hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水中で安定な有機遷移金属錯体の合成と反応

本研究では、水中で安定な水溶性有機遷移金属錯体を合成し、水中での遷移金属-炭素結合の安定性と化学反応性を明らかにし、この知見をもとに水を反応メディアに用いた水溶性遷移金属錯体による触媒反応を開発することを目的に研究を行った。具体的には、d^8の平面4配位錯体である水溶性のパラジウム(II)および金(III)錯体の合成と水中での反応性、中でも炭素-炭素結合生成を伴う還元的脱離反応に関して研究を行った。ジメチルパラジウム(II)錯体では、オレフィンを添加することにより、水中においても選択的に還元的脱離が進行した。また、重水により還元的脱離反応が促進されるトいう特異な現象を見出した。ジメチルおよびジエチル金(II)錯体においても、水中での還元的脱離反応が進行し、ジメチル金(III)錯体ではその還元的脱離反応が、有機溶媒中に比べ、水中で極めて速く進行することが明らかとなった。また、水溶性パラジウム錯体を触媒とする水/有機溶媒二相系でのアリルアルコールによるアリル化の開発に成功した。チオールのアリル化反応においては、水/有機溶媒二相系においてのみ、高い活性が得られるという極めて興味深い結果も得られた。また、攪拌速度を変えることにより、位置選択性を制御できるとことを見出した。即ち、機械的な混合速度が化学反応の選択性を制御できるという新しい概念を見出した。水溶性有機遷移金属錯体を合成し、水中での反応性を明らかにすることは、既存の水中での遷移金属錯体触媒反応の機構を解明するだけでなく、新たな触媒反応を開発する上で重要な知見が得られると考えられる。本研究では水溶性ジメチル金(III)錯体を合成し、その水中での反応性について検討した。ジ-m-ヨードテトラメチル二金[AuMeI]_2とAu当たり1等量のジフェニルホスフィノベンゼン-3-スルホン酸1ナトリウム塩(TPPMS)との反応により、ジメチルヨード(TPPMS)金(III)錯体cis-AuMe_2I(TPPMS)を合成した(収率89%)。この錯体は、水中、30°Cにおいて、容易に還元的脱離が進行し、3時間後にはエタンが定量的に生成した。この時、メタンの生成は全く見られなかった。この事実から、ジメチルヨード(TPPMS)金(III)錯体は、水中において金-炭素結合は加水分解されず、還元的脱離のみが進行したものと考えられる。また、この錯体はTHF、アセトニトリル、エタノール、DMSOなどのいくつかの有機溶媒に可溶であり、これらの有機溶媒中、30°Cでの安定性について検討した結果、水中に比べ、いずれの有機溶媒中において、還元的脱離によるエタンの発生はほとんど見られなかった。以上の結果より、水溶性ジメチル金(III)錯体では、水中で加水分解に優先して還元的脱離が進行し、その速度は、有機溶媒中に比べて、極めて速く進行することが明らかとなった。(1)水溶性ジメチルパラジウム錯体の合成と同定N, N, N', N'-テトラメチルエチレンジアミン(tmeda)を配位子とするジメチルパラジウム(II)錯体との配位子交換によりヽトリフエニルホスフィントリス(3-スルホン酸ナトリウム)(P(C_6H_4SO_3Na-3)_3,TPPTS)、トリフエニルホスフィンモノ(3-スルホン酸ナトリウム)(PPh_2(C_6H_4SO_3Na-3),TPPMS)や1,3,5-トリアザ-7-ホスファアダマンタン(P(CH_2NCH_2)_3,PTA)を配位子とする水溶性ジメチルパラジウム錯体PdMe_2L_2(L=TPPTS, TPPMS, PTA)を合成した。これらの錯体は、種々の核磁気共鳴スペクトル、赤外スペクトルなどの分光学的手法、単結晶X線構造解析および化学反応性などにより同定した。(2)水溶性有機パラジウム錯体の反応水溶性ジメチルパラジウム錯体の水中での還元的脱離反応について検討を行った。

cis-PdMe_2(TPPMS)_2を水中で加熱したところ、パラジウム-炭素結合の加水分解だけでなく、パラジウム上において炭素-炭素結合生成を伴う還元的脱離反応も進行した。さらに、電子吸引性置換基を持つオレフィンを添加することにより還元的脱離が促進され、アクロレインなどのα位にカルボニル基を持つオレフィンでは還元的脱離の促進効果が著しく強いことを明らかにした。また、動力学的な検討を行った。水中における反応では、錯体1分子からエタン1分子もしくはメタン1分子が発生する一次の並行反応であった。気体の発生量をもとに算出した擬一次反応速度定数から、反応の活性化パラメータを求めたところ、律速段階が会合的機構であることが明らかとなった。2.0mol%のPd(OAc)_2/TPPTS触媒存在下、水/ヘキサン二相系での1,1-ジメチルアリルアルコールによるベンゼンチオールのアリル化反応を、攪拌速度を変えて行った。その結果、生成物として1,1-ジメチルアリルスルフィドとプレニルスルフィドの混合物が得られた。撹拌速度が500rpm以上では、1,1-ジメチルアリルスルフィドが主生成物として、プレニルスルフィドに対し、約4.0倍生成したのに対して、300rpm以下では位置選択性の逆転が見られた。プレニルアルコールとの反応でも同様な結果が得られた。撹拌速度の上昇に伴った界面の表面積の増加により、分岐状生成物である1,1-ジメチルアリルスルフィドが選択的に生成したものと推測される。
集団罪悪感の低下がもたらす組織ぐるみの不正行為の社会心理学的実証研究

