hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢マウスモデルを用いた卵の若返りに関する研究

マウスにて加齢卵モデル(排卵後の卵の加齢:遅延受精モデル)を作成した。加齢卵は受精率の低下、受精後の異常発育が多いことが知られており、これまで我々はこの加齢卵で受精時のカルシウムオシレーションのパターンが変化することを報告した。その原因の一つに細胞内ATPが大きく関与すると仮定し、本研究では加齢にともなう細胞内ATPの変化について検討した。従来、細胞内ATP濃度の測定にはルシフェリン・ルシフェラーゼ法が用いられていたが、これは生細胞での測定が極めて困難な測定法であった。そこで細胞内ATPの変化をMagnesium-Greenにより間接的に評価することにより、生細胞での細胞内ATPのリアルタイムでの測定法を開発した。これにより細胞内カルシウム濃度とATP濃度を同時測定することが可能となった。この方法を用い、受精時のカルシウムオシレーションと細胞内ATP濃度の関係を検討したところ、マウス新鮮卵では受精直後(カルシウムオシレーション開始直後)から、細胞内ATP産生が起こることが明らかとなった。このATP産生の亢進は受精後60分以上も持続した。一方、加齢卵ではこの細胞内ATP産生は抑制されていた。この加齢卵での細胞内ATPの産生低下がカルシウムオシレーションのパターンを変化させ、直接あるいは間接的に胚発育異常を惹起していると推測された。今後、この細胞内ATP濃度測定法は、卵細胞の質の新しい評価法になりうると考えられる。また、将来的に卵細胞の質の改善をターゲットとした不妊治療の開発の一助になると考えられる。原因不明不妊の一因を卵細胞質の質の低下と考え、マウスの排卵後の加齢卵をその実験モデルとし、以下の研究を行った。【目的】我々は、排卵後の卵の加齢が、小胞体でのカルシウム(Ca^<2+>)制御能を低下させCa^<2+>オシレーションを変化させること、受精卵の発育異常を惹起すること報告してきた。この一因を加齢卵の細胞質の質の低下、特にミトコンドリアのATP産生能の低下によると仮定し、今回、受精時の細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)と細胞内ATP濃度([ATP]_i)の同時測定を行い,加齢に伴う[ATP]_iの変化を検討した。【方法】MII期卵は過排卵刺激したB6C3F1雌マウスから採取し、hCG投与14時間後に採取した卵を新鮮卵、20時間後を加齢卵とした。精子はICR雄マウスから採取した。細胞内でATPはマグネシウム(Mg^<2+>)と結合して存在することから、[ATP]_iの変化はMg^<2+>感受性蛍光色素による蛍光法で間接的に、[Ca^<2+>]_iも蛍光法により測定した。これにより新鮮卵および加齢卵の受精時の[Ca^<2+>]_i、[ATP]_iの変化をリアルタイムに同時測定した。また、リアルタイムな測定は不可能だが、量的な変化を確実に測定できるルシフェリン-ルシフェラーゼ法(L/L法)でも受精前後の細胞内ATP量を測定した。【成績】蛍光法では、新鮮卵では受精時のCa^<2+>オシレーションの開始と共に[ATP]_iが上昇した。加齢卵では[ATP]_iの上昇は新鮮卵に比べ有意に低かった。L/L法では、細胞内ATP量は受精前には新鮮卵、加齢卵で有意差を認めなかった。受精後は新鮮卵、加齢卵共にATP量は増加したが、その増加量は新鮮卵が加齢卵に比べ有意に大きかった。【結論】マウス卵では受精直後に細胞内ATPの産生亢進が起きることを明らかとした。この亢進は加齢により抑制された。Ca^<2+>オシレーションと細胞内ATP産生のパターンの解析から卵細胞質の評価が可能と考えられる。以上につき、研究成果を第59回アメリカ生殖医学会(平成15年10月13日)にて口演発表した。
ビームチルト型超高能率平面アンテナに関する研究

ビームチルト型超高能率平面アンテナを実現する際重要となる、主要な設計パラメータと放射諸特性の関係を解明し、且つ、実際にこの種の平面アンテナを試作し、各種性能をSHF帯にて検証した。すなわち、(1)ビームチルト型高能率平面アンテナを設計する際重要となる励振位相、励振振幅及び結合係数と開口能率、放射パターン及び指向性利得等につき考察を加え、主ビームを所望の方向に設定可能で、しかも開口能率90%以上の超高能率な平面アンテナを実現する際必須となる設計基礎資料を得た。(2)、(1)で得た設計方法、設計資料を遂使し多素子ビームチルト型超高能率平面アンテナを実際に構成し、電波吸収体により十分に散乱坡が抑制された電波暗室内で、開口能率、利得、及び放射パターン等を精測した。その結果、本平面アンテナの基本放射特性、すなわち、放射パターン、利得、開口能率等の実測値は、設計上有意な範囲で計算値と良く一致することが確認された。また、素子配列の効果により軸比特性等が極めて広帯域になることが明らかにされ、この種のアンテナ系の広帯域化への見通しを得た。更に、素子間隔及び素子間設定位相量とビームチルト角等の設計パラメータを新たに求め、ビームチルト型超高能率平面アンテナを試作しその諸特性につき実験的検討を加え、本設計法の妥当性を理論・実験両面より統一的に検証した。ビームチルト型超高能率平面アンテナを実現する際重要となる、主要な設計パラメータと放射諸特性の関係を解明し、且つ、実際にこの種の平面アンテナを試作し、各種性能を検証した。すなわち、(1)プリント化可能なCP-MSA素子よりなる平面アンテナに着目し、その励振位相及び励振振幅と開口能率、利得等の関係を理論・実験両面より統一的に解明し、ビームチルト型高能率平面アンテナを実現する際必須となる設計資料を得た。(2)、(1)で得た設計方法、設計資料を遂使し多素子超高能率平面アンテナを実際に構成し、電波吸収体により十分に散乱坡が抑制された電波暗室内で、開口能率、利得、及び放射パターン等を精測し、本設計法の妥当性を検証した。その結果、本平面アンテナは、その基本放射特性、すなわち、放射パターン、利得、開口能率等は設計上有意な範囲で計算値と良く一致することが確認された。また、素子配列の効果により軸比特性が極めて広帯域にわたって、良好な特性となることが明らかになり、この種のアンテナ系の広帯域化の見通しを得た。なお、今後は素子間隔及び素子間設定位相量とビームチルト角等の設計パラメータを求め、ビームチルト型超高能率平面アンテナを試作しその諸特性につき実験的検討を加え、本設計法の妥当性を理論・実験両面より統一的に検証することが必要となる。プリント化・集積化が可能で設計性に優れるCP-MSA素子を、超低損失伝送線路である一層構造ラジアル導波路より励振する、新しいタイプのビームチルト型超高能率平面アンテナの基本設計法の確立については平成6年度に達成された。そこで、今年度はビームチルト型超高能率平面アンテナを構成する際重要となる設計上の問題点について総合的考察を加えた。すなわち、(1)素子間隔及び素子間設定位相量とビームチルト角等の関係を求め、次いで、ビームチルト型超高能率平面アンテナを実現する際必須となる、素子間相互結合量に関する設計パラメータを決定した。検討結果によると、本平面アンテナの素子アンテナに係る素子間相互結合量は、ビームチルト角等、放射パターンに関連するパラメータには顕著な影響を与えないことが明らかにされた。(2)、(1)で決定された設計資料を遂使し、30°前後のチルト角を有するビームチルト型超高能率平面アンテナを試作し、その諸特性につき実験的検討を加え、本設計法の妥当性を理論・実験両面より統一的に検証した。
筋音によるヒトの運動時における粘弾性調節機構の解明

