hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性腎不全の進展及び血管障害に対するローズマリー成分カルノシン酸の改善効果

世界的に慢性腎不全症患者は増加の一途をたどっており、我が国の患者数も1300万人に及ぶ。腎機能低下で血中濃度が上昇する尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)が、腎機能の増悪化のみならず、動脈硬化など種々の合併症を誘導することが明らかになってきた。また、ISが細胞内で活性酸素種(ROS)を産生することでこれら作用を発揮することも分かりつつある。本研究は、食成分から慢性腎不全の改善及び血管障害の改善を目指す研究である。具体的には、ローズマリーの抗酸化化合物カルノシン酸(CA)を用い、本年度は動脈硬化の初期段階に関わる血管内皮細胞及び慢性腎不全に密接の関わる腎尿細管上皮細胞HK-2に対するISの悪影響の予防・改善効果を実証することを目的とした。平成26年度は、まず培養血管内皮細胞を用い以下の結果を得た。1ISは細胞内のROS産生及び転写因子NFκBの活性化を介して細胞接着因子であるICAM-1、VCAM-1、E-selectin、さらには単球走化性因子MCP-1の発現を増加させ、これをCAがROS産生やNFκB活性化を抑えることで負に制御すること、2ISが細胞へ作用後、ROS産生のみならず、ROS産生酵素であるNOX4の発現、ISの作用を仲介するダイオキシン受容体AhRの発現をも増加させること、を示し、ISの慢性的な暴露が動脈硬化の発症・進展を促進するさらなる証拠を得た。HK-2細胞についても以下の結果を得た。1ISによりAhRの核移行やROS産生が生じ、それをCA、AhR拮抗薬、ISを細胞内に輸送するOATトランスポーター阻害剤が抑制すること、2ISによるNOX4発現増加もCAやトランスポーター阻害剤で抑えられること、を明らかにした。これらの結果は、CAがISによる慢性腎不全の進展や合併症である動脈硬化の進展に対し、抑制的な効果を持ちうることを示唆するものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。我が国の慢性腎不全症患者数は1300万人に及ぶ。本研究は、医薬からではなく食成分から慢性腎不全の改善及びそれに伴う血管障害の改善を目指す研究である。腎機能低下で血中濃度が上昇する尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)が、細胞内で活性酸素種(ROS)を産生し、腎機能の増悪化のみならず、動脈硬化など種々の合併症を誘導することが明らかになってきた。本研究では、ローズマリーの抗酸化化合物カルノシン酸が、ISによる慢性腎不全の進行および血管壁細胞に対する悪影響を予防・改善できることを、in vivoとin vitro実験から実証すると共に、その作用機序を明らかにする。具体的に以下のことを行う。1)ISによる腎機能低下が、カルノシン酸により予防・改善できるかをin vivo実験で明らかにする。2)ISによる血管壁細胞やヒト尿細管細胞に対する悪影響を、カルノシン酸が予防・改善できるかを、培養細胞レベルで明らかにする。3)上記1)と2)の作用機序を、ダイオキシン受容体(AhR)の関与を焦点の一つとして明らかにする。これは、ISがAhRのアゴニストとして働く報告があり、当研究室でカルノシン酸がISによるAhR活性化を抑制する作用を見出したことによる。平成24年度は、以下の成果を得た。(1)ISがROS依存的に上皮成長因子受容体の発現を増加させることで、昇圧因子アンジオテンシンIIによる培養平滑筋細胞の遊走などを増強させ、動脈硬化の増悪因子として働くことを示した。(2)培養平滑筋細胞において、カルノシン酸が転写因子Nrf2を介して抗酸化酵素HO-1の発現を誘導し、増殖・遊走に関わる分子の活性化の抑制や、ROSの産生阻害を介してIS依存的な細胞の増殖・遊走を抑制することを示した。(3)尿細管由来細胞HK-2において、カルノシン酸はIS依存的なROS産生、腎線維化や炎症に関わる因子(TGFβ、α-SM actin、MCP-1)の発現を抑制することを示した。また、これらISの作用がAhRアンタゴニストで抑制されることを示した。本研究では、ローズマリーの抗酸化化合物カルノシン酸(CA)が、ISによる慢性腎不全の進行および血管壁細胞に対する悪影響を予防・改善できることを、in vivoとin vitro実験から実証すると共に、その作用機序を明らかにすることを目的とする。1ISがROS依存的に上皮成長因子受容体の発現を増加させることで、昇圧因子アンジオテンシンII(AngII)による培養平滑筋細胞の遊走などを増強させ、動脈硬化の増悪因子として働くこと可能性を示した。2培養平滑筋細胞において、CAが転写因子Nrf2を介して抗酸化酵素HO-1の発現を誘導し、増殖・遊走に関わる分子の活性化の抑制や、ROSの産生阻害を介してIS依存的な細胞の増殖・遊走を抑制することを示した。

3尿細管由来細胞HK-2において、CAはIS依存的なROS産生、腎線維化や炎症に関わる因子(TGFβ、α-SM actin、MCP-1)の発現を抑制し、これらISの作用がAhRアンタゴニストで抑制されることを明らかにした。これらのデータをもとに、平成25年度の前半では、ISにより作用が増強されるAngIIに関して以下の成果を得た。1HK-2において、AngIIがERKや転写因子NF-kBを活性化し、腎線維化や炎症に関わる因子TGF-βの発現を増加させ、腎不全の増悪因子として働くことを示した。2HK-2において、CAがHO-1の発現を誘導し、AngII依存的なROS産生やTGF-βの発現を抑制することを示した。世界的に慢性腎不全症患者は増加の一途をたどっており、我が国の患者数も1300万人に及ぶ。腎機能低下で血中濃度が上昇する尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)が、腎機能の増悪化のみならず、動脈硬化など種々の合併症を誘導することが明らかになってきた。また、ISが細胞内で活性酸素種(ROS)を産生することでこれら作用を発揮することも分かりつつある。本研究は、食成分から慢性腎不全の改善及び血管障害の改善を目指す研究である。具体的には、ローズマリーの抗酸化化合物カルノシン酸(CA)を用い、本年度は動脈硬化の初期段階に関わる血管内皮細胞及び慢性腎不全に密接の関わる腎尿細管上皮細胞HK-2に対するISの悪影響の予防・改善効果を実証することを目的とした。平成26年度は、まず培養血管内皮細胞を用い以下の結果を得た。1ISは細胞内のROS産生及び転写因子NFκBの活性化を介して細胞接着因子であるICAM-1、VCAM-1、E-selectin、さらには単球走化性因子MCP-1の発現を増加させ、これをCAがROS産生やNFκB活性化を抑えることで負に制御すること、2ISが細胞へ作用後、ROS産生のみならず、ROS産生酵素であるNOX4の発現、ISの作用を仲介するダイオキシン受容体AhRの発現をも増加させること、を示し、ISの慢性的な暴露が動脈硬化の発症・進展を促進するさらなる証拠を得た。HK-2細胞についても以下の結果を得た。1ISによりAhRの核移行やROS産生が生じ、それをCA、AhR拮抗薬、ISを細胞内に輸送するOATトランスポーター阻害剤が抑制すること、2ISによるNOX4発現増加もCAやトランスポーター阻害剤で抑えられること、を明らかにした。これらの結果は、CAがISによる慢性腎不全の進展や合併症である動脈硬化の進展に対し、抑制的な効果を持ちうることを示唆するものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。in vivo実験を開始する直前に、体調不良を起こしたため実験を控えた。外国人特別研究員の体調不良のため平成25年度のin vivo実験が開始できていない。細胞レベルの実験は概ね成果が得られている。慢性腎不全の典型的なモデルラットである6/5腎摘出ラットは、当研究室は2年ほど前に経験しているが、実験技術として難しいだけでなく、非常に症状が重篤になることから、アデニン投与によるマイルドなモデル系に変更して、本年度は行うことになっている。
AS2と核小体タンパク質による発現抑制を介した葉の分化制御機構の解析

