hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト尿酸代謝完全モデル動物を用いた高尿酸血症発症に関与する環境要因の解明

1.C57BL/6などの実験用マウスよりもHPRT活性が高いことが報告されているB6/XcMSMマウスの繁殖と、亜種差に伴う生殖隔壁を超えた継代飼育に成功した。2.B6/XcMSMマウスがHPRT高活性アレルを持つことを確認すると共に、HPRTアレルのジェノタイピング法を確立した。3.B6/XcMSMマウスを用いることによりXor活性のない血球において、HPRT高活性にともなうプリンサルベージ系の充進によるヒポキサンチン放出の抑制を認めた。4.UoxKO-XcMSMマウス作出により、Xorが高活性であることを除いてヒト尿酸代謝に近づいたマウスを得ることができた。平成26年度の計画は、A. HPRT高活性Uox-KOマウスの系統樹立として(1)B6:129系Uox-KOマウスのC57BL/6(B6)系統への戻し交配。および(2)B6コンソミック系統(XC-MSMマウス)との交配による系統樹立である。(1)B6:129系Uox-KOマウスのC57BL/6(B6)系統への戻し交配。については、スピードコンジェニックおよび5回の戻し交配が終了し、実験動物中央研究所に委託したSTRマーカーを用いたマウス遺伝子頻度検査により、B6バックグラウンドとなったことを確認した。(2)B6コンソミック系統(XC-MSMマウス)との交配による系統樹立については、HPRT遺伝子におけるXC-MSMアレルホモ、Uoxノックアウトアレルヘテロのマウスまで樹立できたが、XC-MSMアレルホモ、Uoxノックアウトアレルホモのマウスが作出できていない。Uoxノックアウトマウスと同様に出生時よりもマウス数が減少していることから、生存率改善作用のあるアロプリノール投与を行っているが、これまで改善は認められない。今後アロプリノールの投与量を検討して生存率の改善を図る。また、ジェノタイピングの改善のため、Uox遺伝子用の新規プライマーを作出した。さらにXC-MSMアレル検出はRFLP法で行っていたが、TaqManプローブを用いたSNP検出法を新たに確立し、迅速なジェノタイピングが可能となった。ヒトと同様にhypoxanthine phosphoribosyl transferase(HPRT)活性が高活性であるB6/Xc-MSMマウスを用いてマウス血液の採血後尿酸偽上昇の現象を検討し、HPRTが低活性である実験用マウスC57BL/6に比べて採血後尿酸偽上昇が69.8%に低下し、アロプリノール存在下でのヒポキサンチン上昇も50.3%に低下した。さらにヒトと同様に尿酸分解酵素(Uox)を欠損させたUox-KOマウスを用いて、アロプリノール存在下でのヒポキサンチン上昇を調べたところ、37.6%まで低下していた。以上より、ヒトでは起こらない採血後尿酸偽上昇現象はマウスに特異的な代謝経路によるものが明らかとなり、実験用マウスを用いたプリン体血中濃度の測定には採血後尿酸偽上昇現象に注意が必要であることが明らかになった。最終年度は、ヒトと同様にhypoxanthine phosphoribosyl transferase(HPRT)活性が高活性であるB6/XcMSMマウスと尿酸分解酵素ウリカーゼをノックアウトしたUoxKOマウスを交配することによりUoxKO-XcMSMマウスを作出した。UoxKO-XcMSMマウスに30mg/100g餌のXanthine oxidoreductase(Xor)阻害薬アロプリノールを投与することにより、UoxKOマウスに同量のアロプリノールを投与した時よりも尿中尿酸排泄量が減少した。さらにUoxKO-XcMSMマウスに30mg/100g餌のXor阻害薬フェブキソスタットを投与することにより、初めて尿中尿酸排泄量が尿中クレアチニン排泄量を下回り、ヒトの尿中尿酸排泄量レベルまで低下させることができた。研究期間全体を通じて、1C57BL/6などの実験用マウスよりもHPRT活性が高いことが報告されているB6/XcMSMマウスの繁殖と、亜種差に伴う生殖隔壁を超えた継代飼育に成功した。2B6/XcMSMマウスがHPRT高活性アレルを持つことを確認すると共に、HPRTアレルのジェノタイピング法を確立した。3B6/XcMSMマウスを用いることによりXor活性のない血球において、HPRT高活性にともなうプリンサルベージ系の亢進によるヒポキサンチン放出の抑制を認めた。4UoxKO-XcMSMマウス作出により、Xorが高活性であることを除いてヒト尿酸代謝に近づいたマウスを得ることができた。今後は、マウスのXorはヒトの100倍の発現量と報告されていることから、まずXor活性を完全に喪失させるために、XorKO-XcMSMマウスおよびXorKO-UoxKO-XcMSMマウスの作出に取り組むことにした。3.B6/XcMSM

マウスを用いることによりXor活性のない血球において、HPRT高活性にともなうプリンサルベージ系の充進によるヒポキサンチン放出の抑制を認めた。4.UoxKO-XcMSMマウス作出により、Xorが高活性であることを除いてヒト尿酸代謝に近づいたマウスを得ることができた。危惧された繁殖率の低下は改善しているものの、平成26年度中に達成予定であったXC-MSMアレルホモ、Uoxノックアウトアレルホモのマウスが作出できていないため。B6/Xc-MSM・Uox-KO(homo/homo)マウスを用いて全身のプリン体代謝への影響を明らかにする。また、B6/Xc-MSMによるプリンサルべージ経路高活性化と並行して、プリンde novo生合成経路の抑制についても進めていく。核酸代謝Uoxノックアウトマウスで生存率改善が得られる用量のアロプリノールを投与しているが改善はみられず、むしろ副作用が認められる。このため、アロプリノール用量調整を今後行う。マウスの系統樹立に時間がかかり、環境要因の検討に入ることができなかったため。当初の予定より遅れ、XC-MSMアレルホモ、Uoxノックアウトアレルホモのマウスが作出できていないため。マウス系統樹立は完了しており、平成28年度は環境要因の検討に着手するので、順当に研究費が使用される。XC-MSMアレルホモ、Uoxノックアウトアレルホモ作出後は計画通りの支出となる。
定年退職後の高齢男性を対象とした地域活動への参加支援プログラムの開発

