hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ａｓ－Ｇｒｏｗｎ架橋型カーボンナノリボンの開発と構造・物性の解明

最終年度において、合成基板鉛直配置型液面下CVD装置を改良することによりAs-grown架橋型カーボンナノリボンの収率向上を図ったが、有意な改善は見られなかった。ガス供給口の配置調整によりガス流の均一化を図ったが、チャンバーからのガス排出の斑を改善できなかったことが原因と考えられる。一方、本研究の過程で新規に開発したナノカーボン物質であるカーボンナノポットについては、テーパード縮径中空胴部に密集しているグラフェン端がヒドロキシル基で修飾されている可能性が高いことを示した。また、カーボンナノポットのI-V特性を測定し、金属的な伝導特性を示すことがわかった。研究期間全体を通じて、独自開発の液面下CVD装置の改良と触媒、触媒担体、合成条件の最適化を図って、カーボンナノリボンを合成し、顕微ラマン分光の2次元マッピングによりカーボンナノリボンの構造を解析した。その結果、カーボンナノリボンは面内結晶サイズが24nm程度のグラフェンシートが23層積層した構造になっていることが示唆された。その開発過程で、新規構造のナノカーボン物質カーボンナノポットを産出した。この新物質はグラフェン層からなり、典型的なサイズは外径が2040nm、内径が530nm、長さが100200nmであり、中空空間のアスペクト比が1020に及ぶことがわかった。このアスペクト比は既存の容器型ナノ物質のものを大きく上回っており、ドラッグデリバリなどへの応用が期待される。そこでこの物質に対する合成条件も最適化し、そのナノ構造や表面修飾官能基、電気伝導特性を明らかにした。その結果、カーボンナノポットの側面の一部にグラフェン端が密集している特異な構造が明らかとなり、しかもそれらがヒドロキシル基で終端されていることが示唆された。また、電気伝導特性は金属的であることも明らかにした。液面下の高温度勾配環境で化学気相合成が可能なサブマリン式基板加熱法を開発して、生成時点で架橋しているカーボンナノリボンの合成に成功した。さらにラマンスペクトルの二次元分布計測システムを組み上げて、ナノリボンがグラフェンシートで形成されていることを明らかにした。ただ、純度を高めることができなかったために電気伝導特性の解明には至らなかった。一方、その過程でサブマリン式基板加熱法を用いた新たなカーボンナノ物質の創製に成功し、カーボンナノポットと名づけた。カーボンナノポットは深底の壺状ユニットが連結してファイバー状に生成するため、ファイバーとしてもユニット単体としてもさまざまな分野で応用が期待される。本年度は、合成基板鉛直配置型液面下CVD装置の改良を終えて、As-grown架橋型カーボンナノリボンの高純度・高効率に合成し、その電気特性を調査する計画であった。しかしながら、特性評価を行えるほど純度と収率が向上しなかったため、計画を変更して反応容器内のガス流の数値解析を行った。その結果、原料ガスの流路が限定的になっていることがわかり、合成装置をさらに改良する必要が生じて、年度内に合成条件の最適化まで至らなかった。
複合化ベシクルによる非平衡細胞モデル系

細胞システムの物理学的本質を理解するため、ゲスト分子を含む複合化ベシクルを設計し、非平衡環境下で機能する細胞モデル系の実験的研究を行った。既に、ベシクル内部のDNA分子の振る舞いを決定する物理パラメータとして、小胞空間サイズが重要であることを発見している。膜のダイナミクスをカップルさせた膜-DNA複合体へとシステムを発展させるために、ベシクル空間の時間発展(膜融合システム)の設計を行った。膜融合は、細胞内の物質輸送や受精・ウィルス感染など多くの生体現象に関わる重要なプロセスであり、様々なタンパク質の援助によって起こる。ここでは、融合を人工的に制御するため、光応答性界面活性剤を利用した。光照射により膜張力の増減をコントロールすることで、融合システムの構築に成功した。マイクロマニピュレーター実験から、光照射によるリポソームの面積減少率を測定し、張力変化を見積もった。そして、膜の自由エネルギーにより、融合の中間体(融合ポア)の安定性について説明した。また、原始的な細胞運動モデルとして、生体エネルギー(ATP分子)を利用する分子モーター・細胞骨格システムとベシクルとの複合化実験を進めた。先ず、脂質膜で被覆した油滴上を走る微小管の運動解析を行った。Cholesterolにより膜面の流動性を増減させると、微小管の運動特性が変化することを見出した。また、2つの微小管が衝突すると、運動の向きが揃う現象が観察された。これらの結果は、曲率を持ち流動性のある場における微小管の集団運動を初めて明らかにしたものである。今後、微小管の集団運動による膜への力学的フィードバックの機構を解明し、原始的な細胞動態機能を創発させる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、膜とゲスト分子から成る「複合化ベシクル」を設計し、非平衡環境下で機能する細胞モデル系の作動原理を理解することである。これまでに、次の成果を得ている。1ベシクル内への分子システム導入とミクロ空間特性:近年、生体細胞では液-液相分離を利用して物質の局在化や化学反応を促進していることが報告されている。そこで、温度上昇により相分離し凝集体を形成するPEG化合物(MeO-PEG)をベシクルに封入し、細胞モデル実験を行った。MeO-PEGは、疎水分子が水溶性のPEGに付加した構造をしており、疎水性相互作用を利用し集合する生体分子をモデル化している。形成された相分離ドメインはある一定のサイズで安定化し、枯渇相互作用によって膜界面へと移動した。さらに、2分子膜で囲まれた細胞サイズ空間では、ドメインのブラウン運動がバルクと比較して顕著に上昇する事を見出した。これは、膜で覆われたミクロ空間が、ある種の非平衡性を顕在化させていることを意味する興味深い成果である。また、DNAを封入したベシクルの複合化ダイナミクスの解析を進めた。小胞の空間サイズに依存してDNAが膜に特異的に吸着しunfoldingする「ミクロ空間特性」の実験結果に対し、その物理メカニズムを自由エネルギー計算により説明した。2運動性ゲスト分子による非平衡ベシクル運動:原始的な細胞運動モデルとして、エネルギーを消費し運動する分子システムとベシクル系との複合化実験を進めた。相分離ベシクルにコロイド粒子を結合させ、電場印加による非平衡状態のダイナミクスを観察した。粒子はdisorder相に選択的に吸着し、粒子局在とカップルした相分離ドメインの輸送現象を見出した。本研究の基礎となる、複合ソフトマター系の非平衡ダイナミクスの実験デザインが大きく進展した。具体的には、細胞サイズの膜小胞内部へのPEG高分子やDNA分子の導入に成功しており、細胞サイズ空間で創発する分子システムの特異性の発見に至っている。

