hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コムギ春化要求性遺伝子Vrn-A1のイネゲノムを介したクローニング

1)イネの感光性遺伝子Hd6のホモログであるCasein Kinase IIα遺伝子(CKIIα)をコムギcDNAライブラリーからクローニングし,構造決定した。コムギCKIIα(tck2a:GenBank accession number AB052133)のORFは全長999bpからなり333のアミノ酸配列を推定した。これまでデータベース上で公開されているアラビドプシスのCKIIαとアミノ酸レベルで90.4%のホモロジーが認められた。また,ATP-binding siteとセリン/スレオニンプロテインキナーゼ活性部位は,ヒト等との間にも高い保存性が認められた。2)tck2aをプローブとしてコムギゲノムのサザンハイブリダイゼーションから,ゲノム中のコピー数と座乗染色体を同定した。少なくともABDの各ゲノム中に複数のコピーが推定された。このうち異数体を利用することで5A,5B,5D染色体からなる第5同祖群染色体上に1コピーずつ座乗することを特定した。3)tck2aの5A染色体上の座乗位置をRFLPマッピングにより同定した。tck2aは,Vrn-A1と1.1cMで連鎖する別の遺伝子であった。4)マーカー数とマッピング集団の数を増やして,Vrn-A1のmap-based cloningに向けて精密地図を作成した。Vrn-A1を含む4.5cMの領域に9マーカーの地図(平均マーカー間隔0.6cM)を作成した。木藤氏(岩手大学)の同定したオオムギで春化応答するESTsをオオムギ染色体連鎖地図上にRFLPマッピングした(Genome誌に投稿中)。コムギ5A染色体上のVrn-A1に対応するオオムギ5H染色体に春化に応答するESTを見出した。本年度の実績は以下の4つにまとめられる.1)コムギVrn-A1に連鎖する開花期を制御する2つの遺伝子座を検出し(Plant Breedingに一部を発表),これら3遺伝子座はいずれもイネの開花期を制御する短日反応性のHd6(Casein Kinase IIα)とは異なることを明らかにした.2)コムギVrn-A1を精密マッピングするため,実績1)で同定できた2遺伝子座を含む遺伝背景の効果を除外してVrn-A1座の効果のみを評価できるマッピング集団を戻し交雑により育成し,高度戻し交雑QTL解析を行っている.これまでに600系統からなるマッピング集団を育成し,ゲノミックDNAを抽出し終え,サザンハイブリダーゼーションによりRFLPマッピングを行っている.3)コムギからイネCasein Kinase IIαのホモグロをクローニングし構造解析と発現様式を明らかとするため,実績2)のマッピング集団の片親であるコムギの染色体置換系統Chinese Spring(Triticum spelta 5A)の幼苗期の全植物体からcDNAライブラリーを作成した.現在,イネで単離されたCasein Kinase IIαをプローブとしてスクリーニング中.4)オオムギで単離された春化処理に応答するEST(木藤ら,1998)29種を,コムギとオオムギの連鎖マップ上に位置付けた(1999,育種学研究1別冊2号p138).これらのESTのうちVrn-A1近傍にマップされた2クローンについて,現在Vrn-A1座との関連づけを行っている.1)イネの感光性遺伝子Hd6のホモログであるCasein Kinase IIα遺伝子(CKIIα)をコムギcDNAライブラリーからクローニングし,構造決定した。
小児慢性特定疾患児の在宅ケアに関する疫学的研究

全国174ケ所の児童相談所を対象に、心身障害児の在宅ケアに係る児童相談所活動の現状と問題点についてのアンケート調査を実施した。133ケ所から回答を得、回収率は76.4%であった。管内都市部人口の割合により、児童相談所を都市型、中間型、非都市型に分け、分析した都市型児童相談所と他型のそれとでは若干の差がみられた。例えば、個別訪問指導は都市型児童相談所よりも中間型、非都市型の方が実施率が高く、一方都市型では個別訪問所よりも所内活動の充実を指向していることが認められた。このことは、都市部での対象児数の規模の大きさや交通の利便さによるのかもしれない。また、都市型児童相談所では必要な条件整備としてデータベースの充実を揚げた割合が高かったが、このことは児童相談所の位置づけとして都市型児童相談所が他型に比し、地域における情報センターとしての役割を揚げた割合が高かったことと符号する。これらは都市部での対象児の把握が困難なことを示すものであろう。更に、非都市型では必要な条件整備として財政的支援を求める割合が高く、また、非都市型の中央児童相談所で職員の研修や関係者への情報提供を重視する傾向が認められ、非都市型でのこれらの面での立ち遅れが伺える。心身障害児の在宅ケアに関しての児童相談所の行政機関としての役割を聞いた結果、地域におけるネットワークの構築と関係機関間の調整(コ-デイネーター役)を揚げた割合が特に高く、このことは児童相談所活動の今後の方向を示すものと言えよう。以上、本調査結果は、今後、児童相談所が心身障害児の在宅ケアを推進していく上で十分参考になし得るものと考える。心身障害児の在宅ケアを推進するうえで、児童相談所がどのように関わっているか、またどのように関わるべきか等を調査する目的で、全国174か所の児童相談所を対象にアンケート調査を実施し、133か所から回答を得た。回収率は76.4%であった。アンケート調査票の内容は心身障害児の在宅ケアに関する相談内容別件数や在宅ケア推進のため児童相談所の役割や問題点、親の会や地域協議会の設置の有無など12項目である。その他心身障害児の在宅ケアに関し、管内で保健、医療、福祉の連携をどのように進めたらよいか、について各児童相談所の意見を聞いた。相談内容別相談件数では、経済給付が最も多く全件数の32%を占め次いで施設入所、療育支援と続いている。障害別では精神薄弱が最も多く半数近くを占め、次いで言語障害が多かった。児童相談所の主たる役割については公的助成の判定と他行政機関との連絡が20%を越えており、次いで集団巡回指導や家庭訪問支援、療育法指導が1514%であった。在宅ケア推進のネックとしてはスタッフ定員の不足がもっとも多く次いで専門知識等の不足、予算の不足等があげられた。その他、必要な条件整備としては、要員定数の増が29%、職員の研修の強化が20%であった。その他の項目についても今後分析を行うが、特に平成6年度においては、各児童相談所を都市型、中間型、非都市型の3型に分類し各型別にこれらの調査結果を詳細に分析し、心身障害児の在宅ケアを推進するための社会システムを構築するうえでの基礎資料を得る計画である。全国174ヵ所の児童相談所を対象に、心身障害児の在宅ケアに係る児童相談所活動の現状と問題点についてのアンケート調査を実施した。133ヵ所から回答を得、回収率は76.4%であった。管内都市部人口の割合により、児童相談所を都市型、中間型、非都市型に分け、分析した。都市型児童相談所と他型のそれとでは若干の差がみられた。

