hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代核融合実験のための高原子番号不純物スペクトルの観測とモデリング

LHD装置に開発した高原子番号不純物ペレットを入射することにより,それらイオンからのスペクトル線を発光させ,可視,VUV及びEUV分光器を用いてスペクトル観測を行った.タングステンのUTAと呼ばれる疑似連続光をEUV領域で観測し,結果を開発した原子モデリング計算と比較し,良い一致を見た.VUV領域ではWVIを代表とするタングステン低電離イオンスペクトルを初めて観測した.また,可視領域で磁気双極子M1遷移を初めて観測し,その波長を原子構造理論と比較した.実験と理論には有意な差が見られ,原子構造理論に更なる改良の必要性を指摘した.磁場閉じ込め装置では第一壁を保護するために長らく炭素材料が用いられてきたが,国際熱核融合実験炉(ITER)ではトリチウム蓄積や高熱流束除去等の理由によりタングステンの使用が決定された.ITERでの核燃焼定常実験を成功させるためにはタングステンの挙動を調べることが死活的に重要である.そこで,プラズマ診断に必要なタングステンに関するデータを取得するために,大型ヘリカル装置(LHD)と付属する分粥計測機器を用いて可視からX線に至るスペクトル線を観測し,スペクトル構造を解明すると共にスペクトル線強度に関するモデリングと不純物診断法の開発を行う.昨年度(平成23年度)にはタングステン含有不純物ペレットをLHDに入射し,既存のEUV分光器を用いてその空間分布を計測した.W^<+41>イオン辺りのスペクトル分布を利用し,電子温度・密度分布から不純物輸送に関する計算を試みた.しかし,計測された電子温度では実験データを説明できず,輸送コードに用いている電離もしくは再結合係数に問題があることが判明した.特に二電子性再結合過程はその複雑性から通常輸送コードには含まれておらず,再結合係数を過小評価している可能性を見出した.つまり,タングステンの輸送を解析する前に電離平衡計算に必要な電離・再結合係数の見直しの必要性が判明した.空間分布を計測しているため容易にプラズマ中心に存在しているタングステンイオンの価数が分かるので,実験から再結合係数の評価を行うことが可能である.今後のタングステン研究に大きな飛躍となることが予想される.また,磁気双極子禁制線の観測ではW^<26+>の3894Åと思われるスペクトルが観測できた.タングステンの磁気双極子禁制線をLHDで初めて観測でき,今後の研究の進展に向け大きなステップとなった.磁場閉じ込め装置では真空壁を保護するため第一壁として炭素材が長年用いられてきたが,国際熱核融合実験炉(ITER)ではトリチウム蓄積回避や高熱流束対応等の理由によりタングステンを使用する.ITERでの核燃焼定常実験を成功させるためには高温プラズマ中でのタングステンの挙動を理解することが死活的に重要となる.そこで,プラズマ分光診断に必要なタングステンに関する基礎データを取得するため,大型ヘリカル装置(LHD)と付属する分光計測機器を用いて可視からX線に至るスペクトル線を観測し,複雑なタングステンスペクトルの構造を解明する.同時にスペクトル線強度に関するモデリングと不純物診断法の開発を行う.昨年度(平成25年度)は新しく開発したタングステン金属細線を内蔵する同軸型ポリプロピレン及び同軸型炭素不純物ペレットを本格的に実験に使用し始めた.LHDにはプラズマ電流が存在しないため許容不純物レベルは非常に高いが,更に入射タングステン量を最適化することに成功し,トカマク装置を含めこれまでに行われてきたタングステンに関する様々な実験研究とは比較にならないほど明るいタングステン光源の生成に成功した.結果として可視域で磁気禁制線と呼ばれる多価に電離されたタングステンイオンからのスペクトルを新たに数多く発見できた.また,W45+イオンが127Å付近で単独に発光していることを突き止め,精度のよい空間分布を得ることに成功した.これまで観測していた60.9Å付近のW44+イオンスペクトルは他のタングステンスペクトルが混合している可能性があったが,今回検証したスペクトルはこれを完全に排除する.また,VUV領域において高スペクトル分解分光計測を開始した.タングステン流入束を計測できる低電離スペクトル線を発見できる可能性がある.磁場閉じ込め装置では第一壁を保護するために長らく炭素材料が用いられてきたが,国際熱核融合実験炉(ITER)ではトリチウム蓄積や高熱流束除去等理由によりタングステンの使用が決定された.ITERでの核燃焼定常実験を成功させるためにはタングステンの挙動を調べることが死活的に重要である.そこで,プラズマ診断に必要なタングステンに関するデータを取得するために,大型ヘリカル装置(LHD)と付属する分光計測機器を用いて可視からX線に至るスペクトル線を観測し,スペクトル構造を解明すると共にスペクトル線強度に関するモデリングと不純物診断法の開発を行う.昨年度(平成24年度)はこれまでとは異なりタングステン細線をポリプロピレンチューブに収めた不純物ペレットを新たに作成した.これをLHDに入射することにより,これまでのタングステン粉末と比較してより定量的にタングステン入射量を制御することに成功した.それに加えて新たにタングステン入射時の制動放射分をEUV分光器を用いて計測し始めた.これによりタングステンの入射量とプラズマに閉じ込められたタングステン量を定量的に把握することが可能になり.より精密なタングステン輸送に関する研究が可能となった.

また,タングステンのより詳しい振舞いを調べるためにW44+イオン発光線の分布を計測し,その定量化を行ったきたが,新たにW45+イオンスペクトルも同定することに成功し,タングステンイオンの定量化にむけた選択枝を増やすことが可能になった.これらイオンスペクトルの精密な解析のためにタングステンスペクトルモデリングを発展させ,少なくとも低価数のタングステンのスペクトルをシミュレーションすることに成功した.今後実験データを解析する上で重要なツールを築き挙げつつある.磁場閉じ込め装置では真空壁を保護するため第一壁として炭素材が長年用いられてきたが,国際熱核融合実験炉(ITER)ではトリチウム蓄積回避や高熱流束対応等の理由によりタングステンを使用する.ITERでの核燃焼定常実験を成功させるためにはタングステンの挙動を把握することが死活的に重要となる.そこで,プラズマ分光診断に必要なタングステンに関する基礎データを取得するため,大型ヘリカル装置(LHD)と付属する分光計測機器を用いて可視からX線に至るスペクトル線を観測し,複雑なタングステンスペクトルの構造を解明する.同時にスペクトル線強度に関するモデリングと不純物診断法の開発を行う.昨年度(平成26年度)は新しく開発したタングステン金属細線を内蔵する同軸型ポリプロピレン及び同軸型炭素不純物ペレットを実験に使用し,W45+イオン(127Å)スペクトルの空間分布を観測することに成功した.これまで観測していた60.9Å付近のW44+イオンスペクトルは他のタングステンスペクトルが混合している可能性があった.今回観測したスペクトルは完全に独立したイオンスペクトルであり,その分布解析を行った.線積分値を局所発光強度に変換し,HULLACコードを用いて計算した発光係数とプラズマの電子温度・密度分布を考慮することにより,コア部のタングステン密度を初めて計測した.コア部のW45+密度は7.8x108cm-3であった.別途解析したW44+密度は1.0x109cm-3であり,両者が良い一致を示した.この手法を用いてコア部のタングステン密度を精度よく計測できることが分かった.また,これまで得られたタングステン分光計測の知見をタングステンダイバータを有するトカマク装置のタングステン診断に応用すべく,中国・EAST装置でEUV分光器の設置準備を進め,首尾よくファーストデータの取得に成功した.ITERではトリチウム蓄積回避や高熱流束対応等の理由によりタングステンを使用する.ITERでの核燃焼定常実験を成功させるためにはタングステンの挙動を把握することが死活的に重要となる.
声帯麻痺に対する音声治療に関する臨床的基礎的研究

