hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA指紋法の林木遺伝育種研究への利用のための基礎研究

遺伝育種研究を深化させる上で,優れた遺伝的指標(遺伝子マ-カ-)の開発が必要不可欠である.本研究ではDNA指紋の手法を林木を対象とした研究分野に導入し,実用化するための基礎的研究として,きわめて高い変異性を検出することができるプロ-プおよびプライマ-の開発とその評価を行った.研究対象樹種として主としてスギを用いて,まず,全DNAの単離法として現在広く用いられているCTAB法について改良を加えた.その結果,DNA回収率が著しく向上し,また,DNA純度もRFLP(制限酵素断片長多型)分析およびPCR(polymerase chain reaction)を行うのに十分であった.この確立された抽出法を用いて,九州地域の20精鋭樹クロ-ンからDNAの単離を行った.一方,DNA指紋に有効なプロ-ブとプライマ-の検索を行った.現在,DNA指紋の主流となっているRAPD法とM13法について検討した.まず,RAPD法では,合成した25組のプライマ-(10bps)対を用いてPCRによりDNAを増幅し,アガロ-ス電気泳動パタ-ン(DNA型)における変異の検出を試みたが,高い変異性を示すプライマ-対を見い出すことはできなかった.しかし,λファ-ジの1種であるM13の塩基配列の一部(約500bps)をプロ-ブとしたRFLPにおいて高い変異性が認められた.このプロ-ブを用いて,先に述べた20精鋭樹クロ-ンの識別を試みた結果,同一のDNA型を示す個体は認められず,このプロ-ブがスギのDNA指紋においてきわめて有効であることが明かとなった.これにより,今後,品種および精鋭樹クロ-ンの分類・同定,交配家系における親子鑑定,天然林での繁殖構造の解明などが可能となった.遺伝育種研究を深化させる上で,優れた遺伝的指標(遺伝子マ-カ-)の開発が必要不可欠である.本研究ではDNA指紋の手法を林木を対象とした研究分野に導入し,実用化するための基礎的研究として,きわめて高い変異性を検出することができるプロ-プおよびプライマ-の開発とその評価を行った.研究対象樹種として主としてスギを用いて,まず,全DNAの単離法として現在広く用いられているCTAB法について改良を加えた.その結果,DNA回収率が著しく向上し,また,DNA純度もRFLP(制限酵素断片長多型)分析およびPCR(polymerase chain reaction)を行うのに十分であった.この確立された抽出法を用いて,九州地域の20精鋭樹クロ-ンからDNAの単離を行った.一方,DNA指紋に有効なプロ-ブとプライマ-の検索を行った.現在,DNA指紋の主流となっているRAPD法とM13法について検討した.まず,RAPD法では,合成した25組のプライマ-(10bps)対を用いてPCRによりDNAを増幅し,アガロ-ス電気泳動パタ-ン(DNA型)における変異の検出を試みたが,高い変異性を示すプライマ-対を見い出すことはできなかった.しかし,λファ-ジの1種であるM13の塩基配列の一部(約500bps)をプロ-ブとしたRFLPにおいて高い変異性が認められた.このプロ-ブを用いて,先に述べた20精鋭樹クロ-ンの識別を試みた結果,同一のDNA型を示す個体は認められず,このプロ-ブがスギのDNA指紋においてきわめて有効であることが明かとなった.これにより,今後,品種および精鋭樹クロ-ンの分類・同定,交配家系における親子鑑定,天然林での繁殖構造の解明などが可能となった.
細菌の膜小胞を介した物質受け渡し機構の解明

細菌は多様な機能を持つ細胞外膜小胞(メンブレンベシクル(MV))を放出し、生物学的に重要な役割を果たすと共にワクチン開発にも応用されている。MVは細胞間での物質運搬にも関わっており、その積荷が細胞に渡されていることは、数多くの研究例で実証されている。しかしながら、その詳細な過程やメカニズムについては全く理解されていない。本研究は、MVによる物質受け渡しプロセスとそのメカニズムの解明を目指す。
複製フォーク進行速度を低下させるDNA断片(大腸菌染色体由来)の解析

大腸菌染色体におけるDNA合成速度はほぼ一定で、1秒当たり約1kbという速い速度で進行していると考えられている。我々は、少なくともプラスミド上において、複製フォークの進行を遅くするという新しい活性(slow down活性)を有するDNA断片を大腸菌染色体上に2種類同定してきた。二次元寒天ゲル電気泳動法による解析により、この活性は、特定部位でのフォーク阻害ではなく、プラスミド上においてほぼ一様に一方向の時のみにフォークの進行速度を低下させることが解った。さらに、この活性と対応して、このプラスミドを持つ菌はフィラメント状に伸び、核の形態も異常になることが判明した。本年度は、このslow down活性の直接的シグナルが、(a)DNA上のcisに働く特異な配列(b)クローンDNA上の転写と複製の衝突(c)クローンDNA上からの転写産物(タンパク質)の影響の3つ考えられる可能性の内のどれであるかを明らかにするために、プラスミドpUCベクター上のlacプロモーターの位置を逆にしたものを構築した。その時にslow down活性を示すDNA断片の向きを本来のものと比較することにより、この活性の原因は、(C)のクローンDNA上からの転写産物の過剰生産によることが明らかになった。同定された2種類のDNA断片の内の1つは、既にDNAの塩基配列が報告されており、そのDNA断片上に3つのORF(ORF1,2,3)をコードしている。そこで各ORFの欠失変異体をPCR方により作製し、それぞれのslow down活性を調べたところ、分子量108kDという大きなタンパク質をコードしていると思われるORF1を欠失した時にのみ、slow down活性は消失した。また、ORF2とORF3の両方を欠失させORF1のみを持たしたものはslow down活性を示した。これらのことより、ORF1によりコードされているタンパク質が、何らかの形でslow down活性に関与していることが明らかになった。同様な実験をもう一つのDNA断片にも適用するため、現在このDNA断片の塩基配列を決定しているところである。
E2A-HLFキメラ転写因子の標的遺伝子の同定とその機能

