hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
消化器癌(胃癌・大腸癌)の転移の予知とその対策一生物学的分子腫瘍マーカーよりの検討

消化器癌の転移能(metastatic potential)を知るべく、病理組織学的多様性、腫瘍マーカーを含めた生化学、発育速度、癌の浸潤・転移に関与する遺伝子異常、血管新生因子などの諸因子などより転移予知の可能性を探っており、その成果は転移予知の重要な指標となりうる事が判明した。また実験的には、ヌードマウスを用いた同所移植による胃癌肝転移モデルの開発に成功し、PCR法を用いた肝微少転移巣の検出を試みているが、この同所性胃癌肝転移モデルの成功は、転移成立機序の解明、潜在的転移能、そして転移抑制実験を行なう上で重要なモデルとなった。一方、浸潤・転移に深くかかわっている細胞外基質分解酵素、マトリックスメタロプロテナーゼ(MMPs)とそのインヒビター(TIMPs)のRNAレベルでの発現、免疫組織学的検討、zymographyによる解析、血清中のMMPs、TIMPsを測定し、潜在性転移能の有無を胃癌組織で検討し、その成果を発表してきた。なかでも当研究所清木教授らにより同定された膜型MMP(MT-MMP)はMMP-2活性化因子として知られ、胃癌組織内でのMT-MMP、MMP-2の共発現している胃癌では、88%に静脈侵襲陽性であり、血行性転移との関連で注目された。また、MMP-7は胃癌組織において癌細胞特異的に発現し、分化型腺癌に優位であり、なかでも癌細胞の癌細胞の脈管内浸襲に重要であると考えられた。一方、胃癌細胞における転移成立に関与するその他の転移関連遺伝子群(血管新生因子、増殖因子、接着因子等)の検討を行なったところ、血行性転移においては血管新生因子vascular endothelial growth factor (VEGF)とMMPsの発現が著名で転移予知可能であることが判明した。最後に治療実験としてヌードマウス胃同所移植肝転移モデルを用いて高転移能を有するヒト胃癌細胞にTIMP-1遺伝子を外来性に導入し、この細胞を同所移植したところ、肝転移は著名に抑制されており、TIMP-1は転移抑制性に働いていることを確認しており、今後臨床レベルでの転移制御のための分子標的として注目に値する。最近癌転移の研究に分子生物学が導入され、なかでも高転移性細胞の生み出す多重的な形質や転移分子マーカーに関し研究が進められておりますが、未だ未解決の問題も多く、また転移を予測するassay systemも確立されていないのが実情である。そこで消化器癌の転移能(metastatic potential)を知るべく、病理組織学的多様性、腫瘍マーカーを含めた生化学、発育速度、癌の浸潤・転移に関与する遺伝子異常、血管新生因子などの諸因子などより転移予知の可能性を探っており、その成果は転移予知の重要な指標となりうることが判明した。また実験的には、ヌードマウスを用いた同所移植によるが胃癌肝転移モデルの開発に成功し、PCR法を用いた肝微小転移巣の検出を試みているが、この同所性胃癌肝転移モデルは今後の転移成立機序の解明、潜在的転移能、転移の自然史を知る上で重要である。一方、浸潤・転移に深くかかわっている細胞外基質マトリックスメタロプロテナーゼ(MMPs)とそのインヒビター(TIMPs)のRNAレベルでの発現、免疫組織学的検討、zymographyによる解析、血清中のMMPs、TIMPsを測定し、潜在性転移能の有無を胃癌組織で検討しその成果を発表してきた。

なかでも同研究所清木教授らにより同定された膜型MMP(MT-MMP)はMMP-2活性化因子として知られ、胃癌組織内でのMT-MMP、MMP-2の共発現している胃癌では、88%に静脈浸襲陽性であり、血行性転移との関連で注目された。更に治療実験としてヌードマウス胃同所移植肝転移モデルを用いて高転移能を有するヒト胃癌細胞にTIMP-1遺伝子を外来性に導入し、これを同所移植したところ、肝転移は著明に抑制されており、TIMP-1は転移抑制性に働いていることを確認しており、今後の遺伝子治療への展開が期待される。消化器癌の転移の予知を知るべく病理組織学的多様性、腫瘍マーカーを含めた生化学、発育速度、癌の浸潤・転移に関与する遺伝子異常、染色体の異常などの諸因子などより転移予知の可能性を検討してきた。更に浸潤・転移に深く関わっている細胞外基質(マトリックスメタロプロテナーゼMMPsとそのインヒビターTIMPs)の免疫組織学的検討、血清中のMMP、TIMPを測定し、潜在的転移能の有無を検討した。また実験的にはヌードマウスを用いた同所性胃癌肝転移モデルの開発に成功し、PCR法を用いた肝臓微小転移巣の検出を試みているが、治療実験として抗癌剤の効果的な投与法の開発、TIMP遺伝子導入による転移抑制実験を行った。本年度、得られた結果は以下の如くである。(1)教室独自で開発した胃癌の同所性肝転移モデルを用い肝転移を併発する群と併発しない腫瘍を特定し、これらの腫瘍の間で何が異なるのか?をがん遺伝子、細胞接着因子、メタロプロテナーゼ、血管新生因子など転移関連因子を多方面から比較検討したところ、ELAM-1,MT-MMP,VEGFが血行性転移に深く関与していた。(磨伊、高橋)(2)肝転移の予防には、どのような薬剤を、どの時期に、どのような経路で投与するのが最も効果的か?一定の見解の無いのが現状である。そこで胃癌肝転移例における転移発生時期は平均600日以前に発生し、肝動注が有効であることが判明した。(3)転移成立機序に関与する宿主側、とくに転移臓器におけるCytokine networkの病態と転移制御の可能性を検討したところ血管内皮細胞に発現しているELAM-1が接着因子として深く関わっていることが判明した。(4)基礎実験として実際のヌードマウスにヒト高転移胃癌細胞株を移植した肝転移モデルへTIMP遺伝子を導入し転移抑制実験に成功し、今後の分子標的治療に対し、新しい展開を迎えようとしている。消化器癌の転移能(metastatic potential)を知るべく、病理組織学的多様性、腫瘍マーカーを含めた生化学、発育速度、癌の浸潤・転移に関与する遺伝子異常、血管新生因子などの諸因子などより転移予知の可能性を探っており、その成果は転移予知の重要な指標となりうることが判明した。また実験的には、ヌードマウスを用いた同所移植による胃癌肝転移モデルの開発に成功し、PCR法を用いた肝微小転移巣の検出を試みているが、この同所性胃癌肝転移モデルの成功は、転移成功機序の解明、潜在的転移能、そして転移抑制実験を行なう上で重要なモデルとなった。
ニューラルネットワークによる履歴推定手法を用いたオンライン地震応答実験手法の開発