音声治療の適応基準を作成するための第一段階として、本研究では、反回神経麻痺患者15名に喉頭内視鏡下に、音声治療の一つであるpushing method(以下、PM)を行い、その効果及び喉頭にみられる変化を検討した。内訳はPM有効例6例(男1、女5)、無効例9例(男8、女1)である。検討項目は以下の6項目:(1)仮声帯の内転の有無、(2)前交連・被裂部距離の短縮の有無、(3)声帯の延長・短縮の有無、(4)両声帯突起間距離の短縮の有無、(5)喉頭蓋の倒れこみの有無、(6)被裂間部の位置。PMにより音声が悪化する時は、健側声帯の内転、健側前交連被裂間距離の短縮、喉頭蓋の倒れこみ等、過剰な喉頭閉鎖がPMにより生じていた。一方、音声が良くなる時は声帯の延長、軸のずれ等がみられた。以上より、PM前後の喉頭内視鏡所見の変化は、以下の5型に分類できることがわかった。1型:喉頭前後径の延長(声帯の伸展)が見られるもの、2型:喉頭前後径の短縮(声帯幅の広がり)が見られるもの、3型:健側声帯の代償が見られるもの、4型:声帯は変化なく声帯以外の喉頭形態の変化が見られるもの、5型:声帯を含め、喉頭の形態変化が見られないもの。1-3型では声帯間隙の狭小化がみられ、音声の改善がある。4、5型では音声の改善がない。各型に於いてPMに関与する喉頭筋が異なることが予想された。次に反回神経麻痺患者13名に声帯筋(甲状被裂筋)の筋電図を、安静時と発声時、PMの有無で施行、比較検討した。内訳は、PM有効例4例(男性2名、女性2名)、PMの無効例9例(男性9名)である。有効例では全例に健側及び患側声帯でPMにより安静時、発声時に発火の増加をみた。この発火の増加は主に振幅の変化であった。無効例ではほぼ全例に於いて安静時、発声時におけるPMの筋電図におよぼす変化はないか、あってもごく僅かであった。音声治療の適応基準を作成することを目的として、本研究では、音声治療の前後で喉頭筋電図検査、喉頭ストロボスコープ検査、音声機能検査、音響分析を施行し、喉頭および呼吸のどのような機能が関与して音声機能が改善するかを検討した。そのために、反回神経麻痺患者20例に対し、音声治療前に喉頭筋電図検査、喉頭ファイバーストロボ検査、音声検査、呼吸機能検査を行なった。音声治療前の喉頭筋電図検査では、筋放電dischargeの有無、frequency、amplitudeを検索した。この際、声門閉鎖訓練の代表的な音声治療であるPushingMethodを行わせて、喉頭筋電図でdischargeが増加するか否かを調べた。喉頭ファイバーストロボ検査では声帯運動の有無、声帯間隙の幅と形を検索した。

その結果、Pushing Methodを行わせた時に喉頭筋電図でdischargeが増加する症例は3例のみであった。また、実際にストロボスコープで観察しても、明らかに声門間隙が小さくなる症例は見あたらなかった。従来言われているほど、pushing methodは有効ではないと考えられる。さらに、平均3カ月間、アクセント法による音声治療を行った後に、同様の検査を行ったが、音響分析で改善の認められた症例はなかったし、喉頭ファイバーストロボ検査でも改善の認められた症例はなかった。すなわち、一側声帯麻痺に対しての音声治療は無意味かもしれない、という結果を得つつある。今後さらに症例を増やし、さらにまた、予定どおりに声門下圧の変化を3年目に行う予定である。なお、この23年、反回神経麻痺の患者が何故か激減し、症例が増えないのが最大の悩みとなっている。音声治療の適応基準を作成することを目的として、本研究では、音声治療の前後で喉頭筋電図検査、喉頭ストロボスコープ検査、音声機能検査、音響分析を施工し、喉頭および呼吸のどのような機能が関与して音声機能が改善するかを検討した。そのために、反回神経麻痺患者20例に対し、音声治療前に喉頭筋電図検査、喉頭ファイバーストロボ検査、音声検査、呼吸機能検査を行なった。音声治療前の喉頭筋電図検査では、筋放電dischrgeの有無、frequency、amplitudeを検索した。この際、声門閉鎖訓練の代表的な音声治療であるPushingMethodを行わせて、喉頭筋電図でdischargeが増加するか否かを調べた。喉頭ファイバーストロボ検査では声帯運動の有無、声帯間隙の幅と形を検索した。さらに、平均3ヵ月間、アクセント法による音声治療を行った後に、同様の検査を行ったが、音響分析で改善の認められた症例はなかったし、喉頭ファイバーストロボ検査でも改善の認められた症例はなかった。なお、ここ23年、反回神経麻痺の患者が何故か激減し、症例が増えないのが最大の悩みとなっている。音声治療の適応基準を作成するための第一段階としてい本研究では、反回神経麻痺患者15名に喉頭内視鏡下に、音声治療のーつであるpushing method(以下、PM)を行い、その効果及び喉頭にみられる変化を検討した。内訳はPM有効例6例(男1、女5)、無効例9例(男8、女1)である。検討項目は以下の6項目:(1)仮声帯の内転の有無、(2)前交連・被裂部距離の短縮の有無、(3)声帯の延長・短縮の有無、(4)両声帯突起間距離の短縮の有無、(5)喉頭蓋の倒れこみの有無、(6)被裂間部の位置。PMにより音声が悪化する時は、健側声帯の内転、健側前交連被裂間距離の短縮、喉頭蓋の倒れこみ等、過剰な喉頭閉鎖がPMにより生じていた。一方、音声が良くなる時は声帯の延長、軸のずれ等がみられた。以上より、PM前後の喉頭内視鏡所見の変化は、以下の5型に分類できることがわかった。1型:喉頭前後径の延長(声帯の伸展)が見られるもの、2型:喉頭前後径の短縮(声帯幅の広がり)が見られるもの、3型:健側声帯の代償が見られるもの、4型:声帯は変化なく声帯以外の喉頭形態の変化が見られるもの、5型:声帯を含め、喉頭の形態変化が見られないもの。1-3型では声帯間隙の狭小化がみられ、音声の改善がある。4、5型では音声の改善がない。各型に於いてPMに関与する喉頭筋が異なることが予想された。次に反回神経麻痺患者13名に声帯筋(甲状被裂筋)の筋電図を、安静時と発声時、PMの有無で施行、比較検討した。
地域型木造住宅の維持管理におけるヘリテージ・マネージメント的手法の可能性

