hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
18トリソミー症候群における自然歴及び健康管理指針の構築

<背景>18トリソミーは,1/4000-8000人に見られる頻度の高い染色体異常症である。生命予後不良な疾患として知られてきたが,自然歴には未だ明らかになっていないことが多い。そのため,人工換気や手術治療も含めて積極的に対応する施設がある一方,出生時から積極的な蘇生をしないことを含めた治療の制限を考慮する施設もあるなど,施設間の治療方針の相違が問題になっている。<目的>18トリソミーの自然歴を明らかにし,合併症に対する管理指針を作成することを目的に,本研究を継続してきた。<方法>平成19年度,(1)長野県立こども病院の症例における臨床研究,(2)サポートグループである「18トリソミーの会」における質問紙調査,(3)18トリソミー児に対する心臓手術の有効性に関する臨床的研究を行った。<結果>(1)長野県立こども病院の臨床研究では,投稿に至る情報は得られなかった。(2)「18トリソミーの会」の質問紙調査によるデータを現在まとめ,投稿準備中である。(3)論文,学会報告,「18トリソミーの会」へのアンケート調査から得られた情報を収集,整理し,投稿準備中である。<まとめ>本研究全体を通して得られた「日本における18トリソミーの現状」についての情報,考察に関して,第100回東京小児外科研究会での特別講演,小児科学第3版「13/18トリソミー症候群」,およびAmJ Med Genet雑誌の招待コメントにおいて発表した。<背景>18トリソミーは1/40008000人に見られる頻度の高い染色体異常症である。生命予後不良な疾患として知られてきたが、自然歴には未だ明らかになっていないことが多い。そのため、人工換気や手術治療を含めて積極的に対応する施設がある一方、出生時から積極的な蘇生をしないことを含めた治療の制限を考慮する施設もあるなど、施設間の治療方針の相違が問題となっている。<目的>18トリソミーの自然歴を明らかにし、合併症に対する管理指針を構築することである。<方法>(1)長野県立こども病院における18トリソミー症例の臨床的研究、(2)サポートグループである「18トリソミーの会」における質問紙調査、(3)18トリソミー児に対する心臓手術の有効性に関する臨床的研究。<結果>(1)長野県立こども病院の症例における臨床的研究から、標準的新生児集中治療により生存期間が大幅に伸びることを示し、専門誌に投稿した(Am J Med Genet 140A:937-944,2006)。本論文は、18トリソミー児へ集中治療を行った場合の自然歴を示した世界初の報告として高い評価を得た(Am J Med Genet 140A:935-936,2006)。(2)「18トリソミーの会」の調査から、日本における18トリソミー児の妊娠分娩状況、出生後の症状と管理状況、成育状況、福祉状況の全貌を明らかにし、長野県立こども病院の調査結果と合わせ、第51回に本未熟児新生児学会教育講演にて発表、また総説にまとめた(日本未熟児新生児学会雑誌19:38-42,2006)。(3)論文、学会報告、「18トリソミーの会」へのアンケート調査から、これまでに20人程度の児が心臓手術を受けていたことがわかった。今後、専門誌への投稿を視野に入れて、まとめていく方向である。
細菌の多糖合成に関与する糖転移酵素遺伝子の構造と機能解析

本研究課題によって3年間に得られた研究成果について概要を述べる。(1)大腸菌rfe-rff遺伝子領域のrfe遺伝子およびORF2遺伝子についてTnphoAによる解析を行い、それぞれのコードする蛋白は膜蛋白であることを証明した。またそれぞれの蛋白のトポロジー解析を行った。(2)KlebsiellaのK2-cps遺伝子領域の全塩基配列を決定し、19個のORFおよびσ^<54>プロモーターを見いだした。この遺伝子の発現調節の解析をするとともに各ORFについてデータベースより相同な遺伝子を検索解析した。(3)大腸菌09-rfb遺伝子領域の全塩基配列を決定し、GDPmannose合成酵素、mannose転移酵素の遺伝子を明らかにした。(4)大腸菌K12のrfa遺伝子領域に存在する4種の糖転移酵素、RfaG,RfaB,RfaI,RfaJの各遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、発現させた。またそれぞれの遺伝子をジーンターゲテイングして欠損した菌株を作製した。これらの菌株を用いて遺伝子の発現を調べ、また各糖転移酵素のアミノ酸を置き換え、酵素活性を調べることによって活性部位の同定を行っている。平成5年度の研究実績の概要1.KlebsiellaのK2莱膜多糖合成遺伝子領域K2-cpsの23Kb全塩基配列を決定し、コードされている17のopenreading frame(ORF)を見いだした。アミノ酸配列の比較によって、データベースから類似の機能蛋白を検索した。また、K2-cpsの発現をmRNA合成のレベルで調節する遺伝子を見いだした。現在発現調節遺伝子の機能と調節機構を解析している。2.enterobacterialcommon antigen(ECA)ならびにlipopolysaccharide(LPS)生合成に関与する大腸菌の染色体領域rfe-rffのRFE蛋白ならびにORF2蛋白が膜蛋白であることを証明した。またそれぞれの蛋白の膜におけるトポロジーを、TnphoAを用いて解析した。それをもとに、膜におけるUDP-GlcNAcをキャリアーリピドに転移する反応のモデルを作製した。平成6年度に得られた研究結果について概要を述べる。(1)大腸菌rfe-rff遺伝子領域のORF1であるrfe遺伝子についてTnPhoAをトランスポ-ズすることによって、Rfe蛋白(UDP-GlcNA転移酵素)の膜におけるトポロジーを解析した。また、すぐ下流に存在し、Rfeと共に転写されるORF2についても膜蛋白であることを証明し、トポロジー解析を行った。(2)Klebsiella K2-cps遺伝子領域の全塩基配列を決定し、プロモーター、各ORFを明らかにした。(4)大腸菌K-12よりrfa領域をクローニングし、個々の糖転移酵素の遺伝子(ORF)を発現ベクターであるlacプロモーターの下流にサブクローニングした。さらに個々の糖転移酵素を発現させ、SDS-PAGEによって確認を試み、RfaG蛋白については発現をゲルの上で確認した。平成7年度に得られた研究結果について概要を述べる。(1)すでに前年度に決定したKlebsiella K2-cps遺伝子領域の全塩基配列の核ORFをデータベースより比較して相同性の高い遺伝子を検索したところ、SalmonellaのcpsG,cpsB,rfbP,orf2.8および大腸菌のgnd、HaemophilusのbexDに類似したORFが見いだされた。また、σ^<54>依存性のプロモーターがこの遺伝子領域の大部分の遺伝子の転写に関与していることが見いだされた。(2)大腸菌K12のrfa領域に存在する、LPSのRコア合成に関わる4種の糖転移酵素RfaG,RfaB,RfaI,RfaJの各遺伝子をT7系発現ベクターに組み込み発現させた。さらに、それぞれの糖転移酵素遺伝子のDNA配列を変えてコードするアミノ酸を部位特異的変異によって改変し、活性部位の同定を試みている。また、染色体上のこれらの遺伝子をそれぞれジーンターゲッテイングして、欠損した菌株を作製した。これらの菌株を用いて遺伝子の発現を調べている。
Zfp521ノックアウトマウスは造血器および脳神経の発生分化機構の解明に寄与する