また、コロイドと膜の複合系の非平衡ダイナミクスに関する実験構築も進んでおり、研究計画は順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。1年目の成果を推し進め、エネルギー散逸する環境下でのベシクルの非平衡運動の創出および機能発現メカニズムの解明を進める。膜と複合化させるゲスト分子として、コロイド粒子に加えて、生体エネルギー(ATP分子)を利用する分子モーター・細胞骨格システムの導入する。これにより、細胞サイズ空間で原始的な細胞動態機能を創発させる。さらに、膜の相分離構造や、DNAの構造転移ダイナミクスの知見を結集させ、膜系をベースとした複合ソフトマターとして人工細胞システムをデザインし、その非平衡ダイナミクス原理を解き明かす。
血管内皮の接着蛋白-NOを介した新しい再潅流障害機序の研究

急性心筋梗塞において、閉塞した梗塞血管の血流を再開させる再潅流療法が普及するに至ったが、これに伴う再潅流障害が問題となっている。この機序の一端を解明するために、培養血管内皮細胞(ヒト臍帯静脈、牛大動脈内皮細胞)を低酸素に暴露させ、以下の内皮細胞機能の変化を調べた。1.von Willebrand因子(血小板接着蛋白)の放出:ヒト臍帯静脈内皮細胞上清中のvon Willebrand因子量をELISAにより、定量した。低酸素暴露により、上清中のvon Willebrand因子量は有意に増加した。2.白血球接着蛋白P-selectin(GMP-140)の細胞表面への出現:P-selectinに対するモノクローナル抗体を^<125>Iでラベルし、ヒト臍帯静脈内皮細胞への特異的結合を測定した。低酸素暴露により、細胞への抗体の結合が増加したことより、P-selectinの細胞表面への出現が増加したことが確認された。3.Nitric Oxide(NO)の産生量:牛大動脈内皮細胞を低酸素に暴露させると、NO合成酵素活性が低下した。また、血管条片を用いて、その張力を測定すると、低酸素暴露後には、NOによる弛緩反応が減弱した。以上の変化は、いずれも血小板、白血球の血管壁への付着、凝集を促進し、血流の障害を起こすことにより、潅流不全を招来する。血管内皮細胞の機能障害が再潅流障害に深く関与していることが判明した。
ヒト男性生殖器官ABH関連抗原発現メカニズムの組織化学的、分子生物学的解析

最終年度の研究では、ヒト男性生殖器に発現されるABH関連抗原の生理学的意義を探るべく、哺乳類での精巣、特に精巣上体でのABH関連抗原の発現を免疫・レクチン組織化学的に検討を加えた。ニホンサル、イヌ、ウサギ、ラット、ヒト精巣でのレクチン組織化学は前年に報告した如く、精母細胞にガラクトース特異的レクチンの染色性が種を越えて見られ、EELやHPAなどの染色性は、幾分、種特異的傾向を示した。今年度はネコ及びラットの精巣上体部での検討を行った。ラツト精巣上体部は、精巣輸出管部から精巣上体管に至るに伴い、上皮細胞での血液型A型特異的レクチンであるHPAやDBAの反応性が増強しつつ見られ、管腔内分泌液や精子にも染色性が認められた。前立線では、凝固線部上皮細胞のゴルジ装置領域に抗A,Ley抗体の反応性が見られ、又EELやGSAI-B4の反応性も顕著に見られた。ネコでは、精巣輸出管部から精巣上体管に至る全領域で抗A抗体とH抗原前駆物質に反応性を有するECAレクチンとの反応性が顕著にみられ、LexやLey抗体との反応性も精巣輸出管部で見られた。これらのことは、精子成熟にABH関連抗原糖鎖が密接に関係していることを示していると考えられる。哺乳類分泌細胞に認められたABH関連抗原がヒト同様な遺伝子の働きによるものか否かを検討するためにキンギョ、マストミス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ニホンザルの血液からDNAを推出し、ヒト血液型A転移酵素遺伝子の塩基配列に基づき3組のプライマーを合成、推出DNAを鋳型とし、PCR増幅を行った。得られた産物の電気泳導パターンは、同一動物では同じで、異種動物では相違していた。ヒト試料をプローブとしてハイブリダイゼーション行うと反応性が見られ、シークエンスを行えたニホンザルでは、人の塩基配列と極めて類似し、動物種を越えてABH抗原遺伝子の存在の可能性が示された。合計63例の解剖体から得られた男性生殖器官各組織に付いて、各個体の血液型と生殖器官組織での抗原発現の関連を抗A、B、H、Lea、Leb、Lex、Leyモノクローナル抗体、アビチン・ビオチン・パーオキシダーゼ(ABC)法を用いて光学顕微鏡レベルで検討した結果、以下の知見がえられた。精巣では、精母細胞などのgermcellの細胞膜面成分に沿ってABH抗原の発現を見るが、精子には、今回用いた抗体との反応性は見られなかった。また、精巣輸出管内に貯蔵されている精子にも抗体との反応性も見られなかった。一方、精巣輸出管、精嚢腺や前立腺では、ABH抗原の発現を認めた。このことは、射精された精子に見られるABO抗原は精嚢腺や前立腺からの分泌抗原が吸着されたもの、すなわち、コーチィングアンチゲンであることを示している。精巣輸出管では、個体のABO並びにLe血液型と矛盾しない抗原の発現が見られ、抗原の発現は、H遺伝子(H)、分泌遺伝子(Se)、ルイス遺伝子(Le)、ルイスX遺伝子(X)の支配を受けていることが判明した。精巣上体管では、各個体ともLeY抗原のみがゴジル領域に一致して発現され、HとXのみの支配を受けていることが判明した。

