hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病における糖タンパクの早期診断マーカーとしての臨床応用の検討

アルツハイマー病(AD)の血液中で糖鎖の変化している可能性の高い3種のタンパクについて、タンパクの同定とそれぞれの糖鎖の測定法を作製して糖鎖量を測定し、3種の糖タンパクのうちトランスフェリンともう1種の免疫系関連タンパクについてADの血液中で糖鎖量が変化していることを見出した。さらに、トランスフェリンのシアル酸は、ADの病初期にすでに変化していることを見出し、血液早期診断マーカーとしての可能性が高いことが分かった。免疫系関連タンパクについてはADとAD以外の認知症の鑑別診断ができる可能性が示唆され、また髄液中Aβと相関していることから脳内のAβの変化を血液でモニターできる指標でもあることが示唆され、優秀な血液診断マーカーとなりうることが示唆された。アルツハイマー病(AD)の生物学的診断マーカーの新たな候補タンパクとして、糖タンパク質について解析を行った。最も有力な候補であるトランスフェリンは、髄液中で糖鎖が変化していることを既に明らかにしており、その簡便な測定方法の確立と臨床応用の可能性を検討した。まず、測定方法の候補としては、検出にレクチンを用いたレクチン酵素免疫測定法の確立を試みた。capture抗体で検出したトランスフェリンから、シアル酸を認識するSSAレクチン、N-アセチルグルコサミンとシアル酸を認識するWGAレクチン、マンノースを認識するCon Aレクチンを用いて糖鎖の検出を試みたところ、SSAによってトランスフェリンのシアル酸量を定量化することが出来、実際にADの髄液中のトランスフェリンのシアル酸量は対照群と区別でき、診断マーカーの測定方法として有効であることが示唆された。今後は、その他の認知症との鑑別の可能性を検討する予定である。また、血中のトランスフェリンについても量と糖鎖についてADと対照群で測定して比較したところ、血中のトランスフェリン量はADで減少し、糖鎖量は増加していることが分かった。血中トランスフェリンについてもSSAによる糖鎖の測定を行い、血中診断マーカーとしての有効性を検討する予定である。その他のマーカー候補糖タンパクについては、すでに2つを同定しており、現在髄液・血中においての量と糖鎖の測定を行っている。最も有力な候補であるトランスフェリンは、髄液中・血液中共に糖鎖が変化していることを既に明らかにしている。今年度は、血中トランスフェリンの糖鎖変化が診断マーカーとして有効であるかどうかを検討した。その結果、血中トランスフェリンの糖鎖変化は、ADの極軽度な群でも起こっており、この変化はADの病態の指標である髄液中アミロイドβタンパクの減少やリン酸化タウタンパクの増加よりも先行して起こっている可能性が示唆された。さらに加えてあと2種の糖タンパクを同定し、そのうち1種は血中において糖鎖が変化している可能性を見い出した。このタンパクもトランスフェリン同様、アミロイドβタンパクの減少やリン酸化タウタンパクの増加よりも先行して起こっている可能性が示唆され、これら2種の血中タンパクの糖鎖は早期診断マーカーとして有用であることを明らかにした。残り1種の糖タンパクは、少数例の検討であるが同様に糖鎖に異常がある可能性が示唆されいてる。現在、これらの糖タンパクの糖鎖の異常部位の同定を行っており、さらに糖鎖量簡易測定法の確立を試みている。また、ADと鑑別の困難であるタウオパチーなどのAD以外の認知症との鑑別に有効であるかを検討している。さらに今後は、糖鎖付加の異常部位の同定を行い、病態との関連を解析する予定である。また、昨年度にはさらに2種の糖タンパクを同定し、そのうち1種ではADの血液中で糖鎖が変化している可能性を見いだした。今年度は、糖鎖変化の見られた1種の糖タンパクについて多数例において血中の糖鎖量を測定した。糖鎖の測定方法としてレクチンを用いたレクチン酵素免疫法による測定が有効であることを明らかにし、簡易測定法を確立した。この方法によって、多数例の症例において血中糖タンパクの糖鎖量を測定した結果、糖鎖の構成糖であるマンノース、N-アセチルグルコサミンいずれにおいてもADで減少していることを見い出した。また、髄液中と血液中の糖タンパクの糖鎖量は相関があることも明らかとなった。今後は、重症例との比較検討やAD以外の認知症との鑑別診断の可能性を検討すると共に、異常構造の部位を特定する予定である。

また、残り1種の糖タンパクについても少数例の検討で糖鎖量が変化している可能性を見い出している。今後、多数例での検討を行う予定である。トランスフェリンについては、レクチン(特にWGA)によるレクチン酵素免疫測定法が当初確立が困難であったが、測定条件などを検討しWGAによるN-アセチルグルコサミン量の測定系が確立しつつある。今後は、測定条件を決定して実際に髄液・血液での糖鎖量の測定を行う予定である。アルツハイマー病(AD)の血液中で糖鎖に異常があることが判っている2種の糖タンパクについて、糖鎖量の測定を行い、診断マーカーとしての有効性を検討した。1種の糖タンパクは、昨年度すでにマンノース量とN-アセチルグルコサミン量が変化していることが示唆されていたが、さらに多数例の検討によりADではこれらの糖鎖量が減少していることが判った。特にADでの髄液中・血液中のN-アセチルグルコサミン量の減少は、髄液中のアミロイドβタンパク(AP)と相関しており、その相関はより髄液で顕著であったが血液でも同様の相関が見られた。このことは、糖鎖量の変化は脳内のAβの動態を血液でも反映し、検出しうる指標であることが示唆された。一方、リン酸化タウタンパク(p-tau 181)との相関は見られなかった。またマンノース量の減少に関しては、p-tau181、Aβとの相関は見られなかった。さらにこの糖タンパクの糖鎖量に関して、少数例ではあるがAD以外の認知症での測定も行い比較検討した。マンノース、N-アセチルグルコサミン共にAD群ではAD以外の認知症群と比較して減少しており、AD以外の認知症との鑑別にも応用できる指標であることが分かった。このことは、髄液中・血液中いずれも同様であった。残り1種の糖タンパクは、マンノース、フコースを測定した。マンノース量はADの血液中で減少していることがわかったが、フコース量に関しては対照群と有意な差は見られなかった。
遺伝性毛細血管拡張性小脳失調症責任遺伝子ATMと糖代謝、翻訳制御に関する研究

