hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳神経系発生過程における前駆細胞特異的マーカーの単離と解析

脳の発生過程における前駆細胞のマーカーを単離するために、我々はまず、発現しているmRNA量の違いに基づいてcDNAクローンを単離するための方法について改善を加えた。一連の実験により、(1)発現量が比較的多いものについてはmodified differentialscreening法(total cDNA probeをcDNA library DNAから調製する方法)を、(2)発現量が比較的少ないものについては改良型cDNAサブトラクション法(Directional tag PCR subtraction法)を用いることによりcDNAクローンが効率よく選択できることを示し、(3)発現量の確認にはNorthern blot解析法に代ってcDNA library DNA Southern blot解析法が有用であることを明らかにした。これらの手法を使用することによりcDNA libraryを一度調製すればそれ以後組織からのRNAを必要とせずに解析を行うことができるので、微量の発生過程の脳組織を用いての解析に有用である。我々は次に、胎生16日のラット脳からpoly (A) RNAを抽出してcDNA libraryを作製し、上記の手法を用いて、胎生期ラット脳には豊富に存在するが成熟脳における発現は著しく減少するmRNAのcDNAクローンの単離を行なった。我々はこのような"胎生期脳選択的"cDNAクローンをこれまでに22種類単離することに成功し、上記の手法が有効であることを示した。塩基配列解析の結果、それら“胎生期脳選択的"クローンの中には9種の既知クローン(βtubulin Mβ5、αtubulinMα1,tymosinβ10,stathmin,βtubulin Mβ2,α-internexin,ferritin Lg subunit,neuronatin,amphoterin)と、13種の新規クローンが含まれていることが判明した。in situ hybridization法での解析では、これらのmRNAの発現は各クローンごとに様々のパターンを呈しながら、脳発達に伴って減少していた。これらの中に、発達過程の小脳の外顆粒層やsubventricular zoneに選択性の強い発現を示すクローンが認められ、脳神経系の発生・分化過程の解析に有用な新しい分子マーカーとして利用できる可能性が示された。本研究の目的は、ラット脳の発生過程で胎生期特異的に発現する遺伝子群を単離し、それらのmRNA発現パターンを詳細に解析することにより、脳神経系の発生・分化過程の解析に有用な新しい分子マーカーを同定することである。我々は、胎生16日のラット脳からpoly(A)RNAを抽出してcDNA libraryを作製し、この中から、胎生16日の脳に比べて生後30日のラット脳で発現が著しく減少するmRNAに対するcDNAクローンを、differential screening法及びその改良法(cDNA library DNA-Southem blot法)を用いて選択した。そして、得られた候補クローンのmRNA発現パターンをNorthem blot法とin situ hybridization法で解析した。その結果、胎生16日脳のcDNA約450クローンの中から、胎生期の脳に選択的に発現するmRNAのcDNAクローンをこれまでに5種類単離することができた。それらのクローンの部分塩基配列を解析したところ、このうち3種はデータベース中の既知の配列(βtubulin Mβ5,thymosin β10,S24類似のribosomal protein)と一致したが、2種については報告されていない新しい遺伝子であることが判明した。in situ hybridization法での解析結果では、これらのmRNAは、各遺伝子ごとに様々な発現パターンを示しながら脳発達に伴って減少しており、生後30日脳での発現は非常に弱いものの、一部の細胞群には尚有意の発現が認められた。また興味深いことに、これらの中のいくつかの遺伝子では、発達過程の小脳外顆粒層やsubventricular zoneに選択性の強い発現が認められた。今回の研究により、ラット脳の発達過程において、胎生期に選択的に発現している遺伝子群はかなり数多く存在することが明らかになり、遺伝子工学的な手法の有用性が示された。このような胎生期選択的な遺伝子群の系統的随所はこれまでほとんど行われておらず、今後、遺伝子発現パターンをさらに詳細に解析すると共にコードする蛋白の構造解析等を行なうことにより、神経系発生過程の各種の前駆細胞を識別する新しい分子マーカーが同定できると考えられる。
難治(療)喘息の病態解明とその対策

1.抗原吸入発作時の肺・気道系におけるケミカルメディエーター遊離のメカニズムと各種自律神経受容体の変化:抗原吸入による感作モルモットの肺で検討した。まず発作15分後にPhospholipaseA_2の活性が50%上昇、やや遅れてロイコトリエンB_4が増加し、3時間後には白血球、次いで好酸球が集積する。この集積した血球と粘膜上皮細胞などを含むlung membraneのリン脂質では、Phosphatidyl choline2.13±0.34mg/10mgProtein(48%)の他、Cholesterol0.52±0.09(12%)、Phosphatidyl ethanolamine1.37±0.11(31%)、Sphyngmyelin0.42±0.04(9%)などが占めていた。一方、アレルギー反応と密接な関係があるとされてきたPhosphatidyl inositolは数%と推定された。更に、アラキドン酸が切り出されるリン脂質は、主にPhosphatidyl choline、Phosphatidyl ethanolanineであり、ともに1/31/5が減少してアラキドン酸が数倍に増加すること、更に、βー受容体数が著減するのに比し、a_1の受容体は増加を示すことも報告した。2.βー交感神経受容体を介さない気管支拡張薬の開発と臨床応用cGMPの上昇により気管支拡張効果を示す薬剤については、既に報告している。(1)抗コリン薬:抗コリン薬の吸入は、コリン受容体を20%以上減少させること、副作用が殆んどないこと、などの点でレギュラーユースにしうると判断された。(2)新キサンチン薬:1メチル-3プロピルのタイプが非常に強い気管支拡張効果を持つことを見出した。この薬剤は高親和性タイプのcAMPフォスホディエステラーゼに対し、強力な阻害作用を持つ。組織のcAMP濃度の低いことを考えると生理的意義が高い。臨床上のSide effectsについては今後検討。(3)コルフォルシン:臨床応用には、なお、検討の継続が必要である。1.抗原吸入の肺・気道系における細胞膜破壊のメカニズムとプロセス,並びに各種自律神経受容体の変化抗原吸入による感作モルモットの肺では,まず15分後にPhospholipase A_2活性が約4050%上昇し,やや遅れてロイコトリエンB_4が増加したあと,白血球が集績することを証明した(Migration of neutrophils in experimental asthma,Ann Allergy in press).この集積した白血球と粘膜上皮細胞などを含むlung membrane preparationを調整し,どのようなメカニズムでロイコトリエンが産生されるかを検討した.その第一歩として,細胞膜では,どのような脂質がどんな割合で存在するかを測定した.従来報告されているPhosphatidyl choline2.13±0.34mg/10mg Proteinの他, cholesterol0.52±0.09, Phosphatidyl ethanolamine 1.37±0.11Sphyngmyelin0.42±0.04などの存在も証明し,一方,アレルギー反応と密接な関係があるとされてきたPhosphatidyl inositolは数%以下と推定される成績を得た.

