hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
噛み合いによる減耗を低減する切歯低形成トラフグの作出基盤の開発

トラフグ養殖における噛み合いを防ぐための歯切り作業軽減を目的として、歯の形成に関与する9つのSCPP遺伝子の機能抑制個体を作出するための基盤技術の開発を行った。約850個体のトラフグ変異導入集団から当該遺伝子群に変異を持つ個体を網羅的に探索したが、機能抑制が期待される変異体は得られなかった。一方ゲノム編集技術により、SCPP遺伝子の一つに変異を持つトラフグの作出に成功し、今後変異ホモ型個体を使った解析が期待される。トラフグ変異集団全個体(845尾分)のゲノムDNAに対し、9つの分泌性カルシウム結合性リンタンパク質SCPP各遺伝子について、5'側から48領域(各約200bp/領域)、SPARC (Exon2,3,4,5,6:445塩基)、SPARCL1 (Exon2,3,4:1145塩基)、SCPP1 (Exon2,3,4,5,6,7,8,9:480塩基)、SCPP2 (Exon2,3,4,5,6,7,8:661塩基)、SCPP3A (Exon2,3,4:259塩基)、SCPP3B (Exon2,3,4:289塩基)、SCPP3C Exon2,3,4:277塩基)、SCPP4 (Exon2,3,4,5,6:741塩基)、SCPP5 (Exon2,3,4,5,6,7+8:409塩基)を設定した。この全48領域(全4706塩基)に対して、NGS (Ion PGMTM)、マルチアンプリコン作製システム(Access ArrayTM)、ゲノム解析ソフト(CLCゲノミクスワークベンチ)を用いて変異塩基スクリーニングを実施し、参照配列とした親魚のゲノム配列と異なる塩基のうち、5%以下のものはシークエンサーのリードエラー、また10%以上も何らかのエラー、さらにin/delも除いた結果、アミノ酸変異を持たない変異が9カ所(SCPP2, SCPP3A, SCPP3C, SPARC)、アミノ酸変異を持つ変異が5カ所(SCPP3A:1カ所, SCPP3C:4カ所)の変異箇所が得られた。変異した塩基により、SCPP3Aではシステインがトリプトファンに、SCPP3C遺伝子ではスレオニンがアラニン(3カ所)あるいはイソロイシン(1カ所)に変異していた。SCPP遺伝子領域群で検出された変異導入率は0.0004%となり、当初の予想(0.4%程度)より低い値となり、変異が入りにくいゲノム領域である可能性が考えられた。顕微注入の機会を複数回得るために、三重県尾鷲栽培漁業センターから車で一時間離れた玉城庁舎までトラフグ未受精卵を輸送した後、人工授精により顕微注入が可能か調べた。その結果、未受精卵を水温17°Cに維持すれば、採卵3-7時間後でも人工授精した後、一時間の顕微注入を実施した後でもふ化仔魚が得られることが明らかとなった。その受精後48時間においてメチレンブルー染色による判定で生残率は8-9割であった。一方、顕微注入した受精後2日または3日の卵を17.3-17.8°Cに保って車で輸送したところ、輸送翌日のメチレンブルー染色による判定で生残率は9割、うちGFPポジ個体は51.6%(n=281)であった。これによって、遠隔地からの卵の提供についても、遺伝子編集試験に供することができることが明らかになった。さらに分泌性カルシウム結合性リンタンパク遺伝子群secretory calcium-binding phosphoprotein(SCPP)に属するSPARLCL1遺伝子に対して、広島大学山本教授から提供されたSPARCL1-TALEN-AおよびBペアをそれぞれ受精卵に顕微注入し、変異導入個体スクリーニングを行った。スクリーニングにはHMA解析を用い、およそ80尾のふ化仔魚に対して変異導入個体探索したが、変異体に特徴的なバンドシフトは見られず、変異導入個体と判断された個体はなかった。また、TALENより効率的に多くの遺伝子に同時にゲノム編集を行うことができるとされるクリスパーキャスによる遺伝子編集に必要なガイドRNAを9種の切歯形成遺伝子に対して、それぞれ設計・合成を行った。それらの内、同じ組織で発現する2-3種のガイドRNAを混合し、複数遺伝子の同時変異導入を試みたが、ふ化仔魚はいずれの場合も得られなかった。遺伝子編集技術が、所属機関内の規則で組み換え体と同等の取扱となったため、これまでのようにトラフグ卵を譲渡いただいた事業所等で顕微注入試験を行うことができなくなった。そのため、まずトラフグ未受精卵の保存と輸送の試験を行うことが必要となった。顕微注入の機会を増やすためトラフグの早期催熟を試みた。11月中旬に20°Cから約10日間かけ15°Cまで冷却し16日間維持した後、12月上旬から0.5°C/2週間で温度を上げ、2月上旬から17°Cを維持した。日長は自然日長とした。3月上旬に雌3尾に対し、カニューレにより卵径を確認したところ約800-1,000μmであった。各4-5kgの体重に対し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを2,500IUで1ないし2回注射投与したところ、当初の卵径1,034μmの個体では初投与から4日後、936μmの個体は12日後、857μmの個体は23日後に排卵が確認された。時期はずれたものの全3尾で約1-2ヶ月早期採卵することができた。

