hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エストロゲンの非遺伝子作用を担うアロマターゼの翻訳後二段階調節機構

本研究ではエストロゲンの非遺伝子作用を担うアロマターゼの翻訳後修飾による急激な発現調節機構を研究する。アロマターゼは細胞内キナーゼ及びホスファターゼによるリン酸化・脱リン酸化により急激な活性、さらに分解調節を受けていることが、再構成系及び阻害剤、siRNAによるノックダウン実験により明らかになった。急速な刺激応答に関わる神経細胞でもグルタミン酸刺激での活性及び酵素量低下、ノルアドレナリン、セロトニン、GABA刺激での活性亢進などを確認した。分解機構にはリン酸化によるユビキチン化、プロテアソーム分解系が関与することを明らかにした。エストロゲンには核内受容体を介する遺伝子作用と膜受容体を介する非遺伝子作用が報告されている。エストロゲンの遺伝子作用については多くの研究によりその詳細な機構が解明されつつあるが、エストロゲンの非遺伝子作用に関しては、短時間の生理反応であり、エストロゲン生成・刺激に関わる調節機構は不明である。急速なエストロゲン供給は、アロマターゼ遺伝子の転写誘導によるエストロゲン合成能の増加では時間的に無理がある。本研究は、こうしたエストロゲンの速やかな合成調節を可能にするアロマターゼ活性の活性化・不活性機構に焦点を当てて、アロマターゼの翻訳後調節について、タンパク質修飾の実態の解析、さらに翻訳後修飾と活性調節の関係を細胞培養レベル及びin vitro再構成系での解析を目指す。平成25年度の研究では、アロマターゼ遺伝子(野性型及びFLAG/Mycタグ付加型)を安定導入した胎盤由来JEG3細胞及び神経細胞由来N38細胞株を作成し、細胞内アロマターゼの酵素活性及びタンパク質量に対するリン酸化・脱リン酸化酵素による制御を確認した。その結果、アロマターゼはリン酸化により二相性に調節されていること、すなわちリン酸化10ー20分で急激に活性を消失していき、それに続いて1ー2時間で酵素タンパク質の分解が進むことが明らかになった。この反応には細胞質の存在が必要であり、細胞内カルシウムシグナル伝達に依存したカルモジュリン依存性キナーゼIIとカルシニューリンがアロマターゼの活性及びタンパク質分解速度に大きく関与していることが明らかになった。実際にリン酸化キナーゼの精製標品を用いて精製アロマターゼをin vitroでリン酸化させ、LC/MS/MS分析によりアロマターゼのリン酸化部位を部分的に同定したが複数個所のリン酸化部位が明らかになった。昨年までの研究でアロマターゼ遺伝子(野性型及びFLAG/Mycタグ付加型)を安定導入したJEG3細胞及びN38神経細胞株を作成し、細胞内アロマターゼの酵素活性及びタンパク質量に対するリン酸化・脱リン酸化酵素による制御を確認した。平成26年度は同定されたリン酸化キナーゼ、CaMKIIの精製標品を用いて精製アロマターゼをin vitroでリン酸化させ、LC/MS/MS分析によりアロマターゼのリン酸化部位の同定を試みたが、明確なリン酸化部位を決定することは出来なかった。そこで、アロマターゼ分子への部位特異的変異導入によりリン酸化部位を潰し、酵素活性及び酵素タンパク質の制御及に関与する部位の同定を進めた。しかしやはり大腸菌を使用した一過性発現系では明確なリン酸化部位は決定出来なかった。Phos-Tag系による解析やリン酸化抗体を使用した解析では明らかにアロマターゼ分子のリン酸化が確認されているので、現在、部位特異的変異アロマターゼの安定発現系を構築して、解析を進行中である。またエストロゲンの非遺伝子作用の最大のターゲット組織である神経細胞におけるアロマターゼの翻訳後調節機構もさらに調べた。アロマターゼ遺伝子を安定導入したマウス視床下部神経細胞由来N38細胞は神経伝達物質やNMDA等によるカルシウムシグナル伝達経路を活性化した時に活性低下を観察した。一方、GABA誘導体のGabapentinでは活性低下が抑えられた。アロマターゼタンパク質の安定性は、小胞体ストレスによって安定性が著しく低下し、プロテアソームによる分解が亢進することも明らかにした。本年度は多くの生理活性分子の制御下、生殖行動などの短期的応答に関与するニューロエストロゲン産生を担うアロマターゼ(AROM)の急速な活性制御に注目してさらに研究を進めた。マウス視床下部神経由来のN38細胞を用い、神経伝達物質によってカルシウムシグナル伝達経路を活性化した場合、神経内アロマターゼの活性に急激な影響を及ぼした。AROM活性は酵素のリン酸化修飾と共にNMDA/グルタミン酸濃度依存的に5ー10分で大幅に低下した。このリン酸化はAROM活性のみでなくAROM蛋白質の安定性低下により細胞内AROM蛋白量を減少させた。このAROM活性の低下はガバペンチンやニカルジピンで阻害、逆に活性化さえ引き起こした。またアセチルコリンやセロトニン等の神経伝達物質、GnIHやキスペプチン等の生理活性神経ペプチドはAROMの活性化を引き起こした。こうしたAROM活性の調節にはリン酸化・脱リン酸化が伴っており、複数の調節因子によるニューロエストロゲンの産生調節機構が示唆された。神経細胞N38のAROMの分解はプロテアソーム阻害剤であるMG132で著しく阻害され、ユビキチン化機構の関与も示唆された。神経細胞内でのAROM蛋白質の半減期が他組織・細胞とは異なり、2時間程度と非常に短いことを見出しており、AROMの分解がUBE2R2・CHIPによるユビキチン化の後にプロテアソームによって進行する事、さらに分解速度の調節が、カルシウムシグナル依存的なAROMのリン酸化修飾と小胞体局在のシャペロンタンパク質GRP94によってなされる事が明らかになった。

