hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
受精における糖鎖の分子認識機構

上記研究課題について、当初の実験計画をほぼ完了したので報告する。精子と卵の大量入手が可能で受精実験の容易な原索動物マボヤを材料として用い、受精における糖鎖の役割について検討を行った。ホヤ類は一般に雌雄同体であるが、マボヤを含む多くの種において自家不稔性を示す。しかし、この分子機構についてはほとんど解明されていないのが実状である。本研究課題では、70kDaの卵黄膜成分HrVC70が精子の卵黄膜への結合と自己非自己識別に重要な役割を果たすことをまず明らかにした。このHrVC70分子は12個のEGF様ドメインにより構成され、分子多型に富み個体間でアミノ酸置換が起こっていること、自己精子よりも非自己精子との結合性が高いこと、自己非自己識別機構が獲得される卵成熟過程で卵黄膜に付着するようになること等から、マボヤにおける自己非自己識別分子の一つであると考えている。その自他識別分子にはフコースが結合しうるコンセンサス配列が5か所存在する。Notch/DeltaなどのEGF様繰返し構造を有する分子間の相互作用においては、フコースの結合が不可欠であることが知られている。我々は、HrVC70を精製し、そのトリプシン消化断片をLC/MSで分析することにより、フコースの結合部位とその糖鎖構造の推定を行った。その結果、フコースが全く結合していないと思われる部位が1か所、フコースが単独で結合していると思われる部位が1か所、Hex-HexNAc-Fucの配列が結合していると予想される部位が3か所あることが示唆された。また、フコースに特異的レクチンを用いたレクチンブロットを行うと、卵黄膜成分のうちHrVC70がほぼ特異的に反応するが、このレクチンはマボヤの受精をも強く阻害することを見いだした。これらの結果は、フコース等の糖鎖がHrVC70の機能を修飾し、精子卵相互作用に深く関わっている可能性を示している。上記研究課題について、初年度の実験計画を行った結果について報告する。受精過程においては、精子が卵保護層(卵黄膜または透明帯)に特異的に結合した後、卵黄膜に精子通過口を開けて、精子と卵との細胞膜融合が可能となる。哺乳類の場合、精子細胞膜表面に局在するガラクトース転移酵素などが精子と卵透明帯との一次的結合に関与すると考えられてきた。しかし、このタンパク質のノックアウトマウスを用いた解析では、受精に必須であるという結果は得られておらず、受精における糖鎖の役割については未だに不明な点が多い。海産無脊椎動物においては、受精における卵黄膜タンパク質の糖鎖の重要性が指摘されている。特に、カタユウレイボヤやマボヤでは、精子フコシダーゼが卵黄膜糖タンパク質のフコース残基に結合することが、精子の卵黄膜への結合において重要な役割を担うと考えられている。しかし、その糖鎖構造に関する知見は得られていない。我々は、マボヤの卵黄膜タンパク質HrVC70が卵黄膜上の精子レセプターとして機能し、しかも雌雄同体であるホヤ類の自己非自己識別分子である可能性が高いことを見いだしている。この分子は、12回のEGF様繰返し構造を有しており、Notchシグナリングと同様の分子間相互作用が想像される。Notchの場合、フコース等がEGF部分に結合することが分子間相互作用において必須であることが証明されている。HrVC70においてもフコシル化される部位が5か所存在し、精子-卵相互作用における重要性が考えられる。HrVC70に含まれる糖鎖構造に関しては今まで全く情報はなかったが、本研究により、少なくともそれぞれ1残基のフコースとN-アセチルガラクトサミン、ガラクトースが含まれることが分かってきた。本研究により、HrVC70の詳細な糖鎖構造の解析や受精における役割に関する解析を行う重要性が示された。

また、フコースに特異的レクチンを用いたレクチンブロットを行うと、卵黄膜成分のうちHrVC70がほぼ特異的に反応するが、このレクチンはマボヤの受精をも強く阻害することを見いだした。これらの結果は、フコース等の糖鎖がHrVC70の機能を修飾し、精子卵相互作用に深く関わっている可能性を示している。
新しい胃癌の癌抑制遺伝子RUNX3の細胞分化・癌化機構の解明と予防・治療への応用

我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析よりRUNX3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連することを示した。さらに将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発癌リスク予測や胃癌の転移予測などの遺伝子診断や遺伝子治療を目指しており、胃癌の発癌予防や消化管粘膜再生にも応用しうると考えている。またRUNX3遺伝子の関与する疾患は主に胃癌と考えられていたが、我々は、肝細胞癌、膵臓癌、大腸癌においてもRUNX3遺伝子の関与の可能性を示唆するデータを得ており(Oncogene, 2004, 2007)、これらの癌においてもRUNX3遺伝子の異常を指標とした遺伝子診断や遺伝子治療への応用を行ないつつある。RUNX3はTGFβ依存性アポプトーシスに重要な役割を果たしており、食道扁平上皮癌における放射線化学療法の感受性に関与していることが明らかになった(Oncogene, 2007)。またRUNX3遺伝子の関与する疾患は主に胃癌と考えられていたが、RUNX3メチル化を指標とした定量メチル化診断システムを用いた血清診断は従来の腫瘍マーカーを補完しうる新しい胃癌の血清診断マーカーになりうる可能性が示唆された(Anticancer Res. 2009, in press)。さらに我々は日立ソフトLuminexシステムにより、多数の検体における複数遺伝子のメチル化を定量的に短時間で測定しうる迅速血清診断システムを確立し、実地臨床に応用しつつある。さらに胃癌の発生母地である慢性胃炎粘膜や腸上皮化生におけるRUNX3の解析や胃癌の転移浸潤におけるRUNX3の関与を明らかとし、将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発癌リスク予測や胃癌の転移予測などの遺伝子診断や遺伝子治療を目指しており、胃癌の発癌予防や消化管粘膜再生にも応用しうると考えている。またRUNX3遺伝子の関与する疾患は主に胃癌と考えられていたが、我々は、肝細胞癌、膵臓癌、大腸癌においてもRUNX3遺伝子の関与の可能性を示唆するデータを得ており、これらの癌においてもRUNX3遺伝子の異常を指標とした遺伝子診断や遺伝子治療への応用を試みる予定である。さらにYeasttwo hybrid system等により、RUNX3と結合する分子を同定し、これを含む複含体または分子経路を解明することにより、これらの中にドラッグデザインしやすい分子標的の見つかる可能性も十分あり、将来の治療応用を視野に入れて研究を進めている。最終的には、RUNX3を分子標的とした癌予防と治療により国民健康の増進と医療費の抑制にも寄与しうると考えている。