自転車こぎ運動と歩行を対象として,運動時の誘発筋音を計測するシステムを構築した.自転車こぎ運動では,ペダルを踏み込むときの大腿の筋を電気刺激したときの誘発筋音から,筋の弾性係数を推定した.弾性係数は,自転車こぎ運動の負荷の大きさに対して線形に変化することを明らかにした.歩行では,踵接地時に下腿の脛の筋を電気刺激したときの誘発筋音から弾性係数を推定する方法を新たに開発した.また踵接地時には椅子に座って安静にしている場合と比較すると,弾性係数が一桁以上大きくなることを明らかにした.トレッドミルを歩行中に総腓骨神経に電気刺激を与えて筋音を計測するシステムを構築し,誘発筋音のみを抽出することに成功した.まず,膝関節角度,足関節角度と筋活動の関係を調べた.関節角度はゴニオメータで,筋活動は筋電計で計測した.その結果,踵接地の前0.2秒から後0.2秒で筋活動が高くなった.そこで,靴の中敷に薄型のフットスイッチを設置して,踵が接地したとき,2回に1回の割合で電気刺激を与えるよう回路を作成した.被験者にメトロノームを聴かせて一歩行周期を1.5秒として3 km/hで240秒歩行させて筋音を計測した.踵接地をトリガとして,電気刺激(パルス幅500μs,刺激強度25 mAまたは8 mA)を加えたときと加えなかったときの筋音をそれぞれ同期加算平均した.歩行のための随意収縮による筋音は加算平均すると零になる.一方,歩行そのものによる加速度は,電気刺激を加えるときと加えないときで理想的には同一の経時変化を示すので,電気刺激を加えたときの信号から加えなかったときの信号を減算すると,電気刺激によって誘発された筋音のみを抽出することができる.抽出された筋音は,電気刺激直後から0.1秒までの区間で減衰振動を示した.刺激強度が25 mAのとき第一陽性ピークは0.023秒に現れ,その大きさは4.6 m/s2であった.第一陰性ピークは0.036秒に現れ,その大きさは-3.8 m/s2であった.刺激強度が8 mAのときにも同様に刺激直後から0.1秒までの区間で減衰振動が計測された.また第一陽性ピークは0.023秒で3.4 m/s2であり,第一陰性ピークは0.036秒で-2.8 m/s2であった.刺激強度が弱いと誘発筋音のピークが小さくなったこと,および誘発筋音のパワースペクトルの周波数帯域から,構築したシステムによってトレッドミル歩行中の誘発筋音のみを抽出できた.自転車こぎ運動と歩行を対象として,運動時の誘発筋音を計測するシステムを構築した.自転車こぎ運動では,ペダルを踏み込むときの大腿の筋を電気刺激したときの誘発筋音から,筋の弾性係数を推定した.弾性係数は,自転車こぎ運動の負荷の大きさに対して線形に変化することを明らかにした.歩行では,踵接地時に下腿の脛の筋を電気刺激したときの誘発筋音から弾性係数を推定する方法を新たに開発した.また踵接地時には椅子に座って安静にしている場合と比較すると,弾性係数が一桁以上大きくなることを明らかにした.1.自転車こぎ運動中の筋音,筋電,膝関節角度および足関節角度を計測するシステムを構築した.対象とする筋を大腿の筋である外側広筋とした.予備実験により,ペダルを踏み込むときで膝関節角度が80度のときに筋活動が大きくなった.そこで膝関節角度が80度で,ペダルを踏み込むとき(down phase)と引き上げるとき(up phase)に電気刺激を皮膚の上から筋に与えて筋音を計測した.また,自転車漕ぐ運動による加速度を取り除くため,電気刺激を与えないで同様の計測を行った.筋音のピークはdownphaseでは電気刺激から0.020秒後に,up phaseでは0.026秒後に観測された.また平均パワー周波数はdown phaseでは23.6 Hzでup phaseでは19.3 Hzであった.これらのことは,固有周波数が高くなっていることを示しており,筋の弾性が増加していることを示すものである.加速度センサを用いる筋音計測では動作による加速度が筋音に混入することが問題であり.また筋音から筋の弾性を推定するためには運動のための筋活動に筋音を消去し,電気刺激による筋音のみを抽出する計測・解析システムの構築に成功した.2.筋音のシステム同定による解析においては,筋線維が筋の走行方向に平行な筋(平行筋)では,入力が電気刺激で出力が筋音であるシステムの伝達関数の次数が筋線維が筋の走行方向に対して傾斜している羽状筋の6次から4次に低下することを明らかにした.これは,羽状筋では筋線維の短縮が皮膚表面の振動として直接観測されるが,平行筋では筋線維の側方への拡大が筋線維の特性を表す振動して皮膚表面で観測されるため,相対的に信号の振幅が小さく,同定されないためであると考えられる.自転車漕ぎ運動を対象として,負荷とペダルの回転数を様々に変化させ,膝関節角度が80度のときに外側広筋に電気刺激を加えて誘発筋音を計測した.筋音のセンサにはコンデンサマイクロフォンを用いた.計測される信号には,誘発筋音に加えて随意筋音と大腿の動きによる振動が含まれる.そこで,同期加算平均して随意筋音を取り除いた.つぎに電気刺激を加えなかったときの信号を同期加算平均して大腿の動きによる振動を求めてこれを前述の信号から取り除いた.

