hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケモカインCXCL12/CXCR4シグナル解析に基づく膵癌進展の病態解明

膵癌患者では血清CXCL12値が有意に高値であり、特に転移症例でより高値であった。切除標本では癌組織の辺縁にCXCR4が発現し、その周囲の間質にCXCL12発現細胞を認めた。またCXCL12刺激による膵癌細胞株では、癌の進展に関与する上皮間葉転換因子のE-cadherinの発現は低下し、Vimentinの発現が増加していた。膵特異的CXCR4ノックアウトマウスと膵癌モデルマウスとの交配マウスでは、膵癌発症、転移巣および死亡率はいずれも低値であった。さらに本マウスでは前癌病変PanINの数にも差を認めた。以上より、CXCL12/CXCR4は膵発癌および進展に重要な役割を持っていることが示された。1、ヒト膵癌患者の血清CXCL12値を測定し対照群と比較検討した。ヒト膵癌患者では有意に血清CXCL12が高値であった。また膵癌患者間において、血清CXCL12値は、その進行度や予後と相関する傾向にあった。切除組織におけるCXCL12とCXCR4の発現および分布について検討した。膵癌組織では癌中心部よりも浸潤部にCXCR4の発現が強く、浸潤部周辺にCXCL12を発現する間質細胞が多く認められた。また転移巣においてもCXCR4を発現する癌細胞とその周囲にCXCL12発現細胞を多く認めた。以上より、ケモカインCXCL12/CXCR4は膵癌の進展や予後などの病態形成に関連する因子であることが示唆された。2、膵癌細胞株におけるCXCR4のmRNA発現量および蛋白産生量を解析した。各種細胞株においてCXCR4のmRNAおよび蛋白レベルで発現が認められた。これは今後予定しているCXCL12刺激による膵癌細胞株を用いたCXCL12/CXCR4の機能解析を行うことが可能であることを意味する。現在リコンビナントCXCL12刺激によるCXCR4強制発現細胞株およびノックダウン細胞株の樹立を行っている。3、膵特異的プロモーター下にCre recombinaseを発現するPtf1a-CreマウスとCXCR4 floxマウスとを交配することにより、膵特異的CXCR4ノックアウトマウス(Ptf1a-Cre;CXCR4f/fマウス)を作成した。この膵特異的CXCR4ノックアウトマウスを用いて、膵の形態形成におけるCXCL12/CXCR4の機能について観察中である。現時点では、検討数は少ないが、膵の大きさ、腺房、膵管、膵島などの構成成分に形態的変化を認めていない。これはCXCL12/CXCR4系は正常の膵発生には影響を与えず、膵癌形成後の進展に関与する分子である可能性を示唆している。1.ヒト膵癌患者血清中のCXCL12値を測定し対照群と比較検討を行った。膵癌患者では高値であり、転移巣を有する非切除症例ではより高値であった。さらに切除標本の解析からCXCR4発現癌細胞は病巣の先進部に多く、その周囲にはCXCL12発現細胞を認めた。以上のことからケモカインCXCL12/CXCR4は浸潤や転移など癌の進展や予後に関与する因子である可能性が示唆された。2.各種膵癌細胞株においてCXCR4の発現が上昇していることを確認したのちに、CXCR4強制発現細胞株およびノックダウン細胞株を樹立した。この細胞株に対してCXCL12刺激による上皮間葉転換(EMT)因子の発現解析を行った。CXCL12の投与濃度によるばらつきはあるが、上皮系マーカーであるE-cadherinの発現は低下し、間葉系のマーカーであるVimentinの発現が増加していた。3.膵特異的CXCR4ノックアウトマウス(Ptfa-Cre;CXCR4f/fマウス)を作製したのちに、膵発癌モデルマウス(Ptf1a-Cre; KrasG12D; TP53R172Hマウス)と交配し、膵癌形成、組織学的悪性度、転移の有無および生存率について検討した。しかしながらコントロール群と比較して有意な差は得られなかった。そこで、異なる膵発癌モデルマウス(Pdx1-Cre; KrasG12D; TP53R172Hマウス)との交配を行い同様の解析を行った。まだ少数の解析ではあるが、本マウス(Pdx1-Cre; KrasG12D; TP53R172H; CXCR4f/f)ではコントロール群に比して、膵癌形成、転移巣、死亡率はいずれも軽度あった。さらに本マウスでは前癌病変である膵上皮内腫瘍性病変(PanIN)の数にも差を認めた。これはCXCL12/CXCR4が癌の進展のみならず、発癌そのものにも関与している可能性を示唆している。1.ヒト膵癌患者における血清CXCL12値の検討では、対照群として膵癌ハイリスク疾患である膵管内乳頭状粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm: IPMN)や慢性膵炎における検討が十分数に達していない。これは当院での慢性膵炎患者数(特に手術症例)が少ないことに起因する。引き続き症例数の確保に努める方針である。2.膵癌細胞株を用いたin vitro解析は比較的順調に進んでいるが、CXCL12投与濃度の設定等の改善点がある。

3.モデルマウスを用いた検討では、当初解析していた膵発癌モデルとの交配にて腫瘍進展に有意な差を認めなかった。そこで他の膵特異的プロモーターを用いた膵発癌モデルマウス(Pdx1-Cre; KrasG12D; TP53R172H)との交配をおこなうことで上記のような仮説を支持する結果と、新たな知見を得ることができた。しかしながら、実験途中からの新たなモデルマウスとの交配であり十分な数の検討ができていない。さらに当実験動物施設では、施設内での感染問題が発生しため、約4ヵ月の間、実質上実験を施行することが困難となり、除菌および系統維持に専念せざるを得なくなったため実験が遅れている。ヒト膵癌患者では、対照群に比して血清CXCL12値が有意に高値であり、さらに患者間では転移巣を有する非切除例でより高値であった。また切除標本の解析からCXCR4発現癌細胞は病巣の先進部に多く、その周囲にはCXCL12発現細胞を認めた。以上のことからケモカインCXCL12/CXCR4は浸潤や転移など癌の進展に関与する分子であるのみならず、予後予測因子である可能性が示唆された。膵癌細胞株においてCXCR4の発現を確認したのちに、CXCL12刺激による上皮間葉転換(EMT)因子の発現解析を行った。上皮系マーカーであるE-cadherinの発現は低下し、間葉系のマーカーであるVimentinの発現が増加していた。これはCXCL12/CXCR4が癌組織の進展・転移に必要なメカニズムであるEMTに関連する因子であることを支持するものである。膵特異的CXCR4ノックアウトマウス(Pdx1-Cre;CXCR4f/fマウス)を作製したのちに、膵発癌モデルマウス(Pdx1-Cre; KrasG12D; TP53R172Hマウス)と交配し、膵癌形成、組織学的悪性度、転移の有無および生存率について検討した。本マウス(Pdx1-Cre; KrasG12D; TP53R172H; CXCR4f/f)ではコントロール群に比して、膵癌形成、転移巣、死亡率はいずれも少なかった。さらに新たな知見として、本マウスでは前癌病変である膵上皮内腫瘍性病変(PanIN)の数にも差を認めた。以上より、CXCL12/CXCR4は膵癌の転移を含めた進展に関与する分子であると同時に、予後を予測する因子であること、さらには発癌そのものにも関与している分子である可能性を示唆している。膵癌患者では血清CXCL12値が有意に高値であり、特に転移症例でより高値であった。切除標本では癌組織の辺縁にCXCR4が発現し、その周囲の間質にCXCL12発現細胞を認めた。またCXCL12刺激による膵癌細胞株では、癌の進展に関与する上皮間葉転換因子のE-cadherinの発現は低下し、Vimentinの発現が増加していた。膵特異的CXCR4ノックアウトマウスと膵癌モデルマウスとの交配マウスでは、膵癌発症、転移巣および死亡率はいずれも低値であった。さらに本マウスでは前癌病変PanINの数にも差を認めた。以上より、CXCL12/CXCR4は膵発癌および進展に重要な役割を持っていることが示された。1、ヒト膵癌患者における血清CXCL12値の検討では、対照群としてヒト膵癌ハイリスク群である膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm: IPMN)や慢性膵炎での検討が十分ではない。
実時間モード解析を用いたダイナミクスベースド画像検査法

