hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビタミンＣとＥの相互作用が及ぼす脂質代謝への影響解析

ビタミンC(VC)とビタミンE(VE)は、抗酸化物質であり、脂質の酸化を防ぐ働きがある。またVEは抗酸化に働くだけではなく、脂質の酸化や代謝と関連することが知られている。一方で、VCがVEと相互作用してVEの還元状態を維持している事がこれまでの研究で知られていた。しかし、その相互作用の生体内における役割は殆どわかっていない。そこでVC欠乏モデルであるSMP30遺伝子破壊(KO)マウスと、家族性VE欠乏症モデルであるαTTP-KOマウスを用いた詳細な解析を行う事にした。即ち、その二系統のマウスをかけ合わせてできるSMP30/αTTPダブルノックアウト(DKO)マウスを作製し、独自のVCとVEの欠乏モデルの解析を行うことにした。まず初めに寿命を解析したところ、VCとVEを両方不足させた時だけ、寿命が著しく低下することが分かった。老化と関連するホルモンを調べた結果、血中アディポネクチンがVCとVEを欠乏させた時に減少することが分かった。アディポネクチンは脂肪組織から放出されるため、精巣上体周囲脂肪の解析を行った。その結果、脂肪組織における遊離脂肪酸、コレステロール、リン脂質量がVEを欠乏させた時に増加し、炎症性の遺伝子発現も増加することが分かった。さらに血中の遊離脂肪酸およびLDLトリグリセリドがVCを欠乏させた時に減少していた。また、肝臓における遊離脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールがVEを欠乏させた時に減少し、リン脂質がVCを欠乏させた時に減少することがわかり、それを補うような脂質合成に働く転写因子SREBF-1遺伝子の発現がVCとVEを欠乏させた時に増加することが確認された。本研究より、VCとVEの欠乏は脂肪組織における炎症反応を誘起する事、血中アディポネクチンを減少させる事、そして肝臓における脂質代謝に影響を与える事が分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。申請者の最終目標は、老化による代謝異常を制御する生理活性物質の発見およびその基礎的な機能の解明である。ビタミンCとビタミンEは、それぞれ水溶性と脂溶性の抗酸化物質であり、脂質の酸化を防ぐ働きがある。またビタミンEは抗酸化に働くだけではなく、脂肪細胞においてアディポネクチンの発現を促す働きも報告されている。アディポネクチンは脂肪細胞から放出され肝臓に作用し、脂質消費を促進する方向へ働きかける。この様に、ビタミンEと脂質代謝の関係は深い。また、ビタミンCとビタミンEは、それぞれ大量投与によりマウスの最長寿命が延長したとの報告もあり、抗老化作用が期待されている。そして、ビタミンCが相互作用してビタミンEの還元状態を維持している事が報告されている。ビタミンCとEはその抗酸化能から投与実験は数多く行われているが、モデル動物が少ないためか生体内におけるビタミンCとEの相互作用に関する基礎研究は殆どない。一方申請者のグループはビタミンC欠乏モデルであるSenescence Maker Protein 30(SMP30)遺伝子破壊(KO)マウスに加え、家族性ビタミンE欠乏症モデルであるα-Tocopherol Transfer Protein(αTTP)-KOマウスを保有している。そこで、その二系統のマウスをかけ合わせてできるSMP30/αTTPダブルノックアウトマウスを作製し、独自のビタミンCとEの欠乏モデルの解析を行うことにした。そしてビタミンCおよびEとの関連が深い脂質代謝に焦点を合わせる事で、老化による代謝異常の基礎的な解明へ繋がるのではないかと考えた。本年度はマウスの繁殖および解剖を行った。さらに、血中および肝臓におけるビタミンCとビタミンEの定量を行った。その結果、ビタミンE欠乏食を与えたマウスでは血中及び肝臓のビタミンEレベルがほとんど欠乏状態になることが分かった。また、脂質解析を行った結果、ビタミンEを与えたSMP30/αTTPダブルノックアウトマウスにおいて、肝臓脂質量が高くなることが分かった。得られた結果のより詳細な解析をこれから行う予定である。また、これらの成果の一部をシンポジストとして日本心理学会第79回大会で発表した。また申請者はビタミンE代謝の加齢変化の研究を以前から進めており、本年度はその成果の発表を国内の学会で行い、European Journal of Nutritionへ論文が受理された。以上の事から、申請者は熱心に研究に取り組んでおり、研究は概ね期待通りに進行している。

その結果、脂肪組織における遊離脂肪酸、コレステロール、リン脂質量がVEを欠乏させた時に増加し、炎症性の遺伝子発現も増加することが分かった。さらに血中の遊離脂肪酸およびLDLトリグリセリドがVCを欠乏させた時に減少していた。また、肝臓における遊離脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールがVEを欠乏させた時に減少し、リン脂質がVCを欠乏させた時に減少することがわかり、それを補うような脂質合成に働く転写因子SREBF-1遺伝子の発現がVCとVEを欠乏させた時に増加することが確認された。本研究より、VCとVEの欠乏は脂肪組織における炎症反応を誘起する事、血中アディポネクチンを減少させる事、そして肝臓における脂質代謝に影響を与える事が分かった。今後は生化学的検査および分子生物学的解析を行い、さらにデータのまとめと論文執筆を行う。まず、過酸化脂質の評価を肝臓および血漿、脂肪組織で行う。さらに肝臓および脂肪組織における、脂質代謝に関する遺伝子の発現量解析を、定量的Real-time PCR法で行う。また、肝臓および脂肪組織における、脂質代謝に関するタンパク質の解析をウェスタンブロッティング法で行う。1.過酸化脂質のしひょうであるMDAおよび4HNEの定量を行う。2.血中のアディポネクチン、酸化HDLおよび酸化LDLをELIZA法で定量する。3.肝臓および脂肪細胞における、アディポネクチンおよびアディポネクチンレセプターを含む脂質代謝に関する遺伝子の発現量解析を、定量的Real-time PCR法で行う。4.肝臓および脂肪細胞における、脂質代謝に関するタンパク質の解析をウェスタンブロッティング法で行う。5.これまでに得られた結果をまとめ、成果を学術雑誌へ投稿する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ダイヤモンド中のNVセンターのナノ配列作製による数量子ビット量子レジスタの実現