誘発筋音のシステムを同定したところ,安静時の変位筋音と同様に3次のモデル(筋音2次+マイクロフォンの回路1次)で近似できた.伝達関数の極から固有周波数を求めて,また被験者の体重から大腿の質量を推定して,弾性係数を求めた.弾性係数は,自転車漕ぎ運動におけるパワー出力に線形に増加することを明らかにした.歩行を対象とした実験では,電気刺激を加えると姿勢にわずかに変化があり,それを立て直そうとする動作が含まれるため,自転車漕ぎ運動と同じ計測方法では,システム同定法を適用できるSN比の信号を抽出することができなかった.そこで,電気刺激を加えないときの歩行による振動(加速度)を自己回帰モデルで近似し,これをもとにカルマンフィルタを構成して,誘発筋音を含む信号を平滑化した.平滑化した信号は歩行による加速度である.これを誘発筋音と歩行による加速度を含む信号から引いて誘発筋音を抽出した.誘発筋音のシステムは,安静時の加速度筋音と同様に6次のモデルで近似できた.伝達関数の極から固有周波数を求めて弾性係数を推定したところ,踵接地時には安静時と比較すると,弾性係数が20倍以上増加することを明らかにした.本研究で提案する方法によって,初めて歩行時の弾性を推定することができた.計測工学歩行は前年度に計測システムを構築した自転車こぎ運動に比べて,運動そのものの周期毎の変動が大きいことが予想されたが,一回の試行で電気刺激ありの信号となしの信号を交互に計測するシステムを構築することによって,歩行の動作そのものによる加速度を十分に取り除くことができ,次の解析に進むことができる誘発筋音を抽出することができた.計画通りに自転車こぎ運動中の電気刺激による誘発筋音を計測するシステムを構築することができた.また,ペダルを踏む込むときと引き上げるときの筋の弾性の変化を間接的に示すことができた.自転車漕ぎ運動および歩行時の誘発筋音を多数の被験者を対象として計測する.このとき,自転車漕ぎ運動では負荷の大きさや周期を変化させる.歩行では歩行速度を変化させる,また,抽出した筋音についてシステム同定法を適用し,同定した伝達関数の極から固有周波数を求める.固有周波数は,筋の弾性の指標である.自転車漕ぎ運動中に電気刺激を与えたときの誘発筋音のSN比を向上させて,システム同定により直接的に筋の弾性の変化を調べる.トレッドミル上を歩行しているときの,筋電,筋音,膝関節角度および足関節角度を計測するシステムを構築する.歩行時の誘発筋音から筋の粘弾性を推定する解析方法を確立する,該当なし
酸化ストレス誘導蛋白質であるＷＤＲ35/ｎａｏｆｅｎ遺伝子の転写制御因子の同定

WD-repeat domainを持つ蛋白質WDR35/naofenの発現調節機構の解明を目的として、転写因子の結合配列を変異させた各種プロモーターを用いたレポータージーンアッセイにより転写調節部位を特定し、プロモーター活性に必要な最小領域を確定できたした。また、ゲルシフトアッセイとChIPを用いて転写因子EGR-1が本プロモーターに結合することを同定できた。さらに、bupivacainはEGR-1の活性化を介してWDR35/Naofenの発現を増加させることが解明した。マウスのNeuro2a細胞においてブピバカインやH2O2が活性酸素(ROS)の産生を介してWDR35/naofen発現を増加させるが、その機序についてはほとんど不明である。本研究では、WDR35/naofen遺伝子のプロモーター領域を解析し、その転写を調節する因子を同定した。ルシフェラーゼアッセイを行った結果はWDR35/naofen遺伝子の翻訳開始点上流(-345-37bp)に強いプロモーター活性を認められた。コンピューター解析した結果、WDR35/naofenのプロモーター領域に転写因子NF-κB、AP-2とEgr-1など結合部位の存在が予測した。転写因子の結合部位に変異を導入したコンストラクトを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行い、予測したAP-2あるいはEgr-1の結合部位(-49-40bp)はWDR35/naofen遺伝子の発現に必須であることが明らかとなった。そこで、この結合部位を含む領域をプローブとしてNeuro2a細胞核蛋白質抽出液と反応させた結果はゲルシフトが起きた。標識しないプローブを過剰添加するコンペティション試験ではシフトしたバンドは消失し、結合部位に変異を入れたプローブの添加はゲルシフトに影響しなかった。さらに特異的なEgr-1抗体はシフトしたバンドを消失させることから、Egr-1がWDR35/naofenプロモーターに結合することが示唆された。Chip assayを行い、Neuro2a細胞内においてEgr-1がWDR35/naofenのプロモーター領域に結合することを示唆した。最後に、Neuro2a細胞においてEgr-1の強制発現はWDR35/naofen発現を増加させることが示した。以上のことから、Neuro2a細胞においてEgr-1がWDR35/naofenのプロモーター活性を制御していることが明らかとなった。WDR35/naofen遺伝子の上流に存在するプロモーター領域を組み込んだルシフェラーゼレポータープラスミドの作製し、ルシフェラーゼアッセイを行い、WDR35/naofen遺伝子プロモーターを同定した。さらに、予測した転写因子の結合部位に変異の導入によってプロモーター活性に対する影響を検討し、WDR35/naofen遺伝子発現に必須領域を解明したと同時に、基本転写因子の結合部位も同定できた。ゲルシフトアッセイを用いて、Neuro2a細胞から抽出した核蛋白質と結合するプロモーター領域を同定した。また、特異的なEgr-1抗体を用いて、WDR35/naofen遺伝子プロモーターにEgr-1の結合を証明した。さらに、Chip assayを行い、Neuro2a細胞内においてEgr-1がWDR35/naofenのプロモーター領域に結合することを確認できた。今、これらの結果をまとめ、論文を作成している。マウスの神経芽細胞腫Neuro2A細胞を用いて、酸化ストレスによるWDR35/naofen発現増加の制御機構とそれによって誘導したアポトーシスについて検討した。Real-time PCRとwestern blot法を用いて、過酸化水素はEgr-1の活性化とWDR35/naofenの発現に対する影響を遺伝子レベルとタンパク質レベルで調べた。過酸化水素を投与した細胞において、投与後6時間からWDR35/naofenの発現が有意に増加し、12時間後に最大におなったと同時に、caspase-3の活性も増大した。同様に、過酸化水素は濃度依存的及び時間依存的にEgr-1の発現も増加させた。Wild-type Neuro2a細胞と比較して、Egr-1 overexpressionした細胞において過酸化水素はWDR35/naofen発現をさらに有意に増加させたと同時にアポトーシスも促進した。また、WDR35/naofen overexpressionした細胞において、アポトーシスが有意に増加したことに対して、siRNAによるWDR35/naofen発現のノックダウンは、過酸化水素による誘導したアポトーシスを明らかに抑制した。以上の結果から、Neuro2A細胞において過酸化水素によって誘導した酸化ストレスは転写因子であるEgr-1を活性化し、WDR35/naofen発現を増加することを介してアポトーシスを促進する可能性が示唆された。酸化ストレスによる神経細胞障害にWDR35/naofenが関与するという新しい発生機序を見出し、酸化ストレスによる神経細胞障害の治療に際して、WDR35/naofenが新た分子標的となる可能性が考えられる。我々はマウスのマウス神経芽細胞腫Neuro2A細胞を用いて、転写因子Egr-1がWD40 reapeatドメンを持つ蛋白質WDR35/naofenのプロモーター活性を制御することを研究してきた。Neuro2A細胞において酸化ストレスは転写因子であるEgr-1を活性化させ、WDR35/naofen発現を増加することを介してアポトーシスを誘導するという新しい機序を見出した。転写因子Egr-1によってWDR35/naofen発現を調節されることを確認するため、siRNAによるEgr-1の発現をノックダウンし、、WDR35/naofen発現に対する影響を調べていた。