シロイヌナズナのAS2は、葉の裏側因子ETTIN/ARF3を抑制し、葉の表側の細胞分化を促進する重要な因子である。AS2はDNA結合を介してETTを抑制し、複数の核小体因子とともにETTのDNAメチル化維持にも関わる。また、AS2の機能には核小体近傍での塊状の局在が必要であるが、ETTを抑制する分子メカニズムは不明である。本研究では、AS2と核小体因子が、DNAのメチル化の制御を介して、どのように植物の細胞分化に関与するかを明らかにする。
型紙系型染の発生と展開に関する調査研究

江戸時代を中心とする型紙のうち、紀年銘墨書をもつ型紙について、墨書の信憑性と有用性を証明したのち、墨書による江戸時代の型紙の編年を試みた。その結果、型紙自体の法量や型の幅は大きく変化しないが、型の天地(「送り」)は時代とともに法量を増す傾向にあることが明らかになった。また明治時代の型紙においては、型紙の幅と型の幅は大きく変化しないが、型紙及び型の天地はその末期までの間に大きく法量を増すことがわかった。型紙系型染の研究は、型紙そのものの調査研究と、これによって染められた実作品の調査研究が両輪をなす。一年目に当たる平成20年度は、型紙の調査及び関連染織品の調査を中心に行なうとともに、型紙作品のデータベース化の準備作業も行なった。今年度行なった調査は、長崎による都内・個人所蔵の型紙の調査及び京都市・京都文化博物館における型紙関連染織品の調査(以上、平成20年11月2021日)のほか、伊藤による三重県伊勢市の伊勢型紙資料館での型紙調査及び名古屋市・徳川美術館での関連染織品調査(以上、平成21年度1月1718日)、奈良市・奈良国立博物館及び京都市・京都市考古資料館における関連染織品の調査(以上、平成20年12月2425日)である。データベース化に関わる作業としては、パーソナル・コンピューター及びプリンター、データベース作成ソフト等を購入し、入手できた国内の美術館所蔵の型紙に関する情報を、臨時職員2名を雇用し、資料を整理後、適宜帳票形式で入力した。(以上、平成20年10月1日11月29日のうち24日間)また型紙に関する情報収集の一環として、都内・個人所蔵型紙の写真撮影を行い(以上、平成20年12月25日)、型紙の種類・模様・時代判定等の分析及びデータベース化に備えることとした。なお、植木も民俗学的な立場から型紙関連資料の収集に努め、型紙及び近世染織関連文献資料の一覧作成などを行った。二年目に当たる平成21年度は平成20年度に引き続き、型紙の調査及び関連染織品の調査を中心に行なった。今年度行なった調査は、長崎による京都市・個人所蔵の型紙の調査(平成21年11月89日)のほか、伊藤による福岡県福岡市美術館での染織品、日本及び東アジアの型染手法の見学及び、福岡県太宰府市九州国立博物館での古代から近代までの染織品、特に沖縄・琉球の型染染織品調査(以上、平成21年度12月56日)である。また、型紙の現存遺品を購入し、型紙の種類・模様・時代判定等の分析に活用した。データベース化に関わる作業としては、平成20年度に購入したパーソナル・コンピューター及びプリンター、データベース作成ソフト等を活用し、入手できた国内の美術館所蔵の型紙に関する情報を、臨時職員2名を雇用、資料を整理後、適宜帳票形式で入力した。(以上、平成21年12月1日平成22年1月29日のうち16日間・15日間)また型紙に関する情報収集の一環として、都内・個人所蔵型紙の写真撮影を行い(以上、平成21年12月10日・17日)、型紙の種類・模様・時代判定等の分析及びデータベース化を行った。最終年度に当たる平成22年度は平成20・21年度に引き続き、型紙の調査及び関連染織品の調査を中心に行なった。今年度行なった調査は、長崎による個人所蔵の型紙の調査及び撮影(平成22年12月2022日)のほか、伊藤による近江上布伝統産業館での麻布型染染織品の見学、及び水口歴史民俗資料館での型染染織品調査(以上、平成22年度12月67日)である。データベース化に関わる作業としては、平成20年度に購入したパーソナル・コンピューター及びプリンター、データベース作成ソフト等を活用し、資料を整理後、適宜帳票形式で入力した。型紙の種類・模様・時代判定等の分析及びデータベース化を行った。また最終年度の成果の一環としては、長崎が「染型紙の編年に関する試論(その1)」『共立女子大学家政学部紀要』57号(2011年1月・4163頁)において、紀年銘墨書をもつ型紙について、墨書の信憑性と有用性を証明し、墨書による江戸時代の型紙の編年の一端を明らかにして、本課題の研究報告とした。
複数の属性を考慮した社会厚生の評価と再分配政策の考察