定年退職後の高齢男性を対象とした地域活動への参加支援プログラムにおいて、《地区のしくみが把握できる》《地区内の人と顔見知りの関係が築ける》こと、さらに、前者の下位には<地区の行事が分かる><地区内での有事の際の対応が分かる><地区内の人の関係性が分かる>が、また後者の下位には<地区内で自身の存在を認めてもらえる><地区内の人とあいさつを交わせる関係になれる><イベントに関する情報交換ができる関係になれる>という概念を内包することの必要性が示唆された。本研究は、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し、概念を抽出し、抽出された概念を基盤にプログラムを開発することを目的としている。そのため、住民の協力が得られ、プログラムの開発までを達成できる地区を選定することが重要となるため、対象地域の検討および選定を地区の自治会長らとともに繰り返しセッションを行うなど、十分に行った。その結果、対象地域および研究参加者は、仙台市青葉区錦ケ丘の定年退職前の向老期(5060歳代)男性20人および向老期男性の家族5人、錦ケ丘自治会長8人、民生委員1人、錦ケ丘地区担当保健師1人の計15人とした。「錦ケ丘」は、近年、宅地造成に伴い人口が急増している地域であり、住民の地域づくりへの意識も非常に高い地域である。そのことから、高齢男性においても地域への関心が高く、本研究の目的である地域とのつながりに対する意見や考えを収集し、その意味を探求できると考え、対象地域として選定した。研究方法は、1インタビュー、2地区の書類・資料等、3参加観察よりデータを収集し、総合的に分析を行う予定である。向老期男性については、錦ケ丘自治会長が保有する地域の情報より、選定条件(定年退職前の5060歳代の男性で、かつ、地域とのつながりに対しての思いや考えを語れる人文)に合った研究参加者の候補を紹介してもらう。その後、研究者より、研究参加者の候補に直接アプローチし、研究協力の同意を得られた向老期男性を対象として選出し、平成26年度の早期に、インタビューおよび参加観察によるデータ収集を行う予定である。地区の書類・資料等については、地区の特徴や今後の展望、課題などが把握されつつあり、それらの情報も考慮しながら、インタビューと参加観察によるデータにおいて、補完する予定である。平成26年度は、これまでのデータを統合し、概念を抽出するとともに、プログラムを開発する予定である。本研究は、定年退職後の高齢男性を対象とした地域活動への参加支援プログラムを開発することを目的としている。そこで、まず、平成24年度は定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し、概念を抽出することを目標としていた。本研究は、方法論としてエスノグラフィーを用いる。エスノグラフィーの目的は文化の記述であり、ある集団に属する人々の経験に基づいたデータを用いて、その人たちの文化と結びついた理論を形成し、人間の行動を理解することができる。エスノグラフィーは人々の生活の中で生じる経験に関するデータから、ある特定集団の文化を帰納的に明らかにしようとするものである。したがって、調査は対象者の行動が行われている場に身を置いて、対象者との相互作用の中から参加観察、インタビュー、対象者の人々が作り出している記録物など多様なデータ収集方法を用いて人々の生活を丸ごと調査するところに特徴がある。そのため、この研究方法を用いることにより定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりという独自の文化の理解が可能であると考えた。しかし、この調査を遂行するには、研究者を受け入れ、信頼関係を築きながら調査を進めていくことが可能な市町村および対象者が必要である。フィールドの選定において、平成24年度は、これらのマッチする対象地域の検討と交渉に困難を極め、時間を要した。定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味においては、文献を中心に概念の整理を行うとともに、定年退職前の男性の生活背景や課題について、学会参加や文献検討から理解を進めていった。これらの得られた結果を基に、平成25年度はフィールドを特定し、より詳細なインタビューおよび分析を行っていく予定である。そのため、住民の協力が得られ、プログラムの開発までを達成できる地区を選定することが重要となるため、対象地域の検討および選定を地区の自治会長らとともに繰り返しセッションを行った結果、宅地造成に伴い人口が急増している政令指定都市内の新興住宅地である仙台市青葉区錦ケ丘をフィールドとした。地区(錦ケ丘)の向老期(4060歳代)男性3人および自治会長8人を対象とし、インタビューを実施し、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し、概念を抽出するに至った。インタビューは対面式にて1人につき60分程度とし、地域とのつながりに対する意見や考え、地域とどのようなつながりを持ちたいと思うか等を、自由に話してもらい本人の承諾を得て録音した。分析の結果、研究対象者の居住年数は49年(他県より移住)であり、全員が輪番制などによる地区内の班長などの役割の経験があった。向老期男性が求める地域とのつながりとして、《地区のしくみが把握できる》《地区内の人と顔見知りの関係が築ける》の2つのカテゴリが抽出された。さらに、前者の下位には<地区の行事が分かる><地区内での有事の際の対応が分かる><

地区内の人の関係性が分かる>が、また後者の下位には<地区内で自身の存在を認めてもらえる><地区内の人とあいさつを交わせる関係になれる><イベントに関する情報交換ができる関係になれる>が抽出された。今後、さらなるデータの追加と検証を行いながら、今回、抽出された概念を基盤にプログラムを開発する予定である。本研究は、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し、概念を抽出し、抽出されたそららの概念を基盤にプログラムを開発することを目的としている。これまで、政令指定都市内の新興住宅地である仙台市青葉区錦が丘をフィールドとし、向老期男性にインタビューし、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し概念を抽出した結果、【地区のしくみが把握できる】【地区内の人と顔見知りの関係が築ける】の2つのサブカテゴリが抽出された。さらに、前者の下位には、<地区の行事が分かる><地区内での有事の際の対応が分かる><地区内の人の関係性が分かる>が内包されていた。また、後者の下位には、<地区内での自身の存在を認めてもらえる><地区内の人とあいさつを交わせる関係になれる><イベントに関する情報交換ができる関係になれる>が内包されていた。これらの概念について、地区の自治会長や担当保健師とセッションを行った。これらの概念を基に、今後プログラムの開発および評価・完成を目指す予定である。今年度は、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味の概念を抽出し、それらを基盤にプログラムを開発、試案を実施しそのプログラムを評価・完成させることが課題であった。しかし、実習や講義などの教育に関する業務の多忙、および対象者の選定や都合などの事情により研究を計画通り、遂行できなかったため。本研究は、定年退職前の向老期男性が求める地域とのつながりの意味を探求し、概念を抽出し、抽出された概念を基盤にプログラムを開発することを目的としている。宅地造成に伴い人口が急増している政令指定都市内の新興住宅地A地区の向老期(4060歳代)男性と町内会長、保健師に対し、インタビューと参加観察を実施した。インタビューは対面式にて1人につき60分程度とし、地域とのつながりに対する意見や考え、地域とどのようなつながりを持ちたいと思うか、町内会長や保健師には地区の概要や向老期男性の地域とのつながり等について自由に話してもらい本人の承諾を得て録音した。分析は、定年退職前の向老期男性が求める“地域とのつながり"に関する意味内容に着目し、その内容を表す最小単位の記述を抽出してコード化し、意味内容の類似性に基づき、カテゴリを組んでいった。その結果、A地区の向老期男性が求める地域とのつながりとして、《地区のしくみが把握できる》《地区内の人と顔見知りの関係が築ける》の2つのカテゴリが抽出された。さらに、前者の下位には<地区の行事が分かる><地区内での有事の際の対応が分かる><地区内の人の関係性が分かる>が、また後者の下位には<地区内で自身の存在を認めてもらえる><地区内の人とあいさつを交わせる関係になれる><イベントに関する情報交換ができる関係になれる>が抽出され、これらの概念を内包するプログラムの必要性が示唆された。
光触媒反応を利用した難除去性有害金属の処理

