hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タイラーウイルスを利用した外来遺伝子の中枢神経内導入の試み

タイラーウイルス(Theiler's murine encephalomyelitis virus,TMEV)はマウスに急性致死性の灰白脳脊髄炎を起こす急性亜群(GDVII株)と、マウス脊髄に持続感染し、脱髄を引き起こす慢性亜群(DA株)に分けられる。DA株は感染初期に主として神経細胞に感染するが、GDVII株と異なり、神経細胞を壊死・脱落させることなく、慢性期にはマウスの脊髄に持続感染することが知られている。我々はまずタイラーウイルス持続感染細胞であるマクロファージではDA株は増殖しウイルスゲノムの維持は可能であるものの、GDVII株はほとんど増殖せずゲノムの維持は不可能であることを明らかにした(J.Virol.71:729-733,1997)。さらにこの現象はマクロファージ細胞のみで認められること(Microbiol.Immunol.43:885-892,1999)、そしてリコンビナントおよび点変異ウイルスを用いることにより、マクロファージにおけるTMEV増殖にはL蛋白翻訳領域1079ntのAUGから翻訳されるL^*という蛋白が重要であることを示した(J.Virol.72:4950-4955,1998)。最後にこれらのデータを踏まえて、DA株のL蛋白翻訳領域にリンホトキシン遺伝子を組み込んだリコンビナント・ウイルスを作製し、培養細胞におけるリンホトキシン遺伝子の発現を検討した。ウエスタンブロット法およびenzyme-linked immunosorbent assayにより、リコンビナントウイルス感染BHK-21細胞においてリンホトキシンの発現が確認された。さらに、L-929細胞に対して明らかな細胞毒性が認められ、発現したリンホトキシンが生物活性を有することが示された(Microbiol.Immunol.43:83-86,1999)。これらのことからTMEVがウイルスベクターとして使用可能であり、単に神経難病の治療のみならず、神経難病の病態解析にも有用であることが示唆された。以上の研究成果から、TMEVが中枢神経内に外来遺伝子を導入するウイルスベクターとして使用可能であることが示唆された。マウスという小動物の中枢神経内に自由に外来遺伝子を導入して発現させることができれば、単に中枢神経疾患の治療のみならず、神経難病の病態解析にも非常に有用であると考えられる。タイラーウイルスを外来遺伝子の中枢神経内導入のベクターとして利用するために、現在作製されている2種類の感染性cDNA(DA株、GDVII株)のうち、どちらの感染性cDNAを使用するのが適切かを検討した。ウイルスの持続感染細胞はマクロファージと考えれいるので、まずそれぞれの親ウイルスをマウス・マクロファージ細胞J-774に感染させ、それぞれの増殖曲線をみた。DA株では細胞内ウイルスは感染後12時間後、遊離ウイルスでは24時間後にピークを示し、明らかにJ-774細胞で増殖した。しかし、GDVII株ではその感染価ははっきりしたピークは示さず、細胞内ウイルスにおいても遊離ウイルスにおいても徐々に減少した。次にSDS-PAGEでウイルス蛋白の合成を検討したところ、DA株では経時的にウイルス蛋白の増加がみられたが、GDVII株ではほとんどウイルス蛋白の合成は認めれなかった。さらにRT-PCRでウイルスRNA量を経時的に検討したところ、DA株では経時的にRNAゲノムの増加がみられたが、GDVII株ではほとんどRNAゲノムの増加はみられなかった。すなわち、DA株は明らかに感染・増殖するものの、GDVII株はほとんど増殖しないことが分かった。

吸着試験ではむしろGDVII株の方がJ-774細胞に対する吸着率がよいことから、上述した両株間の差異は、ウイルスが感染して細胞内に侵入した後、ウイルスRNAの複製の段階における差異と考えられる。外来遺伝子の中枢神経内で発現させるには、リコンビナントウイルスの感染・増殖が必須であることから、我々の目的にはGDVII株ではなく、DA株の感染性cDNAを使用するのが適切と思われた。昨年度、タイラーウイルス持続感染細胞であるマクロファージではDA株は増殖するものの、GDVII株はほとんど増殖しないことを明らかにし(J.Virol.71:729-733,1997)、このことからタイラーウイルスを外来遺伝子の中枢神経内導入のベクターとして利用するためにはDA株を用いることが適切であることを示した。DA株をベクターとして利用するためには、ウイルス持続感染に必須なマクロファージにおけるウイルス増殖に関するウイルス遺伝子領域を決定する必要があるため、今年度はDA株とGDVH株のリコンビナント・ウイルスおよび点変異ウイルスを用いることにより、マクロファージにおけるウイルス増殖に関するウイルス遺伝子領域を検索した。リコンビナント・ウイルスを用いた実験では、マクロファージにおけるタイラーウイルス増殖には、DA株のL蛋白翻訳領域が重要であることが分かった。さらに点変異ウイルスを用いた実験ではL蛋白翻訳領域1079ntのAUGから翻訳されるL^*という蛋白が重要であることが示された(J.Virol.72:4950-4955,1998)。このL^*蛋白はDA株で合成されるが、GDVII株では合成されない。さらにL^*蛋白依存性のウイルス増殖はウイルスRNAの複製の段階で制御されていることが明らかになった。上記のデータを踏まえて、DA株のL蛋白翻訳領域にリンホトキシン遺伝子を組み込んだリコンビナント・ウイルスを作製し、その発現を検討中である。昨年度までの研究により、タイラーウイルス持続感染細胞であるマクロファージではDA株は増殖しウイルスゲノムの維持は可能であるものの、GDVII株はほとんど増殖せずゲノムの維持は不可能であることを明らかにした(J.Virol.71:729-733,1997)。さらにこの現象はマクロファージ細胞のみで認められること(Microbiol.Immunol.43:885-892,1999)、そしてリコンビナントおよび点変異ウイルスを用いることにより、マクロファージにおけるタイラーウイルス増殖にはL蛋白翻訳領域1079ntのAUGから翻訳されるL^*という蛋白が重要であることを示した(J.Virol.72:4950-4955,1998)。本年度はこのL蛋白翻訳領域にリンホトキシン遺伝子を組み込んだリコンビナント・ウイルスを作製し、培養細胞におけるリンホトキシン遺伝子の発現を検討した。
糸状性シアノバクテリアの滑走運動と光応答機構の分子生物学的研究

