hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様な生得的行動を制御する神経領域：内側視索前野の機能解剖学的解析

内側視索前野は視床下部吻側に位置し、多様な生得的行動の中枢的役割を担うことが知られている。しかし、その解剖学的な複雑性が障壁となり、亜領域レベルでの機能や解剖において不明な点が多かった。マウスを用いた解剖学的・機能的な解析により、我々はMPOA亜領域の解剖学的再検討を行い、分子マーカーに基づいた脳地図を作成した。また、性ホルモン受容体の発現と、分子マーカーの発現について報告した。それらのマップを基盤に、MPOAで養育行動・性行動・攻撃行動の際に活性化する神経細胞群の同定を行った。加えて、MPOAで養育行動・性行動・攻撃行動を制御する神経細胞群について検討した。ヒトを含む哺乳類において内側視索前野は、内分泌情報や環境情報、他個体の情報などの社会的情報を統合し、下流の複数の情動に関わる神経領域を制御すること、性行動や養育行動、攻撃行動などの生得的な社会行動を制御する中枢であることが古典的な破壊実験や投射解析から示唆されてきた。また、社会行動に限らず、睡眠や摂食、体温調節などの多岐に渡る生命活動の根源的機能を担う領域としても知られている。内側視索前野は動機づけの神経機構研究においてその重要性が認識されてきた一方で、形態的・機能的複雑性が研究の障害となり、ブラックボックスとして扱われることも少なくなかった。このような背景を鑑みて、申請者らは内側視索前野にどのような種類の神経細胞が分布するかを調べ、その解剖について再検討し、細分化した領域がどのような行動に関連するかについて研究を進めてきた。本研究では、内側視索前野がどのようにして複数の行動を制御しているのかをマウスモデルを用いて検討する。予備的データから、内側視索前野にはそれぞれの行動を制御する特異的な神経細胞の存在が示唆されている。このデータを元に複数のCre-loxp系を用いた遺伝子導入を行い、分布する細胞の種類と機能、下流の神経ネットワークを対応させることを目的とした。内側視索前野のどの種類の細胞が、性行動・養育行動・攻撃行動・摂食行動のうち、どの行動に関連するのかを対応付けるため、ISH法を用いた多重染色により神経種の同定が完了し、各細胞ごとに神経活性の操作を開始するとともに細胞ごとのトレーシング解析を始めている。初年度は遺伝子改変マウスの導入及びウイルスの作成、行動の予備実験等を行った。研究開始前に導入済みであった2系統については戻し交配が終了し、実験を開始した。他の3系統については導入及び戻し交配を行うとともに、creの発現を確認した。ウイルスについては10^13コピー/mlという高いタイターで精製に成功し、実験を開始している。現在のところ順行性トレーシング解析を開始し、養育行動については1系統で特異的に阻害が見られる系統を見出している。ただし、シナプス越え順行性トレーシングについては予想と異なり、シナプス越えを確認できておらずさらなる検討が必要と思われる。哺乳類の内側視索前野は内分泌情報や環境情報、他個体などの社会的情報を統合し、下流の複数の本能や情動に関わる神経領域を制御し、性行動や養育行動、攻撃行動などの生得的な社会行動を制御する中枢であることが古典的な破壊実験などから示唆されてきた。また社会行動に限らず睡眠や摂食、体温調節にも重要な役割を持つ領域としても知られている。内側視索前野の機能的重要性の一方で、形態的複雑性が研究の障害となり、ブラックボックスとして扱われることも少なくなかった。このような背景から、研究代表者らは内側視索前野にどのような種類の神経細胞が分布するかを調べ、その解剖について検討し、細分子化した領域がどのような行動に関連するかについて調べてきた。これまでのところ、内側視索前野における細胞の分類が終了し、少なくとも10種類以上の集団に分かれることが明らかになった。また、それらの細胞の多くが性ホルモン受容体を発現していることも明らかになっている。これらの情報に加え、性行動、養育行動、攻撃行動で活性化する神経細胞が10種の細胞のいずれに相当するのかという定性データが得られた。これをもとにしてcre-loxp系を用いた細胞種特異的な行動における各機能の解明に取り組み始めている。導入した4系統のマウスのうち、2系統で戻し交配が終了し、行動表現型解析に取り組んでいる。また、新たに2つの細胞集団が行動に重要であるという示唆が得られたので、これらのマウスについてもコロニーへの導入を行い、次年度の実験に備えている。第1段階の目標であった内側視索前野のアトラス作成が終了し、論文の投稿、改訂が進んでいる。前年度に開発した高タイターのAAVを用いて最終段階である行動表現型解析に着手しており、当初の計画も十分に達成できる見込みである。加えて、内側視索前野の性的二型核の同定に成功し、特異的なマーカーを発見し報告したなど、予想外の発見もあった。哺乳類の内側視索前野は内分泌情報や環境情報、他個体の社会的情報を統合し、下流の複数の本能や情動に関わる神経領域を制御し、性行動や養育行動、攻撃行動などの生得的な社会行動を制御する中枢であることが古典的な破壊実験などから示唆されてきた。

このような背景から、研究代表者らは内側視索前野にどのような種類の神経細胞が分布するか調べ、その解剖について検討し、細分化した領域がどのような行動に関連するかについて調べてきた。これまでのところ、内側視索前野における細胞の分類が終了し、少なくとも10種類以上の集団に分かれることが明らかとなった一方で、その大部分の細胞が性ホルモン受容体を発現していることを明らかにした。これらの情報に加え、性行動や養育行動、攻撃行動で活性化する神経細胞のマッピングを進めており、行動に対応する神経細胞が同定されている。特に、行動ごとに特異的な細胞集団がそれぞれ存在することと、3つの行動のいずれの場合にも活動している神経細胞集団が存在すること、経験によって活動性が変化する集団がいることが明らかとなっている。この情報を基盤にしてCre-loxp系を用いた神経細胞の操作を6系統のマウスに関して行い、表現型の乏しいマウス系統もあったものの、結果的に4系統について特異的な表現型を同定することができた。内側視索前野は視床下部吻側に位置し、多様な生得的行動の中枢的役割を担うことが知られている。しかし、その解剖学的な複雑性が障壁となり、亜領域レベルでの機能や解剖において不明な点が多かった。マウスを用いた解剖学的・機能的な解析により、我々はMPOA亜領域の解剖学的再検討を行い、分子マーカーに基づいた脳地図を作成した。また、性ホルモン受容体の発現と、分子マーカーの発現について報告した。それらのマップを基盤に、MPOAで養育行動・性行動・攻撃行動の際に活性化する神経細胞群の同定を行った。加えて、MPOAで養育行動・性行動・攻撃行動を制御する神経細胞群について検討した。ほぼ予定通りに研究が進んでいる。今後は今年度の予備実験のデータをもとにサンプル数を増加させるとともに、戻し交配の終わったマウスから優先的に本実験を開始する予定である。また、研究の過程で各行動の連関が見られたため、この現象のメカニズムの解明に関しても申請計画書から外れない範囲で研究を推進していく予定である。予定通りに研究が進行しており、行動実験が進んでいるので、次年度はサンプル数の増加をし、仮説の検証、論文化する予定である。また、新たに見つけた性的二型核マーカー遺伝子に関しても申請計画書から外れない範囲で研究を推進していく予定である。神経解剖学
ハイドロプレーニング現象解析のための粒子法－有限要素法連成ＧＰＵ計算法

