hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新生児腸管を使った小腸移植治療のための基礎的研究

シクロフォスファミドにタクロリムスを加えることでグラフトの長期生着を得たが、マウス肝リンパ球をN-SBT時に注入するとさらに組織学的に良好なグラフトが得られた。一方、成熟小腸をドナーとし血管吻合による小腸移植を行った場合は、同上免疫抑制プロトコールでは、薬剤の中断とともに激しい拒絶反応が認められた。成熟した小腸を用いたSBTは長期にわたる拒絶反応を制御が困難であったが、新規免疫抑制薬FTY720の併用が有効であった。(1)近年の強力な免疫抑制剤の使用をもっても、臨床の小腸移植(SBT)は長期生着がきわめて困難である。免疫学的な新たな攻略が必要とされる。我々は、(2)米国における無脳児をドナーとるす法案が検討されているのを受け、新生仔ラットの小腸をドナーとするSBTの基礎的問題点を検討してきた。平成7年度助成金を使って、現在まで判明した免疫学的利点ならびに問題点をまとめる。【方法】生後24時間以内の新生仔ラット小腸を成熟ラットの腹壁や大網内に移植するnatural revasculizationを利用した移植モデルを用いた。免疫抑制剤(DSG)は短期間のみ使用し、vasculized SBTと比較検討した。【問題】1.大網内移植でないと腸管運動が出にくい。2.移植腸管が均一に発育しない。我々は、新生児臓器が免疫系が未発達である点に注目して、ラットモデルを用いて小児小腸移植の臨床応用のための基礎的検討を続けてきた。これまで明らかになったことをまとめ報告する。(1)同系間移植での検討:新生仔の小腸を血管吻合せずに移植する方法(N-SBT)を用いた。(実験1)新生仔臓器のnatural revasculization率を検討するため、生後直ちに種々の臓器(小腸、脾、肝、腎、心、膵臓)を成熟同系ラットの皮下に移植した。小腸については、生後経時的(24時間以内,4,11,18日目)にその生着率を検討した。(実験2)同系N-SBTでgraftを皮下及び大網内に移植し、graft生着全小腸を摘出し置換手術を行った。graftの評価は病理組織所見ならびに筋電図を参考にした。さらに移植graftの機能を脂肪吸収量の改善度として評価した。【結果および考察】各種臓器の生着率は、脾臓8/7(87.5%),小腸12/17(70.6%),腎臓5/12(41.7%),心臓2/10(20%),肝臓0/10,膵臓0/8であり、臓器により血管新生に差がみられた。小腸の生着率は経時的に低下し生後11日以後ではほとんど生着しなかった。皮下及び大網内で生着率に有意差はみられなかったが、筋電図上で前者は小腸固有の波型は得られなかった。大網内移植で正常に近い波型が認められ、置換手術においても、長期生存が得られた。(2)異系間移植での検討:近交経ラットLEW(RT1^1)をドナー、PVG(RT1^0)をレシピエントとして使用した。新生仔及び成熟ラット小腸の免疫原性を比較する目的で、15-Deoxyspergualin(DSG)5mg/kg/14daysを投与し生着率を比較した。さらにレシピエントの処理として、同様のDSG投与下で脾摘さらに脾摘+胸腺摘除を行い免疫抑制状態を比較した。拒絶の判定は、肉眼所見に組織学的所見を加味し行った。成熟小腸をドナーとし血管吻合による小腸移植を行った場合は、同上免疫抑制プロトコールでは、薬剤の中断とともに激しい拒絶反応が認められた。一方、アロN-SBTの場合、血管吻合を行わなくともホストより血管新生を認め、DSG短期投与下で50%に4週以上生着を認めた。さらに新生仔小腸移植において脾摘を加えると全例で6週以上の生着を認めた。我々は、新生児臓器の免疫系が未発達である点に注目して、ラットモデルを用いて新生児腸管を使った小腸移植の臨床応用のための基礎的検討を行った。
条虫類の宿主転換(野生動物⇔家畜⇔ヒト)と適応放散

本年度は、これまで分離されたTaenia taeniaformis10分離株ならびにEchinococcus multilocularis6分離株を含むTaenia属7種とEchinococcus属2種についてCOI(mitocondorial cytochrome c oxidase subunit I)遺伝子(391bp)について比較した。これらのテニア科条虫の間で、12%程度の塩基配列の相違を示したものは独立種と考えられた。幼虫型(metacestode)で分離された多包条虫E.multilocularisでは動物種(エゾヤチネズミ、ツンドラハタネズミ、ドブネズミ、ブタ)ならびに地域(日本、アラスカ)に関わらず同一の塩基配列を示した。これに対して、分離された地域、中間宿主の異なる従来の形態学的特徴から猫条虫Taenia taeniaeformisとして位置づけられた10分離株について検討したところ北海道虻田のエゾヤチネズミからの分離株(TtACR)を除いて、0.34.1%の範囲で相違が見られた。しかしながら、TtACR9.09.5%の範囲で相違が見られれ、独立株あるいは独立種のレベルの差が見られることが明らかとなった。北海道には従来の猫条虫とは起源の異なるが、現存するネコに適応したテニア属条虫が存在することが明らかとなった。本分離株は形態的にも小鉤の特徴ならびに中間宿主の選択性(エゾヤチネズミに適応)などの生態的特徴からも独立種の可能性が高い。北海道から絶滅したネコ科動物から近年になって移入されたイエネコを代替宿主として維持されたいた遺残種と考えられる。テニア属条虫の系統を論じる上で重要である。なお、虻田のエゾヤチネズミで分離されたのを最後にその後、野外から採取されていないが、実験室内で系統が保存されている。条虫は被食者・捕食者間で生活環が維持されており、これらの多様化には宿主との共進化だけではなく,環境の変化に対応して宿主転換が重要な要因と考えた。現存の宿主と寄生虫の組み合わせで生態的には隔離されているが実験的には適合する例(遺残的な行動)ならびに野外調査(北海道とウルグアイのエキノコックス)による伝播様式を検討し条虫類の環境適応メカニズムを解明する.本年度は特に,分離された地域・中間宿主の異なる猫条虫について、形態(鉤)、各種齧歯類への感染性、嚢虫の蛋白組成、DNAの制限酵素切断パターンについて比較検討した.さらに、DNAフィンガープリント、アイソザイムパターン、COI遺伝子の塩基配列を調べ、これら猫条虫の遺伝的関係を調べた。その結果、日本には少なくとも2つの性質の異なる猫条虫の個体群が存在し、そのうちの一つは世界的に住家性のネズミに寄生する猫条虫と生物学的にも遺伝学的にも近縁であることが明らかとなった。一方、北海道には、これらとは全く起源の異なるエゾヤチネズミを中間宿主とする別の猫条虫個体群が存在することを明らかにした.多包条虫の場合、北海道では他の流行地ではみられないドブネズミを中間宿主とする生活環が成立している可能性示唆された.しかし、DNAフィンガープリントおよびCOI遺伝子の塩基配列のレベルでは、ドブネズミ寄生のものを含めて北海道内に流行している多包条虫は、遺伝的にきわめて均一な個体群であることが明らかとなった。さらに、セントローレンス島産の多包条虫との比較から、北海道で流行している多包条虫はアラスカからごく近年に北海道の一部に移入され、その個体群を起源として北海道全域に急速に広がったものであると推定された。

