hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
琵琶湖固有カワニナ類の寄生虫感受性に対する集団の遺伝的構造の影響の解明

琵琶湖産カワニナ類に広く寄生する吸虫Genarchopsis goppoは、地域によって利用する宿主が異なっている。感染実験および分子系統解析の結果、本種には隠蔽種が存在することが判明し、それぞれ異なる宿主特異性を持つことが示された。また,宿主の琵琶湖産カワニナ類においては,地域個体群間で感受性の差は見られなかった。これらの結果から,琵琶湖におけるG.goppoとカワニナ類の宿主-寄生者関係における共進化の速度は遅く,基本的には両者の種分化に伴うことが判明した。また,当初の目標であった遺伝的多様性の定量は,宿主側の種間にかなりの遺伝的浸透がみられることが示唆される(約10%の個体にその痕跡が見られる)結果となり,ハプロタイプ等による単純な量的比較は困難であることが判明した。今後,交雑による遺伝子の多様化と感染耐性との関連性を明らかにすることが課題である。平成19年度は,琵琶湖およびその集水域から,代表的なカワニナ類6種13個体群について,それぞれ約15個体の母貝から稚貝を得て,Genarchopsis goppo卵(琵琶湖北部産ヌマチチブから採集)の感染実験を行った.現在までの結果では,感受性の差は宿主の種レベルで明らかであり,地理的な違いは検出されていない.このことから,琵琶湖の地域によって見られる感染率の差は,宿主側の耐性の差ではなく,寄生虫側の遺伝的差異による可能性が高くなった.また,平成19年度は宿主および寄生虫のPCR適正条件を検討し,方法および解析に用いるゲノム部位を決定して,予備的な塩基配列解析を行った.その結果,宿主・寄生者の両方とも,遺伝的差異は地理的な距離よりも形態種の方に関連していることが明らかになった.また寄生虫の湖沼型(Genarchopsis gigi型)と河川型(G. goppo型)は別種であることが明らかになり,感染実験の結果と合わせると,前者は琵琶湖固有種であると考えられた以上の実績をふまえ,本年度は,琵琶湖水系の他地域のGenarchopsis goppoを用いた感染実験を集中的に行い,寄生虫側の宿主特異性に地域間差があるかどうかを明らかにする.また,昨年蓄積した宿主・寄生虫両者サンプルの遺伝的解析を行い,個体群ごとの変異量を定量的に求めると共に,遺伝的変異の種・地域個体群間差を明らかにし,寄生虫の感染力および宿主の耐性との関連の有無について検討する予定である.平成20年度は,昨年度の琵琶湖ヌマチチブ由来のGenarchopsis goppoに加えて,河川カワヨシノボリ由来のG. goppo(形態では区別できないが,遺伝的に別種と考えられる)の感染実験を行い,両者は宿主特異性が異なることを確認した.この結果から,G. goppo(隠蔽種含む)の感染に限り,宿主側の遺伝的多様性のレベルと感染耐性のレベルには一義的な相関はないと推定された.また,宿主である琵琶湖産カワニナ類のITS-1塩基配列の解読により,琵琶湖固有カワニナ類の遺伝的変異には地理的変異がほとんど見られないことがわかった.感染実験の結果と合わせ, Genarchopsis goppo感染への耐性は寄生者・宿主の双方の系統的制約によるところが大きいと推定され,個体群間差は無視できるほどであることがわかった.さらに,琵琶湖産カワニナ類の塩基配列解析の際に,雑種と推定されるヘテロ配列をもつ個体がかなり高い確率で見出された.このことは,宿主側の系統および遺伝的多様性の正確な記述のためには,核DNAの1本毎の塩基配列の決定が必要であり,mtDNAは繁殖集団や系統の推定には使えないことを示す.本年度は,サブクローニングによって2組のDNA塩基配列をそれぞれ明らかにし,個体群ごとに平均ヘテロ接合度を求めるとともに,雑種の存在を考慮して宿主の系統推定を行い,宿主の遺伝的多様性および系統と感染体制との関連の有無を明瞭に示す予定である.平成21年度は、琵琶湖および河川型Genarchopsis goppoに加えて、日本各地の約6水系から得られたG.goppoの分子系統解析を行い、琵琶湖産の個体群は日本各地のどの個体群よりも古くに分岐したことが示唆された。しかし、琵琶湖のヌマチチブの原産地と推定される霞ヶ浦のサンプルが未入手であるため、まだ琵琶湖型G.goppoが真に固有種かどうかの結論は得られていない(本年度に解析を実施する予定である)。宿主のカワニナ類の一部(約30個体)について核ITS-1領域にヘテロ配列を持つ個体ののサブクローニングを行った。

現在までに、戻し交雑と推定される個体は得られているが、雑種第一代と決定されるものは発見できていない。以上の未解決点は、引き続き平成22年度からの課題(基盤研究(c)「琵琶湖固有カワニナ類の系統進化および二次交雑が吸虫感染耐性に与える影響」での課題として取り上げ、雑種個体の存在の検討と、それらの個体の寄生虫に対する感受性について研究を進める予定である。
大腸菌ゲノムの総合解析

本研究では、分子生物学的研究が最も進んでいる大腸菌を対象とし、ゲノムの全一次構造の決定を中核とする包括的解析に関する企画調査を行った。その結果に基づき、平成元年度より発足する重点領域研究「大腸菌ゲノムの全体像」における計画班の人員構成、予算特にDNAシーケンサー等機器の配置、大腸菌ゲノムのDNAデータバンクの作成などにつき現状を調査し、それに基づいて今後の実施計画を立案した。今回の重点領域研究で中核的なプロジェクトとなる組織的な一次構造の決定計画については、磯野班長(神戸大学)を中心にDNAシーケンサーにかける材料の調製法の検討と改良を行った。一方、現在使用しうる複数の機種のDNAシーケンサーについて、同一DNAサンプルを用いた詳細な比較検討を行い、今後の計画に参考となる多くの貴重な基礎データを得ることができた。さらに外国における同様の研究計画についても積極的な情報収集を行い組織的な一次構造決定計画、大腸菌染色体の遺伝地図と物理地図(制限酵素切断地図)との対応づけなどを行っている数名の外国人研究者を訪問し相互協力の可能性などについて討議した。
酸化物ナノ粒子へのガス吸着を利用した蓄熱材料の原理実証

