hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
S.sobrinus gtf遺伝子発現株によるバイオフィルム形成機序の解析

ヒト齲蝕は齲蝕原性菌であるStreptococcus mutansおよびStreptococcus sobrinusの2菌種が産生するグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)の作用により歯面上に齲蝕誘発性バイオフィルムを形成することに始まる。現在S.sobrinusは4種類のGTFを産生することが知られている。本研究はS.sobrinusにおけるバイオフィルム形成のメカニズムを、B13N株を由来とした4種類のgtf遺伝子を非齲蝕原性菌Streptococcus anginosusへ導入した形質転換株を作製し、これらを用いて解明することを最終目的としている。本申請ではまず4種類のgtf遺伝子を取得することを目指し、平成13年度はgtfT遺伝子産物を単独発現する形質転換株を作製することに成功し報告した。平成14年度は形質転換株の染色体DNA上におけるgtfT遺伝子構造の確認およびガラス管壁への人工プラーク形成試験を行った。遺伝子構造はPCR法を用いて確認した。まず形質転換株より染色体DNAを精製した。プライマーはgtfT遺伝子上流に位置するp15A領域およびOMZ176株のgtfT遺伝子の塩基配列を参考に設計した。PCRで増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、予想された約6.2kbのDNA断片が検出された。さらにこの断片を数種の制限酵素で切断し再度電気泳動を行った結果、形質転換株上のgtfT遺伝子の構造は親株のそれと同じであることが確認された。次に、この形質転換株をガラス管壁に対する人工プラーク形成能試験に供した。0.5%のショ糖を含むTHB培地に接種し、37°Cにて30゚の傾斜培養を行った。10秒間のボルテックス処理後ガラス管壁に固着した菌体を超音波処理し、濁度測定(550nm)した結果、本形質転換株単独ではガラス壁面に固着する能力はないことが確認された。現在、gtfS遺伝子を単独発現する形質転換株の作製を試みている。本研究は、ヒトロ腔より齲蝕原性細菌の一つとして分離されるStreptococcus sobrinusが産生する4種のグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)の相互作用による齲蝕誘発性バイオフィルム形成メカニズムの解明を最終目標としてS. sobrinusB13N株染色体よりGTFをコードするgtf遺伝子を非齲蝕誘発性口腔細菌のStreptococcus anginosusへ導入した4種のgtf遺伝子(gtfI,U,T,S)単独発現株を作製し、これらを用いて齲蝕試験を行うことを目的としている。目的達成のため、平成13年度は主として、S. sobrinusが有する4種のgtf遺伝子のうち、B13N株より唯一クローニングされていないgtfT遺伝子を大腸菌プラスミドへクローニングとS.anginosus gtfT遺伝子発現株の作製を試みた。まずB13N株より染色体DNAを調製し、これを鋳型としてPCRを行った。使用したプライマーはすでに報告されているS. sobrinus OMZ176株gtfT遺伝子の塩基配列をもとにして設計した。その結果、ほほ予想された大きさのDNA断片が増幅された。この断片を各種制限酵素にて切断してみたところ、OMZ176株のパターンとほぼ一致したためこのPCR断片がgtfT遺伝子であることを確認した。しかしながらこの断片の大腸菌プラスミドへのクローニングを数回繰り返して試みたが、ついにこの断片が挿入されたプラスミドを有する大腸菌クローンを得ることができなかった。そこで方針を変更し、gtfT遺伝子を二分割してPCRで増幅して別々にクローン化することとし、プライマーの再設計を行った。この際、遺伝子の一部が重複するように留意した。PCRを行ったところ予想された大きさの断片が得られた。これらを別々のS. anginosus形質転換株作製用のプラスミドへ導入し、両断片ともにクローン化に成功した。これらの大腸菌クローンよりプラスミドを回収し、制限酵素処理によりプラスミドを直鎖とした後、S. anginosusを順次形質転換した。その結果、いくつかの形質転換株を得ることに成功した。これらの株の培養上清からリコンビナント酵素を部分精製し、SDS-PAGE後、特異抗体を用いた免疫染色と活性染色を行ったところ、抗体に反応しかつ活性を有した酵素を産生する形質転換株であることを確認した。

まず形質転換株より染色体DNAを精製した。プライマーはgtfT遺伝子上流に位置するp15A領域およびOMZ176株のgtfT遺伝子の塩基配列を参考に設計した。PCRで増幅されたDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供したところ、予想された約6.2kbのDNA断片が検出された。さらにこの断片を数種の制限酵素で切断し再度電気泳動を行った結果、形質転換株上のgtfT遺伝子の構造は親株のそれと同じであることが確認された。次に、この形質転換株をガラス管壁に対する人工プラーク形成能試験に供した。0.5%のショ糖を含むTHB培地に接種し、37°Cにて30゚の傾斜培養を行った。10秒間のボルテックス処理後ガラス管壁に固着した菌体を超音波処理し、濁度測定(550nm)した結果、本形質転換株単独ではガラス壁面に固着する能力はないことが確認された。現在、gtfS遺伝子を単独発現する形質転換株の作製を試みている。
てんかんの発作間歇期における行動変化の多面的研究

てんかん患者の発作間歇期にみられる行動変化、すなわち過書、性衝動の変化、哲学・宗教的関心の高まりなどの発作間行動症候群(interictal behavior syndrome)について、これらと関連する要因を抽出するため、行動変化を認める患者と認めない患者に対して多面的に比較検討を行った。対象は、大阪医科大学神経精神科てんかん外来に通院中の患者で、過書、性衝動の変化、哲学・宗教的関心の高まりのうち一つでも認められた15名の行動変化(+)群と、いずれも認められなかった28名の行動変化(-)群である。両群間で、1)年齢、教育期間、発症年齢、罹病期間、過去1年間の発作回数、てんかん分類2)CTスキャン、脳波焦点3)薬剤数4)Mini-Mental State Test、Washington PsychosocialInventoryについて比較検討した。その結果、行動変化(+)群は、全例側頭葉てんかんであり、行動変化(-)群より側頭葉におけるCTスキャンの異常が多く、またWashington Psychosocial Inventoryで、情緒適応、対人関係適応、職業適応、経済状況、全体的心理社会的機能の得点が有意に高く、問題を有していた。以上から、てんかんにおける発作間行動症候群は、主に側頭葉てんかんにみられ、側頭葉の器質的異常を有することが多く、さらに心理社会的要因、特に情緒的な問題や経済的問題と関連しているが、認知障害、左右半球機能障害、発作への心理的ストレスなどの要因とは関連がないと考えられた。また、発作間行動症候群を呈する側頭葉てんかん患者の治療にあたっては、発作のコントロールのみならず、心理社会的側面にも目を向ける必要があると考えられた。
顎関節滑膜表層細胞の発生と配列過程および病的状態における形態的・機能的変化

