hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リウマチ治療を目的としたTNF-alphaに対する「スーパー抗体酵素」の開発

TNF-αは炎症性サイトカインの一種で、慢性関節リウマチを引き起こす主要な因子である。リウマチ治療薬としては、TNF-αや受容体に対する中和抗体が開発されて一定の効果を得ているものの、生理的な機能の抑制による副作用が問題となっている。本研究では、既存のリウマチ治療薬の問題点を克服する新機能性分子の開発を目指してTNF-αを特異的に分解する「スーパー抗体酵素」の作製に取り組み、その取得に成功した。TNF alphaは、慢性関節リウマチを引き起こす主要な因子の一つである。自己免疫疾患やストレスによって関節に炎症細胞が浸潤すると、産生されたTNF alphaによって生理的バランスを超えるレベルまで活性化された各種細胞によって骨破壊が進行し、関節の変形が起こる。リウマチ治療薬としては、TNF alphaの機能を消失させる中和抗体が開発されていて、一定の効果を示している。本研究では、TNF alphaが引き起こすカスケード反応の抑制を目的として、TNF alphaに対するスーパー抗体酵素を作製する。スーパー抗体酵素は中和抗体と異なり、次々と抗原分子を入れ替えながら分解が進むので、投与量を抑えられる点が、中和抗体には無い特徴である。本年度はTNF-alphaに対するモノクローナル抗体のキャラクタリゼーションと、取得したモノクローナル抗体から「スーパー抗体酵素」として機能する抗体の抽出を進めた。酵素免疫測定法により、反応特異性を調べたところ、確立した17株の中の15株が高い反応特性を有しており、4株のIgM抗体がIgG抗体と同等の特異性を示すという特徴があった。TNF-alpaの部分ペプチドを合成してエピトープ解析を試みたが、サンドイッチ型の酵素免疫測定法では決定出来なかった。アッセイ系を変更して再検討を行う。2,「スーパー抗体酵素」の抽出と酵素活性の検討抗体産生細胞からRNAを抽出後、RT-PCR法によってcDNAを合成した。これを鋳型として抗体可変領域遺伝子を増幅させてpGEM-Tベクターに組み込んで塩基配列を決定した。この配列からVk germline geneを推定すると同時に、配列情報をアミノ酸変換して分子モデリングによる立体構造解析を行った。これまでの「スーパー抗体酵素」研究では触媒三ツ組残基様構造を持つIgG型の抗体を取り扱ってきたが、抗TNF-alpha抗体ではIgM抗体にも触媒三ツ組残基様構造を持つものが含まれていた。我々は、抗体の中には免疫応答による突然変異によらず、潜在的に酵素機能を有しているものがあると考えている。IgM抗体は免疫の初期に産生される抗体でIgG抗体よりもgermlineに近い段階の抗体であることから、IgM完全抗体の酵素活性の検討に着手した。合成基質を使ってAmidase活性の検討を進めている。本年度は、おもにTNF-alphaに対するIgM型スーパー抗体酵素の抽出と精製方法の確立、および酵素活性を発揮させるための反応条件の最適化を行った。1,IgM型スーパー抗体酵素の抽出TNF-alphaに対するIgM型抗体の立体構造解析の結果から、酵素活性を検討する抗体としてETNF-11,-12,13抗体を選択した。これらの抗体を含むマウス腹水から抗体を精製する方法としてAffinity精製と組み合わせる第二の精製方法を検討し、変性条件下のサイズ排除HPLC精製行う手法を確立した。2,IgM型スーパー抗体酵素の酵素活性の検討精製ETNF-11,-12,-13抗体について、まず完全抗体の状態でのAmidase活性を調べた。基質にはPeptidyl-MCA基質を用いた。その結果、活性の強さはETNF-13>ETNF-12>>>ETNF-11となり、ETNF-11については、ほとんど酵素活性は認められなかった。そこで、ETNF-13完全抗体を用いて酵素活性を発揮させるための、緩衝液組成について検討すると、50mM Tris-HCl,100mMGlycine,0.1mMCHAPS buffer(pH7.7)が最も適していた。分子モデリングによる立体構造解析では、ETNF-13抗体は軽鎖上に触媒三ツ組残基様構造を持っと推定されたことから、軽鎖を調整してAmidase活性を調べると、抗原反応基当たりの酵素活性は軽鎖単独の方が完全抗体よりも高いことが分かった。本年度は、昨年度までに抽出したTNF-alphaに対するIgM型スーパー抗体酵素、およびその抗体鎖に加え、IgG抗体鎖型スーパー抗体酵素の酵素活性を評価した。1, Amidase活性の評価IgM型スーパー抗体酵素のETNF-11,-12,-13抗体については、完全抗体と抗体鎖、IgG型スーパー抗体酵素では抗体鎖を調製し、Peptidyl-MCAで、基質に対する基質特異性と反応速度を比較した。加水分解傾向が強かったのはTrypsin用の基質として市販されているQAR-MCAであり、この傾向は、他のスーパー抗体酵素とも類似していた。また、反応速度も0.010.1min^<-1>で、天然型抗体酵素の一般的な値を示した。スーパー抗体酵素の体内動態を考えると、10min^<-1>、最低でも1min^<-1>が必要であり、活性の向上が必要である。

一部の抗体・抗体鎖について、recombinant human TNF-alphaに対する分解試験を行った。37□での反応液をSDS-PAGEやWestern blottingで分析すると、スーパー抗体酵素を加えた反応液で、TNF-alphaのバンドが僅かに低分子シフトする傾向が認められたものの、それ以上の反応は起こらなかった。シフトしたバンド部分のN末端アミノ酸解析により、Exopeptidase様の分解が進行していることが分かった。分解断片の方がスーパー抗体酵素との親和性が高く、生成物阻害が起こっていると考えられる。本年度の検討項目はマウスIgM型スーパー抗体酵素の遺伝子発現と完全ヒト型のTNF-alphaの探索を行った。1)マウスIgM型スーパー抗体酵素の遺伝子発現酵素活性を発揮する形で発現、精製して用いるためには適切なVectorと精製方法を選ぶ必要がある。そこで韓国の抗体酵素研究者より実績のあるプラスミドベクターの分与を受けて、まずは軽鎖単独の発現を試みた。すると、そこそこの量で可溶性画分への発現は認められたが、tag (Protein Aが用いられている)を使った精製だけでは純度が不十分であることが分かった。本研究で標的としているTNF-alphaは高価でaffinity columnを用意することが出来ないことと、ここで得られているスーパー抗体酵素はもともと活性が低く、精製方法に問題のある系を使って遺伝子工学的な改良を行うのは、残りの研究期間を考えると適当ではないと判断し、高純度に精製出来る系でヒト型の抗体軽鎖を用意して、その中からTNF-alphaに対する加水分解活性を示すものを抽出する方向に切り替えた。2)ヒト型のTNF-alphaの探索これまでの研究から、ヒトkappa型軽鎖の場合にはV germline geneのsubgroupを絞ることで酵素活性のある抗体鎖の抽出効率が上がると考えている。6種類のsbugroupの中でsubgroup IIに属する場合、酵素活性を示す割合が高いと考えられたことから、subgroup IIのヒト型軽鎖遺伝子をpET20b(+)ベクターで発現させた。18種類の遺伝子をクローニングし、Niクロマトグラフィーと陽イオンクロマトグラフィーの二段階精製によって高純度精製した軽鎖についてTNF-alphaに対する分解活性を調べたが、良好な結果を示すものは得られなかった。
セントロメア領域に特異的なヌクレオソームの結晶構造解析