Zfp521欠損マウスを作製した。Zfp521欠損マウスはメンデルの法則に従って生まれたが、週齢を重ねるとコントロールマウスに比べて小型になり、早期に死亡した。Zfp521欠損マウスは、リンパ網内系組織の委縮が顕著であり、リンパ濾胞の形成不良や多系統にわたる血液細胞の分化の異常がみられた。Zfp521欠損マウスは、多動などの明らかな行動異常が見られた。Zfp521欠損マウスの歯状回で層構造の異常が見られ、神経幹細胞のマーカーであるSox1陽性細胞が減少していた。以上の結果から、Zfp521は神経幹細胞の分化を制御し、脳歯状回の形成に関わること、マウス個体の行動に関わることが明らかとなった。Zfp521キメラマウスとC57BL6との戻し交配を行い、背景をC57BL6化したZfp521欠損マウスを作製した。作製したマウスについて、サザンブロット法でZfp521が欠損していることを確認し、ノーザンブロット法でZfp521の発現がみられないことを確認した。Zfp521欠損マウスはメンデル則に沿って生まれるが、野生型に比べて小型で早期に死亡することがわかった。Zfp521欠損マウスでは明らかな行動異常がみられた。オープンフィールドテストでは野生型に比べ移動距離が増え、中央エリアで過ごす時間が増えるなどの不安行動の減弱が見られた。また、高架式十字迷路試験でも同様の結果が認められた。行動異常に関わる脳の構造変化について解析する目的でZfp521欠損マウスの脳の切片を作製しHE染色したところ、歯状回で層構造の異常が見られた。更に、歯状回で神経幹細胞のマーカーであるSox1の陽性細胞が減少していた。以上の結果から、Zfp521は神経幹細胞の分化を制御し脳歯状回の形成に関わること、マウス個体の行動に関わることが明らかとなった。ES細胞を用いたNature論文ではZfp521は神経細胞への分化に必須であると報告され、Zfp521を欠損すると胎性致死あるいは無脳になる可能性などが検討されていたが、我々のZfp521欠損マウスは短命であるものの生存可能であり、脳神経系の発生・分化機構の解明に寄与するものであった。Zfp521キメラマウスとC57BLとの戻し交配を行い、背景をC57BL6化したZfp521欠損マウスを作成した。作成したマウスにおける脳の解析から、Zfp521は神経幹細胞の分化を制御し脳歯状回の形成に関わること、マウスの行動に関わることを明らかにした。Zfp521非存在下で神経分化が起きるか、などの観点からZfp521欠損マウス由来の初代培養神経細胞を用いて解析を行った。Zfp521はマウスB細胞腫瘍との関連が報告されている。また、私たちはマウスZfp521のヒトホモローグであるZNF521が血球分化に関与することを報告している。私たちが作成したZfp521欠損マウスを用いて病理組織学的解析を行った。HE染色で、造血器組織のなかでも特に胸腺とリンパ節の萎縮がみられ、リンパ球数や形質細胞などに一定の偏りがみられた。さらに、Zfp521と血液細胞分化との関与を検索するために免疫染色やフローサイトメトリー法による解析を行った。研究開始当初はZfp521欠損マウスの解析に関する報告はなく生体内でのZfp521の役割は未知であったため、Zfp521欠損マウスを作製した。Zfp521欠損マウスはメンデルの法則に従って生まれたが、週齢を重ねるとコントロールマウスに比べて明らかに小型になり、早期に死亡した。Zfp521欠損マウスは、脾臓、胸腺、リンパ節などのリンパ網内系組織の委縮が顕著であり、リンパ濾胞の形成不良や多系統にわたる血液細胞の分化の異常がみられた。DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析ではZfp521と血球系統特異的遺伝子や骨髄微小環境などとの関連性が示唆された。Zfp521欠損マウスは、多動などの行動異常が見られた。オープンフィールドテストではコントロールマウスに比べ移動距離が増え、中央エリアで過ごす時間が増えるなどの不安行動の減弱が見られた。さらに、学習能力や記憶力の減弱が示唆された。また、同様の結果は高架式十字迷路試験などでも得られた。これらの結果は統合失調症のマウスの行動と類似がみられた。次に、行動異常に関わる脳の構造変化について組織学的に解析した。Zfp521欠損マウスの歯状回で顆粒細胞の減少や層構造の異常が見られた。胎生19.5日において、コントロールマウスの海馬は正常であったが、Zfp521欠損マウスの海馬は形成不良がみられた。さらに、歯状回と小脳で、神経幹細胞のマーカーであるSox1陽性細胞が減少していた。培養系実験報告ではZfp521は神経細胞への分化に必須でZfp521を欠損すると胎性致死になる可能性が示唆されていたが、私達のZfp521欠損マウスは短命であるものの生存可能であり、発生・分化機構の解明に寄与するものであった。

Zfp521欠損マウスはメンデルの法則に従って生まれたが、週齢を重ねるとコントロールマウスに比べて小型になり、早期に死亡した。Zfp521欠損マウスは、リンパ網内系組織の委縮が顕著であり、リンパ濾胞の形成不良や多系統にわたる血液細胞の分化の異常がみられた。Zfp521欠損マウスは、多動などの明らかな行動異常が見られた。Zfp521欠損マウスの歯状回で層構造の異常が見られ、神経幹細胞のマーカーであるSox1陽性細胞が減少していた。以上の結果から、Zfp521は神経幹細胞の分化を制御し、脳歯状回の形成に関わること、マウス個体の行動に関わることが明らかとなった。Zfp521欠損マウスを作成し、Zfp521が血液細胞および神経の分化機構に及ぼす影響を解析することができた。血液内科今後はさらにZfp521が血液細胞分化と免疫に及ぼす影響について解析を進める予定である。Zfp521欠損マウスを作成し、Zfp521が脳神経系の発生・分化機構に及ぼす影響について、神経幹細胞から個体レベルまで解析することができた。Zfp521欠損マウスにおける血液細胞分化の解析については今後研究を推進する予定である。申請時に計画していたZfp521が免疫機構に及ぼす影響に関する解析は進捗状況が不十分であるため、予定していた試薬の購入などを次年度に繰り越した。今後はさらにZfp521が血球分化および免疫に及ぼす影響について解析する予定である。前年度から引き続いて施行している解析のために必要な試薬の購入にあてる予定である。申請時に計画していた血液細胞の分化に関する解析は進捗状況が不十分であるため、予定していた試薬の購入などを次年度に繰り越した。前年度に計画していた血液細胞の分化に関する解析のために必要な試薬の購入にあてる予定である。
経時データ解析におけるモデル選択法の開発