異物取り込能を有する滑膜表層細胞についての検索を行った。試料はhorseradish peroxidase(HRP)をトレーサーとしてラット頚静脈から注入し、一定時間後固定しレジン包埋した。表層細胞の分布にはDAB反応施した1μm切片を用い、細胞内動態にはカテプシンDとHRPの両抗体を用いた金コロイド二重染色法による免疫細胞化学的検索をした。ラット顎関節内のHRPを取り込んだ細胞の分布は抗カテプシンB,D,L抗体陽性細胞の分布(既発表)と一致し、関節前方部で表層細胞の密な配列、後方部の滑膜ヒダ表面では細胞間の広い配列の部位を認めた。また電顕にてA型細胞のHRPの取り込みとその経時的増加を認めた。さらに二重染色法にてHRP注入10分後にはカテプシンDとHRPが同一空胞内に局在していた。カテプシンB,Dの同一ライソゾーム内の局在(既発表)も加味し,表層細胞の異物取り込み、細胞内処理能が示唆された。現在、HRP注入直後及び数時間後について検索中である。出生時の上関節腔に表層細胞は認めず、各陽性神経は関節円板前方辺縁付着部に認めた。下関節腔形成時に表層細胞が上関節腔側前方部に出現した。細胞出現前に各陽性神経は円板辺縁部で関節腔に近接して分布していた。切歯咬合開始時に上下関節腔完成、円板辺縁部で密な神経網の形成がみられた。表層細胞は徐々に増加し、15日齢前後にその配列の完成をみた。以上より、顎関節では表層細胞の発生や成熟への知覚神経の影響が考えられる。今後、種々の刺激(アジュバント注入や片側抜歯など)下との比較検討を行う。
「四大奇書」の研究

「四大奇書」を総体として研究する書籍『「四大奇書」の研究』を刊行して、各作品の成立事情や社会との関わりを明らかにし、文学・出版史の中に位置づけた。また、「四大奇書」と同じ題材を扱う演劇についての論文を三篇発表し、両者の関係を明らかにするとともに、小説の成立過程についても新たな方向から考察した。あわせて、古典演劇に関する共著(約三分の二を執筆)の書籍一部と論文一篇を発表した。「四大奇書」の成立と変化の過程を解明し、社会の動きと関連づけることにより、当時の社会を多面的に理解することを目指すという目的を達成するため、当該年度の研究実施計画に沿って、『西遊記』の語彙の分布を調査し似通った性格を持つ部位を割り出すことにより、成立過程を検証する「西游記成立考」、なぜ三国時代が特に重要な芸能の題材となったのかを考察することにより『三国志演義』の成立事情について考察した「「三国」について-なぜこの時代が芸能の題材となるのか」のほか、「四大奇書」成立に至る出版と白話文学制作の変化を社会の動きに関係づけで総合的に論じた「明代に何が起こったのか」、更には次年度の計画を先取りして『水滸伝』の成立事情を論じた「『永滸伝』はなぜ刊行されたのが」という四篇の論文を執筆、既発表の業績とあわせて著書『「四大奇書」の研究』にまとめ、研究成果公開促進費を申請、支給を認められて、現在刊行準備中である。また、『水滸伝の衝撃』(勉誠社)の一章の執筆依頼を受けたことをきっかけに、元来三年目に計画していた戯曲との関係に関する考察を前倒しして開始し、「水滸雑劇の世界-『水滸伝』成立以前の梁山泊物語」を執筆、同書に掲載し、その後も明代戯曲と『水滸伝』の関係に関する研究を継続中である。一年目の展開が予定以上に順調に進んだため、研究成果効果促進費を申請し、三年目に刊行を予定していた著書『「四大奇書」の研究』を本来の計画より一年早く汲古書院から刊行した。この書籍の刊行により、「四大奇書」を総体として把握し、その成立と展開を通して当時の社会を多面的に理解するという当初の目標は一定の達成を見たが、研究を更に進展させるため、当初の目標を先取りして、三年目に計画していた演劇と「四大奇書」の関係に関する研究を進展させ、これを一年目の研究と結びつけることにより、『水滸伝』成立以前の梁山泊物語が金と南宋において別々に発展し、金において発展した物語は、元に入って演劇化され、いわゆる水滸雑劇の成立を見る一方で、南宋では全く性格を異にする物語が成長し、それが『水滸伝』の原型となったものと思われること論じた論文「梁山泊物語の成立について-『水滸伝』成立前史-」を『中国文学報』に発表し、『水滸伝』の成立過程と、小説と雑劇の内容がほとんど一致しない理由を解明した。更に、『水滸伝』におけるいわゆる林冲物語が明の李開先の戯曲『宝剣記』の影響を受けているように思われるにもかかわらず、『宝剣記』の方が遅れて成立したとされることに対する疑問から出発して、『宝剣記』原型の成立年代が大幅にさかのぼることを明らかにし、そこから『水滸伝』の成立年代を絞り込むことを試みた論文「『宝剣記』と『水滸伝』-林冲物語の成立について」を『京都府立大学学術報告』に発表して、戯曲を利用した「四大奇書」研究という新たな研究を開始した。二年目から開始した演劇と「四大奇書」の関係という課題に関する研究を更に展開させ、『三国志演義』の内容を題材として扱った演劇の集大成ともいうべき清朝宮廷大戯『鼎峙春秋』に関する考察を進め、論文「清朝宮廷大戯『鼎峙春秋』について-清朝宮廷における三国志劇-」を『中国文学報』に発表した。同論文においては、同劇の内容と成立過程及びその宮廷演劇としての性格を詳しく分析すると同時に、そこで題材として利用されている明代の戯曲の素性を明らかにし、今では失われた戯曲の内容をある程度再構成することを試み、演劇の世界における三国志物語の展開をかなりの程度まで明らかにした。これにあわせて、戯曲の内容の検討から明らかになる三国志物語の形成過程についても考察を進め、中国古典小説研究会関西例会において「演劇と小説の関係について」と題して発表、これをまとめた論文「演劇から見た『三国志演義』」がすでに完成済みで、24年度に発表の予定である。またこれにあわせて、「四大奇書」には含まれないものの、長篇白話小説としてやはり重要な位置を占める『平妖伝』についても、この作品を題材とする清朝宮廷大戯『如意宝冊』について研究を進め、論文「清朝宮廷大戯『如意宝冊』について」を『和漢語文研究』に発表した。

更に、演劇テキストの性格について考察を進めるため、中国最古の印刷された演劇テキストである『元刊雑劇三十種』に対する研究をも進め、赤松紀彦ほかとの共著になる書籍『元刊雑劇の研究(二)貶夜郎・介子推』を汲古書院から刊行した。同書は、『元刊雑劇三十種』のうち二種について、その内容を詳しく論じた解説と校勘記、及び非常に詳細な注と全文の日本語訳を付したものでである。研究代表者は、「貶夜郎」の解説とその全文の訳注作成を担当した。これは全書のおよそ三分の二に当たる。
筋恒常性維持と筋変性のメカニズム解明

