hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多国籍企業によるサプライチェーンの貿易投資政策への影響：国際政治経済学アプローチ

当該研究テーマに関する論文を出版、Discussion paperとして公表した。しかしながら、海外事業活動基本調査の個票を利用した研究については、様々なデータの矛盾点の整理、クリーニング、及び企業による報告バイアスの有無の統計的な分析を完了したものの、仮説を指示する結果を得られなかったため、仮説の再設定を行う必要が生じた。また、共同研究者であるRotunno氏の来日による共同作業が2018年度に実施できなかったこともあり、若干進捗が遅れている。本研究テーマ関連論文の出版にむけた作業の一方で、海外事業活動基本調査の個票を利用した研究については、共同研究者であるRotunno氏とデータ分析の共同作業を実施、実証分析結果を踏まえつつ、その背後にあるメカニズムにつき、同じく共同研究者であるBlanchard氏と研究打ち合わせを行う。これらを踏まえて、2019年度末までに初稿を仕上げる。サプライチェーンの深化と貿易構造に関する論文として、Heckscher-Ohlin: Evidence fromvirtual tradein value added及びOn the stability of intra-industry tradeを出版。これらのサプライチェーンに関する研究を基盤として、本研究課題の最大の焦点である外国直接投資個票データを利用したサプライチェーンと貿易自由化との因果関係についての研究に着手した。具体的には、海外事業活動基本調査個票データの経済産業省への申請・受理の後、データの中身の整合性のチェックを実施した。2017年度末には海外研究協力者であるRotunno氏(Aix-Marseille School of Economics)の来日による共同作業を行った。緻密な研究を行うべくデータの整合性の精査を進めた結果、多くの欠損値や同一企業番号が複数の異なると思われる企業に付されていることなど様々な矛盾点を発見、同矛盾点の解決法を探った。これらの問題点を踏まえて現在データクリーニング作業を行っている。また、特に本研究の統計的分析において重要となってくる企業側による報告バイアスによる疑似因果関係の発見に陥らないよう、企業による報告バイアスの有無を統計的に分析している。サプライチェーンの深化と貿易構造に関する論文(海外研究協力者であるRotunno氏などとの共著)を出版。同時に、本研究課題の中心となる研究の主要なデータである海外事業活動基本調査の個票を経済産業省に申請、ほぼ予定通りデータの提供を受け、データの中身を精査した。様々なデータの矛盾点を整理、データのクリーニング、及び企業側による報告バイアスによる疑似因果関係に発見に陥らないよう、企業による報告バイアスの有無を統計的に分析。ほぼ順調に推移している。本研究課題の中心たる外国直接投資個票データを利用したサプライチェーンと貿易自由化との因果関係についての論文につき、共同研究者であるRotunno氏とデータ分析の共同作業を実施、実証分析結果を踏まえつつ、その背後にあるメカニズムにつき、同じく共同研究者であるBlanchard氏と研究打ち合わせを行う。これらを踏まえて、2018年秋までに初期的な結果を見出し、2018年度末までに初稿を仕上げ、中間報告を学会やセミナーなどにて発表する。海外研究協力者であるRotunno氏の来日による共同作業の航空運賃や滞在費などを研究代表者の所属機関における他の研究費より捻出したため、また同じく海外研究協力者であるBlanchard氏が家族の事情により来日できなかったことより、差額が生じた。両氏は2018年度に来日して共同作業を行う予定。共同作業のための海外研究協力者Rotunno氏及びBlanchard氏の来日が2018年度に実施できなかったこと、また研究代表者の出張旅費を研究代表者の所属機関における他の研究費より捻出したことやPCなど消耗品の購入を延期したため、残額が生じた。次年度においては、旅費・消耗品・人件費を中心に支出する。
発達期における構音障害の診断法ー音声同期圧力分布システムの臨床応用ー

平成30年度は、平成27年度平成29年度までに研究した音響分析装置の活用を行い、実際の患者に活用し、検査を行った。本年度は従来検査を行うことが困難であった障害を持つ小児に対しての検査を行った。発達障害の程度にもよるが、軽度の発達障害を持ち、両側性口唇口蓋裂を持つ患者に対して検査を行ったところ、健常小児と比較して時間を要したが検査を遂行することができた。発達障害を合併する口唇口蓋裂患者と、合併疾患のない口唇口蓋裂児の舌摂食部位に関しては大きな変化は見られず、舌の動態は発達の程度ではなく、口蓋形態に大きく影響を受けるのではないかと考えた。この症例について、平成30年日本小児歯科学会(静岡)にて発表を行った。また、口唇口蓋裂患者の保護者の抱える問題点を再度抽出し具体的支援につなげるため、当大学外来に受診する患者の調査を再度行った。当科に来院する初診患者の平均年齢は4歳11カ月であったが、口唇口蓋裂患者の平均は1歳4カ月であり、口唇口蓋裂児の初診時年齢は非常に低かった。口唇口蓋裂は口腔内の形態異常があるため、早期からの口腔管理が形態・機能の発達に必要であり、歯科受診が必要であることが少しづつ保護者にも理解されてきたためと思われる。当科における初診患者の調査に関しては、平成29年に日本小児歯科学会にて発表を行い、現在投稿準備中である。さらに、初診状況を口唇口蓋裂患者のみで詳細に検討を行った。健常小児の初診時の問診に加えて、舌圧が関連すると考えられる哺乳の状況や発語についてをアンケート方式で調査を行った。この結果については本年度口蓋裂学会にて発表を行う予定である。小児の構音は身体の成長、神経系の発達や巧緻性の発達に伴い成長していくと考えられている。今回我々は構音器官の1つである口腔に着眼し、小児の構音と口腔の成長との関係を明らかにするために分析、検討を行った。今回対象としたのは健常成人(第三大臼歯の萌出しておらず、永久歯に欠損がない成人男性)健常小児(乳歯列完成期、上顎前歯部交換期、上顎前歯萌出完了期)、器質的構音障害患者(舌小帯強直症、口唇口蓋裂)、機能的構音障害患者の4グループに分けて検討した。被験音は、/i/,/s/,/sh/の3音とした。母音である/i/に関しては単音での録音、子音である/s//sh/は母音/a/を子音の前後につけて録音することで子音の特徴をより明確にすることができた。被験者には同じ単語を5回発音させ、5回それぞれに対して音響分析を行った。音響分析は不偏推定法によるケプストラム対数スペクトラムによりパワースペクトラムの描出を行った。描出したパワースペクトラムの最大エネルギー部位を算出し5回の平均を被験者のデータとした。1)健常成人での比較:母音/i/ではどの被験者でのピークが複数見られた。年齢別に検討したところ、増齢に伴いピークの値に変化が出る可能性が示唆された。今後は被験者を増やして再検討する予定である。2)健常小児においては、乳歯列期、上顎前歯部交換期では/s//sh/のピーク値には大きなばらつきがみられたが、/i/に関してはばらつきが非常に少なかった。3)器質性構音障害患者に関しては人数が非常に少なく検討中である。音響システム:構音分析システムに関してはほぼ問題なく稼働している。小児と成人の両方を的確に診断する必要性があるため、設定の一部変更を行い現在は問題ない。今後は器質的、機能的構音障害患者の録音を行うためさらに微細な変化をとらえる必要性がある。構音障害患者に関しては被験者は少ないが健常小児との違いが明らかとなってきているため大きな問題とはならないと考える。被験者の確保:被験者に関しては問題なく確保ができている。当院では器質的構音障害を併発しやすい口唇口蓋裂児のための外来があるため、外来診療時に録音をおこなうことは比較的容易であると考える。機能的構音障害患者に関しては確保がやや困難であるが、筋機能訓練を行っている患児などを対象に構音障害がないかを確認し録音を行っていく予定である。センサーシステム:購入予定であったセンサーが予算不足のためセンサーの使用についての再検討を行った。構音時の舌圧を測定するためには非常に小さい圧力も測定することが必要となる。ニッタ社ではなく共和電業のセンサーは比較的小さい圧力測定が可能であること、また温度変化などにも強いため使用することとした。今回共和電業社製のもので実験を行ったところセンサーケーブルを十分長くすることで口腔内と測定システムをつなぐことが可能であると判断し、使用することとした。使用するセンサーの再検討、測定圧力やセンサーを付ける位置の検討を行ったことで、今回やや予定より遅れてはいるが、センサー使用の環境が整ったため今後は問題な医と考える。小児の構音発達は神経系の発育・形態学的な発育だけではなく、機能的な発達が重要であると言われている。昨年度は健常成人・健常小児・器質性構音障害・機能性構音障害の4つに関してそれぞれ検討を行った。

