hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動学習における学習方略の変容に関する研究:グループ学習による影響に注目して

本研究の目的は、運動技術を練習するときの練習の仕方について、大学生がどの程度正しく認識しているかを、実験的方法を中心にインタビューと質問調査法を組み合わせることによって多角的に分析することであった。分析の結果、彼らは、正しい動きの反復練習を繰り返すだけでは学習にはつながらないことを認識しているにもかかわらず、実際の練習行動においては、できるだけ正しい動きの反復回数を増やす方略を採用していることが分かった。平成21年度においては、主として、文脈干渉効果を題材として、運動学習における反復練習についてのメタ認知の妥当性を実験的に検討した。被験者(バドミントンの初心者60名)は、3種類のバドミントンサーブ270試行の練習を、ブロック練習、ランダム練習、2種類の自己調整練習の4条件下で練習し、翌日ランダム順でのテストを受けた。実験と並行して、練習方略に関するインタビューを行った。実験の結果、明確な文脈干渉効果が見られた。にもかかわらず、自己調整条件でランダム練習方略を採用した被験者は皆無であり、全員がブロック練習か中間型の練習方略を採用した。しかも、テストがランダム順でなされることを予告しても、この傾向は変わらなかった。インタビュー結果からは、初心者がコツをつかむには反復練習が必要であるという強い信念が存在しており、このようなメタ認知が上記のような結果の背景にあることが分かった。これらの結果は、少なくとも今回設定した学習状況においては、運動学習に関するメタ認知が必ずしも妥当なものではなかったことを強く示唆している。また、次年度においては、この実験を継続するとともに、質問調査法を用いて広範囲に運動学習のメタ認知の実態を分析する予定である。その準備として、質問に使う調査項目の洗い出し作業を行うとともに、予備調査を実施した。平成22年度の研究目的は、(1)平成21年度の実験に引き続き、バドミントンサーブの練習事態において、練習者が自発的に採用する練習順序方略が、従来の文脈干渉効果に関する研究で明らかにされてきた有効な順序方略と一致するのかを明らかにすること、(2)他者の学習行動を観察することによって、学習者が採用する学習方略にどのような変容がもたらされるのかを明らかにすること、(3)日本体育学会、日本スポーツ心理学会において発表し、自己調整による運動学習の可能性について情報交換をすること、の3点であった。このうち、(1)については、メタ認知レベルでは文脈干渉効果に沿った判断をする傾向があるにもかかわらず、実際の行動レベルでは不適切な方略を選択しているという興味ある結果を得ることができた。この結果をより明確にするため、当初予定していなかった新たな条件(学習者による自己調整の範囲をさらに拡大した条件)を設定して実験を行った。その結果、課題の難易度に応じた練習量の配分という側面に関しても、適切な自己調整がなされていないことが明らかとなった。新たな条件を設定して実験を行ったため、(2)の目的に関しては、十分なデータを取ることができなかった。(3)については、特に上記の結果を中心に研究発表、あるいはシンポジウムで報告し、様々な研究者との情報交換をすることができた。(2)の目的については、最終年度において実験を行う予定である。学習方略は、学習過程の中でさまざまな要因によって調整され変容していく。最終年度の本年度においては、昨年までの2年間の成果を踏まえ、学習方略の変容に大きく作用すると考えられる二つの要因の影響について実験的に明らかにすることが目的であった。1)テスト場面への転移を最大にするには、テスト場面の状況を想定した学習方略を採用することが有利であるが、そのようなメタ認知による学習方略への影響について検討する。具体的には、あらかじめ練習成果をテストされる場面を経験することが、その後の学習方略にどのような影響を及ぼすかを調べる。2)運動技術の学習はグループで行われることが多い。そこで、モデルの練習風景を観察することが、その後の学習方略の選択に及ぼす影響について検討する。第一の目的については、最終的なテスト場面と同一の条件を予め経験しておくことによる効果は認められたものの、その影響力は弱いことが分かった。今年度、実験とは別途行った質問調査法の結果では、学習効果を高めるためにはテスト場面を意識して練習することが必要であるという認識を持っていることが示されている。このことは、テスト場面への転移を最大限にする工夫が必要であるという認識はあるものの、実際の学習行動には反映されにくいということを意味している。第二の目的に関しては、二つのモデリング条件を設ける実験計画のうち、一方の条件のみのデータ収集にとどまったため、今年度中の分析はできなかった。ただ、今回収集した条件のデータを見る限り、モデルの影響力が極めて強いことを示唆する結果であった。
p53活性化による肝発癌促進機序の検討

癌抑制遺伝子p53の機能障害は肝発癌に密接に関連しているが、慢性肝疾患患者の肝細胞では逆にp53が活性化していることが知られている。申請者は肝発癌モデルマウスの肝細胞においてp53を活性化させると肝発癌が促進することを見出している。そこで本研究課題はその機序を明らかにすること目的とし、肝癌促進因子である結合組織増殖因子(CTGF)の発現上昇、肝細胞アポトーシス、細胞老化・SASP、肝前駆細胞の4点について検討する。本研究によりp53の新たな側面が明らかとなれば、その学術的意義は極めて大きい。さらに慢性肝疾患患者における新たな肝発癌予防法の開発に繋がる可能性もあり、臨床的意義にも富んでいる。
近見反応の大脳内階層的情報処理機構についての研究

本研究は大脳視覚連合領(LS皮質)が近見反応に果たす役割を通じ、当領域の階層的情報処理を分析する研究の一部である。近見反応は輻輳眼球運動・焦点調節・瞳孔縮小を要素運動とする大脳性複合運動であり、その間の連関は適応的に変化する。動物(ネコ)は予め麻酔下で手術を行い、無痛的頭部固定用アダプタ・眼球運動測定用アイコイル・電極用チェンバーを装着した。実験は覚醒状態で行い、眼球運動は磁気サーチコイル法、屈折力は赤外線オプトメータにより測定した。動物はコンピュータ制御下に接近する視標に対し輻輳運動を行うよう訓練した。ニューロン活動・脳内微小刺激等は通常の方法で行った。LS皮質中心視領域ニューロンの約3%は、その活動が輻輳運動・焦点調節の大きさ・速度と相関し、2群に分れた。I群活動は輻輳運動と相関し、焦点調節とは有意な相関を示さなかった。II群活動は焦点調節と相関し、且つ視標速度が速い場合に、輻輳運動と有意に相関した。従ってI群は輻輳運動関連ニューロン、II群は焦点調節関連で且つ視標速度が速い場合に焦点調節・輻輳運動間の連関に役割を果たすニューロンと結論した。次にLS皮質の局所破壊を行い、その結果脱落する機能について調べた。後内側部LS皮質を電気凝固法により両側性に破壊した。破壊後(4匹)、視覚的に輻輳運動・焦点調節を誘発すると、速く大きい運動が有意に減少したが、遅く小さい輻輳運動・焦点調節は残存した。以上の結果および既知の研究結果から、LS皮質は視覚対象の3次元空間内での動きについて視覚情報処理を行い、とくに速い視標運動に際して、脳幹の輻輳運動制御系・焦点調節制御系に促進的な信号を出力、迅速で正確な眼球運動・焦点調節を可能とすることが示された。
暑熱環境不適応による初期胚死滅の分子機構解明と熱帯畜産への応用

