hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
卵黄嚢原始性造血から肝臓・脾臓造血への移行:計量細胞学的観察

2年間の研究の成果は,次の4天にまとめる事ができる.(1)卵黄嚢の造血と卵黄嚢由来の循環赤芽球マウスノ卵黄嚢では胎生89非で欠陥芽細胞索として造血巣が形成され始め,赤芽球生成をおこなった後, 11日以降急速に減衰する.胎生10日の卵黄嚢では殆ど前赤芽球などの幼若な赤血球系細胞であるが,それに加えて, 8μm以上の核径で特異な核膜形態を有し,欠陥芽細胞と類似する幼若造血細胞も少数ながら存在する.この造血細胞は胎生10日の胎児末梢循環欠陥中にも認められる.(2)肝臓造血と脾臓造血肝臓造血は胎生10日11日で始まり,生後1週までつづく.造血は肝臓原基発生と同時に認められる.大型核の増血細胞が多く, 12日以降分化した赤芽球が増加するが,核径8μm以上の大型核造血細胞は15日までは肝臓に残存する.この造血細胞は骨髄が形成されるまで,脾臓に認めることができる.(3)脾臓造血とリンパ球脾臓は胎生16日以降造血細胞が出現し,造血をはじめる.これと同時に小リンパ球があらわれる.小リンパ球の形態から,脾臓は胎生期における骨髄性リンパ球の産生部位と考えられる.(4)巨核球生成巨核球は卵黄嚢造血巣に認められる.骨髄の巨核球にくらべると小型である.卵黄嚢の巨核球はきわめて少数であり,分離膜系の発達を指標にYM1型, 2型, 3型に分類できる.肝臓発生初期の巨核球はYM1ないし2型に対応する.胎生15日で肝臓内から卵黄嚢型の巨核球は消失し,大型の骨髄型巨核球のみになる.2年間の研究の成果は,次の4天にまとめる事ができる.(1)卵黄嚢の造血と卵黄嚢由来の循環赤芽球マウスノ卵黄嚢では胎生89非で欠陥芽細胞索として造血巣が形成され始め,赤芽球生成をおこなった後, 11日以降急速に減衰する.胎生10日の卵黄嚢では殆ど前赤芽球などの幼若な赤血球系細胞であるが,それに加えて, 8μm以上の核径で特異な核膜形態を有し,欠陥芽細胞と類似する幼若造血細胞も少数ながら存在する.この造血細胞は胎生10日の胎児末梢循環欠陥中にも認められる.(2)肝臓造血と脾臓造血肝臓造血は胎生10日11日で始まり,生後1週までつづく.造血は肝臓原基発生と同時に認められる.大型核の増血細胞が多く, 12日以降分化した赤芽球が増加するが,核径8μm以上の大型核造血細胞は15日までは肝臓に残存する.この造血細胞は骨髄が形成されるまで,脾臓に認めることができる.(3)脾臓造血とリンパ球脾臓は胎生16日以降造血細胞が出現し,造血をはじめる.これと同時に小リンパ球があらわれる.小リンパ球の形態から,脾臓は胎生期における骨髄性リンパ球の産生部位と考えられる.(4)巨核球生成巨核球は卵黄嚢造血巣に認められる.骨髄の巨核球にくらべると小型である.卵黄嚢の巨核球はきわめて少数であり,分離膜系の発達を指標にYM1型, 2型, 3型に分類できる.肝臓発生初期の巨核球はYM1ないし2型に対応する.胎生15日で肝臓内から卵黄嚢型の巨核球は消失し,大型の骨髄型巨核球のみになる.研究実施計画に従って、本年度は「卵黄嚢原始性造血から肝臓造血の成立過程」に関連して、次の三点について研究を行い、一部はすでに発表した。1)卵黄嚢と卵黄嚢に由来する原始赤芽球の観察2)肝臓増血細胞の電子顕微鏡による観察3)卵黄嚢と肝臓巨核球系細胞の観察この研究における定量的観察は、従来からの写真計測と、あらたに顕微鏡TVモニター上での計測を合せて行い、とくに顕微鏡テレビ装置の導入によって、細肪計量をきわめて迅速に容易に行う事が可能となり、作業能率が著しく向上した。マウスの胎児で肝臓が形成される以前の時期の循環血液は、卵黄嚢に由来する原始赤芽球からなり、原子赤芽球は分裂を繰返し増殖しながら体内を循環する。胎生9日で卵黄嚢および胎児循環血液細胞は、前赤芽球およびより幼若な造血系細胞からなり、核直径は4.89.8μmに分布する。肝臓造血が始まる胎生11日では6μm以上の核径の細胞は末梢循環から消失し、血液細胞の90%は5μmより小さな核をもつ。電子顕微鏡レベルでの観察では、肝臓造血の成立時点に肝臓に出現する造血系細胞には、核および核小体の形態で卵黄嚢の血管芽細胞とよくにた特徴をもつ造血細胞が存在する。これを核径の計測結果とあわせて考えると、卵黄嚢から肝臓への造血の移り変わりに、核径89μmの大型核の幼若な造血細胞が関連するとみなされる。核計量の成積は引続きおこなう肝臓と脾臓造血の定量観察の基礎となる。肝臓造血の発生に関連して、肝臓巨核球系細胞をとくに卵黄嚢由来巨核球系細胞と肝臓の巨核球生成との関連性を、準超薄切片法で観察した。
小手術を受ける子どもを支える家族の認識と家族への看護援助

