hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経節細胞移植による結腸無神経節症の治療に関する基礎的研究

1はじめにヒルシュスプルング病の病態は、腸壁内の神経細胞を先天的に欠如している病態である。本研究の目的は、神経節細胞のみを移植し、その神経節細胞が生着し、神経ネットワークを形成しうるか否かを検討することである。2対象と方法ラット神経節組織移植Lewisラットの脊椎後根の神経節組織をLewisラットの盲腸から上行結腸の漿膜下に正常群と腸管虚血再灌流負荷群に移植した。2週間後、ラットを犠牲死させて、腸管組織を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色。クロモグラニン染色、シナプトフィジン染色を行い、神経節組織の生着を検討した。その結果、神経節細胞の生着率は両群ともに100%の生着率であった。生着の状態は虚血・再潅流負荷を加えたほうが、正常腸管に移植する群に比べて、より神経節組織が筋層内で癒合している所見を得られた。ラット神経節細胞移植Lewisラットの脊椎後根の神経節細胞浮遊液をLewisラットの盲腸から上行結腸の漿膜下に正常群:腸管虚血再灌流負荷群に移植した。尚、細胞移植は一匹のラットの3ヶ所に、それぞれ異なる細胞数で移植した。移植後2週間後に、ラットを犠牲死させて、腸管組織を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色。クロモグラニン染色、シナプトフィジン染色を行い、神経節細胞の生着を検討している。3今後の研究計画さらに神経節組織移植、神経節細胞移植後の神経線維染色を行い、移植した神経節組織と神経節細胞と腸管の神経線維がネットワークを形成するか否かを検討している。また、これとは別に、PGFPを遺伝子導入した神経節細胞移植を企画している。現在,Lewisラットの腓骨神経細胞及び大腸のmyelinated plexusを採取し、初代培養細胞を用いて,pEGFPをサイトメガロウイルスプロモーターの下流に組み込んだベクターを遺伝子銃を用いて導入し,得られたEGFP導入後の神経細胞を、大腸の粘膜面から粘膜下層と漿膜面から筋層に注入し神経節細胞移植モデルを作成し,ラットは、粘膜面よりの注入に用いた腸管開放部より口側を人工肛門とし、肛門側は縫合閉鎖し、閉腹後に通常の固形食を与え管理している。閉腹後3日、7日、2週間後、1ヶ月後に神経節細胞を導入した腸管を切除し,蛍光顕微鏡を用いての移植神経節細胞の生着と神経線維の増生,ヘマトキシリン.エオジン染色、アセチルコリンエステラーゼ染色、NSE染色による移植神経節細胞と元来、存在する神経細胞と神経繊維の形態の観察抗GFAP抗体による免疫染色による外来神経繊維か内因性の神経繊維かの鑑別を行っているまた電顕による神経節細胞の変性、神経ニューロンの形態を観察する。

さらに,ラット大腸の15分間虚血モデルを作成し,基礎実験として,閉腹後3日、7日、2週間後、1ヶ月後の大腸の組織が,如何に変化するかを上記の染色法を用いて検討中である.昨年度の研究成果として、ラットの腓骨神経節細胞ならびに大腸のMyelinated Plexusを採取し、初代培養細胞を用いて遺伝子銃を用いてpEGFを導入しようと試みたが、1腓骨神経節細胞は、数的に非常に少量しか採取できないこと2大腸のMyelinated Plexusは、採取が困難で培養が困難であること3培養wellへの遺伝子銃による導入が導入効率が低いことから、ラットの脊髄の後根神経節細胞を用いて以下の研究を行った。成熟ラットの脊髄後根神経節を摘出し、培養液に保存した。この神経節を、別のラットを開腹し、その大腸の筋層下に組織移植を行った群を作成した。現在、このラットの組織移植後3日目と7日目の移植した神経節組織の状態を組織学的に検討している。別のラットの成熟ラットの脊髄後根神経節を摘出し、コラゲナーゼ処理後に、培養液中に保存し、リン酸デキストラン法で、pEGFを導入し、その標識した細胞100個200個/0.1mlを別のラットの大腸の漿膜下に移植し、その神経節細胞の状態を組織学的に検討している。さらに、今回のラットは成熟ラットを用いたが、神経節細胞培養が長期間、可能である胎児ラットの神経節細胞を用いての同様の研究計画を企画している。
多細胞生物起源の研究

立襟鞭毛虫は動物に最も近縁な単細胞生物であり、進化における動物の多細胞化を理解する上で重要な生物である。本研究では、立襟鞭毛虫の一種Monosigaovataのゲノム計画を進め、他の生物との遺伝子比較等を網羅的に行った。その結果、細胞間情報伝達に関与する遺伝子については動物と立襟鞭毛虫との間での共通性が高いこと、遺伝子発現調節に関与する遺伝子には動物特異的なものが多いことが明らかになった。今年度までに、立襟鞭毛虫の一種Monosiga avataの大量培養に成功し、国立情報学研究所・藤山秋佐夫教授および国立遺伝学研究所・小原雄治教授の両研究グループの協力のもと、M.ovataのゲノムDNA精製およびゲノムDNAクローニング(BAC, fosmid)を行い、ゲノム塩基配列決定も開始している。RT-PCR法によってM.ovataのシグナル伝達系に関与するホスホリパーゼC、イノシトール3リン酸受容体およびリアノジン受容体遺伝子を単離し、塩基配列決定および最尤法による詳細な分子系統樹解析を行った。その結果、動物特異的と考えられていたこれら遺伝子の多様化が、立襟鞭毛虫と動物の分岐以前に既に起きていたことが明らかになった。大阪大学微生物病研究所の岡田雅人教授の研究グループと共同で、立襟鞭毛虫(M.ovata)および海綿動物(カワカイメン)のチロシンキナーゼsrcとCSKの機能解析を進めており、立襟鞭毛虫と動物のこれら遺伝子産物の共通点や相違点が明らかになりつつある。src特異的阻害剤をM.ovataの培養液中に加えると、単独性と言われているM.ovataが集合体(群体)を形成し、近接した細胞とフィロポディア様の突起によって接着することが確認された。このM.ovataの細胞接着分子メカニズムの解明は、動物の多細胞化を分子(遺伝子)レベルで理解する上での大変重要な知見をもたらすものと期待される。ゲノム比較を行う上で必要となる高次データベースの構築と整備を京都大学化学研究所の隈啓一客員助教授と共同で進めており、これまでに、シグナル伝達系に関与する遺伝子を中心とする「シグナル伝達系データベース」のプロトタイプを作成している。このデータベースには、ゲノム配列が決定された真核生物の遺伝子に関する情報や近隣結合法によって推定された各遺伝子の分子系統樹の情報なども掲載されている。また、大量データ処理に必要不可欠となる複数配列アライメントのソフトウェア改良等についても継続的に行っており、着実に成果を上げている。国立情報学研究所・藤山秋佐夫教授および国立遺伝学研究所・小原雄治教授の両研究グループの協力のもと、立襟鞭毛虫の一種物Monosiga ovataのゲノムDNA精製およびゲノムDNAライブラリー(BAC, fosmid)の作製を行い、ホールゲノムショットガン(WGS)法によるゲノム全塩基配列決定を進めた。小原教授の研究グループの協力のもと、M.ovataのゲノム部分配列(WGSデータの初期アセンブリーによるcontig)を用いた予備解析を行った結果、以下のことが明らかになった。(1)ゲノムG+C含量は約57%である。(2)反復配列が非常に多く、イントロンに2塩基単位の反復配列が多く観察される。(3)イントロンは比較的短いものが多く、平均長は100塩基前後と推定される。(4)ゲノムサイズは、当初の推定値である約1.52億塩基対よりも小さい(1億塩基対以下)可能性がある。東京大学の菅野純夫教授および藤山教授の両研究グループの協力のもと、M.ovataの完全長cDNAライブラリーを作製した。現在、小原教授の研究グループの協力のもと、完全長cDNAライブラリーの大量配列決定を進めている。大阪大学・岡田雅人教授の研究グループと共同で、M.ovataおよび海綿動物(カワカイメン)のチロシンキナーゼSrcとCSKの機能解析を進め、立襟鞭毛虫と動物のこれら遺伝子産物の共通点や相違点を明らかにした。昨年度に引き続き、ゲノム比較を行う上で必要となるデータベースの整備を進め、シグナル伝達系・細胞接着・転写制御・アポトーシスに関与する遺伝子群を中心とする「多細胞化関連遺伝子データベース」のプロトタイプを作製した。このデータベースには、ゲノム配列が決定された真核生物の遺伝子に関する情報や近隣結合法によつて推定された分子系統樹の情報なども掲載されている。M.ovataのゲノム配列決定の進展に伴い、動物の多細胞化を遺伝子レベルから理解するための重要な情報が得られつつある。昨年度に引き続き、国立情報学研究所・藤山秋佐夫教授および国立遺伝学研究所・小原雄治教授の両研究グループの協力のもと、立襟鞭毛虫の一種MonosigaovataのゲノムDNAライブラリー(BAC, fosmid)を用いたホールゲノムショットガン(WGS)法によるゲノム全塩基配列決定を進めた。また、東京大学の菅野純夫教授、藤山教授、小原教授の各研究グループの協力のもと、M. ovata完全長cDNAの大量配列決定も進めた。なお、M. ovataのゲノム部分塩基配列データおよび完全長cDNAの配列データについては、2007年12月に、DDBJより公開した。

