛ではKCNE1-3、内リンパ嚢ではKCNE3の発現を確認した。2)メニエール病ゲノム中のKCNE/KCNQカリウムチャネル遺伝子の解析厚生省前庭研究班の診断基準からみたメニエール病確実例から、十分なインフォームド・コンセントの後、静脈血を採取してゲノム抽出を行う。KCNE1/KCNE3カリウムチャネル遺伝子の塩基配列から、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを作成してPCR法によりその蛋白コード部分の全長を増幅し、増幅された遺伝子断片を回収した後、直接シークエンス法によりその塩基配列を決定して遺伝子変異の有無と遺伝子上の一塩基置換(SNP)について解析を行った。その結果、KCNE1遺伝子上に、112Gホモ、112Aホモ、112G/Aヘテロの3種類の遺伝的バリエーションを、KCNE3遺伝子上に198Tホモ、198Cホモ、198T/Cヘテロの3種類の遺伝的バリエーションを同定した。遺伝子上に同定される一塩基変異(single nucleotide polymorphisms;SNP)とメニエール病の発症およびその臨床症状との相関を検討する目的で、同患者ゲノムにおけるKCNE1、KCNE3遺伝子のSNP解析を行った。メニエール病確実例63名および非メニエール病者(対象群;KCNE1遺伝子については237例、KCNE3遺伝子については211例)から抽出したゲノムにおいてそれぞれのSNPがどのような比率で存在するのかを決定した。[KCNE1遺伝子]メニエール病確実例63例の解析において、112Gホモが28例、112Aホモが8例、112G/Aヘテロが27例であった。非メニエール病群237例においては、112Gホモが192例、112Aホモが20例、112G/Aヘテロが25例であった。112Aを少なくとも一つのアリルに有する割合は、メニエール病群において統計学的に有意に高かった(P<0.001)。[KCNE3遺伝子]メニエール病確実例63例の解析において、198tホモが52例、198Cホモが3例、198T/Cヘテロが8例であった。非メニエール病群211例においては、198Tホモが196例、198Cホモが4例、198T/Cヘテロが5例であった。198Cを少なくとも一つのアリルに有する割合は、メニエール病群において統計学的に有意に高かった(p=0.0015)。KCNE1遺伝子上の112ASNPおよびKCNE3遺伝子上の198CSNP、これら2種類のSNPがメニエール病の発症に何らかの遺伝的背景を与える可能性が推察される。
3次元知能メディアの部品アーキテクチャに基く科学技術計算可視化仮想実験環境の構築

本研究は、シミュレーション実験の対象となる物理空間の構成要素や場をすべて可視的オブジェクトで表現することにより、以下の3点を可能にする仮想実験環境のジェネリックなシステムアーキテクチャを開発した。(a)可視的オブジェクトで表現された物理空間の構成要素や場を組み合わせることによる物理空間のモデリング(b)シミュレーション中におけるこれらの要素や場に対する直接操作(c)シミュレーション結果のこの空間への重畳表示このようなシステムの実現により、目視による観察や直接操作が不可能な物理現象を、直接目視しながら直接操作することによって、実験調査できるだけでなく、実験空間の定義構築も行うことができるようになった。プログラムはすべて、構成要素や場を表す可視的オブジェクトと、シミュレーション結果を重畳表示するオブジェクトに分散して定義され、これらのオブジェクトが仮想実験環境を構築するコンポーネントとなる。計算エンジン部もそのプロクシ・オブジェクトをこの環境のコンポーネントとすることにより、直接操作の対象となる。応用として、携帯電話のアンテナが生成する電磁場と筐体表面の電流のシミュレーションを実例にして、ローレンス・リバモア研究所で開発された電磁場解析ソルバNEC2を高性能計算サーバ上で動作させシミュレーション・エンジンとして用い、中間にAVS、フロントエンドにはIntelligentBoxを用いて、科学技術計算可視化システムの実例を開発した。(1)知能メディアによる科学技術計算可視化モデュールの部品化アーキテクチャの確立とシステム開発(田中譲)・科学技術計算の可視化において標準的ツール・システムの一つであるAVSで定義される個々のプログラム・モデュールに対し、プロクシ・ボックスをIntelligentBox内に定義し、プロクシ・ボックスの画面上での合成によって、AVSのプログラム・モデュールの合成を行い、科学技術計算プログラムも可視化プログラムも、さらには両者の連携もすべてが、これらプロクシ・ボックスを画面上で直接操作して合成することによって定義できるシステム・アーキテクチャを研究開発した。・さらに、各種の物理シミュレーション問題において、プログラムのモデュール分解と、その実験環境の構成要素への分解との整合性が常に保証できるモデュール分解法を研究開発した。(2) 3D知能メディア・システムの拡張(岡田義広)・(1)の方針に従い、AVSとの連携に必要なAPIの抽出と実現を行い、IntelligentBoxを機能拡張し、これらを3次元グラフィック・ワークステーション上に開発した。