hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インターネットと衛星通信を統合した遠隔学習システムの構築と評価

本研究は、衛星通信による遠隔教育を効果的に行うために、インターネットを利用した教育システムを構築しその評価を行うことを目的としている。その成果として、次のような結果を得た。(1)資料提示機能と回答集計機能を備えた衛星講義支援システムの開発本システムにより、講師は、プレゼンテーション用の資料等を、講師の操作に従って、受講者の手元のブラウザに自動的に表示させることができる。本機能により、講義会場のスクリーンに写し出されるプレゼンテーション画面が見にくいという課題が解決される。さらに、回答集計機能により、各地の受講者からブラウザを通してアンケート結果を回収・グラフの提示を行うことができる。講師はリアルタイムに受講者からのレスポンスを得ることができる。(2)教育情報自動検索通知システムの開発受講者は、本システムにキーワードを登録することにより、そのキーワードに関係する教育情報について、随時電子メールで通知を受け取ることができる。本システムでは、Webページ更新情報の解析を行い、受講者にとって価値ある更新がなされたどうかの判断を行う機能も有する。(3)動画像検索システムの開発衛星で配信された講義をインターネットで見ることができるようにするために、動画像検索システムを開発した。本システムは、音声情報と動画情報の時間的なマッピングを行い、検索語が含まれる場面の部分再生を可能にしている。さらに、動画像をインターネットにより配信する際の画質についての検討を行った。本研究では、インターネットと衛星通信を統合した教育システムを構築する。最終的なシステムは、次のサブシステムが統合されたものとなる。(1)講師からの問いに対して受講者がインターネットを介して回答するレスポンスシステム。(2)講師側からインターネットを介してテキスト資料等を送付する資料提示システム。(3)受講者の好みにあった情報を自動検索して通知する情報提供システム。(4)受講者が自学自習することができるオンデマンド学習システム。(5)受講者が講座の復習をすることができるフォローアップシステム。(6)様々な角度からシステムを再評価するためのアセスメントシステム。これらサブシステムのうち、本年度は以下の成果を得た。1.レスポンスシステムの設計・構築授業効果を高めるためには、遠隔サイトの受講者から講師へのフィードバックが必要である。そこで、インターネットにより、講師側にフィードバック情報を集計するシステムを構築した。講師は、集計結果を即時に知ることができ、グラフ等により生徒に提示することができる。2.テキスト・資料提示システムの設計・構築遠隔教育では、テキストや提示パターン、あるいは種々の資料が、受講者に提示されることが重要である。講師が、授業の進行に合わせて、インターネットを介して、デジタル化された資料を受講者の端末に表示することができるシステムを構築した。3.情報提供システムの設計・構築遠隔教育の利用目的には種々あるが、幅広く多数の人達が利用できるためには、実施プログラムに関する情報提供が、普及の鍵となる。そこで、エージェント技術を利用して、これらの情報を、タイムリーに希望者に提供することができるシステムを構築した。本年度は以下の成果を得た。1.教育情報提供システム用Webページ更新自動検出機能の開発昨年度構築した教育情報提供システムにおいて、情報を常に最新に保つために、Webページの更新自動検出機能を開発した。本機能は、HTMLテーブル要素の解析、テーブル要素以外のHTML要素の解析、キーワード解析の3通りの解析方法を利用することにより、本システムにとって価値のある更新を効率的に検出可能となった。実際の教育情報に関するWebページを用いた評価実験の結果、約9割の更新を検出することができた。2.インターネットによる講義配信画像の劣化許容範囲の検討インターネットを介して講義を配信する場合、インターネットの負荷(混雑状況)に応じて画質が劣化し学習が成立しない場合がある。そこで、DV動画による遠隔講義画像について、ネットワーク負荷により画像のビットレート低下率を変化させた画像による主観評価実験を行い、遠隔講義における画像劣化の許容範囲を明らかにした。結果を次にまとめる。(1)主観評価の結果を因子分析した結果、「画質」「臨場感」「分り易さ」「遠隔利点」「授業内容」の5因子が得られた。

(2)評価規準の中央値2.5以上となるビットレート低下率で評価すると、「画質」「臨場感」「遠隔利点」の平均値が2.9%となった。(3)「分り易さ」「授業内容」因子に関しては、ビットレート低下率が大きくても評価が下がりにくい。3.衛星講義において動画の帯域幅と主観評価値の検討衛星講義の伝送速度を1.4Mbps6.8Mbpsに変化させたとき、「良さ/好みの尺度」および「妨害の尺度」の主観評価および静止画像の解像度の評価実験を行った。本研究では、インターネットと衛星通信を統合した教育システムを構築する。本年度は以下の成果を得た。1.意見分類機能を備えた遠隔講義支援システムの開発衛星通信等を用いた遠隔講義を行う場合、遠隔地の学習者の意見をフィードバックするためにインターネットを利用することが有効である。しかし、学習者の人数が多くなると、講師は学習者の意見を把握することが非常に難しくなる。そこで、意見分類機能・キーワード提示機能・アンケート集計提示機能を有するシステムを開発した。意見分類機能とキーワード提示機能は、KeyGraphの手法を基にした。KeyGraphは、比較的少ない数の文章から重要度を計算でき、コーパスを必要としないという特徴を有し、様々な分野の授業に対する汎用性が高い。2.音声情報と同期させた教育用動画像の検索システムの開発衛星講義を受講できなかった学生用あるいは復習用に、講義画像をインターネットで提供することができる。しかし蓄積された動画像を検索することは困難である。そこで、動画像の音声情報とテキスト情報を同期させる手法を開発し、検索キーワードが含まれる部分の動画像を選択的に検索することができるシステムを開発した。3.画質の心理物理評価値を用いたDV動画による遠隔講義環境の検討インターネットにおいてDV動画を用いて講義画像を提供する場合の環境について、画質の心理物理評価値PQRを用いて検討した。PQRと帯域使用率、フレームレート、主観評価結果、ファイル転送時間との関係について明らかにした。その結果、PQRと因子成績は高い相関があり、PQRによりを測定することにより、DV動画による種々の遠隔講義伝送システムについて容易な画質評価が可能になることがわかった。
転写因子FoxQ2による二次軸形成抑制機構