東京大学の森下真一教授の研究グループの協力のもと、M. ovataのゲノム部分塩基配列データを用いた解析を行った結果、(1)ゲノムG+C含量は約57%、(2)反復配列が非常に多く、イントロンに2塩基単位の反復配列が多い、(3)イントロンは比較的短いものが多く、平均長は100塩基前後、(4)ゲノムサイズは、当初の推定値である約1.52億塩基対よりも小さい(46千万塩基対)可能性があることが明らかになっている。また、同ゲノム部分配列データを用いて、(1)各種生物のゲノムおよび遺伝子に対する網羅的相同検索、(2)タンパク質の各種ドメインに関する(Pfam Hidden Markov Modelを用いた)相同性検索、(3)シグナル伝達系・細胞接着・転写制御・アポトーシスに関与する遺伝子群についての網羅的系統樹推定(近隣結合法による予備的解析)、(4)M. ovataゲノムに多数存在するカドヘリン関連遺伝子のドメイン構造推定、(5)上記解析結果を閲覧できるデータベース(仮称:DAGMAN)およびブラウザの試作などの予備的解析も行った。その結果、シグナル伝達系関連遺伝子(PTK, PTP, PLC, PDEなど)が多数存在することが強く示唆された。なお、接着因子、転写因子、アポトーシス関連遺伝子については、このような傾向は観察されなかった。国立情報学研究所・藤山秋佐夫教授および国立遺伝学研究所・小原雄治教授の両研究グループの協力のもと、立襟鞭毛虫の一種MonosigaovataのゲノムDNAライブラリー(BAC, fosmid)を用いたホールゲノムショットガン(WGS)法によるゲノム全塩基配列決定を進めた。昨年度までに作成していたM. orataのゲノム配列データ(build2.0)には、配列特異的なシークエンスエラー(高G+C含量の影響によるもの)が含まれていることが判明しため、今年度はこのエラー対策を行い、WGS法による新たなゲノム塩基配列データを追加し、東京大学の森下真一教授(領域1 :生命システム情報)の研究グループの協力のもと、scaffoldの再構築を行った。新たに作成したゲノム配列データ(build3.0)を用いて予備解析を行った結果、現在までに、M. ovataゲノムについて以下のことが明からかになった。(1)推定ゲノムサイズは約64Mb。(2)推定遺伝子数は約12,700、平均遺伝子長は約4,3000bp。(3)ゲノムのG+C含量は58.4%。(4)遺伝子当たりの平均イントロン数は約6.7、平均イントロン長は約330bp。(5)イントロンやスペーサーなどの非コード領域に2塩基単位の繰り返し配列が多数観察される。(6)動物型のテロメア様配列が全体で約80カ所検出された。
イノベーションが重要な市場における企業結合規制のあり方に関する総合的研究