例えば、個別訪問指導は都市型児童相談所よりも中間型、非都市型の方が実施率が高く、一方都市型では個別訪問所よりも所内活動の充実を指向していることが認められた。このことは、都市部での対象児数の規模の大きさや交通の利便さによるのかもしれない。また、都市型児童相談所では必要な条件整備としてデーターベースの充実を揚げた割合が高かったが、このことは児童相談所の位置づけとして都市型児童相談所が他型に比し、地域における情報センターとしての役割を揚げた割合が高かったことと符合する。これらは都市部での対象児の把握が困難なことを示すものであろう。更に、非都市型では必要な条件整備として財政的支援を求める割合が高く、また、非都市型の中央児童相談所で職員の研修や関係者への情報提供を重視する傾向が認められ、非都市型でのこれらの面での立ち遅れが伺える。心身障害児の在宅ケアに関して児童相談所の行政機関としての役割を聞いた結果、地域におけるネットワークの構築と関係機関間の調整(コーディネーター役)を揚げた割合が特に高く、このことは児童相談所活動の今後の方向を示すものと言えよう。以上、本調査結果は、今後、児童相談所が心身障害児の在宅ケアを推進していく上で十分参考になし得るものと考える。
表面プラズモン共鳴型水晶発振子の開発と複雑系生体分子間相互作用の定量化

本研究の目的は、水晶発振子の金電極上に回折格子を付加することにより、水晶振動現象と表面プラズモン共鳴現象の同時観察することのできるセンサー・デバイスを作製し、構造変化の伴う複雑系の生体分子間相互作用を定量的に解析することにある。今年度の研究により以下の成果を得た。1)水晶発振子にインピーダンス・アナライザーをつなぎ、物質が結合したことによる振動数変化を等価回路のパラメーターとして抵抗値(R)、インダクタンス(L),キャパシタンス(C)の3つの変数としてエネルギー損失値(ΔD)を測定できる装置を完成した。インダクタンス(L)は物質の結合量を表し、表面プラズモン共鳴の屈折率変化と対応するので、差し引いた抵抗値(R)は結合した物質の柔らかさを反映し、振動数変化と屈折率変化を同時に測定することにより、結合した物質の重さと柔らかさが同時に測定できる。2)ガン抑制因子として働くタンパク質p53は、細胞が外界から有害な刺激を受けたときにp53の働きを活性化するためC末端側のアミノ酸がリン酸化をうけ、構造変化して4量体形成ドメインを形成する。これにより、DNA結合能を獲得して転写制御因子として働くことが知られている。この事を利用して、水晶発振子上にp53タンパク質を固定化し、核内物質を添加したときにp53タンパク質のコンフォメーションが変化するのを水晶発振子のエネルギー損失値として算出することができた。この系は、タンパク質のコンフォメーション変化を経時的に検出する装置として一般化できる可能性がある。今年度の研究により以下のような成果を得た。1)水晶発振子の金基板上に572nmのレーザー光を照射することにより、金基板上に物質が結合したことにより、レーザー光の反射角度が変化することがわかった。2)水晶発振子にネットワーク・アナライザーをつなぎ、物質が結合したことによる振動数変化を等価回路のパラメーターとして抵抗値(R)、インダクタンス(L),キャパシタンス(C)の3つの変数として測定する事ができた。インダクタンス(L)は物質の結合量を表し、表面プラズモン共鳴の屈折率変化と対応するので、差し引いた抵抗値(R)は結合した物質の柔らかさを反映し、振動数変化と屈折率変化を同時に測定することにより、結合した物質の重さと柔らかさが同時に測定できた。3)L値の変化から、レーザー光の照射により金基板上の水分子や結合した分子が可逆的に脱離することがわかった。4)これらの成果を元にすれば、表面プラズモン共鳴型の水晶発振子装置の開発が可能になるめどが付いた。1.水晶発振子にネットワーク・アナライザーをつなぎ、物質が結合したことによる振動数変化を等価回路のパラメーターとして抵抗値(R)、インダクタンス(L),キャパシタンス(C)の3つの変数として測定する事が出来た。インダクタンス(L)は物質の結合量を表し、表面プラズモン共鳴の屈折率変化と対応するので、差し引いた抵抗値(R)は結合した物質の柔らかさを反映し、振動数変化と屈折率変化を同時に測定することにより、結合した物質の重さと柔らかさが同時に測定出来た。2.具体的には、ガン抑制因子として働くタンパク質p53は、C末端側の4量体形成ドメイン領域が通常ランダム・コイル構造をしているが、細胞が外界から有害な刺激を受けたときにp53の働きを活性化するためC末端側のアミノ酸がリン酸化をうけ、構造変化して4量体形成ドメインを形成する。

これにより、DNA結合能を獲得して転写制御因子として働くことが知られている。こうした一連のイベントを試験管内で再現し、i)タンパク質の構造変化、ii)タンパク質-タンパク質間相互作用、iii)タンパク質-DNA複合体形成を経時的に観察し、タンパク質の構造変化がDNAへの結合能や転写活性にどのような効果があるかがあるかを定量化することに成功した。本研究の目的は、水晶発振子の金電極上に回折格子を付加することにより、水晶振動現象と表面プラズモン共鳴現象の同時観察することのできるセンサー・デバイスを作製し、構造変化の伴う複雑系の生体分子間相互作用を定量的に解析することにある。今年度の研究により以下の成果を得た。1)水晶発振子にインピーダンス・アナライザーをつなぎ、物質が結合したことによる振動数変化を等価回路のパラメーターとして抵抗値(R)、インダクタンス(L),キャパシタンス(C)の3つの変数としてエネルギー損失値(ΔD)を測定できる装置を完成した。インダクタンス(L)は物質の結合量を表し、表面プラズモン共鳴の屈折率変化と対応するので、差し引いた抵抗値(R)は結合した物質の柔らかさを反映し、振動数変化と屈折率変化を同時に測定することにより、結合した物質の重さと柔らかさが同時に測定できる。2)ガン抑制因子として働くタンパク質p53は、C末端側の4量体形成ドメイン領域が通常ランダム・コイル構造をしているが、細胞が外界から有害な刺激を受けたときにp53の働きを活性化するためC末端側のアミノ酸がリン酸化をうけ、構造変化して4量体形成ドメインを形成する。この事を利用して、水晶発振子上にp53タンパク質を固定化し、核内物質を添加したときにp53タンパク質のコンフォメーションが変化するのを水晶発振子のエネルギー損失値として算出することができた。この系は、タンパク質のコンフォメーション変化を経時的に検出する装置として一般化できる可能性がある。
リアルタイム双方向情報処理システムを用いた動物の行動解析

