hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
培養骨髄細胞を併用した脚延長術の基礎実験ー医師主導型治験開始と効率化の基礎研究ー

施設基準の更新:調製する培養骨髄細胞をGMP基準に準拠して院内製造できる能力を有する事の証明についてISO 13485の更新審査を受け、更新が認可された。当院はTR拠点としての支援も受けており、臨床研究支援さんターの全面的支援を受けている。臨床研究は臨床研究支援センターの機能により高いレベルで遂行された。基礎研究の実施:RUNX2活性化化合物(特願071264.PCT出願済み)は担体と組み合わせて骨補填材料として開発を進めた。材料メーカーとの共同研究で試作品の提供を受けて動物実験を行った。担体からの溶出に問題があり動物実験では濃度が想定外に高くなる事が確認された。担体からの溶出試験を検討し直す予定。FGFrecepter3のシグナルを抑制する化合物の探索に成功した。この化合物の効果をモデル動物で確認した(Endocrinology 2014).施設基準:調製する培養骨髄細胞をGMP基準に準拠して院内製造できる能力を有する事の証明について臨床研究拠点のサイトビジットを利用し、高評価を得た。ISOの基準に基づき施設運営が行われている更新評価を受けた。これによりICH-GCPでの臨床研究が実施可能である事を証明した。医師主導型治験を行う準備は完了している。開発経費面からは高度医療からの保険収載の可能性についても今後臨床研究データで規制当局と協議が必要である。臨床研究の実施:先進医療としての臨床研究を実施する。臨床研究では大腿骨、下腿骨を対象とするために反復投与症例を含めて有効性・安全性臨床データの解析を進める。臨床研究で単回投与(主に脚長差症例)と2回投与症例について長期経過例の安全性評価を目的に臨床レベルでのデータ解析をおこなう。5例ずつ効果安全委員会での審議、厚生労働省の報告を行っているが、病院の支援が受けられており、継続して実施する必要があると考えられる。目標30例に対して29例が参加・終了している。期間内での目標症例数の到達を達成した。基礎研究の実施:RUNX2活性化化合物(特願071264)は担体と組み合わせて骨補填材料として開発を進めた。骨形成新規機能材料としてメーカーとの共同研究を展開し、骨補填材料を高機能医療材料としての開発を進めた。除放化に向けて最適な作用時間と濃度決定の実験を継続して行った。FGFシグナルを抑制的に働く化合物を特定し、臨床研究に展開する予定で前臨床データセットを構築している。この化合物はFGFrecepter3のシグナルを抑制する作用が有りachondroplasiaの治療薬として期待される。この臨床使用を目的に安全性に関わる基礎データの構築をAMEDからの資金に追加して進めた。「ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針」に沿った臨床研究として高度医療の承認を受けた「培養骨髄細胞移植の併用による骨延長術」の前向き臨床研究を行った。期間内に必要症例数の組み入れに成功した。また前臨床試験を追加した。ヒト又は動物由来成分を原料として製造される医薬品等の品質及び安全性確保に関する法令等(医薬発第1314号)に基づき非臨床試験を含む研究データの補足を行い、移植細胞の運命と生体に対する影響を動物実験で確認した。医療として十分な妥当性を証明出来る基礎データを構築した。非臨床試験:安全性試験に関わるデータセットの見直しを行った。
π空間を利用する有機分子フラスコ触媒の創成とトリフルオロメチル化反応の開発

π空間触媒として想定するサブフタロシアニンが取り込む分子の一般性確認,及びフラスコの母体となる様々なサブフタロシアニン誘導体を用いたお椀構造内部への芳香族分子取り込み実験を行った。これまでの研究により,トリフルオロエトキシ化サブフタロシアニン内部にはトルエンとベンゼンが取り込まれることが明らかとなっている。これらの現象がトリフルオロエトキシ基によるものであることを確かめるため,無置換フタロシアニンとトリフルオロエトキシ基がアキシアル位で結合したダイマーを合成したところ,トリフルオロエトキシ化フタロシアニンのみにトルエンが取り込まれることがX線結晶構造解析により明らかとなり,トリフルオロエトキシ基の優位性が現れた。また環拡大型フラスコとして,トリフルオロエトキシ化フタロシアニンが一つのベンゼン環を介して連なったダイマーを合成した。本化合物はサブフタロシアニンモノマーより大きな化合物を取り込むためのフラスコとして利用できると考えられる。当初の目的である反応場としての応用の可能性が明確になったといえる。続いて,トリフルオロエトキシ化サブフタロシアニン自身の光触媒反応を検討することにした。光触媒として可視光域から近赤外域の光を吸収するルテニウム系色素が一般に使用されるが,ルテニウムは高価であるために,有機反応に用いるには問題がある。そこで,トリフルオロエトキシ化フタロシアニンを触媒に用いて,hex-5-en-1-olとペルフルオロオクチルヨージドをLEDランプの照射下にて行った。その結果,還元剤としてアルコルビン酸ナトリウムを用いることで,ラジカル付加反応が進行し,末端がペルフルオロアルキル化された化合物が77%で得られた。この結果は,トリフルオロエトキシ化サブフタロシアニンが光触媒として働いた初めての例である。上記両者を組み合わせたπ空間を利用する反応への展開が大いに期待出来る。25年度が最終年度であるため、記入しない。有機分子触媒による分子変換システム開発という研究項目において,安価な天然アルカロイドであるシンコナアルカロイドを有機触媒として用いたフルオロアルキル基の立体選択的導入法の開発に焦点を当てた研究を展開している。とりわけ,キノリン環の持つπ電子とキヌクリジン環に挟まれた空間で反応を制御することにより,効率的に反応を進めるべく手法を開発しており,今年度は分子状酸素を酸化剤に用いる有機分子触媒的不斉エポキシ化反応の開発に成功した。オレフィンに対する触媒的不斉エポキシ化反応は光学活性エポキシドを合成する最も実用的な手法である。得られたエポキシドは様々な天然物の中間体として用いられ,また医薬品などの生理活性物質合成の際の重要なビルディングブロックである。1980年,Sharpless,香月らはTi(OiPr)4/酒石酸ジエチル/tBuOOH系を用いたアリルアルコールの画期的な不斉エポキシ化反応を報告した。本反応は現在においても強力な不斉エポキシ化反応の実用的手法として広く用いられている。この報告以後,非常に多くの不斉エポキシ化反応の触媒システムが開発されている。金属(Ti, V, Mn, Fe, Zr, Hf, Vなど)と活性酸化剤(各種ペルオキサイド,NaOClなど)を用いる手法,有機触媒と活性酸化剤を用いる手法,および金属(Ruなど)と分子状酸素を用いる手法が挙げられる。しかし有機触媒と分子状酸素を用いる手法は報告されていなかった。

