hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
都市コミュニティをつくる貨幣：沖縄と大阪の模合（頼母子講）に関する研究

本研究は、沖縄県那覇市周辺地域の頼母子講である模合(模合)について文化人類学的フィールドワークを行い、現在主流の「親睦模合」が、都市の流動的な人間関係をつなぎ止め、金融以外の面でも「助け合い」組織として機能していることを明らかにした。また大阪市大正区の調査では、沖縄系の人びとがもちこんだ模合は「タノモシ」として、大阪人を巻き込んで沖縄系コミュニティの核となっていることを明らかにした。平成23年度に引き続き、文献調査と沖縄での現地調査を中心に進めてきた。さらに本年度は、大阪市大正区での模合を中心にした現地調査を精力的に行った。文献調査は、沖縄県那覇市の県立図書館、沖縄県宮古島市の市立図書館、所属大学(京都大学)図書館などで適宜行い、主に過去の模合や沖縄社会全般、大阪大正区に関する書籍を読み込んだ。現地調査では、那覇市周辺の模合に継続して出席し、模合メンバーの個々人の内面に焦点をあて、模合や貨幣についての聞き取りを進めた。また、本研究のテーマでもある模合集団によってつくられるネットワークやコミュニティについて明らかにするため、模合メンバーのネットワーク分析に着手した。模合集団が行う各種のイベントなどにも参加し、模合集団のもつ機能の広がりを理解することができた。また、那覇の宮古島出身者の模合が縁で、沖縄でも最も模合が盛んといわれる宮古島での現地調査も開始した。かつての模合のあり様を残し、かつ多様に展開している宮古島の模合に参加することで研究の視野が広がり、模合の神髄といえるような部分の理解を深めることができた。大阪市大正区では、沖縄系コミュニティのイベント各種に参加し、人びとがどのように大阪において沖縄の伝統を守り、その活動を広めようとしているのかを見ることができた。また、大正区では「頼母子」とよばれている模合の活動に、自らもメンバーとして参加しながら、沖縄の模合との相違を発見してきた。大阪人を巻き込んで行われる大正区の模合がいくつもあることもわかり、大阪ならではの展開がみられた。これまで、現地調査と文献調査を中心に研究を進めてきた。現地調査は、沖縄本島と大阪市大正区で模合集会への参加や模合に関するインタビューを中心に行ってきた。まず、大阪市大正区での調査では、大正区の沖縄系の人びとのコミュニティが、沖縄県人会連合会の活動を中心にまとまっていることがわかった。また連合会は、関西一円の沖縄系の人びとを体育会や新年会などのイベントを通して、一同に集まる機会を作り出していた。そして連合会の中心メンバーは、模合を介して連帯を深めていることが確認された。模合は大正区では「タノモシ」と呼ばれているが、貨幣により親睦を深め、信用を創り出し、ひいてはコミュニティを形成していることが明らかになった。また、「タノモシ」は大正区の大阪人も交えて行われているケースも見られ、模合を通して沖縄系の枠を超えてコミュニティが形成されていることもわかった。沖縄では、那覇とその周辺の模合が、さまざまな機能を持つことがわかったが、とくに近年活発となっている「親睦模合」では、貨幣のやり取りを通じて友情や信頼をつくり、小さなコミュニティを作り出していることが明らかになった。模合は、沖縄で古くは労働交換を意味し、現在では助け合いを意味するユイマールのあらわれといわれるが、実際に、都市で親睦を目的とする模合においても、集会を離れても、メンバーが困ったときにさまざまな形で助け合いが行われていることがわかった。つまり模合は都市においてもまさにユイマールの組織だったといえる。一方で、親睦模合の対となる金融目的の金融模合では、金額は大きくなるものの、そこで生まれる信頼も大きくなるとは限らず、むしろ反比例する側面が見られた。もちろん、金融模合と親睦模合をはっきり区別することはできない。さらにいえば、どちらが良い悪いではなく、両者が共存していることで、模合は成り立っているといえる。23年度においては、計画通り、文献調査と沖縄でのフィールドワークを進めてきた。文献調査は、沖縄の図書館・博物館、国会図書館、国立民族学博物館、沖縄県大阪事務所などで行い、文献、新聞、沖縄の市町村史などから模合(頼母子講)に関する資料を収集し分析した。また模合以外にも、その背景となる関連書籍を読み込んだ。沖縄の現地調査においては、那覇を中心に模合への参加を行ってきた。元同僚の年配女性の集まり、40代中心の友人の集まり、同じ地域に暮らす年配男性の集まり、故郷を同じくする出身者の集まりなど、計9つの多様な集団編成の模合に参加し、そのいくつかは複数回出席し、継続調査を行ってきた。模合の会合では、参与観察とメンバーへの聞き取り調査を行い、会の活動やメンバーの人間関係、会を離れてのつながりの有無、模合で得た金の使用などを調べた。必要な場合は、個々のメンバーの職場や家を訪ねて聞き取りを行った。それ以外に、模合に関するアンケート調査を行い、沖縄の模合の現状を把握することに努めた。

また、かつての模合のあり方を知るために、年配者にインタビューを行った。那覇の牧志市場のおいても、市場独特の模合の特徴やその歴史を継続して調べている。また、沖縄在住の研究者との会談を行い、アドバイスや資料をいただいた。沖縄で行われるいくつかのイベントの参加観察も行い、模合の枠から出て、その背景にある沖縄社会全体の理解を深めた。世界に居住する沖縄系移民が5年に1度沖縄に里帰りして行われる世界ウチナーンチュ大会では、その会場において、ブラジル、ペルー、ハワイなど、世界の沖縄系移民の方々に、移住先での模合の有無やその活動についてインタビューを行うことができた。また、24年度から開始する予定であった大阪大正区でも、模合の調査にすでに着手し、模合の会合の参与観察や聞き取り調査を進めている。平成23年度で得た那覇での調査データをふまえながら、大阪市大正区と宮古島市という2か所の模合を調査することができ、模合というものが、さらには貨幣というものがいかに人と人との絆を結ぶのかということについて、深く考察することができた。今後、当初の計画よりさらに大きな枠組みで模合というものを考えることの手がかりを得たと実感している。2年目ということもあり、那覇で調査をさせていただいた方々との信頼関係も深まり、より深いインタビューが可能になった。那覇では、親睦を目的とした模合が盛んであるが、その親睦模合の「発明」こそが、沖縄で模合が盛んな理由の一つであると考えており、今後の調査で実証していきたい。また、宮古島では模合社会といわれるほど人びとが頻繁に模合を行い、そのお金で子供を大学に行かせるなど、離島ならではの生活の困難を模合で乗り切っていることがわかった。大阪では、大阪人を交えての模合がかなりあり、独自の模合の展開が見て取れた。このように、模合という日本全体ではあまり知られていない活動が、沖縄や大正区では人びとの生活に深く根付き、役立っていることを実証的に明らかにできるデータが揃いつつある。このように、本研究は計画にそって順調に進展しているといえる。文献調査においては、古い模合の形態、現在までの模合の変遷、現在の模合の広がり、手法など、模合について理解を深めることができた。また、模合以外の文献にも目を配ることで、模合の背景にある沖縄社会、伝統文化について理解を深め、かつ、本研究の理論的枠組みを形成することに役立った。沖縄での模合の参与観察・聞き取り調査では、文献でカバーできない模合の情報、たとえばそこで交わされる人びとの語りや心情、醸し出される雰囲気、貨幣の扱われ方、人間関係の広がりなどを知ることができた。また、個々人の模合との関わり、模合への思い、体験などを聞かせてもらい、個別性と全体性から理解する手掛かりを得た。アンケートからは、模合がいかに沖縄社会に深く根付き、多種多様な形で行われているかを知ることができた。年配者からのインタビューでは、文献に書かれていない具体的な情報、貴重な経験談を聞くことにより、模合の現代までの経緯について理解を深めることができた。また、牧志市場の調査から、市場独特の模合のやり方が昔も今も息づいていること、そして模合を通じて市場の人間関係が調整されていることなどがわかってきた。また、沖縄の研究者との意見交換、情報交換を通じて、模合を研究することの意義や、それが沖縄でも期待されているということを再認識できた。
発がん過程におけるインスレーターおよびメチル化機構の相互関係の解明と診断への展開