本研究では、音声周波数レベルの振動分布を実時間計測し、共振周波数やモード波形等の対象固有の振動モード特性を画像特徴量として用いるダイナミクスベースド画像検査法の概念を提案し、その高速実時間化に向けた理論・アルゴリズムの体系化を行った。実際に画像処理、モード解析、構造欠陥認識などの一連の処理を動作可能とする10000fps高速ビジョンをセンシングハードウェアとして開発し、高速ビジョンを用いた部材レベルでの動作試験における亀裂検出から、構造物モデルに対する振動モニタリングの事例を通して、モード解析技術と高速画像処理・認識を融合した実時間ダイナミクスベースド画像検査法の有効性を示した。10000fpsの実時間ダイナミクスベースド画像検査を実現し,音声周波数レベルの振動分布から振動モード特性を瞬時計算する高速ビジョンハードウェアを開発した.A) 10000fps画像処理を行う高速ビジョンハードウェア: 1)小型カメラヘッドと専用FPGAボードを連動させ,PCI-eバスを介しPCメモリ上に512×96画素画像が10000fpsで実時間メモリマップできる高速ビジョンハードウェアを構築した.2)メモリマップされた画像データをランダムアクセスするミドルソフトウェアを開発し,画像処理が10000fpsで実時間動作することを確認した.3)総和・重心を計算するモーメント特徴計算回路を実装し,対象変化に応じて高フレームレート映像が自動記録できることを確認した.B)音声周波数レベル振動分布の実時間振動イメージング:1)高速ビジョンハードウェアに画像の時空間微分積和値を並列パイプライン処理により計算する回路を実装し,特徴点追跡法を実時間動作させた.2)加振装置により音声周波数レベルで部材や構造物を振動させ,複数の特徴点からなる振動分布を10000fpsで実時間計測・イメージングした.3)複数の高速ビジョンを動作させ,ステレオ画像を用いた10000fpsでの三次元振動分布計測に拡張し,その結果が実時間イメージングできることを確認した.(F)構造物の実時間ビジョンベースドモード解析・認識:1)再帰的部分空間同定を用いた振動モード計測法を並列実装し,10kHzで計測された振動分布の振動モード特性を高速計算した.2)部材や構造物を振動させた場合,共振周波数やモード波形を実時間計測し,動的特性の急激変化もモニタリングできることを確認した.3)部材にクラックを付加した場合,固有画像特徴とする振動モード特性の変化を検出し,クラック位置や程度を実時間定量化した.ダイナミクスベースド画像検査法の計測原理及び特徴点追跡,振動分布計測,モード解析,構造欠陥認識の高速化に向けたアルゴリズムの提案を行った.(A)振動分布計測のための輝度勾配ベースド特徴点追跡法:1)加振装置により音声周波数レベルで様々な条件下で強制振動させた対象に対し,オフライン高速ビデオカメラを用いた高フレームレート動画撮影を行った.2)輝度勾配ベースドオプティカルフロー法を用いた振動分布解析を行い,フレーム間隔と振動分布推定精度の関係を解析した.3)フレーム間隔を制御する知的フレームストラドリング方式に基づく特徴点追跡法を提案した.(B)高速ビジョン特性を用いた高速振動モード計測法:1)フレーム間画像変化が小さいという高速ビジョン特性を前提とした再帰的部分空間同定により,大規模行列の特異値分解を必要としない振動モード計測法を実現した.2)高フレームレート動画に対する振動モード計測を通して,計測精度や処理速度等に対する評価を行った.3)次年度行う予定であった高速ビジョンハードウェアへの高速振動モード計測アルゴリズムの実時間実装を一部行い,その基本動作を確認した.(C)振動モード特性に基づく構造物欠陥パタン認識法:1)構造物モデルに対する振動シミュレーション及びそのモード解析を行い,クラック等の位置・程度により,振動モード特性が非線形変化することを確認する.2) Fisher判別分析による教師付き学習を行い,圧縮された固有特徴空間でクラック位置・程度を定量化可能とする構造物欠陥パタン認識法を導入した.3)クラックを施した単純な構造モデルである片持ちはりの振動分布を高フレームレート動画で撮影し,クラック位置に対応した振動モード特性の変化が定量化できることを確認した.部材レベルでの実時間構造物試験:構造部材を加振した試験を通して、構造疲労に伴う振動特性の変化を実時間モニタリングした。A)電子スペックルパタン干渉を生成する干渉光学計構築: 1)高速ビジョン感度特性にあった半導体レーザによるスペックル干渉パタン発生装置を導入した。2)振動する表面粗さのある平面部材にスペックル干渉パタンを投影した場合、オフライン高速ビデオカメラの撮影動画においてサブμmレベルの振動分布が観測されることを確認した。B)部材レベルの微小振動に対するイメージング・振動解析:1)振動する表面粗さのある平面部材の振動分布をオプティカルフロー計測に基づき実時間可視化した、2) 1)の振動分布に基づき、共振周波数等に対応した振動波形を実時間検出した。3)クラックのある部材に対して同様な検証を行い、クラックの有無やそのクラック位置に対応した形での振動特性の変化を確認した。C)強制加振に基づく構造部材の連続振動試験: 1)これまでに開発した振動モード計測システムが長時間にわたり連続稼働することを確認した。2)クラック等の構造部材を強制加振した場合に振動モード特性の時間変化を定量的に捉えることができることを確認した。3)形状の異なる部材に対して実験を行った。

