hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳血管系の動静脈運命決定機構の解明

頭部の脈管形成を担う3つの血管芽細胞集団の,吻端のものはHey2を発現し,眼胞後方外側のものはFlt4を発現する.一方,吻側と眼胞後方の細胞塊の正中部ではShhの発現が確認されたが,その発現部位は,Hey2陽性細胞がFlt4陽性細胞に比較して近傍にあり,動静脈分化にShhの影響が示唆された.また,どの細胞塊からどの血管が派生するかを追跡できるムービーを作成した結果,頭部の基本的血管系は,眼動脈,原始前脳動脈,中脳動脈,原始内頚動脈の先端部分に派生する吻側の細胞塊と, PHBCを経て,脳底部の前方で原始動脈輪と後脳動脈を,後方で脳底動脈を形成する後脳外側の細胞塊から構成されることが確認された.特定器官の脈管形成と動静脈の運命決定から、階層性を持ったvascular treeの形成に至る血管系構築の全過程の詳細は不明であり、その分子機構に関する研究も断片的な事象を対象にしているに過ぎない。本研究では、初期脳血管系構築の全過程をライブイメージングし、明らかとなったイベントごとにその特異的な階層化の過程の分子機構を明らかにしていくことを目的としている。24年度は、ゼブラフィッシュ胚の脳血管系形成過程の階層化のイベントを明らかにするために、ライブイメージングを引き続き行い、特に、動脈と静脈の成熟過程と周囲組織の関係に注目し、組織学的に管腔形成の時間経過を追った。すなわち、凍結切片による観察から、受精後14時間-16時間にかけて、吻端および眼胞の後方に脳血管芽細胞塊とみられるEGFP陽性細胞塊が確認され、それぞれの細胞塊から血管内皮細胞が浸潤し、受精後24時間で内頸動脈、眼動脈、原始中脳血管、眼静脈などが形成された。また、走査電子顕微鏡による観察から、頭部で血管内皮細胞が血管を形成していく様子を捉えることに成功した。脳血管を形成すると思われる細胞は受精後14-16時間までは紡錘形をしていたが、18時間以降になると徐々に薄く広がりながら方向性を持って配列し、時間の経過と共に隣り合う細胞同士が結合し、徐々に管状の構造を形成していった。動脈と静脈で内皮細胞や血管壁の形態が異なることが示唆された。12体節期(受精後15時間)において、間脳および前脳と中脳の境界域の腹側でshhの発現が見られた。これはいずれも、吻側および眼胞腹尾側に出現する動脈性血管芽細胞塊と近接する位置であることから、脳血管系の動脈分化においてもshhが関わっている可能性が示唆された。特定器官の脈管形成と動静脈の運命決定から、階層性を持ったvascular treeの形成にいたる血管系構築の全過程の詳細は不明であり、その分子機構に関する研究も断片的な事象を対象にしているに過ぎない。本研究は、初期脳血管系の全構築過程のライブイメージングから明らかとなったイベントをたどり、初期脳血管系の特異的な階層化過程の分子機構の解明を目的とする。内頚動脈と脳底動脈から形成される動脈輪など、脊椎動物の脳血管系の構成は種を超えて保存されており、本研究の対象にはゼブラフィッシュ胚を用いた。脳血管系の形成過程は、血管内皮細胞特異的なEGFP発現トランスジェニック・ゼブラフィッシュのタイムラプスイメージング、走査電子顕微鏡撮影、組織標本の再構成により解析した。頭部の血管形成は、受精後14-16時間に、胚の吻端から眼胞の後方と、後脳の側腹部にEGFP陽性の血管芽細胞塊が出現することから始まる。それぞれの細胞塊から血管芽細胞が遊走・伸展し、時間の経過とともに隣り合う細胞が結合して管状の細胞索を形成し、24時間までに、前脳の細胞塊からは眼動脈、原始前脳動脈、中脳動脈、原始内頚動脈の先端部分が形成された。一方、後脳の細胞塊からは、原始後脳静脈洞(Primordial hind brain channel)を経て、脳底部の前方では原始動脈輪、後脳動脈、後方では脳底動脈が形成に至る過程が観察された。後脳の側腹部の血管芽細胞塊は、当初、静脈性の遺伝子を発現しており、形態学的にも静脈性のものが動脈性に転換することが明らかになった。また、前脳および後脳の遺伝子の血管芽細胞の出現領域に発現する血管形成に関わる複数の遺伝子を特定できた。現在、これらの遺伝子と脳の血管系の階層化について、関連を解析中である。頭部の脈管形成を担う3つの血管芽細胞集団の,吻端のものはHey2を発現し,眼胞後方外側のものはFlt4を発現する.一方,吻側と眼胞後方の細胞塊の正中部ではShhの発現が確認されたが,その発現部位は,Hey2陽性細胞がFlt4陽性細胞に比較して近傍にあり,動静脈分化にShhの影響が示唆された.また,どの細胞塊からどの血管が派生するかを追跡できるムービーを作成した結果,頭部の基本的血管系は,眼動脈,原始前脳動脈,中脳動脈,原始内頚動脈の先端部分に派生する吻側の細胞塊と, PHBCを経て,脳底部の前方で原始動脈輪と後脳動脈を,後方で脳底動脈を形成する後脳外側の細胞塊から構成されることが確認された.特定器官の脈管形成と動静脈の運命決定から、階層性を持ったvascular treeの形成にいたる血管系構築の全過程の詳細は不明であり、その分子機構に関する研究も断片的な事象を対象にしているに過ぎない。

