hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温超電導磁気軸受で支持された回転体の動力学現象の解明

電力貯蔵用フライホイールなどへの応用が期待されている高温超電導磁気軸受を用いた系では,非接触による低減衰性と電磁力に起因する非線形性とから,系に非線形振動が生じやすいと考えられる.そこで,本研究では,浮上磁石回転時に生じうる非線形振動現象の一つである結合調波共振について、非線形力学系の理論に基づき解析的に検討を行い,実験との比較,検討を行った.まず,回転する浮上磁石の水平,鉛直方向変位を考慮した3自由度の運動方程式を導出し,多重尺度法を用いた解析的な検討から,水平方向の固有振動数と垂直方向の固有振動数の和に近い振動数で磁石が回転しているとき,各方向の振幅が増大する結合調波共振が生じる可能性がある事を理論的に示した.また,結合調波共振は磁石の重心と磁気中心の偏心量がある臨界値以上であるときに生じること,結合調波共振時にみられる水平方向,鉛直方向の支配的な振動数は,各方向の固有振動数から回転周波数にしたがってわずかに変化することを示した.また,その励振された振動数の和が回転振動数になっていることを明らかにした.つぎに,浮上磁石回転軸の傾きを考慮に入れた運動の数値解析を行い,この場合にも結合調波共振が生じることを確認した.また,3自由度の運動解析結果との相違について検討し,解析の妥当性を示した.さらに,非接触の浮上回転実験を行った.レーザードップラー面内振動計により磁石の回転数およびふれ回りの変位を測定し,レーザー変位計を用いて磁石の鉛直方向の変位を測定した.この実験により,解析と定性的に一致する結合調波共振が生じることを確認した.高温超電導磁気浮上系の応用分野の一つとして電力貯蔵用フライホイールの磁気軸受としての研究が進められているが,その磁気的な非接触支持機構の回転軸受としての利用可能性や浮上体回転時の挙動は十分に明らかにされていない.そこで,本研究では,高温超電導磁気浮上系について,磁石に作用する電磁力およびトルクの特性および浮上磁石回転時の動力学的挙動について解析的および実験的に評価を行い,以下の成果を得た.まず,冷却時の磁束を捕捉するという第II種超電導体の性質を反映した発展鏡像法に基づいて,磁石に作用する力・トルクを評価する式を導出し,数値計算および実験により同手法の妥当性を確認した.さらに,超電導による非接触支持機構が磁気抵抗のない効率的な回転軸受として作用することを理論的に確認した.次に,発展鏡像法を利用した6自由度の運動解析手法および解析結果を提示し,数値シミュレーションや解析的評価により浮上体の回転挙動の把握が可能であることを確認した.具体的には,電磁力の解析的評価結果より得られる非線形の運動方程式について,鉛直・水平・回転運動の連成などの性質を考察し,近似解析や直接数値積分による解析からその挙動を定量的に求め,特に定常解の安定性,解の分岐などを調べた.一方,モータによる非接触回転駆動機構を備えた浮上磁石回転システムを製作し,レーザ外径機,レーザ変位計,レーザドップラー面内振動計などを用いて,定常および非定常回転時の水平方向や鉛直方向の振動や回転速度を測定した.その結果,上述の解析結果の一部と対応する実験結果を得ることができた.次年度は,この解析手法をもとに,非線形性に起因する分数調波共振,内部共振,カオス現象,自励振動などを調べるとともに,実験において多自由度の運動の同時測定を可能とすることを試みる.電力貯蔵用フライホイールなどへの応用が期待されている高温超電導磁気軸受を用いた系では,非接触による低減衰性と電磁力に起因する非線形性とから,系に非線形振動が生じやすいと考えられる.そこで,本研究では,浮上磁石回転時に生じうる非線形振動現象の一つである結合調波共振について、非線形力学系の理論に基づき解析的に検討を行い,実験との比較,検討を行った.まず,回転する浮上磁石の水平,鉛直方向変位を考慮した3自由度の運動方程式を導出し,多重尺度法を用いた解析的な検討から,水平方向の固有振動数と垂直方向の固有振動数の和に近い振動数で磁石が回転しているとき,各方向の振幅が増大する結合調波共振が生じる可能性がある事を理論的に示した.また,結合調波共振は磁石の重心と磁気中心の偏心量がある臨界値以上であるときに生じること,結合調波共振時にみられる水平方向,鉛直方向の支配的な振動数は,各方向の固有振動数から回転周波数にしたがってわずかに変化することを示した.また,その励振された振動数の和が回転振動数になっていることを明らかにした.つぎに,浮上磁石回転軸の傾きを考慮に入れた運動の数値解析を行い,この場合にも結合調波共振が生じることを確認した.また,3自由度の運動解析結果との相違について検討し,解析の妥当性を示した.さらに,非接触の浮上回転実験を行った.レーザードップラー面内振動計により磁石の回転数およびふれ回りの変位を測定し,レーザー変位計を用いて磁石の鉛直方向の変位を測定した.この実験により,解析と定性的に一致する結合調波共振が生じることを確認した.
乳酸桿菌による自然免疫賦活化メカニズムの解明