本年度は特に器質的構音障害の代表的疾患である舌小帯強直症、口唇口蓋裂についての検討と機能性構音障害である側音化構音障害を重点的に検討した。それぞれの疾患に関して成人症例と小児症例の資料を採取し、疾患ごとの検討を行った。器質的構音障害である舌小帯強直症と口唇口蓋裂に関しては小児患者(乳歯列完成期)は音のひずみや周波数の乱れが顕著にみられたが、成人患者では小児と同様に器質的問題があるにも関わらずひずみや周波数の変化が顕著には見られなかった。分析した3種類の音(/i//s//sh/)別に検討したところ、小児患者ではすべての音に関して顕著な周波数の変化がみられたが、成人患者では/sh/音では周波数の変化が非常に少なく、/s/音に関しては周波数の変化が最も大きかった。機能性構音障害である側音化構音に関しては小児患者、成人患者ともにひずみは大きく顕著にみられた。分析した3種類の音(/i//s//sh/)に関して検討したところ、小児患者、成人患者ともに/i/で最も周波数の変化が大きかった。また、小児・成人患者ともにすべての症例で第一フォルマントと第二フォルマントの差が大きいという結果となった。側音化構音に関しては、聴覚印象でカ行がタ行に置換される傾向がみられた。音響分析システムに関してはすべての健常児、器質的、機能的構音障害すべての症例で対応することができている。前年度小児患者と成人患者の変化を顕著に診断するために改良を行った。そのシステムで構音障害の検討を行ったところ、機能性構音障害に関しては問題なく検討することができたが、器質的構音障害患者に関しては音のひずみが大きく、若干の調整は必要ではあったが、現時点で問題なく分析が可能な設定になっている。舌圧の測定に関しては、従来使用していたセンサーでは舌圧測定する範囲が狭く、成人や健常小児では比較的正確に測定することが可能であったが、舌の摂食部位が安定しない構音障害小児では圧センサーの測定部位が不足していることが判明した。口蓋に接着できるセンサーであり、小児の口腔内の環境に耐えうることが可能なセンサーへの変更を行った。現時点ではセンサーの床へセンサーを埋め込みを行い測定を行ったが測定値は安定しており、測定を継続することが可能である。本研究では,構音障害をもつ小児患者に対して、侵襲が少なく、また口腔機能との関連が明確になる診断方法の確立を目指している。特に幼児期学童期の小児は、成長期であるため、口腔内の変化も著しく、構音障害の診断を行うことが非常に困難であった。今回は構音時に舌の挙上と口蓋と舌尖の接触をする子音/s//sh/を被験音とし、音響学的分析のみではなく舌圧との関連性を検討することとした。特に今年度は、器質的構音障害の患者を中心に検討を進めてきた。口唇口蓋裂の患者では、今回被験音となった子音/s/sh/は前歯部の歯列不正が著しいこともあり、本来構音が完成するであろう学童期にも健常小児とは異なる音響学的特徴をもつ小児が非常に多くみられた。舌圧に関しては、舌尖部と口蓋との接触部位が健常小児とは異なり、前歯部口蓋と舌尖が接触していない症例が非常に多く、また圧力も健常小児と比較して小さい値を示した。また、舌小帯強直症の患者では、口唇口蓋裂ほどの大きな異常所見はみられなかったが、強直が重症の患者では、わずかに健常小児とは異なる音響学的特徴(周波数ピークの下降)を示した。この結果について、IAPD Chile 2017で発表を行った。今後、舌小帯強直症の患者に関しては1)筋機能訓練後の手術前、2)術直後、3)術後の筋機能訓練後の3点に着眼し、舌小帯強直症に対する手術と構音障害の改善の関係、また筋機能訓練と構音障害との関連について検討していく予定である。本研究では、発達期の小児の構音障害を観察している。
意識障害・廃用患者の生活行動再獲得のケア技術教育の評価に関する研究