精嚢腺では、個体と一致したABO抗原がSe遺伝子の支配を受けて発現されていたが、LeaやLeb抗原の発現は見られず、H、Se、Xの支配を受け、Le遺伝子の関与はないことが判明した。前立腺ではH、Se、Le、Xの各遺伝子の関与が見られ、ABO、Lea、Leb、X、Y抗原がモザイク状に発現され、抗原発現のheterogeneityが示された。ヒト男性生殖器官の内、前立腺では、ABO式血液型抗原発現は、異種的であり、例えばA型個体で、A抗原とO(H)抗原がモザイク状に発現されていることは、既に報告している。本年度の検討では、前立腺でのA1型とA2型におけるA抗原とO(H)抗原の発現の相違について抗A(type14糖鎖特異的)、A1(type3,4糖鎖特異的)及びO(H)抗体、血液型A型特異的であるHPA及びDBAレクチン、O型特異的であるUEA-Iレクチンの反応性を検討したが、光学顕微鏡レベルでは顕著な相違は認められなかった。他の臓器について検討したところ、唾液腺や気管腺の粘液細胞、味蕾細胞、胸腺ハッサル氏小体などで顕著な相違が認められた。A1型由来の粘液細胞や味蕾では、抗A抗体、HPA、DBA及びUEA-Iとの反応が顕著に見られ、von Ebner腺は、これらに加えて、抗O(H)抗体とも反応性が見られた。A2型由来の粘液細胞、味蕾やvon Ebner腺では、DBAとの反応性は殆ど見られず、粘液細胞では、抗O(H)抗体と顕著な反応性を示した。ハッサル氏小体では舌腺粘液細胞と同様な反応性が見られ、加えて、A1型個体では、抗A1抗体との反応性が僅かながら認められた。ABO式血液型抗原発現と糖鎖構造は臓器組織で様々に相違し、それぞれの場で複雑に遺伝的支配を受けていることが示された。また、パラフィン包埋組織片からのABO式血液型遺伝子型判定方法を開発を試み、作成後10年経過した組織片からでも確実に遺伝子型判定が可能となった。ABO式血液型は発見依頼焼く100年を経過し、その間の多くの研究の結果、抗原決定基、生合成機構などが十分に明かにされてきた。しかしながらいまだにその生理学的意義に関しての解明はなされていない。本研究プロジェクトでは、ヒト生殖器官発現されているABO式血液型抗原を主とし検索し、人種、動物間の比較を行い、その生理学的意義を探ろうとした。ヒト生殖器官では、ABO関連抗原は、様々の遺伝子が複雑に関連しながら、かつそれぞれの臓器でその働きを発揮していた。精巣上体部細胞や精嚢腺、前立腺細胞でABO抗原は分泌されていた。精巣内の精子細胞に見られないABO抗原は射精後には見られた。又、ネコ、ラットなどの精巣上体部においても、ヒトで見られたのと同様、ABO関連抗原の発現あるいはレクチンの反応性が見られたれ、精子にも反応性が見られた。このことは、精子成熟途上に抗原が付着されたことを示す。ヒトを含む哺乳類の精母細胞では、ガラクトース糖鎖が発現され、精巣上体で貯蔵されているうちに様々のABO関連抗原が上皮細胞から分泌され、精子に付着することを示す結果がえられた。すなわち、精子成熟にはABO関連抗原あるいは糖鎖が関係していることを示す。又、分泌組織、血管内皮、赤血球での、ABO抗原発現は、例えば、カエルや魚の分泌組織にこれら抗原が見られるなど、脊椎動物の進化と抗原の発現部位には密接な関連が見られた。一方、ヒト、ネコ、イヌ、ニホンザル、ラット、ウサギの味蕾細胞にもABO関連抗原の明瞭な発現が見られた。味蕾細胞は本来味覚受容に特異的細胞であることを考えると、ABO関連抗原が化学受容機構にも関連することを示すものと考えられる。今研究結果から、ABO式血液型関連抗原は、生命現象の基本的働きに関連している可能性が示された。
強相関電子化合物のバルク敏感高分解光電子分光

ごく最近パイロクロア酸化物で初めて超伝導転移が確認されたCd_2Re_2O_7,価数転移を示す金属間化合物YbInCu_4,近藤半導体FeSiおよびその関連物質Mn_5Si_3について,平均自由行程が10Åを超える数百eVの励起光と100meV以下の高分解能を併せ持つビームラインであるSPring-8 BL25SUを利用し,かつ,バルクの物性を損なうことのないよう試料を劈開,破断することで表面の清浄化を行って高分解能バルク敏感光電子分光測定を行い,内殻共鳴増大効果や20-450Kの領域での温度変化を含めた多角的アプローチによってこれらの物質のバルク電子状態に関する詳細な知見を得た.Cd_2Re_2O_7では120Kにおける相転移により電子軌道の混成強度の変化に関する新たな知見が得られた.YbInCu_4では表面の状態を抑えることでバルクにおけるYbの価数揺動状態の変化が温度,組成に対して得られた.FeSiでは20Kでフェルミ準位において約40meVの擬ギャップが,Mn_5Si_3では異なるMnサイトの電子状態の違いが内殻スペクトルにおいて観測された.これらの研究成果は,国際会議および国内の学会で報告を行い,それと同時に審査のある国際雑誌に投稿し,原著論文として受理された.実験は主にSPring-8にて行い,これらの実験環境の整備や補修,実験材料の購入に消耗品費を充てた.また,研究室内での予備実験および単結晶試料の方位決めと切り出しに用いるラウエカメラ,実体顕微鏡などに対して,補修,整備,改良を併せて行った.ごく最近パイロクロア酸化物で初めて超伝導転移が確認されたCd_2Re_2O_7,価数転移を示す金属間化合物YbInCu_4,近藤半導体FeSiおよびその関連物質Mn_5Si_3について,平均自由行程が10Åを超える数百eVの励起光と100meV以下の高分解能を併せ持つビームラインであるSPring-8 BL25SUを利用し,かつ,バルクの物性を損なうことのないよう試料を劈開,破断することで表面の清浄化を行って高分解能バルク敏感光電子分光測定を行い,内殻共鳴増大効果や20-450Kの領域での温度変化を含めた多角的アプローチによってこれらの物質のバルク電子状態に関する詳細な知見を得た.Cd_2Re_2O_7では120Kにおける相転移により電子軌道の混成強度の変化に関する新たな知見が得られた.YbInCu_4では表面の状態を抑えることでバルクにおけるYbの価数揺動状態の変化が温度,組成に対して得られた.FeSiでは20Kでフェルミ準位において約40meVの擬ギャップが,Mn_5Si_3では異なるMnサイトの電子状態の違いが内殻スペクトルにおいて観測された.これらの研究成果は,国際会議および国内の学会で報告を行い,それと同時に審査のある国際雑誌に投稿し,原著論文として受理された.実験は主にSPring-8にて行い,これらの実験環境の整備や補修,実験材料の購入に消耗品費を充てた.また,研究室内での予備実験および単結晶試料の方位決めと切り出しに用いるラウエカメラ,実体顕微鏡などに対して,補修,整備,改良を併せて行った.
早産子宮筋と細胞内カルシウム動態に関する研究

〈目的〉近年、早産と絨毛羊膜炎の関連が注目されている。感染を引き起こすと子宮筋収縮が増大するが、その機序の詳細は解明されていない。我々は、妊娠17日目(早産期)のラット腹腔にEndotoxin(ET)を投与し、炎症モデルを作成した。3時間後に子宮を摘出し、その縦走筋標本で、IP_3産生および細胞内Ca^<2+>動態の測定を行う。〈成績〉1.自然収縮およびOxytocin(OXT)投与後のIP_3産生量[Basal、OXT]は、それぞれCont.群[4.4±0.8、7.1±0.6]、ET.群[7.0±1.2、13.1±2.0](pmol/mg wet tissue、mean±SE、n=12)であり、両群ともOXT投与後の産生量は有意に増加した。両群間の比較検討ではET.群はCont.群に比して自然収縮時より増加の傾向を呈し、OXTを投与するとIP_3産生量は有意に増加した。2.(1)Ca^<2+>存在下(2.5mM)では子宮収縮と共に340/380比の上昇が認められたが、Ca^<2+>free下では、収縮を認めるものの、その340/380比の変化はなかった。(2)Ca^<2+>存在下では子宮収縮と共に子宮筋束に一致し、輝度の上昇が認められたが、Ca^<2+>free下では、収縮を認めるものの、その輝度の変化はなかった。(3)ET投与妊娠子宮筋にて、Ca^<2+>存在下ではOXTの投与により、子宮収縮と共に340/380比の上昇が認められた。〈結論〉1.OXT刺激により、IP_3の上昇を認めたが、Ca^<2+>free下では、細胞内Ca^<2+>の上昇が認められないため、Ca^<2+>非依存性収縮の機序の存在が示唆された。2.ETはIP_3産生を有意に亢進させOXTによる子宮収縮の感受性を上昇させる。さらに収縮に伴って細胞内Ca^<2+>の上昇が観察されたが、現在コントロールとの両者間の比較検討を行っているところである。細胞内Ca^<2+>動態の測定:【.encircled1.】蛍光顕微鏡;妊娠子宮筋にて、Ca^<2+>存在下(2.5mM)ではOXTの投与により、子宮収縮と共に340/380比の上昇が認められた。【.encircled2.】共焦点レーザー、顕微鏡;Ca^<2+>存在下ではOVTの投与により,子宮収縮と共に子宮筋束に一致し、輝度の上昇が認められた。<結論>(1)ラット妊娠子宮筋において、OXTの投与により、IP_3の産生量はCont群よりET群において有意に上昇した。このことはETによりPhospholipaseCの活性化が起こることが示唆された。

