hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子工学的手法によるHLAタイプ改変iPS細胞の作製技術開発

ヒト白血球抗原(HLA)は、免疫系が自己と非自己を区別する上で重要な役割を果たしている。我々はHLA-A ,B ,DRB1の3ローカスにおいてホモ接合を呈する歯髄細胞を収集している。このようなHLAローカスホモの細胞は、他家移植において拒絶されにくいと考えられる。岐阜大学では約300名の提供者から歯髄細胞採取を行い、3ローカスホモ歯髄細胞を3種類得た。しかし、日本人の7割以上をカバーする細胞を発見するのは困難である。そのため、Zinc Finger Nuclease (ZFN)を用いて、HLA遺伝子に変異を導入することにより、疑似的な3ローカスホモの細胞を作製することを試みた。本研究の目的は、50種類で7割の日本人に適合するHLAハプロタイプホモ細胞を、ゲノム編集技術によって作り出すことである。HLAハプロタイプホモドナーは、大規模なスクリーニングによって得ることが可能であるが、稀なHLAタイプがホモになる確率は非常に低く、日本人の2割程度は数十万人のスクリーニングでもカバーできないと予想される。そこで、近年進歩が著しいゲノム編集技術を利用して、擬似的にHLAハプロタイプホモ細胞を作り出す技術を開発することを試みた。HLAタイプがA*02,33;B*44,-;DRB1*13,-の歯髄細胞(DP144)を用いて、表現型がA*33,N;B*44,-;DRB1*13,-という、見かけ上日本人出現頻度2位のHLA3ローカスハプロタイプホモ細胞を作製した。DP144にエレクトロポレーションによりHLA-A2遺伝子のエクソン2および3配列に特異的なzincfinger nuclease (ZFN)をコードするプラスミドベクターを導入後、抗HLA-A2モノクローナル抗体で標識し、FACSにて陰性画分を回収した。細胞を培養後、DNAを抽出、PCR法によってHLA-A2領域を増幅して塩基配列を確認したところ、約5割の細胞で変異が確認された。一方、HLA-A33アリルには変異は確認されなかった。さらに、この細胞に、センダイウイルスベクターをもちいて山中4因子を導入し、iPS細胞コロニーを得た。ポリモルフィズムが高い領域を選んで、ZFNを設計することによって、HLA-Aの片アリルだけを破壊することができた。HLA-A2は世界的にも出現頻度が高いアリルであり、国内だけでなく海外で集めた細胞にも使用することができる。平成27年度は、平成26年度までに作製した遺伝子改変iPS細胞(iPS-DP144')を、次世代シーケンサー対応の2種類のHLAタイピングソフトを用いて解析し、オリジナルの歯髄細胞(DP144)との比較を行った。DP144はHLA-Aのみがヘテロ(A*02,33;B*44,-;DRB1*13,-)であり、HLA-A*02をノックアウトすることで日本人の出現頻度第2位のHLAハプロタイプについて、擬似的に3ローカスハプロタイプホモの細胞を得ることが出来ると考えられた。そこでHLA-A*02のExon2またはExon3領域を特異的に切断するよう設計されたZFNを利用して、Exon3に変異を導入したDP144へ、センダイウイルスベクターを用いた山中因子の導入によるiPS細胞誘導を行い、3ラインのiPS細胞クローン(iPS-DP144'-1,2,3)が得られた(昨年度実績)。iPS-DP144'とDP144のDNAをタカラバイオ社に送付し、NGSによるDNAシーケンスを行った。Conexio Assign v1.0 TruSight HLA Analysis SoftwareによるHLAタイピングの結果をiPS-DP144'とDP144で比較すると、HLA-AはiPS-DP144'がA*33:03:01のホモ、DP144はA*02:01:01:--とA*33:03:01のヘテロとタイピングされた。一方、Omixon HLA Twinでは、iPS-DP144'のHLA-Aは両アレルがA*33:03:01と検出されたものの、片側のアリルについては要解析の指示が出た。またiPS-DP144'ではHLA-A*02の検出はされず、それはHLA-Aにマッピングされたリードの塩基配列でも確認された。汎用ソフトを用いてHLA-AのExon2からExon4までの領域について、DP144に対するiPS-DP144'のカバレッジの比を取ると、Exon2やExon4と比べてZFNのターゲットサイトであるExon3領域の比の値が大きく減少していたことから、iPS-DP144'ではDP144と比較して、Exon3に何らかの構造変化が起きている可能性が考えられた。

そのため、Zinc Finger Nuclease (ZFN)を用いて、HLA遺伝子に変異を導入することにより、疑似的な3ローカスホモの細胞を作製することを試みた。HLA領域をターゲットとしたZFNの設計は、サブタイプ同士の配列の類似性の高さから、困難が予想された。しかし、DP144とOnelambda社が作製したHLA-A2特異的モノクローナル抗体を利用することにより、HLA-A2への変異導入率を約5割まで高めることができた。3種類設計したZFNは、どれも目的通りの活性を持っており、本年度の目標は十分に達成できたと考える。iPS細胞の作製についても、順調に進んでいる。しかし、さらに変異率を高めるためのTk-Neo遺伝子の導入用プラスミドについては、必要な遺伝子断片の入手までにとどまり、来年度の課題として残った。再生医科学ホモロガスリコンビネーションによるTk-Neo遺伝子の導入のためのプラスミド構築を行い、設計済みのZFNとともに、DP144細胞に導入する。G418によるセレクションとFACSを組み合わせて変異細胞を濃縮後、iPS細胞誘導をおこない、HLA-A2陰性、G418耐性、ガンシクロビル感受性のiPS細胞クローンを得る。得られたiPS細胞を免疫不全マウスに移植し、テラトーマを作らせる。ガンシクロビル投与によって、テラトーマが縮小するかどうかを確認する。すでに得られているiPS細胞については、HLA領域のエクソーム解析をおこない、オフターゲット変異の有無を確認する。ほぼ予定通りに研究が進み、必要な物品がすべて購入できたため、残額を次年度に繰り越して有効活用することとした。繰越し額は少額であるため、消耗品購入に充てる。
人工喉頭音源を利用したコミュニケーション支援システムの研究

