hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光近接場元素分析・質量分析顕微鏡の開発に向けた基礎研究

質量分析は、複雑な分子や高分子などの機能性物質の化学分析に欠かすことのできないツールであるが、既存の標準的な小型質量分析装置は空間分解能が不十分であるなどの欠点がある。この欠点を克服するため、光近接場技術により回折限界を超えた微小な光スポットを形成し、それを用いて元素脱離を行い質量分析の空間分解能の向上を図ることを本研究の目的とした。具体的には、既存の走査トンネル顕微鏡をベースにした近接場光学顕微鏡、元素脱離用レーザー光学系ならびに独自に設計・試作した質量分析装置を組み合わせることで、近接場質量分析顕微鏡を開発することき行った。本年度は、昨年度試作した質量分析装置と走査トンネル顕微鏡(散乱型近接場光学顕微鏡)を組み合わせたシステムを構築した。また、分析試料の脱離時の熱ダメージを最小限に抑えるため、アブレーションレーザーをナノ秒のパルスYAGレーザーからフェムト秒チタンサファイアレーザーに変更した。フェムト秒レーザー用の光学系をシステムに組み合わせ、近接場質量顕微鏡装置を構築した。この装置を利用して、バルクの半導体シリコン・金属・ポリマーをターゲットに質量分析が行えることを確認した。極微量物質の分析・空間分解分析を見据え、金クラスターの質量分析実験を行った。計算機シミュレーション結果と比較することにより、脱離した元素数を効率的に検出器まで導くための引き込み電極構造の最適化など、近接場質量顕微鏡装置のシステムとしての性能を向上させるための指針を、本研究を通して明らかとした。ナノスケール材料・構造体の作製・物性評価において、期待した組成・構造が実現しているかを明らかにする手段、すなわち高い空間分解能を有するコンパクトな新しい元素分析評価技術の開発が必要不可欠である。レーザーマイクロプローブを用いた質量分析装置の平面方向の分解能は回折限界(光スポットサイズの数マイクロメートル程度)によって制限される。これを打破するため光近接場技術を利用し、回折限界を超えた微小な光スポットを発生することで、質量分析の空間分解能の向上を図ることを目指している。既存の走査トンネル顕微鏡をベースにした近接場光学顕微鏡、パルスレーザー光学系ならびに独自に設計・試作した質量分析装置を組み合わせることで、近接場質量分析顕微鏡の開発に向けた基礎研究を行った。本年度は、特に近接場質量顕微鏡の質量分析部分の開発を中心に研究を行った。質量分析部の周辺はトンネル顕微鏡部分との配置関係からスペースが限られ、汎用の質量分析装置をそのまま使用することが難しい。また通常のマクロな質量分析に比べナノスケールの局所領域から脱離した元素数は極端に少なくなるため、分解能は多少犠牲にしつつも高効率かつ高感度という点に重点を置き質量分析部分を設計・試作した。まず、その性能評価としてナノ秒レーザーを用いてAu, Ag, Siターゲットをアブレーションし飛行時間法により質量分析を行った。その結果、それぞれの元素を識別し質量分析できることを確認した。これから飛行時間と質量の関係を明らかにし、また現状での質量分析のおよその分解能を見積もった。さらに、局所領域から脱離した元素数を効率的に検出器まで導くための引き込み電極部分についても検討を行った。
担癌生体免疫制御解除法の併用による消化器癌に対する新規免疫制御法の構築

本研究では、効果的な免疫療法の開発のために、消化器癌による免疫抑制の分子機構の解明と克服法の開発、および免疫療法の標的となるヒト消化器癌抗原の同定を試みた。その結果、発現と良好な予後との相関がみられ、免疫原性の高い腫瘍抗原が同定され、さらに、大腸癌シグナル異常による免疫抑制機構が明らかになり、in vitroおよび大腸癌マウスモデルで、シグナル阻害による免疫抑制の解除と免疫療法の効果増強の可能性が示された。本年度は腫瘍抗原や分子標的候補の同定においては、大腸癌患者血清IgG抗体を用いたDNAクローニング法により、患者で免疫原性を認めるS5,S6,S13抗原を単離した。そのうちS6抗原はマウス腫瘍モデルで、DNA免疫により抗腫瘍効果が得られたので、免疫療法に臨床応用できる可能性がある。悪性黒色腫に発現する新規癌精巣抗原として解析されてきたCT4抗原は、大腸癌、胃癌、食道癌、膵癌でも高頻度に発現が認められ、血清特異IgG抗体も高頻度に検出されたので、消化器癌抗原にもなり得ることが明らかになった。さらに、大腸癌で抗原発現が認められた症例では予後が良い傾向が示され、大腸癌細胞での抗原の膜発現が樹状細胞を介した免疫誘導を促進する可能性があると考えられた。本抗原では、HLA-A24結合性T細胞エピトープを同定しているので、今後、消化器癌における免疫療法への応用の可能性を検討する予定である。消化器癌での免疫抑制機構の解析においては、大腸癌では、IL10やVEGFなど、膵癌では、TGFβ,VEGF,IL6,PD-L1などが発現することが判明した。また、新規樹状細胞抑制分子として同定した17Lは、大腸癌や膵癌細胞株でIFNγ刺激による誘導性発現あるいは恒常的発現が認められ、癌細胞の免疫回避に関与する可能性が示唆された。さらに、大腸癌では、RASやBRAF活性型変異によるMAPKシグナル亢進やAPC異常によるWntシグナル亢進を、特異阻害剤やBRAF特異RNAiで阻害することにより、IL10等の免疫抑制分子の産生を阻害できることを見いだした。これらのシグナル阻害分子が個体レベルでの免疫抑制解除に有用であることを検討するために、MAPKシグナル亢進マウス大腸癌モデルを検討した。今後、マウスモデルによる免疫抑制解除法を検討する予定である。本年度は、前年度のヒト大腸癌による免疫抑制の分子機構の結果に基づいて、マウス大腸癌モデルを用いた免疫増強法の開発を中心に研究を実施した。前年度明らかにしたヒト大腸癌MAPKシグナル亢進による免疫抑制性サイトカイン産生を介した免疫抑制に関して、大腸癌マウスモデルで大腸癌のMAPKシグナル抑制による免疫増強効果を検討した。ERK1とERK2のshRNAを連結したレンチウイルスで処理してMAPKシグナルを阻害したマウス大腸癌細胞株を用いて、マウス大腸癌モデルで、予防的あるいは治療的に免疫すると、大腸癌抗原に対するT細胞応答の増強とともに、より強い抗腫瘍効果が得られ、大腸癌細胞におけるMAPKシグナルの阻害は、個体レベルでも、抗腫瘍免疫誘導の増強につながることが証明され、今後、大腸癌においてMAPK阻害薬を併用した免疫療法の効果増強の可能性が示唆された。また、大腸癌が産生するサイトカインは、樹状細胞のSTAT3シグナルの活性化により樹状細胞の機能低下を引き起こす。そこで、STAT3ノックアウトマウスから得た樹状細胞にマウス大腸癌抗原ペプチドを感作して、大腸癌移植マウスに腫瘍内投与したところ、強い抗腫瘍免疫誘導と抗腫瘍効果を示した。臨床応用に向けて、shRNAでSTAT3を低下させたヒト樹状細胞を用いてin vitroT細胞誘導を試みたところ、抗原特異的T細胞を強く誘導した。したがって、STAT3シグナルを阻害した樹状細胞を用いた免疫療法の開発の可能性が示唆された。さらにヒト大腸癌における免疫抑制機序の一つとして、大腸癌Snail誘導上皮間葉転換(EMT)においても、悪性黒色腫と同様に免疫抑制作用の増強を介した転移の促進が起こる可能性を見いだした。
インテリジェント巨大シュガーボールの合成と機能拡張

