hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロカプセルを用いた単一細胞解像度bisulfite法の確立

本研究は、単一細胞レベルでのエピゲノム解析を行うための基礎的な要素技術の開発を行うものである。メチルシトシン解析のためのbisulfite-sequencingは、シトシンをウラシルに変換する反応において同時にDNAの切断が起こるため、微量サンプルからの解析は困難である。本研究では個々の細胞をマイクロカプセルに封入した状態でbisulfite反応を行い、さらにPCR増幅などを行う実験系を構築することによって、単一細胞レベルでのゲノムDNAのシトシン修飾解析の手法を開発することを目的としている。これまでもDNAをアガロースビーズに封入してbisulfite処理を行うことで1細胞からの解析効率を向上する手法が提案されているが、アガロースは高温には耐えられないためそのままPCRを行うことはできなかった。またオイル中に分散した液滴中でPCRを行うエマルジョンPCRという手法も用いられるが、水溶液の液滴は溶液交換が困難であるため、単一の反応を行うことしかできない。本研究ではbisulfite反応とPCRを同一のマイクロカプセル中で続けて行う実験系を確立することにより微量のbisulfite法における解析結果がそもそも何分子のDNAに由来していたかが不明であるというこれまでの問題点を克服し、新しいbisulfite法の標準的なプロトコールを構築することを目的としている。そこで本研究ではこれまで多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収、PCR増幅が可能であることを確認した。さらに、マイクロカプセル生成の手法を種々検討することによりマイクロカプセルの大きさや形状をコントロールすることがある程度可能となった。また、マイクロカプセルに磁気ビーズを添加してカプセルを作成し、容易に溶液置換を行う系を構築した。これらの成果から、微量DNAサンプルから容易かつ効率的にbisulfite反応を行いPCR増幅を行う系の確立に目処を立てることができた。メチルシトシン解析のためのbisulfite sequencingは、シトシンをウラシルに変換する反応において同時にDNAの切断が起こるため、微量サンプルからの解析は困難である。本研究では個々の細胞をマイクロカプセルに封入した状態でbisulfite反応を行い、さらにPCR増幅、次世代シークエンサー用のライブラリー調整などを行う実験系を構築することによって、単一細胞レベルでのゲノムDNAのシトシン修飾解析の手法を開発することを目的としている。またオイル中に分散した液滴中でPCRを行うエマルジョンPCRという手法も用いられるが、オイル中に作られた水溶液の液滴は溶液交換が困難であるため、単一の反応を行うことしかできない。本研究ではbisulfite反応とPCRを同一のマイクロカプセル中で続けて行う実験系を確立することによって、微量のbisulfite法において大きな課題であった解析結果がそもそも何分子に由来していたかが不明な点を克服することで、メチルシトシンの解析法の標準的なプロトコールとして広く使われることが期待される。初年度では多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収し、PCR増幅が可能であることを確認することができた。今後、この成果を元に、反応系の至適化を行うとともに、より複雑な反応を同一マイクロカプセル中で行うことで、ごく微量サンプルからのゲノムワイドのbisulfite-seqのためのライブラリ調製法の確立を目指す。「マイクロカプセルを用いたゲノム上の特定領域におけるbisulfite-sequence法の確立」多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収し、PCR増幅を行う実験系の検討を行った。DNAを含む液滴を作成するために、スプレーを用いる手法やキャピラリから溶液を滴下する方法などを試み、いずれの場合でも直径100マイクロメートル前後のマイクロカプセルを作成できることを確認した。さらに、このマイクロカプセルをbisulfite溶液に再懸濁して溶液交換が可能であり、bisulfite反応を行ってからDNAを回収可能であることも確認できた。「Bisulfite反応及びマイクロカプセル作成の条件検討」bisulfite反応中にDNAがどの程度切断されたかを直接確認するために、1本鎖DNAの5'末端にFITCを付加し、キャピラリシークエンサーでフラグメント解析を行うことでDNAの量及び長さを見積もる手法を確立した。これを用いて、実際にbisulfite反応によってどの程度DNAが切断されたかを直接見積もるとともに、定量PCRを用いて実用的にどの程度のDNAが増幅可能であるかを確認することとし、実際にbisulfite反応の条件の検討を行っている。温度、pH、反応時間、反応液にDNAを保護すると考えられる試薬を添加するなどの検討を開始している。マイクロカプセルの作成条件については、カプセルの直径を自在にコントロールすることが現時点では困難で、今後の検討が必要と考えている。メチルシトシン解析のためのbisulfitesequencingは、シトシンをウラシルに変換する反応において同時にDNAの切断が起こるため、微量サンプルからの解析は困難である。

これまでもDNAをアガロースビーズに封入してbisulfite処理を行うことで1細胞からの解析効率を向上する手法が提案されているが、アガロースは高温には耐えられないためそのままPCRを行うことはできなかった。またオイル中に分散した液滴中でPCRを行うエマルジョンPCRという手法も用いられるが、水溶液の液滴は溶液交換が困難であるため、単一の反応を行うことしかできない。本研究ではbisulfite反応とPCRを同一のマイクロカプセル中で続けて行う実験系を確立することにより微量のbisulfite法における解析結果がそもそも何分子のDNAに由来していたかが不明な点を克服すし、bisulfite法の標準的なプロトコールを構築することを目的としている。そこで本研究ではこれまで多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収、PCR増幅が可能であることを確認した。今年度は反応系の至適化を行ってbisulfite反応やPCRの効率の最適化を試みた。また、マイクロカプセルにマグネタイト粉末を添加してカプセルを作成し、容易に溶液置換を行う系の構築を試みた。マイクロカプセルを用いたゲノム上の特定領域におけるbisulfite-sequence法の確立について、初年度に引き続き多糖類を用いたマイクロカプセル中にDNAを封入し、bisulfite反応を行ってDNAを回収し、PCR増幅を行う実験系の検討を行った。DNAを含む液滴を作成するために、スプレーを用いる手法やキャピラリから溶液を滴下する方法などを検討した。しかし、マイクロカプセルの作成条件については、カプセルの直径をコントロールすることが困難で、条件によってはチューブ状の連続的な形状となってしまうものも生じてしまう。マイクロカプセル中の溶液の置換条件を検討するためには均一な直径のマイクロカプセルの作成が必要と考えているが、その制御が困難であるため、研究計画全体に遅延を生じている。本研究は、単一細胞レベルでのエピゲノム解析を行うための基礎的な要素技術の開発を行うものである。メチルシトシン解析のためのbisulfite-sequencingは、シトシンをウラシルに変換する反応において同時にDNAの切断が起こるため、微量サンプルからの解析は困難である。本研究では個々の細胞をマイクロカプセルに封入した状態でbisulfite反応を行い、さらにPCR増幅などを行う実験系を構築することによって、単一細胞レベルでのゲノムDNAのシトシン修飾解析の手法を開発することを目的としている。
台湾原住民文学および言語環境に関する基礎的研究

