hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パルス波レーザー光を利用した遺伝子導入法の開発

遺伝子治療を行う上で最も重要な基本技術は遺伝子の導入法である。治療用遺伝子を細胞内へ安全かつ効率的に導入するためには、既存の導入技術の改良と同時に従来技術の欠点を補う新規の遺伝子導入技術の開発が必要になる。これまでの研究で、マイクロビーズ(Polystyrene Latex)と細胞の混合液にパルス波レーザー光を照射すると、細胞膜透過性が上昇し、細胞内への物質導入が可能になることを明らかにしている。本研究ではマイクロビーズとパルス波レーザー光を利用した新規遺伝子導入法を確立するため、(1)マイクロビーズ、レーザーおよび細胞の種類の検討(2)本法による膜透過性上昇機序および遺伝子導入機構の検討を行った。大きさの異なるマイクロビーズ(13μm)を使用して、FITC標識デキストラン(M.W.70,0005,000,000)を細胞に導入した結果、導入分子の大きさはビーズの大きさに依存することが明らかになった。その際のviabilityの低下はみられなかった。細胞の種類に関しては、浮遊細胞であるマウス繊維肉腫細胞(Meth-A)と、付着細胞のヒト繊維芽細胞(Fibroblast)を比較した。Meth-Aでは死細胞が比較的多く見られたのに対し、Fibroblastでは殆ど観察されなかった。この結果から、本法による遺伝子導入は、付着性の細胞に対して有効であるといえる。レーザー光として連続波レーザーを用いた場合には上記の結果は得られないことから、パルス波レーザーに特有の現象(応力波による細胞膜の破壊)により、遺伝子が細胞内に導入されると考えられる。遺伝子治療を行う上で最も重要な基本技術は遺伝子の導入法である.治療用遺伝子を細胞内へ安全かつ効率的に導入するためには,既存の導入技術の改良と同時に従来技術の欠点を補う新規の遺伝子導入技術の開発が必要になる.本モデルでは,マイクロビーズを付着させた細胞にパルス波レーザー光を照射することで細胞膜の透過性を高め,外来遺伝子を細胞内へ導入する.本研究では,マイクロビーズの種類およびレーザー光照射条件の検討を行った.1.使用担体の評価(本法での遺伝子導入に適した担体の選択)継体培養中のHeLa細胞にpolystyrene particles(PP)又はglass particles(GP)を接触させ,パルス波レーザー光(Q-switched Nd : YAG laser,532.5 nm)を照射した結果,膜透過性の上昇がみられた(FITC標識デキストランの細胞内導入を蛍光顕微鏡にて確認した).PPは形状および大きさが均一であり,その作製も比較的容易である.また,密度が培養液に近い(1.05)ため,浮遊状態の細胞も含めて多くの種類の細胞に適用可能である.GPはPPに比べ容易にDNAを吸着するため,トランスフェクションの際にはGPが有効と考えられる.2.レーザー光照射条件の検討レーザー光照射条件(パワー密度および照射時間)と膜透過性およびviabilityの関係を評価した.HeLa細胞にPP又はGPを接触後レーザー光を照射した.膜透過性の検出にはFITC標識デキストラン(M.W.70,000)を,viabilityの評価にはXTTを用いた.その結果,膜透過性の上昇はパワー密度に依存し,照射時間には無関係であった.膜透過性上昇の際のviabilityの低下はみられなかった.細胞を生かしたままでDNAを導入するためにはパワー密度を高める(1W/cm^2)必要がある.遺伝子治療を行う上で最も重要な基本技術は遺伝子の導入法である.治療用遺伝子を細胞内へ安全かつ効率的に導入するためには,既存の導入技術の改良と同時に従来技術の欠点を補う新規の遺伝子導入技術の開発が必要になる.本モデルでは,マイクロビーズを付着させた細胞にパルス波レーザー光を照射することで細胞膜の透過性を高め,外来遺伝子を細胞内へ導入する.本研究では,in vitroの遺伝子導入および遺伝子発現効率の評価を行った.また,レーザー光照射時の応力波発生の有無を検証した.1.遺伝子導入効率の評価(In vitro)Green Fluorescent Protein (GFP)をコードするプラスミドDNA(pEGFP-F)をパルス波レーザー光照射後の細胞(HeLa, Cos-7)へ導入後,蛍光顕微鏡およびフローサイトメーターによりGFP発現細胞を検出した.この結果,細胞にポリスチレン微小球(PSM)を付着させた場合ではGFP発現は見られなかった.一方,ヒドロキシアパタイト粒子(HAP)を付着させた場合ではControlの約16倍の発現率を得られた.これは,HAP表面のプラスチャージが遺伝子の細胞内導入に何らかの補助的な役割を果たしているためではないかと考えられた(PSMの表面はマイナスチャージ).2.パルス波レーザー光照射時に発生する応力波の測定マイクロビーズとレーザーを利用する本モデルでは,ビーズへのレーザー光照射により発生する熱および応力波が細胞膜の一部を損傷し,そこから細胞外分子を細胞内へ導入できると考えられる.本実験ではPVDFニードル型ハイドロフェンおよびAEセンサーを用いて,レーザー光照射時の応力波を測定した.直径1・mのPSMを生理食塩水に懸濁しレーザー光を照射したところ,約1MPaの応力波が検出された.この結果より,細胞膜表面のPSMから発生する応力波が膜透過性を高めることが明らかになった.遺伝子治療を行う上で最も重要な基本技術は遺伝子の導入法である。

これまでの研究で、マイクロビーズ(Polystyrene Latex)と細胞の混合液にパルス波レーザー光を照射すると、細胞膜透過性が上昇し、細胞内への物質導入が可能になることを明らかにしている。本研究ではマイクロビーズとパルス波レーザー光を利用した新規遺伝子導入法を確立するため、(1)マイクロビーズ、レーザーおよび細胞の種類の検討(2)本法による膜透過性上昇機序および遺伝子導入機構の検討を行った。大きさの異なるマイクロビーズ(13μm)を使用して、FITC標識デキストラン(M.W.70,0005,000,000)を細胞に導入した結果、導入分子の大きさはビーズの大きさに依存することが明らかになった。その際のviabilityの低下はみられなかった。細胞の種類に関しては、浮遊細胞であるマウス繊維肉腫細胞(Meth-A)と、付着細胞のヒト繊維芽細胞(Fibroblast)を比較した。Meth-Aでは死細胞が比較的多く見られたのに対し、Fibroblastでは殆ど観察されなかった。この結果から、本法による遺伝子導入は、付着性の細胞に対して有効であるといえる。レーザー光として連続波レーザーを用いた場合には上記の結果は得られないことから、パルス波レーザーに特有の現象(応力波による細胞膜の破壊)により、遺伝子が細胞内に導入されると考えられる。
カイラル有効理論に基づく核反応・核構造の統一的記述

