hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラム陰性菌によるLPS-DNA複合体産生の証明と歯周炎におけるその強毒性の解明

歯周病原細菌からリポ多糖(LPS)および非メチル化CpGを含むDNA(CpG DNA)の複合体(LPS-DNA複合体)を抽出し、その病原性を解析することを目的に本研究を行った。中性フェノールを用いた抽出法により、DNA-LPS複合体を抽出することに成功し、さらに結合様式がイオン性・非イオン性の両方であることが示された。また、複合体形成にはLPSの構造が関わる可能性が示唆された。さらに、LPS-DNA複合体による炎症性サイトカインTNF-αの産生量は高純度のLPSに比べ少なかった。LPS-DNA複合体の毒性についてはさらなる解析が必要であると考えられる。(1)菌体からLPS-DNA複合体を効率良く回収する方法の確立:Triton-EDTA処理法の回収効率の検索をまず行った。LPSに対してEDTA処理を行うと、LPSの凝集も解除され、この状態でTriton-X114による二層分配法を行うと、上相のLPS-DNA複合体の回収量が総合的に減少した。このようにTriton-EDTA処理法および電気泳動法による細菌の菌対外構造物を回収方法には操作の煩雑さと回収効率が課題となっていた。そこで、DNAの抽出に用いる中性フェノールを用いたDNA抽出方法を併用し菌体に対して行い、その後のアガロース電気泳動にて確認できたLPS-DNA複合体のバンドを切り出した。切り出したバンド体は電気溶出させて、さらに複合体を形成していないLPSを除去するために二相分配法を用いて精製した。精製した複合体にはLPS-DNAの他にナトリウムイオン等を多量に含むため、限外ろ過にてイオンを除去し、KDO測定法および吸光度測定を行うことで精製した溶液内に確認した。これにより、DNAと2価の陽イオンを介さず複合体を形成しているLPSの存在が示唆できた。(2)LPS-DNA複合体の病原性の解明:LPS-DNA複合体の病原性を比較研究するために、粗精製したものではなく、DNAなどの不純物の少ないLPSを精製する必要があった。そこで、従来のLPS精製法であるホットフェノール法に加え、DNaseI、RNase、proteinase Kによる処理法を併用し、更に重複させることで精製率を上げる試みを行った。3回のホットフェノール法および、2回の各酵素処理を行ったところ、ホットフェノール単独法に比べはるかに核酸・タンパク質の不純物の少ないLPSの精製に成功した。これによりLPS-DNA複合体と純LPSの病原性を比較検討する前処理ができた。(1)LPS-DNA複合体生合成の解明:前年度より、純度の高いLPSの精製を行ったが、LPS-DNA複合体の病原性を検討するにあたり、結合様式の解明が必要であった。そこで、ATCC29523株のLPS生合成遺伝子変異株WQ13Lを作成し、さらにすでに作成している凝集因子変異株HM23MLを比較対象に用いた。まず、菌体外DNAと結合するLPSが細菌表面に存在する遊離していないLPSであることを確認した。次に、抽出時に使用するバッファーのpHおよびEDTAの添加を行い、菌体外DNAがイオン性だけでなく、非イオン性に結合している可能性が示唆された。また、変異株を用いて菌体外DNAーLPS複合体の抽出操作を、EDTAを加えて行い、陰性コントロールとしてボイリング操作を行ったところ、LPS生合成遺伝子変異株では菌体外DNAも検出されなかったことから、菌体外DNAが非イオン性にLPSと結合していることが示された。(2)菌体外DNA-LPS複合体の病原性の解析:菌体外DNA-LPS複合体との比較として純LPS、E-coliの抽出LPSを用い、病原性の検討を行った。予定していたLPS生合成因子欠損株に関しては、複合体の形成がほぼ見られなかったため除外して行った。今回の検討では炎症性サイトカインであるTNF-αを対象として行い、THP-1細胞に対して純LPSおよび菌体外DNA-LPS複合体を加え、産生されるTNF-αをELISA法を用いて測定した。3者ともKDO法によりLPSの総量を揃えた場合、純LPS、DNA-LPS複合体ともに産生量が減少し、DNA-LPS複合体がより減少して示された。歯周病学25年度の当初の計画目標として、効率の良いLPS-DNA複合体の回収方法の確立を挙げた。具体的には、Triton-EDTA処理法および電気溶出法の条件を設定し、回収効率を比較するというものであった。方法の修正は必要になったが、目標であるLPS-DNA複合体の回収方法の確立はできたと考えられる。当初の平成26年度以降の計画として挙げていた通り、以下の項目を実施していく。(1)LPS-DNA複合体の非産生株と野生株とでLPS

化学構造を比較:LPS-DNA複合体を形成しにくい株があることは予備実験にて確認している。そこで、LPSの生合成に関わる遺伝子配列を用いて欠損株を作成し、野生株と比較することで複合体形成に必要なLPS構造を特定する。(2)LPS-DNA複合体の病原性の解析:LPS-DNA複合体と病原性を比較する対象として、純度の高いLPSと、変異株を用いてLPS糖鎖が短い複合体を用意し、それらを用いてLBPを介したマクロファージの活性化、もしくは好中球に対するプライミング反応、リムルス反応のいずれかで病原性を解析していく。(3)LPS-DNA複合体の広汎性と多様性についての検証:LPS-DNA複合体が、他のA. actinomycetemcomitans菌株、あるいは他の歯周病原細菌、大腸菌などグラム陰性菌について同様に産生されるのかを確認し、産生量について培養環境の因子が関わるのかについて検証する。
情報転換因子としてのGTP結合蛋白質

重点領域研究「情報転換因子としてのGTP結合蛋白質」の取りまとめとして次のように企画し、実行した。(1)研究成果報告書の編集、刊行3年間の研究期間中たとえ1年間でも在籍した班員、全員(第1班:計画14名、公募11名;第2班:計画11名、公募7名;班友2名)が研究成果をそれぞれ長文(10ポイント活字でA4版、10ページ前後)の書き下ろし原稿として提出した。これを編集し、12月に刊行した。総ページ数は398ページである。(2)発表論文のデータベース化総括班の事業として同じく全班員の発表論文をReference Update(Current Content)より毎週検索し、編集ソフトEndNoteにアブストラクト付きで格納する作業を続けてきた。1996年8月にこの作業を終了し、全班員に送付して訂正、追加を求めて完璧なデータベースを作製した。総量は2MB(フロッピ-2枚分)に達する。(1)の報告書の巻末に論文タイトル名による班員別の全リストを掲載した。49ページに及ぶものである。(3)文部省主催公開シンポジウム「大学と科学」への参加平成9年1月21,22日に神戸国際会議場で「生命を育む情報」と題して一般向けの講演会を行った。本研究班の有力班員を中心に若干名の招待講演者を加えてプログラムを編成した。2日目は降雪に見舞われたが350名の会場に500名の聴衆が詰めかける盛況であった。しかし「大学と科学」の総経費(10,000千円)は文部省より別途配分を受けたので、本研究費からは支出していない。(4)啓蒙書の刊行G蛋白質を中心とする情報伝達ネットワークに関する研究は世界的にも活況を呈し、その進歩は目覚ましいものがある。しかし、これら最新の研究を支える基本的概念が多くの研究者によって充分に理解されているとは言い難い現状である。このような日本人研究者への啓蒙は我国におけるこの分野の研究を真に発展させるために不可欠である。この目的のため、本重点領域研究の中心的研究者が執筆する啓蒙書を平成9年6月を目途に上梓する。本補助金をもってこの出版の費用の一部を支弁し、本書が広く且つ長く国内に伝播して若手研究者の将来の研究の糧となることを期す。情報転換因子としてのGTP結合蛋白質は、3量体G蛋白質(以下単にG蛋白質)と低分子量で単量体のras蛋白質スーパーファミリーに分類される。元来rasはG蛋白質が介在しない細胞増殖因子受容体の下流に存在するとされており、従って、この2種のGTP結合蛋白質ファミリーは互いに異る細胞情報伝達系に属すると考えられてきた。本研究の本年度の成果は、この2種のファミリーが同一の情報伝達系で相互作用を行っていることを証明したことである。この証明は、好中球においてG蛋白質を介するfMLP受容体刺激に対する活性酸素生成応答が、真菌代謝産物ワートマニンによって特異的に抑制されることの発見に始まる。

