hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内脂質ドメインの構成とダイナミクスの分子解析

1.ミトコンドリア・カルジオリピンドメインのアポトーシスにおける役割プロアポトティックファクターであるチトクロームCはカルジオリピンに選択的に結合するが、カルジオリピンハイドロパーオキサイドには結合しない.ミトコンドリアの脂質ハイドロパーオキシドグルタチオンパーオキシダーゼの過剰発現株を用いた解析からミトコンドリアでのカルジオリピンハイドロパーオキサイドの生成がチトクロームCの遊離の引き金を引いていることが示唆された。2.後期エンドソームのリゾピスホスファチジン酸ドメイン後期エンドソームはオルガネラの中に内膜構造を蓄積している。内膜は特異的なリン脂質、リゾビスホスファチジン酸に富んでいる。リゾビスホスファチジン酸特異的モノクローナル抗体および蛍光相関分光法を用いた解析から、リゾビスホスファチジン酸ドメインは後期エンドソームのルーメン側に局在していることが明らかになった。3.カベオレとグリコシルホスファチジルイノシトールドメイン多くの哺乳細胞には脂質ラフトとカベオレの2つの脂質ドメインが存在する。グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)でアンカーされたタンパク質はラフトに蓄積するがカベオレには集まらない。GPI-欠損株とカベオリン-1の高発現株を用いて、GPI-アンカータンパク質とカベオリン-1との間には負の相関関係があることを明らかにした。4.スフィンゴミエリン特異的タンパク質ライセニンはシマミミズから得られたスフィンゴミエリンを特異的に認識するタンパク質である。リコンビナントライセニンを用い、電子顕微鏡観察によりスフィンゴミエリンはカベオレ、エンドソームおよびトランスゴルジネットワークに蓄積しているがゴルジ体には検出されないことを明らかにした。酸性スフィンゴミエリナーぜの欠損症であるニーマンンピックA(NPA)細胞ではスフィンゴミエリンは後期エンドソーム・リソソームに蓄積していた。NPAでは脂質ラフトの成分であるコレステロールやガングリオシドGM1も後期エンドソームに蓄積しており、脂質ラフトの再分布が起こっていることが示唆された。脂質ラフトはスフィンゴ脂質(スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質)とコレステロールの集合体であり、生体膜上ではリン脂質が形成する不規則な二次元平面上に比較的規則正しく配列した「ドメイン」と呼ばれる微小領域を形成していると考えられている。脂質ラフトの動態についてはわからないことが多いが、これは主として脂質ラフトそのものを追跡する手段が乏しいことに起因している。糖脂質合成欠損株を用いた最近の解析結果は、脂質ラフトの形成にはスフィンゴ脂質としてスフィンゴミエリンの存在が必要十分であることを示唆している。シマミミズ体腔液から精製された毒素・ライセニンは297アミノ酸からなるタンパク質で、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞死を引き起こす。我々はリコンビナントライセニンを用い、細胞内のスフィンゴミエリンの分布を免疫電子顕微鏡法により解析した。その結果スフィンゴミエリンは形質膜、トランスゴルジネットワーク、早期エンドソーム、エンドソームキャリアー小胞および後期エンドソームに分布していることが示された。スフィンゴミエリンはゴルジ体で合成されるにもかかわらず、ゴルジ体にはスフィンゴミエリンは検出されなかった。スフィンゴミエリンの分布は提唱されている脂質ラフトの分布と良く一致する。

また基質への細胞接着に伴う細胞表面でのスフィンゴミエリンの動態を蛍光抗体法によって調べた結果、接着初期のラフリングの際にはスフィンゴミエリンはアクチンと挙動を共にするが、細胞接着後は両者は分離することが示された。ライセニンは6個のトリプトファンを含んでいる。各々のトリプトファン(W)をアラニン(A)に置換した変異体を作製したところ、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、毒性を持たない変異体(W20A)を得ることができた。この変異体を用いることにより、生きた細胞での脂質ラフトの解析が可能になった。脂質ラフトはスフィンゴ脂質(スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質)とコレステロールの集合体であり、生体膜上ではリン脂質が形成する不規則な二次元平面上に比較的規則正しく配列した「ドメイン」と呼ばれる微小領域を形成していると考えられている。脂質ラフトの動態についてはわからないことが多いが、これは主として脂質ラフトそのものを追跡する手段が乏しいことに起因している。糖脂質合成欠損株を用いた最近の解析結果は、脂質ラフトの形成にはスフィンゴ脂質としてスフィンゴミエリンの存在が必要十分であることを示唆している。シマミミズ体腔液から精製された毒素・ライセニンは297アミノ酸からなるタンパク質で、スフィンゴミエリンを特異的に認識し、細胞死を引き起こす。我々はリコンビナントライセニンを用い、細胞内のスフィンゴミエリンの分布について正常細胞と酸性スフィンゴミエリナーゼの欠損病であるニーマンピック・タイプA(NPA)とで比較を行った。NPAは正常細胞に比べ細胞内にスフィンゴミエリンが著しく蓄積した。スフィンゴミエリンは後期エンドソームのマーカーであるリゾビスホスファチジン酸、CD63を含むオルガネラに蓄積した。興味深いことにスフィンゴミエリンの後期エンドソームへの蓄積に伴い、ガングリオシドGM1、コレステロール、GPI-アンカー型タンパク質など一群の脂質ラフト構成成分が後期エンドソームに蓄積した。このことはNPAでは脂質ラフトの再分布が起こっていることを示している。
高スピン分極強磁性材料の探索とそのデバイス適合性の検討