t(17;19)(q22;p13)転座を有するPro-B細胞性急性白血病(t(17;19)^+ALL)は小児ALLの約0.5%に生じる稀なALLである。t(17;19)によりE2A-HLF融合転写因子を生じ、初発時より高カルシュウム血症や出血の合併症を生じる予後不良のALLである。E2A-HLF融合転写因子はIL-3依存性マウスリンパ球においてIL-3を除去しアポトーシスを誘導してもアポトーシスを阻止できることは報告されている。今回の研究で急性前骨髄性白血病(APL)の線溶異常症の原因遺伝子の一つとして同定された、カルシュウム依存性に細胞膜リン脂質結合蛋白annexin IIがt(17;19)^+ALLにも関与していることを証明した。Annexin IIはAPL細胞とt(17;19)^+ALLの4種の細胞株で高発現していたおり、さらにt(17;19)^-ALL細胞株にE2A-HLF強制発現するとannexin IIの発現を誘導できた。IL-3依存性細胞においてannexin IIはIL-3依存性に発現していた。その発現はRasシグナルパスウエー特にRas/phosphatidylinositol3-kinaseを介していることを証明した。更にIL-3非存在下でもE2A-HLFはannexin IIの発現を増加させていた。これらの結果はE2A-HLFがサイトカインが活性化するRasシグナルパスウエーを代償する事によりannexin IIが誘導されることを示している。これらの結果はannexin IIがE2A-HLFの下流遺伝子であることを示している。しかし、annexin IIの細胞表面の発現は4つのt(17;19)^+ALL細胞株で一定ではないことやこれらの細胞株を樹立した患者の初発時の臨床症状より、t(17;19)^+ALL細胞株の線溶異常症の原因遺伝子というより白血病浸潤や高カルシュウム血症との関連があるのではないかと示唆された。2.ANNEXIN IIのクローニングを実施した。ANNEXIN IIの全長のクロニーングをPCR法を用いて実施し、得られたクローンのシークエンスを確認した。更にpMTCB6という発現ベクターに組み込んだ。3.ANNEXIN IIはRasシグナルパスエーのPI3Kを介して発現調節されている。IL-3依存性mouse proB細胞(FL5.16 cell, Baf 3 cell)においてIL-3を除去するとアポトーシス前にANNEXIN IIの発現が低下消失することを見いだした。そこでBaf-3の各種Ras変異株を用いてノーザン法あるいはイムノブロット法を用いてRasの下流のいずれのパスエーを介してANNEXIN IIが発現調節されているかを検討した。4. ANNEXIN IIの細胞局在の検討。良い抗体が得られず実施できていない。来年度に検討する。17;19転座急性リンパ性白血病((17;19)白血病)は、E2A-HLFキメラ転写因子が発現を誘導している標的遺伝子により凝固線溶異常が生じているという仮説をもとに研究計画をたて、ANNEXIN IIを候補遺伝子として解析を実施した。ANNEXIN IIはプラスミノーゲンと組織プラスミノーゲンアクチベーターのレセプターで急性前骨髄性白血に合併する線溶異常症の原因であることが証明されている遺伝子である。

前年度までにANNEXIN IIはE2A-HILFの標的遺伝子であること証明し、さらにANNEXIN IIはRasシグナル伝達経路を介して発現調節されていることを証明した。この結果をふまえて本年度は以下の実験を行い結果が得られている。1.ANNEXIN IIの細胞局在の検討ANNEXIN IIが凝固線溶に関与するためには細胞表面に発現していなければならない。細胞表面の発現量の検討を行った。ANNEXIN IIはカルシュウム依存性に細胞表に発現している。この特徴を利用して、カルシュウム非存在下で遊離した培養液中のANNEXIN IIをイムノブロット法で検索した。17;19白血病は他のリンパ性白血病に比べて細胞表面のANNEXIN IIの発現量は多かったが、17;19白血病すべての細胞株で確認されなかった。E2A-HLFキメラ転写因子の構造には2種類のタイプがあり、このタイプにより細胞表面の発現量が異なる可能性が示唆された。また、細胞株が樹立された症例の初発症状の検討からANNEXIN IIは17;19白血病のもう一つの特徴である高カルシュウム血症との関与が示唆された。2.ANNEXIN IIの機能解析E2A-HLFキメラ転写因子の発現により高アポトーシス機能を有することは証明されている。標的遺伝子のANNEXIN IIがその機能があるか検索した。ANNEXIN IIを過剰発現するIL-3依存性マウスB細胞作成し、実験を行った。しかし、ANNEXIN IIにはE2A-HLF過剰発現したときに得られたようなIL-3機能を代償する抗アポトーシス機能は有していなかった。3.抗アポトーシス機能を有する候補遺伝子のクローニングPCRを用いてクローニングを行ったが、標的遺伝子であるかどうかは今後検討していきたい。
一般応力経路における未固結地盤材料の粘性の実験的研究とモデル化

構造物の死荷重による地盤のクリープ変形を精度良く予測するためには、応力ひずみ関係に対するひずみ速度の影響・クリープ変形・応力緩和等を引き起こす地盤材料の材料粘性の正確な理解とその適切な数学的モデル化が必要となる。今日までの地盤材料の材料粘性の研究では角張った粒子を対象としていたが、自然界では河床礫等の丸みを帯びた粒子もある。本研究では、未固結地盤材料である多種の自然砂質土と人工粒状体(酸化アルミニウム)の材料粘性特性を、定圧一面せん断試験により調べた。自然砂質土では、日本・アメリカ・イギリス・フランスなどの標準砂として用いられている貧配合のシリカ系砂質土を用いた。これらの砂質土はいずれも貧配合であり粒度分布に大差はないが、粒子形状が角張っているものと、比較的球形のものとに大別される。また、人工粒状体である酸化アルミニウムの粒径形状は球形である。検討の結果、同様の粒径分布・粒子径であっても、粒子が球形に近くなると、角張った粒子の粒状体よりもクリープ変形量は小さくなった。さらに、貧配合で角張った粒子形状の砂礫ではひずみ速度急増直後に一時的に応力は増加し、ひずみの増加とともに減衰して元の応力ひずみ曲線に復帰するという載荷速度依存性がある。一方、球形の粒子形状を持つ粒状体ではひずみ速度急増時に応力は急増するが、ひずみの増加に従って大きな減衰を示し、早い載荷速度になるほど応力は低下するという特徴的な挙動を示した。これらの実験結果から、上記の粒子形状に依存した強度変形特性の載荷速度依存性やクリープ変形特性をシミュレーションする数学モデルを構築した。
非コードDNAによる染色体複製制御機構の解明