神経外胚葉が二次軸形成因子に対して抵抗性を持つメカニズムを明らかにするため、ウニ胚を用いて神経外胚葉特異的転写因子であるFoxQ2の下流因子の機能解析を行った。その結果、FoxQ2阻害胚のマイクロアレイにより転写調節因子であるFezを単離した。その機能阻害実験の結果により、二次軸形成因子の一つであるBMP2/4シグナルをFezが細胞内で抑制することにより、神経外胚葉が非神経外胚葉に分化することを防いでいることを明らかにした。また、発生時間をずらして詳細に解析することで、このイベントは間充織胞胚期に行われていることが明らかになった。さらに、このことは神経外胚葉のSpecificationに必要なFoxQ2がその下流因子の一つを利用して非神経外胚葉化シグナルを抑制し、自身の領域サイズを維持していることを示している。本研究は、ウニの初期胚において一次軸形成と二次軸形成のインターフェイスで働くFoxQ2およびその下流因子が二次軸形成を阻害するメカニズムの解析を目的としている。FoxQ2マイクロアレイを行い単離した神経外胚葉特異的な下流因子候補8つについて、それぞれの発現および機能の解析を試みた。まず、一次軸および二次軸形成を乱した胚を用い、軸形成に関連するシグナル経路とそれらの因子の関係を探った。その結果、今回単離されたものは全て一次軸形成シグナルであるwnt/β-catenin経路を阻害した胚ではその発現部位が拡大した。一方、二次軸形成に必要なnodal経路阻害胚(背腹両方を欠損)では全ての遺伝子がその発現部位がほぼ影響を受けなかった。しかし、nodal過剰発現胚やもう一つの二次軸形成因子であるBMP2/4を阻害した胚(双方とも背側領域を欠損し腹側領域が拡大)では一部の遺伝子が発現抑制されることが示された。また、それら下流因子候補の過剰発現胚の外胚葉パターンを解析すると、二次軸を乱すような表現型は得られなかった。よって、現時点では今回得られた遺伝子の中にFoxQ2の下流かつ二次軸形成より前に機能するものは含まれていない可能性が高い。また、それぞれの機能阻害実験により二次軸依存的にパターニングされる神経外胚葉内に乱れを生じるものが得られているのでその詳細な解析を行っている。FoxQ2およびその下流因子が二次軸形成因子nodalの転写を制御している可能性をさらに探るため、nodalの第一イントロンをパフンウニから単離し平成22年度の解析に用いるためレポーターとして蛍光タンパク質(GFP)と結合させた。卵への導入効率と過去に他のウニで報告されている発現調節条件の再現性を検証した。その結果、FoxQ2発現部位でGFPの発現は見られないことの再現性は検証できた。FoxQ2抗体作成に関してはペプチド抗体作成を試みたが今年度は成功しなかったので、現在大腸菌により作製したFoxQ2のマウスへの免疫を始めている。FoxQ2が発現している神経外胚葉は、二次軸形成因子であり腹側外胚葉を誘導するNodalとその下流因子で背側外胚葉を誘導するBMP2/4による非神経外胚葉形成の影響を受けない。これは神経外胚葉が二次軸形成ジグナルを打ち消すメカニズムを備えていることを示唆している。そこでFoxQ2阻害胚を用いたマイクロアレイ解析を行い、発現量が抑制された因子の中で、その時空間的発現パターンからFezを候補因子として機構解析を行った。Fez抑制胚では神経外胚葉のサイズが縮小し、非神経外胚葉領域が拡大したため、それらを誘導するNodalおよびBMP2/4との関連を調べた。その結果、NodalとFezを両方抑制した胚ではFezのみを抑制した胚と同様神経外胚葉のサイズ縮小が見られた。一方、BMP2/4とFezを同時に抑制した胚では神経外胚葉のサイズ縮小は見られなかった。これはBMP2/4が二次軸形成過程において非神経外胚葉を誘導する際、神経外胚葉領域においてはFezがその機能を抑制していることを示唆している。神経外胚葉領域におけるBMP2/4のシグナルの強度を可視化するため、BMPシグナルの細胞内媒介分子であるSmad1/5/8のリン酸化状態を調べた。正常胚において背側外胚葉で高いリン酸化状態を示すSmad1/5/8が神経外胚葉では極端に低い状態に抑えられていた。

しかし、Fez抑制胚ではSmad1/5/8のリン酸化が高い状態で維持されており、正常胚で神経外胚葉領域になる位置の細胞でも、高いリン酸化状態を示す領域は非神経外胚葉に分化していることが示された。このことはFezが神経外胚葉領域特異的にBMP2/4のシグナルを抑制していることを示している。以上よりFoxQ2は自身の発現を抑制する二次軸形成因子BMP2/4に対して、Fezを誘導しBMP2/4シグナルを抑制することで神経外胚葉のサイズを保っていることが明らかになった。
低酸素状態誘発性のオリゴデンドログリアの細胞死に関する研究