室温量子スピンとして優れたNVセンダ同士の相互作用に着目した。量子レジスタの多量子ビット化をめざして、短い距離(13 nm)のNVセンダ配列を規則的なナノホール配列をもつマスク注入により作製する技術を開発した。平均距離5nmの高濃度NVセンタを作製し、離散的時間結晶の生成を室温で実証した。単一NVセンタにもナノホール注入を応用し、量子センサー・アレイを作製した。量子アルゴリズムを高磁場測定と組み合わせたナノNMRにおいて超微量の試料のケミカルシフトを観測する高分解能を達成した。高品質結晶合成により、結晶中の離れた位置のSiV-センタから識別できない単一光子を発生することに成功した。本研究では、ナノスケールのNVセンターの配列を作製して、室温動作の量子レジスタを数量子ビットに拡張することをめざす。イオン注入によるNVセンター作製の位置制御はストラグリングで制限される。FIBとなる窒素イオン源がないので、ナノスケールのNVセンター配列を、散在的に多数作製することは困難である。ところが、ブロードビームでも20 keV窒素分子イオン注入を用いると短い距離のNV-NVペアーを作製できる。一方、ナノホールを用いた窒素イオン(1 MeV)注入でも、短い距離のNV-NVペアーの作成が報告されている、我々は、2つの方法を組み合わせて、ナノホールから低エネルギーの分子イオンを多数注入する方法の開発に取り組んだ。その結果、距離および配列を構成するNVセンターの数を制御するための最適化に進めるとともに、コヒーレンス時間および電荷安定性にもすぐれた配列作製への最適化に進める段階に達することができた。本研究では、NVセンター以外にも、量子情報デバイス応用に優れた特性をもつカラーセンターの探索を行っている。SiV-センターは、発光の70%が、線幅が狭く長波長(738nm)のZPLに集中しているので、量子通信用の単一光子源として適している。我々は結晶格子中の異なる位置のSiV-センターから放出される光子が識別できないことを示すHong-Ou-Mandel量子干渉の実験に成功した。さらに、ラムダ型遷移を用い、低温で光によって電子スピンを初期化するとともに、そのスピン格子緩和時間、コヒーレンス時間を測定し、重ね合わせ状態の生成の証拠となるCPT (coherent population trapping)を観測した。今までESRも観測されていなかったSiV-センター(S=1/2)がスピン量子ビットとして機能することを示すことができた。ダイヤモンド中の単一のNVセンターの単一電子スピンは、優れた特性(光で初期化・読出し、マイクロ波パルスによるスピン操作、長いコヒーレンス時間)を室温で発揮する固体量子ビットである。本研究の目的は、隣接するNVセンター同士が強くコヒーレント結合したNVセンター配列を12C濃縮・高純度結晶中に作製し、室温動作の量子レジスタを数量子ビットに拡張することである。EBリソグラフイーで作製した規則的に並んだナノホールを持つレジスト・マスクを通した窒素分子イオン(15N2+、20keV)注入、熱処理(1000°C)によって、距離13 nmのNVセンター配列を作製する技術を開発した。NVセンター配列は共焦点顕微鏡で読み取れるアドレスをもつ、規則的に並んだ蛍光スポット格子の個々のスポットとして観測される。注入ドーズとナノホール径を変えることにより、スポット当たりのNVセンター数のポアッソン分布の平均値(0.9720)を制御できた。ODMR周波数の違いによって個々の電子スピンを識別できる2個、3個、4個の単一のNVセンター配列作製が確かめられた。基板となるCVDダイヤモンド単結晶の高結晶化を進めたとともに、NVセンターの量子情報処理への応用において新規な手法の開発にも取り組んだ。まず、Eバンドのマイクロ波と3 Tの磁場を用いることにより、高磁場では単一NVセンターの14N核スピンのスピン格子緩和時間を一桁長くできることを示すとともに、RFパルスによる単一核スピンのスピン操作(ラビ振動)を行った。また、超伝導量子ビットとハイブリッド系をなすNVセンター・アンサンブル・メモリにおいて蓄積・読出しの効率の1桁以上の改善を示した。NVセンターの電子スピンのスピン・ロッキングを用いるHartmann-Hahn法を13C核スピン制御に用い、核スピン集団の効率的な高偏極化が得られることを示した。レジスト・マスクのナノホールを通して、複数の窒素分子イオンを注入し、熱処理することによって作製された、NVセンター配列は共焦点顕微鏡の分解能では単一の蛍光スポットとなる。ナノホール径と注入エネルギーとから、NVセンター間の平均距離は13 nmと見積もられる。レジスト・マスクに規則的な並びのナノホール配置を作製することにより、規則的に並んだスポットがひとつの試料に多数(20万)作製される。H27年度までに、(1) NVセンター配列を構成するNVセンターの数(ナノホール当たり生成するNVセンターの数)はポアッソン分布に従うが、平均値(0.9720)は注入ドーズ、ナノホール径により制御できること、(2)NVセンター配列からなるスポットが規則的な格子として並んでいることに加えて、共焦点顕微鏡で読み取れるアドレス(注入エネルギーとナノホール径の識別子になる)により、再度の熱処理や追成長後にも同じスポットの測定に容易に戻ることができること、(3)打ち込んだ窒素イオンからNVセンターへの変換効率は10%であること、(4)個々の電子スピンをODMR周波数の違いとして識別できる2個、3個、4個の単一のNVセンターからなる配列の作製が確かめられたことなど、「短いゲート操作時間をもたらす短い距離をもち、十分な数のNVセンターからなる配列」を作製することは達成された。

これらの配列が量子レジスタとして機能するには、コヒーレンス時間/ゲート操作時間の比を十分に高くする必要があり、H28年度はコヒーレンス時間の改善に取り組むことになる。NVセンターの量子情報処理への応用のための新しい手法の開発においても進展が得られた。単一NVセンターの電子スピンは、「室温電子スピン」と呼ぶにふさわしい特性(光による初期化・読み出し、マイクロ波パルスによるコヒーレント操作、長いコヒーレンス時間)をもっている。本研究では、コヒーレント結合したNVセンター配列を作製し、室温動作の量子レジスタを数量子ビットに拡張することをめざした。このためEBリソグラフィで作製した規則的に並んだナノホールを持つレジスト・マスクを用い、平坦な成長面を持つ12C濃縮・高純度CVDダイヤモンド結晶に、窒素分子イオン(15N2+、20 keV)注入、熱処理(1000°C)によって、距離13 nmのNVセンター配列を蛍光スポット配列として作製する技術を開発した。NVセンター数/スポットのポアッソン分布の平均値(0.9720)の制御、および、ODMR周波数から個々の電子スピンを識別できる24個の配列作製の再現性が確認された。これにより、電荷安定化のための燐ドープ、コヒーレンス時間を改善するための追成長に取り組む段階に進むことができる。2.5 keV窒素イオン注入とナノホール(径20 nm)注入を組み合わせ、共焦点顕微鏡で読み取れるアドレスをもつ、浅い単一NVの配列(ポアッソン分布の平均値1.40)の作製に成功した(イマージョンオイルの1H-NMRにより測定した深さは210 nm)。望みの深さのNVに再現性良く容易にアクセスできるナノNMR用量子センサーアレイが作製できた。「室温量子スピン」が相互作用する量子多体系として、平均距離5 nmの高濃度のNVセンターを高温電子線照射により作製した。このうち3次元の不規則性を持つ100万の室温電子スピンの集団を用いて、室温での離散的時間結晶の生成を実証することに成功した。この結果は捕獲イオン10個を1次元に並べた極低温の実験(メリーランド大学)の論文と並んでNatureに掲載された。室温量子スピンとして優れたNVセンダ同士の相互作用に着目した。量子レジスタの多量子ビット化をめざして、短い距離(13 nm)のNVセンダ配列を規則的なナノホール配列をもつマスク注入により作製する技術を開発した。平均距離5nmの高濃度NVセンタを作製し、離散的時間結晶の生成を室温で実証した。単一NVセンタにもナノホール注入を応用し、量子センサー・アレイを作製した。量子アルゴリズムを高磁場測定と組み合わせたナノNMRにおいて超微量の試料のケミカルシフトを観測する高分解能を達成した。高品質結晶合成により、結晶中の離れた位置のSiV-センタから識別できない単一光子を発生することに成功した。
植物有用メロテルペノイドの生合成メカニズム解明から物質生産へ

