hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌の転写・翻訳系改変による潜在能力活性化機構の解明と二次代謝産物発掘への応用

Streptomyces属放線菌の抗生物質高生産リファンピシン耐性変異株,ストレプトマイシン耐性変異株、及びエリスロマイシン耐性変異株を用いた解析から、RNAポリメラーゼやリボソームにおける点変異が、転写や翻訳の機能のみならず、ATP産生やDNA複製の仕組みまでも大きく変えることを突き止めた。そのような細胞全体の複雑な変化が二次代謝活性化をもたらすことを見出した。加えて、翻訳系を標的とする抗生物質の濃度依存的現象(ホルミシス効果)で放線菌の潜在的二次代謝能を効果的に引き出せることを見出し、その原理の活用が放線菌からの新しい二次代謝産物発掘に向けて極めて有用であることを実験的に証明した。以下に示す3つの課題に取り組み,放線菌の転写・翻訳系改変による潜在的二次代謝能活性化機構を解明する上での重要な知見をいくつか得た。加えて,ここで得られた知見をもとに本研究の応用面(放線菌の潜在的二次代謝能活性化による有用化合物の効率的探索)を拡大させるための新たな方向性も生み出した。1.抗生物質耐性変異による放線菌の二次代謝活性化機構の解明. Streptomyces属放線菌の潜在的二次代謝能を強力に引き出す作用があるエリスロマイシン耐性変異(rrnCの23S rRNA遺伝子における点変異A2281G変異)を新たに特定し,放線菌の二次代謝活性化における同変異の重要性について生理・生化学的な面から解析した。一方,放線菌基準株Streptomyces coelicolor A3(2)の抗生物質高生産リボソームタンパク質S12変異株を用いた生化学・分子生物学的解析から,特定のリボソーム変異には放線菌の転写の仕組みを大幅に変化させる作用があり,このことが二次代謝活性化に大きく寄与する(抗生物質高生産を引き起こす)ことを突き止めた。さらに,リボソーム変異により局在や機能が変化したリボソーム会合タンパク質がこの現象に深く関わる可能性を見出した。2.抗生物質のホルミシスによる放線菌の二次代謝活性化機構の解析. 1の検討過程で翻訳系に作用する抗生物質のホルミシスにより放線菌の潜在的二次代謝能を強力に引き出せることを新たに見出し(論文投稿中),その仕組みの解明にも着手した。3.放線菌の転写・翻訳系改変による新しい二次代謝産物の探索.翻訳系に作用する抗生物質リンコマイシンを用いた活性化アプローチでStreptomyces属放線菌の潜在的二次代謝能を引き出すことに成功し,calcium-dependent antibiotic (CDA)の新奇類縁体を発見した。当初の研究計画に基づき,以下の3つを重点課題とし,放線菌の転写・翻訳系改変による二次代謝活性化機構を生化学・分子生物学的な面から解析した。加えて,その結果を最大限に活かし,放線菌からの有用生理活性物質の発掘に向けた技術開発への応用研究にも取り組んだ。各課題に対する具体的な研究実績を以下に述べる。課題1:薬剤(転写・翻訳系を標的とする抗生物質)耐性変異による放線菌の二次代謝活性化機構の解析。放線菌基準株Streptomyces coelicolor A3(2)が特定のRNAP変異やリボソーム変異を有すると,シグマ因子(RNAPホロ酵素を構成し,プロモーター認識と転写開始に関わる機能を持つタンパク質)の発現プロファルが大きく変化し,このことが二次代謝能の向上に深く関わることを明らかにした。課題2:転写・翻訳系を標的とする抗生物質のホルミシスによる放線菌の二次代謝活性化現象の解析。最小生育阻止濃度より低い濃度のリボソーム攻撃性抗生物質存在下でStreptomyces属放線菌を培養すると,同菌の二次代謝能が大幅に向上することを実験的に証明した。加えて,中でも最も強い作用を示したリンコマイシンによる二次代謝活性化現象の仕組みを放線菌基準株S. coelicolor A3(2)を用いて解析した。その結果,リンコマイシン存在下でF0F1ATP合成酵素の発現やネイティブ状態が変化すること,さらには細胞内ヌクレオチドレベルが上昇することを見出し,これらの変化が二次代謝活性化に関わる可能性を見出した。課題3:放線菌の潜在的二次代謝能活性化による新しい有用生理活性化合物の探索。課題1と課題2の原理を様々な放線菌に活用し,通常の培養では検出に到らない二次代謝産物を検出可能なレベルまで生産量を増加させることに成功した。研究計画に基づき設定した3つの重点課題に対して、以下の成果を得た。課題1:転写・翻訳系を標的とする抗生物質耐性変異による放線菌の二次代謝活性化機構の解析。放線菌基準株Streptomyces coelicolor A3(2)およびその近縁種S. lividansから取得した抗生物質高生産リファンピシン耐性変異株,ストレプトマイシン耐性変異株、およびエリスロマイシン耐性変異株を用いた生化学・分子生物学的解析から、転写・翻訳系における点変異が、RNAポリメラーゼやリボゾームの機能を変化させるのみならず、DNA複製やエネルギー物質ATP生産の仕組みまでも大きく変えることを新たに見出した。その鍵となる因子の特定は今後の課題であるが、このような細胞機能の複雑な変化が放線菌の二次代謝活性化の根本原理であることが見えてきた。課題2:転写・翻訳系を標的とする抗生物質ホルミシスによる二次代謝活性化現象の解析。

