hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「ネッツ」の制御による重症患者に対する新しい治療戦略の提案

本研究においては、重症患者におけるNETsの動態を明らかにした。まず、吸引痰中のNETsの長さが感染症発症日(0病日)から1病日にかけて有意に増加し、68病日では1病日と比較して有意に減少することを明らかにした。また、挿管された重症患者の集中治療室入室時の血液を採取し、NETs、およびNETsの形成過程でみられるシトルリン化ヒストンH3(Cit-H3)の存在を評価した。NETsあるいはCit-H3は、吸引痰中に細菌がみられた症例で高頻度に認められた。上記の結果は、臨床病態においてNETsが感染制御に関連していることや、NETsあるいはCit-H3の制御による重症病態の治療の可能性を示した。ICUに入院し気管挿管された9名の患者から採取された吸引痰を評価した。検体は呼吸器感染発症当日、発症後第1病日、第3ー5病日、第6ー8病日に定期的に採取した。NETsは、免疫組織化学的手法により可視化し、NETs長はトレーシングソフトウェアを用いて定量化した。NETs長は第1病日に有意に増大した。その後NETs長は減少傾向を示し、第6ー8病日には第1病日に比較して有意に短くなった。重回帰分析では、NETs長は第1病日の6つの臨床的指標と相関を示した(白血球数、血小板数、乳酸値、CXC ligand-2、Interleukin-8、プロカルシトニン)。上記の結果は、NETsが呼吸器感染の進行を反映する可能性があること、そして吸引痰のNETsの定量化は炎症の新しい指標になりうることを示している。また、我々は重症病態(外傷、感染症、心停止後、中毒、心疾患、脳梗塞、熱中症等)における血液中のNETs、およびNETs形成過程の一つと考えられているヒストンのシトルリン化(Cit-H3)の発現を評価した。入院時に挿管された49例中、NETsを5名、Cit-H3を11名に認めた。統計解析によりNETsやCit-H3の発現は、誤嚥と有意な関連があることが明らかとなった。このことは、NETsが生体侵襲に対する防御機構として働いていることを示唆している。しかし、一方でNETsはその過剰発現により多臓器不全との関連も示唆されるようになった。NETsは敗血症に対し血栓形成を誘導することで、感染の拡大を防ぐ一方、虚血や過剰な炎症を惹起することにより臓器不全の誘引になるという仮説である。我々は今後NETsと臓器不全との関連を研究する必要がある。今年度は、重症患者の血液中におけるNETs、およびNETs発現の前段階と考えられるCitrullinated Histone H3(Cit-H3)の存在を明らかにし、さらに血液中のNETsあるいはCit-H3の発現と、誤嚥との関連が非常に強いことも明らかにし論文発表した。また、人工呼吸器管理となったARDS症例および特発性肺線維症が急性増悪した7例において吸引痰のNETsの変化と予後との関連について検討し学会発表を行った。PaO2/FIO2(P/F)が200未満となってから24時間以内に吸引痰を採取し、その後経時的にP/FとNETs発現量(NETsの長さ)を測定した。生存した2例では、NETs発現の減少とともにP/Fratioは改善し、人工呼吸器から離脱できた。一方、死亡した5例では、P/Fは改善せず、NETs発現は持続した。この結果は、NETsが上記呼吸不全と強い関連があることを示唆している。さらに、我々は軟部組織感染症の膿汁中には、最初のドレナージ、あるいはデブリドマンの時には好中球が存在するが、NETsは認められないことに着目して研究を行った。5例の軟部組織感染症において、膿汁を調査したところ、すべての症例で好中球が認められたがNETsは1つの検体にも認められなかった。一方、ドレナージをして全身状態が改善した時の膿汁を調べると、5例全例でNETsの発現が認められた。この現象は、NETsが膿汁中では有効に作用できないメカニズムが働いている可能性を示唆している。すなわち、低酸素環境や膿汁中に含まれている物質が、NETsの発現を抑制しているか、DNase等が作用し、発現したNETsをただちに分解していること等が推定される。このメカニズムの解明は、NETs制御による治療戦略の提案にとって極めて重要である。我々は、軟部組織感染症等の膿中において、初回ドレナージ中にはNETsは認められないが、ドレナージ後にはNETsがみられるようになることを発見した。そこで、嫌気的環境下では、NETsの発現が低下するという仮説をたて、健康成人(n=5)から抽出した好中球をphorbol myristate acetateで刺激した。その結果、低酸素環境下ではNetsの発現率が平均で57.8%(p=0.13)低下した。このことは、嫌気的環境がNEts発現に不利であることを示唆している。感染状態と非感染状態を鑑別するのは、熱傷や外傷等全身に著明な炎症が起こっている状況では極めて難しい。我々は、複数の自然免疫受容体の遺伝子発現のパターン解析により鑑別が可能という仮説をたて研究を行った。非感染モデルとしてマウスの20%熱傷モデルを、感染モデルとして盲腸結紮穿通モデルを使用した。

その結果、TLR2, TLR4、およびNLRP3の遺伝子発現はコントロールに比較して両損傷モデルで有意に上昇すること、TLR9の遺伝子発現は感染モデルにおいて熱傷やコントロール(シャムモデル)に比較して有意に低下することが明らかとなった。これをレーダーチャートでパターン解析すると感染モデルと非感染モデルが明瞭に区別できることが示唆された。昨年度の新しい取り組みとして、好中球解析の新たな手法であるハイパースペクトラルイメージングを取り入れた。ハイパースペクトラルイメージングはマラリアに感染した細胞や抗体を産生する細胞の診断に用いられるようになり注目を集めている。人の目は概ね3つの光の帯(緑、赤、青)しか認識することができないが、ハイパースペクトラルカメラは151の光の帯を認識することができる。予備的研究として、呼吸器感染例(n=2)と尿路感染例(n=1)の喀痰および尿の検体を採取し、グラム染色したスライドをハイパースペクトラルカメラで観察した。その結果、感染の時期によって好中球の波長の分布に変化が現れることを発見した。呼吸不全におけるNETsの変化と病態の関連に関する検討においては、研究の見直しが必要となった。動物モデルにおける自然免疫受容体の遺伝子、蛋白発現の継時的測定は、想定以上に時間を要した。本研究課題においては、様々な病態におけるNETsの動態を明らかにしたが、当初の目的であるNETsの制御による治療戦略の提案には至っていない。平成28年度においては、以下の研究を行った。気道熱傷患者の偽膜におけるNETsの発現:偽膜は損傷された気道の脱落上皮、白血球、フィブリン等から形成され、時に気道を閉塞し呼吸機能悪化の原因となる。我々は、偽膜におけるNETs発現を免疫染色で評価した。偽膜にはNETsが認められ、偽膜形成にNETsが関与していること、およびDNase吸入薬等を用いることにより偽膜形成を抑制できる可能性が示唆された。本結果は、第42回日本熱傷学会総会の教育講演で発表した。自然免疫受容体発現パターンの判別分析による感染性、非感染性炎症の早期診断:我々はマウスモデルにおいて受傷24時間後の自然免疫受容体の遺伝子発現において敗血症モデルで特徴的なパターンを示すことを報告した。また、自然免疫受容体の遺伝子発現パターンを、感染、非感染モデルにおいて経時的に測定して判別分析することにより、感染および非感染炎症の早期診断法の開発を試みた。感染モデルとして盲腸結紮穿刺モデル(CLP)、非感染モデルとして20%のIII度熱傷モデル(Burn)を用いた。全血よりtotal RNAを抽出して定量RT-PCRにより自然免疫受容体の遺伝子発現を測定した。TLR2,TLR4の発現は6時間後からCLP、Burnにおいて有意に上昇した。TLR9の発現はCLPにおいてSham, Burnより12時間後から有意に低下した。NLRP3の発現は6時間後、24時間後でCLP、Burnにおいて有意に上昇した。判別分析では6時間後から、各群で特徴的な遺伝子発現パターンを示し、識別誤り率3.03% (6 hr), 6.25% (12hr),6.06% (24hr)で各病態を判別することができた。本研究結果は、本年9月に76th Annual Meeting of the AASTで口演予定である。本研究においては、重症患者におけるNETsの動態を明らかにした。まず、吸引痰中のNETsの長さが感染症発症日(0病日)から1病日にかけて有意に増加し、68病日では1病日と比較して有意に減少することを明らかにした。
口腔がんで発現しているＡＲＥ－ｍＲＮＡを制御するための試み