本研究では、真核生物のセントロメア領域の主要な構成因子であるヒストンH3バリアントCENP-Aを含むヌクレオソームの立体構造を明らかにした。本構造解析によりCENP-Aヌクレオソームは各二分子のヒストンCENP-A、H4、H2AおよびH2Bからなるヒストン八量体にDNAが左巻きに結合していることが明らかとなった。またCENP-Aヌクレオソームでは、ヒストン八量体に安定に結合しているDNAの長さがH3ヌクレオソームと比べ約26塩基対短いことが分かった。この知見より、CENP-Aヌクレオソームが、セントロメア領域に特異的なDNA結合タンパク質のセントロメア領域への集積や、セントロメア領域に特徴的な高次クロマチン構造の形成に関与していることが示唆された。また、CENP-Aのloop1領域のアミノ酸がCENP-Aのセントロメア領域への安定的な局在に重要であることも構造生物学および細胞生物学的解析により明らかにした。本研究の目的は、セントロメア領域に特異的なヌクレオソームの構造解析である。真核生物のゲノムDNAは、S期で複製され、M期で二つの娘細胞に均等に分配される。このM期での均等分配に重要な役割を果たしているのがセントロメア領域である。両極から伸びてきた紡錘糸が結合するキネトコア領域が、セントロメア領域を土台として、その外側に形成される。セントロメア領域の特徴として、ヒストンH3バリアントCENP-Aを含むヌクレオソームが局在している。ノックアウトマウスの解析から、CENP-Aはセントロメア領域の形成に必須の因子であることが明らかとなっているが、セントロメア領域の確立において、どのように役割を果たしているのかは明らかとなっていない。そこで、本研究では、立体構造からCENP-Aの機能を解析することを目的に、CENP-Aを含むヌクレオソームのX線結晶構造解析を行った。研究方法として、CENP-Aを含むヌクレオソームを試験管内において再構成した。そのために、CENP-Aヌクレオソームの構成因子であるヒストンH2A、H2B、CENP-A、H4および147塩基対のDNAを調製した。各ヒストンタンパク質は、大腸菌を用いてリコンビナントタンパク質として発現・精製した。また、結晶化に用いたDNAは、プラスミド上に24個タンデムに繋ぎ、そのプラスミドを大量調整し、そこから制限酵素を用いて切り出し、精製した。これらのヒストンおよびDNAを用いて、CENP-Aを含むヌクレオソームを再構成し、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。その結果、単結晶を得ることに成功した。得られた結晶にX線を照射し、回折波のデータを収集した。現在、回折波のデータから構造を決定しているところである。セントロメアは、S期で複製された姉妹染色分体を2つの娘細胞に正確に分配するのに必要なゲノムDNA上の領域である。これまでの報告により、ヒストンH3バリアントの一種類であるCENP-Aがセントロメア領域の形成に中心的な役割を果たしていることが知られている。CENP-Aはセントロメア領域において、ヌクレオソームを形成しており、このCENP-Aを含むヌクレオソームの立体構造がセントロメア領域に特徴的なクロマチン構造の形成に重要だと考えられる。そこで我々はCENP-AヌクレオソームのX線結晶構造解析を通して、セントロメア領域の形成機構を明らかにすることを研究目的とした。CENP-AヌクレオソームのX線結晶構造解析を行うために、ヒトのヒストンH2A、H2B、CENP-AおよびH4を、大腸菌を用いて発現・精製した。ヌクレオソームの再構成に用いるDNAは、ヒトのセントロメア領域の配列を用いた。試験管内において、塩透析法によりCENP-Aヌクレオソームを再構成した後に、電気泳動法により精製を行った。精製したCENP-Aヌクレオソームを蒸気拡散法により単結晶化した。大型放射光施設にて、得られた結晶にX線を照射し、回折波のデータを収集し、3.6Aの分解能でヒトのCENP-Aヌクレオソームの立体構造を決定した。決定した立体構造より、各2分子のヒストンH2A、H2B、CENP-A、H4からなる八量体にDNAが左巻きに結合した構造であることが明らかとなった。

H3ヌクレオソームとの違いとして、ヒストン八量体に安定に結合しているDNAの長さが121塩基対と26塩基対短いことが明らかとなった。このことはCENP-Aヌクレオソームが形成されることにより、高次クロマチン構造に変化を引き起こし、セントロメア領域に特徴的なクロマチン構造の形成にCENP-Aが寄与している可能性を示していた。
高エネルギー天体現象の観測による高次元宇宙モデルの検証