また、マウス脾細胞溶解液においてラムノース-ビオチンプローブおよび抗マウスCD14抗体を用いたウェスタンブロッティングによる解析を行い、宿主ラムノースレセプターとしてCD14の関与が推察された。すなわち、自然免疫賦活化には菌体表層因子のラムノースがラムノース結合性C型レクチンとしてCD14を介し、宿主の自然免疫賦活化に関与することが推察された。野生株のみを添加した際に認められたTNF-α発現亢進は、貪食阻害剤およびCa2+キレート剤を添加した際には認められなかった。また、野生株の菌体表層構造を取り除いたペプチドグリカン(ATCC27139-PG)または免疫賦活化欠失株の加熱死菌体(MT77-ICW)と共培養した際にもTNF-α発現亢進は認められなかった。以上のことから、マクロファージなど貪食細胞による貪食およびATCC27139の菌体表層構造が自然免疫賦活化には不可欠であると示唆された。一方、ATCC27139による自然免疫賦活化にはCa2+が関与することが示唆された。したがって、ATCC27139の自然免疫賦活化には菌体表層構造の構成因子と宿主C型レクチンレセプターとの結合が不可欠であると推察された。そこで、菌体表層多糖構成成分であるガラクトース、ラムノースまたはグルコースを同時添加し、同様に計測したところ、野生株のみを添加した際に認められたTNF-α発現亢進はラムノースを添加した際にのみ有意に低下した。以上のことから、ATCC27139の自然免疫賦活化には菌体因子としてラムノースが関与することが示唆され、ATCC27139の自然免疫賦活化には宿主のラムノース結合性C型レクチンレセプターが関与することが推察された。マウス脾細胞を用いた競合阻害解析により乳酸桿菌による自然免疫賦活化に不可欠な菌体因子を同定し、研究項目1を達成した。現在は研究項目2である自然免疫賦活化に関わる新規宿主レセプターの同定については、同様にマウス脾細胞を用いた試みており、研究はおおむね順調に進展している。Lactobacillus casei ATCC27139の自然免疫賦活化に関わる菌体因子および宿主レセプター分子を推測するため、マウス脾細胞(7.5×10^5 cells/ml, C57BL/6N)と野生株加熱死菌体(15 μg/ml)を3日間共培養し、TNF-α産生量をELISAにより計測した。野生株のみを添加した際に認められたTNF-αの有意な産生亢進は、貪食阻害剤およびCa2+キレート剤を添加した際には認められなかった。また、野生株のペプチドグリカンまたは免疫賦活化欠失株の加熱死菌体と共培養した際にもTNF-αの産生亢進は認められなかった。以上のことから、自然免疫賦活化にはマクロファージなど貪食細胞による貪食およびATCC27139の菌体表層構造が不可欠であり、菌体表層構造のレセプター分子としてC型レクチンレセプターが推察された。菌体表層構造の構成因子であるガラクトース、ラムノースまたはグルコースを同時添加し、同様の方法にてTNF-α産生量を計測したところ、ラムノースを添加した際にのみTNF-αの産生亢進は有意に低下した。したがって、ATCC27139の自然免疫賦活化には菌体因子としてラムノースが関与することが示唆された。免疫賦活化に関わる宿主レセプター分子を推測するため、マウス脾細胞溶解液について関与が推察されているラムノース糖鎖プローブおよび抗マウスCD14抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、検出されるバンドサイズを比較した。その結果、ラムノース糖鎖プローブを用いた際に認められる検出バンドは抗マウスCD14抗体を用いた際にも同サイズにて認められ、ATCC27139の自然免疫賦活化には菌体表層因子のラムノースがラムノース結合性C型レクチンレセプターとしてCD14を介し、宿主の自然免疫賦活化に関与することが推察された。研究項目2である自然免疫賦活化に関わる新規宿主レセプターの同定について引き続き実験を行うとともに、予定通り菌体表層多糖についても構造の決定を試み、菌体表層構造と自然免疫賦活化作用との関連を明らかにする。細菌学本研究内における重要性、および使用予定機器、実験協力者の都合から平成28年度を予定していた研究計画3であるinvitroにおける宿主レセプターの解析を先んじて始めたのとともに、研究計画1である自然免疫賦活化に関わる菌体表層構造の解析を平成28年度に行うこととなり、結果使用予定分との相違が生じた。次年度の消耗品費(1,460千円)は想定している。内訳は以下の通りである。実験動物購入費等に500千円、菌体構造解析用試薬等購入費に360千円、細胞培養用試薬等購入費を200千円、および一般試薬および培地等購入費に400千円を想定している。
D型インフルエンザウイルスとウシ呼吸器病症候群の関連性の解明

近年米国で発見されたD型インフルエンザウイルスは、ウシ呼吸器病症候群(BRDC)の患畜から高頻度でウイルス遺伝子が検出されることから、BRDCの原因ウイルスの一つである可能性が示されている。これまでに私たちは日本にもD型ウイルスが侵淫していることを初めて明らかにした。本研究では、わが国のウシやブタなどの家畜おけるD型インフルエンザウイルス感染の実態を大規模に調査し、そのBRDCとの関連性や、日本に存在するD型インフルエンザウイルスの生物性状を明らかにすることを目的とする。本年度はまずリバースジェネティクス法の開発とその改良に取り組んだ。ウイルスRNAを発現するプラスミド7種とウイルスのポリメラーゼと核タンパク質を発現するプラスミド4種を293T細胞あるいはHRT-18G細胞にトランスフェクションし、上清中に放出されるウイルス量を比較したところ、HRT-18G細胞の方が多かった。しかし、作製したウイルスの増殖性は、シークエンスは野生型と同一であるにもかかわらず、野生型よりも100倍程度が低かった。その原因を調べるために、ウイルス粒子内に取り込まれるRNA量を比較したところ、作製した組換えウイルスは野生型よりも少ない遺伝子分節があることがわかった。そこでトランスフェクションするプラスミドの割合を変更したところ、野生型と同様の増殖性を持つウイルスの作製に成功した。疫学調査の一環としてウイルス分離を試みた。山形県で呼吸器症状を示したウシの呼吸器スワブから、ウイルスが分離された。分離されたウイルスはこれまで報告のあるD型ウイルスとは遺伝的に異なるウイルスであることがわかった。今後その性状を解析する予定である。当初の計画通りに、D型インフルエンザウイルスのリバースジェネティクスの開発と疫学調査が進展したため。当初の計画通りに今後も、わが国の家畜におけるD型インフルエンザウイルス感染実態の血清学的疫学調査、ウシのBRDC発症とD型インフルエンザウイルス感染の関連性調査、D型インフルエンザウイルスの分離と性状解析、およびD型インフルエンザウイルスの動物感染モデルの確立について研究を進めていく。本年度はわが国の家畜におけるD型インフルエンザウイルス感染実態を明らかにする目的で、疫学調査した。血清疫学的調査では、日本で採取したウシ、ブタ、ヒツジ、ウマの血清についてHI抗体の検出を試みた。本年度に採取したウシ試料50検体で陽性個体はいなかった。その他のブタ、ヒツジ、ウマについてもHI抗体陽性個体はいなかった。また呼吸器病のウシの鼻腔スワブからRT-PCRによるD型ウイルスの遺伝子検出を試みた。本年度に採取した60検体についてはすべて陰性であった。これらの結果から、本年度はD型ウイルスの流行はほとんどなかったと考えられる。D型ウイルスのウイルス学的性状解析のために、リバースジェネテクスの開発を試みた。その結果、RNA polymerase Iを用いる系でD/Oklahoma/1334/2011ウイルスの作出に成功した。今後は様々な変異ウイルスを用いてウイルス性状を明らかにしていく予定である。当初の計画通りに、D型インフルエンザの疫学調査、D型ウイルス性状解析が進展したため。

当初の計画通りに今後も、わが国の家畜におけるD型インフルエンザウイルス感染実態の血清学的疫学調査、ウシのBRDC発症とD型インフルエンザウイルス感染の関連性調査、D型インフルエンザウイルスの分離と性状解析、およびD型インフルエンザウイルスの動物感染モデルの確立について研究を進めていく。
低体温時の至適酵塩基状態ー脳代謝の面からみてー