本研究では、pp32の性質を検討し、口腔がん細胞でpp32の発現を調節することにより、口腔がんの治療を行うための基礎的研究を行った。口腔がん細胞にpp32を強制発現させると細胞の足場非依存性増殖能が低下した。pp32をノックダウンすると、ARE-mRNAの核外輸送・安定化が停止し、足場非依存性増殖能が上昇した。これらの結果は、pp32の発現ががん細胞の悪性化を減弱することを示しており、pp32の発現によるがんの治療の可能性を示している。我々は最近、ARE-mRNAの安定化が細胞をがん化することを証明し、口腔がんなど多くのがんでもHuRが核外輸送され、ARE-mRNAも核外輸送・安定化されていることを見出した。さらに口腔がん細胞のHuRをノックダウンすると足場非依存性増殖能や浸潤活性も低下することを見出し、これらの成果に基づき我々は、ARE-mRNAの核外輸送システムの破綻による、新たな発がん機構を提唱している。本研究では、ARE-mRNAを核外輸送するタンパクHuRに結合するpp32が、細胞質のHuRの発現を低下させることを利用して、口腔がんのがん形質を消失させ、口腔がん治療のための基礎検討を行うことを目的とする。本年度は、pp32のノックダウンによるHuRやARE-mRNAの解析を行い、さらにアデノウイルスベクターの開発に挑戦した。1pp32ノックダウンの確認昨年はpp32の強発現を行ったが、今回は逆にpp32のsiRNAを導入しノックダウン(pp32 KD)を行い、そのがん細胞の性質を確認した。その結果、pp32 KD細胞では、細胞質で発現するHuR量が増加した。また、pp32 KD細胞は、軟寒天中でコントロールより多くのコロニーを形成することがわかった。これらの結果は、pp32のノックダウンはがん細胞の悪性形質を増強することを示唆している。2アデノウイルスベクターの構築pp32のcDNAを含むアデノウイルスベクター構築のため、pp32をアデノウイルスのゲノムを含むプラスミドへの挿入を行ったが、pp32 cDNAを持つプラスミドがとれなかった。これは、pp32 cDNAが構造上複雑で挿入できなかったか、もしくはpp32 cDNAがウイルスもしくは細胞にとって都合が悪いため分解された可能性がある。さらに口腔がん細胞のHuRをノックダウンすると足場非依存性増殖能や浸潤活性も低下することを見出し、これらの成果に基づき申請者らは、ARE-mRNAの核外輸送システムの破綻による、新たな発がん機構を提唱している。本年度は口腔がん細胞のpp32およびそのファミリーのpp32r1の発現ベクターを作成し、その発現を検討し、さらにpp32、pp32r1の口腔がんにおける役割を解析した。1.pp32ファミリーの発現ベクターの作成pp32およびpp32r1遺伝子をOri-gene者から購入し、それぞれの遺伝子をPCR法で増幅し、pcDNA3プラスミドに挿入し、それぞれの発現ベクターを作成した。また作成した発現ベクターをHSC-3などの口腔がん細胞に導入し、実際に各タンパクが発現されるかウエスタン法で確認した。2.pp32、pp32r1の口腔がんにおける役割pp32およびpp32r1ががん細胞の形質に影響するか検討するため、口腔がん細胞であるSAS細胞に各発現ベクターを導入し、それぞれの細胞を軟寒天中で培養しそれらの変化を検討した。その結果、pp32を発現した細胞は、空ベクターを導入したコントロール細胞に比べて軟寒天中でのコロニーが顕著に小さくなり、逆にpp32r1を発現した細胞は軟寒天中でもよく生育し、pp32とpp32r1はがん細胞の持つ足場非依存性増殖能に関して相反する機能を持つことが証明された。口腔がん細胞におけるARE-mRNAの核外輸送・安定化を介した形質を理解するため、初年度はARE-mRNAに直接結合してその輸送に関わるHuRタンパクと結合するpp32とそのファミリーpp32r1について口腔がん細胞を用いて解析した。これまでいくつかの解析によりpp32はがんの抑制に関わり、逆にpp32r1は細胞がん化に関わることが明らかになっている。今回の実験では新たに軟寒天コロニー形成法を用いて、pp32を発現した細胞は足場非依存性増殖能が低下し、pp32r1を発現させた細胞は足場非依存性増殖能が上昇することが証明でき、pp32ファミリーの発がんに関する活性を別の角度から証明したことになり貢献度が大きいと考える。今後は本年度作成したpp

32ファミリーの発現ベクターを応用して、各遺伝子のウイルス発現ベクターを作成する。作成したウイルスベクターを用いて、培養細胞やヌードマウスなどの動物を用いた解析によりpp32ファミリーの機能をさらに詳細に解析し、口腔がん治療のための基礎検討を行う。さらに、HuRの分解制御についても解析を加えたい。pp32はHuRと複合体を形成し、核外に輸送され、細胞質でcaspaseによりHuRが分解されが、pp32r1がこのHuR分解に対してどのような効果を持つかは不明である。そこでpp32r1が強制発現された細胞を形成し、HuRとともにpp32r1が細胞質に輸送されるか蛍光免疫染色法で確認し、HuRが分解されるかをウエスタン法で検討する。HuR分解に対するpp32r1の役割が明らかになれば、次は口腔がん細胞でpp32r1がHuRの分解に対して同様の効果を持つか検討し、がん細胞の細胞質でHuR発現が高い原因を明らかにする。平成25年度は計画でも示したとおり、動物を使った実験をする必要があるので、何人かの大学院生に仕事を分担してもらう予定があり、それらの大学院生に謝金を提供する予定である。実験の状況によっては、分担してもらう大学院生を増やすことも考えており、謝金が増える可能性がある。その他の研究費の使用計画に大きな変更は無いと考えている。
ランダム系における準安定状態の階層性、ダイナミックス、および記憶現象