現在までの研究でアロマターゼ(AROM)強発現細胞株のJEG3細胞を用いて、翻訳後のリン酸化・脱リン酸化で短期的には可逆的活性調節、長期的には不可逆的な蛋白質分解によるAROMの翻訳後二段階調節機構を明らかにしてきた。その活性調節に関わる一次メッセンジャーとしての調節因子、細胞内リン酸化酵素及び脱リン酸化酵素も明らかにしてきた。また蛋白質分解に関与するユビキチン酵素群やプロテアソーム系についても同定することが出来た。本年度から解析の対象を絞った視床下部・視索前野の神経細胞AROMによる急速なエストロゲン産生制御とそれによって応答・発揮される性行動を中心とした生理機能との相関は頻繁に報告されているが、その実態は明確になっていない。本年度までに神経細胞AROM活性を正・負に制御に関与する神経伝達物質・生理活性物質を明らかにすることが出来た。その結果、従来から報告のある性行動を制御するGnIH、ペプスタチンなどの神経ペプチドや種々の神経伝達物質によるAROMのリン酸化・脱リン酸化と活性調節、性行動の発露との関係も明らかにすることが出来ている。アロマターゼの翻訳後修飾による活性調節は迅速にエストロゲン合成量を変化させ得るため、即時性の反応を発揮するエストロゲンの非遺伝子作用の基盤として重要である。そこでマウス視床下部神経由来のN38細胞を用いて神経伝達物質のアロマターゼ活性に対する効果を調べた。グルタミン酸/NMDAによってアロマターゼ活性は5分以内に急速に低下した。一方、ノルアドレナリン、セロトニン、GABAは5分以内に急速な活性増加を誘導した。この急速な活性の増減はリン酸化阻害薬により阻止できることよりリン酸化による調節が示唆された。詳細な解析の結果、アロマターゼ活性はリン酸化により二段階調節されており、先ずアロマターゼはリン酸化により数分以内に酵素活性を低下させる。その後、数時間後にはアロマターゼ蛋白質の安定性低下により細胞内アロマターゼ蛋白含量を減少させる事が明らかになった。性行動誘発への関与が疑われるGnIHやキスペプチン等の生理活性神経ペプチドもアロマターゼの活性化を引き起こした。脳内アロマターゼ活性の調節にはリン酸化・脱リン酸化が伴っており、複数の調節因子によるニューロエストロゲンの産生調節機構が示唆された。神経細胞N38のアロマターゼの分解はプロテアソーム阻害剤であるMG132で著しく阻害され、ユビキチン化機構の関与も示唆された。神経細胞内でのアロマターゼ蛋白質の半減期が他組織・細胞とは異なり、2時間程度と非常に短く、アロマターゼの分解がUBE2R2・CHIPによるユビキチン化の後にプロテアソームによって進行する事、さらに分解速度の調節が、アロマターゼのリン酸化修飾と小胞体局在のシャペロンタンパク質GPR94によってなされる事が明らかになった。アロマターゼの活性調節に関与するリン酸化/脱リン酸化部位については、リン酸化部位候補の部位特異的変異導入により同定を進めている。本研究ではエストロゲンの非遺伝子作用を担うアロマターゼの翻訳後修飾による急激な発現調節機構を研究する。
拡散テンソルMRIの歯科臨床への応用：下歯槽神経と咀嚼筋の新しい画像診断法の開発

本研究は拡散テンソルMRI (DTI)や拡散強調MRI(DWI)などのMRI機能画像を利用して、下歯槽神経や咀嚼筋の定量的画像診断法を開発することを目的とした。得られた研究成果は以下のとおりであった。なおいずれの研究も本学倫理審査委員会の承認を得て実施された。1)健常者を対象として下歯槽神経のDTIを行った結果、同神経のFA値およびADC値が明らかとなった。またトラクトグラフィーにより、76%の症例で神経繊維の可視化が可能であった。2)顎関節症患者を対象として外側翼突筋のIVIM解析を行った結果、f値の上昇は、下頭よりも関節円板に直接付着する上頭において著明であることが明らかとなった。拡散テンソルMRI (Diffusion Tensor Imaging, DTI)は、生体内水分子の拡散の異方性を解析するMRIの手法である。神経や筋ではその線維束の方向に沿った異方性拡散が見られることが知られており、DTIを利用して、その線維構造を可視化することもできる。DTIはこれまで主に中枢神経領域の診断に利用されてきたが、近年、末梢神経の軸索の損傷や骨格筋構造の変化をDTIのパラメーターの変化として検出できることが報告され、今後の臨床応用が期待されている。本研究は、DTIを歯科臨床に応用し、下歯槽神経や咀嚼筋の損傷や回復を評価するための新しい画像診断法を開発することを目的とした。当該年度においては、本学倫理審査委員会の承認のもと、健常ボランティアを対象として下歯槽神経線維を直接描出するためのDTIの最適化を行い、その妥当性を評価した。得られた結果は以下のとおりであった。1) DTI撮像法としては、スピンエコー系シングルショットエコープラナー(SS-EPI)法が最も優れていると考えられた。最適な撮像パラメータについて実験的に検討し、TR/TE/TI= 1500/80/250 msec、スライス厚= 1.8mm: gaplessとし、パラレルイメージング(GRAPPA)を併用することとした。また双極磁場勾配(MPG)は12軸、b値:0, 600s/mm2とした。以上のDTI撮像法の撮像時間は11分30秒であった。2)上記の撮像法を48名の健常ボランティアに適用した。下歯槽神経描出のためにはSiemens社製Advanced Visualization Systemを用い、FA閾値: 0.2,角度閾値: 40°,最小長さ: 35mmと設定した。その結果、96側中の87側(91%)において、下歯槽神経を直接描出することができた。拡散テンソルMRI (Diffusion Tensor Imaging, DTI)は、生体内に存在する水分子の拡散異方性を解析する機能的MRIの手法である。DTIはこれまで主に中枢神経領域の診断や研究に利用されてきたが、最近では末梢神経の軸索の損傷をDTIのパラメーターの変化として客観的に評価できることが報告され、今後の臨床応用が期待されている。本研究は、DTIを歯科臨床に応用し、下歯槽神経の損傷や回復を評価するための新しいMRI画像診断法を開発することを目的とした。前年度においては、下歯槽神経を対象としたDTI撮像法の最適化を行い、同神経の走行を可視化することに成功した。当該年度は更に撮像法および解析法の最適化をはかると共に、拡散異方性のパラメーターの1つであるFA値(fractional anisotrophy)を用いて健常者における下歯槽神経の定量的評価を行い、その結果を国際学会において報告した。当該年度における主な研究成果は以下のとおりである。1.下歯槽神経の定量的評価を行う目的で、DTI上で同神経に関心領域(ROI)を設定し、健常者における下歯槽神経のFA値を求めた。ROIの大きさは6.276.90 [平方mm]であり、解析ソフトウェアとしてMR Neuro 3D Engine (Siemens)を用いた。その結果、FA値の平均値は0.404から0.454の範囲にあり、同値の個体差は大きくないことが示唆された。2. DTIによる下歯槽神経可視化の信頼性を評価する目的で、3D T1強調像(MPRAGE)とのfusion imageを作成した。その結果、神経線維が良好に描出されていた49例の全例において、同線維と下顎管との位置は完全に一致していることが示された。上記のように、現在までに、DTIを用いることによって下歯槽神経の可視化およびFA値を用いた定量的評価が可能であることを明らかにし、これらの成果を国際学会等において報告することができた。したがって当該年度までの目標はおおむね達成されたと考えている。拡散テンソルMRI (Diffusion Tensor Imaging, DTI)は、生体内に存在する水分子の拡散異方性を解析するMRIの手法である。MRIはこれまで主に中枢神経領域の診断に利用されてきたが、最近では末梢神経の損傷をDTIのパラメータの変化としてとらえられることが報告され、今後の臨床応用が期待されている。本研究は、DTIを歯科臨床に応用し、下歯槽神経の損傷や回復を評価するための新しいMRI画像診断法を開発することを目的としている。