糖質の有する分子認識・情報伝達機能を最大限に発揮する機能性デンドリマーとして、「メゾスコピックな精密分子構築」による高い環境応答性能を有する新しい巨大分子の合成を行った。64末端型ポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーの末端アミノ基から、サルコシンN-カルボキン無水物(NCA)のリビング重合を行い、ポリサルコンン鎖が放射状に突起した星型デンドリマーを合成した。さらに、このリビング重合鎖の活性末端からポリ(アミドアミン)デンドリマー分岐鎖(サラウンドデンドリマー)を伸長することにより、マルチプルデンドリマーを合成した。デンドリマーへの低分子化合物のカプセル化を検討した。カプセル化の溶媒は、経皮ドラッグデリバリーにも使われるDMSOを用いた。DMSO中ではデンドリマーを十分に伸長させた状態で、糖を導入することができるため、内部にゲスト分子を効率よくカプセル化することができた。ゲスト分子の添加量を変化させて、カプセル化効率の最適化を行った。星型デンドリマーへの低分子ゲスト(色素ローズベンガル)のローディングを検討した。紫外可視分光光度計を用いて、ゲスト分子の封入量を定量した。また、相間移動挙動も解析したところ、デンドリマーが動的な環境応答性を示し新しい相間輸送媒体として機能することがわかった。マルチプルデンドリマーの細胞認識能を、レクチンを用いた赤血球凝集阻害試験などにより評価した結果、糖鎖間隔が制御されているためにきわめて高い細胞認識能が認められた。また、プラスミドDNAとの複合体形成を電気泳動、CD測定などにより解析した。その結果、メゾスコピックな分子サイズを有するマルチプルデンドリマーは優れた遺伝子キャリアーとして利用できることが確認できた。ポリリシンを核とするポリ(アミドアミン)デンドリマーからさらなるポリペプチド伸長を行ったメゾスコピックデンドリマーとDNAとの複合化を行った。トリプル(差圧粘度/屈折/光散乱)検出器を備えたGPC測定により、デンドリマーの分子サイズと形状を評価した。興味深いことに、ポリ(アミドアミン)部分の分岐度が低いポリマーでも、Mark-Houwink-Sakuradaプロットのべき数が、世代の上昇につれて低下する現象が見出された。これは、世代上昇につれて、ポリマーの粘度が低下し、よりコンパクトな分子として振る舞うことを示唆している。このことは、デンドリマーならではの特徴として、機能化への鍵となる。トリプル検出器は、オンライン粘度測定、屈折率測定と光散乱測定が同時にできるため多分岐高分子の評価に最適であり、分子形状に関する貴重な情報が得られた。64末端型ポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーの末端アミノ基から、サルコシンN-カルボキシ無水物(NCA)のリビング重合を行い、ポリサルコシン鎖が放射状に突起した星型デンドリマーを合成した。さらに、このリビング重合鎖の活性末端からポリ(アミドアミン)

デンドリマー分岐鎖(サラウンドデンドリマー)を伸長することにより、マルチプルデンドリマーを合成した。このマルチプルデンドリマーは、あたかも分岐した神経細胞のような分子形態を持ち、サイズ、形状がメゾスコピックに規制された新高分子である。分子サイズならびに形状を評価するために備品として導入した差圧粘度/屈折/光散乱検出器により正確な解析ができた。本研究の主眼である多分岐高分子の評価に極めて有効であった。周囲を糖ペプチドで修飾することにより、このデンドリマーに分子認識能を賦与し、巨大シュガーボールを合成した(糖誘導体置換NCAを用いた。各種の糖が導入できるが、分子認識能を評価するためN-アセチル-D-グルコサミン誘導体を用いた。)糖質マルチプルデンドリマーの分子認識能を小麦胚芽レクチン(WGA)を用いた赤血球凝集阻害試験により評価した。外殻デンドリマーの内側に入る糖質を考慮して計算したところ、糖1残基あたりの最小阻害濃度は低く、優れた細胞認識能を有していることが判明した。糖質の有する分子認識・情報伝達機能を最大限に発揮する機能性デンドリマーとして、「メゾスコピックな精密分子構築」による高い環境応答性能を有する新しい巨大分子の合成を行った。デンドリマーへの低分子化合物のカプセル化を検討した。カプセル化する時の溶媒は、経皮ドラッグデリバリーにも使われるジメチルスルホキシドを用いた。ジメチルスルホキシド中では、デンドリマーを十分に伸長させた状態で、糖を導入することができるため、内部にゲスト分子を効率よくカプセル化することができた。ゲスト分子の添加量を変化させて、カプセル化効率の最適化を行った。マルチプルデンドリマーの基礎構造である星型デンドリマーへの低分子のローディングを検討した。ゲスト分子として色素ローズベンガルを用いた。紫外可視分光光度計を用いて、ゲスト分子の封入量を定量した。また、相関移動挙動も解析したところ、デンドリマーが動的な環境応答性を示し新しい相関輸送媒体として機能することを明らかにした。マルチプルデンドリマーの細胞認識能を、レクチンを用いた赤血球凝集阻害試験などにより評価した結果、糖鎖間隔が制御されているためにきわめて高い細胞認識能が認められた。また、プラスミドDNAとの複合体形成を電気泳動、CD測定などにより解析した。その結果、メゾスコピックな分子サイズを有するマルチプルデンドリマーは優れた遺伝子キャリアーとして利用できることが確認できた。メゾスコピック領域(10nm以上の分子サイズ)の精密分子構築により、ポリリシンとポリ(アミドアミン)デンドリマーとからなるメゾスコピックデンドリマーの合成を行い、表面糖鎖の導入を行い糖質デンドリマーの合成を行った。この糖質デンドリマーの機能解析として、細胞認識能をレクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により評価した。ポリ(トリメチレンイミン>デンドリマーとポリ(N-メチルグリシン)とからなる星型デンドリマーのゲスト分子の放出挙動を、pHや温度を変えることにより検討した。
おとり型遺伝子を用いた遺伝子発現制御試薬の実用化のための試験研究