ランダム効果モデルについて、カルバックライブラー擬距離に基づく予測分布のリスクの、最大対数尤度によるナイーブな推定量のバイアスの漸近展開公式をラプラス近似手法を用いて導出した。標本数を大きくするときの誤差項のオーダーは未知母数に関して一様であることを示し、バイアスを標本数の逆数のオーダーまで修正した変数選択規準を導出した。ランダム係数が2個の場合の線形混合モデルの最尤推定量を導出し、予測分布のリスクを独立な3つのベータ変量のある関数の期待値として記述し、ラプラス近似の見通しを得たが、誤差項のオーダーの未知母数に関する一様性に関する問題は未解決である。2012年度研究実績を踏まえた2013年度の主な研究計画は次の2つであった。(1)ランダム効果を持つパラレルプロファイルモデルについて、Yokoyama (1995, AISM )が導出した、ランダム効果の導入によって導かれる共分散構造の検定統計量の分布の漸近展開を導出し、そこで得られたテクニックを用いて、モデル選択基準を構築する。(2)ランダム効果を持つパラレルプロファイルモデルの一般化として、正規線形混合モデルにおける仮説検定統計量や未知母数の漸近分布の導出、および情報量基準の導出に取り組む。(1)については、ランダム効果の分散パラメータが正の場合には、Box (1949,Biometrika)の手法を用いて、検定統計量の分布の漸近展開を導出した。分散パラメータが0の場合には、検定統計量の分布は、分散パラメータが正の場合に得られてた分布関数の、打ち切りベータ分布に関する期待値として表現されることが分かり、ラプラス法(鞍点近似)によって分布の漸近展開が得られた。これらの結果は、論文として執筆中である。情報量基準の導出に関しては、モデルに含まれる未知母数の最尤推定量の期待値の展開を基に、モデルのリスクのバイアスを計算する必要があるが、前述のラプラス法が利用できる見通しを得ている。(2)について、ランダム効果がひとつの場合には、(1)と同様の手法が適応できると考えているが、複数の場合には、複数の分散パラメータの推定量うち、母数空間の境界に位置するものの個数によって統計量の形が変わることになり、検討中である。当該年度の研究計画は(a)ランダム効果モデルにおける情報量基準の構築(b)一般化推定方程式におけるQIC基準の精密化である。(a)について、応用上有用であり、かつ、ランダム効果がひとつで、扱いやすいと思われるパラレルプロファイルモデルにおいて、情報量基準の構築を目指した。ランダム効果を持つパラレルプロファイルモデルに関しては、Yokoyama and Fujikoshi (1993, JJSS)は、ランダム効果の仮定した共分散構造を持つという条件下でのパラレルプロファイルモデルの尤度比検定(ある平均構造に関する尤度比検定)を導出し、ランダム効果の導入によって導かれる共分散構造の仮定によって検定の検出力が大きくなることを示した。一方、Yokoyama (1995, AISM)は、Yokoyama and Fujikoshiの前提条件である共分散構造に関する尤度比検定統計量とその極限分布を導出した。ランダム効果を持つパラレルプロファイルモデルの仮説検定問題としては、共分散構造の検定と共分散構造を前提とした平均構造の検定が導出されているが、平均構造と共分散構造の同時検定問題は未だ取り扱われていない。そこで、情報量基準の前に、問題を一般化して正規母集団に関する平均構造と共分散構造の検定統計量のクラスを考え、その帰無仮説のしたでの分布の漸近展開の導出を行った。得られた結果は、情報量基準の構築においてリスクの推定量としての最大対数尤度比の漸近偏差の評価に応用される。(b)に関しては、指導している大学院生が成果を得、単著として投稿中なのでここでは報告しない。ランダム効果を持つGMANOVAモデルの変数選択問題に関するモデル選択規準を導出した。具体的には、g(≧2)個の各群に所属する各個体に関してp時点での観測が行われる場合に、観測時点の多項式回帰を一般化した回帰モデルを考え、切片項を個体変動表わすランダム係数とし、観測誤差は個体と時点に関して独立に同一の正規分布を仮定した。カルバック・ライブラーダイヴァージェンスに基づくモデルのリスクの、最大対数尤度による偏差の漸近展開を導出した。通常のAICであれば、偏差は漸近的に未知母数の個数の2倍であるが、ランダム係数の分散が0の場合には未知母数1個分小さくなり、さらに、ランダム係数の分散が標本数の平方根の逆数のオーダーで0に近づくという状況では、リスクの漸近不偏推定量を得るためには、罰則は、両者の中間の値にすべきことがわかった。AICのリスクの推定量としての偏差は標本数の逆数のオーダーであるが、ランダム効果を持つGMANOVAでは、偏差のオーダーは標本数の平方根の逆数のオーダーであるが、漸近展開公式を利用して、このオーダーまで偏差を修正する修正AICタイプの情報量規準を構築した。(a)ランダム効果モデルにおける情報量基準の構築、(b)一般化推定方程式におけるQIC基準の精密化、(c)線形混合モデルにおける情報量基準の構築とその精密化、に関して次の成果を得た。(a)ランダム効果を導入した成長曲線モデルのカルバックライプラー擬距離に基づく予測モデルのリスクの推定量として、最大対数尤度のバイアスの標本数nが大きくなるときの漸近展開公式を導出し、1/nまでバイアスを補正したAICタイプの変数選択規準を導出した。

