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楕円関数を用いた陽的解表示による形状と大域的分岐構造の研究

楕円関数を用いて微分方程式のすべての候補となる解の表示式を求め,それをもとに大域的分岐構造を凝縮した超越方程式を導き解析するという,独自の手法を深化させさまざまに適用範囲を拡げることができた.cross-diffusion方程式については,空間1次元の場合の楕円関数による解表示から示唆を得た,空間多次元の場合の定常解の存在と安定性に関する結果を得た.線形化固有値問題については,Allen-Cahn型の反応拡散方程式の場合に,線形化固有値問題の固有値を決定する固有方程式を発見し,すべての固有値と固有関数の表示式を厳密に求めた.さらに,拡散係数が零に近づいたときの固有値の漸近公式も得た.四ツ谷は,研究課題の「楕円関数を用いた陽的解表示による形状と大域的分岐構造の研究」に関連する,これまでの研究結果を紹介した数学セミナー連載記事(2011年4月号2012年4月号)を大幅に加筆・修正し,2013年度12月に単行本として日本評論社より出版した.研究課題の中心テーマのひとつであるcross-diffusion方程式(交差拡散方程式)については,Ni教授(ミネソタ大・華東師範大学),Lou教授(オハイオ州立大)と共同研究により,空間1次元の場合の楕円関数による解表示を詳細に検討して,空間多次元の場合の定常解の存在と安定性について全く新しい結果を得た.この結果をまとめた論文は欧文誌DCDSに掲載が決定した.この結果は,今後の期待される多次元問題解析の基礎となるものである.さらに,松本・村井と面積制約条件付平面弾性曲線の問題の曲率の爆発現象についての共同研究を進展させ,国際会議The 9th AIMS Conferenceにおいて発表を行っていた.この内容をもとに,詳しく具体的な計算を実行したものが欧文誌DCDS Supplementに掲載された.この論文で示された楕円関数による解表示はさまざま状況下での曲率の爆発現象の解析の基礎となるものである.森田は全質量が保存される反応拡散方程式の定常解の安定性を調べるひとつの手段として,特別な状況下では,リヤプーノフ関数が構成できることを示した.二宮は,移動性細胞を表現する自由境界問題において,外部刺激が存在する場合に一定速度で移動する細胞領域が存在することを示した.楕円関数を用いて微分方程式のすべての候補となる解の表示式を求め,それをもとに大域的分岐構造を凝縮した超越方程式を導き解析するという,独自の手法を深化させさまざまに適用範囲を拡げることができた.cross-diffusion方程式については,空間1次元の場合の楕円関数による解表示から示唆を得た,空間多次元の場合の定常解の存在と安定性に関する結果を得た.線形化固有値問題については,Allen-Cahn型の反応拡散方程式の場合に,線形化固有値問題の固有値を決定する固有方程式を発見し,すべての固有値と固有関数の表示式を厳密に求めた.さらに,拡散係数が零に近づいたときの固有値の漸近公式も得た.四ツ谷は,研究課題に関連する従来の研究結果を紹介した数学セミナー連載記事を大幅に加筆・修正し単行本とするために2012年度1年間かけ執筆し脱稿した.2013年に出版予定である.研究課題の中心テーマのひとつである交差拡散方程式については,Ni教授(ミネソタ大・華東師範大学),Lou教授(オハイオ州立大)と共同研究により,空間1次元の場合の楕円関数による解表示を詳細に検討して,空間多次元の場合の定常解の存在と安定性について全く新しい結果を得た.この結果を米国・台湾での二つの国際会議において成果発表を行った.この結果は,今後の期待される多次元問題解析の基礎となるものである.さらに,松本・村井と面積制約条件付平面弾性曲線の問題の曲率の爆発現象についての共同研究を進展させ,国際会議The 9th AIMS Conferenceにおいて成果発表を行った.発表内容をもとに詳しく具体的な計算を実行したものが欧文誌DCDS Supplementに掲載決定された.この論文で示された楕円関数による解表示はさまざま状況下での曲率の爆発現象の解析の基礎となるものである.森田は空間多次元の双安定な反応拡散方程式の非平面進行波の存在について調べた.二宮は反応拡散系の解形状を調べるために,反応拡散系の特異極限をとった自由境界問題を取り扱っている.この自由境界問題の取り扱いは非常に困難なため,まず,自由境界問題を少し簡単にしたモデル方程式を取り扱い,円盤上の回転スポット解の存在を示し,この回転スポット解を用いて2次元平面上の回転スパイラル解の構成に成功した.これらの結果はは将来,交差拡散方程式方程式の進行波の研究に有用なものとなると期待される.研究課題の中心テーマのひとつであるcross-diffusion方程式(交差拡散方程式)について,Ni教授(ミネソタ大・華東師範大学),Lou教授(オハイオ州立大)との共同研究により,空間1次元の場合の楕円関数による解表示から示唆を得た,空間多次元の場合の定常解の存在と安定性に関する結果を論文として発表した.空間1次元の場合の解の多重度のついては,長年技術的なネックとなっていた第三種完全楕円積分を取り扱う新たな手法を発見できたので論文作成にとりかかっている.また,若狭准教授(九州工業大学)との共同研究により,3次の非線形項の典型例であるAllen-Cahn型の反応拡散方程式の線形化固有値問題に対して,楕円関数を用いた固有値の決定方程式・固有関数の表示式・漸近公式を得て論文として発表した.