三社のメーカーからEgr-1に対するspecific siRNAを5セット購入し、ノックダウン実験を行ってきたが。すべてのsiRNAはEgr-1の遺伝子発現をノックダウンできななかった。原因はまた不明であるが、その中の1セットsiRNAが他の細胞においてEgr-1の遺伝子発現を効率よくノックダウンすることが報告されていたにもかかわらず、Neuro2a細胞においてEgr-1のノックダウンできなかった。これから、CRISPR-Cas9システムを用いて、Egr-1遺伝子のノックアウト細胞を樹立すると予定している。マウスの神経芽細胞腫Neuro2a細胞を用いて、ブピバカインはWDR35/naofen発現に対する影響とその発生機序、特にEgr-1の活性化との関連について検討した。Real-time PCRとwestern blot法を用いて、ブピバカインはEgr-1の活性化及びWDR35/naofenの発現に対する影響を調べた。その結果はブピバカイン投与1時間後に、Egr-1の発現が遺伝子レベルとタンパク質レベルで増加し始め、2時間に最大になり、その後減少した。これと同時に、WDR35/naofenの発現もブピバカイン投与1時間後に増加し始め、9時間後に最大となった。さらにEgr-1遺伝子の強制発現はWDR35/naofenの発現に対する影響も調べた。Mouse Egr-1遺伝子を強制発現させたNeuro2a細胞においてEgr-1の発現が増加すると同時に、WDR35/naofenの発現も増加した。これに対して、コントロールであるp3.0ベクターの導入はEgr-1及びWDR35/naofenの発現に影響を及ぼさなかった。さらに、Egr-1遺伝子の強制発現細胞においてブピバカインの投与はさらにEgr-1の発現を増加させたと同時に、WDR35/naofenの発現もより多く増加させた。以上の結果から、Neuro2a細胞においてブピバカインは転写因子であるEgr-1を活性化させ、WDR35/naofen発現を増加させることを明らかにした。これらの結果からブピバカインによって惹起した神経細胞障害においてWDR35/naofenが関与するという新しい発生機序を見出した。さらに局所麻酔薬による神経細胞障害に対する新しい治療法の開発に役立つものである。WD-repeat domainを持つ蛋白質WDR35/naofenの発現調節機構の解明を目的として、転写因子の結合配列を変異させた各種プロモーターを用いたレポータージーンアッセイにより転写調節部位を特定し、プロモーター活性に必要な最小領域を確定できたした。また、ゲルシフトアッセイとChIPを用いて転写因子EGR-1が本プロモーターに結合することを同定できた。さらに、bupivacainはEGR-1の活性化を介してWDR35/Naofenの発現を増加させることが解明した。
Gタンパクヘテロ欠損マウスにおける腫瘍発生と石灰化

Gsαヘテロ欠損マウスは、GNASヘテロ欠損マウス(エクソン2ヘテロ欠損)と野生型マウスと交配することにより作成,JSPS fellowship(2002-2003)として所属していた研究室より譲渡可能であったが研究代表の異動に伴い、実験の継続が不可能となった譲渡元研究室での、データは、一部使用可能であった。腫瘍は、生後3ヶ月までの、発生はないが、生後6ヶ月をすぎると、20匹中5匹(25%)、生後6ヶ月をすぎると、1年を過ぎると、19匹中11匹(58%)に、発現がみられ、成長とともに、頻度が増加した。父アリル欠損マウスと母アリル欠損マウスにおける腫瘍発生の頻度に差は認めなかった。そのため、腫瘍発生とインプリントとの関連は示唆しなかった。腫瘍は、耳、足、尾の皮下に発生しており、体幹部発生はなかった。組織は、線維腫や血管線維腫の良性軟部腫瘍であった。発生部位より、外傷と関連した、反応性増殖の可能性が考えられた。Gsαへテロ欠損マウスに発生する腫瘍に対する、エピジェネティクス解析に備え、クロマチン免疫沈降(Chromatin immunoprecipitation:ChIP)のコントロールを行った。正常マウス組織(肝臓、筋肉)約500mg片を、PBSにてホモジナイズした、氷上にて4%ホルマリンにより、クロスリンクさせた。その後、界面活性剤を含むPBSバッファにて再度、軽くホモジナイズした。遠心して、Lysis Bufferを用い、クロマチンを抽出した。超音波破砕器を用いて、クロマチンDNAを、2-300bpのピーク、500bp未満となるように、断片化した(アガロースゲルにて確認)。クロマチン免疫は、クロマチン免疫沈降キット(Upstate社)を用い、抗体は、抗アセチル化ヒストンH3を用いた。免疫沈降し、リバースクロスリンクの後に、DNAを抽出した。ターゲット領域として、GAPDH領域を増幅させた。以上のコントロール実験を、クロスリンク時間、超音波破砕時間等の至適条件を確認した。当初、GNASヘテロ欠損マウスにて、腫瘍発生の頻度と、その腫瘍の特徴と確認する予定であったが、改変マウスの入手が遅れたため、クロマチン免疫沈降のコントロール実験を先に行った。コントロール実験であったため、当教室にて購入済の器械、キット、試薬を用いたため、当該科学研究費は、使用しなかった。Gsαへテロ欠損マウスは、GNASヘテロ欠損マウス(エクソン2へテロ欠損)と野生型マウスと交配することにより作成する。母方アリル欠か、父方アリル欠損かどうかは、遺伝子変異マウスが、父か母かにて判断可能となる。GNASへテロ欠損は、申請者が日本学術振興会海外特別研究員JSPS (Japan Society for the Promotionof Science)fellowship (2002-2003)として、所属していた研究室(Weinstein研究室)より、譲渡可能であるが、改変マウスの入手がおくれ、統計に必要な、マウス数が不足した。そのため、クロマチン免疫沈降法のコントロール実験を優先した。Gsαへテロ欠損マウスにおける、腫瘍発生の頻度を調べる予定であるが、1年間の解析期間が必要であるため、当該科学研究費期間での十分な解析が困難と予測される。そのため、腫瘍発生頻度等の統計は、譲渡元研究室における進行中のデータを合わせての解析を検討している。遺伝子改変マウスのフォローにて、父アリル欠損マウスと母アリル欠損マウスにおける腫瘍発生の頻度に、差があるようならば、腫瘍発生とインプリントとの関連を強く示唆する。そのため、インプリント関連する実験を進める。具体的には、Gsα発現量を、定量的PCRにて比較する。次に、インプリンティングと関連するヒストン修飾をクロマチン免疫沈降法にて調べる。父アリル欠損マウスと母アリル欠損マウスにおける腫瘍発生の頻度にて、差がない場合は、腫瘍の生物学的解析(遺伝子、タンパク発現)を優先する。クロマチン免疫沈降法、PCR,免疫染色の実験となるため、それぞれのキット、試薬を購入する。購入予定抗体として、腫瘍の生物学的性質の解析のため、PCNA、マトリックスメタロプロテアーゼ、ヒストン修飾関連抗体等を予定してる。器械としては、ピペット、電気泳動槽を購入予定。
看護学でのサービスラーニングを応用した都市型・社会参加型カリキュラム開発と評価