熱帯という地域の自然的・社会的諸条件(在地性)を出発点とする新しい畜産学の体系化、すなわち、熱帯畜産の創生を求め、本研究では家畜繁殖学領域からのひとつの試みとして、熱帯畜産の潜在的制約要因である母体の一過性体温上昇(過体温)に起因する種々の繁殖障害を取り上げ、その分子機構を明らかにしようとした。本年度は、研究代表者らが確立した動物実験モデルを用い、暑熱ストレスによる初期胚死滅の誘発および卵胞発育阻害の生理学的機序と分子機構の解明を試みた。その概要は以下のとおりである。1.暑熱ストレス性初期胚死滅に関わる酸化ストレス介在説の証明マウス実験モデルによって得られた上記の仮設を証明するため、抗酸化機能を持つメラトニンを暑熱負荷マウスに投与し、その効果を調べた、その結果、メラトニンは暑熱ストレスによる肝臓での過酸化脂質の増加、卵管での活性酸素の生成を抑制し、さらに初期胚死滅を一定度軽減することを明らかにした。2.暑熱ストレスによる卵胞閉鎖促進の生理的分子機構の解明ラット実験モデルを用い、過排卵反応に対する暑熱ストレスの影響について解析した。その結果、暑熱ストレスは発育卵胞中の顆粒層細胞におけるLH/FSH受容体の発現を強く抑制すること、また、これにより暑熱ストレス下で発育した卵胞ではアポトーシスが亢進することを明らかにした。(業績2)3.暑熱ストレスによる排卵抑制の生理的機序解明シバヤギ実験モデルを用い、上記2と同様の解析を試みた。その結果、シバヤギでも暑熱ストレスは卵胞発育、特にFSHによる選択的卵胞発育の過程を強く抑制すること、また、これにより暑熱ストレス下で選抜された前排卵卵胞は排卵せずに退行することを明らかにした。熱帯という地域の自然的・社会的諸条件(在地性)を出発点とする新しい畜産学の体系化、すなわち、熱帯畜産学の創成を求め、本研究では家畜繁殖学領域からのひとつの試みとして、熱帯畜産の潜在的制約要因である高能力家畜の暑熱環境不適応による母体の体温上昇に起因する初期胚死滅現象を取り上げ、その分子機構を明らかにしようとした。本年度は、研究代表者らが確立したマウス実験モデルを用い、暑熱ストレスは母体内の酸化ストレス亢進を介して胚死滅を誘発するとの仮説を検証した。その概要は、以下のとおりである1.初期胚死滅に関わる胚と卵管組織の相互作用に関する解析排卵直前の卵子成熟期または排卵・受精直後に母体暑熱感作を負荷し、1細胞期胚を回収してグルタチオン含量(GSH)と発生能について解析した。その結果、GSHの低下と初期胚死滅の増加は受精直後に暑熱ストレスを受けた1細胞期胚に認められることを明らかにした(業績1)。2.初期胚死滅の引き金になる2-cell blockに関する解析細胞周期の実行因子であるCdc2に着目して、暑熱感作胚におけるCdc2の挙動を分析した。その結果、暑熱ストレス胚では卵管との相互作用により、Cdc2の不活化が起こり細胞周期が停止することを明らかにした(業績2)。3.母体暑熱感作による卵管・体組織の酸化ストレス亢進に関する解析暑熱ストレスにより卵管・肝臓組織の酸化ストレスが増大し、胚のDNA損傷の増加と胚発生の停止が誘発されることを明らかにした(業績3)。
肝細胞癌に対するinterferon-αの抗腫瘍効果に関する基礎的研究

【検討項目】今回、(1)IFN-αの5種類のサブタイプ別肝癌細胞増殖抑制効果、(2)in vitroのIFN-αと5-Fuの併用による肝癌細胞の増殖抑制効果、(3)IFN-αによるアポトーシスの誘導機序、(4)IFN-α単独あるいは5-Fuの併用によるin vivoの増殖抑制効果を検討した。【結果】(1)IFN-αの5種類のサブタイプ(α1,2,5,8,10)の13種類の肝癌細胞株に対する増殖抑制効果を01024IU/mlの濃度で検討した結果、α5が有意に最も強い増殖抑制効果を示し、以下、α8、α10,α2,1αの順であった。(2)in vitroでは、5-FuとIFN-αによる相乗的細胞増殖抑制作用は確認できなかった。(3)IFN-αは、caspase-3、-7,-8,-9を活性化し、最終的にPARPのproteolysisが生じアポトーシスを誘導する事が判明した。また、Cytochrome c及びSmac/Diablo蛋白のミトコンドリアから細胞質内への放出が観察された。AIF、Bax、Bidに関しては著変は認められなかった。このように、IFN-αによるアポトーシス誘導はミトコンドリア系を介したものであることが判明した。(4)ヌードマウスの皮下にヒト肝細胞癌株を接種し、径10mm前後の腫瘤形成時点から14日間連続でIFN-αCon1(0.01,0.1,1μg/mouse ;0.01μg=臨床量)あるいはPBSのみ(control)を皮下接種し、推定体積を2日毎に測定した。その結果、IFN-αCon1投与により体積が濃度依存性に徐々に減少し、15日目では0.01、0.1μg/mouseでcontrolの約60%、約25%の大きさまで縮小した。1μg/mouseでは、腫癌消失あるいは約10%となった。腫瘍組織の検討によりアポトーシス誘導と血管新生抑制作機序が腫瘍の増殖抑制の機序と判明した。また、5-FuとIFN-α併用投与により、単独投与に比べ明らかな相乗的増殖抑制効果を認めた。【結語】適切なIFN-αや薬剤の組み合わせにより直接的肝発癌抑制効果や抗腫瘍効果などがIFN-αに期待できる。(1)IFN-αのサブタイプのうちα1,2,5,8,10の5種類を使用し01024IU/mlの濃度で13種類の肝癌細胞を2496時間培養し、その増殖に及ぼす作用を検討した。その結果、サブタイプの増殖抑制作用は3つのパターンに大きく分類できた。まず、いずれのサブタイプも同等の増殖抑制作用を呈する場合(2株)、次に全てのサブタイプが増殖抑制作用を示すがα5が最も強い作用を発現する場合(6株)、最後に、α5のみが強い増殖抑制作用を呈し、他のサブタイプは、効果が乏しい場合(5株)であった。