Ataxia Telangiectasia(A-T)は小脳失調症、毛細血管拡張、免疫不全を主徴し悪性腫瘍、早老症、耐糖能異常、るい痩を合併することが知られている。責任遺伝子.ATMはDNA障害認識機構で重要な役割を持つタンパク質であるが、インスリン伝達経路においても役割を担っている可能性が糖尿病を合併することより示唆される。脂肪細胞はアディポカイシを分泌し、脂肪細胞への適切な分化がないとアディポネクチンなどが分泌されず個体がインスリン抵抗性となることが知られている。我々はA-T患者で皮下脂肪貯蔵率が低いことに注目し、ATM欠損が脂肪細胞分化に与える影響をATM欠損MEF、正常MEFを用い検討した。正常型MEFが分化誘導刺激により脂肪細胞へ分化する一方、ATM欠損MEFは脂肪細胞への分化が見られなかった。脂肪細胞の分化にはC/EBPαやPPARγを中心とする転写因子が重要な役割を担っている。そこで、これら分子の発現を分化誘導後に比較検討した。その結果ATM欠損MEFでは分化誘導後のC/EBPαやPPARγの誘導が全く見られず、このことがATM欠損細胞での脂肪細胞分化の障害の原因と考えられた。またインスリン刺激による翻訳量の増加がATM欠損細胞で見られないことが明らかとなり、C/EBPαやPPARγの発現異常と合わせ、ATM欠損細胞での脂肪細胞分化障害の原因と考えられた。また細胞レベルのみならずATM欠損マウスでも耐糖能異常があることを明らかにし、動脈硬化が起こる上でATMが重要な役割を持ち、ATMを活性化させることで動脈硬化の抑制、耐糖能異常の改善につながることを明らかにした。
癌の予防に関する栄養学的研究

高速液体クロマトグラフィーによるポリアミン(プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スパルミン)の測定法を確立した。これまでの方法ではプトレッシンの保持時間の不安定、プトレッシンとカダベリンの分離の不十分、送液ポンプによる気泡の発生等の難点があったが移動相の改良、グラジェントプログラムの変更等により解決された。K562細胞をホリアミン合成阻害剤のdifluoromethylornithine(DRMO)あるいはmethyl-glyoxal-bis-guanylhydrazoneと共に3日間培養すると、死滅細胞は殆どみられないが、細胞の増殖は抑制され、ボリアミンの含量が低下した。主としてスパルミジンの濃度が低下するに従ってウサギ抗K562細胞血清とモルモット補体による細胞障害(以下補体感受性と略す)が増強された。プトレッシンとスペルミンはこの補体感受性の増強に殆ど関与していないと思われる。Transglutaminase(TGase)はタンパク質とタンパク質を架橋し、アミン類とタンパク質を結合してより高次の構造を形成する酵素で、すべての細胞に存在し、Ca^<2+>によって活性化される。したがって補体によって細胞膜が障害を受けると細胞外から細胞内へCa^<2+>が大量に流入するからTGaseは活性化されるものと考えられる。ポリアミンにはTGaseの基質としての役割もある。DFMOによってポリアミンの濃度が減少した細胞にTGase阻害剤であるdansylcadaverineあるいはamantadineを追加して作用させると補体感受性の相乗的増強がみられた。これらの事からDFMOによるK562細胞の補体感受性の増強は、基質としてのポリアミンの減少に伴うTGaseの機能の低下に基づいている事が示唆される。ポリアミンとTGaseとCa^<2+>は補体による細胞膜障害に対する修復機構を形成している可能性がある。1)K562細胞を10% fetal calf serum加RPMI1640培養液で継代培養して増殖させた。これで実験に必要な大量の細胞を安定して供給できるようになった。2)ウサギにK562細胞浮遊液を数回静注して抗K562細胞血清を作成した.3)K562細胞をタ-ゲットとして,ウサギ抗K562細胞血清と補体(市販のモルモット血清)による細胞障害性試験の条件を設定した.4)高速液体のクロマトグラフィ-によるポリアミン(プトレッシン,カダベリン,スペルミジン,スペルミン)の測定方法を確定した。ここではプトレッシンの保持時間が変動するとか,プトレッシンとカダベリンの分離の不十分,あるいは送液ポンプによる気泡の発生が原因と思われるグラフの基線の乱れ等の難点に出会ったが,移動相の改良,グラシェントプログラムの変更等の工夫により解決をみた。以上の準備を経て,実験の結果次のような知見が得られた.ポリアミン合成阻害剤であるメチルグリオキサ-ルビスグアニルヒドラジン(以下MGBGと略す)を添加してK562細胞を3日間5%CO_2インキュベ-タ-で培養した場合,トリパンブル-法でみた限りにおいて細胞の死滅は生じないが,1)細胞の増殖が抑制され,2)ウサギ抗K562細胞とモルモット補体による細胞障害に対する感受性が著しく増強される。次に,MGBGとスペルミジンを同時に添加して培養すると細胞増殖は抑制されずまた補体による細胞障害の増強もみられない。これらのことから細胞の増殖と補体による細胞障害性に対する細胞側の防禦機構にポリアミン特にスペルミジンが関与していることが示唆される。

K562細胞をポリアミン合成阻害剤のdifluoromethylornithine(DFMO)あるいはmethyl-glyoxal-bis-guanylhydrazoneと共に3日間培養すると、死滅細胞は殆どみられないが、細胞の増殖は抑制され、ポリアミンの含量が低下した。主としてスペルミジンの濃度が低下するに従ってウサギ抗K562細胞血清とモルモット補体による細胞障害(以下補体感受性と略す)が増強された。プトレッシンとスペルミンはこの補体感受性の増強に殆ど関与していないと思われる。Transglutaminase(TGase)はタンパク質とタンパク質を架橋し、アミン類とタンパク質を結合してより高次の構造を形成する酵素で、すベての細胞に存在し、Ca^<2+>によって活性化される。したがって補体によって細胞膜が障害を受けると細胞外から細胞内へCa^<2+>が大量に流入するからTGaseは活性化されるものと考えられる。ポリアミンには、TGaseの基質としての役割もある。DFMOによってポリアミンの濃度が減少した細胞にTGase阻害剤であるdansylcadaverineあるいはamantadineを追加して作用させると補体感受性の相乗的増強がみられた。これらの事からDFMOによるK562細胞の補体感受性の増強は、基質としてのポリアミンの減少に伴うTGaseの機能低下に基づいている事が示唆される。ポリアミンとTGaseとCa^<2+>は補体による細胞膜障害に対する修復機構を形成している可能性がある。
ABHファミリーを介したRNAエピジェネティクス制御による新たな癌分子機序の提唱

