hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一酸化炭素中毒における中枢神経障害発現機序に関する研究

毒性にはneurotransmitterあるいはneuromodulatorである一酸化窒素(NO)とCOとの相互作用が関与する可能性が示唆されている。そこで、今年度、ラット線条体におけるNO生成に対するCOおよび低酸素性低酸素の作用についてマイクロダイアリシス法を用いて検討したところ、次のような結果を得た。(1)CO曝露(40分間)は、CO濃度の増加に伴ってNO生成の指標である細胞外NO酸化物(NOx)濃度を減少し、この減少は曝露中止後徐々に回復した。(2)CO3000ppm曝露時の細胞外arginine(Arg)及びcitrulline(Cit)濃度はいずれも有意に減少し、曝露中止後一時的に曝露前と同程度まで回復したが、その後再び減少した。(3)CO3000ppm曝露時にL-Argを投与したところNOxの減少は著明に軽減され、CO曝露中止後の回復も加速されたが、D-ArgではCO曝露中止後短時間においてのみ有意な軽減が認められた。(4)CO3000ppm曝露時にL-Citを投与した場合にはこのような軽減はまったく認められなかった。(5)低酸素性低酸素(40分間)ではO_2濃度に依存してNOxが減少し、8%O_2ではCO3000ppmと同程度となった。この減少は、O_2を通常濃度にすることにより徐々に回復した。(6)8%O_2曝露時にL-Argを投与したところ、NOx減少に対する若干の軽減作用は認められたが、CO3000ppmの場合ほど顕著ではなかった。しかし、通常O_2濃度への復帰後、NOxはCO3000ppmの場合と同様に急速に回復した。以上の知見から、CO曝露は、細胞外L-Arg濃度を減少させてNO生成を抑制し、これには低酸素以外の因子の関与が示唆された。
βアミロイド凝集体の固体NMRによる立体構造解析

アルツハイマー病は、42残基のアミロイドβペプチド(Aβ42)が、分子間β-sheet構造を形成して凝集する過程で、神経細胞毒性を示すことにより発症すると考えられている。本研究代表者らは、Aβ42の系統的なプロリン置換によって、Aβ42は22位および23位でターン構造をとり、15-21位および24-32位で分子間β-sheet構造を形成して凝集するという`悪性コンホメーション'のモデルを提唱した。本研究では、凝集能ならびに神経細胞毒性が特に高いE22K-Aβ42(Italian変異体)に注目し、22位および23位の立体構造を固体NMRによって解析した。まず21-24位のアミノ酸残基を、^<13>C、^<15>Nで部位特異的に標識したE22K-Aβ42の凝集体を調製した。固体NMRによる測定は、本研究分担者の竹腰が開発した核間距離測定法(^<13>C-^1H dipolar-assisted rotational resonance法)を用いた。Mixing time 20msの測定により、全炭素原子のシグナルを帰属したところ、Asp-23のシグナルのみ2種類観測され、2つのコンホマーの存在が判明した。さらにmixing time 500msの測定により、マイナーコンホマーの22-Lysのγ-,δ-炭素および23-Aspのγ-炭素間に顕著なシグナルが認められ、22位および23位でターン構造をとっている可能性が強く示唆された。一方、野生型Aβ42についても同様の実験を行った結果、22-Gluおよび23-Aspの側鎖間にシグナルは認められなかった。これより、野生型Aβ42はItalian変異体とは異なり、通常22位および23位ではターン構造をとっていない可能性が示唆され、その結果、野生型の凝集能ならびに神経細胞毒性がItalian変異体と比べて低いものと考えられた。アルツハイマー病は、主として42残基のアミロイドβペプチド(Aβ42)が、分子間β-sheet構造をとることによって凝集し、その過程で神経細胞毒性を示すことにより発症すると考えられている。本研究者らは最近、Aβ42は22位および23位でターン構造をとり、15-21位および24-32位で分子間β-sheet構造を形成して凝集するという新しいモデルを提唱した。本モデルは、遺伝性の家族性アルツハイマー病の変異が22位に集中していることを合理的に説明するものである。本研究では、凝集能ならびに神経細胞毒性が特に高いE22K-Aβ42(Italian変異体)に注目し、22位および23位のターン構造を固体NMRによって検証することを目的とした。E22K-Aβ42の21-24位のアミノ酸残基を、^<13>Cおよび^<15>Nで部位特異的に標識し、リン酸緩衝液中、37°Cで完全に凝集させた。分子内と分子間の距離情報を区別するため、100%標識体の凝集体、および標識体に非標識体を1:2の比率で混合して凝集させたものを別々に調製した。得られた凝集体の固体NMRによる測定は、本研究分担者の竹腰が開発した新しい核間距離測定法(^<13>C-^1H dipolar-assisted rotational resonance法)により行なった。

まずmixing time 20 msの測定により、すべての炭素原子のシグナルを帰属したところ、23-Aspのシグナルのみ2種類観測され、2つのコンホメーションをとっていることが判明した。さらにmixing time 500 msの測定により、23-Aspおよび24-Valのγ-炭素間と22-Lysのγ-,δ-炭素および23-Aspのγ-炭素間にそれぞれ顕著なシグナルが認められ、22位および23位付近でターン構造をとっている可能性が強く示唆された。アルツハイマー病は、42残基のアミロイド体ペプチド(Aβ42)が、分子間β-sheet構造を形成して凝集する過程で、神経細胞毒性を示すことにより発症すると考えられている。本研究代表者らは、Aβ42の系統的なプロリン置換によって、Aβ42は22位および23位でターン構造をとり、15-21位および24-32位で分子間β-sheet構造を形成して凝集するという`悪性コンホメーション'のモデルを提唱した。本研究では、凝集能ならびに神経細胞毒性が特に高いE22K-Aβ42(Italian変異体)に注目し、22位および23位の立体構造を固体NMRによって解析した。まず21-24位のアミノ酸残基を、^<13>C、^<15>Nで部位特異的に標識したE22K-Aβ42の凝集体を調製した。固体NMRによる測定は、本研究分担者の竹腰が開発した核間距離測定法(^<13>C-^1H dipolar-assisted rotational resonance法)を用いた。Mixing time 20 msの測定により、全炭素原子のシグナルを帰属したところ、Asp-23のシグナルのみ2種類観測され、2つのコンホマーの存在が判明した。さらにmixing time 500 msの測定により、マイナーコンホマーの22-Lysのγ-,δ-炭素および23-Aspのγ-炭素間に顕著なシグナルが認められ、22位および23位でターン構造をとっている可能性が強く示唆された。一方、野生型Aβ42についても同様の実験を行った結果、22-Gluおよび23-Aspの側鎖間にシグナルは認められなかった。これより、野生型Aβ42はItalian変異体とは異なり、通常22位および23位ではターン構造をとっていない可能性が示唆され、その結果、野生型の凝集能ならびに神経細胞毒性がItalian変異体と比べて低いものと考えられた。
オートファゴソーム膜閉鎖過程の分子機構の解明