1.予備調査:平成13年度に行った小手術を受ける子どもの家族へのインタビュー内容を分析した。これより、看護師は小手術を受ける子どもやその家族をどのように捉え関わっているのかについて明らかにするために質問紙を作成した。小児看護学の専門家2名により妥当性の検証後、研究協力の承諾が得られた4名の看護師に質問紙を配布回収し、質問紙の修正を行った。2.本調査:研究協力の承諾を得られた、小児外科看護に携わる看護師600名(32施設)を対象に作成した質問紙を配布し郵送にて回収した。その結果388名より回答が得られた(回収率64.7%:有効回答数382名)。3.分析:統計ソフトSPSSを用いて、単純集計、クロス集計を行った。4.結果:(1)入院前看護師の75%が家族が子どもに手術の説明をすることは難しいと答えていた。81%の看護師は治療の必要性を家族が子どもに説明する必要があると捉えていた。(2)術前日90%以上の看護師は、家族は戸惑い、緊張していると捉えていた。85%の看護師が、家族が子どもと接することが出来るように関わるとしていた。(3)手術日77%の看護師は、家族は術後の子どもの痛みに苦慮していると捉えていた。780%の看護師が、術後の子どもに家族と対応していると答えていた。(4)退院日約30%の看護師が退院時家族に関わる時間がないと答えた。(5)退院後約20%の看護師が退院後の家族について不明と答えた。以上の結果から、小児外科看護に携わる看護師は、家族が戸惑い、緊張し術後の子どもに関わることが難しいと捉え、自ら関わりをもとうとしていることが明らかになった。しかし記述回答では、家族の子どもへの対応に疑問を持っていたり、看護師が家族にうまく対応できていない思いがあった。今後は看護者と家族のやり取りについて明らかすることで、小手術を受ける子どもや家族を支える援助がより明確になると考える。1.予備調査:文献検討により作成したインタビューガイドと観察場面を用いて、小手術のために入院した子どもの家族で研究趣旨に同意を得られた家族4名(父親又は母親)に参加観察とインタビューを行った。その結果、家族の子どもの捉え方や関わりは、家族の育児観や術前後での出来事に影響をうけ経過と共に変化することが分かった。付き添いの有無で、家族の子どもの捉え方や関わりに違いが見られた。以上よりインタビューガイドの検討修正を行った。2.本調査:研究趣旨に同意を得られた小手術を受ける子どもの家族17名(うち付き添い9名)に修正したインタビューガイドを用い半構成のインタビューを行った。この結果家族について以下のことが明らかになった。入院日:その時々で子どもの状態を確認し、手術に向かえるかどうか予測を立てていた。子どもが環境に適応できるように関わり、子どもと一緒に過ごせるよう家族内で調整していた。一方、手術について予測できず、子どもへの説明や術後の対応について見出せていなかった。手術日:術前の子どもの不機嫌さには対応できるが、処置や術後の子どもの苦痛や反応から欲求を読み取れず対応に苦慮し戸惑い、緊張や心細さを感じていた。苦痛を軽減できなくても子どもの傍に居ることを望んでいた。子どもに家族の辛い気持ちを見せないようにコントロールしていた。退院日:子どもが乗り越えられたことを実感し誉めていた。身体状況の把握に努め、医療者に退院後の生活について確認していた。退院後:術前後での子どもの変化を読み取り、子どもの反応を受け止めることを大事にしていた。付き添い環境の違いで子どもの成長の捉えや関わりに違いが見られた。今後分析を進めたい。3.今後:さらに分析を進め、家族への看護援助を明らかにする。手術に関わる小児看護者に、家族が必要とする援助についての認識や重点を置く家族への援助について調査していきたい。

(4)退院日約30%の看護師が退院時家族に関わる時間がないと答えた。(5)退院後約20%の看護師が退院後の家族について不明と答えた。以上の結果から、小児外科看護に携わる看護師は、家族が戸惑い、緊張し術後の子どもに関わることが難しいと捉え、自ら関わりをもとうとしていることが明らかになった。しかし記述回答では、家族の子どもへの対応に疑問を持っていたり、看護師が家族にうまく対応できていない思いがあった。今後は看護者と家族のやり取りについて明らかすることで、小手術を受ける子どもや家族を支える援助がより明確になると考える。
時間拡張モデリング手法を用いた原子論に基づく転位の上昇運動機構の解明

結晶材料中の線欠陥である転位の運動は材料の塑性変形の主たる素過程であり、高温ではすべり面外に移動する特異な上昇運動をすることで高温特有の塑性変形をもたらすことが知られている。しかし、近年ではナノ材料において室温環境下でも転位の上昇運動が発生するという非常に特異な現象が発見された。これは、室温下ではこれまで全く予測されていなかった変形機構であり、ナノ構造物を実用環境下で利用するうえで解明すべき非常に重要な新奇現象である。しかし現状では、転位の上昇メカニズムの原子論的詳細は未解明である。本研究では、時間拡張モデリング手法を用いることで転位の上昇運動機構のエネルギー論的解明を目指す。
土壌集合体の分類基準化に関する研究

黒ボク土を中心として有機質土壌の構造特性を示す物理量を評価し指標化を試みた.とくに黒ボク土の保水性と構造性の関係における土壌有機物の機能を重視して研究を進めた結果,それらの関係について,次のような結論をうることができた.1.黒ボク土層は有機物含有量が深さとともに減少するように堆積している.それに応じて土層断面の性質が分化し,土壌物理性,保水性および構造性の指標は深さの方向に定まった変化の傾向がある.2.有機物含有量の質量表示と容積表示を比較した結果によれば,容積表示の方が土壌構造によく対応し,構造指標として価値が高いことがわかる.3.黒ボク土の構造を鉱物質・有機物・液体・気体の四相系で表示し定量すれば,土壌構造量をよく反映することが明きらかとなった.したがって,質量表示よりも有機物の機能した容積表示による四相分布による土壌集合体の分類がすぐれていることがわかった.4.黒ボク土層の通気性,透水性など透過性の特徴は,土層の構造とよく一致しており,透過性によって土壌構造を分類することも可能であることがわかった.したがって,骨格構造としての団粒構造と間ゲキ構造の指標としての透過性とはよい相関を示している.5.団粒分布の指標としては,団粒係数によるものが比較的汎用性があり,多くの物理量と対応している.しかし,この点の詳細については,なお一層の検討の余地が残された.6.透過性のバラツキは対数正規分布に従うことが統計的に解明された.したがって,透過性の採土必要数は対数値をとった値で考える方がより合理的であることが明きらかにされた.7.土壌集合体をはじめ土壌物理量の多くはそのバラツキに正規性があり,平均値決定のためのサンプル数は誤差率によって単純に求められることが確認された.以上より,土壌集合体分類基準化の基礎的データとしての土壌物理量の性格とその相関性の特徴を明きらかにすることができた.黒ボク土を中心として有機質土壌の構造特性を示す物理量を評価し指標化を試みた.とくに黒ボク土の保水性と構造性の関係における土壌有機物の機能を重視して研究を進めた結果,それらの関係について,次のような結論をうることができた.1.黒ボク土層は有機物含有量が深さとともに減少するように堆積している.それに応じて土層断面の性質が分化し,土壌物理性,保水性および構造性の指標は深さの方向に定まった変化の傾向がある.2.有機物含有量の質量表示と容積表示を比較した結果によれば,容積表示の方が土壌構造によく対応し,構造指標として価値が高いことがわかる.3.黒ボク土の構造を鉱物質・有機物・液体・気体の四相系で表示し定量すれば,土壌構造量をよく反映することが明きらかとなった.したがって,質量表示よりも有機物の機能した容積表示による四相分布による土壌集合体の分類がすぐれていることがわかった.4.黒ボク土層の通気性,透水性など透過性の特徴は,土層の構造とよく一致しており,透過性によって土壌構造を分類することも可能であることがわかった.したがって,骨格構造としての団粒構造と間ゲキ構造の指標としての透過性とはよい相関を示している.5.団粒分布の指標としては,団粒係数によるものが比較的汎用性があり,多くの物理量と対応している.しかし,この点の詳細については,なお一層の検討の余地が残された.6.透過性のバラツキは対数正規分布に従うことが統計的に解明された.したがって,透過性の採土必要数は対数値をとった値で考える方がより合理的であることが明きらかにされた.7.土壌集合体をはじめ土壌物理量の多くはそのバラツキに正規性があり,平均値決定のためのサンプル数は誤差率によって単純に求められることが確認された.以上より,土壌集合体分類基準化の基礎的データとしての土壌物理量の性格とその相関性の特徴を明きらかにすることができた.
日常生活における光曝露環境が双極性障害の病状に及ぼす影響の解明