ALKBH6ノックダウンHeLa細胞由来200ヌクレオチド以上のRNAとALKBH6カイコリコンビナントタンパク質の反応により1-methylguanine量が増加する結果が得られた。また、ALKBH6と複合体を形成するmRNAの存在が示唆され、ALKBH6はmRNAを標的とし遺伝子発現に影響を与えている可能性が見出された。また、淡明細胞型腎細胞癌部においてALKBH6発現は顕著に増加しており、細胞株を用いたALKBH6ノックダウン実験では増殖、遊走、浸潤能の低下が見られ、ALKBH6が淡明細胞型腎細胞の増悪に寄与している可能性が示唆された。ABHファミリーノックダウンHeLa細胞を樹立し、この細胞における増殖能についてWST-8を用いて検証するとABH2、6ノックダウンHeLa細胞において有意な増殖能低下が認められた。また、遊走能をwound healing assayにより検討すると、ABH2、3、5、7、8、9ノックダウンHeLa細胞において運動性低下が見られた。ABHファミリーノックダウンHeLa細胞から200 nt以上のRNAと200 nt以下のRNAを分離抽出し、タンデム四重極型質量分析計による各塩基の修飾レベルを定量した。結果、ABH1ノックダウンHeLa細胞の200 nt以下RNAにおいて5-hydroxymethylcytosineの低下及び、ABH6ノックダウンHeLa細胞200 nt以下RNAにおけるN6-methyladenosine量低下が見られた。ABH6はこれまで機能解析の報告のない機能未知分子であり、ノックダウンによる表現型やRNAメチル化レベルの変化が認められた結果は意義深いものであると考えられた。ABH6ノックダウンHeLa細胞より200 nt以上と以下のRNAを抽出しこれらとABH6カイコリコンビナントタンパク質と反応させた後、質量分析計によって各修飾ヌクレオシドを定量化し、ABH6酵素活性の有無を検証した。結果、200 nt以下のN6-methyladenosine量に変化はなく200 nt以上のRNAに含まれる1-methylguanosine量の増加が見られた。これらの結果は、ABH6が200 nt以上のRNAに含まれるグアニン修飾に関与する可能性と、ABHノックダウン細胞を用いた検証では必ずしもABHの直接的基質を探索する目的には適さない可能性を示唆している。この現状を踏まえるとRNAの鎖長で分離している方法から基質となる配列を同定する検討が必要であると考える。ABHファミリーノックダウンHeLa細胞のRNAおよび癌臨床検体由来RNAの修飾解析修飾解析に遅れが生じている。ABHファミリー会合RNAの探索を目的に以下の検討を行った。細胞内でビオチン化されるBioEaseタグ融合ABHファミリー発現ベクターを構築し293細胞に一過性に強制発現させ、ストレプトアビジンビーズでBioeaseタグ融合ABHファミリーをプルダウンし、これと293細胞由来RNAとを混合させた。そして洗浄操作の後、BioEaseタグ融合ABHファミリーと共沈したRNAについて次世代シーケンサーを用いることで配列の同定を行った。この実験結果からABHファミリーの基質RNAの具体的候補を挙げることができた。中でも注目したのは機能未知ファミリー分子であるABH6がmRNA及びlncRNAとの複合体を形成している可能性である。ABH6とmRNAの会合による生化学的意義について検討するため、ABH6一過性発現時におけるABH6複合体形成mRNAの発現を検討した。すると、会合mRNAの発現低下が認められABH6がRNA安定性制御に寄与する可能性が示唆された。この知見はABH6の機能さらにはRNA修飾制御の新たな機序を解明する糸口になる可能性があると期待された。このABH6について淡明細胞型腎細胞癌臨床検体におけるタンパク質発現をウエスタンブロットにより検討すると非癌部に比べ癌部において明らかな発現増加が認められ、ABH6が淡明細胞型腎細胞癌の癌部において機能していることが示唆された。そこでRNA干渉法により淡明細胞型腎細胞癌細胞株である786-OのABH6をノックダウンし、その表現型を解析すると増殖性が低下した。これらの結果からABH6が新規RNA機能制御分子であり、淡明細胞型腎細胞癌の癌細胞増殖に寄与する分子である可能性が示唆された。ABHファミリーノックダウン細胞由来RNAから質量分析計でRNA修飾を定量比較したが、様々なRNA種が混在するサンプルを用いた検討では精確な実験結果が得られないという課題が浮かび上がった。そこでRNA修飾の生理的機能についてより理解を深めるために、ABHが制御するRNAを直接探索する方策が効果的であると考える。すなわち、ABHファミリー会合RNAを探索し、会合RNAについての修飾をABHリコンビナントタンパク質との反応あるいはABHファミリーノックダウン細胞においての修飾量を検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学29年度が最終年度であるため、記入しない。
可変型遺伝子トラップクローンを利用したＣｒｅ－ｄｒｉｖｅｒマウスの作製

条件的遺伝子破壊に必須のCre driverマウスを大量に作製した。50種類のCre driver ES細胞株(全203クローン)からキメラマウスを作製し、50種類全てをカバーする93クローンについてマウスラインを樹立した。79種類のCre driverマウスを熊大CARDに、51種類のCre driverマウスを理研BRCに寄託した。SACreをノックインした34クローンについて、レポーターマウスであるROSA26Rと交配して得た産仔のX-gal染色を行った。21-T188SACreは、小脳特異的な染色パターンを示した。同様に、mERT2をノックインした25クローンの解析を行った。1、理研BRCの試験研究で作製したCre-driverES細胞株の中から、Fbxo17,Alad,Tspan9,Gzf1,Hip1,Pknox1,Pkig遺伝子を選択し、熊本大学においてキメラマウスを作製した。得られた♂キメラマウスとC57BL/6N♀マウスを交配し、マウスラインを樹立した。引き続き、Wdfy1,Mark3,Fto遺伝子について、キメラマウス作製を試みている。2、同じくCre-driver ES細胞株の中から、Apobec1,Tect1,Klf12,Fblim1,Fry1遺伝子を選択し、理研BRCにおいてキメラマウスを作製した。得られた♂キメラマウスとC57BL/6N♀マウスを交配している。3、X-gal染色を行ったEGTCクローンの中から興味深い発現パターンを示したクローンを選んで、新たなCre-driver ES細胞株を作製した。21-W126(Elov16),21-W377(Zfp13),21-W15(Mett12),21-W74(Fkbp4)クローンにSA-Creをノックインし、21-B186(EST),21-W377(Zfp13),21-W126(Elovl6),21-W74(Fkbp4),21iW15(Mett12),21-T239(Wdfy1),21-T297(Mark3)クローンにmERT2をノックインした。PCRとサザンでCre-driver ES細胞株樹立を確認し、更にキメラマウス作製を試みている。4、EGTCクローンのX-gal染色作業を継続し、新たに29ラインの発現パターンを検討した。平成24年3月末現在&EGTCに登録しているES細胞株は1,067クローンであり、そのうち414クローンに関してキメラマウスを作製し、マウスラインを樹立して、CARD R-BASEに寄託している。さらに99クローンについては、X-gal染色像を公開している。平成24年度に引き続き、X-gal染色を行ったEGTCクローンの中から興味深い発現パターンを示した4クローンにSA-Creを、10クローンにmERT2をノックインし、新たなCre-driver ES細胞株を作製した。また、14種類のCre driver ES細胞株(全54クローン)を用いてキメラマウス作製を試みた。そのうち14種類全てをカバーする26クローンについてマウスライン樹立に成功した。また、新たなCre driverカセットとしてCAGiCE, CAGEiCE, SA-iCEを作製した。これらはCpG配列を無くすと同時に哺乳類の細胞用にコドンを変換したiCreを使用しており、翻訳効率の上昇が期待できる。それぞれEGTCクローンへのノックイン、キメラマウス作製、マウスライン樹立を試みているところである。平成24年度の10種類に続けて、69種類のCre driverマウスラインを熊大CARDに寄託した。このうち49種類の精子を理研BRCへ寄託した。残り30種類については、平成26年度中に理研BRCへの寄託を行う予定である。これらのCre driverマウスと、レポーターマウスであるROSA26Rを交配し、得られた産仔のX-gal染色を行った。6ラインについて胎児期の、57ラインについてアダルトの各臓器のX-gal染色を行っている。X-gal染色を行ったEGTCクローンの中から興味深い発現パターンを示した12クローンにSA-Creを、11クローンにmERT2をノックインし、新たなCre-driver ES細胞株を作製した。また、45種類のCre-driver ES細胞株(全149クローン)を用いてキメラマウス作製を試みた。そのうち45種類全てをカバーする118クローンについてマウスライン樹立に成功した。SACreをノックインした20クローンについて、レポーターマウスであるROSA26Rと交配して得た産仔のX-gal染色を行った。その中で、21-T188(EST)は脳特異的な発現を示した。

