hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
性能指向型火災安全設計法の体系化に関する研究

本研究では、避難安全評価体系を対象として性能指向型工学体系化を目指し、昨年度までに建築基準法の下に定められた避難安全検証法(以下、検証法)について、(1)その計算体系が建築設計に要求する安全水準、(2)計算体系に含まれる特性入力値や予測式が本来持っている変動やばらつきの検証結果への影響度(相対感度)、(3)信頼性工学でいうところの最尤限界点に対応する特性入力値や予測式の部分安全率を、典型的な片コア型オフィスビルを対象として分析した結果を報告した。この中で、改良の必要性が高い予測手法を幾つか指摘し、特に避難開始予測が検証法の計算体系において最も不適切な予測式であることを考察した。そこで、避難開始に関する人間行動の実体に即し、かつ避難安全評価体系に組み込むことが可能な避難開始予測手法を開発するために、まず避難開始予測の基本フレームを構築した。このフレームワークを作成することで避難開始の構造を明らかにすると共に、これを用いて避難開始シナリオを策定することが可能であるという実用性を示した。これにより個々の計画案の建物特性を考慮した避難開始手段を計画し、それを避難安全評価に反映することが将来的には可能なる。次に、避難開始に関わる個々の課題を認識した上で、火災が発生してから在館者が異変に気がつくこと(異変感知)を予測することが避難開始予測の基本であると指摘し、煙の発生に伴う在館者の異変感知について、人間の嗅覚・視覚を取り上げた被験者実験を実施した。一連の実験から、被験者(大学生)が異変感知に至る焦げ臭および煙の濃度を調査し、種々の有益な知見を得ると共に、煙の発生に伴う在館者の嗅覚と視覚を対象とした異変感知モデルを提案した。今後、避難開始に関わる他の課題についても在館者モデルと関連する状況変化の予測手法を整備することで避難開始予測手法を構築し、現在の評価体系を大幅に性能指向型に移行できる。
ＮＩＲＳ計測における頭皮血流分布と脳機能成分の検出：脳卒中患者の活動部位同定

近赤外分光法(NIRS)は非侵襲に脳活動に依存した酸素化ヘモグロビン・脱酸素化ヘモグロビンの変化を計測する脳機能計測法である.近年,NIRS計測信号には頭皮血流を由来としたアーチファクトが少なからず混入することが報告されている.そこで本研究は,少数の短距離Probeを配置することにより局所の頭皮血流を計測することで,計測領域全体に重畳する頭皮血流を推定し,NRS信号から頭皮血流成分を除去する手法を提案した.短距離Probeによる計測データから主成分分析により頭皮血流を推定し,一般線形モデルの説明変数として用いることで,頭皮血流アーチファクトを計測信号から除去することが可能となった.本研究は脳機能計測法である近赤外分光法(NIRS)の計測信号に少なからず混入する皮膚血流由来の脳活動以外の成分(アーチファクト)を除去する方法を開発することである.平成25年度は健常成人に加え,軽度から中等度の脳卒中片麻痺患者を対象とし,片手運動時の脳機能を通常のNIRS計測により比較した.健常者の右手運動,左手運動,患者の健側手運動では運動手と対側の大脳半球に優位な脳活動がみられた.一方,麻痺手運動時の脳活動において,麻痺の回復したまたは軽度に麻痺の残った患者の場合には健常者や健側手運動時と同様の対側優位な脳活動がみられたのに対し,中等度に麻痺の残存した患者の場合には両側賦活,同側優位などの様々な異常パタンが観測された.アーチファクトが混入している状態においても,麻痺の程度と脳活動パタンの関係を得ることはでき,NIRSにより脳機能を評価することは可能であったが,他の脳機能計測法に比べると活動領域が広く見積もられ,活動部位の同定精度は比較的低くなった.次に,通常のNIRS計測に加え,皮膚血流成分を計測するためのProbe間距離の短い計測チャンネルを追加配置し,健常者の片手運動時のNIRS計測を行った.通常のNIRS計測データに対してfMRIなどで用いられている重回帰分析を行う際に,説明変数として皮膚血流データを加える解析を行うことで,NIRS特有の皮膚血流成分を除去し得ることが示された.同様の課題をfMRIで計測した脳活動と比較し,活動部位の同定精度は向上した.近赤外分光法(NIRS)は非侵襲に脳活動に依存した酸素化ヘモグロビン・脱酸素化ヘモグロビンの変化を計測する脳機能計測法である.近年,NIRS計測信号には頭皮血流を由来としたアーチファクトが少なからず混入することが報告されている.そこで本研究は,少数の短距離Probeを配置することにより局所の頭皮血流を計測することで,計測領域全体に重畳する頭皮血流を推定し,NRS信号から頭皮血流成分を除去する手法を提案した.短距離Probeによる計測データから主成分分析により頭皮血流を推定し,一般線形モデルの説明変数として用いることで,頭皮血流アーチファクトを計測信号から除去することが可能となった.平成24年度は健常成人を対象とした実験を行った.左運動野近傍に高密度にNIRS計測Probeを配置し,チルトベッドを用いて一定速度で体幹を傾斜させることで定量的な体幹傾斜とNIRS信号に混入するアーチファクトとの関係を評価した.傾斜に依存したNIRS信号(オキシヘモグロビン・デオキシヘモグロビン)の増減が見られることが確認され,また,計測チャネルごと,オキシヘモグロビン・デオキシヘモグロビンそれぞれに特異的なアーチファクトが混入することが示された.更に,通常のNIRS計測Probeペアに対してProbe間距離の短いチャネルのデータを解析に用いることにより(Yamada et al., J Biomed Opt 2009),アーチファクト成分をNIRS信号から除外することで安静レベルと同等のNIRS信号が得られることを実証した.リハビリテーション領域で盛んに用いられている脳機能計測法である機能的近赤外分光法(functional near-infrared spectroscopy; fNIRS)の計測信号には,アーチファクト(脳活動以外の成分)が少なからず混入する.そこで本研究はfNIRSによる脳卒中患者の脳機能計測時に混入しやすいこれらのアーチファクトの除去法を確立することを目的とした.前年度までに健常成人において確立した,片手運動時の脳活動マップから皮膚血流アーチファクトを除去する手法を,最終年度では脳卒中片麻痺患者の麻痺手運動時のデータへ適用した.結果,広範囲に分布しているように評価されてしまっていた活動部位を,運動関連領域の限定された部位に絞り込むことができた.リハビリテーション工学申請時の予定では,提案手法の試行を3年目の本年度に行う予定であったが,既に健常者データにおいて開始することができているため,(1)当初の計画以上に進展している,とした.申請時の予定では,傾斜角とNIRS信号の関係はどのような分布で混入するか,オキシヘモグロビン・デオキシヘモグロビンそれぞれへ頭部傾斜が与える影響を調査することにあり,それらの目的は達成した.ただし,予定では三次元動作解析装置や加速度計のデータとの関係によりアーチファクトを算出することとしていたが,この手法では高精度のアーチファクト除去は難しかったため,Probe間距離の短いチャネルのデータを解析に用いる手法へとアーチファクト除去法を修正した.なお,論文を出すところまでを予定していたが現時点ではアクセプトに至っていないため,(2)おおむね順調に進展している,とした.