本研究課題は、自動車の安全性向上に資するハイドロプレーニング現象の数値解析手法を構築することが目的とし、有限要素法によるタイヤの変形および路面との接触・摩擦を含む超弾性解析と、粒子法(MPS法)による自由表面流れ解析を用いた流体構造連成解析手法の開発を行っている。平成30年は、まず、二次元のMPS法ソルバーを実装し、既存のベンチマーク解析結果と比較を行うことで、ソルバーの妥当性を確認した。次に、タイヤ表面の形状における複雑壁境界といった問題に対して、二次元MPS法における高精度壁境界モデルの開発を行ってきた。ベンチマーク数値実験を行い、開発したモデルの検証を行った。新たなモデルは、既存の壁境界モデル(粒子壁境界モデルやポリゴン壁境界モデル)より、高精度かつ圧力振動等の不安定性を緩和することが示された。以上、全体として、研究は順調に進捗しているといえる。平成31年度は、三次元MPS法における高精度壁境界モデルの開発を行い、MPS法と有限要素法を用いた流体構造連成解析手法の実現を目指す。開発した手法のGPU並列アルゴリズムを提案し、他の関連研究における流体構造連成解析結果と比較を行うことで、実装したソルバーの精度検証を行う。また、ターゲットとしているハイドロプレーニング現象に特有の数値解析面での課題に対し、モデルや手法を開発することにより解決を図る。具体的には、タイヤ表面が複雑形状であることや、自動車の移動範囲によって解析領域を非常に大きく設定しなければならないといった問題に対して、MPS法の高精度壁境界モデルの適用・改良や、粒子解像度を空間的に変更する手法の適用等を予定している。上記の開発および検討を通じて、ハイドロプレーニング現象の解析システムの原型を構築し、GPU並列環境における並列化効率の向上を図る。
マクロ組織化学を応用した骨盤内自律神経路の立体的再現に関する研究

【目的】ここ数年骨盤外科領域において悪性腫瘍の根治手術の際にさまざまな神経温存術式が行われている。それにともない骨盤内自律神経路に関する詳細な立体的・解剖学的な位置関係の解明が求められている。本研究では、立体的・解剖学的位置関係を明確にできるマクロ解剖学の長所を生かしながらさらに組織化学的な手法を用いwhole-mount染色をすることにより骨盤内臓の自律神経の詳細な走行を明らかにするとともに各神経を構成する繊維の形態を比較することにより骨盤内の部位による神経機能の相違を確認することを目的とした。【方法】死後6時間以内に病理解剖が行われた遺体より骨盤神経叢および直腸をen blockで採取し、Holt's液にて固定.Ach-iodideを用いwhole mount染色を行った。染色後、実体顕微鏡にて観察し、x11.3で写真撮影。computergraphic softを用い140枚の写真を合成し上下腹神経叢から両側骨盤神経叢および直腸膨大部後面に至るmapを作成しその神経走行について検討した。組織学的検索は実体顕微鏡下でwhole mount染色標本の各神経を正確に切除後パラフィン包埋しBodianおよびKluver-Barrera染色で行った。【結果・考察】本whole-mount染色法により骨盤神経叢間交通枝を二経路(直腸後面および直腸前立腺間隙)で確認した。このうち直腸後面交通枝は形態学的に骨盤内臓神経と強く関係していた。またその存在部位と過去の臨床報告とを比較検討するとこの直腸後面交通枝が片側骨盤神経叢温存手術症例において膀胱機能維持に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また骨盤神経叢はその中に存在する神経節の種類により三部位に分けることが可能であり、それぞれの部位における神経節間神経の繊維構成は一定傾向の下で異なっていた。このことから骨盤神経叢の部分切除の際には、その切除部位によって術後の尿路生殖器系障害の種類や程度も変わりうることが考えられた。
腫瘍代謝から見た縦隔腫瘍の診断および治療効果判定

縦隔腫瘍には、胸腺腫、悪性リンパ腫、神経原性腫瘍など様々なものがあり、これらの診断は主としてX線CTやMRI等の形態診断によってなされている。しかし、近年の診断法の進歩にもかかわらず、良性・悪性の鑑別や、悪性度の判定は充分とは言えず、治療法の選択や予後判定が困難な例が少なくない。一方、ポジトロンCTによる代謝測定が脳腫瘍や肺癌の診断や治療効果判定に有用であることが報告されている。本年度は、腫瘍代謝測定が縦隔腫瘍の診断に果たす役割を検討するために、39例の縦隔腫瘍患者に対してポジトロンCTを施行し、縦隔腫瘍の糖代謝およびアミノ酸代謝を測定した。内訳は、神経原性腫瘍4例、嚢胞性腫瘍6例、胸腺腫10例、胸腺癌8例、悪性リンパ腫4例およびその他の悪性腫瘍7例である。このうち37例ではフッ素18フルオロデオキシグルコースを用いて糖代謝を、また30例では炭素11メチオニンを用いてアミノ酸代謝を測定した。全ての腫瘍において糖代謝、アミノ酸代謝は正常骨格筋よりも高値を示した。腫瘍代謝を各腫瘍毎に比較すると、糖代謝、アミノ酸代謝ともに良性腫瘍では悪性腫瘍に比して低値であった。次に各腫瘍群において糖代謝とアミノ酸代謝を比較すると、ほとんどの腫瘍ではアミノ酸代謝よりも糖代謝が高値であったが、胸腺腫では糖代謝よりもアミノ酸代謝が高値であった。即ち、縦隔腫瘍の検出および良悪性の鑑別は糖代謝、アミノ酸代謝のいずれにても可能と考えられた。また、糖代謝よりもアミノ酸代謝が高値であれば胸腺腫を考慮すべきであると考えられた。以上の結果より、ポジトロンCTによる腫瘍代謝の測定は、X線CTやMRI等の従来の形態診断では困難であった縦隔腫瘍の良悪性の鑑別を可能とし、さらに腫瘍の組織型等の質的診断が行える可能性が示された。今後は、各腫瘍の症例数をさらに増やすとともに、腫瘍代謝測定の治療効果判定への寄与について検討する予定である。
半導体界面でサイト制御された不純物挿入層の電子状態と、バンド不連続量制御への応用

