hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不飽和土壌内で発生するフィンガリング流に関する研究

2成層(上層が細粒土、下層が粗粒土)条件下において、湛水降下侵潤時に上下層境界面で発生するフィンガー流について、室内実験を行い、その現象を明らかにした。実験は、横80cm、縦69cm、奥行き1cmのアクリルチャンバーを用いて、2次元的に行った。実験条件としてはチャンバー底面に地下水面を設定し、下層内にcapillary fringeが存在する初期条件下で、表層の乾燥領域で発生したフィンガー流が、毛管飽和している領域に侵入していく状況を設定した。測定に際しては、本科研で開発したマイクロテンシオメータで、測定精度0.2mm水頭のオーダーで圧力をモニタリングした。その結果、従来無視されてきた、上下層境界面の下部に生ずる遷移領域(induction zone)内の僅かの圧力差を正確に測定することに成功した。また、上下層境界面に人為的に擾乱を設定し、境界面からフィンガー流が発生していく過程を詳細に検討することができた。その結果、フィンガー流の発生は2つのステージに分けることができた。まず、最初に、境界面の形状、あるいはフラックスの不均一性に依存する微少な擾乱が発生し、各擾乱の最下部が重力により発達する。しかし2成層境界面直下部に、湿潤部が水平方向に連続する遷移領域が出現した時点で、初期に生じた擾乱は、水平方向のフラックスの移動によって統合され、最終的には、土壌の透水条件と給水条件のバランスによって決定されるフィンガーの大きさと、そのフインガーに対する透水量で決定される数だけ、フィンガーが発達していくことを明らかにした。またその空間的配置も定間隔であった。2次元アクリル製チャンバーを用いて、2成層(上層が細粒土、下層が粗粒土)湛水降下浸潤時のフィンガリング流発生メカニズムの検証を行った。本年度は、材料としてガラスビーズについてのみ実験を行い、以下のような結果を得た。1.ガラスビーズの水分特性及び不飽和透水係数の測定結果より、ガラスビーズは細粒であっても、通常の粗粒土としての砂に比べ非線形性が強く、ヒステリシス効果が大きいことが分かった。2.フィンガリング流が発生する場合、上層からの供給フラックスの大きさによって、遷移領域内の水平圧力勾配の大きさやフィンガーへの影響範囲が変化することを明らかにした。またその影響範囲はフィンガーの径の510倍にまで及んだ。3.下層土下部に地下水面が存在する場合、上下土層の境界面から発達してきたフィンガーは、毛管飽和領域に近づくにつれ流速が加速され、フィンガーの径が減少することを明らかにした。また、帯水土層内の溶質の動きはフィンガーを点源とした水分移動と同様の傾向を示したが、水平方向において限界点が存在することを新たに見いだした。横80cm、縦69cm、奥行き1cmのアクリル製チャンバーを用いて、2成層(上層が細粒土、下層が粗粒土)湛水降下浸潤条件下でフィンガー流を発生させ、その物理特性を調べた。チャンバーの底に地下水面を設定し、下層内にcapillary fringeが存在する初期条件下で、表層の乾燥領域で発生したフィンガー流が、毛管飽和している領域に侵入していく現象を測定した。昨年度開発したマイクロテンシオメーターの測定精度を、0.2mm水頭まで向上させることに成功し、2成層境界面直下部に発達する遷移領域内の、きわめて僅かな圧力差の正確な測定を可能にすることができた。これらの測定の結果、従来その存在が見過ごされていた遷移領域内の水分移動が、フィンガー流の発達と非常に密接な関係があり、フィンガーの空間的な配置の決定に何らかの役割を果しているとの確証を得た。フィンガー流に関して、フィンガーの大きさは供給フラックスと土壌の水分特性によって決定されることが証明されているが、フィンガーの配置については、基本的にある周期で等間隔に発生すると考えられてきた。

しかし、今年度の測定を通して、この配置は遷移領域内における供給フラックスの分配過程によって決定されるとの仮説を立てることができた。来年度(最終年度)は、この仮説の実証を含め、capillary fringe内へのフィンガー流の侵入現象について詳しく解析を行う予定である。2成層(上層が細粒土、下層が粗粒土)条件下において、湛水降下浸潤時に上下層境界面で発生するフィンガー流について、室内実験を行い、その現象を明らかにした。実験は、横80cm、縦69cm、奥行き1cmのアクリルチャンバーを用いて、2次元的に行った。実験条件としてはチャンバー底面に地下水面を設定し、下層内にcapillary fringeが存在する初期条件下で、表層の乾燥領域で発生したフィンガー流が、毛管飽和している領域に侵入していく状況を設定した。測定に際しては、本科研で開発したマイクロテンシオメータで、測定精度0.2mm水頭のオーダーで圧力をモニタリングした。その結果、従来無視されてきた、上下層境界面の下部に生ずる遷移領域(induction zone)内の僅かの圧力差を正確に測定することに成功した。また、今年度は、上下層境界面に人為的に擾乱を設定し、境界面からフィンガー流が発生していく過程を詳細に検討することができた。その結果、フィンガー流の発生は2つのステージに分けることができた。まず、最初に、境界面の形状、あるいはフラックスの不均一性に依存する微少な擾乱が発生し、その最下部は、重力によりある程度発達した。しかし境界面下部において、水平方向に遷移領域が出現した時点で、初期に生じた擾乱は、水平方向のフラックスの移動によって統合され、最終的には、土壌の透水条件と給水条件のバランスによって決定されるフィンガーの大きさと、そのフィンガーに対する透水量で決定される数だけ、フィンガーが発達していくことを明らかにした。またその空間的配置も定間隔であることがわかった。
CCA処理廃材のレーザ誘起ブレークダウン分光法による瞬時識別法の開発