イノベーションや研究開発が特に重要な市場における適切な競争政策・競争法の適用・執行のあり方を考えるため、企業結合規制に特に着目して研究を行った。具体的には、イノベーション競争や研究開発競争の減少が問題となった米国・EUの企業結合審査事例を収集し、市場の画定方法、反競争効果の分析、競争促進効果の分析、競争回復措置(問題解消措置)の設計の各段階についてそれぞれどのように競争法上の評価・分析が行われているのかを検討し、慎重に審査すべき識別基準、違法性判断基準、審査分析の手法、証拠・立証方法、問題解消措置の設計のあり方について我が国における示唆を得るべく分析を行った。本研究は、平成23年度平成26年度の4年間で、イノベーションや研究開発が特に重要な市場における適切な競争政策・競争法の適用・執行のあり方を考えるため、企業結合規制に着目して研究するものである。具体的には、イノベーション競争や研究開発競争に対する考慮が競争法上の評価・分析の対象となる全ての段階(市場の画定、反競争効果の分析、競争促進効果の分析、競争回復措置(問題解消措置)の設計の各段階)について、米国、EU、および、我が国における企業結合規制における分析事例を素材にして、行政機関における合併審査の諸問題のみならず、裁判所における司法審査に耐えうる証拠・立証のあり方も含めて、多角的、総合的に比較法研究する。これにより、4年間の研究期間内に、イノベーション競争や研究開発競争に対する考慮が競争法上の評価・分析の対象となる企業結合についての違法性判断基準、審査分析の手法、証拠・立証方法、問題解消措置の設計のあり方を明らかにする。本年度は、イノベーション競争や研究開発競争の減少が問題となった米国・EUの分析事例の収集・分析と、米国・EUの競争当局関係者のスピーチや論文等から伺える問題意識の分析を行った。本年度は、FRAND宣言付きの標準必須特許を含む膨大な特許ポートフォーリオの取得を目的とした、スマートフォンやタブレットなどの無線端末産業における企業結合審査事例をとりあげ、FRAND宣言付き標準必須特許の特許権保有者が移転される場合(特許権の譲渡により権利者が法的に変更される場合のみならず、株式取得による完全子会社化を通じて、実質的な権利行使主体が変更される場合も含む)に生じる競争上の懸念について検討した。その際には、合併後に懸念される反競争的行動が行われる前に、事前に、問題解消措置等の方法で対応する企業結合規制(特許取得時に行う事前規制)だけでなく、反競争的行動が行われたあとに、事後的に、市場支配的地位の濫用規制(日本の私的独占規制に相当する規制)で対応する視点も、上記の事例分析を行う上で取り入れた。来年度は、2つ以上の顧客を媒介し、間接のネットワーク効果が働く、インターネット上におけるプラットーフォームビジネスに関する企業結合審査上で配慮すべき点を検討するべく、海外競争当局の審査事例を検討する予定である。本研究は、イノベーションや研究開発が特に重要な市場における適切な競争政策・法の執行のあり方を企業結合規制(合併・買収による合併後のイノベーション・研究開発への取組みの低下等の悪影響を事前に防ぐ公正取引委員会による審査制度)に着目して研究する。具体的には、イノベーションや研究開発が特に重要な市場における企業結合に対する競争法・独占禁止法上の評価・分析方法、競争回復措置の設計方法について、行政機関による審査の諸問題のみならず、裁判所における司法審査に耐えうる証拠・立証のあり方をも含め、アメリカ、EUにおける事例を参照しつつ、多角的、総合的に比較法研究するものである。本年度は、2001年に米国・連邦取引委員会(FTC)が審査手続を打ち切り、不問に付した製薬企業同士の株式取得であるGenzyme/Novazyme事件を中心に検討した。本件では、難病の治療薬がまだ市場化されておらず、また2社しか研究開発を進めていない状況の中で、当該2社が結合することによるイノベーション競争・研究開発競争の遅延・低下が反競争効果として問題となる一方で、本件株式取得により未だ治療法が確立していない難病の治療薬の開発が成功する可能性が高まる等の効率性の向上効果が重視された。イノベーション市場の画定の是非、製薬業界におけるイノベーション競争・研究開発競争への悪影響の捉え方、証拠・立証方法、効率性の向上効果の考慮の仕方等の点で、参考となる事例である。具体的には、イノベーション競争や研究開発競争に対する考慮が競争法上の評価・分析の対象となる全ての段階(市場の画定、反競争効果の分析、競争促進効果の分析、競争回復措置(問題解消措置)の設計の各段階)について、米国、EU、および、我が国における企業結合規制における分析事例を素材として、行政機関における合併審査の諸問題のみならず、裁判所における司法審査に耐えうる証拠・立証のあり方も含めて、多角的、総合的に比較法研究する。

本年度は、近時、双方向市場(two-sided markets)として経済学・経営学における研究が進んでいる、異なる2つ以上の顧客群を媒介し、一方のサイドの顧客群の数が多ければ多いほど、他方サイドの顧客群にとっての効用が高まる間接のネットワーク効果が働く、インターネット上におけるプラットフォームビジネス(たとえば、検索サイトやオークションサイトなど)に関するM&Aにおいて、企業結合審査上で配慮すべき課題や慎重に審査すべき識別基準等を明らかにするため、米国やEUなどの海外競争当局の審査事例を中心に検討した。最終年度では、2015年の電気通信事業法改正により、電気通信事業の登録の更新制度が設けられ、総務省による企業結合審査の仕組みが導入されたことを検討した(池田千鶴「電気通信分野における寡占化・グループ化・連携サービスへの対応と規律」日本経済法学会年報58巻55頁ー72頁(2015年))。設備設置事業者のグループ化による更なる寡占化を防止し、設備設置事業者によるサービスの多様化・料金の低廉化の実現や、積極的な投資の維持・促進を図るため、設備設置事業者による競争の縮退を招くおそれの高いMNO間の合併や株式取得等、グループ化に係る資本取引が競争に与える影響について問題ないか否かを総務省が審査を行うことが可能となる。固定通信市場でも、新規事業者が線路敷設基盤(電柱・管路等)を新規に整備することが容易ではない等の特性に鑑み、グループ化の進展により設備設置事業者による競争の確保に支障を及ぼす懸念等を防止する必要があるのは移動通信市場と同様であることから、移動通信だけでなく、固定通信も新制度の対象となる。米国の連邦通信委員会(FCC)制度をモデルとしたものである。総務省による企業結合審査の仕組み(電気通信事業の登録の更新制度)の導入により、公正取引委員会が行う独占禁止法に基づく企業結合規制との二重規制の評価が問題となる。たしかに、企業結合がもたらす競争への影響を考慮する点では共通するが、独占禁止法1条と電気通信事業法1条のぞれぞれの目的や審査要件も異なる上に、総務省の新制度は設備競争の維持に関心がある一方で、公正取引委員会の企業結合審査では、商品・役務の市場を中心に市場支配力が形成、維持、強化される蓋然性を分析し着眼点も異なるため、不要な二重規制というわけではないように思われる。ただし、条件を付す場合には、相互に矛盾する内容とならないように、公正取引委員会と総務省との間で連携が取られることが望ましい。イノベーションや研究開発が特に重要な市場における適切な競争政策・競争法の適用・執行のあり方を考えるため、企業結合規制に特に着目して研究を行った。具体的には、イノベーション競争や研究開発競争の減少が問題となった米国・EUの企業結合審査事例を収集し、市場の画定方法、反競争効果の分析、競争促進効果の分析、競争回復措置(問題解消措置)の設計の各段階についてそれぞれどのように競争法上の評価・分析が行われているのかを検討し、慎重に審査すべき識別基準、違法性判断基準、審査分析の手法、証拠・立証方法、問題解消措置の設計のあり方について我が国における示唆を得るべく分析を行った。海外競争当局(米国司法省、連邦取引委員会、欧州委員会)のWebサイトには、当該企業結合案件の検討結果や報道発表資料が掲載されており、イノベーション競争の減少が反競争効果して問題となったケースの収集はウェブを通じて可能である。また、年次報告書や競争当局関係者によるスピーチ原稿もウェブを通じて収集可能である。
ニカルジピン持続投与による静脈炎発現に対する薬学的介入の有用性評価

