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学級力セルフ・アセスメントシステムを活用したカリキュラム開発に関する研究

本研究ではこのR-PDCAサイクルを分節化、朝学活・終学活・給食などの短時間でも取り組み可能なモデルケース(CAモデル/R-CAモデル)を提案するとともに、研究協力校を中心に小・中学校を中心とした実践事例を一定数蓄積した。さらに、全校レベルで学級力向上プロジェクトに取組む協力校が誕生していることも、本研究の大きな実績と言えるだろう。下位目標の2)改善型学級力セルフ・アセスメントシステムを活用したカリキュラム開発とその効果の検証、3)教員向けの研修用教材と研修プログラムの作成、4)若手教員を対象とした研修会について、研究計画を概ね達成できたことから、以上のような自己評価となった。具体的には、2)は研究協力校を中心に、改善型学級力セルフ・アセスメントシステムを活用した実践事例の蓄積を進めるとともに、その効果を検証するためのデータを収集することができた。また、学級力向上プロジェクトを中心に各教科等を有機的に関連づけたカリキュラム・モデルを検討し、小学校における実践事例を得ることができた。3)及び4)については、マンガ教材を用いた教員研修プログラムを作成するとともに、教員免許状更新講習(愛知教育大学)や教育委員会や学校主催の教員研修会において、実践することができた。なお、28年度の取り組みで明らかになったスマイル・ミーティング(学級力向上のための取り組みを考える学習活動)の停滞については、研究組織内に専門作業部会を立ち上げ、29年度には計5回の活動を行った。現在、スマイル・ミーティングを円滑に進めるため事例集(スマイル・ブック)の作成が進められている。さらに、教育効果の検証においては、質問紙(児童・生徒の自己評価)の結果のみでは判断が難しく、児童・生徒へのインタビュー等や自由記述、さらには学級担任の評価等を考慮する必要があり、当初の想定より重層的な分析が必要となることが明らかとなった。1.目的学級力向上プロジェクトとは、児童生徒が「学級力アンケート」と呼称する調査を実施し、その結果をレーダーチャート形式で可視化して表現する「学級力セルフ・アセスメントシステム」を活用し、学級改善のための主体的な取り組みを行うプロジェクト学習である。今年度は、改善型学級力セルフ・アセスメントシステムを活用した実践事例の蓄積及びマンガ教材を活用した教員研修を行った。2.成果の概要小学校における学級力向上プロジェクトの指導法を確立するため、実際の調査結果をもとに中学年及び高学年の学級力の構造分析を行った。その結果、事前準備として、安心力と規律力の向上を意識した学級経営の必要性が示唆された。また、改良型セルフ・アセスメントシステムを活用した実践事例の蓄積を進め、特別活動と道徳科とを有機的に関連づけたカリキュラム・モデルを作成した。さらに、マンガ教材を活用した教員研修を実践した。3.意義・重要性2点指摘される。1点目は、定量的、実証的な手法を用いて、学級力向上プロジェクトの指導法を示したことにある。小学校中学年、高学年及び中学校の学級力の構造分析を通して、安心力及び規律力を基盤とする小学校と、達成力の向上が要となる中学校とで、指導のアプローチを変える必要が示唆された。2点目は、学級力セルフ・アセスメントシステムの実践事例の蓄積である。
G蛋白質シグナルによる物質輸送ダイナミズムのイメージング解析

低分子量GTP結合蛋白質(G蛋白質)は、細胞内情報伝達を制御する分子として不可欠である。細胞の形態や蛋白質・脂質の移動も制御している。分子の挙動・移動の分子メカニズムは、生きた細胞をイメージングすることによって理解できると考えた。低分子量G蛋白質Rap1による細胞間接着分子のvascular endothelial cadherin(VEC)分子の制御機構について、イメージングを駆使して研究し、Rap1がVECの安定化に重要であることを突き止めた。主な研究成果(1)VE-cadherinのC末端にGreen Fluorescent Protein (GFP)タグを付加して生きた血管内皮細胞でその挙動を観察したところ、VE-cadherin接着の乖離とともに、VE-cadherinが細胞内に取り込まれさらにエンドゾームに局在していくことを明らかにした。このエンドゾームから細胞膜への再移動がcAMPの細胞内の増加により促進されることを明らかにした。cAMPはEpacを介してRap1を活性化することからRap1がVE-cadherinのリサイクリングを調整していることが示唆された。(2)Rap1を介したエンドゾームからのリサイクリングのメカニズムの候補としてRab5の活性化因子RINファミリー分子とRap1との結合を検討した。Rap1がRINと結合することを免疫沈降法とGST-RIN(Ras結合ドメイン)のプルダウン法で確認できた。(3)物質輸送に関わる分子ソーティングネキシンフアミリー(SNX)のなかでSNX27というのがRas結合ドメイン(RAドメイン)を有しており、これに結合する低分子GTP結合蛋白質をスクリーニングした。これまでのこのRAドメインに結合するのはRasファミリー分子と予想されていたが、Ras,Rap1,R-Ras,RheBはSNX27には結合しないことがわかった。細胞内での分子の輸送はこれまでGTP結合蛋白質(G蛋白質)のなかでもRabファミリー、Arfファミリー分子によって調節を受けると考えられてきた。さらに、これらの分子が輸送される小胞やGolgi, endsomeに局在していることが輸送を調節する上では不可欠と考えられてきた。しかし、本研究班では、細胞膜でG蛋白質が活性化されるだけでもVascular endothelial cadherin (VE-cadherin)分子の輸送が増加することを発見した。つまり、輸送の調節は輸送される分子を含む細胞内小器官に直接G蛋白質が局在しなくても、G蛋白質が輸送にかかわることを示した。本研究では、G蛋白質のなかでもRap1分子の活性化により、VE-cadherin分子の細胞内から細胞間接着部位への輸送が促進されることをイメージングによって明らかにすることができた。Rap1の活性化による細胞間接着の増強は、接着分子輸送の増強作用にあることを示した。主な研究成果(1)分子の細胞膜局在化を人為的におこすために、FKBP-FRBシステムを用いた。これは膜局在のためにミリスチン酸化シグナルとFRBを融合した蛋白質を細胞に発現し、さらにFKBPに膜に移行させたい分子を融合させて、ラパマイシンを投与することによって分子を細胞膜局在化を起こすシステムである。Rap1のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)C3Gを細胞膜局在化させるとendosomeからのVE-cadherinの膜への輸送が促進された。(2)Rap1を活性化するほかのGEFも同様に検討したところVE-cadherinの細胞膜移行を促進した。(3)Rap1の水解促進因子のrap1GAPIIの強制発現によって、VE-cadherinの輸送が抑制され、細胞間接着部位でのVE-cadherinの接着が減弱した。Rap1分子の活性化によりVascular endothelial cadherin(VE-cadherin)がエンドゾームから,細胞-細胞接着に移動することを観察していた。エンドゾームでRap1が活性化されることがVE-cadherinのエンドゾームからの輸送に重要であるか?あるいは細胞膜上でRap1が活性化されても輸送が促進されるのかを調べた。Rap1の活性化因子であるC3G,Epac,PDZ-GEF1のグアニンヌクレオチド交換活性部位とFKBPの融合蛋白質を細胞内に発現させるシステムを先ず構築した。さらに膜移行シグナルのミリスチン酸化FRBを細胞膜に発現させて,rapamycin依存性にFRB-FKBPを結合させることすなわちGEFドメインを細胞膜に強制的に移行させ,Rap1を活性化させたときのVE-cadherinの輸送を検討した。Rap1が活性化したことは,細胞膜の伸展が観察されることで確認できた。エンドゾームからのVE-cadherinの輸送もRapamycin添加によって促進されることからRap1の細胞膜上での活性化が重要であることを突き止めた。いずれのGEFによってもこの作用を認めることからRap1の活性化が重要であることがわかった。興味深いことに,Racの活性化っまり膜進展が起きる作用でもVE-cadherinのエンドゾームからの輸送が促進された。