骨格筋は極めて高い再生能力を有する臓器であるが,病的環境下ではその能力が低下し,筋脂肪変性,線維化などが生じる.脂肪変性・線維化は不可逆的な現象であり,運動機能を損なうだけでなく,より一層の筋萎縮の原因となる.しかしながら,筋変性に対する効果的な予防法,治療法は確立していない.本研究の目的はこうした骨格筋の筋脂肪変性,線維化のメカニズムを解明するとともに,その治療法につながる知見を得ることである.骨格筋は極めて高い再生能力を有する臓器であるが,病的環境下ではその能力が低下し,筋脂肪変性,線維化などが生じる.脂肪変性・線維化は不可逆的な現象であり,運動機能を損なうだけでなく,より一層の筋萎縮の原因となる.しかしながら,筋変性に対する効果的な予防法,治療法は確立していない.本研究の目的はこうした骨格筋の筋脂肪変性,線維化のメカニズムを解明するとともに,その治療法につながる知見を得ることである.
モチベーションの脳機能イメージング

1モチベーションに関連したPET・MRIイメージング:モチベーションに関連する神経伝達物質であるセロトニン神経系について、セロトニントランスポーターPETリガンドを用いて健常人と神経疾患患者で病態研究を行った。モチベーション課題を用いて精神神経疾患とセロトニンや脳の組織障害を反映するミクログリアの活性化を調べそれらの関係を調べた。さらにtDCS(経頭蓋直流電流刺激法)を用いて脳局所を刺激し、意欲などの意志力と関係する分子機構を調べた。さらに意志力と関連する感情のアンダーマインニング効果の分子メカニズムの研究に着手した。課題fMRIおよび安静時fMRIを用いて、摂食障害における報酬・損失に対する脳活動の評価、健常者における意志力ネットワークの評価を行った。また、安静時fMRIを用いてレム睡眠期行動異常症における運動感覚ネットワークの変容、さらには意志力と辺縁系ループの関連性について検討した。7T-MRI装置を用いた高空間・時間分解能MRIのデータ収集に着手した。2脳MRIコネクトーム解析技術の開発:機能的MRIコネクトーム解析の精度向上のため、sliding windowを用いた意志力ネットワークの時間的変動を評価する動的ネットワーク解析システムを構築した。また、小さな関心領域の評価に適したコネクトーム解析フレームワークを構築した。3画像データを用いた機械学習技術の開発:多施設・多MRIスキャナのデータから汎化性を高めるための施設間差除去手法を開発した。また、深層学習を脳イメージングに応用するための基盤を確立し、画像データの信号雑音比を向上する技術開発、高精度セグメンテーション技術、画像から意志力に関連した疾患や心理指標の予測技術などを開発した。1セロトニントランスポーターに結合する11C-DASB-PETおよびMRI-VBMを用いて健常人および摂食障害患者の計測を終了し、その成果を年度末に投稿することができた。また、tDCSの脳刺激研究に関しては、前頭前野へのtDCS刺激により刺激側の腹側線条体でのドパミン放出が上昇することが示され、注意の程度と相関することがわかった。この成果は論文に出版することができた。2脳MRIコネクトームの精度を向上するための複数の手法を新たに構築し、健常者のインターネット過剰使用と意志力ネットワーク関する知見を論文報告するなど、当初の計画通りに進展している。3多施設・多スキャナのMRIデータから施設間差の影響を除去することで効果的に統合失調症を層別化しうることを検証できた。さらに、深層学習を用いて複数のMRI解析技術を確立するなど、当初の計画通りに進展している。上記を鑑み、計画はおおむね順調に進展しているものと判断した。本研究はおおむね順調に行われているため、2019年度も基本的には当初の研究計画に基づいて研究を進める。すなわち、1モチベーションに関連したPET・MRIイメージングに関して、H30年度の疾患(摂食障害と統合失調症)に加え、うつや引きこもりなどの意志力の低下した疾患群の分子メカニズムを明らかにする。また、内発的動機づけに着目したPET・MRI研究を継続して、意志力に関係する意欲やその障害に関連する神経基盤の解明を継続する。2脳MRIコネクトーム解析技術の開発に関して、現在取得中の課題・安静時fMRIやDTIのみならず、新たに収集中の7T-MRIに対しても現在の解析システムを適応し、必要に応じてさらなる改良を加えていく。3画像データを用いた機械学習技術の開発に関して、これまで開発した技術を様々な疾患に応用していくとともに、意志力に関連するバイオマーカー探索のために深層学習を用いた手法開発を継続して行う。1モチベーションに関連したPET・MRIイメージングモチベーションに関連する神経伝達物質であるμオピオイド系の画像化を試みたが、研究途中で国の薬物指定となり断念した。一方摂食障害の脳画像研究を進めた。MRI研究では、モチベーションの指標となる生活活動に関連して、24時間生活活動記録などの質問紙やウェアラブルデバイスによる活動量計測を行い、構造・安静時機能MRIの撮像を健常者で行なった。また、摂食障害、統合失調症、脳損傷、パーキンソン病関連疾患などの精神神経疾患患者を対象とした構造・機能的MRIのデータを収集した。2脳MRIコネクトーム解析技術の開発脳MRIコネクトーム解析システムを改訂し、モチベーションに関連したネットワーク解析に対応させた。また、時系列コネクトーム解析に関しても基盤となる解析プログラムを作成した。3画像データを用いた機械学習技術の開発申請者らが開発した自己組織化マップやサポートベクターマシンなどの機械学習ソフトウェアをモチベーション関連バイオマーカーが探索可能なシステムに改良した。また、深層学習を脳イメージングに応用するための基盤となるプログラム開発に成功した。1モチベーションに関連したPET・MRIイメージングに関して、健常被験者を対象としたデータは40名以上の収集を終えており、その解析手法も予備的な結果が得られるほど進展している。また、精神神経疾患患者のデータ収集も進んでおり、当初の計画通りに進展している。2脳MRIコネクトーム解析技術の開発、に関してはシステムをモチベーションに関連したネットワーク解析に対応させ、また時系列コネクトーム解析の基盤となるプログラムを作成するなど、当初の計画通りに進展している。3画像データを用いた機械学習技術の開発、についても自己組織化マップやサポートベクターマシンなどの既存のシステムをバイオマーカー探索目的に特化させ、さらに深層学習などの最新技術を脳イメージングに応用する基盤となるプログラム開発に成功するなど、当初の計画通りに進展している。