本研究ではCeO2ナノ粒子への水蒸気吸着を利用した蓄熱材料の可能性を検証することを目的とした。CeO2ナノ粒子粉末は紫外レーザー法を用いて作製された。作製されたCeO2ナノ粒子の一次粒径は3.55 nm、二次粒径は8.97 nmと算出された。水蒸気吸着量はp/p0 = 0.4、25°Cのとき50 cm3/gであった。このとき蓄えられる熱量は165 J/g (0.17 MJ/kg)と算出された。この蓄熱量は軽い酸化物ナノ粒子の利用により改善されうる。蓄熱デバイスとしての特性評価は水蒸気導入後の温度変化を測定することで行われ、約0.5°Cの温度変化が約1時間続くことが確認された。一般に、酸化物ナノ粒子表面には多量の水蒸気が吸着するが、その吸着に際して40から120 kJ/molの熱(吸着熱)がやり取りされる。水蒸気の吸着現象は室温・常圧近傍で起こるため、単位体積・重量当りの水蒸気吸着量を増加させることが可能であれば、通常は回収・有効利用が困難な室温近傍の低品位熱を利用した新たな蓄熱デバイスへの応用が期待できる。そこで本研究では、セリウム酸化物(CeO2)や他の酸化物ナノ粒子の合成、比表面積の増大化、吸着熱測定を行い、ガス吸着を利用した蓄熱体の原理実証を行なうことを目的とする。今年度はCeO2ナノ粒子の合成から開始した。CeO2ナノ粒子は紫外レーザー法を用いて作製され、XRD、BETを用いて粒径が算出された。水蒸気吸着特性と吸着熱はジーベルツ装置を用いた容量法により測定された。また吸着熱はDSCによっても測定された。表面状態はラマン分光法により測定された。作製された粉末状のCeO2ナノ粒子の粒径はXRDからは3.55 nm、BETからは8.97 nmと算出された。この相違はBETでは凝集体としての二次粒径が測定されるためである。容量法を用いた水蒸気吸着特性の測定は100°C、1 Paの真空中前処理を施した後に行ない、25°Cの相対圧0.4において約50 cm3/gの水蒸気吸着が確認された。35°Cで測定された同様の等温線を用いることで吸着熱は165 J/gと算出された。DSCにより測定された吸着熱は146.9 J/gとなり良い一致を示した。一方、ラマン分光法からはCeO2ナノ粒子表面に有機物が付着していることが確認され、より高い吸着熱を得るためにはその除去が必要であることが明らかとなった。本研究では、酸化物ナノ粒子表面への水蒸気吸着に伴う吸着熱を室温近傍の蓄熱に応用することを目的とし、セリア(CeO2)ナノ粒子の合成、比表面積・粒径と吸着熱の評価に加えて、水蒸気吸着を利用した蓄熱デバイスとしての原理実証を行った。昨年度までに、シングルナノの粒径を有するセリアナノ粒子の合成とその吸着熱の評価を完了し、今年度は吸着熱の増加とデバイスとしての動作実証を行った。吸着熱の増加に関しては、ナノ粒子合成後に表面に残存する有機物の除去が有効と示唆されたため、セリアナノ粒子への熱酸化処理とオゾン酸化処理を試みた。結果として、未酸化処理のセリアナノ粒子の水蒸気吸着量、17 cm3/g (25°C、相対圧p/p0=0.06)に対して、熱酸化処理では同条件で18 cm3/gと吸着量に変化は見られなかった。一方、オゾン酸化後の吸着量は34 cm3/gに倍増しており、オゾン酸化が第一層吸着量の増加に有効であることを見出した。また、オゾン酸化処理はセリアナノ粒子表面の親水性を高める効果が高いことも確認された。また、高吸着熱材料の探索としてLiBH4への水蒸気吸着も試み一水和物の作製に成功した。続いて蓄熱デバイスの原理実証を試みた。試料にはオゾン酸化されたセリアナノ粒子を用いた。まず100°Cに昇温された管状炉の中でセリアナノ粒子表面に吸着している水蒸気を脱着した。その後合成空気雰囲気下で2時間保持し室温に降温した。続いて室温にて水蒸気分圧1.23 kPaの湿潤ガスを試料中へ導入し温度変化を測定した。結果として、水蒸気吸着による0.5°Cの温度上昇が約1時間継続することを確認し、酸化物ナノ粒子表面への水蒸気吸着による蓄熱効果を実証した。

今年度の課題は、セリアナノ粒子を合成し、その水蒸気吸着特性と吸着熱を明らかとすることにある。研究実績の概要に記載したとおり、粒径10 nm以下のセリアナノ粒子の合成に成功し、約50 cm3/gの水蒸気吸着と150 J/g程度の吸着熱を有することを明らかとした。さらに、CeO2ナノ粒子表面への有機物付着が吸着熱の抑制の原因であることを明らかとしており改善指針を得ている。セラミックス材料既存の潜熱蓄熱材料の蓄熱量はおよそ300 J/gであり、今回作製されたCeO2ナノ粒子より得られる蓄熱量はその半分程度となっている。そこで、まずはその吸着熱の改善が必須である。ラマン分光法からはCeO2ナノ粒子表面に有機物が付着していることが示されており、オゾン酸化などによりその除去が可能であればさらなる吸着熱の増加が見込める。さらに、CeO2ナノ粒子よりも比重の軽い酸化物ナノ粒子の適用を試みる。さらに、ナノ粒子酸化物を大量に合成し、実際に蓄熱が可能か否かの原理実証を来年度に実施する。
合金のプラズマ酸化に関する研究

