hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大規模分散情報共有・配信に向けた適応型ピアツーピアシステムの研究

将来的な大規模分散情報共有・配信の基盤をコンテンツ配信ネットワーク(以下CDN)とピアツーピア(以下P2P)を有機的に統合する形で,しかも適応系として構築することを目指して,過去の研究成果も踏まえて,本年度は以下のような成果をあげた.(1)負荷変動に自律的に適応するためのトポロジーの動的最適化,ならびにコンテンツ配置の動的最適化について,P2Pネットワーク,さらに関連の深いアドホックネットワーク上で実現する方式を構築し,シミュレーション実験で有効性を検証した.成果は論文2件(他に投稿準備中3件)として結実した.(2)CDNの動的再構成への予備的な応用を試み,複数サーバの負荷変動にも対応できる動的拡大縮小や再構成の能力を持たせる方式を構築して,シミュレーション実験で有効性を検証した.成果は論文3件(他に投稿準備中1件)として結実した.(3)分散情報共有における信頼性確保のための効率的な方式について検討した.成果は論文1件(他に投稿準備中1件)として結実した.(4)動的に変化する,ないし動的に生成されるコンテンツの分散共有・配信について,重要性をますます増している状況を受け,効率的な方式の予備的な検討を,分散共有メモリや分散データベースの既存の成果も踏まえる形で行った.(5)アクセス誘導に用いるDNSの負荷変動とサーバ負荷変動との関係について重要な知見が得られたので,それに基づくアクセス誘導方式の効率化について予備的な検討を行った.分散システム設計に係わる最先端ソフトウェアツールの調達で,物品費が当初の予定を上回ったが,その寄与もあって,以上のように,予想を越える複数の新たな成果が得られた.将来的な大規模分散情報共有・配信の基盤をコンテンツ配信ネットワーク(以下CDN)とピアツーピア(以下P2P)を有機的に統合する形で,しかも適応系として構築することを目指して,過去の研究成果も踏まえて,本年度は以下のような成果をあげた.(1)負荷変動に自律的に適応するためのトポロジーの動的最適化,ならびにコンテンツ配置の動的最適化について,P2Pネットワーク,さらに関連の深いアドホックネットワーク上で実現する方式を構築し,シミュレーション実験で有効性を検証した.成果は論文2件(他に投稿準備中3件)として結実した.(2)CDNの動的再構成への予備的な応用を試み,複数サーバの負荷変動にも対応できる動的拡大縮小や再構成の能力を持たせる方式を構築して,シミュレーション実験で有効性を検証した.成果は論文3件(他に投稿準備中1件)として結実した.(3)分散情報共有における信頼性確保のための効率的な方式について検討した.成果は論文1件(他に投稿準備中1件)として結実した.(4)動的に変化する,ないし動的に生成されるコンテンツの分散共有・配信について,重要性をますます増している状況を受け,効率的な方式の予備的な検討を,分散共有メモリや分散データベースの既存の成果も踏まえる形で行った.(5)アクセス誘導に用いるDNSの負荷変動とサーバ負荷変動との関係について重要な知見が得られたので,それに基づくアクセス誘導方式の効率化について予備的な検討を行った.分散システム設計に係わる最先端ソフトウェアツールの調達で,物品費が当初の予定を上回ったが,その寄与もあって,以上のように,予想を越える複数の新たな成果が得られた.
グリア細胞による神経幹細胞の増殖開始時期の調節

本課題は、中枢脳神経幹細胞の活性化に及ぼすグリア細胞由来因子の作用を解析することで、発生時間と場の連携を理解することを目的とする。分子遺伝学的解析に優れたキイロショウショウジョウバエの幼虫期において、神経幹細胞の増殖分化は、幹細胞自身が持つ内在的な仕組みとは別に、摂食に伴う栄養シグナルによって細胞非自律的な仕組みで制御されている。特に、脳表層グリア細胞は血液脳関門を形成するだけではなく、体液中の栄養状態や種々のホルモンを認識し、発育段階に応じた神経幹細胞の増殖タイミングを制御している。本研究では、独自に見いだした分泌性インスリン結合蛋白質SDRに着目し、脳発育における機能解析を行った。SDRは、脳表層グリア細胞で発現し、休止期にある中枢脳神経幹細胞の分裂期開始の調節に関わることを見いだした。さらに、SDR変異体で生じる表現型の原因が、神経幹細胞のインスリンシグナルの低下によることを明らかにした。SDRと遺伝学的に相互作用する因子を探索した結果、もう一つの分泌性インスリン結合蛋白質であるImpL2を同定した。2種類のインスリン結合蛋白質が、脳内において競合的に機能することで、神経幹細胞のインスリンシグナルを制御していることを明らかにした。さらに、SDRとImpL2の機能的差違を生み出す要因として、細胞外基質への結合能が関与することを明らかにした。また、SDRは分泌性プロテアーゼMMPの基質になりうること、MMPがSDRと協調的に機能することで、インスリンシグナルを調節している可能性を見いだした。これらの結果から、2種類のインスリン結合蛋白質が、脳内において競合的に機能することで、栄養シグナルに応じた脳発育を厳密に制御していると思われる。神経幹細胞とグリア細胞の相互作用による発生時間と場の連携を理解する重要な知見が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本申請課題は、分子遺伝学的解析に優れたキイロショウショウジョウバエをモデル生物として用い、脳神経幹細胞の分裂開始に及ぼすグリア細胞由来の新規因子の機能解析と通して、発生時間と場の連携を理解することを目的とする。ショウジョウバエ幼虫期において、神経幹細胞の増殖分化は、幹細胞自身が持つ内在的な仕組みとは別に、細胞非自律的な仕組みで分裂開始が厳密に制御されている。特に、脳表層グリア細胞は血液脳関門を形成するだけではなく、体液中の栄養状態や種々のホルモンを認識し、発育段階に応じた神経幹細胞の増殖タイミングを制御する。本研究では、独自に見いだした分泌性因子SDRに着目し、脳発育における機能解析を行う。SDRが、どのように脳内でインスリンシグナル伝達経路を制御し、脳発育と脳構築に関わるかを多角的な視点で解析した。2017年度の研究実績として、組織学的解析および遺伝学的解析を中心として、SDR変異体で生じる表現型の原因が、神経幹細胞のインスリンシグナルの低下によることを明らかにした。さらに、SDRと遺伝学的に相互作用する因子として、分泌性インスリン結合蛋白質であるImp-L2を同定した。この結果から、2種類のインスリン結合蛋白質が、脳内において競合的に機能することで、脳発育を厳密に制御していることが明らかになった。神経幹細胞とグリア細胞の相互作用による分裂開始の仕組みを理解する重要な知見が得られた。栄養摂取に応じた神経幹細胞の分裂期開始は、グリア細胞由来のインスリン様ペプチドと神経幹細胞のインスリンシグナルが重要な役割を果たすことが知られている。リン酸化Akt抗体を用いた抗体染色および脳組織を用いた発現解析により、SDR変異体ではインスリンシグナルが低下していることが分かった。遺伝学実験により、SDR変異体の神経幹細胞でインスリンシグナルを亢進させると、表現型が回復した。これらの結果から、神経幹細胞の分裂期への移行遅延が、インスリンシグナルの低下によることが明らかになった。分泌性因子SDRは、インスリン様ペプチドと結合し、その機能を負に制御するだけではなく、正に制御する機能を有することが分かった。また、GFP融合SDR蛋白質を発現する遺伝子挿入系統を樹立し、GFP-SDRの局在を観察したが、現段階において脳組織内における明確な挙動を観察することはできなかった。一方、SDR遺伝子と相互作用する因子を遺伝学的に探索した結果、もう一つの分泌性インスリン結合蛋白質であるImp-L2を同定した。SDRとImp-L2の二重変異体では、SDR変異体の表現型が抑制されることが明らかになった。当初予定していた研究計画に対して、順調に進展していると判断する。