β位二置換エノンを基質として,メチルヒドラジン,塩基として炭酸セシウム,第四級アンモニウム塩を用いて反応を行ったところ,エポキシドが高収率,高エナンチオ選択性で得られることを見出した。本反応系は,芳香環上の置換基の種類によらず,電子供与性基,電子求引性基を有する基質に対して,高収率かつ高エナンチオ選択性でエポキシドを得ることが可能である。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,キノリン環の持つπ電子とキヌクリジン環に挟まれた空間で反応を制御することでシンコナアルカロイドを有機触媒として用いたフルオロアルキル基の立体選択的導入法の開発に焦点を当てた研究を展開した。その結果,これまでの不斉エポキシ化反応は金属と活性酸化剤を用いる手法,有機触媒と活性酸化剤を用いる手法,および金属と分子状酸素を用いる手法しかなく,今まで報告例がなかった有機触媒と分状酸素を用いる不斉エポキシ化反応の開発に成功した。この結果はトップジャーナルであるAngew. Chem. Int. Ed.に掲載された。また,これだけでなく天然アルカロイドであるシンコナアルカロイドを有機触媒とした不斉反応の開発も着々と進行している。また,シンコナアルカロイドだけでなくサブフタロシアニンを用いた分子フラスコへの展開も行っている。3つのイソインドールユニットから成るサブフタロシアニンはすり鉢状の形をしており,トリフルオロエトキシ基の強力な電子吸引性によって形成された電子不足なπ空間に電子豊富な芳香族化合物を取り込むことができる。この時,サブフタロシアニン周辺のトリフルオロエトキシ基は,取り込まれた化合物の構造によって柔軟に形を変え,あたかも化合物を包み込むような構造をとることがX線結晶構造解析によって確認された。このことを利用して,電子豊富な化合物をサブフタロシアニン内に取り込む分子フラスコとしての応用が可能となる。これらの現象を展開させ,特殊な性質を持つフタロシアニンを化学反応の反応場及び反応種として利用する。このことも有機触媒と合わせて今後展開していくつもりである。今後の研究の展開として,サブフタロシアニンを用いた分子フラスコへの展開と天然アルカロイドであるシンコナアルカロイドを有機触媒とした不斉反応の開発を行っていく。すり鉢構造をしたサブフタロシアニンにトリフルオロエトキシコーティングすることで,電子不足となったサブフタロシアニン内部に様々な電子豊富な芳香族分子を取り込むことのできる新規分子フラスコを合成する。それと同時にトリフルオロエトキシ基によってアキシアル位が活性化されていることを利用し,サブフタロシアニンを求電子的な反応剤として用いる。サブフタロシアニン内部はフッ素のもつ撥水撥油効果によって外界から遮断される。この空間では溶媒効果などを受けず,通常とは全く異なる反応条件で化学反応を行うことができると考えられる。まずはサブフタロシアニンに取り込める化合物の種類や大きさを検討するため,サブフタロシアニンと目的の化合物を混合し結晶化させる。X線結晶構造解析を行うことで,サブフタロシアニンに取り込める化合物の検討を行う。次にサブフタロシアニン内に取り込める基質に対し,アキシアル位に位置する化学活性種を利用した反応を行う。用いる化学種としてはトリフルオロメチル基を計画している。
カーボンナノチューブデバイスの高性能化とばらつき低減技術の開発

本研究では、集積単位となる単層カーボンナノチューブの一本の構造と物性を制御し、カーボンナノチューブ分散液をインク利用することによる高次構造構築の技術を開発することにより、最終的に、カーボンナノチューブの薄膜デバイスの高性能化と性能のばらつき低減をめざす。当該年度では、カーボンナノチューブの純度向上のための分離技術に関する研究、ディスペンサーを用いたナノチューブ分散液の塗布に関する要素技術開発を行った。カーボンナノチューブの分離技術の向上は、得られた半導体カーボンナノチューブを使ったデバイスの高性能化には欠かせない。今回、電界を用いた金属/半導体カーボンナノチューブ分離法である電界誘起層形成法(ELF法)に関し、詳細にカーボンナノチューブの分散および分離環境を調べる技術を確立して長年不明であった分離メカニズムを明らかにした。これにより、カーボンナノチューブインクの実用化に欠かせない分離精度の向上、低コスト化、量産化への指針を得た。また、塗布技術に関して、ディスペンサー等を用いてカーボンナノチューブインクをオンデマンドに塗布する場合は特に、インク中の界面活性剤とカーボンナノチューブの濃度を正確に制御することが重要になる。今回、界面活性剤とカーボンナノチューブの濃度に対し、それぞれ屈折率測定と吸収測定によって検量線を作成した。今後、カーボンナノチューブインクを様々な用途に対応させるため、インクの組成から塗布により得られるカーボンナノチューブ膜の厚さや電気的特性値などについて指標となるデータを構築することが必要と考えられる。また、分散液中のカーボンナノチューブが負に帯電していることや、分散液の環境によってその帯電量が変わる結果が得られたことから、塗布精度を高めるためにも基板との静電的な相互作用を考慮した研究も必要と考えられる。これらに関し、ひきつづき研究を続けていく。本研究では集積単位ともなる単層カーボンナノチューブの一本の物性と構造制御し、カーボンナノチューブの高次構造構築の技術を開発することにより、最終的にはカーボンナノチューブ薄膜デバイスの高性能化と性能のばらつきの低減を目指す。当該年度では、主にカーボンナノチューブ薄膜トランジスタの基礎物性評価としてデバイス性能に対する半導体カーボンナノチューブの長さの影響を調べた。また、分離して得られた半導体カーボンナノチューブ分散液のインクとしての安定性の評価、インクの塗布技術の構築を行った。カーボンナノチューブは、非イオン性界面活性剤で分散し、電界誘起層形成(ELF)法を用いて半導体カーボンナノチューブの高純度化を行うことで半導体インクを調製した。これをさらにサイズ排除クロマトグラフィーを用いて長さで分級し、各カーボンナノチューブ薄膜を熱酸化膜付きシリコン基板上に形成し、最後に電極を蒸着してデバイスを作製した。長さが異なるとパーコレーション閾値が異なる。そのため、各カーボンナノチューブの密度が異なるデバイスを複数作製することで、オンオフ比、オン電流、移動度の性能において傾向を比較した。結果、高純度半導体カーボンナノチューブの長さの違いによる性能の優位差はほぼみられないことを確認した。また、インクの安定性については、約4カ月にわたり冷蔵保管したインクを使用してデバイスを作製し、カーボンナノチューブの製膜性およびデバイス性能の経時変化を評価し、この期間においてインクの安定性を確認した。カーボンナノチューブの薄膜トランジスタの基礎物性の評価を進める中で、カーボンナノチューブインクの塗布技術として、ディスペンサー、インクジェットの塗布技術の習得、カーボンナノチューブインクの安定性評価等を行うことができた。最終的な研究目標であるデバイス性能のばらつきの低減を行うための基盤となる技術を構築できたと考えられる。本研究では、集積単位となる単層カーボンナノチューブの一本の物性と構造制御を行い、カーボンナノチューブの高次構造構築の技術を開発することにより、最終的に、カーボンナノチューブの薄膜デバイスの高性能化と性能のばらつき低減を目指す。当該年度では、カーボンナノチューブの薄膜トランジスタを印刷によってつくる前準備として、半導体カーボンナノチューブの分離、カーボンナノチューブインクを調製、ディスペンサーを用いた基板上へのカーボンナノチューブインクの塗布試験を行った。カーボンナノチューブは非イオン性界面活性剤であるBrijS100で分散し、電界誘起層形成法(ELF法)を用いて半導体カーボンナノチューブを分離した。分離して得られるカーボンナノチューブ分散液には、多量の界面活性剤が含まれる。今回、オンデマンドの印刷をディスペンサーを用いて行うにあたり、界面活性剤がカーボンナノチューブの基板上への塗布を阻害することが考えられたため、界面活性剤濃度を透析によって減らすことで、塗布用のカーボンナノチューブのインクとした。これまでの塗布条件の検討内容としては、基板の処理方法、インク中のカーボンナノチューブの濃度、インク中の界面活性剤濃度、塗布インク量、塗布後の基板の洗浄方法等である。塗布後、カーボンナノチューブがパーコレーション閾値以上の密度で薄膜を基板上に形成していることをAFMを用いて基板観察を行い確認をした。ライフイベントにより研究を一時中断したことを考慮すると、遅延はあるものの順調である。印刷技術を用いたデバイス作製の準備が、最終目標にむけて進められたと考えられる。