エゾムラサキツツジが生産するメロテルペノイドの一種ダウリクロメン酸(daurichromenic acid、DCA)は極めて強力な抗HIV活性を示す。本研究では、植物メロテルペノイド酸化閉環酵素であるDCA synthase及びカンナビノイド合成酵素(THCA synthase)の結晶構造解析による構造機能の解明を目的として、その基盤となる組換え酵素の発現システムについて各種宿主を用いて検討を行った。本年度はBY-2に比べ遺伝子組換えが容易で、また組換え酵素の酵素的な糖鎖除去が可能である酵母Pichia pastorisを宿主とし、DCA synthase及びTHCA synthaseの高発現株の作製を試みた。まずTHCA synthase及びDCA synthaseのcDNAをpPICZAベクターに挿入し、発現カセットを作製した。次いで各発現カセットを切り出し、複数遺伝子の挿入が可能なpAO815及びpPIC3.5Kに順次組み込むことで、各遺伝子の発現カセットを3コピー含むベクターを構築した。次いでエレクトロポレーション法を用いた相同組換えによりP. pastorisに形質転換し、DCA synthaseあるいはTHCA synthaseの発現カセットを1, 4及び7コピー導入した組換え体をそれぞれ調製した。メタノールで発現誘導し、細胞外に分泌した各酵素の活性を測定した結果、THCA synthase及びDCA synthase発現株いずれも、単一コピー組換え体に比べ、4コピー及び7コピー組み換え体ではコピー数の増加に依存して比活性の上昇が確認された。組換え酵素を精製した結果、THCA synthase及びDCA synthaseはいずれも糖鎖付加を受けていることが示唆されたため、7コピー発現株にendoglycosidase Hを導入して共発現株を作製した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。エゾムラサキツツジ(Rhododendron dauricum)はツツジ科に属する落葉低木で、北海道やアジア東北部に分布している。近年の研究から、本植物が生産するメロテルペノイドの一種ダウリクロメン酸(DCA)は極めて強力な抗HIV活性を示すことが証明されており医薬品原料としての期待が高まっている。私はDCA synthase遺伝子を初めてクローン化し、組み換え酵素を用いた生化学的解析により本酵素が大麻(Cannabis sativa)のカンナビノイド合成酵素に類似したFAD oxidaseであることを明らかにした。本成果については本年度国際誌に印刷公表した。本研究はDCA synthase及びカンナビノイド合成酵素という医薬資源を生合成するメロテルペノイド合成酵素について結晶構造解析による構造機能の解明を目的とする。本年度は先ず、酵素-基質の結合様式解明に必要な活性中心リガンドを合成した。これらは各酵素の基質グリフォリン酸及びカンナビゲロール酸のプレニル基二重結合を接触還元したものであり、酵素との親和性を保ちつつ反応性が低下するよう設計した。次に結晶化に向けた試料調製のためDCA synthase及び二種のカンナビノイド合成酵素についてメチロトロフ酵母及びタバコ培養細胞BY-2を宿主として発現を検討した。この結果BY-2を発現宿主としたときに高レベルでの分泌発現を確認し、培養上清をハイドロキシアパタイトおよびCM-トヨパールカラムに付すことで各酵素45mg/Lレベルの精製標品を得ることに成功した。一方酵母発現系での発現量は低かったものの、精製酵素のEndo H処理により結晶化の妨げとなる糖鎖を含まないサンプルを得ることに成功した。現在、精製した3種の各組み換え酵素についてcrystal screen試薬を用いて最適な結晶化条件を検討している。本年度は研究主題とするメロテルペノイド生合成酵素の一つであるダウリクロメン酸合成酵素について、その遺伝子同定から酵素化学的性質に関する研究論文、さらにダウリクロメン酸の植物における生理的意義について考察した報文を印刷公表するに至っている。本研究計画に関してはメロテルペノイド合成酵素の結晶構造解析が主たる目的であるが、本年度はその基盤となる組換え酵素の発現システムについてメチロトロフ酵母および植物培養細胞という異なる宿主を用いて各種検討を行った。このうち植物培養細胞は構造生物学の分野であまり用いられることのないシステムであったものの、ダウリクロメン酸合成酵素およびカンナビノイド合成酵素のいずれも大量発現が可能であることを確認し、これらを電気泳動上単一に精製するスキームを確立した。以上の基礎的な研究に時間を要したため現時点での進捗は遅れているものの、結晶解析に向けて十分量の酵素サンプルが得られており、平成30年度は効率的に研究を推進する。

次いでエレクトロポレーション法を用いた相同組換えによりP. pastorisに形質転換し、DCA synthaseあるいはTHCA synthaseの発現カセットを1, 4及び7コピー導入した組換え体をそれぞれ調製した。メタノールで発現誘導し、細胞外に分泌した各酵素の活性を測定した結果、THCA synthase及びDCA synthase発現株いずれも、単一コピー組換え体に比べ、4コピー及び7コピー組み換え体ではコピー数の増加に依存して比活性の上昇が確認された。組換え酵素を精製した結果、THCA synthase及びDCA synthaseはいずれも糖鎖付加を受けていることが示唆されたため、7コピー発現株にendoglycosidase Hを導入して共発現株を作製した。現在までにDCA synthase及び二種のカンナビノイド合成酵素について、発現、精製システムを確立し結晶解析に向けた材料確保に成功した。今後は精製した三種の各組み換え酵素についてcrystal screen試薬を用いて最適な結晶化条件を検討しつつ、上記還元型基質アナログをソーキングすることにより、リガンドを含有したDCA synthaseおよびカンナビノイド合成酵素の結晶を調製する。次いで大型放射光施設でX線回折像を取得し、既知FADオキシダーゼを鋳型とした分子置換法により位相を決定することで分子モデルを構築する。これらの構造生物学的研究は、豊富な経験を有する本学和漢医薬学総合研究所の森田洋行教授の指導の下行う計画である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
電話回線を利用した音声情報による喉頭がんスクリーニングシステムの開発