核反応を核力に基づいて微視的に記述する際には、g行列有効相互作用を原子核密度で畳み込むことによって原子核間の光学ポテンシャルを構築する、畳込み模型がよく用いられる。g行列有効相互作用はBrueckner-Hartree-Fock(BHF)法により核力から導出され、現象論的3核子力を含んだg行列はこれまでにも構築がなされている。本研究ではカイラル有効理論(Ch-EFT)によって決定された2核子力と3核子力をBHF法に適用することにより、新たなg行列の導出および核反応計算への適用を行い、3核子力効果の分析を行った。昨年度の研究では、導出されたg行列を局所解析関数によって表現することで、広いエネルギー領域において核子-原子核および3He, 4He-原子核弾性散乱の系統的解析を行った。その結果、3He, 4He-原子核弾性散乱では断面積が3核子力効果によって角度分布後方において小さくなることを確かめた。今年度は新しいg行列をより広い範囲の核反応解析に適用するために、Glauber模型に基づく反応解析に着手した。Glauber模型で求まったS行列から光学ポテンシャルを構築することにより解析を行った。この結果を断熱近似やCDCC計算と比較することで、構築された光学ポテンシャルが断熱近似の範囲で分解効果を取り入れたものであると分析した。また、重陽子および3Heを入射粒子として系統的に解析を行い、この枠組は分解効果が重要となる比較的低エネルギーである核子当り40MeV以上で有効な手法であり、カイラル有効理論の核力に基づく新しいg行列が適用可能であることを確かめた。29年度が最終年度であるため、記入しない。核反応の微視的記述において、核力に基づいた原子核間の光学ポテンシャルの構築が重要な役割を果たす。微視的光学ポテンシャルは核子間有効相互作用を原子核密度で畳み込む「畳込み模型」によって構築できる。畳込み模型では有効相互作用として、Brueckner-Hartree-Fock(BHF)法により核力から導出されるg行列有効相互作用(g行列)が広く用いられている。本研究では、カイラル有効理論(Ch-EFT)から決定された2核子力と3核子力にBHF法を適用することで、新たなg行列の構築と核反応における3核子力効果の分析を行った。BHF法により導出されるg行列は非局所性を持ち、数値的に求まるため、畳込み模型に直接適用することは容易でない。そのため求まった非局所g行列と等価な性質を持つ局所g行列の構築が必要となる。その際、光学ポテンシャルに重要な寄与を持つエネルギー殻上の近傍におけるg行列の性質に着目することで、精度良く局所g行列が構築できることを確かめた。今年度は、Ch-EFTの核力を用いたBHF法によるg行列の計算を広範囲のエネルギー領域で実行し、求まった非局所g行列から局所g行列を構築した。そして新たに構築した局所g行列を畳込み模型に適用することにより、核子-原子核弾性散乱および3He, 4He-原子核弾性散乱を系統的に解析した。Ch-EFTの核力に基づく局所g行列を用いた解析で、調整パラメータを導入することなく断面積や偏極分解能などの実験データを再現することに成功した。また、Ch-EFTの3核子力がこれらの散乱を記述する光学ポテンシャルに対して斥力的かつ吸収的な効果を与えることを明らかにし、特に3He,4He-原子核弾性散乱においては3核子力効果により断面積が角度分布の後方で小さくなることを確かめた。Ch-EFTの2核子力+3核子力から構築したg行列が弾性散乱を良く記述したことは、このg行列の信頼性が高いことを示している。g行列から導出される光学ポテンシャルは非弾性散乱などの反応過程の解析にも適用可能であり、本研究で構築したg行列は今後様々な核反応に応用できる。

核構造に対しても、BHF法によりCh-EFTの核力から有効相互作用が導出可能である。この有効相互作用はHartree-Fock法などの平均場理論による核構造解析に用いられるが、この場合においても局所化が必要となる。今後は、これまでの研究で行ってきた非局所g行列の局所化の手法を足がかりに、非局所有効相互作用に対する局所解析関数化の手法を確立する。そして構築した局所有効相互作用を用いて核構造計算を行うことで原子核密度を求め、核反応解析を合わせて実行していく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
19世紀ローマにおける外国人芸術家の活動と交流に関する包括的研究

ローマで活動した外国人芸術家たちの風景画を中心としたデータベースは、総データ件数が2996点にも達し、今後の美術史研究に有用なツールとなった。3年間にわたる本研究課題の研究成果は、論文集『ローマ-外国人芸術家たちの都』(竹林舎)として2013年秋に刊行予定である。本書以降、「近代都市と芸術」シリーズとして7巻の刊行が続くこととなり、19世紀の都市と芸術に関して新しい視点を美術史学に提供することが期待される。本年度は、各担当者が該当国の芸術家のデータベースの構築と調査旅行で収集した資料を中心に研究を進めることができた。各人のコンピュータにおいて作品画像と作品データを入力した後、研究代表者の「ファイルメーカー・サーバー」に各データベースを集約、各端末でそれを閲覧するところまで行えるようになった。研究代表者の佐藤は、ローマで活躍したドイツの画家についてナザレ派以外の1800-20年代を中心に421点の画像を集めた。とりわけラインハルトやコッホがローマで作り上げた風景のイメージは、後のナザレ派にどのような影響を与えていたかを知る指標となる。またこの2人と外国人芸術家との交流も調査できた。研究分担者の大屋は、ローマのフランス・アカデミーでの彫刻家の活動を把握することに努め、131件のデータを作成した。渡辺は、イタリアのアカデミーとドイツのナザレ派の関係を軸に177件のデータを収集し、イタリアの画家とナザレ派が共同で壁画を制作した例に注目した。連携研究者の山口は、イギリスのターナーやイーストレイクを中心に90点の画像を入力した。またバーン=ジョーンズのローマ滞在を調査するため、ロンドンで4点のスケッチブックを調査し、ここからミケランジェロの影響を確認することができた意義は大きい。研究協力者の小針は、フランスの風景画家300点のデータを入力した。なかでも、コローが1825-28年における最初のイタリア滞在でドイツ人エルンスト・フリースとの交流に焦点を合わせている。コローとドイツ人画家とのつながりは不明瞭なままであるが、今後は、コローの作風の完成にドイツ人画家が果たした役割を明らかにしていく予定である。萬屋は、デンマーク人を中心に265点のデータを入力した。デンマークの芸術家、特に彫刻家トーヴァルスンとドイツ人コミュニティーの関係、また風景画家エガスベアのローマ滞在期の作品に関し手研究を進めることができた。来年度は、以上のデータベースを相互に閲覧することにより、作品相互の具体的な影響関係に基づいた芸術家の交流が明らかにされるであろう。本年度は、研究担当者全員参加による、ローマおよびカステッリ・ロマーニの風景実地調査を行った。まず、ローマでは、英独仏、各国の在ローマ美術史研究所を訪ね、現地研究員からの聞取り調査および資料収集を行った。フランス美術アカデミーとなっているヴィラ・メディチとドイツの美術史研究所であるバルトルディ邸は、19世紀当時の芸術家たちの宿泊施設および制作の場でもあったため、両施設の各部屋から望むローマ市街のパノラマ風景を実際に調査し、そこで制作されたと思われる風景画との比較を行った。ブリティッシュ・スクールでは、ローマの風景画に関する重要な文献を多数収集し、ゲーテ博物館では昨年購入されたばかりの、当時の画家たちによるパノラマ風景素描を調査した。ローマ近郊のカステッリ・ロマーニでは、バスを2日間チャーターし、当時の画家たちがスケッチした場所を丹念に回ることができた。ネミ湖、アリッチャ、フラスカーティなど、画題となった地点を集中的に巡ったが、とりわけ、ドイツ人たちがスケッチ旅行で拠点としたオレヴァノのカーザ・バルディ中庭からの眺めが、実際のスケッチポイントであったことを確認できたのは大きな成果と言える。また、ヴィラ・セルペンタラからの山の眺めも、多くの画家によって描かれたものであることが明らかとなった。眺望だけでなく、森の中で風景画に表されている木々や光の表現、また空気感を体感することができたのも今後の研究に役立つ重要な経験である。さらに、チヴォリの滝とヴェスタ神殿は、18世紀のピラネージ以降、画題として取り上げられることが多い重要なスケッチポイントであるが、今回の訪問では遠方からの眺めだけでなく、実際に滝に近づいての調査も行えた。これら実地での体験全てが、今後の研究だけでなく、画像データベースの精度を高める際にも、極めて重要な判断材料となることは間違いない。まず、昨年度に行った現地調査旅行を元に、ローマとその周辺における芸術家同士の交流に焦点を合わせつつ、データ・ベースの充実を図った。また、本年度は、個別に現地調査と資料収集を精力的に行った。新たな調査結果のデータ・ベース入力も精力的に進め、最終的には、各担当者が製作した個別のデータ・ベースを統合したところ、合計2996件ものデータ件数となった。このデータを研究に活用するためには横断検索が不可欠であるため、キーワードの一括検索できるようにデータ・ベースの操作体系と概観を一新した。