更に,これらのうち,抗原吸入による感作・発作でアラキドン酸が切り出される隣脂質は,目にPhosphotidyl choline Phosphatidyl ethanolamineであり,ともに約1/3が減少し,アラキドン酸が数倍に増加すること,更に, βー受容体数が著減するのに比し,a_1容受体は増加の傾向を示すことも新しい知見として報告した(Mechanism responsible for alternations in Numbers of Autonomic nerve veceptors in experimental asthma,Arch Allergy and Immunology,in press).1.病因・病態生理の関係(1)気管支喘息患者を対象に、抗原吸入時の気道収縮とロイコトリエン(LT)の関係を検討するため、前者1秒量、後者LTB_4を指標として測定した。その結果、遅発型においてもLTの増加が1秒量の低下に先行することが分った。(2)感作モルモットの抗原吸入時における気管支肺胞洗浄液(BALF)を経済的に測定した。その結果、吸入間もなくフォスフォライペース活性とLTB_4が相次いで上昇し、次いで3時間遅れで好中球、更に3時間以上遅れで好酸球が集積・増加することが分った。(3)上述と同様の実験で肺(細胞)膜のβー受容体は30%以上減少、αー受容体は37%増加することが分った。更に、この減少は、主としてフォスフォライペースA_2の増加によることも証明できた。2.βー交感神経受容体を介さない気管支拡張薬の開発と臨床応用cGMP上昇による気管支拡張効果を示す薬剤については、既に報告している。(1)抗コリン薬:喘息における気管支平滑筋の収縮(緊張)に迷走神経の関与が考えられている。抗コリン薬の投与はコリン受容体を20%以上減少させること、副作用が殆んどないこと、などの点でレギュラーコースにしうると判断された。(2)新キカンチン薬:1メチルー3プロピルのタイプが非常に強い気管支拡張効果を持つことを見出した。この薬剤は高親和性タイプのcAMPフォスホディエステラーゼに対する強力な阻害作用を持つ。組織のcAMP濃度を考えるとこの酵素の阻害は生理的意義が高い。今後、臨床検討が待たれる。(3)コルフォルシン:アデニレートサイクラーゼを直接活性化することによる気管支拡張効果を持つ。心臓血管等への作用もあることより、臨床応用には、更に検討が必要である。
高齢者の健康アウトカムを予測する血清β2ミクログロブリンの意義とその機序

一般高齢者において血清β2-microglobulin(β2-M)濃度が軽度から中等度高いことの臨床疫学的意義については不明であった。われわれは世界に先駆けて、血清β2-M濃度が一般高齢者における死亡(余命)を有意に予測することを報告した。本研究では、血清β2-Mの臨床疫学的意義をさらに明らかにするために、長期縦断研究のデータを用いて、死因別死亡、慢性腎臓病の発症、体力(歩行速度)の低下との関連を調べたものである。その結果、血清β2-M濃度は、循環器疾患なかでも脳卒中死亡と極めて強い関連があり、その機序に慢性腎疾患(CKD)が介在する可能性が示された。本研究の目的は、一般地域高齢者の健康アウトカムを予測する血清β_2ミクログロブリン(β_2-M)の意義とその機序を明らかにすることである。1.血清β_2-M濃度と主要死因別死亡との関連分析都老研特別プロジェクト「中年からの老化予防総合的長期追跡研究(TMIG-LISA)」の初回調査を受け解析に必要なすべてのデータがそろった65歳以上高齢者1,140人を8年間追跡し、がん死亡59例、循環器疾患死亡83例、その他の死亡73例を特定した。初回調査の血清β_2-M濃度が第1三分位(1.5mg/L以下)に比べた第2三分位(1.6-1.8mg/L)および第3三分位(1.9mg/L以上)の多変量調整済みハザード比は、がん死亡では1.50(95%Cl:0.75-3.00)、1.34(0.57-3.17)、循環器疾患死亡では3.12(1.33-7.29)、4.24(1.75-10.3)、その他の死亡では2.53(1.11-5.77)、4.16(1.76-9.79)であった。2.血清β_2-M濃度と慢性腎臓病(CKD)との関連分析TMIG-LISAでADL障害かつCKD(eGFRが60mL/min/1.73m^2未満)をもたない65歳以上高齢者450人を8年間追跡し、73例(16.2%)の新規CKDを特定した。初回調査の血清β_2-M濃度が第1三分位、第2三分位および第3三分位それぞれのCKD累積罹患率(および多変量調整済みオッズ比;OR)は、10.6%(OR=reference)、10.4%(OR=1.09;0.53-2.24)、34.6%(OR=4.44;2.13-9.25)であり、ROC曲線のAURは0.703であった。血清β_2-MとCKDとの関連の強さおよび予測の精確性は、eGFRよりやや劣るもののcystatin Cとほぼ同等であった。我々はこれまで血清β_2-M濃度が高い高齢者ほどのちの総死亡やADL障害を起こすリスクが高いことを明らかにしてきたが、本研究により、それらは循環器系疾患や慢性腎臓病を介している可能性が高いことが示された。本年度は、既存データを用いて血清β_2ミクログロブリン(β_2-M)と体力との関連を分析するとともに、縦断調査を継続する計画であった。1.縦断調査の継続1) TMIG-LISA対象者のうち2009年時点の生存者について転帰調査(生・死、転居の確認)を実施した。2)草津縦断研究において医学健診を実施し65歳以上住民約560名のデータを入手した。血清β_2-Mと体力との関連分析は、現在まとめ中である。代わりに、追跡期間を延長しアウトカムを増やし、血清β_2-Mと主要死因別死亡との関連を詳細に分析したのでここに報告する。TMIG-LISAの初回調査を受けADL障害がないと判定された高齢者(≧65歳)1,048人を、その後10年間追跡した。この間の死亡例については指定統計目的外使用の許可を得て原死因を特定し、がん、循環器疾患、その他に3分類した。初回調査時の血清β_2-M濃度を男女別三分位にわけ、Kaplan-Meiyer法により生存曲線を比較し、さらにCox比例ハザードモデルを用いて各死因との独立した関連性を調べた。追跡期間中303人が死亡し、その内訳はがん74、循環器疾患115(うち脳卒中57、心疾患55)、その他102、不明12であった。血清β_2-M濃度が高いほど循環器疾患死亡リスクが高かった。

