hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非天然型天然物の生合成リデザインを指向する微生物二次代謝生合成系の精密機能解析

本研究では、微生物二次代謝産物の生合成系の遺伝子情報の拡大に努めながら、多様な二次代謝産物の生合成系を遺伝子・酵素,反応レベルで精密に機能を解析し、これらの遺伝子情報を基盤とした生合成リデザインによる新物質生産への応用することを最終的な目的としている。本年度は、主にポリケチド合成酵素におけるタンパク質ータンパク質の相互作用解析を行った。ポリケチド生合成においては、カルボン酸基質の運搬にアシルキャリアータンパク質(ACP)がしばしば用いられる。ACPは80個程度のアミノ酸からなる小さなタンパク質であり、生物種によらず活性部位のセリン残基が翻訳後修飾によりホスホパンテテイニル化されている。そのホスホパンテテイン鎖の末端のチオール基がカルボン酸基質とチオエステル結合を形成してアシル化ACPとなり、カルボン酸基質が運搬される。アシル基転移酵素(AT)がカルボン酸基質を適切なACPへと受け渡すためには厳密な認識機構が存在するはずであるが、ATとACP間の相互作用は弱いため、複合体構造解析は難しく、これまでにACPの認識機構に関する詳細な知見は得られていなかった。そこで本年度、trans-ATだけによってポリケチド鎖を構築するジソラゾールにおけるATのACP認識機構を解明することにした。まず、結晶化に適した安定な複合体を得るため、ATとACP間クロスリンク反応を用いた手法で検討することにした。基質を模倣した不可逆的阻害剤をパンテテイン部を介してACPに結合させることにより、ATとACPをクロスリンクさせ、複合体を得、結晶化にも成功した。さらに複合体構造を分解能2.03オングストロームにて決定することに成功した。この複合体の結晶構造により、他のATとACPの間のタンパク質間相互作用を予測するためのモデル構造となり得ると考えている。当初の予定であるマクロラクタム抗生物質やアミノグリコシド抗生物質の機能解析については、未だ論文としては仕上がっていないものの順調に進んでいる。さらに、抗生物質ホスホマイシンの生合成経路を明らかにするなど、他の抗生物質の生合成酵素の機能解析も進んでいる。これらを考えるとほぼ予定通りに研究計画が進んでいると考えられる。今後は、マクロラクタムポリケチド抗生物質やアミノ配糖体抗生物質の生合成遺伝子の機能解析をさらに進めて、それらの基質特異性の解明へと進めていく予定である。それらの結果を基に新規類縁体創製を目指す。また、ポリケチド合成酵素におけるタンパク質間相互作用の解明は重要な課題で有り、相互作用解析をさらに進めていく予定である。さらに、他の抗生物質の生合成に関する酵素の機能解析を進めて、生合成リデザインによる非天然型抗生物質創製に向けて、研究を発展させる予定である。本研究では、微生物二次代謝産物の生合成系の遺伝子情報の拡大に努めながら、多様な二次代謝産物の生合成系を遺伝子・酵素,反応レベルで精密に機能を解析する。さらに、これらの遺伝子情報を基盤とした生合成リデザインによる新物質生産への応用することを最終的な目的としている。本年度は、主にヌクレオシド系抗生物質アリステロマシンおよびマクロラクタム抗生物質インセドニン及びクレミマイシンの生合成酵素の機能解析を行った。1)アリステロマシンの生合成酵素の機能解析炭素五員環含有型抗生物質アリステロマイシンの生合成機構を酵素反応レベルで解明することを目的として、アリステロマイシン生合成遺伝子クラスターを特定し、さらに、糖質から炭素五員環型サイクリトールリン酸を形成する酵素Ari2の機能解析を行い、Ari2がフルクトース-6-リン酸を基質、NAD+を補酵素とした反応を触媒し、炭素5員環生成物を与えることを明らかにした。2)マクロラクタムポリケチド抗生物質インセドニン及びクレミマイシンの生合成酵素の機能解析本申請者らは、既にマクロラクタム抗生物質ビセニスタチン開始基質の生合成経路を酵素レベルで解明してきた。さらに、マクロラクタム抗生物質の開始基質であるβ-アミノ酸を運搬する酵素であるVinNホモログが、各天然物の生合成経路に特異的なβ-アミノ酸を認識しゲートキーパーの役割を果たしていることを明らかにしてきた。VinNホモログの基質認識を改変することができれば、天然型とは異なったβ-アミノ酸を取り込ませて、新たなマクロラクタム化合物の創製も期待できる。そこでインセドニン及びクレミマイシン生合成中のVinNホモログの結晶化を行い、その構造解析に成功し、基質認識機構を明らかにした。当初の予定であるマクロラクタム抗生物質の機能解析については、順調に進んでいる。また、ヌクレオシド系抗生物質であるアリステロマイシンの生合成酵素の機能解析では、生合成遺伝子クラスターを特定でき、さらに鍵酵素となる炭素5員環を形成する酵素の機能を明らかにすることが出来た。また、アミノグリコシド系抗生物質に関しては、機能未知の酵素の機能解析を行っており、新たな知見が得られている段階にあり、これらを考えるとほぼ予定通りに研究計画が進んでいると考えられる。本年度は、主にアミノサイクリトール抗生物質パクタマイシンおよびマクロラクタム抗生物質クレミマイシンの生合成酵素の機能解析を行った。抗腫瘍抗生物質であるパクタマイシンは、高度に修飾された炭素五員環