我々はオリゴデンドログリア(オリゴ)の低酸素性・低グルコース誘発性の細胞障害がnon-NMDA型グルタミン酸レセプターを介するCa^<2+>流入によることを明かとした。まず、このnon-NMDA型グルタミン酸レセプターを介するCa^<2+>流入の経路について解明した。Kainate誘発性のCa^<2+>流入はCa^<2+>透過性の低いGluR2を含まないnon-NMDA型グルタミン酸レセプターを抑制するn-acetyl-spermine投与によって減少したが、電位依存性Ca^<2+>チャンネル阻害剤のnimodipineでは抑制されず、Na^+-Ca^<2+>exchanger(NCX)阻害剤のdichlorobenzamilおよびbenzamilで抑制された。以上より、kainate投与時に生じる細胞内へのCa^<2+>流入経路としてnon-NMDA型グルタミン酸レセプターよりの直接流入とreverse modeのNCXを介する流入が明かとなった。次に、我々は細胞内AMPおよびcGMP上昇薬物が低酸素・低グルコース状態誘発性のオリゴの細胞死を抑制し、同時にkainate誘発性のCa^<2+>流入を抑制することを明かとした。この抑制機序について解明した。Na^+ channel openerのveratridineとNa^+/K^+-ATPase阻害剤のouabainを同時に投与し、細胞内へ過剰のNa^+を流入させ、reverse modeのNCXを介するCa^<2+>流入に対するcAMPおよびcGMP上昇薬物の影響を検討した。cAMPおよびcGMP上昇薬物はveratridineとouabainの同時投与によって誘発されるCa^<2+>流入を抑制した。以上より、cAMPおよびcGMP上昇薬物の低酸素・低グルコース状態誘発性のオリゴの細胞障害に対する保護作用の一つとして、NCXの抑制が推察された。1)細胞内cGMP上昇薬物のkanate誘発性のオリゴデンドログリア(オリゴ)の細胞死に対する保護作用オリゴにNa^+/Ca^<2+>exchangerが存在するかをRT-PCRで検討した。isoform IおよびIIIのmRNA発現はすでに同定されたが、isoform IIに関しては、現時点で検討中である。次にオリゴにおける機能的なNa^+/Ca^<2+>exchangerの存在はNa^+チャンネルオープナーであるveratridineと、Na^+,K^+-ATPaseの阻害剤であるouabain同時投与で細胞外よりCa^<2+>influxが誘発されること、このCa^<2+>influxはNa^+チャンネル阻害剤であるtetrodotoxinおよびNa^+/Ca^<2+>exchanger阻害剤であるdichlorobenzamilで抑制されるが、Ca^<2+>channel阻害剤のnimodipineでは抑制されなかったことから明らかとなった。次いで、種々のNa^+channel阻害剤、Na^+/Ca^<2+>exchangerの阻害剤について検討した。その結果、Na^+channel阻害剤としての作用を有するtetrodoxin,phenytoin,lidocaine,pilsicainideおよびNa^+/Ca^<2+>exchanger阻害剤のdichlorobenzamilとbezamilに低酸素+低グルコース状態誘発性のオリゴの細胞障害に対する抑制効果が見出された。平成11年度は、kainate誘発性細胞障害時のCa^<2+>influxにおけるNa^+/Ca^<2+>exchangerの関与、cAMPおよびcGMP上昇薬物のNa^+/Ca^<2+>exchangerへの関与について検討の予定である。1)カイニン酸誘発性Ca^

<2+>流入経路の検討:カイニン酸投与時に生じる細胞内へのCa^<2+>流入の経路について解明した。可能性として以下の3経路が推察された。a)non-NMDA型グルタミン酸レセプターより直接流入する。b)電位依存性Ca^<2+>チャンネルより流入する。c)reverse modeのNa^+-Ca^<2+>exchangerより流入する。カイニン酸誘発性のCa^<2+>流入はCa^<2+>透過性の低いGluR2を含まないnon-NMDA型グルタミン酸レセプターを抑制するn-acetyl-spermine投与によって減少したが、電位依存性Ca^<2+>チャンネル阻害剤のnimodipineでは抑制されず、Na^+-Ca^<2+>exchanger阻害剤のdichlorobenzamilおよびbenzamilで著明に抑制された。以上より、カイニン酸投与時に生じる細胞内へのCa^<2+>流入経路としてnon-NMDA型グルタミン酸レセプターよりの直接流入とreverse modeのNa^+-Ca^<2+>exchangerを介する流入が明かとなった。
深層学習を用いたすい癌の病理組織画像からの細胞タイプ識別モデルの構築

機械学習に基づく計算機支援診断の開発が近年急ピッチで進んでいるが、課題となっているのは教師データの数の不足がある。臨床医師によって画像から腫瘍や細胞の種類をアノテーションする作業には相応の時間がかかり、また熟練を要することから、一般的な画像分類課題のように数万枚というデータを事前に用意するのは現状では困難である。本研究では、深層学習を用いた教師なし学習による画像データのクラスタリングにより、病理組織画像から自動的に細胞画像をその特徴にもとづいて分類するアルゴリズムを構築、学習し、得られた画像クラスターが臨床的な細胞の特徴とよく一致することを示した。学習データとして九州大学の大内田らによる膵臓がんのモデルマウスであるKPCマウスの腫瘍組織を用い、名古屋工大の本谷らの協力により染色方法の異なる二種類のスライスの位置合わせをおこなったものを用いた。二種類の染色画像をもとに細胞構造を画像から解析する畳み込みニューラルネットワークを構築し、特徴抽出を行うと同時に、Information Maximizing Self-Augmented Training (IMSAT)を改良した学習モデルによりクラスター間の相互情報量を最大化するように敵対的訓練によるクラスタリングを行う分類モデルを構築した。特徴パターンをお互いにを行い、8種類のクラスターに分類したところ、正常組織、血管、腫瘍、初期繊維化組織、後期繊維化組織、脂肪組織、細胞間ギャップ、および背景領域に分類できることがわかった。このモデルにより、腫瘍の領域、および繊維化の進行の度合いを強調して可視化することが容易になったと言える。特徴抽出からのIMSATによる教師なしクラスタリングによる画像分類は、病理組織画像の他にも、さまざまな分野での画像解析に役立てることができるため、診断支援アルゴリズムの開発に大いに資することが期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2017年度の研究では、膵がんのモデルであるKPCマウスの組織サンプルから得られた膵臓の腫瘍の連続スライスから作成された複数の染色画像を用い、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色の組織画像からマッソン・トリクローム(MT)染色の組織画像の染色パターンを予測し、自動的に変換するためのコンバーターを深層学習によって構築した。畳み込みニューラルネットワークを階層化させ、入力と出力を連結したU-Netモデルをもとにした敵対的学習ネットワーク(GAN)により画像間の相関を学習させ、細胞の核と原形質を染色するHE画像だけから、細胞間の線維組織を染色するMT染色の度合いを組織レベルで予測できることを示した。このモデルでは、14階層のニューラルネットワークによる深層学習により、元画像の約400分の1まで情報を圧縮した特徴抽出を行なっている。構造相関係数による評価では領域ごとに相関係数0.20.5程度の相関となり、細胞数にして十数個程度の範囲での平均的な染色パターンの分布は精度よく予測できていることがわかったが、細胞核の域に依存するような細かい構造の再現は困難であることを示し、「多元計算解剖学」第4回国際シンポジウムにて発表した。また、それぞれの画像から抽出された特徴パターンを主成分分析によって解析することによって、主に組織内の細胞核の密度に比例する特徴ベクトルの抽出に成功した。画像の単純なピクセルの画素値に基づく主成分分析と比べて、よりMT染色の度合いに比例した分布になっていることから、細胞の分布や構造に基づいた特徴が抽出できていると言える。現在までの研究では、直接HE染色からMT染色のパターンを予測し変換するための深層学習モデルのほかに、HE染色の組織画像の特徴を抽出し、情報を圧縮しながら画像を再現するオートエンコーダー、同様に、MT染色の組織画像の特徴抽出を行うオートエンコーダーを開発し、異なる画像の間の変換を行うネットワークを追加してその相関を学習させることで、HEからMTへの変換に必要な特徴が画像のどのような要素に含まれているかを解析した。この変換ネットワークの主成分分析により、HE染色の組織画像全体から、繊維化の進行度を予想して強調表示されたヒートマップを表示するアルゴリズムを構築した。