高いスピン分極を示す強磁性材料の探索を点接触アンドレーフ反射法(PCAR)によるスピン分極率の直接測定により行った。Co2Fe(Z,Z')系ならびにCo2Mn(Z,Z')系4元系ホイスラー合金を中心に探索し、伝導電子分極率PPCAR>0.7でスクリーニングされた材料で良質の薄膜を作製し、薄膜の熱処理に伴うB2, L21規則化とスピン分極率の相関を調査し、新材料のスピントロニクス応用という観点からの適合性を検討した。新規探索されたホイスラー合金と種々のスペーサー層を用いて面直電流巨大磁気抵抗素子(CPP-GMR)を試作し、磁気抵抗出力の大幅な向上に成功し、再生ヘッド応用の可能性を検討した。従来の限られた3元系ホイスラー合金に合金設計の自由度を持たせるため、4元系ホイスラー合金等の強磁性合金の伝導電子のスピン分極率を点接触アンドレーフ反射法(PCAR)を用いて直接測定し、高い分極率を持つ強磁性合金の探索を行った結果、Co2Fe(Ge,Ga),Co2Fe(Si,Ge),Co2Mn(Ge,Sn)で高いスピン分極率が測定された。これらの材料で薄膜を作製し、強磁性共鳴(FMR)によりGilbertダンピング係数を測定した結果、L21構造を持つCo2Fe(Ge,GのはB2構造にくらべて低いダンピング係数を持つことが分かった。ホイスラー合金の磁気物性についてはデータが少ないので、今後これらの新材料のエピタキシャル膜を使って、結晶磁気異方性、ダンピング係数などを測定していく予定である。また、これらのホイスラー合金のデバイス適合性を検討するために、探索されたホイスラー合金を強磁性層、AgをスペーサとしたCPP-GMR素子を作製し、Co2Fe(Ge,Ga)合金を用いたCPP-GMRで、室温42%,10Kで120%という、世界最高のMR値を測定した。またこのCPP-GMR素子の発振特性を測定したところ、CPP-GMRとしては最高出力の高周波発振を検出した。現在、このCPP-GMRのハードディスク用ヘッド応用の可能性を検討するとともに、この材料を用いた、非局所スピンバルブを試作し、次世代ヘッドへの応用の可能性も検討中である。従来の限られた3元系ホイスラー合金に合金設計の自由度を持たせるため、4元系ホイスラー合金等の強磁性合金の伝導電子のスピン分極率を点接触アンドレーフ反射法(PCAR)を用いて直接測定し、高い分極率を持つ強磁性合金の探索を行った。その結果、Co2Fe(Ge,Ga),Co2Mn(Ge,Ga),Co2Fe(Si,Ge)が高スピン分極強磁性材料として有望であることが判明した。これらの探索材料を電極として、AgをスペーサとしたCPP-GMR素子を作製し、素子における伝導電子のバルクならっびに界面でのスピン散乱非対称性を評価し、室温で高い磁気抵抗がえられるメカニズムを検討した。また高いMR比の得られたCPP-GMR素子について、発振特性を評価した結果、これらの新材料で大きなGHz帯の発信振幅が得られることが分かった。さらに高密度磁気記録用再生ヘッドへの応用の可能性を検討するために、ホイスラー合金層の反強磁性交換結合を利用した3層磁気抵抗素子を試作し、そのMR特性ならびにノイズ性能を評価し、これが狭ギャップ高密度再生ヘッドとして有望であることを示した。さらにCo2Fe(Ge,Ga)合金とAgを使った面内スピンバルブを試作し、トンネル障壁をつかわない低電気抵抗LSVとしては最も高いスピン信号が得られることを示した。これまでに行ったPCAR測定により、Co2Mn(Ge,Ga), Co2Fe(Ge,Ga)などの4元系強磁性ホイスラー合金で、高いスピン分極率が得られることが分かった。これら新規探索材料を強磁性層、Ag, Cu, Cu2TiAlをスペーサとしたCPP-GMR素子を作製し、それらににおける伝導電子のバルクならびに界面でのスピン散乱非対称性を評価した。その結果CFGG/Ag/CFGGのCPP-GMRで高いMR出力が得られた。CPP-GMRの結晶方位依存性を初めて実験的に検証し、Heusler(001)//Ag(001)で最も高いMR出力が得られること、さらにCuの場合はHeusler(011)//Cu(111)の界面で最も高いMR出力が得られることを実験的に検証した。この結果にもとづき、[001]配向したCFGG/Ag多結晶CPP-GMR素子を作成し、実用性の高い多結晶素子としては従来報告されているものの中で、最も高いMR出力を得た。〔連携研究者〕物質・材料研究機構磁性材料センター三谷誠司スピン注入

磁化反転測定物質・材料研究機構磁性材料センター葛西伸哉微細加工・物性測定これまでに行ったPCAR測定により、Co2Mn(Ge,Ga), Co2Fe(Ge,Ga), Co2Fe(Si,Ge)などの4元系強磁性ホイスラー合金で、高いスピン分極率が得られることが分かった。これら新規探索材料を電極として、AgをスペーサとしたCPP-GMR素子を作製し、素子における伝導電子のバルクならびに界面でのスピン散乱非対称性を評価した。これらの材料で高いCPP-GMRが得られる原因を特定するために、磁気抵抗出力を磁性層厚さについて系統的に測定し、理論へのfittingの結果、バルクならびに界面スピン散乱異方性が極めて高くなっていることが分かった。また磁気抵抗出力を最適化するために、スペーサ層をAg, Cu, Cu2TiAlで比較し、全ての層がホイスラー層のCo2Fe(Ge,Ga)/Cu2TiAl/Co2Fe(Ge,Ga)三層素子で高いMR出力を低温アニールで実現できることを示した。申請時に提案したように、新規高スピン分極強磁性材料の探索に成功し、その新材料を種々のデバイスに展開して、いずれのデバイスでもこれまでの記録を更新する特性が得られている。25年度が最終年度であるため、記入しない。またCu2TiAl新規スペーサ材料ですぐれた磁気抵抗特性が得られることをみいだした。ハードディスクメーカーとの共同研究をすすめ、応用上のニーズや仕様を的確に掌握し、これまでの基礎研究でえられた成果をもとに、実用に適したデバイスに展開する。ハードディスクメーカーとの共同研究を進め、応用上のニーズや仕様を的確に掌握し、これまでの基礎研究で得られた成果をもとに実用に適した多結晶デバイスに展開する。
筋成長におけるメカノバイオロジー機構に基づいた革新的骨格筋組織作製技術の開発