(2)蛍光顕微鏡とCLSMを用いることにより、ラット妊娠子宮筋において、細胞内Ca^<2+>と収縮張力の同時測定が実施でき、OXT刺激により、収縮に伴って細胞内Ca^<2+>の上昇が観察された。<目的>妊娠17日目(早産期)のラットの腹腔にEndotoxin(E.coli)を投与し、炎症モデルを作成する。3時間後に子宮を摘出し、その縦走筋標本で、(1)蛍光顕微鏡と(2)共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いて細胞内Ca^<2+>動態の測定を行う。<成績>細胞内Ca^<2+>動態の測定:(1)蛍光顕微鏡;妊娠子宮筋にて、Ca^<2+>存在下(2.5mM)ではOXTの投与により、子宮収縮と共に340/380比の上昇が認められた。Endotoxin投与子宮筋ではなかなか収縮が起こらず、340/380比の上昇については現在検討中である。(2)共焦点レーザー顕微鏡;Ca^<2+>存在下ではOXTの投与により、子宮収縮と共に子宮筋束に一致し、輝度の上昇が認められた。<結論>蛍光顕微鏡とCLSMを用いることにより、ラット妊娠子宮筋において、細胞内Ca^<2+>と収縮張力の同時測定が実施でき、OXT刺激により、収縮に伴って細胞内Ca^<2+>の上昇が観察された。Endotoxin投与子宮筋では現在検討中である。〈目的〉近年、早産と絨毛羊膜炎の関連が注目されている。感染を引き起こすと子宮筋収縮は増大するが、その機序の詳細は解明されていない。そこで我々は、妊娠17日目(早産期)のラットの腹腔にEndotoxin(E.coli)を投与し、炎症モデルを作成した。〈成績〉細胞内Ca^<2+>動態の測定:(1)蛍光顕微鏡;Endotoxin投与子宮筋およびコントロールの妊娠子宮筋にて、Ca^<2+>存在下(2.5mM)ではOXTの投与により、子宮収縮と共に340/380比の上昇が認められた。しかし、その両者間に有意差を認めるかは例数が少なく現在検討中である。(2)共焦点レーザー顕微鏡;Ca^<2+>存在下ではOXTの投与により,子宮収縮と共に子宮筋束に一致し、輝度の上昇が認められた。Endotoxin投与子宮筋ではなかなか収縮が起こらず、子宮筋束に一致し、輝度の上昇かどうかについては現在検討中である。〈結論〉蛍光顕微鏡とCLSMを用いることにより、ラット妊娠子宮筋において、細胞内Ca^<2+>と収縮張力の同時測定が実施でき、OXT刺激により、収縮に伴って細胞内Ca^<2+>の上昇が観察された。Endotoxin投与子宮筋でも同様に収縮に伴って細胞内Ca^<2+>の上昇が観察された。現在この両者間の比較検討を行っているところである。
中性脂肪蓄積心筋血管症に対する栄養療法の開発

中性脂肪蓄積心筋血管症(TGCV)は、代表研究者らが見出した新規疾患概念である。心筋及び冠動脈に中性脂肪が蓄積する結果、重症心不全、不整脈、虚血性心疾患を呈する。TGCVの今のところ明らかな原因は、細胞内中性脂肪分解の必須酵素であるAdipose triglyceride lipase (ATGL)の遺伝的欠損である。本研究では、ATGL欠損皮膚線維芽細胞、ATGLノックアウトマウスを用いたin vitro, in vivoの実験結果から、食事中の脂肪を中鎖脂肪酸に一部置換する食事療法を開発した。本食事療法をATGL欠損症例に対して、短期間、安全に実施しえた。中性脂肪蓄積心筋血管症(Triglyceride deposit cardiomyovasculopathy, TGCV)は、代表研究者が見出した新規疾患概念であり、心筋、冠動脈にTGが蓄積する結果、重症心不全、不整脈、骨格筋ミオパチーを呈する疾患である。TGCV症例由来皮膚線維芽細胞を用いたin vitroの実験において、中鎖脂肪酸(Medium chain fatty acids, MCFA)添加による細胞内TG減少、Adipose triglyceride lipase (ATGL)ノックアウトマウスを用いた動物実験によって、MCFA含有飼料を摂取した群では、心機能の改善、寿命の有意な延長を観察しえた。さらに、申請者所属機関附属病院で経過観察中のTGCV症例を対象に、MCFAを用いた食事療法を行い、その効果を検討した。対象は、ATGL遺伝子欠損に基づく原発性TGCV 3例である。年齢は、40才から59才。1日の総脂肪摂取40g中の脂肪を10gから30gまで段階的にMCFAに置換した食事療法を行った。総カロリーは、1800 kcal/日とした。観察期間は、50日から3か月である。開発した食事療法は、充分に摂取可能であり、入院中の食事療法のコンプライアンスは、良好であった。検討した症例において、心筋内TGの減少、脂肪蓄積関連遺伝子の発現の低下、徒手筋力テストにおいて骨格筋ミオパチーの部分的改善等が観察しえた。以上より、MCFAを含有する食事療法は、TGCVの症状改善、予後改善に有用な可能性が示唆された。症例由来皮膚線維芽細胞を用いた細胞生物学的研究を行った。1)種々の炭素数、不飽和結合数のLCFAを症例由来皮膚線維芽細胞に添加して、細胞内中性脂肪含量、細胞死(アポトーシスやネクローシス)に、与える影響を検討した。LCFAでは、患者由来細胞において、中性脂肪含量の増加とともに、細胞死が生じることを観察した。2)蛍光標識LCFAを用いて、細胞内のLCFAの動態について、共焦点顕微鏡、CARS顕微鏡などを用いて観察した。患者由来細胞では、LCFAが脂肪滴に輸送されることを見出した。3)細胞内中性脂肪蓄積の分子基盤として、脂肪細胞分化のkey playerであるperoxisomeproliferatedactivated receptor-gamma (PPARg)の関与について検討した。患者由来細胞では、PPARgが過剰発現していた。次に、ATGL KOマウスを用いた動物実験を行った。このマウスは、心臓に中性脂肪が蓄積する結果、20週齢で約半数のマウスが心不全死する(Zechner et al. Science. 2006)ことが知られており、中性脂肪蓄積心筋血管症のモデルとなる。そこでATGL KOマウスホモ接合体をコントロール食群、中鎖脂肪酸含食群の2群にわけ、生存曲線について検討したところ、中鎖脂肪酸含食群において、有意な寿命の延長が観察された。予定している細胞生物学的実験及び動物実験が終了した。種々の中鎖脂肪酸中、カプリン酸(C10:0)が最も細胞内中性脂肪含量低下活性が高いことを見出した。また、中鎖脂肪酸含有飼料で飼育したモデルマウスでは、心機能が改善していることも明らかにした。予定していた細胞生物学的実験を終了するとともに、動物実験において、中鎖脂肪酸を用いた食事療法がモデルマウスの寿命の延長を来すことを見出すことができた。中鎖脂肪酸中でも特に有効な成分を特定しえたので、それに応じて栄養療法のプロトコルを改変して、研究代表者所属機関で経過観察中の中性脂肪蓄積心筋血管症症例に対する食事療法の効果を検討していく。開発した中鎖脂肪酸を用いた食事療法が、モデルマウスの心機能、脂肪酸代謝に与える影響を、心臓CT、心臓MRI、BMIPPシンチ、FDG-PETなどで観察、評価する。さらに、研究代表者所属機関で、経過観察中の中性脂肪蓄積心筋血管症患者に対する中鎖脂肪酸を用いた食事療法の効果を自主臨床研究により検討していく。研究を進めて行く上で、必要に応じて、研究費を執行したため、当初の見込み額と執行額は多少異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含めて当初の予定通り計画を進めて行く。