またmERT2をノックインしたクローンを用いて、タモキシフェン誘導の条件検討を行った。平成25年3月末現在、EGTCに登録しているES細胞株は1,161クローンであり、そのうち461クローンに関してマウスラインを樹立し、CARD R-BASEに寄託している。さらに110クローンについては、X-gal染色像を公開している。EGTCデータベースにおける情報発信は順調に進んでおり、共同研究の成果も現れてきている。理研BRCの試験研究で作製したCre-driver ES細胞株の中で、15遺伝子についてキメラマウスを作製し、マウスラインの樹立中である。また、新たなCre-driver ES細胞株を11クローン作製し、キメラマウス作製を試みている。25年度が最終年度であるため、記入しない。理研BRCの試験研究で作製したCre-driver ES細胞株の中で、11遺伝子についてマウスラインを樹立した。また、新たなCre-driver ES細胞株を34遺伝子(全200クローン)作製し、その中の94クローンについてマウスラインを樹立した。理研BRCおよび熊大CARDへの寄託も進めている。Cre-driverマウスとROSA26Rマウスを交配し、得られた産仔のX-gal染色を進めている。SACreをノックインしたAyu21-T188クローンは、EST (CJ063182)をトラップしており、遺伝子としての情報はほとんどない。今回、このEGTCクローンを利用したCre-driverマウスラインが脳特異的なコンディショナルノックアウトに使用可能であることが示唆されたことは、このプロジェクトの有効性を示している。研究計画の変更や、研究遂行上の問題点は特に無い。平成24年度は、平成23年度に引き続き、Cre-driver ES細胞株の作製、キメラマウス作製、マウスライン樹立を進める。得られたES細胞株およびマウスラインを理研BRCに寄託する。Cre遺伝子の発現パターンを解析するために、Cre-driverマウスをレポーターマウスであるROSA26Rマウスと交配し、得られた産仔のジェノタイピングを行い、各種組織・細胞のX-gal染色を行う。脳については、1ミリ厚連続切片のX-gal染色も行う。また理研BRCにおいて、新たなデータベース構築を行う。平成25年度は、Cre-driverマウスライン樹立と理研BRCおよび熊大CARDへの寄託作業を継続して進める。また、Cre-driverマウスとROSA26Rマウスを交配し、得られた産仔のX-gal染色を継続して行う。問題点としては、タモキシフェン誘導の条件検討に時間がかかっている。最適なプロトコールを確立するのは困難なので、次善の策を探して進めることにする。。さらに、理研BRCにおいて、Cre-driverES細胞株およびマウスラインに関する新たなデータベースを構築し、公開する。
C1微生物で拓くメタノールエコノミー：低炭素・循環型社会で活用する基盤技術開発

1.メタノール酵母の有用形質を制御する遺伝子機能の解明とその活用メタノール誘導性遺伝子発現がエタノールによって抑制される「エタノール抑制」には、エタノールそのものではなく、エタノールがアセチルCoAに代謝されることが必要であり、アセチルCoA合成酵素のエタノール抑制に必要な機能領域や活性制御を明らかにした。また、メタノール濃度に応じた遺伝子発現制御における各種転写因子の役割や、転写因子自身の発現制御機構に関する解析を進め、転写因子のリン酸化動態や、発現制御に重要なプロモーター領域を明らかにした。2.メタノール変換反応系の構築前年度に引き続き、C1微生物の代謝系を活用したメタノールへの新規バイオプロセス変換法の開発を進めるとともに、バイオプロセスにより生じたメタノールを検出するための酵母メタノールセンサー細胞の活用技術を開発した。バイオマス由来のペクチンを基質とし、メタノール生成反応を触媒する酵素であるペクチンメチルエステラーゼをモデル酵素として利用し、その活性の強弱を評価することに成功した。3.植物共生メタノール資化性細菌の活用前年度に引き続き、Methylobacterium細菌のメタノール代謝特性や植物上での定着・生存に必要な細胞機能の解析を進めた。植物葉面微生物の優占種であるMethylobacterium属細菌の多くがパントテン酸(ビタミンB5)要求性を示すが、その原因は前駆体化合物β-アラニンの合成能を欠くためであり、実際に葉面に存在することが認められたパントテン酸やその前駆体化合物を獲得して葉面に定着できることを明らかにした。また、シアノバクテリアでは時計遺伝子として知られているKaiCのホモログ遺伝子が、Methylobacterium細菌の葉面定着に重要な役割を果たすことを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.メタノール酵母の有用形質を制御する遺伝子機能の解明とその活用メタノール酵母において強力なメタノール誘導性遺伝子発現に特化された転写制御機構を明らかにするため、転写制御因子と情報伝達関連因子の機能解析を行った。特に、細胞表層に存在するWscファミリータンパク質がメタノール感知に関わる重要な因子であることを見出し、メタノール誘導性遺伝子発現への関与を初めて明らかにした。転写因子については、核移行シグナルの決定や、転写活性化に必要なプロモーター領域の決定とDNA結合についての解析を進めた。メタノール酵母における異種タンパク質生産では、複数の有用タンパク質の生産についての研究を進めた。2.メタノール変換反応系の構築大腸菌にC1微生物代謝系酵素遺伝子を導入した株について、メタノール生成のための培養および反応条件を検討し、従前よりも短時間の反応時間でメタノール生成を確認できた。また、反応中間体定量解析により、細胞内代謝系が想定した方向に進んでいることを確認した。光合成細菌については、新たに導入する遺伝子について複数の発現ベクターを構築したが、導入株の構築には至らなかった。3.植物共生メタノール資化性細菌の活用植物表層微生物の優占種であり、植物から放出されるメタノールを利用し、植物生長促進効果をもたらすことが知られているMethylobacterium属細菌のメタノールエコノミーでの活用を目的に、本属細菌のメタノール代謝特性や植物上での定着・生存に必要な細胞機能の解析を進めた。特に、植物試料から分離した多くの菌株が要求するビタミンについて、その要求性や植物上での利用性を明らかにした。メタノール誘導性遺伝子発現に関わる転写因子やシグナル伝達因子の解析については、新規因子の発見もあり、当初の計画以上に進展している。メタノール変換系の構築については、遺伝子導入株の導入が困難であったことから、計画通りには一部進まなかった。植物共生メタノール資化性菌の解析については、概ね計画通りに進展している。1.メタノール酵母の有用形質を制御する遺伝子機能の解明とその活用メタノール酵母において強力なメタノール誘導性遺伝子発現に特化された転写制御機構を明らかにするため、前年度に引き続き、転写制御因子と情報伝達関連因子の機能解析を行った。メタノール誘導性遺伝子発現はエタノールの共存によって抑制されるが、この抑制がエタノール分子そのものではなく、エタノールからアセチルCoAへの代謝が関与する抑制機構であることを見出した。また、メタノール培養時などにストレス応答に働く情報伝達因子Hog1の新奇機能を明らかにした。一方、転写因子については、Hap複合体の核移行シグナルの決定や、メタノール誘導性転写因子のプロモーター領域の決定とDNA結合についての解析を進めた。メタノール酵母における異種タンパク質生産では、分泌効率を向上させるための培養法や宿主株の改良を進めた。2.メタノール変換反応系の構築前年度に引き続き、C1微生物の代謝系を活用したメタノールへの新規バイオプロセス変換法の開発を進めるとともに、バイオプロセスにより生じたメタノールを検出するための酵母メタノールセンサー細胞の構築と検出条件の最適化を行った。これまでに植物試料から単離したMethylobacterium属細菌の多くが要求するビタミンB5について、その生合成前駆体の要求性を調べ、植物上では複数の前駆体を利用している可能性を明らかにした。メタノール誘導性遺伝子発現に関わる転写因子やシグナル伝達因子の解析については、新たな代謝経路の関与や制御因子の新奇機能の発見もあり、当初の計画以上に進展している。メタノール変換系の構築については、メタノールの検出評価系を新たに確立できたが、バイオプロセスによるメタノール生成効率の向上には至っていない。

