hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ細孔とイオンチャンネル中のイオンの水和と輸送現象

ナノサイズの空間における構造と相挙動および物質移動、イオンチャンネルを想定した水と種々のイオンのダイナミクスの微視的描像を確立することを目的とする。これまでに見出された制約空間における水の特異な相挙動に加えて、異方かつ限定的な水和によるイオンの輸送過程を、計算機シミュレーションにより明らかにした。ナノ細孔としてクラスレートハイドレートと呼ばれる水が作る籠状の空間について、ゲスト分子の種類により結晶構造はどのような影響を受けるかどうかについて詳細に調べた。水は広い温度圧力領域において数多くの結晶多形を有し、それは水分子の持つ水素結合能に深く依存していることは、その四面体構造から明白である。これらは氷IhからIXとして知られ、いくつかはプロトンの位置に自由度がある、したがって有限の残余エントロピーを有し、他の配置の決まった結晶では誘電率は非常に小さい。また、疎水分子を取り込んだ包接水和物も、完全な水素結合をした空間に小さな分子が閉じ込められた物質であり、幾つかの結晶型が知られている。この包接水和物は水単独では不安定であり、ゲスト分子との共存ゆえに安定に存在することができる。最近、さらに小さいヘリウムや水素を包接した氷II(以下C1)と水素を包接した氷Icが(以下C2)発見された。氷IIはc軸方向に直径0.3nm程度の円筒状の空間が存在し、これらに水素が包接されるとその水との比は1:6であることが知られている。また、氷Icはダイアモンド型の配置であり、体心立方格子の半分だけが占有されている。残りが水により占有された結晶が氷VIIであるが、水素で占有されたものが、この包接氷である。したがって、この場合には水と水素の比は最大1:1となる。これらの化合物は低温高圧で安定であるが、そのほかの生成条件や水素の包接量は不明な点が多い。これらは、基本的に包接水和物に分類され、したがってvan der WaalsとPlatteeuwの理論により熱力学的安定性は説明され、したがって分子間相互作用のみから広い温度圧力範囲の相図を予測することが可能であるとの見通しをたてた。本年度の研究では、主として分子動力学計算機シミュレーション(NPT/GC MC)と自由エネルギー計算によりこれらについて調べた。その結果、広い温度・圧力・組成範囲における安定相を決定することができた。また、安定相における水素の包接率についても、理論的に予測できることを示した。分子シミュレーションは未知の結晶構造を予測し、相転移現象を調べ、相図を作成するための非常に強力な手法である。ここではその一例として、水が制約空間を形成する場合のクラスレートを取り上げる。クラスレートハイドレートは水分子が水素結合をしたネットワーク構造のなかに存在する0.5-0.6nmの大きさの空洞に、炭化水素、二酸化炭素などがゲスト分子として取り込まれた非化学量論的な化合物の結晶である。クラスレートハイドレートは、ガスの貯蔵、天然ガス資源、海水の淡水化など多様な用途が期待されている。この工業的な利用には、その生成の平衡と速度に関する様々な基礎研究を経て始めて実用段階に達することができる。生成解離の機構を解明して理論的な平衡の予測と安定性に寄与する物理量を評価できれば、実験に対して指針を与える点でも、また経済的な観点からも社会的貢献度は大きいと考えられる。水素は高圧で立方晶氷(Ic)とイオンチャンネルと同様の筒状の氷IIへ取り込まれることが実験的に知られている。しかしながら、その安定性の起源や氷などとの相平衡、また水素の包接量の温度圧力依存性などには不明な点が多い。本研究では、特に高圧における水素ハイドレートの生成・解離に関して、実験に頼らず第一原理から自由エネルギー計算に基づいて、広い温度や圧力範囲における相挙動を再現/予測する方法を確立することを目的とした。そのため、GCMCシミュレーションにより水素の包接量と安定性、また空洞占有の自由エネルギーから熱力学的安定性と相挙動を調べた。イオンチャンネル中の水とイオンの拡散を調べるために、種々の直径のナノチューブ中に閉じ込められた塩化カリウム水溶液の分子動力学シミュレーションを行った。クーロン相互作用は直接イメージセルとの相互作用として計算した。実質的な陽陰両方のイオンの拡散は、1nm以上になり可能となることが明らかとなった。このチューブ直径下において、イオンの配置の交換速度を調べた結果、初期の不利なイオン配列はナノ秒以下で平衡配置に変化することが分かった。また、拡散係数はバルクの値に収束するチューブ直径は、イオンや水の大きさに依存するが、およそ2.5nm程度であることが判明した。ナノ細孔としてクラスレートハイドレートと呼ばれる水が作る籠状の空間がある。格子を形成する水は、通常の氷(六方晶氷)と同様に最近接の水分子と4本の水素結合をしている。しかし、ゲスト分子を収容する空洞が含まれているので、ゲスト分子が全く存在しない仮想的なクラスレートの密度は氷よりも10%程度低い。

普通のクラスレートは、CS-1およびCS-IIと呼ばれる結晶型をとる。このほかに、二種類以上のゲスト分子存在下のみで生成するHS-III型やBr2をゲストとするHS-I型が知られている。メタンやプロパンはCS-IとCS-IIの結晶型をとる。これらの構造以外に安定な構造は無いのか、また、ゲスト分子の種類により結晶構造はどのような影響を受けるかどうかについて詳細に調べた。これらに基づいて・クラスレートハイドレートの熱力学的安定性の理論と包括的な構造探索方法を開発した。ナノサイズの空間における構造と相挙動および物質移動、とりわけイオンチャンネルを想定した水と種々のイオンのダイナミクスの微視的描像を確立することを目的とする。これまでに見出された制約空間における水の特異な相挙動に加えて、異方かつ限定的な水和によるイオンの輸送過程を、計算機シミュレーションにより明らかにした。具体的には、等温かつ軸方向に対する一定圧力条件における、カリウムと塩素イオン水溶液の様々なナノチューブ内における構造とダイナミクスを、分子動力学シミュレーションにより調べた。チューブサイズが1 nm以上では、イオンの安定配置への緩和は初期配置に強く依存するが1 ns以内に完了する。チューブサイズが1 nm以下では軸方向へのイオン交換には非常に長時間要する。このときの安定構造は、正負イオンが交互に軸方向に並んだ配置であるが、イオンの拡散はナノチューブのサイズに対して減少することを見出した。拡散係数がバルクの値に収束するチューブ直径は、イオンや水の大きさに依存するが、およそ2.5 nm程度であることが判明した。ナノ細孔としてクラスレートハイドレートと呼ばれる水が作る籠状の空間がある。格子を形成する水は、通常の氷(六方晶氷)と同様に最近接の水分子と4本の水素結合をしている。普通のクラスレートは、CS-IおよびCS-IIと呼ばれる結晶型をとる。これらに基づいて、クラスレートハイドレートの熱力学的安定性の理論と包括的な構造探索方法を開発した。これまでの既成のソフトウェアを使用したシミュレーションではなく自作のプログラムにより、ナノ空間におけるイオンの水和とダイナミクスを明らかにしつつあること、またそのために境界条件なども自在に設定できる点を勘案すれば、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。イオンチャンネルのモデルとして、より現実的な親水性壁を設定して、イオンのダイナミクスを明らかにすることが必要であり、次年度に実施する予定である。
走査型電気化学/化学発光顕微鏡を用いた酵素触媒界面の電気化学/発光イメージング