13株で平均をとると、α5は、接触24時間目から、96時間目まで他のサブタイプに比較し有意に(P<0.001以下)強い増殖抑制作用を示した。各種サブタイプで96時間培養した際の13株の生細胞数の平均は、α1、2,5,8,10の順に、79%、69%、27%、55%、66%であった。(2)IFN-αによるアポトーシス誘導メカニズムに関して、カスパーゼの関与、特にcaspase 3の関与について検討を加えた。IFN-αによりアポトーシスが誘導される6株とされない2株で蛍光キットを使用しcaspase3活性を測定すると、アポトーシスが誘導されない2株ではcaspaseの活性化は認めないか、低レベルであった。誘導される6株では、種々のレベルで活性化を認めたが、アポトーシス抵抗性の株と同レベルしか活性化が生じない株も認められた。Caspase 3の他、caspase 9の活性化もいくつかの株で認められている。また、pancaspase inhibitorである、Z-VAD-FMKをIFN-αと伴に培地に加えると、IFN-αによるアポトーシス誘導が抑制され、IFN-αによるアポトーシス誘導がcaspaseの活性化依存性であることが判明した。(3)IFN-α製剤と抗癌剤である5-Fuと併用し細胞増殖抑制作用をMTT assay法で検討を行った。それぞれ肝癌細胞株の増殖を種々のレベルで抑制するが、現状で相加的な作用は、確認しているが、明らかな相乗的な作用までは確認が出来ておらず、現在更に検討中である。(4)IFN-αの癌細胞内シグナ伝達機構に関しては、現在検討中であるが、statなどのリン酸化と増殖抑制作用に相関性は得ていない。IFN-αにより誘導されるアポトーシスのメカニズムに関してアポトーシス関連分子の発現を蛋白及がmRNAレベルで検討した。アポトーシス関連のミトコンドリア蛋白の発現に関してはIFN-α誘導性アポトーシス感受性であるKIM-1株のみを使用した。ミトコンドリア内蛋白と細胞質内蛋白を別々に電気泳動しcytochromec、Smac/Diablo、AIF、Bidの発現をWestern blotting法で検討した。その結果、cytochrome c及びSmac/Diabloに関しては、72時間目で明らかにミトコンドリア分画内の発現が低下する傾向を認めこれらの蛋白のミトコンドリアから細胞質内への放出が示唆された。cytochrome cに関しては細胞質内cytochrome c蛋白量が若干増加した。AIF、Bax、Bidに関しては著変は認められなかった。Procaspase 3,7,8と9の発現に関しては、IFN-α誘導性アポトーシス感受性であるKIM-1株とHAK-1B株の2株と同抵抗性のKYN-3とKMCH-2の2株を使用した。Procaspases 3,7,8と9の発現に関しては、KMCH-2株でのみprocaspase 8と9の発現が元来低かった。IFN-αを添加培養後72時間のそれぞれのcaspaseの活性を検討すると、caspase 3の活性化をKIM-1で明瞭に認め、caspase 8の活性化をKIM-1・HAK-1Bで,caspase 7の活性化を軽度にKIM-1で、caspase 9の活性化をKIM-1・HAK-1Bで認めた。また、PARPのproteolysisをKIM-1・HAK-1Bにのみ認めた。KYN-3とKMCH-2では、活性化は認めなかった。RT-PCRによるcaspaseのmRNAの発現に関する検討では、KIM-1とHAK-1B細胞株において、Apaf-1,caspase 3,8,及び9のbandがIFN-α非添加時と比べ、添加時で明らかに増強していた。
球転がり疲労下におけるセラミックスの微小き裂進展挙動の観察と破壊力学による解明

今年度は,HIP窒素化ケイ素について,球-平板接触化におけるき裂進展挙動を検討するとともに,せん断応力下でのき裂進展挙動の特徴を明らかにした.1.き裂進展駆動力転走軌道上中央部に位置し,球の転走方向と直角に進展するき裂の進展量が極めて顕著である.このき裂に注目し,その進展挙動をより詳細に検討した.進展挙動の評価には,Hansonの接触応力分布解析法とFabrikantの応力拡大係数法を適用した.評価の結果,き裂は表面近傍の浅い領域を進展しているときは,主としてモードI型の進展をするが,深く進展するにつれて,モードII型進展が支配的となることが明らかとなった.また,接触面に摩擦力が発生するすべり-転がり接触条件下でもき裂の進展が観察され,その進展量は転がり接触下よりも大きいことが明らかとなった.その理由についても検討した結果,摩擦力が進展駆動力,特に,K_Iを増加させることが明らかとなった.2.せん断応力下でのき裂進展挙動球接触下で実現されている異位相における複雑な混合モード下でのき裂進展挙動を解明するため,人工的微小欠陥を付与したセラミックス試験片に,ねじり疲労試験機による応力比を変化させたせん断応力を付加することにより,各種応力比のもとでのモードII型き裂進展挙動の観察を行った.また,これと平行して,モードIで破壊した試験片の破面とモードIIで破壊した試験片の破面について,走査電子顕微鏡とレーザ顕微鏡によるき裂進展面の破面解析を行った.その結果,進展挙動は,K_<max>と△Kの両者に支配されることが明らかとなった.また,破面の特徴に関しては,モードI型とモードII型に大きな相違は見られなかったが,圧縮応力が負荷された場合のモードII型破面は,極めてなめらかな粗さを示すという特徴をもつことが明らかとなった.今年度は,HIP窒素化ケイ素について,球-平板接触化におけるき裂進展挙動を検討するとともに,せん断応力下でのき裂進展挙動の特徴を明らかにした.1.き裂進展駆動力転走軌道上中央部に位置し,球の転走方向と直角に進展するき裂の進展量が極めて顕著である.このき裂に注目し,その進展挙動をより詳細に検討した.進展挙動の評価には,Hansonの接触応力分布解析法とFabrikantの応力拡大係数法を適用した.評価の結果,き裂は表面近傍の浅い領域を進展しているときは,主としてモードI型の進展をするが,深く進展するにつれて,モードII型進展が支配的となることが明らかとなった.また,接触面に摩擦力が発生するすべり-転がり接触条件下でもき裂の進展が観察され,その進展量は転がり接触下よりも大きいことが明らかとなった.その理由についても検討した結果,摩擦力が進展駆動力,特に,K_Iを増加させることが明らかとなった.2.せん断応力下でのき裂進展挙動球接触下で実現されている異位相における複雑な混合モード下でのき裂進展挙動を解明するため,人工的微小欠陥を付与したセラミックス試験片に,ねじり疲労試験機による応力比を変化させたせん断応力を付加することにより,各種応力比のもとでのモードII型き裂進展挙動の観察を行った.また,これと平行して,モードIで破壊した試験片の破面とモードIIで破壊した試験片の破面について,走査電子顕微鏡とレーザ顕微鏡によるき裂進展面の破面解析を行った.その結果,進展挙動は,K_<max>と△Kの両者に支配されることが明らかとなった.また,破面の特徴に関しては,モードI型とモードII型に大きな相違は見られなかったが,圧縮応力が負荷された場合のモードII型破面は,極めてなめらかな粗さを示すという特徴をもつことが明らかとなった.本年度は,実機セラミックスベアリング材料として最有力であるHIP窒化ケイ素を中心に,球-平板接触下におけるき裂進展の様子を実験的に検討した.特に,30ミクロン程度の小さな初期欠陥からのき裂進展挙動の解明に重点をおいた.これにおよぼす諸因子の影響の解析を行うため,摩擦力ならびに実時間モニタリングを可能とした試験機を用いて,転がり疲労試験を行った.摩擦係数がほぼ0の転がりと球の動きを拘束したすべりの2条件で試験を行い,微小な初期欠陥からのき裂進展の観察を行った.また,内部方向へのき裂進展挙動ならびに分岐する様子の観察を,疲労試験を途中で中断して,縦割り断面観察により行なった.その結果,き裂の位置と方向によって進展挙動が異なること,また特に,表面近傍の接触領域の中央部分では,き裂が大きく進展するとともに,内部方向へも深く進展することが明らかとなった.また,内部では複雑な分岐挙動を示すことも明らかとなった.さらに,その結果を,Hansonによる接触応力分布の解析解に基づき,応力拡大係数によって評価し,観察したき裂進展挙動を検討した結果,表面近傍では,モードI進展すること,また,内部では圧縮応力下にもかかわらず,モードII進展する可能性のあることが明らかとなった.そこで,走査電子顕微鏡とレーザ顕微鏡によりき裂進展面の破面解析を行い,進展モードの同定を行ったところ,表面近傍では,モードIで進展するが,内部に進展するに従い,モードIIで進展することが明らかとなった.今年度は,HlP窒化ケイ素について,球-平板接触下におけるき裂進展挙動を検討するともに,せん断応力下でのき裂進展挙動の特徴を明らかにした.