本課題では、光触媒である酸化チタンを用いて有害金属イオンの酸化および還元反応を行い、処理性の高い化学種に変換すると同時に、着法や沈澱法にて有害金属を除去・回収する手法を開発した。また、酸化チタンと吸着剤を組み合わせたハイブリッド粒子(HYB)を作成し、HYBを充填したカラム型通水式反応器へ応用し、連続処理装置の実用化を検討した。活性アルミナを母剤とした光触媒吸着剤ハイブリッド(HYB)を調製して、難除去性の亜ヒ酸[As(III)]を水相から光酸化吸着により除去することを検討した。As(III)除去率を算出するに当たり、既存の原子吸光光度計に本補助金により購入した水素化物発生装置を組み合わせた水素化物発生原子吸光法にて分析を行なった。まずHYBの調製条件、特に焼結温度が光触媒反応の活性に与える影響について、キセノンランプを用いる回分反応により検討を行った。HYBを400°C600QCにて焼結した場合、光触媒活性の高いアナタース型のTiO_2を吸着剤上に担持することが可能であり、400°Cにて焼結したHYBが最も高いAs(III)除去効率を示すことが明らかになった。その他モノメチルアルソン酸、カコジル酸、フェニルアルソン酸誘導体等の有機ヒ素化合物の分解についても検討を行った。つぎにHYBを充填したらせん型カラムを用いて連続処理装置の設計を行なった。この際、本補助金にて購入の超高圧水銀ランプを使用した。微粒子であるTiO_2をカラム処理に応用することは困難であるが、本課題にて開発したHYBを利用することで、カラム処理によるAs(III)の連続的な光酸化吸着除去が可能であった。また、通常の直線型カラムを使用した場合と比較し、らせん型カラムを使用した場合、除去効率を向上させることが可能であった。上記で用いたHYBを用いて、難除去性のセレン酸[Se(VI)]の光還元除去についても検討した。還元剤としてギ酸を用いた場合、Se(VI)をSe(IV)や金属Seに還元し水相から除去することが可能であった。また、HYBを用いることで、TiO_2粉末を用いる反応と比較して、有害なギ酸の添加量を削減することが可能であった。本課題では、光触媒である酸化チタンを用いて有害元素イオン種の酸化および還元反応を行い、処理性の高い化学種に変換すると同時に、着法や沈澱法にて有害金属を除去・回収する手法を開発した。また、酸化チタンと吸着剤を組み合わせたハイブリッド粒子(HYB)を通水式反応器へ応用し、連続処理装置の実用化を検討した。平成21年度は以下の検討を行った。1)光触媒酸化を用いたAs(III)や有機ヒ素化合物の光酸化H20年度の結果より、酸化チタンと吸着剤を組み合わせた手法により、難除去性のAs(III)や有機ヒ素化合物の光酸化除去が可能であった。また、HYBを用いることで、カラムを用いたAs(III)の除去が可能であることが分かった。21年度では、HYBを充填したらせん型カラムを光源の周りに配置した連続処理装置の設計を行なった。最終的に10mg/Lのヒ素化合物を含む処理水のヒ素濃度を水質基準である0.01mg/L以下まで低減することが可能であった。2)光触媒還元を用いたSe(VI)の処理H20年度の結果よりSe(VI)の光還元除去において、Se(VI)は還元されてコロイド状のSe(0)沈澱となり、水相から除去が可能であり、HYBを用いることで、TiO_2粉末を用いる反応と比較して、有害なギ酸の添加量を削減することが可能であった。本年度は、HYB調製時における焼結温度、粒子径等の最適化を行った。また、実排水として、高濃度のSe(VI)を含む煤煙脱硫排水にっいて、本法の適用を検討したところ、過剰なギ酸の添加が必要であったが、煤煙脱硫排水を模擬して調製した排水中のSeを排水基準(0.1mg/L)以下にすることが、可能であった。Se(VI)の光還元においては、コロイド状の金属Se沈澱が生成するため、1)で検討したようなカラムを利用することが困難であった。
花崗岩類に産する石英ファブリックに及ぼすマグマ溶液対流について

山梨県東部に分布する新第三紀徳和花崗閃緑岩体は中粒の塊状を呈して、イルメナイト系岩体とマグネタイト系列岩体で特徴づけられる。これらの岩体の岩石組織を詳細に解析した結果、以下に述べるマグマ溶液流動から固化後の塑性-脆性変形史が解明できた。斜長石類の形態定向配列は水平面に対して高角度の方向に集中する傾向を示しが、水平面上では分散型と弱集中型が見られる。鉛直方向に調和的な形態定向配列は、マグマ中に浮遊状態の長軸を有する斜長石類粒子がマグマ溶液流動方向に調和的に配列した結果である。他方、石英のC軸ファブリック解析結果では、イルメナイト系列岩体中に極性の強い配向性が現れるが、マグネタイト系列岩体には配向性は見れない。石英C軸集中を示す組織は転位模様から、再結晶作用を受けておらず、マグマから晶出した初期組織に形成されている。この成因として、ペグマタイト中の石英のC軸方向の極性成長を解析した結果、石英の柱面より錐面がラフ二ング面であり、シリカアモルファス・クラスターがステップに組み込まれて成長している。マグマ中の石英もほぼ同様な成長をしているとしたら、マグマ溶液対流が生じている中でC軸方向に極性成長した微小石英は対流方向に長軸を配列させて、crystal frameの間を充填させながら結晶成長したと推定される。徳和花崗岩類の鉱物の形態や格子ファブリックはマグマ中の熱対流では説明できなく、マグマ溶液対流が原因で形成された初期火成岩類組織の特徴である。11年度は、調査地域の北側の試料採集及び、薄片作成と、石英のC軸ファブリックの測定を終了した。又他の造岩鉱物(長石類、雲母類の微視的変形要素の解析結果と、その成課は、論文にて公表された。他方、石英の形態と、結晶成方向が、重力場におけるマグマ内で、如何なる空間方位の特徴を有するかを解析するために、石英をエッチング処理した後、ナノメーター次元の表現構造(成長模様)をHRSEMで観察・解析をする。このHRSEM解析には特殊なコーティング処理を要し、その処理方法を確立して、成果を論文にて公表した。以上の成果を踏えて、12年度は研究対象地域の南側の調査・試料採集を行ない、修得した解析用の知識・技術を実行する事で、課題である、石英の形態・格子ファブリックとマグマ対流の効果について、明らかにする事が可能となる。1)最終年度では当該地域の北側と南側の両地域から試料採集を遂行して,得られた試料の薄片作成・顕微鏡下で石英のC軸ファブリック解析ならびに斜長石類の形態定向配列解析を行った.2)ペグマタイト,安山岩中の昌洞中に晶出した自形石英の表面及び内部を高分解能走査電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡で組織解析を行った結果,C軸方向に極性成長する石英は数100nmサイズの球状単位で結晶石英の成長をすることが明らかになった.このnmオーダーの球状は,アモルファス・シリカのクラスターと呼ばれるものである.3)斜長石の形態定向配列を有するものは,ほぼ鉛直方向に長軸を配列するものと,無定向配列の2つに区分される.4)石英のC軸ファブリックの極性は斜長石の定向配列を示す組織中に出現することが明になった.5)波動消光等を伴わない石英粒子内に発達する自由転位線の密度は斜長石の形態定向配列の有無に左右されること無く,ほぼ同じ値を示す.