本研究の目的は、日常生活における光曝露環境が双極性障害患者の病状にどのような影響を与えているのかを明らかにすることである。平成30年度は研究申請時の予定通り、175名の外来通院中の双極性障害患者に対して、外来にて病状の評価をして自宅にて連続7日間の間照度計を使用して光曝露を測定した。現在、その結果を解析し論文を作成し、国際医学雑誌に投稿中である。本研究結果により、夜間の光曝露は双極性障害の睡眠の質の悪化と関連していることが明らかになった。さらに日中の光曝露は双極性障害のうつ症状と関連することが明らかになった。現時点では研究計画通り滞りなく研究実施できていると考えている。平成31年度は目標症例数である200名を達成し、達成後は解析及び論文の投稿を予定通り進めていく。平成30年度に購入予定であった研究機器、資材の購入を翌年度に繰り越したため。
光学活性イミドをプロトン源とするエノラート類の不斉プロトン化反応

エノラート類の不斉プロトン化反応は、光学活性なα-置換カルボニル化合物の効率的合成手法として、ここ10数年にわたり国内外で精力的な研究が展開されてきた。これまでに数多くのキラルなプロトン化剤を用いた研究が報告されているが、高いエナンチオ選択性の獲得に成功した例の多くが、限られた基質にのみ有効である場合が多く、一般性に富んだキラルなプロトン化剤はこれまでのところ合成されていない。本研究はこれらの問題点を克服した真に実用的な不斉プロトン化反応の開拓を目的とす。具体的には、同一反応剤で基質に対する広い一般性をもち、100%の不斉収率が期待できる新しいプロトン化剤の開発を目指す。不斉プロトン化反応の開発にあたり、プロトン化剤についての予備的研究を行った結果、これまでにKempのトリカルボン酸から誘導した、分子内にキラルな2-オキサゾリンを持つイミド化合物が2-アルキルシクロアルカノン類のエノラートのプロトン化剤として効果的であることがわかった。この反応には顕著な溶媒効果と金属塩の添加効果が見られ、特にリチウムエノラートをエーテル溶媒中で5当量の臭化リチウム存在下に発生させたものを用いてプロトン化すると高いエナンチオ選択性が得られることがわかった。一方、キラル部分に関して、2-オキサゾリンを持つイミド化合物に加えて、他のヘテロ官能基を持つイミド化合物についてもスクリーニングを行ったところ、光学活性シクロヘキシルエチルアミンから誘導したキラルアミド基を持つイミド化合物が、2-メチルシクロヘキサノンのリチウムエノラートのプロトン化反応において、最も高いエナンチオ選択性を与えることがわかった。中でも、Kempのトリカルボン酸に由来するシクロヘキサン環部分のアルキル置換基がメチル基の場合とシクロヘキシル基の場合とでそのプロトン化生成物の絶対配置が逆となり、しかもそれぞれが85%ee以上の高いエナンチオ選択性で得られることがわかった。これらのキラルイミド化合物は、さらに分子内に不斉炭素を持つキラルなエノラートのジアステレオ選択的プロトン化反応にも効果的なプロトン化剤であることがわかった。また、キラルアミド基を分子内にもつイミド化合物を触媒量とかさ高いフェノールを等量用いた触媒的不斉プロトン化反応において、これまで触媒的プロセスで20%ee以上のエナンチオ選択性を得ることが困難であった2-メチルシクロヘキサノンのリチウムエノラートが79%eeと高い光学純度でプロトン化されることを初めて見い出した。これまでに数多くのキラルなプロトン化剤を用いた研究が報告されているが、高いエナンチオ選択性の獲得に成功した例の多くが、限られた基質のみ有効である場合が多く、一般性に富んだキラルなプロトン化剤はこれまでのところ合成されていない。

本研究はこれらの問題点を克服した真に実用的な不斉プロトン化反応の開拓を目的とする。具体的には、同一反応剤で基質に対する広い一般性を持ち、100%の不斉収率が期待できる新しいプロトン化剤の開発を目指す。不斉プロトン化反応の開発にあたり、プロトン化剤についての予備的研究を行った結果、これまでにKempのトリカルボン酸から誘導した、分子内にキラルな2-オキサゾリンを持つイミド化合物が2-アルキルシクロアルカノン類のエノラートのプロトン化剤として効果的であることがわかった。当該年度は、これをさらに一般性のある反応に発展させ、実用的な高エナンチオ選択的不斉プロトン化反応として確立するために、このプロトン化剤について詳細に検討を行った。まず、キラル部分に関して、2-オキサゾリンを持つイミド化合物に加えて、他のヘテロ官能基を持つイミド化合物についてもスクリーニングを行ったところ、光学活性シクロヘキシルエチルアミンから誘導したキラルアミド基を持つイミド化合物が、2-メチルシクロヘキサノンのリチウムエノラートのプロトン化反応において、最も高いエナンチオ選択性を与えることがわかった。さらに、Kempのトリカルボン酸由来のシクロヘキサン環部分について検討したところ、そのアルキル置換基の大きさによってエナンチオ選択性が大きく変化することを見い出した。この置換基効果については、次年度も引き続き検討する予定である。当該最終年度は平成8年度までに見い出だしたKempのトリカリボン酸から誘導した、分子内にキラルな2-オキサゾリンを持つイミド化合物によるリチウムエノラートのエナンチオ選択的プロトン化反応について、さらに実用性を高めるために反応システムの再検討をおこなった。その結果、顕著な溶媒効果と金属塩の添加効果を見い出し、特にリチウムエノラートをエーテル溶媒中で5当量の臭化リチウム存在下に発生させたものを用いてプロトン化すると高いエナンチオ選択性が得られることが分かった。一方、光学活性シクロヘキシルエチルアミンから誘導したキラルアミド基を持つイミド化合物が、2-メチルシクロヘキサノンのリチウムエノラートのプロトン化反応において、特に有効であることがわかった。中でも、Kempのトリカルボン酸に由来するシクロヘキサン環部分のアルキル置換基がメチル基の場合とシクロヘキシル基の場合とでそのプロトン化生成物の絶対配置が逆となり、しかもそれぞれが85%ee以上の高いエナンチオ選択性で得られることがわかった。これらのキラルイミド化合物は、さらに分子内に不斉炭素を持つキラルなエノラートのジアステレオ選択的プロトン化反応にも効果的なプロトン化剤であることがわかった。例えば、(-)ーメントンのリチウムエノラートに対して、キラルイミド化合物の両エナンチオマーを作用させることで、トランス体の光学活性メントンをそれぞれ選択的に作り分けることができた。また、キラルアミド基を分子内にもつイミド化合物を触媒量とかさ高いフェノールを等量用いた触媒的不斉プロトン化反応において、これまで触媒的プロセスで20%ee以上のエナンチオ選択性をを得ることが困難であった2-メチルシクロヘキサノンのリチウムエノラートが79%eeと高い光学純度でプロトン化されることを初めて見い出した。
放射光共鳴・非共鳴非弾性散乱による異常金属の電荷ダイナミックスの研究