本研究では、独自に見いだした分泌性インスリン結合蛋白質SDRに着目し、脳発育における機能解析を行った。SDRは、脳表層グリア細胞で発現し、休止期にある中枢脳神経幹細胞の分裂期開始の調節に関わることを見いだした。さらに、SDR変異体で生じる表現型の原因が、神経幹細胞のインスリンシグナルの低下によることを明らかにした。SDRと遺伝学的に相互作用する因子を探索した結果、もう一つの分泌性インスリン結合蛋白質であるImpL2を同定した。2種類のインスリン結合蛋白質が、脳内において競合的に機能することで、神経幹細胞のインスリンシグナルを制御していることを明らかにした。さらに、SDRとImpL2の機能的差違を生み出す要因として、細胞外基質への結合能が関与することを明らかにした。また、SDRは分泌性プロテアーゼMMPの基質になりうること、MMPがSDRと協調的に機能することで、インスリンシグナルを調節している可能性を見いだした。これらの結果から、2種類のインスリン結合蛋白質が、脳内において競合的に機能することで、栄養シグナルに応じた脳発育を厳密に制御していると思われる。神経幹細胞とグリア細胞の相互作用による発生時間と場の連携を理解する重要な知見が得られた。SDR変異体の幼虫脳では、神経幹細胞の休止期から分裂期への移行が遅延し、脳発育の遅延を引き起こす。昨年度の研究結果から、SDR変異体の神経幹細胞は、インスリンシグナルが低下していること、変異体の表現型はインスリンシグナルの亢進により回復することが分かった。今後は、摂食に伴う栄養シグナルによって誘導される脳発育進行を理解する目的で下記の3点を中心に研究を実施する。(1) SDR遺伝子と相互作用する因子を遺伝学的に探索し、SDRがどのような機構で脳内インスリンシグナルを制御しているのか解明する。(2)引き続き脳内におけるSDR蛋白質の挙動と分布を組織学的に観察する。(3)SDRとImpL2の結合蛋白質を探索し、インスリン様ペプチドに対して機能的な差違を生み出す仕組みを解析する。これらの実験を通して、神経幹細胞とグリア細胞の相互作用による分裂開始の仕組みを解明し、個体レベルにおける神経発生の時間的調節の仕組みを明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
網羅的アミノ酸置換による光化学系IIの水素結合ネットワークの機能に関する研究

光化学系IIのMnクラスターとルーメンを繋ぐ複数の水素結合ネットワークのうち,D1-Y161 (YZ)などから構成されるネットワークに関与するD1-N298などのアミノ酸置換を行なった変異株を作出し様々な解析を行ったところ,この水素結合ネットワークはプロトン排出には関与していない可能性が高いことが分かった.D1-N298残基はYZの機能に重要であることが明らかになった.別の水素結合ネットワークであるD1-D61から始まる経路は複数存在するが,D1-R334, D2-E302, D2-E323側ではなく,D1-E65およびD2-E312側がプロトン排出に関与していることを示唆する結果を得た.我々は酸素発生型光合成における光化学系II複合体の酸素発生系とルーメンを繋ぐ3つの水素結合ネットワークの機能の解明を目指し,モデル生物の一つである緑藻クラミドモナスを用いて研究を行っている.この水素結合ネットワークは光化学系IIのサブユニットタンパク質(D1, D2, CP43, CP47タンパク質)のアミノ酸残基と水分子から構成されている.これらのタンパク質は葉緑体ゲノムにコードされているので,我々は葉緑体形質転換法を用いて,水素結合ネットワークに関与するアミノ酸残基それぞれを19種類の別のアミノ酸へ置換する網羅的改変を行い,光合成活性にどのような影響が出るかを調べている.平成27年度には,変異株の作出の完了していた10カ所に加え,新たに変異株を作出中であったアミノ酸残基4カ所について,それぞれ19種類の変異株の作出を完了させた.また,二次電子受容体であるYZ (D1-Y161)またはYD (D2-Y160)をフェニルアラニンに置換した変異株も作出した.変異株の作出と並行して,これまでに得られていた変異株の表現型,光化学系IIの蓄積および酸素発生活性を解析した.変異を導入しても光合成活性や光化学系IIの蓄積量にほとんど影響のないアミノ酸残基もあったが,光化学系IIは正常に蓄積しているにもかかわらず光合成できない変異株も数多く見受けられた.それらの中には,酸素発生系が正常に構築されていないと考えられる変異株や酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されたような変異株があった.これまでの結果から,酸素発生系からのプロトン排出において,複数の水素結合ネットワークがS状態遷移の各段階で使い分けられている可能性が示唆された.新たに4カ所のアミノ酸残基(D2-R294,D2-E302,D2-E312,D2-E323)について,それぞれ19種類ずつの変異株を作出した.二次電子受容体であるD1-Y161 (YZ)またはD2-Y160 (YD)をフェニルアラニンに置換した変異株も作出した.これまでに作出済みだった変異株のうち,D1-F339変異株およびD1-E65変異株の光合成的生育,光化学系IIの蓄積量,酸素発生活性を調べた.また,新たに作出したD2-R294変異株についても同様の解析を行った.D2-R294残基は酸素発生系から離れた位置に局在するが,その変異は光合成活性を著しく低下させた.この変異株の多くは嫌気条件下でよく生育するため,酸素の存在下で光阻害を受けやすいと考えられた.D1-N298変異株の熱発光の測定で検出されるシグナルの由来を同定するため,いくつかのD1-N298変異とD2-Y160F変異をもつ二重変異株を作出した.その結果,当初D2-Y160に由来すると考えていた熱発光シグナルが別のものに由来することを確認できた.D1-N298変異株を用いて,光化学系IIのMn定量およびQAからQB/QB-への電子伝達速度の測定を行った.また,D1-D61変異株およびD1-R334変異株については,Mn定量に加えて,酸素発生系におけるS状態遷移を調べるために熱発光の測定を行った.特にD1-N298変異株やD1-D61変異株では,酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されている株が見受けられた.これらのアミノ酸残基は,酸素発生系への水分子の流入や酸素発生系からのプロトンの排出に重要な役割を果たしていると考えられる.さらに,酸素発生系が正常に構築されていないと思われる変異株もあり,水素結合ネットワークが酸素発生系の構築に何らかの役割を果たす可能性が示唆された.我々は酸素発生型光合成における光化学系II複合体の酸素発生系とルーメンを繋ぐ3つの水素結合ネットワークの機能の解明を目指し,モデル生物の一つである緑藻クラミドモナスを用いて研究を行っている.この水素結合ネットワークは光化学系IIのサブユニットタンパク質(D1, D2, CP43, CP47タンパク質)のアミノ酸残基と水分子から構成されている.これらのタンパク質は葉緑体ゲノムにコードされているので,我々は葉緑体形質転換法を用いて,水素結合ネットワークに関与するアミノ酸残基それぞれを19種類の別のアミノ酸へ置換する網羅的改変を行い,光合成活性にどのような影響が出るかを調べた.