また、オートファゴソーム膜の閉鎖を評価するための生化学的な方法として、昨年度条件検討をしたGFP cleavageアッセイ(GFPで標識したオートファゴソームをproteinase Kで限定分解する方法)を重点的に行った。膜の分裂のための機械因子として知られるESCRTタンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。膜分裂の機械因子ESCRTタンパク質群がオートファゴソーム膜へリクルートされることの直接観察についても、さらに確実なデータを取得した。GFP融合ESCRTタンパク質、オートファゴソームタンパク質、リソソームマーカーの3色タイムラプス生細胞観察を行い、オートファゴソーム形成が完成する直前、オートファゴソーム膜が最後に閉鎖する部位にESCRTタンパク質が短時間リクルートされることがわかった。今年度は所属研究室にて新規走査型電子顕微鏡と試料作製装置の納入とセットアップ行い、オートファゴソーム3次元画像データの取得を開始した。現在のところたくさんのデータ例数取得には至っていないが、3D-Correlative Light and Electron Microscopy (3D-CLEM)の試みも開始した。この方法で、形成初期や後期のオートファゴソームを異なる蛍光色素で標識し分け、それらついて電子顕微鏡レベルの解像度で3次元構造を解析することができる。オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する生化学的な方法として、GFP標識した粗精製オートファゴソーム小胞をproteinaseKで限定分解するアッセイを行った。未閉鎖のオートファゴソーム膜のGFPは切断され、完全に閉鎖されたオートファゴソーム膜のGFPは残留することから、オートファゴソーム膜の開閉状態を評価することが可能である。この実験から、ESCRTタンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。GFP融合ESCRTタンパク質CHMP4b-Venusと、オートファゴソームタンパク質SECFP-LC3、リソソームマーカーLysoTracker Redの3色タイムラプス生細胞観察を重ねて行った。昨年度は検出頻度が低かったが、オートファゴソーム形成が完成する直前、膜が最後に閉鎖する部位においてESCRTタンパク質が短時間リクルートする場面の検出を重ねた。これらのタンパク質がオートファゴソーム膜閉鎖に関与する可能性が高い。生化学的アッセイについては、proteinase Kを用いたGFP-cleavageアッセイだけでは不十分な可能性があるため、この方法の最適化を再検討することと平行して、別のアッセイ方法を試みる。昨年度試験できなかった酸性バッファーで未閉鎖オートファゴソームの内部のGFPを消光させる方法について検討する。酸性バッファーの方法はGFPが酸性下で消光する性質を利用している。完全に閉じていないオートファゴソームの穴が数ナノメートルといった小さい場合でもバッファーが通過できるため、開閉の差の検出感度が上がる可能性がある。しかし、pHの大きな変化によってオートファゴソームの保持に大きな影響を与えてしまう可能性も心配している。ESCRTタンパク質のオートファゴソームへのリクルートの直接観察は、ESCRTタンパク質の関与を示す強力なデータとなりうるが、現在はまだ検出例が少ないことが問題となっている。より効率よく検出例を増やせるよう、後期エンドソームなどオートファゴソーム以外に局在するESCRTタンパク質と区別する方法や、優勢阻害細胞などの利用を含み詳細に検討を引き続き進める。生化学的な方法としては、GFPでオートファゴソームを標識した細胞破砕液から得た膜画分にproteinaseKの酵素反応をさせ、残ったGFP陽性小胞の数を蛍光顕微鏡で計測する方法が有効であることがわかった。この方法を用い、細胞質側に湾曲した膜の分裂のための機械因子として知られるESCRTタンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆する予備データを得た。また、平成30年度の研究として計画していたESCRTタンパク質のオートファゴソーム膜へのリクルートの直接観察についても試みた。GFP融合ESCRTタンパク質CHMP4b-Venusと、オートファゴソームタンパク質SECFP-LC3、LysoTracker Redの3色タイムラプス生細胞観察を行った。その結果、オートファゴソーム形成が完成する直前に、膜が最後に閉鎖する部位においてESCRTタンパク質が短時間リクルートされることを少数例検出するに至っている。数秒数十秒といった短時間の現象を局所的に捉えようとしており、データ収集が非常に非効率な状況である。現在、RNA干渉や優勢阻害などの方法を用い、ESCRTタンパク質がオートファゴソーム膜上に長時間停留する条件を探している。オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する方法についての研究は順調に実施することができた。しかし電子顕微鏡法の検討は業者のデモ機を用いたため、多数のデータを取得することがかなわなかった。平成30年度には所属研究室に新規走査型電子顕微鏡と試料作成装置が設置されるので、安定してオートファゴソーム3次元画像データを取得できる予定である。オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する生化学的な方法としては、GFP標識した粗精製オートファゴソーム小胞をproteinaseKで消化するアッセイが有効であることがわかった。膜が閉鎖していればオートファゴソーム小胞内部のGFPが残存するが、閉鎖していないオートファゴソームのGFPは消化されてシグナルを失う。この方法は酵素の反応条件や基質となる細胞破砕液膜画分の量や調整方法に敏感に依存し、安定な結果が出にくいアッセイ系であり、さらなる安定な条件決定が必要である。