シアノバクテリアSynechocystissp.PCC6803は、線毛構造によって固体表面上を運動し、走光性を示す。私は、正の走光性(positive phototaxis)の調節には、Cheタンパク質などのべん毛運動調節因子や受容体に相同性を示すpixG,-H,-I,-J1,-J2,-L遺伝子群がかかわることをすでに報告した。受容体PixJ1は、植物の光受容体フィトクロムの色素結合領域に似た領域をあわせ持つことから、正の走光性の光受容体と考えられた。本研究では、PixJ1が光受容体である可能性を確かめるために、pixJ1遺伝子産物をヒスチジンタグ融合タンパク質(His-PixJ1)としてSynechocystisで発現させ、単離し、生化学的解析をおこなった。SDS-PAGEゲル内でHis-PixJ1は蛍光を発し、その強度は亜鉛イオンによって増加した。このことは、His-PixJ1がSynechocystisの細胞内でフィトクロムと同様に開環テトラピロールを共有結合していることを示している。さらに、His-PixJ1は青色光(最大吸収435nm)と緑色光(最大吸収535nm)による光変換を示した。既知のフィトクロムは赤色光(650-700nm)/遠赤色光(700-750)の光変換を示すことが知られていることから、PixJ1は新規の色素を結合する光受容体であることを明らかにした。PixJ1が結合する色素を同定するために、Synechocystisのゲノムが持つ開環テトラピロールの合成にかかわる遺伝子を探索した結果、ビリルビン(最大吸収460nm)が色素として結合する可能性が示唆されたビリルビン合成酵素(ビリベルヂン還元酵素)は動物のヘム代謝系にかかわることが知られているが、植物やシアノバクテリアではその機能は知られていない。ビリルビンがPixJ1に結合しているかを調べるために、His-PixJ1発現株を親株として、ビリベルヂン還元酵素をコードする遺伝子を破壊した。現在、この破壊株からHis-PixJ1タンパク質を単離して吸収スペクトルの測定を試みている。
ガラスの結晶化手法を応用した固体電解質の配向制御

溶融ガラスの結晶化プロセスを利用した、La-Ca-Si-Al-O系の新しい配向型固体電解質作製法を開発した。溶融急冷法により作製したガラスを種々の条件下で結晶化させ、非常に均質で、かつc軸面が優先的に成長した結晶化ガラスを作製する条件を見出した。得られたセラミックスは導電性に異方性を有するアパタイト型固体電解質であり、配向操作を行わない場合に比べて大幅な物性の向上が得られることを確認した。このようにイオン伝導パスを一方向に優先的に揃えた、電気化学デバイス向けの高度配向型固体電解質を作製するプロセスを確立した。仕込み組成La_10Si_6O_27で示されるランタンシリケート緻密結晶を調製し、導電率などの物性、高温における化学的安定性を明らかとした。特にSiサイトに微量の元素置換を施した緻密試料は1073Kにおいて70mScm^<-1>以上の非常に高いイオン導電性を示し、シリケート系の材料でこれまでに知られている中で最高の導電率を持つ材料の開発に成功した。本材料の特長である導電性の活性化エネルギーが低いことを考えれば、中温作動燃料電池電解質として有力な候補といえる。また水素、二酸化炭素雰囲気下で継続的に導電率測定を行った結果、本材料は化学的にも非常に安定であった。この試料は導電性に異方性を持つと予想され、この材料の配向制御を行うことが出来れば、今後導電性の更なる向上が期待でき、高性能燃料電池の開発につながると考えられる。そこで本研究では、まず溶融法によりシリケートガラスの作製を行い、これを結晶化させる際に優先的にある面を一方向に析出させるという、ガラスを配向の場とする新しいセラミックス作製法を検討した。本年度はまず均質なガラス材料の作製を行った。具体的には白金るつぼ内にセラミックス作製時と同様の混合原料を入れて1873K、空気中で溶融させ、その後黒鉛鋳型内にキャストして急冷後、電気炉にて1073Kより徐冷することによりガラスを作製した。ガラス化の促進のために、また成長される結晶相のイオン導電性の向上を目指し、原料には予めCaO、Al(OH)_3等の第三成分を添加することを検討したところ、非常に均質なガラスの作製が行えた。次年度にこれの結晶化を行う予定である。昨年度に合成に成功したランタンシリケート緻密結晶(仕込み組成La_<10>Si_6O_<27>)のイオン・電子導電率などの物性、高温における化学的安定性を明らかとした。特にSiサイトに微量の元素置換を施した緻密試料は1073Kにおいて70mScm^<-1>以上の非常に高い導電性を示したが、イオンブロッキング法から評価したそのイオン輸率は99%以上であることが明らかとなった。また水素、二酸化炭素雰囲気下での導電率測定を引き続き行ったが、本材料はこれらの環境下でも化学的に非常に安定であった。本材料の特長である導電性の活性化エネルギーが低いことを考えれば、本材料は中温作動燃料電池電解質として極めて有力な候補であるということが分かった。さらに今年度はこの材料に適用可能な電極材料について、その組成、作製法についての検討を行った。正極に(La,Sr)(Co,Fe)O_<3-δ>系、負極にNi-(Ce,Gd)O_<2-δ>系電子・イオン混合伝導体を用いたところ、その性能は良好であり、定常分極測定法により評価した電極過電圧は他の電解質材料に適用した場合の文献値とほぼ同様の低い値であった。以上から、良好な電極/電解質界面が構築できているということが明らかとなった。次年度はこの緻密電解質を用いた発電特性を詳細に評価し、結晶化ガラス電解質を用いた燃料電池性能を評価する際の参考値とする。また昨年度、溶融シリケートガラスの作製を行ったが、今年度はその結晶化過程を検討した。具体的には1873K、空気中での溶融と急冷、電気炉内での1073Kからの徐冷によって作製したガラスを種々の条件下で結晶化させた。試行を重ねた末、非常に均質で、かつc軸面が優先的に成長した結晶化ガラスの作製が行えた。本研究では、溶融ガラスの結晶化プロセスを利用した、La-Ca-Si-Al-O系の新しい配向型固体電解質作製法を開発した。通常の固相法により多結晶セラミックス電解質を合成する代わりに、意図的に目的組成からずらした原料配合比に設計することによって試料を液相に移行させ、溶融急冷法によるガラスをまず作製した。溶融雰囲気は1873K、空気中とし、急冷後1073Kからの徐冷によってガラスを作製した。

このガラスを種々の条件下で結晶化させたところ、非常に均質で、かつc軸面が優先的に成長した結晶化ガラスの作製が行える条件を見出した。この手法を、導電性に異方性を有するアパタイト型固体電解質に適用することで、電気化学デバイス向けの高度配向型固体電解質が作製でき、配向操作を行わない場合に比べて大幅な物性の向上が得られることを明らかとした。中でも本年度は溶融ガラスの結晶化時に材料にかかる酸素濃度勾配を制御することで望みの方向性をもたせた配向性酸化物結晶を析出できるという興味深い現象を見出し(嶺重ら,特願2009-185885)、これにより最も配向度の高い電解質を作製できることが分かった。以上から酸素化学ポテンシャル勾配を外場として利用する新規概念による固体電解質作製プロセスが可能となることを示した。得られたガラスは酸素のイオン導電特性を示し、1073Kにおいて9.0×10^<-5>S・cm^<-1>という導電率、起電力法から求めたイオン輸率が0.89という特性を有していた。さらに厚さ0.4mmの結晶化ガラス電解質を用い、正負両極に白金を用いたセルを作製し、燃料電池として作動することも確認した。以上から、酸素ポテンシャル勾配という外場を利用して溶融ガラスを結晶化させることで配向を誘起し、導電パスが一方向に優先的に揃った固体電解質を作製するプロセスが確立された。
暑熱環境下運動時の中枢性および末梢性疲労による筋出力調節および循環調節への影響