平成28年度には,これまでに作出済みであった14種類の変異株のうち,D2-R294,D2-E312,CP43-A411変異株の表現型,光化学系II蓄積量,活性を解析した.変異を導入しても光合成活性や光化学系IIの蓄積量にほとんど影響のないアミノ酸残基もあったが,光化学系IIは正常に蓄積しているにもかかわらず光合成できない変異株も数多く見受けられた.それらの中には,酸素発生系が正常に構築されていないと考えられる変異株や酸素発生系におけるS状態遷移が特定の段階で阻害されたような変異株があった.また,酸素発生系の光活性化に重要と思われるアミノ酸残基や光合成電子伝達成分の酸化還元状態に重要かもしれないアミノ酸残基も見つかった.これまでの解析結果と総合し,プロトン排出に関与している可能性のある水素結合ネットワークとそうでないものを区別することが出来,平成29年度に重点的に解析すべきターゲットを絞り込むことが出来たと考えられる.平成28年度には,これまでに作出していた形質転換体の解析を重点的に行った.特に,CP43-A411変異株およびD2-E312変異株の光合成的生育,光化学系IIの蓄積量,酸素発生活性を調べた.これらの解析により,当初プロトン排出経路と考えられていた水素結合ネットワークが実際には関与していない可能性を示唆する結果を得た.D2-R294を含む水素結合ネットワークはMn4CaO5クラスターからルーメンへとつながっており,水酸化の結果生成したプロトンの排出経路と考えられているが,D2-R294よりMn4CaO5に近いアミノ酸残基への変異(D2-E302およびD2-E323)は予想に反して酸素発生活性にそれほど大きな影響を与えなかった.このことから,D2-R294はYDの機能に重要である可能性が出てきた.その可能性を調べるために,YDおよびD2-R294の二重変異株を作成した.D2-R294残基への変異は光合成活性を著しく低下させ,酸素の存在下で光阻害を受けやすいが,比較的強い光強度で生育させると,変異株のPSII蓄積量や光合成活性がコントロール株に近づいた.このことから,D2-R294は酸素発生系の活性化になんらかの役割を果たしている可能性が考えられた.D1-N298変異株を用いて,光化学系IIのMn定量およびQA-からQB/QB-への電子伝達速度の測定を行い,還元側の機能はあまり影響を受けていないことを確認した.また,共同研究により,酸素発生活性を検出できなかった変異株の閃光照射による活性測定を行なった結果,酸素発生系の急速な失活でなく,S状態遷移が正常に起こらないために酸素発生しないことが確認できた.光化学系II(PSII)複合体の酸素発生系(Mn4CaO5)とルーメンを繋ぐ複数の水素結合ネットワークの機能の解明を目指し,緑藻クラミドモナスを用いて,水素結合ネットワークを構成するタンパク質(D1,D2,CP43,CP47)のアミノ酸残基を別のアミノ酸へ置換する網羅的改変を行い,その変異が光合成活性に及ぼす影響を調べてきた.平成29年度にはこれまでの手法に加え,PSIIの一次電子受容体QA-の再酸化速度の測定を行った.私たちのこれまでの研究から,水素結合ネットワークの一つであるYZ経路のD1-Asn298がMn4CaO5の機能に重要であり,この経路がMn4CaO5で生成する4プロトンのうちの少なくとも1つの排出に関与すると示唆していた.しかし,D1-Asn298はYZの機能に重要であり,YZ経路のアミノ酸残基のうち,D1-Asn298よりルーメンに近いアミノ酸残基への変異は光合成的生育にそれほど大きな影響を与えなかったことから,YZ経路はプロトン排出には関与しない可能性が示唆された.水分子の輸送に関与すると考えている.一方,D1-Asp61の側鎖の負電荷がプロトンの排出に重要な役割を果たしていることが変異体の解析と共同研究による構造解析から明らかになった.
液滴操作によるマルチマテリアル微細３Dプリンティング技術の開発と応用

2光子マイクロ光造形法は、最も高精細かつ微細な3Dプリンティングである。従来は、単一の光硬化性樹脂で3D微小構造体が作製されてきたが、多様な機能デバイスを作製するには、複数種の材料を組み合わせたマルチマテリアル造形が不可欠となっている。本研究では、我々が考案した「局所加熱による温度勾配によって、微小な樹脂液滴を遠隔操作する方法」を用いて、複数種の材料を入れ換えながら3D構造体を一体作製できるマルチマテリアル3D造形法を開発する。まず、温度勾配による樹脂液滴駆動の基本原理を解明し、さまざま光硬化性樹脂の駆動特性を明らかにする。そして、本手法をフォトニクス、MEMS、医療など幅広い分野へ応用する。
核膜融合に必須な分子シャペロンJemlpと相互作用する核膜タンパク質の機能解析