金属・合金のプラズマ酸化の可能性の検討及びプラズマ酸化の機構を解明する目的で、Cu-Al合金及びAg-Al、Ag-Cd合金の低温プラズマによる酸化挙動を検討した。比較の為に、Ag-Al合金の空気中での酸化挙動を検討した。(1)酸化により著しい強度上昇が認められた。これは、微細なAl酸化物の析出によるものである。(2)酸化挙動は酸化温度によって大きく異なる。即ち、温度域としては高温域(700900°C)と低温域(400600°C)に分けられる。(3)高温域での酸化では電気抵抗が酸化前よりも減少するのに対し、低温域での酸化で増加する。(4)析出酸化物は高温酸化ではAl_2O_3であるが、低温酸化ではO過剰の酸化物である。2.Cu及びAg合金のプラズマ酸化:上記合金を650°C900°Cでプラズマ酸化を試みた。(1)Cu-Al、Ag-Cd、Ag-Al、合金のいずれの合金においてもプラズマ酸化が可能であることを確かめた。(2)プラズマ酸化の方が、通常のガス酸化よりも酸化速度及び硬さの増加が大きいことが明らかとなった。3.以上の結果より、合金の酸化処理にプラズマの利用は極めて有効であることが判明した。今後より詳細な研究を行えば、学術的な意義も大きいばかりでなく実用化への期待も頗る大きい。本研究は,合金の内部酸化現象を利用し,現在まで殆ど明らかにされていないプラズマー固体金属との反応機構の解明を,ガスー固体金属反応と比較することによって試みることを目的としている.本年度は, (1)比較データとして用いるガスによる合金の内部酸化挙動を研究する,(2)同種の合金について,プラズマによる内部酸化が起こるか否かを検討する,(3)上記(1)と(2)の結果を比較検討し,プラズマによる酸化の特徴を明らかにすることに焦点を絞った.なお,合金試料としては,プラズマの効果が顕著に現われることが期待されるCu-Al合金を選んだ.得られた結果を以下にまとめて示す.(1)Rhines法を用いたガスによる内部酸化挙動を詳細に調べた.1例として, Cu-1wt%Al合金を900°C, 10時間酸化すると約200μmの内部酸化層が形成されることがわかった.(2)この銅金は,プラズマを用いても内部酸化が可能であることが,以下の実験結果より明らかとなった.a)組織観察と硬さ測定より,酸化層と未酸化層が明らかに識別でき,且つ酸化層が放物線則に従って成長する.b)ESCA分析よりAlはAL_2O_3を形成している.(3)プラズマ酸化には,酸化速度がガス酸化よりも著しく大きいこと,プラズマ酸化の硬さがガス酸化のそれよりも約2.5倍大きいことなどの特徴があることが明らかとなった.以上の結果より,プラズマによる酸化はガス酸化に較べ,合金中への固溶酸素量の増加を通して,酸化速度及び強度の顕著な増加をもたらすことが明らかとなった.これらの成果は,プラズマ化学及び材料科学的見地から極めて重要なものであり,今後多方面な分野への展開・応用が期待される.なお,本研究の成果については,現在投稿準備中である.本年度は昨年度に得られた知見に基づいて、まず銀合金のプラズマ酸化の特色を明確にする比較研究として、プラズマを使用しない通常の空気中での酸化挙動を研究した。次に、プラズマ酸化をAg合金(Ag-Al、Ag-Cd)に適用し、その有効性を検討した。空気中でのAg-Al合金の酸化は、溶質Al濃度1.54.5at%(0.31.2wt%)、酸化温度400900°Cで行なった。いずれの条件の酸化でも、母相Ag中に微細なAl酸化物が析出する内部酸化のみ(外部酸化なし)が進行することが確かめられた。更にこれらの合金の酸化挙動は、酸化温度によって大きく異なることが明らかとなった。大別すると低温(400600°C)と高温(700900°C)域での2種類の酸化挙動である。

電気抵抗は、高温での酸化では酸化前よりも減少するのに対し、低温酸化では増加することが見い出された。これらの原因を明らかにする為に行った酸化による重量変化測定、透過電子顕微鏡観察、ESCA分析より、Ag-Al合金を空気中で酸化すると、析出酸化物は高温域では化学量論的なAl_2O_3であり、低温域では0の過剰な且つ極微細(30【similar or equal】以下)なAl酸化物であることが判明した。次に、Ag-10at%(12wt%)Cd合金及びAg-2.2at%(0.56wt%)Al合金のプラズマ酸化を650°C700°Cの温度域でマイクロ波プラズマを用いて行なった。組成観察、硬さ測定の結果より、これらの合金がプラズマにより内部酸化されることが初めて見い出された。その上、このプラズマによる酸化は、通常の空気中での酸化よりも、酸化速度が速く且つ強度増加も大きいことが判明した。
タバコモザイクウイルスの増殖に関わる宿主因子の検策

1.30Kタンパクと相互作用する宿主因子を抗30kタンパク抗体を用いて検索した。30kタンパク遺伝子をT7RNAポリメラ-ゼを利用した発現ベクタ-に導入し、大腸菌内で発現させた。このタンパクをウサギに免疫し、30kタンパクに特異的に反応する抗体を得た。抗体は、さらに30kタンパクに対する親和性により精製し、以後の実験に用いた。TMVをタバコのプロトプラストに感染させ、適当な時間アイソト-プでラベルした後、抽出物を抗30kタンパン抗体で免疫沈降し、30kタンパクと共沈する宿主の因子がないか調べたが、特に見いだせなかった。2.TMVに低抗性を示すアラビドプシスの変異株の単離を試みた。アラビドプシスの種をEMSで処理して得た約6000の変異株にTMVを接種し、TMVが増殖できるかを、上葉の抽出液中に含まれるTMV抗原の量によって調べた。現在、TMVの増殖が野性株のアラビドプシスに比べて1/10以下になっている変異株が1株得られている。この、変異がTMVの増殖に直接関わっている宿主因子の変異であるか検討している。また、この低抗性が個々の細胞レベルで有効かどうかを知るため、アラビドプシスのプロトプラストの調製法及びそのプロトプラストへのTMVの感染系を確立した。3.宿主の因子との親和性が変化したと思われるTMVの変異株を人為的に作製した。3'の非翻訳領域に種々の欠損を導入し、得られた変異株の植物に対する反応を調べたところ、病気を引き起こさず増殖するものが得られた。また、コ-トタンパクの変異株の中に、野性型TMVの感染では観察されぬような、一種の宿主の低抗性反応を誘導する変異株が得られた。3'非翻訳領域あるいは変異コ-トタンパクをプロ-ブとして宿主の因子が探索可能と思われる。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ3βのミトコンドリア移行抑制による心不全治療の開発