以上、両種内に見られる種内変異の程度と日本における起源を明らかにした.本年度は、これまで分離されたTaenia taeniaformis10分離株ならびにEchinococcus multilocularis6分離株を含むTaenia属7種とEchinococcus属2種についてCOI(mitocondorial cytochrome c oxidase subunit I)遺伝子(391bp)について比較した。これらのテニア科条虫の間で、12%程度の塩基配列の相違を示したものは独立種と考えられた。幼虫型(metacestode)で分離された多包条虫E.multilocularisでは動物種(エゾヤチネズミ、ツンドラハタネズミ、ドブネズミ、ブタ)ならびに地域(日本、アラスカ)に関わらず同一の塩基配列を示した。これに対して、分離された地域、中間宿主の異なる従来の形態学的特徴から猫条虫Taenia taeniaeformisとして位置づけられた10分離株について検討したところ北海道虻田のエゾヤチネズミからの分離株(TtACR)を除いて、0.34.1%の範囲で相違が見られた。しかしながら、TtACR9.09.5%の範囲で相違が見られ、独立株あるいは独立種のレベルの差が見られることが明らかになった。北海道には従来の猫条虫とは起源の異なるが、現存するネコに適応したテニア属条虫が存在することが明らかとなった。本分離株は形態的にも小鉤の特徴ならびに中間宿主の選択性(エゾヤチネズミに適応)などの生態的特徴からも独立種の可能性が高い。北海道から絶滅したネコ科動物から近年になって移入されたイエネコを代替宿主として維持されていた遺残種と考えられる。テニア属条虫の系統を論じる上で重要である。なお、虻田のエゾヤチネズミで分離されたのを最後にその後、野外から採取されていないが、実験室内で系統が保存されている。
ドイツ語表現力向上プロジェクト－「書く」ことを目的とした「話す」こと－

本研究の目的は、国際的なドイツ語学習者ネットワークPASCH-Global(http://blog.pasch-net.de/pasch-global/)と連携したドイツ語新聞(JAPAN HEUTE)制作を通じて、「CEFR A1/A2レベルの日本語を母語とするドイツ語学習者」のドイツ語表現力を向上させることである。研究目的の達成のため、以下の3点に重点を置いている。1在日ドイツ企業訪問(4社/年)やプロジェクト授業(4回/年)でのドイツ語のプレゼンテーション=「話すこと」を、新聞記事執筆=「書くこと」へとつなげる「書くことを目的とした話すこと」という表現力向上プログラムの開発。2PASCH-net(http://www.pasch-net.de/de/index.html)のMoodleを活用して年間2回の国際プロジェクトを実施し、中期的なドイツ語表現力向上プログラムを開発すること。3在学時にドイツ語新聞制作に関わった卒業生を対象とする「同窓生ネットワーク」を構築し、ドイツ語の生涯学習を可能とするオンラインルームの開発と実用化。2018年度には、いずれの重点項目においても計画通りに研究を進めることができた。ただし、3については、在学中から使用している「学習者ネットワーク」を卒業後の「同窓生ネットワーク」へと発展させることは十分にできているが、在学中にCEFR A2C1まで到達したドイツ語のレベルを維持できている同窓生が少ない、という問題点が浮かび上がってきた。生涯学習としてのドイツ語学習を可能とする「コミュニティ・ドイツ語」の場を作り上げることについては、なお改善の余地がある。(1)筆記力向上のためのワークショップを、定期的に開催することができた(年間4回)。(2)オーストリア・セルビアとの国際プロジェクトを進めることができた(オーストリアとのプロジェクトは新規)。(3)ドイツ語新聞を年3回発行することができた。(4)PASCH-netと協働し、新聞記事をWeb上(PASCH-Global)に公開することができた。(5)在日ドイツ大使館およびドイツ企業訪問に参加し、ドイツ語学習の実践的機会を学習者に提供することができた。またこの訪問において、ドイツ語のプレゼンテーション=「話すこと」を、新聞記事執筆=「書くこと」へとつなげることができた。今後の研究について、以下の3点に重点を置いて進める。1.筆記力向上のためのワークショップを定期的に開催する(年間4回開催予定)。2.国際ワークショップを継続して開催する(2019年度は、オーストリアとセルビアとのワークショップを実施予定)。3.「同窓生ネットワーク」の構築と改善。1.ワークショップについては、CEFR A1/A2対象者に対して、elfchenやHaikuといった短文を中心とする取り組みやすいものから、8001000字程度の長い文章を書く比較的難易度の高いものまで、多様な取り組みを行う。また、ここでの試みを、研究協力者との協働のもとアカデミックライティングへとレベルアップしていくプログラムを作り上げていきたい。同窓会ネットワークについては、昨年度、木更津高専がドイツとの交流プログラムであるPASCHプログラムに加盟後10周年という記念の年を迎え、同窓生と2回にわたって会合をもち、そこに参加した30名以上の「PASCHプログラム参加者」から、現在のドイツ語学習の状況について聴き取りをおこなうことができた。その際にも、ネットワークを使って会合について通知したため、「同窓会ネットワーク」はすでに構築できていると言える。ただ問題点として浮かび上がったのは、在学中にCEFR A2C1まで到達したドイツ語のレベルを維持できている同窓生が少ないことであった。つまり、同窓生のネットワークが構築できていると言えども、それがドイツ語学習者のコミュニティネットワークまでは至っていないということである。今後、この問題点について考え、打開策を見つけ、コミュニティ・ドイツ語の場を作り上げていくことを課題としたい。