本研究では複数属性に基づく社会厚生を評価するための手法を考察した.特に,一般化ローレンツ支配基準の複数属性への拡張を図り,理論的に得られた結果を数量分析に適用するため,線形計画法に基づく手法を提案した.提案した手法は,比較する分布間で明確な支配関係が存在しないとき,社会厚生を改善するために必要な属性の不足量を示すことができるという点で再分配政策に対して明確な含意を持つ.この手法を中国の経済に適用することによって,環境汚染が中国における社会厚生の改善の隘路であることが分かった.また,生産要素の分布によって生ずる経済格差を考えるため,要素価格均等化条件の成立を確認するための手法を提案した.本年度は以下の3点について研究を進めた.第一に,中国における所得,環境,医療の地域間格差を一般化ローレンツ支配基準を複数属性に拡張した基準を用いて評価した.本研究は前年度に予備的な結果を得ていたが,解決すべき課題として残されていた中国の地級市における常住人口の把握について工夫を施した.分析の結果,近年では環境水準の地域間格差が全体でみた社会厚生を改善するうえでネックとなっていることが示唆された.この結果を国際的な研究集会で発表した.第二に,生産要素価格の国家間あるいは地域間での均等化を主張する要素価格均等化定理の成否を検証するための新たな手法を提案した.生産要素が2種類の場合,レンズ条件と呼ばれる条件が要素価格均等化定理が成り立つ必要十分条件であることが明らかにされており,この条件を生産要素の地域間偏在を分析するために用いた研究も多い.本研究では生産要素の数に関わらず要素均等化定理の成立を検証できる手法を提案した.この研究の結果を学術雑誌に投稿した.第三に,世帯構成員数の相違等によって世帯の所得に対するニーズが異なるときに社会厚生を評価するための手法を研究した.よく知られた逐次的一般化ローレンツ支配基準をもとにして,先行研究と同様の条件の下で若干の修正を施した一般化ローレンツ曲線の逐次的比較によって社会厚生の比較が可能であることを示した.本研究で示された手法は,先行研究で示された所得分布関数の直接的な比較よりも一般化ローレンツ曲線を使う点で簡便である.この他,前年度より着手した研究のうち,逐次的一般化ローレンツ支配基準の拡張についても引き続き研究した.本研究では複数属性に基づく社会厚生を評価するための手法を考察した.特に,一般化ローレンツ支配基準の複数属性への拡張を図り,理論的に得られた結果を数量分析に適用するため,線形計画法に基づく手法を提案した.提案した手法は,比較する分布間で明確な支配関係が存在しないとき,社会厚生を改善するために必要な属性の不足量を示すことができるという点で再分配政策に対して明確な含意を持つ.この手法を中国の経済に適用することによって,環境汚染が中国における社会厚生の改善の隘路であることが分かった.また,生産要素の分布によって生ずる経済格差を考えるため,要素価格均等化条件の成立を確認するための手法を提案した.本年度は以下の諸点について研究を行った.第一に,一般化ローレンツ支配基準を拡張した枠組みを用いて近年の中国における地域間格差の推移を社会厚生の観点から評価することを試みた.2006年から2010年を対象期間とした地級市データに基づき,所得,環境,医療に関係する5つの属性によって各地域の厚生水準が決定されると考え,多変量のmajorizationに基づく支配関係の有無を二つの年度間の一対比較によって考察した.その結果,2006年と2010年を比較すれば前者よりも後者の属性分布が望ましいと判断されるが,その他の年度間比較では,沿海部の環境水準が隘路となって,必ずしも社会厚生が過去と比較して改善されたとは言えないことを明らかにした.この結果は,従来,内陸部と沿海部の所得格差の拡大という観点から捉えられてきた中国の地域間格差の理解に新たな視点を付け加えるものである.また,多変量majorizationを用いた分析はその概念や厚生上の含意は広く知られていたものの,これを実際の数量分析に応用した研究は少なく,この点でも意義を持つと考えられる.分析の結果は国際学会で発表された.第二に,逐次的ローレンツ支配基準を複数の移転可能な属性が存在するケースに拡張するための基礎的な研究に着手した.第三に,多変量majorizationの概念を用いて,地域間の要素賦存量比率の類似性を考察する手法の研究に着手した.最終年度に実施した研究の成果:第一に,地域間での生産要素賦存量の偏りをヘクシャー=オリーン・モデルにおける要素価格均等化の成立可能性という観点から評価する手法を提案した.提案した手法は,任意の数の地域,産業,生産要素について適用可能であるとともに,それぞれの生産要素の潜在価格を設定することで,地域間の要素賦存量の偏りを定量的に評価できる.この点で,従来この分野で用いられてきた「レンズ条件」と比較して汎用性を持つ.第二に,世帯人員が異なる世帯から構成される所得分布を評価する逐次的一般化ローレンツ支配基準の拡張を図った.従来,所得分布を比較する時点間で所得以外の属性の分布が異なる場合,一般化ローレンツ曲線ではなく分布関数の比較が必要とされてきたが,一般化ローレンツ曲線に若干の修正を加えた修正された一般化ローレンツ曲線による比較によって支配関係の有無を検証できることを示した.研究期間全体を通じた研究の成果:本研究では複数の属性を考慮して社会厚生を評価する手法の構築とその応用を,ローレンツ支配基準の拡張に焦点をあてて研究した.

特に,様々な支配概念の有無を実際に検証するための手法を提案した.提案した手法は,単に支配関係の有無だけではなく,社会厚生を改善するために必要な再分配の規模やターゲットを明らかにできる点に特徴がある.応用例として中国における地級市レベルでの厚生分布を,所得だけでなく環境や医療の水準を反映する5つの属性に基づき評価した.その結果,沿海部の工業都市における環境水準の改善が社会厚生の改善を図る上で重要であることを示した.また,所得の源泉である生産要素賦存量の偏りを考察するための手法の構築を図るとともに,複数属性に基づく社会厚生の評価に関する理論的な検討を行った.財政・公共経済本研究の主な目的である複数の属性を考慮した社会厚生の評価について,(1)一般化ローレンツ支配基準の複数属性への拡張は理論的な整理も終了しており,実際の数量分析への応用上の問題を検討する段階に到達している,(2)逐次的一般化ローレンツ支配基準の複数属性への拡張についても主要な結果はすでに得られている,(3)当初,平成26年度の完成を目指していた生産要素の分布と要素価格均等化命題の関連については本年度にひとまず研究を完成させ,投稿した学術雑誌より掲載許可の判断を受けていること,(4)逐次的一般化ローレンツ支配基準の拡張を研究する過程で当初計画していなかった新たな問題を発見できたこと,などを踏まえて上記の評価に至った.当初の計画通り,一般化ローレンツ支配基準の複数属性への拡張を図り,これを地域間格差の把握に応用した論文をひとまず完成させ,国際学会で発表することができた.また,平成25年度より開始することを予定していた,逐次的一般化ローレンツ支配基準を複数の移転可能な属性が存在するケースに拡張するための研究に着手できた.これらのことより,研究はおおむね順調に進展していると判断した.本年度は前年度に着手した研究の完成を目指すとともに,本研究で確立した手法を再分配政策の評価への応用する中で新たな課題の発見に努める.平成25年度以降,以下のような形で研究の推進を図る.第一に,平成24年度に得られた多変量majorizationの概念を用いた中国の地域間格差に関する研究の改善を図り,その完成を目指す.具体的には,ひとまず完成した研究成果を内外の学会や研究集会で発表して討論者や出席者からのコメントを基に論文を改訂する.第二に,逐次的一般化ローレンツ支配基準を移転可能な属性が複数あるような形に拡張するとともに,その応用可能性を研究する.本年度の研究において理論的な定式化に関する目途はついたので,得られた結果を論文にまとめるとともに,その応用可能性ならびに再分配政策への政策的含意を得るための枠組みを構築する.第三に,人々の厚生が複数の属性に依存している場合の再分配政策の効果を測る手法の開発に関する研究に着手する.当初,研究成果をヨーロッパもしくは北米で開催される国際学会で発表することを予定していたが,(1)北米・環太平洋地域の国際学会が前年度末に東京で開催され,そこでの研究発表が許可されたこと,(2)研究の分析対象地域である中国で開催された国際学会での発表が許可され,これを他の経費で支弁できたこと,等の理由で使用計画と実額の差異が生じた.関連する分野の図書や統計の購入に充当する他,研究遂行上必要となる備品の購入に充てる.該当なし
細菌感染症に対するファージセラピーとファージワクチンの応用研究