本研究は,構造部材あるいは架橋要素のみを対象に加力実験を行い,その他の部分については数学モデルを設定した地震応答解析を実施し,これらをコンピュータでオンラインに結ぶことにより建物全体の応答実験を進める手法である,サブストラクチャ・オンライン実験を対象に,その解析部分に用いる履歴特性に対して,ニューラルネットワークを用いた履歴推定手法の適用可能性を検討することを主目的としたものである.本年度の研究ではまず検討に用いるネットワークモデルとして,階層型ネットワークを設定し,実地震応答観測により得られた多層骨組のある層における復元力特性を教師データとして,他層の復元力特性の推定を試みた.ネットワークにおける入力ユニットには(1)最大経験変位,(2)最大経験荷重,(3)最小経験変位,(4)最小経験荷重,(5)最新の履歴折り返し点変位,(6)最新の履歴折り返し点荷重,(7)変位増分,(8)現在の変位,をそれぞれ設定し,出力値すなわち推定すべきデータとして現在の復元力を設定した.このネットワークに対して,昨年度までの検討で用いてきたバックプロパゲーション法(BP法)による学習法に加え,ムーアペンローズ一般逆行列を応用した学習法(WL法)も検討対象とし,両者の学習効率についても比較・検討した.その結果,WL法は従来のBP法に比較して学習時間の短縮ならびに推定誤差の低減に極めて有効であり,サブストラクチャ・オンライン実験における履歴推定における有力な学習方法となりうることが分かった.一方,履歴特性の推定精度を向上させるためには,教師データと推定すべきデータを最大応答時における変位ならびに荷重により基準化した上で学習・推定する必要があること,また応答開始初期における微小応答に含まれるノイズ除去による教師データの質の向上が履歴推定精度に大きな影響を与えること,を明らかにした.本研究は,構造部材あるいは架構要素のみを対象に加力実験を行い,その他の部分については数学モデルを設定した地震応答解析を実施し,これらをコンピュータでオンラインに結ぶことにより建物全体の応答実験を進める手法である,サブストラクチャ・オンライン実験を対象に,その解析部分に用いる履歴特性に対して,ニューラルネットワークを用いた履歴推定手法の適用可能性を検討することを主目的としたものである。本研究ではまず検討に用いるネットワークモデルとして,階層型ネットワークを設定し,バイリニア型復元力特性を対象に,履歴曲線の推定能力を検討した.入力ユニットには現在の変位,現在までの最小および最大変位,前ステップまでの最小および最大復元力、変位増分の6データを設定し,出力値すなわち推定すべきデータとして復元力を設定した.このネットワークに対して,(1)教師データと同一ループ上ではあるが推定ポイントが異なる場合の推定能力,(2)履歴面積が異なるループに対する推定能力,(3)学習時の最大許容誤差と推定能力の関係,(4)中間層ユニットの構成と推定能力の関係,(5)教師データ数と推定能力の関係,などについて検討した.その結果,履歴面積の異なるループを推定する能力は教師データの許容最大誤差と履歴ループ数に依存するが中間層ユニット数が推定結果に与える影響は小さいこと,推定すべき履歴ループの後半に生じるずれを修正し精度良くループを再現するためには相当数の教師データと学習回数が必要であり,許容誤差を1オーダー低減するためには学習回数,すなわち収束までに要する計算時間は数倍以上に増加することが明らかになった。本研究は,構造部材あるいは架構要素のみを対象に加力実験を行い、その他の部分については数学モデルを設定した地震応答解析を実施し,これらをコンピュータでオンラインに結ぶことにより建物全体の応答実験を進める手法である,サブストラクチャ・オンライン実験を対象に,その解析部分に用いる履歴特性に対して,ニューラルネットワークを用いた履歴推定手法の適用可能性を検討することを主目的としたものである.本年度の研究ではまず検討に用いるネットワークモデルとして,階層型ネットワークを設定し,Ramberg-Osgoodモデルを対象に履歴曲線の推定能力を検討した.入力ユニットには現在の変位,現在までの最大復元力および最大変位,履歴曲線上の最新の折り返し点(変位および復元力)の計5データを設定し,出力値すなわち推定すべきデータとして現在の復元力を設定した.このネットワークに対して,(1)学習時の最大許容誤差と推定能力の関係,(2)履歴面積が異なるループに対する推定能力,などについて検討した.その結果,許容誤差を10^<-3>および10^<-5>に設定した場合,いずれの場合においても学習値以外の入力に対する履歴特性の推定は可能であったが,その推定精度は許容誤差に依存し,許容誤差の小さい場合の方がその推定能力が高いことを確認した.また同時に,学習時の最小値を越える領域に対する推定能力には限界があり,その能力は出力値を算出する際の荷重係数に支配されることをニューラルネットワークの構成上の特性を定式化することにより明らかにした.本研究は,構造部材あるいは架橋要素のみを対象に加力実験を行い,その他の部分については数学モデルを設定した地震応答解析を実施し,これらをコンピュータでオンラインに結ぶことにより建物全体の応答実験を進める手法である,サブストラクチャ・オンライン実験を対象に,その解析部分に用いる履歴特性に対して,ニューラルネットワークを用いた履歴推定手法の適用可能性を検討することを主目的としたものである.本年度の研究ではまず検討に用いるネットワークモデルとして,階層型ネットワークを設定し,実地震応答観測により得られた多層骨組のある層における復元力特性を教師データとして,他層の復元力特性の推定を試みた.ネットワークにおける入力ユニットには(1)最大経験変位,(2)最大経験荷重,(3)最小経験変位,(4)最小経験荷重,(5)最新の履歴折り返し点変位,(6)最新の履歴折り返し点荷重,

(7)変位増分,(8)現在の変位,をそれぞれ設定し,出力値すなわち推定すべきデータとして現在の復元力を設定した.このネットワークに対して,昨年度までの検討で用いてきたバックプロパゲーション法(BP法)による学習法に加え,ムーアペンローズ一般逆行列を応用した学習法(WL法)も検討対象とし,両者の学習効率についても比較・検討した.その結果,WL法は従来のBP法に比較して学習時間の短縮ならびに推定誤差の低減に極めて有効であり,サブストラクチャ・オンライン実験における履歴推定における有力な学習方法となりうることが分かった.一方,履歴特性の推定精度を向上させるためには,教師データと推定すべきデータを最大応答時における変位ならびに荷重により基準化した上で学習・推定する必要があること,また応答開始初期における微小応答に含まれるノイズ除去による教師データの質の向上が履歴推定精度に大きな影響を与えること,を明らかにした.
イソチオシアナート由来チオヒダントインの抗酸化活性および生体内変化に関する研究