これらに基づき拡散係数が零に近づいたときの固有関数の極限形状の論文を作成中である.一見似た非線形項でも固有値と固有関数の構造は著しく異なることが分かった.さらに,坂元教授(広島大),村井博士との共同研究により,長さ・面積を与えた平面弾性閉曲線の全体構造解明の手法を応用し,円周上の微分型シュレディンガー方程式が極めて多様な進行波解を持つことを明らかにし,国際会議The 10th AIMS Conf.において成果発表した.発表内容に大幅加筆したものが掲載決定された.加えて,曲率の爆発現象の理解,3種反応拡散方程式の2種cross-diffusion方程式による理解,非局所項をもつGierer-Meinhart系の大域的分岐構造の証明の完成も進んでいる.森田は空間多次元反応拡散方程式に対するスペクトルの比較について論文発表した.二宮は反応拡散系のさまざまな多次元進行波を構成し論文として発表し,さらに,最新の研究成果を含めた単行本「侵入・伝搬と拡散方程式」を出版した.大域解析学研究の目的のうち,cross-diffusion方程式に関することと,面積制約条件付平面弾性曲線の曲率の爆発現象については予定通り研究が進んでいる.線形化固有値問題については共著論文(共著者:若狭徹准教授(九州工大))は既に論文を欧文誌に投稿した.供給項をもつGierer-Meinhart系の大域的分岐構造と極限形状解明に取り組んでいきたい.研究の目的のうち,cross-diffusion方程式に関することと,面積制約条件付平面弾性曲線の曲率の爆発現象については予定通り研究が進んでいる.線形化固有値問題については共著論文(共著者:若狭徹准教授(九州工大))がほぼ完成し,推敲の上で2013年6月に欧文誌に投稿する状況にある.供給項をもつGierer-Meinhart系の大域的分岐構造と極限形状解明の計算は若干遅れている.1.cross-diffusion方程式の極限方程式の1次元の場合について,定常解の大域的構造の完全解明,数値計算結果等を論文としてまとめ,欧文誌に投稿する.2.長さ・面積を与えた,平面閉弾性曲線の大域構造解析のための基本的な解の表示式は欧文誌に発表したので,これを応用して爆発現象の解明結果を論文としてまとめ,欧文誌に投稿する.3.3種よりなる反応拡散方程式系を2種のcross-diffusion方程式で近似できることについて,近似の度合いを数値計算で検証を行い,これを用いて3種反応拡散方程式の構造解明を試みる.4.非局所項をもつGierer-Meinhart系の大域的分岐構造と極限形状解明の理論的解析を行う.大きく分けて次の4つの内容について研究を推進する.第1は,交差書拡散方程式の極限方程式の1次元定常解の大域的構造の完全解明,高次元への拡張,数値計算結果等を論文としてまとめ,欧文誌に投稿することである.第2は,長さ・面積を与えた,平面閉弾性曲線の大域構造と爆発現象の解明結果を論文としてまとめ欧文誌に投稿することである.第3は,3種よりなる反応拡散方程式系を2種のcross-diffusion方程式で近似できることについて,近似の度合いを数値計算で検証を行い,これを用いて3種反応拡散方程式の構造解明を試みることである.第4,は非局所項をもつGierer-Meinhart系の大域的分岐構造と極限形状解明の理論的解析を行うことである.
住血吸虫における発育段階特異的遺伝子発現の機能解析

本研究では,住血吸虫遺伝子における分子生物学的適応現象をそれに関わる遺伝子の解析及び発育段階別・株別変化を検討した。また,関連する遺伝子の染色体解析も合わせて行なった。【方法】日本住血吸虫及びマンソン住血吸虫の各虫体別に遺伝子材料を抽出し,genomic DNA library(lambda EMBL4),加えてcDNA library(lambda gtll)を作成した。これらのlibraryを様々なDNA・RNA断片及びモノクロ-ナル抗体によりスクリ-ニングし,遺伝子配列の同定と存在様式を検討した。得られた遺伝子断片は,さらに,染色体マッピングに使用し,染色体構造上の特異性を検討した。【結果及び考察】1.住血吸虫のrRNA geneは,large subunit及びsmall subunit,介在するintervene sequenceにより構成される。このクロ-ンのマッピングの結果,日本住血吸虫とマンソン住血吸虫の間に顕著な差が示された。rRNA遺伝子は,非常conservativeな遺伝子群の一つとされており,同一種におけるこの様な変化は,生物学的に極めて稀な現象であり,その複雑な生活環への関与が考えられる。2。染色体のCーband farmationとrRNAgene populationを用いたマッピング;上記のDNA断片を用いて染色体マッピングを行なったところ,反応位は3番染色体短腕第2次狭窄部であった。この部分は,非常に特殊な三次構造を示し,現在までのところ,他の遺伝子のこの部位での存在は報告されていない。3.p53の解析:p53は,細胞周期の制御因子(negative regulator)として知られている。Lambda gtll cDNA libraryのモノクロ-ナル抗体(Ab2,Oncogene Science,Inc.)を用いたimmunoscreening(piko Blue kit,Stratagene)により,日本住血吸虫雄成虫libraryで陽性クロ-ンを得た。このfusion proteinは約76KDa,1.2KbのRNA断片として発現される。その遺伝子配列及び分子生物学的特徴を現在検討中である。2。
トランスジェニックマウスを用いたアンチセンスによるB型肝炎ウイルス発癌抑制の検討

B型肝炎ウイルス遺伝子HBxを挿入したトランスジェニックマウスを用いて、ホスホロサイオエイトオリゴマー(S-オリゴ)アンチセンスの効果を検討した。昨年の報告で述べたように投与開始をマウスの出生後いつ出来るかをまず検討した。あまりに生後早期(3週生日)にS-オリゴマー1mg腹腔内投与を開始すると、成長障害が見られたため、漸増法にて週3日投与を行なったところ、成長障害や肝臓組織内の細胞浸潤など毒性は認められなかった。この実験条件でHBxに対するS-オリゴアンチセンスを投与されたマウスではセンス投与マウスに較べて、HBx遺伝子の発現が抑えられていた。免疫組織学的検討でもHBx蛋白は減少しているように見受けられた。更に、アンチセンス効果を確かめるために15週生日より1週間連日投与した。投与終了後すぐに解剖し、肝臓より抽出したRNAを用いてRT-PCR及びS1マッピングにて検討した。アンチセンス投与を受けた2匹のマウスではセンス投与マウス及びコントロースマウスに比較して、HBx遺伝子発現が明らかに低下していた。HBxは自分自身の遺伝子発現(DNA→RNAの転写)をHBx蛋白によってコントロールされているので、アンチセンスによるHBx蛋白の生成の抑制があればHBxのmRNAも減少すると考えられる。実際、アンチセンス投与を受けたマウスはHBxの遺伝子発現が蛋白レベルでもmRNAレベルでも明確に抑制を受けていた。このことは、生体内でのアンチセンス効果を臓器特異的に認めたこととなる。今後、更に既に出生1年以上経過して肝癌を発癌しているマウスで癌増殖抑制が見られるかを検討していく予定である。B型肝炎ウイルスの遺伝子の一つで、肝癌発生に関連していると考えられているpX遺伝子(以下HBx遺伝子)を挿入しにトランスジェニックマウスに、ホスホロサイオエイトオリゴマーをHBx遺伝子の一部に相補的配列にしたアンチセンス1(HBx遺伝子中央付近でGC含有率の高い部位を標的)、アンチセンス2(翻訳開始部位付近)を作製し実験を行った。アンチセンス1実験では、マウス28生日より10週間、3回/週でオリゴマーを腹腔内に投与した。1回投与量は1mgとし、アンチセンス投与群2匹、センス投与群1匹、無処置群1匹とした。10週後、肝組織を検索したところ、初期病変である空胞変性肝細胞集合は上記4匹のマウスすべてで同様にみられ、アンチセンス効果は認められなかった。オリゴマー投与群では成長障害などの副作用はみられなかったが、肝組織で門脈周囲に炎症反応が認められ、オリゴマーの作用と考えられた。28生日からの投与開始で効果が認められなかったので、より早期からの投与を検討した。7生日から0.2mg/回の3回/週を1週間、その後14生日より0.5mgとしたところ、21生日以降にオリゴマー投与した3匹に成長障害が認められ、死亡した。そこで14生日からの投与とし、0.2mg/回、3回/週を2週,0.5mg/回,3回/週を1週、その後第35生日より1mg/回,3回/週で5週間投与したところ成長障害も認められず、70生日に組織を検討した。アンチセンス投与群2匹のうち1匹に組織変化がセンス投与群、無処置群に比較し軽微であり、RNAレベルでも低値であった。副作用と思われる組織変化はこのプロトコールでは認められなかった。今後、標的mRNAを変化させたり、投与プロトコールを変更し、より多数の匹数のマウスを検討する予定である。