なお、このデータ・ベースは、現在、今後の一般公開に向けて「閲覧版」の最終調整に入っている(5月末アップ予定)。各担当者は最終成果の発表に向けて、本課題の総まとめとしての論文を執筆中である。本研究課題の研究成果は、竹林舎から2013年秋に研究論文集として「近代都市と芸術シリーズ」第一巻『ローマ:外国人芸術家たちの都(仮題)』として発刊されることとなった。研究代表者はすでに原稿提出済みであり、各担当者も近々提出予定である。この研究論文集は、3月末の研究報告会で討論した内容が活かされるだろう。この報告会では、ローマにおける外国人同士の国際的交流の新たな事実も明らかとなったことから、論文集として出版されることで、今後の19世紀美術史に一石を投じるに違いない。竹林舎で発刊するシリーズは、今後、全8巻で19世紀ヨーロッパの都市と芸術を扱う予定である。この企画自体の発端が本研究課題であり、ローマだけでなくヨーロッパ全体を見通す研究論文集へと展開するきっかけとなった。これまでの国別の美術史研究の限界を打破する目的であった本研究課題の試みは、当初のローマという枠組みを超え、都市環境が果たした芸術への役割を検討する上での重要な研究書シリーズを生み出すこととなり、研究代表者の予想を超えた成果を導き出してくれたのである。データベースの入力作業が順調であり、入力件数に関しては予定以上の作品数がすでに入力済みである。また、本研究課題に興味をもった出版社(竹林舎)から、研究成果を書籍として出版したいとの提案があり、現在、2013年3月末の入稿に向けて、担当者全員が研究を進めているところである。書籍は、研究担当者以外の執筆者も加えた10点ほどの論文を集め、「19世紀の西洋美術と都市」(仮題)シリーズの最初の巻として出版を目指している。24年度が最終年度であるため、記入しない。3月末の入稿を目指して、各担当者が論文をまとめる予定である。その際、各人のデータベースの横断検索を実行することで、これまで見落とされてきた、外国人同士の交流が明らかにされるだろう。データベースの制作は各人が別個に行なっているため、現時点で用語の統一がなされていない。欧文のデータで検索する場合も、英独仏伊の各国語で入力されているため、しばしば、検索でヒットしない場合が生じている。今後は、横断検索の必要性が高まることから、研究会などで用語の統一について検討し、特に地名と人名についての統一を図りたい。
ナノ秒・ナノメートルの着火・消炎メカニズムの解明