本研究は,食品成分であるチオヒダントインの抗酸化性ならびに調理加工への応用,生体内での動態解析をふまえたチオヒダントインの安定性を解明することを目的とした。測定原理の異なる3つの系で抗酸化試験を行った結果,チオヒダントインは抗酸化活性を有することが明らかになり,アミノ酸の側鎖構造に由来する部分構造により抗酸化性のメカニズムが異なることが示唆された。また,チオヒダントインは,酸性から弱アルカリ性で安定であり,高温,金属イオンの共存下でも比較的安定であることが示された。前年度に引き続き,食品中に見いだされるイソチオシアナート(アリル,3-ブテニル,4-メチルチオ-3-ブテニル)と各種アミノ酸から調製したチオヒダントイン(ATH-a.a, 3BTH-a.a, MTBTH-a.a)を用いて以下の実験を行った。1)3BTHを用いて各種pH条件下ならびに各種温度条件下におけるチオヒダントインの安定性を検討した。チオヒダントイン溶液をpH111に調整した緩衝液と混合して4°Cで静置し継時的に270 nmの吸光度を測定して残存率を調べた。3BTH-Phe, TrpはいずれのpHでも24時間後の残存率が5080%に低下し,144時間後には残存率が30%程度になった。そのほかの3BTHはpH18では極めて安定であり,144時間経過後も90%以上が残存していた。pH11では反応開始直後に5060%程度まで残存率が低下し,24時間後にはほとんど残存していなかった。次にpH5の緩衝液と混合し,25,36,50,75,100 °Cでの安定性を検討した結果,昨年度行ったATHの結果と同様,高温になるに従って3BTHの残存率の低下が早まったが,ATHよりも高温条件下での安定性が高かった。ATHおよび3BTHのUVに対する安定性を検討した結果,Trp, Tyr由来のものを除くチオヒダントインは1時間後に50%程度,2時間後には10%程度まで残存率が低下し,紫外線によって速やかに分解することが示された。2)ウサギ赤血球膜ゴーストを用いた抗酸化試験を行った結果,ATH-Tyrに脂質過酸化活性が認められた。3)βカロテン退色法を用いた抗リノール酸過酸化試験の結果,ATHに抗酸化活性が認められた。本研究は食品成分であるチオヒダントインの抗酸化性とそのメカニズムを解明するとともに,チオヒダントインの生体内における変化を解明することを目的としている。食品中に見いだされるイソチオシアナート(アリル,3ブテニル,4メチルチオ3ブテニル)と各種アミノ酸から調製したチオヒダントイン(ATH-a.a, 3BTH-a.a, MTBTH-a.a)を用いて以下の結果を得た。1)ATHを用いて各種pH条件下ならびに各種温度条件下におけるチオヒダントインの安定性を検討した。いずれのATHもpH17では極めて安定であり,168時間経過後も90%以上が残存していた。pH10,11ではいずれのATHも反応開始直後に50%程度まで残存率が低下し,24時間後にはほとんど残存していなかった。次にpH5の緩衝液と混合し,25,36,50,75,100 °Cでの安定性を検討した結果,25,36°Cでは,ATH-Lys, Ser, Thrを除くATHはきわめて安定であった。高温になるに従っていずれのATHも残存率の低下が早まったが,100°C,24時間後でも3080%が残存しており,高温条件下でも比較的安定であることが明らかになった。2)ABTSラジカル消去活性試験を行った結果,Gly, Glu, Tyr, Trp, Ser, Hisから調製したチオヒダントインに強いラジカル消去活性が認められた(IC50 842microM)。Gly, Gluはイソチオシアナートに由来する部分構造が変わっても活性の強さに変化はなかったが,Tyr, Trpの活性の強さはATH>3BTH>MTBTHとなった。ATHを用いてDPPHラジカル消去活性試験を行った結果,顕著な活性を示すものは見られなかった。2年間の研究期間で計画している項目は,(1)チオヒダントインの抗酸化性と化学構造との関連および抗酸化機構の解明,(2)チオヒダントインのpH,温度,光に対する安定性の解明,(3)チオヒダントインの生体内変化の解明である。現時点で,(1)と(2)の一部が終了した。

当初の計画では,23年度に(1),24年度に(2)と(3)を検討する予定であったが,生理活性試験の条件などを検討する必要性から,安定性試験を先に検討することとし,現在までにpHと温度に対する安定性試験を行った。安定性に関する検討はほぼ完了し,抗酸化試験については化学反応を用いる試験系が進んでいる。今後生体モデル系を用いた抗酸化試験を中心に行っていく予定であり,現在までのところ研究は概ね順調に進んでいると考えている。チオヒダントインの安定性試験については,現在,光に対する安定性,アルコール存在下における安定性について検討しているところである。ATHだけでなく,3BTH, MTBTHについても同様の検討を行い,イソチオシアナートの側鎖構造による安定性の比較を行う予定である。これらの実験は7月ごろまでに完了する予定である。また,リノール酸の自動酸化に対する抑制作用,NOラジカル消去活性について現在検討しており,これらの化学反応を用いた抗酸化試験を終えた後,酵素反応を用いるSOD様活性,ラット肝ミクロソーム,ウサギ血液を用いた生体モデル系での抗酸化試験を行っていく予定である。申請時には,23年度の研究経費として抗酸化活性試験用の試薬の購入代金を計上していたが,先に述べたように抗酸化活性試験の一部(生体モデル系)は23年度中に検討できなかったので,経費の一部を24年度に繰り越した。24年度は生体試料を用いた抗酸化活性試験や生体内変化に関する検討を行う予定であるため,繰り越した分も含めた研究費は主に抗酸化試験用試薬(ウサギ血液,ラット肝ミクロソームなど生体試料),代謝試験用試薬(ラット肝ミクロソーム,NADPH生成系試薬)や器具類の購入に使用する予定である。23年度に購入した備品(マイクロプレートリーダー)は,安定性試験と抗酸化活性試験で引き続き使用する。
斜橋・曲線橋の地震時衝突応答予測と落橋防止