1モチベーションに関連したPET・MRIイメージングに関して、モチベーションに関連する神経伝達物質であるセロトニン神経系について、セロトニントランスポーターPETリガンドを用いて健常人と神経疾患患者で病態研究を行った。MRIによるVBMの所見とPET所見の一致性も検討した。さらにtDCS(経頭蓋直流電流刺激法)を用いて脳局所を刺激することで、行動学的な意欲や成績について検討した。課題fMRIを用いて、摂食障害における報酬・損失に対する脳活動を評価した。また、安静時fMRIを用いて、レム睡眠期行動異常症における運動感覚ネットワークの変容、および意欲と辺縁系ループの関連性について検討した。2脳MRIコネクトーム解析技術の開発に関して、機能的MRIコネクトーム解析の精度向上のため、独立成分分析に基づいた心拍・呼吸・体動などのノイズ除去システムを構築した。さらに、構造的MRIコネクトームにおけるトラクトグラフィー精度向上のため、従来の拡散テンソル法に加えて拘束付球面デコンボリューション法に基づくコネクトーム解析システムを構築した。3画像データを用いた機械学習技術の開発に関して、自己組織化マップにk-means法を組み合わせた新規手法と構造MRIを用いて統合失調症の層別化手法を開発した。昨年度開発した、深層学習を脳イメージングに応用するための基盤となるプログラム開発を元に、画像データの信号雑音比を向上するアルゴリズム開発を行った。1セロトニントランスポーターに結合する11C-DASB-PETおよびMRI-VBMを用いて健常人20人、摂食障害患者20人の計測を終了し、論文投稿前の状態である。一方、tDCSの脳刺激結果に関しては、身体の体部表象に関わる脳領域を刺激するとパフォーマンスが改善することも証明でき、おおむね当初の計画通りに進展している。2機能的MRIコネクトーム、構造的MRIコネクトームいずれにおいても、精度を向上するための手法を構築することに成功し、さらなるコネクトーム解析精度向上が期待されるなど、当初の計画通りに進展している。3既存のシステムをもとに統合失調症の効果的な層別化手法を開発し、論文発表した。さらに、開発した深層学習を脳イメージングに応用する基盤プログラムをもとに画像データの信号雑音比を向上するアルゴリズム開発に成功するなど、当初の計画通りに進展している。上記を鑑み、計画はおおむね順調に進展しているものと判断した。1モチベーションに関連したPET・MRIイメージング:モチベーションに関連する神経伝達物質であるセロトニン神経系について、セロトニントランスポーターPETリガンドを用いて健常人と神経疾患患者で病態研究を行った。モチベーション課題を用いて精神神経疾患とセロトニンや脳の組織障害を反映するミクログリアの活性化を調べそれらの関係を調べた。
睡眠・覚醒の分子機構と生理的意義

1.無機セレン化合物はPGD合成酵素の活性を特異的に抑制する。この無機セレン化合物を脳室内に微量投与すると、睡眠が顕著に抑制される。過剰のジチオスレイト-ルの同時投与は、セレンによるPGD合成酵素活性の抑制を消失させ、セレンによる睡眠抑制も消失させる。これらの諸結果は脳内内因性のPGD_2が生理的睡眠を引き起こしているという、われわれの仮説を強く支持するものである。さらに、無機セレン化合物をラットに静注したところ、脳室内投与と同様の覚醒作用が得られたことから、過眠症に分類される諸種疾患への無機セレン化合物の臨床応用の可能性が示された。2.PGE_2のアンタゴニストの中で、AH6809は、ラットではPGE_2の覚醒作用に拮抗したがPGE_2の体温上昇作用には拮抗しなかった。同物質のラット第三脳室内単独投与で、覚醒が阻害され、睡眠の増加が認められた。これらのことから、体温上昇作用と覚醒作用に関与する脳内のPGE_2レセプタ-サブタイプが異なること、脳内内因性のPGE_2が、覚醒を誘起し、維持するように生理的に機能していることが示唆された。3.視床下部領域には、睡眠・覚醒に連関して活動が変化するとともに、PGD_2あるいはPGE_2に反応するニュ-ロンが存在しており、PGにより活動が調節される視床下部領域のニュ-ロンが、睡眠・覚醒調節に関与している可能性が示された。4.近赤外光を利用したシステムを用いて、夜間睡眠中のサル前脳におけるヘモグロビンの酸化・還元状態を調べたところ、レム睡眠時に、脳内酸素消費率が低下している可能性が示された。1.プロスタグランジンE_2(PGE_2)およびD_2(PGD_2)の睡眠・覚醒に対する作用の作用部位について、無麻酔のサルおよびラットにおいて、マイクロダイアリシスプロ-ブを用いて検討している。サルではPGE_2は、後部視床下部において発熱を介さずに、選択的に覚醒を引き起こすことが明らかになった。後部視床下部にはPGE_2のレセプタ-が高密度に存在している部位があり、さらに従来から覚醒中枢といわれていることから、この結果は注目に値するものと思われる。現在ラット用バイオアッセイシステムにおいても、その作用部位の決定を行なうべく条件検討を進めており、視束前野や視床下部後部をはじめ、脳内の多くの部位にPGE_2を投与して、作用の詳細や強弱を比較検討する予定である。2.電気生理学的方法を用いて、視束前野のニュ-ロンを、睡眠時に活動の亢進するもの、覚醒時に活動の亢進するもの、および睡眠・覚醒に無関係なものの3種類に分類し、各ニュ-ロンの視束前野での分布を検討し、さらにPGE_2やPGD_2に対する反応性を調べている。睡眠時に活動の亢進するニュ-ロンは視束前野に広く分布する傾向があり、覚醒時に活動の亢進するニュ-ロンは比較的外側に集中する傾向がある。また覚醒時に活動亢進するニュ-ロンの中にPGE_2に反応するものがある。現在、視床下部後部においての検討も始めている。3.PGE_2のレセプタ-がサルやラットにおいてOVLT近傍、視束前野、後部視床下部の乳頭体周辺の核群など特定の部位に特に高濃度に存在していることが明らかになってきた。4.PGとPG以外の脳内生理活性物質との連関についてはPGの作用部位を明らかにした上で、詳細に検討する予定である。1.サルおよびラット用のバイオアッセイシステムにより、プロスタグランジン(PG)E_2をサルやラットの脳内の種々の部位に投与して、その覚醒作用の作用部位を調べている。