【1】テロメア因子による複製開始タイミングと核内局在制御機構の解明分裂酵母を用いて複製タイミング制御と核内局在の関連を明らかにするため、テロメア因子Taz1, Rif1に制御される後期複製開始点3個所と初期開始点2個所の近傍にlac0リピートを組み込み、発現させたLacI-GFPのシグナルを高解像度顕微鏡で解析した。核膜とテロメアとの相対位置をそれぞれIsh1-mCherryとTaz1-mCherryで検出し、統計的解析を行った。後期開始点は細胞周期を通じて核膜内縁に局在したのに対し、初期開始点は核内のランダムな局在を示した。さらにG1-S期にテロメアに隣接を示し、染色体の同じ腕部にある後期開始点同士の隣接が検出された。これらの後期開始点特異的局在は、複製タイミング制御に必要な「開始点に隣接するテロメア様配列」と、Taz1, Rif1に依存し、時間的空間的制御がともにテロメア因子により制御されることが示唆された。【2】シュゴシンタンパク質による複製開始制御機構の解明Shugoshin 2 (Sgo2)が広範囲のサブテロメア領域での複製開始制御に関与することを発見し、本領域研究の計画班員である加納純子氏らと共同研究を行った結果、Sgo2がNobと名付けられた凝集クロマチン構造形成を通じて、DNA複製のみならず遺伝子の転写を抑制することが明らかとなり、それらの結果をNature Communications (2016)に発表した。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.染色体の特定の部位の複製タイミングをS期後期まで遅らせる制御には、染色体腕部複製開始点近傍にあるテロメア配列が関与する。このしくみの解明と染色体全域での複製制御の普遍的理解に向けて、以下の研究成果をあげた。(1)テロメア配列に結合するTaz1とともに制御に重要な働きをするRif1の機能解析を行い、N末端にあるProtein phosphatase 1 (PP1)結合モチーフが染色体全域での制御に必要であること、いっぽう高度に保存されたC末端50アミノ酸がRif1のテロメア局在に必要であり、Taz1依存的開始点の制御に必要である。(2)Taz1, Rif1依存的な腕部後期開始点がG1期特異的に核膜近傍のテロメアに隣接し、この局在にはTaz1, Rif1,テロメア配列が必要であり、いっぽう初期複製開始点はこのような局在がみられないことを示した(論文準備中)。2.Shugoshin 2 (Sgo2)がサブテロメア領域の複製タイミング制御に関与するしくみの解明を加納純子氏との共同研究で実施し、Sgo2が複製開始ステップでのDDK (Dbf4依存キナーゼ)活性化によって促進されるSld3の開始点への結合段階を抑制することを見いだした(論文投稿中)。Sgo2とSld3を繋ぐしくみについては、Sgo2と相互作用するオーロラキナーゼ(Ark1)について検討中である。複製タイミング制御機構に、腕部複製開始点の核内での局在とりわけテロメアへの隣接が必要であることを見いだした点は大きな成果である。またSgo2による複製タイミング制御に関して加納氏と共同研究を行った成果を投稿中である。上記の成果をより速やかに発表論文にする必要がある。以下の研究計画尾実施し、テロメア配列とテロメア因子による複製タイミング制御のしくみを解明する。(1)Rif1のC末端領域はTaz1との結合に関与しないにもかかわらずRif1のテロメアへの局在に必要である。この領域はRif1-Rif1相互作用に必要であるとの結果を得ており、複合体形成がRif1局在や複製制御に関与するかを明らかにする。(2)腕部後期開始点がG1期にテロメアに隣接する反応にRif1とPP1の結合モチーフが必要である。
スキー動作分析のための広範囲動作計測システムの構築

慣性センサ(加速度・角速度・地磁気センサを組み合わせたセンサ)を用いた新たな動作計測システムが近年開発され、普及してきている。本システムは広範囲動作計測を可能にする一方、遠心力環境下や地磁気が乱れている環境下では使用できない短所をもつ。スキーは、この様な環境におかれるため、計測できない。そこで、スキーの動作計測が可能な広範囲動作計測システムを構築することを目的として研究を実施した。本研究ではジャイロセンサのみの計測システムを開発し、遠心力や磁場の乱れに影響されないシステムを構築した。本手法はスキーのみならず動作計測の幅を拡げるものであり、スポーツ研究の発展に寄与するものである。スキー滑走中の動きを計測するシステムを構築することを目的として研究を進めている。システムは複数個の慣性センサおよびGPSから構成されるものである。申請時の実験計画(3年間)では、1年目(昨年度)は1個の慣性センサを用いた基本アルゴリズムの構築、2年目(今年度)は複数個のセンサを用いた統合的なアルゴリズムの構築およびGPS+慣性センサによる高精度な位置同定アルゴリズムの構築、3年目(来年度)は雪上テストを実施することになっている。初年度は基本アルゴリズムの構築において、計画からの変更が生じたものの、最終的に予定通り進行した。ただし、基本アルゴリズムの変更に伴い、複数個のセンサを用いるアルゴリズムも計画時に予定していたものから変更することとなり、追加の実験が必要となった。今年度はその実験を行った後(約半年)、当初計画の統合的なアルゴリズムの構築(約2か月)を行った。それらの実験については順調に進行した。一方、今年度予定していた2つの課題の内の1つであるGPSに関する実験については当初使用予定の機器の発売が遅れたため、計画が遅れている状況である。ただし、遅れは数か月程度であること、雪上テストを行う来年度の冬まではまだ8か月以上あることから、遅れは十分に取り戻せる範囲である。2年目を終了した現時点において、実験室内における各種動作中の姿勢の計測は可能となった(25年度のシステム制御情報学会にて発表予定)。特に、現在発売されている慣性センサを用いたモーションキャプチャシステムでは計測ができない環境(遠心力がかかる環境)での測定も問題なく測定できているという点で最も大きな課題が解決されたと言える。アルペンスキーの滑走動作計測のためのシステムを構築することを目的として研究を進めている。申請時の実験計画(3年間、注:延長申請許可のため4年間)では、1年目は1個の慣性センサを用いた基本アルゴリズムの構築、2年目は複数個のセンサを用いた統合的なアルゴリズムの構築およびGPS+慣性センサによる高精度な位置同定アルゴリズムの構築、3年目(今年度)は雪上テストを実施する予定であった。全体計画において途中、予定や計画内容に変更が生じたものの、最終的にはアルペンスキーの滑走動作を計測可能なシステムを構築できた。ただし、同時に今年度の雪上実験を通して、システムの使い勝手の面で課題が見えた。来期のスキーシーズン以降に本システムを用いて本格的なスキー実験を実施することを考えた場合、今期のスキーシーズンも有効に活用し、早急にシステムの完成度を上げておくべきであると考えられた。そこで延長申請を行い、4月以降にも引き続き雪上実験を実施した。その結果、ハードウェアの微調整、ソフトウェアのインターフェースの改善等の成果も得られた。本システムでは、実験室外における計測にも関わらず、準備・測定ともに1人で実施可能である。また、実験の準備時間は屋内において1時間半、雪上において10分ほどであり、使いやすいシステムとなった。本研究の目的は、スキー動作の力学メカニズム解明のために必要となる広範囲動作計測システムの構築である。動作計測はカメラを用いて行われることが一般的であるが、カメラでは原理的に広範囲の計測が難しいことから、本研究では慣性センサーに着目して計測システムを開発している。従来の慣性センサーを用いた計測システムでは、遠心力が考慮されていなかったため、スキーのような遠心力が働く条件下での測定ができないという問題があった。本研究では、遠心力への対処がキーポイントとなる。23年度の主要研究テーマは、遠心力を考慮した計測アルゴリズムの実機テストであった。研究計画は、(1)使用する慣性センサーの選定・購入、(2)センサーと解析用ソフトウェア(MATLAB)との通信テスト、(3)遠心力を考慮したカルマンフィルターのアルゴリズム作成(センサー数:1個)、(4)プログラムコード(MATLAB)の作成、(5)アルゴリズムのテスト(実験室内にて屋外環境を模擬して実験)、(光学式動作計測システムを用いて仮想的にGPSデータを作成して模擬実験)、(6)アルゴリズムの修正・調整等であった。