フラストレーションを含むランダム系においては準安定状態が多数存在し、位相空間でみた自由エネルギーは複雑な多谷構造をもつ。その階層的な構造、および、それに起因するダイナミックスや記憶現象に対するより深い理解を目的として、おもにスピングラスの平均場模型に関して詳細な解析を行なった。また、擬1次元導体に生ずる電荷密度波(CDW)をスピングラス的なランダム性をもつ多自由度非線形動力学系であるとする観点から、CDWを古典力学に従う連続媒質と見なす福山ーLeeーRice(FLR)の模型に基づいた解析を行い、その多様な電気伝導現象を統一的に理解することを試みた。本研究により以下の点が明らかにされた。1.スピングラスの平均場模型に関して:(1)SK模型の、実磁化空間でみた自由エネルギー構造は超計量的であり、熱活性化過程による状態の緩和過程は引き延ばされた指数関数型になる。(2)個々のスピングラス物質のもつ相互作用の特長を捕えるようにSK模型を拡張することにより、それぞれの物質でのリエントラント転移の振舞いなどを説明できる。(3)SK模型から導かれたスピングラス描像が、SK模型の状態方程式においてOnsagerの反跳場項を除いた式で記述される系(ナィーブ平均場模型)にも当てはまる。2.CDWのダイナミックスに関して:(1)FLR模型の非線形電気伝導度は特長的な次元依存性を示し、3次元系のものが実験結果に対応する。(2)CDW系のモードロッキング現象は、外部交流電場に誘起された協力現象と理解される。(3)熱浴効果を含めたFLR模型におけるCDW電流の確率的な振舞いは、狭帯域雑音ピークの幅や1/f型の広帯域雑音の実験結果とよく符合する。これらの現象は、CDWの運動パターンにも定常状態に近いものが多数存在し、熱活性化過程によってCDWがその間を確率的に推移することに起因するものと理解される。1.無限レンジ相互作用型イジングスピングラス(SK)模型における準安定状態空間の超計量性:SK模型の準安定(純粋)状態を数値的に解析し,以下の結果が示された. i)エネルギー準位の統計性は,ランダムエネルギー模型を特長づける統計性と等面である. ii)準安定状態間の障壁エネルギーはそのハミング距離(状態間の重なりの程度)とともに増大(減少)する.後者の結果は,準安定状態の張る配位空間が超計量的に構成されていることに対応する.今後,現実の(短距離相互作用型)スピングラスにおいても同様な超計量性が存在するか否か,および,そのような空間での緩和型ダイナミクスを調べていきたい.2.電荷密度波(CDW)のダイナミクス:不純物によるピン止めポテンシャル中を運動するCDWについて, CDWを古典力学に従う連続媒質と見なす福山-Lee-Rice(FLR)模型に基づく研究により,本年度以下の結果が得られた. i)実験的に観測されている.ac+dc電場のもとでのモードロッキング(ML)現象が, FLR模型に基づくシミュレーションで良く再現された.ML現象が不規則性を伴った多自由度非線形動力学系の特性でもあることを示すものであり,現在その機構(ac外場に誘起される動的相転移現象など)を検討している. ii)熱浴効果を表わす不規則的な力を加えたFLR模型のシミュレーションにより,非線形直流伝導度やしきい電場値の温度依存性を調べるとともに, CDW変調電流(狭帯域,広帯域雑音)の確率的振舞いを検討した.

後者は, Nbse_3に対する最新の実験結果と定性的に良く対応している.この解析から,ランダム系における'多数の準定常状態の存在'が示唆される.これまでの静的な準安定状態とは異なる新たな描像であるが,その妥当性を次年度において詳しく検討したい.1.スピングラスの平均場理論スピングラスにおいては準安定状態が多数存在すること(より一般的には位相空間でみた自由エネルギーが多谷構造をもつこと)、および、それに起因する種々の現象に関する詳細な知見を得るため、2、3年の平均場模型について以下の研究を進めた。(1)FexM_<(1-x)>TiO_3系のスピングラスー反強磁性転移について、その相互作用の特長を捕えるようにSK模型を拡張し、レプリカ法で調べた結果、濃度xによって異なる磁化率の温度依存性や有限外部磁場下でのリエントラント転移の振舞いなど、多くの実験事実を説明できた。(2)SK模型の状態方程式においてOnsagerの反跳場項を無視した式で記述される系(ナイーブ平均場模型)について、その準安定状態の温度変化の様子を詳しくシミュレートした。現在データの解析を進めている。2.電荷密度波(CDW)のダイナミックスCDWをランダムな多自由度非線形動力学系であるとする観点から、その多様な電気伝導現象を統一的に理解するため、福山ーLeeーRice(FLR)模型に基づいた解析を行なった。(1)1、2、3次元FLR模型に対する計算機シミュレーションを行ない、非線形電気伝導度の次元依存性およびピン止めポテンシャルの強度への依存性を明らかにした。(2)熱浴効果を含めたFLR模型におけるCDW電流の確率的な振舞い、特に狭帯域雑音ピークの幅や1/f型の広帯域雑音、およびモードロッキングが生じている場合のそれらの振舞いを計算機シミュレーションで調べた。その結果から、このような現象は、CDWの運動がパターンにも定常状態に近いものが多数存在し、CDWが熱活性化過程によってその間を確率的に推移することに起因していると理解された。
頭蓋骨解剖学体系の枠組みから外れた未知の新奇形質「耳舌骨」の多角的解明

