hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分子主鎖に沿う電荷移動構造を有する新規導電性π共役高分子の合成

π共役系高分子は導電性や光機能を有し、学術的な興味や機能性高分子材料としての期待が近年高まっている。本研究では、主鎖に沿った容易な電荷移動を可能とする新規構造の導電性π共役高分子を設計し、その合成及びキャラクタリゼーションを行ない、特性について検討して、この高分子化合物に特異的な挙動を解明することを目的とした。我々が独自に開発した有機遷移金属錯体による重縮合反応を用いて、フラン、チオフェン、セレノフェン等の電子供与性芳香環とピリジン、キノキサリン等の電子欠如性芳香環を交互に主鎖に有するπ共役高分子の合成に成功した。一方、これらの芳香環が炭素炭素三重結合で連結された構造のπ共役高分子の合成や、レドックス挙動を示す単量体としてキノン及びその誘導体を構成成分とする高分子の合成も合わせて行なった。これらの高分子は各種の側鎖を導入することによって、溶解性の向上を図ると共に、側鎖の電子供与能、吸引能に応じて芳香環の電子状態を調節することが可能であった。チオフェンとピリジンを交互に主鎖に有する高分子を電気化学的な酸化還元に供したところ、通常のレドックス反応から予想されるよりもはるかに大きな電位差を有する酸化と還元を示し、酸化された状態での主鎖中で電荷移動によって、新しい電子状態の発現が示唆された。この電荷移動現象は光学的性質にも大きく影響し、例えば上の高分子の3次の非線形光学感受率は、それぞれの構成成分からなるポリチオフェン、ポリピリジンよりもはるかにすぐれている。本研究では、有機金属重縮合法の特性を活かし、異種芳香環の配列を精密に制御することによって、電荷移動構造型π共役高分子という新規概念に基づく有用な機能性材料を創製することができた。電子供与性アリーレン基と電子吸引性アリーレン基の共重合体は主鎖に沿うπ共役系を有するために、他のπ共役高分子にはない電気的、光学的性質が期待される。そこで、電子共与性アリーレン基としてチオフェン(Th)あるいはフラン(Fu)、電子吸引性アリーレン基としてジフェニルキノキサリン(DiPhQx)から成る交互共重合体を、2,5位にトリアルキルスズ基を有するThあるいはFuとDiPhQxのジハロゲン化合物のゼロ価ニッケル鎖体を用いるクロスカップリング法により合成した。得られた共重合体の紫外可視吸収スペクトルの最大吸収波長はpoly(DiPhQx)のそれに比べてcopoly(Th-DiPhQx)では約190nm、copoly(Fu-DiPhQx)では280nmの長波長側へシフトが見られた。また、両共重合体のサイクリックボルタモグラムではp型、n型ド-ピングに由来する酸化、還元特性が観測された。これらから、得られた共重合体は主鎖に沿う電荷移動型のπ共役高分子であることがわかった。さらに、同様の電荷移動型のπ共役高分子はピリジンとセレノフェンの共重合反応からも得られた。主鎖に添ったπ共役系を有する高分子はド-ピングによって導電性を発揮する一方、広がった共役系に基づく光機能を有しており、学術的面及び機能性高分子材料としての期待から内外の研究興味が著しく高まっている。本研究では、主鎖に沿った容易な電荷移動を可能とする新規構造の導電性π共役高分子を合成し、その特性について研究を行ない、多くの有用な知見を得た。我々が独自に開発した有機遷移金属錯体による芳香族ジハロゲン化物の重縮合反応を用いて、チオフェン、セレノフェン等の電子供与性芳香環とピリジン、キノキサリン等の電子欠如性芳香環を交互に主鎖に有するπ共役高分子の合成に成功した。

一方、単量体の選択によって、ランダムに異種芳香環を主鎖に含む高分子の合成も行なった。これらの高分子は各種の側鎖を導入することによって、溶解性の向上を図ると共に、側鎖の電子供与能、吸引能に応じて芳香環の電子状態を調節することが可能であった。チオフェンとピリジンを交互に主鎖に有する高分子はきわめて特長的な電気化学的酸化、還元挙動を示した。すなわち、酸化電位と還元電位との相違が通常の可逆な酸化還元反応と比較してはるかに大きく、酸化された状態での主鎖中で電荷移動がすみやかにおき、新しい電子状態が発現していることがわかった。これは、π共役高分子における電子の易移動性に基づくと考えられる。また、チオフェンとピリジンからなる高分子の3次の非線形光学感受率はそれぞれ構成成分からなる単一高分子、ポリチオフェン、ポリピリジンよりもはるかにすぐれており、電荷移動型のπ共役系の導入によりその機能が向上することがわかった。本研究は電荷移動構造型π共役高分子という新規概念に基づく機能性化合物を設計、合成し、これが光、電子機能材料としてすぐれた有用性をもつことを明らかにしたものである。
特発性肺線維症急性増悪特異的自己抗体の臨床応用に関する基礎的研究

抗アネキシン1抗体特異的エピトープはN末端ペプチドであり、抗アネキシン1抗体はBAL液中に好中球が著増している症例に上昇する傾向がみられた。Western blot解析では、抗アネキシン1抗体の上昇している急性増悪症例において、N末端が欠損したアネキシン1蛋白が強くBAL液中に発現していた。アネキシン1のN末端エピトープのペプチドは、BAL中のCD4陽性細胞を刺激し増殖を亢進させる作用を有していた。II型肺胞上皮癌培養株(A549)c DNAライブラリーを用いたSEREX(serological analysis of recohinant cDNA expression libraries)法により,特発性肺線維症急性増悪関連自己抗体として抗アネキシン1抗体を検出した。A549培養株のm-RNAからQIAexpress蛋白質精製システムを用いて6XHisタグ標識アネキシン1抗原蛋白を作成し,Ni-NTA HisSorb PlateによるELISA解析を確立した。このELISA法を用いて特発性間質性肺炎および膠原病性間質性肺炎の血清中および気管支肺胞洗浄液中の自己抗体の出現頻度について解析を行った。15症例の特発性肺線維症急性増悪症例では,病状が安定した特発性肺線維症や膠原病関連間質性肺炎,間質性肺炎以外のび慢性肺疾患に比較して高力価の抗アネキシン1抗体が血清中および気管支肺胞洗浄液中に存在していた。Western blot解析では,抗アネキシン1抗体の上昇している急性増悪症例において,N末端が欠損したshort formのアネキシン1蛋白が強く発現していた。特発性肺線維症急性増悪症例において,アネキシン1のN末端エピトープに対する免疫反応が重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究により間質性肺炎急性増悪に特異的な自己抗体の確立が可能と考える。II型肺胞上皮癌培養株(A549)cDNAライブラリーを用いたSEREX(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)法により、特発性肺線維症急性増悪関連自己抗体として抗アネキシン1抗体を検出した。A549培養株のm-RNAからQIA express蛋白質精製システムを用いて6XHisタグ標識アネキシン1抗原蛋白を作成し、Ni-NTA HisSorb PlateによるELISA解析を確立した。特発性肺線維症急性増悪症例では、病状が安定した特発性肺線維症や膠原病関連間質性肺炎、間質性肺炎以外のび慢性肺疾患に比較して高力価の抗アネキシン1抗体が血清中および気管支肺胞洗浄液中に存在していた。Western blot解析では、抗アネキシン1抗体の上昇している急性増悪症例において、N末端が欠損したshort formのアネキシン1蛋白が強く発現していた。さらに、アネキシン1のN末端エピトープのペプチドは、BAL液中のCD4陽性細胞を刺激し増殖を亢進させる作用を有していた。特発性肺線維症急性増悪症例において、アネキシン1のN末端エピトープに対する免疫反応が重要な役割を果たしていることが示唆された。
成人T細胞白血病およびHTLV-I関連疾患の比較研究