あまりに生後早期(3週生日)にS-オリゴマー1mg腹腔内投与を開始すると、成長障害が見られたため、漸増法にて週3日投与を行なったところ、成長障害や肝臓組織内の細胞浸潤など毒性は認められなかった。この実験条件でHBxに対するS-オリゴアンチセンスを投与されたマウスではセンス投与マウスに較べて、HBx遺伝子の発現が抑えられていた。免疫組織学的検討でもHBx蛋白は減少しているように見受けられた。更に、アンチセンス効果を確かめるために15週生日より1週間連日投与した。投与終了後すぐに解剖し、肝臓より抽出したRNAを用いてRT-PCR及びS1マッピングにて検討した。アンチセンス投与を受けた2匹のマウスではセンス投与マウス及びコントロースマウスに比較して、HBx遺伝子発現が明らかに低下していた。HBxは自分自身の遺伝子発現(DNA→RNAの転写)をHBx蛋白によってコントロールされているので、アンチセンスによるHBx蛋白の生成の抑制があればHBxのmRNAも減少すると考えられる。実際、アンチセンス投与を受けたマウスはHBxの遺伝子発現が蛋白レベルでもmRNAレベルでも明確に抑制を受けていた。このことは、生体内でのアンチセンス効果を臓器特異的に認めたこととなる。今後、更に既に出生1年以上経過して肝癌を発癌しているマウスで癌増殖抑制が見られるかを検討していく予定である。
触法精神障害者の刑事責任に関する総合的研究－責任能力論・量刑論からのアプローチ

本研究は,イギリス(イングランド・ウェールズ)刑法における量刑論について,現地でのリサーチ等を通じて歴史的背景や理論的根拠を対象とした研究を行うことにより,近時の実務で大きな問題となっている,触法精神障害者に対する量刑の判断枠組みを明らかにすることを目的とする。今年度は,触法精神障害者の量刑判断枠組みを提示する準備作業として,自招性精神障害の刑法的評価の問題に立ち入った検討を試みた。その結果,精神障害に自招性が認められる場合にわが国の裁判実務では,犯行に及ぶ意思を事前に有していたかを問わず,刑法39条の適用が排除されていること,換言すれば,自招性精神障害の場合にも刑法39条の対象たりうることを前提に「原因において自由な行為」の理論を構成する日独の学説とは異なり,わが国の裁判実務は,自招酩酊の場合に責任無能力とされる余地を端的に排除する英米の判例学説の立場に近いことを明らかにした。この成果は,北大刑事法研究会(2018年4月21日「自ら招いた精神障害の刑法的評価:「原因において自由な行為」論からの脱却と展望」)および早稲田大学刑事法学研究会(「自招性精神障害の刑法的評価」2018年5月12日)で報告し,オーディエンスからのフィードバックを得た。また,上記の問題意識の下で英米法圏の判例・学説に検討を加えた論稿「自招性精神障害の刑法的評価:『原因において自由な行為』論の再定位(1)(2・完)」を,北大法学論集69巻6号,70巻1号に投稿した。本年度は,以下に挙げる理由により,当初の期待通り研究の進展があったと評価できる。第一に,わが国の量刑論に関する学説や,裁判員制度の導入を契機として公表された刑事裁判官による論稿の分析を着実に進めた。第二に,自招性精神障害の刑法的評価の問題に取り組み,その成果を北大刑事法研究会および早稲田大学刑事法学研究会にて公表し,北大法学論集に投稿した。第三に,継続して取り組んでいる責任能力論について,単著『刑事責任能力論』を刊行した。今後は,イギリスにおける90年代以降の量刑立法を分析する予定である。2003年刑事司法法が制定されるに至った過程に検討を加えることで、量刑に対する現在の基本的な思考枠組みを把握する(当初の計画では2年目に遂行予定の内容だが,自招性精神障害の問題の検討を前倒ししたために,3年目の研究内容として実行する)。そして、こうした立法の背後にある量刑思想について、ジョエル・ファインバーグ博士やアンドリュー・フォン・ハーシュ教授(フランクフルト大学)の著作を中心とした外国法文献の収集と精読に多くの時間を費やす予定である。現在わが国において,触法精神障害者の量刑がどのように評価され,その背景にある刑罰思想がいかなるものなのかが問題となっている。しかし,ドイツの議論を参考に展開されてきたこれまでの量刑理論は,抽象的な議論にとどまっており,裁判実務において,これらを直接的な指針として用いることは困難である。これまでの量刑理論は,「責任とは何か」という形而上学的な命題から演繹的に導出された基準を提示することに終始し,実務における理論の適用可能性を度外視する傾向があったためである。これに対して本研究は,イギリス(イングランド・ウェールズ)刑法における量刑論について,現地でのリサーチ等を通じて歴史的背景や理論的根拠を対象とした研究を行うことにより,近時の実務で大きな問題となっている,触法精神障害者に対する量刑の判断枠組みを明らかにすることを目的とする。今年度は,これまでに継続してきた,ドイツ法の影響の下で展開されてきたわが国の量刑論についての分析に加え,新たな分析対象として,裁判員制度の導入を契機として公表された刑事裁判官による論稿を加えた。これらを整理・分析することで,わが国の量刑論と実務における判断プロセスの齟齬を認識し,イギリス法の分析対象を一定程度明確にした。また,イギリスにおける量刑論の基礎的な文献の整理・分析に着手した。特に,イギリスにおける90年代以降の量刑立法を分析し,2003年法が制定されるに至った過程に検討を加えることで,量刑に対する現在の基本的な思考枠組みを把握した。以下の2点により,当初の計画よりも進捗が遅れている。1責任能力論から量刑論へと分析対象を移す過程において,自招性精神障害の問題に取り組まざるを得なくなり,この個別論点の解決に時間を割く必要に迫られたこと,2触法精神障害者の処遇を考えるに際して不可避な,精神保健法に関する知識の不足を補う必要が生じたこと。