詳細な検討の結果、ワートマニンはrasの直ぐ上流に存在するPI-3-キナーゼを特異的に阻害することによってこの応答を抑えることが示された。PI-3-キナーゼはもともと細胞増殖因子受容体刺激が活性化する蛋白質チロシンキナーゼの産生物リン酸化チロシンに会合して活性化される。好中球においては、「fMLP受容体→G蛋白質→リン酸化チロシンによるPI-3-キナーゼ活性化→rac(rasファミリーの一員)→活性酸素生成」と情報が伝えられることが証明された。近年、久しく不明だったrasの上流と下流のシグナルカスケードが急速に同定されつつある。PI-3-キナーゼはrasの上流に位置すると考えられるが、このカスケード内で占める正確な位置は不定のままである。特異的阻害薬ワートマニンは、この系におけるG蛋白質の役割を初めて明確に示したばかりでなく、今後PI-3-キナーゼの細胞内シグナルとしての位置づけの解明に貢献することが期待される。事実、本研究はさらにインシュリン受容体刺激から糖代謝活性化に至る情報もPI-3-キナーゼを介して伝達されることを、ワートマニンを用いて証明した。重点領域研究「情報転換因子としてのGTP結合蛋白質」研究班は、GTP結合蛋白質を構成する2大スーパーファミリー、3量体G蛋白質と低分子量G蛋白質をそれぞれ対象とするI、II班より構成されている。この2班を総括する総括班の研究上の目的は、3量体Gと低分子量Gとの両方にまたがる(また両者間のクロストークとしての)細胞内情報伝達系を解析することである。すなわち、形質膜を7回貫通する一本鎖ペプチドという構造上の特徴を有する受容体に共役する3量体Gは、一般に細胞内へcAMP、IP_3、DAGCa^<2+>など低分子の情報物質を介して情報を伝える。それに対し、1回貫通型の細胞増殖・接着因子受容体は蛋白質のチロシン残基リン酸化を介する蛋白質の会合を通じて情報を伝えるが、このカスケードの中心でRasを代表とする低分子量Gが機能している。ホスファチジルイノシトール(PI)-3-キナーゼは元来、後者の情報伝達系の重要なメンバーとして知られていたが、新たに開発したこの酵素の特異的阻害薬ワ-トマニンが好中球において走化性ペプチド受容体3量体Gを介する活性酸素生成を選択的に抑えることから、PI-3-キナーゼが3量体Gからも情報を受け取ることが明らかになった。すなわちPI-3-キナーゼは両情報伝達系の接点に存在する。これが、総括班の初年度の成果の1つであった。ひきつづき第2年度では、3量体Gが直接PI-3-キナーゼを活性化する可能性が検討された。当初は新しいPI-3-キナーゼのアイソフォームがGβγによって活性化されると予想したが、実際には、従来からリン酸化されたチロシン(PY)を介して活性化されることが知られていた同じPI-3-キナーゼ分子が、PYとGβγによって相乗的に活性化されることが明らかになった。また、情報伝達カスケードにおけるPI-3-キナーゼの新しい「上流」としての抗体受容体や、「下流」としての細胞骨格系が、ワ-トマニンを用いて同定されるに至っている。重点領域研究「情報転換因子としてのGTP結合蛋白質」研究班はGTP結合蛋白質を構成する2大スーパーファミリー、3重体G蛋白質と低分子量G蛋白質をそれぞれ対象とするI、II班より構成されている。この2班を総括する総括班の研究上の目的は、3重体Gと低分子量Gとの両方にまたがる(または両者間のクロストークとしての)細胞内情報伝達系を解析することである。
分子実体に基づく自律神経調節機構を備えた循環動態モデルの構築

