hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
身体運動後の骨格筋におけるニトロ化タンパク質のプロテオーム解析

本研究ではラットの骨格筋においてニトロトリプトファン含有タンパク質が生成されることを見出した。また高強度間欠性走運動直後の骨格筋におけるトリプトファン残基のニトロ化修飾には変化が認められなかった。この結果は安静状態におけるニトロトリプトファン含有タンパク質が活性酸素種や活性窒素種のスカベンジャーとして機能している可能性が低いことを示している。また高強度間欠性走運動直後の骨格筋における約60kDaのαーアクチンとシグナル伝達タンパク質であるERKのトリプトファン残基のニトロ化修飾も変化が認められなかった。平成24年度はラットに急性運動を行わせた直後の骨格筋におけるニトロトリプトファン含有タンパク質について、2次元電気泳動と抗ニトロトリプトファン抗体を用いたウェスタンブロッティング、液体クロマトグラフィー/質量分析装置による解析を行うことで、急性運動直後の骨格筋ではα-アクチンのトリプトファン残基のニトロ化修飾に変化が生じる可能性を見出した。一方、近年、細胞内のシグナル伝達タンパク質であるAKTとERK1/2のチロシン残基のニトロ化修飾が、それらの機能に影響を及ぼすことが報告されている。そこで平成25年度は急性運動直後の骨格筋におけるα-アクチンのトリプトファン残基のニトロ化修飾についてさらに検討するとともに、AKTとERK1/2のチロシンとトリプトファン残基のニトロ化修飾が急性運動直後の骨格筋において変化するのかどうかを検討した。骨格筋におけるα-アクチンのトリプトファン残基のニトロ化修飾は、2次元電気泳動でタンパク質を分離した後、α-アクチンのスポットをゲルから切り出して、そのゲルを用いてさらにSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、タンパク質染色を行うことで検討した。その結果、骨格筋におけるα-アクチンのトリプトファン残基のニトロ化修飾は運動直後の筋において減少する傾向にあることが認められた。次にAKTとERK1/2のニトロ化修飾について各タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降を行い、抗ニトロチロシン抗体と抗ニトロトリプトファン抗体でウェスタンブロッティングを行うことで検討した。運動群と非運動群においてAKTの抗ニトロチロシン及び抗ニトロトリプトファン抗体の陽性反応は全く検出できなかった。またERK1/2の抗ニトロチロシン抗体の反応も検出できなかった。一方、ERK1/2の抗ニトロトリプトファン抗体の陽性反応は両群において検出できた。しかしながら、急性運動による影響は認められなかった。近年、骨格筋の収縮時に生じるタンパク質のチロシン残基のニトロ化修飾が糖の取り込み機能の制御に関与している可能性が示されている。一方、我々はトリプトファン残基もニトロ化されることを見出し、骨格筋においてもニトロトリプトファンが生じていることを確認している。したがって、タンパク質のニトロ化修飾が生理的条件である身体運動中あるいは運動後の細胞機能の制御に関与している可能性が考えられる。そこで本研究では中強度持久性走運動及び高強度間欠性走運動によりラットの骨格筋におけるチロシン残基とトリプトファン残基のニトロ化修飾の程度に変化が生じるのか否か、またニトロ化修飾が変化したタンパク質を同定して、そのニトロ化部位を決定し、タンパク質の機能への影響を解明することを目的として実験を行った。実験動物には3ヵ月齢の雄のF344ラットを用いた。ラットに中強度持久性走運動(15m/minの速度で1時間のトレッドミル走)あるいは高強度間欠性走運動(50m/minの速度で1分間のトレッドミル走を1分間隔で18回)を行わせ、その直後にヒラメ筋と足底筋を採取した。ニトロ化修飾されたタンパク質は2次元電気泳動と特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング、質量分析装置を用いて検出した。実験の結果、中強度持久性走運動と高強度間欠性走運動により約60kDa付近に見られるスポットのタンパク質のトリプトファン残基のニトロ化に変化が生じることを見出した。このスポットのタンパク質を質量分析装置で分析した結果、α-skeletal muscle actinであった。本研究ではα-actin以外にも身体運動によりニトロ化が変化する可能性のあるタンパク質を見出している。平成25年度は細胞内シグナル伝達タンパク質のニトロ化に着目して研究を進める予定である。本研究の目的は中強度持久性走運動及び高強度間欠性走運動によりラットの骨格筋におけるチロシン残基とトリプトファン残基のニトロ化修飾の程度に変化が生じるのか否か、またニトロ化修飾が変化したタンパク質を同定することである。平成24年度においては中強度持久性走運動及び高強度間欠性走運動後の骨格筋から数種類のタンパク質のニトロ化修飾が変化する可能性のあることを見出していることから、本研究がおおむね順調に進展していると考えている。

近年、タンパク質のニトロ化修飾が細胞内シグナル伝達タンパク質の活性化を制御していることが示されていることから、平成25年度は細胞内シグナル伝達タンパク質に着目して、中強度持久性走運動及び高強度間欠性走運動後の骨格筋における細胞内シグナル伝達タンパク質のニトロ化修飾の変化について検討する予定である。平成25年度は細胞内シグナル伝達タンパク質のニトロ化修飾に着目して研究を進めるため、研究費は主に細胞内シグナル伝達タンパク質に対する抗体などの消耗品の購入に使用する予定である。また平成24年度に行った研究データを学会で発表する予定であるため、学会大会への参加のために研究費を使用する。
臓器移植における抗体関連型拒絶反応の機序解明と制御に関する研究