超弦理論などに示唆される高次元宇宙モデルの検証に向け、高次元の重力理論がもたらすと考えられる高次曲率重力の動力学を解析する手法を開発すること、また、高次元的なインフレーションを検証するために宇宙超弦が宇宙マイクロ波背景放射に及ぼす影響を研究することに取り組んだ。1.作用函数がRicciスカラーやRiemannテンソルの函数で表現される"f(R)"型や"f(Riemann)"型重力理論の正準形式による記述法を調べた。とくに、超弦理論からは後者のような一般的な重力が導かれ、Einstein-Hilbert作用からのずれが宇宙の膨張史の変更となって現れると予想される。そこで、正準形式による記述を行ない、計量場とそれ以外に生じる独立な自由度が従うべき時間発展方程式、また拘束条件を導出し、それによって函数fを分類した。これらは、宇宙の膨張則の観測などから重力の作用函数の情報を得、またそれを通じて、超弦理論のような高次元時空の基礎理論そのものを探査するための基礎となるべき研究成果である。さらに、高次元膜宇宙モデルの構築のために必要な重力の表面作用も見出した。2.宇宙初期の超弦理論的な高次元インフレーション後に宇宙に残される宇宙超弦が宇宙マイクロ波背景放射に与える痕跡を通じ、高次元インフレーション宇宙を観測的に検証することの可能性を検討した。宇宙超弦の網状構造がつなぎ換え確率の大小によって変化することに着目し、弦の影響で宇宙マイクロ波背景放射に混入する非ガウス性信号からその確率を読み取る方法を提案した。超弦理論などに示唆される高次元宇宙モデルの検証に向けて、高次元の重力理論において顕著な効果を持つと期待される高階曲率項の存在が、宇宙モデルとしてのブレーンワールド解にどのように影響しうるかを調べた。高階曲率項を含む重力の作用として、Ricciスカラー曲率の任意の関数を表現する"f(R)型作用"に着目した。f(R)型重力は、Einsteinの一般相対性理論に高階曲率項の補正を加える場合のもっとも単純な一般化である。まず、この重力理論の下で余剰次元1の薄膜が従うべき重力の方程式、すなわち接合条件を導出した。これは、宇宙が5次元時空である場合に、通常の物質を束縛する3次元膜(ブレーン)の世界面が従うべき重力の方程式であり、系を記述する基礎方程式群の一つを構成する。導出にあたっては、計量以外にf(R)型重力理論に含まれる動的なスカラー自由度を尊重し、膜上の物質が計量場およびスカラー場と結合する効果を完全に取り込んだ定式化を行なった。従前の類似の研究では、物質は計量場とのみ結合することが仮定されており、スカラー場との結合を正しく考慮した接合条件の導出はなかった。この点を一般的な手法で正しく定式化できたことは、それを満たすべき重力解としての高次元宇宙モデルが示すであろう特徴的な性質に近づくものである。f(R)型重力についての方程式を導出したのち、さらにその一般化として、RicciテンソルとWeylテンソルについても任意の函数であるような作用を持つ重力理論の研究にも取り組んだ。これらすべてを包含する作用原理、すなわち作用の表面項を導出した。方程式の導出と同時に、それに従うブレーンワールド解の構築にも取り組み、現実的でもっとも単純な状況の一つである、反deSitter時空に宇宙論的な流体を束縛したブレーンが埋め込まれた解が存在するための条件を見出した。超弦理論などに示唆される高次元宇宙モデルの検証に向け、高次元の重力理論に由来すると考えられる高次曲率作用の宇宙論的な働きについて調べた。1.まず、作用がスカラー曲率の函数"f(R)"で表現されるf(R)重力理論に着目した。f(R)重力の作用は一般に共型変換によってEinstein重力とスカラー場が共存する形の作用に移ることができ、近年、そのスカラー場のポテンシャルエネルギーを用いて現在の宇宙の加速膨張を説明することが試みられている。しかし、太陽重力場を考察したときには観測・実験事実と矛盾することが多く、自然なfの函数形で二つの観測と同時に整合することは困難とされていた。それに対し、スカラー自由度と物質場の一般的な結合を許す広いクラスのf(R)重力理論を提案し、その枠組みでは、単純な函数形であっても加速膨張と太陽重力場の両方を導けることを示した。2.作用がRiemannテンソルの函数で表現される"f(Riemann)"重力理論の性質を調べた。超弦理論からそのような一般的な重力が導かれると予想されるが、これまでいくつか特定の函数形のf以外で宇宙論が考察されたことがなく、方法論の整備が急務となっている。系を動力学的に記述するために正準形式へと変換し、計量場とそれ以外に生じる独立な自由度が従うべき正準方程式を得た。またそれを応用し、Weylテンソルの非線型項が作用に含まれる場合に発生し得る宇宙の不安定性を考察した。以上の成果は、起源としての高次元重力理論を考察する際の手掛かりとなる点で重要である。

1.作用函数がRicciスカラーやRiemannテンソルの函数で表現される"f(R)"型や"f(Riemann)"型重力理論の正準形式による記述法を調べた。とくに、超弦理論からは後者のような一般的な重力が導かれ、Einstein-Hilbert作用からのずれが宇宙の膨張史の変更となって現れると予想される。そこで、正準形式による記述を行ない、計量場とそれ以外に生じる独立な自由度が従うべき時間発展方程式、また拘束条件を導出し、それによって函数fを分類した。これらは、宇宙の膨張則の観測などから重力の作用函数の情報を得、またそれを通じて、超弦理論のような高次元時空の基礎理論そのものを探査するための基礎となるべき研究成果である。さらに、高次元膜宇宙モデルの構築のために必要な重力の表面作用も見出した。2.宇宙初期の超弦理論的な高次元インフレーション後に宇宙に残される宇宙超弦が宇宙マイクロ波背景放射に与える痕跡を通じ、高次元インフレーション宇宙を観測的に検証することの可能性を検討した。宇宙超弦の網状構造がつなぎ換え確率の大小によって変化することに着目し、弦の影響で宇宙マイクロ波背景放射に混入する非ガウス性信号からその確率を読み取る方法を提案した。
代謝モデルシミュレーションによるプラズマ照射細胞応答機構の解明