研究の過程で漸近展開公式によるリスクの近似誤差がランダム効果の分散について一様でないことが分かり、ランダム効果の分散のオーダーをO(1/√n)と仮定した上で漸近展開公式を導出したが、用いたラプラス展開手法の剰余項を詳細に吟味することで、得られた近似公式の誤差のオーダーは、ランダム効果の分散に関して一様なオーダーであることがわかり、これにより変数選択規準を導出することに成功した。(b)指導していた大学院生によりQIC基準の精密化がなされ、さらに予測誤差に基づくCpタイプの情報量規準を導出した。(c)(a)では切片項のみを確率変数としたモデルを扱ったが、拡張として、成長曲線モデルにおいて、複数個の偏回帰係数が確率変数であるモデルの変数選択規準の導出に取り組んだ。線形混合モデルではモデルの識別性を保証するため、誤差項の分散共分散行列に何等かの構造を仮定する必要があり、本研究ではスカラー行列を採用した。心理学や教育学の分野で近年注目されている階層型線形モデルと、数学的には同一のモデルであるからである。一般の線形混合モデルでは、分散共分散行列の最尤推定量の導出は困難であるが、うまく変数変換することで、ある平方和積和行列の固有値と、残差平方和との大小関係で場合分けすることで最尤推定量や最大対数尤度が陽に書けることが分かった。ランダム効果モデルについて、カルバックライブラー擬距離に基づく予測分布のリスクの、最大対数尤度によるナイーブな推定量のバイアスの漸近展開公式をラプラス近似手法を用いて導出した。標本数を大きくするときの誤差項のオーダーは未知母数に関して一様であることを示し、バイアスを標本数の逆数のオーダーまで修正した変数選択規準を導出した。ランダム係数が2個の場合の線形混合モデルの最尤推定量を導出し、予測分布のリスクを独立な3つのベータ変量のある関数の期待値として記述し、ラプラス近似の見通しを得たが、誤差項のオーダーの未知母数に関する一様性に関する問題は未解決である。経時データモデルのうち、ランダム係数が一つの場合に関しては期待していた研究成果を得、複数の場合にも拡張できる見通しが付いたが、ポアソン分布や多項分布等、非正規母集団に対する一般化線形混合モデルに関する研究が遅れているため。数理統計学GMANOVAモデルのモデル選択規準の構築において、モデルに含まれる説明変数の個数が群で共通である場合を扱ったが、群ごとに説明変数の個数を変えた、より一般的なGMANOVAや、ランダム係数の個数を複数とした場合などに、これまでに得られた研究成果を拡張する。ロジステック回帰等の非正規な一般化線形モデルにランダム効果を導入した場合のリスクの評価に取り組む。ランダム効果モデル、線形混合モデル、一般化線形混合モデル、一般化推定方程式法における変数選択やモデル選択法の開発を目的としている。ランダム効果モデルに関しては、パラレルプロファイルモデルに関する共分散構造の仮説検定統計量分布の漸近展開の導出をし、そこで得たテクニックがモデル選択基準の導出や、さらに、一般のランダム効果モデルにも応用できるという見通しを得ている。線形混合モデルや一般化線形混合モデルについては、未だ未着手である。一般化推定方程式法における変数選択法については、予測誤差を基にした選択基準を導出した。
カット長を長くした新たな生検針による、臨床上有用でない前立腺癌の識別能の向上

前立腺癌の診断には前立腺針生検が行われるが、臨床的に有意でない癌の検出が増えることで、過剰治療につながることが危惧されている。そこで臨床的に有意な癌とそうでない癌を識別するための方法が必要である。カット長の長い生検針をTASK社と共同で作成し、従来の生検法でありながら生検採取量を増やす事で、より正確な腫瘍量を評価することを目的とした。新たな生検針の安全性を確認し、前立腺癌の検出能が高いことを確認した。さらに、前立腺全摘除術の全摘標本を用い、臨床上有意でない前立腺癌の識別能を、シミュレーション結果を元に評価したところ、合計生検コア腫瘍長が識別能が高い有用な因子であることが示唆された。本研究は、前立腺針生検の新たな方法(生検のカット長を従来のものより長くすることで、生検採取検体量を増やし、より正確な腫瘍量を評価することを可能にする方法)を用いた研究である。申請者は、これまでに生検カット長を長くすることで、生検腫瘍量の正確な評価ができることをシミュレーション上で示し、そのデータを元に新たにカット長を長くした生検針をTASK社と共同で作製した。その生検針を用いた前立腺針生検を、倫理委員会の承認の元で実際に行い、安全性ならびにその臨床効果についての研究を行ってきた。平成28年度は、新たに作製した生検針を実臨床で使用し、その安全性ならびに有効性について結果の集積を行ってきた。その結果、カット長の長い生検針で生検腫瘍量がより正確に評価できることを示してきた。今後の研究としては、新たな生検針を使用して前立腺癌と診断し、当施設で前立腺全摘除術を行った全摘標本の腫瘍マッピングを行い、insignificant cancerを識別するのに最も有用なパラメーターの統計学的解析を行う。また、カット長を長くすることによるinsignificant cancerの識別能の向上に関して検証する。Insignificant cancerと判定するための生検腫瘍量のカットオフ値の算出を統計学的に行ない、生検腫瘍量とその他の因子(年齢、前立腺体積、PSA、PSAD、T stage、MRI所見)を組み合わせることで、ASに適した患者を検出できるか検討し、新たな組み入れ基準(ノモグラムの作成)を確立する。まず、申請者はTASK社と共同で作製したカット長の長い生検針(long針)を用いた経直腸前立腺針生検を実臨床で行い、その安全性を報告してきた。当教室では、年間200名程度の前立腺生検を行っている。Long針を用いることで、採取できた組織長や生検陽性率が、通常の生検針(normal針)のものと比較すると有意に高いことも報告してきた。検査後に共通の合併症評価シートを用い、全症例において評価を行った。また、カット長を長くすることで、疼痛の増悪も懸念されたため、生検後にフェイススケールを用いて患者の自己疼痛評価を行った。結果、疼痛や合併症含め従来の方法と比べても有害事象はなく、安全に施行できることを報告した。次に、long針で行った症例の生検のコア1本1本の長さを、病理スライド上で計測を行ない、生検コアにおける腫瘍部位をマークし長さを計測した。生検コア長との比率から実測での腫瘍占拠率や最大コア腫瘍長、合計コア腫瘍長を測定することで、各種生検腫瘍量パラメーターを算出した。また、生検結果とも照らし合わせることで、生検陽性率の算出が可能であり、normal針とlong針とでの統計学的に比較検討を行なっている。また、実際にlong針で生検を行い、局所前立腺癌と診断され、当教室で前立腺全摘除術を受けた患者さんを対象とする。当教室では年間約100例の前立腺全摘除術が行われている。全摘標本上で腫瘍部位をGleason score別でマッピングを行っている。これまで行ってきた三次元前立腺癌モデルにおけるシミュレーション結果を元に、TASK社と共同で作成したカット長の長い生検針(long針)を用いた経直腸前立腺針生検を実際に行う。その際、合併症や疼痛の程度といった安全性の評価を行い、採取できた組織長ならびに腫瘍長を測定し、通常の生検針(normal針)のものと比較検討を行なう。さらには生検陽性率の向上の有無も統計学的に解析する。また、long針で生検を施行し、愛知医科大学病院で前立腺全摘除術を行った患者の全摘標本に腫瘍マッピングを行い、三次元構築を行い個別腫瘍体積を算出する。その上で、臨床上有意でないとされる腫瘍体積が0.5 ml以下の前立腺癌の識別能を、シミュレーションやnormal針の検証方法と同様にROC分析におけるAUCを算出し検証を行う。識別能における有用性が確認できれば、Gleason score,Clinical T stage, PSA、MRI所見といった他の予測因子を組み合わせ、新しい生検方法に基づいたASの新たな組み入れ基準(ノモグラムの作成)を行う。