9種のSCPP遺伝子に対するCRISPR/CasのガイドRNA全12種の顕微注入を行った。受精2日後の卵からDNAを抽出し、各遺伝子のアンプリコンDNAに対してHMA解析を行った。各ガイドRNAの切断活性は、SCPP3A-2、3B-1、3B-2、3C-1、4、SPARCについては強く、SCPP1、2、3A-1、3C-2、5、SPARCL1については弱かった。SCPP5に対するガイドおよび人工ヌクレアーゼRNAをトラフグ受精卵およそ500個に顕微注入を行った。ふ化直前の発生率は35.5%で、ふ化後2ヶ月齢において変異導入候補稚魚50尾が得られた。体長5-7cmでタグを打ち、HMA法により変異導入個体7尾を得ることができた。切歯の外部形態を目視で確認したが、明らかな形成不全は認められなかった。これらの遺伝子編集F0個体では体細胞モザイクで変異が導入されていると考えられ、機能欠損の表現型に対する効果は限定的であると考えられた。今後、次世代F1や次次世代F2を作出し、全細胞ホモ型変異個体で形質評価する必要がある。トラフグ養殖における噛み合いを防ぐための歯切り作業軽減を目的として、歯の形成に関与する9つのSCPP遺伝子の機能抑制個体を作出するための基盤技術の開発を行った。約850個体のトラフグ変異導入集団から当該遺伝子群に変異を持つ個体を網羅的に探索したが、機能抑制が期待される変異体は得られなかった。一方ゲノム編集技術により、SCPP遺伝子の一つに変異を持つトラフグの作出に成功し、今後変異ホモ型個体を使った解析が期待される。当初の計画通り変異集団全個体のゲノムDNAに対し、9つのSCPP遺伝子48領域(200bp/領域)について、次世代シークエンサー、Digital PCR等を用いて集約的に解析し、変異塩基の解析を実施し、いくつかの候補箇所を同定した。しかしながら10/30-11/3にかけて、3年間飼育した突然変異導入トラフグ約400尾がアミルウージニウム症で全滅したため予定していた免疫学的調査や変異体の選抜が実施できなくなった。より多くのトラフグは年一回の採卵のため、顕微注入試験の機会が限られているため、調温による早期催熟を有効に活用して研究を推進する。水産育種学当該年度に突然変異導入トラフグ約400尾をアミルウージニウム症ですべて喪失したため、予定していた免疫学的調査や変異体の選抜が実施できなくなり、想定外の研究計画の変更を余儀なくされた。今後は、機能欠損個体の作出については時間のかかるTILLING法は中止し、DNA編集技術(TALENあるいはCRISPR)に集中して研究を推進することとする。変異体が見つかった時に、塩基配列解析を行う予定であったが、今年度は残念ながら変異体が得られなかったため、次年度に塩基配列解析費用を繰り越した。10/30-11/3にかけて、成魚となるまで飼育を続けていた変異導入トラフグおよそ400尾がアミルウージニウム症にて全滅してしまったため、当初計画していた試験ができなくなり、その分の予算が残った。そこで次年度に遺伝子編集試験を重点的に行うこととし、そのために必要なおよそ60万円の予算を繰り越した。遺伝子編集によって得られる変異体候補個体の塩基配列解析に使用する。遺伝子編集試験に関わる顕微注入やRNA合成、塩基配列解析等の消耗品等に使用する。
TGF-βスーパーファミリーによる造血調節に関する基礎研究

TGF-βが造血細胞に及ぼす機能のうち、本年度は単球性白血病細胞株THP-1に対する作用を検討した。TGF-βはTHP-1の増殖に対し、軽度の倍化時間の延長を示すのみであったが、マクロファージ様細胞への明瞭な分化促進作用があり、この作用はTGF-βのシグナル伝達分子として同定されたSmadファミリーの分子を発現させることによっても再現された。TGF-βはTHP-1細胞に、付着性の亢進と活性酸素産生能の亢進を誘導した。活性酸素の放出はTPA刺激でのみ亢進しFMLP刺激には反応しなかった。接着分子の検索ではCDllb(Macl)分子発現増強を示した。CD54(ICAM-1)の発現に変化は見られず、CDlla,CD18の発現はむしろ減少した。TGF-βの単球分化促進作用はTGF-βのシグナル伝達分子として同定されたSmad2,Smad3ならびにDPC4の発現によっても再現された。また、TGF-βスーパーファミリーの骨形成因子(BMP)のシグナル伝達分子であるSmad1の発現によっても誘導された。しかし、TGF-βによる単球分化の際にSmad核移行は検出されず、たとえば、角化細胞の増殖抑制の場合の様に胞体内のSmadがほとんど核内に移行する系とは異なったシグナルの制御機構の存在が示唆された。
初感染ならびに再活性化時HHV-6脳炎の病態解明

【緒言】HHV-6初感染時の脳炎と造血幹細胞移植患者に認められたHHV-6脳炎症例との病態の相違を明らかにする。【考察】HHV-6脳炎は初感染時と再活性化時(移植患者での脳炎)では病態が異なることが推察された。【はじめに】突発性発疹匠は乳幼児期にほとんどの小児が罹患する予後良子好な熱性発疹症でるが、稀に重篤な中枢神経合併症として脳炎・脳症を起こすことが知られている。本研究ではHHV-6脳炎・脳症の発症メカニズムを解明するために、脳脊髄液(CSF)中のウイルスDNA量とサイトカイン、MMP-9濃度について検討した。【対象と方法】対象は血清学的診断(HHV-6抗体価の4倍以上上昇)あるいは血清中のHHV-6 DNA検出によって診断された、HHV-6脳炎・脳症19例(男児8例、女児11例:平均年齢12.4±6.9ヵ月)、HHV-6初感染(ウイルス分離、血清診断)による複雑型熱性痙攣5例(HHV-6 FC群)(男児1例、女児4例:平均年齢132±63ヵ月)およびHHV-6感染を否定された複雑型熱性痙攣19例(非HHV-6 FC群)(男児8例、女児11例:平均年齢17.9±10.4ヵ月)の3群。いずれも発症後48時間以内にCSFを採取されている。CSF中HHV-6 DNA量はreal-time PCR法により測定。また、CSF中サイトカイン量(IL-8、IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70)はCytometric Bead Array (CBA) (BD Biosciences)によって、CSF中MMP-9はELISA (Amersham Biosciences)によって測定した。【結果】3群間において年齢、性別に有意差はなかった。HHV-6脳炎・脳症19例中5例(26.3%)でCSF中からHHV-6 DNAが検出(225-178.5 copies/ml)されたが、他の2群では陽性例はなかった。CSF中サイトカイン及びMMP-9については、HHV-6脳炎・脳症のCSF中IL-8 (p=0.008)、IL-6 (p=0.030)及びMMP-9 (p=0.004)が非HHV-6 FC群と比較して有意に高かった。しかしながら、HHV-6脳炎・脳症のCSF中サイトカイン、MMP-9はHHV-6 FC群と比較して有意な差を認めなかった。また、HHV-6 FC群、非HHV-6 FC群間ではCSF中のこれらバイオマーカー濃度に差はなかった。【考察】HHV-6脳炎・脳症例CSF中のHHV-6 DNA検出率は26%とそれほど高くなく、また陽性例のウイルスDNA量も少なかった。さらに、HHV-6脳炎・脳症例のCSF中IL-6、IL-8濃度がコントロールと考えられる非HHV-6 FC群と比べ有意に高値を示したことから、本症の発症にはウイルスの中枢神経系への直接侵襲よりは、サイトカインを介した中枢神経局所での炎症反応が脳炎・脳症発症に重要な役割を演じていると考えられる。【目的】HHV-6は他のヘルペスウイルス同様初感染後生体内に潜伏感染し、移植患者などの免疫不全患者で再活性化する。本ウイルスは初感染時、再活性化時いずれの状況においても脳炎を発症することが明らかとなっているが、その臨床像はかなり異なる。よって、今年度の研究では、初感染時のHHV-6脳炎、再活性化時のHHV-6脳炎の病態の相違を明らかにすることを目的とした。【方法】22例の初感染時HHV-6脳炎症例、6例のHHV-6感染に伴う熱性けいれん例、14例の非HHV-6熱性けいれん例。さらに、造血幹細胞移植後のHHV-6脳炎症例7例、成人コントロール8例の髄液を用い、髄液中ウイルスDNA量、サイトカイン、ケモカイン、MMP-9、TIMP-1等のバイオマーカーを包括的に測定した。【結果】22例の初感染時HHV-6脳炎患者では、7例で低いコピー数のHHV-6 DNAが検出されたのに対し、移植後のHHV-6脳炎患者群では全例でより多量のHHV-6 DNAが検出された(P<0.001)。髄液中IL-6(P=0.032)、IL-8(P-0.014)、MMP-9(P=0.004)、TIMP-1(P=0.002)は初感染時HHV-6脳炎例のほうが非HHV-6熱性けいれん例より有意に高値を示した。