本研究では、音声周波数レベルの振動分布を実時間計測し、共振周波数やモード波形等の対象固有の振動モード特性を画像特徴量として用いるダイナミクスベースド画像検査法の概念を提案し、その高速実時間化に向けた理論・アルゴリズムの体系化を行った。実際に画像処理、モード解析、構造欠陥認識などの一連の処理を動作可能とする高速ビジョンをセンシングハードウェアとして開発し、高速ビジョンを用いた部材レベルでの動作試験における亀裂検出から、構造物モデルに対する振動モニタリングの事例を通して、モード解析技術と高速画像処理・認識を融合した実時間ダイナミクスベースド画像検査法の有効性を示した。具体的には、以下の項目の研究を行った。1ダイナミクスベースド画像検査法の計測原理・アルゴリズム体系の構築:振動モード特性を固有画像特徴として用いるダイナミクスベースド画像検査法の計測原理及び特徴点追跡、振動分布計測,モード解析、構造欠陥認識の高速化に向けたアルゴリズムの提案を行った。2実時間ダイナミクスベースド画像検査のための10000fps高速ビジョンの開発: 10000fpsの実時間ダイナミクスベースド画像検査を実現し、音声周波数レベルの振動分布から高次振動モード特性を瞬時計算する高速ビジョンハードウェアを開発した。3電子スペックルパタン干渉法に基づく部材レベルでの構造物試験:サブμm微小振動分布に対する実時間電子スペックルパタン干渉計測を実現し、構造部材を強制加振した振動試験を通して,構造欠陥に伴う振動特性の変化の実時間モニタリングを試みた。4大規模構造物モデルを用いたストラクチャヘルスモニタリング試験:大規模構造物モデルの振動分布を遠隔計測する多眼高速ビジョン・超高速アクティブビジョンを構築し,アンビエント加振下での構造物モデルに対するモード特性計測を通し、システム性能を評価した。実際に画像処理、モード解析、構造欠陥認識などの一連の処理を動作可能とする10000fps高速ビジョンをセンシングハードウェアとして開発し、高速ビジョンを用いた部材レベルでの動作試験における亀裂検出から、構造物モデルに対する振動モニタリングの事例を通して、モード解析技術と高速画像処理・認識を融合した実時間ダイナミクスベースド画像検査法の有効性を示した。本年度に行う予定であった電子スペックルパタン干渉を生成する干渉光学計構築,部材レベルの微小振動に対するイメージング・振動解析,強制加振に基づく構造部材の連続振動試験の項目については、概ね計画通り行われた。27年度が最終年度であるため、記入しない。計測工学概ね、研究計画通りに研究は進捗しており、基本的には当初研究計画通りに研究を進めていく予定である。
微細集積回路の歩留り保障設計技術の研究

本研究の目的は,プロセスの最適化から回路特性の最適化までを含んだ歩留り最適化設計手法の提案である。製造プロセスをも最適化の対象とすることで,総合的な歩留り最適化が可能となり,歩留りの改善と設計時間の短縮が同時に達成できる。本年度は、デジタル回路を対象として,チップ内のトランジスタばらつきや,ゲート内のばらつきを考慮した統計遅延解析手法について提案を行なった。詳細は下記の通りである。1.実測値からのチップ内ばらつき抽出手法製造ばらつきを考慮した回路設計では,チップ間のばらつきのみならず,チップ内でのばらつきを考慮する必要がある。本研究では,チップ内ばらつきとチップ間ばらつきのモデル化,および,モデルパラメータの抽出手法を提案する。チップ内ばらつきをチップ間ばらつきから分離するのは困難であったが,電流値のばらつきから直接計算することで,チップ内ばらつきパラメータを抽出する。リングオシレータの発振周波数ばらつきとの比較を行うことで,提案手法の精度検証を行った。2.チップ内ばらつきのサイズ依存を考慮した統計遅延解析手法現実的な回路遅延変動量を知るために,実測したトランジスタ特性のばらつきからゲート遅延ばらつきを求める。従来の統計遅延解析では,チップ内ばらつきのサイズ依存を考慮していなかったが,応答曲面法を用いた手法により,チップ内ばらつきのサイズ依存性を考慮した遅延モデルの生成手法を提案した。3.ゲート内ばらつきを考慮した統計遅延解析手法ゲート遅延ばらつきの見積りにおいて,論理ゲート内のトランジスタ間ばらつきを考慮する事が重要である。本研究では,ゲート内でのばらつきを考慮したゲート遅延ばらつきモデルを提案した。提案モデルは,トランジスタ特性を共通成分と独立変動成分に分けて,それらの変動量から遅延時間を与える。具体的な回路の遅延ばらつきを例に,ゲート内ばらつきを考慮する場合としない場合で,遅延分布に差がでることを示した。
尤度比統計量による非正則条件下の統計的推測とその応用