以上の結果から,新たな膜形成機構(膜伸展)がおきると物理的な感知機構によって,膜形成のために細胞内部から細胞膜表面分子の輸送が促進されることが示唆された。昨年までにエンドゾームからのVE-cadherinの細胞間接着部位への輸送が、cAMP-Epac-Raplを海する系で促進されること、またRap1の活性化に引き続くRac1の活性化による細胞膜の伸展が、VE-cadherinの輸送を促進することを明かにした。これはFKBP-FRBを用いたiRAPシステムにより細胞膜でRap1の活性化を誘導した時にも観察されることから、Rap1の細胞内部での活性化でも細胞膜での活性化でもいずれも、細胞膜を伸展させる結果になれば、細胞は内部から膜構成成分を輸送開始する仕組みがあることを示唆する結果となった。さらにVE-cadherinの細胞膜での安定化機構をイメージングによって明かにする目的でVe-cadherinのFRAP (Fluorescence Recovery after Bleeching)実験を行った。VE-cadherin-GFPが、刺激のない培養条件では90%近くがmobile fractionであるのに対して、cAMPでは70%がmobile fractionになることからcAMPがVE-cadhreinのダイナミズムをresetさせて、より安定化VE-cadherin接着を起こしていることもわかった。さらにVE-cadherinの細胞内ドメインがVE-cadherinの輸送(ダイナミズム)に重要であることを細胞内欠失変異体や、PECAM-1との細胞内ドメインスイッチ変異体を作製して明かにすることができた。昨年度VE-cadherinの細胞間接着部位における挙動について、調べるためにFluorescence recovery after photobleaching (FRAP)でVE-cad-EGFPで検討した。今年度は、さらにFRAPによってcAMP-Epac-Rap1によるVE-cadherinの安定化機構を調べた。VE-cadherin-EGFP,PECAM-1-EGFPの安定化をcAMP刺激によって確認したところ、VE-cadherinのみ安定化がおきることがわかった。これは、VE-cadherinの細胞内ドメインが、重要と考えVE-cadherinの細胞内ドメインを欠失したVEcadherin-delta Cyto-EGFPをFRAPで検討したところ、安定化がみられなかった。このため、β-catenin/α-cateninによるアクチン細胞骨格系へのVE-cadherinのリンクによって、VE-cadherinの細胞間接着への安定化がもたらされると考えた。この仮説を検証するために、VE-cadherinの細胞内ドメインをa-cateninに置換した変異VE-cadherinは、cAMP-Epac-Rap1による安定化が回復した。以上より、cAMP-Epac-Rap
イオン系の速い計測に拠る周辺輸送障壁の崩壊及び回復のダイナミクスの研究

本研究では先ず速いイオンの挙動を計測するために、従来の計測器より10-100倍程度速い時間分解能を有する、高速荷電交換再結合分光装置を改造し、測定精度を改善する。これを用い、Edge Localized Mode (ELM)間のプラズマ周辺部の密度、イオン温度、並びにプラズマ回転分布の同位置・同時計測を行う。これら得られたデータにより周辺輸送障壁の崩壊と回復のダイナミクスの物理機構の解明、並びに周辺輸送障壁回復時の輸送・電場/回転・圧力の相関を詳細に導出し、輸送改善の因果関係と空間構造を決定する機構を解明する事を研究目的としている。今年度は、本研究計画を基に、1.データのクロスチェックに使用できる、高速CCDを用いた分光器を開発し、より確度の高い周辺輸送障壁の解析を行うことを可能にした。2.また、輸送特性やELM等のMHD安定性を決定する重要なパラメータであるプラズマの回転についてもその駆動機構や運動量輸送を、将来の装置ITERでの運転シナリオに近いHモードプラズマで調べた。3.そして、速い計測の特徴を生かし、イオン温度や回転の実時間制御用のシステムの基礎を、物品費を用いて整備し、実際にイオン温度分布とトロイダル回転速度の実時間制御を実証した。これを用い、Edge Localized Mode(ELM)間のプラズマ周辺部の密度、イオン温度、並びにプラズマ回転分布の同位置・同時計測を行う。今年度は、本研究計画に従い、1.先ずプラズマの密度、イオン温度、並びにプラズマ回転分布の同位置・同時計測可能な、高速荷電交換再結合分光装置を改造し、測定精度を改善した。2.次にモノクロメーターを用いて新規計測器の感度較正を行いプラズマ計測に備えた。併せてこの独自の計測器を駆使した計測結果を得るための、データ収集系等のソフトウェアの開発や電源等のハードウェアの整備を物品費を用いて行い、研究基盤の確立を実施した。3.更に、上述の新規計測器を実際にプラズマ計測に適用し、既存の計測器結果とのクロスチェックを行いながら、データベースの収集を行った。以上の研究成果をまとめ、旅費を用いて日本物理学会、及びロシアのサンクトペテルブルクで開催された「第10回Hモード物理と輸送障壁に関するIAEA技術会合」で発表し、論文:Plasma Physics and Controlled Fusionに公表した。今年度は、本研究計画を基に、1.初年度の準備・基礎研究に基づく高速荷電交換再結合分光装置を、更に整備備品費を用いて、計測器の要となる干渉フィルターの最適化と計測点の増設により、周辺輸送障壁からコアに亘る計測範囲、領域ともに広いダイナミックレンジでのイオン温度とプラズマ回転速度計測を可能にした。2.また、JT-60既存の実時間処理計算機と組み合わせることで、NBをアクチュエータとしたイオン温度実時間制御を可能にし、実際にイオン温度の実時間計測、及び制御に成功した。3.また、輸送特性やELM等のMHD安定性を決定する重要なパラメータであるプラズマの回転についてもその駆動機構や運動量輸送を調べ明らかにした。
韓国愛国啓蒙期の翻訳書研究