概ね予定通りに進んでいるが、遠心力への対応としてGPSを用いた方法だけでは、センサー数が複数になった場合に精度の面で十分な水準に達しないことも予想される結果が一部得られていることから、2012年4月現在、センサー数が複数の場合であっても精度を落とさないための追加のアルゴリズムを考案し、テストを繰り返している。具体的には、外乱ノイズの多い地磁気データに頼らないアルゴリズムを考案したこと、および、各センサーの基本処理アルゴリズムの見直しを実施したことである。これまでの結果、例えば、基本処理アルゴリズムの見直しだけであっても、測定能力が大きく向上することが明らかとなった(ジャイロデータの積分誤差が半分以下)。申請時の実験計画(3年間、注:延長申請許可のため4年間)では、1年目は1個の慣性センサを用いた基本アルゴリズムの構築、2年目は複数個のセンサを用いた統合的なアルゴリズムの構築およびGPS+慣性センサによる高精度な位置同定アルゴリズムの構築、3年目(今年度)は雪上テストを実施する予定であった。全体計画において途中、予定や計画内容に変更が生じたものの、最終的にはアルペンスキーの滑走動作を計測可能なシステムを構築できた。平成25年度(3年目)の後半から平成26年度(4年目)には雪上テストを20回程度実施し、システム全体の改善(ハードウェアの微調整、ソフトウェアのインターフェースの改善)をおこなった。さらに、本システムは実験室外における計測にも関わらず、準備・測定ともに1人で実施可能である点が特筆すべき点である。また、実験の準備時間は屋内において1時間半、雪上において10分ほどであり、使いやすいシステムとなった。バイオメカニクス今年度は次の2つの課題を予定していた。1複数個のセンサを用いた統合的なアルゴリズムの構築、2GPS+慣性センサによる高精度な位置同定アルゴリズムの構築。GPSの発売遅延が影響し、2を実施できなかった。そのことから“やや遅れている"という自己評価を行った。ただし、2に比較し、1の方が時間を要する課題であることや、次年度の主な実験が来年の冬となることから、夏の間に十分に遅れを挽回できるものと考えている。予定通り、雪上実験を実施してアルペンスキーの滑走動作が測定できたため、おおむね順調という自己評価を行った。一方、本質的ではないもののシステムの今後活用面では重要となるシステムの使い勝手やシステム全体の作り込みの点では課題が見えた。その様な状況の中、今期のスキーシーズンがまだ残っていたため、急遽延長申請を行い、課題に取り組むこととし、ハードウェアの微調整、ソフトウェアのインターフェースの改善を実施した。本研究の目的は、慣性センサーを用いた、スキー動作の力学メカニズム解明のために必要となる広範囲動作計測システムの構築である。23年度の予定は、慣性センサー1個を用いて、基本的なテストを行うことであった。基本テストは当初の予定通り進んだ。一方、センサーが複数になった場合に精度が低下することが予想される結果が得られ、その対処が必要であることも明らかとなった。
光応答性高分子液晶と周期性多孔体の複合化による光応答性構造色材料の開発

ポリスチレン微粒子/シリカ微粒子の自己組織化により作製したシリカ周期性多孔体(逆オパール膜)にアゾベンゼン分子側鎖を有する高分子液晶を充填し、シリカ逆オパール膜と光応答性高分子液晶からなる複合体フィルムを作製した。このフィルムは、周期長および屈折率に応じた擬似的なフォトニックバンドギャップ形成に基づき、ある特定の波長の光を反射する性質を示した。平成19年度は、この複合体フィルムに偏光照射することで20nmから25nm程度の反射光の光変化を誘起することに成功し、このスイッチング状態がメモリー性を有していることを見出した。平成20年度は、波長変化を大きくすることを目的に、大きな複屈折率を示すことが知られている、トラン基をアゾベンゼン分子と共重合することで、30nm以上の反射光変化を誘起することに成功した。1、高複屈折性光応答性高分子液晶を複合化した光応答性構造色材料の開発シリカからなる周期性多孔体にアゾベンゼン誘導体を側鎖に有する側鎖型光応答性高分子液晶を複合化し、この複合体に、アルゴンイオンレーザー光(488nm)の偏光を照射することで、高分子液晶の光配向変化に伴う複屈折率変化を誘起し、構造色の反射波長を変化させることに成功した。反射波長の変化は、配向構造の分子長軸方向および短軸方向の屈折率の違いに起因することを明らかにした。分子内に3重結合を有するトラン誘導体を共重合した光応答性高分子液晶を用いることで、メモリー性、可逆性を有し、50nmの波長変化を示す光応答性構造色材料を得た。光応答生高分子液晶の主鎖がアクリレートのものよりもメタクリレートの方が、応答性が優れていることが分かった。また、主鎖と側鎖間のメチレンスペーサーも光応答性に大きく影響を与えることが明らかとなった。2、柔軟性光応答性高分子液晶の複合化による光応答性構造色材料の開発光応答性ポリシロキサン高分子液晶をシリカからなる周期性多孔体に複合化し、その光応答性について検討した。アクリレート系光応答性高分子液晶と同等の光応答性を示したが、高温においてスイッチングした状態の安定性が低かった。3、高分子からなる周期性多孔体と光応答性高分子液晶の複合化による光構造色材料の開発高分子からなる周期性多孔体を作製し、光応答性高分子液晶との複合体も光応答性があり、光応答性において、高分子の屈折率が大きく影響を及ぼすことが明らかとなった。ポリスチレン微粒子/シリカ微粒子の自己組織化により作製したシリカ周期性多孔体(逆オパール膜),にアゾベンゼン分子測鎖を有する高分子液晶を充填し、シリカ逆オパール膜と光応答性高分子液晶からなる複合体フィルムを作製した。このフィルムは、周期長および屈折率に応じた擬似的なフォトニックバンドギャップ形成に基づき、ある特定の波長の光を反射する性質を示し、平成19年度は、この複合体フィルムに偏光照射することで、600nmから630nmへの反射光の光変化を誘起することに成功し、このスイッチング状態がメモリー性を有していることを見出した。平成20年度は、波長変化を大きくすることを目的に、大きな複屈折率を示すことが知られている、トラン基をアゾベンゼン分子と共重合することで、約70nmの反射光変化を誘起できることが分かった。さらに、作製が容易であり、より大きな反射光波長変化を示す構造色材料を開発することを目的に、アゾベンゼン高分子とポリビニルアルコール(PVA)を交互に塗布した多層膜構造色材料を作製し、アゾベンゼン高分子の光異性化に伴う反射光波長変化について検討した。ある種のアゾベンゼン高分子は、多層膜中で、PVA膜面に対してアゾベンゼン分子が垂直配向することをみいだした。垂直配向は、光異性化によりランダム状態になり、この垂直配向とランダム状態を光異性化で制御することで、反射光有⇔無のスイッチングが可能であることを見出した。
悪性黒色腫の転移・浸潤に関するマスター遺伝子の解析