移植医療における超急性拒絶反応は、移植片に対して反応する既存抗体が補体を活性化し細胞障害を引き起こすと考えられている。今回、移植ドナー患者のリンパ球による補体成分の活性化を、フローサイトメトリーを用いて直接計測する方法を検討した。当研究の結果、通常の仮説に反しCDC test、結合IgG量、IgGサブクラスは補体活性化の予測因子としては精度が低いことが示された。またHLA抗体の補体活性化を計測するために最も適したパラメータはC3bであり、精度の高い新たな移植患者選択システムとして使用可能である。IVIGはHLA抗体により活性化された補体系を抑制することが示され、免疫感作患者に対する移植医療を進歩させる可能性がある。移植医療における免疫抑制療法は、主にTリンパ球による細胞性免疫をターゲットに発展してきたが、液性免疫による抗体関連型拒絶反応のメカニズムは未だ明らかではない。今回我々はヒト抗HLA抗体による補体成分の活性化をフローサイトメトリーを用い直接計測し、既存抗体によるBリンパ球反応のメカニズムを明らかにする。また日本では生体間移植が主に行われており、多少リスクが高くても移植不可避の症例が多く存在する。私は抗体関連型拒絶反応のメカニズムを解明し、これにより超急性拒絶反応発症のリスクを回避し、さらにHLA抗体陽性患者でも捕体活性化が低い場合移植可能となる可能性を追求する。実験として、ラット肝移植モデルを作成し、動物実験での実験系の確立を目指した。またマウス犠死後2時間以内の血清を凍結し、捕体成分として保存した。リンパ球は脾臓より分離し保存した。フローサイトメトリーを用いCD52に対するモノクローナル抗体であるCampath 1Hにて活性化したリンパ球の活性化ガンマグロブリン値を計測した。抗体はIgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4抗体およびIgM抗体を用いた。また捕体成分を測定するためにフローサイトメトリーの基礎設定を行った。同種異型の血清にて感作されたリンパ球に対し、捕体成分の含まれた同種同系血清(20ul)を付加し、活性化されたリンパ球における捕体系の活性を計測した。C1q, C3c抗体およびiC3b, C3d, C4d, C5, C5b-9抗体を用い、基礎実験を行った。患者の同意を得てヒトHLA抗体陽性患者血清を収集し凍結保存した。健康な成人の同意を得て、コントロールとして血清を収集し凍結保存した。研究協力者であるフロリダ大学Juan C. Scornik教授を訪問し、我々の研究計画の立案、実験系の確立、データの解析につき助言を頂いた。移植医療における超急性拒絶反応は移植片に対して反応する既存抗体があるときに起こると考えられており、補体と結合した抗体が内皮細胞を傷害しこれによって溶血や溶菌が起こる。しかし様々な捕体成分の活性化と、既存抗体の関連は未だ明らかでない。フローサイトメトリを用い補体活性化を直接計測する方法を確立し、HLA抗体による補体活性化のメカニズムを明らかにする。捕体成分を測定するためにフローサイトメトリの基礎設定を行った。当初、同種異型のマウス血清を用いる予定であったが、マウス血漿中の捕体成分が早期に失活したため、反応に乏しく測定困難であった。そのためヒト補体活性の測定を最初から行った。患者の同意を得て収集したヒトHLA抗体陽性患者血清と健康な成人の同意を得て、コントロールとして血清を収集した。また血液成分よりリンパ球を分離し凍結保存した。HLA抗体感作患者血清を用い、リンパ球に対する反応をフローサイトメトリ及びcomplement-dependent cytotoxicity (CDC) testにて計測した。またflow cytometryとCDC testとの比較を行った。さらに結合IgG量、IgGサブクラスと補体成分(C3b,C4d,C5b,C1q,C3d,iC3b,C5b-9)の比較検討も施行した。ドナー患者のTリンパ球に対し、flow cytometryによる結合IgG量とCDC testとの間に有意な相関関係はみられなかった。またC3b活性は結合IgG量、IgGサブクラスによるのではなく、レシピエント血清/ドナーTリンパ球の組み合わせで決定された。すべての患者において優位なIgGサブクラスはIgG1であった。HLA抗体感作患者血清に対しC3bはほぼすべての患者で陽性であり、最も鋭敏な補体成分と考えられた。またC4d、C5bも有用なパラメータであった。ヒト補体成分を測定することは、ドナー・レシピエント適合性の評価を進歩させる可能性があると思われた。

HLA抗体感作患者血清を用い、リンパ球に対する反応をフローサイトメトリ及びcomplement-dependent cytotoxicity (CDC) testにて計測した。この結果、Tリンパ球に対し、結合IgG量とCDC testとの間に有意な相関関係はみられなかった。またC3b活性は結合IgG量、IgGサブクラスによるのではなく、血清/リンパ球の組み合わせで決定された。すべての患者において優位なIgGサブクラスはIgG1であった。C3bはほぼすべての患者で陽性であり、最も鋭敏な補体成分と考えられた。またC4d、C5bも有用なパラメータであった。IVIGはHLA抗体による拒絶反応における細胞障害を阻害する効果があると報告されている。IVIGを用いた拒絶反応抑制メカニズムを検討した。IVIGは臨床で行われている大量ガンマグロブリン療法に準じ、32mg/ml使用した。この結果、IVIGは様々な特異性を持つHLA抗体の免疫グロブリン結合を阻害しなかったが、対照的にIVIGは用量依存性にC3b活性を抑制した。IVIGはHLA抗体レセプターに結合しその活性を阻害するのではなく、HLA抗体により活性化された後の補体系を抑制することが示された。当研究の結果、通常の仮説に反しCDC test、結合IgG量、IgGサブクラスは補体活性化の予測因子としては精度が低いことが示された。またHLA抗体の補体活性化を計測するために最も適したパラメータはC3bであり、精度の高い新たな移植患者選択システムとして使用可能である。IVIGはHLA抗体により活性化された補体系を抑制することが示され、免疫感作患者に対する移植医療を進歩させる可能性がある。当初マウス血清を用い補体の活性化を測定するる予定であったが、マウス血漿中の捕体成分が早期に失活したため、反応に乏しく測定困難であった。そのためヒト補体活性の測定を最初から行った。ヒト補体活性化の検討は予定通り進行しているため、おおむね順調である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、マグネティクビーズ法を用いBリンパ球を分離し、既存抗体がC3c,C4d活性に与える影響を検討する。今までの実験を総合し既存抗体による超急性拒絶反応のメカニズムを解析し、抗体関連型拒絶反応における捕体活性化を抑制する方法を開発する。
肥満におけるPPARSの役割:遺伝子改変ウサギを用いた研究