植物共生メタノール資化性菌の解析については、概ね計画通りに進展している。1.メタノール酵母の有用形質を制御する遺伝子機能の解明とその活用メタノール誘導性遺伝子発現がエタノールによって抑制される「エタノール抑制」には、エタノールそのものではなく、エタノールがアセチルCoAに代謝されることが必要であり、アセチルCoA合成酵素のエタノール抑制に必要な機能領域や活性制御を明らかにした。また、メタノール濃度に応じた遺伝子発現制御における各種転写因子の役割や、転写因子自身の発現制御機構に関する解析を進め、転写因子のリン酸化動態や、発現制御に重要なプロモーター領域を明らかにした。2.メタノール変換反応系の構築前年度に引き続き、C1微生物の代謝系を活用したメタノールへの新規バイオプロセス変換法の開発を進めるとともに、バイオプロセスにより生じたメタノールを検出するための酵母メタノールセンサー細胞の活用技術を開発した。バイオマス由来のペクチンを基質とし、メタノール生成反応を触媒する酵素であるペクチンメチルエステラーゼをモデル酵素として利用し、その活性の強弱を評価することに成功した。3.植物共生メタノール資化性細菌の活用前年度に引き続き、Methylobacterium細菌のメタノール代謝特性や植物上での定着・生存に必要な細胞機能の解析を進めた。植物葉面微生物の優占種であるMethylobacterium属細菌の多くがパントテン酸(ビタミンB5)要求性を示すが、その原因は前駆体化合物β-アラニンの合成能を欠くためであり、実際に葉面に存在することが認められたパントテン酸やその前駆体化合物を獲得して葉面に定着できることを明らかにした。また、シアノバクテリアでは時計遺伝子として知られているKaiCのホモログ遺伝子が、Methylobacterium細菌の葉面定着に重要な役割を果たすことを明らかにした。メタノール誘導性遺伝子の転写制御機構の解明とその活用については、当初の計画に加え、新たに同定したメタノール感知因子から転写因子へのシグナル伝達についての解析を重点的に行う。新規メタノール変換反応系の構築については、大腸菌での発現株を用いた検討を主に進める。植物共生メタノール資化性菌については、当初の計画通りに進める。メタノール誘導性遺伝子の転写制御機構の解明とその活用については、前年度に引き続き、メタノール感知因子から転写因子へのシグナル伝達についての解析を重点的に行う。メカニズムの解明に留まらず、新規宿主による有用タンパク質の高効率生産を達成したい。新規メタノール変換反応系の構築、および植物共生メタノール資化性菌については、当初の計画通りに進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
RNAネットワークを内包した人工細胞の創成

生命の起源において、核酸や蛋白質などの化学物質から、進化する生命システムがいかにして誕生したのかという問題の解決は、生命科学が目指す大きな目標の一つである。したがって現在、生体分子複合体や、それらの相互作用が形成する人工遺伝子発現制御系を構築する必要性が高まっている。本研究では、以下三つの研究目標を定めた。(1)機能性RNA-蛋白質(RNP)複合体を試験管内で再構成できる基盤技術の開発、(2)RNPを利用した人工翻訳制御システムの試験管内構築、(3)人工脂質二重膜(リポソーム)内部に上記翻訳システムを内包した、人工細胞モデル進化系の構築。本年度は、特に課題(2)、(3)に焦点を絞り、人工脂質膜内部での翻訳制御システムの構築を達成した。具体的には、(a)PURE SYSTEMとよばれる精製蛋白質因子から構成される無細胞翻訳系をリポソームに内包し、個々のリポソーム内部での遺伝子発現を追跡、定量するシステムを開発した。また、(b)UV照射に依存してDNAやRNAに結合する低分子を利用した、光による人工翻訳制御システムを開発した。この低分子は、配列非特異的に核酸に結合するが、UV照射により、その相互作用が制御できる。この低分子とmRNAを含む無細胞翻訳系にUVを照射することで、翻訳が目的のタイミングで活性化できる。したがって、目的の基質や光照射に依存して、目的遺伝子発現のON/OFFを自在に制御できる人工細胞モデルの基盤技術を構築することに成功した。核酸や蛋白質などの化学物質から、進化する生命システムがいかにして誕生したのかという問題の解決は、生命科学が目指す大きな目標の一つである。本申請研究では、(1)機能性RNA-蛋白質(RNP)複合体を試験管内で再構成できる基盤技術を開発し、(2)このRNPを利用して、転写後の遺伝子翻訳を自在に制御できる人工翻訳制御システムを構築する。さらに、(3)このシステムを人工脂質二重膜に内包させ、in vitroにおけるRNAネットワークを内包した細胞モデルの実験進化系を構築する。本年度は、人工翻訳制御システムを内包した人工細胞モデルの作成に特に着目し、研究を進めた。具体的には、無細胞蛋白質合成系であるPURE SYSTEMを内包したリポソームを作成し、個々のリポソームにおける遺伝子発現反応をモニタリング・定量するシステムを新たに開発した(2008年度特許出願済、論文投稿中)。これはリアルタイムで複数のリポソームの動き、遺伝子発現を解析できるこれまでにないシステムであり、人工細胞モデル構築の基盤技術としての利用が期待できる。また、micro RNAなどの低分子RNAを基質として、翻訳をON/OFF制御する人工システムを構築し、これをリポソームに内包することで、目的低分子RNA存在時のみ遺伝子を発現する人工リポソームの作成に成功した。これらの研究成果は、RNAを入力因子として、目的の蛋白質の出力に変換できる、細胞内外で人工遺伝子回路を構築するための「人工情報変換素子」としての利用が期待できる。
建物外皮の熱放射特性および日射の反射指向特性の制御による融雪法の提案

