hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リン脂質代謝と脂質メディエーターの総合的研究

産生が、Th1及びTh17型免疫応答を調節して、多発性硬化症の病態を増悪させていることを明らかにした。多発性硬化症の病変部ではmPGES-1を発現しているマクロファージから、大量にPGE2が産生されて免疫応答を調節し、結果として症状を増悪させていることが示唆された。3.骨密度および骨形態計測学的パラメターの測定により、ロイコトリエンB_4(LTB_4)第一受容体(BLT1)ノックアウトマウスでは、卵巣摘除およびLPS投与による骨吸収が顕著に抑制されていることを見出した。破骨細胞ではLTB_4が産生され、BLT1は発現していたがBLT2は発現していなかった。また、BLT1ノックアウトマウス由来破骨細胞のカルシウム吸収能は、野生型マウス由来破骨細胞に比較し減少していた。破骨細胞の形態変化と破骨細胞活性には密接な関係があることを考慮すると、LTB_4は、パラクライン・オートクライン的に作用して破骨細胞活性を増加することが示唆された。4.GPCRの膜貫通領域(TM)内にはGPCR間で保存されたアミノ酸残基が幾つか存在するが、これら残基に変異を有するPAF受容体(PAFR)は小胞体内貯留すること、そして、特異的リガンドを薬理学的シャペロンとして作用させることでこの貯留PAFRが細胞膜へと移送されることを明らかにした。ところで、作製した変異体の内、TM6内のPro^<247>変異PAFRは膜表面に移行させたものをアゴニスト刺激した場合、その後の細胞内移送過程にも異常を有することがわかった。LPAAT3の高度不飽和脂肪酸供給としての役割:我々は新規にリゾホスファチジン酸(PA)アシル基転移酵素3(LPAAT3)を同定した。LPAAT3はAGPATファミリーに属するが、明確な機能はわかっていなかった。詳細にアシル基転移酵素活性を調べると、LPAAT3は20:4-CoAをドナーとしたLPAAT活性と、リゾホスファチジルイノシトール(PI)アシル基転移(LPIAT)活性を持っていた。LPAAT活性はケネディー経路で働く活性であり、LPIAT活性はランズ回路で活躍する活性である。LPAAT3は一つの酵素でありながら2種類の経路で働いていることになる。さらに、PAはPIの前駆体でもあるため、sn-2位にアラキドン酸を持つPIを効率よく合成できることになる。2)マウス発生期血管・リンパ管形成におけるLPA4の機能解析:リゾホスファチジン酸(LPA)は様々な生理活性を有する生理活性脂質であり、これまでに6種類の特異的G蛋白質共役型受容体(LPA16)が同定されている。我々は、LPA4欠損マウスを作製し、LPPA4の生体内における機能解析を行った。欠損雄マウスと交配した妊娠欠損雌マウスを開腹して観察すると、着床は正常だったが、その後の妊娠期の様々な時点で皮下出血・浮腫等の異常が一部の胎仔に認められた。致死となる胎仔も存在し、胎生18.5日(E18.5)での正常仔マウス数は、野生型マウスどうしを交配した時の約半分であった。E18.5における欠損マウスの内臓観察では、心嚢出血、胸腺出血等が観察されたことから、異常出血が胎生致死の一因と考えられた。
神経軸索終末に輸送されるmRNAのクローニング〜軸索形成に関与する因子の解析〜

本研究は、胎生期のラット脳において神経細胞の軸索内を輸送されるmRNAの存在を証明することと、それらの配列、構造、機能の検討により、軸索の形成・成熟をもたらす因子、特に未知因子について明らかにすることを目的としている。さらにそれらが神経回路網形成を促進させ得るかどうかを調べ、痴呆に代表される成熟脳の神経機能低下に対し、その回復への応用をはかる。昨年度は、軸索終末サンプルとして成長円錐画分を生化学的方法により分離し、その中のtotal RNAを材料にして任意配列プライマーの組み合わせによるRT-PCRクローニングを行なったが、軸索終末サンプルの純度を高める必要性が示唆された。そこで本年度は初代培養したラット大脳皮質神経細胞の1個から、軸索終末部をマイクロピペットで吸引し、total RNAを抽出し、あらゆる配列のmRNAをクローニングできるprimerを用いたrandom PCR-based cDNA cloning法を組み合わせ、軸索終末に発現するmRNAを網羅的に同定する方法を考案し実行した。(=Single Axonal Teminal-Randomcloning)。10個の軸索終末から、軸索に発現するmRNAの候補として12クローンを単離した。それらが軸索に局在することを、in situ hybridizationと、軸索マーカーであるリン酸化型neurofilament-Hに対する免疫染色を組み合わせ検討し、9個のmRNAを同定した。これらはいずれも未知配列でありAxomer-1-9(Axonal messenger RNA)と命名した(Gene Bank accession No. ABO97851-ABO97859)。この結果により、これまで軸索内mRNAとして報告されている3つの細胞骨格タンパク質以外にも、軸索終末に局在して何らかの機能を果たすmRNAが、ラットの大脳皮質神経細胞において少なからず存在することを示すことができた。現在、同定されたAxomers mRNAに関して、全長配列のクローニングを進行中である。今後は、(1)コルヒチン処理によるAxomers mRNAの軸索局在の変化の検討、(2)軸索輸送に関わるmRNA自己配列内の特定、(3)輸送に関わる自己内配列に対するantisense oligomerを神経細胞に処理することによる、軸索輸送されるmRNAの機能と意義の解明、に関してさらに実験を重ね、本研究の目的を遂行する。今年度は、シナプス形成前の軸索終末、すなわち成長円錐画分を生化学的方法で分離し、その中のtotal RNAを材料に任意配列プライマーの組み合わせによるRT-PCRクローニングを行い、軸索終末に局在するmRNAを同定することを主目的とした。1.胎生18日齢のラット脳をホモジェナイズし、ショ糖密度勾配超遠心法により成長円錐画分を得た。2.成長円錐画分からtotal RNAを抽出し、4種類のアンカープライマーを用い逆転写酵素により一本鎖cDNAを合成した。次にそれらを鋳型にして、アンカープライマーと15種類の10-merプライマーの組み合わせで60通りのPCR反応を、ゆるい条件で行なった。その結果、成長円錐total RNA中に発現するmRNAの候補として既知配列4種、未知配列11種を得た。3.候補mRNAの軸索終末部での発現を確認する実験を行った。胎生17日齢のラットから大脳皮質神経細胞を初代培養し、培養4-7日後に、微小ガラス管を使って、1個の神経細胞から軸索終末部だけを吸引した。そこからtotal RNAを調製し、候補mRNAの発現をRT-PCRで検討した。未知配列のうち、6配列が軸索終末部にmRNAとして発現していることが示された。残りの未知配列5種と既知配列4種は、軸索終末部での発現が見られなかった。現在は、軸索での発現が示された6配列に付いて、それらの全長配列を解析している。同定された個々のmRNAに関して、軸索内輸送現象の証明や、軸索での機能を解析することが来年度の課題である。

