hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シクロオキシゲナーゼとリポキシゲナーゼのアイソザイム

アラキドン酸から生理活性エイコサノイドを作る代謝系の分岐点にある酵素は、シクロオキシゲナーゼとリポキシゲナーゼである。これらの酵素のアイソザイムの構造と機能を解明することを研究目的とする。1)5-リポキシゲナーゼ阻害剤:抗酸化作用のある化合物YT-18が種々のリポキシゲナーゼのうち5-リポキシゲナーゼを特異的に阻害した。2)12-リポキシゲナーゼの自殺失活:白血球型12-リポキシゲナーゼが反応開始直後から失活し始める現象を追求し、この酵素自体が副産物として作る15-ヒドロペルオキシ酸を14,15-エポキシ酸に変換し、それが酵素蛋白に取込まれて失活を来たすことを示唆する結果を得た。血小板型酵素ではそのような15-ヒドロペルオキシ酸の生成と変換がわずかで、顕著な自殺失活はなかった。3)12-リポキシゲナーゼのアナンダミドとの反応:カンナビノイド受容体の内因性リガンドとしてのアラキドニルエタノールアミン(アナンダミド)が白血球型12-リポキシゲナーゼの基質となり、生物活性を失った。4)12-リポキシゲナーゼ遺伝子の転写調節:血小板型酵素遺伝子の調節領域を調べてた結果、-539から-530bpにあるNFκBエレメントが、酵素遺伝子の発現を抑制することが示唆された。5)シクロオキシゲナーゼ-1の誘導:ヒト巨核芽球白血病細胞CMKで、TPAによってシクロオキシゲナーゼ-1が誘導されることを、酵素活性・蛋白・mRNAの発現で示した。6)シクロオキシゲナーゼ-2の転写調節:マウス骨芽細胞MC3T3-E1でTNFαがシクロオキシゲナーゼ-2を誘導することを見出し、転写調節因子としてNFκBとNF-IL6が協調して働くことを示唆する知見を得た。不飽和脂肪酸のアラキドン酸から生理活性物質が作られる代謝系で、生合成を律速調節するのがシクロオキシゲナーゼとリポキシゲナーゼのような酵素添加酵素である。私達は、その1つの12-リポキシゲナーゼに2種類のアイソザイムが存在することを見出した。また、従来知られていたシクロオキシゲナーゼとは区別されるアイソザイムが発見され、現在活発な研究の対象となっている。1)12-リポキシゲナーゼ遺伝子の構造と機能の解明(分担山本尚三):12-リポキシゲナーゼの2つのアイソザイムのゲノムDNAはすでに単離されており、このうちヒトの血小板の酵素の転写調節因子の解析が進められた。ルシフェラーゼ遺伝子をリポーターとして使い、5'端上流-539からの-530に見出されNFkBモティーフが、周辺のAP-2モティーフなどと関連しつつ、12-リポキシゲナーゼ遺伝子の発現を陰に調節していることを明らかにした。2)12-リポキシゲナーゼのアナンダミドとの反応性(分担上田夏生):カンナビノイド受容体の内因性リガンドとして見出されたアナンダミド(アラキドニルエタノールアミド)と、種々のリポキシゲナーゼとの反応性を調べたところ、15-リポキシゲナーゼと白血球型12-リポキシゲナーゼが、アラキドン酸と大差のない活性を示すことが見出された。

3)抗シクロオキシゲナーゼ-2抗体の調製(分担林陽子):シクロオキシゲナーゼ-2の動態を追究するために、シクロオキシゲナーゼ-2に特異的なペプチドを抗原としてウサギに注射して、ポリクローナル抗体を調製して、ウエスタンブロット法に適用した。4)シクロオキシゲナーゼ-2のリコンビナント酵素標品の調節(分担鈴木啓史):マウス骨芽細胞MC3T3-E1からクローニングしたシクロオキシゲナーゼ-2のcDNAを含むプラスミッドでバキュロウイルスを構築し、カイコの卵の発現させた。不飽和脂肪酸のアラキドン酸から生理活性エイコサノイドを作る代謝系を律速する酵素は、シクロオキシゲナーゼとリポキシゲナーゼである。シクロオキシゲナーゼの2つのアイソザイム(COX-1とCOX-2)、ならびに12-リポキシゲナーゼ2つのアイソザイム(血小板型と白血球型)について、その触媒能と遺伝子発現調節機構を解析した。1)12-リポキシゲナーゼの自殺失活(分担鈴木啓史):白血球型は反応開始直後に失活し始め、2-3分間でほぼ完全に失活する。血小板型ではこのような顕著な自殺失活はなく、反応はほぼ直線状に進行する。白血球型がアラキドン酸と反応すると12位の酸素添加の他に部分的に15位にも酸素添加して、15-ヒドロペルオキシ酸を生じる。後者はさらに同じ酵素の作用で共役トリエンをもつ14,15-エポキシドになる。種々の実験条件を検討して、白血球型ではこのエポキシ酸が酵素蛋白に取込まれることによって失活し、血小板型ではこの14,15-エポキシドをほとんど生成しないために、顕著な失活がないと考えられた。2)5-リポキシゲナーゼの特異的阻害剤(分担鈴木啓史):抗酸化作用をもつ化合物YT-18が、5-リポキシゲナーゼ反応の立上りを阻害し、他のリポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼは阻害しなかった。3)シクロオキシゲナーゼ-1の誘導(分担上田夏生):ヒト巨核芽球系白血病細胞CMKにTPAを与えると、早期の一過性のCOX-2の誘導の後に、ゆっくりとCOX-1が発現することが見出された。4)シクロオキシゲナーゼ-2の誘導(分担山本尚三):マウス骨芽細胞MC3T3-E1にTNFαを与えると、COX-2が1-2時間のうちに顕著な誘導を来たした。その遺伝子DNAの5端上流に見出される種々の転写調節エレメントを解析して、NFκBとNF-IL6が協調して、COX-2遺伝子の転写調節因子として酵素誘導を来たすものと考えられた。
う蝕原性連鎖球菌の菌種特異的タンパク質抗原のクロ-ニング