特徴抽出からのIMSATによる教師なしクラスタリングによる画像分類は、病理組織画像の他にも、さまざまな分野での画像解析に役立てることができるため、診断支援アルゴリズムの開発に大いに資することが期待できる。今後はこの手法をもとにした特徴抽出モデルを元に、がんの進行ステージの異なる複数のマウスのサンプルに対して学習を行うことで、HE染色の画像から組織の状態を分類するクラス分けモデルの構築を行う。また、利用可能なサンプルが得られれば、ヒトの患者の組織画像を元にした学習を行うことを視野に入れている。またさらに、MT染色の予測ネットワークの構築に用いた手法を、細胞の分裂の活発さを示す指標として使われるKi67による免疫染色の画像など複数の免疫染色の画像に対して適用することで、膵がんの組織の領域ごとの悪性度などを予測するモデルを構築し、診断支援に利用できる指標の開発を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
地域密着型プロスポーツとトポフィリアに関する実証的研究

本研究の目的は、地域密着型プロスポーツのトポフィリア(場所愛)を実証的に検証するために、平成23年度から新たに男子プロバスケットボールリーグ(bjリーグ)に参入する「岩手」「長野」の3チームの観戦者と地域住民を対象として、地域密着型プロチームの出現が、「チームアイデンティフィケーション」(TI)と「地域愛着」(PA)にどのような影響を与えたかを、縦断的研究によって明らかにすることである。その結果、プロスポーツの出現による地域愛着に経年変化は見られなかったが、その一方で、チームアイデンティフィケーションは年々高まっていくことが確認された。本研究は、地域密着型プロスポーツのトポフィリア(場所愛)を実証的に検証するために、平成23年度から新たに男子プロバスケットボールリーグ(bjリーグ)に参入する「岩手」「長野」の2チームの観戦者と地域住民を対象として、地域密着型プロチームの出現が、「チームアイデンティフィケーション」(以下TIとする)と「地域愛着」(place attachment)にどのような影響を与えたかを、縦断的研究によって明らかにすることを目的としている。なお本研究のタイトルで用いた「トポフィリア」とは、「人と場所(トポス)や環境との情緒的な結びつき」、あるいは「人々が持つ地域に対する愛着」を意味し(Tuan,1974)、地域密着型を経営の基本に置くプロスポーツチームが醸成する、ファンの地域に対する愛着を検証するためのシンボリックは概念である。昨年度は、実験群とし両チームの開幕戦と2月後半の試合での調査を実施した。それと並行して、同じ時期に、統制群としての地域住民に対して、地域愛着のインターネット調査を用いた。調査では、インターネット調査会社に依頼して400程度の回答を得た。調査項目には、表3に示した、人口統計的変数、観戦行動、地域愛着項目、ブランドイメージを含んでいる。データは観戦者に対する2回の調査と、地域住民に対する2階のインターネット調査の結果を現在分析中であるが、観戦者の地域愛着度は、その他の地域住民に比べて、有意に高いことが判明した。本年度の研究成果に関する具体的内容、意義、重要性等は、以下の3点にまとめられる:1地域愛着の経年比較:地域密着型プロチームの出現が、地域愛着に与える影響について、2チームを対象に調査を行った結果、2チームとも地域愛着が経年的に向上するという結果を得ることができなかった。このことより、地域密着型を謳うプロスポーツチームの誕生を介して、地域への愛着は向上しないことが示唆される。しかし、そもそも観戦者の方がホームタウンに愛着が高いことが示されたため、プロスポーツを観戦する観戦者が元来、地域愛着の高い観戦者が多く集まっていたことが最大の理由であると考えられる。2チームアイデンティフィケーションの経年比較:一方で、チームアイデンティフィケーションの経年変化の推移を見ると、2チームともに、チームに対する愛着は年々上昇傾向にあることが伺える。このことより、観戦者は観戦行動を経験することで、チームへの愛着が醸成されることが経年変化から明らかとなった。3地域愛着とチームアイデンティフィケーションの関係性:最後に、地域愛着とチームアイデンティフィケーションの関係性を明らかにするため、共分散構造分析を行った。しかし、岩手・長野両方において、モデル適合が悪い結果となったが、いずれにおいてもチームアイデンティフィケーションから地域愛着へのパス係数が高いことから、チームアイデンティフィケーションが醸成されることによって、地域愛着が高まるのではないかという可能性を残す結果となった。この分析においては、課題が残るものとなった。本研究では、2011年度から新たにbjリーグに参入した「岩手ビッグブルズ」「信州ブレイブウォリアーズ」の2チームの観戦者と、ホームタウン在住の非観戦者を対象として、地域密着型プロスポーツチームの出現が、地域愛着(以下、PA)にどのような影響を与えるのか、またその後チームアイデンティフィケーション(以下、TI)はどのように変化するのかを、3年間の縦断的研究によって明らかにすることを目的とした。2年目にあたる本調査は、試合会場で観戦者に対して行う来場者自記式調査と、観戦経験のない地域住民に対するインターネット調査から構成される。開幕直後とシーズン終了前の2回の質問紙調査を実験群の観戦者を対象として行い、統制群として、ゲームを観戦したことのない地域住民を対象に、インターネット調査を実施し、PAとTIの時系列変化を調べた。なお、分析には、PAとTIの質問項目を完全回答したサンプルのみを用いた。また観戦者に対しては、人口統計的変数、観戦行動、地域愛着、チーム愛着の4つのジャンルの質問項目を設定し、非観戦者に対しては人口統計的変数及び地域愛着のみを設定した。岩手、長野のPA 5項目の平均値を観戦者と非観戦者の間で前後比較したものである。岩手は、非観戦者では前後に有意な差が見られなかったが、観戦者では「岩手にずっと住み続けたい」に5%水準で有意な差が見られた。