本研究は、より安全で快適に、地域的特色を有しながら木造住宅の長期耐用化を実現するため、居住者や地域住民が、既存木造住宅ストックの歴史や文化、意匠、木造の技や知恵を再発見、再認識するための手段を探るものである。特に現在幾つかの都市で地域の文化財資源を発見し、それらを保存・保全・管理する取り組み「ヘリテージ・マネージメント」という考え方に着目し、そこでの手法を積極的に既存の地域型木造建物の維持管理・継承に役立てるための手法の開発を目指している。今年度は昨年度行った調査をベースに広島県黒瀬町における建物属性および居住者属性、建物維持管理行為、伝統や継承、周辺環境に対する意識といった「歴史文化遺産」的価値に対する考え方を把握するためのアンケート調査、また直接訪問や周辺視察から、伝統や継承、生産システムなどに関する情報収集を行うとともに、こうした木造住宅におけるヘリテージ・マネージメント的手法の可能性について考察した。アンケート調査は2006年11月12月にかけて直接配布・回収(一部郵送回収)した(1,102票配布、565票回収、回収率51.3%)。その結果、居住者の高齢化が進んでいる事、先代から継承したケースが多いこと、3/4程度で何らかの増改築が行われているが伝統に対してさほど意識は高くないこと等が明らかになった。また伝統様式に対する社会的ステータスを意識する居住者が多い様子もうかがえた。居住者とのディスカッションプログラム開発、実務経験者への調査については、地元との調整が付かず実施できなかったが、今回の調査研究から、居住者の歴史文化遺産として意識を向上させることは、継承する上での問題点を考えさせ、また建物の維持管理行為を活性化させる可能性があることがわかった。伝統的木造住宅での伝統文化意識向上プログラム開発、実務者・専門家による支援体制のあり方が今後の課題として挙げられる。特に現在幾つかの都市で地域の文化財資源を発見し、それらを保存・保全・管理する取り組み「ヘリテージ・マネージメント」、「ヘリテージ・マネージャー」という考え方に着目し、そこでの手法を積極的に既存の地域型木造建物の維持管理・継承に役立てるための手法の開発を目指している。今年度は、木造住宅、民家・町家の再生計画・設計、文化財保護などに関する既存研究および文献、また統計資料をレビューするとともに、広島県賀茂台地を中心に民家、町家、在来木造住宅の抽出するため、東広島市黒瀬町を調査対象地域として、この地域独特の民家である居蔵造り住宅に着目し、既往研究を参考に屋根形状や2階の階高・用途などから建物形態について3つの形式に分類した上で、2005年1112月にかけて外観目視による建物マッピング調査を行い、1192件の居蔵造り住宅を確認・抽出した。さらに、これらの調査対象住宅から無作為に抽出した40件について空中写真分析による過去40年間の建物変容を明らかにするとともに、うち17件の居住者に対して、住宅様式・形式に係る言葉の認知と認識、住宅の安全性・快適性・伝統に対する意識などについて把握するための直接訪問によるヒアリング調査を行った。
「連帯」を嚮導概念とする社会的関係資本の蓄積に関する理論的及び実証的研究

本研究は大きく二つの研究目的を措定した。一つは、福祉国家の衰退と新自由主義的グローバル化の進行に対抗する“もう一つの世界"の追求であり、もう一つは大規模自然災害と財政恐慌という二重の国家的リスクに堪えうる持続可能な社会の構築である。現代は、一方でグローバリゼーションや新自由主義的経済の拡大で著しく富が偏在し,経済的格差が拡大するなど、国際社会の平和で持続的な発展が阻害されている。その一方では、シェアリング・エコノミーに代表される相互扶助型経済実践も世界で進んでいる。本研究は、こうした連帯経済の現状を理論的研究、現地調査、および社会実験を通じて明らかにし、今後の展望を得ようとしたものである。理論・歴史的研究として、J・L『社会的経済近未来の社会経済システム』等の基本文献の再読と精査や生活協同組合の発展に多大な影響を与えたR.オウエンの著作等によって社会的・連帯経済のグローバルな現状および理論状況についての俯瞰図の構築に努めた。文献研究として、Ngai Pun et al. (eds.), Social Economy in China and the World (London: Routledge, 2016)およびテツオ・ナジタ〔五十嵐暁郎監訳〕『相互浮上の経済ー無尽講・報徳の民衆思想』(みすず書房、2015年)から、とくに多くの示唆を得た。実態調査として、世界的な連帯経済の動向に詳しく通訳を依頼する広田裕之氏(スペイン・バレンシア大学院)と綿密な打合せを行った上で、2015年9月にポルトガルおよびスペインにおいて現地調査を実施し、ヒアリングや資料収集を通じて研究データの蓄積に努めた。とくにポルトガルのポルト工科大学およびコインブラ大学経済学部と、同国の連帯経済の現状について意見交換を行った。またスペインのマドリード、コルドバ、およびバルセロナにおいて連帯経済や社会的協同組合運動を実践している団体や組織への訪問調査を行った。そして、社会実験としては、大学院での「連帯経済研究」の講義を通じて、連帯経済型人材育成のプログラムの実質化を図った他、東北大震災の被災地において連帯経済型の復興支援プログラムを実施するNPOユナイテッドアースとの連携を実現し、連帯経済型事業に関する実践的研究のプラットフォームを構築した。まず、文献研究として、とくに精読し多くの示唆を得たのが、Ngai Pun et al. (eds.), Social Economy in China and the World, 2016である。急速な経済成長を遂げた中国は新自由主義の申し子でもあるが、その巨大で急速な経済成長の負の側面として、格差の拡大、公的福祉の後退、共同体の崩壊等の現象が見られる。著者たちは、中国の経済社会における「もう一つの経済」のモデルを連帯経済に求め、諸外国・地域との比較において、中国的連帯経済の方向性を見極めようとしており、の著作から本研究の新たなフィールドとしての中国の存在が浮上したことは極めて有益であった。また、米国人歴史学者・テツオ・ナジタ『相互浮上の経済ー無尽講・報徳の民衆思想』からは、「経済と道徳」の視点から近世日本における連帯経済思想と実践の発展について多大な示差を得た。フィールドワークとして、イベリア半島諸国における連帯経済ないし社会的経済の先進事例調査を2015年9月に実施した。ポルトガル・リスボン市の社会的協同組合タニア・ガスパール、ポルトガルの協同組合運動の父とも呼ばれるアントニオ・セルジオが活動拠点とした記念館長で、ポルトガルはもとより欧州の社会的経済の指導者の一人、ジョアン・サラザール・レイト氏に対してポルトガルにおける社会的経済の現状と課題について、それぞれヒアリングを行った。また、ポルト工科大学ソーシャル・ビジネス研究センター訪問を経て、生産型協同組合をポルト各地に設立し雇用創出および人材を育成事業を推進している社会的経済専門学校の理事長、フェルナンド・マルチノ氏に対してヒアリングを実施した。さらに、アンダルシア労働者協同組合の連合本部を訪れ、アンダルシア州政府が2011年12月に制定したアンダルシア協同組合法の意義や実際的効果について詳しくヒアリングを行った。文献研究としては、池本幸生他(編著)『連帯経済とソーシャル・ビジネスー貧困削減、富の再分配のためのケイパビリティ・アプローチ』(明石書店、2015)や本研究の協力者である廣田裕之氏の新著『社会的連帯経済入門ーみんなが幸せに生活できる経済システムとは』(集広舎、2016)等の著作を読み込んだ他、連帯経済の哲学的基礎理論としてアマルティア・センやマーサ・ヌスバウムの「ケイパビリティ・アプローチ」に注目し、文献収集を進めるとともに、連帯経済の実践におけるその理論的意義について考察を進めた。平成28年9月には韓国世宗市で開催された世宗特別自治市・韓国行政自治部共催の「韓日中コミュニティ・ビジネス・カンファレンス」において「コミュニティ・ビジネスの理論と実践」と題して基調講演し、その後のシンポジウムのコーディネーターを務めるなど、連帯経済の理解と促進に関する国際交流を行った。現地調査としては、平成29年9月に、連帯経済による地域力再生を進めるスウェーデン・イエムトランド県にあるトロングスヴィーケン・コミュニティ、イエムトランド県の中心都市エルテルスンドの市街地にある中央大学に拠点を置く起業支援団体、クムパニオン・イエムトラン、ストックホルム郊外にあるBASTA!という、薬物中毒者や薬物関係の犯罪で受刑したことがある人々のリハビリテーションをソーシャル・ビジネスとして行っている労働統合型社会的企業を訪問調査した。また、スットックホルムにおいて、欧州における社会的協同組合等の研究で世界的に著名なヨハナン・ストルイヤン(Yohanan Stryjan)教授にヒアリングを行った。