前年度においては、当施設倫理審査委員会の承認のもと、健常者を研究対象者として、下歯槽神経のFA値(Fractional Anisotrophy)を計測するることに成功した。今年度は、研究対象者を更に増やして解析を行い、その成果を国際誌に発表することができた。主な研究成果は以下のとおりであった。1) 46名92側のすべての下歯槽神経について、FA mapが得られ、任意の部位のFA値を計測することができた。2)同一被験者の左右の下歯槽神経のFA値には、測定部位にかかわらず、有意差は認められなかった。3)同一被験者の同側3部位間の下歯槽神経のFA値には、有意差は認められなかった。4)トラクトグラフィーを行った結果、92側中70側(76%)において、下歯槽神経が全体的もしくは部分的に描出され、神経線維束の可視化が可能であった。以上の結果から、下歯槽神経のFA値を反対側(正常側)と比較することによって、歯科治療の合併症として生じる下歯槽神経損傷の定量的な評価が可能になることが期待された。上記のように、今年度は研究成果を原著論文として国際誌に発表することができた。すなわち今年度の目標を達成したことから、当該研究は順調に進展していると評価できる。拡散テンソルMRI (Diffusion Tensor Imaging, DTI)は、生体内に存在する水分子の拡散異方性を解析するMRIの手法である。本研究は、DTIを歯科臨床に応用し、下歯槽神経や咀嚼筋の損傷や回復を評価するための新しいMRI画像診断法を開発することを目的としている。我々はH28年度までに、DTIを下歯槽神経の診断に応用し、健常者における下歯槽神経のFA値(Fractional Anisotrophy)をはじめて明らかにした。H29年度はDTIと関連するIVIM (intravoxel incoherent motion)解析を応用して、顎関節症患者における咀嚼筋損傷の定量的評価を試みた。すなわち本学倫理審査委員会の承認のもと、顎関節症患者の外側翼突筋部の水分子の拡散および灌流をIVIM解析によって評価し、顎関節部MRI所見との関連を明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、非復位性関節円板前方転位を伴う患者群では円板位置異常のない患者群と比較して、外側翼突筋の上頭においてIVIMのf値(灌流値)が有意に増加することが明らかとなった。一方で同筋の下頭ではf値に有意差を認めなかったが、これは上頭のみが顎関節円板に付着しているという顎関節の解剖学的構造によるものと考えられた。更に下顎頭変形を認めた群では上頭、下頭ともにD値(拡散値)の有意な上昇が見られたが、これは下顎頭変形によって筋の機能低下や萎縮が生じ、その結果外側翼突筋内の細胞外間隙が拡大して細胞外水拡散が増加したためと考えられた。これらの研究成果について、国際誌にて報告を行った。本研究は拡散テンソルMRI (DTI)や拡散強調MRI(DWI)などのMRI機能画像を利用して、下歯槽神経や咀嚼筋の定量的画像診断法を開発することを目的とした。得られた研究成果は以下のとおりであった。なおいずれの研究も本学倫理審査委員会の承認を得て実施された。1)健常者を対象として下歯槽神経のDTIを行った結果、同神経のFA値およびADC値が明らかとなった。またトラクトグラフィーにより、76%の症例で神経繊維の可視化が可能であった。2)顎関節症患者を対象として外側翼突筋のIVIM解析を行った結果、f値の上昇は、下頭よりも関節円板に直接付着する上頭において著明であることが明らかとなった。
心血管疾患発症予防を目的とした中性脂肪の治療目標値の推定

脳心血管疾患は日本人の死因の約25%を占め、発症すると重篤な障害や死亡につながるためその予防は切実な課題である。LDLコレステロールは心血管疾患発症の危険因子として確立しているが、LDLコレステロールに対する薬物治療を行っても心血管疾患発症リスクが残存する。これまでの研究で中性脂肪が心血管疾患発症の危険因子であることが示唆され、中性脂肪は脂質異常症治療の次のターゲットとして注目されている。本研究は、1中性脂肪と心血管疾患発症リスクの調査、2動脈硬化マーカーによる心血管疾患発症リスクが増大する閾値の解析、を通じて心血管疾患の発症を抑制するための中性脂肪の目標値を明らかにすることを目的としている。
無力性口唇の鑑別法と口唇の筋訓練の客観的評価について

本研究では客観的に口唇機能を評価し,矯正治療,あるいは外科矯正治療前後の舌,口唇等の口腔周囲軟組織,および咀嚼筋の活動の相互関係を検討し,形態の改善がどのような機能の変化をもたらすのかを明かにした。〈被験者〉無力性口唇を有する上顎前突と骨格性開咬,および骨格性反対咬合者と,無力性口唇を有さない骨格性反対咬合者を選択し,治療開始時,動的治療完了時,保定時,保定後1年に口唇と咀嚼筋の筋活動を評価した。〈方法〉眼耳平面と床を平行にしデンタルチェア-に座った被験者で,上口唇については左右対称に,下口唇については下唇下制筋とオトガイ筋の走行に平行に,さらに左咬筋前腹と側頭筋にそれぞれ一対の表面電極を2.0cmの間隔で貼付し,口唇を閉鎖,および離開した安静時と口唇を閉鎖および離開してクレンチングした時の口輪筋,下口唇,側頭筋,および咬筋の筋活動をそれぞれ15秒間記録した。計測した電気信号は筋電図用アンプで増幅し,AD変換後(AD Instruments社,MacLab/8) 400Hzでサンプリングしマイクロコンピュータ(マッキントッシュ・パワーブック5300CS)に記録し,解析用ソフト(MacLab/8S)によって最大筋活動値,および筋活動積分値を算出した。〈結果〉無力性口唇は,上顎前突者では下顎骨の成長とoverjetの減少に伴って改善する傾向が見られたが,完全な治癒は見られなかった。骨性正反対咬合者では外科的矯正治療を行ったが,無力性口唇は改善されなかった.骨格性開咬では無力性口唇はすべて改善されていた。一方,初診時に無力性口唇を有する不正咬合者では,クレンチング時に口唇の活動が減少したが,無力性口唇の改善と共に増加する傾向にあった。以上より,無力性口唇は歯列咬合,および顎顔面の形態異常の改善によっても回復しないものがあることがわかった。また,無力性口唇と咀嚼筋の活動に深い関係があることがわかった。さらに,形態の改善によっても回復しない無力性口唇について筋訓練の必要性が示唆された。本研究の第一の目的として口唇の閉鎖・離開によって生じるオトガイ筋の筋活動の差によっての無力性口唇の客観的判定を行った。第二の目的として,口唇の筋活動と切歯の位置,および顎顔面骨格形態との関係を検討した。被験者には,正被蓋者群に47名,逆被蓋群に骨格性下顎前突16名,開咬群に17名を選択した。逆被蓋群,開咬群いずれも外科矯正治療の適応症例である。口輪筋,オトガイ筋,下唇下制筋,咬筋に表面電極を貼付し,口唇閉鎖時と離開時(15秒間)の筋活動を記録し積分値の平均を出し,口唇閉鎖時の平均活動量(EM1)から口唇離開時の平均活動量(EM2)を差し引き,オトガイ