さらに、前立腺全摘除術の全摘標本を用い、臨床上有意でない前立腺癌の識別能を、シミュレーション結果を元に評価したところ、合計生検コア腫瘍長が識別能が高い有用な因子であることが示唆された。今後の研究計画は以下のとおりである。マッピングした標本をスキャンでコンピューターに取り込み、ソフトウエアの3D slicerを用いて三次元モデルの構築を行う。そのモデルを用いて、前立腺内の腫瘍個数や最大腫瘍体積、合計腫瘍体積といった腫瘍の個別解析を行う。生検腫瘍量の各種パラメーターに、PSAやPSAD、前立腺体積、年齢、生検陽性本数などを含めた項目の中で、insignificant cancerを識別するのに最も有用なパラメーターを単変・多変量解析を用いて解析を行う。シミュレーションや通常生検針における結果から有用性が示唆された合計コア腫瘍長(TLC)の有用性の確認も行う。さらに、insignificant cancerの識別能をROC分析のAUCから算出し、normal針の結果と比較することで、カット長を長くすることによる識別能の向上に関して検証する。さらに、0.5 ml以上の腫瘍を含まない前立腺癌と判定するためのTLCのカットオフ値の算出を統計学的に行う。腫瘍体積とGleason scoreや全摘標本における断端陽性の有無を合わせることで定義されるinsignigficant cancerを、生検腫瘍量とその他の因子(年齢、前立腺体積、PSA、PSAD、T stage、MRI所見)を組み合わせることで、ASに適した患者を検出できるか検討し、新たな組み入れ基準(ノモグラムの作成)を確立する。これまでカット長の長い生検針を用いて前立腺癌と診断し、当施設で前立腺全摘除術を施行した症例数が蓄積されている。上記の通り、前立腺全摘標本のマッピングが研究の重要なポイントとなる。研究費を利用して、新た顕微鏡を購入したため、腫瘍長や腫瘍体積の計測・算出が容易になり仕事効率の向上が予想されるため、この調子で研究を推進していく予定である。前立腺癌研究費の中で主な支出計画の顕微鏡の購入が平成29年04月にずれ込んだため、平成28年度分としての計上できていないため。顕微鏡の購入と学会発表旅費、ならびに統計ソフトの購入にあてる予定。
インタ-ロイキン3受容体の構造とシグナル伝達

1)マウスILー3受容体のILー3結合部位であるAicー2抗原のCDNA由来の各種テラクメントをアンチセンスRNA鎖が発現するようにプラスミッドに組み込み、ILー3依存性(同時にGMーCSF依存性でもある)株細胞IC2に導入した。細胞表面に発現するAicー2抗原が少いトランスフォ-マントを各種選択した。これらはいずれもAicー2抗原mRNAの量が少く、そのある株では実際にアンチセンスRNAがS1マッピング法によって検出された。最もAicー2抗原の発現が少い株では実際にアンチセンスRNAは検出できなかったが、これはアンチセンスRNAがすべて使われてしまったためと考えられる。Aicー2抗原の発現量の少い株は、ILー3に対する応答が悪く、増殖するためには非常に高濃度のILー3を必要とした。しかし、同じ株はGMーCSFに対しては元の株とまったく同じに応答するので、Aicー2抗原はILー3に対する特異的レセプタ-と結論できた。また、^<125>I標識ILー3を細胞に結合させた後で化学的架橋を行うと3ないし4本のバンドが得られるが、これらはすべてAicー2抗原アンチセンスRNAを発現する細胞では減少していた。これらの結果は、Aicー2抗原がすべてのILー3レセプタ-にかかわっていることを意味している。2)ILー3受容体はAicー2抗原を含む複数のポリペプチド鎖によって構成されている可能性が高いので、様々な基準によって新しいモノクロ-ナル抗体を新に単離した。それらの基準は、ILー3応答性の消失、ILー3結合の阻害、Aicー2抗原に対する別種の抗体(免疫沈澱が可能な)などである。既に幾つかの候補を得た。
低線量全身照射による制癌効果とその修飾に関する研究

坂本らは10年程前から低線量全身照射による制癌効果の研究を行ってきている。その結果は10ラド或いは15ラドの全身照射をして,照射後615時間の間に腫瘍細胞の移植をすると腫瘍細胞の生着率が低下すること,次に担癌マウスに1015ラドの全身照射後12時間目に腫瘍への局所照射を行うと腫瘍細胞の致死効果が高まり,腫瘍の成長遅延,治癒効果等も増強される事が判った。一方,このような全身照射は転移抑制にも効果があることが動物実験で示された。そこで,本研究では,全身照射の効果が種々の他のエイジェント,例えばBRMと称される薬剤等との併用によって更に増強されるか否かを動物実験によって研究を進める事,悪性リンパ腫の新鮮例に対する全身照射の効果に就いて臨床的な研究を更に進めると共に,固形腫瘍に対する全身照射と局所照射の併用による制癌効果の臨床的検討をする事を目的とした。先ず,OK432と全身照射の併用効果が癌転移に対してどの様な効果を示すかをマイトジェン応答によって調べた所OK432を全身照射の二日前に投与した場合に相乘的な効果がある事が示唆された。これは人工転移と自然転移の双方の実験系で示された。また15ラドの全身照射単独の場合にはマイトジェン応答の増加は認められなかった。これらの事からマイトジェン応答の増加は,少なくとも,OK432と15ラドの全身照射の併用をした場合に,転移抑制の重要な指標の一つであろうと考えられる。臨床的研究では,悪性リンパ腫の新鮮例について,全身照射と局所照射の併用により従来の結果より優れた治療成績を示唆するデ-タが得られているが,結論を出すにはもっと長い観察期間と更に症例を重ねる必要がある。固形腫瘍に対する効果の研究は乳癌,肺癌,食道癌,子宮癌などについてその効果を検討中であるが,まだ結論を出すにはもう少し時間が必要である。
マウスにおけるミトコンドリアDNAの遺伝様式・機構に関する分子遺伝学的解析