本研究の目的は、メダカなど動物の社会性行動の発現メカニズムを明らかにすることにある。そのために本物そっくりな外見と動きをもつバーチャル(VR)動物との対面実験を行い、社会性行動を引き起こす視覚的な要因を明らかにした。コンピュータグラフィクスの利点を活かして、形・色・動きを操作したVRメダカを作成し、本物のメダカとの対面実験を行った結果、メダカはすべての視覚パラメータを統合的に利用して同種他個体の認識を行っていることが示唆された。同システムでの共同研究も成功し、さらに次期プロジェクトの一環として深層学習を利用した視覚認知実験も行った。本研究プロジェクトは、小型魚類(メダカ)の行動解析に計算機を用いたリアルタイム双方向情報処理システムを取り入れ、メダカの群れ形成における相互作用の重要性、群れ形成に関わる視覚情報、および視覚情報の数理モデルを解明するすることを目的とする。平成26年度においては、視覚刺激提示として使用するメダカの3Dアニメーションの作成を行い、完成した3Dアニメーションの提示によるメダカの群れ形成を引き起こす要因の探索を行った。メダカの3Dモデルは、3Dポリゴンに写真テクスチャーを貼り付ける形で作製した(ソフトは3dsMax)。テクスチャーはメダカ6個体分を用意し、動物の個性にも対応した。この3Dモデルに実際のメダカの運動トラッキングデータを組み込み、3Dアニメーションを完成させることに成功した(ソフトはBlender)。次に、完成した人工メダカの形状や色や運動様式を変化させることで、メダカの群れ形成を引き起こす要因の探索を行った。結果、いずれのパラメータもメダカの群れ形成を引き起こす要因になっていることが明らかになった。この結果は、メダカが同種認識をする際の高度な認知機構を示唆している。本業績は、The Sixth International Symposium on Aero Aqua Bio-Mechanisms(Honolulu, Hawaii)、第37回日本神経科学学会(横浜)、第74回日本動物心理学会(愛知)で発表した。学術雑誌での発表は現在準備中である。本研究プロジェクトは、小型魚類の行動解析実験に最先端のリアルタイム双方向情報処理システムを取り入れ、小型魚類の群れ形成における個体間相互作用の重要性を明らかにし、群れ形成に関わる視覚情報とその数理モデル化を目指している。平成27年度としては平成26年度に作製をしたメダカの3Dアニメーションをメダカに提示することで群れ形成に関わる視覚情報を抽出する解析をさらに推し進めた。その結果メダカは同種他個体の動きの中でも特に大局的な運動に強く惹きつけられることが明らかとなった。本業績は、第38回日本神経科学学会(神戸)、第75回日本動物心理学会(東京)、Behaviour2015(オーストラリア)で発表した。さらに平成27年度としてはリアルタイム双方向システムの技術開発を進展させ、運動立体視を利用してキンギョ水槽中にバーチャルな障害オブジェクトを創り出すことに成功した。キンギョは実体としては存在しないバーチャルな障害を避けるような行動を示した。この成果は、第78回情報処理学会全国大会(横浜)にて報告を行った。現在の段階は、リアルタイム双方向情報処理システムに使用予定の小型魚(メダカ)の3Dアニメーションと運動立体視を利用したリアルタイムトラッキングシステムがほぼ完成をした。さらに、このメダカの3Dアニメーションが、実際にメダカを十分に惹きつける能力を持っていること、色や形や動きが変容するとメダカを惹きつける能力が弱まることが明らかとなった。この実験結果は3Dアニメーションの性能の高さを示しいる。またリアルタイムトラッキングシステムも、現実には存在しないバーチャルな立体物の構築に成功しており、これが小型魚にも応用可能であることを示した。研究プロジェクトは順調に推移していると言える。本研究プロジェクトは、小型魚であるメダカの行動解析にリアルタイム双方向情報処理システムを導入し、メダカの群れ形成における個体間相互作用の重要性を明らかにし、群れ形成に関わる視覚情報とその数理モデル化を目指している。平成28年度は平成27年度の行ったメダカの3Dアニメーション(バーチャルメダカ)の提示実験を総合的に実施した。具体的には、バーチャルメダカの形状、色、動き(局所的な動きと大局的な動きの2種)の4つのパラメータを軸に、単独でパラメータを変化させた場合、複数のパラメータを変化させた場合に分けて、それを知覚したメダカの社会的行動の観察を行った。その結果、メダカは同種他個体の形状、色、動きのすべてのパラメータを参照にして認識を行っていることが判明した。動きでは特に大局的な運動に強く惹きつけられることが明らかとなった。本業績は、第39回日本神経科学学会(神奈川県横浜市)で発表した。さらには、国際学術誌(PLosONE誌)でも発表を行った。さらに平成28年度はリアルタイム双方向システムの技術開発を完成させるいことにも注力した。運動立体視を利用して水槽中にバーチャルな動物プランクトンを創り出すことに成功した。メダカの3Dアニメーションによるバーチャル動物を使った実験は、ほぼ完成の域に達し、国際誌への発表として結実した。さらには同技術を応用した共同研究が複数同時に走っている。そのうちのひとつの共同研究は論文投稿までの段階に来ている。本システムは今後さらなる発展が期待できる。リアルタイム双方向情報処理システムに関しては、運動立体視を利用したリアルタイムトラッキングシステムがほぼ完成をした。リアルタイム双方向情報処理システムでは、現実には存在しないバーチャルな立体物の構築に成功しており、さらには小型魚の餌となる動物プランクトンの構築にも成功している。

また先行的な研究によって、これが小型魚にも応用可能であることを示した。研究プロジェクトは順調に推移していると言えるが、残念ながら当初予定していたリアルタイム双方向情報処理システムによる本実験は未だに達成できていない。そこで本プロジェクトを継続課題とし了承を得るに至った。本研究プロジェクトの目的は、メダカなど集団で生活をする動物の社会性行動の発現メカニズムを明らかにすることにある。そのために本物そっくりな外見と動きをもつバーチャル(VR)動物との対面実験を行い、VR動物の各種パラメータを操作することによって、社会性行動を引き起こす視覚的な要因を明らかにする。本年度は最終年度にあたり、主として論文報告のための詰めの実験及び論文発表を行った(PLos ONE誌)。コンピュータグラフィクスの利点を活かして、形・色・動きを操作したVRメダカを作成し、本物のメダカとの対面実験を行った。結果、メダカはすべての視覚パラメータを統合的に利用して同種他個体の認識を行っていることが示唆された。さらに、同システムを広く応用していくために、基礎生物学研究所の客員部門の吉村研究室との共同研究を行い、これも論文としての報告を行った(Nature Communication誌)。メダカは季節性の動物であり、季節によって行動パターンを変えることが知られている。本研究では、その原因として視覚的な要因が大きな影響を与えていることが示唆された。また、次期プロジェクトの一環として、深層学習を利用した視覚認知実験も行い、これも論文としての報告を行った(Frontiers in Psychology誌)。深層学習機に大脳モデルのひとつである予測符号化理論を組み込み、ヒトや魚が知覚すると報告されている蛇の回転錯視を基準にして正しく錯視として知覚するかどうかを検証した。結果、深層学習機は左右の回転、あるいは無回転の知覚を正確に再現することに成功した。今後、本研究で提案した逆心理学が幅広い分野に浸透していくと期待している。いずれの研究もプレス発表を行い、新聞報道や雑誌などで大きな反響を得た。本研究の目的は、メダカなど動物の社会性行動の発現メカニズムを明らかにすることにある。そのために本物そっくりな外見と動きをもつバーチャル(VR)動物との対面実験を行い、社会性行動を引き起こす視覚的な要因を明らかにした。コンピュータグラフィクスの利点を活かして、形・色・動きを操作したVRメダカを作成し、本物のメダカとの対面実験を行った結果、メダカはすべての視覚パラメータを統合的に利用して同種他個体の認識を行っていることが示唆された。同システムでの共同研究も成功し、さらに次期プロジェクトの一環として深層学習を利用した視覚認知実験も行った。
マウス発生過程における血管内皮細胞のダイナミクス

