hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マグマ破壊特性の定量化と計測手法開発を目指した模擬物質の破壊実験

結果を,アメリカ地球物理学会秋季大会(2006年12月)で発表し,物質の変形と流動を記述する数学的モデルの構築を開始した.モデル構築の過程で,マグマの流動と破壊に関する既存の描像とその数学的表現に,ある矛盾のあることに気づいた.これまでのモデルは,非常に小さい歪み領域での周期的変形試験の結果と,歪み速度一定の定常状態での粘性計測の結果に基づいて作られていた.前者の結果は,線形マクスウェル粘弾性モデルでよく説明出来,後者の結果は,歪み速度の増加と共に粘性め低下する,シェアーシニングモデルで説明が出来た.しかし,両者をつなぐようなモデルがなく,マグマがだんだんと加速し,大きな歪み速度と歪みに至って破壊する,という,噴火のモデリングにおいて重要な破壊過程を矛盾無く記述することが出来なかった.マグマの変形特性を支配するミクロなメカニズムの考察と,構成方程式の数学的解析から,時間に依存する流動特性を記述するモデルを提案した.その結果を,日本火山学会秋季大会(2006年10月),および,京都大学基礎物理研究所機関誌「物性研究」で発表した.一方,研究代表者の研究室に設置した破壊試験装置を用いた,火山弾,及び,模擬物質の破砕実験を開始した.脆性領域での岩石の破壊と,粘弾性物質の破壊過程を比較し,新しい構成方程式を用いた破砕モデルを構築していく予定である.前年度までに行った,合成シリケイトメルトの試料を用いた圧縮試験,3点支持の曲げ試験による破壊試験の結果を元に,物質の変形と流動を記述する数学的モデルの構築を行った.火山学の分野で一般的に使われている線形粘弾性モデルでは,非定常な応力・変形場のマグマの挙動を記述することのできないことが明らかになった.まず,粘弾性物質中で急減圧を受けた気泡周囲の応力蓄積過程について,数値計算を行い,応力蓄積の条件を導いた(Ichihara,2008).また,応力蓄積過程における,粘性・粘弾性・物質拡散・慣性など様々な要素の影響をまとめ,定量的に評価した(Ichihara and Nishimura,accepted).それらの知見を,マグマ模擬物質を用いた破砕実験の結果に応用し,破壊物性の時間依存性の重要性を確認した(Kameda, et. al., submitted to GRL).また,マグマの変形特性を支配するミクロなメカニズムの考察と,構成方程式の数学的解析から,時間に依存する流動特性を記述するモデルを提案した(市原,2007).一方,合成シリケイトメルトのガラス転移点付近の挙動について,実験データを解析し,履歴や内部緩和の影響を評価した.その結果,歪硬化性のあることが明らかになった.歪硬化性は,これまでのマグマ破壊モデルではほとんど考慮されていなかったが,流動から破壊へ遷移する過程においては重要な役割を果たしていることが予想される(Ichihara, et. al.,2008).
糖尿病に着目した腹部大動脈瘤の病態解析～DPP-4阻害薬の瘤形成抑制効果の検討～

本研究は腹部大動脈瘤形成及び進展と糖尿病との関連を明らかにし、これらの病態に伴うDipeptidyl Peptidase-4(DPP-4)阻害薬の抗炎症作用をターゲットとした腹部大動脈瘤形成抑制に対する新たな治療戦略を提示することにある。具体的には以下の実験を行っていく。1.マウス腹部大動脈瘤モデルの作成。アンギオテンシンII負荷モデルを用いる。minipumpを埋め込み、AngIIを1000ng/kg/minで皮下投与し、術後4週目に瘤形成の評価を行う。2. Dipeptidyl Peptidase-4(DPP-4)阻害薬による大動脈瘤形成抑制効果の検討。通常食とDPP-4阻害薬混餌投与で瘤形成率について検討する。マウス腹部大動脈瘤モデル(アンギオテンシンII負荷)の作製を行った。麻酔はネンブタールの腹腔内投与にて行った。アンギオテンシンIIのポンプを背部皮下に埋め込み、1000ng/kg/minで投与した。術後4週目に瘤形成効果の検討を行った。大動脈組織をHE、EVG染色で評価した。今後、機序解明として、JNK, NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6などの発現について検討していく予定である。動物実験施設が利用できない状態にあったため、当初の計画より遅れている状態である。至急、マウス大動脈瘤モデルを作成し、瘤形成の機序について検討していく予定である。野生型マウス、糖尿病モデルマウスにおいて、DPP-4阻害薬における抗動脈硬化作用、抗炎症作用として、採取した大動脈組織を用いて、種々のシグナル伝達系物質(JNK, NF-κB)をウエスタンブロッティング法にて評価する。また、大動脈組織の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1、IL-6など)についてELISA法にて検討していく予定である。具体的には以下の実験を行う。1.マウス腹部大動脈瘤モデルの作成(野生型マウス、糖尿病モデルマウス)。2.野生型マウスと糖尿病マウスにおけるDPP-4阻害薬の大動脈瘤形成抑制効果の検討。3. DPP-4阻害薬における大動脈瘤抑制効果の機序としてMMP、炎症性サイトカインの関連について検討。本年度はマウス腹部大動脈瘤モデルの作製を行った。Calcium Chlorideモデル:麻酔はネンブタールの腹腔内投与にて行った。腹部正中切開にて開腹、腎動脈下腹部大動脈から腹部大動脈分岐部にかけて腹部大動脈を露出させた。0.5M CaCl2液を綿花に染み込ませて腹部大動脈に15分間接触させた。腹腔内を生食で洗浄して閉腹した。術後6週目に腹部大動脈瘤形成効果を検討したが、瘤形成に乏しく、Angiotensin IIによる腹部大動脈瘤モデルを作成することとした。野生型マウスで動物実験モデル(Angiotensin II負荷による腹部大動脈瘤)を作成中である。麻酔をネンブタールの腹腔内投与にて行った。minipumpを埋め込み、AngIIを1000ng/kg/minで皮下投与した。今後、DPP-4阻害薬による瘤形成抑制効果の検討を行っていく予定である。動物実験施設が利用できない状態にあったため当初の計画より遅れている状態である。至急マウス腹部大動脈瘤モデルを作成し、DPP-4阻害薬による瘤形成抑制効果の検討を行っていく予定である。野生型マウスにおけるDPP-4阻害薬による大動脈瘤抑制効果の検討、およびその機序として採取した大動脈組織を用いて、種々のシグナル伝達系物質(JNK, NF-κB)をウエスタンブロッティング法にて評価していく。