本研究は組織体としての違反・不正行為(organizational transgressions)の生起を社会心理学、組織心理学から解明し、組織の不正行為の容認にいたる心的メカニズムを明らかにし、現代社会に広がりつつあるモラルハザードを抑制する要因を明らかにすることを目的とした。特にここでは、組織体としての不正行為(組織体犯罪、ホワイトカラー犯罪)に焦点を当てた。研究目的は不正行為の生起に影響を及ぼす組織集団に関する要因を軸としたモデルを構築し、それを検証しそれに基づいて抑止効果を検討することである。昨年度の2つの研究、文献研究、探索的調査の結果から、本年度は新たに組織性違反行為とし、組織内要因を精査し、公正観の低下、情報交換の少なさ、仕事の位置づけのなさ、仕事の排他性、役割認識、内集団志向、外集団認識の低下を仮定した。さらにこのような組織性としての違反行為の心的メカニズムのモデル構築に向け、その中心的概念として、集合罪悪感(collective guilt)を提起した。調査は、組織体犯罪を体験した企業従業員を対象にした。また直接組織体犯罪に関与した従業員に対しても面接調査をおこなった。その結果、まず集合罪悪感は下位概念として「社会に対する申し訳なさ」「共有した責務・償い」「不正行為の後悔」が明らかになった。これらを結果変数として組織要因を重回帰分析、さらにはパス解析した結果、集合罪悪感を規定した要因は外集団認識低下、公正観の低下、情報交換の低下であった。つまり、社会にたいして事の重大さの認識が低いことが集合罪悪感を低下させ、また犯罪を誘発させた。また面接調査から、当事者の罪悪感は内部に対するものであり、コミュニケーションの少なさ、成果志向が犯罪を誘発していた。これらの成果は日本社会心理学会45回大会、国際心理学会28大会で発表した。本研究は組織とくに産業組織における組織体犯罪の発生と抑制に関して社会心理学的見地から実証研究を行うものである。研究1は、関係領域の文献・裁判事例などを資料として、組織体犯罪の定義を行い、発生のメカニズムの理論構成を検討した。メカニズムはその中心的心理的機制として集団罪悪感(Collective guilt)を置いた。まず組織体犯罪とは、集合的効果を目的として集団内メンバーに感知され、犯罪の実行者を含む複数の直接的・間接的関与者によって生じる不正行為であり、それは当該集団以外の人々に何らかの悪影響を与えるものである。また集合的罪悪感とは、集団を構成しているメンバーが集団効果のための結果として生じさせた集団の不正行為が、結果的に外集団の不利益をもたらしたことに対して抱く感情である。組織体犯罪はこのような集合的罪悪感が低下したときに生じやすいと仮定した。その先行条件の組織要因として、(1)役割の細分化と排他性、(2)役割認識、(3)規範化、(4)外集団認識、(5)集団内全体の見通しを仮定し、モデル化した。研究2では、研究1を検証すべく、目的1、組織要因のうち犯罪発生を規定する要因の検討、2、それらの集合的罪悪感の影響関係から、調査を組んだ。対象者は産業組織の従事する300名である。結果は、組織の規定要因としては集団全体の見通しが低く、また集団内の規範が低下し、さらに役割認識が強い場合、さらにそれらは外集団の認識の低下、内集団志向が高くなった場合に組織体犯罪が発生することが明らかになった。しかしながら集合罪悪感は明確な規定とはならなかった。研究3では、組織内で不祥事が発生した組織を対象にモデルを検証することである。また不祥事にかかわった対象者への面接を行った。これらの結果の検討は次年度でよりインテンシブに行う予定である。

研究1、2の成果は、日本社会心理学会45回大会、および、国際心理学会28回大会で発表予定である。本研究は組織体としての逸脱・不正行為(organizational transgressions)の生起を社会心理学、組織心理学から解明し、組織の不正行為の容認にいたる心的メカニズムを明らかにし、現代社会に広がりつつあるモラルハザードを抑制する要因を明らかにすることを目的とした。具体的には不正行為の生起に影響を及ぼす組織集団に関する要因を軸としたモデルを構築し、それを検証しそれに基づいて抑止効果を検討することである。まず本年度の実績としては、昨年度の2つの研究、文献研究、探索的調査の結果を2つの発表として社会心理学会(第45回大会、北星学園大学)で公表した。発表は評価・教示など多くの示唆から、次の研究の手がかりを得ることができた。これらの研究成果を踏まえ、概念の見直しと操作変数の再考をした。そして、組織性違反行為として、公正観の低下、情報交換の少なさ、仕事の位置づけのなさ、仕事の排他性、役割認識、内集団志向、外集団認識の低下を仮定した。さらにこのような組織性としての違反行為の心的メカニズムのモデル構築に向け、その中心的概念として、集合罪悪感(collective guilt)を提起した。調査は、組織体犯罪を体験した企業従業員を対象にした。また直接に組織体犯罪に関与した従業員に対しても半構造的面接調査をおこなった。その結果、まず集合罪悪感は下位概念として「社会に対する申し訳なさ」「共有した責務・償い」「不正行為の後悔」が明らかになった。これらを結果変数として組織要因を重回帰分析、さらにはパス解析した結果、集合罪悪感を規定した要因は外集団認識低下、公正観の低下、情報交換の低下であった。つまり、社会にたいして事の重大さの認識が低いことが集合罪悪感を低下させ、また犯罪を誘発させた。また面接調査から、当事者の罪悪感は内部志向であり、コミュニケーションの少なさ、成果志向が犯罪を誘発していた。この成果の一部は、国際心理学会(International congress of Psychology,28^<th> in Beijing)で発表した。
EGF受容体の過剰発現が胃粘膜の分化,増殖 アポトーシス および癌化に及ぼす影響

EGF関連ペプチド/EGF受容体(EGFR)系は正常消化管上皮細胞の分化・増殖ばかりでなく、癌化や癌の発育進展にも重要な役割を果たしていると推測されている。実際、消化管由来癌細胞株にはしばしばEGFRあるいはリガンドの過剰発現がみられ、EGF/EGFR系の持続的活性化が見られる。我々はEGF/EGFR系が消化管上皮細胞の分化、増殖、アポトーシスに及ぼす役割を正常ラット胎児小腸由来細胞IEC-6および胃粘膜由来細胞RGM1を用いて検討してきた。その結果、消化管上皮細胞がEGF受容体のリガンドであるHB-EGF,amphir egulin等を豊富に発現しており、これらのautocrinegrowthfactorが消化管上皮のself renewalに重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。また、前癌病変モデルとしての活性型ras導入細胞株では、EGF受容体リガンドの過剰発現によるEGF/EGFR系の持続的チロシンリン酸化と、このEGF/EGFR系autocrine loopに依存したアポトーシス耐性獲得が見られることを明らかにした。また、この細胞モデルにおいて転写因子STAT3の恒常的チロシンリン酸化がおこること、さらに、STAT3のドミナント・ネガティブ変異体を用いた検討から、STAT3の恒常的活性化がアポトーシス耐性獲得に中心的役割を果たしているとの知見も得た。今後、さらにSTAT3の下流におけるアポトーシス耐性シグナルを検討することにより、消化管上皮細胞の癌化過程におけるEGF/EGFR系活性化の意義が明らかになると考える。EGF関連ペプチド/EGF受容体(EGFR)系は、消化管粘膜の分化・増殖や再生修復に深く関与するのみならず、癌化や癌の発育・進展にも重要な役割を演じていると推測されている。本研究の目的は、EGFRを同所的かつ特異的に胃粘膜細胞(前壁細胞壁細胞)に過剰に発現するトランスジェニックマウスを作製し、これを用いて胃粘膜の分化・増殖・再生修復やアボトーシス及びの癌化や癌の発育に及ぼすEGFRの役割をin vivoにてより明確にすることである。現在EGFRトランスジェニックマウスを作製中であり、以下に途中経過を示す。open reading frameを含む3.8kbのヒトEGFRcDNAをプラスミドpBluescript II SK(+)のSpe I siteにサブクローニングし、さらに全長2.1kbのヒトGrowth Hormone(GH)cDNAをそのSac II/Xba I siteに挿入した。次に、マウスgastric H^+/K^+-ATPase beta subunitの約1kbのエンハンサー/プロモーター領域のクローニングを試みた。即ち、28塩基のセンスプライマー(5'末端付近にXho I siteを付加)と27塩基のアンチセンスプライマー(5'末端付近にKpn I siteを付加)を設定し、マウスゲノムDNA(尾より抽出)をテンプレートとしPfu DNA polymeraseを用いてStep Down Polymerase Chain Reaction(PCR法)により約1kbのPCR産物を得た。このPCR産物をXho I/KpnIで処理後pBluescript II SK(+)のXho I/Kpn I siteに挿入した。現在得られたクローンをシークエンス中であり、ミスマッチにないクローンを選択出来たらこれを上記のcDNAコンストラクトに挿入する予定である。即ち、マウスgastric H^+/K^+-ATPase beta subunitの約1kbのエンハンサー/プロモーター領域、ヒトEGFRcDNA、ヒトGH cDNAの順に連結したコンストラクトが得られ、EGFRトランスジェニックマウスの作製が可能となる。我々はEGF/EGFR系が消化管上皮細胞の分化、増殖、アポトーシスに及ぼす役割を正常ラット胎児小腸由来細胞圧IEC-6および胃粘膜由来細胞RGM1を用いて検討してきた。