脂肪組織特異的にPPAR-γ2を過剰発現するように,脂肪細胞を標的にした発現ベクターであるAP2にラットPPAR-γ2cDNAを挿入したDNA構築物を作成し,ウサギ受精卵前核内にマイクロインジェクションを行った。その結果,1匹のファンダーウサギを得た。このファウンダーウサギをもとにF1ウサギを得て組織での導入遺伝子の発現をNorthern blot法で検討したところ,遺伝子導入ウサギの組織(特に大動脈とマクロファージ)で明らかにコントロールより高いPPAR-γ2 mRNAの発現が確認された。そこで,大規模な繁殖を行いF2ウサギを得て,通常食飼育下におけるPPAR-γ遺伝子導入ウサギの体重の推移血中のグルコースおよびインスリン値について検討を行った。しかし,これらの検討においていずれの項目もPPAR-γ遺伝子導入ウサギと通常ウサギとの間に有意な差は認められなかった。そこで,10%高脂肪食を4ヶ月間負荷して実験的肥満の誘導下におけるPPAR-γ遺伝子導入ウサギの体重の増加率,脂肪蓄積量,血中グルコースおよびインスリン値さらにグルコース負荷試験を行った。しかし,これらの検討においてもPPAR-γ遺伝子導入ウサギと通常ウサギとの問に有意な差は認められなかった。これらの結果について,今回実験に使用した遺伝子組換えウサギが1系統のみであったことと,導入した遺伝子がラット由来であったことから,PPAR-γの発現量が十分で無かった可能性,また,PPAR-γの種差による点も否定できない。そのため,新たにヒトPPAR-γを高発現する系統の作成と高発現系統を使用した追試を行う必要があると考えられる。現在,ヒトPPAR-γ遺伝子組換えウサギ作成実験の継続により新たに2系統のPPAR-γ遺伝子組換えウサギを得ることに成功している。今後,これらのPPAR-γウサギにおけるPPAR-γの発現解析,表現型解析,肥満実験の追試を行う予定である。まず,脂肪組織特異的にPPAR-γ2を過剰発現するように,脂肪細胞を標的にした発現ベクターであるAP2にラットPPAR-γ2 cDNAを挿入したDNA構築物を作成した。これを,倒立顕微鏡にセットしたマイクロマニュピレーターを用いて,マイクロインジェクション法によりウサギ受精卵前核内に注入した。ウサギ受精卵の採取には,濾胞刺激ホルモン(FSH)もしくは妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)を注射して過排卵処理を施した雌ウサギから採取した。22匹の雌ウサギより483個の卵を採取して342個の受精卵にインジェクションを行い,このうち225個をヒト絨毛性腺刺激ホルモン(hCG)の注射により偽妊娠を誘導した8匹の仮親ウサギの卵管内に移植した。その結果,5匹が妊娠し,18匹の仔ウサギを出産した。胚移植により生まれた仔ウサギの耳生検を行いDNAを抽出して,ラットPPAR-γに特異的なプローブもしくはプライマーを用いてSouthern blot法およびPCR法を実施したところ,これらのうちの一匹(雌)にラットPPAR-γ2遺伝子が導入されていることが確認された。さらに,この遺伝子導入が確認されたウサギをファウンダーとして野生型の雄ウサギを交配しF1ウサギを得て,組織での導入遺伝子の発現についてNorthern blot法で検討したところ,遺伝子導入ウサギの組織(特に大動脈とマクロファージ)で明らかにコントロールより高いPPAR-γ2 mRNAの発現が確認された。現在,今後の計画を実施するためPPAR-γ遺伝子導入ウサギの大規模な繁殖を行うとともに,生まれてきたF2ウサギを用いて体重,血清脂質などの基礎的データの採取を開始した。今進行中の実験としては(1)高脂肪食による肥満、糖代謝におけるPPAR-γ2の作用検討

(2)コレステロール食負荷による動脈硬化発生および進展におけるPPAR-γ2役割の解析である。まず,PPAR-γ遺伝子導入ウサギの通常食飼育下における体重の推移,血中のグルコースおよびインスリン値について解析を行った。また,16週齢の時点でグルコースならびにインスリン負荷試験を実施し,糖代謝能に関する検討を行った。体重の推移,血中グルコースおよびインスリン値にPPAR-γ遺伝子導入ウサギと対照群との間で有意な差は認められなかった。グルコースならびにインスリン負荷試験における血中グルコース値の推移,曲線下面積にPPAR-γ遺伝子導入ウサギと対照群との間で有意な差は認められなかった。次に,肥満におけるPPAR-γの役割についてさらに検討を進めた。PPAR-γ遺伝子導入ウサギおよび対照ウサギに16週齢から10%高脂肪食を4ヶ月間負荷して実験的肥満を惹起した。しかし,高脂肪食負荷後の体重の増加率,脂肪蓄積量,血中グルコースおよびインスリン値,さらにグルコース負荷試験の結果にPPAR-γ遺伝子導入ウサギと対照群との間で有意な差は認められなかった。現在,これらの結果についてさらに詳細に検討するため,現在のラインよりもPPAR-γを高発現する遺伝子組換えウサギラインの作製実験を行っている。今後の計画としては,新たに作製した高発現ラインを用いて(1)高脂肪食による肥満、糖代謝におけるPPAR-γ2の作用の再検討,(2)コレステロール食負荷による動脈硬化発生および進展におけるPPAR-γ2役割の解析である。これまでの研究成績よりPPAR-γ遺伝子導入ウサギの通常食飼育下および10%高脂肪食下における体重の推移,糖代謝能ならびに動脈硬化に関する検討を行ってきたが,いずれもPPAR-γ遺伝子導入ウサギと対照群との間で有意な変化は認められなかった。これらの原因の一つとして遺伝子組換えウサギにおけるPPAR-γの発現量が十分でなかった可能性を否定できない。そこで,さらにPPAR-γを高発現する遺伝子組換えウサギによる追試を行うことを目的に,本年度は,現在のラインよりもPPAR-γを高発現する遺伝子組換えウサギラインの作製実験を行なった。その結果,マイクロインジェクション後の正常胚約1500個を48匹の仮親に胚移植したところ,26匹が妊娠し,83匹の産仔を得ることができた。これら胚移植後に得られた産仔について遺伝子解析を行ったところ,4匹に遺伝子導入が確認された。このうち,離乳時まで生存したのは2匹であった。したがって,我々は現在までに2匹の新たなファウンダーウサギを得ることに成功している(P57系統P97系統)。しかし,残念ながらいずれも雌であったため,発現解析および肥満,動脈硬化の実験に必要な数のウサギを得るためのウサギコロニーの拡大に時間を要している。このうち,P57系統はF1を得るための繁殖を開始しているが,P97系統についてはファウンダーが性成熟に達するのを待っている段階である(雌ウサギの性成熟は4-5ヶ月)。
東アジア証券市場の上場企業における公正価値会計の適用実態に関する実証分析