動物胚の発生過程において形態情報を位置情報に変換する遺伝子はホメオボックス(HOX)遺伝子と呼ばる。これまでの報告で、肺癌細胞などにおいてHOXD3遺伝子の強制発現が細胞接着や運動性を増強させることが示唆された。そこで我々は、HOXD3を発現しているヒト悪性黒色腫細胞株A375MにHOXD3アンチセンス発現ベクターを導入し、細胞の運動・浸潤性の変化および運動・浸潤性に関与する遺伝子の発現変化について解析した。親株、コントロール株と、HOXD3アンチセンス発現ベクター導入株につき運動能・浸潤能を測定したところ、HOXD3アンチセンス導入株では、運動能・浸潤能が有意に低下していることが確認できた。さらにこの2群間において、cDNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、細胞骨格関連蛋白であるcdc42 interacting protein 4 (CIP4)、CIP4とホモロジーの高いKIAA0554、トロポミオシン2(TPM2)の発現が、HOXD3アンチセンス導入よって増強していた。TPM2やCIP4の異常発現は、アクトミオシン系の再構成システムに異常をきたし、その結果、細胞伸展・運動性の低下を引き起こすと考えられる。以上の結果より、HOXD3遺伝子はヒト悪性黒色腫細胞の浸潤・運動性を制御するマスター調節遺伝子として働いている可能性が示唆された。また最近、癌組織ではHOX遺伝子群の発現パターンが正常組織のそれと異なることが報告されている。そこで我々は、悪性黒色腫においてHOX3 9全遺伝子の発現を、定量し解析した場合、その発現パターンは原発巣と転移巣では違い、さらに各転移臓器において臓器特異性の発現パターンがある可能性を考えた。今回、ヒト悪性黒色腫のヌードマウス移植転移モデルを作成し、Real-Time PCR法を用いてHOX3 9全遺伝子の発現パターンを解析したところ、興味深い結果を得た。動物胚の発生過程において形態情報を位置情報に変換する遺伝子はホメオボックス(HOX)遺伝子と呼ばれ、形態形成のプログラムを実行に移すマスター調節遺伝子と考えられてきた。これまでの報告により、HOXD3遺伝子の強制発現が細胞接着や運動性を増強させることからHOXD3が転移・浸潤関連分子の転写を調節している可能性が示唆される。そこで、HOXD3を発現しているヒト悪性黒色腫細胞株A375MにHOXD3アンチセンス発現ベクターを導入し、細胞の運動・浸潤性の変化および運動・浸潤性に関与する遺伝子の発現変化について解析した。内皮下基底膜への浸潤モデルであるマトリゲルへの浸潤性は、対照細胞クローンおよび親株に比べ、HOXD3アンチセンス発現クローンにおいて有意に低かった。細胞外マトリクス成分であるビトロネクチンおよびラミニン-1に対する接触走化性、ならびにファゴカイネティック・トラック・アッセイで測定された細胞運動性もまた、HOXD3アンチセンスを発現させることによって有意な低下が認められた。また、マトリゲルおよびラミニン-1上に細胞を播種した場合、HOXD3アンチセンス発現株は細胞伸展を示すものが少なかった。HOXD3アンチセンス発現クローンと対照クローン間におけるmRNAの発現パターンを比較するためcDNAマイクロアレイ解析を行った。その結果、細胞骨格関連蛋白であるcdc42 interacting protein4(CIP4)、CIP4とホモロジーの高いKIAA0554およびtropomyosin2(TPM2)の発現が、HOXD3アンチセンスを発現させることによって増強することが明らかとなった。TPM2やCIP4の異常発現は、アクトミオシン系の再構成システムに異常をきたし、その結果、細胞伸展や細胞運動の低下を引き起こしていると考えられる。

以上の結果より、ホメオボックス遺伝子HOXD3は、浸潤・運動性を制御するマスター調節遺伝子として働いている可能性が示唆された。動物胚の発生過程において形態情報を位置情報に変換する遺伝子はホメオボックス(HOX)遺伝子と呼ばる。これまでの報告により、肺癌細胞などにおいてHOXD3遺伝子の強制発現が細胞接着や運動性を増強させることが示唆された。そこで、HOXD3を発現しているヒト悪性黒色腫細胞株A375MにHOXD3アンチセンス発現ベクターを導入し、細胞の運動・浸潤性の変化および運動・浸潤性に関与する遺伝子の発現変化について解析した。内皮下基底膜への浸潤モデルであるマトリゲルへの浸潤性、細胞外マトリクス成分であるビトロネクチンおよびラミニン-1に対する接触走化性、ならびにファゴカイネティック・トラック・アッセイにおいて、対照細胞クローンおよび親株と比べ、HOXD3アンチセンス発現クローンにおいて有意な低下を認めた。ラミニンをリガンドとする接着因子である、インテグリンα1,2,3,6鎖β1,3,4鎖αvβ5鎖の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果、各クローン間に有意差を認めなかった。従って、細胞進展・運動性の低下はラミニンに対する接着因子の発現変化によるものではないと考えられる。HOXD3アンチセンス発現クローンと対照クローン間におけるmRNAの発現パターンを比較するためcDNAマィクロアレイ解析を行った。その結果、細胞骨格関連蛋白であるcdc42interacting protein 4(CIP4)、CIP4とホモロジーの高いKIAA0554、tropomyosin2 (TPM2)の発現が、HOXD3アンチセンス導入よって増強していた。TPM2やCIP4の異常発現は、アクトミオシン系の再構成システムに異常をきたし、その結果、細胞伸展・運動性の低下を引き起こすと考えられる。以上の結果より、HOXD3遺伝子はヒト悪性黒色腫細胞の浸潤・運動性を制御するマスター調節遺伝子として働いている可能性が示唆された。最近、HOX遺伝子39個の発現は,胚発生過程で発現されるだけでなく,成体においても組織・臓器に特徴的な発現パターンを示すことが明らかになってきた。また、癌組織ではHOX遺伝子群の発現パターンが正常組織のそれと異なることが報告され,HOX39遺伝子の発現パターンの変化と組織構築の乱れや発癌・転移・浸潤と結び付けて考えることが可能になってきた。さらに、HOX遺伝子は単一の発現だけでなく、同一パラログなど複数の遺伝子が絡み合った状態で発現し、下位の形態形成を進めることが知られている。
バイオリアクタ-による新しい食品素材としてのイソマルト-スの新製造法