その結果、消化管上皮細胞がEGF受容体のリガンドであるHB-EGF,amphir egulln等を豊富に発現しており、これらのautocrinegrowthfactorが消化管上皮のself renewalに重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。また、前癌病変モデルとしての活性型ras導入細胞株では、EGF受容体リガンドの過剰発現によるEGF/EGFR系の持続的チロシンリン酸化と、このEGF/EGFR系autocrineloopに依存したアポトーシス耐性獲得が見られることを明らかにした。また、この細胞モデルにおいて転写因子STAT3の恒常的チロシンリン酸化がおこること、さらに、STAT3のドミナント・ネガティブ変異体を用いた検討から、STAT3の恒常的活性化がアポトーシス耐性獲得に中心的役割を果たしているとの知見も得た。今後、さらにSTAT3の下流におけるアポトーシス耐性シグナルを検討することにより、消化管上皮細胞の癌化過程におけるEGF/EGFR系活性化の意義が明らかになると考える。
児童虐待に関する学校の対応についての調査研究

昨年度の検討を経て下記の調査を実施した。(1)全国の都道府県・政令市対象の現職教員の児童虐待への認識と取り組みの実態に関する調査(2)全国14の都道府県・政令市対象の初任教員の児童虐待に対する知識水準と養成段階における虐待関連講義の実態調査(3)情緒障害児短期治療施設に勤務する教員に対する聞き取り調査(4)校区に養護施設を有し、虐待を受けた児童生徒への取り組みを全校的に実施している小中学校を全国6地域から選定して聞き取り調査。以上に加え、文部科学省児童生徒課が実施した校区に養護施設を有する小中学校の学級担任に対する指導困難性に関する実態調査の結果を合わせ、総合的な検討を加えた。その結果を(1)学校現場における児童虐待対応の課題(2)現職研修(3)教員養成(4)教育行政的な現場支援の方向性という四つの視点から政策提言としてまとめた。略記すれば(1)学校現場には、虐待防止法施行後も自助努力によって問題に対応しようとする構えが強く、機関連携という点で組織的な課題が多いこと(2)研修は画一的なものではなく、職制に応じた内容が求められること(3)養成段階において児童虐待に対する知識を適切に提供することが重要であること(4)人的配置を含めた、各学校の実情に応じた支援が柔軟に実施できる行政システムが必要であること(5)現行のスクールカウンセラー制度等のより有効な活用や、来るべき特別支援教育体制の中での虐待対応の問題など、今後とも政策決定の基礎資料として調査すべき事項についての指摘、である。以上に加え、発見・通告・校内対応・家庭への対応といった各側面の実務における手引きとして、また同時に各種の研修におけるミニマムスタンダードとなり得る資料として、CD-ROMによる視覚教材を独自に製作し、全国の都道府県教育委員会を通じて現場に配布した。本研究班は、急増する児童虐待に対して学校現場がどのような対応をするべきか、また、教育行政サイドはどのような現場支援の体制や教員養成上での配慮をするべきかについて検討し、政策提言をすることを目的として組織された。結成後に二度にわたって調査研究の方向性について討議を行った。この間、文部科学省児童生徒課を通じて全国の都道府県教育委員会を対象に、学校現場での児童虐待への取り組み状況、啓発資料の作成状況、各地域教育委員会との連携のあり方について質問紙調査を行った。結果、児童虐待はすげに学校現場で問題意識をもって受け止められていることが推察できた。この結果を踏まえて、具体的な調査の内容について検討を加えた。その際、(1)学校という組織が抱える構造的な問題ゆえに通報やその後の連携に支障をきたす要因があるのかどうか(2)校種や経験年数といった教員の個人的属性が児童虐待への対応の水準とどのような関連を示すのか(3)教職経験のない初任者における児童虐待への知識水準と、現職教員の知識水準にはどの程度の違いが見られるのか、という点で重要視された。これらは、今後の教育行政施策の中で、学校現場に対する教員加配等を含めた具体的支援の基準策定、現職教員研修及び教員養成過程での児童虐待問題の取り扱い、対応チームの中で学校が果たすべき役割の吟味、につながる課題と考えられた。そこで、初年度から第2年度にかけ、全国の現職教員約5000名と、初任者研修受講者約2500名を対象とした質問表を作成し、調査を実施した。質問表の作成ならびに配布先の決定にあたっては、先に実施した都道府県教育委員会対象の調査結果をもとに、先進的・特徴的な取り組みをしていると判断された7カ所の教育委員会から担当者を招いてヒアリングを実施し,意見集約を行った。(1)全国14の都道府県・政令市対象の現職教員の児童虐待への認識と取り組みの実態に関する調査