健常者においてfMRIと同等の活動部位同定が可能になったため,同様の手法を用いて脳卒中患者の活動領域を正確に評価できるのかどうかを調査する.必要に応じて解析手法に修正を加えていく.健常成人・脳卒中片麻痺患者を対象とし,運動関連領域を広範囲にカバーするよう設計したProbe配置を用い,手指運動時の皮膚血流分布を計測する.主成分分析により高い寄与率の成分を抽出しその分布を同定する.健常者・患者でデータを比較し,脳卒中片麻痺患者に特有の皮膚血流分布が存在するのかを調べる.特に,左右対称性,健常手・麻痺手運動時の差異,麻痺の程度との関係に着目する.当初予定していたソフトウェア(MATLAB)のライセンス購入について,別予算でライセンスを所持できたために,次年度使用額が生じた.別予算で所持できていたソフトウェアのライセンスが昨年度末に切れたため,当初予定していたライセンス購入に当てる.次年度は,論文投稿費・外国語校閲費,論文別刷費,学会誌投稿料などの論文発表費用,旅費・大判ポスター印刷費の学会発表費用のほか,自作の計測関連装具に関する費用を計上した.
肺胞上皮細胞株における水チャンネルの発現とステロイドホルモンによる誘導

肺胞細胞におけるステロイドホルモンによる水チャンネル(AQP-3)の誘導を解明することを目的として研究を行った.ヒト肺胞細胞株(A549Cells)を継代培養し、confluentになったところでdexamethasoneを加え培養した。その後RNAを抽出し、AQP-3のcDNAをprobeに用いてNorthernblotを行った。Dexamethasoneは、10^<-9>から10^<-6>Mの範囲で濃度依存的にAQP-3の発現をup-regulateし、Time courseの実験によりAQP-3の発現はdexamethasoneの刺激後約8時間後にピークを示した。また、転写阻害薬(actinomycinD)によりAQP-3の発現は抑制され、翻訳阻害薬(cycloheximide)によりむしろsuper-induceされることがら、AQP-3はdexamethasoneのprimary response geneであることが示唆された.水の移動(volume flow)については、当初A549 cellsをculture dish内に組み込んだtrans-well上で培養し、trans-well内外で2-4倍の浸透圧差をつけた上でtrans-wellの上層には^<14>C-inulinを加え、濃縮により経時的なradioactivityの上昇を測定することによりvolume flowの指標とすることを検討したが、細胞が完全にtightにならなかったことから指標として用いず、代わりにstopped-flow light-scatteringmethodによる細胞レベルでの水透過性について検討した。これまでの予備実験により、dexamethasone(10^<-7>M)によりA549 cellsの水透過性は1.5-2倍上昇することが示された。
筋トーヌス亢進に対する関節可動域温存によるケア実施時の安楽性に関する検討

拘縮ラットを作成するにあたり、カルプロンフェンRを皮下注射(4mg/kg)で麻酔したWistar系雄ラット(12匹)にプライトン(熱可塑性プラスチックキャスト)とステンレス製の細かな網目の金網を2重巻きにし、最後にワイヤーを巻き、右側足関節を底屈位の状態にした。この方法により、ほとんどはずれることもなく、ラットに齧られることもなく、足関節拘縮モデルを作成することができた。また、今回の実験に関しては、愛知医科大学動物実験委員会の承認(承認番号:2005-53)を受けた。拘縮期間は1週間と2週間、4週間とした。実験期間後、エーテルにより、安楽死をさせた後、両側の下腿三頭筋・前脛骨筋を採取した。ヒラメ筋の一部は10%中性緩衝ホルマリン液で固定後、パラフィン包埋し、マッソン・トリクローム染色を施した。採取したそれぞれの筋組織(下腿三頭筋・前脛骨筋)を液体窒素で冷却したイソペンタン内で急速に凍結固定し、クライオスタット・ミクロトームで10μmの連続切片を作成した。次いでミオシンATPase染色を施し、筋線維のタイプ別に横断面積・構成比を対照群と拘縮群とで比較した。その結果、拘縮群におけるヒラメ筋の横断面積は、固定1週間後で対照群より有意に縮小した。2週間後も縮小したが、4週間後では大きな変化は見られなかった。また、足関節を最大底屈位にすると、下腿三頭筋と前脛骨筋の筋長にどのような変化が起こるか確認中である。今後は、今回の結果を踏まえマッサージによる影響をモデル動物で観察する予定である。筋トーヌス亢進に対する介入を検討する初期段階として、関節拘縮に対する介入(特にアイスマッサージ)についてと、動物に対する実験的関節拘縮作成について文献検討を行った。その結果、今年度はラット膝関節および足関節をギプス固定することで、拘縮モデルを作成することとした。まず、ウイスター系ラットオス7週齢6匹を用いて右後肢の足関節を最大底屈位の状態で相互粘着性弾力性包帯(Coban,3M社)により固定した。それぞれの固定期間は1週間(1匹),2週間(2匹)、4週間(2匹)、1匹は対照群とした。固定期間終了後、ラットを屠殺し両側の後肢を取り出した。その後100%中性緩衝ホルマリン液で組織を固定し、パラフィン包埋を作成した。そして、拘縮を起こした関節がどのように変化したかを関節内外組織で確認するため、アザン染色を行っている。今後、光学顕微鏡下で観察する予定である。なお、今回の実験については、愛知医科大学動物実験委員会の承認(2004-107)を受けた。また、上記の実験と並行して、解剖体(2体)での膝関節の関節包について検討を行った。同時に関節周囲のリンパ、血管、神経の形態学的特徴について肉眼的観察を行った。その結果、関節周囲のリンパ、血管、神経については特徴的構造を認めなかった。関節包については摘出時の操作による影響で明確な結果を得ることができなかった。検証例が少ないこともあり、今後の検証数を増やす予定である。
Bi系酸化物高温超伝導体薄膜の電気的特性への微細構造の影響に関する研究