住宅解体時に発生するCCA処理木材は、建設リサイクル法の指針により分別・適正処理せよとなっている。そこで、新規購入の小型で短パルスYAGレーザと既存の分光器や光学系を組み合わせたレーザ誘起ブレークダウン分光(LIBS)装置を開発し、下記の結果を得た。気乾状態の廃木材では、As228.8nmとCr267.8nmの相対発光強度によりCCA処理廃材が識別できること。湿潤状態の廃木材では、C247.8nmの相対発光強度が400以上のスペクトルを用いると、誤判定が避けられることが分かった。現場で使えるコンパクトな装置を設計したが、設計ミスから計算通りのプラズマが発生せず、CCA処理材の小型識別装置の開発には失敗した。平成23年度に購入した従来よりパルス幅が1桁短く手のひらに乗る程度の大きさの小型YAGレーザと、既存の分光器や光学系を組み合わせた現場で使えるレーザ誘起ブレークダウン分光(LIBS)装置の基本設計を服部が行った。最終年度は前年度までに解決できていない識別法の問題点を優先して下記に示す実験を行った。気乾状態の廃木材の分析ではAs 228.9 nmとCr 267.8 nmの発光を検出することにより識別に成功しているが、湿潤状態にある木材の分析は成功しなかったので、湿潤状態の試験体を作成して、水分とスペクトル強度の関係を調べた。供試レーザは現有のレーザであるQスイッチNd:YAGレーザ(波長1064 nm、パルス幅4 ns)で、照射によって発生したプラズマからの発光を楕円ミラーにより集光し、小型分光器(測定波長範囲190300 nm、分解能0.15 nm)でスペクトル分析した。その結果、湿潤状態の木材から得られた発光強度の低いスペクトルを正規化すると、信号だけではなくノイズも増幅してしまい、これまでと同じしきい値を用いると非CCA処理木材をCCA処理木材として誤判定してしまう可能性があることが分かった。これまでの実験では、Asのしきい値は「228.9 nmの相対発光強度が27」と設定していたが、正規化によって増幅されるノイズがこの値を超えないのは、C 247.8 nm発光強度が約400以上の場合なので、C 247.8 nm発光強度が400以上のスペクトルを識別に用いることで、誤判定は避けられる。よって、湿潤状態にある木材のCCA処理木材かどうかの識別は、これ以上の強度のスペクトルにより識別すれば問題ないことが明らかになった。現場で使えるコンパクトな光学系を設計したが、楕円面鏡の設計ミスから計算通りのプラズマが発生せず、CCA処理材の小型識別装置の開発には失敗した。平成23年度に購入する、従来よりパルス幅が1桁短く、手のひらに乗る程度の大きさの小型YAGレーザと、既存の分光器や光学系を組み合わせた現場で使えるレーザ誘起ブレークダウン分光(LIBS)装置の基本設計を服部が行ったが、前年度までに解決できていない識別法の問題点を優先して下記に示す実験を行った。気乾状態の廃木材の分析では、As 228.9 nmとCr 267.8 nmの発光を検出することにより識別に成功しているが、湿潤状態にある木材の分析ではスペクトルの強度が低下し、識別に影響する可能性があることが判明しているので、湿潤状態の試験体を作成して、水分とスペクトル強度の関係を調べた。平成23年度に備品として購入した小型レーザを用いてCCA処理材の識別を行う計画であったが、識別時の含水率や汚れが識別に大きく影響する可能性が出てきたことから、そちらを優先して実験を行ったので、(2)と判断した。

平成24年度は既に備品として購入した安価な小型・低出力レーザによる識別の可能性を、前年度までと同じ手法で探る計画である。LIBSによる識別実験に必要な消耗品費と成果の国際会議での発表が主な使途となる。
弾性パターニングゲルを用いたヒトiPS細胞のフィーダーフリー高速増殖技術の開発

再生医工学にヒトiPS細胞を活用する上での重要な課題の一つに、ハイドロゲル等の弾性基材におけるiPS細胞の維持・増殖培養技術の確立があげられる。本研究では、独自に開発したハイドロゲルの弾性マイクロパターニング技術に基づきiPS細胞の品質保持・安定増殖のための基材力学場条件を検証したところ、iPS細胞の維持・増殖に至適な基材弾性率条件が存在するとともに、iPS細胞は自発的にその至適弾性領域を指向して移動して、そこでコロニーを形成しつつ未分化性マーカーの発現を最大化することを見出した。これらの知見は、iPS細胞の維持・増殖培養のための弾性基材設計の重要な方針を与えるものと期待される。初年度は細胞間接着の迅速化へのアプローチとして、iPS細胞の運動方向を制御し自発的な集合を促進する収束性運動整流化を駆動する同心円状弾性勾配パターニングゲルの構築を検討した。これまでに既に確立している鋸歯状の非対称弾性勾配を繰り返し配列した弾性場による細胞運動整流作用と、同心円状の弾性パターニングを組み合わせ、円の中央に向かってiPS細胞が集合する圧力を常に負荷することで細胞間接着を最短時間で確保することを期待した培養力学場設計である。この培養力学場上でiPS細胞を高速増殖させる条件については、均一弾性場における表面ラミニン修飾密度とゲル弾性率値の最適値をすでに得ていたものの、新たなパターン上での生着・増殖を検討する段階でそれらの弾性場・表面ラミニン密度の条件に変更が生じることがわかった。このため、収束性運動誘導パターンの基礎弾性場条件およびラミニン修飾密度条件について再検討を行った。ラミニンについてはラミニン511のE8フラグメントを用い、これをゲルに密度を変えて修飾するとともに、弾性率を変えて、iPS細胞の生着と運動、および増殖挙動について系統的に調べたところ、化学固定されたラミニンと物理吸着したラミニンのiPS細胞への作用の区別が極めて重要であることがわかった。通常のiPS細胞培養において、ラミニン修飾基材が用いられるときには単なる物理吸着ラミニンを用いており、基材はプラスティックやガラスなどの数GPaの硬いものが使用されている。これに対して、軟らかいハイドロゲル上にラミニンを化学固定した場合、iPS細胞の生着は抑制されてしまい、生着と増殖を強化するためにはゲル内に残留する収着ラミニンの作用も必要となることが明らかとなってきた。初年度は、このような条件を収束性運動誘導場設計に適切に組み込むパターニングの基礎条件を見出した。iPS細胞の高速増殖を誘導する弾性場およびラミニン修飾ゲルの最適条件設計については、これまでに予備結果が得られており、特許申請にも至っているものの、初年度の検討を通じてラミニンの修飾状態に依存したさらに鋭敏なiPS細胞の生着・増殖挙動の実態が明らかとなってきた。これは当初の予備結果からさらに広がる知見であり、収束性運動誘導パターニングの設計だけを対象とする材料設計以外の検討課題が発生したことが、若干の遅れの理由である。iPS細胞の高速安定増殖を誘導する弾性場およびラミニン修飾条件の最適設計を目的として、初年度までに細胞間接着を促進する収束性運動整流化のため同心円状弾性勾配パターニングの作製を検討してきた。その過程で、培養ゲル表面へのラミニン修飾様式に関し、これまでに明確となっていなかった知見として、化学固定ラミニンと物理吸着ラミニンのiPS細胞への作用の大幅な違いを見出した。そこで第二年次は、弾性パターニンゲル上での培養に先立って、ハイドロゲル上でiPS細胞の安定した生着・増殖を実現する詳細な培養条件とiPS細胞の細胞-基材間相互作用の理解を拡充するため、表面化学と表面力学の両者を制御可能なラミニン固定化ハイドロゲル基材を作製し、iPS細胞の生着・増殖挙動を再調査した。その結果、光架橋性ゼラチンゲル上でのiPS細胞の培養に必要なラミニン固定濃度条件を決定するともに、iPS細胞の培養においては多層的に物理吸着した可動性の高いラミニン層が重要であることを見出した。また、ゲルの弾性率を変えてiPS細胞を培養し挙動を調査したところ、弾性率が低いほどコロニーが密に形成されることが観察され、基材弾性率がiPS細胞の品質に関わる可能性が示唆された。弾性パターニングした硬軟ドメインゲル上のiPS細胞の培養結果からも、コロニーの形成・拡大が軟らかい領域で生じやすい可能性が示唆されており、今後、コロニー密度の評価や生化学的な評価、培養初期におけるコロニー形成の評価を行うことで、iPS細胞の細胞-基材間相互作用の理解が深まることが期待される。第三年次にはこれらの結果を踏まえて、収束性運動により細胞接着促進のための力学場設計とともに、軟らかいゲル上でのiPS細胞の品質すなわち増殖性・細胞機能の評価を進める予定である。初年度に気づかれた、ハイドロゲル上でのiPS細胞の増殖培養に対するラミニン修飾状態の影響の最適化問題について、今年度は明確な結論を得ることができたとともに、弾性率の効果についてより本質的な知見も得ることができた。これらの整理された知見に基づけば、当初より予定している収束性運動誘導のための弾性パターニンゲル上でのiPS細胞の培養と運動評価がさらに再現性高く行うことが可能となったため、初年度に生じた若干の遅れを取り戻すことができたことによる。