(1)Arthrobacter globiformisの培養とそのイソマルトデキストラナ-ゼの分離、精製法の改良を行い大量製製法を確立した。(2)本酵素は、デキストランに対してエキソ型に作用してイソマルト-スのみを生成する(αー1,6ー結合の切断)が、プルランに対してはエンド型に作用してイソパノ-スを生成する(αー1,4ー結合の切断)ことを明らかにした。(3)本酵素によるαー1,6ーおよびαー1,4ーグルコシド結合の分解作用が同一の活性部位でなされるか否かを反応速度的解析を行った。その結果、単一の活性部位によって両結合の分解が触媒されることが明かとなった。(4)本製造法によるイソマルト-スの製造に際しては、デキストランの種類により必要な酸処理の条件を検討したが、各種デキストランに対し0.2N塩酸、95°C、4時間の処理が適当であることを認めた。(5)本製造法によるイソマルト-スの大量製造に際しては、安価なデキストランを使用することが望ましいが、デキストランの種類により従来の研究で明らかになったデキストランの処理条件が異なると考えられるので、それらの条件を各種のデキストランについて検討した。その結果、デキストランT2000に関して従来得られた条件(0.2N塩酸、95°C、4時間処理)が他のデキストランにも適用でき、この条件が各種デキストランのαー1,6ーグルコシド結合以外のαー1,2ー、αー1,3ー、およびαー1,4,グルコシド結合の切断に最も適していることを確認した。この条件下で処理後、イソマルトデキストラナ-ゼの反応よりデキストランの分解率は90%以上となり、イソマルト-スの収率は70%以上となった。1.Arthrobacter globiformisの培養とそのイソマルトデキストラナ-ゼの分離、精製法の改良を行い大量製製法を確立した。2.本酵素は、デキストランに対してエキソ型に作用してイソマルト-スのみを生成する(αー1,6ー結合の切断)が、プルランに対してはエンド型に作用してイソパノ-スを生成する(αー1,4ー結合の切断)ことを明らかにした。3.本酵素によるαー1,6ーおよびαー1,4グルコシド結合の分解作用が同一の活性部位でなされるか否かを反応速度論的解析を行った。4.重合度の異なる一連のイソマルトオリゴ糖の分解に関する反応速度パラメ-タ-を測定し、サブサイト理論により本酵素活性部位のサブサイト親和力を評価した。そのサブサイトの数は5と推定され、本酵素に最も類似した作用機さを示すβーamylaseのサブサイト親和力とは著しく異なっていることが観察された。5.本製造法によるイソマルト-スの製造に際しては、デキストランの種類により必要な酸処理の条件を検討したが、各種デキストランに対し0.2N塩酸、95°C、4時間の処理が適当であることを認めた。6.主として限外濾過膜内での製造を検討した。生成されたイソマルト-スに少量混入してくる副成物のグルコ-スやイソマルトトリオ-スの効率的な除去法、分離法について主に検討し、それらの方法をほぼ確立できた。1.Arthrobacter globiformisを培養し、菌体外に分泌されるイソマルトデキストラナ-ゼを大量に精製した。精製酵素はデイスク電気泳動的に均一性を示した(分子量、約69,000).プロテインシ-

クエンサ-によるNー末端アミノ酸配列を調べた結果、その配列はValーProーThrーAla.........C末端に決定された。しかし、Nー末端にさらに1固のProが結合したタンパク質、即ち、ProーValーProーValーThrーAla.........C末端の配列をもつ同一の酵素タンパク質が2530%の割合で含まれることが示唆された。2.ダイアフロ-セル(PM10)内で連続的に酵素反応を行わせ、生成物のイソマルト-スを限外濾過膜を用いてとり出すことによりイソマルト-スを製造した。3.デキストランは通常αー1,6ー結合以外に本酵素によって分解できないαー1,2ー、α1,3ー、αー1,4ー結合の分岐構造をもつため、各種のデキストランを本酵素により加水分解してもイソマルト-スの収量は3040%である。これらの分岐糖はαー1,6ー結合により酸に対し不安定であるため予め酸により部分水解することによりイソマルト-スの収率を高めることを検討した。その結果、0.2N塩酸、95°C、4時間の処理したデキストランT2000を用いたとき、酵素反応による推定分解率は90%以上となり、イソマルソ-スの収率は70%以上となった。4.限外濾過膜を通して得られた反応液を活性炭ーセライトカラムクロマトグラフイ-およびBioーGel P2のゲル濾過にかけ少量混入している副成物のグルコ-スやイソマルトトリオ-スを効率的に除去することができた。5.酵素はダイアフロ-セル内において、37°C、5日間連続して使用しても活性の低下は認められなかった。(1)最終年度に当たるため、従来の研究成果の再検討を含めたとりまとめを行なった。(2)バイオリアクタ-としてイソマルトデキストラナ-ゼの固定化による限外濾過膜内でのイソマルト-スの製造法を検討するため、種々の方法により本酵素の固定化を試みたが、イソマルト-スの大量製造に適した簡便で安価かつ本酵素を直接使用したときよりも安定性の高い固定化法を開発することができなかった。今後さらに検討を要する課題と考えられる。(3)本製造法によるイソマルト-スの大量製造に際しては、安価なデキストランを使用することが望ましいが、デキストランの種類により従来の研究で明らかになったデキストランの処理条件が異なると考えられるので、それらの条件を各種のデキストランについて検討した。その結果、デキストランT2000に関して従来得られた条件(0.2N塩酸、95°C、4時間処理)が他のデキストランにも適用でき、この条件が各種デキストランのα-1,6-グルコシド結合以外のα-1,2-、α-1,3-およびα-1,4-グルコシド結合の切断に最も適していることを確認した。この条件下で処理後、イソマルトデキストラナ-ゼの反応よりデキストランの分解率は90%以上となり、イソマルト-スの収率は70%以上となった。(4)イソマルトデキストラナ-ゼの酵素化学的性質に関する最終的検討の一つとして、基質アナログ(マルト-ス)を用いた阻害実験を行ない阻害物質定数(Ki)を測定した。本酵素とマルト-スの相互作用により、特徴的なUV吸収スペクトル(差スペクトル)が観察された。マルト-スの濃度をTrp残基に起因する293nm付近の分子吸収係数から算出したKi値は0.09mMとなり、速度論的方法により求めたKi値(0.95mM)とよく一致した。
赤土微粒子に対するフロック形成操作のための最適な攪拌条件の定量的評価