2011年度より開講されている「意識障害・寝たきり患者の生活行動回復技術」の研修を受講した看護師と研修生の受け持ち患者の変化で研修効果を測定した。対象となった患者の身体的変化は1関節可動域の拡大、2食事形態の向上、覚醒時間の延長、3サーカディアンリズムの確立といった変化として確認された。よって、この研修で受講生に身につけさせたい能力である「アセスメント力」や「計画の立案」、「実践能力」の向上であると評価された。以上より、本研究の目的である院外研修の評価を看護の受け手である患者の変化で測定する方法論や所属施設に還元できるまでの修得状況を検討することは研修効果の測定として妥当であると考えられた。平成25年度は、OFF-JT型の看護研修「意識障害・寝たきり(廃用症候群)患者の生活行動回復技術(Nursing to Independence for the Consciousness disorder and the Disuse syndrome Patient ,以下NICDと称す)」を開催した。受講者は6名であり、多くの意識障害患者をケアする施設に勤務する者以外に高齢者施設や精神疾患領域の施設に勤務する者もいた。特に今回同一施設から過去に受講していない受講者とその受け持ち患者および所属施設のスタッフを対象として研修の効果の測定を試みた。受講者のレポートの変化からは、NICDケアがもたらす効果とそのための取り組みかたや自己の課題が明確になっていく様子が捉えられた。また、受講者の「患者アセスメント力」、「生活行動獲得に向けた技術力」、「計画・調整能力」、「看護実践の評価力」、「事例の報告力」の評価に当たってこれらの概念分析を実施しているところである。受講者の受け持ち患者の変化に関しては1脳波(脳の活性化の指標)、2関節可動域(身体の可動性の指標)、および広南スケールにて意識状態の変化を観察した。患者の変化は著名で、身体的変化に加えて意識状態が改善し、家族との会話が成立したが、途中での退院や病状の悪化により6ヶ月のデータ収集の継続が困難であった。そのため、受講者の病院スタッフにも研修前後でのケアの波及効果として、技術面、知識面、意識面に関してアンケート調査を実施した。その結果、直接一緒に受け持ち患者をケアする者はどの側面も理解が深まっていたが、他の病棟やチームメンバーである他職種には通常ケアのとの違いを理解するにいたっていなかった。なお、共同研究者とともに、今回と過去の受講者の継続評価を実施した。その結果患者の変化を整理して成果を学会発表で予定している。平成26年度も前年度に引き続き、OFFーJT型の看護研修「意識障害・寝たきり(廃用症候群)患者の生活行動回復技術(Nursing to Independence for the Consciousness disorder and the Disuse syndrome Patient以下NICDと称す)を開催した。受講生は11名であり、多くの意識障害患者をケアする施設に勤務する看護師や重症心身障害児(者)施設からも参加があり、新たな施設からの参加があった。そのため、受講者が所属する施設のスタッフへの浸透の状況や対象となった患者(利用者)の変化をデータとして測定を試みた。対象となった患者(利用者)の身体的変化は1関節可動域の拡大、2食事形態の向上、覚醒時間の延長、4サーカディアンリズムの確立といった変化として確認された。このことはこの研修で受講生に身につけさせたい能力である「アセスメント力」や「計画の立案」、「実践能力」の向上であると考えられる。しかし、一方で所属施設のスタッフの理解度はアンケート調査の結果、あまり浸透しておらず施設への還元と言う点では成果が得られていない。このことから研修で身につけさせたい能力である「報告力」が身についていないのか、スタッフとの調整力なのか明確にはなっておらず、本年度は「報告力」や「管理・調整能力」の育成も検討する予定である。平成27年度も前年度に引き続き、OFFーJT型の看護研修「意識障害・寝たきり(廃用症候群)患者の生活行動回復技術(Nursing to Independence for the Consciousness disorder and the Disuse syndrome Patient以下NICDと称す)を開催した。受講生は12名であり、多くの意識障害患者をケアする施設に勤務する看護師や重症心身障害児(者)施設からも参加があり、新たな施設からの参加があった。そのため、受講者が所属する施設のスタッフへの浸透の状況や対象となった患者(利用者)の変化をデータとして追加した。また、本年度は所属施設のスタッフへの浸透ができるよう「報告力」に力を入れた研修を実施した。しかし、初めて参加する施設の研修者が自分の言葉で説明することは難しく、「報告力」や「管理・調整能力」の育成という課題が残った。

以上より、本研究の目的である院外研修の評価を看護の受け手である患者の変化で測定する方法論や所属施設に還元できるまでの修得状況を検討することは研修効果の測定として妥当であると考えられた。(理由)平成26年度は11名の研修受講者がおり、そのうち3施設の追跡調査を実施している。対象患者の変化は研修中に研修生と一緒に変化の測定を行っているが、受講後の施設への還元の機会がなかなか得られず、スタッフへのアンケート調査が年度をまたぐ形となっているため。看護学(今後の推進方策)達成度で示したように、年度を越えての報告会を施設内で行う受講生もいるため引き続き昨年度の受講生の施設の変化を調査する予定である。また、本年度もこれまでと同様の研修を予定しているため、本年度の受講生も含む3年分の受講生の変化、対象となった患者(利用者)、所属施設のスタッフの認識・実践の変化を調査してまとめ、研修の効果測定を行う予定である。平成25年度は受講生が少なく、35名程度の追跡調査を予定していたが、1組の受講生と患者しか研究対象者として得ることが出来なかった。また、患者の状態変化も在院期間の問題から継続して測定することが出来なかったのが現状である。平成25年度は受講生が少なかったことに加え、患者の状態変化も在院期間の問題から継続して測定することが出来なかった。そのため、平成26年度は受講生の確保のために年度末より研修の周知を促す活動を実施したため、すでに10名を越す受講者が研修を希望している。また、過去に受講していない施設からの希望もあり、研修効果を検討するための対象者の確保は出来ている。本研究では研修終了時のみの受講者による研修効果の評価ではなく、研修がどのように所属施設に効果をもたらすのかを評価するツールの作成を目的としている。そのため、対象者および所属施設の変化を捉えるツールとして前年度スタッフ向けに実施したアンケート調査の結果をふまえ、本年度は研修前・後に改良したアンケートを実施してスタッフの変化の評価を測定する項目を追加した。また、昨年度の受講生の「患者アセスメント力」、「生活行動獲得に向けた技術力」、「計画・調整能力」、「看護実践の評価力」、「事例の報告力」の概念分析により、下位概念を項目化・点数化し評価ツールを作成している。本年度の研修開始である7月より作成した評価ツールを用いて横断的に本年度の受講生を対象として実施する予定である。これ以外は当初の計画に基づいて研修者およびその受け持ち患者を一組とし、研修効果の評価を実施する予定である。
地域福祉計画の進行管理の概念と方法に関する調査研究