う蝕予防ワクチン開発の目的で、う蝕原性レンサ球菌の中で最も重要なc血清型Streptococcus mutansを用いて、本菌種特異的タンパク質抗原に対する単クロ-ン抗体を作成し、その抗原解析および遺伝子クロ-ニングを試みた。まず、c血清型S.mutans Uー29株の全菌体を用いてマウスに免疫し、免疫マウス脾細胞とミエロ-マ細胞との細胞融合により、抗体産生ハイブリド-マを作成し、この中から、本血清型菌に特異的に反応する単クロ-ン抗体産生ハイブリド-マを酵素抗体法により選択し、単クロ-ン抗体MAb516を得た。このMAb516の抗原決定基は菌体表層のAgI/II上に存在していることが明らかになった。本抗原に対する単クロ-ン抗体として、その他MAb498、C341が得られている。しかしこれらの単クロ-ン抗体は、本抗原と共通抗原を有する他の口腔内レンサ球菌にも反応性を有していた。従って、MAb498およびMAb C341は、AgI/II上の類似タンパクとの共通抗原領域を認識し、MAb516はc血清型菌に特異的な領域を認識している事が示唆された。これまでにc血清型S.mutans特異的単クロ-ン抗体は報告されておらず、本血清型菌がう蝕病巣より最も分離頻度の高い菌である事から、う蝕予防ワクチンの開発のみならず病原性発現機序の解明の上でもMAb516は有用であると思われる。現在、MAb516の認識部位を含む領域をペプチドマッピングにより決し、対応する合成オリゴヌクレチドプロ-ブを用いて、c血清型S.mutans Ingbritt株の遺伝子バンクより陽性クロ-ンを検索中である。ヒトに対して強いう蝕原性を有するミュ-タンス群連鎖球菌の一種であるストレプトコッカス・ミュ-タンスの菌種に特異的な菌体表層蛋白質抗原のクロ-ニングを行う際に、遺伝子発現系での抗原検出用プロ-ブとして使用する単クロ-ン抗体を得るため、本菌種の血清型fであるSE17株を用いてマウスを免疫し得られた免疫脾細胞をミエロ-マ細胞と常法により融合させてハイブリド-マを作製した。得られたハイブリド-マの内、5クロ-ンはミュ-タンス群連鎖球菌中でストレプトコッカス・ミュ-タンスに特異的に反応する単クロ-ン抗体を分泌していた。その内の1クロ-ンの分泌する抗体は本菌種の細胞壁多糖抗原やリポイタコ酸分画とは全く反応せず、また他の口腔連鎖球菌のストレプトコッカス・ミチス(4株)、ストレプトコッカス・サングイス(4株)、ストレプトコッカス・サリバリウス(2株)、ストレプトコッカス・ミレリ(1株)とも交差性を示さなかった。さらにこの抗体は多くの口腔連鎖球菌に共通して存在する表層蛋白質抗原AgI/IIとも反応性を示さないことから、本抗体はストレプトコッカス・ミュ-タンス特異的な未知の蛋白質抗原を認識している可能性が高い。しかし、本抗体の認識する抗原を含むストレプトコッカス・ミュ-タンス培養上清の硫安沈澱分画をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、本抗体を用いてイムノブロット法により当該抗原の検出を試みたが明瞭な蛋白質バンドを検出することはできなかった。これは電気泳動中に抗原が変性しその抗原決定基構造が失われることに起因する可能性が考えられるため、より緩和な分析手段を用いて、現在その抗原を鋭意解析中である。

次に、遺伝子スクリ-ニング用のストレプトコッカス・ミュ-タンス遺伝子ライブラリ-は、本菌種のIngbritt株よりDNAを抽出し、大腸菌系発現ベクタ-のλgt11に組み込んで構築中である。ヒトのう蝕原性連鎖球菌であるミュ-タンス群連鎖球菌の一種、ストレプトコッカス・ミュ-タンスの菌種持異的菌体表層タンパク質抗原のクロ-ニングを行うため、遺伝子発現系での抗原検出用プロ-ブとして単クロ-ン抗体を使用することとし、本菌種の血清型Cである臨床分離株を用いてマウスを免疫した。得られた免疫脾細胞を常法によりミエロ-マ細胞と融合させてハイブリド-マを作製し、ミュ-タンス群連鎖球菌中でストレプトコッカス・ミュ-タンスに特異的に反応すると思われる単クロ-ン抗体産生株を1クロ-ン得た。この株の生産する単クロ-ン抗体は、ストレプトコッカス・ミュ-タンスの細胞壁多糖抗原と反応せず、またプロテア-ゼE処理を行った菌体とは反応性を示さないことから、菌体表層タンパク質を認識している可能性が強く示唆された。さらに、認識する抗原は分子量約140Kd、等電点5.0付近であることが明らかとなった。現在はこの抗体が未知の表層タンパク質抗原を認識するものか、あるいはいくつかの口腔内連鎖球菌に共通して存在する表層タンパク質抗原AgI/II上の特別な抗原決定基を認識するものかについて、さらに解析を進めている。なお、上記の単クロ-ン抗体が今回の目的にそぐわない場合は、ストレコッカス・ミュ-タンスに特異的なウサギ抗血清を抗原検出用プロ-ブとして使用する予定であり、単クロ-ン抗体作製と並行してウサギの免疫を進めている。最後に、遺伝子スクリ-ニング用のストレプトコッカス・ミュ-タンスの遺伝子ライブラリ-については、本菌種のIngbritt株よりDNAを抽出し、大腸菌系発現ベクタ-であるλgtllに組み込んで、すでに構築を完了した。ヒトに対して蝕原性を有するミュ-タンス群レンサ球菌の中でも特に我が国においてはStreptococcus mutansC血清型菌が病巣から最も多く分離され、う蝕発現機序解明および蝕予防ワクチンの開発には本血清型菌が最も有効であると考えられたため、本菌種C血清型菌Uー29株の全菌体をマウスに免疫し、単クロ-ン抗体産生ハイブリド-マを作成し、本菌種特異抗原の検索を行った。その結果、C血清型菌と反応する単クロ-ン抗体MAb516およびMAb498が本菌の菌体表層タンパク質抗原を認識すめことが分かった。この2種の単クロ-ン抗体はいずれも、分子量19万の抗原I/IIあるいはP1抗原、IF抗原等と呼ばれているタンパク質上の抗原決定基を認識し、特にMAbー516はC血清型菌特異的であり、MAb498は抗原I/II類似のタンパク抗原を有する他の血清型菌とも反応性を有していた。従って、単クロ-ン抗体MAbー516の認識する抗原I/IIのC血清型菌特異的領域の遺伝子クロ-ニングは、う蝕予防ワクチンの開発および本菌の病原性発現機序の解明に寄与すると考えられた。本遺伝子クロ-ニングは、供与体DNAとして、C血清型S.mutans Ingbritt株の染色体DNA、ベクタ-として、ファ-ジベクタ-λgtllおよびコスミドベクタ-pHC79を使用した。現在までのところ、MAb516を用いたスクリ-ニングによっては陽性クロ-ンは検出できなかった。免疫電顕的解析によりMAbー498の認識部位は菌体表層全域にわたって、広く分布しているが、MAb516の認識部位は菌体表層の特に細胞分裂面付近および、菌体間の接着部位と思われる突起様構造物上に多く存在し、他の領域にはあまり存在していなかった。このことは、MAbー516の抗原決定基は抗原I/IIの立体構造及び他の何等かの修飾因子が関与していることが示唆される。
トルコ・カッパドキアの都市文化・景観保全に向けた岩窟教会の風化対策に関する研究