本研究では、自作の走査型電気化学顕微鏡(SECM)に発光・蛍光・トポグラフィー計測系をハイブリッドしたシステムにより、ナノメートルレベルの生体機能表面を評価し、デバイス作製や環境センシングへ展開する.これまでの研究で、探針-試料間距離および探針サイズをナノメートルオーダーで制御することを可能にした.これによりイメージングにおける空間分解能の向上のみならず、局所反応誘起に基づくナノリソグラフィーが期待できる.1.我々の計測システムでは、シアーフォース(せん断応力)フィードバック距離制御を採用することにより、プローブ-基板間距離を100nm以下に保持することが可能となっている.基板と垂直方向にプローブを振動させる距離制御プログラムに改良し、イメージングの際生体試料に与える付加を大幅に軽減することができた.具体的には、プローブをxy方向の振動に加えz方向にも作動して距離制御を行うことで、試料に衝突させずに高解像度イメージングが可能となった(防衛大学山田弘博士との共同研究).2.細胞を液中で安定にイメージングすることができた.細胞骨格を蛍光染色した試料の形状・蛍光同時イメージングを検討した.さらに、生細胞をそのままイメージングすることも可能であることを確認した.3.ガラスキャピラリを細尖化したのち、金スパッタ蒸着膜/パリレン蒸着膜の順でコートした.パリレン絶縁膜は安定性に優れ、電極半径70nmのナノ電極を作製できた.電極型(100nm)、光ファイバ型(孔径100nm)、および光ファイバ-電極複合型ナノプローブ各種を作製した.4.デバイス作製技術:プロテインアレイのディメンジョンをナノメートルオーダーにスケールダウンするための要素技術として、ナノ微細加工技術、微粒子配列化技術、極微量サンプルの操作技術が挙げられる.誘電泳動を利用して、微粒子のマニピュレーション、タンパク質-細胞のパターニング技術を確立した.本研究は、局所領域における電気化学的検出などに有効な走査型電気化学顕微鏡(SECM)と、基板表面の局所領域における化学発光を超高感度で検出できる走査型化学発光顕微鏡(SCLM)を組合わせたハイブリッドシステムの構築を目指している.本年度は、プローブ-基板間距離を高精度に制御することにより、本システムの感度および空間分解能を向上させ、実際に固定化酵素などの光機能性界面のイメージングを行い、局所領域における機能解析を実施した.1.プローブ-サンプル間距離制御:SECMプローブにはカーボンファイバーを用い、音叉型水晶振動子に搭載して圧電素子により共振周波数にて振動させた.振動の減衰率が一定になるようフィードバック制御することで、プローブ-サンプル間距離を100nm以下に維持しSECM計測を実施できた.2.測定プローブ作製技術の改良:探針電極絶縁材としてアピエゾンワックスを採用することにより、シアフォースフィードバック走査に十分耐える機械的強度を有するプローブを作製できた.3.抗原-抗体複合体の画像化:プロテインチップの検出系としてシアフォースSECMを適用した場合、空間分解能向上に伴うハイスループット化が期待できる.電極幅、電極間がともに10μmのAuアレイに2-アミンノエタンチオール、グルタルアルデヒドを積層し、さらに坑mouse IgG Fc抗体-ペルオキシダーゼ(HRP)標識mouse IgG複合体を固定化した基板を作製した.過酸化水素0.5mM、フェロセンメタノール(FMA)0.5mMのリン酸緩衝溶液中にて標識酵素反応生成物であるFMA+の還元電流をモニターした.これによりAuアレイ上に固定化した抗原-抗体複合体のSECMイメージ及びトポグラフィーを得ることができた.さらに種々の抗原濃度にてイムノアッセイ(競合法)を実施した.本研究では、自作の走査型電気化学顕微鏡(SECM)に発光・蛍光・トポグラフィー計測系をハイブリッドしたシステムにより、ナノメートルレベルの生体機能表面を評価し、デバイス作製や環境センシングへ展開する.これまでの研究で、探針-試料間距離および探針サイズをナノメートルオーダーで制御することを可能にした.これによりイメージングにおける空間分解能の向上のみならず、局所反応誘起に基づくナノリソグラフィーが期待できる.1.我々の計測システムでは、シアーフォース(せん断応力)フィードバック距離制御を採用することにより、プローブ-基板間距離を100nm以下に保持することが可能となっている.基板と垂直方向にプローブを振動させる距離制御プログラムに改良し、イメージングの際生体試料に与える付加を大幅に軽減することができた.具体的には、プローブをxy方向の振動に加えz方向にも作動して距離制御を行うことで、試料に衝突させずに高解像度イメージングが可能となった(防衛大学山田弘博士との共同研究).2.細胞を液中で安定にイメージングすることができた.細胞骨格を蛍光染色した試料の形状・蛍光同時イメージングを検討した.さらに、生細胞をそのままイメージングすることも可能であることを確認した.3.ガラスキャピラリを細尖化したのち、金スパッタ蒸着膜/パリレン蒸着膜の順でコートした.パリレン絶縁膜は安定性に優れ、電極半径70nmのナノ電極を作製できた.電極型(100nm)、光ファイバ型(孔径100nm)、および光ファイバ-電極複合型ナノプローブ各種を作製した.4.デバイス作製技術:プロテインアレイのディメンジョンをナノメートルオーダーにスケールダウンするための要素技術として、ナノ微細加工技術、微粒子配列化技術、極微量サンプルの操作技術が挙げられる.誘電泳動を利用して、微粒子のマニピュレーション、タンパク質-細胞のパターニング技術を確立した.
シダ類および針葉樹における暗所でのクロロフィル合成関連遺伝子の構造と発現調節