赤土対策の沈砂池には浄水場の浄水システムの固液沈降分離プロセスに組み込まれているフロック形成操作がない。浄水システムの固液沈降分離プロセスにおける懸濁粒子の除去効果がフロック形成の成否に依存することからすると、沈砂池の赤土微粒子の除去効果が現れないのはフロック形成操作を省いているためであるといえる。農地や自然の水循環系に組み込む沈砂池の場合、凝集剤なしで攪拌のみによるフロック形成が必要とされる。そこで本研究では、様々な攪拌操作を試行錯誤的に実験し、速やかに沈降するフロックを形成させる攪拌を見つけ出す。さらに、その最適な攪拌が生成する流れ場を解析し、攪拌の水理を記述する。
機能強化型間葉系間質細胞を用いた細胞移植治療法開発の基盤研究

間葉系間質細胞(Multipotent mesenchymal stromal cells:MSCs)は「免疫制御能」と「多分化能」を有し、細胞性医薬品としての応用が注目されている。本課題では、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)に対するMSCs移植治療の可能性を検討した。まず、抗炎症性サイトカインIL-10を欠損することで慢性炎症を伴うDMDマウスを樹立し、炎症反応によって助長される筋組織傷害および機能障害を明らかにした。また、モデル動物を用いてMSCsの全身投与方法を確立し、安全性と有効性を確認した。今後さらに治療効果を明確にすることで、MSCsの応用が期待された。本研究課題では、間葉系間質細胞(Multipotent mesenchymal stromal cells:MSCs)は「免疫抑制能」と「多分化能」を有し、細胞性医薬品として臨床応用が注目されている。これまでに、研究代表者らは筋分化誘導操作を行ったMSCsを用いて、筋ジストロフィー犬への移植条件の確立に成功している(Kasahara et al., 2012)。しかし、治療効果を得るためには、炎症の鎮静化が必要だと考えた。そこで本課題ではまず、抗炎症性サイトカインIL-10を欠損することにより慢性炎症を伴うことが予想される筋ジストロフィーマウス(IL-10-/-/mdx)系統を樹立して、炎症反応によって助長される筋組織傷害および機能障害を明確にすることを目的とした。その上で、抗炎症作用を示すMSCsを作製し、炎症制御療法の可能性を検討する。IL-10-/-/mdxはmdxと比べて筋組織中の炎症性M1マクロファージの浸潤が増強し、炎症セイサイトカイン・ケモカインIL-1α, IL-1β, RANTES, M-CSF, MIG, IL-6の発現が増加していた。横隔膜は病理学的解析においてはmdxと同等の強い線維化を認めたが、心筋においては、より進行した線維化や拡張型心筋症の病理所見を認めた。さらに呼吸循環機能解析において、IL-10-/-/mdxは安静時期の換気量や左室内径短縮率(%FS)が低下していた。IL-10を欠損することで、mdxマウスの筋組織障害や呼吸循環機能障害が重症化したことから、炎症がDMDの病態を重篤化する重要な要因であることが示唆された。以上の結果より、今後IL-10の抗炎症効果を応用した新たな治療技術の開発が期待された。IL-10発現による機能強化型MSCsの高効率な移植条件の検討と治療効果の評価IL-10は炎症性サイトカインの産生を抑制する一方、抗アポトーシス効果を示すことから、骨髄間葉系幹細胞(MSCs)の移植時にIL-10を利用することで、MSCsの生存率を上げるとともに、病態組織での炎症制御が予測され、結果として生着率の向上が期待できる。そこで、移植時に局所的IL-10の高発現を利用し、移植効率への影響を検討した。マウス下腿に移植する際、リコンビナントIL-10の反復局所投与を行った場合、短期的な生存効率の上昇をすでに確認しているため、長期発現が可能で安全性の高いアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いてIL-10遺伝子を導入したMSCsについて検討した。In vivoイメージング解析の結果、IL-10発現による生存率および生着効率の向上が認められた。なお、血中濃度の増加は軽微であり、組織においてのみIL-10発現の増加を確認した。そこで次の段階として、筋ジストロフィーモデルmdxマウスにおける移植実験を予定しており、全身投与後の病態評価に向けて、呼吸機能、自発行動量、運動量測定における測定条件を確立し、評価項目の設定を行った。また、次年度予定しているイヌを用いた移植実験においても、拡大培養を開始し、局所移植においてIL-10発現MSCsの炎症を有する筋組織に長期間生着することが確認できた。年次計画において、マウスへの骨髄間質細胞(MSCs)およびIL-10発現MSCsを用いた筋組織内における移植効率の比較検討を予定していたが、おおむね計画とおりに実施できており、マウスにおける検討結果を示す事が出来た。ただし施設の異動に伴い、モデルマウスの個体復元を行うなかで繁殖維持が予定より遅れているため、全身投与や病態評価においては、次年度に実施する予定とする。骨髄間質細胞(Multipotent mesenchymal stromal cells, MSCs)は、「免疫制御能」を利用した細胞性医薬品として既に臨床へ応用されている。また、MSCsは「多分化能」を有することから、組織再生においても治療への応用が注目されている。研究代表者らは、筋分化誘導操作を行ったMSCsを用いて、筋ジストロフィー犬への移植条件の確立と筋組織への生着について報告している(Kasahara et al., 2012)。本研究課題ではこれまでに、抗炎症性サイトカインIL-10を欠損し、慢性炎症を伴ったIL-10欠損筋ジストロフィーマウスを樹立(Kasahara et al., 2014)、炎症鎮静化が病態進行の緩和に重要であることを示した。そこで、従来のMSCsを用いた細胞移植法と比べてさらに治療効果を得るため、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてIL-10の長期発現を可能にしたMSCsを作製し、筋ジストロフィー犬への移植実験を行った。その結果、筋肉内局所投与から3ヶ月後の長期にわたり、従来のMSCsと比較して炎症部位への高い生着が可能であった。