カーボンナノチューブの分離技術の向上は、得られた半導体カーボンナノチューブを使ったデバイスの高性能化には欠かせない。今回、電界を用いた金属/半導体カーボンナノチューブ分離法である電界誘起層形成法(ELF法)に関し、詳細にカーボンナノチューブの分散および分離環境を調べる技術を確立して長年不明であった分離メカニズムを明らかにした。これにより、カーボンナノチューブインクの実用化に欠かせない分離精度の向上、低コスト化、量産化への指針を得た。また、塗布技術に関して、ディスペンサー等を用いてカーボンナノチューブインクをオンデマンドに塗布する場合は特に、インク中の界面活性剤とカーボンナノチューブの濃度を正確に制御することが重要になる。今回、界面活性剤とカーボンナノチューブの濃度に対し、それぞれ屈折率測定と吸収測定によって検量線を作成した。今後、カーボンナノチューブインクを様々な用途に対応させるため、インクの組成から塗布により得られるカーボンナノチューブ膜の厚さや電気的特性値などについて指標となるデータを構築することが必要と考えられる。また、分散液中のカーボンナノチューブが負に帯電していることや、分散液の環境によってその帯電量が変わる結果が得られたことから、塗布精度を高めるためにも基板との静電的な相互作用を考慮した研究も必要と考えられる。これらに関し、ひきつづき研究を続けていく。ディスペンサー等を用いて、オンデマンドでカーボンナノチューブ薄膜トランジスタを作製する。インクのカーボンナノチューブや分散剤の濃度等の検討、塗布基板の表面改質や塗布環境等、インク塗布条件の最適化を行う。また、基板全面に塗布する従来法との性能ばらつきの比較検討を、オンオフ比、移動度、ヒステリシス、閾値、特性のばらつき等について調べる。ディスペンサーを用いてオンデマンドのカーボンナノチューブインクの塗布技術を確立させるために、均一性が高いカーボンナノチューブの塗布方法とその評価法について検討を進めたい。そして実際にデバイスを作製して性能評価を行う。当初導入を検討をしていた備品に関して他のものでの代用することが可能となったものがあったこと、また、購入予定としていた消耗品が生産中止となったため断念せざる負えない状況になったことが原因である。なお、購入不可能となった消耗品に関しては、当該年度の研究結果から今後の研究推進に必ずしも必要なものではないと判断できたため、これらの費用を次年度以降の研究計画の促進に充てたいと考えた。出産に伴い、産前産後休暇および育児休暇を取得しており、研究を一時中断した期間があった。次年度以降は、当初の計画どおり進め、インクを塗布する際の制御性を上げるために、基板表面の改質等が可能なLEDランプ等の導入を検討している。インクを塗布する際の制御性を上げるために、LEDランプ等を用いた基板表面の改質が可能なユニットを導入することを検討している。
自死遺族の夢の中での死者との再会とナラティヴ・イメージワーク

本研究期間中に、自死で配偶者を亡くした人2名、子どもを亡くした人1名、親を亡くした人1名、計4名の研究協力が得られ、全員から夢の中での自死者との再会場面を描画することができた。研究協力者の報告をみると自死者との言語的な対話は成立しているとは言いがたく、自死者になぜと問うても、明確にその理由が述べられることはなかった。しかし遺族は、夢の中での自死者のようすから言葉を超えたメッセージをくみとったり、求めても得られないという限界を察したりしていた。そして、その中で印象的な場面を描画することができ、自死者からの肯定的な反応を想像できた例が多かった。これらから、大切な家族を自死で亡くし否定的な諸感情に苦悩する遺族の癒しにつながる体験が、夢を死者と再会可能な空間として遺族とともに描画し語りなおすことによって得られる可能性が示された。研究初年度の22年度は、この自死遺族の夢の中での死者との再会のナラティヴ・イメージワークという挑戦的萌芽研究を実施するにあたり、まず札幌医科大学倫理委員会の倫理審査に諮ることから始めた。研究者の出張と倫理審査の日程がぶつかり、予定よりも時間を要してしまった。倫理審査の承認をいただいた後は、本研究の核となる研究協力者により描画作業とその描画データのデジタルデータへの変換と保存のための道具や資材をそろえることを行った。購入予定であった画像データ処理に優れたハードウェアとソフトウェア機材が、製品の型代わりの時期にあり、発注に手間取るなどしたが、研究の進行に十分な能力を備えたものを準備することができた。肝心の研究協力者を掌握する算段だが、自死遺族の方々との接点は切らさずに維持することができているが、夢の報告しかも自死で亡くなった身内の夢という条件になるとそれを記憶し研究者に語れる状況にある人は思いの他、少ない。この点に関しては、まず睡眠中の夢に関心を持ってもらうこと、夢を何らかのかたちで書き留めるなり、メモするなどして記録してもらうこと、という手続きを研究協力者の候補となる自死遺族の方たちにお願いしなければならないと考え、準備を進めている。改めて研究協力へのお願い文を作成し、関心を持ってくれる方たちに、夢を書き留めるためのミニノートのような簡素なフォーマットのあるメモを渡すなどして、夢への関心と記録の可能性を高める工夫が有効なのではないかと思われる。このような工夫を凝らしている段階であり、22年度は研究協力者からのデータ提供が得られていない状況である。平成23年度の本研究の課題は、自死遺族の中で自死者の登場する夢を研究の趣旨を理解したうえで夢の報告をしてくれる研究協力者を獲得することであった。しかも、夢の報告の内容には、描画作業が含まれるため、協力者の負担は少なくない。そのため、研究協力へのお願い文を作成し、関心を持ってくれる方たちに、研究協力を呼びかけたところ、2例が研究の趣旨を理解し、積極的に自死した家族成員の登場する夢を語り、印象に残った場面の描画を行ってくれた。これによって、平成23年度に予定していた自死者の登場する夢を題材にした面接を実施することができた。しかし、その後の研究協力者の獲得には困難が伴い、説明の機会を繰り返し持つことでさらに1名の協力を得るに至った。
試験信号を必要としない建造物の健康状態モニタリング

