hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分流式下水道に流入する汚水のリスク物質の発生源 ～生活様式か雨天時流入か～

本研究の目的は分流式下水道に流入する汚水のリスク物質-生物検定によって得られた毒性量について,特に疎水性の有機物質に起因する毒性量について発生源を知ることである.疎水性の有機物質に属するリスク物質は多くは汚泥へ移行し,一部は緑農地還元される.想定される発生源は多岐にわたるが本研究では申請者らの先行研究により疑いが高いと考えられた都市的な生活に起因する生活排水か雨天時流入かに焦点をあて発生源を探る.解析の参照物質として,生活排水起源として日用品に起因する化学物質を,雨天時流入起源物質として疎水性画分でのEEMs成分とPAHsとの比を検討する.下水処理場は生活排水をはじめさまざまな廃水を受入れ浄化する.処理は受入廃水の主成分たる有機系のmacropollutantsを対象とするが,そのほかにも微量な有害物質(micropollutants:重金属類や微量有機有害物質)を含んでいる.本研究では特に疎水性の有機物質に着目する.それらは,化学種によっては生物分解されにくく多くが汚泥へ移行する.本研究の目的は下水汚泥中の疎水性有機画分の毒性負荷の発生源を知ることである.方法論として,発生源の疑いを都市的な生活排水か雨天時流入に絞り込み,どちらが発生源なのか?を明らかにする.本年度は以下のようなサイトを検討した:・都市的な生活をしていると想定されるコミュニティプラント・さまざまな特性を持つ分流式下水道の流入水その結果として,コミュニティプラントは複数検討したが,現在のところ採水は難しく,達成できなかった一方異なる特性を持つ分流しき下水道の流入水を入手することができた.その採水,分析を実施した結果,より大都市に立地するサイトにおいて,毒性(発光細菌Vibrio fischeriに対する毒性)が倍程度高いという傾向を得た.少なくとも都市的な地域での流入水のほうが高いという傾向を得られた.本年度は初めて直接流入水を入手し生物検定を実施し,都市的な地域でより高いという明確化された傾向を得られた.初年度は理由を考察する基盤となる,明確な違いを得る調査サイトを見いだすことを主要な目標として設定しており,その点で必要な達成を得られたと考えている.前記の通り最低限必要な成果を得られたが,得られたサイトの発生源は多岐にわたっており,その違いの要員を明確化するには多要因に配慮した方法論とならざるを得ない.それは明確な原因を絞り込むためには非効率を否めない.そのため,既に得られたサイトで毒性の大小が出たその理由を探索することは当然ではあるが,さらに単純な発生源を持ちうるサイトを探索する努力(コミュニティプラント)も同時に行っていきたい.本研究の目的は分流式下水道に流入する汚水のリスク物質-生物検定によって得られた毒性量について,特に疎水性の有機物質に起因する毒性量について発生源を知ることである.疎水性の有機物質に属するリスク物質は多くは汚泥へ移行し,一部は緑農地還元される.想定される発生源は多岐にわたるが本研究では申請者らの先行研究により疑いが高いと考えられた都市的な生活に起因する生活排水か雨天時流入かに焦点をあて発生源を探る.解析の参照物質として,生活排水起源として日用品に起因する化学物質を,雨天時流入起源物質として疎水性画分でのEEMs成分とPAHsとの比を検討する.下水処理場は生活排水をはじめさまざまな廃水を受入れ浄化する.処理は受入廃水の主成分たる有機系のmacropollutantsを対象とするが,そのほかにも微量な有害物質(micropollutants:重金属類や微量有機有害物質)を含んでいる.本研究では特に疎水性の有機物質に着目する.それらは,化学種によっては生物分解されにくく多くが汚泥へ移行する.本研究の目的は下水汚泥中の疎水性有機画分の毒性負荷の発生源を知ることである.方法論として,発生源の疑いを都市的な生活排水か雨天時流入に絞り込み,どちらが発生源なのか?を明らかにする.本年度は以下のようなサイトを検討した:・都市的な生活をしていると想定されるコミュニティプラント・さまざまな特性を持つ分流式下水道の流入水その結果として,コミュニティプラントは複数検討したが,現在のところ採水は難しく,達成できなかった一方異なる特性を持つ分流しき下水道の流入水を入手することができた.その採水,分析を実施した結果,より大都市に立地するサイトにおいて,毒性(発光細菌Vibrio fischeriに対する毒性)が倍程度高いという傾向を得た.少なくとも都市的な地域での流入水のほうが高いという傾向を得られた.本年度は初めて直接流入水を入手し生物検定を実施し,都市的な地域でより高いという明確化された傾向を得られた.初年度は理由を考察する基盤となる,明確な違いを得る調査サイトを見いだすことを主要な目標として設定しており,その点で必要な達成を得られたと考えている.前記の通り最低限必要な成果を得られたが,得られたサイトの発生源は多岐にわたっており,その違いの要員を明確化するには多要因に配慮した方法論とならざるを得ない.それは明確な原因を絞り込むためには非効率を否めない.そのため,既に得られたサイトで毒性の大小が出たその理由を探索することは当然ではあるが,さらに単純な発生源を持ちうるサイトを探索する努力(コミュニティプラント)も同時に行っていきたい.前年度当初予定よりも少ない調査数で明確な傾向がでることが可能になった部分があり,調査のための費用が少なく済んだ.これは当初研究者自身で調査を実施する予定であった下水処理場での流入水の採水について,下水処理場の担当部局が実施していただいたことによるものであった.また一方

逆に調査を構想していたが実際には調査を実施することがかなわなかった調査(コミュニティプラントでの採水調査)があり,その分の支出がなかったためである.今年度は下水流入水の調査においては調査に協力いただける自治体の支援を得つつ,調査を加速し(地点を増加させる)実施するべく検討を実施している.またコミュニティプラントについては,家庭流入水であることが明らかな地点を,さらに調査によって探索し別な手段を検討したいと計画している.
補中益気湯の制御性アダプター分子の発現制御を介した粘膜炎症改善メカニズムの解明

