hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔前癌病変の癌化過程におけるサイトカインとその遺伝子発現の変化

白板症,乳頭腫などの前癌病変あるいは状態から癌化した症例の癌化前後の標本ならびに白板症,初期癌の標本を用い,癌化あるいは異形成の増加に伴うサイトカインの高圧の変化,その遺伝子発現の変化,およびランゲルハンス細胞(LC)数とHLA-OR抗原陽性LC数の変化を免疫組織化学的にあるいはin situ hybridization法で検索した。また,in vitroで口腔癌由来培養細胞(NA)を用い,サイトカインの細胞増殖にあたえる影響と癌遺伝子発現との関係を検討した。その結果,以下のような所見が得られた。1.癌化に伴ってTGF-αが増加し,逆にTGF-βが減少いくことが明らかとなった。また,白板症において異形成が高度になるにつれ,TGF-αが増加していた。このTGF-αの増加は,最近細胞増殖能の示標としてよく用いられているPCNAの発現の増加とよく一致していた。その他のサイトカイン(IFN-γ,TNF-α,IL-7など)の上皮における高圧の変化には,一定の傾向がみられなかった。2.サイトカインのうち癌化過程でもっとも変化のみられたTGF-αのmRNAの発現を検討したところ,癌化にともなってそのメッセージが増加していた。3.LC数およびHLA-DR抗原陽性LC数は,いずれも癌化すると減少する傾向が認められた。IL-1、IL-6、TGF-αなどのサイトカインが腫瘍の発生と維持に関与していることが示唆されている。一方、ランゲルハンス細胞(LC)も上皮における免疫応答の発現に重要な役割を担っており、最近では腫瘍免疫への関与がいわれている。さらにIFN-γ、TNF-αなどのサイトカインがLCのHLA-DR抗原発現を制御しているとの報告もみられる。そこで、前癌病変からの悪性化症例および癌組織におけるIL-1、TFN-γ、TGF-α、INF-αなどのサイトカインの局在を検討するとともに、LCおよびHLA-DR抗原の発現との関連を検索した。その結果悪性化症例では、癌化前にはTGF-αが認められなかったが、癌化後には深部増殖先端部に局在がみられた。それに対し、INF-γは癌化前には棟細胞上方にみられたが、癌化後の標本ではその局在が認められなかった。また癌組織では種々のサイトカインが実質、間質に染色されたが、それらの局在は症例によってさまざまであった。LCとサイトカインの局在との間には、悪性化症例および癌症例とも関連はみられなかった。しかし、HLA-DR抗原とサイトカインとの関連において、細胞浸潤が強くかつIFN-γ陽性の浸潤細胞が多い部位に近接した上皮にHLA-DR抗原陽性のLCが多く認められた。一方、培養細胞の増殖を抑制し分化の誘導を促進する作用をもつTNF-αを用い、口腔癌由来培養細胞(NAcell)の増殖と癌遺伝子の関連を検討したところ、TNF-αによってNAcellの増殖が抑制され、その際ras、myc遺伝子のmRNAの発現が抑制されることが判明した。この結果からrasおよびmyc遺伝子が癌の発生・増殖に関与する可能性が示唆された。以上の結果から、サイトカインはHLA-DR抗原の発現の制御および癌遺伝子の制御をとおして癌化の過程および癌の維持に関与する可能性が推測される。前年度,前癌病変からの癌化症例を用いてIFN-gamma,TGF-alpha,IL-1,TNF-alphaなどのサイトカインの癌化前後の高圧の変化,およびウンゲルハンス細胞(LC)とHLA-DR抗原発現とサイトカインとの関係を検討したところ,サイトカインのなかでTGF-alphaが癌化後に著明に増加すること,IFN-gammaがHLA-DR抗原発現に関与していることが示唆された.また,in vitroの実験で,TNF-alpha,TGF-beta,IFN-gammaによって癌細胞の増殖が抑制され,それが癌遺伝子c-myc,rosの発現抑制に関連していることが明らかになった.

そこで本年度は,同じ癌化症例および種々の異形成を示す白板症の標本を用いて以下の検討を行い,いくつかの興味ある知見を得た.1.癌化あるいは白板症においては異形成の程度が高度になるにつれ,TGF-alpha陽性細胞が増加し,逆にTGF-betaは減少していた.2.主としてTGF-alphaについてそのmRNAの発現と癌化との関連をin situ hybridization法で検討したが,これまでのところ明らかな変化はみられなかった.この点については手段上の問題点によることが考えられるので今後も継続して実験を行う予定である.3.癌化に伴ってLC数およびHLA-DR抗原陽性LC数の減少がみられた.4.TNF-alphaとTGF-betaおよびTNF-alphaとIFN-gammaの併用による癌細胞の増殖に対する硬化を検討したところ,それぞれ相加的あるいは相乗的に癌細胞の増殖を抑制した.また,それぞれの併用によってc-myc mRNAの発現も相加的あるいは相乗的に抑制された.以上の結果から,TGF-alpha,IFN-gammaなどのサイトカインは、HLA-DR抗原の発現,上皮細胞の増殖などを調節することによって癌化過程に何らかの形で関与していることが推測される.
植物病原糸状菌の病原性遺伝子の単離

病原性決定因子として宿主特異的毒素を生産するAlternariaalternata病原菌群について、以下の研究を行った。1.A.alternata病原菌の病原性遺伝子の単離:A.alternata病原菌群のうち主にナシ黒斑病菌(Japanese pear pathotype、AK毒素生産菌)を用いて、その毒素生産(病原性)遺伝子の単離を試みた。塩基置換を引き起こす突然変異誘発物質を用いて、AK毒素欠損(病原性失活)変異株を分離した。分離した毒素欠損株を親株の染色体DNAコスミドライブラリ-によって形質転換し、毒素回復株を選抜した。約7千株の形質転換体の毒素生産性を検定した結果、毒素回復株は検出されず、残念ながら毒素生産遺伝子の単離には致らなかった。しかし、同様な手法を用いて本菌のメラニン生合成に関与する3つの遺伝子を単離した。黒色色素メラニンは本菌の高い腐性能力に関与し、圃場における広い意味での病原性(寄生適応性)に重要な役割を果たす。単離した遺伝子群の解析から、メラニン生合成に関与する3つの遺伝子が本菌染色体DNAの約40kb領域内にクラスタ-として存在することを明らかにした。また、パルスフィ-ルド電気泳動によって本菌染色体を分画し、メラニン生合成遺伝子クラスタ-の構造をさらに解析するとともに、それぞれの遺伝子の発現様式について調査した。本研究で確立した種々の手法は、毒素生産の遺伝子研究に今後大きく貢献するものと考えられた。2.宿主特異的毒素の作用機構の解析:A.alternata病原菌群の病原性研究では、宿主特異的毒素の作用機構の解明も重要な課題である。本研究では、イチゴ黒斑病菌(strawberry pathotype)とトマト・アルタナ-リア茎枯病菌(tomato pathotype)のそれぞれAF毒素とAL毒素について解析し、これまで見いだされていなかった新たな作用を明らかにした。
糖尿病性微小血管障害での新規MAPキナーゼ、BMK1の生理的役割の解明と分子創薬