研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は多少異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
短パルス超音速ビームエピタキシャル法によるIII族窒化物結晶成長とその応用

短波長発光素子用材料として、III族窒化物半導体が最近、非常に多くの人々の注目を集めている。我々は開発された短パルス超音速ビームエピタキシー(SSBE法)とガスソースMBE(GSMBE法)技術をうまく組み合わせ、GaN量子箱の試作に成功した。我々は以前の成果に基づき、AlGaN表面上でのGaN量子ドット作製を行い、超音波ビーム技術により原料の表面分解及び光学評価などの研究を進めた。ドットの作製に使われたSiソースはメチルシランを使用した。通常モードでメチルシランを供給の場合、GaN量子ドットが形成されず、表面モホロジーは非常に平坦である。それがメチルシラン分子が低温で熱分解せず、表面にSi原子が存在しないと考えられる。しかし、超音波モードでメチルシランを供給の場合、GaN量子ドットが形成されたことがAFMなどで確認された。それは低温で熱分解しにくいメチルシラン分子が超音波モードで与えられたエネルギーでSiに分解したことと考えられる。それにより、原料の表面分解が超音波ビームによって促進されたことがわかった。また、フォートルミネセンス評価により、GaN量子箱からと思われるPL発光も低温から室温まで観察された。また、我々はGaN膜をガスソースMBE成長中にInドーピング法を用いてGaN薄膜を作製し、作製したGaN薄膜の室温フォトルミネセンス(PL)発光強度が大幅に増加することを初めて発見した。その手法とは、成長中にInを供給しながら、通常のGaN成長温度でGaN成長を行われるという方法である。作られたGaNサンプルの低温PL特性及び電気特性を調べたところ、Inが供給されなかったサンプルから三つのピーク(3.462eV,3.418eV,3.315eV)が観察され、それぞれバンド端再結合、欠陥及び酸素による誘起、D-A再結合に関連する。しかし、Inが供給して作製されたサンプルから3.418eVと3.315eVのピーク強度が弱くなり、バンド端再結合ピークだけが強くなる。さらに、ホール測定により、室温でのキャリア移動度がInドーピングにより増加することが分かった。それは成長中にInが表面サファクタント効果、あるいは欠陥など非発光センターがIn原子に補償され結晶品質が向上されることと考えられる。この系の物質のバンドギャップが室温でInNの1.9eVからAINの6.2eVと可視光全域、及び近紫外域にわたるため、他のIII-V族化合物では原理的に不可能な波長領域、特に短波長領域のデバイスの実現が可能である。我々はこの材料に注目し、ガスソース分子線エピタキシャル法(GSMBE)で(Al,Ga)Nの成長及び評価を行ってきた。本年度では、我々はGSMBE法でGaN薄膜を成長と評価した。成長には、固体Ga、アンモニアをそれぞれIII族、V族として使用した。Reflection High-Energy Electron Diffraction (RHEED)よる実時間観察を行い、成長中に(1x1)と(2x2)の2種類のRHEEDパターンを見つかった。

詳しい分析によると、(1x1)パターンが窒素リッチ表面に対応し、(2x2)がGaリッツ表面に対応することがわかった。GaN薄膜の品質をX線回折、フォトルミネセンスで評価した所、窒素リッチ表面状態で成長した方がよいことがわかった。それにより、薄膜の品質をRHEEDで実時間制御ができることがわかった。もう一つの研究重点として、このGSMBE法と本研究室で開発した短パルス超音速ビームエピタキシ-(SSBE法)をうまく組み合わせ、GaN量子箱の試作を行った。それはGSMBE法を用い、本研究室の田中らの方法と同様にAlGaN表面上にSiを入れることにより、GaNドットを作製する。本研究では水素で希釈したメチルシランをSiソースとして使用し、短パルス超音速ビームでAlGaN表面に供給する。それは超音速ビームの高エネルギーがメチルシランの分解への促進効果を利用するものである。RHEEDおよびAFMで評価したところ、GaN量子箱はうまく形成したことがわかった。それはGSMBE法として世界で始めて成功したことである。短波長発光素子用材料として、III族窒化物半導体が最近、非常に多くの人々の注目を集めている。我々は開発された短パルス超音速ビームエピタキシー(SSBE法)とガスソースMBE(GSMBE法)技術をうまく組み合わせ、GaN量子箱の試作に成功した。本年度では去年の成果に基づき、更にAlGaN表面上でのGaN量子ドット作製を行い、超音波ビーム技術により原料の表面分解及び光学評価などの研究を進めた。ドットの作製に使われたSiソースはメチルシランを使用した。通常モードでメチルシランを供給の場合、GaN量子ドットが形成されず、表面モホロジーは非常に平坦である。それがメチルシラン分子が低温で熱分解せず、表面にSi原子が存在しないと考えられる。しかし、超音波モードでメチルシランを供給の場合、GaN量子ドットが形成されたことがAFMなどで確認された。それは低温で熱分解しにくいメチルシラン分子が超音波モードで与えられたエネルギーでSiに分解したことと考えられる。それにより、原料の表面分解が超音波ビームによって促進されたことがわかった。また、フオートルミネセンス評価により、GaN量子箱からと思われるPL発光も低温から室温まで観察された。また、我々はGaN膜をガスソースMBE成長中にInドーピング法を用いてGaN薄膜を作製し、作製したGaN薄膜の室温フォトルミネセンス(PL)発光強度が大幅に増加することを初めて発見した。その手法とは、成長中にInを供給しながら、通常のGaN成長温度でGaN成長を行われるという方法である。作られたGaNサンプルの低温PL特性及び電気特性を調べたところ、Inが供給されなかったサンプルから三つのピーク(3.462eV,3.418eV,3.315eV)が観察され、それぞれバンド端再結合、欠陥及び酸素による誘起、D-A再結合に関連する。しかし、Inが供給して作製されたサンプルから3.418eVと3.315eVのピーク強度が弱くなり、バンド端再結合ピークだけが強くなる。さらに、ホール測定により、室温でのキャリア移動度がInドーピングにより増加することが分かった。それは成長中にInが表面
ビデオ画像のコンピュータ解析による顔面表情運動障害の診断・治療支援システムの開発