また、大動脈組織の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1、IL-6など)についてELISA法にて検討していく。その後、糖尿病モデルマウスにおいても同様の実験を進めていく予定である。野生型マウス、糖尿病モデルマウスにおいて、DPP-4阻害薬における抗動脈硬化作用、抗炎症作用として、採取した大動脈組織を用いて、種々のシグナル伝達系物質(JNK, NF-κB)をウエスタンブロッティング法にて評価する。また、大動脈組織の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1、IL-6など)についてELISA法にて検討していく予定である。
土壌粒子に結合した金属イオンを溶出する微生物菌体外物質と放射性セシウムの除染

土壌粒子に結合した金属イオンを溶出する微生物を,放射性セシウム除染に応用することを目指した。土壌細菌500株から,特にセシウム溶出能が高い2株を選抜した。16S rRNA遺伝子解析で,これらはEnterobacter cancerogenusおよびKluyvera cryocrescensまたはその近縁種であることが判明した。培養ろ液中のポリアミン類が溶出効果を示したため,市販のスペルミン,スペルミジンおよびプトレスシンを用いた実験を行ったところ,いずれにも溶出効果が認められた。同株の培養液中にはスペルミンとプトレスシンが含まれ,これらが土壌粒子からのセシウム溶出に機能していると考えられた。一部の金属元素は,土壌中ではイオン化して陽イオンとなり,負に帯電している土壌粒子と結合する。水があれば可溶化して容易に流動しうると考えられても,実際には土壌粒子に固定されたままのことがある。植物の三大栄養素の一つであるカリウムも,土壌粒子に捕捉されて植物の栄養として機能できない,すなわち非可給態となることがある。セシウムはカリウムと同族の元素であり化学的に共通点も多いが,イオン径の違いで土壌粒子にはより強固に結合している。セシウムは降雨等によっても地中深くには移行せず表土にとどまり,このことが原発事故後の土壌汚染を長引かせる一因ともなっている。本研究の初年度においては,土壌改良微生物製剤への利用を目指して取得された菌株(すべて細菌)の中から,カリウムの可給態化能力に長けた株を選別し,同族元素であるセシウムを同様に土壌粒子から溶出させられるかを評価した。実験には畑土(黒土)を用い,5μMの塩化セシウム水溶液に一定時間浸漬後に水で十分に洗浄した模擬セシウム汚染土を用いた。この汚染土を各菌株の培養ろ液に浸漬し,溶出されたセシウムを原子吸光分析により定量した。まず,供試48菌株のうち,溶出液中のセシウム濃度が平均値(実験回により異なるが,1 gの乾燥汚染土から10 mlの培養ろ液中に溶出される濃度が10 ppm程度の値となる)の3倍以上の値を示す7株について,より高精度の追試を行った。新たにセシウム溶出能をもつ菌株を得るためのスクリーニングも継続した。特に,貧栄養状態でも旺盛な成育を示す,いわゆる雑草の類に注目して,30点ほどの異なる雑草を採取,それらの根圏に生育する菌を回収した。これらについては,カリウムの可給態化能力とは無関係に,セシウム溶出能のみを指標にスクリーニングを行った。これまでに,約80株を供試し,うち4株が平均値の3倍以上のセシウム溶出能を示していたために,さらに詳細な解析を行っている。初年度に続き,土壌粒子に強く結合して水では溶出されないセシウムに対して溶出効果を示す微生物を土壌中より分離することを目指した。一次四次におよぶ選抜の結果,有力候補約20株を得たが,培養条件の最適化が困難なものが多く,継代によりセシウム溶出能が低下または消失するもの,冷蔵・冷凍保存に耐えないもの等があり,最終的に通常の実験室環境・条件下でも培養可能な2株(b311株およびb57株)を得て,それらのセシウム溶出メカニズムを解明するための諸実験に供した。まず,土壌粒子からのセシウム溶出に生菌体そのものが関与しているのか,菌体外分泌物等の化学物質のみでもその効果が示されるのかを調べたところ,菌体を除いた培養上清に明確なセシウム溶出効果が確認されたことから,本現象には何らかの菌体外物質が関与していることが示された。培地成分としての陽イオン(カリウムイオン,ナトリウムイオンや一部のアミノ酸等)による単なるイオン交換現象ではないことは,培地のみでは溶出されてくるセシウムの量が僅少であることからも確認された。培養上清中の有機酸,タンパク質や糖質などを対象として,セシウム溶出効果を示す分子を分離・精製そして同定する試みは現在も継続中であるが,ゲルろ過では活性を示す画分が広く分散する傾向にあること,イオン交換クロマトグラフィーによっても単一成分として活性と一致する形での精製が難しいこと,必要以上の長時間培養(60時間)では活性が低下または消失することから,当該物質は比較的易分解性の,本来は高分子の多糖やタンパク質である可能性が考えられた。また,当該2株の同定・分類を行うべく,それぞれの形態観察および遺伝子解析を進めている段階であるが,いずれも好気的条件で培養可能な球菌であった。初年度から引き続いて行ってきたセシウム溶出能をもつ菌株選抜の結果,有力候補約20株を得たが,多くは培養条件の最適化が困難で,継代によりセシウム溶出能が低下または消失するもの,冷蔵・冷凍保存に耐えないもの等が大半であった。主に貧栄養土壌に生育する植物(オオバコやナズナ,ホトケノザ等の,いわゆる雑草を主とする草本植物)の根圏あるいはその近傍に存在する土壌微生物をターゲットとしたために,一部は嫌気性であったり,または根圏の共生微生物で単独培養が困難であったり,さらには一連の実験で用いた培地(ペプトンとグルコースを主体としたもの)との適合性が低い等の理由もあり,最終的には通常の実験室環境下でも取扱い容易な2株を得るにとどまった。