薬剤耐性の病原性細菌が獣医学領域だけでなく、世界中いろんな場面で問題視されてきている。細菌感染症に対して、新しい方策が望まれている。本研究では、「ファージセラピーの実用化への応用研究」と、「ファージワクチンの応用研究」について検討した。我々は、ファージセラピーの研究としてウマの細菌性角膜炎に対する検討を行った。ウマの角膜炎を引き起こす緑膿菌に対してとても効果的なファージを分離した。分離したファージは、角膜炎モデルマウスにおいて、角膜炎を効果的に防ぐことが出来た。また、ファージワクチンのテーマでは、マイコプラズマの抗原を発現するファージの作成を行った。1)ファージセラピーの実用化への応用研究(岩野、樋口、前原、萩原、田村(連携)、研究補助(大学院生、学生、実験補助員))ア)SA実験感染ウシ乳房炎を用いたファージセラピー実用化検討(岩野、樋口、萩原):SA注入によるウシ乳房炎へのファージセラピー試験を行った。SA 103/10ml(100 /ml×10ml)を4つの全乳房に注入。体細胞数およびSA分離の有無等を指標としてSAの乳腺感染を確認し、約5日間の経過観察(SA菌数、体細胞数)を実施した後、ファージ1010/10ml(109/ml×10ml)を2つの乳房(左後ろ、右前)のみに投与した。投与期間は、朝夕2回5日間とした(合計10日間)。ファージ注入後、朝夕に採乳し、各時点乳汁中の細菌数、体細胞数、ファージ数を計測した。結果、菌数の一時的な低下は見られたが、ファージによる炎症反応の収束や、細菌数の劇的な低下は見られなかった。最初に乳房へ注入した細菌数が多すぎたため炎症反応がひどく、ファージの効果が現れにくかった事も一因と考えられる。次年度は、その点を考慮して複数回の再試験を行う予定である。イ)細菌性角膜炎へのファージ製剤開発(岩野、前原、田村):SA、緑膿菌に対する特異的ファージを複数分離することができ、角膜炎モデルマウスにてファージセラピーの劇的な効果を確認できた。また、ファージの吸着効率は高く、試験管内での吸着試験では、30秒以内で90%以上のファージが細菌に吸着することが明らかになった。この性質はウマ角膜炎への点眼剤としての開発に有利に働くものと考えられる。2)ファージワクチンの応用研究(岩野、橋口、樋口、萩原)これまで報告のある論文を精査し、抗原候補となる部位を特定した。次年度からファージディスプレイによりマイコプラズマ抗原を発現したファージの構築を行う予定である。ウマの緑膿菌性角膜炎に対するファージセラピーの応用研究において、以下のような具体的研究成果を得た。1ウマ疾病由来緑膿菌株に対して宿主域が広く、吸着効率の高い有効なファージを分離できた。2角膜炎モデルマウスにおいて、菌投与後から3時間まで有効であり現行のレース後での抗生剤使用に即した適用が期待できた。3角膜炎モデルマウスにおいて、複数のファージをカクテル化することにより、細菌に対して相乗的な増殖抑制効果が見られた。これらの結果は、現行の抗生剤の予防的点眼使用と同レベル以上の効果を期待でき、多剤耐性菌の問題を回避するためにも実用化に向けてさらなる検討をしていきたい。この研究成果を北海道地区獣医師会、日本獣医師会獣医学術学会年次大会発表し、それぞれ北海道地区学会賞、獣医学術学会賞をいただいた。また、黄色ブドウ球菌に対するバクテリオファージの特許申請が認められた、特許第5720045号。本研究では、細菌にのみ感染し死滅させるバクテリオファージを使ったファージ療法ならびにワクチンデザインを主体としたファージワクチンの開発を行おうとするものである。ウマの緑膿菌性角膜炎に対するファージセラピーの応用研究において、本年度は以下の様な具体的研究成果を得た。野外から分離したファージの全ゲノム解析を行い、既報のファージゲノムとの比較解析を行った。ΦR18とΦS12-1は、2本鎖の環状DNAであり、ファージ構築に重要なタンパク質や宿主細菌の膜成分を分解する溶菌酵素などの遺伝子を持っている事が確認出来た。その内容を論文公表した(Genome Announcement 2016 4 (3) )。今後、溶菌酵素遺伝子を利用して、大腸菌発現系などを用いて溶菌酵素を合成し、その効果を検証する予定である。また、イヌ疾患由来の緑膿菌に対してのファージの効果を検証し、キノロン耐性の緑膿菌に対しても溶菌効果が高いことを明らかにし、論文公表した( J. Vet. Med Sci. 2016 in press )。今後、イヌ、ネコなどの伴侶動物への応用も視野に入れて行く予定である。ファージワクチン開発に関しては、マイコプラズマの重要な抗原部位についての組換えを行い、現在抗原の発現を確認中である。今後、生体内での免疫効果を検証する予定である。

分離したファージは、角膜炎モデルマウスにおいて、角膜炎を効果的に防ぐことが出来た。また、ファージワクチンのテーマでは、マイコプラズマの抗原を発現するファージの作成を行った。ファージセラピーの応用研究については、特にウマの角膜炎への応用について大きな進展があった。この成果は、学会でも表彰を受け、現在論文を2報投稿している。また、申請していた黄色ブドウ球菌のファージについても特許が認められた。ファージワクチン研究については、ファージの組み替えが終了し、そのワクチン効果を確かめる段階まで来ている。最終年度は、これら成果をまとめて公表していきたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。獣医生化学これまで同様にそれぞれの課題について取り組む。また、ファージ、緑膿菌それぞれについて全ゲノム解析を行っており、ファージの溶菌システムの詳細な解析とともに、緑膿菌の病原性についても知見を集積していく予定である。ウシを使った感染実験のトライアルができ、本格的な乳房炎へのファージセラピー効果を検証する手はずが整っていること。ウマ角膜炎については、主要病原菌である緑膿菌に対して有効なファージを数種類集めることに成功し、さらに角膜炎モデルマウス試験で絶大な治療効果が得られている。次年度からは、臨床応用製剤化に向けた検証も進めていく予定である。ファージワクチンについては、ほぼ情報整理が終了し、次年度から組み替えファージの作製に取りかかる予定である。以上のように、おおむね順調に進展している状況である。前年度末より、外部委託解析を行っており、その請求分が今年度に繰り越されているため。全体的に方向性に変更はない。乳房炎へのファージセラピーの応用は、条件を整えつつ引き続きファージセラピーの有効性を検証していく。また、ウマ角膜炎への応用に関しては、絶大なる効果が期待でき、製薬企業からのアドバイスも参考にしながら、製剤化への検証を推し進めていく予定である。次年度は実際にウマ角膜炎での実証研究も計画していきたい。今年度は、ファージと緑膿菌の全ゲノム解析から(外部委託)、ファージの溶菌機序、ならびに緑膿菌の病原性に関して詳細な解析を行う。次年度使用額理由次年度に環境中からのファージを大量にハンティング、精製することが必要となり、そのため次年度に安全キャビネットを購入する必要があるため、予算を繰り越して対応することとした。次年度使用計画上記理由の通り、環境中からのファージを大量にハンティング、精製することが必要となり、そのため次年度に安全キャビネット(約120万円)を購入することを計画している。本機器の導入により、2人での安全で効率的な作業ができ、研究の推進が期待できる。
8-17世紀の東アジア地域における人・物・情報の交流