ベトナム科学アカデミー博物館に収蔵されているベトナム産全キクガシラコウモリ属19種を借出し,申請者の主催研究室に今年度導入したマイクロCT(inspeXio SMX-90CT plus)を用いて撮影を行った.Amiraソフトを用いて三次元再構築を行い,19種の成体における聴音器の筋と骨の三次元モデルを構築して耳舌骨を持つ種と持たない種の形態差の実態把握を目指した.借出標本のうち豊富なステージの胎子の入手が完了しているRhinolophusthomasi,R. marshalli,R. pusillus,R. pearsoni,R. simanensis, R. luctusを優先して撮影を行った.マイクロCTで撮影したのち頭部組織切片を作成し,抗αチューブリンによる抗体染色とアザン染色を行った.組織切片をAmiraで三次元再構築し,マイクロCT画像と統合することで,鼓膜・蝸牛・耳小骨・鼓室輪・軟骨・内耳神経・顔面神経・筋の精確な三次元形態モデルを作成した.胎児標本の形態発生分析は順調に進んでおり,関連論文の発表が進んでいる.ライヘルト軟骨がどう分化していくかを把握することが本研究の鍵となるが,ライヘルト軟骨由来形質の発生観察はシカゴ大学のZhe Xi Luoと共同でシカゴにて行う.ライヘルト軟骨の外側末端を遊離させて余剰の骨を作るプロセスとして疑われるのはアポトーシスである.ライヘルト軟骨の末端がアポトーシスによって切り離されるかどうかを検証するため,アポトーシス細胞を検出する方法として確立されているTUNEL法による抗体染色を進めていく.ベトナム科学アカデミー博物館に収蔵されているベトナム産全キクガシラコウモリ属19種を借出し,申請者の主催研究室に今年度導入したマイクロCT(inspeXio SMX-90CT plus)を用いて撮影を行った.Amiraソフトを用いて三次元再構築を行い,19種の成体における聴音器の筋と骨の三次元モデルを構築して耳舌骨を持つ種と持たない種の形態差の実態把握を目指した.借出標本のうち豊富なステージの胎子の入手が完了しているRhinolophusthomasi,R. marshalli,R. pusillus,R. pearsoni,R. simanensis, R. luctusを優先して撮影を行った.マイクロCTで撮影したのち頭部組織切片を作成し,抗αチューブリンによる抗体染色とアザン染色を行った.組織切片をAmiraで三次元再構築し,マイクロCT画像と統合することで,鼓膜・蝸牛・耳小骨・鼓室輪・軟骨・内耳神経・顔面神経・筋の精確な三次元形態モデルを作成した.胎児標本の形態発生分析は順調に進んでおり,関連論文の発表が進んでいる.ライヘルト軟骨がどう分化していくかを把握することが本研究の鍵となるが,ライヘルト軟骨由来形質の発生観察はシカゴ大学のZhe Xi Luoと共同でシカゴにて行う.ライヘルト軟骨の外側末端を遊離させて余剰の骨を作るプロセスとして疑われるのはアポトーシスである.ライヘルト軟骨の末端がアポトーシスによって切り離されるかどうかを検証するため,アポトーシス細胞を検出する方法として確立されているTUNEL法による抗体染色を進めていく.本年度は当該研究室のマイクロフォーカスX線CTによる撮影を中心に進めたため,ランニングコストがかからず実質的に支出がなかったため.
狩猟採集生活のエネルギー収支:アフリカ熱帯雨林における実験的狩猟採集生活調査

熱帯多雨林における狩猟採集生活の可能性とそのエネルギー収支の特徴を検討するため、カメルーン南東部ンドンゴ地域の狩猟採集民Bakaの協力を得て狩猟採集圧の高い森で、8月の乾季と食物が少なくなる4,5月の少雨季に実験的狩猟採集生活の観察調査を実施した。両季とも協力者8家族は2週間、エネルギー源としてのヤマノイモの他十分な食物を確保できた。エネルギー消費については、心拍数の計測データを現在解析中である。本研究の目的は、カメルーン南部ンドンゴ地域のピグミー系狩猟採集民Bakaの協力を得て狩猟採集生活実験を実施し、アフリカ熱帯多雨林における狩猟採集民のエネルギー適応の特徴を明らかにすることである。計画初年度は、2009年2月に農作物携行狩猟採集旅行実験を試みる予定であったが、対象予定者の病気、不在等が重なり、急遽、定住集落における日常生活のエネルギー収支調査を実施した。熱帯多雨林における狩猟採集生活のエネルギー適応を考察する上でこの調査データは必須であるのでこの変更による本研究計画上の問題はまったくない。初年度研究成果は以下の通りである。エネルギー消費量測定調査1. 6組の夫婦を対象にした安静時および活動(シミュレーション)時の心拍数測定2.同上対象者の連続4日間(朝6:00から夕18:00)の心拍数モニタリング3.高齢・若年夫婦各2組(8人)を対象にした加速度モニタリング(1,2と同時に実施)4.高齢・若年夫婦各2組(8人)を対象に1日1人の個体追跡法による消費時間調査エネルギー摂取量測定調査1. 6組の夫婦(12人)を対象にした連続10日間の全摂取食物の計量調査2.高齢・若年夫婦各2組(8人)を対象に1日1人の個体追跡法による摂取食物計量調査3.対象者全員の起床時体重の連続10日間計測調査身体計測調査1.当該地のバカピグミー住民242名を対象にした身長、体重、上腕周囲、ウエスト囲、ヒップ囲、上腕三頭筋皮脂厚、肩甲下皮脂厚の計測調査上記各調査は順調に実施され、現在、入手データを整理、分析中である。本研究の目的は、カメルーン南部ンドンゴ地域のピグミー系狩猟採集民Bakaの協力を得てまったく農作物に依存しない狩猟採集生活を観察し、アフリカ熱帯多雨林における狩猟採集民のエネルギー適応の特徴を明らかにすることである。計画2年度目は、2009年8月に定住集落から約5キロメートルの日常的にBaka住民が利用する熱帯多雨林において8組の夫婦の協力を得て以下のような観察をおこなった。エネルギー消費量に関して、1.8組の夫婦を対象にした連続14日間(朝6:00から夕18:00)の心拍数モニタリング2.8組の夫婦を対象にした連続14日間(朝6:00から夕18:00)の加速度モニタリング3.6組の夫婦を対象にした1日1人の個体追跡法による消費時間調査エネルギー摂取量に関して、1.8組の夫婦を対象にした連続14日間の全採捕食物の計量調査2.6組の夫婦を対象にした1日1人の個体追跡法による摂取食物計量調査3.対象者全員の起床時体重の連続14日間計測調査現在、資料の整理、解析中であるが、暫定的結論は以下の通りである。男性2人(うち1人は妻とともに途中リタイア)が風邪を引き、通常の活動に従事できなかったが、他は健康に過ごせ、体重も維持できた。食物、とくにエネルギー源食物である野生ヤマノイモは2週間十分に確保された。狩猟圧、採集圧の高いと思われる森でも2週間程度であれば純粋な狩猟採集生活は可能であることが判った。計画3年度目は、2010年4月に定住集落から約5キロメートルの日常的にBaka住民が利用する熱帯多雨林において8組の夫婦の協力を得て以下のような観察をおこなった。エネルギー消費量に関して、1. 8組の夫婦を対象にした連続14日間(朝6:00から夕18:00)の心拍数モニタリング2. 8組の夫婦を対象にした連続14日間(朝6:00から夕18:00)の加速度モニタリング3. 6組の夫婦を対象にした1日1人合計12日間の個体追跡法による活動時間調査エネルギー摂取量に関して、1. 8組の夫婦を対象にした連続14日間の全採捕食物の計量調査2. 6組の夫婦を対象にした1日1人合計12日間の個体追跡法による摂取食物計量調査3.対象者全員の起床時体重の連続14日間計測調査現在、資料の整理、解析中であるが、暫定的結論は以下の通りである。