また、髄液中IL-6(P=0.008)、IL-8(P=0.015)、IL-10(P=0.019)は、移植後HHV-6脳炎例のほうが成人コントロール症例より有意に高かった。【考察】初感染時HHV-6脳炎と、移植患者における再活性化時HHV-6脳炎の病態は異なることが示唆された。初感染時HHV-6脳炎は、ウイルスの中枢神経系への直接侵襲よりも宿主免疫反応がより重要な役割を演じている可能性が考えられた。一方、移植後HHV-6脳炎は、中枢神経系でのウイルスの直接侵襲と、それに伴う局所での炎症反応が重要と考えられた。【緒言】HHV-6初感染時の脳炎と造血幹細胞移植患者に認められたHHV-6脳炎症例との病態の相違を明らかにする。【考察】HHV-6脳炎は初感染時と再活性化時(移植患者での脳炎)では病態が異なることが推察された。
計算機プログラムの理論的基礎の総合的研究

各研究分担者は、解析的意味論に基づく述語論理的プログラム言語NUの理論の構築及び処理系の作成等を行なった。NUは、理論的プログラム言語であるうえに手続き的な表現ができ、さらにプログラムの要求仕様と相互に変換が容易であるという特徴をもつ。主な研究業績は、以下の2項目である。1.解析的意味論の研究として、以下の2点について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)実時間並行プロセスに関する諸問題を表現・解析する時制算術に位相空間の概念を導入したenvelope systemと呼ぶ検証システムについて、実時間を陽に表現できるように研究・改良した。また具体的な並行プログラム系の検証に適用した。(2)envelope systemで導入されたプロセスのスケジューラを一般化した概念である拍車に着目したプログラム検証法を発案し、具体的な並行プログラム系の検証を行なった。2.高度に知的な人工知能的課題である音楽情報処理について、PSYCHEと呼ぶピアノなどのアコースティック楽器による表情豊かな美しい演奏を目指した研究を進めた。そこで以下の3点の研究について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)演奏家の演奏の特徴を定量的に抽出し解析するとともに、それらを2次曲線や図形を用いて表現し、音楽の構造について研究を行なった。(2)生ピアノ等の制御に遅延を伴う楽器を用いて自動伴奏を行う実時間制御システムについて研究・開発を行なった。この中には、演奏家の演奏を模倣するシステムを含んでいる。(3)音楽ソフトウェアの統合的環境についてオブジェクト指向に基づく研究・開発を行なった。また12月に研究集会を開催し、基礎的意見交換、研究発表、及び総括的討論を行なった。なお東京電機大学米田信夫教授の研究費は研究の都合で代表者経理にした。NUは、論理的プログラム言語であるうえに手続き的な表現ができ、さらにプログラムの要求仕様と相互に変換が容易であるという特徴をもつ。1解析的意味論の研究として、以下の3点について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)実時間並行プロセスに関する諸問題を表現・解析する時制算術と呼ぶ方法を用いて、グラフィックディスプレイ等の物理的対象を制御するプログラムについて解析を行なった。(2)時制算術に位相空間の概念を導入したenvelope systemと呼ぶ方法を開発し、その上での検証システムについて研究した。(3)これらの方法における決定手続きの助けとするために、正則表現の同値性の決定手続きを利用して、時間の概念を扱う論理式の同値性を判定する方法について研究した。2高度に知的な人工知能的課題である音楽情報処理について、以下の2点の研究について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)演奏家の特徴を定量的に抽出し、それらを解析するとともに、自動伴奏システムを開発した。(2)自動伴奏システムの仕様について研究した。これは上記1-(1)の方法を用いた。

(1)実時間並行プロセスに関する諸問題を表現・解析する時制算術に位相空間の概念を導入したenvelope systemと呼ぶ検証システムについて、2次元的解釈を導入し、また具体的な並行プログラム系の検証に適用した。(2)時間の概念を扱う論理における決定手続きの助けとするために、正則表現の同値性の決定手続きを利用して、論理式の同値性を判定する方法について研究した。さらに有限時間を扱う論理について同値性判定プログラムを実装した。(3) CMPと呼ぶ音楽情報処理のための並行プログラムモデルを開発し、これを用いて自動伴奏システムの仕様を記述し検証を行なった。2高度に知的な人工知能的課題である音楽情報処理について、以下の3点の研究について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)演奏家の演奏の特徴を定量的に抽出し解析するとともに、それらを2次曲線や図形を用いて表現し、音楽の構造について研究を行なった。(2)演奏中に人間が指示をして表情づけを行なう実時間制御システムについて研究・開発を行なった。また、演奏家の演奏を模倣するシステムについて研究した。これらには上記1-(3),2-(1)の結果を用いた。(3)音楽ソフトウェアの統合的環境について研究・開発を行なった。また12月に研究集会を開催し、基礎的意見交換、研究発表、及び総括的討論を行なった。なお東京電機大学米田信夫教授の研究費は研究の都合で代表者経理にした。各研究分担者は、解析的意味論に基づく述語論理的プログラム言語NUの理論の構築及び処理系の作成等を行なった。NUは、論理的プログラム言語であるうえに手続き的な表現ができ、さらにプログラムの要求仕様と相互に変換が容易であるという特徴をもつ。主な研究業績は、以下の2項目である。1.解析的意味論の研究として、以下の2点について一定の成果が得られ、それらを公表した。(1)実時間並行プロセスに関する諸問題を表現・解析する時制算術に位相空間の概念を導入したenvelope systemと呼ぶ検証システムについて、実時間を陽に表現できるように研究・改良した。また具体的な並行プログラム系の検証に適用した。(2)envelope systemで導入されたプロセスのスケジューラを一般化した概念である拍車に着目したプログラム検証法を発案し、具体的な並行プログラム系の検証を行なった。2.高度に知的な人工知能的課題である音楽情報処理について、PSYCHEと呼ぶピアノなどのアコースティック楽器による表情豊かな美しい演奏を目指した研究を進めた。そこで以下の3点の研究について一定の成果が得られ、それらを公表した。(2)生ピアノ等の制御に遅延を伴う楽器を用いて自動伴奏を行う実時間制御システムについて研究・開発を行なった。この中には、演奏家の演奏を模倣するシステムを含んでいる。(3)音楽ソフトウェアの統合的環境についてオブジェクト指向に基づく研究・開発を行なった。
教育のシステムデザインに関する理論分析ならびに実証研究