本研究は、日本、中国、韓国の会計制度を対象に,公正価値会計の意義を再評価し,公正価値会計の将来的な展開の可能性を実証的かつ理論的に検討した結果、日本のみならず、韓国、中国においても会計制度の2分化現状が起きており、上場大企業向けの会計基準と中小企業向けの会計基準を設定することにより、実務のニーズに合った会計制度の設計が行われており、業種別規模別のニーズにあった会計基準を策定することが本来の会計基準の在り方であると結論づけた。本研究は,会計基準の国際的なコンバージェンスを前提として,会計基準,会計実務,市場システム(法制度・会社制度)を対象に,1990年代に生成した公正価値会計の意義を再評価し,公正価値会計の将来的な展開の可能性を実証的かつ理論的に検討することを目的とするものである。この研究目的に照らして、平成22年度は、IFRSを導入して策定された2006年中国会計基準および2011年から強制適用される韓国版IFRSの適用状況の分析を行うための基礎データおよび関連文献の収集を行うとともに、日本の上場企業を対象に実施したリース会計情報の価値関連性に関する実証結果について中国の研究協力者・魏明海教授の在籍する中山大学管理学院および広州大学商学院で特別講演(2010年11月8日・9日)を行った。さらに、12月には東北財経大学会計学院の王春山先生を訪問し、中国での公正価値会計の適用実態について分析するための研究方法について教示いただくとともに、公正価値会計に関する中国での先行研究および中国財政部による会計基準適用実態に関する報告書を入手した。2011年1月には連携研究者の川原尚子教授とともに韓国の啓明大学経営学部のDoSangho教授・KimJungmin教授を訪問し、韓国版IFRSが2011年1月から強制適用されることを受けて韓国における適用実態の研究方法について教示いただくととともに、韓国会計学会の年次大会プロシーディングスを入手した。韓国では、完全版IFRSを国内化している状況で会計研究の方法論に関する議論が活発で、基準設定の基礎にある概念フレームワークに関する基礎理論研究へ回帰する傾向があることが分かった。さらに、2011年2月には川原尚子教授がロンドンの大手アカウンティングファームおよび国際会計基準審議会を訪問し、アジア圏でのIFRS適用状況に関する資料の収集および原則主義会計基準としてのIFRSの適用のあり方と監査についてその本質について聞き取り調査を行った。なお、本研究の研究成果の一部として、5件の研究報告を行った。この研究目的に照らして、平成23年度は、中国における公正価値会計の適用状況について趙彦峰他『公正価値会計研究』(経済科学出版社、2010)に基づいて文献的研究を行なうとともに、規模別会計基準の設定で先行している中国小企業会計準則の日本語への翻訳を行った。また、平成23年11月26日に日中韓国際会議を開催し、中国の東北財経大学および韓国の啓明大学から研究者を招へいし、両国における新会計基準の導入状況について、シンポジウムを開催した。さらに、平成24年1月に上海証券取引所において中国における公正価値会計の適用状況に関する聞き取り調査を行った。中国の経済状況や上場企業の8割が製造業であることを考えるとIFRSのアドプションはあり得ず、会計基準が法律となっていることからも立法権を放棄することになるので引き続きコンバージェンスを行う方針であることがわかった。また、コモンコントロールが一般的であるので企業結合における持分プーリング法の堅持、中国国営企業を保護する観点から関連当事者間取引の開示範囲の限定、市場が未成熟な状態にあるため賃貸用投資不動産の公正価値評価の回避など、重要な部分でカーブアウトしていることが判明した。このようなことを考えると日本はIFRSについて必要な会社が任意適用で、業種別規模別のニーズにあった会計基準を策定することが本来の会計基準の在り方ではないかと考えるに至った。上海の中欧工商管理学院(China Europe International Business School)では本研究の一部として経営者による予測情報の意義について研究報告を行った。とりわけ、韓国、中国におけるIFRS導入に伴う問題点を明らかにすることにある。中国については、中国の経済状況や上場企業の8割が製造業であることを考えるとIFRSのアドプションはあり得ず、会計基準が法律となっていることからも立法権を放棄することになるので引き続きコンバージェンスを行う方針であることがわかった。

また、コモンコントロールが一般的であるので企業結合における持分プーリング法の堅持、中国国営企業を保護する観点から関連当事者間取引の開示範囲の限定、市場が未成熟な状態にあるため賃貸用投資不動産の公正価値評価の回避など、重要な部分でカーブアウトしていることが判明した。なお、韓国についてはK-IFRSの適用開始後の状況について引き続き研究を行いたい。また、日本、韓国、中国のみならず、アメリカやカナダ、イギリスにおいても会計制度の2分化現状が起きており、上場大企業向けの会計基準と中小企業向けの会計基準を設定することにより、実務にニーズの合った会計制度の設計が行われるようになっている。以上を踏まえ、日本はIFRSについて必要な会社が任意適用で、業種別規模別のニーズにあった会計基準を策定することが本来の会計基準の在り方ではないかと考えるに至った。本課題の申請テーマは中国と韓国における公正価値会計の適用状況を分析するとともに、規模別会計基準の在り方を検討することに究極の目的がある。中国における会計基準の適用状況に関する公表データがないため、この点については文献研究と聞き取り調査に依存せざるを得ない。また、韓国は2011年1月からK-IFRSの強制適用が始まったため、韓国については平成24年度に調査を行いたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。韓国における公正価値会計の適用状況の研究については、英語による情報入手が困難なであることから、中国における適用状況の研究の制度研究と実証研究に焦点をあてて進めていきたい。
歩行運動のリズム発生機序における階層機構の解明

薬物投与により、脊髄ネコの脊髄内に存在するcentral pattern generator(CPG)を駆動し、頚筋、前肢筋、体幹筋、後肢筋、尾筋に走る末梢神経を分離して、それぞれのニューログラムを記録し、次いで、脊髄切断により、各部位のCPG間の階層構造を調べた。その結果、後肢筋のCPGがもっとも独立性が高く、前肢筋のCPGは後肢筋のCPGから抑制効果を受けていること、および頚筋のCPGは、頚筋より尾側に存在するCPGから側通性効果を受けていることが明らかとなった。除脳ネコを用いて、中脳に存在するmidbrain locomotor region (MLR)を電気刺激してCPGを駆動させた。CPGの律動性放電活動を、頚筋、体幹筋、後肢筋に走る筋神経からニューログラムとして記録した。その結果、MLRの電気刺激によって頚筋と体幹筋の筋神経からも律動性放電の記録されることを始めて明らかにした。MLR電気刺激によって筋神経に律動性放電活動が出現する割合は筋神経によって異なり、後肢筋の神経の出現律が頚筋と体幹筋のそれらよりも高く、脊髄内に存在するCPGは、その存在する部位によって出現率が異なること、すなわち、階層構造をなしていることを明らかにすることができた。さらに、腰最長筋を支配する筋神経を第一腰髄、第三腰髄、第五腰髄から分離して、MLR電気刺激時の各筋神経からの律動性放電の出現率を調べたところ、第一腰髄神経における出現率がもっとも高く、第五腰髄神経殻には律動性放電が出現しなかった。この事実は、ひとつの筋を動かすCPGのなかにおいても階層構造が組み込まれている可能性を示唆した。歩行運動において、頚筋、前肢筋、体幹筋、後肢筋、尾筋は、それぞれ脊髄内に存在するcentral pattern generator(CPG)によって駆動されていることが明らかにされているが、これらのCPG間には、階層構造が存在するか否かは不明である。そこで、この階層構造の有無を明らかにすることを実験目的とした。人工呼吸下で、33頭の高位脊髄猫の、板状筋(頚筋)、上腕二頭筋・上腕三頭筋(前肢筋)、最長筋(体幹筋)、大腿二頭筋・腓腹筋(後肢筋)、外背側仙尾筋(尾筋)の各神経を分離後、ニアラマイドおよびL-DOPAを投与して、central pattern generatorを駆動させた。各筋のニューログラムに律動性放電の認められた20頭のうち、10頭の猫において、複数の部位の脊髄分断を行い、それぞれのニューログラムの変化を調べた。1) CPGの駆動順位は、後肢、前肢、頚部、体幹と尾部の順であった。2)尾端の機械刺激により、すべてのニューログラムに促通効果が認められた。3)頚筋のニューログラムは、C4-5頚髄切断後、ほとんどが消失した。4)前肢筋のニューログラムは、T7-8胸髄切断後、ほとんどが消失した。5) T7-8胸髄切断後、体幹筋神経のニューログラムに律動性放電の出現した例があった。6)尾筋のニューログラムは、脊髄切断の影響を受けなかった。7)各部位のCPGには、階層構造が存在し、後肢筋のCPGがもっとも独立性が高く、前肢筋のCPGは、後肢筋のCPGから抑制性効果を受けていること、および頚筋のCPGは、頚筋より尾側に存在するCPGから促通性効果を受けていることが明らかとなった。28頭の除脳