長野は、非観戦者では前後に有意な差が見られなかったが、観戦者では「長野は他の地域よりも大切である」に1%水準で、「長野に愛着を感じている」に5%水準でそれぞれ有意差が見られた。これらの結果より、地域密着型プロスポーツチームは観戦者のPAを高めるのではなく、もともとPAの高い地域住民を集める機能があり、またTIを高める因子はチームごとに異なり、チームの活動や取り組みに左右される可能性が示唆された。本年度は、昨年からbjリーグに新規参入する3チームについて調査を行う予定であったが、「千葉」が、チーム経営陣の交代等で混乱したため、開幕戦の調査ができず、結局2チームでの実施となつた。本年度は、新たに参入する群馬において、実施する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。23年度と24年度の調査は、概ね順調に進展しており、これまで試合会場で観戦者に対して行う来場者自記式調査と、観戦経験のない地域住民に対するインターネット調査を実施してきた。具体的には、開幕直後とシーズン終了前の2回の質問紙調査を実験群の観戦者を対象として行い、統制群として、ゲームを観戦したことのない地域住民を対象にして、インターネット調査を実施し、PAとTIの時系列変化を調べた。なお、分析には、PAとTIの質問項目を完全回答したサンプルのみを用いた。3チームでの調査予疋が2チームになったため、本年度は、bjリーグに新規参入する群馬を調査対象とし、10月の開幕戦と来年2月のホームでの試合において調査を実施する予定である。なおインターネット調査に関しては、予算的な制約もあり、これまでの2チームのみとする予定である。平成25年度の調査も基本的に平成23ー24年度の方法を踏襲し、開幕直後とシーズン終了前の2回、観戦者に対する調査を実施し、これを実験群とする。統制群への調査として、地域住民に対するインターネット調査も同じ時期に2回行い、TIと地域愛着に関する比較を行う。さらに本年度は、平成24年度と同様、開幕直前に、観戦者と地域住民に対するフォーカスグループインタビューを行い、チームと地域愛着に関する議論を誘導し、有益な定性的データを収集する。これによって、3年間のプロスポーツの活動が、トポフィリア(場所愛)に与えた影響を包括的に分析する。加えて最終年度は、3年間の調査結果をまとめた報告書を作成するとともに、岩手と長野に対する報告会を開催し、チームごとにパーソナライズされた情報提供の機会を設ける。スポーツビジネスの現場との接点を重視することで、本研究の応用研究としての価値を高める。なお作成された報告書の一部は、チームの許可を得て、学会や論文として発表を行う。
消尽法理の再構築－法学的及び経済学的側面からの総合的研究－

消尽法理の正当化根拠と判断基準について、法学的・経済学的側面から総合的に検討を行った。消尽法理は、特許権者の保護の要請と市場における特許製品の円滑な流通確保の要請とを調和させるための枠組みであり、消尽が否定され、特許権の行使が許されるのは、特許権者以外の出所から別の新たな「特許製品」が生産され、特許権者を出所とする特許製品の需要が奪われることにより、上述の2つの要請の衡量という見地から、特許権者に過度の制約が課される場合に限られることを明らかにした。本研究の目的は、特許法及び著作権法における消尽法理の理論的根拠の解明とその要件論の再構築を、法学的側面と経済学的側面の両面から総合的に行うものである。今年度は、平成23年度の研究で達成された従前の裁判例・学説の体系的整理を前提に、もっぱら消尽法理の適用要件論に関する研究に従事した。この研究に際しては、関連する内外の裁判例が新たに登場したことに鑑み、その理論的検討が中心となった。1つは、特許法上の「生産」概念に関する判決であり、物の「生産」には、供給を受けた物を素材として、加工・修理・組立て等これに何らかの手を加えることが必要であると判示したものである。かような考え方は、消尽の成立をを否定する「生産」要件について、製品に対する物理的加工を要求する研究代表者の見解と整合性を持つものの、本判決のような「生産」概念の厳格な理解には反対も強い。そこで、消尽の局面においては、最高裁判決が用いた「製造」概念を再評価し、これを「生産」概念と峻別する可能性について検討した。さらに、適法ダウンロードされた著作物の複製物の流通に対する消尽法理の適用をめぐる欧米の動向にも注目した。従来、消尽法理は、権利者が有体物としての特許製品あるいは著作物の化体した有体物を譲渡した場合にのみ適用される法理と考えられていたところ、権利者等による著作物の第一拡布が、インターネット上での無体的な手段での拡布であった場合、同法理の適用があるのかという問題である。市場における円滑な流通確保という消尽法理の正当化根拠は、インターネットを介した著作物の流通にも等しく妥当すると考えられることから、消尽法理の適用を肯定すべきではないかという方向から考察を行った。本研究の目的は、消尽法理の理論的根拠の解明とその要件論の再構築を、法学的側面と経済学的側面の両面から総合的に考察するものである。研究最終年度である今年度は、主に平成23年度に行った消尽法理の理論的根拠を再検討する作業から得られた知見、主に平成24年度に行った消尽法理の要件論の再構築作業から得られた知見を総合し、理論的根拠に即した要件論の整理に従事した。具体的には、消尽法理を、特許権という権利の尊重、権利者の保護を要請する規範である「権利保護の原理」と円滑な流通の確保、転得者等の保護を要請する規範である「取引安全の原理」の衝突を調整することを目的としたものと把握した上で、権利保護の原理に対する制約を可能な限り小さくしつつ、可能な限り高い程度で取引安全の原理を充足するために承認された優先条件決定ルールこそが、消尽法理の内実であるとの位置づけを明らかにした。さらに、消尽法理を認めることが、権利保護の原理に対する過度の制約(過剰介入)となっていないかを吟味する場が「対価獲得機会の存否」であり、これを法学・経済学両面から分析した。その上で、要件論の構築においても、特許権者が特許製品から対価を取得する機会があったか否かを軸に据え、自らが譲渡した特許製品と同一性を欠く新たな特許製品が生産されたと認められる場合には、権利者は新たな特許製品から対価を獲得する機会が与えられていないが故に、消尽を否定すべきであり、「特許発明」としての同一性よりも、「特許製品」としての同一性を基軸とした判断が求められることが、研究期間全体を通して明らかとなった。本研究の目的は、特許法及び著作権法における消尽法理の理論的根拠の解明とその要件論の再構築を、法学的側面と経済学的側面の両面から総合的に考察するものである。本年度は、研究の前提として、我が国の従来の裁判例・学説の再検討と体系的整理に着手するとともに、消尽法理の理論的根拠について再検討を行うための準備作業に入った。知的財産権者保護の要請と市場における知的財産の円滑な流通確保の要請とが衝突してい局面で、この両者を適切に衡量するための枠組みを構築する理論的考察を進めた。この作業を行う際には、規範的な分析ともに、消尽法理が社会で実際にもたらし得る帰結、とりわけ、知的財産保有者の収益構造の変化を適切に把握し、それを視野に入れた機能的な分析が必要となる。