1%ハロセン麻酔下の雑種成犬で実験を行った. 62年度は38°Cで対照値の測定,脳組織の採取(N=8)をした.次に30°Cの低体温下,各群の測定,検体の参取(N=13)を行った.30°CでPco_2(37°C値)は,ハイパーカプニア群(HY群)は52.8mmHg,ノルモカプニア群(NO群)は45.2mmHg,ハイポカプニア群(PO群)で34.3mmHgであった.1.動脈血pH(37°C値)は,対照値に比べHY群で7.21, NO群で7.24, PO群で7.33と低下した.髄液のpHはそれぞれ7.27, 7.4, 7.39と,血液に比べアルカリ側に位置した.しかしpHセンサーによる脳皮質のpHは6.8, 6.45, 6.74とより酸性を示した.2.心拍出量は対照値の54.5, 62.5, 43.1%に低下した.38°Cに比べ血圧,脈拍も低下,減少したが,循環面で各群間に差はない. 3.脳血流(CBF)は,それぞれ対照値の86, 71.8, 38.3%に低下し,以前発表したように低体温時もCBFはPco_2の変化に相関する事を示した.4.全身の酸素消費量は,それぞれ対照値の45.2, 47.4, 48%に低下した,脳皮質酸素消費量は106.4, 77.3, 84.9%となり,低体温時には全身に比べて脳皮質の酸素消費の減少の割合が小さかった.5.乳酸,ピルビン酸, L/p比,髄液のカリウム値は,対照値との間で,また群間にも差はない. 6.脳皮質組織中のATP濃度は38°Cで1.35μmol/l, 30°Cでそれぞれ1.53, 1.29, 1.29μmol/lと差はない.同組織のEnergy charge potentialは38°Cで0.89,30°Cでそれぞれ0.91,0.85,0.86だった. 5, 6の結果から, 30°Cの低体温で各群とも脳皮質の虚血や代謝の異常はなかったと考えられる.以上, 30°C低体温の実験結果からは,脳代謝の面からみた至適酸ー塩基状態は特定できない.現在30°Cの各群の実験を継続するとともに, 20°C低体温下の実験を開始した.さらに38°Cに復温した状態の実験を予定している.人為的低体温の目的が中枢神経系の保護にある以上、低体温時の体組織至適酸塩基状態の追究においては、脳の機能や代謝の変化が主な指標になるべきである。この概念に基いて実験研究を行ってきた。A研究方法の洗練と実験の手技的熟練:1脳組織の採取(1)吸引法:諸種生化学的測定に必要な量(1g以上)の脳組織を、可及的に損傷を少くして採取する技術。(2)圧挫法:吸引法で採取した脳組織を、冷却圧挫鉗子で圧挫する段階で、混入した血液を除去する技術。上記(1),(2)とも漸く使用に耐える段階にまで向上したが、本実験で良好な成績を期待するには足りず、一層の工夫と熟練が必要である。2脳組織のpH測定:当初は脳組織P【co_2】の測定を予定していたが、constant relative alkalinityの概念の実証のためには、脳組織pHの追究が妥当と考え、現在脳表面から57mmの深さでpHを測定している。脳組織pHは脳静脈pHより約0.6低い。血液pH変化と脳組織pH変化の相関については、現在の予備実験の段階ではバラツキがあって明らかではない。例数の積重ねが必要である。組織ガス分圧測定装置(クラレKR-500)のセンサー回路に内蔵されている温度補正式の妥当性について現在検討中であるが、ほぼ使用に耐えると思われる。3脳脊髄液の採取と測定血液の混入を完全には排除できないので工夫が必要である。B今後の実験計画:上記のいくつかの問題点を解決しながら、矛定の本実験に着手する。1%ハロセン麻酔下の雑種成犬で実験を行った. 62年度は38°Cで対照値の測定,脳組織の採取(N=8)をした.次に30°Cの低体温下,各群の測定,検体の参取(N=13)を行った.30°CでPco_2(37°C値)は,ハイパーカプニア群(HY群)は52.8mmHg,ノルモカプニア群(NO群)は45.2mmHg,ハイポカプニア群(PO群)で34.3mmHgであった.1.動脈血pH(37°C値)は,対照値に比べHY群で7.21, NO群で7.24, PO群で7.33と低下した.髄液のpHはそれぞれ7.27, 7.4, 7.39と,血液に比べアルカリ側に位置した.しかしpHセンサーによる脳皮質のpHは6.8, 6.45, 6.74とより酸性を示した.2.心拍出量は対照値の54.5, 62.5, 43.1%に低下した.

38°Cに比べ血圧,脈拍も低下,減少したが,循環面で各群間に差はない. 3.脳血流(CBF)は,それぞれ対照値の86, 71.8, 38.3%に低下し,以前発表したように低体温時もCBFはPco_2の変化に相関する事を示した.4.全身の酸素消費量は,それぞれ対照値の45.2, 47.4, 48%に低下した,脳皮質酸素消費量は106.4, 77.3, 84.9%となり,低体温時には全身に比べて脳皮質の酸素消費の減少の割合が小さかった.5.乳酸,ピルビン酸, L/p比,髄液のカリウム値は,対照値との間で,また群間にも差はない. 6.脳皮質組織中のATP濃度は38°Cで1.35μmol/l, 30°Cでそれぞれ1.53, 1.29, 1.29μmol/lと差はない.同組織のEnergy charge potentialは38°Cで0.89,30°Cでそれぞれ0.91,0.85,0.86だった. 5, 6の結果から, 30°Cの低体温で各群とも脳皮質の虚血や代謝の異常はなかったと考えられる.以上, 30°C低体温の実験結果からは,脳代謝の面からみた至適酸ー塩基状態は特定できない.現在30°Cの各群の実験を継続するとともに, 20°C低体温下の実験を開始した.さらに38°Cに復温した状態の実験を予定している.
確率微分方程式と非線形フィルタ-の研究

本研究では次の二つの課題において成果を得た。1.確率微分方程式と超関数。二階放物型偏微分方程式の解は、初期条件がなめらかな関数であれば、適当な確率微分方程式の解を用いて表現される(FeynamanーKacの公式)。本研究では初期条件がSchwartzの超関数で与えられる場合についても、その超関数解が、確率微分方程式の解と超関数の合成を考察することによって得られることを示した。この表現定理にMalliavin Calculusを適用することにより、Hormanderの準楕円性定理の確率論的証明を与えた。2.非線形フィルタ-のベイズ型表現とその安定性。非線形フィルタ-のアルゴリズムを求めるために、通常ノイズはホワイトノイズであることが仮定されている。本研究では、ホワイトノイズでなくても正規型のノイズであれば、フィルタ-を求めるベイズ型の公式が成立することを示した。また正規型のノイズがホワイトノイズに弱収束すれば、フィルタ-をホワイトノイズ型のフィルタ-に収束することを示した。3.混合性のある確率変数列に関する極限定理。独立確率変数の和に関する極限定理については詳細な研究がある。本研究では混合性をもつ従属確率変数列に関する極限定理として次の成果を得た。(a)確率変数列の滞在時間の極限として、ガウス型確率測度とポアソン型確率測度を導びいた。(b)上記確率変数列で駆動される確率差分式の極限として、飛躍型拡散過程を導いた。またそれが、(a)の極限測度を用いて表現されることを示した。
歯髄幹細胞分離法の確立とシグナルネットワーク制御による硬組織再生の新規パラダイム