RUNX3はTGFβ依存性アポプトーシスに重要な役割を果たしており、食道扁平上皮癌における放射線、化学療法の感受性に関与していることが明らかになった(Oncogene, 2007)。またRUNX3遺伝子の関与する疾患は主に胃癌と考えられていたが、RUNX3メチル化を指標とした定量メチル化診断システムを用いた血清診断は従来の腫瘍マーカーを補完しうる新しい胃癌の血清診断マーカーになりうる可能性が示唆された(Anticancer Res. 2009, in press)。さらに我々は日立ソフトLuminexシステムにより、多数の検体における複数遺伝子のメチル化を定量的に短時間で測定しうる迅速血清診断システムを確立し、実地臨床に応用しつつある。さらにYeast two hybrid system等により、RUNX3と結合する分子を同定し、これを含む複合体または分子経路を解明することにより、これらの中にドラッグデザインしやすい分子標的の見つかる可能性も十分あり、将来の治療応用を視野に入れて研究を進めている。最終的には、RUNX3を分子標的とした癌予防と治療により国民健康の増進と医療費の抑制にも寄与しうると考えている。
ＳＯＭを用いた団体スポーツにおける個々の役割及び関係性評価

本研究では、自己組織化マップを利用した団体スポーツにおける個々のポジションの適性やチーム内における関係性の評価を目的として行った。個々の能力を評価記述とするため、個人の身体的な特徴量と心理的な特徴量をデータ群として、入力しチーム全体の関係性を特徴マップに写像して評価を行った。身体的な特徴量は、ポジションに大きく関係しており、心理的な特徴量は、レギュラーメンバーの選抜に大きく関係することが明らかとなった。また、双方のデータ群を組み合わせることで、チーム内のポジションやレギュラーとの関係性を2次元の特徴マップによって表現することができた。スポーツの団体競技において個々のポジションや役割の適性がチームの状態に影響を与えている事は,明らかであり身体的な特徴や心理的な特徴といった見地から非常に多くの研究がなされている.しかし,双方を考慮した団体競技におけるチーム内での個人の役割や関係性を示す研究は,非常に稀であり,身体的特徴と心理的特徴に関する関連性は未だに明らかではない.本研究では,身体的特徴量及び心理的特徴量の双方を考慮した団体スポーツにおける個々の役割適性を判断し,チームの関係性を示すクラスタリング器の開発を目標とする.そこで,本研究では申請者がロボティクス分野において,環境推定などに用いた自己組織化マップ(Self Organazing Maps)を用いて,双方の特徴量を用いたクラスタリング器の開発を目指す.最終年度では,引き続き特徴量データの収集及び自己組織化マップを用いた解析を行い,このアルゴリズムの妥当性に関して研究を行う.現在までに様々なクラスタリング手法が確立されており,他の確立された手法と比較検討し,その妥当性を確かめる.本研究における自己組織化マップは、多次元空間の特徴量をトポロジー空間を保存したまま,自己組織的に2次元でマップ化する事が特徴である.そこで,他の多次元の情報量をクラスタリングできるアルゴリズムと比較検討を行い,本アルゴリズムの利点や欠点を検討する.この結果を踏まえ,今回はラグビー競技を中心にアルゴリズムの整理を行ったが,他の競技内容に関して,同様の実験を行う事が可能かどうかを他の団体競技に本研究のアルゴリズムを採用し,検討を行う.また,このような身体的な特徴量や心理的な特徴量を踏まえたチームの関係性や役割の適性を決定する手段がロボティクス分野(群ロボットの役割適性など)に応用する事が出来ないかを検討する.本研究では、自己組織化マップを利用した団体スポーツにおける個々のポジションの適性やチーム内における関係性の評価を目的として行った。スポーツの団体競技において個々のポジションや役割の適性がチームの状態に影響を与えている事は,明らかであり身体的な特徴や心理的な特徴といった見地から非常に多くの研究がなされている.しかし,双方を考慮した団体競技におけるチーム内での個人の役割や関係性を示す研究は,非常に稀であり,身体的特徴と心理的特徴に関する関連性は未だに明らかではない.本研究では,身体的特徴量及び心理的特徴量の双方を考慮した団体スポーツにおける個々の役割適性を判断し,チームの関係性を示すクラスタリング器の開発を目標とする.そこで,本研究では申請者がロボティクス分野において,環境推定などに用いた自己組織化マップ(Self Organazing Maps)を用いて,双方の特徴量を用いたラスタリング器の開発を目指す.団体スポーツにおけるチーム内の関係性や役割の適性を示すクラスタリング器を開発するには,団体競技のチーム内の関係性や役割に関わる身体的特徴量及び心理的特徴量を明らかにする事が必要である.そこで,当該年度は,統計学的見地に基づき,身体的特徴量及び心理的特徴量の解析を行った.身体的な特徴量は,先行研究(徳永ら)によって行われた手法を用いて,18項目の身体的特徴量を測定し,すべての項目における統計的な処理をポジション別に行った.また、心理的な特徴量は,DIPCA.3という心理テスト用紙を用いて計測を行い解析を行った.心理的な特徴量に関しては,PCA (主成分分析)を用いて特徴量の傾向を調べた.しかし,ポジションにおける適性や関係性を従来の解析方法では見出す事が出来なかった.同時に身体的な特徴量及び心理的な特徴量を提案する自己組織化マップを用いて,多次元のデータをクラスタリングする手法を提案し,解析を行った.スポーツの団体競技において個々のポジションや役割の適性がチームの状態に影響を与える事は、明らかであり身体的な特徴や心理的な特徴といった見地から多くの研究がなされている。しかし、双方を考慮した団体競技におけるチーム内での個人の役割や関係性を示す研究は、非常に稀であり、身体的特徴と心理的特徴に関する関連性はまだ明らかではない。本研究では、身体的特徴量及び心理的特徴量の双方を考慮した団体スポーツにおける個々の役割適性を判断し、チームの関係性を示すクラスタリング器の開発を目標とする。そこで、本研究では申請者がロボティクス分野において、環境推定などに用いた自己組織化マップ(Self Organizing Maps)を用いて、双方の特徴量を用いたクラスタリング器の開発を目指す。本年度は、得たデータを利用して、アルゴリズムの検証を行った。身体的特徴量及び心理的特徴量単体での結果は、統計的な手法と同じような傾向の他に、身体的な特徴量データ群では、ポジションの適性に関するクラスタリングができた。