研究代表者1名・研究分担者27名・海外共同研究者15名・研究協力者9名を5つの班に分け、基本的に各班ごとに、海外調査・国内調査・研究会・シンポジウム等の活動を行った。構成員全員を対象としたものも含め、研究会・シンポジウムの報告の多くは研究成果報告書に収録されており、現地調査の記録は本プロジェクトのホームページhttp://www.l.u-tokyo.ac.jp/phase817/に掲載している。構成員全員で行った活動としては、(1)発足時の研究会、(2)秋田・青森両県調査、(3)中国石浙江省調査、(4)総括シンポジウム「海をかける人・モノ・情報」、(5)研究成果報告書の刊行、の5つがある。第1班「博多・対馬・三浦と日朝(韓日)関係」は、多島海域という特色をもつ日朝間の境界領域で活動する諸人間類型に着目し、(1)韓国慶尚南道・全羅南道調査、(2)九州大学・対馬調査、(3)シンポジウム「中世日韓交流史」、を実施した。第2班「使節・巡礼僧の旅」は、日中間を往来した旅人たちの足跡を文献研究と現地調査との両面からたどり、(1)中国江蘇省調査、(2)五島列島調査、(3)『参天台五台山記』研究報告会、を実施した。第3班「琉球ネットワーク論」は、福建地方との関係を軸に日本列島から東南アジアまでを結ぶネットワークとしての琉球の役割に注目し、(1)中国福建省調査、(2)久米島調査、(3)シンポジウム「朝鮮と琉球」、を実施した。第4班「倭寇ネットワーク論」は、東アジア・東南アジアの沿海民やヨーロッパ人までも含む倭寇という集団を対象に経済・政治・信仰などの諸側面から海域世界の成り立ちに迫り、(1)台湾調査、(2)薩摩半島・島嶼部調査、(3)五島列島・平戸調査、を実施した。第5班「世界観と異文化コミュニケーション」は、異なる文化や民族の相互間に生じるコミュニケーションのあり方を通訳と古地図に着目して追究し、(1)ポルトガル調査、(2)7回におよぶ地図・絵図調査(国内)、(3)シンポジウム「物・人・情報の動きから見たアジア諸地域の交流史」、(4)4回におよぶ研究会、を実施した。1,全体の概要・・・・7月下旬に全メンバーによる会合を開いて基本方針を討議し、あわせて研究報告会(ミニシンポジウム)を開催して、研究代表者・研究分担者・国外共同研究者数名が中-近世日朝関係史・史料論をテーマに報告を行なった。これを通じて国際的な共同研究の重要性が再確認された。また、本科研は、総括班のもとに、テーマごとに5つの班に分かれており((1)対馬・博多と日朝関係、(2)使節と巡礼僧、(3)琉球ネットワーク、(4)倭寇論、(5)世界観・自他認識論)、それぞれにおいて調査・巡検先の準備研究や、研究会の立案等を進めた。本年度実施した調査としては、代表者および総括班を中心とする東北日本海沿岸域・中国浙江省の調査と、第

(4)班を中心とする鹿児島南島方面、および五島・長崎・平戸方面の調査がある。2,秋田・青森県下調査(9月下旬)・・・・青森県深浦町で開かれたシンポジウム(研究代表者が講演)に合わせて、深浦・十三湊などの港町をめぐる。最近発掘された秋田県井川町洲崎遺跡では、井戸枠に二次利用されたために遺った中世の和船を確認し、十三湊遺跡では発掘中の港湾遺構を見学した。その他、渤海使の来た可能性もある秋田城、安東氏の拠点檜山城、北畠氏の浪岡城などを巡検した。3,中国浙江省調査(11月後半)・・・・杭州・寧波では、日中間の僧侶往来の舞台となった径山以下の禅宗五山をすべて訪れた。また寧波では、宋代市舶司(貿易事務所)跡を確認し、天一閣博物館で12世紀に博多居住宋人が某寺に施入した刻石を調査した。舟山列島では後期倭寇の基地となった瀝港(れきこう)などを訪れ、航海信仰としての観音信仰の拠点、普陀山(ふださん)を調査した。4,鹿児島・南島調査(12月下旬)・・・・中・近世の薩摩の港町(坊津・加世田・泊など)を悉皆的に巡検し、各地の歴史資料館などで出土貿易陶磁や貿易関連文書、また航海信仰神の媽祖の廟を調査した(新たに媽祖廟を発見した)。種子・屋久・奄美では、唐人・唐船関連遺跡や遣明船関係港町などを新たに確認した。5,五島・長崎・平戸調査(3月中旬)・・・・唐人町や媽祖廟、キリシタン関連遺跡、遣唐船・遣明船寄港地などを中心に、諸民族雑居の有り様を具体的に調査する。1,研究活動全体の概要本年度は、各班ごとに研究活動を深化させることに重点を置き、それぞれに調査巡検や研究会を行なった。活動の概要は以下の通り。詳細は本研究グループのホームページ(http://www.1.u-tokyo.ac.jp/phase817/)を参照。2,各班ごとの活動状況第1班「対馬・博多と日朝関係」では、中世・近世日朝関係における外交・貿易・漁労活動・対外戦争の実態を研究するため、韓国南部沿岸一帯を現地踏査した(6月中旬)。主な踏査地は、中世倭人の出漁地であった巨文島(全羅南道麗水市)、倭人居留地であった薺浦(慶尚南道鎮海市)、朝鮮侵略時の小西行長軍の駐屯地であった熊川(同)、近世倭館が所在した釜山市である。上記史跡を探索するほか、現地で簡単な研究会を催した。第2班「使節・巡礼僧」では、1072-73年に入宋した日本僧成尋の日記『参天台五臺山記』をテーマに、本科研グループ外部の研究者をも招き、7月21日、中央大学市ヶ谷キャンパスにて研究報告会を開催。10月上旬には、五島列島の福江島・奈留島・若松島・桶島・中通島・小値賀の港湾・遺跡・寺院・博物館などを巡り、古代中世における海外交渉に関する調査を行なった。第3班「琉球ネットワーク論」では、まず東洋文庫所蔵の地誌類を中心に福建省沿岸地域の地図類の調査・収集を行なった。次に、琉球および倭寇と関係の深い中国福建省福州・泉州の現地調査を敢行(10月下旬)。現地では、琉球朝貢使節および冊封使関連遺構、倭寇防御施設跡などを調査した。福建師範大学では琉球・朝鮮関連史料を確認することができた。第4班「倭寇・キリシタン班」は、昨年度実施した国内調査(薩摩半島中心;五島列島中心)について成果を取りまとめつつ、来年度11月に実施予定の台湾調査を計画立案中である。第5班「世界観・自他認識論」では、国内調査を積極的に行なった。京都大学・妙心寺麟祥院・龍谷大学図書館・名古屋蓬左文庫(11月下旬)
超臨界二酸化炭素を利用したリポソームの調製と物性