【目的】ニカルジピン注射液は静脈投与が唯一可能なCa拮抗薬であるため、ICU病棟で汎用されるが、しばしば静脈炎が発現する。一方、ニカルジピン注射液の添付文書の重要な基本的注意の欄に「本剤を長時間投与し、注射部位に痛みや発赤等がみられた場合には、注射部位を変更すること」と記載されているが、静脈炎の発現頻度は不明である。さらに、ニカルジピン注射液の静脈炎に関する論文報告もなく、その対応や予防策が確立していないのが現状である。そこで本研究では、ニカルジピン注射液による静脈炎予防の取り組みを行い、その効果について評価した。【方法】2009年1月から2014年2月の期間中に、ICU病棟においてニカルジピン注射液を末梢より持続投与された患者を対象とした。静脈炎発生に関与する危険因子を後ろ向きに解析し、得られた結果を基に、ニカルジピン注射液を持続投与する患者に対して以下の4項目について薬剤師より注意喚起を行った。1添付文書推奨濃度の0.01-0.02%の順守、2投与速度45mL/h以下での投与、3投与時間が20時間を超えた場合のモニタリングの強化、4少なぐとも96時間での投与ルートの差し替え。さらに、上記4項目の取り組み前後における静脈炎発現状況を調査した。なお、本研究は九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認を得た後に実施した。【成果】静脈炎発生に関与する危険因子の解析の結果、静脈炎発生には投与時間と投与速度が危険因子であることが示唆された。また、静脈炎発現率は、介入前は34.1%(14名/41名)であったが、介入後は11.7%(4名/34名)と有意に減少した。また、介入前は3名の患者で重篤な静脈炎が発現したが、介入後はいずれの静脈炎も軽症であった。以上の結果から、ニカルジピン持続投与による静脈炎発現に対する薬学的介入が有用であることが明らかとなった。
口腔癌臨床標本由来の変異NOTCH1の機能解析【新規標的治療開発に向けて】

1P53、PIK3CAなど既知のがん関連遺伝子については他の固形癌と類似したスペクトラムで変異がみられた。NOTCH経路の遺伝子群に28%と高頻度に変異がみられた。とくに、NOTCH1変異についてはリガンド結合領域に集中していた。HRAS変異については1.8%と低頻度の変異が認められた(口腔外科学会2017年、京都、発表)。2Flow cytometryにおいて、変異NOTCH1の細胞膜局在は不安定になっていた。免疫蛍光法でWT細胞の活性化NOTCH1は核内に認められたが、変異NOTCH1においては細胞質に認められた。qPCRにおいてMOCKと比較し、WTではHES1、HEY1のmRNA発現量が有意に上昇していたが(3倍、P<0.01)、変異NOTCH1では有意に減少していた(37%、P<0.01)。細胞増殖能力はMOCK細胞と比較してWT細胞は有意に(p<0.01)細胞が上昇していたが、変異NOTCH1細胞においては有意に(p<0.01)低下していた。ヌードマウスへの生着率はWT細胞は80%であったが、変異NOTCH1細胞では0%であった(Oncology Reports 2017, Uchibori, Ota, etal)。3マウス脇腹におけるconditional変異HRAS発現マウスを得るプレ実験データが得られた。現在のところ腫瘍化は認められなかった。現在も解析を継続している。口腔癌標本由来NOTCH1変異の機能解析を行っている。A465T変異は、細胞膜への局在の低下、活性化NOTCH1の核内局在の低下、下流因子のmRNA発現レベルの低下を示し、経路の活性低下がみられた。また、A465T発現細胞は、細胞増殖能力が低下し、ヌードマウスへの移植実験では生着率がコントロールに比較して低かった。以上の結果を、Oncology Reportsという海外誌に投稿中である。現在、次世代シークエンサーにより口腔癌臨床標本に対する大規模遺伝子解析を行っている。プレ実験として、申請者らがサンガー法で解析して報告したNOTCH1の変異(青山らBBRC2014)を陽性コントロールとして上記ライブラリーを用いて腫瘍部を×200・正常部を×100の平均カバレッジ深度になるようにシークエンスした。その結果、正常部に全く認められない1塩基変異が腫瘍部でのみリード数の65%の割合で認められ、P値は3.4×10-27と非常に高い信頼度のデータを得られた。この結果は非常に純度の高いものであり、同カバレッジ深度でヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity: LOH)も信頼度が高く評価が可能である。本年の日本癌学会で発表予定である。また、臨床標本の組織切片に対して、NOTCH1、EGFR、変異P53などの免疫組織化学染色による発現解析も行っている。最終年度も引き続き解析を継続する。口腔癌臨床標本由来の変異NOTCH1の機能解析、臨床標本に対する大規模遺伝子解析については、本学分子生命科学教室の協力のもと順調に遂行されている。また、所属教室では多くの手術症例があり、標本の収集も順調である。【結果】1P53などのがん関連遺伝子は他の固形癌と類似したスペクトラムで変異がみられた。NOTCH1変異についてはリガンド結合領域に集中していた。(口腔外科学会2017年、京都、発表)。2変異NOTCH1の細胞膜局在は不安定になっていた。WT細胞の活性化NOTCH1は核内に認められたが、変異NOTCH1においては細胞質に認められた。生着率はWT細胞は80%であったが、変異NOTCH1細胞では0%であった(Oncology Reports 2017)臨床標本に対する遺伝子解析は終了しており、当初の目標を達成している。機能解析についても、NOTCHの腫瘍原性を考察するデータまでは得られている。そのため、おおむね順調と評価した。今後、臨床標本の遺伝子解析データを論文報告していきたい。

細胞増殖能力はMOCK細胞と比較してWT細胞は有意に(p<0.01)細胞が上昇していたが、変異NOTCH1細胞においては有意に(p<0.01)低下していた。ヌードマウスへの生着率はWT細胞は80%であったが、変異NOTCH1細胞では0%であった(Oncology Reports 2017, Uchibori, Ota, etal)。3マウス脇腹におけるconditional変異HRAS発現マウスを得るプレ実験データが得られた。現在のところ腫瘍化は認められなかった。現在も解析を継続している。現在までに、遺伝子解析およびNOTCH1変異の機能解析については、当初の予定通りに進んでいる。最終年度には、大規模遺伝子解析を100例程度行い、報告することを目標としており、現在シークエンサーでランする前段階にある。その結果と臨床情報とを統計学的に照合する予定である。また、変異NOTCH1の解析については、現在1変異のみ海外誌に投稿中であるが、他の変異についても発現細胞を樹立している。同様の手法で数変異について解析し、さらに口腔癌におけるNOTCH1変異の意義について解明できると考えている。臨床標本の遺伝子解析はに加え、機能面の評価としてトランスクリプトーム解析を予定している。また、機能解析については、遺伝子改変マウスによる解析も行いたいと考えている。次世代シークエンサーによる解析が、市場の変動によりキットが安価に購入できたことにより差が生じた。消耗品の価格改定により、若干の相違が生じたため。次年度はサンプル数を追加することにより、差額を使用する。標本数を増やしてシークエンスを行い、使用する予定である。
mTORC1脱制御機構の解明・克服は、進行期CMLの薬剤耐性を打破できるか？