また、心理的特徴量データ群では、レギュラーの傾向を見ることができ、心理的にどのような特徴がある人物がレギュラーになるのかを判断する資料として使用できることが分かった。双方をとりいれた結果では、ポジションに関するグループ分けができ、レギュラーメンバーの選定資料として使えることも分かった。また、他のポジションに適性が見えることも本研究の結果から可能性を見出すことができた。スポーツ科学本研究は,団体スポーツにおけるチーム内の関係性や役割の適性を示すクラスタリング器の開発である.平成24年度は,データの解析として,身体的な特徴量及び心理的な特徴量を統計的な解析手法を用いて,特徴について調査した.平成25年度は,24年度に得られた結果をもとに,自己組織化マップを用いて多次元特徴量をクラスタリングするソフトウェアの開発を行った.自己組織化マップでは,身体的な特徴量を正規化したデータを多次元特徴量として,従来利用されているクラスタリング手法である主成分分析のアルゴリズムと比較し,どのような効果があるかを検証した。また、心理的な特徴量に関しては,DIPCA.3という競技者の心理的特徴を評価する手法にと同様のテストを多次元データとして利用した場合,同等の結果が出るのか等を検証した.結果,身体的な特徴量としては,ポジションによるデータの集まりが見られ,多次元のベクトルを解析するとある程度のポジションに傾向があり,コーチ陣等は,身体的な特徴量をもとにグループの解析が行われている事がわかった.しかし,心理的な特徴量は,DIPCA.3と同様にポジションによる適性は、ないがレギュラーと非レギュラーの区別が出来る事がわかった.つまり、レギュラーになる為には,心理的な成熟が求められており,ポジションの適性には,身体的な特性が関わっている事がわかった.また、本研究で提案している手法では,身体的特徴量及び心理的特徴量の双方で解析が可能である事が証明された.データの統計処理に関しては,本学におけるラグビー部員に協力してもらい,データを身体的特徴量に関して18項目,心理的な特徴量として,DIPCA.3を用いて12項目の評価指標を得る事が出来た.また、従来の統計学的な見地にもとづき、各項目に対して,ポジション的な適性があるかどうかを検証した.身体的な特徴量では,身長や体重等の項目において,ポジションによって有意な差がある事が示された.しかし,18項目すべての項目で特徴的な傾向が示された訳ではなかった.また、複数の項目を組み合わせたデータの適性に関しては,従来の統計学的な見地では,解析する事が困難であるため、自己組織化マップを利用した新しいアルゴリズムにおいて解析を行った.その結果,フォワード(FW)とバックス(BK)において,身体的な特徴量を入力して作成された特徴マップでグループ分けをする事が可能であった.
東日本大震災が及ぼす致死性不整脈発現への影響

今回我々は東日本大震災と不整脈発生との関係について研究した。ICDが植込まれている143症例を対象に福島県と茨城県の複数施設で震災前3ヶ月以前から3年後までの不整脈イベント調査を行ったところ、震災発生前後3ヶ月での致死性不整脈発生率はそれぞれ9.3%と5.4%、非持続性心室頻拍発生率は33%と27%、心房細動発生率は32%と34%であり、いずれの不整脈発生率にも有意差を認めなかった。震災1ヶ月前後、震災後3年間での半年ごとのイベント発生率においても有意な変化はなかった。本結果は海外での結果と異なるが、要因として症例数が少ないこと、ICD植込み症例に限定されたこと、民族気質の違い、が考えられた。巨大な震災後には、短期的および長期的観察期間内に血圧上昇、急性心筋梗塞、脳卒中といった重大な心血管イベントの増加が世界各地から報告されている。災害に際して心血管イベントが増加する背景として、災害による恐怖や不眠などからの急性ストレス、災害における身体運動の制限や食事の偏りなどを背景とした慢性ストレスによって惹起される自律神経失調および免疫システムの障害、心血管ホメオスターシスの破綻によって引き起こされる炎症の進展による心血管障害、等が考えられるが、震災を契機として心室頻拍や心室細動といった致死性不整脈が生じたケースも過去に報告されている。1994年に発生したノースリッジ地震では震災発生後2週間以内に植込み型除細動器(ICD)症例の心室性不整脈イベントが増加した事が報告されており、2008年の四川大地震でも震災発生後の心室性不整脈の有意なイベント増加が報告された。今回、我々は東日本大震災と不整脈発現との関係について焦点を当てて研究することとした。対象は植込み型除細動器が植え込まれている症例とし、震災前と、震災一ヶ月後から3年後の経過をfollow upし、デバイスに記録された不整脈イベントを解析することで不整脈発現の評価を行うこととした。多施設で検討を行うこととしたが、現在までに87症例について調査を行ったところ、それぞれのイベント数は、震災1ヶ月前(持続性心室細動・心室頻拍3例、非持続性心室頻拍14例)、震災1ヶ月後(持続性心室細動・心室頻拍2例、非持続性心室頻拍9例)、震災2年後(持続性心室細動・心室頻拍10例、非持続性心室頻拍23例)であり、現在のところ震災との有意な相関関係を認めていない。今後更なる検討を行う予定である。災害に際して心血管イベントが増加する背景には、災害によって生じる恐怖や不眠などによる急性ストレスが第一に挙げられる。ストレスによって交感神経が活性化され、また凝固促進因子が増加することで、動脈硬化性プラークが破綻し心血管イベントが生じる。そのほかの機序としては、災害における身体運動の制限や食事の偏りなどを背景とした慢性ストレスによって惹起される自律神経失調および免疫システムの障害、心血管ホメオスターシスの破綻によって引き起こされる炎症の進展による心血管障害、などが報告されている。本邦では、1995年に発生した阪神淡路大震災、2004年に発生した新潟県中越地震において急性心筋梗塞をはじめとする心血管イベントの増加が報告されている。今回、我々は東日本大震災の被災を受けた茨城県、福島県、岩手県、山形県において、器質的心疾患を有しICDが植え込まれている患者を対象として、被災前後における不整脈イベントの変化についてICD装置内に残されているデータをもとに短期的および長期的に評価し、震災が及ぼす心疾患患者への影響を不整脈の観点から明らかにすることとした。まずは、preliminary studyとして、当院に通院しているデバイスが植え込まれている35症例(ICD;24例、CRT-D;11例)(男性23例、女性12例)を対象として、震災発生前後1ヶ月間の不整脈イベントについて比較を行ったところ、持続性心室頻拍(前:後);1例:0例、非持続性心室頻拍;5例:4例、心房細動;4例:2例であり、震災前後で不整脈イベントの有意差を認めなかった。今後、症例数や検討項目を増やして検討を続ける予定である。巨大な震災後に重大な心血管イベントの増加が世界各地から報告されている。