暑熱環境下で運動すると、快適な環境下での運動と比較して、疲労感を感じやすく、生体への負担も大きいため、運動継続時間が短縮する。暑熱環境下運動時の疲労は末梢性だけでなく、体温の過剰な上昇による中枢性疲労によっても誘発されることが報告されている。本研究プロジェクトでは、これらの両疲労が筋出力調節および循環調節に与える影響を客観的指標から評価する。脳活動指標として、注意力や運動遂行および抑制機能を評価するP300、運動開始に伴う随伴陰性変動(CNV)および運動関連電位(MRCP)を用いて実験を実施した。また、fMRIを用いた暑熱負荷時の認知機能への影響を検討した。基礎的な実験として、中強度の自転車運動によるP300への影響を2つの温度環境下(20°Cおよび35°C)で検討した。P300の振幅は運動遂行でも運動抑制でも高温環境下の方が低くなったが、運動抑制において顕著な低下が認められた。これらの結果はこれまで注意力などの認知機能評価に用いられている反応時間やエラー率のような行動指標では脳機能の低下を評価し難いことを示唆しており、本研究の有効性を支持するものである。本研究結果は2019年2月にPhysiological Reportsに掲載された。続く実験では暑熱環境下での発汗による脱水に着目し、認知機能への影響を検討した。実験環境は35°Cとし、中強度の自転車運動を約1時間実施した。しかし、飲水の有無が被験者に心理的な影響を与えたため、主効果が見えにくい結果となった。セントラルコマンドへの影響を検討するため、運動開始の関連する電位変化を水循環服を用いて体温を上昇させ、高体温の影響を検討した。現在、解析中であるが、MRCPでの評価は芳しくないものの、CNVでは高体温の影響が認められた。いくつかの結果は国際学会で発表し、今後も国内学会で発表予定である。研究期間の後半で実施するセルフペース運動実験へ向けての予備実験において、いくつかの問題点が考えられた。課題の提示方法を検討する必要があり、提示プログラムソフトを開発する。現在、制作会社と準備を進めており、今夏までには導入できるように進めている。また、小筋群を使った実験では循環応答に大きな変化を得ることが難しく、脚筋を使った実験系を取り入れるため、負荷装置を開発することとなったが、年初から開発に取り組んでおり、夏前までには準備が整う。セントラルコマンドを定量化するために検討している運動開始の関連する電位変化において、提示方法および負荷方法の改善の必要性がみられた。昨年度は事象関連電位を主にプロトコルを設定したため、運動初期の循環応答を検討するのには少し問題点がみられた。また、単純に暑熱負荷による高体温の影響のみを検討したため、効果を得やすかったが、末梢性疲労の影響を検討するためには負荷方法を再検討する必要があると思われた。そこで、本年度は上腕の小筋群を対象とするのではなく、脚部の大筋群を対象とした実験系ができるように負荷装置を製作することとした。2つ目の実験において水分補給による注意力への影響を検討したものの、予想外に2回目のテスト時に事前対策をする被験者が複数いたため、研究期間の後半で実施するセルフペースの実験におけではモチベーションが大きく関与する実験プロトコルとなるため、提示方法の再考が必要と感じられた。来年度もいくつかの予備実験および質問調査で検討し、再来年度以降のプロトコル確立に準備する必要がある。

課題の提示方法を検討する必要があり、提示プログラムソフトを開発する。現在、制作会社と準備を進めており、今夏までには導入できるように進めている。また、小筋群を使った実験では循環応答に大きな変化を得ることが難しく、脚筋を使った実験系を取り入れるため、負荷装置を開発することとなったが、年初から開発に取り組んでおり、夏前までには準備が整う。セントラルコマンドを定量化するために検討している運動開始の関連する電位変化において、提示方法および負荷方法の改善の必要性がみられた。昨年度は事象関連電位を主にプロトコルを設定したため、運動初期の循環応答を検討するのには少し問題点がみられた。また、単純に暑熱負荷による高体温の影響のみを検討したため、効果を得やすかったが、末梢性疲労の影響を検討するためには負荷方法を再検討する必要があると思われた。そこで、本年度は上腕の小筋群を対象とするのではなく、脚部の大筋群を対象とした実験系ができるように負荷装置を製作することとした。2つ目の実験において水分補給による注意力への影響を検討したものの、予想外に2回目のテスト時に事前対策をする被験者が複数いたため、研究期間の後半で実施するセルフペースの実験におけではモチベーションが大きく関与する実験プロトコルとなるため、提示方法の再考が必要と感じられた。来年度もいくつかの予備実験および質問調査で検討し、再来年度以降のプロトコル確立に準備する必要がある。
無水プロトン伝導性液晶高分子膜の創製と燃料電池への応用