自然と文化の両面において価値が高い世界遺産であるカッパドキアにおいて、地域の文化や歴史を伝える遺構や壁画の支持体としての凝灰岩の風化対策、また独特の景観の保全が喫緊の課題となっている。本研究は、脆弱な凝灰岩で構成されたカッパドキアの岩窟教会を対象とし、風雨による浸食や日射による熱応力、冬季の凍結融解等の作用等の劣化・風化のメカニズムを現地における環境測定と実験室実験により明らかにし、保存対策手法の検討と、現地における施工実験、数値解析による効果検証を行う。
プログラムされた核酸複合体を基体とする触媒デザインとそのシグナル増幅への応用

本研究では、DNA複合体を反応場とする触媒反応系の確立を目的としている。DNAを足場とする反応として、Michael付加反応を選んだ。この反応を加速する有機触媒には、酸、塩基、および疎水部分を併せ持つという共通項がある。DNA構造の特性を利用すれば、酸、塩基が特定の疎水環境に適切に配置される理想的な酵素様環境を設計することが可能でる。本研究ではこれを核酸、タンパク質などの検出系におけるシグナル増幅反応として利用する。DNA複合体を反応の足場とすると、その構成要素の化学修飾によりあらゆる機能部位を導入でき、また複数の機能部位同士の距離、配向を自在に制御することが容易である。つまり、DNAに酸、および塩基部位を導入し、ターゲットの存在下でのみ両者が近づくよう設計すれば、DNAを基体として触媒環境を構築することができる。本年度には、酸および塩基を導入したDNAコンジュゲートのライブラリーから酸と塩基の全組み合わせについて触媒能を検討した。結果、基質に対する付加反応は観測されたが、コンジュゲート特異的なシグナル増幅は見られていない。また基質や反応物に関してもライブラリを増やして検討を行ったが、狙った反応は未だ確認されていない。そこで、Michael付加反応ではなくホスホン酸ジエステルの分解反応に着目した。金属錯体がホスホン酸ジエステルを切断する現象はよく知られている。これまでに合成したコンジュゲートを含めて、金属錯体を形成するコンジュゲートの合成によりさらにライブラリを増やし、ホスホン酸ジエステル結合を有する基質の合成も既に完了している。(抄録なし)本研究では、DNA複合体を反応場とする触媒反応系の確立を目的としている。つまり酸、塩基が特定の疎水環境に適切に配置されていれば、Michael付加が加速されると考えられる。DNA構造の特性を利用すれば、このような理想的な酵素様環境を設計することが可能であり、本研究ではこれを核酸、タンパク質などの検出系におけるシグナル増幅反応として利用する。DNA複合体を反応の足場としてとらえると、その構成要素の化学修飾により、あらゆる機能部位を導入でき、また複数の機能部位同士の距離、配向を自在に制御することが容易である。本年度には、酸、および塩基を導入したDNAコンジュゲートの合成を行い、機能ユニットのライブラリーを構築し、ライブラリー内の酸と塩基の全組み合わせについて触媒能を検討した。手法としてはDNAをボスホロアミダイト法により合成し、51末端への導入は固相単体上で行った。その後、固相単体から切り出し、コンジュゲートを得ることができた。また3味端にはアミノ基を導入し、活性エステル化した反応物との縮合反応によりコンジュゲートを合成した。触媒機能の検討では、合成したコンジュゲートについて様々な組み合わせを検討した。これまでの結果において付加反応は観測されたが、狙ったシグナル増幅は見られていないため、基質や反応条件を更に検討する必要がある。本年度に用いるDNAコンジュゲートの合成が完了し機能ユニットのライブラリーを構築することができた。今後、このユニットの組み合わせや反応条件を検討することで当初の目的であるシグナル増幅系を確立することが可能と考えている。反応における基質への反応物としてアセトンを検討していたが、バックグラウンドの増加や揮発等の問題から再現性が得られにくいことが示された。今後は、基質および反応物も条件に合う化合物の合成を行い、分子設計を検討する。また、Michael付加反応の他、Aldol反応、Baylis-Hillman反応など多様な化学反応への展開や、反応生成物のエナンチオ選択性についても並行して検討する。(抄録なし)
ミオシンの構造改変により心筋の力発生能力とエネルギー効率を改善するための研究

本研究の目的は分子の構造改変により心臓を駆動するのに最適なモーター特性(高いエネルギー効率を持ち力発生能力も高い)を持ったミオシンを作成するための基礎的データを得ることである。このため1)分子レベルでの機能測定系の確立および2)遺伝子工学を用いた変異ミオシンの作成を行った。1)についてはin vitro motility assayに光ピンセットを組み合わせた実験系の改良を行い、feedback-enhanced trapによりisometricに相当する条件下で1分子のミオシンとアクチンフィラメントの間に発生する力を測定することを可能にした。これを用いて心臓の適応において大きな役割を果たすと考えられている心筋ミオシンの2つのアイソフォームV1とV3の発生する力を測定、比較したところ両者は発生する力のピークの値に差は認められないものの力を発生している時間に差が見られこれが両者のエネルギー効率に差を生み出す原因となっていると考えられた。2)変異ミオシンの解析についてはヒト家族性肥大型心筋症をモデルに細胞性粘菌ミオシン発現系を用いて変異ミオシンを作成し多面的に機能評価を行った。ATP結合部位、アクチン結合部位、反応性SH基近傍、および軽鎖結合部位における変異ミオシンにつきATPase活性、in vitroでの滑り速度、力発生を測定したところこれらの機能の間に解離がみられた。特に機能部位とは離れた位置にある軽鎖結合部位における変異においてこの傾向は著明でありこの部位がミオシンのエネルギー変換過程において重要な役割を果たしていることが示唆された。また力発生能力と臨床例における予後の間に相関が見られ機能低下が病態形成に重要であること、逆に機能的に優れたミオシン発現させることができれば心不全の治療に有用であることが示唆された。我々は分子の構造改変により最適なエネルギー特性を持った心筋ミオシンを作成することを目標としており、このための分子生物学実験、ならびに測定系の改良を行っている。機能測定の分野ではin vitro motility assayに光ピンセットを組み合わせた実験系の改良を進めた。feedback enhancedtrapによりisometricに近い条件で1分子のミオシンとアクチンフィラメントの間に生ずる力を測定することが可能になった。これを用いて心筋ミオシンに存在する異なるATPase活性を持った2つのアイソフォーム(V1,V3)のforce transientを記録しその持続時間に差があることを認めた(論文投稿中)。心筋ミオシンの構造と機能の関係についてはヒト家族性肥大型心筋症をモデルに細胞性粘菌ミオシン発現系を用いて点突然変異を作成し多面的な機能を評価した。作成した変異はATP結合部位、アクチン結合部位、反応性SH基近傍、そして軽鎖結合部位近傍である。この結果溶液中のATPase活性、in vitroでの無負荷滑り速度、および力発生の間に解離の見られることを見出した。特に注目されたのは従来考えられてきた機能部位とは離れた位置にある軽鎖結合部位近傍の変異であり、ATPase活性が比較的保たれているにも関わらず力発生能力に大きな低下が認められた。従ってこの部位がミオシンのエネルギー変換過程において重要な役割を果たしていると考えられた(Fujita et al.)。また臨床例での生命予後と変異ミオシンの力発生能力に相関があること合わせミオシンの機能の重要性が認識された。同様にSH2基の改変でも力発生に大きな影響が見られ(Suzuki et al)今後の研究に示唆を与える結果であった。本研究の目的は分子の構造改変により心臓を駆動するのに最適なモーター特性を持ったミオシンを作成するための基礎的データを得ることであった。このために分子レベルにおけるミオシンの収縮機能測定系としてin vitro motility assayに光ピンセットを組み合わせた実験系の改良を行い、feedback-enhanced trapによりisometricに相当する条件下で1分子のミオシンとアクチンフィラメントの間に発生する力を測定することを可能にした。