喉頭がん、声帯ポリ-プ、反回神経麻痺、声帯結節、声帯溝症、などの喉頭疾患患者と正常対照者345名が発声した持続母音からなるデータベースを作成した。また、これらすべてを公衆電話回線を通して録音した。したがって、データベースはこれら2種類の音声信号のほかに喉頭疾患名、年齢、性別、心理的嗄声評価値(GRBAS評価値)からなる。ジッタ、シマ、喉頭雑音、スペクトル傾斜特性、平均基本周期、といった音響パラメータを直達音声と電話音声について計算し、統計的に検討した結果、スクリーニングの面からは両者に大きな違いがないことが分かった。3層人工ニューラルネットワークを用いて、入力音声を3つのクラス、すなわち強度嗄声(喉頭がんを疑う)、嗄声(専門医の精密検査必要)、正常、に分類するように訓練した。このシステムを国立がんセンタ東病院に設置し、実験を行った。その結果、国立ガンセンター東病院のある柏地区の住民450名が受診した。その結果については現在評価している。1.喉頭がん患者、声帯ポリ-プ患者、反回神経まひ患者、及び正常者、それぞれ60名、合計240名の発声した持続母音/a/の音声資料を収録してデータベースとして整理した。これは直達音声と電話の市外回線を通した電話音声からなる。2.240例の電話音声を共同研究者の海老原(喉頭がん専門医)が聴取し、正常(0)、嗄声(1)、強度嗄声(2)、の3段階評価を行った。食道がん、肺がん、咽頭がん、などによって嗄声が起こることもあるので、喉頭がんとして疑わしい、非常に疑わしい、というかわりに上のような広く嗄声の評価を行うことにした。3.240例の電話音声資料を音響分析し、基本周波数、基本周期の揺らぎに関するパラメータ、振幅の揺らぎに関するパラメータ、喉頭雑音に関するパラメータ、スペクトル特性に関するパラメータを抽出した。4.3層の人工ニューラルネットワークを構成し、上記2の結果を教師信号、3の結果を入力信号として、ニューラルネットを訓練し、専門医の判断論理をシミュレーションするシステムを作成した。5.受診者と対話しながら指示に従って発声した音声を自動的に取り込んでコンピュータに登録し、音響分析を行った後に、ニューラルネットで診断し、結果を受診者に報告するシステムを試作した。6.上記システムを用いて、国立がんセンター東病院で千葉県柏地区住民を対象にして実験を開始した。これまで、約200名の受診者を処理した。1.前年度に引き続いて喉頭がん、反回神経麻痺、声帯ポリ-プ、ポリ-プ様声帯、声帯結節、声帯溝症、などの喉頭疾患患者の音声と80名の正常者の音声を収録してデータベース(直達音声資料)を作成した。これらは、音声信号と患者の個人情報からなる。個人情報は、病名、年齢、性別のほか聴覚的嗄声評価値(GRBAS)も含む。必要に応じて検索、聴取、追加などができる。2.上記直達音声を電話回線を通して収録した音声に、同様の個人情報を付加して、電話音声資料ファイルとして整備した。3.上記直達音声を電話回線を通すことによって喉頭がんのスクリーニングに有用な音響パラメータ、特に声帯振動のゆらぎと喉頭雑音がどのように変化するかについて詳細に検討した。統計的尺度によって比較した結果、電話音声についても専門医の聴覚的評価性能を、直達音声の場合とほぼ同程度に達成できることがわかった。4.上記結果に基づいて3層ニューラルネットワークを訓練し、喉頭がん音声スクリーニングシステムを試作し、柏市(国立ガンセンター東病院所在地)を中心にスクリーニング実験を開始した。これまで約450名が受診した。現在、スクリーニング結果の追跡調査を行っている。
定量電顕組織化学法による糸球体荒廃過程の三次元的解析

1.糸球体荒廃過程の定量的免疫電顕(実験腎症と材料)アミノヌクレオシド(AN)腎症、偏腎摘出老化ラットの腎組織をPEI潅流、IV、III、I型コラゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン(PG)、の局材を追求した。(成績)糸球体硬化部は〓コラゲン、ラミニンの増量が主体である。糸球体基底膜(GBM)の増加、肥厚はラミニンの著るしい増加で、IVコラゲンはみられない。ANでみられる硬化の主体はボーマンのう上皮(印)がGBMから上皮細胞が剥脱した所を、代りに覆う現象である。Epは相互間、GBM上に細胞外物質を作るが、IVコラゲン、ラミニン、フィブロネクチンである。正常の上皮細胞が作っていない新しいIVコラゲンを癒着の部分に作ることが、新しく発見できた。2培養メサンギウム(M)細胞の細胞外物質に対す反応性(方法)M細胞をEHS腫瘍から抽出したE-ゲル中に培養し、形態、増殖、PG合成をみた。対照はIコラゲンゲル(C-ゲル)、同じ條件での線維芽細胞(F)である。(成績)a.形態:E、Cゲルの中の下細胞、Cゲル中のM細胞は細長で紡錘形であるが、Eゲル中のM細胞は放射状である。b増殖:3H-チミジンによるオートラジオグラフィーで、ガラス上、Cゲル中のM細胞は下細胞と同程度の増殖であったが、Eゲル中のM細胞は下細胞に比べ、有意に低い増殖率を示した。CPG合成:35S硫酸の取りこみによるPG量はM、下細胞ともE、Cゲル間に差はなかった。細胞分画のヘパランサァルフェイトの割合をみると、M細胞はガラス上で約50%、ECゲル中で約10%であり、他はコンドメイチン硫酸であった。PGおよびグリコサミノグリカンの分子量をみるとM細胞ではEゲル中がCゲルのものより小さく、F細胞はその逆であった。以上の如く、ラミニンを主とするEゲルは、M細胞にF細胞と異なる影響を与え、形態、増殖、PG代謝に変化をもたらすことを示した。糸球体硬化はヒト腎炎,実験腎炎を問わず,慢性化の終局的な所見である.硬化はボーマン嚢と糸球体係蹄の癒着,基底膜の肥厚,メサンギウム基質の増加が糸球体の一部から発生する.そこには細胞外物質の増加がある.硬化部に増加する細胞外物質を包埋後免疫電顕法と糸球体細胞の培養細胞が作るプロテオグリカンの生化学的分析を行った.包埋後電顕法は次の3つである.1.抗腎抗体静注後1w以内, 4wの糸球体をIVユラゲン,ラミニン,抗ウサギI_gG,抗ラットC_3, C_<1q>,抗体ラットI_gGを調べた.その結果,ラミニンは基底膜全層に分布するが,抗ラットC_3, C_<1q>は基底膜の内側半分にのみ局在していた.すなわち,抗腎抗体による腎炎初期には障害は血管腔に近いところから起こる.慢性化した肥厚基底膜はラミニン,抗基底膜抗体と反応する.すなわち,正常構〓要素が増加している.2.IC型腎炎で沈着した免疫複合体は抗原,抗体,補体が証明され, IVコラゲン,ラミニン,抗基底膜抗体とは反応しない.すなわち,免疫複合体は空間的に場所を,居することがわかった.基底膜の肥厚はIVコラゲンを含まず,ラミニン,抗基底膜抗体と反応する.すなわち,正常の基底膜要素が増加する.3.癒着は糸球体細胞の腫大,どん食,空胞化,変性を経て,脱落する.そして基底膜は裸となる.ボーマン嚢上皮は腫大し,空胞化し,裸となった基底膜を覆う.そして陰性荷電に富む細胞外物質を大量に作る. IVコラゲン,ラミニンが証明される.すなわち,ボーマン嚢との間に繊維性連絡が完成する.糸球体培養では, ^<35>Sサァルフェイト, ^3Hグルコサミンの取りこみから4.メサンギウム細胞は高度に硫酸化されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを主に合成していることがわかった.1.糸球体荒廃過程の定量的免疫電顕(実験腎症と材料)アミノヌクレオシド(AN)腎症、偏腎摘出老化ラットの腎組織をPEI潅流、IV、III、I型コラゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン(PG)、の局材を追求した。