近年、血管内皮細胞と平滑筋細胞が胚性幹(ES)細胞由来の血管内皮前駆細胞から分化することが示された。また発生学的な解析によりリンパ管は血管(静脈)から発芽する形で形成してくるという説が提唱されている。以上から分化した血管内皮は安定な構造ではなくリンパ管内皮細胞へと再分化する能力を持つ動的な構造であることが予想される。そこで本研究において申請者はES細胞からの血管分化系を用いて、血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞などへと分化するダイナミクスを司る機構を、分子生物学的・生化学的なレベルでの解明を試みる。本年度は主にProx1に焦点を当てて解析を進めた。近年の発生生物学の知見によりリンパ管が静脈から分化する過程においてまずLYVE-1というリンパ管マーカーが発現し、続いてLYVE-1発現領域の一部に発現するProx1というホメオボックス転写因子がさまざまな遺伝子発現の調節をすることによりリンパ管内皮前駆細胞が分化することが示されている。血管内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化におけるProx1の役割を検討するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)にアデノウィルスによりProx1を発現させて、その効果を分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて解析した。リンパ管内皮細胞マーカーであるVEGFR-3とPodoplaninの発現が亢進し、血管内皮細胞マーカーであるVEGFR-2とVE-cadherinの発現が減少した。またProx1によりHUVECsの増殖とVEGF-Cに対する走化性が亢進した。リンパ管の発生においてProx1陽性細胞が静脈から発芽し、VEGF-Cへと遊走する現象が観察される。以上の結果からProx1は遺伝子発現調節を介して細胞の増殖とVEGF-Cへの遊走能を亢進させることでリンパ管発生を進めることが示された。脊椎動物はその循環器系として閉鎖血管系とリンパ系を持ち、酸素や栄養の供給と老廃物の廃棄ならびに末梢組織からの水分や異物の吸収を行っている。個体発生において、これらの血管網は全身のほとんど全ての組織の形態形成にも重要な役割を果たしており、血管発生機構の解明は個体発生を理解する上で重要課題である。血管系は内層の血管内皮細胞とその周囲の壁細胞(血管平滑筋細胞または周皮細胞)からなり、リンパ系は主にリンパ管内皮細胞からなる。血管内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化におけるProx1の役割を検討するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)にアデノウイルスによりProx1を発現させて、その効果を分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて解析した。以上の結果からProx1は遺伝子発現調節を介して細胞の増殖とVEGF-Cへの遊走能を亢進させることによりリンパ管発生を進めることが示唆された。

リンパ管内皮細胞マーカーであるVEGFR-3とPodoplaninの発現が亢進し、血管内皮細胞マーカーであるVEGFR-2とVE-cadherinの発現が減少した。またProx1によりHUVECsの増殖とVEGF-Cに対する走化性が亢進した。リンパ管の発生においてProx1陽性細胞が静脈から発芽し、VEGF-Cへと遊走する現象が観察される。以上の結果からProx1は遺伝子発現調節を介して細胞の増殖とVEGF-Cへの遊走能を亢進させることでリンパ管発生を進めることが示された。
遺伝的相補性に基ずく口腔扁平上皮癌発生に関与する遺伝子単離の試み

ヒト第3染色体のSubchromosomal Transferable Fragments(STFs)クローン16種類を作製し、それらの内、6種類の細胞株のヌードマウスに対する造腫瘍性について検討した。その結果、ヒト第3染色体がほぼ全体が移入されていたA9(neo3B)細胞だけの造腫瘍性が著しく抑制されていた。一方、A9(neo3A)細胞もA9(neo3B)細胞と同様にヒト第3染色体ほぼ全体が移入されていたが、造腫瘍性は抑制されていなかった。2.DNAレベルにおける解析A9(neo3A)及びA9(neo3B)細胞を対象に染色体解析、染色体ペインティング法を用いて解析を行ったが、両細胞株に移入されたヒト第3染色体に大きな構造異常や欠失は認められなかった。また、ヒト第3染色体上のマイクロサテライト・マーカーを用いた解析においても両細胞株のヒト第3染色体に差は認められなかった。従って、両細胞株の造腫瘍性の相違は、移入されたヒト第3染色体の構造やDNAレベルにおける相違によるものではなく、ヒト第3染色体上に位置しているある遺伝子の発現の相違が関与していると思われた。ヒト第3染色体上により、造腫瘍性が抑制されたA9(neo3B)細胞において強く発現しており、抑制されなかったA9(neo3A)細胞において発現が低下あるいは消失している遺伝子を同定・単離することを目的にSSH法を用いた解析を行った。現在解析中でありまだ遺伝子の単離に至ってはいない。4.口腔癌臨床検体・細胞株における第3染色体の構造異常臨床検体・細胞株ともに第3染色体短腕部の構造異常が認められ、同染色体上の遺伝子の機能消失が口腔癌の発生・進展に深く関わっていることが示唆された。A9(neo3)細胞(マウスfibrosarcoma由来の細胞株:A9細胞にpSV2neo遺伝子で標識されたヒト正常第3染色体を1本だけ移入した雑種細胞株)にγ線を4,8,16Gy照射し、染色体をランダムに切断し、それらをG418選択培地にて培養した。生き残った細胞はすべてヒト第3染色体に由来する染色体断片を含んでおり、それらから微小核を作り、A9細胞に移入し合計16種類のSTFsクローンを得た。2)STFsクローンのスクリーニングQバンド分染法による染色体解析及びヒト第3染色体を特異的に染色するプローブを用いた染色体ペインティング法により、移入された染色体断片の大まかなサイズを決めた。また、ヒト第3染色体上に位置している54種類のマイクロサテライト・マーカーを用い、染色体断片の領域を決めた。3)STFsクローンのヌードマウスに対する造腫瘍性に関する検討A9細胞と2種類のA9(neo3)細胞:A9(neo3A)及びA9(neo3B)、4種類のさまざまな大きさのヒト第3染色体断片を持つSTFsクローンをヌードマウスの皮下に注射し、それぞれの細胞の造腫瘍性について検討した。その結果、A9(neo3A)及び4種類のSTFsクローンは親株であるA9細胞とほぼ同様の造腫瘍性を呈したのに対し、A9(neo3B)細胞の造腫瘍性だけが著しく抑制されていた。現在、A9(neo3B)細胞の抑制の機序に関して解析中である。前年度、ヒト第3染色体のSubchromosomal Transferable Fragments(STFs)クローン16種類を作製し、それらの内6種類の細胞株のヌードマウスに対する造腫瘍性を検討した。