当該年度は、アセチルコリンによるペースメーカー細胞の発火頻度調節に関するモデルの作成と毛細血管モデルの精緻化の2テーマについて研究を進める予定であったが、循環モデルをより実用的なものにするために新たなヒト心室筋細胞モデルの開発を避けては通れないという結論に達し、ヒト心室筋細胞モデルの開発に取り組んだ。その成果について以下に報告する。近年蛍光Ca2+インジケーターを用いた計測によって新しい知見が次々と明らかになっている。我々は、この近年得られた実験結果に照らし合わせCICRモデルを新しくモデル化することで非常に重要な細胞の実験所見を新たに再現することができた。CICRモデルを構築するうえで、最も重要だったのは局所Ca濃度を瞬時平衡の式であらわし、L型CaチャネルとRyRチャネルのゲーティングを共役モデルとして表現することで初めて、計算コストを大幅に削減することに成功したHinchモデル(Hinch et al. 2004)の導入である。共役モデルは、LCCの膜電位依存性ゲート、Ca依存性不活性化ゲート、RyRの集合体としてのcouplonの活性化ゲート、この3つのゲートを連結した2の3乗の8状態モデルになっている。LCCのCaゲートとcouplonゲートはCa00, CaL0, Ca0R, CaLRと表現されるゲートの活性化を制御するnanodomainのCa濃度によって開閉が制御される。このモデルを用いて、局所Caを忠実に再現しつつ活動電位を発生し、しかも循環モデル等で収縮を計算するうえで非常に重要なCa濃度変化の時間経過も完全な確率論的計算で得られた結果とほぼ一致するシミュレーション結果を得ることが可能となった。これは最終目標である分子実態に基づく全身循環モデルの重要なパーツの一つとして、大変意義のある研究成果となった。26年度が最終年度であるため、記入しない。すでに天野教授のグループで開発されていたsimBio版のOu model(2012)をもとに、自律神経制御系を含む全身循環モデルを作成した。心室筋細胞モデルの制御については、Nobuaki model(2007)を参考に調整をおこなった。Nobuaki model(2007)において細胞モデルであるKyoto model(2003)の収縮力を制御する箇所に、刺激頻度一収縮力関係を補正するための項が含まれていた。これは、Kyoto modelの収縮力が刺激頻度上昇に応じて弱くなるという性質が見られたためである。しかし、今回のモデルではイソプロテレノール(ISP)の濃度[ISP]で細胞モデルを制御するという目的上、補正項を見込んだ[ISP]を与えて収縮力を制御することができるよう、アルゴリズムを検討した。この検討により、循環モデルがより分子実体に基づく制御に近いものとなった。今回新たに作成した、自律神経制御を含めた全身循環モデルで、ヒト乳児におけるHead-up-tilt試験の結果(血圧変化、心拍変化の計測値および時間経過)がうまく再現できることを確認した。さらに、このモデルを用いて運動状態を再現するためのパラメーターを4つ(vasodilation,activation,venoconstriction,resetting of baro-reflex)に絞り込んだ。循環モデルにおいて、VasodilationはResistanceを減少させ、activationは運動によって活動量が増す組織(上肢UPと下肢L1)の血流量を増加させ、venoconstrictionはComplianceやZero Pressure Filling Volumeとして計算されている静脈系血管にプールされている血液を循環血液の方へ分配する。最後のresetting of baro-reflexは運動時に圧受容体反射のresettingが起こるという現象を再現するための項である。この4つのパラメーターを調節することで、小型のほ乳動物でみられる運動時の臓器ごとの血液分布をうまく再現することができた。当該年度は、アセチルコリンによるペースメーカー細胞の発火頻度調節に関するモデルの作成と毛細血管モデルの作成の2テーマについて研究を進める予定であったが、毛細血管モデルのみ研究が進展したので、以下に報告する。毛細血管における体液の濾過量はスターリング仮説に基づいて計算した。これは、血管内の圧、つまり血圧と組織圧との差、から血管内と組織内の膠質浸透圧の差に濾過係数Kをかけることで、毛細血管壁を介する水の移動量を計算できるというシンプルな式である。毛細血管の構造は円筒状モデルを想定した。毛細血管の圧勾配は動脈端から静脈端へ向けて線形に減少すると仮定した。全長0.6mmの毛細血管を60個のコンパートメントに分割して、各コンパートメントにおいて先に述べたスターリング仮説による式を用いて水の出入りを計算する。動物の組織にはコンプライアンスが非線形であるという特徴がある。このしくみが浮腫を防ぐための負のフィードバック機構をもたらす。また、漏出した水の一部はリンパを通して組織から持ち去られ、頸静脈から血管内へと戻ってくる。毛細血管は基本的には水のみを通す半透膜と考えるが、一部膜を介したタンパクの移動や水に溶解しているタンパクの透過が実験的に観察されている。またリンパ管の役割として、組織にあるタンパクを除去して膠質浸透圧を下げるということが体液調節に重要であるので、タンパクの移動も加味して計算できるモデルにした。このモデルは、これまで教科書にある瞬間を切り取ったグラフとしてしか表現できなかった膠質浸透圧-静水圧関係を、数式でリアルタイムに計算しながら表示させることができ、より現実の生体に近い状態を表現できるモデルとなった。

当該年度は、アセチルコリンによるペースメーカー細胞の発火頻度調節に関するモデルの作成と毛細血管モデルの精緻化の2テーマについて研究を進める予定であったが、循環モデルをより実用的なものにするために新たなヒト心室筋細胞モデルの開発を避けては通れないという結論に達し、ヒト心室筋細胞モデルの開発に取り組んだ。その成果について以下に報告する。近年蛍光Ca2+インジケーターを用いた計測によって新しい知見が次々と明らかになっている。我々は、この近年得られた実験結果に照らし合わせCICRモデルを新しくモデル化することで非常に重要な細胞の実験所見を新たに再現することができた。CICRモデルを構築するうえで、最も重要だったのは局所Ca濃度を瞬時平衡の式であらわし、L型CaチャネルとRyRチャネルのゲーティングを共役モデルとして表現することで初めて、計算コストを大幅に削減することに成功したHinchモデル(Hinch et al. 2004)の導入である。共役モデルは、LCCの膜電位依存性ゲート、Ca依存性不活性化ゲート、RyRの集合体としてのcouplonの活性化ゲート、この3つのゲートを連結した2の3乗の8状態モデルになっている。LCCのCaゲートとcouplonゲートはCa00, CaL0, Ca0R, CaLRと表現されるゲートの活性化を制御するnanodomainのCa濃度によって開閉が制御される。このモデルを用いて、局所Caを忠実に再現しつつ活動電位を発生し、しかも循環モデル等で収縮を計算するうえで非常に重要なCa濃度変化の時間経過も完全な確率論的計算で得られた結果とほぼ一致するシミュレーション結果を得ることが可能となった。これは最終目標である分子実態に基づく全身循環モデルの重要なパーツの一つとして、大変意義のある研究成果となった。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定を変更して、2年目の全身循環のシステムモデルを先にまとめることにしたため計画との単純な比較は難しいが、扱うシステムのボリュームが当初の予定よりも大きいものとなっているため、内容的には予定通りの進展である。平成25年度は当初2つのテーマを掲げていた。そのうちの1つのテーマについては進展したが、アセチルコリンチャネルのモデル化については進展しなかったため。24年度は、当初の予定ではアセチルコリンKチャネルのモデル化と細胞一神経間隙での神経伝達物質の拡散のシミュレーションをおこなうことになっていたが、細部のモデル化をおこなう前に全身循環モデルのプログラムコードの全容をまず把握することを目的として2年目の全身モデルと細胞モデルの統合の部分を先におこなうこととした。ペースメーカー細胞モデルの実装は動作確認まで済ませた。アセチルコリンKチャネルのモデル化が終わってから、来年度以降に発火頻度制御がうまく再現できるよう、調整をおこなう。毛細血管モデルを完成させ、論文にまとめると同時に、全身循環モデルのなかに位置づけ発展させていく。
歯周病における上皮細胞の病態解析