運動機能障害者のコミュニケーション補助方法として、人工喉頭音源を用い、1.発声できる場合はイントネーションを制御してその声が自然に聞こえる方法を、2.発声できない場合は口腔内の動きと関係のあるホルマント情報を装置入力デバイスに利用する方法を検討した。1では、指圧で会話時に即座に適切なイントネーションをつけることが難しいこと、呼気流使用時の制御パラメータ、頭の動きを制御に利用できる可能性を示した。2では、舌や口の動き、声帯の状態とホルマントの関係を明らかにした。また、単純な口の動きをマウスポインタに利用できる可能性を示した。声帯機能が使えない人を対象に、人工喉頭音源を用いて、1.発声できる場合はその音声が自然に聞こえるための方法を、2.発声できない場合は残存発声関連機能を装置入力デバイスに利用する方法を検討している。当該年度は、まず、上記1に関連する昨年度検討しきれなかった人工喉頭音源の制御方法について検討した。昨年度は人工喉頭音声のイントネーションを、イントネーション付加モデルを参考として指圧で制御する方法について検討したが、即座にイントネーションをつけることは難しいことが分かっている。本年度は、健常者を用いた会話を想定した実験により、そもそも適切なアクセントを指で即座につけることができるかを、指でつけたアクセントと同時に発声した声のアクセントを比較することで調べた。その結果、指でつけたアクセントの位置と声のアクセントが必ずしも一致せず、訓練後でも5名中1名しか改善しないことがわかり、指圧では即座に適切なアクセントをつけることが難しいことを明らかにした。そこで、より直観的なイントネーション制御方法として、昨年度に引き呼気流による制御方法について検討し、その変換パラメータを明らかにした。次に上記2に関連して、音声ホルマント周波数を装置入力デバイスに利用する方法を検討しているが、当該年度は音源に人工喉頭を用いたときのホルマント周波数の出現範囲を健常者で詳細に調べた。その結果母音に囲まれる範囲ではホルマントを表出できるが、ホルマントを直接マウスポインタの座標に対応させて操作する方法は難しいといえた。ホルマント抽出に人工喉頭音源を使った時のホルマントへの影響を考察し、音源波形としてはホワイトノイズが比較的適していることが分かった。また、障害者のホルマントを調べる方法として人工喉頭を喉に当てて発声することは難しいと考え、口腔から音源を投入して調べる方法について検討を始めた。声帯機能が使えない人を対象に、人工喉頭音源を用いて、発声ができる場合はその音声の明瞭性や自然性を上げる方法を、発声できない場合は残存発声関連機能を装置入力デバイスに活用する手法を調べている。本年度の成果について以下に述べる。まず、不自然になる人工喉頭音声を、フレーズ指令とアクセント指令に基づくイントネーション付加モデルを参考として指圧で制御する方法について検討した。1.指圧に比例して声高さが変化する擬似アクセント成分に一定の割合で声高さが低くなる擬似フレーズ成分を加えた制御方法と2.指圧によるフレーズ指令とアクセント指令から声高さパターンを数式で生成する方法を比較した。聞いた単語アクセント型を、即座に真似るように指圧で声高さを制御させたところ、どちらも同程度のイントネーションを付加できたが、即座に行うことは難しかった。また、聴取実験や、制御のしやすさの評価から呼気流でのイントネーション制御の変換関数を求めた。このような制御方法を比較していくことでイントネーション制御の半自動化方法に繋がると考えている。また、口の形や舌の位置の情報を、人工喉頭を用いて発した音声のホルマント情報から推定し、ポインティングデバイスの操作に利用する手法について検討している。人工喉頭は一般的には喉にあてて用いるが、当て方や使用時の状況により、人工喉頭の振動音が声道に伝わらないことがある。そこで比較的音を声道に送りやすい頬に当てた場合とパイプを用いて口から送り込んだ場合についてホルマント特性に差がないかを調べた。頬やパイプの場合は喉の場合よりホルマントが抽出しづらく、人工喉頭音源波形の特性の調整や振動子からの直接音の除去方法の検討、ホルマント抽出プログラムの調整が必要であることがわかった。声帯機能を使えない人を対象に、人工喉頭音源で、1.発声できる場合はその音声が自然に聞こえる方法を、2.発声できない場合は残存発声関連機能であるホルマント情報をポインタ装置に利用する方法を検討している。上記1について、人工喉頭音声の声高さをイントネーション付加モデルを参考として指圧で制御する方法を検討した結果、即座にアクセントやイントネーションをつけることは難しかった。また、喉頭摘出者を想定し呼気流で制御する場合の変換パラメータを明らかにした。

最終年度には頭を動かし声高さを制御する方法を検討した結果、アクセントでは指圧より制御しづらい人が多かったが、イントネーションを真似る方法では、頭を上げる角度を声高さに比例させる方法が比較的評価が高かった。この方法は適用できる障害者の多い方法と考え、今後も検討を続ける。上記2について、まず人工喉頭を用いた時に出現するホルマントの範囲を健常者で詳細に調べた。また、音源を頬からや口腔内にパイプで送り込む方法ではホルマント抽出が難しく、抽出プログラム等の調整が必要であることが分かった。最終年度にはa.人工喉頭使用時の喉頭の状態がホルマントに与える影響を調べた。声門開放時の第一、第二ホルマント周波数は閉鎖時に比べどちらも高くなること、また声門開放時ホルマントはささやき声の傾向と似ていることが分かった。使用者で音源を切り替える場合や喉頭の状態によるポインタ位置の補正にこの結果が役立つと考えている。次にb.舌を口腔内前方で固定した状態ならば口唇の丸めと口の開閉だけで、以前から用いてきた舌・口唇のまるめ・口の開閉の3つの動きで出現するホルマント範囲とほぼ同程度で出すことができた。次にポインティング装置を試作し、上記2つの操作法の性能を調べたところ、大きな差はなかった。操作方法を障害の状況に合わせるための選択肢として利用できると考えている。福祉工学、感覚情報工学、生体計測工学当該年度は昨年度遅れていた人工喉頭音源の制御方法を中心に行った。以前から行っている指圧によるイントネーション制御について検討を行ったが、指圧による方法自体難しく、会話時に用いるにはさらなる工夫が必要だと考えている。指圧制御の改良だけではなく、訓練も少なくて済むような他の制御方法についても検討して実用的な方法を探っていきたい。また、残存発声関連機能を装置入力デバイスに利用する方法に関しては、人工喉頭音源波形の検討を行い、発声できない人でも本方法が使用できる可能性を示した。しかし当初予定していた、障害者のホルマント特性を明らかにすることについては、その特性の測定方法を健常者で検討するところまでで、障害者で調べるところまで到達していない。次年度は測定方法を早急に確定し、障害の種類によるホルマント特性の違いに注意しながら分類してその特徴を明らかにし、装置入力デバイスだけではなく、音声認識等にも利用できる結果になるようにまとめていきたい。当初、初年度は人工喉頭音源の制御方法を中心に行う予定であったが、障害を持った被験者の数を確保することが難しかったため、次年度に内容の一部を移している。そのかわり、構音の仕方や人工喉頭音源の位置によるホルマント特性への影響の評価の一部を当該年度に行った。イントネーションの制御方法については、制御時に被験者が着目している要素についての検証がまだ不十分である。また、呼気流を用いてもある程度イントネーション制御が可能であることを確認したが、指圧や呼気圧等の各制御方法でどこまで健常者のイントネーションに近づけることができるかと言う評価が確定していない。そのため、次年度も引き続き制御方法の検討を行っていく予定である。当初予定の内容と次年度の内容が入れ替わっている部分もあるが、1年分の研究成果として考えると当初予定の8割程度は達成できたのではないかと考えている。検討しきれなかった障害者音声の特性の検証を行うと同時に人工喉頭の制御方法についても検討を続ける。
二分脊椎モデルの運動障害に関する基礎的研究