回答のあった152か所の自治体では、71.5%の自治体で、何らかの進行管理の方法を採用しており、推進委員会の設置が最も高い。行政内の連携組織や評価には25%30%の割合で取り組まれていた。これらの方法は第2期計画においてさらに高い割合で盛り込まれている。半数の市町村では、第1期の計画の有効性を認識するなかで、第2期計画に取り組んでいる。複数の進行管理の方法を採用した自治体では、達成度や波及効果などの効果も含めて、第1期の有効性を感じている。進行管理の多様な方法を提案していくことで、地域福祉計画の策定率は高まることが期待される。本年度の研究実施は、(1)進行管理概念の明確化と(2)先行事例の研究であった。(1)については、以下のような実績をもつ。○地域福祉計画の進行管理は、計画評価としての進行管理としての性格をもつ。5年間経った後、第2次に向けての第1次の評価が取り組まれる中で進行管理が課題となっている。そのなかで、恒常的な進行管理が不十分であったことを、明らかにした。○地域福祉計画の進行管理の方法については、DOの段階での進行管理の必要性が判明している。例えば5年後の評価の段階で、進行管理を行うのではなく、計画の内容を実施過程のなかで修正を加えることが進行管理の機能として重要であることを明確にした。○したがって、地域福祉計画における進行管理は、既存の計画が持っている硬直性を超えた新たな定義づけが必要とされる。それは、計画項目の実施を促すものとしてだけではなく、常にダイナミズムを生かす計画空間の確保や維持の動きとして捉え直すことかもしれない。次年度には、地域福祉計画の進行管理の新たな定義づけを試みつつ、実際に動く進行管理の実態調査を図る。(2)については、以下のような実績をもつ。先行事例研究(茅野市・都城市・高浜市)を中心に、進行管理の状況を把握した。○これらの成果としては以下の2つの論文を作成している。高浜市地域福祉計画の検証-『福祉でまちづくり』の視点から-地域福祉計画における新しい「プロセス重視の枠組み」の提案-高浜市・都城市の検証から○茅野市の事例調査については、計画への参加住民等へのヒアリング調査を実施しているところである。○住民自治のまちづくり協議会と地域福祉との接点に関する視点を新たに付け加えることが重要になっている。そのための3つの仮説的類型として、分離型、重なり型、部会型について検討しているところである。地域福祉計画の進行管理に関する調査研究は、次の3つの方法で行った。1つは、昨年度高浜市等において取り組んだ事例調査については、三重県伊賀市において実施した。2つは、都道府県を単位とした進行管理の把握については、第1次計画策定実施率の4つのレベルを考慮し、高い熊本県、やや高い兵庫・宮崎県、やや低い北海道、低い高知県を取り上げ、その取り組み状況を把握した。その結果、相対的に策定率の低い都道府県では、進行管理よりは策定率の低い市町村への支援が中心となっている。他方、高い策定率を示す熊本県では、県の支援計画の見直しのなかで、市町村地域福祉計画の進行管理の状況把握が進んでいるが、個別支援への取り組みには至っていない。市町村における進行管理の停滞は、(1)第1次計画では住民参加が目的化したために、進行管理が対象とするべき事業の具体的な設定が不明確になっていること、(2)担当者の異動によって計画の継続性が担保されていないこと、(3)進行管理の方法がわからないなどの理由が考えられることが判明した。3つは、第1次策定市町村への進行管理に関する実態調査(方法・項目)の検討である。この点に関連して、進行管理概念の検討を同時に行った。第2次計画の策定段階での「評価」として進行管理を捉えるのではなく、計画の進行段階における恒常的なPlan-Do-Seeを試みる必要があることが確認された。それを踏まえ調査項目の設定を行い、2自治体の協力のもとパイロット調査を行った。全国調査上の課題として、(1)担当者の異動によって把握の精度が低下すること、(2)進行管理への住民参加において、第1次計画の効果をどのように把握するかが課題、(3)進行管理すべき計画項目の重点化を明確にすることの必要、(4)行政計画ではあるが事務局を担う社会福祉協議会の関与についての調査課題、などが判明した。これらの成果をもとに、次年度早期の段階で全国調査を試みる。地域福祉計画の進行管理に関する実態を把握するために、全国的な規模での調査と先駆的に進行管理を実施している市町村の事例研究の2つの方法を用いて研究を進めてきた。今年度は、全国調査の分析に力点を置いた。全国調査の結果については、次のようである。

厚生労働省社会・援護局地域福祉課が把握した第2期地域福祉計画の策定市区町村数は、194か所(2010年7月現在)。全市町村1750のうち、第1期策定850(全市町村の48.5%)、第2期策定194(第1期の22.6%)である。なお、194か所のうち、少なくとも2か所は2期を策定していないと判明。市区(139か所)、町村(53か所)の192か所のうち、アンケートの回答者は151か所(78.6%)、その内訳は、市区は110か所(市区の79.1%)、町村41か所(町村の77.4%)。回収率において市区・町村の差はなかった。分析から注目できる内容としては、(1)第2期計画策定の理由について問うた結果(複数回答可)、第1期計画の終了に続いて、計画の有効性を認識したという答えが49.7%で高かった。(2)推進委員会のような組織の設置が一番高い実施率を表している。しかし、77か所の内訳をみると、推進組織だけを設置しているところが31か所で一番多く、有効性の認識は31のうち13にとどまっている(41.9%)。(3)進行管理方法(行動計画・推進委員会・行政内組織・評価体制)の組み合わせとしては、すべて未実施は28.5%、1方法のみ実施は35.1%であった。それらはいずれも地域福祉計画の有効性について低い認識を見せている。2以上の方法で実施したところは全体の36.4%を占めているが、行政内部組織の有無でその内訳をみると、いずれも有効性が高い。行政内部組織無しの場合、評価体制を重視したところにおいて有効性の認識が高く現れた。
マウスおよびヒトｉＰＳ細胞を用いた頭頸部組織の再生技術開発