ノースリッジ地震や兵庫県南部地震において発生した斜橋・曲線橋の落橋崩壊に対して,靭性が大きい特性を有する支承の使用ならびに橋台による桁変位の抑制によって落橋を防止する対策法について研究開発を行ったものである。研究の主点は、桁と橋台間に発生する衝突振動を明らかにすることであり,これにより桁端部や橋台の破壊程度の予測、本落橋防止法の実現の可能性を検証できることとなる.靭性が大きい支承によって支持された桁と橋台間の衝突振動は,入力地震動の僅かな差異によって大きく異なるカオス事象であることを示すとともに,入力強度、応答最大値と遊間の3者には相似性が成立することをシュミレーション解析および実験によって明らかにした.したがって、桁の衝突振動応答においては遊間量の影響が特に大きく,桁の振動特性、地震動の特性などその他の要因はあまり影響しない.衝突振動はカオス事象であるから、工学的には時刻歴解析より寧ろ応答最大値が重要となる.この応答最大値はカオス事象であってもエネルギー原理に支配されるため,予測可能であることを明らかにするとともに,入力強度,応答および遊間の3者間における相似性を保持しエネルギー原理を満足する応答最大値の予測式を開発した.さらに,この予測式をシュミレーション解析結果および実験結果と比較し,非常に良い精度で応答最大値の予測が可能であることが判明した.これにより,複雑な衝突モデルを使用したシュミレーション解析など行わずとも,予測式からの最大衝突速度による単発的衝突解析あるいは衝突実験により桁端部の破壊程度や緩衝材の効果を明らかにすることが容易となり,小さい遊間を採用した実用的な落橋防止法が確立できたことになる.ノースリッジ地震や兵庫県南部地震において発生した斜橋・曲線橋の落橋崩壊に対して,靭性が大きい特性を有する支承の使用ならびに橋台による桁変位の抑制によって落橋を防止する対策法について研究開発を行ったものである。研究の主点は、桁と橋台間に発生する衝突振動を明らかにすることであり,これにより桁端部や橋台の破壊程度の予測、本落橋防止法の実現の可能性を検証できることとなる.靭性が大きい支承によって支持された桁と橋台間の衝突振動は,入力地震動の僅かな差異によって大きく異なるカオス事象であることを示すとともに,入力強度、応答最大値と遊間の3者には相似性が成立することをシュミレーション解析および実験によって明らかにした.したがって、桁の衝突振動応答においては遊間量の影響が特に大きく,桁の振動特性、地震動の特性などその他の要因はあまり影響しない.衝突振動はカオス事象であるから、工学的には時刻歴解析より寧ろ応答最大値が重要となる.この応答最大値はカオス事象であってもエネルギー原理に支配されるため,予測可能であることを明らかにするとともに,入力強度,応答および遊間の3者間における相似性を保持しエネルギー原理を満足する応答最大値の予測式を開発した.さらに,この予測式をシュミレーション解析結果および実験結果と比較し,非常に良い精度で応答最大値の予測が可能であることが判明した.これにより,複雑な衝突モデルを使用したシュミレーション解析など行わずとも,予測式からの最大衝突速度による単発的衝突解析あるいは衝突実験により桁端部の破壊程度や緩衝材の効果を明らかにすることが容易となり,小さい遊間を採用した実用的な落橋防止法が確立できたことになる.ノースリッジ地震および兵庫県南部地震において、斜橋、曲線橋では落橋に至る崩壊が生じたものがある。この原因は、ピンおよびローラー支承の破壊後、橋台による拘束を逃れる変位が発生し、落橋に至ったものである。本研究は、ゴム支承などの高靭性特性によって支承の破壊を防止すると共に、地震時における桁と橋台の衝突を許容し、橋台による拘束を利用した落橋防止法を開発するものである。既に、ゴム支承支持された桁と橋台の地震時衝突応答の特性については研究済みであり、平成12年度は、この理論的に得られた衝突応答特性を実験によって検証した。まず、水平面内2方向の加振が可能となる振動台を作成し、振動台上に斜橋模型および曲線橋模型を設置し、それぞれの衝突振動の測定を行った。ゴム支承の変形量に相当する桁角部の振動中の最大変位、および衝突時の桁端部あるいは橋台被害の評価として桁重心位置における衝突前後の速度の最大変化量の測定を行った。振動台加速度の増加とともに、これらの応答量も全体的に増加はするものの入力には比例せず、最大応答量が小さい場合や大きくなる場合が混在するカオス挙動と同様の傾向を示した。理論的に桁と橋台間の遊間、入力強度、最大応答の3者に相似性が成り立ち、実験結果から斜橋模型、曲線橋模型共にこの確認を得た。さらに、衝突面にサンドペーパーを貼り、衝突時瞬間の状態を変えても、その応答性状はあまり変化せず、桁形状に起因する衝突時速度あるいはその方向の多様性に支配された応答特性となることが確認できた。現在、桁の振動特性の影響、入力加速度より入力速度の応答における支配性など実験的に検証を行っている。この検証後、桁の地震時衝突における最大応答予測式の開発を行う予定である。本研究は、地震時における斜橋、曲線橋の落橋崩壊を防止するため、高靭性特性有する支承を用いると共に、桁と橋台の衝突を許容し、橋台による桁変位の拘束を利用した落橋防止法を開発するものである。

その結果、桁変位や速度の応答量は、振動台加速度の増加とともに全体的に増加はするものの入力には比例せず、最大応答量が小さい場合や大きくなる場合が混在するカオス挙動と同様の傾向を示した。桁と橋台間の遊間、入力強度、最大応答の3者は、理論的に相似性が成り立ち、実験結果からも斜橋模型、曲線橋模型共にこれを確認した。さらに、反発係数や摩擦係数など衝突状態に関わる物理量は桁の最大応答にそれ程影響せず、桁形状に起因する衝突方向の多様性に支配された応答特性となることが確認できた。これらの成果は、11.に示した論文によって公表している。平成13年度は、桁の最大応答予測式の開発を行い、一方向両振幅における桁遊間が等しい斜桁の応答予測については、その数値シュミレーション結果と良好な一致を得た。現在、斜橋が水平2方向加震を受ける場合の最大応答予測への発展、さらに桁振動時の衝突遊間量が左右で異なる曲線橋についてその最大応答予測式の開発を行っている。平成14年度にはこれら予測式の完成をはかるとともに、衝突時緩衝材の効果を含めた橋台パラペットの破壊と移動、さらに地震時中における遊間量拡大に伴う桁応答の変化について研究を行う予定である。ノースリッジ地震や兵庫県南部地震において発生した斜橋・曲線橋の落橋崩壊に対して、靭性が大きい特性を有する支承の使用ならびに橋台による桁変位の抑制によって落橋を防止する対策法について研究開発を行ったものである。研究の主点は、桁と橋台間の発生する衝突振動を明らかにすることであり、これにより桁端部や橋台の破壊程度の予測、本落橋防止法の実現性を検証できることとなる。靭性が大きい支承によって支持された桁と橋台間の衝突振動は、入力地震動の僅かな差異によって大きく異なるカオス事象であることを示すとともに、入力強度、応答最大値と遊間の3者には相似性が成立することをシュミレーション解析および実験によって明らかにした。したがって、桁の衝突振動応答においては遊間量の影響が特に大きく、桁の振動特性、地震動の特性などその他の要因はあまり影響しない。衝突振動はカオス事象であるから、工学的には時刻歴解析より寧ろ応答最大値が重要となり、この応答最大値はカオス事象であってもエネルギー原理に支配されるため、予測可能であることを明らかにするとともに、入力強度、応答および遊間の3者間における相似性を保持しエネルギー原理を満足する応答最大値の予測式を開発した。さらに、この予測式をシュミレーション解析結果および実験結果と比較し、非常に良い精度で応答最大値の予測が可能であることが判明した。これにより、複雑な衝突モデルを使用したシュミレーション解析など行わずとも、予測式からの最大衝突速度による単発的衝突解析あるいは衝突実験により桁端部の破壊程度や緩衝材の効果を明らかにすることが容易となる。
消化管粘膜免疫の特殊性を応用した腸管免疫機構の統御療法