HTLV-Iは西南日本で最も高い陽性率を示すが、カリブ海沿岸、アフリカその他の地域にも存在している。環境、気候、風土、人種の異なる日本と世界各地のATL、HTLV-I関連疾患の発症状況を疫学、臨床で比較することで発症のメカニズム、補助因子、遺伝素因などを明らかにすることができる。1.コスタリカ(サンホセ):175例のサンプルが検討された。内訳は国立小児病院での献血者25名、精神疾患64例、病院外来・入院患者86例。病院患者86例中3検体がHTLV-I/II抗体が陽性であった。3例は75歳、62歳、39歳のいずれもカリブ海沿岸出身の黒人女性である。黒人のみの陽性率は3/80(4%)である。コスタリカのカリブ海沿岸には黒人が多く居住しており、この地域はHTLV-Iのhighly endemic areaと考えられる。2.インドネシア(ジャカルタ):これまでHTLV-Iの調査は系統的には行われていなかったが、ジャカルタのインドネシア・クリスチャン大学の協力を得て、計700例のサンプルを収集することができた。内訳は500例の入院患者(種々の疾患を含む)、輸血献血者(100例)、健常人(100例)である。1例でPA法陽性(32倍)、EIA法陰性、WBではp28のバンドが検出され、判定保留となった。3.フロリダ(マイアミ):マイアミ大学眼科にてぶどう膜炎患者40例の血液サンプルを収集した。HTLV-I抗体は全て陰性であった。4.エジプト(イスマイリア):エジプト人の2例のHAM/TSP患者が見つかった。症状、HTLV-I抗体いずれも日本のHAMと同一である。環境、気候、風土、人種の異なる日本と世界各地のATL、HTLV-I関連疾患の発症状況を疫学、臨床で比較するこで発症のメカニズム、補助因子、遺伝素因などを明らかにすることができる。1.インドネシア(ジャカルタ):これまでHTLV-Iの調査は系統的には行われていなかったが、ジャカルタのインドネシア・クリスチャン大学の協力を得て、計700例のサンプルを収集することができた。フロリダ(マイアミ):マイアミ大学眼科にてぶどう膜炎患者40例の血液サンプルを収集した。エジプト(イスマイリア):エジプト人の2例のHAM/TSP患者が見つかった。
教師の「学び続ける力」の向上を支援するためのデジタル教科書の開発

政策等で提言されている教師の「学び続ける力」を「経験学習力」(松尾2011)の向上ととらえ,教職についての省察を促すための教師用デジタル教材を開発した。基礎調査やパイロット実践に基づき,「経験から学ぶ教師」と「学び,変えられる教師」という2章からなる教材構成とした。各節において,振り返りを促すためのチェックリストなどを盛り込み,利用者がそれを活用し,先行研究等と比較する形で振り返ることができるような教材にした。教材については,中堅現職教員に利用してもらい,自身の教職について振り返ってもらった。その結果,このデジタル教材については,概ね効果的であると判断した。本研究においては,教師の「学び続ける力」を支援するために,経験学習の視点から教師自身が教職経験を省察し,今後の自己成長に結びつけることのできる力をつけるためのデジタル教科書を開発し,その効果を検証することが目的である。本年度は,これまで応募者が設計・実施してきた教育プログラムについて,理論面から再度検討し,本研究課題となるデジタル教科書開発のための理論的な枠組みを明確化した。各種の教師教育用教材について調査し,本教材の独自性についてその位置づけを明確にしようとした。また,理論的な枠組みの主軸となる経験学習については,最新の国内外の知見を整理し,開発のための背景理論を補強する。それとともに,国内外の教師教育学,メディア教育に関する学会に赴き,最新動向についても資料収集し,分析をした。また,理論面だけではなく,学校改革・改善に取り組む教師を対象としたヒアリングについても実施した。これらの情報から得られた知見に基づき,デジタル教科書の内容や提供方法について明確化した。その結果,「学び続ける力」に,「自身が経験から学び成長できる力」と,「自身が学び続け,周囲の人びとを巻き込みながら組織等を変革できる力」のふたつの章で大きくは構成されることを明らかにした。それぞれの章では複数の節を設け,「自己の省察」,「他の情報との比較」,「未来に向けて」,「コラム等の補足情報」により構成していく予定である。デジタル教材として開発する資料の概要が概ね固まり,次年度中に開発に移せそうな段階に来ているため。前年度までに明確にしたコンセプトに基づき,教材を開発した。経験学習を通しての成長について認識をさせ,「学び変えられる教師」へつなげる構成とした。具体的には,以下のような章構成を取る。(a)今までの教職人生について振り返る:今までの教職人生について,振り返らせる。そしてこれからの教職人生において,必要な経験を考えさせる。(b)一皮むけた経験について振り返る:今までの教職人生の中で,一皮むけた経験を選び,その特徴について考えさせる。(c)自身の経験学習力を考えさせる:松尾(2011)の経験学習チェックリストを用いて,自身の経験学習について振り返らせる。そして,これからの人生について考えさせる。(d)学び変えられる教師へ:自分自身が学校内の組織においてどのような立場であったのかを振り返らせ,自身だけではなく,組織を改善していくことを考えさせる。各章では,1自己の省察ー2他の情報との比較ー3未来へ向けてー4コラムという形で構成されている。1においてはチェックリストやワークラインなどのツールを活用し,可視化をする。2においては,これまで取り組んできた調査等をデータとして引き合いに出し,自身のデータと比較させる。3においては,1,2をもとに考えさせる。4においては興味をもった人がさらに勉強できるように,その章における背景理論や参考書等を紹介した。現在,前章の内容についてはほぼ固まった状態であり,具体的な教材制作に入るところである。教材はデジタルで提供することを予定している。今後,教材の評価を行う予定である。評価の視点として,普通に振り返るときと,このようなツールがあるときとでは振り返りの質が異なるのかを軸としたい。本年度中にデジタル教材の開発を行う予定であったが,先行研究を再吟味していると,本教材で捉えようとしている「学び続ける教師像」が個人のみの経験学習の枠内にとどまっている限界点が浮き彫りになった。近年の教師教育あるいは経験学習が個人による成長だけではなく,「つながり」に着目していることを踏まえれば,教師の協働性にもっとスポットを充てるべきであろうと考え,それらを探究するための調査を行った(時任・寺嶋2015, 2016)。現在その成果については重要だと考え,論文投稿を準備をしているが,このため実際の教材の開発やパイロット版の評価については進展が遅れた。基礎調査においては,学校改善を担うスクールミドルの成長発達に寄与する教職経験の具体を明らかにした。学校改善に取り組む2つの公立高校を研究事例とし,スクールミドル5名を対象にインタビュー調査を実施した。複線径路等至性アプローチを用いて分析した結果,スクールミドルは校務分掌の一環としてパイオニア径路とフェロー径路のいずれかを経た経験を持つ事が明らかとなった。具体的には,パイオニア径路の教師は分掌内で学校改善案を発案し分掌内外の教師との関係調整等を行いフェロー径路の教師よりも強くリーダーシップを発揮している可能性が示唆された。また,フェロー径路の教師はパイオニア径路の教師とは異なる役割を自律的に担った経験等を経ていた。

