hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工培養歯根膜細胞を有する再植歯による硬組織再生誘導に関する研究

1.セメント質の再生過程における破歯細胞,セメント芽細胞および再生セメント質基質における非コラーゲン性蛋白質の局在を免疫組織化学的に検討した。その結果,オステオポンチン(OPN),骨シアロプロテイン(BSP)はセメント質再生の初期石灰化に関与し,オステオネクチン,オステオカルシン,BMP-2はその後のセメント質の成熟に関与することが明かになった。2.歯根吸収からセメント質再生の過程でのマラッセ上皮の動態を観察し,基質蛋白の局在について免疫組織化学的に検討した。その結果,マラッセ上皮が網目構造を変化させ,同過程において何らかの役割を担っている可能性を明らかにした。マラッセ上皮は歯根膜組織の恒常性維持だけでなくセメント質再生にも何らかの役割をはたしている可能性があることが示唆された。3.セメント質再生におけるマラッセ上皮の役割をより詳細に明らかにするため,歯根吸収からセメント質再生過程におけるマラッセ上皮の超微形態について検討を行った。歯根吸収過程におけるマラツセ上皮では超微形態が発生過程と類似した像が観察され,歯根吸収時に形態を変化させたマラッセ上皮が,その後のセメント質再生に関与する可能性があることが示唆された。4.歯根吸収時の破歯細胞と吸収窩歯根面の超微形態を観察し,その際のOPN,BSPの局在について免疫細胞化学的検討を行った。その結果,破歯細胞は破骨細胞と類似した形態であった。また,歯根吸収と骨吸収が同様のメカニズムで起こると推察される。歯根吸収直後のセメント質再生初期における基質蛋白の局在は骨組織のリモデリングとは異なるが明らかになった。本研究では、歯根膜細胞の培養、再植歯への培養細胞付着および再植動物実験における一連のシステムを確立し、再植歯周囲の新生セメント質および歯根膜組織の形成状況を形態的に評価した。1.歯根膜細胞の培養と再植歯への付着法の確立ラットならびにイヌ臼歯より遊出させた歯根膜由来細胞を培養し、初代培養細胞を実験に供した。上下顎臼歯を抜歯し、-70°Cにて凍結保存する。次いで、実体顕微鏡下にてラットおよびイヌ歯根のセメント質を完全に除去し、これに培養ディッシュ上でbromodeoxyuridine (BrdU)にて標識した培養歯根膜細胞を付着させた。2.再植システムの確立ラット第一臼歯近心根とイヌの小臼歯を分割抜歯し、再植術を同部に行う再植システムを確立した。3.再植術後の硬組織形成状況についての評価(1)光顕ならびに電顕観察によって、再植歯周囲に新生硬組織が誘導されていることを確認し、BrdU,IodU標識の細胞標識により、培養歯根膜細胞が再植歯周囲の硬組織形成に主要な役割を担っていることを明らかにした。(2)光顕・電顕的免疫細胞化学的観察により、新生硬組織と再植歯との界面にオステオポンチン、骨シアプロテインなどの糖蛋白質が存在することを明らかにした。4.総括:培養歯根膜細胞がセメント質誘導能を有することが示され、本研究システムが歯根膜の再生療法に向けたアプローチとして有用であることが示唆された。1.ラットおよびイヌを用いて歯根膜細胞付着再植菌の再植動物実験によって,再植菌周囲の新生セメント質および歯根膜組織の形成状況を形態的に評価し,再植歯実験モデルの有用性を明らかにした.2.歯根膜由来細胞の培養と再植用歯根への細胞付着法の確立ラットならびにイヌ臼歯より遊出させた歯根膜由来細胞を培養し,初代培養細胞を実験に供した.上下顎臼歯を抜歯し,-70°Cにて凍結保存する。

次いで,実体顕微鏡下にてラットおよびイヌ歯根のセメント質を完全に除去し,これに培養ディッシュ上でbromodeoxyuridine(BrdU)にて標識した培養歯根細胞を付着させた.3.再植後の硬組織および歯根膜形成状況についての評価光・電顕試料の観察によって新生誘導硬組織および歯根膜組織が誘導されたことを明らかにした.これらでは,塩酸により脱灰処理した歯根面で,非処理歯根面に比べて硬組織および歯根膜組織誘導の可能性が高いものと予想される.また,現在,試料を作製中であるため,多数の資料分析を行うにいたってはいないが,現在,BrdU,IodU標識細胞および新生セメント質の形成状況を観察している.さらに,光顕・電顕的免疫細胞化学法によって,ウサギにて作製したポリクロナール抗体を用いての観察を行っている.
メカニズム・デザイン理論

本研究は、メカニズム・デザイン理論で用いられる研究手法を用いることにより、様々な経済環境で耐戦略的で望ましい資源配分を達成するメカニズムの分析を行うことを目的にしている。耐戦略的なメカニズムとは、個人が戦略的な行動をとることにより社会的に望ましい配分を歪めることを防止するものである。本年度は、まずシャプレイ・スカーフの非分割財交換モデルにおける、新しい公平性の概念を導入し、耐戦略的で公平なメカニズムの分析を行い、それらを満たすメカニズムを特徴付けた。そのようなメカニズムとして一般的には強コアメカニズムがあげられるが、3人モデルでは、特殊なメカニズムが存在することが示された。次に、収穫逓増経済モデルにおける、耐戦略的で公平なメカニズムの中で、最も効率性が高いメカニズムの分析を行った。さらに、排除可能な公共財モデルにおける、耐戦略的なメカニズムの中で、最も効率性が高いメカニズムの分析も行った。これらの分析は現在までに執筆した論文の成果を大いに飛躍させたものであり、以前の成果と合わせて学術的にも非常に重要といえる。これらの成果は、本研究の目的である「耐戦略的で望ましい資源配分を達成するメカニズムの分析」という観点から、非常に高い成果であると言える。本研究は、メカニズム・デザイン理論で用いられる研究手法を用いることにより、様々な経済環境で耐戦略的なメカニズムの分析を行った。メカニズムを設計し、効率性・公平性の両観点から分析し、そこで得られた研究成果を2本の論文にまとめ、そのうちの1本を査読付国際学術雑誌に公刊した。もう1本も学会やセミナーでの報告を行った。論文「Strategy-Proof and Fair Mechanism in Shapley-Scarf Econmies」では非分割財の交換モデルにおける、耐戦略的で公平なメカニズムの分析を行った。そしてそのようなメカニズムとして強コアメカニズムが唯一のメカニズムであることを証明した。この結果は、先行研究で得られた結果と合わせて、効率性・平等性・公平性のどの価値基準を要求したとしても、強コアメカニズムが望ましいという結果を含意する点で非常に重要である。この論文を第17回DCコンファレンスで報告した。本研究は今後も様々な経済環境で耐戦略的なメカニズムの分析を計画通りに行っていく。さらに、現在までの成果をさらに改訂し、査読付き国際学術雑誌に投稿していく。
多機能性タンパク質としてのマンナン結合タンパク質の機能解析と糖鎖認識機構の解明