我々は、「転写因子に対するおとり(デコイ)による病態関連遺伝子の発現抑制」と「HVJ-リポソームによる遺伝子導入」を組み合わせた新しい遺伝子治療の有効性と再現性さらに試薬の安定性などを検証した。標的は引き続きNF-kB、AP-1、SP-1とし、その支配下の複数の遺伝子発現と細胞増殖への影響を調べた。SP-1デコイは、TNFα刺激した培養癌細胞(A549、U251)でSp-1支配下にないbFGFには変化は与えないものの、VEGF、TGFβ、組織因子発現誘導を再現性良く抑制し、新たにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)の発現抑制効果も判明した。このuPA抑制は、デコイによる細胞の増殖・浸潤活性抑制に深く関わると考えられる。NF-kBデコイは、家兎バルーン傷害頸動脈内膜肥厚モデルにて、傷害後の血管狭窄の程度を半減させた。デコイの血管壁への導入は、nakedの導入に比べHVJ-リポソーム使用で格段に上昇し、これが血管内膜肥厚抑制にすぐれた治療成績をもたらしたと推測された。AP-1デコイは低酸素刺激に対して有効性を確認した。実用化にはこのような各病態に応じた病因を標的とした因子選択を確立する必要があるが、極めて有効な治療手段としてHVJ-リポソームによるデコイ導入による遺伝子治療の利点が明らかとなった。ただ、安定したHVJ-リポソームの遺伝子導入活性は、リポソーム調製に使用する脂質の品質(酸化度等)や脂質薄膜の状態に依存している。しかも脂質薄膜の調製後、N2置換保存(-20°C)で、そこそこの導入効率を保証出来るのは1週間程度までである。これは既存のリポフェクション試薬の4°C保存に比べ極めて扱いが難しく、現状では流通を含めた使用保証期間も考えると製品には致命的である。今後の製品化にむけては、安定した代替脂質や保存形態等の見直しなどが必要であると判明した。我々の転写因子に対する"おとり"を導入することにより、病態に関わりうるあらゆる遺伝子の発現を抑えるという概念は、今までとは異なる新しい視点からの遺伝子治療へのアプローチである。今回我々は、この概念の遺伝子治療への実用化のため、本年度は、主に培養細胞を用い、標的とする転写因子として、まずNF-κB、AP-1、SP-1を取り上げ"おとり遺伝子"導入による標的遺伝子の発現制御の有効性や再現性を確認を行った。肺腺癌細胞株A549やglioblastoma細胞株U251において、SP-1デコイはこれまでどおり、TNFα刺激によるVEGF、TGFβ発現抑制に加え、同時にPAI-1や組織因子の発現抑制も効果があることが判明した。またこれに一致して、細胞の増殖活性および浸潤活性も抑制できた。口腔扁平上皮癌SASでのNF-kBデコイによる実験では、タンパクや活性レベルでの検証はこれからであるものの、メッセージレベルではMMP-9の発現抑制が同様に観察された。以上のことは"おとり遺伝子"導入による遺伝子発現制御の概念の正しさを示唆しているものといえる。しかしながら、リポソームの調整時期や遺伝子導入の時期によりその効果にばらつきが大きく、卵巣癌細胞など現在導入がうまく言っていない細胞も存在する。今後は、これらの原因が、リポソーム、ウイルス、細胞等何れの原因によるのかを詳しく検証し、その品質管理と適応範囲などの特定のためのデータを集積する予定である。

我々は、「転写因子に対するおとり(デコイ)による病態関連遺伝子の発現抑制」と「HVJ-リポソームによる遺伝子導入」を組み合わせた新しい遺伝子治療の有効性と再現性さらに試薬の安定性などを検証した。標的は引き続きNF-kB、AP-1、SP-1とし、その支配下の複数の遺伝子発現と細胞増殖への影響を調べた。SP-1デコイは、TNFα刺激した培養癌細胞(A549、U251)でSp-1支配下にないbFGFには変化は与えないものの、VEGF、TGFβ、組織因子発現誘導を再現性良く抑制し、新たにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)の発現抑制効果も判明した。このuPA抑制は、デコイによる細胞の増殖・浸潤活性抑制に深く関わると考えられる。NF-kBデコイは、家兎バルーン傷害頸動脈内膜肥厚モデルにて、傷害後の血管狭窄の程度を半減させた。デコイの血管壁への導入は、nakedの導入に比べHVJ-リポソーム使用で格段に上昇し、これが血管内膜肥厚抑制にすぐれた治療成績をもたらしたと推測された。AP-1デコイは低酸素刺激に対して有効性を確認した。実用化にはこのような各病態に応じた病因を標的とした因子選択を確立する必要があるが、極めて有効な治療手段としてHVJ-リポソームによるデコイ導入による遺伝子治療の利点が明らかとなった。ただ、安定したHVJ-リポソームの遺伝子導入活性は、リポソーム調製に使用する脂質の品質(酸化度等)や脂質薄膜の状態に依存している。しかも脂質薄膜の調製後、N2置換保存(-20°C)で、そこそこの導入効率を保証出来るのは1週間程度までである。これは既存のリポフェクション試薬の4°C保存に比べ極めて扱いが難しく、現状では流通を含めた使用保証期間も考えると製品には致命的である。今後の製品化にむけては、安定した代替脂質や保存形態等の見直しなどが必要であると判明した。
シアル酸をモチーフにした血液脳関内通過DDSキャリアの開発