多くの統計的推測問題で通常仮定されている条件が成り立たない非正則条件下における母数推定問題を考察した。非正則モデルの一つである尖点母数の推定問題における尤度比統計量を用いた手法は古くから知られた手法であるが、我々は回帰モデル等の応用上重要である統計モデルにおいて新たな成果を得た。また非正則条件下における母数推定問題を確率過程母数モデルの枠組みまで拡張することに成功した。統計的推測理論において、既存研究の多くがあらかじめモデルに正則条件を仮定し、その上で推定量の一致性や漸近正規性に関する議論を展開している。正則条件が破棄された非正則条件下における統計的推測理論を構築することが本研究の目的である。その際、尤度比統計量を基本的な道具として用いる。査読付論文Fujii(2010)では、ドリフト関数が非有界な拡散過程において、その位置パラメータに関して局所漸近正規性が成り立たず、ベイズ推定量の漸近分布がフラクショナルブラウン運動に関連していること、さらにはそれが漸近有効推定量であることを証明した。続いて論文投稿中ではあるが、回帰関数に微分不可能な"尖った点"(尖点)を有する非線形回帰モデルを考え、その尖点位置パラメータに関する尤度比統計量がドリフトを伴うフラクショナルブラウン運動に弱収束することを示し、最尤推定量やベイズ推定量の漸近的性質がそれを通して説明されることを明らかにした。さらには、強度関数が変化点構造をもつ点過程において、その強度パラメータと変化点パラメータの同時推定問題を考え、強度パラメータに関しては漸近正規性が成り立つのに対して、変化点パラメータの漸近的性質はポアソン過程と関係した複雑な構造をもつことを明らかにした。この成果に関する論文に現在作成中である。また、これらの理論研究と並行し、その結果の裏付けとなる数値シミュレーション実験を実施するための計算機環境を整備し、いくつかの例題に対してシミュレーションを実行し、理論結果との整合性を確認することに成功した。今後の論文・学会発表などの成果報告ではそれらのシミュレーション結果も逐次取り入れてゆく。本研究の目的は、尤度比統計量を通して非正則条件下での推定量の漸近的性質を明らかにすることであり、特に非正則条件下での議論を確率過程母数モデルにまで広げることが大きな関心であった。尤度比統計量を用いた手法は古くから存在し、正則条件下では退化したガウス過程に弱収束することはすでによく知られている。そして近年、非正則条件下では、尤度比統計量が正則条件下とは異なる様々な確率過程へと弱収束することが明らかにされつつあった。本研究では非正則条件下での統計的推測問題を幾つかの統計モデルにおいて検討した。具体的成果を次に挙げる。はじめに、回帰関数に微分不可能な"尖った点"(尖点)を有する非線形回帰モデルを考え、尖点母数と係数母数の同時推定問題を考え、尖点位置パラメータに関する尤度比統計量がドリフトを伴うフラクショナルブラウン運動と関連し、正則条件を満たす係数母数についての尤度比統計量が退化したガウス過程と関連していることを示し、ベイズ推定量の漸近的性質はそれらを通して説明されることを明らかにした(Fujii(2009))。続いて、変化点構造を有する点過程の一つである単純自己修正点過程についての変化点推定問題に取り組んだ。この取り組みの中で副次的に、地震を記述するモデルとして盛んに利用されているストレス解放モデルに対する局所時間の数学的構造を明らかにし、またストレス解放モデルの定常密度関数や強度関数の一様一致推定量を構築することに成功した。この成果は研究代表者と西山陽一氏との共著論文として現在投稿中である。そしてこの結果に基づき、単純自己修正点過程の母数推定問題に取り組み、変化点母数に対する尤度比統計量の弱極限がポアソン過程と関連していることを証明し、さらにより一般化した自己修正点過程についての変化点問題までを考察しまとめた成果を、次年度以降に論文として投稿する予定である。
人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術の開発

本研究ではゼブラフィッシュを用いたゲノム編集技術の開発を目指した。CRISPR/Cas9システムによってDNA二本鎖切断が引き起こされると細胞が持つ二種類の修復機構が働く。1つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、もう1つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。比較的短い相同配列を導入したプラスミドを利用したところ、約80%の頻度で遺伝子挿入が生じており、そのうち60-70%という高頻度で相同配列を利用した正確な遺伝子挿入が行われていることを確認した。さらにこの外来遺伝子の挿入が次世代に引き継がれることを確認した。これまでマウスがモデル生物としての地位を確立してきた背景には胚性幹(ES)細胞を用いたゲノム編集技術がある。マウスでは生殖細胞へと分化可能なES細胞が樹立されているため、相同組換えによりゲノムを編集した個体を作製できる。これにより標的遺伝子を破壊した際の表現型を解析する逆遺伝学的解析が可能となり、多くの遺伝子の生理機能が解明されてきた。一方で世代時間や飼育コスト、ゲノムサイズ、観察の容易さなどから研究目的に適した様々なモデル生物が利用されているが、マウス以外のモデル生物ではES細胞が樹立されておらず逆遺伝学的解析が困難であった。このような状況下で近年、ゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こす人工ヌクレアーゼが開発され大きく注目されている。人工ヌクレアーゼによってDNA二本鎖切断が引き起こされると、細胞が持つ二種類の修復機構が働く。1つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、切断末端が直接繋がれる。この際に高頻度で数塩基の挿入及び欠損変異が生じるため、フレームシフトを誘導し標的遺伝子が破壊される。もう1つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。CRISPR/Cas9システムではgRNAが標的配列の認識に関わり、Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成することによりDNA二本鎖切断を引き起こす。そこでgRNAの認識配列とゲノム標的部位との相同配列を持つドナーベクターを作成し、gRNA,Cas9 mRNAと同時にインジェクションしたこところ、標的遺伝子であるkrtt1c19e遺伝子へ蛍光タンパク質を付加することに成功した。さらにこの外来遺伝子の挿入が生殖細胞にも生じており、次世代に引き継がれることを確認した。これまでマウスでは生殖細胞へと分化可能な胚性幹(ES)細胞が樹立されているため、相同組換えによりゲノムを編集した個体の作製が可能であった。これにより標的遺伝子を破壊した際の表現型を解析する逆遺伝学的解析が進められ、多くの遺伝子の生理機能がマウスを中心に解明されてきた。このような状況下で近年、ゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こす人工ヌクレアーゼであるTALENやCRISPR/Cas9システムが開発され大きく注目されている。効率の良い遺伝子挿入を行うため、gRNAの認識配列とゲノム標的部位との相同配列を持つドナーベクターを作成した。このドナーベクターと細胞ゲノムの標的部位を切断するCRISPR/Cas9システムを同時に導入することにより、哺乳類培養細胞において外来遺伝子が挿入されることを確認した。計画予定通り、ゼブラフィッシュ胚に加えて培養細胞においても本研究にて開発した手法が機能することを確認できた。マウスでは生殖細胞へと分化可能なES細胞が樹立されているため、相同組換えによりゲノムを編集した個体を作製でき、標的遺伝子を破壊した際の表現型を解析する逆遺伝学的解析が進められ、多くの遺伝子の生理機能がマウスを中心に解明されてきた。このような状況下で近年、ゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こすTALENやCRISPR/Cas9システムが開発され大きく注目されている。これらの人工ヌクレアーゼによってDNA二本鎖切断が引き起こされると、細胞が持つ二種類の修復機構が働く。1つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、切断末端が直接繋もう1つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。効率の良い遺伝子挿入を行うため、gRNAの認識配列を持つドナーベクターを作成した。

