hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱対流問題の解の大域構造に対する計算機援用証明

Rayleigh-Benard問題を記述するOberbeck-Boussinesq方程式の解空間の大域的構造を計算機援用により2次元および3次元問題に対して解明した.Rayleigh-Benard問題を記述するOberbeck-Boussinesq方程式の解空間の大域的構造を計算機援用により2次元および3次元問題に対して解明した.1.従来のSchauderの不動点定理に基づいて開発された検証アルゴリズムをBanachの不動点定理を用いた局所一意性をも保証する存在検証手法に拡張した.さらに,精度保証付き数値計算に対するアルゴリズムレベルおよびプログラムレベルでの効率化を実現しながら,これまで得られた以上の大きなRayleigh数に対する局所一意性をともなう非自明解の手法を確立した.2.熱伝導解(自明解)は,流体の物性値によらず任意のRayleigh数に対して存在し,摂動方程式系として見た場合の零解に対応している.したがって,自明解からの分岐点の存在を検証するには,方程式を線形化・対称化した固有値問題を考える必要がある.無限次元固有値問題を精度保証付き数値計算手法で解くことにより,臨界Rayleigh数以外に対しても存在が予想されている自明な熱伝導解からの分岐点の存在検証のために必要な,線形化方程式の単射性の十分条件を導くことに成功した.3.以上の結果を踏まえて,非自明解がさらに不安定化を起こすと予想されている二次分岐点に対する数値的存在検証に取り組んだ.これまでの研究成果より得られた知見を基に従来の分岐理論を精査し,計算機援用証明のための条件を導出した.さらに数値実験によって二次分岐点の存在が検証可能となる十分な確証を得た.さらに,上記研究における議論の中で,分岐点と非自明解の解曲線とを連続的に接続するための基本的着想を得ることができた.本研究はRayleigh-Benard問題を記述するOberbeck-Boussinesq方程式に対し、その解空間の大域的構造を計算機援用によって証明することを目的とする。平成19年度は以下の研究を遂行した。1.昨年度導いた計算機援用証明アルゴリズムの有効性を検証するため、非自明解がさらに不安定化を起こすと予想されている二次分岐点に対する数値的存在検証に取り組み、対称性破壊分岐点の検証に成功した。この結果は計算機において発生する浮動小数点演算の丸め誤差を考慮に入れた区間演算ソフトウェアを用いた実装結果であり、数学的な厳密さを保証する結果である。あわせて、数値計算の効率化にも配慮し、特に線形計算の精度保証付き数値計算の実装技術に関する分野における寄与も視野に入れた研究を行った。2.Rayleigh数をパラメータとする分岐曲線を連続的に追跡するホモトピー的手法について理論的な検討を行い、非自明解同士および非自明解と分岐点を結合することにより、臨界点で熱伝導解からの分岐を起こした後の解曲線を連続的に追跡するアルゴリズム構築の道筋を与えた。具体的には、Rayleigh数を微小な区間に属する任意の値として連続的に表現し、その区間に対する解の局所一意性付き数値計算と陰関数定理との併用により解をパラメータ連続的に包み込んでいく手法の着想を得た。さらに、局所一意性付き検証アルゴリズムおよび実装を行い、数値実験によりその有効性を確認した。本研究はRayleigh-Benard問題を記述するOberbeck-Boussinesq方程式に対し,その解空間の大域的構造を計算機援用によって証明することを目的とする.平成20年度は以下の研究を遂行した.1.3次元熱対流問題に対する精度保証付き数値計算に取り組み,自明解からの不安定化を起こす臨界Rayleigh数直後の矩形解の存在検証に続き,ベナールセルと呼ばれる蜂の巣状のセルの存在証明に成功した.さらに,大域的構造を明らかにするための検証手法について理論・数値計算手法両面から考察を与えると同時に,Navier-Stokes方程式で記述されるKolmogorov問題に対する局所一意性をともなう非自明解の存在検証に成功した.さらに,流体の安定性を記述する非自己共役複素固有値問題であるOrr-Sommerfeld方程式に対する固有対の包み込みの計算機援用証明アルゴリズムを提案し,丸め誤差を考慮した数学的に厳密な数値計算により不安定化を起すパラメータの特定を行なった.2.Rayleigh数をパラメータとする分岐曲線を連続的に追跡するホモトピー的手法について理論的な検討を昨年度に続き行い,非自明解同士および非自明解と分岐点を結合することにより,臨界点で熱伝導解からの分岐を起こした後の解曲線を連続的に追跡する手法の定式化を得ることに成功した.
Ｗｅｂサーバ／クライアント・携帯機器上の高度連携システムの自動生成方式の研究