(3)ドイツ語新聞を年3回発行することができた。(4)PASCH-netと協働し、新聞記事をWeb上(PASCH-Global)に公開することができた。(5)在日ドイツ大使館およびドイツ企業訪問に参加し、ドイツ語学習の実践的機会を学習者に提供することができた。またこの訪問において、ドイツ語のプレゼンテーション=「話すこと」を、新聞記事執筆=「書くこと」へとつなげることができた。今後の研究について、以下の3点に重点を置いて進める。1.筆記力向上のためのワークショップを定期的に開催する(年間4回開催予定)。2.国際ワークショップを継続して開催する(2019年度は、オーストリアとセルビアとのワークショップを実施予定)。3.「同窓生ネットワーク」の構築と改善。1.ワークショップについては、CEFR A1/A2対象者に対して、elfchenやHaikuといった短文を中心とする取り組みやすいものから、8001000字程度の長い文章を書く比較的難易度の高いものまで、多様な取り組みを行う。また、ここでの試みを、研究協力者との協働のもとアカデミックライティングへとレベルアップしていくプログラムを作り上げていきたい。同窓会ネットワークについては、昨年度、木更津高専がドイツとの交流プログラムであるPASCHプログラムに加盟後10周年という記念の年を迎え、同窓生と2回にわたって会合をもち、そこに参加した30名以上の「PASCHプログラム参加者」から、現在のドイツ語学習の状況について聴き取りをおこなうことができた。その際にも、ネットワークを使って会合について通知したため、「同窓会ネットワーク」はすでに構築できていると言える。ただ問題点として浮かび上がったのは、在学中にCEFR A2C1まで到達したドイツ語のレベルを維持できている同窓生が少ないことであった。つまり、同窓生のネットワークが構築できていると言えども、それがドイツ語学習者のコミュニティネットワークまでは至っていないということである。今後、この問題点について考え、打開策を見つけ、コミュニティ・ドイツ語の場を作り上げていくことを課題としたい。欧州での研究調査のため、外国出張旅費として使用予定であった渡航費について、勤務先から出張旅費として提供があったため、今年度は使用しなかった。国際共同ワークショップの開催についても、海外開催の予定であったもの、2019年3月に日本で開催したため、使用しなかった。そのため、次年度使用額が生じた。
糖尿病心筋におけるアドレナリン作用不全の分子機構とその臨床的意義

(1)糖尿病患者左室心筋収縮能のβーアドレナリン(βーAd)作用不全心不全症状のない糖尿病患者での左室心筋収縮能は外因性βーAdに対する反応性が低下していた。(2)糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体特異的低下〈1〉糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体は対照に比し50%低下した。〈2〉βーAdによるアデニルシクラーゼ(AC)活性化も56%低下したが基礎及びフォルスコリン最大刺激AC活性の低下はなかった。〈3〉GTP結合タンパク質(Nis,N1)はモノADPリボシル化反応でみる限り共に著明に増加した。(3)糖尿病ラット心筋βーAd受容体の細胞内分布異常の検討〈1〉心筋細胞を成熟ラットよりコラゲナーゼ法にて単離し、脂溶性^<125>Iーヨードシアノピンドロール(ICYP)及び水溶性(^3H)CGP12177という二種のβーAd受容体遮断薬を用いて各々全細胞及び細胞表面の機能的βーAd受容体数を測定した。糖尿病心筋のβーAd受容体異常は全細胞内受容体の低下ではなく、細胞表面の機能的βーAd受容体数の低下であり、又結合の親和性には差を認めなかった。〈2〉細胞βーAd受容体分布異常の短期インスリン治療による可逆性の検討48時間の強力なインスリン治療により細胞表面βーAd受容体は回復した。(4)糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体低下機構の検討単離心筋細胞に33mMグルコース,10mMケトン体,8mMインスリン処理をしたが表面βーAd受容体の変化を認めなかった。但しphorbol 12-myristate 13-acetateにより15%の改善を示した。一方βーAdによる受容体の"Down regulation"の亢進はなく、その回復が有意に低下していた。以上糖尿病での心機能不全の要因としてβーAd受容体低下と、原因として受容体の細胞内分布異常、特に細胞内より表面への受容体転送異常を示した。その異常の可逆性よりインスリン治療の意義を明らかにした。今后βーAd受容体の細胞表面への転送調節機序の解明が糖尿病心筋での異常機構を明らかにする上で重要である。(1):糖尿病患者左室心筋収縮能のアドレナリン作用不全......エピネフリン注入時の左室心筋収縮能増加は糖尿病患者で,罹病期間が長く,細小血管症の強い症例は大であった. (kashiwagi et al,Diabetes Care投稿中)(2):糖尿病ラットにおける心筋アドレナリン受容体異常について(a)糖尿病ラット心筋細胞膜β-アドレナリン受容体は対照に比し50%低下し,又β-アゴニストによるアデニルシクラーゼ(AC)活性化も56%低下した.基礎及びフォルスコリン最大刺激AC活性の低下はなく, GTP結合タンパク質(Ns,Ni)も共に著明に増加した.

(b)受容体, ACのβ-アゴニスト反応性の低下はインスリン治療にて改善し,血中カテコラミンや, T_3レベルの低下では説明できず,糖尿病に密接に関係した現象であった. (a)(b)をあわせて投稿中である. (Nishio et al,Diabetes)(c)糖尿病心筋β-アドレナリン受容体低下は全細胞内β-アドレナリン受容体の低下ではなく,細胞表面のみ低下していた.更にl-インプロテレノールで"Down regulation"をさせると,それに感受性の受容体のみが低下していて,残存する細胞膜受容体の約40%は非感受性受容体であることが示唆された.この様な糖尿病でのβ-アドレナリン受容体の低下機構の分子機構は更に興味深い現象であり今后の検討を要する.今后の研究の展開......(1)特異的細胞膜β-アドレナリン受容体が何如糖尿病にて低下するかその機構を明らかにし,更に正常化のこころみをInvitro単離心筋細胞を用いて検討する.特にβ-アドレナリン受容体リン酸化による"Desensitization"及び細胞内より外へ受容体"translocation"の異常の二点より明らかにする.(2)糖尿病ラット心筋圧負荷に対して心肥大反応が低下しているかどうかを,糖尿病における心不全発症機構の一要因である可能性についても検討する.特に圧負荷に対するα受容体機能異常の面からも検討する.(1)糖尿病患者左室心筋収縮能のβーアドレナリン(βーAd)作用不全...心不全症状のない糖尿病患者での左室心筋収縮能は外因性βーAdに対する反応性が低下していた。(2)糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体特異的低下...〈1〉糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体は対照に比し50%低下した。〈2〉βーAdによるアデニルシクラーゼ(AC)活性も56%低下したが基礎及びフォルスコリン最大刺激AC活性の低下はなかった。〈3〉GTP結合タンパク質(NsNi)はモノAOPリボシル化反応でみる限り共に著明に増加した。(3)糖尿病ラット心筋βーAd受容体の細胞内分布異常の検討...〈1〉心筋細胞を成熟ラットよりコラゲナーゼ法にて単離し、脂溶性^<125>Iーヨードシアノピンドロール(ICYP)及び水溶性(^3H)CGP12177という二種のβーAd受容体遮断薬を用いて各々全細胞及び細胞表面の機能的βーAd受容体数を測定した。糖尿病心筋のβーAd受容体異常は全細胞内受容体の低下ではなく、細胞表面の機能的βーAd受容体数の低下であり、又結合の親和性には差を認めなかった。〈2〉細胞βーAd受容体分布異常の短期インスリン治療による可逆性の検討...48時間の強力なインスリン治療により細胞表面βーAd受容体は回復した。(4)糖尿病ラット心筋細胞膜βーAd受容体低下機構の検討...単離心筋細胞に33mMグルコース、10mMケトン体、8mMインスリン処理をしたが表面βーAd受容体の変化を認めなかった。但しphorbol12ーmyristate13ーacetateにより15%の改善を示した。一方βーAdによる受容体の"Down regulation"の亢進はなく、その回復が有意に低下していた。以上糖尿病での心機能不全の要因としてβーAd受容体低下と、原因として受容体の細胞内分布異常、特に細胞内より表面への受容体転送異常を示した。その異常の可逆性よりインスリン治療の意義を明らかにした。今后βーAd受容体の細胞表面への転送調節機序の解明が糖尿病心筋での異常機構を明らかにする上で重要である。
組織変形ダイナミクスの定量解析に基づくメダカ顔面形態の立体構築過程の解明