本研究は、この3年間、台湾国内の第一線の台湾原住民文学の研究者と互いに連携を取りながら、研究を推進することができた。それゆえ、最前線の台湾原住民文学の創作と研究状況を充分に理解しながら、予期した以上の研究成果をあげることができた。具体的にあげると、次のようなものがある。1、国際学会での研究報告(4回)。会場は、下記の通りである。国立東華大学(2005.9)、国立中山大学(2006.5)、国家中央図書館(2007.9)、天理大学(2008.4)2、論考の学会誌への発表3、静宜大学および国立台湾文学館での鼎談と講演4、『台湾原住民文学選』の翻訳出版(現在7巻既刊)5、『高一生(矢多一生)研究』全10号の出版6、高一生生誕百年国際シンポジウムの開催の準備(2008年4月18日・19日に開催した)なお、本研究は、台湾原住民文学研究に関する基礎的研究であり、引き続き本研究を発展させる必要がある。幸い平成20年度から22年度まで「台湾原住民族における言語環境の変移および言語転換(日本語から漢語へ)の実相」」(基盤研究(C))を受けることができた。さらなる研究の深化と拡大を期したい。初年度は、二つの学会参加と、フィールドワーク、関連研究誌の発行と研究会の開催、資料蒐集・図書購入、台湾原住民文学の作家や研究者との意見交換などを精力的に行った。以下、項目別に概要を記す。【学会】6月5日に開催された日本台湾学会第7回大会で、「『他者』としての原住民族表象-日本人作家と台湾人作家は原住民族をいかに描いてきたか」において、研究協力者の孫大川氏と魚住悦子氏が座長をつとめ、本研究の周縁をなす、日本人や台湾人作家らいわゆる「他者」による原住民族表象について検討した。さらに、9月2日から4日まで花蓮市で開催された「山海の文学世界-台湾原住民族文学国際研討会」に参加した。これは、台湾原住民文学に関する世界初の国際学会であった。孫大川氏は、この国際学会の主催者であったが、本研究の研究協力者は、他に魚住悦子氏が「シャマン・ラポガンの文学における海と山」を発表、浦忠成氏と〓相揚氏はコメンテーターをつとめた。本研究代表者の下村は、「日本における台湾原住民文学研究-翻訳・出版と書評を中心に-」と題して報告した。【研究会】ツォウ族のエリートであった高一生に関する研究誌『高一生(矢多一生)研究』を7月5日に創刊し、第3号まで出した。【講演】12月27日、台中市にある静宜大学で孫大川氏と共に「山海的文学相逢-台湾原住民文学的日訳與研究」と題して話した。【フィールドワーク】魚住悦子氏と共に『サヨンの鐘』の舞台である南澳(8月31日-9月1日)、霧社・春陽社(9月5日-7日)を調査した。この間、孫大川氏、浦忠成氏、〓相揚氏、魚住悦子氏とは頻繁に情報の交換を行い、さらに花蓮市での国際学会では、陳英雄、胡徳夫、リポック、ワリス・ノカン、シャマン・ラポガン、リムイ・アキ、マサオ・アキ、パイツ・ムクナナ、ブクン、パタイ、ネコッ・ソクルマン、イパオ、アダオ、黒帯・巴代ほかに会っている。【資料蒐集・図書購入】図書は主に台北市・南天書局で購入した。2年目も、初年度同様に学会報告、フィールドワーク、関連研究誌の発行と研究会の開催、資料蒐集・図書購入、台湾原住民文学の作家や研究者との意見交換を行い、翻訳書を刊行した。【学会】

5月20日・21日、高雄・国立中山大学で開催された「台湾文化論述-1990以後之発展」研討会に出席し、「1990年以後在日本台湾文学論述之幾点特色」を報告した。研究成果は、『中国文化研究』23号に発表した。【フィールルドワーク】9月2日から9月12日まで、台北、蘭嶼、台東、鶯歌をまわった。その間、研究協力者の孫大川氏や浦忠成氏らに会って文献資料の提供を受けたり、台湾原住民作家を訪ねたりした。蘭嶼では、シャマン・ラポガン氏に会ってインタビューを行う。さらに作品の舞台や核廃棄物処理施設を見学した。台東では、浦氏が館長をつとめる国立台湾史前文化博物館を参観した。台北では、山海文化雑誌社を訪ね、「台湾原住民族文化大事記」の作成を依頼した。【翻訳書の刊行】11月、孫大川氏、魚住悦子氏らと協同で『台湾原住民文学選8原住民文化・文学評論集I』(草風館)を出版。現在、第9巻「評論集恥を編集中。6月出版予定。【公開講座への参加】07年3月17日、九州大学アジア総合政策センター主催の「第3回SIA台湾編」では、シャマン・ラポガンの海洋文学が取り上げられたが、魚住氏が協力して作品「天使の父親」を翻訳した。『新潮』07年4月号に掲載。【研究会】『高一生(矢多一生)研究』4号、5号を出版。2008年は、高一生(ツォウ族エリート。53年白色テロの中で処刑される)の生誕100周年であり、本研究の一環として研究を進めている。【資料蒐集・図書購入】『飛鼠・山猪・サキヌ』などの原住民文学関係書や『講座世界の先住民族第1巻東アジア』などの先住民族関係書を多数購入した。助成の3年間、台湾国内の第一線の台湾原住民文学の研究者と連携を取りながら、・研究を推進することができた。それゆえ、最前線の台湾原住晟文学の創作と研究状況を充分に理解しながら、予期した以上の研究成果をあげることができた¢今年度は》最終年度であったが、多くの成果を収めることができた。以下、具体的に報告したい。1、2007年9月初旬に、嘉義と霧社でフィールドワークを行った。嘉義では、呉鳳廟、與鳳生誕地などを訪ね多くの収穫を得た。2、呉鳳および「サヨンの鐘」に関する復刻論集を出版する。東京の緑蔭書房より出版。3、学会での口頭報告および特別研究発表。4、『高二生(矢多一生)研究』の7号9.10合併号の出版。5、高一生生誕百年国際シンポジウムの開催の準備(2008年4月18日・19日に開催した)6、報告書全323頁の出版。7、『台湾原住民文学選第6巻』(既刊7巻)の出版予定(6月)
笑気吸入鎮静法とデクスメデトミジン添加リドカインを併用した行動調整法