筋の筋活動の差(EM1-EM2)が正の値を示したものを無力性口唇群群(incompetent lips)とし,負の値を示したものをcompeteny lips群とした。1.口唇閉鎖機能に関して,オトガイ筋の活動は下唇下制筋より敏感であり,口輪筋とは拮抗していたので本研究ではオトガイ筋の活動を用いて口唇の機能を鑑別することにした。上下切歯,および骨格の前後的不調和のほかに,顎骨の垂直的不調和が無力性口唇の原因となることが本研究で明かになった。しかし,顎骨の垂直的な不調和との関係は未だ説明されていない。また,歯列および骨格の不調和が改善されると無力性口唇が改善されるのかは不明である。当初の目的通り,クレンチング時の口唇の筋活動をさらに計測分析すると共に,被験者の治療後のデータ収集分析によってこれらを解明する予定である。本研究では客観的に口唇機能を評価し,矯正治療,あるいは外科矯正治療前後の舌,口唇等の口腔周囲軟組織,および咀嚼筋の活動の相互関係を検討し,形態の改善がどのような機能の変化をもたらすのかを明かにした。被験者無力性口唇を有する上顎前突と骨格性開咬,および骨格性反対咬合者と,無力性口唇を有さない骨格性反対咬合者を選択し,治療開始時,動的治療完了時,保定時、保定後1年に口唇と咀嚼筋の筋活動を評価した。方法眼耳平面と床を平行にしデンタルチェア-に座った被験者で,上口唇については左右対称に,下口唇については下唇下制筋とオトガイ筋の走行に平行に,さらに左咬筋前腹と側頭筋にそれぞれ一対の表面電極を2.0cmの間隔で貼付し,口唇を閉鎖,および離開した安静時と口唇を閉鎖および離開してクレンチングした時の口輪筋、下口唇,側頭筋,および咬筋の筋活動をそれぞれ15秒間記録した。計測した電気信号は筋電図用アンプで増幅し,AD変換後(AD Instruments社,MacLab/8)400Hzでサンプリングしマイクロコンピュータ(マッキントッシュ・パワーブック5300CS)に記録し,解析用ソフト(MacLab/8S)によって最大筋活動値,および筋活動積分値を算出した。結果無力性口唇は,上顎前突者では下顎骨の成長とoverjetの減少に伴って改善する傾向が見られたが,完全な治癒は見られなかった。骨格性反対咬合者では外科的矯正治療を行ったが,無力性口唇は改善されなかった.骨格性開咬では無力性口唇はすべて改善されていた。一方,初診時に無力性口唇を有する不正咬合者では,クレンチング時に口唇の活動が減少したが,無力性口唇の改善と共に増加する傾向にあった。以上より,無力性口唇は歯列咬合,および顎顔面の形態異常の改善によっても回復しないものがあることがわかった。また,無力性口唇と咀嚼筋の活動に深い関係があることがわかった。さらに、形態の改善によっても回復しない無力性口唇について筋訓練の必要性が示唆された。
MRIアーチファクトを相殺する反磁性被覆材の新規開発

磁気共鳴画像(MRI)において、生体内金属による磁化率アーチファクトは大きな問題である。本研究では、歯科臨床における対応策として、口腔内の金属材料を二次的に反磁性材料で被覆することで、アーチファクトの低減を図る新手法(反磁性被覆材)を提案し、その効果について検証を行った。歯科矯正用メタルブラケットを反磁性被覆材で被覆した「反磁性被覆材モデル」を作製してMRI撮像を行い、アーチファクトを三次元画像解析により評価した。その結果、反磁性被覆材の使用により、アーチファクトの形状・発生方向が中和され、到達距離や体積にも減少が認められた。本手法は磁化率アーチファクトの低減に有効であることが示唆された。磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging: MRI)において、生体内金属による磁化率アーチファクトは大きな問題である。とくに口腔内の歯列矯正装置や金属製補綴物によるアーチファクトは脳にまで及び診断に影響を及ぼす。近年、低磁性金属材料の開発が進められるようになったが、歯科臨床への応用にはまだ遠く、当面は既存の金属材料が装着されている患者への対応策を検討する必要がある。そこで本研究では、口腔内が生体内埋入材料と異なり直接アプローチ可能である点に着目した。常磁性材料と反磁性材料の複合化の概念を応用し、口腔内の金属材料を二次的に反磁性材料で被覆することで、アーチファクトの低減を図る新手法(反磁性被覆材)を提案し、その効果について検証を行った。まず矯正用メタルブラケットを反磁性被覆材にて被覆した「反磁性被覆材モデル」を作製した。反磁性被覆材として、反磁性を示すグラファイト粉末を歯科用アルジネート印象材に混合したものを考案したが、研究期間を通じて使用する製品やその配合について検討を行い、より強い反磁性の獲得と操作性の向上が得られるよう改良を加えた。続けて「反磁性被覆材モデル」のMRI撮像を行い、反磁性被覆材によるアーチファクトの低減効果を検証した。アーチファクトの形状・発生方向を観察するとともに、磁場方向における試料中心からの最大到達距離を計測した。さらに三次元画像解析によりアーチファクトの体積を算出し、定量的な評価を行った。従って、常時性・反磁性材料の二次的な複合化でもアーチファクトの低減は可能であることが明らかとなった。本研究が完成した際には、簡便なアーチファクト対策として広く普及する可能性があり、今後の展開が大いに期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。矯正歯科26年度が最終年度であるため、記入しない。
未分化間葉景幹細胞を用いた脂肪細胞分化の分子機構の解明と医学応用