(成績)a.形態:E、Cゲルの中の下細胞、Cゲル中のM細胞は細長で紡錘形であるが、Eゲル中のM細胞は放射状である。b増殖:3H-チミジンによるオートラジオグラフィーで、ガラス上、Cゲル中のM細胞は下細胞と同程度の増殖であったが、Eゲル中のM細胞は下細胞に比べ、有意に低い増殖率を示した。CPG合成:35S硫酸の取りこみによるPG量はM、下細胞ともE、Cゲル間に差はなかった。細胞分画のヘパランサァルフェイトの割合をみると、M細胞はガラス上で約50%、ECゲル中で約10%であり、他はコンドメイチン硫酸であった。PGおよびグリコサミノグリカンの分子量をみるとM細胞ではEゲル中がCゲルのものより小さく、F細胞はその逆であった。以上の如く、ラミニンを主とするEゲルは、M細胞にF細胞と異なる影響を与え、形態、増殖、PG代謝に変化をもたらすことを示した。
酵素反応におけるビタミンB∋⊆補酵素の炭素-コバルト結合活性化の機構

本年度の特定研究では、補酵素機能発現に最も重要なアデノシル基のアデニン部分およびDリボース部分が炭素-コバルト(C-Co)結合のアポ酵素による活性化において果たす役割について、以下に要約される成果を得た。1.ビタミン【B_(12)】補酵素のアデニン部修飾アナログの合成と補酵素喜能アデニン部分を修飾した5つのアナログを合成し、その構造と補酵素機能およびアポ酵素との結合性の関係を明らかにした。トデアザ体および3-デアザ体は天然補酵素のそれぞれ56%,46%の活性を保持していたが、クーデアザ体,【N^6】【N_-^6】ジメチル体,グアノシル【B_(12)】は補酵素として機能せず、拮抗阻害作用を示した。補酵素として活性なアナログのC-Co結合は酵素反応中にホモリシスし、不活性なアナログのそれはアポ酵素に結合しても活性化を受けないことを分光学的に示した。補酵素機能発現およびC-Co結合活性化におけるアデニン部分の窒素原子の重要性の順序はN-7〉6-N【H_2】〉N-3〉N-1であると結論できた。さらに、5′-デオキシアデノシンおよびアデニンの解離定数を測定し、アデニン部分での酵素-補酵素相互作用の性質を考察した。2.補酵素機能発現およびC-Co結合活性化におけるリボース部分の役割補酵素としては機能しないにもかかわらず、C-Co結合がアポ酵素によって活性化され、開裂していくアナログとしてアデニニルエチル【B_(12)】を初めて見い出した。このアナログが酵素とアナログの両方の濃度に依存する二次式に従って分解され、ヒドロキソ【B_(12)】と9-エチルアデニンを生成することを【^(14)C】標識アナログを用いて確立すると共に、後者に新たに取り込まれた水素原子の由来を【^3H】や【^2H】で標識した基質や水を用いて調べた。アデニンとコバルトの間の連結鎖の炭素数が3以上のホモログでは酵素によるC-Co結合の活性化は認められなかったことから、連結鎖の長さと硬さがC-Co結合の活性化を受けるうえで重要であると結論した。
脊椎動物の網膜視細胞の細胞運命決定機構の解析