マンナン結合タンパク質(MBP)はマンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン残基を特異的に認識するレクチンであり、病原微生物の排除に関与している。ブタは、異種移植におけるドナー動物として開発研究の中心となっているが、ブタのMBPについて詳細な研究は行われていない。本研究において、筆者らは新生ブタ血清中にホスホマンナンに特異性をもつ新規レクチン(ホスホマンナン結合レクチン,PMBL)が存在することを明らかにした。PMBLは、MBPと同様に、レクチン経路を介して補体系を活性化することを示した。新生ブタでは、母胎の特殊な胎盤構造により血清中の免疫グロブリンの量が極端に少ないことが知られており、新生ブタから成熟ブタへと成長する過程でPMBLが先天性免疫において重要な役割を果たしていることを示唆している。また、マンナン結合タンパク質(MBP)はヒトでは一種類の遺伝子によりコードされており、主に肝臓で合成されるが、翻訳後修飾の違いから、細胞外に分泌される血清型MBP(S-MBP)と細胞内に留まる細胞内MBP(I-MBP)にわかれる。これまで、S-MBPは先天性免疫において重要であることが知られているが、I-MBPについては未だ不明な点が多い。本研究では、I-MBPが細胞内において特徴的な顆粒状分布を示し、主に小胞体に、一部がGolgiやCOP-II輸送小胞に局在していること、I-MBPは糖タンパク質の生合成中間体と糖鎖を介して相互作用することを明らかにした。これらの結果は、I-MBPが糖タンパク質の細胞内輸送に関与していることを強く示唆している。さらに、補体活性化作用に必要なMBPによる糖鎖認識パターンの解明を目指すアプローチとして、SW1116表面のMBPの内在性リガンド糖鎖を特異的に認識する単クローン抗体の作成に着手し、現在、いくつかの抗体産生株を得て解析を進めている。1.細胞内におけるMBPのオルガネラ局在性の解析本年度はまず、MBP-GFPをHLF(ヒト肝癌細胞)に安定発現させ、MBPの特徴的な細胞内局在性を各種のマーカータンパク質と比較しながら共焦点顕微鏡を用いて詳細に検討した。Golgiのマーカーとしてmannosidase IIを、cis GolgiのマーカーとしてKDEL受容体を、GS(Golgi SNARE)28,GM130を、TGNのマーカーとして、p230 trans Golgiを、ERのマーカーとしてKDEL, DPI, Erp57などを、COPIIのマーカーとしてsec23を、COPIのマーカーとしてα-COP、およびβ-COPを使用し、それぞれの特異的抗体で検出した。その結果、MBPはER膜の一部、特にexit siteと思われる部分およびCOPIIに最も高い局在性が観察された。また、Gold particle法を用いた免疫電子顕微鏡による観察も、共焦点顕微鏡による観察を裏付けていた。なお、MBPのこのような顆粒への選択的蓄積は、細胞をツニカマイシン処理してN-結合型糖鎖の生合成を阻害した場合には見られず、MBPがN-結合型糖鎖の細胞内プロセシングに関与していることを強く示唆している。2.MBPによる補体活性化の分子機構に関する研究補体活性化作用に必要なMBPによる糖鎖認識パターンの解明を目指す一つのアプローチとして、すでにその構造を明らかにしているSW1116表面のMBPの内在性リガンド糖鎖を特異的に認識する単クローン抗体の作成を進めた。SW1116細胞をマウスに免役し、ニトロセルロー膜に結合させた糖鎖ライブラリーを用いて解析した。

現在、いくつかの抗体産生株について、産生される抗体の糖鎖特異性、タイピングなどを進めている。なお、購入したサンプル塗布装置は糖鎖ライブラリー作成に有効に利用されている。ブタ血清中のホスホマンナン結合タンパク質を新たに見出し、その遺伝子クローニングに成功した。マンナン結合タンパク質(MBP)はマンノース、フコース、N-アセチルグルコサミン残基を特異的に認識するレクチンであり、リガンド糖鎖をもつ病原微生物の排除に関与している。われわれは以前、チェコアカデミーのDlabac博士との共同研究により、異種移植におけるドナー動物として開発研究の中心となっているブタ新生血清中には、グラム陰性菌のラフ株に対するClq非依存性(補体古典経路を介さない)殺菌因子が含まれ、この作用がボスホマンナンにより阻害されることを見出している。本年度は、この因子の実体を明らかにする目的で、新生ブタ血清中のレクチンに着目し、その本体の実体解明を進めた。その結果、ブタ血清中にはボスホマンナンに特異性をもつ新規レクチン(ホスホマンナン結合レクチン、PMBL)が存在し、このレクチンがMBPと近縁であることを明らかにした。本レクチンは229アミノ酸からなる33kDaのサブユニットの多量体であり、MBPと同様に、PMBLはリガンド糖を認識した後、レクチン経路を介して補体系を活性化することが明らかとなった。PMBLのアミノ酸配列を他の動物のMBPと比較するとアカゲザルMBP-Aと80.0%、ウサギMBPと54.6%、ヒトMBPと69.9%の相同性を示した。新生ブタでは、母胎の特殊な胎盤構造により血清中の免疫グロブリンの量が極端に少ないことが知られており、これらの結果は、新生ブタから成熟ブタへと成長する過程でPMBLが先天性免疫において重要な役割を果たしていることを示唆するものである。
ホメオボックス遺伝子Crxの導入による網膜神経前駆細胞の分化誘導と移植

網膜神経幹細胞をより効率良く網膜視細胞に分化誘導するために、Crxと同様に視細胞の運命決定に関与している可能性があるホメオボックス遺伝子Otx2について、引き続き機能解析を行った。発生期のOtx2の視細胞における発現パターンを解析したところ、Otx2の発現はCrxにやや先行し、神経網膜においてはほぼ重複していることが示された。Otx2のホモ接合ノックアウトマウスは胎生致死のため、Crxプロモーターの制御下にOtx2の発現を消失させるようなコンディショナルノックアウトマウスを作成した。このコンディショナルノックアウトマウスは、生存および繁殖可能であった。網膜における表現形を解析したところ、生後9日においても視細胞の発生はみられず、アマクリン細胞の増加がみられた。この結果から、Otx2は網膜前駆細胞が視細胞に分化する際に必須であることが示された。続いて、レトロウイルスベクターを用いてOtx2を生後0日の網膜にトランスフェクションし、強制発現実験を行った。細胞系譜解析の結果、ウィルスベクターが感染した細胞のほとんどは視細胞に分化していることが示された。また、Crxプロモーターを用いたルシフェラーゼアッセイにより、Otx2がCrxプロモーター上のCRX結合部位を介してCrxの発現を制御することを示唆する結果が得られた。これらの結果より、Otx2は視細胞の初期発生において必要かつ十分であり、Crxの上流遺伝子として機能していると考えられた。Otx2を網膜神経幹細胞に導入することにより、視細胞への分化を効率よく誘導できる可能性があると考えられる。網膜神経幹細胞をより効率良く網膜視細胞に分化誘導するために、Crxと同様に視細胞の運命決定に関与している可能性があるホメオボックス遺伝子Otx2について、機能解析を行った。発生期のOtx2の視細胞における発現パターンを解析したところ、Otx2の発現はCrxにやや先行し、部位的にはほぼ重複していることが示された。Otx2のホモ接合ノックアウトマウスは胎生致死のため、Crxプロモーター制御下にCrerecombinaseを発現させたトランスジェニックマウスと、Otx2のプロモーター領域と第1イントロンにloxP配列を挿入した遺伝子操作マウスをかけ合わせることにより、Otx2のコンディショナルノックアウトマウスを作成した。生後1ヶ月では著明な網膜の変性と萎縮がみられた。Lineage analysisの結果、ウィルスベクターが感染した細胞のほとんどは視細胞に分化していることが示された。これらの結果より、Otx2は網膜前駆細胞を視細胞へと分化誘導する作用を持ち、単独あるいはCrxと共に網膜神経幹細胞に導入することで効率良く視細胞への分化を誘導できる可能性があると考えられた。
充填スクッテルダイトにおけるラットリングの中性子散乱による研究