その結果,精神障害に自招性が認められる場合にわが国の裁判実務では,犯行に及ぶ意思を事前に有していたかを問わず,刑法39条の適用が排除されていること,換言すれば,自招性精神障害の場合にも刑法39条の対象たりうることを前提に「原因において自由な行為」の理論を構成する日独の学説とは異なり,わが国の裁判実務は,自招酩酊の場合に責任無能力とされる余地を端的に排除する英米の判例学説の立場に近いことを明らかにした。この成果は,北大刑事法研究会(2018年4月21日「自ら招いた精神障害の刑法的評価:「原因において自由な行為」論からの脱却と展望」)および早稲田大学刑事法学研究会(「自招性精神障害の刑法的評価」2018年5月12日)で報告し,オーディエンスからのフィードバックを得た。また,上記の問題意識の下で英米法圏の判例・学説に検討を加えた論稿「自招性精神障害の刑法的評価:『原因において自由な行為』論の再定位(1)(2・完)」を,北大法学論集69巻6号,70巻1号に投稿した。本年度は,以下に挙げる理由により,当初の期待通り研究の進展があったと評価できる。第一に,わが国の量刑論に関する学説や,裁判員制度の導入を契機として公表された刑事裁判官による論稿の分析を着実に進めた。第二に,自招性精神障害の刑法的評価の問題に取り組み,その成果を北大刑事法研究会および早稲田大学刑事法学研究会にて公表し,北大法学論集に投稿した。第三に,継続して取り組んでいる責任能力論について,単著『刑事責任能力論』を刊行した。今後は,イギリス量刑論に分析対象を戻しつつ,イギリス法文献の収集と分析に時間を割く予定である。今後は,イギリスにおける90年代以降の量刑立法を分析する予定である。2003年刑事司法法が制定されるに至った過程に検討を加えることで、量刑に対する現在の基本的な思考枠組みを把握する(当初の計画では2年目に遂行予定の内容だが,自招性精神障害の問題の検討を前倒ししたために,3年目の研究内容として実行する)。そして、こうした立法の背後にある量刑思想について、ジョエル・ファインバーグ博士やアンドリュー・フォン・ハーシュ教授(フランクフルト大学)の著作を中心とした外国法文献の収集と精読に多くの時間を費やす予定である。
大腿屈筋の機能分担と肉離れ発症メカニズムの解明

ハムストリングス肉離れ受傷メカニズム解明のため,伸張性股関節伸展運動およびスプリント動作時のハムストリングスの筋活動動態を明らかにした結果,ハムストリングス各筋はそれぞれ異なる筋活動動態を示した.本研究により運動時のハムストリングス各筋が解剖学的構造・形態の相違に起因する機能の差を有していることが,特定の筋の肉離れ受傷リスクを高める潜在的な要因として関与している可能性が示唆された.ハムストリングス肉離れ受傷メカニズム解明のため,伸張性股関節伸展運動およびスプリント動作時のハムストリングスの筋活動動態を明らかにした結果,ハムストリングス各筋はそれぞれ異なる筋活動動態を示した.本研究により運動時のハムストリングス各筋が解剖学的構造・形態の相違に起因する機能の差を有していることが,特定の筋の肉離れ受傷リスクを高める潜在的な要因として関与している可能性が示唆された.ハムストリングスの機能分担に関する研究では成人10名を対象とし立位で股関節をゆっくり90。まで屈曲させ体前屈位を強制するgood morningトレーニングを等尺性膝最大屈曲筋力の0.8倍の負荷をかけながら施行し,その結果を表面筋電図,MRIでのT2値変化および筋断面積(CSA)変化より評価した.その結果、伸張性運動と短縮性運動のどちらにおいても大腿二頭筋長頭および半膜様筋の活動度が半腱様筋および薄筋の活動度に比べて高く、さらに伸張性運動では半膜様筋の活動度が大腿二頭筋長頭のそれよりも高かった.またMRIのT2値の結果からも、このような運動の筋力トレーニングとしての効果は特に大腿二頭筋長頭や半膜様筋において生じることが推測された。この結果は我々の膝伸展によるハムストリンへの伸張性負荷実験(萌芽研究平成1920年)と異なる結果であった.肉離れを生じた肢位の解析はサッカー協会(Jリーグ映像提供)のビデオを元に2例について2次元での解析をした.サッカーの場合膝伸展よりも,股関節を強制的に屈曲させられてハムストリングスを受傷するケースが多く,膝関節は伸展位はなってなくても,股関節の強制的な屈曲で受傷するケースが多かった.なお受傷した選手が国立スポーツ科学センターを受診した場合は肉離れ部分を中心としたMRI(STIR)画像を撮り,受傷肢位と画像所見の関連,さらにはリハビリテーションと復帰までの過程を検討した.結果として代表的な肉離れでは,筋とともに腱膜(Tendon plate)の損傷が必ず生じており,この腱膜の治癒期間と,スポーツ復帰までの期間がほぼ一致する事が判明した.目的:ハムストリングス肉離れ受傷メカニズムに関与する動作的要因として,スプリント動作の加速局面で多くみられる体幹前傾角度増加がハムストリングスの伸張ストレス増大に関与すると考えられているが,その科学的データは示されていない.そこで本研究では,スプリント走の加速局面およびトップスピード局面におけるハムストリングス構成筋の筋キネマティクスおよび筋活動動態を明らかにし,ハムストリングスに加わる負荷を推定した.測定方法:本研究は男子陸上短距離選手15名を対象とし,屋内陸上競技走路で実施した.対象者は反射マーカー,および筋電図電極を貼付し,以下の2試技を施行した.(1)加速局面の測定:測定凶間中央15m手前よりスターティングブロックを用いたクラウチングスタートからスタートダッシュを行わせた.(2)トップスビード局面の測定:測定区間中央60m手前よりスプリントを行わせた.(1),(2)の条件で8台の3次元光学式位置測定装置を用いて,サンプリング周波数200Hzで対象者が測定区間(約6m)の走路上を走行する際の疾走動作を計測した.頭作の計測と同時に,ワイヤレス表面筋電計を用い,大腿二頭筋長頭,半腱様筋,半膜様筋よりサンプリング周波数2000Hzにて表面筋電位を測定した.分析結果:筋骨格モデリングソフトを用いて,ハムストリングス各筋(大腿二頭筋長頭.半腱様筋,半膜様筋)の筋長および筋-腱張力の推定した.その結果加速局面で体幹の前傾は見られるものの,加速局面とトップスピード局面では筋キネマテックスでは有意差がなかった.なお大腿二頭筋では着地前に筋力がピークになり.半腱様筋,半膜様筋とは異なる挙動を示した.ハムストリングスの筋活動動態の分析に関して,筋活動量およびビークタイミングの分析に加え,Wavelet解析による筋活動の周波数分析を現在推進中である.本年度は主として4種類の実験的研究を行った.1異なる走速度におけるスプリント時のハムストリングスの筋活動動態.2スプリント時のハムストリングスの筋伸張動態の検討.3スプリント時のハムストリングスの筋活動動態の検討.4スプリント時の体幹前傾動作がハムストリングス筋伸張動態および筋活動動態に及ぼす影響この4種類の実験的研究結果より,スプリント動作時のハムストリングスは協調して活動しているが,最大速度付近のスプリントでは,遊脚期後半および接地期において各筋が高い筋活動を示す時点が時系列的に異なっており,筋伸張動態に関しても各筋で異なる時経列変化を示すことが明らかとなった.これらの結果は,大腿二頭筋(BF),半腱様筋(ST),および半膜様筋(SM)の解剖学的構造・形態の差に起因するものと考えられた.