局所的に光エネルギを集中させると,分子が原子になり,さらにイオン化されプラズマ状態になる.プラズマ中のラジカル類が着火源となり,可燃混合気であれば燃焼反応へと移行する.そこで,本研究では,(1)レーザ着火システムのバーナを用いた予混合気体において,レーザ誘起プラズマの形状,自発光スペクトル,ブレイクダウン閾値エネルギ,火炎核成長の様子と火炎核による自発光スペクトル,最小着火エネルギといった着火特性を調査した.(2)定容容器を用いて雰囲気圧力を変化させ,フレーミングICCDカメラによる直接撮影と,カセグレン光学系と分光器を組み合わせた局所分光計測を行うことで,高圧下におけるレーザ誘起プラズマの生成の様子を時系列的に観察した.(3)nsオーダでのブレイクダウン領域の膨張および衝撃波生成過程,μsオーダでの衝撃波の伝播,Hot kernelの成長過程について,そのメカニズムを調査した.さらに,(4)レーザ誘起ブレイクダウン分光法(LIBS法)を層流予混合火炎,エンジンからの排気ガスへ適用した.これらより,以下のことが分かった.(1)レーザ着火はレーザ照射後nsオーダでプラズマが生成し,数μsで火炎核が生成される.(2)レーザ誘起ブレイクダウンは雰囲気圧力に対して強く依存し,高圧下ではプラズマの生成に必要なエネルギは減少することが判明した.(3)レーザ照射後数nsにおける衝撃波およびHot kernelの形状は,プラズマ発光の形状に沿った楕円形であり,その後数μs程度経過すると衝撃波は球状へ,Hot kernelは渦輪を形成し,レーザ照射方向に成長することが分かった.(4)エンジン排ガスでのLIBS計測により,発光強度比から設定空燃比を計測することが可能であることが分かった.局所的に光エネルギを集中させると,分子が原子になり,さらにイオン化されプラズマ状態になる.プラズマ中のラジカル類が着火源となり,可燃混合気であれば燃焼反応へと移行する.そこで,本研究では,(1)レーザ着火システムのバーナを用いた予混合気体において,レーザ誘起プラズマの形状,自発光スペクトル,ブレイクダウン閾値エネルギ,火炎核成長の様子と火炎核による自発光スペクトル,最小着火エネルギといった着火特性を調査した.(2)定容容器を用いて雰囲気圧力を変化させ,フレーミングICCDカメラによる直接撮影と,カセグレン光学系と分光器を組み合わせた局所分光計測を行うことで,高圧下におけるレーザ誘起プラズマの生成の様子を時系列的に観察した.(3)nsオーダでのブレイクダウン領域の膨張および衝撃波生成過程,μsオーダでの衝撃波の伝播,Hot kernelの成長過程について,そのメカニズムを調査した.さらに,(4)レーザ誘起ブレイクダウン分光法(LIBS法)を層流予混合火炎,エンジンからの排気ガスへ適用した.これらより,以下のことが分かった.(1)レーザ着火はレーザ照射後nsオーダでプラズマが生成し,数μsで火炎核が生成される.(2)レーザ誘起ブレイクダウンは雰囲気圧力に対して強く依存し,高圧下ではプラズマの生成に必要なエネルギは減少することが判明した.(3)レーザ照射後数nsにおける衝撃波およびHot kernelの形状は,プラズマ発光の形状に沿った楕円形であり,その後数μs程度経過すると衝撃波は球状へ,Hot kernelは渦輪を形成し,レーザ照射方向に成長することが分かった.(4)エンジン排ガスでのLIBS計測により,発光強度比から設定空燃比を計測することが可能であることが分かった.局所的に光エネルギを集中させると,分子が原子に,さらにイオン化されプラズマ状態になる.プラズマ中のラジカル類が着火源となり,可燃混合気であれば燃焼反応へと移行する.本研究ではレーザ着火法による着火メカニズムの解明を目的としている.まず,メタン空気層流予混合気のレーザ着火過程をシュリーレン撮影にて観察し,次に,レーザ着火の初期段階であるレーザ誘起プラズマの生成過程に注目して高時間,高空間分解能を有する直接高速撮影と特徴スペクトルの分光計測による時系列計測を行った.また,プラズマ消滅後の火炎核形成過程において,当量比や入射エネルギを変化させた場合の最小着火エネルギ,火炎核膨張速度の相関性を求め,以下の知見を得た.(1)レーザ着火における着火過程は,ブレイクダウンによるプラズマ生成過,衝撃波伝ぱ過程,火炎核形成過の3つの過程が確認できた.(2)レーザ誘起プラズマの生成過程における直接撮影の結果,レーザ軸方向に細長い楕円状のプラズマ形状であり,レーザ照射側において強い発光が観られ,約15μsまで発光が確認できた.(3)レーザ誘起プラズマの生成過程における多点局所分光計測より,時間経過に伴い発光スペクトルの発光状態の変化が確認できた.(4)レーザ入射エネルギによる火炎核形成過程の変化が観察でき,その影響は主に火炎核形成過程の初期過程にある.また,エンジン排気ガス計測へLIBS(レーザ誘起ブレイクダウン分光法)システムを適応し,以下の知見を得た.(1)本LIBSシステムにより,エンジン排気ガスでの発光スペクトルを計測することができた.(2)レーザ誘起プラズマの生成過程における時系列分光計測により,連続スペクトル,イオンスペクトル,原子スペクトル,分子スペクトルへと発光状態が遷移していく過程を観察できた.(3)A/FとCI/OI,H_α/OIの発光強度比に良い相関が見られた.

局所的に光エネルギを集中させると,分子が原子になり,さらにイオン化されプラズマ状態になる.プラズマ中のラジカル類が着火源となり,可燃混合気であれば燃焼反応へと移行する.そこで,本研究では,(1)レーザ着火システムのバーナを用いた予混合気体において,レーザ誘起プラズマの形状,自発光スペクトル,ブレイクダウン閾値エネルギ,火炎核成長の様子と火炎核による自発光スペクトル,最小着火エネルギといった着火特性を調査した.(2)定容容器を用いて雰囲気圧力を変化させ,フレーミングICCDカメラによる直接撮影と,カセグレン光学系と分光器を組み合わせた局所分光計測を行うことで,高圧下におけるレーザ誘起プラズマの生成の様子を時系列的に観察した.(3)nsオーダでのブレイクダウン領域の膨張および衝撃波生成過程,μsオーダでの衝撃波の伝播,Hot kernelの成長過程について,そのメカニズムを調査した.さらに,(4)レーザ誘起ブレイクダウン分光法(LIBS法)を層流予混合火炎,エンジンからの排気ガスへ適用した.これらより,以下のことが分かった.(1)レーザ着火はレーザ照射後nsオーダでプラズマが生成し,数μsで火炎核が生成される.(2)レーザ誘起ブレイクダウンは雰囲気圧力に対して強く依存し,高圧下ではプラズマの生成に必要なエネルギは減少することが判明した.(3)レーザ照射後数nsにおける衝撃波およびHot kernelの形状は,プラズマ発光の形状に沿った楕円形であり,その後数μs程度経過すると衝撃波は球状へ,Hot kernelは渦輪を形成し,レーザ照射方向に成長することが分かった.(4)エンジン排ガスでのLIBS計測により,発光強度比から設定空燃比を計測することが可能であることが分かった.
糖恒常性を担う膵β細胞の反復性増殖と可塑性獲得のメカニズム