本研究では、ゲノムスケール代謝モデル(GSMM)の研究が、最も進んでいる大腸菌(E. coli)を例にとり、プラズマ照射による大腸菌の代謝反応変化(ストレス応答)を解析するシミュレーション・システムを構築した。これにより、プラズマ医療の大きな課題である、低温大気圧プラズマ照射による滅菌作用の生物学的機構を定量的に解明する方法論を確立し、酸化ストレスによる大腸菌の代謝の変化による不活化の過程を明らかにした。代謝シミュレーション、特に、ゲノムスケール代謝モデル(GSMM)シミュレーションとは、生物内の代謝反応ネットワークをゲノム情報に基づいて記述したモデルの数値シミュレーションであり、現在、発展目覚ましいシステム生物学の根幹をなす技術の一つである。GSMMシミュレーションを用いることにより、外部からの酸化ストレス等が、生物の代謝に与える影響を詳しく調べることが可能である。本研究では、GSMMの研究が、最も進んでいる大腸菌(E. coli)を例にとり、プラズマ照射による大腸菌の代謝反応変化(ストレス生成)を解析するシミュレーション・システムを構築し、これにより、プラズマ医療の大きな課題である、低温大気圧プラズマ照射による滅菌作用の生物学的機構を定量的に解明する方法論を確立することを目的とする。この研究で得られる知見をもとに、将来は、プラズマ滅菌機構の実験的研究の更なる進展と、人体等動物細胞に対するプラズマ照射の生理学的影響を定量的に解析するプラズマ・GSMM連成シミュレーション技術の開発への発展が期待される。初年度の研究においては、本研究代表者が過去におこなった、液中に存在する大腸菌の不活化研究を念頭において、プラズマ照射条件から、液中の反応活性種(ROS/RNS等)濃度の時間依存性シミュレーションを行い、生成される活性種がどのように大腸菌の代謝応答に影響するかを明らかにする数値シミュレーション・システムの構築をおこなった。具体的には、大腸菌のGSMMシミュレーションコードiJO1366およびCOBRApyを導入し、大腸菌内の鉄硫黄クラスターを含む酵素フマラーゼ、アコニターゼ、DHAD]がスーバーオキシドアニオンラジカルO2-により不活化する際の代謝シミュレーションを行った。プラズマにより生成された活性酸素・活性窒素は、細菌等の生物に接触すると、様々な酸化ストレスを与える。このような生体へのプラズマ照射効果についてより詳細な知見を得るためには、細胞の内部まで含めた現象を解明する必要がある。代謝工学においては、有用な代謝物の増産などを目的として代謝流速均衡解(FBA)による生体内の反応解析が広く用いられており、特に、大腸菌に関してはCOBRApyと呼ばれるシミュレーショツールが公開されている。FBAでは、化学量論と代謝流量とに着目し、定常状態における代謝ネットワーク中の各反応フラックスを計算する。これら細胞内反応フラックス(代謝フラックス)分布は、細菌や酵母の場合、与えられた条件(細胞内へ流入する炭素源や金属イオンなどのフラックス、遺伝子や特定の代謝反応のノックアウトなど)において増殖率が最大となるように決められる。FBAは対数増殖期のような定常状態を仮定しているため、代謝の動的な応答は計算できないが、酸化ストレスを反映した適当な条件の下で計算することで、本研究にも適用可能であると考えられる。これまでの研究では、大腸菌内に誘起、もしくは導入されたスーパーオキシドアニオンラジカル(O2-)が[4Fe-4S]タイプの鉄-硫黄クラスターを含有する酵素を攻撃することから、これらの酵素の関与する代謝パスがプラズマ照射によって損傷を受けたと仮定し、その度合いに応じて大腸菌増殖率を計算することで、プラズマ照射の影響を解析した。本研究では、GSMMの研究が、最も進んでいる大腸菌(E. coli)を例にとり、プラズマ照射による大腸菌の代謝反応変化(ストレス生成)を解析するシミュレーション・システムを構築し、これにより、プラズマ医療の大きな課題である、低温大気圧プラズマ照射による滅菌作用の生物学的機構を定量的に解明する方法論を確立することを目的とした。2年目に研究においては、大腸菌のGSMMシミュレーションコードCOBRApyを用いて、大腸菌内の鉄硫黄クラスターを含む酵素フマラーゼ、アコニターゼ、DHADがスーバーオキシドアニオンラジカルO2-により不活化する際の代謝シミュレーションを行った。シミュレーションの結果、大腸菌の成長率は、フマラーゼやアコニターゼの不活化によって、あまり影響を受けない一方、DHADの不活化に、大きく減衰することが明らかになった。これは、DHADが、分岐鎖アミノ酸の生成経路に直接関連するためである。大腸菌の成長がプラズマ照射により阻害された場合においても、TCA回路がほとんど影響されないため、大腸菌の酸素呼吸はほとんど影響を受けないこともシミュレーションにより示された。

今後の研究では、COBRApyコードを、様々なプラズマ生成条件下で実行し、プラズマパラメータと大腸菌の代謝反応を明らかにし、モデル予測と、大腸菌のプラズマ照射による不活化データとを比較する。特に、大腸菌の各種変異によって生成されるO2-の量の変化は、同コードより評価することが可能である。プラズマ照射により生成される活性酸素を、どのようにGSMMシミュレーションに導入するかは、実験的に不明なことが多いため、容易に解決できる問題ではないが、適当な仮説のもとに、外部条件と大腸菌内の活性酸素量の関係を仮定し、上記シミュレーションを実行する。多くの仮説のもとで実行するシミュレーションは、結果における不確定要素が多いものの、プラズマ照射による大腸菌不活化機構を正しく理解するために注目すべき生体内反応パスに対して重要な示唆を与えることが期待される。プラズマ物理学
癌転移抑制剤の標的タンパク質・パキシリンのX線結晶構造解析

インテグリン裏打ちタンパク質の一つであるパキシリンはインテグリン刺激によって最もチロシンリン酸化されるタンパク質の一つであり、これまでの知見からパキシリンのチロシンリン酸化が細胞運動に深く関与していることが分かっている。本研究では、パキシリンが癌転移抑制剤の標的タンパク質になると考え、その三次元構造を明らかにし、癌転移治療薬開発に重要な情報を提供することを目的としている。パキシリンの構造は大きく二つの構造からなる。すなわち、N末端部分はチロシンリン酸化部位および5つのLDモチーフから構成され、C末端部分は4つのLIMドメインから構成されている。パキシリンのチロシンリン酸化部位は、Tyr31/Tyr118およびTyr40/Tyr181はN末端部位に含まれており、パキシリンのN末端部位のGST融合パキシリンをバキュロウイルス発現系にて作製し立体構造解析のための結晶化を試み、微結晶を得た。また、Tyr31/Tyr118あるいはTyr40/Tyr181についてリン酸化を受けないPheに変異させたパキシリンをバキュロウイルス発現系にてタンパク質を作製し、mgオーダーで純度95%のタンパク質を得ることに成功した。Pheに変異させたパキシリンをSrcなどキナーゼ作用させ、in vitroにおけるパキシリンのリン酸化を行い、リン酸化パキシリンをイオン交換クロマトグラフィーで分離後、マススペクトロメトリーにてリン酸化の確認を行い、パキシリンがTyr31/Tyr118あるいはTyr40/Tyr181のみがリン酸化されていることを確認した。また、これらの変異パキシリンの微結晶を得ることにも成功した。これまで、パキシリンを含むパキシリンファミリーについて、高純度かつ高濃度の精製に成功した例はない。本課題でのパキシリン発現・精製技術の確立によって、今後のパキシリンファミリーの三次元立体構造研究のための技術提供に大きく寄与した。パキシリンのTyr31/Tyr118およびTyr40/Tyr181はN末端部位に含まれており、当該研究ではパキシリンのN末端部位のGST融合パキシリンを作製し立体構造解析を試みた。はじめに、パキシリンのX線結晶構造解析を行うために、GST融合タンパク質の作製を行った。すなわち、パキシリンのN末端部分をバキュロウイルス発現系および大腸菌発現系により、組み替えGST融合タンパク質を得た。次に、得られたタンパク質をグルタチオンセファロースカラムおよびゲル濾過にて精製し、精製パキシリンをシッテイングドロップ法により結晶化を行い微結晶を得た。今後、さらにNASDAの施設を使った無重力状態での結晶化を試みる予定である。さらに、平成17年度に予定していた「リン酸化パキシリンタンパク質の精製とX線結晶構造解析」のためにTyr31/tyr118あるいはTyr40/tyr181をリン酸化を受けないPheに変異させたパキシリンを変異させていないパキシリンと同様にバキュロウイルス発現系にてタンパク質を作成し、mgオーダーで純度95%のタンパク質を得ることに成功した。Pheに変異させたパキシリンにSrcなどのキナーゼを作用させ、in vitroにおけるパキシリンのリン酸化を行い、リン酸化パキシリンをイオン交換クロマトグラフィーで分離後、質量分析計にてリン酸化の確認を行い、パキシリンがTyr31/tyr118あるいはTyr40/tyr181のみがリン酸化されていることを確認した。今後、これらの変異パキシリンを結晶化する予定である。本課題でのパキシリン
クラスルームヒストリー法による学級リサーチメソッドの開発と実践的応用

