hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エスキモー伝承芸能の調査ー遊びと歌と踊りー

60年度,61年度の2年間に4次にわたって実施された現実調査によって得られた400本の録音テープ(400時間),150本のビデオ・テープ(150時間),および写真フィルム等の整理,複製,編集が終了した.音楽の分析・研究のための採譜および音楽地図作製の作業は継続中である.これらの資料は北海道教育大学札幌分校・音楽研究室に保管するが,資料の一部は国立民族学博物館,Ethnology Division of theる.アラスカ・ベーリング海域からカナダ・バフィン島まで,北米大陸の北極圏のエスキモー集落の主要なところをカバーすることの出来た本調査により,緊急に保存を要するエスキモー伝承芸能の記録を行なうことが出来たと同時に,これまで明らかでなかったエスキモーの伝承芸能の全容が,各地域間の比較研究を基に明らかにすることが出来た.これはシベシア大陸から北米大陸への民族移動及び文化の伝播の状況を綜合的に研究するために重要なものと考えられる.この調査・研究で得られた新たな知見のいくつかを以下に例示する.1.ドラム・ダンスの太鼓の叩き方踊り方等から,ベーリング海沿岸地域は鯨猟という共同労働を反映した独特の演奏形態(グループでの太鼓と踊り)により,一つの芸能圏(文化圏)を形成している,さらにこの芸能圏にへだてられている地域,西のシベリア(アジア・エスキモー,チュクチを除き)と東のカナダ・エスキモーにかえって共通する要素が多く(独りで太鼓叩き踊る等),生業形態と芸能による表現との間に個有の関係があることを具体的に示している.2.喉鳴らし遊びは,シベリア(アイヌを含め)とカナダ東部(ハドソン湾沿岸地域)にだけ存在し,アラスカとカナダ中・西部にはみられない.文化要素陥没の一つの例として東西の文化要素の移動,定着に興味ある例を提供している.3.北米大陸,シベリア大陸全域にわたって共通する遊びの中の特徴は,その競技的性格である.したがって2人または2組で行なうものが多いと同時に,笑いをさそうユーモラスな動作を付与しているものも多い.これは対抗と協調という矛盾を克服する手段として,エスキモー社会の存続の要件の一つであったと考えられる.4.エスキモーの芸能の基底にシャマニズムがあり,シャーマンの巫術の内容が,鳥や動物の鳴き声の擬声音とか,人工的に変化させられる特別の音声等異体的な形で芸能の中に示されている.60年度,61年度の2年間に4次にわたって実施された現実調査によって得られた400本の録音テープ(400時間),150本のビデオ・テープ(150時間),および写真フィルム等の整理,複製,編集が終了した.音楽の分析・研究のための採譜および音楽地図作製の作業は継続中である.これらの資料は北海道教育大学札幌分校・音楽研究室に保管するが,資料の一部は国立民族学博物館,Ethnology Division of theる.アラスカ・ベーリング海域からカナダ・バフィン島まで,北米大陸の北極圏のエスキモー集落の主要なところをカバーすることの出来た本調査により,緊急に保存を要するエスキモー伝承芸能の記録を行なうことが出来たと同時に,これまで明らかでなかったエスキモーの伝承芸能の全容が,各地域間の比較研究を基に明らかにすることが出来た.これはシベシア大陸から北米大陸への民族移動及び文化の伝播の状況を綜合的に研究するために重要なものと考えられる.この調査・研究で得られた新たな知見のいくつかを以下に例示する.1.ドラム・ダンスの太鼓の叩き方踊り方等から,ベーリング海沿岸地域は鯨猟という共同労働を反映した独特の演奏形態(グループでの太鼓と踊り)により,一つの芸能圏(文化圏)を形成している,さらにこの芸能圏にへだてられている地域,西のシベリア(アジア・エスキモー,チュクチを除き)と東のカナダ・エスキモーにかえって共通する要素が多く(独りで太鼓叩き踊る等),生業形態と芸能による表現との間に個有の関係があることを具体的に示している.2.喉鳴らし遊びは,シベリア(アイヌを含め)とカナダ東部(ハドソン湾沿岸地域)にだけ存在し,アラスカとカナダ中・西部にはみられない.文化要素陥没の一つの例として東西の文化要素の移動,定着に興味ある例を提供している.3.北米大陸,シベリア大陸全域にわたって共通する遊びの中の特徴は,その競技的性格である.したがって2人または2組で行なうものが多いと同時に,笑いをさそうユーモラスな動作を付与しているものも多い.これは対抗と協調という矛盾を克服する手段として,エスキモー社会の存続の要件の一つであったと考えられる.4.エスキモーの芸能の基底にシャマニズムがあり,シャーマンの巫術の内容が,鳥や動物の鳴き声の擬声音とか,人工的に変化させられる特別の音声等異体的な形で芸能の中に示されている.
疲弊T細胞再活性化機構を基盤とした新規BCGワクチンの開発

1)マイコバクテリア感染防御機構のIL-21の役割卵白アルブミン(OVA)発現Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin(BCG-OVA)をインターロイキン21レセプター(IL-21R)ノックアウト(KO)マウスの気道内に感染させて、肺に存在する抗原特異的CD8T細胞をフローサイトメターにて経時的に観察したところ、感染21日目の肺で抗原特異的IFN-γ産生CD8T細胞の数がIL-21RKOマウスでwild type(WT)マウスに比べて有意に減少していた。IL-7Rα(CD127)、CD122(βcR)、CD62、CCR6で染色したところ、エフェクター/メモリータイプが選択的に減少していることがわかった。しかしながら疲弊exhausted T細胞はIL21RKOマウスとWTマウスに差を認められなかった。2)マイコバクテリア気道感染防御機構のIL-7の役割IL-21/Ag85B融合蛋白質産生レコンビナントBCG(rBCG-IL-21/)を作成してウェスタン法とELISAでAg85B融合IL-21蛋白質産生を確認した。rBCG-IL-7/Ag85Bをマウスの腹腔内に投与して菌数、細胞動態を解析したところ、菌数はコントロールのrBCG-IL-21/Ag85Bと差はなかったが、感染後7日目でのIL-17A産生γδT細胞の数がrBCG-IL-21/Ag85B投与群で有意に低下していた。その低下するIL-17A産生γδT細胞はVγ6を発現しており、BCG感染マウスのγδT細胞を取り出し、in vitroにIL-21を加えるとVγ6 IL-17A産生γδT細胞が選択的にアポプトースをおこすことがわかった。IL-7およびIL-21/Ag85B融合蛋白質産生レコンビナントBCGの作成をし、そのBCGに対する早期の免疫応答を検討した。1)マイコバクテリア感染防御機構のIL-21の役割2)マイコバクテリア気道感染防御機構のIL-7の役割IL-7RαKOマウスではT細胞の分化ができないのでTCRγ鎖トランスジェニックマウスとかけあわせてγδ型T細胞を分化させたマウスを作製できた.Rosa26-loxP-stop-loxP-ICN1-IRES-GFP x MX1-CreマウスでNotchシグナルを末梢で強制的にIL-7R誘導したマウスを作製して,IL-17A産生T細胞の増加したマウスを作製することがわかった.しかし感染実験まで行うことはできなかった.1)マイコバクテリア感染防御機構のIL-21の役割IL-21/Ag85B融合蛋白質産生レコンビナントBCGをマウスに投与して、長期間の抗原特異的T細胞の推移を検討する。結核菌に対する感染防御効果を検証する。2)マイコバクテリア気道感染防御機構のIL-7の役割IL-7/Ag85B融合蛋白質産生レコンビナントBCG rBCG-IL-7をマウスに投与して、長期間の抗原特異的T細胞の推移を検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学1)マイコバクテリア感染防御機構のIL-21の役割BCG感染早期でのIL-21のCD8T細胞の活性化の機序を増殖促進か,アポトーシスかをあきらにするためにCFSEでラベルしてIL21RKOOT-1細胞をもちいて検討する.当初想定した疲弊exhausted T細胞の抑制におけるIL-21の役割をBCG感染後期で明らかにする.2)マイコバクテリア気道感染防御機構のIL-7の役割28年度が最終年度であるため、記入しない。
炎症における遅延型血管透過亢進機構の解明