酸塩基コンプレックスに基づく無水プロトン伝導性液晶の開発を行った。トリアジン系縮合剤である4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリドを用いて、長鎖アルキル基を有する安息香酸誘導体と3-アミノプロパンスルホン酸とのアミド化反応を水酸化カリウム存在下、THF中で室温にて行ったところ、高収率でスルホネート基を有するアミド化合物が得られた。これらを陽イオン交換樹脂を用いて対応するスルホン酸誘導体へと変換した。スルホン酸誘導体は、単独でサーモトロピックカラムナー液晶性を示した。一方、塩基性分子であるイミダゾールとスルホン酸誘導体の複合体においては、イミダゾールが50モル%以下ではカラムナー液晶相が形成されたが、60および65モル%のイミダゾール複合体ではジャイロイド型双連続キュービック液晶相が形成されることがわかった。さらに、酸塩基コンプレックス形成によってプロトン伝導度が1000倍以上向上することを見出した。例えば、100度のキュービック相では10-4 S cm-1オーダーの無水プロトン伝導度が得られた。この結果は、プロトン化されたイミダゾールがプロトンキャリアとして機能したためと考えられる。また、高効率なイオン輸送のための液晶材料の設計指針を得るために、パーフルオロエチレンオキシド鎖を有するブロック構造分子や環状カーボネート基を有する液晶、多様なイオン性基をもつ光重合性液晶の開発にも成功した。研究計画にしたがって、酸塩基コンプレックス形成に基づく無水プロトン伝導性液晶材料を構築することに成功した。特に、配向制御しなくてもプロトンチャンネルが三次元的に連結する双連続キュービック相を発現させることができた。また、イオン性重合液晶の光架橋によるイオン伝導高分子フィルムの開発に成功した。さらに、当初予定にはなかったパーフルオロエチレンオキシド鎖や環状カーボネート基を有するリチウムイオン伝導性液晶材料の開発およびこれを用いたリチウムイオン電池の構築にも成功した。これらの双極子ーイオン相互作用を駆動力として形成されるチャンネル構造は、プロトン化イミダゾールなどのプロトン性塩を溶解することができるため、新たなプロトン輸送場としての機能展開が期待される。現在、酸塩基コンプレックスに基づく無水プロトン伝導性液晶と白金担持カーボン電極との接合体における発電特性を評価しており、有望な成果を得ている。今後は、液晶材料の膜厚、分子配向、および電極材料との接触抵抗が電流密度と電圧に及ぼす効果を詳細に検討し、より高性能な燃料電池の開発を目指す。燃料電池応用を指向した無水プロトン伝導性液晶高分子膜の構築を行った。双性イオン構造としてイミダゾリウムスルホベタイン構造を有する光重合性液晶分子の設計・合成を行った。光重合基にはアクリレート基を採用した。液晶性発現および相転移温度を制御するために重合性基の数を調節した。重合性基を二つ有する扇型分子構造の双性イオンモノマー単独体は、20°C以上でヘキサゴナルカラムナー液晶性が発現した。この双性イオン性モノマーと様々な酸性分子を溶液混合して、溶媒を除去することにより、プロトン伝導性を示す液晶性複合体が得られた。例えば、無水ベンゼンスルホン酸、硫酸、リン酸と双性イオン性モノマーとの等モル混合により得られる複合体は、30°C以上でヘキサゴナルカラムナー液晶性を示した。光ラジカル重合開始剤をドープした双性イオン液晶/酸性分子複合体に対して、液晶場において紫外線を照射することにより、機械的安定性・自立性を有する高分子フィルムを得ることに成功した。双性イオン液晶モノマーを光架橋して得られる高分子フィルムは10-9 S cm-1オーダーのイオン伝導性を示すのに対して、酸性分子との複合体液晶を架橋して得た高分子フィルムでは100°Cの無水条件下で最大で10-3 S cm-1オーダーのプロトン伝導度が得られ、飛躍的な伝導度上昇を達成することに成功した。また、ニトリル基を有する光重合性分子とイミダゾリウム型プロトン性イオン液体からなる二成分系超分子液晶を開発することに成功した。ニトリル基とイオン液体とがイオンー双極子相互作用することにより、プロトン性イオン液体が一次元および二次元チャンネル構造を形成することが明らかとなった。さらに、光架橋により高分子フィルム化することに成功し、双性イオン液晶高分子フィルムよりも高プロトン伝導度を達成することができた。以上、本研究では新しい分子集積手法を開拓した。2017年4月に東京大学から物質・材料研究機構に異動して研究室の立ち上げをするために時間を要した。研究提案書では研究1年目において液晶高分子膜の燃料電池特性の評価まで研究を進展させる予定であったが、新規液晶高分子膜の開発とプロトン伝導性評価までに留まった。しかし、当初予期していなかったニトリル基とプロトン性イオン液体のイオンー双極子相互作用によって二成分系超分子液晶が得られることを新たに見出した。動的な非共有結合によるプロトン性イオン液体の低次元組織化が達成できたことから、当初研究計画よりも高プロトン伝導性を示す液晶高分子膜が得られた。トリアジン系縮合剤である4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-

メチルモルホリニウムクロリドを用いて、長鎖アルキル基を有する安息香酸誘導体と3-アミノプロパンスルホン酸とのアミド化反応を水酸化カリウム存在下、THF中で室温にて行ったところ、高収率でスルホネート基を有するアミド化合物が得られた。これらを陽イオン交換樹脂を用いて対応するスルホン酸誘導体へと変換した。スルホン酸誘導体は、単独でサーモトロピックカラムナー液晶性を示した。一方、塩基性分子であるイミダゾールとスルホン酸誘導体の複合体においては、イミダゾールが50モル%以下ではカラムナー液晶相が形成されたが、60および65モル%のイミダゾール複合体ではジャイロイド型双連続キュービック液晶相が形成されることがわかった。さらに、酸塩基コンプレックス形成によってプロトン伝導度が1000倍以上向上することを見出した。例えば、100度のキュービック相では10-4 S cm-1オーダーの無水プロトン伝導度が得られた。この結果は、プロトン化されたイミダゾールがプロトンキャリアとして機能したためと考えられる。また、高効率なイオン輸送のための液晶材料の設計指針を得るために、パーフルオロエチレンオキシド鎖を有するブロック構造分子や環状カーボネート基を有する液晶、多様なイオン性基をもつ光重合性液晶の開発にも成功した。研究計画にしたがって、酸塩基コンプレックス形成に基づく無水プロトン伝導性液晶材料を構築することに成功した。特に、配向制御しなくてもプロトンチャンネルが三次元的に連結する双連続キュービック相を発現させることができた。また、イオン性重合液晶の光架橋によるイオン伝導高分子フィルムの開発に成功した。さらに、当初予定にはなかったパーフルオロエチレンオキシド鎖や環状カーボネート基を有するリチウムイオン伝導性液晶材料の開発およびこれを用いたリチウムイオン電池の構築にも成功した。これらの双極子ーイオン相互作用を駆動力として形成されるチャンネル構造は、プロトン化イミダゾールなどのプロトン性塩を溶解することができるため、新たなプロトン輸送場としての機能展開が期待される。今後は、双性イオン液晶/酸性分子の複合体およびニトリル分子/イオン液体からなる液晶高分子膜について、触媒担持カーボン電極との接合体を作製し、これらの燃料電池特性の評価を行う。また、まだ達成できていない双連続キュービック液晶構造を発現するプロトン伝導性液晶モノマーの設計・合成を行い、プロトンチャンネルの配向制御がフリーな材料創製の実現を目指す。現在、酸塩基コンプレックスに基づく無水プロトン伝導性液晶と白金担持カーボン電極との接合体における発電特性を評価しており、有望な成果を得ている。今後は、液晶材料の膜厚、分子配向、および電極材料との接触抵抗が電流密度と電圧に及ぼす効果を詳細に検討し、より高性能な燃料電池の開発を目指す。
衛星と降水の同位体観測ネットワ-クによる大陸における水循環過程の研究

