hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C_1微生物によるセリン生産とその酵素化学的及び分子遺伝学的研究

本申請者らは、将来の培養原料として有望なC_1化合物のメタノールを炭素源、エネルギー源に用いてセリン経路を有するHyphomicrobium属細菌を培養し、その菌体を用いたL-セリンなどの水酸化アミノ酸の生産についての基礎的な研究を行ってきた。C_1微生物の特異な代謝経路であるセリン経路は従来本代謝酵素類の活性が高くて安定な微生物が見いだされていなかったために、詳細な酵素化学的研究はほとんど行われていなかった。本研究では、すでに本申請者らが見いだしているHyphomicrobium methylovorumを用いてL-セリンの生産法を検討すると共にセリン経路を構成する各種酵素について酵素化学的、分子遺伝学的研究を行うことを目的とした。H.methylovorumのグリシン耐性変異株であるGM2株は、休止菌体反応系でメタノールとグリシンから34mg/mlのL-セリン生産が可能である。さらに菌株のスクリーニングを行ったところ、71mg/mlのL-セリンを生産できるMN株を見いだすことに成功した。この株によるL-セリン生産においては、1mM CdCl_2を添加することによりL-セリン分解活性を完全に抑制することができ、その結果、グリシンからL-セリンへのモル転換率は100%となった。セリン経路を構成する酵素については、GM2株よりグリセリン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼについて均一にまで精製し、タンパク質化学的、酵素化学的性質を明らかにした。また、GM2株より均一に精製されたセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)の酵素的加水分解を行い、得られたペプチド断片のアミノ酸配列の決定を行った。同時にN末端アミノ酸配列も決定し、これらの配列をもとにDNAプローブを作製した。本腸菌を用いて作製したGM2株の遺伝子バンクとプローブのハイブリダイゼーション試験を行い、SHMTをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。本遺伝子の全塩基配列を決定し、本遺伝子がコードする蛋白質は434アミノ酸からなり、その分子量は46,068と求められた。また、従来知られているSHMTとのアミノ酸配列の比較したところ、大腸菌由来のSHMTとは55%、ウサギ肝臓由来のSHMTとは44%の高い相同性を有していた。本遺伝子を大腸菌のSHMT欠損株に導入したところ形質変換大腸菌はSHMTを発現し、生産された酵素は免疫学的にも酵素化学的にもGM2株由来のSHMTと同一であった。本申請者らは、将来の培養原料として有望なC_1化合物のメタノールを炭素源、エネルギー源に用いてセリン経路を有するHyphomicrobium属細菌を培養し、その菌体を用いたL-セリンなどの水酸化アミノ酸の産生について基礎的な研究を行ってきた。C_1微生物の特異な代謝経路であるセリン経路は従来本代謝系酵素類の活性が高くて安定な微生物が見出されていなかったために、詳細な酵素化学的研究はほとんど行われていなかった。本研究では、すでに本申請者らが見出しているHyphomicrobium methylovorumを用いて、L-セリンの生産法を検討するとともにセリン経路を構成する各種酵素について酵素化学的、分子遺伝学的研究を行うことを目的とした。

H.methylovorumのグリシン耐性変異株であるGM2株は、休止菌体反応系でメタノールとグリシンから34mg/mlのL-セリン生産で可能である。さらに菌株のスクーニングを行ったところ、71mg/mlのL-セリンを生産できるMN株を見出すことに成功した。セリン経路を構成する酵素については、GM2株よりグリセリン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼについて均一にまで精製し、タンパク質化学的、酵素化学的性質を明らかにした。また、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)の均一標品の酵素的加水分解を行い、得られたペプチド断片のアミノ酸配列の決定を行った。同時にN末端アミノ酸配列も決定し、これらの配列を基にDNAプローブを作成した。大腸菌を用いて作成したGM2株の遺伝子バンクとプローブとのハイブリダイゼーション試験を行い、SHMTをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。本遺伝子の塩基配列を決定し、従来知られている動物や大腸菌由来のSHMTとのアミノ酸配列の比較、検討を行ったところ、これらのSHMTにはアミノ酸配列の高い相同性が認められた。本申請者らは、将来の培養原料として有望なC_1化合物のメタノールを炭素源、エネルギー源に用いてセリン経路を有するHyphomicrobium属細菌を培養し、その菌体を用いたL-セリンなどの水酸化アミノ酸の生産についての基礎的な研究を行ってきた。C_1微生物の特異な代謝経路であるセリン経路は従来本代謝酵素類の活性が高くて安定な微生物が見いだされていなかったために、詳細な酵素化学的研究はほとんど行われていなかった。本研究では、すでに本申請者らが見いだしているHyphomicrobium methylovorumを用いてL-セリンの生産法を検討すると共にセリン経路を構成する各種酵素について酵素化学的、分子遺伝学的研究を行うことを目的とした。H.methylovorumのグリシン耐性変異株であるGM2株は、休止菌体反応系でメタノールとグリシンから34mg/mlのL-セリン生産が可能である。さらに菌株のスクリーニングを行ったところ、71mg/mlのL-セリンを生産できるMN株を見いだすことに成功した。この株によるL-セリン生産においては、1mM CdCl_2を添加することによりL-セリン分解活性を完全に抑制することができ、その結果、グリシンからL-セリンへのモル転換率は100%となった。セリン経路を構成する酵素については、GM2株より均一に精製されたセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)の酵素的加水分解を行い、得られたペプチド断片のアミノ酸配列の決定を行った。同時にN末端アミノ酸配列も決定し、これらの配列をもとにDNAプローブを作製した。大腸菌を用いて作製したGM2株の遺伝子バンクとプローブとのハイブリダイゼーション試験を行い、SHMTをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。
あと施工アンカーの引抜き耐力に及ぼす温度条件の影響