本研究は,雑音振動を用いた建造物のヘルスモニタリング手法についての検討である.風や交通騒音等による僅かな振動を利用した建造物の診断は,試験信号を用いないことから建造物のヘルスモニタリングとして有効とされている.しかしながら,雑音振動を利用したパッシブな診断手法では,音源の特性と伝達特性にあわせて最適な分析窓長を選択することが重要な鍵となる.本研究ではケプストラム比とそれに基づく最適な分析窓長の選択方法を提案した.模型実験では,ケプストラム比が0dB以上では建造物の伝達関数が優位に観測されていることを示した.外部雑音を用いた構造物の診断では,雑音の周波数特性に埋もれた構造物の特性を表す伝達系の特徴分析が必要となる.しかし,非定常雑音では定常雑音に比べ自己相関分析による周期性の推定が困難である.平成25年度の研究では,三角窓によるスペクトル累積効果と,自己相関関数ピークの統計処理を用いて,非定常雑音振動から構造物の振動周期の推定を試みた.模型実験によって得られたインパルス応答と,非定常雑音を用いて,分析シミュレーションを実施した.本研究では,コーシー雑音とバースト雑音の2種類を非定常雑音として用いた.自己相関での評価には不向きなバースト雑音では観測信号の減衰部の累積スペクトル分析から構造物のモードパラメータを推定できることが示された.これらの研究成果について,学術論文誌に掲載された.観測された建造物の振動から音源に対する伝達関数の優位性の評価方法を検討した.本研究では,畳み込みの関係にある音源と伝達関数は,ケプストラム領域では,音源ケプストラムと伝達関数ケプストラムの和で表すことができることに着目し,伝達関数と環境雑音のケプストラム比を伝達関数の優位性の評価方法として提案した.また,過渡的な雑音振動部に着目した累積スペクトル分析による診断についても検討した.研究成果については,学術論文誌に論文を投稿した.模型実験による検証実験と並行して,実際の建造物の診断実験に着手した.時間とともに部材の強度が変化する模型を検討していたが,実験の再現性と効率を考えて,強度の異なる模型を複数作成し,それぞれについて診断実験を実施してきた.また,実際の住宅に加速度ピックアップを設置し,予備実験を実施した.模型実験については,形状の異なる模型を試作して,現在はデータ収集と分析を行っている.住宅での予備実験では,分析可能であることを示す結果がある程度得られたものの,本格的な実験には診断に必要な低い周波数帯域が記録可能な測定器が必要となることから,次年度に購入して本格的な実験を試みる予定である.また,本研究で用いた診断アルゴリズムを音場のモニタリングに応用した.ハウリングの発生前に生じる音質の歪み(カラレーションと呼ばれる)を発見できることを実験により確かめた.この成果については,有審査国際会議で報告した.分析窓長と分析精度の関係について検討した.環境雑音と建造物インパルス応答の畳み込みは,それらのケプストラムの和として表現できる.建造物の雑音振動を一定時間区間(フレーム)毎に観測した場合,環境雑音の振幅ケプストラムはフレーム間で変化する.一方,建造物の劣化は環境雑音の変動に比べて十分緩やかであると仮定すると,建造物における伝達関数の振幅ケプストラムは,概ね一定な直流成分と見なすことができる.従って,時間領域で一般的に用いられるSNR(signal-to-noise ratio)と同じ要領で,観測信号ケプストラムの時間平均を,その標準偏差で除したものは,時不変な建造物のインパルス応答と時変な外部雑音のケプストラム比として考えることができる.ケプストラム比が1より大きければ伝達関数が音源に対して優位であると評価できる.本研究では,ケプストラム比を提案し,それに基づく最適な分析窓長の決定方法を試みた.強度の異なる3種類の模型での実験と実建造物での実験を実施し,提案手法の有効性を検証した.成果は電気音響研究会で報告した.現在,論文投稿に向けた準備を進めている.本研究は,雑音振動を用いた建造物のヘルスモニタリング手法についての検討である.風や交通騒音等による僅かな振動を利用した建造物の診断は,試験信号を用いないことから建造物のヘルスモニタリングとして有効とされている.しかしながら,雑音振動を利用したパッシブな診断手法では,音源の特性と伝達特性にあわせて最適な分析窓長を選択することが重要な鍵となる.本研究ではケプストラム比とそれに基づく最適な分析窓長の選択方法を提案した.模型実験では,ケプストラム比が0dB以上では建造物の伝達関数が優位に観測されていることを示した.模型実験の結果については学会・論文などでの報告ができていないものの,実際の住宅での予備実験を順調に進めることができており,さらに,分析手法を音場診断に応用できることを実験で示すなど,計画以上の成果が出ていることから,概ね順調であると判断できる.音響学模型実験の分析を進めるとともに,低周波振動を記録できるデータレコーダを新たに購入して住宅等の実際の建造物の診断実験を実施する.これらの成果について,論文・学会などで報告する.申請時の計画通り,模型実験を通して,様々な環境雑音を想定した伝達系の特徴分析手法を検討した.実験及びシミュレーションは順調に実施され,研究成果についても論文が採録されている.申請時の計画の通り,ケプストラム比による伝達関数の優位性の評価方法を提案し,その有効性を模型実験によって示した.また平成25年度の計画としいた様々な雑音環境に対応した診断アルゴリズムの検討として,雑音振動の減衰部に着目した累積スペクトル分析による診断手法について検証し,研究計画を順調に達成しつつある.