今日多くの人が日常的に利用する環境内に、有用なモバイルアプリケーション、Webサービス関数、Webアプリケーションが広範に提供されている。しかしながら、これらを自動的に連携させ1つのアプリケーションへ統合することは一般には容易ではない。従来の連携技術、すなわちマッシュアップ技術はWeb上のWebサービス関数の連携、あるいは1台のモバイル機器内のモバイルアプリケーション連携に限定されていた。本研究はモバイルアプリケーション、Webサービス関数、Webアプリケーションを統合して、1台あるいは複数台のモバイル機器上で連携するモバイルマッシュアップアプリケーションを自動生成するシステムを開発した。概要本研究は,携帯機器上の位置情報取得,画像認識,手書き入力,音声読み上げなどの高度なモバイルアプリケーションとWeb上の各種サービスの高度連携システムを宣言的記述から自動生成する方式を開発し,その有効性を実証する研究である.平成23年度に開発した方式は1台の携帯機器上で複数のモバイルアプリケーションやWebアプリケーション,Webサービスを連携させるものであった.平成24年度はこれを拡張し,複数の携帯機器上のアプリケーションとWebアプリケーション,Webサービスの連携システムの宣言的記述方式および実装方式を開発した.宣言的記述にはC-MAIDLと呼ばれる言語を利用し,Webアプリケーション,Webサービス,モバイルアプリケーション,計算,連携,出力の6種類のコンポーネントの記述を組み合わせることによって連携システムを定義する.C-MAIDLによる宣言的記述から自動生成された連携システム用モバイルアプリケーションは,ホスト役の携帯機器にインストールされる.またホスト役の携帯機器と(1台以上の)ゲスト役の携帯機器には専用の実行環境があらかじめインストールされており,その実行環境のもとで連携システム用モバイルアプリケーションが動作することにより連携を実現する.本方式により,複数のゲスト携帯機器のバーコードスキャナで読み取った商品情報をホスト携帯機器が収集し,オンラインストアでの販売価格を取得して一覧表示するシステムや,複数のゲスト携帯機器の位置情報から中心点を計算し,その近くのレストランを検索するシステムなどを自動生成できる.本研究は、携帯機器上の位置情報取得、画像認識、手書き入力、音声読み上げなどのモバイルアプリケーションとWebアプリケーション、Webサービス関数との高度連携システムを宣言的記述から自動生成する方式を開発し、その有効性を実証する研究である。平成25年度は、連携コンポーネントとなるモバイルアプリケーションの共有可能機能の記述方式の開発、イベント駆動アプローチによる統合手順記述方式の開発、総合評価を行った。共有可能機能の記述方式は、抽象レベル記述と実装レベル記述からなる。抽象レベル記述では、その共有可能機能が扱うデータ型、インタフェースを記述し、実装レベル記述では機能を実行するためのプロトコルや設定の技術的定義を記述する。これにより、モバイルアプリケーションの緊密な相互連携が可能となり、従来は既に存在するコンポーネントが公開情報を持つ場合のみ統合可能だった問題点を改善することが可能となった。イベント駆動アプローチによる統合手順記述では、従来の逐次型や並列型のみの統合手順といった表現力の制限を、大幅に拡大することが可能となった。すなわち定められた順序に基づく逐次型あるいは並列型の手順実行のみでなく、イベントの発生に伴う起動の必要性に応じてコンポーネントを自由に連携させることが可能となった。総合評価では、さまざまな典型的統合アプリケーションのためのコンポーネント記述と統合手順記述を、共有可能機能の記述方式とイベント駆動アプローチによる統合手順記述方式で行い、実験的に有効性を確認した。以上より最終年度においてモバイルアプリケーション、Webアプリケーション、Webサービス関数の高度連携を行うための現代的技術が開発できた。現在,アプリケーションソフトの実行環境は,伝統的なパソコンデスクトップ・Webサーバ・Webクライアント上から,Android環境やiOS環境の携帯機器上へと急速に拡大している.携帯機器としてはスマートフォンとタブレットコンピュータが代表的である.これらの携帯機器上では,位置情報,画像認識,手書き入力,音声読み上げなどの高度ソフトが無料で利用可能である.もしこれらのアプリケーションソフト同士やWeb上の各種サービスを連携させるシステムが容易に生成できるならば,従来存在しなかった全く新しいタイプの高度応用システムを次々と実現することが可能となる.本研究はWebサーバ/クライアント・携帯機器上の高度連携システムを宣言的記述から作り出す自動生成方式を開発し,その有効性を実証する研究である.平成23年度は1台の携帯機器上の複数応用システムと外部Webアプリ/サービスの連携システムの記述方式と実装方式を開発した. 1台の携帯機器上で連携させたい仕事全体を記述するXML記述方式を開発した.仕事の1つ1つの単位は,機器内のモバイルアプリの起動,外部Webサービスの入力パラメータ付き呼び出しと結果取得,外部Webアプリケーションの入力データ付き起動と出力ページの部分情報抽出に基づく結果取得である.1台のAndroid機器内でXML全体記述から,連携システムをモバイルアプリとして自動生成する方式を開発した.さらに連携システムを,Webサービス関数として,あるいはWebアプリケーションとして生成する方式も開発した.これらの成果については,Web工学の世界的会議であるICWE国際会議において論文発表を行った.ICWE国際会議においては,Webサービスの連携,Webアプリの連携,モバイルアプリの連携を追求している研究者と意見交換を行い,有益な情報やコメントを得ることができた.現在までのところ,本研究はおおむね順調に進展している.

平成23年度に開発した1台の携帯機器上での連携システムの記述方式を拡張し,複数の携帯機器上での連携システムの自動生成に成功している.連携システムのホスト携帯端末はAndroid端末であるが,連携システムに参加するゲスト側の携帯端末はAndroid端末とiOS端末のどちらでも良い.現在の問題は,連携に利用するモバイルアプリケーションの機能の共有方法である.特定のモバイルアプリケーションの機能を連携システムに利用したくても,その呼び出し方法や結果の受け取り方法などが分からなければ,連携は困難となる.そこで,モバイルアプリケーションが持つ共有機能の記述方式を検討している.本研究の現在までの達成度は,おおむね順調に進展している.標準的Android携帯端末の1つであるスマートフォンのNexus One上で代表的な連携システムを自動生成することに成功している.複数端末上で連携を扱う場合において,連携の中心端末としては,Android携帯端末を想定している.また連携に参加する端末としては,Android携帯端末およびiOS携帯端末を想定している.連携の中心端末においては,Webサーバを配置する.Webサーバとしては,モバイル端末用の代表的WebサーバであるAndroidプラットフォーム用i-Jettyシステムを利用する.一般にデータフローに基づくアプリ連携は,共有の子ノードを許す木構造上の計算実行となる.この計算実行開始から実行終了までの処理時間を効率化する実行方式の検討も進行している.また従来iOS携帯端末では実行上の制約・制限がきつく,Android環境のintent呼び出しのような連携機能が存在しなかった.しかしながら最新版iOSへの改訂により,限定的な連携機能を扱える方法が出現しており検討を行っている.
アデノウイルスによる甲状腺ホルモントランスポーターの遺伝子導入と神経の可塑性制御