あと施工アンカーボルト(以下、アンカー)が用いられているコンクリート構造物が、暑中期に外壁や屋根スラブなどが受ける6080°C程度までの温度環境下にさらされた際の、アンカーの引抜き耐力を明らかにするとともに、このような100°C未満の熱の影響を受けた場合を含めた、アンカーの引抜き耐力評価試験方法を確立する。【本研究の目的】金属系や接着系などのアンカーが部材表層に施工されたコンクリート構造物が、80°C程度までの温度環境下にさらされた際の引抜き耐力を明らかにし、アンカー周辺の温度分布、構成材料であるコンクリート、アンカーおよび接着材料の物性値に関する検討結果から、解析に用いる構成則を導き出す。そして、その構成則を組み込んだFEM解析と実験結果を比較し、解析の妥当性を検証する。また、100°C未満の熱の影響を含めたアンカーの耐力評価試験方法確立のために、供試体寸法や加熱方法に関する検討を実施する。本年度は、金属系あと施工アンカーに着目した検討を行った。高さ120mm一定とし、直径が100、150、200mmと異なるコンクリート母材中心に、直径12mmの金属系あと施工アンカーを埋込み長さ60mmで施工し、温度20、35、50、65、80°Cで加熱冷却後に、そして、加熱時における引抜き耐力について検討を行った。なお、試験時の拘束条件について、コンクリート母材側面を鋼管で拘束する場合および拘束しない場合について試験を行い、耐力評価試験方法の検討も行った。昨年度は,主に金属系のあと施工アンカーを対象とした検討を行い,あと施工アンカーの引抜き耐力と温度の関係に関するデータを取得した。昨年度は,主に金属系のあと施工アンカーを対象とした検討を行ったが,今年度は,樹脂系のあと施工アンカーに関する検討も行う。また,今年度から解析に資するデータの取得も開始する。
角膜創傷治癒機転におけるサイトカインネットワークの役割

角膜創傷治癒機序について、すでに上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)が角膜の上皮細胞、内皮細胞、実質細胞の増殖を促すこと、これらの増殖因子がこれらの細胞で産生されていることを確認してきた。さらに、PDGFは、角膜細胞の増殖促進だけではなく、遊走をも促進させることを明らかにしてきた。本研究では、さらに発展させ、最近発見されたヘパリン結合性EGF(HB-EGF)の角膜細胞増殖促進および遊走の増強について検討した。すなわち、まず白色家兎から眼球を摘出し、角膜細胞を分離、培養した。これにHB-EGFを処理し、細胞増殖動態を検討した。その結果、HB-EGFを加えると、上皮、実質、内皮細胞のいずれも増殖が亢進することがわかった。また、HB-EGFを単独加えた場合、1-20μg/mlの範囲で、実質細胞と内皮細胞の遊走を促進したが、上皮細胞の遊走は促進しなかった。しかしながら、HB-EGFは、フィブロネクチン誘導性の上皮細胞の遊走を量依存性に促進した。チェッカーボードアッセイ法により、実質細胞と内皮細胞は主にケモタキシスで、上皮はケモキネシスにより遊走していることが明らかになった。インターロイキン-1α(IL-1α)、IL-6、TNFは単独では、上皮細胞の遊走を起こさなかったが、フィブロネクチン存在下では遊走を促進した。これらの作用はいずれもケモタクシスによることが明らかになった。このようにさまざまのサイトカインによるネットワークにより角膜創傷治癒機構が構成されているものと考えられる。
鉛ガラス・リングイメージチェレンコフ・ニュートリノ検出器の開発研究

本研究では、まず、現在進行中のKEK-神岡間長基線ニュートリノ振動実験K2Kで、KEK内の前置検器の鉛ガラス電磁カロリメータを用いて電子ニュートリノ反応の検出、測定を試みた。K2K実験では電子ニュートリノは、主成分であるμニュートリノの約1%しかない。この研究で、電子ニュートリノ反応抽出の技法の開発を行ったとともに、既存のタイプの鉛ガラス検出器での高感度電子ニュートリノ反応検出の限界を示した。将来の高感度撮像型電子ニュートリノ検出器の候補としては、鉛ガラスからのチェレンコフ光を鏡で集光しチェレンコフリングを撮像するタイプと、シンチレータからの光をレンズで集光し粒子の軌跡を撮像するというタイプが考えられる。これらは発光原理はチェレンコフ光とシンチレーション光の違いはあるが、それ以外の、光を集め、高感度イメージ検出器で撮像するという点など共通する部分が多い。そこで本研究では将来の高感度電子ニュートリノ検出器を開発するという目的のもとに、両タイプの検出器の可能性を念頭に置きながら開発を進めた。後者のシンチレータとレンズを用いた検出器は(1)粒子の奇跡を3次元で捕らえられるので方向の測定精度が高い。(2)光量が多いため粒子のエネルギー測定分解能が高い。という利点がある。初年度にはシミュレーションを用いて検出器の概念設計を行った。そして上のような利点から、まずはプロトタイプ検出器としてシンチレーション光撮像型検出器を製作することとした。次年度NaIシンチレータブロックとレンズ、イメージインテンシファイア、CCDカメラを購入し、プロトタイプ検出器を製作し、基礎的なテストを行った。さらに13年度には、京都大学と共同でこのプロトタイプ検出器を用いて宇宙線測定、ビーム入射試験を行った。宇宙線測定ではブロック内で止まったμ粒子からの崩壊電子の検出に成功した。現在、より定量的な性能評価のための解析を行っている。将来の大強度陽子加速器を用いたニュートリノ振動実験の前置検出器として実用化するためには、検出器の大型化が必要である。十分な反応数を得るためには、反応標的である発光体の質量最低約1トン必要である。本研究の次なるステップは大型化の可能性の追求である。そのためには、プロトタイプを用いて得られた基礎データをもとにして検出器シミュレーションを開発し、検討を進めて行くことが必要である。リングイメージチェレンコフ検出器を用いたニュートリノ振動実験のモンテカルロシミュレーションを実際に将来の大強度陽子加速器で得られるニュートリノビームを想定して行った。そしてLSND実験で示唆されているミューニュートリノから電子ニュートリノへの振動のパラメータ領域を完全にカバーするために検出器に必要とされる性能を評価した。その結果、ニュートリノ反応でできる荷電レプトンにくわえ反跳陽子を高効率で捕らえバックグランドを効果的に取り除く必要性が示された。チェレンコフ検出器で陽子に対する高い検出効率を得るためには鉛ガラス程度の高い屈折率が必要であることも示された。鉛ガラスリングイメージチェレンコフ検出器には高感度高分解能光検出器が必要である。そこで今年度はまず、既存の位置分解型光電子増倍管(マルチアノードPMT)の検出効率を上げるための開発研究を始めた。検出効率を上げるひとつの方法は光電面に従来のアルカリ金属膜ではなくガリウム砒素燐(GaAsP)を用いることである。これにより光電面の量子効率をアルカリに比べ2倍以上あげられる可能性がある。これまでマルチアノードにGaAsPを用いたものは存在しなかった。そこでまず、現在入手可能なGaAsP光電面をもつハイブリッドPMT、通常のアルカリ光電面をもつマルチアノードについて検出効率を測定することから始めた。そしてGaAsPの有効性を確認した後、次年度GaAsP光電面をもつマルチアノードPMTを開発する予定である。という利点がある。