1.降水の安定同位体が水蒸気輸送過程に強く規制されていることを用いて、世界に100ヶ所以上のステ-ションを有する国際原子力機関と世界気象機関共同の降水の観測ネットワ-クによる同位体測定デ-タと、衛星デ-タとを関連づけて大規模な水循環過程を解明するために、衛星デ-タの処理を行った。大型計算機を用い、積雪被覆面積の月別デ-タを取出し、また、Global Vegetation Index(GVI)週間デ-タについては月間値のカラ-表示化を実施した。これらの面積や活動の時計列変動については、購入した高速パソコンを用いて画像処理を行い、これらの月別変動と年々変動の様子を明らかにした。2.降水の同位体デ-タについては、パソコンを用いてグラフ化し、衛星デ-タと関連づけた。先ず、アジア地域における大規模な水循環過程を検討したところ、積雪被覆面積に加えて積雪深のデ-タの必要性と、東ユ-ラシアにおける積雪量と日本の降水の同位体デ-タとの間の新たな関連、を見出すことができた。3.2.に記した関連は、私が今日まで見出してきた、日本海側の降雪に関わる水蒸気輸送過程などに関する我々が現在持ちあわせている同位体に関する知識からは理解できない問題と同一のものであった。「ひまわり」の衛星画像からは、新潟以北の日本海側と北陸地方では降雪をもたらす降雪雲システムが異なること分かってきた。そこで、MOS-1の衛星デ-タを用いて、日本海上のそれらの雪雲における水蒸気量と雲水量を計算したところ、新潟以北と北陸地方の降雪をもたらす日本海上の降雪雲システムにおいて、水蒸気量はほぼ変わらず、雲水量は前者の方が後者より大きいという、これまた予想外の結果であった。これらのことから、東アジアから日本へかけての水循環の機構が未知の部分の多いシステムであることが明らかになった。
子嚢菌類からの新規生理活性リード化合物の探索

Emericella属、Talaromyces属菌をはじめとする子嚢菌及び医真菌とその関連菌類について抗真菌活性を中心とした医薬品のリード化合物と新規化合物の検索を行い、概略以下の知見を得た。E.falconensisから得られた新規還元型アザフィロン誘導体には発癌プロモーター抑制作用が期待され、falconensone Aにはレチノール酸の分化誘導増強活性が見出された。また、E..heterothallicaの新規cyclosterol類はフミガツス症の原因菌Aspergillus fumigatusに対して特異的な抗菌活性を示すことを見出している。E..purpureaからは新規セスタルペン2種と新規インドロジテルペン2種を単離・構造決定した。T.cnvolutusからはアザフィロン類とともに新規tetramic acid誘導体4種を単離し、その構造を確定するとともに、これらがCandida albicans等に抗菌活性を示すことを見出した。医真菌に関しては関連筋も含めてさらに数十種を培養し、TLC、HPLC及び抗菌試験による検討をもとに成分の分離を行った。深在性病原菌の関連種であるAuxarthron conjugatumより赤色色素2種を単離し、その構造を推定した。さらに、Oidiodendron属菌より得たtetranorditerpenoid誘導体数種の構造を決定し、カンジダ症の原因菌Candida albicansに特異的に強い抗菌活性を示すことを見出した。さらに、肺真菌症患者から分離されたスエヒロタケからindigotinとともに新規インドール系橙色色素を得て、その構造を確定するとともに強い細胞毒性を確認し、スエヒロタケの病原性との関連を示唆した。Emericella属菌についてはTLC及びHPLCによる検討をもとに成分の分離を行った。E.hetrothallicaからAspergillus fumigatusに強い抗菌性を示す18,22-cycloergostane骨格を有するステロイド3種を単離し、それらの構造を決定した。このうち2種は新規化合物であり、それぞれemesteroneA、Bと命名した。また、既に分離した以下の化合物については生理活性の検討を行った。E.falconensisから得られた新規azaphilone誘導体9種についてはすべて抗発癌プロモーター作用が観察された。長い共役系を有する新規黄色化合物falconensone Aにはレチノール酸の分化誘導を増強する活性が見出された。今後、Talaromices属菌及びE.purpurea、E.foveolata等の成分分離及び生理活性の検討を行っていく。医真菌については関連菌も含めて数種を培養し、TLC、HPLC及び抗菌試験による検討をもとに成分の分離を行った。日和見感染による肺真菌症患者から分離されたスエヒロタケからは青黄色色素indigotin、indirubin、isatin及びtryptanthrinとともに新規インドール系橙色色素を得て、現在その構造を推定している。さらに、Auxarthron conjugatumより赤色色素2種を単離し、その構造を推定した。これらの生理活性については今後検討していくとともに他の菌の成分検索を続けていく。医真菌に関しては関連菌も含めてさらに数十種を培養し、TLC、HPLC及び抗菌試験による検討をもとに成分の分離を行った。深在性病原菌の間連取であるAuxarthron conjugatumより赤色色素2種を単離し、その構造を推定した。さらに、Oidiodendron属tetranorditerpenoid誘導体数種を単離し、その構造を決定した。これらの化合物はCandida albicansに強い抗菌活性を示す。Emericella属菌及びTalaromyces属菌についてTLC及びHPLCによる検討をともに成分の分離を行った。E.hetrothallicaから得られたAspergillus fumigatusに強い抗菌性を示す新規18,22-cyclosteroidについて生理活性の検討を行った。

E.falconensisから得られた新規黄色化合物falconensone Aにレチノール酸の分化誘導を増強する活性を見出し、その誘導体に強い分子誘導活性と細胞増殖抑制作用を観測した。Talaromices属菌数種についてアザフィロン誘導体を検索し、成分及び旋光性の違いから2系統に分けた。Talaromyces cnvolutusからはmitorubrin誘導体とともにtetramic acid誘導体5種(新規4種)を単離し、その構造を確定した。この中にはCandida albicansに強い抗菌活性を示す化合物があることを見出した。医真菌及びその関連菌については約100株を培養し、抗菌試験による検討をもとに成分の分離を行った。Oidiodendron属菌からtetranorditerpenoid誘導体数種を単離し、その構造を決定した。これらの化合物はCandida albicansに強い抗菌活性を示し、構造活性相関について示唆を与えることができた。また、日和見感染による肺真菌症患者から分離されたスエヒロタケからはindigotin等とともに新規インドール系橙色色素を得て、その構造を確定した。本化合物は強い細胞毒性を有し、スエヒロタケの病原性との関連が示唆された。さらに、深在性病原菌の関連菌であるAuxarthron conjugatumより新規赤色色素2種を単離し、その構造を推定した。
消化管粘膜細胞のホスホリパ-ゼA_2アインザイムの生理的機能