課題1と同様に2種類のStreptomyces属放線菌を用いて、特に強い二次代謝活性化作用を示すリンコマイシンによる現象を、生化学・分子生物学的な面から詳しく解析した。その結果、それらの抗生物質は、放線菌の生育を完全に阻害しない低濃度では、同菌の物質輸送系や薬剤耐性機構、さらにはリボソームタンパク質など、細胞の維持や増殖に関わる重要な因子の遺伝子の発現を大幅に変化させることを突き止めた。課題3:放線菌の潜在的二次代謝能活性化による新しい有用生理活性物質の探索。薬剤耐性変異と抗生物質のホルミシス効果を利用することで、Streptomyces属放線菌のみならず、様々な放線菌の潜在的二次代謝能を引き出すことに成功し、両手法を組み合せることでより効率的に活性化できることも実証できた。本検討で新たに生産させた二次代謝産物の単離・精製、構造解析は現在も検討中であるが、今後、それらから新しい有用二次代謝産物を見つけ出せる可能性は十分に期待できる。Streptomyces属放線菌の抗生物質高生産リファンピシン耐性変異株,ストレプトマイシン耐性変異株、及びエリスロマイシン耐性変異株を用いた解析から、RNAポリメラーゼやリボソームにおける点変異が、転写や翻訳の機能のみならず、ATP産生やDNA複製の仕組みまでも大きく変えることを突き止めた。そのような細胞全体の複雑な変化が二次代謝活性化をもたらすことを見出した。加えて、翻訳系を標的とする抗生物質の濃度依存的現象(ホルミシス効果)で放線菌の潜在的二次代謝能を効果的に引き出せることを見出し、その原理の活用が放線菌からの新しい二次代謝産物発掘に向けて極めて有用であることを実験的に証明した。課題1[薬剤(転写・翻訳系を標的とする抗生物質)耐性変異による放線菌の二次代謝活性化機構の解析]は,おおむね順調に進展している。一方,課題2(転写・翻訳系を標的とする抗生物質のホルミシスによる放線菌の二次代謝活性化現象の解析)については,当初の予定以上の達成にあり,放線菌の二次代謝研究に新たな方向性を生み出せる可能性も見えてきた。実際に課題2に対しての具体的な成果として,学会発表(4件:国内2,海外2)に加え,国際的評価が高い学術誌(Applied and Environmental Microbiology誌)への原著論文の掲載があげられる。課題3(放線菌の潜在的二次代謝能活性化による新しい有用生理活性物質の探索)は,計画よりも進捗状況が若干遅れ気味ではあるが,最終年度(平成27年度)に本格的に取り組むための基盤を整えることはできている。以上の理由を総合的に判断し,上述したような自己点検評価に至った。27年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物学今後も以下3つを重点課題として,当初の計画に基づき,研究を実施する。各課題に対する具体的な推進方策を以下に述べる。課題1:薬剤(転写・翻訳系を標的とする抗生物質)耐性変異による放線菌の二次代謝活性化機構の解析。放線菌基準株Streptomyces coelicolor A3(2)を供試菌株として,RNAポリメラーゼ(RNAP)変異やリボソーム変異によりシグマ因子の発現プロファイルが変化する仕組みを生化学・分子生物学的な面から詳細に解析し,二次代謝活性化の鍵を握る因子を特定する。その結果を基に,薬剤耐性変異により放線菌の二次代謝能が向上する現象の全容解明を目指す。
脂肪酸酸化調節因子マロニルCoA量の測定法の開発

肥満・糖尿病の原因として糖・脂質代謝異常があげられる。現在、各臓器の代謝変化をin vivoで解析するには、放射性化合物(RI)を用いた方法で行い、特別な実験施設を必要とする。そこで、非放射性(non-RI)試薬による糖・脂質代謝測定法の開発を行っている。本研究では、脂肪酸酸化調節因子として働くマロニルCoA量の測定法の開発を行った。non-RIマロニルCoAの測定は、酵素分解による反応生成物を測定した。まず、脂肪酸合成酵素(FAS)によりアセチルCoAと反応させ、生成したNADPをD-Glucose-6-phosphate (G6P)とGlucose dehydorogenase (G6PDH)で反応させ、6-Phospho-D-Gluconate (6-PG)に変える。さらに6-PGをPhosphoglconate dehydorogenase (6-PGDH)で反応し、NADPHに変換、これを酵素サイクリングにより増幅後、比色定量した。酵素濃度、反応時間等の至適反応条件を検討し、96ウェルプレートでマロニルCoA標準液による標準直線(080pmol)を作成した。次に生体試料の調整方法を検討した。生体試料(脳神経核、筋肉、肝臓)は、測定緩衝液でホモジナイズ後、熱処理、遠心した。上清中のマロニルCoA量を測定し、non-RIでの組織中マロニルCoAの測定を可能にした。しかし、筋肉や肝臓においては、試料中に含まれる多量の内因性物質(G6P、6-PG等)の充分な除去が難しく、マロニルCoAのみを選択的に測定することが難しい。引き続き、内因性物質を確実に除去するため、方法め改良を行っている。今後は、絶食や過栄養食を与えたときめ脳視床下部神経核、末梢組織の微量なマロニルCoAの変化量を測定し、動物を用いた治療薬の開発、スクリーニングに活用していきたい。
コピペ時代のプログラミング能力評価手法の開発

近年のソフトウエア開発においては、サンプルプログラムのコピーペースト・開発ツールの利用・既存ライブラリの利用など、プログラムの一部がブラックボックス化された状況でプログラムを作成することが多い。このような状況においては、プログラミング言語の文法を完全に記憶していることよりも、作成したいプログラムを俯瞰的に理解してプログラムを設計する能力が重要となる。本研究では、プログラムに対する俯瞰的な理解力を測るための新しい評価手法を確立することを目的とする。提案するプログラミング能力評価システムでは、プログラムで作成された画像や動画像(以下、コンテンツと呼ぶ)を2つ提示し、どちらのコンテンツのプログラムが難しいかを受験者に判断させることで、受験者のプログラミング能力を測る。提案方法の妥当性を検証するために、大学・専門学校・工業高等専門学校・IT会社の学生や社員に対して実証実験を行った。また、プログラミング教育を担当する教員にも能力評価試験をためしてもらい、実験結果や教員のコメントをもとに能力評価システムの改善を行った。出題に関しての補足説明の表示することによる難易度評価の際に注目すべき部分を明確することにより評価の精度が高くなり充分な能力評価ができるようになった。また、出題時にコンテンツだけでなく、入力データも表示することで、測定できるプログラミング技法の種類を広めることができた。また、出題する問題を適切に選択れば、プログラミングの初心者から上級者までの能力評価が可能となることもわかった。近年のソフトウエア開発においては、サンプルプログラムのコピーペースト・開発ツールの利用・既存のライブラリの利用など、プログラムの一部がブラックボックス化された状況でプログラムを作成することが多い。本研究では、プログラムに対する俯瞰的な理解力を測るための新しい評価手法を確立することを目的にする。提案するプログラミング能力評価システムでは、プログラムで作成された画像や動画像(以下、これらをコンテンツと呼ぶ)を2つ提示し、どちらのコンテンツのプログラムが難しいかを学生に判断させるというテストを行うことで、学生のプログラミング能力を測る。本年度は、次のことを行った。1.コンテンツ開発:同評価システムで用いる試験問題(コンテンツ対)を作成した。2.実験用サーバーシステムの開発、試験問題をWebで受験できるように、サーバーシステムを構築し、20問程度の問題を掲載した。3.提案方式の妥当性の評価実験:専門学校のゲーム系学科、グラフィックス系学科、ソフトウエア系学科の学生のに対して、同システムを使って試験を受けてもらい、その結果を分析した。本年度の研究により、提案方式は、学生のプログラミング能力を測定することに十分有益な方法であることを証明した。また、今後、測定の精度の向上、ならびに、測定できるプログラミング技法や画像処理技術の範囲を増やすためのコンテンツの開発が重要であることが判明した。コンテンツ開発、Web用試験システムの作成などのシステム開発は順調に進んでいる。また、提案方式の効果を測るための実験については、コンピュータ専門学校と協力を得ることができた。作成した試験問題に関しては、プログラミングの出力結果であるコンテンツのみからソースを想像することによる勘違いや、関数部分を難しさの判定にいれるかどうかわからないなど今後、試験問題の精度をあけるために必要な検討項目も判明した。また、受験者(学生)にとってアプリで遊ぶ感覚で試験に取り組むことができ、かつ勉強にもなることが受験者の感想から判明し、負担をかけずに受験・学習できるという特性を得た。以上のように、本研究課題は順調に進捗している。本年度は、測定できるプログラミング技法や画像処理技術の範囲を増やすため、プログラミング結果であるコンテンツに加えて、初期入力データも受験者に提示するような改良案を提案し、同案を実現する評価システムを開発した。さらに、新しい評価手法用の出題問題の作成を行った。評価システムを用いて、プログラミング教育担当者などに本システム上で模擬試験を受けてもらい、我々の意図した能力を測定できる可能性があるか否か、改善点がどこにあるかについてを評価してもらった(評価実験)。評価結果を受けて、新方式の妥当性を確認し、さらに、改善点の検討を行った。入力データ表示機能付き、コンテンツ比較システムを完成させた。また、入力データ表示付きの出題問題を多数開発した。評価実験を実施し、その結果を分析した結果、改良した手法により、出題範囲や測定できる能力が増大することを示すことができた。また、測定精度を向上するための、プログラミング担当者からの意見も多数収集することができた。今後の測定制度改善策に役立てることができる。