宇宙線測定ではブロック内で止まったμ粒子からの崩壊電子の検出に成功した。現在、より定量的な性能評価のための解析を行っている。将来の大強度陽子加速器を用いたニュートリノ振動実験の前置検出器として実用化するためには、検出器の大型化が必要である。十分な反応数を得るためには、反応標的である発光体の質量最低約1トン必要である。本研究の次なるステップは大型化の可能性の追求である。そのためには、プロトタイプを用いて得られた基礎データをもとにして検出器シミュレーションを開発し、検討を進めて行くことが必要である。現在進行中の長基線ニュートリノ振動実験K2Kの前置検出器のデータを解析し、電子ニュートリノ反応の検出手法の開発をおこなった。検出器のシミュレーションを行い、ニュートリノ反応で期待される発光量、光学系の効率などから光検出器の位置で期待される光子数を評価した。そして必要な性能を備える光検出器を選定、購入した。選定にあたっては、光電面が高量子効率を持つこと、高利得であること、ビームに同期してゲートを掛けられることを条件にした。量子効率に関しては半導体薄膜の技術の進展により可能になったGaAsP光電面を採用することで対応した。これにより従来のアルカリ金属膜の光電面に比べ数倍の量子効率が得られる。また高利得を得るために新しく開発された2段MCPイメージインテンシファイアを用いることとした。また光学系に関してもシミュレーションを繰返し、最適化を行った。その結果を踏まえて市販のカメラレンズの一つを選定した。13年度はこれらの要素部品を一つの検出器に組み立てて宇宙線、加速器ビーム、ニュートリノビームを用いたテストを行う。電子ニュートリノ反応の高感度検出のための研究、開発を行った。まず、現在進行中のKEK-神岡間長基線ニュートリノ振動実験K2Kで、KEK内の前置検出器の鉛ガラス電磁カロリメータを用いて電子ニュートリノ反応の検出、測定を試みた。K2K実験では電子ニュートリノは主成分であるμニュートリノの約1%しかない。この研究で、電子ニュートリノ反応抽出の技法の開発を行ったとともに、既存のタイプの鉛ガラス検出器での高感度電子ニュートリノ反応検出の限界を示した。次に、新しいタイプの高感度電子ニュートリノ検出器の開発製作に先立ち、鉛ガラスからのチェレンコフ光を撮像するタイプとシンチレータからの光をレンズで集光し撮像するというタイプの比較検討を行った。その結果、後者のタイプの検出器の方がより高感度電子ニュートリノ検出に適していることがわかった。そしてNaIシンチレータブロックとレンズ、イメージインテンシファイア、CCDカメラを組み合わせたプロトタイプ検出器を製作した。そしてこれを用いて宇宙線測定、ビーム入射試験を行った。現在、より定量的な性能評価のための解析が行われている。
制御蛋白質の機能構造

1.転写調節蛋白質CRPの突然変異体のうち、DNA結合能を有するが転写活性化能を欠損したものを単離した。変異はCRP立体構造上の特定のループ部分にマップされ、この部分がRNAポリメラーゼとの相互作用領域であると結論した。2.RNAポリメラーゼδサブユニットの突然変異体で、CRPへの応答を欠損したものを単離した。変異体の配列決定からこの変異はαのC末領域にマップされ、この部分がCRPとの相互作用領域であると結論した。4.Ada蛋白によるalKA遺伝子の転写調節領域を部位特異的突然変異プロモーターの解析にもとづき決定した。5.大腸菌Cro、酵母GAL4のDNA結合ドメイン、マウスOc+-3蛋白質のホメオドメインの溶液中での立体構造をNMR法などで決定した。6.アクチベーター蛋白質PhoBに応答できなくなるRNAポリメラーゼの突然変異がαサブユニットに存在することを発見し、その領域を決定した。この部分は、PhoB蛋白質との相互作用部位と結論した。7.転写終結活性および抗転写終結活性が変化したRNAポリメラーゼの突然変異体を単離した。これらの変異はβ^'サブユニットに存在することが明らかになった。8.マウスのグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子のエンハンサーが約2.5kb上流に、サイレンサーが300bp上流に存在することを示した。9.固定化オペロンを利用し、光学顕微鏡と画像処理装置により、RNAポリメラーゼがDNA上をスライドする様子の直接観察に成功した。
ヒストンシャペロン複合体から迫るクロマチン構造形成の分子基盤

多くのヒストンシャペロンが発見されているが、それらの機能はヌクレオソーム形成だけにとどまらず、ダイナミックな染色体機能制御とも密接に関わることが明らかとなってきている。本研究はヒストンシャペロン複合体解析を通してクロマチン構造形成の詳細な分子機構、および遺伝子発現に伴うクロマチン制御の解明を目指したものである。現在までに、出芽酵母、分裂酵母において、FLAG/HAエピトープタグを付加したヒストン遺伝子株を構築し、各種ヒストン複合体を精製することに成功した。驚いたことに、出芽酵母、分裂酵母、ヒトでヒストンH3/H4複合体の構成因子が異なることを見いだし、現在、これらの違いからクロマチン形成の共通の分子基盤と戦略のバリエーションについて、細胞周期制御やタンパク量制御に焦点を当てて機能解析を進めているところである。また、cdc10温度感受性変異株にタグを付加したピストンH3を導入し、同調培養条件でのヒストン複合体精製や、ヒストン過剰発現と染色体観察を行った。その結果、ヒストン遺伝子の3'UTR領域の新たな機能や、大量発現による複合体形成異常など複合体解析の技術的な問題点が明らかとなってきた。今後、それらの問題を解決するとともに、様々な条件においてヒストンと相互作用する因子を複合体として解析することから、ヒストンの合成から分解までヒストンメタボリズムの全貌の理解、細胞増殖と関連する制御機構の理解にまで繋げたいと考えている。出芽酵母、分裂酵母において、FLAG/HAエピトープタグを付加したヒストン遺伝子株を構築し、各種ヒストン複合体を精製することに成功した。また、タンパク質総量としてはほとんど同じにもかかわらず、細胞抽出液から精製されるヒストンH2A-H2B量は、H3-H4に比較して10倍以上多いことが明らかとなった。さらに、出芽酵母H2A-H2B複合体にはヒストンシャペロンNap1以外にFACT(Spt16、Pob3)が含まれることが明らかとなった。FACTはもともとクロマチン転写伸長を促進する因子として同定されたが、最近ヒストンH2A-H2Bをヌクレオソームから除くことが示唆されている。今後、新生ヒストンの核輸送や特異的クロマチン形成経路、およびそれらの制御機構、つまり「ヒストンの一生」とも言うべきヒストンメタボリズムの全貌の理解に繋げたい。
グラフト肝虚血再灌流障害の飛躍的改善：間葉系幹細胞導入による臓器保存液の開発