それらが軸索に局在することを、in situ hybridizationと、軸索マーカーであるリン酸化型neurofilament-Hに対する免疫染色を組み合わせ検討し、9個のmRNAを同定した。これらはいずれも未知配列でありAxomer-1-9(Axonal messenger RNA)と命名した(Gene Bank accession No. ABO97851-ABO97859)。この結果により、これまで軸索内mRNAとして報告されている3つの細胞骨格タンパク質以外にも、軸索終末に局在して何らかの機能を果たすmRNAが、ラットの大脳皮質神経細胞において少なからず存在することを示すことができた。現在、同定されたAxomers mRNAに関して、全長配列のクローニングを進行中である。今後は、(1)コルヒチン処理によるAxomers mRNAの軸索局在の変化の検討、(2)軸索輸送に関わるmRNA自己配列内の特定、(3)輸送に関わる自己内配列に対するantisense oligomerを神経細胞に処理することによる、軸索輸送されるmRNAの機能と意義の解明、に関してさらに実験を重ね、本研究の目的を遂行する。
挿入配列の土壌環境での動態の解明と新規遺伝子獲得への応用

環境細菌は、変動しやすい様々な環境に適応し生存するために、複雑な遺伝子発現調節機構に加えて、水平伝播による遺伝子の外部からの獲得やゲノム構造の再編成など、よりダイナミックな遺伝子構造の変化を伴う環境適応機構を有していると考えられる。本研究では、難分解性環境汚染物質分解酵素遺伝子の周辺領域に高頻度で検出される可動性のISに注目することにより、(1)これらISの自然環境での分布と動態の把握、(2)自然環境での機能的遺伝子カセット創出のメカニズムの解明、(3) ISを利用した新規遺伝子取得方法の確立を達成目標とする。前年度までに、有機塩素系農薬gamma-HCH汚染土壌から直接抽出したDNAを鋳型とし、PCRで増幅した2コピーのIS6100で挟まれた領域に高頻度でgamma-HCH分解に関与するlin遺伝子群が存在することを明らかにし、その成果を国際学術誌に発表した。さらに、(i)IS6100は、gamma-HCH汚染土壌由来DNAからはPCRで検出されるが、各種非汚染土壌からは検出されないこと、(ii) PCRでIS6100が検出されない非汚染土壌をgamma-HCHで人工的に汚染させた場合に、IS6100が検出されるようになること、(iii)同非汚染土壌を各種芳香族化合物で人工的に汚染させた場合には、IS6100が検出されるようにはならないこと、を確認し、土壌環境微生物中で、gamma-HCH汚染特異的にIS6100の増幅が認められることを明らかにした。また、(i)汚染化土壌中で、2コピーのIS6100で挟まれた領域の塩基配列が汚染化後の日数によって変化し、IS6100が汚染化により動的挙動を示していること、(ii)汚染化土壌には既知のlin遺伝子群を有さない微弱なgamma-HCH分解菌が出現しているらしいこと、が明らかとなった。本研究では、難分解性環境汚染物質分解酵素遺伝子の周辺領域に高頻度で検出される可動性のISに注目することにより、(1)これらISの自然環境での分布と動態の把握、(2)自然環境での機能的遺伝子カセット創出のメカニズムの解明、(3)ISを利用した新規遺伝子取得方法の確立を達成目標とする。本年度は、まず、有機塩素系農薬gamma-HCH汚染土壌から直接抽出したDNAを鋳型とし、PCRで増幅した2コピーのIS6100で挟まれた領域に高頻度でgamma-HCH分解に関与するlin遺伝子群が存在することを確認し、その成果を国際学術誌に投稿、受理された。本手法は、新規かつ簡便な培養非依存的機能遺伝子取得法として高く評価された。さらに、PCRでIS6100が検出されない非汚染土壌をgamma-HCHで人工的に汚染させたところ、IS6100が検出されるようになることを明らかにした。同土壌を芳香族化合物で人工的に汚染させた場合には、IS6100が検出されるようにはならず、土壌中でのIS6100の増幅は、gamma-HCH汚染特異的であることが示された。さらに、2コピーのIS6100で挟まれた領域の塩基配列を決定したところ、(i)汚染後の日数によって最も多量に存在する同領域の塩基配列が全く異なること、(ii)既知のlin遺伝子は同領域に見出されないこと、が明らかになった。また、汚染土壌は微弱なgamma-HCH分解活性を示したが、既知のlin遺伝子群は検出されず、新規遺伝子の存在が示唆された。
YBCO系超伝導体薄膜の光応答

YBa_2Cu_3O_<7-x>薄膜の臨界点近傍での光応答を調べた.超伝導体を臨界点付近に置き光を照射すると抵抗が生じる.その機構には,熱による温度上昇効果(ボロメトリック効果)とそれ以外の効果(ノンボロメトリック効果)があり,ノンボロメトリック効果には,光子がク-パ-対を直接破壊する機構や,トラップされた磁束が光によって移動し電圧が生じるフラックスクリープの機構などがある.しかし,実際どの機構が支配的なのかはよく分かっていない.ノンボロメトリック機構においては,高速かつ可視光から遠赤外光におよぶ広い波長領域での応答が期待され,これによって高速・広帯域な光検出素子ができる可能性がある.そこでまず応答速度を調べた.振幅変調された半導体レーザ光(波長830nm)を超伝導体のブリッジ(幅25mu,長さ400mu,厚さ100nm)に照射して,4端子法により得た応答信号をプリアンプで増幅しダブルバランストミキサ(DBM)を用いて中間周波におとしてロックインアンプで検出した.その結果,最高100MHzまでの応答が確認できた.しかしそれ以上の応答はプリアンプの性能および測定回路のインピーダンス整合の問題によって測定することができなかった.次に応答がボロメトリックかノンボロメトリックかを判定した.そのためには信号の温度依存性を詳細に調べる必要があり,その結果,100KHzまではボロメトリック応答が支配的であるが,1MHzあたりでクロスオーバーして,10MHz以上ではノンボロメトリックな機構が支配的であることがわかった.最後にノンボロメトリック機構の解明のために,電流-電圧測定における非線形性を測定した.その結果,信号と非線形性は強く関連していることがわかった.しかし,これは研究途中であり,どの機構が支配的かの確証は得られていない.YBa_2Cu_3O_<7-x>薄膜の臨界点近傍での光応答を調べた.超伝導体を臨界点付近に置き光を照射すると抵抗が生じる.その機構には,熱による温度上昇効果(ボロメトリック効果)とそれ以外の効果(ノンボロメトリック効果)があり,ノンボロメトリック効果には,光子がク-パ-対を直接破壊する機構や,トラップされた磁束が光によって移動し電圧が生じるフラックスクリープの機構などがある.しかし,実際どの機構が支配的なのかはよく分かっていない.ノンボロメトリック機構においては,高速かつ可視光から遠赤外光におよぶ広い波長領域での応答が期待され,これによって高速・広帯域な光検出素子ができる可能性がある.そこでまず応答速度を調べた.振幅変調された半導体レーザ光(波長830nm)を超伝導体のブリッジ(幅25mu,長さ400mu,厚さ100nm)に照射して,4端子法により得た応答信号をプリアンプで増幅しダブルバランストミキサ(DBM)を用いて中間周波におとしてロックインアンプで検出した.その結果,最高100MHzまでの応答が確認できた.しかしそれ以上の応答はプリアンプの性能および測定回路のインピーダンス整合の問題によって測定することができなかった.次に応答がボロメトリックかノンボロメトリックかを判定した.そのためには信号の温度依存性を詳細に調べる必要があり,その結果,100KHzまではボロメトリック応答が支配的であるが,1MHzあたりでクロスオーバーして,10MHz以上ではノンボロメトリックな機構が支配的であることがわかった.最後にノンボロメトリック機構の解明のために,電流-電圧測定における非線形性を測定した.その結果,信号と非線形性は強く関連していることがわかった.しかし,これは研究途中であり,どの機構が支配的かの確証は得られていない.
札幌市の過去20年間におけるRSウイルス野生株の遺伝子変異に関する研究