本研究ではアドレナリンに代わって、デクスメデトミジンを加えた局所麻酔薬を使用し、副作用・デメリットとして考えられている鎮静作用を行動管理法の一つとして使用するため、安全性を確保することが本研究遂行の絶対条件であり、被験者の呼吸や循環といったバイタルサインをどのようにモニタリングするかが非常に重要である。障害者・非協力小児の抑制下歯科治療中のモニタリングは単回の測定は可能であっても定時的に継続して計測することが非常に困難であった。障害者や非協力小児においては、鎮静に至るまでの導入時の安全確保が行動管理上の課題であり、健常成人と同様の研究方法では安全の担保が不可能であった。歯科治療を行うに当たり、障がい者や非協力な小児では抵抗感が大きな体動となることが多く、何とか局所麻酔までは行えても、ミリ単位の精密作業が必要であるいわゆる歯科治療は困難であることが多い。現在このような患者は、レストレイナーと呼ばれる抑制器具を使用し抑制下で行うか、静脈内鎮静法(IVS)や全身麻酔(GA)下で歯科治療を行っている。そこで本研究では、血管収縮薬としてリドカインに添加したα2作動薬「デクスメデトミジン」の副効果である鎮静作用を利用し、非協力患者の歯科治療時の行動調整を行うことが可能であるかを検討することが目的である。本研究は薬剤を用いた行動調整を検討するため、被験者の呼吸・循環状態の確認が重要である。特に鎮静効果の評価の際には呼吸状態のモニタリングが非常に重要とされ、パルスオキシメーターは無侵襲で簡便に装着できるため非常に有用である。しかし小児や障がい者に関し、歯科治療時には抑制器具を使用することが多く、パルスオキシメーターのプローブ設置位置に難渋する上に体動の大きさから測定不能になることが多い。したがって独自の解析アルゴリズムやセンサーの改良により、低年齢児の使用が可能な機種を入手後、研究環境を整えるための予備研究を行った。まずは最も計測が困難であると考えられる低年齢児における抑制器具を使用した歯科治療時の計測を行った。抑制器具とセンサーの位置関係に留意し、両手・両足にセンサーを設置して比較検討し、より継続的に信頼に値する計測が行える方法を模索した。続いて成人の障がい者に関しては、別構造の抑制具を使用することから、同様の比較検討により最適なセンサー位置や固定法を工夫し、抑制下歯科治療時の継時的なモニタリングが全例ではないが、比較的高確率で実施可能であることが確認できた。障がい者や非協力小児に対する歯科治療において、行動管理は治療の成否をも左右する重要なファクターである。しかし、我々歯科医がそれらをコントロールする手段は多くはなく、レストレーナーと呼ばれる抑制器具を使用したり、併せて人力での固定を試みることが多く、精密作業が求められる歯科治療は困難を極めるのが現状である。その歯科治療の際には疼痛管理の目的で、歯科用の局所麻酔薬を使用することがほとんどであり、治療対象が障がい者や非協力小児の場合も例外ではない。歯科用の局所麻酔薬といえば、血管収縮薬であるアドレナリンが添加された薬剤が頻用されているが、近年、そのアドレナリンに代わって「デクスメデトミジン」を添加した薬剤に関する研究が散見されるようになった。デクスメデトミジンは、アドレナリンと比べて心機能への負担が少ない血管収縮薬としても働くが、鎮静薬として市販されている薬剤であることから、当然のことながら鎮静作用を有する。健常人に対する歯科用局所麻酔薬として考えると、その鎮静作用は副作用・デメリットとして考えられることが多いが、障がい者や非協力小児に対しては、行動管理法の一つとして使用できる可能性がある。その可能性を探るのが本研究の目的であるが、安全に本研究を遂行するには、被験者の呼吸・循環状態を監視できる体制が非常に重要であり、初年度はその体制づくりよりスタートした。今年度は、その体制・システムで、様々なタイプの被験者においても継続的に監視でき、その結果が数値化して評価可能なシステムであるかを検証した。それと同時に、被験者に薬剤使用することから安全性について検討していたが、社会背景も鑑み、医療倫理の問題からも更なる検討を加えることとなり、現在、再検討しているところである。その歯科治療の際には疼痛管理の目的で歯科用の局所麻酔薬を使用することが多く、血管収縮薬であるアドレナリンが添加された薬剤が頻用されているが、近年、そのアドレナリンに代わって「デクスメデトミジン」を添加した薬剤に関する研究が散見されるようになった。デクスメデトミジンは、アドレナリンと比べて心機能への負担が少ない血管収縮薬としても働くが、本来は鎮静薬として市販されている薬剤である。健常人に対する歯科用局所麻酔薬として考えると、その鎮静作用は副作用・デメリットとして考えられることが多いが、障がい者や非協力小児に対しては、行動管理法の一つとして使用できる可能性があり、その可能性を探るのが本研究の目的である。本年度は安全性の検討を主に進めたが、歯科麻酔関連学会において同様の報告が散見されており、以前に比べ安全性の問題をクリアする根拠が増えてきている。