進行期慢性骨髄性白血病(CML)とチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)耐性について。CMLは融合遺伝子BCR/ABLにより発症する造血器悪性腫瘍であり、未治療では数年の慢性期を経た後に、急性白血病に似た致死的な進行期CML(移行期/急性転化期)に移行し、有効な治療法のない時代の生存期間中央値は数年であった。BCR/ABL融合蛋白を標的としたTKIは、慢性期の殆どの患者に極めて高い持続的な効果をもたらし、その予後を劇的に改善した。一方で進行期CMLでは、TKIの効果は一時的で、高率に耐性を生じその予後は極めて不良である。耐性患者の多くでBCR-ABL非依存的に、様々な成長因子受容体を介してPI3K/Akt/mTOR経路の活性化が見られ、TKI耐性に関わっていると報告されている。mTORは細胞増殖、生存、成長、および代謝機構を調節する細胞内の栄養センサーとして働くセリンスレオニンキナーゼである。mTORは細胞においてmTORC1およびmTORC2という2種類のタンパク質複合体として存在しており、それぞれ特異的な結合タンパク質であるRaptorおよびRictorを構成タンパク質とする。申請者は本研究において、慢性期と進行期CML(移行期/急性転化期)の骨髄臨床検体を比較するRNA解析を行い、特にmTORの構成要素であるRaptorの発現異常と、Pi3k/AKT経路の活性化signatureを確認した。現在Raptorの発現異常により、Pi3k/AKT経路の活性化,TKI耐性を再現できるか, CML細胞株のK562を用いて検証実験をおこなっているところである。予備実験において進行期CML症例にて、mTORC1の主要構成要素の脱制御が生じている可能性を見出した。そこで医科研病院のゲノム解析同意取得進行期CML症例(n=1)、慢性期CML症例(n=1)、Ph(+)ALL症例(n=1)、非ホジキンリンパ腫症例(n=1)のRNA-seqによる発現解析を行った。Library調整kitとしてTruseq RNA access (illumina社)を用い、次世代シーケンサはNextSeq500を用いた。サンプルはtotal RNA20ngをinputとした。解析pipelineはGenomon RNAを用いた。結果、CML-BC症例だけでなく、Ph+ALLにおいてmTORC1の主要構成要素遺伝子の発現異常がRNA seqでも確認された。これらはCML-CP症例やcontrolの非ホジキンリンパ腫症例では観察されなかった。今後は症例を増やして解析していきたい。当初は10例ほどの進行期CML症例でのRNA seq解析を予定していたが、ゲノム解析の同意が取得できた症例が2例しか得られなかった。慢性骨髄性白血病(CML)の原因であるBCRABLを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は殆どの慢性期CML患者に長期生存をもたらしている。一方、進行期患者ではTKI耐性を示し、その予後は極めて不良であり、その克服が急務である。主な耐性機序の一つにmTOR経路の活性化が挙げられ、mTOR阻害剤をTKIと併用する試みは一定の成果を上げている。一方で新たな耐性を生み出す問題も指摘されている。申請者はmTOR複合体の主要構成要素であるRaptorが、進行期CML症例においてのみ脱制御を受けている可能性を見出した。本研究は進行期CML症例でのRaptorの脱制御の機能的意義を、TKI耐性の面から明らかにすることを当初の目的とした。2016年度に引き続き2017年度は、1)進行期CML症例において実際にRaptor、およびmTOR経路が脱制御を受けているかを実証する2)脱制御があれば、その機構をターゲットシークエンスや全エクソンシークエンスなどのゲノム解析で解明するの2点を目標とした。具体的には慢性期および進行期CML症例10例のRNAシークエンスと全エクソンシークエンスを行った。結果、RNAシークエンスにて、Raptor、およびmTOR経路の発現異常を支持する所見を得た。しかし、全エクソンシークエンスなどのゲノム解析ではこれらRaptor、およびmTOR経路の遺伝子異常は見出せなかった。Raptor、およびmTOR経路の発現異常の原因として当初想定していたのはdirectなゲノム異常、即ちRaptor、およびmTOR経路のゲノム異常であると考えていたが、より上流のpathway異常やepigeneticな遺伝子のゲノム異常や、場合によってはepigenetic異常を考慮する必要があると考えられた。RNAシークエンスにて、Raptor、およびmTOR経路の発現異常を支持する所見を得たものの、Raptor mTOR経路を標的としたパネル解析、全エクソンシークエンスなどのゲノム解析ではこれら発現異常の原因となるRaptor、およびmTOR経路近辺の遺伝子異常を見出す事ができなかった。よって、RaptorおよびmTOR経路の発現異常をin vitroで再現する系の構築には至らなかった。

耐性患者の多くでBCR-ABL非依存的に、様々な成長因子受容体を介してPI3K/Akt/mTOR経路の活性化が見られ、TKI耐性に関わっていると報告されている。mTORは細胞増殖、生存、成長、および代謝機構を調節する細胞内の栄養センサーとして働くセリンスレオニンキナーゼである。mTORは細胞においてmTORC1およびmTORC2という2種類のタンパク質複合体として存在しており、それぞれ特異的な結合タンパク質であるRaptorおよびRictorを構成タンパク質とする。申請者は本研究において、慢性期と進行期CML(移行期/急性転化期)の骨髄臨床検体を比較するRNA解析を行い、特にmTORの構成要素であるRaptorの発現異常と、Pi3k/AKT経路の活性化signatureを確認した。現在Raptorの発現異常により、Pi3k/AKT経路の活性化,TKI耐性を再現できるか, CML細胞株のK562を用いて検証実験をおこなっているところである。10例ほどの進行期CML症例でのRNA seq解析を予定している。進行期CML症例があつまらなければ、同じく1例ではあるが同様の現象が確認された類縁疾患であるPh染色体陽性急性リンパ性白血病も解析の候補として加える予定である。また、発現異常が多数例で確認できればその機序をゲノム変異(必要ならepigenetics)の観点から探索予定である。Raptor、およびmTOR経路の発現異常の原因としてdirectなRaptor、およびmTOR経路のゲノム異常を中心に申請時には考えていたが、より上流のpathway異常やepigeneticな遺伝子のゲノム異常や、場合によってはepigenetic異常を考慮する必要があると考えられる。よって、本年度は得られているRNAシークエンス結果、全エクソンシークエンス結果の再解析などを既報や公共のpathway、CHIP seqのdatabaseを用いて行い、引き続き脱制御機構の機序解明を目指す。脱制御の機序解明は極めて重要である。機序解明が得られれば当初の予定通り、RaptorおよびmTOR経路の発現異常をin vitroで再現する系の構築まで行いたい。
高齢者の難聴が配偶者の身体的・心理的健康及び活動・参加に及ぼす影響の探索