この段階に到達したのは,当初計画よりもやや遅れた平成27年6月であった。それら2株の培養法,特に大量培養法に関しては,易培養性であることを基準として選抜を進めたために,比較的短時間で確立することができた。培地選択や培養温度,通気条件等も詳細に検討できた。それら2株が産生する,セシウム溶出に直接関与する菌体外物質の精製と同定に関しては,培養上清を凍結乾燥後にゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーを試みたところ,単一成分として活性と一致する形での精製が難しいこと,長時間(60時間)培養を継続した場合や,粗精製状態で冷蔵保存した場合にはセシウム溶出活性が著しく低下または消失することが判明した。今のところは安定的に活性を維持させながら精製等を行うための条件を検討している段階である。当該物質は高熱には比較的安定(80°C程度までは活性を維持)であるが,常温では短時間で低分子化する多糖やタンパク質である可能性が考えられた。これらのことが判明するまでに4か月ほどを要し,プロジェクト全体の進行がその分だけ当初計画から遅れることとなった。前年度に引き続き,土壌粒子に強く結合して水では溶出されないセシウム(セシウムイオン)を解離・溶出する効果を示す微生物菌体外物質の探索を行った。段階的な選抜を重ねて有力菌株を10株以下に限定し,それらの培養ろ液を用いて非放射性セシウムの溶出実験を実施した。カラムに非放射性セシウムを結合させた土壌粒子を充填し,供試微生物の培養ろ液を通すことでセシウムの溶出を行い,ICP-発光分光分析法/ICP-質量分析法により溶出液中のセシウムを検出・定量した。セシウム溶出に生菌体そのものも関与しているのか,菌体外分泌物等のみでも溶出効果が示されるのかを調べたところ,培養ろ液のみでも非常に高いセシウム溶出効果が確認された。培地に含まれるカリウム,ナトリウムやアミノ酸等による単なるイオン交換現象ではないことは,培地のみで溶出されてくるセシウムの量が僅少であることからも確認された(以上,前年度実験の追試・精査)。成分量を1/21/4に希釈した培地を用いても,最終的な菌体量が同じになるように培養を続ければ,全く同程度のセシウム溶出能を示すことが示された。セシウム溶出に関与する菌体外物質に関しては,長時間培養を継続すると溶出活性が消失すること,熱処理には安定であるが,透析により溶出活性が低減すること等がわかっている。このようなセシウム溶出能をもつ菌体外物質を産生する有力菌株を10株のうち,最も高いセシウム溶出活性を示す菌株(サンプル番号33b)について16S rRNA遺伝子解析を行ったところ,Enterobacter cancerogenusであることが示された。同菌は,異なる複数の地点の土壌から単離されており,安定的に一貫して高いセシウム溶出能を示すことがわかった。前年度に引き続き,土壌粒子からのセシウム溶出能をもつ菌株選抜を進めた結果,有力候補を10株にまで限定することができた。他の多くの菌株は,培養や継代が困難で,継代によりセシウム溶出能が消失したり,冷蔵・冷凍保存に耐えないもの等が多かった。主に貧栄養土壌に生育する植物の根圏あるいはその近傍に存在する土壌微生物をターゲットとしたために,明らかな嫌気性であったり,または単独の培養が困難であったり,さらには一連の実験で用いた富栄養培地との適合性が低い等の理由で,最終的には取扱いが特に容易な1株を得た(サンプル番号33b)。この菌株は,16S rRNA遺伝子解析の結果より,Enterobacter cancerogenusであることが示された。この段階に到達したのは,当初計画よりも遅れた平成28年9月であった。
機能から形態異常への進展でのmicroRNAの関与と機序：喫煙の動脈硬化での検討

本研究の目的は、喫煙者における血管機能障害から血管形態異常への動脈硬化進展におけるmicroRNA(miR)の果たす役割を明らかにすることである。喫煙者において、血管機能形態同時評価を通じて動脈硬化重症度の判断を行い、動脈硬化の進展に伴うmiRの発現の変化を検討した。平成30年度は、合計25例の喫煙者、非喫煙者の登録を行った。平成30年度内に禁煙開始5か月後に到達された方は、開始後5か月後分の血管形態評価、血管機能評価、miR解析のための採血、を実施した。また、平成29年度に登録され、平成30年度内に禁煙開始1年後に到達された方は、開始後1年後分の血管形態評価、血管機能評価、miR解析のための採血を実施した。採取した血液よりのmiR抽出を実施した。その後、非喫煙群で血管障害を生じていない群と、喫煙群で血管障害を生じている群で、miRプロファイリング解析を実施した。抽出検体が適正であることを確認したのちに、得られた結果の両群間での差異につき、解析を実施した。その結果、miR-27、miR-455、miR-1、miR-133、miR-136、miR-142、miR-337、miR-369、miR-370、miR-409、miR-411、miR-431、miR-432、miR-493、miR-584、に発現差異を認めた。今後、これらの差異を認めたmiRのそれぞれの意義につき、検討を進める。さらには、これらのmiRのうち、どれが喫煙に伴う動脈硬化進展に関与するのか、関与するならば単独で関与するのか、それとも複数が組み合わさって関与するのか、さらに探索を進める。本研究の目的は、喫煙者における血管機能障害から血管形態異常への動脈硬化の進展におけるmiRNAの果たす役割を明らかにすることである。喫煙者において、血管機能形態同時評価を通じて動脈硬化重症度の判断をおこない、動脈硬化の各段階におけるmiRNA発現の相違を検討する。また、禁煙治療後の経時的なmiRNA発現変化の検討や、非喫煙者での同様の評価から喫煙者、非喫煙者の差異を明らかにする検討を行うことで、動脈硬化の進展におけるmiRNAの果たす役割を明らかにする。平成27年度は、例の喫煙者を登録した。登録した喫煙者において、24時間前より激しい身体活動中止、12時間前より絶食、6時間前よりたばこ、アルコール飲料、カフェイン含有物、ビタミンC含有物の中止、6時間以上の睡眠、22-25度の室温、検査前30分間の仰臥位安静、午前7-12時の間に実施、の条件下で、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。以後禁煙治療を実施していただいた。平成27年度内に禁煙開始5か月後に到達された方は、開始後5か月後分の血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。血管機能評価は、高解像度超音波装置を用い、収縮期血圧より高い圧で一定時間駆血したのちに開放し、血流増加に伴い生じる拡張反応を測定する血管内皮依存性血管拡張反応評価を実施した。今回、この血管内皮依存性血管拡張反応に加え、駆血中に生じる血管収縮現象も評価した。平成27年度は、例の喫煙者を登録し、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。患者様の登録は、おおむね順調に進んでいる。また、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血もおおむね順調に実施している。取得した血管エコーデータを解析し、血管形態評価、血管機能評価をおこなっている。随時、おおむね順調に血管エコーデータの解析、血管形態評価、血管機能評価を実施している。miRNA解析は、miRNA解析を実施する体制に変更があった。本研究の目的は、喫煙者における血管機能障害から血管形態異常への動脈硬化進展におけるmicroRNA(miRNA)の果たす役割を明らかにすることである。喫煙者において、血管機能形態同時評価を通じて動脈硬化重症度の判断を行い、動脈硬化の各段階におけるmiRNAの発現の相違を検討する。平成28年度は、合計50例の喫煙者、非喫煙者の登録を行った。登録した喫煙者、非喫煙者において、24時間前より激しい身体活動中止、12時間前より絶食、6時間前よりたばこ、アルコール飲料、カフェイン含有物、ビタミンC含有物の中止、6時間以上の睡眠、22-25度の室温、検査前30分間の仰臥位安静、午前7-12時の間に実施、の条件下で、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。平成28年度内に禁煙開始5か月後に到達された方は、開始後5か月後分の血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。血管形態評価と血管機能評価の結果から、男性喫煙者における新たな血管障害の指標を見出した。血管駆血時に血管収縮反応が生じる場合には血管障害が少なく、この血管収縮反応が生じない場合には血管障害が強いことを見出した。その知見をまとめた結果を論文投稿し、atherosclerosisに採択され、掲載された。採取した血液よりのmiRNA抽出を開始した。