アミノサイクリトールであり、その生合成機構は興味深い。本年度はパクタマイシン生合成の鍵段階と考える窒素原子の導入機構に着目し、in vitroでの酵素機能解析を中心として生合成機構を調べた。1つのアミノ基転移酵素であるPctCは、パクタマイシンの1位の窒素原子の導入に関わると予想し、生合成遺伝子クラスター中に存在する脱水素酵素PctPによる酸化反応とPctCによるアミノ基転移反応を検討した。その結果、N-アセチルグルコサミンのN-グリコシドの3位の水酸基がアミノ基へと変換されることを明らかにした。さらに、N-グリコシド生成後、他の変換反応より以前に3位の水酸基がアミノ基へと変換されることが分かった。マクロラクタム抗生物質クレミマイシンの生合成酵素であるCmiS1は、III型チオエステラーゼに分類されるが、単にチオエステルの加水分解を行うだけではなく、α,β-不飽和脂肪酸チオエステルである2-ノネノイルチオエステルに対しグリシンのMichael付加反応とチオエステルの加水分解反応を触媒する。CmiS1がどのような機構で触媒するかに興味が持たれた。CmiS1の結晶化には成功しなかったものの、その類縁酵素の結晶構造解析を行い、Michael付加反応とチオエステル加水分解反応の反応機構を明らかにすることに成功した。当初の予定であるマクロラクタム抗生物質の機能解析については、順調に進んでいる。また、アミノグリコシド抗生物質の1種であるパクタマイシンの生合成酵素の機能解析では、生合成の鍵段階と考える窒素原子の導入機構の機能を明らかにすることが出来た。また、カナマイシンなどの代表される2ーデオキシストレプタミン含有型アミノグリコシド系抗生物質に関しては、機能未知の酵素の機能解析を行っており、新たな知見が得られている段階にある。さらに、抗生物質ホスホマイシンの生合成経路を明らかにするなど、他の抗生物質の生合成酵素の機能解析も進んでいる。これらを考えるとほぼ予定通りに研究計画が進んでいると考えられる。本研究では、微生物二次代謝産物の生合成系の遺伝子情報の拡大に努めながら、多様な二次代謝産物の生合成系を遺伝子・酵素,反応レベルで精密に機能を解析し、これらの遺伝子情報を基盤とした生合成リデザインによる新物質生産への応用することを最終的な目的としている。本年度は、主にポリケチド合成酵素におけるタンパク質ータンパク質の相互作用解析を行った。ポリケチド生合成においては、カルボン酸基質の運搬にアシルキャリアータンパク質(ACP)がしばしば用いられる。ACPは80個程度のアミノ酸からなる小さなタンパク質であり、生物種によらず活性部位のセリン残基が翻訳後修飾によりホスホパンテテイニル化されている。そのホスホパンテテイン鎖の末端のチオール基がカルボン酸基質とチオエステル結合を形成してアシル化ACPとなり、カルボン酸基質が運搬される。アシル基転移酵素(AT)がカルボン酸基質を適切なACPへと受け渡すためには厳密な認識機構が存在するはずであるが、ATとACP間の相互作用は弱いため、複合体構造解析は難しく、これまでにACPの認識機構に関する詳細な知見は得られていなかった。
自己決定にかかわる支援における偶有性とそれを活かす組織についての実証的研究

自己決定が困難と言われがちな知的障害・発達障害当事者の自立生活への支援活動団体での参与観察を継続して行い、また関連する諸団体での聞き取り調査等も行うことで、自己決定という概念そのものを問い直した。自己決定はある一定の時空間だけでなされるものではなく、長いプロセスの中でさまざまな条件と本人なりの受けとめ方、周囲のかかわりの中でなされるものであり、またその後も繰り返しやり直されていくものである。それを支援するとき、支援者には一定の同一性と同時に、内部での複数性を必要とする。そのためには組織内部に偶発的な要素(具体的には「できない」スタッフや「無駄」に見える時間)を取り込むことが必要である。たこの木クラブを中心として、多摩地域で知的障害当事者とともに生きることを模索する団体と、首都圏内で知的障害当事者の自立生活を支援する団体等に、継続して参与観察とインタビュー調査を行なった。現在明らかになっている知見としては、第一に、多摩地域での「ともに生きる」活動が成立してきた経緯が少しずつ明らかになっていることが挙げられる。多摩ニュータウンの生まれた頃に、各地から移り住んできた団塊の世代の中から、三つの保育園での統合保育の試みと就学運動で結びつき、また生協活動を通してそのつながりが拡大し、自立生活運動との連結から多摩市の外へも広がっていったことが明らかになった。ただし、まだ聴き取り調査に終わっており、当時の資料収集などは十分に行なえていない。第二に、知的障害当事者とともに生きる、あるいは自立生活を支援するという中で、支援者がなそうとしていることは、社会学の基礎理論と結びつけて論じなくてはならないことが見えてきた。具体的にはN・ルーマンのコミュニケーション論である。ルーマンは知的障害当事者とのかかわりを想定してはいなかったため、その点における修正はいくつか必要だが、少なくとも近代的主体を安易に想定しないという点で、ルーマンの議論は参考になる。現在はこの点に関する論文を執筆中である。第三に、これらの運動が目指す方向性が、単に「障害」にとどまるものではなく、価値を共有しきれない他者との共生という、より広がりを持つものであることが、明確に見えてきた。たとえば刑務所における刑務官と受刑者のかかわりにも援用可能である。この点についても原稿を準備しているところである。以上、歴史記述としても、理論的にも、重要な発見が多くみられた。昨年度は、第一に、多摩地域での調査研究を継続的に展開した。グループホームでの生活支援の状況、あるいは介護労働者の置かれた状況や仕事に対して感じる「つらさ」「つまらなさ」「痛み」などについて、現場で働く人たちの声を聴き、また同時に参与しながら観察を続けた。また、他者に危害を与える知的障害当事者を取り巻く状況について、当事者から危害を与えられた側の視点も取り入れつつ、渦中にある人たちの葛藤や模索、ネットワークを作りながらの取り組みなどに、自身もかかわりながら調査研究を進めた。第二に、ニクラス・ルーマンの議論の検討も継続的に展開した。特にダブル・コンティンジェンシー概念およびインクルージョンとエクスクルージョンに関して、ルーマンの議論全体を再検討しながら考察した。第三に、これらに基づいて論文等を執筆した。一部はまだ投稿中である。具体的には、多摩地域での知的障害者支援活動の本質をどのように捉えるかということをテーマとし、それが当事者とのかかわり、あるいは支援者同士のかかわり、さらにいえば周囲の近隣住民とのかかわりをそれぞれダブル・コンティンジェンシーとして捉えかえし、そのつど何が起きているのかを探り続ける姿勢だということを明らかにした上で、それが問題の解決を求めるものというより、関わり続けることそのものなのだということを、近年のルーマン解釈の議論に即して明らかにした。以上の中から見いだされてきたのは、知的障害を持つ人たちの包摂という課題について、彼らが問題であるとみなす考え方や、逆に「障害」が擬制であると捉える考え方ではアプローチしきれない領域があり、それは理論社会学においても重要な課題であるということである。昨年度はその理解を深めると同時に、具体的にその議論を展開することに力を注いだといえる。今年度は、多摩地域の知的障害者支援活動については、昨年度から引き続いての参与観察を行った。総合福祉法をめぐる政治的な動きや、自立支援法下で制度的な細かい変更点が現場に大きく影響を与えるさまなどを知ることができた。また、自立生活を新たにスタートする当事者が複数名いたことから、まだ日の浅い支援者たちが、当事者とのかかわり方や支援に関する考え方を大きく変えていく様子を知ることもできた。さらに、都内での知的障害者支援活動団体が相互に交流する場を運営することによって、多摩地域で長くかかわってきた団体のみならず、他の団体の支援体制や組織作りについて学ぶ機会を得た。