サルにおいては視床下部後部領域で特に作用が強く見られるなどの結果が得られている。ラットでも、その他多くの部位での作用を検討中である。2.PGD_2の合成酵素が、セレニウムイオンにより特異的に阻害されることが、最近当研究所で明らかにされた。そこで、ラット第三脳室内にセレニウム化合物をマイクロダイアリシス法により投与し、脳内PGD_2合成酵素活性を阻害して脳内内因性のPGD_2量を減少させることにより睡眠・覚醒がどのように変化するのかを調べた。その結果、セレニウムが睡眠を顕著に抑制することが見出された。この結果は脳内内因性のPGD_2が生理的に睡眠を誘発しているというわれわれの作業仮説を支持するものである。3.ニュ-ロンレベルでの研究では、視床下部領域で睡眠・覚醒に関連して活動の変化するニュ-ロンを見出し、その分布を求めた。これらの中には睡眠・覚醒の状態変化に先立って活動の変化が見られるものがあり、これらは積極的に睡眠あるいは覚醒を引き起こすよう機能している可能性がある。さらに、これらニュ-ロンの中に、PGに反応するものが存在することを明らかにしている。4.ラットにおいて、断眠に伴う脳内各部位のエネルギ-代謝の変化を、2ーdeoxyglucoseを用いて検討し、睡眠・覚醒の生物学的機能に関して辺縁系が重要な役割を果していることが示唆された。5.三菱化成生命科学研究所の近藤宣昭博士との共同で、冬眠中のリスの脳内PG量を測定し、脳内PGの冬眠現象における役割について検討を試みている。1.PGE_2のアンタゴニスの中で、AH6809は、ラットではPGE_2后覚醒作用に培抗したがPGE_2の体温上昇作用には培抗しなかった。同物質は、サルにおいては、PGE_2の覚醒作用にも体温上昇作用にも培抗せず、別のPGE_2アンタゴニストが覚醒作用に選択的に培抗を示している。これらのことは、脳内のPGE_2レセプタ-の中に、サブタイプがあり、PGE_2の体温上昇作用と覚醒作用とに関与するサブタイプが異なること、これらのサブタイプに種差が存在することなどを示唆しているものと考えられる。2.近赤外光を利用した田村システムを用いて、夜間睡眠中のサル前脳におけるヘモグロビンの酸化・還元状態を調ベたところ、レム睡眠時に特異的に、酸化型ヘモグロビンの増加と還元型ヘモグロビンの減少、総ヘモグロビン量の増加が認められた。レム睡眠中には、酸素の消費率が低下している可能性を示唆している。3.無機セレン化合物はPGD合成酵素の活性を抑制する無機セレン化合物を脳室内に徴量投与すると、睡眠が顕著に抑制される。これは脳内内因性のPGD_2が主理的睡眠を引き起こしているという、われわれの仮説を強く支持する結果である。さらに、無機セレン化合物をラットに静注したところ、脳室内投与と同様の覚醒作用が得られた。投与量が多くなりすぎると、摂食量を抑制するなど副作用があるが、無機セレン化合物の過眠症に分類される諸種疾患への臨床応用は可能かもしれない。4.冬眠リスの脳をサンプリングすることに成功し、冬眠期を含め、ほぼまる1年間にわたるリス脳のサンプリングが間なく完了しようというところである。各時期のリス脳のPGD_2、PGE_2、PGF_<2α>を定量し、PGの脳内での役割、冬期と睡眠との差異などについて考察する予定である。
埋立処分場排水管のスケール閉塞抑制方法の開発

埋立処分場からの浸出水を系外へ排出し処理設備へ送るまでの排水管内壁には硬質スケールが発生し遂には閉塞事象を誘引する.実際に現場で採取されたスケールを観察したところ,樹脂製配管の内壁を精確に象った純カルサイトがほぼ一定の時間間隔で剥離してできた彎曲鱗片が高曲率スポットに堆積しその後それらが強固に相互結着して閉塞がおこることがわかった.管内壁での核発生・剥離した遊離断片の相互結着ともに配管内での恒常的な微生物代謝による炭酸塩晶析(MICP)に因る.浸出水が排水管へ流入する前に集中的にMICPを誘起し,管内での硬質スケール形成を遅滞させる手法の開発とさらに解決すべき問題点の明確化をおこなった.1いわき市内郷宮地区に所在する管理型廃棄物最終埋立処分場の排水管から閉塞の原因となる硬質スケールをサンプリングし,その性状と化学組成を解明した。硬質スケールは劈開性を示す。これはスケールが先ず排水管内壁に核発生したのち管の中心線方向へ円筒対象に成長することを示唆する。スケールはサンプリングされた時点では黒色と硫化水素臭を呈する。これはスケール中に鉄などの硫化物が含有されることを示唆するがX線回折測定により検知されるほどの量ではなかった。硬質スケールは炭酸カルシウムの最安定結晶であるカルサイトのみから成っており,これは多くのほかの埋立処分場と同様だった。2埋立層底部からの浸出水に含まれる代表的な金属イオンの濃度を測定した。カルシウムイオンの濃度が年間をつうじて約2kg/m3と高く他の金属種の濃度はいずれもカルシウムよりも2桁低かった。これは硬質スケールが実質的には炭酸カルシウムのみから成るという結果と矛盾しない。硬質スケールの原因となるカルシウムイオンの供給は完全に浸出水に因る。他方炭酸イオン(二酸化炭素)に就いては空気からの溶解と微生物などの代謝の2種類の因子が考えられた。一箇月に亙る曝気をおこなったが全くスケールが形成されなかったことから,後者の微生物の代謝を想定した。当該の浸出水中の有機態窒素の濃度は100mg/L200mg/Lであり富栄養化がみられることから微生物の代謝の関与が推測された。3硬質スケールの形成と,近年着目されるコンクリート,土中でのバイオミネラリゼーションの形態的類似性に着目して操作型電子顕微鏡による採取スケールの微構造観察をおこなうとバクテリア類の生息の痕跡痕が多数見いだされた。このことから今後はバクテリアの代謝による二酸化炭素の発生が硬質スケール発生の重要な因子であるという前提で浸出水中の溶解カルシウムイオン濃度を低下させる方策が需要になる。山がちな国内のほとんどの管理型廃棄物最終埋立処分場は上方へ数百メートル四方の巨大な開口部を有する擂り鉢型構造をしており一箇所の処分場あたり開口部から年間数十万トンの雨水が降り注ぐ。降水は遮水工にさえぎられて山の自然土壌には浸透せず処分場底部に設置された排水管より外界へ排出される。排出された水は廃水処理施設で環境基準を充たすように処理されたのち河川などへ放流される。この廃水処理施設は必ずしも埋立処分サイトの近傍に設置することはできず,処分場底部から廃水処理施設までへの排水管は最低でも長さ数百メートルにおよぶ大規模なものになる。この廃水運送管の内壁には年間最低でも数ミリメートルの厚さの硬質スケールが形成される。このため排水管を設置してからわずかに3年から5年のあいだに管のスケール閉塞がおこる。処分場内の埋立層中の含水率が極度に増加するのは避ける必要があり,排水管を交換する必要がでる。この交換は大規模な工事を伴い管理型埋立処分場のメインテナンス上重い負担となる。そこで排水管内での硬質スケールの形成要因を解明し,その形成速度を有意に低減する手法を見いだし確立することが本プロジェクトの目的である。まず研究協力者のひめゆり総業(株)が現在実際に操業しているいわき市内郷宮地区に在る管理型廃棄物最終埋立処分場において排水管内から硬質スケールを採取し,その構造と化学的組成の解析をおこなった。硬質スケールは管内壁から中心線へむかって薄層が積み重なって成長した痕跡を有し,明確な劈開性がある。スケール形成の端緒となる核発生は先ず管の内壁面でおこり,管の中心へむかってスケールが生長することがわかった。採取されたスケールは黒く硫化水素臭を放ち,金属硫化物を含むことが示唆されたが,エックス線回折で検知できる量的水準ではなく,スケールじたいはほぼ完全に炭酸カルシウム(結晶系はカルサイト)から成っていた。浸出水中のカルシウムイオンの濃度の低減が課題であることが明らかになった。埋立土層の年間降水量と排水管のサイズから,土層中での雨水の滞留時間を概算したところ,一週間以上雨水は埋立土層にトラップされながら流下し,底部に設置された排水管から排出されるという描像がえがけた。このことから,一週間ていどの時間スケール内に,生物学的炭酸塩沈澱法(MICP : microbially induced carbonate precipitation)により溶解カルシウムイオンを不溶塩化することが求められる。MICPを加速するうえでの問題は,土中の貧栄養性とシリカ質の土砂粒子表面の生物学的親和性の不足である。2016年度には上記の二点のうち,主に後者の課題にとりくんだ。