1.ヘテロ界面のバンド不連続量を理論予測するために、自己無撞着な強結合法による計算プログラムを完成した。本プログラムでは、sp^3s^*基底の強結合近似により価電子密度を求め、静電的ポテンシャルを自己無撞着に決定出来る。ヘテロ界面を有する超格子構造を用いて、自己無撞着な計算を行なう。2.本プログラムを用いてGaAs/AlAsヘテロ界面の価電子帯バンド不連続量ΔE_vを計算し、(100)と(110)界面でΔE_v=0.51eV、(311)A界面でΔE_v=0.50eVの理論値を得た。この結果、GaAs/AlAs界面のΔE_vは、高指数面も含め面方位に依存しないことが明らかになった。3.GaAs/Si(2ML)/AlAs界面のΔE_vを理論計算し、ΔE_v=-1.36eV[(100)-As界面]、2.1eV[(100)-Ga界面]、0.35eV[(110)界面]、-0.12eV[(311)A-As界面]、1.67eV[(311)A-Ga界面]の理論値がそれぞれ得られた。Si2原子層を界面に挿入することにより、ΔE_vを制御することが可能で、変化量は面方位と面の極性に大きく依存することが明らかになった。特に、(311)A GaAs上の結晶成長では、ドープされたSiは成長条件によりドナーにもアクセプターにも成り得るので、(311)A界面でのΔE_v制御の実現性が最も高いと考えられる。1)ヘテロ接合のバンド不連続量を理論予測するための自己無撞着な強結合法のプログラムを完成した。本プログラムではsp^3s^*基底の強結合法により電子構造と電子密度を求め、静電的ポテンシャルを自己無撞着に決定している。ヘテロ接合を繰り返して有する超格子構造に対して自己無撞着な計算を行うことが出来る。2)本プログラムを用いてGaAs/AlAsヘテロ界面の価電子帯のバンド不連続量を計算し、(100)と(110)界面で0.51eV、(311)A界面で0.50eVの理論値を得た。この結果は、この系のバンド不連続量は、高指数面も含め面方位に依存しないことを示している。また、(311)A界面のバンド不連続量を光電子分光法により測定し、計算結果を支持する結果を得た。3)さらに、GaAs/Si(2ML)/AlAs界面について価電子帯のバンド不連続量を理論計算し、(100)As界面で-1.36eV、(100)Ga界面で2.1eV、(110)界面で0.35eV、(311)A-As界面で-0.12eV、(311)A-Ga界面で1.67eVの理論値がそれぞれ得られた。Si2重層を界面に挿入することによりバンド不連続量を制御することが可能で、変化量は面方位と面の極性に大きく依存することが明かになった。特に、(311)A-GaAs上の結晶成長では、ドープされたSiは成長条件によりドナーにもアクセプターにも成り得るので、(311)A界面へのSi原子層挿入によるバンド不連続量の制御が有望である。4)(100)界面で、Si2重層が3原子層に渡り再分布した場合、バンド不連続量の変化が小さくなることが計算より明かになった。

実際の系でもSi原子層は2層以内にきちんと納まっておらず、それ以上に広がって、バンド不連続量の制御を妨げていると推測される。1.ヘテロ界面のバンド不連続量を理論予測するために、自己無撞着な強結合法による計算プログラムを完成した。本プログラムでは、sp^3s^*基底の強結合法近似により価電子密度を求め、静電的ポテンシャルを自己無撞着に決定出来る。ヘテロ界面を有する超格子構造を用いて、自己無撞着な計算を行なう。2.本プログラムを用いてGaSa/AlAsヘテロ界面の価電子帯状バンド不連続量ΔΕ_υを計算し、(100)と(110)界面でΔΕ_υ=0.51eV、(311)A界面でΔΕ_υ=0.50eVの理論値を得た。この結果、GaSa/AlAs界面のΔΕ_υは、高指数面も含め面方位に依存しないことが明らかになった。3.GaAs/Si(2ML)/AlAs界面のΔΕ_υを理論計算し、ΔΕ_υ=-1.36eV[(100)-As界面]、2.1eV[(100)-Ga界面]、0.35eV[(110)界面]、-0.12eV[(311)A-As界面]、1.67eV[(311)A-Ga界面]の理論値がそれぞれ得られた。Si2原子層を界面に挿入することにより、ΔΕ_υを制御することが可能で、変化量は面方位と面の極性に大きく依存することが明らかになった。特に、(311)A GaAs上の結晶成長では、ドープされたSiは成長条件によりドナーにもアクセプターにも成り得るので、(311)A界面でのΔΕ_υ制御の実現性が最も高いと考えられる。
排水処理リアクターの微生物生態系における食物連鎖の定量的評価

本研究では、活性汚泥における微生物生態系を制御した実験を行うことで、微生物の食物連鎖の変化に対して、窒素安定同位体比の変化を調べた。具体的には、捕食ー被食作用の影響のみを把握するため、活性汚泥を飢餓条件下(曝気のみの条件)において運転し、活性汚泥を連続的に採取して分析に供することで、窒素安定同位体比等の変化を把握した。その結果、36日後には活性汚泥濃度が半減するとともに、窒素安定同位体比が8.3‰から10.8‰に上昇する傾向が確認された。本研究により、窒素安定同位体の自然存在比に着目することで、微生物食物連鎖の機能(捕食効果)を定量的に評価できる可能性が示唆された。平成28年度は、活性汚泥における微生物生態系を制御した実験を行うことで、微生物の食物連鎖の変化に対して、窒素安定同位体比がどのように変化するのか調べた。具体的には、捕食ー被食作用の影響のみを把握するため、活性汚泥を飢餓条件下(曝気のみの条件)において運転した。このとき、活性汚泥を連続的に採取して分析に供することで、窒素安定同位体比等の変化を把握した。同時に、水質、汚泥量、微生物相、高次生物を把握し、汚泥の食物連鎖における捕食作用を示すデータを取得した。本実験により得られた結果から、活性汚泥の濃度(MLSS, MLVSS, COD)と窒素安定同位体比の関係を把握し、汚泥の食物連鎖における捕食作用の解析を行った。以上により、安定同位体比の変化が微生物群集における捕食作用を示すデータとなることが示唆された。これまで、生物学的排水処理法では、有機物分解や余剰汚泥の減容化に対して、微生物食物連鎖が重要な役割を担っていると考えられてきたが、その評価はほとんど行われていなかった。しかし本研究により、窒素安定同位体の自然存在比に着目することで、捕食に伴う同位体分別効果を利用して、微生物食物連鎖の機能(捕食効果)を定量的に評価できる可能性が示唆された。当初の研究計画どおりに進展しており、研究成果も得られつつある。本研究では、活性汚泥における微生物生態系を制御した実験を行うことで、微生物の食物連鎖の変化に対して、窒素安定同位体比がどのように変化するのか調べた。同時に、水質、汚泥量、微生物相、高次生物を把握し、汚泥の食物連鎖における捕食作用を定量的に把握した。また、活性汚泥の運転管理の指標であるSRTに対して、本研究で提案する食物連鎖の指標である窒素安定同位体比の関係性を調べることで、適切な運転管理に向けた食物連鎖の理解と制御のための基礎的な知見を得ることを行った。SRTを長く維持することで、高次生物の出現等により生態系ピラミッドの食物連鎖長が長くなり、余剰汚泥の減容化がより進行しやすくなると考えられるが、これまではSRTと食物連鎖の定量的な関係は不明であった。そこで、活性汚泥におけるSRTが異なる条件において、余剰汚泥の発生量と窒素安定同位体比の比較したところ、SRTの増加とともに窒素安定同位体比が上昇しており、食物連鎖による汚泥の減容化を定量的に明らかにすることができた。これまで、生物学的排水処理法では、有機物分解や余剰汚泥の減容化に対して、微生物食物連鎖が重要な役割を担っているが、その評価はほとんど行われていなかった。平成29年度は、活性汚泥の運転管理の指標であるSRTに対して、本研究で提案する食物連鎖の指標である窒素安定同位体比の関係性を調べることで、適切な運転管理に向けた食物連鎖の理解と制御のための基礎的な知見を得ることを行う。具体的には、SRTを長く維持することで、高次生物の出現等により生態系ピラミッドの食物連鎖長が長くなり、余剰汚泥の減容化がより進行しやすくなると考えられる。しかし、これまではSRTと食物連鎖の定量的な関係は不明であった。そこで、活性汚泥におけるSRTが異なる条件において、余剰汚泥の発生量と窒素安定同位体比の比較によって関係性を調べる。また、本手法の実下水処理場への適用を目指して、実際の下水処理場における活性汚泥に関する窒素安定同位体比を比較する。流入下水と余剰汚泥の窒素安定同位体比の連続的な比較を行う。