異常金属物質の代表である遷移金属酸化物は、高温超伝導や超巨大磁気抵抗効果、多重強秩序性など多彩な物性、機能を示し、これらの物性発現機構を解明し制御することを目的として、共鳴非弾性X線散乱(RIXS)による電子励起状態の観測、また最近発見された鉄系超伝導体を対象とした非共鳴非弾性散乱による格子振動の観測によって超伝導発現に重要な電子相関に関する詳細な情報を解析した。この結果、(LaSr)xNiO4,(LaBa)xCuO4で観測されている静的電荷の縞状構造(charge stripe state)からの電荷揺らぎと考えられる電荷励起状態の観測に初めて成功した。Charge stripe構造の周期に対応する運動量のところから発達する電荷励起を観測したもので、今後理論計算との比較により電子相関に関する定量的な議論や超伝導特性との関係が議論できるものと期待される。また、鉄系超伝導体:LaFeAO_<1-y>F_y,PrFeAsO_<1-y>を対象とした多結晶X線非弾性散乱による格子振動の状態密度観測を行った。第一原理計算との比較により、Fe-As結合が関わる格子振動のみ計算より約30%もバネ定数が小さいことが明らかとなった。この考察において、Fe原子に磁気モーメントの存在を考慮することによって実験との定量的な一致が得られることがわかり、スピン-格子相互作用の重要性が示唆される結果が得られた。異常金属物質の代表である遷移金属酸化物は、高温超伝導や超巨大磁気抵抗効果、多重強秩序性など多彩な物性、機能を示し、これらの物性発現機構を解明し制御することを目的として、共鳴非弾性X線散乱(RIXS)による電子励起状態の観測によって電子相関に関する詳細な情報を解析した。実験は、高温超伝導発現に磁性がどのように関与しているかを明らかにするために、Cuを磁性不純物であるNiに置換したLa_2Cu_<1-y>Ni_yO_4を対象とし、Niの周りの電子状態を選択的に解析することに成功した。今回の結果からNiと周りの酸素に存在するホールとが束縛状態を形成することが明らかになり、磁性不純物としてよりもむしろ電子状態に大きな影響を与えていることがはっきりした。これは、RIXSが不純物元素を特定した電子状態の研究に有効な分光手法であることを明らかにしたこと、さらに超伝導発現にかかわる不純物電子状態を明らかにしたことに章義がある。本研究ではさらにスピンや軌道の自由度が複雑に絡み合った結果、多彩な秩序状態を示すt_<2g>電子系遷移金属酸化物として知られるYVO3のスピンや軌道の秩序状態に依存した電荷励起状態をエネルギー、運動量空間で実験的に観測することに成功した。これは、電子の持つ多重自由度が関係した秩序状態によって電子状態も異なることを意味しており、理論的な解析を進めることにより電子間に働く相関の詳細を定量的に議論することが可能となる。強相関電子系の物性・機能発現の解明とその制御につながる成果が得られたといえる。
ダイニンのプロテア-ゼ消化フラグメントによる微小管の滑り運動

ダイニンを種々のプロテア-ゼにより消化し,得られたフラグメントにより引き起こされる微小管滑り運動を調べることは,ダイニンの分子構造と機能を関連づける上で重要であり,微小管系細胞運動研究の基礎となりうる。本研究ではまずダイニンβ鎖上での,ATP/バナジン酸存在下におけるトリプシン切断部位のマッピングを,ダイニン特異抗体を用いたイムノブロッティング法により行った。その結果,ダイニン重鎖ダイニン重鎖のATP結合部位近傍でダイニン重鎖が切断されることがわかった。このことは,ダイニンがATPを分解する際,ATP結合部位付近のコンホメ-ションが変化することを示唆する。次にダイニンをはじめとする微小管結合タンパク質のプロテア-ゼ分解が,微小管滑り運動の際に起こっているのか否かを,細胞運動の中では古くから詳細に調べられている精子鞭毛運動系で調べた。まず種々のプロテア-ゼインヒビタ-をシロサケ精子除膜モデルに作用させたところ,数種のキモトリプシン様セリンプロテア-ゼインヒビタ-によりモデルの運動が阻害された。またこれらの阻害は高濃度ATPによって再活性化されたモデルにのみに観察された。つまり,内在性プロテア-ゼはATP依存的に機能していると考えられる。そこでシロサケ精子抽出液から種々のカラムクロマトグラフィ-を用いてキモトリプシン様プロテア-ゼの精製を試みた。その結果,分子量95万,65万の二種の高分子量プロテア-ゼの存在が明らかになった。これら二種のプロテア-ゼはサブユニット構造等から,真核生物に広く分布している多機能プロテア-ゼ(プロテアソ-ム)と同一であると思われる。プロテアソ-ムはユビキチン系タンパク質分解経路に関与していると考えられており,微小管結合タンパク質のユビキチン化を手掛りにして,微小管滑り運動の分子機構を今後詳細に調べていきたい。
イオンビーム誘起CVD法による超微粒子の作製とその磁性