○単一の雌雄の生殖系列細胞を用いたmtDNAのコピー数の測定mtDNAの遺伝様式において、これまで仮説とされてきたボトルネック効果(生殖細胞形成過程の一時期にmtDNA分子数が極端に低下する現象)について詳細な解析を行った。様々な発生段階の単一細胞におけるmtDNA分子数を測定した結果、卵核胞期胚(4.6×10^5)、未受精卵(4.8×10^5)、前核期胚(5.0×10^5)、2細胞期胚(2.24×10^5)、4細胞期胚(1.4×10^5)、8細胞期胚(7.1×10^4)、胚盤胞期胚の内部細胞塊(3.8×10^3)、PGC(8.5d:2.4×10^3,10.5d:2.8×10^2,11.5d:2.3×10^2,12.5d:3.2×10^2,13.5d:3.9×10^2)であった。体細胞では10^3分子と考えられているのに対して、初期胚では10^410^5分子であったものの、始原生殖細胞(10.5-13.5d)では10^2分子まで減少しており、PGCのの11.5dの段階で極小となった。これまで、mtDNAのボトルネック効果は、胚盤胞期に起こるとも考えられてきたが、この可能性については本実験から否定され、PGCの移動期に起こることが明らかとなった。また、その際のコピー数は200コピー程度であり、子孫への伝達される時の分配の単位になると考えられる。本研究の結果は、mtDNAの遺伝様式の特徴について明らかにしたばかりでなく、mtDNAの突然変異によるミトコンドリア病の遺伝解析に応用が期待できる。〇初期胚における外来性(体細胞、生殖細胞由来)ミトコンドリアに対する排除能力初期胚のもつ精子由来ミトコンドリアを排除する機構が、他の細胞由来ミトコンドリアに対しても認識・作用するのか否かを検討した。C57BL/6J-mt^<spr2>(Mus spretus型mtDNAを持つ系統)より外来性ミトコンドリアとして、精子が形成される直前の円形精細胞、また体細胞由来として肝臓からミトコンドリアを調整した。調整したミトコンドリアはPIEZOマイクロマニピュレーションシステムにより、C57BL/6J(Mus musculus型mtDNAを持つ系統)の前核期胚に導入した。外来性mtDNAを導入した初期胚は2細胞期、胚盤胞期そして出生個体まで発生させ、各発生段階で回収した後、プロティナーゼK溶液で反応させることでDNA試料とした。その後、系統差によるDNA多型を利用したprimerを設計し、ABI7700システムによる外来性mtDNAのみの定量を行うことで、外来性mtDNAの各発生段階における変化を調べた。その結果、導入した平均150コピーの円形精細胞由来mtDNAは2細胞期では350-450コピーまで増加したものの胚盤胞期には40コピー程度まで低下した。また、出生個体ではほとんど外来性mtDNAは検出されなかった(1/39)。一方、肝臓由来mtDNAは平均30コピー導入され、2細胞期で70コピー、胚盤胞期で30コピーと円形精細胞の時と同様の増減を示したものの、出生個体では約50%(13/25)の伝達率が観察された。つまり、円形精細胞由来mtDNAは肝臓由来mtDNAよりも多いコピー数の導入にも関わらず、子孫には残りにくいことが明らかとなった。以上の結果から、初期胚の外来性ミトコンドリアに対する排除能力は、1)生殖細胞に特異的、2)初期発生過程での時期特異性はない、ことが考えられる。
標準理論を超える物理の階層性問題に対する新しい機構

標準理論を超えるTeVスケールの物理における小さい階層性問題について、ヒッグス粒子が大きな異常次元を持つ模型を考案し、現象論的に可能であることを示した。具体的には、強く相互作用するTeVスケールの質量を持つ粒子系と相互作用することにより、大きな異常次元が得られる。また、同様の機構によるアクシオン模型の問題の解消についても考察した。素粒子の標準理論において、ヒッグス粒子は電弱対称性の自発的破れを起こしかつ素粒子の質量の起源を与えるという中心的な役割を果たす。一方、ヒッグス粒子の理論には2次発散の量子補正による階層性問題という理論的に不可解な点があり、この問題を解消するものとして例えば標準理論の超対称理論への拡張がTeV領域以上での物理として最も有望視されている。しかしながら、ヒッグス粒子は未だに発見されず、近年その質量に対する下限として(エネルギー換算で)114GeVという値が実験から与えられたことにより、超対称理論に拡張しても階層性問題が完全に解消されるわけではないことが指摘され、多くの議論を呼んでいる。一方、素粒子の質量には大きな階層的構造があり、特にトップクォークの質量が突出しており電弱対称性の破れのスケールに非常に近いことも非常に興味深いなぞである。実は、先の階層性問題にはトップクォークの質量が大きいことがその要因のひとつになっている。そこで、TeV領域において標準理論に加えて新しいゲージ相互作用系を仮定し、トップクォークの質量を与える大きな湯川相互作用が、トップクォークと新しい系の重い(複合)粒子と混合することにより有効相互作用として現れる模型を提案し、その具体的な機構や問題点についての考察を与えた。このシナリオでは、ヒッグス粒子とトップクォークとの相互作用が高エネルギーで弱いとすれば、上記の階層性問題は基本的に解消される。それと同時に、突出して大きいトップクォークの質量の生成機構をも与えている。今年度はこの様な機構を持つ模型として2つ可能性、(1)超共形対称性を持つ理論への拡張(2)超対称性の破れを与えるゲージ伝播機構として特殊な型を持つ理論への拡張について詳しい考察を行った。(前者は論文に掲載、後者については年度内に論文を発表予定)素粒子の標準理論において、ヒッグス粒子は電弱対称性の自発的破れを起こしかつ素粒子の質量の起源を与えるという中心的な役割を果たす。これらの階層性に絡む問題に対して、対称性の小さい破れと考えるのではなく、何らかのダイナミクスによる自発的な構造として理解されるのではないか、という立場で研究を進めてきた。そのため場の量子論の繰り込み群的な特性の研究という側面も同時に併せ持つ。今年度は、超対称標準模型および標準模型のヒッグスセクターの階層性問題を解消もしくは緩和する新しい現象論的なシナリオについての研究を行い、超対称模型については既に論文として発表した。超対称を持たない新しいヒッグス模型については、国際会議SCGT06において発表をおこなった。現在、関連する2編の論文を投稿中である。一方、クォーク・レプトンの質量間の階層的構造がダイナミクスによって生じるようなある模型を提案し、その現象論についての研究を行った。今年度は,アクシオン模型についての研究を主に行った。素粒子の標準理論のstrong CP問題は,Peccei-Quinn(PQ)対称性を仮定するのが有力な解決法であり,アクシオンの存在が予言される。しかし,問題解決のためにはPQ対称性は極めて正確なものでなくてはならず,そのような大域的対称性は不自然であると考えられる。このPQ対称性の問題に対して,これまでにもいろいろな提案がされてきたが,今回PQ対称性を自発的に破る場に強い湯川相互作用を導入し,大きな異常次元を与えることによりこの問題を解消するような,ダイナミカルなアクシオン模型を新しく考察した。本研究課題では,これまで標準理論のヒッグスセクターの微調整問題を解決するような機構を探り,大きな異常次元による新しい機構と具体的な現象論的模型の構築を行った。このアクシオン模型の研究も,実は基本的なアイデアは共通しており,その意味でこれまでの研究の拡張になっている。またさらに,SU(5)_1×SU(5)_2という直積群の超対称大統一理論の枠組はアクシオン模型とうまく合うことも分かり,具体的な模型について考察した。これらの結果は現在論文としてまとめているところである。