本研究では、初期脳血管系の全構築過程のライブイメージングから明らかとなったイベントをたどり、初期脳血管系の特異的な階層化過程の分子機構の解明に挑戦する。当該年度はゼブラフィッシュの脳血管系の形成過程の詳細を形態学的に明らかにするとともに、特に脈管形成と運命決定に関わる遺伝子の探索を行った。結果、血管内皮細胞のEGFP発現トランスジェニック・ゼブラフィッシュを用いたタイムラプスイメージングと、動・静脈のマーカー遺伝子によるin situ hybridizationにより、発生初期に頭部に出現する血管芽細胞塊ごとの動脈性と静脈性の形質を明らかにした。さらに得られた結果を視覚的に理解するために、血管芽細胞塊ごとに色分けし、それぞれ血管芽細胞塊からどの血管が派生するかを追跡できるムービーを作成した。その結果、当初、前脳と後脳の腹側に認められたfli陽性細胞塊のうち,後脳の腹側の細胞塊は、眼胞後方の外側の細胞塊と腹側の細胞塊との2つの系統の細胞に分けられることが明らかになった。動脈系(脳底動脈を除く)は吻端の細胞塊から、静脈系は眼胞後方の外側の細胞塊に由来し、眼胞後方の腹側に出現する動脈系の細胞塊からは原始内頸動脈,鰓弓動脈,外背側大動脈が発生することを明らかにした。一方、fli陽性細胞が発生する吻側と眼胞後方の正中部では両側性にshhの発現が確認された。脳血管系の構築の階層化の詳細なイメージングはほぼ終了し、初期の脳血管系発生の3次元ムービーとアトラスを完成することが出来た。それにより、階層化に関与するイベントの詳細も理解することが可能となった。しかし、当初の予定よりイメージングに時間が掛かり、イベント毎の分子機構の解析まで至っていない。我々の明らかにした初期脳血管系の形成過程の詳細はこれまので発生学の常識とは異なっており、新たな血管形成の概念を打ち立てる必要性を示したと言える。血管芽細胞塊ごとに色分けし、それぞれ血管芽細胞塊からどの血管が派生するかを追跡できるムービーは、見る者誰もが利用できる参考資料であり、新しい形の血管発生アトラスである。脳だけでなく、血管発生に関わる研究者全てにとって、インパクトのあるものであり、世界にアピールできるツールとなるであろう。しかし、当初予定していた脳特異的な脈管形成の分子機構と動静脈の運命決定機構の解析では、shhの発現のみ新しい知見であり、十分な成果を得ることが出来なかった。次年度は、脈管形成に関わる既知遺伝子の発現局在を網羅的に解析し、その機能評価を行い、責任遺伝子を探索する。すなわち、脈管形成に関わる既知遺伝子の発現局在をin situ hybridizationで明らかにする。これにより、脈管形成時の責任遺伝子の探索を行う。MOもしくはmRNAのインジェクション等により責任遺伝子候補の発現制御を行い、二光子顕微鏡によるライブイメージングからそれらの遺伝子の脈管形成と血管新生への関与を明らかにする。次年度は脈管形成に関わる既知遺伝子の発現局在を網羅的に解析し、その機能評価を行い、責任遺伝子を探索する。1.脳特異的な脈管形成の分子機構解析:脈管形成に関わる既知遺伝子の発現局在をin situ hybridizationで明らかにする。すなわち、機能解析をMOもしくはmRNAのインジェクションによる発現制御と、二光子顕微鏡によるライブイメージングにより行い、それらの責任関与を明らかにする。2.動静脈の運命決定機構の解析:脳特異的な脈管形成に関わる2つの領域のGFP陽性細胞塊は、出現時にそれぞれHey2とflt4を発現しており、すでに動静脈の決定がなされている可能性が高い。
π-d相関系有機導体の広帯域伝導性とダイナミックス

ラジオ波周波数以下の計測装置を新たに作製し、α-(ET)_2I_3における複素誘電率・伝導率の周波数分散を観測した。まず、ラジオ波域でc^*方向の複素伝導率の周波数分散を測定した。周波数分散が顕著であったのは、10^8-10^9Hzの領域である。ドルーデモデルに基づいた解析を試みたところ、周波数分散がよく再現されることが分かった。このとき、パラメータとしてプラズマ振動数と緩和時間が入ってくるが、それらの値は、通常の金属で得られている値に比べて約3桁異なっている。α-(ET)_2I_3のab面における光学伝導率がすでに報告されているが、プラズマ振動数は10^<13>Hzのオーダーをとり、c^*方向に比べて約3桁大きい。この違いは、伝導率の異方性を反映したものと考えられる。また、プラズマ振動数と緩和時間ともにT_<MI>170Kの温度域で、その温度変化が激しくなった。NMRやラマン分光測定から、T_<MI>以上の温度域でも電荷不均衡化の兆候が報告されている。したがって、プラズマ振動数と緩和時間の激しい温度変化は、電荷不均衡化の前駆現象が現れ、温度の低下とともに成長していると考えられる。ラジオ波域における誘電率はT_<MI>以下で、温度に依存せず、ほぼ1をとる。これまでに報告があるab面内の誘電率が10-10^2の値をとることを考えると、面内と面間方向では極めて大きい異方性が誘電応答に存在することが分かった。より周波数を下げていくと、低温の誘電率が増加することが見出された。誘電率の実部は、階段状の変化が低温でみられ、周波数に依存して変化する。一方、誘電率の虚部の温度変化には、ピークを観測した。周波数が増加するにつれ、ピークが現れる温度が上昇する。誘電率の実部と虚部にみられた異常が、デバイ緩和に起因することを明らかにした。デバイ緩和の出現は、c^*方向に誘電分極が生じることを示している。その原因として、電荷不均衡化したπ電子の寄与が考えられる。超伝導体λ-(BEDT-TSF)_2GaCl_4(T_c=4.8K)において、0.5K<7<150Kの温度範囲で45GHzのマイクロ波伝導率測定を行った。T_c以下の超伝導状態におけるロンドン侵入長は、T/T_c<0.5の十分低温ではほとんど温度に依存せず、超伝導対称性がs波であることが判明した。一方、T_c以上の金属状態では、直流伝導率σ_<dc>に比較して複素伝導率の実部σ_1は小さくなり、かつ、複素伝導率の虚部σ_2ではT_cに向かって発散的な増大を観測した。この現象は、通常の金属状態における電磁波応答を記述するドゥルーデモデルでは説明できない新規な現象である。σ_1の減少は、マイクロ波損失に寄与する準粒子数密度の減少に関連しており、フェルミレベル近傍に擬ギャップの出現によると考えられる。この状態は、局所的な電子対の形成に起因した超伝導状態への前駆現象と考えられる。α-(BEDT-TTF)_2I_3の面間方向についてラジオ波域の反射測定を行い、伝導率・誘電率の温度変化と周波数分散を得た。金属-絶縁体転移温度(135K)以上では、伝導率は分散をもたず、直流の値にほぼ等しいことが分かった。一方、転移温度以下では、伝導率が3桁ほど急激に減少し、周波数分散も見出した。しかし、誘電率はほぼ1程度であり、温度変化を示さない。面内方向の誘電率が10-10^2という大きい値をとることから、絶縁体状態の誘電性は極めて異方的であることを明らかにした。

誘電率の実部は、階段状の変化が低温でみられ、周波数に依存して変化する。一方、誘電率の虚部の温度変化には、ピークを観測した。周波数が増加するにつれ、ピークが現れる温度が上昇する。誘電率の実部と虚部にみられた異常が、デバイ緩和に起因することを明らかにした。デバイ緩和の出現は、c^*方向に誘電分極が生じることを示している。その原因として、電荷不均衡化したπ電子の寄与が考えられる。
立体異性体生合成酵素反応の分子機構