本研究で得られたおもな成果は次の通りである。1.暗所でのクロロフィル合成に関与する遺伝子のうち葉緑体ゲノム上のchlL遺伝子とchlN遺伝子を、シダ類の2種(ワラビ・ホウライシダ)と針葉樹の2種(クロマツ・カラマツ)とからクローン化することに成功し、それらの遺伝子構造の特徴を明らかにした。(1)ワラビ・ホウライシダでは、chlL・chlNの両者とも、RNAエディティングを受けることによってはじめて機能し得る遺伝子産物が生じる可能性を見い出だした。この可能性をRT-PCR法によって検討した結果、ワラビのchlL遺伝子では、RNAエディティングが実際に起きていることが証明できた。(2)暗所でのクロロフィル合成能をもつクロマツに対して、カラマツは、暗所でのクロロフィル合成能力を失っている。しかしカラマツでも、クロマツの場合と同様に、chlLとchlNの両遺伝子とも機能しうる完全な構造が保持されていることが明らかになった。シダ類と針葉樹において、chlL遺伝子とchlN遺伝子の転写パターンをノーザンハイブリダイゼーションによって分析し、両遺伝子の発現様式を解析した。(1)暗所でワラビ・ホウライシダの胞子から原糸体を生育させた場合、いずれの場合も、chlLとchlNの両者の転写産物が検出され、それぞれのコード領域から予想されるサイズであった。一方、転写産物の蓄積量は、それぞれを明所で生育させた場合と顕著な差がないことが明らかになった。以上の結果は、クロマツの芽生えにおいてもまったく同様であった。(2)カラマツを暗所で発芽させると、クロマツの芽生えの場合と違って、黄化芽生えになるにもかかわらず、カラマツでも、chlLとchlNの両遺伝子とも転写産物が検出された。しかし転写産物のプロセジングが異常となっていることがわかった。1.代表的なシダ類であるワラビとホウライシダにおいて、葉緑体DNAからchlL遺伝子に相同な配列をクローン化することに成功した。得られたDNAクローンのヌクレオチド配列を決定し、それぞれのアミノ酸コード領域を解析したところ、ワラビとホウライシダのchlL相同遺伝子では、いずれの場合もRNAエディティングの起きている可能性が高いことを見出だした。下等な維管束植物であるシダ類の葉緑体においてもRNAエディティングが起きているとすれば、それは世界で初めての発見であり、植物におけるRNAエディティング機構の進化を考えるうえできわめて重要な意義をもつ。2.代表的な針葉樹類であるクロマツとカラマツにおいて、chlL相同配列を全DNAからPCRによってクローニングすることを試みた。その結果、カラマツではクローン化に失敗したが、クロマツでは成功した。クロマツのDNAクローンの構造解析を行なったところ、クロマツのchlL相同遺伝子は、シダ類から単離したものと高い相同性を示した。マツ類とシダ類で同定することのできたchlL相同配列は、より下等な光合成生物である光合成細菌や真核ソウ類のchlL相同遺伝子が示す構造上の特徴をよく保持していた。3.本年度の成果をさらに発展させ論文発表するために、今後は、(1)シダ類のchlL遺伝子で見出だしたRNAエディティングの可能性について検討を加えるとともに、(2)暗所ではクロロフィル合成ができないカラマツのchlL遺伝子相同配列をクローン化し解析を行なうことを計画する。これらの研究成果を平成6年に開催される国際植物分子生物学会(6月)および国内の植物生理学会(3月)で発表する。また遺伝学会(10月)ではRNAエディティングの機構と進化についてのシンポジウムを計画準備中である。

(1)ワラビとホウライシダのchlL遺伝子相同配列について昨年度見出したRNAエディティングの可能性を検討した。cDNAの塩基配列をRT-PCR法によって解析した結果、ワラビchlLの場合ではコード領域内の少なくとも6か所でエディティングが起きていることが証明された。この発見は、下等な維管束植物であるシダ類の葉緑体での高頻度のRNAエディティングを示すものであり、植物界におけるエディティング機構の意義と進化を考えるうえで重要な意義をもつ。(2)chlL遺伝子相同配列は、暗所での緑化能のないカラマツにも存在したので、その配列を単離した。構造解析の結果、機能し得る遺伝子構造を保持していることがわかった。chlL相同配列の発現様式をノーザン分析によって調べたところ、暗所で生育させたカラマツ芽生えの場合にも、暗所での緑化能のあるクロマツの場合と同様に高いレベルの転写産物が検出された。(3)暗所でのクロロフィル合成に関わる葉緑体遺伝子のうち、chlL遺伝子とは別のchlL遺伝子に相同な配列をクローン化した。シダ類のホウライシダと、マツ類のクロマツとカラマツから単離できたDNAクローンの構造を解析したところ、いずれのchlN相同配列のコード領域も、他の光合成生物に由来するchlN相同遺伝子が示す構造上の特徴をよく保持していることが明らかになった。(4)これらの成果を国際植物分子生物学会(平成6年6月アムステルダム)および国内の植物生理学会(平成7年3月島根)で発表した。また遺伝学会(平成6年10月大阪)では、シンポジウム「RNAエディティングの機構と進化」を組織開催した。1.色素体遺伝子chlLおよびchlNのクローンと構造解析:暗所でのクロロフィル合成に関与する色素体遺伝子のうち、今年度は、(1)カラマツからchlL遺伝子を単離すると同時に、(2)chln遺伝子を、ワラビ・ホウライシダ・クロマツ・カラマツから単離した。そして、(3)それらの塩基配列を決定し、構造を解析した。その結果、当初の目的の通りに、シダ植物であるワラビ・ホウライシダと裸子植物であるクロマツ・カラマツとの4種すべてから、chlLとchlNの両遺伝子をクローン化することに成功し、それらのすべての遺伝子構造の特徴を明らかにすることができた。上記の4種のうちカラマツだけは、暗所でのクロロフィル合成能力を失っているが、他の3種と同様に、chlLとchlNの両遺伝子とも機能しうる構造を保持していることが明らかになった。2.chlL遺伝子およびchlN遺伝子の発現様式の解析:(1)ワラビ・ホウライシダの原糸体においてと、(2)クロマツ・カラマツの芽生えにおいて、それぞれ、chlL遺伝子とchlN遺伝子の転写パターンをノーザンハイブリダイゼーションによって分析した。暗所で生育させた場合、暗所でのクロロフィル合成能をもつワラビ・ホウライシダ・クロマツでは、いずれにおいても、chlLとchlNの両遺伝子の転写産物がそれぞれ遺伝子領域の大きさから予想されるサイズで検出されるが、暗所でのクロロフィル合成能がないカラマツだけは、異常なサイズの転写産物しか検出されないことがわかった。また、これらの転写産物の蓄積量は、それぞれ明所で生育させた場合と顕著な差がないことが明らかになった。
犬悪性黒色腫に対する新たな腫瘍特異的キラーT細胞療法に関する研究