動学的意思決定モデルに基づいて教育システムのあり方を理論・実証の両面から分析した。その結果として(1)能力別学級編成を行うタイミング及び学級の相対規模に関して、望ましい教育システムデザインの考察を可能とする理論的土台を提示した(2)才能発掘メカニズムの効率性を検証した(3)学校教育制度の国家間の差異を明らかにした(4)教育意思決定と経済発展との相互依存関係に対して説明を試みた。本研究は教育のシステムデザインをテーマとし、経済学的アプローチに基づいた理論的枠組みを構築するとともに、実証的な分析を行うことを目的とする。本研究の特徴としては、教育成果が不確実な状況下における教育の意思決定を記述する理論モデルを構築し、それに基づき実証的な検証ならびに政策的な提言を行うところにある。研究初年度となる2008年度は、教育の動学的な意思決定を記述する理論的枠組みの構築および各種実証分析を目的として、関連研究のサーベイや理論モデルの洗練化、データベースの構築に従事した。理論モデルの構築に関しては、各個人がそれまでの教育成果を前提として、自身の適性や能力に関する期待値を条件付きでアップデートし、効用を最大化するよう教育に関する意思決定を各期に行う動学的理論モデルの構築に努めた。そこでは、早い段階での専門化(もしくは才能の選抜)は(最終的な教育成果が不確実であるがゆえに)個人を過度なリスクにさらす一方で、専門化を遅らせることは、非効率な教育につながる。こうしたトレードオフに直面した状況で、専門化を行うタイミングならびにその選抜基準に関して望ましい教育システムのあり方を理論・実証両面から検証することを目指している。一方で実証面では、チェスのトーナメントプレイヤーのランキング制度ならびに将棋の奨励会制度を題材として、その競争を通じた訓練・選抜プロセスを動学的意思決定モデルに沿って構造推定を行う作業に努めた。そこで導かれた主要な結論は、チェスプレイヤーの意思決定において外部の機会費用が決定的に重要である、将棋の奨励会システムは才能の発掘という観点からは必ずしも効率的ではない、というものであり、その成果は研究会で発表するとともに論文としてまとめ、近く専門誌に投稿するべく準備を進めている。研究2年目となる2009年度は、教育の動学的な意思決定を記述なる理論的枠組みの構築および各種実証分析を行うとともに、研究成果の一部は学術論文としてまとめ専門誌に投稿した。こうしたトレードオフに直面した状況で、専門化を行うタイミングからでびにその選抜基準に関して望ましい教育システムのめり方を理論・実証両面から検証することを目指している。一方で実証面では、ヨーロッパ主要国の教育関連データを用いて、各国の教育システムデザインの相違について検証した。そこには明確な効率性と公平性のトレードオフが存在し、公平性を重んじる国家ほど、専門化のタイミングを遅らせる傾向があることを指摘した。この研究は学術論文としてまとめ、海外専門誌にて公刊される運びとなった。教育のシステムデザインをテーマとして、理論、実証両面において研究活動に従事した。こうしたトレードオフに直面した状況で、専門化を行うタイミングならびにその選抜基準に関して望ましい教育システムのあり方を検証したのが実証面での成果である。具体的には、ヨーロッパの18か国の統計データを用いて、最適な教育システムについてのカリブレーションを行った。結果として、近年のヨーロッパにおける専門の早期化を理論的に裏付けた。この成果は海外専門誌に公刊される運びとなった。加えて、優れた才能の発掘、ならびにその育成を効率的に行う教育システムに関しても研究を行った。囲碁、将棋、チェスの育成システムを題材として、それを理論モデルとして記述すると同時に、プロを目指すプレイヤーのデータを用いて才能発掘メカニズムの効率性を検証した。各プレイヤーが、これまでの勝敗結果をもとに自分自身の才能の有無を予測し、引き続き競争を続けるか否かを決定するプロセスを動学的意思決定モデルとして記述し、データをもとに構造推定を行っている点に研究の特徴がある。この研究の一部成果は、ワーキングペーパーないしは研究報告書の形で発表した。研究最終年度にあたる平成23年度は、教育のシステムデザインをテーマとしたこれまで3年間の研究内容を深化させるとともに、研究の総括として研究成果の公刊に努めた。本研究の特徴は、動学的意思決定モデルに基づいて教育システムのあり方を模索している点にある。

そこでは各個人が、それまでに受けた教育の成果を前提として、自分自身の適性や能力に対する合理的期待を形成することで教育に関する意思決定を各期にわたって行っていく。そこでは、早い段階での専門化は、教育成果に不確実性が伴うゆえに、個人を過度のリスクにさらす一方で、専門化が早いほど効率的な教育成果が期待できる。こうした教育のトレードオフを理論的に記述することで、専門化を行うタイミングや選抜の方法に関して考察を行い、望ましい教育システムのあり方を模索した。教育の不確実性に着目し、教育を通じて能力・適性が明らかになっていく過程を記述することで、教育を経済学的観点から分析可能にしている点が本研究の意義である。こうした理論モデルを活用することで、ヨーロッパ各国で専門化のタイミングが年々遅くなっていることや各国間の専門化のタイミングの違いを説明した。具体的には、ヨーロッパの18か国の教育統計に基づいて専門化のタイミングについて実証することで、労働市場における不確実性が高い国ほど専門化が遅くなる傾向があること、また、不確実性の高まりによって専門化が晩期化していることを説明した。以上の研究成果を論文どしてまとめて専門誌に投稿し、今年度、海外専門誌に掲載される運びとなった。
幹細胞と増殖因子徐放剤の併用による成熟血管再生と再生組織“血管化”基盤技術の開発