補中益気湯は、免疫増強と免疫制御の両面的な臨床効果を有するが、その作用メカニズムに不明な点が多く、本質的な薬効成分はほとんど明らかとなっていない。補中益気湯に含有されるイヌロオリゴ糖は、本漢方薬と同様に、炎症性シグナルカスケードの抑制性アダプター分子のIRAK-Mなどの発現を増強し、抗がん剤により誘発される小腸粘膜炎症病態を改善する。そのメカニズムの一つとして、植物性生薬に含まれる多糖およびオリゴ糖が腸管免疫系の司令塔であるパイエル板免疫機能を調節し、そのパイエル板から遊出したリンパ球は脾臓などの造血系へと帰巣することから、呼吸器などの局所粘膜免疫系の免疫機能を調節することが推測されている。本申請課題では、補中益気湯の精製イヌロオリゴ糖を用いて、パイエル板や腸管膜リンパ節免疫細胞などでの制御性免疫機能調節作用へのイヌロオリゴ糖群の関与を解析することとした。まず、イヌロオリゴ糖を経口投与した若齢BALB/cマウス(7週齢、雌)のパイエル板免疫細胞の初代培養を行い、ELISAを用いて各種サイトカインの分泌パターンの測定を行った。その結果、イヌロオリゴ糖によりパイエル板のT細胞からIL-2およびIFN-γの産生が増強されることが示唆された。次に、イヌロオリゴ糖を経口投与したマウスパイエル板でDNAマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を行うことで、免疫機能調節においてどのような遺伝子群が関与しているか推測することとした。その結果、炎症や免疫細胞の活性化に関与するサイトカインの遺伝子発現量低下、炎症誘導に関与するカスケードを抑制する因子の遺伝子発現量増加が認められた。以上のことから、イヌロオリゴ糖はパイエル板免疫細胞でサイトカインの分泌パターンの変動や遺伝子発現を抗炎症方向へ調節することで、炎症病態を改善させている可能性が考えられた。
ヘテロサイクリックアミンによる肝発癌での腫瘍遺伝子の活性化

食品中に、調理中に形成される発がん物質であるヘテロサイクリックアミンは、そのほとんどが肝細胞がんを引き起こす。このヘテロサイクリックアミンにより引き起こされたラットの肝細胞がんでのH,K,Nーras遺伝子の活性化を、PCR法で検討した。用いた試料は、いずれもすでに組織学的に肝細胞がんであることが確認された、パラフィン包埋フォルマリン固定標本である。組織学的にがんであることが確認された部分よりPCR法により各々H,K,Nーras遺伝子を増幅し、選択的hybridization法により、12、13、59、61番目のコドンの突然変異を解析した。その結果、2ーaminoー3ーmethylimidazo〔4,5ーf〕qunoline(IQ)で誘発された肝臓がん22例中、変化のあったものはHーrasで13番に3例、Kーras、Nーrasでは変化は認められなかった。さらに、2ーaminoー3,8ーdimethylimidazo〔4,5ーf〕quinoxalineで誘発されたものでも、17例につき検討し、Hーras,Nーrasに変化は認められず、唯一Kーrasの13番に1例だけ変化が認められたのみであった。以上の如く、ヘテロサイクリックアミンによるラットの肝臓発がんでは、ras遺伝子が活性化されることは必要条件ではないことが明らかとなった。マウスにおける肝臓がんでは、多くの化合物でras遺伝子の活性化が発がんと強く結びついていると報告されている。今回の結果だけでは動物種の違いか、化合物の違いかが明らかではないが、ヘテロサイクリックアミンのラットにおける肝臓発がんのメカニズムは、多くのマウスのものと異なることが明らかとなった。現在、ヘテロサイクリックアミンによるマウスの発がんにつき、検討中である。
アメリカの＜政教分離・信教の自由＞判例理論の歴史的研究：1940-1971

本研究の目的は、合衆国憲法の<政教分離・信教の自由>の規範内容とその基盤にある諸思想について、これまで充分に行われていない歴史的アプローチにより、新たなより深い理解を獲得することである。そのため本研究は、合衆国最高裁の<政教分離・信教の自由>判例の歴史的展開を、それが現代的展開を始めてから、政教分離に関する違憲審査基準を定立するまでの時期について(1940年1971年)、追跡した。本研究期間全体を通じて、研究対象期間の1940年から1971年までの合衆国最高裁の<政教分離・信教の自由>の全判決を時系列に沿って一つひとつ解読していくという作業を、基盤とした。その上で、次第にこれを、(p)個別の裁判官(具体的には、ブレナン・ダグラス・ブラックの各裁判官)の<政教分離・信教の自由>判例理論を把握する試みと、(q)諸判決の法廷意見の集積である「判例法」を首尾一貫した内容のものとして読み取る試み、と同時進行させて、研究を全体的に深めていくことを心がけた。最終年度の本年度は、ブレナン裁判官の<政教分離・信教の自由>理解((p))の解明に重点を置いた。彼は、<信教の自由>法理を新たに展開させた1963年判決の法廷意見を執筆する一方で、<政教分離>に関する同年の別の判決において浩瀚な補足意見を執筆し、自身の<政教分離>理解を示している。その両者を総合的に理解することを軸とした。本研究期間中、本研究で獲得した視座を生かして、日本国憲法の<政教分離・信教の自由>に関する歴史研究や、日本国憲法の精神的自由(19条の内心の自由、20条の信教の自由と政教分離原則)研究、また立憲主義に関する原理的考察を行う研究に関する成果等を公表した。本年度は、本研究の第1段階として、合衆国最高裁の<信教の自由・政教分離>の諸判決を、1940年判決から初めて、時系列に沿って一つひとつ解読していく作業に取り組み、1961年判決にまで及んだ。それぞれの判決について、最高裁内部にどんな複数の立場が存在し、それぞれの立場の分岐点がどこにあるのかを解明し、法廷意見は一つの立場か複数の立場の妥協か、後者の場合どんな妥協か、の検討を行った。本研究の第1段階の進行に伴い、本研究の第2段階ー(p)個別の裁判官の<政教分離・信教の自由>判例理論を把握する作業と、(q)諸判決の法廷意見の集積である「判例法」を首尾一貫した内容のものとして読み取る試みーを、同時進行させるよう、心がけた。本年度の研究における、(p)の主な把握対象は、ブラック、フランクファータ、ダグラス、ジャクソンの諸裁判官だった。<政教分離>に関する立場は一般に、「分離派」と「配慮派」に二分されて語られる。本年度の本研究の対象期間たる1941年61年の合衆国判例は、明らかに「分離派」優位だった。本年度の本研究は、「分離派」の中にもいくつかの異なる考え方が存在したこと、(「分離派」優位の)「判例法」のレベルのみならず、「分離派」裁判官諸個人の考え方のレベルでも、不整合ないし矛盾が内包していたこと、などを解明した。本年度中に公表できたのは、本研究課題の諸主題「政教分離」・「信教の自由(内心の自由)」・「立憲主義」・「宗教」に関連する研究成果にとどまった。本年度の達成目標は、本研究の全対象期間(1941年71年)の諸判決の半分以上の解読であった。実際には、本年度中に1961年の判決にまで及ぶことができた。そういう面では本研究はおおむね順調に進展している。だが一方、本年度は残念ながら、諸判決そのものの検討に精一杯で、海外調査を実施できなかった。この点で、本年度までの達成度を「やや遅れている」と自己評価した。本年度は、昨年度に引き続き、本研究の第1段階として、合衆国最高裁の<信教の自由・政教分離>の諸判決を、時系列に沿って一つひとつ解読していく作業に取り組み、予定通り1971年判決にまで及んだ。本研究の第1段階の進行に伴い、本研究の第2段階ー(p)個別の裁判官の<政教分離・信教の自由>判例理論を把握する作業と、(q)諸判決の法廷意見の集積である「判例法」を首尾一貫した内容のものとして読み取る試みーを、同時進行させた。(p)の主な把握対象は、ブラック、ダグラス、ブレナンの諸裁判官だった。<政教分離>に関する立場は一般に、「分離派」と「配慮派」に二分されて語られるが、本研究の対象期間たる1941年71年の合衆国判例は、明らかに「分離派」優位である。本年度までの本研究は、「分離派」の中にもいくつかの異なる考え方が存在したこと、(「分離派」優位の)「判例法」のレベルのみならず、「分離派」裁判官諸個人の考え方のレベルでも、不整合ないし矛盾が内包していたこと、などに焦点を当てている。