1マウスinduced pluripotent stem (iPS)細胞を用いて、気道上皮細胞および筋細胞へ分化誘導することに成功した。分化誘導した気道上皮細胞を人工気管とともに気管欠損部へ、筋細胞を反回神経損傷後の甲状披裂筋に移植し、生着を確認した。気道上皮細胞では線毛やタイトジャンクションの回復も確認できた。3ヒトiPS細胞から気道上皮細胞への分化誘導に成功した。分化誘導された細胞はαアセチル化チューブリンで標識される線毛様構造を有し、さらにそれらは運動機能を有していることが確認された。本研究の目的は、頭頸部臓器切除後の欠損組織に伴う機能障害の回避とQuality of Lifeの向上をはかり、国民の健康増進に寄与することである。このため、マウスおよびヒトiPS細胞から頭頸部臓器を構成する気管上皮や軟骨などに分化誘導した細胞を足場材料とともに各々の組織欠損モデル動物に移植し、組織学評価および機能性評価により有効性と機能性を検証することで、頭頸部領域における再生医療基盤技術の開発を行っていく。平成26年度では、(1)マウスおよびヒトiPS細胞の培養と未分化性の検証、(2)マウスおよびヒトiPS細胞への蛍光マーカーの導入、(3)気道上皮細胞および軟骨細胞への分化誘導、(4)実験動物を用いた頭頸部臓器の損傷モデルの作製、を実施した。(1) iPS細胞の培養と未分化性の検証マウス胎児線維芽細胞上にiPS細胞を播種することで長期的に維持培養でき、各種未分化マーカーの発現をRT-PCRおよび免疫染色で確認した。(3) 1気道上皮細胞および2軟骨細胞への分化誘導1成長因子、サイトカイン、ALI (Air-Liquid Interface)培養を組み合わせることで、気道上皮マーカーの発現や気道上皮特有の線毛構造や線毛運動を確認することができた。2軟骨細胞への分化成長因子、サイトカイン、低分子化合物を組み合わせることで、軟骨細胞の中間体である沿軸中胚葉マーカーの発現が著しく上昇した。(4)頭頸部臓器の損傷モデルの作製ウサギ、ラットを用いて気管の損傷モデルを作製した。本研究では、iPS細胞を利用した頭頸部領域における再生医療基盤技術の開発目指している。平成27年度は、分化誘導させたマウスiPS細胞を人工気管と組み合わせ、気管欠損部に移植し、気道上皮を含めた気管の再生実験を行った。2.移植足場材料の検討:分化細胞を組み込む最適なスキャフォールドを検討するため、ポリプロピレンメッシュと様々な濃度のアテロコラーゲンを用いて人工気管を作製した。0.5もしくは1%の濃度で作製した人工気管は多孔質であり、良好な気道上皮再生が得られた。(Nakaegawa Y, etal. Ann Otol Rhinol Laryngol.2016)3.移植方法の検討:人工気管にマウスiPS細胞から分化させた気道上皮細胞を付加させ、ヌードラットへの移植を行った。移植細胞の生存、更に線毛やタイトジャンクションも確認することができ、機能性を有した気道上皮細胞の再生が得られた。(Ikeda M, etal. Acta Otolaryngol. 2016)前年度までにiPS細胞から気道上皮細胞への分化誘導法がある程度確立できており、時間とコストを削減できたため。本研究では、iPS細胞を利用した頭頸部領域における再生医療基盤技術の開発を目指している。平成28年度はビトリゲル上で分化誘導させたヒトiPS細胞を、ポリプロピレンとコラーゲンからなる人工気管とともに気管欠損部移植し、気道上皮の再生を図った。1.ヒトIPS細胞から気道上皮細胞への分化誘導:Gotohらのプロトコル(Gotoh S, et al., Stem Cell Reports. 2014)に従い、ヒトiPS細胞から2次元培養で腹側前方前腸へ分化させ、その後3次元培養でスフェロイド形成を行い、気液界面培養(Air Liquid interface: ALI)を行うことで気道上皮細胞へ分化させた。誘導5256日目において、ヒトiPSから誘導された細胞はαアセチル化チューブリンで標識される線毛様構造を持つこと、更にそれらは線毛運動機能を有していることが確認された。また、透過型電子顕微鏡を用いた観察から、線毛様構造は9組の2連微小管が2本の微小管を囲む「9+2」構造を持ち、チューブリンを骨格とする線毛であることが確認された。2.ビトリゲル上でも同様線毛を有する気道上皮細胞への分化誘導が得られることを確認した後、ポリプロピレンとコラーゲンからなる人工気管と組み合わせ、ヌードラットの気管開窓部へ移植した。移植後2週間の時点でヒトiPS細胞由来線毛上皮細胞が生存していることが確認された。

以前報告(Otsuki K et al. Laryngoscpoe. 2014)した分化誘導方法をベースにしながら進めているため、分化誘導方法の開発に費やす時間とコストを大幅に削減できたため。平成27年度の結果に基づきながら、更に再生気管の評価を続けるとともに、喉頭やその他頭頸部臓器の損傷、欠損モデルにも移植実験を行い、その再生効果を確認する。特に再生上皮組織に関しては、線毛運動、水輸送、イオン輸送、バリア機能などについても評価する。また長期観察モデルにより再生組織の経時的な変化についても検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。頭頸部外科学平成26年度の結果に基づきながら、蛍光マーカーでラベルされたiPS細胞から気道上皮細胞や軟骨細胞への高効率な分化誘導を行い、足場材料と共に気管損傷モデル動物に移植する。また、ヒトiPS細胞にも蛍光マーカー(GFPやtdTomatoなど)を導入し、移植後の生着評価に用いる。気道上皮細胞や軟骨細胞だけでなく、喉頭筋など他の頭頸部臓器を構成している細胞にも分化誘導させていく。概ね研究が順調に遂行されたため、研究費を節約することができた。研究が概ね順調に遂行したため、研究費を節約することがきた。次年度はより多くの消耗品が必要となる予定であり、物品費にあてる。研究計画上、翌年度は今年度よりも多くの消耗品が必要となるため物品費にあてる。
水界における硫酸還元過程の再検証

現在、湖沼の嫌気層における硫酸還元は硫酸塩から硫化水素へ1ステップで起こると考えられている。所が、裏磐梯の小野川湖における観測結果は、硫酸塩の現少量と硫化水素の増加量の間に1ケ月のタイムラグがあり、両者の間に亜硫酸塩やチオ硫酸塩等の中間生成物が生成している可能性を強く示唆している。本研究は、1)小野川湖の嫌気層で硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素を測定し、これら化合物の間のマスバランスより、2)培養実験より硫酸還元過程を再検証することを目的にした。その結果、次の事項が明らかになった。1.現場観測による検証従来、測定例のない亜硫酸塩、チオ硫酸塩を測定した所、両者共に水塊が嫌気的になると蓄積し、10月7日に底上60cmでそれぞれ最大値1.5μmol/l、0.72μmol/lを記録し、中間生成物の存在は確認された。しかし、天然現象は振れ幅が大きく、今年度、小野川湖では嫌気層の発達が十分ではく、嫌気的期間も短く、嫌気層の深さも小さかった。その結果、硫酸還元も活発ではなく、生成し蓄積した硫化水素の最大値は5.3μmol/lで、平成6年度の31mol/lの1/6、平成7年度の22μmol/lの1/4であった。それ故、マスバランスによる硫酸還元過程を検証するに足るデータは得られなかった。今後、観測を継続し、論証して行きたい。2.培養実験による検証電子供与体としてグルコースを添加すると硫酸還元は一番活発に行われ、実験開始後37日後に亜硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素が同時に急激な増加を始めた。2週間後にはそれぞれ35、25、80μmol/l増加し、前2者は極大となりその後減少に転じたのに対し、硫化水素はその後も増加し続けた。今回の実験は硫酸塩濃度を80mmol/lに設定し、濃度が高すぎる事が判明したので、実験条件を適正化し実験を続ける予定である。
「青年組織」を手掛りとしたソ連の体制変動過程の解明