本研究では,出芽酵母小胞体の分子シャペロンJem1pと相互作用する,出芽酵母の新規核膜タンパク質Nep98pの機能解析を目的として研究を行なっている.本年度は,Nep98pの機能および機能領域の解析を行なった.遺伝子破壊実験によって,Nep98pの機能が酵母の増殖に必須であることが示されている.そこでNep98pの機能する過程を明らかにするため,Nep98pに関する温度感受性変異株の作製を行なった.得られた温度感受性変異株を制限温度にシフトすると,G2/M期に対応する細胞の割合が増加した.また,そのような細胞中では核分裂の進行に欠損が観察され,抗チューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって,スピンドル形態に異常を示すことが明らかとなった.電子顕微鏡を用いた解析から,nep98温度感受性変異株ではスピンドル極体の構造に異常を持つことが明らかとなった.以上の結果から,Nep98pはスピンドル極体の機能発現に必須な役割をはたしていると考えられる.スピンドル極体の機能は,酵母接合時の核融合にも必要であり,nep98温度感受性変異株の接合子は2つの1倍体核の接近と核外膜の融合の過程に欠損を示すことが明らかとなった.Nep98pは膜貫通領域を1つ持つ膜内在性タンパク質であり,N末端をサイトゾル側に向けたトポロジーをとる.また,C末端側にはJem1pとの相互作用領域が存在する.これらの領域の機能を明らかにするため,様々なNep98pの部分欠失変異株を作製した.この結果,Jem1pとの相互作用領域は酵母の増殖に必須であり,ここがわずかでも欠失すると酵母は致死となることが明らかとなった.また,N末端のサイトゾル側ドメインは酵母の増殖に必須ではなかったが,接合時の核融合およびNep98pの核膜局在に必要であることが示された.本研究では,出芽酵母小胞体の分子シャペロンJem1pと相互作用する,出芽酵母の新規核膜タンパク質Nep98pの機能解析を目的として研究を行なっている.本年度は,Nep98pの機能および機能領域の解析を行なった.遺伝子破壊実験によって,Nep98pの機能が酵母の増殖に必須であることが示されている.そこでNep98pの機能する過程を明らかにするため,Nep98pに関する温度感受性変異株の作製を行なった.得られた温度感受性変異株を制限温度にシフトすると,G2/M期に対応する細胞の割合が増加した.また,そのような細胞中では核分裂の進行に欠損が観察され,抗チューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって,スピンドル形態に異常を示すことが明らかとなった.電子顕微鏡を用いた解析から,nep98温度感受性変異株ではスピンドル極体の構造に異常を持つことが明らかとなった.以上の結果から,Nep98pはスピンドル極体の機能発現に必須な役割をはたしていると考えられる.スピンドル極体の機能は,酵母接合時の核融合にも必要であり,nep98温度感受性変異株の接合子は2つの1倍体核の接近と核外膜の融合の過程に欠損を示すことが明らかとなった.Nep98pは膜貫通領域を1つ持つ膜内在性タンパク質であり,N末端をサイトゾル側に向けたトポロジーをとる.また,C末端側にはJem1pとの相互作用領域が存在する.これらの領域の機能を明らかにするため,様々なNep98pの部分欠失変異株を作製した.この結果,Jem1pとの相互作用領域は酵母の増殖に必須であり,ここがわずかでも欠失すると酵母は致死となることが明らかとなった.また,N末端のサイトゾル側ドメインは酵母の増殖に必須ではなかったが,接合時の核融合およびNep98pの核膜局在に必要であることが示された.
人工的な疑似細胞内非平衡環境における並進型発動分子のエネルギー論

本研究は、独自に開発した任意の外力を与えることの可能な1分子力学応答計測装置を用いて、細胞内部の環境を“人工的"にin vitroの系に構築する。並進型の発動分子であるキネシンの運動に伴うゆらぎと応答を、外部から人為的に与えたゆらぎと見分けながら計測し、その数理モデル解析を通じて、細胞内のような非熱的にゆらぎ、非常に混雑した環境下における並進型分子モーターのエネルギー論(エネルギーの入出力等)を、人工的な環境を用いて明らかにする。また、生体分子に限らず様々な並進型分子モーターの比較検討を通じて、「発動分子」一般がもつエネルギー変換機構の理解を目指す。
癌転移を調節する好中球による癌細胞三次元凝集球体誘導反応の解析

癌組織から癌細胞が逸脱する過程は、癌転移の律速段階としてもっとも重要である。以前より、癌組織の中で多数の癌細胞よりなる凝集体が形成され、腫瘍血管を通じて流出し、腫瘍塞栓を形成して転移が成立する機構が観察されてきた。しかしながら、癌細胞の凝集体形成機構については不明であった。本研究では、好中球がヒト乳癌細胞株であるMCF-7細胞の球状凝集塊形成を誘導する因子を産生することを見出し、その因子の同定を行ったところ、好中球のプロテアーゼのうち、特にカテプシンGが重要であることを見出した。凝集反応の機構としては、この反応が2価イオンのキレート剤の添加で阻害されること、およびE-カドヘリンに対する抗体の存在下においても阻害されたことによって、E-カドヘリン依存的に凝集が起こることが示唆された。さらに、カテプシンGの癌細胞凝集メカニズムを検討する目的で、キモスタチンなどの低分子酵素活性阻害剤の存在下において、凝集活性が阻害されるか検討した。その結果、カテプシンGの癌細胞凝集は、酵素阻害剤によっては抑制されなかったことから、その凝集誘導は酵素活性によらない新しい機構によると考えられた。細胞凝集塊形成は、結合組織との接着を担うintegrinの接着性が弱まり、E-cadherinを介する細胞間接着が強まることにより誘導される。そこで、凝集塊の形成前後におけるintegrinαVとβ1の発現を確認した結果、カテプシンG処理ではintegrinの発現は変化しなかった。従って、カテプシンGは、integrinを不活性化させることにより凝集塊を誘導する可能性が示唆された。一方、E-cadherinの発現は維持されていた。よって、カテプシンGは、酵素活性非依存的な新しい機構によって癌細胞の三次元凝集を誘導すること、さらに細胞へのカテプシンGの結合に続くシグナル伝達を介したインテグリンの不活化が重要であることが明らかになった。癌転移機構の一つとして、癌細胞が球状凝集塊を形成して腫瘍組織から逸脱した後、リンパ管および血管において腫瘍塞栓となり転移叢を形成する現象が報告されている。しかし、その癌細胞凝集体の形成機構は不明であった。本研究では、癌組織に侵入する細胞である好中球が、ヒト乳癌細胞株、MCF-7細胞の球状凝集塊形成を誘導する因子を産生することを見出し、その因子の同定と凝集誘導メカニズムの検討を行った。その結果、好中球が、その活性化刺激に応じてMCF-7細胞に対する凝集誘導因子を放出すること、また、好中球のその活性は、セリンプロテアーゼの阻害剤によって阻害されることを見出した。そこで、好中球の産生するプロテアーゼとして、精製カテプシンGと好中球エラスターゼについて調べたところ、いずれにも活性が見出された。ただし、カテプシンGは、エラスターゼよりも低いタンパク濃度で凝集を誘導したことや、それぞれの特異基質を分解する酵素活性を基準にした場合、カテプシンGは、エラスターゼよりもはるかに低い酵素活性で凝集を誘導したことより、カテプシンGのほうがより重要であることが見出された。実際の好中球の破砕物中の酵素活性も、カテプシンGのほうが高かったことからも、このことが裏付けられた。従って、好中球の癌細胞凝集塊誘導因子として、好中球プロテアーゼ、特にカテプシンGを同定することができた。