6)花崗岩マグマの冷却過程における初期火成岩組織形成に伴う石英粒子の格子ファブリックは多くはランダム配列が特徴として知られている.しかし本研究では固体流動や脆性変形を受けていない初期花崗岩組織中の石英粒子は,格子ファブリックに定向配列と斜長石の形態定向配列で特徴付けられることが明らかになった.このような花崗岩組織は花崗岩マグマのイルメナイト系列岩体に出現して,マグネタイト系列の花崗岩組織には見られない.この両系列ではイルメナイト系列はマグネタイト系列に比較して低温条件で形成されている.花崗岩岩体のマグマ規模におけるマグマの熱対流の他にイルメナイト系列マグマ中に含まれるシリカ・クラスターが高密度のマグマ溶液の下降流動が起きた.この高密度シリカ・クラスター溶液が石英のC軸方向を鉛直に配置し且つ結晶成長を促進させた.7)上述の成果は国際学術雑誌に投稿する為,原稿を準備中である.
疼痛伝達脊髄二次ニューロンにおけるガスメッセンジャーの機能解明

硫化水素は,火山性ガスに含まれる有毒ガスとしてよく知られているが,同様に有毒ガスとして知られている一酸化炭素,一酸化窒素とともに生体内で産生され,重要な役割を担っていることが明らかとなった.本研究では,痛みを認識するセンサーの一つであるTRPA1チャネルに作用する硫化水素が酸性条件下で細胞内に移行しやすくなり,その反応性を高めることが明らかとなった.また,脊髄での知覚神経の伝達では,硫化水素が増強あるいは抑制に働き,複雑な調節を行う可能性が示された.生体内の硫化水素の産生を調節することは鎮痛薬を開発する糸口となりうるかも知れない.今年度は昨年度得られた知見をもとにさらに詳細な解析を推進した。知覚神経二次ニューロンの伝達に対するガスメッセンジャーの役割を試験した。解析を進めるに当たり、昨年度確立したラット脊髄スライス標本を用いたパッチクランプ法を用いた。すなわち、脊髄後角第II層に存在する興奮性知覚神経二次ニューロンおよび抑制性介在ニューロンのactivityを検出した。今年度の解析においては、昨年度応答が見られたガスメッセンジャーの1つである硫化水素の作用の詳細を明らかにすることを目的とした。硫化水素は知覚神経の侵害受容器として機能するTRPチャネルの1つであるTRPA1チャネルに作用し知覚神経を興奮することを既に明らかにしている。本実験系で見られた知覚神経二次ニューロンの活性化がTRPA1チャネルによるものかどうかを解析した。硫化水素(1 mM)に応答したニューロンに対して、TRPA1チャネルの阻害薬であるHC030031(10 μM)存在下で硫化水素を適用したところ、硫化水素による活性化が抑制されたニューロンと抑制されなかったニューロンが見られた。従って、硫化水素はTRPA1チャネルだけでなく他のチャネルにも作用することが示唆された。また、二次ニューロンの活性化には知覚神経一次ニューロンから直接接続するシナプスの活性化による場合と一次ニューロンの興奮伝導を介した場合が考えられている。そこで、興奮伝導を遮断するテトロドトキシン存在下で硫化水素の活性化を測定した。その結果、テトロドトキシン存在下でも硫化水素による神経興奮が見られたことから、硫化水素は接続する前シナプスもしくは二次ニューロン自体に直接作用する可能性が示された。硫化水素は,火山性ガスに含まれる有毒ガスとしてよく知られているが,同様に有毒ガスとして知られている一酸化炭素,一酸化窒素とともに生体内で産生され,重要な役割を担っていることが明らかとなった.本研究では,痛みを認識するセンサーの一つであるTRPA1チャネルに作用する硫化水素が酸性条件下で細胞内に移行しやすくなり,その反応性を高めることが明らかとなった.また,脊髄での知覚神経の伝達では,硫化水素が増強あるいは抑制に働き,複雑な調節を行う可能性が示された.生体内の硫化水素の産生を調節することは鎮痛薬を開発する糸口となりうるかも知れない.今年度は本研究の初年度であり,知覚神経の伝達に対してどのようにガスメッセンジャーが関与しているかを明らかにする目的で,脊髄内の知覚神経二次ニューロンに対するガスメッセンジャーの作用を明らかにすることを試験した.まず初めに,解析を実施するための実験系を確立した.また,今年度はガスメッセンジャーのうち,現在最も注目されている硫化水素による作用のを解析した.測定に際し,対象動物は標本の大きさを確保するためラットを用い,脊髄スライスの潅流標本を用いたパッチクランプ法を実施した.知覚神経は末梢の一次求心性のニューロンが脊髄内で二次ニューロンに信号が伝達される.この二次ニューロンに対してパッチクランプ法を適用し電気生理学的にシナプスの活性化を測定すると,種々の膜電位で固定した条件下で得られる自発的な興奮性あるいは抑制性ニューロンのインパルスが得られる.これらの活性化に対する硫化水素の作用を評価した.硫化水素は,末梢の一次ニューロンに対して発痛性の刺激作用を示すことを既に明らかにしたが,脊髄内の二次ニューロンに対して硫化水素は興奮性および抑制性のニューロンに対して活性化あるいは抑制的に作用することが示された.脊髄中にはさまざまな特徴をもつニューロンが存在することから,それぞれに対して硫化水素が異なる作用をしたと考えられた.今年度は、昨年度までに得られた結果をまとめ、より詳細な解析を加えた。知覚神経二次ニューロンの伝達に対してガスメッセンジャーとして注目されている硫化水素がどのような作用を示すのかをラット脊髄スライス標本を用いたパッチクランプ法によって明らかにした。これまで、興奮性のインパルスを自発的に発生させる知覚神経に対して、硫化水素を適用するとその興奮性が増強されるニューロンと抑制されるニューロンがそれぞれ存在していることが示された。しかしながら、それらに加えて、硫化水素によって興奮が増強したのちにその興奮が逆に減少するニューロンが存在することを今回新たに見出した。興奮の増強には硫化水素のターゲットで知られるTRPA1やその他の未知のチャネルの関与が示唆された。抑制効果の要因として、これまでにも報告のあるターゲットの存在が考えられるものの同定には至らなかった。これらの応答に時間差が生じた理由も分かっていない。このようなパターンで応答するニューロンは、計測したうちの約半数に及んだ。硫化水素は内因性の調節因子として認識されつつある。脊髄組織中での生理的な役割の全容を明らかにするまでには至らなかったが、硫化水素は知覚神経の伝達を複雑に調節する可能性が示された。獣医学今年度は硫化水素による知覚神経二次ニューロンの興奮作用の詳細を明らかにすることを目的とした。