また、たとえばオートファゴソーム完全に閉じておらず20 nm程度の小さい穴が開いている場合は、proteinase Kが十分進入できない可能性がある。オートファゴソーム膜閉鎖の評価に時間を費やしたため、平成29年度に計画されていたオートファゴソーム膜の内膜と外膜を区別する方法の確立については実施することができなかった。一方で、オートファゴソーム内膜と外膜の分離の制御因子の探索については、平成30年に予定されていたESCRTタンパク質のノックアウト細胞やRNA干渉による実験を実施することができた。さらに3色タイムラプス生細胞観察を試み、オートファゴソーム形成が完成する直前に、膜が最後に閉鎖する部位においてESCRTタンパク質が短時間リクルートされることを少数例検出するに至っている。これらのタンパク質がオートファゴソーム膜閉鎖に関与する可能性が高いことがわかりつつある。また、オートファゴソーム膜の閉鎖を評価するための生化学的な方法として、昨年度条件検討をしたGFP cleavageアッセイ(GFPで標識したオートファゴソームをproteinaseKで限定分解する方法)を重点的に行った。膜の分裂のための機械因子として知られるESCRTタンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。膜分裂の機械因子ESCRTタンパク質群がオートファゴソーム膜へリクルートされることの直接観察についても、さらに確実なデータを取得した。GFP融合ESCRTタンパク質、オートファゴソームタンパク質、リソソームマーカーの3色タイムラプス生細胞観察を行い、オートファゴソーム形成が完成する直前、オートファゴソーム膜が最後に閉鎖する部位にESCRTタンパク質が短時間リクルートされることがわかった。今年度は所属研究室にて新規走査型電子顕微鏡と試料作製装置の納入とセットアップ行い、オートファゴソーム3次元画像データの取得を開始した。現在のところたくさんのデータ例数取得には至っていないが、3D-Correlative Light and Electron Microscopy (3D-CLEM)の試みも開始した。この方法で、形成初期や後期のオートファゴソームを異なる蛍光色素で標識し分け、それらついて電子顕微鏡レベルの解像度で3次元構造を解析することができる。オートファゴソーム膜の閉鎖を評価する生化学的な方法として、GFP標識した粗精製オートファゴソーム小胞をproteinaseKで限定分解するアッセイを行った。未閉鎖のオートファゴソーム膜のGFPは切断され、完全に閉鎖されたオートファゴソーム膜のGFPは残留することから、オートファゴソーム膜の開閉状態を評価することが可能である。この実験から、ESCRTタンパク質複合体のノックアウト細胞やRNA干渉細胞では、オートファゴソームの閉鎖に障害があることを示唆された。
可変幾何構造トラスの分散的姿勢制御に関する研究

三角形のフレ-ムを要素とする可変幾何構造トラスは、構造が単純で取り得る姿勢に自由度があることから、新しいタイプのマニピュレ-タとして期待されているが、その姿勢制御は逆に自由度の多さ故、困難な問題とされていた。そこで、本研究代表者は先に、伸縮性のある構造を積極的に位置付けた姿勢制御方式を提案し、神経ネットワ-ク理論に基づいてこの問題を並列分散処理する可能性を見い出した。この枠組みは基本的に緩和(エネルギ-最小化)に基づいているため、制御対象となる可変幾何構造トラスは、障害物の形状や位置によってデッドロック状態に陥ることがある。従って、任意の環境に対して自律的に対処し得るような学習能力を考慮する必要があった。一般に、生物の神経ネットワ-クの情報処理は、「アクティブティダイナミクスによる緩和」と「学習ダイナミクスによる結合強度の変化」が重要な役割を演じているものと考えられている。本研究代表者は、緩和と学習というこれら2つのパラダイムの両方に妥当性があるならば、それらの基本原理が矛盾なく統合した更に高次のメカニズムが存在する可能性があると考え、この観点に立った自己組織化機能の数理モデルを2種類提案した。これらのモデルは幾つかの興味深い特性を示すが、同時にそのダイナミクスは非常に複雑であるため、先ず、ユニット数を少なくしたモデルの基本的な動特性を調べることが重要となる。リカレント型の緩和ネットを学習可能な多層ネットでクロス結合した1つのモデルでは、各緩和モジュ-ルの持つエネルギ-平面が、クロス結合に伴う相互作用によって動的に変化し、全体の動作に有効に作用していることが明らかとなった。この特性は、可変幾何構造トラスに対して「幾つかの姿勢を予め記憶しこれを滑らかに順に想起して行く」動作を可能とするために必要であると考えている。
ラマン・スペクトル微細構造による量子固体フォノンの研究

量子固体である固体ヘリウム4と固体ヘリウム3は,量子交換相互作用と零点振動による特徴ある性質が期待でき,大きなフォノン間相互作用と,格子点近傍の単一粒子的運動が予想される。固体ヘリウムのフォノンの研究は,20年前頃盛んに行なわれた。米国のベルツハーマー等が,フォノンの分散関係と,1次および2次ラマン散乱スペクトルの理論計算を行った。分散関係については、当時行なれた中性子散乱の実験結果とよく一致した。1次ラマン散乱は当時の実験で確認されたが,2次ラマン散乱のスペクトルの微細構造は観測されなかった。この研究では,我々は実験条件を従来より大幅に改善して固体ヘリウム4のラマン散乱の観測を行った。すなわち,ヘリウム3クライオスタットを用いて温度を0.7Kに冷却し,分光器の分解能を1.1カイザーまで上げ,多チャンネル光子計数検出器で全スペクトルの同時計測を実現した。その結果,7.39±0.06カイザーに1次ラマン散乱ピークを観測するとともに,10から45カイザーに2次ラマン散乱を観測し,そのスペクトル中に4つのピークを明瞭に分離観測することに成功した。それらのピークは,それぞれ,17.1,20.9,25.2,30カイザーで観測された。理論によれば,2次ラマン散乱のスペクトル構造は偏光条件で敏感に変わる。そこで,入射光と散乱光の偏光条件を種々変えて測定したところ,理論と定性的によく一致する結果が観測された。これらの研究成果により,2次ラマン散乱が量子固体の有力な研究手段であることを実証し,量子固体研究の新しい展開を可能にした。この研究成果は、日本物理学会で口頭発表し,米国フィジカル・レビューB誌に発表し,第19回低温国際会議でも発表の予定である。
針葉樹心材形成の培養細胞によるシミュレーション

