hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属ガラスの環境依存型分子動力学ポテンシャルデータベースの開発

本研究は、金属ガラスの分子動力学計算に不可欠である高精度な環境依存型分子動力学ポテンシャルの標準規格の構築を行い、ポテンシャル開発ソフトを特定領域研究メンバに公開し、ポテンシャルデータベースを開発することを目的とする。ポテンシャル作成において最も大きな課題となる、最適なパラメータの探索手法についての開発を行った。第三者にポテンシャル作成が可能なような汎用性のある遺伝的アルゴリズム(GA)が有効であることに着目し、これを発展させたものを考え、上記作成ソフトに組み込んだ手法を単元系(シリコン)及び多元系(シリコンーボロン)に適用し、その有効性を示した。本成果は、雑誌論文に投稿し、掲載可となっている。なお、開発したポテンシャル開発ソフトは公開を前提としているため、インターフェース部分を作成した。ユーザはWebページにおいて、使用したいポテンシャル関数形、合わせ込みたい構造を入力すれば、金属ガラスの分子動力学ポテンシャルの作成が可能になっている。分子動力学に関して知識のなかったユーザも簡便に分子動力学シミュレーションを出来るようになると考えられる。最後に、作成したソフトについて国内・国際学会における学会発表を行い、広く情報交換を行った。ポテンシャルの標準規格化のため、現在提案されているポテンシャルの調査を行い、物理的な概念・関数形(例えば二体・三体・イオン・ボンドオーダー・電荷移動ポテンシャル)により分類した。結果、主たるポテンシャルとして、二体ポテンシャルと、EAM型の三体ポテンシャルが提案されていることがわかった。Ni, Al, Cu系を対象に提案されているポテンシャルを実際に使って分子動力学計算を行い、二体ポテンシャルと多体ポテンシャルの違いがアモルファス構造にどのような影響を及ぼすかを調べた。また、アモルファス金属を最適な温度で構造緩和を行い、構造を特性化する手法を提案した。結果、配位数及び角度分布は比較的良く似た傾向を示すが、(0,0,12,0)ボロノイ多面体の割合、さらにBCC構造の出現の有無などの違いが現れた。これらの違いは二体ポテンシャルの物性の再現性の低さによるものと考えられる。また、Si-Hポテンシャル作成手法をベースに、ポテンシャル作成手法及びプログラムの開発を行なった。作成手法では、様々な結合長さ、結合角度、配位数に対応する冗長性のあるポテンシャルを作成するために、第一原理分子動力学法を使って、仮想的な系の結合距離・エネルギ・弾性定数を求め、信用のある実験データと組み合わせてポテンシャルの合わせこみデータとする。あわせこみ手法にはGA(Genetic Algorithm)を使う。GAで作成したポテンシャルが一つに定まらない場合は、さらに合わせこむデータを増やす。適当なポテンシャルが決まらない場合は、ポテンシャル関数形を見直し、拡張性の高い形に修正して、再度合わせこみを行なう。以上のようなあわせこみ手法を提案し、プログラムに実装した。
未知混合物系試料の知能化定性定量分析

混合物中に含まれる未知物質の定推定量分析のための、新しい知能化計測及び分析法の開発を行なった。この方法は、データベースやライブラリーを全く用いることなく、観測データ自身から、コンピュータが学習し、パターン認識的に、そこに含まれる物質を推定することができ、分離化学・分析化学と併用することにより、有用性が期待できる。以下に、具体的成果を列挙する。1)理論開発:主成分分析法と非負拘束条件の導入による、混合物データセットからの成分スペクトル推定法の開発を行なうと共に、エントロピー最小化規範の導入により、唯一のスペクトル推定法を考案した。この手法において、解が不定であるとき、エントロピー規範は、どこまで成分を分離するかについて、検討を行なった。2)システム化:ミニコンピュータMicroVAX【II】と、赤外分光光度計Parkin-Elmer983とをオンライン接続し、開発した手法をプログラム化し、自動計測・分析可能システムを完成し、グラフ,波形の処理,表示システムMacintoshをこれに直結させた。3)化学反応追跡データ及び、多波長分光画像データへの応用:考案した手法を検証するため、キシレン異性体混合物からの成分スペクトル推定を行なった。それにより、本手法の有用性を確認した上、実際の応用例として、試薬の化学反応過程を可視吸光分光計測し、中間成分物のスペクトル及び、濃度比の経時変化を求めた。また、顕微分光画像中に含まれる成分のスペクトル及び濃度の推定を、Ratの肝蔵組職及び筋肉細胞データに応用した。
光造形システムによる実態モデルの寸法安定性および歯列模型の置換に関する研究

目的:外科的矯正治療の対象となる症例に対しては,近年スパイラルCTデータと3次元光造形システムを利用した実体モデルを作成し,術前矯正治療を含めた治療計画および,手術術式の検討が行われてきている.しかしメタルで作成された矯正用器具によるア-ティファクトにより歯牙の形態および咬合関係の再現は不可能である。このため、歯列模型を実態モデルへ正確に位置づけし、置換することが必要である。本研究の目的は、歯列模型の位置づけの指標となるスプリントおよびバ-の形態と材質の選択を行い、歯列模型の実態モデルへの置換とその再現性について検討することにある。方法:1)歯列模型の置換に使用するバ-の材質として、CTによるア-ティファクトが少ない材質を選定し、これらを一定寸法に加工する。つぎにこれらの実態モデルを作成しその再現性を検討する。2)矯正用ブラケットによるア-ティファクトの影響を乾燥頭蓋骨を用い、矯正用ラケット装着、および未装着の実態モデルを頭部X線規格写真により検討する。3)歯列模型の実態モデルへの置換とその再現性に関して1)、2)で得られた結果より、置換用バ-のついたスプリントを作成し、乾燥頭蓋骨の実態モデルを作成し歯列模型を置換する。つぎにこの置換済みモデルの再現性を実測と頭部X線規格写真により検討する。結果:歯列模型の位置付けの指標となるスプリントおよびバ-については純チタンとアクリルレジンにより検討を行った結果純チタンについてはエックス線によるアーチファクトが認められ、アクリルレジンではほぼ認められなかった。金属製ブラケットによるアーチファクトは、実態モデル上で半径約7mmにおいて認められ、置換用バ-は安全性を考慮しブラケットより約10mm離すことが望ましいと考えられた。これらの条件より作成された置換用バ-のついたスプリントを乾燥頭蓋骨に装着し作成し、実態モデルを作成した。次に歯列模型置換後のモデルのX線規格写真と乾燥頭蓋骨のX線規格写真をそれぞれトリ-スし、比較検討を行った結果、上顎前歯切端では上下的に約0.5mm、前後的には約0.3mm、咬合平面では約1度の違いが認められたにすぎず,歯列模型の実態モデルへの置換に有効であることが認められた.目的:外科的矯正治療の対象となる症例に対しては,近年スパイラルCTデータと3次元光造形システムを利用した実体モデルを作成し,術前矯正治療を含めた治療計画および,手術術式の検討が行われてきている.しかしメタルで作成された矯正用器具によるア-ティファクトにより歯牙の形態および咬合関係の再現は不可能である。次に歯列模型置換後のモデルのX線規格写真と乾燥頭蓋骨のX線規格写真をそれぞれトリ-スし、比較検討を行った結果、上顎前歯切端では上下的に約0.5mm、前後的には約0.3mm、咬合平面では約1度の違いが認められたにすぎず,歯列模型の実態モデルへの置換に有効であることが認められた.
アワノメイガ属嗅覚受容体遺伝子群の分子進化と性フェロモン受容機構との関連性の解明