甲状腺ホルモンは甲状腺で生合成され、その分泌は視床下部-下垂体-甲状腺系フィードバック経路により監視され厳密に調節されている。この際に関知されるのが遊離甲状腺ホルモン濃度である。今日まで甲状腺ホルモンはその見かけの疎水性から脂質2重膜を容易に通過し、細胞内に入ると考えられてきた。しかしながら近年この甲状腺ホルモンの膜輸送が単純な拡散ではなくトランスポーターを介した膜輸送であることが提唱されてきたがその分子メカニズムは不明であった。更に甲状腺ホルモンが脳内に入り視床下部や下垂体に到達するためには脳血液関門や脳脊髄液関門を通過しなくてはならずその場所における輸送機構も想定されてきた。我々はこれまで有機アニオントランスポーター遺伝子群の多くを単離し発表してきた。我々の単離したクローンのうち有機アニオントランスポーターoatp2およびoatp3は中枢神経系において甲状腺ホルモンを輸送し、oatp2は海馬錐体細胞や小脳プルキンエ細胞などの神経細胞に、oatp3は網膜、脈絡叢、視上核、下垂体前葉、甲状腺に発現しており、血液脳関門、血液髄液関門を構成するとともに、視床下部-下垂体-甲状腺系フィードバック経路において血中遊離甲状腺ホルモン濃度を細胞内に伝達するするトランスポーターである事が明らかになった。また今日までに我々はヒト有機アニオントランスポーターのうちOATP、LST-1、OATP-Eが甲状腺ホルモンを輸送することを明らかにした。LST1はヒト肝臓のみに発現しており、ヒトOATPは脳のみに発現している。一方、OATP-Eは主に末梢の臓器に発現していることからヒトにおいてはラットとは異なり甲状腺ホルモンを輸送する有機アニオントランスポーターは臓器特異的に発現していることが明らかにした。現在有機アニオントランスポーターアデノウイルスを作製し終わり、細胞導入を始めている。さらに血中に甲状腺ホルモンが存在するにも関わらずその作用が発揮されない疾患として甲状腺ホルモン不応症(Refetoff病)が発見されたが、その病態はは従来甲状腺ホルモンに対する核レセプターの異常であるとされていた。しかし最近それでは説明できない新たな原因として甲状腺の膜輸送異常が提唱され、病態との関連が示唆された。発達期におけるニューロンの形態形成、シナプス形成において甲状腺ホルモンが重要な働きをしていることが知られており、ホルモンの欠乏が知的障害をともなうクレチン病の原因である。甲状腺ホルモンはトランスポーターを介して形質膜を透過し細胞内に取り込まれることが示唆されていたが、研究代表者は近年、中枢神経系に発現しており甲状腺ホルモンを輸送する2つのラット有機アニオントランスポーターoatp2およびoatp3を世界に先駆けて単離した。in situ hybridizationおよび抗体の結果からoat2は海馬錐体細胞や小脳プルキンエ細胞などの神経細胞と脈絡叢に、oatp3蛋白は網膜、脈絡叢、視上核、大脳皮質錘体細胞に発現していることから、どちらも中枢神経系に甲状腺ホルモンを輸ぶトランスポーターであり血液脳関門、血液髄液関門を構成・制御しニューロンの発達や可塑性を制御する重要な機能を持つ分子であると考えられた。研究代表者はラット大脳よりプロスタグランジンD2を輸送する新規有機アニオントランスポーターmoat1を単離した。単離されたcDNAのアミノ酸配列はLST-1、oatpfamily、プロスタグランジントランスポーターに相同性が高かった。moatlの蛋白は、有機アニオントランスポーターに共通の12箇所の膜貫通領域を持つと推測された。moat1のmRNAは全ての臓器に4.4キロと2.3キロの転写産物が認められた。また、moat1のヒトのホモログと考えられるクローンKIAA0880の転写産物(4.4および2.2キロ)もまた全てのヒト臓器に認められた。さらに2つの転写産物の発現量は各臓器によって異なっていた。moatlを発現させた卵母細胞は特異的にプロスタグランジンD2、ロイコトリエンC4、タウロコール酸を細胞外のナトリウム非依存性に輸送した。moatlのmRNAは中枢神経系の神経細胞に広く分布していたが特に海馬と小脳に強く発現していた。以上からmoat1はその構造と基質特異性の点からみて既知の有機アニオントランスポーターとは異なる全く新しいトランスポーターであると結論づけた。

また今日までに我々はヒト有機アニオントランスポーターのうちOATP、LST-1、OATP-Eが甲状腺ホルモンを輸送することを明らかにした。LST1はヒト肝臓のみに発現しており、ヒトOATPは脳のみに発現している。一方、OATP-Eは主に末梢の臓器に発現していることからヒトにおいてはラットとは異なり甲状腺ホルモンを輸送する有機アニオントランスポーターは臓器特異的に発現していることが明らかにした。現在有機アニオントランスポーターアデノウイルスを作製し終わり、細胞導入を始めている。さらに血中に甲状腺ホルモンが存在するにも関わらずその作用が発揮されない疾患として甲状腺ホルモン不応症(Refetoff病)が発見されたが、その病態はは従来甲状腺ホルモンに対する核レセプターの異常であるとされていた。しかし最近それでは説明できない新たな原因として甲状腺の膜輸送異常が提唱され、病態との関連が示唆された。
糖鎖の生体内代謝を追跡する革新的分子プローブの開発

糖質(複合糖質)は、それぞれ重要な機能を持っている。糖鎖の分解は、その機能をオフにする役割を担っており、非常に重要であるが、細胞内で特定の複合糖質が、いつ、どの酵素に分解されているかを追跡することは不可能である。そこでこれを可能にする、新しい分子ツールの開発を目指した。興味対象の複合糖質構造に対して、その構造をあまり変化させずに仕掛けを施し、その基質が分解されたときに、分解した酵素と共有結合を形成できるようにすれば、追跡が可能となる。今回、独自のアイデアでこれを実現できる分子ツールを開発することに成功した。本研究は、未だ全容が不明な細胞内複合糖質の糖鎖代謝に着目し、「どの酵素がどの糖鎖構造をいつ分解するか」を解析できる新しい分子プローブの開発を目的としている。本提案では、糖鎖構造の中でも最も重要で、かつユニークな構造を持つ「シアル酸」の糖鎖からの切断過程を解析できるプローブの創製を目指す。他の糖加水分解酵素に対する分子プローブ創製も念頭におき、一般性の高い分子設計コンセプトを確立することに挑む。これまでの代謝解析プローブは、「プローブの反応性を下げる」ことで、「酵素-プローブ複合体のlifetimeを長くする」ものであった。本研究は、「プローブの反応性を天然型基質と同程度に維持」し、「安定な酵素-プローブ複合体を形成させる」という、これまでと異なる設計概念の検証に取り組むものである。これを実現できると考えられる、新しいトリックを組み込んだシアリルガラクトースプローブを設計した。今年度は、このプローブの合成を検討すべく、まずはシアル酸単糖で検討した。設計分子を単純な官能基変換によって、合成することが困難であることが予備検討でわかっていたが、今年度、さらに種々検討したが、やはり目的物を得ることができなかった。そこで、金錯体を触媒に用いるカップリング反応を鍵工程とする、新たな合成法を考案した。これに用いる前駆体の合成にも幾分苦労したが、工程数を要するものの、前駆体の合成法を確立できた。さらに、鍵工程のカップリング反応を試みたところ、目的生成物を得ることに成功した。未だ、収率・選択性の改善が課題であるが、設計したトリックを含む構造を構築可能であることを確認することができた。当初の予定どおり、合成法の確立にほぼ成功したことから、概ね順調と言える。本研究では、未だ全容が不明な細胞内複合糖質の糖鎖代謝に着目し、「どの酵素がどの糖鎖構造をいつ分解するか」を解析できる新しい分子プローブの開発を目的としている。本提案では、昨年度同様、糖鎖構造の中でも最も重要なユニットの1つである「シアル酸」のシアリダーゼによる切断を解析できるプローブの開発を目的としている。昨年度は、「プローブの反応性を天然型基質と同程度に維持」し、「安定な酵素ープローブ複合体を形成させる」分子設計概念の下、新しいトリックを組み込んだシアリルガラクトースプローブを設計した。また、その新規構造の合成手法をシアル酸単糖を用いて確立した。本年度は、昨年確立した手法を、設計したシアリルガラクトースプローブ合成に適用すべく検討した。しかり、立体選択性、位置選択性共に望まない生成物のみを与え、望む化合物を得ることはできなかった。ガラクトースユニット構造の変更や、分子内反応への展開を試みたが、全くうまく行かなかった。反応がうまく行かないのは、ガラクトースユニットの立体的な嵩高さが原因と考え、大きなガラクトースユニットを反応点近傍に惹きつけるdirectingグループを導入したシアル酸ユニットを新たに設計した。これを合成し、実際に反応を試してみると、中程度の収率ながら、シアリルガラクトースユニットの合成を達成することに成功した。また、合成したシアリルガラクトースプローブの生物活性評価にも取り組んだ。設計したシアリルガラクトースプローブの合成に成功し、生物活性評価を開始出来ているため、概ね順調と言える。本提案では、昨年度同様、糖鎖構造の中でももっとも重要なユニットの1つである「シアル酸」のシアリダーゼによる切断を解析できるプローブ開発を目的としている。昨年度までに、本目的を達成できる分子として、新たに2,6-シアリルガラクトース型のプローブを設計した。2,6-連結部をグリコシル化反応によって構築する独自の合成手法を考案し、これを種々検討し改良することで、設計したプローブの合成に成功した。本年度は、この分子が、代謝追跡に利用できる機能を発揮するか、幾つかの生化学的実験によって検証した。まず、購入可能なシアリダーゼに対する阻害活性を調べた。本プローブが期待通りの機能を発揮すれば、シアリダーゼ活性を最終的に阻害することになる。実際、本プローブ分子は、シアリダーゼに対し顕著な阻害活性を示した。このことから、期待通りのプローブ機能が発揮されていることが示唆された。また、さらに本プローブをさらに改変し、蛍光団を組み込んだプローブの合成を検討した。当初、アルキンを9位に導入することを考えたが、周辺官能基の影響のためか、うまくいかなかった。そこで、アジド基を導入後、クリック反応を利用して、蛍光団を導入した。本蛍光プローブを用いた解析によって、さらなる確証を得ることに成功した。