模型実験の方法を変更したことで,実験に必要な機材を簡略化することができた.国内開催の国際会議で発表することで,旅費が大幅に削減できた.これまで用いてきた実験模型のダンピング係数は実際の建造物の物よりも大きく,振動しにくい模型であった.今後,実用化を目指して研究を進める上で,どの程度のダンピング変化まで分析可能であるかを調査する必要がある.このことから,ダンピング係数が実際の建造物に近い模型を製作して,平成26年度以降のモニタリング試験を進める.同時に,実際の建造物の雑音振動も観測し,模型実験の妥当性を裏付ける分析結果を示す.実際の建造物の雑音振動の観測には,地震計等を購入する必要がある.既に提案してきた累積調波分析を用いる雑音振動からの建造物診断手法に,平成24年度で研究したケプストラム比を導入する.模型実験あるいはシミュレーションを通して,様々な環境雑音に対応した診断アルゴリズムの実現を目指す.模型実験とシミュレーションを用いて,提案する診断アルゴリズムの環境雑音の特徴と時変性に対する効果を評価する.さらに,次年度のモニタリングシステムの構築に向けた実験環境の整備と,模型の製作に取りかかる.実際の建造物の測定には,低周波振動を記録できるデータレコーダが必要であり,平成27年度に購入し住宅などの診断実験を実施する.国際会議への投稿・発表を計画していたが,論文投稿に変更したことで,外国旅費等を削減することができた.次年度以降で,分野のマッチする国際会議があれば発表する予定である.分野のマッチする国際会議があれば,積極的に発表する予定である.また実際の構造物の雑音振動の観測も必要であることから,地震計等の購入も検討する.該当なし
サプレッション配列による新規遺伝子発現抑制技術の開発とメカニズムの解明

本研究では、新規遺伝子発現抑制システムRNA silencing inducible sequence (RSIS)について解析した。RSISは約100 bp程度のDNA配列であり、その5'側と3'側に抑制したい遺伝子の一部の配列を融合して発現させると、イネにおいて転写後発現抑制を誘導できる。しかし、シロイヌナズナではその抑制の効果はみられなかった。そこで、本研究ではシロイヌナズナにおいてもサプレッション効果がある新規サプレッション配列をスクリーニングした。新規サプレッション配列はsiRNAの蓄積がほとんど確認されず、RSISとは異なるメカニズムであると考えられた。本研究では新規遺伝子発現抑制システムRSISのRNAサイレンシングの有効性の確認と、分子メカニズムを解明する。現在までの研究で、RSISはイネにおいて、いくつかの発現量が比較的高い遺伝子においてサイレンシング効果が認められている。しかしながら、シロイヌナズナでは効果が認めらていない。そこで、本研究ではシロイヌナズナにおいて(も)効果のあるRSISのようなサプレッション配列を検索することにした。まず、GFPを発現するシロイヌナズナを作製した。次に、ランダムな配列のDNAをGFPの一部のDNA配列と融合し、ランダムDNA-GFPライブラリーを作製した。このライブラリーを、GFPを発現するシロイヌナズナに導入した。形質転換後、GFPが光らなくなることを指標にスクリーニングを行い、ランダムDNA配列を同定した。本年度は、500ライン程度のライブラリー導入形質転換体を作製し、その中から20ライン程度のGFPが光らないラインをスクリーニングした。これらのラインは、世代を経てもサプレッションが継続した。これらのラインのランダム部分の配列を調べたところ、全て異なる配列であった。これらの配列の多くは、mRNAレベルでGFPの発現を抑制した。これらのサプレッション配列を、もう一度GFPを発現するシロイヌナズナに導入したところ、数ラインについてGFPの強い発現抑制が確認された。また、RNAiのサプレッションに関わる遺伝子のノックアウトラインを取り寄せ、またノックダウンラインを作製し、GFPのサプレッションが起こっているラインと掛け合わせた。現在、掛け合わせたラインを育成し、解析中である。遺伝子抑制法として用いられているアンチセンス法やRNAi法は、特許で抑えられており、新たな遺伝子抑制法の開発が急務である。本年度は、20種類程度のサプレッション配列をコレクションすることができた。これらの配列はいくつかのゆるい共通モチーフを持ち、これらがサプレッションに関わっている可能性がある。本研究では、新規遺伝子発現抑制システムRNA silencing inducible sequence (RSIS)のRNAサイレンシングの有効性の解析と、その分子メカニズムの解析を目的とする。RSISは、約100 b程度のヒトグルカゴンペプチドをコードするDNA配列であり、この5'側と3'側に、抑制させたい遺伝子の配列の一部を融合させると、転写後発現抑制を誘導できる。RSISはイネにおいて、比較的発現量が高い遺伝子でサイレンシング効果が確認されている。しかし、シロイヌナズナでは明確な効果が認められていない。そこで、本研究では、分子メカニズムの解析に有利であるシロイヌナズナにおいて効果のあるサプレッション配列を検索することにした。方法としては、まずランダムDNA配列を作製し、これらの5'と3'側にGFPの配列の一部を融合したライブラリーを作製する。このライブラリーを、GFPを発現するシロイヌナズナに導入し、GFPが光らなくなる(=サプレッションが起こる)ことを指標として、新規サプレッション配列をスクリーニングする。前年度までに、500ライン程度のライブラリー導入形質転換体を作製し、この中からGFPの強い抑制が確認された数ラインと導入されたランダム配列を同定した。これらのラインは、mRNAレベルでGFPの発現が抑制されていた。これらの配列に共通なモチーフを検索したところ、いくつかの弱い共通性を持つモチーフが見つかった。また、イネによる実験から、RSISのサプレッション効果は、RSISが融合されたmRNAの転写終了が異常になることが原因となって起こることがわかった。また、イネにおいて効果が確認されているヒトグルカゴンペプチド以外のサイレンシング配列においても、RSISと同様の経路でサプレッションが起こっていることがわかった。本研究では、新規遺伝子発現抑制システムRNA silencing inducible sequence (RSIS)について解析する。RSISは約100 bp程度のヒトグルカゴンペプチドをコードするDNA配列であり、その5'側と3'側に抑制したい遺伝子の一部の配列を融合して発現させると、転写後発現抑制を誘導できる。ヒトグルカゴンペプチド以外にも、このようなサプレッション効果のある配列はいくつか見つかっており、その他にもある程度の頻度で存在すると考えられる。