犬の悪性黒色腫は難治性疾患の一つとされている。これに対し我々は、メラノーマに特異性の高い新たな活性化リンパ球療法(CAT療法)の開発を目的として、犬組織球細胞株DH82や腫瘍抗原ペプチド、抗Gpnmb抗体の併用について検討を行ったが、CATの増殖効率や抗腫瘍活性における有意な増強は認められなかった。一方、免疫不全マウスの皮下に悪性黒色腫細胞株(CMM2)を接種し、同時にCAT、あるいは腫瘍抗原ペプチド存在下で活性化したCATを投与した場合、腫瘍の成長において有意な抑制を認めた。以上より、CAT自体は一定の抗腫瘍活性を有するものの、より実効性を高めるためにさらなる改良が必要なものと考えられた。まず、新たな抗原提示細胞としての利用法を確立するために、犬培養細胞株DH82をATCCより購入し、継代培養を行った後、適当なレベルでの放射線照射を行うことで不活化させることが可能なことを確認した。具体的には、5Gyでは残存する細胞が存在するのに対し、10Gy、20Gy、50Gyの3条件においては、照射から7-14日後の生存細胞数がほとんど認められなくなった。また、同細胞に対し、mitomyciun C(50ug/ml、30分、37°C)による不活化も可能であることも確認した。次に、これまでのin vitroの結果を、よりin vivoの系で検討するため、免疫不全マウスを用いた予備実験を行った。まず、我々の保有する犬悪性黒色腫細胞株6種のうち、in vitroでの細胞障害活性、ならびに成長曲線において良好な結果が認められていたMiとPuに対して、Balb/c nu/nuマウスならびにNOD scidマウスの2種の免疫不全マウスを用い、マウス皮下に接種した後の成長を観察した。この結果、nu/nuマウス、scidマウスのどちらにおいても21-28日後に至るまで良好な腫瘤の腫大を認めた。また、どちらの細胞株においても、ほとんどの個体において接種21日目頃より中心部の自壊を認めたが(9個体/12個体中)、nu/nuマウスでは自壊、壊死部が広がるにつれて腫瘍全体の成長曲線が鈍るのに対し、scidマウスの場合では、28日を超えても腫大を続ける傾向が認められた。これはマウス種におけるNK細胞の有無が関与しているものと考えられた。このため、接種腫瘍細胞近傍に活性化リンパ球を投与した場合の反応性についても、マウス種によって異なる可能性が考えられた。上記と並行して、本学動物医療センターに来院された悪性黒色腫症例の臨床データならびに免疫学的プロフィールのデータ収集を継続して行った。犬の悪性黒色腫は、高い転移率と低い従来の治療法への反応性から難治性疾患の一つとされている。これに対し我々は本研究において、腫瘍による免疫寛容誘導経路の阻害と、腫瘍抗原ペプチドによる刺激を組み合わせた新たな免疫療法の検討を行った。まず、犬由来培養細胞株DH82に着目し、同細胞の有する抗原提示能を利用するために、放射線、もしくは化学的に不活化させる条件を決定した。この不活化したDH82と腫瘍抗原ペプチドとを混合し、これらをリンパ球活性化時に添加したが、どの条件においてもリンパ球の増殖活性、ならびに抗腫瘍活性を有意に向上させることはできなかった。一方、これまでのin vitroでの結果に基づき、腫瘍抗原ペプチドを用いて活性化させたリンパ球の抗腫瘍活性について、ヌードマウスを用いたin vivoでの検討を行った。犬悪性黒色腫細胞株としてはMiを、また免疫不全マウスとしてBalb/c nu/nuマウス、腫瘍抗原ペプチドとしてTyrosinaseをそれぞれ選択した。この結果、腫瘍細胞とリンパ球を同時にマウスに接種した場合には、活性化リンパ球による明らかな抗腫瘍活性を認めたが、腫瘍抗原ペプチド添加の有無における有意な差異は認められなかった。また、1cmほどに成長した腫瘍に対し、同腫瘍内に直接リンパ球を接種した場合には、リンパ球接種、またペプチド添加のどちらにおいても有意な抗腫瘍効果は認められなかった。これらの結果はin vitroの結果と一致しないものであり、活性化リンパ球による抗腫瘍効果を示してはいるものの、ペプチド刺激単独では限界があることを強く示唆するものと考えられた。このbreakthroughとして、Gpnmbなどの免疫寛容誘導経路に対するより効果的な阻害の方法を新たに検討する必要がある。今後は、臨床現場における応用を目的として、本方法に対しさらなる改善を行っていくものである。腫瘍免疫学DH82を用いた実験は、次年度における本実験の条件付けとして十分な達成度を満たしていると考えている。本年度の実験はどちらも、「生存を確認されないレベルの不活化が行われた」ことを示している。将来的な臨床応用を考えた場合、個体差に基づいた拒絶反応があるとはいえ、同種(どちらもイヌ)の腫瘍細胞の一部が播種される可能性がある。

このため、細胞に対する確実な不活化は不可欠であり、これらの実験結果は本研究において不可欠な内容である。一方、免疫不全マウスに対する予備実験の方では、当初の予定通りの内容と、予定通りでなかった点、また予見を超えた内容とが存在した。まず、培養細胞株の中ではとくにKMecを用いる予定であったのが、細胞株の保存がうまくできておらず、良好な継代培養を行うことができなかった。このため昨年度は、主な実験をMiで行った。また私自身の知識が浅く、一言に免疫不全マウスと言っても、現行では通称nu/nuマウスに加えて、NOD系統のscidマウス、リンパ節やパイエル板が消失するというalyマウス、さらには遺伝子改変により作製されたrag1ノックアウトマウスなども商業的に購入可能であった。本研究内容においては、1異種接種(イヌの細胞を、マウスに接種)であることから、免疫不全でなければならないこと、2活性化リンパ球による抗腫瘍活性は、直接的な細胞障害活性と同時に、周囲の免疫担当細胞の局所的な活性化も行っていること、の2点を考慮した結果、NK活性の残存するnu/nuマウスと、NK活性をも消失しているscidマウスの2種を選択し、予備実験を行った。この結果、腫瘍の成長に応じて成長曲線に違いが認められることが確認されており、次年度以降の本実験のためにも非常に有用な知見が得られたものと考えている。まず、DH82を用いた新しい抗原提示ならびにリンパ球活性化についての検討を行う。放射線、もしくは化学的に不活化させたDH82に対し、腫瘍関連抗原ペプチド(Tyrosinase, gp100, TRP2, MAGE1など)を用いた抗原提示細胞としての能力を、細胞障害活性の系を用いて測定する。この際、ペプチド添加後のDH82細胞そのものを用いた場合と、超音波破砕し、破砕液を添加することでリンパ球の抗原特異性+賦活化が可能であるかも検討する。検討項目は添加する細胞の量(リンパ球との比率)、ペプチド添加量、ペプチドの種類、細胞破砕液の濃度などである。対象とする悪性黒色腫細胞株はMiもしくはKMecを用いる予定である。次に、免疫不全マウスに対する本実験としては、まずKMecを分与いただいた東京大学獣医外科学研究室より再度分与していただき確保する。このKMecやMiに対し同様の予備実験を進めると同時に、実際のマウスへの皮下接種を行うことで、キラーT細胞を中心に活性化させたリンパ球の抗腫瘍効果や、抗Gpnmb抗体による免疫寛容機構の阻害効果について、in vivoにおける腫瘍成長曲線によって評価、検討する。また、nu/nuマウス、scidマウスを用いたマウス種による違いについてもあわせて検討する。これらの検討において良好な結果が得られた場合には、我々の保有する健常犬に対し、ペプチドを添加したDH82や破砕液の利用、あるいは抗Gpnmb抗体などを用いた活性化リンパ球投与に関する安全性について、予備的な検討を行う予定である。
超高張力鋼板の成形CAEのための材料パラメータ同定と成形限界クライテリオン