脊椎動物の顔面形態は種によって最も多様性に富んだ形質の一つであり、またヒトに限らずさまざまな生物において個体識別やコミュニケーションに使用される重要な形態である。これまでに、眼や咽頭など、顔面を構成する各器官の形成を司る分子は数多く同定されてきた。しかし、顔面にある各器官の配置パターンの形成プロセスは全く不明のままである。本研究では、小型魚類顔面形態の形成過程において、どのような発生プログラムに基づいて各器官の配置パターンが決定されるのかを、時系列を追うことにより、組織レベルおよび細胞レベルにおいて何が駆動要因になっているのかという観点から明らかにする。今回はとくに、咽頭を構成する咽頭弓の形成過程に着目する。本年度は、ゼブラフィッシュ胚を用いて鰓弓形成過程のイメージングおよび記載を行った。EGFP・kikGR・tdTomatoトランスジェニック系統やkikGR・Lyn-EGFP・tdTomato-NLSなどのmRNAインジェクション法を用いて、鰓弓を構成する神経堤細胞の細胞核や細胞質を可視化することにより観察した。その結果、鰓弓の形成過程では神経堤細胞の移動、集合および凝集、伸長、左右の形成の融合、伸長という段階を経ることがわかった。現在、とくに伸長過程に着目して、組織の動態を記載した論文をまとめる予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今回はとくに、将来の眼と咽頭を構成する眼胞および咽頭弓の形成過程に着目する。本年度は、小型魚類頭部領域のイメージング手法の確立に注力した。メダカは頭部形成初期である体節形成期(st. 1826)に周期的な収縮運動を行うため3次元イメージングが難しいため、まずは収縮運動の生じないゼブラフィッシュ胚を用いてイメージングを試みた。胚を保持する低融点アガロースの濃度と保持の方法を検討することにより、2光子顕微鏡または光シート顕微鏡を用いて頭部領域を約半日にわたる長時間3次元イメージングすることが可能となった。現在はトランスジェニック系統やkikGR mRNAインジェクションおよび蛍光色素を用いることにより、細胞核や細胞質を可視化して頭部形態の変形を解析している。観察系の確立に時間を要した。頭部形態形成プロセスの計測・定量化を行っていく予定である。
近代日本の地主金融―担保の構成と結果の視点から―

日本の地主は,松方財政期や日清戦争後の増税期などに農民の土地を買い集め,買入地の多く,特に松方財政期のそれは貸金の流地取得によるものであった.これは,地主制史研究では通説になっている.では逆に,地主の貸金はどのような性格をもち,どのような結果を生んだのか.これに対する答えはきわめて不十分である.地主は多様な農村金融(質入,書入などの担保金融,あるいは無担保による信用貸)を営んだが,それらがどのような性格を持ち,相互にどう関係し,どのような結果を生んだかは,煩瑣な資料解析が敬遠され,説得的な学説が存在しない.本研究は,各地に保存されている一次資料を利用して,地主金融の性格,これらの結果およびその変化を解明するものである.平成28年度までの研究により,在村地主の存在の有無と農村内の金融のあり方との関係が新たな論点になると考えられた.そこで29・30年度は時代を明治後期(資本主義確立期)に移し,在村地主の存在と信用組合などの産業組合の組織化の関係を考察した.具体的には,明治後期に産業組合はどこを区域として設立されたか,だれがどんな事情で設立したかを,全国レベルで明らかにしようとした.課題に対して,1資本主義確立期の日本の農村では,1889年に始まる町村制に適合的な,部落を越えた広がりをもつ産業組合が組織された,2部落の横断的結合による規模の経済を中小地主層が図ったと考えられる,という結論が得られた.精力的に資料収集・調査および分析を行ったことによる.引き続き資料収集および調査を軸とする研究計画に沿った支出に努める.日本の地主は,松方財政期や日清戦争後の増税期などに農民の土地を買い集め,買入地の多く,特に松方財政期のそれは貸金の流地取得によるものであった.このことは日本地主制史の研究では通説になっている.では逆に,地主の貸金はどのような性格を持ち,どのような結果を生んだのか.これに対する答えは不十分なものでしかない.地主は多様な農村金融(質入,書入などの担保金融,あるいは無担保による信用貸)を営んだが,それらがどのような性格を持ち,相互にどう関係し,どのような結果を生んだかは,煩瑣な資料解析が敬遠され,説得的な学説が存在しない.本研究は,各地に保存されている一次資料を活用して,地主金融の性格と結果,その変化を解明するものである.今年度は質入と書入の利用状況と結果について考察した.明治10年代に作成された村名寄帳の中には,村の土地所有者の質入・書入利用に関する情報を記載したものがある.福島県信夫郡A村の村名寄帳によって10年代の質入・書入の利用状況と結果を考察し,次のような結果を得た.1書入が盛んに利用された一方で質入の利用は少ない.質入が利用されたのは11,12年で,近世以来主要な金融手段であった質入は13年以降,制度化されて間もない書入にとって代わられたとみられる.2書入では何度も書き換えられるものが多く,返済期限を過ぎても利子が支払われる限り処分されない慣行があったとみられる.しかし10年間に村民の6割が書入の結果として土地売渡を余儀なくされた.一方質入は,新規借入が書入で行われるのに伴い,書入に書き換えられた.そして質入のほとんどは(書入を経たものを含めて)土地売渡に結びついた.3土地所有の小さな者ほど土地担保金融への依存度が高かった.また,12町所有者で流担保となった者が多く,中規模自作農が地租の負担に苦しんだ結果とみられる.計画に従って資料を収集したが年度後半,資料収集と分析に若干の遅れが生じたことによる.日本の地主は,松方財政期や日清戦争後の増税期などに農民の土地を買い集め,買入地の多く,特に松方財政期のそれは貸金の流地取得によるものであった.このことは日本地主制史の研究では通説になっている.では逆に,地主の貸金はどのような性格を持ち,どのような結果を生んだのか.これに対する答えは不十分なものでしかない.地主は多様な農村金融(質入,書入などの担保金融,あるいは無担保による信用貸)を営んだが,それらがどのような性格を持ち,相互にどう関係し,どのような結果を生んだかは,煩瑣な資料解析が敬遠され,説得的な学説が存在しない.本研究は,各地に保存されている一次資料を活用して,地主金融の性格と結果,その変化を解明するものである.昨年度は,明治10年代,福島県信夫郡A村における質入と書入の利用状況と結果について考察,1書入が質入に取って代わって盛んに利用された,2弁済されず何度も書き換えられた挙げ句に流地となった書入が多い,3そうした借用者の典型は自作中・下層とみられる(昨年度報告書で中規模自作農としたのを訂正する),などの結果を得た.今年度はやはりA村を対象に,そのような金融状況の背景を考察,次のような結論を得た.農民の金融依存は10年代前半に顕著で,養蚕製糸農民の生活費増大,副業開業のための初期投資が要因とみられる.有力地主の存在しないA村で借用者は,同等以下の土地所有者あるいは村外者の資金に依存していた.