難聴高齢者の配偶者に対して、難聴が配偶者に与える影響を配偶者の身体的、心理的、社会的な影響を探索した。その結果、配偶者の難聴高齢者に対しては、コミュニケーションに関する負担を感じながらも、老いの自然な姿として捉えていることも語りから確認できた。さらに、量的調査から、身体的な状況は約80%が普通以上の健康状態であり、心理的にはコミュニケーションの変更や関係性の変化に負担を感じていたものの、配偶者の主体的健康感が高い場合はストレスの感じ方が低く、配偶者の愛情の度合いが高ければ関係性の変化や変化した状況へ適応することへの情緒的な反応も低くなることが明らかとなった。活動・参加はほとんど影響がなかった。本研究は、難聴高齢者の家族である配偶者が、難聴の高齢者のコミュニケーションや生活の中でどのようなストレスや社会参加への制限を感じているのか、また、それらに関連する要因を検討することを目的としている。本年度は、その一年目であり、当該年度の計画は二つである。一点目は、本研究の主要な概念である難聴高齢者の配偶者のストレスに関する文献の検討を行うことである。難聴高齢者の配偶者に関する文献は、これまでにいくつか検索されているものはあるが、スカリンシの作成した尺度(Significant Other Scale for Hearing Disability (SOS-HEAR))以上のものは見つけられなかった。そこで、手始めにスカリンシの作成した尺度の翻訳の許可を著者に得ることから始めた。数回のメールでの依頼を通して、著者より翻訳許可の受諾を得ることができた。その後、共同研究者とともに翻訳作業に入り、第一段階の和文への翻訳は終了した。二点目は、難聴高齢者と共に暮らす配偶者のストレスの実態を把握するためのインタビュー調査のための対象者の確保である。このために、地域在住高齢者を対象に難聴に関する講演会を開催した。講演会では、難聴の高齢者本人への影響を話すとともに、共に暮らす家族への影響を説明することで、研究対象者の募集も同時に行った。その結果、講演会参加者60人の内の約5割の研究協力候補者を得ることができた。しかし、研究参加候補者は単身者が多かったことと、夫婦二人暮らしであっても難聴を認めないケースも多く、調査対象者としては3組の確保にとどまった。。平成27年度においては、平成26年度に課題となっていた研究対象者である難聴高齢者と暮らす「配偶者」の確保に努めた。その方法として、地域の社会福祉協議会主催の介護予防事業において、難聴と介護予防の関連性に関する健康教室を開催し、参加者より研究対象候補者を募ったところ、新たに5名を得ることができた。この5名に対し、難聴高齢者と暮らすうえでの配偶者としての困り事などについて聞き取り調査を実施した。これにより、昨年度からの3名を加えて合計8名の配偶者が得られ、その聞き取り結果から、当初の仮説を支持する内容もあるものの、各夫婦によりストレスの感じ方にも大きな違いがあることが明らかとなった。従って、わが国の難聴高齢者の配偶者のストレスに関する共通性を導き出すまでにいたっていないと判断した。以上から次年度に於いても、さらに対象者を募り、聞き取りを重ね、わが国における難聴の高齢者と暮らす配偶者のストレスや社会活動への影響を質的に探索していく計画である。さらに、Dr Scarinciらの作成した尺度について、わが国での適用を検討するためにバックトランスレーションを予定していたが、わが国の高齢者の聞き取りを重ねていく中で、ストレスの感じ方やその状況に大きな隔たりを感じたため、尺度の使用そのものについても検討を行う必要があることから、平成28年度に向けて継続して再翻訳の有無や内容を含めて検討していく予定である。平成27年度は、難聴高齢者の配偶者を探索し、難聴の高齢者と暮らすうえでのストレスや社会参加への影響を聞き取ることであった。研究対象者の探索のために、介護予防に関連する健康教室の講演の機会を得たことから、その全会場(8会場)に出向き、難聴と介護予防に関する講演を合計160名余りに実施し、その後対象者を募ったものの、最終的に面接が実施できたのは5名のみであった。さらに、その5名に聞き取りを実施したところ、5組の夫婦によりストレスのレベルや感じ方も全く異なるために、共通性を導き出すことができす、さらに、先行研究で抽出されている内容とも大きく異なることから、わが国の高齢者夫婦のストレスをもう少し聞き取ることが必要と考え、新たな対象者の探索を計画し、取り組みはじめたところである。平成28年度は,難聴のある高齢者と暮らす配偶者の精神的なストレスの認知の仕方について,平成27年度に引き続き配偶者からの聞き取り調査を実施した。対象は研究分担者である大学附属病院の耳鼻咽喉科医師からの紹介,シルバー人材センターでの対象者募集,地域における介護予防事業等の広報活動を通して28年度には新たに15名の研究協力を得ることができた。これにより,対象者は合計23名となった。その内,条件を満たした12名分(男性5名,女性7名平均年齢78.3歳)の聞き取りデータを文字に起こし,文脈の意味を吟味しながら分類したところ以下のような結果が得られた。

「テレビの音が大きくていらいらする」,「夜通しラジオを大音量で聞いているのでとてもうるさく眠れない」,「会話の声が大きすぎて隣の家まで聞こえるようだ」などの【自分を基準にした音量設定】,「何度も同じことを聞いてくる」や「聞こえるようにはっきり話して」など【自分の理解に基づいた会話の要求】など,聞こえに関わるストレスの認知について抽出された。さらに,それらの認知以外に,「会議で相手の声が聞こえているのか心配になる」や「「自分と娘や孫との会話の中に入ってこられないで,一人で料理だけ食べている」姿を想像したり実際に経験して感じている【聞こえづらさへの同情心】や「聞こえにくい状況はこの先自分も歳を取れば同じようになる」といった【老いの姿としての難聴の受容】を配偶者の姿をとおして感じている状況も抽出された。一方「大声で一方的に言いたいことをいうだけなので,萎縮する気持ちになる」や「聞こえにくいために,会話もほとんど無い」ことから,【距離をおいた関係】が伺えた。今後は,データをさらに詳細に分析し,わが国における難聴の高齢者をもつ配偶者のストレスを測定可能な項目からなる尺度を提案する計画である。平成27年度にも記載したことであるが,難聴のある高齢者と暮らす配偶者のストレスや社会参加の制限等を調査し,難聴という事象が当事者以外へ与える影響を探ることが本研究課題であった。研究開始後,先行研究であるScarinciらのオーストラリアの対象をもとに作成された尺度を翻訳し,和訳後の文言の妥当性を確認する目的で条件に合う対象者を探したところ,対象者の抽出及び選出に多くの時間を要したことが遅延の第一の理由である。さらに,得られた対象者に対して翻訳した尺度を用いたところ,該当しない項目が半数以上あることが判明した。この状況から,翻訳した尺度で調査を継続することは適切でないと判断し,わが国の難聴をもつ高齢者の配偶者の実情把握を最優先で行うこととした。この計画の修正が研究遅延の第二の理由である。その様な中で,平成28年度は27年度分に追加データを加え,それをもとにわが国の難聴高齢者と暮らす配偶者のストレスと感ることや難聴高齢者に感ている態度等を把握することができた。この内容をもとにScarinciの論文の質問項目を参考にして平成29年度はわが国独自の尺度を作成し量的調査を実施する予定である。平成29年度は、難聴のある高齢者の配偶者151名に対し、続柄、身体的状況及び外出・交流頻度、愛情尺度、並びにSucarinciの考案したSOS-Hear尺度(難聴者のための重要他者尺度)を翻訳した邦文版にて心理的・社会的影響をさらにそれらの関係性について調査した。SOS-Hear和文版は、「コミュニケーションの変更(6項目)」「コミュニケーションの負担(6項目)」「関係の変化(3項目)」「外出と社交(4項目)」「適応への情緒的反応(5項目)」「配偶者に対する気遣い(3項目)」で構成され、苦痛の程度を「とてもそう思う」4点から「全く思わない」1点の4段階で把握した。結果は以下の通りであった。配偶者は、男性48名(31.8%)、女性103名(68.2%)、平均年齢は73.8±4.6歳であった。配偶者の主観的健康感は普通以上が121名(78.8%)であった。SOS-Hear(和文)は、「コミュニケーションの変更」は、12.9±3.5点、「コミュニケーションの負担」10.6±3.7点「関係の変化」5.0±1.9点「外出と社交」7.0±2.3点「適応への情緒的反応」9.6±3.2点「配偶者に対する気遣い」
3'-非翻訳領域による薬物代謝酵素発現の制御とその機構に関する薬理遺伝学的研究