ネコを用いて、頚筋(板状筋)、体幹筋(腰最長筋、外腹斜筋)、後肢筋(大腿二頭筋・半腱様筋、腓腹筋・ひらめ筋)に走る筋神経を分離して記録電極に乗せてから、中脳に存在するmidbrain locomotor region(MLR)を電気刺激して脊髄内にプログラムされているcentral pattern generator(CPG)を駆動させた。CPGが駆動された結果生ずる運動ニューロンの律動性放電活動を、これらの筋神経からのニューログラムとして記録した。その結果、MLRの電気刺激によって頚筋と体幹筋の筋神経からも律動性放電の記録されることを始めて明らかにした(J.Vet.Med.Sci.,59,951-952,1997)。MLR電気刺激によって筋神経に律動性放電活動が出現する割合は筋神経によって異なり、後肢筋の神経の出現率は50%であったが、頚筋は14%、と体幹筋は14%と25%であり、脊髄内に存在するCPGは、その存在する部位によって出現率が異なること、すなわち、階層構造をなしていることを明らかにすることができた。さらに、10頭の除脳ネコを用いて、腰最長筋を支配する筋神経を第一腰髄、第三腰髄、第五腰髄から分離して、MLR電気刺激時の各筋神経からの律動性放電の出現率を調べたところ,第一腰髄神経における出現率は約50%ともっとも大きく、第五腰髄神経殻には律動性放電が出現しなかった。この事実は、ひとつの筋を動かすCPGのなかにおいても階層構造が組み込まれている可能性を示唆している。
新規抗ガン剤開発に向けたヘパラナーゼの構造基盤の解明

ヘパラナーゼはヘパラン硫酸を特異的に分解するエンドグリコシダーゼの一つで、ガンの転移や浸潤に関与することが知られている。本研究では、ヘパラナーゼの立体構造を明らかにすることを目的として研究を開始した。大腸菌やカイコ等を用いて様々な発現系を検討し、目的のタンパク質を1Lの培養液から約5mgの可溶性画分として得ることに成功した。得られた組換えタンパク質を用いて抗体を作製し、ELISAでヘパラナーゼ特異的に反応することを確認した。作製した抗体およびヘパラナーゼとの複合体での結晶化を試み、微結晶を得ることに成功した。また、他のヘパラナーゼ型のβ-グルクロニダーゼについても単結晶を得ている。ヘパラナーゼはヘパラン硫酸を特異的に分解するエンドグリコシダーゼの一つで、ガンの転移や浸潤に関与することが明らかとなり、様々な生化学的研究が進んでいるが、立体構造に関しては未だ解明されていない。そこで、ヘパラナーゼの立体構造を決定し、ヘパラナーゼの酵素反応メカニズムを分子レベルで明らかにすることを目的として研究を開始した。昨年度、pETベクターを用いた大腸菌での発現系を構築し、目的のタンパク質を可溶性画分として得ることに成功したが、結晶化条件を検討するには十分な量が得られなかった。そこで、本年度は不溶性画分の巻き戻しを行うため、界面活性剤の種類や濃度の検討を行った。その結果、SDS-PAGEやウエスタンブロッティングにより可溶性画分に目的のタンパク質のバンドを確認することができた。また、リンカーの長さやリンカーを構成するアミノ酸の種類を変えたコンストラクトやpColdベクターを用いた発現系を検討したところ、pColdベクターの系では巻き戻し操作を必要としない可溶性画分に目的のタンパク質が発現する条件を見いだした。さらに、p-ニトロフェニルグルクロナイドを基質としてβ-グルクロニダーゼ活性を測定したところ、調製した組換えタンパク質は酵素活性を有していることが明らかとなった。現在、得られた組換えタンパク質を精製し、結晶化条件を検討中である。また、他のヘパラナーゼ型のβ-グルクロニダーゼについても組換えタンパク質の発現系を検討している。ヘパラナーゼはヘパラン硫酸を特異的に分解するエンドグリコシダーゼの一つで、ガンの転移や浸潤に関与することが明らかとなっており、様々な生化学的研究が進んでいるが、立体構造に関しては未だ解明されていない。昨年度、pETベクターを用いた大腸菌での発現系を構築し、界面活性剤の種類や濃度の検討を行ったところ目的のタンパク質を可溶性画分として得ることに成功した。今年度は、さらに改良を加え、1Lの培養液から約5mgの組換えタンパク質を得ることに成功した。また、得られた組換えタンパク質を用いて抗体を作製し、ELISAでヘパラナーゼ特異的に反応することを確認した。前年度、ヘパラナーゼ単体での結晶化に取り組み、微結晶が得られたものの構造解析には適していなかったので、今年度は抗体と結合させることで安定化し質の良い結晶が得られる可能性があると考え、結晶化を行う際に作製した抗体を添加して検討した。その結果、前年度と同様、微結晶しか得られなかった。また、他のヘパラナーゼ型のβ-グルクロニダーゼについても組換えタンパク質の発現を検討したところ、カイコを用いた発現系で体液中に発現し、ブレビバチルスを用いた発現系でも可溶性に発現した。そこで、アフィニティーカラムやイオン交換カラムを用いて精製し、結晶化を行ったところ、単結晶を得ることに成功した。ヘパラナーゼはヘパラン硫酸を特異的に分解するエンドグリコシダーゼの一つで、ガンの転移や浸潤に関与することが明らかとなっているが、立体構造に関しては未だ解明されていない。そこで、ヘパラナーゼの立体構造情報を決定し、ヘパラナーゼの酵素反応メカニズムを分子レベルで明らかにすることを目的として研究を開始した。まず、ラットヘパラナーゼ全長をコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌発現用のプラスミドpET15bに組み込み発現系を構築した。大腸菌BL21(DE3)を用いて発現を試みたが封入体に多く発現していたため、宿主(大腸菌rosetta2(DE3)あるいはrosetta-gami2(DE3))や培養温度、コールドショックベクター等の検討を行ったが、改善しなかった。また、pFastBac1に組み込んだものをトランスポジションしてバクミドを作製し、カイコ幼虫での発現も検討したが、SDS-PAGEで目的のバンドが見られなかった。