抽出されるmiRNA量の安定化をはかるための抽出法の微調整を実施しながら、抽出を行っている。同時に、抽出検体が今後のmiRNAプロファイリング解析に適するか否かも判定しながら、慎重に抽出を継続している。平成28年度は50例の喫煙者、非喫煙者を登録し、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。患者様の登録は、おおむね順調に進んでいる。また、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血もおおむね順調に実施している。随時、おおむね順調に血管エコーデータの解析、血管形態評価、血管機能評価を実施している。取得した血管エコーデータを解析し、血管形態評価、血管機能評価をおこない、喫煙者における新たな血管障害指標を見出し、論文作成のうえ報告したが、さらにその指標の解析を継続している。今回報告した内容は、登録時データからの解析結果であった。そこで、登録時から禁煙5カ月後までの指標の変化から、血管障害の程度を推測できる指標につき、ひきつづき、検討をおこなっている。miRNA解析は、現在採取した血液よりのmiRNA抽出を実施している。抽出されるmiRNA量の安定化をはかるための抽出法の再検討、調整を実施しながら、抽出を行っている。本研究の目的は、喫煙者における血管機能障害から血管形態異常への動脈硬化進展におけるmicroRNA(miRNA)の果たす役割を明らかにすることである。喫煙者において、血管機能形態同時評価を通じて動脈硬化重症度の判断を行い、動脈硬化の進展に伴うmiRNAの発現の変化を検討し、動脈硬化の進展におけるmiRNAの果たす役割を明らかにする。平成29年度は、合計30例の喫煙者、非喫煙者の登録を行った。登録した喫煙者、非喫煙者において、24時間前より激しい身体活動中止、12時間前より絶食、6時間前よりたばこ、アルコール飲料、カフェイン含有物、ビタミンC含有物の中止、6時間以上の睡眠、22-25度の室温、検査前30分間の仰臥位安静、午前7-12時の間に実施、の条件下で、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。以後禁煙治療を実施していただいた。平成29年度内に禁煙開始5か月後に到達された方は、開始後5か月後分の血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。また、平成28年度に登録され、平成29年度内に禁煙開始1年後に到達された方は、開始後1年後分の血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。採取した血液よりのmiRNA抽出を実施した。抽出されるmiRNA量の安定化をはかるための抽出法の微調整を実施しながら、抽出を行った。その後、非喫煙群で血管障害を生じていない群と、喫煙群で血管障害を生じている群で、miRNAプロファイリング解析を実施すべく、抽出検体が適正か否かを慎重に確認している。今後、得られた結果の両群間での差異につき、解析を進める。平成29年度は30例の喫煙者、非喫煙者を登録し、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血、を実施した。また、血管形態評価、血管機能評価、miRNA解析のための採血もおおむね順調に実施できた。
酸化ストレスに応答し・機能するバイオマテリアルプラットフォームの設計の設計

適度な酸化ストレスは外敵からの予防や疾病の治癒など、生体に不可欠な機構であるものの、様々な環境要因により過剰に発生した場合には重篤な疾病に関連することが明らかになりつつある。本研究では、安定な「ニトロキシルラジカルを担持させた材料」をプラットフォームとし、生体イメージング、酸化ストレス傷害治療のみならず、遺伝子治療や細胞工学等広範な生体適合性・機能材料創出への検討を行い、「活性酸素種を除去する新しい材料科学」の概念を構築した。本研究では、安定な「ニトロキシルラジカルを担持させた材料」をプラットフォームとし、生体イメージング、酸化ストレス傷害治療のみならず、遺伝子治療や細胞工学等広範な生体適合性・機能材料創出への展開を目指した。これまで予備的に得られているデータを振り返り、TEMPO含有高分子材料を種々設計し、その材料の物理化学特性を明らかにするだけでなく、細胞毒性、ROS消去能、生体内動態等の基礎的評価を行った。また、血液との接触によるリンパ球のダメージに対する評価を行い、特性と機能の相関を検討した。(1)TEMPOを有するブロック共重合体、ナノゲルの合成を行った。(2)材料の物理化学特性、特に水中での自己組織化、pH応答能、表面特性、還元剤耐性等の物理化学的評価を行い、合成した材料の特性を評価した。また還元剤耐性評価では、血中のアスコルビン酸等の還元剤に対する耐性、組織内のグルタチオンに対する耐性を中心に評価し、イメージング剤としての可能性を検討した。(3)X-バンドおよびL-バンドESRによる材料シグナリングの評価を行った。(4)材料の細胞毒性評価をWSTアッセイとともにサイトカインの定量によって評価した。(5)ROS発生細胞モデルによる細胞評価と虚血還流動物を用いた動物モデルにより評価を行った。脳虚血再灌流モデルに関しては筑波大医学部鈴木講師らと共同で進めた。(6)ラジカルナノ粒子の脳へのデリバリー解析をESR及び蛍光を利用し、血液脳関門の透過能を見積もるとともに遺伝子運搬や再生に関する検討を行った。第二年度以降は初年度に得られた知見を基にRNPの生理活性、薬物キャリア、イメージング剤および細胞操作を目的としてアプローチを進めた。これらの具体的成果を列記する。1.RNPの設計と血中滞留性の評価:pHに応答して壊れる、体積相転移するRNPに対して、血中滞留性とともに体内動態の検討を行った。血中半減期はpH応答型のRNPおよび非応答型RNPでそれぞれ15分、4時間であった。2.RIラベル化:生体活性とともに動態を高感度で精度良く見積もるために、^<125>Iを用いてRIラベル化を行い、上述の血中滞留性とともに臓器分布評価を行った。3.ナノ治療:これらの基礎的知見をふまえ、酸化ストレス傷害に対するナノ粒子治療システムの検討を行った。特にアルツハイマーモデルのAβアミロイド障害神経-細胞実験において酸化ストレスに対するミトコンドリア・アポトーシスへのRNPの影響を検討を、DNA傷害および過酸化脂質傷害に対するRNPの効果を評価し、定量的な知見を得た。さらに酸化ストレスによる疾患が強く懸念される腎臓の虚血再灌流などのモデル疾患に対する細胞および動物評価を行い、好成績を得た。4.薬物送達システム:胡椒から抽出されるファイトケミカルのピペリンを利用し、RNPへの可溶化および治療効果をin vitroで検証した。ピペリン含有RNPはその抗酸化特性が著しく向上した。これはRNPがスーパーオキシド及びヒドロキシラジカルを消去するのに対し、ピペンリンがカタラーゼ活性を向上させるため、相乗効果を発揮することが見いだされた。5.バイオイメージング:このようなpH応答性粒子にTEMPOを導入することにより、T2緩和能の変化一を創り込むことが可能となった。これは、腫瘍や炎症部位に応答してイメージングが期待される。第三年度は第二年度までに得られた知見を基にRNPの生理活性、薬物キャリア、イメージング剤および細胞操作を目的としてアプローチを進めた。1.RNPの設計:第二年度までに利用してきたRNPの特性を基に新たに材料設計を行った。特に経口投与に対する小腸取り込みの最適化を図るため、鎖長および組成の最適化した。2.RIラベル化:上で設計した新材料に対して生体活性とともに動態を高感度で精度良く見積もるために、RIラベル化と動態評価を進め、詳細な検討を行った。3.ナノ治療:これまでに得られた基礎的知見をふまえ、酸化ストレス傷害に対するナノ粒子治療システムの検討を行う。これまで脳、心臓、腎臓虚血再灌流に対するRNPの効果を明らかにし、高い効果を示してきた。また、アルツハイマーモデルのAβアミロイド障害神経細胞実験において酸化ストレスに対するミトコンドリア・アポトーシスへのRNPの影響を検討してきた。