1)2型糖尿病モデルのOLETFラットにおいて、糖尿病性の合併症が明らかとなる52週齢で、腎臓の細動脈でのBMK1活性の上昇が認められた。2)マウスの左大腿動脈周囲にポリエチレンカフを留置し、炎症性血管障害モデルマウスを作成してBMK1の活性化を検討した。カフ留置による障害血管では新生内膜の肥厚が認められ、同部位では対照群と比べてBMK1の活性が高いことが確認された。3)RASMCにおいて、アルドステロンの刺激により濃度依存的なBMK1の活性化が認められ、硬質コルチコイド受容体拮抗薬のエプレレノンによってBMK1の活性化が阻害された。4)BMK1の上流にあるMEK5を遺伝子抑制するとBMK1の活性化は完全に阻害され、アルドステロン刺激によるRASMCの増殖は約50%抑制された。5)RASMCにおいて、血小板由来増殖因子(PDGF)の刺激により濃度依存的なBMK1の活性化が認められた。また、PDGF刺激によりアダプター蛋白Gab1とチロシンフォスファターゼSHP-2のリン酸化と結合が増加していた。PDGF刺激によりSHP-2の脱リン酸化酵素活性は上昇し、SHP-2阻害によりPDGF刺激によるBMK1活性化が抑制された。以上の結果より、糖尿病や炎症による血管障害ではBMK1の活性が上昇しており、in vitroの実験でもそれは裏付けられた。本研究でBMK1およびその関連分子は糖尿病性微小血管障害の分子創薬ターゲットになりうる可能性が示された。2)野生マウスの左大腿動脈周囲にポリエチレンカフを留置し、炎症性血管障害モデルマウスを作成してBMK1の活性化を検討した。3)RASMCにおいて、血小板由来増殖因子(PDGF)の刺激により濃度依存的なBMK1の活性化が認められた。PDGF刺激によりSHP-2の脱リン酸化酵素活性は上昇しており、酵素不活性のSHP-2-C/S変異体導入細胞をPDGFで刺激した場合、BMK1の活性化が有意に抑制されていた。PDGF刺激によるSHP-2脱リン酸化酵素の活性化が、BMK1の活性化に必要である可能性が示唆された。4)BMK1の上流にあるMEK5をadenovirus vectorにより遺伝子抑制するとBMK1の活性化は完全に阻害され、その際のPDGF刺激によるRASMCの遊走は約25%抑制された。BMK1およびその関連分子は糖尿病性微小血管障害の分子創薬ターゲットになりうる可能性がある。1)マウスの左大腿動脈周囲にポリエチレンカフを留置し、炎症性血管障害モデルマウスを作成してBMK1の活性化を検討した。2)RASMCにおいて、アルドステロンの刺激により濃度依存的なBMK1の活性化が認められ、硬質コルチコイド受容体拮抗薬のエプレレノンによってBMK1の活性化が阻害された。3)BMK1の上流にあるMEK5を遺伝子抑制するとBMK1の活性化は完全に阻害され、アルドステロン刺激によるRASMCの増殖は約50%抑制された。4)RASMCにおいて、血小板由来増殖因子(PDGF)の刺激により濃度依存的なBMK1の活性化が認められた。

また、PDGF刺激によりアダプター蛋白Gab1とチロシンフォスファターゼSHP-2のリン酸化と結合が増加していた。PDGF刺激によりSHP-2の脱リン酸化酵素活性は上昇しており、酵素不活性のSHP-2-C/S変異体導入細胞をPDGFで刺激した場合、BMK1の活性化が有意に抑制されていた。以上の結果より、糖尿病や炎症による血管障害ではBMK1の活性が上昇しており、in vitroの実験でもそれは裏付けられた。本研究でBMK1およびその関連分子は糖尿病性微小血管障害の分子創薬ターゲットになりうる可能性が示された。
舌圧測定と嚥下造影検査の同時記録によるパーキンソン病患者の嚥下機能評価

【目的】パーキンソン病(PD)の死因の第1位は肺炎であり,嚥下障害は肺炎発症のリスク因子と考えられている.嚥下障害はPD患者の半数以上にみられるが,自覚症状に乏しく,むせのない誤嚥も多いことから,精度の高い評価法によって早期に診断することが重要である.本研究では, PD患者を対象に舌圧測定と嚥下造影(VF)検査の同時記録により嚥下機能を定量的に解析することを目的とした.【対象と方法】対象はPD患者22名(男性12名,女性10名, 69.6±7.3歳)とし, VF検査と同時に嚥下時舌圧を記録した.舌圧は5箇所の感圧点を有する舌圧センサシート(SwallowScan, Nitta)を用いて測定した.測定部位は口蓋前方(Ch1),口蓋中央(Ch2),口蓋後方(Ch3),口蓋周縁(Ch4, Ch5)とし,各Chの舌圧最大値(kPa),舌圧持続時間(秒)を算出した. VF検査は,バリウム水溶液3ml, 5mlをそれぞれ命令嚥下で3回記録した. VF検査から口腔通過時間(OTT),咽頭通過時間(PTT),嚥下回数,口腔/咽頭残留,誤嚥を評価した.【結果】舌圧持続時間はOTTとの間に有意な相関を認めたが, PTTとの間に関連はみられなかった.口腔/咽頭残留および複数回の嚥下がみられる患者では,口蓋正中部の舌圧最大値が低かった. VF検査で誤嚥を認めた患者群の最大舌圧値は,誤嚥のなかった患者群と比較し全ての測定部位で低値であった.PD重症度(Hoehn-Yale)が高いほど舌圧最大値は低くなる傾向を示した.【考察】嚥下時の舌口蓋接触時間は口腔期における舌の食塊操作と関連することが示唆された.口蓋正中部の舌圧低下は,舌の筋力低下による食塊の駆出力に起因し,口腔残留や分割嚥下を生じると考えられた.誤嚥を認める患者やPD重症度が高い患者では,嚥下時舌圧が低下することから,嚥下障害の早期診断に有用である.【目的】パーキンソン病(PD)の死因の第1位は肺炎であり,嚥下障害は肺炎発症のリスク因子と考えられている.嚥下障害はPD患者の半数以上にみられるが,自覚症状に乏しく,むせのない誤嚥も多いことから,精度の高い評価法によって早期に診断することが重要である.本研究では, PD患者を対象に舌圧測定と嚥下造影(VF)検査の同時記録により嚥下機能を定量的に解析することを目的とした.【対象と方法】対象はPD患者22名(男性12名,女性10名, 69.6±7.3歳)とし, VF検査と同時に嚥下時舌圧を記録した.舌圧は5箇所の感圧点を有する舌圧センサシート(SwallowScan, Nitta)を用いて測定した.測定部位は口蓋前方(Ch1),口蓋中央(Ch2),口蓋後方(Ch3),口蓋周縁(Ch4, Ch5)とし,各Chの舌圧最大値(kPa),舌圧持続時間(秒)を算出した. VF検査は,バリウム水溶液3ml, 5mlをそれぞれ命令嚥下で3回記録した. VF検査から口腔通過時間(OTT),咽頭通過時間(PTT),嚥下回数,口腔/咽頭残留,誤嚥を評価した.【結果】舌圧持続時間はOTTとの間に有意な相関を認めたが, PTTとの間に関連はみられなかった.口腔/咽頭残留および複数回の嚥下がみられる患者では,口蓋正中部の舌圧最大値が低かった. VF検査で誤嚥を認めた患者群の最大舌圧値は,誤嚥のなかった患者群と比較し全ての測定部位で低値であった.PD重症度(Hoehn-Yale)が高いほど舌圧最大値は低くなる傾向を示した.【考察】嚥下時の舌口蓋接触時間は口腔期における舌の食塊操作と関連することが示唆された.口蓋正中部の舌圧低下は,舌の筋力低下による食塊の駆出力に起因し,口腔残留や分割嚥下を生じると考えられた.誤嚥を認める患者やPD重症度が高い患者では,嚥下時舌圧が低下することから,嚥下障害の早期診断に有用である.
異種界面活性剤吸着層を持つ共連続エマルションを利用した多孔性微粒子の孔径分布制御