ウサギのLPS胸膜炎をモデルに、その早期に産生されるサイトカインを標的にして、遅延型血管透過亢進に関っているメディエーターを明らかにし、遅延型血管透過亢進の機構の解明を試みた。その結果、ウサギのLPS胸膜炎では血管透過亢進は2相性を示し、H1ヒスタミン拮抗剤は即時型透過を完全に抑制したが、遅延型透過は全く抑制されなかった。この炎症で最も早期に産生されているサイトカインはTNFαとIL-8であり、産生のピークは約2時間にあり、遅延型血管透過亢進のピークに一致していた。LPS胸膜炎でのIL-8の産生は抗TNFα抗体で約60%が抑制されたが、TNFα産生は抗IL-8抗体では抑制されなかった。遅延型血管透過亢進は、抗TNFα抗体投与または抗IL-8抗体投与によって約90%が抑制された。TNFα投与ではIL-8産生と遅延型透過に類似した血管透過亢進が起こるが、この透過亢進は抗IL-8抗体でほぼ完全に阻止できた。一方、IL-8の投与ではTNFαの産生は誘導されず、抗TNFα抗体はIL-8による血管透過亢進を阻止できなかった。また、ホストの好中球を枯渇させると遅延型血管透過亢進は完全に消失するが、即時型透過は抑制されず、TNFαの生産は正常ウサギと同様の産生量があり、IL-8の産生量は約65%に減少することが判明した。IL-1raを炎症局所に投与してIL-1βの機能を阻止しても、TNFαおよびIL-8の産生、即時型、遅延型いずれの血管透過亢進も影響を受けなかった。また、IL-1βを注射しても血管透過亢進は起こらなかった。以上より、遅延型血管透過と炎症早期の白血球浸潤は密接に関連しており、TNFαによって誘導された胸腔の常在細胞あるいは白血球が産生するIL-8による白血球浸潤が遅延型血管透過に関与していることが明らかになった。血管透過亢進は炎症性浮腫と組織の膨化や臓器の機能空間の減少による機能障害の主要な病態の1つで、この透過亢進の主要な部分を占める遅延型透過のメカニズムの解明は炎症の基本概念を知るうえで重要であるが現在も不明である。本年度はウサギのLPS胸膜炎における血管透過亢進が、一般の急性炎症と同様に2相性に起こること、この遅延型透過は好中球枯渇ウサギでは起こらないことを確認し、この実験系が遅延型透過のメカニズムを知るために妥当な系であることが証明された。この系において、抗TNFα抗体により炎症2時間の早期の白血球浸潤を阻止すると、遅延型透過も阻止できた。一方、IL-1ra組換体を用いると、同様に白血球浸潤の阻止は見られるが、遅延型透過は全く影響されないことが判明した。また、好中球枯渇動物ではTNFαの産生は全く抑制されていなかった。従って、遅延型透過はTNFαによって引き起こされる炎症2時間目の好中球浸潤と密接な関連があるが、TNFαはその直接のメディエーターではないとの結論が得られた。

これらの結果から、遅延型透過の直接のメディエーターを見いだすため、ウサギの系において、TNFαおよびIL-8の組換体およびこれらに対する抗体を作成する必要があると考え、その開発を行い、その精製に成功した。また、抗体も得られこれらを用いてウサギTNFαおよびIL-8のELISA系を開発した。そこで、この炎症におけるIL-8の産生動態を調べると、IL-8はTNFαと同様炎症2時間をピークとする炎症初期に産生されていることが判明し、遅延型透過のメディエーターの候補となりうることをつきとめた。次年度はこれらの因子の相互誘導関係、抗体による阻止実験により遅延型透過の直接のメディエーターを同定する予定である。平成8年度の研究により作成したTNFα、IL-8の組換体、抗体を用い、LPSで起こしたウサギ胸膜炎について、これらのサイトカインの産生動態と遅延型血管透過亢進への関与、サイトカイン相互の作用について検索を行った。その結果、LPS胸膜炎においては、TNFαとIL-8のいずれも胸水中の濃度のピークは炎症2時間目にあり、遅延型血管透過のピークに一致していた。LPS胸膜炎でのIL-8の産生は抗TNFα抗体で約60%が抑制されたが、TNFα産生は抗IL-8抗体では抑制されなかった。LPS胸膜炎の遅延型血管透過亢進はTNFα抗体投与あるいは抗IL-8抗体投与のいずれによっても約90%が抑制された。また、TNFα投与では1.5時間目に、IL-8投与では1時間目にピークを有する遅延型血管透過亢進が再現され、その血管透過の動態はLPS投与の場合に近似していた。TNFα投与ではIL-8産生と遅延型血管透過亢進が起こるが、この遅延型血管透過亢進は抗IL-8抗体でほぼ完全に阻止できた。一方、IL-8の投与ではTNFαの産生は誘導されず、抗TNFα抗体はIL-8による遅延型血管透過を阻止できなかった。これらの結果から、LPS胸膜炎での遅延型血管透過亢進はLPS刺激でTNFαが産生され、そのTNFαで産生が誘導されたIL-8によっていることが明らかになった。このIL-8の産生細胞は、白血球枯渇ウサギではIL-8の産生量が約65%に減少することから、胸腔の常在細胞と浸潤してきた白血球の両者と考えられた。
細菌・菌類病抵抗姓トランスジェニック植物の創成に間する研究