性、年齢、調査地域、既往歴、BMI、血圧、Hb、Alb、HbA1c、T-Chol、HDL-Chol、尿蛋白、eGFR、cystatin C、WBC、logCRP、logIL-6、健康度自己評価、うつの有無を調整した、第2および第3三分位のハザード比(第1三分位=reference)は、循環器疾患では2.36(95%Cl:1.21-4.61)、3.31(1.62-6.76)、うち脳卒中では3.78(1.45-9.88)、4.58(1.59-13.2)であった。血清β_2-Mは一般高齢者における循環器疾患(とりわけ脳卒中)死亡の強い独立した予測因子である。本年度は、縦断調査を継続しながら、血清β_2ミクログロブリン(β_2-M)濃度に影響する因子を分析し、高齢者の血清β_2-M濃度がライフスタイル等の修飾により可変なものかどうかを明らかにする計画であった。1.縦断調査の継続草津縦断研究における悉皆調査(65歳以上1,952人が応答)と医学健診(同611人が受診)を実施した。一般地域住民(新潟県Y町で2004年に実施した基本健康診査の受診者1,402人)における血清β_2-M濃度はどの年齢階級においても男女差は見られず、60歳以降は急峻に上昇していた。草津縦断研究の70歳以上高齢者539人および都健康長寿医療センターの縦断研究(TMIG-LISA)の対象コホート65歳以上高齢者1,081人のデータを用いた横断分析では、血清β_2-M濃度は腎機能指標(Cr,Cystatin C,推定GFR,尿蛋白の有無)と最も強く関連していたが、重回帰分析法により腎機能指標など重要な交絡要因を調整しても、老化・栄養指標(年齢,BMI,Hb,A1b)や炎症指標(CRP,WBC)あるいは血清脂質(T-Chol,HDL-Chol)とそれぞれ独立して関連していた。興味深い点は、BMI,Hb,AlbおよびT-Cholとは負の相関性が、CRPやWBCとは正の相関性があったことである。ライフスタイルとの関連では、性、年齢、調査地域を調整しても、魚介類や卵の摂取頻度、喫煙・飲酒習慣、さらには身体組成・機能(骨格筋%,通常歩行速度)とも関連していた。心血管系疾患のpreclinicaldiseaseとしての動脈脈波伝播速度(baPWV)とも有意に相関していた。血清β_2-M濃度は食生活や身体活動により修飾可能であると推察され、今後、介入研究によりその検証を行う必要がある。
食道癌におけるトランスフェリン受容体の機能解明と分子標的薬の探索

ヒトの上部消化管に起こる食道癌は悪性度の高い癌であるものの、初期症状が殆どないため、発見時にはすでに進行しており周囲組織へ浸潤・転移していることも少なくない。本研究は食道癌の発症及び進行において重要と考えられるトランスフェリン受容体の詳細な機能解明を行うことで食道癌の病因を分子細胞レベルで理解し、分子標的治療薬の探索・創薬に繋げることを最終的なゴールと位置づける研究である。
戦前期日本の経済発展と地域経済構造

本研究の成果は以下の3点にまとめられる。明治期の警察統計データの入力を進めるとともに、明治大正期の府県別農林水産業従事者数と無業者数を推計し、既存の推計を改訂した。既存の推計にもとづきながら戦前期の府県間人口移動にかんするデータを作成し、戦前期の人口移動と地域間格差にかんする分析をおこなった。各国の長期的なGDP推計において、第三次産業のGDPがどのように推計されているかを調べ、今後の改訂において有効な方法および推計に際して留意すべき点を検討した。平成23年度中の研究成果は、大きくわけて2つある。ひとつは、1906年以前の府県別産業別有業人口のうち、無業者ならびに第一次産業従業者の系列を作成したことである。梅村又次による全国レベルの産業別有業人口は、1906年から1940年までをカバーしており、これを国勢調査や帝国死因統計のデータを使ってブレイクダウンすることで、当該期間の府県別データを作成することができる。しかし、それ以前の期間については、第一次産業と無業をのぞいて産業別有業人口の全国値が存在しない。そこで手はじめに、明治初期に作成された府県別の戸籍に記載された職業データを利用して、第一次産業および無業の府県別有業人口系列を作成した。具体的には、明治7年(1874年)の戸籍に掲載されている府県別職業別データから第一次産業従業者ならびに無業者の人口比を求め、これを1906年の同人口比と直線補間でつなげることで各年の比率を求め、この値に各年の人口を乗じて、府県別の値を求める。さらに、長期経済統計に記載されている全国値と、府県別値の合計が一致するように補正する。この作業が終了したことによって、警察統計を用いた府県別の第三次産業従業者数の推計(これが本研究計画の核心でもある)が完成すれば、残差として第二次産業の従業者数も算出できることになる。もう一つの成果は、史料としての警察統計の探索にかんするものである。現在、国立国会図書館に所蔵されていた警察統計については閲覧可能な状態にあるが、茨城県と北海道については明治期の警察統計はまったく所蔵されていない。しかし、調査により統計局図書館に、明治10年代の茨城県の警察統計が所蔵されていることが分かり、一部を複写して入手した。また、府県統計書にも明治期の警察業務関連のデータが掲載されている可能性が高いため、今後北海道にかんする調査とあわせて史料収集を進めることとした。本年度の研究計画では、警察統計にもとづき、明治大正期の府県別第三次産業人口を推計する予定であったが、マイクロフィッシュから必要な表を電子化する作業に予想以上の時間を要したため、年度内に推計を完成させることはできなかった(2013年7月完成予定)。また、上記の推計結果と、研究代表者による戦前期の府県間人口移動推計を組み合わせ、人口移動と府県間格差の関係を分析した。その結果、戦前期に見られた地域間格差の縮小傾向は、貧しい府県から豊かな府県へ人口移動によってもたらされた可能性が示唆され、この暫定的な結論は、2012年9月に一橋大学で開催されたAsian Historical Economics Conference(AHEC)で論文共著者により報告された(報告タイトル"Regional Inequalityand Migration in Prewar Japan 1890-1940")。警察統計の入力に十分な時間を取れていない。各年、各地域によって統計書のフォーマットがことなるため、入力作業を外部に委託することが難しいことが大きな要因である。しかし、今回推計した第一次産業および無業についての系列が比較的安定した(異常な動きが見られない)系列になったので、最終的には信頼度の高い推計値を作ることが可能なのではないかという感触を得ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。まずは、マイクロの紙焼き、統計局図書館所蔵資料の複写を行った上で、警察統計書データの入力を最優先で実施する。目標としては、夏期休暇中に概ね入力が終了している状態にしたい。時間がどうしても不足する場合には、大学院生等に入力作業を依頼することも検討する。
生殖免疫の立場から見た不育症、早産、妊娠高血圧症候群の病態解明