これを用いて心臓の適応において大きな役割を果たすと考えられている心筋ミオシンの2つのアイソフォームV1とV3の発生する力を測定、比較したところ両者は発生する力のピークの値に差は認められないものの力を発生している時間に差が見られこれが両者のエネルギー効率に差を生み出す原因となっていると考えられた。さらに現在心不全において増加しているとされる心房型ミオシン軽鎖の生理的意義に着目し、機能解析を進めている。これまでにに心房型ミオシン軽鎖の発現がin vitroにおける滑り速度を低下させることを見出したこれまでの検討によれば滑り速度の低いミオシンは力発生能力が高い可能性があり、この点について検討を行いつつある。すでに報告した心筋症型変異ミオシンの作成および機能評価からミオシン頭部の構造変化を増幅する役割を果たすと思われるC端のalpha-helixおよびそれに付着して機能を制御している軽鎖の重要性に着目し現在変異分子を作成中である。
HSCによるIa型超新星の早期観測による親星の研究

Ia型超新星の早期観測を実現するため、大学院生・研究協力者と共にすばる望遠鏡の観測時間を獲得をめざし観測提案を提出したが、残念ながら今年度は採択されなかった。一方、Hyper Suprime-CamのStrategic SurveyProgramの繰り返し観測が2018年秋に実施されたので、その解析を進めている。15バンド同時撮像カメラDMCの改修については望遠鏡微動調整のためのガイダーを購入、カメラ部分の改修も引き続き継続して作業中である。研究協力者の大学院生Jian Jiang氏他と既存の早期観測データを調べ、明るいIa型超新星と暗いIa型超新星は早期増光の割合が大変高いことを示した。一方で、通常の明るさのIa型超新星で早期増光を示すものはほとんど見つからなかった。これはIa型超新星の起源が複数ある可能性が高いことを示す重要な結果である。この結果は国際会議および査読論文で発表した。また早期増光について、2016年に発見したヘリウム外層爆発起源の超新星爆発を念頭に、ヘリウム外層爆発モデルと、伴星や星周物質との相互作用を比較した理論予想のより詳しい研究を研究協力者の京都大学の前田氏らと発表した。さらに、スペクトル線の特徴(シリコンやチタン)に注目しながら、色と明るさとスペクトル等の関係について研究協力者の大学院生と興味深い特徴を見つけ、査読論文として投稿準備を進めている。すばる望遠鏡の共同利用観測時間に応募をしたが、残念ながら採択されなかった。すばる望遠鏡、特にHyper Suprime-Camの採択割合は低いため、ある程度やむを得ない面がある。そこで既存のデータを広く調べることを大学院生で研究協力者のJian Jiang氏らと行った。その結果、計画当初の目標としていた10個を超える11個の早期増光を文献のデータから見つけることができた。この個数は当初の目標の個数を超えている。それらを調べた結果、明るいIa型超新星ではほぼすべてが早期増光を示し、暗いIa型超新星でも高い割合で早期増光を示す一方、普通の明るさのIa型超新星では早期増光がほとんど見つからなかった。これは科学的に大きな進展である。ただし、普通の明るさのIa型超新星についてはさらに統計を増やす必要がある。また15バンド同時撮像カメラDMCの改修についてはまだ各種作業中であり遅れている。全体としておおむね順調に進展していると言える。すばる望遠鏡の観測時間については、引き続き共同利用観測の応募を続け、他の採択された観測時間とあわせて、Ia型超新星の早期観測を目指す。2019年秋のHyper Suprime-Cam戦略枠時間にあわせた共同利用観測提案を提出した。また2019年5月には別に採択されたHyper Suprime-Camの観測も利用して探査を行う予定である。また、木曽観測所シュミット望遠鏡で広視野カメラTomo-eが2019年4月に完成予定であるため、15バンド同時撮像カメラDMCの改修を進め、近傍超新星の早期観測によっても統計の不足を補っていく。

また2019年5月には別に採択されたHyper Suprime-Camの観測も利用して探査を行う予定である。また、木曽観測所シュミット望遠鏡で広視野カメラTomo-eが2019年4月に完成予定であるため、15バンド同時撮像カメラDMCの改修を進め、近傍超新星の早期観測によっても統計の不足を補っていく。
NMRとX線によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