本年は活性酸素を消去することにより、抗癌剤の効果に与える影響を検討するとともに、遺伝子発現系の検討も行った。これら細胞および動物実験モデルに対し、定量的な知見を得た。さらに酸化ストレスによる疾患が強く懸念される消化管系の障害(NSAID障害や潰瘍性大腸炎)などのモデル疾患に対する細胞および動物評価を行った。4.表面処理剤:新たに表面コーティング用の材料設計を行い、血液との接触においてROSを消去することにより、血液の活性化と粘着に関する基礎検討を行い、血液適合性表面の新しい展開を行った。本研究では、前述した目的を達成するために、第三年度までに得られている知見をベースに新たな材料設計、メカニズム解析等を進め、本研究の目的を達成する。1.新しい抗酸化ストレス材料の設計1:これまで作成してきたニトロキシド含有ナノ粒子(RNP)にシリカナノ粒子を封じ込めたsiRNPの設計を行った。2.新しい抗酸化ストレス材料の設計2:これまでの親疎水型ブロック共重合体によるナノ粒子をさらに展開し、ABA型ブロック共重合体によるナノ粒子の設計を進め、ニトロキシド封入型フラワーミセルの作製を行う。具体的にはニトロキシドラジカルを有するポリアミン-b-PEG-ポリアミンとポリアニオンでフラワーミセルの設計を進めた。3.腹膜透析液の開発:腹膜透析は血液透析に比べて社会復帰するためのハードルが低いだけでなく、心臓負担や残腎機能保持に有利であるものの、長期にわたる治療により予後不良な被嚢性腹膜硬化症を併発するという大きな問題がある。上記で設計したsiRNPは触媒的に活性酸素を消去するだけでなく、シリカによる不要物の吸着も期待できるため、腹膜に対する酸化ストレスの低減と吸着能の向上を実証した。4.創傷治療剤の開発:フラワーミセルの組成を制御し、室温前後でゲル化挙動を観察する。ポリイオンコンプレックスの相転移は極めて鋭敏であるため、局所炎症低減をマウスカラギーナンモデルを離礁して検討し、高い効果を実証した。5.抗酸化ストレスナノ粒子が癌に与える影響の解明:前年度見いだしたRNPの抗がん剤へのアジュバント活性の原因を追究した。特に炎症性転写因子Nf-κBの核内移行を抑制していることを確認した。第三年度は第二年度までに得られた知見を基にRNPの生理活性、薬物キャリア、イメージング剤および細胞操作を目的としてアプローチを進め、(1)経口投与RNPの最適化、(2)RIラベル化と動態評価、(3)抗がん剤アジュバント効果、遺伝子発現とともにNSAIDsの経口デリバリーにも成功した。(4)また、表面処理剤として血液との親和性が高い表面を構築した。このように当初の目標が順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、本研究の目的を達成するために、第三年度までに得られている治験をベースに新たな材料設計、メカニズム解析等を進め、本研究の目的を達成する。(1)新しい抗酸化ストレス材料の設計(1):これまで作成してきたニトロキシド含有ナノ粒子(RNP)にシリカナノ粒子を封じ込めたsiRNPの設計を行う。(2)新しい抗酸化ストレス材料の設計
カレッジ級数学における能動的学習のための動的・静的挿図教材作成支援システムの構築