本年度中には具体的な成果を公表できなかったが、1947年判決のラトレッジ裁判官執筆の反対意見に着目することで、「分離派」内の様々な考え方の共通点と相違点が浮き彫りになりうるとの感触を得た。本年度の達成目標は、本研究の全対象期間(1941年71年)の諸判決の解読であった。その目標を達成できたという面で、本研究はおおむね順調に進展している。本年度は、昨年度までの研究実績の上に、概ね次のように研究を進めた。まず、本研究の第1段階ー研究対象期間の1940年から1971年までの合衆国最高裁の<政教分離・信教の自由>の全判決を時系列に沿って一つひとつ解読していくという作業ーの、二巡目の取り組みに重点を置いた。次に、それを絶えず、本研究の第2段階ー(p)個別の裁判官の<政教分離・信教の自由>判例理論を把握する作業と、(q)諸判決の法廷意見の集積である「判例法」を首尾一貫した内容のものとして読み取る試みーの取り組みと同時進行させて、研究を全体的に深めていくことを心がけた。<政教分離>に関する立場は一般に、「分離派」と「配慮派」に二分されて語られるが、本研究の対象期間の合衆国判例は、明らかに「分離派」優位である。本年度までに本研究は、「分離派」の中にもいくつかの異なる考え方が存在したこと、(「分離派」優位の)「判例法」のレベルのみならず、「分離派」裁判官諸個人の考え方のレベルでも、不整合ないし矛盾が内包していたこと、などの解明を深めてきた。本年度は、<信教の自由>法理が新たな展開を見せた1963年の判決に焦点を当てることで、<政教分離・信教の自由>法理の全体像の解明を進めることができるという着想を得た。同判決の法廷意見を執筆して新たな<信教の自由>法理を提示したブレナン裁判官は、<政教分離>に関する同年の別の判決において浩瀚な補足意見を執筆し、自身の<政教分離>理解を提示している。ブレナン裁判官の<政教分離・信教の自由>理解を軸にすることで、本研究主題の見通しがよくなるのではないかという感触を持っている。本年度は、日米における宗教的自由と政教分離に関する複数の研究成果を公にしたものの、米国の本研究対象期間における宗教的自由と政教分離に関する研究成果を公にすることができなかった。この点で、現在までの進捗状況を「やや遅れている」と自己評価した。本研究の目的は、合衆国憲法の<政教分離・信教の自由>の規範内容とその基盤にある諸思想について、これまで充分に行われていない歴史的アプローチにより、新たなより深い理解を獲得することである。そのため本研究は、合衆国最高裁の<政教分離・信教の自由>判例の歴史的展開を、それが現代的展開を始めてから、政教分離に関する違憲審査基準を定立するまでの時期について(1940年1971年)、追跡した。本研究期間全体を通じて、研究対象期間の1940年から1971年までの合衆国最高裁の<政教分離・信教の自由>の全判決を時系列に沿って一つひとつ解読していくという作業を、基盤とした。その上で、次第にこれを、(p)個別の裁判官(具体的には、ブレナン・ダグラス・ブラックの各裁判官)の<政教分離・信教の自由>判例理論を把握する試みと、(q)諸判決の法廷意見の集積である「判例法」を首尾一貫した内容のものとして読み取る試み、と同時進行させて、研究を全体的に深めていくことを心がけた。最終年度の本年度は、ブレナン裁判官の<政教分離・信教の自由>理解((p))の解明に重点を置いた。彼は、<信教の自由>法理を新たに展開させた1963年判決の法廷意見を執筆する一方で、<政教分離>に関する同年の別の判決において浩瀚な補足意見を執筆し、自身の<政教分離>理解を示している。その両者を総合的に理解することを軸とした。
中枢神経系におけるマウスレトロウイルスレセプターに関する研究

1.目的中枢神経系におけるマウスレトロウイルス(MLV)レセプター遺伝子をクローニングし、我々が分離したラットの脳でよく増殖するMLVを用いて、その性状を明らかにする。2.方法これまでにクローニングされたMLVレセプター遺伝子が、ファミリーを形成している可能性に着目し、マウス腺維芽細胞由来のMLVレセプター遺伝子/アミノ酸チャネル(ecoR)をハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。3.結果および考察(1)ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、ラットの中枢神経系にもecoR関連遺伝子が発現していることが示された。(2)ラットのゲノムDNAを用いて、緩やかな条件および厳しい条件で、サザンブロットハイブリダイゼーションを行なった結果、ラットにecoR遺伝子およびこれと相同性のある遺伝子が存在することが示唆された。(3)ラット脳のcDNAライブラリーから、緩やかな条件でクローンを選択した結果、22個のクローンが得られた。これらのクローンの中には、ナトリウムチャネルと部分的に相同性を持つものがあった。今後、これらの遺伝子産物とウイルスの相互作用を解析する予定である。
中枢神経系のトロンボポイエチン受容体(c-mpl)遺伝子発現及び遺伝子変異の解析

先天性血小板減少症患者のトロンボポイエチン受容体遺伝子(c-mpl)の解析日本より5例、米国より1例の先天性無巨核球性血小板減少症患者のc-mpl遺伝子を解析した。その結果、日本人患者1例において、病因と考えられる遺伝子変異(Q186X、1499 delT)を同定した。このことは、トロンボポイエチン受容体遺伝子のknockout mouseと同様の表現型を示すヒトの常染色体劣性の遺伝形式をとる遺伝病を、先天性無巨核球性血小板減少症患者において世界で初めて証明した点で意義がある。なお、このc-mpl遺伝子異常が見つかった先天性無巨核球性血小板減少症患者には、特異的な神経合併症(Dandy-Walker症候群)を認めた。これはトロンボポイエチン受容体が造血系細胞のみならず神経系細胞の発生分化に関与している可能性を示唆すると考え、以下の解析を行った。ヒトの各種臓器におけるc-mpl遺伝子発現の定量解析市販されているヒトの成人組織16種類、胎児組織8種類由来のcDNA、および胎内死亡した在胎週数20週から40週の胎児の脳組織(大脳・小脳・脳幹部・脊髄)よりcDNA合成した。そしてこれら各々のcDNAの中に存在するc-mpl mRNA量をreal-time TaqMan PCR法にて定量した。その結果、血小板や巨核球などの造血系細胞に高い発現がみられたものの、胎児の神経組織を含め、造血系以外の組織ではc-mpl遺伝子の発現はほとんど見られなった。その結果、日本人患者1例において、病因と考えられる遺伝子変異(Q186X、1499delT)を同定した。ヒトの各種臓器におけるc-mpl遺伝子発現の定量解析市販されているヒトの成人組織16種類、胎児組織8種類由来のcDNA、および胎内死亡した存胎週数20週から40週の胎児の脳組織(大脳・小脳・脳幹部・脊髄)よりcDNA合成した。その結果、胎児の神経組織を含め、造血系の臓器以外ではc-mpl遺伝子の発現はほとんど見られなかった。
琉球方言の記述・比較研究