これまでにも硫化水素は様々なチャネルに作用することが報告されているが、知覚神経二次ニューロンに対してTRPA1チャネルの関与がある可能性を評価することができた。また、硫化水素が一次ニューロンと形成するシナプスに対して作用する可能性が明らかとなった。次年度は、硫化水素が作用する全体像を明らかにすることを継続しつつ、他のガスメッセンジャーとの相互作用についても検討する。今年度は知覚神経の伝達に対してどのようにガスメッセンジャーが関与しているかを明らかにする目的で,1)評価系の確立、2)ガスメッセンジャーの作用を明らかにすることを計画した.対象とした脊髄標本における測定を確立し,3種類の代表的なガスメッセンジャーのうちの最も新しい因子である硫化水素の作用を評価することができた.この点から,今年度の目的の主要な部分について達成したと言える.次年度はこれらの結果を継続・発展させ,種々のガスメッセンジャーの作用あるいはそれらの相互作用について実施する.24年度および25年度で得られた知見をもとにより詳細な解析を進め、知覚神経二次ニューロンに対する硫化水素の作用の全容を明らかにする。可能性のあるチャネルの遮断薬を用いて硫化水素の作用点を明らかにする。更には、25年度に着手できなかった病態モデルを用いて、実際に硫化水素が内因性に作用しうるかを解析する。また、他のガスメッセンジャーの単独作用あるいはそれらの複合的な作用の知見を得ることを試みる。26年度は本研究期間の最終年度であり、成果をまとめつつ更なる研究のシーズを発掘することも合わせて検討することを念頭に置きつつ推進する。24年度の成果を基に更に解析を進め,知覚神経二次ニューロンに対する各ガスメッセンジャーの機能とそれらの相互作用を明らかにする.また,これらのガスメッセンジャーの作用機序を明らかにするために阻害剤等を用いて部位の特定を試みる.更には,神経因性疼痛モデルを用いた二次ニューロンのガスメッセンジャーに対する応答変化の解析を行いガスメッセンジャーが内因性あるいは外因性にどのように作用しうるかを解析する.25年度にこれらのモデル作製の検討を開始する.モデル動物より採取した脊髄スライス標本において,ガスメッセンジャー単体あるいは複合曝露による応答を測定する.また,後根神経刺激した二次ニューロンの応答についてもガスメッセンジャーの作用の変化を明らかにし,神経伝達のより詳細な検討を加える.そして,これらの阻害剤を投与したとき,神経因性疼痛モデル動物の行動にどのような作用があるかを評価する.神経因性疼痛という病態においてガスメッセンジャーがどのように関与しているかを正常状態の脊髄スライス標本による結果と比較しながらin vivoの機能を明らかにする.該当なし
南極大陸における曝露繊維の表面特性を考慮した高機能繊維素材の開発

南極域において、H.16年H.17年にかけて第45次南極越冬隊の協力の下、旗状に縫製した織物試料(綿・羊毛・ナイロン6・ポリエステル・アクリル)を東オングル島迷子沢にあるイメージングリオアンテナの支柱に取り付け、夏季(184日)、極夜季(52日)、冬季夏季(194日)の期間曝露を行った試料、及び内陸旅行のルート整備に伴う赤旗(ナイロン6)の交換時に取り外し収集した試料について、表面形態、表面分析、熱分析、結晶化度等の測定を行い検討した。又、同一試料を西宮市で曝露を行い、穏和な地域との比較を行った。結果、曝露により表面のスキン層は消失していたが冬季夏季にかけて約130日間の曝露と、極夜季に52日間曝露された羊毛とナイロン6の繊維表面にプレート状の結晶が観察された。一般に水蒸気中に繊維を12時間曝露した場合に、モノマーやオリゴマーが結晶化することが知られているが、特に極夜期間は紫外線の影響がほとんどないため、気象条件との関連で興味が持たれる。又、回収された旗のうち、標高1200m付近では、吹き下ろしの強風のため旗は引き裂きさかれて試料の残存量が少ないが、標高3700m付近の旗には、強風により摩擦溶融による硬化部分がみられ注目している。又、南極域では国内の曝露では見られない表面の窒素量が増加傾向にあるなど一考すべき結果が得られている。なお、これらの結果をもとに、アクリル板2枚に試料を挟み込み、風の影響と水分の浸入を完全に防ぐ様に配慮したパネルを作製して、紫外線のみの影響による曝露をH.18年1月より開始している。同時に絹織物を加え、条件設定を変えて曝露を続行中でもある。これらの試料が入手され次第、H.16年H.17年度に得られた結果を総合的に検討し、極寒地における劣化のメカニズムを解明して本研究の当初の目的であった高機能繊維素材の開発に着手する予定である。南極地域観測時に、昭和基地からドームふじに至る約1000km(標高差約1,500m)の間に立てられたルート標識の旗(ナイロン6平織物)を試料として、極寒地域に於る繊維の劣化の検討を行った。ルート旗は、色褪せて引裂かれており原形を留めるものはなく激しく劣化したもので、電顕により表面を観察したところ、繊維軸と直角方向にクレーター状の凹凸が、ほぼ20μm間隔に規則性をもってエッチングされていた。しかし、これらのクラックは決して繊維の中心部には及んでいない。比較のために、日本国内(西宮市)の平地で曝露をしたナイロン6平織物は、繊維軸に対して直角方向にネジくぎ状のクラックが25μm間隔にみられ、クラックもかなり中心部に及んでいる等、様相を異にするものであった。又、ESCA測定による表面分析や強伸度測定を行った結果、興味ある知見が得られたので、一部をまとめてPolymer Journalに発表した。しかし、これらの試料は、試料採取など系統的でなく、繊維の劣化機構の解明には不確定要素をぬぐえない部分が多い。そこで南極域における繊維劣化のメカニズムをより詳細に解明するために、ナイロン6、ポリエステル、アクリル、綿、羊毛、絹織物について、旗状の試料を作成し、南極越冬45次隊及び46次隊の協力を得て、昭和基地の東オングル島迷子沢にあるイメージングリオメータアンテナの支柱を利用しての曝露、及び内陸においての長期曝露を続行中である。今回、夏季期間の41日間曝露した試料は日本に持ち帰られたので、目下、表面形態やESCAによる表面分析を行い、西宮(日本)での曝露試料と比較検討を行っている。又、観測隊でルート整備に用いる赤旗のうち、交換したものを回収して併せて試料とする予定である。これらの曝露試料は回収後、気象条件を考慮し、極寒地と温和な地域での表面特性の違いを解明していく予定である。

