hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小規模施設でも遺伝子組換えヤギを作出できる精巣媒介性核移植法の開発

本研究は小規模施設でも遺伝子改変ヤギを作製することを可能とする精巣媒介性核移植法の開発を目的とした.本研究では,3つのこと,すなわち,ヤギにおける精巣細胞の分離ならびに短期培養を確立したこと,精巣幹細胞へのトランスフェクションが極めて困難なこと,精巣への改変細胞移植法の基礎的知見が明らかになった,が明らかになった.これらを考慮し,研究を進めることでヤギにおける精巣媒介性核移植法が確立できる可能性が考えられた.本研究は小規模施設でも遺伝子改変ヤギを作製することを可能とする精巣媒介性核移植法の開発を目的とした.本研究では,3つのこと,すなわち,ヤギにおける精巣細胞の分離ならびに短期培養を確立したこと,精巣幹細胞へのトランスフェクションが極めて困難なこと,精巣への改変細胞移植法の基礎的知見が明らかになった,が明らかになった.これらを考慮し,研究を進めることでヤギにおける精巣媒介性核移植法が確立できる可能性が考えられた.小規模施設でも遺伝子改変ヤギの作成が可能な精巣媒介性核移植法の開発のために,平成25年度は精巣へベクターを注入した後の精巣組織状態の検索ならびにこれまでの通常プラスミドベクターを用いた精巣媒介性核移植法による交配実験を行った.性成熟を過ぎたヤギに対して,通常のGFPプラスミドベクターの注入したところ,精巣組織での組換えは確認できなかった.この結果,やはり性成熟を迎えたヤギでは精巣の構造が確立されているため,精巣幹細胞へベクターを届けることは難しいことが確認できた.また,組織学的に見えれば,精巣への遺伝子導入が組織に与える影響はほとんどないと考えられた.また,雄ヤギにベクター注入した後に3頭の雌ヤギと交配させた結果,2頭で流産してしまったため,1頭のみ産子が得られた.得られた雄産子ではGFP遺伝子の組換えは認められなかった.上記に加えて,平成26年度で行う精巣へのベクター注入のために,ウイルスの構築ならびにベクターの改良を開始した.ヤギの精巣が簡単に得られなかったため,替わりにブタの精巣を使い,精巣へのウイルス感染条件ならびにPiggyBacトランスポゾンを用意した.遺伝子導入した細胞を酵素処理し,精巣細胞への遺伝子導入効率を確認した.その結果,ウイルス感染では,低タイターであっても,酵素処理した精巣細胞への感染が認められた.現在,これが精巣の幹細胞なのかどうかを確認するために,精巣幹細胞特異的マーカーでの確認を進めている.本年度,申請研究から以下3つの結果が得られた.しかし,精巣媒介性核移植法の確立までには至らなかった.第一に,精巣を酵素処理することで細胞を分離し,ヤギ幹細胞を分離することができた.また,同幹細胞を短中期培養しても,一定の未分化能を保持させられる培養法が確立できた.第二に,精巣幹細胞へウイルスベクターを用いてトランスフェクションすることは困難であった.第三に,in vitroで遺伝子改変をした細胞を精巣へ注入することによって,GFPを発現した細胞の定着が認められた.以上のことから,精巣媒介性核移植法の確立における最大のハードルは,精巣幹細胞の遺伝子改変であることが明らかになった.ここをクリアすることが可能となれば,1頭の雄ヤギのみで遺伝子改変精子,ひいては遺伝子改変個体を作製できる可能性があるため,今後,この点を中心に研究を進めていく必要があると考えられた.獣医臨床繁殖学本年度の目標である「現法の確認ならびにその結果を見た改善」はおおよそ達成できた.やはり,精巣媒介性核移植法を確立するためには,適切なベクターならびに動物への注入法の選択が重要であることが明らかになった.平成25年度後半から26年度前半にかけて,ベクターの構築を進めたい.また,精巣へのトランスフェクション方法として単に注入するだけでなく,in vivoエレクトロポレーションを検討し,より効率の高い精巣幹細胞への遺伝子導入を進めたい.ベクターの構築ならびにH26に個体を用いた実験を行うための予算が必要であったため.ベクタープラスミドの購入ならびにヤギの購入に用いる.
複数言語環境で育つ若者の自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践の開発

本研究は、複数言語環境で育ってきた若者たちに対して自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践を構想することを目的としたものである。まず、複数言語環境で育ってきた若者が必要とする日本語教育とはどのようなものかを若者たちおよび教師たちへのインタビュー、教育実践の視察、教員との交流をもとに探った。そして、それらの知見をもとに日本語教育実践をデザインした。調査研究の成果は口頭発表および論文の形で公表しており、今後も引き続き分析・考察を進めていく予定である。本研究は、複数言語環境下で育ってきた若者たちに対して自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践を構想することを目的としている。複数言語環境の下で育ってきた若者たちの多くは、自らの将来を描くことは容易ではない環境に置かれている。しかし、現在、行われている支援の多くは教科学習支援が中心であり、進学支援、キャリア支援といった視点からの支援は少ない。そこで本研究では、複数言語環境で育ってきた若者が必要とする日本語教育とはどのようなものかをインタビューと教材分析を通して明らかにし、それらの知見をもとに、複数言語環境で育ってきた若者たちの自己形成・キャリア形成を支えていくための日本語教育実践の構築および教材の開発を行うことを目指している。このような研究目的のもと、本年度は、若者たちが必要としている日本語教育実践および教材を明らかにしていくことを目的とし、以下の2点を実施した。1)複数言語環境で育った若者たちへのインタビュー調査:外国籍児童、帰国生、国際結婚家庭の子どもなど複数言語環境で育ってきた若者を対象とし、インタビュー調査を行った。インタビューでは、若者たちの受けてきた日本語教育について語ってもらう中で、彼らに必要な日本語能力および日本語教育実践について探った。2)自己形成・キャリア形成に注目した日本語教育実践のデザインおよび実施:留学生向けの日本語授業において、自己形成・キャリア形成に注目した授業をデザインし、実施した。3)ボランティア向けの講座における成果の公表:1)、2)の実践から明らかになった知見を地域のボランティア向けの講座において、公表した。本研究は、複数言語環境下で育ってきた若者たちに対して、自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践を構想することを目的としている。複数言語環境で育ってきた若者が必要とする日本語教育とはどのようなものかをインタビューと教材分析を通して明らかにし、それらの知見をもとに複数言語環境で育ってきた若者たちの自己形成・キャリア形成を支えていくための日本語教育実践の構築および教材の開発を行うことを目指している。このような研究目的のものと、本年度は、主に海外の中等教育現場での日本語教育のあり方を探ることを目的とし、以下の3点を実施した。1)国内の年少者日本語教育実践の分析・考察:申請者がこれまで国内で行ってきた日本語教育実践の分析・考察を行い、その成果を公表した。また、国内外で行ってきた調査の結果を公表した。2)海外の年少者日本語教育実践の実態調査:海外の中等教育の現場で日本語教育に関わる教師との交流を通して、教育環境および日本語教育実践の実態の把握を行った。3)日本語教育実践のデザイン・実施:海外で日本語教育に携わる教員を対象とした教員研修において、ライフデザイン・キャリア形成を意識した日本語教育実践をデザインし、実施した。2)海外の年少者日本語教育実践の実態調査:海外の中等教育の現場で日本語教育に関わる教師との交流および現地での授業見学、授業デザインを通して、海外の中等教育現場の実態の把握を行い、そのうえで、可能な日本語教育実践のあり方を現地の教師と共に探った。3)日本語教育実践のデザイン・実施:海外で日本語教育に携わる教員を対象とした教員研修において、自己形成・キャリア形成を意識した日本語教育実践をデザインし、実施した。また、その授業実践の一部を分析・考察し、成果として公表した。所属先の変更に伴い、海外の現場の教員との関わりが増えたため、研究デザインを当初予定していた国内だけでなく、海外での教育現場も対象としたものへと見直すこととした。そのため、当初のスケジュールよりもやや遅れが出ている。本研究は、複数言語環境下で育つ若者たちに対して、自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践を構想することを目的としている。まず、複数言語環境で育ってきた若者が必要とする日本語教育とはどのようなものかを文献調査、当事者および教育関係者へのインタビュー、授業見学等を通して明らかにした。その後、それらの知見をもとに、複数言語環境で育ってきた若者たちの自己形成・キャリア形成を支えていくための日本語教育実践のあり方について具体的な実践を通して考えていくことを目指した。本年度はこれまでの研究成果をまとめ、公表することを目指し、以下の3点を実施した。1)海外調査結果の公表:昨年度の海外調査で得られたデータを分析・考察し、口頭発表および論文の形で公表した。2)国内の教育実践の分析・考察、成果の公表:前年度までの国内の教育実践の成果をまとめ、論文として公表した。