ヒノキ(Chamaecyparis obutusa)、スギ(Cryptomeria japonica)およびラクウショウ(Taxiodium distichum)の形成層から誘導・培養したカルス細胞中に心材成分の一種であるヒノキレジノールが含まれ、スギカルス中には微量のアガタレジノールも存在することを示した。培養細胞中でのノルリグナン生合成経路を知るために、[U-^<14>C]-フェニルアラニン、[U-^<14>C]-ケイヒ酸、[2-^<14>C]-p-クマ-ル酸を投与した結果、ヒノキレジノールヘの放射活性の取り込みが確認され、これらが前駆物質であることが示された。さらに、ヒノキ科のCupressus lusitanicaの培養細胞による心材成分ヒノキチオールの生産性に影書する要因を明らかにしようとした。この樹種の懸濁培養は、Fe^<2+>のみを1/10濃度にしたGamborgB5培地(スタロース20g/L、BAPl0 ^<-5>mM、NAA l0^<-2>mM)良好な成長(3週間67倍)を示した。一方、B5培地を1/10に希釈してFe^<2+>のみを2.5倍濃度にし、エリシターを添加した培地では、37日間で細胞1g(乾重)あたり1525mgのヒノキチオールが生産された。この生産条件下でC.lusitanica細胞は短期間に^<14>C-メバロン酸から^<14>C-ヒノキチオールを生産した。したがってメバロン酸経路の寄与が確認された。しかし、^<14>Cの取込率が小さいことや、^<13>C-グルコース投与実験における各炭素の標識パターンの結果との関係などから、非メバロン酸経路の可能性も残されている。心材成分合成を行いつつある細胞から酵素を単離しようと試みたが成功しなかった。さらにトレーサーを用いるセルフリーのアツセイ系を改良する必要がある。針葉樹として、ヒノキ(Chamaecyparis obutusa)、スギ(Cryptomeria japonica)およびラクウショウ(Taxiodium distichum)の枝の形成層からカルス細胞を誘導・培養して、各カルス中に心材成分の一種であるヒノキレジノールが含まれ、スギカルス中には微量のアガタレジノールも存在することを示した。ヒノキレジノール生産を制御(刺激)する因子を明らかにするために、スギおよびラクウショウのカルスにおいて、培地の糖組成ならびに窒素源、リン源およびホルモンの種類と濃度について検討したところ、これらの因子はヒノキレジノール生産量に若干の影響を及ぼしたが、材中のノルリグナンに相当する生産量は得られなかった。さらにラクウショウカルスについては、光、KHCO_3添加、ラジカルスカベンジャー添加の効果を調べ、スギカルスにおいてはエリシターおよび過酸化水素の添加を試みたが、ヒノキレジノール生産量は若干の変動するに留まった。これらの培養細胞では、継代が進むにしたがってヒノキレジノールの含量が減少する傾向が見られた。培養細胞中でのノルリグナン生合成経路を知るために、[U-^<14>C]-フェニルアラニン、[U-^<14>C]-ケイヒ酸、[2-^<14>C]-p-クマ-ル酸を投与した結果、ヒノキレジノールへの放射活性の取り込みが確認され、これらが前駆物質であることが示された。

既にエリシターの刺激によるヒノキチオール生産が知られているCupressus lusitanicaの培養細胞を用いた[I-^3H]-ゲラニオール投与実験により、ゲラニオールがヒノキチオールの前駆物質であることを示した。また、[U-^<13>C]-グルコースを投与して得たヒノキチオールの各炭素の標識パターンからその生合成経路に関する知見を得た。(i)培養細胞による心材成分の産生とそれに及ぼす培養条件の影響:針葉樹として本年度は、ヒノキ科のCupressus lusitanicaの培養細胞による心材成分ヒノキチオールの生産性に影響する要因を明らかにしようとした。カルスを懸濁培養に移し、細胞成長とヒノキチオール生産の良好な培養条件を求めた。スクロース20g/L、BAP 10^<-5>mM,NAA10^<-2>mMを含むGamborg B5培地(但しFe^<2+>は1/10濃度)中で3週間培養すると細胞は67倍成長した。一方、B5培地を1/10に希釈してFe^<2+>のみを2.5倍濃度にし、エリシターを添加した培地では、37日間で細胞1g(乾重)あたり1525mgのヒノキチオールが生産された。(ii)心材成分生合成酵素の単離と特性解明:上の結果から、形成層代謝に相当する細胞増殖に必要な条件と心材成分生合成に関連する二次代謝の要因とはかなり明確に異なることが明らかになった。そこで、心材成分合成を行いつつある細胞から酵素を単離しようと試みたが成功しなかった。さらにトレーサーを用いるアッセイ系を改良する必要がある。(iii)心材成分前駆体の合成と投与:樹木細胞内での心材成分合成の経路を知ることは、学術的に重要であり、生合成遺伝子の導入により、成長が早くて腐りにくい樹種の創製にも発展する可能性がある。そこで、ヒノキチオール生合成の経路の研究を行った。生産条件下でC.lusitanica細胞は47日という短期間で^<14>C-メバロン酸から^<14>C-ヒノキチオールを生産した。したがってメバロン酸経路の寄与が確認された。しかし、^<14>Cの取込率が小さいことや、^<13>C-グルコース投与実験における各炭素の標識パターンの結果との関係などから、非メバロン酸経路の可能性も残されている。
ハイブリッドクラウドにおける動的セキュリティ検知・調停制御技術の研究開発及び構築