また、本研究と目的は異なるが、局所麻酔を行う際に同様の薬剤を用いる方法が岡山大学より特許申請されており、知的財産の観点からの検討を専門部署へと確認を行った。本研究では他研究と圧倒的に異なる問題として対象が障がい者や非協力児であることが挙げられるが、対象者の呼吸・循環などの解析対象データのばらつきも健常成人に比してはるかに大きいことがわかり、当初の計画では解析が難しい点も上がってきた。そのため研究方法をアレンジする必要が生じ、現在、対策を講じている段階である。本研究で使用する薬剤は医科領域ではすでに頻用されており、人体へ与える影響は確認されており安全性は担保されていると考えていたが、本研究での使用方法は適応外使用にあたるため、実施に際し安全性の再検討を行うよう倫理委員会より指摘があり、その問題への対策に時間を要している。障がい者や非協力小児に対する歯科治療において、行動管理は治療の成否をも左右する重要な要素である。しかし、我々歯科医がそれらをコントロールする手段は多くはなく、抑制器具を使用かつ人力で体動を抑え込むよう試みることが多く、精密作業が求められる歯科治療は困難を極めるのが現状である。そこで本研究ではアドレナリンに代わって、デクスメデトミジンを加えた局所麻酔薬を使用し、副作用・デメリットとして考えられている鎮静作用を、行動管理法の一つとして使用する可能性を探るのが目的である。本研究では、静注用の鎮静剤として認可されている薬剤を歯科用局所麻酔薬に混注し使用するため、適応外使用の範疇となることからより慎重な運用が必要であった。そのため確固たる安全性を確保することが本研究遂行の絶対条件であり、被験者の呼吸や循環といったバイタルサインをいかにモニタリングするかが非常に重要であった。健常な成人であればモニタリングは容易であるが、歯科治療に対する恐怖・嫌悪を露わにする障がい者・非協力小児の治療中のモニタリングは想像以上に困難であった。血圧測定においては、単回の測定は可能であるが計測の導入に至るまでに、定時的に継続して計測することに困難を極めた。障がい者では体動が大きく測定器具がずれてしまい計測不能になることが多く、非協力小児においては測定器具自体の感度の問題で計測不能なことが多かった。これらの不具合がみられた際、測定器具の再装着のためには抑制具の解除が必要となるため、治療の中止につながる可能性を鑑みると計測を中断せざるをえなかった。経皮的静脈血酸素飽和度に関しては、低環流や体動に強い計測器を用いても、血圧と同様に継続的な計測が困難であった。障がい者や非協力小児においては、鎮静に至るまでの導入の期間にいかに安全を担保できるかが行動管理上の課題であると考えられた。本研究ではアドレナリンに代わって、デクスメデトミジンを加えた局所麻酔薬を使用し、副作用・デメリットとして考えられている鎮静作用を行動管理法の一つとして使用するため、安全性を確保することが本研究遂行の絶対条件であり、被験者の呼吸や循環といったバイタルサインをどのようにモニタリングするかが非常に重要である。障害者・非協力小児の抑制下歯科治療中のモニタリングは単回の測定は可能であっても定時的に継続して計測することが非常に困難であった。障害者や非協力小児においては、鎮静に至るまでの導入時の安全確保が行動管理上の課題であり、健常成人と同様の研究方法では安全の担保が不可能であった。
中枢モノアミン受容体・膜内共役物質と抗うつ薬の生化学的作用機序の研究

抗うつ薬投与後のラット脳β受容体の減少機構とセロトニン(5-HT)およびプロテインキナーゼの役割について情報伝達系の生化学的関連を検討しリン酸化反応の関与とその意義を考察した。ラット皮下に埋め込んだ浸透圧ポンプにより抗うつ薬を7-14日間持続的に投与した。浸透圧ポンプの効果は、ヒトより半減期が著しく短い抗うつ薬は1日1回投与や最終投与24時間後に屠殺する方法では慢性投与の効果を得られないことを示した。各種抗うつ薬慢性投与後の大脳皮質膜画分と細胞質画分ではプロテインキナーゼC(Cキナーゼ)活性に有意な変化を認めなかった。Cキナーゼの調節ユニットに結合する[^3H]phorbol-12、13、dibutyrate(PDBu)の結合特性を各種抗うつ薬長期投与のラット脳各部位の膜標品について調べたところ、colmipramine(CMI)、imipramine,mianserin14日間投与後の扁桃体膜標品で[^3H]PDBu結合部位の有意な増加を認めた。またCMI14日間投与後の扁桃体の細胞質画分のCキナーゼ活性は有意に増加した。扁桃体の[^3H]PDBu結合部位の増加はp-chlorophenylalanine処置および5-HT_2受容体、5-HT_1c受容体阻害薬で見られることから、シナブス間隙の5-HTの減少とイノシトールリン脂質代謝(IP)に共役した受容体阻害が関与する。したがって抗うつ薬長期投与後の[^3H]PDBu結合部位の増加は1P代謝回転の低下に対するCキナーゼの"up-regulation"を反映するものと考えられる。抗うつ薬で増加したCキナーゼがリン酸化する基質蛋白質の候補として、前シナプスではB-50(F1)蛋白、87K蛋白、tyrosine hydroxylaseなど遺伝物質の遊離や合成に関わる蛋白質が、また後シナプスではβ受容体、α1受容体、mACh受容体や抑制性GTP結合調節蛋白(Gi)など受容体・情報伝達系の調節に関わる蛋白質のリン酸化が考えられる。基質蛋白質の同定が今後の課題となる。また扁桃体に特異的な因子としてニューロペプタイドとの関連も検討している。抗うつ薬投与後のラット大脳皮質β受容体減少機構とセロトニン(5-HT)の役割について膜内共役物質を介した生化学的機序を検討した。1.ミアンセリン(MIA)やマプロテリン(MPR)は従来β受容体を減少しないと報告されていたが、1日2回3日投与の6時間後25%減少することを認め、24時間で急速に回復する。フルオキセチン(FLX)や5ヒドロキシトリプトファン(5HTP)をMIAやMRPと伴用するとβ受容体の減少は促進され24時間以上減少が維持される。すなわちシナプス内5-HTの増加はβ受容体減少を促進維持させる。2.プロティンキナーゼC活性化薬12-0-テトラデカノイルホルボール13-アセテート(TPA)は抗うつ薬によるβ受容体の減少を促進し、それ自体もβ受容体を減少した。一方Cキナーゼ阻害薬(H-7)は抗うつ薬によるβ受容体減少に若干抑制する傾向を示した。