その結果、ヒト第3染色体ほぼ全体が移入されたA9(neo3B)細胞のみ造腫瘍性が著しく抑制されていた。一方、同様にほぼ全体が移入されていたA9(neo3A)細胞では造腫瘍性は抑制されなかった。本年度は、これら両細胞の造腫瘍性の相違をDNA及びRNAレベルで解析し、ヒト第3染色体に存在していると思われる癌抑制遺伝子の同定を試みた。同時に、口腔癌臨床検体及び細胞株を用いて第3染色体短腕の構造異常について解析した。1.DNAレベルにおける解析A9(neo3A)及びA9(neo3B)細胞を対象に染色体解析を行ったが、両細胞株に移入されたヒト第3染色体に大きな構造異常や欠失は認めなかった。また、ヒト第3染色体上のマイクロサテライト・マーカーを用いた解析においても両細胞株のヒト第3染色体に差は認めなかった。従って、両細胞株の造腫瘍性の相違は、移入されたヒト第3染色体の構造やDNAレベルにおける相違によるものではなく、ヒト第3染色体上に位置する遺伝子の発現の相違が関与していると思われた。ヒト第3染色体上より、A9(neo3B)細胞で強く発現し、A9(neo3A)細胞で発現低下あるいは消失する遺伝子を同定・単離することを目的にSSH法を行ったが,現在解析中であり遺伝子の単離に至っていない。3.口腔癌臨床検体・細胞株における第3染色体の構造異常臨床検体・細胞株とも第3染色体短腕部の構造異常が認められ、同染色体上の遺伝子の機能消失が口腔癌の発生・進展に関わっていることが示唆された。
摂食による末梢感覚組織の遺伝子発現応答の計測および味覚神経伝達回路網の可視化観察

本申請研究は、味細胞と感覚神経細胞の特性を解明し、そこから得られた知見に基づき末梢入力系を可視化するトランスジェニック(tg)動物の作製と解析を行うものである。味細胞側に関しては、味受容体や下流の情報伝達系因子など細胞種特異的に発現する遺伝子のプロモーターを利用して、GFPなどの蛍光性タンパク質により細胞を標識し、細胞種別の遺伝子発現特性を解明する。味神経側に関しては、どれが味神経細胞であるのかを解剖学的・分子神経化学的に特定することが不可能であることから、味神経細胞が存在する神経節の遺伝子発現特性の解明から開始し、味神経細胞特異的遺伝子の同定と、それらの遺伝子のプロモーターを用いたtgマウスを作製し、味細胞とのシナプス形成機構を分子遺伝学的に解明することを目標としている。現在までに、味蕾および末梢感覚神経節のDNAマイクロアレイ実験は完了しており、比較対照組織のデータを併せて、味蕾および末梢感覚神経節の遺伝子発現特性を詳細に解析している途上である。味蕾において、味刺激受容後の味細胞内シグナリングに関与する新たな遺伝子を同定したほか、多様な味蕾細胞の分化に関与しうる候補因子を複数同定し、新たな研究の萌芽を得た。末梢感覚神経節においては、2種の遺伝子の発現様式から味神経のみを同定しうる可能性を見出した。これらの遺伝子の発現制御領域を用い、味神経のみを標識するtgマウスの作出を試みている。一方、特定の味細胞を蛍光標識したtgマウス作製を試みは、嗜好的味覚受容体T1R3の転写制御下でEGFPをレポーターとして発現させることに成功した。このマウスと上述の味蕾特異的遺伝子から嗜好的味覚受容細胞の遺伝子発現特性を解析し、これまでに複数の嗜好的味覚受容細胞特異的な発現を示す遺伝子を同定している。本申請研究の遂行により、新たな知見とそれに基づく多数の味覚研究の端緒が得られた。本申請研究は、味細胞と感覚神経細胞の特性を解明し、そこから得られた知見に基づき末梢入力系を可視化するトランスジェニック動物の作製と解析を行うものである。味神経側に関しては、どれが味神経細胞であるのかを解剖学的・分子神経化学的に特定することが不可能であることから、味神経細胞が存在する神経節の遺伝子発現特性の解明から開始し、味神経細胞特異的遺伝子の同定と、それらの遺伝子のプロモーターを用いたトランスジェニックマウスを作製し、味細胞とのシナプス形成機構を分子遺伝学的に解明することを目標としている。現在までに、味蕾および末梢感覚神経節のDNAマイクロアレイ実験は完了している。比較対照組織のデータを併せて、味蕾および末梢感覚神経節の遺伝子発現特性を詳細に解析しているところである。また、味細胞特異的遺伝子、具体的には嗜好的味覚受容体T1R3および忌避的味覚受容に関与するガストデューシン(Ggust)、のプロモーターの下流に、レポーターとしてEGFPおよびDsRed2を連結し、味細胞を蛍光標識したトランスジェニックマウスの作製を試みた。しかし、これまでに適切な個体を得るには至っておらず、継続してトランスジェニックマウスの作製を試みる予定である。
T-DNAラインの物性フェノーム解析によるシロイヌナズナのゲノム機能解明