iPS細胞の高速安定増殖を誘導する弾性場およびラミニン修飾条件の最適設計を目的として、細胞間接着を促進する収束性運動整流化のため同心円状弾性勾配パターニングの作製を検討する過程で、第二年次までにiPS細胞の良質なコロニーを保った安定増殖には実は20-40kPa程度の中程度の基材弾性率が最適である可能性を見出していた。そこで最終年次では、それらの弾性率条件下でのiPS細胞の幹細胞性の定量的評価を進めた。ラミニン固定した弾性率可変スチレン化ゼラチンゲル(5-130 kPa)の上で長期培養したiPS細胞に対して、未分化マーカーとしてOct3/4、SSEA-4の免疫蛍光染色強度のイメージングサイトメトリー解析を行ったところ、30-40kpaのゲル上においてOct3/4の発現が最も高くなることがわかった。さらに興味深いことに、30kPaの領域と200kPaの領域を非一様にパターニングしたゲル基材においては、iPS細胞のコロニーは30kPa領域を目指して移動し(硬→軟への移動)、そこで安定した増殖を示すことが確認された。予備的検討では5kPa領域と30kPa領域をパターニングしたゲル上においては、今後は逆に軟→硬への移動を示しつつ、やはり30kPa領域において安定増殖をしめし、そこでOct3/4の発現がもっとも高まった。これらの結果より、iPS細胞の品質保持・安定増殖には基材の至適弾性率条件が存在するとともに、iPS細胞は自発的に至適弾性領域を指向して移動する性質を有することがわかった。この知見はiPS細胞の局所的集積技術の基盤として、集積させたのちに他の種類の細胞を領域区分的な追加共培養を施すことでiPS細胞を含む異種細胞の機能的局所配置に応用可能であり、オルガノドテクノロジーへの展開も期待される。再生医工学にヒトiPS細胞を活用する上での重要な課題の一つに、ハイドロゲル等の弾性基材におけるiPS細胞の維持・増殖培養技術の確立があげられる。本研究では、独自に開発したハイドロゲルの弾性マイクロパターニング技術に基づきiPS細胞の品質保持・安定増殖のための基材力学場条件を検証したところ、iPS細胞の維持・増殖に至適な基材弾性率条件が存在するとともに、iPS細胞は自発的にその至適弾性領域を指向して移動して、そこでコロニーを形成しつつ未分化性マーカーの発現を最大化することを見出した。これらの知見は、iPS細胞の維持・増殖培養のための弾性基材設計の重要な方針を与えるものと期待される。iPS細胞の運動集合化のための収束性運動誘導パターニングの設計を効果的に進めるための前提となるゲルの条件を再度徹底的に確立する。iPS細胞の簡便・迅速な維持培養のためには、培養基材の表面化学・表面力学の両特性を正確に定義し、最適化することが本質的である。ラミニンの作用とハイドロゲルの弾性特性の効果について詳細が見えてきたため、この両効果の協調作用について早期に整理を終える。その上でiPS細胞の生着を確保し、運動の制御を可能とする弾性場設計条件について段階的に固めていく。今年度は、これまでに確立したラミニン修飾条件および弾性率条件を踏まえて、弾性パターニングゲル上でのiPS細胞の運動評価と、細胞機能評価にフォーカスし、iPS細胞のメカノバイオロジーに関する基盤知見の拡充を推進する。29年度が最終年度であるため、記入しない。医用生物物理工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
高等学校における教育資源配分の効率性および多元的な教育資源調達手法の検討