近年糖尿病では、膵島量の減少を伴うインスリン分泌不全が発症に先行して出現することが明らかになり、膵島量の制御機構の解明が急がれている。我々は、この機構を解明する目的で、膵β細胞特異的に細胞を誘導しその後の再生を解析する「膵島再生マウス」と膵β細胞の移植により膵β細胞が過剰な状態を誘導する「擬膵島移植マウス」の2つのモデルを用いて膵島再生機構を解析している。また再生機構を解明するために必要なレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCMD)法による膵島単離の実験系を立ち上げた。この手法を用いて平成30年度はLCMD法による解析を進めた解析の過程で、膵島再生マウスでは細胞死誘導効率の差によりその後の血糖値が左右されることが判明したため、確実に細胞死を誘導できる実験条件の最適化を行い、その後にLCMD法で再生現象を解析した。膵島再生時のインスリンの発現変化や細胞分裂を、免疫染色とLCMD法によるqPCR解析の間で比較解析することにより、LCMD法によるqPCR解析により膵島再生現象を定量的に評価できることを確認した。そこで次に細胞分裂マーカーのqPCR解析により膵β細胞増殖を経時的、定量的に評価した。さらに、再生膵島では未熟な膵β細胞の遺伝子マーカー群の発現が誘導されることを見いだした。一方、膵亜全摘術により膵島量を膵島再生マウスと同等まで減少させた場合には、細胞増殖は誘導されるものの未熟な遺伝子マーカー群は誘導されず、再生条件によって異なる膵β細胞の再生応答が惹起されることが明らかになった。2型糖尿病患者では、インスリンを分泌する膵β細胞の機能のみならず細胞数も減少しており、その数は長年の病態の進展とともに進行性に減少することが知られている。一方、健常者では膵β細胞の量は一定に維持されている。この維持には膵β細胞の細胞死と細胞分裂が正確に制御されることが必須である。我々は本研究で、膵β細胞量の維持機構について、膵島再生マウスと膵島移植マウスを用いて解析している。平成28年度には膵島再生マウスの膵β細胞の増殖を定量解析した。その結果、膵β細胞の細胞死誘導後に、膵島再生マウスでは速やかな膵β細胞の細胞増殖が誘導されるものの、処置前膵島のほぼ半分の量に達した時点で再生がほとんど停止することが明らかになった。この再生停止が膵β細胞の細胞分裂能の限界によるものかを検討するために、再生が停止した状況で、再度膵島再生の誘導を行った。すると、膵β細胞は再び細胞分裂を示すことが示された。このことから、何らかの機転で再生が制御され再生停止が生じていることが考えられた。さらに我々は、上記の「膵β細胞量を減少させるモデルマウス」とは逆に、「膵β細胞移植により膵島量を過剰に増加させたマウス」を作製し膵β細胞機能と膵β細胞量を解析した。すると、この膵島移植マウスでは内因性の膵β細胞に細胞死が誘導され、細胞数が激減することが明らかになった。この細胞死の機序を解析したところ、細胞外のグルコース濃度の低下に加え、近傍の膵β細胞由来の液性因子の減少が原因であることと見いだした。特に、膵β細胞でのインスリンシグナルを阻害すると著明な細胞死が誘導されることが示された。インスリンを分泌する膵β細胞でのインスリンシグナルの生理的意義については、現在一定の見解がなく、平成29年度以降にその詳細な機序の解明を目指す。本研究では、糖尿病の主要な病態である膵島量の減少と、根治的治療となり得る膵島再生の機序を解明することを目指している。平成28年度の解析で、膵島量の制御機構について多くを解明することができた。特に膵β細胞の生存維持に局所のインスリンシグナルが重要であることを明らかにすることができ、インスリンシグナルの重要性に重点を置きながら、基本的には申請書での提案通りに研究を進めて行く予定である。糖尿病は慢性の高血糖を本態とする代謝疾患であるが、その発症機序として膵島量の減少の重要性が明らかになっている。一方、健常人では膵β細胞がゆっくりと細胞死と細胞増殖を繰り返しながら、生涯に渡り膵島量が一定に保たれている。従って、生体では膵島量を感知しその変動に応じて膵島の増殖や生存を調節していると考えられる。我々は膵β細胞特異的に細胞死を誘導するとその後に一過性の膵β細胞増殖が誘導されることを見いだした。今年度は、この応答をより定量的に解析する目的で、レーザーキャプチャーダイセクション法による膵島の回収をおこない、再生過程にある膵島での各種遺伝子発現の変化を観察した。その結果、細胞死誘導後の血糖値と膵島内インスリンの発現量に逆相関があることや、細胞死誘導後は著明な高血糖がなくとも明らかな膵β細胞の増殖誘導が起こることを見いだした。このことから膵島量の変化と膵β細胞増殖がリンクしていることが示されたが、細胞増殖は血糖値以外の因子により誘導されている可能性が考えられた。また、我々は膵β細胞に細胞死を誘導する実験とは全く逆に、人為的に過剰な膵β細胞をマウスに移植する実験を行った。すなわち、膵β細胞の腫瘍細胞株であるMIN6細胞を野生型マウスに移植し、MIN6細胞増殖に伴う低血糖が誘導させ、内因性の膵β細胞の変化を観察した。

その結果、低血糖状態では膵β細胞に高頻度のアポトーシスが誘発されており、アポトーシスが低血糖と局所のインスリンシグナルの減弱の両者により惹起されていることを見いだした。これらの結果から、膵β細胞は細胞を取り囲む細胞外のグルコース濃度やインスリン濃度によりインスリンの需要量を感知し、細胞の生存や死を調節することにより膵島量が動的に制御されていることを明らかにした。我々は、膵β細胞特異的に細胞死を誘導する実験系を用いて膵β細胞の生死を規定している因子および増殖を誘導する因子を解析している。当初の計画に沿って、免疫染色によるシグナル制御機構の解明を進め、平成29年度には再生に関わる複数のシグナル分子が膵島再生中に発現誘導されることを見いだした。また、これらの研究と並行して、我々は膵島再生中の遺伝子発現変化を定量的に評価するために、レーザーキャプチャーダイセクション法による膵島回収の実験系を立ち上げた。膵臓には極めて多くのRNA分解酵素が存在するため、遺伝子発現の定量解析に応用可能な質と量のRNAを回収するために様々なプロトコールの修正を行い、漸く安定して遺伝子発現の定量解析を行う実験系を確立し、現在再生中の膵島を用いて解析を進めている。また、膵島量の動的な制御機構を解明する目的でマウスに対しMIN6細胞の移植実験を行い、膵β細胞の生死の制御機構を解明し、糖尿病領域の学術論文(Kitamoto et al. Metabolism, 2018)として成果を発信することができた。以上の様に、実験計画はほぼ予定通り進めることができていると考えている。近年糖尿病では、膵島量の減少を伴うインスリン分泌不全が発症に先行して出現することが明らかになり、膵島量の制御機構の解明が急がれている。我々は、この機構を解明する目的で、膵β細胞特異的に細胞を誘導しその後の再生を解析する「膵島再生マウス」と膵β細胞の移植により膵β細胞が過剰な状態を誘導する「擬膵島移植マウス」の2つのモデルを用いて膵島再生機構を解析している。また再生機構を解明するために必要なレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCMD)法による膵島単離の実験系を立ち上げた。この手法を用いて平成30年度はLCMD法による解析を進めた解析の過程で、膵島再生マウスでは細胞死誘導効率の差によりその後の血糖値が左右されることが判明したため、確実に細胞死を誘導できる実験条件の最適化を行い、その後にLCMD法で再生現象を解析した。膵島再生時のインスリンの発現変化や細胞分裂を、免疫染色とLCMD法によるqPCR解析の間で比較解析することにより、LCMD法によるqPCR解析により膵島再生現象を定量的に評価できることを確認した。そこで次に細胞分裂マーカーのqPCR解析により膵β細胞増殖を経時的、定量的に評価した。さらに、再生膵島では未熟な膵β細胞の遺伝子マーカー群の発現が誘導されることを見いだした。一方、膵亜全摘術により膵島量を膵島再生マウスと同等まで減少させた場合には、細胞増殖は誘導されるものの未熟な遺伝子マーカー群は誘導されず、再生条件によって異なる膵β細胞の再生応答が惹起されることが明らかになった。平成29年以降も、本申請で提案した計画に沿って膵β細胞の増殖制御機構の解明を進めて行く予定である。特に膵β細胞前駆細胞については、再生中の膵島内での存在を可視化するための分子マーカーを絞り込む計画である。また、インスリンシグナルが膵β細胞の生存に重要であることは明らかになったものの、他の因子の関与も否定できないことから、引き続き膵β細胞由来の種々の液性因子の関与を解析する。
歴史社会学の可能性の再検討:自殺の系譜学的探求に準拠して