構成元素の組み合わせにより、多彩な物性を示すスクッテルダイト化合物において、主たる物性を担う希土類イオンが大きなプニクトゲンのカゴに内包されていることで現れる巨大な熱振動"ラットリング"の重要性が指摘されている。単結晶中性子回折実験及びMEM法による構造解析から、重い電子系超伝導体PrOs_4Sb_<12>及び関連物質NdOs_4Sb_<12>についてラットリングの可視化を行った。解析の結果、熱振動を反映したPr,Ndの核密度分布の詳細について温度変化を含めて明らかにした。PrOs_4Sb_<12>におけるPrイオンの分布は、低温の8KにおいてOs,Sbと比較して倍近く拡がっているものの、等方的で単純なガウス型の分布をもち、カゴの中心が安定位置である事を明らかにした。昇温により急激に分布の幅は拡がり、100K以下から異方性が現れること、また非調和性が200K付近から顕著になることを見出した。NdOs_4Sb_<12>におけるNdイオンについては、Prと比べてさらに拡がった分布を持つ一方、8Kにおける最大密度はカゴの中心にあり、オフセンターポテンシャルが存在しないこと、室温では異方性を持った強い非調和熱振動を示している点など、Prイオンと似た振舞いを示すことを明らかにした。今回の結果から、ROs_4Sb_<12>において強い非調和ポテンシャルの存在と同時に、オフセンター安定位置が存在しないことを直接的に明らかにした。これらの結果は、今後の超音波分散の起源を含めた数々の特異な物性の解明に向け、有益であると考えられる。Pr系初の重い電子系超伝導体PrOs_4Sb_<12>の物性において重要性が指摘されている、特異な熱振動"ラットリング"の詳細を明らかにする目的で、単結晶中性子回折実験及びMEM法による構造解析を行った。解析の結果、Prの核密度分布の詳細を明らかにすることに成功し、室温において、Prの分布がSbからなるカゴの空隙に対応する<111>方向に異方的に拡がっていることを明らかにした。その拡がりは半値全幅で0.6Åと非常に大きく、加えてその分布は空間的に平坦に拡がっており、単純な調和振動子モデルから大きく外れていること、すなわち強い非調和性を持つことを明らかにした。一方低温の8Kでは、半値全幅で0.14ÅとOs,Sbと比較して倍近く拡がっているが、室温と比べて鋭く、ガウス型の分布をもつ事を見出した。その分布については、分解能の範囲で異方性はなく、最大密度がカゴの中心にあることを明らかにした。ラットリングを特徴づける実験結果の一つとして、超音波分散の存在からオフセンター振動の可能性が示唆されている。今回の結果は、少なくともその振幅が0.1Å以下であることを示している。また、低温でのフォノンの顕著なソフト化から、非調和項の重要性が指摘されているが、今回の室温のPrの分布から。強い非調和ポテンシャルの存在を直接的に明らかにした。ラットリングに加え、PrOs_4Sb_<12>における主たる相互作用を明らかにする目的で、磁場中中性子回折により磁場誘起相の秩序構造を調べた。磁場誘起秩序相における磁気モーメントの向きの印加磁場方向依存性を調べ、H||[001]では磁場に垂直な反強磁性モーメントが、H||[110]では磁場に平行であることを明らかにした。この結果から、PrOs_4Sb_<12>における主たる相互作用が、磁気的な双極子や八極子相互作用ではなく、非磁性の四極子相互作用であることを見出した。
RNA結合蛋白質を介したシグナル伝達の制御に関する分子遺伝学的研究

本特定領域研究では、分子遺伝学的手法が駆使でき、かつ高等生物に極めて近い細胞内シグナル伝達経路を有するモデル生物である分裂酵母を用いて、RNA結合蛋白質を介するシグナル伝達制御のメカニズムを解析した。まず、遺伝学的手法により、複数の新規RNA結合蛋白質を同定した。その中の一つであるKHタイプのRNA結合蛋白質であるRnclは、MAPキナーゼの脱リン酸化酵素であるPmp1 mRNAと結合し、安定化することで、MAPキナーゼシグナルを負に制御する役割がある。しかも、RnclはMAPキナーゼによるリン酸化シグナル依存的に、Pmp1 mRNAの安定性を制御する。そこで、Rnclの制御機構を明らかにし、MAPキナーゼシグナルに与える影響を解析した。その結果、Rnclが核内核外移行による制御と、ユビキチンプロテアソーム経路による制御を受けることを明らかにした。また、tRNA deaminaseの突然変異体であるtad3-l mutantを単離し、この変異体が、細胞周期のG1/S, G2/Mの移行に重要な働きをしていることを明らかにした。さらに、新規RNA結合蛋白質として、RRMタイプのRNA結合蛋白質を同定し、アクチン結合蛋白質のmRNAと結合し、安定化することを見出した。さらに、Pmk1 MAPキナーゼが、このRNA結合蛋白質をリン酸化することにより、RNA結合能力を負に制御することにより、細胞質分裂を制御する可能性を示唆するデータを得た。これらの結果は、従来MAPキナーゼシグナルは転写因子のリン酸化を介して遺伝子発現を制御すると考えられてきたが、RNA結合蛋白質はMAPキナーゼによるリン酸化を受けてmRNAの安定性や翻訳の制御などのメカニズムを介して、遺伝子発現の鍵と握る重要な役割を果たしていることを提唱する。高等生物に極めて近い細胞内情報伝達経路を有する分裂酵母モデル生物を用いて、RNA結合蛋白質を介するシグナル伝達の制御機構を解析した。特に我々の同定したERKのホモログであるPmk1 MAPキナーゼ経路、およびProtein Kinase Cなどのシグナル伝達経路とRNA結合タンパク質の関係を中心に解析を行った。我々はcdc4というアクチンリングのコンポーネントを構成する遺伝子の変異体を取得した。そして、cdc4変異体の表現型を回復する因子としてRRMタイプのRNA結合タンパク質Nrd1を同定した。Nrd1を過剰発現することでcdc4タンパクは安定になり、nrd1をノックアウトするとcdc4タンパクは不安定になることから、Nrd1はcdc4タンパク量を制御することが明らかとなった。さらに、Nrd1を過剰発現することでCdc4タンパクが正しくアクチンリングに局在できること、Nrd1をノックアウトするとCdc4タンパクがアクチンリングに局在できなくなることから、Nrd1はCdc4タンパク量の制御を介してアクチンリング形成に関与することが明らかとなった。さらに、Nrd1の効果はCdc4の3'UTRの配列に依存することが示唆された。また、Nrd1にはMAPキナーゼによるリン酸化サイトが存在するが、非リン酸化型のNrd1はcdc4変異体を回復する能力があるが、リン酸化型のNrd1はcdc4変異体を回復する能力が失われることがわかった。さらに、Nrd1がcdc4変異体を回復する能力はPmk1MAPキナーゼに依存することがわかった。また、イノシトールリン脂質経路において機能する因子を分子遺伝学的アプローチで同定するというスクリーニングにおいて、新たなRNA結合タンパク質としてPufファミリーのプミリオホモログを同定した。哺乳類に極めて近い細胞内情報伝達経路をもつ分裂酵母をモデル生物として用いて、RNA結合タンパク質を介するシグナル伝達の制御機構を解析した。特に、高等生物で細胞増殖や癌化に深く関わる細胞内シグナル伝達経路であるMAPキナーゼとRNA結合タンパク質の関係を中心に解析した。