本研究では、教育資源配分の効率性および多元的な教育資源調達手法の検討をするにあたり、その基礎的な調査として、英国の学校における教育資源の調達および活用方法、また、教育資源を取り扱う人材育成のあり方について調査を実施した。具体的には、Multi-Academy Trustが管理する学校の財務状況についてインタビュー調査を行い、資源調達および資源配分の現状について明らかにするとともに、それらの教育資源を取り扱うschool business managerにどのような能力が求められるか整理を行った。本研究では、高等学校における「効率的」な教育資源配分のあり方を考察し、多元的な教育資源調達手法を模索することで、教育水準の維持向上、学校経営ガバナンス向上に寄与する政策をどう設計するか検討することを究極的な課題としている。具体的な研究目的は以下の通りである。A.各々の高等学校がどの程度の教育資源を有しているかの調査・解明B.各々の高等学校が投入している教育資源量と教育成果との関連性の分析・解明C.教育資源調達を担う人材に必要な能力、具体的な業務内容の検討本研究は、これらの目的のもとに実施されており、特に昨年度は「A.各々の高等学校がどの程度の教育資源を有しているかの調査・解明」に必要な元データ収集のための調査を中心に行った。大阪府立高等学校を対象とした調査では、公教育費と私教育費の両面をふまえた各学校が一年間に使用できる教育活動費(学校の運営経費から人件費と設備投資費を抜いたもの)を計算したところ、公立の高等学校といえども学校間で少なくとも約1.6倍の差があることが分かった(生徒一人当たりで年間約6万円、一クラスあたりで年間約240万円の差)また、寄付金や後援金等も考慮すると、回答のあった学校だけでも私教育費収入に最大で年間800万円以上の差が出ており、公立の学校といえども対等な競争条件、いわゆるイコールフッティングのもとでの競争が行われていない可能性が高いことが分かった。今後は、より詳細な分析ができるよう調査範囲を広げるとともに、多元的な教育資源調達手法を模索するために、国内外の先進事例についての事例調査を進めていく。具体的には、Multi-Academy Trust(MAT)が管理する学校の財務状況についてインタビュー調査を行い、資源調達および資源配分の現状と課題について明らかにするとともに、それらの教育資源を取り扱うschool business managerにどのような能力が求められるか整理を行った。MATが運営する学校の増加や、各学校のacademy化等により、教育内容だけでなく、教育資源の配分および調達についても、例えば年度を超えた教育予算の繰越が可能になるなど、英国では学校の自治機能がますます大きくなる傾向にある。そのため、教育資源の管理についても、school business manager等の人材には、「budget planning」といった従来から必要とされている能力だけでなく、「fundraising and income generation」等の能力もまた必要とされるようになっている。現職に雇用されたばかりであるということ、また、本務において大学として新しく取り組んでいるプロジェクトを担当していることもあり、当初想定した以上に時間の調整が難しく、本研究課題について十分に時間をかけ取り組むことが困難であった。平成27年度については、前年度の取組をもとに本務業務を進められるとともに、本研究代表者の所属する組織の構成員が増員されたこともあり、業務負担がかなり軽減される見通しである。そのため、前年度の研究状況の遅れについては、十分に取り戻すことができる環境が整えられている。教育行政学昨年度は「A.各々の高等学校がどの程度の教育資源を有しているかの調査・解明」のための現地調査・文献調査を中心に研究を行ったが、同研究目的の更なる追及を行うためにも、昨年度よりも調査範囲を広げた質問紙調査の実施が必要となる。そのため、本年度の計画として、まずは関西圏の高等学校を対象とした質問紙調査の作成・実施を行う。次に、「B.各々の高等学校が投入している教育資源量と教育成果との関連性の分析・解明」のために上記の調査により判明した教育資源量と、各学校による教育成果との分析するにあたって、教育成果の指標が必要となる。学校評価の先行研究及び実務事例をもとに、数理的分析が可能となるよう教育成果の指標化を図る。さらに、「C.教育資源調達を担う人材に必要な能力、具体的な業務内容の検討」を行うにあたり、先行事例として、特に英国の学校におけるbusiness managerについて、文献調査および訪問調査から、その具体的な業務内容、業務に必要とされる能力、制度的な課題について明らかにする。【現在までの達成度】欄にも記載した通り、本務との時間調整が申請時の想定以上に困難であったため研究の進行に遅れが出ており、当初平成26年度に実施する予定であった質問紙調査が、平成27年度に繰り越された影響で次年度使用額が生じることとなった。具体的には、質問紙調査の統計処理のために必要な「物品費」15万円(統計処理ソフト、情報処理端末、書籍等)と、質問紙の郵送・回収に必要な「その他」

15万円(625部×240円)の分が次年度使用額となっている。上記の通り、質問紙調査の郵送・回収およびその分析のために必要な物品の購入に使用する。質問紙調査は、質問紙を5月中に作成し、67月に郵送・回収を行い、8月以降にその分析を実施する。そのため、質問紙の郵送・回収費として67月に15万円を使用し、分析のために必要な物品として78月に統計処理ソフト、情報処理端末、書籍等の購入を行う。
臨床応用を目指した細胞周期関連分子を介した肝再生促進メカニズムの解明

細胞周期を制御する分子を介した方法で肝再生医療へ応用するため、G0期にある肝細胞をG1期へと再進入することが可能と考えられるエストラジオール(E2)を用いた肝再生促進モデルでその可能性について検討を行った。E2投与によりKi67の陽性率が増加したため、これを用いて肝障害マウスの生存を検討したところ、投与時期の違いでその生存率が異なる事を見いだした。このことより肝障害時には時期特異的な再生への関与があり、その解明により再生を効率よく促進出来る可能性が示唆された。前年度までの研究結果より、著明に進行した肝障害では、細胞周期制御による骨髄細胞移植のみでの予後改善効果には限界がある事が考えられたため、肝細胞そのものの増殖を誘発する事に焦点をあて、肝細胞における細胞周期関連分子の発現を直接制御する事により、細胞増殖を促進する事が可能ではないかと考え研究を行った。肝再生を担う分子メカニズムとして、細胞周期関連分子、特にp27^<Kip1>の発現、分解系に着目し、p27^<Kip1>を介してGO期にある肝細胞をG1期へと再進入することが可能と考えられるエストリオール(E3)ならびにエストラジオール(E2)を用いた肝再生促進モデルで検討を行った。それらの投与によりKi67やBrdUの免疫染色を行ったところ、投与により陽性率が増加したため、細胞周期を促進させ肝再生の一端を担っている事は確認できたが、肝障害モデルマウスに対して投与を行った場合での有意な傷害改善効果は認められなかった。そのためこれらの実験系において実際にp27^<Kip1>を介して再生促進が行われているかを検討する為に、p27^<Kip1>の発現をWestern blottingにて確認を行ったが、有意な発現の変化は認められなかった。またCCl_4を用いた肝障害モデルマウスでの検討よりp27^<Kip1>ノックアウトマウスではCCl_4投与前後でapoptosisに関与する遺伝子の発現増加が認められた事より、肝再生においてp27^<Kip1>は逆に抑制系に関与している可能性も考えられ、現在検討を行っている。前年度は肝再生を担う分子メカニズムとして、細胞周期関連分子、特にp27^<Kip1>の発現・分解系に着目し、p27^<Kip1>を介してG0期にある肝細胞をG1期へと再進入することが可能と考えられるエストリオール(E3)ならびにエストラジオール(E2)を用いた肝再生促進モデルでの検討を行った。Ki67やBrdUに対する免疫染色では、これらの投与により陽性率が増加したため、細胞周期を促進させ肝再生の一端を担っている事は確認できたが、急性肝障害モデルマウスに対して投与を行った場合での有意な生存率改善効果は認められなかった。また肝障害の刺激を与えた直後にE2を投与した群では、逆に生存率が低下するといった、当初の予想と異なる結果が得られた。そこでこれらの実験系において肝障害後のE2の投与時期を変えて再度検討を行なったところ、投与時期の違いにより生存率が異なる事を見いだした。そのためそれぞれの投与時期における細胞周期関連分子、ならびにapoptosisに関与する遺伝子の発現の違いが生存率の違いに結びついている可能性を考え、Western blotにて蛋白の発現解析を行なった。その結果、E2の投与時期の違いにより細胞周期関連蛋白の発現パターンが異なること、またapoptosisの頻度も異なることを確認し、障害肝における再生において、これらの分子が重要な働きをしていることが確認出来た。今後はそれぞれの時期での関連分子の発現解析ならびにDNAマイクロアレイによる網羅的解析により、再生に関与する責任分子の同定ならびにp27の上流のシグナルを担う分子の同定を行なうための研究を行う予定である。前年度は肝再生を担う分子メカニズムとして、細胞周期関連分子、特にp27^<kip1>の発現・分解系に着目し、p27^<kip1>を介してG0期にある肝細胞をG1期へと再進入することが可能と考えられるエストラジオール(E2)を用いた肝再生促進モデルで検討した。Ki67やBrdUに対する免疫染色で陽性率が増加したため、E2投与が細胞周期を促進させ肝再生の一端を担っている事を確認した。さらにその効果が肝障害後のE2の投与時期の違いにより、その生存率が異なる事を見いだした。しかし、マウスを用いた再検を行なうと必ずしも一定の発現パターンの変化を示さなかったため、培養細胞系を用いて同様の結果が得られるか検討を行った。しかしマウスでの検討と同様の結果を得る事はできなかった。