韓国愛国啓蒙期の翻訳書を明治期の出版文化との関連で考察するこの研究では、昨年度の韓国愛国啓蒙期の出版事情の調査、明治期の出版事情の調査、韓国語翻訳書のリスト作成とその原本調査及び資料収集、に続いて、本年度は、(1)当時の図書流通状況調査、(2)翻訳の担い手の調査、(3)翻訳書の内容分析、を行った。1.図書流通状況については、書誌学界・出版界の従来までの研究成果調査と、当時の新聞や雑誌記事調査を通じてその実態把握に努めた。中国特に上海からの図書輸入が民間の書店において活発であったこと、日本図書の広告が紙上にしばしばあらわれていたこと、そして在韓日本人の図書出版活動も活発であったことなどが確認できた。2.翻訳書の出版元は、学部編輯局、私立学校、書舗・書局、団体、個人などであり、翻訳はこれらの出版元を中心に行われていた。翻訳者の代表的存在である玄采は学部編輯局で活動したが、彼による翻訳書は個人出版のほうが多い。普成館・徽文館発行のものの多くは、普成専門学校・徽文義塾の教科書として、その教師による翻訳が殆どである。校閲として名があげられている申海永は日本留学経験を持ち普成専門学校長であり、さまざまな図書を翻訳した安国善は早稲田大学で政治学を学んでおり、日本留学生の活躍が目立つ。だが、翻訳者個人に対する研究は未だ充分ではなく、この調査では断片的情報しか収集できなかった。3.柴四朗著『挨及近世史』は麦鼎華の漢訳本から張志淵によって重訳され、平田久纂訳『伊太利建国三傑伝』は梁啓超訳述から申采浩によって重訳されるが、これらは翻訳語彙の流布と同異という点で注目される。また翻訳書においては原書の序や結語が韓国読者へのものに書き直されており、翻訳者の意図がうかがえる。この翻訳書研究によって、併合以前の日韓文化交流の実体究明のための基礎作業の一つができた。また新たな課題も明らかになってきた。日朝修好条規締結後、保護国化、併合に至るまでの間にあったはずの、学術文化交流の担い手の一つとして、留日学生の存在もあるが、むしろ韓国居住日本人の文化的な活動と在韓日本人社会のあり方の究明が急務となる。韓国愛国啓蒙期の外国事情書・英雄伝類の韓国語翻訳書を、明治期の出版文化との関連で考察しようとする今年度の研究では、次のような作業を行った。(1)「開化期文学叢書」所収の32種の翻訳書の元本確認作業を行った。分布を見ると、日本図書の翻訳が多い。日本の場合、戦争史と偉人伝が中心になっているが、特に、西洋近代の戦争史と偉人伝は、中国の図書からの翻訳もあり、これは当時の韓国人による韓国の偉人伝の出版とともに、危機に直面した当時知的状況を反映したものと思われる。(2)翻訳書の出版元と販売店の状況をつうじて、当時の出版社と出版物流通の状況把握を行った。一方、広告のなかには、日本の教育参考書や教養書の翻訳書もあり、当時韓国内の日本人社会の出版状況をも含めて、より幅広い調査の必要性を感じる。(3)東京大学、早稲田大学、国学院大學の図書館で、翻訳書の元本となった日本図書の調査を行った。資料のコピーは、まだ完了していないので、この作業は継続中である。(4)明治期の出版事情調査の一環として、博文館をはじめとしたおもな出版社の出版物の状況把握を行った。その「万国戦史」シリーズの一部が翻訳されている。(5)韓国語翻訳書のリストを作成し、その原本調査と資料収集を行った。教科書や教科学習参考書の場合は、その元本の確認が難しく、広告に書名がある加藤弘之の『強者の権利競争論』のように、図書原本がいまだ確認されていないものが多い。来年度は、今年度の作業に続いて、当時韓国と日本・中国との図書の流通状況や、翻訳を担った人々の個人調査と翻訳書の内容分析、そして学会発表を行い、研究を深めていきたい。なお、今年度の補助金は、主に関係図書購入に充てた。

校閲として名があげられている申海永は日本留学経験を持ち普成専門学校長であり、さまざまな図書を翻訳した安国善は早稲田大学で政治学を学んでおり、日本留学生の活躍が目立つ。だが、翻訳者個人に対する研究は未だ充分ではなく、この調査では断片的情報しか収集できなかった。3.柴四朗著『挨及近世史』は麦鼎華の漢訳本から張志淵によって重訳され、平田久纂訳『伊太利建国三傑伝』は梁啓超訳述から申采浩によって重訳されるが、これらは翻訳語彙の流布と同異という点で注目される。また翻訳書においては原書の序や結語が韓国読者へのものに書き直されており、翻訳者の意図がうかがえる。この翻訳書研究によって、併合以前の日韓文化交流の実体究明のための基礎作業の一つができた。また新たな課題も明らかになってきた。日朝修好条規締結後、保護国化、併合に至るまでの間にあったはずの、学術文化交流の担い手の一つとして、留日学生の存在もあるが、むしろ韓国居住日本人の文化的な活動と在韓日本人社会のあり方の究明が急務となる。
クロザピンへの切り換え方法の最適化に関する後方視的研究

研究目的:クロザピンは治療抵抗性統合失調症への適応を有する唯一の抗精神病薬であり、精神症状だけでなく社会的機能まで改善させることが報告されている。一方で、クロザピン導入時における、前薬の抗精神病薬からの切換え方法は世界的にも確立されていない。本研究では、クロザピンへの切り換え方法として汎用されている1スイッチ法、2漸減-スイッチ法、3クロスタイトレーション法のうち、いずれの方法がクロザピンを安全に導入・継続するために最適な方法であるか探索することを目的とした。研究方法:千葉県内のクロザリル患者モニタリングサービス(CPMS)登録施設において、平成29年3月までにクロザピンが開始された症例を対象に、患者背景や薬歴、検査値、精神症状、クロザピンの切換え方法などを後方視的に調査した。研究成果:本研究は千葉大学大学院医学研究院倫理審査委員会(承認番号2807)の承認を得て実施した。千葉大学大学院医学研究院精神医学(教授伊豫雅臣)の全面的な協力と、千葉県内のCPMS登録全16施設(浅井病院、旭中央病院、磯ヶ谷病院、海上寮療養所、亀田総合病院、亀田クリニック、木更津病院、国府台病院、下総精神医療センター、総武病院、袖ヶ浦さつき台病院、千葉病院、千葉県精神科医療センター、千葉大学病院、成田赤十字病院、茂原神経科病院)からの研究協力を得て、「オール千葉」の体制で実施した。研究協力施設の獲得にあたっては、千葉クロザピン・サターン・プロジェクトの臨床活動と連動することにより、多くの施設から本研究の重要性と有用性についての賛同が寄せられ、当初の想定よりも多くの施設から研究協力が得られた。平成29年度に各施設での調査と症例報告書の収集がほぼ終了し、計300例程度の症例数を確保できた。平成30年度中に、解析ならびに論文化して結果を公表し、クロザピン適正使用ガイドライン等への収載を目指している。
マルコフ連鎖モンテカルロにおける幾何学的手法の研究