発がん過程で遺伝子が不活化される機構にはプロモーター領域のメチル化とインスレーター機構がある。本研究では両者の関連性を探るために後者の因子の一つであるCTCFとメチル化について研究した。乳腺では、がん化する際にCTCFが核から細胞質内へと発現部位が変化し、同様の傾向が胆道あるいは子宮体部内膜病変でも認められた。一方、メチル化酵素であるDnmtは悪性腫瘍ほど高発現しており、腫瘍化に伴いメチル化が亢進していることを認めた。さらにCTCFの細胞質内発現とDnmtの発現は相関しており、腫瘍の進展に従って後者が主体を成すことで、前者が役割を終了し細胞質内へと移行する可能性が示唆された。発がん過程における様々なゲノム異常と共にエピゲノム異常としてのメチル化あるいはインスレーター機構の異常に関して検討を加えてきた。特に、乳癌や胆道癌では、他の悪性腫瘍同様に様々な遺伝子のプロモーター領域におけるCpGアイランドにおけるメチル化によって不活化が生じているだけでなく、上流にあるインスレーター機構によって転写制御をうけていることも明らかにした。これまで、独立して研究されてきたこの二つの機構は、実は相互に関連性をもっていることも明らかになった。すなわち、メチル化による発現停止により、本来のインスレーター機構の役割である、発現制御機構が必然的にその必要性が失われることを説明している可能性がある。事実、本来核内に発現しているインスレーター調節因子であるCTCFが、細胞質へとその発現部位を変化させていることにも繋がる。それら細胞質内発現と連動して、メチル化変換酵素であるDnmt-1と3bもメチル化異常を反映して、蛋白レベルならびにmRNAレベルでもその量を増していることも明らかになった。一方、乳癌や胆道癌でのメチル化は、他の悪性腫瘍同様、数々の遺伝子において多く認められ、共通した遺伝子の不活化も認められた。さらにそれらの頻度はDnmt-1と3bの発現だけでなく、CTCFの細胞質内発現とも相関した。すなわち、高メチル化状態の乳癌や胆道癌では、それらの反映してメチル化変換酵素の発現亢進を示す共に、一方の転写制御因子であるインスレーター調節因子であるCTCFがその役割を失い、細胞質内へのその局在を移して、分解へと向かっている可能性を示唆した。乳癌及び胆道癌におけるDnmt-1と3bの発現ならびにCTCFでの核・細胞質発現の挙動と臨床病理学的諸因子との関連性では、TNM分類の中でもT因子との関連性を認め、腫瘍の進展に伴ってこれらの因子が変化していく可能性を示唆していた。腫瘍細胞における転写制御機構の内、発現遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化によるものとインスレーター機構による転写抑制が存在している。両者は腫瘍においても関連しているものと考えられるが、それらを検討している研究は少ない。特にインスレーターの代表的な因子としてCCCTC bindingfactor: CTCFに関しては発がん過程あるいはメチル化との関連性には言及されていない。本研究ではこの両者の相互関係について検討した。メチル化機構に関しては、変換酵素であるDNA methyltransferase: Dnmt-1と3bに関して、mRNAおよび蛋白レベルで発現を量的並びに局在を検討した。対象とした症例は乳腺症を主体とした増生症ならびに良性腫瘍である線維腺腫や乳管内乳頭腫、そして浸潤性乳管癌各種(乳頭腺管癌、充実性腺管癌および硬癌)である。CTCFの発現は乳腺症をはじめとして線維腺腫や乳管内乳頭腫など良性腫瘍では主に核内にその発現の局在を認める一方、浸潤性乳管癌の多くは核内発現が減弱し、細胞質内発現が認められた。この傾向はがん化に向けて漸次移行する結果を示した。さらに、種々の臨床病理学的因子とではT因子と年齢に有意な相関を示した。一方、Dnmt-1と3bの核内発現は良性腫瘍に比し、浸潤性乳管癌の多くで発現亢進が観察され、特にDnmt-3bとCTCFの核内発現が有意に相関していたメチル化の頻度に関しても核内発現の減弱ならびに細胞質内発現の亢進の両者に有意な相関性を認めた。これまでの検討からインスレーター機構とメチル化機構は互いに独立した機構ではなく、相互に関連性を持っており、癌化に向けて本来のインスレーター機構が果たしてきた役割がメチル化機構に取って代わることで、その局在を核内から細胞質内への移動することが明らかになった。各臓器の多段階発癌過程では各遺伝子が不活化される機構にプロモーター領域のメチル化が重要である一方、これとは別個にインスレーター機構も転写制御因子でもある。これまでインスレーター因子としてCCCTC bindingfactor: CTCFが同定されている。本研究では、このCTCFに注目し、各腫瘍における動態を探る一方、転写調節機構であるメチル化に関して、制御しているものとしてDNA methyltransferase:Dnmt-1、3bについて検討し、CTCFとの関連性を探った。まず乳腺腫瘍について、CTCFとDnmt-1の発現を検討し、さらに各種遺伝子のメチル化状態を探った。乳癌では、CTCFは良性腫瘍では核内を主座としている一方、浸潤癌になるに従い細胞質内発現を示した。さらに、悪性腫瘍になるに従いメチル化の頻度とDnmt-1、3bの発現の亢進を認め、両者に相関を認めた。