(3)科学技術計算可視化システムの実例への応用(赤石美奈)・電磁場のシミュレーションを実例にして、プログラムのモデュール分解と、その実験環境の構成要素への分解との整合性が常に保証できるモデュール分解法を研究開発した。(4)仮想実験環境のマン・マシン・インタフェースの開発(林世紀)・(1)の方針に従い、(2)(3)の成果を用いて、インタラクティブな3D仮想実験環境のマン・マシン・インタフェースを研究開発するとともに、システムの統合アーキテクチャを明らかにした。応用として、携帯電話のアンテナが生成する電磁場と筐体表面の電流のシュミレーションを実例にして、ローレンス・リバモア研究所で開発された電磁場解析ソルバNEC2を高性能計算サーバ上で動作させシミュレーション・エンジンとして用い、中間にAVS、フロントエンドにはIntelligentBoxを用いて、科学技術計算可視化システムの実例を開発した。
実験用ミニブタを用いた脳梗塞モデルの開発ならびに再生医療研究への応用

本研究では、1年目にラクナ梗塞モデルを完成させ、2年目にそのモデルを再生医療への応用を検討する事を目標とした.ミニブタラクナ梗塞の作製に成功し,その応用への前段階としてGFP遺伝子導入ブタの脳内におけるGFP発現を確認した.また,脳細胞の増殖部位確認も個体レベルで確認し,再生医療への応用に大きく踏み出した.本研究では、1年目にラクナ梗塞モデルを完成させ、2年目にそのモデルを再生医療への応用を検討する事を目標とした.ミニブタラクナ梗塞の作製に成功し,その応用への前段階としてGFP遺伝子導入ブタの脳内におけるGFP発現を確認した.また,脳細胞の増殖部位確認も個体レベルで確認し,再生医療への応用に大きく踏み出した.齧歯類とヒトでは脳の組織学的組成が大きく異なる。すなわち、脳組織は神経細胞体が多数を占める灰白質と神経線維が多数を占める白質によって構成されるが、その灰白質と白質の比や、脳溝(脳の皺)の有無などが大きく異なる。これら基本的な脳組織の相違に起因して、これまで齧歯類を用いて得られた実験結果がヒト、特に医療現場では齧歯類同様の結果を得られなかった可能性がある。そこでこれまでに中大脳動脈梗塞モデルを作製し、ブタの脳梗塞モデルがヒトの疾患モデルとして非常に有用である事を明らかにした(J Neurosurg.2006 104(2 Supp1):123-32)が、今後の再生医療への応用を鑑みた場合、より臨床に即したラクナ梗塞モデル作製の必要がある。そこで、初年度は、疾患モデルとしてブタのラクナ梗塞モデル作製を群馬大学脳神経外科学と共同で試み、疾患モデルとしての有用性を検討した。前脈絡叢動脈を閉塞させる事で疾患モデルの作製を試み、病理学的な類似性だけでなく白質障害により運動障害が起きる事や、梗塞時間により可逆あるいは不可逆的な変化になるなど、臨床的に非常に重要な事柄が明らかにした(Stroke.2008Jan;39(1):205-12)。従って、今年度は計画通り、このモデルを利用し、再生医療への応用を検討する。また脳障害に伴う運動障害をより明確に検出するため、データロガを搭載した加速度計を体表に固定し、ケージ内でブタの動きに伴う3次元での加速度変化の範囲を調べた。その結果、ブタの動きに伴う加速度変化の記録が可能ではあるものの、十分な解析のためには最大4Gの測定範囲をもつ加速度計が必要と考えられた。以上の通り、疾患モデルの病理学的評価はもとより、臨床症状の客観的評価も整いつつある。本年度は最大目標である再生医療への応用へ研究の最終毅階へ予定通り進める。本研究では、1年目にラクナ梗塞モデルを完成させ、2年目の今年はその疾患モデルを応用する事を目的とし、以下の4つの目標を立てた。その目的と到達度を以下に記す。1.GFP遺伝子導入ブタからの脳神経前駆細胞の回収ならびに分化・増殖のコントロール2.ミニブタからの骨髄採取及び培養・増殖3.ミニブタ脳梗塞モデルを用いた移植医療研究4.ミニブタ脳梗塞モデルの脳ならびに行動の解析まず初めに、本学解剖学講座の平尾助教に御協力頂き、まず静岡県畜産技術研究所の河原崎氏らが作製したGFP遺伝子導入ブタを御提供頂き、神経組織におけるGFP発現に関して調べた結果、嗅上皮においては嗅細胞や支持細胞、ボーマン腺ならびに嗅神経に発現が認められた。また、ブロモデオキシウリジン(BrdU)や各種抗体を用いて免疫染色を行った結果、未分化な前駆細胞から成熟した嗅細胞においてGFPを発現しているのが確認された。また、共同研究者の齋藤らは、脳細胞が分裂能を残していると思われる生後2週齢のブタにBrdUを腹腔内投与した結果、脳室周囲(SVZ, Subventricular Zone)ならびに海馬の歯状回神経細胞層より更に内側にある小型の細胞においてBrdUが確認された事から、これらの細胞が再生治療のために有用である事が示唆された。なお、後者の小型細胞に関して、更に精査している。以上の結果から、本GFP遺伝子導入ブタが脳梗塞モデルを用いた再生医療研究に有用である事が確認された。4つの目標のうち1つ目はクリア出来たものの、回収したSVZ周囲の細胞および骨髄細胞の培養および分化・増殖のコントロールが困難を極めた。詳細な原因は現在でも不明であるが、ブタはマウスやラットと異なり頭蓋骨が厚い。従ってSVZ周囲の細胞を回収するまでに時間を要するため、回収段階で細胞の活性が失われている可能性がある。それ以外にも、培養条件なども検討中である。本研究では2年という短期間に多くの目標を掲げたが少々消化不良の感は否めない。しかしながら、有用なミニブタ疾患モデルが完成し、GFP遺伝子導入ブタの入手と共に、移植細胞の候補選定も目処を付ける事が出来た事から、本研究で今後の研究基盤が整える事が出来た。