その中から見えてきたのは、それぞれの団体は、地域の特色や、支援者の個性、何より当事者との関係のありようによって、それぞれ異なる支援体制や組織作りを行ってきており、多摩地域での団体とは異なるありようもあることだった。さらにいえば、同じような思想や発想を共通基盤としており、最終的に直面する課題の数々は似てくることも確認できた。そして、相違点については、クリティカルな局面への対応の仕方や考え方の違いであることが明確になってきた。ほとんど同じような思想を持っていても、ある局面への対応が異なることから、支援体制や組織作りも違ってくるのである。もうひとつ、今年度は否応なく東日本大震災での支援活動にもかかわったが、そこでも本研究課題と同じような課題があることがわかった。レスキュー段階はもちろんだが、中長期的支援段階に入ると、各団体間の連絡調整が大きな課題となる。その中で組織づくりを模索する団体を側面支援することによって、本研究課題を問うための調査研究として位置づけられるような知見も得られた。前年度に引き続き、知的障害者支援団体への参与観察を継続するとともに、関東圏の知的障害者の自立生活支援団体の活動や個々の当事者、介助者の状況についての調査を行った。また同時に、就学運動(どんな障害があっても普通学級で同じように学ぶ環境を求める運動)についての調査も一部行った。ここから明らかになったことのひとつは、重度あるいは軽度の知的障害・精神障害の当事者が自立生活するのを支援するというとき、ヘルパーたちが直面しがちな感情的な諸問題には、ジェンダーによる違いがそれなりにあるということである。知的障害当事者で自立生活をしている人の中には男性がまだ多いこともあり、これまであまり表面化してこなかったが、社会的地位に価値を置く人たちと、周囲の人との関係性に重きを置く人たちとでは、介助者たちが直面させられる課題も異なってくる。もうひとつには、介助者の側の感情面・心理面での負担感は、給与の問題だけでは解決しないことである。介助やケアという仕事が、いわゆる専門性に依拠する形ではなく、それでも一定の遣り甲斐や積み重ねを感じられるものとしていくための介助論が必要であり、そのためにはベースとなる組織のありようについて問うことが不可欠である。さらに、これまでの知見をまとめていくために、社会学の理論的な基礎を改めて検討し直した。シンボリック相互作用論の可能性と限界について考察すると同時に、システム論等の検討も行った。また、さまざまな形でなされる社会的排除について、事例検討と理論について学び、支援と差別や排除との関係性について検討した。また同時に、ベースとなる組織のありように関して検討するため、再度組織論を検討しなおした。理論的な考察を含めた成果発表については、査読雑誌に投稿を試みたが、まだ成果とはなっておらず、雑誌論文以外の形も含めて、成果の公表の仕方について現在検討中である。社会学当初から想定していた研究の目的のうち、自己決定の支援における偶有性という課題については、現在理論的に詰めつつある。具体的に取り上げる概念は単独の偶有性ではなく、二重の偶有性とすべきだということなど、考察が進んでいる。
神経電気刺激法の応用による末梢神経分枝の特異的再生法～過誤支配のない神経再生

神経障害に対する神経縫合・移植の際に電気刺激を加えることで神経再生促進および再生方向に影響が与えることが報告されている。本研究では電気刺激により軸索の再生方向を誘導し、臨床的に問題となる神経過誤再生の改善に寄与するかどうかを検証した。ラット坐骨神経と末梢枝を対象として、神経切断・縫合および電気刺激を切断前、切断後神経縫合前、切断後神経縫合後に行った。いずれの条件においても末梢枝の支配筋には明らかな影響は見られず、軸索再生方向の誘導は得られなかった。本モデルではラットの神経長が短く、逆行性の電気刺激による他方の末梢枝への影響があり、結果が得られえない一つの要因として考えられた。本研究では電気刺激による神経再生促進効果について、神経分枝毎に電気刺激を行うことによる、より選択的な神経再生を得ることを目的としている。これまでにも電気刺激による神経軸索再生促進効果については報告されているものの、神経分枝および神経の標的組織毎に検討した報告は極めて少ない。本方法により過誤支配の少ない神経軸索再生の促進効果が得られる可能性について検討している。まず過去の報告をもとに神経の電気刺激の条件設定を検討した。ラット坐骨神経を対象に切断・縫合後に電気刺激を行った。神経の電気刺激時間20, 40, 60分、頻度1, 5, 10, 20Hzの単回刺激でそれぞれ予備実験を行った。評価は筋電図計PowerLab 26T(ADInstruments)を用いて活動電位の振幅、潜時を計測し比較検討したが大きな違いは見られず、刺激時間20分・頻度20Hzで条件設定を行うこととした。次に坐骨神経の分枝である脛骨神経、総腓骨神経の走行解剖を確認し、またそれぞれの支配筋を筋電図計を用いて同時に確認した。実際には小さな複数の枝が早期に分枝されることが確認され、個体差も見受けられたため、条件を統一するため今回は脛骨神経、総腓骨神経以外の分枝については切断して検討を行うこととした。その際に得られた神経を用いて軸索再生評価手技の予備実験として、Toluidine blue染色で神経軸索の数・直径、ミエリン鞘の厚みの測定、及びS-100蛋白の免疫染色でシュワン細胞の染色を行った。電気刺激法を長時間行う上で、刺激による体動で刺激電極が動いてしまい、安定した刺激が行えないことが問題となった。それに対しては刺激電極を固定する器具を用いて行うことと、極力刺激時間を少なくすることで安定した刺激が可能となり実験継続している。一方で顔面神経麻痺においては回復過程での過誤支配による異常共同運動が問題になることがある。本研究では電気刺激により軸索の再生方向を誘導し、過誤支配の少ない神経再生が期待できるかどうかを検証した。ラット坐骨神経と末梢枝を対象として、神経切断・縫合をそれぞれ行った。電気刺激も坐骨神経本幹、脛骨神経、腓骨神経の3カ所で行った。切断前(n=3)、切断後神経縫合前(n=3)、切断後神経縫合後(n=3)に電気刺激を行い、4週後に電気生理学的評価、組織学的評価、筋量測定を行い評価した。切断前刺激では本幹・末梢枝いずれの部位で刺激を行っても、明らかな差は認めなかった。切断後縫合後刺激でも同様に刺激部位の違いによって明らかな差は認めなかった。切断後縫合前刺激では末梢枝と比べて本幹の刺激で再生軸索数が増加する傾向がみられた(本幹刺激群:活動遠位1.38mV、軸索数1100.4、脛骨筋量0.554g、ヒラメ筋量0.442g脛骨神経刺激群:活動電位1.42mV、軸索数623.7、脛骨筋量0.346g、ヒラメ筋量0.432g腓骨神経刺激群:活動電位1.58mV、軸索数523.0、脛骨筋量0.405g、ヒラメ筋量0.342g)。いずれの条件においても末梢枝の支配筋である脛骨筋、ヒラメ筋の電気生理学的評価には明らかな影響は見られなかった。本研究では電気刺激部位を変えても明らかな軸索再生方向の誘導は得ることはできなかった。しかし切断後縫合前の本幹刺激で軸索数が増加したことは、顔面神経回復前の電気刺激が過誤支配を増強する可能性を示唆した。本モデルではラットの神経長が短く、逆行性の電気刺激によりもう一方の末梢枝へ影響を与えており、結果が出にくい要因として考えられた。得られた条件を元に本実験に移る。