凝集反応の機構としては、この反応が2価イオンのキレート剤の添加で阻害されること、およびE-カドヘリンに対する抗体の存在下においても阻害されたことによって、E-カドヘリン依存的に凝集が起こることが示唆された。これらの結果によって、好中球によって産生されたカテプシンGによって癌細胞がE-カドヘリン依存的に自己凝集を起こし、三次元凝集体を形成する機構を明らかにした。癌組織から癌細胞が逸脱する過程は、癌転移の律速段階としてもっとも重要である。以前より、癌組織の中で多数の癌細胞よりなる凝集体が形成され、腫瘍血管を通じて流出し、腫瘍塞栓を形成して転移が成立する機構が観察されてきた。しかしながら、癌細胞の凝集体形成機構については不明であった。本研究では、好中球がヒト乳癌細胞株であるMCF-7細胞の球状凝集塊形成を誘導する因子を産生することを見出し、その因子の同定を行ったところ、好中球のカテプシンGが重要であることを見出した。さらに、カテプシンGの癌細胞凝集メカニズムを検討する目的で、キモスタチンなどの低分子酵素活性阻害剤の存在下において、凝集活性が阻害されるか検討した。その結果、カテプシンGの癌細胞凝集は、酵素阻害剤によっては抑制されなかったことから、その凝集誘導は酵素活性によらない新しい機構によると考えられた。細胞凝集塊形成は、結合組織との接着を担うintegrinの接着性が弱まり、E-cadherinを介する細胞間接着が強まることにより誘導される。そこで、凝集塊の形成前後におけるintegrinαVとβ1の発現を確認した結果、カテプシンG処理ではintegrinの発現は変化しなかった。従って、カテプシンGは、integrinを不活性化させることにより凝集塊を誘導する可能性が示唆された。一方、E-cadherinの発現は維持されていた。そこで、カテプシンGが、細胞受容体に結合し、シグナル伝達系に作用することで本反応を誘導することが考えられた。そこで、細胞に対する結合性を検討したところ、カテプシンGは細胞に結合性が認められた。よって、カテプシンGは、酵素活性非依存的な新しい機構によって癌細胞の三次元凝集を誘導すること、さらに細胞へのカテプシンGの結合に続くシグナル伝達を介したインテグリンの不活化が重要であることが明らかになった。
メサンジウム細胞と細胞外基質の接着による情報伝達とその腎炎進展への意義の解明

多くの進行性糸球体腎炎の共通病理組織像は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰沈着とそれに引き続く糸球体の硬化であろう.これらのECMは糸球体細胞から分泌される一方、その細胞表面受容体であるインテグリンを介して糸球体細胞に働きかけ、糸球体炎の持続や硬化の進展にさらに寄与することが予想される.近年、インテグリンを介したECMの細胞接着により様々な情報伝達経路が活性化されることが明らかにされつつある.そこで本研究では、インテグリンを介した細胞接着の情報伝達機構を培養細胞を用いたin vitroの系で解析するとともに、腎炎糸球体においてこれらの情報伝達経路がいかなる動態にあるかを、腎炎モデル動物を用いたin vivoの系で解析し、腎炎の進行における細胞接着依存性の情報伝達機構の関与とその意義を明らかにすることを目的とした.その結果,本年度では以下のことを明らかにし得た.即ち、1)培養メサンジウム細胞や線維芽細胞のECMへの接着によりMAPキナーゼの活性化が誘導されること(J Biol Chem 1995;270;269-273)、及び、2)ループス腎炎を自然発症する1prマウスの腎糸球体では、接着斑キナーゼpp125FAK(FAK)の発現とそのチロシンリン酸化がコントロールマウスに比較して著しく亢進していること(1994年、日本臨床免疫学会総会にて発表)、が明らかにされた.MAPキナーゼは接着依存性の情報伝達系でFAKの下流に位置すると考えられ、細胞の増殖や分化に重要な役割を果すセリンスレオニンキナーゼである.従って、1prマウスの糸球体に認められたFAKの活性化は、その下流の情報伝達経路を介して、糸球体細胞の増殖や形質転換へと結びつき、ループス腎炎の進展に寄与していることが予想された.多くの進行性糸球体腎炎の共通病理組織像は、細胞外マトリクス(ECM)の過剰沈着とそれに引き続く糸球体の硬化であろう.これらのECMは糸球体細胞から分泌される一方、その細胞表面受容体であるインテグリンを介して糸球体細胞に働きかけ、糸球体炎の持続や硬化の進展にさらに寄与することが予想される.近年、インテグリンを介したECMの細胞接着により様々な情報伝達経路が活性化されることが明らかにされつつある.そこで本研究では、インテグリンを介した細胞接着の情報伝達機構を培養細胞を用いたin vitroの系で解析するとともに、腎炎糸球体においてこれらの情報伝達経路がいかなる動態にあるかを、腎炎モデル動物を用いたin vivoの系で解析し、腎炎の進行における細胞接着依存性の情報伝達機構の関与とその意義を明らかにすることを目的とした.その結果,本年度では以下のことを明らかにし得た.即ち、1)培養メサンジウム細胞や線維芽細胞のECMへの接着によりMAPキナーゼの活性化が誘導されること(J Biol Chem 1995;270;269-273)、及び、2)ループス腎炎を自然発症する1prマウスの腎糸球体では、接着斑キナーゼpp125FAK(FAK)の発現とそのチロシンリン酸化がコントロールマウスに比較して著しく亢進していること(1994年、日本臨床免疫学会総会にて発表)、が明らかにされた.MAPキナーゼは接着依存性の情報伝達系でFAKの下流に位置すると考えられ、細胞の増殖や分化に重要な役割を果すセリンスレオニンキナーゼである.従って、1prマウスの糸球体に認められたFAKの活性化は、その下流の情報伝達経路を介して、糸球体細胞の増殖や形質転換へと結びつき、ループス腎炎の進展に寄与していることが予想された.
自己免疫疾患の発生機序解明を目指したモデル系の開発