精力的に資料収集および調査,分析を行い,昨年度の遅れを挽回したと考えている.日本の地主は,松方財政期や日清戦争後の増税期などに農民の土地を買い集め,買入地の多く,特に松方財政期のそれは貸金の流地取得によるものであった.このことは日本地主制史の研究では通説になっている.では逆に,地主の貸金はどのような性格を持ち,どのような結果を生んだのか.これに対する答えは不十分なものでしかない.地主は多様な農村金融(質入,書入などの担保金融,あるいは無担保による信用貸)を営んだが,それらがどのような性格を持ち,相互にどう関係し,どのような結果を生んだかは,煩瑣な資料解析が敬遠され,説得的な学説が存在しない.本研究は,各地に保存されている一次資料を活用して,地主金融の性格と結果,その変化を解明するものである.養蚕の盛んな福島県信夫郡A村を対象にした昨年度までの研究で,明治10年代前半,農民が書入(後の抵当)という土地担保金融に深く依存し,同後半の松方デフレ期に流池売渡を余儀なくされたこと,有力地主のいない村で,借用者は同等以下の経済力(土地所有)の村内者の資金に依存していたことなどが明らかになった.以上のことから,有力地主の存在の有無と村の中での金融のあり方との関係が新たな論点になると考えられた.そこで,今年度は時代を明治後期に移し,在村地主の存在と信用組合などの産業組合の組織化の関係を考察しようとした.これまでに福島県をはじめ各地で関係資料の収集を終え,分析を行っている.精力的に資料収集および調査,分析を行ったことによる.日本の地主は,松方財政期や日清戦争後の増税期などに農民の土地を買い集め,買入地の多く,特に松方財政期のそれは貸金の流地取得によるものであった.これは,地主制史研究では通説になっている.では逆に,地主の貸金はどのような性格をもち,どのような結果を生んだのか.これに対する答えはきわめて不十分である.地主は多様な農村金融(質入,書入などの担保金融,あるいは無担保による信用貸)を営んだが,それらがどのような性格を持ち,相互にどう関係し,どのような結果を生んだかは,煩瑣な資料解析が敬遠され,説得的な学説が存在しない.本研究は,各地に保存されている一次資料を利用して,地主金融の性格,これらの結果およびその変化を解明するものである.平成28年度までの研究により,在村地主の存在の有無と農村内の金融のあり方との関係が新たな論点になると考えられた.そこで29・30年度は時代を明治後期(資本主義確立期)に移し,在村地主の存在と信用組合などの産業組合の組織化の関係を考察した.具体的には,明治後期に産業組合はどこを区域として設立されたか,だれがどんな事情で設立したかを,全国レベルで明らかにしようとした.課題に対して,1資本主義確立期の日本の農村では,1889年に始まる町村制に適合的な,部落を越えた広がりをもつ産業組合が組織された,2部落の横断的結合による規模の経済を中小地主層が図ったと考えられる,という結論が得られた.精力的に資料収集・調査および分析を行ったことによる.資料収集および調査を基軸とする研究計画に沿った支出に努める.引き続き資料収集および調査を軸とする研究計画に沿った支出に努める.引き続き資料収集および調査を軸とする研究計画に沿った支出に努める.引き続き資料収集および調査を軸とする研究計画に沿った支出に努める.資料の収集および調査,分析で若干の遅れが生じた.当初計画よりも資料収集および調査において進展があったため,前倒し支払を請求した.しかし前倒し支払額の全額は使用できず,若干の次年度使用額が生じた.研究計画に沿って支出するよう努める.資料分析に時間を割かざるを得ず,資料収集および調査のための十分な時間が取れなかった.計画的かつ適切な使用を心がける.研究計画に沿って支出するよう努める.
葉温と土壌水分の非破壊計測によるイネの干ばつ抵抗性の品種・施肥レベル間差異の評価

本研究は、イネの干ばつ抵抗性の品種・施肥レベル間差異を、葉温と土壌水分の非破壊計測から評価することを目標としている。圃場に干ばつ抵抗性の異なる5品種のイネを栽培し、さらに施肥レベルと堆肥の量の異なる区を設け、ビニルハウス内で水ストレス処理を与えた。そして、干ばつ抵抗性の品種間差異ならびに、施肥レベル間差異、堆肥間差異について、熱電対による葉気温差の連続計測と深さ別土壌水分含量の計測から検討した。土壌水分含量はTDR土壌水分計測法により、区に埋めたチューブにプローブを挿入して、深さ60cmまで10cm毎に深さ別土壌水分含量を計測した。葉温や気象データは、データロガーからノートパソコンに転送して解析した。葉温を環境条件で補正して指数化し、作物水ストレス指数を求めるためのモデル葉の特性を明らかにするため、湿潤モデル葉からの蒸発量を計測し、気象データから理論式により求めた理論値と比較した。両者は近い値を示し、モデル葉の妥当性が確認された。干ばつ抵抗性品種や堆肥ならびに少肥条件では、乾燥条件下でも乾物生産が高く保たれたが、モデル葉により求めた作物水ストレス指数が低く保たれ、水ストレスが低いことが明らかとなった。また、これらの条件では、地表から深層までの土壌水分含量の低下が大きかったことから、蒸発散量が高く保たれていることが明らかとなった。SPAD値においても、乾燥条件下において乾物生産が高く保たれた干ばつ抵抗性品種や牛糞堆肥では高く、収量の低かった多肥では低い傾向がみられ、葉色と生育との対応がみられた。以上より、イネの干ばつ抵抗性の品種間差異と、堆肥ならびに施肥レベルによる差異を、葉温と深さ別土壌水分含量の非破壊経時計測により、地上部と地下部の両面から評価することができ、生育の高く保たれた品種や施肥条件では、乾燥条件下においても吸水により蒸散を高く保っていることが明らかとなった。本研究は、イネの干ばつ抵抗性の品種・施肥レベル間差異を、葉温を土壌水分の非破壊計測から評価することを目標としている。圃場に、ジャポニカ・インディカの水稲・陸稲から、干ばつ抵抗性の異なるイネを8品種栽培し、ビニルハウス内で灌水頻度を少なくすることにより、水ストレス処理を与えた。本年度は、干ばつ抵抗性の品種間差異を中心として、熱電対による葉気温差の連続計測と深さ別土壌水分含量の計測を行った。土壌水分はTDR土壌水分計測法により計測した。長さ30cmのプローブを土壌中に挿入して、深さ10cmと20cmまでの土壌水分含量を、また区の中に埋め込んだチューブにチューブプローブを挿入して、深さ50cmの土壌深層まで5cm毎の深さ別土壌水分含量を計測した。干ばつ抵抗性品種では水ストレス条件下でも乾物生産が高く保たれていたが、地表から深層までの土壌水分含量の低下が大きかったから、蒸発散量が大きいことが明らかになった。一方、干ばつ感受性品種の生長は大きく抑制されたが、土壌水分含量の低下は小さく、蒸発散量は小さいことがわかった。また、干ばつ抵抗性品種では感受性品種よりも葉温が低く保たれ、このことからも干ばつ抵抗性品種は水ストレス条件下でも土壌水分を多く吸水して蒸散を高く保つことにより、生長を保っていることが明らかとなった。以上により、本年度は干ばつ抵抗性の品種間差異を、葉温と深さ別土壌水分含量の非破壊経時計測により、地上部と地下部の両面から評価することができた。来年度は、干ばつ抵抗性の品種間差異について、土壌水分含量の経時変化をさらに長時間にわたり詳細に計測するとともに、干ばつ抵抗性の施肥レベル間差異について、地上部と地下部の両面から定量的に評価する計画である。