コロニーアイソレーション法にてヒト歯髄組織より分離した歯髄幹細胞は、間葉系幹細胞マーカーを高く発現しているとともに多分化能も具備していることから、再生療法への応用が可能な品質が担保されていた。また、分離した歯髄幹細胞をスフェロイド三次元培養した結果、インテグリンシグナルが活性化し、硬組織形成細胞への分化が誘導された。一方、コラーゲン内にて三次元培養した結果、硬組織形成細胞への分化が抑制された。インテグリンをはじめとするシグナルを制御するとともに、スキャフォールドとしてコラーゲンを使用することで、歯髄組織全体の再生を誘導できる可能性が示唆された本研究の目的は、歯髄組織由来未分化間葉系細胞の分離手法を確立すること、さらに歯髄幹細胞分化におけるシグナルネットワークを包括的に解析することにより、新しいパラダイムを構築し、その結果の臨床応用への展望を図ることである。そのために下記課題について検討する。今年度は下記課題について検討した。1.確実な歯髄組織由来未分化間葉系細胞の分離手法の確立:間葉系幹細胞を未分化な状況で分離する手法に基づいて、歯髄組織より細胞を分離することが可能であった。歯髄組織のみならず、歯肉組織、歯根膜組織からの分離も同様に可能であった。分離された細胞には、間葉系幹細胞マーカーの高い発現が確認された。さらに、in vitroにおいて、骨芽細胞/象牙芽細胞への分化のみならず、軟骨、脂肪への分化が確認された。2.歯髄組織由来未分化間葉系細胞の硬組織形成細胞への分化誘導:未分化間葉系幹細胞分離方法を応用し、分離された歯髄幹細胞をスフェロイド培養することにより、骨芽細胞および象牙芽細胞への分化傾向が示された。これは、歯髄細胞が本来硬組織を形成する能力を保持しているためと推察される。さらにマウス頭蓋への移植実験においても、骨様硬組織の形成が確認された。スフェロイド培養による移植は、スキャフォールドを使用しないため、感染、炎症のリスクを無くすことができるうえで臨床上有用であると思われる。間葉系組織である歯髄組織には、間葉系幹細胞が存在しており、歯髄幹細胞と呼ばれている。歯髄幹細胞は他の間葉系幹細胞と同様、間葉系幹細胞マーカーを高発現しているが、その特性の詳細は未だ明らかではない。また、歯髄幹細胞の分離方法について、これまで統一された方法はなく、各研究者が独自の方法で分離しているのが現状である。未分化間葉系幹細胞としての特性を維持するためには、細胞間のコンタクトを排除することが重要であることから、我々は、幹細胞分離の際に、形成されたコロニー同志がコンタクトしないような細胞濃度で播種するとともに、分離した後も十分にスパースな状況で細胞を維持した。このような手法により、安定的に歯髄組織より歯髄幹細胞を採取することが可能となった。さらに、歯髄幹細胞の特性について検討することを目的として、歯髄幹細胞の三次元スフェロイド培養を行った。通常細胞培養は2次元平面ディッシュ上にて行うが、オリジナルの組織は3次元であるため、もともとの特性を解析する上で3次元スフェロイド培養は有用である。その結果、3次元培養した歯髄(幹)細胞は、硬組織形成細胞としての特性を強く示すことが明らかになった。間葉系幹細胞として多様な細胞に分化誘導することが可能な歯髄幹細胞であるが、硬組織形成細胞へのコミットメントがその基本にあると考えられる。さらに、3次元スフェロイド培養において、接着斑下流のシグナル因子がリン酸化されていることが明らかになり、インテグリンシグナルが硬組織形成細胞への分化に関与している可能性が示唆された。歯髄幹細胞を三次元スフェロイド培養することにより、硬組織形成細胞への分化誘導が容易に行うことが可能となることから、三次元スフェロイド培養した歯髄幹細胞を臨床応用することで、骨あるいは象牙質の再生することができるものと期待される。未分化間葉系幹細胞である歯髄幹細胞は、間葉系マーカーを発現しており、多分化能を有することが特徴であり、臨床における再生医療の有力なソースとして期待されている。しかし、歯髄組織から効率よく歯髄幹細胞を分離するための手法はいまだ確立されていない。STRO-1といった典型的な間葉系幹細胞の表面抗原に対するFACSを用いての回収では、回収された細胞の幹細胞としての特性は優れていると報告されているが、回収効率が悪いのが大きな問題である。今回、歯髄組織から効率的に歯髄幹細胞を分離回収するために、間接滑膜由来の間葉系幹細胞の分離システムを応用し、歯髄組織からコラゲナーゼ、ストローメライシンにより個々の細胞に分離した歯髄細胞を適度な濃度で培養し、コロニーを形成した細胞を回収し、歯髄幹細胞として実験に供した。本システムを使用することで、単一な細胞集団ではなくヘテロな細胞集団であるものの、比較的多くの幹細胞を分離することが可能である。しかし、分離した歯髄幹細胞をP0あるいはP1で臨床に使用するには細胞数が少なすぎる。そのため、歯髄幹細胞を何代か継代培養する必要がある。しかし、継代培養の条件について十分な検討はされていない。今回、歯髄幹細胞の培養条件を疎あるいは密にし、歯髄幹細胞特性に与える影響について検討する。また、歯髄幹細胞以外に、口腔内において容易に採取できる組織として、歯肉組織がある。