そこで、本年度の後半期には、知的財産保有者の収益構造・収益獲得ルートに関する分析にも従事した。ここでは、知的財産保有者と知的財産の利用を欲する者との間での「契約」締結による利用許諾とその対価徴収が重要な要素となる。そこで、本研究課題から見れば派生的な研究とはなるが、知的財産の利用を内容とする実施契約に対する規制のあり方についても考察を広げ、民法理論との整合性に特に留意しつつ検討を進めた。本年度は、基本的・原理的な研究に軸足を置いたため、具体的な要件論など解釈論には踏み込めなかったが、今年度の基礎研究をもとに、次年度以降、具体的な成果に結びつけたい。昨年度に行った従前の裁判例・学説の体系的整理を前提として、消尽法理の要件論を再検討するという当初の目的を、新たに登場した内外の裁判例をも踏まえつつ、おおよそ達成することができた。今年度は、知的財産保有者の収益構造、利得獲得手段に関する分析を行いつつ、消尽法理の理論的根拠を再検討するという当初の目的をおおよそ達成することができた。ただし、研究計画では、比較法研究のための海外調査を予定していたが、調整がつかず断念せざるを得なかった。今後は、これまでの研究のまとめとして、法学・経済学両面からのアプローチを接合した総合的な研究を行い、理論的根拠と整合的な要件論・効果論の確立を図る。今後は、本年度に行った基礎研究に経済分析を加えた総合的な研究に着手するとともに、理論的根拠との整合性を持った具体的な要件論の確立を図る。また、今年度断念せざるを得なかった海外調査も行う予定である。今年度に引き続き、本研究課題に関連する文献・資料の購入を進める。また、本研究目的を達成するためには、実務家との交流により実務的知見を獲得することが不可欠となる。そこで、学会や研究会等に積極的に参加し、研究成果の報告や意見交換を通じて、他の研究者の研究成果に触れるとともに実務的知見を獲得する。そのための旅費を支出する。さらに、今年度に予定していた内外の研究調査について、調整がつかず断念せざるを得なかったものもあり、研究費に残額(次年度使用額)が生じた。次年度は、これを外国旅費として支出する予定である。さらに、前述の通り、今年度は海外調査を行うことができなかったこともあり、研究費に残額(次年度使用額)が生じた。次年度以降、これを外国旅費として支出する予定である。
siRNA を用いた急性感音難聴治療モデル

現在開発中の急性感音難聴治療薬の標的分子であるMAP kinase群が、急性感音難聴発症時の蝸牛でどの様な時間経過で活性化しているか明らかにした。またsiRNA等による蛋白合成レベルでの治療介入モデルの構築にむけて、リン酸化MAP kinase群の量的変化とMAP kinase蛋白総量の発現変化を個別に解析した。マウス内耳においてphospho-MEK1/ERK/P90RSKカスケードは、らせん神経節と感覚上皮で騒音暴露後3-6時間をピークに活性化していた。この際total-MEK1/ERK/P90RSKには増加を認めず、一時的なリン酸化によるもので蛋白合成を伴わないものと考えられた。JNK,p38MAPKについては48時間後のらせん神経節での遅発性活性化を認めた。p38MAPKの遅発性増加には蛋白合成を伴っていた。これらの所見はsiRNAによる蛋白合成抑制など、新たな急性感音難聴治療戦略の基盤となると考えられる。当研究の目的は、c-junを特異的かつ効率的に抑制するsiRNAをマウス内耳に投与することにより、c-jun発現からアポトーシスに至るカスケードを抑制して、内耳を急性障害から防御するモデルを構築することである。平成22年度は騒音発生装置を作成し、CBAマウスを120dB SPL,4000-8000バンドノイズに2時間暴露する騒音性難聴モデルマウスを作成した。この騒音刺激は一時的な高度難聴(Temporary threshold sift : TTS)および永続的な感音難聴(Permanent threshold sift : PTS)を引き起こす刺激として確立されたものである。さらに内耳内でのc-jun発現を確認し、騒音暴露前、騒音暴露後に内耳でのc-jun発現のタイミングをQuantitative realtime RT-PCRで定量検討した。その結果蝸牛でのc-jun発現は騒音暴露直後にコントロール(騒音にさらされていない群)の3.85倍まで増加し、12時間以内にコントロールレベル(0.97倍)にもどる事がわかった。この検討により騒音暴露後の内耳でもc-jun発現を引き金とし、アポトーシスへ至るカスケード(JNK pathway)が活性化されることが確認されたほか、騒音暴露後のc-jun発現の時間経過を検討することにより、適切なタイミングでc-jun特異的siRNAを投与することが可能となった。すなわち、リポソームとして内耳に導入されたプラスミドベクターの効果は導入後72時間で最大となるため、まずプラスミドベクター投与後に騒音暴露をおこなってc-junの発現を検討する必要があることが判った。また平成22年度には内耳にc-jun特異的siRNAを投与するにあたって、c-jun特異的siRNAを発現するプラスミドベクターを構築した。このプラスミドベクターはマウスの細胞内でマウスU6プロモーターによりSmall hairpin RNA(shRNA)を発現し,shRNAはsiRNAへと分解される。siRNAがターゲットとするシークエンスは5'AAAGTCATGAACCACGTTAAC-3'であり、このsiRNAによりc-jun mRNAは効率的に分解される。平成23年度には、マウスにc-Jun siRNA発現プラスミドを鼓室内投与し、120dBの騒音に2時間暴露した後1時間後に蝸牛を採取し、ウエスタンブロット法にてc-Jun発現量を検討したが、当初予想したc-Jun発現量の抑制は得られなかった。そこで、上記の騒音暴露に・よる急性感音難聴モデルで、c-Junおよびc-Junをリン酸化する酵素であるJNK,JNKを含むMAPキナーゼ群の蛋白であるMEK1, ERK1/2, P90RSK, P30MAPKの総蛋白量およびリン酸化蛋白量の変化を経時的に検討して、siRNA等による治療戦略に適した新たな標的分子の検索を行った。騒音暴露前(コントロール)、騒音暴露直後、3時間、6時間、12時間、24時間、48時間にMultiplex法にて上記の蛋白質の定量をおこなったところ、Phospho-JNKは暴露後3時間(コントロールレベル[100±7.3% ; Mean±S.D.]と比較して167.2±18.1%)をピークとして増加していた他、48時間後(185.4±13.8)にもピークをみとめた。