本研究は研究代表者が開発したイオンビーム誘起CVD法により微粒子作製を行い、数原子あるいはクラスターから構成される磁性微粒子の磁性、構造を調べることを目的としている。特に今年度においては、将来高密度磁気記録材料として注目を集めている「非常に高い磁気異方性を有するFePt及びCoPt系合金微粒子の作製」を先ず成功させることを目的として実験を行ってきた。その結果、1.Dualイオンビーム誘起CVD法を確立し、これによりFePt合金微粒子作製が再現性よく実現出来ることを確認した。これはイオンビーム法により世界で初のFePt微粒子の作製である。2.このようにして作製したFePt粒子は、比較的大きな磁気異方性定数(10^6erg/cc)を示すことがわかった。しかしながら、完全なL1o規則合金のもつ10^7erg/ccに比較して一桁小さい値であり、この原因は完全な規則合金の微粒子ではなく、fccとfctの二相分離である為であることが判明した。現在作製条件を系統的に変え、規則度の高い微粒子を作成する実験を継続中である。3.CoPt合金微粒子も本方法で作製しその磁性・構造を系統的に調べた結果、作製時に非晶質構造をもつにも係わらず、すでに大きな磁気異方性を持つ事がわかった。4.上記の非晶質微粒子を焼鈍した結果fccとfctの混相となり、磁気異方性か増加しないことが判明した。上記の研究成果は国際会議(インターマグ、磁性・磁気材料国際会議等)や国内会議(応用磁気学会等)などで発表し、学術論文としても纏めて報告をしている。本研究は、Dual型イオンビーム誘起CVD(Ion Beam Induced)という新しい方法を用いることにより、数原子(あるいはクラスター)から構成される超微粒子の作製を行い、それらの形状、あるいは配列を制御し、微粒子間の磁気的相互作用、各微粒子のもつ磁性、光一磁気光学効果を系統的かつ詳細に調べることを目的とするものである。具体的には、大きな磁気異方性をもつCo, L1_0規則合金[Fe_<50>pt_<50>.CO_<50>pt_<50>]及びCo/Pt等の多層膜構造のナノ・ドットを対象としている。本年度(平成14年度)は、次の事項について行った。i)現有のイオンビーム加工装置をDual型イオンビーム装置にするため、設計及び装置改良ii)微粒子作製時において基板加熱(最大600°C)を行うための装置改良i)及びii)については、現在装置改良が進行中である。またiii)については直径0.2μmまでのCo微粒子を制御よく作製でき、それらの磁性を磁気力計及びXMCD(X-ray Magnetic Circular Dichroisim)によって評価し、興味ある結果を得ることができた。この結果は、2003年3月に開催された国際磁気学会(Boston)で発表した。本研究はDual型イオンビーム誘起Ion Beam Induced(IBI)CVD法という本研究室で開発した微粒子作製法を用いることにより数原子(あるいはクラスター)から構成される磁性超微粒子を作製し、それらの形状、配列等を制御し、微粒子間の磁気的相互作用、各微粒子のもつ磁性、光-磁気光学効果を系統的かつ詳細に調べることを目的としている。材料としては、大きな磁気異方性定数(>10^7erg/cc)をもち、将来の超高記録密度材料として有望視されているL1_0規則合金(FePt, CoPt)薄膜及びCo/Pt等の多層構造膜のナノ・ドットを対象としている。平成15年度における研究成果を以下に要約する。i)現有イオンビーム加工装置をDualイオンビームにする改良はほぼ終了し、2つのソースを用いて合金微粒子作製が可能となった。ii)微粒子作製時において基板加熱(最大600°C)

する改良作業はほぼ終了し、正常に温度制御が可能であることを確認した。そしてCo微粒子を基板温度を系統的に変化させて作製し、その磁性を検討した。iii)今まで困難であると考えられていたFePt規則合金微粒子の作製に成功した。現在、それら粒子の磁気特性を評価中である。既に磁気力顕微鏡法により磁化分布を観察した。これらの成果はいくつかの国際会議(例えば米国材料学会(2003年11月、Bostonにて開催))、国内の研究会にて発表すると共に、学術論文にもまとめて発表している。本研究は研究代表者が開発したイオンビーム誘起CVD法により微粒子作製を行い、数原子あるいはクラスターから構成される磁性微粒子の磁性、構造を調べることを目的としている。特に今年度においては、将来高密度磁気記録材料として注目を集めている「非常に高い磁気異方性を有するFePt及びCoPt系合金微粒子の作製」を先ず成功させることを目的として実験を行ってきた。その結果、1.前年の段階でDualイオンビーム誘起CVD法を確立したが、今年度はこれによりFePt合金微粒子作製が再現性よく実現出来ることを確認した。これはイオンビーム法により世界で初のFePt微粒子の作製である。2.このようにして作製したFePt粒子は、比較的大きな磁気異方性定数(10^6erg/cc)を示すことがわかった。しかしながら、完全なL1o規則合金のもつ10^7erg/ccに比較して一桁小さい値であり、この原因は完全な規則合金の微粒子ではなく、fccとfctの二相分離である為であることが判明した。現在作製条件を系統的に変え、規則度の高い微粒子を作成する実験を継続中である。3.CoPt合金微粒子も本方法で作製しその磁性・構造を系統的に調べた結果、作製時に非晶質構造をもつにも係わらず、すでに大きな磁気異方性を持つ事がわかった。4.上記の非晶質微粒子を焼鈍した結果fccとfctの混相となり、磁気異方性か増加しないことが判明した。上記の研究成果は国際会議(インターマグ、磁性・磁気材料国際会議等)や国内会議(応用磁気学会等)などで発表し、学術論文としても纏めて報告をしている。
有棘細胞癌の予後と免疫学的因子についての次世代シーケンサーを用いた解析

生検または切除された皮膚有棘細胞癌のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本を用いて、各種免疫学的染色を行い、腫瘍のPD-L1発現や、腫瘍に浸潤するCD8陽性またはCD4陽性T細胞などの免疫担当細胞の組成を調べるとともに、FFPE標本からRNA、DNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いた解析により、腫瘍及び浸潤免疫細胞の発現する因子と予後との相関を調査し、未だ不明な点の多い皮膚有棘細胞癌の腫瘍免疫応答の解明とともに、有棘細胞癌の進展、予後に関与する様々な白血球サブセット、抗原提示、チェックポイントパスウェイに関わるバイオマーカーを検索する。
新しい脂肪吸収評価法を用いた至適生体部分小腸移植モデルの作成

幼若ブタを用いて生体部分小腸移植モデルの作成とその評価を行なった。第1相:ブタ小腸自家移植による検討。15-20kgの幼若ブタを用いて同所性小腸自家移植を行なった。その結果、移植後レシピエントの安定した生存には全小腸の30%程度のグラフト長を必要とすること、血行再建には上腸間膜動静脈の結腸枝分枝直後の部分を用いることが手技的に最も有利であることが示された。第2相:ブタ生体部分移植モデルの作成。第1相と同様の手技でブタ小腸同種移植を行なった。FK506を主体とした免疫抑制療法を施行する群と免疫抑制を行なわない群とに分け、術後経過と組織学的検討により比較した。その結果、免疫抑制療法により移植後きわめて急性期の拒絶反応およびGVHDの抑制が可能であることが確認された。またこの間の血液生化学的検索などによれば、グラフト機能は自家移植術後同様生体維持に十分なだけ温存されていると判断され、ここにある程度のグラフトの機能評価が可能なブタ生体部分移植モデルが完成した。第3相:標識長鎖脂肪酸(ヨードフェニルメチルペンタデカン酸-^<123>I:BMIPP)吸収能評価法を用いたブタ生体部分小腸移植後のグラフト機能評価。第1、2相で作成されたブタ小腸自家移植および同種移植モデルを用いて、BMIPPを経胃瘻的に投与し腸管吸収の状況をコントロール(胃瘻造設のみ)および短小腸群と比較した。この結果、自家移植群および同種移植群で吸収の低下と術後の経時的な吸収能回復の可能性が示されたが、きわめて個体差が大きく一定の評価を得るには至らなかった。以上ブタ生体部分移植モデルを作成し、比較的短期間(術後1か月程度)の生存を得た。作成したモデルは、グラフト機能評価に十分耐えるものであったが、移植後ある程度の期間を経て軽度の拒絶反応を示す例が散見され、また重篤な呼吸器感染などいくつかの合併症を経験し、さらに安定した長期生存を獲得する上で解決すべき問題点と思われた。BMIPP吸収能に関しては、移植手技や術後経過期間等との間に一定の傾向を見出すには至らず、さらに実験を追加して検討する必要があるものと考えられた。ブタを用いた生体部分小腸移植のモデル作成の前段階として、移植の手技的な問題を解決するとともに、移植腸管の至適部位および長さの決定を目的として、部分小腸自家移植モデルの作成を行った。検討には体重20kg程度の幼若ブタを用いた。ブタの解剖学的特徴から空腸のみを部分的にグラフトとして移植するにはその血管構築の面から採取する長さに制限が生じることから、部位としては回腸を用いることとした。生体移植が前提であることから腸管の長さには自ずと制限があり、ドナーの立場からは可及的に短いことが望ましい。全小腸の20%および30%の長さに相当する回腸をグラフトとし、さらにグラフト以外の残存腸管の切除を移植時に同時に行う群と移植2週間後に2期的に行う群とに分け、それぞれの差を比較検討した。