平成17・18年に、学生ボランティア用Web学習プログラムを、学生と協働して、作成した。平成19年には、試用し、平成20年にボランティア学生用サイトの学生のログ(活動日誌)や、活用に関する学生の意見、関わった教員の意見から評価した。ボランティア学習一般サイトは、現在も、毎月500600のアクセスがあり、使用されている。ボランティア学生用サイトでの活動記録は、webでの学習方法は馴染みが薄く、多くの学生の使用には至らなかったが、試用した学生は多くの学びを報告していた。教員の学習支援は、学生へのガイダンスや学習中の支援に関しては、更なる方策が必要であると評価された。今後、Webベースのサービス・ラーニング科目として改善する。本年度、社会参加型カリキュラム開発のために下記の予備的調査を行なった。1)米国サービスラーニング先進校のプログラム調査:サービスラーニングの全体システムを探索するため、ワシントン大学看護学部の現地調査とウイスコンシン大学オークレア校サービスラーニングセンターのセンター長を招聘し情報収集を行なった。ウイスコンシン大学では受講生の登録から、受講のオリエンテーション、受講中の学習管理、履修管理をコンピューターで行っており、電子学習(e-ラーニング)は地域のあらゆる施設で学生が活動している場合有効であると考えられた。2)プログラムデザインと学習コンテンツ作成:研究者らの先行研究から導いた教育プログラム、(1)ヘルス・ボランティア出会い(準備)コース、(2)ヘルス・ボランティア、入門コース(基礎編)、と(3)領域別知識と技術コース、(4)ボランティア相互支援コースの中で、(1)と(2)をe-ラーニングでの学習プログラムと考え、コンテンツ作成準備を行なった。既存のボランティアに関するテキスト情報から、本e-ラーニングでの学習コンテンツ概要を作成した。そして、e-ラーニングのシナリオ作成、オーサリング、システム作成、そして、学生の振り返りを促進する、記録とその教員のフィードバックのための掲示板機能でのコミュニケーション機能の強化システム設計を専門家と構築開始した。3)ボランティアの場および学生受け入れ先の連携ニーズ調査と場の拡大活動:大学の所在する地域での学生受け入れパートナーの連携ニーズ調査を開始した。場の拡大の一貫として、国際ボランティアの場の拡大のため、タイ、マヒドン大学医学部看護学科地域看護学と、相互に学習環境を視察し、教育連携を協議し、学生の能力にあったフィールドについて協議した。大学院へのボランティアの場として、可能性の探求のために、パキスタン北部地震後の支援依頼に対応し、ニーズを調査した。本年度、計画した2つの目標に沿った研究活動を行なった。1.ボランティアについての学習サイト(一般サイト)とボランティア学生のためのe-ラーニングサイトを、『ヘルスボランティア・コミュニティ・e-センター』と命名し、研究分担者、ソフト開発会社とボランティア学生をメンバーとするミーティングを重ね開発し、平成19年1月にサイトをオープンした。1)一般公開のボランティア学習サイトに計9コンテンツ:(1)ウエブサイトの紹介、(2)ボランティアとは、(3)ボランティアの基本姿勢、(4)コミュニケーションについて、(5)ヘルス・ボランティアの1日、(6)みんなの活動の安全を守るために、(7)ボランティアギャラリー、(8)ボランティア情報リンク、(9)スペシャルインタビュー、を作成した。2)ボランティア「学生サイト」は登録制とし、活動を通しての学生の学習支援と、活動自体を支援する目標で、5コンテンツ:(1)ニュース、(2)フォーラム、(3)リフレクション、(4)e-ラーニング、(5)ボランティアリンク、を作成した。2.ボランティア受け入れ先の協働・連携に関するニーズ調査を、学生ボランティアを受け入れている国内、海外機関(学部学生はタイ、大学院生はパキスタン)の受け入れ担当者から学生受け入れ連携のニーズ調査を行なった。国内の受け入れ先は、ボランティアの仕事は専門性を必要としない業務であるが、存在が重要であるので、無断の休みがないように、学生ボランティアのリーダーとの連絡やコミュニケーションの手段が重要であることが語られた。海外の受け入れ機関の担当者は、日本のボランティア学生の興味と学習能力に合わせて受け入れたいとのことであった。教員に対して、事前の学生のオリエンテーション、現地での健康管理を要望した。学生は、事前のオリエンテーションが有用で、重要であると述べられた。来年度、本ウエブサイトの活用度と活用している学生、管理している側の評価を行なってゆく。今年度の目標は、へルスホランティアについての一般学習サイド、および、ボランティア学生用サイドでの活用と学習効果を評価し、Web上の問題点を抽出し、改善することであった。1.一般へルスボランティア学習サイトの利用は、開始した2007年4月から2008年3月までで、113,724のヒットが記録され、14,448のアクセスを数えた。学生ボランティアのフォーカスグループでは、Webのアクセスの場所が不明確で、利用できなかったと報告された。