カレッジ級数学の授業で,学生の理解度を促進し,学習内容を定着させるためには,反転授業や『学び合い』などの能動的学習(アクティブ・ラーニング)を実施する必要がある.能動的学習を実施するためには,図のないプリントと教科書だけでは難しく,使用する動的・静的挿図教材の開発が必須であり,TeXによる挿図教材作成支援システムKeTCindyの開発を進めている.本研究期間を通して,KeTCindyを用いて,以下のことを実現し実施した.1)KeTCindyのスライド作成機能を改良して,音声や動画を付けたスライドが作成できるよう機能を拡張した.2)カレッジ級数学の動的・静的挿図教材を用いた能動的学習の授業デザインとして,スライドとプリント配付による予習中心型授業を確立した.具体的には,次の手順で授業を実施した.事前に,プリントを配付し,LMSや教育用SNSに音声・動画付きスライドを載せる.授業中は,スライドの解説を要点を絞って行い,『学び合い』でプリントの課題を解くことに集中させる.プリントは,課題ルーブリックを用いて学生同士でピアレビューさせる.次回の授業で小テストを行い,授業内容の理解度を確認させる.3)授業で作成した動的・静的挿図教材は,現在,webページ「KeTCindyによる教材作成支援」で公開している.また,毎年実施しているKeTCindy体験ワークショップで教材を披露し,カレッジ級数学教員の間で質の高い教材に改良するよう試みた.KeTCindyの機能拡張については,KeTCindyパッケージにスライドを簡単に自動生成できるようにコマンドを追加した.とくに,シミュレーションを効果的に表示するために,場所を指定してパラパラ動画が挿入できるだけでなく,PDF上でページ送りやページ戻しもできるスライダー機能を装備した.PDFに音声を埋め込むためのLaTeXソースファイルについて検討している.能動的学習の授業デザインについては,KeTCindyで作成したスライド提示による能動的学習型授業を行い,学生アンケートを実施した.アンケート結果からは,板書とスライド提示を比較して,どちらが授業に適しているか質問したが,ほとんどの学生はスライド提示でもかまわないと回答した.ただし,ノーティングの時間をとる,何度でも確認できるよう携帯端末などから見えるようにする,携帯端末上で負荷がかからないようファイルサイズをかなり小さくできる,などという工夫は必要である.KeTCindy講習会参加者から挿図教材のアイデアを収集し,KeTCindyで簡単に作成できることを確認した.作成した挿図教材は参加者に提供し,私たちのwebページ「KeTCindyによる図入り教材の作成」に教材事例としてアップしている.また,参加者の要望に応えて,いくつかの図入り教材を作成した.上記結果を,国内では,日本高専学会,RIMS短期共同研究集会で発表し,日本高専学会誌に論文掲載が決定した.国際会議では,ICMS2016, SII2016で発表した.シミュレーションを表示する機能をKeTCindyに装備できた.また,KeTCindyで作成したスライド提示による能動的学習型授業を実施し,学生アンケートも好意的な結果が得られた.さらに,KeTCindy講習会も順調に開催し,参加者から挿図教材事例を収集し,webページ「KeTCindyによる図入り教材の作成」で公開できた.国内外の発表も順調に行えた.KeTCindyの機能拡張については,基幹となる数学ソフトウェアを数値計算ソフトScilabから統計処理ソフトRへ移行した.移行した理由は,Scilabはバージョン更新による不具合が多く,この対応に毎回時間を要したが,Rはバージョン更新でも安定し,メンテナンスが充実しているため,基幹となる数学ソフトウェアとして適していることによる.また,LaTeX用パッケージmedia9を用いて,PDFに音声ファイルmp3や動画ファイルmp4を埋め込むことができるようになった.能動的学習の授業デザインについては,スライドによる授業の欠点を補うために,印刷配付教材と併用してノーティングしやすい環境を提供する,学内LANや教育SNSなどweb上にスライドを掲載し,携帯等の端末から見えるようにする,携帯等の端末でも負荷がかからないようファイルサイズを小さくできる,などという工夫を行った.KeTCindy講習会で使用するKeTCindyインストール説明用PDFスライドをWindows版とMacintosh版に分けて作成し,講習者に好評だった.また,研究分担者を含めたグループでPDFスライド教材を作成し,これらを収集後,効果的なスライドになるよう検討会を重ねた.完成したスライド教材については,私たちのwebページ「KeTCindyによる図入り教材の作成」に掲載する予定である.上記結果を,国内では,日本数学教育学会,日本高専学会,RIMS短期共同研究集会「数学ソフトウェアとその効果的教育利用に関する研究」で発表した.国際会議では,ICCSA2017,SII2017で発表した.KeTCindyを用いて,PDFスライドに音声ファイルmp3や動画ファイルmp4を埋め込むことができるようになった.また,作成したPDFスライドによる能動的学習型授業の構成がまとまりつつあり,今後の検討会で確定できそうである.さらに,KeTCindy講習会のインストール用スライドや授業スライドを作成収集し,検討会も行った.国内外の発表も予定通り順調に行った.カレッジ級数学の授業で,学生の理解度を促進し,学習内容を定着させるためには,反転授業や『学び合い』などの能動的学習(アクティブ・ラーニング)を実施する必要がある.能動的学習を実施するためには,図のないプリントと教科書だけでは難しく,使用する動的・静的挿図教材の開発が必須であり,TeXによる挿図教材作成支援システムKeTCindyの開発を進めている.本研究期間を通して,KeTCindyを用いて,以下のことを実現し実施した.

1)KeTCindyのスライド作成機能を改良して,音声や動画を付けたスライドが作成できるよう機能を拡張した.2)カレッジ級数学の動的・静的挿図教材を用いた能動的学習の授業デザインとして,スライドとプリント配付による予習中心型授業を確立した.具体的には,次の手順で授業を実施した.事前に,プリントを配付し,LMSや教育用SNSに音声・動画付きスライドを載せる.授業中は,スライドの解説を要点を絞って行い,『学び合い』でプリントの課題を解くことに集中させる.プリントは,課題ルーブリックを用いて学生同士でピアレビューさせる.次回の授業で小テストを行い,授業内容の理解度を確認させる.3)授業で作成した動的・静的挿図教材は,現在,webページ「KeTCindyによる教材作成支援」で公開している.また,毎年実施しているKeTCindy体験ワークショップで教材を披露し,カレッジ級数学教員の間で質の高い教材に改良するよう試みた.PDFスライド教材に音声を付加する方法を検討する.また,KeTCindyで作成したスライド提示による能動的学習型授業を実施しながら,能動的学習の授業デザインを確立する.さらに,KeTCindy講習会を開催してKeTCindyを普及するとともに,参加者から挿図教材事例を収集し,webページ「KeTCindyによる図入り教材の作成」で公開する.これらの成果を国内外に発表する.現行のPDFスライド作成機能が十分であるか検討する.また,現行の授業で作成したPDFスライドを使用しながら,能動的学習の授業デザインを確立する.さらに,KeTCindy講習会を開催し,KeTCindyを普及するだけでなく,私たちが確立したPDFスライドによる能動的学習型授業も推奨していく.PDFスライド教材を収集し,効果的なスライドに修正し,私たちのwebページ「KeTCindyによる図入り教材の作成」で公開する.これらの成果を国内外で発表する.PDFスライド教材を作成するためにKeTCindyの開発に重点を置いたため,授業デザインのための研究授業用ipadを一部購入しなかったことによる.今年度は支出を抑え,PDF教材作成や授業デザイン検討会を中心に活動してきた.次年度は,これまでの研究成果を国内外に広く発表するだけなく,今後の課題対策に向けた活動経費に使用していく予定である.具体的には,国内での国際研究集会の海外研究者招聘旅費,iBookによるKeTCindy関係書籍の出版,新規webページ用レンタルサーバー関係,KeTCindyのTeXLive化などである.PDFスライド教材作成のためのKeTCindyの開発が進んだことにより,KeTCindyで作成したPDFスライド教材を研究授業で使用できるようになった.今年度は研究授業を数回行い,PDFスライド授業による授業デザインを調査・分析する予定である.
バクテリオファージ尾部基盤の構築原理の解明