歯周病は、細菌感染による歯肉上皮細胞の破綻とそれに続く免疫担当細胞によって引き起こされる疾患である。しかし、上皮細胞の病態解析は免疫担当細胞の解析に比べ、殆ど行われていない。本研究では、ヒトのカテプシンCとLystと呼ばれるリソソーム機能に異常をきたすと、重度の歯周病を引き起こすことに着目した。カテプシンCノックアウトマウスおよびLyst遺伝子に変異があるベージュマウスを使用して、歯周病性細菌を感染させて、上皮細胞に関する生理学的・病理学的役割について解明を目指した。しかし上皮細胞の病態解析は免疫担当細胞の解析に比べ、殆ど行われていないのが現状である。本研究では、ヒト・カテプシンCの遺伝子異常が、重度の歯周病と手掌・足底の角化異常を引き起こすことに着目し、カテプシンCノックアウトマウスを使用して、歯周病における上皮細胞での本酵素の生理学的・病理学的役割について解明を目指すものである。まず本年度については、カテプシンCノックアウトマウスを用いて歯周病原性細菌P.gingivalisを口腔内に感染させた後、in vivoによる口腔内上皮細胞および皮膚上皮細胞の病態を解析した。これには、肉眼的・病理組織学的解析を行なった。具体的には口腔内感染後、歯肉部・舌部・口蓋部・舌下部・頬部の5点について発赤・浮腫・欠損・乾燥・発疹の観察項目を設定し、3段階評価でスコアー化した。また、発症のピークになる時間を算定し、病理組織学的解析を行った。その結果、野生型マウスに比べ、カテプシンCノックアウトマウスの歯肉部位での炎症の増加と骨吸収の増加が認められた。しかしながら、予想よりも骨吸が弱いため、今後感染方法を詳細に検討していく予定である。骨吸収での至適条件が決定された後に、病理組織学的解析において炎症反応、すなはち、炎症性サイトカインであるIL-1,IL-6,TNF-αなどELISAキットを用いて解析を行う予定である。I.上皮細胞培養系における形態学的解析:エンドソーム・リソソーム特異的蛍光染色試薬リゾトラッカーを用いて解析を行った。歯周病原性細菌君8功P.gingivalisを感染させた後、カテプシ・ンC KO-マウス由来の上皮系培養細胞でエンドソーム・リソソームの空胞化の有無に関して形態学的観察を行なった。正常細胞はリゾトラッカーと君P.gingivalisの局在が一致したが、カテプシンC KO-マウス上皮細胞ではP.gingivalisの局在したコンパートメントは空胞化が認められた。II.上皮細胞培養系における生化学的解析:我々が以前に行なったカテプシンE-KOマクロファージの実験では、エンドソーム・リソソーム性膜タンパク質であるLAMP-1、LAMP-2、LIMP-2が野生型マクロファージに比べ、カテプシンE-KOマクロファージ内に蓄積し、逆に可溶性リソソーム酵素であるβ-glucronidase、β-hexosaminidase α-mannosidaseの細胞内量が減少し、培養液中への分泌が亢進していた。そこで、LAMPL1、LAMP-2、LIMP-2などの膜タンパク量の変動をカテプシンC KO-マウス上皮培養細胞でも同様にこれらの膜タンパク質が蓄積しているか検討した。しかしながら、予想に反して両細胞には著しい差異が認められなかった。また、可溶性リソソーム酵素について細胞内酵素活性と細胞外分泌量を酵素活性も変化はなかった。さらにエンドソーム・リソソームのpHについて、リゾセンサーという蛍光プローブをエンドサイトーシスさせ、24時間後のpHについて解析を行なったが、著しい差は認められなかった。今後は細胞膜のタンパク質の変化について検討する予定である。本研究では、歯周病における上皮細胞での本酵素の生理学的・病理学的役割について解明を目指すものである。上皮細胞培養系における形態学的解析:エンドソーム・リソソーム特異的蛍光染色試薬リゾトラッカーを用いて解析を行った。

歯周病原性細菌P.gingivalisを感染させた後、カテプシンC KO-マウス由来の上皮系培養細胞でエンドソーム・リソソームの空胞化の有無に関して形態学的観察を行なった。正常細胞はリゾトラッカーとP.gingivalisの局在が一致したが、カテプシンC KO-マウス上皮細胞ではP.gingivalisの局在したコンパートメントは空胞化が認められた。上皮細胞培養系における生化学的解析:我々が以前に行なったカテプシンE-KOマクロファージの実験では、リソソーム性膜タンパク質が野生型マクロファージに比べ、カテプシンE-KOマクロファージ内に蓄積し、逆に可溶性リソソーム酵素の細胞内量が減少し、培養液中への分泌が亢進していた。そこで、カテプシンC KO-マウス上皮培養細胞でも同様にこれらの膜タンパク質が蓄積しているか検討した。しかしながら、予想に反して両細胞には著しい差異が認められなかった。また、可溶性リソソーム酵素について細胞内酵素活性と細胞外分泌量を酵素活性も変化はなかった。さらにエンドソーム・リソソームのpHについて、リゾセンサーという蛍光プローブをエンドサイトーシスさせ、24時間後のpHについて解析を行なったが、著しい差は認められなかった。今後は細胞膜のタンパク質の変化について検討する予定である。マウスの細胞レベルつまり、野生型とカテプシン欠損マクロファージとの差異は明確に観察された。しかしながら、一部の実験、すなわち、マウスの個体レベル、野生型と欠損マウスで差異は観察できなかった。また、実験的歯周炎での解析でも、予想外にマウスの個体レベルでのフェノタイプとして差異が出にくかった。これらの理由により、実験が予想よりもやや、遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。既に本研究内容は、国際学会、生化学会、薬理学会、基礎歯科医学会などで学会発表として複数回行っている。しかし、予想に反する結果も多いので、変更点を探っている。方向としては、細胞レベルでの解析を中心に解析を行なっていく予定である。
1930年代日本における中国人留学生の文学・芸術運動に関する基礎的研究

1)関係資料の発掘、収集、整理とデータベース化本研究にとって基礎資料の発掘、収集、整理は最も重要な作業であり、本年度も当初の研究実施計画に基づき、前年度に引き続いて関係各資料の発掘、収集に努めた。その結果、中国人留学生が組織した社会科学研究会、雑誌〈留東学報〉をはじめ、覃子豪、顔一烟等東京左連関係者の初歩的資料、彼らが日本語を学んだ東亜高等予備校の在籍者名簿の一部などを発掘、収集した。上記資料はすべて埼玉大学に集中し、現在もその整理とデ一タベース化が進行中である。またこの過程で、30年代日本の中国人留学生の文学・芸術運動を取り上げるならば、研究対象を大陸からの留学生だけにとどめず満州、台湾からの留学生も射程に入れるべきではないかとの示唆を受け、現在当該研究者との連携、資料の掘り起こし、広がりを追求中である。本研究は資料の発掘、整理を含め緒についたばかりである。日本人関係者としては秋田雨雀、藤森成吉、村山知義等の関係資料を発掘したが、まだまだ不十分で、今後も関係各資料の発掘、収集、整理、データベース化に努めたい。2)成果の公表萌芽的研究である本研究的なものは資料、成果の公開、共有が何よりも急務であろう。それが次への進展、土台でもある。本研究は上記のようにまだ緒についたばかりだが、現在満州、台湾の中国人留学生の研究者とも連携しながら冊子体の論文資料集を計画中である。1.資料の発掘と収集本年度は研究の初年度でもあり、関係資料の発掘、収集を中心に作業を進めた。本年度の研究実施計画にしたがい、30年代日本に留学した中国人留学生の文学・芸術運動に関する資料の収集に努め、日本近代文学館、都立中央図書館実藤文庫などに赴き、関係資料を収集、コピーした。具体的には、<文海>、<雑文>、<質文>などの当時の雑誌、<伝記文学>などの関係資料、さらには東京美術学校、東京文理科大学、法政大学、東京高等師範学校などの30年代中国人日本留学生に関する資料を入手した。また、日本国内にない諸資料、<大晩報>などについては、それをマイクロフィルムのかたちで入手した。だが、本研究に関する基礎資料は、すでに散逸してしまっているものが大半である。このため、今後も引き続き資料の発掘、収集に努めたい。2.研究に対するレヴュ-中国に赴き、本研究の課題、内容について上海華東師範大学の呉俊氏などからレヴュ-を受け、多くの成果を得た。3.資料の集中、整理、データベース化上記作業によって得た諸資料、成果をすべて埼玉大学に集中し、公開を可能にすると共に、パーソナルコンピューターを使って資料の整理、分析、データベース化に努めた。その際、中文関係資料の処理の円滑化などを図るため、パーソナルコンピューター(DELL300)を購入し、必要最低限の中国語環境を整え、資料の整理、データベース化に当たった。収集した資料の整理、分析、データベース化は現在も進行中である。
組織培養技術を利用した植物器官における二次代謝制御メカニズム測定系の開発

