hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分子物質の超微量測定法-免疫酵素的サイクリングーの開発と実用化

ウマのフェリチン(分子量50万)を高分子量物質のモデルとして用い,その抗体を吸着させた直径30100μmのガラスビーズを固相として,從来の酵素免疫測定法の改良,および10^<-22>モルの高分子量物質が測定可能な, "免疫酵素的サイクリング"を開発した.1)240個のガラスビーズを用いて, 115×10^<-9>モルのフェリチンを含む溶液54nlに加え, 38゚Cで5分間抗原抗体反応を行い,フェリチンを固相に固定した.よく洗浄後このビーズ塊を290nlのFab'-ガラクトシダーゼ抱合体液に加え, 38゚Cで1時間反応させて,フェリチンとFab'-抱合体を結合させた.ビーズ塊を洗浄して, 32μlのメチルウンベリフェリルガラクトースを基質として含む反応液に加え, 38゚C1時間反応させてメチルウンベリフェロンを遊離させて,蛍光測定を行った.ビーズ塊を用いることにより,従来2日がかりの測定を2時間半に短縮し,また微量の反応液を用いることにより,抱合体や基質の使用量を1/5001/50に減らして節約できた(酵素免疫測定法の改良).2)1)に述べた手技を同様に行い, 15×10^<+20>モルのフェリチンを試料として,またガラクトシダーゼ反応には440nlの2-ニトロフェニルーβ-D-ガラクトシダーゼを基質として含む溶液を用いた.遊離されたガラクトースを,十分量のNAD^1とガラクトース脱水素酵素を含む440nlの反応液を加えて,相当量のNADHに転換した.このNADHをNADサイクリングにより2,000倍に増幅して測定した.この免疫酵素的サイクリングにより, 1)より感度を30倍上げることができた.3)直径30100μmのガラスビーズ1個を用い, 110^<-22>モルのフェリチンを含む2.6nlの反応液に加えた.抱合体とガラクトシダーゼ反応液は15nlを用い,生成されたガラクトースを脱水素酵素でNADHとし,このNADHをNAD二重サイクリングにより, 11万倍に増幅した.この測定は60600個の分子を測定でき,現存する測定法中最高の感度を示した.ウマのフェリチン(分子量50万)を高分子量物質のモデルとして用い,その抗体を吸着させた直径30100μmのガラスビーズを固相として,從来の酵素免疫測定法の改良,および10^<-22>モルの高分子量物質が測定可能な, "免疫酵素的サイクリング"を開発した.1)240個のガラスビーズを用いて, 115×10^<-9>モルのフェリチンを含む溶液54nlに加え, 38゚Cで5分間抗原抗体反応を行い,フェリチンを固相に固定した.よく洗浄後このビーズ塊を290nlのFab'-ガラクトシダーゼ抱合体液に加え, 38゚Cで1時間反応させて,フェリチンとFab'-抱合体を結合させた.ビーズ塊を洗浄して, 32μlのメチルウンベリフェリルガラクトースを基質として含む反応液に加え, 38゚C1時間反応させてメチルウンベリフェロンを遊離させて,蛍光測定を行った.ビーズ塊を用いることにより,従来2日がかりの測定を2時間半に短縮し,また微量の反応液を用いることにより,抱合体や基質の使用量を1/5001/50に減らして節約できた(酵素免疫測定法の改良).2)1)に述べた手技を同様に行い, 15×10^<+20>モルのフェリチンを試料として,またガラクトシダーゼ反応には440nlの2-ニトロフェニルーβ-D-ガラクトシダーゼを基質として含む溶液を用いた.遊離されたガラクトースを,十分量のNAD^1とガラクトース脱水素酵素を含む440nlの反応液を加えて,相当量のNADHに転換した.このNADHをNADサイクリングにより2,000倍に増幅して測定した.この免疫酵素的サイクリングにより, 1)より感度を30倍上げることができた.3)直径30100μmのガラスビーズ1個を用い, 110^<-22>モルのフェリチンを含む2.6nlの反応液に加えた.抱合体とガラクトシダーゼ反応液は15nlを用い,生成されたガラクトースを脱水素酵素でNADHとし,このNADHをNAD二重サイクリングにより, 11万倍に増幅した.この測定は60600個の分子を測定でき,現存する測定法中最高の感度を示した.モデル実験として、ウマのフェリチンを抗原として用い、従来の直径3mmのポリスチレンボールを固相として用いる"酵素免疫測定法"の一つであるサンドイッチ法をミクロ化した。直径100μmのガラスビーズの表面をフェリチン抗体でコートし、リン酸緩衝液(分散媒)中に分散させた。130×30×2mmのテフロン板に小さな井戸(3×2mm)を穿ち、パラフィン油を満たして、その底にビーズの小集塊(20.1μl)をとって、分散媒を吸い出した(ポプコンボール法)。次に抗原(110×【10^(-20)】mol)を含む溶液50050nlをビーズ塊に加え、38°Cで30分おいて、抗原抗体反応によりフェリチンをビーズに固定する。204μlの分散

媒で4回ビーズ塊を洗滌し、出来るだけ洗滌液を吸い取った後、0.5μlのFab′-βガラクトシダーゼ複合体溶液をビーズ塊に加えて、38°Cで1.5時間反応させて、複合体を抗原に結合させた後、再び204μlの分散媒でビーズ塊を4回洗滌する。これらの操作は、全て実体顕微鏡下で行った。続いてビーズ塊を、25μlのウンベリフェリルガラクトサイド溶液を3mlのパイレックス試験管の底にとった中に移し、38°Cで30分間ガラクトシダーゼ反応を行う。次に1.0mlのグリシン-NaOHpH10.4を加えて反応を止め、試験管を直接螢光計に挿入して、螢光測定を行う。このミクロ化により、(1)測定時間を従来の2日から6時間に短縮し、(2)酵素標識抗体の使用量を1/500に、酵素反応液を1/30に減らして節約した。現在、このビーズ1ヶを用い、6nl(【10^(-9)】l)の抗原溶液(【10^(-22)】モルの抗原を含む)を用いて反応させ、20nlのβ-ガラクトシダーゼ反応液中に生成されるガラクトースを、酵素反応を利用する増幅反応、"酵素的サイクリング"を用いて1000倍に増幅して螢光測定することを試みつつある。ウマのフェリチン(分子量50万)を高分子量物質のモデルとして用い、その抗体を物理的に吸着させた直径100μmのガラスビーズを固相として、次の超微量測定法を完成した(詳しい手法は昨年度の報告書参照)。1)ガラスビーズ集塊290nl(ビーズ240個、ビーズ間隙37nl)に、115×【10^(-19)】molのフェリチンを含む54nlの憐酸緩衝液を加えて、37°Cで1時間反応させた。フェリチンが結合したビーズを、6.2μlの憐酸緩衝液で洗い、290nlのフェリチン抗体Fab ́とβ-ガラクトシダーゼの複合体溶液を加え、38°C1620時間反応して、ガラクトシダーゼをガラスビーズに結合させた。3.2μlのメチルウンベリフェリルガラクトシド溶液と加え、38°Cで1時間反応させて、メチルウンベリフェロンとガラクトースを、水解放出させた。全混合液を1.0mlのグリシン緩衝液に加え、メチルウンベリフェロンを螢光測定した。最高感度は1.25×【10^(-19)】mol(フェリチン分子2,000個)であった。2)15.5×【10^(-19)】molのフェリチンを、1)と同じ方法でビーズに結合させて、O-ニトロフェニルガラクトシド溶液440nl中で反応させた。放出されたガラクトースを、3.2μlのガラクトース脱水素酵素と過剰の【NAD^+】を含む反応液中で、NADHに転換した。このNADHを、既に開発したNADサイクリングを用いて、1,900倍に増幅して測定した。最高感度は0.74×【10^(-19)】mol(フェリチン分子1,200個)であった。3)110×【10^(-21)】molのフェリチン溶液2.6nl,2.9μlの洗滌緩衝液、15nlのFab ́-ガラクトシダーゼおよびO-ニトロフェニルガラクトシド溶液;15nlのガラクトース脱水素酵素反応液を用い、2)と同様にガラクトースをNADHに転換した。このNADHをNADサイクリングを2回連続して行い(二重サイクリング)、11万倍に増幅した。最高感度は5.7×【10^(-22)】mol(フェリチン分子10個)であった。
ラット腸間膜リンパ管を用いた五苓散の浮腫改善機序の解明