坐骨神経の切断縫合後にそれぞれの神経分枝に対し刺激を行い、評価を進めていく。Fluoro-Gold, Fast Blueを使用した二重標識法を用いて、脊髄での染色されたニューロン数・局在を計測し、分枝への電気刺激による影響を評価する予定である。形成再建外科実験計画の遅れとともに若干のラットの購入、組織学的評価のための各種染色剤の購入が遅れているため。ラットの購入、免疫染色抗体、神経回路標識用のトレーサーを購入予定である。
地球環境ガバナンスにおける政策ネットワークに関する研究

本研究は、多国間環境条約(MEAs)の形成過程・実施過程の検証を通じ、国際政治学におけるアイデアの役割に関する研究と社会学におけるネットワークの役割に関する研究及び専門知の役割に関する研究を統合し、科学的知見に基づき社会的に有効な多国間環境条約の形成に必要な科学者、行政官、企業、環境保護団体等とのネットワーク形成に関する統合的な視座の獲得を目的としている。MEAsが企業行動を変更させる力となるためには、条約成立後の詳細枠組みの設定や定期会合を通じて形成される人的ネットワークが重要であり、実際の技術開発のアイデア、更には企業の国際戦略の検討に条約成立後に成立した専門知識集団が大きな役割を果たしている。今年度は、本研究の目標である「MEAsの形成」と「MEAsの実施過程」の二元論を克服し、MEAsの持続的発展のための要素を特定するため、比較ケースとして米国における政策ネットワークを分析することとしていた。研究の初年度であった19年度において,基本的な文献調査が進展した。これを基に形成された仮説の実証方法につき内外の有識者と対話するとともに,行政官,環境NGO,エネルギー・ビジネスや排出量取引に関わるコンサルタント等の実務家からヒアリングを行う予定であった。また,中央政府と地方政府の政策変更のスピードの差に着目し,東京都や横浜市といった先進自治体と環境省や経産省といった中央政府の関係を,米国の連邦政府とカリフォルニアやマサチューセッツといった先進自治体との関係と比較する予定であった。今年度途中に,職を辞することとなり,研究計画を全うできなかったが,横浜市及び経産省との打合せ,ヒアリングを行った。初年度においては理論的整理を行い、以下の3つの視点を得ることができた。第一に、政策ネットワークの中で議論されてきた「認識の共同体論」の動向であり、社会構築論に吸収されてしまう過程を分析した。第2は、そこから生み出される専門知の政策活用の研究である。日本における京都議定書の交渉経緯をケースとして分析した。第3に、地球環境ガバナンスを巡る国際政治理論の変化の分析である。この分野においては、いくつかの研究会における口頭報告の段階であるが、前二者の分野では論文を執筆しており、現在投稿準備中である。今年度は、本研究の目標である「MEAsの形成」と「MEAsの実施過程」の二元論を克服し、MEAsの持続的発展のための要素を特定するため、比較ケースとして米国における政策ネットワークを分析することとしている。
蛍光プローブを利用としたイソチオシアネート標的蛋白質の新規探索法