ハイブリッドクラウドにおける動的セキュリティ検知・調停制御技術に対し、計画に基づき推進し、当初目標を達成した。動的セキュリティ検知では、場のリスクを計算するセキュリティ場の基本理論構築ならびにプロトタイプを開発した。異種ネットワーク間のセキュリティポリシーでは、ポリシーを陽に表現するサービスモデルを新たに提案しLoAエレベーションを加えた基盤のプロトタイプを構築した。最適データ配置では、秘密分散を用いた分散データ管理を提案し、パブリッククラウドのみの最適組み合わせによりプライベートクラウドより廉価な構成となることを示した。これらは、論文発表するとともに成果論文集を発行し関係機関に広く周知した。ハイブリッドクラウドにおける動的セキュリティ検知・調停制御技術の研究開発及び構築を実施するにあたり、計画に基づき以下のような成果を達成した。動的セキュリティ検知・制御技術については、RFIDを用いた入退室管理実験を行った。この結果、入退室管理の物理セキュリティから得られる情報を基に新たな情報セキュリティ制御方式としてペリメータライン(防御ライン)の概念を導出した。また、PCへの来訪者の接近度合いによりセキュリティレベルを動的に検知制御する概念を提案した。ハイブリッドクラウドにおけるセキュリティポリシ調整技術については、判断基準および基本的な方式の検討を行った。具体的には、ポリシ調整の自動化を図るために、新たにポリシのXML化を行い、動作検証によりその有効性を明らかにした。データ配置の動的最適化技術については、配置方法、秘密分散技術を用いた複数クラウド利用方法について基本的な方式を理論的に研究した。即ち、クラウドスケジュールサービスを対象に、日付情報を送信する際に日付のかく乱を行うアルゴリズムを新たに提案し、複数クラウド上で安全にスケジュールを共有できる方式を考案した。さらに、複数クラウドの情報を集積し総合的に信頼度を計算する理論を検討した。また、関連する技術調査として、CSA(Cloud Security AIliance)に参加し、欧米におけるクラウドセキュリティの動向ならびに、国内のデータセンタの現地調査を行い、今後の研究開発に関する知見を得た。今年度は、ハイブリッドクラウドにおける動的セキュリティ検知・調停制御技術の研究開発及び構築を実施するにあたり、計画に基づき以下のような成果を達成した。動的なセキュリティ検知については、昨年度は不審者一人の位置のみを考慮した方式を提案したが、今年度は、より現実的な観点から、複数人のフォーメーションを考慮した方式に拡張し提案した。具体的には、従来の不審者の位置情報に加え、居室における不審者の割合を考慮したマルチペリメータラインを新たに提案した。異種ネットワーク間におけるセキュリティポリシについては、昨年度は主に個別の方式の提案と基本検討を実施したが、その成果に基づき、SAMLとOAuthを用い認証を行いながらCP/CPSやSLAを考慮したポリシ調停を提案し、これによりダイナミックに最適クラウドを選択する基盤部分のプロトタイプの実装を行った。最適データ配置については、マルチクラウドを前提とした秘密分散方式を利用し、前述のポリシ調停を最適に行う具体的な方式と鍵管理方式を同一条件のホモクラウド環境において明らかにした。また、今後の拡張性の観点ならびに新たな発想を得るため、ユーザインタフェースに関する知見が豊富な長崎大学の小林教授とディスカッションし、スマートデバイスにおけるリッチコンテキストとクラウドサービスのコンテキストとの連携の可能性を見いだすことが出来た。今後の研究に生かして行きたい。また、CES(Consumer Electronics Show)などを視察し、ウェアラブルコンピュータや3Dプリンタなどが注目されておりセンシングや可視化に生かすなど今後の検討課題を得た。また、米国では、名寄せ問題が顕在化し、Identity Theft Protectionというジャンルの会社が沢山登場している。クラウドセキュリティにおいても新たな対策の必要性があることが認識できた。今年度は、本事業の最終年度であり、計画に基づき当初の目標を達成し、以下に成果の概要を示す。動的なセキュリティ検知については、複数人の配置を考慮したモデルについて、場のリスクを計算する新しい考え方であるセキュリティ場の基本理論を構築した。また、動的なセキュリティ検知のプロトタイプ版として、RFID(FeliCa)を利用したセキュリティ場への入退室管理とその状況をハイブリッドクラウド調停基盤に通知する機能を開発し、その有効性を実証した。異種ネットワーク間におけるセキュリティポリシーについては、計画に従い昨年度の基盤に、LOAエレベーション機能を加えサービスやユーザの条件により認証レベルを動的に可変とする基盤のプロトタイプを構築した。さらに、ポリシーの表現とその強制を表現できるサービスモデルを提案し、プロトタイプを作成してその有効性を検証した。このモデルは、サービス側がサービスポリシーを機械可読の形で公表しておきそのポリシーを利用者のポリシーにしたがって評価する。一致すればサービス提供を受けるものであり、評価エンジンとともに提供した。結果としてP3Pによく似た、しかしポリシー一般に拡張したサービスモデルを作ることに成功した。また、サービスポリシーの標準化も提案している。また、内部統制をクラウドに及ぼすための解析も行った。最適データ配置については、秘密分散を用いたデータ管理方式の評価をさらにすすめ、ヘテロマルチクラウド環境においてパブリッククラウドのみの最適組み合わせによりプライベートクラウドよりもより廉価に高い機密性や可用性をもつ構成を可能とすることを示した。

また、データと鍵管理方式については、パブリッククラウドとしてDrpoboxを利用したプロトタイプを実装し性能評価を行い実用性があることを示した。さらに、本成果を広く普及させるために、成果論文集を発行し関係各所に配布した。26年度が最終年度であるため、記入しない。情報ネットワークセキュリティ26年度が最終年度であるため、記入しない。3つのサブテーマについて基本検討が進んでいるが、システム全体を実現する方式については、検討途中である。今年度は、ハイブリッドクラウドにおける動的セキュリティ検知・調停制御技術の研究開発及び構築を実施するにあたり、計画に基づき以下のような成果を達成した。動的なセキュリティ検知については、昨年度は不審者一人の位置のみを考慮した方式を提案し本年度は複数人のフォーメーションを考慮した方式に拡張し提案した。具体的には、従来の不審者の位置情報に加え、状況(居室における不審者の割合)を考慮したマルチペリメータラインを新たに提案した。異種ネットワーク間におけるセキュリティポリシについては、昨年度は主に個別の方式の提案と基本検討を実施したがその成果に基づき、SAMLとOAuthを用い認証を行いながらCP/CPSやSLAを考慮しダイナミックに最適クラウドを選択する基盤部分のプロトタイプの実装を行った。最適データ配置については、マルチクラウドを前提とした秘密分散方式を利用し前述のポリシ調停を最適に行う具体的な方式と鍵管理方式を、同一条件のマルチクラウド(ホモクラウド)環境において明らかにした。これは,当初計画通りおおむね順調に推移していると言える。個別に検討が進んでいるため、今年度は、個別の研究成果の全体システムへの統合を推進する。来年度は、計画に基づき全体としては、基盤部分のプロトタイプの動作を検証するとともに、個別の方式を統合して動作することを確認する。動的なセキュリティ検知については、オフィスでの人やPCの配置の考慮、マルチペリメータラインの高度化によりより、精度の高いリスク検知をおこなう方式を提案する予定である。
種子形態形成におけるイネSUMO遺伝子の機能の解明