1.き裂進展駆動力転走軌道上中央部に位置し,球の転走方向と直角に進展するき裂の進展量が極めて顕著である.このき裂に注目し,その進展挙動をより詳細に検討した.進展挙動の評価には,Hansonの接触応力分布解析法とFabrikantの応力拡大係数法を適用した.評価の結果,き裂は表面近傍の浅い領域を進展しているときは,主としてモードI型の進展をするが,深く進展するにつれて,モードII型進展が支配的となることが,明らかとなった.また,接触面に摩擦力が発生するすべり一転がり接触条件下でもき裂の進展が観察され,その進展量は転がり接触下よりも大きいことが明らかとなった.その理由についても検討した結果,摩擦力が進展駆動力,特に,K_Iを増加させることが明らかとなった.2.せん断応力下でのき裂進展挙動球接触下で実現されている異位相における複雑な混合モード下でのき裂進展挙動を解明するため,人工的微小欠陥を付与したセラミックス試験片に,ねじり疲労試験機による応力比を変化させたせん断応力を負荷することにより,各種応力比のもとでのモードII型き裂進展挙動の観察を行った.また,これと平行して,モードIで破壊した試験片の破面とモードIIで破壊した試験片の破面について,走査電子顕微鏡とレーザ顕微鏡によるき裂進展面の破面解析を行った.その結果,進展挙動は,K_<max>とΔKの両者に支配されることが明らかとなった.また,破面の特徴に関しては,モードI型とモードII型に大きな相違は見られなかったが,圧縮応力が負荷された場合のモードII型破面は,極めでなめらかな粗さを示すという特徴をもつことが明らかとなった.
麻疹ウイルスの感染防御に関与するエンベロープ糖蛋白質の立体構造に関する研究

麻疹ウイルスのH及びF蛋白質はウイルス感染に際し感染防御抗原として重要である。我々はこれまでに、これら蛋白質の構造解析等を目的として研究を進め、ウイルス粒子よりある種の蛋白分解酵素を用い、HA活性を損なう事なくH蛋白質を可溶化しうる事を示した。本研究では、バキュロウイルスベクターを用い、組換え体分泌型H及び蛋白質を大量に発現する事を目的とした。麻疹ウイルス豊島株のcDNA上で、H及びF遺伝子の細胞質及び膜貫通ドメインを除き、さらにH蛋白質に対してはインフルエンザウイルスA/Japan株(H3亜型)HA蛋白シグナル配列を含む16残基をつないだ。PCRによって増幅したDNA断片をバキュロウイルスベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、野生型バキュロウイルスのDNAと共に昆虫細胞にトランスフェクションし組換え体バキュロウイルスを得た。ウイルス感染細胞には麻疹ウイルスに対する抗H及び抗F単クローン抗体で免疫沈降する分子量70Kと40Kの組換え体H及びF蛋白質が検出された。次に、パルス標識したこれら蛋白質をチュースしその挙動を解析すると、H蛋白質は徐々に培養液中に検出され、チュース4時間目で標識されたH蛋白質の約20%、さらに24時間では80%が培養液中へ分泌された。一方、F蛋白質では、培養液中に分泌されるが、すぐに分解されるためかF蛋白質の減少が見られた。以上の結果より組換え体バキュロウイルスの作成のために用いた、インフルエンザウイルスのHA蛋白のリーダーSequenceは分泌型H蛋白質を大量に回収する手段として有効であった事が示された。さらに、本年度は分泌型H蛋白質を大量に回収するために抗体を用いたアフィニテイクロマトグラフィとゲルろ過クロマトグラフィによって精製を行った。この性状を調べると分子量70Kのモノマーであった。また、赤血球凝集活性を示さなかった。本研究では、バキュロウイルスベクターを用い、組換え体分泌型H及びF蛋白質を大量に発現する事を目的とした。PCRによって増幅したDNA断片をバキュロウイルスベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、野性型バキュロウイルスのDNAと共に昆虫細胞にトランスフェクションし組換え体バキュロウイルスを得た。次に、パルス標識したこれら蛋白質をチェ-スしその挙動を解析すると、H蛋白質は徐々に培養液中に検出され、チェ-ス4時間目で標識されたH蛋白質の約20%、さらに24時間では80%が培養液中へ分泌された。一方、F蛋白質では、培養液中に分泌されはするものの、すぐに分解されるためかF蛋白質の減少が見られた。