超伝導デバイスの重要性が高まる高周波での応用においては薄膜の表面抵抗の低いことが重要になるが,臨界温度が高いBi系酸化物超伝導体(BSCCO)は良質な薄膜の作製が困難なため,YBCO薄膜に比べて研究例が少なく,表面抵抗に影響を及ぼす因子についてもよくわかっていない。本研究では高品質BSCCO薄膜作製技術を用い,表面抵抗のより低い薄膜を目指して,2212相および2223相薄膜の表面抵抗と薄膜微細構造の関係に注目し,主にインターグロースの影響について検討した。得られた知見を以下に述べる。1.製膜条件等の薄膜微細構造への影響の評価:製膜条件あるいは熱処理によるインターグロース量,粒塊径などの微細構造の違いを評価し,その可変範囲を把握した。これを基に電気的特性測定用試料を作製した。2.電気的特性の評価および微細構造の影響の検討:表面抵抗,臨界温度,臨界電流密度などの電気的特性を評価した。YBCO薄膜では,表面抵抗が粒界での損失に影響されていることを示唆する,残留表面抵抗の粒径・臨界電流密度積依存性が報告されているが,BSCCO薄膜ではそのような依存性は見られなかった。一方,BSCCOで起こりやすいインターグロースの影響を2212相/2223相インターグロース薄膜について調べたところ,BSCCO薄膜の残留表面抵抗はインターグロース量に依存することがわかった。2223相の割合の増加につれて残留表面抵抗は減少し,2223相単相では0.5mWという低い値が得られた。インターグロース量に対する残留表面抵抗の変化率はインターグロース量が小さい単相付近の領域で大きい。臨界温度,臨界電流密度についても単相付近での変化率が大きく,2223相単相付近で最も高い値を示した。このような変化の一因として,異なる相の間でのキャリア分布の変化が生じて各相のキャリア濃度が変化することが考えられた。
自然免疫系におけるTAK1/MAPKKKの負の制御機構

自然免疫系において重要な役割を果たすToll様受容体(TLR)の多くは、炎症性サイトカインの一つであるIL-1βと類似の機構で細胞内シグナル伝達を行い、MAPKKKファミリーの一つTAK1を介して転写因子NF-κBを活性化する。これらの刺激によるTAK1の活性化は一過的であるが、一旦活性化されたTAK1を速やかに不活性化させる機構は未だ不明である。この機構を明らかにするため、関与する因子の探索および作用機序の解析を行った。まず、精製用タグを融合させたTAK1を安定発現するHeLa細胞株を樹立し、IL-1βで刺激後の細胞からTAK1複合体を精製して質量分析を行った結果、新規TAK1結合タンパク質の候補として、E3ユビキチン(Ub)リガーゼXを同定した。解析の結果、XがTAK1の活性化因子であるTAB1の分解を介してTAK1を負に制御している可能性が示唆された。本研究の成果は、未解明のままになっている自然免疫系におけるTAK1の負の制御機構の理解に貢献するものであり、将来、炎症性サイトカインの過剰産生が問題となる敗血症などの致死的な急性炎症の新たな治療薬の開発につながる重要な知見の一つになると考えられる。また、最近、成人T細胞白血病ウイルスHTLV-1がコードする制御タンパク質TaxがTAK1を活性化することが報告された。われわれは、TAK1のアダプタータンパク質TAB2がTaxによるTAK1の活性化に関与する可能性を考え検討を行った。その結果、TaxがTAB2と複合体を形成してTAK1の活性化を引き起こすこと、TaxによるTAK1の活性化にはTax自身のUb化が必要であり、さらにこれまで不明であった宿主細胞におけるTax E3 Ubリガーゼとして,TRAF2,5,6がその候補になりうることを明らかにした。自然免疫担当細胞であるマクロファージや樹状細胞は,Toll-like Receptors (TLRs)を中心とした微生物認識機構によって活性化され,IL-1やTNFαなどのさまざまな炎症性サイトカインを産生する。MAP3Kファミリーの一つであるTAK1は,これらの炎症性サイトカインやTLRのシグナル伝達経路において必須の役割を果たしており,その活性化機構についてはすでに理解が進んでいるが,刺激によって一旦活性化されたTAK1を速やかに不活性化させる負の制御機構ついては未だ不明な点が多い。本研究では,自然免疫系におけるTAK1の負の制御機構を明らかにすることを目的とし,それに関わる因子の探索を以下の二つの方法で試みている。1)TAK1の活性制御因子は,その活性状態(活性化前,活性化後,不活性化後)に応じて,TAK1と結合あるいは解離することが予想される。そこで,複合型タグ(TAPタグ)を用いて,刺激前後の細胞内からTAK1を含む複合体を精製しそこに含まれるタンパク質を同定する。このために,TAPタグを付したTAK1(TAP-TAK1)の発現プラスミドを構築し,TAP-TAK1が内在性TAK1と同様にIL-1刺激によってリン酸化(=活性化)されることを確認した。また,TAP-TAK1を内在性TAK1と同程度の量で安定発現するHeLa細胞株を樹立した。今後,この細胞株を用いて活性状態の異なるTAP-TAK1複合体を精製し,その構成タンパク質群を同定する。2)既知のTAK1制御因子と直接結合するタンパク質をyeast two-hybrid法を用いてスクリーニングする。

現在までに,E3 Ubiquitinリガーゼやタンパク質分解に関わる因子などが単離されており,TAK1そのものあるいはその制御因子の分解を介した活性制御機構の存在が示唆される。今後,この可能性を生化学的手法を用いて検討する予定である。自然免疫系において重要な役割を果たすToll様受容体(TLR)の多くは、炎症性サイトカインの一つであるIL-1βと類似の機構で細胞内シグナル伝達を行い、MAPKKKファミリーの一つTAKIを介して転写因子NF-κBを活性化する。これらの刺激によるTAK1の活性化は一過的であるが、一旦活性化されたTAK1を速やかに不活性化させる機構は未だ不明である。そこでこの機構を明らかにすることを目的とし、それに関わる因子の探索および作用機序の解析を行った。まず、精製用の複合型タグを融合させたTAK1(TAP-TAK1)発現プラスミドを構築し、TAP-TAK1を安定発現するHeLa細胞株を樹立した。この細胞をIL-1で刺激後、TAK1を含むタンパク質複合体を精製して質量分析を行った結果、新規TAK1結合タンパク質として、E3ユビキチンリガーゼXを同定した。レポーターアッセイを用いた解析の結果、XがTAKIによるNF-κBの活性化を強く抑制すること、またこのとき、TAK1の活性化因子であるTAB1の発現量がX依存的に減少することを見いだした。siRNAでXをノックダウンした細胞では、IL-1刺激後のTAK1の活性(TAB1のバンドシフトを指標に検出)がコントロールsiRNAを導入した細胞よりも高いことがわかった。以上のことから、XはTAB1の分解を介してTAK1を負に制御している可能性があると考えられる。この制御機構はTLRシグナル伝達経路においても同様であると予想される。本研究の成果は、未解明のままになっている自然免疫系におけるTAK1の負の制御機構の理解に貢献するものであり、将来、炎症性サイトカインの過剰産生が問題となる敗血症などの致死的な急性炎症の新たな治療薬の開発につながる重要な知見の一つになると考えられる。
成人T細胞白血病におけるEZH2制御性miRNAの発現解析と臨床応用