本研究の対象蛋白質の1つであるテイルリゾチームは昨年明らかになったように、Ser351とAla352の間でプロセッシングが起こる。C末端側ドメインは3量体形成に必須であり、切断後も複合体として留まる。このC末端側ドメインはテイルおよび成熟ファージ中にも存在していることがウェスタンブロッティングにより証明されていたが、テイルから直接同ドメインを単離して確認することは出来ていなかった。しかし、最近になってテイルから同タンパク質のバンドを取り出してエドマン分解により直接同C末端ドメインが存在することを証明することができた。当研究室で学位取得後米国パーデュー大学に留学した金丸は、最近gp5-gp27が複合体の結晶化に成功し、同結晶が約2.5A分解能の回折点を与えることを見いだした。ごく最近、gp27のセレノメチオニン置換体を含む複合体を用いて位相を決定することが出来た。この複合体はgp5とgp27を各3分子含むヘテロ6量体であり、3月中には構造が決定できそうで、既にgp5のC末端に細長いβヘリックスが見えてきている。他方、小尾繊維の繊維形成に必須のgp57Aは熱変性および変性剤による変性が高度に可逆的である珍しい例である。この蛋白質の会合の性質を詳細に調べるためにUVモニターとレイリー干渉計を用いて広範囲の濃度領域で重量平均浮揚分子量を測定した。この実験は、またいくつかの温度およびいくつかの濃度のグアニジン塩酸存在下でも行った。その結果、単量体は二次構造を持たないこと、基本会合体は2量体であって六量体と平衡関係にあることが明らかとなった。高濃度領域では6量体はさらに会合する傾向にある。単量体-2量体間の平衡定数は30°C付近に極大値を持つが、2量体-6量体間の平衡定数は温度に対して単調に減少した。今年度は特に2つの蛋白質に焦点を合わせて研究を行った。即ち、尾部基盤蛋白質でリゾチーム活性を持つティルリゾチームと尾繊維及び小尾繊維の形成に必須な分子シャペロンgp57Aである。前者については以下のことが明らかになった。ティルリゾチームは分子量6万3千の前駆体として合成される。大量発現系を構築して同蛋白質を調製したところ、期待通りの分子量の蛋白質が合成されたが、この前駆体は80%以上が切断を受け、2つの断片を生じていた。これらの蛋白質をSDS電気泳動により分離してアミノ酸配列分析を行った結果、この切断部位は351残基目のC末端側であり、感染時におこるプロセッシングと同部位であることが分かった。さらに、前駆体C末端ペプチドに対する抗体を作成して切断されるC末端領域を調べた結果、C末端領域は切断後も基盤構成成分として基盤内に留まることが分かった。現在、テイルリゾチームは共同研究者である米国オレゴン大学のBrian Matthews教授の研究室で結晶解析が進んでいる。他方、もう一つの基盤構成成分であるgp27を単離精製する過程で、この遺伝子産物がテイルリゾチームと結合して複合体を形成することが分かり、この複合体についてもBrian Matthews教授の研究室において構造解析が開始されることになった。分子シャペロンgp57Aについては、これまでに以下のことが明らかになった。本タンパク質は円2色性(CD)スペクトルによれば約94%がαヘリックスからなり、沈降平衡法に基づく超遠心分析の結果、4量体を形成していることが明らかである。

gp57Aは熱変性やグアニジン塩酸などの変性剤による変性がきわめて可逆的であり、示差走査型微少熱量測定(DSC)および円2色性(CD)により、1つの中間体を経る三状態転移が観測された。本研究の対象蛋白質の1つであるテイルリゾチームは昨年明らかになったように、351Serと352Alaの間でプロセッシングが起こる。C末端側ドメインは3量体形成に必須であり、切断後も複合体として留まる。このC末端側ドメインはテイルおよび成熟ファージ中にも存在していることがウェスタンブロッティングにより証明されていたが、テイルから直接同ドメインを単離して確認することは出来ていなかった。しかし、最近になってテイルから同タンパク質のバンドを取り出してエドマン分解により直接同C末端ドメインが存在することを証明することができた。当研究室で学位取得後米国パーデュー大学に留学した金丸は、最近gp5-gp27が複合体の結晶化に成功し、同結晶が分解能約2.5A分解能の回折点を与えることを見いだした。現在セレノメチオニン置換体を作成中である。この複合体は3分子のgp5と6分子のgp27からなるヘテロ9量体で、成功すればセレノメチオニンを用いて位相が決定できた最も大きな複合体になるとのことである。他方、小尾繊維の繊維形成に必須のgp57Aは熱変性および変性剤による変化が高度に可逆的である珍しい例である。この蛋白質の会合の性質を詳細に調べるためにUVモニターとレイリー干渉計を用いて広範囲の濃度領域で重量平均浮揚分子量を測定した。この実験は、またいくつかの温度およびいくつかの濃度のグアニジン塩酸存在下でも行った。その結果、単量体は二次構造を持たないこと、基本会合体は2量体であって六量体と平衡関係にあることが明らかとなった。高濃度領域では6量体はさらに会合する傾向にある。単量体-2量体間の平衡定数は30°C付近に極大値を持つが、2量体-6量体間の平衡定数は温度に対して単調に減少した。昨年度、gp5-gp27ヘテロ6量体の結晶化に成功した後、セレノメチオニンを用いた同型置換体の作成を試みてきたが、収量に問題があり、まだ成功していない。これと並行して古典的な重原子同型置換も試みており、イリジウムによる同型置換体が有望である。また、元のヘテロ6量体も精製度を上げるなどにより、さらに大きな結晶が得られるようになってきている。同型置換体は、もしヘテロ6量体が時間がかかりそうであれば、gp5のC末端が除去されて生じるgp5-gp27ヘテロ2量体の構造を解いてからその位相を利用して解くことも考えている。この間、gp5のプロセッシングとgp5-gp27間の相互作用の解析も進展し、gp5のプロセッシングが不可逆であって温度に依存してpHには依存しないのに対し、gp5とgp27の相互作用は可逆的でpHに強く依存し、pH8では会合しているが、pH6ではgp27は完全に解離することが分かった。なお、同複合体の結晶系はR_<32>でa=b=275.7A、c=386.7Aである。他方、基盤の開始複合体であるgp10-gp11複合体およびgp15複合体の結晶化にも成功した。前者は基盤周辺部(ウェッジ)の開始複合体で、我々がこれも各3分子からなるヘテロ6量体であることを示している。後者はテイルの完成に必要な2つの遺伝子産物の一つで、電子顕微鏡観察で、リング構造を形成することを見いだした。この構造体はテイルのコネクターを構成すると考えられ、現在もう一つのテイルの完成に必要な蛋白質であるgp3の大量発現、精製を進めている。
慢性C型肝炎の病態を規定する遺伝因子のゲノムワイド解析