札幌市の過去20年間にわたるRSウイルス感染症の分子疫学を、RSウイルスの中で非常に変異に富むとされる、large glycoprotein(G)遺伝子における変異を解析することにより明らかにした。方法としては、PCF-RFLP法や、直接シークエンス法を用いた。サブグループA株流行においては、個々のシーズンの流行株には優位流行株があること、そしてそれが23年毎に他の株に交替していく現象を本邦において初めて明らかにした。更に欧米の野外株を加えた検討で、サブグループA株の流行には地域集積性よりも、時間集積性のあることを示した。これらの現象は、欧米や韓国における研究においても明らかとなってきているが、RSウイルスの強い伝播力と集団の密度、そしてRSウイルスの免疫原性や集団免疫の蓄積など様々な要因が関連し合って生み出している現象と考えられる。RSウイルスサブグループB株の分子疫学の解析では、A株にみられたような世界的な時間集積性を明らかにすることはできなかった。この現象は伝染力、伝播のスピードがA株に比べ劣ることを示唆するものと考えられる。一方、19801986年に渡る6シーズンの分離株においては、遺伝子進化を思わせる直線的な変異を初めて明らかにしたが、これは同一地区で流行を繰り返していく際に、herd immunityをすり抜けるためのウイルス側の戦術と考えられる。RSウイルスの分子疫学の特徴として、いくつか株が同時に存在し、それぞれが進化を遂げていくことがあげられるが、これはインフルエンザB型の変異の様子と似ているといえる。過去20年間に渡って札幌市において分離された200株余りのRSウイルス野外株をHEp-2細胞を用いて再分離した。細胞よりRNAを分離し、cDNAを作成した。RSウイルスのG遺伝子のほぼ全域をカバーするプライマーによりG遺伝子を増幅し、その産物を数種類の制限酵素を用いて切断、その切断パターンにより遺伝子型を決定した。これにより、サブグループA125株を分析したところ、10種類の異なった遺伝子型に分けることができた。各シーズン毎に優位な流行を示した遺伝子型を特定することができたが、優位な流行株は1-3シーズン続いた後に他の遺伝子型の株に交替していく現象が認められた。連続した15シーズン中6種類の優位な株が特定できた。サプグループA株流行においては、個々のシーズンの流行株には優位流行株があること、そしてそれが23年毎に他の株に交替していく現象を本邦において初めて明らかにした。
持続可能な環境資源利用システムに関する研究-インドシナ半島を対象として-

本研究は、大規模な森林伐採や過度の焼畑によって森林の質の低下が著しいラオス北部地域を対象に、農村の社会経済的な状況を把握すると共に、焼畑を営む農民の森林利用の実態を明らかにすることを目的としている。本研究はラオス北部ルアンパバン県を対象とし、以下の4つの研究調査から構成されている。1.30ケ村600世帯を対象としたヒアリングおよびアンケート焼畑農民の生活実態が詳細に明らかとなるとともに、焼畑農村においても、徐々に貨幣経済が浸透し、換金作物や特用林産物の栽培・収穫が盛んとなり、農民の生計向上に役立ってきていることが明らかとなった。2.食材を指標とした森林依存度調査コメが不足し森林への依存が強い村落、森林への依存は強いがコメはかなり自給できている村落、コメが自給でき林への依存もさほど強くない村落、の3つのタイプがあることが明らかとなった。3.民族間の森林認識の差異に関する調査中地ラオ族(カム族)、高地ラオ族(モン族)ともに、焼畑サイクルを中心とした森林認識が行われていることがあきらかとなった。4.土地利用政策に関する調査土地利用の分配プロジェクトが、土地の効率的な利用を農民に促す効果が認められる一方、村落内での貧富の差の拡大、共同的な森林保全や管理のしくみが弱まる可能性が指摘できた。今後、森林再生の経済的・生活環境的な意義についての認識を村落内で共有することが重要であることが明らかとなった。3ケ年の研究の初年度にあたる2001年度は、以下のような研究を行った。(1)既存研究のサーベイインドシナ半島、とりわけラオスおよびタイにおける焼畑問題、森林の保全と利用、生活改善などに関する既往の文献や調査等のサーベイランスを行った。(2)ラオスにおける調査実施のための調整と事前調査ラオス北部のルアンナムタ県、中北部ルアンパバン県、南部サヴァナケット県において、土地利用、焼畑農民の生活実態、焼畑に関わる規制、土地・森林分配事業などに関する事前調査(9月の雨期および1月の乾期)を行った。ルアンナムタ県においては、ケシ栽培からの転換を軸とした食糧保証プログラムと、焼畑安定化政策とのリンケージの必要性が明らかとなった。ルアンパバン県においては、土地・森林分配事業の結果配分された土地の利用方法に関する実態調査を開始し、あわせて近年の低地への移住政策と焼畑安定化との関連性を検討した。南部サヴァナケット県については、コーヒー等の換金作物と森林との土地利用上のコンフリクト発生の可能性があきらかとなり、総合的な土地利用政策の必要性が浮き彫りとなった。(3)ルアンパバン県における焼畑農民の森林依存度に関する調査ルアンパバン県シングン郡の数ケ村を選び、食材、資源採取などの視点からみた焼畑農民の森林への依存度を調査し、村落により、いくつかのパターン分ができることがあきらかとなった。また土地・森林分配事業に基づいて分配された森林の、村落による管理と利用の実態に関するヒヤリング調査を行い、森林法等に基づく法的な規制と、実際の村落レベルでの規則にかなりの差異があることがあきらかとなった。3ケ年の研究の2年度目にあたる2002年度は、以下のような研究を行った。(1)既存研究のサーベイ(継続)ラオスおよびタイにおける焼畑問題、森林資源の保全と利用などに関する既往の研究や関連する統計・調査等のサーベイランスを行った。(2)ラオス中北部ルアンパバン県シングン郡における農村金融の実態調査ラオス北部中北部ルアンパバン県シングン郡において、焼畑農民の生活安定化と現金収入、小規模産業おこしを目的として始められた農村貯蓄組合(オムサップ)の実態を、4ケ村について聞き取り調査を行った。