ワサビなどの機能性食材に含まれるイソチオシアネートITC類は、抗ガンや抗菌作用を有するが、その生理機能の発現機序は未だ不明な点が多い。研究代表者らは、これまでの研究から生理条件下でITCがタンパク質のリジン残基と結合することを見出してきた。本研究ではITCを分子内に有する蛍光色素に着目した。まず蛍光ITC修飾タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製・特異性解析を行い、蛍光染色などに応用した。蛍光顕微鏡による観察により、容易にITC付加反応が確認された。ITC標的タンパク質もゲルの直接蛍光撮影及び抗体を用いた手法により複数確認できたが、同定は今後の課題である。日本の誇るワサビなどの機能性食材に含まれるイソチオシアネートITC類は、抗ガンや抗菌作用を有する。しかしながらその生理機能の発現機序は未だ不明な点が多い。研究代表者らは、これまでの研究から生理条件下でITCがタンパク質のリジン残基と結合することを見出し、ITCのターゲット分子の優れた「タグ」になると考えている。一方で、微量で活性を有するITC分子の追跡は容易ではない。本研究ではITCを分子内に有する蛍光色素に着目し、これを用いた生理機能解析を探求した。まずFITC修飾タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製を行い、特異性解析とウエスタンブロットなどへの応用を行った。培養上清からの抗体精製の過程で抗体が培地中のpH指示薬であるPhenol Redに結合することを見出したが、FITCの持つフルオレセイン構造に比べれば低い結合性であった。次に、FITCでin vitro修飾したタンパク質(グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素)を電気泳動し、ゲルを蛍光測定した場合と、PVDF膜に転写して得られた特異抗体と二次抗体(酵素標識)、化学発光法を用いた場合の感度比較を行った。その結果、抗体を用いた手法は、蛍光法に比べて10倍程度低濃度のITC修飾を検出できることがわかった。ゲルを直接蛍光測定する手法も簡便であり、二つの手法を併用して進めることとした。FITC暴露したHL60細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、濃度依存的に蛍光物質が細胞に取り込まれたことから、細胞内標的タンパク質の探索を行った。CaCo2細胞およびHL60細胞ともにゲルのフルオレセイン蛍光検出および取得した坑フルオレセイン抗体によるウエスタンブロット法のいずれによっても複数の標的分子が見出された。二次元電気泳動によっても複数の標的タンパク質が検出されたが、免疫沈降法などを用いたタンパク質同定については今後の課題である。研究代表者らは、これまでの研究から生理条件下でITCがタンパク質のリジン残基と結合することを見出し、ITCのターゲット分子探索のための優れた「タグ」になると考えている。本研究ではITCを分子内に有する蛍光色素に着目し、これを用いた生理機能解析を探求している。今年度はFITC修飾タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製を行い、特異性解析とウエスタンブロットなどへの応用を行った。FITCをタンパク質に結合させ、マウスに免疫し、特異抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を2株得ることが出来た。培養上清からの抗体精製の過程で抗体が培地中のpH指示薬であるPhenol Redに結合することを見出したが、FITCの持つフルオレセイン構造に比べれば、低い結合性であった。しかしながら、培養細胞などを用いた実験においては、pH指示薬無しの培地を用いるなど、抗体の特異性について慎重に解析すべきであることがわかった。次に、FITCでin vitro修飾したタンパク質(グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素GAPDH)を電気泳動し、ゲルを蛍光測定した場合と、PVDF膜に転写して得られた特異抗体と二次抗体(酵素標識)、化学発光法を用いた場合の感度比較を行った。その結果、抗体を用いた手法は、10倍程度低濃度のITC修飾を検出できることがわかった。ゲルを直接蛍光測定する手法も簡便であり、ITC標的分子を探索するため、今後は二つの手法を併用して進めることとした。目標としていたFITC抗体の取得は出来た。但し、Phenol Redとの交差性を確認する実験研究に時間がかかり、蛍光色素ITCとリジン誘導体の反応性について解析が充分に進められていない。in vitroでのFITC修飾タンパク質の電気泳動とその泳動ゲル、転写膜での蛍光・発光法の検出感度の比較検討は完了した。今後、真の目的である実際の細胞を用いた標的蛋白質の探索(免疫沈降法等)について実施するが、予定通りの進捗状況といえる。

質量分析器の解析用PC及びソフトのアップグレードを行い、ITC付加したタンパク質あるいは低分子ペプチド等の構造解析が出来る環境を整えることが出来た。食事から得られたITCが反応する最初の場として、腸管を想定し、Caco2細胞を用いて、まずは蛍光ITCの作用点(標的蛋白質)を調べる。複数の蛍光色素ITCを用いて、ITC特異的な標的分子を見つけていく。その際には、蛍光を指標とするのに加え、特異抗体も免疫沈降法などに活用していく。他にもAITCやBITCなど、すでに取得済みのITC修飾リジンに対する抗体も活用し、実際の食品に含まれるITCによる標的分子探索につなげていく。作用点として、タンパク質のみならず、アミノリン脂質なども想定している。研究計画を一部見直し、新たにアミノリン脂質もITCの標的候補として、研究を進める。10万円ほどH25年度に繰り越しが出たが、年度内納品が難しい試薬を購入しなかったためである。この繰り越しも前年度経費の6%程度であり、H24年度の研究費は適正に用いられたと考えている。この予算は、ITCの標的蛋白質の探索のための試薬購入用として補填する。また、H25年度は主として免疫沈降用試薬、タンパク質二次元電気泳動機器・試薬や簡易型蛍光検出装置などに研究費を用いる予定である。標的蛋白質が絞り込まれた場合は、同定を外注する費用も生じる。rhodamine Bのモノクローナル抗体作成も検討するため、各種培養細胞試薬や器具、牛血清なども購入する。
高濃度塑粘性スラリー系撹拌槽におけるカバーン形成状況に及ぼす通気操作の影響の解明