トロピノン還元酵素(TR)は、主にナス科の薬用植物に見いだされるトロパンアルカロイドの生合成反応を触媒するNADPH依存型酸化還元酵素である。TRには反応立体特異性の異なる2つの酵素(TR-IとTR-II)が存在し、アルカロイド中間体であるトロピノンの3位のカルボニル基を互いに反対の立体配置をもつ水酸基へと還元する。両酵素とも分子量約30kDaのサブユニットがホモ2量体を形成しているが、そのアミノ酸配列は64%が同一である。両酵素の立体特異的反応機構を解明するために、これらの結晶構造を2.4または2.3Åの分解能で決定し詳細に比較した。両TRサブユニットの全体構造はほぼ同一であり、ロスマンフォールドからなるコアドメインとそこから突き出た小ドメインからなっていた。小ドメインの電子密度は両TRともに低く、溶液中では比較的自由なコンフォーメーションをとると考えられた。予想される基質結合部位にトロピノンをモデリングしたところ、TR-IIではトロピノンの窒素原子が結合すると予測される部位にグルタミン酸残基が存在し、この両者の間の静電気的結合がトロピノンの配向を決定していると推定された。一方TR-Iにおいてトロピノンの窒素原子が結合すると予測される部位には電荷をもったアミノ酸残基は存在しなかったが、これとは反対側にヒスチジン残基が存在しており、これがトロピノンの窒素原子を反発することによってTR-IIとは逆の反応立体特異性を獲得しているものと推定された。すなわち両酵素の分子進化においては、共通のbackbone構造をもつ基質結合部位の電荷の分布がアミノ酸の変異によって変化し、これにより互いに逆の反応立体特異性が獲得されたことが判明した。大腸菌による大量発現系・精製系の確立大量の精製酵素を供給するため、Datura stramonium由来の両TRcDNAをpET21dベクターにクローニングし、可溶性タンパクを効率よく得るための培養・誘導条件を検討した。その結果、TR-IではLB倍地中0.1mMのIPTGで37°C、250rpm、3時間の誘導で、またTR-IIでは25°C、100rpm、16時間の誘導で、最大量の可溶性発現タンパク質が得られ、以降これらの条件で培養を行った。次にこれら発現TRタンパク質の精製条件を検討した。TR-Iでは2種のHIC及び、色素リガンドアフィニティー、イオン交換のカラムクロマトグラフィーで、一方TR-IIでは2種のHIC及びイオン交換のカラムクロマトグラフィーで精製した。両者とも5Lの培養液から約20mgの高純度なタンパク質が得られた。TR結晶化条件のスクリーニングと最適化結晶学的諸性質の決定得られた結晶のプレセッション写真を撮影し、結晶系、空間群、格子定数など結晶の性質を調べた。その結果、TR-IではX線構造解析に適した性質をもつ結晶が1つ得られた。TR-IIの結晶はモザイシティーの高さに起因する回折斑点の不分離が見られた。そこで再度結晶化条件のスクリーニングをおこない、明確な回折斑点を与える結晶を得ることが出来た。昨年度に検討した両TR酵素の結晶化及び測定条件を最適化した。TR-IIにおいてはX線による結晶の損傷を抑えるため、結晶を液体窒素中で凍結し-160°Cの冷気中で測定をおこなった。TR-Iでは分解能2.4ÅまででRmerge=4.34%、TR-IIでは2.6Åまでで6.32%の信頼性の高いデータを収集できた。TRには1次構造上の相同性が高く3次元構造が既知のタンパク質が存在しないため、回折X線波の位相は重原子置換法により計算した。

まず重金属元素としてHg,Pt,Au,Sm,Ir,Pbを含む約20種の化合物や無機塩を含む溶液にそれぞれの結晶を浸漬し、試薬の濃度や時間を検討した。置換が期待された結晶は回折データを収集し、非置換体結晶との差パタ-ソン計算や差フーリエ計算によって重原子置換の有無を確認した。最終的にTR-Iでは水銀化合物であるEMTSで、TR-IIではHgCl_2またはKAu(CN)_2で置換した場合に位相計算に適した置換体結晶が得られた。これらの回折データから異常分散差を含めて位相を計算し溶媒領域の平滑化により改善した。計算された位相の正しさを表すfigure of meritの平均はTR-Iで0.81、TR-IIで0.82であった。これらの位相より計算した電子密度図は、両TRとも一部の領域を除いてアミノ酸側鎖の方向までが明確に認識できる良好なものであった。この電子密度図をもとにグラフィックプログラム上でTRタンパク質の構造モデルを作製した。電子密度の不明瞭な部分は、明瞭な部分のモデルから計算した位相を使って電子密度図を計算し直した。このようにして作製したモデルをプログラムX-PLORにより繰り返し精密化したところ、測定値との誤差を示すR値はTR-Iで20%、TR-IIで22%にまで低下した。前年度に引き続き両TR酵素の結晶構造解析をおこなった。構造モデルはTR-Iでは2.4Å、TR-IIでは2.3Åの分解能において精密化し、モデルの誤差を示す指標であるR値は、TR-Iで0.155、TR-IIで0.205という良好な値にまで低下した。また各アミノ酸残基の立体化学的性質も良好であった。両TRの2量体構造はほぼ同一であり、サブユニットは主に疎水的相互作用によって会合していた。またサブユニットの構造も両TR間で保存されており、ともにロスマンフォールドからなるコアドメインとそこから突き出た小ドメインからなっていた。両ドメイン間には基質結合部位と予測されるクレフトが存在し、補酵素であるNADPとの共結晶であるTR-Iでは、このクレフトの底部にNADPが結合していた。この補酵素結合部位の構造はTR-IIにおいてもTR-Iと同一であった。またクレフト内に活性残基であるTyrが突出しており、その位置も両TRで同一であった。以上のことよりTRの反応立体特異性はトロピノンの酵素への結合方向のみによって決定されていることが明らかとなった。そこで基質結合部位にトロピノンをモデリングしたところ、TR-IIではトロピノンの窒素原子が結合すると予測される部位にグルタミン酸残基が存在し、この両者の間の静電気的結合がトロピノンの配向を決定していると推定された。一方TR-Iにおいてトロピノンの窒素原子が結合すると予測される部位には電荷をもったアミノ酸残基は存在しなかったが、これとは反対側にヒスチジン残基が存在しており、これがトロピノンの窒素原子を反発することによってTR-IIとは逆の反応立体特異性を獲得しているものと推定された。すなわち両酵素の分子進化においては、共通のbackbone構造をもつ基質結合部位の電荷の分布がアミノ酸の変異によって変化し、これにより互いに逆の反応立体特異性が獲得されたことが判明した。
日本と中国に共通の危救植物の人為的保存と増殖に関する遺伝学的研究