また、処理プロセスが異なる条件において、窒素安定同位体比と活性汚泥法の基礎的データの比較を行う。環境工学設備備品費として計上していたリアクター一式や試薬の一部に関して、研究の進捗状況に基づく軽微な予定修正を踏まえて、より効率的な研究の進展を図るとともに、研究資金の効率的な活用のために、次年度使用額が生じた。次年度使用額に関しては、リアクター実験を行うための備品等や炭素・窒素安定同位体比の分析のための試薬費用に加えて、研究の深化にむけて新たに分析項目を追加することに伴う消耗品や試薬、そして当初の予定以上の論文発表を見込んでいるため、英文校閲費用などに使用する予定である。
取り外し可能な屋内用移動式手すりに関する研究

使いやすさは能力の状況に応じて変化するものであるが、手すりは一度設置すると容易に付け替えたりする事は難しい状況下にある。そのため取り外しが容易で、安全性に優れた手すりの開発が望まれている。本研究課題のような人間と道具との係わりに関する研究では、ヒトの動作特性を調べて、人間と親和性のあるユニバーサルデザインを設計するといった姿勢が不可欠である。そのため、1)人が手すりを使用する場合の動作分析から、手すり使用場所と配置の関係について明らかにした上で、手すりの設置場所を特定した。その上で、2)移動式手すりの簡易モデルを試作し、その試作器の評価実験を試みた。取り外しの可能な手すりの試作器は、手すり本体を(株)矢崎製イレクターパイプ(径30mm)で、また最も重要となる手すりと壁面との接合部に強力圧縮原理を応用した(株)イタルトービジャパン製の吸着フック(製品名:スーパーTACO)を、手すり本体6カ所に取り付けて作成した。また、壁面は吸着しやすいように光沢のある平らな市販のアクリル板を用いた。評価実験は、壁面の鉛直方向と垂直方向の長期・短期の引張外力について設置直後と設置一月経過後にそれぞれ行った。引張荷重は、短期外力として10kg重から50kg重までの力を20秒間、長期外力として20kg重の力を10時間加えた。その結果、設定した引張外力で接合部が壁面から外れることはなかった。また、外力をかけずに壁面に設置した状態で1ヶ月後に再実験を行った場合においても、壁面から外れることはなかった。このことから、試作器が取り外しが容易で、安全な手すりである可能性が示唆された。今後、さらなる詳細な強度実験を行い、実用化に結びつける必要がある。そのためには、1)適切な設置場所における評価実験、2)さらに長期設置による安全性の検証などが検討課題として挙げられた。人間と道具との係わりに関する研究では、ヒトの動作特性を調べて、人間との親和性のあるユニバーサルデザインを設計するといった姿勢が不可欠である。そこで本年度は、移動式手すりの試作を行う前段階として、まず屋内でヒトが手すりを使用する場合の動作分析に着目して予備的な移乗介助動作実験を介助者の視点から行った。具体的には、住宅内便所での移乗介助動作について、どの介助動作時にどのような目的で手すりを使用するかを作業分析を試みながら、その有効な介助動作とその空間の使われ方の分折を試みた。実験方法は、自由空間と一般的な住宅にみられる便所空間内での移乗介助動作について行い、それぞれの動作分析方法として動作解析装置(VICON370)を用いた。自由空間ではその介助動作時の動作本来に着目して、手すりの使用しやすい介助位置と介助手技の検討を行った。また、一般的な住宅内便所では介助動作と構成空間内の進入方向、入口幅による介助動作のし易さの影響と、手すり使用の特性について分析を行った。その結果、介助位置はどの方向からの介助動作においても便器前方位が最適であり、介助手技は手すりの利用に影響することがわかった。さらに、既存の手すり配置計画は自力で動作を行う場合を想定しているため、介助動作時には不十分であることが示唆された。また、進入方向、入口幅は移乗介助動作や手すりの利用に影響することが確認できた。今後の課題として、介助動作時の手すりの有効性については動作分析を用いて確認できたが、どの場所に、どの目的で設置することが適切かどうか等の更なる検討が残った。
高分子固定化型キラル有機分子触媒によるワンポット合成法の開発