本研究の目的は、クラスルームヒストリーを調査方法及び実践方法として開発し、日本の小学校における効果を例証することである。成果を測定するため、デジタルエスノグラフィーを、小学校3年生2クラス、小学校5年生1クラス、小学校6年生2クラスで実施した。その結果、次の2点が明らかになった。(1)ナラティブコミュニティとして学級を開発することで、児童による自治的な問題解決と文化創造をより促進することができる。(2)クラスルームヒストリーというメソッドにより、学級における集団的なリフレクションを促進し、学級のアイデンティティを確立することができた。本年度は下記3つのサブテーマを実施した。(1)クラスルームヒストリー法のリサーチメソッドの開発・改善を遂行した。この研究課題を遂行するため、構築主義的アプローチによる質的調査の手法(カテゴリー分析のエスノフラフィー)を援用した<学級づくり>研究の理論枠組みに加え、ライフヒストリー研究の手法を組み込み、クラスルームヒストリー法のリサーチメソッドを開発・改善した。(2)当該年度では、小学校における中学年1クラス高学年1クラスの質的調査を実施し、ドキュメント資料化(前半分)を行った。これと同時に、既存調査3クラスのデータ整理・入力(トランスクリプト)を実施し、この資料を対象として(1)で開発したクラスルームヒストリー法による分析を行い、その成果を日本特別活動学会第22回大会で報告を行った。第一に、学級を変革する主体として教師=子どもを捉え、調査と実践を両立する手法としてクラスルームヒストリー法の学校臨床学的調査法としての可能性を明らかにした。第二に、社会学の理論を援用して学級活動の教育理論を構成し、特別活動における偶発的領域(児童による文化創造と問題解決のプロセス)を解釈=記述する意義と理論的含意を明らかにした。従来の特別活動では、偶発的領域と計画的領域・必然的領域が未整理のため、実践プログラム化の際には「教師の勘どころ」(職人芸)として語られやすかった。そこで本研究では、その3領域を整理することにより、実践知の記述と汎化可能性を企図した分析枠組みを構想した。(3)デジタルデバイスを用いた児童相互の記録を基に、学級に設置された電子情報ボード等を活用して、学級生活の変容をヴィジュアライズして問題解決や文化創造に寄与する実践(ライフヒストリー法)を2クラスで実施した。この実践もデジタル記録し、トランスクリプトを実施している。研究の2年次として計画通り、三つのサブテーマに取り組んだ。第一は教師研究で用いられているライフヒストリー法を参考として開発したクラスルームヒストリー法というリサーチメソッドを改善した。この手法の意義及び必要性については、日本特別活動学会の課題研究の依頼を受けた報告で、国内に成果を発信した。第二はクラスルームヒストリー法を用いた調査分析から、クラスルームアイデンティティの構成過程を明らかにした。具体的にこれまでに蓄積した5クラスのドキュメントをもとに、分析を行った。第三は学級生活の向上におけるクラスルームヒストリー法の効果を検討した。第二第三の成果に関して、小学校高学年の分析結果についてはSociety for Information Technology and Teacher Education(SITE2015)において、中学年の分析結果についてはThe 13th Hawaii International Conference on Education(HICE2015)で報告を行った。本研究の主要な結果は以下の通りである。第一にデジタル写真を用いたクラスルームヒストリー発表会により、学級の発達過程を可視化し、児童の学級アイデンティティを高めることができた。第二に、デジタル・クラスルームヒストリーによって、ナラティブコミュニティとしての学級の発達と自治的な文化創造や問題解決の促進効果がみられた。なお、クラスルームヒストリー法の必要性を学級活動史から明らかにした成果を論文として報告し、本研究の知見を学校現場に実践的・実用的にわかりやすく説明した実践論稿を教師用図書雑誌(『児童心理』『体育科教育』等)で2編報告を行った。平成27年度は研究計画に基づき、三つのサブテーマを遂行した。第一はクラスルームヒストリー法のリサーチメソッドとともに実践メソッドとして両立する可能性とその意義について整理し、調査=実践=解釈枠組の精緻化を行った。第二は、平成25年から27年までに蓄積した映像データをトランスクリプトし、クラスルームアイデンティティの構成過程を分析し、その構成過程に果たす「クラスルームヒストリー型の話合い活動」の意義を分析した。第三は、上記のクラスルームヒストリー法の理論的精緻化と実践分析から、<学級づくり>におけるクラスルームヒストリー法の実践的可能性を解釈=記述した。第21屆臺灣教育社會學論壇(日文發表)に招待され、中学年2クラス・高学年2クラスの学年段階内比較分析結果をもとに、第一と第二の成果を報告した。また日本特別活動学会第24回大会にて、第二第三のサブテーマをまとめ、5学級を対象とした分析(学級間比較分析、エピファニー分析、学級活動頻出ワード分析、小規模校への応用実践の結果分析)を報告した。分析結果では、(1)学級をナラティブコミュニティ(語りの創発的共同体)として再文脈化することは、児童生徒の自治的な問題解決や文化創造を活性化しうること、(2)クラスルームヒストリーという方法は、学級の集団的内省を促進し、学級のアイデンティティの再構成過程を産出すること、(3)映像データによるエビデンスとふりかえりの促進(及び保護者対応としての有効性)の3つを明らかにした。また学級をめぐる日常的言語資源(なかよく、楽しく等)に潜む問題性や学級における経験の共約不可能性などの課題を見いだした。