哺乳動物の種種の臓器の細胞内には、タンパク質構造が全く異なった2種類のホスホリパ-ゼA_2(PLA_2)アイソザイムが存在する。1つは膵臓から分泌されるPLA_2に極めて類似した酵素でI群PLA_2と呼ばれる。もう1つのアイソザイムはマムシ毒PLA_2に類似しておりII群PLA_2と呼ばれる。本研究においては、胃、小腸、大腸、肝臓等の消化管系臓器に存在するPLA_2アイソザイムを、酵素化学的、免疫化学的、分子生物化学的手法を用いて同定し、さらに炎症性疾患とPLA_2アイソザイムとの関連を明らかにすることを目的とした。得られた結果を以下に記す。1.ラットのI群PLA_2cDNAをプロ-ブに用いて胃粘膜mRNAのノ-ザンブロット分析を行ったところ、強陽性を示すmRNAが存在することが確認された。次に胃粘膜cDNAライブラリ-からI群PLA_2cDNAをクロ-ニングし、その塩基配列を決定した。その配列は膵臓PLA_2のそれと一致した。つまり胃粘膜にはI群PLA_2が存在する。2.ラットのII群PLA_2cDNAをPCR法等を用いてクロ-ニングし、その塩基配列を決定した。II群PLA_2は小腸粘膜に存在する。3.抗I群PLA_2抗体および抗II群PLA_2抗体を用いて免疫組織化学的研究を行い、I群PLA_2は胃粘膜の主細胞に、II群PLA_2は小腸粘膜のパネット細胞、肝臓のクッパ-細胞、脾臓の単核球/マクロファ-ジに局在することを明らかにしている。4.ラットにBCGとリポ多糖を投与すると、肝臓組織にII群PLA_2が誘導されることを明らかにした。つまり炎症性メディエイタ-による炎症の発生機序にII群PLA_2が深く関わっていることが示唆された。今後II群PLA_2と病態との関わりをさらに追求する必要がある。1、ラットの膵臓ホスホリパ-ゼA_2(sーPLA_2)に対するcDNAをプロ-ブに用いて、胃粘膜mRNAのNorthern Blot分析を行ったところ、強陽性を示すmRNAが存在することを確認した。胃粘膜cDNAライブラリ-からsーPLA_2に相当するcDNAをクロ-ニングし、その塩基配列を決定した。その配列は膵臓PLA_2と完全に一致した。こうして胃粘膜にI群PLA_2が存在することが確認された。2、ラットの脾臓膜結合性PLA_2(mーPLA_2)を精製し、その部分一次構造を決定した。その知見をもとにして合成オリゴヌクレオチドを合成し、それをプライマ-に用いてラット脾臓cDNAバンクおよびラット腸粘膜cDNAバンクにPCR法を適用した。PCR法で増幅したcDNAからmーPLA_2に相当するcDNAをクロ-ニングし、その塩基配列を決定した。この報告は、ラットII群PLA_2の全一次構造の報告として始めてものである。このようにして腸粘膜にII群PLA_2が存在することが確認された。3、抗sーPLA_2抗体および抗mーPLA_2抗体を用いてラットの胃および腸粘膜に対する免疫組織化学的研究を行った。sーPLA_2は主細胞にmーPLA_2はパネット細胞に局在する。1.ラットの脾臓組織をハサミとピペットを用いて物理的に破砕し細胞を遊離させた。このものをセプラセルを用いた密度勾配遠心法で単核球/マクロファ-ジとリンパ球とに分けた。

一方肝臓をコラゲナ-ゼで灌流して遊離細胞を調製後さらに遠心分離し、肝実質細胞とクッパ-細胞を中心とする非実質細胞とに分けた。各細胞に存在するホスホリパ-ゼA_2(PLA_2)の活性を測定し、さらに抗II群PLA_2抗体を用いてPLA_2の性質を調べたところ、次の結果を得た。II群PLA_2は脾臓では単核球/マクロファ-ジに、肝臓ではクッパ-細胞に主に局在する。2.ラットにBCGを静注すると肝臓のPLA_2活性は、未処置ラットに比べて1.7倍に上昇する。リポ多糖(LPS)処置では1.6倍になる。BCGとLPSの両方で処置すると2.4倍なる。増加したPLA_2活性は抗II群PLA_2抗体によって中和されること、インムノブロット分析を行うと、抗II群PLA_2抗体と免疫学的に交差するタンパク質が肝細胞中に誘導されることがわかった。一方脾臓組織では、同様の処置でPLA_2の比活性は変動しない(脾臓の総容量はBCG処置により3倍に増大する)。この結果は、炎症性メディエイタ-でラットを処置することにより、II群PLA_2が組織特異的に誘導されることを示唆している。
エネルギー回収型次世代放射光源の入射合流部における非慣性電子相互作用の研究

超高輝度・超短パルス次世代X線放射光源であるERL放射光源(エネルギー回収型リニアック;Energy-Recovery Linac=ERL)の実現に必要な電子ビーム動力学の諸問題のうち、入射合流部における非慣性電子相互作用の研究を行った。非慣性電子相互作用は、電子バンチが偏向軌道を通る時に現れる相互作用であり、横方向空間電荷、縦方向空間電荷、コヒーレント放射力などの総称として定義される。これらの相互作用が引き起こす電子バンチのエミッタンス増大は、ERL放射光源で発生する放射光輝度の低下をもたらす。したがって、非慣性電子相互作用は、ERL放射光源における最重要研究課題のひとつである。われわれは、エミッタンス増大を最小にする入射器合流部の最適設計法、非慣性電子相互作用の解析が可能な粒子トラッキングコード、非慣性電子相互作用によるエミッタンス増大の測定手法、について研究を行った。入射器合流部の最適設計法では、合流部出口において、縦方向空間電荷力が作る電子軌道の分散をビームエンベロープと一致させることにより、エミッタンス増大が最小となることを示し、複数の効果(縦方向空間電荷、横方向空間電荷)によるエミッタンス増大が同時に補償されるような入射器合流部の設計が自動的に得られる手法を提案した。非慣性電子相互作用の解析が可能な粒子トラッキングコードは、研究代表者が過去に作成したトラッキングコード(Java)を、高速化と並列化が可能なC言語に移植し、非慣性電子相互作用の計算ルーチンを組み込んだ。非慣性電子相互作用によるエミッタンス増大の測定手法として、ダブルスリット法を採用し、装置の設計と製作を行った。これらの研究の結果、非慣性電子相互作用の効果を最小にするERL入射器合流部の設計法が明らかになり、これを次世代光源であるコンパクトERL、大強度γ線源などの設計に適用した。エネルギー回収型リニアック(Energy-Recovery Linac;ERL)の技術に基づく次世代放射光源は、フェムト秒の短パルスX線、干渉性をもったコヒーレントX線の発生を可能にする装置であり、その実現が放射光ユーザーから強く求められている。ERLにおいてX線干渉性の大小を決めるパラメータは電子ビームのエミッタンス(電子ビームの空間的広がり)である。したがって、ERL開発の重要な課題は、(1)エミッタンスが極めて小さい電子ビームを生成し、(2)エミッタンスが劣化しないように電子ビームを加速し周回軌道に導き、(3)アンジュレータから放射光を得ることである。本研究では、入射電子ビームと周回電子ビームが同一軌道に合流する「合流部(merger)」における電子ビームのエミッタンス劣化(増大)に注目し、その解析手法の開発と実験による解析手法の妥当性検証を目的としている。本年度は、電子追跡コードの粒子生成方法アルゴリズムがエミッタンス計算に与える影響を調べ、特に、エミッタンスが小さい場合には、粒子生成を一般的な乱数ではなくlow discrepancy sequenceと呼ばれるアルゴリズムを用いなければならないことがわかった。また、エミッタンス測定実験のためのスリットスキャンチェンバーの設計と製作を行った。幅が数十マイクロメータの金属スリットを用いて電子ビームを空間的に切り取る装置であり、2台一組で用いることで電子の位置/運動量の分布(エミッタンス)を測定できる装置である。超高輝度・超短パルス次世代X線放射光源であるERL放射光源(エネルギー回収型リニアック;Energy-RecoveryLinac=ERL)の実現に必要な電子ビーム動力学の諸問題のうち、入射合流部における非慣性電子相互作用の研究を行った。