本研究は、特定T細胞クローンの動態を追跡できるT細胞レセプター(TCR)トランスジェニックマウス(Tg)を用いて、抗原特異的免疫寛容とその破綻を誘導する系を作製して、自己免疫疾患の発生機序解明の一助となることを目指している。本年度は主として前半の寛容誘導系を検討し、以下の成果を得た。1。抗原(OVA)の経口投与による寛容誘導1)脾臓T細胞の免疫機能の抑制:(a)クロノタイプ抗体作製により殆どのT細胞はOVA特異的CD4+細胞であることを確認した。(b)OVA飼料で2-3週間飼育されたマウスより得た脾細胞をin vitroでOVAを再刺激すると、IL-2及びIFN-γ産生の著しい低下が見られた。しかし、IL-2添加により両サイトカイン産生能は回復した。IL-4産生は著変なかった。すなわち、Th1細胞機能が抑制されたアナジー状態が2週間の連続経口刺激により誘導された。(c)in vitroの再刺激による抗原特異的T細胞の増殖は抑制されていた。(d)抗原特異的或いは非特異的標的細胞に対する細胞傷害性を検討したが、いずれも誘導されていなかった。2)血清IgE値の低下:OVA飼料で飼育されたマウスの血清IgEの値は低下していた。3)腸管(局所)粘膜上皮間Tリンパ球(IEL)の活性化:(a)in vitroによる再刺激のない状態におけるIELでは、IL-2及びIFNγの発現は脾臓に比較して高かった。(b)抗原特異的CTL、LAK活性及びNK活性の増強が認められた。(c)IELの内増殖したサブセットはCD8α/α細胞のみで、抗原特異的CD4+細胞数に変化はなかった。(b)及び(C)は抗原刺激により活性化されたCD4+細胞によるTh1型のサイトカイン産生の結果であることが示唆される。以上、抗原の投与によりin vivoで脾臓T細胞に抗原特異的アナジー潜在能を誘導することに成功した。従来の方法では、経口投与に加えて腹腔或いは静脈からの抗原刺激が必要であったため、どこでどのようにしてアナジーが誘導されるか不明瞭であった。本実験でどのようにしてアナジーが誘導されるか不明瞭であった。本実験系では、腸管粘膜局所でのT細胞は活性化されていることから、少量抗原の持続的刺激が脾臓T細胞のアナジーをin vivoで誘導していることを明確にした。2。胸腺外自己抗原に対する反応系モデルの作製:1)OVA発現トランスフェクタントの移植:分泌型OVA発現の同系細胞トランスフェクタントを作製し、皮下に移植することにより持続的に少量の抗原を提示する胸腺外自己抗原にみたてた系とした。移植局所リンパ球にはキラー活性が亢進していたが、サイトカイン発現は低かった。脾細胞ではOVA刺激によるサイトカイン産生は高くなかった。脾臓にはクロノタイプ陽性CD4+細胞が存在し、胸腺内でもDP細胞の排除は誘導されなかった。すなわち、分化成熟したT細胞は末梢で抗原特異的に抑制されていることが示唆された。2)OVA-Tgマウスの作製:OVA遺伝子を分泌型と膜型に構築し、インシュリンのプロモーターを結合してマウス受精卵に導入した。現在ファウンダーに於ける導入遺伝子の発現を検索中である。共同研究社Zinkenagelらの系による誘導では、末梢T細胞のアナジーが充分誘導できなかったので、今後は以上の抗原特異的免疫寛容を誘導した系を用いてその破綻誘導を試みる。本TCR-TgマウスのT細胞はMMTウイルスをスーパー抗原として認識するので、本研究結果とモデルマウスを共同研究者であるZinkernagelと分担してMMTウイルス感染によって破綻誘導を検討する。(なお、2年計画であった本研究の助成は単年で打切られているが、続行する。)本研究は、特定T細胞クローンの動態を追跡できるT細胞レセプター(TCR)トランスジェニックマウス(Tg)を用いて、抗原特異的免疫寛容とその破綻を誘導する系を作製して、自己免疫疾患の発生機序解明の一助となることを目指している。1。3)腸管(局所)粘膜上皮間Tリンパ球(IEL)の活性化:

(a)in vitroによる再刺激のない状態におけるIELでは、IL-2及びIFNγの発現は脾臓に比較して高かった。(b)抗原特異的CTL、LAK活性及びNK活性の増強が認められた。(c)IELの内増殖したサブセットはCD8α/α細胞のみで、抗原特異的CD4+細胞数に変化はなかった。(b)及び(C)は抗原刺激により活性化されたCD4+細胞によるTh1型のサイトカイン産生の結果であることが示唆される。以上、抗原の投与によりin vivoで脾臓T細胞に抗原特異的アナジー潜在能を誘導することに成功した。従来の方法では、経口投与に加えて腹腔或いは静脈からの抗原刺激が必要であったため、どこでどのようにしてアナジーが誘導されるか不明瞭であった。本実験でどのようにしてアナジーが誘導されるか不明瞭であった。本実験系では、腸管粘膜局所でのT細胞は活性化されていることから、少量抗原の持続的刺激が脾臓T細胞のアナジーをin vivoで誘導していることを明確にした。2。胸腺外自己抗原に対する反応系モデルの作製:1)OVA発現トランスフェクタントの移植:分泌型OVA発現の同系細胞トランスフェクタントを作製し、皮下に移植することにより持続的に少量の抗原を提示する胸腺外自己抗原にみたてた系とした。移植局所リンパ球にはキラー活性が亢進していたが、サイトカイン発現は低かった。脾細胞ではOVA刺激によるサイトカイン産生は高くなかった。脾臓にはクロノタイプ陽性CD4+細胞が存在し、胸腺内でもDP細胞の排除は誘導されなかった。すなわち、分化成熟したT細胞は末梢で抗原特異的に抑制されていることが示唆された。2)OVA-Tgマウスの作製:OVA遺伝子を分泌型と膜型に構築し、インシュリンのプロモーターを結合してマウス受精卵に導入した。現在ファウンダーに於ける導入遺伝子の発現を検索中である。共同研究社Zinkenagelらの系による誘導では、末梢T細胞のアナジーが充分誘導できなかったので、今後は以上の抗原特異的免疫寛容を誘導した系を用いてその破綻誘導を試みる。本TCR-TgマウスのT細胞はMMTウイルスをスーパー抗原として認識するので、本研究結果とモデルマウスを共同研究者であるZinkernagelと分担してMMTウイルス感染によって破綻誘導を検討する。(なお、2年計画であった本研究の助成は単年で打切られているが、続行する。)
拡張されたガウス展開法に基づく非等方量子多体系の統一的解明