1.器官培養用の培養装置の開発実験材料として、ベラドンナの不定根を用いた。ドラム型培養装置、および、通気撹拌型培養槽を用いて、ベラドンナ不定根培養系に適した装置の試作を試みた。まず、気相中に不定根を保持し培地を霧状にして供給する方法を試みたが、安定して培養でき、かつ、培養条件を容易に制御できるような実験用装置の構築は困難であった。種々の検討の結果、ドラム型培養槽内に金網などメッシュ状の内筒を設置し、これに、分化した器官を捕捉させるようにして培養する方法が、本研究目的に最も近い形と考えられた。この方法では、培養中に、金網や金網表面に張り付けた多孔質担体(大孔径のスポンジ等)に自動的に植物器官が付着した。培地量や回転数を変化させれば、培地中への浸漬時間やそのタイミングを制御することが可能である。また、通気撹拌型培養槽の撹拌軸に金網からなるカゴを固定し、これに不定根を付着させ培養する方法について、現在、検討を行っている。2.実験に適した培養系の開発実験に用いた培養系は、きわめて安定に分化することが確かめられている。ここから、全く同じく条件下でも分化せず、かつ液体振とう培養可能な細胞を分離し、増殖させることに成功した。さらに、この脱分化細胞を分離する過程で、一旦は脱分化するものの、全く同じ培地条件で継代すると分化し始める株が確認された。このように、「分化」という現象に関連した生化学的な変化を解析するうえで、有用な培養系が得られた。しかし、培養槽を用いてこれらの系を培養することに関しては、特に最後に述べた培養系の維持が困難であり、詳細な条件検討を進めている。3.環境条件の変化に対する反応さらに、活性酸素に関連する物質の影響について検討する予定であったが、これについては、実施に至らなかった。
PTH/PTHrP受容体遺伝子変異によるシグナリングと細胞分化異常

(1)平成18年度研究計画の要約平成17年度に野生型PTH/PTHrP受容体(PTH-R)、PTH-R^<H223R>(Jansen型)、およびPTH-R^P132L(Blomstrand型)遺伝子発現ベクターを作製し、骨芽細胞でのPTH-Rタンパクの細胞内局在について検討を行った。今年度は、PTH-Rタンパクの細胞内局在部位の違いを詳細に検討するため、myc-tagを組み込んだcDNAを作製し、免疫沈降および免疫電顕の詳細な所見を得る。(2)研究成果内容PTH-Rタンパクを発現させた骨芽細胞を用い、PTH-Rタンパクの細胞内局在をwesternblot法にて確認したところ、野生型PTH-Rタンパクは膜に強い局在を示しだのに対し、BolmstrandおよびJansen型PTH-Rタンパクは細胞質および膜分画にそれぞれわずかに局在していること、とくにBlomstrand型PTH-Rタンパクは、小胞体などのorganelleに蓄積されていることが示唆された。また、PTH-Rを導入していないコントロールでは、PTH-Rタンパクは検出されなかった。これらの結果は免疫電顕でも確認された。さらに、変異型PTH-Rと野生型PTH-Rとのユビキチン化の相違について比較検討するため、PTH-R発現ベクターをtransfectionした骨芽細胞にproteasome抑制剤であるMG132を投与後、抗PTH-R抗体で免疫沈降を行い、その後抗ユビキチン抗体を用いてwesternを行ったところ、有意な差を得ることができなかった。これは、上記手法による検出の難しさを示していると考えられたため、新たにPTH-R発現ベクターのC末端にc-myc tagを付加した発現ベクターを構築した。平成19年2、3月の時点で細胞内局在の確認ならびに免疫沈降の所見を得つつある。(1)平成17年度研究計画の要約野生型PTH/PTHrP受容体(PTH-R),PTH-R^<H223R>(Jansen型)、PTH-R^<P132L>(Blomstrand型)遺伝子を発現した骨芽細胞における変異型遺伝子タンパクの細胞内局在を電顕レベルで観察し、さらに小胞体あるいは細胞膜に局在する変異型受容体から伝達されるシグナリングの差異、ならびに、それによって生じる骨芽細胞の分化について検討する。(2)研究内容野生型PTH-R、PTH-R^<P132L>及びPTH-R^<H223R>遺伝子発現ベクターをMC3T3-E1細胞にtransfectionし、共焦点レーザー顕微鏡及び免疫電顕観察を行い、変異型受容体の細胞内局在を観察した。その結果、野生型PTH-R遺伝子を導入したMC3T3-E1細胞では、細胞膜表面に均一なPTH-R陽性反応を認めた。またPTH-R^<P132L>遺伝子を導入した細胞では、細胞膜表面にPTH-R陽性反応をほとんど認めず、小胞体の一部に蓄積する像、および細胞質内に拡散する像を認めた。一方PTH-R^<H223R>遺伝子を導入した細胞では、細胞膜上に変異型タンパクの局在が僅かに認められたが、細胞質内に散在する像も観察された。以上の結果より、野生型PTH-Rタンパクは小胞体・ゴルジ体を経由してすみやかに細胞膜上に輸送されるが、PTH-R^<P132L>タンパクは小胞体の"quality control(品質管理機構)"によって細胞膜まで輸送されず、小胞体蓄積および細胞質内漏出によって処理される可能性が推測された。また、PTH-R^<H223R>は僅かに細胞膜まで輸送されていることから、変異型タンパクのコンフォメーションの違いに起因すると考えられた。(3)研究実績上記までの研究成果を、日本小児歯科学会、日本骨代謝学会、米国骨代謝学会、および歯科基礎医学会にて発表した。

これは、上記手法による検出の難しさを示していると考えられたため、新たにPTH-R発現ベクターのC末端にc-myc tagを付加した発現ベクターを構築した。平成19年2、3月の時点で細胞内局在の確認ならびに免疫沈降の所見を得つつある。
樹木年輪の化学分析による森林生態系への酸性雨影響評価