視覚は人の生活に必須である。目で光を受ける神経細胞である網膜視細胞が形成・維持される機構かを明らかにすることは、学問上の意義のみならず、視覚障害の診断や治療に重要である。私達は視細胞が形成される機構を、主にマウスを用いて解析し、網膜幹細胞の増殖のメカニズム、視細胞の分化と維持のメカニズム、視細胞からのシグナルを伝える網膜双極細胞の機能メカニズムと人疾患の関連について、分子レベルでの理解を大きく進めることができた。我々は、網膜視細胞の運命決定機構の分子機構を解明するために、網膜視細胞におけるOtx2発現制御機構の解析、Otx2蛋白質の機能ドメインの解析などを通じて、視細胞の運命決定における遺伝子制御と蛋白質制御の解析を行って、本年度は下記の研究成果を得た。(1)視細胞の運命決定に必須であるOtx2遺伝子の発現制御因子の同定我々は、マウスOtx2遺伝子の周辺領域-30kb+80kbに視細胞エンハンサーがあることを見出し、この領域からさらに、トランスジェニックマウスを用いた解析で500bpの領域が胎生13日目の視細胞での発現に重要であることを見出した。これをさらに確認するために、500bpのエンハンサー断片の下流にミニマムプロモーター配列とOtx2遺伝子をつなげたコンストラクトでOtx2コンディショナルノックアウトマウスの機能回復実験を行い、この500bpを含むコンストラクトで機能回復されることを見出した。これによって、500bp断片が視細胞の運命決定に必要な遺伝子制御領域であることが確認された。(2)Otx2とCrxの生体機能ドメインの解析Otx2とCrxは同じ視細胞前駆細胞に発現しているが生体機能は異なる。機能互換性があるかどうかを検定するために、我々はBACを用いてCrx-BACにOtx2 cDNAを組み込んだもの、Otx2-BACにCrx cDNAを組み込んだコンストラクトを作成した。Crx-BAC-Otx2 cDNAを用いてCrx KOマウスを、Otx2-BAC-Crx cDNAを用いてOtx2 CKOマウスを機能回復できるか検定したところ、CrxでOtx2 CKOマウスの機能回復がなされたが、Otx2はCrx KOの機能回復できなかった。これによって、視細胞の運命決定には蛋白質の違いより発現のタイミングが重要であることが明らかとなった。我々は、網膜視細胞の運命決定機構の分子機構を解明するために、網膜視細胞におけるOtx2発現制御機構の解析ならびにOtx2蛋白質の機能ドメインの解析を通じて、視細胞の運命決定における遺伝子制御と蛋白質制御の解析を行い、本年度は下記の研究成果を得た。(1)細胞の運命決定に必須であるOtx2遺伝子の発現制御因子の同定我々は、マウスOtx2遺伝子の周辺領域-30kb+80kbに視細胞エンハンサーがあることを見出し、この領域からさらに、トランスジェニックマウスを用いたin vivo解析で500bpの領域が、胎生13.5日の視細胞での発現に重要であることを見出した。これをさらに確認するために、500bpのエンハンサー断片の下流にミニマムプロモーター配列とOtx2遺伝子を繋げたコンストラクトでOtx2コンディショナルKO(CKO)マウスの機能回復実験を行い、この500bpを含むコンストラクトで機能回復されることを見出した。さらに、このエンハンサーに複数の転写因子が結合することを見出し、現在候補となる転写因子の網膜特異的CKOにおけるOtx2の発現を検定中である。この解析から視細胞運命決定の分子機構が明らかになると期待される。(2)錐体で発現する転写因子raxとMEF2Dのコンディショナルノックアウト(CKO)マウスの解析rax-floxマウスとタモキシフェン誘導性のCrx-CreERT2マウスとのかけあわせで、視細胞でのrax CKOマウスを作製し、raxの錐体発生での機能を解析している。rax-flox : Crx-CreERT2のマウスの生後4-6日に2回タモキシフェン投与し、生後21日目に網膜を解析したところ、錐体が特異的に大きく減少しており、raxが錐体の維持に必須であることが明らかとなった。さらに、MEF2D CKOを作製しており、すでにヘテロ状態のものは完成しており、ホモ欠失CKOができ次第、網膜の免疫組織学的解析、生理学的解析を行い、MEF2Dの錐体発生における機能を明らかにしていく。我々は、まずBrdUとIdUを胎生期マウスに投与し、網膜切片の解析から、網膜未分化前駆細胞は最後の細胞周期でOtx2が発現することを見出した。これはOtx2の発現が視細胞運命決定に密接に関与していることを意味する。

次に我々は、主にトランスジェニックマウスを用いたin vivo解析でOtx2遺伝子の上流で進化的に良く保存されている500bpの領域が、Otx2の視細胞エンハンサーであることを見出し、さらに、この500bpを含むOtx2発現コンストラクトを導入したトランスジェニックマウスにおいてOtx2 CKOマウスが機能回復されることを見出した。さらに、このエンハンサーにraxホメオボックス蛋白質とHesファミリー分子が結合し、ルシフェレースアッセイによってraxがエンハンサーを活性化すること、Hes1,5がともにその活性を抑制することを明らかにした。さらに、raxの網膜でのタモキシフェン誘導性CKOマウスシステムを作製し、胎生15日においてrax欠損網膜を作成すると、Otx2の発現が特異的に消失し、Otx2 CKOと同様にPax6陽性細胞が著しく増加した。これらの結果から、視細胞運命決定は転写因子raxとNotch-Hesシグナルが視細胞エンハンサーに作用し、最後の細胞周期でNotch-Hesのシグナルがはずれることによって、網膜前駆細胞に発現するraxがOtx2を活性化するという分子機構が明らかになった。これは、転写因子という細胞内的因子とNotchシグナルという細胞外的因子が鍵となるエンハンサーに作用することによって細胞運命が決定されるというコンセプトを明らかにした成果である。
正常p53cDNAによる大腸癌形質抑制に関与する遺伝子群の単離、同定と機能解析

正常p53蛋白質は転写調節因子であり複数の遺伝子の発現を調節することが報告されている。p53遺伝子の癌抑制活性発現には種々の遺伝子の発現変化を伴うと考えられるが、その詳はまだ不明である。正常p53dcDNAをヒト培養大腸癌細胞に導入して癌形質が抑制された細胞を既に得ており、この癌形質抑制に伴い発現が増加あるいは減少する遺伝子群を同定することは正常p53遺伝子の癌抑制機構の解明につながると考えられる。これまでに元の大腸癌細胞(COKFu)と癌形質抑制細胞(N-p53/CMV CL1)の間でdifferential display法に従ってmRNA発現量を解析し、強度に差が見られたcDNAフラグメントをプローブとしたノーザンブロットを行い、元の大腸癌細胞のmRNAとより強くハイブリダイズするものを3クローン、癌形質抑制細胞のmRNAとより強くハイブリダイズするものを3クローン得ている。これらのフラグメントを再増幅しpCR IIベクターにクローニングした後、シークエンスを決定しデータベース(GenBank,EMBL)によるホモロジーを解析した。その結果、癌形質抑制細胞では発現しているが元の癌細胞では発現していない2つのクローンがヒト細胞間接着関連遺伝子testican、ATP bindingcassette transporterの1つであるABC1遺伝子のそれぞれの3′nonooding領域の一部と一致していた。これらのクローンを用いて癌形質抑制細胞のcDNAライブラリをスクリーニングし、この遺伝子のcoding領域を含むクローンを単離し、ノーザンブロットにより癌形質抑制に伴って発現することを確認した。他のクローンについては、高いホモロジーを示すような既知遺伝子はこれまでに見出されなかった。testicanはrhabdomyosarcomacelllinesにおいて発現の低下が報告されており、大腸においても発現低下により細胞間の相互作用がなくなり細胞の異常増殖に繋がると予想された。今後testicanやABC1遺伝子を大腸癌細胞に導入しその作用を解析していく。正常p53遺伝子が癌抑制活性を発現する際には種々の遺伝子発現も変化すると予想されるがその詳細はまだ解明されていない。正常p53cDNAをヒト培養大腸癌細胞に導入して癌形質が抑制された細胞を既に得ており、この癌形質抑制に伴い発現が変化した遺伝子群を同定することは正常p53遺伝子の癌抑制機構の解明に重要と思われる。これまでに元の大腸癌細胞(COKFu)と癌形質抑制細胞(N-p53/CMV C1.1)の間でdifferential display法によりmRNA発現量を解析し、強度に差が見られたcDNAフラグメントをプローブとしたノーザンブロットを行い、元の大腸癌細胞のmRNAとより強くハイブリダイズするもの、癌形質抑制細胞のmRNAとより強くハイブリダイズするものを数種ずつ得ている。これらはそれぞれ正常p53により発現が低下する遺伝子群と増加する遺伝子群を反映している。これらのクローンは塩基対数は同じであるが配列が異なる複数のcDNAフラグメントを含んでいる可能性が考えられる。そこでこれらのフラグメントを再増幅しpCR IIベクターにクローニングした後、シークエンスを決定し既知の遺伝子とのホモロジーを解析した。その結果、癌形質抑制細胞では発現しているが元の癌細胞では発現していない1つのクローンのシークエンスがヒト細胞間接着関連遺伝子の3 ́noncoding領域の一部と一致していた。このクローンを用いて癌形質抑制細胞のcDNAライブラリをスクリーニングし、この遺伝子のcoding領域を含むクローンを単離し、ノーザンブロットにより癌形質抑制に伴って発現することを確認した。
メタロチオネインによる生体内での量的調節の可能なフリーラジカル除去機能