鶏胚脊髄に切開を入れ二分脊椎を作成した。(1)二分脊椎を持つヒヨコは下肢麻痺を発症した。(2)障害部位の運動ニューロン数には違いが無いが、インターニューロン数に大きな違いが有る。(3)正常で起こる脊髄前角運動ニューロンの過剰産生とそれに引き続く神経細胞死が、二分脊椎ではほとんど見られず、その結果、適正な運動神経と骨格筋の結合が出来ず、正常の神経支配が出来ない可能性が有る。(4)二分脊椎では後索が正常に比較して有意に小さくなった。さらに、感覚神経線維が同側の後索のみならず、対側の後索、側索、前索をも上行することが明らかになった。(5)二分脊椎において脊髄の発達が遅れ、シナプス数が減少し、細胞間隙の減少が遅れる。1)まず、本年度は次の頁に記載したように二分脊椎の脊髄におけるIslet-1陽性運動ニューロンの変化を解析し、J Vet Med Sciに発表した。正常で起こる脊髄前角運動ニューロンの過剰産生とそれに引き続く神経細胞死が、二分脊椎においては減少していることを免疫組織化学を用いて証明し、適正な運動神経と骨格筋の結合が出来ず、正常の神経支配が出来ない可能性が有ることを報告した。2)次に、変成法による感覚神経走行の解析を行った。卵内で脊髄再開裂手術により二分脊椎を作成し、孵卵直後の二分脊椎及び正常個体を麻酔し後根線維を切断し運動状態を観察。3日間生かし、経心臓灌流固定を行い、脊髄を切り出し、オスミウム後固定、樹脂包埋し、ガラスナイフで脊髄の切片を作成、トルイジンブルー染色を行った。手術後の歩行状態を観察では後根線維切断により、正常ではほとんど変化が認められなかったが、二分脊椎では下肢の痙縮が著しくなり歩行困難が増強された。このことは感覚神経の伝達に異常が有ることを示唆した。変性法での感覚神経の追跡では、二分脊椎では後索を通過する線維が著しく減少し、後索が正常の後索に比較して有意に小さくなった。さらに、感覚神経線維が同側の後索のみならず、対側の後索や、さらに側索、前索をも上行することが明らかになった。このことは、二分脊椎において障害部位より上方へは感覚神経が上行しにくく、感覚情報が正常に上行できず異常な回路を形成することを示しており、このことが本疾患の歩行異常の原因の一つであると考えられた。1)二分脊椎の脊髄におけるIslet-1陽性運動ニューロンの変化を解析し、J Vet Med Sciに発表した。これらの所見をまとめてNeurosci Res 71:85-91,2011に報告した。さらに次の論文に関する予備実験も行った。鶏胚脊髄に微少ナイフで切開を入れ二分脊椎を手術的に作成することに成功した。(1)機能的には二分脊椎を持つヒヨコは障害部位に相当する下肢の共動筋、拮抗筋の不均衡による麻痺を発症した。(2)障害部位の運動ニューロン数には違いが認められないが、インターニューロン数に大きな違いが有ることを示した。

(3)2011年に二分脊椎の脊髄におけるIslet-1陽性運動ニューロンの変化を解析し、J Vet Med Sciに発表した。この論文では、正常で起こる脊髄前角運動ニューロンの過剰産生とそれに引き続く神経細胞死が、二分脊椎ではほとんど見られないことを免疫組織化学で証明し、その結果、適正な運動神経と骨格筋の結合が出来ず、正常の神経支配が出来ない可能性が有ることを報告した。(4)同時に2011年に、変成法による感覚神経走行の解析を行った。孵卵3日後に経心臓灌流固定を行い、脊髄を切り出し、オスミウム後固定、樹脂包埋し、ガラスナイフで脊髄の切片を作成、トルイジンブルー染色を行った。本変性法での感覚神経の追跡では、二分脊椎では後索を通過する線維が著しく減少し、後索が正常の後索に比較して有意に小さくなった。さらに、感覚神経線維が同側の後索のみならず、対側の後索や、さらに側索、前索をも上行することが明らかになった。このことは、二分脊椎において障害部位より上方へは感覚神経が上行しにくく、感覚情報が正常に上行できず異常な回路を形成することを示しており、このことが本疾患の歩行異常の原因の一つであると考えられた。(5)さらに、電子顕微鏡による観察により、二分脊椎において脊髄の発達が遅れ、シナプス数が減少し、細胞間隙の減少が遅れることも示した(未発表)。これらの結果から二分脊椎症における神経回路異常は発生初期から起こり、治療も早期に開始しなければならないことを示した。申請していた研究内容については、ほぼ申請時の予想どおりの結果が得られ、論文を国際誌に2報報告した。特に発生段階での異常とともに、孵化後の歩行可能状態でも感覚系に異常のあることを報告できたことは大きな進展であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請時の内容はほぼ完成したが、実験の間に明らかになった他の異常についても検討を進める。ただし、方法論的には従来の方法では明瞭に示すことが出来ないので、昨年度共同実験施設に整備された二光子顕微鏡等の特殊機器を使用して検討したい。本年度はその為の予備実験も含めて、発展的に研究を広げたい。
遺伝学を用いたセントロメアおよびヘテロクロマチン構造の形成機構の解析