なお、これらの結果をもとに、アクリル板2枚に試料を挟み込み、風の影響と水分の浸入を完全に防ぐ様に配慮したパネルを作製して、紫外線のみの影響による曝露をH.18年1月より開始している。同時に絹織物を加え、条件設定を変えて曝露を続行中でもある。これらの試料が入手され次第、H.16年H.17年度に得られた結果を総合的に検討し、極寒地における劣化のメカニズムを解明して本研究の当初の目的であった高機能繊維素材の開発に着手する予定である。
粘菌アメーバの時空間振動ダイナミクスを活用するバイオコンピュータの研究開発

単細胞生物・真性粘菌は、中枢神経系を持たないが、環境刺激情報の記憶、最適化問題解決等の高度な情報処理を実現する。こうした自律分散型情報処理は、自発的に伸縮する繊維状タンパク群が、時空間振動ダイナミクスを自己組織化することにより実現するものと考えられる。本研究では、粘菌の自発的挙動に応じて光刺激をフィードバックするシステムを構築することで、時空間ダイナミクスが情報処理機能を創発する機序を解析し、その過程を再現する数理モデルを導出した。さらに、粘菌に類似したダイナミクスをもつ、近接場光相互作用する量子ドット系を用い、最も難しい組合せ最適化問題の一つである充足可能性問題の解探索を実現するシステムのアイデアを具体化し、特許出願を実現した。単細胞生物・真性粘菌変形体は、神経系のような中央集権型指令系を持たないが、環境刺激情報の記憶、最適化問題解決、ロボット制御等の高度なタスクを実現できる。こうした自律分散型情報処理は、細胞外質中の繊維状タンパク群が、集団的に時空間振動ダイナミクスを自己組織化することにより実現するものと見られるが、詳細機序は不明な点が多い。本研究では、粘菌の自発的挙動に応じて光刺激をフィードバックする実験観察システムを構築することにより、時空間ダイナミクスが情報処理機能を創発する機序を解析するとともに、類似したダイナミクスをもつデバイスにより革新的平行計算を実現する方法を探るべく、ニューラルネットワーク型バイオコンピュータを開発した。当システムは、最も難しい組合せ最適化問題の1つである巡回セールスマン問題(TSP)の解探索を、都市数Nの2乗個の素子(粘菌分枝群)を結合することにより実行する。一般に、TSPの可能な有効解の数は、階乗のオーダー((N-1)!/2)で成長するため、最適解の導出はNの増大とともに飛躍的に困難となる。著者らの先行研究で、N=4(素子数16)の場合、当システムが高い確率で最適解に到達できることが示されていた。我々は、当システムの解探索能力をNの関数として評価し、それを外挿する事で、時空間振動ダイナミクスを平行計算に活用する我々の方法が、より大きなサイズの様々な実用的問題に対しても、有効な解決手段となり得ることを示したいと考えている。その第一歩として本年度は、当システムの素子数を64へと拡大し、8都市のTSPに対する性能評価を行った。その結果、当システムは高い確率で良好な解に到達した。また、解探索に要する時間が、N=4の場合と比較して、劇的に成長しないことが示唆された。単細胞生物・真性粘菌は、神経系のような集中制御系を持たないが、環境刺激情報の記憶、最適化問題解決等の高度な情報処理を実現できる。こうした自律分散型情報処理は、自発的に伸縮する繊維状タンパク群が、時空間振動ダイナミクスを自己組織化することにより実現するものと見られるが、詳細は不明な点が多い。本研究では、粘菌の自発的挙動に応じて光刺激をフィードバックするシステムを構築することで、時空間ダイナミクスが情報処理機能を創発する機序を解析するとともに、類似したダイナミクスをもつ物質を用いて革新的な平行計算を実装するための要件を明らかにすることを目指した。このシステムは、巡回セールスマン問題(TSP)の解を探索できる。TSPは最も難しい組合せ最適化問題の一つであり、有効な解(巡回経路)の総数は、Nの増大とともに指数関数的((N-1)!/2)に成長する。本システムの探索は、粘菌のN^2本の分枝(足)により行われる。それらが複雑な振動ダイナミクスに基づき伸び縮みしながら、どの足を伸ばせば光(嫌いな刺激)の照射リスクを最小化できるか試行錯誤し、最終的にN本の分枝のみが伸長したとき、その組合せが一つの解を表現することとなる。本年度は、N=4,5,6,7,8の場合の性能を比較した。その結果、Nが増大しても解の質は劣化せず(N=8の場合、上位約19%の短い経路長)、解到達時間はNに比例することが分かった。つまり、探索空間の成長がNの非線形関数となるにもかかわらず、探索に要する「時間」等の資源の増大をNの線形関数に抑えながら、「正確さ」は維持することができているのだ。このことは、本ダイナミクスが、ある程度正確な計算を「探索コスト」を低く抑えながら実現できる「経済的」な探索能力を有している可能性を示唆する。これは、類似したダイナミクスを活用するデバイスの優位性を主張する一つの論拠となり得る。
炎症性腸疾患おけるTh17型炎症の制御性T細胞による抑制に関する研究