シンコナアルカロイド、シンコナアルカロイド四級塩、キラルイミダゾリジノン塩、キラルピロリジンなどの不斉有機分子触媒を固定化した高分子微粒子や架橋高分子の合成およびキラル有機分子触媒組込型高分子の合成に成功した。得られた高分子触媒を不斉アルキル化反応、不斉Diels-Alder反応、不斉Michael付加反応、不斉非対称化反応などに用い、触媒構造、スペーサー構造、高分子構造を最適化することにより、低分子モデル触媒と同等以上の不斉選択性を有する高分子触媒の開発に成功した。高分子微粒子触媒は特に高い回収性を示し、その再使用においても、触媒性能を低下させることなく、5回程度の再使用が可能であった。次に、キラルイミダゾリジノン塩およびキラルピロリジン部位を有する2つの高分子微粒子によるワンポット反応を行った。触媒構造、スペーサー構造、高分子構造や反応条件を検討した結果、高分子微粒子内部に導入したそれぞれのキラル触媒が独立して作用し、光学活性化合物が高選択性で得られる系を見いだした。また、酸触媒としてスルホン酸、塩基触媒としてキラルピロリジン部位を有する2つの高分子微粒子によるワンポット反応が進行し、目的とする光学活性化合物の合成にも成功していることから、本手法が相反する性質の触媒の同一系内でのワンポット反応に有効であることが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はキラル有機分子触媒を種々の高分子に固定化した、高分子固定化型キラル有機分子触媒(PC)の合成を行い、複数の高分子固定化型キラル有機分子触媒を用いた、光学活性化合物のワンポット合成システムの確立を目的とした。本年度はPCの系統的合成とPCを用いた不斉反応に関する知見を得ることを目的とした。これまで、シンコナアルカロイド、シンコナアルカロイド四級塩、キラルイミダゾリジノン塩(MacMillan触媒)、丸岡触媒、プロリノール誘導体、キラルピロリジン触媒などの有機分子触媒を高分子に固定化した、種々の高分子微粒子固定化型キラル有機分子触媒(PC1)、架橋高分子固定化型キラル有機分子触媒(PC2)およびキラル有機分子触媒組込型高分子(PC3)の合成に成功した。本研究で開発した合成法により、目的の反応に合わせた共有結合型またはイオン結合型高分子触媒を調製することができ、特にPC3はいくつかの重合法と組み合わせた多様な高分子触媒を提供することが可能となった。合成したPCの触媒活性に関する知見を得るために、PCを用いた触媒的不斉反応を行った。いずれのPCも高分子構造をチューニングすることにより、対応する低分子触媒と同等以上の触媒性能を示したことから、高分子構造が不斉反応の反応性や立体選択性に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。また、PC1は回収・再使用性、PC2は合成の容易さ、高分子構造の多様性、PC3は不斉選択性にそれぞれ優れていることが明らかとなり、用途・目的に応じた使い分けが可能であることを見いだした。平成26年度計画は高分子固定化型キラル有機分子触媒(PC)の合成として、高分子微粒子固定化型キラル有機分子触媒(PC1)、架橋高分子固定化型キラル有機分子触媒(PC2)、キラル有機分子触媒組込型高分子(PC3)および多分岐高分子固定化型キラル有機分子触媒(PC4)の合成を計画しており、ほぼすべてのPCの合成ができた。また、平成27年度に実施予定のPCを用いた触媒的不斉反応にも既に着手していることから、研究はおおむね順調に進展している。平成27年度はPCを用いた触媒的不斉反応とPCを用いたワンポット合成反応を行う。まず、高分子に導入した有機分子触媒に対応した不斉反応を行い、PCの触媒性能の評価を行う。不斉反応における転化率、生成物の収率、立体選択性、触媒の再使用性に関して、PCの特徴を明らかにすると共に、PCの合成条件を再検討し、高性能PCの開発を目指す。さらに、コモノマー構造の設計により、SPの親水性ー疎水性バランスを調節したPCを合成し、水系での不斉反応に適用することで、環境調和型不斉反応を行う。

次に、上記の不斉反応の知見を基に、複数のPCを用い、ワンポット合成を行う。各反応における転化率、生成物の収率、立体選択性から各PCの触媒性能評価を行う。特にPCの組み合わせを精査し、プロセス化学の観点から実用性の高い反応系の開発に注力する。さらに相反する性質の触媒によるワンポット合成や高収率かつ高立体選択性で光学活性化合物が得られ、高い再使用性を有する(またはフローシステムへの応用が可能な)環境調和型PCの実用的開発を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
人工DNA結合タンパク質を利用したDNA情報ナノ空間における機能性錯体の精密配置

本研究では、DNAにより構成される空間を、塩基配列情報を含んだ情報ナノ空間ととらえ、この情報に基づき金属錯体などの機能性物質群を分子レベルで精緻に配置することを目的をとして、金属錯体を結合した人工亜鉛フィンガーを合成及びジンクフィンガーによる金属錯体配列を行うテンプレートを拡張するために、2重鎖を束ねたDXモチーフの検討を行い、2次元、3次元上に定位する手法の確立を行った。DXには4または5本鎖からなる数種類があるが、本研究では5本鎖からなる逆平行型のDXを用いた。ZFとしてGGGGCGを認識する2ドメインのF1F2、および、トリスビピリジンRu(II)錯体を結合したRu-F1F2を用いた。X線構造解析により明らかにされたDNAのZF結合部位とZF本体の空間配置を考慮して、認識塩基配列のDX内での位置を設計した。ZFとDXとの結合及び相互作用についてはゲルシフトアッセイ(EMSA)を用いて調べた。EMSA実験でのDXは全て[γ-^<32>P]ATPで1つのssDNAを5'-末端標識後に、アニーリングしたものを用いた。認識部位を移動することで、ジンクフィンガー及びRu錯体の位置が位相をもって変化する。そこで、ZF結合部位の位相を変化させたDXテンプレートを用意し、ZFを導入したところ、すべての場合において結合することが分かった。ZF結合部位の位置を交叉部の右、左、あるいは両方に組み込んだ配列においても、ZFが結合可能であることが分かった。それぞれの位相についてZF部位を4ユニットに増加させたところ、ZF濃度を増加させるにつれて目的通りに複数のZFユニットを配置できることがわかった。本年度の研究成果により、DX分子をテンプレートに用いることによって、金属錯体間の距離を精密に制御して多数配列した系を構築できることを明らかにした。
軌道剛性急変箇所を対象とした道床沈下解析法の開発と沈下メカニズムの解明