致死性不整脈が震災を契機として生じたケースも過去に報告されており、1994年のノースリッジ地震では震災発生後2週間以内に植込み型除細動器(ICD)症例の心室不整脈イベント増加が、2008年の四川大地震でも心室不整脈のイベント増加が報告された。しかし、我が国における震災と不整脈の関係についての報告は非常に少なく、さらに上室性不整脈と震災に関する報告は海外でも見当たらない。今回我々は東日本大震災と上室性および心室不整脈発生との関係について研究した。対象は震災以前にICDが植え込まれている症例とし、震災前3ヶ月以前から3年後までの経過をデバイスに記録された不整脈イベントを解析することで評価を行った。被災地である福島県ならびに茨城県の複数施設でfollow upが可能であった143症例について調査を行ったところ、震災前後3ヶ月間の心室不整脈によるICD適切作動率はそれぞれ9.3%と5.4% (p=0.23)、非持続性心室頻拍イベント発生率は33%と27% (p=0.24)、心房細動発生率は32%と34% (p=0.76)であり、いずれの不整脈発生率にも有意差を認めなかった。震災発生1ヶ月前後でのICD適切作動率(6.2% vs. 3.0%, p=0.22)、非持続性心室頻拍イベント発生率(23% vs.17%, p=0.23)、心房細動発生率(23% vs. 27%, p=0.47)にも有意差を認めず、震災以降3年間における半年ごとの各イベント発生率においても際だった変化は見られなかった(ICD適切作動率(p=0.61)、非持続性心室頻拍イベント発生率(p=0.83)、心房細動発生率(p=1.56))。以上の結果から、本研究では東日本大震災を契機に上室性および心室不整脈の有意なイベント発生率増加は確認されなかった。この結果は、過去の海外での報告結果と異なるが、この要因として、症例数が少ないこと、対象症例がICD植込み症例に限定されたこと、民族気質の違い、といったことが考えられた。不整脈茨城県、福島県、岩手県、山形県の東日本大震災被災各地区からの該当症例をピックアップし、データ収集を行う予定であったが、思ったほどの症例数が現在のところ集められていない。また、海外で報告されているほどの震災と不整脈イベントの相関関係が現在のところ認められていないこともあり、他の関連因子を含めて現在データ集積そして解析を行っているところである。平成24年度の予定としては、茨城県、福島県、岩手県、山形県の東日本大震災被災各地区からの該当症例をピックアップし、短期的なデータとなる震災発生1ヶ月以内のイベントに関するデータ収集を行うことである。茨城県においては、県南地区を筑波大学、県央地区を茨城県立中央病院、水戸済生会総合病院、県北地区を日立総合病院がそれぞれ担当し、福島県は福島県立医科大学が、岩手県は、岩手県立医科大学が、山形県は山形大学がそれぞれデータ収集を担当することとした。各施設に調査を依頼し、データの収集を行っているところであるが、データ収集内容が途中で変更となるなどの問題もあって、進行状況としては予定よりはやや遅れているところである。本年度は、震災発生後急性期の収集データをもとに危険因子などの解析も行っていく予定であるが、データ収集と併せて予定通りの日程で調査を遂行するつもりである。一昨年、東日本大震災前後短期間内での心室性不整脈イベントが震災後に有意に増加していたとする報告があった。我々の研究ではまだ一定の結論を得ていないが、より広範囲の地域で多くの症例数を、そして長期間の経過での不整脈イベント変化を観察すること、また上室性不整脈イベントやデバイスで記録された他の関連因子情報を含めて詳細に比較検討することをテーマにこの一年頑張っていきたい。今回の研究における当初の目的は、東日本大震災の被災を受けた茨城県、福島県、岩手県、山形県の植え込み型除細動器(ICD)植え込み
終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護師教育プログラムの構築

本研究は,終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護介入を検討し,看護師の教育プログラムの構築を目指す研究である.今年度は,地域でがん医療を行っている一般病院10か所に勤務する看護師496名を対象として,調査を実施した.終末期がん看護の中でも,患者と家族の意見の相違がおこりやすい,在宅移行支援に関して看護師の実践の実態と関連要因,患者と家族の意見に相違があった場合に介入できる程度,コミュニケーションスキルについて回答を求めた.378名より回答を得て,現在分析中であり,結果は随時国内外の学術集会および雑誌に投稿予定である.さらに,今後の教育プログラム開発に向けて,終末期がん看護に関連する既存のコミュニケーションプログラムについて海外文献を中心とした文献検討を実施した.その成果は8th Hong Kong International Nursing Forum(香港)にて発表した.また,がん看護学会に参加し,終末期のコミュニケーションおよび終末期がん患者の家族看護実践に関する情報収集を行った.現在は,終末期がん患者と家族間コミュニケーションを促進する看護介入について,より具体的な実態に関する調査の準備中であり,調査用紙の作成,研究計画,倫理審査申請の準備に取り組んでいるところである.その後は,現在計画中の調査の分析結果とこれまでの研究の成果を合わせ,看護師の教育プログラム案を構築し,内容の妥当性をがん看護の専門家と共に検討する予定である.両親に看病・介護が必要となり,研究時間が減少して遅れた分が取り戻せていない.更に,調査開始直前に震災が起こり,研究協力施設が一時的に混乱したため調査開始延期を余儀なくされ,一層遅れが生じた.今後は,まだ終了していない調査の分析と現在計画中の調査の実施,分析,教育プログラム案の立案を実施する.すでに実施した調査データの分析は,共同研究者と分担,協力して実施する予定である.今年度の調査に関しては,データの整理,入力は外注し,効率化を図る.教育プログラムの作成に関しても,研究結果を踏まえて研究協力者と協働して作成する予定である.本研究の目的は,終末期がん患者の家族間のコミュニケーションを促進する看護介入を検討し,看護師の教育プログラムを構築することである.今年度は,研究計画に沿って,基礎的研究となる終末期がん患者と家族間の良好なコミュニケーションについて,主に国内の文献を中心に概念分析を進めている.まず,Rodgersの概念分析の方法を用いることから,研究者で方法論についてConcept Development in Nursingを抄読した.他にも概念分析の研究方法論に関する文献の抄読および概念分析を行った論文を読み,方法論についての理解を深めた.その上で,主に国内の文献について,ディスカッションしながら,分析を進めているところである.また,末期がん患者と家族間のコミュニケーションの実際と家族間のコミュニケーションに対する専門職の関わりを知るために,緩和デイケアに参加し,患者家族の観察を行うとともに,専門職に関わりに関する情報収集を行った.また,緩和ケアに関する研修会に参加し,情報収集を行い,研修参加メンバーと,家族間のコミュニケーションを含む,がん患者とその家族のケアに関するディスカッションを行った.がん看護学会,東アジア看護学研究者フォーラム等に参加し,国内外の家族看護およびコミュニケーションに関する研究知見に関する情報収集,および研究者間での情報交換を行った.今後は,看護師に対する調査を行い,末期がん患者と家族間の良好なコミュニケーションを促進するために行っている看護実践内容等を明らかにする予定である.その際に上記で得た情報を活用して,データ収集,分析方法をより妥当なものとする.今年度は,本研究の基礎となる概念の分析に予想以上に時間を要した.また,両親の看病と介護のために研究時間が減少し,進行が遅れた.本研究は,終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護介入を検討し,看護師の教育プログラムの構築を目指す研究である.今年度は,急性期病院の一般病棟に勤務する看護師10名を対象に,終末期がん患者の家族間コミュニケーションで困難に思ったこと,どのように患者と家族,または家族間のコミュニケーションに関与しているかについてインタビュー調査を実施した.インタビューデータから逐後録を作成し,分析データとした.分析には質的帰納的方法を用いた.家族間コミュニケーションを促進させるために,看護師が行っていることは何か,という視点でコード化を行い,内容の類似性によってコードをまとめて抽象度を上げて表題をつけ,カテゴリー化を行った.また,がん看護および家族看護に関する学会の学術集会に参加し,終末期がん患者と家族のコミュニケーションに関する新な知見の情報収集と類似領域の研究者との情報交換を行った.今後は,今年度得られた知見を学会で発表し,結果を公表する予定である.また,緩和ケア病棟看護師を対象として同様の調査を実施することを予定している.緩和ケア病棟看護師を対象とした調査の結果と今年度得られた結果と合わせて,質問紙を作成し,看護師の終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護実践の実態及び関連要因を量的研究によって明らかにする予定である.その実態を踏まえて,看護師教育プログラムを構築する予定である.昨年度,両親の看病で研究時間が減少して遅れた分が,まだ取り戻せていないため.本研究は,終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護介入を検討し,看護師の教育プログラムの構築を目指す研究である.今年度は,昨年度実施した,急性期病院に勤務する看護師10名を対象としたインタビュー調査で得られたデータの内,終末期がん患者と家族間のコミュニケーションを促進させる実践の語りを質的帰納的に分析した結果の一部を,7th Hong Kong International Nursing Forum(香港)にて発表し,研究者間での意見交換を行った.また,家族看護およびがん看護に関連する学術集会およびInter national Research Conferenceに参加し,終末期がん患者と家族のコミュニケーションに関する知見の情報収集および研究者間での情報交換を行った.