鱗翅目昆虫では種特異的な性フェロモンが配偶行動に不可欠な役割を果たしているが、種分化に際して関連する遺伝子にどのような変化が起きるのかは明らかではない。そこで、交雑可能な種間でも性フェロモン成分が異なるアワノメイガ属を対象として、性フェロモン合成・受容系に関わる遺伝子群の種間比較を行った。まず、任意の遺伝子の種間比較を可能にする研究基盤として、アワノメイガとウスジロキノメイガのフォスミドライブラリーを作製し、PCRによるスクリーニング系を整備した。そして、両ライブラリーから性フェロモン受容体、性フェロモン結合タンパク質、性フェロモン不飽和化酵素遺伝子を含むフォスミドクローンを単離し、ショットガンシーケンシング等によりアワノメイガ約330kb、ウスジロキノメイガ約265kbのゲノム塩基配列を決定した。鱗翅目昆虫では種特異的な性フェロモンが配偶行動に不可欠な役割を果たしているが、種分化に際して遺伝子レベルでどのような変化が起きるのかは明らかではない。そこで、交雑可能な種間でも性フェロモン成分が異なるアワノメイガ属を対象として、性フェロモン合成・受容系に関わる遺伝子群の構造と発現の種間比較を行い、遺伝子の変化の同定を試みる。平成22年度はヨーロッパアワノメイガのBACライブラリーから単離した性フェロモン受容体サブファミリーに属する嗅覚受容体遺伝子を含むクローンの詳細な塩基配列約90kbを決定した。その結果、8個以上の遺伝子がタンデムに並ぶクラスターがZ染色体上に座乗することを明らかにした。このうち4個の遺伝子には、第7エクソンと第7イントロンにまたがる181bpの反復配列が見出され、遺伝子重複への関与の可能性が示唆された。その他、カイコの第23染色体に相当する常染色体上にも2個の遺伝子がタンデムに位置していた。遺伝子の配置と配列の相同性には相関が見られた。また、ヨーロッパアワノメイガとの比較を行うために、近縁ではあるが性フェロモン成分が異なるアワノメイガのオス踊からフォスミドライブラリー(56,832クローン)を作製するとともにPCR法によるスクリーニング系を構築した。これを用いて性フェロモン合成系の鍵酵素遺伝子やフェロモン受容体・フェロモン結合タンパク質遺伝子等を含むフォスミドクローンを単離して、正しく単離できたかを一部の塩基配列を決定して確認した。このうちフェロモン結合タンパク質遺伝子を含むクローンについて詳細な塩基配列決定に着手した。さらに、多数個体のアワノメイガのオス成虫の触角からtotal RNAの調製を行った。平成22年度は前年度に作製したアワノメイガフォスミドライブラリー(74,648クローン)からPCR法によるスクリーニングを行い、性フェロモン受容体、性フェロモン結合タンパク質、性フェロモン不飽和化酵素遺伝子を含む9個のクローンを単離し、ショットガンシーケンシング等により計約263kbのゲノム塩基配列を決定した。その結果、性フェロモン結合タンパク質遺伝子が3個と2個の遺伝子がタンデムに並ぶクラスターが背向的に位置していることが判明したほか、フェロモン不飽和化酵素遺伝子についても先行報告では明らかでなかった広域にわたる遺伝子構造を解明できた。また、近縁ではあるが性フェロモン成分が異なる種において当該遺伝子の構造にどのような相違があるかを明らかにするため、ウスジロキノメイガのオス蛹からフォスミドライブラリー(57,600クローン)を作製するとともにPCR法によるスクリーニング系を構築した。さらに、当該遺伝子を含む9個のクローンを単離して、各クローンのショットガンライブラリーを作製し、ゲノム塩基配列決定に着手した。平成24年度は、前年度までに単離したアワノメイガとウスジロキノメイガの性フェロモン受容体、性フェロモン結合タンパク質、性フェロモン不飽和化

酵素遺伝子を含むフォスミドクローンからショットガンシーケンシング等によりアワノメイガ約330kb、ウスジロキノメイガ約265kbのゲノム塩基配列を決定した。その結果、性フェロモン結合タンパク質遺伝子クラスターの構造が両種間でよく保存されていることが明らかとなった。さらに、ウスジロキノメイガの性フェロモン受容体遺伝子クラスターの構造をほぼ決定し、遺伝子重複により生じたと思われる、タンデムに位置した遺伝子群を見いだした。また、フェロモン不飽和化酵素遺伝子のうちΔ11-desaturaseについて、アズキノメイガとウスジロキノメイガでは相同ではない遺伝子が発現していて、アワノメイガでは発現していないことが知られていたが、アワノメイガとウスジロキノメイガのΔ11-desaturase周辺のゲノム構造を決定した結果、両種とも遺伝子自体は3コピーずつ偽遺伝子化することなく存在していることが明らかとなり、遺伝子発現の違いは転写制御によることが示唆された。アワノメイガで解析を予定していた性フェロモン関連遺伝子の構造をほぼ明らかに出来たほか、ウスジロキノメイガのフォスミドライブラリーの作製やクローン単離等を当初計画より1年早く完了し、計画期間内に詳細なゲノム構造の比較が行える目処が立った。24年度が最終年度であるため、記入しない。アワノメイガ、ウスジロキノメイガにおける性フェロモン関連遺伝子群の構造決定をさらに進めるとともに、RNA-seq等による各遺伝子の発現量の比較を行う。また、これらの形質を遺伝的に解析するために、アワノメイガと近縁で性フェロモン成分の異なるアズキノメイガとの間のBF1集団の作出を行う。さらに、同一のフォスミドクローンには包含されない遺伝子間の位置関係を明らかにするためにFISH解析を行う。
視覚障害者のための薬剤情報提供システムの構築とその薬学教育への展開