任意の孔径分布を有する多孔性微粒子を調製し工業的に展開するためには,調製時の動的に変化する界面特性および素材の物理的特性が,孔形成に及ぼす影響を明らかにすることが不可欠である。そのためには,調製過程の液滴内でのエマルションの相互作用,動的に変化する物性,形成される孔の特性との関係を,界面科学的・速度論的検討をもとに解析し,多孔性微粒子の特性と操作条件との関係を一般化することが必要である。そのようなことから,平成29年度は,多孔性微粒子の孔形成のメカニズムと多孔性微粒子の調製技術の確立を目指した。その結果,添加条件と多孔性との関係を明らかにしたが,内部界面への各界面活性剤の吸着形態とそれぞれの相互作用の評価が難しく,技術の確立には至らなかった。そこで,平成30年度は,吸着形態と相互作用とを明らかにするとともに,調製技術の確立を目指した。具体的には,界面活性剤種および撹拌速度が,多孔性ポリマー微粒子の諸特性に及ぼす影響ならびに界面活性剤の界面への吸着状態を評価・検討した。その結果,界面活性剤種の組み合わせによって,多孔性微粒子の形状,細孔の形状,細孔径,比表面積,総孔体積に及ぼす影響を明らかにした。このことから,界面活性剤の混合による協同作用が多孔性ポリマー微粒子の孔形成に影響を及ぼしていることが示唆された。また,撹拌速度の増加とともに多孔性微粒子の粒径が変化し,また,多孔性微粒子内の細孔経も変化し増大した。このことから,モノマー液滴内に存在するミセルも膨潤とともに影響を受けることが確認された。以上のことから,界面活性剤種の組み合わせや撹拌速度によって細孔径の制御の可能性が示唆された。多孔性微粒子の孔径分布制御およびその最適操作プロセス設計のためには,多孔性微粒子の調製過程で発現する界面の特性と動的に変化する素材の物性が,孔形成に及ぼす影響を解析することが不可欠である。そこで平成27年度は異なる界面特性を持つ界面間の相互作用の界面科学的検討を行なった。主に界面活性剤の種類,組み合わせおよびその濃度が多孔性微粒子の構造および孔径に及ぼす影響と,それらの結果から孔径分布制御の可能性について検討した。油相に添加する界面活性剤種および濃度を段階的に変えて調製した多孔性微粒子は,いずれも形状は真球状であったが,表面には微細な凹凸と孔が形成されていることがわかった。表面の微細な凹凸は微小な粒子が集合して形成していることがわかった。この微粒子群のサイズは界面活性剤の濃度,種類により異なっていた。さらに,多孔性微粒子表面に形成されていた微細な孔は,表面に存在している微粒子群の間隙として形成されており,孔径は界面活性剤種および濃度により大きく異なっていた。これは,油相内でミセルを形成している界面活性剤のHLBの違いと界面活性剤の構造,ミセルの集合状態および数により,外水相からの水の取り込み量と分散安定性が異なり,孔形成に影響を及ぼしたためであると考えられる。また,孔形成を多角的に検討するために,分散相に重合性モノマーと非重合性溶媒を採用し,重合にともなう相分離による孔形成についても検討した。非重合性溶媒の鎖長と極性基の種類と有無を変化させた結果,溶媒種により微粒子の構造は異なり,マトリックスタイプの多孔性微粒子から単核の中空微粒子まで変化した。多孔微粒子の構造は孔内を充填する溶媒種と壁材種にも大きく依存することがわかった。研究計画では,平成27年度は「異なる界面特性を持つ界面間の相互作用の界面科学的検討」を実施する予定であった。そこで,異なる界面活性剤種,およびそれらの混合系における添加比率を段階的に変化させ,形成されるミセルと,その結果調製される多孔性微粒子の孔径,構造等に及ぼす影響を検討した。一連の結果から,液滴間の合一・分裂挙動に及ぼす影響を明らかにした。以上のことから,本研究課題の進捗状況はおおむね順調に進展していると評価した。そのためには,調製過程の液滴内での異種共連続エマルションの相互作用,動的に変化する物性,および,形成される孔の特性との関係を界面科学的・速度論的検討をもとに解析し,多孔性微粒子の特性と操作条件との関係を一般化することが必要である。そこで,平成27年度は異なる界面活性剤種が多孔性微粒子の幾何学的形状および構造に及ぼす影響を検討した。その結果,水の取り込み量やミセルの形成との関係を明らかにした。このようなことから,平成28年度は,孔径制御技術の確立を念頭に,調製過程での孔形成と界面活性剤種の影響をさらに詳細に検討した。具体的には以下のとおりである。まず,複数の異種界面活性剤を含むモノマー溶液をもとに重合を行い,多孔性微粒子を調製した。その際に,平成27年度で得られた知見をもとに,界面活性剤種,濃度,組み合わせを変化させ,孔径分布,粒径を測定し,孔径制御技術の可能性について検討した。