これまでの知見を基に,終末期がん患者と家族とのコミュニケーションに関する質問紙調査を看護師を対象に実施する予定であり,現在,質問紙の内容の検討を行っているところである.今後は,倫理審査を受け,調査を実施する予定である.次年度は,この質問紙調査の実施と,分析を行い,結果の公表を行う予定である.調査後は,これまで得られた知見を統合し,終末期がん患者と家族間のコミュニケーションを促進するための看護師の要因,スキルを明かにして教育プログラム案を構築し,内容の妥当性に関して,がん看護の院内教育に携わっている専門看護師,認定看護師および看護教員との意見交換を行う予定である.一昨年度の両親の看病で研究時間が減少して遅れた分が取り戻せていない部分があるため本研究は,終末期がん患者の家族間コミュニケーションを促進する看護介入を検討し,看護師の教育プログラムの構築を目指す研究である.今年度は,地域でがん医療を行っている一般病院10か所に勤務する看護師496名を対象として,調査を実施した.終末期がん看護の中でも,患者と家族の意見の相違がおこりやすい,在宅移行支援に関して看護師の実践の実態と関連要因,患者と家族の意見に相違があった場合に介入できる程度,コミュニケーションスキルについて回答を求めた.378名より回答を得て,現在分析中であり,結果は随時国内外の学術集会および雑誌に投稿予定である.さらに,今後の教育プログラム開発に向けて,終末期がん看護に関連する既存のコミュニケーションプログラムについて海外文献を中心とした文献検討を実施した.その成果は8th Hong Kong International Nursing Forum(香港)にて発表した.また,がん看護学会に参加し,終末期のコミュニケーションおよび終末期がん患者の家族看護実践に関する情報収集を行った.現在は,終末期がん患者と家族間コミュニケーションを促進する看護介入について,より具体的な実態に関する調査の準備中であり,調査用紙の作成,研究計画,倫理審査申請の準備に取り組んでいるところである.その後は,現在計画中の調査の分析結果とこれまでの研究の成果を合わせ,看護師の教育プログラム案を構築し,内容の妥当性をがん看護の専門家と共に検討する予定である.両親に看病・介護が必要となり,研究時間が減少して遅れた分が取り戻せていない.
仰臥位から座位への姿勢変化がもたらす脳活動からみた看護援助の検証

本研究では座位姿勢援助と脳活動との関係について検証を行った。研究1では、健康高齢者を対象とした。その結果、ベッド上座位では大脳の活性化は少ないことが示された。研究2では、介護老人福祉施設入居者を対象として、ベッド上での座位と椅子での座位の検証を行った。その結果、椅子での座位にのみ有意な脳活性が認められた。これらより、大脳を活性化させる看護援助は、ベッド上よりも椅子での座位が効果的であることが示唆された。本研究の目的は、仰臥位からギャッチベッド上での座位への姿勢変化したときの大脳の活動状態を生理学的・主観的な指標を用いて評価・分析を行い、座位姿勢が大脳を活性化させる看護ケアとして有用かどうかを確認するための基礎的な検証を行うことである。平成19年度は平成20年度の本実験のためのプレ実験を行うことであった。シルバー人材センターに登録の健康高齢者男女計45人(男性22名、女性23名)を対象に(1)基礎データ(年齢、身長、体重、実験前後の血圧・脈拍)、(2)大脳活性指標(脳波:脳波計使用、大脳局所ヘモグロビン値:レーザー組織血液酸素モニーター使用)、(3)主観調査(覚醒度)、(4)自律神経機能評価指標(心電図解析による高周波及び低周波成分、心拍数)のデータを収集した。結果は以下の通りである。(1)基礎データ(平均±SD)1)年齢(歳):全体;68.7±3.0、男性;69.0±3.2、女性;68.5±2.8、2)身長(cm):男性;165.6±4.8、女性;152.5±5.0、3)体重(kg):男性;64.0±7.4、女性;51.6±8.8、4)収縮期血圧(mmHg):男性(前)131±14.6(後)132±15.1、女性(前)119±14.0(後)126±14.6、5)拡張期血圧(mmHg):男性(前)79±6.5(後)80±7.4、女性(前)72±9.2(後)76±9.8、6)脈拍(回/分):男性(前)65±10.4(後)61±10.6、女性(前)66±9.6(後)60±8.5統計学的には、男性は実験前と比較すると、実験後の脈拍に有意な減少がみられた。女性は、収縮期、拡張期共に実験後の血圧の有意な上昇、脈拍の有意な減少がみられた。実験前後値の変化量の男女比較においては、収縮期血圧のみ女性の方が有意に多かった。他のデータについては、現在解析中である。【目的】仰臥位から座位への姿勢変化が大脳を活性化させるかどうかを生理学的・主観的な指標を用いて測定し、看護ケアとして有用かどうか検証を行うことが研究の目的である。健康成人については、姿勢を変化させることで大脳が活性化するとの結果が、研究者のこれまでの研究の中で得られているため、高齢者を対象とすることとした。【研究1】<方法>健康高齢者を対象に、基礎的な検証を行った。測定項目はベッド挙上角度70度と30度における脳波パワー値と主観調査である。70度は自力座位に近く、30度は臨床で用いられる角度であることより設定した。測定部位は国際10/20法に基づく、Fp_1(左前頭極部)、Fp_2(右前頭極部)、F_3(左前頭部)、F_4(右前頭部)、C_3(左中心部)、C_4(右中心部)、O_I(左後頭部)、O_2(右後頭部)の8点である。分析区間は仰臥位、座位1期、座位2期、座位3期の各5分間とした。挙上角度70度と30度のそれぞれにおいて仰臥位と各区間による比較を行った。また、角度間の比較も行った。<結果>70度座位に一部の測定部位で仰臥位と比較して有意な脳活性が認められたのみであり、有意な脳活性が全部位でみられた成人とはベッド上座位における脳活動が異なることが示された。【研究2】<方法>施設入所高齢者を対象に、臨床的な検証を行った。有意差の認められなかった30度での座位の検討は、椅子(車椅子)座位における検証に変更した。測定部位は研究1と同じである。認知症の被験者が存在したため、主観調査は実施せずに会話を行い、その部分の脳波データの解析を行うこととした。<結果>椅子座位のみに有意な脳活性が認められ、大脳を活性化させる看護ケアとしては、ベッド上よりも椅子座位への援助を行う方が望ましいことが示唆された。
化合物半導体超微結晶の調製と量子サイズ効果に基づく光機能開発