ヘパラナーゼはプロセッシングを受け、8kDaと50kDaのヘテロダイマーを形成して活性を示すことから、それぞれのドメインをリンカーでつないだ発現系の作製を行ったところ、少量ではあるが可溶性として調製することに成功した。ウエスタンブロッティングにより、目的のタンパク質であることも確認済みである。巻き戻し操作を必要としない可溶性画分として目的のタンパク質を調製できたことは、今後の機能および構造解析にとって大きな一歩であると考えられる。結晶化やモノクローナル抗体作製に必要な組換えタンパク質を大腸菌を用いた発現系で短時間で大量に、また活性を持った状態での調製に成功した。また、他のヘパラナーゼ型のβ-グルクロニダーゼについても発現系の構築に着手している。(1)最初のステップである「タンパク質の発現」がなかなか上手くいかず、様々な発現系を作製するのに時間がかかった。(2)出産のため、10月13日以降産前休暇を取得したので、実験期間が半年間しかなかった。現在、得られているラットヘパラナーゼに加え、他のヘパラナーゼ型のβ-グルクロニダーゼについても同様に結晶化条件の検討を行う。また、モノクローナル抗体が得られれば、ヘパラナーゼとの複合体についても結晶化条件を検討する予定である。まずは、前年度に検討したタンパク質の発現条件について再現性を確認し、大量に調製する。もし、予想より収量が低ければ、封入体の巻き戻し反応や、動物細胞であるHEK293細胞を用いた発現を検討する。また、ラット以外のヘパラナーゼ(例えばヒトやマウス等)を用いることも考えている。ヘパラナーゼが大量に調製にできたら、精製し、結晶化条件を検討する。また、モノクローナル抗体を作製し、抗体が得られればヘパラナーゼとの複合体についても結晶化条件を検討する予定である。ラットヘパラナーゼ以外のヘパラナーゼ型β-グルクロニダーゼについても、組換えタンパク質を調製し、精製および結晶化を行うので、精製に必要なイオン交換カラムやゲルろ過カラムを購入する。また、結晶化条件検討に必要な結晶化試薬および結晶化用プレートを購入する。当初の計画通り、得られたヘパラナーゼを精製するために、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを使用する。また、結晶化条件検討のため、結晶化試薬および結晶化用プレートを購入する。さらに、モノクローナル抗体の作製のため、抗体産生細胞培養用の培地やプレート等を購入する。
電子レンジ加熱した市販総菜中の内分泌攪乱化学物質濃度の測定

内分泌攪乱化学物質(ビスフェノールA、フタル酸エステル類)の食品容器から食品への移行の測定例は現在までのところ少ない。そこで本研究は基礎的データを得る目的で、近年ますます購買層の拡大しているプラスチック容器入りの総菜に着目し、購入時及び電子レンジ加熱した後のビスフェノールAとフタル酸化合物を測定した。1)フタル酸化合物:周りの環境からの混入を排除するのはなかなか困難で、ブランクは高い値となった。クリーンアップは、日本環境化学会の定めた方法を一部改変したのみで割合簡単に行え、抽出効率は7585%であった。同定はGCMSで、測定は逆相HPLC、絶対検量線法で行った。本法では10種のエステルが分離可能であったが、定量下限値を超えて頻繁に検出されたのはフタル酸ジ-n-ブチルフタル酸ジブチルベンジル、フタル酸ジ-2-エチルヘキシルで、この3種物質により、脂肪分の多い食品に溶出しやすさ、レンジ加熱による増減などは異なった。2)ビスフェノールA:蛍光検出器を用いたHPLCで感度よく測定できるが、試みたクリーンアップ法2種では食品中の來雑物を除けず,Tsuda, T. et al., J. Chromatogr. B, 723, 273(1999)の方法で抽出、クリーンアップ後、同定、測定共にGCMSで行った。標準物質の測定を6回以上行い、標準偏差(s)を求め、3_sを検出下限値、10_sを定量下限値とした。食品4種を用いて測定したところ、食品中の脂質が多いほどビスフェノールA(BPA)含量は高く、加熱後のBPAは増加していた。また、容器にサラダ油を入れ、室温に3h放置、100°C5minおいたものを比べたところ、BPAの移行は後者で高かった。食品中、1食分で1日の許容摂取量の6%というものが最高であったが、今後食品の取り方によっては無視できない値となる可能性もある。1.まず、日本環境化学会の定めた方法に基づき、標準物質を加えて抽出効率の良い抽出法及びクリーンアップ方法の検討を行った。1)フタル酸化合物:抽出は周りの環境からの混入を排除するのはなかなか困難であった。抽出効率は7585%で、もう少し効率を上げる予定である。クリーンアップは、これまでに試みた限りでは割合簡単に行えそうである。測定は本年は逆相液体クロマトグラフィーで行い、今のところ10種のフタル酸エステルが分離可能である。今後さらに食品の測定数を増やし、テイクアウト食品中に含まれる量、加熱することによる量の変化を明らかにする予定である。2)ビスフェノールA:日本環境化学会のクリーンアップ法ではビスフェノールAの溶出時間近辺にまだ多くの化合物が含まれていた。クリーンアップ法についていろいろ検討したが、余りよい結果が得られていない。そこで、液体クロマトグラフィーの条件を検討中である。2.モデル実験のための固相抽出法様々な調味液を調整し、容器に入れて電子レンジ加熱の前後での、フタル酸エステル、ビスフェノールA量の変化を見るため固相抽出を試みた。水系では回収率は100%に近い値が得られた。
思春期の運動習慣形成、及び骨量に影響を及ぼす環境要因の解明