この結果、30%小腸移植を行い、2期的に残存腸管の切除を行うことにより最高の生存を得ることができるものと判断された。そこで次の段階として、この方法を用い同じサイズのブタを使って同種小腸移植を試みた。免疫抑制剤としてはFK506(0.3mg/kg/day)を用いた。技術的には移植が可能であること、および急性期の拒絶反応のコントロールが可能であるとの結果が得られたが、未だ長期生存が得られるには至らず、術後管理法特に免疫抑制方法のプロトコールに工夫が必要である。今後長期生存モデルが完成した段階で生体部分小腸移植のモデルを確立し、さらにこれを用いての消化吸収能を中心としたグラフト機能評価を行う予定である。(評価)今回の研究の骨格をなすのは、ブタを用いての生体部分移植モデルの作成とその評価である。これまでのブタ小腸自家移植による検討結果から、移植後レシピエントの安定した生存が得られるためには全小腸の30%程度のグラフト長を必要とすること、血行再建には上腸間膜動静脈の結腸枝分枝直後の部分を用いることが手技的に最も有利であることが示された。その後全く同様の手技をFK506を主体とした免疫抑制療法下に同種移植に応用し、グラフト機能を含めた術後経過の評価を行なってきた。その結果、移植後比較的短期間においては、高度の拒絶反応およびGVHDの抑制が可能であることが組織学的検討から確認された。またこの間の血液生化学的検索などによれば、グラフトの機能は自家移植術後同様生体維持に十分なだけ温存されていると思われ、ブタ生体部分移植モデルの作成の可能性が十分高いことがあらためて示された。しかし移植後長期的経過においては次第に軽度の拒絶反応の発症をきたす例も散見され、感染その他の合併症とともに長期生存を得る際の問題点と思われた。今後はこれまでに明らかになった移植術後の拒絶反応抑制、感染症予防などに関するプロトコールの問題点を改善することにより、ブタ生体部分移植モデルの長期生存モデルの確立を目指す。そしてグラフト機能の評価、特にRIなどを用いての消化吸収機能を中心に詳細に検討する。また移植後短期、長期でのこれらの機能の比較を行なうことにより、グラフト腸管の機能回復の過程を明らかにする。また予備的実験において、超音波トランジットタイム血流計が種々の条件による血管血流量の変化の測定に有用であることが示されており、これを用いて移植後各時点におけるグラフトの支配動脈の血流を測定し、移植後の消化吸収機能変化との比較、さらには拒絶反応時のモニタリングとしての有用性の評価を行なう予定である。幼若ブタを用いて生体部分移植モデルの作成とその評価を行なった。前年までの研究を通じて、移植後レシピエントの安定した生存が得られるためには全小腸の30%程度のグラフト長を必要とすること、血行再建には上腸間膜動静脈の結腸枝分枝直後の部分を用いることが手技的に最も有利であること(以上第1相)、およびFK506を主体とした免疫抑制療法を用いてグラフトの機能評価が可能なブタ生体部分移植モデルが安定して作成できること(第2相)が示された。これらの結果を受けて、平成8年から9年には標識長鎖脂肪酸(ヨードフェニルメチルペンタデカン酸-123I:BMIPP)吸収能評価法を用いたブタ生体部分小腸移植の評価を試みた。第1相および第2相で作成されたブタ小腸自家移植および同種移植モデルを用いて、BMIPPを経胃瘻的に投与し腸管吸収の状況を、コントロール(胃瘻造設のみ)および短小腸群と比較した。その結果、自家移植群および同種移植群での吸収の低下と術後の経時的な吸収能回復の可能性が示されたが、きわめて個体差が大きく一定の評価を得るには至らなかった。
小スケール中心核をもつ棒状銀河の力学進化の研究

まず、平衡円盤モデルに関しては、Hernquistの3次元円盤モデル用の計算コード厚さゼロ(2次元)の円盤に適用できるように修正し、円盤モデルを作成した。テスト計算として、粒子数N=20,000とした。円盤の密度分布は、観測されているように指数関数的とし、円盤の局所安定性の指標である、ToomreのQは典型的な値としてQ=1.5を採用した。次に、このモデルを用いて、系の密度とポテンシャルを適当なbasis setで展開してポアソン方程式を解く、Self-Consistent Field Methodで系の時間発展を数値的に追跡した。basis setとして、Toomre diskの密度とポテンシャルに基づいた基底関数を使用した。このモデルは、力学時間の2倍程度の時間で棒状不安定を起こして棒状構造を形成した。棒状構造が完全に発達した段階で、円盤の中心部に、質量が円盤の全質量の1%の質量のコアを断熱的に付加し、その後の棒状構造の形状変化を観察した。コアの質量が円盤の1%となってから約56倍の力学時間で棒状構造はかなりまるく変化した。コアを付加する前の棒状構造の軸比は2:1程度であったが、約6倍の力学時間で、軸比は4:3程度になった。棒状構造は中心部のコアにより、数倍の力学時間でかなりその構造を変化させることが明らかになった。現状では、個々の星の軌道変化を追跡していないため、棒状構造の形状変化が中心核による星の軌道散乱によるものか、または、inner Lindblad resonanceのような共鳴現象であるのかは明らかではない。今後は、星の軌道分布によってこのメカニズムの解明をする必要がある。
尿細管MR機能との比較を通じた腸管MRの血圧代謝関連病態における新たな意義の解明