強相関多体系に対する最も強力なシミュレーション手法の一つであるマルコフ連鎖モンテカルロ法に、「埋め立て法」などの幾何学的手法を応用し、収束を劇的に改善する一般的な方法を見出した。さらに、エネルギーギャップの精密測定法、量子モンテカルロレベルスペクトロスコピー法、局所Z_Nベリー位相の測定法、相互作用の非等方性が強い系に対する有効な有限サイズスケーリング法の開発を行った。また、「埋め立て法」のための汎用ライブラリBCLとそれを応用した量子モンテカルロ法アプリケーションWormsを開発し、インターネット上で公開した。本研究の目的は、「埋め立て法」や「Walker法」に代表される独創的な幾何学的手法をさらに発展させることにより、モンテカルロ法の収束を劇的に改善する方法を見出し、それらの新しい手法をランダムスピン系の統計力学に応用し、さらに、新しいアルゴリズムに基づくソフトウェアの整備・公開することにある。我々の「埋め立て法」では、1)詳細釣り合いを明示的に破り、2)棄却率を最小化する。さらにこれを拡張し、詳細釣り合いを満たしつつも棄却率を最小化するアルゴリズムも開発している。この方法は、ポッツ模型の局所更新法に用いた場合、従来の埋め立て法と同程度に有効であることが示されている。このアルゴリズムは、ダイナミクスなど詳細釣り合いの有無が影響する場合に特に有用である。また、「埋め立て法」の連続系への応用を行った。従来の熱浴法を拡張するだけでなく、分子動力学法を用いたハイブリッド法を組み合わせることにより、従来の方法に比べ、数倍10倍程度効率良くサンプリングが行えることを示した。他にも、量子モンテカルロ法によるエネルギーギャップの精密測定法、量子モンテカルロ法により求めたエネルギー準位の交差により相転移点を精度よく求める「量子モンテカルロレベルスペクトロスコピー法」の開発とスピンパイエルス系の相転移への応用、トポロジカルな秩序変数として期待されている局所Z2ベリー位相の量子モンテカルロによる測定法の開発、相互作用の非等方性が強い系に対する有効な有限サイズスケーリング法の開発と非等方性起源の有限サイズスケーリングへの強い補正の起源の解明などを行っている。さらに、「埋め立て法」のための汎用ライブラリBCL (Balance Condition Library)を開発し、インターネット上で公開した。本研究の目的は、「埋め立て法」や「Walker法」に代表される独創的な幾何学的手法をさらに発展させることにより、モンテカルロ法の収束を劇的に改善する方法を見出し、それらの新しい手法を強相関多体系の統計力学に応用し、さらに、新しいアルゴリズムに基づくソフトウェアの整備・公開することにある。さらに、量子モンテカルロ法によるエネルギーギャップの精密測定法、「量子モンテカルロレベルスペクトロスコピー法」の開発とスピンパイエルス系の相転移への応用、トポロジカルな秩序変数として期待されている局所Z(N)ベリー位相の量子モンテカルロによる測定法の開発、相互作用の非等方性が強い系に対する有効な有限サイズスケーリング法の開発と非等方性起源の有限サイズスケーリングへの強い補正の起源の解明を行った。さらに、「埋め立て法」のための汎用ライブラリBCL (Balance Condition Library)とそれを応用したワームアルゴリズム量子モンテカルロ法アプリケーションWormsを開発し、インターネット上で公開した。今年度はこれを拡張し、詳細釣り合いを満たしつつも棄却率を最小化するアルゴリズムを開発し、ポッツ模型の局所更新法に用いた場合、従来の埋め立て法と同程度に有効であることを示した。

加えて、「埋め立て法」にもとづく「棄却なし向き付きフープ量子モンテカルロ法」のプログラムを作成し、従来の方法では緩和が遅くシミュレーションが困難であったスピンパイエルス系の量子相転移現象を調べ、2次元における「スピン液体」状態の存在の可能性を示した。他にも、量子モンテカルロ法によるエネルギーギャップの精密測定法、量子モンテカルロ法により求めたエネルギー準位の交差により相転移点を精度よく求める「量子モンテカルロレベルスペクトロスコピー法」の開発とスピンパイエルス系の相転移への応用、トポロジカルな秩序変数として期待されている局所Z2ベリー位相の量子モンテカルロによる測定法の開発、相互作用の非等方性が強い系に対する有効な有限サイズスケーリング法の開発などを行った。研究計画に挙げた、アルゴリズム開発、それにもとづくプログラム開発と公開、さらにそれを用いた量子スピン系の研究が平行しておおむね順調に進んでいる。研究計画に挙げた、アルゴリズム開発、それにもとづくプログラム開発、さらにそれを用いた量子スピン系の研究が平行しておおむね順調に進んでいる。平成24年度の研究を継続するのと同平行して、既存のモンテカルロ法との組み合わせ手法の探求とその効果の検証(長距離相互作用系におけるO(N)法との組み合わせ、拡張アンサンブル法との組み合わせ、波数空間・周波数空間での直接モンテカルロ法の開発)を進める。また、汎用ライブラリBCLの機能拡張、ドキュメント整備も進めていく。平成23年度の研究を継続するのと同平行して、既存のモンテカルロ法との組み合わせ手法の探求とその効果の検証(長距離相互作用系におけるO(N)法との組み合わせ、拡張アンサンブル法との組み合わせ、波数空間・周波数空間での直接モンテカルロ法の開発)を進める。主として、他の研究者との情報交換・研究打合せ・成果発表のための出張旅費、およびプログラム開発・資料整理に対する謝金、その他消耗品に研究費を使用する計画である。
アブドゥルカリームの反乱の歴史的意義－「リーフ・ナショナリズム」の再検討－