径路進行の際には受験指導等を重視する学校文化との衝突が生じ,スクールミドルは同僚グループによる協力体制を形成した上で先輩教師からの支援を受けた経験を経ている事が明らかとなった。この結果を踏まえ,(a)今までの教職人生について振り返る,(b)一皮むけた経験について振り返る,(c)自身の経験学習力を考える,(d)学び変えられる教師へと成長するためのアクションを考えるという部分に分け,各節において,振り返りを促すためのチェックリストなどを盛り込み,利用者がそれを活用し,先行研究等と比較する形で振り返ることができるような教材にした。教材については,中堅現職教員に利用してもらい,自身の教職について振り返ってもらった。その結果,このデジタル教材については,概ね効果的であると判断したうえで,教材を修正しまとめた。政策等で提言されている教師の「学び続ける力」を「経験学習力」(松尾2011)の向上ととらえ,教職についての省察を促すための教師用デジタル教材を開発した。基礎調査やパイロット実践に基づき,「経験から学ぶ教師」と「学び,変えられる教師」という2章からなる教材構成とした。各節において,振り返りを促すためのチェックリストなどを盛り込み,利用者がそれを活用し,先行研究等と比較する形で振り返ることができるような教材にした。その結果,このデジタル教材については,概ね効果的であると判断した。本年度ある程度まとまった内容を元に,デジタル教材の開発を行っていく。当初「デジタル教科書」としての開発を考えていたが,学習者の双方向的な環境を確保しにくいことが課題となる。まず紙ベースで開発し,プラットフォームや資料の提供メディアについて再考することで対応したい。次年度はじめに教材内容検討に関する研究成果を報告を予定している。それが終了し次第,デジタル教材の開発を進め,その開発概要を日本教育工学会において報告する。そこで得られた評価をもとに再度修正を行い,教材を完成させる。完成された教材を数名の現職教員に試してもらい,省察の精度が高まったかどうかについて検討したい。教育工学年度末に予算申請した旅費が当初想定したものよりも安かったため。残った予算については,次年度に割り当てて活用する。
ネクロプトーシス回避機構の解明

ネクロプトーシス刺激後のGFP-LC3分子複合体を解析した。いくつかのLC3分子複合体を形成する新規候補分子を同定することができ、腸管上皮を用いた検討ではHADHAを同定した。パルミチン酸誘導性オートファジーが腸上皮のパルミチン酸誘導性細胞死を回避する方向で機能している可能性が示唆された。また、オートファジーにて基質認識に使用されるユビキチン鎖を解析するため、鎖特異的にポリユビキチン化を動的に可視化する独自技術を開発した(PolyUb-FC)。この技術を用いて、ネクロプトーシスの中心分子であるRIPK3の可視化を試みたところ刺激誘導性に共局在することが判明した。ネクロプトーシス誘導シグナルからオートファジーが誘導される分子機構、オートファジーがネクロプトーシス回避に働く分子機構を明らかにするため、GFP-LC3マウスから樹立したMEFを用いてネクロプトーシス刺激によるオートファジー誘導の最適条件を検討した。TNFa+ZVADやTNFa+CHX+ZVADなどを用いて濃度時間検定を行った。さらに、RIPK3が発現しているヒト大腸がん細胞株とRIPK3を発現していないヒト大腸がん細胞株にて検討を行った。オートファジーの誘導は、免疫染色によるLC3 puncta数の変化やウエスタンによるLC3-IIの誘導を用いて検定した。また、ネクロプトーシス刺激によるオートファジー誘導機構を明らかにするために、GFP-LC3分子複合体を解析した。ネクロプトーシス刺激後にGFP-LC3のGFPにて免疫沈降を行い、CBB染色を行った。ネクロプトーシス刺激による誘導性バンドを複数認めた。質量分析にてGFP-LC3に誘導性に結合する分子の同定を行った。いくつかのLC3分子複合体を形成する新規候補分子を同定することができた。現在その分子のオートファジーにおける機能解析を行っている。また、腸管上皮細胞は食事抗原に日々さらされている。新たにオートファジーと細胞死を同時に誘導する食事抗原のスクリーニングを行った。そのなかで脂肪酸に着目して検討を行ったところ、パルミチン酸刺激にてオートファジーが誘導され、細胞死も誘導されることが明らかになった。現在その刺激において誘導される細胞死がネクロプトーシスであるかの検定を行っている。オートファジー関連分子の同定を行い、機能解析を行っている。今後は、新規刺激と共にこの分子の機能をin vitroやin vivoで検討して行く。ネクロプトーシス誘導シグナルからオートファジーが誘導される分子機構やオートファジーがネクロプトーシス回避に働く分子機構を明らかにするため、オートファジーにて重要なユビキチン鎖を解析した。研究代表者は細胞死シグナルにおけるユビキチン解析を行ってきた(Nature 2009, Nat. Immunol. 2015)。ポリユビキチン鎖は結合様式により8種類あるが、ネクロプトーシスに際し如何なるユビキチン鎖を誘導しているかは不明であった。これまでポリユビキチン鎖についてin vitroおよびin vivoで可視化解析し得る系が存在せず解析が困難であったことも1つの要因である。鎖特異的抗体は動的解析できず、Ub-GFPとセンサータンパク質は鎖状になる前から蛍光標識されている。そこで、鎖特異的にポリユビキチン化を動的に可視化する独自技術を開発した(PolyUb-FC)。同技術は、蛍光蛋白質再構成法(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)による分子間相互作用の検出原理を用いている。予め2つに分割した蛍光タンパク質monomeric Kusabira-Green(mKG)の遺伝子に、ユビキチン遺伝子をそれぞれ融合し、ユビキチンが相互作用すると、分割したmKGの断片が近接により再構成され蛍光能を回復し、相互作用を蛍光シグナルとして検出することが可能である。研究代表者はK33鎖結合型の可視化に世界で初めて成功し、オートファジーアダプター分子p62との共局在を明らかにしている(Autophagy 2018)。この知見を手がかりに機能しているユビキチン鎖の同定をおこなっていく。消化器内科試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため、追加実験も含め有効利用して行く。
分子動力学法による鉱物の相転移と微細組織形成機構