近年、薬剤の効率的な利用あるいは副作用の軽減を目的として薬剤送達システムの開発が進められてきた。しかし、中枢神経系への送達は、脳内への物質の送達を厳しく管理する血液脳関門(BBB)が障壁となり、従来、困難とされてきた。本研究では、乳ガンが高頻度で脳に転移する事象に注目し、乳ガン特異的に発現する糖鎖を用いてリポソームを修飾することで、リポソームのBBB通過の可能性を検討することとした。リポソームの作製、シアル酸を含む目的糖鎖の合成に成功し、シアロ糖鎖修飾リポソームの開発に成功した。本研究は3つの部分から構成される。1つはリポソームの調製であり、2つめは指向性を有する糖鎖の構築とそれを用いたリポソームの修飾である。最終的に糖鎖修飾リポソームのDDSキャリアーとしての指向性の評価である。当該年度においては、第一段階の研究である、リポソームの調製を行った。リポソームの調製において主体となるリン脂質に加えて、ガングリオシド(シアル酸を有するスフィンゴ糖脂質)の添加が有効であることが知られている。その添加剤として牛の脳などから抽出したガングリオシドが用いられてきたが、希少性や不均一性の問題からリポソームの大量調製が阻まれており、本研究では、化合合成ガングリオシドによる代替が可能がどうかを検討した。抽出ガングリオシドの主要成分であるGM3に着目し、糖鎖部分の構造-活性相関、脂質部分の構造活性相関を検討し、合成コストの点も勘案し、安価で大量合成が可能なガングリオシドとして植物型セラミド含有GM3をリード化合物として見出した。それを用いてリポソームを調製した。さらに得られたリポソームは、粒子径、分布、ゼータ電位などが抽出ガングリオシド含有リポソームと同等であることが明らかになった。炎症部位に発現するセレクチンとそのリガンド糖鎖であるシアリルイスXをモデルとして当該リポソームの指向性を評価したところ、抽出ガングリオシドを用いたリポソームと同等、あるいはそれ以上の良好な結果を示した。本研究の主要研究課題であるDDSは、リポソームの効率的作製、糖鎖によるリポソームの修飾、最後に糖鎖修飾リポソームの評価から成る。本研究では、2種類の方法での糖鎖修飾リポソームの作製を検討し、成功した。1つは合成ガングリオシドを構成成分に用いるリポソームの作製である。ガングリオシドの非還元末端に位置するシアル酸はグリセロールを部分構造として有するので、容易にアルデヒドに変換でき、その高い反応性を利用してタンパク質を結合し、さらにそこに糖鎖を付加することで糖タンパク質を模倣したリポソームの修飾を達成した。糖鎖としてシアリルルイスXを用いることで、ガンや炎症へのDDSに成功した。もう1つは、細胞膜の主要成分であるコレステロールに着目し、糖鎖修飾コレステロールを成分としてリポソームを作製する方法である。マンノースやガラクトースをリンカーを介してコレステロールに結合した後、それらを成分としてリポソームを作製した。得られたリポソームがガラクトースやマンノースを認識するレクチンが存在する標的臓器に到達することが実証され、本リポソームもDDSキャリアーとして有用であることが示された。今後は、乳ガンのマーカー分子、換言すれば血液脳幹内(BBB)を通過するための鍵分子であるシアロ糖鎖(シアリルα2-3ガラクトシルβ1-3ガラクトサミン、シアリルα2-3ガラクトシルβ1-3(シアリルα2-6)ガラクトサミンなど)を合成し、それらを2種のリポソームに結合することで、BBB通過用DDSキャリアーとしての機能を評価する。本年度の成果としてこれらの糖鎖の合成に必要な方法論を確立した。本研究課題は、以下の2行程からなる。1つは、キャリアとなるリポソームの効率的な合成であり、これについては昨年度までに達成した。もう1つは、リポソームに指向性に付与する糖鎖の合成と、それによるリポソームの修飾である。本研究では、BBB通過を達成するための鍵分子としてシアリルα(2-3)ガラクトシルβ1-3ガラクトサミン、シアリルα2-3ガラクトシルβ1-3(シアリルα2-6)ガラクトサミンに着目し、本年度はその合成を行った。2種の標的化合物を効率的に合成するために、合成中間体であるシアリルα2-3ガラクトース、シアリルα2-6ガラクトサミン、ガラクトサミンの各ユニットの効率的合成法の確立が必要である。

シアリルα2-3ガラクトースのユニットは、当研究室により大量かつ簡便な合成法が確立されたN-Trocシアリルガラクトースを出発物質に用いることで、鍵中間体であるシアリルα2-3ガラクトース供与体をグラム単位で合成することができた。シアリルα2-6ガラクトサミンユニットは、高い反応性を有することで知られているN-Trocシアル酸を供与体に、また後の4糖骨格構築に向けて適切に保護したガラクトサミン誘導体を受容体に用いることで効率的な合成を達成した。各々の2糖を縮合して4糖とした後、リポソームに結合するために末端アミノ基を有するリンカーを導入した。現在、得られた糖鎖修飾リポソームの物理的性質(形状、サイズ、電荷など)を測定するとともに、マウスを用いたDDSキャリアーとしての評価を進めている。本技術の基盤となるリポソームの作製を達成しており、糖鎖による修飾を残すのみである24年度が最終年度であるため、記入しない。糖鎖修飾リポソームを早期に完成し、リポソームの物理化学的性質(形状、サイズ、電荷など)を測定、評価するとともに、マウスを用いたin vivoでの評価を進める。24年度が最終年度であるため、記入しない。
組換え微生物を用いた環境修復のための宿主-ベクターシステムの開発

Rhodococcus sp.AN-22のアニリン代謝に関与する酵素において、構成的に発現するカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ、cis,cis-ムコン酸サイクロイソメラーゼ、およびムコノラクトンイソメラーゼ遺伝子をクローニングし、これらを転写するプロモーター領域を明らかにした。また本菌のコールドショックタンパク質をコードするcspAおよびcspB2遺伝子をクローニングし、cspB1遺伝子を含むこれらの遺伝子のプロモーター領域を明らかにした。次にRhodococcus sp.AN-22の形質転換法を最適化し、従来の方法と比較して、15倍形質転換効率を高めることに成功した。決定したcspB1遺伝子のプロモーター領域の下流に、転写因子GATA-1(致死性ペプチド)をコードする遺伝子やDNA gyrase活性を阻害するタンパク質をコードするccdB遺伝子を連結した低温致死カセットを構築した。これらの低温致死カセットを本菌に導入した後、低温条件での致死性の発現を調べたところ、親株は15°Cで生育したのに対し、構築したカセットを導入した形質転換株は生育を示さなかった。しかしその後、生育温度を30°Cにシフトさせた場合、菌の生育が見られたことから、発現した転写因子GATA-1やccdB遺伝子産物は本菌を死滅させたのではなく、生育を抑制したのみであることが明らかになった。さらに強力な致死遺伝子を含む低温致死カセットを構築する目的で、制限酵素Sfi Iをコードする遺伝子をクローニングすることを試みた。同遺伝子をクローニングし、得られた断片の塩基配列を調べたところ、いずれのクローンも完全な目的遺伝子を含んでいなかった。この結果は、完全なSfi I遺伝子を有する形質転換株では、同遺伝子のわずかな発現によって大腸菌のゲノムが消化され、死滅することによると結論した。(1)構成的に発現するプロモーターについてRhodococcus sp.AN-22のアニリン代謝に関与する酵素において構成的に発現するカテコール1,2-ジオキシゲナーゼ、ムコン酸シクロイソメラーゼ、およびムコノラクトンイソメラーゼ遺伝子をクローニングし、それぞれcatA2、catB、およびcatCとした。catA2遺伝子の推定されるアミノ酸配列は、既にクローニングされているcatA1遺伝子の配列と98%の類似性を示した。またcatA2遺伝子の転写開始点を解析したところ、アニリン誘導条件、および非誘導条件下で培養した場合でも、本遺伝子は翻訳開始点より821bp上流から転写されており、構成的に発現していることが明らかになった。(2)コールドショック応答機構について本菌のコールドショックタンパク質をコードする遺伝子の中で、CspAをコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。推定されるアミノ酸配列は、本菌から既にクローニングされているcspB1遺伝子から推定される配列と71%の類似性を示した。両遺伝子のプロモーター領域の配列を比較したところ、大腸菌で報告されているcold box等のモチーフ配列を見出しことはできなかった。また予備実験として、cspB1遺伝子のプロモーター領域の下流に転写因子GATA-1(致死性ペプチド)をコードする遺伝子を連結し、低温条件での致死性の発現を調べた。その結果、親株は15°Cの条件で生育したのに対し、転写因子GATA-1を導入した株は生育を示さなかった。しかしその後、生育温度を30°Cにシフトさせた場合、菌が生育したことから、発現した転写因子GATA-1は、本菌を死滅させたのではなく、生育を抑制したのみであることが明らかになった。本菌のコールドショックタンバク質をコードする遺伝子の中で、CspB2をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。推定されるアミノ酸配列は、本菌から既にクローニングされているcspAおよびcspB1遺伝子から推定される配列と、それぞれ85%および81%の類似性を示した。