本研究では、プログラムに対する俯瞰的な理解力を測るための新しい評価手法を確立することを目的とする。提案するプログラミング能力評価システムでは、プログラムで作成された画像や動画像(以下、コンテンツと呼ぶ)を2つ提示し、どちらのコンテンツのプログラムが難しいかを受験者に判断させることで、受験者のプログラミング能力を測る。本年度は、提案方法の妥当性を検証するために、被験者のプログラミング経験などを収集するためのアンケート機能を実験システムに実装し、それを用いた実験を行った。本システムの妥当性を示すためには、被験者のプログラミング能力をなんらかの形で把握し、それと本システムでの試験結果とを比較する必要がある。H29年度は、実験開始前に簡単なアンケートを取り、プログラム能力を自己申告してもらうという方法をとることにした。このため、能力を自己申告できるような質問内容を検討しアンケート機能を実験システムに実装した。アンケート機能を搭載した実験システムを用いて、工業高専ならびにIT企業の協力を得て実験を行い、様々な実験データを収集することができた。H29年度は、当初の予定通り、能力を自己申告できるような質問内容を検討しアンケート機能を実験システムに実装した。また、工業高専学校ならびにIT企業の協力を得て、Cプログラミング教育を受けた学生やIT企業で働くプログラマ、SE、システム構築担当者、営業担当者などに対して同システムを用いた評価実験を行った。これらより、様々なデータを収集することができた。近年のソフトウエア開発においては、サンプルプログラムのコピーペースト・開発ツールの利用・既存ライブラリの利用など、プログラムの一部がブラックボックス化された状況でプログラムを作成することが多い。このような状況においては、プログラミング言語の文法を完全に記憶していることよりも、作成したいプログラムを俯瞰的に理解してプログラムを設計する能力が重要となる。提案方法の妥当性を検証するために、大学・専門学校・工業高等専門学校・IT会社の学生や社員に対して実証実験を行った。また、プログラミング教育を担当する教員にも能力評価試験をためしてもらい、実験結果や教員のコメントをもとに能力評価システムの改善を行った。
消化管癌の分子病理診断用ミニcDNAアレイ及び抗体アレイの開発と実践導入

消化管癌のマイクロアレイ技術を用いた分子病理診断による癌の個性の実践導入をを目指して、次のことを行った。1)消化管癌について、serial analysis of gene expression(SAGE)法を用いて網羅的遺伝子発現解析を行った。胃の高分化腺癌、低分化腺癌及び非癌部胃粘膜を対象に解析し、generating gene type IV(Reg IV)をはじめ胃癌に特異的に高発現する種々の遺伝子が同定された。Reg IVは、realtime RT-PCRによる検索では確かに胃癌で高発現しており、ステージと相関していた。さらに、それぞれの組織型に特異的発現を示す遺伝子がいくつか同定され、それには、細胞増殖、染色体安定性、蛋白分解などに関わるものが含まれていた。胃癌特異的に発現していた数種のtagは全く未知のものであり、reverse SAGEにより遺伝子の同定を行っている。2)胃癌患者及び健常人ボランティアを対象とし、遺伝子多型(SNP)と癌の発生・進展との関連を解析した。E-cadherinでは、rSNPとリンパ節転移との間に相関傾向がみられ、MMP-1では、rSNPと胃癌の発生及びステージとの間に有意な相関が認められた。3)診断用ミニcDNAアレイを用いた分子病理診断システムを構築した。ホルマリン固定あるいは新鮮凍結された生検組織について、laser microdissectionを併用して正確にDNA及びRNAを抽出し、それぞれの臓器癌に対する診断用ミニcDNAアレイを用いて癌の個性診断を行うとともに、正常粘膜試料では、消化管癌に関連したSNP同定用ミニアレイを使用し、発癌感受性、薬剤感受性、遺伝性腫瘍の同定などを行うものである。この実践運用により、新しい癌の予防・診断・治療の展開が期待できる。4)蛋白アレイ作成のための蛋白の固相化及び抗原・抗体反応の成立の条件設定を行っており、実践導入は今後の課題である。
話しことばの認識と生成におけるリズムの役割

<1)聞き取り(listening)のメカニズムについて>___ーa)聞き取りを行う際に、発話の流れを聞き手は一定の単位で区切って(chunking)、極く短い期間一時的に記憶する(echoic memory)と考えられている(Pimslure,1970ほか)。この単位をperceptual sense unitと名付ける。これについて、脳梁損傷者、1才6ヶ月から9才0ヶ月の幼児、健常な成人を含む、1000名以上の被験者を動員して20回以上の実験を繰り返した結果、perceptual sense unitとは「聞き手が一気に(holistically)に知覚することが出来る7つ(±2)以内の音節が伝える1つの意味単位」であることがつきとめられた。特定の文法単位がこのunitを構成すると考えないほうがよい。b)Perceptual sense unitをholisticallyに知覚する作業は、このunit同士の文法的・意味的関係を解明していく分析的(予想と検証を繰りかえしてこの作業は行われる)作業とは、神経心理学的に互いに異なる機構によって支えられている。聞き取りはこの互いに異なる2つの機構の共同作業によって成り立つ。c)Holisticに知覚されるための1つの重要な条件は、unitを構成する約7つ以内の音節が300ms以内の短い時間幅で結ばれていることだが、そのような音節群は、cognitiveな作業によって破壊されることなく、そうでない音節群(音節間隔が500ms以上の音節群)よりも有意に長く、echoic memoryに保存される。<3)拍・音節と言語のリズムについて>___ー1才6ヶ月の幼児の発話にみられるリズム現象を規定する要因は、拍ではなくて音節である。<4)言葉のtimingcontrolのメカニズムについて>___ー前掲1)のperceptual sense unitの性格はuniversalなものだと考えられる。この仮定にたって各言語の音節構造を模した無意味語を作り、この末尾にかぶせるF_0とdurationを色々に変えて、echoic memoryに、その無意味語が保持される割合を調べることによって、language specificな現象を調べることが出来ると考えられる。現在のところ、ここから得られた知見が、研究分担者の大山、三浦による「日本語学習者のプロソディに関する研究」(研究発表欄参照)の現象をかなり説明できる。<5)ジェスチャ-と言葉の知覚・認識について>___ーa)iconixから談話の意味をとる作業は言語能力と高い相関関係がある。b)ジェスチャ-の単位(gestural phrase)はperceptual sense unitと一致する。c)ジェスチャ-は発話と同期するか、それより早い目に生起する。この順を機械的に逆にして、ジェスチャ-を発話より1秒遅らせると、発話を理解する作業は有意に阻害される。
中枢神経傷害後の血管新生を制御する生体システムの抽出