EZH2阻害剤DZNepはATL細胞株において低下していたmiRNAであるmiR-181aなどの発現を回復させ、Caspaseの活性化、Annexin陽性細胞の増加などアポトーシスと思われる現象を引き起こした。miR-181aは抗アポトーシス分子であるBCL2 mRNAと結合する可能性が示されており、DZNepによりBCL2のmRNAおよびタンパク発現を抑制することが示された。DZNepによるATL細胞株の細胞増殖抑制はmiR-181aを介したBCL2発現制御により引き起こされていると考えられ、EZH2およびmiRNA発現制御はATLに対する治療標的となる可能性が示された。EZH2(Enhancer of zeste homolog2)はヒストンメチル化酵素活性を有し、ターゲット遺伝子のサイレンシングを介して様々な癌腫において腫瘍の形成や進展に閑所していると報告されており、我々はHTLV-1ウイルス感染により引き起こされる成人T細胞白血病(ATL)においてEZH2が過剰発現し予後と関連することを報告している。またmiRNAの発現異常は様々な癌・腫瘍で認められ、我々の以前の研究でも患者由来ATL細胞ではmiRNA発現が全体的に健常者と比べ低下していることを報告している。今回我々はEZH2の遺伝子サイレンシングが機能性小分子RNAであるmiRNA発現に関わっているかについて検討を行った。まずATL細胞株に対しEZH2阻害剤DZNep (3-deazaneplanosin A)を用いたところCaspaseの活性化、Annexin陽性細胞の増加などapotosisによると思われる細胞株の増殖抑制を示した。またqPCRによりATL患者細胞で発現低下しているmiRNAを調べたところmiR-181aの発現増加が認められた。またアレイ解析およびqPCRによりDZNepはATL細胞株において抗アポトーシス分子であるBCL2の発現抑制が確認され、WebデータべースTargetScanで検索したところmiR-181aはBCL2 mRNAの3'UTR領域に結合サイトが存在することがわかった。以上のことからEZH2は細胞増殖に密接に関わっており、EZH2はmiR-181aを介して抗アポトーシス分子であるBCL2の発現を制御しているものと考えられた。EZH2はヒストンメチル化酵素活性を有するポリコーム蛋白複合体の構成蛋白であり、様々な腫瘍で発現亢進し、腫瘍細胞の増殖に関わっていることが知られている。pan-Histone methyltransferase inhibitorであるDZNepはEZH2を抑制し、ATL細胞株はapoptosisにより細胞死が引き起こされることがわかった。次にDZNep処理によるmRNA発現の網羅的解析を行ったところanti-apoptosisに関与する分子であるBCL2の発現変動が顕著で、タンパクレベルでも発現抑制が確認されたが、BCL2の発現に影響を及ぼすような分子は認められなかったため、miRNAの関与を考えた。そこでDZNepにより、健常者およびATL患者におけるmiRNA発現の網羅的解析からATL患者において発現が抑制されているmiRNAとしてmiR-181aに着目した。ウェブデータベースを用いたmiRNAの標的予測ではmiR-181aはBCL2 mRNAの3'UTR内で2箇所結合する部位があると予想され、DZNepによるBCL2の発現抑制はmiR-181aを介したパスウェイと考えられた。実際にmiRNA変動をtumor suppressor miRNAsアレイおよびqPCRで解析したところmiR-181a発現の回復が引き起こされ、BCL2 mRNA発現の抑制およびタンパクレベルでの抑制が確認された。また他に幾つかのBCL2を標的としたmiRNAの変動が認められたがmiR-181aほどの動きは認められなかった。またmiR-181amimicをATL細胞株へトランスフェクションすることで細胞増殖の抑制が確認された。以上のことよりDZNepによるATL細胞株の細胞増殖抑制はmiRNAによるBCL2抑制により引き起こされていることが強く示唆され、EZH2を標的とした治療はATLに対する新規治療薬としての可能性が示唆された。臨床検査医学EZH2により発現増加するmiRNAおよびmiRNA標的遺伝子の推定まではできている。しかしmiRNAmimicの細胞株への導入による標的遺伝子の発現抑制の確認がまだできていない。理由としてはHTLV-1細胞株へのtransfectionが非常に困難であり、現在様々な遺伝子導入法の検討を行っている。新たに遺伝子導入機器を研究室で購入したためその機器による導入条件を検討中である。条件が整い次第、当該年度に実施する予定であったmiRNAmimicによるmiR標的遺伝子の阻害活性の評価およびEZH2を標的としたsiRNAを導入することでmiR-181aが直接的にEZH2により制御されているかの検証を行う。

当初予定していた平成26年度の計画として挙げていた計画が細胞株に対する遺伝子導入が困難であったため実験計画に遅れが発生した。現在様々な導入法を検討中であり、系が確立次第速やかにmiR-181aの標的mRNA3'UTR領域を組み込んだレポーターベクターとmiRNA模倣分子を細胞株に導入し、ルシフェラーゼアッセイを用いたmiRNAの標的配列阻害活性を評価する。物品費は主に当該研究に必要な各種細胞の培養関連試薬・消耗品、siRNAやmiRNA mimicsなどの合成オリゴ、トランスフェクション試薬の購入などにあてられる。旅費は成果発表のための旅費にとして使用される。
単子葉植物イネを用いた葉の初期発生メカニズムの解明