その後、スペインに移動し、ジローナ大学のジョセフ・ルイス教授を訪問し、連帯経済を促進する新たな地域通貨システムについてヒアリング調査を行うなど、その他関連団体を訪問調査した。昨年度の「今後の研究の推進方策」の内、理論・歴史研究については、空想社会主義者の議論を「連帯」の観点から再検証する作業は、ローバーと・オーウェンについては行えたものの、サン=シモンやプルードンについては着手することができなかった。また、因果応報論を基調とする仏教思想に「連帯」の理念とその実践を、カトリシズムの教義に内在するヒューマニズムとの対比において、探求する作業も十分には進捗していない。建国大学校の金才賢教授ら韓国の連帯経済の研究者へのインタビューは2016年度は実現できなかったが、「韓日中コミュニティ・ビジネス・カンファレンス」において韓国や中国の実践家と交流できたことは特筆すべき成果である。また、連帯経済を基盤とした地域づくりを約20年かけて実践してきた韓国ソウル市麻浦区にあるソンミサン・マウルを二度にわたって訪問調査し、ヒアリングや資料収集を行ったことは研究上、大きな意義があった。スウェーデンでの現地調査では、連帯経済的な地域づくりで世界的な注目を集めるトロングスヴィーケン・コミュニティを訪れ、そのリーダーとして活動を牽引してきたニルス・ニルッソン氏に長時間に及ぶヒアリングを行え、資料の提供を受けたことで、同国における社会的協同組合の伝統を背景にした連帯経済の進展を研究する上で多大な成果を得たと言える。社会実験では、2016年に熊本地震で大きな被害を受けた熊本県阿蘇地方を同志社大学政策学部学生有志とともに訪ねて、特定非営利活動法人ユナイテッドアースの被災地支援活動に参加し、瓦礫の撤去や被災家屋の清掃等の作業に従事し、連帯経済的視点からの復興支援活動の意義について実地に検証できた本年度は「『連帯を嚮導概念とする社会的関係資本の蓄積に関する理論的及び実証的研究」(平成27年度挑戦的萌芽)に関連する研究調査のために現地調査とアクションリサーチを重点的に実施した。まず、平成29年7月に福岡県朝倉市一帯で甚大な被害を発生させた北部九州豪雨被災地で調査と自らボランティア活動を行い、被災地での「連帯」の具体的内容を体験的に参与観察した。8月初旬に、朝倉市杷木町において、災害発生後いち早く現地本部を立ち上げ、主として農業復興支援を行っている特定非営利活動法人ユナイテッドアースを訪問し、現地責任者から支援活動の内容と進捗状況や効果についてヒアリングおよび現調査を行った。その後、朝倉市杷木町寒水地区の民家の泥出し作業に自ら従事し、ボランティアが築く連帯型信頼ネットワークの実動状況を参与観察するとともに、被災者にヒアリングを行い、ボランティアによる無償の労力提供とそれによる被災者の復興促進というシェアリング・エコノミー関係が成立していることを確認した。10月には、福岡県糸島市において、九州大学の大学院生が、糸島市や九州大学と協働して推進している「糸島空き家プロジェクト」を中心に視察しヒアリング調査を行った。同プロジェクト・スタッフの案内で5件の空き家活用事例を視察した。
確率測度の構造の解析的・代数的研究

本課題の目的に沿って5名の研究代表者・分担者は平成6年度に以下の研究を進め、一部は学術論文等で公表した。(1)多次元Brown運動とフラクタルについて(志村)次の二つの問題に取組み中間結果を得た。(1)ベルヌイ・ランダム吸収点が配置されているd次元正方格子上を運動する単純ランダムウォークについて、吸収点に吸収されるまでの間の出発点からの最大変位の分布の∞でのexponential decayを得た。(2)R^2の上半平面{x_2>0}上の反射壁拡散過程でそのgeneratorがφ(x_2)∂^2/∂x-_1^2+∂^2/∂x^2^2で与えられ境界{x_2=0}で退化するものについて、その境界からの回遊過程のt〓0での漸近的性質を調べた。(2)(梅津)複素多様体上のBrown運動の局所特性の研究の関係で複素射影空間内の解析曲面の構造特性を調べた。(3)(塚田、近藤)(1)実際の情報処理システムが扱う様々なデータの構造の分析と、その処理アルゴリズムの開発の現状について総括しその問題の数学的側面を考察した。(2)あいまいさを含む論理を扱うファジイ論理について、その代数的構造を調べ、また数学基礎論の立場からそのモデル論を論じた。(4)(小林)(1)語の書き換えシステムをモデルとする代数系の構成と特徴付けを行ない、そのアルゴリズム上の評価へ応用した。(2)既存の素数判定法について調べ、より効率的と思われる判定法を考案した。
プレセニリン1蛋白質と神経細胞死を結びつける情報伝達経路の同定