落雪事故の原因となる恐れのある高層建築物の外装部材など雪処理の困難な部位に堆積した積雪を建物外皮の熱放射特性および日射の反射指向特性を利用し融雪する新たな手法の提案を目的として研究を行った。屋外でのモデル実験により、壁面の日射反射率の違いが外装部材(庇)の融雪に及ぼす影響を検討し、熱放射および反射特性を利用した融雪法の有効性を確認した。庇の日射吸収率を増した仕様と反射率の高い仕様を比較すると、庇の上に堆積した積雪の融雪時間の差は最大で50時間以上あった。放射解析の結果、庇の日射吸収率と壁面の反射率を高めた仕様の融雪能力が最も高いことが分かった。近年、室内環境改善や意匠性の向上を目的に庇やルーバーなど多様な外装部材が用いられるようになっている。これらの外装部材からの落雪事故が首都圏の高層建築物を中心に頻発している。建物を含む積雪地の放射環境については、積雪期には無雪期とは全く異なる放射環境が形成されることが示されており、建物外皮からの放射熱が融雪に寄与する可能性が既往研究から示唆されている。しかしながら建物外皮の熱放射特性および日射の反射指向特性を利用し外装材周りの融雪をする技術に関する研究は未だ行われていない。本研究は、落雪事故の原因となる恐れのある高層建築物の外装部材など雪処理の困難な部位に堆積した積雪を建物外皮の熱放射特性および日射の反射指向特性を利用し融雪する新たな手法の提案を目的とする。平成25年度は文献調査により、塗料の波長別反射特性などの基礎データの収集を行った。また、実建物の庇を対象とした観測を行い壁表面温度と庇の融雪状況に関するデータを得た。アルミ仕上げとした南面側の壁表面温度は氷点下の気温であっても日射により約50°C近くまで上昇し、庇上で壁面からの放射によるものと考えられる融雪が確認され、融雪法の検討に必要な基礎データを取得した。平成26年度は、建物外装(外壁-庇)における熱放射特性を利用した融雪法の検討のため、建物外装を対象とした放射解析を行い、融雪の促進に有効な仕様を明らかにした。次に、屋外において放射解析に基づいた仕様によるモデル実験を行い、庇および外壁の日射吸収率(反射率)が異なる仕様について計8ケースの融雪データを取得すると共に、熱放射および反射特性を利用した融雪法の有効性を確認した。落雪事故の原因となる恐れのある高層建築物の外装部材など雪処理の困難な部位に堆積した積雪を建物外皮の熱放射特性および日射の反射指向特性を利用し融雪する新たな手法を提案した。1)文献調査による基礎データの整理:塗料の波長別反射特性など数値解析等に必要なデータを整理した。2)建物外皮の放射特性の測定:サーモカメラを用いて、外皮表面仕上が異なる試験体を対象に表面温度の推移をインターバル計測し、気象条件と外皮放射特性に関するデータを整理した。3)外装部材の融雪に関するモデル実験:屋外でのモデル実験により、壁面の日射反射率の違いが外装部材(庇)の融雪に及ぼす影響を検討し、8ケースのデータを取得すると共に、熱放射および反射特性を利用した融雪法の有効性を確認した。降雪量20cm以上の条件で日射反射率の影響が顕著に見られ、庇の上に堆積した積雪の融雪時間の差は最大で50時間以上あった。4)熱放射特性を利用した融雪法の検討:建物外装を対象とした放射解析を行い、融雪の促進に有効な仕様を検討した。放射解析の結果、庇裏面の日射吸収率は大きい方が良く、積雪が少ないときの日射の吸収を考慮すると、庇表面の日射吸収率は大きい方が良いことが分かった。また、庇裏面の日射吸収率が大きいときは壁面の日射吸収率が小さい(反射率が大きい)ほど、融雪能力が大きくなり、長波長放射による伝熱は、対流放熱による熱損失が発生するため、反射日射による伝熱方式に比べ劣ることが分かった。屋外実験において、平年より少ない降雪であったが、実験準備が早かったため、所定のデータが入手できた。また、共同研究者が同一機関に所属しており、情報共有・打ち合わせ等が行いやすい環境であったことによる。雪氷工学平成27年度は屋外におけるモデル実験結果のデータを精査した上で、融雪法の提案に必要な実測および解析を行う。共同研究者が同一機関に所属しており、意思疎通および連携がはかりやすい環境であったことによる。屋外観測において、当初見込みよりも機器の損耗が少なく、観測機器の消耗品購入に充当する物品費に残額が生じたため。平成26年度は外装部材の融雪に関するモデル実験を行うと共に放射解析についても検討する。特許性が見込まれる場合は出願に向けた検討を行う。

観測機器の消耗品交換に充当し、測定精度の維持のため使用する。屋外観測において、当初見込みよりも機器の損耗が少なく、観測機器の消耗品購入に充当する物品費に残額が生じたため。残額が生じた物品費を観測機器の消耗品交換に充当し、データ精度の維持のため使用する。
海岸砂地における松枯れ被害跡地への広葉樹導入に関する研究