様々な原因で脳と脊髄から構成される中枢神経系が傷害されると、感覚機能障害、運動機能障害など、傷ついた部位に応じて様々な症状があらわれる。この症状は、疾患の種類や個体差はあるものの、時間がたつにつれて僅かに自然回復する。症状の自然回復には、病態で傷ついた神経組織の修復が必要であり、いかにして神経組織を自然修復させるか、そのメカニズムの解明が待ち望まれている。研究代表者らはこれまでに、神経組織の自然修復には、病巣での血管新生が関与することを見出している。本課題では、病態における血管新生のメカニズムについて、特に神経組織の傷害と修復との関連について着目し研究を行った。脳や脊髄が外傷や炎症により傷つくと、病巣では旺盛な血管新生が観察される。病態の急性期における血管新生は、末梢に由来する炎症性細胞が中枢神経系へ浸潤するための足場として働くことで、組織傷害を悪化させる働きをもつ。一方で、慢性期の血管新生は、傷害により血管網が脱落した結果生じる虚血を解消させたり、血管の循環系の機能の一つである栄養分の供給を再開させるものがあり、結果として組織の修復を促すと考えられている。病態における血管新生のメカニズムを解明することで、組織の傷害や修復の制御が実現する可能性がある。血管新生の制御は、脳脊髄疾患に対する新しい治療戦略であると期待されるが、現時点で、脳脊髄における血管新生の分子メカニズムには不明な点が多くある。研究代表者らは過去の研究において、中枢神経系の自己免疫疾患である多発性硬化症のモデル動物においては、神経組織が脱落した後に血管新生が生じる現象を観察している。また、炎症により傷ついた神経回路が再建すると、血管新生も鎮静化する様子も確認している。これらのことから、中枢神経傷害後の神経回路の脱落と再建により促される中枢神経系の環境変化が、血管新生を正と負に制御する可能性を考えた。本年は、in vitroの実験系を使用して、神経組織に由来する血管新生を制御する分子の探索を行った。神経組織には血管新生を抑制する作用があることがわかり、HPLC等の分画手法を用いて神経組織成分を分画し、血管新生を促進する分画を抽出することに成功した。脳と脊髄からなる中枢神経系が傷害されると、病巣では新たな血管の増生が認められる。この血管新生を呼ばれる現象は、組織の修復に必要であると考えられているが、中枢神経傷害後の血管新生のメカニズムには不明な点が多い。研究代表者ら中枢神経傷害後の血管新生が、傷ついた神経に由来する物質によって導かれるという仮説をたてた。本課題では、神経細胞に含まれる血管新生促進因子の同定を行っている。血管新生には、血管内皮細胞の増殖が必要である。これまでの検討で、傷ついた脳組織を模擬する脳組織抽出液に、血管内皮細胞の増殖因子が含まれることを見出した。また、生化学的な手法を組み合わせて、血管内皮細胞の増殖活性を含む脳組織抽出液フラクションの分画に成功し、さらにその分画に含まれる成分を質量分析により解析した。含まれる成分について、血管内皮細胞の増殖活性があるかを網羅的に探索した。その結果、通常は細胞内に含まれているが、細胞が傷ついた際に細胞外に放出する、新規血管新生因子の同定に成功した。同定した因子の細胞内シグナル伝達機構についても解析を実施した。さらに、同定した因子の生体内での発現パターンを免疫染色のより解析した。その結果、得られた分子は大脳皮質に豊富で、また特に大脳皮質第5層の神経細胞に豊富に発現していること、一方でオリゴデンドロサイトやアストロサイトでの発現は高くないことを見出した。今後、神経細胞特異的に同定因子の発現を抑制させたマウスにおいて、中枢神経傷害後の血管新生が抑制されるか検討する。中枢神経系が傷害を受けると、受傷部位に応じて、様々な症状があらわれる。症状の発症や悪化の組織学的な原因のひとつに、神経回路の脱落が挙げられる。中枢神経系の疾患による後遺症を軽減する方法として、傷ついた神経回路の修復を促すことが有望と考えられている。かつて、大人の中枢神経系の神経回路の修復は期待できないと考えられていた。しかし近年の研究により、疾患の種類や個人差こそあるものの、大人の中枢神経回路は自然に修復するポテンシャルを残していることがわかってきた。また研究代表者らはこれまでに、傷害部位で新たに形成される血管が、神経回路の修復の促進に寄与することを見出してきた。そこで本研究では、中枢神経傷害後の血管新生の機序を解明し、二次的に神経回路の修復を後押しすることを目指した。本研究では、血管新生と神経回路の脱落・修復が観察される、指定難病の多発性硬化症のモデルマウス(脳脊髄炎マウス)を用いた。脳脊髄炎誘導後に、血管新生と同時期におこる神経系の挙動を観察したところ、神経回路の脱落が観察された。そこで、傷ついた神経細胞から放出される物質が、血管新生を促すか検証するため、in vitroの実験を行った。その結果、通常は神経細胞内に含まれているが、細胞が傷ついたことで細胞外の放出する分子の中に、血管内皮細胞の増殖を促す作用があることがわかった。見出した分子が、血管内皮細胞側に作用する際に、血管内皮細胞側に発現する分子を同定し、同定した分子群のin vivoでの役割についての解明も行った。得られた成果について、論文を執筆し、投稿へ進めている。