糖鎖の分解は、その機能をオフにする役割を担っており、非常に重要であるが、細胞内で特定の複合糖質が、いつ、どの酵素に分解されているかを追跡することは不可能である。そこでこれを可能にする、新しい分子ツールの開発を目指した。興味対象の複合糖質構造に対して、その構造をあまり変化させずに仕掛けを施し、その基質が分解されたときに、分解した酵素と共有結合を形成できるようにすれば、追跡が可能となる。今回、独自のアイデアでこれを実現できる分子ツールを開発することに成功した。今後は、単糖プローブでの機能評価、および設計した2糖型シアリルガラクトースプローブの合成に取り組む計画である。昨年度合成したシアル酸単糖プローブ、および本年度合成したシアリルガラクトースプローブの生物活性評価、並びに機能評価を進める。また、機能評価に用いる多くの誘導体合成も進める予定である。ケミカルバイオロジー有機合成化学シアル酸単糖プローブの合成法確立に専念したため、生物活性評価を実施しなかった。生物活性評価のための予算を次年度に繰越したため、次年度使用額が生じた。年度途中で、研究代表者が異動になったため、予算執行に変更が生じた。バクテリアシアリダーゼの精製酵素を購入し、プローブの機能評価をすすめる。また、ヒトシアリダーゼ酵素を発現し、同様に機能評価をすすめる。九州大学で本課題に関係する合成化学を推進するため、不足している器具・装置を購入する。また、生物活性評価を進めるための試薬等も購入予定である。
ブロイラーの脂肪酸動員とケトン体生成に対するリポ酸の作用に関する研究

平成13年度:ビタミン様作用因子のリポ酸はその投与量を増やすとブロイラーの中性脂肪と遊離脂肪酸の血中成分を共に増加させる。そこで、脂質代謝に及ぼすリポ酸の作用機序を明らかにするため、絶食によって脂肪酸動員を高めたブロイラーにリポ酸の注入実験をおこなった。その結果から、リポ酸は血中遊離脂肪酸を増加させ、これと同時に採食時の約7倍にまで高まった絶食時の血中ケトン体濃度(脂肪酸代謝産物)を著しく低下させることが明かになった。次いで、リポ酸注入に対する脂肪組織の脂肪分解反応を微量透析法で分析したが、その脂肪分解能に変化はみられなかった。平成14年度:前年度の実験により、リポ酸は飼料エネルギーの利用にも影響を及ぼすものと考え、至適(3100kcalME/kg)または低エネルギー(2600kcalME/kg)飼料を給与したブロイラーの成長に対するリポ酸の影響を検討した。この実験ではエネルギー給与水準の影響が顕著にでるよう飼育温度を21±2°Cと低く設定した。リポ酸による増体量の変化は至適エネルギーを与えたときに示されなかったが、低エネルギー区の増体量はリポ酸の投与で有意に低下した。また、リポ酸投与区の飼料摂取量はエネルギー水準に関係なく減少したものの、飼料効率を有意に高めるリポ酸の作用が至適エネルギー区において認められた。血中成分や肝臓の酸素消費量等の分析では、このリポ酸とエネルギー水準との相互関係を説明できる結果は得られなかった。以上の結果から、リポ酸は肝臓の脂肪酸酸化を抑制することで血中遊離脂肪酸の増加と脂肪酸の再エステル化をもたらすものと結論づけられた。またケトン体生成を抑制するリポ酸の作用はケトーシスの予防・軽減への利用が可能と考えられることと、エネルギーの給与水準と飼育温度を考慮すれば飼料効率の改善、代謝調節に応用できるものと示唆された。ビタミン様作用因子の一つとして生体で機能するリポ酸が採食または絶食時のブロイラーにおける血漿遊離脂肪酸とケトン体に及ぼす影響について検討した(実験1)。ブロイラーの代謝反応を明確に観察するため、リポ酸をカテーテルから静脈内に直接90分間連続注入し、その30分毎に採血をおこなった。その結果、主に以下の反応が認められた。1)リポ酸を注入することで血漿遊離脂肪酸は採食状態に関係なく経時的に増加した。2)ブロイラーを絶食にすると、血漿中のケトン体(βヒドロキシ酪酸)は採食時のニワトリのそれと比べて約7倍にまで増加した。3)そこへリポ酸を注入したところ、ケトン体濃度は経時的に著しく減少した。また、採食時のニワトリでも同様な代謝反応が確認された。次に、マイクロダイアリシス法を活用してリポ酸注入に対する脂肪組織の脂肪分解能および血漿遊離脂肪酸とグリセロールの変化を検討した(実験2)。その結果、以下の点が示された。1)リポ酸注入に伴う血漿遊離脂肪酸の増加は生じたが、マイクロダイアリシス実験によって評価した脂肪組織の脂肪分解能には変化がなかった。2)また、血漿中のグリセロール濃度を同時に分析したところ、リポ酸注入量を25から50mg/kg/hrに高めると一過性の脂肪分解反応が認められた。これらの結果をまとめると、実験計画上の仮説どおり、リポ酸にはブロイラーの血漿遊離脂肪酸を増加させる作用とケトン体生成を抑制させる作用があった。しかし、リポ酸が血中遊離脂肪酸を増加させる主な原因には、その投与量依存的な一過性の脂肪分解能の冗進があるものの、むしろ肝臓におけるケトン体生成を含む脂肪酸代謝の低下によるところが大きいものと示唆された。