大学Webからアクセスできるよう、改良を加え、Webに関しての「必要な情報は得られたか」、「年齢」「性別」に関してアクセス者のフィードバック情報を得るよう改良し評価を始めた。ボランティア活動報告(リフクションノート)は、今年度、19件であった。この活用は、ボランティア活動をしている学生の数と比較して多くはない。その要因調査を、ボランティア学生の中で、Web上の振リ返りノートの利用をしないかった学生の中で調査協カの得られた学生からフォーカスインタビューで利用に関する調査をした。一次分析結果として、1)現在はボランティア活動を義務ではないため、記録作成は動機付けとはならない、2)ボランティアの記録や同-ボランティア学生間の連絡携帯電話を使用してのメールであるため、PC上のコンピュータを使う時間とエネルギー必要である。3)Web上で、彼の学生の経験を参考にしたいが、現在のWebでは、彼学生の経験の共用はできない。4)デジタルに馴染んでいない、等であった。2.プログラム改善計画Webアクセスしやすく、大学Webからリンクできるよう改善する。加えて、早期にボランティア学習をカリキュラム化し、その教授方法として、Web上学習を学生に普及し、ランティア活動を支援する必要があり、来年度、サービスラーニングとして体系化する予定である。最終年度の研究成果:研究目標に沿って、Web上ヘルス・ボランティアの1)一般学習サイト評価、2)学生サイトトのリフレクションを目的とした活動記録(ログ)の使用状況の評価を行い、3)来年度、1・2年生を象に、Webと対面クラスを組み合わせたサービスラーニング科目のシラバスを準備し開講の準備をした。1)一般サイトの利用状況:2007年1月から2008年11月までの約2年間で14.768件のアクセスがあり、1年1目が700件前後であり、2年目め600件前後のアクセスを維持した。サイトはボランティアの定義から安全な活動の進め方まで、詳細で分かりやすい情報であったと考えられた。Webは科目の一部で活用できると考えられた。2)学生サイトの試用情況:(1)学生ログ:提出されたログは、登録した122名中9名で延べ30件であった。ログを提出した学生は、“記録を残すことは意義がある"と記録した.面接した学生の多くは、記録をする・振り返り活動かち学ぶという考えはなかったと報告していた。書かれ光記録内容は、活動内容、感じたこと、今後の活動と活動からの学びがログから評価できた。(2)教員のWeb学習支援の関わりと評価:多くの教員がプログラムを開発するまでは関われたが、プログラム試用が始まってからは、Web管理をする教員のみが関わることになった。
並列計算技術を用いたタンパク質・核酸複合体のダイナミクスの解析

平成14年度は、前年度までに性能を向上させたエネルギー・1次・2次微分の並列計算システムを用いて、GlnRSとの結合定数が野生型の30倍であるGln-tRNAアプタマーと野生型Gln-tRNAのダイナミクス解析を行った。またこれまでの二面角系基準振動モード解析計算に加えて、並列分子動力学計算により、アプタマーと野生型それぞれのフリー状態および複合体形成状態のダイナミクスを解析した。Gln-tRNA分子では、フリー状態でループの内側でスタックしていると思われるアンチコドンループの塩基が複合体構造中ではループの外に出ているので、フリー状態の立体構造がX線結晶解析により得られているPhe-tRNAのアンチコドンループを参照構造として、Gln-tRNAのアプタマーおよび野生型のフリー状態の立体構造をモデリングした。これらの構造およびGlnRSとの複合体構造に対して水分子を陽に含んだ系において並列分子動力学計算を行い、得られたトラジェクトリを主成分解析によって解析した。これにより、基準振動モード解析で得られていた大きな低周波運動が分子動力学計算でも見られることを確認し、さらにアプタマーと野生型においてフリー状態のダイナミクスと複合体形成に伴う構造変化の関係・相違を解析することができた。さらにElastic Network Modelによるダイナミクス解析システムを開発し、これまでのシステムに加えて大規模なtRNA-ARS複合体のダイナミクスを簡便に見積もることができるようになった。これらのシステムを統合的に用いて、Gln系以外の数個のtRNA-ARS複合体について、フリー状態と複合体形成状態のダイナミクスの相違を解析するための初期の結果を得た。また、これまでの成果であるGln系のtRNA-ARS複合体の二面角系基準振動モード解析結果をまとめた論文が、Chemical Physics Letter誌で印刷中である。平成13年度は、比較的分子量の小さいGln系のtRNA-ARS複合体について二面角系基準振動モード解析をすすめ、フリー状態と複合体形成状態において低周波数領域の数十個のモードの相関解析を行った。その結果、ARSは複合体形成に伴うダイナミクス変化が小さいのに対してtRNAは大きくダイナミクスが変化することを明らかにし、さらにフリー状態のtRNAにすでに内在している複合体形成状態でのモード運動を同定した。またGlnRSとの結合定数が野生型の30倍であるGln-tRNAアプタマーと野生型のダイナミクスの比較解析を行い、低周波数領域において両者に共通するモード運動と相違がみられたモード運動をそれぞれ明らかにした。これらの成果は、生物物理学会第39回年会(平成13年10月に大阪にて開催)および生体分子ダイナミクス及びプリオン機構研究会(平成14年2月に岡崎にて開催)にて発表した。また申請者が開発したエネルギー・1次・2次微分の並列計算アルゴリズムをさらに改良し、大幅な性能向上を実現した。この方法は、ユーザが独立に計算可能な単位「サブタスク」の間の依存関係を指定すると、システムが自動的にサブタスクをプロセッサに配置して並列計算を行い、かつ必要なデータ通信を行ってくれるというものである。システムは、遺伝的アルゴリズムを用いて、負荷の分散と通信コストの最適化を同時に満たすようなプロセッサ割り当てを効率的に探索する。これにより、Gln系のtRNAを計算対象として用いた場合、プロセッサ台数が60台のときの並列化効率をこれまでの方法の約9倍にすることができた。これらの成果は、Journal of Computational Chemistry誌に掲載された。
ハフニウム超伝導体を用いた究極の感度を持つ超伝導検出器への挑戦

本研究の目的はハフニウム超伝導体(Hf)を用いて世界最高感度の超伝導トンネル接合素子(STJ)を開発し、宇宙・素粒子物理実験における実用化の第一歩を踏み出すことである。STJは超伝導検出器の一種であり、信号電荷を一つ励起するのに必要なエネルギー(Δ)が半導体検出器と比べて35桁小さいため、信号が大きくなり高感度・高分解能な検出が可能となる。HfのΔは現状で世界最高感度であるAl超伝導体に比べても1/8と小さいため8倍の高感度化が可能である。初年度は、作ったHf-STJおよびHf/Al-STJのサンプルをこれまでに達成できなかった極低温にして性能評価を行った。当初は筑波大学にある希釈冷凍機を補修することにより、今の130mKより低い温度を達成する予定であったが、結果として補修は費用対効果が良くないことが分かり、別の方法を取ることになった。代表者が共同研究を行っている、韓国のグループが持っている断熱消磁冷凍機(ADR)を借りて用いることで、35mKというこれまでの最低温での測定を実施した。3月にHf-STJを35mKに冷やし、55Feの5.9keVのX線を照射した。その結果、Hf-STJでは世界で初めてX線(1光子)の信号を確認することに成功した。また、冷やすことによって障害となっていた漏れ電流が低減できることも確認した。現在、代表者の所属研究室において詳細な解析を行っているところである。元々の予定では、初年度で手持ちの希釈冷凍機を補修して130mK以下の低温を実現する予定であったが、その代わりに共同研究を行っている韓国グループの冷凍機を用いて実験を行った。予定していたIV特性の調査だけにとどまらず、55Fe線源による5.9keVのX線を照射した試験を行った。この結果、Hf-STJとしては世界で初めて1光子の信号をとららえることに成功した。最終目標の遠赤外線1光子分光までは、まだエネルギーで数桁の違いがあるが、極めて重要な一歩であり、初年度としては十分な結果を得ることが出来た。最終年度は、引き続きHf-STJの作成と性能評価を推進する。6月には再度韓国での冷凍機試験を予定している。超伝導コイルを用いて磁場を印加し、測定のノイズとなるジョセフソン電流を低減することで、前回よりも感度の高い測定を実現する予定である。また、その結果を詳細に解析し、7月にある18th Workshop on Low Temperature Detectorsにおいて報告する。また、この成果はジャーナル論文として投稿する予定としている。当初予定していた希釈冷凍機の補修を取りやめ、浮いた経費で韓国での測定を行った。その差額として30万円ほどの差異が生じた。
組み紐理論とフレアー理論を用いた結び目と横断的結び目の研究