相同配列を持たないプラスミドでは約50%の頻度で日相同末端結合により遺伝子挿入が生じていた。一方で、10bpから40bpの比較的短い相同配列を導入したプラスミドでは約80%と挿入頻度が上昇し、そのうち60-70%という高頻度で相同配列を利用した正確な遺伝子挿入が行われていることをDNAシークエンスにより確認した。さらにこの外来遺伝子の挿入が生殖細胞にも生じており、次世代に引き継がれることを確認した。次世代への継代効率はインジェクションした胚における挿入効率と大きく相関があることを明らかとした。本研究ではゼブラフィッシュを用いたゲノム編集技術の開発を目指した。CRISPR/Cas9システムによってDNA二本鎖切断が引き起こされると細胞が持つ二種類の修復機構が働く。1つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、もう1つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。比較的短い相同配列を導入したプラスミドを利用したところ、約80%の頻度で遺伝子挿入が生じており、そのうち60-70%という高頻度で相同配列を利用した正確な遺伝子挿入が行われていることを確認した。さらにこの外来遺伝子の挿入が次世代に引き継がれることを確認した。二年目以降に予定していた外来遺伝子の挿入法を確立した。遺伝子挿入が次世代に効率良く引き継がれるためにはインジェクションを行ったF0世代の体細胞において広範囲でゲノム編集が行なわれている必要があることを見出している。ゼブラフィッシュ胚の出来るだけ発生初期にゲノム編集が引き起こされるようにすることで更に遺伝子挿入効率を上げられないか検討する。脂質生化学今後はこれまでに確立した遺伝子挿入法がその他のゲノム部位においても有効であるのか調べていく。またゼブラフィッシュ以外のモデル生物、細胞において汎用性があるのか検討を行う。[連携研究者]理化学研究所脳科学総合研究センター発生遺伝子制御研究チーム小林琢磨Ca2+インジケータのトランスジェニック系統の作成・解析次年度使用額は45円であり、ほぼ予定通り使用した。次年度使用額は2円であり、ほぼ予定通り使用した。次年度使用額は45円であり、当初の計画通り使用する。次年度使用額は2円であり、当初の計画通り使用する。
中枢神経系幹細胞の分化機構の解析

神経幹細胞のマーカーであるnestin遺伝子のエンハンサー領域を用いてgreenfluorescent protein(GFP)を神経幹細胞に強く発現させ、その細胞を可視化し、さらにfluorescence activated cell sorting(FACS)を用いて分離する方法を開発した。同様に、異なる細胞腫に発現する幾つかの遺伝子のプロモーター領域を用いて、ニューロン前駆細胞、およびドーパミンニューロンを可視化・分離することに成功した。分離・濃縮された神経幹細胞あるいはドーパミンニューロンを、パーキンソン病モデルラットへ移植したところ、アンフェタミンによって誘発される回転運動が有意に抑制されることから、脳内でドーパミンニューロンに成熟し機能回復が起こったものと考えられた。さらに、ES細胞にGFPレポーターを導入して、ES細胞から分化誘導したドーパミンニューロンの分離を試みた。FACSで分離した細胞を同様に、パーキンソン病モデルラットヘ移植し、機能回復を確認した。これらの方法は、将来神経変性疾患の治療に必要な細胞の分離の方法を開発する際に役立つものと考えられるが、トランスジーンを導入しなければならないという欠点がある。そこで、神経幹細胞およびそこから分化した細胞の表面に特異的に発現する蛋白質に対するモノクローナル抗体を作成するため、胎仔前脳細胞を免疫して得られたハイブリドーマの大規模なスクリーニングを行った。FACS及び免疫組織化学によって選別されたクローンのうち、特に興味深いものを二つ選択して、発現クローニング法によって抗原遺伝子を決定したところ、EphrinB1とM6であることが明らかになった。これらの蛋白質は、神経幹細胞およびそこから発生する神経系細胞の増殖・分化に関与している可能性がある。また今回得られた抗体はこれらの細胞の分離に役立つ可能性があると考えられる。神経幹細胞を生きた状態で同定し、これを分離することができるように、神経幹細胞で選択性高く発現しているnestin遺伝子のエンハンサー制御下で蛍光物質であるGreen Fluorescence Protein(GFP)をコードする遺伝子をおいたレポーターコンストラクト(nestin-EGFP)を作成し、これを神経組織へと導入した。nestin-EGFPレポーター遺伝子を有するトランスジェニックマウスにおいては、神経幹細胞を含む未分化な細胞が密集している脳室周囲部(Ventricular Zone,VZ)に強い蛍光が観察された。EGFP陽性の細胞をセル・ソーター法により分離したところ、マーカーの発現、多分化能、自己複製能などの指標を満たす神経幹細胞活性が濃縮できることが認められた。また、同レポーター遺伝子は、成人脳内に存在する神経幹細胞/神経前駆細胞を同定・分離する上でも有効であることを見出した。本研究では、このgp130、そして神経幹細胞のmitogenであるEGFのレセプターの下流で働くシグナル伝達分子であり、MAP kinase経路の活性化に関与しているGab1の欠失変異体マウスにおける神経幹細胞の動態を含めた中枢神経系発生の異常を解析することによって、神経幹細胞の長期維持機構およびの本質に更にせまることを目的としている。Gab1のホモ欠失変異体(gab^<-/->)は胎生16日目までに胎盤の発達異常により死亡してしまう故に、まず、胎生14目目の線条体における神経幹細胞の数をneurosphere法によって野生型と比較したところ、顕著な差は見られなかったが、EGFに対する反応性は消失していた。また、この時期に現れ始めるオリゴデンドロサイト前駆細胞の数が減少していた。しかしながら、ニューロンの分化および生存に変化は見られなかった。さらに、ヘテロ欠失変異体(gab^<+/->)の成体の側脳室周囲に存在している神経幹細胞の数を、これもneurosphere法によって調べたところ、野生型に比べて約80%その数が増加していた。また、gp130を介したシグナルによってその発現が亢進されるGFAPの発現は生後7日目の脊髄および成体脳でも低下していた。

一方、これまでubiquitousに発現すると考えられていたGab1の中枢神経系の発生過程における発現を組織免疫化学染色によって確かめたところ、驚いたことに神経幹細胞が最も多く存在すると考えられる脳室周囲での発現が、生後2日目までは非常に低く、それ以外の領域で強く発現していた。しかしながら、生後19日目および成体においては脳室周囲に強く発現していた。これらのことは、Gab1が主に生後から成体に至るまでの神経幹細胞の維持に負に作用しており、胎生期では主にオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化増殖あるいは生存に必要であることを示唆している。本研究では、gp130、そして神経幹細胞のmitogenであるEGFのレセプターの下流で働くシグナル伝達分子であり、MAP kinase経路の活性化に関与しているGab1の欠失変異体マウスにおける神経幹細胞の動態を含めた中枢神経系発生の異常を解析することによって、神経幹細胞の長期維持機構およびその本質に更にせまることを目的としている。Gab1のホモ欠失変異体(gab^<-/->)は胎生16日目までに胎盤の発達異常により死亡してしまう故に、まず、胎生14日目の線条体における神経幹細胞の数をneurosphere法によって野生型と比較したところ、顕著な差は見られなかったが、EGFに対する反応性は消失していた。また、この時期に現れ始めるオリゴデンドロサイト前駆細胞の数の減少が見られたが、ニューロンの分化および生存に変化は見られなかった。一方、CNTFなどのgp130を介したシグナルによって正に制御されているGFAPの発現は、生後7日目のヘテロ欠失変異体(gab^<+/->)の脊髄で亢進していた。そのため、胎生14日目の脊髄の初代培養の系において、CNTF存在下で3日間培養を行ったところ、ヘテロ欠失変異体(gab^<+/->)ではGFAPの発現量が野生型に比べて亢進しており、CNTFに対する反応性が亢進していることが確認された。さらに成体においては、ヘテロ欠失変異体(gab^<+/->)の側脳室周囲に存在している神経幹細胞の数を、neurosphere法によって調べた結果、野生型に比べて約80%その数が増加していた。以上より、Gab1は(1)胎生期では主にオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖あるいは生存に必要であること、(2)GFAPの発現、つまりアストロサイトの分化においては抑制的に働くこと、(3)主に生後から成体に至るまでの、神経幹細胞の維持には負に作用していることが示唆された。神経発生過程における神経幹細胞の分化機構を明らかにすることを目的として、分化過程における特定の細胞を生きたまま同定することのできる抗体を作成した。胎生11日目のマウス胎仔期の終脳の細胞をラットに免疫し、約7000のハイブリドーマをクローン化した。
レーザによる任意組織における発癌モデル開発