本研究は歴史社会学の可能性を再検討することを目的として、具体的には日本における自殺の展開を歴史的に分析した。自殺の理論は社会学の重要な理論的準拠点とされてきたが、自殺がはらむ歴史的位相については充分に考えられてこなかった。それに対し本研究は、自殺の社会学的分析に歴史的パースペクティブを補うことで、自殺の社会学的分析が歴史社会学にはたすことのできる寄与をさぐる。それによって、1)前近代の自殺が意志の病として特権化されていなかったこと、2)しかし20世紀以降の社会では個人の意志の在不在を問う社会システムが自殺を深く規定してきたことがあきらかにされた。近世においては、意志の病としての自殺が問題化された形跡は少ない。それに対し近代で自殺は、人の意志が強く介在する現象として意味論的に再編され、その結果、解決すべき医学的病や社会的病理として社会システムのなかに組み込まれる。具体的には、近代日本においては、(1)自殺を治癒可能な病とみなす「医療化」、(2)自殺を経済システムと結び付ける「貨幣化」、さらに、(3)自殺を解決すべき政治資源とする「政治化」が進むのであり、それが現代における自殺の意味論と自殺予防対策の枠組みをいまだ規定しているのである。初年度にあたる本年度は、(1)自殺の歴史社会学に関する先行論文の検討と各自の問題関心の先鋭化をおこなう研究会を計5回開催するとともに、(2)近現代の自殺に関する専門的知識をもつ諸氏にヒアリングを実践し、とくに現代の自殺を取り囲む問題を明確にすることに努めた。(1)に関しては、デュルケム自殺論の再検討や死の社会学に関する文献調査、および歴史社会学における自殺の把握に関する文献調査とその批判的検討をおこなった。そのなかで自殺を把握するうえで「意志」の問題が社会学的・歴史的にはいかに処理されてきたのかが問題として浮上し、それを具体的にあきらかにする理論的焦点として過労自殺、自殺対策基本法の成立過程、自殺と精神病理の関係に関する問題の研究が集中的に実行された。それを受け、(2)現代の自殺の問題に関して専門的な場でいかなる議論と対処がなされているかを把握するために、ヒアリング調査が実行された。これにかんしては(1)竹島正氏、川野健二氏、稲垣正俊氏から自殺予防総合対策センターの活動と現在の自殺対策の問題について説明を受けるとともに、(2)弁護士である川人博氏に過労自殺の現状とその問題についてヒアリングし、(3)精神科医である金亨徹氏にうつ病と自殺との関係に関するレクチャーを受けた。さらに(4)歴史社会学者である香西豊子氏を招き幕末・明治の衛生問題に対する社会編成の問題に関する検討を行い、自殺を把握する権力の歴史的構成についての議論を深めた。最後に、これら共同の基礎的研究・調査を踏まえ、各人が近世、近代、現代における自殺とそれを捉える社会の編成に関する問題をあきらかにすることに努めるとともに、論考の執筆のための文献的調査を実行した。研究二年度目にあたる本年は、自殺の歴史社会学に関する先行論文の検討と各自の研究の達成を検討する研究会を計四回開催し自殺を歴史社会学的に検討することの可能性と問題が分析された。とくに議論されたのは近現代の自殺を歴史社会学的に検討する可能性である。近現代の自殺は同時代的な社会構造から分析されることが多いが、自殺を招くとともに自殺を問題化する社会の歴史的構造についても分析する必要がある。その観点から第一に過労自殺の認定をめぐる歴史が検討された。近代社会は自殺を意志的な死として問題化してきたが、過労自殺ではむしろこの意志が封殺され就業者が死に追いやられることが問題となる。その意味で過労自殺の認定には制度的・社会通念的な抵抗がしばしばみられるのであり、その過労自殺の問題化の歴史をあきらかにすることで現代社会における自殺の意味が捉えかえすことが目指された。第三に現代の自殺を捉える枠組みとしての自殺対策基本法の成立過程の分析が実行された。近年、自殺の増加に伴い、自殺が政治的資源として政治家や官僚、医師や社会活動家たちの注目を集めている。その達成としての自殺対策基本法に集約される社会的な取り組みの歴史が分析されることで自殺を社会問題化する社会の構造が分析された。

以上のように本年度はとくに現代における自殺を起点としてその歴史的奥行きを多方面から捉えることが実現された。本研究は、日本に展開されてきた自殺の特徴と変化を歴史社会学的に探るものである。デュルケムの『自殺論』以来、自殺は社会学にとって重要な分析の準拠点となってきた。しかし自殺の社会現象として特質が充分、分析されてきたともいいがたい。それに対して、本研究は具体的な社会現象としての自殺を、近世、近代の日本をフィールドとして歴史社会学的に分析した。そのために文献的調査がなされるとともに、精神科医、医師、弁護士、NPOなどへのインタヴューをくりかえされた。それによってあきらかにされたのは、1)前近代の自殺が意志の病として特権化されていなかったこと、2)しかし20世紀以降の社会では個人の意志の在不在を問う社会システムが自殺を深く規定してきたことである。近世においては、意志の病としての自殺が問題化された形跡は少ない。それに対し近代では、自殺は、人の意志が強く介在する現象として意味論的に再編され、まただからこそ解決すべき医学的病や社会的病理として社会システムのなかに組み込まれる。具体的には、「生命保険にかかわる自殺」と「過労自殺」の一般化がそれをよく示す。前者においては、自殺が意志の病として生命保険の支払対象にますます組み入れられることで戦後の家や中小企業の暮らしを深く規定し、また後者では、過労に基づく意志の病として少なくとも一旦は認定されることで、自殺は企業や労働者を縛る法的意味を大きくしたのである。こうした分析によって、本研究は近代日本において、1自殺を治癒可能な病とみなす「医療化」、2自殺を経済システムと結び付ける「貨幣化」、さらに、3自殺を解決すべき政治資源とする「政治化」が進むことを照らしだし、それによって現代の自殺を考える上で重要な歴史的背景をあきらかにした。なおその詳細は、『『歴史社会学の可能性の再検討:自殺の系譜学的探究に準拠して』研究成果報告書』にまとめられている。自殺にかかわる歴史社会学の先行研究の検討、インタビュー調査を含めた現在を起点とした自殺の歴史社会学的分析を本研究は着実に進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は現在、過労自殺や生命保険における自殺の分析、自殺に関わる政策成立過程を分析することにおいて着実な成果がみられる。今後それを論文化、または発表することで発展させるとともに、他の研究者からの批判をあおぎつつ戦前や近世まで視野に含めた自殺の分析を進めることが目指される。
死細胞貪食による動物個体の成長期間調節機構の解析