次に、胆道癌ではCTCF発現は、非癌部では細胞質内発現を認める症例は少なく、核内にその発現を認める傾向が認められ、癌部においては顆粒状に細胞質内に強発現する傾向を認めた。一方、Dnmt-1は、核内に発現を認め、癌部により発現する傾向が見られた。さらに子宮体部病変では、正常内膜では多くの内膜腺上皮の核内発現を示す一方、内膜過形成、異型過形成、内膜癌になるに従い、核内発現が減少し、細胞質内発現を認める傾向有していた。以上の研究結果より、インスレーター機構とメチル化機構とには多段階発癌過程の中でも腫瘍の進展に伴った両者が密接に関連性を持っていることが示唆され、各種遺伝子の不活化機構は当初はインスレーターにより、転写が制御されている一方、徐々にDnmtによりメチル化が進行するに従い、転写が制御され発癌への進行した結果、インスレーター機構の役割を終え、その存在部位を核内から細胞質へと移行するものと考えられる。発がん過程で遺伝子が不活化される機構にはプロモーター領域のメチル化とインスレーター機構がある。本研究では両者の関連性を探るために後者の因子の一つであるCTCFとメチル化について研究した。乳腺では、がん化する際にCTCFが核から細胞質内へと発現部位が変化し、同様の傾向が胆道あるいは子宮体部内膜病変でも認められた。一方、メチル化酵素であるDnmtは悪性腫瘍ほど高発現しており、腫瘍化に伴いメチル化が亢進していることを認めた。さらにCTCFの細胞質内発現とDnmtの発現は相関しており、腫瘍の進展に従って後者が主体を成すことで、前者が役割を終了し細胞質内へと移行する可能性が示唆された。これまでの検討で、CTCFの役割の一端であるインスレーター機構は転写抑制を示すことは明らかにすることが達成できた。これらの結果は本来、転写部位である核内にてその局在が認められたことは本来の機能部位を支持するものでもある。しかし、増殖症とはいえ、非腫瘍性疾患である乳腺症をはじめとして、線維腺腫や乳頭腫において核内発現を示す一方、悪性腫瘍である浸潤性乳管癌では核内発現の減弱だけでなく、細胞質内発現の亢進を示していることは何らかの制御機構の変貌を来している結果を反映しているものと推察される。すなわち、本来の機能を発現する核内でその役割が何らかの影響によって失ってしまい、細胞質内への移動してしますのかもしれない。細胞質内がCTCFの貯留場であるか否かは不明ながら、本来のインスレーター機能は細胞質内では発揮できないものと思われる。では、何故に核内から細胞質内へと移動するのか?本研究の成果としてメチル化機構が大きく関わっていることが明らかになった。すなわち、非腫瘍、良性腫瘍ではメチル化の頻度は低いものの、悪性腫瘍になるに従いメチル化の頻度を増し、それらがCTCFに核内発現減弱、細胞質内発現亢進と相関を示すことに裏付けられている。メチル化とインスレーター機構は両者とも転写抑制を司っている重要な機能であるが、互いに補填するものではなく一方が、機能を発揮している場合、他方がその機能を失い、局在を移動していく可能性が考えられる。本研究ではそれらの推論をある程度あきらかできた。さらに発がん過程において、様々な遺伝子のメチル化の蓄積とインスレーター機能の消失ががん化に向けて関与しているものと考えられる。
肺移植に対する超高密度窒素ナノバブルを使用した新たな臓器保存液の開発

平成30年度は前年度に引き続きナノバブル保存液を用いて、ラット肺に対し臓器保存を行った。現時点でナノバブル保存液が有効性があると考えている。既存の肺EpTU保存液をコントロール群に、ナノバブル保存液でのラット肺保存群で比較検討を行った。評価するタイムポイントが不十分であったため追加検討を行った。4時間、8時間、16時間、24時間を作成し保存臓器の状態を評価した。保存液溶液pHや組織中のATPなどナノバブル群で炎症の程度が軽微ではないかと推定しており、さらなる定量化と追加検討(炎症性サイトカインなど)を進めている。また組織学的評価では、TUNELにCapase-3などの細胞死マーカーの追加検討を行っており、おおむね推定されていた結果であったと判断している。タイムポイントの設定に難渋しているが、おおむね予定通りの進展と考える。現在、またコントロール群の追加検討と、モデルの再構成などを行っている段階でありこの検討が終わり次第、移植実験に移る予定である。また上記並行して、移植実験でのコントロール群の検討を行っている段階であり、虚血再灌流モデルの再検討を行っている。ナノバブル保存での肺移植に関してはおおむね問題ないと判断している。検討すべき保存時間のタイムポイントの設定に難渋しているが、おおむね順調に進んでいると判断している。この検討が終わり次第、移植実験に移る予定である。平成29年度は研究計画に沿って行った。1高濃度窒素ナノバブル臓器保存液の精製とその保存液の分析、また2そのナノバブル保存液を用いて、ラット肺に対し臓器保存を行った。1に関しては、至適ナノバブル保存液を決定するためにまずナノバブル保存液の成分分析を行った。ナノバブル精製機の作動時の窒素流量や作動時間を調整しその違いを検討した。既存の肺EpTU保存液をナノバブル精製機で1時間以上作動させることで溶液中のNO濃度はがplateauに達することを確認した。またNO濃度は継時的に減少することや、またナノバブル化することでpHの変動も少ないことも確認できた。この条件を現時点での至適ナノバブル保存液の精製法を設定し、臓器保存のステップに移った。2では、既存の肺EpTU保存液をコントロール群に、ナノバブル保存液でのラット肺保存群で比較検討を行った。評価するタイムポイントを設定するためにまず長期モデルとして72時間モデル作成し、その時点での保存臓器の状態を評価した。72時間時点では炎症による臓器のダメージ、肺臓器壊死が進んでおり差が顕著ではないと判断し、当初予定通りの4時間、24時間、48時間の臓器保存モデルの作成に移った。現在、2の解析段階である。現時点では組織学的検査ではナノバブル群で炎症の程度が軽微ではないかと推定しており、その定量化を進めている。組織のATP測定や保存液の炎症性サイトカインの測定などを行っている。平成29年度は、1高濃度窒素ナノバブル臓器保存液の精製とその保存液の成分分析、また2そのナノバブル保存液を用いて、ラット肺に対し臓器保存を行った。おおむね研究計画の方向性に変更ないと考えている。上記ラット肺の臓器保存での解析が終了後、すみやかにラット肺移植モデルの作成を行い、移植実験を進めていく。経費節減に努め、予定通り計画も進展したことにより経費削減することができた。次年度のラットでの動物実験に必要な物品費などに充当する予定である。研究はおおむね順調に進展したが、少額の次年度使用が生じた。その分、物品費として使用予定である。
脳におけるレトロトランスポゾン発現の性差と生殖機能