今年度の成果として、RRM型RNA結合タンパク質であるNrd1が、細胞周期を制御するアクチン結合タンパク質をコードするcdc4のmRNAと結合し、cdc4 mRNAを安定化することを見出した。さらに、cdc4変異体は細胞質分裂の異常を示すが、Nrd1を過剰発現させることで細胞質分裂異常が改善することから、Nrd1は細胞質分裂にも関与することが明らかとなった。cdc4 mutantの表現型はMAPキナーゼであるpmk1をノックアウトすることでも回復するが、これは非リン酸化型のNrd1がより強くRNAと結合するためであることを証明した。さらに我々は、Pmk1MAPKによってNrd1がリン酸化され、リン酸化された状態ではNrd1のRNA結合能力が低下することを発見した。さらに、イノシトールリン脂質経路において機能する因子を分子遺伝学的にスクリーニングした結果、PUFリピートを有するプミリオファミリーのRNA結合タンパク質を同定した。驚いたことに、これらのプミリオ遺伝子は、MAPキナーゼの上流で機能して、cell integrityシグナルに関与することが明らかとなった。また、我々は分子遺伝学的手法を用いてMAPキナーゼ経路において機能する因子として低分子量Gタンパク質であるRho1,Rho2を同定した。プミリオはこれらのRhoの制御因子のRNAと結合することによって、MAPキナーゼシグナルの制御に関わることが明らかとなった。
肢体不自由児者の移動視標に対する位置認知・位置予測特性と眼球運動特性の分析

肢体不自由児者は、視力の問題がなくても学習や生活場面において視線活動を苦手とする場合が多く、そのことが主因となりさまざまな困難を有しているといわれる。本研究では、移動する視標に対する肢体不自由児者の視線活動に着目し、移動視標に対する位置認知、位置予測の特性について明らかにする。さらに、移動視標の位置認知中の眼球運動の特徴、および移動視標遮蔽後の位置予測中にどのような眼球運動の特徴を示すか明らかにする。本研究により、肢体不自由児者の視線活動の特徴と認知プロセスが把握できれば、学習や生活環境の改善やトレーニング方法の開発などにより、教育、医療、福祉分野への応用が期待される。
花崗岩地盤山地を上流域にもつ畿内・瀬戸内の初期農耕社会の土砂災害と土地利用

崩壊しやすい花崗岩地盤が上流域になる畿内・瀬戸内の平野部において、稲作開始の前後の時代の、土砂移動(災害)や土地利用変遷を、発掘調査記録に基づいて検討した。土砂移動は、瀬戸内南岸は殆ど無いが、北岸や近畿では縄文晩期後葉と弥生前期末の事例が多い。頻度差は河川特性等の違いにも関わる。後氷期の沖積作用によって、埋積が進んだ谷では縄文後期中葉までには氾濫と河道変化が頻発するようになったが、それが弥生時代の初期水田の基盤たる滞水域の形成も促進した。集落の発展と災害の危険が背中合わせだった。京都大学構内遺跡でのボーリング調査による粒度分析によって、京都白川の弥生時代前期末の土石流は、複数の地点で、土石流全体としては流れが弱まっていきながらもその過程では流れの強弱を繰り返していたと思われることが確認できた。また、発掘調査によって、この土石流について、(1)本流の幅が100m前後に及ぶ地点があること、(2)土石流直前には昆虫などが生息できるほどには水が引いて多少とも安定した瞬間があったと思われること、(3)大きくは2波に別れること、以上の3点を新たに指摘できた。これらの成果は、先史時代における災害予測の存否を推測させる手がかりとなろう。しかし、この白川の大規模土石流の影響は、合流する鴨川流域では河川氾濫の規模としては大きくはなく、さらに下流の淀川では、今年度におこなった既往報告書の悉皆調査的検討では、弥生前期末に洪水を指摘できるような遺跡をほとんど全く確認できなかった。ただし京都盆地西半では、白川扇状地と同様に縄文時代晩期および弥生時代前期末頃の2時期の土砂移動が先学によって確認されており、従って、京都盆地からの流水が淀川一筋に収斂する直前に位置する巨椋池が天然の出水調節弁として機能していたことが、あらためてうかがえた。巨椋池周辺には先史遺跡が非常に少なく、このことは、本研究対象地域における他の地域での、実際の遺跡分布を検討するうえで重要な留意点を提供してくれる。なお、京都大学構内遺跡のように大規模土砂移動の平面分布やそれ以前の旧地形に関するデータが詳細に把握できる遺跡はあまりないことに加えて、上流域が花闇岩地盤の平野部においては中小規模の土砂移動は過去数千年の時間幅でみれば頻発していると言えることから、先史時代の土砂移動現象を現代の地形の現地踏査によって推測することは、残念ながら、困難な場合がほとんどであるという見通しが立った。前年度のボーリング・発掘、および既往の調査によって京大構内遺跡で得た、白川弥生土石流の堆積物粒度分析データを比較し、以下の解釈をした。(1)窪地には土石流直前に水溜まりがあった可能性があり、土石流の誘因に降雨を想定し得る。(2)土石流に先行して河道の水流が弱まった可能性がある。(3)土石流は広い範囲で少なくとも2波が流れ下った。(4)第1波よりも第2波の方が包含砂礫が大きい地点とその逆の地点とがあったので、第1波は広く弱く第2波が狭く強かった可能性がある。さらに、京大構内遺跡の既往の発掘成果を再検討した結果、京都白川の土砂移動は、縄文時代後期中葉・後葉、晩期中葉・後葉、弥生時代前期末の活発化がうかがえ、200500年周期という見通しが立った。大阪湾北岸や播磨灘に注ぎ込む河川の流域での土砂移動については、縄文晩期弥生中期の初期農耕前後の時期に、頻発していたことが確認できた。特に、上流に花崗岩地盤をもつ沖積平野の遺跡の場合、京都白川と同じく弥生前期末の類例が目立ち、その土砂移動によって土地を離れたり地点を移動したりする例が多いことがわかった。ただし、この時期の堆積土砂は厚みは京大構内遺跡の半分以下で巨礫も含まず、土砂移動の規模は白川弥生土石流の方がはるかに大きい。植生は白川と同様だが上流域の他の素因も吟味し、誘因と併せて原因を比較検討する必要がある。初期水田については、基盤に帯水層がある比較的広い窪地の緩傾斜を利用して営まれる傾向があるが、その基盤とは、白川モデル同様に、上流から供給される土砂の質・量の違いによって形成される、自然堤防と後背湿地の組合せであることを確認できた。基盤層の堆積は、縄文晩期の中葉や後葉になる例が複数存在し、弥生前期末の土砂移動も次代の可耕地の基盤形成に寄与している。白川モデルと比べると、土砂移動周期は対比可能だが、規模の違いがその後の土地利用に差を生じさせたようだ。京都市の白川扇状地における弥生前期末の土石流堆積物の地点別粒度分析データを基に、その土石流が複数地点で複次的に流れたことを明らかにした。