今後はコラゲナーゼ処理で得られたマウス初代培養細胞を用いて再度検討を行い、E2投与による細胞増殖促進の効果に関する分子の同定を目指す。その結果を踏まえて、それぞれの時期での関連分子の発現解析ならびにDNAマイクロアレイによる網羅的解析により、再生に関与する責任分子の同定ならびにp27の上流のシグナルを担う分子の同定を行なうための研究を行う予定である。
分子進化工学によるBT殺虫タンパク質からの「タンパク質殺虫剤」の創生

下記の3項目について成果が得られた。1.障害構造の導入によるCry1Aa殺虫タンパク質上の受容体結合領域の解析Cry1Aa殺虫タンパク質のあるアミノ残基をポイントミューテーションによりシステインに置換し、さらにこのシステインを介して小さな立体障害構造(N-(9-acridinyl)maleimid;以降NAM)を導入して受容体との結合が邪魔できるか否かを検討することにより、カイコ中腸上の二つの受容体(アミノペプチダーゼNおよびカドヘリン様タンパク質)に対するこのタンパク質上の結合部位候補を再検討し、さらに候補領域を狭める試みを行った。その結果、アミノペプチダーゼN結合領域は殺虫タンパク質のドメイン3上にあり、しかも582位に導入したNAM標識で結合が邪魔される範囲にあることが判明した。2.カイコ中腸上皮細胞上のCry1Aa殺虫タンパク質受容体の解析Cry1Aa殺虫タンパク質が結合するカイコ中腸上皮細胞膜上の4種類のアミノペプチダーゼNアイソフォームのcDNAをクローニングし、それらの1次構造を決定した。また、それらのアイソフォームに対する抗体を作製して識別を可能にした結果、Cry1Aa殺虫タンパク質は主にアイソフォーム1(BmAPN1)に結合することが明らかになった。3.ファージディスプレイ系を用いた殺虫タンパク質ライブラリーとスクリーニング系の完成ドメイン2と3にランダムに変異を持つ殺虫たんぱく質を発現したファージのライブラリーを10^9レベルで構築することに成功した。また、受容体であるカドヘリン様タンパク質を用いて、結合性の高い殺虫タンパク質を発現したファージを結合性の低い殺虫タンパク質を発現したファージの中から選抜するスクリーング技術を、結合親和性の異なるCry1AaとCry1Abを発現したファージをモデルにして検討し、完成した。今期は、進化工学におけるミューテーション導入部位と、本研究において進化工学のメインの手法とするファージディスプレイ法に関して、以下のような成果を得た。1)モノクローナル抗体による殺虫性タンパク質上の受容体結合部位の解析殺虫性タンパク質に結合し、殺虫性タンパク質の受容体への結合を阻害するモノクローナル抗体を用いて、殺虫性タンパク質上の受容体結合部位の解析を行った。デリーションミュータントにより、モノクロクローナル抗体は殺虫性タンパク質のドメイン3領域のある部分に結合することが明らかになり、殺虫性タンパク質の受容体結合部位はその近辺にあると予測された。また、この結果から、進化工学に向けてミューテーションを試みるべき殺虫タンパク質上の領域が明らかになってきた。2)ファージディスプレイ系による高親和性殺虫性タンパク質選抜法の確立ある種のファージを用いることにより、殺虫タンパク質を活性をもったままの形でファージ上に発現させることが可能になった。また、これにより受容体に対する親和性の異なる殺虫性タンパク質、すなわち殺虫活性の異なる殺虫性タンパク質をin vitroで選抜し、さらにはファージをそのまま昆虫を使ったin vivoの評価系にかけることが可能になった。1)ミューテーション導入による受容体結合領域の解析殺虫性タンパク質にポイントミューテーションを導入し、これまでに挙がってきた受容体結合候補部位の何れが真の結合部であるかについて解析を開始した。すなわち、殺虫性タンパク質の受容体結合候補領域のアミノ酸残基を1残基ずっ順次システイン残基に置換し、さらにはそのシステイン残基に標識化合物を結合させることにより、殺虫性タンパク質の受容体結合能力を阻害して受容体結合領域を決定するシステムを考案し、これまでに10種類のミュータントを作製した。今後はこれらのミュータントタンパク質の結合性を評価して受容体結合の候補領域を狭めて行きたい。2)第2の受容体、アミノペプチダーゼNに対するファージスクリーニング法の検討

第2の受容体アミノペプチダーゼNに結合する「殺虫性タンパク質発現ファージ」の構築法を検討した。その結果、何れの方法で作成したファージも第1の受容体カドヘリン様タンパク質には結合したが、アミノペプチダーゼNには結合しなかった。一方、アミノペプチダーゼNと殺虫性タンパク質の結合特性を検討したところ、2分子間の結合は弱く、解離しやすいことが明らかになった。これらの結果から、殺虫性タンパク質を正しく発現したファージは出来ているものの、アミノペプチダーゼNと殺虫性タンパク質との結合が弱きために、実際の系ではファージを保持できるほどの結合が実現できないものと考えられた。そこで、現段階の発現法で十分にアミノペプチダーゼNに対する結合性が増したファージをスクリーニング出来ると考えられた。1)障害構造の導入による受容体結合領域の解析CrylAa殺虫クンパク質のあるアミノ残基をポイントミューテーションによりシステインに置換し、さらにこのシステインを介して小さな立体障害構造(N-(9-acridinyl)maleimid ;以降NAM)を導入して受容体との結合が邪魔できるか否かを検討することにより、カイコ中腸の二つの受容体(アミノペプチダーゼNおよびカドヘリン様タンパク質)に対するこのタンパク質上の結合部位候補を再検討し、さらに候補領域を狭める試みを行った。その結果、アミノペプチダーゼN結合領域は殺虫タンパク質のドメイン3上にあり、しかも582位に導入したNAM標識で結合が邪魔される範囲にあることが判明した。一方、カドヘリン様タンパク質結合領域はドメイン2上にあり、311位や377位に導入したNAM標識が結合を阻害する範囲にあることが明らかになった。これらにより、効率的なスクリーニングを可能にする、ライブラリー構築のための殺虫性タンパク質分子上の変異導入候補領域がさらに狭められた。2)ファージディスプレイ系を用いた殺虫タンパク質ライブラリーとスクリーニング系の構築ドメイン2と3にランダムに変異を持つ殺虫たんぱく質を発現したファージのライブラリーを10^gレベルで構築することに成功した。また、受容体であるカドヘリン様タンパク質を用いて、結合性の高い殺虫タンパク質を発現したファージを結合性の低い殺虫タンパク質を発現したファージの中から選抜するスクリーング技術を、結合親和性の異なるCry1AaとCry1Abを発現したファージをモデルにして検討し、完成した。
ハイブリッドドーピングによる量子ドットベース機能性ナノ材料の開発