本研究では、家族性アルツハイマー病(FAD)の原因遺伝子産物として発見されたプレセニン1(PS1)を研究対象の中心において、ADにおける選択的神経細胞死のメカニズムを解明することを目的とした。さらに最近、第17染色体遺伝子に連鎖したパーキンソニズムを伴う家族性前頭側頭葉型痴呆(FTDP-17)の原因遺伝子としてタウの変異が同定されたことから、この2つの痴呆疾患で共通に起こる神経細胞死の経路を同定しようと試みた。平成10年度は、生体脳内においてPS1変異とAβ42分子種産生増加との関連性を明らかにした。また、ヒト以外にウシ、マウスのプレセニリン遺伝子をクローニングし、プレセニリンホモログの系統発生学的解析を行いFADにみられるミスセンス変異のアミノ酸部位が保存されていること、生体内で断片化して存在するプレセニリン蛋白質の切断部位近傍のアミノ酸配列は種を越えて保存されていることなどが明らかにされ、プレセニリン研究における発生生物学的研究の重要性があらためて浮き彫りにされた。平成11年度は、FTDP-17において同定されたアミノ酸置換型変異タウを用いて細胞生物学的検討を行った。その結果、2種類の変異型タウ(Val337Met,Arg406Trp)が、微小管ネットワーク構築を阻害すること、その効果は、3つの微小管結合部位をもつ短いタイプのアイソフォームでのみ見られることなどが明らかにされ、タウのアミノ酸置換が直接微小管ネットワーク構築を阻害することによって神経細胞死が起こる可能性を示した。本研究課題の成果は、変異型プレセニリンと変異型タウのそれぞれの機能の一端を明らかにしたことであり、タウの脳内蓄積という点でFTDP-17と共通項を持つADにおいてもプレセニリンとタウを介した神経細胞死の経路が存在していることが予測される。本研究の目的は、家族性アルツハイマー病(FAD)の原因遺伝子であるプレセニリン1(PS1)の遺伝子変異がどのようなメカニズムで選択的神経細胞死を引き起こすかを解明することである。本年度は、in vitroの系で証明されてきたPS1変異とβアミロイド(Aβ)42分子種産生増加の現象が生体内でも起こっていることをPS1に変異を持つ脳組織中のアミロイド分子種を定量し、統計的な解析を行うことによって直接的に証明した。しかしながら、現時点ではAβ42分子種が選択的神経細胞死を誘発するのか、PS1変異が選択的神経細胞死を誘導した結果Aβ42分子種産生増加がおこっているのか明らかになっていない。そこで現在、本研究の実験計画に沿って、脳組織あるいは変異型PS1を誘導する培養細胞系を用いて、Aβ42分子種分泌との直接的な関係を蛋白質レベルで解析すると共に、変異型PS1に起因するアポトーシス関連蛋白質の発現制御機構を、本大学共同研究設備を用いて定量RT-PCR法に基づいて解析を行っている。また、変異型PS1遺伝子導入細胞株をいくつか作成済みであり、本研究室の備品であるレーザー顕微鏡を用いた形態観察も行っている。本研究課題を進めていく上で、PS1遺伝子の基礎的な解析は非常に有用な情報を与えてくれる。研究代表者自身、本年度ウシプレセニリン遺伝子のクローニングについて学会発表(日本神経化学会、米国神経科学会)を行った。プレセニリンのアミノ酸配列の系統発生学的な解析を行い、予測されうる機能領域について興味深い知見が得られた。これらの研究成果は、本研究課題の方向性を見極める上で非常に参考になった。今後はPS1蛋白質の神経細胞死への作用点に焦点をあてて研究を進めていく予定である。
放射線治療効果を時間差判定するための光・核医学・MRI・CT融合画像ソフトの開発

本研究の目的は悪性腫瘍の治療を行った後に、各画像の特性を融合させて正確な治療効果を判定するプログラムソフトを開発することにある。治療の間に腫瘍は分子生物学的、機能生理学的、形態学的に変化していく、腫瘍細胞の分子生物学的変化を光画像と核医学画像と、CTやMRI画像を重ねて同時解析する。これらの3つの画像を同時登録されるというプログラムソフトを開発して、時間差画像診断を可能とすることを最終目標としている。乳癌腫瘍細胞(HER2+とHER2-)を播種したウェルプレートをひとつの人工模型として、この系を時間差の画像を得るファントムとして検討し、以下の研究成果を得た。1.(1)抗がん剤(タキソール)処理;(2)抗がん剤(ハーセプチン)処理;(3)RI標識ナノ粒子処理;(4)アンチセンス処理;(5)SiRNA処理を行い、細胞のviabilityを光学的手法を用いて、検討した。2.各細胞の反応性はHER2+とHER2-との間で有意な差が認められた。3.各細胞の処理濃度依存性はHER2+とHER2-との間で有意な差が認められた。4.各細胞の反応性は(1)(5)との間に時間的乖離があり、さらに、この時間的乖離と細胞のviabilityをin vivoにて評価するとされているTc-99m標識放射性医薬品の取り込みとの間にも乖離が認められた。以上の成果から、分子生物光学画像と核医学画像との時間差診断を示すソフトを開発中である。治療の間に腫瘍は分子生物学的、機能生理学的、形態学的に変化していく。腫瘍細胞の分子生物学的変化を光画像と、核医学画像と、CTやMRI画像を重ねて同時解析する。腫瘍細胞を播種したウェルプレートをひとつの人工模型として、この系を時間差の画像を得るファントムとして検討し、本年度は以下の研究成果を得た。1.プレートに播種した腫瘍細胞(P-gp=多剤耐性関連たんぱく質を過剰発現)に多剤耐性克服剤を暴露した後;(1)抗がん剤アッセイを行った;(2)P-gpの機能を見る蛍光物質(Rhodamine)の取り込みを検討した;(3)P-gpの機能を見る放射性物質(Tc-99m-MIBI)の取り込みを検討した;(4)P-gpをコードする遺伝子mdrに対するアンチセンスシークエンスオリゴヌクレオチドをTc-99mにて標識した物質の取り込みを検討した。(1)と(2)、(1)と(4)との間に相関が認められたが、(1)と(3)との間には乖離が認められた。2.プレートに播種した乳がん細胞(HER2を過剰発現)に抗がん剤(タキソールと抗HER2抗体)を暴露した後;(1)細胞のviabilityを検討した;(2)細胞の膜透過性を検討した;(3)細胞のアポトーシスを検討した抗がん剤がタキソールである場合は、(1)と(2)と(3)について全ての乳がん細胞により相関が認められたが、抗HER2抗体(=ハーセプチン)の場合は、(1)と(3)との間に乖離が認められた。細胞の状態により結果が大きく左右されることが判明したため、当初の計画を一部変更することを余儀なくされた。
体外栄養源による配偶子幹細胞の発生進行制御機構の解明