イネの種子の形態形成はざまざまな遺伝子機能が複雑に相互作用することで達成される。SUMOは翻訳後修飾に関わることで遺伝子機能を調節する重要な因子の1つであろうと推察されている。種子の形態形成においても重要な役割を果たしていると考えられる。そこでこの研究では、種子の形態形成に対するイネのSUMOの役割を明らかにすることを試みた。SUMOはすべての真核生物に存在する保存性の高い低分子量タンパク質である。イネにはすでに3種類のSUMO遺伝子の存在が確認されていたが、新たに3つのSUMOを見つけた。これによりイネゲノムには6つのSUMOが存在することが明らかとなった。このうちの2つのSUMOはモノSUMO化に、残りの4つはポリSUMO化に関与することが示唆された。これらの6つのSUMO遺伝子はすべてが発現していた。このうち、SUMO1遺伝子はイネの穂で強く発現していた。これらの遺伝子発現を抑制した形質転換体を作成を試みたがSUMO1を除くSUMOの発現抑制体を得ることができなかった。SUMO1の発現抑制体も1個体しか得られず、これも矮性となり種子の形態形成に異常が認められた。これらの結果からSUMOは植物の生存において非常に重要な役割を果たすものであることが強く示唆された。SUMO化修飾に関わるE1、E2、E3を単離し、これらによりSUMO化されるタンパク質の検索を試みた。その結果、複数の遺伝子産物がSUMO化修飾を受けることが示唆された。SUMOはタンパク質の翻訳後修飾に関わっており、SUMO化されることにより、標的となるタンパク質の機能に変化が生じることが報告されている。しかし植物のSUMOに関する知見は非常に少なく、SUMO化の機構およびその機能はほとんど未知である。イネゲノムには3つのSUMO遺伝子が存在することが示唆され、それぞれをSUMO1、SUMO2、SUMO3と名付けた。これらの遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を構築し、イネに導入した。その結果、アンチセンスSUMO1遺伝子を導入したイネでは、わい性の表現型を示し、老化の促進と出穂時期の異常が認められた。野生型イネにおけるSUMO遺伝子の発現パターンを調べるため、RT-PCR及びRealtime PCRを用いた発現解析を行った。その結果、SUMO1・SUMO2はどの部位においても発現が認められた。いずれの部位においてもSUMO1の発現量がSUMO2の発現量よりも大きかった。器官による発現量の違いを調べたところ、穂ばらみ期の未熟な穂でSUMO1・SUMO2ともに強く発現していることが分かった。SUMO1、SUMO2、SUMO3のそれぞれのプロモーター領域を単離し、それぞれの下流にGUS遺伝子を結合したバイナリベクターを構築してイネを形質転換した。得られた形質転換体を用いて様々な組織におけるGUS遺伝子の発現を解析した。その結果、SUMO1遺伝子は、カルス・葉・穂ばらみ(小穂・枝梗)での発現が確認され、特に穂ばらみでの強いGUS活性が検出された。これらのことより、イネでは3つの遺伝子のうちSUMO1遺伝子が主に働いていることが示唆された。また、未熟な穂で強く発現することからこれが穂の形態形成に関与していることが示唆された。
畜産廃棄物処理メタン発酵槽内の指標微生物の動向と消化液の土壌還元に伴うリスク評価

畜産廃棄物を処理するフルスケールメタン発酵プラントにおける指標微生物の挙動を調査した。プラントは、受入槽、中温メタン発酵槽(37°C、滞留時間30日)、殺菌槽(70°C、滞留時間1時間)などからなる。廃棄物の計画受入量は、牛ふん尿45.4t/日、生活系・水産系・農業系残滓4.6t/日の計50t/日とし、COD容積負荷は6kg-COD/m^3・日である。指標微生物の調査項目は、大腸菌群、大腸菌ファージ、アメリカのEPAにおいて下水汚泥を土壌還元する際に基準が設けられているふん便性大腸菌群、およびデンマークにおいて畜産廃棄物のバイオガスプラントの衛生学的指標として推奨されているふん便性連鎖球菌とした。一例として受入槽、中温メタン発酵槽、殺菌槽の各段階における、ふん便性大腸菌群の変化について述べる。ふん便性大腸菌群は136日目を除き、結果的に殺菌槽において全ての場合検出限界以下まで除去された。アメリカのEPAでは下水汚泥を農地に還元する際の微生物基準をFCで2×10^6個/gTS以下としている。よって本プラントでは殺菌槽を経ることによりEPAの基準を十分に満たしていることが判明した。また、各指標微生物の投入牛ふん尿に対するメタン発酵槽出口および殺菌槽出口における死滅率の結果から、メタン発酵槽出口、殺菌槽出口共に、ふん便性大腸菌群とふん便性連鎖球菌が最も良く除去され、次いで大腸菌群、大腸菌ファージの順で除去されていることが解った。熱による殺菌試験より、大腸菌ファージが最も不活化しにくく、次いでふん便性連鎖球菌、ふん便性大腸菌群の順で不活化する傾向にあることが解った。しかしながら、殺菌試験結果をチックの法則にあてはめたところ、最も温度変化の影響を受けるのが大腸菌ファージであり、ふん便性大腸菌群とふん便性連鎖球菌はほぼ同程度であった。各指標微生物の温度と死滅時間の関係が得られたことから、今後バイオガスプラントの殺菌槽の設計指針として活用できる可能性を得た。本研究では、畜産廃棄物を処理するフルスケールメタン発酵プラントにおける指標微生物の挙動を調査した。プラントは、受入槽、中温メタン発酵槽(37°C、滞留時間30日)、殺菌槽(70°C、滞留時間1時間)、消化液貯留槽(2500m^3x3基)などからなる。プラントの計画受入量は、牛ふん尿45.4t/日、生活系・水産系・農業系残滓4.6t/日の計50t/日とし、COD容積負荷は6kg-COD/m^3・日である。プラントのスタートアップは、植種汚泥として、2%消石灰添加ラグーン汚泥を用い、1337°Cまで温度を上昇させた後牛ふん尿の投入を開始した。各段階における指標微生物の調査項目は、大腸菌群、大腸菌ファージ、アメリカのEPAにおいて下水汚泥を土壌還元する際に基準が設けられているふん便性大腸菌群、およびデンマークにおいて畜産廃棄物のバイオガスプラントの衛生学的指標として推奨されているふん便性連鎖球菌とした。本実験では、プラントのメタン醗酵槽内の温度が37°Cに安定した日を運転0日目とした。