このことから、増加した5HTによるβ受容体減少の促進はCキナーゼの活性化による可能性が示唆された。従来抗うつ薬によるβ受容体の減少はノルエピネフリンの増加のみによると考えられていたが、5-HTイノシトールリン脂質-Cキナーゼを介した異種性脱感作によってβ受容体-アデニル酸シクラーゼ系が調節されていることが示唆された。3.デシプラミン(DMI)とMIAの14日間投与24時間後の大脳皮質膜のGTP結合調節蛋白(NsとNi)のαサブユニットをコレラ毒素と百日咳毒素を[【^(32)P】]NADにより、ADPリボシル化して標識し、オートラジオグラフィーを施行して比較した所、両抗うつ薬投与後Nsd,Nidともに量的変化を認めなかった。4.MIA投与後β受容体が減少した状態に蛋白合成阻害薬サイクロヘキシシドを脳室内に注入した結果、MIA最終投与75時間後もβ受容体は減少し続けた。この結果より、抗うつ剤によるβ受容体減少は細胞内移行による実質的受容体の消化によることが示唆され、その回復は受容体蛋白の合成によるものであることが示唆された。抗うつ薬投与後のラット大脳皮質β受容体の減少機構とセロトニン(5ーHT)の役割について情報伝達系の生化学的関連をin vivoならびにin vitroのスライス実験により検討し,プロテインキナーゼとβ受容体のリン酸化反応の関与とその意義を考察した,デシプラミン(DMI)とミアンセリン(MIA)をラット皮下に埋め込んだ浸透圧ポンプにより7日間持続的に投与した場合,DMIとMIAのいずれも約50%の著明なβ受容体の減少が認められた.この浸透圧ポンプの効果は,ヒトより半減期が著しく短い抗うち薬は1日1回投与や最終投与24時間後に屠殺する方法では慢性投与の効果を得られないことを示し浸透圧ポンプの使用などが必要となる.大脳皮質スライスにおいて5ーHTは1ーイソプロテレノール(ISO)によるβ受容体の減少には影響を与えず,再インキュベーションによるβ受容体の回復を抑制する傾向を示した.ホルボールエステル(TPA)の脳室内注入によるプロテインキナーゼC(PKーC)の活性化はβ受容体を減少し, DMIのβ受容体減少率を促進したが,DMIによる最大のβ受容体の減少に対しては相加的ではなかった.これより,イノシトールリン脂質代謝を介して活性化されたPKーCがβ受容体の減少を調節している可能性が示唆された.また,β受容体のリン酸化を間接的に知るために,大脳皮質β受容体を[^<125>I]iodohydroxypindrol(ICYP)ーdiazirineを用いてフォトアフィニティー標識を行った.その結果,分子量51Kと62Kのポリペプチドが標識された.DMIを7日間持続投与した膜標品ではこの2つのポリペプチドの電気泳動上の移動が遅れ,見かけの分子量は若干大きくなった.これはβ受容体がリン酸化されpiが取り込まれたためであることを示唆する所見と考えられる.大脳皮質のプロテインキナーゼA(PKーA)活性はDMI 14日間投与後有意に減少した.一方,PKーC活性は増加傾向を示した.プロテインキナーゼCの調節ユニットに結合する[^3H]phorbol-12、13、dibutyrate(PDBu)の結合特性を、各種抗うつ薬長期投与のラット脳各部位の膜標品について調べた。Clomipramine、imipramine、mianserinの14日間長期投与後の扁桃体膜標品で、[^3H]
最適化性能がスケールフリーであるルーティング最適化アルゴリズムの構築

新しい最適化手法の基本的なアルゴリズムを提案し,その基礎実験を行った.研究成果は, 4件の研究発表としてまとめられた.特に,相互接続型のニューラルネットワークに適用するための創発的学習アルゴリズムを提案した.このアルゴリズムでは,ノードの評価値・リンクの評価値・ネットワーク構造全体の評価値という3種類の評価値および評価方法を用いている.この結果,ネットワーク構造自体を学習により獲得するという結果を得た.これは,従来の単純なニューラルネットワークの学習手法では不可能な新しい成果である.新しい最適化手法の基本的なアルゴリズムを提案し,その基礎実験を行った.研究成果は, 4件の研究発表としてまとめられた.特に,相互接続型のニューラルネットワークに適用するための創発的学習アルゴリズムを提案した.このアルゴリズムでは,ノードの評価値・リンクの評価値・ネットワーク構造全体の評価値という3種類の評価値および評価方法を用いている.この結果,ネットワーク構造自体を学習により獲得するという結果を得た.これは,従来の単純なニューラルネットワークの学習手法では不可能な新しい成果である.本研究では,自律分散的な進化的手法を用いて,IPネットワークのルーティングを最適化するアルゴリズムの構築を目標としている.特に以下の3つの特徴を持つ最適化アルゴリズムを目指している.【特徴A】最適化性能がスケールフリーである(ネットワークの規模に依存しない最適化).【特徴B】部分最適ではなく全体最適を実現する(ネットワーク全体にとっての最適化).【特徴C】負荷分散のみならず機能分散を実現する(サービスの優先順位に応じた最適化).平成21年度は,これらの有効性をシミュレータ上で明らかにするために,まず特徴Aと特徴Bに関連して,それぞれ以下の課題Aと課題Bに取り組んだ.【課題A】提案手法における最適化性能のスケールフリー性を確認するため,10万台のルータ/端末と数億のパケットを同時に計算できるシミュレータ用のコンピュータを購入した.これにより,ネットワークの規模に影響されない最適化性能を検証できる環境を構築した.【課題B】全体最適な経路と部分最適な経路が異なる状態(ジレンマ状態)であるIPネットワークを,マルチエージェントシミュレーションにより再現し,その最適化手法について検証した,IPネットワークのような個体間の関係をトポロジカルに表現する環境において,ジレンマ状態であっても,全体最適を得るアルゴリズムを明らかにした.具体的には,狭い相互作用範囲と広い選択範囲を用いる進化的最適化手法により,全体最適な解を得る可能性を示した.本研究では,自律分散的な進化的手法を用いて,ネットワークを最適化するアルゴリズムの構築を目的としている.特に以下の3つの特徴を持つ最適化アルゴリズムを目指している.【特徴A】最適化性能がスケールフリーである(ネットワークの規模に依存しない最適化).【特徴B】部分最適ではなく全体最適を実現する(ネットワーク全体にとっての最適化).【特徴C】負荷分散のみならず機能分散を実現する(通信の優先順位に応じた最適化).本年度は,【特徴B】部分最適ではなく全体最適(ネットワーク全体にとっての最適化)を実現できることを確認するためのシミュレータを計算機上に構築した(実施計画(1)に該当).また,そのシミュレータ上で,ネットワークのノード/リンク/ネットワーク全体のそれぞれに評価値を与えて,進化的手法により創発的に最適化するアルゴリズムを提案し,シミュレータに実装した.その結果,提案した創発的最適化手法により,【特徴B】が実現できることを確認した(実施計画(2)に該当).一方,【特徴A】最適化性能のスケールフリー性,および【特徴C】負荷分散に加えて機能分散の実現,については,シミュレータ上での実装まで至っていない.これらは,平成23年度に実装予定である.また,創発的最適化手法の新たな応用に向けて,ニューラルネットワークなどの情報処理ネットワークの最適化にも取り組んでいる(実施計画(3)に該当).従来手法に対する優位性を示すまでには至っていないが,提案手法による【特徴A/B/C】の実現が示される場合には,従来手法に対する優位性があると予想されるため,平成23年度も引き続き取り組んでいく予定である.本研究では,自律分散的な進化的手法を用いて,IPネットワークのルーティングを最適化するアルゴリズムをの構築を目的としている.特に以下の3つの特徴を持つ最適化アルゴリズムを実現し,シミュレータ上でその有効性を解明することを目指している.【特徴A】最適化性能がスケールフリーである(ネットワークの規模に依存しない最適化).【特徴B】部分最適ではなく全体最適を実現する(ネットワーク全体にとっての最適化).【特徴C】負荷分散のみならず機能分散を実現する(通信の優先順位に応じた最適化).2010年度までに,【特徴B】部分最適ではなく全体最適(ネットワーク全体にとっての最適化)を実現できることを確認するためのシミュレータを計算機上に構築した.また,そのシミュレータ上で,ネットワークのノード/リンク/ネットワーク全体のそれぞれに評価値を与えて,進化的手法により創発的に最適化するアルゴリズムを提案し,シミュレータに実装した.その結果,提案した創発的最適化手法により,【特徴B】が実現できることを確認した.2011年度は,【特徴A】最適化性能のスケールフリー性,および【特徴C】負荷分散に加えて機能分散を実現する最適化手法の研究に取り組んできた.新しい最適化手法の基本的なアルゴリズムは,2011年6月の人工知能学会全国大会にて発表した.