3)日本語教育実践のデザイン・実施:海外で日本語教育に携わる教員を対象とした教員研修において、自己形成・キャリア形成を意識した日本語教育実践をデザインし、実施した。本研究は、複数言語環境で育ってきた若者たちに対して自己形成・キャリア形成を支える日本語教育実践を構想することを目的としたものである。まず、複数言語環境で育ってきた若者が必要とする日本語教育とはどのようなものかを若者たちおよび教師たちへのインタビュー、教育実践の視察、教員との交流をもとに探った。そして、それらの知見をもとに日本語教育実践をデザインした。調査研究の成果は口頭発表および論文の形で公表しており、今後も引き続き分析・考察を進めていく予定である。昨年度より、所属先が変わったため、研究活動の実施スケジュールおよび実施内容に変更が生じた。海外の現場の教員との関わりが増えたため、研究デザインを当初予定していた国内だけでなく、海外での教育現場も対象としたものへと見直すこととした。そのため、当初のスケジュールよりも多少の遅れが出ている。今年度までの研究成果および課題を踏まえ、来年度は以下の研究活動を行う予定である。1)今年度までに行った海外日本語教師に対する日本語教育実践の分析・考察を行い、その成果を学会等で公表する。2)これまでの成果を踏まえ、国内外の中等教育段階における日本語教育実践をデザインし、実施する。また、その成果を本研究課題のまとめとして公表する。年少者日本語教育今年度の研究成果および課題を踏まえ、来年度は以下の研究活動を行う予定である。1)国内における年少者日本語教育実践の成果の公表。2)今年度行った海外日本語教師に対する日本語教育実践の分析・考察を行い、その成果を学会等で公表。3)今年度に引き続き、国内外の初等中等教育段階に向けた日本語教育実践をデザイン、実施する中で考察を深めていく。研究活動のうち、教師・支援者へのインタビューを行う時間が十分に取れなかった。来年度以降の課題として継続していきたい。2014年度より、所属先が変わったため、当初予定していた研究計画デザインを一部修正した。そのため、研究計画の実施に際して、当初予定していたよりも遅延が生じた。今年度より所属先が変わったため、当初予定していた研究計画に変更が生じた。今年度使用できなかった助成金は、来年度の授業実践の実施および分析・考察、また、それらを踏まえた成果の公表に伴う資金として使用する予定である。今年度の研究成果および課題を踏まえ、来年度は以下の研究活動を行う予定である。1)今年度に実施した日本語教育実践の分析・考察:申請者がこれまで国内で行ってきた日本語教育実践の分析・考察を行う。
神経幹細胞の自己再生、多分化能および生着能におけるサーカディアンリズム機構の解析