またケトン体生成を抑制するリポ酸の作用はケトーシスの予防・軽減への利用が可能と考えられることと、エネルギーの給与水準と飼育温度を考慮すれば飼料効率の改善、代謝調節に応用できるものと示唆された。
PETバリデーティッドFEAに基づく顎骨リモデリングシミュレーションの構築

本研究は,歯科インプラントにおける臨床的偶発症の予防,さらには歯科インプラントの埋入に係るメカノバイオロジカルな反応の把握した顎骨リモデリングシミュレーションの最適化に寄与する.すなわち,従来の解剖学的な観点を考慮した手法に加えて本シミュレーションを埋入システムに包含することで,より安全で効率的な歯科インプラント治療を実現することが期待される.上記に示す展望の実現に向けて,これまで申請者らが従事してきた研究並びに臨床経験を基に新たな知見を得ることを目標として本課題に携わった.特に申請書において,研究目標を年度ごとに細分化してマイルストーンを設置している.本年度は,共同研究者の小川らが確立した実験モデルを踏襲して,Wistar系ラットの脛骨部について純チタンのカスタムメイドインプラントを埋入したモデルを用いて解析を行った.骨強度評価ソフトウェア(MECHANICALFINDER,計算力学研究センター,日本製)を使用して,撮像したラット脛骨CTのDICOMデータより骨形状を抽出し,有限要素モデル(以下, FEモデル)を作成した.ラット脛骨の皮質骨および海綿骨の材料特性は,部位特異的な骨梁構造及び材料非線形性を考慮した設定を行うことで骨内領域を従来手法に比べてより実現象の再現性に富んだモデル構築に成功している.加えて,本モデルは経時的な骨代謝の観察と対照することでインプラントの骨梁形態変化の評価を行う基盤となるFEモデルである.今年度は有限要素解析モデル(以下, FEモデル)の作成を行った.複数のFEモデルを作成して,骨リモデリングシミュレーションの解析に堪えうるFEモデルの接点数や要素数について検討を行った.これは,申請書に記載した研究計画に沿った進捗状況である.本年度に得られた結果を元に各種解析をコンター図及び応力ヒストグラムよりインプラント周囲骨におけるミーゼス応力,各種主応力,ひずみエネルギー密度(以下,SED)などの指標により3次元的な応力状態の定性及び定量分析を検討している.また, FEモデル作成がおおむね順調に進行していることから,現状の保有する資源の保守などに加えて今年度の計画に合わせた使用額の計上を予定している.具体的には,各種応力解析に必要十分な機能を有した解析用PCのメインテナンスならびにソフトウエアの保守,更にはデータ整理などの費用を要すること想定される.本研究は,歯科インプラントにおける臨床的偶発症の予防,さらには歯科インプラントの埋入に係るメカノバイオロジカルな反応の把握した顎骨リモデリングシミュレーションの最適化に寄与する.すなわち,従来の解剖学的な観点を考慮した手法に加えて本シミュレーションを埋入システムに包含することで,より安全で効率的な歯科インプラント治療を実現することが期待される.上記に示す展望の実現に向けて,これまで申請者らが従事してきた研究並びに臨床経験を基に新たな知見を得ることを目標として本課題に携わった.特に申請書において,研究目標を年度ごとに細分化してマイルストーンを設置している.本年度は,共同研究者の小川らが確立した実験モデルを踏襲して,Wistar系ラットの脛骨部について純チタンのカスタムメイドインプラントを埋入したモデルを用いて解析を行った.骨強度評価ソフトウェア(MECHANICALFINDER,計算力学研究センター,日本製)を使用して,撮像したラット脛骨CTのDICOMデータより骨形状を抽出し,有限要素モデル(以下, FEモデル)を作成した.ラット脛骨の皮質骨および海綿骨の材料特性は,部位特異的な骨梁構造及び材料非線形性を考慮した設定を行うことで骨内領域を従来手法に比べてより実現象の再現性に富んだモデル構築に成功している.加えて,本モデルは経時的な骨代謝の観察と対照することでインプラントの骨梁形態変化の評価を行う基盤となるFEモデルである.今年度は有限要素解析モデル(以下, FEモデル)の作成を行った.複数のFEモデルを作成して,骨リモデリングシミュレーションの解析に堪えうるFEモデルの接点数や要素数について検討を行った.これは,申請書に記載した研究計画に沿った進捗状況である.本年度に得られた結果を元に各種解析をコンター図及び応力ヒストグラムよりインプラント周囲骨におけるミーゼス応力,各種主応力,ひずみエネルギー密度(以下,SED)などの指標により3次元的な応力状態の定性及び定量分析を検討している.また, FEモデル作成がおおむね順調に進行していることから,現状の保有する資源の保守などに加えて今年度の計画に合わせた使用額の計上を予定している.具体的には,各種応力解析に必要十分な機能を有した解析用PCのメインテナンスならびにソフトウエアの保守,更にはデータ整理などの費用を要すること想定される.FEモデル作成がおおむね順調に進行していることから,現状の保有する資源の保守などに加えて今年度の計画に合わせた使用額の計上を要する.使用計画として、各種応力解析に必要十分な機能を有した解析用PCのメインテナンスならびにソフトウエアの保守,更にはデータ整理などの費用に充てること予定している.
ペクチンのホウ酸架橋による細胞伸長の制御