生体内の不要な細胞は細胞死が誘導され、食細胞により速やかに貪食される。貪食受容体のDraperとintegrin βνを欠いたショウジョウバエでは成長が遅れることから、貪食受容体を介した死細胞貪食が個体の成長期間を調節すると仮定し、その仕組みを検証した。食細胞を用いた実験により、死細胞貪食後の細胞では成長促進に関係する遺伝子Bの発現が増加すること、Bの転写抑制因子Cの発現が低下すること、およびCの転写抑制因子Aが活性化することがわかった。よって、貪食後の細胞ではAが活性化してCの発現量が低下することで、Cに発現を抑えられていたBの発現量が増加し、個体の成長が促される仕組みが予想された。死細胞の貪食除去には、多細胞生物に共通かつ必須な役割があると予想されている。研究代表者は、貪食受容体を持たないショウジョウバエでは貪食が著しく抑制されるだけでなく、個体が成虫になるまでに要する期間が長くなることを見出した。本研究では「不要な細胞を取り除くことで成長が促進する」という視点から解析を行っている。具体的には、貪食に依存した動物個体の成長期間調節の存在を示し、その仕組みを明らかにするための実験を行っている。本年度は、死細胞を貪食した食細胞が成長促進因子を生産すると仮定し、貪食依存に発現が誘導される遺伝子群を見出すためのスクリーニングを行った。はじめにスクリーニングに利用する食細胞および死細胞を決定した。食細胞は、ショウジョウバエ胚ヘモサイト由来株のS2細胞に決定した。低血清培地での培養によりDraper経路、インテグリン経路という2つの異なる情報伝達経路を介した貪食能を獲得する特徴を持つからである。死細胞はシクロヘキシミド処理したS2細胞に決定した。同細胞ではアポトーシス細胞様の細胞死が誘導され、かつ細胞死依存に被貪食能を獲得するからである。次に、スクリーニング法を決定した。予算の都合で、当初予定したmRNA seq解析からより安価なマイクロアレイ解析に変更した。それによる定量性の低下に伴う擬陽性を排除するために、貪食反応に用いる死細胞を、mRNAを含まない死細胞断片へと変更した。死細胞貪食前と後の食細胞からRNAを抽出してマイクロアレイ解析を行ったところ、約18500遺伝子中337遺伝子で貪食依存の発現量増加がみられ、うち延べ89遺伝子が成長促進に関係すると思われる遺伝子であった。本研究成果は「貪食依存に発現する成長促進因子」の存在を強く示唆する大変重要なもので、目的達成へ向けた研究が順調に継続可能だとわかった点で意義深い。25年度は、死細胞を貪食した食細胞が成長促進因子を生産すると仮定に基づき、貪食依存に発現が誘導される遺伝子群を見出すためのマイクロアレイ解析を行った。ショウジョウバエ培養細胞を用いた同解析により、337遺伝子で貪食依存の発現量増加が見られた。本年度は、これらの発現誘導機構を知るための解析を行った。337遺伝子のうち発現が誘導される可能性がより高い50遺伝子について、文献検索によりそれらの転写を調節する因子を調べたところ、12の転写因子が見出された。その全てついて、ゲルシフトアッセイにより転写因子活性化の貪食依存性を検証したところ、転写因子Aのみ依存性が見られた。一方、貪食受容体のDraperおよびintegrin beta-nuの発現をRNA干渉で抑制した食細胞では、貪食依存の転写因子Aの活性化は観察されなかった。Aが転写を調節する遺伝子B(マイクロアレイ解析で同定)は発生に関与することが知られていることから、「Draperまたはintegrin beta-nuを介して死細胞を貪食した食細胞は、転写因子Aを活性化して遺伝子Bの発現を誘導し個体の成長を促す」仕組みの存在が示唆された。また、転写因子Aの成長への関与を知るために同遺伝子の発現を欠いたショウジョウバエの解析を予定していたが、同個体は致死であった。現在、部位特異的に発現を抑制した個体を作製している。死細胞の貪食除去には、多細胞生物に共通かつ必須な役割があると予想される。研究代表者は、貪食受容体のDraperおよびintegrin beta-nuを持たないショウジョウバエでは貪食が著しく抑制されるだけでなく、胚から成虫になるまでに要する期間が長くなることを見出している。本研究では「不要な細胞を取り除くことで成長が促進する」という視点から解析を行った。昨年度までに、マイクロアレイ解析およびゲルシフトアッセイなどにより、死細胞と共存させた食細胞では発生関連遺伝子Aの発現が増加すること、Aの転写調節因子Bは貪食受容体依存に活性化することを見出した。本年度は、Aの発現誘導機構およびBの成長への関与を明らかにするための解析を行った。Bは転写リプレッサーであることから、BがAの発現を正に調節するには仲介分子の存在が必要となる。Aの転写リプレッサーとして知られるCがそれにあたるかを検証した。