また,孔形成のメカニズムを検討するために,模式的な界面を形成し,孔径性について詳細に検討した。その結果,HLBおよび構造が異なる界面活性剤種を用いることで,多孔性微粒子の粒径,孔径,および孔体積制御の可能性を見出した。また,一方で,比較的親水性が高い界面活性剤の場合,調製初期の段階では水の取り込み量は増加するが,調製過程において時間とともに吸着部位および形態が異なり,結果として,閉孔を有する中空カプセルを形成することも確認した。界面活性剤種,濃度,および組み合わせによって,調製される多孔性微粒子の粒径・孔径分布制御の可能性を見出した。このことから,本研究の進捗状況は概ね順調に進んでいると評価した。任意の孔径分布を有する多孔性微粒子を調製し工業的に展開するためには,調製時の動的に変化する界面特性および素材の物理的特性が,孔形成に及ぼす影響を明らかにすることが不可欠である。そのためには,調製過程の液滴内での異種エマルションの相互作用,動的に変化する物性,形成される孔の特性との関係を界面科学的・速度論的検討をもとに解析し,多孔性微粒子の特性と操作条件との関係を一般化することが必要である。平成28年度までは異なる界面活性剤種が多孔性微粒子の幾何学的形状および構造に及ぼす影響について基礎的な検討を行い,多孔性微粒子の粒径,孔径,および孔体積制御の可能性を見出した。そこで,平成29年度は二種の界面活性剤による多孔性微粒子の調製を行うとともに,界面活性剤の吸着状態と相互作用とを明らかにすることで,孔形成のメカニズムと多孔性微粒子の調製技術の確立を目指した。具体的には,二種の界面活性剤を溶解したモノマー溶液を調製し,主に懸濁重合法により多孔性微粒子を調製した。調製した多孔性微粒子は孔径および多孔度を評価した。また,多孔性微粒子形成のメカニズムを明らかにするために,可溶化量についても検討した。その結果,添加条件と多孔性との関係を明らかにした。しかしながら,内部界面への各界面活性剤の吸着形態とそれぞれの相互作用の評価が難しく,技術の確立には至らなかった。そのため,次年度は吸着形態と相互作用とを明らかにするとともに,調製技術の確立を行う予定である。二種の界面活性剤による多孔性微粒子の調製が可能になり,その添加条件と多孔性との関係が明らかになりつつあるが,内部界面への界面活性剤の吸着形態と相互作用の評価が難しく解析に時間がかかっており,平成29年度では本技術の確立に至らなかった。そのため本研究の進捗状況を「やや遅れている」と評価した。そのためには,調製過程の液滴内でのエマルションの相互作用,動的に変化する物性,形成される孔の特性との関係を,界面科学的・速度論的検討をもとに解析し,多孔性微粒子の特性と操作条件との関係を一般化することが必要である。そのようなことから,平成29年度は,多孔性微粒子の孔形成のメカニズムと多孔性微粒子の調製技術の確立を目指した。その結果,添加条件と多孔性との関係を明らかにしたが,内部界面への各界面活性剤の吸着形態とそれぞれの相互作用の評価が難しく,技術の確立には至らなかった。そこで,平成30年度は,吸着形態と相互作用とを明らかにするとともに,調製技術の確立を目指した。具体的には,界面活性剤種および撹拌速度が,多孔性ポリマー微粒子の諸特性に及ぼす影響ならびに界面活性剤の界面への吸着状態を評価・検討した。その結果,界面活性剤種の組み合わせによって,多孔性微粒子の形状,細孔の形状,細孔径,比表面積,総孔体積に及ぼす影響を明らかにした。
ｉＰＳ細胞の分化抵抗性解析による安全性の確保

iPS細胞誘導の4因子とヒトあるいはラット由来の細胞表面抗原を2A配列でつないだレトロウイルスベクターの作成を作成した。このベクターを用いてiPS細胞の誘導効率と外来因子の量比の問題を検討したところ、Sox2の発現が低いこととOct3/4の高発現が多能性誘導に深くかかわることが明らかとなった。遺伝子発現解析から細胞外環境に対する反応性の違いが示唆され、ケモカインのCCL2を用いることでiPS細胞の樹立効率を上昇させることを見出した。また、核内因子に着目しWhsc1l1 variant1に3因子によるiPS細胞誘導の際に樹立効率を上昇させる活性があることを見出した。iPS細胞由来の細胞による腫瘍化の問題を解決するために分化抵抗性を示す細胞に着目し、その分子基盤の解明からiPS細胞とES細胞の差異を明らかにすることを目的としている。iPS細胞とES細胞の最も大きな違いは外来因子を導入したことである。そのためiPS細胞とES細胞の差異を生み出す原因の有力な手掛かりとなることが考えられる。そこで外来因子の不活性化の均一性や再活性化の有無そしてそれらと分化抵抗性との関係を解析しを行っている。iPS細胞誘導の各因子(Klf4, Sox2, Oct3/4, c-Myc)とヒトあるいはラット由来の細胞表面抗原を2A配列でつないだレトロウイルスベクターの作成を作成した。Sox2-high, Oct3/4-lowの細胞集団(低効率)とSox2-low, Oct3/4-highの細胞集団(高効率)を遺伝子導入後2日において分取しマイクロアレイをもちいて遺伝子発現を解析した。両者の比較から細胞外環境に対する反応性の違いが示唆され、ケモカインのCCL2を用いることでiPS細胞の樹立効率を上昇させることを見出した。さらに始原生殖細胞と体細胞リプログラミングの関係に着目し、始原生殖細胞からはリプログラミング因子のいずれの1因子でも多能性が誘導されることを明らかにした。この培養系を用いてマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行い、c-MycとL-Mycの違いを生み出す分子の候補遺伝子を同定した。iPS細胞由来の細胞による腫瘍化の問題を解決するために分化抵抗性を示す細胞に着目し、その分子基盤の解明からiPS細胞とES細胞の差異を明らかにすることを目的とした。そこで外来因子の挙動を生細胞においてシングルセルレベルでモニターするシステムを構築した。しかしながら外来因子の再活性化と分化抵抗性に関しては当初の予想に反して直接の関係がなさそうであることが明らかになった。一方で構築したシステムを用いて、iPS細胞誘導効率における4因子の最適比を明らかにした。さらに導入因子の量比がiPS細胞誘導効率を変化させる分子メカニズムについてマイクロアレイによる遺伝子解析を行った。その結果、細胞外環境に対する反応性が異なることが示唆された。特にGPCRのパスウェイが変動していることからGPCRファミリーの一つであるケモカインに着目し、iPS細胞の樹立効果を上げる因子としてCCL2の同定に成功した。さらに転写因子とエピジェネティックモディファイヤーに着目してc-Mycを除く3因子の導入の際にのみではあるが、Whsc1l1 variant1がiPS細胞の樹立効率を上昇させることを明らかにした。このようにTagベクターによる導入因子の可視化に成功したことから、新たな因子の同定にも成功するという成果を上げることができた。腫瘍化に関してはc-MycとL-Mycに着目し始原生殖細胞の脱分化系を用いてc-MycとL-Mycの違いを生み出す分子の候補遺伝子を同定した。iPS細胞由来の細胞による腫瘍化の問題を解決するために分化抵抗性を示す細胞に着目し、その分子基盤の解明からiPS細胞とES細胞の差異を明らかにすることを目的とする。これを用いて外来因子の不活性化の均一性や再活性化の有無そしてそれらと分化抵抗性との関係を解析している。iPS細胞誘導の各因子(Klf4, Sox2, Oct3/4, c-Myc)とヒトあるいはラット由来の細胞表面抗原を2A配列でつないだレトロウイルスベクターを作成した。このベクターを使うことによってそれぞれの因子の発現を細胞表面抗原に対する抗体とフローサイトメーターにより生細胞でモニターすることが可能となった。