平成25年(2013年)9月9日27日に国外調査を行い、メリーリャ(スペイン)とラバト(モロッコ)を訪問した。メリーリャはモロッコ北東部沿岸に位置するスペイン領の「飛び地」で、その地政学的特徴により、アフリカ大陸からヨーロッパ大陸へ渡るための玄関口として、特にヨーロッパへの移住や移動を試みるアフリカ諸国出身者にとってその認識が拡大しつつある。メリーリャには、モロッコ人やスペイン人、アラブ、ベルベル、ムスリム、キリスト教徒、ユダヤ教徒などエスニシティや帰属宗教を異にする人々が居住する。またメリーリャは、スペイン領モロッコ時代に植民地政府の拠点の一つとなった地であり、リーフ戦争時には周辺農村部を含め激しい戦闘が繰り広げられた地域でもある。メリーリャにおける人々の混住状況について、史料から本格的な定量分析が可能となるのは、19世紀半ば以降の史料である。今回の調査では、とりわけスペイン領モロッコ時代(1912-56年)直前のメリーリャの住民の混住状況を把握することのできる史料や、本研究課題であるリーフ戦争期に関連する史資料の収集を目的に、メリーリャの総合文書館や軍事文書館、図書館に通い作業に従事した。ラバトも訪問し、研究書等の購入に従事した。2013年12月7日には、スペイン史学会第155回定例研究会(慶應塾大学三田キャンパス)において「メリーリャにおける異教徒の混住ー19世紀末20世紀初頭の住民基本台帳を手がかりにー」を行い、同年9月のメリーリャでの調査を通じて収集した史料を一部加えて報告した。また2013年8月には、北アフリカ・マグリブ地域研究者による「マフザン研究会」を発足した。「マフザン」と表現されるマグリブ地域の王朝(国家)権力の性質について、おもにモロッコ、アルジェリアを中心に中世現代にかけて幅広く議論することを目的として、何度か研究会を開催し個別発表を行った。平成25年(2013年)9月にメリーリャ(スペイン)とラバト(モロッコ)で国外調査を行った。特にメリーリャの総合文書館や軍事文書館、図書館を中心に通い、スペイン領モロッコ時代(1912-56年)直前のメリーリャの人々の混住状況に関する史資料収集に従事した。その際の調査を通じて入手した史料の一部を分析しながら、スペイン史学会第155回定例研究会で「メリーリャにおける異教徒の混住ー19世紀末20世紀初頭の住民基本台帳を手がかりにー」を発表した。平成25年度は、夏季のメリーリャとラバトにおける国外調査および、パキスタン・ラホールでのイスラーム地域研究国際会議、スペイン史学会定例研究会などでの発表を重点的に行った。国外調査を通じて20世紀初頭のメリーリャの住民基本台帳やリーフ戦争に関する史資料を収集することができた。これらの史資料についてはまだ分析が完了していないものも多々あるため、今後は入与した史資料の解析に努めることが第一に重要な作業である。また、モロッコ、スペイン、フランスを中心とした図書館や文書館等でのさらなる調査に従事し、リーフ戦争と「リーフ・ナショナリズム」に関する分析を進め、それらに基づいた研究発表や論文執筆を積極的に行いたい。平成24年度(2012年度)の本研究の研究業績については、以下のとおりである。リーフ戦争(1921-26年)は、今日でも検証作業の続く論点の多様な戦争である。スペインの植民地支配下にあったモロッコ北部リーフ地方で勃発したリーフ戦争は、何を希求した戦いであったのか。本研究の最大の研究目的であると同時に、その鍵を「リーフ・ナショナリズム」に求めた本研究は、ナショナリズム論の応用と、リーフ戦争に関するモロッコ、スペイン、フランスなどの史料の複眼的な分析を検証作業の中心に置いている。その予備的考察として、前述した英文の論文において、一部の史料分析とナショナリズム論の検証を行った。平成24年度後半には、同年10月20日発行の『史学雑誌』(史学会、第121編第10号)に、ギー・ペルヴィエ著(渡邊祥子訳)『アルジェリア戦争-フランスの植民地支配と民族の解放-』の新刊紹介を執筆した。2012年は、アルジェリア独立から50年目の節目の年であった。アルジェリア近現代史の転換点となったアルジェリア独立戦争について、フランスとアルジェリア双方の視点から実証的に分析されている同書は、隣国モロッコの植民地時代という同時代の同様の状況を研究対象としている私自身にとって、参考となる箇所を多く含む興味深い文献である。

ラバトも訪問し、研究書等の購入に従事した。2013年12月7日には、スペイン史学会第155回定例研究会(慶應塾大学三田キャンパス)において「メリーリャにおける異教徒の混住ー19世紀末20世紀初頭の住民基本台帳を手がかりにー」を行い、同年9月のメリーリャでの調査を通じて収集した史料を一部加えて報告した。また2013年8月には、北アフリカ・マグリブ地域研究者による「マフザン研究会」を発足した。「マフザン」と表現されるマグリブ地域の王朝(国家)権力の性質について、おもにモロッコ、アルジェリアを中心に中世現代にかけて幅広く議論することを目的として、何度か研究会を開催し個別発表を行った。スミスやアンダーソンなどのナショナリズム論を整理、応用しながら、本研究の主要な研究目的である「リーフ・ナショナリズム」の予備的考察および検証に従事した。その研究成果として、前述したように、A Preliminary Consideration of "Rif Nationalism" : In relation to the resistance of 'Abdal-Karim al-Khattabiと題した論文を執筆した。平成25年(2013年)9月にメリーリャ(スペイン)とラバト(モロッコ)で国外調査を行った。特にメリーリャの総合文書館や軍事文書館、図書館を中心に通い、スペイン領モロッコ時代(1912-56年)直前のメリーリャの人々の混住状況に関する史資料収集に従事した。その際の調査を通じて入手した史料の一部を分析しながら、スペイン史学会第155回定例研究会で「メリーリャにおける異教徒の混住ー19世紀末20世紀初頭の住民基本台帳を手がかりにー」を発表した。平成24年度は、すでに入手済みのリーフ戦争やスペイン領モロッコ史関連の史料、文献等の分析および、ナショナリズム論の整理に重点を置いて研究を行った。他方、国外での史料調査および史料収集に従事することも重要である。平成25年度は、モロッコ、スペイン、フランスを中心とした図書館や文書館等での調査に従事し、「リーフ・ナショナリズム」を分析するためのさらなる史料収集を進めたい。また、文字史料による分析とともに、モロッコ北部リーフ地方での現地調査を重ねながら、「リーフ・ナショナリズム」の継続、断絶あるいは復興の実態について検証し、モロッコ近現代史における「リーフ・ナショナリズム」の位置づけを試みる。平成25年度は、夏季のメリーリャとラバトにおける国外調査および、パキスタン・ラホールでのイスラーム地域研究国際会議、スペイン史学会定例研究会などでの発表を重点的に行った。国外調査を通じて20世紀初頭のメリーリャの住民基本台帳やリーフ戦争に関する史資料を収集することができた。これらの史資料についてはまだ分析が完了していないものも多々あるため、今後は入与した史資料の解析に努めることが第一に重要な作業である。また、モロッコ、スペイン、フランスを中心とした図書館や文書館等でのさらなる調査に従事し、リーフ戦争と「リーフ・ナショナリズム」に関する分析を進め、それらに基づいた研究発表や論文執筆を積極的に行いたい。
カニクイザルを用いた卵巣臓器全体の凍結技術確立