本研究では、線虫(C.elegans)の生殖腺前駆体において、配偶子幹細胞とニッチ細胞の体外栄養源に応答する機構を分子レベルで解明することを目標とし、これまでにpten-ampk-TORC1経路が細胞自律的、すなわち生殖幹細胞内で機能すること、また、体外栄養源として必須アミノ酸とエタノールあるいはエタノールの代わりに脂肪酸混合物を添加することにより生殖幹細胞の休眠を解除する知見を得ていた。ptenはインスリンやPDGFなどの成長因子のシグナルを負に制御していることや、成長因子の中でも哺乳動物のIGF-1はアミノ酸によって転写が促進される知見があることから、線虫では、エタノールや必須アミノ酸などの栄養源に応答してインスリン/IGF-1様リガンドの転写活性が亢進し、下流のインスリン/IGF-1-TORC1経路を活性化して配偶子幹細胞が休眠解除されるという仮説を立てた。そこでqRT-PCR法により飢餓条件下とエタノール、必須アミノ酸、その両方の栄養源を与えた条件における40存在するインスリン/IGF-1様リガンドの転写産物量を比較したところ、複数のリガンドが栄養に応答して増えていることが認められた。これらの栄養に応答するインスリン/IGF-1様リガンドのいずれかが配偶子幹細胞の休眠解除を促進すると考えられるが、それらの単独変異体は不妊の表現系を示さないことからリダンダントに機能していると考えられる。今後、多重変異体や過剰発現の表現系を精査することにより、配偶子幹細胞の休眠解除に関わるインスリン/IGF-1様リガンドを同定できることが期待できる。線虫(C.elegans)の生殖腺前駆体において、配偶子幹細胞とニッチ細胞の体外栄養源に応答する機構を分子レベルで解明することを目標とし、以下の成果を得た。1)insulin/IGF signaling (IIS)経路を負に制御するptenやampk変異体では飢餓条件下にも関わらず配偶子幹細胞を作り出す生殖幹細胞が異常増殖する。それらの変異体における異常増殖にTORC1経路の因子群であるTOR,RAPTOR,Rheb,RagA,RagCの活性が必須であることを見出した。このことからptenやampk遺伝子の共通の下流因子として、TORC1が機能していることが示唆された。さらに、pten-ampk-TORC1経路が細胞自律的、すなわち生殖幹細胞内で機能することを示唆する知見を得た。2)体外栄養源として必須アミノ酸とエタノールあるいはエタノールの代わりに脂肪酸混合物を添加することにより生殖幹細胞の休眠を解除する知見を見出した。TORC1は、インスリン/IGFなどの成長因子とアミノ酸によって活性化することが他の動物の実験系で知られており、1)で示唆されたTORC1の関与を裏付ける。3)上述したPTENやAMPK、及びTORC1の周辺で機能する新規因子を探索するべく遺伝学的スクリーニングを行った。RNAiスクリーニングではポリ(U)ポリメラーゼをコードするpup-2が単離された。また、EMSを用いたスクリーニングより、変異体(アリル)td89を得た。最近の知見では、pup-2は特定のマイクロRNAを負に制御する機能を有することが分かってきていることから、生殖幹細胞の休眠を促進するマイクロRNAが存在する可能性が示唆された。
可動型不斉発現素子の開発-鉄カルボニル錯体を用いた生理活性物質の不斉合成研究

(A)光学活性なジエン鉄カルボニル錯体の合成ソルビン酸と光学活性なアルコールを縮合して得られるキラルなジエノエステル体に対するジアステレオ選択的な鉄カルボニル化反応を検討した結果、不斉源としてexo,exo-2-(arylsulfonamido)-3-bomeol誘導体を用いた場合に優れた立体選択性が得られ、特にN-アリール基として2-ナフチルスルホニル基が最も良いことが分かった。(B)ジエン鉄カルボニル錯体を不斉源とした環化付加反応光学活性なピペリジン環の簡便な合成法の確立を目指し、イミン錯体(3)とDanishefskyジエンとの[4+2]環化付加反応の利用を検討した結果、塩化メチレン中過塩素酸リチウムが効果的であること、また反応性と立体選択性に重大な影響を及ぼす窒素上の置換基として、パラメトキシベンゼン(Ar=PMP)が必須であることが判明した。このようにジアステレオ選択的に得たデヒドロピペリジノン誘導体(4)は1,4還元、脱錯体化、ケトンのヒドリド還元を経由して、消化管運動抑制作用を有するピペリジンアルカロイド[(-)-SS20846A]へ導いた。(C)ジエン鉄カルボニル錯体の可動型不斉発現素子としての利用ジエナ-ル錯体(1)より合成したシアノヒドリン誘導体(5:LG=Ac,3,5-DNG,2,4,6-TCB,PO(OEt)_2)を酸共存下メタノールと反応させると、アセテート体(5a)は1位の立体異性体で反応性が異なるものの、ベンゾエ-ト誘導体(5b,c)やリン酸エステル体(5d)においては、いずれのジアステレオ体からも同一の1,5置換体(6a)を与えした。一方、求核種(RS,N_3)を、過塩素酸リチウム共存下エーテル中室温で反応させるか、THF中:触媒量のBF_3・Et_2Oとアルコールを氷冷下反応させると、それぞれ(E,Z)-7a-dが選択的に得られた。
ニジマス精巣で発現しているSRY様mRNA群のcDNAクローニングと解析

我々は、魚類の性決定・分化の機構を解明することを目的として、ニジマスを用いてSRY様遺伝子の単離を開始した。本実験ではその第一歩として、未成熟ニジマス精巣で発現しているSRY様mRNA群のcDNAクローニングと解析を行ったのでその結果について報告する。1.魚類の生殖器官で発現しているSRY様mRNA群を単離するため、未成熟ニジマスの精巣及び卵巣のcDNAを用いて、哺乳類のSRY遺伝子のDNA結合領域(HMG box)のアミノ酸配列に基づいてPCRを行ったところ、精巣のみ期待される約200塩基対のDNA断片が増幅された。更に、このDNA断片サブクローニングし、得られた22クローンについて塩基配列を決定した結果、7種のSRY様HMGbox配列が明らかになった。(RTSOX-Te3、-Te16、-Te29、-Te32、-Te38、-Te43、-Te49)。7種のクローンのうちRTSOX-Te43のHMG boxのアミノ酸配列は、当研究室で既に未成熟ニジマス精巣より単離され、全構造が決定されているSRY様mRNAのcDNAクローンRTSOX-LZのHMG boxのアミノ酸配列と同一であった。2.各クローンのHMG boxのアミノ酸配列を比較し、比較的相同性の低いRTSOX-Te3、-Te29及び-Te38についてmRNAの組織特異性を調べた結果、興味深いことにRTSOX-Te3は精巣で、-Te29及び-Te38は卵巣で強く発現していることが明らかになった。(1).RTSOX-Te3について、未成熟ニジマス精巣のcDNAライブラリーをスクリーニングし、RTSOX-Te3を持つcDNAクローンを単離、全構造を決定することが出来た。RTSOX-Te3は、488アミノ酸からなり、マウスSryのHMG boxのアミノ酸配列と58%の相同性があるHMG boxが存在していた。更に、このHMG boxのアミノ酸配列はマウスSox8、9、10のそれと約90%以上の非常に高い相同性を有していた。RTSOX-OvA、-OvB、-OvCcDNAクローンは各々289、367、633アミノ酸からなり、マウスSryのHMG boxのアミノ酸配列と68%、59%、52%の相同性があるHMG boxが存在していた。更に、RTSOX-OvBに関しては、リンパ系細胞の転写活性化因子として単離・同定されたマウスSox4と、HMG box(91%のホモロジー)に加え、C末端部分(Sox4の転写活性化領域)でも高いホモロジー(46%)を有していた。また、RTSOX-OvCに関しては、転写調節因子に特有のロイシン・ジッパー・モチーフやグルタミンに富む配列が存在し、ニジマス精巣で特異的に発現しているRTSOX-LZと構造的に非常に類似していた。