神経回路の性差は性行動や生殖生理等、性特有の機能の性差に結びつくのみならず、特定の疾患に対する罹患率の性差や環境要因に対する影響の感受性の性差を形成する基盤となる。様々な化学物質の曝露影響バイオマーカーとしてレトロトランスポゾンL1が知られているが、本研究では脳におけるその発現の性差について検討した。その結果、視索前野においてL1発現に性差がみられ、またそのL1発現の性差は環境因子と相互作用し変化する可能性が明らかとなった。今後はその発現がどのような機能的な性差に結びつくのか、より詳細に検討することにより脳の性分化機構の解明に少しでも近づけるように研究をすすめたい。環境化学物質が子どもの脳に働き、正常な脳の発達を妨げることが懸念されている。環境化学物質の影響機序の一つとして、レトロトランスポゾンの一種であるLong interspersed element-1(L1)のRNA発現量増加およびそのゲノムDNAへの再挿入の増加が報告されており、化学物質曝露の曝露影響バイオマーカーとしても広く用いられている。脳内では他の臓器に比べてL1が強く発現しており、化学物質曝露によってより強くL1が発現し、その結果、脳の発達の異常が誘導される可能性がある。前年度までの研究で、マウスを用いた動物実験により、視索前野におけるL1 RNAの発現に雌雄差があることが明らかとなっている。本年度は1L1発現を制御するエピジェネティック要因の解明と、2L1のDNA再挿入の検討を行った。1に関しては、a) DNAメチル化を制御することが知られているDNAメチル基転移酵素Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b、b)脳におけるDNAメチル化の安定に重要なMeCP2、c) DNAの脱メチル化に重要な役割を果たすTet1, Tet2, Tet3の発現を視索前野で検討したところ、Tet2の発現に有意な性差が認められた。このことはTet2の発現増加が引き金となり、DNA脱メチル化が起こりその結果L1発現に性差が生じている可能性を示唆している。一方2に関しては、遺伝子組換えによりL1のゲノムへの再挿入を検出できるマウスを系統維持しており現在も検討中である。環境中化学物質の増加等、子どもを取り巻く環境変化が後発的な脳機能異常発症を導く可能性が懸念されている。環境汚染物質曝露により発現増加することが知られており、染色体上で“コピー・アンド・ペースト"を繰り返す“動く遺伝子"レトロトランスポゾンlong interspersed elemenent-1(L1)は神経系に強く発現しており、体細胞においてもゲノムDNAの再編を誘導し細胞機能に影響をおよぼす可能性が指摘されている。もしも脳においてLINE-1の発現やそのゲノムDNAへの再挿入に性差があるのであれば、化学物質に対する感受性の性差を産み出す原因となっている可能性が考えられる。本研究はマウスを用いた動物実験により、脳においてL1発現・DNA再挿入に性差が存在するかどうか明らかにすることを目的とする。まず、脳において雄雌で形態や機能が異なる性的二型核のひとつ、視索前野におけるL1 RNAの発現をRealtime PCR法により測定し、雌雄で比較した。その結果、B6系統およびC3H系統の成体マウスにおいて雌雄間で有意な発現レベルの違いが観察された。この結果をふまえ、視索前野においてL1のDNAへの再挿入に性差があるかどうか検討を始めた。具体的にはCMVプロモーターの下流にL1遺伝子を配置し、さらに下流の3'-非翻訳領域に、3'側から5'側に向かって“逆向き"に1CMVプロモーター、2中間部をγ-globin intronで分断された緑色蛍光タンパクEGFP遺伝子、3polyA、の3種の配列が挿入された遺伝子配列が組み込まれた遺伝子組換えマウスを導入し、蛍光観察あるいはEGFPに対する抗体を用いた免疫染色でL1がDNAに再挿入した細胞を特異的に検出し、細胞数の比較を行う。現在、遺伝子組換えマウスの系統維持に成功し、雌雄のマウスの脳で細胞数の検討を行っているところである。発達期の脳は、神経突起伸張やシナプス形成が起こる形態形成時期であり、この時期に脳への有害影響は永続的な脳機能の低下を引き起こす。また血液脳関門の形成も十分でないため、呼吸器や消化器経由により取り込んだ有害化学物質の影響をうけやすいことも知られている。このような環境化学物質の発達期の脳への有害機序の一つとして、脳内のでのレトロトランスポゾン増加が考えられる。特にレトロトランスポゾンの一種であるLong interspersed element-1(L1)のRNA発現量増加およびそのゲノムDNAへの再挿入の増加が危惧されている。前年度までの検討により、マウスを用いた動物実験から、脳内の視索前野においてL1の発現の雌雄差があることが明らかになった。

また、L1発現を制御する因子として、DNAメチル化因子の発現を検討したところTet2の発現に有意な性差が認められた。本年度は、実際の有害化学物質の曝露が直接的なL1の発現誘導を引き起こし、さらにその影響に性差があるのか調べる第一歩として、大気汚染物質として知られる有機二次エアロゾルを発達期にマウスに曝露し、その行動とレトロトランスポゾン発現への影響を調べた。その結果、マイルドな行動異常が検出されるとともに、L1発現の異常が検出された。これらの結果から有害物質曝露下におけるL1の発現の性差を調べる基盤を構築することができた。医歯薬学平成25年度は平成24年度に先行して始めたL1発現の性差の分子メカニズムに関わる研究において大きな進展がみられ、DNAのエピジェネティック修飾が性差形成に何らかの影響をあたえていることが明らかになりつつある。一方で、L1ゲノム再挿入の性差に関しては未だ十分な検討ができていない。当初1系統のマウスで研究を行う予定であったが2系統のマウスを用いて、どちらの系統でも再現性よくL1発現の性差を検出することができたため、研究の根幹となる部分は十分に達成できた。当初の計画では平成24年度は発達段階に着目した研究まで行う予定であったが、そこまで研究をすすめることはできなかった。一方で、平成25年度に行う予定であったL1発現の性差を制御するメカニズムの解析の中で、視索前野におけるエピジェネティック関連遺伝子発現の性差をいくつか見いだすことができ、平成25年度分に関して先行して一部達成した部分もある。また、DNA再挿入に関する検討に関しては、当初からある程度予想はされていた技術的に困難な部分はクリアでき、性差の解析が可能なところまで研究を進めることができた。L1ゲノム再挿入の性差に関して、現在までは遺伝子組換えマウスの利用にこだわって研究をおこなってきたが、それに加えてゲノムDNAを抽出し、直接検討することを開始し、より多面的に検討を行うことを予定している。また、DNAのエピジェネティック修飾がどのようにL1発現の性差につながるのかに関してはより掘り下げて検討を行う予定である。平成24年度にできなかった発達段階に関わる研究に関して平成25年度で研究を行うとともに、平成25年度に予め予定されていた研究を行う。L1発現・DNA再挿入の雌雄差形成機構に関して、特に性ステロイドの投与等を行うことで、性ステロイドの下流で雌雄差が形成される可能性について検討を行う。また、L1発現・DNA再挿入を制御するエピジェネティック機構の性差の検討を行う。特にDNAメチル化に働くDnmt1, 3a, 3b ,MeCP2、脱メチル化に働くTet13などに着目して検討するエピジェネティック因子の数を増やし、7週令・視索前野における発現量の雌雄差を解析し、どのようなDNA修飾がL1発現・DNA再挿入の性差を導くのか検討を行う予定である。平成25年度にはbisulfite sqeuencing法を用いてDNAメチル化解析を行う予定であったが、エピジェネティック修飾に関連する因子の発現に関する研究が大きく推進したことで順序的に後回しになった。平成26年度には、このような結果をふまえて、エピジェネティック修飾に関連したDNA修飾およびヒストン修飾に関連するエピジェネティック解析を行う。
「子ども虐待防止の実践力」を育成する教員養成のあり方