霊長類のカニクイザルを用いて卵巣臓器凍結技術を確立することが研究目的である。カニクイザルから卵巣動静脈をつけたまま卵巣全体を摘出する技術を検討した。卵巣を凍結する際の凍結保護剤の条件検討、緩慢凍結方法の条件検討を行った。凍結融解後の卵巣の機能を検討するため、Propidium iodide(PI)を用いて細胞のバイアビリティを測定、FSH添加後の培養液中のエストロゲン濃度をELISAで測定した。本研究では霊長類のカニクイサルを用いて卵巣臓器凍結技術を確立することを目的とした。ヒトと同じ霊長類での凍結技術は将来のヒトへの臨床応用の基礎的データとして重要な意味をもつと考え本実験を遂行した。卵巣臓器全体を卵巣動静脈をつけたまま凍結融解し、自家移植する際に血管吻合を行って、卵巣全体を自家移植する方法をめざし下記の成果を得た。1カニクイサルを全麻下に腹腔鏡で卵巣を確認し、卵巣動静脈をつけたまま卵巣全体を摘出する技術を確立した。2卵巣動静脈をつけたまま摘出した卵巣を凍結するための凍結保護剤の最適な条件を設定した。凍結保護剤はLeivovitz L-15 Medium(無機塩類、アミノ酸、ビタミン、糖類を含む)にDMSO、ショ糖、10%胎児血清を加えたものを用いた。DMSO、ショ糖の濃度をそれぞれ1M、1.5Mと設定した。室温から-7度までは-2度/毎分の冷却スヒードでおこない、-7度から-30度まては-0.3度/毎分、-30度から-190度までは-50度/毎分で行った。3これらの実験結果の評価を行うために、凍結融解した卵巣の組織学的検討を行った。HE染色による形態学的検討とTUNEL染色、C aspase-3染色を行い、凍結融解した卵巣への障害の程度を検討した。コントロールの卵巣と比較し、TUNEL染色、C aspase-3染色が陽性となる細胞は約10-15%増加した。4これらの組織学的検討に加え、卵巣組織、細胞がどの程度生存しているのかを直接的に調べるためにバイアビリティの検討を行った。死細胞の細胞膜のみを通過するPropidium iodide(PI)を用いる方法と、FSH添加によるエストロゲンの産生能力を比較する方法の2つの実験を施行した。PI法ではコントロールの卵巣との有意差は認めなかった。またエストロゲン産生能力も有意差を認めなかった。本研究では霊長類のカニクイザルを用いて卵巣臓器凍結技術を確立することを目的としている。ヒトと同じ霊長類での凍結技術は将来のヒトへの臨床応用の基礎的データとして重要な意味をもつと考え本実験を遂行中である。卵巣臓器全体を卵巣動静脈をつけたまま凍結、融解し、自家移植する際に血管吻合を行って、卵巣全体を自家移植する方法をめざしている。カニクイザルを用いた実験を行う上で動物の特性、飼育技術を身につけることがまず必須であると考え、動物センター主催の講習会などに参加した。そのうえで、研究者はカニクイザルを全麻下に腹腔鏡で卵巣を確認し、卵巣動静脈をつけたまま卵巣全体を摘出する技術を確立した。まずは実験を遂行する上での素地ができたと考える。卵巣動静脈をつけたまま摘出した卵巣を凍結するための凍結保護剤の最適な条件を設定中である。一般的に用いられている凍結保護剤はDMSOやエチレングリコールであるが、最も適した濃度や平衡化時間などは未解明であることからヒトと同じ霊長類での検討は非常に大事である。また、緩慢凍結法で凍結を行うことを目的としているが、同様にその最も適した条件設定を検討中である。本実験の核となるデータを集積中である。これらの実験結果の評価を行うために、凍結融解した卵巣の組織学的検討を行っている。HE染色による形態学的検討とTUNEL染色、Caspase-3染色を行い、凍結融解した卵巣への障害の程度を検討している。これらの組織学的検討に加え、卵巣組織、細胞がどの程度生存しているのかを直接的に調べるためにバイアビリティの検討を行う準備を開始した。死細胞の細胞膜のみを通過するPropidium iodide(PI)を用いる方法と、FSH添加によるエストロゲンの産生能力を比較する方法の2つの実験を準備中である。施行中の凍結融解方法が適正かどうかを検討するために必須の実験と考えている。本年度に予定していた下記の実験がおおむね施行することができたので順調に進展していると判断している。(1)カニクイザルから卵巣動静脈をつけたまま卵巣全体を摘出するための技術。ケタミン0.1ml/kg、キシラジン0.05ml/kgを大腿部に筋肉注射し、イソフルレン3%で麻酔を維持する。前腕部に点滴ルートを確保し、心電図モニター、酸素飽和度モニターを装着する。臍下正中切開で開腹し卵巣を動静脈を付けたまま摘出する。閉腹後、麻酔からの覚醒を確認した後ケージに戻す。

12時間後より食事を再開し2週間後に抜糸する。卵巣を摘出する直前にヘパリンを1000単位静注しヘパリン化を行う。摘出した卵巣を4°Cのヘパリン化した生理食塩水に浸漬すると同時に動脈からも1ml/分の速度で10分間還流する。その後、凍結保護剤に切り替え、0.5ml/分の速度で60分間還流した。(2)凍結保護剤の最適な条件設定(本研究の核となる実験)凍結保護剤はLeivovitz L-15 Medium(無機塩類、アミノ酸、ビタミン、糖類を含む)にdimethyl sulphoxide(DMSO)、ショ糖、10%胎児血清を加えたものを用いている。DMSO、ショ糖の濃度をそれぞれ0.5Mから3.0M、0.1Mから2.0Mの様々な条件で作成し、それぞれの凍結保護剤で緩慢凍結、融解をおこなった。室温から-7度までは-2度/毎分の冷却スピードでおこない、-7度から-30度までは-0.3度/毎分、-30度から-190度までは-50度/毎分で行った。融解は凍結していた卵巣を37度の温水中に浸けた後、融解液(Leivovitz L-15 Mediumに10%胎児血清、1.0MのDMSO、0.1Mのショ糖を加えたもの)に浸透した。今後は実験計画通り、下記の3つの実験を行っていく予定である。(1)凍結保護剤のどの条件が最も卵巣への障害が少ないかを調べるためにさらにバイアビリティの検討を引き続き行う。ポジティブコントロールとして凍結していない卵巣、ネガティブコントロールとして凍結保護剤を使用せず凍結した卵巣を用いる。凍結融解した卵巣を1mmの厚さにスライスし、Leivovitz L-15 MediumにPIを加えた培養液で組織培養する。培養後、固定、切片を作成し、488nmのレーザーで励起して観察する。PIが取り込まれた死細胞は615nmの波長で蛍光を発するので蛍光を発する細胞が少ない方がバイアビリティが高いと判断できる。またFSH添加によるエストロゲンの産生能力を比較する。FSHを添加後、培養液中のエストロゲン濃度をELISAで測定していく。(2)緩慢凍結法の最適な条件設定を行う。室温から-7度までは-2度/毎分、-7度から-30度までは-0.3度/毎分、-30度から-190度までは-50度/毎分の冷却スピードでおこなう群と、室温から-7度までは-1度/毎分、-7度から-30度までは-0.2度/毎分、-30度から-190度までは-10度/毎分で行う群の2群で比較し、上記と同様のバイアビリティの検討を行う。(3)自家移植した卵巣の機能回復の評価を行う。設定した凍結保護剤と緩慢凍結法で凍結融解した卵巣臓器をもともとの個体に自家移植する。カニクイザルを開腹後、融解した卵巣を直ちに移植に供する。残存している対側の健常卵巣を新たに摘出し、その卵巣動静脈に融解後の卵巣動静脈の吻合を行う。通常の月経周期が回復するかどうか、月経周期に伴うエストロゲン、プロゲステロンの上昇を確認し、自家移植した卵巣が正常に機能しているかどうか判断する。実験に必要な薬品やガラス器具などを購入する必要がある。実験動物(カニクイザル、70万円/1匹)は2匹購入予定としている。研究期間が2年間と限られているため効率よく研究を進めるために実験補助者を週に1日(月に5日)程度雇用する際の経費を計上する予定である。
高温型燃料電池材料へのヒ-トサイクルの影響