本研究においては、生体内外で作成された再生組織の内部に十分かつ効果的に血管誘導を促すことを目的に、1幹細胞と増殖因子の複合体移植による再生血管の成熟化現象の解明、2筋膜弁で被覆することにより皮弁化された再生組織への血流増強効果、について研究を実施した。その結果、1脂肪組織幹細胞と徐放化塩基性線維芽細胞増殖因子との複合体投与によって、マウス虚血肢モデルおよび糖尿病マウス創傷治癒モデルにおいて再生血管の成熟化が確認された。2筋膜弁内においても血管の成熟化が確認されたが、再生組織への血管新生増強効果については有意な所見を得るには至らなかった。まずC57BL/6Jマウス鼠径部脂肪塊よりASCsを分離精製後、徐放化bFGF添加群、非添加群に分けて培養し得られた培養上清中に含まれる種々の増殖因子(HGF, VEGF, TGF-ß1)をELISA法で計測した。次にC57BL/6J(雄性・12-15週)マウスに対し、独自の方法でマウス下肢虚血モデルを作成し、以下に示す如く虚血下肢大腿に筋肉内投与した。ゼラチンハイドロゲル群(実験群1)、ASCs 1×106移植群(実験群2)、徐放化bFGF 30ug移植群(実験群3)、徐放化bFGF 30ug+ASCs 1×104混合移植群(実験群4)、徐放化bFGF 30ug+ASCs 1×106混合移植群(実験群5)。評価方法は継時的肉眼観察及びレーザードップラーを用いた血流定量評価を移植0,4,7日後に実施した。また、移植7日後に虚血肢を採取し、組織学的及び免疫学的観察(αSMA,CD31,CD146,TGF-beta1)を実施した。その結果、ELISAにおいては、ASCsより放出される増殖因子は徐放化bFGFの添加により増強された。下肢虚血モデルに対するレーザードップラーによる血流定量解析の結果、移植4,7日後において実験群4および5が他群と比較し有意な血流改善率を認めた。組織学的評価においても実験群4,5は他群と比較して内腔が大きく血管壁も厚く、かつαSMA,CD146,TGF-beta1陽性が示す如く新生血管の構造的安定化と成熟化が認められた。以上より、マウス下肢虚血モデルにおいてASCsと徐放化bFGFの混合移植は単体投与群に比べより効果的な血管再生効果を提供し、かつ新生血管の構造的安定化と成熟化に寄与することが示唆された。本年度は主として以下に示す2つの研究について実施した。1.難治性皮膚潰瘍モデルを用いた幹細胞ー徐放化増殖因子複合体同時投与における創傷治癒促進効果の検証と組織評価糖尿病マウス(BKS.Cg+Leprdb/+Leptdb/Jcl)の鼠径部皮下脂肪より脂肪組織由来幹細胞(ASCs)を準備した。同種同系マウスの背部に直径9mmの皮膚全層欠損創を作成後、以下に示す投与物に応じて5群に分類した。グループ1:低用量ASCs+徐放化bFGF、グループ2:高用量ASCs+徐放化bFGF、グループ3:低用量ASCs、グループ4:徐放化bFGF、グループ5:生理食塩水群。皮膚欠損創のサイズを継時的に観察し、投与後14日後に組織採取後評価した。その結果、混合投与群(グループ1および2)において潰瘍の縮小傾向が顕著であった。組織学的観察においても混合投与群においては、十分な厚みのある皮下構造とともに連続する重層扁平上皮構造が観察され、各種免疫染色(CD31、CD146、SMA、I型コラーゲン)の結果では新生血管の大きさが大きく、成熟化が示唆された。2.ラット血管付筋膜弁モデルを用いた幹細胞ー徐放化増殖因子複合体同時投与における主軸血管ー再生血管の階層化および成熟度評価と、再生組織(軟部組織、骨組織)の血管化および組織機能評価Okudaらの方法(Okuda, Ann Plast Surg, 2010)に従ってラット深下腹壁動静脈を茎とする筋膜弁を拳上し、上記1に記載した要領で筋膜弁にそれぞれ注入投与し、2週目に組織採取して評価を行った。現時点においては肉眼的に混合投与群において細かな血管網の発達が確認されているものの、走査電子顕微鏡による微細形態の検証、免疫染色等による新生血管の成熟化等については検証中である。実験モデルの作成や研究サンプルの評価に関しては当初の計画とは一部異なる点もあるが、概ね予定した通りに推移している。しかしながら、使用する細胞や投与する増殖因子の種類については今のところ細胞に関してはASCsのみ、増殖因子に関してはbFGFのみしか実行できていない。また血管の成熟度を証明するための更なる評価法(走査電子顕微鏡、VEカドヘリン免疫染色、Tie-やAng-1, 2などの遺伝子発現)についてもまだ未完成の状態である。本年度は前年度に引き続き、ラット深下腹壁動静脈を茎とする筋膜弁モデルを用いて以下に示す研究を実施した。