顔面神経麻痺などを原因とした顔表情運動障害に対し、麻痺診断、治療方針や形成再建治療などの手術計画の決定、治療経過や術後評価などの支援などを目的として、「ビデオ画像からのコンピュータ解析による顔面表情運動障害の診断や治療・手術計画支援システム」を構築して、この支援システムを臨床に応用し、システムの有効性の検証と改良を行ない、さらには標準的な評価システムとして国内外への普及を行なった。本研究の内容や開発したシステムの詳細、また顔面表情運動障害への応用の詳細につき、インターネットでの配信を目指してホームページ作成を進めていたが、本年度で作成を完成させ、ホームページを公開した。1、治療・手術支援システムの改良とシステム実験:(1)鏡利用の3次元撮影装置・頭部固定装置の検証を行い、また被験者への撮影表情指導のビデオ作成を進めた。(2)現行の日本語表示より全英語表示へのシステム表示法の改良を進め、より普遍性の高い部位別ウインドウ設定法を検討した。(3)開発した3次元表情運動解析のアルゴリズムのシステム実装を検討し、移動量測定のキャリブレーション機能の検証を進めた。(4)撮影時の体動による測定誤差対策として、解析ソフトでの体動移動量の処理法を検討した。(5)3台のビデオカメラによる3次元撮影装置を製作し、健常者での試用と患者での臨床応用を進め、その3次元表情運動解析のアルゴリズムの検討を進めた。2、治療・手術支援システムの臨床応用と評価:顔面神経麻痺の保存療法や再建手術、顔面神経麻痺による病的共同運動・拘縮や顔面痙攣に対するボツリヌストキシン治療を対象として、治療や手術前後に各種表情運動のビデオ撮影を3次元撮影装置(頭部固定装置あるいは3台のビデオカメラ利用)も利用して計15名に行った。これらのビデオ撮影データをシステムにより表情運動解析し、解析結果の臨床的意味付け及びこれに基づいた手術・治療計画の検討や治療評価を行った。また、顔面運動障害の患者アンケートによる自覚症状の改善度、機能的検討(兎眼、食事のもれ・言語の口唇機能)、柳原法やHB法による評価、などと解析結果を比較・検討し、開発したシステムの有効性につき検討した。筋移植や神経再建例では筋電図(誘発電位や干渉波形)検査を行い、筋電図検査による表情運動評価と比較・検討した。3、研究成果の発表、システムの普及:本研究や開発したシステムの詳細についての研究発表や、顔面表情運動障害への応用の詳細につき、インターネットでの配信を目指してホームページ作成を進めた。1、治療・手術支援システムの改良とシステム実験(1)鏡利用の3次元撮影装置・頭部固定装置の検証を行い、また被験者への撮影表情指導のビデオ作成を進めた。2、治療・手術支援システムの臨床応用と評価顔面神経麻痺の保存療法や再建手術、顔面神経麻痺による病的共同運動・拘縮や顔面痙攣に対するボツリヌストキシン治療を対象として、治療や手術前後に各種表情運動のビデオ撮影を3次元撮影装置(頭部固定装置あるいは3台のビデオカメラ利用)も利用して計12名に行った。3、研究成果の発表、システムの普及本研究や開発したシステムの詳細についての研究発表や、顔面表情運動障害への応用の詳細につき、インターネットでの配信を目指してホームページ作成を進めた。1.治療・手術支援システムの改良とシステム実験:(1)より高い精度と再現性を目指した撮影方法の改良:鏡利用の3次元撮影装置・頭部固定装置の検証を行い、また表情撮影法の検討として被験者への撮影表情指導のビデオ作成を進めた。(2)解析ソフトの改良:現行の日本語より全英語表示へのシステム表示法の改良を進めた。(3)開発した3次元表情運動解析のアルゴリズムのシステム実装の検討と、移動量測定のキャリブレーション機能の検証を進めた。

(5)鏡利用以外の3次元撮影法の開発として、3台のビデオカメラによる3次元撮影装置を製作し、健康な被検者での試行を行なった。また、その3次元表情運動解析のアルゴリズムの検討を進めた。2.治療・手術支援システムの臨床応用と評価]:顔面神経麻痺の保存治療や再建手術、顔面神経麻痺による病的共同運動や眼瞼痙攣に対するやボツリヌストキシン治療の患者を対象として、治療や手術前後に各種表情運動のビデオ撮影を新3次元撮影装置・頭部固定装置も利用して計20名に行なった。これらのビデオ撮影データをシステムにより表情運動解析し、解析結果の臨床的意味付けおよびこれに基づいた手術・治療計画の検討や治療評価を行った。また、顔面運動障害の自覚症状の改善度、機能的検討(兎眼の程度、食事のもれ・会話などでの口唇機能)、および柳原法・HB法による評価と解析結果を比較・検討し、開発したシステムの有効性につき検討した。神経血管柄つき筋移植例については筋電図(誘発電位や干渉波形)検査を行い、筋電図波形から計算された運動量とシステム解析による運動量の比較検討を行なった。3、研究成果の発表、普及:本研究内容や開発したシステムの詳細につきインターネットでの配信を目指して、研究発表のホームページ作成を進めた。1、治療・手術支援システムの改良とシステム実験(1)鏡利用の3次元撮影装置・頭部固定装置の検証を行い、また被験者への撮影表情指導のビデオ作成を進めた。(2)現行の日本語表示より全英語表示へのシステム表示法の改良を進め、より普遍性の高い部位別ウインドウ設定法を検討した。(3)開発した3次元表情運動解析のアルゴリズムのシステム実装を検討し、移動量測定のキャリブレーション機能の検証を進めた。(4)撮影時の体動による測定誤差対策として、解析ソフトでの体動移動量の処理法を検討した。(5)3台のビデオカメラによる3次元撮影装置を製作し、健常者での試用と患者での臨床応用を進め、その3次元表情運動解析のアルゴリズムの検討を進めた。2、治療・手術支援システムの臨床応用と評価顔面神経麻痺の保存療法や再建手術、顔面神経麻痺による病的共同運動・拘縮や顔面痙攣に対するボツリヌストキシン治療を対象として、治療や手術前後に各種表情運動のビデオ撮影を3次元撮影装置(頭部固定装置あるいは3台のビデオカメラ利用)も利用して行った。これらのビデオ撮影データをシステムにより表情運動解析し、解析結果の臨床的意味付け及びこれに基づいた手術・治療計画の検討や治療評価を行った。また、顔面運動障害の患者アンケートによる自覚症状の改善度、機能的検討(兎眼、食事のもれ・言語の口唇機能)、柳原法やHB法による評価、などと解析結果を比較・検討し、開発したシステムの有効性につき検討した。筋移植や神経再建例では筋電図(誘発電位や干渉波形)検査を行い、筋電図検査による表情運動評価と比較・検討した。
窒素含有キラル化合物不斉合成のための微生物生産プロセスの開発