琉球方言の中でも調査資料の乏しい八重山郡竹富町西表祖納地域の方言を調査し、資料を整備した。調査内容は、音韻、活用(動詞・形容詞)、助詞についてである。調査の結果、まず当該地域のワ行子音は/b/に対応することがわかった。これは沖縄北部方言のワ行子音/b/にも関連するが、沖縄北部方言に見られた/gw/は当該地域では観察できなかった。今後の課題は、平成13年度、14年度に調査を実施した宮良方言と白保方言の資料とも合わせて、当該地域のワ行子音がどのように沖縄北部方言のそれと関連しているのかについて考察し、ワ行子音の変化過程を明らかにしたい。また音声面では鼻母音の[a]が観察できた。この音については、祖内方言に留まらず、八重山方言の音声変化を記録する上で大切な音声だと考えられるので、引き続き緻密な記述調査が必要である。次に活用体系は、他の八重山方言と同様サアリ系であり、沖縄本島方言とは異なることがわかった。今後は近隣方言との差異について観察し比較研究を進めていく。琉球方言の中でも調査資料の乏しい八重山郡石垣市白保地域の方言を調査し、資料を整備した。調査の結果、まず当地域のワ行子音は/b/に対応することがわかった。これは沖縄北部方言のワ行子音/b/にも関連するが、沖縄北部方言に見られた/gw/は当地では観察されなかった。今後の課題は、昨年度調査を実施した宮良方言の資料とも合わせて、当地のワ行子音がどのように沖縄北部方言のそれと関連しているのかについて考察し、ワ行子音の変化過程を明らかにしたい。また音声では、中舌母音の[i]が観察されたが、先行研究に見られる[e]は観察できなかった。この点については、八重山方言の音声変化を記録する上で緻密な調査と、充分な議論が不可欠である。次に活用体系は、他の八重山方言と同様であり、沖縄本島方言とは異なることがわかった。続いて助詞では、いわゆる共通語の「が」に対応する助詞はなく、代わって係助詞の[du]と連体助詞の[nu]とが、格助詞「が」の働きを担いつつある。係助詞[du]と連体助詞[nu]とがどのような過程を経て格助詞化していくのかについて考察を深めたい。これまでの研究成果に照らし合わせ、ウチ・ソトの関係で、当方言の「ガ」について述べれば、ウチ・ソト意識は崩壊し、機能分担の一翼を担えず淘汰され、格助詞、連体助詞ともに「ヌ」がすべてを担っている。調査を進める一方で、平行して調査資料をまとめ、成果を論文としてまとめている。来年度の調査資料をも合わせて報告書を作成する予定である。
マイクロ波加熱による火炎中のすす粒子低減技術の検討

マイクロ波を火炎に照射することにより,火炎中のすす濃度を低減させることを試みた。レーザ計測手法を用いて,火炎中のすす濃度分布およびすす粒子径を計測し,種々の火炎においてすす生成過程に及ぼすマイクロ波照射の影響を調べた。その結果,マイクロ波を照射させることで火炎中のすす濃度が最大約20%低減する傾向が観察された。一方,すす粒子径にはほとんど変化が見られなかった。燃焼場にマイクロ波を照射するためのマイクロ波発生装置の製作を行った.マイクロ波を効率よく照射するためには,導波管を用いたシングルモードの発生装置が有効であるが,バーナおよび光学計測のための観察用窓,燃焼ガスを排出させる排出孔等を設置する必要があることを考慮し,照射効率は低いが簡便に装置の改良が可能なオーブン式(マルチモード)を採用した.市販のマイクロ波加熱装置(既存)に平面対向流拡散火炎バーナを設置できるよう改良した.本バーナは上方のノズルから窒素で希釈された燃料,下方のノズルから空気が導入されるものであり,燃料流と空気流の衝突した付近に平面拡散火炎が安定的に形成されることを確認した.マイクロ波の周波数は2,45GHzで,最大出力を700Wとし,出力はゼロから700Wまで可変とした.光学計測として,火炎中のすすの体積濃度とすす粒子径が同時に計測可能なレーザ誘起赤熱法(LII)を適用することを試みることとし,その光学系の構築を行った.本手法はレーザ光をすす粒子に照射させることによりすす粒子を赤熱させ,その発光特性からすすの体積濃度を,また発光の時間的な減衰からすす粒子の直径を推定するものである.光源として既存のパルスYAGレーザの第2高調波(532nm)を使用する.すすからの発光はハーフミラーにより2方向に分けられ,それぞれ中心波長が410nmと670nmの干渉フィルターを通して光電子増倍管に導かれる.光電子増倍管からの信号は既存の高速サンプリングのオシロスコープに取り込まれ,そのデータは解析用パソコンに保存される.本年度は,すすからの発光スペクトル強度を基に,すすの体積濃度を算出した,その結果,マイクロ波照射により,火炎中のすす堆積濃度が減少する傾向が認められた.ディーゼルエンジンはあらゆる熱機関のうちでも優れた高い燃料経済性を持っており,省エネルギーや地球温暖化抑制の立場から注目されている.しかし現状では微粒子状物質(PM)のすすおよび窒素酸化物(NOx)の排出が多いという問題点を抱えている.本研究では,マイクロ波を用いたすす抑制技術の検証を行うために,エチレンの拡散火炎にマイクロ波を照射し,火炎へのマイクロ波照射がすす濃度分布にどのような影響を及ぼすかを2次元的に調べることを目的とした.2次元のレーザ誘起赤熱法の構築においては,532nmND3+:YAGレーザをシリンドリカルレンズによりシート状にして計測対象に入射させた.レーザシートは高さ20mm幅0.5mmで強度は0.5J/cm2とし,中心部分の10mmのみを観察に用いた.LII信号は532nmバンドストップフィルタと410nm(FWHM10nm)の干渉フィルタを通してICCDカメラにて検出した.ICCDカメラのゲートタイミングはレーザ発振後20ns後,ゲート時間は50nsとした.シングルモードのマイクロ波照射装置内に直径4mmの石英製円管を設置し,そこからエチレンガスを鉛直上方へ噴射させて拡散火炎を形成させ,その火炎に上記レーザシートを照射し,拡散火炎中のすす濃度分布を行った.また,火炎温度の計測は2色法を用いて行われ,580nm(FWHM10nm)と670nm(FWHM10nm)の二つの干渉フィルタを用いた.実験では,エチレンの流量を0.3L/minとし,マイクロ波照射強度を0W,50W,100W,150Wの4条件とした.その結果,マイクロ波を照射することですす体積濃度の減少が観察され,特にすす体積濃度が一定以上濃い領域でマイクロ波の影響が顕著であることが明らかとなった.一方,マイクロ波照射によるすす粒子温度の有意な変化は観察されなかった.平成22年度に構築した2次元レーザ誘起赤熱法(LII)を用いて,種々の火炎および条件下における計測を行い,すす生成過程に及ぼすマイクロ波照射の影響を明らかにした.シングルモードマイクロ波発生装置内に種々の形態を有する火炎,すなわち平面拡散火炎,噴流拡散火炎および過濃予混合火炎を形成させ,火炎内のすす体積濃度分布の計測を行った.2次元LIIでは,532nmND3+:YAGレーザをシリンドリカルレンズによりシート状にして計測対象に入射させた.レーザシートは高さ20nm幅0.5nmで強度は0.5J/cm2とし,中心部分の10nmのみを観察に用いた.LII信号は532nmバンドストップフィルタと410nm(FWHM10nm)の干渉フィルタを通してICCDカメラにて検出した.ICCDカメラのゲートタイミングはレーザ発振後20ns後,ゲート時間は50nsとした.