我々は,これまでに有害な有機溶媒を用いずに環境適応型の溶媒である超臨界二酸化炭素(scCO_2)を利用することによって,一段階でリポソームを調製する新しい方法(超臨界逆相蒸発法:scRPE method)の開発に成功した。本研究では,本法に適したリン脂質の分子構造や形成プロセスを探索すると共に,scCO_2の機能性を利用することによって,リポソームの構造や粒子径を一段階で制御することを目的とした。その結果,以下のことを明らかにした。1.本法に適したリン脂質の分子構造を検討したところ,scCO_2(60°C, 200bar)とエタノールの混合流体への溶解度の高いフォスファチジルコリン(PC)型のリン脂質を用いると,大きな一枚膜リポソームが得られることが分かった。さらに,飽和炭化水素鎖を有するDPPCと不飽和炭化水素鎖を有するDOPCの比較検討を行ったところ,DOPCリポソームの方が,その保持効率は大きく最高で約40%にも及ぶことが分かった。2.リポソームの形成プロセスを探索したところ,リポソーム形成の前段階において水/scCO_2エマルションが得られることを見出し,このエマルションの粒子径を圧力を操作することによって変化させ,得られるリポソームの粒子径も制御可能であることが分かった。また,添加するエタノールの量を変化させることによって形成プロセスを制御し,リポソームの構造(多重膜リポソームおよび一枚膜リポソーム)も制御可能であることが分かった。3.リポソームの量産を目指し連続生産可能な新しいシステムを構築した。その結果,リン脂質濃度が10mMまでは,大きな一枚膜リポソームを連続生産可能であることが分かった。さらに,水溶性の有効成分としてグルコースやビタミンCを,油溶性の有効成分としてビタミンA誘導体やコレステロールなどを内包したリポソームを本法によって調製可能であることも見出した。
障害を持ちながら急性期病院を退院する患者とその家族の退院準備性を高める看護ケア

本研究の目的は,障害を持ちながら急性期病院を退院する患者とその家族の退院への準備性を明らかにし,円滑な在宅療養移行に向けて必要な準備性を高めるための効果的な看護ケアを検討することである。昨年度に引き続き第三段階として,心疾患を中心に疾病や障害を持ちながら急性期病院を退院する患者と家族を対象とした面接調査のデータ分析を行った。その結果,患者・家族は退院が決定することで在宅療養への決意を固めていくが,病状説明を受けても,疾病や障害により今後生じる生活上の支障や困難,将来的な病状の変化,それらに対し必要な準備や有効な対処方法などの予測やイメージがつかず,不安を抱えながら退院を迎えていることがわかった。一方で「なるようにしかならない」「深く考えなかった」などの楽観視も見られたが,このような家族が必ずしも退院後に現実に直面し困難に陥るわけではなく,むしろ困難を前向きに捉え取り組んでいることもあり,退院支援には退院を脅威ではなく乗り越えられるものと捉えるという認知面への働きかけも重要だと考えられた。次に第四段階として,医療機関で在宅療養専門の相談窓口として退院調整に携わっている看護師の業務の参加観察と聞き取り調査を行い,退院支援として(1)患者・家族の在宅療養への意思の確認,(2)アセスメントと課題の抽出,(3)患者・家族のニーズの把握,(4)必要かつ可能な在宅療養支援の明確化,(5)療養者・家族と専門職との退院後の目標や支援のすり合わせ,(6)必要なサービス提供者への橋渡し,(7)療養者・家族との契約関係の明確化,(8)退院後のモニタリングを抽出した。第四段階の8つの援助をべースにして,(2)には第一段階で抽出した7項目のアセスメントを,また第三段階の結果から(4)には認知の転換,(5)には患者の病状や退院後の生活のイメージ化を促進するための働きかけを加え,(7)を削除して,「家族の退院準備性を高めるための看護ケア」を作成した。本研究の目的は、障害を持ちながら急性期病院を退院する患者とその家族の退院への準備性を明らかにし、円滑な在宅療養移行に向けて必要な準備性を高めるための効果的な看護ケアを検討することである。平成18年度は、第一段階として、疾病や障害を持ちながら病院を退院する患者家族にどのような準備性が必要とされるのかについて、文献による検討を行った。退院調整看護師・退院支援看護師の活動に関する文献、疾病や障害を持つ患者家族の退院を扱った事例研究、退院調整・退院支援の場で活用されているアセスメント項目などを参考にした。その結果、[患者の病状やセルフケアカ][家族の体力・体調]といった身体的能力、[退院後の生活に関する知識・理解力・判断力][家族と本人の退院への思い][家族と本人の退院への自信][生活の場の環境][周囲のサポート]などが重要であることがわかった。第二段階として、急性期病院における障害を持つ患者の退院の現状を知るために、急性期病院に勤務している、あるいは最近まで勤務していた看護師10名にインタビューを行った。その結果、自宅退院となる患者家族には退院指導を行うが方法は施設によって差があり1回のみの場合も多いこと、相談室やMSWが関わるケースも多いが問題発生のリスクが高いと判断された場合が中心であることなどが明らかになり、十分な支援を受けずに退院になるケースも多いのではないかと考えられた。第三段階として、障害を持ちながら急性期病院を退院する患者とその家族は、どのような準備性を持って退院を迎えるのか、その準備性はどのような過程で獲得されるのか、準備性の不足のためにどのような困難に直面しているのかを明らかにするために、第一段階の結果を基にインタビューガイドを作成し、退院後3ヶ月以内の患者・家族を対象に面接調査を行うことにした。現在、データ収集と分析を並行して進めているところである。次に第四段階として,医療機関で在宅療養専門の相談窓口として退院調整に携わっている看護師の業務の参加観察と聞き取り調査を行い,退院支援として(1)患者・家族の在宅療養への意思の確認,(2)アセスメントと課題の抽出,(3)患者・家族のニーズの把握,(4)必要かつ可能な在宅療養支援の明確化,

(5)療養者・家族と専門職との退院後の目標や支援のすり合わせ,(6)必要なサービス提供者への橋渡し,(7)療養者・家族との契約関係の明確化,(8)退院後のモニタリングを抽出した。第四段階の8つの援助をべースにして,(2)には第一段階で抽出した7項目のアセスメントを,また第三段階の結果から(4)には認知の転換,(5)には患者の病状や退院後の生活のイメージ化を促進するための働きかけを加え,(7)を削除して,「家族の退院準備性を高めるための看護ケア」を作成した。
膜脂質の細胞内輸送・動態に関する研究