異物である胎児が拒絶されないことを免疫学的に検討し、また流産、早産、妊娠高血圧腎症(PE)などの妊娠合併症の免疫状態を対比することは疾患の予防・治療にも繋がる。本研究は免疫系を新たなパラダイムであるTh1/Th2/Th17/制御性T細胞(Treg)で検討し、さらに新たな細胞集団である制御性NK細胞(NKreg)につながった。(1)Tregからの解析:Treg細胞はアロ妊娠の際の着床や妊娠初期に重要であること、妊娠後期ではTreg細胞が減少しても妊娠異常が生じないことを明らかにした。また父親抗原を認識するTreg細胞が着床前に子宮領域リンパ節で増加し、着床直後に子宮で増加することを見い出した。(2)NKreg細胞からの解析:NKreg細胞がCD25を発現し、妊娠子宮に増加すること、NKreg細胞は免疫抑制に作用するIL-10、TGF-βを産生するが、拒絶に関与するIFNγ、TNFαの産生はないことを証明した。またLPSやpoly(I:C)を妊娠マウスに投与すると流産が引き起こされるが、NKreg細胞は炎症を抑制する作用があることを証明した。(3)Th17細胞からの解析:流産例では進行流産になると子宮内のTh17細胞が増加し、好中球も増加するが、臨床症状に乏しい初期流産では子宮内Th17細胞は変化しなかった。早産例では絨毛膜羊膜炎がIII度(最も進行したもの)では羊水中のIL-17が増加し、子宮内にもTh17細胞が増加した。IL-17はTNFαと協調し、羊膜細胞からのIL-8の産生を亢進させることも見い出した。(4)妊娠高血圧腎症(PE)の際の免疫:PEでは末梢血T細胞、NK細胞からのVEGFの産生が低下しており血管新生阻害の要因になること、Galectin 1発現が低下しトレランス機構が破綻していること、T細胞中のgranulysinが増加しており、かつTreg細胞も減少し拒絶反応が起こりやすい状況にあることを見い出した。異物である胎児を許容するために、母体は胎児許容機構を有し妊娠が維持されているが、この機構が破綻すると流産、早産、妊娠高血圧症候群が発症するとも考えられるが、詳細は不明である。本研究では、まず妊娠維持機構を明らかにし、次に妊娠合併症における母体免疫系の変化を明らかにした。本年度に得られた結果は以下の如くである。[正常妊娠における妊娠維持機構]これまで制御性T細胞(Treg)が妊娠維持に重要な役割を果たすことを報告してきたが、今回マウスの系でアロ妊娠の際、子宮と領域リンパ節にはアロ抗原特異的Tregが増加しており、しかもKi67陽性であることを証明し、妊娠子宮では父親由来抗原に対する免疫寛容を誘導していることを初めて証明した(投稿準備中)。また制御性NK細胞が存在することも明らかにし(J.Reprod.Immunol 2008)、これらNK細胞はpoly I:C、LPS、R837でTLR3、TLR4、TLR7を刺激してもNK活性が増強しないこと、IFN-γやTNF-αなどのThlサイトカイン産生が増強せず妊娠維持の重要な役割を果たすことを証明した(Fertil Steril 2008)。[異常妊娠における免疫機構]ヒト流産例の着床部ではgranulysin(GL)

陽性NK細胞が増加しており、NK細胞が絨毛外トロホブラスト(EVT)と接触しパーフォリンを介してEVTへGLが移行し、最終的に核に移行したGLによりアポトーシスで生じさせることを証明した(Am J Pathol 2008)。本研究はヒトにおいて母体免疫細胞が胎児組織に攻撃し流産の原因となることを示した初めての報告である。また早産例の羊水中ではThl7細胞から産生されるIL-17が増加し、IL-17はTNFαと相乗的に作用し羊膜間質細胞からのIL-8産生を高めること、この作用にはMAP kinaseが重要であることを証明した(第23回日本生殖免疫学会賞受賞)。その他Treg減少が着床不全や妊娠高血圧症候群の要因となることを見い出した。異物である胎児が母体から拒絶されずに妊娠が維持される機構を正常妊娠と異常妊娠で対比することにより明らかにすることが本研究の目的である。研究2年目で得た成果は以下の如くである。BALB/C♀x DBA/2♂の妊娠ではDBA/2に発現するMls la抗原を胎仔が発現し、母獣はT細胞受容体(Vβ6)で同抗原を認識する。この系を用いることにより着床前に子宮の領域リンパ節で父親抗原特異的制御性T(Treg細胞)が増殖していること、妊娠直後(5.5p.c)では子宮で同Treg細胞が増加することを見い出した。即ち父親抗原特異的Treg細胞が着床前からすでに領域リンパ節で増加し、着床に備えていることを初めて明らかにした。さらに着床期、妊娠初期にTreg細胞を抗CD25単クローン抗体で減少させるとアロ妊娠の場合のみ着床不全や流産が生じることも見い出した。現在、領域リンパ節から子宮への父親抗原特異的Treg細胞の移動に関与するケモカインの同定と、父親抗原特異的Treg細胞に発現する分子を同定中であり、ヒト妊娠に応用したいと考えている。ヒト妊娠において末梢血Th17細胞が変動しないことを初めて報告し、さらに進行流産や絨毛膜羊膜炎を呈した早産症例ではTh17細胞が子宮で増加し、TNFαとIL-17により、IL-8産生が相乗的に高まり炎症を増強させることも見い出した。さらに妊娠高血圧腎症(PE)では末梢血Treg細胞が減少し、そのメカニズムの1つとしてアポトーシスが亢進していること、PEのT細胞、NK細胞からのVEGF産生が低下しており血管新生に不都合を生じていること、トレランスに重要な役割を果たしているgalectin1発現がPE症例のT細胞、NK細胞で著滅していることを見い出した。以上の如く、研究2年目に多くの成果を得ることが出来、Treg細胞とTh17細胞の妊娠成立に果たす役割につき明らかにした。本年度の研究で、妊娠時のトレランスの誘導が妊娠維持に重要なことを明らかにした。(マウスを用いた研究)BALB/c x DBA/2の交配の際、DBA/2に発現するMls IaはT細胞受容体のVβ6で認識される。そのため父親抗原特異的制御性T細胞(Treg)はCD4^+CD25^+Foxp3^+Vβ6^+細胞で同定できる。さらにKi67発現をみることで父親抗原を認識し増殖するTregを同定できる。同Treg細胞は着床前に子宮所属リンパ節に集簇し、着床後に妊娠子宮に増加することを認めた。また同Treg細胞はCCR5、CCR4を高発現することを認めた。T細胞、B細胞を欠くNOD/SCIDマウスにBALB/c由来のCD4^+CD25^+細胞を除去したリンパ球を輸注しTreg欠損マウスを作製した。
ショウジョウバエ成熟神経系幹細胞の増殖・増殖停止・分化を制御する微小環境の解析