その結果,シングルモードによるマイクロ波照射によるすす濃度分布の変化を明確に確認することはできなかった.また,同様の手法を用いて,マルチモードマイクロ波発生装置内における火炎中のすす体積濃度分布計測を行うとともに,すすの一次粒径計測を行った.異なる2つの経過時間におけるLII信号強度を計測し,その強度の減衰過程からすすの粒径を求めることを試みた.この際,効率良くマイクロ波を火炎に照射させることを目的として,マイクロ波発生装置内に表面にマイクロ波吸収体を塗布した断熱材(サセプター)を挿入して実験を実施した.その結果,マイクロ波照射により火炎中のすす濃度が約10%から20%低減する傾向が観察された.特に,すす濃度の高い領域ですす濃度の減少が顕著であることが確認された.一方,すすの一次粒子径はマイクロ波照射によりほとんど変化しなかった.これらの結果から,すす濃度の減少は,粒径の減少が要因ではなく,すす粒子の数密度が減少したことによるものと推測された.
マスト細胞のサイトカイン産生における転写因子MITFの役割

マウス骨髄由来培養マスト細胞(BMMC)の分化と形質発現においてmi遺伝子産物である転写因子MITFが関わっていることが明らかにされている。我々はこれまでc-kitレセプター、マスト細胞特異的プロテアーゼ(MMCP)、α4-integrin、そしてα-MSHレセプター(MC1R)の発現がMITFによって制御されていることを明らかにしてきた。これらは非活性化状態のマスト細胞で、MITFがその形質発現に関わっている例である。マスト細胞はIgEを介した特異的抗原刺激によって、またその他の非特異的刺激により様々なサイトカインを産生・放出し生体において様々なアレルギー反応の惹起に中心的な役割を果たしていることが知られている。そこで我々は、活性化マスト細胞でのサイトカイン産生におけるMITFの関わりを検討した。正常マウス由来BMMC(+/+ BMMC)とmi遺伝子座に突然変異を持つmi/miマウス由来BMMC(mi/mi BMMC)をIgE/DNP-HASで抗原刺激した場合のIL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-13,TNF-α遺伝子の発現誘導をNorthern blot法で調べた。その結果、+/+BMMCでは刺激後30分以内にIL-4,IL-6,IL-13,TNF-αmRNAの発現が誘導された。ところがmi/mi BMMCではTNF-αmRNAの発現が全く誘導されず、また逆にIL-5mRNAの発現が強く誘導された。この結果からMITFがマスト細胞においてTNF-αの発現を誘導すると共に、IL-5の発現を抑制していると考えられた。その機構を調べる為にTNF-α遺伝子とIL-5遺伝子の上流をクローニングし実際にMITFがどのように発現制御に関わっているか検討している。
生物の移動運動にみられる環境適応性の数理的解明

真正粘菌変形体及びヒトの2足歩行においてみられる環境変化に対する適応性について研究を行った。真正粘菌変形体は忌避物質に接した後に、その濃度に応じて適切な振る舞いをすることが知られている。本研究では、現象論的モデル方程式を提案し、細胞先端部における化学反応の活性化の制御が環境適応的な振る舞いにおいて重要な役割を果たすことを示した。また、ヒトの2足歩行システムに関する数理モデルを解析し、股関節、及び膝関節のダイナミクスを歩行速度の関数として記述することによって、システムが様々な環境変化に適応できることを数値シミュレーションによって確認した。生命活動において特徴的なこととして環境の変化に対するシステムの柔軟な適応性が挙げられる。その仕組みを理解するためには、数理モデリングを行い、システムの維持において本質的な役割を果たすパラメータを発見することが必要である。今年度は真正粘菌変形体及びヒトの2足歩行においてみられる環境変化に対する適応性について研究を行つた。真正粘菌変形体においては細胞全体でみられるゲルの収縮弛緩運動とゾルの流動現象に加え、移動運動をする際に先端部である化学反応が起きていることが報告されている。そこで、それらを考慮に入れた現象論的モデル方程式を提案した。生物実験において先端部が忌避物質に接した後に、その濃度に応じて移動方向を反転させ、その場から逃げる現象や細胞が分裂する様子が観察されるが、そのような振る舞いを提案したモデルによって再現することができた。また、そのような適応性は先端部で起きる化学反応を制御することで得られることが示唆された。ヒトの2足歩行においては様々な環境変化に対してシステムの維持を可能にするためにはシステム全体の状態を評価する変数を発見することが重要となる。相空間において歩行状態と転倒状態を分けるセパラトリクス近傍において数値実験を行った結果、歩行速度によってシステムの状態が評価できることがわかった。さらに、股関節及び膝関節を歩行速度に応じて制御することによって様々な環境変化に適応できることを数値シミユレーションによって確認した。真正粘菌変形体にみられる環境適応性真正粘菌は、進展運動中に忌避物質に接触した際、その濃度に応じて適切に運動方向を変化させる振る舞いを見せる。そのような環境適応性の仕組みは未だ明らかになっておらず、数理的な理解が重要な課題になっている。本年度は、忌避物質に接した際に細胞が見せる特徴的な振る舞い(通過、分裂、反射)を再現する数理モデルの作成を行い、環境適応性の再現にとって重要な機構を明らかにすることを試みた。真正粘菌の運動を再現するモデル方程式ではこれまで考慮されていなかった、細胞先端部分でおきる化学反応を考慮に入れたモデル方程式を導出した。原形質の量によって細胞先端部分で起きる化学反応を制御することによって、忌避物質の濃度に応じて振舞いを変化させる様子を再現することに成功した。このことから原形質流動と進行パルスの間の適切な相互作用によって環境適応性が現れることを示すことができた。2足歩行システムにみられる環境適応性ヒトの2足歩行システムにみられる環境適応性の数理的解明によって生理学や工学の分野において有益な情報を提供することができる。本年度は不安定な地面(杭の上)を歩くシステムの環境適応性について考察した。杭の上に着地した時の足の位置と膝関節角度の間に適切な拘束条件を与えることによって、2足歩行システムが杭の上を安定に歩行することを数値シミュレーションによって確認した。さらに、着地時の姿勢を歩行速度の関数として変化させることで歩行の安定性が向上することを示した。
高齢化社会における死生観に関する総合的研究