染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体複製や分配の正確な分子機構を解明することは、遺伝学における本質的な課題の一つである。本研究では、主にプロテオミクスを用いて新規セントロメアタンパク質を同定してセントロメアを構成する巨大複合体の実体を知ることを目的としている。また、同時にセントロメアやその近傍のヘテロクロマチンの形成に必要な分子機構の解明を試みといる。これまでの研究で、ヒトおよびニワトリ細胞からセントロメアタンパク質CENP-HおよびCENP-Iを含むCENP-H/I複合体に少なくも13種類のタンパク質を含むことが明らかにできた。19年度は、更なるセントロメタンパク質の同定に成功し、CENP-H/I複合体が他のセントロメアタンパク質複合体とどのような関係にあるのかを明らかにできた。また、セントロメアやその近傍のヘテロクロマチンの重要な働きを担う可能性がAgo3遺伝子およびAgo3/Ago4のダブルノックアウト細胞を作成し、ノックアウト細胞において、ヘテロクロマチン形成の必要と思われる遺伝子の発現およびタンパク質量が変化していることを明らかにできた。染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、細胞のがん化など細胞に対する悪影響が生じる。報告者はこれまでに、高等動物の染色体分配機構に必須なセントロメアの形成機構の解明に注目して研究を進めてきた。本年度の研究では、主にプロテオミクスを用いて新規セントロメアタンパク質を同定し、それらの機能解析を通じてセントロメアの分子実体の解明を目指した。具体的には、CENP-KからCENP-RおよびCENP-50と名付けた9種類のタンパク質が、CENP-HおよびCENP-Iと巨大複合体を形成することを明らかにした。さらに、この複合体は、3種類のサブ複合体に分けられることも明らかになった。そのサブ複合体のうち、CENP-H,CENP-I,CENP-K,CENP-Lを含むサブクラスは、新しく合成されたCENP-Aがセントロメアにターゲットされる際のマークとして働いているということを示唆する結果を得た。また、CENP-O,CENP-P,CENP-Q,CENP-RおよびCENP-50からなるサブクラスのノックアウト細胞は、細胞の増殖が可能であり、他のサブクラスと異なった機能を有することが明らかになった。来年度以降は、ノックアウトマウスの作成も行い、細胞レベルだけでなく、個体レベルでの影響も解析する予定である染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。昨年度までの研究で、ヒトおよびニワトリ細胞からセントロメアタンパク質CENP-HおよびCENP-Iと強く相互作用する9種類のタンパク質を同定した。18年度は、昨年度までの実験を繰り返し、さらなるタンパク質の同定を進め、CENT-H/I複合体には昨年同定したタンパク質を含め少なくも13種類のタンパク質を含むことが明らかにできた。CENP-H/I複合体を構成するタンパク質のノックアウト細胞を複数作成し、それらが正常な染色体分配とキネトコア形成に必須な役割を担っていることが明らかになった。さらに、CENP-H/I複合体が、新しく合成されたCENP-Aの取り込みに重要な働きを担うことを示すことができた。また、セントロメアやその近傍のヘテロクロマチンの重要な働きを担う可能性がAgo3遺伝子のノックアウト細胞を作成し、ノックアウト細胞において、ヘテロクロマチン形成の必要と思われる遺伝子の発現が低下していることを明らかにできた。
治療抵抗性関節リウマチに対するTet3を標的とするエピゲノム創薬

代表的な自己免疫疾患である関節リウマチ(RA)においては、DNAメチル化異常が滑膜の攻撃的な表現型に関与することが示唆されている。申請者らはこれまでに、慢性炎症刺激がDNA脱メチル化酵素であるTet3の発現を増強し、滑膜の攻撃的な表現型への変化を誘発すること、Tet3の阻害が関節破壊を強力に抑制することを明らかにしてきたが、治療応用にはTet3の発現調節機構の詳細を解明する必要がある。申請者らの予備的検討により、TNFやIL-1はNFkB依存性にTET3 mRNAの発現を誘導するが、Tet3タンパクの分解を強く抑制することでTet3タンパクの発現が顕著に増強することが明らかとなった。現在、患者由来滑膜組織・培養滑膜細胞において、TET3タンパクの標的となる遺伝子の網羅的解析を行なっている。一方で、O-linked Nacetylglucosamine (O-GlcNAc)は、O-GlcNAcトランスフェラーゼ(OGT)によってセリン/スレオニンに付加され、同部位に起こるリン酸化と拮抗し、タンパクのユビキチン化を阻害する。Tet2/3のタンパクにはO-GlcNAcサイトが多く存在し、OGTによるO-GlcNAc化がユビキチン化を阻害することを報告される(JBC2015,290;4801-4812)が、申請者らはFLSにおいてTNF刺激によりこのOGTも発現が誘導されることを確認した。現在、患者由来滑膜組織・培養滑膜細胞におけるO-GlcNAcトランスフェラーゼ(OGT)の発現、O-GlcNAc化の状態、炎症性サイトカインによる誘導とその発現調節機構を確認中である。今後、Tet3依存性の滑膜細胞の表現型変化におけるO-GlcNAc化の関与を明らかにし、治療抵抗性RAに対するエピゲノム創薬に展開する予定である。Tet3依存性の滑膜細胞の表現型変化におけるO-GlcNAc化の関与の検討と並行して、滑膜細胞におけるTET3の標的分子の網羅的解析を先に行い、single-cell analysisなどの報告と合わせて、より良い治療標的を模索中である。滑膜細胞におけるTET3の標的分子の網羅的解析を先に行い、single-cell analysisなどの報告と合わせて、より良い治療標的を模索中である。一方で、O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)は、O-GlcNAcトランスフェラーゼ(OGT)によってセリン/スレオニンに付加され、同部位に起こるリン酸化と拮抗し、タンパクのユビキチン化を阻害する。Tet2/3のタンパクにはO-GlcNAcサイトが多く存在し、OGTによるO-GlcNAc化がユビキチン化を阻害することを報告される(JBC 2015,290;4801-4812)が、申請者らはFLSにおいてTNF刺激によりこのOGTも発現が誘導されることを確認した。タンパクのユビキチン化の評価系の確立に時間を要したため代表的な自己免疫疾患である関節リウマチ(RA)においては、DNAメチル化異常が滑膜の攻撃的な表現型に関与することが示唆されている。

現在、患者由来滑膜組織・培養滑膜細胞におけるO-GlcNAcトランスフェラーゼ(OGT)の発現、O-GlcNAc化の状態、炎症性サイトカインによる誘導とその発現調節機構を確認中である。今後、Tet3依存性の滑膜細胞の表現型変化におけるO-GlcNAc化の関与を明らかにし、治療抵抗性RAに対するエピゲノム創薬に展開する予定である。Tet3依存性の滑膜細胞の表現型変化におけるO-GlcNAc化の関与の検討と並行して、滑膜細胞におけるTET3の標的分子の網羅的解析を先に行い、single-cell analysisなどの報告と合わせて、より良い治療標的を模索中である。施設内の他のラボの協力を得て、ユビキチン化の評価系を急ぐとともに、早いうちに組織評価、動物実験を行っていく予定である滑膜細胞におけるTET3の標的分子の網羅的解析を先に行い、single-cell analysisなどの報告と合わせて、より良い治療標的を模索中である。
T細胞により認識される腫瘍抗原由来ペプタイドを用いた腫瘍特異的免疫能誘導の試み