定住村に近く狩猟圧、採集圧が高いと思われる熱帯多雨林において、さらにこの地域でもっとも採捕生活には厳しい時期と考えられている少雨季(4-5月)においても食物、とくにエネルギー源食物である野生ヤマノイモは2週間十分に確保され、実験協力者は期間中全員体重を維持し、健康に過ごすことができた。
肺サーファクタント蛋白によるマトリックスメタロプロテアーゼ活性制御機構の解明

肺サーファクタンント蛋白質D(SP-D)が、細胞外基質分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性を抑制することが本研究によって示された。SP-Dは、従来より知られてきた自然免疫作用のみならず、肺組織内でのMMP活性を制御することによって、肺の組織恒常性維持に関与しており、MMP活性亢進が病態に関わるような肺気腫や間質性肺炎などの呼吸器疾患の発症を抑止している可能性が示された。近年、マトリックスメタロプロテアーゼ(Matrix metalloproteinase;MMP)とよばれる細胞外マトリックス分解酵素が、生体組織破壊性病変において大きな役割を演じていることが知られるようになってきている。呼吸器領域においては、感染防御を担う蛋白と知られてきた肺サーファクタント蛋白がMMP活性を修飾し、肺気腫や間質性肺疾患発症に関与することが報告されてきている。本研究では肺サーファクタント蛋白とMMP活性制御機構と、肺気腫発症の分子メカニズムの解明を目的に研究を遂行中である。本研究課題遂行により、ラット肺より採取した肺胞マクロファージ細胞を用い、肺サーファクタント存在、非存在でのMMP活性について検討したところ、肺サーファクタント蛋白D存在下ではMMP-9活性および蛋白発現が明らかに低下していることが判明している。このことは従来報告されている肺サーファクタントDノックアウトマウスにおいて、肺内MMP-9活性が亢進し、肺気腫病変を生じる事実と一致した結果である。一方、肺サーファクタントD存在下では、ラット肺胞マクロファージにおけるMMP-9 mRNA発現レベルはむしろ増強しており、肺サーファクタントDによるMMP-9活性制御抑制機構解明のために、シグナル伝達などを含めた分子基盤について次年度更なる研究をすすめていく予定である。また、各種炎症惹起状態での肺サーファクタント、MMP活性状況についても検討をすすめ、肺気腫、肺間質性障害の発症機序について解明をすすめていく予定である。肺サーファクタント蛋白質D(SP-D)による、肺内でのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性制御機構の解明を目的として研究を遂行した.SP-Dノックアウトマウスにおいて、肺内でのMMP活性亢進し肺気腫病変を呈することが従来より示されていたが、本研究により肺内マクロファージからのMMP-9分泌に対するSP-Dの抑制効果の細胞レベルでの機序が明らかとなった。ラット肺胞マクロファージをSP-D存在/非存在下に培養した際の、細胞外へのMMP-9分泌についてザイモグラム、Western blottingにより測定したところ、SP-D存在下に培養したマクロファージからのMMP-9分泌及びMMP-9活性は強く抑制されていた。また細胞内の納MP-9蛋白発現についても同様に、SP-D存在下に培養したマクロファージにおいてはMMP-9蛋白発現は抑制されていた.一方、リアルタイムPCRを用いたMMP-9メッセンジャーRNAの半定量実験では、逆にSP-D存在下で培養を行ったマクロファージの方がMMP-9mRNA発現量が増加していた。以上のことから、SP-DによるMMP-9分泌抑制は、マクロファージ内のmRNAレベルから蛋白に翻訳される過程に作用していることが判明した.本研究は、SP-Dが、肺内でのMMP活性を制御することにより、肺の組織恒常性維持に寄与している可能性を示唆するものである.SP-Dは従来より知られてきた自然免疫作用のみならず、肺気腫や間質性肺炎など、MMP活性亢進が病態に関わるような各種呼吸器疾患の発症を抑止する働きを担っている可能性が示唆された。
車椅子アスリートの体幹制御機構の解明-ハイパフォーマンスを実現する神経機序とは-

ヒトの体幹筋はあらゆる身体運動において身体を支える役割を担う。腕を挙げるという動作でさえ、上肢運動と同時に体幹筋が姿勢保持をすることで初めて遂行可能となる。この場合動作の意識は腕を挙げることにあり、体幹筋の活動は意識されることはない。それにも関わらず、体幹筋は上肢の運動に協調し、適切なタイミング・強さで活動する。こうした体幹筋の活動を我々の脳や脊髄といった中枢神経系はどう制御しているのだろうか。本研究では車椅子アスリートを優れた体幹制御能力を有するモデルとし、種々の神経学的手法を用いその制御特性を明らかにすることで、優れた体幹制御を可能にする神経メカニズムを解明する。
緩クリーニ代数を用いたシステムの遷移系モデル簡略化