(2)全国14の都道府県・政令市対象の初任教員の児童虐待に対する知識水準と養成段階における虐待関連講義の実態調査(3)情緒障害児短期治療施設に勤務する教員に対する聞き取り調査(4)校区に養護施設を有し、虐待を受けた児童生徒への取り組みを全校的に実施している小中学校を全国6地域から選定して聞き取り調査。以上に加え、文部科学省児童生徒課が実施した校区に養護施設を有する小中学校の学級担任に対する指導困難性に関する実態調査の結果を合わせ、総合的な検討を加えた。その結果を(1)学校現場における児童虐待対応の課題(2)現職研修(3)教員養成(4)教育行政的な現場支援の方向性という四つの視点から政策提言としてまとめた。略記すれば(1)学校現場には、虐待防止法施行後も自助努力によって問題に対応しようとする構えが強く、機関連携という点で組織的な課題が多いこと(2)研修は画一的なものではなく、職制に応じた内容が求められること(3)養成段階において児童虐待に対する知識を適切に提供することが重要であること(4)人的配置を含めた、各学校の実情に応じた支援が柔軟に実施できる行政システムが必要であること(5)現行のスクールカウンセラー制度等のより有効な活用や、来るべき特別支援教育体制の中での虐待対応の問題など今後とも政策決定の基礎資料として調査すべき事項についての指摘、である。以上に加え、発見・通告・校内対応・家庭への対応といった各側面の実務における手引きとして、また同時に各種の研修におけるミニマムスタンダードとなり得る資料として、CD-ROMによる視覚教材を独自に製作し、全国の都道府県教育委員会を通じて現場に配布した。
単結晶ゼオライト薄膜創製のための化学輸送法の開発

本研究では単結晶ゼオライト薄膜の創製のための新しいプロセスである「化学輸送法」を開発することを目的とする。単結晶薄膜を得るには「核発生」と「結晶成長」のプロセスを制御する必要がある。半導体プロセスにおいてはCVD,PVDにより比較的制御性よく種々の薄膜が得られているが、この成功は化学種を気相(流通している流体)より固体表面に輸送-反応-析出させる形態をとっているためであると考えた。そこでこの考え方を液相法である水熱合成に適用することを試みた。まず通常の水熱合成法を用いて、水晶基板上にMFI型のゼオライト(Silicalite-I,ZSM-5)の合成を検討した。反応温度175°Cで透明な溶液系から多結晶膜を合成可能な条件を見いだすことに成功した。そこでこの知見をもとに高圧下で流通型の製膜装置を試作し、多結晶膜の合成を検討した。基板は外径1/2インチステンレスチューブ内にテフロンを用いて固定することとし、マントル型のヒーターを用いて外部より加熱した。液体クロマトグラフィー用のポンプを用いて、前述の透明な溶液を175°Cの平衡蒸気圧よりも大きい20-30気圧で注入し、水晶基板上での製膜を行った。この際に圧力と流量はポンプの押し込み条件と反応器出口のニードルバルブを調節して設定した。これまでに最高10時間までの連続合成を行ったが、生成物が得られていないため、現在溶液組成、基板表面処理、繰り返し合成の影響を検討中である。
新規潰瘍性大腸炎治療薬の探索

本研究において我々は、トロピセトロンがα7nAChR刺激作用および5-HT3R阻害作用を含む複数の抗炎症経路を有する安全な新規UC治療薬としての可能性を見出した。また、慢性DSS腸炎モデルを用いて杜仲葉エキスの腸炎抑制効果について検討を行い、杜仲葉エキスがUCの再発を抑制する可能性が示唆された。さらに、ガランタミンの慢性DSS腸炎に対する効果を検討し、ガランタミンがUCの維持療法に有効である可能性が示唆された。このように、本研究では既存薬や健康食品に着目し、UCの新規治療薬としていくつかの候補薬剤を見出すことができた。現在の潰瘍性大腸炎(UC)の治療目標は寛解期への導入であり、根治には至っていない。一方、ステロイド薬や免疫抑制剤など現在の治療薬には様々な副作用があり、このことが患者のQOLを低下させる原因の1つとなっている。さらに、その副作用の治療のために多くの医療費が必要であることも問題である。従って、今までとは違ったメカニズムを持つ副作用の少ない新規UC治療薬の開発が望まれている。これまでに我々は、5-HT3受容体阻害薬であるトロピセトロンが、α7型ニコチン姓アセチルコリン受容体(α7nAChR)刺激作用を介して腸炎のスコア、好中球の浸潤、組織像といった様々な指標においてデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)腸炎を抑制することを明らかにした。また、選択的α7nAChR刺激薬を投与することにより腸組織内のIL-6およびIFN-γを抑制すること、さらに免疫染色法を用いることにより大腸組織内においてもDSS腸炎の形成に伴って浸潤したマクロファージにα7nAChRが存在していることを見出した。これらのことから、α7nAChR刺激薬は有効なUC治療薬となりうることが示唆された。そこで、平成26年度の本助成でトロピセトロンによるDSS腸炎抑制効果のより詳細なメカニズムについて検討を行った結果、トロピセトロンの腸炎抑制作用はTNF-αに依存しない可能性が示唆され、α7nAChRを刺激することにより大腸組織へのマクロファージの浸潤が抑制されることを見出した。以上の結果から、トロピセトロンがDSS腸炎を抑制するメカニズムとして、1.大腸においてマクロファージに存在するα7 nAChRsの刺激を介して,2.マクロファージからのIL-6産生抑制によりT細胞の活性化を阻害し,3.大腸においてT細胞からのIFN-γの産生が抑制され,4.さらなるマクロファージの活性化を抑制する可能性が考えられた。現在の潰瘍性大腸炎(UC)の治療目標は寛解期への導入であり、根治には至っていないのが現状である。一方で、ステロイド薬や免疫抑制剤など現在の治療薬には様々な副作用があり、これらの副作用が患者のQOLを低下させる原因のうちの1つとなっている。さらに、その副作用の治療のために多くの医療費が必要であることもまた大きな問題である。これらのことから、今までとは違ったメカニズムを持つ副作用の少ない新規UC治療薬の開発が望まれている。これまでに我々は、トロピセトロンがα7型ニコチン性アセチルコリン受容体(α7nAChR)刺激作用を持つことに着目し、その腸炎抑制効果について検討を行っており、平成26年度の本助成ではこれまでの知見を元に検討を行い、トロピセトロンの詳細な腸炎抑制効果のメカニズムを明らかにし、トロピセトロンのα7nAChR刺激作用および5-HT3R阻害作用を含む複数の抗炎症経路を有する安全な新規UC治療薬としての可能性を示唆した(Tasaka Y et al, Journal of pharmacological sciences, 2015, 127(3), 275-283)。また、過去の文献等を参考に慢性腸炎モデルについて検討を行い、5%DSSと3.5%DSSの投与を組み合わせることにより、慢性DSS腸炎モデルを確立した。慢性DSS腸炎モデルはこれまでの急性DSS腸炎モデルと比べて、よりヒトの病態に近いモデルであり、様々な候補薬剤の腸炎抑制効果を検討する上で有用であると考えられる。平成27年度は杜仲葉エキスに着目し、慢性DSS腸炎モデルを用いてその腸炎抑制効果について検討を行った。その結果、3%、9%杜仲葉エキスを含有する餌を投与することにより、慢性DSS腸炎モデルの腸炎のスコア、大腸の短縮、好中球の浸潤が抑制された。また、杜仲葉エキスは特に腸炎の急性症状よりも慢性期の再発症状に対して抑制効果を示し、杜仲葉エキスがUCの再発を抑制する効果が示唆された。我々は、既存薬や健康食品など既に安全性の確立されている化合物、およびそれらの化合物の持つα7nAChRやニューロキニン1受容体(NK1R)など複数の薬理学的メカニズムに着目し、その腸炎抑制効果について検討を行っている。これまでに我々は、トロピセトロンがα7nAChR刺激作用を持つことに着目し、その腸炎抑制効果について検討を行った結果、トロピセトロンが腸炎抑制効果を有すること、およびその詳細な腸炎抑制効果のメカニズムを明らかにし、トロピセトロンがα7nAChR刺激作用および5-HT3R阻害作用を含む複数の抗炎症経路を有する、安全な新規UC治療薬としての可能性が示唆された(Tasaka Y etal, Journal of pharmacological sciences, 2015, 127(3), 275-283)。