SPAD値においても、乾燥条件下において乾物生産が高く保たれた干ばつ抵抗性品種や牛糞堆肥では高く、収量の低かった多肥では低い傾向がみられ、葉色と生育との対応がみられた。以上より、イネの干ばつ抵抗性の品種間差異と、堆肥ならびに施肥レベルによる差異を、葉温と深さ別土壌水分含量の非破壊経時計測により、地上部と地下部の両面から評価することができ、生育の高く保たれた品種や施肥条件では、乾燥条件下においても吸水により蒸散を高く保っていることが明らかとなった。
血液透析患者の自己管理行動に影響する要因

平成19年20年度科学研究費(基盤研究C)課題:「血液透析患者の自己管理行動に影響する要因」において,研究の枠組み1の通りに従い研究を進めた.明らかにしたい課題は,1.医療従事者サポート,家族サポート並びに健康行動に対する自己効力感.が血液透析患者のセルフケア行動に与える影響.2.ソーシャルサポートが血液透析患者のセルフケア行動と精神的健康に及ぼす影響.3.血液透析患者の精神的健康の実態と血液透析患者の精神的健康に影響を与える要因血液透析年数による比較.4.医療従事者・家族サポートが血液透析患者のセルフケア行動と透析指標に及ぼす影響.5.最終的には,概念枠組みのとおり各変数間の関係性を明らかにすることであった.研究1の医療従事者サポート,家族サポート並びに健康行動に対する自己効力感が血液透析患者のセルフケア行動に与える影響では,家族および医療従事者からのサポートは,自己効力感を介してセルフケア行動に間接的な影響を与えることが明らかになった.このことは,本研究の仮説を支持することとなり,患者のセルフケアの対する効力感を高めることは,セルフケア行動の実施と定着につながる.セルフケアに対する高い効力感を維持するためには,家族や医療従事者からの支援が得られるような環境の整備が重要である.また,男性患者と比べて,女性患者(特に後期高齢者)が受領している家族からのサポートは少なかった.このことは後期高齢者に独居者が多いことを反映,後期高齢者女性に重点をあてた介入の必要性がある.カリウム・リン・塩分・水分の摂取量の制限について,「とても/まあまあよくできた」と回答した患者の割合は約67割,適度な運動については5割を下回っていた.このことから,今後,食事・水分摂取量の管理,適度な運動の定着を図っていくことが課題である.研究2のソーシャルサポートが,血液透析患者のセルフケア行動と精神的健康に及ぼす影響に関する研究では,血液透析患者の精神的健康を良好に保つためには,ソーシャルサポートのうち,行動に対するサポート(道具的サポート)が有効であり,情緒的なサポートは有効でなかった.このことは,医療従事者はその特徴を踏まえ血液透析患者の精神的健康について有効な支援が得られるような環境の整備が必要である.研究3の血液透析患者の精神的健康の実態と血液透析患者の精神的健康に影響を与える要因血液透析年数による比較に関する研究では,1.血液透析年数16年以上の人は,合併症や身体症状が悪くうつ傾向にある.2.血液透析患者の精神的健康に影響を及ぼしているマイナス要因は,倦怠感,頭痛,食欲不振,などの身体症状や,関節痛などの合併症であり,プラスの要因として,自己効力感,医療従事者サポートである. 3.精神的健康に自己効力感が影響しているのは,透析6-15年の患者であり,自己効力感が高ければ,精神的健康は良好の方向に作用する.4.医療従事者サポートの受領を高く認知している人は精神的健康が良好である(6-15年). 5.血液透析年数1年以下の透析導入期の患者は,透析による「倦怠感」などの症状が精神的健康に影響を与えていた.特に血液透析患者の50.3%の人が,神経症的傾向にあり, 20年前と同じ傾向が見られた.以上より,血液透析患者の精神的健康は約50%の人が神経症的傾向にあり,約20年前の結果と現在も同じ状況にある.透析年数16年以上という長い透析歴を持つ人の中で,年齢的にみると, 4554歳の人が神経症的傾向が強い.特に精神的健康と16年以上という長い透析歴との関係を見た研究は過去になく,新たな発見と言える.また, 75歳過ぎて透析開始となった後期高齢者は, GHQ得点が高く,うつ傾向にあることが明らかになった.透析導入は,多くのセルフケアに向けての課題をクリアできるように支援する必要があるが,これらの指導は,患者の年齢,心理状態,受容段階を見極め適切な時期に行う必要がある.また,高齢者の透析導入は,うつ傾向に導くことが明らかになったため,この場合も家族や医療従事者サポートが必要となる.また,血液透析年数別に見た背景要因と精神的健康との関連は,「透析1年以下」は,なれない透析後の倦怠感が精神的健康を低くしており,導入期,安定期へと透析の各治療段階で起こりうるさまざまな身体症状や合併症について説明し,軽減させるためのケアについて医療従事者のサポートが必要であろう.また,「2-5年」群は比較的精神的健康が安定している.「6-15年」群は比較的安定しているが,セルフケア行動に対する自己効力感を高く維持するために,医療従事者の支援が得られるような環境の整備が必要である.「16年以上」群は,身体的な自覚症状や合併症(関節痛)があるため,患者へのサポートが非常に重要な時期である.研究4の医療従事者・家族サポートが血液透析患者のセルフケア行動と透析指標に及ぼす影響に関する研究では,1.医療従事者サポートの下位因子「病気行動への説明・助言サポート」が自己効力感に影響を与え,情緒的サポートは自己効力感には影響を与えない.2.家族サポートについても,「疾患に対する行動的サポート」が有効であり,情緒的励ましは効果がなかった.3.ソーシャルサポートは,健康行動に対する自己効力感を通じて間接的にセルフケア行動に影響をもたらすことが明らかになった.