本研究は「子ども虐待防止の実践力」を育成する教員養成のあり方を明らかにすることを目的に国内及び海外調査を行った。国内調査では、大阪府及び北海道の小中高教職員と全国特別支援学校(病弱)教員調査、大学教職科目担当者調査により、児童虐待対応の現状及び虐待に係る認識と教育・研修のあり方、学部段階における虐待に関する教育の現状について分析し課題を明らかにした。海外調査からは学校におけるSafegaurding(英国)、学校における予防教育(スウエーデン・オーストリア)、学校を支えるシステム(米国)等に関する知見を得た。それらを踏まえて教員養成段階での教育内容と方法及び教員研修のあり方について提言した。1、24年度に実施する「学校や教員に対するニーズ調査」の予備調査として聞き取り調査。教員やSCからは、発見・通告に際して子どもの変化に気づくことや教員間のチームワークの重要性、また保護者への対応や危機管理・機関連携のあり方が課題であること、さらに業務の多忙さなどが指摘された。また児童福祉・母子保健領域の専門家からは(1)発見・対応・ケアに関する課題として「虐待を受けた子どもの理解と対応スキル」「虐待問題をソーシャルワーク的視点でみる力」「教育と福祉の連携」「教員の自己覚知」等が指摘され、(2)予防教育の視点としては「加害者にならない教育」「被害を回避する教育」の2軸を踏まえた概念整理の必要性が共有された。2、Web上に公開されているシラバスから「教員養成における子ども虐待」の授業開講状況の調査。(1)授業は教育学部を有する半数以上の国立大学において開講されている、(2)当該授業は養護教諭免許状、特別支援学校の免許状取得のための必要授業のほかに幼稚園・小学校・中学校・高等学校の普通免許状取得に際して必修科目中、教育職員免許法施行規則第6条第4欄「生徒指導、教育相談及び進路指導等に関する科目の理論及び方法」に位置付く授業が多い、(3)他に第6条第2欄「教職の意義等に関する科目」、第3欄「教育の基礎理論に関する科目」において開講されている事例が存在する、(4)但しこれらの授業は概ね授業者に依存する形で開講されでいる事が確認された。3、スウエーデン・フィンランド・オーストリアへの現地調査と来日中のDR F.Putnamへの聞き取り調査。(1)スウエーデン調査から児童虐待は子どもの人権侵害で、親が子どもを叩くことを禁ずる法律があり身体的虐待が少ないこと、また教師への発見・対応の研修や学校における生徒へのハビリテーションなどの多くの取り組みがありそのことで虐待防止ができると考えていること等が確認された。(2)オーストラリア調査から児童虐待は「Gewalt an Kindern」という語で把握され学校でも家庭でも起こる問題として認識されていること、学校で導入される暴力防止教育の中心はいじめに関することが多いこと、学校における暴力防止や虐待予防教育は子どもの権利に関する教育が重視され子どもの教科書にも論及されていることが確認された.子ども虐待の防止と予防のために教員養成段階でなすべき教育内容と方法を明確にし、卒業後の現職教員への継続した研修のあり方を明らかにすることを目的に以下の研究を行った。1.平成24年度学校調査の分析。1大阪府内及び北海道旭川児童相談所管内の公立小中学校教職員調査、2大阪府立高等学校調査、3スクールカウンセラー調査、4全国特別支援学校(病弱)調査について、地域差・学校種・職種を踏まえて分析した。その結果、教育・研修の内容に必要な事項が明らかになり、また個別の体験を類型化・体系化する教育・研修の方法や機会が必要なことも明らかになった。さらに国や地方の教育行政への要望として、教育や研修の充実などのソフト面のみではなく組織や体制の整備の必要性もある事が確認された。2、大阪教育大学と北海道教育大学の教免法第6条を担当する教員を対象にWeb調査を行った。授業において取り上げている子ども虐待に関する事項や、取り上げることが適切である事項が明らかになり、複数の教職科目担当者が種々の科目で子ども虐待を取り上げ、教員免許取得者に対して必修化すべき教育内容と考えていることが確認された。3、24年度に引き続き行った英国調査では、資料収集とレスター州への現地調査を行った。教員へのSafeguradingの研修を行っている担当者への聞き取り調査からは、レスター州(英国)では、学校におけるChild protectionは、Safeguradingの概念の中心的事項として扱われていることが明らかになり、実践を行っている小中学校への訪問調査を行った。またレスター大学における教員養成担当者への、教員養成におけるChild protectionの扱われ方に関する聞き取り調査を行った。4、平成2325年度の総合研究報告書を作成し、「子ども虐待防止の実践力」を育成する教員養成の在り方と現職研修に関する提言を行った。1、子ども虐待問題への社会的ニーズ調査(学校教職員に対する調査)

子ども虐待に関する教育内容の明確化を目的として、平成24年8月11月にかけて、1大阪府と北海道の公立小・中学校(766校)の管理職766名と教員2752名、2大阪府立高等学校(154校)の管理職154名と教員462名、3特別支援学校(病弱:85校)の管理職と教員、4大阪府内のSC248名を対象に質問紙調査を行った。(1)有効回答は、1小・中学校管理職462名(60.3%)、小中学校教員1282名(46.6%)、2高等学校管理職69名(44.8%)教員150名(32.5%)、3特別支援学校63校(64.1%:管理職63名教員292名)、4SC49名(19.6%)であった。(2)単純集計から1「児童虐待の防止力を育成するために必要な教育・研修」について、学部学生と現職教員に必要な内容の違いや、2大阪と北海道では虐待への対応経験や被虐待児童生徒の示す情緒行動の問題への対応困難感の違い等が認められた。これらは次年度に分析を行うことでカリキュラムマップ作成の基礎資料となる。2.海外調査(ストックホルム、ロンドン、ボストン、ウイーン)1ストックホルムとボストン調査では、教員養成を行っている大学・児童福祉局・小中学校教員等への聞き取り調査と資料収集、ロンドンではNSPCC主催の会議参加と学校教育研究者や大学教員(ソーシャルワーク専門)への聞き取り調査、及び資料収集を行った。現時点までの調査で、調査国の現職教員研修の実施状況に違いがあることを確認したが、教員養成段階での児童虐待の扱い方についてはほとんど把握できていない。一方、学校と児童福祉機関との連携の実際や学校における予防教育に関しては一定の情報を収集した。2ウイーン調査は、23年度に未実施の児童福祉局への聞き取り調査(児童虐待の実態及び学校との連携のあり方)を行った。計画していた調査のうち、(1)聞き取り調査においては24年度の質問紙調査にむけて調査表を策定するにたる結果を得ることができた。また(2)授業開講状況調査からは、現時点における日本の大学での教員養成における子ども虐待問題の開講状況を把握できた。(3)海外調査に関しては、予定の3力国(スウエーデン・フインランド・オーストリア)について文献調査や現地調査による予備調査を行い、一定の内容を確認でき、また新たな知見も得られた。しかし、オーストリアにおいては児童虐待問題の捉え方やこの問題への学校や教員の位置づけが日本とは異なっており、さらに児童福祉局への調査を行なう中で全体像を整理する必要があること、また3力国における教員養成のあり方に関してはほとんど調査できていないことなどから次年度の調査が必要である。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画していた調査のうち、1質問紙調査は、大阪・北海道の小中学校(766校)と大阪の高等学校(154校)、全国の特別支援学校(病弱:84校)とスクールカウンセラーを対象に調査を実施し、小中学校の管理職からは概ね60%・教員からは50%弱の回答を得ており、高等学校や特別支援学校からも一定の回答を得た。
悪性眼球突出症の病因・発症・重症化機構の解明