本研究の主な目的は,1板材成形シミュレーションのために不可欠な板材の弾塑性材料パラメータを大ひずみ域で取得するための実験・解析手法を確立すること,2板の成形限界,特にエッジ割れモードのクライテリオンを確立すること,3異方硬化発展を表現するモデルを板成形CAEソフトに実装すること,4超高張力鋼板(UHSS)の材料データベースを作成することである.これらについての成果の概要は以下のとおりである.1板材の大ひずみにおける加工硬化式としてSwift-Voce混合モデルを用いて,その式中の重み係数を板の面内引張り曲げ試験と対応する弾塑性逆解析により決定する方法論を確立した.平面ひずみ引張り,液圧バルジ,引張り・圧縮(二軸)試験による多軸応力の材料特性を取得する方法の妥当性を確認した.また,これを異方性板にも適用することにより,大ひずみ異方性降伏関数のパラメータが決定できる.2平頭パンチによる円筒穴拡げ試験および引張り曲げ実験から,これら二つのモードにおけるエッジ割れ限界を取得した.エッジの打ち抜き加工の影響が無視できる(例えば,ワイヤカット,機械加工)場合には板の異方性に起因するひずみ局所化とその発展がエッジ割れを支配していることがわかった.とくに円筒穴拡げ試験では,大ひずみ異方性とその発展を表現できるモデルを用いた成形シミュレーションの結果は実験を良い精度で予測することがわかった.3異方硬化発展を表現するモデルをLS-DYNAに実装して,円筒穴拡げ試験,バルジ試験,絞り試験,実プレス部品の成形シミュレーションを行った.その結果,異方性発展を考慮することで,成形シミュレーションの予測精度が格段に向上することが確認できた.4超高張力鋼板(UHSS)の材料データベースの枠組みを作り,本研究で得られた材料データを保管した.1.大ひずみ異方性材料パラメータの決定:大ひずみ域での単軸応力状態における応力ーひずみ関係(硬化特性)を面内引張り曲げ試験から決定する方法を確立した.これは,加工硬化が大ひずみまで続くSwiftモデルと硬化が収束するVoceモデルの混合型モデルを用い,その中の重み係数を引張り曲げ実験で得られるパンチストロークと曲げひずみの関係がFEMシミュレーションと一致するように決めるものである.平成28年度にはこの実験方法の確立と,構成式重み係数を敏感に反映する力学応答の特定,材料のバウシンガー効果や異方性の影響などについて,実験とFEMシミュレーション結果を比較しながら詳細に検討した.超高張力鋼板980Yを用いて実験を行い,単軸引張り試験では試験片のくびれ発生のためにひずみ0.11までしか得られなかった応力ーひずみ曲線がこの方法では0.27まで求めることができた.その他,切欠き付き試験片を引張り用いた平面ひずみ引張り試験法や画像相関法(DIC)による液圧バルジ試験法,二軸応力試験機を用いた引張り・圧縮(純粋せん断モード)試験法などについて検討した.2.エッジ割れ現象の解明:面内引張り曲げおよび穴拡げ試験によるエッジ割れの実験を行った.両試験モードでは割れの発生ひずみが異なることがわかった.3.CAEソフトへの異方性発展材料モデルの実装: Yoshida6次降伏関数を用いた異方性発展材料モデル(Yoshida et al., Int. J. Plasticity, 73, 2015)を汎用FEMコードLS-DYNAに組み込みこんだ.これを用いて穴拡げ試験のFEMシミュレーションを行い,異方性発展がひずみ局所化に及ぼす影響について検討した.平成28年度計画では,超高張力鋼板について,以下の3項目を実施することとした.1.大ひずみ異方性材料パラメータの決定,2.エッジ割れ現象の解明,3.CAEソフトへの異方性発展材料モデルの実装.項目2については実験に着手し始めたところで,やや遅れはあるが,項目1.と2.については計画どおりに進んでいる.平成29年度では,主に以下の3つの課題について取り組んだ.1.大ひずみ異方性の発展の決定法の確立:高張力鋼板の大ひずみ異方性の発展を面内引張り曲げ実験から求める方法について確立した.これは板の圧延方向から角度α傾いた方向の試験片の応力σαとr値rαを弾塑性逆問題として求めることにより行われる.2.異方性発達を考慮した穴拡げのFEMシミュレーションと実験: 1.で確立した鋼板の異方性発達を6次降伏関数とその発展モデルを用いて記述した.それを用いて,円孔板の平頭パンチによる穴拡げの数値シミュレーションを行った.異方性を一定としたモデル(等方硬化モデル)とその発展を考慮したモデル(異方硬化モデル)でのひずみ分布のシミュレーション結果を比較したところ,異方硬化モデルを用いた場合のほうが実験結果により近いことがわかった.また,楕円穴拡げの問題では,圧延方向に45度傾いた楕円穴縁からのひずみ集中が45度より圧延方向に傾いて起こる現象(実験結果)は異方硬化モデルでしか再現できなかった.これらの結果から,板材成形シミュレーションの高精度化のためには異方性発展モデルを使う必要があることがわかった.3.面内引張り曲げを用いた伸びフランジ成形限界:レーザカット,ワイヤカットで作成した高張力鋼板試験片を用いて,面内引張り曲げを用いた縁割れ実験を行った.この結果から,ひずみ勾配が大きいほど限界ひずみが大きいことがわかった.ただし,成形限界ひずみに及ぼすひずみ勾配の影響は平頭パンチ円孔穴拡げでの結果とは定量的には同じにならなかった.