GSK-3β活性によるミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)開孔の機序解明を目的として研究を行った。(1) GSK-3βはvoltage dependent anion channel 2との相互作用によりミトコンドリアへ移行すること、(2) N末端のK15がミトコンドリア移行シグナルの機能に重要であること、(3) GSK-3βの上流のERKおよびAktは酸化ストレスによりミトコンドリアへ移行し、脱リン酸化されること(4) ERKおよびAktの特異的な脱リン酸化酵素であるDusp5およびPHLPP1は酸化ストレスによりミトコンドリアへ移行することを見出した。(i)心筋細胞を酸化ストレスに暴露しGSK-3βとの結合が増加する蛋白を、GSK-3β抗体を用いた免疫沈降法ならびに二次元電気泳動法を用いて検索した。酸化ストレスによりGSK-3βとの相互作用が3倍以上増加するゲル上のspotを9つ見出し、LC/MSにより蛋白を同定した。この中にはPhosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 5-phosphatase AおよびVoltage dependent anion channel 2(VDAC2)が含まれていた。(ii)まずはVDAC2に着目して研究を進めた。VDAC2抗体による免疫沈降を行い、GSK-3βとの相互作用が酸化ストレスにより増加するかを確認することを試みたが、入手可能なVDAC2抗体はH9c2細胞を用いた実験ではいずれも非特異的バンドが多数検出されたため、VDAC1, VDAC3には存在せずVDAC2特異的なアミノ酸配列をepitopeとした抗体を家兎を利用して制作した。しかし、異なる2個体を用いて制作したVDAC2抗体でもやはりVDAC2に特異的なバンドは検出されなかったためFLAG標識VDAC2抗体を作成した。抗FLAG抗体による免疫沈降物中のGSK-3βは外因性の過酸化水素により増加し、酸化ストレスに反応してGSK-3βがミトコンドリアに移行し、VDAC2と相互作用することが確認された。siRNA法によりVDAC2の発現を抑制し、H9c2細胞のミトコンドリア分画および細胞質分画におけるGSK-3βの蛋白量をウェスタンブロット法により評価したところ、酸化ストレスによるミトコンドリア分画のGSK-3βの蛋白量増加はVDAC2のノックダウンにより減少していた。(iii) GSK-3βのミトコンドリア移行制御の臨床応用を念頭に置き、心不全モデル動物の作成に取り組んだ。近年注目され、臨床的にも頻度が高い心腎連関による心不全を想定し、片腎全摘および残存腎の2/3摘除を行った腎不全モデルを作成した。今後心機能の推移を観察、評価予定である。グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)によるミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)の分子制御機構の解明を目的として研究を進めている。これまでに(1)GSK-3β抗体による免疫沈降物を用いた二次元電気泳動によりVoltage dependent anion channel 2(VDAC2)との相互作用がGSK-3βのミトコンドリア移行に寄与すること、(2)GFP標識GSK-3β蛋白のN末端の各種点変異体のミトコンドリア移行効率を蛍光time-lapse顕微鏡で観察することにより、N末端の一部アミノ酸がミトコンドリア移行シグナルとして機能していることを見出した。GSK-3βはそのリン酸化状態によりmPTP制御および細胞生存/細胞死に相反する影響を与える。すなわち、リン酸化/非活性化状態ではmPTP開孔/細胞死を抑制するのに対して、非リン酸化/活性化状態ではこれを促進する。そこで、GSK-3βのリン酸化を制御する上流のキナーゼ、ERKおよびAktのミトコンドリア移行、ミトコンドリア内での局在、リン酸化状態およびその調節機構について検討を開始し以下の成績を得た。(i)酸化ストレスによりGSK-3βと同様にERKおよびAktのミトコンドリアへの移行が促進sれた。ERKは主にミトコンドリア外膜へ、Aktはミトコンドリア外膜、膜間スペース、内膜へ分布した。(ii)一方、リン酸化ERKおよびリン酸化Aktは酸化ストレスにより全ミトコンドリア分画で著明に減少した。リン酸化GSK-3βの蛋白量はリン酸化ERK、リン酸化Aktの蛋白量と相関していた。(iii)IGF-1の投与により酸化ストレスが惹起するERK、Akt、GSK-3βの脱リン酸化は抑制され、リン酸化ERKはミトコンドリア外膜で、リン酸化Aktはミトコンドリア内膜で、リン酸化GSK-3βは外膜および内膜のいずれでも増加した。(iv)ERKおよびAktの特異的な脱リン酸化酵素であるDusp5およびPHLPP1の動態について検討した。酸化ストレスによりDusp5は主にミトコンドリア外膜で、PHLPP1は内膜で増加した。当初設定した実験計画に沿って研究をすすめ、概ね順調に進展している。GSK-3βがミトコンドリアへ移行する機序についてはその結合蛋白であるVDAC2と、GSK-3β自体のN末端に存在するミトコンドリア移行シグナルが寄与することを明らかにした。さらに、今後行う予定であったin vivoの実験系の手技もほぼ確立されていた。しかし、予備実験でミトコンドリア内GSK-3βのリン酸化を制御する興味深い機構を示唆する成績が得られたため、一部予定を変更して新しいシリーズの実験を追加、先行しておこなっている。

すなわち、ミトコンドリア内でも外膜、膜間スペース、内膜とその分布部位によって、内膜上に存在するmPTPの制御に対する影響が異なる可能性が考えられたため、ミトコンドリア内の局在をさらに詳細に検討することとした。ミトコンドリア内の総GSK-3βとリン酸化GSK-3β、および上流のキナーゼであるERKとAktのミトコンドリア内局在とリン酸化状態、ERKやAktのリン酸化を制御する脱リン酸化酵素であるDusp5、PHLPP1のミトコンドリア内の局在を酸化ストレスやIGF1存在下で検討することとし、実験を遂行している。グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)活性によるミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)開孔は虚血再潅流障害による心筋細胞死や、不全心における心筋細胞死を惹起し病態の増悪に寄与する。そこで、GSK-3βによるミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)開孔分子制御機構の解明を目的として研究を行った。(1)GSK-3βは酸化ストレス下ではvoltage dependent anion channel2(VDAC2)との相互作用によりミトコンドリアへ移行すること、(2) N末端のK15がミトコンドリア移行シグナルとして機能していることを見出した。GSK-3βはそのリン酸化状態によりmPTP開閉の制御および細胞生存/細胞死に相反する影響を与える。そこでその調節機構について心筋細胞のミトコンドリア分画を分離し、さらにtrypsin digestionにより外膜、内膜、マトリックス分画に分け検討した。(3)GSK-3βを制御するERKおよびAktはいずれも酸化ストレスによりミトコンドリアへ移行した。ERKは主に外膜へ、Aktは外膜、内膜へ均等に分布した。(4)リン酸化ERKおよびリン酸化AKtは酸化ストレスにより著明に減少した。(5)IGF-1投与は酸化ストレスによるERK、Akt、GSK-3βの脱リン酸化を抑制した。(6)ERKおよびAktの特異的な脱リン酸化酵素であるDusp5およびPHLPP1は酸化ストレスにより、それぞれ外膜、内膜へ移行することが確認された。(7) GSK-3βのN末端K15が蛋白脱アセチル化酵素SIRT3の標的であることが報告された。心筋細胞においてミトコンドリアのSIRT3レベルとGSK-3βレベルには負の相関が見出された。今後はDusp5, PHLPP1, SIRT3によるGSK-3βのミトコンドリア局在制御が細胞死に影響を与えるかを検討する。GSK-3β活性によるミトコンドリア透過性遷移孔(mPTP)開孔の機序解明を目的として研究を行った。(1) GSK-3βはvoltage dependent anion channel 2との相互作用によりミトコンドリアへ移行すること、(2) N末端のK15がミトコンドリア移行シグナルの機能に重要であること、(3) GSK-3βの上流のERKおよびAktは酸化ストレスによりミトコンドリアへ移行し、脱リン酸化されること(4) ERKおよびAktの特異的な脱リン酸化酵素であるDusp5およびPHLPP1は酸化ストレスによりミトコンドリアへ移行することを見出した。
異種分析融合による青果物の抗酸化能関与成分の解明と非破壊推定