溶融炭酸塩型燃料電池の開発に材料腐食は避けられない問題であり、装置の性質上ヒ-トサイクルの効果は重要である。本年度は電池構成材料に広く用いられている元素であるニッケルを取り挙げ、溶融炭酸塩共存下での高温腐食速度を定常状態下、ヒ-トサイクル下熱天秤で測定し、表面を走査電子顕微鏡で観察した。それぞれの機構を解明、比較した。1.ニッケルに塗布した溶融塩量による影響:Li_2(CO)_3の場合初期から重量増加は放物線則に従い、6mg/cm^2の塗布量で最大となった。(Li_<0.62>K_<0.38>)_2CO_3の場合、反応開始後40時間は3乗則に、それ以後放物線則に従った。15時間反応時の重量増加は3mg/cm^2の塗布量で最大であった。2.ニッケル高温腐食の温度依存性:(Li_<0.62>K_<0.38>)_2CO_3を35mg/cm^2ニッケルに塗布し、温度を923Kから1073Kまで変化させて、高温腐食を行なった。いずれの場合も反応初期を除き放物線則が成り立ち、放物線則速度定数の活性化エネルギ-は負になった。この特異現象の原因に酸化ニッケルの溶融炭酸塩への溶解度の関与が示唆された。3.ヒ-トサイクルの影響:(Li_<0.62>K_<0.38>)_2CO_3を51mg/cm^2塗布したニッケル試料を昇温速度40K/分で1073Kまで上げて2時間保持した後、放冷し試料温度が443Kになったところで再び40K/分で加熱するサイクルを20回繰り返した。この場合の重量増加速度は、連続定常加熱の場合に比して放物線則速度定数が2.5倍大きくなった。すなわち、ヒ-トサイクルは高温腐食を促進する。原因として、サンプル表面の熱収縮の不均一性によるひび割れ等が挙げられる。今後ヒ-トサイクルの上限下限温度、上昇下降速度、サイクル数の影響等に研究を進めていく方針である。
骨軟部腫瘍の転移メカニズム-matrix metalloprotinaseの観点より-

肺転移を形成するまでの間にはいくつかのプロセスが必要である。その初期の過程では、まづ固形腫瘍から個々の腫瘍細胞が遊離して血管基底膜へ侵入しなければならない。血管基底膜はタイプIVコラーゲン、ラミニン等から成り、腫瘍がこの膜を通過するにはこれらの膜成分を変性させ小孔を形成しなければならない。一方,膜成分を変性・消化させるものとしてはメタロプティナーゼ(matrix metalloproteinase,以下MMP)が知られている。我々は骨軟部腫瘍のMMP活性を調べ,肺転移能との関係で検討を加えた。方法論として培養細胞を用いるため,先づ培養細胞株の樹立に努めた。その結果,4種の骨肉腫,2種の軟肉腫,4種の転移性骨腫瘍(癌),4種の悪性線維性組織球腫,3種類の骨巨細胞腫について細胞株を樹立することができた。無血清培地下の各培養細胞にMMP産生刺激剤としてのインターロイキン1(以下IL-1)を加え、その培地を採取して電気泳動に流し、トランスファー後、抗MMP抗体を作用させ,その後発色させてバンドの色調により活性度を検討した。その結果,肺転移能の高い細胞株は多数バンドのゼラチナーゼ活性を有していた。また細胞は培養環境を変えることでもその形質発現に大きな影響を与えるため,タイプIコラーゲン,タイプIVコラーゲンゼラチン等をコーティングした培養中で同様の実験を行うと,特にゼラチン下で大きな活性を増幅してみることができた。骨腫瘍組織中には破骨細胞の存在をかなりの頻度で認める。我々は,破骨細胞様の多核巨細胞を腫瘍細胞のconditioned mediumを用いて実験的に作製し,組織化学的検索からこの細胞がIL-1を産生することが示された。従って以下のように考えている。腫瘍細胞は破骨細胞の形成をもたらし,この破骨細胞はIL-1の産生にて腫瘍細胞のMMP活性を高め,その結果局所の骨破壊や肺転移が進展する。骨肉腫や軟骨肉腫等の悪性骨腫瘍や横絞筋肉腫や悪性線維性組織球腫等の悪性骨軟部腫瘍の組織培養系を確立した。樹立した細胞株細胞のmatrixーmetalloproteinase産生能を無血清下で検討した。無刺激下の状態では産生能は決して高くはなかったが,インタ-ロイキン1を添加すると産生能は著明に増加した。分子量72000のゼラチナ-ゼが最も顕著に現われそれより低分子の分子量が40000ぐらいまでにわたる多数のゼラチナ-ゼ活性を骨肉腫細胞株細胞に認めることができた。軟骨肉腫では分子量72000のゼラチナ-ゼ活性と分子量57000のストロメリシン活性をみることができた。ストロメリシンは軟骨のプロテオグリカンを分解する能力があるため軟骨細胞由来の軟骨肉腫に本活性を認めたことは腫瘍の増大能力を知るのみならず軟骨代謝を知る意味でも意義が高いと考えられる。悪性軟骨腫瘍でも分子量72000のゼラチナ-ゼと分子量57000のストロメリシン活性を一部に認めることができた。これらの酵素活性は副腎ステロイドホルモンで抑制することができた。matrixーmetalloproteinase活性は複数のサイトカインの刺激でそれぞれ異なった状態を示すことが現在、実験にて確かめており、今後これらのことを報告予定である。また、骨腫瘍の骨破壊酵素活性をひきだすには骨に近い状態の環境下に培養細胞を置く必要があると考え現在実験をすすめている。