視覚障害者が患者となった場合に,服用する薬剤の情報を正確に入手し,活用するには多大な努力が腰とされる.そこで調剤された薬剤の情報が視覚障害患者にも正確に伝達されるようにする目的で点字シール形式による薬袋記載事項の提供システムと点訳版「薬のしおり」の提供システムを,兵庫県薬剤師会との連携で構築した.さらに薬学教育の中でも視覚障害患者への薬剤情報提供教育を充実する目的で薬袋記載事項の点訳による情報提供実習を展開した.1.薬袋記載事項点字シールと点訳版「薬のしおり」提供システムの構築94種類の薬袋記載事項が墨字と点字で表記されたシールを作成し,兵庫県薬剤師会を通じて医療機関に提供できるシステムを構築した.医療施設へのアンケートから使用性については良好との評価を得た.さらに220品目の繁用医薬品の「薬のしおり」を点訳し,視覚障害者によるモニター実施後,同じく兵庫県薬剤師会との連携で提供できるシステムを構築した.2.視覚障害患者のための薬袋記載事項の点訳による情報提供実習の充実点字実習用テキストを作成し,学部3年次学生の実習において調剤実習の一部として点訳ボランティア連絡会の協力を得て実施し,薬剤情報のバリアフリーへの学生段階からの意識向上に努めた.視覚障害者が患者となった場合に,服用する薬剤の情報を正確に入手し,活用するには多大な努力が腰とされる.そこで調剤された薬剤の情報が視覚障害患者にも正確に伝達されるようにする目的で点字シール形式による薬袋記載事項の提供システムと点訳版「薬のしおり」の提供システムを,兵庫県薬剤師会との連携で構築した.さらに薬学教育の中でも視覚障害患者への薬剤情報提供教育を充実する目的で薬袋記載事項の点訳による情報提供実習を展開した.1.薬袋記載事項点字シールと点訳版「薬のしおり」提供システムの構築94種類の薬袋記載事項が墨字と点字で表記されたシールを作成し,兵庫県薬剤師会を通じて医療機関に提供できるシステムを構築した.医療施設へのアンケートから使用性については良好との評価を得た.さらに220品目の繁用医薬品の「薬のしおり」を点訳し,視覚障害者によるモニター実施後,同じく兵庫県薬剤師会との連携で提供できるシステムを構築した.2.視覚障害患者のための薬袋記載事項の点訳による情報提供実習の充実点字実習用テキストを作成し,学部3年次学生の実習において調剤実習の一部として点訳ボランティア連絡会の協力を得て実施し,薬剤情報のバリアフリーへの学生段階からの意識向上に努めた.我々が情報を入手する80%以上は視覚に基づくことが報告されている.従って視覚障害者が薬剤を使用する上で薬剤情報を正確に入手し,活用するには多大な努力が必要とされる.そこで平成11年度は調剤された薬剤の用法・用量を視覚障害者にも正確に伝達できるような薬袋記載事項の点字シールによる情報提供システムを考案し,それを薬学教育のなかでも展開することを目的とした検討を主に行った.(1)視覚障害者のための薬袋記載法の調査,検討本学で作成した薬袋記載事項の点字シールの使用性について病院薬剤部や薬局に郵送方式によるアンケート調査を実施した.その結果,本学の点字シールを利用して9施設では患者に活用されていることを認めた.また視覚障害者の誤飲防止を検討している団体に協力をお願いして,視覚障害者のための各種薬袋記載法の使いやすさについて調査を実施した.また学部3年次学生の薬剤学実習において調剤実習の一部として3時間の薬袋記載事項の点訳実習を行った.(2)点訳版「くすりのしおり」データベースの試作兵庫県薬剤師会で作成された約150種の繁用医薬品の「くすりのしおり」データベースを現有設備の点字プリンターで作成中である.点訳ボランティア連絡会に校正をお願いしており,それが終了後点字読解可能な視覚障害者に協力を呼びかけて,モニターしていただくことで,来年度中には繁用医薬品の点訳版「くすりのしおり」を制作する予定である.視覚障害者が病気になって医療機関を受診し,医師により処方せんが発行された場合,患者が主体的に薬物治療に取り組めるような支援として薬剤師は処方された薬剤に関する情報を視覚障害患者のためにも提供する必要がある.このため,神戸薬科大学では薬剤学実習の一部として薬袋記載事項の点訳実習を行っている.本年度は受講している3年次学生にアンケートを行った.点訳実習の学生の理解度は良好で,卒業後薬剤師として働く場合にも本実習が役立つものと考えられた.兵庫県薬剤師会との連携による,薬袋記載事項の点字シールの医療機関への提供は順調に進展しており,視覚障害患者の薬袋に点字シールは定期的に使用されている状態になった.そこで本年度は基礎的な薬の使用・保管法について説明した「くすりののみ方,使い方」という6分程度録音のカセットテープを朗読ボランティア連絡会の協力のもと作成し,同様の内容を点訳した資料と共に兵庫県内の薬剤師会23支部に配布した.さらに患者向けの薬剤情報「くすりのしおり」データベースの点訳版作成は点訳ボランティアグループ連絡会の校正面での協力で順調に進んでおり,約150種の繁用医薬品の点訳データを作成することができており,来年度前半には兵庫県薬剤師会が作成している約220品目の薬剤情報データベースが点訳データベースとして利用可能になる予定である.

平成13年度は視覚障害者用に作成したこれら資料について視覚障害者による評価を実施し,その解析結果を基に改良を加える予定にしている.我々が情報を入手する80%以上は視覚に基づくことが報告されている.従って視覚障害者が薬剤を使用する上で薬剤情報を正確に入手し,活用するには多大な努力が必要とされる.そこで平成13年度は調剤された薬剤の情報を視覚障害者にも正確に伝達できるようにする目的で点訳版「薬のしおり」による情報提供システムを兵庫県薬剤師会との連携で構築した.さらに薬学教育のなかでも視覚障害患者への薬剤情報提供教育を充実することを目的とした研究を行った.(1)点訳版「薬のしおり」データベースの構築兵庫県薬剤師会で作成された約220品目の繁用医薬品の「薬のしおり」データベースを現有設備の点訳ソフトと点字プリンターで作成した.点訳ボランティア連絡会が校正を担当して,誤訳防止に努めた.また点字読解可能な2名の視覚障害者や兵庫県盲人福祉協会に依頼し,数品目のしおりのモニターも行った.平成14年3月より兵庫県内の薬局で視覚障害者が依頼すれば,現在服用中の薬剤の点訳版「薬のしおり」を提供できるシステムを兵庫県薬剤師会との連携で構築した.(2)視覚障害者のための薬袋記載法の点訳による情報提供実習視覚障害者のための各種薬袋記載事項の点訳実習を,カリキュラムの変更もあったため,新たに点字実習用テキストを作成し,学部3年次学生の医療薬学系II実習において調剤実習の部として点訳ボランティア連絡会の協力を得て実施した.
巨大ひずみ加工による結晶粒超微細化強化と析出強化の同時利用の実現