我々は溶液中で調製した硫化亜鉛(ZnS)や硫化カドミウム(CdS)のコロイド状懸濁溶液が共に粒径が2-5_<nm>の独立した超微結晶から構成され、それらが優れた光触媒活性を示すことを報告してきた。本研究ではペンタフルオロフェニル基で表面修飾したCdS超微結晶(φ_f-CdS)の調製と物性を明らかにすると同時に、CO_2の可視光還元能を有するCdS超微結晶の開発を目的とした。1.φ_f-CdS超微結晶の調製と特性。溶液中で調製した半導体超微粒子がほぼ単分散のナノスペース超微結晶をとり、比較的安定にその形態を保持していることに着眼し、CdS超微結晶を溶液法により生成させた後、ペンタフルオロチオフェノールを加える方法によってペンタフルオロフエニル基で修飾したCdS(φ_f-CdS)超微結晶を得た。含水メタノールから調製したφ_f-CdS超微結晶は^<19>FNMRならびに高分解透過型電子顕微鏡観察によって、立方晶系の結晶構造持つ粒径3-6_<nm>の超微結晶構造を取っていることが判明した。特記すべきは特性は、φ_f-CdSがメタノールによく溶解すること、さらに、芳香族ケトン類をアルコールに可視光還元する光触媒として活性を維持していることを見いだした。2.CO_2光還元能を有するCdS超微結晶の調製。DMFを反応溶媒とし、過塩素酸カドミウムと硫化水素の反応によって生成するCdS(CdS-DMF)は、TEM観察によって粒径が3-5_<nm>の六方晶系の超微結晶であることが判明した。CdS-DMFを光触媒としてトリエチルアミンを電子源とするCO_2還元を可視光照射下に行ったところ、選択的にCOへの還元が確認され(量子収量が0.1(400_<nm>))、DMF分子によるCdS超微結晶の表面修飾に基づく量子サイズ効果の発現の結果と推論した。
サイトカイン遺伝子を導入したヘルペスウイルスベクターワクチンの開発

1)イヌのinterferon-γ遺伝子をクローニングしてワクシニアウイルスゲノムに組み込んだ組み換えウイルスを構築し、このウイルスに感染した細胞中に生物活性を有するイヌのinterferon-γが発現していることを確認した。2)細胞性免疫の誘導に重要な役割を果たすと考えられているサイトカイン、イヌinterleukin-12遺伝子をくろ-にんぐしてワクシニアウイルスゲノムに組み込んだ組み換えウイルスを構築し、このウイルスに感染した細胞中に生物活性を有するイヌのinterleukin-12が発現していることを確認した。3)Neospora caninumタキゾイト表面タンパクNcSAG1及びNcSAG2を発現する組換えワクシニアウイルスを構築した。この組換えウイルスはNeospora caninumマウス感染モデルにおいて防御効果をもつことが明らかになった。防御効果はNcSAG2発現ワクシニアウイルスのほうがNcSAG1発現株より有効であった。4)Neospora caninumタキゾイト表面タンパクNcSAG2を発現する組換えイヌヘルペスウイルスを構築した。この組換えウイル間接蛍光抗体法により感染細胞中に原虫NcSAG2と同様な構造をもつタンパクが発現されることが明らかになった。この組換え体を接種したイヌにおいて原虫表面抗原と反応する抗体が誘導された。5)ウシヘルペスウイルス1型ゲノム内にCryptosporidium parvumスポロゾイト表面タンパクp23遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを構築した。これをMDBK細胞に感染させ、Western blotting法にて解析した。原虫が発現するタンパクと同じ23kDaの分子量を持つタンパクの発現が確認された。ウサギに接種するとp23に対する高い抗体価を持つIgGが得られた。(目的)インターロイキン12(IL-12)は、p35とp40のサブユニットから成るサイトカインであり、NK細胞やT細胞の細胞傷害性の活性化や、INF-γ分泌を誘導し、またCD4^+T細胞のTh1型への分化を促進することにより、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。本研究では、イヌのIL-12遺伝子をワクシニアウイルス及びイヌヘルペスウイルスに組み込み、発現させることにより、細胞性免疫を強く誘導する機能を持つ組換えウイルスの作出を目的としている。これまでに我々は、イヌのIL-12cDNAをRT-PCR法によりクローニングし、塩基配列を確認すると共に大腸菌により発現させた。(方法・結果)イヌの末梢血単核細胞を単離し、LPSで刺激後、total RNAを抽出した。これを鋳型とし、既知の塩基配列をもとにp35とp40サブユニットそれぞれのそれぞれ蛋白質コード領域のみを増幅するようなプライマーを用いてRT-PCRを行い、約670bpと約990bpのフラグメントが得られた。それぞれのフラグメントをコードするcDNAクローンをTAクローニング法によりpCR2.1プラスミドにクローニングし、塩基配列を決定した。各クローンは既知のイヌの塩基配列との比較により、それぞれp35とp40のサブユニットであると同定した。次に、抗IL-12抗体を得るためにGST fusion systemを用い、大腸菌によりIL-12のサブユニットp35とp40のcDNAそれぞれをGlutathione S-transferase(GST)との融合蛋白として大量発現する系の構築を試みた。GST遺伝子を含む発現プラスミドpGEX-5X-3にp35とp40のcDNAそれぞれ組み込んだpGEX/p35、pGEX/p40を作製した。これらのプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、IPTGによる発現誘導後、p35とp40の産生をSDS-pageにより確認した。現在、この融合蛋白をマウスに免疫し、抗体IL-12抗体の作成中である。