本研究は炎症性腸疾患の発症・慢性化機序解明のため、既存の研究とは全く視点を変え、研究代表者が独自に見いだした粘膜局所におけるIL-7を介した新しい免疫調節機構、活性化IL-7レセプター陽性腸管粘膜内リンパ球による炎症惹起機構の考え方に加え、腸管粘膜再生の概念を導入することにより、腸管局所免疫機構の特殊性を利用した新しい治療法の開発を目指す目的で行われた。本年度の研究では腸管上皮細胞が骨髄由来未熟T細胞に発現するIL-7受容体を表出することに注目し、腸管上皮細胞と腸管粘膜内T細胞が同じpathwayを通ることを推定し、ヒト骨髄由来細胞が内胚葉性の腸管上皮細胞に分化しうる可能性を見出した。男性ドナーより同種骨髄移植を受けた女性レシピエントの腸管生検組織を用いて、食道、胃、小腸、大腸においてドナー由来腸管上皮の存在を明らかとした。この結果はこれまで否定されてきた腸管外由来の上皮細胞の存在を示唆する。更に、正常部おけるドナー由来腸管上皮の頻度は低率であったが、上皮再生過程における検討でGVHDの回復期小腸再生上皮では約10-15倍の頻度の上昇を認めた。更に胃潰瘍辺縁の再生上皮では正常腺管に比べ、30-40倍の頻度でドナー由来上皮細胞の存在を認めた。従って、ヒト骨髄由来細胞は急激な上皮傷害を起こした腸管上皮の再生過程をレスキューする役割を果たしていると考えられる。本研究は腸上皮の病的状態、例えば難治性腸疾患における重篤な潰瘍性病変、炎症性病変に対して、骨髄由来細胞による粘膜上皮の再生を目指した治療法の開発につながるものとして注目される。来年度以降、現在解析しつつある腸管上皮の分化を制御する機構を担う分子に対するターゲット療法を開発することは今後、創薬に発展すると考えられる。
新規なインスリン受容体関連受容体の腎臓における生理的意義の解明

インスリン受容体ファミリーに属する新現受容体、インスリン受容体関連受容体(insulin receptor-related receptor,IRR)には、現在知られているインスリンファミリー(インスリン、インスリン様増殖因子など)はいずれも結合しないことが示されており、IRRはオルファンレセプターの一つである。従って、その媒介する生理作用は明らかではないが、IRRは腎臓・胃などに局在し、局所作用を媒介している可能性がある。今回、私はIRR mRNAの高発現臓器である腎臓をターゲットにIRRの生理的役割を検討した。ラットIRRに対する特異的抗体を作製し、Western blot法により腎臓では皮質部において特異的にIRRタンパク質が同定された。また、正常ラット腎臓に対するin situ hybridizationおよび免疫組織化学的アプローチによって、IRRが皮質部集合管上皮細胞全体の20-30%を占める介在細胞(B型)に特異的に発現していることを見出した。さらに、その分布の局性を検討したところ、主として上皮細胞のbasolateral側に局在していた。介在細胞(B型)の機能としては、管腔へのHCO_3。分泌による体内の酸・塩基平衡の調節が考えられている。従って、腎臓においてIRRが媒介する生理作用も、介在細胞特異的な体液バランスの調節に関与していることが示唆される。以上の研究により、今後さらに尿細管細胞の機能を制御する新しいシグナル伝達経路が発見される可能性もあり、血圧をコントロールする上で新たな医薬品開発への応用が期待される。また、これらの検討は、インスリンファミリーに属する新規生理活性物質と考えられるIRRのリガンド探索への手がかりになると考えられる。そのリガンド探索のための研究は現在進行中である。
核分葉と遺伝子発現調節の関係:好中球およびATL細胞を利用した研究

HTLV-1感染細胞が成人T細胞白血病・リンパ腫の腫瘍細胞へ多段階のステップを経て進展して行く過程を細胞表面のCD7、および癌抑制遺伝子産物であるCADM1の発現量の変化で解析できることを明らかにし、遺伝子のメチル化の網羅的解析の結果、この過程の変化は遺伝子のメチル化によって制御されていることが示唆された。腫瘍化の中間段階の細胞は無症候性キャリアの段階からすでに出現していた。multi-color FACSによるHTLV-1感染細胞のCADM1/CD7の発現レベルの解析を継続し今年度は約60例で解析を行った。その結果HTLV-1キャリアの段階からCADM1(-)/CD7 high(H)、CADM1(+)/CD7dim(D)、CADM1(+)/CD7low(L)の3つの集団が認められ、病態の進行とともにD、Lの集団が増加すること、末梢血中プロウイルス量が多い、異常リンパ球が増加している等の進行したキャリアではD、Lの集団にinverse PCRで共通のmajorなバンドが認められ、clonalな増殖とともにclonal evolutionが起こっていることなどを明らかにした。これらの分画をソーティングし、メチル化アレイ解析によりプロモーターメチル化の網羅的解析を行い、PからDへの進展に伴い大きくプロモーターメチル化のパターンが変化し、DとLではほとんど変化がなかったことから、HTLV-1キャリア、indolent ATL、acute ATLの症例でこれらの集団の遺伝子発現アレイ解析を施行した。クラスター解析の結果acuteのL、キャリア、indolent ATLに関わらずDとL、およびHがclusterされてきた。これらの結果はメチル化アレイ解析の結果から予測されたように、既にHTLV-1キャリアの段階からclonalに増殖を始めているDの集団は既にATLとしての基本的な性格をもった集団であることを示唆し、腫瘍化へ向けて病態の進行とともにこれらの集団が徐々に増加して行き、Acute typeのLの集団でさらに発現が変化する遺伝子、あるいはpathwayが最終的な腫瘍化に重要と考えられる。また、今回の結果はこれらの遺伝子発現パターンの制御にプロモーターメチル化が非常に重要な働きをしていることを示唆している。我々の開発したCD3/7の発現レベルを用いたmulti-color FACSによる急性型ATL細胞の検出系において急性型ATL細胞はCD3dim/CD7lowの分画に高度に濃縮されるが、同時にCD3dim/CD7dimの集団が検出されinverse PCRによる解析でこの集団は急性型ATL細胞と同じクローンであり、腫瘍化過程のHTLV-1感染細胞を検出している可能性が示唆された。急性型以外に慢性型ATL、無症候性キャリアの検体を80例解析した。その結果、キャリアから病型が進行するにつれてCD7dim/lowの集団が増加していくことが明らかになった。CD7 high、dim、negativeの3分画にソーティングを行い形態を観察すると、CD7 high画分は核異型が乏しいのに対して、CD7 dim分画では軽度の核のくびれが見られ、CD7 negative分画では核のくびれが強い花弁細胞が濃縮され、HTLV-1感染細胞の腫瘍化過程の進行に伴う表面形質の変化とともに核異型が進行していくことが明らかとなった。従来の解析系では、CD7high集団とCD7dim集団の分離が不完全で、CD7low集団についても一部非感染細胞が混入している可能性があり、より純度の高い細胞集団を解析するため、ATL細胞で高発現していることが報告されているCADM1の発現レベルを組み込んだ解析系を開発した。その結果HTLV-1感染細胞ではCD7発現レベルの低下とともにCADM1の発現が見られCD7high集団とCD7dim集団が明瞭に分離されることが明らかになった。これらの分画をソーティングにより分取し、メチル化アレイ解析によりプロモーターメチル化の網羅的解析を行い、腫瘍化過程に伴う遺伝子発現のエピジェネティックな制御の変化を解析し、核分葉化に関連する新たな遺伝子候補の検討を行っている。計画通り研究が進展している。HTLV-1感染細胞のCD7high集団とCD7dim集団をソーティングにより分取し、メチル化アレイ解析によりプロモーターメチル化の網羅的解析を行うことによって腫瘍化過程に伴う遺伝子発現のエピジェネティックな制御の変化を解析する。現在、3症例について上記の解析を行なったが、さらに症例数を増やして解析を行なう。また、同一症例において病型が進展した場合には解析を行ない、進展前と比較する。
中重度要介護者の在宅療養継続に向けた家族支援プログラムパッケージの開発と実用化