Per遺伝子などの時計遺伝子が形成する転写・翻訳のネガティブフィードバックループが、24時間周期の生理リズムを生み出す体内時計の機構であることが明らかになってきた。私は神経幹細胞の自己複製能がPer2の抑制的調節を受け、24時間周期のリズム性を有していることを明らかにしてきた。そこで平成16年度では、Per2による抑制調節の分子機構を明らかにし、生体マウス脳内における神経幹細胞活性の日内リズム性について検討した。胎生15.5日目のマウス線条体よりニューロスフィア法にて神経幹細胞を培養した。増殖因子であるEGFによって増殖刺激を与え、3日間に渡りRNAの抽出を行い、Per2やPer1などの時計遺伝子や細胞周期関連遺伝子の発現量の変化をRT-PCR法にて測定した。また、時計遺伝子Per2のAS投与の影響についても検討した。さらに成体マウス脳内の神経幹細胞自己複製能をBrdU免疫染色法にて検討した。その結果、EGFの刺激により、時計遺伝子Per2とBMAL1遺伝子の発現は3日間にわたり約24時間周期で変動し、またPer2遺伝子AS投与により、神経幹細胞のDNA合成能が上昇することが観察された。しかしながら、Per1や時計遺伝子産物の認識配列であるE-boxを含むサイクリンD1やサイクリンB1、またはWee1は24時間周期の発現変動は認められなかった。一方、成体マウス歯状回顆粒細胞下層に存在する神経幹細胞の自己複製能には、明瞭な日内リズム性が存在することを明らかにできた。以上より、神経幹細胞の自己複製能がPer2やBMAL1などの時計関連遺伝子によって周期的に調節され、特にASによるPer2遺伝子発現低下は、神経幹細胞の効率的な増殖法であることを明らかにすることができ、内在性神経幹細胞の活性も時計遺伝子の支配を強く受けている可能性を示唆できた。体内時計が24時間周期の生理リズムを生み出す分子的機構は、ピリオド遣伝子などの時計遺伝子が形成する転写・翻訳のネガティブフィードバックループであることが明らかになってきた。一方、神経幹細胞は自己再生能とニューロンやグリアへの多分化能を併せ持った未分化な細胞であり、その広範な応用性と供給の安定性から再生医療の分野で注目されている。しかし、神経幹細胞の諸機能における日内リズム性については報告が皆無である。私は時計遺伝子によって駆動される体内時計システムが、神経幹細胞の自己再生能や分化および移植時の生着能力に関与しているのではないかと考えるに至り、神経幹細胞における体内時計の役割を明らかにすることを最終目標として実験を行った。ニューロスフィア法にて、胎生15日目のマウス線条体より神経幹細胞を培養し実験に用いた。1週間増殖させた神経幹細胞を遠心分離によって回収し、培養ディッシュあるいは培養プレートに播種し、神経幹細胞の増殖因子である上皮成長因子EGFによって刺激を与えた。増殖刺激後、4時間ごとに3日間連続で生細胞数測定アッセイ(WST-8アッセイ)、DNA合成アッセイ(BrdUアッセイ)およびRNA抽出、細胞の固定を行い、神経幹細胞の自己再生能や時計遺伝子の発現の時系列を詳細に検討した。その結果、上皮成長因子EGFによる増殖刺激によって、神経幹細胞のDNA合成能と生細胞数の増加率は明瞭な24時間のリズム性を示した。また、時計遺伝子ピリオド2のmRNA量も24時間周期で変動していた。さらにピリオド2タンパク質量も24時間周期で変動しており、このタンパク質レベルでのリズム位相は、細胞増殖リズムに比較して180度反対位相であった。これらの実験より、神経幹細胞の自己再生能は時計遣伝子ピリオド2の抑制的調節を受け、24時間周期のリズム性を有していることが明らかとなった。
微分方程式の漸近解析の研究

本補助金による標題研究における実績は下の通りである。1.小パラメーターを含む線型常微分方程式系に対する初期値問題の構造の解明ができた。本質的な部分は適切な漸近族の導入とその空間における演算の整備である。このため、ある種の常微分方程式系の可解性の議論の見直しを要した。在来の研究では、漸近族の考察が不十分であったために、問題の本質的な構造を適切な形で見抜くことができず、したがって、議論の整理も十分ではなかった。本研究では、この点で著しい改良がなされたわけである。この段階までの研究成果については、代表者が本年度の日本数学会年会および秋季総合分科会ですでに報告した。また、論文を準備中である。2.1項の成果の延長として(1)非線型常微分方程式系に対しては、非線型性の処理と線型の場合の結果の応用との二面からなる。問題点は前者であるが、現在の段階では、見通しはすでに立っており、残りは細部の検証と必要な概念の整備が主なところということができる。これらは、今後の課題の一つである。(2)偏微分方程式系における対応する問題については、体系的な結果は十分とは言えない。ただし、線型双曲系の場合には、擬微分作用素、Fourier積分作用素の援用で、常微分方程式系の研究に帰着できるので、対応する常微分方程式系での研究は有効である。しかし、偏微分方程式系特有の高次元性を正当に反映させた成果は将来の重要な課題の一つである。3.以上の実績を得る上で、代表者・分担者を中心に行なった活発な研究連絡活動、および関係する研究者は当研究機関に招いての討議が極めて有益であった。本補助金で、これらの研究活動のかなりの部分をまかなうことができたことを特記しておきたい。
TAP遺伝子の多型と疾患感受性における役割

1.TAP〔Transporter associatedwithantigen presentation〕分子はサイトゾルから小胞体内腔へペプチドを輸送することにより主要組織適合遺伝子複合体〔Major Histocompatibility Complex:MHC〕クラスI分子にペプチドを供給する。ラットではTAP遺伝子に多型が存在し、TAP遺伝子の多型によってMHCクラスI分子に結合するペプチドのレパトアが変化する。我々はヒトTAP〔TAP1,TAP2〕遺伝子に多型が存在するか否かを検討した。その結果、3個のTAP1アリルと5個のTAP2アリルの存在が確認された。しかし、アリル産物間のアミノ酸置換は13個しかなく、しかも置換の大部分はペプチド輸送の特異性に影響を及ぼさないと思われるATP結合ドメインに位置していた。このことから、ヒトTAP遺伝子の多型によって疾患感受性が規定される可能性は低いことが示唆された。2.TAP遺伝子に機能的に意義のある(すなわち、MHCクラスI分子に結合するペプチドのレパトアを変化させるような)多型のある唯一の動物種であるラットのクラスI遺伝子には、低レベルの多型しか存在しない。一般的に、MHCクラスI遺伝子自体に多型の乏しい動物では、TAP遺伝子の多型によってMHCクラスI分子に結合するペプチドのレパトアの個体差が生み出されているのかも知れない。この仮説を検討するために、我々は、MHCクラスI遺伝子に多型の乏しい代表的動物であるシリアンハムスターからPCR法を用いてTAP遺伝子を増幅し、多型の有無を検索した。現在までに、合計11系統のハムスターからTAP2遺伝子の膜貫通ドメインを増幅し、その塩基配列を決定したが、ラットTAP2遺伝子に見られるような多数のアミノ酸置換を伴うような多型は検出されていない。今後さらにハムスターの数を増やして検討する予定である。
オプティカ自動試着装置を用いた着装心理評価とデザインコンセプト伝達に関する研究

1.色と着装心理についてオプティカル自動試着装置を用いて、5種のフォーマルドレスをSD法によりイメージ評価してもらい因子分析した。その結果、上位因子と色の持つイメージがほぼ一致していることがわかり、イメージに及ぼす色の重要性が確認された。また、自動試着装置を用いた評価と写真による評価とでは大きな違いは認められず予想外の結果となった。しかしどのドレスにおいて“豪華さ"の因子が上位に挙げられており、等身大で評価できるという本装置の有効性がわかった。次に、調査により抽出した3つの人気ブランドのスタイル写真をデジタルカメラ等でデジタル化し、コンピュータにより画像処理をおこなって異色の試料を作成し、“どの色が似合うか"について調べた。その結果、似合うと思う色と似合った色とに差異があり、緑については肌の色との関係があることが示唆された。ファッションカラーについて詳細にするため、各シ-ズンの街頭での流行色とメーカーの提案色との関連を調べた。その結果、最近の無彩色の流行が消費者の色のチョイスにも影響を与えていることが分かった。2.デザインコンセプトの伝達について1の人気ブランドのデザインコンセプトの中からキーワード7つを選び、消費者である20前後の女性がどのようにデザインコンセプトを認識しているのかSD法を用いて分析した。その結果、デザインのシンプル性がやや認識されていた以外は各ブランドともデザインコンセプトがよく伝わっていないことが分かった。このことから衣服を購入する際には流行要素(今年の場合シンプル、リアルクロージング)やフィーリング、ブランドバリュー等の方が重要視されていることが示唆された。一方、各ブランドでの似合うと思う色と似合った色を比較したところ、1つのブランドではいずれもオリジナル色が人気があり、ブランドイメージを形成する上で色が大きなを役割を果たしているものと考えられる。
社会的側面から野生動物問題の解消を目指す順応的モデルケースの構築