本研究ではコンケーブ翼付撹拌槽におけるスラリー系流体を対象とし、カバーンが生起し、流動・混合不良に陥る状況を、通気操作を施すことで、如何に改善させることができるかを定量的に検討した。画像解析を用いて算定した槽縦断面における未混合面積率の経時変化に基づき、混合速度定数k_sを定義した。検討の結果、どの通気速度Qにおいても、ある回転数n以上になるとk_sはnの増加に伴い急激に増大し、未混合領域の解消に有効であることが分かった。これは翼からの吐出流に伴う気泡の浮遊パターンの変化に起因していることを明らかにした。一定以上の応力を加えないとずり流動を生じないスラリー系流体を、小型翼を用いて撹拌すると、翼の廻りにのみ流動が生じ、その外側では静止する現象を生じることが知られている。このような流動領域はカバーンと呼ばれ、カバーン内外では液の交換が起こらないため、槽全体の混合状態が極めて不良となる。一方、通気操作を行うことで槽内に大きな循環流を発生できることが知られている。そこで本研究では撹拌槽におけるスラリー系流体を対象とし、通気操作を行うことで槽内の流動・混合状態を改善させることができるかを定量的に検討した。用いたスパージャーは2種類であり、リング径0.09mの小スパージャーと、リング径0.14mの大スパージャー、大小2つを組み合わせた計3通りで実験を行った。スパージャーは槽底に設置した。翼には、通気撹拌時に、翼の背後に気泡が集まり大気泡化することを防ぐことのできる6枚コンケーブ翼を用いた。対象液は、降伏応力を有する0.2wt%カルボキシビニルポリマー水溶液とした。通気操作を行わない翼のみでの実験ではカバーン内にヨウ素溶液を注入して、カバーンを褐色にする着色法を用いた。一方、通気操作時には、カルボポール水溶液にヨウ素溶液を注入してカルボポール水溶液を褐色に着色した後、通気撹拌を開始し、チオ硫酸ナトリウム水溶液を液面の軸近傍から注入して脱色し、淀み領域を可視化する手法を用いた。槽縦断面における淀み領域の面積は画像処理ソフト"Image Hyper II"を用いて求めた。検討の結果、以下の3つのことが明らかとなった。1.通気操作を行うことは、この改善に対して有効である。2.よどみ領域を解消させるためには、翼を槽底近傍に設置することにより、よどみ領域を撹拌し流動を起こすことが重要である。3.大スパージャーを槽底部に設置することにより、よどみ領域を通る流れを起こすことが重要である。一定以上の応力を加えないとずり流動を生じないスラリー系流体を小型翼を用いて撹拌すると、翼の廻りのみ流動し、その外側では静止する現象を生じることが知られている。このような流動領域はカバーンと呼ばれ、カバーンの内外では液の交換が起こらないため、槽全体の混合が極めて不良となる。一方、通気操作を行うことで槽内に循環流を発生させることができる。しかし撹拌場での気泡群の浮遊パターンがスラリー系流体の流動状態に及ぼす影響の解明は十分になされていない。これらのことを背景に、前年度は、スラリーを模擬した、降伏応力を有する流体であるカルボキシビニルポリマー水溶液流体を対象に通気撹拌操作を行い、コーンケイブ翼を槽の液深3分の1高さに設置し、大型リングスパージャーを槽底部に配置して通気するのが、流動・混合状態の改善に有効であることを明らかにした。同結果に基づき、本年度は通気量Q[L/min]や翼回転数n[s^<-1>]の変化が混合速度に及ぼす影響を定量的に検討した。前年度と同様にカルボキシビニルポリマー水溶液を対象に、通気撹拌操作を行い、槽群断面における未混合面積率の経時変化に基づき、まず混合速度定数k[s^<-1>]を定義した。次に操作条件Qやnの変化が混合速度定数kに及ぼす影響を定量的に検討した。その結果Q=10L/minにおいては、混合速度定数kはnに依存せず一定であったのに対し、Q=15L/minではkはnの約5乗に比例して大きくなり、未混合領域の解消に有効であることが分かった。高通気量の場合、撹拌に伴う翼からの吐出流によって気泡の浮遊パターンが変化し、高回転数では気泡によって流動が生じる領域が槽全体に広がることにより、混合速度定数左が大きくなることを明らかにした。このような流動領域はカバーンと呼ばれ、その内外では液の交換が起こらないため、槽全体の混合が極めて不良となる。

一方、通気操作を行うことで槽内に循環流を発生させることができる。しかし撹拌場での気泡群の浮遊パターンがスラリー系流体の流動状態に及ぼす影響の解明は十分になされていない。これらのことを背景に、一昨年度(本研究初年度)は、スラリーを模擬した、降伏応力を有する流体であるカルボキシビニルポリマー水溶液流体を対象に通気撹拌操作を行い、コーンケイブ翼や大型リングスパージャーの、流動・混合状態の改善に有効である設置条件を明らかにした。前年度は同結果に基づき、通気量Q[L/min]や翼回転数n[s^<-1>]の変化が混合速度に及ぼす影響をヨウ素-ハイポ脱色過程における槽縦断面での未混合面積率の経時変化に基づき、混合速度定数紅s^<-1>を定義し、両操作条件Q,nの変化が混合速度定数kに及ぼす影響を定量的に検討した。本年度(最終年度)は、さらに両操作条件の変化範囲をQ=10,15,20L/min,n=3,4,4/5,5,6s^<-1>にまで拡大させ、同様に検討を行った。その結果、いずれの通気速度の条件においてもn=4s^<-1>まで(以下、低回転数域)はkは一定であり、44.5s^<-1>(遷移域)においてkは急激に増大し、それ以上の回転数(高回転数域)ではkの増大傾向は緩慢となることを見出した。気泡と液流動の観察結果から低回転数域では、気泡は、スパージャーから上昇後、その大半は翼にトラップされずに通過すること、遷移域では、気泡は一旦翼にトラップされ合一した後、カバーンを打ち破って上昇すること、さらに高回転数域では、気泡は翼により破泡された後、翼から水平方向に吐出されることを確認し、これらのことが、上述のkの回転数依存性の原因となっていることを明らかにした。
マイクロ・フレキシブル機構の加工を可能にする光造形加工システム