シロイヌナズナ純系T-DNA挿入ラインを対象として、胚軸の物性を形質指標とするフェノーム解析を行った。網羅的な解析の結果、従来は関与が全く考えられていなかった新規遺伝子多数が、物性制御において重要な働きをすることがわかった。また、物性変化を生ずる可能性が高い遺伝子のラインを対象とした選択的な解析により、これらの遺伝子の機能が検証できた。さらに、成長形質と物性との変化の違いや生育環境による影響も明らかになり、植物の柔軟かつ複雑なゲノム機能制御の実態が示された。ABRCより3回に分けて提供されたシロイヌナズナ純系T-DNA挿入ラインを対象として、芽ばえの物性を形質指標とするフェノーム解析を実施した。先行研究(平成1719年度基盤研究(C))で確立したプロトコールにしたがって、24穴ウェルを用いて各ラインの芽ばえを効率的に生育させ、荷重-伸び解析法と応力緩和法を連続的に適用するプログラムにより、引っ張り試験機を用いて各々の胚軸の物性を解析した。本研究に用いた純系T-DNA挿入ラインには、発芽能力が全くないか非常に低い系統や、生育初期に芽ばえが枯死してしまう系統が予想外に多く含まれており、物性の解析を行うのに十分な数の測定データが実際に得られたラインは、全体の半分程度に留まった。発芽率の低さや生育状況の悪さが偶発的な要因によるのかどうかをチェックするため、実験は2回ずつ独立に行ったが、状態が悪い系統の生育状況はほとんど改善しなかった。したがって、それらのラインの物性解析は不可能と判断した。また、今年度の後半からは、解析効率を上げるため、荷重-伸び解析法と応力緩和法で得られる5種の物性パラメータのうち、全伸展性の解析に集中するようにプロトコールを変更した。現在までに胚軸の成長と全伸展性に関する解析が終了したラインを見ると、成長量に顕著な変化を示したラインは少なかったが、伸展性にはかなりの割合で変化が見られ、本研究の目的である物性を形質指標とするフェノーム解析の有効性が支持された。また、2回の独立した解析結果はお互いによく一致しており、結果の再現性が高いことも示された。前年度に引き続き、シロイヌナズナの純系T-DNA挿入ライン(ABRC CS27941,CS27942,CS27951,CS27952)を対象として、芽ばえの物性を形質指標とするフェノーム解析を実施した。解析には、種子セットの構成ラインをSALKNo.に沿って対象として行く網羅的なアプローチと、物性変化を生ずる可能性が高い細胞壁代謝、微小管の構築と機能、並びに細胞膜構成成分の合成と機能に関わる遺伝子のラインを対象とした選択的なアプローチの2つを併用した。前者に関しては、解析の効率を考慮して、物性を示す5つのパラメータのうち全伸展性のみを測定した。一方、後者の解析では、荷重-伸び解析法と応力緩和法を連続的に適用するプログラムを用いた。解析の進展に伴って、一部のラインでは種子の発芽率が保存中に急速に低下することが判明した。この現象がT-DNA挿入による遺伝子破壊に起因するかどうかを検証するため、入手以来、保管期間が3年を経過したCS27941及びCS27951をABRCより再度提供してもらい、追加解析を行った。両方のアプローチに共通して、成長速度に顕著な変化を示したラインは少なかったが、伸展性にはより高い割合で変化が見られた。ただし、物性変化を示すことが予想された後者の解析対象の中にも、全く成長速度や物性に変化を示さないラインが多く含まれており、遺伝子機能の欠損が他の遺伝子によって補償される現象が普遍的に存在することがわかった。また、本研究での基本的な培養条件である暗所、貧栄養下では、成長形質や物性がより安定的に制御されている可能性について、予備的に検討した。シロイヌナズナ純系TーDNA挿入ラインを対象として、芽ばえの物性を形質指標とするフェノーム解析を実施した。4つの種子セット(ABRC CS27941、CS27942、CS27951、CS27952)の構成ラインをSALKNo.に沿って選択する網羅的なアプローチと、物性変化を生ずる可能性が高い遺伝子のラインを対象とした選択的なアプローチの2つを併用した。前者のアプローチにより、従来の知見では物性制御に直接関与しないと思われていた新規遺伝子が複数同定された。ただし、これらのラインの多くでは成長形質には明瞭な変化がなかった。そこで、培養条件を変更して同様の解析を行ったところ、白色光下あるいは浸透ストレス条件下ではより高頻度で成長形質の変化が見られることがわかった。すなわち、本研究での基本的な培養条件である暗所、貧栄養下では、成長形質や物性がより安定的に制御されていることが明らかになった。

一方、後者の解析の結果、予想通り、細胞壁代謝、細胞骨格の構築と機能、あるいは細胞膜の機能に関わる遺伝子に関するラインでは、かなりの割合で物性が変化しており、これらの遺伝子が物性制御に関わることが明瞭に示された。また、重金属の取り込みや輸送・解毒に関与する遺伝子のラインでも、高頻度で物性や成長形質の変化が認められた。このように、本研究の結果、成長調節や環境応答に関わる既知の遺伝子の機能が検証されるとともに、物性制御を通してこれらの過程に影響する新規遺伝子群の存在が明らかになった。研究対象としたシロイヌナズナ純系T-DNA挿入ライン(ABRC CS27941,CS27942,CS27951,CS27952)には、発芽率が非常に低くて解析困難なラインが多く含まれており、その原因の解明に時間がかかっているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。発芽率が低い系統に関しては、ABRCより追加提供してもらった新規ロットを用いて再度解析する。また、本研究での基本的な培養条件である暗所、貧栄養下では、成長形質や物性がより安定的に制御されている可能性が示唆されたので、光及び浸透圧条件を変えた環境下で生育させた芽ばえを用いた解析も平行して実施する。
HIV感染に関連する口腔病変の発生に関する分子病理学的研究

1ヒトパピローマウイルス(HPV)が口腔疾患にどのぐらい関与しているかを知るために111例の検体についてSouthernプロットハイブリダイゼーション、PCR法でL1C1/L1C2とL1C/L1C2mプライマーを用いて検討した。病変は扁平上皮癌30例、白板症34例、乳頭腫9例、線維性ポリープ6例、エプーリス6例、正常は14例である。HPVは扁平上皮癌19.4%、白板症では20.6%であり、タイプとしては18型か88.5%で最も多く、またこれまで口腔病変では知られていない70型が新たに発見された。(Oral Med Pathol 1999;4:17-23)2扁平上皮癌80例、白板症26例、白板症中の初期癌10例を用い、TGF-β1、TGF-βRI、TGF-βRIIについて免疫組織化学、免疫電顕学的検索を行った。浸潤癌のTGF-β1は白板症および初期癌よりも強くみられた。一方、浸潤癌のTGF-βRI、TGF-βRIIは白板症と比べると、著明に減少した。初期癌ではTGF-β1の増加は認められなかったが、TGF-βRI、TGF-βRIIの減少がみられた。(Oral Med Pathol.4:55-61,1999.)3日本人のもつウイルス関連胃癌におけるEB-ウイルスのLMp2A遺伝子の発現とエクソン2.6.のシークエンス解析を行った。その結果塩基配列の突然変異が10個にみられ、そのアミノ酸レベルの変異は3つあった。特にコドン3と8の突然変異はセリンをスレオニンに変えるもので、これはEBVに特異的な細胞傷害性Tリンパ球結合エピトーブに関するものであった。(Virus Genes 19:2,103-111,1999)1 HIV感染に関連した口腔病変としてはカンジダ症がもっとも多いので、パラフィン包埋試料からPCRでCandida albicansを迅速に検出する方法を確立し、その結果は歯科基礎医学会誌に発表した。(Swe Swe Win論文)2ミャンマーのヤンゴン大学歯学部のSwe Swe Win博士、ベトナムのホーチミン大学歯学部のNauyen Thi Hong博士と「HIV感染者の口腔病変」というテーマで、それぞれの大学にてセミナーを行った。3 HIV感染者に扁平上皮癌が発生しやすいことが知られているが、このときどのような遺伝子の変異がおこるかをLOHで検索するための実験を行っている。4 HIV感染者にみられる毛状白板症の発生にはEpstein Barrウイルス(EBV)の関与が考えられているが、本学の白板症についてEBVを検索したところ、約40%という高率でPCRによりEBVが検出された。現在さらにIn situ hybridizationや免疫組織化学で検索を行っている。(Virus Genes 19:2,103-111,1999)
S1Pの腫瘍関連免疫細胞に与える影響および乳癌制御機構の解明