また得られたIL-12cDNAを組み込んだ組換えワクシニアウイルス及びイヌヘルペスウイルスも、現在作成中である。イヌインターロイキン12(cIL-12)はp35とp40のサブユニットからなるサイトカインである。昨年度の研究でそれぞれのcDNAをクローニングし大腸菌系で発現させた。本年度の研究において大腸菌発現産物をマウスに接種して抗体作製を試みた結果抗p40抗体を得ることが出来たが、抗p35抗体は得られなかった。P35とp40の両方のcDNAを組込んだ組換えワクチニアウイルスrVV/IL-12を構築した。この組換えウイルスにおいてはワクチニアウイルスp7.5プロモータ下流にp35とp40遺伝子をIRES配列で連結して配置してあり、一本のmRNAにp35とp40の配列が転写される。このmRNAが翻訳されるにあたりIRES配列の作用によりp35とp40が個々に生成することが期待される。実際にrVV/IL-12を感染させた細胞上清中にp35とp40の複合体が検出され、さらにIL-12の生物活性を有することが明かになった。P35とp40遺伝子を単独で組込んだ組換えワクチニアウイルス、rVV/p35およびrVV/p40、も構築しそれぞれのmRNAが転写されていること、p40が発現していることを確認した(大塚、松本芳、松本安)。イヌインターフェロン-β(cIFN-β)遺伝子を組込んだ組換えワクチニアウイルスVV/cIFN-βを構築した。VV/cIFN-β感染細胞の抽出液および培地中にcIFN-βが存在し、生物活性も有することが明かになった。tunicamycin処理によりN-linked糖鎖付加を阻害するとcIFN-βは培地中に分泌されなくなる。VV/cIFN-βを低multiplicity of infection(m.o.i)で感染させるとウイルスの増殖は著しく阻害されたが高m.o.i.での感染においては阻害効果は観察されなかった(玄、岩田)。Neospora caninum(N.caninum)は1988年に発見された細胞内寄生性原虫で、家畜、伴侶動物に感染すると神経麻痺や死の原因となる。特に牛における流産、死産、神経疾患の主な原因の一つとしてN.caninumの感染が挙げられ、畜産業に大きな経済的被害を与えている。N.caninumの終宿主がイヌであることからイヌにおけるN.caninum感染をコントロール出来れば他の中間宿主の感染もコントロール出来るもの考え、本年度の研究においてはサイトカインの一種であるインターフェロン(IFN)のN.caninumに及ぼす作用、イヌヘルペスウイルス(CHV)をベクターとした組み換えワクチンの免疫原性等を調べた。
石器消費からみた農耕社会展開過程の考古学的研究－北部九州と韓半島を素材として－

本研究の目的は、北部九州弥生時代および韓半島青銅器・初期鉄器時代における石器の生産・消費様態を地域間で比較しつつ社会システムの一端として明らかにすることである。平成24年度は2012年9月から2013年3月まで大韓民国・釜山大学校博物館を拠点として長期間現地で滞在調査したことにより、韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代における石器生産や消費形態に関する情報を悉皆的に収集することができた。以下、本年度の研究活動の内容を具体的に記述する。(1)韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代における石器生産遺跡を中心に発掘調査報告書を閲覧し、これまで研究を行ってきた弥生時代北部九州地域の石器生産・流通と比較するための基礎的な情報を得た。また石器生産遺跡出土石器類の資料調査を行い、使用石材、製作技法について確認した。(2)青銅器時代・初期鉄器時代における石斧に関し、慶尚南道地域(南江流域)を中心に代表的な遺跡出土品について各所蔵機関に直接赴き資料調査を行った(晋州・大坪里遺跡、草田遺跡、平居遺跡、沙月里遺跡など)。特に研究史上注目されてきた片刃石斧に関して、形態・使用石材・製作技法などに着目して詳細に観察しデータを収集したことにより、石器生産や消費形態を分析する上での基礎となる編年や地域性に関する貴重な情報を得ることが出来た。(3)弥生時代後半期および青銅器時代から初期鉄器(原三国)時代における利器の材質変化(鉄器化)と石器生産との関連性について、研磨具である砥石の分析からアプローチした。北部九州においては弥生時代中期後半以降、鍛錬鍛冶技術が導入されるが韓半島南部ではその前段階に鍛冶技術が認められることや、砥石目の細粒化が達成されていることなどが明らかになった。以上のように、当該年度は北部九州の弥生時代との比較対象地域である韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代における石器生産や鉄器化に関して、非常に多くの情報を収集できた。本研究の目的は、農耕社会(北部九州弥生時代、韓半島青銅器・初期鉄器時代)における石器の流通・消費の変遷を社会システムの一端として明らかにすることである。以下、本年度の研究活動の内容を記述する。1、木工用石斧である片刃石斧について北部九州地域と韓半島南部の資料を悉皆的に集成した。形態、法量、製作技術に関する検討を踏まえ、弥生時代前期末から中期前半において九州島「外部」から完成品として流通していた可能性が高いことを明らかにした。論文で用いたデータのうち主要な資料については、直接所蔵機関に赴いて実見調査を行った(小郡市埋蔵文化財調査センターなど)。内容は雑誌論文として平成24年度初めに投稿を予定している。2、本年度は口頭発表を中心に研究を展開した。第97回東アジア考古学会例会では、「扁平片刃石斧の系統性と画期」と題して、弥生時代北部九州地域に流通する片刃石斧について、韓半島南部を含めた製作技術の系統性の観点から検討した。第60回埋蔵文化財研究会では「北部九州における弥生時代の石器流通」と題して、北部九州の弥生時代における石器流通とその変遷過程について総合的にモデル化した。3、壱岐市カラカミ遺跡の発掘調査(2011年9月)および出土石器類の整理・報告、分析に主体的に参画した。敲石や台石、砥石などの鍛冶関係石器について顕微鏡(エニティ社ワイヤレスデジタル顕微鏡3R-WM401PC)を用いて観察した。分析・考察は報告書の刊行(平成24年度末)に合わせて投稿を予定している。4、弥生時代中期後半を中心に飯塚市立岩遺跡群で生産された石庖丁(いわゆる立岩系石庖丁)を集成した。なかでも福岡県立嘉穂高校所蔵の考古資料について、所蔵状況の把握と整理、写真撮影、実測調査を行ったことは特筆される。資料紹介として雑誌への投稿を予定している。以上のように、本年度は弥生時代北部九州を中心とした石器流通・消費システムとその変遷について研究を深め、研究目標を概ねみたすことができた。