本研究は,中重度要介護者の在宅療養継続に向けた家族支援プログラムパッケージの開発とその実用化を検討することを目的としている。このパッケージは,研究代表者らが開発した家族介護生活評価チェックリスト(FACL)の測定結果に基づいて,家族介護生活の脆弱な側面に対して家族支援するものである。FACLに対応した家族支援は,介護家族や訪問看護師への面接調査や質問紙調査をもとに,在宅看護・家族看護の専門家・研究者でその支援内容を検討した。さらに,訪問看護師らを対象に聞き取り調査を実施し,現場での実用性を検討した。成果物として,中重度要介護者の在宅療養継続に対する家族支援プログラムパッケージを作成した。平成26年度は、家族支援プログラムパッケージの作成として、介護家族の在宅介護生活を多角的に評価する指標(家族支援生活評価チェックリスト,以下FACL)の側面に基づき、家族支援の方針を検討した。FACLの側面に基づく家族支援とは、FACLの7側面(生活と介護のバランス、緊急事態への心積り、家族介護肯定感、家族介護役割充足感、在宅介護の受容、介護に対する経済的余裕、十分な介護サービス)に対して、介護家族がWell-beingな状況で介護継続できるよう、家族の認知的変容と対処行動の向上を意識したもので、家族の自律・自立を目指した看護師の意図的な支援方略である。訪問看護を行っている専門看護師・認定看護師・教育担当者・管理者を対象に、これまでの看護経験の中から、FACL側面の家族支援に効果があった事例を想起してもらい、有効であった支援内容について、半構造化インタビュー調査を実施した。FACLの一側面である「家族介護肯定感」の形成・向上を促す支援として、6つの家族支援方略が明らかになった。現在、論文投稿に向けて準備を行っている。また、FACLの一側面である介護家族の「十分な介護サービス」の評価については、要介護高齢者の特徴、介護家族の特徴、利用している介護サービスの視点から、既存のデータを再分析している。残りの側面については、文献検討の段階である。平成27年度は、昨年度に引き続き、家族支援プログラムパッケージの作成として、家族介護者の在宅介護生活を多角的に評価する指標(家族支援生活評価チェックリスト、以下FACL)の側面に基づき、家族支援の内容を検討した。FACLの側面とは、生活と介護のバランス、緊急事態への心積り、家族介護肯定感、介護役割充足感、在宅介護の受容、介護に対する経済的余裕、十分な介護サービスの7側面である。「生活と介護のバランス」については、家族介護者の介護と仕事の両立、生活と介護のバランス保持に向けた対処行動について調査した。前者は家族介護者による質問紙調査、後者は文献検討とインタビューを実施した。インタビューの分析は平成28年度に持ち越しとなった。「十分な介護サービス」については、既存のデータを再分析した結果、医療的ケア数の多さ、介護者が担っている介護種類数の多さ、夜間介護、家族介護者の健康状態の不良等を特徴とした家族介護者が介護サービスを不十分と感じていた。「十分な介護サービス」は上記に該当する家族介護者の支援の検討が必要であることが示唆された。「家族介護肯定感」については、既存のデータを用い、家族介護者の対処方略と介護生活への影響を再分析した。この結果については論文投稿中である。さらに、既存のデータを基に、要介護者の性別と主に介護を担っている家族介護者の続柄について、既存のデータで分析を行った結果、妻を介護する夫や義父を介護する嫁で介護生活へのネガティブな影響をより強く感じているなどいくつかの特徴が明らかになった。これらの結果は家族支援プログラムパッケージに含めた。本年度は、家族支援プログラムパッケージを試作し、そのパッケージの内容的妥当性を検討する予定であった。FACLの7側面に基づいた家族支援を検討するにあたり、要介護者の性別と主介護者の組み合わせによる認知・対処の特徴と相違、家族介護者の利用している介護サービスの認識、生活と介護のバランス保持に関する既存の論文について検討を行い、前者は論文投稿、後者の2つは学会発表を行った。やや遅れているを選択した理由として、家族支援プログラムパッケージの臨床現場での実用化を重視した場合、多様の状況が想定されることから、その多様性を考慮して既存のデータを再分析したり、議論したりしたためである。平成28年度は、昨年度に引き続き、家族支援プログラムパッケージの作成とその実用化に向けて会議を行った。家族支援プログラムパッケージの作成では、家族介護者を対象に「生活と介護のバランスを保持するための対処行動」についてインタビューを実施した。その結果、「要介護者と家族の生活パターンを同調させる」、「家族介護者自身の身体の健康維持に努める」など6カテゴリーが抽出された。これらの結果は、家族支援プログラムパッケージの「生活と介護のバランス」の家族支援に含めた。また、家族介護者を対象にした既存の在宅介護の包括的な調査研究を用いて、家族介護者の生活に及ぼす在宅介護のネガティブな影響とポジティブな影響を検討した。その結果、家族介護者の社会機能障害の発現が介護犠牲という認識の前駆状態であり、社会活動制限感は自己犠牲を増悪し、気分転換は自己犠牲を軽減する対処方略であった。一方、ポジティブな認知評価や介護のペース配分でポジティブ心理は促進され、自己・家族成長の前駆状態であった。私的な支援追求や介護役割の受容が満たされれば、自己・家族成長が促進されていた。これらの結果は家族支援プログラムパッケージの「家族介護肯定感」の家族支援に含めた。以上、検討した家族支援内容について、訪問看護認定看護師を対象に家族支援内容の妥当性や家族支援プログラムパッケージの現場での実用性について会議を実施した。