コムソモールの崩壊過程を辿ることでソ連の体制変動の含意を明らかにする試みの一環として、コムソモールが唯一の青年組織としての正統性を喪失し、ペレストロイカの進展によって自発的に形成されてきた他の青年組織と、青年層の支持や新体制における存在意義をめぐって競合し時には協調関係を模索する諸相を論究したのが、今回の主研究である。「非公式団体」と称される青年層の社会組織の有り様を検証することは、ペレストロイカという時代を理解するための重要な要素であるばかりでなく、ソ連体制を規定する国家と社会の関係を探る上で欠くことができない作業である。そこで「非公式団体」が社会現象として最も注目を浴びた1987年から1988年の前半頃に、コムソモールと「非公式団体」との相互関係がどのように展開され、それがコムソモールの変質過程に決定的に影響したダイナミズムを多面的に検討し、研究課題の一部分としてまとめた。また、両者の歴史的相関が80年代後半の政治社会状況にどのように反映されているのかを再考するために、1920年代のコムソモールや青年文化を論じた先行研究について書評論文において考察した。そして、ペレストロイカを社会運動の視点から把握する予備的スラップとして、コムソモールと「非公式団体」の関係を社会運動論から論じる小論を準備した。方法論や資料の点で不十分な点が残るが、最終的総括にむけて重要な部分をまとめる事ができた。
シンクロトロンX線高分解能散乱法によるメソスコピック材料の構造研究

メカノフュージョン法によって作成したFeN、TiAlなどの高分解能粉末X線回折データをシンクロトロンX線を用いて収集し、メソスコピック相の構造と熱処理による変化を調べた。アンモニア雰囲気を用いたボールミル法で最大7%のNを合むFeNが作れるが、そこに含まれるメソスコピック相の構造は熱処理温度、時間によって様々な変化を示す。また、TiAlは非常に乱れた構造をもつ合金相を含み、この相は熱処理によってTiAl_3に結晶化する。つぎに、FeSiBCoCuNb微粉末をαFeの変態温度前後の種々の温度と時間で熱処理した試料についてX線データを測定し、Co添加によるFeSiBCuNbの透磁率の増大と構造変化の相関を調べた。とくに、Si溶解αFe相と金属間化合物Fe_3Si生成の初期過程に注目した。さらに、多結晶Fe/Gd多層膜の磁化構造を共鳴X線磁気散乱法で調べた。磁化整列状態および捩れ状態の双方で厚さ5nmのGd膜は厚み方向に不均一に磁化すること、また、捩れ状態においてはGd磁気モーメントの方向が厚み方向に不均一であること、その方向は温度に依存することが初めて明らかになった。すなわち、補償温度に近い温度ではGdモーメントはFe層との界面でのみ捩れているが、補償温度より30°C低い温度では捩れ角が増し、膜の厚み中心では外部磁場に垂直になっている。最近、高エネルギー・ボールミルによりホウ素、シリコン、金属などを雰囲気ガス中で粉砕し、これらの炭化物、窒化物粉末を直接合成する方法がオーストラリアで開発された。生成される粉末は数10数100nmの粒径を持つ。粒子の外皮部は固体/固体反応、固体/気体反応を起こし、非晶質化している。粉砕度の制御により、非晶部が粒体積の80%を占める粉末を作ることができるが、このような粉末は新規な物性を示し、新素材として超硬度材料などへの応用が検討されている。非晶部は高度の反応性を有し、粉末の物性を支配するが、原子配列が極度に乱れているため、その構造を通常のX線回折法で調べるのは難しい。本研究は、我が国のシンクロトロンX線散乱・回折技術とオーストラリアの材料を結び付け、メソスコピック材料の原子構造、組織を解析し、物性との相関を探ることを目的としている。平成7年11月高エネルギー物理学研究所放射光実験施設でシンクロトロン・ビームタイムを得、Si、B、Mo、V、Zrなどの窒化物について高分解能粉末回折実験を行なった。その結果、実験室のX線装置では非晶部の散乱に埋れて分解できないブラッグ・ピークが検出され、また、非晶部の散乱が試料作成条件によって様々な微細構造を示すことが分かった。現在データを解析するとともに、高温における構造変化をX線実験で調べるため、試料加熱装置の設計を進めている。平成8年9月オーストラリアよりA.W.Steavensonを招へいし、高エネルギー物理学研究所においてシンクロトロン放射を用い、メカノフュージョン粉末のメソスコピック構造についてX線回折実験を行なった。試料はオーストラリアでA.Calkaがボールミル法により作成したものである。昨年の成果に基づき、高温回折実験を計画したが、試料加熱ステージの準備が整わなかったので、室温で散乱角10100゚の範囲の粉末データを収集した。実験室のデータでは幅の広い1本の回折線が数本に分解され、また、微小な回折ピークが多数観察された。平成8年11月米国よりS.M.Brennanを招へいし、高エネルギー物理学研究所でGsAs/Siの表面構造に関して、超高真空X線回折実験を行なった。東工大で作成した試料を高真空容器で筑波に運搬し、微小角入射法により、再構成表面から分数次反射の測定を試みた。明瞭なブラック反射は観察されず、粉末図形が観察されたので、試料の規則性が低いと結論した。平成9年1月大隅一政を西オーストラリアに派遣し、同地区における微小部X線回折の研究状況を視察、調査した。

この分野でもシンクロトロン放射が非常に有用であるため、オーストラリア研究者の日本施設使用希望が強いことが判明した。平成9年3月研究代表者が第20回オーストラリア結晶学者連合に出席し、以上の研究成果を発表した。メカノフュージョン法によって作成したFeN、TiAlなどの高分解能粉末X線回折データをシンクロトロンX線を用いて収集し、メソスコピック相の構造と熱処理による変化を調べた。アンモニア雰囲気を用いたボールミル法で最大7%のNを含むFeNが作れるが、そこに含まれるメソスコピック相の構造は熱処理温度、時間によって様々な変化を示す。また、TiAlは非常に乱れた構造を持つ合金相を含み、この相は熱処理によってTiAl_3に結晶化する。つぎに、FeSiBCoCuNb微粉末をαFeの変態温度前後の種々の温度と時間で熱処理した試料についてX線データを測定し、Co添加によるFeSiBCuNbの透磁率の増大と構造変化の相関を調べた。とくに、Si溶解αFe相と金属間化合物Fe_3Si生成の初期過程に注目した。さらに、多結晶Fe/Gd多層膜の磁化構造を共鳴X線磁気散乱法で調べた。磁化整列状態および捩れ状態の双方で厚さ5nmのGd膜は厚み方向に不均一に磁化すること、また、捩れ状態においてはGd磁気モーメントの方向が厚み方向に不均一であること、その方向は温度に依存することが初めて明らかになった。すなわち、補償温度に近い温度ではGdモーメントはFe層との界面でのみ捩れているが、補償温度より30°C低い温度では捩れ角が増し、膜の厚み中心では外部磁場に垂直になっている。
メサンギウムにおけるセロトニンを介したコラーゲン産生と糖尿病性腎症進展機序の解析