各種析出強化型銅合金に,高圧ねじり(HPT)加工を施し,加工硬化量及び,時効硬化挙動に付いて系統的な調査を行った.HPT加工による到達最高硬さ,及び続く時効強化挙動に及ぼす加工温度の影響を明らかにした.さらに,HPT加工後の自然時効が,続く人工時効に及ぼす影響についても明らかにした.以上の結果は,巨大ひずみ加工による結晶粒超微細化と析出強化の重畳の実現へ新たな知見を与えるものである.初年度にあたる平成25年度は,析出挙動の異なる,Cu-Ti系(スピノーダル分解),Cu-Be系(fcc母相に中間相が核形成),Cu-Cr系(fcc母相にbcc-Crが核形成)の3つの合金系を使用し,室温と150°Cにおいて巨大ひずみ加工の一つである高圧ねじり(HPT: High Pressure Torsion)加工を施し,その後の析出硬化挙動を調査した.いずれの合金においても,HPT加工により結晶粒径が100nmオーダーまで超微細化し,硬度が大幅に増加した.この時,結晶粒径はCu-Be系合金,Cu-Ti系合金,Cu-Cr系合金の順に結晶粒径は微細化し,加工による強度上昇量と結晶粒径は,溶質原子の原子濃度と対応していた.すなわち,溶質原子濃度の増加により,強度が大きくなり,結晶粒径は微細化した.さらに,Cu-Be系合金においては室温で加工した場合よりも,150°C加工後の強度が大きくなるという興味深い結果を得た.このことより,150°CのHPT加工中にBe原子による転位の固着や,Be原子のクラスタリングが生じていることが示唆された.HTP加工後の各合金に300350°Cの範囲で時効熱処理を行った.Cu-Be系合金とCu-Ti系合金では時効硬化挙動を示したのに対して,Cu-Cr系合金では時効と伴に軟化が生じた.最大析出硬化量はCu-Be系合金,Cu-Ti系合金でそれぞれ,ΔHv=50,100となり,定性的には析出相の形成の容易さと対応した.組織観察の結果,Cu-Be系合金ではG.P.ゾーンが,Cu-Ti系合金ではβ'相が微細に析出していた.これらの析出物の形成により時効硬化挙動を示したことが分かる.また,Cu-Cr系合金ではbcc-Cr相の粒界析出のみが観察され,結晶粒内での析出は認められなかった.第二年度に当たる平成26年度は,析出強化型のCu-Be系合金とCu-Ti合金へ,高圧ねじり(HPT)加工を行い,その後,時効熱処理を行うまでの室温保持(自然時効)時間を変化させ,析出挙動の調査を行った.巨大ひずみ(SPD)加工によって作製されたバルクナノメタルには,高密度の格子欠陥が含まれる.その中でも,過飽和に導入された空孔は,室温においても急激にその濃度が低下し,平衡濃度近くまで減少することが知られている.このことから,析出硬化型合金において,SPD加工後から時効熱処理を行うまでの時間は,析出挙動へのパラメータとして考えることが出来る.Cu-Be系合金は,溶体化処理後の時効熱処理により,G.P.ゾーンが核形成し,その後,中間相を経て安定γ相へと変化する.一方で,Cu-Ti合金では,スピノーダル分解によりβ'相が形成し,その後安定β相へと変化する.Cu-Be系合金では,HPT加工後の自然時効時間の増加とともに,続く人工時効におけるピーク硬さが減少し,またピーク硬さに至るまでの時間が短くなった.すなわち,HPT加工後に自然時効を施すと,続く人工時効時に負の効果が現れた.一方で,Cu-Ti合金では,自然時効による人工時効時のピーク硬さと,そこまでの到達時間の変化はほとんど見られず,自然時効の影響はほとんど現れなかった.この結果は,HPT加工により導入された格子欠陥の自然時効中の消滅が影響したためと示唆された.Cu-Be合金では,自然時効時間が増加するに従い,空孔濃度が低下し,強化相であるG.P.ゾーンの核形成頻度が低下したと理解される.一方,Cu-Ti合金は析出物の核形成を必要としないスピノーダル分解によって析出反応が進行するため,人工時効前の空孔濃度によって,析出過程が変化しなかったと理解できる.巨大ひずみ加工の一つである,高圧ねじり(HPT)加工をCu-Be系合金,Cu-Ti系合金をモデル材料として用いて,SPD加工後に続く,自然時効中の格子欠陥密度変化を,透過型電子顕微鏡法,電気抵抗測定,X線回折法,示差熱分析法,陽電子分光測定法といった,多角的アプローチから定量的に計測し,それぞれの格子欠陥密度と続く人口時効時の析出硬化挙動の関連性について検討を行った.ここで,Cu-Be合金は,G.P.ゾーンの核形成を経て析出硬化が生じ,Cu-Ti合金では,スピノーダル分解を経て時効効果が生じる.HPT加工により高密度に導入された格子欠陥(粒界,転位,空孔)のうち,粒界密度(結晶粒径),転位密度は最長1ヶ月間の自然時効においても,ほとんど変化が生じないのに対して,空孔は室温程度の低温でも回復が生じ,その濃度が低下することを明らかにした.さらに,この空孔濃度の低下に依って,Cu-Be系合金では,室温保持時間の増加により,析出硬化能が減少するのに対して,スピノーダル分解によって析出硬化が生じるCu-Ti系合金ではほとんど影響を受けないことを明らかにした.各種析出強化型銅合金に,高圧ねじり(HPT)加工を施し,加工硬化量及び,時効硬化挙動に付いて系統的な調査を行った.