1バセドウ病およびバセドウ病眼症の遺伝因子の解析日本人およびポーランド人のバセドウ病患者を対象にサイトカインや免疫応答分子の遺伝子多型の解析を行い、(1)TNF-αのプロモーター領域の多型は、日本人と同様ポーランド人でも眼症と関連を認めた。(2)IL-13遺伝子多型は日本人ではバセドウ病の発症と関連が認められた。しかしポーランド人では認められなかった。眼症との関連は認められなかった。(3)IFN-γ遺伝子多型は日本人においてバセドウ病患者の抗甲状腺剤に対する治療抵抗性と関連がみられたが、バセドウ病の発症や眼症の発症との関連はみられなかった。(4)IL-6、IL-18遺伝子多型はバセドウ病やバセドウ病眼症と関連は認められなかった。(5)CTLA-4遺伝子多型は日本人でもポーランド人でも、バセドウ病との関連がみられたが、眼症との関連はみられなかった。(6)日本人ではCD40、ICAM-1などの免疫応答分子の遺伝子多型とバセドウ病やバセドウ病眼症との関連は認められなかった。2手術が必要となった重症のバセドウ病眼症患者における検討3自己抗原候補遺伝子の病変部における発現・調節眼症患者および対照患者の後眼窩組織にリアルタイム定量PCR法にて、TSH受容体、サイログロブリンの発現を認めた。しかしその発現量は甲状腺に比較して極微量であった。2手術が必要となった重症のバセドウ病眼症患者における検討CTLA-4遺伝子多型とバセドウ病発症、TNF-α遺伝子プロモーター領域の-1031T/C多型と眼症との間に有意な関連が認められた。3自己抗原候補遺伝子の病変部における発現・調節眼症患者および対照患者の後眼窩組織にリアルタイム定量PCR法にて、TSH受容体、サイログロブリンの発現を認めた。1バセドウ病眼症の疾患感受性遺伝子の検索日本人334例とポーランド人264例のバセドウ病患者を対象に、CTLA-4遺伝子多型やサイトカイン遺伝子多型とバセドウ病やバセドウ病眼症との関連性を検討した。1)CTLA-4遺伝子多型は日本人でもポーランド人でもバセドウ病の発症と関連していたが、眼症とは関連が認められなかった。2)IFN-γ遺伝子多型は日本人においてバセドウ病患者の抗甲状腺剤による治療抵抗性と関連がみられたが、眼症とは関連がみられなかった。3)IL-13遺伝子多型は日本人においてバセドウ病の発症と関連がみられたが、眼症とは関連がみられなかった。4)日本人においても、ポーランド人においてもTNF-α遺伝子プロモーター領域の遺伝子多型と眼症との間に有意な関連が認められた。5)IL-18遺伝子のプロモーター領域の-607C/A多型と眼症との間に弱い関連が認められた。バセドウ病眼症の発症にはTNF-α遺伝子あるいはこれと連鎖不均衡にある遺伝子の多型が遺伝因子として関与しているものと推測される。2自己抗原の候補遺伝子の病変部における発現・調節眼症患者および対照患者の後眼窩組織に、リアルタイム定量PCR法にて、TSH受容体、サイログロブリンの発現を認めた。しかしその発現量は甲状腺に比較して極少量であった。(3)IL-6、IL-18遺伝子多型はバセドウ病やバセドウ病眼症と関連は認められなかった。(4)日本人ではCD40、ICAM-1などの免疫応答分子の遺伝子多型とバセドウ病やバセドウ病眼症との関連は認められなかった。2手術が必要となった重症のバセドウ病眼症患者における検討CTLA-

4遺伝子多型とバセドウ病発症、TNF-α遺伝子プロモーター領域の-1031T/C多型と眼症との間に有意な関連が認められた.人種、地域により遺伝因子の関与の程度は異なることが示唆された。
散漫散乱および低エネルギー励起に関わるイオンの動的挙動

1ローター型強力X線源によるX線散乱実験および原子炉を利用した中性子散乱実験を、超イオン電導体AgBr、CuI、通常のイオン性結晶KBr、NaClなどについて行った。温度依存性を明らかにするため、これらの回析実験の温度領域は、室温から低温(10K)までとした。X線散乱実験および中性子散乱実験を行った、AgBr、CuI、KBr、NaClなどすべての物質で、熱振動における原子間の相関の効果に起因する、バックグラウンドに振動的な形状が現れることを確認した。バックグラウンドの振動的な形状は室温で非常に顕著で、温度が下がるとともに減少し、低温(10K)では明確ではない。2熱振動における原子間の相関の効果を取り入れたバックグラウンド強度の表現式を、超イオン導電体AgBrに適用し、X線散乱強度プロファイルのリ-トベルト法によるフィッティングを試みた。この方法と、従来の多項式によるバックグラウンド強度式をん用いた場合との比較を行った。熱振動の相関を取り入れた場合の方が、多項式を採用するより、バックグラウンドの振動的な形状をより再現でき、リ-トベルト法の精度をあげることが可能となった。3アニオン伝導型超イオン導電体での低エネルギー励起の存在、およびその分散を明らかにするため、TOF分光器を用いて、アニオン伝導型超イオン導電体CsPbCl_3の中性子非弾性散乱実験を行った。この結果、測定されたQの全部の領域において、分散のない約1.8meVの低エネルギー励起を観測した。PbCl_6の構造単位が存在し、この構造単位での孤立した振動モードが分散のない励起の原因となっている可能性がある。
悪性骨軟部腫瘍における薬剤耐性獲得機構の解明