Ca_2SiO_4に含まれるPの濃度を変数にして,常温で出現する結晶構造を,結晶学的及び熱力学的に考察した.Pの濃度が低いときには,高温から冷却されると熱力学的安定相への順次相転移する.しかし,Pの濃度が高くなると変調構造が出現し,しかもその変調の波長(N)は化学組成(特にP/(Si+P)=xの値)に依存した.これらの間には非常に良好な相関関係が依存し,式N=4.370-2.50xで表された・ただしxの範囲は0.118<x<0.250である.一次元のインコメンシュレート相の反射はO=ha*+kb*+1c*+nkと表すことができる.ただしh,k,l,nは反射の指数である.変調の波数ベクトル(k)はTEMを用いた電子線回折法で(1/N)a*+c*と決定できた.また,変調の波数ベクトルが紙面に垂直になる方向からの格子像も撮影することができた。Pが比較的少ない場合,偏光顕微鏡による薄片観察から,インコメンシュレート相は直行ニコルでは斑な消光をすることから,同一結晶粒内にインコメンシュレート相と熱力学的安定相のalpha'相が共存することが確認できた.この組織は,単結晶のalpha相が冷却されると,最初にalpha'相がラメラとして晶出し,その後ラメラの間に残ったalpha相がインコメンシュレート相への転移した結果形成されたと考えられる.さらにPが増加すると,六方晶系の結晶が得られた.この結晶はa軸方向に2倍とc軸方向に3倍の超構造を示しているので,alpha相が冷却過程に相転移してできたものであると考えられる。
抗体関連型拒絶反応における凝固系制御の重要性:新しい検査法および治療法の開発

ABO不適合移植の移植前検査は、レシピエント血清中の赤血球凝集反応による抗体価測定のみが予後を予測する情報であるが、加えてドナー側の血管内皮細胞における抗原量を移植前にあらかじめ予測できたら重要な因子になると思われる。グラフトのABO発現を予測するマーカーとしてドナー血小板のABO抗原の発現を調べた。血小板は個人差が高く、中央値より30倍高い高発現の患者検体が存在した。しかし血管内皮細胞では、高発現のものが多く、発現に個人差は見られなかった。ドナー側の血管内皮細胞におけるABO抗原量が高発現の場合、レシピエント側の移植前の抗体量の他に、移植後に起こる免疫応答の評価が重要になると思われた。【研究目的】移植ドナー不足解消への取り組みとして、抗ドナー抗体陽性移植(ABO血液型不適合移植、クロスマッチ(HLA抗体)陽性移植)が取り組まれているが、現在これらの移植前の検査法としては抗体価測定のみである。移植医療の質を高めるため、抗原抗体反応後の補体、炎症反応、凝固系の亢進を指標にした新しい検査法の開発【1】、また凝固系制御の観点から抗体関連型拒絶反応の治療法の探索【2】が本研究の目的である。【今年度進捗状況】【1】拒絶反応を推測する有効なin vitroアッセイの開発移植グラフト血管内皮細胞におけるA,B抗原発現量の推定Flow cytometry法を用い、血小板のA,B抗原レベルの定量解析を行い、個人差の判定、およびグラフト血管内皮細胞との関連を評価する。→今年度は、健常人血小板を使用し、FCM法が確立できたので、来年度はドナー血小板を用い定量解析を進める。凝固亢進の指標今年度は、抗体の接着、補体活性の上昇により、発現上昇し、外因系凝固経路を活性化する血管内皮細胞のtissue factor(TF)に注目し、TFの活性化を測定するassayを開発した。【2】移植後の凝固制御による拒絶反応の抑制、治療今年度、ヒトのトロンボモジュリンを発現するブタ(hTM-Tg pig)が誕生し、そのブタの血管内皮細胞を使った解析を行う中で、トロンボモジュリンが抗凝固作用のみでなく、抗炎症効果を持つことが実証されつつある。ブタを使った大動物in vivo実験で、実際の拒絶反応に抑制効果があるかリコンビナントトロンボモジュリンを用いて実験を進めた。→今年度は、50人のドナー患者血小板を使用し、A,B抗原の発現レベルを解析し個人差が高いことがわかった。また高発現血小板も採取し、来年度はドナー内皮細胞と血小板のA,B抗原発現の関連性を解析する。レシピエント血清中の抗体価と補体活性能今年度は、レシピエント患者25名の血清中における抗体価特にIgGサブクラス解析と、補体活性マーカーClqの解析を進めた。来年度は、抗体関連型拒絶反応(AMR)を起こしたレシピエント患者血清を用いIgGサブクラスのパターン解析、Clq沈着の解析を進める。【2】移植後の凝固制御による拒絶反応の抑制、治療今年度、ヒトのトロンボモジュリンを発現するブタ(hTM-Tg pig)の詳細な解析を行い論文発表した。来年度は、DICの治療で臨床使用可能な我が国で開発された可溶性トロンボモジュリン(リコモジュリン)が、移植医療において移植時の虚血再灌流時に産生が予想されるトロンビンの制御に使用できないか、in vitro in vivoモデルで確認する。レシピエント、ドナー検体を用いて抗体関連型拒絶反応(AMR)を予測しうる移植前検査の開発を目指した。