イネのホメオボックス転写因子OsWOX4は茎頂分裂組織の維持に機能し、葉原基でも発現する(Ohmori et al., Plant Cell, 2013)。本課題ではOsWOX4の葉の初期発生における機能を明らかにすることを目的に研究をおこなった。前年度までに、誘導系のOsWOX4ノックダウン株を用いて、葉の機能解析に適した一過的ノックダウンの系を確立し、OsWOX4がサイトカイニン生合成に機能するLOG遺伝子の発現を制御することで維管束形成に関わることを示唆していた。今年度はサイトカイニン含有量に対するOsWOX4ノックダウンの影響を解析した。その結果、OsWOX4をノックダウンさせることで、サイトカイニン量が顕著に減少することを示した。このことからOsWOX4はLOG遺伝子の発現制御を介して、サイトカイニン生合成を正に制御し、維管束形成に寄与していると考えられた。中肋は葉が直立するために必要な構造である。これまでにDL遺伝子が、葉原基の中央部において細胞分裂を促進し、中肋形成の初期段階が進むことがわかっている。OsWOX4がノックダウンすると、葉原基の葉の中央部特異的な厚み形成がみられなくなり、中央部の向軸ー胚軸方向の細胞数が減少した。また、DLの発現が顕著に減少していた。これらからOsWOX4がノックダウンすると、DLの発現が維持されなくなり、葉原基の形態異常につながったと考えられる。また、前年度までに得ていたマイクロアレイのデーターを用いて、Gene Ontology解析を行った結果、OsWOX4は細胞の活性を保つ機能があることが示唆された。この結果は、テクノビット切片を用いた詳細な解析結果からも支持された。これらから、OsWOX4は茎頂分裂組織の維持に加え、葉の初期発生を多面的に制御する、イネの発生に非常に重要な因子であることを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。OsWOX4はイネの茎頂分裂組織で機能し、葉原基でも発現する。本研究は、OsWOX4に着目し、葉の初期発生を明らかにすることを目的としている。デキサメタゾン(DEX)によりOsWOX4ノックダウンを誘導できる株を用いて解析した。DEX処理により、葉の成長が著しく阻害されたため、切片での観察を行った。その結果、液胞の形態に異常が生じていた。DEX処理により、液胞は大きく歪になり、また、維管束や葉の周縁部など、コントロールでは液胞化が進んでいない部分の細胞でも液胞化が進行した。細胞周期S期とG2/M期のマーカー遺伝子の発現を解析したところ、どちらも、DEX処理により発現が著しく低下していた。これらから、OsWOX4がノックダウンすることで、葉の細胞が正常に制御されなくなっていると考えられた。次に、形態に対する機能を明らかにするため、一過的ノックダウンの系を確立したところ、多面的な表現型が見られた。この中で、細胞分化の解析がしやすい維管束の解析を進めた。DEX処理をした植物では、木部と師部の発達が著しく阻害された。細胞の形態が判断しやすい木部細胞を用いて、組織分化を定量的に解析した。その結果、OsWOX4ノックダウンにより、分化した木部細胞の成長が阻害されると同時に、新たにできる木部細胞の数が減少した。これらから、OsWOX4は維管束における組織分化と、細胞運命の決定に機能していると考えられた。OsWOX4の機能を包括的に理解するため、誘導系株の誘導後3時間、12時間後の植物を用いてトランスクリプトーム解析を行った。個別の発現解析をしていた遺伝子を確認したところ、同様の結果が得られていたことから、信頼性のあるトランスクリプトームデーターであると考えられた。また、3時間後に有意に発現が変動した遺伝子は全て増加していたことから、OsWOX4は転写抑制因子であると考えられた。予定していた形態学的な解析とトランスクリプトーム解析を進めることができた。形態学的な解析では維管束中心に解析を進め、また液胞の形態異常の表現型では細胞周期制御にOsWOX4が機能していることを示した。また、信頼性のあるトランスクリムトームデーターを得ることができた。このデーターは、今後、OsWOX4の機能解析を行うにあたり大変重要な情報源になると考えている。本研究は、OsWOX4に着目し、イネの葉の初期発生を明らかにすることを目的としている。本研究では、誘導系のOsWOX4ノックダウン株を用いて解析を行っている。前年度までに、葉における機能解析に適した、一過的なノックダウンの系を確立し、OsWOX4がイネの葉の発生を多面的に制御することを示していた。今年度は、その中で維管束に重点を置き解析を進めた。細胞の形態が明確な木部細胞に着目したところ、OsWOX4がノックダウンすることで、木部分化が著しく阻害される一方で、維管束のイニシエーション自体は大きく影響されないことが示唆された。そこで次に、OsWOX4が維管束分化のどこに機能しているかを明らかにすることを考えた。

シロイヌナズナの先行研究では維管束発生を制御する経路が提唱されている。そこで、経路に関わる遺伝子のイネのオーソログだと考えられる遺伝子の発現を解析した。In situ hybridizationにより、発現パターンを調べた結果、それらの遺伝子は、イネにおいても維管束で特異的に発現していた。また、OsWOX4を一過的にノックダウンさせた植物において、同様に発現パターンを調べた結果、OsWOX4をノックダウンさせたことで、植物ホルモンであるサイトカイニンに影響を与える遺伝子の発現が著しく低下していることが明らかになった。サイトカイニンは維管束イニシエーション後の維管束発生に役割を持つと考えられる。このため、この遺伝子発現の結果はOsWOX4をノックダウンさせた時に見られる表現型とも一致する。また前年度に行ったトランスクリプトームのデーター解析を進め、OsWOX4の下流因子の有力な候補を得た。現在、その遺伝子の機能の解析を進めており、機能抑制変異体において植物の発生に関わる興味深い表現型を見出している。前年度に明らかにしていた葉におけるOsWOX4の多面的な機能の中で、維管束における機能を詳細に進めることができた。形態的な観察から、OsWOX4は維管束イニシエーション後の維管束発生に役割を持つことが考えられた。また、シロイヌナズナで維管束初期発生に関わる遺伝子のオーソログの発現解析を行い、OsWOX4が発現を制御する遺伝子をつきとめた。シロイヌナズナにおいてOsWOX4のオーソログであるWOX4は確立された維管束メリステムの細胞増殖に機能することが示されている。このことから、イネにおいて、OsWOX4はより早い段階からの維管束発生に機能を持っていることが考えられる。さらにトランスクリプトームのデーター解析から、OsWOX4の下流因子として有力候補を絞り、その候補遺伝子の機能抑制変異体で面白い表現型が出ることを発見することができた。この遺伝子の機能解析を進めることで、OsWOX4がどのように植物の発生を制御しているかを明らかにしていけると考えている。イネのホメオボックス転写因子OsWOX4は茎頂分裂組織の維持に機能し、葉原基でも発現する(Ohmori et al., Plant Cell, 2013)。本課題ではOsWOX4の葉の初期発生における機能を明らかにすることを目的に研究をおこなった。前年度までに、誘導系のOsWOX4ノックダウン株を用いて、葉の機能解析に適した一過的ノックダウンの系を確立し、OsWOX4がサイトカイニン生合成に機能するLOG遺伝子の発現を制御することで維管束形成に関わることを示唆していた。今年度はサイトカイニン含有量に対するOsWOX4ノックダウンの影響を解析した。その結果、OsWOX4をノックダウンさせることで、サイトカイニン量が顕著に減少することを示した。このことからOsWOX4はLOG遺伝子の発現制御を介して、サイトカイニン生合成を正に制御し、維管束形成に寄与していると考えられた。中肋は葉が直立するために必要な構造である。これまでにDL遺伝子が、葉原基の中央部において細胞分裂を促進し、中肋形成の初期段階が進むことがわかっている。OsWOX4がノックダウンすると、葉原基の葉の中央部特異的な厚み形成がみられなくなり、中央部の向軸ー胚軸方向の細胞数が減少した。また、DLの発現が顕著に減少していた。これらからOsWOX4がノックダウンすると、DLの発現が維持されなくなり、葉原基の形態異常につながったと考えられる。
量子ドットプローブを用いたフェニルプロパノイド系抗アミロイド性新素材の分子設計