また,面内引張り曲げにおけるひずみ分布をさらに詳細に調べるため画像相関法(DIC)による試験片内のひずみ分布について調べた.平成29年度では,板材の異方性の発達を記述するモデルに必要な材料パラメータを決定する方法を,種々の板材方向の面内引張り曲げ実験データを用いた弾塑性逆解析から決定する方法が確立できた.また,この方法を応用して,異方硬化モデルを用いた円孔および楕円孔の穴拡げのシミュレーションを行い,従来の等方硬化よりも精度の高い結果を得ることができた.また,面内引張り曲げによる伸びフランジ成形限界についても順調に研究が進んでいる.本研究の主な目的は,1板材成形シミュレーションのために不可欠な板材の弾塑性材料パラメータを大ひずみ域で取得するための実験・解析手法を確立すること,2板の成形限界,特にエッジ割れモードのクライテリオンを確立すること,3異方硬化発展を表現するモデルを板成形CAEソフトに実装すること,4超高張力鋼板(UHSS)の材料データベースを作成することである.これらについての成果の概要は以下のとおりである.1板材の大ひずみにおける加工硬化式としてSwift-Voce混合モデルを用いて,その式中の重み係数を板の面内引張り曲げ試験と対応する弾塑性逆解析により決定する方法論を確立した.平面ひずみ引張り,液圧バルジ,引張り・圧縮(二軸)試験による多軸応力の材料特性を取得する方法の妥当性を確認した.また,これを異方性板にも適用することにより,大ひずみ異方性降伏関数のパラメータが決定できる.2平頭パンチによる円筒穴拡げ試験および引張り曲げ実験から,これら二つのモードにおけるエッジ割れ限界を取得した.エッジの打ち抜き加工の影響が無視できる(例えば,ワイヤカット,機械加工)場合には板の異方性に起因するひずみ局所化とその発展がエッジ割れを支配していることがわかった.とくに円筒穴拡げ試験では,大ひずみ異方性とその発展を表現できるモデルを用いた成形シミュレーションの結果は実験を良い精度で予測することがわかった.3異方硬化発展を表現するモデルをLS-DYNAに実装して,円筒穴拡げ試験,バルジ試験,絞り試験,実プレス部品の成形シミュレーションを行った.その結果,異方性発展を考慮することで,成形シミュレーションの予測精度が格段に向上することが確認できた.4超高張力鋼板(UHSS)の材料データベースの枠組みを作り,本研究で得られた材料データを保管した.1.大ひずみ異方性材料パラメータの決定:平成28年度には主に大ひずみ領域における加工硬化特性とその異方性に焦点を当てて研究したが,29年度には変形異方性(r値異方性)について研究する.また,平面ひずみ引張り試験を用いた弾塑性逆問題解析で大ひずみ平面ひずみ応力を求める方法を確立する.また,種々のUHSSについて実験・解析によりデータの蓄積を行う.2.エッジ割れ現象の解明:標準試験としては,引張り曲げ試験(Fig.4)と穴拡げ試験(Fig.5)を用いる。割れ限界のクライテリオンは力学ベースの枠組み(塑性不安定・ひずみ局所化、亀裂の不安定進展など)で考えるが、破断限界はエッジの形成(ブランク打ち抜き時に形成される硬化層・マイクロクラックなど)に強く依存するため,標準試験ではこの影響をそのまま含んだ板(同じ打ち抜き条件のもの)を使う必要がある.
癌浸潤病巣における「血管リンパ管新生」の提唱と腫瘍組織学的意義

腫瘍組織が発育進展する際には、間質浸潤とともに血管新生が重要である。腫瘍組織および腫瘍周囲において、血管マーカー(factor VIIIrelated antigen)・リンパ管マーカー(podoplanin)両者が陽性の「血管リンパ管」の病理組織学的特徴を明らかにすることができた。血管リンパ管は、腫瘍組織内のみならず、腫瘍近傍の組織にも認められ、癌の初期進展に重要な役割を演じていることが示唆された。癌の発育・進展には、腫瘍細胞の浸潤性増殖とならび、腫瘍血管新生が重要である。我々は、癌浸潤病巣で「毛細血管・毛細リンパ管」両者の性質を有する脈管が新生される現象を把握してきている(血管リンパ管新生angio-lymphatic genesis)。本研究では、「血管リンパ管新生」の機序を解明し、この脈管が小静脈・小リンパ管へと連結することで、腫瘍の血行性・リンパ行性転移を惹起することを証明する。はじめに、内視鏡的に切除された早期胃癌を用いて、血管マーカー(factor VIIIrelated antigen)およびリンパ管マーカー(podoplanin)の二重免疫染色を行い、癌初期浸潤と血管リンパ管の関連を組織学的に解析した。この結果、腫瘍組織内および腫瘍周囲組織内において血管(静脈)およびリンパ管に加えて、血管リンパ管が新たに形成されていることが証明された(腫瘍脈管新生)。次いで、三次元培養法を用いて、ヒト線維芽細胞、およびリンパ管内皮細胞・血管内皮細胞を積層して、三次元培養組織モデルを作製した。この三次元組織は、結合組織内にリンパ管を有しており、癌細胞を添加することで、間質浸潤・腫瘍脈管侵襲を経時的に観察可能であった。三次元培養組織に添加された癌細胞が、結合組織内を浸潤し、リンパ管内へと脈管侵襲する組織像を確認できた。今後は、このモデルを使用して、腫瘍脈管の病理組織学的特徴および分子生物学的機序を解明する予定である。病理組織材料で、「血管リンパ管」の形成が証明された。さらに、三次元培養組織モデルの作成を成功し、癌細胞の脈管侵襲の解析が可能となった。申請者は、数多の癌を病理組織学的に解析し、癌の転移に関する実績を重ねている(Kijima H, etal. J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2014; Hiratsuka S, et al. Nature Commun 2013)。その結果、癌浸潤病巣で「毛細血管・毛細リンパ管」両者の性質を有する脈管が新生される現象を把握してきている(血管リンパ管新生angio-lymphatic genesis)。(1)内視鏡的に切除された早期胃癌を用いて、血管マーカー(factor VIIIrelated antigen)およびリンパ管マーカー(podoplanin)の二重免疫染色を行い、癌初期浸潤と血管リンパ管の関連を組織学的に解析した。その結果、胃癌の腫瘍組織内および腫瘍周囲組織内において血管(静脈)およびリンパ管の新生に加えて、血管リンパ管が新たに形成されていることが証明された(腫瘍脈管新生:論文投稿中)。(2)三次元培養法を用いて、ヒト線維芽細胞、およびリンパ管内皮細胞・血管内皮細胞を積層して、三次元組織モデルを作製した。この三次元組織に添加された癌細胞が、結合組織内を浸潤し、リンパ管内へと脈管侵襲する所見が確認された(論文作成準備中)。今後、このモデルを使用して、腫瘍脈管の病理組織学的特徴および分子生物学的機序を解析予定である。病理組織材料で、「血管リンパ管」の形成が証明された(腫瘍脈管新生:論文投稿中)。また、三次元組織モデルの作製に成功し、癌細胞の脈管侵襲の解析が進行している(論文作成準備中)。申請者は、数多の癌を病理組織学的に解析し、癌の転移に関する実績を重ねている。その結果、癌浸潤病巣で「毛細血管・毛細リンパ管」両者の性質を有する脈管が新生される現象を把握している(血管リンパ管新生angio-lymphatic genesis)。本研究の目的は、「血管リンパ管新生」の機序を解明し、この脈管が小静脈・小リンパ管へと連結することで、腫瘍の血行性・リンパ行性転移を惹起することを証明する。平成29年度の研究は、主として(1)ヒト消化器癌における血管リンパ管の病理組織学的解析, (2)三次元培養法による血管リンパ管モデルの作製と解析,(3)個体レベル(マウスモデル)での血管リンパ管新生の解析、の2点を行った。(1)ヒト消化器癌における血管リンパ管の病理組織学的解析:内視鏡的に切除された早期胃癌を用いて、血管マーカー(factor VIIIrelated antigen)およびリンパ管マーカー(podoplanin)の二重免疫染色を行い、癌初期浸潤と血管リンパ管の関連を組織学的に解析した。その結果、腫瘍組織内および腫瘍周囲組織内において、血管リンパ管が新たに形成されていることが証明された(論文受理・印刷中)。