堆積物の粒度特性の垂直変動を複数地点で解析するこの作業は、文字記録のない大規模土砂移動現象の様態解明に供するだろう。また、白川扇状地での先史土砂移動を網羅的に検討して、谷の埋積が進んだ縄文前期後半から河川氾濫が増加することや、谷の埋積以前では10001500年間隔で土石流が発生していたことを明らかにした。この成果は、花崗岩地帯での自然状態での土砂移動の頻度予測として、現代の防災活動に貢献し得る。瀬戸内の諸平野の研究では、北部では近畿と同じく縄文後期中葉・晩期後葉・弥生前期末に氾濫が目立つのに対して、南部では土砂災害例が希少なことがわかった。植生は変化しないので、氾濫頻度の差異は、地質や植生や気候よりも、平均勾配や河川密度など河川ごとの特性に関わると思われる。瀬戸内南部の平野は、縄文後晩期は、上方細粒化する堆積物の層厚が大きく面積も広いので、蛇行河川による氾濫原と思われ、遺構面も形成されない。弥生前期は、遺構埋土が土壌化層になるので、氾濫原の陸化が進行している。弥生前期までには掘削が始まっていた深い環濠は、埋土が砂層ではなく粘土質なので、治水対策よりも居住域の乾燥化を目的としたのだろう。初期農耕期の集落立地においては、白川モデルの網状河川地帯とは異なる蛇行河川地帯の故か、微高地上でも河川流向への意識は薄い。その後、弥生中期中葉を境に集落分布の変化があるが、当該期には、高松平野で、下流域での噴砂の他に中流域での同時期の河川氾濫も認められるので、自然災害もその遠因と想定できる。
肺癌における早期診断、抗がん剤感受性マーカーの網羅的解析

作製した肺癌に対する単クローン性抗体の中から、早期血清診断に有用な抗体群を選択した。その結果、血清診断用マーカーとして抗CAXII抗体を報告した。その他、組織診断に有用と思われる抗MYH9抗体、抗BSG抗体は投稿中、抗MUC5B抗体は投稿準備中である。プラチナ製剤感受性マーカーとして抗IMMT抗体を樹立した。腫瘍関連自己抗体の解析では、抗Hu-C, Hu-D自己抗体は小細胞癌と大細胞性神経内分泌癌を鑑別出来ることを報告した。抗癌剤感受性予測マーカーとして抗Galectin-3自己抗体を見出した。自己抗体を見出す方法として癌組織と同一患者の血清を用いる方法の利点を報告した。報告は業績参照。肺癌抗体の血清診断への応用に向けた検討は、腺癌を中心に300個の抗体の少数例の各種肺癌患者血清と健常人血清を用いた一次スクリーニングと、その中で有用と考えられた抗体に関しては各種組織型の肺癌細胞株を用いた免疫染色と免疫ブロット法を行った。有用と思われた抗体に関しては、多数例の肺癌を含めた各種癌患者の血清や健常人血清を用いたプロテインマイクロアレイ法を行うための方法の確立を行った。その中で、MUC5B対する抗体は腺癌の扁平上皮癌の鑑別に有用で、腺癌患者の予後とも関連している新たな肺腺癌マーカーであることを見出した。現在名分報告として、まとめている段階である。MYH9に対する抗体は、腺癌の予後と関連するマーカーであることが分かり、これも英文論文としてまとめているところである。その他、病理組織、患者血清診断に有用と思われる抗体が幾つかあるので、実験を追加して英文論文としてまとめる予定である。自己抗体に関しては、癌組織や癌細胞株とは反応するが、合成した正常タンパク質とは反応しないものが数多くあることが分かった。抗ANXA2自己抗体は合成タンパク質との反応性は肺癌患者と健常人血清では大きな相異はなかったが、癌細胞株から抽出したタンパク質とは癌患者血清とのみ強く反応した。このような腫瘍特異的翻訳後修飾を受けたタンパク質を用いた自己抗体解析が重要であることが分かり、これをまとめているところである。多数の抗原タンパク質がこのような状況にあり、健常人血清、良性肺疾患とは反応しない癌の早期診断マーカーとしての重要性を検証していく予定である。また、抗癌剤感受性予測マーカー獲得に自己抗体を用いているが、抗癌剤の効果があった患者となかった患者の治療前の血清を比較する方法で、効果のなかった患者でのみ認められたGalectin-3を見出した。これに関しても、現在まとめているところである。樹立抗体の血清診断マーカーとしての有用性の検討:昨年は肺腺癌を中心に検討したが、今年度は神経内分泌肺癌細胞を免疫源として作製した抗体との反応性をROC解析法で検討した。その結果、健常人と各種肺癌患者血清との比較でAUCが0.7以上の抗体は27個あり、0.98を示す抗体もあった。これら27抗体中、免疫ブロット法とホルマリン固定・パラフィン包埋組織での免疫染色法で使用可能な抗体は8個であり、その中で小細胞癌のみに強い染色性を示す抗体を見出し、抗原同定を行った。その結果、紫外線やプラチナ製剤などによるDNA損傷を修復する機能を有するRad23Bに対する抗体であった。これら抗体に関しては組織診断、血清診断マーカーとしての有用性をさたに検討していく。また、樹立したMHY9とBasiginに対する抗体は肺腺癌の予後不良マーカーとなることをまとめ、英文論文として投稿した。肺癌特異的もしくは抗癌剤感受性予測可能な自己抗体の獲得:プラチナ製剤の感受性を予測可能な血清中の自己抗体として抗Galectin-3抗体を同定し、個々の抗癌剤治療前の血清や肺生検材料における反応性を検討した。その結果、抗癌剤治療がPR,SDであった患者群に比して効かなかったPD群の患者では有意に自己抗体量が多いこと、両者のROC解析ではAUCが0.8で、治療前に抗癌剤の効果が予測可能であること、生検組織でも同様の傾向を示した。現在、論文校正中である。また、二次元電気泳動法を用いた自己抗体の獲得法として、患者血清と同一患者の肺癌組織もしくは細胞株の両者で比較検討した。その結果、両者で獲得される自己抗体の種類は大きく異なること、同一患者の血清と組織における検討では、腫瘍細胞に加えて腫瘍間質に対する自己抗体の獲得も可能であることを見出し、報告した(Biomed Res 35(2): 133-143, 2014)。報告は業績参照。1.樹立済み抗体を用いた患者血清との反応性の検討:神経内分泌肺癌