本研究は、糖尿病性腎症の進展・増悪のメカニズムの一端を明らかにし、糖尿病性腎症の予防・治療法の開発のための手がかりを得るために、セロトニンのメサンギウム領域における起源・セロトニンからIV型コラーゲン産生に至る経路の意義を明らかにすると共にセロトニン及びIV型コラーゲンと糖尿病性腎症の関連を更に究明することを目的として行った。1.セロトニンによるIV型コラーゲン産生における細胞内シグナル伝達機構の解析ヒトメサンギウム細胞におけるセロトニンによるTGF-β産生に至るシグナル伝達機構の解析では、セロトニン刺激からPKCが活性化に至る経路を明らかにするために、百日咳毒素を用いて3量体G蛋白質の関与を検討した。本件等の結果3量体G蛋白質の関与が示唆された。また、TGF-β産生からIV型コラーゲン産生に至るシグナル伝達機構の解析ではIV型コラーゲン産生に関与するTGF-β受容体サブタイプは解析中である。2.in vivoにおける糖尿病性腎症の発症・進展におけるセロトニンの役割の解析糖尿病性早期腎症患者の蛋白尿の変化に対するセロトニン2A受容体拮抗物質阻害剤(塩酸サルポグレラート)の作用を検討した。2型糖尿病患者(n=100)の尿中セロトニン排泄量は非糖尿病者(n=40)のそれに比し有意に高値であった。また、尿中セロトニン排泄量は血糖コントロールと有意の正の相関と示した。更に早期腎症2型糖尿病患者20名を無作為にセロトニン2A受容体拮抗物質阻害剤(塩酸サルポグレラート)投与郡と非投与郡の2群に分け、その効果を検討した結果、セロトニン2A受容体拮抗物質阻害剤投与郡で尿中アルブミン排泄量が有意に減少した。以上より、糖尿病性腎症におけるセロトニン及びIV型コラーゲンの重要性が示唆され、糖尿病清掃機腎症の治療に対するセロトニン2A受容体拮抗物質阻害剤の可能性を示唆し得た。本研究は、糖尿病性腎症進展・憎悪のメカニズムの一端を明かにし、糖尿病性腎症の予防・治療法の開発のための手がかりを得るため、セロトニンのメサンギウム領域における起源・セロトニン刺激後の細胞内シグナル伝達機構の解析を行ない、糖尿病性腎症の発症・進展におけるセロトニンからIV型コラーゲン産生へ至る経路の意義を明らかにすると共にセロトニン及びIV型コラーゲンと糖尿病性腎症関連を更に究明することを目的とする。本年度は細胞内シグナル伝達とセロトニン受容体阻害剤と糖尿病性腎症の蛋白尿の関連を検討した。1.セロトニンによるIV型コラーゲン産生における細胞内シグナル伝達機構の解析ヒトメサンギウム細胞におけるセロトニンによるTGF-β産生へ至るシグナル伝達機構の解析ではセロトニン刺激からPKCが活性化に至る経路を明らかにするために、百日咳毒素を用いて3量体G蛋白質の関与を検討した。G蛋白質の関与が示唆された。一方、TGF-β産生からIV型コラーゲン産生へ至るシグナル伝達機構の解析ではIV型コラーゲン産生に関与するTGF-β受容体サブタイプを検討中である。新たにミトコンドリアにおける酸化ストレスの関与についても検討を加えている。2.in vivoにおける糖尿病性腎症の発症・進展におけるセロトニンの役割の解析糖尿病性早期腎症患者の蛋白尿の変化に対するセロトニン2A受容体拮抗阻害剤(塩酸サルポグレラート)の作用を検討し、塩酸サルポグレラート投与により尿中アルブミン排泄を減少させることを認めた。

以上より、糖尿病性腎症におけるセロトニン及びIV型コラーゲンの重要性が示唆され、糖尿病清掃機腎症の治療に対するセロトニン2A受容体拮抗物質阻害剤の可能性を示唆し得た。
ハイブリッド法を用いた脳におけるNa,K-ATPaseアイソザイム発現の研究

Na,K-ATPaseは、あらゆる高等動物細胞の形質膜に存在し、Na^+イオンとK^+イオンの能動輸送をになう酵素であり、2つのサブユニットから成る。即ち触媒作用をもつαサブユニットと、機能の不明な糖タンパクであるβサブユニットである。最近、cDNAクローニング法により、ラット脳にはαサブユニットが3種類あることが見出された(α_1、α_2、α_3型)。α_1サブユニットは、ほとんどあらゆる組織中に存在するけれども、α┣D22とα┣D23┫D2サブユニットは脳に特異的である。そこで本研究おいて、我々はラット大脳皮質において、ニューロンとグリア細胞のうちいずれの細胞が、α┣D22┫D2あるいはα┣D23┫D2サブユニットを発現しているのか、ハイブリッド法を使って調べた。実験動物には、S-D系成熟ラット雄を用いた。4%パラホルム固定液でラットを潅流固定後、大脳皮質の凍結切片(厚さ8μm)を作製した。cDNAプローブとして、既に得られているα┣D22┫D2およびα┣D23┫D2サブユニットをコードするcDNAを制限酵素で切断し、3'-非翻訳領域のみを含む断片を┣D135┫D1Sでアイソトープラベルしたものを使用した。スライドグラス上に貼付された切片を、HCl、およびNaCl-Nacitrate液を通した後、pronase処理を行なった。さらにglycine、paraformaldehyde処理を切片に施し、空気乾燥させた。次に切片をプローブ液とハイブリダイズさせた(37°C24時間)。ハイブリダイズ後、formide液で十分切片を洗浄後、脱水ー空気乾燥した。最後に切片にオートラジオグラフィー処理を行なった。実験結果によれば、α┣D22┫D2およびα┣D23┫D2サブユニットのmRNAは、ニューロンとグリア細胞いずれにも検出され、グリア細胞についてもアストロサイト、オリゴデンドロサイト共に発現されていた。しかしながら、血管内皮細胞には発現されていなかった。今後、対照実験として、α┣D22┫D2、α┣D23┫D2サブユニットが生化学的には検出されない組織を使って、ハイブリッド法の反応特異生をチェックしてみる予定である。
安定でクリーンなO_2^-発生デバイスの開発と応用 -改良型酵素による新しい活性酸素実験ツール-