今後は得られたこれらの蛋白質の生物活性並びに構造等の解析を行いたい。麻疹ウイルスのH及びF蛋白質はウイルス感染に際し感染防御抗原として重要である。我々はこれまでに、これら蛋白質の構造解析等を目的として研究を進め、ウイルス粒子よりある種の蛋白分解酵素を用い、HA活性を損なう事なくH蛋白質を可溶化しうる事を示した。本研究では、バキュロウイルスベクターを用い、組換え体分泌型H及びF蛋白質を大量に発現する事を目的とした。麻疹ウイルス豊島株のcDNA上で、H及びF遺伝子の細胞質及び膜貫通ドメインを除き、さらにH蛋白質に対してはインフルエンザウイルスA/Japan株(H3亜型)HA蛋白シグナル配列を含む16残基をつないだ。PCRによって増幅したDNA断片をバキュロウイルスベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、野生型バキュロウイルスのDNAと共に昆虫細胞にトランスフェクションし組換え体バキュロウイルスを得た。ウイルス感染細胞には麻疹ウイルスに対する抗H及び抗F単クローン抗体で免疫沈降する分子量70Kと40Kの組換え体H及びF蛋白質が検出された。次に、パルス標識したこれら蛋白質をチェ-スしその挙動を解析すると、H蛋白質は徐々に培養液中に検出され、チェ-ス4時間目で標識されたH蛋白質の約20%、さらに24時間では80%が培養液中へ分泌された。一方、F蛋白質では、培養液中に分泌されるが、すぐに分解されるためかF蛋白質の減少が見られた。以上の結果より組換え体バキュロウイルスの作成のために用いた、インフルエンザウイルスのHA蛋白のリーダーSequenceは分泌型H蛋白質を大量に回収する手段として有効であった事が示された。さらに、本年度は分泌型H蛋白質を大量に回収するために抗体を用いたアフィニテイクロマトグラフィとゲルろ過クロマトグラフィによって精製を行った。この性状を調べると分子量70Kのモノマーであった。また、赤血球凝集活性を示さなかった。
新規制癌剤の創製を指向した極微量イソキノリン海洋天然物の実用的供給手段の開発

新規制癌剤の開発リード化合物としてタイ国チュラロンコーン大学薬学部カニ博士の協力のもと、バンコク東側に位置するチョンブリ地方・シーシャン島沿岸に生息する青色海綿Xestospongia sp.のメタノール浸透液を青酸カリウム前処理後、抽出、分離精製してレニエラマイシンM(RM)をはじめとする6つの新規イソキノリン天然物を獲得した。次に、二次代謝産物の安定誘導体であり、グラムスケールで得られたRMから既知天然物レニエラマイシンE(RE)、J(RJ)およびジョルマイシンへの変換経路を開発した。また、各種誘導体を合成し、ヒト実験腫瘍細胞に対する細胞毒性試験を実施し、それらの制癌活性を評価した。さらに、REやジョルマイシンの分解反応によるミモサマイシンやレニエロンの生成を確認し、その反応機構を提唱した。この結果、これまでアジア沿岸に生息する様々な海洋生物の二次代謝産物として報告されてきたシンプルイソキノリン海洋天然物がレニエラマイシン類の分解生成物である可能性を提示した。一方、海綿を餌として生息するウミウシ,Jornna funebrisの探索研究を展開し、ジョルナマイシンA-Cの単離、構造解析を展開した。さらに、本系天然物の恒久的な供給手段の開発を目的として原海洋生物の生態調査を実施し、養殖に必要な基礎的情報とその解析を行った。また、逆合成解析から立案した合成経路に従い、RMの全合成研究を展開し、基本骨格の構築に成功した。以上のように新規制癌剤のリード化合物として世界的に注目を集めながら、天然物として供給が困難であることから様々な研究が進展しなかったレニエラマイシン系海洋天然物の実用的供給手段の開発に成功し、本系天然物を基盤とする創薬研究の展開に必要な基盤的情報を提供できた。なお、本研究成果に対して本研究者が所属する明治薬科大学は平成18年度、日本学術振興会・「アジア・アフリカ学術基盤形成事業」の拠点大学として採択されたことから、本研究は関連諸国の研究者の協力のもと、さらなる発展が期待される。2001年12月にタイ国バンコク東側に位置するチョンブリ地方、シーシャン島沿岸に生息する青色海綿Xestospongia sp.(湿重量、8.4kg)のメタノール浸透液をリン酸緩衝液によりpH7に調整してから、10% KCN水溶液処理、続く分配抽出により得たアルカロイド含有画分(16.2g)から主成分としてrenieramycin M (RM:1.822g)を得た。次にマイナー成分の探索を実施した結果、5つの新規天然物、RN(247mg)、RO(43.5mg)、RQ(18.5mg)、RR(101.2mg)、RS(15.0mg)か得られた。またRM→RE(69.6%)、RM→RJ(69.6%)、RM→RR(35.1%)、RN→RO(69%)など本系既知極微量成分への変換に成功した。またRMからインドのマンダパン湾に生息する海洋生物Jorunnafunebrisの極微量代謝産物として最近報告されたJorumycinへの変換に成功した。さて、本系海洋天然物の単離にあわせてrenieroneやmimosamycinなどのシンプルイソキノリンアルカロイドが見いだされている。しかしながら、我々が考案した原海洋生物のKCN前処理を組み込んだ探索研究ではこれらのアルカロイドが全く得られない。一方、カルビノールアミン単位を含むREやjorumycinは化学的に不安定であり、クロロホルム中、室温で放置すると徐々に分解する現象を見いだした。

そこでこれらをクロロホルム中、触媒量のプロトン酸と酸化剤共存させて積極的に分解させたところRMからrenieroneとmimosamycinが、またjorumycinからrenierol acetateとmimosamycinが得られることを明らかにした。また、その斬新な分解機構を推定した。さらに天然物の化学的変換により様々なrenieramycin誘導体を合成し、HCT116、QG56、DY145などのヒト実験腫瘍細胞に対する生物活性試験を実施した。その結果、ナノモルスケールで活性を示すいくつかの化合物を見いだすとともに、7位に水酸基あるいはCN基や2つのキノン環の存在が活性の発現には必須であることを明らかにした。なお、9位側鎖エステルを加水分解しても活性が維持される点は興味深い。一方、RMを標的とする全合成研究を展開し、その基本骨格の構築に成功した。新しい制癌剤のリード化合物として世界的に注目されているレニエラマイシン系極微量海洋天然物の実用的供給手段として昨年度、タイ国に生息する青色海綿Xestospongiaの化学的に不安定な二次代謝物をKCN前処理による安定化に続く抽出分離操作によりグラムスケールで誘導することに成功した。本年度、まず青色海綿に共生するウミウシJorunna funebrisを採集し、外套膜、内臓、および卵の3つの部分に分け、それぞれの二次代謝物の探索を実施した。その結果、Jorunnamycin A-Cと命名した3つの新規天然物を見出し、各種機器スペクトルの詳細な解析から構造を推定した。続いて、青色胃海綿の主アルカロイドであるrenieramycin Mの化学変換によりJorunnamycin A及びCへの変換を達成した。また、Jorunnamycin Bへの変換ではその特徴的な右半部構造単位の構築に必要な合成手段を確立するとともに、2,3の天然物の化学変換に成功した。現在、renieramycin MからJorunnamycin Bへの変換を実施している。一方、本系天然物の恒久的な供給手段の確立をめざして、全合成研究を展開し、5環系基本骨格の構築に成功した。現在、側鎖の導入について検討している。なお、これらの研究を展開する過程においてレニエラマイシン系天然物の側鎖の変換手法を開発できたので、様々な誘導体の合成か可能となった。そこで、各種誘導体の合成と生物活性試験を実施した。その結果、ヒト実験腫瘍細胞に対してナノモルスケールで活性を示す化合物を見出した。本系天然物が発見されてから四半世紀が経過している。ユニークな構造と興味ある生物活性に興味が持たれていたにも関わらず、様々な研究を展開するうえで、これまでサンプルの供給がたいへん困難であったが、今回の研究により創薬に関する様々な領域における研究を展開することが可能になった。
紡錘体形成チェックポイントに関与するZW10の間期における機能とその活性制御機構