本研究ではラット腸間膜およびそのリンパ管を用いることにより、それらの形態学的検討や分子生物学的解析を行い、五苓散の新たなリンパ浮腫治療方法の構築およびその作用機序の解明を目的に、本研究を進めてきた。これまでの研究により、五苓散にはラット腸間膜リンパ管の収縮に対する効果は認められなかったが、五苓散の構成生薬である沢瀉には30mg/mlの濃度でラット腸間膜リンパ管収縮速度を有意に低下させたことが分かった。漢方方剤である五苓散とその構成生薬である沢瀉を2g/kgをSDラットに投与し、投与1時間後に麻酔下で開腹、盲腸近傍から結腸近傍を切離し、顕微鏡下で腸間膜リンパ管を単離した。単離した腸管膜リンパ管をvessel chamberに付属したガラスピペットに挿入し、AQP1、VE-cadherin、aSMAタンパク質を用いてリンパ管の免疫組織化学染色を行なった。AQP1タンパク質は発現していないまたは発現量が低く確認できなかったが、VE-cadherin、aSMAはリンパ管壁に発現していることを確認した。また単離したリンパ管を用い、PCR法により水チャネルであるAQP1、リンパ管形成に関与するProx1、リンパ球の接着・遊走に関与するLYVE-1のmRNAの発現量を解析した。AQP1mRNA発現量は低く解析ができなかったが、五苓散と沢瀉のProx1、LYVE-1発現量はコントロールに比べ、減少傾向を示した。以上のことより、五苓散と沢瀉のラット腸間膜リンパ管収縮速度を低下させた理由として、リンパ管の機能不全が考えられる。単離した腸管膜リンパ管を用いて免疫組織化学染色を行なっているが、抗体濃度の条件検討や共焦点レーザー顕微鏡での画像の検出条件の設定に時間を費やしているため当初の計画より多少遅れている。また単離した腸管膜リンパ管のタンパク質およびRNA量が低いため、計画よりも時間を費やしている。SDラットに五苓散および生薬エキスを投与し、麻酔下で開腹、盲腸近傍から結腸近傍を切離後、顕微鏡下で腸間膜リンパ管を単離しAQP1、CD31、podoplanin、VEGFR-3、VEGFR-Cのタンパク質量およびmRNA発現量を測定する。さらにタンパク質局在性を解明するために、腸間膜リンパ管を顕微鏡下でvessel chamberに付属したガラスピペットに挿入し、AQP1抗体、podoplanin抗体、VEGFR-3、VEGFR-C抗体、LYVE-1抗体およびCD31抗体を用いリンパ管の免疫染色を行う。漢方方剤である五苓散とその構成生薬である沢瀉、猪苓、白朮、茯苓、桂皮を各20gに水道水500mLを加え、煎じ器ニューマイコン漢方煎器文火爛々(EK-SA10型)にて火力中で50分間煎じた。得られた煎液は二重に重ねたガーゼにて濾過し、その後凍結乾燥法により凍結乾燥エキスを得た。200gのSDラットを麻酔下で開腹、盲腸近傍から結腸近傍を切離し、顕微鏡下で腸間膜リンパ管を単離した。単離した腸管膜リンパ管をvessel chamberに付属したガラスピペットに挿入し、作製した五苓散とその構成生薬の各凍結乾燥エキスを130ug/mlの濃度の範囲でchamber内に投与し、CCDカメラから得られた画像を解析ソフトにより腸管膜リンパ管の収縮期および拡張期の直径、収縮速度および頻度を測定・解析をした。五苓散にはラット腸間膜リンパ管の収縮に対する効果は認められなかったが、五苓散の構成生薬である沢瀉には30mg/mlの濃度でラット腸間膜リンパ管収縮速度を有意に低下させた。五苓散とその構成生薬である沢瀉、猪苓、白朮、茯苓、桂皮の凍結乾燥エキスを作製し、ラット腸間膜リンパ管を用いてリンパ管の収縮速度、直径を解析しデータを得ている。現在は腸間膜リンパ管に五苓散とその構成生薬を投与し、リンパ管のAQP1抗体、CD31抗体、podoplanin抗体、VEGFR-3、VEGFR-C抗体のタンパク質発現量を定量するための試料を作製中である。