[1]安定でクリーンなO_2^-発生源の完成(田村)[67N-47N融合タンパク]NADPHoxidaseの制御サブユニットp47の自己制御をはずすために、短縮型p47(47N)を短縮型p67(67N)とつないだ融合型を遺伝子工学的に創製した。[RacQ61L変異体]Racの代わりに恒常的活性型のRac変異体Q61Lを使うことにより、67NとRacの間を格段に安定化できることを見い出した。また、これと上述の67N-47Nとを組み合わせて酵素を再構成すると、これまでのどの場合より安定なcomplexが得られた。[活性化剤SDSの割愛]我々はcytochrome b_<558>を再脂質化する際の脂質の組成を工夫することにより、活性化剤SDSなしで、酵素が活性化できることを見い出した。[保存法]濃い濃度で酵素サブユニットを混ぜて活性化させたのち、凍結すると、解凍後も活性が全く落ちていないことを見い出した。これにより、活性化酵素を凍結した状態で発送し、利用者は実験時に解凍して用いることが可能になった。[2]完成した新規デバイスの応用アミロイド形成の実験系としてしばしば用いられるHEK細胞を用いてO_2^-の影響を調べた。デバイスを5,000倍希釈で用いた時、細胞の増殖がとまり、500倍希釈では細胞死が起こることが親察された(三浦)。SODを共存させた時にはこのような現象は見られなかった。一方、ニューロン細胞ではさらに高濃度のデバイスを加えた時,細胞死が起こった(中村)。また、海馬スライスへのO_2^-の影響を継続的に調べるための予備実験として、実験用シャーレにメジウムとデバイスを入れ特殊電極により測定したところ、デバイスから多量の活性酸素が発生していることが確認された(吉田)。[1]安定でクリーンなO2-発生源の開発NADPHoxidaseの制御サブユニットP67の自己制御(マスキング)をはずした短縮型,67Nとp47あるいはracの融合型を遺伝子工学的に創製し,これらを用いてoxidase活性化能すなわちO_2^-産生能を調べた。[67N-47N融合タンパク]67Nと47Nをつないだものでは,47N-67N,67N-47Nともに融合しないものと同等以上の活性が見られた。25°Cでの安定性は67N-47Nでよりすぐれており、融合しないものにくらべて8倍の安定性を示した(t1/2=290min).kineticsの検討から、67N-47Nは酵素complexへの結合力が強まっていること、またもうひとつの制御サブユニットであるracのcomplexへの結合を強めていることが明らかになった。さらに、酵素本体であるシトクロムb558をベシクルに取り込ませる際に脂質の組成を工夫すると、通常必要な活性化剤を入れないですでに活性化されていることを発見した。活性化剤としてはふつうSDSを使うので、これを入れなくて活性化できるという性質は、いずれ細胞へ応用しようという本プロジェクトにおいては、大きな利点であり進歩である。[67N-rac融合タンパク]67Nとracの融合では、67N-racの順につないだものが、活性が良好で安定性も非融合の10倍近くに上昇した。kineticsの検討から67N-racにおいて、complexとの結合力がましていること、が明らかになった。

一方、rac-67Nの順につないだものは、活性が15%程度しかなく、安定性も改善されなかった。また、67N-racにおいスペーサーを長くしたものは、安定化の効果がうすれることがわかった。これらの結果からoxidase complexの構造、特にシトクロムb558に対する制御サブユニットの位置関係を示すモデルを提唱した。[さらに安定なcomplexの創出]上記2つの融合体の延長線上には3つともつないだ融合タンパクが理論的に考えられる。しかし、これはつねにN-末とC-末のあいだを結ぶ遺伝子工学の原理からして不可能である。そこで、これに代わる方法を試行錯誤した結果、racの代わりに永久活性型のrac変異体を使うことにより、67Nとracの間を非常に安定化できることを見い出した。そこで、これと先の67N-47Nとを組み合わせて酵素を再構成したところ、これまでのどの場合より安定なcomplexが得られた。この安定性は以後の細胞実験への使用するにたえるものである上、racを前もって活性化する必要がないというメリットが付け加えられた。[2]かんたんな系をつかった模擬実験細胞実験の際につかう96穴のプラスチックmicroplateに上記の安定化酵素のひとつを入れ、電子供与体NADPHを加えたところ、complexはただちにO_2^-を出し始め、その後持続した発生が1時間以上に亘って続いた。[1]安定でクリーンなO_2^-発生源の完成(田村)[67N-47N融合タンパク]NADPHoxidaseの制御サブユニットp47の自己制御をはずすために、短縮型p47(47N)を短縮型p67(67N)とつないだ融合型を遺伝子工学的に創製した。[RacQ61L変異体]Racの代わりに恒常的活性型のRac変異体Q61Lを使うことにより、67NとRacの間を格段に安定化できることを見い出した。また、これと上述の67N-47Nとを組み合わせて酵素を再構成すると、これまでのどの場合より安定なcomplexが得られた。[活性化剤SDSの割愛]NADPHoxidaseの活性化には活性化タンパク因子のほかに、活性剤としてSDSが要るのがこれまでの常識であった。我々はcytochrome b_<558>を再脂質化する際の脂質の組成を工夫することにより、活性化剤なしで、酵素が活性化できることを見い出した。この方法で活性化した酵素の安定性を認べると、SDSを使った場合と比べてさらに安定であることが明らかになった。[保存法]濃い濃度で酵素サブユニットを混ぜて活性化させたのち、凍結すると、解凍後も活性が全く落ちていないことを見い出した。これにより、活性化酵素を凍結した状態で発送し、利用者は実験時に解凍して用いることが可能になった。[2]完成した新規デバイスの応用アルツハイマー病の特徴であるアミロイド形成の実験系としてしばしば用いられるHEK細胞を用いてO_2^-の影響を謂べたところ、デバイスを5,000倍希釈で用いた時、細胞の増殖がとまり、500倍希釈では細胞死が起こることが見い出された(三浦)。SOD(superoxide dismutase)を共存させた時にはこのような現象は見られなかったことから、これはO_2^-の効果であると考えられた。一方、ニューロン細胞では相当濃度のデバイスを加えても細胞死は起こらなかった(中村)。このように細胞によって酸化ストレスへの抵抗性にかなりの差があることがわかった。