緩クリーニ代数の部分クラスの間の関係および遷移系モデルの関係による記述に関して,以下の成果を得た.(1)ある種のイデアル完備化によって*-連続なべき等左半環とD-連続なべき等左半環の間の随伴関係を与えるための十分条件および一般に与えられないことを示す具体例(2)完備べき等左半環が二項関係および二項多重関係によって表現可能であること(3)クォンテールをある集合上の二項関係全体のなすクォンテールへ理想的に埋め込むための必要十分条件緩クリーニ代数の部分クラスの間の関係および遷移系モデルの関係による記述に関して,以下の成果を得た.(1)ある種のイデアル完備化によって*-連続なべき等左半環とD-連続なべき等左半環の間の随伴関係を与えるための十分条件および一般に与えられないことを示す具体例(2)完備べき等左半環が二項関係および二項多重関係によって表現可能であること(3)クォンテールをある集合上の二項関係全体のなすクォンテールへ理想的に埋め込むための必要十分条件本研究は,システムの遷移系モデルを自動的に簡約化する方法論を確立することを目的とする.緩クリーニ代数を用いると,「遷移系=項,双模倣関係=等式」として扱うことが可能である.本研究では,緩クリーニ代数の項を(等価性を保ちながら)自動的に簡約化する手続きを明らかにすることにより,目的の達成を目指す.簡約化手続きは,自由代数の具体的構成法から導かれると予想される.今年度は,自由緩クリーニ代数の具体的な構成を明らかにすることを目標に取り組み1.緩クリーニ代数の部分クラスである*-連続なべき等左半環とD-連続なべき等左半環の間にある種のイデアル完備化によって随伴関係が得られるための十分条件およびこれが一般には成り立たないことを示す木言語を用いた具体例2.緩クリーニ代数の部分クラスである完備べき等左半環が二項関係および二項多重関係によって表現可能であること3.木言語の部分クラスと木オートマトンの部分クラスの間にある種の対応付け(クリーニの定理)が成り立つことを示した.成果1は,学術雑誌Bulletin of Informatics and Cyberneticsに掲載されることが決まっている.成果2についてはイギリスで開催されたWorkshop on Lattices, Relations and Kleene Algebrasにおいて報告した.成果3については現在論文にまとめている最中である.上記の結果はいずれも,自由緩クリーニ代数の構成を明らかにする重要な手掛かりを与える本研究は,システムの遷移系モデルを自動的に簡約化する方法論を確立することを目的とする.緩クリーニ代数を用いると,「遷移系=項,双模倣関係=等式」として扱うことが可能である.本研究では,緩クリーニ代数の項を(等価性を保ちながら)自動的に簡約化する手続きを明らかにすることにより,目的の達成を目指す.簡約化手続きは,自由代数の具体的構成法から導かれると予想される.昨年度緩クリーニ代数の部分クラスである完備べき等左半環が二項関係および二項多重関係によって表現可能であることを示したが,ここで与えた埋め込み写像は,完備べき等左半環の単位元を二項多重関係全体のなす完備べき等左半環の単位元にうつすとは限らないなど,多少奇妙な振る舞いを示す.今年度は,この奇妙な振る舞いが,分配律を弱めたことに起因して起こるのか否かを検証するために,完備べき等半環の表現定理について考察を行い,埋め込み写像の奇妙な振る舞いが分配律を弱めたことに起因するわけではないということを確認するとともに,完備べき等半環が理想的に表現可能であるための十分条件を与えた.この結果により,完備べき等左半環が理想的に表現可能であるための十分条件も得られるのではないかと予想される.加えて,べき等半環のイデアル完備化についても考察をおこない,イデアル完備化が完備上半束の圏から上半束の圏への忘却関手の左随伴を与えることを示す方法に対して,上半束をT代数上の上半束へ一般化すると,例として,完備べき等半環の圏からべき等半環の圏への忘却関手の左随伴を扱えるようになることを示した.この結果を完備べき等左半環とべき等左半環の間の関係に応用できなれば.緩クリーニ代数の具体的な自由生成の方法を与える大きな手掛かりになるであろう.本研究は,システムの遷移系モデルを自動的に簡約化する方法論を確立することを目的とする.緩クリーニ代数を用いると,「遷移系=項,双模倣関係=等式」として扱うことが可能である.これまでの研究で得られた知見は次のとおりである.(1)緩クリーニ代数の部分クラスである完備べき等左半環が二項関係および二項多重関係によって表現可能であるが,ここで与えた埋め込み写像は,完備べき等左半環の単位元を二項関係および二項多重関係全体のなす完備べき等左半環の単位元にうつすとは限らないなど,多少奇妙な振る舞いを示す.(2)クリーニ代数の部分クラスである完備べき等半環(クォンテール)に対して同様の埋め込み写像で二項関係全体のなす完備べき等半環へ埋め込んだ場合にも,この奇妙な振る舞いは起こる.

つまり,この奇妙な振る舞いは分配律を弱めたことに起因するわけではない.(3)完備べき等半環が単位元を保ちつつ二項関係全体のなす完備べき等半環へ埋め込が可能であるための条件.(2)での考察結果は(3)で得られた条件の完備べき等左半環への適用可能性を示唆している.これらを踏まえて今年度は(1)で与えた埋め込み写像が奇妙な振る舞いをしないための条件を与えた.また(3)の内容をケンブリッジ(イギリス)で開催された13th International Conference on Relationaland Algebraic Methods in Computer Scienceにて報告した.完備べき等半環の自由生成は,クリーニ代数の自由生成の手がかりを与えており,しかも,自由完備べき等半環は,自由モノイドのべき集合という極めて単純な構成により得られる.よって,緩クリーニ代数の具体的な自由生成の方法を与える手がかりを得るために,緩クリーニ代数の部分クラスである完備べき等左半環の自由生成について考察をおこなおうとしたが,完備べき等半環ほど単純にはいかないことが分かり,試行錯誤の状況が続いているため進捗がやや遅れている.24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度行ったイデアル完備化に関する考察と同様,より一般論的な観点から自由生成の具体的な方法を探るアプローチも取り入れると見通しがよくなるのではないかと考える.24年度が最終年度であるため、記入しない。
レーザーマイクロダイセクションを応用した前立腺癌の治療個別化に関する研究

骨転移を有する前立腺癌76例(試験集団46例、検証集団30例)。PSA再燃を遺伝子解析の組み合わせを用いて順序ロジスティック解析で予測した(AUC=1.0)。10個の予後因子(PSA値、GS,EOD、間質細胞のAR, Klf4, ERα,癌細胞のOct1, TRIM36, Sox2, c-Mycの発現)が同定され、それらを有する個数により46例を3群、favorable 0-3,intermediate 4-7, poor 8-10に分けたところ、3群の5年生存率はそれぞれ90、32、12%であり群間に有意差を認めた。25年度は、前年度に作成した骨転移を有する前立腺癌(46症例による解析)の臨床再発、癌特異的生存率を予測する分子診断モデルの妥当性を検証した。骨転移を有する前立腺癌に対して70年以上前からアンドロゲン除去療法が実施されている。治療への反応性、耐久性は個々により様々で効果持続期間が短く早期に臨床再燃し癌死に至ったり、効果持続期間が長く生命予後が長かったりする症例がある。治療開始前に診断に用いた前立腺生検標本にて臨床再燃、癌特異的生存率を予想できれば前立腺癌治療に新たな展開が期待される。対象は骨転移を有する前立腺癌で前年度に用いた集団とは独立した新たな集団30例。前立腺生検標本をレーザーマイクロダイセクションにて癌細胞、間質細胞を別々に採取しRNAを抽出した。アンドロゲンシグナル、エストロゲンシグナル、幹細胞マーカー、その他の前立腺癌と関連する遺伝子の発現をRT-PCR法にて測定し臨床病理学的背景因子との関連を調べた。前年度に提唱したSox2, Her2, CRP, AR, ERαと臨床パラメーターを組み合わせることで臨床再燃を予測するモデルの妥当性を評価した(Area under the curve=1.0)。また10個(Oct1, TRIM36, Sox2, c-Myc, AR, Klf4, ERα, PSA, Gleason score, extent of disease)の癌特異的生存率に関与する因子を同定した。これらのリスク因子を用いて患者を3群(良好群、中間群、不良群)に分類したところ、5年生存率はそれぞれ78%,48%, 0%であった。本研究は骨転移を有する前立腺癌において生検標本を用いた分子診断は臨床再燃および癌特異的生存率を強力に予測できるモデルの妥当性を評価した。24年度は骨転移を有する前立腺癌の臨床再発、癌特異的生存率を予測する分子診断モデルを構築した。対象は46例の骨転移を有する前立腺癌。本研究は骨転移を有する前立腺癌において生検標本を用いた分子診断は臨床再燃および癌特異的生存率を強力に予測できる手段であることを見出した。本研究では骨転移を有する前立腺癌患者の治療前の生検標本を用いてアンドロゲン遮断療法の耐久性、癌特異的生存率を予測できるか検討した。対象は骨転移を有する前立腺癌76例(試験集団46例、検証集団30例)。生検標本をレーザーマイクロダイセクション法にて癌細胞、癌細胞周囲の間質細胞を別々に採取。RNAを抽出しcDNAを作成しqRT-PCRを施行し、臨床病理学的背景因子との関連を解析。試験集団の46名中9名がPSA再燃せず経過観察中、15例が再発あり加療中、22例が癌死。検証集団では5名がPSA再燃せず経過観察中、13例が再発あり加療中、12例が癌死した。年齢、PSA値、T,N分類、EODなどの臨床パラメータを用いてある程度PSA再燃を予測することは可能であったが(AUC= 0.83)、これらの臨床パラメータに間質細胞でのAR、ERαの発現、癌細胞でのSox2, Her2,CRPの発現を加えると高率(AUC=1.0)にPSA再燃を予測することができた。これらは検証集団でも妥当性が確認された。