単離した腸管膜リンパ管をvessel chamberに付属したガラスピペットに挿入し、AQP1、VE-cadherin、aSMAタンパク質を用いてリンパ管の免疫組織化学染色を行なった。AQP1タンパク質は発現していないまたは発現量が低く確認できなかったが、VE-cadherin、aSMAはリンパ管壁に発現していることを確認した。また単離したリンパ管を用い、PCR法により水チャネルであるAQP1、リンパ管形成に関与するProx1、リンパ球の接着・遊走に関与するLYVE-1のmRNAの発現量を解析した。AQP1mRNA発現量は低く解析ができなかったが、五苓散と沢瀉のProx1、LYVE-1発現量はコントロールに比べ、減少傾向を示した。以上のことより、五苓散と沢瀉のラット腸間膜リンパ管収縮速度を低下させた理由として、リンパ管の機能不全が考えられる。単離した腸管膜リンパ管を用いて免疫組織化学染色を行なっているが、抗体濃度の条件検討や共焦点レーザー顕微鏡での画像の検出条件の設定に時間を費やしているため当初の計画より多少遅れている。また単離した腸管膜リンパ管のタンパク質およびRNA量が低いため、計画よりも時間を費やしている。腸間膜リンパ管に五苓散とその構成生薬を投与し、リンパ管新生に関するタンパク質発現量およびタンパク質局在性を解明する。また、腸間膜を用いてCompound48/80によりマスト細胞を刺激した後、五苓散および生薬エキスを投与し、ルテニウムレッド染色およびトルイジンブルー染色を行い、マスト細胞の活性を検討する。SDラットに五苓散および生薬エキスを投与し、麻酔下で開腹、盲腸近傍から結腸近傍を切離後、顕微鏡下で腸間膜リンパ管を単離しAQP1、CD31、podoplanin、VEGFR-3、VEGFR-Cのタンパク質量およびmRNA発現量を測定する。さらにタンパク質局在性を解明するために、腸間膜リンパ管を顕微鏡下でvessel chamberに付属したガラスピペットに挿入し、AQP1抗体、podoplanin抗体、VEGFR-3、VEGFR-C抗体、LYVE-1抗体およびCD31抗体を用いリンパ管の免疫染色を行う。(次年度使用額が生じた理由)29年度にラット腸間膜リンパ管の機能解析を行い、ウエスタンブロットや免疫染色に用いる各種抗体や試薬を購入しなかったため未使用額が生じた。(次年度における未使用額の使用計画)未使用額は次年度に用いる各種抗体や試薬の経費に充てることとしたい。
C02回収式石炭直接燃焼MHD発電機内電磁場-流体の強い相互作用の検討

CO2回収型石炭燃焼MHD-汽力発電システムを提案・解析し、米国で開発された低温電極MHD発電機を用いると、酸素製造電力、CO2液化電力を含めて45%(高位発熱量(HHV)基準)の効率が得られることを見いだした。なお、従来方式では30%程度に低下する。また、CO2未回収石炭燃焼高性能MHDシステムも提案し、空気加熱器動作温度が1620K、1780K、2100Kのとき、MHD発電システム効率は、それぞれ50%、55%、60%以上になることを示した。数値解析による実験結果の検討も実施し、ロシアの出力15MWパルスMHD発電機に関して、衝撃波を効果的に計算できるように流体部分は陰解法TVD法を、乱流モデルにはk-ωモデル、電気部分はガラーキン有限要素法を用いて、非対称大規模境界層剥離と主流部分の複雑な衝撃波が誘起されていることを示し、実験的に見いだされている発電出力の飽和現象は、衝撃波と境界層剥離によってもたらされたことを明らかにした。また時間依存3次元解析も開始し、出力10MW級発電機隣接陰極間短絡現象を解析し、隣接電極間短絡が生じた場合、電磁場と流体場の強い3次元的MHD相互作用の結果、電流分布の複雑な3次元構造と短絡電流の分岐現象の発生を初めて発見した。・課題1:電磁界と流体の相互作用の解明大型のMHD発電機においては電磁界と流体の3次元的相互作用により従来経験されていなかった現象が予想される。また、高性能MHD発電機の実現には、MHD発電機内の衝撃波の解明、及び、電流集中アーク現象・電極間短絡現象など電極近傍現象の解明が不可欠である。本年はマックスウェル方程式、及び、乱流モデルを含む、圧縮性を考慮したナビェストークス方程式の時間依存2次元解析コードを開発し、中国科学アカデミー電工研究所の石炭燃焼MHD発電実験機を解析し、実験結果と比較した。その結果、中国の実験チャネルでは流れ方向及び磁界と流れ双方に直行する方向の電流リ-クが大きく、発電性能を劣化させていることなどを見いだし、電流リ-クの防止により発電性能は大きく改善されることなどを明らかにした。また、時間依存3次元解析コードの開発にも着手し、電極上での電流集中など、重要な3次元現象の再現に成功し、次年度の研究でより詳細に解明する方針である。なお、電界は有限要素法、流体は衝撃波の解析に有力なTVD法を用いて解析している。・課題2:MHD発電機-インバータ-交流系統相互作用の解明MHD発電機からの電気出力は直流であるので、交流系統に接続するためにはインバータを介して直流を交流に変換する必要がある。本年度の研究により、MHD発電機は他励式インバータを介して交流同期発電機と強い相互作用を引き起こすことが明らかにし、また、交流系統の事故がMHD発電機内のプラズマの振舞いに大きな影響を与える可能性があることを明らかにし、来年度以降の詳細な検討が重要問題であることを示した。CO2回収型石炭燃焼MHD一汽力発電システムを提案・解析し、米国で開発された低温電極MHD発電機を用いると、酸素製造電力、CO2液化電力を含めて45%(高位発熱量(HHV)基準)の効率が得られることを見いだした。また、CO2未回収石炭燃焼高性能MHDシステムも提案し、空気加熱器動作温度が1620K、1780K、2100Kのとき、MHD発電システム効率はそれぞれ50%、55%、60%以上になることを示した。数値解析による実験結果の検討も実施し、ロシアの出力15MWバルスMHD発電機に関して、衝撃波を効果的に計算できるように流体部分は陰解法TVD法を、乱流モデルにはk-ωモデル、電気部分はガラーキン有限要素法を用いて、非対称大規模境界層剥離と主流部分の複雑な衝撃波が誘起されていることを示し、実験的に見いだされている発電出力の飽和現象は、衝撃波と境界層剥離によってもたらされたことを明らかにした。

また時間依存3次元解析も開始し、出力10MW級発電機隣接陰極間短絡現象を解析し、隣接電極間短絡が生じた場合、電磁場と流体場の強い3次元的MHD相互作用の結果、電流分布の複雑な3次元構造と短絡電流の分岐現象の発生を初めて発見した。
テクスト構成に関する日仏対照研究の基礎:遂行性と話法を中心に