本研究では、研究対象として植物病原細菌インゲンかさ枯病菌,キウイフルーツかいよう病菌,イネもみ枯細菌病菌を中心に研究を行った。1)インゲンかさ枯病菌に関しては、本菌の産生する毒素ファゼオロトキシン(PHT)の単離・精製およびファゼオロトキシン耐性遺伝子のクローニングを行い、PHT非感受性OCTase遺伝子をクローニングすることに成功した。さらに、PCR法により、タバコのRuBisCOの小サブユニットのトランジットペプチド遺伝子とPHT非感受性OCTase遺伝子の5'領域を増幅・融合し,トランジットペプチドをもったOCTase遺伝子を作成した。この融合遺伝子を、植物発現ベクターpBI121のβ-グルクロニダーゼ遺伝子と置換することでプラスミドpMY6を構築し,アグロ感染性によりタバコ植物へ導入した。得られたトランスジェニックタバコはPHTに対し強い耐性を示すとともに,インゲンかさ枯病菌の増殖を著しく抑制することが明らかになった。2)キウイかいよう病菌P.s.actinidiaeについては、培養濾液から、ファゼオロトキシンと同様の活性物質が単離され、この活性物質はキウイおよびインゲンに黄色のハロ-を生じること、またE.coliに対し生育阻害活性を示し、この阻害はL-アルギニンおよびL-シトルリンの添加により相補されることなどから、ファゼオロトキシンと同一か、あるいは類似した毒素であることが確認された。現在pMY6を用いてキウイへ遺伝子導入を実行中である。3)イネもみ枯細菌病菌の病原性と病原毒素の相関性を明らかにする目的で,イネもみ枯細菌病菌の野性株とTn4431を有する病原性欠失変異株を作出した後、その変異株(♯19株)に野性株のコスミドゲノムライブラリーより病原性回復遺伝子をクローン化した。その結果,本菌の病原性に毒素トキソフラビンが密接に関係していることが明らかとなった。1.非特異的病原毒素の単離・同定および毒素耐性遺伝子のクローニング1)インゲンかさ枯病菌の産生する毒素ファゼオロトキシン(PHT)を対象に、生産菌自身のゲノムDMAよりPHT耐性遺伝子を探索・解析を行った結果、PHT非感受性OCTase遺伝子をクローニングすることに成功した。さらに、PCR法により、タバコのRuBisCOの小サブユニットのトランジットペプチド遺伝子とPHT非感受性OCTase遺伝子の5′領域を増幅・融合し、トランジットペプチドをもったOCTase遺伝子を作成した。この融合遺伝子を、植物発現ベクターpBI121のbeta-グルクロニダーゼ遺伝子と置換することでプラスミドpMY5を構築した。2)植物病原細菌の生産する非特異的毒素、イネもみ枯細菌病菌およびキウイフルーツかいよう病菌の産生する病原毒素の分離・精製を行い、現在これら毒素の構造を決定するとともに、これらの粗毒素を用いて、生産菌自体のゲノムDNAから毒素耐性遺伝子をクローニング中である。2.植物への遺伝子導入および植物体再生技術の確立1)植物への遺伝子導入では、上記のPHT非感受性OCTase遺伝子をpBI121のbeta-グルクロニダーゼ遺伝子と置換することで植物導入用プラスミドpMP31を構築し、この遺伝子をアグロ感染法によりタバコ植物へ導入した結果、形質転換タバコはPHTに対し強い毒素耐性を示さなかった。そこで、現在PHT非感受性OCTaseを葉緑体へ移行させるためプラスミドpMY5を用いてタバコおよびキウイフルーツ植物を形質転換中である。2)シバおよびムギなどの禾本科植物に関しては、現在エレクトロポレーション法によるカルスおよび胚組織への遺伝子導入法および植物体再生法の確立を行っている。1。

インゲンかさ枯病菌抵抗性トランスジェニック植物の作出前年度の研究で,インゲンかさ枯病菌の毒素ファゼオロトキシン(PHT)非感受性OCTase遺伝子をPCR法により,タバコのRuBisCOの小サブユニットのトランジットペプチド遺伝子と増幅・融合し,トランジットペプチドをもったOCTase遺伝子を作成した。本年度はこの融合遺伝子を、植物発言ベクターpBI121のβ-グルクロニダーゼ遺伝子と置換することでプラスミドpMY6を構築し,タバコに導入した結果,形質転換タバコはPHTに対し強い耐性を示すとともに,インゲンかさ枯病菌の増殖を著しく抑制することが明らかになった。現在,プラスミドpMY6をアグロ感染法によりキウイフルーツ植物を形質転換し,毒素耐性およびキウイフルーツかいよう病に対する抵抗性を確認中である。2。イネもみ枯細菌病菌の病原性毒素の同定イネもみ枯細菌病菌の野生株とTn4431を有する大腸菌を接合して,毒素生産性および病原性欠失変異体を得た。その変異株(♯19株)を用いて,ゲノムライブラリーを作製し,Tnを含むDNA断片を得た後,これをプローブとして野生株のコスミドゲノムライブラリーより目的DNA断片を含むコスミドをコロニーハイブリダイゼーションで選抜し,♯19株に導入した。得られた形質転換株(♯19-61株)は強い毒素生産性と病原性を回復した。さらに,この毒素について構造決定し,トキソフラビンと同定した。♯19は本毒素を全く生産しないのに対し,♯19-61株は高い生産能を有したことから,イネもみ枯細菌病菌の病原性には,毒素トキソフラビンの生産能が密接に関係することが明らかとなった。この毒素に対する分解微生物を探索中である。
系外銀河ハロ-の赤外線測光による質量分布の観測的研究