初めにレシピエントの抗A,抗B抗体価のIgG subclass解析を行った。AMRを起こした群と、non-AMR群でIgG subclassに違いがあるか確認した。抗A抗体価は、total IgG,IgM subclass IgG1,IgG2,IgG3,IgG4いずれも、AMR群、non-AMR群で優位差はなかったが、AMR群がnon-AMR群に比して低値群が少なく中程度以上であった。次にグラフトのABO発現を予測するマーカーとしてドナー血小板、赤血球のABO抗原の発現を調べた。血小板は赤血球に比べて個人差が高く、中央値より30倍高い高発現の患者検体が存在した。血小板で高発現、低発現であった患者検体の血管内皮細胞での発現を比較したところ、血管内皮細胞では、高発現のものが多く、発現に個人差は見られず、血小板とのABO抗原の発現に相関性も見られなかった。ドナー側の血管内皮細胞におけるABO抗原量が高発現の場合、レシピエント側の移植前の抗体量の他に、移植後に起こる免疫応答の評価が重要になると思われた。本研究の目的は、移植前検査法の開発を行い、実際の患者検体の測定を行って、臨床結果と照らしあわせ、この検査法の有用性を評価することであるが、今年度実際の患者検体を用い測定することができた。次年度は、その結果と臨床結果と照らしあわせ解析を進めること。24年度が最終年度であるため、記入しない。【1】拒絶反応を推測する有効なin vitroアッセイの開発移植前検査としての有用性が、急性拒絶反応を起こした群(AMR群)と、拒絶反応を起こしていない群(non-AMR群)とをレトロスペクティブに比較し、その有意な差が認められたら、より簡便な検査として用いられるようにプロトコール化すること。【2】移植後の凝固制御による拒絶反応の抑制、治療可溶性トロンボモジュリンと膜型のトロンボモジュリンの特徴の違いを詳細に比較検討し、可溶性トロンボモジュリンを移植時でのどのような病態で投与するのが一番適しているのか、in vitro in vivoモデルで確認する。
神経分化とリンクして発現誘導される受容体型チロシンホスファターゼの機能解析

分化発達過程の神経細胞に、特異的に発現誘導される受容体型チロシンホスファターゼPTP-BEM1の生理機能を明らかにすることによって、神経細胞の分化発達の分子機構の一端を理解することを目的とした研究を行なった。まず、PTP-BEM1に対する特異的な抗体を作製し、神経系における発現分布を解析した。光顕レベルでは、PTP-BEM1が幼若期(生後2-3日)の神経細胞の軸索に濃縮されていることを確認し、電顕レベルでは、小胞膜様の構造にシグナルが得あられることを見い出した。次いで、生理活性を解析するために触媒ドメインとGSTとの融合蛋白質を作製してその活性の特異性を検討した。また、免疫沈降法によってnative蛋白質を精製し、その活性を検出することにも成功した。その結果、いずれも人工基質p-nitorophenylphosphateに対して強い活性を示すこと、蛋白質基質に対しては比較的広い特異性を示すこと、さらに、リン酸化された不活性型Srcチロシンキナーゼを効率良く脱リン酸化して活性化することを見い出した。以上の結果から、神経細胞の軸索伸展過程において活性化されるチロシンリン酸化反応(主にSrc型チロシンキナーゼが関与する)の制御に、PTP-BEM1が関与することが示唆された。一方で、そのin vivoでの存在意義を検討するために、PTP-BEM1のノックアウトマウスの作製を試みた。PTP-BEM1遺伝子のexon2にneo遺伝子を挿入したtargeting vectorを構築し、相同組み換え体ES細胞を得、現在キメラマウスの作製段階にまで至っている。[目的]神経系の発生・分化の進行に従って神経細胞に特異的に発現誘導される受容体型チロシンホスファターゼPTP-BEM1の生理的役割を明らかにすることによって、神経分化の分子機構の一端を理解するとを目的とする。[方法]特異抗体を作製し、PTP-BEM1の発現特性を解析する。ホスファターゼドメインを発現させて、活性の特性を検討する。マウスの全長cDNAをクローニングし、それをプローブにPTP-BEM1の遺伝子を単離する。通常のジーンターゲッティングベクターを構築し、ノックアウトマウス作製を行い表現型を観察する。[結果]マウスcDNAおよび遺伝子の単離に成功し、細胞外にフィブロネクチンTyprIII様構造の繰り返しを持ち、細胞内に一つのホスファターゼドメインをもつことが明らかとなった。GST融合蛋白質として調製したホスファターゼドメインは強い活性を有し、その不活性型ミュータントを用いた基質の検索を開始した。得られた特異抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、PTP-BEM1蛋白質が分化階段の神経組織で高く発現していることが示された。また、エクソン2にNeo遺伝子を挿入することによって遺伝子を破壊するターゲッティングベクターの構築を終え、相同組み換え体ESのselectionを現在進めている。
ゲノムワイドな膜蛋白質の構造、機能分類:G蛋白質共役型受容体への応用

本研究では、立体構造が限られている困難性を克服し、ゲノムワイドに膜タンパク質の立体情報を得、機能情報を抽出する方法論を提示することを目的としたが、特にモデルケースとしてG蛋白質共役型受容体(GPCR)を中心とし、各種ゲノムから判別し、構造,機能の観点から分類して、分類後の代表配列に対する詳細な立体構造モデリング法を確立することを目指した。以下に具体的研究を示す。1.比較ゲノム:13年度までに完成したGPCR遺伝子予測システムを使い、各種ゲノムのGPCR候補を予測、比較解析した結果、103種の細菌のCompleteゲノム、酵母、線虫、ショウジョウバエについて、GPCR遺伝子をスクリーニングし、多細胞生物から、急激にGPCR候補遺伝子数が増大することを見出した。2.構造、機能分類:立体構造既知のロドプシンに近いクラスAファミリーの受容体について、膜貫通部分に出現するアミノ酸頻度、細胞内および細胞外ループの長さ分布、結合リガンドの関係性を調べた。その結果、特にGsと結合する受容体は、他の受容体と明確に特性が異なり、判別が可能であることを見出した。3.膜貫通領域での立体構造予測:ロドプシン、アドレナリン受容体を代表とするクラスAファミリーの受容体について、立体構造既知のロドプシンをテンプレートとして比較モデリングの手法で立体構造を予測する基盤を作った。比較モデリングの際に、膜タンパク質に特化したアラインメント法を開発した。具体的には、膜内環境でヘリックス間の相互作用部分が保存されるよう制限がかかるようなアラインメント法である。
日本自動車産業における「系列の解体」と地域集積構造の変動に関する調査研究