前年度に引き続き、独自の手法により作製した筋組織モデルを利用して力学的刺激(負荷)が組織の成長に与える影響について評価した。これまでに、継続的な電気刺激によって運動負荷を与えることで筋組織の成熟化を促進することに成功している。そこで、より成熟した筋組織を構築することを目的として、さらに強い運動負荷を与えた(電気刺激のパルス幅を3ミリ秒から10ミリ秒に変更)ところ、筋組織の成熟度(収縮能)は同程度であった。したがって、組織の成熟化に運動負荷が効果的である一方、この手法のみで組織を成長させることには限界があることもわかった。そこで、運動負荷とは異なるメカノストレスに対する筋組織の反応性について検証した。具体的には、重量制御培養が可能な装置を使用して微小重力や過重力環境で筋組織を培養した。その結果、微小重力条件(10-3 G)では筋芽細胞の増殖や分化が抑制され、過重力状態(5 G)で培養することによって筋管分化が促進される様子が観察された。以上の結果から、重力環境が筋組織の成長に影響を与えることがわかった。これまでの研究結果から、運動負荷によって筋組織から産生されるIL-6が増大することも明らかにしており、重力負荷によっても同様にサイトカイン産生等に影響を及ぼすことについて今後検証していきたい。本研究において、運動負荷および重力負荷によって筋組織の成長を促進および抑制させるメカノバイオロジーに基づいた手法を確立することに成功した。筋組織作製技術およびそれに対して様々なメカノストレスを与えるシステムを構築したことにより、筋成長メカニズムと力学的負荷の関係性をより深く追究するための研究として今後有用である。特に、動的な負荷である運動負荷と静的な負荷である重力負荷による筋成長の相違点に着目したアプローチが有効と考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。生体の構造(特に配向性)を模倣した筋組織モデルを構築し、力学的刺激(負荷)が組織の成長に与える影響について評価した。具体的には、収縮能を有する配向した筋管組織を作製し、継続的に電気刺激を与えることによって筋収縮運動を一定時間継続させ、これが組織の収縮能に及ぼす変化を観察した。まず、パターン化温度応答性培養基材を用いてヒト骨格筋由来筋芽細胞を同一方向に配向させ、フィブリンゲルに張り付けた状態で基材から剥離させた。この状態で3週間程度分化誘導(たとえば、2%ウマ血清培地で培養)することにより、収縮能を有する筋管組織を得ることに成功した。この筋組織をコントロールサンプルとし、分化誘導1週間後から電気刺激条件下で2週間培養するサンプルを作製した。電気刺激条件としては、電圧10 V、パルス頻度1 Hzは固定し、duration timeおよび電気刺激継続時間・休止時間を変化させて最適な条件を検討した。電気刺激を1時間継続した後3時間休止する条件を繰り返し行ったところ、電気刺激を与えないコントロールサンプルと比較して収縮挙動が大きくなる傾向にあった。以上の結果から、上記の電気刺激条件により持続的な筋収縮運動を行わせることで筋組織の成長を促進する適度な負荷を与えられることが示唆された。また、筋収縮を持続させることで数種類のタンパク質産生が影響されていることがわかってきており、次年度以降に詳細を検討する予定である。以上の結果から、メカノバイオロジーの観点から筋組織への負荷と成長に関する知見を得るための組織作製技術および評価システムを確立することに一部成功した。次年度以降も負荷の種類を変化させることで筋成長に及ぼす影響を検討し、メカノバイオロジーの視点から組織モデルとしての有用性について評価していく予定である。骨格筋組織を機能化・成熟化する手法はすで確立しており、本研究を遂行するにあたり安定的に筋組織を得ることができている。その結果、様々な電気刺激条件における収縮挙動を観察することが可能となっており、筋成長を促進するための最適な刺激条件を見出すことに成功している。この条件で持続的に収縮運動を行わせることによる筋組織への効果は顕著であり、研究計画において期待された重要な結果を得たと考えている。さらに、共培養組織としての特徴として、線維芽細胞の存在が筋組織の成熟化に影響する様子が観察されており、本研究課題のテーマのひとつである異種細胞間で及ぼしあう影響についても興味深い結果が見られ始めている。さらに、神経細胞の導入についても検討中であり、ヒトiPS細胞から運動ニューロンに分化誘導させる実験に着手している。現時点で良好な結果が得られており、研究計画に沿って引き続き順調に進行できると考えている。前年度に引き続き、生体の構造(特に配向性)を模倣した筋組織モデルを構築し、力学的刺激(負荷)が組織の成長に与える影響について評価した。特に、継続的な電気刺激条件による筋組織の成熟化手法について詳細に検討した。電気刺激条件としては、電圧10 V、パルス頻度1 Hzで1時間継続して刺激した後3時間休止する条件を繰り返し行った。パルス幅を3ミリ秒として刺激を行った結果、電気刺激を与えないコントロールサンプルと比較して収縮挙動が十分に大きくなることを明らかにした。また、収縮能以外の評価項目として筋線維の構造について評価したところ、運動負荷2週間後にはコントロールサンプルと比較して顕著に太い筋線維ができることがわかった。以上の結果から、適度な運動負荷により構造的・機能的に筋組織を成熟させる手法を確立した。また、筋収縮を持続して行うことで筋組織から産生されるIL-6が増大することがわかった。この結果は、運動に伴い内分泌組織として筋組織が応答する生理的メカニズム解明に利用できることを期待させるものであった。