HPT加工による到達最高硬さ,及び続く時効強化挙動に及ぼす加工温度の影響を明らかにした.さらに,HPT加工後の自然時効が,続く人工時効に及ぼす影響についても明らかにした.以上の結果は,巨大ひずみ加工による結晶粒超微細化と析出強化の重畳の実現へ新たな知見を与えるものである.本申請課題では,巨大ひずみ高による結晶粒超微細化と,加工後の熱処理による析出強化を重畳させ,強度に優れかつ延性を保持した合金を創製するための指針を確立することを目的としている.具体的には,析出硬化型の銅合金を用いて,1)巨大ひずみ加工条件(温度,速度,ひずみ量),2)強化相の析出挙動(中間相の有無,核形成またはスピノーダル分解),3)強化相の体積分率の3つに注目し,これらを系統的に変化させ,結晶粒微細化強化と析出強化を同時に実現するための原理原則を探る.第一年度の平成25年には,上記の目的のうち1)と2)について,基礎的な知見をえた.すなわち,加工温度の変化により,続く時効時の析出挙動が異なり,これは加工中の溶質原子のクラスタリングや転位上への偏析による事を示した.第二年度に当たる平成26年度には,強化相析出物の形成挙動の相違により,加工中に導入された格子欠陥密度の変化に対して,その析出挙動が敏感に変化する事を明らかにした.金属材料工学最終年度の平成27年度では,巨大ひずみ加工後の自然時効中の格子欠陥密度の変化をより詳細に検討するために,これまでに行ってきた比抵抗測定に加えて,示差熱分析とX線分析を行う.比抵抗測定と示差熱分析では,空孔と転位の密度変化を捉えることができ,X線分析では転位密度の変化のみに敏感である.従って,これらの手法を併用することで,空孔と転位の密度変化を分離することが可能となる.さらに,Cu-Ti合金のTi濃度による析出挙動の変化についても調査を行う.Cu-Ti合金は,そのTi濃度によって,析出物の形成機構が核形成からスピノーダル分解へと変化する.従って,Ti濃度変化によって,自然時効に続く人工時効時の析出挙動が異なる事が予想される.平成2526年度に得られた結果と,平成27年度の結果を併せて,本申請研究の総括を行う.本研究では,巨大ひずみ加工による結晶粒超微細化強化と,加工後の熱処理による析出強化を重畳させ,強度に優れかつ延性を保持した合金を創成するための指針を確立する事を目的としている.具体的には,4種類のCu基析出強化型合金を用いて,1)巨大ひずみ加工条件(温度,速度,ひずみ量),2)強化相の析出挙動(中間相の有無,核形成またはスピノーダル分解),3)強化相の体積分率の3つに注目し,これらを系統的に変化させ,結晶粒微細化強化と析出強化を同時に実現するための原理原則を探る.H25年度は,上記で挙げた目的のうち,1)と2)について基礎的な知見を得ることが出来た.さらに,Cu-Be合金において,HPT加工温度が150°Cの場合に室温で加工した場合よりも,高い強度が得られるなどの興味深い結果も得ることが出来た.昨年度参加を計画していた国際会議(TMS annual Meeting,米国)に,学内業務の関係で出席することが出来なかった.H26年度以降は,Cu-Be系合金,Cu-Ti系合金を用いてHPT加工後直ちに時効を行い,析出挙動の調査を行う.これは,巨大ひずみ加工によって導入された高密度の格子欠陥のうち,空孔濃度は室温程度の低い温度でも平行濃度まで急激に減少することが報告されているためである.
決定的アルゴリズムに基づき動作する構造化オーバーレイネットワークの設計と実装

構造化オーバーレイネットワークのためのデータ集計の仕組みに対してタイムスロットの概念を導入することにより、広域に分散したデータを従来よりも正確に集計する仕組みを開発した。これにより、様々な地域に設置されているセンサからの観測データを効率的かつ正確に集計することが可能となる。また、データの集計機能によって得られるネットワーク全体の情報を基に、各ノードの負荷を従来よりも効率的に分散させる機能を開発した。以上により、「ノードの物理的位置を考慮した通信機能」「各ノードに分散したデータの正確な集計機能」「効率的な動的負荷分散機能」のすべてを備える構造化オーバーレイネットワークを実現した。平成25年度は、構造化オーバーレイネットワークに参加している各ノードによって管理されているデータを集計するためのスケーラブルな集計アルゴリズムと通信プロトコルを開発した。本研究課題で開発した集計手順では、各ノードが持っているデータの合計値や平均値などの集計結果をO(log N) (Nはオーバーレイネットワーク上のノード数)の通信データ量で求めることができる。そのため、10万ノード以上が参加する大規模な構造化オーバーレイネットワークに対して導入可能である。さらに、新たにタイムスロットの概念を導入することにより、従来の構造化オーバーレイネットワークの集計手法よりも正確な集計結果を得ることが可能となった。また、開発した集計アルゴリズムと通信プロトコルを導入した構造化オーバーレイネットワークのプロトタイプシステムを実装し、実験を通じて集計アルゴリズムと通信プロトコルの特性を検証した。この実験結果より、実装したプロトタイプシステムではオーバーレイネットワーク上の全ノードを対象とした正確なデータ集計をO(log N)の通信データ量で行うことができることを確認した。これらの研究開発の成果を平成26年3月に開催された情報処理学会第76回全国大会で発表した。さらに、上記の集計アルゴリズムで得られた集計結果にもとづき、各ノードが自律的に負荷分散を行う動的負荷分散アルゴリズムを開発した。この負荷分散アルゴリズムを用いることにより、不安定な通信状況下においても安定した情報管理と情報提供が可能となった。この負荷分散アルゴリズムを導入した構造化オーバーレイネットワークのアプリケーションとして、災害発生時などの通信インフラが不安定な状況下でも安定して情報を提供するP2P型安否情報共有システムを開発した。開発したシステムの仕組みと特性については平成26年2月の情報処理学会論文誌で発表した。平成25年度までに構造化オーバーレイネットワーク上で管理されているデータを集計するためのスケーラブルな集計アルゴリズムの開発を行った。しかし、開発した集計アルゴリズムにはノードの参加と離脱が頻発した場合に集計結果の正確性が低下する問題があった。そこで、平成26年度には、これまでに開発した集計アルゴリズムに対してデータの時系列変化を考慮する仕組みを導入することにより、スケーラブルで正確なデータ集計手法を実現した。このデータ集計手法を用いることにより、広域に分散された膨大な数のコンピュータによって管理されているデータを正確に集計することが可能となる。また、この正確なデータ集計結果を活用することにより、決定的アルゴリズムに基づいた効率的な動的負荷分散を実現できると考えられる。この研究成果については、平成26年に開催された2つの国際会議で発表した。一方、本課題で研究開発している構造化オーバーレイネットワークでは、参加している各ノードが自律的に負荷分散を行うため、不安定な通信環境下においても情報管理と情報提供を継続することができる。また、このオーバーレイネットワークは決定的アルゴリズムに基づいて制御されるため、情報の種類や地域性を考慮しながらデータの分散管理を行うことができる。そこで、これらの特徴を活かしたアプリケーションとして、災害発生時に安否情報を提供するための情報管理システムの開発を行った。このシステムでは、災害が発生したとしても通信可能なコンピュータのみを用いて情報提供を継続できるだけではなく、情報の種類や地域性を考慮したデータ集計を行うことにより目的の情報を的確に取得することが可能となる。この研究成果については、平成26年度に開催された1つの国際会議で発表した。平成26年度までに本研究課題で開発した構造化P2Pネットワークにおける効率的なデータ集計手法を活用することにより、構造化P2Pネットワークに含まれるすべてのノードの状態を考慮した効率的な動的負荷分散手法を開発した。また、この動的負荷分散手法を構造化P2PネットワークWaonに導入することにより、従来手法よりも効率的に負荷分散を行うことができる構造化P2Pネットワークを実現した。従来の構造化P2Pネットワークでは一部のノードの状態のみに基づいて動的負荷分散処理を実行するため、各ノードの負荷(計算量、記録データ量、通信データ量など)をネットワーク全体に分散させるまでに長い時間を要するという問題がある。一方、平成27年度に開発した新たな動的負荷分散手法では、構造化P2Pネットワークに含まれるすべてのノードの負荷の合計値や平均値を集計し、この集計結果に基づいて作成された効率的な負荷分散の計画に基づいて動的負荷分散処理を実行する。そのため、新たに開発した動的負荷分散手法ではネットワーク全体に負荷を分散させるまでに必要となる時間が従来手法よりも短いという特徴がある。この新しく開発した動的負荷分散手法を、決定的アルゴリズムに基づいて動作する構造化P2PネットワークWaonに導入した。これにより、物理ネットワークを考慮した通信機能とデータ集計機能を有し、効率的な動的負荷分散を行うスケーラブルな構造化P2Pネットワークを実現した。本研究課題で開発した理論やアルゴリズムについては、平成27年度に開催された1件の国際会議で発表した。また、平成27年度に行った構造化P2PネットワークWaonの性能評価結果については、平成28年度内に学術論文としてまとめ、学術論文誌に投稿する予定である。