悪性骨軟部腫瘍は極めて悪性度の高い腫瘍である。近年の系統的化学療法導入により、飛躍的な生存率の向上が得られている。しかし、薬剤耐性化を来たし化学療法の奏功しない症例では、集学的治療にも関わらず依然予後は極めて不良である。さらなる治療成績向上のためには、肉腫における薬剤耐性獲得機構の解明が必須である。本研究では、肉腫の細胞自律的および非細胞自律的な薬剤耐性獲得メカニズムを解明し、治療成績向上のための基盤研究を以下のステップに分けて検討する。(1)肉腫細胞の細胞自律的な機構の解析、(2)周囲間質環境からの肉腫細胞への働きかけによる非細胞自律的な機構に対する分子細胞生物学的および臨床検体を用いた解析、(3)肉腫細胞を用いた薬剤耐性動物モデルを用いた、既存の抗腫瘍薬と薬剤耐性獲得機構を阻害する分子標的治療の組み合わせによる、新規の薬剤耐性克服治療の可能性を探索する。今年度は上記(1)、(3)に焦点をあて解析を進め以下の新しい知見を得た。滑膜肉腫細胞株における経口マルチチロシンキナーゼ阻害薬であるパゾパニブ(PAZ)耐性株(PAZ耐性株)を樹立、耐性メカニズムの検討した結果、PAZ耐性株では親株と比較して増殖能が高く、PAZによる細胞周期のG1 arrestが生じにくくなっていた。さらに、親株とPAZ耐性株間の遺伝子発現の違いについて網羅的解析を行った結果、PAZ耐性株ではチロシンホスファターゼの1種であるMKP3の発現が低下し、MAPK経路が活性化されているためPAZ耐性化を来している事を見いだした。(投稿中)今回の結果により、進行肉腫におけるPAZ耐性化が克服される可能性があり、臨床的インパクトは極めて大きいと予想される。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨肉腫(Osteosarcoma: OS), Ewing肉腫(Ewing's Family of Tumor: EFT)などに代表される肉腫は、若年者に好発する極めて悪性度の高い腫瘍である。近年の系統的化学療法導入により、飛躍的な生存率の向上が得られているが、薬剤耐性を来す症例では依然予後は極めて不良である。(1)肉腫細胞の細胞自律的な機構の解析、(2)周囲間質環境からの肉腫細胞への働きかけによる非細胞自律的な機構に対する分子細胞生物学的および臨床検体を用いた解析、(3)肉腫細胞を用いた薬剤耐性動物モデルを用いた、既存の抗腫瘍薬と薬剤耐性獲得機構を阻害する分子標的治療の組み合わせによる、新規の薬剤耐性克服治療の可能性の探索。25年度は、肉腫細胞の細胞自律的な薬剤耐性化獲得メカニズムの解明を細胞株に対する抗癌剤長期曝露を進めた結果、既に確立済みであった、OS, EFTの薬剤耐性株(耐性株)に加え、軟骨肉腫(Chondrosaroma: CS)、滑膜肉腫(Synovial sarcoma: SS)、悪性神経鞘腫腫瘍(Malignant peripheral nerve sheath tumor: MPNST)の耐性株を樹立した。過去にCS, SS, MPNSTの耐性株の報告はなく、画期的な成果と考えられる。さらに、それぞれの細胞株の親株と耐性株の遺伝子発現の変化を、DNAおよびmicroRNAマイクロアレイ法にて検討した結果、耐性株で強く発現している複数の候補遺伝子を同定した。これの遺伝子により、細胞自律的な薬剤耐性が制御されている可能性があり、引き続き分子生物学的な解析を進める予定である。26年度は、肉腫細胞の細胞自律的な薬剤耐性化獲得メカニズムの解明を細胞株に対する抗癌剤長期曝露を進めた。既に確立済みであった、OS, EFTの薬剤耐性株(耐性株)に加え、軟骨肉腫(Chondrosaroma: CS)、滑膜肉腫(Synovial sarcoma: SS)、悪性神経鞘腫腫瘍(Malignant peripheral nerve sheath tumor: MPNST)の耐性株、及び約400種類に及ぶ薬剤ライブラリーを用いて耐性克服が可能となる薬剤をスクリーニングした結果、MAPK経路阻害剤、プロテアソーム阻害剤などにより薬剤耐性が克服される可能性が示唆された。

過去に本研究に類似した、CS, SS, MPNSTの耐性株を用いた大規模な薬剤耐性克服実験の報告はなく、画期的な成果と考えられる。また、肉腫細胞にてGFPを発現させることで、各種肉腫細胞と骨髄間質細胞(Bone marrow stroma cell: BMSC)を共培養し、肉腫細胞のみの増殖を解析可能な実験系も確立した。悪性骨軟部腫瘍は極めて悪性度の高い腫瘍である。近年の系統的化学療法導入により、飛躍的な生存率の向上が得られている。しかし、薬剤耐性化を来たし化学療法の奏功しない症例では、集学的治療にも関わらず依然予後は極めて不良である。さらなる治療成績向上のためには、肉腫における薬剤耐性獲得機構の解明が必須である。本研究では、肉腫の細胞自律的および非細胞自律的な薬剤耐性獲得メカニズムを解明し、治療成績向上のための基盤研究を以下のステップに分けて検討する。(1)肉腫細胞の細胞自律的な機構の解析、(2)周囲間質環境からの肉腫細胞への働きかけによる非細胞自律的な機構に対する分子細胞生物学的および臨床検体を用いた解析、(3)肉腫細胞を用いた薬剤耐性動物モデルを用いた、既存の抗腫瘍薬と薬剤耐性獲得機構を阻害する分子標的治療の組み合わせによる、新規の薬剤耐性克服治療の可能性を探索する。今年度は上記(1)、(3)に焦点をあて解析を進め以下の新しい知見を得た。滑膜肉腫細胞株における経口マルチチロシンキナーゼ阻害薬であるパゾパニブ(PAZ)耐性株(PAZ耐性株)を樹立、耐性メカニズムの検討した結果、PAZ耐性株では親株と比較して増殖能が高く、PAZによる細胞周期のG1 arrestが生じにくくなっていた。さらに、親株とPAZ耐性株間の遺伝子発現の違いについて網羅的解析を行った結果、PAZ耐性株ではチロシンホスファターゼの1種であるMKP3の発現が低下し、MAPK経路が活性化されているためPAZ耐性化を来している事を見いだした。(投稿中)今回の結果により、進行肉腫におけるPAZ耐性化が克服される可能性があり、臨床的インパクトは極めて大きいと予想される。本研究では、前述のように肉腫の薬剤耐性獲得機構を以下の3ステップに分けて検討する予定である。(1)肉腫細胞の細胞自律的な機構の解析、(2)周囲間質環境からの肉腫細胞への働きかけによる非細胞自律的な機構に対する解析、(3)肉新規の薬剤耐性克服治療の可能性の検討。本年度は(1)のステップが順調に進捗し、前臨床段階へ応用可能な候補薬剤が同定できると共に、ステップ(2)の解析準備も終了しており予定通りの達成度と判断される。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、(1)の肉腫細胞の細胞自律的な薬剤耐性克服に対しては、既にスクリーニングにて抽出されたMAPK阻害剤、プロテアソーム阻害剤などを用いて、克服メカニズムのin vitroでの詳細な解析、さらには担癌マウスモデルを用いたin vivoの解析を行う。その結果、今後の臨床応用へとつながる基礎的なデータが蓄積されると予想される。また上述の(2)のステップ、すなわち肉腫細胞の非細胞自律的な薬剤耐性化獲得メカニズムについても、昨年度に構築された実験系を用いて解析を進める。各種肉腫細胞とBMSCを共培養し肉腫細胞の薬剤感受性が変化するかを検討する。
アデニン-7-オキシドの合成と反応