バチルス類などの遍在土中バクテリアは,表面の電荷による静電相互作用により固体表面に集合的に附着し,そこにバイオフィルムを形成する。いったんバイオフィルムが形成されれば,そこへ積層的にバクテリアが世代交代しながら増殖していくことは,栄養の確保さえされれば容易である。シリカサンド,ガラス,スラグなどの無機化合物系の固体を処分場で採取した浸出水中へ浸漬し,その表面へのバイオフィルムの形成の経過をトレースした。その結果,土中に遍在するケイ酸塩系の固体の表面はバクテリアの高密度繁殖には適さず,バイオフィルムなどの被覆的な形成は不可能なことがわかった。そこで,十年ほどまえに研究代表者がとりくんだポリアクリル酸表面へのカルシウムイオンの吸着傾向をヒントにし,同様の化学的構造を有し,さらに一般廃棄物として大量に産出される樹脂製廃棄物に着目した。この樹脂性廃棄物を炭素源・窒素源を含む有機物質とともに浸出水と共存させると,樹脂性廃棄物の表面に24時間以内にバイオフィルムが形成され,MICPを劇的に加速することができた。1)生物学的炭酸塩沈澱誘引(MICP)により,環境水中のカルシウムを不溶塩として沈澱させ,カルシウム濃度を有意に低減させることが技術的に可能になった。2)適切な温度条件を選択することにより,埋立処分場浸出水などにみられる極端に高い溶解カルシウムイオンの濃度(例:1000グラム毎立方メートル2000グラム毎立方メートル)を一週間ていどの時間スケールのうちに通常の地下水のカルシウムイオン濃度のレベル(数十グラム毎立方メートル)まで低減させることが可能になった。3)適切な「微生物棲息用足場材料」をみいだすことにより,土中もしくは水中での微生物(バチルス類)の繁殖密度を向上させ,MICPの速度を劇的に向上させることができるようになった。4)上記の足場材として,どのような物質が適当であるかが把握できた。表面にカルシウムイオンを(よわく)ひきつけるとともに,微生物を健全に繁殖させることができる素材を択ぶことが重要である。5)さらに,本研究の最終目的上,上記の足場材はきわめて安価に且つ大量に入手可能なものである必要がある。研究代表者の既往の研究をヒントに,大量に排出され,さらに埋立処分場の処分土中にも混合しうるような樹脂製の廃棄物を選定した。この樹脂製廃棄物を微生物と共存させることにより,MICPの発生速度をおおむね二倍まで増加させることができるようになった。この廃樹脂製足場材の添加はとくに微生物の発生初期段階で効果があることが明らかになった。6)顆粒上の足場材の埋設にはプロセス工学的にみて解決すべき問題があることがわかった。それは水流による流下である。これを防ぐために,適切な条件での廃樹脂製足場材のバルク成型が必要である。乾式成型の有効性を確認した。水の汚濁の程度が高い場合にはスケールの発生と成長は速く,これを遅らせることができれば装置系のランニングコストの低減への効果は絶大である。処分土層からの浸出水の濁度が高いため,流下する固形物(SS)の附着・堆積の継続的な発生がスケール形成の主要因である可能性を考えていたが,SSの化学成分はスケールのそれとは一致しない。硬質スケールの形成は完全に微生物の代謝活動に因り発生する二酸化炭素が浸出水中に溶解したカルシウムイオンと化合してできる炭酸カルシウムに起因する。これは通常MICPとよばれる自然発生過程である。
糖尿病患者の「自己管理への家族参加」に焦点をあてた教育方法の検討

糖尿病患者の家族のあり様は、糖尿病患者の自己管理や患者の自己管理への取り組み、気持ちに大きな影響を与えているが、実際に家族のどのようなあり様が患者の自己管理への取り組みにどう影響しているのかは、明らかにされていない。そこで本研究は、2型糖尿病患者とその同居家族が自己管理に取り組んでいるものとして視点を置き、自己管理行動、自己管理に関わる考え、心理的支えについて糖尿病患者の家族が患者の自己管理への参加にどのように存在しているか、また、家族の参加のしかたで患者の自己管理への思いがどのように影響しているかの2点を明らかにした。方法は、糖尿病患者とその家族14組の、患者および家族のそれぞれから、面接を中心としたデータ収集を行い、質的分析方法にてデータ分析した。その結果、以下の3点が見出された。1.家族が患者の自己管理への参加のしかたには4つのパターンに分類される。その4つのタイプは(1)患者にすべてを任せる、(2)患者に委譲できない、(3)自己管理への参加に迷う、(4)範囲を決めて取り組む、であった。2.患者が、自分の管理を家族に期待する程度に種類がある。(1)依存、(2)自分の管理の領域を守りながら期待、(3)無関心までの種類があり、その程度により家族の「協力に対する役に立っている感覚」が異なっていた。3.家族が患者への自己管理の参加のしかたと、患者が自分の管理を家族に期待する程度の関係は、患者が食事療法の主体を家族に頼り過ぎると家族が患者の役に立っている感覚が弱くなる傾向にあり、家族が患者の自己管理への考えを尊重している場合は、患者は意欲を持って自己管理が行える傾向にあることを見出した。これらの結果は、家族参加の程度と参加のしかたを査定する視点を明確にしたものであり、糖尿病患者とその家族に対する教育方法開発の基盤の一つとなることが示唆された。糖尿病の自己管理は、生活と密着している療養方法であるため食事場面や活動、ストレスマネージメントなど、家族と生活時間の調整や家族との相互関係に大きく影響を受けている。家族のあり様は糖尿病患者の自己管理や患者の自己管理への取り組み、気持ちに大きな影響を与えていることは臨床の場でもよく言われているが、実際に家族のどのようなあり様が患者の自己管理への取り組みにどう影響しているのかは、明らかにされていない。今回、2型糖尿病患者とその同居家族が自己管理に取り組んでいるものとして視点を置き、自己管理行動、自己管理に関わる考え、心理的支えについて糖尿病患者の家族が患者の自己管理への担い方、参加にどのように存在しているかを明らかにしようとした。つまり、患者の自己管理に対する家族の「共に担う」「参加する」という存在の可能性の実証を試みた。本年度は、面接を中心としたデータ収集を行った。この結果、患者が自分の管理を家族に期待する程度は、依存から無関心までの種類があり、その程度により家族の「協力に対する自己効力感」が異なっているのではないかとの仮説が立てられた。すなわち、患者が食事療法の主体を家族に頼り過ぎると家族が患者の役に立っている感覚が弱くなる傾向にあり、家族が患者の自己管理への考えを尊重している場合は、患者は気持ちが安定して自己管理が行える傾向にあることを見出した。次年度に予定している調査項目を策定するに至った。
腎糸球体疾患における線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーの関与