銀河および銀河クラスター規模の構造形成に関して、通常観測されている星の質量のみを足し合わせた重力質量だけでは、ゆらぎ成長のタイムスケールが宇宙年齢と整合しないことがしられている。またより直接的には、銀河のガス成分の回転速度分布からも、見えている星の数倍から10倍もの重力源の存在が示唆される。本研究の目的は、銀河ハロ-領域の質量を担っている低質量星の寄与を、これまで困難だった赤外線測光観測の方法により検証しようとするものである。平成8年度、9年度の2年間の間に、大気の透過特性やシ-イング条件の優れた米国・ハワイのマウナケア観測所における赤外線と可視光の2回の測光観測を実施し、これまでに比べて非常に暗いレベルのハロ-領域の放射成分を測定することができた。この観測にもとづいて、可視から赤外域にかけてのカラー(スペクトル分布の情報)と空間的分布に関する情報が得られた。これにより、ハロ-に存在する低質量星の型や質量についての制限条件が与えられるので、いわゆるダ-クハロ-質量としてガスの回転曲線から示唆されている全質量に対する星の寄与の割合を見積もることができる。今回の観測的研究では、波長約1.5ミクロン程度までのカラーの情報に限定されていたが、約0.2太陽質量クラスまでの低質量星の寄与に関して定量的な議論を可能とする興味深いデータが得られているので、具体的な銀河のモデルにもとづいて星の質量と回転曲線の説明に必要な重力質量との関係を導いた。本研究の目的は、宇宙における重力相互作用の結果として形成されてきた銀河規模の構造に、銀河ハロ-の質量を担っている低質量星の寄与を、赤外線測光観測の方法を使って検証することである。平成8年度には、大気の透過特性やシーング条件(像のゆらぎ)に優れた米国・ハワイのマラナケア観測所におる赤外線および可視光の2回の測光撮像観測を行ってその結果を解析することにより、これまでに比べて非常に暗いレベルのハロ-領域の放射成分、特に近赤外線域の成分を測定できた。この観測に基ずいて、可視から赤外域にかけての「色(カラー)」の情報とその空間的分布が得られたので、ハロ-の低質量星の型とその範囲について制限条件が決められ、いわゆるダ-クハロ-質量として回転曲線から推定されている全質量に対する寄与を粗い精度ながら具体的に示唆することが可能となった。ただし、「色(カラー)」から推定される星の質量について不定性を減らすためには、より長波長側の測光値を、ハッブル宇宙望遠鏡のようにスペースからの観測により得る必要があるので、今回の成果を基礎として、ハッブル望遠鏡への観測申請を計画している。又、一方でカラーと質量との関係を決める要素として、星の重元素存在量の推定値が重要であり、我々はその点に力点をおいてモデル解析を進めている。宇宙における銀河規模の構造形成に関して、通常観測されている星の質量のみを足し合わせた重力質量だけでは、ゆらぎ成長のタイムスケールが宇宙年齢と整合しない。また直接的には、銀河のガス成分の回転速度の銀径分布からも、見えている星の数倍から10倍もの重力源の存在が示唆される。本研究の目的は、銀河ハロ-領域の質量を担っている低質量星の寄与を、これまで困難だった赤外線側光観測の方法により検証しようとするものである。平成8年度、9年度の2年間の間に、大気の透過特性やシ-イング条件の優れた米国・ハワイのマウナケア観測所における赤外線と可視光の2回の側光観測を実施し、これまでに比べて非常に暗いレベルのハロ-領域の放射成分を測定することができた。

今回の観測的研究では、波長約1.5ミクロン程度までのカラーの情報に限定されていたが、約0.2太陽質量クラスまでの低質量星の寄与に関して定量的な議論を可能とする興味深いデータが得られているので、具体的な銀河のモデルにもとづいて星の質量と回転曲線の説明に必要な重力質量との関係を導いた。
在留邦人が増加するアジア諸国における日本の居住文化の継承と変容

グローバル化に伴いボーダーレスで人が往来する現在、自身が持つ文化とは異なる文化の地で居住する人が増加している。そこで本課題では、異文化の地においても継承される日本の住文化を明らかにし、日本の住文化の再認識および再評価を行い、将来的な多民族社会での相互理解に寄与する研究を行う。具体的には、至近10年で在留邦人数の伸びが最も高いアジアにおいて、その中でも最多である転勤などの外的要因により転居した長期滞在者を対象に現地仕様の住居での住みこなし調査を行い、そこから日本の住文化の継承実態および、現地の住文化との融合による変容を明らかにし、今後も継承される日本の住文化の動向を解明する手掛かりを得る。
昆虫脳性分化機構の「進化」を探る

本年度はまずDoublesex発現細胞の標識と脳内分布の調査のため、前年度に作成した抗コオロギDoublesex抗体を用いた免疫組織化学法による脳内Doublesexタンパク質の発現解析を行った。しかし前年度に作成したいずれの抗血清を用いても、コオロギ脳内でDoublesexタンパク質を検出することができなかった。その理由として、作成した抗体が標的タンパク質を正しく認識できていない可能性と、そもそもDoublesexタンパク質の発現量が検出限界以下である可能性が考えられた。上記の実験と並行して、CRISPR/Cas9systemを利用したGeneTrap系統の作成も進めた。コオロギ受精卵にCas9タンパク質とdoublesex遺伝子のイントロン領域を標的としたgRNAを顕微微量注入し胚発生を進めた胚を得たところ、8割の胚においてinsertion/deletionが生じていることが明らかとなった。次に、Cas9タンパク質、gRNAとともにGeneTrap vectorをコオロギ受精卵に顕微微量注入し、GeneTrap系統を樹立することを試みた。しかし、この実験を行なっている間に、本研究室で維持しているコオロギ個体群に致死性のウイルスが感染し実験の継続が困難な状況となってしまった。これまでに、コオロギ脳ではfruitless遺伝子が性決定に寄与しないという結果を得ていた。昆虫におけるfruitless遺伝子の分子進化解析により、コオロギを含む多新翅上目昆虫やそれよりも原始的な昆虫においてはfruitless遺伝子が性決定に寄与しないであろうこと、カメムシを含む準新翅上目においてfruitless遺伝子の性特異的遺伝子産物を生じさせうる新規なプロモーターの獲得が起こったことを明らかにした。本年度はまずfruitless発現細胞の分布について調査した。コオロギのFruitlessタンパク質に対する特異的抗体を用いてコオロギ脳内のFruitless発現細胞を可視化し、それらに雌雄差や発生ステージに依存した差異があるかを検討した。その結果、コオロギ脳内でFruitlessタンパク質は極めて広範な細胞で発現していることが明らかとなった。モデル昆虫であるショウジョウバエでは、オス特異的なFruitlessタンパク質が存在し、このタンパク質が特定の細胞クラスターでオス特異的に発現することで、その細胞クラスターを“オス化"する。その一方、雌雄共通のfruitless遺伝子産物は極めて広範な細胞で発現する。コオロギのfruitless遺伝子について、これまで性特異的転写産物の存在を確認できていないことから、コオロギ脳で発現するFruitlessタンパク質の局在は、ショウジョウバエにおける性非特異的fruitless遺伝子産物と類似した発現パターン・機能を持つと推測している。また次年度、Dsx発現細胞の同定を行うため、コオロギDsxに対する特異的抗体の作成の準備を進めた。上記の実験と並行して、昆虫におけるdoublesex遺伝子の分子進化について調査した。doublesex遺伝子は転写因子をコードするが、目的のDNA配列への結合に必要なDMドメインにおいて、コオロギdoublesexで多くのアミノ酸置換が起こっていることを見出した。種々の昆虫のdoublesex遺伝子についてそのDMドメインの構造を比較することによって、このアミノ酸置換が昆虫の中でも極めてレアな現象であることや、このアミノ酸置換によって目的のDNA配列への結合が阻害されうることを示唆する結果を得た。Doublesex遺伝子の分子進化については、これまでの知見からは予想できない極めて興味深い現象に迫れている。次年度へ向けて、組み替えタンパク質の調整やCRISPR法を利用したKnock-in技術に使用する遺伝子組み替えベクターの構築も順調に進んでいる。また、上記の研究実績の他にも、本年度はコオロギ脳において「行動遂行時に不活化する神経細胞を可視化する実験技術」を開発しており、極めて有望な成果が出ている。本研究ですでに作成した、もしくは作成に取り組んでいる性決定遺伝子特異的抗体による組織染色と上記の実験技術を組み合わせることで、fruitless・doublesex発現細胞が性特異的行動に関与するか否かを評価できると考えている。このように、次年度以降は当初の研究計画以上の成果が見込まれるため、当初の研究以上の進展が得られたとした。本年度は、まずDsx発現細胞の同定を行うために必要な、コオロギDsxに対する特異的抗体の作成を行なった。コオロギ脳内で発現するDsxには3種類のアイソフォームが存在する。これまでに行ったmRNAレベルの発現解析により、これらの3種類のDsxアイソフォームは、オスで発現量の多いMale-type Dsx (DsxM),メス特異的なFemale-type Dsx (DsxF')、そして両方の性で同程度に発現するCommon-type Dsx (Dsxcom)に分かれる。これらDsxアイソフォームは、C-末端にアイソフォーム特異的な領域を持つ。抗コオロギDsx抗体の作成にあたり、大腸菌発現系を利用してアイソフォームの共通領域ならびにDsxM、Dsxcomのアイソフォーム特異的領域をGST融合タンパクとして大量発現・精製し、抗原として用いた。DsxF'についてはアイソフォーム特異的配列が短いため、この領域に相当するペプチドを人工合成し、抗原とした。抗コオロギDsxcom抗体以外についてはすでに抗血清を得ており、現在抗体の性能評価を進めている。原始的な不完全変態昆虫における脳・神経系の性分化の分子基盤・神経基盤とその進化を探るべく、本研究ではこれまでにモデル昆虫であるショウジョウバエ脳で脳の性分化に関与するfruitless遺伝子、doublesex遺伝子に着目し、昆虫におけるこれら2遺伝子のの分子進化を明らかにして来た。