昨年度までに、ショウジョウバエ成虫脳において、羽化後の数日間、触角神経索周辺に位置するグリア細胞が増殖することを報告した。神経細胞のプログラム細胞死が同領域、同時期に進行していることを見いだしたとともに、グリア細胞の増殖を引き起こしていることを明らかにした。また、針による傷害や触覚切除による触角神経索の変性によって、同様のグリア細胞の増殖が引き起こされることが示唆された。本年度は、これらのグリア細胞の増殖が同様の機構によって引き起こされている可能性を検証するために、脊椎動物で傷害時の応答に深く関わっているTNFに着目した。ショウジョウバエのTNF遺伝子の一員であるEigerの変異体では、神経変性に対するグリア細胞の応答が鈍るばかりでなく、プログラム細胞死に応答するグリア細胞の増殖もほぼ抑えられていた。さらに触角神経索周辺部の一部の細胞にeigerが発現していることを確かめた。また羽化直後のプログラム細胞死は野生型と同程度に起きていることから、Eigerはこの細胞死には関わらないと考えられる。以上の結果は、損傷におけるグリア細胞の増殖ばかりでなく、神経細胞のプログラム細胞によるグリア細胞の増殖にもEigerが介在していることを示唆する。興味深いことに、eiger mutantでは神経細胞のプログラム細胞死が羽化3日後には野生型よりも多く起きていた。このことはEigerあるいはそれによって誘導されるグリア細胞の増殖が、プログラム細胞死によって引き起こされる二次的な影響を抑えていると考察される。本研究によって、成熟過程の脳における神経細胞のプログラム細胞死を補償する機構が存在すること、それが神経傷害への応答と少なくとも一部は同じ機構によっているという、いままでにない新しい知見を得ることができた。現在、国際誌に投稿をするべく準備を進めている。また、成虫脳全体の細胞数とその経時変化を計測する目的で共同研究を行っており、成果の一部は紀要として報告された。ショウジョウバエ成体脳における増殖細胞の有無を蛹期後期から羽化50日後(寿命は60日程度)まで解析した。キノコ体に関わる神経幹細胞はもっとも長く分裂を続け、羽化直前に分裂を終えると報告がある。蛹期後期にbrdUを注入したところ(DNA合成細胞が標識される)、キノコ体神経幹細胞だけでなく触角神経索周辺にもBrdU陽性細胞が観察された。羽化後のショウジョウバエにbrdUを餌として与えて解析したところ、羽化直後から6日後まで触角神経索周辺にBrdU陽性細胞が観察され、それ以降はほぼ観察されなかった。観察されたBrdU陽性細胞がDNA合成のみを行う多糸化細胞であるのか、あるいは分裂細胞であるのかを確かめるために、2時間のbrdU標識後すぐに固定した試料と、さらに5日間BrdUを含まない餌で飼育し固定した試料で、brdU陽性細胞数を比較した。その結果、標識直後よりも5日後の試料に、より多くのbrdU陽性細胞が観察された。また熱ショック誘導的に分裂細胞の一方の子孫細胞を標識するMARCM法を利用した解析の結果、触角神経索周辺に陽性細胞が観察された。以上の結果から、既知の分裂細胞よりも長く、また成体脳においても分裂する細胞が触角神経索周辺に存在することが明らかになった。BrdU陽性細胞の細胞種を同定するために神経細胞マーカーである抗ELAVとグリア細胞マーカーである抗REPO抗体を用いて、brduとの3重染色を行い解析したところ、分裂能を持つ細胞はグリア細胞であり、グリア細胞と同定できなかった細胞の2種類の細胞を産み出していることが示唆された。今回、観察された分裂細胞は胚期、蛹期の神経幹細胞とは異なる。一方、ほ乳類の成体脳にみられる神経幹細胞はグリア細胞であることが知られている。今回、細胞種を同定できなかったBrdU陽性細胞があり、神経細胞に分化している可能性を否定できない。ほ乳類との類似性を検証するため、今後より詳細な解析行う予定である。本研究によって明らかになったショウジョウバエ成体脳におけるBrdU陽性細胞のサブタイプの有無の検討とその同定を試みた。ショウジョウバエ成体脳には多くのグリア細胞があるが分類はなされていない。そこで低頻度ながらも分裂期に体細胞組み換えを引き起こすことによって子孫細胞の一方を標識することのできるMARCM法とBrdU標識、抗REPO抗体による免疫抗体染色を組み合わせて形態観察を試みた。その結果、ニューロパイル中に多数の突起をのばしているグリア細胞、二つの突起をもち触角神経索を囲んでいるグリア細胞、突起を持たず触角神経索の周囲に分布するグリアが観察された。標識効率がひくく増殖能を持つ細胞とその子孫細胞を同定するには至らなかったが、同じREPO陽性・BrdU陽性として識別される細胞集団は均質ではなく、形態からみて3つに分類できることをみいだした。グリア細胞の増殖を引き起こす要因を検討した。ショウジョウバエの腹随では羽化直後から神経細胞のプログラム細胞死が起きることが知られている。このような細胞死が細胞増殖と関わっている可能性を考えた。成体脳におけるプログラム細胞死の有無を検討したところ、触角神経索周辺に神経細胞のプログラム細胞死が観察された。そこでプログラム細胞死が抑制される変異体で解析したところ、BrdU陽性のグリア細胞は観察されなくなった。さらに触角を切除して触角神経索に軸索変性を誘導したところ、触角神経索周辺にBrdU陽性のグリア細胞が観察された。