Okudaらの方法に従って(Okuda T, et al, Ann Plast Surg 2010)、ラット深下腹壁動静脈を茎とする大きさ約3x2cm大の筋膜弁を作成し、同系ラット鼠蹊部脂肪塊よりあらかじめ分離精製した脂肪組織由来幹細胞(ASCs)および可溶性ゼラチンゲルに含浸させた塩基性線維芽細胞増殖因子(以下徐放化bFGF)またはその両方を種々の用量で筋膜内に複数個所に少量ずつ注入移植した。筋膜弁を再度元の位置に戻し、周辺との血行を阻害するためにシリコンシートで被覆後創閉鎖した。2,4週目に再度筋膜弁を採取して後述する各種評価を実施した。その過程において、ASCsあるいは徐放化bFGFの投与量によってはその注入容量そのものが多くなってしまい筋膜弁が膨化するなど実験結果を左右してしまうような現象も起こってしまったため十分な検体数を確保することができなかった。今後更に検体数を増やして統計解析を進めていく予定であるが、現時点で評価可能であった検体に対して1レーザードップラー血流計による血流量の評価、2走査電子顕微鏡での微小血管構造の形態的観察、3CD31、CD146、α-SMAなどに対する抗体を用いた免疫染色による再生血管の評価を実施しているところである。更に筋膜弁主軸血管と末梢再生血管との間で起こる再生血管の“階層化"現象に対する検討に関しても上記同様、十分な検体数の確保に至っていないことから、今後さらなる検体数の増加をし、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼTie2とそのリガンドであり壁細胞から分泌されるAngiopoietin-1(Ang-1)両者の発現が亢進状態にあるか、またAng-1のアンタゴニストであるAng-2の発現が低下状態にあるかどうかについてWestern Blottingで検証する予定である。実験モデルの作成や使用する細胞ないしは増殖因子の種類、研究サンプルの評価に関しては当初の計画とは一部異なる点もあるが、大幅な逸脱はなく推移しているものと考えている。しかしながら、上述のごとく研究サンプルの作成にやや難渋していることから再生血管の詳細な評価については予想通りに進んでいない。加えて研究代表者、研究分担者のその他の業務にかかるエフォートの増加や研究室の移転など研究業務に費やす時間の現象といった予想外のことが発生したことも一因である。前年度に発生した研究代表者、研究分担者のその他の業務にかかるエフォートの増加、研究室の移転による動物実験業務の大幅な縮小など予想外のことが発生したことから研究を1年間の延長を認めていただいた。このような状況の中で、本年度はこれまで通りラット深下腹壁動静脈を茎とする筋膜弁モデルを用いて以下に示す研究を実施した。2,4週目に再度筋膜弁を採取してCD31、CD146、α-SMA、TGF-βなどに対する抗体を用いた免疫染色による再生血管の評価を実施した。その結果、各実験群においてCD31、CD146、α-SMA、TGF-βの発現の程度が異なり、特にα-SMA、TGF-βの発現が強く発現するなど定性的に実験群間における差が認められた。しかしながら筋膜弁主軸血管と末梢再生血管との間で起こる再生血管の“階層化"現象に対する検討に関しては検体サイズが小さかったことなどの理由から免役組織学的検証の限りでは十分な確認はできなかった。再生組織の“血管化"に関しても十分な検証はできなかった。
インプラント周囲口腔粘膜は癌化しやすい!

近年、インプラント治療患者の年齢層が高齢化により口腔癌の好発年齢に一致してきている。「field cancerization」という概念より、常に慢性炎症の環境下にあるインプラント周囲上皮は、発癌のリスクが高いと考えられる。この仮説をもとに我々は、4NQOを用いた自然発癌モデルラットを使用し、インプラント周囲口腔粘膜と癌の相関性について検討した。6ヶ月間の4NQO投与によってインプラント周囲上皮の発癌は認められなかったが、対象群と比較して、N/C比の増大や異型核分裂などの細胞異型が多く見られた。この結果から、インプラント周囲上皮は発癌リスクが高い可能性が示唆され、さらに長期的な観察によって明らかになると考えられた。現在、日本は超高齢化社会を向え、インプラント治療を行う高齢者も増加の一途をたどっている。また、口腔粘膜癌の発症は50歳代から急激な増加を示すことが知られており、インプラント適応年齢と一致している。インプラント周囲粘膜が常に慢性炎症を起こし、活発な細胞分裂により遺伝子の変異が蓄積しやすい状態であることから、発癌との相関性が示唆される。我々は、「インプラント周囲口腔粘膜は癌化しやすい」と仮説を立て、4-Nitoroquinoline 1-Oxide(4NQO)を用いた口腔癌の自然発癌モデルラットを使用した実験モデルを考案した。これらの結果から、病理学組織学的観察やテロメラーゼ活性の定量等により統計学的に発癌率を比較検討することで、インプラント周囲粘膜上皮と癌化における相関性を明らかにすることが本研究の目的とした。平成20年度では、(1)ラットロ蓋部用インプラントの開発、(2)発癌物質(4NQO)の調整および指摘濃度の決定、(3)ラットロ蓋部へのインプラント埋入術式の確立などの本実験の前準備ならびに予備実験を主体として行なってきた。特注ラット用インプラントの開発は完了したが、発癌剤投与期間がまだ短いため、発癌ラットの完成には至っていない。実験をこのまま継続し、21年度以降に結果を発表したいと考えている。我々は、実際にインプラント周囲の下顎歯肉から頬粘膜に進展した扁平上皮癌の症例を経験したことから、「インプラント周囲口腔粘膜は癌化しやすい」と仮説を立て、4-Nitoroquinoline 1-Oxide(4NQO)を用いた口腔癌の自然発癌モデルラットを使用した実験モデルを考案した。これらの結果から、病理学組織学的観察やテロメラーゼ活性の定量等により統計学的に発癌率を比較検討することで、インプラント周囲粘膜上皮と癌化における相関性を明らかにすることが本研究の目的である。現在まで、本実験における口蓋部用インプラントの決定およびラット口蓋部へのインプラント埋入術式の確立がなされ、今年度は発癌物質(4NQO)投与を行ない、指摘濃度の決定および病理組織学的観察における予備実験を行っていった。埋入後において、インプラント脱落症例が認められたコトから、実験動物用マイクロCTにて、定期的に生存させたままインプラントの残存を確認し、効率性の向上をはかった。現在、4NQOは継続投与中であり、来年度にかけて、46カ月における飼育を行ない(1)発癌率における統計(2)病理組織学的検討(3)免疫化学染色による観察を行っていく。インプラント周囲粘膜は常に慢性炎症の状態である為、常に活発な細胞分裂を繰り返すことで遺伝子の変異が蓄積しやすい状態であることから発癌との関連性が示唆される。本実験は「インプラント周囲上皮口腔粘膜は癌化しやすい」という仮説のもと、4-Nitoroquinoline 1-Oxide(4NQO)による口腔癌の自然発癌モデルラットを使用した実験モデルを考案した。自然発癌モデルラットを使用した実験モデルを考案し、統計学的・分子生物学的に比較検討することで、インプラント周囲口腔粘膜と癌化における相関性を明らかにすることを目的としている。実験群は6週齢ラットの口蓋正中部にインプラント(φ1.3mm×6mm)を埋入し、埋入を行わない対象群とともに、7週齢より4NQO(50ppm)を飲料水として約5ヶ月投与した。経時的に麻酔下にて口蓋の肉眼的観察を行ない、22週で屠殺後、標本作製を行なった。