細胞内において、小胞体(タンパク質の合成工場)で合成されたタンパク質をゴルジ体(タンパク賓の貯蔵庫)に正しく輸送することは極めて重要な現象である。我々は以前の研究により、小胞体上のt-SNAREであるsyntaxin18(Syn18;小胞体-ゴルジ体間の輸送に関与)が細胞周期に関わるタンパク質(ZW10、RINT-1)等と複合体を形成していることを見いだし、ZW10が小胞体-ゴルジ体間のタンパク質輸送に関わっていることを明らかにした。しかし、RINT-1のSyn18複合体における機能は明らかにはなっておらず、本研究はRINT-1の機能解析を目的とし着手した。まず、RINT-1の欠失変異体を用いた解析から、RINT-1のZW10のみと結合する領域(RINT-1のアミノ末端領域)を発現させると、ZW10が小胞体から解離した状態で検出された(発現したRINT-1のアミノ末端領域がZW10を小胞体から排除)。さらに、RINT-1の欠失変異体を用いた解析から、RINT-1の発現抑制がZW10を小包体から除去し、小胞体からのタンパク質輸送に影響を与えることを明らかにした。細胞内での物質の輸送は、ダイニン/キネシンという二つのモータータンパク質により仲介されている。ZW10はタイニンのアクセサリータンパク質であるダイナクチン複合体のサブユニットと結合することが知られている。そこで、ZW10とダイニンーダイナクチン複合体の相関関係を調べていた。その過程において、ノルジヒドログアイアチン酸(NDGA)という薬剤で細胞を処理するとZW10が中心体付近(ダイニンが向かう先)に局在変化しているという知見を見いだした。また、NDGAはダイニン-ダイナクチン複合体も中心体付近に集積させるという効果を持っていることも見いだした。今回発見したNDGAの薬理作用は、ダイニン-ダイナクチン複合体およびそれの結合タンパク質の解析に極めて有用であると考えられる。今までの研究から、紡錘体形成チェックポイントタンパク質であるZW10が小胞体-ゴルジ体間のタンパク質輸送に関与していることを見い出しており、本研究ではZW10の小胞輸送における具体的な機能の解明を目的として着手した。実績1:NDGAによるZW10の局在変化に関してNDGAは初め、リポキシゲナーゼの阻害剤として同定されていた薬剤であったが、このNDGAがダイニン-ダイナクチン複合体を中心体に集積させるという知見を見い出した。さらに、NDGAによってダイニン-ダイナクチン複合体を中心体に集積させた際、ZW10もその局在を中心体に変化させた。これらの結果から、ZW10の局在はダイニン-ダイナクチンの局在に依存している可能性が示唆され、ZW10が間期において小胞体から出芽した小胞とダイニン-ダイナクチンを繋ぐ膜受容体として機能しているという仮説を証明できる一つの証拠であると考えている。また、NDGAはZW10のみならず、ダイニン-ダイナクチンと結合するタンパク質の局在も中心体に変化させたことから、NDGAはダイニン-ダイナクチンの機能を亢進させている可能性が示唆され、NDGAがダイニン依存的な輸送の解析に有用な薬剤になると考え、現在投稿用論文を作製中である。実績2:RINT-1の機能解析ZW10はSyntaxin18複合体において、RINT-1と直接結合していることが明らかになっているが、RINT-1のSyntaxin18複合体での機能は不明であった。そこで、RINT-1とZW10の結合部位を同定した結果,RINT-1のアミノ末端領域でZW10と結合しており、その領域を発現させるとZW10の小胞体局在が顕著に減少した。また、RINT-1の発現抑制を行ったところ、初期輸送過程に位置するオルガネラの分散を引き起こした。また、RINT-1の発現抑制はSyntaxin18複合体に含まれるZW10の量を減少させた。以上の結果から、RINT-1はZW10をSyntaxin18複合体にリクルートする機能を有しているとしてMolecular Biology of the Cellに現在、論文を投稿中である。

ZW10はタイニンのアクセサリータンパク質であるダイナクチン複合体のサブユニットと結合することが知られている。そこで、ZW10とダイニンーダイナクチン複合体の相関関係を調べていた。その過程において、ノルジヒドログアイアチン酸(NDGA)という薬剤で細胞を処理するとZW10が中心体付近(ダイニンが向かう先)に局在変化しているという知見を見いだした。また、NDGAはダイニン-ダイナクチン複合体も中心体付近に集積させるという効果を持っていることも見いだした。今回発見したNDGAの薬理作用は、ダイニン-ダイナクチン複合体およびそれの結合タンパク質の解析に極めて有用であると考えられる。
シャトル・スタミナテスト(SST)による中・高年齢者の評価法について

全身持久力の測定・評価法については、生理学的には最大酸素摂取量(VO_2max)が最も適当な指標とされているが、特定の機器や専門的な知識・技術が必要であり、また多人数を短時間に測定することが難しい。一方、簡便なフィ-ルドテストとしての踏み台昇降テストには、最大酸素摂取量との相関に疑問があり、持久走テストには、広いグラウンドを必要とするという難がある。そこで、申請者らは、屋内の10m区間を3分間全力で往復する際の走距離で持久性を評価する「シャトル・スタミナテスト(Shuttle Stamina Test;以下SSTと略す)」を考案し、その妥当性と安全性を検討してきた。本研究では、このSSTにおける中・高齢年齢者のための評価基準(評価表)を作成するため、本テストを2050歳代の健康な男性計1503名に適用し、次の成果を得た。1.SST以外の体力テストも同時に行い、Tスコアを用いた統計手法で加齢に伴う低下を調べたところ、SSTにおける低下は、立位体前屈、閉眼片足立ち、垂直跳びの低下より明らかに小さく、反復横跳び、上体起こし、垂直跳びの低下と同等の大きな低下(50歳代には20歳代の55ー65%)を示した。2.SST成績における年齢階級別の度数分布の正規性を検討したところ、すべての年齢階級で統計的に有意な正規性が認められたため、平均値±0.5標準偏差を「普通(3)」とする5段階の評価基準(表)を作成した。3.この評価基準を某企業の健康男性361名(無作為抽出)に適用したところ、各年齢階級の分布が「3」を中心とした正規性を示し、評価基準の有効性が確認された。
フォトクロミック分子の電子機能変化を用いた有機半導体メモリ