由来細胞株を免疫源にランダム免疫法で樹立した単クローン性抗体196個を用い、肺癌患者血清27例と健常者血清8例との反応性をdot-blot法で検討し,その結果をROC解析した。その結果、健常人血清に比して肺癌患者血清中でのAUC値が0.6以上のものは40個で、0.7以上のものは4個、0.8以上のものは1個見出された。その中で、抗原同定した抗CAXII抗体に関しては多数例の血清を用いて、肺癌の早期血清診断マーカーになることを見出し報告した(PLoS ONE 7(3): e33952, 2012)。一方、シスプラチン耐性細胞株を免疫源に作製した抗体の中から、免疫染色、免疫ブロット法が可能な2個の抗体を選択し、抗原同定、抗癌剤治療効果の判定が済んでいる肺生検組織を染色し、腺癌における抗癌剤感受性を予測できる可能性のある抗体を選択した。現在、論文作成中。2.血清中の自己抗体を利用した腫瘍関連抗原の同定:2次元電気泳動法で同定した肺癌患者の自己抗体が認識した腫瘍関連抗原はそれぞれの組織型の肺癌で合計130個、86種類の腫瘍関連抗原を見出している。これら86種のタンパク質を合成し、PVDF膜にドットし、自動ドットブロット装置(MicroDot arrayer)上で肺癌患者血清27例(抗体の検索と同様の患者)、非腫瘍清肺疾患患者血清7例、健常人血清8例を一次抗体として反応させた。その結果、健常人血清に比して各種組織型の肺癌患者血清中でAUC値が0.6以上の抗原タンパク質を39種見出した。来年度は、多数の肺癌患者血清を用いた絞り込みを行う予定である。また、この方法で神経内分泌肺癌の小細胞癌と大細胞性神経内分泌癌を鑑別するHu-C, Hu-Dを見出し報告した(Int J Oncol 40: 1957-1962, 2012)。肺癌特異的単クローン性抗体の患者血清との反応性に関しては、腺癌抗体を中心に現在まで約300個が終了している。肺癌患者血清中での反応性が認められた抗体に関しては、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌大細胞性神経内分泌癌と肺癌で代表的な組織型の細胞株を用いた、免疫染色、免疫ブロット法を行っている。一次スクリーニングで肺癌の血清診断に有用と考えられる抗体に関しては、新たにプロテインアレイを使用した多数例の患者血清(肺癌や胃癌大腸癌、乳癌等の代表的な癌との反応性を検討する予定である。肺腺癌の新たなマーカーとして、従来使用されているTTF-1に加えて、MUC5Bに対する抗体をこの研究で樹立し,現在英文論文としてまとめている。TTF-1とMUC5Bを合わせて使用することにより、腺癌の診断率が大きく向上する。また、TTF-1陰性でMUC5B陽性症例は著しく予後不良であることも見出した。夏までに投稿する予定である。肺腺癌患者血清中の自己抗体の二次元電気泳動と免疫ブロット法を組み合わせた二次元免疫ブロット法(2DE/IB)による解析を3例の肺腺癌(AD)患者血清を用いて、対象とするタンパク質をAD由来細胞株2種(A549, LC-2/ad)を等量混合したもの、もしくは血清を採取した患者のAD組織を用いて、両者で同定される腫瘍抗原の相違を検索した。その結果、細胞株からは計53スポット41抗原、腫瘍組織からは計58スポット45抗原が同定され、両者で共通する抗原は9個のみであった。AD患者血清と反応した複数個のANXA
microRNAに着目した川崎病冠動脈瘤における血管微小粒子の役割解明と新薬開発

川崎病急性期における血管内皮細胞傷害という側面から、我々が同定したCAL症例のEMPsに内在する特異的な2種類のmicroRNA(microRNA-145-5p, microRNA-320a)を用い、I.ヒト単球/マクロファージ細胞を用い、CAL症例に特異的なmicroRNAがターゲットする遺伝子群の発現実験を行い、CAL形成に関わる機序を明らかにし、II.CAL症例患者のiPS細胞を樹立し血管内皮細胞へ誘導後、遺伝子発現の違いによる刺激実験を行う。さらに、III.この特異的なmicroRNAの川崎病急性期における冠動脈病変内での局在を同定し、川崎病急性期におけるCAL形成の病因を解明する。
ケルビンフォース顕微鏡によるナノスケール半導体キャリア濃度分布の定量