さらに,BFおよびSMに関して,遊脚期後半において瞬間的に高い伸張負荷が生じている可能性が明らかとなったことから,スプリント時のハムストリングスが解剖学的構造・形態の差に起因した異なる筋活動動態および筋伸張動態を有していることが,特定の筋の肉離れ受傷リスクを高める潜在的な要因として関与している可能性が示唆された.また,高速疾走時の体幹前傾動作がスプリント時のハムストリングス肉離れ受傷危険因子であることが示された.本論文の一連の研究により,スプリント動作におけるハムストリングス各筋の筋活動動態,筋伸張動態,およびそれらの関連性を明らかにし,ハムストリングス肉離れ発生メカニズムの解明に向け重要な知見を示すことが出来たと考えられる.臨床的にはハムストリングスの肉離れをその重症度に応じて3種類に分類し,血管型,筋膜部分損傷型,研完全断裂型としてそのメカニズムの差異と治癒までの期間の違い,および手術の可否について明らかにする事が出来たハムストリングスの筋活動動態の分析に関して,筋活動量およびピークタイミングの分析に加え,Wavelet解析による筋活動の周波数分析も終了する予定であったが,Wavelet解析の手法に問題が生じ,現在本手法を再検討中である.24年度が最終年度であるため、記入しない。第3年次の硫究はそのまま遂行する予定であり,Wavelet解析の結果も後12ヶ月後には出せる予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
補体結合性抗HLA抗体とIgGサブクラスの臓器移植後慢性拒絶反応における役割

平成30年度においては、研究計画通り、小児肝移植患者の補体結合性を加味したドナー特異的抗HLA抗体と臨床経過の関連について解析を行った。その結果、ドナー特異的抗HLA抗体の存在と移植肝の線維化との有意な関連が認められた一方、補体結合性抗HLA抗体と肝線維化の関連は認められず、肝移植における補体結合性の解析の意義は現時点では認められないと考えられた。また、ドナー特異的抗HLA抗体量の指標となっている蛍光強度と補体結合性の間に有意な関連を認めており、補体結合性を追加解析をこれら蛍光強度によって代替し得る可能性が示唆された。これらの解析結果を国内の学術集会(日本外科学会定期学術集会、日本移植学会総会、日本肝移植研究会、など)や国外の学術集会(27th International Congress of The Transplantation Society)で報告した。また、肝移植において意義の明らかにされていない抗HLA-Cw抗体や抗HLA-DP抗体の意義についても解析を行い、その成果を国内の学術集会(日本消化器外科学会総会)等で報告した。またこれらの成果は、現在論文としてまとめており、欧文誌への投稿準備中である。抗HLA抗体のIgGサブクラスに関する解析に関しては、平成30年度内においても行うことができなかったが、重要なテーマであると考えており、平成31年度以降の課題であると考えている。IgGサブクラスの解析のための体制構築は達成できなかったが、抗体の補体結合性の解析は対象となる症例全例で行うことができ、補体結合性を加味した抗HLA抗体と臨床経過の関連の解析も行うことができた。このことから、研究全体としては概ね順調に推移していると言える状況である。平成30年度までの研究を総括し、その成果を論文投稿する予定としている。また、さらに長期における臨床経過と抗HLA抗体との関連について解析を行っていくことで、新たな情報発信をしていけると考えている。今後は、抗HLA抗体のIgGサブクラスを解析し、臨床経過との関連を明らかにすることで、その成果についても学術集会や英文誌での発表を行っていけるものと思われる。平成29年度においては、研究計画通り、小児肝移植患者の抗HLA抗体のスクリーニング結果と臨床経過の関連について解析を行った。その結果、まず免疫抑制剤であるカルシニューリン阻害薬の血中濃度とドナー特異的抗HLA抗体との関連を明らかにし、国内の学術集会で発表するとともに英文誌への投稿を通して情報発信を行った(Tokodai et al. Transplant Direct, 2017)。さらに、抗HLA抗体スクリーニング後の患者に対し、病理組織学的評価を行うことにより、ドナー特異的抗HLA抗体の存在と移植肝の線維化との有意な関連を明らかにし、その結果についても英文誌にて発表した(Tokodai et al. Pediatric Transplant, 2018)。この結果は診療方針決定に直接寄与するものと考えられ、さらに解析対象を広げるとともに補体結合性抗HLA抗体と肝線維化の関連についても重要なテーマであると考えている。その他、本研究のメインテーマの1つである抗HLA抗体の補体結合性についても解析を進めており、平成29年度内に対象症例の9割程度の症例で補体結合性の解析が終了しており、平成30年度に残りの1割の症例で解析を進めることで、対象症例全体での補体結合性抗体の意義について解析を行い、その成果についても国内外の学術集会や英文誌での発表を通して情報発信を行う予定である。抗HLA抗体のIgGサブクラスに関する解析に関しては、平成29年度内には行うことができなかったが、重要なテーマであると考えており、平成30年度以降、解析を行えるための体制作りを継続していく予定である。IgGサブクラスの解析のための体制作りが遅れてはいるものの、抗HLA抗体と臨床経過の関連の解析も行うことができ、また、抗体の補体結合性についても全対象症例に対して解析を行う目途がついていることから、研究全体としては概ね順調に推移していると言える状況である。

IgGサブクラスの解析のための体制構築は達成できなかったが、抗体の補体結合性の解析は対象となる症例全例で行うことができ、補体結合性を加味した抗HLA抗体と臨床経過の関連の解析も行うことができた。このことから、研究全体としては概ね順調に推移していると言える状況である。平成29年度までの研究を継続し、さらに長期における臨床経過と抗HLA抗体との関連について解析を行っていくことで、新たな情報発信をしていけると考えている。また、抗体の補体結合性についての解析を完了し、その結果を解析することで、その成果についても学術集会や英文誌での発表を行っていけるものと思われる。平成30年度までの研究を総括し、その成果を論文投稿する予定としている。また、さらに長期における臨床経過と抗HLA抗体との関連について解析を行っていくことで、新たな情報発信をしていけると考えている。今後は、抗HLA抗体のIgGサブクラスを解析し、臨床経過との関連を明らかにすることで、その成果についても学術集会や英文誌での発表を行っていけるものと思われる。ほぼ全額を予定通り使用しており、少額の残額のみ次年度での使用を希望する。
哺乳類脳機能の左右差の意義解明のために、左右半球を連絡する原因分子を同定する