本研究は、フレキシブルな3次元マイクロ機構を製作することを可能にする光造形システムを提案、設計、試作することを目的として研究を行なった。その成果は次のとおりである。(1)三種類のくぼみを制御する方法を提案、検討、実験した。(a)空気圧制御:液体樹脂にノズルを挿入し、密閉したノズル内の空気に圧力をかけてくぼみを形成し、圧力を調整することでくぼみのレベルと形状を制御する。この方法では、大気圧と温度の変動の影響によりくぼみの液面が激しく変動することが判明した。10μmよりも高い制御精度を求めるなら、装置全体を完全に大気圧と遮断し、0.01°C精度で温度制御する必要がある。(b)樹脂量制御:樹脂を樹脂タンクに密閉し、露光部分のみ穴が空いて空気と接しており、そこでくぼみを形成する。樹脂タンク中の樹脂量の調整によりくぼみのレベルを制御する。この方法では、大気圧と温度の影響が少なくなる。しかし、移動板の精度や摩損の問題が生じる。(c)自由液面差制御:くぼみを形成するノズルと樹脂タンク中の液面を両方開放し、くぼみ液面と樹脂タンク中の液面との液面差を調整するによって、くぼみのレベルを制御する。この方法では、上述二つ方法の問題はなくなり、制御しやすい。装置も簡単である。(2)くぼみ形状の数式化モデルの解析に基づいて、くぼみレベルや安定性に影響する要素を分析した。その結果に基づき、液面差制御法を採用した造形装置を設計、製作した。(3)液層厚さの検討を行なった。液層は7μm以下薄くなると、樹脂内にある希釈剤の揮発により、くぼみの液面は自励振動が生じ、最後にテーブルに張り付いてしまう。このため、現在の実験装置構造での造形可能の液層厚さは、7μmが限界であることがわかった。(4)製作した造形装置により,マイクロ・フレキシブル造形物(Cantilever)を造形、本研究の有効性を検証した。装置も簡単である。マイクロマシン用の高い分解能を必要とする光造形では、加工面を高精度の平滑面にする必要があるので、石英板などの窓を介してレーザーを照射する規制液面方式が採用されてきた。しかし、この方式は一層分を固化した後に加工物を引き上げると、窓と固化した最上層が接着した状態になっているので、フレキシブルな機構の部分は引き剥がされてしまうことが問題であった。この問題を解決するために本研究では、自由液面式を採用して、レーザー光の照射点の近傍の液面レベルを局所的な流体圧の操作によって、制御する方法を提案し試みている。はじめに取り上げた方法はノズルから流出する空気流によって、液面を一定位置に押し下げる液面制御方式である。しかし、予備実験の結果、流出する空気流が液面を不安定に振動させてしまうため、安定した液面制御が達成できなかった。そこで、つぎに空気を流出させずに、気泡を安定に保つ方法で液面を制御する方法に改善した。コンピュータシミュレーションの結果からは1μmの精度で制御できることが分かり、この方法の優位性が確認できた。しかし、実験した結果は、数十分以上のの長い周期で液位が数100μmのオーダーでドリフトすることが認められた。

この原因の究明の結果、大気圧の変動の影響を受けていることが分かり、この対策を検討し、次年度の研究課題とするための改善案を創出した。自由液面式光造形法によって、マイクロな機構を製作するためには、光硬化性樹脂液面の表面張力などの影響を避け、造形層厚を高精度に制御し解像度を向上することが不可欠である。そこで、空気圧により液面を制御する方法を考案した。樹脂にノズルを挿入し、密閉したノズル内の空気に圧力をかけてくぼみを形成する。そして、ノズル内空気の圧力を制御することで任意のくぼみ形状を形成する実験装置を作った。しかし、大気圧の変動の影響によりくぼみ底部の液位が激しく変動することが判明した。そこで、装置全体を密閉容器に入れ、再び液位を測定したところ、液位の変動を10μm程度に抑えることができた。この変動は温変化によるものと考えられる。空気を制御対象としている方法では、高精度の制御ができないため、樹脂量操作による液位制御方法を新たに提案した。この方式では樹脂を樹脂タンクに密閉し、くぼみを形成する部分にのみ穴が開いており、そこで空気と接している。樹脂タンクには調整針を挿入し、その棒を出し入れすることによりくぼみの形状を制御する。制御対象を液体にした場合、非圧縮性であるために圧力変動・温度変動による体積変化を最少に抑えられる利点がある。以上の手法を用いて造形装置を製作した。樹脂タンクの上面には密着した状態でX-Yテーブルがあり、テーブルの中心にはくぼみが成形される穴がある。くぼみの上方にはレーザ変位計を取り付け、常時液位を測定する。実験により、テーブル静止時にはくぼみは安定しているが、ステージ移動時に液位が変動してしまうことが分かった。液位変動は、X-Yテーブルと樹脂タンクの接触面が滑らかでないなどの理由によるものと考えられる。それを避けるため、移動テーブルを樹脂タンク下に配置する、新しい高精度造形装置の設計、製作を終了した。本研究は、光硬化性樹脂表面の露光硬化スポットの周囲に微小なくぼみを形成し、局所的に樹脂自由液面を高精度に制御することによって、フレキシブルな3次元マイクロ機構を製作することを可能にする光造形システムを提案、設計、試作することを目的とする。本年度に行った主な研究内容は、次の通りである。(1)三種類のくぼみを制御する方法を検討、実験した。空気圧制御法では、大気圧と温度の影響により、くぼみの液面が激しく変動することがわかった。樹脂量制御法では、大気圧と温度の影響が少なくなるが、移動板の精度や摩損の問題が生じ、樹脂量調整に対するくぼみの反応は遅いこともあることがわかった。液面差制御法では、前述の二方法の問題はなくなり、制御しやすく、装置も簡便であるが、一方、ステージ移動振動の影響があることがわかった。(2)くぼみ形状の数式化モデルの解析に基づいて、くぼみレベルや安定性に影響する要素を分析した。その結果に基づき、液面差制御法を採用した造形装置を設計、製作した。(3)液層厚さの検討を行なった。液層は7μm以下薄くなると、樹脂内にある希釈剤の揮発により、くぼみの液面は自励振動が生じ、最後にテーブルに張り付いてしまう。このため、現在の実験装置構造での造形可能の液層厚さは、7μmが限界であることがわかった。(4) 3次元CADデータから造形ファイルにの情報処理、システムの制御プログラムの設計・最適化、造形実験を行った。マイクロ・フレキシブル造形物(Cantilever)を製作した。
エプスタイン・バー・ウイルス関連腫瘍の進展阻止をめざすPD-L1発現抑制法の開発

本研究の目的はエプスタイン・バー・ウイルス関連リンパ増殖性疾患(Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorder、以下EBV-LPD)に対するPD-1/PD-L1経路の新規阻害法として、PD-L1遺伝子発現抑制が使えるかを検討することである。そのために、PD-L1陽性EBV-LPDを用い、PD-L1発現に関わる転写因子とmicroRNAを同定する。現在までに、EBV-LPDにてEBV(+)細胞およびマクロファージがPD-L1陽性であることは確認された。また活性型リン酸化STAT1 (pSTAT1)に対する抗体を用いた免疫染色にて、EBV-LPDでは、pSTAT1陽性細胞分布が、PD-L1強陽性細胞の分布と概ね一致することも確認された。当初は、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認(クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。以上から、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、1Trans AMキット(Active Motif社)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、2PD-L1 mRNAの3'非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、3細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、4細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。当初の計画では、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認(クロマチン免疫沈降法)を予定していた。また、PD-1がT-cell lymphomaの腫瘍陽性遺伝子である可能性(Nature 552, 121 [2017])が報告され、さらに、PD-1/PD-L1療法により成人型T細胞性白血病/リンパ腫が増悪する例(New England Journal of Medicine 378, 1947 [2018];ただし反論あり)も報告された。以上から、当初の方針を以下のように微小修正した。すなわち、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。