本研究では、抗酸化関与成分に基づく機能性表示の基盤技術として青果物の全数検査を目指し、1青果物を電子スピン共鳴(ESR)スピントラップ法、核磁気共鳴(NMR)メタボロミクス、近赤外分光法及び蛍光指紋という複数の手法で分析し、2データ統合及びネットワーク相関解析によって各種活性酸素種の消去を担う関与成分を明らかにする。さらに、3関与成分特有の吸光・蛍光波長を探索し、その含有量を非破壊かつ高精度推定する手法を開発する。今年度は、コマツナ、リンゴおよびモモについてESRスピントラップ法、NMR、近赤外分光法および蛍光指紋による分析を行ってデータを蓄積した。このうちコマツナについては予備的なデータ解析も実施し、近赤外スペクトルとNMRスペクトルの間に相関関係をStatistical Heterospectroscopyにより確認した。その結果、NMRスペクトルのうち糖類のシグナルに関連する化学シフト領域と、近赤外スペクトルにおけるOH基伸縮の第1倍音やCO基の伸縮に対応する1570、2150および2270 nm近傍の吸光度に、顕著な相関関係があることが明らかとなった。このことは、近赤外スペクトルに糖類の変化に関する情報が含まれていることを示しており、研究目的である抗酸化性関与成分の推定においても、実際の成分変化を反映した検量線作成が可能なことを示唆していると考えられる。本成果は2019年9月に開催されるthe19th biennialmeeting of the International Council for NIR Spectroscopy (NIR2019)において発表予定である。研究目的の達成に必要なデータを順調に蓄積できた。また、近赤外分光スペクトルとNMRスペクトルの相関解析を行い、3年目以降に実施予定のネットワーク相関解析が実現可能であるという感触を得た。個体差、季節変動、年次間差、産地間差などのばらつきを考慮したデータを取得するため、産地や出荷時期の異なる試料を各年度に収集し、各分析手法のデータ蓄積を図る。
20世紀初頭におけるドイツ資本のイギリス進出と敵国債務委員会資料

この研究の第1課題、すなわち、イギリスにおける敵性資産管理を統括する位置にあった敵国債務委員会の設置目的、所蔵資料の構成、秘密報告書と覚書の内容については、ほぼその概要を解明できた。第2課題であるイギリス(本国+英帝国)におけるドイツ資本の具体的な活動と、より一般的な課題として設定したドイツの対先進国向け投資の歴史的意義については、次のように要約できる。1.ドイツの先進国投資は、在外保管証券のイギリス集中を通して、ポンド決済の中心地であるロンドン金融市場に投資の1拠点をおいていた。2.ドイツの対イギリス投資の実際は、在英取得・保管証券と企業進出とを通して、大戦前には貿易と資本の両面での対英攻勢を強めていた。3.ドイツ大銀行ロンドン支店は、伝統的な貿易金融業務と並んで、在英保管証券を利用した事業投資にも関与していた。今後に残された論点は、次のようなものである。第1。在英保管証券の金融的機能を明らかにして、イギリスがドイツの先進国投資の主要拠点であったことを論証するには、2と3の関連をロンドン金融市場メカニズムの中で解明していく必要があり、さしあたりは、債務委員会の証言資料と敵国銀行資産管理報告、そしてロンドン資本市場の研究史を突き合わせていくことが必須である。第2。この研究の狙いは、ドイツの資本輸出に占める対先進国投資の意義を解明することにあった。それでは、先進国投資を含めたこの時期のドイツの資本輸出全体、さらにはドイツの対外経済展開全般は、総体としてどのように理解されるべであろうか。それは、「マルク決済圏」の構築によってイギリスのエンパイア・ルートと全面対決するものであったのか、それとも、「ポンド決済圏」との共在・競合を同時進行させた別様のものであったのか。これが、これからの我々の究極的な研究目標である。本研究の第1課題は、大戦中のイギリス政府部内に設置された敵性資産管理の諸組織の編成、特にそれらを統括する位置にあった敵国債務委員会の目的、所蔵資料の構成、秘密報告書の内容を明らかにすることである。本年度は主にこれらの解明に従事して、角のような新たな知見を得た。1.大戦中のイギリス政府による適性資産管理は、「対敵国貿易禁止(修正)法」(1914ー1918年)を起点とする敵諸国とのあらゆる種類の通商禁止を経て、商務省が任命する敵性資産管理官による在英(英帝国)敵国事業の資産管理・清算・売却、および大蔵省によるドイツとオ-ストリア・ハンガリ-の敵性銀行ロンドン支店(5行)の営業管理・清算へと進むが、1916年11月設置の債務委員会はその中にあって、敵諸国との戦前の未決済取引の実態解明とその決済方法の提案を直接の目的としつつも、最終的にはイギリス側(本国+英帝国)と敵4ケ国との間の短期・長期の債権・債務関係を網羅的に調査していくことになる。2.委員会の報告書は、戦前の未決済のままの債権・債務を決済局という公的機関を設置して一括して処理すべきだと勧告したが、同時に「債務と資産の報告に関する(秘密)覚書」において、イギリスと敵諸国間の貸借バランスの総括表を提示した。第2点に関連して注意すべきは、(1)独英の資本関係の実態は、イギリスからのかなりの短期借りの関係を持続させながらも、1890年代末からイギリスで取得・保管された証券投資の増大と1907年「特許・意匠法」を契機に急増した直接投資(化学・電機など)を通して、貿易と資本の両面で対英攻勢を強めたこと、(2)ドイツ3大銀行ロンドン支店は伝統的な貿易金融と並んで、在英保管証券などを利用した在英ドイツ企業や海外企業への融資にも積極的に関与したこと、この2点である。次年度は、これらをさらに具体的に分析していく予定である。第1。第2。

それは、「マルク決済圏」の構築によってイギリスのエンパイア・ルートと全面対決するものであったのか、それとも、「ポンド決済圏」との共在・競合を同時進行させた別様のものであったのか。これが、これからの我々の究極的な研究目標である。この研究の第1課題、すなわち、イギリスにおける敵性資産管理を統括する位置にあった敵国債務委員会の設置目的、所蔵資料の構成、秘密報告書と覚書の内容については、ほぼその概要を解明できた。第2課題であるイギリス(本国+英帝国)におけるドイツ資本の具体的な活動と、より一般的な課題として設定したドイツの対先進国向け投資の歴史的意義については、次のように要約できる。1.ドイツの先進国投資は、在外保管証券のイギリス集中を通して、ポンド決済の中心地であるロンドン金融市場に投資の1拠点をおいていた。2.ドイツの対イギリス投資の実際は、在英取得・保管証券と企業進出とを通して、大戦前には貿易と資本の両面での対英攻勢を強めていた。3.ドイツ大銀行ロンドン支店は、伝統的な貿易金融業務と並んで、在英保管証券を利用した事業投資にも関与していた。今後に残された論点は、次のようなものである。第1。在英保管証券の金融的機能を明らかにして、イギリスがドイツの先進国投資の主要拠点であったことを論証するには、2と3の関連をロンドン金融市場メカニズムの中で解明していく必要があり、さしあたりは、債務委員会の証言資料と敵国銀行資産管理報告、そしてロンドン資本市場の研究史を突き合わせていくことが必須である。第2。この研究の狙いは、ドイツの資本輸出に占める対先進国投資の意義を解明することにあった。それでは、先進国投資を含めたこの時期のドイツの資本輸出全体、さらにはドイツの対外経済展開全般は、総体としてどのように理解されるべきであろうか。それは、「マルク決済圏」の構築によってイギリスのエンパイア・ルートと全面対決するものであったのか、それとも、「ポンド決済圏」との共存・競合を同時進行させた別様のものであったのか。
日本人の健康・病気観とHealth Locus of Control