テクストの構成の違いに関する日仏対照研究で, 3つの仮説を立てた。仮説1)日本語は,フランス語に比べて,結束性と指示の明確性において低い。仮説2)日本語は,フランス語に比べて,視点の明確性と遂行性に関して高い。仮説3)以上の特徴が2言語間のテクスト構成の違いの言語的基盤となっている。本研究でこれらの仮説が,呼びかけ詞を初めとする多くの言語事象によって,再検証された。本研究はテクスト構成からみた,日本語とフランス語の特徴を,対照言語学的観点から明らかにするものである。その中で平成21年度は特に,「日本語は,フランス語に比べて,遂行性に関して高。」という仮説の検証に費やした。フランス語の呼びかけに使われる親族名称名詞(Papa, Mamanなど)を,文学作品,インターネット上の投稿文,作例など,さまざまなデータを資料として検討し,その遂行的性格を明らかにした。この遂行的性格は,程度の差はあれ,罵り語,職業名詞,敬称表現,呼びかけ語など,他のいくつかの名詞(句)にも見られる。そのフランス語の結果を,日本語の同様の名詞(句)と対照させ,一括して遂行名詞と名付け,その性質を言語ごとに明らかにした。その結果,この遂行的性格は,日本語の名詞でより顕著に現れることを示した。またこの現象は,1人称の地位が日本語では特権的であることとの関わりを研究した。これらの違いが日本語とフランス語のテクストの性質の違いに寄与していると思われる。この点は,来年度以降の研究でさらに深化させたい。以上の研究成果発表は来年度に集中的に,国際学会における発表,研究論文の出版という形で行う予定である。また,平成23年度に本格的に取り組む予定であった教材開発に関しては,参考文献の収集が予想よりも順調にすすんだことなどもあり,かなり当初の予定を先取りすることができた。資料の研究が進み,教材の中身に関しては,予定していた分量の約半分の量を作成できた。本年度の課題の重要テーマである遂行性に関しては,その語の発話そのものが強い遂行性を持つと考えられる名詞を複数とりあげ,遂行名詞として同定する条件を検討した。特に親族名称を表す名詞を中心としてデータを集め,その性質を多方面から検討した。フランス語の親族名称の遂行性と統語的性質およびそのテクスト中での役割については,研究成果を国際学会で発表した。その結果,会場および参加者とのその後のやりとりで,様々なコメントを得ることができ,新たな共同研究をするきっかけとなった。また,この国際学会への参加で,親族名称名詞以外の遂行的性格をもつ名詞である,罵り語・職業名詞・敬称表現語・呼びかけ語などに関する,新だな研究資料の存在を知った。このフランス語の成果を,日本語の同様の名詞(句)と対照させ,日本語と,フランス語の名詞句における遂行性の対照研究という,ほとんど未開拓の分野を本格的に論じる準備が整った。また,遂行性と並んで発話の重要な発話の側面である指示は,テクスト構成の比較対照ではさけて通れない問題であるが,この関連では,日仏のゼロ照応可能性に関する違いの研究を行い,国際学会で発表した。先の遂行名詞とあわせて,今後話法の研究へとつなげる布石となった。上述の基礎研究の応用として位置づけている特定目的のためのフランス語教材に関しては,教材原案をほぼ作成し終え,フランス語校閲に出せる段階になった。その開発め過程で,外交文書で使われる文が,通常の言語使用といかにかけ離れているかを観察できた。過去2年間の研究成果を元にして,今年度はその成果をまとめ,さらに応用研究を行った。まず理論的研究に関しては,昨年度に引き続き,名詞のもつ遂行性の研究を続けた。特に昨年度研究成果を発表した親族名称を表す名詞に加えて,職業,敬称をあらわす名詞を引き続き研究すると周時に,新たに呼びかけ語をとりあげた。呼びかけ語に関しては,フランス語で新たに発表された最近の研究に基づき,上記の名詞の引用節の中での役割を特に研究し,遂行性との関連を明らかにし,日仏の引用句,さらには話法の違いを統一的に説明する可能性を探った。研究の最終成果の一部は,平成24年7月に開催される第三回フランス語学世界大会で発表し,学会プロシーディングスに掲載されることが決定している。上述のに基研究の応用として位置づけている特定目的のためのフランス語教材「国際機関で働きたい人のためのフランス語講座」に関しては,当初の予定通り,本年で重点的に制作を行った。この制作には,フランス国オルレアン大学の書語科学学科の教員とスタッフと研究協力をすることができ,フランス語部分の校閲,録音を委託した。成果は,研究代表者のホームページで近日中に公開予定である。また,その一部は,科学技術融合振興財団の研究助成金を得て,さらにiPhone,iPad用アプリケーションとしても利用できる形で開発した。その開発の過程で,ゲームの手法を利用した言語教育にけるマルチメディアとの可能性について考察できた。
原子間力顕微鏡と化学発光タンパク質を用いたATP超解像イメージング法の開発

本研究ではサブナノスケールでイメージングが可能な原子間力顕微鏡(AFM)を用い、AFM探針にATPが結合すると発光を触媒するルシフェラーゼを結合することにより新たなアプローチ法によるATPの超解像顕微鏡を構築すること、そして構築した顕微鏡を用いてミトコンドリアの外膜表面のATP透過型チャネルの機能について明らかにする。ATP透過チャネルは抗がん剤の薬剤ターゲットとして注目されており本研究によって創薬に必要な基盤情報が得られる可能性がある。
JAB、STAT3遺伝子導入によるin vivo血管平滑筋細胞増殖抑制について

(1)JAB cDNA組込みアデノウイルス・ドミナントネガティブSTAT3 cDNA組込みアデノウイルス作成JAB cDNAおよびドミナントネガティブSTAT3 cDNAをpAdCMVLink-1に組換え、pAdCMVJAB,pAdCMVDNS3を作成。それぞれをアデノウイルスベクターADVCMVLacZと293細胞にco-transfectionし、組換えアデノウイルスADVCMVJAB,ADVCMVDNS3を作成を試みた。この過程でpAdCMVJABは293細胞の増殖を著しく抑制することが見いだされ本方法ではpAdCMVJABの大量精製は不可能であると判断した。そこでADVCMVDNS3についてのみ組換えアデノウイルスDNAを抽出しPCR法により組換えを確認後、ウイルスを大量精製した。(2)再生内膜肥厚に対するADVCMVDNS3遺伝子導入の効果検討ラット頸動脈バルーン傷害時に傷害局所の内腔から特殊バルーンカテーテルを用いてDNS3遺伝子を導入した。傷害血管におけるDNS3発現とそれに伴うStat3リン酸化の抑制をウエスタンブロット法を用いて確認した。DNS3遺伝子導入により新生内膜形成が著しく抑制された。その機序として、新生内膜における平滑筋細胞増殖の抑制と(BrdUラベル法)、アポトーシスの亢進(TUNEL法)が関与することが明らかとなった。全身臓器の炎症所見や多臓器におけるDNS3遺伝子発現はみられず明らかな副作用はなかった。以上から、Stat3が新生内膜平滑筋細胞の増殖亢進・アポトーシス抑制を介して血管傷害によるリモデリングに重要な役割を果たしており、Stat3活性を制御する遺伝子治療が有効である可能性が示された。今後、大同物を用いた実験を行い臨床応用に結びつけたい。ラット頸動脈にバルーン傷害を加えると14日後に平滑筋細胞増殖により新生内膜が形成された。これを生体内における平滑筋細胞増殖モデルとした。2)バルーン傷害モデルにおけるJAB・Jak2・STAT発現免疫組織染色法にて、傷害前、傷害後2、7、14日の血管壁におけるJAB・Jak2・STAT3蛋白質発現を検討した。傷害前の正常血管においてはJak2・STAT3蛋白質の明らかな発現を認めなかった。傷害2日目に中膜平滑筋細胞にJak2・STAT3蛋白質が認められ、新生内膜形成が最も盛んな7日目に内膜・中膜平滑筋細胞においてJak2・STAT3蛋白質がピークとなった。14日目には内膜・中膜平滑筋細胞ともにJak2・STAT3蛋白質発現が消失した。JABについては、数種類の抗体を使用して免疫組織染色法を行っているが、バックグラウンドが高いなどの問題があり現在も引き続き検討中である。3)JAB cDNA組込みアデノウイルス・ドミナントネガティブSTAT3 cDNA組込みアデノウイルス作成新生内膜形成中の血管に発現するJak2・STAT3蛋白質の意義を解明するため、JAB cDNA組込みアデノウイルス(Adv-JAB)・ドミナントネガティブSTAT3 cDNA組込みアデノウイルス(Adv-DNSt3)を、バルーン傷害時に傷害局所の内腔から特殊バルーンカテーテルを用いて遺伝子導入し、その影響を検討する。そのために、現在、コスミドベクターに組み換えたJAB cDNAおよびドミナントネガティブSTAT3 cDNAをアデノウイルスベクターに組み換え増殖中である。
局所的外部シグナル導入による、大腸菌の誘引応答時間の計測