1.本調査研究の目的は、1990年代から21世紀初頭の期間の日本自動車産業とその代表的な集積地の変動を明らかにし、日本製造業の空洞化防止に理論的政策論的示唆を与えることである。2.調査研究の理論的枠組として自動車の製品アーキテクチャ、サプライヤー・システムと自動車産業集積との関連を理論的に解明するように努めた。次いで工業統計表によって全国から22の自動車産業集積工業地区を取り出し、各工業地区において主要自動車事業所ある25の市町をモデルとして取り出し統計的検証を行った。3.25市町と同一県内の人口規模がほぼ等しい合計113市町との間の経済力の平均値の差の検定をおこなったところ、1990年、2002年の両年において、集積市町の経済力は非集積市町よりは高いことが確認されたが、同期間の成長率においては有意の差が認められないことが検証された。次いで同期間について21の自動車産業集積モデル市町の経済力の変動と同市町が属する工業地区の自動車産業出荷額と従業者の変動等とのあいだに相関関係が認められるかどうかを統計的に検証したところ、有意な相関が認められる場合と認められない場合が混在しており、全体としては芳しい結果が認められなかった。4.そこで、(1)愛知型地域集積モデルの豊田市、刈谷市、西尾市、(2)大都市圏型地域集積モデルの横浜市、川崎市、横須賀市、藤沢市、平塚市、座間市、武蔵村山市、(3)広域型地域集積モデルの太田市、鈴鹿市、広島市、浜松市、磐田市、防府市、苅田町について、相関関係の有無の背景を明らかにするために、人口増加率、1人当たり民力水準、1人当たり市町民税収納率、製造品出荷額(自動車以外)の同期間の変動を具体的に分析し、相関関係の有無の解釈を行った。5.調査研究の結果は、自動車産業集積市町においては、地域レベルの空洞化は生じていないが、今後自動車集積地は緩やかに衰退するであろうことを示している。またITとロジスティクスの発展によって、地域集積による「近接の利益」が次第に小さくなるために集積地は全国に次第に分散する共に、集積空間の輪郭がぼんやりとしたものに変わるであろうこと、集積地間の階層化がいちだんと鮮明になる可能性を示している。日本自動車産業の国際競争力の重要な源泉の一つは、組み立てメーカーと部品メーカーとの間に形成された「日本的な関係」であり、そうした関係の「場」が日本的な地域集積を生み出してきた。世界自動車産業の国際的再編成は、こうした日本的な地域集積の内実である地域内分業及び地域間分業を変容させつつある。それは日本製造業の「従来型」が新しいグローバル型に変容する過程ともいえる。本研究は、そうした視点から新たな競争力の源泉が何であるかを追求する独創的な研究を意図している。本年度の研究には三つの柱がある。一つは地域集積に関わる研究である。自動車産業の地域集積と1980年代以後世界的に取り上げられてきた「新産業集積」との比較研究である。新産業集積が地域ネットワーク論として開放型集積であるのに対して自動車産業集積は「ハブアンドスポーク型」であり、閉鎖型である。こうした閉鎖型の産業集積地が2002年現在、全国に23工業地区ある。この23工業地区の類型化を行った。

もう一つは、日本型の自動車産業のサプライヤー・システムの研究である。サプライヤー・システムについては、藤本隆宏氏らの優れた研究がある。これらの先行研究を基礎に、90年代以後のサプライヤー・システムがどのように変化したのかを研究した。おそらく本研究全体の基調と関わることだが、90年代以後日本の自動車産業のサプライヤー・システムは、むしろ進歩し効率的になった。このことが一面では一部地域集積の解体と他の地域集積の高度化、強化を引き起こしたと考えられる。その様態がどのようなものであるかについては、現在分析中であるが、申請者が愛知型とよぶ豊田市を中核とする巨大な自動車産業集積が深化しているといえる。それが新産業集積と呼ばれる型に近づくのか、従来型の閉鎖的集積の変容にとどまるのかは、今後の研究課題にとどまっている。最後の一つは、日本自動車メーカー、部品サプライヤーの中国における事業展開の研究である。急激発展する中国自動車産業と市場は、日本の産業集積にきわめて大きな影響をもつ。そうした日本への影響という視点から、広州本田汽車とそのサプライヤーの調査を行った。1研究目的日本自動車産業の国際競争力の重要な源泉の一つは、組み立てメーカーと部品メーカーとの間に形成された「系列的取引関係」であり、そうした関係の「地域空間」が自動車産業の地域集積であるとされてきた。1990年代以後の世界自動車産業の国際的再編成は、こうした「系列的取引関係」を変容させ、したがって地域集積を変化させつつある。本研究は、そうした変容過程にある自動車産業の地域集積構造の変動を追求することを意図している。2本年度の主要研究内容本年度の研究は、2002年度「工業統計表工業地区編」によって抽出した自動車産業集積地23工業地区の主要自動車関連事業所のある25市町をモデルとして取り上げ、19912002年までの市町の経済変動と自動車産業との相関関係を統計的実証分析することにほぼ費やされた。得られた知見は次のようなものである。(1)愛知型集積地(愛知県の4工業地区)においては、自動車産業とモデル市の経済との間には強い相関関係があるという仮説は、4工業地区の従業者数および出荷額が順調に増加したという背景のもとで、モデル市町の人口増加、製造業出荷額に関しては支持される。(2)準愛知型(静岡県の2工業地区)においては、自動車産業とモデル市の経済との間には強い相関関係があるという仮説は、磐田市については支持されるが、浜松市については支持されない。(3)「製造業に占める自動車産業の比重」によって自動車産業と地元経済との間には強弱様々の相関関係があるという仮説は支持されない。(4)大都市圏型においては、相関関係は認められないという仮説は支持されない。横浜市や川崎市においては正あるいは負の相関関係が認められる。(5)いったん出来上がった自動車産業集積地は、周辺より高い産業力を蓄え、人口維持能力を高める。自動車産業が負の変動(従業者の減少等)をたどっても、集積地の民力はただちには減少しない。集積地の人口、民力の変動はもっと多様な要因によって引き起こされる。3今後の研究計画以上の成果は2つの学会(日本中小企業学会全国大会、中四国商経学会17年度大会)で報告し、現在3編の論文を印刷中である。次年度は25市町の経済実態をさら詳細に分析したうえでとりまとめをおこなう。
mRNAキャップ構造認識タンパク質の遺伝子発現と認識機構の構造解析