軌道剛性急変箇所のためのバラスト道床沈下解析法を開発し,道床沈下の発生・進展メカニズムの解明に取り組んだ.軌道剛性急変箇所としてコンクリートとバラストの接続部およびレール継目部を対象とした.道床沈下解析法は,軌道振動問題と道床沈下問題との弱連成解析手法とした.当該手法を用いて,軌道剛性急変箇所の道床沈下の発生・進展の各種因子,特に車輪の走行速度や走行方向,継目部でのレール凹凸などの影響を検討した.また,沈下量の評価対象で粗粒材の集合体であるバラスト材は力学挙動に空間的ばらつきを有する.そのため,道床への作用力や沈下量に対するバラスト材の力学挙動の空間的ばらつきの影響を数値実験により検討した.本研究では,軌道剛性急変部の道床沈下解析手法の構築と,当該箇所における道床沈下メカニズムの解明を目的としている.平成27年度は,下記4点の研究成果を得た.(1)軌道剛性急変部の道床沈下量予測のための軌道振動・道床沈下連成解析手法の構築に関し,まくらぎの浮きおよびレール凹凸をモデル化し当該の連成解析法に導入した.また,レール継目の振動・接触モデルを振動解析に実装した.(2)コンクリート道床・バラスト道床接続部のバラスト道床沈下を対象とした有限要素解析を行ない,道床沈下は接続部から5本目のまくらぎ付近で著大となること,沈下量の空間分布形状は車両の進行方向や走行速度によらず概ね同様であること,などがわかった.(3)車両・軌道系の連成振動応答に及ぼすバラスト材のヤング率の空間変動の影響を評価するために,スペクトル確率有限要素法を用いた軌道振動解析を行なった.解析手法の構築に際しては,バラスト部の動的応答を数値Green関数を用いて評価することで,連成振動解析時の計算負荷の抑制を図った.また,バラスト部の領域境界で粘性境界を導入することで,領域境界からの不自然な波の反射の抑制を試みた.解析の結果,まくらぎ・バラスト間作用力の変動量は,バラスト材のヤング率の変動係数10%に対して0.5%程度と非常に小さく,走行速度の影響も小さいが,輪重の変動量は走行速度の増加によって増幅することがわかった.(4)cyclic densificationモデルに基づくバラスト道床沈下解析において,粒子群最適化手法を用いて材料パラメータを同定した上で,解析結果に対するバラスト材の材料パラメータの影響感度を評価した.また,バラスト材のヤング率の空間変動が道床沈下量に及ぼす影響について,スペクトル確率有限要素法を用いて評価した.平成27年度は単調載荷過程についてバラスト材のヤング率の変動の影響を評価した.軌道振動・道床沈下連成解析法の構築は,ほぼ予定通り進捗している.また,コンクリート道床・バラスト道床接続部でのバラスト道床沈下解析についても,車両の走行条件の影響を検討しており,レール凹凸モデルの導入も予定どおり平成27年度に終えている.また,バラスト材の力学挙動の変動を考慮した車両・軌道系の連成振動解析については,バラスト材のヤング率の空間変動の影響をスペクトル確率有限要素法を用いて評価し,バラスト道床の発生源外力であるまくらぎ・バラスト間作用力に対するバラスト材のヤング率の空間変動の影響について検討している.さらに,当初平成27年度の研究実施を予定していなかった,バラスト材の弾塑性モデルの材料パラメータ同定や,材料パラメータの解析結果に対する影響感度の評価解析を実施し,さらにバラスト材のヤング率の空間変動がバラスト道床の単調載荷解析結果に及ぼす影響について,スペクトル確率有限要素法を用いて評価した.これらはいずれも平成28年度以降に予定していた研究課題の一部である.以上より,平成27年度は当初の研究課題のほとんどについて実施でき,平成28年度以降に予定していた研究課題の一部に着手し,研究成果も得ることができている.よって,当初の計画以上に進展していると判断した.本研究では,軌道剛性急変部の道床沈下解析手法の構築と,当該箇所における道床沈下メカニズムの解明を目的としている.平成28年度は,以下4点の研究成果を得た.(1)平成27年度に開発した軌道振動・道床沈下連成解析法を用いて,レール継目箇所における道床沈下解析を実施し,軌道や走行車両の諸条件,特に継目部近傍でのレール凹凸高さが道床沈下量の発現・進展に及ぼす影響を明らかにした.(2)軌道の構成要素の形状や力学特性のばらつきが軌道振動解析におけるまくらぎ・道床間作用力に及ぼす影響について,特にレールの曲げ剛性の空間変動の影響を評価する解析手法の定式化を終えた.また,バラスト材のYoung率の空間変動が軌道系各部の振動応答の変動に及ぼす影響を評価するにあたり,確率有限要素法解析の確率空間での離散化条件が解析結果に及ぼす影響を評価した.特に,Karhunen-Loeve展開,polynomial chaos展開の展開項数の影響について検討した.(3)Cyclic densificationモデルに基づく道床沈下解析において,バラスト道床のYoung率の空間的ばらつきが道床沈下解析結果に及ぼす影響を評価するにあたり,繰り返し載荷過程における影響評価のためのスペクトル確率有限要素法を開発し,解析に実装した.(4)Cyclic densificationモデルの単調載荷モデルで用いられている修正

Drucker-Pragerモデルを用いた弾塑性解析を対象に,材料定数のばらつきが応力解に及ぼす影響を評価するために,応力解の確率密度関数の変化をFokker-Pranck-Kolmogorov方程式でモデル化し数値解を求める解析手法の定式化を終え,解析に実装した.特に,弾性および降伏応力の制御パラメータのばらつきの影響について,簡易な問題において試計算を実施した.レール継目部におけるバラスト道床沈下解析における継目構造の条件設定の影響については,レール凹凸高さについては検討したが,一度の解析の計算負荷が大きくなることもあり,他の影響要因についての検討は,まだ部分的なものにとどまっている.また,軌道各部の構成要素のばらつきが軌道振動解析のまくらぎ・道床間作用力に及ぼす影響については,Young率の空間変動に関する確率空間離散化の影響の評価とレール曲げ剛性の空間変動の影響評価手法の開発を終えているが,その他のばらつきの影響の定量評価手法の開発は未着手である.一方で,弾塑性モデルの材料定数のばらつきを考慮したバラスト道床沈下解析法の開発に関しては,スペクトル確率有限要素法を用いる手法,Fokker-Planck-Kolmogorov方程式を数値的に解いて解析結果の変動特性を評価する方法のいずれも,当該年度の当初計画またはそれ以上の研究の進捗となっている.以上の理由より,当該研究課題の開始時からの進捗状況を総合的に判断し,「やや遅れている」と自己評価した.本研究では,軌道剛性急変部の道床沈下解析手法の構築と,当該箇所における道床沈下メカニズムの解明を目的としている.平成29年度は,以下3点の研究成果を得た.(1)前年度までに開発した軌道振動・道床沈下連成解析法を用いて,レール継目箇所における道床沈下遺跡を実施した.特に,継目部近傍のまくらぎ支持剛性が道床沈下量の発現・進展に及ぼす影響をパラメータスタディにより予測・評価した.また,車両の走行速度や継目遊間長,継目部におけるまくらぎ支持方法が道床沈下量の発現・進展に及ぼす影響について,既往の研究成果を調査した上で,解析プログラムの一部改良の上で検討を試みた.(2)軌道の構成要素の形状や力学特性のばらつきが軌道振動解析におけるまくらぎ・道床間作用力に及ぼす影響について,レールの曲げ剛性の空間変動の影響について,数値実験を通して検討した.また,車両重量のばらつきの影響については,検討のための解析方法を定め,数値実験に取り組んだ.(3)Cyclic dinsificationモデルに基づく弾塑性有限要素法を用いたバラスト道床沈下解析を対象に,モンテカルロ法を用いて弾塑性パラメータの空間的ばらつきが沈下解析結果に及ぼす影響について検討した.また,スペクトル確率・弾塑性有限要素法を用いた空間的ばらつきの影響検討法の開発に関し,NISP法の実装に取り組み,ばらつきの影響の定量評価だけでなく,解析の安定性についても検討した.さらに,弾塑性パラメータのばらつきがcyclic dinsificationモデルを用いた応力解析結果に及ぼす影響を検討するために,Fokker-Planck-Kolmogorov方程式を用いる解析方法の開発のために必要となる定式化に取り組んだ.軌道剛性急変箇所のためのバラスト道床沈下解析法を開発し,道床沈下の発生・進展メカニズムの解明に取り組んだ.軌道剛性急変箇所としてコンクリートとバラストの接続部およびレール継目部を対象とした.道床沈下解析法は,軌道振動問題と道床沈下問題との弱連成解析手法とした.当該手法を用いて,軌道剛性急変箇所の道床沈下の発生・進展の各種因子,特に車輪の走行速度や走行方向,継目部でのレール凹凸などの影響を検討した.
機能性ペプチドカクテル修飾型エクソソームの腫瘍へのオンデマンド薬物送達技術