また、よりヒトの病態に近い慢性腸炎モデルについて検討を行い、5%DSSと3.5%DSSの投与を組み合わせることにより、慢性DSS腸炎モデルの確立を行った。平成27年度は本慢性DSS腸炎モデルを用いて既によく使用され安全性の確立している健康食品である杜仲葉エキスに着目し、杜仲葉エキスの慢性腸炎に対する有効性について検討を行った。その結果、杜仲葉エキスは特に腸炎慢性期の再発症状に対して抑制効果を示し、杜仲葉エキスがUCの再発を抑制する効果が示唆された。従って、本研究は概ね順調に進んでいると考えている。現在の潰瘍性大腸炎(UC)の治療目標は寛解期への導入であり、根治には至っていないのが現状である。一方で、ステロイド薬や免疫抑制剤など現在の治療薬には様々な副作用があり、これらの副作用が患者のQOLを低下させる原因のうちの1つとなっている。さらに、その副作用の治療のために多くの医療費が必要であることもまた大きな問題である。これらのことから、今までとは違ったメカニズムを持つ副作用の少ない新規UC治療薬の開発が望まれている。これまでに我々の研究により、α7型ニコチン性アセチルコリン受容体(α7nAChR)の部分アゴニストであるトロピセトロンがα7nAChR刺激作用および5-HT3R阻害作用を含む複数の抗炎症経路を有する安全な新規UC治療薬であることを見出した。また、従来の急性DSS腸炎モデルと比べ、よりヒトの病態に近いモデルと考えられる慢性DSS腸炎モデルの確立を行った。この慢性DSS腸炎モデルを用いて杜仲葉エキスの腸炎抑制効果について検討を行い、特に腸炎の急性期よりも慢性期においてDSS腸炎惹起による腸炎のスコアの上昇、大腸の短縮、好中球の浸潤が抑制され、杜仲葉エキスがUCの再発を抑制する効果が示唆された。本年度は、α7nAChRのアロステリックなアゴニストであるガランタミンを用いて慢性DSS腸炎に対する効果を検討した。その結果、対照薬であるメチルプレドニゾロン1mg/kgが腸炎の急性症状を抑制したことに対して、ガランタミン2mg/kgでは慢性期の再発症状に対して抑制効果を示し、ガランタミンがUCの維持療法に有効である可能性が示唆された。このように、本研究では既存薬や健康食品に着目し、UCの新規治療薬としていくつかの候補薬剤を見出すことができた。また、急性モデルと慢性モデルを組み合わせることにより、より臨床に近い病態モデルで評価することが可能であった。本研究において我々は、トロピセトロンがα7nAChR刺激作用および5-HT3R阻害作用を含む複数の抗炎症経路を有する安全な新規UC治療薬としての可能性を見出した。また、慢性DSS腸炎モデルを用いて杜仲葉エキスの腸炎抑制効果について検討を行い、杜仲葉エキスがUCの再発を抑制する可能性が示唆された。さらに、ガランタミンの慢性DSS腸炎に対する効果を検討し、ガランタミンがUCの維持療法に有効である可能性が示唆された。我々は、α7nAChRやニューロキニン1受容体(NK1R)など複数の薬理学的メカニズムに着目し、その腸炎抑制効果について検討を行っている。これまでに我々は、トロピセトロンがα7nAChR刺激作用を持つことに着目し、その腸炎抑制効果について検討を行ってきた。
ニオブ・スズ複合超伝導線材の特性に関する材料力学的研究