オートファジーは飢餓などのストレスに対する応答に留まらず、変性蛋白質の除去やオルガネラの品質管理など様々な重要な機能を持つことが明らかになってきた。オートファジーの分子機構はATG蛋白質の機能解析を基軸として急速に解明されつつあるが、オートファジーに必須の構造である隔離膜がどこでどのようにしてできるのかという謎はまだ解かれていない。我々は隔離膜形成に必須の膜脂質であるイノシトール3燐酸(PI3P)の微細局在をナノレベルで解明することを通じてこの問題にアプローチしてきた。これまでの研究により、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法(QF-FRL法)を用いてPI3Pを特異的かつ定量的に標識する方法を確立した。プローブとなるリコンビナント分子の1アミノ酸を置換した変異体、あるいはPI3Pを欠損する酵母変異体などの陰性対照により標識特異性を確認した。この方法で酵母および哺乳類細胞のオートファゴソーム、オートファジックボディーなどのPI3P分布を解析したところ、酵母細胞ではPI3Pの内葉・外葉のトポロジーが哺乳類細胞と異なり、従来の想定とは一致しないことを見出した。さらにPI3P加水分解酵素を欠損する酵母細胞を作製して解析し、上記のPI3Pトポロジーの形成とオートファジーの成立にPI3P加水分解酵素の作用が関与することを確認した。これらの結果は他の方法では原理的に得ることが極めて困難であり、隔離膜形成機構の解明に重要な新知見である。24年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、多種多様な機能に関連する膜脂質であるフォスファチジルイノシトール4,5-2燐酸[PI(4,5)P2]の細胞膜上のナノ局在を解明するために、凍結割断レプリカをホスホリパーゼCδ1のPHドメインで特異的に標識する方法を開発し、種々の培養細胞の解析に用いてきた。この方法では化学固定や人工プローブの発現などが必要でないため、どのような細胞にも応用でき、しかも定量的な解析が可能である。これらの利点を生かし、動物体内の生理的条件で分化した細胞の解析に応用する方法を開発した。ラット体内の膵外分泌部の腺房を取り出し、加圧凍結装置(HPM010)を用いて加圧凍結し、凍結割断レプリカを作製した。凍結割断レプリカをトリプシン、DNaseI、SDSで順次処理することによって脂質標識に適した標品を得て、PI(4,5)P2を標識、解析した。膵外分泌細胞は高度に分化した単層上皮細胞であるが、頂部、タイト結合部、側・基底部の細胞膜でのPI(4,5)P2密度には違いがなかった。一方、ギャップ結合部では、周囲の細胞膜よりも有意に高いPI(4,5)P2密度が見られ、チャネル開閉との関連が示唆された。膵外分泌細胞の細胞内には分泌顆粒、ゴルジ装置、小胞体など高度に発達したオルガネラが観察されたが、これらの限界膜には有意のPI(4,5)P2標識はなかった。これらの結果のうち、細胞膜の所見は従来、培養細胞を用いた実験で報告されていたものと異なり、またギャップ結合への集中は初めて明らかになった結果である。PI(4,5)P2の機能的意義を明らかにする上で、動物体内の細胞を解析することの重要性が示唆された。動物体内の細胞を用いてPI(4,5)P2のナノ局在を明らかにすることができた。これらは年度当初の計画通りである。急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を他の細胞、脂質に適用し、より広範な細胞現象の解析に応用する。特に様々な遺伝子改変が容易な酵母細胞を用い、膜脂質の輸送・動態の分子メカニズムの解明を進める予定である。
細胞表面の局在量調節をコンセプトとするGPCR制御剤開発のための基盤研究

本研究では、LTB4受容体(BLT1)のリン酸化がLTB4濃度の上昇で亢進し、これが引金となりBLT1を介する細胞応答が変化することを見つけた。BLT1は、周辺のLTB4が低濃度から高濃度へ変化することを感知してシグナル変換すると考える。炎症時、局所産生されたLTB4は血中放出され、好中球はこの際の濃度勾配を頼りに局所へ向かう。この濃度勾配は遊走の方向決定に重要とされてきたが、我々はこれに新たな意義を加えたい。本研究では、BLT1には高親和性と低親和性の少なくとも2つのリガンド認識構造が存在し、それぞれが初期応答(低濃度下での遊走)と終末応答(局所高濃度下での脱顆粒)に関わることを提唱する。*ERからのGPCR搬出量制御(糖鎖修飾):α2bアドレナリン受容体は、N型糖鎖修飾を受けないが、構造変異受容体が膜に発現しないことから糖鎖修飾非依存的な品質管理機構が存在することを既に推察している。26年度は、プロテアソーム阻害剤実験や共焦点顕微鏡観察による局在解析で、糖鎖付加のないこの受容体もERADによる品質管理を受けていることを確認した。また、この品質管理に関わる因子としてOS9を検討しているが、この分子とα2bアドレナリン受容体の結合領域の検討を開始した。なお、N型糖鎖修飾とGPCRの品質管理に関しては、ナイアシン受容体(GPR109a)についても行い、従来型とは異なるN型糖鎖修飾モチーフ(N-X-Cモチーフ)を見いだし、この通常とは異なるモチーフの生理学的意義(なぜ正常型モチーフではダメなのか)についても検討した(平成27年度論文発表予定)。*細胞内取込み、リサイクル制御(リン酸化、ユビキチン化):ロイコトリエンB4の第一受容体(BLT1)は未刺激状態で既に5カ所のリン酸化修飾を受けており、リガンド刺激に伴い、これに2カ所のリン酸化修飾が加わることを確認した(詳細な修飾部位は未発表)。前者のみ、後者のみ、全てのリン酸化部位の3つの欠損型BLT1の作製が終了し、現在、これらの修飾の生理学的意義を検討中である。ユビキチン修飾解析に関しては、候補ユビキチンリガーゼのBLT1結合領域を推定し、また、このユビキチンリガーゼがBLT1のみならず、広範なGPCRに結合することを示唆した。その他のBLT1結合蛋白質に関しては、現在もユビキチンスプリット型酵母2-ハイブリッドスクリーニング法で探索中である。ロイコトリエンB4(LTB4)受容体(BLT1)の細胞質側複数箇所のリン酸化度合いがリガンド濃度依存的に亢進することを確認した。加えて、このリン酸化修飾を欠失させた変異BLT1は低濃度リガンドに対する応答性は正常型BLT1と差異が無いが、高濃度リガンドに対してはシグナル伝達能や遊走性が正常型とは異なることを示唆した。我々はこうした結果から好中球におけるLTB4/BLT1経路の役割に関し、以下の様な作業仮説を立てた。(1)低濃度LTB4認識によるBLT1活性化の始まり(遊走は惹起されるが、脱顆粒などは起こらない)→(2) BLT1の構造変化によるLTB4親和性の低下(低濃度LTB4の結合をトリガーとするBLT1の局在変化、或は、オリゴマー化が起因?)→(3)高濃度LTB4によるさらなる活性化(細胞質領域のリン酸化亢進)→(4)シグナル伝達の変換(リン酸化部位へのアレスチン結合などが関与?)→(5)新たな細胞応答の始まり(炎症局所特異的な脱顆粒、活性酸素産生など)。現在、この仮説を立証できる証拠は蓄積しつつある。最終年度である平成28年度にこの作業仮説を立証し、好中球が炎症局所で起こす脱顆粒や活性酸素の産生が受容体活性化初期の遊走段階では起きない理由を明らかにしたい(新しい情報伝達機構の提唱)。当初の計画に加え、新たな受容体リン酸化修飾の生理学的意義を見出すチャンスをつかんだ。最終年度に論文としてまとめることにも目処がついた。申請課題を遂行すべく、最終年度に以下のことを明らかにした。(1) LTB4刺激濃度依存的なBLT1リン酸化亢進の確証:HeLa細胞内で強制発現させたBLT1のリン酸化をPhos-tag SDS-PAGE法で評価し、リン酸化がリガンド濃度に依存して亢進することを確証した。(2) BLT1の表在確認:作業仮説が正しいならば、BLT1は低濃度LTB4で初期活性化(例えば遊走惹起)されても細胞内に取込まれず、細胞表面に留まるはずである。これを東京大学大学院工学研究科の長棟輝行教授が開発した表在GPCR特異的な蛍光標識法を活用し、共焦点蛍光顕微鏡を用いたタイムラプス解析で証明した。(3) BLT1リン酸化亢進とシグナル変換の意義:BLT1の全リン酸化部位は既に決定し、その部位変異体も作製した。BLT1のリン酸化は、恒常的な部位が5箇所、リガンド刺激依存的な部位が2箇所であった。そこで変異体は、恒常的な部位のみ(Δb-phos)、誘導的な部位のみ(Δi-phos)、全部位(Δphos)の3種類を作製した。