これまで我々の研究室では、心臓・腎臓などの臓器障害やひいては生命予後にも深く関与することが知られる核内受容体の1つ、ミネラルコルチコイド受容体(以下MR)についてその活性化機構の解析を進めてきた。直近では、腸管上皮特異的にCreを発現するVillin-CreマウスとMR floxマウスとの交配で得られた腸管上皮特異的MR欠損マウス(以下Vil MR-KO)を用いて、腸管上皮MRが生体のNa恒常性に深く関与していること、塩分過剰かつMR活性亢進下の血圧上昇に寄与することを明らかにした。本研究では、前年度の検討において、尿細管特異的にCreを発現するKSP-CreマウスとMR floxマウスを用いて腎尿細管特異的MR欠損マウス(以下KSP MR-KO)を作出し、KSP MR-KOではControlに比べ、尿中Na排泄の亢進およびその代償と思われる便中Na排泄の低下を認め、Na出納においてVil MR-KOとは対照的な表現型を呈することを明らかにした。今年度は、これらのNa動態の違いが血圧代謝病態にもたらす差異を探求するべく、Control、Vil MR-KO、KSP MR-KOの3群に高脂肪食を負荷し、その表現型の比較解析を行った。Controlでは、高脂肪食の長期負荷において、体重増加とともに血圧・空腹時血糖の上昇、尿中アルブミンの増加を認め、MR標的遺伝子であるSgk1発現の上昇を認めた。血中アルドステロンの上昇は見られず、何らかの機序でMRが活性化され、MR感受性が亢進している病態が考えられた。一方、Vil MR-KOにおいては、Controlに比べ体重増加が抑制される傾向を認め、血圧上昇は有意に抑制されていた。KSP MR-KOは妊孕性が落ちている影響か、十分なサンプルサイズの確保に難渋しており、ControlおよびVil MR-KOと比較した有意差検討はできていない。これまで我々の研究室では、心臓・腎臓などの臓器障害やひいては生命予後にも深く関与することが知られる核内受容体の1つであるMR(mineralocorticoid receptor)について、その活性化機構や相互作用因子、さらには腸管上皮における機能の解析をin vitroおよびin vivoの系を用いて進めてきた。直近では腸管上皮特異的MR欠損マウス(Villin MR-KO)を用いた研究により、腸管上皮MRが生体のNa恒常性に深く関与していること、塩分過剰とMR活性亢進下の血圧上昇に寄与することを示したが、本研究ではこれまでの研究手法も用いながら腎尿細管におけるMRと腸管上皮MRの比較解析を行っている。まず我々は、MR floxマウスおよび尿細管特異的Cre発現マウスであるKSP-Creマウスを用いて腎尿細管特異的MR欠損マウス(KSP MR-KO)を作成し、表現型解析として体重、摂餌量、尿中・便中排泄電解質を測定した。ControlとKSP MR-KOマウスの比較において、摂餌量と体重推移には差を認めなかった一方で、KSP MR-KOマウスではControl群に比べ尿中Na排泄量が約30%多く、便中Na量は約50%抑制されていた。予想していたように、KSP MR-KOマウスではMR欠損によるNa再吸収障害を腸管Na吸収を活性化させることで代償していると考えられた。この現象はVillin MR-KOマウスと対になるものであった。また、上記KSP MR-KOの作成に時間を要したため、Villin MR-KO, Controlマウスへの高脂肪食負荷を平成29年度中に前倒して開始している。現在開始後6週程度で両マウス間での差異は見られていないが、代謝性障害に伴う表現型の出現には長期の負荷を要すると考えられるため、計画通り14週間負荷の経過を引き続き評価・解析していく。尿細管特異的MR欠損マウスの作出に時間を要したため、平成30年度に実施予定であった高脂肪食負荷を前倒しで開始している。その後尿細管特異的MR欠損マウスの作出が完了し、上記のように表現型解析を進めることができている。現時点での解析結果は我々のこれまでの腸管上皮特異的MR欠損マウスを用いた解析と整合性があり当初想定したものと合致していることから、研究計画はやや遅れているものの今後予定する実験計画を遂行できるものと考えている。本研究では、前年度の検討において、尿細管特異的にCreを発現するKSP-CreマウスとMR floxマウスを用いて腎尿細管特異的MR欠損マウス(以下KSP MR-KO)を

作出し、KSP MR-KOではControlに比べ、尿中Na排泄の亢進およびその代償と思われる便中Na排泄の低下を認め、Na出納においてVil MR-KOとは対照的な表現型を呈することを明らかにした。今年度は、これらのNa動態の違いが血圧代謝病態にもたらす差異を探求するべく、Control、Vil MR-KO、KSP MR-KOの3群に高脂肪食を負荷し、その表現型の比較解析を行った。Controlでは、高脂肪食の長期負荷において、体重増加とともに血圧・空腹時血糖の上昇、尿中アルブミンの増加を認め、MR標的遺伝子であるSgk1発現の上昇を認めた。血中アルドステロンの上昇は見られず、何らかの機序でMRが活性化され、MR感受性が亢進している病態が考えられた。一方、Vil MR-KOにおいては、Controlに比べ体重増加が抑制される傾向を認め、血圧上昇は有意に抑制されていた。KSP MR-KOは妊孕性が落ちている影響か、十分なサンプルサイズの確保に難渋しており、ControlおよびVil MR-KOと比較した有意差検討はできていない。まずはKSP MR-KOで見られた尿中・便中排泄電解質の変化の機序を評価するべく、腎・腸管におけるMR標的遺伝子である上皮性Naチャネル(ENaC)ファミリーやSGK1、さらに他のNaチャネルの発現量解析をRNA,蛋白レベルで確認する。Villin MR-KOでは腸管上皮でのENaC発現低下が便中Na排泄増加の原因となっていたことからも、KSP MR-KOでは尿細管でのENaC発現低下が予想される。これらVillin MR-KO, KSP MR-KOマウスの通常食下での機能解析が終了した後、既に負荷を開始している高脂肪食負荷群に加え、DOCA錠埋込+1%NaCl飲水負荷、高脂肪食+1%NaCl飲水負荷の群を作成し、各負荷における血圧・Na動態の変化だけでなく、免疫染色を含めた病理学的評価と各種遺伝子発現変動のマイクロアレイ法およびリアルタイムPCR法を用いた評価を行うことで、高血圧・臓器障害・食塩感受性における腸管上皮・尿細管MR機能の臓器特異性について解析したいと考えている。本研究は、当教室の研究の流れの中で行っている研究であり、H29年度の前半は、効率的に研究資金を運用することができたため、次年度に余剰金を回すことに成功した。上述のとおり上記モデルマウスの作成に時間を要したこともありH30年度に行う表現型解析の配分が増し、同年度はより多くの研究資金が必要となることが予想されるため、資金使用計画としては合理的な配分で行うことができたと考えている。
高度情報社会における意識と行動に関する潜在構造分析的研究