これまでの研究において、スケール不変な超対称ゲージ理論における異常次元や超対称性の破れのパラメータのくりこみ群的様相について調べ、階層性問題などの現象論的模型の考察への応用を試みてきた。スケール不変な超対称ゲージ理論には双対性と呼ばれる性質があるが、これまでの研究の発展として、超弦理論と関連して考察されている特殊なゲージ理論における、Dualitycascade(双対性の連鎖)と呼ばれる特異な現象における、超対称性の破れのパラメータのくりこみ群的様相について調べた。その結果、破れのパラメータは連鎖を繰り返すと共に指数関数的に減少することを示した。そのほか、標準理論の拡張の研究と関連して、宇宙のバリオン数生成を説明するようなヒッグスセクターの新しい拡張の可能性についての研究も行なった。
連続的環化反応を基盤としたNF-κB阻害活性を有するent-カウレン類の合成

エンメイソウなどの薬草から単離されるent-カウレン類は有用な生物活性を持つことが知られている。本研究では、特にNF-κB阻害活性を有するent-カウレン-15-オン類に着目し、その全合成を目的とする。ビシクロ[3.2.1]オクタンを含む6/6/6/5員環で構成されるカウレン骨格の効率的構築法として連続的な環化反応を立案した。種々の検討の結果、低原子価チタンを用いた連続的な分子内ラジカル環化反応により一挙に構築する合成法を見出した。本研究は、連続的環化反応を用いたビシクロ[3.2.1]オクタン骨格効率的構築法の開発を基にしたNF-κB阻害活性を有するent-カウレン類の全合成および類縁体合成を目的とする。ent-カウレン類のうちD環が酸化されたent-カウレン-15-オン類はNF-κB阻害活性を示し、そのCD環部分がファーマコフォアと推定されている。そこでまずCD環部分に相当する官能基を備えたビシクロ[3.2.1]オクタン骨格を効率的に構築する方法論を開発し、その方法論を用いて、CD環構造を有する各種類縁体の合成とNF-κB阻害活性を有するent-カウレン-15-オン類の全合成を目指す。本研究ではまず、ent-カウレン-15-オン類の効率的CD環構築を行うための方法論として、連続的環化反応を考案した。すなわち、2-シロキシブタジエンと側鎖にプロパルギル基を有するエノンとのディールスーアルダー反応によりC環を構築し、生じたシリルエノールエーテルと末端アルキンとの間で遷移金属触媒を用いた5-exo-dig環化反応によりエキソメチレンを有するD環部分を構築し、ビシクロ[3.2.1]オクタン骨格を得ることができる。基質の合成として、置換基を有するプロピナールとシクロヘキサノンとの森田ーベイリスーヒルマン反応に成功し、側鎖に種々のプロパルギル基を有するシクロヘキサノンを得た。続いて、鍵反応である北原ーダニシェフスキージエンとの分子間ディールスーアルダー反応/遷移金属触媒を用いた5-exo-dig環化連続反応の検討のため、段階的に反応を試みた。その結果、ディールスーアルダー反応成績体を得ることに成功し、現在ent-カウレン-15-オン類のCD環部分の効率的構築法の確立を検討している。本研究は、連続的環化反応を用いたカウレン骨格効率的構築法の開発を基盤とし、NF-κB阻害活性を有するent-カウレン-15-オン類の全合成を目的とする。本研究ではまず、ent-カウレン-15-オン類の効率的CD環構築を行うための方法論として、ディールスーアルダー反応を用いた連続的環化反応を考案した。すなわち、2-シロキシブタジエンと側鎖にプロパルギル基を有するエノンとのディールスーアルダー反応によりC環を構築し、生じたシリルエノールエーテルと末端アルキンとの間で5-exo-dig型の環化反応によりエキソメチレンを有するD環部分を構築することで、ビシクロ[3.2.1]オクタン骨格を得ることができる。実際に反応を試みたところ、低収率ではあるが、連続的なディールスーアルダー反応/5-exo-dig環化反応が進行し、CD環部分を得ることに成功した。しかしながら、ごく最近に同様の反応例が北京大学のLee Chi-Sing准教授のグループから報告されており、合成計画の変更を余儀なくされた。そこで、低原子化チタンを用いた連続的な分子内ラジカル環化反応によりカウレン骨格を一挙に構築する計画とした。すなわち、エポキシドを有するA環部分と、プロパルギル側鎖を有するシクロへキセノンであるC環部分からなる基質に対し、3価のチタン試薬を作用させることにより、エポキシドの開環をトリガーとするラジカル環化反応によりBD環を一挙に構築できると考えた。本方法論のモデルとして、まずABC環の構築を検討した。α-イオノンを出発原料として用い、エポキシドを有するA環部分とC環部分のシクロへキセノンを併せ持つ基質を合成した。本基質でのラジカル環化反応を行った所、立体選択的に望みのABC環部分を得ることに成功した。今後は、プロパルギル側鎖の導入を行い、連続的ラジカル環化反応でのカウレン骨格の構築を検討する。他グループとの研究内容の重複により、合成ルートの変更を余儀なくされた。より堅実な合成ルートを採用することで、当初の計画よりやや遅れ気味になってはいるが、順調に進んでいる。カウレン骨格はビシクロ[3.2.1]オクタンを含む6/6/6/5員環で構成され、AB環の核間位とBCD環の核間位にそれぞれ不斉4級炭素を有する。このカウレン骨格の効率的な構築を行うための方法論として、低原子価チタンを用いた連続的な分子内ラジカル環化反応により一挙に構築することとした。