キャップ結分タンパク質(CBPあるいはIF-4Eと呼ばれる)は生体内にごく微量存在し、タンパク質合成開始に重要な役割を演じている。このタンパク質の生化学的および構造化学的性質を明かにすると共に、mRNAキャップ構造との特異的な認識機構を分子/原子レベルで解明することを目的として本申請課題を研究し、以下の研究成果を得た。[1]ヒトキャップ結合タンパク質(hCBP)遺伝子(全長660塩基対)の化学合成[2]hCBP遺伝子のpBR322ベクターへの組み込みと、大腸菌中からのヒト成長ホルモンとの融合タンパク質としての大量発現法の確立[3]hCBPタンパク質のヒト成長ホルモンからの切り出しと単離、精製法の確立[4]mRNAキャップ構造認識に重要に関与すると考えられる機能性アミノ酸の一連のモデル相互作用実験からの検索[5]上記の実験より、hCBPタンパク質中のキャップ認識に重要と推定された各機能性アミノ酸残基の非機能性アミノ酸へ変換した変換体CBP遺伝子の作成法の確立[6]一連のmRNAキャップ構造アナログの化学合成[7]mRNAキャップ構造アナログと天然型および変換体CBPとの結合様式をUVおよび蛍光スペクトルを用いて調べ、また、キャップ構造アナログを結合させたアフィニチークロマトを用いその結合能を調べた。その結果、CBPタンパク質中の33および37番目のHis、102番目のTrpおよび105番目のGluがキャップ認識に重要であることを明かにし、その可能な認識様式を提唱した。[8]CBPタンパク質/mRNAキャップ構造アナログ複合体の立体構造は、現在、X線およびNMRにより解析中である。タンパク質(Cap Binding Protein,CBP)の生化学的および構造化学性質を明らかにすると共に、mRNAキャップ構造との特異的な認識機構を分子レベルで解明することを目的として、本年度はそのCBPタンパク質を多量に得るためにCBP遺伝子の化学合成とそのベクタ-の構築および大腸菌による発現を試み、その大量発現に成功した。即ち、CBP遺伝子の塩基配列のfragmentation,そのsynthesizerによる化学合成,各fragmantのligation,構築したCBP遺伝子のpBR322ベクタ-への組み込み,ヒト成長ホルモンとの融合タンパク質遺伝子の作成,次いでこれの大腸菌H10株のIrpプロモ-タ-支配下の発現用プラスミドへの組込みを行った。このようにして調整した大腸菌を用いて、3ーインドールアクリル酸処理により融合タンパク質としてCBPを発現させた。次いでαーthrombinを用いて部位特異的切断を行い、目的のCBPタンパク質を融合タンパク質から切り離した。以上のようにして発現させたタンパク質は一連のカラムクロマトグラファ-を駆使して精製した。ついで調整したこのタンパく質が目的とするCBPタンパク質であるかの確認はゲルクロマトグラフィ-により分子量決定,アミノ酸分析および自動アミノ酸配列解析装置を用いて行った。現在、純粋なCBPタンパク質を約100mg得ている。一方、CBPタンパク質のアミノ酸配列からmRNAキャップ構造認識に重要に関与する活性サイトを一連のモデル実験を基に推定した。現在、このことを確認し認識機構を解明するために、各種アミノ酸残基を変換したCBPタンパク質をカセット変換体法により調整中である。キャップ結合タンパク質(Cap Binding Protein,CBPあるいはIFー4Eと呼ばれる)の生化学的および構造化学的性質を明らかにすると共に、mRNAキャップ構造との特異的な認識機構を分子/原子レベルで解明することを目的として、昨年度に成功したヒトIFー4Eタンパク質の大腸菌中での大量発現をもとに、本年度は、(1)その分離精製法を確立し、(2)mRNAキャップ認識に重要に関与するアミノ酸配列の推定、(3)これらアミノ酸を他の非機能性アミノ酸へ置換した変換体IFー4Eタンパク質の作成、(4)変換体IFー4Eを用いたmRNAキャップとの相互作用実験を中心に研究を進めた。即ち、(1)に対しては種々のクロマトグラフィ-操作により単一のIFー4Eタンパク質を精製分取し、

アミノ酸シ-クエンサ-によりその全一次配列を決定した。(2)に対しては、他に報告されているマウスおよびコウボIFー4Eタンパク質とのアミノ酸配列比較より、mRNAキャップ認識に際してアミノ酸残基が102から105までのTrpーGluーAspーGluがキャップ構造認識に重要であることを推定した。(3)に対しては、カセット変換法により、TrpをPhe、また、Glu、Asp、Gluを各々Alaに変換した合計4種類の変換体IFー4Eタンパク質を作成した。(4)に対しては、各々調製したIFー4E変換体とmRNAキャップアナロ-グとの結合様式を種々の分光化学的手法により解析し、とりわけ、Trpー102とGluー105のアミノ酸残基がキャップ構造の認識に重要であることを明らかにした。現在、以上の知見を基に、IFー4EのmRNAキャップ認識機構の原子/分子レベルでの解析を進めている。キャップ結合タンパク質(CBP)の生化学的および構造化学的性質を明らかにすると共に、mRNAキャップ構造との特異的な認識機構を分子/原子レベルで解明することを目的として、(1)mRNAキャップ構造の認識結合に重要と考えられる各機能性アミノ酸を非機能性アミノ酸で置換えた変換体CBPの大量発現、(2)一連のmRNAキャップ構造m7GMP誘導体の化学合成、(3)CBP天然型および変換体とm7GMP誘導体との結合様式(会合定数)の各種スペクトルによる測定、(4)m7GMPを共有結合させたアフィニチイーカラムによる天然型および変換体CBPの結合能の測定および(5)天然型および変換体CBPのキャップ構造認識機構のX線およびNMRによる構造解析の研究を進めた。(1)に対しては、天然型CBPの102から105番目のTrp-Glu-Asp-Gluの各アミノ酸残基をPhe(Trpに対して)あるいはAlaに変換した。また、33、37および200番目のHisをAlaに変換した。これら変換体タンパク質の大腸菌からの大量発現および精制法を確立した。(2)に対しては、m7GMP、m7GDP、m7GTPなどの7メチルグアニン(m7G)誘導体を化学合成し、(3)これら誘導体と天然型および変換体CBPタンパク質との結合様式をUV吸収および蛍光発光スペクトル法により調べた。その結果、mRNAキャップ構造の結合には102番目のTrp、105番目のGlu、33および37番目のHisが重要であることを明らかにした。このことは、(4)m7GMPを末端に持つアフィニチークロマトグラフの実験からも示唆された。即ち、CBPタンパク質の33、37、102、および105番目のいづれのアミノ酸残基を変換したCBPタンパク質はカラムへの結合能が低下した。現在、(5)の天然型/変換体CBPのX線およびNMRによる立体構造解析を進めている。
快・不快の味覚反応と相関のある活動を示し、さらにその反応を誘導する神経機構の解明

神経活動の分子マーカーである最初期遺伝子の転写機構に基づいた遺伝子組換え法を用いて、マウスにおける快反応もしくは不快反応と相関のある活動を示す神経細胞を、脳全域に亘って単細胞レベルの解像度で同定する。さらに、同定された神経細胞に加え、申請者らがこれまでに同定した不快反応と相関のある活動を示す前交連後脚介在核の神経細胞について、化学遺伝学的手法を用いて、それら神経細胞の活動の、快・不快反応に対する因果的効果を明らかにする。
不全心における自己再生誘導因子の探索