これらの相互作用の結果引き起こされる電子バンチのエミッタンス増大は、ERL放射光源で発生する放射光輝度の低下をもたらす。したがって、非慣性電子相互作用を詳しく研究し、これによるエミッタンス増大を補償するような設計を行うことは、ERL放射光源の設計研究における最重要課題のひとつである。われわれは、エミッタンス増大を最小にする入射器合流部の最適設計法、非慣性電子相互作用の解析が可能な粒子トラッキングコード、非慣性電子相互作用によるエミッタンス増大の測定手法、について研究を行った。入射器合流部の最適設計法では、合流部出口において、縦方向空間電荷力が作る電子軌道の分散をビームエンベロープと一致させることにより、エミッタンス増大が最小となることを示し、複数の効果(縦方向空間電荷、横方向空間電荷)によるエミッタンス増大が同時に補償されるような入射器合流部の設計が自動的に得られる手法を提案した。非慣性電子相互作用の解析が可能な粒子トラッキングコードは、研究代表者が過去に作成したトラッキングコード(Java)を、高速化と並列化が可能なC言語に移植し、非慣性電:子相互作用の計算ルーチンを組み込非慣性電子相互作用によるエミッタンス増大の測定手法として、ダブルスリット法を採用し、装置の設計と製作を行った。これらの研究の結果、非慣性電子相互作用の効果を最小にするERL入射器合流部の設計法が明らかになり、これを次世代光源であるコンパクトERL、大強度γ線源などの設計に適用した。
岩石の破壊過程に及ぼすインクルージョン形状のAE計測による評価

本研究では、インクルージョン(介在物)形状の複雑さが岩石の破壊過程に及ぼす影響を調べるため、凝灰岩のマトリクス(基質)に介在物として安山岩片を含む凝灰角礫岩の板状供試体を用いた単軸圧縮試験、円柱供試体を用いた単軸圧縮、圧裂引張試験を主に行い、載荷過程でのAEを計測した。介在物形状の複雑さを定量化するために、供試体表面や円柱供試体の場合はX線CT画像より、テクスチャ解析等で利用されている指標(画像分割による煩雑性を表すCp、境界線長さの尺度Cl等)を導入した。また、各供試体の断面の介在物形状を反映した2次元FEM解析により、応力集中領域の評価を行った。これらの実験、解析により得られた主な知見を、以下にまとめる。1.凝灰角礫岩の供試体に占める安山岩片の割合が増すと、AEの発生数が増加する傾向が見られた。この安山岩質介在物から発生するAEは、基質部分から発生するAEに比べ高周波数成分が卓越していた。2.板状ならびに円柱状供試体を用いた単軸圧縮、圧裂引張試験により、AE震源は介在物の境界あるいは基質内に多く分布した。またAE震源の集中領域は、後の破断面上に位置し、供試体断面上に観察されるき裂分布とも対応していた。3.AEの集中領域の多くは、2次元FEM解析による応力集中領域とも対応していた。4.圧裂引張試験によると、供試体断面内の介在物形状の複雑さ指数(特に、Cp、Cl)の値と、その断面近傍で発生したAE事象数あるいは相対AEエネルギの総和との間には、相関性が認められた。これまでの結果を総合すると、一様な応力が材料に作用した場合、介在物の幾何学的な複雑さに応じて応力集中領域が形成され、それに伴い微小き裂が集中しAEが発生すると考えられる。従って、地下岩盤や斜面の安定性評価にAE計測を利用する場合、岩盤構造の複雑さを考慮した解釈が必要になると考える。本年度は、当初の計画を変更して次年度以降に行う予定であった、安山岩質のインクルージョン(介在物)を有する角礫凝灰岩の車軸圧縮および圧裂引張試験を先に実施した。これは現有の岩石切断機による板状供試体の整形が困難であったためと、車軸圧縮および圧裂引張試験用の円柱供試体内部をX線CTにより撮影することができたためである。この実験では、X線CTデータより載荷前に供試体内の安山岩質介在物の形状を求め、載荷中には6チャンネルのAE計測と表面き裂の進展をビデオカメラで撮影し、試験後には供試体切断面内のき裂分布と介在物およびAE震源分布との関係について検討した。また、介在物の形状に伴う応力集中箇所の分布に関しても、2次元FEM解析により調べ、き裂分布、AE震源分布等と対比した。1、載荷前に円柱供試体をX線CTにより調べ、得られた断層面の密度分布を用いて、介在物の3次元構造を再構成することができた。これにより、任意断面の介在物形状が抽出可能になった。2、介在物形状の定量的な表現方法としては、フラクタル次元や画像のテクスチャ解析で使用されるパラメータが有効であることがわかった。