構造化オーバーレイネットワークのためのデータ集計の仕組みに対してタイムスロットの概念を導入することにより、広域に分散したデータを従来よりも正確に集計する仕組みを開発した。これにより、様々な地域に設置されているセンサからの観測データを効率的かつ正確に集計することが可能となる。また、データの集計機能によって得られるネットワーク全体の情報を基に、各ノードの負荷を従来よりも効率的に分散させる機能を開発した。以上により、「ノードの物理的位置を考慮した通信機能」「各ノードに分散したデータの正確な集計機能」「効率的な動的負荷分散機能」のすべてを備える構造化オーバーレイネットワークを実現した。平成25年度までの研究開発より、本研究課題で開発している構造化オーバーレイネットワーク上のデータ集計手法では、ノードの参加や離脱が頻発したときに集計結果の正確性が低下するという耐churn性の問題があることが判明していた。そこで、平成26年度にはデータの時系列変化を考慮した仕組みを導入することにより上記の問題を解決した。これにより、構造化オーバーレイネットワークに参加しているすべてのノードの計算負荷の総量や必要となる通信帯域を集計することが可能となった。ここで開発した技術は、本課題の最終目標である決定的アルゴリズムに基づく効率的な動的負荷分散手法を実現するための基礎技術となる。ここで開発したデータ集計手法を活用することにより、本研究課題の目標である効率的な動的負荷分散手法を実現できると考えらえる。また、本研究課題で研究している構造化オーバーレイネットワークのアプリケーションとして、災害発生時であっても安定して情報管理と情報提供を行う安否情報管理システムの開発を行った。本研究課題の目標である応用システムの開発についても順調に進捗している。さらに、平成25年度と26年度の間に5件の国際会議と1件の学術論文で上記の研究成果について発表を行った。本研究課題の目標である3件の国際会議発表と2件の学術論文発表を達成しつつある。以上より、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。コンピュータネットワーク平成27年度には、本研究計画の最終目標である構造化オーバーレイネットワークにおける効率的な動的負荷分散手法の確立と評価を目指す。平成26年度までの研究開発により、この動的負荷分散手法を実現するために必要となるすべての基礎技術を揃えることができた。そこで、これらの基礎技術を活かした動的負荷分散アルゴリズムを再設計し、すでに実装してある構造化オーバーレイネットワークにこのアルゴリズムを組み込む。また、実装した構造化オーバーレイネットワークを用いた評価実験を行う。
ゲノム編集による異種2次代謝産物生産麹菌の迅速・多重遺伝子操作技術の開発

麹菌は日本の醸造産業のみならず、異種タンパク質生産の宿主として世界的に利用されている産業的に有用な糸状菌である。さらに最近、異種2次代謝産物生産を目的として国内外で使用されるようになっている。本研究では、研究代表者らが麹菌において確立したゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムを発展させ、異種2次代謝産物生産の効率化や生産性向上に利用することを目的とした。平成29年度は、CRISPR/Cas9システムを利用し、複数の遺伝子を単一の株で改変する技術、ならびに2次代謝生合成遺伝子を導入するための技術を開発した。具体的には、ゲノム編集用プラスミドをリサイクリングすることにより、高効率の遺伝子破壊や遺伝子導入を無限に繰り返すことが可能になった。平成30年度は、異種二次代謝産物生産のモデルとして、7つの生合成遺伝子によって合成される担子菌由来の抗細菌活性をもつジテルペンpleuromutilinの生産を行った。遺伝子導入の標的部位として、分生子の色素合成に関与するwA、硝酸資化に必要なniaD、ウリジン/ウラシル生合成に必要なpyrGの各遺伝子を選択した。麹菌野生株RIB40を宿主として段階的に形質転換を行い、各標的部位の欠失に由来する表現型を指標として株を選択することで、7つのpleuromutilin生合成遺伝子すべてが導入された株を効率的に取得した。得られた株の代謝物において、GC/MS解析によりpleuromutilinの生産が確認され、抗菌活性も検出された。さらに、取得された生産株を用いて、生産性向上のための代謝経路の遺伝子改変を行った。pleuromutilin合成につながるアセチルCoAの供給やエルゴステロール生合成経路について遺伝子改変を行った結果、pleuromutilin生産量の増加が見られた。以上の結果から、ゲノム編集を利用した効率的な遺伝子導入や遺伝子破壊により、麹菌における異種二次代謝産物生産ならびに生産性向上に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。麹菌Aspergillusoryzaeは日本の醸造産業のみならず、異種タンパク質生産の宿主として世界的に利用されている、産業的に有用な糸状菌である。本研究では、申請者らが麹菌において確立したゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムを発展させ、異種2次代謝産物生産の効率化や生産性向上に利用することを目的とした。最初に、ゲノム編集用プラスミドの自律複製を可能とするために、Aspergillus nidulans由来のDNA断片AMA1の半分にあたる領域を挿入することで、麹菌において50-100%の高い変異導入効率を得ることに成功した。そして、多重変異導入や多重遺伝子導入を同一の株で繰り返し行うことを目的として、麹菌のゲノム編集用プラスミドのリサイクリング技術を確立した。一度形質転換したゲノム編集用プラスミドを脱落させるため、過剰発現により生育阻害を示す転写因子AoAce2を使用し、誘導性のプロモーター制御下で発現するようにした。その結果、ゲノム編集用プラスミドの脱落に成功し、この導入・脱落の操作を繰り返すことにより多重変異導入が可能になった。さらに、ゲノム編集用プラスミドとともにドナーDNAを同時に導入することで、標的の遺伝子を破壊するノックアウト、標的とする遺伝子座に外来遺伝子を挿入するノックインをほぼ100%の効率で行うことに成功した。ここでは、標的とする遺伝子座に形質転換マーカーを導入せずに行うため、ゲノム編集用プラスミドをリサイクリングすることにより、遺伝子破壊や遺伝子導入を無限に繰り返すことが可能になった。以前、研究代表者らが初めて麹菌でCRISPR/Cas9システムを確立した際には、その変異導入効率は高くなかったが(10-20%)、本研究においてゲノム編集用プラスミドを自律複製型にすることにより50-100%の高い割合で変異株取得が可能になった。これは、以降の多重遺伝子改変を効率的に行うために十分に高い割合であり、本研究の目的を達成するための基盤となる成果である。実際に本研究において、標的とする遺伝子座に形質転換マーカーを導入することになしに、高効率のノックインとノックアウトが可能となった。また、自律複製型ゲノム編集用プラスミドの形質転換において薬剤耐性マーカーを用いることで、形質転換のために栄養要求性の宿主を取得する必要がないようにした。しかし一方で、糸状菌において形質転換用マーカーのリサイクリングは数多く行われてきたのに対し、薬剤耐性マーカーのリサイクリングに関する知見はなかった。本研究では、生育阻害を誘導する転写因子遺伝子Aoace2を同時に利用することで、薬剤耐性マーカーを含むゲノム編集用プラスミドの脱落・再利用を初めて可能とした。以上のようなゲノム編集用プラスミドのリサイクリングによって、生産させたい異種2次代謝産物の生合成遺伝子をゲノムに導入したうえで、形質転換マーカーの数を気にすることなく、無制限の遺伝子改変が原理的に可能となった。本研究でのゲノム編集技術の整備は大きく進展しており、次年度に予定している麹菌における異種2次代謝産物の生産性向上に貢献することが期待される。