脂肪細胞は軟骨細胞や骨芽細胞と同様に中胚葉多能性幹細胞から間葉系幹細胞、脂肪芽細胞、前駆脂肪細胞を経て分化するとされているが、その実体には不明点が多い。本研究では、脂肪細胞の初期分化の分子機構の解明に向けて、軟骨形成不全症のモデルマウスである機能獲得型変異FGFR3軟骨特異的過剰発現トランスジェニックマウス(FGFR3-Ach-Tg)を用いて、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の軟骨細胞の増殖・分化における機能的意義を検討した。軟骨特異的にCNPを過剰発現するトランスジェニックマウス(CNP-Tg)をFGFR3-Ach-Tgと交配させることにより、成長板軟骨にCNPを過剰発現するFGFR3-Ach-Tg (CNP/FGFR3-Ach-Tg)を作製した。FGFR3-Ach-Tgにおける吻臀長の伸長抑制はCNP/FGFR3-Ach-Tgにおいて著しく改善し、野生型マウスとほぼ同程度まで回復した。また、内軟骨性骨化により形成される四肢長管骨及び椎骨の伸長抑制も改善した。組織学的にも、FGFR3-Ach-Tgにおける成長板軟骨の短縮はCNP-Tg/FGFR3-Ach-Tgにおいて改善し、増殖・前肥大化軟骨細胞層の細胞間基質、肥大化軟骨細胞層の増大を認めた。マウス胎仔培養脛骨においてFGF2を添加することによりMAPKのリン酸化の亢進が認められたが、CNPあるいはそのセカンドメッセンジャーであるcGMPにより抑制された。MAPK系阻害剤であるPD98059は野生型あるいはFGFR3-Ach-Tgの培養脛骨の伸長を同程度に促進した。
分子アーキテクトニクスの土台となるヘテロシステムの構築と量子物性の探索

分子ー電極からなるヘテロシステムにおいて、分子スピンと電極電子系が織りなす量子物性を探索した。金表面における金属フタロシアニン分子について、トンネル顕微鏡(STM)を用いた分子操作により近藤効果とスピン軌道相互作用における量子相転移を制御することを実現した。ヘテロシステムの電極として有望である2次元トポロジカル絶縁体の候補であるシリセンやワイル半金属の候補である遷移金属カルコゲナイドMoTe2やWTe2の原子構造と電子状態を明らかにした。また、レーザー光電子分光を使って非占有の表面状態についてスピン分裂やスピンテクスチャを明らかにした。(1)鉄フタロシアニン分子の磁性と電子状態:Ag(100)、(110)、(111)基板上での鉄フタロシアニンの吸着構造と磁性に着目した電子状態をSTSおよびIETSにより調べた。1層目の吸着構造は、基板の対称性にかかわらず、分子の対称性を反映したと思われる正方格子を組む。いっぽう、2層目分子の数が少ない場合には、基板の対処性を反映したと思われるナノ構造が観察された。Ag(100)では、9個の分子から構成される3x3サイズの正方格子が、規則的にならんだ構造が観察された。Ag(110)では、アスペクト比の大きな1次元ナノ構造体の周期構造が観察された。Ag(111)では、そのような特徴的な構造は観察されなかった。(2)A02班の石田グループとの共同研究:Ag(111)上のシリセンの電子状態に関して、基板の電子状態を半無限系で扱える手法を用いて解析を行った。スラブ模型で得られた結果と概ね良く一致する結果が得られた。(3)ヘテロシステム合成システムの構築:ヘテロシステム合成/探索するための超高真空システムの設計と建設を行った。超高真空システムは、試料導入室と蒸着等のヘテロ系合成を行う試料処理室との2室構成になっている。試料処理室は、イオンポンプとターボ分子ポンプからなる排気系、試料加熱ステージ、蒸着源、表面分析のための高速反射電子回折装置(RHEED)からなる。組上げて真空排気をおこない、ヘテロ系の構築をおこなう準備が整ったといえる。また、RHEEDの回折スポットの時間変化を追跡するために、高感度カメラと制御系からなる計測・解析システムを立ち上げた。テストとして、Ag(111)単結晶表面におけるシリセンの構造変化を追跡し、低速電子回折で得られた結果やSTM観察との比較を行い、再現する結果が得られた。(1)分子接合における伝導チャンネルの決定C60単分子を超伝導STM探針(Nb)と超伝導基板(Pb)で挟んだSTM単分子接合における伝導経路について、接合で起こる多重アンドレーフ反射の解析を行い、伝導チャンネル数、透過係数を決定した。C60分子の3つの非占有分子軌道(LUMO)が伝導経路に寄与していること、分子の配向によって透過係数が変わることがわかった。配向に依存して、3つの伝導チャンネルがほぼ均等な透過係数を示す場合、3つの内の一つが大きな寄与をする場合がある。これは、分子軌道の空間分布の違いを反映しているものと考えられる。この結果は、Physical Review B誌で発表し、Editor's suggestionに選ばれた。(2)STM接合における分子磁性の操作Au(111)基板に吸着した鉄フタロシアニン(FePc)について、STM探針を分子中心にある鉄イオンに近づけ接触させることで、近藤効果が支配的な強結合領域とスピン軌道相互作用が支配する領域の間をクロスオーバーさせることができることを示した。第一原理計算から、探針がFeイオンに近づくと、鉄イオンの位置が金基板側から探針側に徐々に移動し、イオン・金基板間の相互作用が弱められ、近藤温度を決める交換相互作用Jが小さくなることが本質的な役割をすることがわかった。(3)領域内の共同研究A02班石田グループとシリセンの電子状態計算について、共同研究を進めた。半無限電子状態計算をh-BN膜で修飾したCu(111)上のシリセンについて適用しスラブ模型による結果を比較した。前年度に、STM探針-磁性分子(鉄フタロシアニン)-金電極からなる単分子量子ドットにおいて、近藤領域とスピン軌道相互作用領域の二つの状態間のクロスオーバーが可逆的に起こることを前年度に見出し,予備的な理論解析を行った。今年度は、DFT計算による詳細な幾何構造の決定と電子状態の解析を実施した。STM探針が鉄イオンに近づくと、鉄イオンが探針側に動き、鉄イオン・金電極間の距離が最大で0.1nm伸びることがわかった。これに伴い、dz2軌道の状態密度が全体的に狭まり金電極とのs-d混成相互作用が弱くなることがわかった。クロスオーバーは、STMの探針操作により近藤カップリングが弱くなった結果、近藤遮蔽によって繰込まれていたスピン軌道相互作用が露になったため起きたと解釈される。多層シリセンの構造解析を低速電子回折および動力学理論解析によって行った。ハニカム原子層が積層したスタッキング構造、ダイアモンドSi結晶の(111)面にSi原子、Ag原子または欠陥が周期的に配列した構造、理論計算により提案されていた前駆体構造等さまざまな構造モデルについて比較検討した。ダイアモンドSi結晶の(111)面にAg原子が配列したモデルが最も良く実験結果を再現することを見出した。このことから、多層シリセンはグラファイト様のスタッキング構造ではなく、ダイアモンドSi結晶の(111)面をベースとする構造であることがわかった。