このベクターを用いてiPS細胞の誘導効率と外来因子の量比の問題を検討したところ、Sox2の発現が低いこととOct3/4の高発現が多能性誘導に深くかかわることが明らかとなった。一方でDsRedを発現するレトロウイルスベクターとともに樹立したiPS細胞を用いて分化の抵抗性と外来因子の再活性化との関係について調べたところ、分化抵抗性を示す細胞においてDsRedの発現のみられるものはなく、分化抵抗性は外来因子の再活性化によるものではないことが明らかになった。導入遺伝子の発現をモニターするTag付きベクターを作成し、iPS細胞誘導効率における4因子の最適比を明らかにした。導入因子の量比がiPS細胞誘導効率を変化させる分子メカニズムについてマイクロアレイによる遺伝子解析を行った。その結果、細胞外環境に対する反応性が異なることが示唆された。特にGPCRのパスウェイが変動していることからGPCRファミリーの一つであるケモカインに着目し、iPS細胞の樹立効果を上げる因子としてCCL2の同定に成功した。さらに転写因子とエピジェネティックモディファイヤーに着目してc-Mycを除く3因子の導入の際にのみではあるが、Whsc1l1 variant1がiPS細胞の樹立効率を上昇させることを明らかにした。このようにTagベクターによる導入因子の可視化に成功したことから、新たな因子の同定にも成功するという成果を上げることができた。そのため達成度としてはおおむね順調に進展していると考えている。一方で、腫瘍化の問題に関しては始原生殖細胞と体細胞リプログラミングの関係についての解析からc-MycとL-Mycの差異を生み出す候補因子の同定に成功した。未分化性を維持する培養条件と分化誘導条件下それぞれで培養したiPS細胞をNanog-GFPの発現を指標に分取し、マイクロアレイ解析を行っている。候補因子を絞るためにオープンソースのデーターを含め他のアレイデーターとの比較検討を行っている。今後速やかに候補因子をピックアップする。また、Tag付きベクターによるiPS細胞誘導効率の最適比を明らかにした。外来因子と分化抵抗性に関しては当初の予想に反して直接の関係がなさそうであることが分かった。このように当初の計画を着実に進めているものの、計画からは予想外の結果も得られており、達成度としてはおおむね順調に進展していると考えている。一昨年度の成果から外来因子の再活性化と分化抵抗性に関しては当初の予想に反して直接の関係がなさそうであることが明らかになっており、今後は外来因子の再活性化にこだわらずにリプログラミングの結果どのように分化抵抗性細胞が生じるのかを解析していく。未分化性を維持する培養条件と分化誘導条件下それぞれで培養したiPS細胞をNanog-GFPの発現を指標に分取し、遺伝子発現の変化や腫瘍化との関連について解析を行う。これまでに腫瘍化に関してはc-MycとL-Mycの差異がかかわることが報告されている。
Ｎｅｃｄｉｎ－Ｓｉｒｔ１複合体によるミトコンドリア制御機構

ミトコンドリアの生合成や機能を制御する転写補因子PGC-1αと、ニューロンの分化や生存に関与するnecdinによる、ミトコンドリアの生合成と、ミトコンドリア障害からの神経の防御機構について検討した。NecdinはPGC-1αのユビキチンープロテアソーム経路を介した分解を阻害し、PGC-1αの安定化を正に制御し、ミトコンドリアの生合成と、ミトコンドリア障害に対する神経保護作用を促進する事が明らかとなった。ミトコンドリアは細胞におけるエネルギーの生産工場と例えられる重要な細胞内小器官である。これらミトコンドリアの機能破綻はアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患との関連性が近年、注目されている。本研究対象であるnecdinやSirt1はニューロンにおいて複合体を形成し、ニューロンの生存維持に極めて重要な役割を果たす事をこれまでに見いだしている。平成25年度はミトコンドリア機能のマスター因子であり、かつ、Sirt1の脱アセチル化活性の基質であるPGC-1αに注目し、これら3者の分子メカニズムの解明を目指した。申請時までに、PGC-1αとnecdinを共発現させるとPGC-1αの発現が増大する事を見いだしていたが、これがPGC-1αのユビキチン化による分解の抑制を介したものかを検討した。PGC-1αのユビキチンE3リガーゼであるRnf34をクローニングし、検討した結果、3者は安定的な複合体を形成するが、necdinはRnf34のユビキチン化活性を極めて強力に阻害した。この事により、necdinはPGC-1αの安定化に関与し、その活性を正に調整している可能性が見いだされたため、PGC-1αによるミトコンドリアの生合成に対するnecdinの効果を検討した。検討はnecdin欠損マウスを野生型と比較する事で行った。ミトコンドリアを構成する蛋白質やミトコンドリア量、または、ミトコンドリアDNAを定量的に検討した結果、necdin欠損マウスにおいて有意にこれらの量が減少していた。これらの事からnecdinは、PGC-1αを介しミトコンドリアの生合成を促進している事が示唆された。細胞小器官の一つであるミトコンドリアは、細胞内の主要なエネルギー産生の場である。脳やそれを構成するニューロンは、その活動に大量のATPを必要とし、ミトコンドリアで産生されるATPを細胞の生存や活性維持のエネルギー源としている。このため、ミトコンドリアの機能破綻はパーキンソン病をはじめとする神経変性疾患の病因となりうる。本研究では、ミトコンドリア機能のマスター因子であり、かつ、Sirt1の脱アセチル化活性の基質であるPGC-1αに注目し、これら3者の分子メカニズムの解明を目指した。これまでに、necdinがPGC-1αのユビキチン化の抑制を介した安定化を促進する事を見いだしたが、平成26年度においては、PGC-1αを介したニューロン内における生理的機能に焦点を当て、解析を行った。昨年度までに、PGC-1αの安定化を介したミトコンドリア生合成の促進作用をnecdinが有する証拠を得ていたので、本年度では、ミトコンドリアを介した抗酸化作用について検討を行った。ミトコンドリア呼吸鎖複合体に特異的に作用し、活性酸素種(ROS)の産生を促す薬剤と、necdin欠損マウス由来の胎児脳大脳皮質から調整した初代培養ニューロンを用い、検討した結果、necdinはROS産生の抑制と、ROS誘導性のアポトーシスを阻害する事が明らかとなった。また、これらの効果は、necdinがPGC-1αの安定化と、それに伴うミトコンドリアの生合成の促進を介している事も明らかとなり、necdinはミトコンドリアの生合成と、これを介した抗酸化作用を促進する事を新たに見いだした。前年度までに、necdinがPGC-1αのユビキチン化の抑制を介した安定化と、それに伴うミトコンドリアの生合成を促進する事が明らかとなっていたため、本年度は、ミトコンドリアの機能破綻が関与する神経変性疾患の一つであるパーキンソン病を例に取り、necdinと神経保護作用について検討した。パーキンソン病は実験的にモデル細胞やモデルマウスが確立しており、また、ミトコンドリアとの相関についても、多くの報告が存在する。