本年度は空間非等方な量子系として、(1)磁場中のハドロンと(2)有限体積系のハドロンに注目して理論研究を行った。(1)前年度に予言した「ハドロニック・パッシェン・バック効果」は、ハドロン内部のスピン・軌道(LS)結合と比べて強い磁場によって軌道角運動量の第三成分が分岐する現象である。この現象は、ハドロン波動関数の劇的な変形を伴い、QCDスケールと比較して弱い磁場でさえ誘起されるという意味で観測的にも有力な研究対象である。本年度はこの現象に関する特徴的な崩壊過程について詳細な考察を行った。特に、QCDの有効場理論であるポテンシャル非相対論的QCD(pNRQCD)に基づくP波クォーコニウムの輻射崩壊の定式化を考案することで、崩壊モード(E1崩壊やM1崩壊)の分岐比や崩壊の空間異方性についての解析的な公式を導出し、相対論的重イオン衝突実験における観測可能性の考察を行った。これらの成果は論文としてまとめられ、Physical Review Dに掲載された。(2)「有限体積効果」自体は、格子場の理論の数値シミュレーションにおいて必然的に生じる誤差評価や、現実的な実験環境において避けられない「有限サイズ」の補正、真空のゼロ点エネルギーシフト(いわゆる、カシミール効果)などと関連しており、技術的な問題としてだけではなく純粋な物理現象としても注目されるべき興味深い話題である。本年度は周期的・反周期的境界条件が課された箱型や平行板型の有限体積系におけるハドロンの性質について解析を行った。具体的にはカイラル対称性の破れ・回復と関係する非摂動カシミール効果が核子に及ぼす影響を議論し、それに伴う核子質量の有意なシフトを予言した。予言した物理量は将来的な格子QCDシミュレーションにおいて検証されることが期待される。本研究では、非等方量子系の統一的解明を促すため、量子色力学(QCD)におけるクォーク少数系であるハドロンに着目し、特に一定の条件下で実現する「非等方ハドロン」(あるいは、「変形ハドロン」)の性質に注目することで研究を進めてきた。(1)前年度に予言した「ハドロニック・パッシェン・バック効果」の特徴的な輻射崩壊モードについての新たな定式化の構築と、摂動展開の主要項までの考察はひとまず完了した。これにより「非等方ハドロン」からの崩壊過程に注目するという新たな研究分野の道筋を開拓したことが大きな成果である。(2)これまで注目してきた磁場中のハドロン系だけでなく、新たな研究対象として有限体積系におけるハドロン物理の研究にも着手した。これは当初の研究計画には含まれていなかったが、磁場中のハドロン系のある種の一般化とも解釈でき、非等方量子系の普遍的な理解に寄与するうえで発展性のある研究対象であると考えている。(1)本年度に得られた成果の素朴な拡張としては、「ハドロニック・パッシェン・バック効果」に対して、ポテンシャル非相対論的QCD(pNRQCD)の高次項において導入が可能となるカラー8重項クォーコニウムの寄与を議論する。また、輻射崩壊だけでなく、強い相互作用による崩壊やクォーコニウム生成過程に対する影響を議論するための定式化の構築ができると良い。さらに、これまでの研究では簡単のため静磁場を仮定してきたが、実際の加速器による重イオン衝突実験では有限温度効果や電磁場の時間依存性、生成物質の渦度などが絡み合った複雑な環境が生じている。したがって、全ての効果を包括的に考慮したシミュレーションによる予言が理想的な課題であるが、少なくとも定性的な議論までを確定させることが望ましい。(2)カイラル対称性の破れ・回復に関する非摂動カシミール効果のハドロンへの影響について、発展的な研究を行う。特に、チャームクォークと軽いクォークから構成されるD中間子は(他のハドロンと比較して)カイラル凝縮に対する濁りの少ないプローブであることが期待されるため、同様の効果を検証する予定である。強い磁場中でのクォーク少数多体系(ハドロン)の性質を解明することは、RHICやLHCで行われている相対論的重イオン衝突実験、あるいは強磁場中性子星(マグネター)における観測量に関わるだけでなく、QCDの非等方な非摂動ダイナミクスの検証、および非等方な量子力学少数系に対する普遍的な理解を深化させるという意味でも重要である。さらに、空間非等方な形状の波動関数を精密に求める数値解法の開発は、同時に推進されるべき課題の一つである。本年度は、有限軌道角運動量を持つ2体系に対する「円柱座標ガウス展開法」の開発を行い、特に、磁場中のP波チャーモニウムの性質に焦点を当てて詳細な解析を行った。結果として、磁場中の質量スペクトルと波動関数の変形の精密計算に成功した。特に、波動関数の変形には、強磁場中の量子力学において知られている軌道・スピン角運動量の第三成分の分岐現象(いわゆる、パッシェン・バック効果)が反映されている。この現象が起こる磁場の大きさは、系のスピン軌道相互作用(LS結合)との相対的なスケールに依って決まるため、系の条件次第では極めて弱い磁場においても劇的な変形が生じうる。このため、相対論的重イオン衝突実験において瞬間的に生成する磁場に対する有意な観測量としての期待も高まったため、P波チャーモニウムの輻射崩壊における異方性の議論も同時に行った。これらの研究成果は論文としてまとめられ、現在投稿中である。

このような「ハドロニック・パッシェン・バック効果」の発見は、チャーモニウムに限らず有限軌道角運動量を持つあらゆるハドロンにおいて生じる現象であり、模型や手法を問わず議論できる研究対象という意味で、理論・実験両分野において大いに発展が見込める成果である。当初の予定通り、有限軌道角運動量を持つ量子少数系に対する「円柱座標ガウス展開法」の開発に成功し、年度内に論文としてまとめられたので、おおむね順調に進展していると評価する。特に、P波チャーモニウム系におけるパッシェン・バック効果が当初の想定よりも遥かに弱い磁場において実現することを定量的に予言できたため、相対論的重イオン衝突実験における現実的な観測可能性の議論も行うことができ、今後の研究の発展として当初の予定より多岐に渡るテーマ設定が可能となった。本年度は空間非等方な量子系として、(1)磁場中のハドロンと(2)有限体積系のハドロンに注目して理論研究を行った。(1)前年度に予言した「ハドロニック・パッシェン・バック効果」は、ハドロン内部のスピン・軌道(LS)結合と比べて強い磁場によって軌道角運動量の第三成分が分岐する現象である。この現象は、ハドロン波動関数の劇的な変形を伴い、QCDスケールと比較して弱い磁場でさえ誘起されるという意味で観測的にも有力な研究対象である。本年度はこの現象に関する特徴的な崩壊過程について詳細な考察を行った。特に、QCDの有効場理論であるポテンシャル非相対論的QCD(pNRQCD)に基づくP波クォーコニウムの輻射崩壊の定式化を考案することで、崩壊モード(E1崩壊やM1崩壊)の分岐比や崩壊の空間異方性についての解析的な公式を導出し、相対論的重イオン衝突実験における観測可能性の考察を行った。これらの成果は論文としてまとめられ、Physical Review Dに掲載された。(2)「有限体積効果」自体は、格子場の理論の数値シミュレーションにおいて必然的に生じる誤差評価や、現実的な実験環境において避けられない「有限サイズ」の補正、真空のゼロ点エネルギーシフト(いわゆる、カシミール効果)などと関連しており、技術的な問題としてだけではなく純粋な物理現象としても注目されるべき興味深い話題である。本年度は周期的・反周期的境界条件が課された箱型や平行板型の有限体積系におけるハドロンの性質について解析を行った。具体的にはカイラル対称性の破れ・回復と関係する非摂動カシミール効果が核子に及ぼす影響を議論し、それに伴う核子質量の有意なシフトを予言した。予言した物理量は将来的な格子QCDシミュレーションにおいて検証されることが期待される。本研究では、非等方量子系の統一的解明を促すため、量子色力学(QCD)におけるクォーク少数系であるハドロンに着目し、特に一定の条件下で実現する「非等方ハドロン」(あるいは、「変形ハドロン」)の性質に注目することで研究を進めてきた。(1)前年度に予言した「ハドロニック・パッシェン・バック効果」の特徴的な輻射崩壊モードについての新たな定式化の構築と、摂動展開の主要項までの考察はひとまず完了した。これにより「非等方ハドロン」からの崩壊過程に注目するという新たな研究分野の道筋を開拓したことが大きな成果である。
ステロイド合成・代謝変調に関与する肝臓中CYPsの新たな多臓器毒性の可能性