その結果をもとに家族支援プログラムパッケージの緻密性を検討した。本年度は、家族支援プログラムパッケージの試用と実用化の検討をする予定であった。家族支援生活評価チェックリスト(以下、FACL)の7側面に基づき、家族支援プログラムパッケージの家族支援内容を検討しているが、臨床現場での実用化を重視すると、多様な状況が想定された。家族支援内容について家族介護者・要介護者の特性、介護以外の生活状況、状況に対する対処方略などを考慮し検討している。やや遅れている原因は家族支援内容の検討に最も時間を要したことからである。本研究の目的は、中重度要介護者の在宅療養継続に向けた家族支援プログラムパッケージの開発と実用化の検討であった。主要な結果は以下の通りである。家族支援プログラムパッケージは、介護家族の在宅介護生活を多角的に評価する指標(家族支援生活評価チェックリスト,FACL;堀口ら、2013)の7側面、生活と介護のバランス、緊急事態への心積もり、家族介護肯定感、家族介護充足感、介護に対する経済的余裕、十分な介護サービス、在宅介護の受容に基づき、文献検討や面接・質問紙調査を実施し、家族支援を検討した。具体的には、家族介護肯定感の形成・向上を促す支援として、訪問看護師に面接調査を実施し、介護の成功体験が得られる環境づくりなど6つの家族支援が明らかになった。生活と介護のバランスでは、生活と介護のバランス保持に向けた対処行動として、家族介護者に面接を実施し、要介護と家族の生活パターンを同調させるなど6つの家族支援が明らかになった。介護と仕事の両立では、主介護者に質問紙調査を実施した結果、両立には、主介護者の柔軟な働き方や介護量の調整などの必要性が示唆された。十分な介護サービスに関する調査では、医療的ケアの負担軽減、家族介護者の健康維持の重要性が示唆された。その他の側面は、訪問看護師、保健師、在宅看護の専門家と文献検討を基にグループディスカッションを行い、家族支援を明らかにした。最終年度となる平成29年度は、これまでの研究成果と文献検討を基に、家族支援プログラムパッケージを完成させ、その実用化を検討した。在宅現場での実用化に向けて、訪問看護ステーションの管理者・訪問看護認定看護師・教育担当者とグループディスカッションを行い、プログラムパッケージを精錬させた。完成した家族支援プログラムパッケージは、訪問看護で活用し,中重度要介護者を在宅介護している介護家族に対し、調査を進めている。本研究は,中重度要介護者の在宅療養継続に向けた家族支援プログラムパッケージの開発とその実用化を検討することを目的としている。このパッケージは,研究代表者らが開発した家族介護生活評価チェックリスト(FACL)の測定結果に基づいて,家族介護生活の脆弱な側面に対して家族支援するものである。FACLに対応した家族支援は,介護家族や訪問看護師への面接調査や質問紙調査をもとに,在宅看護・家族看護の専門家・研究者でその支援内容を検討した。
新生血管スプラウティングにおけるペリサイトの働き

組織や器官の再生においては血管系の新生・再生が不可欠であり、その機序を理解する事は極めて重要である。我々は新生血管の発芽機構について、特に血管内皮細胞周囲に存在するペリサイト(周皮細胞)の役割に着目して形態学的解析を進めてきた。背部皮膚に創傷を作成した創傷治癒モデルマウスを用い、内皮細胞マーカー(トマトレクチン、CD31)、ペリサイトマーカー(NG2 chondroitin sulfate proteoglycan)、および増殖細胞マーカー(BrdU)を用いて創傷部組織を多重免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡で三次元的に検索したところ、血管新生部に認められるほとんどの発芽中の新生内皮細胞にペリサイトが付随する事が明らかとなった。また、マウス腫瘍モデル(Lewis lung carcinoma細胞(3LL-MEIA株)を皮下移植)を用いて、創傷治癒モデル動物と同様の方法で内皮、ペリサイト、BrdUの分布を追跡したところ、ほとんどの新生内皮細胞にペリサイトが付随しており、創傷治癒モデルと極めて類似の所見が得られた。さらに、創傷治癒モデルを用いて血管内皮細胞と血管内皮増殖因子VEGF-Aに対する免疫染色を併せて行ったところ、VEGF-Aは線維芽細胞様細胞や、血管壁のペリサイトに分布することが明らかとなった。以上の結果から、血管新生の場においてペリサイトは内皮細胞の発芽部に密接し、血管内皮増殖因子VEGF-Aを産生することで、内皮細胞の発芽を積極的に誘導することが強く示唆された。この結果は、ペリサイトの生理的意義の新しい一面を示唆するとともに、内皮のみならずペリサイトをターゲットとして、血管新生の抑制を図る新たな方法を開発し、がん治療などに応用していく可能性も含むものと考えている。(1)病理組織の血管新生機序について、より詳細に理解するため、既存血管壁からの内皮細胞スプラウティングに加え、骨髄由来の間葉系幹細胞の血管新生への関与を検索した。マウス皮膚創傷治癒モデルを用い、血管内皮細胞マーカーとしてPECAM-1(CD31)、ペリサイトマーカーとしてNG2 proteoglycan、さらに間葉系幹細胞のマーカーとしてc-Kit(CD117)のそれぞれの抗体で多重免疫染色を施して共焦点レーザー走査顕微鏡で観察を行ったところ、PECAM-1陽性の血管周囲にc-Kit陽性の細胞群が分布することが観察された。これらの細胞は術後1日目から多数観察され、c-Kit陽性細胞が血管壁に密接して存在する像も往々認められた。さらに、このような密接部位では、c-Kit陽性細胞は内皮マーカーであるPECAM-1も同時に発現していることが明らかとなった。これらの所見は、局所における血管新生が、その場の既存血管壁からの内皮細胞のスプラウティングのみならず、血流に乗って局所に現れる間葉系幹細胞によっても引き起こされる可能性を示すものと考える。すなわち、間葉系幹細胞が既存血管壁に導入されて、新生血管内皮細胞として伸長を遂げることが推測される。BrdUを用いた過去の検索においては、血管新生部に増殖像を示す新生内皮細胞および新生ペリサイトの存在が多数確認されているが、上記のようにc-Kit陽性反応がPECAM-1陽性反応と共在する場面は往々認められたものの、対照的にc-Kit陽性反応がペリサイトマーカーのNG2陽性反応と重なる場面は全く認められなかった。このことは、血管新生局所で多数認められるペリサイトが、間葉系幹細胞からではなく、既存の血管壁ないしは周囲の結合組織から増殖(あるいは分化)することを示唆するものであり、興味深い所見と考えている。これらの成果については、平成17年の第110回日本解剖学会総会・全国学術集会シンポジウム「血管系をめぐって:部位特異性と形成機構の問題点」において発表を行う予定である。(2)新生血管のスプラウティングにおけるペリサイトの積極的な関与を探るため、マウス皮膚創傷治癒モデルを用い、血管内皮成長因子であるVEGF-Aに対する免疫組織化学染色を行った。biopsy punchを使用した本創傷モデルでは、術後5日目に血管新生のピークをみることがこれまでの検索で明らかになっているが、VEGF-Aの陽性反応は、術後5日目に新生血管に多数付随して認められるペリサイトに局在して観察され、ペリサイトによる血管内皮細胞増殖の促進の可能性が強く示唆された。この結果については平成16年の日本解剖学会関東支部第92回学術集会で発表を行った。これらの所見の普遍性に関しては、マウス腫瘍を用いた他の血管新生モデルにおいても検索を続行中である。また、以上に平行して、ペリサイトにおけるVEGF-AのmRNA局在の同定についても、上記の血管新生モデルでin situ hybridizationを行う準備を進めている。