脳機能の左右差はヒトではよく知られているが、その分子的基盤は、ほとんど分かっていない。また、マウスを用いた左右差の分子基盤を探る実験でも、神経伝達物質受容体の定量等のボトム・アップ的アプローチによるものが殆どである。さらに、体軸を形成する遺伝子のスクリーニングは数多いが、それらはすべて動物の初期発生期に誘導される分子に限られており、成熟した個体に対する徹底した遺伝子の網羅的スクリーニング皆無であった。哺乳類左右脳の遺伝子発現の違いを解明するために、平成21年度に収集した成獣ラット海馬CA3領域サンプルを次世代DNAシークエンサーを利用して遺伝子解析を行った。まず、収集された左右の海馬CA3サンプルより、short RNAライブラリを調製した。ライブラリ調整には理化学研究所オミックス基盤領域(鶴見)で開発されたLNAを用いてアダプターダイマーを除去する最新式のプロトコルを採用した。その結果、1サンプルあたり、約1000万タグ、左右合計6サンプルのshort RNAのシークエンシングに成功した。シークエンスされたshort RNAの中、約9割がmiRBase15に登録されているmicro RNAであった。micmoRNAの発現で際立った左右差が認められるものは殆ど無かった。また残る1割においては、バイオインフォマティック的手法により新規microRNA解析を行ったところ十数種類の新規microRNA候補遺伝子が見付かった。新規microRNA候補遺伝子の中から発現(タグ数)が高い2つの遺伝子の発現をin situ hybridization法を用いて確認した。新規microRNA候補遺伝子でも左右発現差が顕著な物は皆無であった。哺乳類左右脳の遺伝子発現の違いを解明するために、次世代DNAシークエンサーによる遺伝子解析を提起したが、平成21年度は、シークエンサーにかけるサンプルの収集に終始した。具体的には、成獣大脳辺縁系海馬のサンプルを調製した。サンプルは、RNAの劣化を最小限にするために、トライゾール液に浸潤させ、-80度で数量が揃うまで冷凍保存した。また、理化学研究所オミックス基盤領域(鶴見)では、CAGE(Cap Analysis of Gene Expression)解析の最適化を図り、10月にプロトコルが定まった。それら収集した資料よりRNA抽出を試行したところ、RNAの純度は高いのもの、サンプル量が充分でないこと判明した。したがって、平成21年度後半は、さらに数多くの個体から、左右海馬サンプルの調製をおこなった。現在、新しく収集した資料を加えてRNAを抽出している段階であり、平成22年度には網羅的な遺伝子のスクリーニングの結果が分かることが期待される。
覚せい剤精神病の発症機転と再発準備性に関する実験的研究 ードーパミン-グルタミン酸およびドーパミン-セロトニン相互作用の役割ー

覚せい剤精神病の発症機転と再発準備性の形成機転について、平成4年度はドーパミン-グルタミン酸相互作用の役割に焦点をしぼり以下の知見が得られた。(1)Methamphetamine(MAP)5mg/kgを2時間毎に4回連続投与し、脳内透析法によって、側坐核と線条体でグルタミン酸の動態を検討した結果線条体においてのみ細胞外グルタミン酸は約2倍に放出が亢進した。(2)上記のMAP連続投与の後、1週間後に脳内各部位のドーパミン、HVA DOPAC含量を測定した結果、線条体のみで生食投与群に比較して有意に減少していた。(3)MAP連続投与にNMDA受容体拮抗薬であるMK-801を同時投与すると線条体のDA枯渇およびDA取り込み部位の減少効果が阻止された。(4)MAP反復投与による常同行動、移所運動量を指標とした行動感作の成立はMK-801を同時投与によって阻止された。以上の知見から覚醒剤精神病の発症機転と再発準備性の形成のメカニズムを次のとおり考察した。MAP反復投与により線条体を中心にグルタミン酸放出が促進し、NMDA受容体の異常刺激によってDAニューロンの変性を惹起する。その結果としての不可逆的な神経終末DA取り込み部位の減少やDA自己受容体感受性の低下が、MAP投与時の細胞外DA放出の増大に関与し、行動感作として永統化するであろう。MK-801はMAP投与によるNMDA受容体の過剰刺激に拮抗することにより、上記病的機転を阻止し、行動感作の成立を阻止したいといえるだろう。覚せい剤精神病の発症機転と再発準備性の形成機転について、ド-パミンーグルタミン酸およびド-パミンーセロトニン相互作用の役割を明らかにする目的で、平成3年度の研究は順調に進行し、以下の知見が得られた。(1)In Vitroで脳切片の滞流によってド-パミン遊離をみる方法を確立し、NMDA受容体刺激によって、ド-パミン遊離が促進することを明らかとし、その遊離は競合的拮抗薬APVおよび非競合的拮抗薬MKー801によって用量依存的に抑制することを認めた。(2)微小脳内透析法を用い、Methamphetamine投与によるド-パミン放出の促進は、MKー801の前処置によって抑止されることが明らかとなった。(3)微小脳内透析法によるグルタミン酸の測定法を確立したが、Methamphetamine投与によるグルタミン酸放出の促進を認めることができなかった。脳内グルタミン酸は神経由来以外のプ-ルが圧倒的に多いためと考えられ、グルタミン酸再取り込み阻害薬を用いて再検討する予定である。(4)Methamphetamine投与は線条体シナプス間隙5ーHT放出を用量依存的に促進した。この効果はセロトニン生合成阻害薬のPCPA、枯温薬reserpine前処置によって部分的に抑制された。すなわち放出される5ーHTの起源は貯蔵プ-ルの両方のコンパ-トメント由来であることが明らかとなり、ド-パミン放出の起源が機能プ-ル由来であることと対照的であった。
原生生物の系統と進化