4NQO投与14週例より実験群・対象群ともに口蓋正中、後方部に角化の亢進を思わせる白色調を示し始め、そのうち実験群の1例(1/5)では後方インプラント周囲上皮部でびらん型を呈していた。18週例では両群ともに過角化を示す割合は増加し、実験群では3例(3/5)、対象群の2例(2/6)、過角化に伴う白色病変もしくはびらん型の病巣を認めた。22週後では、実験群では全例(5/5)がびらん型を呈し、一部でインプラント周囲粘膜と連続性が認められた。一方、対象群においては、半数(3/6)に過角化が認められた。これらの結果より、インプラント周囲上皮は口腔粘膜上皮と比較して早期に発癌を惹起する可能性が示唆された。今後は採取した資料を用いて、病理組織学的検討による腫瘍細胞の浸潤傾向、細胞異型の比較や分子生物学的検討による発癌遺伝子の発現レベルの比較を行なっていき、インプラント周囲粘膜と癌化との関連性をさらに追及していく予定である。
キチン質の酵素糖化促進因子の解析

将来的に食品分野に応用が可能なStreptomyces griseusを材料に、多糖バイオマスであるキチン質の酵素分解を飛躍的に促進する因子である多糖モノオキシゲナーゼ(LPMO10)の解析を行った。S. griseusのゲノム中に存在する6つのLPMO10のうち、5つについて解析を行い、4つはキチン分解を促進することを証明した。最も解析の進んだSgLPMO10FについてはFEBS Journalに成果を報告し、セルロース分解を促進することが判明したSgLPMO10Aに関しては投稿準備中である。1)キチン結合タンパクに属するSgCBP V,キチン結合ドメインを持つプロテアーゼの組換えタンパクに関して精製法を確立した。CBDを持つタンパクはキチンアフィニティカラムで最初の精製を行った。ワンステップでは不純物が取り除けなかったため、限外濾過カラム、もしくはイオン交換カラムを用いた精製法で2段階精製する方法を確立した。また、プロテアーゼに関してもベンザミジンカラムを用いて初めの精製を行い、イオン交換カラムで2段階精製に成功した。25年度中でSgCBP II-V全て、及びキチン結合ドメインを持つプロテアーゼの精製に成功した。2)組換えタンパクの大量精製を行い、相乗効果試験及び詳細な活性測定をする。SgCBP II-IVに関しては、キチンを基質とした活性をUHPLCで直接測定する実験を進めている。3)SgCBP Vに関しては、大量精製に成功し、キチンを基質とした相乗効果試験の再現性を確認中である。また、キチンと同じ多糖質であるセルロース上でも活性があることが確認できたため、セルロースと市販のセルラーゼとの組み合わせも試している。現時点では得られた分解産物の検出方法が確立できていないため、反応系をスケールアップするか、検出系を感度の高いものにするか検討中である。4)キチン結合ドメインを持つプロテアーゼをキチン質とタンパクの複合体であるエビ殻に作用させ、酵素分解の前処理に効果を示すことを証明した。このタンパクは自己分解作用を示すため、大量精製が困難ではあるが、精製法は確立できたので、十分な精製タンパクが得られ次第さらに実験を進める。これまでに精製済みSgCBP I(新潟大との共同研究により酵素を頂いた)、当研究室で精製したSgCBP II-Vのキチン分解酵素との相乗効果試験と至適pHや至適温度、濃度等の解析を行ってきた。全部はデータが揃っていないため、引き続き各酵素のキャラクタライゼーションを行っていく。各CBPは基質によって反応性が異なることが判ったが、反応機構は似通っている。なぜこの菌株が5つもCBPを持っているのか非常に興味深い。詳細な結合試験は、最も解析が進んでいるSgCBP IVとその変異型組換えSgCBP IVのうちのひとつに関して行った。手法が確立したので、他のSgCBPに関しても同手法で進める。今のところ、結合の強さと基質の分解能力には相関は見られない。SgCBP Vに関しては、2つあるドメインのうちの1つに関しても組換えタンパクを作成することに成功し、精製方法を確立した。もう1つのドメインに関しては苦戦している。精製に成功したシグナル配列を除く全長と、推定キチン結合ドメインとして登録されていた部分が、セルロース上でモノオキシゲナーゼ活性、あるいはセルロース上にニックを入れる活性を持つことが明らかになった。最も解析が進んでいるSgCBPIVに関して4つの変異型組換えベクターを作成し、そのうち1つの精製に成功した。基質に対する結合試験と、キチン分解酵素と組み合わせた分解試験を終えたところである。基質に対する結合力は変わらないものの、αキチン、βキチンに対する分解効率に差があることが明らかになった。当研究室で精製方法を確立したSgCBPII-V(それぞれ論文中でSgLPMO10A-Fに改名)に関しては、大量精製を行い、キチン分解酵素との相乗効果試験、及び至適pHや至適温度、濃度等の解析を行ってきた。新潟大と共同研究により解析を行っているSgCBPIは、精製済みのタンパクを頂けなくなったため、こちらで発現及び精製を行うことになった。こちらの装置では新潟大と同様の方法ではうまく精製できなかったため、精製法から検討中である。SgCBPII-Vの詳細な結合試験の結果、基質への結合の強さと分解能力には相関がみられなかった。SgCBPIV及びVに関しては変異体を数種作成し、分解試験及び結合試験を行って、活性に重要な残基を明らかにした。また、変異体でも基質への結合の強さと分解能力には相関がないことをはっきりさせることができた。また、最も解析の進んでいるSgCBPIVで、αキチンの分解効率が野生型酵素よりも高い変異体を作成することに成功した。天然の大部分のキチンを占めるαキチンは、工業的に最も利用されているが、強固な構造のため、酵素分解効率が非常に低い。αキチンの分解効率をパワフルに促進できる変異型酵素の作成は非常に画期的であり、分解効率向上の機構を解明することで、今後の実用化や応用につながる。SgCBPVに関しては、全長、及びドメイン1つに関しては、キチン・セルロースの両方を基質とした解析が進んでいる。なぜこの菌株が5つもCBPを持つのかを明らかにすることで、より効率よい酵素分解法を提案できると考えている。