更に、RTSOX-OvBに関しては、リンパ系細胞の転写活性化因子として単離・同定されたマウスSox4と、HMG box(91%のホモロジー)に加え、C末端部分(Sox4の転写活性化領域)でも高いホモロジー(46%)を有していた。また、RTSOX-OvCに関しては、転写調節因子に特有のロイシン・ジッパー・モチーフやグルタミンに富む配列が存在し、ニジマス精巣で特異的に発現しているRTSOX-LZと構造的に非常に類似していた。
カドヘリンスーパーファミリーの細胞間相互作用における役割

細胞接着分子カドヘリンは、細胞外領域に4回の特徴的な繰り返し構造(カドヘリンモチーフ)を持つ膜タンパク質で、遺伝子ファミリーを形成しており、癌細胞の接着と脱離に重要な役割を果たしていることがわかりつつある。最近カドヘリンモチーフを持つが全体の構造が異なる分子が見つかってきており、その機能に関心がもたれている。そこで、この新しいカドヘリンスーパーファミリーに属する遺伝子をクローニングするために、既知のカドヘリン間の細胞外領域でよく保存されているアミノ酸配列LDREとDXNDNのプライマーを合成し、マウス14日目胚のRNAを鋳型としてPCRを行なったところ、約130塩基のバンドを得た。このバンドの塩基配列を決定したところ、既知のカドヘリンと部分的な相同性はあるが、明らかに異なった構造を有する約30種類の分子が検出された。これらのPCR断片をプローブとしてマウスの脳のcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、2.8kbのインサートを持つクローンλMPC28を得た。塩基配列の決定により、このなかに6回のカドヘリンモチーフが存在し、細胞質領域はカドヘリンファミリーとは全く相同性を示さない分子であることが明らかになった。MPC28の発生過程における発現パターンをノザンブロットで解析した結果、MPC28は、マウス11日目胚の脳で発現が始まり、新生児までは増加し、その後次第に減少することがわかった。さらにMPC28の発現の局在を調べるためにin situ hybridizationを行なったところ、MPC28は、11日目胚の脳の頭頂部に近い部分の脳に隣接する間充織の一部に限局していることが明らかになった。また、身体の他の部分では全く発現が認められなかった。今後さらに詳しいMPC28の局在を調べるとともに、発生過程における機能を明らかにしていく予定である。
腸管寄生線虫の定着と排除を規定する寄生虫側に発現するリガンドの同定

腸管寄生線虫Nippostrongylus brasiliensis(Nb)の定着環境である粘液の主成分、ムチンのシアル化(シアロムチン)がNbの排除に関与すること、一方で定着時には極微量のシアル化が存在することからシアロムチンを軸にNbの定着・排除を規定する寄生虫側のリガンドの同定を試みた。シアロムチンへのNbの指向性は認めなかった。またシアロムチンに対するNb側のリガンドも未同定と課題を残した。ムチンの糖鎖解析結果は、先行結果を概ね支持するものであった。腸管寄生線虫の定着と排除に関わる分子の同定のために、ネズミの寄生虫であるNippostr Ongylus brasiliensis(Nb)のマウス感染系を用いた。研究代表者らはこれまで、Nbのマウスからの排除に腸管粘液の主成分であるムチンの糖鎖末端にシアル酸が付加することが重要であることを示してきた。本研究では、ムチンのシアル化がNbの定着と排除にどのように関わっているのかを、寄生虫(Nb)側のシアル酸結合部位(分子)を同定することで明らかにすることを目的としている。1.シアル酸結合部位の探索;シアル酸結合部位を調べるために、BSA(ウシ血清アルブミン)標識したシアル酸をNbと反応させ、蛍光標識した抗BSA抗体を作用させる系を確立しつつある。同様に、Nbの抽出物を電気泳動して分子量別に展開し、膜に転写させた後に各分子量に対するシアル酸結合性を検討中である。2.シアル酸に対するセンサー探索;Nbにシアル酸を認識するセンサーが存在する可能性を考え、シアル化ムチンを含む粘液に対するNbの化学走性を調べた。これまでのところ、シアル化ムチンに対する走化性は特に認められず、粘液に対する負の走化性を認めた(第68回日本寄生虫学会東日本支部大会浜松市、第125回成医会東京都、第2回蠕虫研究会宮崎市)。3.Nb結合性宿主分子の探索;排除されるNbとされないNbとの比較で、排除されるNbのみに結合しているマウスの粘液中のタンパク質の検出を検討中である。免疫応答によって腸管腔に分泌される物質がN.brasiliensisに結合して、あるいは取り込まれることで虫体の排除が誘導されている可能性が高いことから、排除される虫体表面に結合しているマウス由来物質の検出を二次元電気泳動で解析した。その結果、排除される虫体のみに明確に認められ、排除されない虫体には認めないスポットは検出し得なかった。排除誘導物質は虫体に生理的に作用していると考えられ、取り込まれている場合についてさらに解析を続けている。N.brasiliensisを排除している時期(感染後9日)と未感染時期の粘液について、レクチンアレイによる糖鎖解析を実施した。その結果、これまでレクチンの組織染色で得られた結果とほぼ同様の結果を得た。すなわち、排除期の粘液糖鎖は未感染時のそれに比してフコースおよびシアル酸に富んでいた。さらに、O-結合型糖鎖に関してはN-アセチルガラクトサミンの結合様式に増減が認められた。組織染色ではシアル酸の結合様式がα2,3型であることと排除に相関を認めたものの、今回の結果はα2,3型では変化を認めず、α2,6型での増加であった。ただこのα2,6型の増加はO-結合型糖鎖に限局したものではないため、さらな検討が必要である。現在、質量分析機を用いた糖鎖の網羅的解析を検討中であり、また場合によっては解析し終えた糖鎖をさらにそのままin vivoあるいはin vitroの実験に応用できるかどうかについて検討中である。上記結果は材料と方法が入手容易なために、投稿準備が整うまで学会発表を控えている。腸管寄生線虫の定着と排除に関わる分子の同定のために、ネズミの寄生虫であるNippostrongylus brasiliensis(Nb)のマウス感染系を使用している。研究代表者はこれまで、腸管粘液の主成分であるムチンの糖鎖末端にシアル酸が付加することが、Nbのマウスからの排除に深く関わることを示してきた。本研究では、寄生虫(Nb)側のシアル酸結合分子(リガンド)とその局在を探索・同定することで、粘液ムチンの糖鎖変化の感染防御への関わり方を分子レベルで明らかにすることを目的としている。1)粘液糖鎖の解析ムチンのシアル化が、どのような糖鎖に対して起きているかを明らかにするために、粘液の糖鎖組成を質量分析器で解析した。ムチンの糖鎖は多くがO結合型であるので、ヒドラジン分解後、BlotGlyco^Rで糖を精製し、MALDI-TOF MS解析した。その結果、未感染粘液に比してフコースの高発現が認められた。前年度までの組織切片上でのレクチンの結合性、あるいはレクチンアレイ(45種類のレクチンへの結合性を検索)