赤外レーザ誘起遺伝子発現操作(IR-LEGO)法による各種組織における癌モデル作製を目指した。まず、レーザ照射の標的としての膵臓細胞を可視化したトランスジェニック(TG)メダカと、がん組織への血管浸潤を観察するため、血管可視化TG系統も作出した。次に、レーザにより発癌させるTG系統に関しては、ヒートショックで組み換え酵素Creを発現する系統は他の研究機関から入手予定で、Creの発現によって、構成的プロモーター制御下で癌遺伝子が誘導されるTG系統も作製中である。本研究では熱ショック遺伝子プロモーター支配下に部位特異的組換えを介して癌遺伝子を強制発現するトランスジェニック系統に対して、顕微鏡明視野下で観察できる各種臓器の構成細胞を標的に赤外レーザを照射し、標的細胞を起源とする癌をメダカ個体の任意臓器に発生させる。しかしながら、起源となる細胞種を予め特定しておくことも重要と考え、その細胞の可視化を考えた。まず、膵臓癌のモデルを想定して、膵管細胞に特異的な転写因子であるPTF1のメダカホモログをメダカゲノムデータベースよりマウスRTF1のアミノ酸配列データを元にBLAST検索し予測した。予測した配列データに特異的なプライマーを設計し、メダカ胚から抽出したRNAを用いRT-PCRによりクローニングし、メダカホモログの配列を決定した。さらに、クローニングした部分配列からRNAプローブを作製しWhole-mount in situ hybridizationで発現パターンの確認を行い、膵臓での発現を確認した。膵管特異的に同様に発現するPDX1等に関しても、上記と同様にしてメダカホモログのクローニング並びに発現パターンの確認を行った。一方、癌における血管新生および転移を観察するための血管可視化メダカ作製に向けて、血管内皮細胞分化マーカーであるFLT1(血管全体)、EFNB2(動脈)、EPHB4(静脈)を含むBACクローンをデータベースより見出し、NBRPより入手した。これらのBACを精製し大腸菌内での相同組換えによりcDNA部分を蛍光タンパク質の遺伝子配列に置換した。置換したBACをメダカ受精卵に微量注入法で導入したところ、血管特異的な蛍光タンパク質の発現が確認できなかったことから、それら遺伝子のプロモーター領域のクローニングに着手した。標的とする膵臓組織を可視化するために昨年度クローニングしたPTF1やPDX1、Insulin、Nestinのプロモーター(2kbp10kbp)の下流に蛍光タンパク質の遺伝子を繋いだコンストラクトを作製し、メダカ卵に微量注入法により遺伝子導入したところ、Insulin及びNestinのコンストラクトで膵臓組織特異的な蛍光タンパク質の発現が確認できた。その後、これらの個体を育て次世代での蛍光タンパク質の発現を確認したところ、Nestinで1系統、Insulinで2系統のトランスジェニックラインの樹立に成功した。一方、がん組織への血管浸潤を可視化するため血管可視化トランスジェニックラインの樹立に関しては、FLT1(血管全体)、EFNB2(動脈)、EPHB4(静脈)を含むメダカBACクローンに対して蛍光タンパク質の組換えを行い、シーケンシングにより設計通りに組換えに成功していることが確認できたが、これらのコンストラクトをメダカ卵に微量注入法により遺伝子導入しても血管での蛍光タンパク質の発現が確認できなかった。そこで、別の遺伝子としてfli1(血管全体)で同様にBACトランスジェニック作製を試みたところ、導入した約200個体中30個体で血管での蛍光タンパク質の発現が確認できた。また、赤外レーザにより発癌させる系統樹立に関しては、(1)ヒートショックプロモーター制御下でCreを発現する系統と(2)Cre発現によって、構成的プロモーター制御下で癌遺伝子が誘導される系統が必要であるが、(1)に関しては基生研の田中実研究室で作製に成功しておりこれを譲渡していただく手続きを進めている。(2)に関しては、現在、メダカβアクチンプロモーターの下流にloxPの2箇所およびそれらに挟まれた転写停止配列(STOP)からなるfloxed STOPカセット、さらにその下流にGFP-活性化Kras(KRasG12V)、SV40 largeT抗原を繋いだベクターも構築し、これを導入したTG(floxed STOP)メダカ系統も作製中である。まず、レーザ照射の標的とする膵臓組織を可視化するために、PTF1、PDX1、Nestin,insulinのメダカホモログをクローニングし、膵臓での発現を確認した。そこで、それぞれのプロモーター領域に蛍光タンパク質の遺伝子を繋いだコンストラクトを遺伝子導入したトランスジェニック(TG)メダカを作出したところ、P(insulin-2kb)-EGFPとP(Nestin-2kbp)-mOrangeを遺伝子導入した系統で膵臓特異的に蛍光タンパク質の発現を確認した。P(insulin-2kb)-EGFPTGメダカは2系統、P(Nestin-2kbp)-mOrange TGメダカは1系統の樹立に成功した。