2014年の11月より2015年の10月まで産休・育休を取ったため、その期間メイルのみで学生の指導を行っていた。精製タンパクの形で頂いていたSgCBPIを精製からしなくてはならなくなった。SgCBPVに関しては、2つあるドメインのうち1つに関して組換えタンパクが得られていない。全長、及びドメイン1つに関しては、キチン・セルロースの両方を基質とした解析が進んでいる。SgCBPIVに関しては順調にデータ蓄積できており、2報目の執筆に向けてさらなるデータの取得を行っている。また、UHPLCを用いたLPMO活性測定法を一部改変し、当研究室でも直接活性の測定が可能になった。28年度末までに未解析のSgLPMO10Eを除くSgLPMO10A-F(旧SgCBP I-V)についての活性を明らかにした。SgLPMO10Eを除くSgLPMO10A-Fは、全てキチンを基質にした際に活性を示したが、SgLPMO10A(旧SgCBP V)はキチン分解酵素による分解促進効果を示さず、セルロースの酵素分解を促進することが分かった。SgLPMO10Aの効果は、結晶性の高いろ紙を基質にした際に特に顕著であった。また、SgLPMO10Aは、キチンを基質にした際に脱アセチル化能を示したことから、新規機能を持つLPMOであると考えられた。SgLPMO10Aの解析結果については、現在投稿準備中である。また、SgLPMO10Aの2つのドメイン(AA10の触媒ドメイン及びCBM2)に関して各々の機能を詳細に解析するためのコンストラクトが完成し、組換えタンパクの発現試験まで進めることができた。機能未解析のCBM2ドメインに関しては、今後も解析を進める。SgLPMO10Aに関しては、変異体も数個作成し、活性に重要なアミノ酸残基の一つを明らかにした。SgLPMO10F(旧SgCBP IV)の2つの変異体に関してキャラクタライゼーションを行い、56番目のチロシン残基はキチンに対する活性に重要であるが、必須ではないことを明らかにした。また、この残基をトリプトファンに変えると、野生型と比較してα-キチン上で酵素分解活性が促進される理由を考察した。現在共同研究先に裏付けの実験を依頼しており、その結果が得られ次第論文をまとめる予定である。今まで精製が難航していたキチン結合ドメインを持つプロテアーゼの精製方法を確立した。十分な量の組換え精製酵素が確保でき次第SgLPMO10、キチナーゼ、プロテアーゼを組み合わせた実験を行う予定である。将来的に食品分野に応用が可能なStreptomyces griseusを材料に、多糖バイオマスであるキチン質の酵素分解を飛躍的に促進する因子である多糖モノオキシゲナーゼ(LPMO10)の解析を行った。S. griseusのゲノム中に存在する6つのLPMO10のうち、5つについて解析を行い、4つはキチン分解を促進することを証明した。最も解析の進んだSgLPMO10FについてはFEBS Journalに成果を報告し、セルロース分解を促進することが判明したSgLPMO10Aに関しては投稿準備中である。妊娠後期に入院を余儀なくされ、学生の指導が途中からできなくなった。さらに、出産、育休に入ったためメイルのみで指導を行っており、若干遅れが生じている。
遺伝子治療を目的とした非分裂細胞への遺伝子導入法の開発

HIVベクターによる非分裂細胞への遺伝子導入法の開発を目的とし、CD4/AdおよびLZ/HIVの二段階感染により非分裂細胞への遺伝子導入が可能か検討した。1.非分裂期の培養細胞の調整HeLa細胞をX-線照射、aphidicolinで処理し細胞周期を止め、PI染色によるFACS解析により細胞増殖が停止していることを確認した。2.非分裂細胞へのCD4の発現CD4を発現するアデノウイルスベクター(CD4/Ad)を作成し、細胞周期を止めたHeLa細胞に感染させ、CD4が発現していることをFACS解析により確認した。3.CD4/AdとLZ/HIVの二段階感染による非分裂細胞へのβ-gal遺伝子の導入β-galを発現するHIVベクター(LZ/HIV)を作製し、HeLa細胞をX-線照射、aphidicolinで処理し細胞周期を止めCD4/Adを感染させ、CD4を発現させた後、LZ/HIVの二段階感染によりβ-gal遺伝子が導入、発現していることを確認した。4.非分裂細胞への導入遺伝子の染色体への組み込みの確認遺伝子導入された非分裂細胞のDNAを用いてLMPCR(Linker Mediated PCR)によりHIVベクターの染色体への挿入部位を増幅し、塩基配列を決定し染色体への組み込みを確認した。5.神経細胞及びマクロファージへの遺伝子導入NT2細胞を分化させてつくった神経細胞及び末梢血単核球由来のマクロファージにCD4/AdおよびLZ/HIVの二段階感染によりβ-gal遺伝子が導入、発現していることを確認した。以上よりCD4/AdおよびLZ/HIVの二段階感染により非分裂細胞への遺伝子導入が可能であり、導入された遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれていることを確認した。1.非分裂期の培養細胞の調整HeLa細胞をX-線照射、aphidicolinで処理し細胞周期を止め、FACS解析により細胞増殖が停止していることを確認した。2.非分列細胞へのCD4の発現CD4を発現するアデノウイルスベクター(CD4/Ad)を作成し、細胞周期を止めたHeLa細胞に感染させ、CD4が発現していることを確認した。3.CD4/AdとLZ/HIVの二段階感染による非分裂細胞へのβ-qal遺伝子の導入β-qalを発現するHIVベクター(LZ/HIV)を作製し、HeLa細胞をX-線照射、aphidicolinで処理し細胞周期を止めCD4/Adを感染させ、CD4を発現させた後、LZ/HIVの二段階感染によりβ-qal遺伝子が導入、発現していることを確認した。当初の計画通り、CD4/AdとLZ/HIVの二段階感染による非分裂培養細胞(HeLa)における遺伝子導入法を確立した。現在、染色体への組み込みの確認のためのinversePCR法を確立中である。2.非分列細胞へのCD4発現CD4を発現するアデノウイルスベクター(CD4/Ad)を作成し、細胞周期を止めたHeLa細胞に感染させ、CD4が発現していることをFACS解析により確認した。4.非分裂細胞への導入遺伝子の染色体への組み込みの確認

5.遺伝子導入された非分裂細胞のDNAを用いてLMPCR(Linker Mediated PCR)によりHIVベクターの染色体への挿入部位を増幅し、塩基配列を決定し染色体への組み込みを確認した。神経細胞及びマクロファージへの遺伝子導入NT2細胞を分化させてつくった神経細胞及び末梢血単核球由来のマクロファージにCD4/AdおよびLZ/HIVの二段階感染によりβ-gal遺伝子が導入、発現していることを確認した。以上よりCD4/AdおよびLZ/HIVの二段階感染により非分裂細胞への遺伝子導入が可能であり、導入された遺伝子が標的細胞の染色体に組み込まれていることを確認した。