フォトクロミック・ジアリールエテンは、光反応に伴って変化する両異性体が熱安定性を有し、高い耐久性を有する分子である。この分子は次世代の情報記憶材料として期待されており、光反応を用いる次世代高密度フォトンモード光メモリ材料として検討されている。本研究では、光反応ではなく電気的なキャリア注入による有機半導体メモリへの応用研究を行った。分子に電子やホールなどのキャリア注入を行うには、その分子がキャリア受容性を有すことが重要である。そこで電子受容性であるオキサジアゾール基とホール受容性であるトリフェニルアミン基を有する非対称型ジアリールエテン分子を設計し、その蒸着薄膜に対してキャリア注入を行うことで初めてキャリア注入による異性化反応に成功した。これにより超高密度記憶が可能な有機半導体分子メモリの新原理が実証された。さらに光照射によるメモリ素子の消去のセル選択性(ランダムアクセス消去)を確保するために、電界印加による光異性化反応感度制御を試みた。ジアリールエテン膜の着色状態膜に対して種々の波長の光照射を行い外部に取り出される光電流を調べた。外部光電流は光励起状態分子からHOMO・LUMOレベルのホール・電子が移動し、電極を通じて取り出されたことになり、励起状態が強制的に基底状態に戻されることを意味している。実験結果によれば光の波長が短いほどこの外部キャリア生成効率は高く、約1V/nm程度の電界で数十%程度の効率が得られることが判明した。これはこの電界強度では光異性化反応の量子収率が大幅に制御できる可能性を示していることになる。尚、本研究を遂行中に偶然、特定のジアリールエテンにおける異性化状態に依存した特異なマグネシウム蒸着選択機能を発見した。これは有機メモリの微細な電極形成に応用可能であり、当該分野に大きな影響を与える技術になるであろう。フォトクロミック・ジアリールエテンは、次世代の情報記録様材料として期待されている。従来は光反応を用いたフォトンモード光メモリ材料として検討されてきたが、今回有機半導体メモリへの応用の可能性を探求した。電流注入によりジアリールエテン分子に異性化反応を起こすには、電子とホールの両方をキャリアするバイポーラー性分子の開発が不可欠である。これまでに分子中のアリール基をトリフェニルアミンにより修飾することでホール輸送性を持つことは知られていたが、今回さらに電子輸送性をも有する分子として、アリール基をオキサジアゾール基で修飾した非対称型ジアリールエテンを用いた実験を行った。ITOガラス基板上に、ホール輸送層としてα-NPB層、さらに上記ジアリールエテン層を順に真空蒸着により形成し、Mg陰極を形成して、紫外光照射により得た着色状態を初期状態とした上で、電圧を印加し電流注入を行った。その結果、電流注入により電流の絶対量が低下し、またこの低下した電流値は紫外線照射で復帰することが確認出来、有機半導体メモリの動作原理が確認された。また本メモリに最適な分子構造を目指して、アリール基をカルバゾール基で修飾したジアリールエテン分子も開発中である。ジアリールエテン薄膜へのキャリア注入・輸送メカニズムに関しては、同薄膜が着色状態とはいえ閉環体、開環体両異性体の混合状態で形成されていることから、単純なエネルギーバンドモデルでは説明しきれない面がある。そこで、同薄膜へのホール注入・輸送メカニズムを明らかにするために、異性化の比率と電流特性の関係を詳しく調べた。その結果、着色体(閉環体)10-20%程度までの低異性化比率までは、開環体分子中にイオン化ポテンシャル値の異なる閉環体が存在することによるキャリアトラップにより、プールフレンケル型のメカニズムにより電流が制限されていることが明らかとなった。

フォトクロミック・ジアリールエテンは、光反応に伴って変化する両異性体が熱安定性を有し、高い耐久性を有する分子であり、次世代の情報記憶材料として期待されている。従来は光反応を用いたフォトンモード光メモリ材料として検討されてきたが、今回新たに有機半導体メモリへの応用を目的として、ジアリールエテン膜に対して電極からのキャリア注入による分子の励起による異性化反応を用いた分子メモリとしての研究を行った。特に蒸着ジアリールエテン薄膜へのキャリア注入による異性化反応に関しては前年度に原理実証を行ったので、今年度は新たに光照射によるメモリ素子の消去のセル選択性(ランダムアクセス消去)を確保するために、電界印加による光異性化反応感度制御を試みた。さらに、ユビキタスコンピューティング分野で使用可能な超低コスト有機メモリの実現を目指し、ウェットプロセスで製造可能なポリマー系半導体メモリの基礎物性解明を目的として、フォトクロミック分子ドープポリマーへのキャリア注入特性を調べた。電界印加による光異性化感度制御については、ジアリールエテン膜の着色状態膜に対して種々の波長の光照射を行い外部に取り出される光電流を調べた。外部光電流は光励起状態分子からLUMOレベルの電子、HOMOレベルのホールが移動し、有機膜から電極を通じて取り出されたことを示しているので、励起状態からの異性化反応が強制的に抑えられて基底状態に戻されることを意味している。実験結果によれば光の波長が短いほどこの外部キャリア生成効率は高く、約1V/nm程度の電界で数十%程度の効率が得られることが判明した。これはこの電界強度では光異性化反応の量子収率が大幅に制御できる可能性を示していることになる。フォトクロミックポリマーへのキャリア注入実験の結果によれば、蒸着薄膜と同様にドープされたジアリールエテンが閉環体の時に高いキャリア注入特性を示すことがわかった。膜中でのホール伝導に関しては、蒸着膜では閉環体でポテンシャルバリアが低くなることがホール伝導が向上する原因となっていたが、フォトクロミックポリマーの場合は同じモデルでは説明が困難で、今後さらに調査・研究を行っていく必要がある。尚、本研究を遂行中に偶然、特定のジアリールエテンにおける異性化状態に依存した特異な蒸着メタル選択機能を発見した。これは有機メモリの微細な電極形成に応用可能であり、当該分野に大きな影響を与える技術になるであろう。
音楽療法による味覚改善法の開発