蛋白質の折れ畳み過程を追跡するための高速分光システムの開発

蛋白質の折り畳み過程を詳しく観察することで、蛋白質アミノ酸配列から折り畳み構造を予測するための手がかりを得ることを目的として、以下の装置開発を行った。1)蛋白質の折り畳み過程を開始するための高速の溶液混合装置の開発。石英板の間にミキシングプレートを挟み込むデザインのセルを開発し、約50マイクロ秒の溶液混合時間を、再現性良く達成することに成功した。このセルは、各種の分光測定が容易であるという特徴も持っている。2)高速の時分割CD測定装置の開発。蛋白質の二次構造の成長を観察するために、CDスペクトルの測定装置の開発を行った。高いスループットをもつプリズム分光器を開発し、光学遅延板を使ったCD測定を行った。開発した装置を使って、標準試料のCDスペクトルを測定することに成功したが、ミキシングセルと組み合わせることには成功していない。セルの光学歪みをできるだけ減らす工夫が必要である。以上の装置開発をもとに、以下の研究成果をあげた。1)シトクロムcの折り畳み過程の時分割X線小角散乱の測定。開発した溶液混合セルを用いて、シトクロムcの折り畳み過程の時分割測定を行った。シトクロムcが、二次構造とコンパクトさを同期させて折り畳みを進めることを明らかにした。2)ポリグルタミン酸のコイルヘリックス転移過程の観察。蛋白質を構成する基本構造であるヘリックスが形成する過程を、開発した溶液混合装置を使って追跡した。測定の結果、コイルヘリックス転移には、いったん形成した短いヘリックス構造が、連結して長いヘリックスを作る過程があることを新しく明らかにした。3)アポミオグロビンの折り畳み過程の時分割測定。アポミオグロビンは7本のヘリックスを持つ蛋白質である。これらのヘリックスが段階的に形成する様子を、時分割測定により明らかにした。本研究では,蛋白質の折り畳み過程を追跡するための実験装置の開発を行なう。特に,蛋白質の三次構造形成をモニターするために有効である近紫外域のCDスペクトルを,感度よく検出するための新しい分光器を開発する。今年度の成果を以下に説明する。1)分光効率高いプリズム分光器の開発。微弱なCD信号を検出するために,分光効率が高く,迷光の少ない分光器を開発する必要がある。そのため,本研究ではオフプレーンプリズム・フラットフィールド分光器という新しいデザインの分光器を新しく設計・開発を行なった。2)上で設計したプリズム分光器に,光のマルチチャンネル検出を可能にするCCD検出器を取りつけ,分光システムの製作を完成した。また,CDスペクトルの測定を行なうための光学素子として,ベレック板と呼ばれる偏光回転板を使うことにした。3)高速の溶液ミキサーの開発。折り畳みの初期過程を観察するために,高速の溶液ミキサーが必要である。本研究では,従来のミキサーに改良を加え,溶液混合時間を約200μ秒から,約50μ秒にまで短縮した。以上の努力により,今年度は,従来に無い非常に明るい分光装置の開発に成功した。来年度は,開発した分光システムと溶液ミキサーを組み合わせて,CDスペクトルの測定とそれに伴う問題点の解決を行なう。装置開発が完成した時点で,シトクロムcやアポミオグロビンなどの蛋白質系での測定を行なうことを目的とする。

このセルは、各種の分光測定が容易であるという特徴も持っている。2)高速の時分割CD測定装置の開発。蛋白質の二次構造の成長を観察するために、CDスペクトルの測定装置の開発を行った。高いスループットをもつプリズム分光器を開発し、光学遅延板を使ったCD測定を行った。開発した装置を使って、標準試料のCDスペクトルを測定することに成功したが、ミキシングセルと組み合わせることには成功していない。セルの光学歪みをできるだけ減らす工夫が必要である。以上の装置開発をもとに、以下の研究成果をあげた。成果の幾つかはすでに論文発表を行った。1)シトクロムcの折り畳み過程の時分割X線小角散乱の測定。開発した溶液混合セルを用いて、シトクロムcの折り畳み過程の時分割測定を行った。シトクロムcが、二次構造とコンパクトさを同期させて折り畳みを進めることを明らかにした。2)ポリグルタミン酸のコイルヘリックス転移過程の観察。蛋白質を構成する基本構造であるヘリックスが形成する過程を、開発した溶液混合装置を使って追跡した。測定の結果、コイルヘリックス転移には、いったん形成した短いヘリックス構造が、連結して長いヘリックスを作る過程があることを新しく明らかにした。3)アポミオグロビンの折り畳み過程の時分割測定。アポミオグロビンは7本のヘリックスを持つ蛋白質である。これらのヘリックスが段階的に形成する様子を、時分割測定により明らかにした。
コンディションナルノック法を用いたNna1の生理機能解析