植物の一次細胞壁に存在するペクチン質多糖ラムノガラクツロナンII(RG-II)は、ホウ酸によって分子間架橋される。この架橋を介して形成されるペクチンネットワークが細胞接着や伸長に必須である。本研究では、RG-II架橋率低下による細胞伸長の抑制の分子機構の解明を目指し、本過程に必要な分子の同定を目標とした。RG-IIのホウ酸架橋率の低下で根の細胞伸長が抑制されるホウ酸欠乏環境において、主根伸長の抑制が緩和されたシロイヌナズナ変異株の原因遺伝子の同定と生理学的な解析を行った。前年度までに、原因変異のひとつが、真核生物に広く保存された機能未知タンパク質の機能欠損・発現抑制であることを明らかにした。本変異株の細胞壁のホウ素濃度を測定したところ根・地上部ともに低下していた。細胞壁中のRG-II特異的な糖であるKDO量も低下する予備的な結果を得た。ホウ酸によるRG-IIの相対的架橋率を測定したところ、本変異株では増加または野生型株と同等の値を示した。変異株探索で得られたペクチン主鎖の合成を担う酵素をコードすると予想される遺伝子破壊株においても同様に、細胞壁中のホウ素濃度とKDO量の低下およびRG-II架橋率の維持が観察された。この現象は、RG-II量の減少によって、少ないホウ素量でRG-IIの架橋率が維持できるようになり、結果として低ホウ酸条件下において根で細胞伸長抑制の緩和が起こったと考察された。この結果は、ホウ素欠乏で起こる細胞伸長の抑制は、「ホウ酸架橋されたRG-IIの絶対量の減少」ではなく、「ホウ酸架橋されたRG-IIの相対的な減少」で起こされることが考察され、架橋されていない単量体RG-II量が細胞伸長の制御に関わる仮説が導かれた。加えて、本研究でペクチン合成に関与する新たな遺伝子の同定をし、本変異株探索によって細胞壁合成遺伝子の効率的な同定が可能であることを示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物の一次細胞壁に存在するペクチン質多糖ラムノガラクツロナンII(RG-II)はホウ酸によって分子間架橋され、この架橋が細胞伸長に必須であることが明らかにされている。本研究では、RG-II架橋率が低下したときに起こる細胞伸長抑制の分子機構の解明を目指し、RG-II架橋率低下による細胞伸長の抑制に必要な分子の同定を目的とした。RG-IIのホウ酸架橋低下によって根の細胞伸長が抑制されるホウ酸欠乏環境において、主根伸長の抑制が緩和された「ホウ酸欠乏低感受性シロイヌナズナ変異株」を単離し、原因遺伝子の同定と生理学的な解析を進めた。独立な2株の原因変異が、真核生物に広く保存された機能未知の膜タンパク質の機能欠損・発現抑制であることを確定させた。本変異株は低ホウ酸濃度条件下で野生型株と比較して細胞の長さおよび根の長さは増加した。一方、低・高ホウ酸濃度条件において根全体の乾燥重量は顕著に低下し、細胞壁に存在するホウ素濃度は低下を示した。これより原因遺伝子は正常な成長に必須である因子であり、同時にホウ素に対する感受性を変化させる因子であることを明らかにした。さらに、2株の原因変異が、ペクチンの主鎖であるホモガラクツロナン合成を担うと予想される酵素の機能欠損・低下であることを見出した。本変異株では細胞壁に結合するホウ素濃度が低下したが、RG-IIの相対的なホウ酸架橋率は野生型株と比較して違いが認められなかった。この結果から、本変異株ではRG-II量の低下が引き起こされ、少ないホウ素量でRG-II架橋率および細胞伸長・成長が維持されていると推察された。これより、架橋されたRG-IIの絶対量ではなく、RG-IIの相対的な架橋率または架橋されていない単量体のRG-IIが細胞伸長を決定する可能性が考察された。RG-II架橋率低下による細胞伸長の抑制に必要な分子の同定を目的とした変異株探索では、ホウ酸欠乏条件下における主根伸長抑制の緩和を顕著に示す独立な複数の変異株の原因遺伝子の遺伝学的な証明に至った。原因遺伝子のひとつは、真核生物に高く保存されているものの植物ではその生理機能が全く明らかにされていない遺伝子であった。本研究は植物での本遺伝子の生理機能を初めて明らかにする成果であり、細胞壁ペクチン合成や機能維持に関わる新たな分子の同定となることが期待された。

細胞壁中のRG-II特異的な糖であるKDO量も低下する予備的な結果を得た。ホウ酸によるRG-IIの相対的架橋率を測定したところ、本変異株では増加または野生型株と同等の値を示した。変異株探索で得られたペクチン主鎖の合成を担う酵素をコードすると予想される遺伝子破壊株においても同様に、細胞壁中のホウ素濃度とKDO量の低下およびRG-II架橋率の維持が観察された。この現象は、RG-II量の減少によって、少ないホウ素量でRG-IIの架橋率が維持できるようになり、結果として低ホウ酸条件下において根で細胞伸長抑制の緩和が起こったと考察された。この結果は、ホウ素欠乏で起こる細胞伸長の抑制は、「ホウ酸架橋されたRG-IIの絶対量の減少」ではなく、「ホウ酸架橋されたRG-IIの相対的な減少」で起こされることが考察され、架橋されていない単量体RG-II量が細胞伸長の制御に関わる仮説が導かれた。加えて、本研究でペクチン合成に関与する新たな遺伝子の同定をし、本変異株探索によって細胞壁合成遺伝子の効率的な同定が可能であることを示した。次年度も引き続き、ホウ酸欠乏低感受性変異株の生理学的および遺伝学的な解析を進め、RG-II架橋率低下による細胞伸長の抑制に必要な分子を明らかにする。原因遺伝子が確定した変異株に対しては、細胞壁のRG-II量およびホウ酸架橋率を測定し、ホウ素欠乏に対する感受性が低下した要因を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
アスパラガスの雌雄性を操作する

温室内で栽培している食用アスパラガスの雌株・雄株の花芽に、植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン、ブラシノステロイド、ジベレリン、アブシシン酸、エチレン前駆体、ジャスモン酸、サリチル酸)と、それらの生合成・分解阻害剤を与えた。これらのいずれに関しても、濃度に応じて花芽の成長を抑制した。雌花の雄蕊の退化を抑制する物質と、雄花の雌蕊の成長を促進する物質が見出されることを期待していたが、そのような物質は見出されなかった。前年度までの解析により、食用アスパラガスの性決定遺伝子の候補としてAoMYB35を見出していた。カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターによりAoMYB35を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(AoMYB35ox)を作出したが、この植物体の表現型は野生型と同様であった。シロイヌナズナのMYB35(AtMYB35)の欠損変異体であるatmyb35は雄性不稔の表現型を持つ。これとAoMYB35oxを交配して、atmyb35を遺伝的背景としてAoMYB35を発現するシロイヌナズナを作出したが、これはatmyb35と同様に雄性不稔の表現型を示した。これは、AoMYB35がAtMYB35の発現部位において発現していなかったことか、それらの機能に差異があることに起因すると考えられる。これらの可能性に関しては今後更に検証する余地がある。前年度に、食用アスパラガスの各花器官(花被片、雌蕊、雄蕊)の転写産物をRNA-Seqにより網羅的に解析すると共に、食用アスパラガスの全ゲノムをMinIONという次世代シーケンサーにより解析しており、これらと先行研究のデータを基に、更なる雌雄性決定遺伝子の候補を同定することも試みたが、そのようなものは得られなかった。以上の結果を基に、1件の論文発表を行った。食用アスパラガスの性決定遺伝子の探索のため、過去に行われたRNA-Seqのデータを再解析し、AoMYB35という遺伝子が雄花特異的に発現することを見出した。シロイヌナズナにおいてAoMYB35のホモログの欠損は雄蕊の発達不全を引き起こすことが知られていたことから、この遺伝子について更なる解析を行った。その結果、AoMYB35は雄株のみに存在し雌株には存在しないという、非常に興味深いことが示唆された。AoMYB35の発現が発達初期の雄花雄蕊において特に強いということも見出した。食用アスパラガスの性決定遺伝子は比較的少数であるということが先行研究から示唆されていることも考慮すると、AoMYB35は性決定遺伝子の候補として有力であると考えられる。先行研究において、食用アスパラガスの雄蕊が植物ホルモン・サイトカイニンを多量に含むことが示唆されていたため、その生合成と分解に関わる遺伝子のクローニングと発現解析を行った。この結果、サイトカイニン生合成遺伝子の一つであるAoLOG2は、雌株と雄株の両者に存在するものの、その発現量が雄花の雄蕊において高いことが示唆された。食用アスパラガスのタペータムの発達・退化の際の細胞内DNA含量やカロースの合成・分解のパターンについても解析した。食用アスパラガスの花に各種植物ホルモンを与えるという試験も行った。これにおいては、オーキシンが雌蕊と雄蕊の発達を抑制し、サイトカイニンが雄花の雌蕊の発達を促進するような結果が得られたが、屋外で行ったため天候の影響を受けやすく、施用の効果が不安定になりがちであったと考えられる。このため、当該試験に関しては屋内実験系を用いた再評価が必要であると考えている。以上の結果を基に、1件の論文発表と8件の学会発表を行った。生理活性物質を与える試験に関しては再評価が必要であるものの、性決定遺伝子の候補として有力なものを見出すことができた。当該遺伝子は、食用アスパラガスの雌雄性決定機構を明らかにする上で非常に有用であると考えられるため。2016年度に実施した実験により、植物ホルモンであるオーキシンとサイトカイニンが食用アスパラガスの花器官の発達に影響を与えうることが示唆されていたが、当該実験は屋外で行われたものであり、それら植物ホルモンの施用方法や頻度等に検討の余地があった。2017年度は、温室内で栽培した食用アスパラガスの花芽に対してオーキシンとサイトカイニンを与えるという実験を行った。オーキシンを与えた際には、擬葉は歪曲しながら成長し、サイトカイニンを与えた際には、擬葉の太さが増大し、これらは2016年度の結果と同様であった。一方、2017年度は、オーキシン処理もサイトカイニン処理も花器官の形態には影響を与えなかった。このような植物ホルモンないし生理活性物質の施用実験に関しては、今後更に検討・最適化する必要があると考えられる。また、食用アスパラガスの花の各器官(鱗片葉、雌蕊、雄蕊)の転写産物をRNA-Seqにより網羅的に解析した。これにより、それらの器官で活性化されていると考えらえれる遺伝子を明らかにした。雌花の雄蕊は細胞死により退化するが、これに関わる可能性のある遺伝子も見出した。遺伝子の発現様式を基に、各花器官で活性化していると考えられる代謝経路も明らかにした。