歯肉組織に含まれる歯肉幹細胞を分離し、歯髄幹細胞と比較することで、歯髄幹細胞以外口腔内における幹細胞の特性を把握し、またその臨床での使用の可否について検討する。さらに、臨床における移植を考える際にスフェロイド培養した歯髄幹細胞を局所に移植することで、コラーゲン等のスキャフォールドを使用することなく移植することが可能である。スフェロイド培養した歯髄幹細胞の特性についても検討する。歯髄組織から歯髄幹細胞を分離するにあたり、間接滑膜由来の幹細胞を分離する手法に準じて分離を行い、間葉系幹細胞マーカーの発現が高い分画を得ることができた。これらの細胞を分化誘導したところ、骨、軟骨、神経への分化誘導が可能であった。特に、三次元スフェロイド培養した歯髄幹細胞は石灰化Nodule形成を顕著に示し、骨芽細胞マーカーを高発現していた。すなわち、歯髄幹細胞は、硬組織形成細胞への分化能が高い細胞であり、臨床において骨、象牙質といった硬組織再生が必要な場における再生医療のソースとして有用であると推測される。実際、SCIDマウス頭蓋に形成した骨欠損に移植したところ、骨様の硬組織形成が確認された。しかし、歯髄組織の再生において、非石灰化組織である歯髄組織を誘導するためには、石灰化を制御する必要がある。コラーゲン内にて培養した歯髄幹細胞は、骨芽細胞マーカーの発現が概して低発現だったことから、コラーゲンをスキャフォールドとして使用することで、非石灰化組織である歯髄組織の再生を図ることが可能ではないかと推察される。歯髄組織に存在する幹細胞の存在は10年ほど前に報告され、その後多数の研究者により検証されている。未分化間葉系幹細胞である歯髄幹細胞は、神経、血管、脂肪といった組織・細胞に分化する能力を有しているが、特に硬組織形成細胞に分化する能力が高い。しかし、歯髄組織の量は限られており、歯髄幹細胞をいかに効率的に採取するのかは大きな課題である。また、歯髄幹細胞を組織再生に応用する場合、どのような組織の再生に使用するのか、その際にどのような手法を用いるのかについて、いまだ結論は出ていない。歯髄幹細胞の分離において、幹細胞マーカーを用いたFACSによる分離法が一般的である。しかし、分離できる細胞数が少ないという大きな欠点を有する。我々は、間葉系幹細胞の特性の一つである高い分裂能を指標とし、コロニー形成細胞を分離することで、ヘテロな集団ではあるが、多くの間葉系幹細胞を分離することが可能であった。さらにこれらの細胞は、間葉系幹細胞マーカーを高く発現していた。幹細胞の臨床応用において、コラーゲンをはじめとするスキャフォールドの使用が一般的であり、スキャフォールドにより局所への適用が容易となる。しかし、スキャフォールドは生体にとって異物であり、炎症反応を惹起する可能性がある。今回、コロニーアイソレーション法にて分離した歯髄幹細胞を、スフェロイド三次元培養することにより、スキャフォールドフリーの状態で局所に応用することが可能であった。その結果、細胞懸濁液で応用した場合と比較して、硬組織形成能が高まっていることが確認された。この結果から、スフェロイド三次元培養した歯髄幹細胞を骨再生あるいは象牙質再生といった硬組織形成へ応用することが有効であると推察される。これらの結果を踏まえ、歯髄幹細胞の臨床での応用についてさらに検討を進める予定である。歯髄幹細胞分離法、特性解析において問題なく進行している。
知識活用を指向したビデオ教材による知識獲得のための知識構造再構成アプローチ

反転学習やMOOCsへの注目が示しているように,ビデオ教材の普及は,知識活用の準備としての個別学習による知識獲得を行いやすくした一方で,学習者の自立性が求められる.本研究では,教師が伝えたい知識の構造の学習者による再構成をベースとして,ビデオ学習における知識獲得のための具体的なタスクを設定し,知識活用の前提としての知識獲得の支援の実現を目指す.そして,ビデオ学習をガイドすると同時に,学習者の理解だけではなく,タスク遂行の観点から適応的な支援をし,有意義な学習体験を実現することを目指す.反転学習やMOOCsへの注目が示しているように,ビデオ教材の普及は,知識活用の準備としての個別学習による知識獲得を行いやすくした一方で,学習者の自立性が求められる.本研究では,教師が伝えたい知識の構造の学習者による再構成をベースとして,ビデオ学習における知識獲得のための具体的なタスクを設定し,知識活用の前提としての知識獲得の支援の実現を目指す.そして,ビデオ学習をガイドすると同時に,学習者の理解だけではなく,タスク遂行の観点から適応的な支援をし,有意義な学習体験を実現することを目指す.
子宮内膜症のポストGWAS解析：クロマチン相互作用を介した転写制御メカニズム解明

子宮内膜は深部の基底層と子宮腔に近い機能層に分かれる。機能層は卵巣ホルモンの影響を受けて、増殖・脱落という周期的変化を繰り返す。子宮内膜機能層は月経周期に応じて剥落・増殖を繰り返す、高い再生能を有する組織であり、内膜腺上皮と呼ばれる一層の円柱上皮細胞および腺上皮を支持する間質細胞から構成される。我々は子宮内膜関連疾患の発症機序を考える上で、起源となる内膜機能層腺上皮細胞のゲノム特性を明らかにすることが重要であると考えた。また、腺上皮細胞は管状構造を呈して発達していることに着目し、腺上皮細胞を管単位で分離する実験手法を確立し、単一腺管レベルという最小機能単位でDNAシーケンスを行った。結果として、子宮内膜から採取した腺管において、PIK3CAやKRASを含むがん遺伝子に体細胞変異が多数検出された。驚くべきことに、各腺管で保有する変異はクローナルな状態に達していたが、腺管ごとに異なる体細胞変異を保有していた。その結果、腺管の集合体である内膜組織はゲノムがモザイク状態を呈していた。さらに、子宮内膜症病変の上皮細胞において、同様の癌関連遺伝子に体細胞変異が認められた。特にKRAS変異における変異頻度が顕著に増加していた。これは、モザイク状ゲノムを呈する子宮内膜が月経血逆流を介して卵巣に生着・増殖する過程で、KRAS変異を有する腺上皮細胞が生存に有利となり、クローナルに増殖した結果、子宮内膜症発症に繋がったことを示唆している(Suda & Nakaoka et al. Cell Reports 2018)。本研究によって、正常子宮内膜組織において、PIK3CAやKRASといった、がん関連遺伝子に体細胞変異が存在することを世界で初めて発見することができた(Suda & Nakaoka et al. Cell Reports, 2018)。我々が確立した腺上皮細胞を管単位で分離する実験手法は、単一腺管レベルという最小機能単位でゲノムシーケンスを実施可能にし、今後様々な展開が期待できる。我々はこれまでの研究によって、正常子宮内膜組織において、PIK3CAやKRASといった、癌関連遺伝子に体細胞変異が存在することを示したが、ヒト正常子宮内膜に蓄積している癌関連遺伝子変異の機能的影響は未解明である。子宮内膜は月経周期に応じて増殖・脱落を繰り返す組織であるため、癌関連遺伝子変異を有する細胞が組織再生、つまり、組織機能維持に有利に作用する可能性が考えられる。また、子宮内膜に癌関連遺伝子変異を蓄積していても、大部分の女性は生涯を通じて婦人科癌に罹患しない。このことは、子宮内膜を含む正常組織は、癌関連遺伝子変異が生じている細胞の存在をある程度許容・利用しつつ、恒常性を維持し、破綻を防ぐための制御機構を備えているのではないかと考えられる。そこで、癌関連遺伝子変異を保有する正常子宮内膜上皮細胞の分子表現型特性を明らかにしたい。さらに、癌関連遺伝子に変異が存在下において、生体恒常性を維持するために必要な分子特性を探索するために、正常子宮内膜上皮細胞において、RNA-sequencingによる網羅的遺伝子発現解析を行う。子宮内膜症は卵巣や腹腔などの病変部位において、子宮内膜様組織が認められることが病理学的特徴ある。つまり、月経時に剥がれ落ちた子宮内膜の一部が卵管を逆流し、卵巣や腹腔に生着・増殖することで、子宮内膜症が発症すると考えられている。子宮内膜は深部の基底層と子宮腔に近い機能層に分かれ、機能層は卵巣ホルモンの影響を受けて、増殖と脱落という周期的変化を繰り返す。我々は子宮内膜症発症機序を考える上で、起源となる内膜機能層腺上皮細胞のゲノム特性を明らかにすることが重要であると考えた。さらに、子宮内膜症病変において、同様の遺伝子に体細胞変異が認められ、特にKRAS変異における変異頻度が顕著に増加していた。これは、モザイク状ゲノムを呈する子宮内膜が月経血逆流を介して卵巣に生着・増殖する過程で、KRAS変異を有する腺上皮細胞が生存に有利となり、クローナルに増殖した結果、子宮内膜症発症に繋がったことを示唆している(Suda & Nakaoka et al. Cell Rep in revision)。腺上皮細胞は内膜基底層付近から管状構造を呈して発達していることに着目し、腺上皮細胞を管単位で分離する実験手法を確立できた。単一腺管レベルという最小機能単位でDNA/RNAシーケンスを行う技術基盤は今後の子宮内膜症ゲノム研究において極めて有用であると思われる。