プライマー伸長法によってcspA、cspB1およびcspB2遺伝子の転写開始点を調べたところ、これらの遺伝子はそれぞれ開始コドンから174bp、184bpおよび115bp上流から転写されていた。転写開始点から推定されるプロモーター領域の配列を比較したところ、cspAおよびcspB2プロモーター領域は、よく類似していたが、cspB1プロモーター領域は、cspAおよびcspB2プロモーター領域と類似性を示さなかった。またcspB1プロモーターからの転写物量は、cspAおよびcspB2プロモーターからの転写物量と比較して少なかった。以上の結果は、cspB1プロモーターは、本菌の他のコールドショックプロモーターとは異なる制御を受けている可能性を示唆している。さらにこれらのプロモーター領域には、cold box等のモチーフ配列を見出すことはできなかったことから、本菌の低温応答機構は、既報のものとは異なる可能性が示唆された。cspB1遺伝子のプロモーター領域の下流にDNA gyrase活性を阻害するタンパク質をコードするccdB遺伝子を連結し、低温条件での致死性の発現を調べた。その結果、親株は15°Cの条件で生育したのに対し、ccdB遺伝子を導入した菌株は生育を示さなかった。しかし、生育温度を30°Cにシフトさせた場合、同菌株が生育したことから、ccdB遺伝子の発現によって本菌が死滅したのではなく、本菌の生育を抑制しただけであることが明らかになった。Rhodococcus sp.AN-22において構築する低温致死カセットに用いる制限酵素遺伝子を決定するために、本菌のゲノムDNAを調製し、主に8塩基認識の制限酵素を中心に、遺伝子配列の情報が利用できること、また容易に入手できる点を考慮して、消化パターンを調べた。その結果、Streptomyces fimburiatusから得られるSfi Iが、本菌のゲノムを適当なサイズで消化できることを見出した。Sfi I遺伝子をPCRによって増幅するために、S.fimburiatus NBRC15411のゲノムDNAを塩化ベンジル法により調製した。調製したゲノムDNAを鋳型としてSfi I遺伝子を増幅し、pGEM-T easyにクローニングし、得られた断片の塩基配列を調べたところ、いずれのクローンも完全な目的遺伝子を含んでいなかった。これはSfi I遺伝子を有する形質転換株では、同遺伝子のわずかな発現によって、ゲノムが消化され、死滅し、不完全なORFを有するものだけが生育してきたと結論した。そこでわずかに生合成されるSfi Iによる消化から大腸菌のゲノムを保護する目的で、Sfi I methylase遺伝子をクローニングし、同遺伝子を保持する大腸菌でSfi I遺伝子をクローニングすることを試みた。その結果、低コピータイプのベクターであるpMW218においてSfi I遺伝子をクローニングすることができた。今後は得られた遺伝子を足がかりとして、低温致死カセットの構築を進めたいと考えている。
明治期におけるドイツ科学教育の導入の研究―独創性育成教育の失敗の原因を探る―

周知のように日本の科学研究の最大の問題点として指摘されるのが、独創性の不足である。その原因は何処にあるのか。これについてはいろいろな観点から述べられているが、明治期の科学教育の導入という観点からはほとんど論じられていない。特に、明治10年代からは、独創性で群を抜くドイツ科学を生み出したドイツの科学教育を我が国は導入したのである。それにもかかわらず、なぜ我が国の科学研究がドイツ科学のように独創性を発揮することができなかったのか。この原因を明治期のドイツ科学教育の導入の様態を分析することによって解明するのが、本研究の目的である。昨年は、我が国の理科教育における近代科学の基本的自然観の再生産の問題を研究し、明治期に導入された欧米の理科教育論書・理科教科書と明治日本の理科教育論書及び教科書との関係を探る必要性が明らかになった。このため、今年度は、明治期に導入された欧米の理科教育論書・理科教科書と明治日本の理科教育論書及び教科書との関係を探るのに必要な資料の探索と、整理を行い、若干の展望を得た。明治24年の「理科の要旨」にある,「通常の天然物・及び現象の相互・及び人生に対する関係」の重視は,ドイツのユンゲの著書『生活共同体としての村の池』(Dorfteich als Lebensgemeinschaft)に表れた「生活共同体説」の影響である、というのが通説である。しかし、その辺の事情については、日本科学史学会の機関紙『科学史研究』誌上にこれまでいくつか研究が発表されてはいるものの、必ずしも共通理解が得られているとはいえない。そこで、本著書以外のユンゲの理科教育書を検討し、さらに、日本側におけるその影響・移入過程を詳細に探る視点の必要性が判明した。次の二つの柱で研究を進めた。(1)明治10年代以降、ドイツのいかなる科学教育思想・システム(教科書、教材、教授法、カリキュラム等々)が導入され、その思想・システムの特質はどのようなものであったかを解明するための資料を調査した。その際、科学教育に限らず、ドイツ教育学一般の導入動向と合わせながら検討した。そのため、我が国に導入されたドイツの科学教育の思想(家......ユンゲ、バイエル、クリューガー、等々)ごとに、その理念、教授法、教材、教科書、内容の選択と構成等々の特質をデータベース化して、分析・検討した。その結果、日本の理科教育書にはドイツの関連研究書が文献として明示されているものがあるが、その引用・参考関係は必ずしも明確ではない。したがってドイツ科学教育思想家をある程度限定して詳細な照合調査が必要であることが判明した。(2)ドイツの科学教育の独自性を探るために、現代のドイツの科学教育の実態を広範に調査した。各州の科学関係の学習指導要領に現れた科学教育の動向、研究団体の科学教育構想(IPN、PING)、科学教科書における科学教育課程の動向、科学教育研究の動向について関係資料を収集し、分析を行った。その結果、第三回国際数学理科研究の調査結果(TIMSS)についての世論の盛り上がりが、ドイツでは珍しく連邦レベルの科学教育改革を促し、各州の科学教育課程改革に影響を及ぼしつつあることが判明した。これまで科学教育における近代科学の基本的自然観の再生産の問題は全くといってよいほど扱われてこなかった。しかし近代科学を生み出しえなかった非西欧に属するわが国の理科教育の特質を理解するうえでも、また理科の学習を進めるうえでも、近代科学の基本的自然観の再生産という問題は、看過できない重要な問題である。そこで次の点を解明した。1.関連先行研究を整理し、理科教育研究の文脈においても、たしかに外国の科学教育思想導入におけるわが国の伝統的自然観と近代科学の自然観とのかかわりの問題が取り上げられたり、上記の日本語「自然」の研究成果に依拠しつつ理科教育にも頻出する「自然」と英語の"Nature"とが含意する意味の相違についても言及されている。さらに近代科学の基本的自然観を構成するいくつかの理念が現代の日本人(大学生)にどの程度形成されているのか、その実態調査が行われていることを明らかにした。2.この問題を研究する基本的視点として、理科教育史的視点、理科教育の目的論的視点、及び比較理科教育学的視点をも含めた包括的な理科教育論的視点の3つを提案した。3.近代科学の基本的再生産を結果として授業の中で行っているドイツの著名な実践家であるヴァーゲンシャインによる「落下の法則」の範例的教授過程を事例を再構成した。4.ヴァーゲンシャインの範例的教授過程における「自然の数学化可能性」観の伝達の意味と方法を分析し、近代科学の誕生を見た西欧の科学教育論における近代科学の基本的自然観の再生産の様相の一端を解明した。