平成17年度に製作し,18年度に立ち上げ及び調整を行ってきた実用超伝導線材の極低温応力/歪依存性評価装置を用いていくつかの実用線材の特性評価を行った。試料線材にはタンタル(Ta)繊維で内部補強したNb_3Sn線材,銅・ニオブ合金(CuNb)で内部補強したNb_3Sn線材,従来型の(補強無しの)Nb_3Sn線材の3種類を用意した。これらの試料線材について,14-18テスラ(T)の磁場中,4.2Kで応力-歪特性,臨界電流I_cの歪依存性を調べた。Ta補強のNb_3Sn線材は従来よりTaの延性に起因する高延性かつ,Taの熱膨張係数がNb_3Snのそれと近いために残留歪が小さいことが特徴であった。応用面からはこの残留歪を大きくすることが課題であったが,今回それに成功し,応力/歪依存性も大幅に向上させることに成功した。本研究はこの開発の評価を担当した。得られた結果の一部を文献値と比較し,良い一致を確認した。つまり,本研究で製作した極低温応力/歪依存性評価装置によって得られる結果の妥当性が示された。本研究によって得られた結果の一部は,複合超伝導体の電磁機械特性に関する国際ワークショップおよび国際磁石技術会議において発表した。本研究によって得られた成果の意義は,実用超伝導線材の臨界電流の応力/歪依存性のデータベース構築に資するだけでなく,強磁場発生のためのコンパクトな冷凍機冷却超伝導マグネットの開発や,核融合炉用・加速器用の大型超伝導マグネットの開発においても重要なデータベースとなることにある。平成17年度は実用超伝導線材の臨界電流の応力/歪依存性を評価するための装置(強磁場極低温機械特性評価装置)の設計と製作を行った。装置は東北大学金属材料研究所附属強磁場超伝導材料研究センターに設置されている18テスラ超伝導マグネットに合わせて設計し,材料は非磁性のステンレスと真鍮を主として用いた。設計にあたっては岩手大学工学部の片桐教授に助言を頂き,てこを利用して超伝導線材を引っ張る構造とした。てこの力点に作用させる応力をロードセルによって測定する事で試料に印加される応力を評価する。歪は,試料線材を取り付けた電極間の距離の変位をクリップゲージによって測定する。直径52mmの超伝導マグネットボア内に歪印加機構を収納するために設計・製作には時間を要した。歪を測定するためのクリップゲージは極低温用を特注して用いた。現在,装置の立ち上げ作業中である。装置の設計・製作と並行して実用ニオブ・スズ超伝導線材の歪効果についての研究も行った。ニオブ・スズ線材に横方向(線材軸と垂直方向)に圧縮応力が印加されたときの特性劣化について,小コイルを製作して実験で調べるとともに,有限要素法を用いた応力解析を行って調べた。その結果,実用ニオブ・スズ超伝導線材における中心補強の有用性を示す事ができた。また,事前曲歪効果(室温で繰り返し曲歪を与えることで超伝導特性が向上する効果)をコイルや撚線に応用することにも取り組んでおり,これらの実験結果について国内学会,国際会議で発表した。平成18年度は昨年度製作した実用超伝導線材の極低温応力/歪依存性評価装置の立ち上げを行い,4.2K(ケルビン),18T(テスラ)中でニオブ・スズ複合超伝導線材の臨界電流の応力/歪依存性を測定した。応力印加にはステッピングモータを用いた。モータでナットを直接回すことで応力負荷棒を引き上げ,てこを利用して超伝導線材に引張る。モータ部分は装置本体から取り外し可能とし,モータ取付け部分の設計,製作を行った。これにより遠隔操作による実験が可能となった。印加応力はロードセルを用いて計測し,歪は電極間の変位をクリップゲージによって計測する方式とした。ロードセルとクリップゲージの信号は動歪測定器に取り込み,そのアナログ電圧出力をデータ収集する。クリップゲージの較正のために,歪ゲージによる直接測定も行う。試料線材に流す電流はシャント抵抗を用いて,試料線材の発生電圧は直流増幅器を通してデータ収集する。したがって,データ収集は5チャンネルの電圧計測となる。これらの電圧の計測ノイズ除去のために1Hzローパスフィルタを自作し,ナショナルインスツルメンツ製DAQ cardと端子台,および計測ソフトLabViewを用いてデータ収集系を構築した。現在,標準的なニオブ・スズ複合超伝導線材の臨界電流の応力/歪依存性を評価し,文献値との比較を行いながら計測精度の調整を行っている。

応用面からはこの残留歪を大きくすることが課題であったが,今回それに成功し,応力/歪依存性も大幅に向上させることに成功した。本研究はこの開発の評価を担当した。得られた結果の一部を文献値と比較し,良い一致を確認した。つまり,本研究で製作した極低温応力/歪依存性評価装置によって得られる結果の妥当性が示された。本研究によって得られた結果の一部は,複合超伝導体の電磁機械特性に関する国際ワークショップおよび国際磁石技術会議において発表した。本研究によって得られた成果の意義は,実用超伝導線材の臨界電流の応力/歪依存性のデータベース構築に資するだけでなく,強磁場発生のためのコンパクトな冷凍機冷却超伝導マグネットの開発や,核融合炉用・加速器用の大型超伝導マグネットの開発においても重要なデータベースとなることにある。
悪性胸膜中皮腫の増殖シグナル分子を標的とした局所制御法の開発

高度難治性腫瘍である悪性胸膜中皮腫でも切除可能な場合には根治切除である胸膜肺全摘を含む集学的治療(化学療法、放射線療法)により長期生存が得られることがあり、因子解析により条件を検討したところ、比較的短時間に完全切除が可能な症例でPSが良好であること、と判明した。しかしながらそのような症例は全患者の約2割程度であった。細胞株を用いた検討にて糖代謝に関わるtype II hexokinaseに対するsiRNA干渉法により増殖を制御できることが判明した。さらにSendai virusをベクターにした治療法を検討中である。1胸膜中皮腫細胞株の収集および,遺伝子,蛋白の分離と調整2臨床胸膜中皮腫検体からの病理学的解のための組織標本作製,遺伝子,蛋自の分離と調整3 II型ヘキソキナーゼ等の解糖系酵素,c-Met, Akt等のシグナル伝達分子, Hypoxia-inducible factor elementを有する遺伝子群に対する抗体,およびそれら遺伝子群に対する遺伝子増幅用プライマーの作成4胸膜中皮腫細胞株に対するRNA干渉法によるII型ヘキソキナーゼ遺伝子発現の阻止と増殖活性に及ぼす影響に関する解析初年度にRNA干渉法による糖代謝関連酵素の阻害による細胞レベルでの中皮腫増殖抑制効果を見出したが、in vivo応用および臨床応用可能な治療系の確立のために、より多くの分子情報および解析検体の収集が必要となった。次年度には中皮腫臨床検体のサンプリングおよび蛋白、核酸の分離調整を行った。まずは発現解析システムおよびDNAメチル化解析システムを確立のために、中皮腫に比べて豊富に確保されている肺癌検体を用いて検討し、一定のデータを得ている。その基礎臨床データとなる千葉中皮腫研究グループで集積した60例以上の中皮腫患者に関する診断、組織型、治療、予後などについてまとめ、英文誌に報告した。また、細胞培養装置、クリーンベンチ等の刷新する必要が生じ、安定のために腫瘍細胞培養にかかる消耗品を必要とした。現在、中皮腫遺伝子治療をめざしたsendai virusを用いた細胞導入技術の安定化のための実験にようやく着手し始めることができた。初年度にRNA干渉法による糖代謝関連酵素の阻害による細胞レベルでの中皮腫増殖抑制効果を見出したが、in vivo応用および臨床応用可能な治療系の確立のために、より多くの分子情報および解析検体の収集が必要となった。次年度には中皮腫臨床検体のサンプリングおよび蛋白、核酸の分離調整を行っている。まずは発現解析システムおよびDNAメチル化解析システムを確立のために、中皮腫に比べて豊富に確保されている肺癌検体を用いて検討し、一定のデータを得ている(英文誌に報告)。中皮腫遺伝子治療をめざしたsendai virusを用いたin vitroにおける細胞導入技術が安定化し、in vivo実験を施行中である。
フランス2000年都市連帯・再生法による基礎自治体主導の保全的刷新型都市計画