現在まで乳癌10例,食道癌31例,膵癌4例についてMAGE遺伝子とMHCの発現につき検討してきた.これらの症例でHLA-Alの患者はなかった.MAGE遺伝子の発現率は,乳癌でMAGE-1陽性1例(10%),MAGE-3陽性3例(30%),MAGE-1,MAGE-3とも陽性例が1例(10%)であった.食道癌患者ではMAGE-1陽性7例(23%),MAGE-3陽性14例(47%),両者とも陽性3例(10%)であった.膵癌ではMAGE-1陽性1例(25%),MAGE-3陽性2例(50%),両者とも陽性1例(25%)であった.以上の結果から,乳癌及び消化器癌においてはMAGE-3の頻度がMAGE-1に比べ高いことが明らかとなった.なお,MAGE-1蛋白の存在は抗体(久留米大学免疫学伊東恭悟教授より供与)を使用したウエスタン解析にて乳癌の1例を除き全例陽性となり,遺伝子発現と蛋白合成との整合性が証明された.これらの発現と患者の予後との関連では,MAGE-1&MAGE-3の両者の遺伝子発現が陽性の患者において有意に良好であった.HLA-A2陽性で腫瘍がMAGE-3を発現する食道癌患者では詳細な検討を行った.この患者の末梢血リンパ球はHLA-A2拘束性MAGE-3由来ペプチド(FLWGPRALV)にてパルスした培養樹状突起細胞にて刺激することにより増殖をしたが,この一方HLA-A1拘束性MAGE-1由来ペプチドで処理した樹状突起細胞で刺激したリンパ球は増殖を示さなかった.増殖をみた条件では同じくリンパ球のTNF産生が有意に高かった.上記で適当に刺激された培養リンパ球はHLA-A2&MAGE-3陽性の自己腫瘍に対する障害活性を有していたが、HLA-A24&MAGE-3陽性のアロの腫瘍に対する障害は弱かった.以上から,プロフェッショナル抗原提示細胞を利用した腫瘍抗原由来ペプチドによる能動免疫療法は臨床応用が期待できるものと考えられた.現在は,T細胞のクローニングを行い,MAGE-3由来ペプチドに反応するT細胞レセプターの同定を行っている.現在まで乳癌10例,食道癌31例,膵癌4例についてMAGE遺伝子とMHCの発現につき検討してきた.これらの症例でHLA-Alの患者はなかった.MAGE遺伝子の発現率は,乳癌でMAGE-1陽性1例(10%),MAGE-3陽性3例(30%),MAGE-1,MAGE-3とも陽性例が1例(10%)であった.食道癌患者ではMAGE-1陽性7例(23%),MAGE-3陽性14例(47%),両者とも陽性3例(10%)であった.膵癌ではMAGE-1陽性1例(25%),MAGE-3陽性2例(50%),両者とも陽性1例(25%)であった.以上の結果から,乳癌及び消化器癌においてはMAGE-3の頻度がMAGE-1に比べ高いことが明らかとなった.なお,MAGE-1蛋白の存在は抗体(久留米大学免疫学伊東恭悟教授より供与)を使用したウエスタン解析にて乳癌の1例を除き全例陽性となり,遺伝子発現と蛋白合成との整合性が証明された.これらの発現と患者の予後との関連では,MAGE-1&MAGE-3の両者の遺伝子発現が陽性の患者において有意に良好であった.HLA-A2陽性で腫瘍がMAGE-3を発現する食道癌患者では詳細な検討を行った.この患者の末梢血リンパ球はHLA-A2拘束性MAGE-3由来ペプチド(FLWGPRALV)にてパルスした培養樹状突起細胞にて刺激することにより増殖をしたが,この一方HLA-A1拘束性MAGE-1由来ペプチドで処理した樹状突起細胞で刺激したリンパ球は増殖を示さなかった.増殖をみた条件では同じくリンパ球のTNF産生が有意に高かった.上記で適当に刺激された培養リンパ球はHLA-A2&MAGE-3陽性の自己腫瘍に対する障害活性を有していたが、HLA-A24&MAGE-3陽性のアロの腫瘍に対する障害は弱かった.以上から,プロフェッショナル抗原提示細胞を利用した腫瘍抗原由来ペプチドによる能動免疫療法は臨床応用が期待できるものと考えられた.現在は,T細胞のクローニングを行い,MAGE-3由来ペプチドに反応するT細胞レセプターの同定を行っている.現在まで検討した担癌患者は乳癌9例、食道癌30例であり、全例腫瘍細胞の腫瘍組織適合抗原のクラス1(フローサイトメトリーで検索)は陽性であったが、HLA-A1陽性患者はなかった。乳癌患者でのMAGE遺伝子発現はMAGE-1陽性例(10%)、MAGE-3陽性3例(30%)両者とも陽性1例(10%)、食道癌患者ではMAGE-1陽性7例(23%)、MAGE-3陽性14例(47%)両者とも陽性3例(10%)であった。患者の予後との関連においては、単独では有意ではないが、MAGE-1&-3遺伝子両者を発現するものは有意に予後は良好であった。MAGE-

3遺伝子の発現頻度が高いことより、MAGE-3由来ペプタイド(EVDPIGHLY for HLA-A1 & FLWGPRALV. for HLA-A2)の合成を行ったが、現在まで検討した健常人、担癌患者ともにHLA-A1陽性患者の出現はなく、まず超音波破砕腫瘍抽出抗原を用いた動物実験とヒト末梢血リンパ球からの自己腫瘍特異的なポピュレーションの誘導実験を行った。その結果マウス基礎実験(Balb/cマウス)では、2種類の同系腫瘍(MOPC104E & MethA)を用いて、脾細胞から誘導した培養APC(GM-CSF 2000U/ml)を腫瘍抽出抗原でパルスし、腹腔内投与したのち静脈内投与することにより、腫瘍特異的なprotective immunityの誘導が可能であった。ヒト末梢血リンパ球から誘導された培養APCは以前に報告した表面マーカーに加え、CD14弱陽性でCD33強陽性の樹状細胞を示すものであった。さらにかかるAPCに腫瘍抽出抗原をパルスし、末梢血リンパ球の非付着分画を混合培養することにより、抽出抗原特異的に増殖し、自己の腫瘍のみに強い細胞障害活性を示すエフェクターの誘導が可能であった。現在まで検討した担癌患者は乳癌10例、食道癌31例、膵癌4例であり、主要組織適合抗原のクラス1は陽性であったが、HLA-A1陽性患者はなかった。MAGE遺伝子発現は、乳癌患者ではMAGE-1陽性1例(10%)、MAGE-3陽性3例(30%)両者とも陽性1例(10%)、食道癌患者ではMAGE-1陽性7例(23%)、MAGE-3陽性14例(47%)両者とも陽性3例(10%)、膵癌患者ではMAGE-1陽性1例(25%)、MAGE-3陽性2例(50%)両者とも陽性1例(25%)であった。MAGE-1に対する抗体を用いたウエスタン解析では乳癌の1例を除きその他の腫瘍は陽性となり、遺伝子発現との一致が見られた。患者の予後との関連においては、症例の追加にもかかわらずMAGE-1 & -3遺伝子両者を発現するものは有意に予後は良好であった。本年度はMAGE-3由来ペプタイド(FLWGPRALV for HLA-A2)を用いてまずHLA-A2 & MAGE-3陽性の食道癌患者末梢血リンパ球とペプチドパルス抗原提示細胞との混合培養系よりペプチド特異的にTNF産生を行うポピュレーションを誘導した。ついで自己腫瘍、アロの食道癌細胞株、アロの乳癌細胞株に対する細胞障害活性を測定し、HLA-A2 & MAGE-3陽性の食道癌細胞株に対してHLA-A2特異的に障害活性を示した。現在クローニングを行い特異的なCTLcloneのT細胞受容体のレパトワを決定すべく進行中である。マウス基礎実験(Balb/cマウス)では、2種類の同系腫瘍(MOPC104E & MethA)を用いて、脾細胞から誘導した培養APC(GM-CSF 2000U/ml)を腫瘍抽出抗原として、前年度の超音波破砕腫瘍抽出抗原から一歩進めて、熱ストレス蛋白であるglucose-regulated protein 94を腫瘍細胞より抽出し、単独投与とパルスした培養抗原提示細胞投与との比較を行い、皮下投与したのち腫瘍を皮内投与することにより、腫瘍特異的なprotective immunityの誘導を証明した。
ナシ自殖Ｆ２集団を利用した果実有用形質に関するMASの開発と新規機能性品種の開発