エクソソームは、直径30-200 nmの脂質二重膜で覆われた細胞が分泌する小胞で、私たちの血液や尿、唾液等の体液にも大量に含まれている。さらに、miRNAや酵素等の機能性分子を内包して分泌され、それらを他の細胞に運搬することで、細胞間コミュニケーションに寄与している。一方で、細胞毒性が無いことはもちろん、患者自身のエクソソームを治療に用いた場合に免疫原性の原因にならない等の理由から、次世代型ドラッグデリバリーツール(DDS)ツールとして期待されている。しかしながらDDSへ応用する上で、エクソソームの細胞内移行や細胞標的効率の改善が必要不可欠とされている。平成29年度までにおいて、申請者は、その細胞内移行に関する課題を解決するために、エクソソームの取込みに重要な細胞内取込み機構「マクロピノサイトーシス」を誘導する機能性ペプチド「アルギニンペプチド」をエクソソーム膜に簡便に化学修飾し、エクソソームの細胞内移行効率、及び、内包薬物のサイトゾル送達効率の顕著な改善に成功している。平成30年度では新たに本研究課題において、がん細胞など特定の細胞を標的する技術を更に組み込むことで、疾患に応じたオンデマンドなエクソソームDDSの実現に向けた技術基盤の構築を目的としている。そこで、ヒト乳腺がん細胞(MCF-7細胞)に対して選択的な細胞内移行を示す機能性ペプチド「sC18」をエクソソームに疎水基を介して簡便に修飾し、MCF-7細胞に対するエクソソームの細胞内移行効率を増強する技術開発を達成した。さらに、そのペプチド修飾がマクロピノサイトーシスの誘導することを明らかとした。引き続き、本研究課題における申請内容に沿って、そのエクソソームの受容体標的・細胞内移行性を詳細に検討している。上記の通り平成30年度は、本研究課題目的である「がん細胞など特定の細胞を標的する技術を確立し、疾患に応じてオンデマンドに対応可能なエクソソームDDSの技術基盤の構築」に基づき、疎水基を結合したsC18を合成し、それを簡便にエクソソーム膜に修飾することで、ヒト乳腺がん細胞(MCF-7)に対するエクソソームの細胞内取込みを増強させる技術開発を達成した。さらに、sC18を分岐型にした「(sC18)2」を合成し、それをsC18と同様の方法で、エクソソームに修飾した結果、sC18を修飾した場合と比較して効率的にエクソソームの細胞内移行を促進することを明らかとした。また、これまでsC18、及び、(sC18)2の詳細な細胞内取込み機構については不明であったが、sC18、或いは、(sC18)2をエクソソーム膜に修飾することでマクロピノサイトーシスが顕著に誘導されることを明らかとした。このマクロピノサイトーシスは、がん細胞に過剰発現している上皮成長因子受容体(EGFR)やケモカイン受容体CXCR-4、糖タンパク質等を介して誘導される。そのため申請者はマクロピノサイトーシスはがん標的、及び、その機構を明らかとする上で重要な機構であると考える。現在、本研究課題申請書に沿って、上記マクロピノサイトーシス関連受容体の形質膜発現量の異なるがん細胞を用いて、sC18、及び、(sC18)2、及び、それらを修飾したエクソソームの標的受容体を明らかとする研究を開始しており、それらペプチド修飾、及び、ペプチドの構造が細胞内移行機序やがん受容体標的に与える影響を明らかとする上で重要な知見が得られている。引き続き平成31年度以降も、申請研究内容(i)「各種がん細胞への効率的な取込みを可能とする機能性ペプチドカクテル修飾型エクソソームの技術開発とin vitro実験における導入評価」に基づき、がん受容体を介して細胞内移行が促進されたエクソソームの内包物の放出が達成されているか、蛍光プローブ等を用いた物理化学的側面や分子生物学的な側面から解析し、細胞小器官や細胞内分子を標的とする薬剤活性とも総合的に評価、判断して優れた細胞、及び、がん受容体標的技術の開発研究を展開する。さらに、申請研究内容(ii)「機能性ペプチドカクテル修飾型エクソソームの担がんマウスにおける体内動態評価と抗がん剤送達」に沿って、これまでに用いた各種がん細胞を移植した担がんヌードマウスに対して、in vivo蛍光イメージングに最適な蛍光プローブを内包したエクソソームを投与し、経時的なエクソソームの体内動態・腫瘍集積性を評価し、得られた結果を、用いる機能性ペプチドの種類や設計にフィードバックし、細胞内取込みや細胞標的、サイトゾル送達、さらには血中滞留性や腫瘍集積性に関して優れた最適な手法の確立に繋げる。

平成29年度までにおいて、申請者は、その細胞内移行に関する課題を解決するために、エクソソームの取込みに重要な細胞内取込み機構「マクロピノサイトーシス」を誘導する機能性ペプチド「アルギニンペプチド」をエクソソーム膜に簡便に化学修飾し、エクソソームの細胞内移行効率、及び、内包薬物のサイトゾル送達効率の顕著な改善に成功している。平成30年度では新たに本研究課題において、がん細胞など特定の細胞を標的する技術を更に組み込むことで、疾患に応じたオンデマンドなエクソソームDDSの実現に向けた技術基盤の構築を目的としている。そこで、ヒト乳腺がん細胞(MCF-7細胞)に対して選択的な細胞内移行を示す機能性ペプチド「sC18」をエクソソームに疎水基を介して簡便に修飾し、MCF-7細胞に対するエクソソームの細胞内移行効率を増強する技術開発を達成した。さらに、そのペプチド修飾がマクロピノサイトーシスの誘導することを明らかとした。引き続き、本研究課題における申請内容に沿って、そのエクソソームの受容体標的・細胞内移行性を詳細に検討している。上記の通り平成30年度は、本研究課題目的である「がん細胞など特定の細胞を標的する技術を確立し、疾患に応じてオンデマンドに対応可能なエクソソームDDSの技術基盤の構築」に基づき、疎水基を結合したsC18を合成し、それを簡便にエクソソーム膜に修飾することで、ヒト乳腺がん細胞(MCF-7)に対するエクソソームの細胞内取込みを増強させる技術開発を達成した。さらに、sC18を分岐型にした「(sC18)2」を合成し、それをsC18と同様の方法で、エクソソームに修飾した結果、sC18を修飾した場合と比較して効率的にエクソソームの細胞内移行を促進することを明らかとした。また、これまでsC18、及び、(sC18)2の詳細な細胞内取込み機構については不明であったが、sC18、或いは、(sC18)2をエクソソーム膜に修飾することでマクロピノサイトーシスが顕著に誘導されることを明らかとした。このマクロピノサイトーシスは、がん細胞に過剰発現している上皮成長因子受容体(EGFR)やケモカイン受容体CXCR-4、糖タンパク質等を介して誘導される。そのため申請者はマクロピノサイトーシスはがん標的、及び、その機構を明らかとする上で重要な機構であると考える。現在、本研究課題申請書に沿って、上記マクロピノサイトーシス関連受容体の形質膜発現量の異なるがん細胞を用いて、sC18、及び、(sC18)2、及び、それらを修飾したエクソソームの標的受容体を明らかとする研究を開始しており、それらペプチド修飾、及び、ペプチドの構造が細胞内移行機序やがん受容体標的に与える影響を明らかとする上で重要な知見が得られている。引き続き平成31年度以降も、申請研究内容(i)「各種がん細胞への効率的な取込みを可能とする機能性ペプチドカクテル修飾型エクソソームの技術開発とin vitro実験における導入評価」に基づき、がん受容体を介して細胞内移行が促進されたエクソソームの内包物の放出が達成されているか、蛍光プローブ等を用いた物理化学的側面や分子生物学的な側面から解析し、細胞小器官や細胞内分子を標的とする薬剤活性とも総合的に評価、判断して優れた細胞、及び、がん受容体標的技術の開発研究を展開する。さらに、申請研究内容(ii)「機能性ペプチドカクテル修飾型エクソソームの担がん
英語・日本語バイリンガル児の初期言語発達過程の調査