本年度は、まず近年、国際的にも研究の盛んな潜在構造分析に関し、主要雑誌による文献調査と研究動向を「潜在構造分析論の現状」としてJ.Japan Stat.Soc.に提言し掲載受理されている。本年の新規理論の展開として、潜在スケログラム分析は多数の2値変量の因果関係によって分岐階層の構造を解明する有効な方法論であるが、この分岐階層の構造を線形階層構造の混合とし、この混合比の評価にも分解方程式に新解法を提唱した。このことは不均質な母集団に関する分析にも有用である。さらに、広範な現実の潜在構造に関し、具体的な数学的構造モデルを中心に、潜在ガットマン尺度を用いた潜在特性の階層評価など幾つかの新しい研究を促進することが出来た。また、このような一般的な線形モデルにおける連関測度に組込まれない背景要因の影響に関して理論展開に成功し、J.Royal Stat.Soc.に採択されている。他方、実証的研究としては、新たに「現代におけるメディアと学生意識のかかわり」と題するアンケート調査(学生の背景と56応答項目)を行い、潜在意識・概念の解明を行った。対象として学生約500名と若い社会人175名のデータを得、両群を比較対照としている。また、最近のバブル現象に見られるように、素情報の受容に関する潜在意識と人間のゲーム的調整型顕在行動分布を、工場生産での活動を行動分布になぞらえ、そのパフォーマンスを評価する研究を行った(Physica-Verlag)。また、社会科学文献データベースの著者情報から顕在化された共同研究に関する潜在構造の分析も進捗し、国際学会で論文発表を行い大きな反響を得た。また、これらの分析において、複雑なデータ処理や定式計算を実現するパソコン対応のソフトウエアシステムの開発も着実に進捗している。このように本年度は相当の研究成果をみた。
Fas受容体を介するトリパノソーマ感染宿主細胞のアポトーシス抑制機構の解析

Trypanosomacruzi(T.cruzi)は中南米でシャーガス病を引き起こす病原体として重要な細胞内寄生原虫であるが、その分子細胞病理と感染動態については明らかにされていない点が多い。宿主細胞と寄生虫の相互作用を分子レベルで解明することを目的として研究を進め、T.cruziは感染宿主細胞においてFasを介するアポトーシス抑制について解析した。HeLaおよびHT1080細胞にT.cruziを感染させ3-4日培養すると、原虫は細胞内で十数個に増殖した。この時点で抗Fas抗体によりアポトーシスを誘導し、感染および非感染細胞における細胞死、核の分断化、細胞膜リン脂質のトランスロケーション、DNAフラグメンテーションについて経時的に調べた。T.cruzi感染HeLa細胞では抗Fas抗体添加3日後にも生存している細胞が認められた。またFas誘導6時間後に細胞の核を蛍光染色し観察したところ、非感染細胞では59.5%がアポトーシスを起こしているのに対し、感染細胞では30.0%と約半分であった。またアネキシンVにより細胞膜ホスファチジルセリン(PS)の局在をFACSにより測定した場合、HTl080細胞では経時的にPSが細胞外膜に表出してくるが、T.cruzi感染HT1080では明らかに抑制がみられた。さらに、Fas誘導24時間後に感染HT1080細胞ではDNAフラグメンテーションは認められず、非感染細胞との間に大きな差がみられた。またcaspage-3活性も感染細胞では抑制されており、この結果から、T.cruzi感染による宿主細胞のアポトーシス抑制はFasを介するシグナル伝達経路の比較的初期過程に起こると予想された。以上の結果から、T.cruzi感染では寄生虫自身が自己の生存・増殖のために何らかのシグナルを放出して、宿主細胞の細胞死を回避させる機構を持つ可能性が示唆された。1.Trypanosoma cruzi錘鞭毛期(trypomastigote)、無鞭毛期(amastigote)と、HeLa細胞を宿主細胞とするin vitro感染モデル系を用い、アポトーシスに伴う細胞核の凝縮、染色体DNAの断片化といった変化を観察した。コントロールであるHeLa細胞で、アポトーシスのシグナルを伝達するFas受容体のアゴニスト抗Fas抗体(CH-11)によりアポトーシスを誘導し、経時的に細胞死の過程を確認した。2.1の実験系にT.cruziを感染させ、感染宿主細胞でアポトーシスの抑制がみられるかどうか調べたところ、顕著な抑制がみられた。抗Fas抗体添加6時間後、Hoechst dyeにより細胞核を染色すると、非感染細胞では59.5%がアポトーシスを引き起こしたが感染細胞では30.0%と約半分であった。また、アポトーシスにより細胞膜リン脂質ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンの局在が内膜から外膜に移行することが知られている。そこで、ホスファチジルエタノールアミンに特異的に結合するペプチドによりその変化をフローサイトメーターを用いて測定した結果、感染細胞ではリン脂質の移行がみられなかった。以上より感染細胞では明らかにFasを介するアポトーシスの抑制が起きていると考えられる。3.T.cruziのcDNAまたはgDNAを哺乳動物細胞で発現するベクターに連結したライブラリーを作製した。CMVエンハンサー、アクチンプロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子をもつ発現ベクターを用い、Fas遺伝子でトランスフェクトしたHeLa細胞にエレクトロポレーションにより導入し、T.cruziの組み換え遺伝子を安定に発現させた。現在トランスフェクトした細胞でアポトーシスを誘導し、細胞死を抑制するクローンをスクリーニング中である。Trypanosoma

cruzi感染によりHeLa細胞のアポトーシスが抑制されることを見出したので、今年度は新たにHT1080細胞を用い、さらに解析を進めた。T.cruziを感染させたHeLa、HT1080細胞を3-4日培養し抗Fas抗体によりアポトーシスを誘導し、感染および非感染細胞における細胞死、核の分断化、細胞膜リン脂質のトランスロケーション、DNAフラグメンテーションについて経時的に調べた。T.cruzi感染HeLa細胞では抗Fas抗体添加3日後にも生存している細胞が認められた。またFas誘導6時間後に細胞の核を蛍光染色し観察したところ、非感染細胞では59.5%がアポトーシスを起こしているのに対し、感染細胞では30.0%と約半分であった。またアネキシンVにより細胞膜ホスファチジルセリン(PS)の局在をFACSにより測定した場合、HT1080細胞では経時的にPSが細胞外膜に表出してくるが、T.cruzi感染HT1080では明らかに抑制がみられた。さらに、Fas誘導24時間後に感染HT1080細胞ではDNAフラグメンテーションは認められず、非感染細胞との間に大きな差がみられた。またcaspase-3活性も感染細胞では抑制されており、この結果から、T.cruzi感染による宿主細胞のアポトーシス抑制はFasを介するシグナル伝達経路の比較的初期過程に起こると予想された。以上の結果から、T.cruzi感染では寄生虫自身が自己の生存・増殖のために何らかのシグナルを放出して、宿主細胞の細胞死を回避させる機構を持つ可能性が示唆された。現在その因子を探索中である。