プルキンエ細胞死と運動失調を主徴とする自然発症ミュータントマウスpcd(Purkinje cell degeneration)の原因遺伝子はNna1/CCP1であることが報告された。近年、Nna1は脱グルタミン酸酵素として注目され、その機能の欠失はtubulinのC-末端においてglutamateの蓄積を及ぼし、直接にプルキンエ細胞死を引き起こし、これがpcdマウスの運動失調のメカニズムと考えられている(Cell,2010。Nna1の機能ドメインはC-末端の酵素であることから、遺伝子改変マウスの技術を用いてC-末端のexon21-22をfloxするマウスを作製した。まず、全身KOマウス(null)の行動解析では運動失調と学習障害が見られた。組織解析では小脳全体の萎縮および分子層の縮小が確認され、プルキンエ細胞の消失も多く見られた。次に、小脳委縮の原因を調べるために、細胞死の指標であるcleaved caspase-3の免疫染色した結果、アポトーシス細胞はnullマウスのプルキンエ細胞層と顆粒細胞層にあることを明らかにした。最後に、神経細胞死のメカニズムを分析するために、polyglutamated tubulin(PolyG-tubulin)の発現量をウェスタンブロットで解析したところ、Nna1 nullマウスではWTの約1.6倍であった。小胞体(ER)ストレス活性化経路に関連する遺伝子CHOPをIn situ hybridizationで調べた結果、3週齢のKOマウスのプルキンエ細胞層にCHOPの陽性シグナルが多数見られた。ERストレス経路の活性化はNna1の機能損失の一つの結果と考えられる。以上の研究過程から、Nna1の機能ドメインを欠失させると、pcdマウスと類似した病理的な所見が確認された論文を2018年のJ neurochemistry1に公刊された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。小脳は運動中枢の一つであり、平衡機能と随意運動を司る。小脳には脊髄小脳変性症をはじめ沢山の難病が知られておりモデル動物の開発も盛んである。運動失調を主徴とするpcd (Purkinje cell degeneration)変異マウスの責任遺伝子はNna1であると知られてる。組織解析では、pcdマウスの小脳におけるプルキンエ細胞死と顆粒細胞死が見られた。Nna1の機能喪失はプルキンエ細胞死を引き起こす原因であると報告されているが、顆粒細胞死に直接に関係しているかは不明である。本研究は、小脳のプルキンエ細胞と顆粒細胞を対象にそれぞれNna1ノックアウトマウスを作出し、行動解析・組織解析・分子生物解析によりPcd病態を分析し、Nna1の機能喪失と顆粒細胞死との関係を明らかにする。すでに、Nna1全身KOマウス(null)は得られている。nullマウスでは、運動失調と小脳の縮小が見られた。分子層も顆粒層も薄くなってプルキンエ細胞の脱落も見られた。所見はpcdマウスと同様である。神経細胞死のメカニズムを分析するために、細胞死の指標であるcleaved caspase-3とBaxの発現を免疫染色で分析した結果、アポトーシス細胞はnullマウスのプルキンエ細胞層と顆粒細胞層にあることを明らかにした。Iba1の染色では、活性化されたミクログリア細胞がプルキンエ細胞層と顆粒細胞で顕著に増加することが明らかにした。Nna1 nullマウスの解析は順調で予測通りに進行している。cKOマウスの繁殖も順調に進んでおり、行動解析と組織解析も随時できるようになっている。小脳のプルキンエ細胞と顆粒細胞のNna

1ノックアウトマウス(cKO)を作製し、行動解析・組織解析・分子生物解析によりpcd表現型を調べ、Nna1の機能喪失と顆粒細胞死との関係を分析し、Nna1の欠失による神経回路への影響及びグリア系細胞の動態を明らかすることにより、Nna1の生理機能の全容とニューロンネットワークとの関係を解明することを目的としている。cKOマウスの表現型を組織解析的な手法を用いて経時的に解析し、プルキンエ細胞および顆粒細胞の生死の状態を明らかにする。死が起こる細胞と起こらない細胞に分け、分子欠損が引き起こす細胞死に関する因子やERストレスに関与する因子の変化に着目し、野生型マウスの細胞と比較しながら検討する。活性化アストロサイトのマーカーであるGFAP、活性化ミクログリア細胞のマーカーに対する抗体を用いて活性化の状態を確認する。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
神経細胞培養技術を用いた体内埋め込み型人工網膜に関する研究

本研究では、培養神経細胞と光電素子と中心としたMEMS(Micro-Electro-Mechanical System)を組み合わせ、光覚回復を目的とした体内埋め込み型人工網膜の研究開発を行なっている。外部装置から光通信で送られたデータに基づき、埋め込んだ培養神経細胞を電気的に刺激する。なお末梢神経を用いて神経細胞と中枢の間を架橋することにより、その軸索を中枢へ導き、信号を伝達させようと考えている。従って提案する人工網膜では、電極から培養神経細胞へ、さらに培養神経細胞から視覚中枢への信号伝達の安定的な再構成が、本質的な課題である。以上のようなハイブリッド型人工網膜を実現するために、我々のグループはこれまでに、次のようなテーマについて研究を行なった。・刺激電極アレイの設計と作製・電極周辺の電荷密度分布の解析・電極上における神経細胞培養と軸索誘導・末梢神経線維を用いた軸索誘導の動物実験人工網膜の研究開発は未だ黎明期にある。