その結果、2つの村においては、開始後数年間で、換金作物の植え付けや家畜の購入などに積極的に利用され、資金規模、貸し出し実績ともに急激に成長しており、焼畑への過度の依存を低減していくうえで大きな効果があることが明らかとなった。同時に他の2村では、村人の信頼を獲得できずに、貯蓄の引き出しなどによって規模が縮小していた。この違いは、資金と貸し出しの管理体制が大きく関わっていることがあきらかとにった。(3)同ルアンパバン県ナムバック郡における焼畑農民の実態調査ルアンパバン県ナムバック郡のラオ・ルム、カムー、モン族の6ケ村を選び、かれらの伝統的な森林区分、特用林産物の採取と利用の実態社会経済状況などについて、ヒヤリング調査を行った。その結果、民族ごとの伝統的な森林区分や、特用林産物の採取と販売の実態があきらかとなった。(4)同ナムバック郡における森林利用と経済状況に関するアンケート調査の準備同地域において、約600世帯を対象とした実態調査を行うため、研究協力者であるルアンパバン県農林局との打ち合わせを行い、調査票の確定作業を行った。調査は2003年5月に実施予定である。(5)これらの成果を解析し、複数の論文を作成中である。3ケ年の研究の3年度目にあたる2003年度は、以下のような研究を行った。(1)既存研究のサーベイ(継続)ラオスおよびタイにおける焼畑問題、森林資源の保全と利用などに関する既往の研究や関連する統計・調査等のサーベイランスを行った。(2)ラオス中北部ルアンパバン県シングン郡における農村金融の実態調査(継続)昨年度に引き続き、ラオス北部中北部ルアンパバン県シングン郡において、焼畑農民の生活安定化と現金収入、換金作物の導入などを目的とした農村貯蓄信用組合(オムサップ)の実態についての調査を行った。その結果、資金規模、貸し出し実績がともに成長を続け、換金作物の植え付け、家畜の飼育などに有効に利用され、結果として焼畑への過度の依存を低減していくうえで大きな効果があることが明らかとなった。また同時に、事業規模の拡大に伴って、村外からの預け入れや、村外者への貸付なとが行われるようになり、村落単位での協同的な活動から、ある地域をカバーする金融活動へと発展(変質)しつつある状況が明らかとなった。(3)同ルアンパバン県ナムバック郡・ンゴイ郡における森林利用と社会経済状況に関する調査の実施同地域において、20ケ村を対象として実態調査(アンケートおよびヒアリング)を行った。調査は、村落委員会のメンバーを対象とした村落調査と、各村内の10世帯を対象とした世帯調査である。主な調査項目は、家族構成・水田焼畑等の営農実態主要な換金作物の作付け状況と投下労働力等である。その後、調査票のチェックおよび補足的なヒアリングなどを行った。村落結果から、村落全体の営農状況、貨幣経済の浸透状況、持続可能な経済発展のための課題を解析し、世帯調査からは、換金作物の作付け実態、投下労働力と生産物の売却による現金収入から見た生産性などを解析し、焼畑に代替しうる営農形態や米の確保手段について解析を行っている。(5)これらの成果を解析し、複数の論文および最終報告書を作成中である。
バイオナノカプセルを用いたHBV感染機構の解明

ヒトB型肝炎ウイルスの表面抗原(HBsAg)Lタンパク質を出芽酵母に発現させて作成した中空ナノカプセル(バイオナノカプセル:BNC)をHBVのモデルウイルスとして用い、HBVの感染機構の中で解明が遅れている膜融合機構をin vitroで詳細に解析した。その結果、HBsAg Lタンパク質のN末領域に新規膜融合モチーフを同定し、連続するフェニルアラニン残基が膜癒合活性の必須アミノ酸残基であることを明らかにした。本年度は、ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)のヒト肝臓特異的な感染機構を明らかにするため、酵母由来HBV表面抗原L粒子(バイオナノカプセル:BNC)をHBVのモデルウイルス粒子として用い、以下の実験を行なった。1) BNCを含む膜コンパートメントの同定とプロテオーム解析、2) BNCの膜透過ペプチドの同定。1)に関しては、BNCを取り込んだ培養ヒト肝細胞をホモジナイズし、OptiPrep密度勾配遠心法によって分離することにより、BNCを特異的に含む膜成分の分離を試みた。しかしながら、BNCの局在が広くブロードとなり、特定の膜画分に濃縮することが出来なかった。そのため、代表者は鋭意検討を重ね、ヒト肝臓細胞の膜画分をショ糖密度勾配遠心法によって分離し、可溶化して得られた膜タンパク質画分を、BNCをカラム樹脂に結合させて作成したタンパク質カラムへ流し、BNCに特異的に結合する膜タンパク質を探索した。その結果、約45kDa、48kDa、55kDa、260kDaの4種の結合タンパク質を単離する事に成功した。現在、質量分析計による解析を進めている。これらのタンパク質はHBVの新規受容体である可能性が高く、同定すればHBVの新しい治療法の開発に繋がる。2)に関しては、これまでの研究で明らかとなった、HBV表面抗原Lタンパク質のN末部位をカバーする合成ペプチドを複数合成し、代表者が独自に開発したペプチド提示リポソームを用いた膜融合評価実験法によって膜融合能を評価した。その結果、Lタンパク質のN末24アミノ酸をコードするペプチドが、高い膜融合活性を示す事が明らかとなった。この結果は、HBVの感染機構を理解する上で極めて重要な知見であり、またHBVの感染を阻害する新たな治療薬(膜融合阻害薬)の開発に繋がる。この様に、本研究は研究計画に従って順調に進捗している。本研究は、B型肝炎ウイルスの感染機構を試験管内で詳細に解析することにより、既存の逆転写酵素阻害剤に代わる、新しい作用機序の治療薬の開発に繋がる基礎的知見を得ることを目的としている。本年度は、近年抗ウイルス薬の標的として注目されるウイルスの膜融合機構に着目し、昨年度までに24アミノ酸残基に絞り込んだHBVの新規膜融合モチーフを生化学的手法により詳細に解析を行なった。始めに、合成ペプチドを表面提示するリポソームを用いたin Vitro膜融合アッセイ法(lipid-mixing assayおよびleakage assay)を構築し、新規膜融合モチーフの膜融合活性を詳細に解析した。その結果、膜融合の活性中心領域として15アミノ酸残基PreS1(9-29)を同定し、その中の連続した2つのフェニルアラニン残基(F14/15)が必須アミノ酸残基であることを明らかにした。またPreS1(9-24)は、Iipid-mixing活性に比べleakage活性が著しく高いことから,膜の破壊を引き起こす可能性が示唆された。そのため、蛍光標識ジャイアントリポソームを用いて形態学的解析を行なったところ、ペプチドの添加に伴いリポソームの崩壊が観察され、PreS1(9-24)が膜破壊能を有していることが明らかとなった。さらに、遠紫外円偏光二色性スペクトル法を用いてPreS1(9-24)の二次構造解析を行なったところ、40%TFE存在下の疎水性条件において、α-helix構造の割合が増加することが明らかとなった。このような構造変化は、膜融合活性を示さない変異体PreS1(9-24:F14/15A)では観察されないことから、ペプチドの構造変化が膜融合活性(膜破壊活性)の発現に重要と推定された。
グローバル化時代における市民参画型政策決定過程:フィリピンにおける市民社会研究