子宮内膜は深部の基底層と子宮腔に近い機能層に分かれる。機能層は卵巣ホルモンの影響を受けて、増殖・脱落という周期的変化を繰り返す。子宮内膜機能層は月経周期に応じて剥落・増殖を繰り返す、高い再生能を有する組織であり、内膜腺上皮と呼ばれる一層の円柱上皮細胞および腺上皮を支持する間質細胞から構成される。我々は子宮内膜関連疾患の発症機序を考える上で、起源となる内膜機能層腺上皮細胞のゲノム特性を明らかにすることが重要であると考えた。また、腺上皮細胞は管状構造を呈して発達していることに着目し、腺上皮細胞を管単位で分離する実験手法を確立し、単一腺管レベルという最小機能単位でDNAシーケンスを行った。結果として、子宮内膜から採取した腺管において、PIK3CAやKRASを含むがん遺伝子に体細胞変異が多数検出された。驚くべきことに、各腺管で保有する変異はクローナルな状態に達していたが、腺管ごとに異なる体細胞変異を保有していた。その結果、腺管の集合体である内膜組織はゲノムがモザイク状態を呈していた。さらに、子宮内膜症病変の上皮細胞において、同様の癌関連遺伝子に体細胞変異が認められた。特にKRAS変異における変異頻度が顕著に増加していた。これは、モザイク状ゲノムを呈する子宮内膜が月経血逆流を介して卵巣に生着・増殖する過程で、KRAS変異を有する腺上皮細胞が生存に有利となり、クローナルに増殖した結果、子宮内膜症発症に繋がったことを示唆している(Suda & Nakaoka et al. Cell Reports 2018)。本研究によって、正常子宮内膜組織において、PIK3CAやKRASといった、がん関連遺伝子に体細胞変異が存在することを世界で初めて発見することができた(Suda & Nakaoka et al. Cell Reports, 2018)。我々が確立した腺上皮細胞を管単位で分離する実験手法は、単一腺管レベルという最小機能単位でゲノムシーケンスを実施可能にし、今後様々な展開が期待できる。本課題は、GWASで同定された子宮内膜感受性SNPによって変化する転写制御機構を明らかにするものである。ENCODE、Roadmap、FANTOMといった大規模プロジェクトを通じて、GWASで同定されたSNPにおける転写制御機構を理解するためには、疾患に関連する組織や細胞株に着目する重要性が指摘されてきた。申請者の先行研究においても、子宮内膜症GWASで同定された9p21領域SNPは子宮内膜組織特異的なエンハンサー領域であった(Nakaoka et al. PLOS Genet 2016)。さらに、疾患関連SNPによる機能的変化が特定の細胞環境下において顕在化する可能性が考えられる。例えば、子宮内膜症のようにホルモン依存性疾患においては、エストロゲンやプロゲステロンといったホルモンが分泌される環境下においてSNPによる機能的変化が顕在化する可能性がある。上述の検討によって、腺管単位でのDNAシーケンス解析によって子宮内膜腺上皮にはゲノムレベルで異質性が存在することが明らかになった。体細胞変異によって増殖能を獲得した上皮細胞において、疾患感受性SNPが転写制御機構に作用し、疾患発症に繋がる分子的表現型が誘導される可能性がある。
(+)-リゼルグ酸の合成研究

リゼルグ酸は麦角菌の産出する麦角アルカロイドの加水分解によって得られる分子で、これらアルカロイドの中心骨格をなす化合物である。麦角アルカロイドはアドレラリン、セロトニン、ドパミン受容体に作用するものが多く多彩な生理活性を有することが知られている。また、インドールを含む特徴的な四環性骨格の構築は合成化学的にも興味深く、現在までに10例以上の全合成が報告されている。当研究室においても異なるアプローチによる二つの合成経路を報告しているが、これらの合成経路は段階数、総収率について問題が残るものであった。そこで私は、光学活性リゼルグ酸のより効率的な全合成を目指し研究に着手した。前年度までの検討により主骨格となる四環性骨格の構築法は確立していたが、閉環メタセシス反応において二重結合の異性化によって得られる分離困難な副生成物が得られていた。これは末端にメチル基を有するアリルアミンユニットを用いていることが原因と考え、クロトンイミドのアルドール反応を用いることで末端メチル基を有さないアリルアミンユニットを大量合成することに成功した。新たなユニットを用いたところ閉環メタセシス反応は円滑に進行し、続くヘック反応と併せて効率良く四環性骨格を構築することができた。続く側鎖の官能基変換によりリゼルグ酸を100mgスケールで合成することに成功した。また、インドールを含む特徴的な四環性骨格の構築は合成化学的にも興味深く、1956年のウッドワードらによる初の全合成を皮切りに、現在までに10例以上の全合成が報告されている。リゼルグ酸の有する特徴的な四環性骨格のうち、C環を分子内ヘック反応によって、以前の合成研究で工程数が長くなる原因となっていたD環を閉環メタセシス反応によって構築することで、合成の短工程化が可能ではないかと考えた。実際、既知化合物から誘導したインドールを含むアリルアミンと上部ユニットとを還元的アミノ化によって縮合することで環化前駆体を得た後に、閉環メタセシス反応および分子内ヘック反応を行うことで、リゼルグ酸の持つ四環性骨格の構築に成功した。現在、更なる官能基変換について検討を行っている。
咀嚼筋電音フィードバックを用いた食質感知覚メカニズムの解明