本研究は既に2002-2004年度の交付を受けた科研費研究の延長線上にあるが,我国で2004年6月に景観法が制定されたこと,また2005年度にいわゆる「まちづくり2法」の成立を見たことから,フランスに於ける景観街づくりと中心市街地(再)活性化の連関を,主に制度面から明らかに,それを如何にして我国の都市問題に応用してゆくかを考察した。成果として,フランスの学会で2度の発表できたことは,本研究が国内のみならず海外でも関心を引き通用するものであることを証明する。また,政策形成支援として国土交通省都市、地域整備局主催の景観評価委員会(委員長:浅見泰司東大教授)に於いて景観の費用便益分析に取り組んだ成果が報告書として刊行されただけではなく,新聞にもそのエッセンスを寄稿できた。これらの成果は,ふたつの発展を見せている。一方は,これまで保全に力点を置いてきた研究に再開発の景観街づくりを視点を導入しつつある点であり,他方は,屋外広告パネルを財源としたレンタサイクルの研究に拡がりを持たせている点である。本研究は既に2002-2004年度の交付を受けた科研費研究の延長線上にあるが、我国で2004年6月に景観法が制定されたこと、さらに本通常国会でいわゆる「まちづくり3法」の改正が予定でれていること、さらにはフランス2000年都市連帯・再生法による都市計画の策定が遅れを見せていること等から、寧ろフランスに於ける景観街づくりの長所を日本のそれに如何に組み込んでゆくのかに時間をかけた。成果としては、まず国レヴェルの政策形成への支援が挙げられる。具体的には、まちづくり3法改正の基礎資料として同省住宅局に提出したフランスの景観街づくりによる中心市街地活性化に関する報告書(後掲)や、2006年3月から始まった都市・地域整備局主催の景観評価委員会(委員長:浅見泰司東大教授)への委員就任である。さらに、政策研究大学院大学や法制大学公共政策大学院での現職公務員を対象とした講義でフランスの景観街づくりを我国の景観法との比較から紹介し、実地の運用に於いて対処しておくべき点を講じた。とりわけ、我国の景観行政は土地利用計画や住宅政策と分離しているので、その点への配慮を喚起した。無論、フランスの都市計画自体の研究も怠りなく進めており、とりわけ都市連帯・再生法の形成過程や、それへの論評等に関する既往研究の収集、さらには、パリ市を中心とした都市計画の立案過程や合意形成の試行の基礎資料の収集が飛躍的に進んだ。その他、フランスの景観街づくりに絡め、都市ストックの有効利用に関する考究や、我国で過熱気味のコンパクト・シティ論へのフランスの考え方を考察した。本研究は既に2002-2004年度の交付を受けた科研費研究の延長線上にあるが、我国で2004年6月に景観法が制定されたこと、また2005年度にいわゆる「まちづくり2法」の成立を見たことから、フランスに於ける景観街づくりと中心市街地(再)活性化の連関を、主に制度面から明らかに、それを如何にして我国の都市問題に応用してゆくかを考察した。成果としては、住宅総合研究財団の印刷助成を得て、『住宅政策なくして中心市街地の活性化なし-フランスに於ける中心市街地活性化のための三位一体の都市政策』なる単著を丸善から2007年1月に出版できたことが大きい。また、同書を一般向けに解り易く書き直した論文「古いヨーロッパ・フランスは抵抗する」を、三浦展(編著):『下流同盟-格差社会とファスト風土』(東京:朝日新書、2007年1月)により出版した。また、これらの知見を踏まえた政策形成支援として国土交通省都市・地域整備局主催の景観評価委員会(委員長:浅見泰司東大教授)に於いて景観の費用便益分析に取り組んでいる他、政策研究大学院大学での現職公務員を対象とした講義でフランスの景観街づくりを我国の景観法との比較から紹介し、実地の運用に於いて対処しておくべき点を講じた。さらに、本年度になり増加した社会貢献として各地・各界の講演会への招聘があり、例えば日仏景観会議柳川大会、富岡製糸場世界遺産登録推進シンポジウム、日仏会館フランス文化講演シリーズ等に登壇した。
共感経験尺度(EES)とロールシャッハテストの比較

共感経験尺度(テスト)を大学院生、大学生、専門学校生あわせて310名に施行した。また、同時に孤独感尺度(LSO)、自意識尺度も施行した。今回の調査にあたっては、EESの妥当性を高めるべく、従来の調査項目を改良し、共有経験尺度と共有不全経験尺度という下位尺度を設定できるようにした。項目分析と因子分析を行い、また信頼性が確認され、共感経験尺度の改訂版をまず作成した。これにより、角田(1992)で問題点とされた「共感」と「同情」の識別が可能となった。2つの下位尺度の得点分布から、共感性のタイプ分けを試み4タイプ(両向型、共有経験優位型、両貧型、共有不全経験優位型)を抽出した。両向型は、他者との感情の共有経験と他者の感情を共有できなかった不全経験のどちらも高く、共有経験優位型(共有型)は、他者の感情を共有した経験のみが高い。また、両貧型はどちらの経験にも開かれておらず、共有不全経験優位型(不全型)は他者の感情を共有できなかった経験が高いものである。各タイプと孤独感尺度ならびに自意識尺度との関連を検討した結果、両向型が自己と他者の個別性を認識し、もっとも共感性が高いと考えられた。共有型は「同情」タイプに相当し、両貧型はもっとも共感性が低く、不全型は他者との心的距離があり、親密さを求めながらも他者との関係がもちにくいものと考えられた。以上について、「教育心理学研究」にまとめ、投稿し採用された(第42巻、2号掲載予定)。現在、各タイプから10名ずつの被験者を抽出し、ロールシャッハテストを施行している。12名については取り終え、反応の記号化を行った。次年度も引き続き、ロールシャッハテストを施行し、各タイプを深層心理学的観点から明確にする予定である。
新規DNA脱メチル化因子を用いたiPS細胞誘導時の体細胞リプログラミングの改善