「研究の目的」同一細胞上の複数のべん毛モーターの、外部シグナル導入に対する回転方向変化を観測することで、外部シグナルに応じた細胞内シグナルがどのように細胞内を伝達していくかを明らかにし、細胞の情報処理システムを理解する。「研究実績」・新規光学系を開発することで、大腸菌の細胞周囲に僅かミリ秒の時間で,局所的に外部シグナルを導入することが可能となった。また、導入した外部シグナル濃度の定量方法を確立することができた。・外部シグナルの導入に対する、細胞の応答時間を高い時間分解能で計測することに初めて成功した。・細胞の応答時間の距離依存性から、細胞内シグナルが、シグナルの発信源からべん毛モーターへと方向性を持って伝達される様子が明らかになった。また、距離依存性から導出される拡散係数は、これまでの研究で報告さえているシグナルの拡散係数に一致し、細胞内の情報伝達の本質が細胞内シグナル分子の拡散であることが明らかになった。これらの結果により、大腸菌の細胞内情報伝達の動態を初めて明らかにすることができた。・細胞応答の時間内訳を、細胞の酵素反応に要する時間、情報伝達に要する時間に分解して解析することに初めて成功した。・細胞の応答を引き起こす、外部シグナル濃度の閾値を一細胞計測により初めて計測することができた。・大腸菌の外部シグナル濃度上昇,下降に対する刺激感受性を1細胞レベルで初めて評価することに抵抗し,過渡的な外部シグナル濃度上昇,下降に対する大腸菌の生理応答に,ヒステリシスが存在しないことが明らかになった.(抄録なし)「研究の目的」同一細胞上の複数のべん毛モーターの、外部シグナル導入に対する回転方向変化を観測することで、外部シグナルに応じた細胞内シグナルがどのように細胞内を伝達していくかを明らかにし、細胞の情報処理システムを理解する。「研究実績」・新規光学系を開発することで、大腸菌の細胞周囲に局所的に外部シグナルを導入することが可能となった。・外部シグナルの導入に対する、細胞の応答時間を計測することに世界で初めて成功した。複数細胞の平均から得られるものではなく、個々の細胞から得られる1細胞計測の結果から、新たな知見を得ることができると期待される。これらの結果により、これまでブラックボックスであった細胞内の情報伝達過程を初めて明らかにすることができた。・細胞の応答を引き起こす、外部シグナル濃度の閾値を一細胞計測により世界で初めて計測することができた。この結果は、近年注目されているバクテリアの外部シグナル検出機構の共同性を強く支持する結果である。・大腸菌の外部シグナル濃度上昇,下降に対する刺激感受性を1細胞レベルで初めて評価することに抵抗し,過渡的な外部シグナル濃度上昇,下降に対する大腸菌の生理応答に,ヒステリシスが存在しないことが明らかになった.当初の目標である、細胞内情報伝達の様子を明らかにすることに成功したのに加え、外部シグナルの細胞応答の閾値の1細胞計測、細胞応答時間の内訳の解析、のように予想以上の結果も得ることができたため。・外部シグナル濃度を減少させた場合の、細胞が誘引応答から復帰する際の外部シグナル濃度の閾値を、シミュレーション、実験から導出し、細胞応答前後の細胞の外部シグナル感受性のヒステリシスの有無を調査する。・誘引応答を引き起こす外部シグナルの研究が一通りまとまってきたので、今度は忌避応答を引き起こす外部シグナルを用いて同様の実験を行い、誘引応答、忌避応答時の情報伝達の違いについて調査することでシグナル応答時の情報伝達システムを包括的に明らかにする。(抄録なし)
ダウン症出生前診断のためのAFP,hCG及びE3の三成分同時定量法の開発

希土類イオンキレートを標識体とする時間分解蛍光イムノアッセイ(TR-FIA)は高感度かつ多成分を同時に測定するイムノアッセイを確立することが可能である。本申請では,希土類イオンとしてEu^<3+>とSm^<3+>を用い,ダウン症出生前診断のマーカーである母胎血中AFP,hCG及びエストリオール(E3)の三成分の同時測定を目的とするTR-FIAについて検討した。AFP及びhCGはサンドイッチ法,E3は競合法で測定した。三成分を同一ウェル上で測定するために,AFP及びhCGはマイクロタイタープレート上で,E3はTSPプレート上で反応させ,このマイクロタイタープレートにTSPプレートを被せることにより三成分同時定量を行った。本三成分同時定量における検量域はAFPが3.91-1000ng/mL,hCGが877-250000IU/L,E3が0.39-100ng/mLの範囲で得られ,これらはいずれも妊婦の正常値を十分測定できるものであった。また同時再現性は日内及び日間でそれぞれAFPが1.81-9.84%及び4.93-15.83%,hCGが2.98-9.47%及び5.34-21.04%,E3が3.05-8.93%及び6.26-21.70%と良好であった。さらに本法と従来法との相関はAFPがr=0.987,hCGがr=0.924,E3がr=0.938と良好であった。本法は多数の検体を希釈せずに同時定量することができ,分析に要する時間も2時間弱と迅速な方法であるためマススクリーニング法としても有用であると思われる。また,2種の希土類イオンを標識に用いる3種の分析対象物の同時アッセイ法は,本報告が初めてである。近年、ダウン症出生危険率の算出に母体血を用いる方法が報告され、これは、α-フェトプロテイン(AFP)とヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)およびエストリオール(E3)の三成分の測定値と体重、家族歴などのファクターをもとに算出するものである。現在までに、これら三項目の測定は市販のイムノアッセイキットを用い個別に行われているが、この方法では必要な検体量や経費等の問題から一般的なスクリーニングには不向きである。本研究は希土類イオンキレートの特性を生かした時問分解蛍光イムノアッセイによる上記三成分の同時測定法の開発を行い、臨床診断に役立てることを目的とし、本年度は以下の成果を得た。1)標識抗体(抗原)の調製:Euキレート標識化抗AFP抗体及びSmキレート標識化抗hCG抗体は特異抗体をEu(Sm)キレート標識剤と反応させ調製した。また,Euキレート標識化E3はE3-ウシ血清アルブミン複合体(E3-SA)を標識抗原として調製した。2)測定法の確立:Euキレート標識化E3-BSA,ウサギ抗E3抗血清、スタンダードを抗AFP抗体と抗hCG抗体を固相化したマイクロタイタ-プレートに添加し,第二抗体固相化Transferable Solid Phase (TSP)プレートで覆い、免疫反応後,両プレートを洗浄し,マイクロタイタ-プレートにはEuキレート標識抗AFP抗体溶液及びSmキレート標識化抗hCG抗体溶液を加えた後放置する。再洗浄後,蛍光増強試薬を加えSmとEuの時間分解蛍光強度を同時に測定する。一方TSPプレートは蛍光増強試薬を添加したマイクロタイタ-プレートに移しEu活性を測定する。確立した方法によるそれぞれの検量域は妊婦の血中濃度範囲を十分カバーするものであった。次年度は本法の臨床での有用性について検討する。