116日目以前は、受け入れ牛ふん尿の不足により、主に近隣の牧場から得たラグーン汚泥をメタン醗酵槽に投入した。また、投入量が計画投入量よりも少なかったため、実際のCOD容積負荷は1kg-COD/(m^3・日)程度と計画COD容積負荷の約1/6という運転状況にあった。一例として受入槽、中温メタン発酵槽、殺菌槽の各段階における、ふん便性大腸菌群の変化について述べる。ふん便性大腸菌群は136日目を除き、結果的に殺菌槽において全ての場合検出限界以下まで除去された。アメリカのEPAでは下水汚泥を農地に還元する際の微生物基準をFCで2x10^6個/gTS以下としている。よって本プラントでは殺菌槽を経ることによりEPAの基準を十分に満たしていることが判明した。各指標微生物の投入牛ふん尿に対するメタン発酵槽出口および殺菌槽出口における死滅率の結果から、メタン発酵槽出口、殺菌槽出口共に、ふん便性大腸菌群とふん便性連鎖球菌が最も良く除去され、次いで大腸菌群、大腸菌ファージの順で除去されていることが解った。畜産廃棄物を処理するフルスケールメタン発酵プラントにおける指標微生物の挙動を調査した。プラントは、受入槽、中温メタン発酵槽(37°C、滞留時間30日)、殺菌槽(70°C、滞留時間1時間)などからなる。廃棄物の計画受入量は、牛ふん尿45.4t/日、生活系・水産系・農業系残滓4.6t/日の計50t/日とし、COD容積負荷は6kg-COD/m^3・日である。指標微生物の調査項目は、大腸菌群、大腸菌ファージ、アメリカのEPAにおいて下水汚泥を土壌還元する際に基準が設けられているふん便性大腸菌群、およびデンマークにおいて畜産廃棄物のバイオガスプラントの衛生学的指標として推奨されているふん便性連鎖球菌とした。一例として受入糟、中温メタン発酵槽、殺菌糟の各段階における、ふん便性大腸菌群の変化について述べる。アメリカのEPAでは下水汚泥を農地に還元する際の微生物基準をFCで2×10^6個/gTS以下としている。よって本プラントでは殺菌糟を経ることによりEPAの基準を十分に満たしていることが判明した。また、各指標微生物の投入牛ふん尿に対するメタン発酵槽出口および殺菌槽出口における死滅率の結果から、メタン発酵槽出口、殺菌槽出口共に、ふん便性大腸菌群とふん便性連鎖球菌が最も良く除去され、次いで大腸菌群、大腸菌ファージの順で除去されていることが解った。熱による殺菌試験より、大腸菌ファージが最も不活化しにくく、次いでふん便性連鎖球菌、ふん便性大腸菌群の順で不活化する傾向にあることが解った。しかしながら、殺菌試験結果をチックの法則にあてはめたところ、最も温度変化の影響を受けるのが大腸菌ファージであり、ふん便性大腸菌群とふん便性連鎖球菌はほぼ同程度であった。各指標微生物の温度と死滅時間の関係が得られたことから、今後バイオガスプラントの殺菌槽の設計指針として活用できる可能性を得た。
放射線抵抗細菌Deinococcus radioduransのDNA2本鎖切断修復

真性綿菌D.radioduransは放射線超耐性の生物である。本研究は、放射線超耐性の仕組みを明らかにすることである。1)分離してある放射線感受性変異の原因遺伝子をクローニングするために、λファージのコスミドライブラリーを用いて形質転換し、放射線抵抗性を示すλファージを検索し、recA、recN、lexAなどのhomologをクローニングした。このアプローチではうまくクローニングできないものに関しては、大腸菌とD.radioduransとのシャトルベクターを用いてクローニングを継続中である。2)1999年に発表された全ゲノム配列に含まれる機能未知のORFは約1000個である。この中に放射線超耐性を決定する遺伝子があると考え、網羅的なゲノム破壊を計画した。そのために先ず、PCRによって増幅した全長遺伝子の中程にクロラムフェニコール遺伝子を挿入し、double crossing overによって染色体遺伝子破壊を試みた。この方法によってrecA遺伝子やlexA遺伝子を破壊することができたので、未知の遺伝子に対しても同様に破壊を行っている。また、未知のORFの中程をPCR増幅しクローニングした断片を、プラスミドに乗せたままでsingle crossing overによって染色体に挿入することでも変異体が得られることがわかった。今後はこれらの方法を用いて1000個のORFを網羅的に破壊し、放射線耐性に関わる遺伝子を突き止めてゆきたい。3)DNA損傷をシグナルとして発現する遺伝子を検索するために、シャトルベクターにプロモーターの無い大腸菌lacZ遺伝子をクローニングした。この5'上流に、D.radioduransの染色体断片をクローニングし、X-galで青いコロニーを作るものを集めて解析することのできるpromoter trapを作成した。これを用いて今後は放射線誘導遺伝子の解析を行う予定である。
非造影超音波エコーを用いた頸動脈プラーク客観的評価指標確立と性状診断法の開発