受精卵のDNA脱メチル化に重要なGSEとその相互作用因子でH3R17me2a酵素Mettl23を、多能性細胞の樹立へ応用することを目的に、各KOES細胞を作製し機能解析を行った。ゲノムDNAを用いた各メチル化産物のドットブロット解析では、野生型と比べて大幅な変化は認められなかったが、特定の領域ではKOES細胞で5fCの量が有意に増加し、この変換に必須のTDGの蓄積量は減少していた。さらにH3R17me2阻害剤TBBD添加ES細胞ではGSEとH3.3の蓄積量の減少が認められた。以上より、特定の領域において、GSE及びMettl23はES細胞においてもDNA脱メチル化への関与が示唆された。受精卵において能動的DNA脱メチル化は,その過程としてDNAメチル化の指標となる5-メチルシトシン(5mC)の酸化により5hmCへと変換されることが知られている。本研究計画で解析しているGSE及びMettl23とヒストン修飾H3R17me2aはこの5mCの酸化機構に重要である母性因子として我々が同定し,その成果については現在査読中である。これら因子はES細胞でも発現が認められていることから,GSE及びMettl23は多能性細胞においても5mCの酸化に関与している可能性を考え,本研究計画を構築した。平成27年度は当初の予定通り,多能性細胞として最も品質が高いとされるマウスES細胞におけるGSE,Mettl23,及びH3R17me2a抗体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)解析を行い,これらDNA脱メチル化制御因子がどの遺伝子領域に蓄積しているかを調べることにした。まず,次世代シーケンサーを用いたChIP-seq解析の前に,受精卵においてDNA脱メチル化される領域として知られるOct4,Nanog,及びDnmt3b領域におけるChIP解析を行い,定量PCR (qPCR)解析によりGSE,Mettl23及びDnmt3bの蓄積量を調べた。その結果,いずれの領域でも蓄積していることが示された。次に,GSEとMettl23をノックアウト(KO)したES細胞を樹立し,上記領域における5mC及び5hmC抗体を用いたChIP (MeDIP及びhMeDIP)解析を行った。その結果,野生型と比較して各KOES細胞では,予想通り5mCの量が有意に増加していたが,驚いたことに5mCの酸化産物である5hmCの量も増加していることが明らかとなった。本研究結果は,ES細胞における能動的DNA脱メチル化機構は受精卵と異なることを示唆するものとなった。当初の研究計画では,次世代シーケンサー解析によりGSE,Mettl23,及びH3R17me2aの蓄積をゲノムワイドに調べることで,制御領域を同定し多能性細胞におけるDNA脱メチル化機構の解明及び,これら因子が制御遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが当該年度の目標であった。しかし,GSEやMettl23のKOES細胞の解析結果により,5mCと5hmCの蓄積量が共に有意に増加していることが明らかとなった。この結果は,5hmCへの変換を促進するというGSEとMettl23の受精卵における機能とは異なる結果となった。このことから、次世代シーケンサーを用いた解析を行う前に,5hmCの酸化産物である5fC及び5CaCの蓄積量をChIP解析により野生型とGSE及びMettl23KOしたES細胞で比較することで,KOES細胞におけるさらに詳細なDNA脱メチル化状態の評価を行うこととした。その結果,野生型ES細胞と比較して各KOES細胞では,どのメチル化産物も有意に増加していることが明らかになった。その原因は不明だが,ウェスタンブロット解析により,GSE及びMettl23が蓄積していた領域であるDnmt3bやOct4のタンパク質量を調べた結果,KOES細胞でそれらタンパク質量が減少していることが明らかになった。研究計画であるゲノムワイドな解析は今後行う予定であるが,本来の目的の一つである多能性細胞におけるDNA脱メチル化機構の解明を果たすために,少なくともGSE及びMettl23KOES細胞を用いた解析は,ES細胞におけるDNA脱メチル化機構を解明する重要なモデル細胞として大変有用であり,今後の研究計画においても使用する予定である。受精卵において,特に精子由来のゲノムは大規模なDNA脱メチル化を経験することが知られている。この機構の一端としては,DNAメチル化の指標となる5-メチルシトシン(5mC)が酸化酵素であるTet3タンパク質により5hmCへと変換されることが重要であることが知られているが詳細な機構は明らかになっていない。これまでの我々の研究により,このTet3は生殖細胞特異的発現タンパク質GSEとその相互作用因子で新規にヒストン修飾酵素として同定したMettl23と協調して働き,そのヒストン修飾により5mCから5hmCへの変換が制御されることを見出した。これら結果については現在査読中である。ES細胞においても5hmC化は多能性維持に重要であり,GSEとMettl23はES細胞でも発現している。そこで本研究では, GSE及びMettl23ノックアウト(KO)ES細胞におけるDNA脱メチル化に及ぼす影響について調べることとした。まず,各KOES細胞において5mCの酸化産物である5hmC, 5fC,及び5CaCの蓄積量を,ゲノムDNAを用いたDot blot解析で調べたところ,5fC及び5CaCの産物が野生型と比べて少ないことが明らかになった。

しかし,興味深いことに,Oct4, Nanog, Dnmt3bといった受精卵で5hmC化される領域においては,5fC及び5CaC産物がKOES細胞で増加していることがわかった。また,これら領域において5fCや5CaCをCに変換する酵素であるTDGの蓄積量を調べると,KOES細胞で減少していることが明らかになった。以上のことから,GSEやMettl23はES細胞において,特定の領域においてDNA脱メチル化機構に関与していることが示唆された。受精卵のDNA脱メチル化に重要なGSEとその相互作用因子でH3R17me2a酵素Mettl23を、多能性細胞の樹立へ応用することを目的に、各KOES細胞を作製し機能解析を行った。ゲノムDNAを用いた各メチル化産物のドットブロット解析では、野生型と比べて大幅な変化は認められなかったが、特定の領域ではKOES細胞で5fCの量が有意に増加し、この変換に必須のTDGの蓄積量は減少していた。さらにH3R17me2阻害剤TBBD添加ES細胞ではGSEとH3.3の蓄積量の減少が認められた。以上より、特定の領域において、GSE及びMettl23はES細胞においてもDNA脱メチル化への関与が示唆された。当初の予定では平成28年度で,iPS細胞の誘導時にGSEとMettl23を過剰発現させることでその誘導効率を従来の方法で誘導したiPS細胞と比較する予定であった。この実験でiPS細胞の誘導効率が改善されることが望ましいが,それが認められないことも十分予想される。そこで,GSEとMettl23を過剰発現させたiPS細胞誘導時に,これら制御領域の遺伝子発現プロファイル及びエピジェネティック修飾の変化を調べることで,確実な成果の獲得を期待できる。そのために,多能性細胞として最も高品質なマウスES細胞を用いたGSE及びMettl23の制御領域の同定とDNA脱メチル化機構の解明は必須である。しかし前年度の成果から,GSEとMettl23の欠失はES細胞において5mCの蓄積量の増加だけでなく全ての酸化産物が増加するという予想外の結果となった。このことから,非メチル化領域が減少していることが予想されるが,GSEとMettl23が果たす役割とそのDNA脱メチル化機構の詳細は不明である。そこで本年度の研究計画としては,ES細胞におけるGSEとMettl23の機能を詳細に調べるために,これら抗体を用いた免疫沈降解析を実施しその沈降物を質量分析によりタンパク質を同定することで,ES細胞におけるGSEとMettl23の相互作用因子の網羅的な同定をおこなう。相互作用因子を明らかにし,そのタンパク質のES細胞における既知な機能を組み合わせて考えることで,DNA脱メチル化機構の解明に重要な知見を得る。また,GSEとMettl23が制御する領域を同定するために,野生型及び各KOES細胞を用いた次世代シーケンサーによるゲノムワイドな解析も同時に行う。これら実験結果から,多能性細胞におけるDNA脱メチル化機構の解明とその意義を明らかにできると期待される。分子発生生物学次年度使用額が生じた理由としては,物品費において,初期胚を得るためのマウス使用数を抑えることができたことがあげられる。初期胚を獲得するためにはマウスに過剰排卵処理を施すが,排卵数は個体差が生じる。