薬物代謝酵素活性の個体差の原因の一つとして遺伝子多型が注目されているが、3'-非翻訳領域の多型に着目した研究は少ない。本研究では、グルクロン酸転移酵素UGT1A1を対象に、3'-非翻訳領域の多型の影響を解析することを目的とした。具体的には本遺伝子の3'-非翻訳領域に連鎖して存在する多型群(1813C>T, 1941C>G, 2042>G : ^#IBハプロタイプ)を解析対象とした。野生型及び^#IBを有する変異型発現プラスミドを調整後、COS-1細胞またはHepG2細胞にトランスフェクトした。24時間後にアクチノマイシンD処理を行って転写を止め、さらに経時的に細胞より全RNA画分またはミクロソーム画分を回収し、リアルタイムPCR法にてmRNAの定量を、イムノブロット法にて蛋白質の定量を行い、野生型と変異型の場合を比較した。mRNA及び蛋白質共に、変異型では発現レベルが低くなる傾向が見られたが、有意な差は認められなかった。また、安定性には全く差が見られなかった。UGT1A1は生体内においてビリルビンの抱合反応を担っている。そこで、日本人健常人554名につき、UGT1A1ハプロタイプと総ビリルビン値との相関解析を行った。ハプロタイプ^#IBを有するヒトでは、野生型ディプロタイプのヒトに比べ、^#IB単独ではビリルビン値上昇に有意な変化が見られないものの、エンハンサー領域の多型を有する^#60(-3279T>G)と同一染色体上にある場合、有意なビリルビン値の上昇が認められた。さらに、^#60単独では、有意な影響は認められなかった。以上の結果から、^#IBハプロタイプが有する機能影響は小さいものの、^#60と連鎖して同時に存在することにより、in vivoでは相加的(または相乗的)に機能影響が認められたと考えられ、3'-非翻訳領域の多型の重要性が示唆された。本研究では、グルクロン酸抱合酵素UGT1A1を対象に、3'-非翻訳領域の遺伝子多型のmRNA安定性・代謝能等への影響を解析することを目的とする。本年度はUGT1A1全長cDNAのクローニング及び変異体発現プラスミドの作成を行った。1.全長cDNAクローニング最近の研究により、mRNAはその5'末端と3'末端が結合したループ構造で蛋白質翻訳を行うことが報告されている。実際のin vivoでの状態に則した条件で解析を行うため、本研究では転写開始よりpoly Aまでを含めた全長のUGT1A1 cDNAをクローニングした。具体的には、肝臓のpolyA RNAにつきoligo dTプライマーを用いて逆転写後に両端にタグ配列をつけ、本タグ配列およびcDNA特異的なプライマーを用いて増幅することにより5'-RACEおよび3'-RACEを行った。シーケンシングにより確認した配列をゲノムDNAの参照配列(AF297093)と比較して5'末および3'末が最も長いクローンを選択した。cDNA全長が増幅できるプライマーを設計して増幅し、哺乳動物発現用CMVプロモーターを有するベクターに挿入した。大腸菌を形質転換後、クローンよりプラスミドを調製し、全cDNA配列の確認を行い、人為的な変異が導入されていないことを確認した。

2.変異導入クローニングしたcDNAに、日本人由来検体において既に同定していた3'-非翻訳領域の遺伝子多型3種を、個別にまたは同時に変異導入した。具体的には、変異を持つプライマーを用いた方法により変異を導入し、大腸菌を形質転換後、クローンよりプラスミドを調製し、全cDNA配列の確認を行い、目的とする変異の導入および目的の場所以外に変異が導入されていないことを確認した。薬物代謝酵素活性の個体差の原因の一つとして遺伝子多型が注目されているが、3'-非翻訳領域の多型に着目した研究は少ない。本研究では、グルクロン酸抱合酵素UGTIAIを対象に、3'-非翻訳領域の多型のmRNA安定性・代謝能等への影響を解析することを目的とする。本年度は変異体発現プラスミドの導入及び発現、及びin vivoにおけるビリルビン値とハプロタイプとの相関解析を行った。1.変異体発現プラスミドの導入及び発現昨年度調製した野生型及び変異型(^#IB:3'-非翻訳領域の遺伝子多型1813C>T、1941CC>G、2042CC>Gが連鎖)ハプロタイプを有するプラスミドを大量に調製し、COS-1細胞及びHepG2細胞にトランスフェクションした。各細胞につき全RNA画分およびミクロソーム画分を調製し、それぞれTaqMan法及びImunoblot法にて解析し、野生型及び変異型共にmRNA及び蛋白の発現を確認した。UGT1A1は生体内においてビリルビンの抱合反応を担っている。そこで、日本人健常人554名につき、UGT1A1ハプロタイブと総ビリルビン値との相関解析を行った。ハプロタイプ^#IBを有するヒトは、野生型ディプロタイプのヒトに比べ、単独ではビリルビン値上昇に有意な影響を与えないものの、エンハンサーの多型を有する^#60(-3279T>G)と同一染色体上にあり、かつもう一本の染色体上に^#6(Gly71Arg)が存在する場合、有意なビリルビン値の上昇が認められた。一方、^#60単独のハプロタイプと^#66との組み合わせでは、有意な上昇は認められなかった。このことから^#6IBハプロタイプはin vivoレベルで、ビリルビン値の上昇に寄与することが明らかとなり、UGT1A1活性の低下に関与することが示唆された。昨年度は、UGT1A1の3^'-非翻訳領域で見いだされた、3種の連鎖する遺伝子多型を同時に有する変異型発現プラスミドに関し、培養細胞における発現を確認したが、今年度はその解析を行った。1.mRNM発現レベルおよび安定性の解析野生型及び変異型発現プラスミドを、COS-1細胞及びHepG2細胞にトランスフェクトした。24時間後にアクチノマイシンD処理を行って転写を止め、さらに経時的に細胞より全RNA画分を回収し、リアルタイムPCR法にてUGT1A1 mRNAの定量を行い、野生型と変異型の場合を比較した。特にCOS-1細胞において、変異型では発現レベルが低くなる傾向が見られたが、有意な差は認められなかった。また、安定性には全く差が見られなかった。2.蛋白質発現レベル及び安定性の解析野生型及び変異型発現プラスミドを、HepG2細胞にトランスフェクトした。24時間後にアクチノマイシンD処理を行って転写を止め、さらに一定時間後に細胞よりミクロソーム画分を回収し、イムノプロット法にてUGT1A1蛋白の定量を行い、野生型と変異型の場合を比較した。変異型で発現レベルが低い傾向が得られたが、安定性の差は認められなかった。
骨格筋損傷修復を制御する新たなシグナル伝達経路