ホップ・フライプで移り合う閉4組み紐の対で横断的結び目とみたとき異なるが自己絡み数が同じものを構成した。また閉3組み紐と閉7組み紐の対についても同様の例を構成した。pとqを整数とするとき(p,q)型トーラス結び目の2橋指数を決定した。また交代的な射影図を持つ閉組み紐についても2橋指数を求めた。境界付きフレアーホモロジー理論において曲面の(境界を止めた)写像類群の不変量が定義されている。この不変量を種数が2で境界が1つの円周からなる曲面の写像類群のうち1次元ホモロジー群への作用が自明であるトレリ群に対して計算した。結び目の立体的な表示方法の1つである橋表示から1方向の幅を測ることによって橋指数が定義されている。この橋指数を2次元的な幅を測ることによって拡張し2橋指数という結び目不変量が定義されていた。(p,q)型トーラス結び目の2橋指数を昨年度に決定した。今年度はこれを拡張し閉組み紐表示されたとき交代射影図を持つような結び目に対して2橋指数は交点数より2だけ大きいことを示した。ヘガードフレアー理論における横断的結び目の不変量を計算することにより次に挙げる4つの特徴を持つ横断的結び目対S, Tの具体例を構成した:S(4)はSから4回の安定化操作を施して得られる、S(4)とTの位相的結び目型は同じ、S(4)とTの自己絡み数は同じ、S(4)とTの横断的結び目型は異なる。結び目図式の各交点において交点を無くすあらゆる操作を考えその状態和を計算することによりジョーンズ多項式を計算できることがカウフマンにより指摘されていた。これは各交点の周りの2本の弧を使った状態和を計算しているとみなせる。この考えを拡張し各交点の周りの3本の弧を使った状態和を計算しても結び目の不変量を構成できることを示した。来年度の課題として以下の3つに取り組みたい。この不変量をより多くの具体的な結び目について計算する。各交点の周りの4本の弧を使った状態和を計算しても結び目の不変量を得られるかを調べる。ジョーンズ多項式からホバノフホモロジーが定義されたことを真似て各交点の周りの3本の弧を使った状態和の結び目不変量からホバノフ型ホモロジーを構成する。本年度は境界付き3次元多様体の不変量を使って写像類群について調べた。OzsvathとSzaboはヘガードフレアーホモロジー群と呼ばれる閉3次元多様体の不変量を定義していた。Lipshitz, Ozsvath, Thurstonはこの不変量を境界付き3次元多様体に拡張し境界付きフレアーホモロジーと呼ばれる不変量を定義した。境界が1つの円周からなる曲面Sは写像柱と呼ばれる境界が2つの曲面から成る3次元多様体と自然に対応するので,この多様体の境界付きフレアーホモロジーが写像類群の不変量を与えることが自然に考えられる。彼らはこの不変量が単射(忠実)であることを示した。そこで写像類群の中でも特に重要な部分群であるトレリ群に対してこの不変量の具体的な計算を実行した。トレリ群とは曲面Sの1次元ホモロジー群に自明に作用する写像類群の元から成る集合である。Sの種数が2であるときトレリ群の元として2種類の元が考えられる。1つはSを1つ穴あきトーラスと2つ穴あきトーラスに分ける1本の曲線Cに沿ったデーンツイストであり、もう1つはSを2つ穴あきトーラスと3つ穴あき球面に分ける2本の曲線Dに沿った適切なデーンツイストである。Cに対応する不変量は18個の生成元と62個の関係式から成る鎖複体であり、Dに対応する不変量は38個の生成元と154個の関係式から成る鎖複体であることが分かった。鎖複体の鎖ホモトピー類が写像類群の不変量である。CとDに対応する元は異なる元であることが既に知られているのでこれらの鎖複体は互いに鎖ホモトピーの範囲で同型ではない。しかしそれぞれのホッホシルトホモロジーを計算すると同型であることが分かった。これはCとDに対応して写像柱の上下の曲面を同一視して得られる2つの多様体を結び目フレアーホモロジー群は区別しないことを示している。横断的結び目の不変量の1つとして結び目接触ホモロジー群が知られているが、具体的な計算は困難である。そこでこの不変量から誘導され計算がより簡単である修飾数と呼ばれる不変量も知られていた。負符号ホップ・フライプで移り合う閉組み紐対のうち組み紐数が4の例で横断的結び目として異なる新しい例を構成できることが、計算機を使った修飾数の計算により分かった。

現在は修飾数で区別できる横断的結び目対を拡張し、より一般的な例を構成する方法について考察している。結び目の平面的な表示方法の1種であるグリッド表示を使って結び目フレアーホモロジー群を計算する組み合わせ的な方法が開発されていた。結び目の立体的な表示方法の1つとして、グリッド表示を自然に拡張したキューブ表示が提案されていた。グリッド表示を使った結び目フレアーホモロジー群の計算方法を、キューブ表示に自然に拡張しても結び目フレアーホモロジー群と本質的に同じ情報しか得られないことが知られていた。そこでキューブ表示以外の結び目の立体的な表示について研究した。結び目の立体的な表示方法の1つである橋表示から1方向の幅を測ることによって橋指数が定義されている。この橋指数を2次元的な幅を測ることによって拡張した2橋指数という結び目不変量が定義されていた。2橋指数が決定されていた結び目の型は(2,q)型のトーラス結び目だけであったが、これを拡張し(p,q)型トーラス結び目の2橋指数を決定した。結び目フレアーホモロジー群における横断的結び目の不変量を計算することによって、負符号ホップフライプで移り合う閉組み紐対の中に古典的不変量だけでは区別できない横断的結び目の新しい例を具体的に構成することができた。結び目接触ホモロジー群から誘導される不変量の1つである修飾数を計算することによって、負符号ホップ・フライプで移り合う閉組み紐対のなかに横断的結び目として異なる新しい例を具体的に構成することができた。昨年度に計画していた修飾数の計算によって横断的結び目の新しい具体例を構成する作業が難航したため、交付決定されていた金額の一部を次年度に使用する予定とした。今後は各交点の周りの4本の弧を使った状態和から結び目不変量を構成できるか、さらにホバノフ型ホモロジーを構成できるかについて調べる。修飾数の計算を実行するために用いた計算機を当初の計画より安価なものとしたため、交付決定されていた金額の一部を次年度に使用する予定とした。今後は本年度に構成した横断的結び目対を変形した例を調べ、どのように拡張すれば一般的な例を構成できるのかについて調べる。各交点の周りの4本の弧を使った状態和から結び目不変量を構成できるかを調べるためには大きな連立方程式を解く必要がある。この計算のためにより計算速度の速い計算機を購入する。また得られる結果を国内外の研究会で発表するために使用する。修飾数によって区別できる具体例をより多く構成し期待される一般的な例の特徴をつかむために、本年度から繰り越す研究費と合わせて、不変量の計算を効率的に実行できる計算機を購入することを計画している。また得られる結果を国内外の研究集会で発表するために使用する。
脂肪組織及び精密に配置された血管・リンパ管網を有する人工ヒト皮膚モデルの確立