この症状は、疾患の種類や個体差はあるものの、時間がたつにつれて僅かに自然回復する。症状の自然回復には、病態で傷ついた神経組織の修復が必要であり、いかにして神経組織を自然修復させるか、そのメカニズムの解明が待ち望まれている。研究代表者らはこれまでに、神経組織の自然修復には、病巣での血管新生が関与することを見出している。本課題では、病態における血管新生のメカニズムについて、特に神経組織の傷害と修復との関連について着目し研究を行った。多くの候補分子の中から、活性をもつ分子の同定に成功すると共に、その分子の発現パターンの解析まで終了したため。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学、神経化学・神経薬理学同定した分子のin vivoでの働きについて検討する。具体的には、多発性硬化症の実験動物モデル(experimental autoimmune encephalitis, EAE)の病巣を局所に誘導したマウスを作出し、そのマウスにおいて神経から漏れ出る同定分子が血管新生を促進させる働きがあるかを解析する。神経細胞で同定因子の発現を抑制される処置を施したマウスにEAEを誘導し、その後におこる新生血管の形成を組織学的に解析する。さらに、同定した分子の働きがEAEに特異的な現象ではないかを検討するため、脳挫傷モデル(controlled cortical impact)における血管新生に対する同定因子の作用についても検討する。同定した因子による血管新生効果が個体レベルの表現系に対しても働きうるか検証する。脳腫瘍モデルマウスでは、腫瘍周囲の血管新生によって腫瘍の増悪化が導かれ、生存率の低下を導くことが知られている。同定した因子の働きを抑制させたマウスでは、生存率の低下が抑制されるか、観察する。血管新生を制御する神経組織由来の分子の候補を絞り込むことに成功したため。候補となっている分子群の中から、標的分子を同定する。標的分子の同定を速やかに進めるために、細胞内シグナル伝達機構についても同時に進め、標的分子の候補を絞り込む作業も同時並行して進める。さらに標的分子が組織内で発現するか、遺伝子レベルでも検討を進め、in vivoで作用しうる分子という枠でも、標的分子の絞り込みを進める。これらの作業を行うことで、標的分子がいかにして細胞に働きかけるか細胞内シグナルを明らかにすることができ、さらにin vivoで検討する上での予備的な知見を得ることもできる。
超伝導転移を利用した高エネルギー分解能マイクロカロリメータの開発

本研究は、昨年度より開始されており、エネルギー分解能の点で極めて優れた超伝導転移端温度計(Transition Edge Sensor TESと略す)を用いたX線検出器の開発を行うものである。昨年、1個TESが破損したが、今年はIr-TESとIr/Au-TESについて動作を確認し、放射光での実験も実施できた。次に、Ir-TESについてであるが、安定性や動作抵抗を高くできるなどのメリットがMo、Tiに比べてあるが、製膜が難しく、不均一な熱伝導性のためによい成果が得られなかった。このためIrセンサーとAuセンサーを二重膜にバイレイヤ構造にして、伝導率を均一化したり、センサーの数を増やし、1個当りの面積を減らす多ピクセル化を試みた。この方針に基づき、Ir/Auというバイレイヤ型を試作したところ、超伝導転移端の特性が極めてシャープになり改善が見られた。5.9KeVのX線に対するエネルギー分解能もFWHM=9.4eVになった。これを筑波の高エネルギー加速器研究所(KEK)の放射光装置で、8KeVのX線入射に対する蛍光X線分析を行い約1桁エネルギー分解能のよい出力蛍光X線を得た。また、Ir-TESについて多ピクセル化して、X線の入射位置が測定できることを示した。来年は更なるエネルギー分解能向上とともにAu/Ir/Auなど三重膜にもトライしてみる予定である。従来、X線やガンマ線の測定に用いられてきた半導体検出器は、実用に十分な効率・エネルギー分解能・計数率特性を有するために広く使われてきたが、エネルギー分解能が電荷キャリア数のゆらぎにより制限を受けるという問題があった。極低温においては、物質の熱容量は極めて小さくなるので、個々のX線・γ線入射により十分大きな温度上昇が生じ、この温度上昇を高感度の温度計で測定すれば、入射粒子のエネルギーを精度よく測定できるマイクロカロリメータが実現できる。本研究では、Ir超伝導体を超伝導転移端温度内に保持し、吸収体の温度上昇を、超伝導体の急峻な抵抗変化から求めることで、高感度な超伝導転移端温度計(Transition Edge Sensor : TES)の開発を行うものである。平成16年度は、個々のピクセルの熱容量が小さく、高いエネルギー分解能が期待できる、ピクセル型の素子構造について検討を進めると共に、手持ちのイオンエッチング装置を改造したスパッタ装置を導入し、その立ち上げを行った。また、Ir/Au超伝導体を用いた、それぞれ熱容量の異なる10個のピクセルを有するTES素子を製作し、その動作を確認した。一方、本TES素子の信号を解析したところ、飽和状態には到達していないことが分かった。また、Ir超伝導体を用いた50um x 50umの小型ピクセルを20個有する検出器の製作を行い、その動作を確認した。一方、本検出器の特性を詳細に求めるための放射光実験を計画したが、測定中に素子が破断するなどの問題が生じたため、位置応答の詳細については求めていないものの、信号の立ち上がり時間、立下り時間のばらつきが見られており、入射位置依存性があるものと考えられる。
家庭防災備蓄におけるモラルハザードの実証分析

本研究は、家庭防災備蓄行動を妨げている要因の一つであるモラルハザードについて、2017年12月に日本全国を対象に実施した家庭防災アンケート調査データを用いて検証する。先行研究では、防災におけるモラルハザードは、主に個人の災害保険への加入や公的な防災対策が原因として指摘されているが、本研究はこれらに加えて、他者が行う防災備蓄を認知していることが自身の防災備蓄行動に及ぼす影響について検証する。本研究では、家庭防災備蓄行動を妨げている要因の一つであるモラルハザードについて、申請者が2017年12月に日本全国を対象に実施した家庭防災アンケート調査データを用いて詳細な分析を行うことを目的としている。特に、自助と共助・公助との関連性について注目し、他者の防災行動が個人自身の防災備蓄行動に及ぼす影響の有無やその程度について検証する。本年度は、まず、個人防災に関連する最新の研究について追加的な文献調査を行った。特に近年は、行動経済学や社会心理学的な背景を踏まえた実験的アプローチによる研究が行われるようになってきており、そうした研究の知見を参考に分析モデルの構築をする。次に、データ整理を行い、2017年12月に実施した家庭の防災備蓄状況に関するアンケート調査データを分析用データに加工した。そして、分析の第一段階として日本の家庭レベルの防災備蓄の現状や意識に関する基本統計量を示した。また、家庭のアンケート調査では正確な情報を収集することが難しい「公的備蓄状況」に関して、都道府県別のデータ収集を進めた。さらに、仙台・神戸において防災対策の現状やこれまでの取り組みについて現地調査を実施した。また、研究の途中経過について仙台・神戸の防災研究会で発表し、次年度の分析に向けて有意義なコメントをもらうことができた。本研究の進展により、自助・共助・公助のバランスについて定量的な議論するきっかけになることを期待している。現在までの進捗状況は下記のとおりである。(1)文献調査:個人防災に関連する最新の研究について追加的な文献調査を行った。(2)データ整理:2017年12月に実施した家庭の防災備蓄状況に関するアンケート調査データを分析用データに加工した。(3)統計分析:第一段階として日本の家庭レベルの防災備蓄の現状や意識に関する基本統計量を示した。(4)追加データ収集:都道府県別の「公的備蓄状況」に関するデータの収集を進めた。(5)防災対策の現状把握:仙台・神戸の防災対策の現状やこれまでの取り組みについて現地調査を実施した。(6)セミナー発表:研究の途中経過について仙台・神戸の防災研究会で発表し、次年度の分析に向けて有意義なコメントをもらうことができた。今後の研究の進め方として、引き続き関連文献のレビューは行いつつ、前年度に統計ソフトによって整理した分析用データを用いてデータ分析を開始する。具体的には、モラルハザードに関連する仮説の検証を行い、分析結果を地理情報システム(GIS)ソフトを用いて可視化する。加えて、前年度に引き続き「公的備蓄状況」に関するデータを収集する。上記の計画と同時並行で被災地や将来大規模災害の発生が懸念されている地域の現地調査を実施し、防災対策の現状を把握する。研究成果は国内学会やセミナー等で発表する。(5)防災対策の現状