本研究は、20世紀後半以降の政策決定過程における市民の参加方法をモデル化し、これをフィリピン共和国において成立した共和国法NO.8550(RA8550)の成立過程に応用し、この結果を先述のモデルにフィードバックすることによって市民参画型政策決定過程モデルを提唱することを目的とした。これらの研究を遂行することにより20世紀後半以降の政策決定過程の変容をモデル化し、さらに、政策決定過程における政府と市民の連携手法および有権者のニーズを効率的に政策に反映させる手法を明確にすることが可能となる。RA8550は貧困に直面している漁村の発展と、フィリピンを取り囲む海洋の水質を管理し、環境保全を目的として成立した法案である。同法案の成立過程にはNGOが参入し、漁師のニーズを政策に反映させた。RA8550の成立過程に参入したNGOは、Philippine Rural Reconstruction Movement、Tanggol Kalikasan、Haribon Foundation、NGO for Fisheries Reformである。これらのNGOに対する調査を実施した結果、同法に対する参入方法は次の通りである。(1)政策分析、(2)アドボカシー活動、(3)ポピュラリゼーション。(1)については、アドボカシー活動を行うために、専門スタッフが政策についての分析を行う。政策分析は、政策立案者および政治家に政策提言を行う際に重要となるので、詳細な分析が求められる。(2)については、政策研究でえられた結果を、政策立案者、政治家、有権者に提言する。(3)については、政策成立の重要性をメディア、出版物、集会などを通じて有権者に訴え、政策成立に対する有権者の意識を高める活動である。今年度の調査の結果、これらの3つの手法が市民参画型政策決定過程の特徴であることが明らかとなった。
逆畳み込み積分法による心収縮の同期性の心収縮力に及ぼす影響の解析

本研究では従来はあまり注目されていなかった心収縮の同期性が心室の収縮力に及ぼす影響について犬摘出交叉灌流心を用い検討した。心収縮を心筋固有の収縮特性の時間経過と同期性の変化の2つの要因に分離して評価するため、畳み込み積分モデル(仮説)を提唱した。この仮説に基づき収縮中の心室をいろいろな時相で大電力ペーシングを行い、得られた左室の圧波形から時間軸で逆畳み込み積分を行い心筋収縮の時間経過を算出した。その結果、心収縮初期に興奮する心筋群は機械的な興奮が遷延するのに対し、後期に興奮する心筋群は短時間で興奮が完了することが示された。この心筋の特性の不揃いさのため、大電力瞬間ペーシングで電気的な収縮の同期性を高めても必ずしも機械的な同期性は保たれないものと思われた。むしろ生理的な刺激伝導系を介して遅れを持って収縮するほうがより機械的な収縮の同期性が維持されるものと思われた。本研究の前提である畳み込み積分の仮説を評価するため、犬摘出灌流心の心室細動圧波形の周波数解析を行い、そのケプストラから周波数軸での逆畳み込み積分を行った。その結果、算出された心筋の収縮性の時間経過は時間軸の逆畳み込み積分で得られたものに近い単峰性の波形であった。この波形はカテコラミンで増加し容積変化では変化せず心筋のエラスタンスの時間経過に近いものと思われた。〔まとめ〕畳み込み積分の概念を利用することにより心収縮を心筋固有の収縮特性の時間経過と同期性の変化の2つの要因に分離評価することが出来た。「目的」一般に心室の収縮力は心筋の収縮力を反映すると考えられている.しかしながら,心室は単一の細胞ではなく空間的な広がりを,持っているため,刺激伝導系を介して興奮が全体に伝わるのに時間がかかる.その結果,心室筋の興奮がどれほど同期して起きるかが心室の収縮力の重要な決定因子になってくる.そこで,本研究では心筋の収縮の同期性がいかに心室機能に影響を及ぼすかを検討した.「方法」雑種成犬の心臓を摘出し,その冠動脈を支持犬の動脈血で定圧で,潅流した.心室内にラテックスの風船を挿入し,その風船の容積をサーボポンプで制御することにより心室容積を自在にコントロールした.左心室の血圧は風船内に血圧計を挿入し測定した.「初年次のプロトコール」心室筋の収縮の同期性を変化させるため,心室を(1)右心室の基部, (2)左心室の基部,あるいは(3)心尖部から電気刺激し,心房刺激で得られた心室の収縮力と比較した.心室収縮の同期性は心電図のQRS時間から推定した.即ちQRS時間が延長するほど同期性が低下しているとみなした.「結果」心室収縮の同期性は心房刺激>心尖部刺激>右心室刺激=左心室刺激の順であり,左心室の収縮力もこの順に従った.左心室の収縮力は心房刺激に比較して,心尖部刺激で5-10%,両心室刺激でおよそ20%低下していた.「考察」心室の興奮は心房刺激の時に最も同期して起きるものと思われる.実際に心室を刺激する部位を変えると同期性は変化し,それに伴って心室の収縮力が変化することが示された.ある瞬間の心室の収縮力は、数学的にはその瞬間迄に既に収縮を開始している心筋の弾性率の時間経過と、その瞬間迄に収縮に関与した心筋量をあらわす同期過程の時間経過の広い意味での畳み込み積分(convolution)であらわされるものと思われる。