クロコウジカビAspergillus nigervar.macrosporusが分泌する酸性プロテアーゼAは基質特異性、阻害剤に対する反応性、一次構造、分子量等の性状が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる新規の酸性プロテアーゼである。本研究では、プロテアーゼAの立体構造、変性中間状態ならびに中性変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにすることを目指してX線結晶構造解析とX線小角散乱測定を行った。本酵素が活性を示すpH1.53で得られた結晶についてX線回折を測定したところ、1.5Åの分解能の反射が得られた。重原子誘導体の探索を行った結果、Hgおよび2種類のPtの同型置換体が得られた。電子密度図から、この分子はクロワッサン型をしており、αヘリックスを含まずβシートのみからなることが分かった。アスパラギン酸プロテアーゼも主としてβシートからなるクロワッサン型をしており、プロテアーゼAは分子量がアスパラギン酸プロテアーゼに比べて約半分であるにもかかわらず、分子の外形はアスパラギン酸プロテアーゼと大雑把には相似形といえる。ただ、βシート構造の分子全体に対する配向が両者で明らかに異なっており、プロテアーゼAの立体構造法は新規の3次元構造だと考えられる。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果、GuinierプロットからpHが高くなるに従って慣性半径Rgが増大することが示された。またKratkyプロットから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded structureであること、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態であること、が分かった。pH4.5からpH8.0への遷移速度をX線小角散乱測定したところ、時定数0.5秒の遷移が見られた。
老人性難聴の分子病理学的解析～蝸牛外側組織に焦点を当てて～

老人性難聴では約1/4の症例で原因を説明しうる光学顕微鏡的病理組織所見が認められない。そこで、我々は、内耳の凍結保存の推奨や、パラフィン包埋内耳切片を用いた免疫組織学的検討、レーザーマイクロダイゼクション法による蝸牛内機能単位別の遺伝子発現の同定といった分子生物学的手法の側頭骨病理学への導入を行い、老人性難聴への蝸牛外側組織における内耳特異的タンパクcochlinの関与の可能性を指摘した。老人性難聴は、様々な原因が想定されているが、病理組織変化が見られない症例が知られている。我々は、この原因として、ラセン靱帯やラセン板のタンパク組成の変化による振動特性の変化や、K^+イオンのリサイクリングの阻害物質の沈着などを予測している。そこで、東京都老人医療センター剖検病理科において、病理解剖時に採取されたヒト側頭骨を凍結保存しRNAを抽出、超高齢者(90歳以上)と、前期高齢者間において蝸牛外側組織に多く発現する難聴遺伝子のmRNA発現量の比較を行った。ヒト内耳組織からのRNA抽出は、RNAlater溶液中にて骨迷路を削り、蝸牛・前庭の膜迷路を採取することで、良質なRNA抽出が可能であった。本法は我々が独自に開発した手法であり、その詳細を原著として、Acta Otolaryngologicaに掲載予定である。またヒト蝸牛外側組織におけるmRNA発現量の比較検討結果も今後発表予定である。ここで得られた結果を基に、加齢性難聴を呈する近交系マウスと呈さない近交系マウスを用い、聴性脳幹反応による聴覚評価を行ったのち、これらから摘出された内耳よりRNA・タンパクを抽出した。そこで、同様にTaq Man PCR法による定量的RT-PCR法を用い、mRNA発現量を比較しデータを解析中である。今後この結果を基に、ウェスタンブロット法によるタンパク発現量の解析、免疫組織学的解析を行い、蝸牛外側組織における老人性難聴の病態の考察を行う予定である。(平成19年8月1日より平成20年3月31日まで育児休業のため研究中断となった。)老人性難聴は、酸化ストレス説など様々な原因が想定されているが、ヒト側頭骨病理学的研究では、約25%の症例に光顕上上病理組織変化が見られない症例が存在する。本法は我々が独自に開発した手法であり、その詳細は原著として、Acta Otolaryngol. 2007;127:1024-30に発表している。さらに、レーザーマイクロダイゼクション法を用いてホルマリン固定パラフィン包埋側頭骨標本により、蝸牛内ラセン靱帯、血管条、外有毛細胞、ラセン神経節の部位別mRNA抽出にも成功した(2008年日本耳科学会にて報告)。今後、凍結標本で得られたmRNAの加齢による発現変化の知見を元に、レーザーマイクロダイゼクション法を用いて、蝸牛内細胞レベルでのmRNA発現量の増減と免疫組織染色法により、老人性難聴の分子病態を解析する予定である。老人性難聴の病態としては、酸化ストレス説など様々な原因が想定されているが、ヒト側頭骨病理学的研究では、約25%の症例に光顕上上病理組織変化が見られない症例が存在する。我々は、この原因として、ラセン靱帯やラセン板のタシパク組成の変化による振動特性の変化や、k^+イオンのリサイグリングの阻害物質の沈着などを予測している。そこで、東京都健康長寿医療センター剖検病理科において、病理解剖時に採取されたヒト側頭骨を凍結保存しRNAを抽出、超高齢者(90歳以上)と、前期高齢者間において蝸牛外側組織に多く発現する難聴遺伝子のmRNA発現量の比較を行い、加齢により発現量の変化する遺伝子の探索を行っている。ヒト内耳組織からのRNA抽出は、RNA later溶液中にて骨迷路を削り、蝸牛・前庭の膜迷路を採取することで、良質なRNA抽出が可能であった。本法は我々が独自に開発した手法であり、その詳細のは原著として、Acta Otolarngol. 2007;127:1024-30に発表している。

さらに、レーザーマイクロダイゼクション法を用いてホルマリン固定パラフィン包埋側頭骨標本より、蝸牛内ラセン靭帶、血管条、外有毛細胞、ラセン神経節の部別mRNA抽出にも成功している(2008年日本耳科学会にて報告)。また、蝸牛外側壁に多く発現するある種の細胞外マトリックスは免疫組織化学的に染色性が加齢により変化する傾向を認めている(2009年日本耳科学会で報告)。現在、加齢による凍結標本におけるmRNA発現と免疫組織染色性の変化につき、レーザーマイクロダイゼクション法を用いて相関を検討中であり、ヒトにおける老人性難聴の病態解析を行っている。老人性難聴の病態としては、酸化ストレス説など様々な原因が想定されているが、ヒト側頭骨病理学的研究では、約25%の症例に光顕上上病理組織変化が見られない症例が存在する。我々は、この原因として、ラセン靱帯やラセン板のタンパク組成の変化による振動特性の変化や、K^+イオンのリサイクリングの阻害物質の沈着などを予測している。そこで、東京都健康長寿医療センター剖検病理科において、病理解剖時に採取されたヒト側頭骨を凍結保存しRNAを抽出、超高齢者(90歳以上)と、前期高齢者間において蝸牛外側組織に多く発現する難聴遺伝子のmRNA発現量の比較を行い、加齢により発現量の変化する遺伝子の探索を行っている。ヒト内耳組織からのRNA抽出は、RNA later溶液中にて骨迷路を削り、蝸牛・前庭の膜迷路を採取することで、良質なRNA抽出が可能であった。本法は我々が独自に開発した手法であり、その詳細は原著として、Acta Otolaryngol.2007;127:1024-30に発表している。さらに、レーザーマイクロダイゼクジョン法を用いてホルマリン固定パラフィン包埋側頭骨標本より、蝸牛内ラセン靭帯、血管条、外有毛細胞、ラセン神経節の部位別mRNA抽出にも成功している(2008年日本耳科学会にて報告)。現在、加齢による凍結標本におけるmRNA発現と免疫組織染色性の変化につき、レーザーマイクロダイゼクション法を用いて相関を検討することを目的とし、パラフィン包埋側頭骨切片からのRNA定量法につき条件検討を行っている段階である。
CREB的を分子標的とした大動脈瘤に対する遺伝子治療の開発