また針で脳に損傷を与えた場合でも、その近傍にBrdU陽性のグリア細胞が観察された。以上の結果から、ショウジョウバエの成虫脳では発生の一過程であるプログラム細胞死に依存してグリア細胞の増殖が引き起こされているが、実は同様のグリア細胞の増殖は壊死や神経変性も含めた脳の障害によっても引き起こされており、グリア細胞の増殖は脳の恒常性の一端を担っているのではないかと考察した。昨年度までに、ショウジョウバエ成虫脳において、羽化後の数日間、触角神経索周辺に位置するグリア細胞が増殖することを報告した。神経細胞のプログラム細胞死が同領域、同時期に進行していることを見いだしたとともに、グリア細胞の増殖を引き起こしていることを明らかにした。また、針による傷害や触覚切除による触角神経索の変性によって、同様のグリア細胞の増殖が引き起こされることが示唆された。本年度は、これらのグリア細胞の増殖が同様の機構によって引き起こされている可能性を検証するために、脊椎動物で傷害時の応答に深く関わっているTNFに着目した。ショウジョウバエのTNF遺伝子の一員であるEigerの変異体では、神経変性に対するグリア細胞の応答が鈍るばかりでなく、プログラム細胞死に応答するグリア細胞の増殖もほぼ抑えられていた。さらに触角神経索周辺部の一部の細胞にeigerが発現していることを確かめた。また羽化直後のプログラム細胞死は野生型と同程度に起きていることから、Eigerはこの細胞死には関わらないと考えられる。以上の結果は、損傷におけるグリア細胞の増殖ばかりでなく、神経細胞のプログラム細胞によるグリア細胞の増殖にもEigerが介在していることを示唆する。興味深いことに、eiger mutantでは神経細胞のプログラム細胞死が羽化3日後には野生型よりも多く起きていた。このことはEigerあるいはそれによって誘導されるグリア細胞の増殖が、プログラム細胞死によって引き起こされる二次的な影響を抑えていると考察される。本研究によって、成熟過程の脳における神経細胞のプログラム細胞死を補償する機構が存在すること、それが神経傷害への応答と少なくとも一部は同じ機構によっているという、いままでにない新しい知見を得ることができた。現在、国際誌に投稿をするべく準備を進めている。また、成虫脳全体の細胞数とその経時変化を計測する目的で共同研究を行っており、成果の一部は紀要として報告された。
生業視点からみた現代山村におけるコミュニティ環境の分析

高齢化と人口減少に直面している現代山村コミュニティにおける住民の生活維持の工夫を、自然環境の生業的利用という視点からあきらかにしようと試みた。九州脊梁山脈の山村コミュニティを事例として、空中写真を用いた写真判読、インタビュー調査、T型集落点検を実施し、自然資源利用の変遷の実態を把握するとともに小規模な家族農業の役割について分析を行った。分析の結果、高齢化と人口減少に直面する山村コミュニティにおいては、自分たちの世帯と家族の生活維持のために行ってきた山村農業が自然環境の持続的な利用において重要な役割を果たしていることが示唆された。戦後日本の山村では、人口減少と高齢化により、山林や農地、水源など、周辺の生活環境の保全すら困難になりつつある集落も多いが、その実態が地理的経済的条件、その他のコミュニティのおかれた状況によって異なる。本研究の目的は、日常生活の存続条件である生業との関係に焦点をあてて、山村におけるコミュニティ環境の変化を検討することである。平成25年には、研究分担者とともに宮崎県諸塚村、および熊本県水俣市久木野地区におけるコミュニティ環境の変遷についての調査を実施した。調査項目は、世帯、家族から森林、水環境にわたる広範囲な内容を含んでいる。その結果、森林利用および水環境の変遷に関するデータを収集することができた。さらに、それらの調査地小地域のデータの一般化可能性を確保するために、条件のことなる山村地域等についての小規模な補充的調査も実施した。さらに、諸塚村については、写真判読等の方法により、航空写真を用いたベースマップを作成した。その結果、森林利用についての時系列的変化についての概要が把握されるとともに、同地域におけるヒアリングにベースマップを活用できるようになった。その成果の一部については、平成26年5月の西日本社会学会(西南学院大学)において研究分担者ととともに報告する予定である。研究の初年度にあたる本年度は、これまで得られた情報を整理しながら各自の調査可能領域を明確化し、調査対象地域についての目途をつけることを主な目標とした。そのため、現地調査および、調査その他の機会を利用した分担者との意見交換を重視した。調査の対象としたのは、阿蘇地域、水俣市域、諸塚村村域等の山村集落である。そのほか、九州の山村のなかで、グリーン・ツーリズムなどの環境を用いた顕著な活動が見られる地域についても参考地域として若干の調査を行った。現地調査では、山村(特に村落組織や家の現状、土地利用、人口移動)に関する資料を重点的に収集し、併せて住民への調査主旨や調査計画についての説明を行なった。さらに、一部の地域では調査票を用いた面接調査を実施し、世帯の家族構成や所得、生産活動の現状についての資料をえた。それらの調査を通して、既存の統計等では把握しにくい、生活用水への湧水等の利用実態や山菜の栽培などの自給のための多様な生業の実態、狩猟の現状や鳥獣への対策等を具体的な生活行動の水準で知ることができたことは本研究にとって重要かつ有意義であった。それらのデータは、写真および文書などのデータとして蓄積するとともに、研究分担者、調査補助者も含めた打ち合わせの機会を設け、現役農家を含む各方面の専門家からの助言も参考にしながら、調査の進め方を検討した。それらの検討を踏まえて、主に大字の範囲を対象とする航空写真判読による土地利用変遷の把握に着手し、今後のデータ整理および本研究の成果とりまとめの方向についての見通しを得た。人口減少の進む山村において、そこに住みつづける工夫を住民たちはいかに行ってきたのかという点を、戦後の山村コミュニティにおける自然環境利用の変遷に焦点をあてて明らかにすることを目的として研究を進めた。まず、焼き畑の伝統をもつ山村集落のなかから複数の地域を選定し、それらの地域において時代別の航空写真を用いた植生判読の結果や、すでに行政によって作成されていた地図資料等の分析を行い、さらにT型集落点検および住民へのインタビューによって山村の生活実態と環境の変化との関連性を把握した。その結果、限られた集落の事例からではあるが、伝統的な生活様式を維持していると思われる山村集落において、農という人の営みを軸に自然環境はかなり大きく変化し続けていること、さらにその持続的な変化過程に、人口減少や高齢化という条件下で生きる人々の生活保全の工夫が織り込まれていることを確認できた。それらの成果をもとに、西日本社会学会第72回大会において「〝農的自然〟の可能性ー生業、観光、食と農」と題するシンポジウムを行った。それらのシンポジウムの内容およびディスカッションをもとにして牧野厚史2015「今、なぜ〝農的自然〟なのか」、藤村美穂「現代山村における農的自然ーコモンズ論との対話ー」を西日本社会学会『西日本社会学年報』の特集論文として公表した。さらに本研究の成果の一部を用いて徳野貞雄監修、牧野厚史・松本貴文編『暮らしの視点からの地方再生』(九州大学出版会)を著書として公刊した。農村社会学、環境社会学ヒアリングによるデータ収集についてはおおむね順調に進捗しており、その成果公表の機会も予定されている。