予備実験より味覚試薬の濃度および被験音の条件を以下のように決定した。すなわち味質は、甘味と塩味の2種類とし、濃度は各々0.1、0.05、0.01、0.005(モル濃度)の、4種類とした。被験音は、音圧レベル5070dBで周波数を10Hz、4000Hz、20KHzの3種類とした。音の高低(Hz)が味覚閾値に及ぼす影響について検討を行った。被験者として全身性疾患の認められない正常有歯顎者18名(平均年齢21.3歳)を選択した。その結果、甘味は、20KHzの音刺激により味覚閾値が上昇する傾向を示した。音楽には癒しの効果があるということは周知の事実であり、人が癒される音楽を聴いたとき味覚の閾値になんらかの影響を及ぼす可能性が考えられる。しかし、音や音楽が味覚閾値に影響を及ぼすか否かについては、全く明らかにされていない。本研究は種々の音や音楽が味覚閾値に及ほす影響を明らかにするとともに、味覚機能低下を改善する音楽療法を構築しようとするものである。また、味覚をつかさどる神経は、脳神経系の舌咽神経と顔面神経と迷走神経である。その間から分岐する神経が、内耳神経である。味覚障害の原因は刺激を受けた味蕾の数に対する刺激感覚だけではなく、歯、舌、口唇、口腔粘膜への接触感、視覚、嗅覚ともに総合的に評価され精神心理的な要素も大きく左右する。従って、聴覚を刺激することでも味覚に影響を及ぼすことが推測される。本研究によって音や音楽の味覚閾値に及ぼす影響が明らかになり、味覚機能低下の改善に有用な音楽療法が構築されれば、より快適な食生活、さらにはQOLの向上が可能となり、歯科医学的に極めて有意義であると考える。本年度は予備実験を行い、男性5名女性2名計7名の被験者を用いて味覚試薬の濃度および被験者の条件を決定した。すなわち味覚は、甘味(スクロース)・塩味(塩化ナトリウム)の2種類とし、濃度は0.100、0.050、0.010、0.001(mol/l)の4種類とした。被験音は、音圧レベル50dB(静かな公園)70dB(電車の車内)で周波数を10Hz4000Hz、200000Hzの3種類とした。現在、この実験条件で正常有歯顎者を対象に、データの採取を行っている。本研究は種々の音や音楽が味覚閾値に及ぼす影響を明らかにするとともに、味覚機能低下を改善する音楽療法を構築しようとするものである。一昨年度の予備実験より味覚試薬の濃度および被験音の条件を以下のように決定した.すなわち味質は、甘味と塩味の2種類とし、濃度は各々0.1、0.05、0.01、0.005(モル濃度)の4種類とした。昨年度は、音の高低(Hz)が味覚閾値に及ぼす影響を検討した。今後は、得られたデータの分析を行っていく。
時期特異的な発がん感受性におけるbivalentヒストン修飾の意義の解明

本研究では、時期特異的な発がん感受性の機構を明らかにする目的で、乳腺におけるbivalent修飾の解析を行った。ラット乳腺上皮細胞のChIP-chipから、高感受性時期の乳腺上皮細胞に特異的なbivalent遺伝子91個を抽出した。その内、乳腺腫瘍でDNAメチル化を受けているのは7遺伝子であった。4遺伝子は、正常乳腺上皮細胞で低発現であり、ヒト乳がんでメチル化サイレンシングのがん抑制遺伝子も含まれていた。以上のことから、発がん物質に高感受性時期の乳腺のbivalent遺伝子が同定された。それらの一部は、がんでDNAメチル化されており、発がんにおけるbivalent修飾の意義が示唆された。第二次性徴期の乳腺は環境要因に対して感受性が高い事が知られているが、その分子機構は未だ明らかになっていない。申請者はこれまでに、ラット乳腺上皮細胞のChIP-chipを行い、発がん物質に対して高感受性時期の細胞では、低感受性時期に比べて、bivalent修飾を有する領域が増加していることを見いだしている。そこで本研究では、時期特異的発がん感受性の機構をエピジェネティクスの観点から明らかにする目的で、高感受性時期の乳腺におけるbivalent修飾の意義の解析を行っている。1年目の本年度は、乳腺上皮細胞のChIP-chipデータの詳細な解析を行った。まず、高感受性時期(7週齢)の乳腺上皮細胞において特異的にbivalent修飾を有する遺伝子91個を抽出した。そのgene ontology解析から、Notchシグナル・kinase活性・細胞接着に関わる遺伝子が濃縮された。次に、これら91遺伝子に関して、発がん感受性への関与を推定するために、自らの樹立したラット正常乳腺上皮細胞・変異原物質PhIPおよびDMBA投与のラット乳がん・乳がん細胞株におけるDNAメチル化データとの統合解析を行った。その結果、6個の遺伝子が、正常乳腺上皮細胞ではメチル化されておらず、乳がん・乳がん細胞株でメチル化されており、乳腺発がんに関与するbivalent遺伝子の候補として抽出された。その中には、細胞間相互作用に関わるがん抑制遺伝子、乳腺発がんに関わる遺伝子も含まれていた。今後は、より高感度・高精度な解析を行うために、乳腺上皮幹細胞を単離し、ChIP-sequencingを行う。また、本年度に抽出した6遺伝子に関して、高感受性・低感受性時期乳腺上皮細胞および乳がんにおける発現解析を行い、発がんへの関与を解析する。さらに、乳腺組織切片を用いたbivalent修飾の可視化を試みる。申請時の計画通り、高感受性時期の乳腺上皮細胞特異的なbivalent遺伝子で、かつ、正常乳腺ではDNAメチル化されておらず、乳がんでDNAメチル化されている遺伝子を同定できた。また、今後必要となる技術のひとつであるsequential ChIPの条件検討と最適な抗体の同定も進めることができた。よって、おおむね順調に進展していると考えられる。私はこれまでに、発がん物質に高感受性時期のラット乳腺上皮細胞では、低感受性時期に比べて、bivalent領域が増加していることを見いだしている。本研究では、時期特異的発がん感受性の機構をエピジェネティクスの観点から明らかにする目的で、高感受性時期の乳腺におけるbivalent修飾の意義の解析を行っている。最終年度である本年度では、高感受性時期の乳腺上皮細胞において特異的なbivalent遺伝子である91遺伝子について詳細な解析を行った。正常幹細胞のbivalent遺伝子は、がんでDNAメチル化されやすいことが知られているので、独自のラット乳腺腫瘍DNAメチル化データを用い、乳がんでメチル化されているのは7領域を抽出した。また、正常乳腺上皮細胞で低発現の4遺伝子(Cnnm3, Higd1a, Leprel1, Mdga2)、高発現の1遺伝子(Noth3)を同定した。Leprel1は、ヒト乳がんでメチル化サイレンシングされているがん抑制遺伝子であった。現在は、過剰発現およびノックダウンの準備を行っている。さらに、切片を用いたbivalent修飾の可視化のために、現在、マウス大腸の組織を用いたヘテロクロマチン修飾の組合せの可視化に成功している。以上のことから、発がん物質に高感受性時期の乳腺において特異的なbivalent遺伝子が同定された。それらの一部は、がん抑制遺伝子であり、bivalent修飾の意義が示唆された。平成28年度は、乳腺上皮幹細胞を用いたChIP-sequencingを集中的に行う。また、本年度に抽出した

6遺伝子中に、乳腺発がんとの関与が報告されている3遺伝子が含まれていたので、それらに関する詳細な解析を進める。同時に、乳腺組織切片を用いたbivalent修飾の可視化を試みる。分子生物学