これらの成果を踏まえ、瀋陽大学教育学院での招待講演(1件)、日本子ども社会学会の特集論文(査読)依頼があった。本研究の目的は、クラスルームヒストリーを調査方法及び実践方法として開発し、日本の小学校における効果を例証することである。成果を測定するため、デジタルエスノグラフィーを、小学校3年生2クラス、小学校5年生1クラス、小学校6年生2クラスで実施した。その結果、次の2点が明らかになった。(1)ナラティブコミュニティとして学級を開発することで、児童による自治的な問題解決と文化創造をより促進することができる。(2)クラスルームヒストリーというメソッドにより、学級における集団的なリフレクションを促進し、学級のアイデンティティを確立することができた。本年度は、研究目的としてサブテーマの三つの内、二つを達成した。(1)欧米のカリキュラム研究の中で注目されているライフヒストリー研究を、日本独特の教育課程である特別活動の研究に応用することは、日本のみならず欧米のカリキュラム研究やクラスルームリサーチにとっても独創的な成果を産出する可能性を、学級経営史や特別活動の実践分析から明らかにし、日本特別活動学会の課題研究において成果報告を行った。(2)小学校5学級(特に中心的な実践を行うベテラン教諭による3学級と比較対象としての若年層教員の2学級)で実践を行い、最新のデジタルデバイス(iPod touch等)を用いた児童相互の記録を基に、学級に設置された電子情報ボード等を活用して、学級生活の向上をヴィジュアライズして問題解決や文化創造を行う実践方法を開発するとともにその有用性を明らかにし、アメリカの教育工学会(SITE2015)で報告を行った。この結果、次年度(三カ年計画の研究最終年度)に、実践の再分析とリサーチメソッドの精緻化を残すのみとなった。教科教育学(特別活動)これまで順調に計画に従って研究が展開できているため、次年度も計画に基づきながら、三つのサブテーマをさらに進展させる。一つはクラスルームヒストリー法を用いた特別活動のカリキュラム研究の意義及びリサーチメソッドの方法論を精緻化し、学会での報告や論文として成果を報告する。二つ目は、前年度に蓄積した実践の再トランスクリプトから実践分析の再整理を行い、上記の報告に踏まえる。三つ目には、これらの研究成果を教育現場の研修や教員用図書雑誌等を通じて、成果の社会的還元を行い、さらなる成果の発信を行う。質的調査及び実践=調査手法としてのライフヒストリー法の開発は順調に進んでおり、特に今年度の調査により、既存の調査で収集していた学級と同様の問題状況を抱えた異なる小学校中学年の調査が実施でき、学級づくりについて同学年2学級を対象とした比較分析の可能性を新たに広げることができた。またドキュメント資料のトランスクリプトにおいても質的資料化と分析は順調に進んでおり、計画通りに進展している。成果の報告についてはまず国内学会で成果の中間報告を行った。
嚥下障害解明にむけた嚥下関連筋群の分子機構の解析

高齢社会を迎え、摂食・嚥下機能の低下が大きな社会問題となっている。「摂食・嚥下障害」というとこれまでは中枢性の疾患のみにスポットがあたり、口腔機能の低下からくるものはあまり問題にされてこなかった。しかし実際の介護の現場、また日常生活を営んでいる患者でさえ、「むせる」「飲み込みづらい」などの黄色信号を発しているものが少なくない。摂食・嚥下の一連の動作には直接的に30以上の筋が関与しており、それらが実にタイミングよく連動する。それぞれの筋線維特性を明らかにすることが、これまでの神経生理学的な数々の報告とあいまって、摂食・嚥下の複雑なメカニズムの解明に一助をなすと考える。さらには、これら筋群のほとんどが口腔内、外より明視的に位置を同定することができ、摂食・嚥下障害の医療現場に対しての情報提供にもつながるのではないかと考えた。そこで、下記2点について重点的に検討を行った。口腔機能特有の現象である離乳期における筋線維特性の変化と、無歯顎状態で機能するマウスの筋線維特性を正常マウスと比較検討した。1.離乳前後におけるマウス咬筋浅層、深層の筋線維特性の変化2.成長期のmicrophthalmiaマウスを用いた咬筋筋線維特性の検索さらには、舌筋、顎二腹筋など他の筋に関する離乳期の筋線維特性、in vitroという条件にメカニカルストレスを与えた実験などで、機能と筋線維特性の変化を詳細に検討した。今回研究機関の間で、離乳など筋の機能が劇的に変化するタイミングで、多くの筋組織でMHC2aというIsoformが増加していることが明らかとなった。また、このIsoformは無歯状態の筋などでは、優位に少なかった。よって、筋機能低下に最も関連がある重要なIsoformであることが示唆された。摂食・嚥下関連筋群の分子生物学的な検索、特に分子量の多い筋収縮蛋白であるミオシン重鎖の各アイソフォームの組成の解明に焦点を絞り、それぞれの筋線維特性から、関連筋群のもつ摂食・嚥下に関する制御機構を解明することを本研究の目的とし研究を設定した。まず第一に、口腔領域の大きな機能変化である吸綴運動から咀嚼運動、すなわち離乳現象が、口腔領域の摂食・嚥下関連筋群の筋線維特性に与える影響について検討した。これまでマウス成獣の咬筋は、速筋タイプのみから構成されることは知られていた。しかし、速筋タイプの各Isoformの構成比が発育過程でどのように変化していくのか不明であった。特に発育過程に見られる「離乳」という現象は、咬筋に大きな機能的役割の変化をもたらすと想像できる。そこで出生直後、生後3,7,14,21日齢の咬筋のIsoformの構成比を蛋白レベルで明らかにした。その結果、出生直後から14日齢まではMHC-2aとMHC-2dの発現がみられ、MHC-2bは発現していなかった。そして生後21日目になると遅筋タイプのIsoformであるMHC-1およびMHC-2aが消失し、MHC-2bの発現が見られた。このMHC-2bは、速筋タイプのIsoformの中で最も収縮速度が速く、力の強いIsoformである。マウスの離乳期は生後2から3週とされており、MHC-2bの発現は離乳時期と一致していた。対照である前頚骨筋にはこのような変化は認められなかった。この結果より、吸啜から咀嚼への機能の変化とMHCIsoformの構成比の変化に関係があることが示唆された。同様の観点からの実験を顎運動に重要な役割を果たす外側翼突筋、さらに嚥下に関係する舌筋について検討したところ、口腔機能の変化がミオシン重鎖の組成に大きな影響を与えている可能性が明らかとなってきた。前年度は、in vivoの実験系において筋に与える機能と筋収縮タンパクのIsoformの構成比の変化について離乳、歯牙喪失などの時期に関する口腔領域の筋についての研究を行ったが、その結果を踏まえ今年度はin vitroの実験系を組んだ。培養された筋芽細胞に適正な機械的刺激を加えることにより、細胞の増殖や分化が促進されることが報告されている。しかしながら、機械的刺激が、筋線維の特性に与える影響については不明な点が残されていた。そこで我々は、最終的には速筋型へ優位に分化するとされる、マウス骨格筋筋芽細胞株C2C12細胞に対し伸展刺激を加え、細胞の分化の過程における筋収縮蛋白の構成変化を観察した。筋の特性を明らかにするために調べたIsoformは、ミオシン重鎖(MHC)の速筋型に属するMHC-2b,2d,2aである。細胞をシリコンチャンバー上に播種後、シリコンチャンバーに15%伸張(1秒伸展/1秒弛緩)の機械的な伸展刺激を加え、それぞれのMHC Isoformについて定量が可能であるLightcyclerを用いてmRNAの量を経時的に比較した。その結果、伸展群で最初MHC-2bが多く出現した。また、伸展刺激を加えない対照群で経時的に増加したMHC-2dは、伸展群ではほとんど認められなかった。さらに、伸展群のMHC-2aが対照群に対し有意に増加した。