真核生物内部におけるさまざまな原生生物の系統的位置を、多くの分子種の配列情報データに基づく分子系統樹解析により総合評価することを目的として研究を進めてきた。これまでの研究において、培養条件を確立し、核酸抽出に成功している原生生物種、すなわち、Giardia lamblia,Trichomonas vaginalis,Trichomonas tenax,Entamoeba histolytica,Trypanosomacruzi,Blastocystis hominis,Plasmodium falciparum,Toxoplasma gondii,Cryptosporidium murisについては、本年度も他施設の研究協力者の支援の下でこれらの維持を継続して行なった。ミトコンドリアをもたない寄生虫でアユに寄生するGlugea plecoglossi(Microsporidia)については、培養ができないため、大量のサンプルを採取して核酸抽出を行なった。また、培養が可能なMicrosporidia(Encephalitozoon cuniculiびEncephalitozoon hellem)については、培養条件を確立し、核酸抽出およびその大量調製を行なった。これらのオリジナルデータを含めてさまざまな分子種の分子系統樹を推定し、それらの結果を総合評価した結果、以下の可能性の高いことが明らかとなった。1.ミトコンドリアをもたない分類群のいづれもが、進化の過程でミトコンドリアを2次的に喪失したものである。3. Microsporidiaは、従来示唆されていたように真核生物の初期に分岐した分類群ではなく、むしろ菌類もしくは動物・菌類の共通祖先の近くに位置づけられる。これまでに、Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Trichomonas tenax, Entamoeba histolytica, Trypanosoma cruzi, Blastocystis hominis, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Criptosporidium muris, Encephalitozoon hellem,およびE.. Cuniculiについて、他施設の研究協力者の支援の下で、培養条件・核酸抽出の条件を確立し、継代・維持を継続した。アユに寄生するGlugea lecoglossi(Microsporidia)については、培養ができないため、大量のサンプルを採取して核酸抽出を行なった。ペプチド鎖伸長因子(EF-1α, EF-2),イソロイシン-tRNA合成酵素(IleRS),ヴァイリン-tRNA合成酵素(ValRS)を対象とし、一次構造データが存在しない生物種について、それらの遺伝子解析を行ないデータの蓄積に努めた。さらに、B. hominisについては、小亜粒子リボソームRNA(SSUrRNA),液胞型ATPase(v-ATPase),70kDa熱ショック蛋白質(hsp70)の遺伝子解析を、E.. Hellem, E. Cuniculiについては、ミトコンドリア型hsp70の遺伝子解析を行った。これらのオリジナルデータを含めてさまざまな分子種の分子系統樹を推定し、それらの結果を総合評価した結果、以下の可能性が高いことが明らかとなった。1)ミトコンドリアをもたない分類群のいづれもが、進化の過程でミトコンドリアを2次的に喪失したものである。2)Alveolata(繊毛虫やPlasmodium, Toxoplasmaなどを含む分類群)はStramenopiles(褐藻、珪藻やBlastocystisを含む分類群)の姉妹群を形成する。3)Microsporidiaは、従来示唆されていたように真核生物の初期に分岐した分類群ではなく、むしろ菌類もしくは動物・菌類の共通祖先の近くに位置づけられる。不明な点の多い原生生物界の系統関係を、さまざまな遺伝子の配列情報データに基づいて総合的に解析し、真核生物の初期進化に関する新たな知見を得ることを目的として研究を行った。本年度、遺伝子解析の対象とした原生生物種は、ミトコンドリアをもたない寄生虫であるGlugea plecoglossi(microsporidia類)、Encephalitozoon hellem(microsporidia類)、E.cuniculi(microsporidia類)、Giardia lamblia(diplomonads類)、Trichomonas vaginalis(parabasalids類)、Entamoeba histolytica(entamoebids類)、ミトコンドリアに相当するキネトプラストを有する寄生虫であるTrypanosoma cruzi(kinetoplastids類)、および、チトクロムをもたないミトコンドリアを有するとされる寄生虫Blastocystis hominisの合計8種である。対象とした遺伝子は、小亜粒子リボソームRNA,ペプチド鎖伸長因子(EF-1α,EF-2)イソロイシン-およびヴァリン-tRHA合成酵素(IleRS,ValRS)、70kDa熱ショック蛋白質(hsp70)、液胞型ATPaseであり、これらについての配列データをもとに、塩基もしくはアミノ酸置換に関するさまざまな確率モデルに基づいて原生生物界の系統関係を最尤法により検討し、主として以下に示す結論を得た。1.小亜粒子リボソームRNAやペプチド鎖伸長因子の系統樹では、ミトコンドリアをもたない3つの分類群、すなわち、microsporidia類、diplomonads類、parabasalids類が真核生物の進化の非常に早い時期に分岐している。これらの中でmicrosporidia類の分岐が最も早いとする可能性が高い。

2.上記3つの分類群のValRS配列(G.lamblia,T.vaginalis,E.hellem)は、IleRSをアウトグループとする系統樹上で、ミトコンドリア由来のものを使用していると考えられる通常の真核生物型の配列の中に完全に含まれる。このことは、これらの祖先がかつてはミトコンドリアを有しており、進化の過程でそれを2次的に失ったのだとする可能性を示唆している。3.microsporidia類、(E.hellem,E.cuniculi)のいずれもが、ミトコンドリア型hsp70を有しており、それらの配列は系統樹上で明らかに他の真核生物のミトコンドリア型hsp70のグループの中に含まれる。このこともまた、microsporidia類におけるミトコンドリアの2次的喪失の可能性を示唆している。4.ミトコンドリア型hsp70の系統樹におけるmicrosporidia類の系統的位置は、ペプチド鎖伸長因子や小亜粒子リボソームRNAの系統樹に示されるように、真核生物の歴史の古い時代に分岐したものではなく、むしろ菌類や動物などの高等真核生物に近いとの可能性が高い。異なる分子種での結論の矛盾は、分子系統樹推定法の方法論上の問題に依存して生じている可能性が高いため、今後データ解析面での再検討が必要である。真核生物内部におけるさまざまな原生生物の系統的位置を、多くの分子種の配列情報データに基づく分子系統樹解析により総合評価することを目的として研究を進めてきた。これまでの研究において、培養条件を確立し、核酸抽出に成功している原生生物種、すなわち、Giardia lamblia,Trichomonas vaginalis,Trichomonas tenax,Entamoeba histolytica,Trypanosomacruzi,Blastocystis hominis,Plasmodium falciparum,Toxoplasma gondii,Cryptosporidium murisについては、本年度も他施設の研究協力者の支援の下でこれらの維持を継続して行なった。ミトコンドリアをもたない寄生虫でアユに寄生するGlugea plecoglossi(Microsporidia)については、培養ができないため、大量のサンプルを採取して核酸抽出を行なった。また、培養が可能なMicrosporidia(Encephalitozoon cuniculiびEncephalitozoon hellem)については、培養条件を確立し、核酸抽出およびその大量調製を行なった。これらのオリジナルデータを含めてさまざまな分子種の分子系統樹を推定し、それらの結果を総合評価した結果、以下の可能性の高いことが明らかとなった。1.ミトコンドリアをもたない分類群のいづれもが、進化の過程でミトコンドリアを2次的に喪失したものである。
最上川源流部の生物多様性保全に関する研究