その最適化手法の基礎実験の結果は,2011年9月の電気関係学会九州支部連合大会にて発表した.しかし,IPネットワークへ適用するシミュレーションへの実装までは至らなかった.今後,提案手法による【特徴A/B/C】の実現により,従来手法に対する優位性があることを示す予定である.
ミトコンドリア分解を起点とした恒常性維持システムの解析と心不全治療への応用

ミトコンドリア特異的オートファジーによるミトコンドリア分解(マイトファジー)を起点としたミトコンドリア恒常性維持システムを解析し、心不全治療への応用を目指した基礎的検討を行った。新規ミトコンドリア分裂、マイトファジー誘導分子BCL2L13を発見し、その機構解析を行った。またマイトファジーやオートファジーの過程に関わる因子FKBP8、TSC2、TLR9の遺伝子改変動物についても病態モデルを用いた解析を行い、その機能を明らかにした。心不全症例では心筋細胞内のミトコンドリア形態異常を伴うことが多い。しかしながらその制御機構には不明な点が多い。心筋細胞内におけるミトコンドリアの融合・分裂やオートファジー性分解(マイトファジー)を含めたミトコンドリア恒常性維持システムの多面的解析を通じた心不全病態の理解と新規治療標的の探索を行うものである。本年度はミトコンドリア分解機構に関わる新規分子機構の探索ならびにその機能解析を行った。ミトコンドリア特異的オートファジーであるマイトファジー必須分子として、酵母においてはAtg32が同定報告されているものの、哺乳類細胞におけるAtg32の機能的ホモログは同定されていなかった。私たちは細胞死関連因子として知られるBCL2関連蛋白質の一つであるBCL2L13がミトコンドリア外膜上に発現しており、ミトコンドリアの分裂を誘導すると共に、マイトファジーレセプターとして機能することを明らかにした。BCL2L13過剰発現によりミトコンドリアは分裂するが、siRNAを用いたノックダウンによりミトコンドリア伸長が認められた。この分裂誘導にはBCL2L13に存在するBHドメインが関与しており、BHドメイン欠失変異体ではミトコンドリア形態変化は誘導されなかった。さらにBCL2L13はLIRモチーフを介してオートファジー関連蛋白質であるLC3と結合することを明らかにした。LIRモチーフの変異体BCL2L13はミトコンドリア分裂を誘導可能であったが、マイトファジーは誘導されなかった。またBCL2L13はAtg32欠損酵母においてマイトファジーを回復することから、Atg32の機能的ホモログであることが示唆された。本年度においては目的としていたマイトファジー分子機構の解明に成功した。すなわち、ミトコンドリア分解機構であるマイトファジーに関する分子機構としてAtg32と同様の構造を持つ蛋白質の解析を行い、新たにBCL2L13の同定ならびに機能解析を行った。また心筋におけるミトコンドリア膜電位喪失とマイトファジーの関連を解明するための、遺伝子改変マウス作出も完了しており、これらの機能解析を進めていく。またマイトファジー検出系としてのmKeima恒常的発現細胞の樹立ならびに機能解析も完了している。さらに心筋特異的にミトコンドリア分裂を抑制する遺伝子改変マウスの作出も行っており、まもなくその生理学的解析を開始可能な状態である。以上よりおおむね順調に進展していると判断される。心不全症例では心筋細胞内のミトコンドリア形態異常を伴うことが多いが、その制御機構については不明な点が多い。本研究では、新たに見いだしたミトコンドリアfissionおよびmitophagy誘導因子であるBcl関連蛋白質の解析を端緒として、マイトファジーを起点としたミトコンドリア恒常性維持システムの多面的解析を通して、心不全治療への応用を目指した基礎的検討を行う。心疾患におけるミトコンドリア形態異常の分子機構を解明することで、新たな心不全治療分子標的の探索を目指している。本年度は酵母Atg32のほ乳類における機能的ホモログとして同定したBCL2L13の心筋細胞における評価を行った。新生仔ラット単離心筋細胞においても継代培養細胞と同様にBcl2-L-13の過剰発現によりミトコンドリアのfragmentationが誘導され、Bcl2-L-13のノックダウンによりミトコンドリアの伸長が観察された。この結果よりBcl2-L-13は心筋細胞においてもミトコンドリアダイナミクスに重要な役割を果たすことが示唆された。引き続き、Bcl2-L-13の過剰発現及びknockdown下において、酸化ストレスやGPCRアゴニストなど種々のストレスに対する心筋細胞の応答性変化について検討を行う。さらに心臓組織におけるBCL2L13の生理学的および病態的意義を評価するために、Cre-loxPシステムを用いた心筋特異的遺伝子改変動物の作出を行った。targetingvectorを作製し、相同組み換え体のES細胞をスクリーニングし、ES細胞クローンのインジェクションにより、floxed alleleを持つマウスを得た。本マウスを心筋特異的Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、目的の遺伝子改変マウスを得た。酵母Atg32のほ乳類における機能的ホモログとして同定したBCL2L13は、ミトコンドリア分裂を誘導するとともにマイトファジーレセプターとして機能する。この分子機構がマウス心筋細胞においてどのような生理的機能および病態モデルにおける機能を評価するため、心筋細胞特異的遺伝子改変マウスの作出ならびに解析を開始しており、現在評価が順調に進行している。さらに心筋特異的fission抑制遺伝子改変マウスについても、薬剤誘導性を含めた2系統を作成済みであり、順次解析を開始する体制が整っている。