その意味では順調に進捗している。ただし、航空写真判読については、1調査地区について作成が終了した状況である。そこで、(2)おおむね順調に進展しているという評価とした。当初計画では、以下のように目標を設定していた。調査対象地域について、これまで得られた情報を整理し、共有する。各自の調査可能領域を明確化し調査計画をたてる。同時に社会学以外の分野の文献も含め、山村研究(特に村落組織や家の研究、土地利用についての研究、人口移動に関する研究)の資料などを収集する。初年度の調査においては、それらをふまえて対象村落を具体的に選定し、上記iの聞き取り、iiを開始することである。それらの目標については達成した。さらに、本年度は一部の成果について学会報告等のかたちで公表できる見込みである。そこで(2)と評価した。最終年度である平成26年度は、調査を引き続き実施するとともに、航空写真判読によるベースマップ作成とその検討、さらに調査結果のとりまとめに力を注ぐことにしたい。本年度は、引き続き調査対象地区についてのヒアリング、資料収集にあたるとともに、航空写真判読による土地利用変遷とのデータの照合を行うことによって、本研究の主テーマである山村住民の能動性・主体性の分析が可能な現代山村論の構築に有用な知見を可能な限り多く抽出することを目指す。そのために現地調査のみではなく、必要な打ち合わせ、研究会等をも開催し、成果の公表と結びつける。物品費および人件費については、航空写真判読が最終年度となったため。さらに、調査旅費については、調査先の好意等により、主に調査補助員の旅費等が縮減できたことなどがある。本年度は航空写真判読および、調査地の調査補助員の増員が見込まれる。それらの費用に次年度使用額をあてる予定である。本研究は、その性格上、主な研究費として次の三種類の経費が必要である。第1に現地調査を実施する研究旅費、さらに、第2に打ち合わせ等の旅費、第3に航空写真判読に必要な専門家からのアドバイス、判読にかかる謝金等である。昨年は、地元住民のスケジュールに合わせて調査計画を調整したこと、さらに、写真判読を近隣の研究機関(研究分担者のいる機関)で引き受けてもらうことができたことなどにより、調査旅費および打ち合わせに予定していた旅費をかなり繰り越すことになった。本年度は、それらの経費をも加えることによって、効率的で効果的な調査研究を実施していく。
神経因性膀胱の薬物治療-グルタミン酸及びセロトニン受容体を中心とする基礎的研究

1.分子生物学的形態実験In situ hybridizationを用いた正常ラットの仙髄排尿中におけるグルタミン酸受容体サブタイプのmRNAの発現に関する研究により、副交感神経核とOnuf核ではAMPA型グルタミン酸受容体のサブタイプ(GluRAD)とNMDA型グルタミン酸受容体サブタイプ(NR1,NR2AD)の発現が異なることが判明し、このグルタミン酸受容体サブタイプの発現の相違が副交感神経核とOnuf核の機能的相違を反映していることが示唆された。2.電気生理学的実験(1)電気生理学的手法を用いた排尿の求心路に関する実験では、脊髄クモ膜下に投与されたNMDA型およびAMPA型受容体拮抗薬は容量依存性に脊髄内の求心路を抑制し、両者は相乗的に作用することが判明した。(2)セロトニン受容体のうち、5-HT_<1A>受容体拮抗薬は排尿の求心路に対しては抑制効果を持たず、遠心路に対してのみ作用することが判明した。In situ hybridizationを用いた正常ラットの仙髄排尿中におけるグルタミン酸受容体サブタイプのmRNAの発現に関する研究では、副交感神経核においてNMDA型受容体サブタイプのmRNAとしてNMDAR1の発現がみられ、またAMPA型受容体サブタイプのmRNAとしてGluRAの発現が認められた。一方、Onuf核においてNMDA型受容体サブタイプのmRNAとしてNMDAR1、NMDAR2A、およびNMDAR2Bの発現がみられ、AMPA型受容体サブタイプのmRNAとしてGluRCとGluRDの発現が認められた。このように副交感神経核とOnuf核においてはグルタミン酸受容体サブタイプのmRNAの発現が異なることが判明した。電気生理学的手法を用いた排尿の求心路に関する実験では、脊髄クモ膜下に投与されたNMDA型およびAMPA型受容体拮抗薬は容量依存性に脊髄内の求心路を抑制し、両者は相乗的に作用することが判明した。セロトニン受容体のうち、5-HT_<1A>受容体拮抗薬は全身投与によっても、あるいはまた脊髄内クモ膜下投与によってもウレタン麻酔下のラットの排尿反射を容量依存性に抑制することが判明した。電気生理学的実験により5-HT_<1A>受容体拮抗薬は排尿の求心路に対しては抑制効果を持たず、遠心路に対してのみ作用することが判明した。また5-HT_<1A>受容体拮抗薬は末梢性には膀胱収縮を抑制しなかった。このようにtrans-ACPDは排尿反射を抑制することが確認された。膀胱を充満させ、等容量性の膀胱収縮を誘発し、trans-ACPDを脊髄クモ膜下投与(1-10μg)すると、5μg以上の投与で膀胱収縮が抑制された。また抑制時間はdose-dependentであることも判明した。trans-ACPDの作用部位を検討するため、ラットの脳幹部橋排尿中枢の電気刺激により誘発される膀胱収縮に対するtrans-ACPDの脊髄クモ膜下投与の効果を検討した。脳幹部橋排尿中枢の電気刺激により誘発される膀胱収縮は、trans-ACPD 10μgの投与により、平均で前値の27%にまで低下した。このように、trans-ACPDは排尿神経路のうち少なくとも下行性神経路の仙髄レベルに作用することが判明した。(2)セトロニン受容体のうち、5-HT_<1A>受容体拮抗薬は排尿の求心路に対しては抑制効果を持たず、遠心路に対してのみ作用することが判明した。
エックス線画像を用いた新しい骨構造解析法による骨折リスク評価