生理的にはこの確率的な同期過程は刺激伝導系の特性を反映し比較的一定の性質を保っているものと思われる。本研究ではこの様な概念の妥当性を検討し実際に心収縮性と同期性と分離評価する事を試みた。〔時間軸での逆畳み込み積分〕収縮中の犬摘出交叉潅流心を大電力瞬時ペーシングし刺激伝導系を介さずに直接心筋収縮をおこさせた。さまざまな時相の大電力ペーシングで得られた心室の収縮力を比較することにより、数値的に逆畳み込み積分(deconvolution)を行い、生理的な収縮時の同期過程と心筋の収縮特性を評価した。その結果、心収縮の早期に心室の圧発生に関与する心筋は、機械的な興奮時間が長く収縮の立ち上がりからそのピークまでの時間も延長していた。一方心室の収縮の後期に興奮を開始する心筋は興奮時間は全般に短く、興奮の立ち上がりからそのピークまでの時間は短縮していた。〔周波数軸での逆畳み込み積分〕犬摘出交叉潅流心の心室細動圧波形の周波数解析を行い、そのケプストラから周波数軸での逆畳み込み積分を行った。その結果、算出された心筋の収縮性の時間経過は時間軸の逆畳み込み積分で得られたものに近い単峰性の波形であった。この波形はカテ・コラミンで増加し容積変化では変化せず心筋のエラスタンスの時間経過に近いものと思われた。〔まとめ〕畳み込み積分の概念を利用することにより心収縮と心筋固有の収縮特性の時間経過と同期性の変化の2つの要因に分離評価することができた。
周期的電位変調を用いる電気化学クロマトグラフの開発

クロマトグラフ法の分離プロセスは,分配,拡散等の現象を応用したものである.したがって,ある一つの分離カラムを使用する限り,分離特性の変化は移動相の組成や温度の変更による程度にとどまる.このため,申請者らは,クロマトグラフ分析法に新たな制御パラメーター(自由度)を与える目的で,電場制御型のクロマトグラフを開発してきた.この新しい方法では,カラム充填材料に電導性をもつ多孔質粒子を選び,充填剤表面と試料イオンの間の電場による相互作用を利用して,イオン性物質を分離する.今回の申請では現在の手法をさらに発展させ,固定相表面に繰り返してパルス状電位を与える実験を行った.すなわち,パルス状の電位を固定相に連続的に与え,分離の自由度をさらに増大させることを試みた.無機陰イオンの分離を行う場合,固定相にポリアニリンを修飾したカーボン粒子を用い,正の電位(>1.5V)を与えると,陰イオンは固定相表面と非常に強く相互作用し,事実上溶離しない.このとき,0から1V,また0Vに戻るような矩形波パルスを固定相に与えるとイオンは固定相を離れカラム内を移動できるため,パルスのDuty比に応じて平均移動速度(保持時間)を変化させることができた.ここでパルスの周期を小さくすると,固定相からの離脱/再結合が追従できなくなる.したがって,それぞれのイオンの保持時間に周波数特性が現われ,分離度をパルス周期により変化させられた.このように,固定相/移動相界面でのイオン交換反応の速度を制御困難な拡散等の熱的現象から制御容易な電気的現象に変換することが可能となった.クロマトグラフ法の分離プロセスは,分配,拡散等の現象を応用したものである.したがって,ある一つの分離カラムを使用する限り,分離特性の変化は移動相の組成や温度の変更による程度にとどまる.このため,申請者らは,クロマトグラフ分析法に新たな制御パラメーター(自由度)を与える目的で,電場制御型のクロマトグラフを開発してきた.この新しい方法では,カラム充填材料に電導性をもつ多孔質粒子を選び,充填剤表面と試料イオンの間の電場による相互作用を利用して,イオン性物質を分離する.今回の申請では現在の手法をさらに発展させ,固定相表面に繰り返してパルス状電位を与える実験を行った.すなわち,パルス状の電位を固定相に連続的に与え,分離の自由度をさらに増大させることを試みた.無機陰イオンの分離を行う場合,固定相にポリアニリンを修飾したカーボン粒子を用い,正の電位(>1.5V)を与えると,陰イオンは固定相表面と非常に強く相互作用し,事実上溶離しない.このとき,0から1V,また0Vに戻るような矩形波パルスを固定相に与えるとイオンは固定相を離れカラム内を移動できるため,パルスのDuty比に応じて平均移動速度(保持時間)を変化させることができた.ここでパルスの周期を小さくすると,固定相からの離脱/再結合が追従できなくなる.したがって,それぞれのイオンの保持時間に周波数特性が現われ,分離度をパルス周期により変化させられた.このように,固定相/移動相界面でのイオン交換反応の速度を制御困難な拡散等の熱的現象から制御容易な電気的現象に変換することが可能となった.
ケトン食は加齢性骨格筋機能低下に対する新規介入方法となりうるか