本研究は、セイヨウナシXニホンナシおよびニホンナシXチュウゴクナシ自殖F2集団を材料にして、高密度連鎖地図の作製および有用形質に関するDNAマーカー開発を行い、今後の新品種開発に役立てることを目的として実験を行った。果実の追熟性について、セイヨウナシXニホンナシF2集団個体果実を用いて、追熟処理としてエチレン処理を行い、その後の硬度低下を指標に評価を行った。台風により落果した個体もみられ、当初の予定より少ない個体になったものの、非追熟型、追熟型、中間型の3つの型に分類することができた。中間型を追熟性として加えると非追熟性:追熟性が3:1の遺伝分離比に適合した。追熟性が劣性形質である可能性が示唆された。同時に追熟性とエチレン生成の関係について、F2集団個体のナシACC合成酵素遺伝子(PpACS1)の遺伝子型を決定し、エチレン生成型と追熟性の相関を調査した。結果、エチレン生成型と追熟性の間には、相関がみられなかった。セイヨウナシBrown spot病罹病性の遺伝子座については、昨年度に引き続きRAD-seq解析を行い、Brown spot病罹病性の遺伝子座にこれまでより近接したSNPマーカーを数種得ることが出来た。さらにナシ果実に独特のざらざらした食感を構成する要素であるリグニンの定性及び定量分析を、セイヨウナシ、ニホンナシ、チュウゴクナシ品種で行った。この中で、ニホンナシの良食味品種は、果芯部と果肉部のリグニン含量の差が最も大きいことが判明した。食味部分である果肉において、長い人為的選抜の中で、リグニン含量の低下がもたらせられた可能性を示唆するものであった。セイヨウナシの重要病害であるBrown spot病罹病性の遺伝子座について、よりファインマッピングがされた。また他の病害罹病性についても、マッピングされつつありある。また追熟性についても、遺伝様式が明らかになりつつある。病害罹病性遺伝子座についても、個体数を増やし、よりファインマッピングを試みる。さらに追熟性などの重要形質については、より個体数を増やして、遺伝様式の解明をおこなうと同時にマッピングとマーカー開発を行う。食感を左右するリグニン含量についても、調査をすすめる。さらには酸度、大きさ、熟期などの果実重要形質も同様にQTL解析を行う予定である。本研究は、ニホンナシXセイヨウナシおよびニホンナシXチュウゴクナシ自殖F2集団を材料にして、研究代表者および分担者が次世代シーケンサーにより取得したニホンナシおよびセイヨウナシのESTおよびゲノム配列およびセイヨウナシ、チュウゴクナシの公開ゲノム情報を利用して、有用形質に関するマーカー開発を行い、今後の新品種開発に役立てることを目的として実験を行った。ナシ果実ACC合成酵素について、PpACS1とPpACS2が熟期に関与すると考えられ、そのうちPpACS1について、自己触媒エチレン生成機構を指標として、熟期を支配する遺伝子の探索を行った。成熟期の約1ヶ月前より自己触媒エチレン生成が起こることを明らかにし、かつその機構が移行する前後で発現が消失する情報伝達に関与する遺伝子及び転写因子を同定した。これらの遺伝子について、今後熟期との関連が見られるかより明らかにしてマーカー開発を行う必要がある。ニホンナシXセイヨウナシのF2集団をもちいて、新たにSSRマーカーの数を増やし、再度セイヨウナシBrown spot病罹病性の遺伝子座のQTL解析を行い、セイヨウナシBrown spot病罹病性座とニホンナシ黒斑病罹病性遺伝子座が近接していることを明らかにした。また赤星病抵抗性遺伝子座について、QTL解析を試みたが、結果、有意なQTLは検出できなかった。評価方法についてより検討する必要がある。さらにニホンナシにおける網羅的トランスクリプトーム解析を行い、SNPマーカー開発を行った。セイヨウナシの重要病害であるBrown spot病罹病性の遺伝子座について、マーカー作成を行い、利用できるようになった。また他重要形質についても、候補遺伝子を絞り込んでいる状態である。本研究は、ニホンナシXセイヨウナシおよびニホンナシXチュウゴクナシ自殖F2集団を材料にして、次世代シーケンサーにより取得したニホンナシおよびセイヨウナシのESTおよびゲノム配列およびセイヨウナシ、チュウゴクナシの公開ゲノム情報を利用して、有用形質に関するマーカー開発を行い、今後の新品種開発に役立てることを目的として実験を行った。今年度は、肉質の遺伝解析の試みとして、ナシ果実に独特のざらざらした食感を構成する要素である石細胞およびその化学構成要素であるリグニンの定性及び定量分析を、セイヨウナシおよびニホンナシ品種で行った。結果、ニホンナシおよびセイヨウナシ品種で、縮合型リグニン含量およびその構成モノリグノールとしてのシリンギル・リグニン(Sリグニン)およびグアイアシル・リグニン(Gリグニン)比率が異なることを明らかにした。肉質の改善のためには,詳細な遺伝様式を明らかにする必要がある。またセイヨウナシBrown spot病罹病性の遺伝子座についてRAD-seq解析を行い、現在SNPマーカーを選抜している。黒星病抵抗性および赤色果色集団育成の為に`おさ二十世紀'X`紅梨'のF1および自殖F2集団の育成を行った。またセイヨウナシ品種が有する単為結果性について、単為結果処理で増減する転写因子のうちNACファミリーに加えて、MYB遺伝子を新たに選抜した。