本研究では、心筋細胞内におけるミトコンドリアの融合・分裂やオートファジー性分解(マイトファジー)を含めたミトコンドリア恒常性維持システムの多面的解析を行った。まず、ミトコンドリア特異的オートファジーであるマイトファジー必須分子として酵母で同定報告されているAtg32の、哺乳類細胞における機能的ホモログを探索した。細胞死関連因子として知られるBCL2関連蛋白質の一つであるBCL2L13がミトコンドリア外膜上に発現しており、ミトコンドリアの分裂を誘導すると共に、マイトファジーレセプターとして機能することを明らかにした。BCL2L13過剰発現によりミトコンドリアは分裂するが、siRNAを用いたノックダウンによりミトコンドリア伸長が認められた。ミトコンドリア分裂にはBHドメインが必須であった。さらにBCL2L13はLIRモチーフを介してオートファジー関連蛋白質であるLC3と結合しマイトファジーを誘導した。またBCL2L13はAtg32欠損酵母においてマイトファジーを回復することから、Atg32の機能的ホモログであることが示された。引き続き、Bcl2-L-13の過剰発現及びknockdown下において、ストレス応答性変化について検討を実施した。さらに心臓組織におけるBCL2L13の生理学的および病態的意義を評価するために、Cre-loxPシステムを用いた心筋特異的遺伝子改変動物の作出を行った。また、マイトファジーのほ乳類機能的ホモログ候補としてBCL2L13と共に同定したFKBP8についても、Cre-loxPシステムによる心筋細胞特異的欠損マウスを作製・解析し、ストレス応答において心臓保護的に機能していることを明らかにした。ミトコンドリア特異的オートファジーによるミトコンドリア分解(マイトファジー)を起点としたミトコンドリア恒常性維持システムを解析し、心不全治療への応用を目指した基礎的検討を行った。新規ミトコンドリア分裂、マイトファジー誘導分子BCL2L13を発見し、その機構解析を行った。またマイトファジーやオートファジーの過程に関わる因子FKBP8、TSC2、TLR9の遺伝子改変動物についても病態モデルを用いた解析を行い、その機能を明らかにした。現在までの進捗状況の通り、ミトコンドリア分裂融合ならびにマイトファジーに関わる新規分子の同定に成功しており、今後はこの分子が心筋細胞ならびに心臓、心不全を含めた病態においてどのような機能を発揮しているかについて、新たな遺伝子改変マウス作出および生理学的機能解析を進める。さらに心筋におけるミトコンドリア膜電位喪失とマイトファジーの関連についての研究を推進するとともに、心筋細胞特異的ミトコンドリア分裂抑制マウスを用いて、ミトコンドリアダイナミクスが心臓病態において有する機能を解析する。現時点までで、ミトコンドリア分裂融合ならびにマイトファジーに資する重要な分子の同定に成功しており、今後は上記分子およびミトコンドリアダイナミクスに関与する分子の遺伝子改変動物を用いて、これらの現象が心臓において果たしている生理的および病態的意義についての解析を順次進めていく。その過程において、心不全治療についての鍵分子となる創薬分子標的を確定する方針である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
生体内プロスタグランジンの新しい代謝物による測定法の開発実用化

TXA_2産生の指標として今までTXB_2が用いられてきたが、これは採血中に人工的に産生されるので、血中TXA_2の指標となり得ないことが明らかになった。それに代るものとして11ーdehydro(DH)ーTXB_2が選ばれたが、班員の小野薬品のグル-プによってまずこの酵素免疫測定法が確立された。その後RIAキットが他社から市販されるに到ったので研究はしやすくなったが、測定のためには抽出精製は欠くことの出来ないステップであった。そこで班員の三共の分析代謝研究グル-プの協力で固定化抗体カラムによる抽出精製法の検討が始められた。徳島大・山本班員のグル-プの作成した11ーDHーTXB_2に対する単クロ-ン抗体を用いて固定化カラムを作り、本研究班のワ-クショップにより標準抽出法が確立された。この方法を用いて班員が配布試料の測定を行い、且つ各種病態モデルや臨床の患者についても応用し、固定化抗体カラムが尿ばかりでなく、血漿中の11-DH-TXB_2の測定も可能であることが確かめられた。しかしながら11-DH-TXB_2をTXB_2の指標とするにあたって、なお多くの問題がある。例えば動物種差は極めて大きな問題であり、イヌのようにほとんど産生されない動物もある。幸いヒトでは産生TXB_2からの変換量も多く、半減期も約60分と長いので臨床的には指標となり得る筈である。さらに測定にあたって11-DH-TXB_2の光学異性体のオ-プン型を用いること、RIAの妨害物質をどの様に除去するか、各社からの市販のラベル化標準品の信頼性(各ロツト毎のバラツキ)など多くの問題があることがわかった。以上の様に三年間の研究を通じて、11-DH-TXB_2の固定化抗体カラムを用いる抽出精製による測定法が一応確立され、その問題点も多く明らかになった。昭和63年12月910日に1泊2日の班会議を開き活発な討論が行われた。1.11ーデヒドローTXB_2抗体固相化カラムについて:山本班員のもとで作られた単クローン抗体をカラムにつめ固相化して11ーデヒドローTXB_2を分離精製する方法は進藤(中川)班員の努力で成功し使用可能なまでになった。しかしこの完成がやや遅かったため班員は充分検討する時間がないのは残念であった。これは来年度行う予定である。しかし現在まで次のことが明らかになった。(1)尿の11ーデヒドローTXB_2の測定は可能である。(2)血漿中の11ーデヒドローTXB_2測定のためにはクリーンアップが必要である。後者のために林、中川、森田の各協力者がワークショップを作って早く測定法を統一することになった。また、カラムの再生法を検討する。2.11ーデヒドローTXB_2のラクトン型と開環型:一般的には酸性でラクトン型、塩基性で開環型となるが、その移行は必ずしも容易でなく時間もかかる。カラムは開環型のみ吸着されるので、その方法がなお問題であることがわかった。3.11ーデヒドローTXB_2生成の動物種差:ウサギは生体内でTXB_2より11ーデヒドローTXB_2への変換は行われるが、イヌ、サルではほとんど行われず極めて動物種差が強いことがわかった。