眼科学、エレクトロニクス、マイクロマシン、材料工学、情報通信工学、バイオテクノロジー、脳神経科学など、さまざまな研究領域が垣根を越え、多岐にわたる専門知識および高度な技術が必要な分野である。そして今後、多くの問題を解決しなければならず、実用化までには長い年月を要する。特に我々のハイブリッド型人工網膜の場合、電極アレイから培養神経細胞へ、さらには培養神経細胞から視覚中枢への信号伝達の安定的な再構成が本質的な課題である。前途多難な研究だが、社会的意義は大きく、今後とも実用化に向けて積極的に研究を展開する所存である。様々な医用材料によって、多くの視覚系疾患の治療が可能になった。ところが最も重篤な視覚系疾患ともいえる「失明」を回復させるような治療方法は、いまだ開発されていない。もし失明患者に光覚(光を感じる感覚)だけでも回復させることができれば、大きな助けとなるだろう。そこで我々は、光覚再生を目的とした視覚代用臓器を開発すべく、培養細胞と光電素子からなる「体内埋め込み型人工網膜」の研究を進めている。我々が作成を試みている人工網膜は、光電素子と、その上に培養される神経細胞とグリア細胞、神経細胞の軸策を高次中枢へ導く末梢神経繊維から構成されている。外界の光信号は光電素子によって電気信号へ変換され、白金電極を通じて細胞群へ与えられる。この信号は神経細胞によって捉えられ、さらに高次中枢へと送られる。なおグリア細胞などの支持細胞と神経細胞を共培養することで、神経細胞の軸策成長を促進させる予定である。そして埋め込み手術を容易にするために、前根部の後眼房に人工網膜を埋め込み、末梢神経繊維を用いて人工網膜と脳の高次中枢を架橋手術し、人工網膜中の神経細胞の軸策を中枢へ導く計画である。以上のように神経細胞を「生きた結線ワイヤー」として用いる点が、この人工網膜の特徴である。我々は本年度、驚異的な再生能力を持つことで知られているイモリの神経細胞を素材に選び、神経細胞の培養実験を行なった。まお前述のフォトダイオードアレイがまだ完成していないので、培養用ディッシュとして、市販の多電極ディッシュを代用品として使用した(この多電極ディッシュには、石英ガラスとITO(indium-tin-oxide)からなる基盤上に50μメートルの大きさの多数の白金電極を150マイクロメートル間隔で縦横8×8に配置されている)。その結果、培養開始20日前後で、細胞体(約10μメートル)の10倍から最大20倍もの長さの神経突起を成長させることができた。

我々が作成を試みている人工網膜は、光電素子と、その上に培養される神経細胞とグリア細胞、神経細胞の軸策を高次中枢へ導く末梢神経繊維から構成されている。外界の光信号は光電素子によって電気信号へ変換され、白金電極を通じて細胞群へ与えられる。この信号は神経細胞によって据えられ、さらに高次中枢へと送られる。なおグリア細胞などの支持細胞と神経細胞を共培養することで、神経細胞の軸策成長を促進させる予定である。そして埋め込み手術を容易にするために、前眼部の後眼房に人工網膜を埋め込み、末梢神経繊維を用いて人工網膜と脳の高次中枢を架橋手術し、人工網膜中の神経細胞の軸策を中枢へ導く計画である。以上のように神経細胞を「生きた結線ワイヤー」として用いる点が、この人工網膜の特徴である。本年度、生体の神経系を電気的に刺激する際に用いる「多点刺激電極」の設計を行なった。この電極は、正負の対になった電極が縦横3x3の格子状に並んでいて、既存のマイクロマシン技術を用いて作成可能である。作成に先立ち、コンピュータによる電極の性能評価を行なったところ、約数マイクロアンペアの電流で神経細胞1個を興奮させること可能であることが判明した。本研究では、培養神経細胞と光電素子を中心としたMEMS(Micro-Electro-Mechanical SyStem)を組み合わせ、光覚回復を目的とした人工眼「ハイブリッド型人工網膜」の研究開発を行なっている。外部装置から光通信で送られたデータに基づき、埋め込んだ培養神経細胞を電気的に刺激する。なお末梢神経を用いて神経細胞と中枢の間を架橋することにより、その軸索を中枢へ導き、信号を伝達させようと考えている。従って提案する人工眼では、電極から培養神経細胞へ、さらに培養神経細胞から視覚中枢への伝達の安定的な再構成が、本質的な課題である。本年度は、「神経インターフェースの擬似神経パルスの評価」と、「外部装置から神経インターフェースへのデータ転送」について研究を行なった。1.神経インターフェスの擬似神経パルスの評価動物の脳への電気刺激により、視覚野で生じる視覚誘発電位を測定した。まずは単一パルスに対する応答を記録した。パルス幅を数百μ秒から数ミリ秒まで、パルスの大きさを数μアンペアから数百μアンペアまで変化させ、電気刺激を行なったところ、パルス幅の変化よりもパルスの大きさの変化に視覚野の応答が影響されることが判明した。2.外部装置から神経から神経インターフェースへのデータ転送提案する人工網膜では、体外で取得した画像データ(アナログ信号)をデジタル信号へ符号化した後、光通信方式で神経インターフェースへ伝送し、神経インターフェース内の回路で擬似神経パルスを生成する必要がある。そこで赤外線LED、フォトダイオード、A/Dコンバータ、D/Aコンバータを用いて電子回路を作製し、通信の実験を行なった。その結果、比較的単純な回路でも十分にデータ転送が行なえることが判明した。※成果の公表を見合わせる必要がある場合は,その理由及び差し控え期間等を記入した資料(A4判縦長横書き1枚)を添付すること。