加齢性筋機能低下症(サルコペニア)では、骨格筋量や筋力低下などが主症状として知られるが、同時に筋の支配神経、および神経筋接合部の萎縮も観察される。本研究では骨格筋および神経変性に対する解決方策として、神経系疾患や代謝異常症へ対する治療法として用いられてきた「ケトン食」による栄養介入が、筋および神経機能低下を抑制するかを検証する。骨格筋培養細胞(C2C12)および実験動物を用いて、骨格筋に対するケトン体の作用機序を検証する。次に実験動物を用いて骨格筋、神経筋接合部、神経軸索に対するケトン食の作用機序を検証する。最後に加齢動物を対象としてケトン食が筋および神経機能低下を抑制するかを検証する。加齢性筋機能低下症(サルコペニア)は、各種疾患の誘因であるとともに健康寿命を低下させることから、その予防が急務である。またサルコペニアには筋機能低下のみならず支配神経の変性が関与することから、筋に加え支配神経の機能維持・改善が重要であると考えた。本研究では、神経系疾患や代謝異常症への治療法として用いられてきたケトン食(KD)に着目し「KDが骨格筋と神経へ作用する分子メカニズムの解明と、KDによる骨格筋と神経の機能低下の抑制」に挑むこととした。2018年度は、培養骨格筋細胞におけるケトン体の作用機序の解析および2生体においてケトン食が骨格筋、神経、神経筋接合部へ及ぼす影響の解析を検討課題とした。課題1を検証するために筋細胞(C2C12)を培養・分化させケトン体を添加し、分化後の筋管細胞に出現する神経筋接合部の形成に変化が生じるかを検討した。その結果、ケトン体を添加した筋管細胞としていない筋管細胞では、両条件間で神経筋接合部の形成数が異なる様相を観察した。次に検討課題2を検証する前に、C57BL/6Jマウスを対象としてKD介入の適切な条件を決定することとした。KD(糖質: 0%,脂質: 90%,タンパク質: 10%)または通常食(糖質: 80%,脂質:10%,タンパク質: 10%)を12週間摂取させその後解剖を行なった。期間中、2週毎に実施したインスリン負荷試験では、KD群(n=6)は6週間目において血糖値が通常食群(n=7)より有意な低置を示し、12週間時点での血糖値は通常食と相違なかった。また12週の時点で摘出した腓腹筋を、神経と筋を架橋する神経筋接合部の形成に寄与するPGC-1αやMuSKタンパクの発現をウエスタンブロット法にて通常食群と比較したところ、群間に有意な差は確認されなかった。以上からKDが身体へもたらす影響は、介入期間によって異なる可能性が示された。2018年度は、ケトン体が骨格筋PGC-1α活性とミトコンドリア生合成に与える影響を分子レベルで解析することを目的として2つの検討課題を設定した。培養骨格筋細胞を用いた実験では、筋細胞(C2C12)を培養・分化させケトン体を添加し、分化後の筋管細胞に出現する神経筋接合部(NMJ)の形成に変化が生じるかを検討した。当初の仮説に示したケトン体がPGC-1αやミトコンドリア関連タンパクの増加が観察されるかについては、これから検証を行うことで十分に期間内に分析が終わると考えられる。また生体を用いた実験では、ケトン食の適切な実施条件を決定するために9-11週令のC57BL6Jマウス13匹を用い、12週間の食事介入を実施し(ケトン食群=6匹、通常食群=7匹)2週毎にインリン負荷試験を実施した。期間中に週ごとの血糖値変化を追跡することで、ケトン食による身体応答を簡易的に評価した結果、6週間目においてインスリン感受性が向上し、12週間目ではインスリン感受性が低下していた。また12週間目で摘出した骨格筋を対象として、NMJの形成時に多く発現するタンパクを評価したところ、通常食群と相違なかった。したがってケトン食による適切な介入期間を6週間に設定し、骨格筋、神経、神経筋接合部へ及ぼす影響を今後解析する。介入条件の検討を優先したため解析が年度をまたぐこととなってしまったが、適切な条件を見出すことができたため、今後の解析はスムーズに進む予定である。したがって大きな遅れは生じておらず、結果を得られていることから概ね順調に進展していると考えられる。今後はこれまでに残っている解析を継続すると共に、ケトン食が加齢に伴う神経筋接合部破綻や神経機能低下を抑制するかを検証していく。特に今年度は自然老化マウス(ジャクソン社より購入予定)を用いる。自然老化マウス20匹を、通常食群(9匹)とケトン食群(9匹)に群わけする。介入期間は6週間とし、ケトン食摂取時に観察される生理学的な変化(血中ケトン体濃度の上昇、血糖値の変化など)の評価も実施し、ケトン食による介入条件が適切であるかも判断する。また分析はミトコンドリア生合成や機能(呼吸機能,酵素活性)、神経筋接合部の変化などを中心に生化学・病理学的な解析手法を用いる。また、ケトン食の作用機序に関与するとされるmTORやSirtシグナルの解析も実施する。さらにケトン食介入によって、骨格筋症状および神経、神経筋接合部の変性がどの程度消失するかを新たに評価する。

その指標として主に筋タンパク質の分解シグナル(ユビキチン・プロテアソーム系やオートファジー)、神経および神経筋接合部の変性時に発現量の増加が見られるマーカー(心筋型トロポニンT)を解析する。また研究全体を通して、その他解析を行う必要が生じた場合速やかに取り入れる。加齢性筋機能低下症(サルコペニア)では、骨格筋量や筋力低下などが主症状として知られるが、同時に筋の支配神経、および神経筋接合部の萎縮も観察される。本研究では骨格筋および神経変性に対する解決方策として、神経系疾患や代謝異常症へ対する治療法として用いられてきた「ケトン食」による栄養介入が、筋および神経機能低下を抑制するかを検証する。骨格筋培養細胞(C2C12)および実験動物を用いて、骨格筋に対するケトン体の作用機序を検証する。次に実験動物を用いて骨格筋、神経筋接合部、神経軸索に対するケトン食の作用機序を検証する。最後に加齢動物を対象としてケトン食が筋および神経機能低下を抑制するかを検証する。加齢性筋機能低下症(サルコペニア)は、各種疾患の誘因であるとともに健康寿命を低下させることから、その予防が急務である。またサルコペニアには筋機能低下のみならず支配神経の変性が関与することから、筋に加え支配神経の機能維持・改善が重要であると考えた。本研究では、神経系疾患や代謝異常症への治療法として用いられてきたケトン食(KD)に着目し「KDが骨格筋と神経へ作用する分子メカニズムの解明と、KDによる骨格筋と神経の機能低下の抑制」に挑むこととした。2018年度は、培養骨格筋細胞におけるケトン体の作用機序の解析および2生体においてケトン食が骨格筋、神経、神経筋接合部へ及ぼす影響の解析を検討課題とした。課題1を検証するために筋細胞(C2C12)を培養・分化させケトン体を添加し、分化後の筋管細胞に出現する神経筋接合部の形成に変化が生じるかを検討した。その結果、ケトン体を添加した筋管細胞としていない筋管細胞では、両条件間で神経筋接合部の形成数が異なる様相を観察した。次に検討課題2を検証する前に、C57BL/6Jマウスを対象としてKD介入の適切な条件を決定することとした。KD(糖質: 0%,脂質: 90%,タンパク質: 10%)または通常食(糖質: 80%,脂質:10%,タンパク質: 10%)を12週間摂取させその後解剖を行なった。期間中、2週毎に実施したインスリン負荷試験では、KD群(n=6)は6週間目において血糖値が通常食群(n=7)より有意な低置を示し、12週間時点での血糖値は通常食と相違なかった。また12週の時点で摘出した腓腹筋を、神経と筋を架橋する神経筋接合部の形成に寄与するPGC-1αやMuSKタンパクの発現をウエスタンブロット法にて通常食群と比較したところ、群間に有意な差は確認されなかった。以上からKDが身体へもたらす影響は、介入期間によって異なる可能性が示された。2018年度は、ケトン体が骨格筋PGC-1α活性とミトコンドリア生合成に与える影響を分子レベルで解析することを目的として2つの検討課題を設定した。培養骨格筋細胞を用いた実験では、筋細胞(C2C12)を培養・分化させケトン体を添加し、分化後の筋管細胞に出現する神経筋接合部(NMJ)の形成に変化が生じるかを検討した。
ジョン・ロックの政治思想における自然法理論の変容過程