本法は多数の検体を希釈せずに同時定量することができ,分析に要する時間も2時間弱と迅速な方法であるためマススクリーニング法としても有用であると思われる。また,2種の希土類イオンを標識に用いる3種の分析対象物の同時アッセイ法は,本報告が初めてである。
DNAの高度機能性素材としての利用

DNAを遺伝子としてではなく高度機能性素材として、たとえば細胞培養用バイオマトリックス、抗DNA抗体検出用素材、発癌性物質検出用フィルターなどの各種生医学材料、抗菌性物質徐放性材料、さらには高選択性クロマトグラフィーの担体などとして実用化を目指す研究を行った。たとえば、酸性多糖のアルギン酸でDNAを不溶化する方法を見出し、DNA-アルギン酸フィルム、ゲル、繊維等を調整することができた。この方法でDNAをミリポア-フィルターに固定化し、発癌性の環境汚染物質を特異的に集積、あるいは除去するフィルターを開発した。さらにDNA-アルギン酸を用いたELISA法により抗DNA抗体の検出が可能となったことから、臨床的なデータとあわせてこの系の有用性を追求し,診断法として確立する基礎を築いた。また、不溶化DNA-金属錯体をアルギン酸を用いてフィルム化し抗菌性を付与した徐放性機能性物質を作製し、その抗菌活性について細胞培養法より検討した。その結果、銀イオンを配位させたDNA-アルギン酸フィルムが抗菌性フィルムとして極めて有用であることを見出した。すなわち、DNAを用いる事によりアルギン酸フィルム中に銀をより多く固定化できることがわかり、また、そのように調整されたフィルムは大腸菌および黄色ブドウ球菌の生育を阻害することが示された。本研究はDNAを高度機能性素材として、たとえば細胞増殖抑制用バイオマトリックス、抗DNA抗体検出用素材、発癌性物質検出用フィルター等の各種生医学材料、抗ウイルス性物質徐放性材料、さらに高選択性クロマトグラフィーの担体等として利用の道を探り実用化することを目的とする。本年度の研究実績昨年までの研究の結果、天然多糖であるアルギン酸とのコンプレックスにする方法によりDNAをその天然構造を保ったまま効率的に不溶化する方法を見いだした。この方法を用いて次の研究を行った。研究に用いるDNAは魚類白子よりの効率的な調製法を開発しつつ、各グループに供給された(三上)。1)不溶化DNA-アルギン酸複合体の細胞培養用バイオマトリックスとしての利用(平、久保木、西)DNAマトリックスの細胞増殖に及ぼす影響を細胞培養系により検討すると共に、細胞増殖をコントロールする機能性素材につき研究を進めた。2)抗DNA抗体検出法の開発と診断薬への利用(長田、西)酸性多糖であるアルギン酸を用いて従来の塩基性ペプチドとは異なるDNAの固定化を行い、これを固相とした抗DNA抗体検出のためのELISA法を開発した。3)発癌性物質検出用フィルターおよび樹脂の作製(戸倉、西村、西)DNA-アルギン酸をミリポア-フィルター上にコーティングし、ベンツピレン等のDNA結合性発癌物質をこのフィルター上に集め、極めて微量でも検出できる微量発癌性物質検出システムを開発した。DNAを遺伝子としてではなく高度機能性素材として、たとえば細胞培養用バイオマトリックス、抗DNA抗体検出用素材、発癌性物質検出用素材、発癌性物質検出用フィルターなどの各種生医学材料、抗菌性物質徐放性材料、さらに高選択性クロマトグラフィーの担体などとして実用化を目指すものである。現在までの研究の結果、DNAを用いてヒト線維芽細胞の増殖を抑制することを見いだした。これらの現象の機構解明を行うとともに腫瘍細胞についても同様の効果があるかどうかを検討した。さらに増殖抑制効果のあるDNAをアルギン酸などを用いて固定化した際の効果についても調べた(西、久保木)。DNA-アルギン酸を用いたELISA法により抗DNA抗体の検出が可能となったことから、臨床的なデータとあわせてこの系の有用性を追求した。さらに患者にとって有害な抗DNA抗体をDNA-アルギン酸フィルムに吸着・除去した疾病の診断のみならず治療への応用を図る(西、長田)。不溶化DNA-金属錯体をアルギン酸を用いてフイルム化し抗菌性を付与した徐放性機能性物質を作製し、その抗菌活性について細胞培養法により検討した(西、平)。*研究に用いるDNAは魚類白子よりの効率的な調製法を開発しつつ、各グループに供給された(三上)。DNAを遺伝子としてではなく高度機能性素材として、たとえば細胞培養用バイオマトリックス、抗DNA抗体検出用素材、発癌性物質検出用フィルターなどの各種生医学材料、抗菌性物質徐放性材料、さらには高選択性クロマトグラフィーの担体などとして実用化を目指す研究を行ってきた。

本年度はDNA-アルギン酸を用いたELISA法により抗DNA抗体の検出が可能となったことから、臨床的なデータとあわせてこの系の有用性を追求し、診断法として確立する基礎を築いた。さらに患者にとって有害な抗DNA抗体をDNA-アルギン酸フィルムに吸着・除去し疾病の診断のみならず治療への応用を図る予定である。また、不溶化DNA-金属錯体をアルギン酸を用いてフィルム化し抗菌性を付与した徐放性機能性物質を作製し、その抗菌活性について細胞培養法により検討した。その結果、銀イオンを配位させたDNA-アルギン酸フィルムが抗菌性フィルムとして極めて有用であることを見出した。すなわち、DNAを用いる事によりアルギン酸フィルム中に銀をより多く固定化できることがわかり、また、そのように調製されたフイルムは大腸菌及び黄色ブドウ球菌の生育を阻害することが示された。今後、細菌感染を防ぐような創傷カバー剤や食品用の包装剤としての利用が期待される。
厳密解を用いた一次元量子系の動的性質の理論的研究