本研究は、思春期の運動習慣の形成、及び骨量増大に関連する環境要因を検討することを目的として実施した。その結果、低出生体重の女子、及び両親の学歴がともに13年以上(短大・大卒以上)である女子の運動時間が少ないこと、家庭の社会経済状況が低い男子はスポーツクラブに所属している割合が少ないこと等、子どもを取り巻く社会環境が子どもの運動時間に影響する可能性が示唆された。また、思春期の骨強度増大は、運動時間だけでなく、座位時間の影響を受ける可能性が示唆された。本研究は、現在継続中の出生コホート研究のデータを用いて、思春期の運動習慣形成、及び骨量に影響を及ぼす環境要因を検討し、思春期の運動習慣形成、及び骨量増大に寄与する要因を明らかにすることを目的としている。平成26年度は、これまで継続して実施している小学4年生から中学3年生を対象とした骨強度測定、及び生活習慣調査を実施した。また、これまでの蓄積データを用いて、出生体重(2,500g以上か未満か)と小中学生の運動習慣(1週間あたり7時間以上か未満か)との関連を検討した。その結果、必要なデータが得られた児童生徒は726名(男子401名、女子325名)であり、そのうち出生体重が2,500g未満である低出生体重児は55名(7.6%)、小中学生期の運動時間が7時間/週未満のものは266名(36.6%:男子28.2%、女子47.1%)であった。男子では出生体重と小中学生の運動時間に有意な関連はみられなかったが、女子では、出生体重が2,500g未満である児童生徒は出生体重が2,500g以上の児童生徒と比較して、小中学生の一週間の総運動時間が7時間未満になる割合が有意に高かった(Prevalence Ratio 1.84, 95%信頼区間: 1.35-2.50)。機序や性差の理由など、今後更なる検討が必要であるが、小中学生の女子において、出生体重(2,500 g未満)が推奨運動時間(1日60分以上)を満たさない要因となる可能性が示唆された。本研究は、現在継続中の出生コホート研究のデータを用いて、思春期の運動習慣形成、及び骨量に影響を及ぼす環境要因(胎内環境、家庭環境、近隣環境、学校環境等)を検討し、思春期の運動習慣及び骨量増大に寄与する要因を明らかにすることを目的として実施している。平成27年度はこれまで継続して実施している小学4年生から中学3年生を対象とした骨強度測定、及び生活習慣調査を実施した。また、当初の計画通り加速度計を用いた身体活動量調査、及び社会環境と子どもの運動時間調査を実施した。さらに、生涯にわたる運動習慣形成に関連する要因を把握するために、当初の計画に追加して高齢者を対象としたスポーツグループの参加に関連する要因の検討も行い、論文発表にて成果を報告した。環境要因と思春期の運動習慣の関連について、今年度は家庭環境の観点から両親の社会経済状況(両親の教育歴)と子どもの運動時間について検討を行った。その結果、女子において、母親の教育歴が12年以上(短大卒業以上)の児童生徒は、12年未満(高校卒業まで)の児童生徒と比較して、一週間の総運動時間が7時間未満である割合が有意に高いことが示された(12年以上:50.9% vs 12年未満:36.8%, PR: 1.31, 95%信頼区間: 1.01-1.71)。父親の教育歴とは関連がみられなかった(PR: 0.94, 95%CI: 0.73-1.21)。また、男子では、両親の教育歴と運動時間に有意な関連はみられなかった。今後は、母親の教育歴が高い女子小中学生の運動機会を増加させる、介入可能な要因を探索することが必要である。平成27年度に実施予定であった内容(1骨強度測定、生活習慣調査の実施、2加速度計を用いた身体活動量調査、3社会環境と運動時間調査)が当初の目的、計画通りに遂行できているため。本研究は現在継続中の出生コホート研究のデータを用いて、思春期の運動習慣形成、及び骨量に影響を及ぼす社会環境要因を検討し、子どもの運動習慣形成、及び骨量増大に寄与する要因を明らかにすることを目的としている。平成28年度は、平成18年から継続して実施している小学4年生から中学3年生を対象とした骨強度測定と生活習慣調査を実施するとともに、昨年度実施した加速度計を用いた身体活動量調査と社会環境要因に関する質問紙調査より、以下の3つの関連の検討を行った。1家庭の社会経済状況とスポーツクラブの所属の有無、及び身体活動量の関連、2スポーツクラブ等の所属とGrit(やり抜く力)との関連、3加速度計で測定した身体活動、座位時間と骨強度の関連各結果の概要は以下のとおりである。1男子において、社会経済状況が高い家庭の子どもはスポーツクラブに所属している割合が多かった。2スポーツクラブに所属している男子は、根気スコア(Gritスコアの一部)が高かった。3男女ともに、中強度以上の身体活動(歩行以上の運動)時間が長いほど、骨強度が高かった。女子では1日の中で座っている時間が短いほど骨強度が高かった。また、当初の計画に追加して、生涯にわたる運動習慣形成に関する要因を検討するため、子どもの頃の社会経済状況と高齢期におけるスポーツ関係のグループへの参加との関連を検討した。

その結果、男性において、子どもの頃に低い社会経済状況であった人は高齢期にスポーツ関係のグループに参加する割合が少なかった。加えて、昨年度検討を行った両親の学歴と子どもの運動時間について、論文発表にて成果を報告した。本研究は、思春期の運動習慣の形成、及び骨量増大に関連する環境要因を検討することを目的として実施した。その結果、低出生体重の女子、及び両親の学歴がともに13年以上(短大・大卒以上)である女子の運動時間が少ないこと、家庭の社会経済状況が低い男子はスポーツクラブに所属している割合が少ないこと等、子どもを取り巻く社会環境が子どもの運動時間に影響する可能性が示唆された。また、思春期の骨強度増大は、運動時間だけでなく、座位時間の影響を受ける可能性が示唆された。平成26年度に実施する予定であった内容(1骨強度測定、質問紙調査の実施、2出生体重と運動習慣との関連の検討、3各学校への調査結果の還元、4次年度調査に向けた児童生徒の社会環境に関する質問票の検討)が当初の目的、計画通りに進められているため。これまでと同様に計画通り、平成28年度の骨強度測定、及び生活習慣調査を実施する。また、これまでの研究成果を学術論文として発表するとともに、昨年度実施した身体活動量調査、及び社会環境と運動時間に関する調査データをまとめ、子どもの運動時間や骨量獲得に影響を及ぼす要因を検討する。研究から得られた情報を対象の児童生徒に身近に知ってもらい、骨量増大や運動習慣形成のきっかけに少しでもなるよう、最終年度までの骨量に関する結果をまとめたポスターを作成し、対象の全小中学校へ配布した。運動疫学平成26年度と同様に平成27年度の骨強度測定、及び生活習慣質問紙調査を実施する。また、出生体重と小中学生の骨量との関連について検討を行う。さらに、家庭環境、近隣環境、学校環境等の社会環境要因に関する調査を実施し、小中学生の運動習慣、及び骨量との関連を検討する。前年度の未使用額を含め、交付金額内で今年度の研究計画を遂行するよう努めたが、すべてを正確に調整することはできず、若干の未使用額が生じた。当初の計画では、超音波骨量測定装置(Achilless A-1000Insight, Lunar)を購入する予定であったが、販売用の機器がなく(別モデルに変更されたため)、レンタル用の同機器を使用することに変更したため、未使用額が生じた。未使用額分は次年度の予算に含め、当初の計画通り、骨強度測定に必要な経費(超音波骨量測定装置のレンタル費用、消耗品の購入、測定補助者への謝金や交通費、及び生活習慣調査に用いる調査票、結果票などの印刷費や通信費等)、及び情報収集や研究成果の公表に関する費用(論文の作成に関わる英文校正費や投稿料、掲載料、学会発表に関わる諸費用や旅費等)に使用する予定である。今年度未使用額分については、次年度も同様に超音波骨量測定装置(Achilless A-1000 Insight, Lunar)のレンタル費用に支出するとともに、当初の予定で費用不足のために購入台数が限られていた活動量測定機器の購入費用に充当する。
リンパ管内皮細胞特異的カドへリンのクローニング