高齢化社会のため大動脈瘤患者が増加している。しかし、大動脈瘤に対する治療法はステントグラフトや人工血管置換による外科的治療に限られている。そのため、高リスク群において、手術後の重篤な合併症が危惧され、降圧療法のみで経過を見られることが多い。最近、このような高リスク群に対しての治療法として、侵襲の少ない遺伝子治療が検討され始めているが未だ確率されていない。そこで、新たな遺伝子導入による治療法としてCREB (cAMP response element binding protein)を標的とした動脈瘤の治療法の開発を計画した。ヒト大動脈瘤壁由来の細胞でも、正常細胞同様にTGF-βを使用することにより、正常細胞と同様に細胞増殖を低下させることが確認できた。昨年度から今年度にかけて、動脈瘤壁の由来細胞に対して遺伝子導入の検討を行った。アテロコラーゲン法による導入を試みた。アテロコラーゲンは細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンを酸素可溶化したもので生体適合性が高いバイオマテリアルである。siRNAとアテロコラーゲンは複合体を形成し、ヌクレアーゼによる分解を回避し、安定した状態で存在し、効率よく細胞内へ導入できると言われている。瘤壁に対して適切な導入効率を得るため、種々の検討が必要であり、その条件の検討を行った。最近、このような高リスク群に対しての治療法として、侵襲の少ない遺伝子治療が検討され始めているが未だ確立されていない。今回、われわれは、新たな遺伝子導入による治療法としてCREB(cAMP response element binding protein)を標的とした動脈瘤の治療法を開発することとした。以前よりわれわれのグループでは、正常動脈平滑筋細胞においてTGF-βがCREBをリン酸化することにより細胞増殖を減少させることを示してきた。(Kamiya K, Sakakibara K and et al.Mol Cell Biol. 2007May;27(9):3489-98.)本年度、まずこの現象がヒト大動脈瘤壁由来の細胞でも、正常細胞同様にTGF-β使用することにより正常細胞と同様に細胞増殖を低下させることを確認した。次に、動脈瘤壁の由来細胞に対して遺伝子導入の検討を行った。われわれはアテロコラーゲン法を使用することとした。siRNAとアテロコラーゲンは複合体を形成し、ヌクレアーゼによる分解を回避し、安定した状態で存在し、効率よく細胞内へ導入できるといわれている。適切な導入効率を得るため種々の検討が必要であり、その条件の検討を現在行っている。動脈瘤壁の由来細胞に対して遺伝子導入の検討を行っている。導入法としてはアテロコラーゲン法を使用した。siRNAとアテロコラーゲンは複合体を形成し、ヌクレアーゼによる分解を回避し、安定した状態で存在し、効率よく細胞内へ導入できるといわれているが、導入効率が上がらず難渋しているため今後遺伝子導入効率をあげることが第1目標である。それと並行して、ヒト大動脈瘤壁からの血管平滑筋細胞を採取しCREBの発現を正常壁から採取した平滑筋細胞と比較し評価することを行う。さらに今年度は以下の2点を目標とする。1.ヒト腹部大動脈瘤においてCREB関連の因子の発現をDNAマイクロアレイを利用し検討。2.マウス腹部大動脈瘤モデルでの動脈瘤拡大抑制効果があるかどうか検討する前段階として動脈瘤モデルの作成。昨年に引き続き大きな変化はなく主にIn vitroでの実験を予定している。細胞培養関連(シャーレ、培養液、ウシ胎児血清)、効率のよいsiRNACREBを探すため数種類を探す増殖因子(PDGF,TGFβなど)、ヒト大動脈正常細胞(平滑筋細胞)、Transfection用のアテロコラーゲンへの使用を予定している。免疫染色を始める予定であり条件設定のため数種類の抗体の購入、マウスの実験用の準備も予定している。
オランダにおける教育の自由と質保証に関する研究　－学校評価に着目して－