半導体量子ドットへの不純物ドーピング技術は、量子効果に起因する特性をさらに高度化するための有望な手段である。本研究では、不純物ドーピングに加えて化学ドーピングを量子ドットに適用した技術により、シリコン量子ドットの高機能化と新機能創出を実現することを目的としている。本年度は,個々のドーピング技術に関して実験的な検討を行い、以下のi)-v)の成果を得た。i)置換型不純物ドーピングに関して、不純物濃度制御による発光波長制御および発光効率の改善に成功した。ii)不純物ドープシリコン量子ドットの成長初期段階のラマン散乱スペクトルおよび透過型電子顕微鏡観察を行い、成長メカニズムに関して知見を得た。iii)NREL(アメリカ合衆国)のグループと共同で、フェムト秒過渡吸収分光法により不純物ドープシリコン量子ドットの光励起キャリアダイナミクスを調べ、量子ドット内の自由キャリアの有無とサイズの関係を明らかにした。iv)貧溶媒添加法によるサイズ分離技術により、シリコン量子ドットのサイズ分布を10%以下に抑制し、発光線幅の抑制に成功した。また、ドナー・アクセプタ対発光のピークエネルギーと再結合レートのサイズ依存性を定量的に決定した。v)化学ドーピングの基礎技術として、電子供与体である亜硫酸イオンを溶解した液中のシリコン量子ドットの発光特性を詳細に調べ、亜硫酸イオンから量子ドットへの電荷移動により光励起により生成した余剰キャリアを補償できることを明らかにした。当初計画通り、不純物ドープシリコン量子ドットの基礎物性解明に関して系統的な研究を実施し、置換型不純物ドープシリコン量子ドットの発光エネルギー・線幅・不純物準位に関する定量的な情報を実験的に得ることに成功した。また、独自の電子顕微鏡観察用試料を開発し、形成メカニズムに関する知見を得た。化学ドーピングについても、電子供与体との相互作用について、重要な基礎データを得た。研究経過は順調であり、当初計画に従って推進する。来年度は、構造物性解明と不純物ドーピングメカニズム解明のため、アトムプローブトモグラフィーによる原子スケールでの不純物分布解明と不純物濃度依存性について研究を行う。サイズ・不純物濃度と発光特性について、より発展的な研究を実施する。具体的には、サイズの範囲や不純物濃度制御範囲を拡大し、ゲル電気泳動法によるサイズ分離技術を開発する。化学ドーピングに関して、量子ドットへの電荷の注入メカニズムの把握が非常に重要であるため、電気化学的手法によるシリコン量子ドットの酸化還元準位の決定に関する実験を検討する。当初予定していた、材料等の購入費が少なく済んだため。また次年度初期の開催の会議に変更したため、学会参加費、旅費が不要となったため。
GISTにおけるがん幹細胞の同定と機能解析;グリベック耐性克服を目指して

がん幹細胞マーカーであるCD133の発現と機能についてGIST臨床検体、病理標本、初代培養及びxenograft Linesを対象に解析を行った。結果として、CD133陽性細胞は、高い腫瘍形成能、グリベック抵抗性を有していた。免疫組織染色法による病理学的検証では、GISTに対する特異性を示す傾向が示唆された。以上の結果より、GISTにおけるCD133陽性細胞は、がん幹細胞活性を有することが示唆された。GISTは、年間10万人に2人程度の発症率といわれており、近年、消化管全般に幅広く分布する間葉系腫瘍(Gastrointestinal mesenchymal tumor:GIMT)の大部分を占める1つの腫瘍単位とみなされている。これまでの研究によりGISTは、カハール介在細胞を発生起源とする腫瘍であることが示唆されており、KITやCD34がその分子マーカーとされる。一方、CDI33は神経系腫瘍、前立腺癌、大腸癌等においてTumor-initiating cellsのマーカーとして注目されるが、GISTにおけるCD133の発現と意義は不明である。今年度の研究において、GIST臨床検体由来細胞の樹立及びCDI33の発現と機能について検討した。臨床検体を用い、初代培養及びNOGマウスへの移植を行った結果、入手検体(n=19)中、初代培養により1細胞株及びNOGマウスへの移植により2つのxenograftが樹立された。これらの細胞を用いたFACSによるCD133の発現解析によりCD117発現細胞とMargeするCD133陽性細胞が同定された。また、CD133高発現細胞のNOGマウスでの造腫瘍性は、CD133発現と正の相関を示した。Imatinibに対する感受性評価では、CD133陰性細胞に比べ、CD133陽性細胞で有意に耐性能を示した。GIST細胞の一部はCD133を発現し、腫瘍形成能、薬剤耐性などに関わる可能性を示した。今年度の研究において、GIST臨床検体(n=26)GIST7及びGIST22より2株の初代培養細胞(GIST7.3およびGIST22D6)の樹立に成功した。これら初代培養細胞の腫瘍形成能の評価をSCIDマウスへの皮下移植により評価した結果、GIST7.3で腫瘍形成を確認することができた。GIST22D6は、現在評価中である。また、GIST7.3由来Xwnograftの病理解析では、紡錘状の組織像を有し、免疫組織染色ではKITが陽性であった。フローサイトメーターによるCD133の発現解析では約2%のCD133陽性細胞を検出した。一方、CD133の病理学的検証では、病理標本(パラフィン切片)用いて免疫染色法により評価をおこなった。症例背景は、症例数;62例、性別;男性33例/女性29例、年齢;26-86歳、Size;1.5-23cm、Delle+/-;12例/38例、KIT陽性率;95.2%、CD34陽性率;98.4%、Mitotic rate(/50HPF);0-5(43例)/6-10(9例)/11-(7例)、Risk;Low(29例)/Intermediate(20例)/high(11例)である。判定結果として、CD133陽性率は80.6%(50/62)であり、GISTに対する特異性が示された。CD133は神経系腫瘍、前立腺癌、大腸癌等においてTumor-initiating cellsのマーカーとして注目される。われわれは、GISTにおけるCD133の発現と機能について臨床検体、GIST由来初代培養2細胞株及び3つのxenograft Linesを対象に解析を行った。初代培養細胞の腫瘍形成能の評価をSCIDマウスへの皮下移植により評価した結果、GIST7及び22で腫瘍形成を確認することができた。また、病理解析では、紡錘状の組織像を有し、免疫組織染色ではKITが陽性であった。さらに、KIT発現細胞とMargeするCD133陽性細胞が同定された。Imatinibに対する薬剤感受性試験では、CD133陰性細胞に比べ、CD133陽性細胞で有意に耐性能を示した。病理学的検証を免疫組織染色法により評価をおこなった。