2014年度の一つ目の成果は、研究課題である栃木県自然環境課が実施している「獣害対策モデル地区事業(以下モデル事業)」の事業評価について、調査結果を原著論文「社会心理学理論を基にした野生動物に対する住民意識調査の実施とその検証-計画的行動理論と野生動物に対する人々の許容性モデルの応用事例-」としてまとめ、学術雑誌「哺乳類科学」(査読付)に正式に受理され、掲載されたことである。当論文では、モデル事業に指定された二地区において、全世帯へのアンケート調査を実施し、我が国で使用されることが少なかった特定の社会心理学理論(計画的行動理論など)を検証し、その有効性を示した。更に、今後住民に対してどのように普及啓発プログラムを実施することが効果的か、具体的な提案をした。これらの研究結果及び論文は、栃木県のみならず、獣害対策を実施している全国の行政機関にとっても、参考になる事例研究となり、大きな意義がある。また野生動物管理に関する英文の書籍“Urban Wildlife Conservation-Theory and Practice"の1章を共同執筆し、Springer社から発行された。26年度が最終年度であるため、記入しない。2013年度の研究の一つ目の成果は、当研究課題である栃木県自然環境課が実施している「獣害対策モデル地区事業(以下モデル事業)の効果測定について、その成果を論文"Assessing the impact of a wildlife education program on Japanese attitudes and behavioral intentions"にまとめ、国際学術雑誌(Environmental Education Research/査読付き)に投稿し、受理されたことである。内容は、モデル地区(実験群)と近隣地区(対照群)の全世帯へのアンケート調査の結果をまとめたもので、モデル地区の住民の獣害対策を実施することへの自信が近隣地区に比べ有意に高いことを示し、モデル事業が住民に与える潜在的な影響力を明らかにした。この研究結果は、これまで詳細な効果測定が行われることなく実施されてきた獣害対策事業の地区及び住民に与えるインパクトを、その内容と程度を初めて明らかにしたものであり、事業実施者である県にとっては今後の事業や活動内容を改善する上で重要なポイントが明確になり、政策に直結する成果となった。二つ目の成果は、当研究の成果を国内外の学会及び研究会で発表したことである。具体的には、2013年10月に米国メリーランド州で行われた北米環境教育学会で、当研究の成果"Assessing the impact of awildlife education program in Japan"を発表し、海外の研究者と意見交換をし、今後の研究の改善点などを議論した。日本の事例を海外で報告したことで、日本における獣害対策や普及啓発の成果や課題が、欧米の事例と比較しどのように異なるのか、国際比較も含め議論することができ、同様の問題を抱える世界中の研究者や行政担当者にとって参考になる成果を示すことができた。3つ目の成果は、モデル事業を実施している栃木県自然環境課の担当者及びモデル地区の住民と定期的に議論し、今後の方向性に関する検討ができたことである。研究の成果を随時共有し、意見交換をすることで、今後どのように住民参加型の活動を改善していけばよいか、またどのような研究をしていくことが有効かなど、調査結果を踏まえて議論している。研究課題の成果を査読付論文として発表し、国内外の学会で報告することができており、研究は計画以上に成果を出していると言える。今後は、栃木県内でこれまでアンケート調査を実施してきた全ての地区のデータを統合し、モデル地区事業が住民や地区に与えた影響を、マクロなスケールから、特に住民の行政の政策への評価や対策を行うことに関する住民の主体性に着目し、定量的に分析する。また、アンケートの自由回答の箇所で住民が記述した文章をテキストマイニングの手法を用いて分析することで、アンケートの形式的な回答項目では把握できない住民の感情を定性的・定量的に分析する。これらの分析をすることで、モデル地区事業の社会的側面からの総合的な評価を実施する。
マングローブにおける塩分負荷によるテルペノイド濃度上昇の生理的役割の解明