超伝導と近藤効果の競合を調べるために、超伝導を示すIn単原子薄膜におけるマンガンフタロシアニン(MnPc)の吸着構造および電子状態をSTMにより研究した。MnPcの吸着により超伝導ギャップが狭まること、MnPcのマンガンイオンにおいて近藤共鳴状態を示唆する特徴的なスペクトルを見出した。基板・吸着分子からなるヘテロシステムについて新たな知見が得られていることから、順調に進展していると評価した。以下の3つの研究テーマを進めた。(1)2次元超伝導In原子層とマンガンフタロシアニン(MnPc)との相互作用:2次元超伝導体と分子スピンとの相互作用を走査トンネル顕微鏡及び第一原理計算によって調べた。In単原子層における超伝導状態の破壊と磁性MnPc分子の吸着量との関係、MnPc分子スピンと基板電子系との相互作用により近藤共鳴状態が現れること、また、MnPc分子スピン間の相互作用により磁気秩序が発現している可能性をを見出した。磁気秩序の発現には、基板電子を介した間接的な相互作用であるRKKY相互作用が有力であると考え、In原子層のフェルミ面の形状を考慮に入れたモデル計算を行い、実験データを合理的に説明できることがわかった。さらなる詳細な知見を得るために、第一原理計算の結果と合わせて解析を継続する予定である。(2)ヘテロシステムの土台となる新奇物質群の研究:Au(111)基板におけるBi薄膜の成長過程における構造及び電子状態発展を明らかにした。ワイル半金属の有力候補である遷移金属ダイカルコゲナイドWTe2の表面構造と電子状態を走査トンネル顕微鏡、低速電子回折及び第一原理計算によって明らかにした。弱いvan der Waals(vdW)相互作用で積層している物質であるが、結晶表面では、金属や半導体結晶と同様に表面緩和が起きていることがわかった。(3)非占有電子状態におけるラシュバスピン軌道相互作用の研究:グラフェンでカバーしたIr単結晶表面の鏡像ポテンシャル表面状態におけるラシュバ分裂の計測に成功した。n=1及びn=2鏡像電子状態のスピンテクスチャが反転している可能性を示す結果を得た。研究計画で設定した内容に沿って研究が進められていることから、順調に進んでいると評価した。平成29年度は、以下の三つの研究を行なった。(1)鉄フタロシアニン(FePc)分子とCu、Ag、Auなどの金属電極との接合とスピン物性ついてトンネル顕微鏡(STM)と第一原理計算をもとに研究してきた成果を系統的に考察した。Au電極に接合したFePc分子について、STM探針を使って分子中心にあるFe原子の位置を電極表面に対して垂直に変位させることで近藤効果とスピン軌道相互作用に由来する異方的なスピン状態との間の量子相転移を制御することを実現した。量子相転移の制御に関して新たな方向性を示した。(2)スピン軌道相互作用の非占有電子状態に対する影響について、レーザー多光子光電子分光および第一原理計算・半無限系電子状態計算による研究を行なった。グラフェンで覆ったIr電極における非占有鏡像表面状態について、スピン軌道相互作用由来のスピン分裂を観測し、また円偏光励起によりスピンテクスチャを決定した。
アクチン結合タンパク質コフィリン及びデストリンの脳内動態の研究

Escherichia coliに大量発現させたコフィリンとデストリンを抗原としてウサギに作らせた抗体をアフィニティー精製し、マウス小脳及び大脳海馬領域の凍結切片を材料として、主に間接蛍光抗体法により両タンパク質の分布様式を調べた。小脳では、コフィリンは分子層から白質まで広く分布していたが、プルキンエ細胞の細胞体及び樹状突起に比較的多く存在し、また顆粒細胞層にはアクチンの分布と類似した網目状の分布も見られた。デストリンは白質にはあまり含まれず、主にプルキンエ細胞の細胞体と顆粒細胞層に多く分布していたが、顆粒細胞層での分布様式はコフィリンとは異なっていた。ただし、ABC法を用いた場合には、顆粒細胞層ではアクチン、コフィリン、デストリンの三者とも小脳系球にその分布が見られ、細胞体の染色は非常に弱かった。海馬領域では、デストリンが細胞体の豊富な錐体細胞層や歯状回の顆粒細胞層に分布していたのに対して、アクチンはこれらの層には少なく、放線層や多彩細胞層に豊富であった。また、コフィリンは小脳の場合と同様に広く分布しており、放線層では繊維状の染色像も見られた。コフィリンとデストリンは構造的にも機能的にも類似したアクチン結合タンパク質であるが、上記の観察結果は両者の局在が必ずしもアクチンと対応せず、また両者間で分布様式に差異があることを示している。コフィリンもデストリンも同程度のイノシトールリン脂質結合能を有し、また両者ともリン酸化による機能制御が示唆されており、更にコフィリンのアクチン重合調節能はpHにも依存するため、これらの性質と細胞の種類による発現レベルの差異が、両者の分布様式の差異やアクチンと局在が対応しない要因を成している可能性が考えられる。
遺伝学的・免疫学的・海洋物理学的統合アプローチによるオニヒトデ広域動態の解明