症例背景は、症例数;62例、性別;男性33例/女性29例、年齢:26-86歳、Size;1.5-23cm、Delle+/-;12例/38例、KIT陽性率;95.2%、CD34陽性率;98.4%、Mitotic rate(/50HPF);0-5(43例)/6-10(9例)/11-(7例)、Risk;Low(29例)/Intermediate(20例)/high(11例)である。判定結果として、CD133陽性率は80.6%(50/62)であり、GISTに対する特異性が示された。
リモートセンシングによる大気・海洋相互作用の研究

本研究は衛星データを利用した熱・運動量・淡水等のフラックスの推定、海洋過程、大気過程の研究に分けられ、本年度は次のような成果を得た。(1)フラックスの推定:広域の海面の熱フラックスを推定する手法としてバルク法に衛星データを組み込んだアルゴリズムを開発した。ここでは、風速をGEOSAT/アルチメータより、海面水温をNOAA/AVHRRより求め、船舶観測データと併せて計算し、熱フラックスが海面水温に対応していることを確認した。(杉森)海面水温と表層水温の関係を明らかにするため、係留ブイによる連続観測システムを製作し田辺湾にて観測を開始した。これと同時に海洋の放射率の確定のため放射収支量測定を行い、夜間値0.973±0.008を得た。(今里)GEOSAT/アルチメータによる風速と波高の推定アルゴリズムの有効性を、気象庁ブイによる観測値との比較により確認し、これを日本海での季節風吹き出し時の風波の発達の研究に適用した。短波入射量についてもGMS/VISSRデータを用いた高精度な日射量推定モデルを作成し、日本南方海域について解析を行った。(川村)淡水フラックス推定のため船上計測用の降雨量計を試作し、海洋上での実験結果より測定精度について検討した。(深澤)(2)海洋過程研究:海洋表層混合層の短期変動を解析するため、熱の水平移流項を考慮した3次元モデルを適用し、船舶による24時間定点観測データより熱フラックスと風、海面水温の時間変動を解析した。(杉森)(3)大気過程:大気・海洋熱交換量と気象現象との関係を明らかにするため、日本海南部および東シナ海での気象庁ブイデータより3時間毎の熱交換量をバルク法により求め、年間熱損失量を解析した。またGMSの雲画像およびIR資料より東シナ海上の換気の吹き出し現象を解析した。(木村)海に吸収される短波長放射を正確に推定するために、層状の巻雲を含んだ大気・海洋モデルを用いて数値シミュレーションを行った。(高島)本研究は衛星データを利用した熱・運動量・淡水等のフラックスの推定、海洋過程、大気過程の研究に分けられ、本年度は次のような成果を得た。(高島)
MR拡散強調と水分子輸送関連遺伝子解析による肺癌悪性度の研究

肺癌例での原発病変の検出能およびリンパ節転移の正診率は、MR拡散強調画像がPET-CTより優れていることが判明した。拡散強調画像による胸部の病変の良悪の診断では、拡散強調画像はPET-CTより優れていた。肺癌例における拡散強調画像のsignal intensity anddistributionは、癌組織の癌細胞量および分布を表していることが判明した。拡散強調画像のADC値は、腫瘍の細胞密度(tumor cellular density)とCD31で表現される血管新生因子と有意な関連があった。・これまでの研究で、肺癌症例の原発巣は、FDG-PETでは描出されない病変があるのに対し、拡散強調画像ではほとんどの症例において原発巣が描出されることが判明した。・肺癌例に対する拡散強調画像は、リンパ節転移の有無の判定に有用であった。肺癌例でのリンパ節転移の診断成績は、FDG-PETによる正診率が76%であるのに対し、拡散強調画像では88%と高い傾向を示し、臨床的に有用であった。拡散強調画像はFDG-PETに比較し誤陽性・誤陰性が少ないことが判明した。FDG-PETは、高価で施行できる施設が限定されるのに対し、拡散強調画像は比較的安価であり、施行できる施設を選ばない点が有益と考えられた。・肺癌で最も多い組織型である腺癌のADC値は、扁平上皮癌のそれに比較して有意に大であった。広範囲な粘液状基質を伴っているとADCは高値となり、壊死組織では腫瘍のADC値が低値を示し、ADC値は病理所見を反映していると考えられた。・拡散強調画像のADCは、病理学的に組織の腫瘍の割合と負の相関を有意し、組織の間質の割合と正の相関を有した。・MRI拡散強調画像は、肺癌の臨床に有益と考えられる。・肺癌症例におけるMR拡散強調画像により描出率は97%と、FDG-PETによる86%に比較し、有意に高値であった。肺癌例でのリンパ節転移の正診率は95%と、FDG-PETの90%に比較し、有意に高値であった。肺癌例においては、拡散強調画像はFDG-PETに比較し有益に有益であった。・胸部の悪性病変のADC値(1.280±0.336)は、良性病変のそれ(1.991±0.816)に比較し、有意に低値であった。胸部の悪性病変のSUVmax値(6.837±6.158)は、良性病変のそれ(2.681±3.338)に比較し、有意に高値であった。胸部病変に対する拡散強調画像の感度・特異度・正診率は、PET-CTのそれと同等かそれ以上であった。胸部病変に対する良悪性の評価として、拡散強調画像はPET-CTと同様に使用可能である。・肺癌例での原発病変の検出能およびリンパ節転移の正診率は、MR拡散強調画像がPET-CTより優れていることが判明した(Usuda K,et al.Ann.Thorac.Surg.91:1689-1695,2011)。それによると、拡散強調画像による肺癌原発巣の検出は97%と、PET-CTの86%に比較し有意に良好であった。拡散強調画像による肺癌のN因子の正診率は81%と、PET-CTの71%に比較し良好な傾向があったが有意とはいえなかった。リンパ節転移陽性病変に対する拡散強調画像の感度は75%と、PET-CTの48%に比較し有意に良好であった。リンパ節転移陰性病変に関する拡散強調画像の特異度は99%と、PET-CTの97%と同様であった。リンパ節転移の有無に関する拡散強調画像の正診率は95%と、PET-CTの90%に比較し有意に良好であった。拡散強調画像のADC値とPET-CTのmaximumstandardized uptake value(SUV max)との間には、弱い逆相関関係が判明した。・胸部の悪性病変のAD)C値(1.27±0.35×10^<-3>mm^2/sec)は、良性病変のそれ(1.66±0.58×10^<-3>mm^2/sec)に比較し有意に低値であった。胸部の悪性病変のSUVmax値(6.84±6.13)は、良性病変のそれ(3.89±4.04)に比較し高値であったが有意とはいえなかった。肺癌のADC値(1.27±0.33×10^<-3>mm^2/sec)は、良性病変のそれに比較し有意に低値であった。肺癌のSUVmax値(6.74±6.06)は、良性病変のそれに比較し高値であったが有意とはいえなかった。胸部病変に対する拡散強調画像の感度・正診率は、PET-CTのそれらに比較し有意に良好で、特異度は同様であった。
脳内における方向性を持った軸索形成機構の解析