不純物ドープSiとSiドープGa2O3の仕事関数とそれらのキャリア密度との関係を、走査プローブ顕微鏡の一種であるケルビンフォース顕微鏡(KFM)を用いて調査した。KFMにより観察される仕事関数はキャリア密度から理論的に予想されるバルクフェルミレベルに表面準位の電荷によるバンド曲りの影響が重畳していることが、ドナー的性質とアクセプタ的性質の2種類の表面準位を仮定したモデルの計算により示唆された。また、比較的小さなキャリア密度においてはバンド曲りの影響は小さく、KFMにより測定される仕事関数よりキャリア密度とキャリア種を同時に評価できる可能性が示された。初年度は、最も一般的で広範囲にわたるドーピング濃度の材料が比較的入手しやすいSiウェーハについて、できるだけ多種の試料を系統的に測定し、KFM法によるキャリア濃度評価の可能性について検証を行った。評価したウェーハのキャリア濃度として、n型の約10^20cm^-3から10^10cm^-3、p型については10^19cm^-3から10^12cm^-3にわたるおよそ20種の試料を準備し、KFMによる仕事関数測定を行った。その結果、n型p型どちらの試料においてもキャリア濃度が10^-14cm^-3台以下の領域において理論値に近い値が観測され、この範囲においてのキャリア濃度定量の可能性が確認された。一方、比較的高濃度の試料においては、予想される仕事関数とは逆の濃度依存性が見られ、この傾向は2種類の表面準位を仮定したバンドベンディングモデルにより説明できることが示された。また、測定範囲の広範囲化を目指した光照射実験のための光励起KFM測定システムの準備を行った。初年度の不純物ドープしたSi試料Siにおけるキャリア濃度測定に引き続き、Si試料の測定と解析を行った。また、測定精度・測定可能範囲を検証する一つの手法として試料の温度制御機構を導入して実験を行った。測定時の試料温度を変化させることによる効果について、低濃度中濃度のキャリアを持つSiについて調査した結果、温度上昇によりキャリア濃度に対する電位変化の応答が大きくなることが実験的に確認された。ワイドバンドギャップ材料への適用としては、ドーピングによりキャリア濃度制御した酸化物半導体やSiCについての実験を開始した。前者についてはn型のGa系酸化物薄膜において、比較的高キャリア濃度の領域における仕事関数の挙動が表面電荷によるバンドベンディングを考慮したモデルにより再現できることが示唆された。なお、キャリア濃度測定範囲の広範囲化の試みの一つであった光照射下における実験をSi試料に適用したが、Siにおいては顕著な効果が得られないことが確認されたた。そこで、他の光学遷移の異なるワイドバンドギャップ材料についての実験準備を開始した。通常のKFM法を用いたSi系材料におけるp/n判定およびキャリア濃度測定の精度と定量可能範囲については概ね結果が纏まったものと考えられる。なお、試料温度制御による効果についての検証については引き続き検証を行う。今年度から実験を開始したワイドバンドギャップ材料については、今のところサンプル数が少ないため、次年度はサンプル数を増してできるだけ広範囲におけるデータ収集を目的として実験を進める予定。本研究におけるキャリア濃度測定範囲の広範囲化の試みの一つであった光照射による実験においては、Si試料については顕著な効果が得られなかった。次年度はワイドバンドギャップ材料にたいする光照射の効果について検証する。最終年度は前年度に引き続き、ワイドギャップ半導体についての評価を続けるとともに、各材料におけるキャリア密度の測定可能範囲について調査、検討を行った。ワイドバンドギャップ半導体としては、SiをドーピングしたGa2O3を選択した。様々な濃度のSiが添加されたターゲットを用いてPLD法によって作製されたGa2O3薄膜について、KFM法により表面電位を測定した。ホール測定により試料のキャリアは電子であり(n型)その密度は10の15乗cm-3から10の20乗cm-3の広範囲にわたっていることが確認された。KFM法によって観察されたn型半導体である試料の仕事関数は、キャリア密度の上昇に伴い上昇する傾向が見られた。このことは、前年度までに調査したSiのn型高濃度領域における挙動と類似しており、表面準位によるフェルミレベルピニングとバンドベンディングを考慮したモデルを用いることで説明されることが示された。計画時に測定対象として想定していたSiCについては、広範囲のキャリア密度とキャリア種の試料を系統的に調査するには至らなかったが、キャリア密度の違いによる表面電位の差異とSi面、C面における電位の違いもKFMにより観察されることが示唆された。キャリア密度の測定可能範囲については、低ドーピング濃度領域においては真性キャリア密度から10の15乗cm-3程度までの範囲であれば、KFM法によりキャリア種とキャリア密度を同時に、また直接的に知ることが可能と考えられる。一方、高ドーピング濃度領域においては、表面準位によるフェルミレベルピニングの影響によりバルクフェルミレベルの変化とは異なった仕事関数が観察されるが、材料によってはこの挙動を把握したうえで解析を行うことで、10の20乗cm-3程度の高濃度領域までKFM法により評価を行うことも期待できる。

また、比較的小さなキャリア密度においてはバンド曲りの影響は小さく、KFMにより測定される仕事関数よりキャリア密度とキャリア種を同時に評価できる可能性が示された。第一段階として検証の対象としたSiにおいてキャリア濃度測定の可能性とその適用範囲についての知見を得ることができた。また、第2年度以降に行う光照射実験用のシステムの準備を行った。SiC、酸化物等のいくつかのワイドバンドギャップ半導体におけるキャリア濃度評価実験を行う。特にSiCについてはドーピング条件の異なるサンプルを増やし、できるだけ広範囲におけるデータ収集を目的として実験を行う。また、試料温度制御による測定手法の高度化の可能性があると判断し、これについても検証を行う予定。測定される表面電位への光照射の効果については、Si材料に引き続き、SiCや酸化物半導体などの光学遷移の異なるいくつかのワイドバンドギャップ材料についての検証を行う。表面科学・薄膜工学第2年度はワイドギャップ半導体としてSiC等の評価を行い、キャリア濃度の測定精度と測定可能範囲について検証を行う。また、光励起効果について各種半導体に対して実験を行う。加えて、面積の異なるフラットヘッドプローブを用いた実験を行い、その測定分解能と測定精度の関係について調査を行う。
家乏胎仔と作成した先天性横隔膜ヘルニアの病態に関する研究

手術施行群(胎仔手術による先天性横隔膜ヘルニア〔以下本症と略す〕の実験モデル)と薬剤投与群(母獣への薬剤投与による本症実験モデル)の2群を作成した.1)手術施行群、薬剤投与群ともにその新生仔の外観、体重はコントロ-ル群と比較してなんらの異常を認めなかった.2)手術施行群はコントロ-ルと比較して、左右の肺とも著しく小さく、肺重量および肺重量体重比の低下を認めた.組織学的には、一様に強い無気肺を認めるが、肺胞の分化成勢には異常を認めなかった.3)薬剤投与郡においては、現時点までの胸膜内および腹膜内臓器に異常はなく,横隔膜にも欠損は認められなかった。マウスセラットにおいてnitrofen(NIP)投与は,安定した本症の発生と認めるのに対して,このことは著明な差であった.家兎における本症の発生域値に達していなかったものと考えられる.4)薬剤投与群においては,横隔の欠損がないため,腹膜臓器による肺の圧迫はない.しかし,これにもかかわらずコントロ-ル群と比較して肺重量体重比の低下を認め、また組織学的に肺胞の形成障害を認めるとともに肺組織内のリン脂質量の低下を認めた.これは薬剤投与群における肺の分化成熟異常と示唆するものである.5).この変化は横隔膜の形成障害に先行するprimaryな変化であり、仮に横隔膜の修復をおこなっても病態の改善を期待出来ない肺の変化である.手術施行群(胎仔手術による先天性横隔膜ヘルニア〔以下本症と略す〕の実験モデル)と薬剤投与群(母獣への薬剤投与による本症実験モデル)の2群を作成した.1)手術施行群、薬剤投与群ともにその新生仔の外観、体重はコントロ-ル群と比較してなんらの異常を認めなかった.2)手術施行群はコントロ-ルと比較して、左右の肺とも著しく小さく、肺重量および肺重量体重比の低下を認めた.組織学的には、一様に強い無気肺を認めるが、肺胞の分化成勢には異常を認めなかった.3)薬剤投与郡においては、現時点までの胸膜内および腹膜内臓器に異常はなく,横隔膜にも欠損は認められなかった。マウスセラットにおいてnitrofen(NIP)投与は,安定した本症の発生と認めるのに対して,このことは著明な差であった.家兎における本症の発生域値に達していなかったものと考えられる.4)薬剤投与群においては,横隔の欠損がないため,腹膜臓器による肺の圧迫はない.しかし,これにもかかわらずコントロ-ル群と比較して肺重量体重比の低下を認め、また組織学的に肺胞の形成障害を認めるとともに肺組織内のリン脂質量の低下を認めた.これは薬剤投与群における肺の分化成熟異常と示唆するものである.5).この変化は横隔膜の形成障害に先行するprimaryな変化であり、仮に横隔膜の修復をおこなっても病態の改善を期待出来ない肺の変化である.以下に示す2つの実験群を設定し研究を進めている。第一群:妊娠2224日目の家兎母獣の胎仔に対し横隔膜突破法により本症モデルを作成した(コントロ-ルは同腹の新生仔とした)。第二群:妊娠早期の家兎母獣にNIP(Nitrofen)含有飼料を経口摂取させその新生仔において横隔膜の欠損と肺の低形成を検索し、薬剤の有効な投与時期、量を検討中である。以下の結果を得た。(1)第2群においてはいまだ横隔膜の欠損を認めるに至っていない。(2)両群においてコントロ-ル群(第2群におけるコンドロ-ル群とは何らの処置をしていない家兎からの新生仔とした)と比較して新生仔の外観、体重に差を認めない。(3)第1群においては胸腔内に陥入した腹腔臓器により圧迫され肺はコントロ-ル群と比べ著しく低重量であるが、組織学的には肺胞レベルの分化、成熟に障害、遅延は認められない。(4)第2群においては横隔膜の欠損がなく腹腔臓器による肺の圧排がないにもかかわらずコントロ-ル群と比較して肺はやや低体重であり、組織学的に肺胞レベルの分化、成熟に障害、遅延を認める。(5)両群において肺組織内リン脂質を測定しているが、第2群においてコントロ-ル群と比較して著しく低値を示した。手術施行群(胎仔手術による先天性横隔膜ヘルニア〔下下本症と略す〕の実験モデル)と薬剤投与群(母獣への薬剤投与による本症実験モデル)の2群を作成し、主に以下の結論を得た。1).手術施行群,薬剤投与群ともその新生仔の外観、体重はコントロ-ルト比較してなんらの異常も認めなかった。2).手術施行群はコントロ-ルと比較して、肺が左右とも著しく小さく、肺重量および肺重量体重比の低下を認めた。組織学的には、一様に強い無気肺を認めたが、肺胞の分化成熟には異常を認めなかった。3).薬剤投与群はコントロ-ルと比較して肺重量体重比の低下を認めた。組織学的には肺胞の形成障害およびそれに伴う気腫状の変化、無気肺を認めた。4).肺組織内のリン脂質量は、手術施行群ではコントロ-ルと差はなく、薬剤投与群では低下していた。5).手術施行群において認めた肺の変化は腹腔臓器による肺の圧迫によりsecondaryの変化で、臨床的には横隔膜修復によって改善が期待できる病態である。