近年、造礁サンゴの食害種、オニヒトデの大量発生が世界各地で起きており、サンゴ礁生態系が壊滅的な状況にある。オニヒトデは多産で長い浮遊幼生期をもつので、大量発生機構の解明には、初期生態の把握が必須である。本研究では、複雑な幼生の広域分散過程を時空間的に捕らえるために、遺伝子解析、幼生分散に関する数値シミュレーションを統合することにより、幼生分散過程を解明することを試みた。日本国内10箇所、フィリピン、パラオ、マジュロ、ポンペイ、フィジー、タヒチ、オーストラリアのグレートバリアリーフ3箇所、コロモ諸島3箇所、ケニア、計23箇所において採集したサンプルの集団解析を行った。結果、西岸境界流の影響があると考えられる日本国内とフィリピン、グレートバリアリーフ内、南アフリカの4地域の内部ではほぼ遺伝的に均一となり、幼生分散による遺伝子流動が強く起きていることが示唆された。一方、太平洋諸島は互いに遺伝的に有意に集団分化しており、遺伝子流動が限られていることが明らかとなった。また、集団解析、黒潮周辺海域における幼生分散シミュレーションそれぞれの結果を統合的に解析することにより、オニヒトデの幼生分散における黒潮の影響や過去の大量発生の2次的伝播の検証等を行った。その結果、遺伝子解析によって示唆されていたフィリピンから日本国内への幼生分散の可能性を強く支持する結果が得られた。日本国内では、黒潮と中規模渦の効果により非対称的にサンゴ礁間での幼生分散が起こっている可能性の高いことが示唆された。以上より、日本国内及びフィリピン、台湾における2次的大量発生の伝播が十分に起こり得ることが証明された。一方で、太平洋諸島では統計学的に有意な集団分化が起こっていたが、数値シミュレーション上でも幼生分散範囲が限られていることが示され、太平洋諸島間での2次的大量発生伝播の可能性は低いことが示唆された。生殖腺観察による産卵期の推定ならびに,ミトコンドリアDNA配列を用いた種判別法を用いて,宮古島北部に位置する八重干瀬において,オニヒトデの幼生採集調査と物理観測を行った.様々な水深から合計27個体の野外オニヒトデ幼生が同定された.水深別では水深7mから最も多く採集され,時期としては八重干瀬内において北東方向への流動場が卓越する満潮前後のサンプルからオニヒトデの幼生が見つかりやすい傾向がみられた.生殖腺観察による産卵期の推定は宜野湾市近海において6月から8月末にかけて行った.高度多型を示す16個のマイクロサテライトマーカーの開発に成功した.PCRによる各遺伝子座の増幅は,CTAB法でDNAを精製することにより改善された.対立遺伝子数は3-12個(平均7.1,n=24)であり,16個のマーカー全てで多型が認められた.ヘテロ接合度の観察値(Ho)と期待値(He)はそれぞれ、0.087-0.913と0.163-0.892であった.この高度多型を示す本MSマーカーのうち,5個を用いて,高知県竜串,鹿児島県奄美大島,沖縄県宜野湾,石西礁湖から採集された,計252個体のオニヒトデを解析した.6ペア個体群のうち4ペア個体群で統計的に有意な集団分化が検出され,それらの地点間での遺伝子交流は制限されていることが示唆された.一方で残り2ペア個体群の竜串-宜野湾,宜野湾-石西礁湖のペア個体群に関しては統計的に有意な集団分化はみられなかった.地理的にはより近い竜串-奄美大島間では集団分化がみられ,より離れた竜串-宜野湾間で集団が混合している可能性が見られることから,竜串-宜野湾間では海流に運ばれた幼生の行き来がある可能性が示唆された.昨年までに開発したマイクロサテライトマーカーを用いて、和歌山から石垣島にいたるまでオニヒトデの生息域をほとんどカバーする日本国内10箇所とフィリピン、パラオ、ポンペイ、マジュロ、フィジーの計15オニヒトデ大量発生集団を解析した。その結果、大きく4つのグループを検出することが出来た。最も遺伝的に離れたグループは南半球に位置する、地理的距離がもっとも離れたフィジーであり、2つ目のグループは地理的に2番目に離れているポンペイとマジュロであったが、Fisher's exact testの結果互いに統計学的に有意に分化していることがわかった。3つ目のグループはややフィリピンと日本全国と近いグループとしてパラオであり、このグループは、ポンペイ、マジュロのグループよりも、フィリピンと日本の集団に遺伝的距離が近かった。最後のグループは日本全域10箇所とフィリピンを含むグループで、このグループ内では明確な遺伝構造が検出できなかった。遺伝的距離と地理的距離の間の関係(Isolation By Distance, IBD)を調べたところ、全ての海域で解析した際にはIBDパターンが見られ、それぞれの集団が地理的に分化している可能性を示したものの、日本とフィリピンの集団だけで解析した際にはIBDパターンは検出されず、これらの集団の間には幼生分散を介した遺伝子流動が存在することが示唆された。さらに、黒潮を再現する3次元海水流動モデルであるJCOPEモデル上で幼生を見立てた粒子追跡を行ったところ、フィリピンから日本への幼生分散及び、日本国内間での幼生分散が再現され、集団解析の結果と一致する結果となった。

本研究では、複雑な幼生の広域分散過程を時空間的に捕らえるために、遺伝子解析、幼生分散に関する数値シミュレーションを統合することにより、幼生分散過程を解明することを試みた。日本国内10箇所、フィリピン、パラオ、マジュロ、ポンペイ、フィジー、タヒチ、オーストラリアのグレートバリアリーフ3箇所、コロモ諸島3箇所、ケニア、計23箇所において採集したサンプルの集団解析を行った。結果、西岸境界流の影響があると考えられる日本国内とフィリピン、グレートバリアリーフ内、南アフリカの4地域の内部ではほぼ遺伝的に均一となり、幼生分散による遺伝子流動が強く起きていることが示唆された。一方、太平洋諸島は互いに遺伝的に有意に集団分化しており、遺伝子流動が限られていることが明らかとなった。また、集団解析、黒潮周辺海域における幼生分散シミュレーションそれぞれの結果を統合的に解析することにより、オニヒトデの幼生分散における黒潮の影響や過去の大量発生の2次的伝播の検証等を行った。その結果、遺伝子解析によって示唆されていたフィリピンから日本国内への幼生分散の可能性を強く支持する結果が得られた。日本国内では、黒潮と中規模渦の効果により非対称的にサンゴ礁間での幼生分散が起こっている可能性の高いことが示唆された。以上より、日本国内及びフィリピン、台湾における2次的大量発生の伝播が十分に起こり得ることが証明された。一方で、太平洋諸島では統計学的に有意な集団分化が起こっていたが、数値シミュレーション上でも幼生分散範囲が限られていることが示され、太平洋諸島間での2次的大量発生伝播の可能性は低いことが示唆された。
血管新生因子の研究-モヤモヤ病など脳乏血性疾患治療のための基礎的研究