最終年度にあたり、研究計画に沿って以下のように研究活動を実施した。1.研究会の開催7月に研究会を開催して、昨年度以降の個人研究の進捗状況を報告すると共に、これまでの研究活動から得られた知見を全員が発表し、意見交換を行った。2.個人研究華園聰麿東北地方の観音札所巡礼の実態の考察渡辺喜勝調査票を用いた現代日本人の「死」と「来世」に関する意識調査の分析池上良正大学生に対する死生観のアンケート調査の分析諸岡道比古信者の手記における死生観分析鈴木岩弓墓の変化にみる死生観の変化分析板垣恵子死生観に関する医療従事者に対するアンケート調査の分析山嵜亮隠岐島前の葬送習俗からみた死生観分析間宮啓壬山梨県における「組」の葬儀を事例にした死生観分析安保英勇宮城県農村部における高齢者の死生観分析何燕生近年の「自然葬」運動と「自然葬」志向に関する基礎的研究3.報告書の刊行3月末刊行を目指して、準備を進めている。本研究計画の初年度に当たる今年は、交付申請書に記載した実施計画案にほぼ沿う形で研究活動を実施した。1.全体活動6月28日に研究者全員が顔を合わせ、今後の研究の運び方に関して詳細な検討を行った。その際には、それぞれの個別研究を全体の研究の中にどのように位置づけるか、そしてまた個別研究相互の関係をどのように絡めるかといった研究方針を協議し、相互の研究の今後のあり方を確認した。2.個別研究花園聰磨:実態調査の他に理論研究を行い、論文を公刊した。渡辺喜勝・板垣恵子:医療施設におけるアンケート調査を実施し、結果を分析中である。鈴木岩弓:仙台市内の墓地で実態調査を実施し、論文にまとめた。池上良正:死生観に関するアンケート調査をつくば市などで実施し、結果を分析中である。諸岡道比呂:信者の信仰告白が記された手記を収集し、その内容の分析を行っている。山崎亮:島根県匹見町において聞き取り調査を実施し、資料整理を行っている。間宮啓壬:身延山参詣者に対する聞き取り調査、及び居住地における追跡調査を実施している。何燕生:「葬送の自由を進める会」会員に対する聞き取り調査を実施している。安保英勇:宮城県田尻町においてアンケート調査を実施し、結果の分析を行っている。本年度は、研究者それぞれが交付申請書に述べた研究計画に、ほぼ沿う形で研究を実施した。1.研究会の開催7月に共同研究参加者が参加する研究会を開催し、昨年度の研究会以降の個人研究の進行状況を述べて意見交換をすると同時に、今後の進め方について話し合った。以後の研究の連絡にはE-mailを活用し、随意、意見交換を行ってきた。2.個人研究華園聰麿:津軽の札所において実態調査を実施した。渡辺喜勝:医療施設で末期患者・医療従事者の死生観に関するアンケート調査を実施し、分析中。池上良正:昨年度から実施中の大学生に対する死生観のアンケート調査の範囲を拡大し、分析中。諸岡道比古:関西地区に本部を置く宗教団体を訪問し、信者の手記を収集し分析している。鈴木岩弓:仙台市内の民間共同墓地における墓碑銘を収集し、死生観の分析を行い報告した。板垣恵子:医療施設で末期患者・医療従事者の死生観に関するアンケート調査を実施し、分析中。山崎亮:島根県西部の廃寺村落において、高齢者から死生観に関する聞き取り調査実施。間宮啓壬:身延山参拝者に対する聞き取り調査を実施し、分析している。安保英勇:宮城県田尻町で実施した死生観に関するアンケート調査の分析を行った。何燕生:自然葬を推進している人々に聞き取り調査を実施した。(1)研究会の開催7月に研究会を開催して、昨年度以降の個人研究の進捗状況を報告すると共に、これまでの研究活動から得られた知見を全員が発表し、意見交換を行った。(2)個人研究華園聰麿東北地方の観音札所巡礼の実態の考察渡辺喜勝調査票を用いた現代日本人の「死」と「来世」に関する意識調査の分析池上良正大学生に対する死生観のアンケート調査の分析諸岡

道比古信者の手記における死生観分析鈴木岩弓墓の変化にみる死生観の変化分析板垣恵子死生観に関する医療従事者に対するアンケート調査の分析山嵜亮隠岐島前の葬送習俗からみた死生観分析間宮啓壬山梨県における「組」の葬儀を事例にした死生観分析安保英勇宮城県農村部における高齢者の死生観分析何燕生近年の「自然葬」運動と「自然葬」志向に関する基礎的研究(3)報告書の刊行3月末刊行を目指して、準備を進めている。
空中写真による歴史的景観の分析手法の体系化に関する基礎的研究

収集した各種空中写真のうち、先史時代より現代にまたがる歴史的景観の復原的空中写真判読に最も適当と思われる写真を利用し、以下の項目に関する調査研究を行い、その成果を報告書にまとめ発表した。研究地域、項目に関する調査研究を行い、その成果を報告書にまとめ発表した。研究地域、項目は次のとおりである。与喜山、春日山、三輪山、二上山における先史時代より現代に至る植生と斜面安定性に関する調査、三輪山山麓における古墳の造成、削平に関するとみられる先史時代の景観、恭仁京における人工水路の下刻、飛鳥京、大津京、恭仁京のプランに関する歴史地理学的考察、奈良盆地における中世の域郭、近世の陣屋町の景観、吉野山地における山村の立地と変容、大阪都心部の戦前、戦後の市街地の変貌、奈良西郊における戦後の住宅地開発。以上のほか、わが国における空中写真の発達に関する抄史をまとめた。(1)木津川流域の地形分類図を試作し,その周辺に営まれた古代の恭仁京のプランとの関係を検討した.その結果,空中写真から恭仁京左京の道路跡なども検出でき,復原研究に新しい知見を提起することが可能となった.(2)桂川流域についても地形分類図を試作し,河川流路の変化を明らかにすることができた.さらに地形の変化との関係から長岡京の立地についても検討した.その結果,長岡京の造営が淀津と密接に関係すること,さらに河川に近接していたことから河川の氾濫の影響があったことなどを明らかにすることができた.(3)奈良県の葛城地方についても地形分類図を試作し,特に葛城川と曽我川による沖積平野の形成のプロセスを探る基礎資料を得ることができた.そして古代の葛城氏という豪族がこの地方に本拠を置いた地理的実体についても検討した.例えば4世紀代の大型墳墓の立地と沖積低地との関係,水田形成のための地形的条件などについて考察を試みた.さらに律令時代に初期にこの地につくった大和国府の位置の比定についても試考した.(4)奈良県天理市近郊については,断層地形扇状地,沖積平野などについて地形分類図から歴史時代の遺跡の立地について検討した.特に布留川の扇状地においては縄文時代から古墳時代に至る遺物が出土しているので,扇状地の形成を追跡するのに恰好なファールドであることを確認することができた.さらに山の辺道の断層崖下にある古墳時代前期の古墳の造営が,既存の丘陵地形をどのように利用・改変したかについて空中写真から検討することができた.また石上神宮が鎮座する場所について,その自然的基礎ー主として地形的な面ーについて考察した.以上の他,奈良盆地の古代の宮都(飛鳥・藤原京・平城京)についても準備的な考察を試みた.本年度は歴史的景観の復原、分析に利用しうるあらゆる空中写真の蒐集と検討、歴史時代の各段階における都市・村落の事例分析、ならびにこれ等の成果を結集することを目標とするとともに、他方現行の空中写真や第2次大戦直後の米軍空中写真に先行する1945年以前のわが国で行なわれた撮影事業についても最初期よりの検討を行ない、大阪城付近、大阪中心部、広島中心部等の知られることの少ない二三の事例をも提示した。各時代についてみると、古代に関する研究では、飛鳥・恭仁・大津京等従来とかく位置の研究において決定的な手掛りを欠いていた古代宮都について写真判読結果による手掛りをつかみ、中近世に関する研究では、大和の荘園・城館・陣屋町等の形態分析を写真判読によって行なった。近代に関する研究では奈良郊外、大阪市中心部等を対象として、戦前や米軍の空中写真等も利用した判読成果もあげられた。以上の成果に加うるに、前年度蒐集の資料やその研究をも加えて、64頁に及ぶステレオトリプレットに排列した空中写真や解析結果、関連研究を中心とする報告書を作成した。
ホスホリラーゼ異常リン酸化による心不全発症機序の解明