新規の性決定遺伝子の候補の単離やマーカー開発に役立てるべく、次世代シーケンサー・MinIONを用いた食用アスパラガスゲノムのリーシークエンシングも行い、合計約14.8塩基(食用アスパラガスのゲノムサイズの約11倍)のデータを得た。以上の結果を基に、1件の学会発表を行った。研究計画に記載した実験・解析はおおむね実行できており、一定の結果が得られている。温室内で栽培している食用アスパラガスの雌株・雄株の花芽に、植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン、ブラシノステロイド、ジベレリン、アブシシン酸、エチレン前駆体、ジャスモン酸、サリチル酸)と、それらの生合成・分解阻害剤を与えた。これらのいずれに関しても、濃度に応じて花芽の成長を抑制した。雌花の雄蕊の退化を抑制する物質と、雄花の雌蕊の成長を促進する物質が見出されることを期待していたが、そのような物質は見出されなかった。前年度までの解析により、食用アスパラガスの性決定遺伝子の候補としてAoMYB35を見出していた。カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターによりAoMYB35を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(AoMYB35ox)を作出したが、この植物体の表現型は野生型と同様であった。シロイヌナズナのMYB35(AtMYB35)の欠損変異体であるatmyb35は雄性不稔の表現型を持つ。これとAoMYB35oxを交配して、atmyb35を遺伝的背景としてAoMYB35を発現するシロイヌナズナを作出したが、これはatmyb35と同様に雄性不稔の表現型を示した。これは、AoMYB35がAtMYB35の発現部位において発現していなかったことか、それらの機能に差異があることに起因すると考えられる。これらの可能性に関しては今後更に検証する余地がある。前年度に、食用アスパラガスの各花器官(花被片、雌蕊、雄蕊)の転写産物をRNA-Seqにより網羅的に解析すると共に、食用アスパラガスの全ゲノムをMinIONという次世代シーケンサーにより解析しており、これらと先行研究のデータを基に、更なる雌雄性決定遺伝子の候補を同定することも試みたが、そのようなものは得られなかった。以上の結果を基に、1件の論文発表を行った。生理活性物質を与える試験に関しては、当初の計画に従って引き続き行う。この試験においては、施用の効果が安定するよう、温室で栽培された株を用いる。計画立案当初は、サイトカイニン分解遺伝子が食用アスパラガスの性決定遺伝子の候補であると考えていたが、その遺伝子は雌株と雄株の両者に存在する。AoMYB35は、雄株特異的に存在し、かつ雄蕊の発達に関わることから、これが性決定遺伝子の候補であると現在は考えている。このため、今後はこの遺伝子についての解析に注力する予定である。花器官の発達に影響を与える生理活性物質の探索を引き続き進める。RNA-Seq解析により、雌花と雄花それぞれの各花器官において活性化されている可能性のある代謝経路が抽出できたが、それらの経路に影響を与えうる生理活性物質の効果の評価には特に注力する。2016年度に単離した性決定遺伝子の候補であるAoMYB35という遺伝子に関しても、機能解析を進める。
羊膜由来細胞株の神経細胞への分化誘導と神経細胞移植への応用

ヒト羊膜上皮細胞は胎生初期の外胚葉由来の細胞で、適切な培養下で神経系の細胞に分化することが知られている。ヒト羊膜由来細胞を神経細胞への分化を強く誘導する条件の培地で培養し、神経細胞への誘導分化を行い、成ラットの脳の線条体、脳室周囲などに移植を行った。ヒト羊膜由来細胞より調製した細胞浮遊液をコートしていない培養皿を用い、OPTI-MEM^<TM>に5%胎仔牛血清、上皮細胞成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を添加した培地で培養を行った。培養開始2日後に、再び細胞を集め、浮遊液とし、bFGF, all-trans retinoic acid (RA)などを添加した無血清培地を用いて、更に2日間培養後、定位脳手術装置を用いて8週齢ラットの脳に移植を行った。この時、羊膜由来細胞にはGFPが発現されるプラスミドを組み込んだ。移植後、1週、4週にラットを還流固定し、移植された細胞の動態を調べた。4週目に至っても、生着した移植細胞はみられた。蛍光抗体法でGFAPの発現やMAP-2の発現がみられ、ダリア細胞や神経細胞に分化している細胞もみられたが、その割合は低かった。また、1週目と4週目に分化した細胞の割合や数に有意な差はみられなかったが、4週目は1週目に比べて移植された細胞が分散している傾向があった。更に、BrdUの取り込みから移植細胞の増殖能はほとんどみられなかった。今後、生着細胞の割合を増やし、高率に神経細胞に分化させる条件の検討を要すると考えられた。ヒト羊膜由来細胞を神経細胞への分化を強く誘導する条件の培地で培養し、神経細胞への誘導分化を行い、自己複製能を有し、且つ、培養を続けると必ず神経細胞に分化することが運命づけられた神経細胞前駆細胞に当てはまる段階の細胞の存在を自己複製能と神経細胞のマーカーの発現との関係から検討した。培養2日目にはnestin陽性の細胞が出現し、培養5日目から8日目にかけてMAP-2陽性の神経細胞に分化したと考えられる細胞がみられた。自己複製能はMAP-2発現の前まで認められ、その維持にはEGF、bFGFが必要であった。また、RAは神経細胞への分化を促進した。
次世代シーケンシングによるメダカ小分子RNAの完全解析と機能の解明