次に癌特異的生存との関係を検討したところ、10個の予後因子(PSA値、GS,EOD、間質細胞のAR, Klf4, ERα,癌細胞のOct1, TRIM36, Sox2,c-Mycの発現)が同定された。10個の予後因子を有する個数により46例を3群、favorable 0-3,intermediate 4-7, poor 8-10に分けたところ、3群の5年生存率はそれぞれ90、32、12%であり群間に有意差を認めた(図3)。検証集団でも同様に妥当性を確認した。治療前の生検標本を用いることで骨転移を有する前立腺癌のPSA再燃、癌特異的生存率を予測することができた。このような分子診断はアンドロゲン遮断療法の効果が低いことが予想される症例の選択と、新規薬剤の併用を行うなどの個別化医療に応用できる。前立腺癌本研究の特記すべきこととして1ホルマリン固定された前立腺生検標本からRNAを抽出できたこと、2レーザーマイクロダイセクション法を用いることで癌細胞、間質細胞を別々に採取し検討したこと、3骨転移を有する前立腺癌としては比較的多数の症例で長期予後が判明しているコホートを用いたこと4診断時の標本で臨床再燃の有無を予測できたこと、5同様に癌特異的生存率に関して新しい予後分類を提唱したことがあげられる。以上より平成25年度の研究成果は順調に進展していると考える。本研究の特記すべきこととして1ホルマリン固定された前立腺生検標本からRNAを抽出できたこと、2レーザーマイクロダイセクション法を用いることで癌細胞、間質細胞を別々に採取し検討したこと、3骨転移を有する前立腺癌としては比較的多数の症例で長期予後が判明しているコホートを用いたこと4診断時の標本で臨床再燃の有無を予測できたこと、5同様に癌特異的生存率に関して新しい予後分類を提唱したことがあげられる。以上より平成24年度の研究成果は順調に進展していると考える。今後はより大規模なコホートでも有用であるかの妥当性の検討を行う。これまでは進行前立腺癌に対するアンドロゲン遮断療法の治療効果の耐久性に関する検討であったが、この実験手法を応用し限局性前立腺癌に対する放射線療法の治療効果の耐久性に関する検討を行う。今後は今回臨床再燃に有用であった遺伝子の組み合わせ(Sox2, Her2, CRP, AR, ERα)と判別分析に用いた計算式が他の骨転移を有するコホートでも有用であるかの妥当性の検討を行う。生命予後に関しても検討できればリスク分類による生命予後の差についても妥当性を検証する。
単分子での光電変換観測に向けた機能性π電子系分子の創出

我々は単分子エレクトロニクスに向けた新規なπ電子系分子の開発を行なっている。中でも本研究では、単分子での光電変換観測の実現に向けた化合物開発に注力した。単分子で光電変換を実現するためには、正孔輸送部位、電子輸送部位、および、電極との接合を担うアンカー部位を導入した化合物開発が不可欠である。そこで、オリゴチオフェンの両端にフラーレンとチオールアンカーを導入した分子の設計と合成を行なった。さらに得られた化合物の光・電気化学物性を調査した。本研究の全体構想は有機合成化学・構造有機化学に基づく機能性π電子系の創出をもとに、単分子エレクトロニクス実現の基盤となる学術的知見を得ることである。この中で本研究では、単分子素子の機能化に注目し、具体的には、光電変換機能を付与した単分子素子材料の創出を目的としている。この目的実現に向けて、正孔輸送部位、電子輸送部位、金属電極と有機分子を接合させるアンカー部位を単分子に導入した化合物開発を行っている。昨年度までにチオフェン4量体、8量体を正孔輸送部位とした三成分導入分子の開発を達成している。そこで平成25年度は、これらで確立した合成法を活かして長鎖チオフェンを導入した誘導体合成の検討を行なった。これまでに得られた分子はいずれも有機溶媒に可溶であったため、単離精製は分取クロマトグラフィで行なった。また、構造同定はNMR, MSで行なった。得られた生成物の基礎物性評価は溶液状態の電子吸収スペクトル、サイクリックボルタンメトリー測定、蛍光スペクトル測定で行った。さらに金基板への吸着能を明らかとするため、平成24、25年度に開発した分子について、金表面上での単分子膜を作製した。サイクリックボルタンメトリーを用いて単分子膜の評価を行なった結果、期待どおりの吸着度と吸着能を有することが明らかとなった。また、単分子膜評価の予備検討として、原子間力顕微鏡を用いた観察も検討も開始した。本研究の全体構想は有機合成化学・構造有機化学に基づく機能性π電子系開発を切り口として、単分子エレクトロニクス実現の基盤となる成果を得ることである。この中で本研究では、単分子の素子機能化に注目し、光電変換機能を付与した単分子素子材料の創出を目的とする。具体的には、正孔輸送部位、電子輸送部位、金属電極と有機分子を接合させるアンカー部位を単分子に導入した化合物開発を行う。平成24年度は、これらの部位を導入した化合物合成の検討を中心に行った。本研究を達成するためには、最終的な機能評価時において化合物を有機溶媒に溶かして用いる必要がある。すなわち、溶解度の確保が不可欠となるため、ヘキシル基を導入したチオフェン4量体を基本ユニットとしてチオフェン8量体、チオフェン12量体を正孔輸送部位として用いることとした。また、電子輸送部位としてフラーレン、アンカー部位としてチオールを用いた。これらを導入した分子の合成ルートの検討を行った結果、金属錯体を用いた触媒反応と古典的有機合成反応を組み合わせた逐次合成ルートを確立することができた。これらの化合物は有機溶媒に対して十分な溶解性を有していたため、単離精製は分取クロマトグラフィで行うことができた。また、構造同定も行うことができた。得られた生成物の基礎物性評価を電子吸収スペクトル、サイクリックボルタンメトリー測定で行った。その結果、期待どおりの光吸収特性と両極性特性を有することが示唆された。本研究の全体構想は有機合成化学・構造有機化学に基づく機能性π電子系の創出をもとに、分子エレクトロニクス実現の基盤となる学術的知見を得ることである。この中で本研究では、単分子レベルでの素子機能化に注目している。具体的には、光電変換機能を付与した単分子素子材料の創出を目的としている。これまでにチオフェン4量体、8量体を正孔輸送部位とした三成分導入分子の開発を達成している。得られた分子はいずれも有機溶媒に可溶であったため、単離精製は分取クロマトグラフィで行なうことが可能である。その結果、本研究目的に合致した光吸収特性と電気化学特性を持つことが明らかとなった。さらに金基板への吸着能を明らかとするため、金表面上での単分子膜を作製した。単分子膜評価の検討にむけて、原子間力顕微鏡を用いた観察も行なった。また、単分子光電変換の観測に向けて連携研究者と光照射下での電流ー電圧測定の予備評価を行なった。構造有機化学目的化合物の合成と基礎物性評価、単分子膜評価が進展している点で、おおむね計画どおりに進行している。