しかし、シロイヌナズナではその抑制の効果はみられなかった。そこで、まずシロイヌナズナにおいてもサプレッション効果がある配列をスクリーニングすることにした。方法としては、100 bp程度のランダムな配列のDNAを作製し、その5'側と3'側にGFPの一部を融合したライブラリーを作製する。これを、GFPを発現するシロイヌナズナに導入して、GFPが光らなくなる(=サプレッションが起こっている)ことを指標として、新規サプレッション配列をスクリーニングする。これまでに500ライン以上のライブラリー導入形質転換シロイヌナズナを得ており、そのうち、サプレッションが起こる配列を数個得た。これらの形質転換体ではmRNAレベルでGFPの発現が抑制されており、互いの配列に弱い相同性が確認された。small interfering RNA (siRNA)の蓄積を調べたところ、弱いシグナルしか確認できなかった。イネにおいては、RSIS導入形質転換体において、21-24 ntのsiRNAが蓄積していた。このことから、今回シロイヌナズナで発見したサプレッション配列は、イネとは異なるメカニズムのものと考えられる。一方、イネによる実験では、RSISとその他のサプレッション配列を調べたところ、リードスルーが高い頻度で起こっており、転写終了異常によりサプレッションが引き起こされることがわかった。本研究では、新規遺伝子発現抑制システムRNA silencing inducible sequence (RSIS)について解析した。RSISは約100 bp程度のDNA配列であり、その5'側と3'側に抑制したい遺伝子の一部の配列を融合して発現させると、イネにおいて転写後発現抑制を誘導できる。そこで、本研究ではシロイヌナズナにおいてもサプレッション効果がある新規サプレッション配列をスクリーニングした。新規サプレッション配列はsiRNAの蓄積がほとんど確認されず、RSISとは異なるメカニズムであると考えられた。ライブラリー形質転換体の作製時に、シロイヌナズナを育成しているグロースチャンバーに害虫が発生したため、実験が遅れた。また、申請者が所属する研究室がかわったため、実験のセットアップ等に時間がかかっており、研究の進行が遅れている。植物分子生物学、植物生理学前年度までに同定した数個のサプレッション配列の効果を確かめるため、GFP以外の遺伝子の抑制に効果があるかどうかを確認する。また、small RNAの有無を確認し、イネと同様な経路でサプレッションが起こっているかどうかを確認する。
自己Ia反応性T細胞トレランス成立に対するIa分子発現の量的効果の解析

(1)E^d_α遺伝子が導入されたC57BL/6トランスジェニックマウスに,アイソタイプが混合したIa分子(A_β, E_α)が存在するか否かを解析するために,その脾細胞を^<35>Sメチオニンで標識し,界面活性剤で可溶化した後,モノクローナル抗A_β抗体で免疫沈降を行い, 2次元電気泳動法にて解析した.その結果, A_β, A_αのスポット以外に,正常のE_αのスポットと全く同一の場所にスポットが検出された.これは,導入されたE_α遺伝子産物が内因性のA_β遺伝子産物と会合して,アイソタイプが混合したIa分子がこのトランスジェニックマウスに存在していることを示唆する結果である.(2)現在継代・維持されているE^d_α遺伝子ヘテロ接合体のマウス同士を交配させ,導入されたE^d_α遺伝子に関してホモ接合体の個体を作製した.ホモ接合体か否かは,正常B6マウスとの交配実験により確かめた.(3)このホモ接合体トランスジェニックマウスをBALB/cマウスと交配し, F_1マウスを作製した.このF_1マウスの脾細胞を^<35>Sメチオニンで標識し,モノクローナル抗A_β抗体で免疫沈降し, 2次元電気泳動法にて解析すると, A_β, A_αのスポット以外に, E_αの位置にスポットが検出された.これはこのF_1マウスにおいて,アイソタイプが混合したIa分子(A_β, E_α)が存在することを示唆している.(4)このようなアイソタイプが混合したIa分子が特異的な機能を有しているか否かを調べるために,リンパ球混合培養反応を行った. (BALB/c×B6)F_1マウスのリンパ節細胞を反応細胞とし, (BALB/c×トランスジェニックマウス)F_1マウスの脾細胞を刺激細胞としたリンパ球混合培養反応では,明らかな増殖反応が認められなかった.これは正常のマウスにおいてもこのアイソタイプが混合したIa分子が微量ながらも存在し, T細胞がそれに対してトレランスの状態にあることを示唆する結果である.(1)E^d_α遺伝子が導入されたC57BL/6トランスジェニックマウスに,アイソタイプが混合したIa分子(A_β, E_α)が存在するか否かを解析するために,その脾細胞を^<35>Sメチオニンで標識し,界面活性剤で可溶化した後,モノクローナル抗A_β抗体で免疫沈降を行い, 2次元電気泳動法にて解析した.その結果, A_β, A_αのスポット以外に,正常のE_αのスポットと全く同一の場所にスポットが検出された.これは,導入されたE_α遺伝子産物が内因性のA_β遺伝子産物と会合して,アイソタイプが混合したIa分子がこのトランスジェニックマウスに存在していることを示唆する結果である.(2)現在継代・維持されているE^d_α遺伝子ヘテロ接合体のマウス同士を交配させ,導入されたE^d_α遺伝子に関してホモ接合体の個体を作製した.ホモ接合体か否かは,正常B6マウスとの交配実験により確かめた.(3)このホモ接合体トランスジェニックマウスをBALB/cマウスと交配し, F_1マウスを作製した.このF_1マウスの脾細胞を^<35>Sメチオニンで標識し,モノクローナル抗A_β抗体で免疫沈降し, 2次元電気泳動法にて解析すると, A_β, A_αのスポット以外に, E_αの位置にスポットが検出された.これはこのF_1マウスにおいて,アイソタイプが混合したIa分子(A_β, E_α)が存在することを示唆している.(4)このようなアイソタイプが混合したIa分子が特異的な機能を有しているか否かを調べるために,リンパ球混合培養反応を行った. (BALB/c×B6)F_1マウスのリンパ節細胞を反応細胞とし, (BALB/c×トランスジェニックマウス)F_1マウスの脾細胞を刺激細胞としたリンパ球混合培養反応では,明らかな増殖反応が認められなかった.これは正常のマウスにおいてもこのアイソタイプが混合したIa分子が微量ながらも存在し, T細胞がそれに対してトレランスの状態にあることを示唆する結果である.
CDNAmicrarrayを用いた大腸癌発癌機構の解明と個人別大腸癌データベースの作成