今年度はコオロギ脳で性分化を担うと予想されるdoublesex遺伝子について、この遺伝子を発現する神経細胞の可視化・同定を進めるために必要な実験ツールの確立を進めることができた。本年度はほぼ想定通りに研究が進捗しており、これまでの研究状況・準備状況を踏まえ、次年度に本研究の目的を達成することは十分に可能だと考えている。本年度はまずDoublesex発現細胞の標識と脳内分布の調査のため、前年度に作成した抗コオロギDoublesex抗体を用いた免疫組織化学法による脳内Doublesexタンパク質の発現解析を行った。しかし前年度に作成したいずれの抗血清を用いても、コオロギ脳内でDoublesexタンパク質を検出することができなかった。その理由として、作成した抗体が標的タンパク質を正しく認識できていない可能性と、そもそもDoublesexタンパク質の発現量が検出限界以下である可能性が考えられた。上記の実験と並行して、CRISPR/Cas9systemを利用したGeneTrap系統の作成も進めた。コオロギ受精卵にCas9タンパク質とdoublesex遺伝子のイントロン領域を標的としたgRNAを顕微微量注入し胚発生を進めた胚を得たところ、8割の胚においてinsertion/deletionが生じていることが明らかとなった。次に、Cas9タンパク質、gRNAとともにGeneTrap vectorをコオロギ受精卵に顕微微量注入し、GeneTrap系統を樹立することを試みた。しかし、この実験を行なっている間に、本研究室で維持しているコオロギ個体群に致死性のウイルスが感染し実験の継続が困難な状況となってしまった。これまでに、コオロギ脳ではfruitless遺伝子が性決定に寄与しないという結果を得ていた。昆虫におけるfruitless遺伝子の分子進化解析により、コオロギを含む多新翅上目昆虫やそれよりも原始的な昆虫においてはfruitless遺伝子が性決定に寄与しないであろうこと、カメムシを含む準新翅上目においてfruitless遺伝子の性特異的遺伝子産物を生じさせうる新規なプロモーターの獲得が起こったことを明らかにした。これまでの研究より、fruitless遺伝子がコオロギ脳において性特異的神経回路の構築に関わるか?という問いについてはネガティブな結果を得ているため、今後はdoublesex遺伝子に着目して研究を展開する。doublesex遺伝子については1性特異的遺伝子産物を検出する抗体を作成し、脳内分布を明らかにすること2CRISPR法を用いたknock-in法を利用し、Doublesex発現細胞の神経細胞形態を明らかにすること3【現在までの進捗状況】で触れた新規技術を用いて、性行動時にこれらの神経細胞が賦活化するかを調査すること、これら3点に関する研究を優先的に進めていく。また、コオロギDoublesexのDMドメインにおける変異の蓄積が結合
MBE成長したNiFe/MnPtエピタキシャル膜の交換結合