1.メタロチオネイン合成阻害がフリーラジカル誘起物質の毒性に与えるの影響予め硫酸亜鉛(200μmol/kg)をICR♂マウス(5W)に1回皮下投下して肝臓中のメタロチオネイン濃度を増加させることにより、四塩化炭素(0.5ml/kg)投与で認められる血漿GPT活性の上昇が著しく抑制された。しかしながら、メタロチオネイン合成阻害作用を有するプロパルジルグリシン(500μmol/kg)を硫酸亜鉛投与2日前から1日1回、3日間皮下投与することにより、硫酸亜鉛による肝臓中メタロチオネイン濃度の増加が抑制され、しかも、肝毒性(血清GPT活性の上昇)の軽減も見事に抑制されることが明らかとなった。2.生体内でのフリーラジカル生成に応じたメタロチオネインの量的調節機構ICR♂マウス(5W)に各種フリーラジカル誘起物質(四塩化炭素;0.3ml/kg,メナジオン;400μmol/kg,パラコート;200μmol/kg,セファロリジン;4mmol/kg,アドリアマイシン;35μmol/kg,ブレオマイシン600mg/kg)をそれぞれ1回腹腔内投与して、24時間後に組織(肝臓,腎臓,肺,心臓中メタロチオネイン濃度を測定した。その結果、四塩化炭素では肝臓,腎臓,肺,心臓、メナジオンでは肝臓、パラコートでは肝臓,肺,心臓、セファロリジンでは肝臓,腎臓、アドリアマイシンでは肝臓,心臓およびブレオマイシンでは肝臓,肺,心臓中でそれぞれコントロールに比べて有意にメタロチオネイン濃度が増加した。このように、フリーラジカル誘起物質は生体内でそれ自身がフリーラジカル除去作用を有するメタロチオネインの合成を誘導することが明らかとなった。3.カラゲニン足浮腫に対するメタロチオネインの抑制効果ICR♂マウス(5W)にメタロチオネイン(2.0mg/kg)をカラゲニン投与直前に尾静脈内投与することによって、カラゲニン(1w/v%,20μl/mouse)右後肢足蹠皮下投与で認められる足浮腫の発生が著しく抑制されることが見出された。フリーラジカルの産生が炎症の発現に関与していることから、このような現象はメタロチオネインがカラゲニンによって産生されたフリーラジカルを除去したためと考えられる。以上のように、生体内において、メタロチオネインは量的調節の可能なフリーラジカル除去因子として重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
虚血性網膜疾患の分子病態解明と治療開発

網膜分枝閉塞症を含めた虚血性網膜症の病体形成には、眼内VEGFの動態が深く関与していている。これらの病態において長期的に視力を維持するためには、同じく眼内VEGF濃度を低値に抑えることが望ましいことが明らかになった。また、マウスの実験からは、網膜虚血に随伴する網膜新生血管の形成に、末梢血由来の炎症性細胞の関与は少ない一方、硝子体中のマクロファージの役割は重要であると考えられた。本年度はまず、網膜変性疾患の血管・血球系と網膜神経細胞の役割および分子病態を明らかにするため、成体のマウスの正常網膜における骨髄由来の細胞の役割について骨髄移植を用いて検討した。研究の結果、少なくとも組織が完成した成体においては、骨髄由来の細胞は網膜内にほとんど存在しないことが確認された。しかし、MNUを投与し、成体マウスに網膜変性を誘発すると、多数の骨髄由来の細胞が網膜内に急速に侵入した。主な侵入経路として、網膜血管、毛様体、視神経周囲のくも膜下腔が重要であると考えられた。網膜剥離による網膜神経障害モデルにおいても同様な結果が得られた。骨髄由来の細胞の多くは、網膜に侵入後マイクログリアに分化し、免疫活動に活発に携わっていることが判明した。さらに臨床的には未熟児網膜症におけるVEGFの関与を調べる目的で、未熟児網膜症患者の前房水VEGF濃度を測定し、活動性及びstageとVEGF濃度に関連があることがわかった。さらに網膜変性症の機能的解析を行うため、中型動物モデルとして世界で初めて網膜色素変性のウサギモデル(トランスジェニックウサギ)の作成に成功した。ウサギは眼球の大きさがヒトに近いため、細胞シートの移植や人工視覚の移植実験に使える動物モデルとしても有用であると考えられた。サルを用いた実験では網膜神経節細胞起源の電位起源を含むことで知られる、photopic negative response (PhNR)の局所応答の記録に世界で初めて成功し、黄斑部におけるPhNRの分布特性を明らかにした。この電位の記録は、網膜の虚血性疾患(例えば未熟児網膜症など)の網膜内層機能の評価にも使用できると考えられた。本年度では病的網膜血管新生の分子メカニズムと治療の可能性を明らかにするため、マウスを用いて、生理的な血管新生や高濃度酸素負荷に続発する病的な血管新生における骨髄由来細胞の関与を検討した。高濃度酸素負荷後の網膜では、一部の新生血管にGFP陽性細胞の集積があり、その多くはマイクログリアの特徴を有していたが、網膜内でも骨髄由来細胞の分布は不均一であり、骨髄由来細胞の病態への関与は大きくないと考えられた。つぎに、ヘパラン硫酸(HS)の役割について検討した結果、マウス眼内液中のHSは、器官形成期に一致して濃度が高く、未熟児網膜症など眼の器官形成期特有の病態において病的血管新生を抑制する役割を担っていることが示唆された。実際の症例において未熟児網膜症における前房水中のVEGF濃度と採取時期、stageとの関連について検討したところ、stageの進んでいる方が高く、同じstageでは採取時期が早い方が高かった。抗VEGF抗体投与後はVEGF濃度が著しい低下が確認された。さらに、培養網膜色素上皮細胞(RPE)へのアミロイドβ負荷によりVEGF産生は増加するが、小胞体ストレスを抑制する薬剤によりその抑制が可能であったことから、小胞体ストレスを標的とした薬剤が加齢黄斑変性治療のターゲットとなる可能性が考えられた。加齢黄斑変性の発生病態を形態学的にアプローチするため、脈絡膜に焦点を当て、スペクトラルドメイン光干渉断層計を用いて、正常眼における後極の脈絡膜厚マップを作成し、その分布解析を行ったところ、視神経乳頭下方の脈絡膜が有意に菲薄であることが示された。滲出性加齢黄斑変性症モデルである、マウスレーザー誘発脈絡膜新生血管(以下CNV)モデルを用いて、抗血管新生効果・抗炎症効果の両方を備えたヘパリンの治療効果を検討した。その結果、一定濃度以上のヘパリンを眼内投与することにより、CNVは縮小した(Tomida et al., IOVS 2011 in press)。強膜内陥術を施行した未熟児網膜症のうち、前房水を採取できた18眼のVEGF濃度は1001890pg/mlで、1000pg/mlをこえる眼は1眼を除いて平均修正在胎週数40週以内に集中していた。VEGF濃度は、併用ありで1101±470pg/ml、併用なしで641±284pg/mlであった。我々は、網膜における虚血疾患として糖尿病網膜症に次いで頻度の高い、網膜静脈分枝閉塞(BRVO)に対する抗VEGF療法の功罪について詳細に検討した。BRVOの無灌流領域(NPA)の面積をデジタル画面上で測定し、抗VEGF療法前後のNPA面積を比較した。その結果、1回の抗VEGF療法の前後でNPAの面積は有意に変化しないことを報告した(Terui et al. Retina. in press)。