把握:仙台・神戸の防災対策の現状やこれまでの取り組みについて現地調査を実施した。(6)セミナー発表:研究の途中経過について仙台・神戸の防災研究会で発表し、次年度の分析に向けて有意義なコメントをもらうことができた。今後の研究の進め方として、引き続き関連文献のレビューは行いつつ、前年度に統計ソフトによって整理した分析用データを用いてデータ分析を開始する。具体的には、モラルハザードに関連する仮説の検証を行い、分析結果を地理情報システム(GIS)ソフトを用いて可視化する。加えて、前年度に引き続き「公的備蓄状況」に関するデータを収集する。上記の計画と同時並行で被災地や将来大規模災害の発生が懸念されている地域の現地調査を実施し、防災対策の現状を把握する。研究成果は国内学会やセミナー等で発表する。
冥王代ジルコンのソースマグマの主成分元素組成：ジルコン晶出実験からの制約

本研究は、ジルコンとケイ酸塩メルト(マグマ)の反応実験からジルコン晶出とマグマの主成分元素組成の関係を明らかにし、ジルコン晶出モデルを構築する。このジルコン晶出モデルを用いて、申請者がこれまでのに制約した、岩石記録の残っていない46-40億年前(冥王代)の初期地球に存在していた地殻の主成分元素組成の範囲から、冥王代唯一の遺物であるジルコンを晶出させうる組成(ジルコンのソースマグマの組成)を決定し、冥王代地殻の主成分組成にさらなる制約を与える。本年度は、珪酸塩マグマからのジルコン晶出(ジルコニウムの飽和)モデルの確立とジルコンーケイ酸塩マグマ間での希土類元素分配係数の決定のため、ジルコンと珪酸塩メルトの反応実験の手法確立に取り組んだ。まず、地球の珪長質地殻から月の苦鉄質・珪長質までの幅広い組成範囲で、4種類の出発物質を酸化物・炭酸塩・水酸化物の粉末試薬から合成し、希土類元素を添加した。珪酸塩メルトからジルコンを晶出させ、化学分析に十分な大きさまで成長させるのは難しいため、本研究では天然のジルコンとケイ酸塩メルトを反応させ、愛媛大学理学部のピストンシリンダー高圧発生装置を用いて、この出発物質を高温・高圧条件下で全融解させ、天然のジルコン鉱物と反応させる手法をとった。この手法では、ジルコンからメルトへのジルコニウムや希土類元素の拡散プロファイルを得ることで、マグマのジルコニウムの飽和濃度やジルコンーケイ酸塩メルト間分配係数を求める。天然のジルコン鉱物を用いてメルトとの反応実験から希土類元素の分配係数を決定するのは新しい試みであり、希土類元素を添加するのではなく、より天然の状況に近い希土類元素濃度で反応実験を行うことで、分配係数を正しく決定できると考えられる。天然のジルコンの粒内にはZr濃度や希土類元素組の濃度に不均質性があり、この不均質性を解消するために高温炉で長時間のアニーリングを行った。実験試料は京都大学理学部の電子線マイクロアナライザーを用いてジルコン、ケイ酸塩メルトの主成分・微量元素組成分析を行った。天然ジルコンの使用には、Zr濃度や希土類元素濃度が不均質であることと、流体との反応といった変質作用により鉱物組織が破壊されているという2つの問題があった。この2つの問題は高温でのアニーリングによる元素の拡散と、組織の再結晶化で解決できるかと思われたが、アニーリングにより揮発しやすい微量元素(例えば鉛、ウラン)が結晶中から出て行くことで、結晶の破壊がさらに進むことになった。今後は、天然ジルコンに加え、人工ジルコンを合成してジルコンとケイ酸塩メルトの反応実験を行う。出発物質には酸化物、炭酸塩、水酸化物の粉末から合成した試料と天然あるいは合成のジルコン粒を用いる。実験装置は愛媛大学理学部のピストンシリンダー型高圧発生装置を用いる。実験の条件は圧力1GPa、温度10001300°C、酸素フガシティNi-NiOバッファーとし、この条件で合成粉末試料を全融解させてケイ酸塩メルトを作り、ジルコン粒と共存させ、平衡状態にする。実験回収試料中の急冷ガラス、ジルコン粒の主成分元素組成分析は京都大学理学部の波長分散型X線分光器付随の電子線マイクロアナライザーを用い、希土類元素組成分析は東京大学大気海洋研究所の二次電子イオン質量分析計を用いて行う。ジルコン粒からケイ酸塩メルトへのジルコニウムの拡散・溶解プロファイルを取り、ジルコンとメルト境界面におけるジルコニウム飽和濃度を算出する。さらに、愛媛大学理学部の常圧炉を用いてジルコニウムを添加したケイ酸塩ガラスを作成する。作成したケイ酸塩ガラスはラマン分光分析法やX線吸収法、X線回折法を用いて構造を分析・解析する。そして、得られたガラス(メルト)構造情報からケイ酸塩メルト中でのジルコニウムの配置とその他ケイ酸塩メルトを構成する元素の配置の関係を明らかにし、ジルコニウムの飽和・不飽和に関与する元素を決定する。これらの実験結果から、ジルコン晶出(ジルコニウム飽和)についてメルト組成・温度を変数としたモデルを構築する。このジルコン晶出モデルを用いて、申請者がこれまでに制約した冥王代地殻の組成範囲のうちでジルコンが晶出しうる組成を決定する。