また、筋組織と線維芽細胞を共培養したところ、運動により組織全体が伸縮することで線維芽細胞も刺激を受け、線維芽細胞が産生するVEGFの量がそれに伴い増大することも確認した。このような異種細胞の協同的な反応に注目することで、より複雑な共培養組織を対象とした生体に近いレベルでのメカノバイオロジーを追究できると考えている。以上のように、メカノバイオロジーの観点から筋組織への負荷と成長に関する知見を得るための組織作製技術および評価システムを確立することに成功した。次年度はさらに重量負荷等の異なる力学負荷が組織の成熟度に及ぼす影響について検討する。最終的には、それらの知見を統合的に評価することでメカノバイオロジーの視点から組織モデルとしての有用性について検討していく予定である。収縮能を有する骨格筋組織を安定的に作製する技術をすでに確立しており、さらに電気刺激により継続的に運動させることで力学的負荷を与える手法も構築している。この手法を基盤として組織の成熟化を促進する最適な電気刺激条件を見出しており、メカノバイオロジーの観点から組織の成熟化を捉えることに成功している。さらに、異種細胞との共培養に着目した結果も一部得られており、さらなる展開として神経細胞の導入にも着手している。これまでとは異なる種類の力学的負荷として重量負荷培養システムを構築しており、現在このシステムを用いた研究も進行中であることから、研究計画に沿って順調に進行していると考えている。前年度に引き続き、独自の手法により作製した筋組織モデルを利用して力学的刺激(負荷)が組織の成長に与える影響について評価した。これまでに、継続的な電気刺激によって運動負荷を与えることで筋組織の成熟化を促進することに成功している。そこで、より成熟した筋組織を構築することを目的として、さらに強い運動負荷を与えた(電気刺激のパルス幅を3ミリ秒から10ミリ秒に変更)ところ、筋組織の成熟度(収縮能)は同程度であった。したがって、組織の成熟化に運動負荷が効果的である一方、この手法のみで組織を成長させることには限界があることもわかった。そこで、運動負荷とは異なるメカノストレスに対する筋組織の反応性について検証した。具体的には、重量制御培養が可能な装置を使用して微小重力や過重力環境で筋組織を培養した。その結果、微小重力条件(10-3 G)では筋芽細胞の増殖や分化が抑制され、過重力状態(5 G)で培養することによって筋管分化が促進される様子が観察された。以上の結果から、重力環境が筋組織の成長に影響を与えることがわかった。これまでの研究結果から、運動負荷によって筋組織から産生されるIL-6が増大することも明らかにしており、重力負荷によっても同様にサイトカイン産生等に影響を及ぼすことについて今後検証していきたい。本研究において、運動負荷および重力負荷によって筋組織の成長を促進および抑制させるメカノバイオロジーに基づいた手法を確立することに成功した。
乳癌健診に向けたNAF(乳頭吸引分泌液)中の新しい分子マーカーの探索

本研究は乳管内に存在する少量の分泌液(Nipple Aspiration Fluid、NAF)を対象にして、プロテオミクスの技術を用いて、早期乳癌の検出に有用な分子マーカーを検索し、最終的に新しい検診方法を開発することを目的とするものである。本研究で最大の難点はサンプル採取の方法であり、昨年行った検討により、採取を進めているが、プロテオミクスによる解析をするのに十分量を採取することが困難なことが多い。乳癌息者からは数10μl採取可能であるが、コントロールとすべき正常患者(非乳癌息者)からの採取が少量となっている。本点についてはさらに工夫をこらす必要がある。NAFの採取と平行して、乳癌組織、細胞を用いた実験により、乳癌の早期診断に有用なマーカーの検討も行っており、上皮増殖因子(EGF)ファミリーの1つであるアンフィレグリンに関してさらに詳細な検討を行った。アンフィレグリンを乳癌細胞に高発現させると細胞運動能、浸潤能の亢進が見られるが、そのメカニズムとして細胞膜分子であるアンフィレグリンの細胞膜貫通ドメインが核膜に移行し、ヒストンメチル化を引き起こすことが明らかになった。そこで乳癌細胞への遺伝子導入によりヒストンメチル化酵素の発現を亢進させると運動能上昇が見られ、ヒストンメチル化の阻害薬によりメチル化状態を下げると運動能の低下が認められた。ヌードマウスにおける腫瘍形成実験ではヒストンメチル化を亢進させた乳癌細胞で著明な増殖が見られた。ヒストンメチル化がNAFにおけるターゲット分子の1つになる可能性が考えられた。本研究は乳管内に存在する少量の分泌液(Nipple Aspiration Fluid、NAF)を対象にして、プロテオミクスの技術を用いて、早期乳癌の検出に有用な分子マーカーを検索し、新しい検診方法を開発することを目的とするものである。今年度は本研究の基礎技術をなすプロテオミクス解析の検討を腫瘍組織サンプルを用いて行なった。また、免疫組織学的方法を用いて、乳癌初期病変、前癌病変における有用な分子マーカー検索を行なった。プロテオミクス解析の検討として、倫理委員会の進行状況やサンプル入手の点から大腸癌サンプルを用いて、基礎的検旨討を行った。プロテオミクスの手法としては二次元電気泳動とmass spectrometry(MS)を用いたものが最もよく用いられているが、NAFのような体液の解析には種々の問題点が指摘されている。そこで2-nitrobenzenesulfenyl chloride(NBS)によりトリプトファン残其をラベルしてMSと定量的プロテオミクス解析を行なうNBS法による検討を行った。12例の大腸癌組織と非癌部組織を対象にNBS法で処理されたサンプルをMSで解析し、癌組織で非癌部の1.5倍以上、発現量に差のあるペプチド139個を得ることができ、そのうち128個を同定した。71個が癌組織で高発現、57個が癌組織で低発現していた。癌組織で著明に高発現しており、抗体が入手出来るもの6個(S-adenosylhomcysteine bydrolase, Galectinl, RAN, Zyxin, Vimentin, Reticulocalbin)についてウェスタン法および免疫組織染色を用いて、本法の妥当性を検証した。ウェスタン法で検討した結果、上記6分子はいずれも癌組織において著明な発現亢進を示した。また、免疫組織学的検討の結果、ウェンタン法同様、癌部で陽性所見が得られたが、大部分で癌細胞のみならず周囲の間質細胞にも発現亢進が見られ、特にGalectinlおよびVimentinは間質細胞に局在が認められた。NBS法はプロテオミクス解析に非常に有用であると考えられた。乳癌を用いて種々の分子の発現を免疫組織学的に検討した所、早期乳癌、DCIS、atypical ductal hyperplasiaの段階から発現亢進がしているものとしてヒストン修飾が注目された。本研究で最もcriticalな因子の1つはサンプル採取の方法である。そこで、今年度はサンプル採取法について検討を行った。インフォームド・コンセントの得られた患者およびヘルシー・ボランティアに対して、室温、加温方法、マッサージ・運動の有無、乳頭角質栓除去、体位、吸引時間などについて検討を行った。Nipple dischargeの見られる患者はマッサージを施行するだけで分泌液の採取が可能であった。一方、dischargeのない患者に対しては、室温を十分に暖めておいた上で、蒸しタオルで乳房全体を15分程度、加温を行ない、乳頭方向に向かうマッサージを1-2分程度、実施する場合が最も採取が容易であった。閉経期では乳頭に角質栓が見られるので、除去が必須であり、座位で約15秒の陰圧をかけるのが最も良かった。また、乳癌の早期診断に有用なマーカーを乳癌組織および正常組織を用いて調べたところ、アンフィレグリンに着目して詳細な検討を行った。免疫組織化学的にアンフィレグリンの発現状況を検討したところ、非癌部に比べて癌部の発現の亢進を認めた。また、アンフィレグリン低発現の乳癌細胞株に遺伝子導入したところ、運動能、浸潤能の著明な亢進が見られた。NAFにおけるターゲット分子の1つになる可能性が考えられた。