本研究においてはマングローブの耐塩性におけるテルペノイド合成の生理学的役割を明らかにすることを目的とした。まず、塩ストレス負荷条件下のマングローブ植物体におけるテルペノイド濃度変化と合成酵素遺伝子の発現を追跡するとともに、テルペノイド合成遺伝子発現及び組織中における各テルペノイド成分の濃度と塩分濃度との相関について解析し、マングローブ根においては塩濃度とテルペノイド濃度及び合成遺伝子発現は強く相関するが、葉においては必ずしも相関は認められず、組織によりテルペノイド合成の調節機構及び生理的役割が異なっていることが示唆された。また、酵母へのテルペノイド合成遺伝子の導入はその塩耐性形質に影響することも明らかにされた。これらの知見はテルペノイドが膜脂質として機能するとの仮説を支持する結果と考えられた。最後に、塩ストレスにより特異的に誘導される遺伝子群を解析し、ストレス関連転写因子と一群のテルペノイド合成遺伝子が塩ストレスにより発現上昇していることを見出した。申請者はストレス耐性と細胞膜構造の観点から沖縄産マングローブの脂質分析を行い、塩分負荷によりマングローブのテルペノイド濃度が上昇することを見いだしてきている(Oku et al.2003,J PIant Res)。さらに、テルペノイドの役割解明のための準備として、生合成酵素遺伝子のクローニングを試み、マングローブからテルペノイド生合成遺伝子のクローニングに初めて成功している。本年度は、これらの遺伝子情報をもとにテルペノイド濃度変化と合成酵素遺伝子の発現を追跡するとともに、テルペノイド合成及び組織中における各テルペノイド成分の濃度と塩分濃度との相関について詳細な解析を行った。その結果、塩負荷に伴い根においてはマングローブの種を問わず、テルペノイド生合成酵素遺伝子発現及びテルペノイド濃度が塩分濃度依存的に増加した。しかしながら、葉において、テルペノイド濃度は必ずしも塩分濃度と相関せず、組織によりテルペノイドの生理的役割が異なっていることが示唆された。他方、植物ステロールは根において塩分濃度依存的な変動は示さず、塩分耐性においてテルペノイドが植物ステロールとは異なる役割を演じていることが示された。これらの成果をまとめて現在論文投稿中である。さらに、本年度は膜脂質成分としてのテルペノイドの関与を明らかにするため、人工膜モデルであるリポソームへの取り込みを検討した。テルペノイドは少量ではあるが定量的に植物ステロール同様リポソームに取り込まれ、膜成分として機能する可能性が示された。次年度は、膜の物理的性質ひいては膜透過性に及ぼすテルペノイドの影響をリポソーム膜モデルで詳細に検討する計画である。マングローブから耐塩性因子をスクリーニングする方法として大腸菌を用いた系が確立されているので、本研究においても、テルペノイド合成遺伝子の大腸菌内での過剰発現によりルペノイド濃度を人為的に増加させ、耐塩性への影響を明らかにすることをまず試みた。マングローブのテルペノイド合成遺伝子としては既に申請者等の研究室においてクローニングされているものを用いた。しかしながら、大腸菌を用いる系では細胞内のテルペノイド濃度を増加させることができず当初想定していた評価ができなかった。微生物を酵母に切り替えてテルペノイド濃度の影響を評価する必要がある。この実験と並行して、メヒルギとオヒルギを用いて、塩分濃度を増減させ、テルペノイド濃度への影響を調べた。メヒルギ及びオヒルギ両者においてテルペノイドは塩分濃度に依存して増減し、テルペノイド合成遺伝子の発現もこれと連動していることが明らかになった。根のテルペノイド濃度と塩分濃度間には塩濃度の増減を通じて相関が認められ、マングローブにおいて塩分がテルペノイド合成の重要な制御因子であることを示唆する結果と考えられた。テルペノイドに対する抗体作成については、低分子であるテルペノイドそのままでは抗原とならないため、タンパク質と連結したコンジュゲートを作成し抗原とすることが考えられる。,今年度はルペオールをモデルとして、タンパク質と連結するための誘導体化について検討した。まず、ルペオール水酸基のスクシニル化またはリン酸エステル化によりテルペノイド骨格に酸性基を導入し、これをタンパク質との連結の足がかりとすることを試みた。スクシニル化については、試薬の無水コハク酸の反応性の問題で、十分な反応率が得られず、触媒等の反応条件のさらなる検討が必要と判断された。また、リン酸エステル化に関しては、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドを縮合剤としてリン酸を結合することを試みた。この反応は定量的であるが、リン酸基同士の結合などの副反応のため、生成物から目的物の単離が課題として残された。

マングローブの耐塩性機構は一様ではなく、進化の過程で獲得した様々なメカニズムが関与する複合的事象と想定できる。これはとりもなおさず実用化のためにはあらゆる可能性を想定した総体的な機構解明が重要であることを指摘している。本研究はマングローブの耐塩性形質の発現機構を脂質成分(テルペノイド)濃度の側面から解析することにより新たな耐塩性機構を見いだし、塩ストレス耐性作物の創生ひいては食糧増産等に寄与できる基礎知見を得ることを目的とする。本年度はまずテルペノイド合成遺伝子の発現調節を制御するプロモーター領域の特定を試みた。すなわち、オヒルギ根からDNAを調整し、TAIL法によりテルペノイド合成遺伝子上流のDNA断片を増幅し、データベース(PLACE)との照合によりプロモーター領域の同定を試みた。約500-600bpのDNA断片をTAIL法により獲得できたが、いずれの場合にもプロモーター配列の同定には至らなかった。今後は上流域遺伝子の取得法をゲノムウォーキング法へと切り替える予定である。プロモーター解析と併せて、塩ストレス負荷により誘導される遺伝子群の解析を行った。その結果、10カテゴリーに分類される48種類の遺伝子が塩ストレスにより誘導されていたことが明らかになった。各カテゴリーから選択した13種の遺伝子についてはリアルタイムPCRにより塩ストレスによる発現上昇を再確認した。そのうち、2つの転写因子といくつかのイソプレノイド代謝遺伝子が初めてマングローブの塩ストレス耐性遺伝子として同定された。最後に、トリテルペノイドの塩ストレス耐性機能について酵母を用いて検証した。トリテルペノイド合成遺伝子を導入した酵母の増殖速度は塩負荷条件下でコントロールよりも高く、トリテルペノイドが酵母に体塩性形質を賦与することが初めて確認された。
ニッケル触媒を利用した純水ベースの超精密表面研磨手法の開発