本研究の目的は、樹木年輪の化学分析から、森林生態系が受けている酸性雨の影響を評価する手法を確立することである。福岡県矢部町のスギ年輪中の金属濃度を、地表面から0.3mと1.0mの幹の位置で分析した。辺材中のカルシウム分布は3つのグループに分類された。これらの分布パターンは、個々の木が受けている酸性雨の影響の大小と土壌の緩衝能力の違いによると考えられる。すなわち酸性雨影響の初期段階では、緩衝作用により土壌溶液中のカルシウム濃度は増加するが、緩衝能力が低下した土壌はカルシウム濃度は増加せず、pHが低下する。矢部スギは、目視では完全に健全と評価され衰弱傾向は観察されていないが、酸性雨影響の初期段階にあると考えられるカルシウム分布が多く見られた。酸性雨の降下が続くと、土壌の緩衝能力はさらに低下し、地下水へ多量の金属が移行するので、森林土壌は次第に貧栄養状態になり、衰退・枯死へと向かうと考えられる。樹齢推定500年(中心部欠如)の太宰府クスノキと健全木である樹齢130年の佐賀クスノキ及び樹齢122年の久留米クスノキについて分析を行った。健全木と比較すると太宰府クスノキのいくつかの金属元素分布は特徴的な増加をある時期に示していた。この増加は1910年頃から始まっており、この時期に何らかの環境変化があり、土壌溶液中の金属濃度が増加したと推定される。太宰府クスノキの生育場所の土壌pHは極めて低く、何らかの理由により土壌の酸性化が起こったことを暗示している。佐賀と久留米のクスノキでは金属交換容量は樹齢で単調に変化していたが、太宰府クスノキの年輪の金属交換容量は金属分布が増加している年輪では高い値を示した。土壌溶液の金属濃度増加に対してクスノキが生理学的な対応を起こしたと推定されるが、結果的には枯死したと推定される。樹木は必要とする金属を土壌環境に依存している。土壌水と一緒に経根吸収された金属は、幹の仮道管を経由して樹冠に移動し、葉に蓄積後、落葉で地表に戻る。樹木に取り込まれた金属の一部は毎年形成される年輪に保持される。上に述べた金属サイクルが定常的に営まれている森林では、生育している樹木の年輪中の金属分布は一定していると期待される。しかし、酸性雨により金属サイクルが乱されると、年輪中の金属分布に変化として記録される。辺材中のカルシウム分布は、濃度がほぼ一定のもの(-)と樹皮側で濃度が増加しているもの(+)にわけられた。更に0.3mと1.0mのカルシウム分布の組合せからスギは3つのグループに分類された。(1)0.3m(-)と1.0m(-)、(2)0.3m(+)と1.0m(-)、(3)0.3m(+)と1.0m(+)である。酸性雨のような外的要因を受けず定常的サイクルにある森林生態系では、年輪中のカルシウム分布は(1)のグループが多いと期待される。酸性雨が森林に降下すると、土壌固相から金属が土壌溶液へ移行する、土壌の緩衝作用が働く。酸性雨影響の初期段階では、緩衝作用により土壌溶液中のカルシウム濃度は増加する。

従って(2)や(3)のグループが多く確認された矢部スギは、目視では完全に健全と評価され衰弱傾向は観察されていないが、酸性雨影響の初期段階にあると考えられる。酸性雨の降下が続くと、土壌の緩衝能力は次第に低下し、地下水へ多量の金属が移行するので、森林土壌は次第に貧栄養状態になり、衰退・枯死へと向かうと考えられる。本研究の目的は、樹木年輪の化学分析から、森林生態系が受けている酸性雨の影響を評価する手法を確立することである。樹木は必要とする金属を土壌環境に依存している。土壌水と一緒に経根吸収された金属は、幹の仮道管を経由して樹冠に移動し、葉に蓄積後、落葉で地表に戻る。樹木に取り込まれた金属の一部は毎年形成される年輪に保持される。本研究では、福岡県太宰府市太宰府天満宮境内に生育していたが、原因不明のまま枯死したクスの木の年輪解析を行い、その原因解明を目指した。樹齢推定500年(中心部欠如)の太宰府クスノキと健全木である樹齢130年の佐賀クスノキ及び樹齢122年の久留米クスノキについて分析を行った。健全木と比較すると太宰府クスノキのいくつかの金属元素分布は特徴的な増加をある時期に示していた。この増加は1910年頃から始まっており、この時期に何らかの環境変化があり、土壌溶液中の金属濃度が増加したと推定される。年輪中の硫黄同位体の分析は、太宰府クスノキの硫黄源が土壌・地下水から雨へ変わってきていることを示している。すなわち、1900年までの年輪は現在の土壌・地下水に見出された硫黄と同じ同位体比であるが、1900年代以降は化石燃料由来の軽い硫黄値を示していた。しかし、福岡近郊のクスノキ葉の硫黄分析の結果は、より汚染がひどい場所でもクスノキは健全に生育しており、大気汚染が太宰府クスノキの枯死の直接的な原因ではないことを示していた。太宰府クスノキの生育場所の土壌pHは極めて低く、何らかの理由により土壌の酸性化が起こったことを暗示している。佐賀と久留米のクスノキでは金属交換容量は樹齢で単調に変化していたが、太宰府クスノキの年輪の金属交換容量は金属分布が増加している年輪では高い値を示した。土壌溶液の金属濃度増加に対してクスノキが生理学的な対応を起こしたと推定されるが、結果的には持ちこたえることができなかった。
非接触超音波法による先端複合材料の健全性診断