我々は、門脈投与した間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cells: MSCs)が、肝臓において虚血再灌流障害の抑制につながることを示してきた。引き続き、臨床応用のために、MSCsの培養上澄からexosomeを分離採取する技術を確立した。これについては、同種異系細胞間での免疫反応の抑制が認められることを示している。ラット肝移植モデルでの検証をするために、部分肝移植モデルを作成しexosomeの働きを検証したところ、レシピエントの生存期間が長くなる傾向が見られた。先に報告したように、我々のグループでは、門脈投与した間葉系肝細胞(Mesenchymal stem cells: MSCs)が、肝臓において虚血再還流障害の抑制につながることを示し(Kanazawa H, 2011)、また他研究グループの検討から、MSCsにより臓器移植に伴う拒絶反応の抑制や免疫寛容が誘導される可能性があると考え、研究を開始した。初年度の、MSCsを含む各種培養細胞上清よりExsomeを分離採取する技術を確立したが、これについては、同系異種細胞間での免疫反応の抑制が認められることまでは既に示した。それらをうけて、今年度は、ラット肝移植モデルでの検証を進めるべく、ラット肝移植モデルを安定して運用できるよう実験をすすめている。ドナーLewラットより全肝を摘出し、ET-Kyoto液に保存後、同系ラットに移植するモデルを作成中である。レシピエントラットでは、全肝臓を切除し、グラフト肝を同部に間置する同所性モデルとした。臨床での生体部分肝移植をイメージし、部分肝移植モデルとしている。具体的にはbacktableで肝を80%切除し、血管系は、肝上部下大静脈、肝下部下大静脈ともレシピエントの下大静脈に手縫いにて吻合している。施行時期により生存が若干不安定となるが、原因は主として、バックテーブルにおける、肝のハンドリングにあることがわかってきた。Exosomeの投与ルートについては、保存液中、ないしはレシピエント静脈投与にて検討予定である。我々の研究グループにおいては、間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cells;MSC)が、肝臓において虚血再還流障害の抑制効果をもたらす(Kanazawa H, 2011)事を見出し、また他研究グループの検討から(Popp FC, 2008)、MSCにより臓器移植に伴う拒絶反応の抑制や免疫寛容が誘導される可能性を仮定し、既に提示の計画に基づいた研究を開始した。以下実施状況につき提示する。現在MSCの産生するExosomeに注目して研究を進めている。Exosomeは血液や尿、腹水などの体液や細胞培養の上清などから採取可能な直径40-100nm前後の分泌小胞で、母細胞の細胞膜及び内部に存在する各種蛋白質やマイクロRNAなどを豊富に含み、細胞間でのシグナル伝達や遺伝情報の伝達に関与している(Valadi H, 2007)。このExosomeは、由来する細胞により免疫抑制作用を持つ事が知られており、マウス及びラットを用いた実験的臓器移植モデルにおいて、ドナー樹状細胞培養液由来のExosomeを移植前に経静脈投与することにより、移植臓器の生着期間の延長が報告されている(Peche H, 2003)。我々の研究グループは上、MSCを含む各種の培養細胞上清よりExosomeを分離採取する技術を確立した。透過型電子顕微鏡にて直径約100mで二重膜構造を持つExosomeと考えられる小胞が確認されている。続いて、このExosomeが異種抗原に対する反応において抑制的に働くことを証明するため、リンパ球交叉反応試験を用いた実験を実施した。同系異種細胞間での免疫反応に関するExosomeの効果を調べたところ、Exosome存在下に培養した樹状細胞を用いた系では、Exosome非存在下で培養を行った樹状細胞を用いた系に比して、同系異種細胞間での免疫反応の抑制が認められる事が確認出来た。我々のグループでは、門脈投与した間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cells: MSCs)が、肝臓において虚血再灌流障害の抑制につながることを示してきた(Kanazawa H, 2011)。また他の研究グループの検討から、MSCsにより臓器移植に伴う拒絶反応の抑制や免疫寛容が誘導される可能性があると考え、研究を開始した。初年度の、MSCsを含む各種培養細胞上清よりExosomeを分離採取する技術を確立したが、これについては、同種異系細胞間での免疫反応の抑制が認められることまではすでに示している。最終年度では、さらにラット肝移植モデルでの検証を目標とした。同種異系での移植については、脳死移植を前提とした全肝移植モデル作成は問題なく施行でき、その際、保存時間を24時間まで延長することが可能であった。しかしながら、臨床での生体部分肝移植をイメージした、ラット部分肝移植では技術的な問題が依然残っている。具体的なモデル作成としては、backtableで肝臓を80%切除し、レシピエントでは肝上部、肝下部とも手縫いにて吻合している。手技によるものか、ラットの脆弱性によるものか、時期による生存の波が解消しきれていない。

Exosomeを投与した群では、生存期間が長くなる傾向は見られたが、結論は得られていない。小児外科、移植外科初年度でexosome抽出ができていること、2年目で、動物実験モデルの部分肝移植モデルの作成にほぼ目処がついたこと、から上記区分になると考えています。当初、LEWラットの脂肪組織より樹立した間葉系幹細胞から培養液濃縮液を抽出した。具体的には、100mm-dishに0.1%血清含有培地にて脂肪組織由来間葉系幹細胞を培養し、培養開始48時間後に培養液のみを回収し、市販されている濃縮カラムを用いて細胞分泌成分を回収する。濃縮の有無はFUJI Dry Chem(富士フィルム社)を用いて総タンパク質量を測定すると共に、ローリー法による吸光度計を用いた定量を行い確認する。という手法にて、用意した濃縮液を実験に用いたが、予備実験にて、毒性が強く、治療濃度域が極めて狭いと考えられた。ここで、exosome抽出により、研究を進めることとし、前記のごとく分離採取、効果判定できている。全肝移植での長時間保存グラフトに対する改善効果、部分肝移植でのグラフト再生促進効果につき検討する。ET-Kyoto液にexosomeを添加し、ドナー肝臓を保存、その後レシピエントラットに移植して生存率や血液生化学データ等にて評価を行う。上記の条件で、コントロール群、study群とも効率に死亡する場合は、長時間保存実験においては、保存時間の短縮にて対応する。部分肝移植モデルについては、切除率の低減で対応予定である。今後、ラット移植モデルを用いた評価を行う。先ずドナーとなるLEWラットの肝臓をET-Kyoto液にて還流し、摘出後に同保存液に浸す。既に我々は4度冷保存時における肝臓保存限界時間を明らかにしている事から、肝臓の保存時間を24時間と固定する。24時間保存した肝臓をレシピエントラットに移植し、「生存率の算定」「血液生化学の測定」「肝臓病理の解析」などを行う。この項目ではET-Kyoto液による最適な「保存温度(4度・23度・37度)」を決定する。当該実験は京都大学にて実施する。24時間保存で保存温度間で有意な差が確認されなかった場合には、ドナー肝臓の保存時間を18時間、12時間と6時間づつ短くして実験を遂行する。一方、Luciferase-Tg LEWラットの肝臓を同条件にて保存し、同一個体や組織を経時的に発光輝度の追跡が可能であるIVISを用いて肝臓の保存状態を評価する細胞培養、exosome分離のための、試薬類などに予算の1/3を用いる予定である。また、ラット移植モデル作成、検体作成、標本作製に残り2/3を用いる予定である。
大規模・高性能VLSIのレジスタ転送レベルにおけるテスト容易化設計に関する研究