平成6年度に開始された日中共同研究「日本と中国に共通の危救植物の人為的保存と増殖に関する遺伝学的研究」も最終年度となり、各々の研究分担者は、実験、野外での調査及び採集と平行して、これまでの3年間の研究結果をまとめる段階に入った。黒木は、8月初旬に吉林省、黒龍江省に出かけ、雌雄異株ギシギシ属、ネギ属の調査、研究を行った。そのうち、長春において、日本に広く分布して様々な核型を示すことが報告されているノビルを採集することができた。また、採集したギシギシ属のDNAを抽出し、DNA系統保存の系を確立しつつある。黒木と行動を共にした研究協力者國府方は、稀少種であるDendranthema oreastra(キク類植物)を持ち帰り、蛍光インシチュ・ハイブリダイゼーション法を用いて染色体の観察を行い、種内多様性を分析して、種保全に寄与する研究を行っている。また、種子を採集し、その一部は無菌播種による組織培養に成功し、組織培養による大量増殖及び系統保存の系を確立しつつある。島田は8月初旬に四川省に出かけ、サクラソウ属危救植物の野外調査及び採集を行った。これらの結果をふまえて、種の多様性に考慮した組織培養法の系の確立に関する研究を行い、葉片からの再分化の誘導に成功した。現在、この方法を用いて大量増殖及び系統保存を行っている。島田と行動を共にした船本はユキノシタ属を持ち帰り、染色体と種或いは個体群との関係についての研究を行い、種により染色体と核型が異なり、これらの変異とユキノシタ属種の環境への適応による種分化がかなり相関していることをつきとめ、種多様性の指標として染色体の形質がかなり有効であることを示唆した。近藤は10月初旬に陜西省に出かけ、キク類植物の生育環境を調査し、乾燥地での適応についての生態学的知見を多く得た。その一部を持ち帰り、生育環境での調査結果をふまえた組織培養系統保存法、DNA保存法を確立した。また、採集した植物の一部を材料として、分子細胞遺伝学的手法を用いた染色体観察を行い、種多様性に関する多くの知見を得た。近藤と行動を共にした日詰はマツ属植物の野外調査を行い、その一部を採集した。現在それらからDNAを抽出して、インシチュ・ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法を用いた種内或いは属内の多様性の分析を行い、それをもとにDNA保管に関する方法論を確立しつつある。横田は、10月中旬に海口に出張予定であったが、出張直前に以前から煩っていたC型肝炎の様態が急に悪化し、医師の診断により出張を中止せざるをえなくなった。研究協力者周は、11月下旬から12月中旬にかけて来日し、船本とともに東広島市、新潟市、両津市、岩木町、千葉市、日南市においてユリ科、キンポウゲ科を調査、採集した。また、広島大学理学部附属植物遺伝子保管実験施設において、組織培養苗条原基法による野生植物の系統保存法を学んでいただいた。現在、採集して持ち帰った植物体を材料にして中国の研究所で組織培養苗条原基法による系統保存を行っている。中国側での研究の総括を行っている洪は平成9年2月下旬から3月上旬にかけて来日し、近藤とともに東広島市周辺においてユリ科、キンポウゲ科の野外調査及び採集を行い、現在、それらを材料として、種保全学的研究及び系統分類学的研究を行っている。また、広島大学理学部附属植物遺伝子保管実験施設において、研究代表者近藤と今後の共同研究の打ち合わせを行い、中国側としては、今後も共同研究を発展させていくことを強く望んでいることを近藤に伝えた。

近藤は10月初旬に陜西省に出かけ、キク類植物の生育環境を調査し、乾燥地での適応についての生態学的知見を多く得た。その一部を持ち帰り、生育環境での調査結果をふまえた組織培養系統保存法、DNA保存法を確立した。また、採集した植物の一部を材料として、分子細胞遺伝学的手法を用いた染色体観察を行い、種多様性に関する多くの知見を得た。近藤と行動を共にした日詰はマツ属植物の野外調査を行い、その一部を採集した。現在それらからDNAを抽出して、インシチュ・ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法を用いた種内或いは属内の多様性の分析を行い、それをもとにDNA保管に関する方法論を確立しつつある。横田は、10月中旬に海口に出張予定であったが、出張直前に以前から煩っていたC型肝炎の様態が急に悪化し、医師の診断により出張を中止せざるをえなくなった。研究協力者周は、11月下旬から12月中旬にかけて来日し、船本とともに東広島市、新潟市、両津市、岩木町、千葉市、日南市においてユリ科、キンポウゲ科を調査、採集した。また、広島大学理学部附属植物遺伝子保管実験施設において、組織培養苗条原基法による野生植物の系統保存法を学んでいただいた。現在、採集して持ち帰った植物体を材料にして中国の研究所で組織培養苗条原基法による系統保存を行っている。中国側での研究の総括を行っている洪は平成9年2月下旬から3月上旬にかけて来日し、近藤とともに東広島市周辺においてユリ科、キンポウゲ科の野外調査及び採集を行い、現在、それらを材料として、種保全学的研究及び系統分類学的研究を行っている。また、広島大学理学部附属植物遺伝子保管実験施設において、研究代表者近藤と今後の共同研究の打ち合わせを行い、中国側としては、今後も共同研究を発展させていくことを強く望んでいることを近藤に伝えた。日中両国の絶滅の危機に瀕する植物の研究、増殖と保全に関する基準ずくりの3年間にわたる共同作業が始まった。島田は、海南島に出かけ、2種の野性稲の生育場所を調査し、変異性高いことを把握した上で、植物体と種子を採集し、組織培養始めた。そして、島田が再度南開大学へ出かけ、培養系の確立をした。中国政府は、野性稲の遺伝子の国外持ち出しを厳しく規制しており、日本での研究はできないので、今後は中国側分担者に研究を委ねることとなった。日詰は、10月中旬から下旬にかけて、青海省東部高山で、中国西部で稀なマツ科トウヒ属の調査、研究を行った。標高の高い地帯でPicea crassifoliaを研究し、低い地域に自生するPicea wilsonilとは分布の境界地域で同所していたが、雑種による遺伝的汚染は無いと結論ずけた。現在、また、同省から原始的タイプのニンニク(ユリ科)持ち帰り、ISH法を用い、日本の栽培ニンニクと染色体比較研究を行った。また、中国産ソテツを持ち帰り、染色体を研究した。船本は、日詰と行動を共にして、ユキノシタ科4属7種を採集し、日本に持ち帰って染色体の分析を行っている。Hydrangea bretschneideriには、同属によくみられる種内培数性は見られなかった。Philadelphus incansは2n=26で、種名の異なる日本産のものと何等違いは無いことが分かった。日詰と船本は、また、近藤の材料であるキク類Ajavia属植物の生個体と種子を多く採集した。近藤はそれらを使って、現在、分析を進めている。横田は、1月中旬に、海南島へ出かけ、絶滅危惧種のラン科数種(名前が分かっているものだけで4種)、サトイモ科1種、イラクサ科4種を調査、採集して、日本に持ち帰った。
顕著な抗腫瘍効果を発揮する白金二核錯体を基盤とした創薬研究