今後、候補遺伝子について、遺伝子導入した形質転換個体の作製とマーカーの開発を行う予定である。セイヨウナシの重要病害であるBrown spot病罹病性の遺伝子座について、よりファインマッピングがされつつある。また他単為結実性などの重要形質についても、候補遺伝子を絞り込んでいる状態である。本研究は、セイヨウナシXニホンナシおよびニホンナシXチュウゴクナシ自殖F2集団を材料にして、高密度連鎖地図の作製および有用形質に関するDNAマーカー開発を行い、今後の新品種開発に役立てることを目的として実験を行った。果実の追熟性について、セイヨウナシXニホンナシF2集団個体果実を用いて、追熟処理としてエチレン処理を行い、その後の硬度低下を指標に評価を行った。台風により落果した個体もみられ、当初の予定より少ない個体になったものの、非追熟型、追熟型、中間型の3つの型に分類することができた。中間型を追熟性として加えると非追熟性:追熟性が3:1の遺伝分離比に適合した。追熟性が劣性形質である可能性が示唆された。同時に追熟性とエチレン生成の関係について、F2集団個体のナシACC合成酵素遺伝子(PpACS1)の遺伝子型を決定し、エチレン生成型と追熟性の相関を調査した。結果、エチレン生成型と追熟性の間には、相関がみられなかった。セイヨウナシBrown spot病罹病性の遺伝子座については、昨年度に引き続きRAD-seq解析を行い、Brown spot病罹病性の遺伝子座にこれまでより近接したSNPマーカーを数種得ることが出来た。さらにナシ果実に独特のざらざらした食感を構成する要素であるリグニンの定性及び定量分析を、セイヨウナシ、ニホンナシ、チュウゴクナシ品種で行った。この中で、ニホンナシの良食味品種は、果芯部と果肉部のリグニン含量の差が最も大きいことが判明した。食味部分である果肉において、長い人為的選抜の中で、リグニン含量の低下がもたらせられた可能性を示唆するものであった。セイヨウナシの重要病害であるBrown spot病罹病性の遺伝子座について、よりファインマッピングがされた。また他の病害罹病性についても、マッピングされつつありある。また追熟性についても、遺伝様式が明らかになりつつある。供試個体数を増加させ、よりファインマッピングを行う予定である。また新たな解析手法としてRAD-seqの導入を図り、病害罹病性を正確に判定できるマーカー開発を行う予定である。単為結実性などの重要形質については、形質転換体の作成やマーカー開発を行う。また肉質についての解析は、より広い遺伝資源の調査とF2集団での解析を行っていく予定である。病害罹病性遺伝子座についても、個体数を増やし、よりファインマッピングを試みる。さらに追熟性などの重要形質については、より個体数を増やして、遺伝様式の解明をおこなうと同時にマッピングとマーカー開発を行う。食感を左右するリグニン含量についても、調査をすすめる。さらには酸度、大きさ、熟期などの果実重要形質も同様にQTL解析を行う予定である。
現代競争市場における戦略的管理会計システムの構築

本研究では,現代競争市場における管理会計の役割を,顧客分配価値の概念をもとに,以下のように分析した。まず,顧客分配価値を,下記のように関数化された,2つの曲面(ここで,xは価格軸,yはベネフィット軸,zは顧客分配価値軸である),の交差する部分にできる曲線(ただし,m=1,n=1のときは直線になる)として定義した。消費者行動曲面(次式で示される座標の集合体としてとらえられる)企業行動曲面(次式で示される座標の集合体としてとらえられる)現代競争市場における管理会計の役割を概念的に捉えるならば,それには,上述のmとnとを融合する役割があるといえる。管理会計の体系(システム)を,意思決定と業績評価と収益性管理として捉えるならば,現代競争市場においては,mとnとが,それらを明確にガイドすることになる。これを具体化するために,競争市場における原価計算システムとして考案したのが,Kotlerの製品階層概念をコスト・オブジェクティブとしたコア・プロダクト原価計算である。これをベースに行った戦略的管理会計システムの構築という研究は,付加価値の分配という側面から見た,投資行動を包含する,企業経営戦略の一環としてのグループ経営,リスク管理,情報管理等に資するための意思決定と,コスト収益性分析にもとづく利益管理,業績評価とに一石を投じる研究となったと考えている。また本研究のプロセスで,製品階層概念を形成する拡張製品(augmented product)の役割とこれを創造するマーケティング活動とを分析することを試みた。このことが,本研究で構築された戦略的管理会計システムを,公的法人等の企業以外の組織の経営に活用する研究の道を拓くこととなった。そこで,後半の研究期間(平成17年度)の中で,医療機関・医療システムの効率化に関わる諸問題に対し,本研究の成果である戦略的管理会計の視点からアプローチするという研究も試みてみた。この当該期間における最後の研究は,本科研研究の中心的成果が,公的組織やNPOを含め,企業以外の多くの組織の健全なる事業活動の育成にも大きく貢献するという確信を,研究代表者にもたらした。初年度における研究成果としては,「11.研究発表」に示すような,共著を得ることができた。その内容は,以下の3つの担当章として記述されている。1.河野充央「海外事業展開と管理会計-エクセレント・カンパニーの条件-」『新版現代会計-創造性/国際性/学際性-』第3章,創成社,2004,pp.5066。(1)グループ経営に対する考察(グループ経営の意義と戦略的グループ経営成立の諸要因,組織の分権と集権)(2)戦略的グループ経営と海外事業展開-連結経営への外生要因-(社会技術的制度改革とグループ経営,産業空洞化とグループ経営)(3)グループ経営と管理会計の役割(グループ経営とマネジメント・コントロール-戦略的計画設定と目標達成の手順,管理会計の活用用件,グループ経営と市場の論理)2.河野充央「情報化社会と管理会計」『新版現代会計-創造性/国際性/学際性-』第18章,創成社,2004,pp.327344。(1)現代競争市場の仕組みと管理会計の役割(現代競争市場の仕組み,現代競争市場における管理会計の役割)(2)顧客価値と会計情報(3)情報システム創造とその会計管理(4)ソフトウエアの進化とその会計管理