本研究は,航空宇宙機器・輸送機器などの重要な構造用材料であり,今後より一層多く使用される炭素繊維強化高分子および金属系複合材料の超音波による局所的な損傷・劣化診断を目指すものである.今年度は,圧電振動体の共振特性から複合材料の接触部分の劣化を検出する点接触共振の励起・検出に向けた研究を開始した.すぐれた圧電定数と温度特性を有するランガサイト直方体の共振モードを理論解析し,対象物との点接触に適する点(振動の腹)と支持に適する複数の点(振動の節)を決定することができた.この結果をもとに設計したプローブ針と支持点をもつmmオーダの直方共振体を作製し,その全体をコイルに印加する外部磁場によって励起・検出することに成功した.測定物との接触は文字通り一点のみであり,また支持点は面外変位を持たない不動点であるため,理想的な点接触共振が実現した.このセンサを利用したスペクトロスコピーでは,接触部位の弾性特性を反映して変化する共振周波数の感度は,強磁性体の小球を振動体とする従来法に比べて10100倍向上した.チタン合金を母材とするSiC繊維強化複合材料について,明瞭なコントラストの画像が得られた.独自に開発した点接触超音波顕微鏡を用いて,シリコンカーバイド繊維の断面内のヤング率分布を計測することに成功した.この結果,コア部に存在する炭素のヤング率が500GPaを超える高いものであることが判明した.これは,グラファイトに似た炭素結晶のC軸が半径方向に向いた集合組織を有し,弾性定数が極めて大きなa軸が繊維の軸方向を向いていたためであり,内部組織と弾性定数の測定結果に良い相関を見出すことができた.また,シリコンカーバイド層の中でも弾性定数は分布しており,特に炭素に近い部分では弾性定数が急激に減少していた.おそらく,炭素が拡散してきたことにより,理想的なSiCの組成に比べて炭素が過剰に混入した組織となっているために,弾性定数の低下が見られたものと考えられる.本研究は,航空宇宙機器・輸送機器などの重要な構造用材料であり,今後より一層多く使用される炭素繊維強化高分子および金属系複合材料の超音波による局所的な損傷・劣化診断を目指すものである.今年度は,圧電振動体の共振特性から複合材料接触部分の劣化を検出する点接触共振の励起・検出に向けた研究を開始した.すぐれた圧電定数と温度特性を有するランガサイト直方体の共振モードを理論解析し,対象物との点接触に適する点(振動の腹)と支持に適する複数の点(振動の節)を決定することができた.この結果をもとに設計したプローブ針と支持点をもつmmオーダの直方共振体を作製し,その全体をコイルに印加する外部磁場によって励起・検出することに成功した.測定物との接触は文字通り一点のみであり,また支持点は面外変位を持たない不動点であるため,理想的な点接触共振が実現した.このセンサを利用したスペクトロスコピーでは,接触部位の弾性特性を反映して変化する共振周波数の感度は,強磁性体の小球を振動体とする従来法に比べて10100倍向上した.チタン合金を母材とするSiC繊維強化複合材料について,明瞭なコントラストの画像が得られた.新たな超音波顕微鏡として発展することを期待している.本研究は,航空宇宙機器・輸送機器などの重要な構造用材料であり,今後より一層多く使用される炭素繊維強化高分子および金属系複合材料の超音波による局所的な損傷・劣化診断を目指すものである.今年度は,圧電振動体の共振特性から複合材料の接触部分の劣化を検出する点接触共振の励起・検出に向けた研究を開始した.すぐれた圧電定数と温度特性を有するランガサイト直方体の共振モードを理論解析し,対象物との点接触に適する点(振動の腹)と支持に適する複数の点(振動の節)を決定することができた.この結果をもとに設計したプローブ針と支持点をもつmmオーダの直方共振体を作製し,その全体をコイルに印加する外部磁場によって励起・検出することに成功した.測定物との接触は文字通り一点のみであり,また支持点は面外変位を持たない不動点であるため,理想的な点接触共振が実現した.このセンサを利用したスペクトロスコピーでは,接触部位の弾性特性を反映して変化する共振周波数の感度は,強磁性体の小球を振動体とする従来法に比べて10100倍向上した.チタン合金を母材とするSiC繊維強化複合材料について,明瞭なコントラストの画像が得られた.独自に開発した点接触超音波顕微鏡を用いて,シリコンカーバイド繊維の断面内のヤング率分布を計測することに成功した.この結果,コア部に存在する炭素のヤング率が500GPaを超える高いものであることが判明した.これは,グラファイトに似た炭素結晶のC軸が半径方向に向いた集合組織を有し,弾性定数が極めて大きなa軸が繊維の軸方向を向いていたためであり,内部組織と弾性定数の測定結果に良い相関を見出すことができた.また,シリコンカーバイド層の中でも弾性定数は分布しており,特に炭素に近い部分では弾性定数が急激に減少していた.おそらく,炭素が拡散してきたことにより,理想的なSiCの組成に比べて炭素が過剰に混入した組織となっているために,弾性定数の低下が見られたものと考えられる.
エバネッセントフォントン力を利用した近接場領域における顕微・操作システムの開発

本研究は、近接場光が存在する光学境界面で微粒子や蛋白分子などを観測・操作するために、近接場でそれらの粒子が受けるエバネッセントフォトン力を利用して(1)微粒子等を回折限界以下の分解能で観測する超解像顕微法の開発、(2)先端に集束構造を持たせた特殊形状の光ファイバーマニピュレーターを開発して微粒子等を捕捉、操作させるシステムの開発、および(3)これらを統合した近接場領域における分子や微粒子の反応、合成を可能にするシステムを開発することを目的とし、以下のような研究成果が得られた。1)光ファイバーマニピュレータとして、光ファイバー端面に直径10μmのラテックス球を接着させる方法を考案し、最適な集束光学系を明らかにするため、FDTD法によって電磁場解析を行い集束光学系における出射パターンを計算し、微粒子操作・捕捉が可能な構造を設計した。2)製作した光マニピュレータを用いて、YAGレーザー光(波長1.06μm)を導波させて水中において微粒子を操作捕捉できることを明らかにした。とりわけ、直径40nmの金微粒子を捕捉、操作できることを実験的に明らかにし、複数金微粒子を配列するのに成功した。3)集束機能を持たせた先端球型光ファイバーマニピュレータの球先端に、直径100mmオーダーの金微粒子を固定させる技術を開発し、エバネッセント場内において光波を散乱させることに成功した。4)プリズムに臨界角以上の入射角で、二本の対向レザービームを入射させて逆向きのエバネッセントフォトン力をプリズム表面上に誘起させ、レーザー強度を調節することでプリズム表面上の直径10μm程度の微粒子を、毎秒数十μmの速度で位置決めすることに成功した。5)エバネッセント界面における微小物体を非接触・非破壊的に駆動位置決めを行う新規な技術として、エバネッセントフォトン力による方法を開発し、2次元面内において粒径20ミクロンのラテックスの位置を制御できることを示した。本研究計画は、近接場光が存在する光学境界面で微粒子や蛋白分子などを観測・操作するために、近接場でそれらの粒子が受けるエバネッセントフォトン力を利用して(1)微粒子等を回折限界以下の分解能で観測する超解像顕微法の開発、(2)先端に集束構造を持たせた特殊形状の光ファイバーマニピュレーターを開発して微粒子等を捕捉、操作させるシステムの開発、および(3)これらを統合した近接場領域における分子や微粒子の反応、合成を可能にするシステムを開発することが目的である。今年度は、エバネッセント波によるフォトン力を直接計測するために、先鋭化光ファイバーをカンチレバーとしてエバネッセント領域に挿入することにより、強度変調レーザーにより誘起されたエバネッセントフォトン力を検出することを試みた結果、大きさ50pN程度の力が先鋭化ファイバー先端に働いていることが明らかとなった。この大きさは電磁場理論による解析の結果ともほぼオーダー的に一致している。さらにエバネッセントフォトン力の検出実験において対向させたレザービームによって互いに方向が逆向きのエバネッセントフォトン力をプリズム表面上に誘起させ、これによってプリズム表面上の微粒子の位置制御に利用できることを着想し、実際にYAGレーザーを二分割させてプリズム状に対向するエバネッセント場を発生させ、その位置及びレーザー強度を調節することで直径10μm程度の微粒子を一次元ではあるが、毎秒数十μmの速度で位置決めすることに成功した。