昨年は、我が国の理科教育における近代科学の基本的自然観の再生産の問題を研究し、明治期に導入された欧米の理科教育論書・理科教科書と明治日本の理科教育論書及び教科書との関係を探る必要性が明らかになった。このため、今年度は、明治期に導入された欧米の理科教育論書・理科教科書と明治日本の理科教育論書及び教科書との関係を探るのに必要な資料の探索と、整理を行い、若干の展望を得た。明治24年の「理科の要旨」にある,「通常の天然物・及び現象の相互・及び人生に対する関係」の重視は,ドイツのユンゲの著書『生活共同体としての村の池』(Dorfteich als Lebensgemeinschaft)に表れた「生活共同体説」の影響である、というのが通説である。しかし、その辺の事情については、日本科学史学会の機関紙『科学史研究』誌上にこれまでいくつか研究が発表されてはいるものの、必ずしも共通理解が得られているとはいえない。そこで、本著書以外のユンゲの理科教育書を検討し、さらに、日本側におけるその影響・移入過程を詳細に探る視点の必要性が判明した。
ニワトリ消化管の抗菌ペプチドによる自然免疫機能とその強化への挑戦

ヒナへのプロバイオティクス給与により,サルモネラ菌由来LPSの感作で誘導される,盲腸での抗菌ペプチドである6分子種のトリβディフェンシン(AvBD)と2分子種のカテリシディン(CATH)の発現性が高めること,一方,プロバイオティクスの炎症性サイトカインの発現性への影響は小さいことが示された。プロバイオティクスは,腸内細菌叢の構成に影響して感染防御に寄与するという報告があるが,本実験の結果は,AvBDとCATHの発現性を向上させることを示唆している。このことは,プロバイオティクスは,ヒナ消化管の抗菌ペプチド産生による自然免疫能を高めて,感染防御機能を向上させることを示している。ニワトリ消化管の病原菌による感染はニワトリの健康を傷害し,鶏肉や鶏卵を汚染して食中毒の原因にもなる。トリβディフェンシン(AvBD)は抗菌ペプチドで,14分子種が同定されている。私たちはAvBDをニワトリのヒナで獲得免疫が発達する前の感染防御に働く重要な因子と考えている。プロバイオティクスは乳酸菌等の生体に有益な作用をもたらすと考えられている生菌剤である。本研究は、ニワトリ消化管のAvBDを介する自然免疫機構の解明とその強化法の追究を目的としている。本年度は、ブロイラーヒナにおいて摂取した飼料が最初に到達する消化管部位である腺胃に発現するAvBDの同定とその局在を検証し、これの発現に及ぼすプロバイオティクスの影響を解析した。プロバイオティクスは乳酸菌(Streptococcus faecalis)をベースとするもので異なる濃度で給与した。その結果、腺胃の粘膜にはAvBD1、2、4、6、10、12の遺伝子発現が検出された。プロバイオティクス給与して7日目と14日目にこれらのAvBDの遺伝子発現を解析すると、2%プロバイオティクス給与で7日目にAvBD12発現が低下した以外にはAvBD発現に及ぼすプロバイオティクス給与の影響は認められなかった。一方、AvBD12の局在を免疫染色で解析すると、表面上皮細胞と腺胃腺の白血球様細胞に検出された。プロバイオティクス給与は、表面上皮細胞のAvBD蛋白密度は減少させること、腺胃腺の陽性細胞の密度には影響しないことが認められた。これらのことから、プロバイオティクスは腺胃のAvBD分泌を促進して胃内容の有害生物の低減に寄与するものと考えられた。本研究はニワトリ消化管の感染防御機能を向上させるために,消化管に抗菌ペプチドのトリβディフェンシン(AvBD)を発現する機能が存在することを実証し,この機能がプロバイオティクス(乳酸菌)の給与により強化される可能性とその機構を追究することを目的としている。前年度は,1消化管粘膜において微生物成分を認識するToll様受容体とAvBD発現を誘導すること,ヒナへのプロバイオティクス給与はAvBD遺伝子発現には影響しなかったが、腺胃粘膜のAvBD蛋白密度を減少させるので、これを分泌させる作用があることを示唆した。本年度はプロバイオティクスがグラム陰性菌成分のリポ多糖(LPS)を認識して、その下流でAvBDや炎症性サイトカインの発現を誘導する機能に影響する可能性を検証した。その結果、ヒナへプロバイオティクス給与(P区)または非給与(対照区)し、LPSを経口摂取させると、腺胃のAvBD6と12発現、盲腸のAvBD1,2,4,5,6,7発現はP区で対照区より高いこと、炎症性サイトカインのIL1B発現は両区で差はなかったが、IL6は腺胃で、IFNγは盲腸で対照区に比べてP区で低かった。このことからプロバイオティクスは腺胃と盲腸においてAvBD発現を誘導するLPSへの応答性を高めるものと考えられた。一方、炎症を誘導するサイトカインの発現はプロバイオティクスにより腺胃と盲腸で抑制される可能性が示唆されたが、この作用は両部位で異なる可能性がある。本研究はニワトリ消化管の感染防御機能を向上させるために、消化管で抗菌ペプチドが産生され、この機能がプロバイオティクス給与により強化される可能性とその機構を追究することを目的としている。前年度までに腺胃と盲腸で微生物分子パターンを認識するToll様受容体(TLR)と8分子種のトリβディフェンシン(AvBD1, 2, 4, 5, 6, 7, 10, 12))が発現すること、プロバイオティクスを給与したうえで、サルモネラ菌リポ多糖(sLPS)を感作させると一部のAvBDの発現性が高まること、一方で炎症性サイトカイン発現への影響は小さいことを示した。平成27年度はカンピロバクターLPS(cLPS)も同様のAvBD発現への影響を示すか、また他の有力な抗菌ペプチドであるカテリシディン(CATH)の発現もプロバイオティクスの影響を受けるかを追究した。その結果、cLPSを感作させると、盲腸において、プロバイオティクス給与区と対照区との間でAvBD発現に影響しないか、または一部のAvBD発現はプロバイオティクス区で低かった。次に、腺胃と盲腸において4分子種のCATH(CATH1-4)が発現すること、サルモネラ菌LPSを感作させると、盲腸でCATH1と2の発現が対照区よりプロバイオティクス区で高くなった。しかし、cLPS感作ではCATH発現にプロバイオティクス区と対照区との間で差は見られなかった。消化管細胞の抗菌ペプチド産生能を制御する機構に、エピジェネティクスが関わる可能性を検討するためにヒストンアセチル化を同定し、今後にこれを発展させてプロバイオティクスの影響を解析できる可能性も示唆した。