大腸癌の手術症例を用いて、リンパ節転移を規定する遺伝子群の抽出、言い換えれば、リンパ節転移の有無を予測する遺伝子セットの作成を試みた。31例の大腸癌症例で再現性の確認された約10000の遺伝子の発現について、前述の階層的クラスタリングを行うと、リンパ節転移を有する症例と有さない症例が2群に分類されたが、不完全である。そこで、粘膜下層までの進達度の大腸癌14例にしぼり、病理学的にリンパ節転移のある群とない群に分け、両群間でT検定を行い、有意差のある発現を示した22遺伝子群を抽出して、再度、クラスタリングするとリンパ節転移の有無で大腸癌が2つのグループに分類された。ここで、病理学的にはリンパ節転移が証明されていない2例が、転移のない他の症例とは離れて別のグループを形成していた。この2例は腫瘍組織のリンパ管浸潤が著明であり、これらのリンパ節には病理診断では認識できなかった微小転移がある可能性が考えられた。このような解析を行う上で、作成した遺伝子セットが、新たな症例(future sample)でも、同様に予測し得るかについての検討が必要となった。病理学的に明らかに診断のついた大腸腺腫、原発性大腸癌、大腸癌転移巣をテストサンプルに用いて、大腸腫瘍の悪性状態を特徴づける遺伝子群の抽出を試みた。Pearson correlation coefficientなどの統計学的手法を応用し、最終的に独自の解析方法であるAlgorithm for Diagnosing Malignant State(ADMS)を開発し、この解析方法を用いて、future sampleについても、その悪性度の予測が可能な335個の遺伝子セットを作成した。この335遺伝子には、アポトーシス、細胞回転、接着因子に属する135の既知の遺伝子が含まれていた。この中に、臨床に応用可能な新規遺伝子が含まれる可能性があり、現在、侯補遺伝子についてのさらなる検索を行っている。DNAマイクロアレイは、現在において包括的な遺伝子解析を可能にする最も重要なテクノロジーであると考えられる。この技術は、癌およびその前癌病変、もしくは転移巣において発現が、正常と比較して亢進、もしくは低下している遺伝子を見い出し、その因果関係を解析し、膨大な遺伝子情報を絞り込み、発癌や転移を規定する新しい遺伝子を同定するための最も可能性のある方法である。マイクロアレイから得られる遺伝子情報は膨大であり、それを解析する際、最も大切なことは、その研究の背景となる知識であり、外科医としての臨床的、病理学的なアイデアをもってこのテクノロジーを利用することにより、実際の診断、治療に有用な大腸癌関連遺伝子を絞り込むことができ、ひいては創薬を推進すると共に、個々人の遺伝子発現に基いた個別の大腸癌の予防や治療法を行うことも夢ではなくなると考えられる。未知の遺伝子を含む20.160種類の遺伝子のヒトcDNAマイクロアレイを用いて大腸腺腫、癌および各種転移巣に発現する遺伝子の発現プロファイルのデータベース化し、統計学的手法であるクラスタリングを用いることにより、遺伝子データと病理・臨床データの関連性を包括的に解析し、発癌、転移に関与する遺伝子を見つける。さらに、それにより、大腸癌を従来の臨床病理学によらない、分子生物学的な層別化(molocular classification)を試みる。未知の遺伝子を含むヒトcDNAマイクロアレイを用いて大腸腺腫、癌および各種転移巣に発現する遺伝子発現プロファイルをデータベース化し、統計学的手法であるクラスタリングを用いることにより、遺伝子データと病理・臨床データの関連性を包括的に解析し、発癌、転移に関与する遺伝子を見つけ、さらに、それにより、大腸癌を従来の臨床病理学によらない分子生物学的な層別化(molocular classification)を試みることを目的に研究をすすめている。

現在、Research Genetics社から購入した20.160個のクローンで作成したヒトcDNAマイクロアレイを用いて、ヒト臨床検体から抽出したmRNAをマイクロアレイへハイブリダイゼーションする際の条件および再現性を確認した。その後、大腸癌症例の解析を開始し、35症例の大腸腫瘍(腺腫、癌、転移巣)の遺伝子発現プロファイルを用いて統計解析を行い、腫瘍の悪性度を特徴づける遺伝子群の抽出法の開発を行った。さらにその遺伝子群(現時点では335遺伝子)を用いて未知サンプルについて悪性度の遺伝子発現による予測が可能であるかについて解析を開始している(論文投稿中)。また、これらの臨床検体を用いた研究の基礎になる研究として、ヒト大腸癌細胞株の遺伝子発現解析およびこれらを用いた制癌剤感受性に関する解析を行っている。さらに、理化学研究所が作製したマウスcDNAマイクロアレイを用いて、マウス癌細胞の制癌剤感受性に関する(論文投稿中)、マウス乳癌高転移細胞株を用いた転移関連因子の解析を行った。病理学的に診断のついた大腸腺腫、原発性大腸癌、大腸癌転移巣の計35症例をテストサンプルに用いて、大腸腫瘍の悪性状態を特徴づける遺伝子群を、Pearson correlation coefficientなどの統計学的手法を用いて試み、最終的に独自の解析方法であるAlgorithm for Diagnosing Malignant State(ADMS)を開発し、この解析方法を用いて、future sampleについても、その悪性度の予測が可能な335個の遺伝子セットを作成した。この335遺伝子には、アポトーシス、細胞回転、接着因子に属する135の既知の遺伝子が含まれていた(Biochem Biophys Res Cmmun 2002 16;296(2):497-506)。この中に、臨床に応用可能な新規遺伝子が含まれる可能性があり、現在、候補遺伝子についてgene targetingを行っている。これらの335個の遺伝子の解析が個人別データベースの作成に重要であると考えられる。また、将来、個人別データベースをもとに、個別化した治療を行うために、ヒト大腸癌細胞株を用いた、フッ化ピリミジン系抗癌剤の感受性もしくは耐性に関与する遺伝子の解析を開始したが、3組の耐性株および親株の比較から、81遺伝子を抽出し、これらのセットがこの抗癌剤の感受性を予測しうることを細胞レベルの研究で確認でき、現在、臨床検体での解析、および、81遺伝子の確認実験を開始している。
ヘムを解毒する病原菌のヘム排出ポンプの構造・機能解析