炎症性腸疾患は腸に慢性の炎症を起こす難病で、腸での免疫応答の制御に異常があるとされる。制御性T細胞は免疫応答を抑制する細胞で炎症性腸疾患治療への応用が期待されている。近年、炎症性腸疾患ではT細胞を介した免疫応答の中でTh1型とTh17型反応の関与が示唆されている。制御性T細胞はTh1型大腸炎は抑制するが、Th17型大腸炎を抑制できるかどうか不明であった。本研究では、制御性T細胞がTh1型に加えてTh17型大腸炎を抑制できる事を示し、炎症性腸疾患にTh17型反応が関与していたとしても制御性T細胞が治療に応用できる事を示した。マウスTh17型炎症に対する制御性T細胞の抑制効果を検討するため、CB-17ScidマウスにBalb/cマウス由来CD4+CD62L+CD25-T細胞1x10^6を腹腔内投与して大腸炎を誘導した。炎症を起こした腸管ではreal time PCRにてTh1型サイトカインIFN-γとTh17型サイトカインIL-17の上昇を認めた。また、大腸より粘膜固有層単核球を分離し、T細胞からのサイトカイン産生を検討した所、CD4+T細胞からのIFN-γ、IL-17産生が上昇していた。ScidマウスにCD4+CD62L+CD25-T細胞1x10^6と共に同数のCD4+CD25+制御性T細胞を腹腔内投与すると大腸炎誘導が抑制されたが、上記のIFN-γ、IL-17産生は共に抑制され、制御性T細胞はin vivoでTh17型大腸炎を抑制することが示された。ヒトTh17型炎症に対する制御性T細胞の抑制効果を検討する目的で、ヒト末梢血ナイーヴCD4+T細胞よりTh17細胞の誘導法について検討した。ナイーヴCD4+T細胞をIL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α、抗IL-2抗体、抗IFN-γ抗体存在下に抗CD3抗体/抗CD28抗体付着ビーズで刺激するとIL-17を高レベルに産生する細胞が誘導された。IFN-γ産生はわずかであり、Th17型細胞が誘導されたと考えられる。対照的にナイーヴCD4+T細胞をIL-12、抗IL-4抗体存在下に刺激すると、Th1型細胞が誘導されIFN-γを高レベルに産生したが、IL-17産生はわずかであった。マウスでTh17細胞を誘導するTGF-βの添加は、逆にIL-17産生を抑制した。以上よりヒトTh17型細胞の誘導法が確立された。潰瘍性大腸炎・クローン病の炎症性腸疾患患者および非炎症性腸疾患である大腸ポリープなどの対照患者より小腸・大腸内視鏡検査時に生検サンプルを採取し、RNAを抽出した。RNAよりcDNAを作成した。Real time PCRでTh17型サイトカイン、Th1型サイトカインRNAの発現レベルを解析した。潰瘍性大腸炎、クローン病でTh17型サイトカインIL-17とTh1型サイトカインIFN-γの発現が高レベルの症例を認めた。ヒトTh17型炎症に対する制御性T細胞の抑制効果を検討する目的で、ヒトナイーヴCD4+T細胞よりTh17細胞の誘導法について更に検討を加えた。健常人末梢血より単核球を分離、磁気ビーズを用いてナイーヴCD4+T細胞(CD4+CD62L+CD25-)をIL-1β、IL-6、IL-23、抗IL-12抗体、抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体存在下に抗CD2抗体/抗CD3抗体/抗CD28抗体付着ビーズで刺激するとIL-17を高レベルに産生する細胞が誘導され、最も至適な条件と考えられた。IFN-γ産生も認めたが低レベルであり、Th17型細胞が誘導されたと考えられる。潰瘍性大腸炎ではTh17型サイトカインIL-17優位の、クローン病ではTh1型サイトカインIFN-

γ優位のサイトカイン発現亢進を認めた。制御性T細胞(Treg)の特異的マーカーであるFoxP3の発現は、IL-17やIFN-γの発現と相関しており、炎症に応じてTregが腸管に動員されている事が示された。炎症性腸疾患に対するTreg移入療法を考案するにあたり、より多くのTregを移入するため、in vitroで培養・増殖したTregを移入する方法が考えられる。免疫抑制剤ラパマイシンはin vivo、in vitroでTreg増殖効果があると報告されており、ラパマイシン誘導Tregの治療への応用に関して検討した。Balb/cマウスCD4+T細胞をラパマイシン存在下に刺激培養すると、3週間で細胞数は8倍に増加し、Treg割合が40%に上昇した。CB-17 ScidマウスにBalb/cマウス由来CD4^+CD62L^+CD25-T細胞1x10^6を腹腔内投与して大腸炎を誘導した。炎症を起こした腸管ではreal time PCRにてIFN-γとIL-17の上昇を認めた。また、大腸粘膜固有層単核球からのサイトカイン産生を検討した所、IFN-γ、IL-17産生が上昇していた。scidマウスにCD4^+CD62L^+CD25-T細胞1x10^6と共に同数のラパマイシン培養CD4^+T細胞を腹腔内投与すると大腸炎誘導が抑制され、IFN-γ、IL-17産生は抑制された。ラパマイシン誘導Tregがin vivoでTh1と共にTh17型大腸炎を抑制することが示された。
アルツハイマー病脳における細胞内アミロイドβ蛋白産生部位の同定

アルツハイマー病の患者に認められるアミロイドβ蛋白(Aβ)の脳内沈着は疾患特異性が高く、アルツハイマー病の主原因のひとつであると考えられている。Aβはアミロイドβ前駆体蛋白(βAPP)から未同定のプロテアーゼによって切出されるが、C末側のアミノ酸配列によって規定される2つのsubspeclesが存在することが知られている。このうち、Aβ40は最後のアミノ酸がバリンで終り、Aβ42はアラニンで終わっている。分泌されるAβのおよそ90%はAβ40であるにもかかわらず、アルツハイマー病の発症にはAβ42が重要な役割を演じていることが最近の研究から分かってきたが、どのような機構でAβ40とAβ42が選別されて産生されるのか一切不明のままである。特に、それぞれが別個のプロテアーゼによって切出されるのか、それとも同一のプロテアーゼによって産生されるのかは研究者の興味の中心だった。われわれは、細胞質内に存在する代表的なプロテアーゼであるカルバインとプロテアソームに対する阻害剤を培養細胞に作用させて、そのAβ産生に及ぼす影響を、Aβ40とAβ42を別個に検出可能な鋭敏なELISA法を用いることによって検討した。この結果、カルパインの特異的阻害剤であるカルパスタチンの活性中心ペプチドの投与のよって、Aβ42の産生が増加し、Aβ42のAβ全体にしめる割合が増加することが判明したが、プロテアソームの特異的阻害剤では変化がなかった。これらの結果は、Aβ40とAβ42が別個の酵素によって産生される可能性を示すものである。
移動特性が異なる天然オーキシンの植物における生理的役割の違い