MHC-2dは、筋の機能変化に応じて、その性質を収縮力の強いMHC-2bや収縮力が弱く持続力のあるMHC-2aに変化させるのではないかとするin vivoでの報告がある。今回の結果より、筋芽細胞は持続的な伸展刺激により、MHC-2aの性質を獲得したことを示している。従って、筋細胞は環境変化に対応し、細胞の増殖、分化が促進されるだけでなく、Isoformのレベルでも積極的にその性質を変化させていることが、in vitroの実験系において初めて明らかとなった。高齢社会を迎え、摂食・嚥下機能の低下が大きな社会問題となっている。「摂食・嚥下障害」というとこれまでは中枢性の疾患のみにスポットがあたり、口腔機能の低下からくるものはあまり問題にされてこなかった。しかし実際の介護の現場、また日常生活を営んでいる患者でさえ、「むせる」「飲み込みづらい」などの黄色信号を発しているものが少なくない。摂食・嚥下の一連の動作には直接的に30以上の筋が関与しており、それらが実にタイミングよく連動する。それぞれの筋線維特性を明らかにすることが、これまでの神経生理学的な数々の報告とあいまって、摂食・嚥下の複雑なメカニズムの解明に一助をなすと考える。さらには、これら筋群のほとんどが口腔内、外より明視的に位置を同定することができ、摂食・嚥下障害の医療現場に対しての情報提供にもつながるのではないかと考えた。そこで、下記2点について重点的に検討を行った。口腔機能特有の現象である離乳期における筋線維特性の変化と、無歯顎状態で機能するマウスの筋線維特性を正常マウスと比較検討した。1.離乳前後におけるマウス咬筋浅層、深層の筋線維特性の変化2.成長期のmicrophthalmiaマウスを用いた咬筋筋線維特性の検索さらには、舌筋、顎二腹筋など他の筋に関する離乳期の筋線維特性、in vitroという条件にメカニカルストレスを与えた実験などで、機能と筋線維特性の変化を詳細に検討した。今回研究機関の間で、離乳など筋の機能が劇的に変化するタイミングで、多くの筋組織でMHC2aというIsoformが増加していることが明らかとなった。また、このIsoformは無歯状態の筋などでは、優位に少なかった。よって、筋機能低下に最も関連がある重要なIsoformであることが示唆された。
ハイリスク者における新型インフルエンザワクチンの有用性に関する研究

幼児における新型インフルエンザワクチンの有効性は、オッズ比で0.67であった。健常成人、妊婦、中高生、施設入所高齢者では1回接種で高い抗体応答を認めたが、筋ジストロフィー患者では2回接種が必要と考えられた。免疫原性評価においては接種前抗体価を考慮する必要がある。小児入院症例調査から、ノイラミニダーゼ阻害薬の高頻度使用(93%)と早期投与および早期入院が、疾病負担の減少に貢献した可能性がある。15才の幼児を対象として単価新型インフルエンザワクチンの有効性について、症例対照研究を実施した。解析対象は症例6例、対照55例となった。統計学的に有意なワクチン有効性を検出することはできなかった(対象者の背景特性を調整した推定ワクチン有効率は25%(95%信頼区間:47990%))が、防御因子と考えられるもの(新型ワクチン接種)は検査確定新型感染症に対し、オッズ比は1より小であり、リスク因子と考えられもの(基礎疾患や通園など)は1より大であった。サンプルサイズが小さかったことが最も大きな限界点と考えられた。また、新たに発生した新型インフルエンザに対するワクチンについての有効性研究では、ワクチンの供給が流行の最中あるいは流行終息後となる点が大きな障害となると考えられた。単価新型インフルエンザワクチンを健常成人31人に2回接種、筋ジストロフィー患者(平均35歳)に1回接種し、接種前後の中和抗体価を測定した。健常成人の幾何平均抗体価は接種前14、1回接種後164(上昇倍数12.0)、2回接種後167(同12.2)であり、2回目のワクチン接種による更なる抗体価上昇は認めなかった。ワクチン接種後に1:40以上の抗体価を獲得した対象者の割合は1回接種後90%、2回接種後90%であった。また4倍以上の抗体価上昇を得た者はそれぞれ84%、84%であった。筋ジストロフィー患者の幾何平均抗体価は接種前10、接種後90(上昇倍数9.5)であった。73%の対象者がワクチン接種後に1:40以上の抗体価を獲得し、85%の対象者で4倍以上の抗体価上昇を認めた。いずれの集団においても単価新型ワクチンの1回接種によって新型ウイルス感染に対する防御能が獲得されること示唆された。また、ワクチン接種による重篤な有害事象の発現を認めなかった。さらに現在、高齢者、妊婦、中高生を対象に抗体価測定を実施中である。単価新型インフルエンザワクチンを施設入所高齢者71人に1回接種、妊婦150人と中高生106人に2回接種し、接種前後の中和抗体価を測定した。施設入所高齢者の幾何平均抗体価(GMT)は接種前39、1回接種後259(上昇倍数6.6)であった。ワクチン接種後の抗体保有率(SPR)は93%、抗体陽転率(SCR)は73%であった。妊婦のGMTは接種前13、1回接種後285(上昇倍数22.3)、2回接種後273(上昇倍数21.4)であった。SPRは1回接種後94%、2回接種後91%、SCRはそれぞれ88%、87%であった。中高生のGMTは接種前15、1回接種後245(上昇倍数16.7)、2回接種後279(上昇倍数18.7)であった。SPRは1回接種後91%、2回接種後92%、SCRはそれぞれ80%、83%であった。単価新型ワクチンの1回接種によって抗体価は大きく上昇し、妊婦と中高生では2回接種による抗体応答の増強は認めなかった。2009/10シーズンに、検査確定インフルエンザA感染にて5つの病院に入院した16歳未満の小児515例について、臨床特性を検討した。年齢の中央値は6.3歳(0-15歳)であり、64%が男児であった。42%が何らかの基礎疾患を有していた(多い順に喘息20%、けいれん及びてんかん17%)。入院の主因として、呼吸器系合併症が49%、神経系合併症が28%、加えて両者の併存が5%であった。60%が発症から24時間以内、79%が48時間以内に入院していた。93%がノイラミニダーゼ阻害剤の投与を受けており、73%は発症から24時間以内、87%は48時間以内に投与を開始していた。3%がICU管理を要しており、1%が人工呼吸管理を受けていた。死亡例はなく、1例(0.2%)に後遺症を認めた。多変量解析の結果から、神経疾患の存在がICU管理のリスク因子と考えられた(調整オッズ比4.64、基礎疾患全体では祖オッズ比1.7)。諸外国と比べた場合、日本において入院率や死亡率が低いことが指摘されているが、入院の早さや、抗ウイルス薬が高頻度かつ早く投与されていることが貢献している可能性が示唆された。