本年度は,分子線エピタキシー(MBE)法を用いてMgO(100)基板上にMnPt/NiFe交換結合膜を作製し,その構造と交換異方性について検討を行った.さらに,磁性層を面心立方晶系のNiFeから体心立方晶系のFeCoNiに変化させた場合についても検討した.(1) Pt(001)/MgO(001)上のMnPtは(100)配向(a面配向)となり,Cr(001)/MgO(001)上のMnPtは(001)配向(c面配向)となることが分かった.c面配向の膜では300°Cの熱処理後でも交換結合磁界が得られなかったが,a面配向膜は熱処理により130Oeの交換結合磁界を示した.また,a面配向の膜では膜面内に大きな4回対称の磁気異方性を示した.これはMnPt層内の反強磁性磁区が結晶軸に添った形で形成され,それらとNiFe層が交換結合しているというモデルである程度説明可能であることが分かった.一方,c面配向の膜では上記の4回対称異方性が現れておらず,交換結合の結晶配向依存性を示す結果が得られている.(2) FeCoNi(001)/Mg○(001)上のMnPt層は室温成長ではa面配向,200°C成長ではc面配向となることが分かった.これらの膜は磁性層を先に成長しているため,as-dep膜でも交換結合磁界が得られるが,その大きさが配向性により若干異なっていた.c面配向の膜では30Oe程度であるが,a面配向膜は80Oeの交換結合磁界を示した.また,膜面内の4回対称磁気異方性もa面配向膜の方が大きな値を示した.これらの結果はMnPt/NiFeの時と同様,配向性の違いを反映しているものと考えられる.NiFeとFeCoNiを磁性層として用いた場合に見られる交換結合磁界の大きさの違いとして,磁性層のスピン配置によりその上に成長するMnPt層のスピン配置が影響を受けること,MnPt層の規則度の違い,磁性層の種類により交換結合が変化することなどが考えられる.本年度は,分子線エピタキシー(MBE)を用いてSrTiO_3(100)およびMgO(100)基板上にMnPt/NiFe交換結合膜を作製し,その構造と交換異方性について検討を行った.(1)基板温度を変化させてSrTiO_3(100)上にNiFeを成長させ,その成長表面をRHEEDにより調べた結果,NiFe層は基板の配向性を受け継いでエピタキシャル成長することが分かった.また,NiFe層上のMnPtは基板温度100°Cまでは(100)配向を200°C以上では(001)配向と変化することが分かった.このMnPtの配向性の変化は磁気特性に大きく影響を与え,(100)配向膜の交換結合は220 Oe程度であるが,(001)配向のものではほぼ0となった.これは交換結合がMnPt反強磁性層のスピンの向きにより大きく変化することを意味する.また,MnPtは規則合金であるため大きな交換結合磁界を得るために一般に熱処理が必要であるが,MBE法では室温成膜でも大きな交換結合が得られるという興味深い結果が得られた・(2)MgO(100)基板上にMnPt層を成膜した場合,PtやCrなど下地層材料を変化させることによりMnPtの配向性を制御できることが分かった.(100)および(001)配向のMnPt上にNiFeを成膜したが,両者とも交換結合磁界はほぼ0となった.しかしながら,膜面内の磁気異方性は大きく異なり,(100)配向したものではNiFe層だけでは説明できない大きな4回対称の異方性が観測された.これは,MnPt層内の磁区が結晶軸に添った形で形成され,それらとNiFe層が交換結合しているためと考えられる.一方,(001)配向膜では上記の4回対称異方性がかなり小さくなり,交換結合の結晶配向依存性を示す結果が得られた.本年度は,分子線エピタキシー(MBE)法を用いてMgO(100)基板上にMnPt/NiFe交換結合膜を作製し,その構造と交換異方性について検討を行った.さらに,磁性層を面心立方晶系のNiFeから体心立方晶系のFeCoNiに変化させた場合についても検討した.(1) Pt(001)/MgO(001)上のMnPtは(100)配向(a面配向)となり,Cr(001)/MgO(001)上のMnPtは(001)配向(c面配向)となることが分かった.c面配向の膜では300°Cの熱処理後でも交換結合磁界が得られなかったが,a面配向膜は熱処理により130Oeの交換結合磁界を示した.また,a面配向の膜では膜面内に大きな4回対称の磁気異方性を示した.これはMnPt層内の反強磁性磁区が結晶軸に添った形で形成され,それらとNiFe層が交換結合しているというモデルである程度説明可能であることが分かった.

一方,c面配向の膜では上記の4回対称異方性が現れておらず,交換結合の結晶配向依存性を示す結果が得られている.(2) FeCoNi(001)/Mg○(001)上のMnPt層は室温成長ではa面配向,200°C成長ではc面配向となることが分かった.これらの膜は磁性層を先に成長しているため,as-dep膜でも交換結合磁界が得られるが,その大きさが配向性により若干異なっていた.c面配向の膜では30Oe程度であるが,a面配向膜は80Oeの交換結合磁界を示した.また,膜面内の4回対称磁気異方性もa面配向膜の方が大きな値を示した.これらの結果はMnPt/NiFeの時と同様,配向性の違いを反映しているものと考えられる.NiFeとFeCoNiを磁性層として用いた場合に見られる交換結合磁界の大きさの違いとして,磁性層のスピン配置によりその上に成長するMnPt層のスピン配置が影響を受けること,MnPt層の規則度の違い,磁性層の種類により交換結合が変化することなどが考えられる.
脳原発悪性リンパ腫の患者血液中の腫瘍細胞の同定とその意義

脳原発悪性リンパ腫の患者の末梢血液中に腫瘍細胞が存在するか否かを知るために、血液中の腫瘍細胞を同定するための手段を確立したうえで、実際に検索を行ないつつ、リンパ装置のない脳に発生する脳原発悪性リンパ腫の病態を解析することを目的とした.今年度の研究では、既に株化されている悪性B細胞性リンパ腫の腫瘍細胞株を陽性コントロールとして用いた.この細胞株本来の固有のIgH遺伝子再構成VH-D-JH配列をRT-PCRで増幅後、これまで検索した頭蓋内悪性リンパ腫とはin situ hybridization法でも明らかに区別できる、即ち特異性の高いと考えられるCDR3配列を決定.次いで正常ヒトリンパ球との割合を変えた混合試料由来のmRNAを元にした同様の方法論でも解析した上で、実際の各頭蓋内悪性リンパ腫の患者末梢血中のリンパ腫腫瘍細胞検出の可能性を検討した.しかし、これまでのところ、残念ながら、有意な検出には至らなかった.技術的なハードル、方法論的なハードル、あるいは陽性コントロールの設定による問題点が考えられた.症例が少ないためでもあるかもしれない.しかし、本研究の一環として行った、頭蓋内悪性リンパ腫と全身性リンパ腫の差異をがん抑制遺伝子p14の異常の有無で検索したとこころ、変異の頻度が大きく異なっていることが判明し、頭蓋内悪性リンパ腫患者の末梢血中の腫瘍細胞の同定の検索を更に推進すべきであると結論づけられた.脳原発悪性リンパ腫の解析をするにあたって、治療後の経過からも、明らかに転移性でないと判断できる症例のみを検索の対象とした.今年度の研究では、腫瘍細胞特異的塩基配列の確認方法の確立に重点をおいた.手術により摘出された6例の凍結脳腫瘍組織からtotal RNAを抽出の後、Northern Blot解析をおこなった.全例でIgMの発現を確認したことから、FR2AもしくはVH-leader senseprimerとCmu antisense primerを用いたRT-PCRをおこなうことにより、部分IgH-VHと全長IgH-VHを増幅した.その上で、それぞれの塩基配列10ないし20クローンを症例間で比較することにより症例特異性の高い、即ち腫瘍細胞由来と考えられるCDR3領域をひとまず決定した.しかし、RT-PCRから得られたクローンの結果のみの判定では、擬陽性となるクローン混入の可能性が排除できないと考え、症例特異性の高いと判断したクローンをprobeとしたin situ hybridization(ISH)で凍結切片上の分布を検討した.そして腫瘍細胞と考えられる大部分の細胞での実際の発現を確認することにより、最終的に腫瘍細胞特異的なIgH鎖遺伝子再構成の塩基配列と決定した.組織レベルでの再確認は煩雑ではあるが、病理形態学的な視点を追加することにより、反応性に存在するB細胞由来のクローンの混入の可能性を完全に排除できる点で、極めて有用性が高いと考えられた.前年度の研究では、腫瘍組織からmRNAを抽出の後、IgH鎖遺伝子の再構成VH-D-JH配列をRT-PCRで増幅後、症例毎に特異性の高いCDR3配列をひとまず決定した.更に、それぞれの配列をもとに、特異性が高いと思われる塩基配列領域をプローブとして各症例の凍結切片組織を対象にin situ hybridization法を行ない、選んだプローブ毎の症例特異性を組織レベルで再確認することにより、選択した塩基配列が、症例毎の腫瘍組織本来の固有のIgH遺伝子再構成配列であることを最終的に確認することができた.この方法論の有用性と確実性は明らかで、論文としても報告した.そこで、今年度は、症例を増やすと同時に、末梢血中に腫瘍細胞がどれくらいの割合で存在すれば、前述の方法論で陽性と判定できるのかを確認する目的で、B細胞性リンパ腫の腫瘍細胞株を用い、ヒト体液細胞の中に混入するであろう具体的な腫瘍細胞数の割合を変化させ、その上で、前年度と同様な方法論を用いて、検証を試みた.具体的には、先ず悪性B細胞性リンパ腫の腫瘍細胞株の個性、即ちその細胞株本来の固有のIgH遺伝子再構成配列を決定した.次いで、他種類の細胞系の腫瘍細胞株、ここでは悪性グリオーマ細胞株を用い、それぞれの腫瘍細胞数の割合を変えた上で、その混合試料よりmRNAを抽出し、同様の方法論で、悪性リンパ腫の腫瘍細胞本来の個性が検出できるかを検討した.更に、ボランティアの正常ヒトリンパ球を用いて、同様の方法論で正常リンパ球数に対する腫瘍細胞数の割合を変えることにより、どれくらいの割合であれば腫瘍細胞の個性を検出できるかについて検討した.脳原発悪性リンパ腫の患者の末梢血液中に腫瘍細胞が存在するか否かを知るために、血液中の腫瘍細胞を同定するための手段を確立したうえで、実際に検索を行ないつつ、リンパ装置のない脳に発生する脳原発悪性リンパ腫の病態を解析することを目的とした.今年度の研究では、既に株化されている悪性B細胞性リンパ腫の腫瘍細胞株を陽性コントロールとして用いた.この細胞株本来の固有のIgH遺伝子再構成VH-D-JH配列をRT-PCRで増幅後、これまで検索した頭蓋内悪性リンパ腫とはin situ hybridization法でも明らかに区別できる、即ち特異性の高いと考えられるCDR3配列を決定.次いで正常ヒトリンパ球との割合を変えた混合試料由来のmRNAを元にした同様の方法論でも解析した上で、実際の各頭蓋内悪性リンパ腫の患者末梢血中のリンパ腫腫瘍細胞検出の可能性を検討した.