骨肉腫細胞由来のmatrix metalloproteinase(MMP)が培養環境により産生状況が変わりうることを証明した。通常培養条件下に比べ,タイプIコラ-ゲン,ゼラチン,タイプIVコラ-ゲンを含んだ骨に近い環境下ではMMP産生(MMP2,ゼラチナ-ゼとMMP3ストロメリシン)が増強された。即ち骨肉腫骨芽細胞はそれが本来であるべき環境下におかれることで本来の細胞活性を示すことが示され,今後の局所骨破壊機序を生化学的に検索していくうえで重要な知見と思われた。高転移性骨肉腫細胞株と低転移性株の両株を樹立することができた。これは転移機序を解明していくうえで有用なモデルと思われる。今後、検索をすすめるつもりでいるが,現時点では高転移性株ではmultipleのゼラチナ-ゼ活性が低転移株に対して有意に認められている。肺転移を形成するまでの間にはいくつかのプロセスが必要である。その初期の過程では、まづ固形腫瘍から個々の腫瘍細胞が遊離して血管基底膜へ侵入しなければならない。血管基底膜はタイプIVコラーゲン、ラミニン等から成り、腫瘍がこの膜を通過するにはこれらの膜成分を変性させ小孔を形成しなければならない。一方、膜成分を変性・消化させるものとしてはメタロプロティナーゼ(matrix metalloproteinase,以下MMP)が知られている。我々は骨軟部腫瘍のMMP活性を調べ、肺転移能との関係で検討を加えた。方法論として培養細胞を用いるため、先づ培養細胞株の樹立に努めた。その結果、4種の骨肉腫、2種の軟骨肉腫、4種の転移性骨腫瘍(癌)、4種の悪性線維性組織球腫、3種類の骨巨細胞腫について細胞株を樹立することができた。無血清培地下の各培養細胞にMMP産生刺激剤としてのインターロイキン1(以下IL-1)を加え、その培地を採取して電気泳動に流し、トランスファー後、抗MMP抗体を作用させ、その後発色させてバンドの色調により活性度を検討した。その結果、肺転移能の高い細胞株は多数バンドのゼラチナーゼ活性を有していた。また細胞は培養環境を変えることでもその形質発現に大きな影響を与えるため、タイプIコラーゲン、タイプIVコラーゲン、ゼラチン等をコーティングした培養中で同様の実験を行うと、特にゼラチン下で大きな活性を増幅してみることができた。骨腫瘍組織中には破骨細胞の存在をかなりの頻度で認める。我々は、破骨細胞様の多核巨細胞を腫瘍細胞のconditioned mediumを用いて実験的に作製し、組織化学的検索からこの細胞がIL-1を産生することが示された。従って以下のように考えている。腫瘍細胞は破骨細胞の形成をもたらし、この破骨細胞はIL-1の産生にて腫瘍細胞のMMP活性を高め、その結果局所の骨破壊や肺転移が進展する。
微小蛋白質結晶の異常分散法によるX線構造解析法の開発

微小蛋白質結晶のX線構造解析法の開発を目的とし、輝尽性蛍光体イメージングプレートを採用した高感度で高精度のX線カメラ露光リアルタイム検出装置を試作し、X線異常分散効果を利用して構造解析の処理を行うための計算機プログラムシステムを開発した。これらを用い、シンクロトロン放射光による異常分散効果を最適化した回折データを微小蛋白質結晶について測定し、抗体など3種の蛋白質の結晶構造を解析した。ダンシルリジンに結合するマウス抗体のFvフラグメントについて、多波長異常分散法用の回折データ処理と異常分散項の算出処理のプログラムを用いて解析を進めた。その結果、異常分散パターソン合成による相補性決定部位のメチオニンに結合した白金のサイトを得ることができた。その後、分子置換法とモデル精密化法を併用してこのFvフラグメントの結晶構造を1.6A分解能という抗体では最も高い精度で解析を完了することができた。白色X線による異常分散効果の測定系と処理系も新たに開発し、ラウエ回折法に基づく今後の時分割実験による動的構造研究でも適用可能となった。マウス抗ニトロフェノール(NP)抗体3B44のFavフラグメンの微小結晶について、開発した検出装置を用いることにより3A分解能の回折データを得ることができた。このものの臭素化NPとの複合体の多波長データでは臭素化NPの結合が十分でなかったため分子置換法を適用し、3A分解能で構造解析に成功した。また、抗体NIG9のFabでも結晶が微小で従来法では回折データが得られなかったが、開発した測定処理系によって2.5A分解能の良好なデータを得た。さらに、リボヌクレアーゼU_2も1.8A分解能での解析を完了した。このものの異常分散差フーリエ合成ではイオウ原子のみを明瞭に電子密度として見いだすことができた。研究初年度の平成2年度においては、輝尽性蛍光体イメ-ジングプレ-トを検出媒体とするカメラ一体型検出器を設計し、『X線カメラ露光リアルタイム検出装置』として製作した。これに『計測制御用コンピュ-タシステム』を接続し、イメ-ジングプレ-トの回転ドラムへの脱着と交換の機構、蛍光の集光検出部等のテストを終え、総合的な装置の調整、評価および必要な改良等を行っている。単色X線による蛋白質結晶の回折パタ-ンを、高エネルギ-物理学研究所放射光実験施設の水平型四軸X線回折装置ビ-ムラインを用いて得、回折パタ-ンの計算機シュミレ-ションプログラムと回折強度算出プログラムを開発した。このプログラムの作製、整備と評価は大いに進展し、トリプシンー医薬品阻害剤の複合体、リボヌクレア-ゼU2、ダンシルリジン結合免疫グロブリンFvの微小結晶について測定処理を行い、デ-タのクオリティ-を示すR_<Imerge>が14%台という良好な結果を得た。特に、分解能が2.5Åまでのデ-タではR_<Imerge>が2%以下となり、極めて精密な回折X線強度の測定が可能であることを示し、これら予備的な成果を、日本薬学会年会、日本結晶学会年会で3件、および仏国での国際結晶学会議で3件を発表した。また、単色X線を用いる多波長異常分散法の解析処理プログラムを作製してアミラ-ゼインヒビタ-の結晶について適用し、原子散乱因子の異常分散項の適切な見積もり法を併用してその原子位置を決定した。平成3年度に計画している異常分散元素を含む蛋白質結晶の探索を、蛍光X線量を検出するX線吸収スペクトル法により予備的に行ない、蛍光X線の検出感度が高く極めて有望な手法であることを定量的に知ることができた。