前シーズンにインフルエンザA(H1N1)単価ワクチンを接種した健常成人32人を対象に、2010-11シーズンに季節性ワクチンを2回接種し接種前後の中和抗体価を測定した。幾何平均抗体価は接種前57、1回接種後197(上昇倍数3.4)、2回接種後217(同3.8)であった。ワクチン接種前の抗体保有率(1:40以上)は72%、接種後は100%(1回後、2回後とも)、抗体陽転率は47%(1回後)、53%(2回後)であった。前シーズンにパンデミックワクチンの接種を受けた者が対象であり、該当シーズン接種前から比較的高い抗体価が認められた。1回接種によって抗体価は大きく上昇し、2回接種による抗体応答の増強は認めなかった。重篤な有害事象を認めなかった。小児科医104人に、インフルエンザワクチン、診療について実態調査を行った。基礎疾患を有する小児について91%、健常小児について82%がワクチン接種を推奨すると答えた。重篤な疾患の予防効果について98%、発症防止効果について83%が有効とした。シーズン中の発熱児に対する迅速診断について、31%が必ずまたはほぼ実施、38%が発症からの経過時間によって実施とした。シーズン中のノイラミニダーゼ阻害薬(NI)処方については、27%が迅速診断陽性者へ処方、70%は陽性者に加えて陰性でもインフルエンザを疑えば処方するとした。0歳児へのNI処方については、42%は保護者による拒否がなければ原則処方、39%が保護者の希望があれば処方するとした。19%は迅速診断陽性でも処方しないと答えた。10代に対するNI処方については、63%がオセルタミビル以外を優先するとし、7%は原則としてオセルタミビルを処方するとした。弱毒生ワクチン(75%)、アジュバントワクチン(52%)、皮内マイクロインジェクションワクチン(41%)の順に本邦への導入が望ましいとされた。H22年度を含め、当初計画していた施設入所高齢者、神経筋疾患患者に加えて、妊婦や中高生において新型ワクチンの免疫原性を検討した。逆にパンデミックシーズンの検討に重きを置いたため、それ以後のシーズンについて、研究進捗がやや遅れている面もあり、(2)とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22、23年度研究にて、健常成人、筋ジストロフィー患者、施設入所高齢者、妊婦、中高生における単価不活化新型インフルエンザワクチンの中和抗体価を指標とした免疫原性(および副反応)について検討を行った。これについてさらに、詳細な疫学解析を進める。また、2010/11シーズンの3価ワクチンについて健常成人に関して抗体価測定を実施中であり、引き続き免疫原性評価を行う。また、小児科医を対象に、インフルエンザ診療に関するアンケート調査を行っており、これについて解析を進める。平成24年度が最終年度が最終年度となるため、上記を中心にこれまでの研究の総括を行う。
日本語学習の中級移行段階での文章読解における意味処理とその自動化に関する研究

本研究は、中級移行段階の読解において、読解に使用される文章の性質、学習者の知識、その知識の処理における自動化との関連で、効果的な指導法を明らかにすることを目的とし、教材作成及び実験、アイカメラでの調査を行ったものである。教材として、文章中の語彙の処理の自動化を促すための、単語フラッシュ認識練習教材を作成した。これは、単語の瞬間的な認知、認識を促す練習をすることにより、文章理解の際の単語の意味処理を自動化させるための教材である。コンピュータ画面に、ある単語をごく短時間(1/43秒)提示し、画面上からその情報が消えた後で、学習者が提示されていた単語の再認、あるいは意味認識ができるかを選択式の問題に答える練習教材である。本研究においては、単語提示を、単語の品詞別、表記別(漢字、カタカナ、ひらがな)、初級教科書における提出課別、読解文章別に行えるように、教材を整備した。本研究において、単語フラッシュ認識練習教材を処遇として用い、読解の実験を行った。実験においては、被験者を2グループに分け、処遇を与えた場合と処遇を与えない場合とで、内容理解テストにおいて差が見られるかを、標準化した得点(Z値)により比較した。その結果、処遇を与えた場合の方が与えない場合より、標準化得点が2.32.6点上がったことがわかった。被験者を読解力の高い学習者と低い学習者と2群に分け、標準化得点の変化を調べたところ、読解力の高い学習者より、低い学習者の方が処遇後の得点の伸びが著しく、3.23.7点上がった。また、被験者に対するアンケートでは、単語フラッシュ認識練習教材に対し、全体の79.2%の者が役に立つと考えていることがわかった。アイカメラでの読解中の学習者の目の動きの記録から、中級移行段階においては、注視が非常に多く、処理容量が主に文字及び単語認識のために割かれていること、読解力の高い学習者の方が低い学習者より逆行を多く行っているが、全体の注視数は読解力の高低で有意な差はないこと、中級移行段階より中級半ばの学習者の方が注視数が減っていることが認められ、まとまった意味処理に比重が移ることがわかった。今年度は、1)中級レベルの文章の特徴と読解が困難になる要因の分析、2)言語的知識の自動化の程度を調べ、必要に応じて知識の活性化、自動化を促す試作教材の作成、3)アイカメラでの読解中の眼球運動の記録の収集と分析、を計画、実施した。中級レベルの文章に関しては、特に中級前半から半ばにかけては、文章中の使用語彙、文型ともにコントロールされ、外国語学習という視点からトピックが選ばれ、文章が作成されていることが多い。そのため、文章作成段階で学習者の既有知識を予測されてはいるものの、必ずしも学習者が共通に文章の背景的知識を持っているとはいえない。言語的には、省略された主語や目的語等の把握、指示詞の指示内容の理解、談話の中での言語形式、例えば接続表現やムード・モダリティに関係する表現(例ハズダ、ワケダ、モノダ等)の正確な意味理解が要求されると言える。言語的知識の自動化の程度を調べるために、コンピュータ教材を試作し、5名の学習者に対し試用した。その結果、ある程度の自動化の程度が測定できるという結果が得られた。また、知識の活性化、自動化を促す試作教材についても、範囲を限定して教材を試作、試用し、現在は教材を改良し本教材を作成している段階である。アイカメラによる読解中の眼球運動の記録は、千葉工業大学のプロジェクト・マネジメント学科の教官に協力を依頼し、データの収集を行い、初級修了段階の読みと中級後半の読みの比較を実施した。現在は収集データの分析を行っている。現在のところ、未習語には全体として注視が多く、停留時間も長いことがわかっている。これは初・中級どちらも未習語の意味処理には、既習語の意味処理と比較し格段に処理のために容量が使われていることを示していると考えられる。

被験者を読解力の高い学習者と低い学習者と2群に分け、標準化得点の変化を調べたところ、読解力の高い学習者より、低い学習者の方が処遇後の得点の伸びが著しく、3.23.7点上がった。また、被験者に対するアンケートでは、単語フラッシュ認識練習教材に対し、全体の79.2%の者が役に立つと考えていることがわかった。アイカメラでの読解中の学習者の目の動きの記録から、中級移行段階においては、注視が非常に多く、処理容量が主に文字及び単語認識のために割かれていること、読解力の高い学習者の方が低い学習者より逆行を多く行っているが、全体の注視数は読解力の高低で有意な差はないこと、中級移行段階より中級半ばの学習者の方が注視数が減っていることが認められ、まとまった意味処理に比重が移ることがわかった。