本研究の目的は、肥大型心筋症におけるホスホリラーゼ異常スレオニンリン酸化の機能的意義を明らかにし、新規心不全発症機序を解明することである。精製したWT-ホスホリラーゼ, ThrXAla-ホスホリラーゼ, ThrXAsp-ホスホリラーゼを用いて機能発現実験を行った。NADPH産生量を指標としたForward反応では、ThrXAsp-ホスホリラーゼ活性はWT-ホスホリラーゼおよびThrXAla-ホスホリラーゼ活性と比較して有意に低下した。ゲル泳動Reverse反応においても、Forward反応と同様にThrXAsp-ホスホリラーゼ活性低下が明らかとなった。申請者は肥大型心筋症患者でPRKAG2遺伝子変異を同定し、この変異をマウスに導入すると筋型グリコーゲンホスホリラーゼに特異的な異常スレオニンリン酸化が起こることを見いだした。本研究の目的は、肥大型心筋症における[1]筋型グリコーゲンホスホリラーゼ異常スレオニンリン酸化の機能的意義を明らかにし、新規の心筋症・心不全発症機序を解明すること、[2]異常スレオニン・リン酸化を阻害する化合物を同定し、心不全治療薬創薬の基礎を築くことである。リン酸化部位のスレオニンを負電荷を持つアスパラギン酸で置換することにより、スレオニン部位が恒常的にリン酸化された擬似状態を作成可能である。一方、スレオニンのアラニンへの置換は、脱リン酸化されたスレオニンの擬似状態(非リン酸化状態のスレオニン)となり、これらの手法はリン酸化研究において広く用いられている。そこで平成27年度には、ヒトcDNAライブラリーから、mGPの野生型、および今回同定したX番スレオニンの置換変異型(Thr X Asp;リン酸化変異、Thr X Ala;非リン酸化変異)のタグ融合mGPタンパク発現コンストラクト作成し、調整中である(pCMV-mGP-WT, pCMV-mGP-ThrXAsp, pCMV-mGP-ThrXAla)。申請者は肥大型心筋症患者でPRKAG2遺伝子変異を同定し、この変異をマウスに導入すると筋型グリコーゲンホスホリラーゼに特異的な異常スレオニンリン酸化が生じることを見いだした。本研究の目的は、肥大型心筋症における[1]筋型グリコーゲンホスホリラーゼ(mGP)異常スレオニンリン酸化の機能的意義を明らかにし、新規の心筋症・心不全発症機序を解明すること、[2]異常スレオニンリン酸化を阻害する化合物を同定し、心不全治療薬創薬の木曽を築くことである。一方、スレオニンのアラニンへの置換は、脱リン酸化されたスレオニンの擬似状態となる。平成28年度は、mGPの野生型および今回同定したX番スレオニンの置換変異型(Thr X Asp、Thr X Ala)のタグ融合mGP蛋白発現コンストラストを作成した。作成したコンストラクトを培養細胞にトランスフェクションさせ、WT-mGP, ThrXAla-mGP, ThrXAsp-mGPを生成した。NADPH産生量を指標にIn vitroにてmGP活性を測定したところ(Forward反応)、ThrXAsp-mGPはWT-mGTおよびThrXAla-mGPと比較して有意にホスホリラーゼ活性が低下することが明らかとなった。この傾向は、試験管内にAMPを添加することにより更に明確となった。海外研究協力員(脇本博子助教、Seidman教授)との連絡や連携が良好であったため。申請者は肥大型心筋症患者でPRKAG2遺伝子変異を同定し、変異をマウスに導入すると筋型グリコーゲンホスホリラーゼに特異的な異常スレオニンリン酸化が生じることを見いだした。本研究の目的は、肥大型心筋症における[1]筋型グリコーゲンホスホリラーゼ(mGP)異常スレオニンリン酸化の機能的意義を明らかにし、新規心不全発症機序を解明することである。平成29年度はReverse反応(ゲルアッセイによるmGP活性測定系)によって変異型mGP機能を解析した。Reverse反応においてもForward反応と同様に、ThrXAsp-mGPはWT-mGTおよびThrXAla-mGPと比較して有意にホスホリラーゼ活性が低下することが明らかとなった。次世代シーケンス手法を用いて、肥大型心筋症発端者30例を対象に更なるPRKAG2変異のスクリーニングを行ったが、同遺伝子の変異は検出されなかった。