珪酸塩メルトからジルコンを晶出させ、化学分析に十分な大きさまで成長させるのは難しいため、本研究では天然のジルコンとケイ酸塩メルトを反応させ、愛媛大学理学部のピストンシリンダー高圧発生装置を用いて、この出発物質を高温・高圧条件下で全融解させ、天然のジルコン鉱物と反応させる手法をとった。この手法では、ジルコンからメルトへのジルコニウムや希土類元素の拡散プロファイルを得ることで、マグマのジルコニウムの飽和濃度やジルコンーケイ酸塩メルト間分配係数を求める。天然のジルコン鉱物を用いてメルトとの反応実験から希土類元素の分配係数を決定するのは新しい試みであり、希土類元素を添加するのではなく、より天然の状況に近い希土類元素濃度で反応実験を行うことで、分配係数を正しく決定できると考えられる。天然のジルコンの粒内にはZr濃度や希土類元素組の濃度に不均質性があり、この不均質性を解消するために高温炉で長時間のアニーリングを行った。実験試料は京都大学理学部の電子線マイクロアナライザーを用いてジルコン、ケイ酸塩メルトの主成分・微量元素組成分析を行った。天然ジルコンの使用には、Zr濃度や希土類元素濃度が不均質であることと、流体との反応といった変質作用により鉱物組織が破壊されているという2つの問題があった。この2つの問題は高温でのアニーリングによる元素の拡散と、組織の再結晶化で解決できるかと思われたが、アニーリングにより揮発しやすい微量元素(例えば鉛、ウラン)が結晶中から出て行くことで、結晶の破壊がさらに進むことになった。今後は、天然ジルコンに加え、人工ジルコンを合成してジルコンとケイ酸塩メルトの反応実験を行う。出発物質には酸化物、炭酸塩、水酸化物の粉末から合成した試料と天然あるいは合成のジルコン粒を用いる。実験装置は愛媛大学理学部のピストンシリンダー型高圧発生装置を用いる。実験の条件は圧力1GPa、温度10001300°C、酸素フガシティNi-NiOバッファーとし、この条件で合成粉末試料を全融解させてケイ酸塩メルトを作り、ジルコン粒と共存させ、平衡状態にする。実験回収試料中の急冷ガラス、ジルコン粒の主成分元素組成分析は京都大学理学部の波長分散型X線分光器付随の電子線マイクロアナライザーを用い、希土類元素組成分析は東京大学大気海洋研究所の二次電子イオン質量分析計を用いて行う。ジルコン粒からケイ酸塩メルトへのジルコニウムの拡散・溶解プロファイルを取り、ジルコンとメルト境界面におけるジルコニウム飽和濃度を算出する。さらに、愛媛大学理学部の常圧炉を用いてジルコニウムを添加したケイ酸塩ガラスを作成する。作成したケイ酸塩ガラスはラマン分光分析法やX線吸収法、X線回折法を用いて構造を分析・解析する。そして、得られたガラス(メルト)構造情報からケイ酸塩メルト中でのジルコニウムの配置とその他ケイ酸塩メルトを構成する元素の配置の関係を明らかにし、ジルコニウムの飽和・不飽和に関与する元素を決定する。これらの実験結果から、ジルコン晶出(ジルコニウム飽和)についてメルト組成・温度を変数としたモデルを構築する。このジルコン晶出モデルを用いて、申請者がこれまでに制約した冥王代地殻の組成範囲のうちでジルコンが晶出しうる組成を決定する。
セミ・インタクト細胞を利用した情報伝達分子システムの再構成と1分子反応解析

細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムEGF-Ras-MAPKシステムは、細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムである。このシステムの内、新規遺伝子発現に至るメインストリーム、すなわちEGFと受容体の結合から、低分子量G蛋白質Rasの活性化、MAPキナーゼカスケードの情報伝達をへてERKが核移行するまでを再構成することを目的とし研究を行った。複雑な細胞システムを精製分子から完全再構成することは不可能であるので、生細胞から要素を減らしていくこと(トップダウン法)によって再構成を行うことととし、抗生物質であるstreptolysin Oで細胞膜を透過性にしたヒト上皮由来のA431細胞(セミ・インタクト細胞)を調整した。セミ・インタクト化の最適条件を検討した結果、EGFおよびATPの添加によってセミ・インタクト細胞内に生細胞と同様にEGF受容体のリン酸化反応を起こすことが可能になった。受容体のリン酸化は、蛍光標識した抗活性型EGF受容体抗体確認した。次に、HeLa細胞より細胞質を調整し、大腸菌に別途発現・精製したMEK1(MAPKK),CFP-ERK2(MAPK)、およびATP,GTPを添加して、A431セミ・インタクト細胞内に導入したところ、CFPの蛍光は細胞核外のみに認められた。これは、静止細胞状態でERKがMEKと複合体を形成して細胞質に存在することに対応している。同様に調整したセミ・インタクト細胞にあらかじめEGFを与えた場合、核外の蛍光は減少し、核内に強い蛍光が集積した。これはEGF情報によるMEK1,CFP-ERK2のリン酸化により、CFP-ERK2が核内に移動したものと考えられる。以上のように、情報伝達システムのプロトタイプが完成した。
蓚酸生成の制御因子としてのSPT/AGTの細胞内局在の意義

肝臓のserine : pyruvate/alanine : glyoxylate aminotransferase (SPT/AGT)はヒトや草食動物ではペルオキシゾーム(Ps)に、肉食動物では大部分がミトコンドリア(Mt)に存在する。ラットではこの両オルガネラに存在し、グルカゴンの投与でMtの酵素のみが顕著な誘導を受ける。SPT/AGTはセリン代謝とグリオキシル酸代謝に関与するbifunctional enzymeであり、セリン代謝にはどちらのオルガネラに存在しようと実質的に関与することが本学生化学第一における研究により明らかにされている。従って、本酵素の種特異的、食習性依存性細胞内局在はグリオキシル酸をその生産の場であるオルガネラにおいて適切に代謝するためと考えられる。尿路結石形成の最大の危険要因の一つである蓚酸の直接の前駆体としても知られるグリオキシル酸は、ヒトや草食動物では主として肝臓の(Ps)でグリコール酸から生産される。グリコール酸は光呼吸の中間体であり、動物組織より植物に多く含まれている。一方、グリオキシル酸はL-ヒドロキシプロリン(L-Hyp)からも産生されること、およびその産生細胞内部位は(Mt)であることが知られている。本研究では、ラットにL-Hypやグリコール酸を投与すると尿中への蓚酸排泄が著明に増加すること、グルカゴンによるMtのSPT/AGTの誘導はL-Hypからの蓚酸生成を有意に減少させるが、グリコール酸からの蓚酸生成には影響を与えないことを示した。L-Hypは動物の総蛋白質の30%を占めるコラーゲンに10-13%(w/w)も含まれていることから、肉食動物において、SPT/AGTのMt局在はL-Hyp由来のグリオキシル酸を効率良くグリシンに代謝し、有害な蓚酸の過剰生産を防ぐために有効であると推察された。セリン:ピルビン酸/アラニン:グリオキシル酸トランスアミナーゼ(SPT/AGT)をペルオキシソーム(Ps)とミトコンドリア(Mt)の両方に持つラットでは、通常は60-70%がPsに、30-40%がMtに存在するが、グルカゴンの投与により約10倍に及ぶMtのSPT/AGTの選択的な誘導が起こる。このグルカゴン投与ラットをSPT/AGTの細胞内局在に関して肉食動物と類似の状態を持つモデルとして取り扱って本実験を行う。(1)ヒドロキシプロリン(Hyp)からグリオキシル酸への代謝経路には(1)Hypオキシダーゼ、(2)1-pyrroline-5-carboxylateデヒドロゲナーゼ、(3)ミトコンドリア型Aspトランスアミナーゼ、(4)4-hydroxy-2-ketoglutarate(HKG)アルドラーゼが関与し、このうち(1)と(4)がHyp代謝に特異的である。グルカゴン投与でSPT/AGT活性は誘導されたが、(1)、(4)の活性は誘導されなかった。(2)In vivo代謝実験:グルカゴン投与ラットおよび対照ラット(24時間絶食)にHyp、グリコール酸あるいはこれらのVehicleであるH2Oを胃管チューブを用いて投与し、当大学動物実験センターの代謝ゲージで飼育する。各グループ2-6匹ずつ、計12-36匹のラットを用いて実験を行う。ヒドロキシプロリンとグリコール酸の投与量はラットが肉食のみ、あるいは草食のみで1日に必要なエネルギー量を賄おうとした時に摂取すると予想されるHyp、グリコール酸のそれぞれの量の10倍量、50倍量とした。ヒドロキシプロリン、グリコール酸の投与直後より塩酸蓄尿を開始し、餌の摂取も再開。2日間に亘って24時間蓄尿を行った後、ラットを屠殺し、肝臓を摘出。肝臓のHypオキシダーゼ、4-hydroxy-2-keto-glutarate(HKG)アルドラーゼ、SPT/AGT活性を測定した。また、尿中のクレアチニン、蓚酸、グリコール酸は酵素法により当大学生化学第一教室所有のMicroplate readerを用いて、そして尿中のHyp、プロリン、グリシン、セリン、アラニン、アンモニア、尿素および、グリオキシル酸はHPLC法により当大学機器センターのPICO-TAGを用いて測定した。ヒドロキシプロリン、グリコール酸の投与で尿中の蓚酸排泄は確かに増加した。ヒドロキシプロリンを投与したグルカゴン投与ラットでは対照ラットと比べて尿中蓚酸排泄は有意に減少した。また、グリコール酸を投与したグルカゴン投与ラットでも対照ラットと比べて尿中蓚酸排泄がわずかに減少していた。