本研究の目的は、オランダにおける学校評価の全体像を捉え、「教育の自由」と教育の質保証の関係を明らかにし、日本において教育の質を守りながら地域や実情に応じた教育を実現するための示唆を得ることにあった。この目的を達成するために、まず、今年度は次の2つの研究を進めた。1つめは、オランダのオルタナティブ・スクールが構想する学校評価に関する研究である。昨年度の研究で、オランダで最も「教育の自由」を享受してきたと考えられるオルタナティブ・スクールが、どのような学校評価を構想するのかを明らかにし、自由にもとづく多様性を認める学校評価制度の在り方を考察した。今年度は、この昨年度の研究にもとづきつつ、オルタナティブ・スクールが実施する授業実践などもふまえ、考察を深めた。2つめは、近年、オランダで導入された「教育ガバナンス」と呼ばれる政策プログラムに関するものである。これによって、学校評価の際に学力テストの結果が重視され、質が悪い学校であると判断されると制裁を受けることとなった。この「教育ガバナンス」の基礎には、もともと教育以外の分野に適用されてきた応答的規制がある。そこで、まず、この応答的規制がどのようにオランダの教育に引き取られ、どのように評価されているのかを整理した。その上で、「教育ガバナンス」の影響を考察した。さらに、これらの研究を含め、この3年間で追究してきたオランダの学校評価に関する包括的な研究を行った。この成果にもとづき、博士論文を執筆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、オランダにおける学校評価の全体像を捉え、「教育の自由」と教育の質の保証との関係を明らかにし、日本において教育の質を守りながら地域や実情に応じた教育を実現するための示唆を得ることにある。そのために本年度は、(1)オランダの「教育の自由」のもとで独自の教育を行っているオルタナティブ・スクールをめぐる学校評価の研究、(2)国が質の保証のために行っている学校評価及び学力テストの現在の動向についての研究を行った。この2点については交付申請書に記載した計画通りであったが、加えて(3)日本における学校評価政策についての研究も進めることができた。まず(1)の研究においては、オランダのオルタナティブ・スクールのうち現在最も学校数が多いダルトン・スクールに焦点をあてて研究を進めた。この研究によって、ダルトン・スクールに関していえば、2000年代のオランダでは「教育の自由」のもとでオルタナティブ・スクールの教育実践を認めながら、教育監査を通じた教育の質の保証を実現できているといえると考えられた。一方で、(2)の研究によって、2000年代後半以降、オランダでは学力テストによる学習達成度さえ標準を満たしていれば、学校が教育をより自由に決定できるという形で「教育の自由」を保障する方向へと政策が動いていることが明らかとなった。加えて、(3)の研究によって、日本の学校評価政策についての研究を進められたことで、(1)や(2)のようなオランダの研究を日本へ活かすための方途をわずかながら探ることができた。これらの研究により、日本への示唆を得ることを念頭に置きながら、オランダの近年の動向をふまえて「教育の自由」と教育の質保証の関係の一端を明らかにすることができたといえる。そのために本年度は、1最も自由を享受してきたと考えられるオルタナティブ・スクールが、どのような学校評価制度を構想するのかを明らかにし、自由にもとつく多様性を認める学校評価制度の在り方を考察した。また、2オランダで用いられる学校の自己評価ツールの研究も同時に進めた。この2点については交付申請書に記載した計画通りであったが、加えて3日本における教育実践研究も進めることができた。まず1の研究においては、オランダのオルタナティブ教育連盟が、2005年『監督枠組』を批判して新たな学校評価の形を提案した報告書「全ての学校は1っ」に焦点をあてて研究を進めた。これにより、オルタナティブ教育連盟が構想する学校評価の在り方を明らかにできた。そこでは、オルタナティブ教育連盟が懸念する学校評価の副次的影響が生じにくくなると考えられた。ただし、それを実現するための学校へのサポートという点に未だ課題がみられた。一方2の研究においては、1990年代後半、学校の自己評価を重視する学校評価制度がオランダで整備されつつあった頃に、より良い自己評価ツールを開発することを目指して行われたプロジェクトとその結果開発されたツールZEBOに焦点をあてて研究を行った。その結果、自己評価ツールZEBOの意義と限界を整理でき、日本の学校評価への示唆も明らかにできた。加えて3の研究で、日本の教育実践についての研究を進められたことで、学校評価の対象となる教育実践の内実を探ることができた。これらの研究により、日本への示唆を得ることを念頭に置きながら、オランダの学校評価の知見をふまえて「教育の自由」と教育の質保証の関係の一端を明らかにすることができたといえる。

この目的を達成するために、まず、今年度は次の2つの研究を進めた。1つめは、オランダのオルタナティブ・スクールが構想する学校評価に関する研究である。昨年度の研究で、オランダで最も「教育の自由」を享受してきたと考えられるオルタナティブ・スクールが、どのような学校評価を構想するのかを明らかにし、自由にもとづく多様性を認める学校評価制度の在り方を考察した。今年度は、この昨年度の研究にもとづきつつ、オルタナティブ・スクールが実施する授業実践などもふまえ、考察を深めた。2つめは、近年、オランダで導入された「教育ガバナンス」と呼ばれる政策プログラムに関するものである。これによって、学校評価の際に学力テストの結果が重視され、質が悪い学校であると判断されると制裁を受けることとなった。この「教育ガバナンス」の基礎には、もともと教育以外の分野に適用されてきた応答的規制がある。そこで、まず、この応答的規制がどのようにオランダの教育に引き取られ、どのように評価されているのかを整理した。その上で、「教育ガバナンス」の影響を考察した。さらに、これらの研究を含め、この3年間で追究してきたオランダの学校評価に関する包括的な研究を行った。この成果にもとづき、博士論文を執筆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、交付申請書に記載した計画では、(1)オランダの「教育の自由」のもとで独自の教育を行っているオルタナティブスクールをめぐる学校評価の研究、(2)国が質保証のために行っている学校評価及び学力テストの現在の動向についての研究を行うことを予定していた。実際には、これらに加えて(3)日本における学校評価政策についての研究も一部ながら進めることができた。「研究の目的」を達成するために、計画していた研究のうち、オランダにおけるオルタナティブ・スクールに焦点をあてた研究や、国が推し進める学力テストに関する研究などをこれまでに実施してきている。その際に、当初は想定できていなかったオランダの学校評価制度の近年の動向や、そこに見られる変化をふまえて研究を進められている。近年のオランダの学校評価制度は、テストの結果をより重視する方向へと展開している。こうした学校評価制度の展開に対して、オルタナティブ教育連盟が提言を示した報告書「全ての学校は1つー初等教育における成果の評価へのオルタナティブ、現在の議論への貢献ー」を出している。最も自由を享受してきたと考えられるオルタナティブ・スクールは、どのような学校評価制度を構想するのかを明らかにし、自由にもとづく多様性を認める学校評価制度の在り方を考察したい。その際、国レベルでの制度がもとづく学校評価の理論とオルタナティブ・スクール側が構想する学校評価の理論にも踏み込んで検討を行いたい。今後は、「研究の目的」を達成するために、オランダの学校評価の全体構造を探究する研究を進める。そのために、まずは近年の学校評価政策の転換の背景にある理論をおさえたい。そして、これまでの研究をふまえ整理し直すことで、オランダの学校評価の全体構造を整理し、日本において教育の質を守りながら地域や実情に応じた教育を実現するための示唆を得ることを目指す。
非行的態度と親子関係に関する日本と中国の比較研究