超高齢社会化が進む中で、アミロイド線維の沈着によって引き起こされる疾病が大きな社会問題となりつつある。本研究では、自然界に普通に分布しているフェニルプロパノイド化合物に着目し、それらに、長さや性質の異なる糖鎖や脂肪酸鎖を付加した複合体ライブラリーを作成し、どのようにすれば抗アミロイド活性を高めることができるかについて検討した。抗アミロイド活性の測定には量子ドットで標識したアミロイド性ペプチドをプローブに用い、さらにハエと線虫を用いた実験も実施した。その結果、リパーゼによってエステル化したフェルラ酸とカフェ酸を新規抗アミロイド性化合物として提案することができた。本研究は,天然に広く分布するフェニルプロパノイドに着目し,それらに,長さや性質の異なる糖鎖や脂肪アルコール鎖を付加した複合体ライブラリーを作成し,量子ドットで蛍光標識したアミロイド性タンパク質をプローブに用いて標的タンパク質固有の抗アミロイド性新素材の分子設計を行うことを目的とした。平成26年度は,まず,酵素合成法によるフェニルプロパノイド複合体の調製を行った。すなわち,市販の桂皮酸及びその誘導体にβグリコシダーゼ及びリパーゼによって長さや性質の異なる糖鎖,脂肪アルコール鎖あるいはその両方を付加することを試みた。その結果,典型的なフェニルプロパノイドの一つであるフェルラ酸のグリコシル化,リポフィル化及びグリコ・リポフィル化に成功した。そこで,次に,これらのフェニルプロパノイド複合体の抗アミロイド活性を簡易・迅速に追跡することができるよう,量子ドットプローブの調製を試みた。プローブの本体には,アミロイドβ(Aβ)及びアポリポプロテインII(apoA-II),ヒト型シスタチン(L68Q),ヒト型ステフィンA及びB(HSA及びHSB)を用いた。まず,Aβ及びapoA-IIは化学的合成法によって,L68Q,HSA及びHSBはピキア酵母発現系によってそれぞれN末側にシステイン残基を付加し,そのシステイン残基にリンカー(sulfo-EMCS)を介して量子ドット(QD-PEG-NH2)を結合させた。こうして作成した量子ドットプローブを用いてグリコシル化フェルラ酸,リポフィル化フェルラ酸,グリコ・リポフィル化フェルラ酸の抗アミロイド効果を調べたところ,リポフィル化及びグリコ・リポフィル化はフェルラ酸の抗アミロイド効果を有意に上昇させることが明らかになった。このことは,チオフラビンT法及び電子顕微鏡観察によっても追認された。本研究は,量子ドットによって蛍光標識化したアミロイド形成探索子(量子ドットプローブ)を創製し,これを用いてフェニルプロパノイドに由来する抗アミロイド性新素材の分子設計を行うことを目的としている。平成26年度の結果を受けて,本年度はフェニルプロパノイド及びその誘導体の抗アミロイド性の構造-機能相関を明らかにする目的で,まずは多様なアミロイド性タンパク質に対して,アミロイド形成状態を高感度かつ定量的に測定することが可能な「ユニバーサル量子ドットプローブ」の開発を試みた。標的アミロイド性タンパク質にはアミロイドβ,アポリポプロテインII,ヒト型シスタチン,ヒト型ステフィンB,インスリン及びリゾチームの6種類を用いた。その結果,量子ドットにCLIVAGDから成るペプチドを付加したもの(LD6)がアミロイド形成のユニバーサルプローブとなり得ることを見出すことができた。そこでLD6の抗アミロイド化合物分子設計の有用性についての検証を行った。すなわち,4-ヒドロキシ安息香酸(4hBA:分子量138.12)を取り上げ,これを基本骨格にしたメチルエステル(4hBA1:分子量152.15),エチルエステル(4hBA2:分子量166.18),プロピルエステル(4hBA3:分子量180.12)及びブチルエステル(4hBA4:分子量194.23)の抗アミロイド効果を調べた。その結果,チオフラビンT法及び電子顕微鏡観察法と同等以上の感度で抗アミロイド効果(4hBA4>4hBA3>4hBA2>4hBA1>4hBA)を確認することができた。また,平成27年度はアミロイドーシス発症モデルハエ(ヒトアミロイドβ42過剰発現ショウジョウバエ)を用いた実験系(1歩行運動能,2寿命,3アミロイドβ発現量,4関連遺伝子群発現量)を確立することができた。平成27年度は多様なアミロイド性タンパク質のアミロイド化をモニターすることができるユニバーサル量子ドットプローブを開発することに成功した。こうして作成したユニバーサルプローブ(LD6)を用いて,フェニルプロパノイドに由来する抗アミロイド化合物創製の分子設計のための実験を実施した。広義のフェニルプロパノイドである4-ヒドロキシ安息香酸及びそのエステルを用いて検証した結果,LD6は従来からのアミロイド測定方法と同等以上の感度でアミロイド化及びその阻害効果を追跡できることが確認された。また平成27年度はアミロイドーシス発症モデルハエ(ヒトアミロイドβ42過剰発現ショウジョウバエ)を用いたアッセイ系を確立することができた。このような成果の上にたって,現在,標的タンパク質固有の優れた抗アミロイド効果を持つ新素材の分子設計を継続し実施中である。本研究はフェニルプロパノイド系抗アミロイド性新素材の創製を目的としたものである。また本研究では、アミロイド形成阻害活性の測定に量子ドットによって蛍光標識化した探索子(量子ドットプローブ)を用いていることを特長としている。平成26年度はアミロイドβ(Aβ)に量子ドットを付加したAβプローブを用いて、グリコシル化及びリポフィル化がフェニルプロパノイド系化合物の抗アミロイド効果に及ぼす影響を調べた。