本研究は乳管内に存在する少量の分泌液(Nipple Aspiration Fluid、NAF)を対象にして、プロテオミクスの技術を用いて、早期乳癌の検出に有用な分子マーカーを検索し、最終的に新しい検診方法を開発することを目的とするものである。本研究で最大の難点はサンプル採取の方法であり、昨年行った検討により、採取を進めているが、プロテオミクスによる解析をするのに十分量を採取することが困難なことが多い。乳癌息者からは数10μl採取可能であるが、コントロールとすべき正常患者(非乳癌息者)からの採取が少量となっている。本点についてはさらに工夫をこらす必要がある。NAFの採取と平行して、乳癌組織、細胞を用いた実験により、乳癌の早期診断に有用なマーカーの検討も行っており、上皮増殖因子(EGF)ファミリーの1つであるアンフィレグリンに関してさらに詳細な検討を行った。アンフィレグリンを乳癌細胞に高発現させると細胞運動能、浸潤能の亢進が見られるが、そのメカニズムとして細胞膜分子であるアンフィレグリンの細胞膜貫通ドメインが核膜に移行し、ヒストンメチル化を引き起こすことが明らかになった。そこで乳癌細胞への遺伝子導入によりヒストンメチル化酵素の発現を亢進させると運動能上昇が見られ、ヒストンメチル化の阻害薬によりメチル化状態を下げると運動能の低下が認められた。ヌードマウスにおける腫瘍形成実験ではヒストンメチル化を亢進させた乳癌細胞で著明な増殖が見られた。ヒストンメチル化がNAFにおけるターゲット分子の1つになる可能性が考えられた。
マルトリンパ腫幹細胞ニッチと微小循環系の関連の解析

胃MALTリンパ腫と幹細胞、微小循環系、自律神経系の関連をサブスタンスPから検討した。ハイルマニイ菌感染マウスを用い、サブスタンスP陽性神経、受容体が、豊富に細動脈、細静脈周囲に認められ、幹細胞を含むMALTリンパ腫細胞上にも分布した。拮抗剤抑制効果からも、サブスタンスPの重要性が明らかとなった。また、MALTリンパ腫内にはVEGF, Vasohibin2が分布し、陽性細胞は一致せず、VEGF拮抗剤投与時にはVasohibin2が代償的に増加することが明らかとなった。臨床例の検討からサブスタンスP関与が示唆された。また、VEGF拮抗剤効果減弱にVasohibinが関与することが示唆された。ハイルマニイ菌感染系を用いて、形成された胃および肝MALTリンパ腫を対象として、リンパ腫内における幹細胞の分布、その近傍の微小循環系、自律神経、筋線維芽細胞、リンパ球、形質細胞の分布について組織化学的、電顕細胞化学的に検討した。また、MALTリンパ腫症例胃組織について同様な検討を行なった。1)ハイルマニイ菌感染マウスによる検討カニクイザルおよびヒト由来のハイルマニイ菌感染C57BL/6マウスに投与後、胃、肝臓組織を採取し、H.heilmanniiの局在およびVEGF-A, C,Flt-1, Flt-4, Flk-1, HGF, c-Met, CGRP, NK-1, RAMP1の局在について検討した。その結果、胃リンパ腫においては、VEGF-A, Cがその受容体を介してその増大に関与することが、明らかとなったが、胃以外の肝臓、肺については有効性は限られたものだった。次にsubstance P免疫活性陽性部について検討すると、陽性部位は腫瘍内に散在性に観察された。また、NK1R免疫活性は腫瘍全体に分散する微小循環系上に認められた。さらにsubstance P拮抗剤のspantide II投与により肝臓、肺、胃の腫瘍の有意な縮小を認めた。また、胃c- Met免疫活性はリンパ腫細胞、HGF免疫活性は毛細血管内皮細胞、HGFA免疫活性はその他の間葉系細胞に認められた。胃、肝臓、肺組織内に上皮細胞内浸潤を伴ったリンパ球の集積が認められた。c-Met拮抗剤投与により、肝臓と肺において有意に腫瘍が縮小した。2)症例による検討動物実験による検討と平行して、胃マルトリンパ腫症例の内視鏡的生検組織を用いた検討を行った。まだ、症例数は限られているが、マウスモデルと同様な免疫組織化学的結果が得られた。1)感染実験による検討2)臨床例における検討症例による検討に関しては、H.heilmannii陽性症例がかなり集積してきた。その疾患としては、MALTリンパ腫に加え慢性胃炎、鳥肌胃炎が主であり、Helicobacter pylori陰性例に限れば、その半数近くがH. heilmannii陽性例であることが明らかとなった。そこで、臨床例を用いて、substance P, NK-1R, CD31, Musashi-1陽性細胞の局在を検討した結果、マウスの結果とほぼ同様の所見が得られた。以上より、ヒトMALTリンパ腫においても、substance P拮抗剤が、Helicobacter pylori除菌療法や抗がん剤無効例において有意義であることが示唆された。まずピロリ菌の類縁で人獣共通感染症を引き起こすハイルマニイ菌感染マウスを用いた検討を行い、免疫組織化学を用いて胃MALTリンパ腫に関するsubstance Pの関与の検討を行った。その結果、リンパ腫との関連については、リンパ球に対する反復性刺激などによる炎症性のリンパ球の増殖が最初におこり、その後の遺伝子の転座などにより腫瘍化にいたると考えられているが、substance Pは、この初期の機転から関与することがあきらかとなった。すなわち、substance P陽性壁在神経およびその受容体のNK-1Rが、リンパ腫形成初期に豊富に分布し、substance P免疫活性陽性部位は輸入細動脈、輸出細静脈周囲に認められるだけでなく、幹細胞を含むリンパ腫細胞上にも分布した。さらに拮抗剤のspantide II、aprepitant投与により腫瘍増殖が抑制されることからも、MALTリンパ腫におけるsubstance Pの重要性が明らかとなった。さらに、VEGF, c-Met拮抗剤のAxitinib投与によるMALTリンパ腫形成についてVEGFとともに血管新生に促進作用をもつVasohibin2 (VASH2)の局在およびAxitinib投与時の変化について検討した。その結果、VEGF低下時にVASH2が代償的に増加することが明らかとなった。臨床例についての検討からは、qRT-PCRをハイルマニイ菌感染の判定に用いることが可能となったため、陽性率が向上し、症例が急速に集積しており、統計学的な検討が可能な症例の検討が可能となり、組織化学的手法でsubstance Pと幹細胞の検討も可能となった。その結果、マウスの感染モデルと同様にMALTリンパ腫形成にsubstance Pが関与することを示唆する所見が得られた。