核酸構成塩基の1つであるadenine(I)は,環内に4個の窒素を持つので,N-oxide体には理論上4種の位置異性体が可能である。これら4種の異性体の中で,1-,3-,及び9-oxide体は既知であったが,7-oxide体(II)が未知であった。本研究では,このadenine7-oxide体(II)を化学的に合成することに成功し,その特性,化学的性質,生物活性を調べることができた:1.本研究代表者らがguanine7-oxideの合成のために開発した段階的「フェナシルアミン経路」をIIの合成に応用しようとしたが,不成功に終わった。しかし,この試みで6-mercaptopurine7-oxideを初めて合成することができた。2.ベンジル基を制御合成子として利用して有機過酸によるアデニン環の直接的N-オキシド化を検討したところ,3-benzyladenine及び1-benzyladenineがそれぞれ対応する7-オキシド体を与えた。これらのN-オキシド体を硫酸/トルエンによる非還元的脱ベンジル化に付したところ,標的化合物adenine7-oxide(II)を得ることができた。3.ここに得た新規adenine7-oxide(II)の構造は,X線結晶構造解析によって確定し,このものの化学性質や互変異性について種々の興味ある知見を得た。4.他の研究機関に依頼したテストによれば,adenine7-oxide(II)は濃度50μg/mlにおいてマウス白血病細胞L5178Yに対して増殖阻害活性を示さなかった。また,抗ウイルス活性や抗菌性も示さなかった。
ミトコンドリア品質管理を基盤とした加齢による卵の質の低下に対する新規治療法の開発

女性の加齢による妊孕力低下の原因として、卵の加齢による卵の質の低下が重要である。本研究では、ミトコンドリアの品質管理に着目し卵の質の低下のメカニズムを検討した。本研究では、卵の加齢とオートファジーによる選択的ミトコンドリア分解機構(マイトファジー)の変化を解析し、“卵の質の低下"に対する新しい予防・治療法の開発を目指す。研究初年度は、排卵後加齢卵(排卵後に時間が経過した卵)を用いた実験系にて、1ミトコンドリア転写因A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)の発現量の変化とミトコンドリア局在の変化、2オートファジー検出のマーカー分子であるLC3発現、3マイトファジーのマーカーであるParkinの発現を検討した。その結果、排卵後加齢卵では、新鮮卵と比べオートファジーが亢進している可能性が示唆された。またマイトファジーに関しても、排卵後加齢卵で亢進している可能性が示唆された。研究2年目は、母体加齢においても同様の現象が起きているかどうか検討を行った。加齢マウス(生後1年)を成熟雄マウスと交配させ、前核期胚を採取、胚盤胞形成について検討した。また、アポトーシス陽性細胞の割合を検討した。加齢マウス由来のin vivo胚は、若年マウスと比べ有意に胚盤胞形成率が低下し、アポトーシス細胞の増加が認められた。加齢マウス由来の卵について、TFAM、LC3、Parkinの発現を免疫蛍光染色にて検討した。排卵後加齢卵、母体加齢卵はいずれも卵の質が低下する事が明らかになったが、そのメカニズムにオートファジーおよびマイトファジーが関与している可能性がある。しかしながら、両者の卵の質の低下のメカニズムに関しては、すべてが同様と言うわけではないことが明らかとなった。今後さらに詳細な卵の質の低下の分子機構を解明する必要がある。研究の初年度は、我々がこれまで「卵の質の低下」モデルとして採用してきた排卵後加齢卵におけるmitochondria transcriptional factor A (TFAM)の発現および局在の変化に関する検討を予定し実施した。排卵後の加齢卵はコントロール卵と比べ、TFAMの発現(タンパク質レベル)は変化しなかった。共晶点レーザー顕微鏡を用いてTFAMとミトコンドリアの局在分布を検討した結果、コントロール卵ではTFAMとミトコンドリアは共局在していたが、加齢卵のTFAMとミトコンドリアの共局在率は低下していることがわかった。さらに、排卵後加齢卵におけるマイトファジーの検出とマイトファジー制御機構に関する検討を行った。オートファジーの代表的なマーカー分子であるLC3の発現を検討した結果、コントロール卵と比べ排卵後加齢卵ではLC3の発現が増加していた。LC3とミトコンドリアの共局在を共晶点レーザー顕微鏡を用いて検討した。その結果、LC3の発現はミトコンドリアの一部との共局在が示された。マイトファジーのマーカー分子と考えられているParkinの発現を検討した結果、コントロール卵と比べ排卵後加齢卵ではParkinの発言が増加している結果が得られた。マイトファジーの抑制と活性化に関する検討を行った。マイトファジーの活性化には、ミトコンドリア脱共役剤であるCCCPを用いた。コントロール卵とCCCP投与卵における、LC3およびParkinの発現を検討した。その結果、CCCP投与卵はコントロール卵と比べ、LC3よparkinの発現が増加していることがわかった。卵の質の低下モデルである排卵後加齢卵を用いた実験はこれまで多くの研究で我々が行ってきた実験系であり、予定された実験を実施することができた。研究の結果も、当初予想された結果が得られておりおおむね順調に研究が進展している状況である。卵の質の低下は、ミトコンドリア機能低下によるATP産生低下が一因である。本研究では、ミトコンドリアの品質管理に着目し卵の質の低下のメカニズムを検討する。卵の加齢とオートファジーによる選択的ミトコンドリア分解機構(マイトファジー)の変化を解析し、マイトファジー制御機構の活性化を標的とした“卵の質の低下"に対する新しい予防・治療法の開発を目指す。2017年度(研究初年度)は、排卵後加齢卵を用いた実験系にて、1ミトコンドリア転写因A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)の発現量の変化とミトコンドリア局在の変化、2オートファジー検出のマーカー分子であるLC3発現、3マイトファジーのマーカーであるParkinの発現、4マイトファジー誘導下でのLC3またはParkinのミトコンドリアとの局在を返答した。2018年度は、母体加齢においても同様の現象が起きているかどうか検討を行うことにした。母体加齢は、生後約1年の加齢マウスを用いて検討を行った。まず、はじめに加齢マウスの卵の質の低下が起きているかどうか、in vivoおよびin vitroでの受精および胚発育について検討を行った。加齢マウスを成熟雄マウスと交配させ、腟栓を確認後day 1に卵管を採取し、前核期胚を採取、胚盤胞形成について検討した。