供試フェニルプロパノイドには桂皮酸及びその誘導体を用いた。βグリコシダーゼ及びリパーゼによってフェニルプロパノイド複合体を調製した。種々検討の結果、至適修飾鎖長があるもののリポフィル化の有効性を確認することができた。平成27年度は多様なアミロイド性タンパク質に対して、アミロイド形成状態を高感度かつ定量的に測定することが可能な「ユニバーサル量子ドットプローブ」の開発を試みた。標的タンパク質にはAβに加えて、アポリポプロテインII、ヒト型シスタチン、ヒト型ステフィンB、インスリン及びリゾチームの6種類を用いた。文献情報を参考にプローブの分子設計を試みた結果、量子ドットにCLIVAGDから成るペプチドを付加したものをユニバーサルプローブLD6として提案することができた(特願2015-126857)。最終年度である平成28年度は、生体系におけるリポフィル化フェニルプロパノイドの効果を中心に検討した。1ヒト神経芽細胞腫由来SK-N-SH細胞及びマウス初代培養ニューロンを用いた神経保護効果、2Aβ過剰発現ショウジョウバエ(GAL4-elav/+, AS-Aβ42/+)の運動能力保持効果、及び3線虫Cenorhabditis elegansの寿命延長効果を調べたところ、フェルラ酸ブチルエステル及びカフェ酸ヘキシルエステルの有効性が示された。超高齢社会化が進む中で、アミロイド線維の沈着によって引き起こされる疾病が大きな社会問題となりつつある。本研究では、自然界に普通に分布しているフェニルプロパノイド化合物に着目し、それらに、長さや性質の異なる糖鎖や脂肪酸鎖を付加した複合体ライブラリーを作成し、どのようにすれば抗アミロイド活性を高めることができるかについて検討した。抗アミロイド活性の測定には量子ドットで標識したアミロイド性ペプチドをプローブに用い、さらにハエと線虫を用いた実験も実施した。その結果、リパーゼによってエステル化したフェルラ酸とカフェ酸を新規抗アミロイド性化合物として提案することができた。平成26年度は,アミロイド性タンパク質のN末端側にシステイン残基を導入することによって量子ドットと結合させることに成功した。こうして作成した量子ドットプローブを用いて,代表的なフェニルプロパノイドであるフェルラ酸のグリコシル化,リポフィル化及びグリコ・リポフィル化複合体の抗アミロイド活性を測定し,リポフィル化及びグリコ・リポフィル化がフェルラ酸の抗アミロイド効果を有意に上昇させることを明らかにした。現在,カフェ酸やクロロゲン酸等,分子の一部にC6-C3構造を持つフェニルプロパノイド化合物に長さの異なる糖鎖や脂肪アルコール鎖を付加して様々なタイプの複合体を調製中である。こうして,当初に掲げた目標どおり,標的タンパク質固有の優れた抗アミロイド効果を持つ新素材の分子設計を継続し実施中である。平成26年度に開始した本研究は,これまでおおむね計画通りに進展している。平成26年度は天然に広く分布しているフェニルプロパノイドのリポフィル化,グリコシル化,及びグリコ・リポフィル化複合体を調製することに成功し,平成27年度はユニバーサル量子ドットプローブLD6の創製に成功している。
ショウジョウバエ視覚系における視神経投射地図の形成機構

ショウジョウバエ視覚系において、各視神経の複眼内での位置とその軸索の投射先の位置は完全に対応している(retinotopy)。このような対応関係を保証する機構を明らかにするため、この過程に関わる遺伝子の機能を解析している。これまでにWntファミリーに属する分泌性蛋白であるDWnt4の役割について研究し、視覚中枢の腹側で発現するDWnt4が視神経軸索によって受け取られ、non-canonical Wntシグナルを介して直接的に軸索走行を制御していることを示した。本年度はretinotopy形成を保証するDWnt4以外の分子を探索した。focal adhesion kinase(FAK)はfocal contactに局在して様々な細胞運動過程を制御することが知られているが、そのショウジョウバエホモログFak56Dの機能はDWnt4と密接に関係していると考えられていた。そこでFak56D変異体の表現型を調べたところ、DWnt4に類似した表現型は見られなかったが、視神経軸索の通り道である眼柄の形態が異常を示し、それによって視神経軸索の束状化が失われたが。この異常は眼柄を構成するグリア細胞のみにおいてFak56Dを発現させることによって回復した。DFak56Dの機能は視神経軸索走行においてはDWnt4と関係していないが、眼柄形成を介して正常な視神経軸索走行に寄与していると考えられる。ショウジョウバエの7種のWntファミリー遺伝子の発現を様々な時期において調べたところ、視神経軸索が投射する以前の早い時期においてはDWnt6が視覚中枢の腹側において発現していることを見出した。また、視神経軸索投射が完了した後の遅い時期においてはDWnt4とDWnt10が視覚中枢のより深部の神経節(medulla)のそれぞれ腹側・背側において特異的に発現していることを見出した。これらの遺伝子発現は視神経軸索およびその周囲に存在する別の神経軸索の走行を制御していると考えられる。今後はこれら腕遺伝子の変異体の表現型をそれぞれの時期において解析していきたいと考えている。昨年度はWntファミリーに属する分泌性蛋白であるDWnt4の役割について重点的に研究し、視覚中枢の腹側で発現するDWnt4が視神経軸索によって受け取られ、non-canonical Wntシグナルを介して直接的に軸索走行を制御していることを示した。本年度は、遺伝学的相互作用の解析からDWnt4による軸索走行においてJNK経路が関与することを明らかにした。また、複眼背側の運命を決定するiroquoisホメオボックス遺伝子群の変異体では背側視神経上にDWnt4が異所的に局在し、視覚中枢の腹側に投射した。しかしDWnt4の受容体をコードするDfrizzled2とiroquoisの二重変異体においてはそのような表現型は抑圧されたため、iroquoisは背側視神経がDWnt4を受容する能力を抑制し、それによって腹側の視神経のみが視覚中枢の腹側に投射するものと考えられた。脊椎動物においてはEph/Ephrinファミリー分子によってretinotopyが制御されることが知られており、ショウジョウバエにおいてもiroquoisやDWnt4以外の様々な遺伝子が関与していると考えられる。DWnt4の脊椎動物ホモログであるWnt9の役割は不明だが、脊椎動物においてはWnt3が背腹軸方向のretinotopyを制御することが最近報告された。脊椎動物と無脊椎動物においてretinotopyの分子機構がどのように保存されているのか、非常に興味深い問題である。

これらの遺伝子発現は視神経軸索およびその周囲に存在する別の神経軸索の走行を制御していると考えられる。今後はこれら腕遺伝子の変異体の表現型をそれぞれの時期において解析していきたいと考えている。
情動・ストレス・意思決定の認知神経科学