しかし、これまでのところ、残念ながら、有意な検出には至らなかった.技術的なハードル、方法論的なハードル、あるいは陽性コントロールの設定による問題点が考えられた.症例が少ないためでもあるかもしれない.しかし、本研究の一環として行った、頭蓋内悪性リンパ腫と全身性リンパ腫の差異をがん抑制遺伝子p14の異常の有無で検索したとこころ、変異の頻度が大きく異なっていることが判明し、頭蓋内悪性リンパ腫患者の末梢血中の腫瘍細胞の同定の検索を更に推進すべきであると結論づけられた.
ヒトDNA複製開始反応関連蛋白質が結合しているゲノムDNA領域の同定

本研究の目的はORC、CDC6、MCM等の複製開始蛋白がin vivoで結合しているゲノムDNA領域を同定することである。まず、従来より行ってきたMCMとクロマチンの結合をATPで安定化し、制限酵素で可溶化し免疫沈降でMCM-クロマチン複合体を単離するという方法を用い、そのクロマチンDNAを幾つかクローニングした。しかし当初期待していた配列上の類似性は認められず、また平行して行っていた生化学的検討から、MCMの結合部位が、ORCやCDC6の結合部位とまったく同じではないことが分かってきたので、これらが複製開始点とどのような関係になっているかを各々の部位について検討するのは困難が予想されたので行わなかった。そこで、すでに複製開始点であることが示されており、生物学的にも興味深いグロビン領域を標的に、ホルマリンクロスリンクを用いたクロマチン免疫沈降法を行うべく検討を始めた。ホルマリンクロスリンク法については、酵母では成功例の報告が多いが、ヒト等の高等真核生物においてはその核構造の複雑性ゆえか、成功例は少なく、至適条件も確立されていない。申請者らは最近ようやく至適と考えられる条件を確立した。この条件設定は、申請者らが従来行ってきた研究において明らかにしてきたヒト複製制御蛋白の核内制御をもとに、それがクロスリンクによってどれだけ保持できるかと言うことを指標に行った。すなわち、可溶型は架橋後も界面活性剤で可溶化されるが、結合型はクロマチンやマトリックスに架橋され、本来は可溶化される高塩処理によっても可溶化されないという条件をさがした。本法を用いることによって、グロビン領域における複製開始蛋白の結合の同定が可能となってきており、現在検討を精力的に進めつつある。
PLKを標的とした婦人科癌の治療とマイクロアレイによる抗癌作用機序の解析

これまでわれわれは、PLKが婦人科癌治療の分子標的となるかどうかを検討するため、PLKの発現を抑制するβ-hydroxyisovalerylshikonin(β-HIVS)と、PLKの発現は変化させずにPLKの機能を阻害するscytoneminの婦人科癌に対する作用についてin vitro,in vivoで検討し、有意な抗癌作用を確認した。そして、これらの薬剤添加後の遺伝子発現変化をマイクロアレイにより解析した。今年度は、その結果を裏付けるため、northern法、リアルタイムRT-PCR法、western法によるmRNAや蛋白の発現を検討した。その結果、細胞周期・アポトーシス・分化・増殖・転写・シグナル伝達に関連した遺伝子の発現変化を認め、western法でそれらの蛋白発現の変化を確認した。今回われわれは、PLKが婦人科癌治療の分子標的となるかどうかを検討するため、PLKの発現を抑制するβ-hydroxyisovalerylshikonin (β-HIVS)と、PLKの発現は変化させずにPLKの機能を阻害するscytoneminの婦人科癌に対する作用についてin vitro, in vivoで検討し、有意な抗癌作用を確認した。しかし、同じ濃度のβ-HIVSまたはscytoneminを投与しても正常子宮内膜上皮細胞の増殖は抑制されなかった。細胞周期ではG2/M arrestが確認された。またannexin V assay、ミトコンドリア膜電位の解析でアポトーシスに陥った細胞が増加していた。マイクロアレイにより細胞周期・アポトーシス・分化・増殖・転写・シグナル伝達に関連した遺伝子変化を認め、ウエスタン法でそれらの蛋白発現の変化を確認した。これまでわれわれは、PLKが婦人科癌治療の分子標的となるかどうかを検討するため、PLKの発現を抑制するβ-hydroxyisovalerylshikonin (β-HIVS)と、PLKの発現は変化させずにPLKの機能を阻害するscytoneminの婦人科癌に対する作用についてin vitro,in vivoで検討し、有意な抗癌作用を確認した。今年度は、これらの薬剤添加後の遺伝子発現変化をマイクロアレイにより解析し、その結果を裏付けるため、northern法、リアルタイムRT-PCR法、western法によるmRNAや蛋白の発現を検討した。これまでわれわれは、PLKが婦人科癌治療の分子標的となるかどうかを検討するため、PLKの発現を抑制するβ-hydroxyisovalerylshikonin(β-HIVS)と、PLKの発現は変化させずにPLKの機能を阻害するscytoneminの婦人科癌に対する作用についてin vitro, in vivoで検討し、有意な抗癌作用を確認した。薬剤投与前後の遺伝子発現変化、蛋白発現変化が予定通りに明らかとなり、おおむね順調に進展している。In vivoの実験として、ヌードマウスに婦人科癌(卵巣癌、子宮体癌、子宮頸癌、絨毛癌)細胞株を移植し、β-HIVSやscytoneminを投与して抗癌作用を有するかどうか、重篤な副作用がないかどうかを検討する。
Notchシグナルの人為操作を目指した新規ツールと活性測定法の創出