本研究の目的は「トモシンセシス画像を用いた新しい骨構造解析法」をもとに、簡便かつ精度の高い骨折リスク評価法を確立することである。日常臨床の場では、2重エネルギーエックス線吸収測定法(DXA)による骨密度解析が骨強度の指標として使われているが、糖尿病など生活習慣病患者は、骨密度が正常にもかかわらず、骨折リスクが高いことが知られている。昨年度は大腿骨頸部のトモシンセシス像に関心領域を設定して骨梁テクスチャーパラメーターを解析し、DXAで求めた骨密度に、トモシンセシス像から得られた複数の骨梁パラメーターを加えることで、骨強度との相関が有意に向上することを確認した。本年度は、糖尿病症例を対象とした場合、骨密度にトモシンセシス像から得られる複数の骨梁パラメーターを加えた新しい骨折予測指標が、DXA画像から得られる海綿骨微細構造の状態を表す指標であるTrabecular bonescore (TBS)やWorld Health Organization (WHO)が開発した骨折リスク評価法であるFracture risk assessment tool (FRAX)と比べて、骨強度との相関性がより高いことを確認した。トモシンセシス画像を用いた骨梁テクスチャーパラメーター解析とDXAによる骨密度を組み合わせることで、従来の確立された骨強度評価指標と比べて、糖尿病患者の骨強度予測をより高精度に行える可能性が示唆された。平成29年度に構築した骨梁解析法を使って、糖尿病症例におけるエックス線画像を用いた新しい骨構造解析法の有用性を評価した。種々の代表的な生活習慣病における臨床評価を行い、エックス線画像を用いた新しい骨構造解析法の臨床的有用性を明らかにし、システム性能向上のための課題を探る。日常診療の骨粗鬆症診断基準では,2重エネルギーエックス線吸収測定法(DXA)による骨密度が用いられるが,骨密度測定のみでは骨折リスクを十分に予測し得ない。本年度は、大腿骨頸部のトモシンセシス像に関心領域を設定し、2値化処理および細線化処理などの画像処理を行って、関心領域内の骨梁テクスチャーパラメーターを解析した。CTデータを用いた有限要素解析によって骨破断強度を求め、骨梁テクスチャーパラメーターとの相関性を評価した結果、DXAで求めた骨密度に、トモシンセシス像から得られた複数の骨梁パラメーターを加えることで、骨強度との相関は有意に向上した。また、従来の臨床的な骨折指標と比較した場合も、骨密度にトモシンセシス像から得られた複数の骨梁パラメーターを加えた骨折予測指標の方が骨強度との相関が高かった。トモシンセシス画像を用いた骨梁解析を行うことによって、DXAでは得られない骨質の情報を求めることができると考えられた。トモシンセシス画像を用いた新しい骨梁テクスチャーパラメーター解析法を実現化し、CTデータを用いた骨強度との相関を評価した。その結果、2重エネルギーエックス線吸収測定法(DXA)で求めた骨密度に、トモシンセシス像から得られた複数の骨梁パラメーターを加えることで、骨強度との有意な相関性向上が認めらることを確認した。原発性骨粗鬆症,糖尿病,膠原病,慢性腎臓病など,骨折のリスクが上昇する病態について、トモシンセシス像から得られる骨梁パラメーターと骨強度との関連性を評価する。これにより、各病態の骨強度予測におけるトモシンセシス像から得られる骨梁パラメーターの有用性を明らかにする。海外出張旅費が予定よりも安価であったため。研究成果を発表するための出張旅費の一部として使用する。
生体内分解性高分子担体からの制癌薬の放出制御に関する研究

1.キトサント小球体の調製法:カニ殻由来のキチンを約63%または55%脱アセチル化して製したキトサンを用い、それぞれ1.5%または5%の希酢酸溶液とした。モデル薬物としてフルオロウラシル(5FU)を配合したのち、攪拌下でナタネ油中に滴下し減圧乾燥して小球体を得た。フラスコ上部より懸垂させて用いる自作のスタ-ラ-使用により、90%以上の高収率で小球体を得ることが可能になった。2.粒子径と薬物含量:アルカリ処理後乾燥した小球体は良好な球状を呈し、その粒径は滴下する溶液のキトサン濃度、粘度、攪拌条件により若干の制御が可能だった。薬物含量は必ずしも仕込量に比例せず、むしろ粒径に左右され、同一仕込量では粒径が大きい程高含量であった。主薬の分配係数によっても異なると考えられるが、5FUではキトサン量の10%から30%の添加で12/30メッシュの小球体1g中に4050mgの5FUが見出された。また実体顕微鏡と電子顕微鏡による観察で主薬が小球体表面に析出する現象も認められた。3.主薬の放出製:日局第2液100mlを試験液とし、小球体10mgを用いて放出試験を行った。アルカリ処理したのみでは30分以内に放出が完了した。腹腔内での持続的な薬物放出により腹腔内での制癌効果を期待するために、徐放化を図った。まず無水酢酸を用いて表面を再アセチル化し、放出を抑制することを試みた。赤外線吸収スペクトルの変化から、主薬が影響を受けない条件でもアセチル化は進行し、放出も抑制されることが確認された。次にキトサン小球体調製時にキチン粉末を添加して粒子表面にキチン層を構成することを試みた。乾燥の進行しない段階で添加した場合には徐放化に利用できることが判明した。試験液にリゾチ-ムを生理的濃度で添加すると顕微鏡下では分解は明らかではなかったが、放出がさらに長時間持続する傾向が認められた。