これらのパーキンソンモデルを活用し、necdin誘導性のミトコンドリア生合成の促進を介した神経保護作用の効果の確認するために、アデノ随伴性ウイルスによるnecdinの過剰発現系を組み合わせ、検討した結果、パーキンソンモデル細胞、マウス共に、necdinはPGC-1αの発現増加とミトコンドリアの生合成の促進を介したドーパミン作動性ニューロンの保護作用を示した。得られた知見はNature Communicationsに受理、掲載された。ミトコンドリアの生合成や機能を制御する転写補因子PGC-1αと、ニューロンの分化や生存に関与するnecdinによる、ミトコンドリアの生合成と、ミトコンドリア障害からの神経の防御機構について検討した。NecdinはPGC-1αのユビキチンープロテアソーム経路を介した分解を阻害し、PGC-1αの安定化を正に制御し、ミトコンドリアの生合成と、ミトコンドリア障害に対する神経保護作用を促進する事が明らかとなった。NecdinがPGC-1αの安定化を介したミトコンドリア生合成と、抗酸化作用を有する事を、現象面や分子メカニズムの観点から、広くアプローチ出来、様々なエビデンスを得る事が出来た。しかし、一方で、Sirt1を介した脱アセチル化によるPGC-1αの活性促進作用と、necdinの関係性については、いくつかの手法を用いて検討したものの、現時点で十分議論出来うる証拠を得る事が出来なかった。これは、これまで報告にあるPGC-1αとSirt1の相互作用が、脳以外の肝臓や筋肉をはじめとする末梢組織を用いた解析が主であり、脳やニューロンではその関係性が異なっている事も示唆出来る。予想外ではあったが、necdin単体で、PGC-1αを介したミトコンドリア生合成と機能促進作用を正に制御している事は、大きな発見であり、これまでの到達度としては十分進行していると判断している。総合生物これまで得られた知見から、今後は、ミトコンドリアの機能破綻が関与する神経変性疾患の一つであるパーキンソン病を例に取り、necdinと神経保護作用について検討する予定である。パーキンソン病は実験的にモデル細胞やモデルマウスが確立しており、また、ミトコンドリアとの相関についても、多くの報告が存在する。これらのパーキンソンモデルを活用し、necdin誘導性のミトコンドリア生合成の促進を介した神経保護作用の効果の確認と、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患の新たな治療的、予防的手法の探索を行う。研究実績の概要で述べた様に、necdinとPGC-1αにおける分子メカニズムの解析は計画通り進行し、達成する事が出来た。一方で、Sirt1を介した脱アセチル化に関する検討に関しては、期待されるPGC-1αの活性化制御の調節機構の結果が得られなかった。しかし、様々な実験手法を用いてミトコンドリアを量的に定量する事が出来、necdinがミトコンドリアの生合成を正に調節する事を示唆するデータを数多く得る事が出来た。平成26年度は研究計画通り、概ね期待される結果が得られたが、今後の実験計画において、これまで以上のマウスの購入が必要となる予定である。パーキンソン病モデルマウスはC57BL/6系統を用いるが、これまで研究に用いていたICR系統より高額である事を考慮し、本年度分の一部を、次年度の予算に加える事で、無理の無い予算執行計画が立てられると判断したため。また、予定していた海外での学会発表を次年度に変更したため、旅費等に関しても平成26年度の研究費に未使用額が生じた理由となっている。平成25年度の研究実績から、necdinはPGC-1αの安定化を介しミトコンドリアの生合成を促進する事が示唆された事から、この生理学的意義の検討を中心に研究を進める予定である。
多元素系新反応

安田氏は分子量50万以上のアイソタクチックポリ(メタクリル酸メチル)で単分散なポリマーの合成を行ない、得られたポリマーのアセトン溶液と単分散シンジオタクチックポリ(メタクリル酸メチル)のアセトン溶液を混合して得られるステレオコンプレックスを合成し優れた物性を有するポリマーを得た。藤原氏は希土類錯体のようなfーブロック遷移金属化合物だけでなく、V,pd金属のようなd-ブロック遷移金属化合物を用いたメタン等の活性化を行なった。またCO,CO_2を用いなくても酢酸合成が可能になっており新しい発見であるといえる。高井氏の研究は金属から有機化合物への電子移動反応における第2、第3の金属元素の添加による反応制御と新しい炭素ー炭素骨格合成反応の開発を目的としている。実際クロムとニッケル、亜鉛と鉛の組み合わせによる反応の促進を見出しており、さらに第2の金属の添加効果はマンガン金属を用いる反応においても見出されている。山田氏の研究目的はラジカル環化反応の立体選択性および位置選択性を予測することにより、ラジカル環化反応に適した合成中間体の分子設計を行ない、効率のよい多環式化合物の合成法を開発することにあり、既にいくつかの系で合成に成功している。小国氏は対称化合物の触媒的不斉非対称化炭素ー炭素結合形成を目的とし、新規キラルシッフ塩基配位子の分子設計を行ない、実際に不斉反応を実現した。穐田氏はヒドロトリスピラゾリルボレートを配位子とする種々の金属錯体を合成し新しい反応の開発を行なった。実際には金属錯体として鉄分子を用いて成功した。安田らは新しい希土類を用いてアイソタクチシチ-が高い,高分子量単分散ポリメタクリル酸メチルの合成に初めて成功した。これを既に合成してあるシンジオタクチシチ-の高い高分子量単分散ポリメタクリル酸メチルと混合することにより,ステレオコンプレックスが作成でき良好な物性が期待できる。藤原氏は遷移金属触媒によるメタンの活性化を経る研究を行い,VO(acac)_2/K_2S_2O_8/CF_3COOH系触媒を用いてメタンとCOの反応より,酢酸を97%の高収率で得た。またYb(OAc)_3/Mn(OAc)_2/NaClO/H_2O触媒系では水の中でも反応が進んだ。またV含有ヘテロポリ酸/K_2S_2O_8/CF_3COOH系触媒によりメタンやプロパンの反応を行うと容易に部分酸化が進行し相当するエステル類が高収率で得られた。高井氏らはクロム(II)やマンガン,亜鉛などの低原始価金属から有機化合物への電子移動を触媒量で制御できる金属元素を見いだし,新しい炭素-炭素結合生成反応の開発を目的としているが,本年は主にクロム(II)の還元力の再検討を行った。α-ハホウ酸エステルをTMEDAとLiIを添加して塩化クロム(II)で還元すると,共存しているアクリル酸エステルへの分子間1,4-付加反応が高収率で進行した。藤田氏は3次元的に閉じた構造を遷移金属と多座配位子からの自己集合により構築し,その内部孤立空間での新規な現象を探索することを目的として研究を行っているが,本年は新しい3座配位子(L)を用いてM6L4型錯体を合成した。またこれらの錯体の分子認識能について検討したところ,錯体内部空孔にカルボラン4分子が包接されることも分かった。山田氏はMM2遷移状態モデルを用いて連続環化反応に適したステロイドやビタミンD3等の多環式天然物合成を行い,MM2計算が非常に有用なことを示した。1)希土類金属錯体を重合開始剤として用い,メタクリル酸エステルのアイソタクチック重合,トリメチレンカーボネートのリビング重合,フッ素化アクリル酸エステルのリイング重合による高分子量単分散ポリマーの合成を行った。[安田]2) f-ブロック遷移金属である希土類錯体のメタンとCOあるいはCO_2との反応による酢酸合成の他,Yb-イミンジアニオン錯体および新しいV錯体の触媒活性について,種々の反応で検討した。生成物の選択性はガスクロマトグラフィーで行った。[藤原]3)クロム(II)塩やマンガン,亜鉛の金属化合物から有機化合物への電子移動を触媒できる第3の金属を見出し,新しい炭素結合形成に利用した。[高井]4) MM_2遷移状態モデルを用いて計算を行い,連続ラジカル環化反応によるステロイドやビタミンD_3の合成を行うもっとも最適条件を求めた。[山田]5)キラルシッフ塩基のチタン錯体を合成してアルデヒドの不斉シリルシアノ化,不斉アリル化,ジケテンの不斉付加等に対する触媒作用を調べる。[小国]6)ヒドロトリスピラゾリルボレート(Tp)を配位子とする鉄・コバルト・ニッケル等のTpMR型錯体の構造および反応性に関する研究を行い,特に14電子錯体である鉄錯体の特性を明らかにした。[穐田]安田氏は分子量50万以上のアイソタクチックポリ(メタクリル酸メチル)で単分散なポリマーの合成を行ない、得られたポリマーのアセトン溶液と単分散シンジオタクチックポリ(メタクリル酸メチル)のアセトン溶液を混合して得られるステレオコンプレックスを合成し優れた物性を有するポリマーを得た。