Notchシグナルは、種々の組織発生に関与する重要な細胞間シグナル伝達経路の1つであり、その人為操作は多能性細胞から標的細胞への分化誘導に有用である。本研究では、ヒトD114およびJAG1リガンド固定化ビーズを調製し、それらがT細胞分化誘導活性を有することを実証した。DII4については、点突然変異を導入することにより、野生型よりも優れた活性を有するリガンドタンパク質の開発に成功した。Notchシグナルは様々な組織の発生に関わる重要な細胞間シグナル伝達経路の一つである。従って、Notchシグナルを人為的操作することができれば、胚性幹細胞(ES細胞)やiPS細胞などの多能性細胞から目的細胞への分化誘導法として、有用である。しかしながら、Notchシグナル伝達経路の人為的制御手段は不足しており、より挑戦的かつ網羅的な研究が必要である。本研究では、この問題を解決するため、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系の樹立、3)ES細胞やiPS細胞へ1)で作製したツールの分化系列かつ時期特異的添加による分化制御の検証を行い、Notchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目的とする。本年度は、1-a)固相化リガンドタンパク質の作製:固相化Jagged1タンパク質の作製およびDelta4リガンドの部分断片を含むタンパク質の調製を行った。いずれも目的タンパク質のアミノ酸配列から推測される分子量より大きいサイズで検出されたため、糖鎖などの翻訳後修飾が起こっていることが示唆された。1-b)Notchリガンドファージ抗体作製:Delta4ファージ抗体作製のため、抗原タンパク質の作製を行った。1-c)Notch活性調節ツールの選択・最適化:Delta4タンパク質の活性をNotchシグナル応答性発光レポーターを用いた定量的・経時的活性測定法を確立した。本研究では、この問題を解決するため、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系の樹立、3)in vitro細胞分化系細胞へ1)で作製したツールの分化系列かつ時期特異的添加による分化制御の検証を行い、Notchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目的とする。本年度は、1)固相化リガンドタンパク質の作製:固相化Jagged1タンパク質の作製およびDelta4リガンドの部分断片を含むタンパク質の経時的活性測定を行った。その結果、Delta4, Jagged1固相化タンパク質により、活性化がおこること、2) Jagged1, Delta4リガンドの部分断片により活性化には領域特異性があること、異なる細胞では、Jagged、Delta4リガンドタンパク質による応答が異なることを明らかにした。本年度は、1) Dll4, Jagged1タンパク質固相化ビーズを用いて、Notchシグナル活性化変化を経時的に測定した結果とDll4, Jagged1発現細胞によるNotchシグナル活性経時変化を比較し、これらリガンド発現細胞の増殖がNotch活性に寄与すること、さらにリガンド発現細胞の増殖を薬剤で停止させた場合には、リガンド固相化ビーズによるNotchシグナル活性化とリガンド発現細胞によるNotchシグナル活性化のパターンが類似していることを明らかにした。さらに2)Dll4活性化にネガティブに働くアミノ酸残基が存在すること、3)Dll4タンパク質固相化ビーズがT細胞分化を誘導できることを明らかにした。本計画では、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系の樹立、3)ES細胞やiPS細胞へ1)で作製したツールの分化系列かつ時期特異的添加による分化制御の検証を行い、Notchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目的としている。本年は、1), 2)について概要に示した通りの結果が得られた。3)について適切な分化系の検討を重ねる必要があったため。

本研究では、この問題を解決するため、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系の樹立、3)ES細胞やiPS細胞へ1)で作製したツールの分化系列かつ時期特異的添加による分化制御の検証を行い、Notchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目的とする。本年度は、1)各種の断片を含むDll4リガンド固相化ビーズを用いて、Notchシグナル活性化変化を経時的に測定した。その際に複数のNotch発現細胞を用いて、Notchシグナル受容体種類やそれら発現量とリガンドビーズによる活性化の定性、定量的解析を行った。2) Jagged1タンパク質を用いて、1)と同様の解析を行った。3)1,2)を比較検討し、Notch発現細胞の違いによるリガンド活性化、それら活性化に必要なリガンドドメインの同定を行った。更に、Dll4については、点変異に導入することで野生型を上回る活性を持つ変異体の作製に成功した。Notchシグナルは、種々の組織発生に関与する重要な細胞間シグナル伝達経路の1つであり、その人為操作は多能性細胞から標的細胞への分化誘導に有用である。本研究では、ヒトD114およびJAG1リガンド固定化ビーズを調製し、それらがT細胞分化誘導活性を有することを実証した。DII4については、点突然変異を導入することにより、野生型よりも優れた活性を有するリガンドタンパク質の開発に成功した。本研究では、Notchシグナル伝達経路の人為的制御手段不足問題を解決するため、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系の樹立、3)in vitro細胞分化系細胞へ1)で作製したツールの分化制御活性の検証により、Notchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目的としているが、現時点で、1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製を確立し、2)Notchシグナルの定量的かつ経時的活性測定系を複数細胞種で確立した。ただし、1)の一部計画については、遅れているため、27年度で引き続き検討するとともに、3)in vitro細胞分化系細胞へ1)で作製したツールの分化制御活性の検証を行う予定にしている。1)Notchシグナルを活性化・阻害するツールの作製については引き続きDll4, Jagged1の必須ドメイン、残基の探索、2)分化系列かつ時期特異的添加による分化制御の検証についてはT細胞分化を用いて検討を行い、より簡便なNotchシグナル調節による細胞分化の人為的操作法の樹立を目指す。細胞生物学固相化リガンドタンパク質の作製:26年度に引き続き、1)Delta4, Jagged1固相化リガンドタンパク質の作製と最小断片化を行う。2)リガンドタンパク質によるNotchシグナル応答を内在性遺伝子発現変化を測定し、経時的活性測定系との相違を解析する。3)in vitro細胞分化系に対して、固相化リガンドタンパク質を添加し、既存のNotchシグナル活性化手法と比較する。