本研究の目的は、平成6・7年度の2年間で、先に平成2年度科学研究費(奨励研究)を得て筆者が開発した日本版Health Locus of Control尺度によって測定される個人の健康や病気に対するコントロール信念の特性と、疾患に対するイメージや生命倫理問題に対する態度との関連について検討することである。研究の初年度には、大学生と看護学生とを対象として、SD法を用いてさまざまな疾患についてのイメージを測定した。その結果、疾患の身近な経験は、疾患イメージのうちでも心理的距離の因子に反映されること、生物医学的専門知識の有無は、その疾患イメージの形成に多面的に影響していることがうかがえた。また、個人のhealth locus of controlの特徴によって、疾患イメージも異なっていることが確認された。研究の2年目には、個人のhealth locus of control特性の測定と同時に、生命倫理問題への態度や想定された心身不調に際してとる対応について、日本の大学生と中年期以降の成人、および韓国とアメリカの大学生とを対象とした質問紙調査を行った。その結果、生命倫理問題については、4群の対象者はいずれも異なる態度を示しており、またこれらの態度は個人のhealth locus of controlの違いを反映していることが示された。想定された心身不調に対して選択する対処法については、不調の種類によって対処法は異なるものの、対象者群間での差異も大きいことが明らかとなった。またいずれの対象者群においても、個人のhealth locus of controlの特徴と選択する対処法との間に関連性が認められた。さらに、日本と韓国およびアメリカの大学生のhealth locus of control尺度得点についての因子分析結果の比較から、これらの3群間で、健康や病気についてのコントロール信念の内容に差異のあることが示唆された。今年度からの2年間で上記研究課題の達成を計画しているが、初年度である平成6年度には、個人の原因帰属傾向であるLocus of Controlと保健医療問題をめぐる態度との関連性についての検討が主な課題であった。病気はその生物学的・医学的な側面(disease)だけではなく、様々な社会的・心理的側面(illness)を持つが、健康心理学的アプローチにおいてはillnessが直接的なテーマとなる。そして、個人の保健行動や保健医療をめぐる態度には、各自の疾患に対する認知やパーソナリティー特性などの個人的要因が大きな役割をもつと考えられる。そのため今年度は、まず現在論議されている保健医療問題に関する基礎的な資料を集め、論点を整理することによって取り上げるトピックスを決定し、選択された各トピックに関してSD法によるイメージ測定を行なうことによって各種疾患のイメージ構造を調べ、さらに個人のLocus of Control特性との関連について検討した。看護学生と大学生の計370名を対象とした調査の結果、各種疾患15種について25対の形容詞によるSD法を実施し、形容詞対の因子構造を検討したところ、予後・力量生・許容度・感受性・心理的距離・活性度の6因子が抽出された。この6因子にもとづいてイメージ構造を検討することにより、たとえば、エイズはがんとは予後で類似しながら活性度で異なるなどの、各疾患の持つ心理的意味(illness)が明らかにされた。また、個人の帰属傾向によりそれらの心理的意味も異なることが示された。さらに、diseaseについての知識の有無や、その疾患についての身近な経験の有無が、疾患イメージの形成に影響を及ぼすことも示されている。これらの結果の一部は既に平成6年度の日本健康心理学会第7回大会で報告しているが、現在さらに学会発表と論文を準備中であり、これを基礎として来年度の研究を実施していく予定である。平成6・7年度の2年間で上記研究課題に取り組む計画で、平成6年度には個人の健康や病気に対する帰属傾向(Health Locus of Control:以下HLCと略)と疾患イメージとの関連を検討した。

本年度は、大学生とその親の世代を対象として、社会的な関心を集めている生命倫理問題への態度と、個人のパーソナリティ要因としてのHLCとの関連を検討し、さらに国際比較により日本人のマクロな健康・病気観を分析することを目的とした。収集した基礎的史料から生命倫理に関する現在の中心的なトピック計13項目を選択し、それへの態度を問う質問項目を作成。また、HLC尺度に示される個人の特性と、上記13項目で測定されるような現実の様々な問題への態度とをつなぐ要因として、日常的な心身不調時の行動傾向を把握した。これら3種の質問項目を各々のネイテイブ・スピーカーにより韓国語および英語に翻訳し、質問紙を韓国とアメリカの大学等の調査協力者へ送付してデータを収集することとした。各々の文化的背景により健康・病気の概念やヘルスケア・システムの違いが大きく(そのためにこそ、このような研究に意義があると思われるのだが)、それらを検討しながらの翻訳版の作成には時間を要した。さらに各々の国情や調査時期の問題があり、国際比較分のデータは現在収集の途中である。日本の大学生及びその親の世代の中年男女については既に調査済みであるが、HLCによる帰属傾向と生命倫理への態度とが、統計的にも有意に関連することが示された。たとえば、内的帰属の高い者はインフォームド・コンセントや自身への病名告知に賛成し、また自身の延命治療を拒否し脳死判定に賛成する一方、臓器のドナーとなることや献体には否定的であり、主体的で自己完結的な死を選択するなど、興味深い知見が得られている。今後さらに国外のデータをあわせた解析を行い、本年8月の国際心理学会への発表と論文作成を予定している。
がん支持療法創出を目指した可視化・数値化可能な光る耳下腺培養細胞系の構築

がん治療で問題となる唾液分泌障害は予防が第一であり、支持療法として唾液腺防護剤をがん治療時に同時に使用することが効果的である。唾液腺防護剤の開発には、唾液腺の機能を可視化・数値化できる唾液腺培養系と薬効の検証のために動物モデルが必須となる。本研究では、申請者らが作製した“蛍光耳下腺マウス"を利用して、長期培養で唾液分泌能が低下するというこれまでの問題点を克服し、唾液腺の機能を可視化・数値化できる光る耳下腺培養系を構築する。また、蛍光耳下腺マウス個体を放射線、化学療法剤暴露の動物モデルとして確立することで、既知の抗酸化剤の唾液腺防護効果を判定する。
流体力学にあらわれる対称双曲系の特性的境界値問題