本研究では、軸索伸長に必要とさられる駆動力発生の分子メカニズムの解明を行った。その結果、軸索ガイダンス分子Netrin-1はリン酸化酵素Pak1を通じ、クラッチ分子であるShootin1のリン酸化修飾を促進する。このリン酸化によりShootin1はアクチン繊維の逆行性移動に伴う運動エネルギーを細胞接着分子および細胞外基質に伝達することで、軸索伸長に必要となる駆動力の発生を制御する。以上の結果から化学シグナルを運動エネルギーに変換する分子機構の一端が明らかになった。神経細胞は、1本の軸索と複数の樹状突起を有し機能する。培養神経細胞を用いた解析により、神経細胞は細胞内に備わる自律的な機構を利用し、複数の未成熟な神経突起の中から1本の軸索を形成する性質を有することが解っている。一方、発生時期の脳内においては、軸索の形成およびその伸長方向は規定されている。脳内の神経細胞は細胞外シグナルの制御を受けることで、軸索形成を行うと考えられている。しかしながら、軸索形成の方向性を制御する細胞外シグナルおよび細胞内の分子機構に関する知見は殆ど得られていない。本研究では、細胞外分子Netrin-1と細胞内で軸索形成を担う分子であるShootin1に着目し、細胞外シグナルが制御する軸索形成機構の解析を進めた。神経細胞の軸索形成は細胞外分子Netrin-1により促進される。この際、Netrin-1はリン酸化酵素Pak1を介してShootin1のリン酸化を促進する。リン酸化によりShootin1の分子構造は変化し(分子内相互作用の解離)、アクチン線維との結合親和性が上昇する。その結果、Shootin1は「クラッチ分子」として機能することで、突起伸長に必要な牽引力の発生を行う。これらの結果から、細胞外分子であるNetrin-1はShootin1の活性制御を行い軸索の形成を促進すると考えられた。次に、脳内における軸索形成機構の解析を行った。作製したShootin1ノックアウトマウスの表現型は、Netrin-1やDCC(Netrin-1受容体)のノックアウトマウスの表現型と酷似しており、脳梁、海馬交連の形成不全など脳構造に顕著な異常を示した。これらの結果から、細胞外シグナルが制御する軸索形成と脳組織の形成においても、Shootin1の関与が示唆された。発生段階の脳において、神経細胞の軸索の形成およびその伸長方向は細胞外シグナルにより制御されている可能性が近年示唆されてきたしかしながらその詳細な分子メカニズムに関しては不明類点が多く解明すべき点が数多く残されている。本研究では、軸索伸張を促進する細胞外分子としてnetrin-1に、細胞内で軸索伸長に必要とされる駆動力の発生に関与するクラッチ分子としてshootin1に着目することで、細胞外シグナルのよる軸索伸長の制御機構の解析を目指した。まずnetrin-1の刺激の応答し、shootin1のSer101およびSer249がリン酸化酵素PAK1によりリン酸化される。さらにリン酸化されたshootin1は成長円錐辺縁部の存在するアクチン繊維と強く相互作用することを見出した。この結果からshootin1のリン酸化修飾はshootin1の有するクラッチ分子としての活性を正に制御する可能性が考えられた。軸索の伸長には成長円錐においてアクチン繊維の逆行性移動を利用した駆動力の発生が必要と考えられている。そこでリン酸化shootin1が成長円錐において駆動力の発生に関与しているかTractionforce microscope法を用いた解析を行った。その結果netrin-1刺激により成長円錐で発生する駆動力の顕著な上昇が認められた。しかし、この駆動力の上昇はshootin1の発現抑制を抑制した場合やpak1の活性を阻害した場合には有意に抑制された。以上の研究から、netrin-1刺激による軸索の伸長は、クラッチ分子であるshootin1のリン酸化修飾を通じた活性の制御を行うことで軸索伸長に必要な駆動力の発生に関与することが示唆された。Shootin1のSer101、Ser249のリン酸化を特異的に認識するリン酸化抗体を用いた解析から、Netrin-1の刺激によりこれら2か所のリン酸化が促進されることを明らかにした。その詳細な機構として、Netrin-1によりCdc42、Rac1の活性化が誘導されリン酸化酵素Pak1と結合しPak1の活性化を引き起こす。そして、Pak1によりShootin1がリン酸化される。この一連のシグナル伝達機構を明らかにした。また、リン酸化型Shootin1は神経突起先端に存在する成長円錐に強く濃縮することから、リン酸化がShootin1の細胞内局在を制御することを見出した。これらの解析から、これまで不明であった細胞外シグナルによる軸索形成分子Shootin1の活性制御機構を明らかにでき、研究は予想外の発展がみられた。Shootin1はクラッチ分子として機能することでアクチン線維の運動エネルギーを接着分子に伝達することで、突起伸長に必要な牽引力の発生に関与する。そこで、Traction force

microscopyを用い神経軸索先端で発生する力の計測を行う。特にShootin1の発現を抑制した場合やリン酸化量を変化させた場合や、Netrin-1の刺激を加えた場合に成長円錐で発生する力がどのように変化するか解析する。さらに、Shootin1のリン酸化修飾による活性制御が脳形成時にどのような働きをするか解析する。すでに作製したShootin1ノックアウトマウスにShootin1の野性型、非リン酸化型あるいは疑似リン酸化型を子宮内電気穿孔法により導入する。この脳切片を培養し軸索が形成される様子をタイムラプス顕微鏡で観察する。野性型の発現により正常な軸索形成が回復され、非リン酸化型Shootin1では軸索形成が抑制されたまま留まる、そして、疑似リン酸化型では軸索の形成促進が認められれば、Shootin1のリン酸化による活性化が必要であると結論づけられる。研究計画の変更により研究費の前倒しを行ったが、研究の進捗状況に合わせ予算執行計画を変更したところ未使用額が生じた。未使用額を含めた次年度の研究計画は次の通りである。本研究の遂行に際し、培養神経細胞および組織を得るために実験動物(マウス、ラット)、細胞培養に必要な培地、血清やガラスプラスチック器具、遺伝子導入やライブイメージングに必要なDNA作製のための分子生物学試薬が必要であり、これらの購入に使用する。また、学会や論文発表により研究成果の対外的発表を積極的に行うため、学会参加費や旅費、英語論文校閲のための費用も必要である。