また、マウス腫瘍モデル(Lewis lung carcinoma細胞(3LL-MEIA株)を皮下移植)を用いて、創傷治癒モデル動物と同様の方法で内皮、ペリサイト、BrdUの分布を追跡したところ、ほとんどの新生内皮細胞にペリサイトが付随しており、創傷治癒モデルと極めて類似の所見が得られた。さらに、創傷治癒モデルを用いて血管内皮細胞と血管内皮増殖因子VEGF-Aに対する免疫染色を併せて行ったところ、VEGF-Aは線維芽細胞様細胞や、血管壁のペリサイトに分布することが明らかとなった。以上の結果から、血管新生の場においてペリサイトは内皮細胞の発芽部に密接し、血管内皮増殖因子VEGF-Aを産生することで、内皮細胞の発芽を積極的に誘導することが強く示唆された。この結果は、ペリサイトの生理的意義の新しい一面を示唆するとともに、内皮のみならずペリサイトをターゲットとして、血管新生の抑制を図る新たな方法を開発し、がん治療などに応用していく可能性も含むものと考えている。
HGFにより誘導される核内転写因子の同定

HGFやTGFαは肝細胞に対する増殖因子として、またTGFβは増殖抑制因子として知られており、in vivoではこれらの増殖および増殖抑制因子が協調して肝再生を制御しているものと考えられている。これらの増殖因子による細胞増殖機序のうち、受容体以降のシグナル伝達機構は、Rasの活性化とそれに続くRaf/MAPK系が重要であることが主に癌細胞株を用いて明らかにされてきた。本研究では、初代培養ラット肝細胞を用いて、HGFやEGFがそれぞれの受容体チロシンリン酸化を経て、MAPK活性化からサイクリンD1発現に相加的に作用し、その結果DNA合成活性が相加的に増強されることを明らかにした。また、肝細胞の増殖抑制因子であるTGFβがサイクリンD1とサイクリンE1の間に作用し、サイクリンE1発現を抑制することでDNA合成活性を阻害することも証明した。一方、増殖因子によって誘導されたシグナルは最終的に核に伝達され、特異的な転写因子を誘導していると考えられるが、MAPK以降の分子機構は現在のところ不明である。一方、細胞周期はサイクリン/サイクリン依存性キナーゼ(cdk)により調節され、細胞が分裂・増殖する際には種々のサイクリン/cdkの活性化が生じているが、最初に発現増強するサイクリンはG1サイクリンであるサイクリンD1である。我々は増殖因子刺激によってサイクリンD1遺伝子発現が増強することに着目し、サイクリンD1遺伝子の5'上流領域を単離、その転写調節領域を解析した。その結果、増殖因子によって誘導される新規転写因子がサイクリンD1遺伝子プロモーターに結合することを見出した。平成10年度に実施した研究は以下の通りである。(1)ラット初代培養肝細胞に肝細胞増殖因子(HGF)を添加し、サイクリンD1遺伝子の発現誘導を確認した。(2)RT-PCR法を用いてラットサイクリンD1 cDNAをクローニングし、塩基配列を確認した。(3)(2)で確認したサイクリンD1 cDNAをプローブにしてラットgenomic DNAライブラリーをスクリーニングし、8個の陽性クローンを単離した。(4)これらのクローンの制限酵素マッピングを行い、5′flanking sequenceを含んだクローンを選択した。(5)このクローンに関して、全塩基配列と転写開始点の決定を行った。現在、このクローンを用いて、サイクリンD1遺伝子の転写調節領域を決定するために、種々の長さの5′flanking sequenceをレポーター遺伝子の上流に挿入したプラスミドを組み換え中である。一方、ラット初代培養肝細胞への電気遺伝子導入法の確立を目指し、エレクトリックセルジェネレーターを用いて種々の条件で検討しているが、約5%の細胞に遺伝子導入が可能となっている。ラット初代培養肝細胞に肝細胞増殖因子(HGF)を添加し、Northern blotを行ったところ、添加24時間後にサイクリンD1 mRNAの発現増強が認められた。ラットgenomic DNAライブラリーをラットサイクリンD1 cDNAをプローブに用いてスクリーニングし、6個のクローンを単離した。それらのマッピングを行い塩基配列を決定したところ、その中の1つのクローンにはサイクリンD1遺伝子5'上流-5 kbからエクソン3までが含まれていた。このクローンから5'上流領域を含む約6 kbのDNA断片を単離し、さらに種々の長さのラットサイクリン遺伝子5'上流領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したレポータープラスミドを作製した。サイクリン増強が確認されているラット肝癌細胞dRLh84にこれらのレポータープラスミドを導入し転写活性を検討したところ、-2.6から-1.5 kbの間に強い転写活性が認められた。現在、この領域に存在する転写調節領域を同定する目的で、dRLh84細胞およびHGFを添加したラット初代培養肝細胞の核抽出物を用いてDNaseIフットプリンティングを行っている。今後は、同定された転写調節領域からサイクリンD1の転写調節メカニズムを明らかとし、HGFに代表される増殖因子に誘導される転写因子の同定を進めていく予定である。

HGFやTGFαは肝細胞に対する増殖因子として、またTGFβは増殖抑制因子として知られており、in vivoではこれらの増殖および増殖抑制因子が協調して肝再生を制御しているものと考えられている。これらの増殖因子による細胞増殖機序のうち、受容体以降のシグナル伝達機構は、Rasの活性化とそれに続くRaf/MAPK系が重要であることが主に癌細胞株を用いて明らかにされてきた。本研究では、初代培養ラット肝細胞を用いて、HGFやEGFがそれぞれの受容体チロシンリン酸化を経て、MAPK活性化からサイクリンD1発現に相加的に作用し、その結果DNA合成活性が相加的に増強されることを明らかにした。また、肝細胞の増殖抑制因子であるTGFβがサイクリンD1とサイクリンE1の間に作用し、サイクリンE1発現を抑制することでDNA合成活性を阻害することも証明した。一方、増殖因子によって誘導されたシグナルは最終的に核に伝達され、特異的な転写因子を誘導していると考えられるが、MAPK以降の分子機構は現在のところ不明である。一方、細胞周期はサイクリン/サイクリン依存性キナーゼ(cdk)により調節され、細胞が分裂・増殖する際には種々のサイクリン/cdkの活性化が生じているが、最初に発現増強するサイクリンはG1サイクリンであるサイクリンD1である。我々は増殖因子刺激によってサイクリンD1遺伝子発現が増強することに着目し、サイクリンD1遺伝子の5'上流領域を単離、その転写調節領域を解析した。その結果、増殖因子によって誘導される新規転写因子がサイクリンD1遺伝子プロモーターに結合することを見出した。