またCO,CO_2を用いなくても酢酸合成が可能になっており新しい発見であるといえる。高井氏の研究は金属から有機化合物への電子移動反応における第2、第3の金属元素の添加による反応制御と新しい炭素ー炭素骨格合成反応の開発を目的としている。実際クロムとニッケル、亜鉛と鉛の組み合わせによる反応の促進を見出しており、さらに第2の金属の添加効果はマンガン金属を用いる反応においても見出されている。山田氏の研究目的はラジカル環化反応の立体選択性および位置選択性を予測することにより、ラジカル環化反応に適した合成中間体の分子設計を行ない、効率のよい多環式化合物の合成法を開発することにあり、既にいくつかの系で合成に成功している。小国氏は対称化合物の触媒的不斉非対称化炭素ー炭素結合形成を目的とし、新規キラルシッフ塩基配位子の分子設計を行ない、実際に不斉反応を実現した。穐田氏はヒドロトリスピラゾリルボレートを配位子とする種々の金属錯体を合成し新しい反応の開発を行なった。実際には金属錯体として鉄分子を用いて成功した。
円偏光蛍光シグナルのプラズモン増強メカニズム解明による高感度検出システムの構築

金属NPs表面に誘起される電場がキラル分子との励起子相互作用からキラリティシグナル増強が生じるメカニズム解明の研究を行い、g値が小さい電子許容遷移シグナルの検出感度向上のためのLSPR増強分光分析の基礎概念を構築することを目的とした。得られた知見を以下に示す。電子遷移吸収・蛍光に影響を与える因子は被電場増強分子により異なり、LSPR・NSET・量子収率・分子間エネルギー移動の因子が複雑に協同することが明らかとなった。プラズモニックNPsのスペーサー長や形状異方性を導入したAgNPsとの相互作用から最大で約1.6倍のシグナル増強に成功し、LSPR効果によるキラル光学特性増強の可能性を実証した。発光性キラル化学種の中には円偏光発光(CPL)を示す化合物が存在する。有機系CPL材料は無機材料に比べて材料の柔軟性、分子設計の自由度、多様な材料加工・操作性および比較的安価であるという利点から注目されている。有機CPL化合物の研究開発に関して、近年多くの注力が注がれているのが発光効率(量子効率:Φ)と円偏光度(glum値)のtrade-offの改善である。CPL強度の定量的な評価の指標である、Kuhn非対称性因子(glum = 4|m||μ|(|m|2+|μ|2)-1cosθ)の定義から、通常、高いΦを得ようとする場合、電気双極子(μ)許容遷移を必要とするが、この場合glum値が<10-3程度の小さい値となる。一方、大きなglum値は、磁気双極子(m)許容遷移から10-1程度の大きな強度が得られるが、発光強度は減少する。したがって、高いΦと高いglum値を兼ね備えた材料を実現するために、1)立体構造と光遷移を加味した複雑な分子設計、2)化学修飾・超分子構造形成による光学的性質兼具を可能にする試みがなされている。しかしこれらの手法は化合物限定的なものであり、増幅率も数倍程度しか見込めない。そこでこれらに代わる改善法として3)金属ナノ粒子(NPs)-有機分子hybridによるシグナル増強法を提案している。本課題は、このLSPR-CPL増強の詳細なメカニズムを明らかとし、高感度CPL分析技術の確立を目指す。初年度はLSPR増強メカニズムの基本となるNPsとキラル分子の相互作用の研究を行い、CPL増幅率向上の検討を行った。LSPRと隣接する分子の励起子のカップリングにより蛍光寿命・glumを共に増強できることが明らかとなった。有機色素キラルJ凝集体と単一粒子径NPs(10 nm)が近接して配置された系を構築し、そのキラル分光特性から低量子収率の蛍光シグナルおよびglum値が510倍の飛躍的増強が得られた。発光に寄与する吸収はLSPRと励起子が結合した吸収が関与していることが励起スペクトルの測定から示唆された。この増強的相互作用を示す系は、効率的な円偏光発光システムになる可能性を秘めており、NPs構造をより精密に制御することで、キラル光学機能特性の増強作用効率の向上を検証している。NPs粒子の電場増強効果は、NPsと対象キラル物質との空間的配置が変化するようなサイズ、形状、媒質の誘電率および集合体形態に強く依存する。つまりはナノ粒子形状による発光強度および励起子キラリティのマニュピュレーションが可能なことを示唆されている。そこでseed-mediated-photoconversion法を用い、NPs表面保護剤としてクエン酸を加えた球形ナノ粒子のコロイド水溶液に可視光を照射することで、アスペクト比の異なる貴金属ナノ粒子の制御を行った。詳細な構造や複合体形成の有無の知見を得るため走査型プローブ顕微鏡測定で直接観測し確認を行った。有機CPL材料は無機材料に比べて材料の柔軟性、分子設計の自由度、多様な材料加工・操作性および比較的安価であるという利点から注目されている。そこでこれらに代わる代替案として3)金属ナノ粒子(NPs)-有機分子hybridによるシグナル増強法を提案している。本課題は、このLSPR-CPL増強の詳細なメカニズムを明らかにし、高感度CPL分析技術の確立を目指す。初年度はLSPR増強メカニズムの基礎となるNPsとキラル分子の相互作用の研究を行い、蛍光・CPL増幅率向上の検討を行った。H28年度は貴金属粒子の形状を変化させ隣接する分子の励起子とのカップリングのLSPR光学特性依存性について調査した。