本研究では次世代シーケンサーを用いてメダカおよびトラフグの各組織(速筋、遅筋、腸、眼、脳、心臓、肝臓、卵巣、精巣、初期胚など)から得た小分子RNA(miRNA, piRNA, siRNA)の塩基配列を解読し、その発現プロフィールを明らかにした。精巣、卵巣以外の各組織ではmiRNAが主要な発現産物であったが、精巣、卵巣ではpiRNAが主要な発現産物であることが推定された。またメダカとトラフグに共通に発現している未同定の小分子RNAを多数見いだした本研究では次世代シーケンサーを用いてメダカおよびトラフグの各組織(速筋、遅筋、腸、眼、脳、心臓、肝臓、卵巣、精巣、初期胚など)から得た小分子RNA(miRNA, piRNA, siRNA)の塩基配列を解読し、その発現プロフィールを明らかにした。またメダカとトラフグに共通に発現している未同定の小分子RNAを多数見いだしたメダカとともにこれまでメダカのリファレンスとして活用されてきたフグも対象に解析を進めた。メダカ成魚から7種類の組織(筋肉、消化管、眼球、脳、心臓、卵巣、精巣)、およびトラフグ1年魚から7種類の組織(速筋、遅筋、消化管、眼球、脳、心臓、肝臓)を単離し、それぞれから小分子RNAを分画した。次にそれらをアプライドバイオシステムズ社次世代シーケンサーSOLiD用のバーコードを組み込んでcDNA化・増幅し、混合してSOLiDによるシーケンシングを行なった。第1回目の解析では4ランを行ない、各々2000万4100万リードのバーコードによる識別可能なリードデータを得た。今回用いた実験系では挿入断片を35塩基まで解読できたが、数百万種にのぼるシーケンスデータが得られたため、まずは同一の塩基会列が50以上出現したものを抽出した。さらにシーケンシングの平均クオリティ値が20以上のデータのみを抽出した。以上によりそれぞれのランで抽出された塩基配列は2万種類前後となった。SOLiDの2塩基エンコーディングシステムによる0、1、2、3の「配列データ」を直接塩基配列に変換した。まずはマイクロRNAの種類と頻度を調べるため、得られた塩基配列をmirBASEなどの公共のデータベースに対してホモロジー検索を行なった。それぞれのmiRNA種について1数塩基の塩基置換、や1、2塩基の挿入欠失を示す多数のバリアント(数十数百)が見いだされたので、シード配列を共有するバリアントを1グループとしてデータを整理・統合した結果、約120種類の既知miRNAの存在が確認できた。その他、既知miRNAと相同性を示さない多数の塩基配列が見いだされたので、新規機能をもつRNAである可能性も含めてさらなる解析を進めている。メダカ成魚から11種類の組織(筋肉、消化管、眼球、脳、心臓、卵巣、精巣、受精卵、および8卵割期・発生ステージ21・ステージ22の各個体)、およびトラフグ1年魚から11種類の組織(速筋、遅筋、消化管、眼球、脳、心臓、肝臓、成熟精巣、未成熟精巣、成熟卵巣、未成熟卵巣)を単離し、小分子RNAを分画した。次にそれらにバーコード配列を付加しながらcDNA化して増幅、混合し、SOLiDによるシーケンシングを行なった。これまでに3ランのシーケンシングを行なった。それぞれのランでのべ1.1億リード、1.6億リード、2.0億リードのバーコードによる識別可能なリードデータを得た。これらからシーケンシングの平均クオリティ値が20以上のデータのみを抽出して解析を進めた。それらの小分子RNAのシーケンスをmiRNAのデータベースであるmiRbaseに対して相同性検索を行なった結果、5000種以上の既知miRNA、miRNA*と一致あるいは高い相同性を示すシーケンスの存在が確認できた。また成熟精巣、未成熟精巣、成熟卵巣、未成熟卵巣においてはmiRNAの長さである22塩基前後でなく、2530塩基の小分子RNAが大多数を占めていた。このことはショウジョウバエやマウスの生殖系列細胞において、小分子RNAの中で主要な分子はpiRNAであることと一致した結果であると考えられた。これら以外にも特定のtRNAの分解物が高い頻度を示した。またこれらのカテゴリーに分類できない小分子RNAの存在も示唆された。今後、得られたデータをさらなる解析を進めて、各小分子RNAの分類と機能の解明を進めて行きたい。昨年度までに得られたメダカの小分子RNAを分類し、筋肉,腸,眼,脳,心臓,卵巣,精巣7組織で合計10,173,886リードをマッピングした。卵巣,精巣の25-31ntのデータについては卵巣,精巣のリード数が他組織のリード数を大きく上回っていた。この傾向はトラフグでも同様であった。これらの結果からメダカ生殖細胞でもショウジョウバエやマウス同様、piRNAの発現が示唆された。分布の特徴としては,25-31ntのデータセットでは特に卵巣で広範囲に小さなピークがみられた。一方、体細胞では特定の場所に集中してマッピングされる傾向が強く,その多くはtRNAのコード領域であった。卵巣,精巣においては塩基長ごとに分割したデータセットを作成したが,数多く見られた配列の分布をみてみると,各塩基長でみられるものと特定の塩基長でみられるものの2種類が確認できた。

また反復配列が数多く転写されていることが示唆された。k-mer解析によって,18-31ntの配列の反復回数を参照した。またこれまでの他生物の研究でp1RNAはゲノム上の一方の鎖上にクラスター上にマップされること,ある場所を境目にして逆鎖から転写されることが報告されているが,メダカにおいても同様の傾向がみられた。各染色体で数多くマップされた配列をBLAST検索した結果,既知の小分子RNAやtRNA,rRNAにヒットしなかったものが,体細胞では5種,卵巣では塩基長26ntで23種,30ntで38種を筆頭にのべ153種,精巣では塩基長28ntの36種を筆頭にのべ127種が見出された。また7種のtRNA断片が組織非特異的に著しく多くみられた。これらの新規小分子RNAが実際に細胞内でどのような働きをしているかは不明であり,今後これらについてその生理学的機能を詳細に検討していく必要がある。