食細胞を死細胞と共存させたところ、Cの発現の減少が観察された。そして、RNA干渉でBの発現を抑制した食細胞では、死細胞依存のCの発現減少が抑えられた。よって、死細胞を認識した食細胞では「貪食受容体を介してBが活性化」し、「BがCの発現を抑制」し、「Cの減少によりAの発現が促進」するA発現誘導機構の存在が示唆された。現在、貪食受容体がBを活性化する仕組みを調べている。Bを持たないショウジョウバエは成虫にまで成長しないため、主要な食細胞のヘモサイトでBの発現を抑えて成長期間を調べることになる。それに先立ち、ヘモサイト特異的に貪食受容体の発現を抑えたショウジョウバエを作製して観察したところ成長の遅れはみられなかったので、当初予定していたヘモサイト特異的にBの発現を抑制した個体の解析は中断した。よって、Bの成長への関与については結論を得られなかった。貪食受容体による成長期間調節を規定する細胞群を特定した後に、解析を再開する。生体内の不要な細胞は細胞死が誘導され、食細胞により速やかに貪食される。貪食受容体のDraperとintegrin βνを欠いたショウジョウバエでは成長が遅れることから、貪食受容体を介した死細胞貪食が個体の成長期間を調節すると仮定し、その仕組みを検証した。食細胞を用いた実験により、死細胞貪食後の細胞では成長促進に関係する遺伝子Bの発現が増加すること、Bの転写抑制因子Cの発現が低下すること、およびCの転写抑制因子Aが活性化することがわかった。よって、貪食後の細胞ではAが活性化してCの発現量が低下することで、Cに発現を抑えられていたBの発現量が増加し、個体の成長が促される仕組みが予想された。本年度は、貪食受容体を介した遺伝子発現誘導の根拠となる「発生に関与する遺伝子の発現を調節する転写因子の活性化」および「転写因子活性化の貪食受容体依存性」を明らかにしたからである。これは、本年度の研究が計画通りに遂行されたことを意味する。研究は順調に進展しているといえ、翌年度以降の研究遂行が可能と考えている。分子生物学、生化学、細胞生物学、発生生物学、免疫学本年度に引き続き、貪食受容体依存の貪食により活性化する転写因子Aの遺伝子発現誘導機構の全容解析、および成長期間調節機構を解析する。前者については、主に培養細胞を用いて解析を進める。貪食受容体を起点とした貪食誘導性情報伝達経路を担う分子群の関与や転写因子活性化機構、および貪食を導く情報伝達経路と遺伝子発現の関与の有無の特定を目指す。後者については、主にショウジョウバエを用いて解析を進める。遺伝子Aを欠いたショウジョウバエは致死なため、Aの発現を部位または時期特異的に抑制あるいは誘導したショウジョウバエを作製し、成長への関与を調べる。本年度は、本研究目的である「死細胞の貪食により動物個体の成長期間が調節される仕組みを明らかにする」ための第一歩として、「死細胞の貪食に依存した成長期間調節の存在」を示唆する結果が得られたからである。実験方法に多少の変更点があったものの、研究は順調に進展しているといえ、翌年度以降の研究遂行が可能と考えている。平成27年度にショウジョウバエ個体の詳細な観察を行うため、蛍光実体顕微鏡が必要となる。
マウスとスンクスのcDNAライブラリーを用いた歯種決定因子の探索

歯の発生研究には多くの課題があるが、とりわけ歯種の決定機構の解明は重要課題のひとつである。しかし、従来からよく利用されている動物であるマウス(齧歯類)は切歯と臼歯の2種しか歯種を持たないという点で特殊な動物であり、マウスを使う限り、歯種の決定機構の研究には自ずと限界がある。一方、スンクス(食虫類)は実験動物としては未知の点が多く、扱いが難しいところがあるものの、全ての歯種が揃っている点で他に代え難い。こうした点から、マウスとスンクスの比較研究を行いつつ、スンクスの歯種決定に関与する遺伝子の探索を行ない、下記のような成果を得た。1.スンクスの歯列形成の正常発生段階表の作成スンクスの歯列形成の詳細な記載が無いことから、正常発生段階表(normal stage)の作成に着手した。スンクス胎仔のE16-20の時期を中心に、顎顔面部の6μm厚連続切片を作成し、これをもとにコンピュータによる立体構築と顕微鏡下での詳細な観察を行った(山中ほか、第45回歯科基礎医学会、盛岡、2004年9月、ポスター発表)。2.遺伝子発現解析昨年度までに作成したライブラリから、Bmp4,Fgf8,Msx1のクローニングに成功し、whole mount in situ hybridizationによって顎顔面における発現パターンを明らかにした。そして、上顎と下顎における領域形成の差、発現の時期などを明らかにし、歯胚の歯種決定の時期を決定した(田畑・植村、第16回国際解剖学会・京都・2004年8月、シンポジウム発表)。歯の発生にはまだまだ多くの課題があるが、とりわけ歯種の決定機構の解明は重要課題のひとつである。しかし、従来からよく利用されている動物であるマウスは切歯と臼歯の2種しか歯種を持たないという点で特殊な動物であり、現在の研究では歯種の決定機構の研究に自ずと限界がある。こうした点から、マウスとスンクス(すべての歯種を持つ実験動物、食虫類の一種)の比較研究を念頭にして、スンクスの歯種決定に関与する遺伝子の探索を行なった。1.スンクス胎仔のcDNAライブラリからの遺伝子クローニングまず、発生第8日のスンクス胎仔から作成したcDNAライブラリを用い、マウスの歯胚発生に関与する遺伝子Bmp4,Fgf8,Shhのデジェネレートプライマーを作成して、PCRを行なった。そしてこれらのPCR産物をプローブとし、再び同ライブラリを用いて、目的遺伝子のホモログを釣り上げた。これらスンクスの遺伝子はクローニングされ、シーケンスされ、DDBJを介して遺伝子登録した。また、それぞれの発現様式もwhole mount in situ hybridizationによって明らかにした(Cellular Mol.Biol.48:OL289-296)。2.スンクスの歯列形成の正常発生段階表の作成スンクスの歯列形成の詳細な記載が無いことから、正常発生段階表(normal Stage)の作成に着手した。スンクス胎仔のE16-20の時期を中心に、顎顔面部の6μm厚連続切片を作成し、これをもとにコンピュータによる立体構築と顕微鏡下での詳細な観察を行っている。現在、この作業にかなりの時間を取られているが、次年度では一定の成果が得られる見込みである。こうした点から、マウスとスンクス(すべての歯種を持つ実験動物、食虫類の一種)の比較研究を念頭にして、スンクスの歯種決定に関与する遺俸子の探累を行なった。1.スンクスの歯列形成の正常発生段階表の作成スンクスの歯列形成の詳細な記載が無いことから、正常発生段階表(normal Stage)の作成に着手した。この作業にかなりの時間を取られたが、9月に最初の報告をすることができた(山中ほか、第45回歯科基礎医学会、盛岡)。2.スンクスの遺伝子発現解析昨年度までに作成したライブラリから、Bmp4,Fgf8,Msx1のクローニングに成功しており、現在、プローブを作成してin situ hybridizationのデータ解析に着手するところである。

スンクス胎仔のE16-20の時期を中心に、顎顔面部の6μm厚連続切片を作成し、これをもとにコンピュータによる立体構築と顕微鏡下での詳細な観察を行った(山中ほか、第45回歯科基礎医学会、盛岡、2004年9月、ポスター発表)。2.遺伝子発現解析昨年度までに作成したライブラリから、Bmp4,Fgf8,Msx1のクローニングに成功し、whole mount in situ hybridizationによって顎顔面における発現パターンを明らかにした。そして、上顎と下顎における領域形成の差、発現の時期などを明らかにし、歯胚の歯種決定の時期を決定した(田畑・植村、第16回国際解剖学会・京都・2004年8月、シンポジウム発表)。