VLSIのテストを可能にするためにはテスト容易化設計が必須であるが、テスト容易化により過剰なテストを強いる場合があり、その場合には歩留ま劣化という重大な問題を引き起こす場合がある。昨年度から、テスト容易化に伴う相反する問題を両面から扱っている。最近の微細化により、製造ばらつきにる遅延故障が問題になっているが、この場合物理的な欠陥によって引き起こされる故障ではないため、今後さらに過剰テストを考慮した遅延故障テストが必要になると考えられるため、レジスタ転送(RT)レベルからの過剰テスト緩和に重点を置いた。本年度は、昨年度に引き続き、これまでに提案したRTレベル回路の縮退故障に対するテスト容易化設計の改良に関する考察を行った。さらに、昨年度提案した均一ビット幅データパス向けの遅延故障に対するテスト容易化設計法を、不均一ビット幅データパスして適用するための、遅延故障に対するビット幅調整機能を実現する機構についても研究を行った。今年度の成果として得られた遅延故障に対するビット幅調整機構では、テストパターンの印加可能性を下げてハードウェアオーバヘッドを抑えたため、任意の遅延テストを印加できない。これについては今後も改良を継続する必要がある。過剰テストの緩和においては、昨年度に得られた冗長手法では対応できなかったRTレベル回路モデルにも対応した。具体的には、RTレベルにおける回路の冗長性を、RTレベルの回路の構造情報に加え、さらに上流の高位合成段階で得られる回路の機能情報を用いることにより、RTレベルで完全に探索できなかった機能情報を補完し、従来法では扱えなかった回路構造上の冗長聖判定を可能とした。本年度は主にデータパス部のテスト容易化を考察した。データパスは、組合せ回路で構成される機能ブロックと、記憶要素であるレジスタ、およびそれらを接続する信号線で構成される。ビット幅の不均一なデータパスでは、組合せ回路で構成される機能ブロックの入出力でビット幅が変化する。これを踏まえ、不均一なデータパスへ応用可能な縮退故障に対するテスト容易化設計法を提案した。現段階ではビット幅の変化には対応していないが、データパスの回路要素へ任意の値の伝搬を保証するこれまでの階層テスト生成手法に対し、提案したテスト容易性では、データパスの回路要素へ元々回路の持つ機能で伝搬可能な値のみを考慮する時間展開テスト生成手法を導入した。これにより、不均一ビット幅に対する回路モデルを定義することにより、ビット幅の変化するデータパスへ応用できると考える。また、階層テスト生成手法において不均一なビット幅を扱うためのビット幅調整機能を実現する機構についても継続して考察を行っている。本年度はさらに、遅延故障に対するテスト容易化設計法も提案した。遅延故障においては冗長性判定が特に重要になってきている。提案法はビット幅の均一なデータパスに対するものであるが、提案法の中で冗長遅延故障の高速判定を行っている。この判定手法はビット幅の不均一なデータパスにも応用可能である。また、コントローラを含めたレジスタ転送レベル全体での冗長遅延故障判定について継続して考察を行っている。本年度は、RTレベル回路のデータパス部の縮退故障を対象としてテスト容易化を考察するとともに、これまでに得られた成果に基づき、遅延故障への対応を考察した。遅延故障は、レジスタからレジスタまでのデータ転送が、仕様通りの速度で行われないという故障で、これらの問に存在する幾つかの機能ブロックを通る経路上の遅延をモデル化したものである。そのため、遅延故障のテストでは外部入力からレジスタへ、テスト系列の各パターンを回路の実動作速度で設定し、レジスタに取り込まれたテスト系列に対する応答を外部出力まで伝搬する必要があるので、縮退故障の場合とは回路に要求する性質が異なる。そこで、遅延故障に対するテスト容易性の評価尺度を定義し、これに基づくテスト容易化設計法を提案した。提案法はビット幅の均一なデータパスに対する手法であるが、遅延故障に対するビット幅調整機能を実現する機構についても継続して考察を行っている。遅延故障テストにおいては、テスト容易化前の回路ではテスト不可能(冗長)な故障が多数存在し、テスト容易化後にそれらをテストすることによる過剰テストが重大な問題となる。過剰テストを行うと、良品を不良品と誤判定することによる歩留まり低下が生じ、深刻な問題を引き起こす。そのため、遅延故障の冗長性判定が特に重要になってきている。昨年度はビット幅の均一なデータパスに対すパス遅延故障の冗長判定法を提案した。今年度は、この判定手法をビット幅の不均一なデータパスに応用し、さらに、コントローラ部を通るパス遅延故障についても扱う方法論を提案した。

過剰テストの緩和においては、昨年度に得られた冗長手法では対応できなかったRTレベル回路モデルにも対応した。具体的には、RTレベルにおける回路の冗長性を、RTレベルの回路の構造情報に加え、さらに上流の高位合成段階で得られる回路の機能情報を用いることにより、RTレベルで完全に探索できなかった機能情報を補完し、従来法では扱えなかった回路構造上の冗長聖判定を可能とした。
神経変性の制御における成長因子プログラニュリンの役割に関する研究