現在までに、EBV-LPDにてEBV(+)細胞およびマクロファージがPD-L1陽性であることは確認された。また活性型リン酸化STAT1 (pSTAT1)に対する抗体を用いた免疫染色にて、EBV-LPDでは、pSTAT1陽性細胞分布が、PD-L1強陽性細胞の分布と概ね一致することも確認された。当初は、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認(クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。以上から、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、1Trans AMキット(Active Motif社)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、2PD-L1 mRNAの3'非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、3細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、4細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。当初の計画では、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認(クロマチン免疫沈降法)を予定していた。また、PD-1がT-cell lymphomaの腫瘍陽性遺伝子である可能性(Nature 552, 121 [2017])が報告され、さらに、PD-1/PD-L1療法により成人型T細胞性白血病/リンパ腫が増悪する例(New England Journal of Medicine 378, 1947 [2018];ただし反論あり)も報告された。以上から、当初の方針を以下のように微小修正した。すなわち、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。
歯根膜の低酸素応答におけるPLAP-1が及ぼす影響

近年、低酸素応答が各種疾患の病態形成に果たす役割が着目されており、歯周組織における同応答の役割も明らかになりつつある。本研究課題では、歯根膜に高発現する細胞外気質タンパクPLAP-1が、低酸素環境下で低酸素誘導因子HIF-1誘導性に発現が上昇する一方で、炎症性サイトカイン存在下では発現が抑制されることが明らかとなった。また歯根膜細胞のPLAP-1は歯根膜の低酸素応答を制御している可能性が示唆された。この結果は、歯周組織の恒常性維持におけるPLAP-1の新たな機能を見出したものといえる。本研究課題では、低酸素状態で発現が亢進する歯根膜特異的分子PLAP-1が歯根膜組織の低酸素応答に担う役割について検討を行っている。平成28年度の研究成果について以下に報告する。1)低酸素下でのPLAP-1の発現に関する解析低酸素下で培養したヒト歯根膜細胞において、低酸素誘導因子HIF-1alphaの発現が上昇していた。予備実験で認められた低酸素下でのPLAP-1の発現上昇がHIF-1alpha誘導性のものであるかを検討するため、HIF-1alphaの分解抑制剤(Deferoxamine)とHIF-1転写活性阻害剤(chetomin)を用いてHIF-1alpha発現亢進時、HIF-1転写活性抑制時のヒト歯根膜細胞におけるPLAP-1の発現量を解析した。HIF-1alpha発現亢進時にはPLAP-1の発現は上昇し、HIF-1転写活性阻害時にはPLAP-1の発現は低下した。次に、臼歯間に矯正用のエラスティックゴムを挿入し、矯正力をかけることで歯根膜を低酸素状態にしたマウスの顎骨を採取し、作製した切片を用いて低酸素状態の歯根膜組織におけるHIF-1alphaの発現に関して免疫組織学的解析を行った。圧迫側の歯根膜組織は低酸素状態となっており、さらにHIF-1alphaの発現亢進が認められた。以上の結果から低酸素下ではHIF-1誘導性にPLAP-1の発現が上昇することが示唆される。2)歯根膜の低酸素応答におけるPLAP-1の役割に関する解析低酸素により誘導されるPLAP-1が歯根膜の低酸素応答にどのような影響を及ぼすのかを検討するために、ヒト歯根膜細胞にsi RNAを導入することによりPLAP-1抑制細胞株を作製した。平成28年度には低酸素下でのPLAP-1の発現上昇メカニズムへの低酸素誘導因子HIFの関与が強く示唆される結果が得られた他、si RNA導入によりPLAP-1抑制ヒト歯根膜細胞株の作製が完了したため、研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。本研究課題では、低酸素状態で発現が亢進する歯根膜特異的分子PLAP-1が歯根膜組織の低酸素応答に担う役割について検討を行った。平成29年度の研究成果について以下に報告する。一般に、炎症性疾患の病巣局所では、末梢血流の循環障害および炎症細胞浸潤による酸素消費の増加により低酸素環境が誘導されると考えられている。そこで、低酸素状態で発現が亢進するPLAP-1の歯周病局所における発現変化についてマウス歯周病モデルを用いて検討した。すなわち、C57BL/6の上顎第二臼歯に5-0絹糸を結紮し、7日後の骨吸収をmicroCTにて確認後、凍結切片を作製した。同切片よりレーザーマイクロダイセクションにて歯根膜組織のみを採取しIL-6およびPLAP-1の遺伝子発現をリアルタイムPCRにて検討した。microCT解析の結果、コントロールとして採取した非結紮側に比べ、絹糸結紮側では顕著な歯槽骨吸収が認められた。さらに、歯根膜組織においてIL-6遺伝子の発現が上昇する一方で、PLAP-1遺伝子の発現は有意に減少することが明らかになった。この結果をin vitroにて確認するために、ヒト歯根膜細胞をIL-1betaあるいはTNF-alpha存在下で培養し、炎症性サイトカインがPLAP-1遺伝子の発現に及ぼす影響について検討を加えた。その結果、両サイトカイン存在下で培養したヒト歯根膜細胞におけるPLAP-1遺伝子発現は有意に抑制されていることが明らかとなった。以上の結果は、炎症反応がPLAP-1発現を抑制していることを示唆しており、同分子の新たな発現制御メカニズムの解明につながるものと考えられる。マウス歯根膜低酸素モデルを用いてin vivoでの歯根膜の低酸素部位におけるHIF-1alphaの発現とPLAP-1の発現の相関性について解析を行う。一方で作製が完了したPLAP-1抑制ヒト歯根膜細胞に加えて、PLAP-1強発現細胞株の作製を行い、PLAP-1が歯根膜の低酸素応答に如何なる役割を担っているのかを検討する。