(2)三次元培養法による血管リンパ管モデルの作製と解析:リンパ管を有する三次元組織において、癌細胞の間質浸潤から新生リンパ管への脈管侵襲の特性を解明する成果を上げられた(論文投稿準備中)。(3)個体レベル(マウスモデル)での血管リンパ管新生の解析:マウスモデル完成・解析にいたらず、残念ながら十分な研究実績をえられなかった。腫瘍組織が発育進展する際には、間質浸潤とともに血管新生が重要である。腫瘍組織および腫瘍周囲において、血管マーカー(factor VIIIrelated antigen)・リンパ管マーカー(podoplanin)両者が陽性の「血管リンパ管」の病理組織学的特徴を明らかにすることができた。血管リンパ管は、腫瘍組織内のみならず、腫瘍近傍の組織にも認められ、癌の初期進展に重要な役割を演じていることが示唆された。(1)病理組織材料で、「血管リンパ管」を含む腫瘍脈管新生の詳細な解析を行う。(2)三次元培養法を用いて、癌細胞の間質浸潤・腫瘍脈管侵襲を経時的に観察可能し、その詳細な病理組織学的特徴および分子生物学的機序を解明する。(2)また、三次元組織モデルを用いて、癌細胞の間質浸潤・腫瘍脈管侵襲を経時的に観察可能なモデルを作製し、その詳細な病理組織学的特徴および分子生物学的機序を解析する。病理組織学
糖鎖合成酵素遺伝子の癌細胞特異的発現制御領域の解析とその遺伝子治療への応用

神経外胚葉系由来のヒトメラノーマやT細胞白血病細胞では、酸性糖脂質GD3の特徴的な発現が認められる。そこでGD3合成酵素ゲノム遺伝子の構造と転写調節領域を解析し、以下の結果を得た。GD3合成酵素ゲノム遺伝子は、1、5個のエキソンより構成され、転写開始点は、約-525nt(+1:A of ATG)に存在した。2、本酵素遺伝子強発現メラノーマ細胞株おいて、本酵素遺伝子5'上流域約2.3kbに存在するプロモーター/エンハンサー活性は弱かったが、これにSV40エンハンサーを付加することにより明らかなプロモーター活性が検出された。また、このプロモーター活性は本酵素遺伝子非発現細胞株では、検出されなかった。3、5'上流域の段階的欠失変異ルシフェラーゼ活性の検討により、-1023-746ntに遺伝子発現に一致したプロモーター活性が検出された。4、この領域にはTATAボックスはなく、GCボックスが存在し、既知の転写因子結合モチーフを検索した結果、CREB、c-Myb、v-Myb.GATA.MAF1、Sp1等の結合モチーフが存在した。現在までに、ヒトメラノーマのsurvival factorとして、CREBが作用していること、また、c-MybがFGF-2を間接的にtransactivationしてFGF-2を介したメラノーマのautocrine growthに関与していることが報告されている。このような知見を考慮して、今後、GD3合成酵素遺伝子発現におけるこれらの転写因子の関与について詳細に検討を進める。また、本酵素遺伝子の5'上流域-1023-746ntに検出された強いメラノーマ特異的プロモーター活性を応用することにより、メラノーマ特異的遺伝子治療の開発に発展させる。
M^+→e^++γ実験のための大強度静止ミュービームおよび測定装置の調査研究

いわゆる素粒子の標準模型を越える世界の探索として、レプトンフレーバ数の保存則を破る反応が注目されている。それらの中でもミュー粒子の稀崩壊は最も可能性の高い反応であり、真剣な検討に値する。本調査研究では、ミュー粒子の電子と光子への崩壊過程に関する過去の実験の問題点を洗い出して、現存する施設と開発可能な測定技術による飛躍的改善の可能性が追求された。結果として、大型液体キセノンカロリメータによる、光子のエネルギー、入射位置、入射時間の高精度の測定が可能である事が判明。小型テスト器を作成して検証実験より確認された。電子測定用運動量分析装置(スペクトロメータ)についても、主に日本で開発、蓄積された薄肉超伝導ソレノイド磁石の技術を応用して、特殊な磁場分布を持つ軸対象磁石(COBRA)を用いることにより、バッククラウンドを大幅に低減させることが可能になることが判明した。以上の基本的な構想に基づき、必要な技術的開発がなされた。その第1は、液体キセノンのシンチレーション光測定のための光検出器の開発である。シンチレーション光の検出には普通光電子増倍管が使用されるが、本研究では、約-100°Cという低温であること、測定すべきシンチレーション光の波長が175nmと短く透過物質が限られていることなど多くの課題を解決する必要があった。また、多量ガスを使用することから、液化システム、ガス制御システム上の問題があったが、パルス管冷凍器の開発により解決された。その他の開発研究も含めて、ミュー粒子の電子・光子崩壊実験の見通しが立ち、実験提案書として結実し、スイス、ポールシェラー研究所の承認が得られた。素粒子の標準理論では、クォークには世代間の混合があり、異なる世代間で遷移が起こるのに対し、レプトンにはそれがない。したがって、レプトンのフレーバーは厳密に保存されているようにみえる。この保存則に対する最も厳しい制限を与えている実験データの一つであるμ→e^+γ崩壊の分岐比の上限値は現在2×10^<10>である。一方、超対称性理論と大統一理論によると、レプトンフレーバーの保存はμ→c^+γ崩壊の分岐比にして10^<12>から10^<14>で破れの可能性が指摘されている。μ→e^+γ崩壊の分岐比10^<14>の感度の測定の可能性を調査した。その結果、μビーム源としては、スイスPSI研究所にμビーム強度、factor x 10^8/sのμビーム源が存在するが、実用的なビーム強度、ビームサイズ、バックグラウンド、占有可能時間など詳細な調査研究が必要であることがわかった。また、米国において、μビーム衝突器のμビーム源の開発が進められているが、強度は数桁強力なμビームが期待できるものの、完成まではまだ時間を要するようである。米国ロスアラモス研究所で実施され、現在データ解析中の実験MEGAの調査を行った。その結果、ソレノイド測定器の問題点が判明した。すなわち、電子軌跡のマルチターンにより、チェンバーワイヤーのヒット本数が増えることによる軌跡再構築の困難さと、TOF精度の劣化である。将来は、この2点を解決することがポイントとなる。カロリメー夕としては、その期待されるエネルギー分解能、応答の高速性からして、液体キセノン・カロリメー夕が最適との判断に基づき、小型テスト装置による諸テストを重ねてきたが、大型実用器の設計に資するため、冷凍液化、ガス回収システムの実例を、米国コロンビア大学で調査した。小型冷凍器による液化と液体窒素による液化、液体でのキセノン回収とガス態での回収保管の優劣を比較検討中である。μ→e^++γ実験の観点から、現在使用可能なミューオンビームの調査をおこなった。