このリン酸化欠損BLT1をHeLa細胞、CHO-K1細胞、RBL-2H3細胞などで発現させ、低濃度、高濃度LTB4で刺激した際の細胞応答を正常型BLT1発現細胞と比較し、リン酸化修飾の欠損で高濃度リガンド下での脱顆粒応答が顕著に低下することを見出した。遊走能に関しては、Boyden-chamber法によって、リン酸化修飾欠損によって高濃度LTB4刺激でのBLT1を介する走化性が顕著に低下することを見出した。(4)リン酸化欠損型の応答異常の原因解明:cAMP産生、ERK活性、Akt活性を調べ、高濃度リガンド刺激で惹起されるこれら全ての応答がリン酸化修飾の欠損で異常となることを見出した。本研究では、LTB4受容体(BLT1)のリン酸化がLTB4濃度の上昇で亢進し、これが引金となりBLT1を介する細胞応答が変化することを見つけた。BLT1は、周辺のLTB4が低濃度から高濃度へ変化することを感知してシグナル変換すると考える。炎症時、局所産生されたLTB4は血中放出され、好中球はこの際の濃度勾配を頼りに局所へ向かう。この濃度勾配は遊走の方向決定に重要とされてきたが、我々はこれに新たな意義を加えたい。本研究では、BLT1には高親和性と低親和性の少なくとも2つのリガンド認識構造が存在し、それぞれが初期応答(低濃度下での遊走)と終末応答(局所高濃度下での脱顆粒)に関わることを提唱する。当初の計画を達成でき、また、N型糖鎖研究に関しては、当初計画にない新たな研究も成功に導くことができた。新しい情報伝達制御機構の証明をする必要から、当初予定をしていなかった実験もしなければならない。機器の不足から協同研究の必要が発生している。幸い、協同研究者に恵まれ、順調に推移できると考えている。生化学、分子生物学計画2年目である平成27年度は、糖鎖修飾、リン酸化修飾、ユビキチン修飾のGPCR機能、細胞内輸送における重要性をさらに明らかにし、論文化に向けて仕上げの実験を進めていきたいと考えている。基本的な推進方策に関しては変更はない。平成26年4月より岡山理科大学理学部に教授として着任し、新しい研究室を立ち上げた。東京大学時代と比べ、研究環境に不十分な点はあるが、GPCRに関する創薬基盤研究をさらに広げるために新しい課題にも取り組むつもりである。
ポリジアゾ化合物の光および放射線分解による高スピン分子の生成過程

ポリジアゾ化合物から高スピン分子を得る光分解生成過程においては,光励起直後の励起一重項状態から基底多重項状態に至る迄に,励起状態でのスピン転換過程が不可避的に介在する.本研究ではピコ秒レーザーホトリシスによって生成する過渡的活性化学種の時間分解吸収スペクトルを観測し,スピン転換過程について知見を得た.高スピン分子の前駆体であるジアゾ化合物はすべて合成,精製しNMR, IRおよび元素分析によって確認した.サンプルとして, 1, 3ビス(α-ジアゾベンジル)ベンゼン/MCH系を採用した.レーザーホトリシスおよび時間分解過渡吸収スペクトルの測定には,繰り返し周波数が多く出力も安定したレーザーが不可欠であるので,マイクロコンピュータ制御ピコ秒Nd^<3+>:YAGレーザー測定システム(大阪大学基礎工学部又賀研究室特殊実験室)を使用させて頂いた.測定の結果, 355nmで励起直後から26psで400800nmの広範囲にわたって過渡吸収があらわれ, 80psではさらに強くなり,吸光度は0.033以下ではあるが過渡的活性種の生成が明瞭に検出された. ns時間領域では吸収強度は弱くなり,すでに過渡的化学種の減衰がみられた.基底三重項分子であるジフェニルメチレンのジアゾ前駆体であるジフェニルジアゾメタンのピコ秒レーザーホトリシスによる動力学的研究によれば,光励起後窒素が脱離した後の一重項-三重項のスピン転換過程におけるジフェニルメチレンの第一励起三重項状態の生成には300psを要するという実験結果を考慮すると, 80ps時間領域で観測された過渡吸収スペクトルは, (1)2個のN_2を持つジアゾ前駆体から窒素が1個脱離して生成した励起一重項重モノカルベンの吸収,あるいは(2)1光子(または2光子)吸収過程で一重項状態を保持したまま,段階的に2個の窒素が脱離した励起一重項ジカルベン(高スピン分子の励起一重項状態)の吸収に由来する可能性が強いことがわかった.ポリジアゾ化合物から高スピン分子を得る光分解生成過程においては,光励起直後の励起一重項状態から基底多重項状態に至る迄に,励起状態でのスピン転換過程が不可避的に介在する.本研究ではピコ秒レーザーホトリシスによって生成する過渡的活性化学種の時間分解吸収スペクトルを観測し,スピン転換過程について知見を得た.高スピン分子の前駆体であるジアゾ化合物はすべて合成,精製しNMR, IRおよび元素分析によって確認した.サンプルとして, 1, 3ビス(α-ジアゾベンジル)ベンゼン/MCH系を採用した.レーザーホトリシスおよび時間分解過渡吸収スペクトルの測定には,繰り返し周波数が多く出力も安定したレーザーが不可欠であるので,マイクロコンピュータ制御ピコ秒Nd^<3+>:YAGレーザー測定システム(大阪大学基礎工学部又賀研究室特殊実験室)を使用させて頂いた.測定の結果, 355nmで励起直後から26psで400800nmの広範囲にわたって過渡吸収があらわれ, 80psではさらに強くなり,吸光度は0.033以下ではあるが過渡的活性種の生成が明瞭に検出された. ns時間領域では吸収強度は弱くなり,すでに過渡的化学種の減衰がみられた.基底三重項分子であるジフェニルメチレンのジアゾ前駆体であるジフェニルジアゾメタンのピコ秒レーザーホトリシスによる動力学的研究によれば,光励起後窒素が脱離した後の一重項-三重項のスピン転換過程におけるジフェニルメチレンの第一励起三重項状態の生成には300psを要するという実験結果を考慮すると, 80ps時間領域で観測された過渡吸収スペクトルは, (1)2個のN_2を持つジアゾ前駆体から窒素が1個脱離して生成した励起一重項重モノカルベンの吸収,あるいは(2)1光子(または2光子)吸収過程で一重項状態を保持したまま,段階的に2個の窒素が脱離した励起一重項ジカルベン(高スピン分子の励起一重項状態)の吸収に由来する可能性が強いことがわかった.