これまで我々は、造影剤を用いた術前頚動脈超音波エコー(CEUS)の定量化に成功し、脳梗塞予防のため行われる血行再建術後周術期合併症の予知を可能とした。一方で、アレルギーなどで造影剤投与が困難な患者も存在することから低侵襲な検査であるSMIの定量化が急務となっている。本研究は、研究期間を2年(平成30年度令和元年度)とし、超音波エコー装置による非造影微小血管イメージングSuperb Microvascular Imaging(SMI)定量法を確立することで、SMIに基づく完全無侵襲頚動脈プラーク脆弱性診断法の確立を目指している。現在までの進行状況としては、頚動脈内膜剥離術の術前検査としてCEUSおよびSMI、脳循環検査(gas PET,SPECT)を行い、現在までで40症例のデータを収集できている。今年度末には予定の60症例に達する予定である。対外的な活動としては、2018年4月にドイツにて開催されたComputerAssisted Radiology and Surgeryにて、これまで我々が行ってきたCEUSによる血行再建術後周術期合併症の予知に関しての研究成果の報告を行った。現在、当院にて頚動脈内膜剥離術を行う患者を対象に解析データの収集を行っている。術前精査ではSMIに加え、従来通りの造影超音波検査、gas PETおよびSPECT撮像を行っている。現在までで40症例のデータを収集できおり、今後の予定手術を含めると今年度中には60症例に到達する予定である。現段階での予定手術を含めると本年度中に60症例に達する予定である。ソフトウェアの開発に関しては研究データの収集を進めつつ継続して行っており、より汎用性のある解析ソフトウェアへのカスタマイズを本学研究協力者と進めている。今後、同症例については元データの取り出しを開始しSMI定量値の検討を行う予定としている。また、頚動脈内膜剥離術中に摘出したプラークの病理標本に関しても血腫、脂質・壊死、線維化の各領域をCEUSおよびSMIにて比較し、これらを区別するカットオフ値を決定する予定である。本年度末には、SMI定量値を用いた頸動脈プラーク不安定性推定法と内膜剥離術中脳塞栓発症予知法を確立し全60症例のデータについて統計解析後、論文投稿を行う。当初の予定していた検査数は概ねクリアできているが、頚動脈の石灰化が強く超音波検査を実施できない症例も多くあったため予定より試薬に用いる予算を消化できなかったためと考えている。今後、症例の蓄積に伴い試薬購入数の増加が見込まれることや、解析に使用する必要物品に関して次年度に計上するものが多くあるため予定金額は全て使用できる見通しである。
非B非C型劇症肝炎小児におけるTTウイルスの意義

1.正常小児におけるTTウイルス(TTV)の感染率を検討した。N22のプライマーによる検討では、0-15歳までの正常小児114例のTTV陽性率は、33例、28.9%であり、7歳以降に加齢とともに急に上昇したが13歳以降は明らかに低下した。2.TTVのnon-codingregionの塩基配列を調べ、系統樹解析を行うことによって母子4組においてTTVの母子感染の確認が可能であった。3.小児の非A-非G型肝炎患者41例においてTTVの検出を試みた。N22のprimerを用いたPCRでは、非A-非G型肝炎患児の31.7%が陽性であり、正常小児114名のTTV陽性率28.9%と比べて有意差はなかった。TTV陽性の肝炎13例におけるgenotypeは、genotype1が11例、genotype2が2例であり、正常小児(33例中genotype1が30例、genotype2が3例)と比べて有意差を認めなかった。4.胆汁うっ滞が遷延し、体重増加不良などの症状が認められた血清TTV陽性の新生児肝炎3例において、大量ガンマグロブリン療法後に血清総胆汁酸の著明な低下とともに体重増加の改善が認められた。肝組織のTTVDNAが陽性であり、治療後に血清からTTVDNAが消失した。このように一部の新生児肝炎の発症にTTV感染が関与している可能性がある。本研究の目的は、1)TTウイルス(TTV)の小児非B非C型劇症肝炎における病因としての意義を明らかにするために対象症例についてTTV-DNAの陽性率を検討し、また、2)TTVの母子感染について、a)TTVの母子感染率、b)母子感染に影響する母親側の因子の解析、C)母子感染小児の臨床経過および肝病理所見を明らかにすることにある。これまでの研究成果としては、小児におけるTTVのgenotype分布およびウイルス量について検討した。対象は正常小児群114名、非A-G型肝疾患(以下、肝炎群)42名。方法は血中のTTV DNAをPCR法にて検出し、N22領域のPCR(N22-PCR)陽性検体については定量を行った。またN22領域の塩基配列を決定し、genotypeを解析した。結果は、N22-PCR陽性者は、正常群27.2%、肝炎群66.7%であり、肝炎群の方にN22-PCR陽性者が有意に多かった。正常群におけるgenotypeの分布は、G-1が87.1%、G-2が9.7%、判定不能が1名であり、G3-6の者はいなかった。肝炎群でもgenotype分布は同様であり、G-1が92.9%、G-2が7.1%であった。ウイルス量は正常群において2.56±1.28(n=27)、肝炎群では3.89±0.78(n=9)と肝炎群の方がウイルス量が有意に多かった。また10^2/ml以下の低ウイルス血症の者は正常群では74.1%、肝炎群では11.1%であり、正常群に低ウイルス血症の者が有意に多かった。以上のように正常群に比べて、肝炎群の方にN22-PCR陽性者が有意に多く、またウイルス量が有意に多かった。genotypeは両群とも約90%がG-1であり、genotype分布に差を認めなかった。1.正常小児におけるTTウイルス(TTV)感染状況を調べる目的で、015歳までの正常小児114例のTTV陽性率をN22領域およびnon-codingregion (NCR)に設定されたprimerによるPCR法によって検討した。NCRのプライマーによる検討では1歳を境に8090%まで上昇するが10歳以降は逆に少し低下した。N22のプライマーでは7歳以降年齢と共に急に上昇したが13歳以降低下した。2.C型肝炎母子感染追跡症例のうちHCV未感染で肝機能正常の32例について、NCRのプライマーを用いてTTV陽性化時期(感染成立時期)を検討した。

生後1か月までが2例、26か月17例、712か月8例、1324か月3例であり、残る2例は18か月および24か月時まで陰性であった。このようにほぼ全ての小児が周産期から幼児期にかけてTTVに感染するものと考えられる。3.非A-非G型肝炎小児患者31例(劇症肝炎3例を含む)においてTTV感染状況を調べた。N22のprimerを用いたPCRでは、非A-非G型肝炎患児の32%が陽生であり、正常小児と比べて有意差はなく、genotypeの分布にも差を認めなかった。さらにIgM型抗体の免疫複合体を調べたところ、非A-非G型急性肝炎8名中5名が陽性であり、慢性肝炎の5名には陽性者はいなかった。血清トランスアミナーゼ上昇時および正常化時と2点以上測定できた急性肝炎の3例においてIgM抗体の消失が確認された。劇症肝炎例ではポストの血清がなく、IgM抗体の変化を検討できなかった。以上の結果から小児期における原因不明の肝障害の一部はTTVの急性感染と関連している可能性が示唆された。