アルツハイマー病の脳からのAΒ排泄障害はAΒ全身クリアランスの障害と関連する

まず我々は,酸化ストレスマウス(Ttpa^<-/->マウス)では酸化ストレスによって全身Aβクリアランスが障害されているかをin vivoで直接的に検証するため,マウス頚静脈から[^<125>I]Aβ_1-40を5_μCi注射した後,1分後から360分後まで経時的に尾静脈より採血しトリクロロ酢酸(TCA)沈殿後にシンチレーションカウンターにて[^<125>I]を測定することにより,血中Aβクリアランスを定量した.[^<125>I]Aβ_1-40のtotalbody clearanceは2ヶ月齢のwild typeマウスと25ヶ月齢のwild typeマウスを比べると19.4%の減少を認めるのに比べ,25ヶ月齢のTtpa^<-/->マウスでは酸化ストレスのために更に39.9%減少した.この実験により,我々がこれまでに想定してきたように脳から血液へのAβクリアランスのみならず(今回の結果とともに論文投稿中),酸化ストレスによって血中からのAβクリアランスも低下していることが証明された.そこで,血中Aβのクリアランスを規定している主要臓器は肝臓であるため,全身でのAβクリアランス低下を認めた原因の検索のため,肝臓でAβの取り込みを担っている蛋白であるLRP-1をTtpa^<-/->マウス肝臓の粗膜分画と細胞膜分画とのそれぞれにおいて定量した.粗膜分画ではLRP-1の減少は認めず,肝臓でのLRP-1の発現量は低下していないと思われたが,細胞膜分画でのLRP-1の発現量は低下しており,肝臓で発現したLRP-1の膜へのtraffickingが酸化ストレスにより障害されていると考えられた.また,酸化ストレスが血中Aβのクリアランスを障害しマウス血漿Aβが増加する原因として,上記の他にも血中のAβ結合蛋白の変化の可能性が考えられる.そこで,Ttpa^<-/->マウスとwild typeマウスとの血漿でAβ結合蛋白であるApolipoproteinE,transthyretinをWestern blottingにより定量したが,それらの量的な変化は認めなかった.以上の結果より,酸化ストレス下においてAβの肝臓における体外への排泄が障害され,それ故に血中Aβ増加が惹き起こされていることを証明した.即ち孤発性アルツハイマー病の新たな病態として「酸化ストレスによる肝臓LRP機能障害」を発見したため,この内容で論文を投稿(Journal of BiologicalChemistry)し,現在revise中である.まず我々は,酸化ストレスマウス(Ttpa^<-/->マウス)では酸化ストレスによって全身Aβクリアランスが障害されているかをin vivoで直接的に検証するため,マウス頚静脈から[^<125>I]Aβ_1-40を5_μCi注射した後,1分後から360分後まで経時的に尾静脈より採血しトリクロロ酢酸(TCA)沈殿後にシンチレーションカウンターにて[^<125>I]を測定することにより,血中Aβクリアランスを定量した.[^<125>I]Aβ_1-40のtotalbody clearanceは2ヶ月齢のwild typeマウスと25ヶ月齢のwild typeマウスを比べると19.4%の減少を認めるのに比べ,25ヶ月齢のTtpa^<-/->マウスでは酸化ストレスのために更に39.9%減少した.この実験により,我々がこれまでに想定してきたように脳から血液へのAβクリアランスのみならず(今回の結果とともに論文投稿中),酸化ストレスによって血中からのAβクリアランスも低下していることが証明された.そこで,血中Aβのクリアランスを規定している主要臓器は肝臓であるため,全身でのAβクリアランス低下を認めた原因の検索のため,肝臓でAβの取り込みを担っている蛋白であるLRP-1をTtpa^<-/->マウス肝臓の粗膜分画と細胞膜分画とのそれぞれにおいて定量した.粗膜分画ではLRP-1の減少は認めず,肝臓でのLRP-1の発現量は低下していないと思われたが,細胞膜分画でのLRP-1の発現量は低下しており,肝臓で発現したLRP-1の膜へのtraffickingが酸化ストレスにより障害されていると考えられた.また,酸化ストレスが血中Aβのクリアランスを障害しマウス血漿Aβが増加する原因として,上記の他にも血中のAβ結合蛋白の変化の可能性が考えられる.そこで,Ttpa^<-/->マウスとwild typeマウスとの血漿でAβ結合蛋白であるApolipoproteinE,transthyretinをWestern blottingにより定量したが,それらの量的な変化は認めなかった.以上の結果より,酸化ストレス下においてAβの肝臓における体外への排泄が障害され,それ故に血中Aβ増加が惹き起こされていることを証明した.即ち孤発性アルツハイマー病の新たな病態として「酸化ストレスによる肝臓LRP機能障害」を発見したため,この内容で論文を投稿(Journal of BiologicalChemistry)し,現在revise中である.