§HuSNPチップを用いたCHCの発症進展を規定する遺伝子多型のゲノムワイドな解析学内倫理委員会に研究計画を提出し許可を得た後に、充分なインフオームドコンセントを行い了解が得られたCHC活動症例、ASC症例、健常人各30例から得たDNAを用いて検討した。HuSNPチップにはヒトゲノムワイドに認められる約1500箇所のSNPsを含むオリゴヌクレオチドがブロットされている。患者より採取したDNAを用いチップ付属プライマーでPCRを行い50300bp程度の増幅産物を得て増幅産物からビオチン標識プラィマーを用いビオチン標識プローブ(1本鎖DNA)を作成しチップ上でハイブリダイズし染色、専用スキャナーでスキャンし各SNPのハイブリダイズ蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を検量線上で対照しalleleの存在頻度を算出、患者群・健常人群間でのalleleの出現頻度差をカイ2乗検定で検定し、疾患特異的な多型が認められる遺伝子を同定を試みたところ、CHCと健常人では全染色体にわたり100個以上(各染色体で5から15個)の遺伝子型が異なるSNPが存在していることが明らかとなった。またCHC活動例とASC症例でも全染色体にわたり30個以上の遺伝子型が異なるSNPが存在していることが明らかとなった。そこで既に報告したCHC活動例とASC症例で遺伝子多型の発現頻度が有意に異なるIL-10の多型が異なるCHC活動例群と同じ遺伝子多型を有するASC症例を比較するとSNPの分布が異なっており、それらは全染色体にまたがっていた。以上よりCHCの病態形成には異なる染色体に複数存在する遺伝子多型が総合的に関与することが示唆された。しかしこれらの遺伝子について病態により表現頻度が異なるかさらに詳しく検討したが、はっきりとした傾向は認めなかった。§HuSNPチップを用いたCHCの発症進展を規定する遺伝子多型のゲノムワイドな解析学内倫理委員会に研究計画を提出し許可を得た後に、充分なインフォームドコンセントを行い了解が得られたCHC活動症例、ASC症例、健常人各30例から得たDNAを用いて検討した。HuSNPチップにはヒトゲノムワイドに認められる約1500箇所のSNPsを含むオリゴヌクレオチドがブロットされ、これらSNPsは12.77cMの間隔で位置し染色体上の位置が判明している。患者より採取したDNAを用いチップ付属プライマーでPCRを行い50300bp程度の増幅産物を得て増幅産物からビオチン標識プライマーを用いビオチン標識プローブ(1本鎖DNA)を作成しチップ上でハイブリダイズし染色、専用スキャナーでスキャンし各SNPのハイブリダイズ蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を検量線上で対照しalleleの存在頻度を算出、患者群・健常人群間でのalleleの出現頻度差をカイ2乗検定で検定し、疾患特異的な多型が認められる遺伝子を同定を試みている。現在のところ、CHCと健常人では全染色体にわたり100個以上(各染色体で5から15個)の遺伝子型が異なるSNPが存在していることが明らかとなった。
老化促進マウスを用いた骨量維持機構の基礎的解明

骨粗鬆症を惹起する老化促進マウスP6(SAMP6)は種々の生理活性物質の効果を判定するために使用される。水浸拘束ストレス(WRS)を1日6時間、週5日間、4週間行なうことによりSAMP6の骨量が減少したので、6週齢雄SAMP6を用いて、WRSによる骨量減少に対するビタミンK2(VK2)の効果を骨代謝マーカーや骨形態計測により判定した。大腿骨遠位端の骨量を小動物用X線CT装置で測定したところ、海綿骨量、皮質骨量ともWRS群で有意に減少した。さらに、VK2投与により海綿骨量が回復する可能性が示唆された。一方、骨代謝マーカーの変動を検討したところ、骨形成マーカーは変動しなかったが、骨吸収マーカーはI型コラーゲン架橋C-テロペプチド(CTX)がWRS群とWRS+VK2群で高値を示した。尿中カルシウム量はWRSにより増加したが、VK2により回復した。次に、骨形態計測により骨の微細な構造を検討した。骨構造パラメーターでは、コントロール群の二次海綿骨の骨梁は島状で連続性が途絶しており、このマウス種の特徴と考えられた。さらにWRSにより骨梁が細く小型となったが、VK2により丸みを帯びてやや大型化した。骨吸収パラメーターでは、コントロール群と比較してWRS群で大型の多核破骨細胞と広い吸収窩を認めた。VK2により多核破骨細胞は減少し、吸収窩も縮小した。骨形成パラメーターではWRSによる骨芽細胞の増加と類骨形成及び石灰化速度の亢進を認めた。VK2はさらに骨芽細胞を増加させ、骨形成を促進した。以上より、WRSは骨吸収と骨形成が亢進する高代謝回転型の骨量減少を誘発するが、VK2は骨吸収を抑制して、骨形成を亢進する形成優位の高代謝回転となり、骨量減少を抑制することが明らかとなった。骨粗鬆症モデルマウスである老化促進マウス(SAMP6)の雌4週齢に対して、早期に骨量減少を来す目的で卵巣を摘出し、骨量の変動を20週齢まで検討した。この結果、皮質骨密度、海綿骨密度ともコントロールと差を認めず、骨粗鬆症は発症しなかった。そこで、重力の影響を除外する目的で、6週齢の雄SAMP6に対して、水浸ストレス(WRS)を行なった。WRSは拘束状態のSAMP6を24°Cの水中に1日6時間浸し、この状態を週5日、4週間実施した。4週後に屠殺して大腿骨を摘出した後、小動物用X線CT装置で骨密度を測定した。測定部位は大腿骨遠位端である。WRS群では、海綿骨密度はコントロールに比べて有意に減少したが、皮質骨密度は差を認めなかった。さらに、骨代謝マーカーの変動を測定したところ、骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ(ALP)とGla-osteocalcin(Gla)、及び骨吸収マーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRACP5b)は差を認めなかった。しかし、総osteocalcinと、コラーゲン代謝産物であるC末端テロペプチド(CTX)はWRS群で有意に高かった。このことは骨形成の抑制とコラーゲンの分解を示唆しており、SAMP6にWRSを行うと4週間という比較的短時間で骨密度が減少することが明らかとなった。来年度はこのモデルを用いて、骨代謝におけるビタミンK2の作用を明らかにする予定である。