テトラゾラト架橋白金(II)二核錯体に標的指向性DDSキャリアまたはハロゲンを導入し、更なる薬効の向上および副作用の軽減を図った。その結果、非常に高い抗腫瘍効果および効果持続性を発揮する誘導体を見出すことが出来た。リード化合物はColon-26大腸がん皮下移植マウスに対して、白金製剤オキサリプラチンよりも遥かに有効な抗腫瘍効果を発揮した。また、腫瘍が大きく成長してから投与した場合においても高い効果を発揮し、その効果は単回(静脈内)投与後数週間持続した。これらのことから、テトラゾラト架橋白金(II)二核錯体は、進行がんに奏功する有望な次世代白金製剤として、今後の臨床応用が期待される。既存の制がんテトラゾラト架橋白金(II)二核錯体(テトラゾラト架橋錯体)が、非常に高効率にL1210マウス白血病細胞に取り込まれ、蓄積することを確認した。ほとんどのテトラゾラト架橋錯体は、シスプラチンよりも数倍数十倍高い細胞内蓄積量を示した。シスプラチンの細胞内蓄積量は、L1210シスプラチン耐性細胞において、著しく低下した。一方、テトラゾラト架橋錯体の場合、むしろL1210シスプラチン耐性細胞において、より高効率に細胞内に蓄積することがわかった。つまり、シスプラチンとテトラゾラト架橋錯体の細胞内取込機構は、明らかに異なると推定される。また、7種類のテトラゾラト架橋錯体を新たに合成し、標的指向性DDSキャリアとの複合体を形成させ、そのin vitroおよびin vivo活性を検討した。DDSキャリア導入による効果は、B16悪性黒色腫移植マウスの延命率において、明らかに認められた。さらに、マウスに移植した腫瘍の増殖を99.8%抑制する錯体を、新規錯体の中に見いだすことが出来た。テトラゾラト架橋錯体が、従来の白金制がん剤とは異なる機構でがん細胞内に取り込まれることが分かり、白金制がん剤に対して耐性を獲得したがんに対して有効な治療薬を開発できる可能性が高まった。また、顕著なin vivo抗腫瘍効果を発揮する錯体が、新規錯体の中から見いだされた。テトラゾラト架橋錯体を基盤とする創薬研究を行った。テトラゾール5位に特定の置換基を導入した4つのテトラゾラト架橋錯体(SK36-39)について、マウスcolon-26大腸がんに対するin vivo抗腫瘍効果を調べたところ、SK36およびSK38が大腸がん治療薬であるオキサリプラチンよりも高い効果を発揮することを確認した。SK38に至っては、大腸がんの増殖をほぼ100%抑制することが分かった。また、一連のテトラゾラト架橋錯体が、DNAを高効率に凝縮させることによって遺伝子発現が抑制されるという、制がん白金錯体の新たな作用機序が確認された。さらに、DNA以外の標的分子の存在を示唆する成果が得られたことから、テトラゾラト架橋錯体の制がんメカニズムには複数の標的分子が関連していることが分かった。大腸がん移植マウスを用いたin vivo実験で、白金製剤オキサリプラチンよりも遙かに高い活性を発揮する化合物を見いだすことが出来た。また、作用機序の一端を解明することに成功した。最終年度は化合物と血清タンパクとの相互作用を検討する必要がある。マウスに移植した腫瘍の増殖を99.8%抑制する錯体を見いだすことが出来たので、in vivo実験を繰り返し、顕著な抗腫瘍効果の再現性を確認する。また、この錯体を基盤に様々な誘導体を合成し、創薬研究を進める。最終年度は大規模なin vivo実験を行い、一連の化合物の抗腫瘍効果と毒性を調査する。リード化合物を選定し、本格的な前臨床試験の準備を整える。生物無機化学27年度末実施予定のin vivo実験に使用するマウスの購入に充てる予定であったが、共同研究者とin vivo実験の詳細を練り直してから、次年度に実施することにした。共同研究者との会合は、年度末の薬学会年会で行った。次年度にin vivo実験を行う際に、実験動物の副作用の指標として血球数を測定する装置を購入する必要があり、繰越金を動物用血球計数装置の購入の一部に充てたい。28年度のin vivo実験に使用するマウスの購入費に充てる予定である。動物用血球計数装置ベトスキャンHM II(ABAXIS)購入の一部に充てる。
エピゲノミクスを基盤とした固形癌に対する先制医療の推進と臨床研究による評価

肺癌や消化器癌などの固形癌は、早期癌の状態で発見できれば外科的切除にて十分根治が見込め、また、根治切除後の補助化学療法により死亡率が減少することも示されている。これら事実は、画像上で診断可能となる前の微小癌状態(発症前期)ならば、少なくとも一定の割合の肺癌・消化器癌は化学予防(Chemoprevention)にて治癒できる可能性があることを示唆する。本研究では、研究代表者らが開発したメチル化DNA検出技術を用い、(1)喀痰を用いた肺癌・便を用いた消化器癌の非侵襲的がんスクリーニングの精確性の検証、(2)発症前期での微小癌検出を行うための診断アルゴリズムの開発、を行う。これら研究と並行して、(3)新規の前向き臨床試験を計画遂行し、検体収集および臨床データ収集を行い、(1)、(2)にて開発を行った診断アルゴリズムを含む検出システムの検証を行うことで、非侵襲的メチル化DNA検出を新機軸とした発症前期における肺癌/消化器癌を診断/予測し、Chemopreventionを可能にする革新的先制医療(Preemptive Medicine)への「橋渡し」を行う。すでに収集されている便・喀痰便検体を用い、(1)肺癌・消化器癌全体の非侵襲的がんスクリーニングの精確性の検証を行い、発表できるところまで仕上げる予定である。(2)メチル化DNA解析結果と臨床データを照合することによる診断アルゴリズムの開発は、プログラム言語をpython3に統一しシュミレーションを開始している。(3)前向き臨床試験を計画し臨床試験として開始する予定である。(1)肺癌のデータ検証は順調に進んでおり論文作成が進行中である。その一方、消化器癌全体の非侵襲的がんスクリーニングの精確性の検証は解析検体数及びブラッシュアップしないといけない臨床データが多く遅れている。(2)メチル化DNA解析結果と臨床データを照合することによる診断アルゴリズムの開発は、プログラム言語をpython3にて構築中であり、概ね順調であるが、(1)の結果を必要とする。3)前向き臨床試験を計画し臨床試験としてはプロトコール作成が遅れており、まだ改定を進めている状態である。(1)喀痰と肺癌スクrリーニングに関する報告を行う。(2)消化器癌全体の非侵襲的がんスクリーニングの精確性の検証のための糞便解析検及び臨床データの整備を今年中に進める。(3)臨床試験プロトコールを固定し本年度中に開始を行う。(4)(1)(2)の結果次第では、バイオマーカーの再検討及び再構成、再解析を鋭意行う予定とする。
人間とコミュニケーションできる自律型知能ロボットに関する研究