実臨床において、重篤な心不全に陥った患者が多数存在し自然治癒することはほとんど期待できない。本研究では、補助心臓を有するマウス心筋梗塞モデルを用いて、心臓自己再生修復機能を誘導あるいは阻害する因子の同定を試みた。まず、C57BL/6マウスの心臓に冠動脈左前下行枝(LAD)結紮による急性心筋梗塞を誘導後、梗塞心をレシピエントマウス腹部に移植し補助心臓モデルを作成した。このモデルでは心室重量の有意な増加、移植細胞の生着率向上が認められた。本研究で得られた知見は、心臓の自己修復能のみならず細胞移植効率に対するメカニカルストレスの影響を示し、新たな心臓再生療法の開発に役立つと思われる。本年度は、マウス異所性心移植モデルを用いてメカニカルストレスが心筋再生に及ぼす影響を検討した。まず、マウス冠動脈左前下行肢の結紮により心筋障害(梗塞)モデルを作製し、障害心を「対照群」と「メカニカルストレス軽減群」とに分けた。「対照群」では、障害心は摘出されることなく、そのまま通常通り心拍動を続ける。一方、「メカニカルストレス軽減群」では、障害心は摘出後、別の正常マウスの腹腔内に移植され、左室のメカニカルストレスがほぼ取り除かれた状態で心拍動を続ける。別の正常マウス腹腔内に移植され、メカニカルストレスが軽減された障害心は、補助人工心臓装着下の患者における障害心を模擬的に再現していると考えられる。これらのマウスを用いて障害心の再生・修復に関する評価およびドナー細胞(心筋幹細胞を含む心臓由来細胞)の生存率や障害心に対する生着率を検討した。その結果、メカニカルストレスを軽減された障害心では、有意に細胞の生存率や増殖能が増加し、ドナー細胞の生着率や生存率が高かった。さらに移植ドナー細胞から分化した内皮細胞や心筋細胞の割合も高かった。以上の結果より、メカニカルストレスの軽減が障害心の心筋再生および移植したドナー細胞の生存に貢献していることが示唆された。本研究で用いたマウス異所性心移植モデルは、補助人工心臓装着下の患者における障害心を模擬的に再現していると考えられ、本研究で得られた知見は補助人工心臓装着下の患者における障害心の病態解明に役立つと考えられる。近年、心臓においても自己再生修復能力があることが明らかになってきた。しかし、実際の臨床においては重篤な心不全に陥った患者が多く存在し、自然治癒することはほとんどない。その原因として、障害心臓の内在的な環境の悪化などによる心臓における自己再生修復能力の低下が考えられる。それを支持する事例として、Ventricular Assist Device (VAD)装着後の重症心不全患者で心機能の回復がしばしば認められることが挙げられ、メカニカルストレス軽減によって心臓の自己再生修復能力が上昇する可能性が考えられる。そこで、本研究ではメカニカルストレスを軽減した心筋組織を用いて、自己再生修復機能を誘導あるいは阻害する因子を同定することを目的とする。平成23年度は、メカニカルストレスが心筋再生修復に及ぼす影響を明らかにするために、異所性心移植モデルマウスを用いた検討を行った。左前下行枝(LAD)結紮により心筋梗塞を作製して、別のマウスの腹部に異所性に移植することで、メカニカルストレスを軽減した群とした。対照群は心筋梗塞を作製後、Sham開腹したものとした。マッソン・トリクローム染色によって形態学的変化を観察した結果、メカニカルストレス軽減群では梗塞部位の壁厚は保たれており、左室の重量は減少していた。また、組織学的解析の結果、梗塞境界領域ではKi67陽性細胞増殖が増加しており、TUNEL陽性アポトーシスは減少していた。さらに、両群の梗塞心に幹細胞(GFP陽性)移植を行った結果、メカニカルストレス軽減群では移植した細胞の生着は良好であると共に、Ki67陽性細胞増殖も増加していることが分かった。以上の結果から、メカニカルストレス軽減によって、心筋再生修復が促されることが示された。加えて、幹細胞の生着・増殖の増加にも寄与することが示唆された。メカニカルストレスが心筋再生修復に寄与する点が明らかとなった。この結果に基づいて、今後、その分子メカニズムを解明する必要がある。平成23年度の結果に基づいて、メカニカルストレスを軽減した心筋組織を用いて、心筋組織内の分子(特に細胞外基質・接着分子)の発現変化を調べ、心筋再生修復との関連を検証する。また、心筋幹細胞に着目した評価を行う。上記の研究の推進方策に基づいて、研究費(PCR Array購入費、免疫染色やウェスタンブロッティング用の抗体購入費)を使用する。

平成23年度は、心筋組織内の分子(特に細胞外基質、接着分子)の遺伝子発現変化をPCR Arrayにて解析する予定であったが、行わなかったため、未使用額が生じた。尚、未使用額については上記の研究費(PCR Array購入費、免疫染色やウェスタンブロッティング用の抗体購入費)に加えて使用する。
色素性乾皮症バリアント群の遺伝子診断法を確立する。

臨床像およびカフェイン添加時に紫外線感受性が増強する色素性乾皮症バリアント群の初代培養線維芽細胞を用いて、DNAレベルおよび蛋白レベルで分子生物学的解析をおこなった。免疫沈降法を用いたDNAポリメラーゼイータ蛋白の発現を検討したところ、色素性乾皮症バリアント群の患者から得られた初代培養線維芽細胞にはDNAポリメラーゼイータ蛋白の発現がないことが確認された。また、それらの細胞におけるDNAポリメラーゼイータ遺伝子の遺伝子変異についてシークエンス法をもちいて検討したところ、日本人に特徴的な遺伝子変異を同定するに至った。日本人色素性乾皮症バリアント群患者においては、28アリルの変異のうち11アリル(39%)にG490T、5アリル(18%)にC725T、5アリル(18%)にG916T変異を認めた。つまり創始者効果があることを発見した。このホットスポットの同定により今後の日本人色素性乾皮症バリアント群の遺伝子解析が容易になった。さらに、免疫沈降法で光線過敏を有する患者の簡便なスクリーニングが可能となった。申請者はこれらの成果をアメリカ研究皮膚科学会雑誌に報告している(Tanioka M, et. Al. Molecular analysis of DNA polymerase eta gene in Japanese patientsdiagnosed as xeroderma pigmentosum variattype. J Invest Dermatol 127:1745-1751,2007.)。本年度は光線過敏症状がありXPV群を疑われる患者から得られた培養線維芽細胞がDNA合成酵素H(POLH)の遺伝子変異をDNAシークエンス法を用いて検討した結果、いくつかの特徴的な遺伝子変異を同定することができた。さらにPOLH遺伝子の変異を有している細胞が正常なPOLHタンパクを発現しているかどうか免疫沈降法を用いてタンパク質のレベルで検討した結果、変異を有している細胞には蛋白の発現がない、もしくはとても弱いことが判明した。また、この免疫沈降法で正常なPOLHタンパクが検出できなかった細胞がDNA合成酵素H遺伝子の変異を有しているか否か検討し、POLHタンパクの発現の有無がPOLH遺伝子の変異の有無と相関していることを確認した。さらにこの相関関係をふまえて、光線過敏症状を有する患者がXPV群かどうかのスクリーニング検査に免疫沈降法が利用できるかどうか検討中である。XPV群において同定された遺伝子変異は、日本人患者に特定の変異であり、諸外国の遺伝子変異とは相異なるものであった。さらに残念ながらこれらの変異は新たな制限酵素サイトを有しておらずPCR-RFLP法によるスクリーニングは可能となっていない。日本人に特徴的な変異は変異の箇所がスプライシング異常を来すようなイントロンエクソンの境界部にありRT-PCR法を用いてスプライシング異常が認められることを確認した。上記研究結果の第一報は国際英文雑誌に投稿中である。