静田は線型対称双曲系に対する特性的境界値問題の解が時間について強連続であることを示す際に用いる論法を整理し従来のものと比べて新らしい見通しのよい証明を得た.結果は平成8年7月アテネで開かれた第2回非線型解析国際会議で発表した.坂本は半空間におけるTricomi型方程式の境界値問題を研究し幾つかの結果を得た.宮武は2次元空間でのNavier-Stokes方程式の定常問題に関するKolmogarovの問題を考察し解の分岐を具体的な方法で示すことによって分岐曲線が分岐点において凸であることを証明した.この結果は平成9月3月リスボンで開かれた応用解析に関する国際会議で発表された.藪田は特異積分作用素について研究を行った.篠田はパーコレーションに関する新らしい結果を得て、平成8年9月に奈良女子大学数学教室で行われた非線PDE研究集会で発表した.柳沢は平成8年10月から文部省在外研究員としてヨーロッパに滞在し、特性根の多重度が一定でない場合の対称双曲系に関する結果についてイタリー及びドイツの大学に招かれて講演を行った.静田は線型対称双曲系に対する特性的境界値問題の解が時間について強連続であることを示す際に用いる論法を整理し従来のものと比べて新らしい見通しのよい証明を得た.結果は平成8年7月アテネで開かれた第2回非線型解析国際会議で発表した.坂本は半空間におけるTricomi型方程式の境界値問題を研究し幾つかの結果を得た.宮武は2次元空間でのNavier-Stokes方程式の定常問題に関するKolmogarovの問題を考察し解の分岐を具体的な方法で示すことによって分岐曲線が分岐点において凸であることを証明した.この結果は平成9月3月リスボンで開かれた応用解析に関する国際会議で発表された.藪田は特異積分作用素について研究を行った.篠田はパーコレーションに関する新らしい結果を得て、平成8年9月に奈良女子大学数学教室で行われた非線PDE研究集会で発表した.柳沢は平成8年10月から文部省在外研究員としてヨーロッパに滞在し、特性根の多重度が一定でない場合の対称双曲系に関する結果についてイタリー及びドイツの大学に招かれて講演を行った.
がん悪性度診断ための新規PET用チミジンホスホリラーゼＦ18イメージング剤の開発

1)TP阻害化合物を基本骨格とした非放射性フッ素化阻害化合物の合成:F-18の半減期(約110分)が比較的短時間であり、その標識体の合成は簡便且つ短時間での反応を用いることでなくてはならないことを考慮し、標識体の合成にあたり標識剤との反応性に優れた前駆体を合成することを目的としている。検討された数多く候補化合物の中から、FIMU骨格構造の化合物の構築を成功した。FIMUの合成に関して、合計8つの合成ルートを検討した結果、下図に示しているルートを確立することができた。市販品から八段階を経た効率的な短い合成ルートであった。この化合物FIMUは、TP阻害作用の測定の際の標品として用いるのみでなく、放射性核種で標識する際の手法の確認、迅速な反応が行える条件等の基礎検討としても参考物質として用いる予定である。2)合成した非標識標品化合物FIMUのTP阻害活性の測定:TPに対する酵素阻害活性の測定を行う。方法は、チミジンからチミンへと変換する反応を利用し、このときのTP活性により生成されるチミンをHPLCで定量し、IC50を算出した。結果として、FIMUのIC50は2.2 nMであり、IIMUの二倍ぐらい強かったことが分かった。すなわち、このコールドFIMUのTP阻害活性はIIMUと同程度を示した。3)FIMUの放射性F-18標識プローブの合成検討:1)の合成ルートを沿い、18F標識体への構築を検討している。鍵中間体2BOMで保護されたアルコール体から、放射性18Fを導入する計画であったが、今現在、18F-DASTという標識剤が市販されてなく、入手困難である。その理由は試薬の調製は極めて難しいであることにあると考えられる。今現在、新規な放射性F-18ラベル法を有機化学反応メカニズムに基づいて開発している最中である。
ヒトのループス腎炎惹起性抗DNA自己抗体の分子生物学的アプローチによる性状解析

全身性自己免疫疾患の原型である全身性エリテマトーデス(SLE)は多彩な症状を示すが、なかでも腎障害は生命予後に関わる警戒すべき病型である。本研究ではまず、ヒトループス腎炎の発症に陽性荷電抗DNA抗体が密接に関わっていることを明らかにした。すなわち、1.ループス腎炎患者では陽性荷電抗DNA抗体を認めたが、腎炎を欠くSLE患者では陽性荷電抗DNA抗体を認めない。2.同一症例の検索でもループス腎炎発症時には陽性荷電抗DNA抗体を認めたが、治療によって症状が軽快すると陽性荷電抗DNA抗体は消失した、3.ループス腎炎患者の陽性荷電抗DNA抗体は中性抗DNA抗体よりも腎糸球体基底膜を構成するヘパラン硫酸に明らかに強く結合した。これらの成績はヒトSLEでも陽性荷電抗DNA抗体がループス腎炎の病態形成に関連することを支持している。次にループス腎炎患者の陽性荷電抗DNA抗体の遺伝子解析を行った。その結果、ループス腎炎患者由来の陽性荷電抗DNA抗体軽鎖遺伝子(cDNA)には抗原結合部位である相補決定部(CDR)領域に複数の突然変異が生じており、またCDR3領域にはDNAに結合するアミノ酸を多数含んでいた。この成績は病原性自己抗体の産生には抗原特異的な刺激が重要であることを示唆している。またSLE患者の陽性荷電抗DNA抗体の軽鎖遺伝子mRNAは抗DNA抗体産生B細胞でもっぱら使用されていた。さらに患者女子中球DNAより単離した陽性荷電抗DNA抗体に対応する新しい胚細胞型遺伝子産物の計算上の等電点はきわめて高く、自己抗体の病原性はヒトSLEでは胚細胞型Ig遺伝子の選択によって規定されていることがわかった。さらにこの胚細胞型遺伝子はSLE患者に特異性が高く、今後のSLEの遺伝子診断、遺伝子治療に寄与するものと考える。全身性エリテマトーデス(SLE)の腎障害は生命予後に関わる警戒すべき症状で慎重な臨床的対応を必要とする。本年度は、陽性荷電抗DNA抗体が腎炎惹起性であるとするループスマウスにおける仮説がヒトSLEでも成立するか否かを検討した。腎炎を持つSLE患者と腎炎症状を欠く患者血清より抗DNA抗体を回収し、等電点電気泳動でその荷電状態を解析した。その結果、腎炎患者では陽性に強く荷電した抗DNA抗体を認めたが、腎炎を欠く患者ではかかる抗DNA抗体は存在しなかった。また同一症例で追跡しても、腎炎の活動期には陽性荷電IgG型抗DNA抗体の出現を認めたが、寛解期には消失していた。つぎにループス腎炎患者より抗DNA抗体を回収し、陽性荷電抗DNA抗体と中性のものとに分画後、腎糸球体の主要なプロテオグリカン、ヘパラン硫酸との結合性をELISA法で検討した。陽性荷電の抗DNA抗体は中性のものに比べ、明らかにヘパラン硫酸に強く結合した。これらの成績は陽性荷電抗DNA抗体がSLE患者の腎病変を惹起するという我々の作業仮説を良く支持している。SLE患者の腎炎惹起性抗DNA抗体の免疫グロブリン遺伝子cDNAの解析を行ない、さらにそのcDNAに対応する胚細胞型の免疫グロブリン遺伝子を単離した。その結果明らかになったことは、ヒトループス腎炎惹起性抗DNA抗体は、そもそも陽性に荷電した胚細胞型の免疫グロブリン遺伝子を選択的に使用しており、さらにこれに複数の突然変異が生じていたことである。このことは、ループス腎炎の発症に関与する陽性荷電抗DNAの産生機序には、ポリクローナルなB細胞活性化よりは、むしろ交差反応性を含めて抗原特異的なB細胞の刺激が重要であることを示唆している。