乳癌の転移過程において腫瘍微小環境は重要であり、その中でもT細胞やマクロファージ等の腫瘍関連免疫細胞(TAIC)が注目されている。スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞情報伝達物質として働く脂質メディエーターである。乳癌患者の腫瘍微小環境において、S1PがTAICに作用することで腫瘍免疫微小環境の形成に寄与し、癌の浸潤、転移や薬物療法の効果に影響を及ぼしている、という仮説を検証するために本研究を立案した。本研究では、動物実験及び患者検体の解析により、S1PのTAICに対する役割とその臨床的意義を明らかにし、脂質メディエーターを標的とした新たな乳癌治療の開発につながる研究基盤を構築する。
防風通聖散および大柴胡湯の肝発癌・肝線維化抑制効果の研究

防風通聖散(TJ-62)の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠TJ-62投与群は肝線維化および、肝発癌を有意に改善した。またマクロファージ系のサイトカインの抑制が認められた。これより、TJ-62はマクロファージを介した間接的な肝線維化抑制効果をもつことが示唆された。また大柴胡湯(TJ-8)についても同様の実験を行い、肝線維化及び肝発癌抑制効果を持つことを実証した。これまで非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対して様々な治療が試みられているが十分な効果は上げていない。我々は漢方薬・防風通聖散(TJ-62)の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠乏性脂肪性肝炎・肝硬変モデルを用いて実験を行なっている。防風通聖散投与群は肝線維化および炎症反応、肝発癌抑制効果を有意に改善した。これついてサイトカイン発現を検討したところマクロファージ系のサイトカインの抑制が認められた。このことから、防風通聖散はマクロファージを介した間接的な肝線維化抑制や炎症反応の改善を行っていることが示唆された。肝発癌も線維化や炎症と関連することから抑制のメカニズムにつながる可能性が考えられた。また8種類の生薬からなる大柴胡湯(TJ-8)についても同様の実験を行い、肝線維化及び肝発癌抑制効果を有意に持つことを実証した。漢方薬を使ったこの結果は代替医療の研究が進んだ米国でも注目されている。現在各生薬レベルでの肝線維化効果を検討するため、メダカを用いた脂肪肝・肝線維化モデルにおいて個々の生薬の作用機序について検討中を行う予定である。臨床の場においては非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対して様々な治療が試みられているが十分な効果は上げていない。我々はこれまで漢方薬・防風通聖散(TJ-62)の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠乏性脂肪性肝炎・肝硬変モデルを用いて実験を行なっている。ここまでのメカニズムについて検討するため、サイトカイン発現を検討したところマクロファージ系のサイトカインの抑制が認められた。この成果をもとに第39回日本肝臓学会西部会ワークショップ「NASH治療の現状と問題点」において「防風通聖散はNASHに対するマクロファージ系の炎症制御効果を持つ治療薬になる」と題して発表を行った。現在各生薬レベルでの肝線維化効果を検討するため、メダカを用いた脂肪肝・肝線維化モデルにおいて個々の生薬の作用機序について検討を行う予定である。肥満に高頻度に合併する脂肪肝特に非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は肝線維化、肝硬変の原因として注目され、NASHからの肝発癌も報告されている。近年肥満改善薬として漢方薬である防風通聖散(TJ-62)や大柴胡湯(TJ-8)が注目され始めている。臨床的にも脂肪肝を改善することが報告されているが詳細なメカニズムについてはわかっていない。我々は漢方薬・防風通聖散(TJ-62)と8種類の生薬からなる大柴胡湯(TJ-8)について、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に対する治療効果の検討のため、ラットコリン欠乏性脂肪性肝炎・肝硬変モデルを用いて検討を行った。これについてサイトカイン発現を検討したところマクロファージ系のサイトカインの抑制が認められた。このことから、防風通聖散(TJ-62)はマクロファージを介した間接的な肝線維化抑制や炎症反応の改善を行っていることが示唆された。大柴胡湯群(TJ-8)において前癌性病変であるGSTP染色が優位に抑制され、またサイトカインアッセイを行うとマクロファージ関連サイトカインの有意な抑制を認めた。このことから防風通聖散および大柴胡湯はCDAA投与ラット肝硬変モデルにおいて肝線維化を改善し、前癌性病変発生を抑制した。これらの結果より今後NASHに伴う肝線維化抑制の新しい治療薬となる可能性が示唆された。線維化や炎症と関連することから肝発癌抑制のメカニズムにもつながる可能性が考えられた。

漢方薬を使ったこの結果は代替医療の研究が進んだ米国でも現在注目されており、さらなる検討が必要であると考えている。これまで予定してきた内容についてほぼクリアーできている。本年度の目標としている生薬の検討のみが残っている状態である。現在論文投稿準備中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。防風通聖散の個々の生薬についての検討が今後の大きな課題である。現在メダカを使ってのモデルを作成中である。
オルガノイドを用いた膵癌phenotypeによる膵星細胞の基質リモデリング解析