本研究の目的は最先端科学技術を支える半導体デバイス基板材料の高精度表面作製技術の確立にある.半導体デバイス材料として期待されるSiCおよびGaN等を加工対象としているが,高脆性かつ化学的に安定であるため困難を極める.これまで表面平坦化手法として化学機械研磨(CMP)が利用されてきた.CMPでは砥粒を用いるため,加工後表面の機械的ダメージの導入を完全に避けることができず,最終的なデバイイス性能や歩留まり低下を招く.そこで我々は化学作用のみで進む平坦化技術として触媒表面基準エッチング(CARE)法を提案している.本手法は,基準面に固体触媒を用い,その触媒作用によって基準面上でのみエッチング反応が誘起される.基準面に最も近づく被加工物凸部から選択的にエッチングされるため,高能率に平坦面を得ることができる.また加工液に超純水を用いていることから環境調和型のクリーンな加工法でもある.しかしながら,触媒由来のエッチングのみで反応が進行するためその加工速度はいまだ遅く,その改良が求められていた.昨年度,本手法の反応経路から使用する触媒に大きく依存することが明らかとなり,Niを使用することでこれまでの約10倍もの加工速度を得ることが示された.また,電気化学的手法を導入することで本来,即座に失われるNiの高い触媒活性を,長時間維持することにも成功し,高精度表面および高加工速度を持ち合わせる平坦化手法の確立に大きく近づいた.また,Ni以外の触媒の検討を始めており,さらに高い触媒活性を示す金属を発見した.今後をそれらを用いた加工実験を行い,本手法の加工能率を向上させていく.当初の予定として,Ni利用における条件設定,および加工装置の作製,新規触媒の探索,各種機能性材料への適応また,計算機シミュレーションによる反応メカニズムの解明を掲げていた.電気化学的手法により,Ni利用における電位等の条件出しを行い,作製した加工装置を用い,安定した加工をSiC基板だけでなくSiO2基板においても実現することができた.また並行して実施していた計算機シミュレーションの結果から本反応がこれまで開発してきたCARE法と同様の間接型加水分解反応であることを明らかにすることができた.これは触媒探索において非常に有益な知見であり,実際にNiよりも優れた触媒性能を示す金属の選定を可能にした.これらより,進捗としてはかなり順調に進呈していると判断できる.昨年度は電気化学的手法の導入によりNiの利用をほぼ確立できた.また,新たな触媒としてFeが期待できることも明らかになった.本年度はFeをNiと同様に利用できるよう条件出しを行い本手法の確立に努める.また,光電気化学的酸化法としてUV照射を援用したCARE法の開発も並行して行っていく予定である.本研究の目的は最先端科学技術を支える半導体デバイス基板材料の高精度表面作製技術の確立にある.半導体デバイス材料として期待されるSiCおよびGaN等を加工対象としているが,高脆性かつ化学的に安定であるため困難を極める.これまで表面平坦化手法として化学機械研磨(CMP)が利用されてきた.CMPでは砥粒を用いるため,加工後表面の機械的ダメージの導入を完全に避けることができず,最終的なデバイイス性能や歩留まり低下を招く.そこで我々は化学作用のみで進む平坦化技術として触媒表面基準エッチング(CARE)法を提案している.本手法は,基準面に固体触媒を用い,その触媒作用によって基準面上でのみエッチング反応が誘起される.基準面に最も近づく被加工物凸部から選択的にエッチングされるため,高能率に平坦面を得ることができる.また加工液に超純水を用いていることから環境調和型のクリーンな加工法でもある.しかしながら,触媒由来のエッチングのみで反応が進行するためその加工速度はいまだ遅く,その改良が求められていた.昨年度,本手法の反応経路から使用する触媒に大きく依存することが明らかとなり,Niを使用することでこれまでの約10倍もの加工速度を得ることが示された.また,電気化学的手法を導入することで本来,即座に失われるNiの高い触媒活性を,長時間維持することにも成功し,高精度表面および高加工速度を持ち合わせる平坦化手法の確立に大きく近づいた.また,Ni以外の触媒の検討を始めており,さらに高い触媒活性を示す金属を発見した.今後をそれらを用いた加工実験を行い,本手法の加工能率を向上させていく.当初の予定として,Ni利用における条件設定,および加工装置の作製,新規触媒の探索,各種機能性材料への適応また,計算機シミュレーションによる反応メカニズムの解明を掲げていた.電気化学的手法により,Ni利用における電位等の条件出しを行い,作製した加工装置を用い,安定した加工をSiC基板だけでなくSiO2基板においても実現することができた.また並行して実施していた計算機シミュレーションの結果から本反応がこれまで開発してきたCARE法と同様の間接型加水分解反応であることを明らかにすることができた.これは触媒探索において非常に有益な知見であり,実際にNiよりも優れた触媒性能を示す金属の選定を可能にした.これらより,進捗としてはかなり順調に進呈していると判断できる.昨年度は電気化学的手法の導入によりNiの利用をほぼ確立できた.また,新たな触媒としてFeが期待できることも明らかになった.本年度はFeをNiと同様に利用できるよう条件出しを行い本手法の確立に努める.また,光電気化学的酸化法としてUV照射を援用したCARE法の開発も並行して行っていく予定である.
自己免疫疾患を制御する肝臓由来の新規分子の探索および機能解析

本研究は非免疫組織として捉えられていた肝臓が免疫組織としての機能を有すること、そしてその役割が自己免疫疾患の発症や病態に関与することを示すことで人為的な制御を行うための新たな切り口を見つけることを目的とするものである。これまでの実験によりニューロテンシンがT細胞機能を抑制する可能性を見いだしてきた。そこで本年度は試験管内での実験によりニューロテンシンがT細胞機能をどのように抑制するかを調べてきた。はじめにリアルタイムPCR法によりニューロテンシンの受容体となりうる3つの受容体の発現をCD4+T細胞、CD8+T細胞それぞれで調べたところ、いずれの受容体も少なからず発現していた。現在ニューロテンシンの受容体の阻害剤や中和抗体を用いて3つの受容体のうちどの受容体がニューロテンシンのT細胞機能の抑制に関与しているかを調べているところである。またニューロテンシンからのシグナルがT細胞受容体シグナルのどの分子の活性を抑制しているのかも合わせて検討しているところである。一方、生体内でのニューロテンシンの機能を解析するために生体でのニューロテンシンの過剰発現系や発現抑制系を構築して丁細胞機能を中心に解析を進めているところである。さらに肝臓由来の新規分子の探索を行い、炎症によって肝臓で分子Xの発現が著しく上昇することを発見した。この分子を生体内で過剰発現させるとT細胞数の変化が確認された。そこで現在この分子Xの欠損マウスの準備を進めているところである。これまでの研究により、ニューロテンシンがT細胞機能を制御しうる新たな因子である知見が得られはじめたこと、さらに生体内でT細胞に何らかの影響を与えうる可能性を有する分子として分子Xが見いだされたことは肝臓からの因子が生体内で免疫学的な役割を果たしていることを示唆するものであり、意義深いものである。
イオニクス材料のメゾ構造制御

イオニクス材料に関してナノからメゾオーダーのポアをもつ多孔体が合成できれば、様々な電気化学的なデバイスを高性能化でき実用化に繋げる可能性が広がる。本研究においてはこのような多孔体の合成を目標に、下記の二種類の新しい合成法について研究を行った。1.界面活性剤であるC_<16>H_<33>(CH_3)_3NClを鋳型として、Li_6W_2O_9水溶液からタングステン酸を析出させた。33重量%に及ぶ高濃度でC_<16>H_<33>(CH_3)_3NClを共存させることが、MCM-41様のメゾポア多孔体を得る上で重要であった。pH=6.1の水溶液から、MCM-41様の結晶構造をもつ六方晶でa=44.8Aの析出物が得られた。pH=1.5で得られた析出物は約25Aの層間隔をもつ層状化合物であり、逆に塩基性の水溶液からは何等析出しなかった。MCM-41様の析出物を大気中で270°C以上に加熱すると、そのメゾ構造は次第に壊れていった。2.V_2O_5/B_2O_3=4/1のモル比の混合物を溶融させたのちに急冷して得た固化体からエタノールを溶媒としてB_2O_3を溶出すると、固化体の形態を保持したままのV_2O_5のメゾ多孔体が得られた。その比表面積は34.75m^2/gにも及び、V_2O_5の微細な針状晶がその伸張方向を揃えて凝集し、その間に電解質溶媒が染み込みやすい多孔体組織をもっていた。この多孔体を正極として用いてリチウム二次電池を作製すると、400μA/cm^2にも及ぶ放電電流および114mAhr/gに及ぶ放電容量が得られ、これまでに報告されたV_2O_5を正極としたいずれの場合をもはるかに凌ぐ高性能を示すことが分かった。なおこの電池における放電プロセスは、Li_xV_2O_5の形で表すとx=0.8までの組成範囲において、Li_xV_2O_5のxが小さなα相を経由して、ε相の組成領域において充放電サイクルを繰り返していることが分かった。
各種腫瘍における腫瘍幹細胞動態を制御する因子に関する解析