全身性自己免疫疾患の原型的なものとして把握されている全身性エリテマトーデス(SLE)は多彩な症状を示すが、なかでも腎障害は生命予後に関わる警戒すべき病型で慎重な臨床的対応が必要である。昨年度の研究実績として、ヒトSLEでもループスマウスと同じように、陽性荷電抗DNA抗体がループス腎炎の惹起に密接に関連していることが明らかになった。本年度はループス腎炎患者の陽性荷電抗DNA抗体の遺伝子解析を行った。患者Bリンパ球メッセンジャーRNA(mRNA)から陽性荷電抗DNA抗体cDNAを単離し、さらに患者好中球のgenomic DNAよりより、陽性荷電抗DNA抗体遺伝子に対応する新しい胚細胞型Igkappa遺伝子を同定した。ループス腎炎患者由来の陽性荷電抗DNA抗体の軽鎖遺伝子には抗原結合部位である相補決定部(CDR)領域に複数の突然変異が認められ、特にCDR3領域にはDNAに結合するアミノ酸が多数含まれていた。この成績は病原性自己抗体の産生に抗原特異的な刺激が重要であることを示唆している。SLE患者の陽性荷電抗DNA抗体の軽鎖mRNAはds-DNAに結合するB細胞に優先的に発現しており、一般の外来性抗原に反応するB細胞では使用されていなかった。患者好中球DNAより単離した陽性荷電抗DNA抗体に対応する胚細胞型遺伝子産物の計算上の等電位はきわめて高く、ヒトSLEでは自己抗体の病原性は胚細胞型遺伝子の選択により規定されていることが示唆された。SLE患者と正常者でこの胚細胞型Ig遺伝子の存在をPCR-SSCP法を用いて検討したところ、この胚細胞型遺伝子は患者に特異性の高いものであることが判明した。本研究で示した成績は、SLEの遺伝子診断、遺伝子治療が可能であることを示唆している。
ヒト消化器癌において化学療法感受性を規定する遺伝子学的諸因子の同定

本年度は主に、5-FUの感受性を規定する諸因子について解析を行なった。具体的には5-FUによるDNA障害に対する細胞応答が、p53やミスマッチ修復能とどのように関連しているのかを、複数の癌及び正常線維芽細胞株を用いて詳細に検討した。その結果、p53は細胞周期の変化には大きく関与しているものの、5-FU感受性を直接規定するものではないことが明らかになった(投稿中)。また、5-FUの標的酵素であるチミジル酸合成酵素が同様に抑制されている状態では、ミスマッチ修復異常細胞は正常細胞に比較して5-FU感受性が低く、ミスマッチ修復が5-FU感受性規定因子として関与している可能性が示唆された(投稿中)。さらにミスマッチ修復遺伝子MSH2のノックアウトマウス由来の胚線維芽細胞株と正常細胞を用いて5-FU感受性を比較した結果、正常細胞の方がMSH2遺伝子欠損細胞よりも5-FU感受性が高いことが明らかになった。今後、他のミスマッチ修復遺伝子欠損細胞を用いて同様の検討を行なうとともに、これらの遺伝子欠損株に遺伝子導入し、ミスマッチ修復能を回復させた場合の5-FU感受性についても検討する予定である。なお、マイクロサテライト不安定性解析によりミスマッチ修復能を正確にこれを評価する方法を確立してきたが、既に800例以上の症例に関して解析を終了した。特に、胃癌、大腸癌、食道癌では多数の陽性症例を同定するに至っている。これらの症例ではp53遺伝子変異の有無も確認しており、将来的にはp53やミスマッチ修復能と化学療法の奏功度との関連を議論できるものと考える。このように、DNA修復能を正確に評価する基本解析系の開発を軸とし、これを用いた細胞株、臨床検体両者の解析を両輪として研究を進めている。今後はDNA修復遺伝子以外の因子にも注目し、抗癌剤感受性を規定する遺伝子学的諸因子の同定に向けて研究を進めていきたい。
ヒト大腸癌の発生と進展に関する細胞生物学的研究

1)分子生物学的研究5q染色体上にある大腸腺腫の原因遺伝子を明らかにすべく、その近傍より40個のコスミドクロ-ンを単離し、そのマッピングをおこなった。その一つ(TBA遺伝子と命名)は大腸がんで高頻度に欠失が認められ、大腸がんの発生に深く関わっている重要な遺伝子である可能性が強く示唆された。また、17pに存在するがん抑制遺伝子の産物であるP53の発現を免疫組織学的に検討し、大腸がん組織84例のうち51例(60.7%)において核に局在するP53を検出した。いづれの症例においても隣接する正常粘膜にP53は全く検出されず、この遺伝子の機能異常が大腸がんの発生に深く関与しているものと推定された。細胞外マトリックス分子と接着する細胞側受容体であるインテグリンのα2、α6、β1、β4各サブユニットに対するモノクロ-ナル抗体を作製し、大腸がんにおけるインテグリン発現の変化を調べた。α2β1インテグリンは大腸がんの94%(32/34例)において過剰発現し、その抗体は大腸がん細胞のコラ-ゲンへの接着を阻止した。またα6β4インテグリンの過剰発現は33%(12/36例)に認められ、その受容体はラミニンである可能性が示唆された。2)臨床病理学的研究DNA ploidyの側面から大腸がんの進展を考えるため、粘膜病変の残っているmpmがん24例についてploidy構成のマッピングをおこなった。また、最近注目されているflat adenoma 39病変についてDNA測定をし、組織異型度との関連を調べた。軽度異型では全例がdiploid、高度異型では全例がaneuploidであったが、中等度異型では病巣の大きさによってaneuploidyの頻度が異なり、5mm以下では14.3%と低く、5mm以上では80%と高率であった。