(5)組織・システムの進化と管理会計との関わり(6)顧客分配価値の創造と戦略的管理会計3.河野充央「戦略/情報/犯罪/リスク管理-リスク管理会計-」『新版現代会計-創造性/国際性/学際性-』第20章,創成社,2004,pp.366377。(1)企業経営とリスク管理会計(2)情報リスクに関わる諸問題(3)戦略リスクに関わる諸問題第2年度(平成17年度)における研究成果としては,「11.研究発表」に示すような,共著および共編著を得ることができた。その内容は,以下のとおりである。1.河野充央「戦略的グループ経営と管理会計」『グループ企業の管理会計』第6章,税務経理協会,2005,pp.109127。(1)論理展開のベース(2)戦略的グループ経営と海外事業展開-連結経営への外生要因-(3)グループ経営と管理会計の役割について2.河野充央「医療管理会計の方法と今後の研究課題-ヘルスケア・システムとそのマネジメントについて-」『文化会計学会研究叢書第1巻病院管理会計-高齢社会の病院経営/医療サービス-』第1部第4章,五絃舎,2006,pp.4661。(1)ヘルスケア・システムの会計管理とその要素(2)ヘルスケア・システムの戦略的展開とその要素(3)ヘルスケア・システム研究への科学的アプローチの方法3.河野充央「医療原価の分類/管理/計算方法」『文化会計学会研究叢書第1巻病院管理会計-高齢社会の病院経営/医療サービス-』第2部第5章,五絃舎,2006,pp.6583。(1)医療原価計算の方法と機能(2)医療原価の分類と管理(3)医療原価の計算とその本質4.河野充央「ヘルスケアサービスの本質と医療原価計算の戦略的展開-競争環境下における医療原価計算について-」『文化会計学会研究叢書第1巻病院管理会計-高齢社会の病院経営/医療サービス-』第2部第6章,五絃舎,2006,pp.8498。(1)サービス原価計算の戦略性(2)医療原価計算システムの戦略的展開5.河野充央「患者分配価値と病院分配価値-公益性と効率性の両立を目指して-」『文化会計学会研究叢書第1巻病院管理会計-高齢社会の病院経営/医療サービス-』第2部第10章,五絃舎,2006,pp.161163。(1)病院と会計(2)医療付加価値会計へのアプローチ(3)医療マーケティング会計へのアプローチ(4)医療付加価値会計と医療マーケティング会計との融合
嗅神経前駆細胞の増殖、分化機構、および多能性に関する研究

脊椎動物の嗅覚器発生は、胚前部で一対の外胚葉板が厚みを帯びる事から始まる。この実験計画開始当初、嗅プラコードを誘導および特定するメカニズムの定義は存在せず、幾つか矛盾する例があった。文献上混乱を招く原因として主に誘導(ある特定の組織の運命が外来因子の作用によって変化する)と分化(特定の組織の細胞特性が変化する)の過程がはっきり区別されていないことが挙げられる。これを念頭に置いてパスハーキー氏は初めに、組織間相互作用を誘導起因作用と分化起因作用とに区別する特定マーカーの利用によって、嗅覚器誘導に関する分析法を幾つか確立した。我々は、これまで一般的に嗅プラコードの特定に重要だと考えられていたレチノイン酸が、正しくは分化に深く関わっているのではないかと考える。なぜなら、レチノイン酸経路を阻害すると嗅神経の形成は妨げられるが、嗅プラコードは誘導されたからである。レチノイン酸は、神経組織を阻害するだけではなく、嗅覚器官の非神経部分をも増加させる。従って我々はレチノイン酸が嗅上皮のパターン形成と分化の役割を果たしているが、嗅プラコードの誘導には影響を与えないと考える。我々が得たデータは、嗅プラコード誘導に深く関与しているのはレチノイン酸ではなくIGFだと示唆している。任期終盤で氏は、IGFと未知の因子が相互的に作用してできるcoordinate signalingが嗅プラコードを誘導するというモデルを立て、検証を行っている。氏は、その未知の協同因子も探索している。これらの研究によって嗅覚器誘導の仕組みについて正確な機構が解明され、嗅覚器発生に関する理解がいっそう深まった。この研究の目的は、ニワトリとマウスの嗅覚プラコードの発生を運命づける細胞間・分子間相互作用を解明することである。嗅覚プラコードは、一連の未知の分子・細胞シグナルを受けた非神経外胚葉より形成される。しかし、嗅覚プラコードの発生機構、すなわち、嗅覚プラコードが初めて形成されるのはいつであるのか、その周りにどのような組織があり、その組織間の相互作用がどのようなものなのかといった基本的なことすらも未だ解明されていない。パスチャキ氏は、この嗅覚器誘導の基本を解明し、氏の立てた仮説を検証する最善の手法を確立すべく実験を行った。氏はまず、組織培養で嗅覚プラコードを発生させる為の最適条件を与える複数の化学物質を補充することにより、効率的で再現性の良い嗅覚プラコード培養の手法を確立した。そして、この手法を用いる事により我々は、嗅覚プラコードが成長し分化する為の必要条件を多数確定した。さらに氏は現在この培養法を用い、幾つかの候補となる組織あるいは分子が嗅覚器の発生に与える影響を調べている。氏は分化、具体的には、ニューロンと嗅覚幹細胞の出現が始まるのは、嗅覚プラコードが或る特定の時期以降に摘出された場合に限るということを発見した。また、嗅覚プラコードの分化にはレチノイン酸が必要であることを確認した。これらのデータは、嗅覚器発生の二段階方式を示唆している。第一段階は誘導の段階。そして第二段階は、レチノイン酸の媒介を受けて分化する段階である。
歯質に繰り返し応力を負荷した時の疲労破壊に関する研究

歯質に繰り返し応力を負荷した時の疲労破壊を知る目的で、引張り試験で疲労試験を行った。疲労試験に先立ち、歯質試片の、試片形状、試片の保管方法などについて、本年度は人歯にかわり比較的入手可能な牛歯を被験歯として検討し、疲労強度を求めた。1.牛歯象牙質の引張試験及び疲労試験に使用可能な形態についてマイクロカッターを使用し、当教室試作の歯科用タービン定送り装置を用いたことで両端に把持部分を持つダンベル型の試片の規格化が行えた。この試片の破断は中央部で生じ、引張試験及び疲労試験に使用可能であった。2.牛歯の保管条件が象牙質の引張強さに及ぼす影響について同一個体の左右牛歯下顎第一中切歯について屠殺直後と、一定期間冷凍保管してから解凍したもの、沸騰水中で加熱したものについて比較した。その結果、引張強さは冷凍保管は1年間では79.0MPaで屠殺直後の77.1MPaと変わらない値であったが、沸騰水で加熱すると70.3MPaと減少していた。このことより、疲労試験に用いる試料としては冷凍保管したものでは特に問題ないことが明らかとなった。(以上、第25回日本歯科理工学会および第75回IADRにて発表)3.牛歯の年令が象牙質の引張強さに及ぼす影響について検討牛歯の萌出状態で推定年齢を求め、各年令の牛歯象牙質の引張強さを求めた、推定年齢1.54歳の範囲内の牛歯象牙質は77.373.1MPaで、年令による差は認められなかった。(以上、第26回日本歯科理工学会にて発表)4.牛歯象牙質の疲労強度について推定年齢2歳の牛歯下顎第一中切歯を1週間以内冷凍保管後の象牙質の10^5回の時間的強度(疲労強度)をステアケース法を用いて求めたところ51.0±3.6MPaであった。(以上、第27回日本歯科理工学会にて発表予定)歯質に繰り返し応力を負荷した時の疲労破壊を知る目的で、引張り試験で疲労試験を行った。(以上、第27回日本歯科理工学会にて発表予定)