本研究の目的は、肥大型心筋症におけるホスホリラーゼ異常スレオニンリン酸化の機能的意義を明らかにし、新規心不全発症機序を解明することである。精製したWT-ホスホリラーゼ, ThrXAla-ホスホリラーゼ, ThrXAsp-ホスホリラーゼを用いて機能発現実験を行った。NADPH産生量を指標としたForward反応では、ThrXAsp-ホスホリラーゼ活性はWT-ホスホリラーゼおよびThrXAla-ホスホリラーゼ活性と比較して有意に低下した。ゲル泳動Reverse反応においても、Forward反応と同様にThrXAsp-ホスホリラーゼ活性低下が明らかとなった。平成28年度は、作成したコンストラクトをトランスフェクトさせた培養細胞間で、細胞内グリコーゲン量を比較する。具体的には、細胞溶解液をアミログルコシダーゼ処理したのちに生じるグルコースを測定し、グリコーゲンを定量する予定である。また、ForwardおよびReverse反応によって、擬似スレオニンリン酸化によるmGPのグリコーゲン分解能の変化を定量的に測定する。実験系としては、トランスフェクションした培養細胞を溶解し調整後、20μgのタンパクサンプルを、G1,6BP, G6-PDホスホグルコムターゼとグリコーゲンを含むバッファー内で反応させ、反応過程で生じるNADPHを吸光度計(340nm)で測定することでmGPのグリコーゲン分解能を定量評価する。平成29年度はReverse反応(ゲルアッセイによるmGP活性測定系)によって変異型mGP機能を解析する。また、変異型mGPを特異的に阻害/活性化するコンパウンドのin silicoスクリーニングを行う。循環器内科7,383円に相当する研究試薬購入の必要性がなかったため。研究費に相当する研究試薬購入の必要性がなかったため。研究用試薬を購入予定である。
好中球MPOフラグメントのリコンビナントパネルによるMPO自己抗体生産機序の解析

血管炎において、好中球抗体MPO-ANCAはリスクとして病態に関連していることが明らかになってきている。しかし、MPO-ANCAの値が、必ずしも血管炎の病態を反映していない場合もあり、MPO-ANCAが高値であっても重篤化と関連しないことから、MPO-ANCA値は、血管炎の1つのリスクと考えるのが妥当ではないかと考えられる。重篤化には、MPO-ANCAの対応分子MPOに対するエピトープが関係している可能性があった。リコンビナントMPO断片をセットとしたパネルをつくり、エピトープ解析用とした。MPO-ANCA高値を示した患者血清のMPO-ANCAのエピトープをウエスタンプロットにて解析した結果、MPOの長鎖(H鎖)のNおよびC末端に単独で反応するエビトープが重症化と関連していることが示唆された。プレートにコートしたリコンビナントMPO断片は、ウサギのポリクローナル抗体による反応性を確認し、エピトープ解析用に十分対応できることが明らかになった。本ELISAシステムを血管炎患者の血清のエピトープ解析に供した。一方、さらに、H鎖のN末端のリスクエピトープの特定をするために、H鎖のN末端のリコンビナントMPO断片に相当する部分を10分割して、その部分に対応した合成ペプチドを作成し、H鎖のN末端のリスクエピトープに単独で反応した血清とH鎖のN末端との反応の阻害により反応性を特定した。その結果、N末に単独反応したMPO-ANCAは、特定の部位のペプチドによって阻害された。本研究でのMPO-ANCAのリスクエピトープの解析によって、病態との関係を明らかにすることが可能になった。正常時には血中に認められない好中球ライソゾーム酵素myeloperoxidase(MPO)に対する自己抗体MPO-ANCAが増加する疾患が注目されている。この自己免疫疾患の発生機序を解析する上で、自己抗体が認識するMPOのエピトープ部位の解析は重要である。これまでELISA法にて高抗体価を示したMPO-ANCA関連腎炎患者血清が、MPO H鎖(59kDa)の糖結合部位付近と反応することを明らかにした。そこで、これまで、リコンビナントMPO H鎖の各種ペプチド断片を作製してきた。本年度は、さらに、L鎖の各種ペプチド断片も作製した。この様な条件で確立した各種リコンビナントMPOペプチド断片遺伝子を組み込んだ大腸菌を大量に培養し、Ni-NTAアフィニテ-カラムを用いて精製した。得られたMPOペプチド断片を用いて、抗体との反応をwestern blot及びELISA法により解析に使用した。【方法】MPO cDNAを種々の断片領域に分け、His-タグ発現ベクターpQEに組み込み、大腸菌に導入した。各MPOペプチド断片の発現量が異なるため、2.5から60Lを培養し発現させた。その菌体をグアニジン塩酸にて変性後、Ni-NTAアフィニテ-カラムを用いて精製した。得られたそれぞれのペプチド断片は、患者血清を用いてwestern blotおよびELISA法によりMPO-ANCAの抗原認識部位を解析した。【結果・考察】ペプチド断片に対する患者血清の反応性を解析した結果、MPO-ANCA関連腎炎患者の血清は、N末端側のペプチド断片に反応した。今後、症例数を増やして病態とMPO-ANCA認識エピトープとの関連をさらに明かにする。この自己免疫疾患の発生機序を解析するために、自己抗体が認識するMPOのエピトープ部位を解析する。本年度は、昨年度得られた大腸菌由来MPOペプチド

断片のdeletion mutantsを用いたELISA法をパネル解析用として確立し、B-cellおよびT-cellエピトープ解析することを目的とした。【方法】1)パネルの確立:MPOを7部分に分け、それぞれの断片を大腸菌に発現させ、リコンビナントMPO断片を得、これらの断片パネルセットとしたウエスタンプロット法とELISA法を確立した。2)B-cellエピトープ解析:ELISAにより反応部位を調べた。3)T-cellエピトープ解析:各断片をコートしたウエルに患者の単核球をまき、2日間培養後、thymidineの取り込を調べた。【結果】MPOのN,C末端に単独で反応するB-cellエピトープは、MPO-ANCA関連疾患の重症化と関連しており、オリゴクローナルあるいはポリクローナルの反応性を示した場合は、軽度の病態と関連していた。また、T-cellエピトープはL鎖に認められ、MHCIIの拘束性も認められた。血管炎において、好中球抗体MPO-ANCAはリスクとして病態に関連していることが明らかになってきている。しかし、MPO-ANCAの値が、必ずしも血管炎の病態を反映していない場合もあり、MPO-ANCAが高値であっても重篤化と関連しないことから、MPO-ANCA値は、血管炎の1つのリスクと考えるのが妥当ではないかと考えられる。重篤化には、MPO-ANCAの対応分子MPOに対するエピトーブが関係している可能性があった。リコンビナントMPO断片をセットとしたパネルをつくり、エピトーブ解析用とした。MPO-ANCA高値を示した患者血清のMPO-ANCAのエピトーブをウエスタンプロットにて解析した結果、MPOの長鎖(H鎖)のNおよびC末端に単独で反応するエピトーブが重症化と関連していることが示唆された。プレートにコートしたリコンビナントMPO断片は、ウサギのポリクローナル抗体による反応性を確認し、エピトーブ解析用に十分対応できることが明らかになった。本ELISAシステムを門管炎患者の血清のエピトーブ解析に供した。一方、さらに、H鎖のN末端のリスクエピトーブの特定をするために、H鎖のN末端のリコンビナントMPO断片に相当する部分を10分割して、その部分に対応した合成ペプチドを作成し、H鎖のN末端のリスクエピトーブに単独で反応した血清とH鎖のN末端との反応の阻害により反応性を特定した。その結果、N末に単独反応したMPO-ANCAは、特定の部位のペプチドによって阻害された。本研究でのMPO-ANCAのリスクエピトーブの解析によって、病態との関係を明らかにすることが可能になった。