本研究ではいくつかの窒素含有キラル化合物の生産に有用なカルボニル還元酵素のタンパク質科学・遺伝子工学の面からの解析を行い、これをバイオ不斉還元システムに応用した効率的な生産プロセスの開発を成し遂げようとしたものである。(1)3-キヌクリジノン還元酵素活性を有するAgrobacterium tumefacienから、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明とアミノ酸配列の解析を行った。その結果、SDRスーパーファミリーに属するタンパク質と判明した。さらに、アミノ酸配列情報をもとに遺伝子のクローニングを行い、大腸菌内で大量発現させることに成功した。還元反応に必要な補酵素NADHを供給する系としてグルコース脱水素酵素遺伝子を、同じ大腸菌内に共発現させた。この共発現菌体を触媒として、3-キヌクリジノンの不斉還元反応を行ったところ、20%基質を定量的に変換して(R)-3-キヌクリジノールを生産することに成功した(2)Rhodococcus erythropolisのアミノアルコール脱水素酵素遺伝子の大量発現大腸菌を触媒として、MAK還元反応の検討を行った。効率的生産プロセス開発の障害となる生成物阻害を解除するため、本酵素遺伝子のランダム変異を行い安定性の優れた変異型酵素を取得した。これらの変異酵素を解析した結果、5カ所アミノ酸残基に置換変位が導入されていることが判明した。また、本酵素はアミノアルコール類により強く誘導されるが、その発現調節機構も明らかにした。本研究ではいくつかの窒素含有キラル化合物の生産に有用なカルボニル還元酵素のタンパク質科学・遺伝子工学の面からの解析を行い、これをバイオ不斉還元システムに応用した効率的な生産プロセスの開発を成し遂げようとするものである。(1)3-キヌクリジノン還元酵素活性を有するAgrobacterium tumefaciensNK1株から、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明とアミノ酸配列の解析を行った。(2)Rhodococcus erythropolisのアミノアルコール脱水素酵素遺伝子の大量発現大腸菌を触媒として、MAK還元反応の検討を行った。(3)スクリーニングで見出した(S)-アミノケトン還元酵素活性を有する酵母Hansenula ofunaensisから、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明を試みた。(4)上記でクローニング・ライブラリー化した酵素に加えて、探索により発見した菌株からの酵素・遺伝子の単離を進め、酵素ライブラリーの充実を図った。本研究は、いくつかの窒素含有キラル化合物の生産に有用なカルボニル還元酵素のタンパク質科学・遺伝子工学の面からの解析を行い、これをバイオ不斉還元システムに応用した効率的な生産プロセスの開発を成し遂げようとするものである。(1)Agrobacterium tumefaciensから取得した3-キヌクリジノン還元酵素をコードする遺伝子のクローニングを行い、大腸菌内で大量発現させることに成功した。さらに、還元反応に必要な補酵素NADHを供給する系としてグルコース脱水素酵素遺伝子を、同じ大腸菌内に共発現させた。この共発現菌体を触媒として、3-キヌクリジノンの不斉還元反応を行ったところ、20%基質を定量的に変換して(R)-3-キヌクリジノールを生産することに成功した。(2)Rhodococcus erythropolisのアミノアルコール脱水素酵素によるアミノケトン化合物不斉還元反応における生成物阻害を解除するため、本酵素遺伝子のランダム変異を行い安定性の優れた変異型酵素を取得した。(3)スクリーニングで見出した(S)-アミノケトン還元酵素活性を有する酵母Hansenula ofunaensis等3株から、不斉還元反応を触媒する酵素の単離を行い、諸性質の解明を行った。

(4)上記でクローニング・ライブラリー化した酵素に加えて、探索により発見した菌株からの酵素・遺伝子の単離を進め、酵素ライブラリーの充実を図った。
新規テロメレース活性抑制遺伝子の機能解析による発がん機構の解明

2) PITX1の発現消失がメラノーマの悪性度と相関を示すことを明らかにし、メラノーマにおける悪性度を決定する診断マーカーとしての応用の可能性を示した。PITX1をマウスのメラノーマ細胞へ導入した結果、テロメラーゼの主要構成成分として知られているTERT遺伝子の著しい抑制効果を示した。加えて、テロメラーゼ活性が抑制された細胞クローンを用いて、RNAiによるPITX1遺伝子の発現をノックダウンさせた結果、テロメラーゼの活性化が誘導された.さらに、種々のがん組織においてPITX1の発現スクリーニングを可能にした組織アレイ解析を行った結果、肺がん、胃がん、前立腺がんなどを含む種々のがんでその発現の消失あるいは低下が認められた。とりわけ胃がんでは、70%(11/16)にPITX1の発現消失が高頻度に認められた。このように、PITX1は,テロメラーゼ活性の制御を通じて様々のがんの発がん過程に関与することが予想された。さらに、メラノーマにおけるPITX1の発現を解析した結果、7種類の中の5種類の細胞株において著しい発現消失が認められた。このことより、PITX1はメラノーマの発生過程においても重要な役割を担っている可能性が示唆された。がんにおいてPITX1遺伝子の変異は報告されていないことから、PITX1の発現消失あるいは低下は、エピジェネティクスの変化あるいはPITX1の発現を抑制する分子に起因する可能性が示唆された。そこで、PITX1の発現消失が認められメラノーマ細胞株において、DNAメチル化の阻害剤である5-アザシチジン(5-Aza)処理によるPITX1の発現変動解析を行った結果、5-Aza濃度依存的にPITX1の発現増加を示し、TERTの発現は逆相関して低下した。このように、メチル化などのエピジェネティクスの変化がPITX1上に存在することが示唆され、今後その詳細な解析ががん発生メカニズムの解明あるいは診断法などの開発につながることが期待された。本年度においては、ヒトメラノーマ組織標本におけるPITX1発現と臨床病理学的因子との関連を検討した。ヒト正常皮膚標本3例およびヒトメラノーマ組織標本40例を用いた。正常皮膚組織においては、メラノサイトにおけるPITX1発現を、他方腫瘍組織における発現はメラノーマ細胞に焦点を当て、免疫組織化学的にPITX1蛋白を検出した。腫瘍組織においては、メラノーマ細胞におけるPITX1陽性細胞の有無で陽性例と陰性例に分けた。増殖活性の検討は上皮内黒色腫(メラノーマin situ)を除く26例を対象とし、腫瘍細胞500個以上におけるKi-67labelingindex (KI,%)を算出した。PITX1蛋白は、メラノサイトにおいて発現していることを確認した。メラノーマ症例におけるPITX1陽性例は21例(52.5%)、陰性例は19例(47.5%)であった。両群間において年齢、性別および組織型に差はなかった。他方、腫瘍の厚みは、陽性例が1.90±7.11mm、陰性例が3.19±10.3mmであり陰性例で有意に高値を示した(P=0.001)。また、転移の有無を比較したところ、PITX1陽性例では21例中1例(4.76%)のみであったのに対し、陰性例では19例中7例(36.8%)と陰性例において有意に転移陽性例が多かった(P=0.012)。さらにステージ0-II群(n=30)とIII-IV群(n=10)に分類したところ、前者におけるPITX1陽性例は19例(63.3%)、後者では2例(20.0%)と病期の進行に伴ってPITX1陽性例が有意に減少した(P=0.019)。PITX1陽性例においてPITX1陽性領域と陰性領域におけるKIを算出したところ、陽性領域は12.5±1.54、陰性領域は29.8±4.38でありPITX1陰性領域において有意に増殖能が高かった。このように、PITX1は細胞増殖を負に制御する因子で、特にメラノーマ細胞においてがん抑制遺伝子として機能していること、さらにその発現低下がメラノーマの悪性度マーカーとなる可能性が示唆された。本年度において, PITX1のカウンターパートの網羅的探索と機能解析を中心に実施した.DNA転写制御を行うタンパク質は単独で機能するわけではなく,他のタンパク質との相互作用によって複合体を形成して機能していることから,機能単位としてはたらくPITX1タンパク質複合体を決定することは, PITX1のテロメレース制御機構を明らかにする上で重要な分子情報を得ることができると考えられる.そこで申請者らは, FLAGを付加したPITX1を安定に発現するHeLa細胞を樹立し, FLAG抗体よるタンパク質の濃縮,質量分析計LC-MS/MS解析によってPITX1に直接結合している分子を同定する実験系を構築した.実験の結果, Flag-PITX1と結合する因子としてRNA helicase Aを同定した. RNA helicase Aはテロメレース抑制遺伝子としてこれまで報告のあるp53やCTCF, HDAC1などの分子と結合する因子であり, PITX1-RNA helicase A複合体を介した新たなテロメレース制御機構の分子ネットワークの存在が示唆された.さらに, RNA helicase Aのテロメレース制御への関与を直接的に解析するために, siRNAを用いた発現抑制実験を行った.