有機色素キラルJ凝集体と単一粒子径NPs(10 nm)が近接して配置された系を構築し、そのキラル分光特性から低量子収率の蛍光シグナルおよびglum値が510倍の飛躍的増強が得られた。発光に寄与する吸収はLSPRと励起子が結合した吸収が関与していることが励起スペクトルの測定から示唆された。この増強的相互作用を示す系は、効率的な円偏光発光システムになる可能性を秘めており、NPs構造をより精密に制御することで、キラル光学機能特性の増強作用効率の向上を検証している。NPs粒子の電場増強効果は、NPsと対象キラル物質との空間的配置が変化するようなサイズ、形状、媒質の誘電率および集合体形態に強く依存する。そこでアスペクト比の異なる貴金属ナノ粒子とキラル分子と相互作用させ量子収率、glum値などの光機能増強を球形ナノ粒子と比較した。アスペクト比の異なる貴金属ナノ粒子はSeedless法2)により調製した。詳細な構造や複合体形成の有無の知見を得るため走査型プローブ顕微鏡測定で直接観測し確認を行った。被増強電場分子と貴金属ナノ粒子の濃度依存性がLSPR共鳴波長とOGの蛍光波長のオーバーラップによる再吸収、FRETによるエネルギー損失およびLSPR増強効果の比率を変化させることが示唆された。有機CPL材料は、分子設計の自由度、多様な材料加工・操作性および比較的安価であるという利点から注目されている。有機CPL化合物の研究開発に関して、近年多くの注力が注がれているのが発光効率(Φ)と円偏光度(glum値)のtrade-offの改善である。CPL強度の定量的な評価の指標である、Kuhn非対称性因子の定義から、通常、高いΦを得ようとする場合、電気双極子(μ)許容遷移を必要とするが、この場合glum値が<10-3程度の小さい値となる。一方、大きなglum値は、磁気双極子(m)許容遷移から10-1程度の大きな強度が得られるが、発光強度は減少する。したがって、高いΦと高いglum値を兼ね備えた材料を実現するために、1)立体構造と光遷移を加味した複雑な分子設計、2)化学修飾・超分子構造形成による光学的性質兼具を可能にする試みがなされている。しかしこれらの手法は化合物限定的なものであり、増幅率も数倍程度しか見込めない。そこでこれらに代わる代替案として3)金属ナノ粒子(NPs)-有機分子hybridによるシグナル増強法を提案している。本課題では、金属NPs表面に誘起される電場がキラル分子との励起子相互作用からキラリティシグナル増強が生じるメカニズム解明の研究を行い、glum値が小さい電子許容遷移シグナルの検出感度向上のためのLSPR増強分光分析の基礎概念を構築することを目的とした。得られた知見を以下に示す。(1)電子遷移吸収・蛍光に影響を与える因子は被電場増強分子により異なり、LSPR・NSET・量子収率・分子間エネルギー移動の因子が複雑に協同することが明らかとなった。(2)プラズモニックNPsのスペーサー長や形状異方性を導入したAgNPs@SiO2との相互作用から最大で約1.6倍のシグナル増強に成功し、LSPR効果によるキラル光学特性増強の可能性を実証した。金属NPs表面に誘起される電場がキラル分子との励起子相互作用からキラリティシグナル増強が生じるメカニズム解明の研究を行い、g値が小さい電子許容
糖とインスリンによる腎血流生理調節と高血圧発症機序

糖とインスリンに着目し、腎血流調節作用と高血圧発症機序を明らかにした。麻酔下ラットの腎局所血流の反応をレーザードップラー法で検討した。50%ブドウ糖の急性静脈内投与により血糖は上昇し腎髄質血流が約20%減少した。この反応は活性酸素消去剤Tironの腎髄質間質内前投与により消失した。一方、50%ブドウ糖の静脈内投与後にインスリンを腎髄質間質内投与しても腎髄質血流は変化しなかった。また50%ブドウ糖を直接腎髄質間質に投与しても腎髄質血流は低下した。したがって、血糖の上昇は腎髄質局所の酸化ストレスにより腎髄質血流を減少し、血圧を上昇させることが示唆された。次にDahl食塩感受性高血圧(DahlS)ラット、Dahl食塩非感受性高血圧(DahlR)ラットおよびSprague-Dawley(SD)ラットに10%ショ糖を飲水ボトルで2週間投与したところ、DahlSラットとDahlRラットでは投与1週より有意な血圧上昇がみられたが、SDラットでは2週にわたり有意な血圧上昇はみられなかった。DahlSラットの血圧上昇はアンジオテンシン受容体拮抗薬で抑制された。尿中の過酸化水素の排泄はDahlSラットとDahlRラットではショ糖投与後有意な増加があったが、SDラットではごく軽度に留まった。また、DahlSラットでの血圧上昇と尿中過酸化水素排泄の増加はNa-glucose cotransporter(SGLT)の阻害薬phlorizinの投与により抑制された。さらにPhlorizinの腎髄質間質投与は50%ブドウ糖の急性静脈内投与による髄質血流の低下を抑制した。以上のことから、ショ糖負荷による血糖上昇はレニン・アンジオテンシン系やSGLTを介して腎酸化ストレスを亢進し、腎髄質血流を減少、ナトリウムの再吸収を亢進し高血圧発症に関与していることが示唆された。糖尿病ではしばしば高血圧の合併があり、降圧は糖尿病性腎症に対し絶大な腎保護効果がある。したがって本研究では糖尿病の病態を形成する最大の因子である糖とインスリンに着目し、腎血流調節作用と高血圧発症機序を明らかにすることを目的とした。糖とインスリンの腎血流調節作用:麻酔下ラットの腎局所血流を光ファイバーを用いたレーザードップラー法で検討した。腎局所の血流変化メカニズムを明らかにするために、腎間質にカテーテルを挿入し薬液を投与した。50%ブドウ糖を静脈内投与し、血糖上昇に対する腎局所血流の変化を観察した。その結果、50%ブドウ糖の急性静脈内投与により血糖は上昇し腎髄質血流が約20%減少した。この腎髄質血流低下は活性酸素の消去剤であるTironの腎髄質間質内前投与により消失した。この時、血圧は有意ではなかったが上昇傾向を示した。糖による高血圧発症と腎障害:Dahl食塩感受性(DahlS)ラットにショ糖を経口負荷すると、血糖の上昇とともに昇圧と尿蛋白の増加がみられた。このモデルにアンジオテンシン受容体拮抗薬を持続皮下投与したところ、降圧とともに尿蛋白が減少し、レニン・アンジオテンシン系の関与が示唆された。