ビーム強度、質、研究所の受け入れ体制からして、スイスのポールシェラー研究所(PSI)が最適であるとの結論を得た。実験の具体的な設計について、陽電子分析系は、超伝導薄型ソレノイド電磁石を主体とする設計を行い、気球実験BESSに使用されている超伝導薄型ソレノイド電磁石を基本にして、非一様ソレノイド磁場を持った、一定半径軌跡スペクトロメータ(COBRA)のアイディアに到達する。これにより、高エネルギー陽電子の選択的トリガーを容易にし、かつ、軌跡の図形認識を容易にすることができた。一方、光子測定のためのカロリメータは液体キセノンカロリメータの可能性を追求した。液体キセノンカロリメータはこれまで電離カロリメータとして用いられてきたが、本実験で要求される性能を実現するには、蛍光信号を用いることがより実際的で、かつ高性能が期待される事が判明した。既存および建設中の低温液体カロリメータ(液体Xe,Kr,Ar)の調査により、Xeの液化方式(小型冷凍器による直冷方式)、粒子入射窓のハニカム化、多線信号線、高圧線の導入コネクターと高圧絶縁線の見通しを得た。容器の強度計算を含む第1次設計を終えた。実験全体の見通しがたち、実験提案書を作成しPSI研究所へ提出し、実験承認を得た。現在は液体キセノンカロリメータの建設に向けて、ガスの液化、冷却、回収システムの具体的な検討に入ると同時に、液体キセノンの物性に関して基礎的な試験研究を進めている。
スーパーオキシド産生(制御)及び消去作用からみた植物性食品素材の評価と活性物質

スーパーオキシ(SO)は多くの活性酸素の源であり、好気的生物にとって一次代謝や生理機能(感染防御)において基本的な物質である。一方、その過剰な産生は細胞の老化やがん化を招くものとして、その制御も重要であることが示されている。SOを制御するために我々生物系は酵素(スーパーオキシドディスムターゼ)を備えているが、非酵素的な制御も重要である。この研究では、そこで日常的な食によるスーパーオキシド産生、もしくはその抑制の可能性を追求し、活性を担う各種成分の化学的、生理的特性を明らかにすることを目的とした。平成6年度にはSOの産生や消去作用を検出する系を種々確立し、これら系を用いて熱帯アジア産非栄養的食用植物種の活性評価を行ってきた。また、平成7年度には和産食用植物についての評価を行った。評価できた活性植物種の化学的研究を展開した結果、まずタイ国産ナンキョウから得られた1′-acetoxychaviol acetate(ACA)に興味が持たれた。ACAは極めて協力なキサンチンオキシダーゼ(XOD、SOを産生する酵素)阻害剤となり、また、分化HL-60を用いた細胞系においてもTPA刺激によるSO産生を顕著に抑制した。さらにACAはHL-60細胞内でのSO産生をも抑制することをフローサイトメトリー(FCM)で確認した。ACAは強力な発がんプロモーション抑制物質でもある。発がんプロモーション過程にはSOやそれに由来する各種活性酸素が一部関与している。従って、ACAの発がん抑制機構として、そのSO産生抑制作用があるものと示唆できた。一方、和産アオジソからSO捕捉物質として(R)-rosmarinic acid(RA)を単離・同定した。1,2-ジフェノール部を重要構造部位とするRAのこの捕捉活性はビタミンCより協力で合った。興味あることにRAは、ACAと違って、発がんプロモーション短期検出活性、Epstein-Barrウイルス活性化抑制作用には陰性あった。今後RAの動物試験結果と相まって、SOと発がんとの関連がさらに深く理解できるものと考えられる。スーパーオキシド(O_2)は活性酸素の源であり、好気的生物生体にとって感染病防御など重要な役割を持つと共に、過剰な生産や存在は細胞の老化やがん化の原因となることが知られている。最近O_2制御系として酵素系(スーパーオキシドディスムターゼ、SOD)と共に、非酵素系による制御機構が注目されている。本研究では食品成分のO_2の産生、産生抑制、消去に与える効果を系統的に検討する一方、活性を担う化合物を解明し、さらには、当研究者がこれまで行ってきた発がん抑制活性との相関性を追及することを目的としている。O_2検出アッセイ系を種々検討し、酵素による系としてキサンチン-キサンチンオキシダーゼ(XOD)系を、またHL-60細胞のTPA刺激によるO_2産生を検出する細胞系も導入した。すでに本研究者は、発がん抑制効果を総合的に評価するため、多様な和産、熱帯アジア産食用植物を集めていた。今回、これらから、発がん抑制効果の著しい種、中程度の種、無効種を、それぞれ8種、6種、7種選び、両アッセイにて活性を検定した。その結果;1.酵素系および細胞系でO_2産生抑制(または消去)活性を示した種はそれぞれ4種であった。特に細胞系において、熱帯アジア産Artemisia lactifloraの活性は強く、活性物質究明の候補植物として注目された。2.O_2産生抑制(または消去)

活性と発がん抑制活性との間には明確な正の相関は認められなかった。しかしながら、細胞系により活性ありと評価できた4種はいずれも、著しい発がん抑制活性を示す植物であった。3.強力な発がんプロモーション抑制物質であるACAはXODを阻害し、また、細胞系においても極めて強くO_2産生を阻害した。このことから、ACAの発がん抑制効果にはO_2産生抑制が関与しているものと考えられた。以上を基礎として、次年度では食用植物の総合的活性評価と、活性物質の解明に取り組む予定である。スーパーオキシド(SO)は多くの活性酸素の源であり、好気的生物にとって一次代謝や生理機能(感染防御)において基本的な物質である。一方、その過剰な産生は細胞の老化やがん化を招くものとして、その制御も重要であることが示されている。SOを制御するために我々生物系は酵素(スーパーオキシドディスムターゼ)を備えているが、非酵素的な制御も重要である。この研究では、そこで日常的な食によるスーパーオキシド産生、もしくはその抑制の可能性を追求し、活性を担う各種成分の化学的、生理的特性を明らかにすることを目的とした。平成6年度にはSOの産生や消去作用を検出する系を種々確立し、これら系を用いて熱帯アジア産非栄養的食用植物種の活性評価を行ってきた。また、平成7年度には和産食用植物についての評価を行った。評価できた活性植物種の化学的研究を展開した結果、まずタイ国産ナンキョウから得られた1'-acetoxychavicol acetate(ACA)に興味が持たれた。ACAは極めて強力なキサンチンオキシダーゼ(XOD、SOを産生する酵素)阻害剤となり、また、分化HL-60を用いた細胞系においてもTPA刺激によるSO産生を顕著に抑制した。さらにACAはHL-60細胞内でのSO産生をも抑制することをフローサイトメトリー(FCM)で確認した。ACAは強力な発がんプロモーション抑制物質でもある。発がんプロモーション過程にはSOやそれに由来する各種活性酸素が一部関与している。従って、ACAの発がん抑制機構として、そのSO産生抑制作用があるものと示唆できた。一方、和産アオジソからSO捕捉物質として(R)-rosmarinic acid(RA)を単離・同定した。1,2-ジフェノール部を重要構造部位とするRAのこの捕捉活性はビタミンCより強力で合った。興味あることにRAは、ACAと違って、発がんプロモーション短期検出活性、Epstein-Barrウイルス活性化抑制作用には陰性あった。今後RAの動物試験結果と相まって、SOと発がんとの関連がさらに深く理解できるものと考えられる。