1)糸球体上皮細胞障害とFGF2昨年、ラット糸球体上皮細胞障害モデルであるPuromycin Aminonucleoside (PAN)腎症を作成し、FGF2の関与を報告した。本年度は、更にPAN腎症モデルに外因性FGF2、FGF2中和抗体を投与し経過の変化を観察した。外因性FGF2投与により蛋白尿の増加、糸球体上皮細胞障害の助長、Bowman嚢上皮細胞増殖による癒着病変形成が観察され、逆に中和抗体投与によりこれらは変化は軽減された。以上は糸球体上皮細胞障害とそれに連続するBowman嚢上皮細胞増殖による癒着病変形成にFGF2が重要な役割を演じていることを示唆している。2)メサンギウム細胞の形質とFGF受容体の関係メサンギウム細胞増殖モデルであるThy1腎炎モデルにおいて、メサンギウム細胞増殖期にFGF受容体のmRNAが発現していることを明らかにした。この時期に外因性FGF2を投与するとメサンギウム細胞増殖が惹起され、細胞外基質の増加が観察される。このFGF受容体発現メサンギウム細胞は、αsmooth muscle actin染色が観察され、形質の変化とFGF2受容体発現の関係が明らかになり、形質転換した易増殖性(活動性)メサンギウム細胞の成長因子との関係を明らかにした。3)尿細管障害とFGF2急性虚血性腎障害ラットモデルの尿細管細胞増殖期にFGFあるいは受容体のmRNAが発現し、この時期に外因性FGF2を投与すると尿細管障害が増強し、間質に肉芽腫様の変化が観察され、尿細管間質病変の増悪が観察された。各種腎疾患の尿細管間質障害にFGF2が関与している可能性が示唆された。4)本年度の総括各種腎障害モデルにおいてFGF2の関与を明らかにし、その生理作用の解明を外因性FGF2や中和抗体投与により行った。今後の遺伝子発現による確認を行う予定である。
進行性歩行障害に対する歩行訓練装置の開発と応用

本研究で開発する歩行訓練装置は自宅での使用を想定しているので,容易に身体に装着できるように小型で携帯可能なセンサシステムを開発するとともに,杖や歩行器などの補装具と訓練場所を想定した装置に改良を加え用いた.完成したセンサシステム等を身体に装着し健常者による歩行実験を行いセンサによりデータを取得できるか確認し,さらに,そのデータを用い訓練者に有用な訓練情報を提示すると共に,歩行訓練の達成度を呈示できる波形処理システムを開発した.本研究で開発する歩行訓練装置は自宅での使用を想定しているので,容易に身体に装着できるように小型で携帯可能なセンサシステムを開発するとともに,杖や歩行器などの補装具と訓練場所を想定した装置に改良を加え用いた.完成したセンサシステム等を身体に装着し健常者による歩行実験を行いセンサによりデータを取得できるか確認し,さらに,そのデータを用い訓練者に有用な訓練情報を提示すると共に,歩行訓練の達成度を呈示できる波形処理システムを開発した.歩行訓練中に脚部の状態を計測する身体装着型センサとその波形処理方法を検討し,歩行訓練に有益な情報を患者に呈示,さらに訓練の達成度を自動的に評価するセンサシステムを開発することが本研究の目的である.補助なしでの歩行が困難な患者に対しては,電気刺激装置や杖による上肢のサポートを加え円滑な歩行を訓練することが考えられる.また,自宅での使用を想定した場合,訓練場所として平行棒や歩行練習用階段が考えられるので,それら装置を用いた場合の歩行訓練装置の有効性を評価するため,それら平行棒などの装置を購入し改良を加えた.歩行障害者のための歩行訓練装置を開発するため,ポータブル運動計測用センサの開発,ポータブル筋電図計測用センサの開発(連携研究者:電気通信大学・水戸和幸助教が指導),ポータブル電気刺激装置の開発(研究分担者:東北大学・渡邉高志准教授が担当),補装具(杖,歩行器,車椅子)の改良・開発,訓練場所を想定した装置(昇降式平行棒,歩行練習用階段)の改良・開発を並行して行った.本研究で開発する歩行訓練装置は自宅での使用を想定しているので,容易に身体に装着できるように小型で携帯可能なセンサシステムと電気刺激装置を開発するとともに,杖や歩行器などの補装具と訓練場所を想定した装置を購入し改良を加えた.完成したセンサシステム等を身体に装着し健常者による歩行実験を行いセンサによりデータを取得できるか確認した.今後は,そのデータを用い訓練者に有用な訓練情報を呈示する波形処理方法を開発する予定である.歩行訓練中に脚部の状態を計測する身体装着型センサとその波形処理方法を検討し,歩行訓練に有益な情報を患者に呈示,さらに訓練の達成度を自動的に評価するセンサシステムを開発することが本研究の目的である.補助なしでの歩行が困難な患者に対しては,電気刺激装置や杖のサポートにより円滑な歩行を訓練することが考えられる.また,自宅での使用を想定した場合,訓練場所として平行棒や歩行練習用階段が考えられるので,それら装置を用いた場合の歩行訓練装置の有効性を評価するため,それら平行棒などの装置に改良を加えた.歩行障害者のための歩行訓練装置を開発するため,ポータブル運動計測用センサの開発,ポータブル筋電図計測用センサの開発(連携研究者:電気通信大学・水戸和幸助教が指導),ポータブル電気刺激装置の開発(研究分担者:東北大学・渡邉高志准教授が担当),補装具(杖,歩行器,車椅子)の改良・開発,訓練場所を想定した装置(昇降式平行棒,歩行練習用階段)の改良・開発を並行して行った.本研究で開発する歩行訓練装置は自宅での使用を想定しているので,容易に身体に装着できるように小型で携帯可能なセンサシステムと電気刺激装置を開発するとともに,杖や歩行器などの補装具と訓練場所を想定した装置に改良を加えた.完成したセンサシステム等を身体に装着し健常者による歩行実験を行いセンサによりデータを取得できるか確認し,さらに,そのデータを用い訓練者に有用な訓練情報を呈示する波形処理方法を開発した.歩行訓練中に脚部の状態を計測する身体装着型センサとその波形処理方法を検討し,歩行訓練に有益な情報を患者に呈示,さらに訓練の達成度を自動的に評価するセンサシステムを開発することが本研究の目的である.補助なしでの歩行が困難な患者に対しては,電気刺激装置や杖のサポートにより円滑な歩行を訓練することが考えられる.また,自宅での使用を想定した場合,訓練場所として平行棒や歩行練習用階段が考えられるので,それら装置を用いた場合の歩行訓練装置の有効性を評価するため,それら平行棒などの装置に改良を加えた.歩行障害者のための歩行訓練装置を開発するため,ポータブル運動計測用センサの開発,ポータブル筋電図計測用センサの開発(連携研究者:電気通信大学・水戸和幸助教が指導),ポータブル電気刺激装置の開発(研究分担者:東北大学・渡邉高志准教授が担当),補装具(杖,歩行器,車椅子)の改良・開発,訓練場所を想定した装置(昇降式平行棒,歩行練習用階段)の改良・開発を並行して行った.本研究で開発する歩行訓練装置は自宅での使用を想定しているので,容易に身体に装着できるように小型で携帯可能なセンサシステムと電気刺激装置を開発するとともに,杖や歩行器などの補装具と訓練場所を想定した装置に改良を加えた.完成したセンサシステム等を身体に装着し健常者による歩行実験を行いセンサによりデータを取得できるか確認し,さらに,そのデータを用い訓練者に有用な訓練情報を呈示すると共に,歩行訓練の達成度を呈示できる波形処理システムを開発した.
ニワトリの卵巣分化過程で発現するPー450遺伝子群の構造と機能の研究