(3)弥生時代後半期および青銅器時代から初期鉄器(原三国)時代における利器の材質変化(鉄器化)と石器生産との関連性について、研磨具である砥石の分析からアプローチした。北部九州においては弥生時代中期後半以降、鍛錬鍛冶技術が導入されるが韓半島南部ではその前段階に鍛冶技術が認められることや、砥石目の細粒化が達成されていることなどが明らかになった。以上のように、当該年度は北部九州の弥生時代との比較対象地域である韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代における石器生産や鉄器化に関して、非常に多くの情報を収集できた。本研究の対象地域のうち北部九州地域の弥生時代の石器流通・消費に関しては、当該期における代表的な器種である伐採用石斧(両刃石斧)、木材加工用石斧(片刃石斧)、穂摘具(石庖丁)の基礎的データの収集がほぼ終了し、総合的な考察が可能な状況にある。一方、比較対象地域である韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代の資料に関しては、データは収集しているものの、直接所蔵機関に赴いて観察を行う実見調査が不十分といえる。まず、平成23年度に行った研究成果を学術雑誌に投稿する。特に、弥生時代北部九州地域の木材加工用石斧(片刃石斧)の流通に関してはいくつかの学会において既に口頭発表しているため、その発表内容をもとに論文を執筆する(平成24年度初めに投稿予定)。また、時間の都合上、実見調査が不十分であった韓半島南部の青銅器時代・初期鉄器時代の石器資料について直接所蔵機関に赴いて資料調査を行い、北部九州地域との地域間比較の有効な材料とする。さらに、九州大学大学院人文科学研究院考古学研究室が継続的に調査を行っているカラカミ遺跡を主要な対象として、鍛冶関係石器の分析を継続的に行い、弥生時代における利器の材質転換(鉄器化)と石器流通・消費システムの変容について考察する。考察に際しては、農耕社会の展開と石器生産・流通などの経済的側面の関係、利器の材質転換(鉄器化)と鍛冶技術の導入などに関する研究事例を、国内・海外問わず広く摂取して行う。
1分子蛍光イメージング法によるmRNAのプロセシングと核外輸送の解析

真核生物はDNAが蓄えられている核と蛋白質が合成されている細胞質が核膜で隔てられている。そのため、mRNAの核外輸送は遺伝子発現の調節機構にとって重要な過程である。申請者らは共焦点顕微鏡を用いて、mRNAを1分子レベルで生きている細胞内で観察してきた。本年度はこれらの研究を発展させ、より詳細にmRNAの核内運動を解析するとともに、スプライシング反応をリアルタイムに観察する技術の確立を行った。1.mRNAの核内運動の解析mRNAの核内における拡散運動を詳細に解析した。その結果、mRNAにはほぼ止まっている物と、運動している物がほぼ同じ割合でいた。mRNAの長さを変えて観察したところ、運動しているmRNAは長さによらず同じ拡散速度で動いており、その値は水中の1/100程度であった。一方、蛍光相関分光法(FCS)を用いて核内の粘性を測定した所、水中の3倍程度であり、粘性の変化で説明する事はできなかった。これらの結果から、mRNAは何らかの核内構造物と結合解離を繰り返しながら拡散運動している可能性が示唆された。2.スプライシングの観察mRNAは転写された後スプライシング反応によって、余分な配列(イントロン配列)が切出され、成熟mRNAとなる。最近の知見によれば、転写とスプライシング、核外輸送は密接に関連している事が示唆されている。そこで、mRNAのエキソン、イントロンを別々の色素で染め分け、プリズム分光を用いてスプライシングを観察するための技術を確立した。3.mRNAの細胞質輸送の観察mRNAのある種のものは細胞質に核外輸送された後、特定の部分に局在化し、細胞極性の決定に関与する。そこで、線維芽細胞の先端に局在化し細胞の運動方向の決定に関与するb-actin mRNAを細胞質で1分子蛍光イメージングした。その結果、mRNAは主に拡散運動で局在化している事が明らかになった。
新しい抗ウイルス戦略をめざしたヘルペスウイルス遺伝子発現制御因子の解析

本研究の目的は、ヒトに様々な疾患を引き起こす単純ヘルペスウイルス(HSV)およびEpstein-Barrウイルス(EBV)感染直後に発現する制御因子およびウイルス特異プロテインキナーゼの機能発現機構を、主に宿主細胞機構との相互作用の観点より解析し、新たな抗ウイルス剤開発や抗ウイルス戦略構築に向けての基礎的な知見を蓄積することにある。本年度の成果は以下の通りである。(i)HSV感染直後に発現する遺伝子発現制御因子ICP0が相互作用するさらなる宿主細胞因子の同定を試みた。その結果、ICP0が宿主転写因子BMAL1と相互作用することを明らかにした。また、ICP0とBMAL1との相互作用は、GST pull down法によっても確認された。さらに、レポーターアッセイの結果、ICP0はBMAL1と協調してBMAL1特異的な転写を活性化することが明らかになった。以上の結果は、ICP0がBMAL1と相互作用することによって、遺伝子発現を制御していることを示唆している。(ii)EBVの制御因子EBNA-LPはEBVがB細胞に感染した際に最初に発現する制御因子であり、EBVによるB細胞の不死化に大きな役割を果たしているco-acitvatorであることが知られている。本年度は、EBNA-LPのco-activatorとしての機能発現機構の解明を試みた。まず、宿主細胞機構によるEBNA-LPの主要リン酸化部位を解析し、35番目のセリン残基であることを明らかにした。このセリン残基をアラニンに置換した変異体はco-activator機能を消失したが、グルタミン酸に置換した変異体は野生株と同等のco-activator機能を有していた。次に、EBNA-LPの核マトリックス局在部位に必須な部位を同定し、それにアラニン置換を施した変異体を作製した。この変異体は、核マトリックスにも核にも局在せず、また、co-activator機能も消失していた。以上の結果は、EBNA-LPのco-activatorとしての機能発現には、宿主キナーゼによるリン酸化および宿主機構による核または核マトリックスへの局在が重要であることを示している。(iii)EBVはそのゲノムにプロテインキナーゼ(BGLF4)をコードしてる。周知のように、ウイルス特異酵素は、抗ウイルス剤の理想的な標的である。本年度においては、BGLF4をGSTおよびHis tagと融合させる形で発現する組み換えバキュウロウイルスを作製し、簡便かつ大量に機能的なBGLF4を精製する系を確立した。また、BGLF4は自己リン酸能を有し、宿主の翻訳因子EF-1δのリン酸化に関与していることを明らかにした。以上の結果は、BGLF4が宿主因子を修飾することによって、EBVの増殖に寄与していることを示唆している。