3、3次元AE震源標定結果と、供試体内の介在物配置との関係を調べると、単軸圧縮、圧裂引張試験共に、AE震源は介在物とマトリクス(軟質部分)の境界あるいはマトリクス内に多く分布していることがわかった。4、また、試験後に観察した供試体切断面上のき裂分布とAE震源分布にも、対応が見られた。5、更に、AE震源が集中している箇所は、その断面の介在物の形状を用いた2次元FEM解析による応力領域とも、ほぼ一致することを確かめた。次年度は、初年度に計画していた基礎的な実験、計測を遂行しデータの蓄積を図り、介在物の形状が岩石の破壊に及ぼす影響、ならびにAE発生特性との関係について検討する予定である。本年度の研究実施計画に基づき、形状の異なるインクルージョン(介在物)を含んだ板状人工岩石供試体を作製し、単軌圧縮試験を行い、応力の増加に伴うAE計測およびき裂進展過程の追跡を行った。板状人工岩石供試体の作製条件として試行錯誤を経た結果、次のように定めた。すなわち、ベース材料には石膏、中粒砂、水を重量比11:20:9で混合し、自然乾燥させたものを用いる。寸法は、80×80×10mmとする。材料内の介在物としては、エポキシ系硬質樹脂、登別産熔結凝灰岩を用いる。これまでに、三角形、円形等、単純な形状の介在物を含んだ供試体に関して圧縮試験を行った。その結果、2次元FEM解析により確認された応力集中領域の近傍にAEが多く発生し、そこから供試体の最終破断に至ることがわかった。また、前年度に実施した介在物(安山岩)を含んだ角礫凝灰岩の圧裂引張試験データを用いて、介在物形状の定量的な評価指標とAE活動との関係について検討した。その結果、次の事がが明らかになった。1)円柱供試体の円柱軸に垂直な断面内に現れる介在物の形状の複雑さを定量化するために、二値画像のフラクタル次元、被度、テクスチャ解析で用いられる指数Cp(画像分割による煩雑度)、Cl(境界線長さの尺度)、Cc(4分割成分数による尺度)について検討した結果、いずれも介在物形状の見た目の複雑さを反映していることがわかった。2)中でも、指数Cp、Clが高い断面では、その断面近傍のAE発生数ならびに相対AEエネルギーの総和も高い値を示し、相関性が講められた。今後は、様々な形状の介在物を含んだ人工岩石材料ならびに介在物を含んだ板状岩石供試体の圧縮試験結果を行い、形状の複雑さを解析し、各指数とAE活動、破壊過程の違い、FEMによる応力集中領域との関係について検討する予定である。これまでの実験で供試体として使用した、凝灰岩のマトリクス(基質)中にインクルージョンとして安山岩片を含む凝灰角レキ岩を、33X33X10mmの板状に整形し、単軸圧縮試験を実施した。載荷中に発生するAEを4個のセンセで検出し、2次元の震源標定を行った。また、マトリクス部とインクルージョン部分のヤング率を変えた2次元FEM解析を行い、載荷に伴う応力集中領域を調べた。本年度のこの実験により、以下のような結果を得た。1)低い応力レベルからAEは発生するものの、破断直前に発生数が急増する傾向が、いずれの供試体にも見られた。低い応力レベルからAEが発生するのは、材料の不均一さによるものと考えられる。2)AE震源は、後の破断面上の一部に集中していた。この傾向は、既往の研究結果と調和的であった。3)AEの集中領域は、供試体の表裏のどちらかの面に見られる応力集中領域近傍に一致していた。ただし、インクルージョンの内外の区別はできなかった。また、インクルージョン形状の複雑さとの関係も明瞭ではなかった。これは、供試体の厚さの影響が大きいためと考えられる。
腸管寄生原虫の病原性発現機構の解明

本年度も引き続き、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)が発現しており、溶血活性を有するレクチン(EhIgl)の溶血活性部位同定を行った。EhIglのフラグメントを組換え型タンパク質として大腸菌で発現し、Niカラムを用いて精製した。計8種類のEhIglフラグメントタンパク質に関して溶血活性アッセイを行い、活性部位の絞り込みを行った結果、EhIglのアミノ酸787-846の領域に溶血活性が存在することが明らかとなった。本領域はEntamoeba属のIgl分子のみが有するアミノ酸配列である可能性が高く、この領域を標的とした抗体あるいは薬剤により、赤痢アメーバが有する病原性を抑えることができると考える。また、EhIglに対するモノクローナル抗体を供与頂き、EhIglが赤痢アメーバの培養液中に分泌されるか検討したところ、培養液中のEhIglを検出できる抗体があり、その抗体を用いた評価系の構築を試みた。しかし、赤痢アメーバ培養液中に多量に含まれるウシ血清成分(アルブミンや抗体)を除く必要があり、評価系の構築には至らなかった。そのため、GPIアンカー型タンパク質であるEhIglが、赤痢アメーバが有するホスホリパーゼにより切り出されるかの検討実験を行えず、今後も継続して研究を行う予定である。実際にEhIglが赤痢アメーバから分泌され、その病原性に寄与していることが明らかとなれば、本評価系により分泌を抑制する方法についての検討ができ、将来的に赤痢アメーバ感染による発症を抑える方法を開発できる。まず、非病原性で溶血活性が弱いアメーバ(Entamoeba dispar)の有するレクチン(EdIgl)の溶血活性をEhIglと比較し、EdIglの溶血活性が有意に低ければ、EdIglとEhIglのアミノ酸配列に違いが見られる部位に、EhIglの溶血活性部位が絞り込まれると考えた。しかしながら予想に反し、EdIglにもEhIglと同程度の溶血活性があり、両タンパク質ともにC末端側に溶血活性部位が存在することが明らかとなった。さらに、E. histolyticaにおいて、EhIglの発現量を低下させると、E. histolyticaの有する溶血活性が低下することから、組換え型Iglタンパク質で得られた知見に加え、実際の腸管病原寄生虫であるE. histolyticaにおいても、EhIglが溶血活性を制御していることを明らかにすることができた(論文投稿中)。同時に、組換え型EhIglタンパク質のうち、ランダムに変異を入れたもの、C末端の一部を欠失したもの及びC末端を断片化したものの溶血活性を調べた。その結果、EhIglのアミノ酸配列のうち、726番目から967番目の間に溶血活性部位が存在することが明らかになった。これらの結果より、IglがE. histolyticaの溶血活性に関与する病原因子であることが示され、EhIglの溶血活性部位をさらに絞り込むことで、創薬の際の標的アミノ酸決定することができ、Iglが結合する宿主細胞上のリガンドの同定が容易になると考えられる。本年度計画していた以下の点について自己評価を行った。当初はE. disparのIglには溶血活性がないと予想しており、E. histolyticaのIglと比較することでEhIglの溶血活性部位を絞り込もうと考えていた。しかしながら、予想に反してEdIglにもEhIglと同程度の溶血活性があるという新知見を得ることができた。さらにE. histolyticaにおいて、Iglの発現量が溶血活性に影響を与えることを明らかにできたことで、本分子がE. histolyticaの病原性に深く関与していることが示唆された。また、EhIglの溶血活性に関与する部位を250アミノ酸程度に絞り込むことができた。以上の点より、おおむね研究計画通りに順調に進展していると評価できる。非病原性で溶血活性の弱いアメーバ(Entamoeba dispar, Ed)も同様のレクチンを有すると同時に、IglにはIgl1とIgl2のアイソフォームがあるため、それぞれ組換え型タンパク質を作製し、各アイソフォームの溶血活性を調べたところ、すべてで溶血活性が確認された。Entamoeba histolyticaとEntamoeba disparではEhIgl2とEdIgl2の発現量は同等だが、EhIgl1の発現量がEdIgl1よりも高いため、EhIgl1の発現を抑制したEntamoeba histolytica株を作製し、溶血活性を検証した。その結果、EhIgl1発現抑制株では、親株と比較して溶血活性が低く、EhIgl1の発現量がEntamoeba histolyticaの溶血活性に影響を与えることが示された[Kato K eta al., PLoS ONE, 12, e0181864 (2017)]。また、抗体によるEhIglの溶血活性中心の検証では、EhIgl1のC末端側を認識するモノクローナル抗体がEntamoeba histolyticaの溶血活性を抑制した一方で、組換え型EhIgl1の溶血活性を増強するという非常に興味深い結果が得られた。このことは、EhIgl1の溶血活性中心がC末端側に存在するという以前に報告した結果を補強するものであり、EhIgl1のC末端側を抗体あるいは薬剤でブロックすれば、Entamoeba histolyticaの溶血活性を抑制できることを示唆する結果である。