本研究計画は、近接場光が存在する光学境界面で微粒子や蛋白分子などを観測・操作するために、近接場でそれらの粒子が受けるエバネッセントフォトン力を利用して(1)微粒子等を回折限界以下の分解能で観測する超解像顕微法の開発、(2)先端に集束構造を持たせた特殊形状の光ファイバーマニピュレーターを開発して微粒子等を捕捉・操作させるシステムの開発、および(3)これらを統合した近接場領域における分子や微粒子の反応・合成を可能にするシステムを開発することが目的である。今年度は、光ファイバーマニピュレータの設計および操作・捕捉特性の検討を行った。マニピュレータとしては、ガラス細管を溶融延伸させたマイクロピペットに微小球を接着させる方法と光ファイバー端面に直径10μmのラテックス球を接着させる方法について考案し、FDTDによる電磁場解析を行い、最適な形状を検討した。次にこれらの知見をもとに、実際にポリスチレンラッテクス球を用いたマニピュレータを製作する方法を開発して波長1.06μmのYAGレーザーをファイバーに導波させて微粒子の捕捉・操作特性を実験的に求めた。その結果、直径3μm程度のラッテクス球を選択的に捕捉・移動できることが分かった。また、先端球型ファイバーマニピュレータでは直径40、200nmの金微粒子を捕捉出来ることに成功し、移動速度も毎秒80μm程度の速度が得られることが分かった。今後、この研究成果をさらに拡張させてファイバー先端に複数の微粒子を接着させることにより同時に複数の微粒子を捕捉させる方法や、金微粒子の配列固定方法を開発してナノサイズ光回路の研究開発を行っていく予定である。本研究計画は、近接場光が存在する光学境界面で微粒子や蛋白分子などを観測・操作するために、近接場でそれらの粒子が受けるエバネッセントフォトン力を利用して(1)微粒子等を回折限界以下の分解能で観測する超解像顕微法の開発、(2)先端に集束構造を持たせた特殊形状の光ファイバーマニピュレーターを開発して微粒子等を捕捉、操作させるシステムの開発、および(3)これらを統合した近接場領域における分子や微粒子の反応、合成を可能にするシステムを開発することが目的である。今年度は、昨年度に開発した光ファイバーマニピュレータに金微粒子を接着させることでプローブ機能を付与させる新規なマニピュレータを開発するとともに、エバネッセントフォトン力による2次元微粒子位置決め技術の開発を行うことを目的とした。その結果、以下のような結果が得られた。1)集束機能を持たせた先端球型光ファイバーマニピュレータの球先端に、直径100nmオーダーの金微粒子を固定させる技術を開発し、エバネッセント場内において光波を散乱させることに成功した。今後、マニピュレータによって組み立てた構造を開発したプローブによって観測することで本プローブの有効性を確認できる。2)エバネッセント界面における微小物体を非接触・非破壊的に駆動位置決めを行う新規な技術として、エバネッセントフォトン力による方法を開発し、2次元面内において粒径20ミクロンのラテックスの位置を制御できることを示した。さらに、これらの方法を組み合わせて複数微粒子の操作・捕捉も可能になると考えられる。
高次神経機能におけるカルモデュリンキナーゼIVの遺伝子欠損マウスを用いた機能解析

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMキナーゼ)は、神経系におけるカルシウム情報伝達機構において中心的なシグナル経路を構成しているプロテインキナーゼと考えられている。本研究は、(CaMキナーゼの神経系における機能を形態学的に明らかにするために企画し以下の成果を上げた。(1)CaMキナーゼIγの単離と発現解析CaMキナーゼIγの2つの分子種(γ1,γ2)の単離に成功し全一次構造の決定した。神経系の遺伝子発現解析を施行した結果、本分子が視床下部および松果体に豊富に発現することを明らかにした。また、強制発現系で細胞内局在を検討した結果、両分子とも細胞質と神経突起に局在することを明らかにした。さらに、東北大学薬学部の福永教授との共同研究により、両分子の酵素学的な性質を明確にした。(2)CaMキナーゼIIIの単離と発現解析CaMキナーゼIIIは、伸展因子2の特異的なリン酸化酵素として、カルシウムによる蛋白質の合成の調節に深く関与していることが知られていたが、神経系の発達過程における機能を明らかにする目的で、in situハイブリダイゼーション法を用いて遺伝子発現解析を施行した。その結果、CaMキナーゼIIIは、大脳皮質などにおいて生後1週までに一過性に発現の増強が観察され、本酵素が神経発達過程のシナプス形成などに関与している可能性が示唆された。(3)CaMキナーゼIV遺伝子欠損マウスを用いて行動解析CaMキナーゼIVは、これまでの我々の発現解析より、脊髄後角および後角神経節に発現していることが知られている。本酵素の侵害刺激に対する機能を明確にするために、遺伝子欠損マウスを用いて、侵害刺激応答に対する行動解析を施行した。その結果、hot plate test, tail flick test, formalin testなどで侵害刺激に対する応答の明らかな減弱が観察された。機序の解明のさらなる検討が必要である。以上、申請した実験計画に従い、CaMキナーゼIVの神経細胞における生理的意義の解明のために着実に研究を展開し成果をあげている。Ca^<2+>カルモデュリン依存性ブロテインキナーゼ(CaMキナーゼ)は、神経系におけるカルシウム情報伝達機構において中心的なシグナル経路を構成しているプロテインキナーゼと考えられている。(1)CaMキナーゼIβ2の成熟期神経系における発現解析神戸大学医学部、南康博教授との共同研究により、一次構造決定と遺伝子発現局在を明らかにして既に報告したCaMキナーゼIの新たな分子種(CaMKIβ2)の神経系における発現局在と細胞内局在を明らかにするために、特異抗体の作成し、本分子の蛋白レベルでの発現を免疫組織学的に解析した。その結果、遺伝子発現局在と一致し、視床核、視床下部、扁桃核、海馬、大脳皮質などに非常に強い免疫陽性神経細胞が認められ、他のCaMキナーゼとは相異なる発現分布を示すことを明らかにした。さらに神経細胞においてCaMKIβ2が核内に非常に豊富に局在することを明らかにし、本分子が、核内で転写因子などのリン酸化などを介した遺伝子発現調節に関与している可能性を形態学的に提示した。(2)CaMキナーゼIβ2の神経発達過程における発現解析さらに免疫組織学的解析法により、本分子の神経発達過程における発現局在を検討した。その結果、神経発達過程の非常に早期より、CaMKIβ2の発現することを明らかにし、本分子が成熟神経細胞のみならず発達分化過程の神経細胞において重要な機能を果たす可能性を明らかにした。(3)CaMキナーゼIγの単離と発現解析CaMキナーゼIγの単離に成功し全一次構造の決定に成功した。さらに、神経系の遺伝子発現解析を施行した結果、本分子が視床下部に特に豊富に発現することを明らかにした。