A.APP/PS1系ハイブリッドマウスを用いて以下の検証を行った。アルツハイマー病脳では異常蓄積したAβによりシナプス外のNMDA型受容体が活性化状態なっていることが示唆されており、PGRNに関しても当研究室において、その有無がてんかん発作の発症に関与する可能性が示唆されている。B.TDP-43系ハイブリッドマウスを用いて以下の検証を行った。1.行動学的解析ー6-7ヶ月齢のTDP-43系マウスを対象として、Y迷路試験、ローターロッド試験、オープンフィールド試験を実施した。交配の影響でサンプル数が不足しているが、ハイブリッドマウスとその他のジェノタイプ間に学習機能、運動機能、情動行動に差は見いだせなかった。2.組織学的解析ー30週齢のPGRN-HZおよびTDP-43/PGRN-HZの脳切片を用いて抗TDP-43抗体および抗リン酸化TDP-43抗体を用いて免疫組織染色を行い封入体の有無等を検証したが、明確な封入体の形成は確認できなかった。神経細胞数に関してはニッスル染色により皮質第5層で減少傾向がみられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は主にAPP/PS1系を用いて検証を行った。まず8週齢のAPP/PS1-Tg, APP/PS1/PGRN-KOの脳を用いて,抗Aβ42抗体による免疫組織化学染色により蓄積の程度を調べたところ蓄積がほとんどみられず,ニッスル染色による比較でもジェノタイプ間に差がみられないため,今後は30週齢のマウスを対象に検証を行うこととした。1.脳の組織学的解析抗Aβ42抗体による免疫組織化学染色ではWTおよびPGRN-KOの脳では観察されなかったAβの蓄積がAPP/PS1-Tg, APP/PS1/PGRN-KOの大脳皮質,海馬を中心に観察された。蓄積の程度についてはサンプル数が少なく比較は行えていないAPP/PSEN1-Tg, APP/PSEN1/PGRN-KOの大脳皮質および海馬から各種溶液(TBS,ギ酸)を用いてAβを連続的に抽出しELISA法によりAβ量を測定した。サンプル数が少ないものの,傾向としてどちらの分画においても大脳皮質より海馬においてAβ量が多く,ジェノタイプ間での差はほとんどないと考えられる。2.行動学的解析3.分子生物学的解析Aβにはミクログリアを活性化させる作用があり, PGRN欠如もミクログリアの活性化を亢進させることが示されている。そこで本年度は培養ミクログリアを確保するため,マウスの大脳および海馬からミクログリアを単離する実験系を確立した。ハイブリッドマウスの作出につき十分なサンプル数が確凝きていないため。まずはサンプル数の十分な確保を行う。これと並行してWTおよびPGRN-KOのミクログリア培養系を用いてアミロイド添加実験を行う。またミクログリアの活性化により生じるサイトカインの産生や過酸化物の蓄積をリアルタイムPCRやウェスタンブロッティング法によって解析し,各群で比較する。さらに生後1年以上のマウスを用いて加齢による影響も検討する。
数論的代数幾何学の研究

黒川は、モノイドのスペクトルに基づく絶対スキーム論とその数論的代数幾何への応用を研究した。例えば、トーラス埋め込みは絶対スキーム論の一部と見なすことができることを示しまた、ゼータ関数への応用も与えた。藤田は、多様体Vとその有理因子Dの対からなる対数多様体とその上の偏極構造に対して小平エネルギーの概念を拡張し、森-川又理論の改良版を用いて、3次元の偏極多様体の小平エネルギーのとりうる値は負の範囲では離散的であることを示した。岡は代数トーラス内の完全交差多様体に対し射影多様体のレフシェッツ型定理の一般化を与えた。また、射影平面曲線の補集合の位相構造について詳しく調べ、トーリックコンパクト化を用いる手法をさらに発展させた。野口は正則写像のモジュライ空間の構造の研究とそのディオファントス幾何の問題に応用に関しS. Lang予想を解決したが、このことにより関数体上では双曲的複素空間はその有理点に関して有限性の性質をもつことが証明された。次に、代数体上定義された双曲多様体をいかに構成するかが問題となるが、野口は増田一男と協同で、そのような多様体を構成するアルゴリズムを発見し、コンピューターを用いて今まで知られていなかった双曲多様体を構成することに成功した。辻は、偏極多様体の随伴直線束に関する藤田の予想をほぼ完全に近い形で解決した。さらに、無限非分岐被覆でのもとでの小平次元の不変性の研究をし、「一般型の多様体の場合、その普遍被覆が小平次元を決定する」ことを証明した。これは飯高予想に答えるものである。つい最近、上の問題に関して、辻自身により開発された一般化されたバーグマンの核を用いて、より一般的な取り扱い方法を得、「イントリンシック双曲型ボリュームは一般型の多様体に対して負のRicci曲率を持つ」ことを示した。代表者福田は、特異点の族がパラメータに沿って位相型を変えないための代数的な条件を与えた。
染色体複製開始とその制御を行う、動的かつ複合的蛋白質高次装置の機能構造特性

DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行するほか、複製開始制御機構の標的因子ともなっている。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、「DnaAが直接関わる、動的かっ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指した。1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明まず、超好熱菌DnaA蛋白質を精製して、機能解析した。大腸菌以外では初めてとなるin vitro複製開始再構成系を構築することに成功した。さらにこのDnaAを用い複製開始複合体の結晶作成を進めた。また、大腸菌DnaAのN末ドメインの機能構造解析を進め、DnaA-DnaA相互作用機構とDnaBヘリカーゼ装着機構を解明した。また、DnaAのATP複合体形成動態解析を進め、新たな機能構造を解明した。2.DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関Hda機能解析を進め、Hdaの複合体形成との機能構想相関を見いだした。クランプの機能構造解析を進め、Hdaとの相互作用機構を検討した。さらに、新規のクランプ結合因子の機能解析を進めた。さらにDnaA相互作用因子の探索をプロテオミクス手法で行い、多種の因子を同定し、機能解析を進めた。多種のDiaA変異体を分離し機能構造相関解析を進めた。DiaAの結晶構造解明に成功した。DnaA-DiaA複合体が複製開始複合体の形成促進を行うことを初めて解明した。4.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発DnaAドメインIVを結合標的とした化学修飾オリゴヌクレズチドを設計し、合成に成功した。これを用いて結合様式などの解析を進めた。複製開始とその制御は細胞周期中で起こる決定的重要性を持つ反応の1つである。DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行する。本計画研究では、これまでの本研究グループの研究実績と基盤に立脚し、「複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、DnaAが直接関わる、動的かつ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指している。(1)全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明超好熱菌由来のDnaA蛋白質を精製した。DNA結合能・高次複合体形成能・複製開始能などに関する生化学的機能解析を行い、機能特性を解明した(論文投稿準備中)。(2)RIDA分子機構解明:DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関DnaA/Hda/クランプの相互作用機構と機能構造相関の解明を進め、論文発表した(JBC,2005)。(3)DnaA,Hda,クランプ相互作用因子探索DnaA機能制御因子の生化学的探索を行い、候補因子を見いだした。(5)蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発DnaAドメインIV(DNA結合ドメイン)を特異的分子標的とした薬剤を設計し合成法の開発を進めた。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、DnaAが直接関わる、動的かつ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解することを目指した。1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明超好熱菌