昨年度までに、本方法論のモデル基質として、エポキシドとエノンのみを有する化合物を用いてABC環の立体選択的な構築に成功している。そこで、天然物合成に向けて必要な酸素官能基を備えた基質を調製し、同様に分子内ラジカル環化反応を検討することとした。A環部フラグメントである6,6-ジメチル-2-シクロヘキセン-1-アセトアルデヒド、C環部フラグメントである2-ヨード-2-シクロヘキセン-1-オンとのカップリング反応により検討基質を得た。C7位とC14位の酸素官能基がそれぞれケトンまたはアルコールの基質について、ラジカル環化反応を行ったところ、C7位がアルコール、C14位がケトンの基質のときにはカウレン骨格と同じ立体化学の3環性化合物が得られた。一方、C7位がケトン、C14位がアルコールの基質ではAB環がcisに縮環した化合物が選択的に得られた。今後は、プロパルギル側鎖を導入した光学活性なC環部フラグメントを調製し、A環部フラグメントとのカップリングの後、連続環化反応でのカウレン骨格の構築を検討する。エンメイソウなどの薬草から単離されるent-カウレン類は有用な生物活性を持つことが知られている。本研究では、特にNF-κB阻害活性を有するent-カウレン-15-オン類に着目し、その全合成を目的とする。ビシクロ[3.2.1]オクタンを含む6/6/6/5員環で構成されるカウレン骨格の効率的構築法として連続的な環化反応を立案した。種々の検討の結果、低原子価チタンを用いた連続的な分子内ラジカル環化反応により一挙に構築する合成法を見出した。所属機関異動に伴う研究設備・備品などのセットアップ、人員の再配置・再教育などに予想より時間がかかり、当初の計画よりやや遅れ気味だが、順調に進んでいるモデル化合物を用いて連続的ラジカル環化反応によりカウレン骨格の構築を検討する。然る後、NF-kB阻害活性を有するent-カウレン類の全合成に向けて、合成研究を開始する。有機合成化学現在、段階的に行っている反応を連続的に行えるか検討する。然る後、種々の基質を合成して連続的環化反応の適用限界を調査する。その際に、同時にent-カウレン類のCD環部分の誘導体合成も狙うことで、研究展開をさらに促進させる。本年度の研究の進展がやや遅れた分、未使用となる研究費が生じてしまった。本年度は研究の進展がやや遅れた分、未使用となる研究費が生じてしまった。次年度は研究の進展が大いに期待できるため、消耗品等の購入により繰越分を使用する予定である。
免疫系による生体の統御・肝再生に伴っておこる自己認識の変化

肝を部分切除した【F_1】マウスの免疫応答は肝再生の過程で一過性に減弱する。この時期に一方の親マウスの脾臓細胞を静注すると、注入した細胞に対する【F_1】anti-Parent CTL(auto-reactive CTL)の誘導が抑制されることを発見した。そこで肝再生の過程で惹起される生体内の変化、特に自己認識の変化に焦点をあて研究計画に沿って実験を行い、以下の研究成果を得た。1.60年度研究計画とその成果(1)肝部分切除【F_1】マウスに強い免疫寛容を誘導するための基礎的条件の確立。実験に用いた数種類の【F_1】マウスの中でCB6【F_1】マウスが最も高い再現性を示した。肝部分切除した【F_1】マウスに親細胞を注入する時期は、肝切除後2日目から4日目までに注入した際に最も強い免疫寛容が誘導され、7日目以降に注入したのでは抑制が全くみられなかった。注入する脾臓細胞の数は2×【10^7】個を注入した時に強い寛容がみられた。(2)培養再生肝細胞が産出する免疫系を活性化する物質の同定。肝細胞の性状を知る目的で、再生肝細胞を遠心分離法により実質細胞と非実質細胞に分け、プラスチックに膠着する細胞を培養し、その性状を同定した(ギムザ染色,EA,EAC, iosette等)。培養肝実質細胞はMLRを抑制しなかったが、非実質細胞は抑制した。しかし同系T細胞の増殖は両者とも増殖した。2.61年度研究計画とその成果(1)再生肝細胞が産出する免疫系を活性化する物質の同定(続)。細胞を用いた場合と同様、肝実質細胞の上清はMLRを抑制しないが非実質細胞の上清は強い抑制活性をもっていた。現在これらの培養上清中に含まれる活性化物質の物理化学的性状を調べている。(2)抑制性細胞の同定。この寛容の誘導には、抑制性マクロファージ以外に比較的幼若な細胞群が関与しており、詳細な性状を検索中である。
受容体介在性エンドサイトーシスを利用した活性酸素分解酵素のダブルターゲティング

近年、虚血性疾患、炎症等の数多くの疾患に活性酸素種が関与することが明らかにされつつあるが、その発生ならびに障害の機序に関しては未だ不明な点が多い。こうした活性酸素障害に対する治療にはSODあるいはCATなどの活性酸素種を効率よく分解する酵素の利用が有望視されている。本研究では、受容体介在性エンドサイトーシスを利用して活性酸素代謝カスケードにおいて協同的に作用するスーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)およびカタラーゼ(CAT)の2種の酵素を細胞選択的に同時にターゲティングすることにより、活性酸素障害を効率よく抑制するという従来にない全く新しい着想に基づく治療戦略を考案し、これを実証した。サクシニル化により負電荷を付与したCATはスカベンジャー受容体を介して、マンノース修飾CATはマンノースレセプターを介して肝臓の非実質細胞に細胞に取り込まれ、虚血再灌流活性酸素障害に対して顕著な障害抑制効果を示した。さらに、マンノース修飾SODとサクシニル化CATという異なった受容体介在性機構を利用してターゲティングを行ったときは受容体レベルでの競合が起こらないために同時に両者を効率よく肝臓の非実質細胞へ送達させることが可能であり、相乗的な活性酸素障害抑制効果を得ることができた。また、その障害抑制機構として、ICAM-1の発現レベルがCAT誘導体投与によって減少し、好中球の組織内浸潤が抑制されて、結果として組織障害が軽減されることが明らかになった。以上、虚血再灌流時の活性酸素障害のメカニズム解明及びその治療法に関する基礎情報が得られたことによって、臓器移植などへの応用研究に対して極めて有益な知見を提供できるものと考えられる。こうした活性酸素障害に対する治療にはSuperoxide Dismutase(SOD)あるいはCatalase(CAT)などの活性酸素種を効率よく分解する酵素の利用が有望視されている。申請者のグループではこれまでにSODを取り上げ、種々の化学修飾法を利用することによりSODの体内動態を細胞レベルで精密に制御可能であることを明らかにしてきた。SODの作用により生成する過酸化水素を分解するCATとのダブルターゲティングにより活性酸素障害がより効果的に抑制可能であると推察されるが、標的とすべき細胞ならびにその細胞へのターゲティングに適した受容体に関する情報は得られていない。そこで本研究では、マウスにおける肝虚血・再灌流障害を対象にSODならびにCATを受容体介在性エンドサイトーシスの機構により肝臓の実質細胞、血管内皮細胞あるいはKupffer細胞に選択的に送達することによる障害抑制効果を検討した。ウシ肝臓由来のCATを用い、それぞれ、アシアロ糖タンパク質受容体を介して肝細胞に、マンノース受容体を介して肝非実質細胞に取り込まれる、ガラクトース修飾体およびマンノース修飾体を合成した。また、スカベンジャー受容体あるいは細胞表面をターゲットとした誘導体、さらにはポリエチレングリコールで修飾することにより細胞外濃度を維持するタイプの誘導体も併せて合成した。その結果、肝非実質細胞ターゲティング型CAT誘導体が優れた効果を示すことが明らかとなった。さらには、SOD誘導体との併用によりさらなる効果改善か得られた。以上の結果より、これら活性酸素分解酵素誘導体の最適な組み合わせ投与により虚血・再灌流障害に対するダブルターゲティング療法の可能性が示された。