また、MALTリンパ腫内にはVEGF, Vasohibin2が分布し、陽性細胞は一致せず、VEGF拮抗剤投与時にはVasohibin2が代償的に増加することが明らかとなった。臨床例の検討からサブスタンスP関与が示唆された。また、VEGF拮抗剤効果減弱にVasohibinが関与することが示唆された。感染実験による検討に関しては、免疫組織化学によるMALTリンパ腫に関するsubstance Pの関与の検討はかなり進んだ。その結果、リンパ腫との関連については、リンパ球に対する反復性刺激などによる炎症性のリンパ球の増殖が最初におこり、その後の遺伝子の転座などにより腫瘍化にいたると考えられているが、substance Pは、この初期の機転から関与すると考えられている。胃MALTリンパ腫の形成機転に関しては、Helicobacter属細菌をはじめとした抗原刺激によりまずpolyclonalな増殖が起こると考えられている。この点についてはH. heilmannii感染モデルを用いた検討から、substance P陽性壁在神経およびその受容体のNK-1Rが、リンパ腫形成初期に豊富に分布し、substance P免疫活性陽性部位は輸入細動脈、輸出細静脈周囲に認められるだけでなく、幹細胞を含むリンパ腫細胞上にも分布した。さらに拮抗剤のspantide II、aprepitant投与により腫瘍増殖が抑制されることから、MALTリンパ腫におけるsubstance Pの重要性が明らかとなった。臨床例についての検討では、qRT-PCRをH. heilmannii感染の判定に用いることが可能となったため、陽性率が向上し、症例が徐徐に集積しており、統計学的な検討が可能な症例の検討が可能となった。その結果、組織化学的手法でsubstance Pと幹細胞の検討も可能となった。その結果、マウスの感染モデルと同様にMALTリンパ腫形成にsubstance Pが関与することを示唆する所見が得られた。日経メディカルにて紹介された内容について記載しております。消化器内科、胃MALTリンパ腫、Helicobacter属感染次年度には、動物実験に関しては、VEGF, c-Met拮抗剤のAxitinib投与によるMALTリンパ腫形成について検討する。特に血管新生に関してはVEGFとともに血管新生に促進作用をもつVasohibin2 (VASH2)の局在およびAxitinib投与時の変化について検討する。また、感染マウスの全身的な検討から、Sjogren症候群に類似した涙腺におけるリンパ球集族を認めた。この変化はいまのところ唾液腺では観察されていない。この病変は、胃と同様にMALTリンパ腫への進展が想定され、その点もSjogren syndromeに近いと考えられ、Helicobacter属の感染がその病因の一つの可能性もあり、少なくともその実験モデルになると考えられる。そこで、Sjogren syndromeの診断に必須と考えられるSSA, SSB抗体、CD70陽性リンパ球の有無似ついて検討する予定である。また、症例による検討に関しては、qRT-PCRを用いることにより、H. heilmannii陽性例がMALTリンパ腫および胃炎症例で多く認められることが明らかとなっている。
架橋型アンチセンス核酸による転写活性制御法の開発

アンチセンス核酸は人間の体内において、標的遺伝子のみを特異的に不活性化することができるため、様々な分野で応用され、現在では医薬品化されるにいたっている。しかしながら、これら核酸誘導体による標的遺伝子の認識能力は、形成された二重鎖の安定性だけに依存しているため、安定性に大きな差のない配列を誤認識するオフターゲット効果が起こることがあり、問題となっている。そこで我々は、標的遺伝子を共有結合を介して配列選択的に捕捉することのできる遺伝子発現制御法の開発を本研究の目的と定めた。細胞中に存在するの過酸化脂質が核酸塩基部と付加体を形成することに着目し、その部分構造をモチーフとした4-オキソアルケナール基を導入した機能性核酸の開発を前年度に引き続き行った。4-オキソァルケナール基の保護方法を検討した結果、2-メトキシメチルフラン誘導体を与えることが明らかとなった。2-メトキシメチルフラン誘導体は、脱保護条件において、速やかに4-オキソアルケナール基を与えることから、これまでにない保護気を開発することができたといえる。この誘導体を導入したプローブと、相補鎖とのクロスリンク能を評価した結果、4-オキソアルケナール基の正面にシトシンが位置する配列の際に最も効率よく相補鎖とのクロスリンク反応が起こることを明らかとした。また、アデノシンが相補的な位置にきた際にもクロスリンク反応が起こり蛍光性の誘導体が精製することが明らかとなった。本年度においては、相補鎖と共有結合を介してクロスリンクする機能性核酸誘導体の合成と、相補鎖とクロスリンクする際の配列選択性について評価を行った。細胞中に存在するの過酸化脂質が核酸塩基部と付加体を形成することに着目し、その部分構造をモチーフとした4-オキソアルケナ-ル基を導入した機能性核酸の開発を行った。4-オキソアルケナール基の導入方法としては、プローブ核酸の5'末端にウレタン結合を介して導入する方法が最も簡便であることが明らかとなった。相補鎖とのクロスリンク能を評価した結果、4-オキソアルケナ-ル基の正面にシトシンが位置する配列の際に最も効率よく相補鎖とのクロスリンク反応が起こることを明らかとした。
光合成光化学反応中心IIでの反応ダイナミクス