私は公募班であったので、毎年申請書類を提出していたが、本年度は4年間でおこなわれる特定領域研究「心の発達:認知的成長の機構」にとっての最終年度であった。私はこの特定領域研究で主として子どもの第2言語習得過程について研究してきた。第2言語としての英語習得研究と第2言語としての日本語習得研究の両方を行ってきた。使用データは1990年代の初期から取り続けてきたものである。本年度は第2言語として英語を習得した日本人の子どもを被験者に、彼等の英語の初期発達過程について考察を加えた。特に、機能範疇(functional category)の出現時期とその習得について分析した。私の結論は、日本人の英語学習者は極めて早い時期から英語の機能範疇を発現させ、また使用できるようになるというものである。なぜならば、これは普遍文法に関わりのある領域であり、このような領域は早く習得でき、かつ母語からの転移というものも起こりにくい領域であるから、というものである。研究発表も数多く行った。2000年6月にはJACET中部地区大会で、7月には日本認知科学会で、さらに、8月には日本言語科学研究会で、9月にはアメリカのウィスコンシン大学で開かれたSecond Language Research Forum(SLRF)で、私のこれまでの研究成果を口頭発表してきた。また、これらの口頭発表は、静岡大学教育学部研究紀要(2001年3月出版)を始めとして、その他現在投稿中のものも含め、2001年、2002年度中には論文として出版される見込みである。
抗血管内皮増殖因子リボザイムによるヒト膵癌肝転移遺伝子治療モデル

本研究はヒト膵癌の増殖・進展、特に遠隔転移をヒト癌-免疫不全動物移植/肝転移モデル(ヒト膵癌肝転移モデル)において解析し、VEGF189のmRNAを特異的に分解するリボザイムが実際にヒト膵癌の肝転移を免疫不全動物マウス個体内で阻害・予防できるか否かを検討した。平成11年度はVEGF189を分解するリボザイムの作成と膵癌培養細胞への組み込みを中心として実験を進め、細胞関連型のVEGF189アイソフォームに特異的に存在する塩基配列を標的としたハンマーヘッド型リボザイム(V189Rz)を作成した。まず、人工的に作成したRNA基質を用い、このRz-1の特異性・切断活性をin vitroで解析し、至適pH、温度、Mg濃度を確認した。細胞関連型VEGF189の発現の確認された膵癌株を用い、in vitroで分解活性の確認されたリボザイムをベクターpHβに組み込む(pHβ/V189Rz,pHβ/dis-V189Rz)をリポフェクションにより遺伝子導入した。平成12年度はVEGF189を分解するリボザイムを組み込んだ膵癌培養細胞MIAPaca-2の細胞生物学的特性をin vivo実験動物系を利用して解析した。細胞関連型VEGF189の発現の確認された膵癌株にリボザイム(pHβ/V189Rz,pHβ/dis-V189Rz)をリポフェクションにより遺伝子導入した。RT-PCR・シークエンス解析でリボザイムの導入を確認し(MIA Paca-2/VR)、同定されたリボザイム導入細胞株を用いて細胞生物学的解析を行った。また、リボザイム導入ヒト膵癌株(MIA PaCa-2/VR)とHUVECをco-cultureし血管内皮細胞の組織プラスミノーゲン活性化因子を測定した。さらに、これらのヒト膵癌培養細胞株を免疫不全マウスの脾門部(門脈)に移植し、肝転移能を実験動物学的に解析した。以上の研究で抗VEGF189リボザイムはヒト膵癌株のin vivoでの肝転移を阻害することが明らかになった。平成11年度はVEGF189を特異的に分解するリボザイムの作成と膵癌培養細胞への組み込みを中心として実験を進めた。まず、ヒト膵癌株(MIAPaCa-2,Capan1等)より細胞全RNAを精製し、これを鋳型としたRT-PCR法によってVEGFmRNAのアイソフォームの発現形式を明らかにした。アイソフォーム解析のためにExon1Exon8およびExon4Exon7にプライマーを設計しPCRを行い、増幅されるcDNAフラグメントのサイズから各アイソフォームの有無を確認した。ついで、細胞関連型のVEGF189アイソフォームに特異的に存在するExon6の塩基配列を標的としたハンマーへッド型リボザイム(V189Rz)を作成し、人工的に作成したRNA基質を用い、このRz-1の特異性・切断活性をin vitroで解析し、至適pH、温度、Mg濃度を確認した。

現在、RT-PCR・シークエンス解析でリボザイムの導入を確認し(MIA Paca-2/VR)、同定されたリボザイム導入細胞株を用いて細胞生物学的解析を行いつつある。本研究はヒト膵癌の増殖・進展、特に遠隔転移におけるVEGF189の機能をヒト癌-免疫不全動物移植/肝転移モデル(ヒト膵癌肝転移モデル)において解析した。VEGF189のmRNAを特異的に分解するリボザイムを用い、実際にヒト膵癌の肝転移を免疫不全動物マウス個体内で阻害・予防できるか否かを検討した。平成12年度はVEGF189を分解するリボザイムを組み込んだ膵癌培養細胞MIAPaca-2の細胞生物学的特性をin vivo実験動物系を利用して解析するとともに、RT-PCR・シークエンス解析でリボザイムの導入を確認し(MIA Paca-2/VR)、同定されたリボザイム導入細胞株を用いて細胞生物学的解析を行った。細胞関連型VEGF189の発現の確認された膵癌株を用い、in vitroで分解活性の確認されたリボザイムをベクターpHβに組み込む(pHβ/V189Rz,pHβ/dis-V189Rz)をリポフェクションにより遺伝子導入した。RT-PCR・シークエンス解析でリボザイムの導入を確認し(MIA Paca-2/VR)、同定されたリボザイム導入細胞株を用いて細胞生物学的解析を行った。また、リボザイム導入ヒト膵癌株(MIA PaCa-2/VR)とHUVECをco-cultureし血管内皮細胞の活性指標である組織プラスミノーゲン活性化因子(tissue plasminogen activator,TPA)を測定した。さらに、in vitroで分解活性の確認されたリボザイム/ベクター(pHβ/V189Rz,pHβ/dis-V189Rz)をリポフェクションにより遺伝子導入したヒト膵癌培養細胞株を免疫不全マウス(ヌードマウス、SCIDマウス)の皮下、脾門部(門脈)に移植し、増殖性、肝転移能を実験動物学的に解析した。