これらの結果から、プロバイオティクス給与はsLPSにより誘導されるAvBDとCATH発現を増強させて感染防御機能を高めること、しかしこのLPS作用はsLPSとcLPSとで異なる可能性が示唆された。ヒナへのプロバイオティクス給与により,サルモネラ菌由来LPSの感作で誘導される,盲腸での抗菌ペプチドである6分子種のトリβディフェンシン(AvBD)と2分子種のカテリシディン(CATH)の発現性が高めること,一方,プロバイオティクスの炎症性サイトカインの発現性への影響は小さいことが示された。プロバイオティクスは,腸内細菌叢の構成に影響して感染防御に寄与するという報告があるが,本実験の結果は,AvBDとCATHの発現性を向上させることを示唆している。このことは,プロバイオティクスは,ヒナ消化管の抗菌ペプチド産生による自然免疫能を高めて,感染防御機能を向上させることを示している。主要な目標であるプロバイオティクスが消化管AvBD産生をもたらすLPSに対する応答性の検証は達成しているが、これに関連して遺伝子発現だけでなく免疫染色でもAvBD蛋白の局在変化を検証するという点では、腺胃では成果を得たが、腸管では検出できていないという課題を残している。この理由として現在までに作製している抗体の感度や特異性に問題があるか、または組織中に蛋白が少ないかが考えられる。家畜生体機構学AvBD抗体の精製を高度に行って特異性を強化するなどにより、AvBD免疫染色性を改善する。さらに抗菌ペプチドとしてAvBDだけでなく、カセデリシディンについても消化管での発現を解析する。AvBDとカセデリシディン発現への影響を検証する微生物抗原として、サルモネラ菌LPSとグラム陽性菌成分を用いるように計画していたが、鶏肉の食中毒問題を引き起こす原因菌としてカンピロバクターによる事故が多いので、これを勘案して今後にグラム陽性菌ではなく、カンピロバクターLPSが抗菌ペプチド発現に及ぼす影響を検証する。腺胃での解析は順調に行うことができた。病原微生物が蓄積しやすい盲腸でのAvBD発現とプロバイオティクスの影響の解析も試みたところ、AvBDの遺伝子月現は検出されたが、免疫染色による蛋白質の局在は検出できていない。抗菌ペプチドである「カセデリシディン」に対する抗体を作製し、これの消化管における遺伝子発現だけでなく、タンパク質の局在特性も解析する予定である。正確な抗体作製に時間をかけても必要な情報を確実に入手し、そして抗体作製費とこれを用いる実験に必要な経費を次年度予算と合わせて支出することとした。本研究は抗菌ペプチド(トリβディフェンシン(AvBD)によるヒナ消化管の自然免疫機能をプロバイオティクスにより強化するための基礎的な機構解明を目的としている。プロバイオティクス給与で腺胃のAvBD12蛋白の分布が減少することを示唆したが、さらにこれを発展させて、プロバイオティクス給与により、微生物成分の刺激に応答してAvBD産生・分泌機能が向上するかを明らかにしていく。消化管の他の部位でも基本的な解析を行うが、摂取飼料が最初に到達する腺胃での解析に重点を置くこととする。3種類のニワトリのカセデリシディンに対する抗体を作製する費用として約40万円を見込んでおり、次年度の経費と合わせてこれらの抗体を用いたカセデリシディン蛋白局在を解析する実験を実施する。
歯科治療中の精神的緊張度に関する基礎及び臨床的研究-より簡便な方法を求めて-

歯科治療中の精神的緊張度をより簡便で確実に確認する方法を求める目的で、普通抜歯症例の循環動態および身体各部の温度を併せ観察した。対象は本学附属病院口腔外科外来を受診した患者で、呼吸、循環器系に異常がなく本研究の目的および測定方法の概略を説明し、同意の得られた下顎智歯の普通抜歯症例6例である。使用機器は非観血的持続血圧監視装置UV101、深部温度計及びサーミスタ温度計である。測定項目は循環動態として収縮期血圧、拡張期血圧および脈拍数、身体各部の温度として、前額部深部温、手背部深部温、手背部皮膚温および爪床部表面温である。患者に測定機器を装着し、15分間の安静を保った後に測定を開始した。測定開始時の値を術前値とし、その後、歯科用キシロカイン^<(R)>を用いて局所麻酔を行い、その直後の値を局麻後とした。さらにヘ-ベルを使用し歯牙の脱臼を行っているときの値を抜歯中、抜歯が終了し、咬合ガ-ゼを咬んで5分後を術後として測定記録した。その結果以下の結論を得た。1.収縮期血圧は局麻後および抜歯中に術前と比較して有意に上昇し、術後は術前より低くなった。拡張期血圧は局麻後、軽度に上昇し、抜歯中にはほとんど術前の値に戻り、術後は術前と比較して有意に下降した。2.手背部深部温は抜歯中に軽度の下降を示した。手背部皮膚温は局麻後および抜歯中に下降傾向を示した。爪床部表面温は局麻後および抜歯中に有意に下降し、術後は術前よりも上昇した。3.歯科治療中の緊張度の判定に身体各部の温度の測定は用いることが可能であり、特に爪床部表面温の測定が有用と思われたが、抜歯中の緊張度を観察するためには、血圧と末梢温のいずれか一方の観察のみではなく、両者の観察を併用したほうがより多角的な評価が可能となると思われる。
細菌のアミノ酸排出機構の解析