心理社会的ストレス下で人がどのような認知を行っているのか、それは人々の意思決定にどのような影響を及ぼしているのかといった問題は、未解明の部分が非常に多い。本研究ではその解明を目的として、脳波(事象関連電位)測定と生理指標測定を用い、皮質における注意・覚醒ないしは行動剃御のメカニズムが、心理社会的ストレス下でどのように変化するのかを観察することを目的とした。研究1では、エラー認知時に生じるエラー関連電位(ERN)と呼ばれる、}像関連電位を指標として用い、その振幅が心理祉会的ストレス下でどのように変化するかを検証した。ストレス指標として同時に唾液中αアミラーゼを測定した。結果、まず心理社会的ストレスによって唾液中αアミラーゼ濃度ならびにERN振幅が心理社会的ストレス下で有意に増大した。しかしながら両者に相関は見られず、皮質における覚醒度と身体的覚醒度で異なる制御メカニズムが存在することが示唆された。研究2、3では、心理社会的ストレス下で、経済学的意思決定課題に対する回答に変化が見られるかを検証した。研究2では、時間割引課題を用い、ストレス指標としては唾液中αアミラーゼを用いた。結果、ストレス反応と時間割引の間に負の相関が観察され、ストレス反応が高い人ほど将来における報酬の価値を大きく割り引くことが分かった。研究3では、心理社会的ストレスが、独裁者ゲームの回答パターンにどのような変化を与えるかを観察した。独裁者ゲームは、他者に対する報酬分配を通じて、社会的交換場面における寛容さを測定する指標と考えられている。ストレス指標としては再びαアミラーゼを用いた。結果、ストレス反応を生じる人(アミラーゼ濃度の上昇が見られた人)は、反応が見られなかった人と比べて有意に報酬を他者に分配することが分かった。心理社会的ストレスによって、他者に対する寛容さが強められた可能性を示唆している。
トロンボモジュリンの抗凝固作用とエンドサイトシスにおける構造・機能相関の解析

トロンボモジュリン(TM)は血管内皮細胞上のトロンビンレセプターで、トロンビンによるプロテインCの活性化におけるコファクターとして機能する。活性化プロテインCは血液凝固第Va因子、第VIIIa因子を分解・失活化し、血液凝固反応を強く制御する生理的に不可欠な蛋白質である。一方、内皮細胞TMはエンドトキシン、TNF、IL-1などのサイトカイン処理により細胞表面から消失すると報告されている。我々は、これまでにヒトTMのcDNAをクローニングし、その推定アミノ酸配列からTM分子内に特徴的な6個の上皮細胞増殖因子(EGF)様ドメインの存在を明らかにした。本科学研究費の補助のもと、TMのEGF様ドメインの役割を明らかにする目的で、site-directed deletionmutagenesisおよび動物細胞発現系を用いて各種リコンビナントTMを作製し、以下の研究成果をあげた。(1)TMのコファクター活性発現にはTM上の6個のEGF様ドメインの中、特に第4、5および6EGF様ドメインが重要である、(2)最低限のコファクター活性の発現には、第4および第5EGF様ドメインが不可欠であり、プロテインCはCa^<2+>を介して第4EGF様ドメインに結合し、トロンビンは第5EGFドメインに結合する、(3)プロテインCのGlaドメインがCa^<2+>を介してTMの第4EGFドメイン上のAsp(349)残基を含む領域に結合する、(4)動脈硬化誘発物質であるホモシステインが血管内皮細胞TMを還元的に変性させて機能を低下させるとともに、TMのmRNA合成を高め、これが異常機能TMの生成につながる可能性があること、などを明らかにし報告してきた。現在、TM遺伝子上の5'側プロモーター領域の単離と構造解析を行い、細胞での発現機構の解析を行っている。今後、これらの研究成果を更に発展させ、TMの内皮細胞でのエンドサイトシス機構をはじめとする発現調節機構を明らかにする予定でいる。トロンボモジュリン(TM)は、血管内皮細胞上のトロンビンレセプタ-で、トロンビンによる血漿抗凝固因子のプロテインC(PC)の活性化促進因子である。TMはまた、トロンビンの凝固促進活性を直接的に阻害する作用もあり、血管内壁上の最も重要な凝固制御因子である。他方、内皮細胞上のTMは、TNFなどのサイトカイン刺激を受けて、細胞表面から消失するが、この理由の1つにエンドサイトシスが考えられている。本研究では、遺伝子工学的、蛋白工学的手法を用いて、TM上のトロンビンおよびPC結合部位の構造を明らかにするとともに、TMのエンドサイトシスに関係するTM分子内の特異的構造を明らかにすることを目的とする。本年度、申請者は次の2点を明らかにした。(1)TM上のトロンビン結合部位の解析:トロンビンはTMの細胞外領域に存在する6個のEGF(上皮成長因子)ドメインのいずれかに結合することが、これまでに明らかにされている。そこで今年度は、これらのEGFドメインのうちのどのドメインにトロンビンが結合するかを明らかにするため、複数のEGFドメインからなるリコンビナント変異蛋白質(例えば、EGF16、EGF45、EGF56蛋白質など)を作製して検討した。その結果、トロンビンはTMのNH_2末端から5番目のEGFドメインに結合することが明らかになった。(2)TM上のPC結合部位の解析:PCはCa^<2+>を介してTMと相互作用し、主にリコンビナントTM蛋白質を用いた研究から第4EGFドメイン内にPC結合部位の存在が示唆されていた。

そこで、TMの第4EGFドメインのAsp(349)をAlaあるいはGluに置換した変異TM蛋白質を作製して検討したところ、Asp→Ala変異でPC結合能は特異的に消失した。この結果からTM上のPC結合部位はAsp(349)と決定した。トロンボモジュリン(TM)は血管内皮細胞上のトロンビンレセプターで、トロンビンによる凝固制御因子プロテインC(PC)の活性化促進因子(コファクター)として機能する。研究代表者らは、これまでにヒトTMcDNAの構造解析から、TMは特徴的な複数のドメイン構造から構成されており、TM分子内に存在する6個の上皮増殖因子(EGF)様ドメインの内、N末端側から第4、第5および第6EGF様ドメインがTMのコファクター活性の発現に重要であること、その内の第4EGF様ドメインにPCがCa^<2+>を介して結合し、トロンビンは第5EGF様ドメインに結合することを報告した。また、TM遺伝子の発現が各種サイトカインやc-AMPなどで制御調節されていることを報告した。本年度は、以下の研究を目的とした。(1)TMの第4EGF様ドメイン内のアミノ酸を変異させた改変型TMを作製し、PCの活性化能に及ぼす影響の検討。(2)動脈硬化促進因子の一つホモシステインの内皮細胞TMの発現に及ぼす影響。(3)TM遺伝子の発現調節機構の解析のためTM遺伝子の5'上流のプロモーター領域を単離し構造を解析する。結果:(1)TMの第4EGF様ドメイン内のAsp349をAlaに改変したTM(DA)およびAsp349をGluに改変したTM(DE)を作製し、TM存在下でのCa^<2+>依存性のPCの活性化能を検討した結果、TM(DA)では野生型TMと異なり、Ca^<2+>依存性のPC活性化能が消失したが、TM(DE)には野生型TMと同様のPC活性化能が認められ、TMの第4EGFドメインのAsp349近傍にCa^<2+>を介したPC結合部位の存在が示唆された。(2)ホモシステインは内皮細胞表面TMを失活化し、TMmRNAの発現を促進して機能異常TMを細胞表面に発現することを明らかにした。(3)TM遺伝子のプロモーター領域を単離し、この領域の構造と遺伝子発現の関係を解析している。また、最終年度にあたり本研究を総括した。