一方、がん組織への血管浸潤を可視化するため、血管可視化TG系統の樹立に関しては、メダカFLT1、EFNB2、EPHB4を含むメダカBACクローンを精製し、cDNA部分を蛍光タンパク質の遺伝子配列に置換した。このBACをメダカ受精卵に導入したところ、血管での発現は認められなかった。そこで、fli1で同様にBAC TG系統の作製を試みたところ、血管での蛍光タンパク質の発現が確認できた。赤外レーザにより発癌させるTG系統樹立に関しては、1ヒートショックプロモーター制御下でCreを発現する系統と2Cre発現によって、構成的プロモーター制御下で癌遺伝子が誘導される系統が必要であるが、1に関しては他の研究機関から入手予定で、2に関しては、現在、メダカβアクチンプロモーターの下流にloxPの2箇所およびそれらに挟まれた転写停止配列(STOP)からなるfloxed STOPカセット、さらにその下流にGFP-活性化Kras(KRasG12V)、SV40 largeT抗原を繋いだベクターも構築し、これを導入したTG(floxed STOP)系統も作製中である。Cre発現で癌遺伝子が誘導されるベクター構築に遅れを生じているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。遅れを生じているベクター構築に注力し、トランスジェニック系統樹立に専念する。
生活習慣と排便状況の関係：腸内細菌叢のみえる化による新しい疾病予防の検討

本研究では、包括的な糞便評価のための例示的なカードツールを開発し検証した。38人の健康な成人において、カードツールを用いた便の体積、形態、色、および臭いの観察は、体重計、水分計、硬度計、比色計、および臭気測定装置を用いて決定された実際の便の客観的特徴と比較された。便モデル(2cm×10cm)の数と実際の体重との間に有意な正の相関(ρ= 0.778)が観察された。ブリストル便形態尺度は、含水量(ρ= 0.717)と有意な正の相関、ならびに糞便硬度(ρ= ー0.843)および接着性(ρ= ー0.761)との負の相関を示した。カラーカードツールを使用した観察判断の間で、便のL*a *b *色空間値は大きく異なった。臭気の観察と測定された臭気指数との間に有意な相関は観察されなかった。結論として、糞便の量、形、および色は、多面的な評価カードツールを使用した観察によって推定できる。健康な日本人の生活習慣、腸内細菌叢、疾患発症との相互関係を明らかにすることを目的とした横断的研究を実施した。2080歳までの男女を722名を研究対象者とした。腸内細菌叢のシークエンスは16S-rRNA法で解析した。生活習慣、疾病罹患状態、糞便状態などのメタデータも収集した。糞便状態は本研究で開発した多面的な評価カードツールで評価した。細菌群集構造(Bray-Curtis指数)とメタデータとの関連をステップワイズ回帰で分析した結果、19項目が関連し、最も強い要因はコホートの違い(現居住地域)で、運動習慣、座位時間、睡眠時間、食事要因に加え、習慣的な排便頻度や採便当日の糞便の形状・色・量など、複数の排便・糞便状況が関連していた。19項目により細菌群集構造の個人差の7.3%が説明された。以上の結果から、糞便状態の多面的観察評価から、腸内細菌叢のみえる化の可能性が示唆された。糞便は、日々の生活において観察可能なものである。古くから一般的に糞便は日常的な健康状態を反映するバロメーターであると言われているものの、これまで排便状況や糞便の状態と生活習慣や疾患との関わりについて科学的に証明した研究は少なく、また糞便を客観的に評価する方法などは確立されていない。そこで、糞便の状態を客観的かつ簡便に把握するツールを研究・開発することは非常に重要である。平成28年度は、先行研究を基に開発した「排便状況および糞便の状態に関する質問票(糞便状態評価ツール)」の妥当性を検討することを目的とした。38名の健康な成人を対象とし、便の量、便の色、形、においなどの主観的評価を実際の便(妥当基準)を秤量計、水分計、色彩色差計、臭気測定器を用いた測定し、比較した。排便者の回答した便モデルの本数(直径2cm×長さ10cm)と秤量法による糞便の実測重量は、有意な正の相関(r=0.778, p<0.001)が認められ、本モデルによる便量の推定がある程度可能であることが示唆された。また排便者によって分類されたブリストル便形状スケール(Bristol Stool Form Scale)と、実際の糞便の水分含有量の比較を行ったところ、有意な正の相関(r= 0.691, p<0.001)が認められた。ブリストルスケールに基づいた糞便の形状は、水分量と高い相関が認められ、先行研究(Blake et al, 2016)の結果とほぼ一致した。またクリープメーターを用いて、便の硬さや付着性(粘稠度)を測定する方法を確立した。より詳細な便の特徴をとらえることが可能となる。さらに糞便の色および臭気について、主観的評価との相関は比較的良好な一致率が得られた。以上より、「糞便状態評価ツール」の妥当性は比較的良好であり、本ツールを用いることで糞便状態をある程度推定できる可能性が示唆された。排便者の栄養状態ならびに腸内細菌叢の特徴を反映する糞便の量・硬さ(水分量)・色といった便の特徴を、妥当性および再現性高くかつ簡便に評価することができる評価ツールを開発し、広く活用していくことを想定している。経過はおおむね順調に進展している。本検討結果をふまえて、改良版を作成し、排便量や形状、色、においが食事内容や生活習慣とどのような関連があるのかを視野に入れ、解析を進めている。目的:健常成人の糞便状態の観察評価のための糞便評価ツールの有効性を調べること。研究デザイン:糞便評価ツールを用いた糞便試料の容積、形態、色および臭気の観察評価を、健常成人38人の実際の糞便の客観的特徴と比較した。客観的測定は、計量秤、水分計、硬度計、色彩計、および臭気測定装置を用いて行った。結果:糞便モデル(直径2cm×長さ10cm)の数と糞便の実際の重量との間に有意な正相関(ρ= 0.778、p <0.001)が観察された。