解析では、フコースに加えてシアル酸の発現亢進をも認めているが、それはムチン中のN結合型糖鎖における変化の可能性が強く示唆された。2)寄生虫側のシアル酸リガンド探索還元末端を介した糖鎖固定化法と非特異吸着を抑制する特殊表面処理によって、糖鎖リガンドの探索が可能となった。この方法を用いて、Nb虫体の抽出物中のシアル酸リガンド検出を検討中である。3)超小型内視鏡による腸管腔内における寄生動態の観察(リガンドを検証する実験系の開発)本学高次元医用画像工学研究所の鈴木直樹教授の開発した小型内視鏡は、市販の小動物用内視鏡に比して特段に小型かつ高解像度で、マウス小腸でのNbの動態観察が可能となった。しかしながら、空気で内腔を広げる必要性、長期麻酔下での観察に向けた条件設定など検討課題を残した。
微量試料からの高効率クロマチンプルダウン法の開発

本研究の目的は、哺乳類(マウス)の、始原生殖細胞をはじめとする少数の細胞における転写制御因子の結合部位を決定するための手法を開発することである。特定の転写因子に結合したゲノムDNAを効率よく精製するため、その転写因子に目印(タグ)をつけた遺伝子改変マウスや細胞を作成した。転写因子に結合したゲノムDNAを増幅する手法を開発し、定量的な増幅が行われる条件を見出した。これらを総合し、10, 000個の細胞において転写因子に結合したゲノム部位を決定できるようになった。本年度は微量試料からの高効率クロマチンブルダウン法の開発に必要となる細胞・マウスの作成をおこなった。始原生殖細胞の形成過程およびその維持におけるBlimp1の結合部位の同定に必要なマウスを作出するため、相同組み換えによりBlimp1遺伝子にタグ(EGFPおよびビオチンリガーゼ標的配列(Avitag))を付与した。培養細胞での強制発現実験により、Blimp1はC末端よりもN末端の方がタグの付与に適していることが判明した。したがって、これらのタグが挿入されるようBlimp1 locusにノックインしたES細胞を作出した。また、少数細胞(1000個)からのChIP法確立のための実験系として、Oct3/4のC末端がEGFPでタグされた機能的なES細胞を理研CDB丹羽仁史博士に分与していただき、キメラマウスを作出した。また、ビオチンリガーゼを恒常的に発現するES細胞株を理研免疫研の古関明彦博士より分与していただき、Oct3/4のC末端がAvitagでタグされるようノックインした。ES細胞におけるOct3/4の結合部位には十分な知見があるので、少数細胞へのChIP法を最適化するためのコントロールとして用いる予定である。すなわち、多数(10^7個)の細胞におけるタグ付きOct3/4の結合部位を基準として、細胞数を減らしてChIPおよびゲノムDNA断片の増幅をしたときのデータと比較し、感度・精度・確度を測定する。またOct3/4は多能性の形成・維持だけでなく、生殖細胞形成にも重要であるので、手法の確立にもちいるだけでなく、始原生殖細胞における結合部位を同定することも生物学的に重要であると考えられる。BlimplとOct3/4の、相同組換え実験の一部およびキメラマウス作出は理研CDB変異マウス開発室と共同でおこなった。本年度は前年度に引き続きノックンマウスの作成と、その検証を行った。Blimp1のlocusにタグをコードするDNAを挿入し(EGFPおよびAvitag)、タグ付きBlimp1を発現するようにデザインしたES細胞(前年度作出)をマウス初期胚に移植しキメラマウスを作成した(理化学研究所動物資源開発室との共同研究)。これらキメラマウスよりヘテロ、ホモマウスを順次作成した。Blimp1は、その遺伝子が欠失すると胚性致死となる重要な転写因子であるが、タグ付きBlimp1のホモマウスは一見して健常であり、かつ正常な生殖器官と繁殖能力を保持しており、Blimp1の機能が付加したタグによって損なわれていないことが判明した。また始原生殖細胞におけるBlimp1の発現が正常であるか否かを免疫染色により検証した。その結果、Blimp1が発現する全ての発生ステージにおいてタグ付きBlimp1は核に局在しており、その発現は既知の知見と一致した。さらにWestern Blotting解析により始原生殖細胞(発生12.5日)を解析し、付加したEGFPが分解を受けることなくタグ付きBlimp1タンパク質として合成されていることを確認した(Avitagについても検証中)。以上の解析から、タグ付きBlimp1について、その発現、局在、タグ付加、機能すべてにおいて、当初の計画通りのノックインマウスを作出することができたと結論付けられる。このマウスはChIPのみならずBlimp1のあらゆる生化学的解析に有用であると考えられる。また、Oct4-Linker-Avitagを用いたChIPおよびChIP DNA増幅実験から、10^410^5個のES細胞から転写因子Oct4のChIP解析が可能であるという一次的な解析結果を得た。ChIPに用いるビーズに対する非特異的吸着の最小化、DNA増幅に用いるべきキャリアの選定は完了しつつあると考えられる。本年度は前年度に完成したタグ付きBlimp1ノックインマウス(EGFP-Blimp1ホモ接合体)を大量生産し、後述するクロマチン免疫沈降(ChIP)に十分な数の雌雄マウスを得ることが出来た。また、EGFPの代わりにビオチンリガーゼ標的配列でタグしたマウス(BT-Blimp1)についても、全身でビオチンリガーゼを発現するマウスと掛け合わせ、BT-Blimp1/BirAの両方についてホモ接合となったマウスを作出した。これによりBlimp1のChIPに必要な、当初計画したマウスが全て完成した。