質感知覚は様々な感覚から入力された情報を処理するだけでなく、予測、意思決定、身体制御、感覚運動フィードバックなどを含んだ、多感覚的、適応的、能動的なプロセスの結果としても生じる。食質感知覚はこのようなプロセスを考えるうえで最適の題材である。それは食質感知覚には「食べる」という能動的な動作によってもたらされる感覚フィードバックの情報が大きく貢献しているからである。これまで咀嚼音をフィードバックして食質感を変容させる様々な研究が行われてきたが、フィードバックの時間ずれや、利用できる食品の物性上の制約が課題であった。我々は近年、咀嚼に完全に同期したフィードバック音を、あらゆる物性の食品について返すことができる画期的な手法を考案した。それは咀嚼音そのものではなく咀嚼時の咬筋の筋電波形を音に変換したものをフィードバックするという手法である。今年度の進捗として、まず英語論文2本が公刊された(Appetite, JACIII)。また、さまざまな食質感形容詞、オノマトペ間の関係性、咬筋以外からの咀嚼運動情報計測、フィードバックの遅延と食質感変容の効果量との関連等について検討を進め、これらの成果の一部について、福祉情報工学研究会(2017年5月)、ヒューマンインターフェースシンポジウム(2017年9月)、日本接触嚥下リハビリテーション学会学術大会(2017年9月)等で発表を行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。質感知覚は様々な感覚から入力された情報を処理するだけでなく、予測、意思決定、身体制御、感覚運動フィードバックなどを含んだ、多感覚的、適応的、能動的なプロセスの結果として生じる。今年度の実績としてまず単純に筋電波形をそのまま音に変換してリアルタイムにフィードバックしただけでも、噛みごたえやざらざら感といった食質感が変化すること、さらに高次質感(高級感、新鮮さなど)や行為主体感(食べている実感など)が変化することを示した。この成果はPhysiology & Behavior誌に掲載された(Endo, Ino & Fujisaki, 2016)。次に、咬筋の筋電波形のエンベロープを取り出して任意の音信号を振幅変調して出力できるように装置を改良し、漬物音をフィードバックする実験を行った。その結果、筋電音をそのままフィードバックするよりも、介護食の漬物を噛んだ時の違和感を減少させることに成功した。この成果はヒューマンインターフェースシンポジウム2016で優秀プレゼンテーション賞を受賞し(遠藤・金子・井野・藤崎, 2016)、またJACIII誌に論文が掲載された(Endo, Kaneko, Ino & Fujisaki, 2017)。国際誌に複数の論文が掲載されたり、優秀プレゼンテーション賞を受賞したりするなど、順調なスタートを切ることができている。現在、疑似咀嚼音の種類を14種類に増やすと同時に、評価軸に形容詞対だけでなくオノマトペを加えて、咀嚼動作に同期させた音を聴く条件と、咀嚼動作なしで音だけを聴く条件における食質感評価を比較する実験を進行中であり、取得したデータについての詳細な分析を、これから順次、進めていく。その他にも、高齢者を被験者とした実験や、さらなる装置の改良などを進めていく予定である。
Y染色体上遺伝子と性スペクトラム

哺乳類の雌雄(男女)は体のサイズをはじめとして、一見して容姿で見分けられるほど様々な部位で異なる表現型を示す。この表現型の違いはほとんどがY染色体の有無によって決定されている。主にY染色体上にあるSry遺伝子が精巣分化を誘導することで、精巣からのホルモン分泌を起点とする全身レベルでのドミノ倒し的な雄への分化が引き起こされる。それでは、Sry以外のY染色体上の遺伝子は一体どのような機能を持っているのだろうか?性スペクトラムへ影響するのだろうか?そこで本研究では、Y染色体上の様々な遺伝子についてTriple CRISPR法を用いてノックアウトマウスを作出し、それらの性的表現型を理研BRCの表現型解析パイプラインに乗せることで、網羅的かつ定量的に解析することで、各器官レベルでの性スペクトラムにどの程度Y染色体上遺伝子が関わるかを網羅的かつ定量的に明らかにすることを目的としている。初年度はY染色体上のターゲット可能な遺伝子を10個にまで絞り込み、それぞれの遺伝子に対して効果的なsgRNAをデザイン・機能評価したうえでTripleCRISPR法によってマウスを作出した。いずれの遺伝子についてもマウスの作出効率に大きな差は無かったことから、これらのTriple CRISPRが発生に悪影響を与えていないことを確認した。一方で、一部のノックアウトマウスでは、生殖細胞の発生・機能に異常が起きることも発見した。現在、こうして作製したファウンダーマウスは順次、表現型解析パイプラインに乗せて解析をすすめている。まず、計画していた通り、初年度でY染色体上のユニークな遺伝子10個を候補因子として絞り込み、全てに対して効果的なsgRNAのデザイン・合成に成功した。これらのsgRNAを用いてTripleCRISPR法によってノックアウトマウスを作出した結果、発生効率自体には大きな影響はなかった一方で、生殖細胞の発生に影響を与える因子も存在していた。上記のようにして作製したファウンダーマウスについて、全身でどのような性スペクトラム上の表現型を示すかを把握するため、理研BRCの日本マウスクリニックにある表現型解析パイプラインに乗せて解析を開始した。本パイプラインでは、離乳前から生後26週にわたって、経時的に代謝、血液、骨/骨格、癌、循環器、感覚器、皮膚/被毛、神経/行動といった多領域にわたる検査項目を網羅的かつ定量的に解析する。具体的には、8週齢で可視的検査(Modified SHIRPA)、9週齢で血算検査、10週齢で尿検査、11週齢で血液生化学検査、13週齢での聴覚検査、14週齢でブドウ糖負荷試験、18週齢でアディポサイトカイン、血清生化学(糖・脂質系)検査、19週齢で眼底検査、22週齢でX線検査および骨密度・体脂肪検査、24週齢で心電図検査、26週齢でFACS検査、最終的に26週齢で剖検を行う。既にC57BL/6J系統について標準的な数値は全ての項目で得られているが、本実験ではコントロール群もIVFおよび胚移植を経るため、通常の交配ラインとは表現型が多少異なることが想定される。そのため、本実験で用意したコントロールマウスの雌雄を同じパイプラインに流すことで、基本的な性スペクトラム上の両極の表現型を正確に把握することができる。各実験群について710個体をパイプラインに流していく予定である。最終的に、各項目についてTriple CRISPRのファウンダーが、性スペクトラム上のどの位置にいるかを定量的に決定する。平成31年度は、引き続きファウンダーマウスのパイプライン解析を続け、10個の遺伝子について、それぞれ最低7匹のマウスを解析する予定である。現時点では3遺伝子を解析中であり、4月中にパイプライン解析用のマウス作出を完了する予定である。表現型の得られたY染色体遺伝子のノックアウトマウスについて、繁殖可能であればファウンダーの中から完全な遺伝子欠失ラインを確立する。これまでの他の遺伝子の解析経験から、ファウンダー中に1020%程度の割合で3つのsgRNAでターゲットした領域を丸ごと欠失したマウスが生まれている。ただし、多くのY染色体上遺伝子は精子発生での機能が示唆されているため、精子発生異常をきたす可能性が高い。もし精子形成異常で繁殖不能な場合は、ファウンダーの中からシークエンスにより対象遺伝子の機能が最も明確に阻害されている個体を選ぶ。その上で表現型の見られた器官について、RNAシーケンシングによって遺伝子発現の網羅的解析をし、対象遺伝子および他の下流遺伝子ネットワークの変化を理解する。さらに目的遺伝子のコードするタンパク質の種類に応じて詳細な生化学的解析などを行うことで、対象遺伝子が標的器官でどのように機能しているかを分子レベルで解析する。それでは、Sry以外のY染色体上の遺伝子は一体どのような機能を持っているのだろうか?性スペクトラムへ影響するのだろうか?そこで本研究では、Y染色体上の様々な遺伝子についてTriple CRISPR法を用いてノックアウトマウスを作出し、それらの性的表現型を理研BRCの表現型