DNA鎖を用いた分子コンピューティングの実現手法に関する研究

DNAコンピューティングは、DNAの分子認識機能を利用することによって、モル当たりアボガドロ数オーダーの超並列演算を可能にする方法として期待されており、特に、NP完全問題のように問題の規模に対して計算量が著しく増大する場合において、従来の計算機に比べて取り扱える問題の規模が大きくなることが期待されている。DNAコンピューティングについては、これまでにいくつかのインプリメンテーションが提案されており、小規模な問題については実際に演算も行なわれているが、必ずしもそのまま大規模な問題に対してスケーラブルではない。本研究では、まず、組み合わせ問題のブール代数化と、DNA鎖長へのコーディングを用いてナップサック問題を解くアルゴリズムを提案し、実際に小規模な問題について演算を行ない、解の有無を判定することができた。この方法では、まず、DNA断片の全ての組み合わせからなるDNAをLigation反応によって生成した後、PCR反応によって条件を満たす組み合わせのみを増幅し、電気泳動によって解の有無を判定する。また、解となる組み合わせを具体的に知る方法として、大腸菌プラスミドを用いたクローニングを行ない、DNA配列を読み取った。この方法では、複数の解が存在する場合にも各々分離して解が得られるという利点がある。さらに、DNAコンピューティングにおいて問題の規模を大きくする際に現実的な問題として現われるてくるであろう、分子生物学的プロセスの信頼性の問題に注目し、間違った組み合わせに対してLigation反応が起こる割合を塩基対ごとに調べ、エラー率の評価を行なった。本年度はDNA鎖を用いたコンピューティングの基礎となる、オリゴヌクレオチド断片の作製およびライゲーション反応について定量的な評価を行なうための予備実験を行なった。任意の長さを持つ比較的長いオリゴヌクレオチド断片を簡便に得るため、マルチクローニングサイトを持つプラスミドDNAの一部分を制限酵素によって切り出したり、また、合成プライマーを用いたPCR反応によってプラスミドDNAの一部分を複製する方法について実験を行なった。DNAコンピューティングでは、解こうとする問題の規模が大きくなるに従って非常に多くの種類のオリゴヌクレオチド断片を準備する必要があることから、合成するよりも既存のDNAの一部分を複製・増幅する方が効率的である。ライゲーション反応については、オリゴヌクレオチド断片との間にミスマッチのあるプライマーを合成によって準備し、ミスマッチの程度や反応条件とライゲーション効率との間の関係を定量的に調べる実験を現在行なっている。これにより、DNAコンピューティングにおいて信頼性を確保するために必要なリソースの量(DNA分子の長さや個数)が計算でき、演算可能な問題の規模を見積もることができる。また、異なるオリゴヌクレオチド断片の間にはハミング距離のような符号間距離を定義することができ、適当な冗長符号化を行なうことによって信頼性を向上させることができる。具体的な問題へのDNAコンピューティングの適用例としてナップザック問題への適用を試みた。
自己凝集性ペプチドを基材とした金属イオン回収材の開発

原発事故で生じた汚染水の処理や希少金属の捕集のため、合成エラスチンペプチド分子およびその修飾体、ジスルフィド結合で二量体化したダイマー、さらにアミノ酸置換したアナログ等を用いて、合成、温度依存制自己凝集能測定および金属塩との相互作用に関する検討を行った。これらのペプチドは簡便に合成することが可能で、海水中、淡水中で分解されることはなかった。各種金属塩の存在下で自己凝集能を検討したところ、イオン価数の増大とともにペプチドの凝集温度が低下し、凝集能が向上したことが明らかとなった。この結果は、エラスチン由来ペプチドがイオンと相互作用することで低温、低濃度で凝集し溶液から分離可能であることを示した。「研究の目的」原発事故で生じた汚染水の処理や希少金属の捕集のため、水中に溶けている金属を回収する方法の開発、改良について、我々が開発した合成エラスチンペプチド分子(FPGVG)のオリゴマーおよびその修飾体、オリゴマーをジスルフィド結合で二量体化したダイマー、さらに分子中のアミノ酸配列をPheからTrpに置換したペプチド等を用いて、合成、自己凝集能測定および金属との相互作用に関する検討を行った。「研究実施結果」ペプチドの合成については、通常法のFmoc固相合成法およびあらかじめ調製したフラグメントペプチドを用いた縮合法、アミノ酸混合法を実施した。システインを用いたS-Sダイマーの形成は、空気酸化法、選択的縮合法のどちらにおいても目的のダイマーが調製された。また、ペプチド分子に対してN末端の化学修飾を種々の脂肪酸で施した誘導体を調製した。得られたペプチドの凝集性を濁度法を用いて検討したところ、水中においてmg/mLのペプチド濃度域で10°C40°Cの範囲で温度依存的に凝集するというコアセルベーション能を有することが確認された。これらのペプチドに対し、今年度では種々の1価および2価の金属イオンを共存させた状態でのコアセルベーションを測定し、十分な凝集性を保持していることを確認した。また、あるN末端アミノ基の修飾がコアセルベーションを促進することを見出した。次年度では、海水中など自然環境中での合成ペプチドの凝集能やイオン結合能について検討を行い、原料がアミノ酸であるため自然環境における安全性が非常に高く、大規模かつ簡便に使用可能な金属回収機能性分子の開発を目指す。