I.研究の目的青年の非行的態度とその形成要因と考えられる親子関係について、日本と中国との比較研究を行う。そのために、日本中国両国で中学生と高校生を対象に調査を行い、非行的態度と親子関係の構造を分析する。II.研究の方法下記の調査、分析を行った。1.被験者:中国中学生211名、中国高校生192名、日本中学生460名、日本高校生400名。なお、中国は北京、日本は東京およびその近郊と金沢である。2.調査内容:個人要因として、非行許容性、道徳意識、愛他性等、親子関係について、父ー子関係、母ー子関係。その他、対人関係、環境要因について調査した。3.分析方法:中国ー日本と中学ー高校の属性別に集計を行い、分散分析、相関分析を行った。III.研究の結果中国は日本より非行に非許容的、道徳意識が高く、愛他的であった。また、愛他行動を行う理由は中国は理性的判断であり、愛他性と道徳性が同じ因子で説明できるが、日本は情緒的判断であり、愛他性と道徳性は分離する。日本、中国共に親子関係が非行的態度と関係がある。これは両国とも高校生により中学生に顕著である。親子関係のうち、日本では親子の良好な関係が非行的態度と関係が深いが、中国ではこれに加えてコミニュケ-ションや親や介入も重要である。I.研究の目的日本と中国は両国とも非行の問題をかかえている。日本の現状は衆知のように「遊び型」等々の分析がなされている。他方、中国の非行は子どもの数の政策的原因による減少と関係があるといわれている。そこで本研究は日本と中国における非行的態度と親子関係について調査し、両国の比較検討を行なう。II.調査1.対象日本の東京及び近県と石川県、中国北京において、中学生、高校生を対象に調査を行なった。2.調査内容非行的態度として愛他心、共感性、問題行動等、親子関係として父及び母に対する態度や不満について調査した。3.実施状況上記内容の調査を行ない、デ-タの収集を行なった。4.結果平成2年3月現在、調査結果を整理し、コンピュ-タ入力を行なっている。なお、分析結果については平成2年4月以降に明らかになる。I.研究の目的本研究の目的は日本と中国における非行的態度と親子関係及び、それらに影響する諸要因について調査検討することである。平成2年度の目的は調査結果の分析を行うことである。II.調査1.調査対象日本では東京及び近県と金沢市、中国では北京市において中学生・高校生を対象に調査を行った。2.調査内容非行的態度について、愛他性、共感性、問題行動、価値観、生活習慣、友人関係等、親子関係として父及び母に対する態度や不満について調査した。III.平成2年度の研究経過平成2年度は上記の調査研究のうち、調査デ-タの分析を行った。分析方法は国別単純集計、項目間のクロス集計及び多変量解析である。以上の分析により、日本と中国では異なる非行的態度があること、その背景要因も異なる事が分かった。なお、結果の詳細については平成3年度に検討し発表よる予定である。
シスプラチンの近位尿細管アポトーシス発現過程における活性酸素の関与の検討

シスプラチン誘発急性腎不全における近位尿細管細胞の細胞死に活性酸素が重要な役割をしていることが示されている、尿細管細胞死はアポトーシスとネクローシスの過程をとるが、活性酸素がいずれの過程の細胞死に関与しているのかは不明である。今回の研究において、ラットにシスプラチンを静脈内投与して急性腎不全を惹起させ、活性酸素の一つで、強力な作用を有するhydroxyl radical scavengerであるdimethylthiourea (DMTU)を前投与して、急性腎不全発症を抑制した。その際の尿細管細胞アポトーシスの程度とその誘導蛋白であるp53発現の変化を検討した。腎機能の指標である血清クレアチニンと組織傷害の程度は、DMTU前投与にて抑制できた。TUNEL法にて検討した尿細管細胞アポトーシスは、シスプラチン投与3日後から増加し、5日後には最大となった。アポトーシスに陥った細胞は、組織傷害が最も顕著であった髄質外層に多く認めた。DMTU前投与では、アポトーシスに陥った細胞を髄質外層の尿細管細胞に認めるものの、その程度はDMTU非投与と比べて、著明に減少していた。アポトーシス誘導蛋白であるp53陽性細胞を免疫染色法にて検討したところ、シスプラチン投与1日後に最大となり、局在は髄質外層の尿細管細胞に認めた。その後は減少した。DMTU前投与にて、P53陽性細胞は有意に減少していた。P38MAPKはシスプラチン投与にて、免疫染色にて髄質外層の尿細管細胞に染色され、8時間後に陽性細胞は最大となり、DMTU前投与で陽性細胞数は減少した。以上の結果から、シスプラチン誘発急性腎不全において、活性酸素は髄質外層の尿細管細胞でのp38MAPK活性を介してp53発現を亢進させ、腎機能障害と尿細管細胞のアポトーシス発現に関与していることが示唆された。ラットにおけるシスプラチン誘発急性腎不全発症に、活性酸素による近位尿細管細胞のアポトーシスが腎機能低下に強く関与することが知られている。しかし、活性酸素がどのような細胞内機序にてアポトーシスが発症するのかは不明である。アポトーシス誘導蛋白であるp53発現と活性酸素の関連を明らかにすることを目的とした。シスプラチン5mg/kg体重をラットに静注5日後の血清クレアチニン濃度は0.7mg/dLであったが、活性酸素の一つであるhydroxyl radicalのscavengerであるdimethylthiourea(DMTU)500mg/kg体重のシスプラチン投与前の腹腔内投与とその後の125mg/kg体重の1日2回腹腔内投与の5日後の血清クレアチニン濃度は0.3mg/dLとシスプラチン誘発急性腎不全はDMTU投与により予防された。腎機能のみならず腎組織においても尿細管傷害は有意に抑制された。一方、アポトーシス誘導蛋白の一つであるp53の腎における発現について、シスプラチン投与後の経過をWestern blot法あるいは免疫染色法にて検討した。投与前の発現は認められなかったが、1日あるいは2日後にp53の発現がピークとなり、その後は減少した。hydroxyl radical scavengerであるDMTUの腹腔内投与にて、シスプラチン投与後のp53発現は有意に抑制された。今後は、活性酸素がp53発現に関するどの因子に影響を与えているのを検討する予定としている。その後は減少した。

シスプラチン誘発急性腎不全における近位尿細管細胞の細胞死に活性酸素が重要な役割をしていることが示されている、尿細管細胞死はアポトーシスとネクローシスの過程をとるが、活性酸素がいずれの過程の細胞死に関与しているのかは不明である。今回の研究において、ラットにシスプラチンを静脈内投与して急性腎不全を惹起させ、活性酸素の一つで、強力な作用を有するhydroxyl radical scavengerであるdimethylthiourea(DMTU)を前投与して、急性腎不全発症を抑制した。その際の尿細管細胞アポトーシスの程度とその誘導蛋白であるp53発現の変化を検討した。腎機能の指標である血清クレアチニンと組織傷害の程度は、DMTU前投与にて抑制できた。TUNEL法にて検討した尿細管細胞アポトーシスは、シスプラチン投与3日後から増加し、5日後には最大となった。アポトーシスに陥った細胞は、組織傷害が最も顕著であった髄質外層に多く認めた。DMTU前投与では、アポトーシスに陥った細胞を髄質外層の尿細管細胞に認めるものの、その程度はDMTU非投与と比べて、著名に減少していた。アポトーシス誘導蛋白であるp53陽性細胞を免疫染色法にて検討したところ、シスプラチン投与1日後に最大となり、その後は減少した。DMTU前投与にて、p53陽性細胞は有意に減少していた。p53陽性細胞の局在は髄質外層の尿細管細胞に認めた。以上の結果から、シスプラチン誘発急性腎不全において、活性酸素は髄質外層の尿細管細胞でのp53発現を亢進させ、腎機能障害と尿細管細胞のアポトーシス発現に関与していることが示唆された。