本研究では,山形県米沢市に位置する酸性河川(松川)において水質,底質および水生昆虫群集に関する現地調査を行い,多変量統計的手法を用いて酸性水域において特徴的な環境因子が水生昆虫群集の構造に与える影響について検討した.本研究から以下の知見が得られた.松川上流部ではpHが4.5程度であり,河床堆積物中のAl含有率が高く,河床堆積物中のChlorophyllα量が低く付着藻類の生息が抑制されていることが明らかとなった.松川上流部の河川水中に存在する溶解性AlはpHの上昇に伴って多核Al加水分解生成物を経て不溶性Alに形態が変化し,河床に堆積しているものと考えられる.申請者は以前の研究において多核Al加水分解生成物が付着藻類の増殖を阻害することを明らかにしており,松川上流部において多核Al加水分解生成物が生成し,それらが河床に生息する付着藻類の生息に悪影響をおよぼしている可能性がある.また,中流部以降では硝酸イオン等の栄養塩類および塩化物イオンが一般的な渓流河川に比べて高濃度で存在していた.松川は中流部において農業地帯,下流部において米沢市街地を流下しているため農地および家庭からの廃水流入が下流部における汚濁の要因と考えられる.松川における水生昆虫群集は,上流部においてその種数および個体数が非常に少なく,貧弱な群集構造を形成しており,流下に伴ってChironomidae(ユスリカ科)を中心とした多様な群集構造へと遷移していくことが明らかとなった.松川上流部における水生昆虫群集は低pHおよび高濃度の酸等の水質的なストレスと共に付着藻類に代表される餌資源の不足を反映した特徴的な水生昆虫群集が形成されているといえる.松川上流部において中和処理等によってpHを5以上にし,河川水中のAlを除去することによって水環境の大幅な改善が期待できることが示唆された.本研究では,山形県米沢市に位置する酸性河川(松川)において水質,底質および水生昆虫群集に関する現地調査を行い,多変量統計的手法を用いて酸性水域において特徴的な環境因子が水生昆虫群集の構造に与える影響について検討した.本研究から以下の知見が得られた.松川上流部ではpHが4.5程度であり,河床堆積物中のAl含有率が高く,河床堆積物中のChlorophyllα量が低く付着藻類の生息が抑制されていることが明らかとなった.松川上流部の河川水中に存在する溶解性AlはpHの上昇に伴って多核Al加水分解生成物を経て不溶性Alに形態が変化し,河床に堆積しているものと考えられる.申請者は以前の研究において多核Al加水分解生成物が付着藻類の増殖を阻害することを明らかにしており,松川上流部において多核Al加水分解生成物が生成し,それらが河床に生息する付着藻類の生息に悪影響をおよぼしている可能性がある.また,中流部以降では硝酸イオン等の栄養塩類および塩化物イオンが一般的な渓流河川に比べて高濃度で存在していた.松川は中流部において農業地帯,下流部において米沢市街地を流下しているため農地および家庭からの廃水流入が下流部における汚濁の要因と考えられる.松川における水生昆虫群集は,上流部においてその種数および個体数が非常に少なく,貧弱な群集構造を形成しており,流下に伴ってChironomidae(ユスリカ科)を中心とした多様な群集構造へと遷移していくことが明らかとなった.松川上流部における水生昆虫群集は低pHおよび高濃度の酸等の水質的なストレスと共に付着藻類に代表される餌資源の不足を反映した特徴的な水生昆虫群集が形成されているといえる.松川上流部において中和処理等によってpHを5以上にし,河川水中のAlを除去することによって水環境の大幅な改善が期待できることが示唆された.
「小腸-膵β細胞」を枢軸とした候補遺伝子プールの構築による糖尿病遺伝子の同定

日本人2型糖尿病は「インスリン分泌不全」を第一義的理由とするため、若年発症成人型糖尿病は良いモデル疾患である。現在まで6種類の若年発症成人型糖尿病の原因遺伝子が同定されているが、これらの遺伝子は同一カスケード内で相互に機能連関したHNF転写因子をコードする。しかも発生原基が膵β細胞と共通である小腸ですべて発現している。そこで膵β細胞と小腸の共通発現遺伝子群を網羅すべく発現遺伝子(EST)を大量集積してきた。ヒト膵島腫瘍細胞の25753個のESTの分類化、集団化(クラスタリング)を施行し、膵島発現遺伝子データベースと照合した結果、3103種類の既知遺伝子と3054種類の未知遺伝子を獲得した。そして新たに3384個のESTが膵島に発現していることを明らかにできた。さらに機能別分布も施行し、遺伝子発現・蛋白生成に関与するESTが既知のものでは最も多く256種類を占めることを確認した。そして転写因子のESTからなる独自のマイクロアレイを作成して解析し、膵、肝、小腸に共通に発現する12個の新規糖尿病候補転写因子を獲得した。また糖尿病候補転写因子HIF-1αを用いた関連解析を施行し、糖尿病発症に係る変異(P582S)を同定した。次にラット膵島並びにRINm5FのESTを合計40170個採取し、分類化、クラスタリングを施行し、4078種類の既知遺伝子と6328種類の未知遺伝子を獲得した後、上記ラットのESTをプローブとして用いて現在まで3326種類のラージスケールin situハイブリを行い129個の膵島特異的発現遺伝子を獲得した。また2型糖尿病を含むストレス関連疾患の発症機構解明のためラット海馬の発現遺伝子も網羅し7173種類のESTを獲得したり、合併症の遺伝素因を網羅するため、先ずラットの網膜発現遺伝子に関しても約13000個のESTを獲得した。現在まで6種類のMODY原因遺伝子が同定されているが、これらの遺伝子は同一カスケード内で相互に機能連関したHNF転写因子をコードする。しかも発生原基がβ細胞と共通である小腸ですべて発現している。そこで膵β細胞と小腸の共通発現遺伝子群を網羅すべくESTを大量集積した。正常ヒト膵島細胞より2万個のESTと、ヒト小腸EST1.5万個を集積後、さらにラットの正常β細胞についても約2万個のESTを新たに確保した。ラットインスリン産生細胞株(RIN)については現在約1.2万個を取得し進行中である。マウスについても正常ヒト膵島細胞で約1万個、インスリン産生細胞株(MIN6)で約2万個のESTを新たに確保できた。先行して獲得したヒト正常膵β細胞、ヒトインスリン産生細胞株、ヒト小腸のEST合計約3万個のESTの分類化、集団化(クラスタリング)を施行し、約5000種類の既知遺伝子を確認し、そのうち約300種類の共通遺伝子を同定した。また膵島ESTのみの機能別分布も施行し、遺伝子発現・蛋白生成に関与するESTが既知のものでは最も多く、15%を占めることを明らかにできた。上記のESTを用いて独自のcDNAマイクロアレイを作成しているが、クラスタリングの遅れからスポッティングは発現順位と無関係に施行している。またスポッターのドライステップにおける不備を改良するのにやや時間を要したが、ハイブリダイゼーションの至適条件は確立できた。