さらに最近、異種2次代謝産物生産を目的として国内外で使用されるようになっている。本研究では、研究代表者らが麹菌において確立したゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9システムを発展させ、異種2次代謝産物生産の効率化や生産性向上に利用することを目的とした。平成29年度は、CRISPR/Cas9システムを利用し、複数の遺伝子を単一の株で改変する技術、ならびに2次代謝生合成遺伝子を導入するための技術を開発した。具体的には、ゲノム編集用プラスミドをリサイクリングすることにより、高効率の遺伝子破壊や遺伝子導入を無限に繰り返すことが可能になった。平成30年度は、異種二次代謝産物生産のモデルとして、7つの生合成遺伝子によって合成される担子菌由来の抗細菌活性をもつジテルペンpleuromutilinの生産を行った。遺伝子導入の標的部位として、分生子の色素合成に関与するwA、硝酸資化に必要なniaD、ウリジン/ウラシル生合成に必要なpyrGの各遺伝子を選択した。麹菌野生株RIB40を宿主として段階的に形質転換を行い、各標的部位の欠失に由来する表現型を指標として株を選択することで、7つのpleuromutilin生合成遺伝子すべてが導入された株を効率的に取得した。得られた株の代謝物において、GC/MS解析によりpleuromutilinの生産が確認され、抗菌活性も検出された。さらに、取得された生産株を用いて、生産性向上のための代謝経路の遺伝子改変を行った。pleuromutilin合成につながるアセチルCoAの供給やエルゴステロール生合成経路について遺伝子改変を行った結果、pleuromutilin生産量の増加が見られた。以上の結果から、ゲノム編集を利用した効率的な遺伝子導入や遺伝子破壊により、麹菌における異種二次代謝産物生産ならびに生産性向上に成功した。今後の研究課題の推進方策については、大きな変更や問題はない。平成30年度は麹菌における異種2次代謝産物の生産性向上を目指した研究を行う。最初に、ゲノム編集技術による高効率のノックイン技術を利用し、2次代謝生合成遺伝子を複数の染色体部位に導入することで、麹菌における異種2次代謝生合成遺伝子の多重導入技術を確立する。また、糸状菌において分化と2次代謝産物生産との関連は報告されているが、研究代表者らはこれまでに、麹菌の分化(菌核形成)に関与する転写因子を多く同定している。これをもとに、異種2次代謝産物高生産に関与する転写因子を探索する。この転写因子に加え、代謝経路の酵素や副反応産物生成の原因となるシトクロムP450をコードする遺伝子を対象とし、ゲノム編集プラスミドのリサイクリング技術により、ノックアウトおよびノックインを繰り返して、異種2次代謝産物の高生産株を作製する。以上により、異種2次代謝産物を高生産する麹菌株を取得し、生合成研究で使用できるようにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
機能未知なるカオナシ遺伝子の正体解明を目指す戦略的ゲノム研究

カオナシ遺伝子を統合的に解析するために、慶應ヒト遺伝子データベースを構築し、メダカカオナシ遺伝子のノックダウン解析結果や初期胚における発現パターンによる検索を可能とした。さらにヒトカオナシ遺伝子を培養細胞で強制発現させた細胞内局在解析や、高効率なメダカ発現コンストラクトの開発を行った。タンパク質コード遺伝子のみならず小分子カオナシRNAを対象としてシーケンシングと解析を行った。1.カオナシデータベースの構築および改良NCBIのRefseq geneとEBIのEnsembl geneのデータを独自に統合した慶應遺伝子データベース(KeioGeneDB)にメダカカオナシ遺伝子の発現解析およびノックダウン解析の画像データを入力し、wwブラウザーを用いて画像や表現型の情報を閲覧できるシステムを構築した。さらに、個々のデータを自動更新する機能を追加したが、non-coding RNAの存在や複数の遺伝子をまたぐcDNA情報の存在により現在Ensembl、NCBIのデータが共に混乱しているため完全な自動化は避けた。2.カオナシ遺伝子の発生初期ステージにおける発現解析メダカの発生ステージごとのcDNAを用いて延べ250遺伝子の発現解析を行った。さらにいくつかの発現に特徴のある遺伝子に関しては成体各組織での発現解析も行った。3.ノックダウン法による機能解析表現型に特徴のある遺伝子を選択し、再設計したアンチセンスオリゴと5塩基の置換を行ったネガティブコントロールオリゴを用いた確認実験を行うとともに、変異体で表現型が報告されている遺伝子を複数選択し、表現型コントロール実験を行った。4.カオナシRNAの解析小分子RNAの中には機能不明で特徴的な配列を持たないカオナシRNAが膨大に存在する。そこで、メダカを用いて小分子カオナシRNAのクローニングと配列解析を行った。メダカ精巣由来のtotal RNAから30塩基のRNA画分を抽出し、解析した結果、コーディング遺伝子とも反復配列とも関連の見られない新規のRNAを多数発見した。これらのシーケンスデータをタグ配列を取り除き自動で染色体上にマッピングするプログラムを作成した。1.カオナシテータベースの改良メダカカオナシ遺伝子の発現解析およびノックダウン解析の結果の閲覧が可能な慶應遺伝子データベース(KeioGeneDB)を改良し、ノックダウン解析結果の表現型やターゲット遺伝子の初期胚における発現パターンによる検索を可能とした。2.カオナシ遺伝子の細胞内局在解析ノックダウン解析の結果、表現型に特徴のあったTMEM141および魚類に存在しないカオナシ遺伝子であるTMEM171、LLN14をクローニングし、強制発現系による細胞内局在解析を行った。膜タンパク質であるTMEM141は核に、TMEM171はゴルジ、また既存のモチーフが全くないLLN14は核に局在が見られた。3.トランスジェニックベクターの開発魚類に存在しないカオナシ遺伝子を解析するため、ヒトカオナシ遺伝子のトランスジェニックメダカの作製を試みた。しかし、導入効率も低く、スクリーニングが困難であるため、新規トランスジェニックベクターの開発を行った。選別マーカーとして心筋でRFPを発現し、外来遺伝子を発現するユニットと併せて2つの発現ユニットを1つのコンストラクト上に持つ基礎ベクターを構築した。コントロールとして骨格筋プロモーター下でGFPを発現させたところ2色の蛍光を示す個体を得ることができた。今回構築したコンストラクトは魚類の旨トランスジェニック体を容易にスクリーニングできるという点で極めて有用であると考えられる。4.カオナシRNAの解析小分子KNAの中には機能不明で特徴的な配列を持たないカオナシRNAが膨大に存在する。そこで、昨年度に続き500サンプルのメダカ精巣由来の30塩基のRNAのシーケンスを解析した。
肝再生療法を目指した自己未梢血幹細胞の体外増幅・分化システムの開発