由来の精製DnaA蛋白質を用い、DNA結合能・高次複合体形成能・複製開始能などに関する機能特性を解明し、論文発表した(Genes to Cells)。超好熱菌由来のDnaA蛋白質のDNAとの共結晶作成を作成した。大腸菌DnaAのN末ドメインのNMR解析をほぼ完遂し、結晶作成も検討した。また、DnaAの機能構造とATP依存的な複合体形成動態との相関解明に成功し、論文発表した(JBC)。さらに、2重鎖DNAの開裂反応に特異的欠損をもつと推測されるDnaA変異体を分離した。2.RIDA分子機構解明:DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関Hda機能のヌクレオチド結合による制御の分子機構解明を進めた。Hda-クランプ複合体の機能解析によりRIDA機構解明を進めた(JBCおよびJSB)。3.DnaA,Hda,クランプ相互作用因子探索機能未解明だったタンパク質が新規のクランプ結合因子であることを解明し、その機能解析を進めた。DiaAの結晶構造解明に成功し、DnaA-DiaA複合体の形成に必要な機能構造の解明を行った。5.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発DnaAドメインIVにおける機能アミノ酸残基の解析を行った。これに基づき化学修飾オリゴヌクレオチドを設計した。DnaA蛋白質は複製起点と複製開始複合体を形成して2重鎖DNAの開裂という開始反応を遂行するほか、複製開始制御機構の標的因子ともなっている。本計画研究では、複製開始反応と開始制御反応の分子機構を、DnaAが直接関わる、動的かつ複合的蛋白質相互作用として、特に蛋白質構造に基づいて理解する」ことを目指した。1.全長DnaAの構造解析と複製開始複合体の構造解明まず、超好熱菌由来のDnaA蛋白質を用い複製開始複合体の結晶作成を進めた。さらに、大腸菌DnaAのN末ドメインのNMR解析を完遂し、立体構造解明に成功した。これに基づき、変異体解析も進め、複製開始複合体形成時のDnaA-DnaA相互作用におけるN末ドメインの役割を解明した。加えて、DnaBヘリカーゼ装着におけるN末ドメインの機能構造を初めてアミノ酸残基レベルで解明した(JBC)。また、DnaAの機能構造とATP複合体形成動態との相関解析を進め、新たな機能構造の役割を解明した(Mol.Microbiol.)。さらに、2重鎖DNAの開裂反応に特異的欠損をもつDnaA変異体の解析を進め、複製開始における新たなメカニズムモデルを作成し検証した(論文執筆中)。2.RIDA分子機構解明:DnaA/Hda/クランプ相互作用機構・機能構造相関Hda機能のヌクレオチド結合による制御の分子機構解明を進め、Hdaの複合体形成との相関を見いだした(論文執筆中)。クランプの機能構造解析を進め、Hdaとの相互作用機構を検討した。3.DnaA, Hda,クランプ相互作用因子探索新規のクランプ結合因子の機能解析を進めた。さらにDnaA相互作用因子の探索をプロテオミクス手法で行い、多種の因子を同定した。機能解析を進めている。DnaA-DiaA複合体が複製開始複合体の形成促進を行うことを初めて解明した(論文投稿中)。5.蛋白質構造とその機能特性に基づいた阻害剤設計と開発DnaAドメインIVを結合標的とした化学修飾
偽落屑症候群の分子遺伝学的解析

格子状角膜ジストロフィーと偽落屑症候群を合併した2症例を含む一家系12名について、格子状角膜ジストロフィーの原因遺伝子であるTGFBI遺伝子のPCR直接塩基配列決定法による変異解析を行った。その結果12人中4人にL527Rのmissense mutationを認めた。格子状角膜ジストロフィーを認めない2症例でもTGFBI遺伝子のL527Rを認めたので、このmissense mutationでは浸透率は約50%である可能性が高いと考えられた。また発症した2症例では表現型と所見の程度にほとんど差を認めなかったため、発症した場合は表現型の差異はほとんどない可能性が高いと考えられた。偽落屑症候群は、続発性緑内障の最大の危険因子であるがその病態はほとんど未解明である。偽落屑症候群の遺伝学的素因・背景を明らかにすることを本研究の目的とする。具体的には本研究は以下の2本立てで実施する。<1>2つの異なる眼疾患である偽落屑症候群と格子状角膜ジストロフィは、ともにアミロイド物質の沈着がその病因として示唆されている。これを利用して、両疾患を合併している稀少な症例を遺伝学的に解析し、関係を明らかにする。<2>ごく最近欧州で偽落屑症候群の有力な危険因子として報告されたLOXL1遺伝子の多型を日本人症例で解析する。本研究は長崎大学遺伝子解析研究倫理委員会の承認を受けている。当科外来通院中の偽落屑症候群の罹患者および非罹患者にインフォームド・コンセントのもと、末梢血から多数のDNAサンプルを収集し、塩基配列決定法によって日本人におけるLOXL1遺伝子の変異、多型について検証する。本診断は告知されており、遺伝子解析について了解を得ている。また並行して、格子状角膜ジストロフィと偽落屑症候群を合併した2症例を含む一家系12名についても同様にLOXL1遺伝子について検証する。現在偽落屑症候群の罹患者および非罹患者の血液サンプルを収集中であり、高分子ゲノムDNAの抽出とLOXL1遺伝子の変異解析については日程調整中である。格子状角膜ジストロフィーの一家系についてはすでにDNA抽出は終了し、LOXL1遺伝子の変異解析についてPCR条件検討し、準備実験中である。偽落屑症候群の遺伝学的素因・背景を明らかにすることを本研究の目的として研究を開始した。2つの異なる眼疾患である偽落屑症候群と格子状角膜ジストロフィーは、ともにアミロイド物質の沈着がその病因として示唆されている。これを利用して、両疾患を合併している稀少な症例を遺伝学的に解析した。格子状角膜ジストロフィーと偽落屑症候群を合併した2症例を含む-家系12名について、格子状角膜ジストロフィーの原因遺伝子であるTGFBI遺伝子のPCR直接塩基配列決定法による変異解析を行った。格子状角膜ジストロフィーを認めない2症例でもTGFB1遺伝子のL527Rを認めたので、このmissense mutationでは浸透率は約50%である可能性が高いと考えられた。尚、変異を認めた4人とも50歳以上であるが、更なる加齢に伴い発症することを考慮する必要がある。(これまでTGFBI遺伝子の解析は多数報告されているが、その変異の浸透率、表現度についてはあまり知られておらず、重要な知見と思われる。)現在、偽落屑症候群の有力な危険因子として欧州から報告されたLOXL1遺伝子の多型を本家系ならびに当科外来通院中の偽落屑症候群の日本人罹患者および非罹患者にて解析する準備を続行している。
統合失調症多発家系における家系内希少変異の探索