解析パイプラインに乗せることで、網羅的かつ定量的に解析することで、各器官レベルでの性スペクトラムにどの程度Y染色体上遺伝子が関わるかを網羅的かつ定量的に明らかにすることを目的としている。初年度はY染色体上のターゲット可能な遺伝子を10個にまで絞り込み、それぞれの遺伝子に対して効果的なsgRNAをデザイン・機能評価したうえでTripleCRISPR法によってマウスを作出した。いずれの遺伝子についてもマウスの作出効率に大きな差は無かったことから、これらのTriple CRISPRが発生に悪影響を与えていないことを確認した。一方で、一部のノックアウトマウスでは、生殖細胞の発生・機能に異常が起きることも発見した。現在、こうして作製したファウンダーマウスは順次、表現型解析パイプラインに乗せて解析をすすめている。まず、計画していた通り、初年度でY染色体上のユニークな遺伝子10個を候補因子として絞り込み、全てに対して効果的なsgRNAのデザイン・合成に成功した。これらのsgRNAを用いてTripleCRISPR法によってノックアウトマウスを作出した結果、発生効率自体には大きな影響はなかった一方で、生殖細胞の発生に影響を与える因子も存在していた。上記のようにして作製したファウンダーマウスについて、全身でどのような性スペクトラム上の表現型を示すかを把握するため、理研BRCの日本マウスクリニックにある表現型解析パイプラインに乗せて解析を開始した。本パイプラインでは、離乳前から生後26週にわたって、経時的に代謝、血液、骨/骨格、癌、循環器、感覚器、皮膚/被毛、神経/行動といった多領域にわたる検査項目を網羅的かつ定量的に解析する。具体的には、8週齢で可視的検査(Modified SHIRPA)、9週齢で血算検査、10週齢で尿検査、11週齢で血液生化学検査、13週齢での聴覚検査、14週齢でブドウ糖負荷試験、18週齢でアディポサイトカイン、血清生化学(糖・脂質系)検査、19週齢で眼底検査、22週齢でX線検査および骨密度・体脂肪検査、24週齢で心電図検査、26週齢でFACS検査、最終的に26週齢で剖検を行う。既にC57BL/6J系統について標準的な数値は全ての項目で得られているが、本実験ではコントロール群もIVFおよび胚移植を経るため、通常の交配ラインとは表現型が多少異なることが想定される。そのため、本実験で用意したコントロールマウスの雌雄を同じパイプラインに流すことで、基本的な性スペクトラム上の両極の表現型を正確に把握することができる。各実験群について710個体をパイプラインに流していく予定である。最終的に、各項目についてTriple CRISPRのファウンダーが、性スペクトラム上のどの位置にいるかを定量的に決定する。平成31年度は、引き続きファウンダーマウスのパイプライン解析を続け、10個の遺伝子について、それぞれ最低7匹のマウスを解析する予定である。現時点では3遺伝子を解析中であり、4月中にパイプライン解析用のマウス作出を完了する予定である。表現型の得られたY染色体遺伝子のノックアウトマウスについて、繁殖可能であればファウンダーの中から完全な遺伝子欠失ラインを確立する。
各種自己免疫疾患の病因としてのHuman Foamy Virus(HFV)感染に関する研究

病因が不明である各種自己免疫疾患の病因の一つとしてHuman foamy virus(HFV)が関与しているとの仮説をたて、平成5年度よりゲノムDNAからHFV遺伝子をPCRによって増幅し、検出しうるかいなかの検討を行った。検出感度を上げ、同時に特異性を高めるためにnested PCR法を用いてゲノムDNAからHFV遺伝子のbel-2領域を増幅(457bp)した後、HFV cDNAクローンをプローブとしたSouthem blot法でHFV特異的シグナルを同定するという方法を用いた。各種呼吸器疾患、各種自己免疫疾患、健常者を含む320例を検討対象とした。その中に家族性地中海熱(familial Mediterranean fever.FMF)症例が3例含まれていた。検討の結果、3例のFMF患者全例でゲノムDNA中に存在するHFV特異的なシグナルの存在が検出された。一方、健常者や他の疾患症例では全例、HFVプロウイルス由来のシグナルを認める事はなかった。FMFは発熱、腹痛、胸痛、関節痛などが周期的に出現することを特徴とした地中海沿岸諸国に多発する疾患で、一般に常染色体劣性遺伝をするといわれている。しかし、遺伝的背景が明らかでない例もあり、病因は未だ不明である。わが国での報告例は少ないが、その多くは遺伝的素因が明確でない。報告例が少ない点は人種差によるためのみでなく、本疾患が余り知られておらず、簡便な診断法がない事も影響している。FMF患者にHFVプロウイルスの存在が検出された本研究結果は、直ちにHFV感染をFMFの病因と断定することにはならない。しかし、HFVとFMFの関連について血清学的、組織学的、ウイルス学的な検討を含めた総合的な研究を体系的に行っていくことの有用性を示す重要な成績であると考える。HFV(Human foamy virus)は、1971年に最初のヒト・レトロウイルスとして同定されたが、現在まで散発的な検出報告があるだけで、疾患との明らかな関連性は不明であり、本邦では未だ十分な研究は施行されていない。そこで、各種自己免疫疾患の病因となりうる可能性を推測して、系統的なHFV遺伝子の検出の検討に着手した。【.encircled1.】ゲノムDNA上のHFVプロウイルス検出の検討:今年度はHFVに特異的な遺伝子領域bel-1、bel-2あるいはLTR遺伝子領域を選択し、遺伝子配列をもとに作成したPCR用のprimerを用いて、患者末梢血あるいは気管支肺胞洗浄液(BALF)細胞から抽出したゲノムDNA中にHFVがプロウイルスとして存在するか否かを検討した。HFV遺伝子DNA断片存在の有無は、アガロースゲル電気泳動によって特異的な大きさのバンドの出現をもって確認した。対象とした50症例(SLE、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、サルコイドーシスなど)では、現在までのところプロウイルスの存在は検出されていない。今後はnested primerを用いた二重PCR法やサザン・ブロット法などの使用によって検出感度を向上させると共に、病変局所に浸潤した細胞を用いることにより、より感染細胞の存在する可能性の高い検体からの検出を試みる予定である。【.encircled2.】培養上清中の逆転写酵素(RT)活性の測定:BALF細胞とU937細胞の長期混合培養が可能であった計20例について培養上清中のRT活性を測定した。対象症例中、陽性対照としたHIV-1のRT活性に近似したRT活性の存在を示す例が3例認められた。これらの症例は抗HIV-1、HTLV-1抗体は陰性であった。今回検出されたRT活性がHFV感染に起因するか否かは不明であるが、今後更に検討したい。