孵化直後のニワトリ左卵巣より調製したcDNAライブラリ-より見出したR450c17cDNAはその塩基配列より推測されるアミノ酸配列がヒト、ウシ、ラットなどのPー450c17と高い相同性を示した。このPー450c17cDNAを高発現ベクタ-であるpCDーSRα296に挿入し、cos7細胞に導入したところ,プロゲステロン,及びプレグネノロンに対するCー17ハイドロキシラ-ゼ活性,そして17αーOHプロゲステロン,及び17αーOHプレグネノロンに対する17,20ーリア-ゼ活性を示すことが確認された。M.WatermanらがウシPー450c17cDNAを用いて行なった実験結果と比較して,17αーヒドロキシラ-ゼ活性は弱く,又プロゲステロンに対する反応特異性よりプレグネノロンに対する特異性の方が若干弱いなどの特徴が観察された。また17αーOH体に対する特異性は,17αーOHプロゲステロンに対する方が,17αーOHプレグネノロンに対する特異性よりも強く,ウシのP450c17とは逆の相関性を示唆した。これとは別に種々のステロイドホルモン合成型Pー450のニワトリ胚発生と器官分化に伴なう発現の消長を調べ、ニワトリの性分化,生殖腺分化過程におけるこれらPー450遺伝子群の役割を探る為,あらかじめ性判別を行なった孵卵開始後2,3,4,5,6,7,9,11,13日胚中に於けるPー450c17,及びPー450aromの発現をそのcDNAのPCRによる増巾により検出した。この結果Pー450c17遺伝子は雌雄ともに孵卵2日目胚で既に発現していることが示され,また雌雄における発現の違いはほとんど見られなかった。しかしPー450aromは雌では7日目以降に解析したすべての胚でPCR産物が検出され、またそれ以前の胚にも検出されるものがあったが,雄では13日目胚まではほとんど検出される胚は無く,明確な雌雄の差を示した。ニワトリの生殖腺分化は孵卵後56日とされているが,Pー450c17の発現はこれより前に既に始まっており、またPー450aromの発現は生殖腺の分化と同期して制御されていることが強く示唆された。
非コードRNAによるメカニカルストレス感知機構の解明

近年の高齢化社会の進展に伴い、我が国における骨粗鬆症患者が急増している。骨粗鬆症の進行に伴う骨折は寝たきりの原因となり、死亡率も高めることが大きな問題となっている。長期の臥床生活は骨への荷重減少を招き、これが原因となって骨形成が低下すると考えられていることから、骨形成を促進する効果的な治療法や治療薬の開発が強く求められている。骨形成は骨芽細胞、吸収は破骨細胞が担っており、そのバランスによって恒常性が維持されている。骨細胞は骨における最も存在比率の高い細胞種であり、遺伝学的解析によりメカニカルストレスを感知するセンサーであると考えられている。しかし、メカニカルストレス感知機構は知見が少なく、不明な点が多く残されている。そのためメカニカルストレス感知機構の全容解明には新たな視点からのアプローチが重要であると考えられる。そこで本研究で我々は、ノンコーディングRNA(ncRNA)に着目した。ncRNAはタンパク質をコードしないRNA群であり、ゲノムのエピジェネティック修飾や、転写・翻訳、RNAの安定性など、遺伝子発現の様々な段階で制御因子としての役割を果たしている。本検討では、骨細胞特異的ncRNAによるメカニカルストレス感知の分子機構と骨代謝制御を明らかにすることを目的とし、本研究を実施した。本年度は、骨細胞ならびに骨芽細胞を蛍光タンパク質でラベルしたマウスからFACSを用いて各細胞群を単離し、次世代シークエンサーを用いてncRNAの網羅的発現解析を実施した。これらのncRNAのうち骨細胞特異的に発現するncRNAを20種類同定した。次いで、同定したncRNAを恒常的に過剰発現する骨細胞細胞株を作成し、in vitroにおける機能を検討した結果、石灰化に有意な差が認められた。本検討では、骨細胞特異的ncRNAによるメカニカルストレス感知の分子機構と骨代謝制御を明らかにすることを目的とし、本研究を実施する。これらのncRNAのうち骨細胞特異的に発現するncRNAを同定した。同定したncRNAを恒常的に過剰発現する骨細胞細胞株を作成し、in vitroにおける機能を検討した結果、石灰化に有意な差が認められた。in vivoならびにin vitroの解析ともに当初の計画通りに進行していると考えられる。平成27年度の研究を継続するとともに、新たに下記の検討を実施する。1.荷重応答性非コードRNAの同定と機能解析2.骨細胞特異的ncRAN発現