このことから医療従事者のサポートのあり方,看護介入の指針が得られたこと,医療従事者は常に腎不全や血液透析に関する実践的な知識を持ち,患者からの相談に,いつでも対応助言できる態勢を整えることが必要であることの示唆を得られた.研究5は血液透析患者の自主管理行動(セルフケア行動)に影響する要因に関する研究では,概念枠組みのとおり各変数間の関係性を明らかにすることであった.医療従事者・家族サポートは,自己効力感を介して,セルフケア行動を高め,セルフケア行動の高い人は,身体症状や合併症の訴えが少ない傾向にある.医療従事者サポートは患者の精神的健康を高め,身体症状の低い人は精神的健康が高い事が検証された.この血液透析患者の自主管理行動に影響する要因の関係性を明らかにした研究はなく,この結果から,どの部分にどのような働きかけが必要であるかが理解できる.平成19年20年度科学研究費(基盤研究C)課題:「血液透析患者の自己管理行動に影響する要因」において,研究の枠組み1の通りに従い研究を進めた.明らかにしたい課題は,1.医療従事者サポート,家族サポート並びに健康行動に対する自己効力感.が血液透析患者のセルフケア行動に与える影響.2.ソーシャルサポートが血液透析患者のセルフケア行動と精神的健康に及ぼす影響.3.血液透析患者の精神的健康の実態と血液透析患者の精神的健康に影響を与える要因血液透析年数による比較.4.医療従事者・家族サポートが血液透析患者のセルフケア行動と透析指標に及ぼす影響.5.最終的には,概念枠組みのとおり各変数間の関係性を明らかにすることであった.研究1の医療従事者サポート,家族サポート並びに健康行動に対する自己効力感が血液透析患者のセルフケア行動に与える影響では,家族および医療従事者からのサポートは,自己効力感を介してセルフケア行動に間接的な影響を与えることが明らかになった.このことは,本研究の仮説を支持することとなり,患者のセルフケアの対する効力感を高めることは,セルフケア行動の実施と定着につながる.セルフケアに対する高い効力感を維持するためには,家族や医療従事者からの支援が得られるような環境の整備が重要である.また,男性患者と比べて,女性患者(特に後期高齢者)が受領している家族からのサポートは少なかった.このことは後期高齢者に独居者が多いことを反映,後期高齢者女性に重点をあてた介入の必要性がある.カリウム・リン・塩分・水分の摂取量の制限について,「とても/まあまあよくできた」と回答した患者の割合は約67割,適度な運動については5割を下回っていた.このことから,今後,食事・水分摂取量の管理,適度な運動の定着を図っていくことが課題である.研究2のソーシャルサポートが,血液透析患者のセルフケア行動と精神的健康に及ぼす影響に関する研究では,血液透析患者の精神的健康を良好に保つためには,ソーシャルサポートのうち,行動に対するサポート(道具的サポート)が有効であり,情緒的なサポートは有効でなかった.このことは,医療従事者はその特徴を踏まえ血液透析患者の精神的健康について有効な支援が得られるような環境の整備が必要である.研究3の血液透析患者の精神的健康の実態と血液透析患者の精神的健康に影響を与える要因血液透析年数による比較に関する研究では,1.血液透析年数16年以上の人は,合併症や身体症状が悪くうつ傾向にある.
小児特発性ネフローゼ症候群の病態解明－質量分析法による病勢関連蛋白質の同定－

小児慢性腎疾患において、特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)は重要な位置を占めており、同疾患の病態解明に寄与する知見を得て、発症予防、及び、治療薬の開発を促進させることを目的として本研究を開始した。この目的のために、ISSNS関連因子を同定し、同時に、標的傷害組織部位を確認することを試みる。我々が先の研究でISSNSのdeep proteinとして同定した、ISSNSの病因候補一次質量ペプチドイオン3個に対し、ペプチドシークエンスタグ法を用い、病因候補蛋白質を同定する。病因候補蛋白質をラットに投与し、蛋白尿の誘導を確認し、病理学的に病因候補蛋白質の傷害部位を確認する。また、同定した病因候補蛋白質を小児ISSNS患児の血清中に確認し、蛋白尿、低アルブミン血症そして全身性浮腫といったネフローゼの病勢に関与する因子との関連を調べる。今年度は次の実験を行い、結果を得た。平成29年度は、平成28年度に得た3個のペプチドイオンをタンデム質量解析し、分解して得られた生成イオンのピーク間の質量差を測定し、各ペプチドイオンのアミノ酸配列情報を得た。平成30年度は、これにトリプシン処理した時の、ペプチド末端のアミノ酸の種類とその質量のデータに対し、マスコットサーチを行い、同フラクションに含まれるポリペプチドイオンを同定した。現在、論文を投稿準備中である。生成したペプチドイオンを同定できた。研究成果を発信するために、現在、論文を投稿準備中である。(具体的内容)小児慢性腎疾患において、特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)は重要な位置を占めており、同疾患の病態解明に寄与する知見を得て、発症予防、及び、治療薬の開発を促進させることを目的として本研究を開始した。この目的のために、特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)関連因子を同定し、同時に、標的傷害組織部位を確認することを試みる。我々が先の研究で小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)のdeep proteinとして同定した、ISSNSの病因候補一次質量ペプチドイオン3個に対し、ペプチドシークエンスタグ法を用い、病因候補蛋白質を同定する。検体として、保護者ならびに本人に、インフォームドコンセント・アセントを行い、書面で承諾を得られた小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群患者の、ステロイド治療前ネフローゼ期の血清を用いた。候補一次質量ペプチドイオンは、これまでの我々の研究結果から、すでに、等電点が判明していたため、1初期精製には、イオン交換クロマトグラフィーを、2中間精製には、イオン交換高速液体クロマトグラフィーを、また、質量も判明しているため、3最終精製には、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーを行い、3個の目的ペプチドイオンを精製した。ほぼ当初の予定通りに、順調に、進んでいる。候補一次質量ペプチドイオンは、これまでの申請者の研究結果から、すでに、等電点が判明しているため、1初期精製には、イオン交換クロマトグラフィーを、2中間精製には、イオン交換高速液体クロマトグラフィーを、また、質量も判明しているため、3最終精製には、ゲルろ過高速液体クロマトグラフィーを行い、目的ペプチドイオンを精製する。精製したペプチドイオンをタンデム質量解析し、分解して得られた生成イオンのピーク間の質量差を測定する。これに、トリプシン処理した時の、ペプチド末端のアミノ酸の種類とその質量の情報をあわせ、病因候補蛋白質を同定する。前年度に精製した3ペプチドイオンを質量解析し、分解して得られた生成イオンの情報を基にマスコット解析した。ほぼ予定通りに、順調に、進んでいる。