目的とする化合物を得ることが成功している点で、計画どおりに進行している。最終年度は、単分子での光電変換観測に向けた機能評価を中心に行なう。この評価で得られた知見をフィードバックした化合物開発の検討も行なう。当初の計画どおり、計画次年度の平成25年度は基礎部物性評価と単分子膜評価を行う予定である。おおよそ計画どおりに研究が進展していることから、経費の使用計画も当初のとおり執行する予定である。
免疫不全ブタを用いた癌治療実験モデルの開発と応用

生後4-6週の免疫不全ブタの肝実質内にヒト肝細胞癌株HepG2を超音波ガイド下で局注し、ヒト肝細胞癌ゼノグラフトモデルの作製に成功した。超音波検査で腫瘍の生着を確認した後に、血管造影検査および造影CT検査を施行し、早期濃染、washoutといったヒト肝細胞に矛盾しない画像所見が得られた。また病理学的に中-低分化型肝細胞癌に矛盾しない所見が得られた。今後は本モデルを使用した治療実験を行うことで、ヒト肝細胞癌に対する新たな治療モダリティの開発や、現存治療の有用性評価などへの応用が期待される。本研究では、体細胞クローン技術により作成された重度免疫不全ブタ、Il2rg-KOブタに対してヒト癌細胞を移植することにより、大動物ではなければ困難な抗腫瘍治療実験に適した動物モデルを開発し、その有用性を検証する。現在大動物担癌モデルは存在せず、既に臨床に用いられている治療も科学的論拠もなく経験や治療成績に基づいたトライアンドエラーの結果行われているものが多い。当モデルではいままで不可能であったIVR治療や、リンパ節郭清・肝切除・ラジオ波焼灼術などの外科手技、内視鏡治療や全身化学療法の治療効果およびその組み合わせ治療の相乗効果の実験が、採血データや病理組織、分子生物学的手法など科学的データに基づいて検討可能となり、新規治療開発を容易にし、臨床研究を効率化して医療の進歩と経済に大きな変化をもたらす可能性を持つ。これまでに、ヒトがん細胞株の皮下生着実験、ヒト肝細胞株HepG2の経皮的肝内局注実験、血管造影検査施行下のCT検査(CTAP/CTHA)による画像評価実験を施行下。皮下生着実験では肝細胞癌株HepG2をを含む各種ヒトがん細胞株の皮下局注を行い、いずれの細胞株も生着することを確認した。次にHepG2を超音波ガイド下に肝内に局注し、経時的に腹部超音波検査による腫瘍生着及び増大を確認した。肝内局注より約4週後にCTAP/CTHA検査を施行し早期濃染を伴う腫瘤を認め、同部を病理学的に評価した。画像所見、病理所見ともに肝細胞癌に矛盾しない所見であった。既に肝細胞癌ゼノグラフトモデルの作製に成功し、画像的・病理学的にその妥当性を評価している。本研究では、体細胞クローン技術により作製された重度免疫不全ブタ、Il2rg-KOブタに対して人癌細胞を移植することにより、大動物でなければ困難な抗腫瘍治療実験に適した動物モデルを開発し、その有用性を検証する。当モデルでは今まで不可能であったIVR治療や、リンパ郭清・肝切除・ラジオ波焼灼術などの外科手技、内視鏡治療や全身化学療法の治療効果およびその組み合わせ治療の相乗効果の実験が、採血データや病理組織、分子生物学的手法など科学的データに基づいて検討可能となり、新規治療開発を容易にし、臨床研究を効率化して医療の進歩と刑事に大きな変化をもたらす可能性を持つ。前年度に行った経皮的な局所注射法で作製したモデルは多発肝細胞癌に相当する。本年度は、1作製した肝細胞癌モデルに対する血管内治療実験と、2単発の肝細胞癌モデル作製を目指して癌細胞株を含む細胞シートの肝内への埋没実験を行った。1では肝内局注より約4週間後のモデルに対し経皮的肝動脈化学塞栓療法(TACE)を施行し、ヒトと同様な処置が可能であることを確認し、画像的、病理学的評価を行った。2ではHepG2を含むゲルシートを小開腹下で直接肝被膜下に埋没縫合する実験を行ったが、4週間後までに癌細胞の生着は見られなかった。既に肝細胞癌ゼノグラフトモデルを用いて治療実験(TACE)を行い、血液学的・病理的に治療程度の評価を行っている。生後4-6週の免疫不全ブタの肝実質内にヒト肝細胞癌株であるHepG2を超音波ガイド下で局注することによりヒト肝細胞癌ゼノグラフトモデルの作製に成功した。局注後、超音波による経時的な画像フォローアップを行うことにより、腫瘍の生着を確認した。生着を確認した段階で、血管造影検査および造影CT検査を施行し、肝臓を摘出することで、ヒト肝細胞癌における画像所見及び病理組織学的所見との整合性を確認した。研究開始当初は、局注後の腫瘍生着率が不良であったが、細胞株を細胞外マトリックス製剤に混合させることにより高率な腫瘍生着が得られ、血管造影検査でコロナサイン、造影CT検査で早期濃染、washoutといったヒト肝細胞に矛盾しない画像所見が得られ、病理学的にも中-低分化型肝細胞癌に矛盾しない所見が得られた。一方、本研究では生着した腫瘍が肝内両葉多発性に認められており、抗がん剤やTACE治療などの内科的治療の効果判定には有用と思われるが、切除や局所治療などの外科的切除の対象となる単発腫瘍の形成は得られていない。この原因として局注時の圧入により肝内類洞を介した細胞株を含む液体が、広く肝内に広がっている、もしくは腫瘍生着後の多発肝内転移などが考えられる。