統合失調症多発家系において、その家系内にあるレア変異を全エキソンシーケンスという方法で検出することで疾患原因遺伝子を同定しようとした。今回我々は3家系でこの方法を行い、いずれの家系においても潜在的候補遺伝子を抽出することが出来たが、どの遺伝子が実際に疾患原因なのかまでは、現時点では見極められなかった。今後は、iPS細胞などを利用した機能解析と多数の弧発症例を用いての検証を行い、新規原因遺伝子を同定していく。家系内で複数の精神疾患罹患者を有する家系に対象を絞り、その家系内だけの希少変異を同定することで疾患の原因遺伝子を同定しようと計画した。当初10家系を収集する予定であったが、全エキソン解析の予算と、家系内で多数のサンプルを解析する必要性を併せて考慮すると、3家系行うことが限界であった。第1の家系は水頭症と統合失調症様の精神症状を併せ持つ家系であり、その家系内から罹患者2名、非罹患者1名を選択し全エキソン解析を行った。罹患者のみにみられる一塩基置換を抽出し、更に同家系内から別の2名(1名は罹患者、もう1名は非罹患者)を加え、3名のエキソン解析から抽出した一塩基置換を対象に直接シーケンス法にて確認、候補を絞った。この家系については今後他大学と協力して研究を進めていく予定。第2の家系は統合失調症とパニック障害の患者が複数存在する家系であり、三世代に渡り計6名の罹患者を有していた。罹患者2名、非罹患者1名で全エキソン解析を行い優性遺伝モデルで解析し、その結果を他の罹患者3名で検証した結果、罹患者のみに共通する一塩基置換は11遺伝子の11箇所に確認された。今後は、これら11遺伝子全てのエキソーム解析を弧発例の罹患者群で検証していく予定であるが、今年度中は実現がかなわなかった。第3の家系は3世代に渡り統合失調症罹患者を12名有する大家系であり、その家系内から罹患者7名、非罹患者3名の検体を収集し、うち罹患者2名、非罹患者3名の検体を用いて全エキソン解析を行った後、その他の検体を用いて直接シーケンス法にて検証を行った。優性遺伝モデル、劣性遺伝モデル双方の解析結果から、2遺伝子に候補遺伝子が絞られた。いずれも統合失調症の原因としては新規のものであり、今後の展望次第では治療に結びつくような大きな成果をあげられる可能性があるが、これも今年度中に論文という形での成果発表とまではいかなかった。家系内で複数の精神疾患を有する家系に対象を絞り、その家系内だけの希少変異を同定することで疾患の原因遺伝子を同定しようと計画した。われわれは対象家系を10家系収集する予定であったが、その後に全エキソン解析をすることを考えると、予算上、対象家系を大幅に減じる必要性が出てきた。よって、われわれはより特殊な表現型が一致している家系にのみ対象を絞り、サンプルを収集することを試みた。これらサンプルを用いた全エキソン解析で、家系内の希少変異、そして疾患の原因遺伝子を同定出来ると考えている。これまで統合失調症において、数多の疾患感受性遺伝子が報告されているが、このように多くの候補遺伝子が同定されるのは疾患集団の表現型が不均一か、または、より根幹の症状だけに絞って疾患集団を同一化させていることに原因があったのではないかと考え、より希少な表現型が一致する家系で全エキソン解析を行うことは、これまでにない画期的な方法であると考えている。近年、ハンチントン病のような遺伝的神経疾患が、幻覚や妄想などの精神症状を併発するという報告が散見されており、われわれも偶然ではあるが、サンプル収集の際に同様の事象を経験した(T. Nakano et al., 2013)。よって、収集したサンプルがそのような神経疾患ではないかを除外する目的で、プライマーを作成し、事前に研究参加者からの了承を得て、PCR法及び直接シーケンス法にてハンチントン病ではないことを確認した。現時点では、収集した家系はハンチントン病でないことが確認され、これから全エキソン解析に移行する予定となっている。当初の計画と比較し、やや遅れていると言わざるを得ない一番の原因は、適当なサンプルを収集することに想定外に時間を要したことが挙げられる。限られた予算の中で完全に目標に到達しようとすると、極めてまれな表現型を有する家系に絞る必要があり、この条件に該当する家系を探すことに時間を要した。また、当初から予測していたことであったが、病院に入院、または通院している罹患者であれば協力を要請しやすい状況にあるが、検体採取時に病院に通院していない罹患者や、健常な非罹患者の検体収集は困難を極めた。しかしながら、既に必要なサンプルは入手しており、当初の計画からは遅れてはいるものの、具体的な実験に移る態勢は整っている。前述の通り、まず著明な遺伝的神経疾患(ハンチントン病)を除外する目的でプライマーを作成し、ハンチントン病ではないことを確認した。

今後は、現在収集しているサンプル(DNA)を精製、濃度調整したうえで、全エキソン解析を実施する予定である。この作業自体はそれほど時間を要さないものと思われる。一家系を解析するのに、長くて一ヵ月程度と想定している。問題は、この解析で得られたデータから有用なものを吟味、抽出していく作業であるが、ここに多くの時間をとられるものと想定している。まずは、得られたデータが確実なものか、全エキソン解析とは別の方法、ここでは直接シーケンス法やメルティングカーブ法を用いて行っていく。この際、全エキソン解析に用いなかった同じ家系の罹患者、非罹患者をすべて使用しての確認を行う。これまでの経験上、全エキソン解析では、heterozygousに限っていえば個人を解析すると一人当たり数百個(およそ400個)の多型登録のない非同義的一塩基置換が同定されることが推定され、サンプルを一人増やして比較するとそれが約半分になる。今回はそれを踏まえて同一家系内で多くの検体を収集したので、ある程度まで候補遺伝子を絞れると期待している。全エキソン解析は高価なため、なるべく少数のサンプルで行いたいが、前述のように候補が広く残ってしまう可能性があることが経験上分かったため、少なくとも同一家系内の3名もしくは4名で行いたい。この全エキソン解析にかかるSureSelect Human All Exon Kitや試薬類を購入する費用として研究費のほとんどを計上している。それでも候補は一つに絞れないことが予想されるため、同一家系内の他サンプルを用いた直接シーケンスやメルティングカーブ法にかかる試薬購入費用として、その残りを使用する予定である。