骨格筋は再生能の高い組織であり、その損傷修復過程においては、骨格筋における組織幹細胞である筋衛星細胞(SCs: satellite cells)が重要な役割を担っている。本研究において、我々は受容体型チロシンキナーゼRor1がSCsに選択的に発現しており、骨格筋損傷に伴い発現・産生される炎症性サイトカインがSCsに作用し、NF-κB経路を活性化することによりRor1の発現が増強されることを見出した。さらに、SCsにおいて発現増強されるRor1がSCsの機能制御において重要な役割を担うことを明らかにした。平成26年度の研究では、申請者の研究室における実験動物飼育状況の制約等のため、当該年度後半における筋衛星細胞(SCs)特異的なRor1遺伝子ノックアウト(KO)マウスの作製以外は、主に筋芽細胞株C2C12細胞を用いたin vitro分化誘導系を用いた解析を行い、以下の成果を得た。(1)Ror1floxedマウスとPax7CreERT2/+マウスの交配により、SCs特異的なRor1KO(cKO)マウスを作製した。(2)C2C12細胞を用いた筋分化誘導系においてRor1の発現を抑制すると筋分化が促進すること、およびRor1の高発現により筋分化が抑制されることから、Ror1は筋分化を抑制することが示唆された(未発表)。(3)またIL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインにより、NF-κB経路の活性化を介してRor1の発現が増加することが見出された(未発表)。(4)さらに、マウスRor1遺伝子上流のレポーター解析により、この遺伝子上流の-1-500, -1000-1500bpが炎症性サイトカインによるRor1の発現誘導に必要なこと、およびこれらの領域にNF-κB結合部位が存在することが見出された(未発表)。平成27年度の研究では、前年度の研究成果を踏まえて、(前脛骨筋へのカルディオトキシン投与による)マウス骨格筋損傷修復モデルを用いて受容体型チロシンキナーゼRor1の発現・機能の解析を行った。その結果、Ror1が骨格筋組織幹細胞である衛星細胞(SCs)に特異的に発現しており、骨格筋損傷に伴い、その発現が一過的に誘導されることが明らかになった。また、骨格筋損傷により誘導されるRor1の発現は、炎症性サイトカインTnf-α、Il-1βの発現誘導に引き続いて起こることが見出された(未発表)。さらに、骨格筋損傷によるRor1の発現誘導は、TNF-α及びIL-1βに対する特異的中和抗体の投与により抑制されること、ならびにRor1の発現抑制によりSCsの増殖が阻害されることが明らかになった(未発表)。また、C2C12細胞を用いたin vitroの解析から、TNF-αやIL-1βによるC2C12細胞の増殖は、Ror1の発現抑制により阻害されることが示された(未発表)。さらに、SCs特異的なRor1コンディショナルノックアウトマウス(Ror1 cKO)を作製したところ、骨格筋損傷に伴うSCsの増殖が阻害されること、及びRor1 cKOマウス由来のSCsではスフィア解析において、野生型マウス由来のSCsに比べて、スフィアのサイズ、数が顕著に減少することが明らかになった(未発表)。以上のin vivo、in vitroの解析から、骨格筋損傷修復に伴い(免疫担当細胞等より)発現誘導・産生されるTNF-α、IL-1βによりSCsにおいてRor1の発現が一過的に増強され、SCsの増殖・幹細胞性維持において重要な役割を担うことが明らかになった。本年度の研究により、筋衛星細胞(SCs)特異的Ror1遺伝子KOマウスを作製することができた。また、C2C12細胞を用いたin vitro分化誘導系により、Ror1が筋分化を抑制することを明らかにした。さらに、炎症性サイトカインによりNF-κB経路の活性化を介してRor1の発現を誘導することを見出し、当初の目的・計画に鑑みて、SCs特異的なRor1cKOマウスを用いた解析は実施できなかったが、C2C12細胞を用いたin vitroの解析によりRor1遺伝子上流のNF-κB結合部位についての情報を得ることができ、想定以上の研究成果を挙げることができたと考えられるため、本研究は順調に進展していると判断される。また、最終年度(平成27年度)に向けた、Ror1cKOマウスを用いた予備実験を概ね完了しており、準備状況も良好であると考えている。分子細胞生物学(今後の推進方策)

平成26年度はC2C12細胞を用いたin vitro筋分化誘導系による解析を進めてきたが、最終年度(平成27年度)では平成26年度に実施することが出来なかったSCs特異的なRor1cKOマウスを用いてのカルディオトキシン(CTX)による骨格筋損傷修復モデル実験を実施し、その分子病態解析を推進することにより、in vivoでのSCsに発現するRor1の役割を明らかにするとともに、Ror1さらにはそのリガンドであるWnt5aの関与の有無についても検討することにより、その分子機構の実体を解明したいと考えている。また、平成26年度の研究によりC2C12細胞を用いたin vitro解析系からもRor1の発現誘導機構についても興味深い予備的な成果を挙げることが出来たので、今後は遺伝子発現制御機構についても詳細に検討する予定である。さらに、研究の進捗状況を踏まえて、同じRorファミリー受容体型チロシンキナーゼであるRor2の骨格筋損傷修復過程における役割についても検討する計画である。前述のとおり、平成26年度の研究では、申請者の研究室における実験動物飼育スペースなどの制約のため、当該年度での実験動物を用いた研究は、同年度後半における筋衛星細胞(SCs)特異的なRor1遺伝子ノックアウト(KO)マウスの作製およびCTXを用いた骨格筋損傷修復モデルの予備実験にとどめた。平成27年度では、上半期よりSCs特異的なRor1cKOマウスを用いた解析を推進するため、これらのマウスの飼育、維持、遺伝子型解析、骨格筋損傷修復モデルにおける病理組織学的・免疫化学的解析を強力に実施する必要があり、実験補助者を雇用するための経費についても重点的に使用する計画である。