本研究は脳の乏血性疾患を治療すべく、脳腫瘍、脳動静脈奇形、炎症性物質などヒト生体組織から血管の新生を促す物質(因子)を分離し、それを臨床応用しようとするものであり、その一歩として活性をもつ因子を分離することを目的とした。手術的に摘出採取した脳腫瘍組織ホモジネートから45KD近くに異常スポットを発見したが、その性質を同定するには至らなかった。そこで次に被検体の量を増すべく腫瘍細胞の培養を行いその上清を採取し、凍結保存することにより比較的大量の検体を確保すると同時に、なるべく自然の環境に近づけるため他の病気より切除されたヒト大脳の血管から細切、ホモジネート、ユラーゲナーゼ処置により毛細血管内皮細胞の分離、培養を行った。後にこの継代細胞群は細菌感染を起したため、次に述べる別の細胞株を利用し、最終的な実験を行った。すなわち、第1に患者より摘出した髄膜腫約10gを細切し、ホモジナイズした後、超音波細胞破壊装置にて細胞を壊し摂氏4度において10万G、1時間超遠心した後、その上清を採取した。これをファルマシア社製高速液体クロマトグラフィーを用いて分離精製を試みた。カラムはヘパリン親和性カラムおよびイオン交換Mono-sカラムを使用した。この過程で単一ピークを示した分画の活性を、ウシ肺動脈内皮細胞の増殖能で検討した。実験群は、RPMI1640単独群、RPMI1640+10%ウシ胎児血清群、RPMI1640+上清群とした。第2に、ヒトグリオーマ細胞株A-172を大量培養し約2lの培養上清を得た。0.45μmのミリポアフィルターで濾過後同様に分離精製し、単一ピークを得た。この分画の活性を同様に検討した。その結果、ヒトグリオーマ培養上清は細胞増殖活性を有することが判明した。両者ともに電気泳動では多峰性のパターンを有していた。本研究は血管新生因子の分離同定することが目的である本年度はまず血管新生物質を多く含有するものと思われる生体物質を臨床症例を利用して集収した。すなわち脳原発性神経膠腫摘出標本、転移性脳腫瘍,(腎癌,黒色腫)2例、脳動静脈奇形の摘出標本を-70°Cに凍結深在、一部を組織培養しその上澄を一部凍結保存した。上澄の検索は一次元電気泳動法を使用していたが不充分であり二次元電気泳動法を利用し更に渡銀法を重ねることによりその検出分離能力を向上させることに作業の大半をついやした。そしてこの方法を実際応用可能なものにした。一方アッセイシステムとしては研究費の一部で孵卵器を購入した。孵化鶏卵の半漿膜に新生した上管を画像解析装置タスを使って、量的に把握して正常像と比較する方法を現在考案中である。現在のところ平面上に血管像をシュミレーションして描き、これをTexture Assay System(TAS)のテレビ画面上に映し出しこの血管像の占める面積を求め画面全体の面積に対する比率として求める方法が比較的有効であることが判明したが、細かい血管をどのようにして画像にするか問題を残した。同時に共同研究者として行っている実験"核磁気共鳴法を用いた中枢神経系疾患診断に関する実験的研究"においても血管の新生状態を顕微鏡的に観察した。

すなわちラット脳に実験脳腫瘍Fisher433系gliomaを移植し、生存生着が確認された後MRIに関する実験を施行した後にラットをSacrifyし移植glioma周辺の血管増生の程度を検鏡した。その結果この系のgliomaは血管新生因子を多く含有する可能性が判明した。このように、in vitroでは活生物質の失活の問題もあり併せてin vivoの実験も平行して行う必要性を感じた。手術により採取したヒト脳腫瘍,脳動静脈奇形,炎症産物等は何らかの血管新生作用はあると思われたが,それがspecificな作用なのか,異物に対するnon specificな反応なのか,未だ判然としていない. 1640SDS Pageを利用して45K近傍に異常なSpotsを発見しているが,未だどのような性質のものか判然としていない.このようにして血管新生因子含有物質の同定に努めてきたが試料の量が少なく,その採取,活性の測定には不向きであることが判明した.そこで今回は,ヒト脳悪性腫瘍培養上澄を大量に採取蓄積凍結保存することを目標とした.そのため我々はRTMY-1640に10%ウシ胎児血清を加えた培養液でヒトグリオーマA=172を培養しその上澄を1回2030mlずつ採取し,それを約5倍に濃縮し, -70°Cで凍結保存した.現在までにこれは約1lを蓄積することができたが, 10lを目標にしている.一方同時に活性因子のバイオアッセイシステムとしてヒト脳血管内皮の増殖度を観察することも考慮した.そこでその基礎実験としてラットの脳から血管内皮細胞を取出し,培養する操作も同時に行っている.次の段階ではこうして得られた材料をもとにしてFolkman等のヘパリンを利用したTWO Step methodniより因子の分離を試みる予定である.比較的大量の血管新生因子を採取するために今年度はヒト脳腫瘍組織を利用し、組織そのものあるいは確立した脳腫瘍株培養上清における因子活性の検索を試みた。すなわち、第1に患者より摘出した髄膜腫約10gを細切し、ホモジナイズした後、超音波細胞破壊装置にて細胞を壊し摂氏4度において10万G、1時間の超遠心した後、その上清を採取した。これをファルマシア社製高速液体クロマトグラフィーを用いて分離精製を試みた。カラムはヘパリン親和性カラムおよびイオン交換Mono-Sカラムを使用した。この過程で単一ピークを示した分画の活性を、ウシ肺動脈内皮細胞の増殖能で検討した。実験群は、RPMI1640単独群、RPMI1640+10%ウシ胎児血清群、RPMI1640+上清群とした。第2に、ヒトグリオーマ細胞株A-172を大量培養し約2lの培養上清を得た。0.45μmのミリポアフィルターで濾過後にヘパリン親和性カラム、Mono-Sカラムで分離精製し、単一ピークを得た。この分画の活性を第1のアッセイと同様に3群に分類し、ウシ肺動脈血管内皮細胞の増殖能で検討した。次に髄膜腫およびA-172細胞株の単一ピークをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い分子量の決定を試みた。《結果》(1)髄膜腫をホモジネイト、超音波破壊して得た上清の単一ピークには、対象群に比して有意な血管内皮細胞の増殖は認められなかった。(2)確立したヒトグリオーマ細胞株A-172の培養上清から得た単一ピークは、RPMI単独群、RPMI+ウシ胎児血清群に比して5倍の増殖能が存在した。(3)この単一ピークのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動では、複数のバンドが認められた。
巨大血管腫特異的な遺伝子群の腫瘍新生血管における機能

癌の血管新生に特異的な分子標的を単離することは、癌の病態を把握するだけでなく新しい診断と治療のマーカーとして提供する上で極めて重要である。そこで本研究では肝臓に生じた増殖が早く、手術後くり返し再発する血管腫を対象に増殖が遅い血管腫mRNA間でDifferential Display(DD)を行ない特異的な遺伝子を単離することにした。さらに肝臓に生じた肝細胞癌(HCC)と胆管癌(CCC)の血管新生の高低を左右する因子についての検討を進めることにした。その結果、1. DD法で得られたクローンのうち増殖の早い血管腫に発現が高い5クローンを単離した。5クローンについての部分塩基配列から新しい遺伝子であることが示唆された。2.細小血管密度の高いHCC症例では、非癌部位に較べて癌部位で促進因子、血管内皮増殖因子(VEGF)の発現が高く阻害因子トロンボスポンジン1(TSP-1)は低かった。他方、血管密度が低いCCCではVEGFの発現は低く、TSP-1の発現は高かった。以上の結果をもとに、血管内皮に発現する新しい遺伝子の単離と構造、機能の解析さらに血管新生阻害因子TSP-1の発現の機構について現在仕事を進めている。