研究成果は、(1)ロボットの視覚機能の実現、(2)コミュニケーションのためのロボットのbehavior(ふるまい)の実現、(3)behavior列を学習するメカニズム、の3つの部分的な課題からなる.(1)ロボットの視覚機能の実現本研究で想定する実世界は、コンピュータシミュレーションで実現できるほど単純ではなく、実際にロボットを作成する必要がある.研究の第一段階として、視覚を持ち、人間の行為を理解できるロボットを作成した.また,ロボットが視覚センサ等を通して人間の行為を理解する機能を実現した.最近、比較的単純な画像処理技術を基に、人間の行為を理解する研究が報告されているが、本研究でもそれらの研究に習い、できるだけ単純な画像処理で、人間の特定の行為を理解するアプローチをとった.(2)コミュニケーションのためのロボットのbehavior(ふるまい)の実現人間の行為を効率よく理解するためには、ロボット側から、理解の程度、または理解したい行為に関する情報を人間に伝えなければならない.このためのロボットの基本的なbehaviorについて考察し,実際にロボットにインプリメントした.(3)behavior列を学習するメカニズムロボットの目的は,人間とコミュニケーションしながら,人間が好むbehavior列を学習することである.ここでは,人間から与えられる報酬をもとに,behavior列を学習する方法について考察し,実験を通してその有効性を確認した.研究成果は、(1)ロボットの視覚機能の実現、(2)コミュニケーションのためのロボットのbehavior(ふるまい)の実現、(3)behavior列を学習するメカニズム、の3つの部分的な課題からなる.(1)ロボットの視覚機能の実現本研究で想定する実世界は、コンピュータシミュレーションで実現できるほど単純ではなく、実際にロボットを作成する必要がある.研究の第一段階として、視覚を持ち、人間の行為を理解できるロボットを作成した.また,ロボットが視覚センサ等を通して人間の行為を理解する機能を実現した.最近、比較的単純な画像処理技術を基に、人間の行為を理解する研究が報告されているが、本研究でもそれらの研究に習い、できるだけ単純な画像処理で、人間の特定の行為を理解するアプローチをとった.(2)コミュニケーションのためのロボットのbehavior(ふるまい)の実現人間の行為を効率よく理解するためには、ロボット側から、理解の程度、または理解したい行為に関する情報を人間に伝えなければならない.このためのロボットの基本的なbehaviorについて考察し,実際にロボットにインプリメントした.(3)behavior列を学習するメカニズムロボットの目的は,人間とコミュニケーションしながら,人間が好むbehavior列を学習することである.ここでは,人間から与えられる報酬をもとに,behavior列を学習する方法について考察し,実験を通してその有効性を確認した.
性ステロイド依存性腫瘍におけるプロゲステロン局所調節機構の解析

平成13年度は、ヒト乳癌(60例)及び卵巣癌(85例)における5α-reductaseの発現を免疫組織化学やPR-PCR等によって検索しその意義を検討した。その主な結果は下記の如くである。1.浸潤性乳管癌では、58%の症例で腫瘍細胞に5α-reductase type 1の発現が見られたが、type 2の発現は15%程度であった。2.乳癌における5α-reductase type 1の発現はandrogen receptor (AR)や3β-HSD、17β-HSD type5と相関しており、5α-reductas type 1が活性型アンドロゲンの局所合成・作用に重要な役割を担っていることが明らかとなった。3.5α-reductase type1の発現は腫瘍径や細胞増殖能と逆相関し、局所で産生されたアンドロゲンは腫瘍増殖を抑制している可能性が推察された。5α-reductaseがプロゲステロンの代謝に関与しているという明らかな所見は今回得られなかった。5.卵巣癌における5α-reductase type 1の発現はARと相関し、局所のアンドロゲン作用に関与している可能性が示唆されたが、プロゲステロン代謝への関与は明らかではなかった。平成12年度のin vitroの実験データからは5α-reductaseはプロゲステロン代謝の重要な酵素であると考えられた。しかしヒト乳癌や卵巣癌組織では、5α-reductaseはむしろアンドロゲンの局所合成・作用を調節する重要な因子であることが明らかとなった。今回の所見は、エストロゲン依存性腫瘍におけるアンドロゲンの局所的役割を考えるうえで大変重要な所見と思われた。平成12年度は、肝外末梢組織におけるプロゲステロン代謝経路を同定するために、3種類の培養細胞株(U937、HL60、THP-1)を用いて、プロゲステロン代謝産物の同定と代謝経路の検討を行った。検索したいずれの培養細胞においても、プロゲステロンは5α-pregnan-3,20-dioneに代謝された後、5α-pregnan-3β-ol-20-oneを経由して最終的に5α-pregnan-3β,6α-diol-20-oneに代謝された。従って5α-reductionが初めの反応であると考えられた。Northern analysisでは5α-reductase type 1のmRNAが検出された。またU937cellでは、一部のプロゲステロンは4-pregnen-20α-ol-3-oneに変換後代謝され、20α-reductionを初めのステップとする代謝経路の存在も同定された。クローニングの結果、この20α-reductionを行う酵素はhuman hepatic bile acid-binding proteinであることも明らかとなった。以上の所見から、プロゲステロンは肝外末梢組織において、主に5α-reductaseによって不活化されることが明らかとなった。そこで平成13年度は、乳癌及び子宮内膜癌病理組織標本を用いて5α-reductase isozymesの組織内発現を明らかにするとともに、各症例における他のステロイド合成酵素の発現パターン、estrogen receptor α,β及びprogesterone receptor A,Bの発現、臨床的予後等、種々の臨床病理的因子と比較し、5α-reductaseの局所的役割について総合的に解析する予定である。
消化管粘膜防御機構におけるion transportの役割と臨床応用への研究

平成13年度1.粘膜防御因子多重測定システムの全消化管への応用ラット十二指腸において確立した粘膜防御因子測定システムがラット空腸および大腸にも応用可能であることが明らかになった。2.抗酸粘膜防御機構および酸惹起性上皮細胞傷害の検討上記システムを用いて、十二指腸における管腔内酸に対する粘膜防御機構がcapsaicin感受性知覚神経および内因性prostaglandinによって制御されることが明らかになった。さらに、病態生理的管腔内pH(1.0-2.0)によって生体顕微鏡下で再現性のある上皮細胞傷害が惹起されること、sodium bicarbonate cotransporter (NBC)を介した細胞内重炭酸イオンの流入が抗酸粘膜防御に重要であることが明らかになった。上記システムにより、空腸においても管腔内酸やタウロコール酸により粘膜上皮細胞内pHが低下し、濃度依存性に細胞傷害性を生じることが明らかになった(投稿準備中)。また、大腸粘膜血流が管腔内pH6.0より増加し、この増加にcapsaicin感受性知覚神経が関与することが明らかになった(投稿準備中)。さらに十二指腸においてindomethacinにより内因性prostaglandin産生を阻害すると管腔内酸に対する傷害感受性が増加することが明らかとなった(投稿準備中)。ラット十二指腸においてNBCのisoformである膵型NBCがbasolateral膜に発現し、細胞内への重炭酸流入に重要な役割を持つことが明らかになった。平成14年度1.粘膜防御機構における知覚神経の検討ラット十二指腸における管腔内酸に対する粘膜防御機構がcapsaicin感受性知覚神経によって制御されること、知覚神経上のvanilloid receptorがacid sensorとして働き、proton濃度(pH)を感知して粘膜防御機構を作動させることが明らかになった。さらに、胃から大腸までvanilloid receptor-1が粘膜内および筋層内に発現することが明らかになった。この知覚経路は大腸における短鎖脂肪酸吸収にも関与することが明らかになった(投稿準備中)。さらに、酸に対する知覚神経経路は主に迷走神経求心路を介し、内因性経路も関与する可能性が明らかになった(投稿準備中)。2.空腸における粘膜防御機構の検討ラット十二指腸においてNBCのisoformである膵型NBCがbasolateral膜に発現し、細胞内への重炭酸流入に重要な役割を持つことが明らかになった。またCFTRがapical膜に発現し、重炭酸分泌に関与することが明らかになった。4.ヒト十二指腸粘膜におけるion transporterの発現倫理上の問題が未だ解決しておらず、検体採取が不十分で、十分な検討まで至らなかった。1.粘膜防御因子多重測定システムの全消化管への応用ラット十二指腸において確立した粘膜防御因子測定システムがラット空腸および大腸にも応用可能であることが明らかになった。2.抗酸粘膜防御機構および酸惹起性上皮細胞傷害の検討