本年度において、報告者が明らかにしたことは、ロックが自らの政治思想を、現世における人間の生活に対する彼の総合的な理解の一部として提示したということである。具体的に言えば、ロックは、現世における人間の活動が、「政治の世界」、「社交の世界」、「良心(信仰)の世界」という三つの領域で営まれるものと捉えており、「政治の世界」についての彼の見解は、他の二つの世界における人間のあり方と常に対比されながら形成されていった。ロックにおいて、現世における人間の活動は、究極的には理性よって認識された神の意志、すなわち自然法によって律せられるべきものであった。しかしながら、彼の認識論哲学の精緻化とともに、理性的論証による自然法認識の試みは次第に困難なものになっていった。それにもかかわらず、ロックは自然法の観念を放棄しなかった。ロックによれば、人間は完全に自然法を認識できないけれども、プロパティ(生命、財産)の保全に関わることについては、非常に高い蓋然性を持って正しい判断を下すことができる。この意味で、「政治の世界」は、ほぼ自然法に従って営まれることが可能である。さらにロックは「社交の世界」の教育の役割に注目した。社交の世界では評判の機能によって、人間は他者の好評を得ようとして、自発的に道徳的に行為するように教育される。また、理性だけでは完全に自然法を認識できない人間にとって、「良心の世界」における信仰は、神の意志に適った生活を営むためにやはり必要であった。こうした観点から見れば、ロックの政治的議論、とりわけ『統治二論』における抵抗権に関する議論を、宗教的な信仰の現れとして解釈するは不適当であること、また、『寛容書簡』における宗教的寛容の議論は、信仰の自由の表明というよりは、「政治の世界」から「良心の世界」への介入を戒める議論として理解されることが明らかになる。
補酵素における非共有結合性相互作用の定量的評価とリサイクル触媒作用

生体内酸化還元系補酵素が関与する反応はタンパク中の疎水場における非共有結合性相互作用により制御されている。我々はこれまでに種々の補酵素モデル反応で疎水的環境において初めてルイス酸である金属イオンが、リサイクル可能な触媒として有効に機能することを見いだしている。本申請研究では、反応中間体として生成する補酵素のラジカルイオン種と非共有結合性相互作用をする触媒との結合の強さと、触媒活性との関係について検討し、生体内酸化還元系補酵素における非共有結合性相互作用を定量的に評価し、リサイクル可能な触媒作用との関係を明らかにすることを目的としている。補酵素およびそのモデル化合物の電子状態は、疎水環境における金属イオン等のルイス酸との非共有結合性相互作用によって元の電子状態から大きく変化し、特にラジカルイオン種でその変化は顕著になる。今年度は、まず疎水環境において各種補酵素ラジカルイオン種と非共有結合的相互作用をする物質の探索を行い、補酵素ラジカルイオンとの分子複合体形成の結合様式や電子状態等をESRやストップドフロー法、各種レーザー時間分解測定により得られる過渡種の分光学的情報をもとに明らかにした。その結果と、補酵素の酸化還元反応における、これらの物質の触媒活性の違いに関する速度論的解析結果を組合わせて、触媒活性と触媒分子複合体の安定性との相関性を見いだし、それを理論計算の結果と比較検討した。また、触媒が効率的にリサイクル使用可能になる条件を探索した。
脳内モノアミンオキシダーゼ調節因子の機能異常による情動、社会性障害発症機構の解明

モノアミンオキシダーゼ(MAO)による迅速なモノアミンの代謝分解が、脳高次機能発現に必須であり、その破綻は様々な脳神経疾患を誘発する。申請者は、ユビキチンリガーゼRinesがMAO蛋白質のユビキチン化と分解を促進し、マウス脳におけるMAO蛋白質量の調節を介してモノアミン量および情動と社会性行動を制御することを報告していた。本研究では、脳高次機能発現における、RinesによるMAO蛋白質の分解とそれに伴うモノアミン動態制御機構を解明するため、若齢高齢Rines欠損マウスを用いて検討した結果、Rines欠損マウスは、週齢依存的に異なった行動表現型およびモノアミン動態変化を示すことを発見した。モノアミン動態の変化を観察1、若齢、壮年期、高齢の各時期のRines欠損マウスと野生型マウスにおける各種脳領域(前頭前野、海馬、扁桃体、線条体等を含む、情動などの高次脳機能に重要である部位)において網羅的にモノアミン動態を観察し、それぞれの時期特有のRines欠損マウスにおけるモノアミン動態の変化を確認した。2、各時期のRines欠損マウスのモノアミン関連薬剤に対する感受性の違いを観察した。以上の結果から、Rines欠損マウスの時期依存的な行動異常を一部説明することができた。MAO-A阻害薬は、うつ病などの治療に長年使用されており、PTSDやパニック障害の患者にも有用である。MAO-A欠損マウスでは、各種脳部位のモノアミン量が増加し、情動記憶の亢進、攻撃性の増加などの情動異常が見られ、ヒトにおいてもMAO-A遺伝子変異患者が、Brunner症候群と呼ばれる反社会的行動や攻撃性を示す。逆にMAO-A量が多いと、抑うつ、不安の傾向が高くなる。しかしMAO蛋白質量の制御機構、特に分解機構についてはこれまで報告がなかった。申請者はこれまでに、1)ユビキチンリガーゼRinesがMAO蛋白質のユビキチン化と分解を促進し、マウス脳におけるMAO蛋白質量の調節を介してモノアミン量を制御すること、2)Rines欠損マウスを用いて、MAOA分解機構の破綻が、ストレスに対する、情動および社会性行動とモノアミン反応性の異常を誘導することを報告していた。MAO-A量の低下で見られる攻撃性が幼児期の虐待などのストレスによって悪化することも知られている。したがって本研究での若齢期のRines欠損マウスでの行動やモノアミン制御機序を解明することは、情動だけでなく行為障害などの発症機序の解明に寄与できると考えられる。さらに、MAO-Aの過剰発現は、神経変性疾患に関与することが報告されているため、本研究は、神経変性疾患の発症機序の解明にも貢献できる可能性がある。静止時のマウスのモノアミン測定および一定の行動におけるマウスのモノアミン測定は順調に進んでいる。しかし、高齢マウスを用いてのマイクロダイアリシスなどの侵襲性の高い実験におけるマウスの死亡率が高いため、個数を確保するのに少し困難がある。脳神経科学さらなる行動異常の解析やその他の生化学的実験の推進のためにも、新たな機器類の購入を行うなどし、現在共同研究している他研究機関との連携を強めて行う予定である。また、高齢マウス実験における、マイクロダイアリシスおよびストレス試験を含めた各種行動解析によるマウスの死亡率を減少させるため、麻酔やプローブ挿入および行動解析の侵襲を和らげる条件検討を行う。本年度の実験においては、モノアミン測定および免疫染色などの実験に関わる消耗品および機器が、当研究室および、他共同研究室の既存物を使用できることが多かったことによる。既存ではできない新規の行動解析、各種モノアミンおよび生化学解析に必要な機器の購入とそれらに付随する消耗品の購入を行い、当該研究の目的を遂行する予定である。