さらに、便の形状の観察評価のためのブリストルスツールフォームスケールは、糞便の含水率(ρ= 0.691、p <0.001)と有意な正の相関を、糞便硬度(ρ= -0.843、p <0.001)および接着性(ρ= -0.761、p <0.001)と負の相関を示した。糞便のL*a *b *色空間値は、色見本との比較観察による色判定の間で有意に異なった(p <0.05)。匂いの観察評価と測定された匂い指数との間には有意な相関は観察されなかった。参加者と研究者の間の観察評価の一致度(κ係数)は、糞便の量(κ= 0.708、p <0.001)および色で(κ= 0.708、p <0.001)中程度の一致、糞便の形状で高い一致(κ= 0.887、p <0.001)、臭いで低い一致(κ= 0.243、p = 0.031)であった。結論:糞便評価ツールを用いた観察により、糞便の容積、形態および色を評価可能性であることが示唆された。社会実装:本研究で妥当性を検証した糞便評価ツールを「腸みえるシート」と命名し、商標登録を完了した。本年度の研究成果を英語論文に取りまとめ、学術誌に投稿した。本研究で開発した糞便評価ツールの名称、「腸みえるシート」を商標登録した。腸みえるシートを用いて大規模な疫学研究を開始した。以上の成果から、当初の計画以上に進展していると判断した。本研究では、包括的な糞便評価のための例示的なカードツールを開発し検証した。38人の健康な成人において、カードツールを用いた便の体積、形態、色、および臭いの観察は、体重計、水分計、硬度計、比色計、および臭気測定装置を用いて決定された実際の便の客観的特徴と比較された。便モデル(2cm×10cm)の数と実際の体重との間に有意な正の相関(ρ= 0.778)が観察された。ブリストル便形態尺度は、含水量(ρ= 0.717)と有意な正の相関、ならびに糞便硬度(ρ= ー0.843)および接着性(ρ= ー0.761)との負の相関を示した。カラーカードツールを使用した観察判断の間で、便のL*a *b *色空間値は大きく異なった。臭気の観察と測定された臭気指数との間に有意な相関は観察されなかった。結論として、糞便の量、形、および色は、多面的な評価カードツールを使用した観察によって推定できる。健康な日本人の生活習慣、腸内細菌叢、疾患発症との相互関係を明らかにすることを目的とした横断的研究を実施した。2080歳までの男女を722名を研究対象者とした。腸内細菌叢のシークエンスは16S-rRNA法で解析した。生活習慣、疾病罹患状態、糞便状態などのメタデータも収集した。糞便状態は本研究で開発した多面的な評価カードツールで評価した。細菌群集構造(Bray-Curtis指数)とメタデータとの関連をステップワイズ回帰で分析した結果、19項目が関連し、最も強い要因はコホートの違い(現居住地域)で、運動習慣、座位時間、睡眠時間、食事要因に加え、習慣的な排便頻度や採便当日の糞便の形状・色・量など、複数の排便・糞便状況が関連していた。19項目により細菌群集構造の個人差の7.3%が説明された。以上の結果から、糞便状態の多面的観察評価から、腸内細菌叢のみえる化の可能性が示唆された。便の硬さ、色、臭いなどの複合的な因子について主観的な評価と客観的な評価との関連を検証することは、今後の研究の発展に寄与すると考えられ、その重要性が示唆される。本ツールを使用することにより、排便者が自ら、客観的かつ簡便に、繰り返し自身の排便状況を把握することができる。便の状態は我々の食事・栄養摂取状況を反映し、また一部の疾患の罹患や発症とも関連することから、本ツールの利用により、健康状態の把握、疾患の早期発見などの効果が期待される。今後、この「糞便状態評価ツール」を用い、日本人の幅広い年齢における糞便の状態を調査し、糞便と様々な生活習慣や健康状態・疾患との関わりを多面的に解析する予定である。
中学校進学後20ヶ月の学校適応に及ぼす小学校高学年からの社会的スキル訓練の効果

中学校進学後に学校不適応が急増する現象(「中1ギャップ」)に対する予防策として、小学校高学年での社会的スキル教育の効果が、縦断的介入研究によって検討された。小学校高学年(6年)で行った社会的スキル教育による向上効果は、小学校在学中および中学校進学後8ヶ月から1年2ヶ月まで維持されることが確認された。しかし、同期間の、学校不適応についての指標において、効果は確認されなかった。不登校やいじめなどの学校不適応の発生率が、中学校に進学した後1年で急増する「中1ギャップ」の背景・主たる要因に、小学校後半から中学校1,2年にかけての同世代との人間関係形成と維持の困難と、それに必要とされる社会的スキルの獲得不足があると仮定し、その解消にむけた、社会的スキル教育の効果を確認することが本研究全体のねらいである。具体的には、<1>小学校6年秋期時点での、児童の社会的スキルの獲得状況が、中学校進学後のクラスおよび学校全体への適応感、および学校ストレス反応をどれだけ予測するか、比較的規模の大きい縦断的調査研究で検討すること、<2>介入研究として、小学校5・6年から中学校1年までに行う、社会的スキル訓練が、中学校進学後20ヶ月(中学2年の11月末まで)のクラス・学校適応感や学校ストレス反応の低減に及ぼす影響を、縦断的介入研究として実施し効果を検討すること、の2点を目的とする。平成18年度中は、小学校5年生から中学校2年までを対象とした、社会的スキル尺度(本人評定および教師評定)、学校適応尺度、学校ストレス尺度などを作成し、その信頼性、および妥当性が確認された。また、各学年における標準化も行われた。同時に調査対象中学校区の中学校と小学校に調査実施の依頼をすすめ、平成19年度からの、研究協力校の児童の社会的スキルの獲得状況および学校ストレス反応の測定について、調査協力を得た。他方で、介入研究の予備的調査として、小学校5・6年から中学校1年までに行う、社会的スキル訓練プログラムを、新潟県内の複数の研究協力校教諭に協力を仰ぎながら、また、県外の小中学校での実践活動、あるいは、当該領域の専門家の資料や助言を仰ぎながら、作成した。児童期における社会的スキル訓練、集団プログラムについてのプログラムについては、海外の資料も収集し検討した。不登校など学校不適応が中学校に進学した後1年で急増する「中1ギャップ」の背景・主たる要因に、小学校後半から中学校1,2年にかけての同世代との人間関係形成と維持の困難と、それに必要とされる社会的スキルの獲得不足があると仮定し、その解消にむけた、社会的スキル教育の効果を確認することが本研究全体のねらいである。平成19年度中は、小学校5年生から中学校2年までを対象とした、社会的スキル尺度(本人評定および教師評定)、学校適応尺度、学校ストレス尺度などを用いて、研究協力校の児童の社会的スキルの獲得状況および学校ストレス反応の測定について、調査を行った。同時に、小学校5・6年から中学校1年までに行う、社会的スキル訓練プログラムを、新潟県内の複数の研究協力校教諭に協力を仰ぎながら、実施した。また、県外の小中学校での実践活動、あるいは、当該領域の専門家の資料や助言の提供を受けつつ、作成した。平成20年度にむけた、データ解析についての資料も収集した。不登校など学校不適応が中学校に進学した後1年で急増する「中1ギャップ」の主たる要因に、小学校後半から中学校1,2年にかけての同世代との人間関係形成と維持の困難と、それに必要とされる社会的スキルの獲得不足があると仮定し、その解消にむけた、社会的スキル教育の効果を確認することが本研究全体のねらいである。平成20年度中は、平成19年度までの研究の継続および研究完成年度として、小学校5年生から中学校1年までに継続して行った社会的スキル訓練プログラムの成果を、社会的スキル尺度(本人評定および教師評定)、学校適応尺度、学校ストレス尺度などを用いて評価し、得られたデータの解析を行った。3年間で得られた結果について、先行研究を参照しながら、考察を加えた。また、本研究の中で開発された、教室での社会的スキル授業の進め方について、教育現場に提供可能な冊子の作成をすすめた。