グリコール酸は光呼吸の中間体であり、動物組織より植物に多く含まれている。一方、グリオキシル酸はL-ヒドロキシプロリン(L-Hyp)からも産生されること、およびその産生細胞内部位は(Mt)であることが知られている。本研究では、ラットにL-Hypやグリコール酸を投与すると尿中への蓚酸排泄が著明に増加すること、グルカゴンによるMtのSPT/AGTの誘導はL-Hypからの蓚酸生成を有意に減少させるが、グリコール酸からの蓚酸生成には影響を与えないことを示した。L-Hypは動物の総蛋白質の30%を占めるコラーゲンに10-13%(w/w)も含まれていることから、肉食動物において、SPT/AGTのMt局在はL-Hyp由来のグリオキシル酸を効率良くグリシンに代謝し、有害な蓚酸の過剰生産を防ぐために有効であると推察された。
RNA干渉法を用いたヒドロキシエチルスターチが血液細胞に及ぼすシグナル機構の解明

HES溶液は血小板細胞内情報伝達を変化させることにより、血小板の活性化や、血小板の細胞死を促進することが確認された。HES溶液の血小板への影響は物理的刺激亢進病態、炎症病態で増強される為、特に人工心肺下手術周術期の血小板活性化、機能障害を、HES溶液大量投与により助長する可能性があると考えている。目的In Vitro下の実験により、Hes溶液によるヒト血小板細胞活性、細胞死への影響を、コラーゲン刺激、Shear Stress下の状況で比較検討する事.その時の血小板細胞内シグナリングの変化を、p38MAPK, Aktのリン酸化を中心に観察する事。キナーゼ阻害剤を用いて細胞内シグナリングを抑制する事で、Hes溶液がもたらした血小板活性、血小板細胞死への影響を観察する事.結果Hes溶液が血小板細胞内シグナリングを修飾することにより、血小板細胞の活性化、細胞死を促進する現象を示した。今後は、遺伝子ノックダウン血小板細胞を用いた実験により、インヒビター投与と同様の結果がもたらされるのか検討予定である。今回の実験結果がVivoにおいても、同様の現象が起こるのか検討する必要がある。目的HES溶液によるヒト血小板活性と血小板細胞死への影響を、コラーゲン刺激やShear Stress刺激のIn Vitro実験系で評価する。上記研究系における血小板細胞内情報伝達の変化を、p38MAPK,Aktのリン酸化を中心に観察する。これらのリン酸化酵素の阻害剤を用いて血小板の細胞内情報伝達を抑制した際に、血小板活性や血小板細胞死へのHES溶液の影響を観察する。方法生理食塩水、低分子HES(平均分子量7万/置換度0,6)、高分子HES(平均分子量60万/置換度0.75)、5%Alb溶液に、全血を10%, 25%, 50%で置換し、30分間の室温での攪拌放置後、コラーゲン(2ug/ml for 10min)刺激や、Shear Stress (250 dyne/cm2 2分間あるいは10分間)負荷の影響を評価する。フローサイトメトリー法で評価する。結語HES溶液は血小板細胞内情報伝達を変化させることにより、血小板の活性化や、血小板の細胞死を促進することが確認された。当研究グループは、現在さらにin Vivoの研究系においてHES溶液の影響を追試している。
生体賦活化

生体において抗体産出細胞等の特定の細胞が活性化される機構を分子レベルで理解し、それに基づいて薬剤等の生体賦活因子を生体系の特定部位に効率良く送達するシステムの開発を目的として、以下の研究成果が得られた。1.生体賦活因子の生体系への送達に関する成果としては、薬剤の経皮吸収性を飛躍的に増強する素材としてd-リモネンおよびその同族体の開発に成功し、その主な作用部位が皮膚角質層の細胞間隙脂質であることが明らかにされた。また、わずかな温度変化に応答して薬物放出をON-OFF制御できる高分子ゲルの開発にすでに成功しているが、高分子の化学構造および温度の変化幅を変えることによって、ゲル内部の圧力生起過程を制御でき、これによって種々の薬物放出パターンを精密に制御し得ることが示された。2.特定細胞内への生体賦活因子の搬入に関する成果としては、リポソームに細胞融合能を付与する目的で2本鎖を有するポリエチレンオキサイド(PEG)脂質を合成し、卵黄レシチンとの混合リポソームを作成した。この機能化リポソームは植物プロトプラストに対し、融合の機構で取り込まれることが実証された。さらにプラスミド内包PEGリポソームも動物細胞に効率良く導入され、細胞内への遺伝子の組み込みが証明された。またムラミルジペプチドのD-グルコースアナログ(GADP)をCM-カードランやCM-キチンに担持することで、単体では達成できないレベルの高い免疫担当細胞活性化能を発現できることが明らかにされた。以上より、生体賦活因子の生体系への送達を制御し、さらに特定細胞内に選択的に搬入するという、従来に無い画期的な薬物送達システムの可能性が拓かれた。