細胞には, RNA helicase Aを発現するHeLaおよびSiHa細胞を用い, siRNAをり導入後48hrおよび72hr後の細胞において, qRT-PCRによってhTERTの発現量の定量化を行った.その結果, 72hr後ではHeLaではおよそ2倍, SiHaでは3.75倍のhTERTの発現上昇が認められた.これらの結果より, PITX1はRNA helicase Aと機能的な複合体を形成して,テロメレースの発現を負に制御している可能性が示唆された.本研究期間において、PITX1が新規のメラノーマの悪性度マーカーとして利用できる可能性が示唆されたことから高い達成度を得ることができたと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらに症例数を増やし解析を進めることによりPITX1の悪性度マーカーとしての実用化の見通しを立てる。一方、PITX1にかかわる分子群の同定を実行し、それらの詳細な機能解析を通して「PITX1-テロメラーゼ抑制経路」をとりまく制御ネットワークを明らかにし、その情報を元に新たな制がんの戦略提示を行う。
中緯度沿磁力線電流の研究

1.中低緯度の地上に現れる沿磁力線電流の効果を定量的に見積もり、それを地上磁場観測データおよび人工衛星観測データ(エ-ルステッド衛星)と比較することを行った。計算結果によると、電離層直上での地磁気の傾き(伏角)が大きく影響するため、地理的経度により、沿磁力線電流の効果がかなり異なることがわかった。また、この衛星の観測データを解析することにより、これまで、地上観測データおよび精密磁場観測衛星Magsatデータから存在が推測されてきた昼間側から電離層に流れ込み、夜側から流れ出す実質電流(net-current)の存在を確認することができた。2.DE-2による磁場観測データを統計的に解析し、電離層に起因すると考えられる中緯度沿磁力線電流を夕方側でも確認することができた。また、この電流は冬半球で明瞭に現れること、両半球間を磁力線に沿って流れる電流は、計算機シミュレーションにより従来得られてきた結果とは逆の傾向を示すことがわかった。3.中緯度における磁場変動とMUレーダー観測データとの比較を行った。その結果、擾乱時の地上磁場変動の大部分は、沿磁力線電流を含む磁気圏電流の効果であることが示唆された。4.SuperDARN HFレーダーデータの解析を行い、午後側日照・日陰境界付近のサブオーロラ帯に電離層不規則構造の出現する確率が大きいことが分かった。(1) MAGSAT衛星による磁場観測データを、既に当グループでデータベース化したDE-1およびDE-2のデータと共通の形式に変換するため、オープンリールの古い磁気テープから既設のワークステーションHP-9000に接続された大容量磁気ディスクに収納した。(2)上記磁場観測データを太陽活動度、季節、地磁気活動度等により分類し統計的処理および今後の一般利用を考慮して、リレーショナル型データベースを構築するため、既設のワークステーションJCC/JU1にデータベースソフトウェア(オラクル8)をインストールした。(3)既にデータベース化された極域上空におけるDE-1衛星のデータを解析することにより、高度数千キロメートル上空で、磁場観測値がこれまでには報告されたことのない一見奇妙な変動を示すことが明らかになった。すなわち、磁場の水平成分が高度に依存して向きを回転させ、その方向がダイポール軸と太陽方向のなす角度あるいは季節により、南北半球で規則的であることがわかった。この結果は、第104回地球電磁気・地球惑星圏学会で報告した。(4)エールステッド衛星による磁場観測データは衛星の打ち上げが1999年3月に延期されたため、今年度は使用できなかった。(1)沿磁力線電流が中低緯度に及ぼす効果の見積もりと、エールステッド衛星観測データによる確認:地上に現れる沿磁力線電流の効果を定量的に見積もり、それを、地上磁場観測データおよび人工衛星観測データと比較することを行った。計算結果によると、電離層直上での地磁気の傾き(伏角)が大きく影響するため、地理的経度により、沿磁力線電流の効果がかなり異なることが分かった。また、エールステッド衛星の観測データを解析することにより、これまで、地上観測データおよび精密磁場観測衛星Magsatデータから存在が推測されてきた昼間側から電離層に流れ込み、夜側から流れ出す実質電流(net-current)の存在を確認することができた。(2)電離層に起因すると考えられる磁気圏電流および中緯度沿磁力線電流の確認:DE-2による磁場観測データを統計的に解析し、中緯度沿磁力線電流を夕方側でも確認することができた。また、新たな事実として、この電流は冬半球で明瞭に現れること、両半球間を磁力線に沿って流れる電流は、計算機シミュレーションにより従来得られてきた結果とは逆の傾向を示すことがわかった。(3)中緯度における磁場変動とMUレーダー観測データとの比較を行った。