本研究では、海岸砂防林管理の一つの方向として、マツクイムシ被害を受けた砂地クロマツ林への在来広葉樹導入の可能性を検討するため、マツクイムシ被害跡地への広葉樹の侵入状況や在来広葉樹の砂地への導入、広葉樹の埋砂耐性等に関する研究を行った。1.海岸砂地におけるマツクイムシ被害林分の植生調査:鳥取県内のマツクイムシ被害を受けた海岸クロマツ林計36ヶ所の植生調査を行い、マツクイムシ被害後の林分遷移の現状と将来的な遷移の方向を検討した。クロボク土壌に成立した林分では常緑樹の侵入が目立ったのに対し、砂地上のクロマツ林では常緑樹の侵入は少なく、落葉樹の侵入が多く認められた。2.海岸砂地クロマツ林への広葉樹の導入調査:常緑樹が砂地クロマツ林で生育する条件を調べるために、砂地クロマツ林とそれを取りまくいくつかの環境条件下にスダジイとタブノキ植栽し、活着の程度や成長の種間差を調べた。その結果、裸地砂丘上や、松枯れで生じた林冠ギャップ内でのスダジイやタブノキの生育は困難であったのに対し、クロマツの林冠下ではスダジイやタブノキの活着は可能であった。またスダジイに比べタブノキの方が活着はよかった。タブノキはスダジイに比べ蒸散を抑え、水分を有効に利用していることが、砂地上での生存を支えているものと考えられた。3.樹木苗木の埋砂耐性に関する調査:スダジイ、タブノキ、クロマツの苗木を対象とし、実験的に埋砂処理を行い、苗木の生存に与える影響について検討を行った。その結果クロマツが最も埋砂に強く、以下タブノキ、スダジイの順であった。平成11年度は鳥取県の海岸砂地におけるマツ枯れ被害林分の植生調査と海岸砂地クロマツ林への広葉樹の導入調査を行った。マツ枯れ被害林分の植生調査に関しては鳥取県の海岸クロマツ林36ヶ所を選び植生調査を行った。その結果クロマツ林の上層に出現した広葉樹は、砂地上に成立するクロマツ林(砂クロマツ林)と森林土壌上に成立するクロマツ林(土クロマツ林)とで種組成や種数などに違いがみられた。土クロマツ林で出現率が高かったのはタブノキ、モチノキ、スダジイなどの常緑広葉樹であった。一方、砂クロマツ林で出現率が高かったのは、ハゼノキやヤマザクラなどの落葉広葉樹であった。土クロマツ林では植栽されたクロマツが枯死した後次第にシイ-タブ林へ移行していくと考えられる。砂クロマツ林は今後当面、上層に落葉樹が優占する広葉樹林へ移行すると考えられ、その後の土壌の変化によっては、シイ-タブ林が成立する可能性が考えられた。また海岸砂地クロマツ林への広葉樹導入としては、鳥取大学乾燥地研究センター内のマツ枯れ被害林分を中心に、林分、ギャップ裸地砂丘の3ヶ所に1年生のスダジイとタブノキを植栽し、活着と初期成長およびそれに影響する環境要因について予備的調査を行った。植栽1年目の生存率はタブノキ、スダジイともに林内で約7割、ギャップで約3割、裸地砂丘では全て枯死した。また、ギャップにおいて苗木の活着に最も大きなマイナス要因となるのは土壌の乾燥であると考えられ、砂丘マツ枯れ後地に広葉樹を導入する際にはまず土壌の乾燥対策が重要であることが明らかとなった。平成12年度は以下の調査を行った。1.海岸砂地におけるマツクイムシ被害林分の植生調査昨年度の補足調査として、主に下層植生の調査を行った。

土クロマツ林には常緑広葉樹、砂クロマツ林では落葉広葉樹の稚樹が多く出現する傾向が認められた。2.海岸砂地クロマツ林への広葉樹の導入調査平成11年度における予備実験の結果として、マツ枯れ被害林でのギャップ地において、植栽されたスダジイとタブノキの枯死が多く、その原因は主に土壌の乾燥に在ることが考えられた。本年度は鳥取大学乾燥地研究センター内のマツ枯れ被害林分内のギャップ地と林内において、スダジイとタブノキの2年生苗木を植栽した。苗木の一年間の生存率はギャップ地でスダジイが0%、タブノキが11%であり、林内ではスダジイが24%、タブノキが74%であり、昨年の予備実験同様ギャップ地での生存率の低さが顕著であった。またタブノキに比ベスダジイの生存率の低さも顕著に顕れた。また、ギャップ地での生存率向上を目的とし、ギャップ地での再生紙マルチを用いた植栽実験も行ったが、植栽したタブノキとスダジイはすべて枯死し、再生紙マルチの効果は認められなかった。同時に植栽したクロマツ苗木については27%の生存率がみられた。3.樹木苗木の埋砂耐性に関する調査平成13年3月より調査を開始した。現在調査を継続中である。平成13年度は以下の調査を行うとともに、3年間のとりまとめを行った。1.海岸砂地クロマツ林への広葉樹の導入調査平成11、12年度における実験の結果として、マツ枯れ被害林でのギャップ地において、植栽されたスダジイとタブノキの枯死が多く、その原因は主に土壌の乾燥に在ることが考えられた。またスダジイとタブノキを比較するとスダジイで生存率が低いことが明らかとなった。本年度は鳥取大学乾燥地研究センター内のグロースチャンバーを用い、急性の乾燥ストレスに対するスダジイとタブノキの生理生態的反応に主眼をおいた調査を行った。ポットに植栽したスダジイとタブノキで、灌水を停止した後のポットの水分状態変化を比較すると、タブノキよりもスダジイで土壌含水率の低下が激しく、スダジイの水消費が大きいことが示唆された。湿潤条件下での光合成速度はタブノキが大きく、蒸散はスダジイが大きかった。これによりタブノキに比較してスダジイの方が水利用効率が小さいことが明らかになった。2.樹木苗木の埋砂耐性に関する調査乾燥地研究センターの砂丘圃場に試験区を設け、完全埋砂区、2/3埋砂区、対照区の3段階の処理を行い、クロマツ、スダジイ、タブノキ苗木の生存課程を調べた。いずれの調査区においてもクロマツは最も生存率が高く、完全に埋没させた状態でも処理開始3ヶ月後に約半分の生存が認められた。これに対し、スダジイやタブノキは埋砂に対する耐性は弱く、特にスダジイにおいて大きな柿死率が見られた。完全埋砂区ではスダジイが枯死の開始も速度も速い結果を得た。タブノキはクロマツに比べると埋砂に対する抵抗性は弱いが、2/3の埋砂では枯死が少ないことも認められた。
高温超伝導量子干渉デバイスの作製及び雑音特性に関する研究

人間の脳の神経活動によって生ずる低周波磁気信号は、約0.1以下と低周波地磁気のさらに1億分の1以下と極めて弱い。現在のところリアルタイムでこれらの微弱な磁気信号を検出できるセンサーは超伝導量子干渉デバイスいわゆるSQUID磁束計以外にない。ニオブ(Nb)のような金属系超伝導体を用いた低温SQUIDでは既に10fT程度の磁場まで測定できるようになっており実際に脳磁場計が開発されている。但し、これを動作させるためには液体ヘリウム(温度:4.2K)による冷却が不可欠でありこれがシステムの大型化、高価格化を招き、普及を妨げる要因となっている。ところで、1986年の酸化物高温超伝導体の発見によって超伝導デバイスにおいて動作温度を液体窒素温度(77K)程度上昇させることを可能にした。本研究は生体磁気信号を検出するため、77Kで安定動作する高温SQUID応用を実現することを目指し、高温SQUIDの形状設計、作製及びその雑音発生機構の解明を行った。本申請者は、自分らが開発したバイクリスタル基板上にエピタキシャル成長したYBCO人工粒界ジョセフソン接合を用い、ワッシャー型DC-SQUIDの形状選定や実験結果と設計値との比較、校正等の方法で、設計パラメーター及び計算式を確定した。これらの結果を基づいて最適化した77Kで安定動作SQUIDは、再現性や対称性良く、最大出力電圧約24muV、最大磁束-電圧変換効率約68muV/phi_0の高い価が得られた。また、申請した超低雑音増幅器等を用いて、高温SQUIDの低周波1/f雑音の発生機構を調べたところ、その雑音の主な原因は磁束ゆらぎではなく、SQUIDを構成するジョセフソン接合の臨界電流ゆらぎであることを判明した。今後、これらの成果を基に、高温SQUIDの固有雑音発生機構をさらに解明し、雑音レベルを減少させていくことが重要な課題である。
超並列ハードウェア化に適したニューラルネットワーク・トポロジと問題の冗長分散表現