肝再生療法を目指し、幹細胞より肝細胞へのin vitroでの増殖・分化システム開発の研究を行った。幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞とヒト臍帯血間葉系幹細胞を使用した。1、ヒト骨髄間葉系幹細胞より肝細胞への分化誘導法の開発ヒト骨髄間葉系幹細胞へヒトパピローマウイルスのE7遺伝子とhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)遺伝子を導入し、寿命延長させたUE7T-13細胞を用い、肝細胞へ分化促進するサイトカインの条件と、スキャフォルド蛋白について検討した。UE7T-13細胞を脱メチル化剤5-azaで処理した群と未処理群で検討した。それぞれの群にHGF、aFGF、bFGF、LIF、OSM、ITS premixを組み合わせ添加し、3週間培養し、アルブミンmRNA発現を検討した。また、4型コラーゲンを用いて分化能への影響を検討した。アルブミン染色、PAS染色、尿素合成能も検討した。また、4型コラーゲン存在下で培養すると、高い分化能を示した。2、ヒト臍帯血間葉系幹細胞より肝細胞への分化誘導法の開発ヒト臍帯血間葉系幹細胞にhTERT遺伝子を導入したUCBTERTを用い、脱メチル化剤5-aza、HDAC阻害剤であるトリコスタチンA処理群と未処理群で検討した。それぞれで、各種サイトカインを添加し、アルブミンmRNA発現量、PAS染色、尿素合成能を検討した。その結果、5-aza処理後に、HGF、OSM、FGF2にて培養した細胞がもっともアルブミン合成能が高く、PAS陽性細胞数、尿素合成能も有意に高値を示した。以上より、幹細胞より肝細胞へ分化転換するための、最も効率の高い方法を2種類の細胞を用いて確立し、肝再生療法に貢献するものと期待される。われわれはヒトの肝再生医療実現に向け、ヒト幹細胞の増殖・分化システムの開発を目指して研究を進めている。将来的に末梢血への応用を考慮し、まず幹細胞の肝細胞への分化誘導システムを確立するために、ヒト間葉系幹細胞を用いて検討を行っている。最近、とりわけ肝細胞への分化能が高いことが報告されている、ヒト骨髄間葉系細胞およびヒト臍帯血間葉系幹細胞を使用し、肝細胞への分化システムを検討した。まず、ヒト骨髄間葉系細胞およびヒト臍帯血間葉系幹細胞へレトロウイルスTERT遺伝子を導入した細胞を樹立した。これらの細胞を、1)脱メチル化剤である5-アザシチジンとHDAC抑制剤トリコスタチンAを使用して、肝細胞特異的遺伝子発現を検討した。5-アザシチジンは1μMおよび5μMで処理した。トリコスタチンAはで24時間あるいは48時間処理後、3週間培養し、1週間置きに肝細胞特異的遺伝子発現を検討した。5-アザシチジンとトリコスタチンAの併用も検討した。2)HGF, FGF-2、FGF-4、OSMを組み合わせて培養し、肝細胞特異的遺伝子発現を検討した。検討した遺伝子は、アルブミン、TAT、TO、CK18、CK8、HNF3ベータ、HNF4を検討した。その結果、5-アザシチジン1μMで処理した細胞で、肝細胞への分化を強く認めた。トリコスタチンAでは、肝細胞への誘導作用は認めなかった。サイトカインの組み合わせでは、HGF/FGF-2およびHGF/FGF-2/OSMの組み合わせが最もアルブミン発現の誘導能に優れていた。

以上より、5-アザシチジンとHGF/FGF-2あるいはHGF/FGF-2/OSMの組み合わせが最も優れていると推定されるため、現在この組み合わせで検討を進めている。肝再生療法を目指し、幹細胞より肝細胞へのin vitroでの増殖・分化システム開発の研究を行った。幹細胞として、ヒト骨髄間葉系幹細胞とヒト臍帯血間葉系幹細胞を使用した。1、ヒト骨髄間葉系幹細胞より肝細胞への分化誘導法の開発ヒト骨髄間葉系幹細胞へヒトパピローマウイルスのE7遺伝子とhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)遺伝子を導入し、寿命延長させたUE7T-13細胞を用い、肝細胞へ分化促進するサイトカインの条件と、スキャフォルド蛋白について検討した。UE7T-13細胞を脱メチル化剤5-azaで処理した群と未処理群で検討した。それぞれの群にHGF、aFGF、bFGF、LIF、OSM、ITS premixを組み合わせ添加し、3週間培養し、アルブミンmRNA発現を検討した。また、4型コラーゲンを用いて分化能への影響を検討した。アルブミン染色、PAS染色、尿素合成能も検討した。また、4型コラーゲン存在下で培養すると、高い分化能を示した。2、ヒト臍帯血間葉系幹細胞より肝細胞への分化誘導法の開発ヒト臍帯血間葉系幹細胞にhTERT遺伝子を導入したUCBTERTを用い、脱メチル化剤5-aza、HDAC阻害剤であるトリコスタチンA処理群と未処理群で検討した。それぞれで、各種サイトカインを添加し、アルブミンmRNA発現量、PAS染色、尿素合成能を検討した。その結果、5-aza処理後に、HGF、OSM、FGF2にて培養した細胞がもっともアルブミン合成能が高く、PAS陽性細胞数、尿素合成能も有意に高値を示した。以上より、幹細胞より肝細胞へ分化転換するための、最も効率の高い方法を2種類の細胞を用いて確立し、肝再生療法に貢献するものと期待される。