ほとんどすべての生物は環境から鉄を取り込んで生体反応に利用している。鉄ポルフィリン錯体であるヘムは細胞内で合成され、タンパク質に結びつき様々な働きを行うコファクターである一方、遊離ヘムは強い細胞毒性をもつ。グラム陽性細菌は感染宿主から鉄源・ヘム源としてヘムを奪う際、遊離ヘムに晒されることから、解毒するためにABCトランスポーターであるヘム排出ポンプを作動させている。院内感染で恐れられている黄色ブドウ球菌や連鎖球菌はこのヘム排出ポンプを欠損すると血液中で増殖できなくなることからこれら病原菌の宿主感染において重要な役割をはたしていることが理解できる。申請者はこれまでにジフテリア菌ヘム排出ポンプのヘム依存的ATPase活性化、ATP結合によるヘム遊離といった生化学、およびヘム型、ATP型、フリー型の結晶構造解析を行ってきた。本年度はヘム型のより分解能の高い結晶の取得を試みた。また、ヘム結合部位の配位子であるグルタミン酸に変異導入して、膜再構成系においてヘム依存的ATPase活性を調べた。ヘム排出ポンプHrtBAでは結晶構造解析からHrtBサブユニットのグルタミン酸219が配位子としてヘムに結合していることが判明した。従来知られているヘム結合タンパク質ではヒスチジン、システイン、チロシンが配位子であるため、珍しい例と言える。アラニン、グルタミン変異ではヘム依存的ATPase活性の上昇がなくなった。また、ヒスチジン変異体では精製時から等量的にヘムを結合してることが判明した。これらの結果はポジション219におけるヘム配位結合がATPaseの活性化に関与していることを示している。黄色ブドウ球菌、連鎖球菌やジフテリア菌のようなグラム陽性病原性細菌は宿主のヘムを奪いとる一方、過剰なヘムの毒性を回避するためにヘム排出ポンプHrtBAを駆動させている。この新規ABCトランスポーターの機能と構造の知見はABCトランスポーターの輸送の仕組み解明という学術理解のみならず、抗菌剤開発の助けになると期待される。申請者は(1)ジフテリア菌由来のHrtBAトランスポーターのATPアナログであるAMP-PNP結合型の結晶構造を明らかにした。ATPaseサブユニットHrtAはダイマー構造で2分子のAMP-PNPがダイマー境界面に結合していた。トランスポーターサブユニットであるHrtBもダイマーでヘリクスI、IIどうしが向き合って接していた。HrtAダイマーの構造はこれまでに明らかにされたABCトランスポーターのATPaseドメインの普遍的構造を支持していた。一方、HrtBダイマーの構造はこれまでに知られていない新規ドメイン構造を提示した。申請者はATP結合によってヘムがかい離することを明らかにしており、今回構造はATPアナログが結合し、ダイマー構造の形成によりヘムがかい離した後の安定な構造であることが示唆された。(2)また、ヘムアナログであるマンガンポルフィリン結合型の結晶を得ることに成功した。マンガンポルフィリンもヘム同様、HrtBAのATPase活性を促進させることが示されたので、結晶中でヘム同様に結合部位に入っているものと考えられる。(3)ヘムやATPなどが結合していないアポ型の結晶を得ることができた。(4)プロテオリポソームを用いた一般的な取り込み法やドナーアクセプターリポソーム法によるヘムアナログ亜鉛ポルフィリンのHrtBAリポソームへの転移の促進が見られなかった。輸送活性を観察する新たな測定系の構築が必要である。HrtBAのAMP-PNP結合型の結晶、構造決定は迅速に遂行できた。一方、ヘム結合型では良質な結晶が得られなかった。マンガンポルフィリンもATPase活性を促進させることがわかったので、ヘムの代わりに複合体の結晶化を試みたところ、意外にも5オングストロームほどの分解能をもつ反射データが得られた。ヘム輸送活性の検出に関しては、ATPase活性に依存した輸送を裏付けるデータが得られなかった。これはヘムが水に溶けにくく、試験管、リポソームに付着したり溶液中で凝集するために試験管内の実験が困難であるからと思われる。ヘムはほとんどの生物にとって必須のタンパク質補欠分子族であり、細胞内で合成される。一方、被食者由来のヘムは捕食者にとって主要な鉄・ヘム源である。タンパク質から遊離したヘムは毒性があるため生物はその毒性を回避しながら取り込み、利用している。グラム陽性病原菌はヘムを解毒する特有のポンプHrtBAをもっている。HrtBAはABCトランスポーターに属し、その欠損株は血中での生育が阻害されることが報告されており、ヘムを排出すると考えられる。近年、黄色ブドウ球菌や連鎖球菌などいくつかの病原菌では抗生物質耐性菌が出現しており、このヘム排出ポンプは新たな創薬の対象ともなっている。本研究はこのヘム排出ポンプの生化学的性状と構造基盤を明らかにし、ABCトランスポーター分子機序解明のパラダイムとすることを目標としてきた。申請者はこれまでに発現系構築、可溶化精製法を確立し、ATPase活性、ヘム結合・解離活性を詳細に研究し、また、ATPアナログ結合型の結晶構造を決定した。本年度はヘムアナログであるマンガンポルフィリン結合型の結晶およびタンパク質単独(アポ型)の結晶を得て、大方の構造情報を得た。HrtBAトランスポーターはATPaseサブユニットであるHrtA2分子と膜結合サブユニットHrtB2分子からなる。ひとつのHrtBサブユニットは4本の膜貫通ヘリックスと200アミノ酸残基の細胞外ドメインからなる。

マンガンポルフィリンは膜から突出した4本のヘリクスの上端(細胞外ドメイン直下)に結合していた。アポ型ではこれら4つのヘリクスがずれて、膜中からヘムが侵入できる構造となっており、この構造がヘム高親和性をもたらすものと推定した。以上からヘムが膜中からヘリクスの間に入り、ATP結合によって細胞外に排出される様子がイメージできるようになった。ヘム結合型の良質な結晶が得られなかった。マンガンポルフィリンはヘム同様にATPase活性を上昇させるため、ヘムアナログとみなすことができ、良い結晶が得られた。しかしながら、結晶の分解能はまだ4オングストロームをきっておらず、また、ポルフィリン環の電子密度が十分に見られなかった。アポ型は細胞外ドメインの電子密度が見えていない。細胞外ドメインはフレキシブルな構造をとっている可能性がある。ポンプタンパク質へのヘム結合・解離は生化学的に観察できているが、膜再構成系におけるヘムの輸送は観察に成功していない。これは一般的なトランスポーターでは輸送基質膜が横断するのに対して、ヘム排出ポンプでは膜中のヘムが結合し、その後、膜外に排出されるため、検出系の確立が困難であるためである。ほとんどすべての生物は環境から鉄を取り込んで生体反応に利用している。鉄ポルフィリン錯体であるヘムは細胞内で合成され、タンパク質に結びつき様々な働きを行うコファクターである一方、遊離ヘムは強い細胞毒性をもつ。グラム陽性細菌は感染宿主から鉄源・ヘム源としてヘムを奪う際、遊離ヘムに晒されることから、解毒するためにABCトランスポーターであるヘム排出ポンプを作動させている。院内感染で恐れられている黄色ブドウ球菌や連鎖球菌はこのヘム排出ポンプを欠損すると血液中で増殖できなくなることからこれら病原菌の宿主感染において重要な役割をはたしていることが理解できる。申請者はこれまでにジフテリア菌ヘム排出ポンプのヘム依存的ATPase活性化、ATP結合によるヘム遊離といった生化学、およびヘム型、ATP型、フリー型の結晶構造解析を行ってきた。本年度はヘム型のより分解能の高い結晶の取得を試みた。また、ヘム結合部位の配位子であるグルタミン酸に変異導入して、膜再構成系においてヘム依存的ATPase活性を調べた。ヘム排出ポンプHrtBAでは結晶構造解析からHrtBサブユニットのグルタミン酸219が配位子としてヘムに結合していることが判明した。従来知られているヘム結合タンパク質ではヒスチジン、システイン、チロシンが配位子であるため、珍しい例と言える。アラニン、グルタミン変異ではヘム依存的ATPase活性の上昇がなくなった。また、ヒスチジン変異体では精製時から等量的にヘムを結合してることが判明した。これらの結果はポジション219におけるヘム配位結合がATPaseの活性化に関与していることを示している。これまでにABC排出ポンプの構造解析で輸送基質の結合が明らかになったものは2例ほどしかない。ヘムエクスポーターの構造は新規性があり、輸送の仕組みを明らかにするためにはマンガンポルフィリン結合型の構造決定が急務である。