Phospho-c-Junは3時間(302.3±14.8)、12時間(335.2±31.2)をピークとする2峰性の増加をしめした。Phospho-MEK1は3時間(214.4±13.3), Phospho-ERK1/2は6時間(318.9±18.4), Phospho-p90 RSKは3時間(229.3±18.2), Phospho-p30 MAPKは48時間後(216.3±14.2)をピークとする増加をしめした、又Phospho-p30MAPKは3時間後にも有意な増加(117.4±13.6 ; p<0.01)をしめした。総蛋白量についてはTotal-MEK1, Total ERK1/2, Total-p90 RSKの増加はリン酸化蛋白の増加にともなって有意ではあったものの、いずれも100±20%以内に留まっており、これらの蛋白質の活性化はde novo蛋白合成ではなく主にリン酸化によるものであると考えられた。Total-c-JunはPhospho-c-Junと一致して、3時間(195.7±13.0)、12時間(217.4±6.1)をピークとする増加をしめした。またTotal-p30MAPKもリン酸化蛋白量のピークと一致して3時間後(134.8±11.6),48時間後(159.7±12.2)に増加しており、c-Jun, p30MAPKについてはその活性化にはde novo蛋白合成が主に寄与すると考えられた。急性感音難聴の治療戦略としてはde novo合成により合成される蛋白についてはsiRNAによる遺伝子発現-蛋白合成の抑制は有効で、主にリン酸化のみにより活性化される蛋白については蛋白活性自体の抑制が有効と考えられる。平成24年度にはまず、10週齢CBA/Jマウスを120dBオクターブバンドノイズに暴露した後、暴露前、暴露12時間後、24時間後、14日後に聴性脳幹反応により聴力を検討した。暴露直後(58.1&#61617;12.5 dB SPL, n=8)から12時間後(73.6&#61617;14.4, n=8)にかけて最大となり、24時間後(48.6&#61617;15.7, n=7)には部分的に回復、また14日後(40.0&#61617;13.8, n=6)にも永続的に持続する難聴をみとめた。いずれも暴露前の聴力閾値(20.6&#61617;5.6, n=8)に比べて有意な上昇をみとめた(p<0.01, Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U-test)。またMEK1/ERK/p90RSKカスケードのマーカーとしてphospho-p90RSKの発現量が最大となる時間経過(騒音暴露後3時間)、JNK/c-Junカスケードのマーカーとしてphospho-JNKの発現量が最大となる時間経過(騒音暴露後3時間および48時間)、またphospho-p38MAPKの発現量が最大となる時間経過(騒音暴露後48時間)で免疫染色法により各分子の内耳での発現部位を検討した。phospho-p90RSKは騒音暴露3時間後にらせん靭帯、感覚上皮のコルチ器外有毛細胞、内有毛細胞、支持細胞で発現していた。phospho-JNKは騒音暴露3時間後にらせん靭帯、感覚上皮のコルチ器外有毛細胞、内有毛細胞、支持細胞、らせん神経節で発現していた。また48時間後にはらせん神経節で発現していた。phospho-
Beyond MHz帯電力用扁平磁性粉末積層コンポジット磁心材料の磁化機構の解明

Beyond MHz帯で高透磁率と低損失を両立し,熱暴走リスクの少ない候補材料として期待される扁平金属磁性粉末積層コンポジット磁心材料を対象に,扁平粉末の磁化特性や磁気構造,扁平粉末積層コンポジット磁心材料の透磁率やコアロスなどの磁気物性評価によってBeyond MHz帯磁化機構を解明する。これらの知見をもとに磁心材料の開発指針を整理し,材料試作/評価によって本研究の有用性を実証する。
遺伝性ムコ多糖代謝異常症の分子病態解析と酵素補充療法開発に関する研究