「研究の目的」昨年度に引き続き、原発事故で生じた汚染水の処理や希少金属の捕集のため、温度依存的自己凝集能を持つ合成エラスチン分子を用いた、合成研究、自己凝集能測定、海水や生理食塩水中での凝集特性に関する検討を行った。「研究実施結果」本年度は、特にダイマーペプチドにおいてその凝集機構の詳細についての検討を行った。トリプトファン含有ジペプチドは、純水中においても濃度0.5 mg/mLという極めて薄い濃度で凝集温度(Tt=39度)という非常に高いコアセルベーション能を示すことを見出した。また、蛍光測定、粒子径測定、分子動力学計算結果から、このペプチドは透明に見える溶液中でも微小凝集体を形成していることを見出した。また、モノマーペプチドを用いて、各種の塩に対する凝集性を調べたところ、(FPGVG)5においては、同じ価数の金属イオンの違いには凝集性はほとんど影響せず、むしろ陰イオンの数、すなわち、金属イオンの価数に影響を受けることが明らかとなった。また、このイオン価数と凝集温度(Tt)は直線性の相関を示すことが判明した。一方、ペプチドのN末端アミノ基をアセチル化すると、この直線の傾きが非常に小さくなることが明らかとなった。この、アセチル化ペプチドはフリー体と比べると1/10の濃度で有為な凝集を示した。また、陰イオンの違いにおける効果を調べたところ、フリーペプチドでは、フッ素、塩素、臭素の順にTtが低下したが、アセチル体では逆に増加した。また、フリー体ではヨウ素イオンが存在すると、このペプチドがより強く凝集するようになることが見出され、これは、ヨウ素イオンの捕捉に適用できる発見であると考えられた。一方、さらにN末端を調査カルボン酸で修飾すると、鎖長依存的にTtが減少した。これらの結果は、エラスチンペプチドを用いたイオン捕集ポリマーを作製する上での有益な情報を与えた。本研究では、挑戦的課題としてエラスチン由来のアミノ酸配列を持つペプチドを用いた金属イオンの改修機能を有する分子を開発することを目的としている。この目的を達成するために、量的に合成可能で常温(25度)付近で機能を発揮することができるペプチドの開発が必要とされている。また、金属を取り込んだ形での凝集体の形成も必要とされる性質である。本年度の研究においては、ペプチドの調製は、ほぼ簡便かつ容易に達成することができた。

また、アミノ酸からなるペプチドは自然界でも安全に分解される特性を有することが強く期待されるが、今回の研究においても分子全体をアミノ酸のみから合成したペプチドがコアセルベーションを起こすことが確認できたため、安全な分子として目的物を得ることが可能であると現在のところ判断されている。一方で、分子に比較的毒性の低い脂肪酸を結合させたものでもコアセルベーション活性が確認され、むしろその能力が増強されたことから、これらの修飾体を用いても目的の分子とすることができると考えられた。調製したペプチドから、当初の想定通りに水中においてmg/mLのペプチド濃度域で10°C40°Cの範囲でコアセルベーションを示すものが複数得られた。その凝集活性は、金属イオン存在下でさらに増強されることが確認された。以上の結果を総合すると、本年度の研究結果から目的とする常温付近でコアセルベーション能を有し、金属と相互作用しつつ凝集する、環境に優しいペプチドの開発研究は、計画通りにおおむね順調に進んでいると判断された。環境科学今後の本研究課題の推進方策については、前年作成したペプチドの環境中での安定性の検討と、機能改良を実施する。まずは、合成したペプチドの環境中での挙動を解析する。このため、河川や海から採取した淡水や海水中でのペプチドの安定性を調べる。温度を4°C、10°C、20°C、30°Cに設定し、1日3ヶ月インキュベートした後、HPLCと質量分析装置を用いて分解状況の解析を行う。分解が速すぎる場合には、切断を受けるアミノ酸配列を質量分析で同定後、それらを別のアミノ酸に置換することで分解速度を調節する。分解が非常に遅すぎる場合には、ペプチド結合中に各種酵素で切断を受けるアミノ酸配列を挿入し、分解速度を調節する。また、ペプチドの金属結合能力の向上のために、アミノ酸の置換を検討する。昨年、トリプトファンの導入を実施したが、さらにヒスチジンの導入を検討する。トリプトファンやヒスチジンの側鎖、インドール基やイミダゾール基には窒素原子が存在しており金属へ配位する性質を持つ。このため、トリプトファンやヒスチジンをペプチドに追加的に導入して金属結合能力の向上を試みる。これらのアミノ酸の導入によりコアセルべーション能が低下する場合には、繰り返し配列数を増加させてこれを防ぐ。当初計画時にはペプチド合成用の試薬、特に、保護アミノ酸の購入費用を多く見込んでいたが、実験技量の向上のためにその実使用金額が、見込み金額を下回ったため、差額が生じた。また、本研究費での国内学会発表旅費の支出を当初計画していたが、主に近隣での学会発表を行ったため、当該研究費を要せず費用に残を生じた。以上の理由で次年度使用額を生じることとなった。次年度においては、さらに研究を進展させるために、新たなアナログペプチドの合成や多量に試薬を必要とする量的な調製を実施する。このために、前年生じた差額を用いて合成試薬、精製器具を購入する。これにより、ダイマーペプチドの実用性を評価することで、本挑戦的萌芽研究を一層発展させることを目指す。