本研究では、並列処理の有力なパラダイムの一つであるニューラルネットワークの集積化を現実的なものとするために、以下の方針で研究を行なってきた。まず、ニューラルネットワークのアーキテクチャとして、2つの独立素子集合に分割可能な結線トポロジーを用いることにより、完全グラフ的配線を避ける。このようなトポロジーはグラフ理論の分野で二部グラフ構造と呼ばれているものである。また問題表現方式の冗長分散化によって、素子、配線の欠陥を許容し、歩留まりを向上する。ニューラルネットワークのハードウェア化に関して多くの研究が行なわれているが、大規模な相互結合型ニューラルネットワークをハードウェア化することは非常に困難な状況にあるといえる。また、相互結合型ニューラルネットワークの計算手法自体にも多くの問題があり、現状では十分な能力を持っているとはいい難い。本研究では、相互結合型ニューラルネットワークのハードウェア化を支援し、またネットワーク自体の能力を向上させることを目的として、2部グラフ構造のネットワーク・トポロジーを用いた。まず、ハードウェア化に関する問題と相互結合型ニューラルネットワークの計算方法が持つ問題点を指摘し、それらの多くを2部グラフ構造のネットワーク・トポロジーと新しく提案する学習アルゴリズムによって改善できることを示した。また、2部グラフ構造ボルツマンマシンを用いて連想記憶のシミュレーションを行ない、その学習能力と結合の障害に対する頑強性を検証した。
社会的相互作用障害における脳内ヒストン修飾作用の関与

小児自閉症の特徴の一つである社会的相互作用障害と脳内ヒストン修飾作用による遺伝子発現調節機構との関連性について調べるため、ヒストン修飾作用の一つであるアセチル化修飾に着目し、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の生後発達に伴う変化をPETで測定した。その結果、脳内におけるHDAC活性の局在を確認し、また、幼若期から成熟期にかけて増加することが確認された。本研究では脳内でのヒストン修飾作用を可視化することに成功し、将来、ヒト研究へと応用され社会的相互作用障害との関連性を明らかにすることが期待される。本研究では、小児自閉症の特徴である社会性行動障害と脳内における遺伝子発現調節機構のひとつであるヒストンへの修飾作用との関連について明らかにすることである。平成22年度は、小児自閉症のモデル動物の一つである胎生期VPA曝露により作成した自閉症モデルラットの生後発達期における脳内のヒストン修飾作用をin vivoで非侵襲的にイメージングするために、ポジトロンエミッショントモグラフィ(PET)によるイメージング法の確立に取り組んだ。ヒストン修飾作用のうちアセチル化に関与するヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)に着目し、PETプローブとして、HDAC阻害剤のsuberolyanilide hydroxamic acidの類縁体である^<18>F標識体である6-([F-18]-fluoroacetamide)-1-hexanoicanilide([F-18]FAHA)を合成することに成功した。また、[F-18]FAHA-PETにより、ラットの脳内におけるHDAC活性のPETイメージングを行い、in vivoでの脳内局在ならびに局所酵素活性の定量化に成功した。さらに、既存の様々なHDAC阻害剤の投与実験を行った結果、脳におけるHDACアイソザイムの部位特異性が明らかとなった。さらに、[F-18]FAHA-PETを行いマカクサルでも脳内でのHDACイメージングが可能であることを確認した。本研究では、可逆的な遺伝子発現調節機構のひとつであるヒストンへの修飾作用が社会性相互作用の障害との関連性を明らかにする。昨年度に引き続き、社会性相互作用が形成される生後発達期から成熟期に重点を置き、脳局所におけるヒストン修飾の変化を確認するために、ポジトロンエミッショントモグラフィ(PET)を用いたヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)のin vivoイメージングを行った。PETプローブにはHDAC阻害剤であるSAHAの類縁体で6-([F-18]-fluoroacetamide)-1-hexanoicanilide([F-18]FAHA)を用いた。ラットを4つの発達段階(4、8、24、96週齢)に分けて幼若から老齢までの脳における[^<18>F]FAHAの取り込み量を観察した結果、[^<18>F]FAHAは成熟期である24週齢まで増加し、老齢期では成熟期に比較して減少した。脳局所の変化では線条体および視床での[^<18>F]FAHA取り込み量が小脳や延髄よりも高値であった。これらの脳部位における[^<18>F]FAHAの取り込みはradio-TLC法による代謝物解析からHDACとの反応であることを確認し、また、in vitroオートラジオグラフィ法により、HDAC1,2,3および6の選択的な阻害を確認した。これらのことから、[^<18>F]FAHAによるin vivoでの脳内HDAC活性を捉えることに成功し、発達に伴い局所で変化する可能性が示唆される。遺伝子発現調節機構のひとつであるヒストン修飾作用と社会性行動障害との関連性を調べるため、ヒストン修飾作用の一つであるヒストンのアセチル化を調節しているヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)に着目し、脳内におけるHDAC活性をin vivoで観察するために、ポジトロンエミッショントモグラフィ(PET)による生体イメージングを行った。HDAC活性を可視化するためのPETプローブには、ヒドロキサム酸系HDAC阻害剤であるsuberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)の構造類縁体であり、ポジトロン放出核種のフッ素18(F-18)を標識した6-([F-18]-fluoroacetamide)-1-hexanoicanilide ([F-18]FAHA)を用い、ラットおよびマカクサルの脳内PETイメージングを行った。ラットおよびマカクサルの脳内HDAC活性を可視化する事に成功し、また、in vivoでの酵素活性測定法を確立した。また、死後脳の組織切片によるHDACの免疫染色を行った結果、PETイメージングで得られた脳局在と一致したことから、[F-18]FAHAがHDAC活性を反映していることが確認された。脳内における特異的なHDAC活性を確認した後、発達に伴う変化について調べた結果、幼少期から成長期にかけて、脳全ての領域でHDAC活性は上昇し、特に、海馬、線条体、大脳皮質および視床の領域で高値を示し、脳幹部および小脳は低値を示した。