上記システムを用いて、十二指腸における管腔内酸にたいする粘膜防御機構がcapsaicin感受性知覚神経および内因性prostaglandinによって制御されることが明らかになった。さらに、病態生理的管腔内pH(1.0-2.0)によってin vivoで再現性のある上皮細胞傷害が惹起されること、sodium bicarbonate cotransporter(NBC)を介した細胞内重炭酸イオンの流入が抗酸粘膜防御に重要であることが明らかになった。上記システムにより、空腸においても管腔内酸やタウロコール酸により粘膜上皮細胞内pHが低下し、濃度依存性に細胞傷害性を生じることが明らかになった(投稿準備中)。また、大腸粘膜血流が管腔内pH6.0より増加し、この増加にcapsaicin感受性知覚神経が関与することが明らかになった(投稿準備中)。さらに十二指腸においてindomethacinにより内因性prostaglandin産生を阻害すると管腔内酸に対する傷害感受性が増加することが明らかとなった(投稿準備中)。ラット十二指腸においてNBCのisoformである膵型NBCがbasolateral膜に発現し、細胞内への重炭酸流入に重要な役割を持つことが明らかになった。現在、他の消化管での発現を検討中である。1.粘膜防御機構における知覚神経の検討ラット十二指腸における管腔内酸に対する粘膜防御機構がcapsaicin感受性知覚神経によって制御されること、知覚神経上のvanilloid receptorがacid sensorとして働き、proton濃度(pH)を感知して粘膜防御機構を作動させることが明らかになった。さらに、胃から大腸までvanilloid receptor-1が粘膜内および筋層内に発現することが明らかになった。この知覚経路は大腸における短鎖脂肪酸吸収にも関与することが明らかになった(投稿準備中)。さらに、酸に対する知覚神経経路は主に迷走神経求心路を介し、内因性経路も関与する可能性が明らかになった(投稿準備中)。2.空腸における粘膜防御機構の検討十二指腸においてsodium bicarbonate cotransporter(NBC)を介した細胞内重炭酸イオンの流入が抗酸粘膜防御に重要であることを明らかにしたが、空腸においてはタウロコール酸惹起性上皮細胞傷害がCFTRおよびanion exchanger(AE)を介した重炭酸分泌を抑制することで軽減することが明らかになった(投稿準備中)。また、虚血下の空腸における粘膜防御に上皮細胞上のATP receptorが関与することが明らかになりつつある。またCFTRがapical膜に発現し、重炭酸分泌に関与することが明らかになった。
12・13世紀スコットランドにおけるナショナル・アイデンティティの形成

本研究は、12, 13世紀のスコットランドにおけるナショナル・アイデンティティの形成過程を分析したものである。同時代に発給された国王証書を詳細に調査した結果、国王宮廷に集う聖俗貴顕たちの間で、共通のアイデンティティの基盤となる王国共同体意識を生み出す関係として、広域的な政治的コミュニケーション関係が構築されていく過程が、具体的に明らかとなった。本研究の主軸は、国王宮廷の場における貴族の相互関係の詳細を明らかにすることであり、22年度はそのための情報の収集と整理を主としておこなった。第一に、出版済みの叙述史料を収集し、それらの記述の中から貴族間の直接的な相互関係をうかがい知ることのできる叙述を洗い出して整理した。第二に、宮廷の場における国王と貴族たちの協働の結果として生み出された証書史料のマニュスクリプトの調査のため、スコットランドおよびイングランドの国立文書館や国立図書館などを訪問し、史料状況の全体像を把握した上で、必要な史料のデジタル化の作業を進めた。22年度末の段階において、全体の7割程度の史料の収集を終えている。一方で、宮廷貴族に関する情報を網羅的かつ効率的に分析するためのデータベースの作成に着手し、出版済みの史料からの情報とマニュスクリプトの解読から得られた情報とをあわせて整理する作業を進めた。現在、史料収集の完了とデータベースの完成に向けての作業を着実に進行中である。本研究の中心課題は、12・13世紀のスコットランドの国王証書の分析を中心に、国王宮廷の場における諸侯たちの政治的コミュニケーションの様相を具体的に明らかにすることを通して、彼らの間にスコットランド人としての共通のアイデンティティが形成されていく過程を明らかにすることである。平成23年度は、昨年度に引き続き夏期に渡英し、スコットランド国立文書館やスコットランド国立図書館をめぐり、国王証書のマニュスクリプト(写本)の調査と収集をおこなう一方、実際に訪問できない文書館や図書館に所蔵されているマニュスクリプトのデジタル複写を依頼し、本研究の分析に必要な史料の収集作業を概ね完了した。収集した史料をもとに、諸侯の動態を具体的に探るための情報を抽出したデータベースの作成作業を進行中であるが、一部の史料収集が予定の期間通りに進まなかったために、データベースの完成には至っていない。したがって、いまだ統計的な分析に基づく全体像を描く段階にはきていないが、個々の事例からは、移動する国王宮廷が諸侯たちの人的結合関係のハブとしての機能を果たし、多層的な人的ネットワークを構築していく様子が垣間見える。最終的な結論を導くには、すべての史料の情報を総合的に分析した結果を待つ必要があるが、国王宮廷の場における政治的コミュニケーションが促進されていく中で、諸侯たちの間に、地域的な利害を越えた王国の諸侯としての立場が築かれていく過程を具体的に提示することができるとの見通しを得ている。
日本語学習者のためのノダ形式会話教材の開発に関する研究

本研究は、近年のグローバル化による日本語学習者の爆発的な増加に対応すべく、日本語会話に必須の形式であるノダ形式の語用論的機能を、日本語教育の立場から分析・考察する。そして、当該形式を「使えるようになる」「理解できるようになる」ための会話教材の作成を目的とする。具体的には、まず、日本語母語話者対象の調査を基に、主に話し言葉で使用されるノダの主要な実現形(以下、ノダ形式)の語用論的機能、および使用の性差を明らかにし、日本語母語話者の意思伝達方略を記述する。その成果を踏まえ、各習得レベルの日本語学習者が「使用すべき」「理解すべき」ノダ形式を記述し、当該形式を取り入れた自律型会話教材を作成・公開する。
DNA修復における損傷・ミスマッチ部位認識機構の1分子イメージング