さらに、筋分化誘導操作を行っていないにも関わらず、一部のIL-10発現MSCsによる新たな筋線維様組織の再生が確認された。本課題の遂行により、今後さらにIL-10発現MSCsによる抗炎症効果および分化能を応用した治療技術の開発が期待された。間葉系間質細胞(Multipotent mesenchymal stromal cells:MSCs)は「免疫制御能」と「多分化能」を有し、細胞性医薬品としての応用が注目されている。本課題では、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)に対するMSCs移植治療の可能性を検討した。まず、抗炎症性サイトカインIL-10を欠損することで慢性炎症を伴うDMDマウスを樹立し、炎症反応によって助長される筋組織傷害および機能障害を明らかにした。また、モデル動物を用いてMSCsの全身投与方法を確立し、安全性と有効性を確認した。今後さらに治療効果を明確にすることで、MSCsの応用が期待された。DMDに対するステロイド療法が着目されているが、従来、炎症と病態との関係の解析は十分ではなかった。抗炎症性サイトカインIL-10を欠損したmdxマウスの作出と病態解析を行い、炎症素因による重症化を証明した。今後、抗炎症療法開発や免疫寛容誘導遺伝子治療への応用が期待される。IL-10機能強化型MSCsを用いた移植効率の向上効果を免疫不全マウスにおいて確認出来たため、次年度はさらに筋ジストロフィーモデルマウスやモデル犬への移植実験を行い、高効率の移植条件を検討する予定とする。また、移植期間中に運動機能や活動量を解析し、移植における安全性および治療効果を評価する予定とする。細胞生物学、生化学、分子生物学本年度の研究成果より、筋ジストロフィーにおいて炎症素因による重症化が証明されたことから、今後さらに炎症を標的とした抗炎症療法開発が重要であると考えられる。そこで次年度より、IL-10欠損mdxマウスを用いてMSCsの「抗炎症効果」を示す最適な細胞移植条件を検討する予定である。マウスの移植実験を推進していたが、使用する疾患系統マウスの繁殖維持が予想外に難航したため、当初の計画よりも実験規模を縮小せざるを得なかった。研究計画に沿って必要な物品を購入し、計画通りの研究を遂行することが可能であった。本年度は3751円が未使用となったが、この価格ではこれ以上必要な物品は購入できなかった。マウスを用いた移植実験を引き続き予定しており、使用する疾患系統マウスの繁殖維持の見通しがついたため、当該年度にて実施出来なかった実験においては次年度に追加実験を予定している。当該年度にて未使用分は次年度の物品購入費に充てる計画である。本年度の残高3751円は、来年度分と合算して必要な消耗品の購入に充てる予定である。
GISTにおける脱リン酸化酵素活性およびKIT転写活性に着目した新規治療法の探索

KITやPDGFRA変異を有するGISTにおいては、チロシンキナーゼ阻害剤が有効であるが、二次性のRTK変異獲得に代表されるチロシンキナーゼ阻害剤抵抗性が大きな問題である。グループでは、脱リン酸化酵素の1つであるPP2Aに変異があるとa)GIST患者の予後が不良となり、b)発がん因子KITの自己リン酸化亢進をさせ、更にはc)悪性化能獲得に関与することを示してきた。さらに、GISTにおいて予後良好因子であるpfetin (KCTD12)と発がん因子であるKITの間には、遺伝子・タンパク質発現量に関してお互いに干渉していることを同定しており、GIST細胞が過剰な増殖サイクルに入る現象から回避している可能性を見出している。本研究ではそれらの先行発見に基づいて、GISTにおける1)発がん因子であるKITの発現制御機構の解析と、2)脱リン酸化酵素賦活剤の投与による抗腫瘍効果を検討し、予後予測や薬剤奏功性のバイオマーカー・新規治療標的としての可能性を探索し、臨床応用を目指している。本年度はGIST臨床検体におけるKIT発現量の予後因子としての可能性の検証として、順天堂大学医学部附属順天堂医院病理部に蓄積されているGIST約100例のホルマリン固定パラフィン包埋検体(FFPE)を用いてDNA/RNAを抽出し、KIT変異を有するGISTにおけるKIT発現量定量とPPP2R1A変異有無の確認を行った。それらの発現、変異データは臨床病理学的因子との解析を進めその特徴の同定を試みた。また、GISTにおける脱リン酸化酵素賦活剤の抗腫瘍効果の探索としてGITS細胞株にnativeなPP2A(PPP2R1Aにコードされる脱リン酸化酵素)を活性化する薬剤であるFTY720を使用しその抗腫瘍作用の検証を進めた。上記検証はまだ途中でありやや遅れている。来年度もGIST臨床検体のコホート作成を引き続き進め、KIT、PPP2R1A、KCTD12の発現変異との相関確認を進める。また、GITS細胞株におけるPP2A脱リン酸化酵素の抗腫瘍作用の検証を引き続き進める。

また、GITS細胞株におけるPP2A脱リン酸化酵素の抗腫瘍作用の検証を引き続き進める。本年度はGIST臨床検体におけるKIT発現量の予後因子としての可能性の検証として、順天堂大学医学部附属順天堂医院病理部に蓄積されているGIST約100例のホルマリン固定パラフィン包埋検体(FFPE)を用いてDNA/RNAを抽出し、KIT変異を有するGISTにおけるKIT発現量定量とPPP2R1A変異有無の確認を行った。それらの発現、変異データは臨床病理学的因子との解析を進めその特徴の同定を試みた。また、GISTにおける脱リン酸化酵素賦活剤の抗腫瘍効果の探索としてGITS細胞株にnativeなPP2A(PPP2R1Aにコードされる脱リン酸化酵素)を活性化する薬剤であるFTY720を使用しその抗腫瘍作用の検証を進めた。上記検証はまだ途中でありやや遅れているため使用額差が生じている。
局所ハイパーサーミア用無侵襲生体制御加温装置の試作

癌治療におけるハイパサーミアでは、無侵襲で生体内深部の加温をすることが望まれている。本研究では予めCT等により位置の同定が行われている癌患部に対して、マイクロ波を用い適切な加温を施すため、加温パターンの可変ができ、また選択的加温を行うことができるアプリケータ(生体に電磁波を照射するアンテナ)を開発した。またこのアプリケータを用いて最適加温が行われるようにマイクロコンピュータにより制御されたハイパサーミア用加温装置を開発した。さらに開発した装置を用いた場合の加温媒質内部の温度分布解析を行った。従来から一般にマイクロ波を用いた生体加温では、加温の深度はせいぜい数cm程度であると言われており、これにより無侵襲マイクロ波ハイパサーミアの限界が規定されていたが、今回開発したアプリケータは放射される電界に対し一種のレンズ作用を有することから、加温の最大深度は4.30MHzを用いた場合7cm以上となり、従来の2倍以上、加温の範囲を広げることに成功した。また、開発したアプリケータは焦点位置を変化することができるため、加温の深さおよび範囲を自由にコントロールできるものであり、アプリケータ単独でこのような機能を有するものは、本研究によるものが初めてである。開発したアプリケータを用いた制御加温装置は2450MHzを用いたものおよび430MHzを用いたものがあり、各々比較的浅部加温用、深部加温用とに用途を分けることができる。加温対象となる部位の温度の制御性は2450MHzを用いたものでは±0.3°C、430MHzを用いたものでは±0.5°Cと制御性が優れている。また、加温媒質の表面は装置から供給される表面冷却用水によって患者への苦痛を排除するよう設計されている。また開発した装置は加温開始時からハイパサーミア温度に達するまでの温度上昇レートをコントロールすることができ、臨床応用可能なハイパサーミア装置として、非常に有効なものである。