腫瘍幹細胞は放射線療法や化学療法に耐性の一群の細胞で、腫瘍の転移や再発の原因になるとされている。本研究では、腫瘍幹細胞の動態を解明する目的で、様々な腫瘍における腫瘍幹細胞を解析した。悪性リンパ腫の一種であるホジキンリンパ腫では、小型単核の細胞の中に腫瘍幹細胞としての性格をもつものがあり、この一群の細胞では活性酸素除去能力が高かった。またリンパ球形質細胞性リンパ腫では、Bリンパ球、形質細胞いずれのマーカーも発現しない一群の細胞が腫瘍幹細胞としての性格をもつことを明らかにした。子宮内膜癌では、腫瘍幹細胞の数を制御する因子としてTGF-betaシグナルが重要な役割を果たすことを明らかにした。腫瘍幹細胞の動態について、そのマーカーとしてアルデヒド脱水素酵素に着目して検討した。子宮内膜癌の臨床検体において、アルデヒド脱水素酵素の活性の高い腫瘍細胞を多くもつ症例は予後不良で、リンパ節転移や再発を高頻度に来すことを我々は報告した。アルデヒド脱水素酵素の活性の高い腫瘍細胞は、周囲の腫瘍細胞と比較してSmad3の活性化がみられないことを見出した。そこで子宮内膜癌細胞株を用いて検討した結果、Smad3を活性化させるシグナルを阻害すれば、アルデヒド脱水素酵素の活性が増加することがわかった。これらの結果は、子宮内膜癌においてのみではなく、肺腺癌においてもみられることも明らかにした。Smadシグナルは腫瘍周囲の間質から供給される様々な因子によって調節されていることがわかっている。現在、その因子について解析を行っているところである。腫瘍幹細胞は治療抵抗性の一群の腫瘍細胞であり、再発や転移の原因となることが知られており、その制御は腫瘍の根絶に必須のものである。本研究では、さまざまな腫瘍における腫瘍幹細胞の動態を解析することを目的とした。ある種のリンパ腫では、Bリンパ球マーカーであるCD20と形質細胞マーカーであるCD138をともに発現することが知られている。このリンパ腫の細胞株で検討したところ、このリンパ腫を特徴づけるCD20、CD138のいずれも発現しない少数の腫瘍細胞で活性酸素除去能力が高く、抗癌剤に対する抵抗性も高いことがわかった。この細胞のみを単離して培養すると、他のCD20陽性細胞、CD138陽性細胞が出現し、逆にこの細胞以外の分画からはCD20陰性、CD138陰性の形質をもつ細胞は出現しなかった。以上のことより、リンパ腫においても腫瘍幹細胞的な性質をもつ一群の細胞群が存在することがわかった。さらに、子宮内膜癌のおける腫瘍幹細胞を制御する因子についても解析し、Nodalという因子が腫瘍幹細胞に対して抑制性に働くことを見出した。子宮内膜癌組織検体において、免疫組織化学的に検討したところ、腫瘍幹細胞を特徴づけるマーカーと、Nodalの発現が相反するパターンを示した。また、Nodalを添加して培養したところ、子宮内膜癌細胞株でみられる腫瘍幹細胞を特徴づけるマーカーの発現が減弱した。この減弱は、腫瘍幹細胞マーカー遺伝子の転写効率には関係せず、蛋白質分解が関与していることも明らかにした。腫瘍幹細胞は、治療抵抗性の腫瘍細胞で、腫瘍集団の一部にのみ存在するとされているが、その確たるマーカーが少なく、実態の把握は困難である。これまでの研究で、子宮類内膜細胞癌でアルデヒド脱水素酵素(ALDH)1A1が腫瘍幹細胞マーカーとして有用であることを報告した。また、肺腺癌でorphan nuclear receptorであるNR0B1もマーカーとなり得ることを報告した。そこで、本年度は子宮類内膜細胞癌において、ALDH1A1の発現を制御する因子について解析した。ALDH1A1のプロモーター領域ではOct-1とNFYAが結合する領域に変異を加えると、ALDH1A1の転写は有意に抑制され、両転写因子が、ALDH1A1の転写に関与することが示された。ところが、免疫染色にてALDH1A1とOct-1, NFYAの発現を検討すると、必ずしもALDH1A1陽性細胞のみが両転写因子を発現しているわけではないことがわかった。詳細に解析した結果、NFYAには二種類のアイソフォームがあり、短い方のアイソフォームがALDH1A1の転写を活性化していること、ALDH1A1陽性細胞では、このアイソフォームが有意に発現していることが明らかとなった。以上の結果より、ALDH1A1の転写を活性化する因子を同定することができた。さらに、NR0B1については、肺腺癌細胞株で検討した結果、PPAR-gammaと相互作用することがわかり、その意義については、次年度に解析することとなった。また、悪性リンパ腫についても腫瘍幹細胞的な性格をもつ細胞について、活性酸素(ROS)を除去する能力に着目して検討し、これまでにホジキンリンパ腫細胞において, in vitro colony形成能およびNOD/Scidマウスへの移植により確認した。

その結果、ROS除去能力の高い細胞では造腫瘍能も高いことがわかった。種々の腫瘍における腫瘍幹細胞の動態を検討する目的で、アルデヒド脱水素酵素に着目して研究した結果、子宮内膜癌のみならず、肺癌においても、アルデヒド脱水素酵素を調節する因子を見出しつつあり、研究は順調に進捗している。今年度の計画の一つであるALDH1A1の転写調節機構を明らかにすることができ、NFYAのアイソフォームが関与していることを報告することができ、予想以上に進展させることができた。さらに、NR0B1とPPAR-gammaの相互作用も見出すことができ、次年度にその意義を解析する予定である。ニッチについても、現在解析をすすめており、おおむね計画は順調に進展している。アルデヒド脱水素酵素を調節する因子として、Smad3シグナルを見出した。今後は、そのシグナルを調節する因子の同定を行う予定である。さらに実際の臨床検体において、見出した因子とアルデヒド脱水素酵素の関係を検討することも検討している。これらの研究は、腫瘍の中でも化学療法や放射線療法などの種々の治療法に抵抗性を示す腫瘍幹細胞の制御に応用できるものと考える。NR0B1とPPAR-gammaの相互作用について、まず相互作用に必要なNR0B1のドメインを決定する。次に、相互作用に必要なドメインに変異を加えた変異体を利用して、NR0B1とPPAR-gammaの相互作用の意義を解析する。また、ニッチについても、ALDH1A1を発現する細胞の周囲の状況を解析する。消耗品として、Smadシグナルを調節する因子の同定のためのスクリーニングに用いる免疫組織化学に必要な薬品を購入する予定である。また、学会での成果発表、論文投稿のためにも研究費を使用する予定である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため、当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め当初予定通りに計画を進めていく。具体的には消耗品、情報収集あるいは成果発表のための国内旅費、研究成果発表費用(投稿料)に用いる予定である。
抗T細胞抗体およびILー2で活性化された口腔癌患者由来Tリンパ球の抗腫瘍活性