ホウレンソウ葉緑体から分離した光化学系反応中心II複合体(PS II RC)での補欠分子の空間配置・反応ダイナミクスを明らかにするために以下の解析を行なった。我々は、この複合体に2分子結合するβ-caroteneの吸収極大が489nm(短波長型),507nm(長波長型)と異なることを見いだし、これを利用して、β-carotene分子を選択的に励起し、Chlorophylla(Chl a)へのエネルギー転移効率を測定し、両者の位置関係を探索した。その結果、PS II RC内で、色素のふたつのクラスターが存在すること、すなわちD_1タンパク質側には、光化学的に不活性なフェオフィチン、短波長型β-carotene分子、Chla_<665>、Chla _<675>、が存在し、D_2タンパク質側には光化学的に活性なフェオフィチン、長波長型β-carotene分子、Chl a_<670>、Chla _<675>、が存在することを明らかにすることができた。こうした各々の色素の同定は世界で初めてである。さらに磁気円偏光二色性を用いて、色素間の相互作用について解析を行い、色素間の相互作用が非常に弱く、紅色光合成細菌とは大きく異なることを明らかにした。反応ダイナミクスについては、藍色細菌(Synechococcus sp.PCC6803)の突然変異体を用いることにより解析を行い、D_1タンパク質の2分子のアミノ酸置換が電荷再結合反応に大きな影響を与えること、またこれが定常状態で観測される蛍光の変化を説明できることを明らかにした。こうした事実を基づいて、来年度以降、蛍光の和周波混合法により反応ダイナミクスを詳細に解析するための準備を始めた。
税法における裁判外の権利救済手続

本研究は、納税者の権利救済という観点から、現行の不服申立制度及びその前置主義並びに不服申立審理機関である国税不服審判所の構成や役割が、違法な租税の確定又は徴収が行われた場合に、納税者それを争い、その権利利益の保護を求めることを保障する制度及び手続になっているか否かという点を明らかにしようとしたものである。本研究では、税法の領域における現行の不服申立制度を納税者の権利利益を救済するための裁判外の権利救済手続と位置づけて、不服申立前置主義とその正当化理由の問題点、不服申立審理機関である国税不服審判所の審判官の構成の問題点などを検討し、裁判外の権利救済手続及び権利救済機関として考えられる改正試案を考察した。平成17年度は、資料収集を重点的に行い、租税争訟の現状を把握し、不服申立制度とその周辺領域の関連を概観した。また、ドイツにおける裁判外の権利救済制度との比較を念頭に、ドイツ租税基本法(Abgabenordnung-1977年AO)第7編「裁判外の権利救済手続」第347条から367条までを翻訳した。平成18年度は、前年度の研究を踏まえ、わが国における現行不服申立制度に関する問題点を検討した。その内容は、不服申立制度の沿革、不服申立前置主義とその正当化理由、不服申立前置主義の問題点、不服申立審理機関としての国税不服審判所審判官の構成及び審理機関としての問題点、さらに裁判外の紛争解決システム試案として、不服申立と訴訟の選択制、国税審判官の構成、審理の公開、市民審判員の採用などの提言を試みた。なお、平成18年3月に国税不服審判所編「国税不服審判所の現状と展望」(判例タイムズ社)が出版され、又、平成18年11月には日本税理士会連合会から「国税不服審判所のあり方についての意見」が出されるなど、現行の不服申立制度について議論がなされているところである。平成17年度は、当初の研究計画に沿って研究課題に関係する資料の収集に努めるとともに、わが国の不服申立制度について権利救済手続という観点から、不服申立前置主義の正当化理由が合理性を有するか否かという点について検討した。その結果、不服申立前置を強制することには以下のような疑問点があることが明らかになった。1.国税の賦課の大量性・反復性について正当化理由として主張されてきた課税処分の大量性・反復性については、申告納税制度の下での課税処分が申告納税を前提としていることから、その課税処分は補助的な役割を与えられているに過ぎず、課税処分をするについては、個別的な理由があり、個々の納税者に即した税務調査を経たうえで当該処分行われるのであるから、大量性・反復性ということが正当化理由としては十分な説得力をもつものとは言い切れない面がある。2.課税処分の専門性・技術性について課税処分の専門性・技術性については、納税者が課税処分に異議を申し立てる場合、課税庁の専門技術的な判断が税法の正しい解釈・適用に適合するかどうか、すなわち課税庁の知識と経験そのものが基本的な争点となるのであるから、課税処分の専門性・技術性を主張しても前置主義を強制することの正当化理由として十分な説得力をもつとは言い切れない面がある。3.裁判所の負担軽減論について裁判所の負担軽減論については、係争の事案の内容によっては法令の解釈問題など紛争の早期解決のために直ちに裁判所の判断を求めることが適切な場合も考えられ、そのような場合にまで納税者に不服申立の前置を強制することが合理性を有するかという点について検討する必要がある。

また、不服申立と取消訴訟の選択を納税者に認めたとしても、裁判所が訴訟の氾濫に悩まされるかどうかも明らかではないことなどから、両者の選択制にしたとしても、納税者は、それぞれの権利救済制度の特徴とそのもとでの救済の可能性、費用、労力等を総合的に判断して、この二つの争訟制度のいずれかを選択するのではないかということが考えられる。上記のことから、これまで主張されてきた不服申立の前置を強制する正当化理由については、十分な説得力をもつとは言い切れない面があることが明らかとなった。平成18年度は、当初の研究計画に沿って研究課題に関係する資料の収集を引き続き行うとともに、前年度に明らかにした権利救済手続としての不服申立前置主義の正当化理由に対する疑問に続いて、現行の不服申立審理機関が納税者の権利救済機関及び納税者と課税庁との紛争を解決する独立した第三者機関として適正にその機能を果たしうるのかという点について検討し、問題点を抽出するとともにその解決試案を示した。1.問題点としては、国税不服審判所は、あくまで国税庁の機関であり、審判所と主管部との間で常時人事交流が行われていることから、審理機関としての独立性・公正性が確保されているかという点が挙げられる。また、国税不服審判所長が通達等と異なる判断をする旨を申し出た場合に、国税庁長官は、国税不服審判所長に対して指示権限を行使する制度になっているが、審判所の独立性と公正性という観点から、当該指示権限を維持したままでの不服申立前置の強制に合理性があるのかという問題点を指摘した。2.上記問題点に対する解決試案としては、一般の行政事件のように不服申立と訴訟の選択制の導入が考えられる。選択制を導入したとしても、納税者は、それぞれの救済制度の特徴のもとで救済の可能性、紛争解決の手段を、費用・労力等を総合的に判断して、いずれかを選択して紛争解決の途を見出していくのはないかと結論を得た。また、国税審判官の構成についても、現行制度では、弁護士、税理士、公認会計士、大学の教授若しくは助教授、裁判官又は検察官などがあげられているが、兼職や非常勤が認められないことから、希望者が少ないのが現状である。この点については、兼職や非常勤を認め、さらに市民審判員の採用なども考えられるのではないかとの試案を示した。またイギリスの一般審判所の制度なども参考例として検討した。結論として、納税者と課税庁との紛争を解決する裁判外のシステムとして、あるいは納税者の権利救済制度としての現行不服申立制度(前置主義)は、その機能を適正に果たしうるよう改正されるべき時期にきているものと思われる。
D-セリン脳内代謝機構の解明と精神分裂病治療への応用に関する研究