平成29年度は、平成28年度に得た3個のペプチドイオンをタンデム質量解析し、分解して得られた生成イオンのピーク間の質量差を測定し、各ペプチドイオンのアミノ酸配列情報を得た。平成30年度は、これにトリプシン処理した時の、ペプチド末端のアミノ酸の種類とその質量のデータに対し、マスコットサーチを行い、同フラクションに含まれるポリペプチドイオンを同定した。現在、論文を投稿準備中である。生成したペプチドイオンを同定できた。◎候補一次質量ペプチドイオンからの小児ISSNS病因候補蛋白質の同定ーペプチドシークエンスタグ法による同定ー精製した3個のペプチドイオンをタンデム質量解析し、分解して得られた生成イオンのピーク間の質量差を測定し、各ペプチドイオンのアミノ酸配列情報を得る。これに、トリプシン処理した時の、ペプチド末端のアミノ酸の種類とその質量の情報をあわせ、病因候補蛋白質を同定する。本年度に得たペプチドイオンのデータに対し、マスコットサーチを行い、病因候補蛋白質を同定する。つづいて、同蛋白質をネフローゼ患児の血清中に確認し、病勢との関連を調べる。研究成果を発信するために、現在、論文を投稿準備中である。初年度は、目的ペプチドイオンの精製に留まり、ペプチドシークエンスタグ法を用いた病因候補たんぱく質の同定までには至ってないため。(理由)平成29年度は、前年度に精製したペプチドイオン情報を得るに留まり、病因候補蛋白質の同定までに至らなかったため。(使用計画)今年度に得られたペプチドイオンのデータに対し、マスコットサーチを行い、得られた情報を基に、病因候補蛋白質を同定する。(理由)平成30年度は、病因候補蛋白質の同定に留まり、研究結果を発信するには至らなかったため。(使用計画)研究成果を英語論文として発信するため、現在は投稿準備中である。前年度に精製した3個のペプチドイオンをタンデム質量解析し、分解して得られた生成イオンのピーク間の質量差を測定し、各ペプチドイオンのアミノ酸配列情報を得る。
ヌクレオソーム1分子イメージングによるヘテロクロマチン動態の解明

最近、代表者らは細胞のクロマチンが従来考えられてきたような、いわば結晶のように規則正しく折り畳まれた階層構造ではなく、液体のように不規則で流動的な構造であることを明らかにした。それでは、この流動的な環境において、ヘテロクロマチン領域はどのようなメカニズムでクロマチンを不活化しているのであろうか?代表者らは、ヘテロクロマチンは個々のヌクレオソームのダイナミクス(動態)の抑制によって規定されているという仮説を立てた。本研究では、仮説を検証するため、ヌクレオソーム1分子イメージングによってヘテロクロマチンのヌクレオソーム動態を解明する。そしてクロマチン不活化のメカニズムをヌクレオソーム動態の実験・理論の両面から明らかにすることを目的としている。本年度はヘテロクロマチンの動態解明のため、以下の2つの項目について研究をおこなった。ヘテロクロマチン領域のヌクレオソーム動態の解析ーヘテロクロマチンにおいて、ヌクレオソームのリンカーDNAをつなぎ止めるクリップの役割をしていると考えられているリンカーヒストンH1を蛍光ラベルし、H1に富んだヌクレオソームの1分子解析をおこなった。ヘテロクロマチン領域のヌクレオソーム動態制御に関与する因子の同定ー核内膜直下のヘテロクロマチンについては、核膜の裏打ちタンパク質LaminA/CやLBRなどのヘテロクロマチン形成に対する関与が示唆されている。これらの核内膜タンパク質を体系的にノックダウンし、ヌクレオソームの動きを解析した。計画通りのH1-ヌクレオソームの1分子イメージング実験、データ解析を遂行することができ、有意義な結果を得ることができた。また本年度までの結果を論文発表することが出来た(Nozaki et al. Mol. Cell, 2017)。さらに米国ウッズホール海洋生物学研究所Shribak博士らが開発したOI-DIC顕微鏡を用いて、生細胞内の密度イメージングに成功し、ヘテロクロマチンの密度定量をおこなった。その結果、ヘテロクロマチンの密度(208 mg/mL)はユークロマチン(136 mg/mL)のわずか1.53倍であることが明らかになった。この成果は、米国細胞生物学会MBoC誌に「ハイライト」として掲載された。計画は順調に進んでいる。来年度理研・高橋恒一らと共同でモンテカルロ計算機シミュレーションを組み合わせ、測定値に基づくクロマチン環境を再現する。高橋らと代表者はヌクレオソームの濃度・動きを再現するシステムを既に構築しているため、この方法をさらに改良し、どのくらいの大きさのタンパク質が、どのくらいのヌクレオソームの動きによって、クロマチンにアクセスできるようになるのか?を詳細に解析する。そして、ヘテロクロマチンにおいて、抑制されたヌクレオソームの動きがタンパク質のクロマチンへのアクセシビリティに与える影響を明らかにする。また、リンカーヒストン・HP1・ヒストンメチル化酵素を過剰発現させ、ヌクレオソーム動態と遺伝子発現が低下するかを確認する。技術的な困難はない。本年度は以下の3つの項目について研究をおこなった。ヘテロクロマチン様ラベルのために内在性ヒストンプロモーターH4-PA-mCherry安定発現NIH3T3細胞を作製した。そしてユークロマチン様ラベルにはEF1a-プロモーターH4-PAmCherry安定発現NIH3T3細胞を作製した。ヌクレオソーム1分子観察のため、細胞内の限られた範囲だけを照らし出すことができる斜光照明のシステム(原理Tokunaga et al., Nat. Methods, 2008)を用い、H4-PAmCherry安定発現細胞を用いて、動画50ms/frame撮影をおこなった。そして観察した蛍光輝点は点拡かり(ガウス)関数でフィッティングし、正確な中心を決定する。次に1個1個のヌクレオソームの動きを追跡し、データを集めた。そして1細胞当たり数万のヌクレオソームの輝点情報を集める。この情報からヌクレオソームの動きを定量化するため、動きの平均2乗変位(MSD)を算出した。細胞の作製、測定、データ解析のシステムを立ち上げ、計画通りに進んだ。