6).薬剤投与群に認めた変化は、横隔膜の形成障害に先行するprimaryな変化であり、修複をおこなっても改善が期待できない病態と考えられる。手術施行群(胎仔手術による先天性横隔膜ヘルニア〔以下本症と略す〕の実験モデル)と薬剤投与群(母獣への薬剤投与による本症実験モデル)の2群を作成した。1)手術施行群、薬剤投与群ともにその新生仔の外観、体重はコントロ-ル群と比較してなんらの異常を認めなかった。2)手術施行群はコントロ-ルと比較して、左右の肺とも著しく小さく、肺重量および肺重量体重比の低下を認めた。組織学的には、一様に強い無気肺を認めるが、肺胞の分化成勢には異常を認めなかった。3)薬剤投与群はコントロ-ル群と比較して肺重量体重比の低下を認めた。組織学的には肺胞の形成障害およびそれに伴う気腫状の変化、無気肺を認めた。4)肺組織内のリン脂質量は、手術施行群ではコントロ-ル群と差はなく、薬剤投与群において著明に低下していた。これは薬剤投与群における肺の分化成勢異常と示唆するものと考えられる。5)手術施行群において認めた肺の変化は腹腔臓器による肺の圧迫によるsecondaryの変化で、臨床的には横隔膜の修復により病態の改善が期待出来る肺の変化である。6)薬剤投与群に認めた変化は、横隔膜の形成障害に先行するprimaryな変化であり、仮に横隔膜の修復をおこなっても病態の改善が期待出来ない肺の変化である。
ダニ主要アレルゲンDerf2の脂溶性リガンド探索と複合体の構造・機能解析

著者はその立体構造とMLタンパク質の構造類似性から、ダニ主要アレルゲンDer f2が脂質様リガンドと結合する可能性を示唆してきた。本研究は、Der f2の脂質様リガンドを探索し、その複合体の構造解析を行なうことを目的としている。平成19年度は、1「Der f2の大量発現および精製」、2「Der f2のリガンド探索とNMRによる複合体の構造解析」、3「Der f2とリガンド複合体の結晶化とX線結晶解析」を行なった。1では、大腸菌による大量発現系を用いて、リガンド探索および構造解析に必要十分なタンパク量を得た。2では、Der f2が大腸菌表面と結合することから、Der f2と大腸菌JM109株破砕物との結合実験、ならびにDer f2とリポ多糖の結合実験を行なった。複合体の確認はゲルろ過クロマトグラフィーとNMRを用いた。Der f2と大腸菌破砕物との複合体の構造解析から、リガンドは糖脂質であり、腸内グラム陰性菌に共通の三糖の繰り返し(→4GlcNAcβ1→3Fuc4NAcαl→4ManNAcAβ1→)をもつことが示唆された。また、Der f2とリポ多糖との結合も確認された。Der f2のトリプトファン蛍光がリポ多糖との結合により消光することを利用して、結合定数を求めた結果、KdはμMのオーダーであることがわかった。3では、Der f2とlipid Aとの結晶化スクリーニングを行ない、得られた結晶を回折測定した。現在解析が進行中であるが、Der f2分子内に脂質の電子密度が見えている。本研究に必要な試薬類や器具類には消耗品費を用いた。ダニ主要アレルゲンDer f2は、その立体構造とMLタンパク質の構造類似性から、脂質様リガンドを結合する可能性が示唆されている。平成18年度は、1「Hisタグ融合Der f2のベクター構築、発現および精製」、2「Der f2のリガンド探索とNMRによる複合体の構造解析」を行なった。1では、大腸菌による大量発現系を構築し、リガンド探索および構造解析に必要十分なタンパク量を得た。2では、Der f2が大腸菌表面と結合することから、大腸菌破砕物の中にDe f2のリガンドがあることを期待して、Der f2と大腸菌破砕物との結合実験を行なった。複合体形成の確認にはNMRを用いた。結合実験は、まず13C標識した大腸菌JMIO9株を超音波処理により完全に破砕し、15N標識したHisタグ融合Der f2に直ちに加えた。30分後、この懸濁液をHisTrap HPカラムにかけ、精製してNMR試料とした。この試料の13C-HSQCスペクトルより、JM109破砕物由来のシグナルが明瞭に観測された。化学シフトから、リガンドが糖脂質である可能性も考えられた。また15N-HSQCスペクトルでは、リガンド結合前後でDer f2のシグナルの位置や強度に差がみられた。これはDer f2がリガンド結合により、構造変化を起こしたことによると考えられる。設備備品として購入した密閉式超音波細胞破砕装置は、大腸菌の破砕実験のために用いた。