1.本研究において、まず1/r^2型相互作用を持つ連続体模型、超対称t-J模型に対する厳密な熱力学を構成した。解析的な手法を用いて上の模型は自由な分数統計粒子と熱力学的に等価であることを示した。また超対称t-J模型の比熱、スピン感受率、電荷感受率の温度依存性を計算し、それらの結果から有限温度においてもスピンと電荷の分離現象が起きていることを見いだした。この現象は他の模型では見られないものである。よって我々はこの模型を、Tomonaga-Luttinger液体に対する基本的な模型として位置づけた。次に超対称模型を多成分系に拡張し、その熱力学を構成した。その結果(1)低温においては、スピンと電荷が起こること(2)磁場がかかっているときは、各成分が自由な分数統計粒子になること(3)磁場がかかっていないときは、各成分がパラ統計という別のタイプの分数統計粒子になること、がわかった。これらの結果から、内部対称性と分数統計描像との関係が明らかになった。以上し1/r^2型相互作用を持つ一次元可解模型についての成果である。この他に、ベ-テ仮説で解くことのできる可解模型と分数排他統計との関連を議論した。特に反強磁性ハイゼンベルグ模型と他成分分数統計粒子は熱力学的に等価であることを示した。この結果は、分数統計の概念が、1/r^2型相互作用を持つ一次元可解模型にとどまらず、広いクラスの一次元量子系に当てはまることを示唆するものである。まとめると、可解模型の熱力学の研究を通じて、新しいタイプの素励起描像が得られたことが本研究の主要な成果である。その素励起描像の現実の系における妥当性は比熱、帯磁率などの熱力学量を実験的に観察することで検証可能である。
英語と日本語の移動表現の第二言語習得―日・英・中・韓を母語とする学習者を比較して

本研究の目的は、中国語話者、英語話者、韓国語話者による日本語の移動表現(例.ジョンが家に走って入った)の習得、ならびに日本語話者による英語の移動表現(e.g., John ran into the house)の習得を容認度判断タスクと産出タスクを使って調査し、母語と目標言語における移動事象の語彙化パターン(Talmy, 1985)の違いが移動表現の第二言語習得にどのように影響するかを検証することである。平成28年度は、以下の二つを行った。1)産出研究(ストーリー・ライティングタスク(cf. Harley, 1989)を用いた研究)のデータの分析を進めた。2)容認度判断研究を行うため、Inagaki (2004)で用いられた容認度判断タスクの中国語版を作成した。1)で得られた産出データは、筆者がこれまでの研究で収集した容認度判断データを補完するものであり、分析を進めることにより、学習者の中間言語体系を別の角度から検証できる。2)で開発した中国語版と以前開発した日本語版を用いることにより、中国語を母語とする日本語学習者のデータ、ならびに中国語話者の母語のデータの収集が可能になる。今後、この二種類のデータを収集し、そのデータを比較、分析することにより、稲垣(2010)で得られた中国語話者による日本語習得の結果がL1の影響によるものであるかが検証できる。平成29年度、30年度は上記の二種類のデータの収集を行なった。現在収集したデータの分析を進めている。本研究の目的は、中国語話者、英語話者、韓国語話者による日本語の移動表現(例.ジョンが家に走って入った)の習得、ならびに日本語話者による英語の移動表現(e.g., John ran into the house)の習得を容認度判断タスクと産出タスクを使って調査し、母語と目標言語における移動事象の語彙化パターン(Talmy, 1985)の異なる組み合わせが移動表現の第二言語習得にどのように影響するかを検証することである。平成27年度は、以下の二つを行った。1)産出研究1(ストーリー・ライティングタスク(cf. Harley, 1989)を用いた研究)のデータを収集し、分析を進めた。2)容認度判断研究1を行うため、Inagaki (2004)で用いられた容認度判断タスクの中国語版を作成した。今後、この二種類のデータを収集し、得られたデータを比較、分析することにより、稲垣(2010)で得られた中国語話者による日本語習得の結果がL1の影響によるものであるかが検証できる。研究代表者の稲垣俊史が、平成28年度より同志社大学へ転出することになり、名古屋大学での後始末で超多忙となり、予定通り研究を進めることができなかったため。研究代表者の稲垣俊史が新任校の同志社大学で超多忙となり、予定通り研究を進めることができなかったため。

2)で開発した中国語版と以前開発した日本語版を用いることにより、中国語を母語とする日本語学習者のデータ、ならびに中国語話者の母語のデータの収集が可能になる。今後、この二種類のデータを収集し、そのデータを比較、分析することにより、稲垣(2010)で得られた中国語話者による日本語習得の結果がL1の影響によるものであるかが検証できる。研究代表者の稲垣俊史が新任校の同志社大学で超多忙となり、予定通り研究を進めることができなかったため。本研究の目的は、中国語話者、英語話者、韓国語話者による日本語の移動表現(例.ジョンが家に走って入った)の習得、ならびに日本語話者による英語の移動表現(e.g., John ran into the house)の習得を容認度判断タスクと産出タスクを使って調査し、母語と目標言語における移動事象の語彙化パターン(Talmy, 1985)の違いが移動表現の第二言語習得にどのように影響するかを検証することである。平成28年度は、以下の二つを行った。1)産出研究(ストーリー・ライティングタスク(cf. Harley, 1989)を用いた研究)のデータの分析を進めた。2)容認度判断研究を行うため、Inagaki (2004)で用いられた容認度判断タスクの中国語版を作成した。1)で得られた産出データは、筆者がこれまでの研究で収集した容認度判断データを補完するものであり、分析を進めることにより、学習者の中間言語体系を別の角度から検証できる。平成29年度、30年度は上記の二種類のデータの収集を行なった。現在収集したデータの分析を進めている。新しい職場の環境に一刻も早く適応し、当該研究に時間を割けるよう努力したい。新しい職場環境にも徐々に慣れてきており、その分より多くの時間を当該研究に割けるよう努力してゆく。新しい職場環境にも徐々に慣れてきており、今年度は特に産出研究(ストーリー・ライティングタスク(cf. Harley, 1989)を用いた研究)のデータの分析を進め、その結果を報告書にまとめる予定である。研究の遅れにより、旅費、人件費、謝金等の執行が滞ったため。29年度の助成金にプラスして、研究の遅れた部分を完了させるために使用する予定である。28年度の助成金にプラスして、研究の遅れた部分を完了させるために使用する予定である。
海藻脂質の抗肥満効果の解明と食品への応用に関する研究