口腔癌の治療に抗T細胞(CD3)抗体およびIL2で活性化されたリンパ球(CD3・LAK細胞)を用いた養子免疫療法を行う際,化学療法剤および放射線療法と併用して行われる場合を想定し,化学療法および放射線照射が本細胞の増殖反応および細胞障害活性に及ぼす影響について検討を行った。さらに,より強い細胞障害活性を持った細胞を大量に誘導するために、各種サイトカインおよびOK432等のBRMが細胞に及ぼす影響について検討した。また各種培養液,培養BAGについても比較検討した。1.CD3・LAK細胞に化学療法剤(CDDp,5ーFu,MTX,PEP,BLM,ADR)の添加,および放射線照射(1.25,2.5,5.0,10.0,20.0Gy)を行い,それぞれが細胞に及ぼす影響につき,細胞増殖反応および細胞障害活性を測定し検討した。その結果,CD3・LAK細胞の増殖反応は放射線照射および化学療法剤により抑制された。しかし細胞障害活性については,放射線照射および化学療法剤の影響をほとんど受けなかった。この結果より,CD3・LAK細胞による養子免疫療法は,放射線照射および化学療法との併用効果が期待できるものと考えられた。2.CD3・LAK細胞に及ぼす各種サイトカインの影響を検討した。増殖反応は,rILー2が低濃度の場合にのみrTNFーαの添加により増強された。rINFーγ,rGーCSF,rIL1ーα,rIL1ーβの添加では,細胞増殖反応に明らかな影響はみられなかった。いずれのサイトカインも細胞障害活性には明らかな影響を及ぼさなかった。CD3・LAK細胞誘導初期のOK432の添加では,その細胞増殖パタ-ンに明らかな影響はみられなかったが,細胞障害活性は有意に増強された。このことより,OK432添加CD3・LAK細胞は養子免疫療法に用いる細胞としてより有用であると考えられた。また各種無血清培地およびGasーPermiable Bagを用い,CD3・LAK細胞の細胞増殖パタ-ンおよび細胞障害活性を測定し比較検討した結果,いずれも良好であり差異はみられなかった。口腔癌患者に対する養子免疫療法に際し、抗T細胞抗体がすべてのTリンパ球を活性化させ、インタ-ロイキン2(IL2)がこのリンパ球をさらに分化、増殖させる性質を利用し、患者リンパ球の細胞障害活性の誘導に関して検討を行い、IL2単独で活性化され細胞障害能をもつLymphokine-ActivatedKiller(LAK)細胞との比較を行った。(1)抗T細胞抗体およびIL2による口腔癌患者Tリンパ球の細胞障害活性誘導条件の検討:抗T細胞抗体およびIL2により、健常人および患者末梢血リンパ球の口腔癌由来樹立細胞株に対する細胞障害活性が誘導された。これはLAK細胞のそれと比較して若干低い傾向であったが、細胞増殖率はLAK細胞より数段高く、単位培養あたりの細胞障害活性はLAK細胞より高い値を示した。(2)抗T細胞抗体およびIL2で活性化された細胞障害性口腔癌患者Tリンパ球の長期培養法の検索:各種無血清培地およびGas-PermiableBagを用い、口腔癌患者リンパ球を培養し、細胞障害活性を保持したまま長期に、大量に増殖させることが可能であった。

無血清培地ではAIM-V(GIBCO社)、HyMedium910(コ-ジンバイオ社)、Gas-permiableBagではSteriCell(Dupont社)が比較的良好な結果をもたらした。今後この養子免疫療法が、口腔癌治療において化学療法および放射線療法の複合療法と併用して行われるに際し、培養誘導された本細胞に対する化学療法剤および放射線照射量の影響について検討する。さらに、より強い細胞障害活性を持った細胞を大量に培養するために、各種サイトカインおよびOK432等のBRMの影響を検討する。口腔癌の治療に抗T細胞(CD3)抗体およびIL2で活性化されたリンパ球(CD3・LAK細胞)を用いた養子免疫療法を行う際,化学療法および放射線療法と併用して行われる場合を想定し,化学療法剤および放射線照射が本細胞の増殖反応および細胞障害活性に及ぼす影響について検討を行った。さらに,より強い細胞障害活性を持った細胞を大量に誘導するために,各種サイトカインおよびOK432等のBRMが細胞に及ぼす影響について検討した。また各種培養液,培養BAGについても比較検討した。1.CD3・LAK細胞に化学療法剤(CDDP,5ーFU,MTX,PEP,BLM,ADR)の添加,および放射線照射(1.25,2.5,5.0,10.0,20.0Gy)を行い,それぞれが細胞に及ぼす影響につき,細胞増殖反応および細胞障害活性を測定し検討した。その結果,CD3・LAK細胞の増殖反応は放射線照射および化学療法剤により抑制された。しかし細胞障害活性については,放射線照射および化学療法剤の影響をほとんど受けなかった。この結果より,CD3・LAK細胞による養子免疫療法は,放射線照射および化学療法との併用効果が期待できるものと考えられた。2.CD3・LAK細胞に及ぼす各種サイトカインの影響を検討した。増殖反応は,rILー2が低濃度の場合にのみrTNFーαの添加により増強された。rINFーγ,rGーCSF,rILIーα,rIL1ーβの添加では,細胞増殖反応に明らかな影響はみられなかった。いずれのサイトカインも細胞障害活性には明らかな影響を及ぼさなかった。CD3・LAK細胞誘導初期のOK432の添加では,その細胞増殖パタ-ンに明らかな影響はみられなかったが,細胞障害活性は有意に増強された。このことより,OK432添加CD3・LAK細胞は養子免疫療法に用いる細胞としてより有用であると考えられた。また各種無血清培地およびGasーPermiable Bagを用い,CD3・LAK細胞の細胞増殖パタ-ンおよび細胞障害活性を測定し比較検討した結果,いずれも良好であり差異はみられなかった。