DNA修復機構の素過程を1分子レベルで解明することを目的とし、大腸菌のヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復でDNA損傷除去に重要な役割を果たしているヘリケースを中心に、修復タンパク質群の遺伝子のクローニング、発現、精製を行い、蛍光標識、基質DNAの作製、1分子観察系の確立を行った。これらをもとに、DNA-タンパク質間、タンパク質-タンパク質間相互作用の1分子イメージングを行い、ヘリケースのDNAへの結合モード、会合状態を明らかにした。DNA複製・修復・組み換えは、種の遺伝的連続性を保証する最も重要な機構である。DNA複製が驚くほど複雑なのは、世代を通じてゲノムを保全するため、きわめて正確でなければならないことによると考えられている。現時点では、これらの機構でさまざまなタンパク質分子が実際にどのように相互作用しつつ、非常に複雑な反応を速やかに、そして絶妙の精度で触媒するのかについてのダイナミクスはわかっていない。そのダイナミックなプロセスの理解には、直接タンパク質が機能している現場を可視化することが鍵となる。そこで、本研究では、これまでの研究で主に取り扱ってきた大腸菌のDNAヘリカーゼUvrDがDNA損傷除去に重要な役割を果たしているヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復に焦点を絞り、蛍光標識したDNA結合タンパク質を用いて、DNA上でのタンパク質問の相互作用を1分子イメージング測定することにより、DNA修復機構の素過程をDNA上でのタンパク質問の相互作用を1分子レベルで解明することを目的とした。平成20年度は、ヌクレオチド除去修復に関係するタンパク質並びにミスマッチ修復に関係しているタンパク質の遺伝子をクローニングし、発現・精製を行った。また、現在1分子計測の分野で、タンパク質のガラス基板への非特異吸着を抑制するために標準的に用いられているポリエチレングリコール(PEG)コーティングに改良を加え、非特異吸着抑制能を10倍向上させることに成功し、DNAへのDNAヘリカーゼUvrDの結合モードの違いを、クリアに1分子レベルで観察することに成功した。さらに、UvrDのDNAへの結合分子数を明らかにするため、Cys欠失変異体を作製し、Cy5で高特異的に標識したものを用いて、一本鎖突出(dT12、dT20及びdT40)をもつ二本鎖DNA(18bp)に結合するUvrDの分子数をCy5の1分子褪色の段階数で定量し、UvrDのDNAへの結合分子数が、2分子あるいは3分子であることを明らかにした。そこで、本研究では、これまでの研究で主に取り扱ってきたDNAへリカーゼUvrDが大腸菌のDNA損傷除去に重要な役割を果たしているヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復に焦点を絞り、蛍光標識したDNA結合タンパク質を用いて、DNA上でのタンパク質問の相互作用を1分子イメージング測定することにより、DNA修復機構の素過程をDNA上でのタンパク質間の相互作用を1分子レベルで解明することを目的とした。平成21年度は、平成20年度にクローニング・発現・精製の系を確立したDNA修復タンパク質などについて、蛍光標識を試みた。DNAへリカーゼUvrDのDNAへの結合分子数の1分子イメージングについては、ATP存在下でも、結合分子数が複数であることを明らかにした。この実験によって得られた結果は、UvrDが単量体ではなく、多量体でヘリケース活性を発揮していることを示している。また、タンパク質問相互作用を1分子顕微鏡で測定するために、損傷が挿入されたDNAの作製を行い、ガラス基板やμmサイズのビーズに固定するためのDNA末端の修飾を行った。さらに、蛍光1分子イメージング顕微鏡の開発を行い、蛍光標識したDNA修復タンパク質が、損傷を挿入したDNAと相互作用している現場を可視化することができた。
光受容タンパク質の構造と機能の理論的研究

本年度の研究成果は大きく2つに分けられる。第一はロドプシンの波長制御である。視覚を司るロドプシンの吸収波長は、生物種によって異なり、生物の生息環境に応じて最適化されている。その吸収波長の制御機構の解析が、本研究の目的である。具体的にはアナゴロドプシンを対象に用いた。当該タンパク質は、従来のものとは異なる、長距離型の波長制御機構を持つことが近年報告された。本研究では、ホモロジーモデリングと分子動力学計算の手法を用いて、分子構造を構築および精製した後、量子力学計算手法を用いて吸収波長を算出した。結果これら結果に対して、主成分解析を応用し、制御機構を説明することに成功した。第二はチャネルロドプシンの構造モデルを構築したことである。当該タンパク質は、神経の情報伝達機構を解析する手段や、盲目マウスの視覚の復元などに用いられている重要なタンパク質にも関わらず、その分子構造が未知であったために、分子レベルでの解析や応用が十分に行われていなかった。本研究において私は、当該タンパク質にアミノ酸配列レベルで特徴的なパターンがあり、それを構造モデルの構築に応用できることを発見した。モデルされた構造に前項で述べた手法を応用したところ、実験的な光学的的特性が再現されたため、同モデルの精度が非常に信頼できることが示された。またこの後、同モデルをもとに行われた実験においても、モデルを支持する結果が得られている。本研究は生物の薄明視を司る光受容タンパク質ロドプシシの波長制御機構に関するものである。ロドプシンの吸収波長はその生物の光環境に応じた進化を遂げている。しかしながら分子レベルでどのように生物種毎に固有の光波長選択性を実現するメカニズムはまだ解明されていない。従って、ロドプシンの光制御機構の解明は分子レベルでの生物の進化と、人間にとっても重要な視覚の実現という2つのテーマと深く関連している。またロドプシンは構造が解けている数少ないGタンパク質共役受容体の一つとして、創薬の分野からも非常に重要なタンパク質でもある。具体的に本研究では、長距離性と相乗性という新規の波長制御メカニズムを併せ持つアナゴロドプシンに対して、理論的な計算手法を用いて解析を行った。我々は、ホモロジーモデリング、分子動力学計算、量子力学計算などの様々な計算手法を組み合わせることで、計算機上で上記の実験結果を再現することに成功した。更に上記の計算結果を解析し、波長制御はレチナールと呼ばれる発色団分子がアミノ酸置換によって、微細に構造変化を起こすことで実現されていることを示した。この構造変化は、これまでにモデルを使って定性的に示されてはきたが、実際のタンパク質中で波長と相関を持っていることを定量的に示すことに成功した。本研究は実験的に構造未知のタンパク質に対して、計算機上で実験データを再現することに成功した点、また高精度の計算を数百回以上実行し、統計的に信頼できるデータを同分野で初めて示した点、において今後の研究へ与える影響も大きい。