本研究は、統合失調症のNMDA型グルタミン酸受容体機能障害仮説に基づいて、同受容体のアロステリックアゴニストであるD-セリンの作用を調節する分子機構をあきらかにすることにより、統合失調症のあらたな診断法および薬物治療法を確立することを目標課題としている。ほ乳類動物の中枢神経系においてD-セリンがNMDA受容体の内在性アロステリックアゴニストとして作用することから、本報告者はD-セリン脳内合成・代謝系に着目し、それにかかわる神経ネットワークを細胞レベルおよび分子レベルで明らかにすることを試みた。第一に、ラット大脳新皮質および線条体においてニューロンの細胞体をin vivoで選択的に破壊し、局所におけるDセリンおよび各種神経伝達物質の濃度の変化を調べた。その結果、D-セリン生合成には大脳皮質および線条体それぞれにおいて局所ニューロンが重要な役割を担っていることが明らかとなり、ニューロン-グリア細胞間の相互作用が推定された。第二に、differential screening法をもちいて、D-セリンによって選択的に発現が誘導される2種類の遺伝子を単離した。D-セリン投与後にラット大脳新皮質においてmRNA増加を認めた遺伝子dsr-1(D-serine responsive transcript-1)およびdsr-2の構造および組織発現分布があきらかとなった。本研究によって得られた知見に基づいて、今後D-セリン応答遺伝子のヒト遺伝子多型を解析することにより、疾患とのかかわりを解析して将来の臨床診断が可能となるとともに、この遺伝子産物(たんぱく質)を標的分子とする薬物をスクリーニングすることにより、内在性D-セリンの細胞外濃度を高めることによるNMDA受容体機能を改善する治療法の確立が可能となると考えられる。これらの遺伝子産物の機能を神経ネットワークのレベルでさらに解析することにより統合失調症に対する新規治療薬の開発の標的をあきらかにすることが期待される。本研究は、NMDA型グルタミン酸受容体コアゴニストであるD-セリンが、精神分裂病の難治性症状を改善する効果があると推定されていることから、脳内在性D-セリンの代謝機構にかかわる調節因子群を明らかにして、それらを標的分子とした精神分裂病の新しい治療薬を開発することを目的としている。本申請者は、differential cloning法の一つであるRNA arbitrarily primed PCR(RAP-PCR)法を用いて、D-セリンによってラット大脳皮質において発現が誘導される遺伝子転写産物を解析し、D-セリンの代謝および生理的機能に重要な役割を果たしていると考えられる分子の同定を行ってきた。cDNAクローニングの結果、D-セリン投与によって脳内で発現の上昇する2種類の転写産物を単離し、それぞれdsr-1(D-serine responsive transcript-1)およびdsr-2と名付けた。構造解析および組織分布の結果から、推測されるdsr-1遺伝子発現産物は、神経系でシナプス小胞膜などにおいてproton-ATPaseの他のサブユニットと相互作用する可能性、およびD-セリンの取り込みや放出を調節する役割を持つ可能性が考えられる。一方、dsr-2遺伝子産物は、中枢神経系にのみ発現しており、脳内局在としては、大脳皮質、海馬、線状体といった前脳部に多く存在する。すなわち、D-セリンの脳内分布に一致し、D-セリン分解系酵素であるD-amino acid oxidaseとは逆相関性の分布を示すことが明らかとなった。現在、dsr-1およびdsr-2の、ラットおよびヒトにおけるゲノム構造を解析中である。このように本研究によってはじめて明らかとなったD-セリン応答遺伝子は、いずれも、その構造、組織分布ならびにD-セリンに対する選択的応答性などから、中枢神経系において神経シナプス小胞機能の調節や、D-セリンの代謝に関わる遺伝子であることが推測される。

今後これらの遺伝子産物を中心としてD-セリンの代謝や作用に関わる分子機構を解明することにより精神分裂病の新規治療薬開発における標的候補分子が明らかとなると期待される。本研究は、統合失調症のNMDA受容体機能障害仮説に基づいて、受容体のアロステリックアゴニストであるD-セリンの作用を調節する分子機構をあきらかにすることにより、統合失調症のあらたな診断法および薬物治療法を確立することを目標課題としている。本申請者は、第一に、in vivoにおいてD-セリン合成にかかわる神経ネットワークを明らかにするために、ラット大脳新皮質および線条体においてニューロンの細胞体を選択的に破壊し、局所におけるD-セリンおよび各種神経伝達物質の濃度の変化を調べた。その結果、D-セリン生合成には大脳皮質および線条体それぞれにおいて局所ニューロンがなんらかの役割を担っていることが明らかとなり、ニューロン-グリア細胞間の相互作用が推定された。第二に、D-セリンによって選択的に発現が誘導される2種類の遺伝子をあきらかにした。D-セリン投与後にラット大脳新皮質においてmRNA増加を認めた遺伝子dsr-1(D-serine responsive transcript)およびdsr-2の構造および組織発現分布をあきらかにした。さらに、ラット、マウスおよびヒトにおけるそれぞれの遺伝子のゲノム配列をあきらかにして現在、D-セリンによってこれらの遺伝子の発現を調節をうける転写制御領域の解析をすすめている段階である。本研究によって、(1)D-セリン応答遺伝子のヒト遺伝子多型を解析することにより、疾患とのかかわりを解析して将来の臨床診断が可能となるとともに、(2)この遺伝子産物(タンパク質)を標的分子とする薬物をスクリーニングすることにより、内在性D-セリンの細胞外濃度を高めることによるNMDA受容体機能を改善する治療法の確立が可能となると考えられる。今後、これらの遺伝子産物の機能を神経ネットワークのレベルでさらに解析することにより上記目的達成を推進することができると思われる。