ワカメに含まれるカロテノイドの一種であるフコキサンチン(Fc)の脂質代謝及び糖代謝改善作用について検討を行った。Fcは脂肪細胞においてUCP1蛋白質の発現を亢進させ、脂肪重量を減少させる。UCP1蛋白質の発現調節機構を明らかにするため、Fcを投与した糖尿病肥満モデルマウス(KK-Ayマウス)の脂肪組織での約4000個の脂質代謝関連遺伝子の発現量変化を、DNAマイクロアレイ法により調べた。その結果、脂肪細胞の膜状に存在するβ3アドレナリンレセプター(Adrb3)の発現量がFc投与群で上昇していた。更にRT-PCR法による検討でもAdrb3 mRNAの発現上昇が確認された。Adrb3に対する刺激はUCP1蛋白質による脂質代謝の促進、及びUCP1蛋白質の発現調整に関わる。このことからFcは脂肪細胞でのAdrb3の発現量を高めることにより、Adrb3に対する刺激の感受性を高め、UCP1蛋白質の発現亢進作用を示すことが示唆された(投稿準備中)。更にFcによる抗糖尿病効果について詳細な検討を行った。KK-Ayマウスに対してFcを投与した。その結果、Fc投与群では血糖値が正常マウス(ICRマウス)の値にまで改善した。又糖負荷試験を行った結果、Fc投与群では有意な糖代謝能の改善が認められた。更にFc投与群では白色脂肪組織中のTNFαmRNA発現量が正常マウスの値まで改善されていた(投稿準備中)。このことからFcは脂肪細胞から分泌されるインスリン抵抗性惹起に関わるアディポサイトカインであるTNFαの分泌量を正常な状態にすることにより,抗糖尿病作用を示すことが明らかとなった。本年度の研究よりFc摂取による脂肪細胞でのUCP1蛋白質の発現調整機構を明らかにした。又、Fcは脂肪細胞に働きかけ、脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの分泌量を調節し、インスリン抵抗性を改善することが示された。ワカメに含まれるカロテノイドの一種であるフコキサンチン(Fc)の脂質代謝促進作用について検討を行った。Fcの食品としての安全性を評価する上で摂取後の体内動態ついて検討した。その結果、Fcを投与したマウスの白色脂肪組織ではFcの代謝産物であるフコキサンチノール、アマローシアキサンチンAが多く蓄積していた。又、3T3-L1脂肪細胞を用いた実験からフコキサンチノールがFcよりも強い脂肪細胞への分化抑制効果を持つことが明らかとなった(雑誌論文)。Fcの吸収性の向上を目的として、Fcと中鎖脂肪酸を併用して糖尿病肥満モデルマウスに投与する実験を行ったところ、内臓脂肪の蓄積抑制や白色脂肪組織でのUCP1タンパク質の発現誘導がみられた。又、海産物由来の代表的な機能性成分である魚油とFcを併用して投与した場合にも内臓脂肪減少効果が向上したことから、Fcは他の機能性成分と組み合わせることでより強い効果を示すことが考えられた。更にFcの新たな機能として血糖値の上昇を抑制する抗糖尿病効果を明らかにした。Fc投与マウスでは白色脂肪組織中のTNFαのmRNA発現量が抑制させており、これがFcによる血糖値の上昇抑制効果の作用機構であることが示唆された(投稿準備中)。又、正常マウスに対して高脂肪食にて摂取させ肥満状態にしたマウスを用いた実験では、Fcを投与したマウスにおいて筋肉組織での糖の取り込みに関わるGLUT4のmRNA発現が高まった(投稿準備中)。これらのことからFcは脂肪組織だけではなく、筋肉組織などの他の代謝に関わる組織にも働きかけ、その機能を発揮していることが示唆された。本年度の研究より摂取したFcの脂肪組織での動態と脂肪組織と筋肉組織での機能について明らかにした。今後はその作用機構について更に詳細に検討する予定である。
結核菌細胞壁脂質の化学生物学研究

結核菌細胞壁脂質のマクロファージに対するネクローシス誘導のメカニズム解明に向けて、原因物質とみなされるフチオセロールジマイコセレート(PDIM)およびその構成成分であるマイコセロシン酸とフチオセロールのスケールアップ合成を行っている。現在までに、マイコセロシン酸とフチオセロールは数百ミリグラムずつ合成した。また、もう一つの結核菌毒性細胞壁脂質とみなされているPGL-tb1の全合成を達成した(論文準備中)。本合成では、PDIMの合成経路に則り、マイコセロシン酸の合成およびフチオセロールの中間体からの末端アセチレン誘導体を合成し、三糖が付いたヨードベンゼンと薗頭カップリングで接続することにより、三糖が付いたフチオセロール誘導体を合成した。このフチオセロール誘導体とマイコセロシン酸の縮合によってPGL-tb1の全合成を完了した。さらに、PDIMの合成研究で見出した、立体選択的プロトン化を実現する嵩高いプロトン化剤である2-アルキルベンズイミダゾールを用いて、天然物合成によく使われるγ-ラクトンとδ-ラクトンの短工程合成に成功した(Tetrahedron Letters, 60, 411, (2019))。本研究では、嵩の低いアルキル鎖を有するα,β-不飽和イミドのBirch還元におけるプロトン化では2-イソプロピルベンズイミダゾールが有効であり、α,β-不飽和イミドのβ,γ-不飽和イミドへの異性化反応におけるプロトン化では2-メチルベンズイミダゾールが高立体選択的に生成物を与えることを見出した。加えて、この立体選択的プロトン化を利用して抗がん物質PM1163Bの全合成を達成した(Syntlett, 30, 709, (2019))。既に報告しているPDIM Aの全合成経路(Organic Letters, 18, 132 (2016)、Chemistry Letters, 45, 550 (2016))に則り、マイコセロシン酸とフチオセロールは数百ミリグラムずつ合成した。また、PGL-tb1の全合成も達成し、現在は論文作成のための各合成中間体のスペクトルデータの採取を進めている。これについても、数百ミリグラムからグラムスケールのスケールアップ合成を行っているが、再現性はとれており、特に困難な箇所は無い。現在、フチオセロールの蛍光標識体の合成にもとりかかっている。また、これらの化合物の合成研究途上見出した、嵩高いプロトン化剤としての2-メチルベンズイミダゾールによる立体選択的なプロトン化反応が、他の化合物の合成にも応用できることもわかっており、他の生物活性物質の合成研究への展開を進めている。予備実験として、PDIMおよびその構成成分であるマイコセロシン酸とフチオセロールのマクロファージのネクローシス誘導活性を検討し、フチオセロールが活性を示すことがわかっている。本研究でフチオセロールとマイコセロシン酸を数百ミリグラムずつ合成しているので、この実験の再現性を検証し、結核菌細胞壁脂質の活性を再検証する。また、フチオセロールのアルキル鎖部分の末端に蛍光色素を取り付けた蛍光標識体を合成し、活性を評価する。活性が確認され次第、蛍光によってそのマクロファージ内の分布を確認する。また、PDIMがネクローシス誘導活性を示すことが報告されていることから、蛍光ビーズにマイコセロシン酸を結び付けた後、フチオセロールの蛍光標識体を縮合してダブルラベル化PDIMを作成し、マクロファージ内でのPDIMの加水分解を可視化する。さらに、フチオセロール蛍光標識体の発光基を光反応基に組み替えた化合物を合成し、マクロファージ内で光反応により標的タンパク質との共有結合を形成させ、標的タンパク質を同定する。