本研究は、ステロイド合成・代謝に関与する肝臓中のcytochrome P450薬物代謝酵素誘導が、肝臓以外とくに子宮内膜腺癌の増加させる機序解明を目的として実施した。とくに本研究では、エストロゲン代謝を変調に最も関連するCYPの分子種を特定すること、その分子種の誘導とエストロゲン代謝変調の関連性について肝臓と子宮について検索した。平成18年度の研究において、肝臓におけるエストロゲン代謝に最も関与するCYPの分子種として報告されているCYP1B1が、本研究でも誘導されたことから、この分子種がエストロゲン変調に関連する薬物代謝酵素最も有力候補であると考えられた。平成19年度は、肝臓中と発癌部位である子宮におけるCYP1B1をはじめとする各分子種の分布を遺伝子発現レベルと、免疫組織化学染色によるタンパクの発現を検索した。さらに、肝臓中のエストロゲン代謝において強い発癌性をしめすエストロゲン代謝物4水和物(4HE)と発癌性を示さないエストロゲン代謝物2水和物(2HE)を測定した。その結果、肝臓においてCYP1B1は他の分子種である1A1、2B1および3A2と同様発現していたが、発現強度はCYP3A2より弱かった。一方、内因性エストロゲンの影響を排除するために卵巣を摘出した動物の子宮を用いた実験では、無処置群とエストラジオール、2HE、4HEおよびエストロゲン変調による子宮癌を促進するindole3carbinol(I3C)投与のいずれのおいても、CYP1B1は最も強く発現していた。しかし免疫組織化学染色では、肝臓はほぼ遺伝子発現と同様のCYps分子種の抗体が小葉中心部に観察されたが、子宮ではいずの分子種もほとんど陽性像は認められなかった。これらの動物の肝臓中の2HEおよび4HEを測定したところ、I3Cのみに双方の著しい増加が観察された。これらの結果から、CYP1B1を誘導するような化合物における2HEと4HEのエストロゲン代謝変調は、おもに肝臓での代謝による可能性が示唆された。さらに多くの化合物で同様の経路が存在することを確認することが今後必要と考える。肝臓における薬物代謝酵素誘導は、薬物代謝における主経路の一つであるが、近年、肝臓での薬物代謝酵素誘導が肝以外の増加へ各種毒性を示す例が指摘されている。申請者らは、今までの研究において、エストロゲン代謝経路と共通の薬物代謝酵素を誘導する化学物質が、エストロゲン代謝を変調させ、ホルモン依存性器官の発癌を修飾する可能性を研究してきた。肝臓の薬物代謝酵素を介したエストロゲン代謝の変調による毒性経路は、その機序において不明な点が多く、新しい毒性発現機序の一つになりうると考えられる。エストロゲン代謝に関わる薬物代謝酵素としてCytochrome P450(CYP)1B1の関与が報告されている。またエストロゲン代謝において肝臓では、エストロゲン活性が低く、発がん性のない2-hydroxyestradial(2HE)への代謝が主経路であり、エストロゲン活性を有し親化合物より発がん性の強い4-hydroxyestradiol(4HE)への経路は通常では主でないと考えられており、我々の今までの研究では、肝臓中のCYP1A、3A2とともに1B1の発現の増加が認められている。

本研究は、今までの研究をさらに推し進め、ステロイド合成・代謝変調に関与する肝臓のcyotrome P450(CYPs)薬物代謝酵素誘導が肝臓以外の臓器へ発癌を含む毒性を誘発する新たな毒性経路となる可能性を検索し、その主役とする薬物代謝酵素を特定するために実施した。とくに、平成18年度においては、P450薬物代謝酵素の中でエストロゲン代謝変調に最も関わっている酵素の検索および肝臓以外におけるその酵素の発現について検索した。平成18年度の研究では、検索化学物質としてCYPs誘導を介した肝臓の4HEへの代謝を増加させ子宮癌発生を促進することが明らかなIndole 3 carbinol(I3C)を選んだ。13Cをラットに混餌投与し、肝臓および子宮におけるCYPs酵素(1A1,1A2,1B1および3A2)誘導の有無をmRNAおよび免疫組織化学染色による蛋白発現レベルで検索した結果、肝臓におけるこれらの酵素の誘導は認められたものの、子宮局所での発現の変動は認められなかった。また肝臓において2HEよび4HE水酸化酵素の増加が認められた。これらのことから、子宮局所でなく、肝臓におけるCYPsの誘導を介したエストロゲンが子宮発癌に関与していると考えられた。またエストロゲン代謝に関連するCYPsの種類について、CYP1Aおよび3A2などはフェノバルビタールなど多くの肝毒性物質で誘発されるがエストロゲン代謝変調は認められないことから、CYP1B1がエストロゲン代謝に関わるCYPとして最も注目すべきであると結論した。本研究は、ステロイド合成・代謝に関与する肝臓中のcvtochrome P450薬物代謝酵素誘導が、肝臓以外とくに子宮内膜腺癌の増加させる機序解明を目的として実施した。とくに本研究では、エストロゲン代謝を変調に最も関連するCYPの分子種を特定すること、その分子種の誘導とエストロゲン代謝変調の関連性について肝臓と子宮について検索した。昨年までの研究において、肝臓におけるエストロゲン代謝に最も関与するCYPの分子種として報告されているCYP1B1が、本研究でも誘導されたことから、この分子種がエストロゲン変調に関連する薬物代謝酵素最も有力候補であると考えられた。本年度は、昨年に引き続き、肝臓中と発癌部位である子宮におけるCYP1B1をはじめとする各分子種の分布を遺伝子発現レベルと、免疫組織化学染色によるタンパクの発現を検索した。さらに、肝臓中のエストロゲン代謝において強い発癌性をしめすエストロゲン代謝物4水和物(4HE)と発癌性を示さないエストロゲン代謝物2水和物(2HE)を測定した。その結果、肝臓においてCYP1B1は他の分子種である1A1、2B1および3A2と同様発現していたが、発現強度はCYP3A2より弱かった。一方、内因性エストロゲンの影響を排除するために卵巣を摘出した動物の子宮を用いた実験では、無処置群とエストラジオール、2HE、4HEおよびエストロゲン変調による子宮癌を促進するindole carbinol(I3C)投与のいずれのおいても、CYP1B1は最も強く発現していた。しかし免疫組織化学染色では、肝臓はほぼ遺伝子発現と同様のCYps分子種の抗体が小葉中心部に観察されたが、子宮ではいずの分子種もほとんど陽性像は認められなかった。これらの動物の肝臓中の2HEおよび4HEを測定したところ、I3Cのみに双方の著しい増加が観察された。これらの結果から、CYP1B1を誘導するような化合物における2HEと4HEのエストロゲン代謝変調は、おもに肝臓での代謝による可能性が示唆された。