医薬品や化粧品の研究開発で行われてきた動物実験は、倫理面だけではなく、安全性と有効性の面から問題点が多く、ヒト培養細胞を用いたin vitro代替評価法が強く望まれている。また、移植や再生医療の分野では、熱傷などの皮膚組織の欠損に対する治療法として培養皮膚が利用されている。しかし、現在普及している人工皮膚組織は、本来のヒト皮膚組織にみられる表皮・真皮・脂肪組織の階層構造を欠き、形態・機能維持に必須の循環系を再現していない。本申請課題ではこれら欠点を補った人工ヒト皮膚組織を作製し、生体に近い外界刺激に対する防衛性や反応性をもつ新たな評価モデルを確立する。
潜在性致死性不整脈疾患における遺伝子変異特異的顕性化因子についての検討

遺伝性不整脈疾患の遺伝子変異特異的表現型及び顕性化因子についての検討を行った。運動誘発性ブルガダ症候群(亜型ブルガダ症候群)で同定したSCN5A R1632Cは、心筋ナトリウムチャネルの新規かつ特異な機能異常を有することが判明し、分子病態を解明し得た。発熱誘発性QT延長症候群(LQTS)で同定したKCNH2 G584Sの機能異常を解明し、また、発熱誘発性LQTSにKCNQ1変異(D611Y、921G>A)を同定し得た。冠攣縮による一過性心筋虚血は、LQTSの顕性化因子となりうることを明らかにし、さらに、LQTSの新規顕性化因子として左脚ブロック関連cardiac memoryを同定し得た。我々は、発熱時にQT時間が著明に延長しtorsades de pontesを発症した潜在性QT延長症候群(47歳、女性。KCNH2-G584S)、運動時に失神を呈し、心房頻拍、洞機能不全を合併したブルガダ症候群(17歳、男性。SCN5A-R1632C)、運動時に心肺停止となったブルガダ症候群(15歳、女性。SCN5A-A735E)、冠攣縮性狭心症にて心室細動を発症した症例(51歳、男性。KCNH2-P10S)など、異なる顕性化因子によって致死性不整脈を発症した症例において、各病態と関連すると考えられる遺伝子変異を同定し得た。さらに、各変異を作成し、培養細胞株に発現させ、パッチクランプ法にて電気生理学的特性を検討した。細胞外液を低温から高温にした時、野生型KCNH2は外向き電流の増大を認めたが、G584S変異は外向き電流の増大が軽微であった。野生型では高温時は不活性化曲線の脱分極側シフトが大きかったが、G584S変異では小さかった。一方、他のKCNH2変異では野生型と同様に高温時に外向き電流の増大を認めた。これらの結果から、G584S変異では、高温時は不活性化の増強によりKCNH2電流/IKrの増高が軽微であり、本変異キャリアでは発熱時にQTが延長する主因と考えられた。SCN5A-R1632C変異は、野生型SCN5Aと比べ不活性化曲線の過分極シフト、速い不活性化からの回復の遅延を認め、速い不活性化状態の安定性が増強していた。本変異は、高頻度刺激で電流抑制が強く、頻拍時によりNa電流が減少すると考えられ、運動時にNaチャネル機能異常が増強し、表現型を説明し得ると考えられた。このように、潜在性致死性不整脈疾患患者において、遺伝子変異特異的顕性化因子を同定し、さらに、チャネル機能異常を解析することにより、各顕性化因子による致死性不整脈発症の分子機構の解明につながると考えられる。ブルガダ症候群は壮年男性に多く、心イベントの発症は典型的には安静時や睡眠時に多い。しかし、我々は、有症候性ブルガダ症候群27例のうち、運動中に心イベントを発症した症例を2例見出した(非典型ブルガダ症候群)。1例(15歳、女性)はSCN5A-A735E変異を有し、他1例(17歳、男性)はSCN5A-R1632C変異を有していた。培養細胞株発現系を用いたパッチクランプ法による機能解析では、A735E変異はナトリウム電流(INa)を発現しなかった。一方、R1632C変異は速い不活性化からの回復が著明に遅延し、速い不活性化状態の安定性が増強していた。そのため、保持電位-90mV(心筋の静止膜電位付近)から脱分極パルスを与えたときのINa電流値は著明に減少していた。また、高頻度刺激によりINaは著明に抑制されたことから、本症例では運動時にINaがさらに減少し心イベントを発症したと考えられた。さらに、発熱時には通常QTc時間は短縮するが、発熱時にQTcが延長し心イベントを発症した潜在性QT延長症候群2例を経験した。1例(47歳、女性)にKCNH2-G584S変異を、他1例(2歳、男児)にKCNH2-D609Gを同定し得た。発現実験では、野生型KCNH2では細胞外液を低温から高温にした場合KCNH2電流の増大を認めた。一方、G584S変異、D609G変異では、KCNH2電流の増大は軽微であり、それはKCNH2チャネルの不活性化の増強によることを明らかにした。発熱時にQTc時間が延長し心イベントを発症した症例で同定された変異はKCNH2のS5-pore領域に限局しており、KCNH2チャネルの構造-機能連関の解明にも有益な情報をもたらした。我々の研究成果は、潜在性遺伝性不整脈疾患の疾患概念を細分化し、遺伝子変異特異的治療法・マネジメントの確立や新規治療法の開発につながる可能性がある。我々は、運動中に心イベントを発症し、心房頻拍、洞機能不全を合併したブルガダ症候群(非典型ブルガダ症候群)に新規SCN5A-R1632C変異を同定した。培養細胞株発現系を用いたパッチクランプ法による機能解析では、R1632C変異は速い不活性化からの回復が著明に遅延し、速い不活性化状態の安定性が増強していた。