オーキシンのインドール-3-酢酸(IAA)は、植物の細胞伸長や細胞分化を調節する非常に重要な植物ホルモンである。最近、フェニル酢酸(PAA)が重力方向に極性移動しないユニークな特性をもち、植物に広く存在するオーキシンであることが明らかになった。しかし、植物におけるPAAの生合成や生理的役割はまだ解明されていない。その生合成経路を解明するため、PAA生合成の候補遺伝子としてシロイヌナズナのIAA生合成酵素TAA1をコードする遺伝子のホモログ(TAR3およびTAR4)に着目し、それらがコードするタンパク質の酵素機能を解析した。大腸菌でTAR3とTAR4タンパク質を調製して酵素活性試験を行った結果、TAA1と比較すると低活性ではあるが、フェニルアラニンからPAA生合成の予想中間体フェニルピルビン酸を生成することがHPLCなどで確認された。次年度、シロイヌナズナのTAR3およびTAR4遺伝子の過剰発現体の表現型解析とオーキシン代謝物分析を行い、in vivoにおけるPAA生合成への寄与を明らかにする。さらに、シロイヌナズナでPAA生合成に関与する可能性のあるシトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP79A2の機能解析を行った。CYP79A2遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現させたところ、PAA量のみが特異的に増加した。一方、シトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP79B2をコードする遺伝子の過剰発現体では、IAAのみが特異的に増加した。興味深いことに、どちらの遺伝子過剰発現体でも側根形成の促進が認められたが、PAAが特異的に増加した時はIAA量が減少し、反対にIAA量が増加したときはPAA量が減少した。これらの結果、シロイヌナズナにおいてCYP79A2がPAA生合成に関与しうること、また2つのオーキシンが相互に濃度調節するメカニズムが存在することが明らかになった。当初の予定通り、シロイヌナズナのTAR3とTAR4が、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を生成する酵素活性をもつことをin vitroで示すことができた。また、これらの遺伝子過剰発現体をシロイヌナズナで作成することも完了した。引き続き、順調に遺伝子過剰発現体の表現型解析と、オーキシン代謝物の分析を進めている。PAA生合成に関与する可能性のあったシロイヌナズナのシトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP79A2の機能解析を進めた結果、その遺伝子過剰発現体でPAAが特異的に増加することをを発見した。これにより、植物の遺伝子を使って初めてPAA量を特異的に増加させることに成功した。さらに、CYP79B2遺伝子の過剰発現体も使って解析した結果、IAAとPAAの間に相互に濃度制御するメカニズムが存在することを初めて発見した。これにより、PAAがIAAと協働的に植物の成長調節をしていることを示唆する重要な証拠を得た。また、本研究課題でオーキシン代謝物の分析技術を改良したことにより、他のオーキシン研究も大きく進展した。改良法でオーキシン代謝物を分析した結果、アグロバクテリウムがクラウンゴールを形成する際にIAAとPAAの両方を過剰に生成していることを明らかにすることができた。これにより、微生物と植物の相互作用においても、2種類のオーキシンが利用されている可能性が示唆された。これらの進捗状況から、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。当初の研究計画通り、PAA生合成の予想中間体であるフェニルピルビン酸の質量分析計(LC-MS/MS)を使った分析法を確立する。これを用いて、TAR3とTAR4の遺伝子過剰発現体のフェニルピルビン酸を分析し、これらの遺伝子が予想した経路でPAAの生合成に関与しているか検証する。また、これらの遺伝子欠損変異体の解析も同様に進める。これに続き、もうひとつのPAA生合成の候補遺伝子であるADTの解析を進める。ADTの過剰発現体および欠損変異体を使い、オーキシン代謝物分析と表現型解析を行うことで、PAA生合成との関係性を探る。

一方、シトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP79B2をコードする遺伝子の過剰発現体では、IAAのみが特異的に増加した。興味深いことに、どちらの遺伝子過剰発現体でも側根形成の促進が認められたが、PAAが特異的に増加した時はIAA量が減少し、反対にIAA量が増加したときはPAA量が減少した。これらの結果、シロイヌナズナにおいてCYP79A2がPAA生合成に関与しうること、また2つのオーキシンが相互に濃度調節するメカニズムが存在することが明らかになった。当初の予定通り、シロイヌナズナのTAR3とTAR4が、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を生成する酵素活性をもつことをin vitroで示すことができた。また、これらの遺伝子過剰発現体をシロイヌナズナで作成することも完了した。引き続き、順調に遺伝子過剰発現体の表現型解析と、オーキシン代謝物の分析を進めている。PAA生合成に関与する可能性のあったシロイヌナズナのシトクロムP450モノオキシゲナーゼCYP79A2の機能解析を進めた結果、その遺伝子過剰発現体でPAAが特異的に増加することをを発見した。これにより、植物の遺伝子を使って初めてPAA量を特異的に増加させることに成功した。さらに、CYP79B2遺伝子の過剰発現体も使って解析した結果、IAAとPAAの間に相互に濃度制御するメカニズムが存在することを初めて発見した。これにより、PAAがIAAと協働的に植物の成長調節をしていることを示唆する重要な証拠を得た。また、本研究課題でオーキシン代謝物の分析技術を改良したことにより、他のオーキシン研究も大きく進展した。改良法でオーキシン代謝物を分析した結果、アグロバクテリウムがクラウンゴールを形成する際にIAAとPAAの両方を過剰に生成していることを明らかにすることができた。これにより、微生物と植物の相互作用においても、2種類のオーキシンが利用されている可能性が示唆された。これらの進捗状況から、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。当初の研究計画通り、PAA生合成の予想中間体であるフェニルピルビン酸の質量分析計(LC-MS/MS)を使った分析法を確立する。これを用いて、TAR3とTAR4の遺伝子過剰発現体のフェニルピルビン酸を分析し、これらの遺伝子が予想した経路でPAAの生合成に関与しているか検証する。また、これらの遺伝子欠損変異体の解析も同様に進める。これに続き、もうひとつのPAA生合成の候補遺伝子であるADTの解析を進める。ADTの過剰発現体および欠損変異体を使い、オーキシン代謝物分析と表現型解析を行うことで、PAA生合成との関係性を探る。