ヒト膵癌組織では間質量や浸潤様式に個体差があることから、ヒトおよび遺伝子改変自然発癌マウス(KPC :KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL- R172H /+;Cre)の膵癌組織を用いて膵癌オルガノイドを樹立し、膵癌細胞のphenotypeに応じて誘導される膵星細胞とその基質リモデリング能の解析を行うことで、膵癌phenotypeに応じた個別化治療を開発することを目的として研究を行っている。In vitroにおいて膵星細胞が膵癌オルガノイドの基底膜破壊およびleading cellとしての基質リモデリングを行っていることが示唆されたため、これをin vivoで検証した。膵癌オルガノイドと基底膜破壊に関わるとされるMMP2あるいはMT1-MMPをshRNAでノックアウトした膵星細胞をヌードマウスへ共移植したところ、膵癌増生および浸潤能の低下を認めた。また、これまで3例のヒト膵癌由来オルガノイドを使用し解析を行ってきたが、オルガノイド樹立効率の向上により、さらに8例のヒト膵癌由来オルガノイドの樹立に成功した。これにより計11例のヒト膵癌由来オルガノイドを用いた膵癌phenotypeごとの分類が可能となり、形態学的にもductal typeやcribriform type, solid typeに分類できた。各オルガノイドは同一検体由来の膵星細胞も樹立しており、それらを用いた共培養モデルを作製し、膵星細胞の間質増生能を評価し、実際の組織標本における間質量と比較・検討を行った。また、これらをcancer panel sequenceによってゲノム解析を行い、膵癌オルガノイドのgenotype解析を行い、これら膵癌オルガノイドのgenotypeと3次元共培養モデルにおける膵星細胞との癌間質相互作用への影響といった膵癌phenotypeを照合し解析を進めた。当初の計画に沿って、shRNAによってノックダウンした膵星細胞と膵癌オルガノイドをヌードマウスに共移植し、癌の増殖・浸潤能について評価できた。これにより、in vivoにおいても膵星細胞のMMP2あるいはMT1-MMPが、コラーゲンIVからなる基底膜の破壊を介して癌細胞の浸潤能に強い影響を与えていることを確認した。また、ヒト由来膵癌オルガノイド樹立件数が大幅に増加し、これらのゲノム解析を行うことで膵癌phenotypeごとの遺伝子学的背景が明らかとなった。ただし、マウス共移植モデルにおいての癌が膵星細胞の間質増生能へ与える影響については検体数が少なく検証不十分であった。樹立した11例の膵癌オルガノイドを用いて、ヌードマウスへの共移植モデルをそれぞれ作成し間質増生能について比較・検討を行う。また、原発巣のみではなく、転移巣、播種層についても検討を行ない、間質の特徴がリンパ節転移、肝転移、腹膜播種に与える影響についても検討する。これらによって、膵星細胞の間質増生に影響を与える癌細胞由来の因子を検索し、同因子を標的とした遺伝子改変膵オルガノイドの作成や化合物投与試験を行い検証する。ヒトの膵癌組織では間質量や浸潤様式に個体差があることから、ヒト・マウスの膵切除組織より樹立した膵オルガノイドを用いて、膵癌細胞のphenotypeに応じて誘導される膵星細胞とその基質リモデリング能の解析を行い、膵癌細胞のphenotypeに応じて形成される微小環境に適した個別化治療を開発することを目的として研究を行った。まず3次元培養モデルを用いてヒト、マウスの膵切除組織より膵オルガノイドの樹立を行った。マウスは遺伝子改変マウス(KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL- R172H /+;Cre)を用いて行った。マウスの膵切除組織からは6匹全てで膵癌、正常膵管上皮細胞を樹立することができた。一方、ヒトの膵切除組織からは、膵癌は3/6症例で、正常膵管上皮細胞は3/3症例で樹立することができた。樹立したオルガノイドは極性を持つ管腔構造を有していた。一部例外があるものの、樹立したオルガノイドは継代・保存が可能であった。次に樹立した膵オルガノイドと膵星細胞との共培養を行い、形成される微小環境について質的・量的パターンの検討を行った。最初にin vitroで3次元培養を行ったところ、膵癌オルガノイド単独ではオルガノイドは腺管構造を維持するのに対して、膵星細胞との共培養群では膵癌オルガノイドは極性を失い、周囲への浸潤がみられた。さらにin vivoでの検討を行うため、免疫不全マウスを用いて膵同所移植を行った。膵癌オルガノイド単独群では腺管構造が保たれているのに対して、共移植群では極性を失い、周囲間質への浸潤がみられた。また周囲の腺房は萎縮し間質増生がみられ、膵星細胞によって浸潤微小環境が形成されていると考えられた。当初の計画通り、ヒト、マウスの膵切除組織より安定して膵オルガノイドを樹立できるようになった。また、樹立したオルガノイドは膵星細胞との3次元共培養モデルを用いて検討を行うことで、オルガノイドの形態変化および浸潤様式を観察することができた。さらには、マウス同所移植モデルを用いて、in vivoでの浸潤微小環境の形成についても検討を行うことができ、おおむね順調に進展していると考えられる。一方、膵癌および膵星細胞のphenotype別解析については、in vitroの3次元培養の実験では質的・量的パターンに有意な差を観察できておらず、マウス同所移植モデルを用いてin vivoでの検討を重ねている。

遺伝子改変膵癌マウスモデルから樹立した膵癌オルガノイド、ヒト膵癌から樹立したオルガノイドを膵星細胞と3次元培養下に共培養した場合にオルガノイドが極性を失い、周囲への浸潤が亢進することを確認したが、膵癌細胞と膵星細胞のphenotype別解析においては質的・量的パターンに有意な変化は見られなかった。しかし、コラーゲンIV蛍光免疫染色やタイムラプスによる経時的観察、三次元画像観察によって、膵星細胞によるオルガノイドへの直接接触が起点となってオルガノイドの基底膜破壊とコラーゲン内への浸潤が起こることが確認できた。さらに、基底膜破壊に関わる因子としてマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)に着目して解析したところMMP2, MT1-MMPの発現が膵癌オルガノイドに比べて膵星細胞でmRNA,タンパクレベルにおいていずれも著明に高発現していることがわかった。そこでsiRNAによるMMP2あるいはMT1-MMPの発現抑制を行った遺伝子改変膵星細胞とオルガノイドとの3D共培養実験を行ったところ、いずれも発現抑制群で有意にオルガノイドのコラーゲン内浸潤能が低下した。一方でMT1-MMPの活性化に必要なTIMP2はオルガノイド、膵星細胞の両方で発現しており、共培養時にTIMP2阻害薬を添加するとオルガノイドのコラーゲン浸潤能は低下したものの、上記siRNAによって膵星細胞のMMP2あるいはMT1-MMP発現抑制と組み合わせた場合には浸潤能低下について相加・相乗効果は見られなかった。当初の計画に沿ってヒト、マウスの膵癌オルガノイドを樹立し、phenotype別解析を行った。膵癌オルガノイドは3次元培養条件下において、単独培養に比べて膵星細胞との直接共培養を行った際に有意に浸潤能が亢進することを発見した。さらにオルガノイドのコラーゲン内浸潤に、癌微小環境内に存在する膵星細胞のMMP2やMT1-MMPが、コラーゲンIVからなる基底膜の破壊を介して強い影響を与えていることを確認した。オルガノイド自体の基質リモデリング能と遺伝子発現の違いについては現在のところ有意なものは見つかっておらず、さらなる解析が必要である。ヒト膵癌組織では間質量や浸潤様式に個体差があることから、ヒトおよび遺伝子改変自然発癌マウス(KPC :KrasLSL-G12D/+;Trp53LSL- R172H /+;Cre)の膵癌組織を用いて膵癌オルガノイドを樹立し、膵癌細胞のphenotypeに応じて誘導される膵星細胞とその基質リモデリング能の解析を行うことで、膵癌phenotypeに応じた個別化治療を開発することを目的として研究を行っている。In vitroにおいて膵星細胞が膵癌オルガノイドの基底膜破壊およびleading cellとしての基質リモデリングを行っていることが示唆されたため、これをin vivoで検証した。膵癌オルガノイドと基底膜破壊に関わるとされるMMP2あるいはMT1-MMPをshRNAでノックアウトした膵星細胞をヌードマウスへ共移植したところ、膵癌増生および浸潤能の低下を認めた。また、これまで3例のヒト膵癌由来オルガノイドを使用し解析を行ってきたが、オルガノイド樹立効率の向上により、さらに8例のヒト膵癌由来オルガノイドの樹立に成功した。