このことはイヌ、サルでの実験での測定は無意味であることを示している。4.病態:妊娠中毒症では母体では重症時TXB_2産生が多く、胎児では軽症の方が重症より産生量が多い。ヒト尿中ではGC/MSに比しRIAでは1ng/ml位高い値を示す。虚血心、辨膜疾患で11ーデヒドローTXB_2は高い値を示す。5.その他の測定法:GC/MS、アダム法カラムによる測定法も紹介された。6.11ーデヒドローTXB_2に代る指標として2,3ージノールTXB_2が検討された。7.炎症におけるLTの役割も報告、討論された。昨年度につづき固定化抗体カラムを用いた11ーdhydro(DH)ーTXB_2の測定法について検討した。昨年末、林、森田、中川よりなるワ-クショップが測定法を確立し、配布した資料について各班員が測定した結果を班会議で討論した。(a)尿は固定化カラムで測定可能であるが、血液はHPLCなどの前処理が必要で、その値はGCMSの測定結果と一致した。こうして測定したヒト血漿の正常値は、30pmol/ml plasmaであった(林)。(b)11ーDHーTXB_2は測定前に必ずオ-プン体化すること及び妨害物質の除去が必要であり、ゲル由来の妨害物質の除去のためにはカラムを直前に95%ETOHで洗う必要がある(中川)。(c)RIAの標準品のIC_<50>はAmersham社とCayman社では異なり、前社でも時期により異なることがあるので注意すること(沢田、森田)。またCayman社のものはラクトン環が多いので開環する必要がある(渡辺)。(d)11ーDHーTXB_2ーHRPの結合物によるEIAは感度がよく(0.202ー10pg/tube)、尿はもとより血漿も稀釈して少量用いれば直接法で測定可能であるとの報告(近藤)があり、討論された。(e)ラットにmonoclotarinを投与しておこす糖尿病で11ーDHーTXB_2より2,3ーdinorーTXB_2が増加する(沢田)。(f)GCMS法でも添加実験からヒト血漿の11ーDHーTXB_2は2.8ー3.04pg/mlであった。(g)ADAM・HPLCでも測定可能であるが狭雑物の除去が必要である。(h)アレルギ-性炎症モデルの滲出液中では11ーDHーTXB_2が高い。滲出液の粘度が高いと圧を加えるので固定化カラムからもれる(渡辺)。(i)11ーDHーTXB_2産生には動物種が強く、ウサギ1に対し、モルモット、サル、ラットは1/10、イヌは産生がない(川村)。(j)ヒト尿中の11ーDHーTXB_2はインドメタシン減少(佐藤)。(k)妊娠中毒症の母体血では11ーDHーTXB_2産生が増大していた(関)。以上、注意すれば尿ばかりでなく血漿を含めて測定出来ることが明らとなった。
衝突蒸気雲中における高速化学反応の分光学的測定

本年度実施した研究は、大きく分けて3つある。まず第一は、硫酸塩岩の衝突蒸発実験とレーザー蒸発実験の比較である。K/T大量絶滅事件において大量に衝突脱ガスを起こしたと考えられている硫酸塩岩(とくに硬石膏CaSO_4)をターゲットにし、レーザー照射と衝突蒸発実験を行った。分光観測結果の比較により、この2つの実験で発生する高温蒸気雲の中の原子種・分子種にはほとんど差がなく、温度圧力条件さえうまく制御できれば、レーザーにより衝突蒸気雲の再現実験が可能であることが分かった。ただし、現状では圧力の測定方法が確立していないため、正確な再現実験はまだ困難である。第2は、石英(SiO_2)のレーザー照射実験とその観測のために必要な理論スペクトルの生成コードの開発である。これは、地球型惑星の主成分であるケイ酸塩岩の蒸発現象を理解するための基礎となるものである。具体的には、SiOの発光スペクトルを任意の温度・柱状密度・波長分解能に対して計算できるコードを開発し、天然の石英のレーザー照射により生成した高温蒸気雲の観測スペクトルと比較した。実験結果は理論曲線が、実際のスペクトルに非常によく近似し、温度推定に有用であることが確認できた。第3は、衝突蒸気雲の熱力学記載に不可欠な圧力測定のための測定技術の開発である。この実験では、石膏(CaSO_4・2H_2O)のような結晶構造に水を含む鉱物にレーザー照射をすることにより水素を大量に含む高温ガスプリュームを生成し、高速分光観測を行った。水素の出す輝線は一般的に圧力広がりを顕著に示すので、圧力計として使える可能性がある。今回の実験では、7000-20000Kという高温領域においてH_α,H_βなどの水素の強い輝線が現れ、その輝線の線幅はH5nmと非常に大きくなることが観測された。また解析の結果、石膏の高温蒸発体の状態方程式を決定することに成功した。本年度は、まず高性能分光器を購入し、集光光学系、トリガー回路系、CCD検出器及び制御計算機と組み合わせて観測システムを立ち上げた。このシステムは、波長および感受度の較正試験を行い、当初の目標性能が出ていることを確認した。その後、宇宙科学研究所の2段式軽ガス銃を使って性能試験を行い、比較的低速(4km/s)の衝突でも分光に十分な光量が得られることを確認した。しかし、弾丸に使用したナイロンからは、強い気体発光(つまり、原子輝線や分子バンドの発光)が見られず、標的に使った玄武岩からのNa線と固体・液体の小片から生ずる黒体輻射スペクトルが観察された。そこで、第2の性能試験として、パルスレーザー照射実験を行った。レーザーには、パルスあたり600mJというかなりの大きなエネルギーを持つNd:YAGレーザーを用いた。標的には、衝突実験と同じく玄武岩を用いた。レーザー実験の結果、比較的低速度の衝突実験とは異なり、NaやKなどの揮発性元素以外にも、Mg、Fe、Caなどの元素の原子スペクトルが観測された。しかし、Mg0などの分子スペクトルは、かなり弱いものしか観測されなかった。これは、4km/s程度の衝突では、Mg0などの不揮発性元素の酸化物の蒸発が起きないことを示している。一方、レーザーの実験結果を理解するため、簡単な熱力学計算コードを作り、レーザー照射による物質の昇温・蒸発を記述する半解析的な数値モデルと組み合わせて解いた。その結果、レーザービームを0.1mm程度までに集光させた場合には、Mg0などの分子は、かなりが解離・原子化してしまうことが分かった。これは、レーザー照射実験で、強い原子輝線が観測され、分子バンド発光が弱いことをよく説明する。

今回の実験では、7000-20000Kという高温領域においてH_α,H_βなどの水素の強い輝線が現れ、その輝線の線幅はH5nmと非常に大きくなることが観測された。また解析の結果、石膏の高温蒸発体の状態方程式を決定することに成功した。