また、BRVOの68名に対する抗VEGF療法の結果を検討した結果、浮腫の発症早期で浮腫がそれほど高くない時期に抗VEGF療法を行った症例では、再発時に投与前よりも浮腫が高くなるリバウンド現象が起こりやすいことを見いだした(Yasuda et al. Retina. in press)。脈絡膜厚の解析を光干渉断層計を用いて行った結果、正常眼では視神経乳頭下方に脈絡膜厚の菲薄化領域があることが見つかった。また、中高年の強度近視眼では、経時変化で眼軸の延長、後部ぶどう腫高の増加、脈絡膜厚の非薄化が起こっていた。
セマフォリン分子　Ｓｅｍａ７Ａの腸管炎症制御作用の解析

消化管は栄養素の消化吸収機能のみならず免疫機能も有する組織である。常に外来抗原である食物と接することから、消化管組織における免疫反応は厳密に制御されていなければならない。消化管における免疫制御の破綻は炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎及びクローン病)の発症につながる。消化管における免疫応答制御に関与する細胞として、近年、腸管マクロファージが注目されつつある。腸管マクロファージは過剰な免疫応答の抑制において中枢的役割を果たしており、その制御の破綻は腸内細菌に対して過剰な免疫反応を惹起し、炎症性腸疾患のような慢性炎症の引き金となる。しかしながら、この腸管マクロファージの制御メカニズムはまだ明らかになっていない。申請者はSema7Aは腸管上皮細胞の基底膜に特異的に高発現し、腸管粘膜固有層に常在する調節性マクロファージとの相互作用する際に、炎症性マクロファージとの異なる受容体であるαβインテグリンを介して、その下流のシグナルを活性化し、マクロファージに免疫抑制性サイトカインであるIL-10の分泌を誘導することを明らかにした。さらにSema7A欠損マウスの解析から、Sema7Aを介したマクロファージによるIL-10産生が腸管免疫恒常性維持に重要な役割を担うことが明らかとなった。これらの結果は、マクロファージのサブセットによってSema7Aの受容体の発現パタンが異なり、特に、腸管免疫システムにおいてのSema7Aは炎症抑制性機能を持ち、Inflammatory Bowel Diseaseなど難治療性腸疾患の治療に向けた分子標的候補となる可能性を示唆している。当初研究目的のように、本研究では大腸炎モデルマウスを用いSema7Aとインテグリンによる腸管上皮細胞とマクロファージの相互作用を媒介する分子メカニズムを明らかにした。さらに、Sema7Aは腸管マクロファージのIL-10産生を誘導することにより、大腸炎モデルマウスにおいて炎症を抑制する治療効果があることが明らかになった。これらの結果により、当初の研究目的に十分に達成する結果を得られたと考えられる。今まで、大腸炎モデルマウスにおいてのSema7Aの機能解析を行い、腸管免疫システムにおいての炎症制御機構を明らかにした。これらの結果に基づいて、今後、炎症性腸疾患者からの検体を用い、ヒトにおいてSema7Aの腸管免疫反応制御システムにおいての影響を検討する。
震災復興ボランティア活動を介した発達障害学生の社会参加支援プログラムの構築

本研究の目的は、発達障害を含む社会性に困難な背景をもつ大学生の、社会参加を支援するプログラムを開発することにある。プログラムは学生相談室とボランティアセンターが共同で計画し、1個別相談、2SSTを基本としたグループワーク、3ボランティア活動の3つをコンテンツとして、10ヶ月間にわたって行われた。登録者数は26名で、グループワーク(全11回)の延べ参加者数は72名、ボランティア参加に至ったのは2名であった。アセスメントで明らかになったのは、精神疾患や不登校、家族関係のこじれなど、様々な問題を重層的に抱え、自己像の傷つきが著しい、「二次障害」が前景化した学生が登録者の過半数を占めることだった。そこでまずプログラムの軸を、社会場面にエントリーするための基盤強化に置いた。とくにグループワークは、参加の持続を最優先にし、特性に起因する問題や困難には段階的にアプローチする心理的安全性の高いグループの創出に配慮した。具体的には1ブレインストーミング法に基づく批判的意見の禁止、参加者全員の発言機会の保証、2小グループ化(1グループ23名)の徹底、3各小グループにファシリテーター配置、4脆弱性の共有、といった取り組みである。なお4は、発達特性に由来する困難感のチェックシートを記入後、ファシリテーターが「私たち皆、苦手なことはありますよね」と、問題や困難を「私たち」のストーリーとして、グループで共有するよう積極的に働きかけるものである。個別相談で自己像に言及するとき、過度に自罰的、他罰的な表現となる学生も、このグループ構造においては「自分もこれが苦手で...」と、シートを使って冷静かつ自発的に、苦手さや困難感を言語化することが出来ていた。このワーク後も継続的に個別相談を利用した学生のうち2名がボランティア活動にエントリーしたほか、自己の特性に合わせた活動の選択に前向きな姿勢を示していた。