まず、リンパ管内皮細胞を得るために犬の胸管内皮細胞を剥離培養して、数回の経代を経たものをその後の実験に供した。(1)培養リンパ管内皮細胞のmRNAを抽出後、動物間でも保存性の高いCytoplasmic domainにDegenerate primerを設定しRT-PCRを行った。その結果、リンパ管内皮細胞でも予想される大きさにPCR productが観察された。(2)予想される大きさのPCR productをPCR II TOPOベクターに組み込んで、recombinantの単一コロニーを採取し、sequenceを行ってカドヘリンらしいクローンを拾った。(3)その結果人のカドヘリン5とカドヘリン10に相同性の高いクローンが得られた。(4)カドヘリン5に対する抗体で、培養犬胸管内皮細胞を染色するとCell contactの部位に発現が見られた。(5)カドヘリン5に対する抗体でWestem blottingを行うと、HUVEC(人臍帯静脈内皮細胞よりも少し小さな135kDaのシグナルが得られた。(6)カドヘリン5のCytoplasmic domainのsequenceを犬と人で比較すると、homologyは78%で犬のほうがやや短く、これが分子量の差になっているものと思われた。(7)一方、カドヘリン10のcharacterizationは現在までのところ乏しく、胎生期に脳での発現が報告されているが、血管やリンパ管内皮細胞での報告はない。(8)そこで、種々の培養細胞でカドヘリン10のmRNAの発現をNorthem blottingで観察したところ、HUVEC,DTECの他にGlioma,glioblastoma.Hela.MDBK等で発現があり、特にglioma,glioblastomaで発現が強かった。(9)人のカドヘリン10のcDNAの全長を得るため、人のカドヘリン10のCytoplasmic domainをprobeとして、HUVECのcDNA libraryをスクリーニングした。(10)その結果、全長2.4kbのcDNAが得られた。ChickのCadherin 10との相同性は96.1%と高く、Cadherin 10のHuman homologueと考えられた。以上より、得られたクローンはカドヘリン5と10と考えられた。リンパ管内皮細胞はカドヘリンの種類としては血管内皮細胞と同じ性格を有しているが、いままでに報告のないカドヘリン10の発現がリンパ管内皮細胞にもみられた。カドヘリン10は内皮細胞だけではなく、幅広い組織内分布が予想され、各細胞に共通の性格があるものと推測された。まず純度の高いリンパ管内皮細胞を得るため、犬の胸管内皮細胞のprimary cultureを手に入れた。そして、mRNAを分離しcDNAを合成した後、カドヘリンの細胞内ドメインのうち極めて保存性の高いPPYDTL(アミノ酸配列)とWGPRFK(アミノ酸配列)で混合プライマーを作成し、犬胸管内皮細胞のcDNAをtemplateとしてPCRを行い、TA cloningの後シークエンスを行った。その結果2種類のカドヘリン分子が増幅された。

さらに、細胞内ドメインの保存性の高いEGGGEE(アミノ酸配列)の混合プライマーと2種類のカドヘリンのspecific primerとで同様にPCR、TA cloning sequenceを行い、細胞内ドメインの約2/3の長さのカドヘリン2種類が増幅された。1つ(CADLAB)はカドヘリン5(Vカドヘリン)によく似ているが、相同性は78%で増幅された範囲でカドヘリン5よりも8残基短くwestern blotでやや全体の分子量がやや小さいことが予想され、リンパ管内皮細胞特異カドヘリンの候補遺伝子と考えられた。もう一方(CADLAD)は、カドヘリン10とよく類似していて、増幅された長さは全く一致しアミノ酸レベルで相同性92%を示した。従って、CADLADはカドヘリン10の異種相同分子と予想された。今後、犬の血管内皮細胞(大動脈のprimary culture)を使用して同様の実験を行い、CADLABと異なるカドヘリン5の異種相同分子の存在を確認し、候補遺伝子の全長のシークエンスを完成させる予定である。まず、リンパ管内皮細胞を得るために犬の胸管内皮細胞を剥離培養して、数回の経代を経たものをその後の実験に供した。(1)培養リンパ管内皮細胞のmRNAを抽出後、動物間でも保存性の高いCytoplasmic domainにDegenerate primerを設定しRT-PCRを行った。その結果、リンパ管内皮細胞でも予想される大きさにPCR productが観察された。(2)予想される大きさのPCR productをPCR II TOPOベクターに組み込んで、recombinantの単一コロニーを採取し、sequenceを行ってカドヘリンらしいクローンを拾った。(3)その結果人のカドヘリン5とカドヘリン10に相同性の高いクローンが得られた。(4)カドヘリン5に対する抗体で、培養犬胸管内皮細胞を染色するとCell contactの部位に発現が見られた。(5)カドヘリン5に対する抗体でWestern blottingを行うと、HUVEC(人臍帯静脈内皮細胞よりも少し小さな135kDaのシグナルが得られた。(6)カドヘリン5のCytoplasmic domainのsequenceを犬と人で比較すると、homologyは78%で犬のほうがやや短く、これが分子量の差になっているものと思われた。fig(7)一方、カドヘリン10のcharacterizationは現在までのところ乏しく、胎生期に脳での発現が報告されているが、血管やリンパ管内皮細胞での報告はない。(8)そこで、種々の培養細胞でカドヘリン10のmRNAの発現をNorthern blottingで観察したところ、HUVEC、DTECの他にGlioma,glioblastoma,Hela,MDBK等で発現があり、特にglioma,glioblastomaで発現が強かった。