アミノ酸の自己合成能をもつ細菌が、その生合成経路にかかる代謝制御が解除されたとき、アミノ酸を細胞外に分泌するようになる。その分泌能は同じアミノ酸を細胞内に取り込む機能が欠失しても損われない事例があることから、細菌は取り込み系とは別個にアミノ酸の排出機能を備えていると考えられる。本年度はD-およびL-アラニンを分泌併産するコリネ型細菌野生株Corynebacterium lactofermentumにおいてD-アラニンの排出系が存在することを遺伝生化学的に証明することを試みた。野生株をニトロソグアニジンで変異処理し、D-アラニン要求性変異株を含む最少寒天培地上でコロニーの周囲にできるハローが親株に比べて大きくなった変異株を取得した。生産試験により、これらの変異株の中には分泌アラニンに占めるD体の比が上昇したものの他にD-アラニンのみを分泌するものがあることがわかった。後者の変異株と野生株について、アラニンラセマーゼの阻害剤であるD-サイクロセリン存在下でのD-アラニン取り込み反応を行い、細胞内のD-アラニン蓄積量を測定したところ、そのレベルは変異株では約4割減少していることが認められた。この取り込み反応系に脱共役剤であるCarbonyl cyamide m-chlorophenyl hydrazoneを添加すると両株ともD-アラニン蓄積量は同レベルまで上昇した。さらに脱共役剤を除外して蓄積細胞からのD-アラニンの排出速度を比較した結果、変異株は野生株に比べて約1/3の排出速度を示した。これらの結果から、C.lactofermantumはエネルギー依存的にD-アラニンを排出する機能を有することが明らかになった。各種アミノ酸の発酵生産に使われているCorynebacterium glutamicumやEscherichiai coliは、アミノ酸生合成経路の代謝制御が解除されたとき、アミノ酸を細胞外に分泌し、その分泌能は同じアミノ酸の細胞内とり込み系が欠失しても損なわれない事例が知られることから、これらの菌種はとり込み系とは無関係なアミノ酸の排出機能を備えていると考えられる。それを検証するために、アミノ酸の細胞内過剰蓄積による増殖能の喪失を指標に、スレオニンおよびフェニルアラニンの排出欠損変異株の取得を試みた。両菌種の野生株からニトロソグアニジン変異処理により多数の2-アミノ-3-ヒドロキシ菌草酸(スレオニンアナログ)あるいは4-フロロフェニルアラニン(フェニルアラニンアナログ)耐性変異株をまず分離し、その中から高濃度(1020mg/ml)のスレオニンまたはフェニルアラニン含有プレート上で生育できない変異株を選び出した。それらの変異株を最少培地で増殖させた後、高濃度アミノ酸含有培地に移して培養し、菌株内のアミノ酸を熱水抽出して測定することにより、アミノ酸多量蓄積株の同定を現在行っている。一方、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したアラニン生産菌を用いてアラニン排出系を解析するために、まずその遺伝子源を探索した。Arthrobacter ureafacjensは高濃度の培地中NH_4^+によってアラニンデヒドロゲナーゼを誘導合成し、β-クロロピルビン酸存在下で酵素活性と相関してアラニンを分泌することを見い出し、本酵素がアラニン合成に働いていることを確認した。C.glutamicumとE.coliのアラニン生産菌の作製を目的に、本酵素遺伝子のクローン化を試みている。
遺伝子改変技術を用いたVEGFR-3の機能解析

本研究では、内皮細胞におけるProx1の発現を人為的に制御することでProx1の生体における機能を解析することを目的として、2種類のトランスジェニックマウスの作成を進めた。1つは、独自にクローン化したVEGFR-3転写制御領域に、Creリコンビナーゼを接続したトランスジーンである(R3-Cre)。もう一つは、CAG promoter-loxP-GFP(または、βgeo)-pA signal-loxP-Prox1 cDNA-pA signalという構造からなるトランスジーン(CFPまたはCGP)で、Creリコンビナーゼによる切り出しが起きると、それまで発現していたGFP(lacZ)の発現が消失し、下流のProx1 cDNAが発現する。交配により、これら2種のトランスジーンを持つマウスを作成し、内皮でProx1を強発現するマウスを得ることが出来る。R3-CreマウスとROSA26Rマウスとの交配により得られた産仔において、X-gal染色を行ったところ、10系列のうち4系列において、内皮におけるlacZの発現が確認された。作成した3系列のCFPマウスのうち、GFPの蛍光により全身性の発現が期待された1系列を、内皮および心臓でCreを発現するR3-Creマウスと交配した。2種のトランスジーンを持つマウスでは、心臓におけるGFPシグナルの消失およびProx1の発現誘導は確認されたが、内皮におけるProx1の発現誘導は確認出来なかった。GFPの蛍光により全身性の発現が期待されたCFPマウスであるが、内皮細胞におけるトランスジーンの発現が、無い、もしくは十分でないことが予想された。血管およびリンパ管内皮でCGPトランスジーンを強く発現するマウスを作出する必要性がある。リンパ管内皮は、胎生期において、静脈内皮細胞から出芽し分化することが知られている。ホメオボックス転写因子Prox1の遺伝子欠損マウスでは、この静脈内皮からの出芽が起きない。また、ヒト血管内皮初代培養細胞にProx1遺伝子を強発現させた実験では、本来血管内皮で発現する遺伝子群の発現が抑制され、代わりにリンパ管内皮で発現の多いVEGFR-3(Flt-4)の発現が誘導される。これらの結果から、Prox1は、静脈内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化を制御する因子として考えられている。本研究では、内皮細胞におけるProx1の発現を人為的に制御することでProx1の生体における機能を解析するため、2種類のトランスジェニックマウスの作成を進めた。1つは、CAG promoter-loxP-βgeo-pA signal-loxP-Prox1 cDNA-pA signalという構造からなるトランスジーン(CGP)で、Creリコンビナーゼによる切り出しが起きると、それまで発現していたlacZの発現が消失し、下流のProx1 cDNAが発現する。もう一つのトランスジーンは、独自にクローン化したVEGFR-3転写制御領域に、タモキシフェンの投与によりCreリコンビナーゼの活性化が誘導される、MerCreMer遺伝子[Dr. Reth(ケルン大学)より分与]を接続したものである(R3-MCM)。交配により、これら2種のトランスジーンを持つマウスを作成し、タモキシフェンを投与することで、内皮でProx1を強発現するマウスを得ることが出来る。現在、2種のトランスジェニックマウスが各3系列ずつ得られている。R3-MCMマウスは、ROSA26Rマウス(Jackson研究室より導入)と交配中であり、内皮特異的にMerCreMerが発現していることを確認した後、CGPマウスと交配する予定である。遺伝子欠損マウスやヒト血管内皮初代培養細胞を用いた解析から、ホメオボックス転写因子Prox1は、静脈内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化を制御する因子として考えられている。1つは、CAG promoter-loxP-βgeo(または、GFP)-pA Signal-loxP-Prox1 cDNA-pA signalという構造からなるトランスジーン(CGPまたはCFP)で、Creリコンビナーゼによる切り出しが起きると、それまで発現していたlacZ(GFP)の発現が消失し、下流のProx1 cDNAが発現する。もう一つのトランスジーンは、独自にクローン化したVEGFR-3転写制御領域に、Creリコンビナーゼを接続したものである(R3-Cre)。現在、CGPおよびCFPマウスが、それぞれ3系列ずつ得られている。CGPトランスジーンの発現を、X-gal染色により確認したところ、2系列では、神経や筋肉など異所性の発現が見られ、1系列では、脳・心臓・肝臓・皮膚など広範囲にわたり発現が確認されたものの全身性では無かった。また、GFPの蛍光により、CFPトランスジーンの発現を確認したところ、1系列で全身性の発現が確認された。残り2系列は現在F1マウスを取り、トランスジーンの発現を確認しているところである。R3-Creマウスは、10系列得られており、それぞれ、CreリコンビナーゼのインディケーターマウスであるROSA26Rマウスと交配している。産仔が得られたら、X-gal染色を行い、胎生期および成体での、各組織におけるCreの発現を確認する予定である。