研究目的遺伝性ムコ多糖症に対する安全で有効な治療法の開発を目的として、本症の分子病態解析を行う。本研究においては原因酵素であるSulfatase蛋白質の三次元構造を解析し、構造と機能の関連性および遺伝子変異と臨床表現型との相関性を明らかにする。研究結果1.ムコ多糖症II型(Hunter病)の原因酵素iduronate-2-sulfatase(IDS)について、16種類のIDS点変異を発現ベクターに挿入してCHO細胞にトランスフェクションし、stableなcell lineを作成して発現蛋白質の生化学的解析を行った。重症型と軽症型の変異の機能的差異に明確な結果が得られた。重症型変異はIDS酵素活性は検出されず、軽症・中間型変異では僅かに45kD,55kDの成熟体が確認され、残存活性も確認された。2.ムコ多糖症II型原因酵素IDSの3次元構造モデルを4S、ASAとGALNSの構造を基にhomology modeling法にて構築した。立体構造と変異酵素体の生化学的解析からさらなる病態解析を進めている。本研究においては原因酵素であるsulfatase蛋白質の三次元構造を解析し、構造と機能の関連性および遺伝子変異と臨床表現型との相関性を明らかにする。研究結果(1)ムコ多糖症IVA型原因酵素GALNSについて、common mutation D60Nを含む4種類のmild変異発現ベクターを作成し、CHO細胞にtransfectionした。得られた変異酵素をWestern blot,Km,熱安定性から性状を解析した。先の研究にて構築したGALNS構造モデルから構造的変化を調べると、mild変異酵素蛋白質は立体構造上で大きな変化を示さず、従って機能が不完全ながら保持されていることが明らかとなった。(2)ムコ多糖症II型原因酵素IDSについて、18種類の変異発現ベクターを作成し、CHO細胞にtransfectionしてstable発現系を作成中である。またIDS酵素蛋白質についても構造モデルを構築して、構造と機能解析に取り組みつつある。研究結果(1)ムコ多糖症II型(Hunter病)の原因酵素iduronate-2-sulfatase(IDS)について発現ベクターpCXNにwildと16種類のIDS点変異遺伝子を挿入しCHO細胞にトランスフェクションした。G418選択培地で培養してstableなcell lineを作成し、発現蛋白質の酵素活性測定とWestern blot解析を行った。患者細胞や低発現系では変異酵素の活性は感度以下で検出されず、重症型と軽症型の変異の機能的差異は不明であったが、今回のstable発現系で明確な結果が得られた。重症型変異(5種類)はIDS酵素活性は検出されなかった。Western blotでは75kDの前駆体のみが確認された。軽症・中間型変異(5種類)はwildの約0.1-2%の活性が検出された。Western blotではQ531Xは73kDの前駆体が、他の変異は75kDの前駆体、62kDの中間体、僅かに45kD,55kDの成熟体が確認された。(2)IDS3次元構造モデルの構築:4S、ASAとGALNSの構造を基にhomology modeling法にてIDSの3次元構造モデルの構築を試みた。全体構造は4S、ASA、GALNSと同様に2つのドメインから形成され、N末端の大きなドメインはα/β構造を示し、10本のβシートがαへリックスにサンドイッチ状に狭まれていた。C末端の小さなドメインは4本の逆平行βシートとそれに直角に配置するαへリックスから構成されていた。さらに側鎖の解析を進めている。
新規生物防除法の確立を目指した牧草共生菌と近縁病原菌の感染機構の比較解析

1.ProAのEfESDCプロモーターへの結合性先に,牧草共生菌Epichloe festucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須なZn(II)2Cys6タイプの転写制御因子をコードするEfPROAを同定した。さらに、EfPROA破壊株において、Aspergillus nidulansの有性生殖に必須なesdCの相同遺伝子EfESDCの転写レベルが顕著に低下し、EfESDCがPROAの下流遺伝子であると推定された。マルトース結合タンパク(MBP)とProAの融合タンパク(MBP-ProA)を大腸菌で発現し、精製した。ゲルシフトアッセイ法を用いて、MBP-ProAのEJESDCのプロモーター配列への結合活性を調査したところ、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから631bP上流の配列GCGCCGに結合することが明らかとなった。本年度は、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから1140bp上流の配列GGCGCにも結合することを明らかにし左。さらに、EfESDCのプロモーター制御下の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を調査し、GFPの高発現には、140bp上流の配列GGCGCが必須であることが明らかとなった。2.クロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いたE.festucaeのProAに制御される遺伝子群の解析ProAとGFPとの融合タンパク(ProA-GFP)発現ベクターを構築し、E.festucae野生株に導入した。得られた形質転換体においてProA-GFPが核に局在していることをGFP蛍光の観察により確認した。転写因子をクロマチンに固定した形質転換体から免疫沈降によってProA-GFPとともに結合したDNA断片を抽出した。リアルタイムPCR法により、抽出したDNA断片中にEfESDCプロモーターを含む複数のプロモーター配列が高濃度で存在することが明らかとなった。先に、麦角菌科エンドファイトEpichloe festucaeから共生に不可欠な遺伝子としてPROAを同定した。植物病原菌の植物感染におけるPROA相同遺伝子の機能を解析するために、メロンつる割病菌からFoPROAを単離し、メロンつる割病菌のFoPROA変異株を作出した。得られた変異株の宿主メロンに対する病原性を検定したところ、野生株と変異株で病原性に差は認められず、本菌の植物感染にFoPROAは必須でないことが明らかとなった。2.E.festucaeにおけるFOW2相同遺伝子(EfFOW2)の機能解析先に、所属研究室では、メロンつる割病菌の植物感染に不可欠な遺伝子としてFOW2が同室された。E.festucaeの共生能力におけるFOW2相同遺伝子の機能を解析するために、E.festucaeからEfFOW2を単離し、E.festucaeのEfFOW2変異株を作出した。得られた変異株を宿主ペレニアルライグラスに接種したところ、変異株は野生株と同様に宿主の細胞間隙に伸長し、共生関係を成立した。以上の結果は、E.festucaeの宿主植物との共生確立にEfFOW2は必須でないことを示した。先に、Nowrousianらは、Sordaria macrosporaのPROA相同遺伝子PRO1の機能を解析するためマイクロアレイを用いて、野生株とPRO1破壊株における遺伝子発現パターンを網羅的に比較し、PRO1破壊株において転写レベルが低下または上昇する遺伝子群を同定した。このうちPRO1破壊株において顕著に転写レベルが低下している約50遺伝子について、E.festucaeゲノムからその相同遺伝子を検索したところ、12遺伝子の相同配列が検出された。そこで、これら遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いたリアルタイムPCR法によって、共生時における各遺伝子の転写レベルを調査した。その結果、Aspergillus nidulansの有性生殖関連タンパク質をコードするesdCと相同性を示すEf_03600の転写レベルがEfPROA破壊株において顕著に低下した。1.植物病原菌におけるPROA相同遺伝子の機能解析先に、イネ科牧草の共生菌Epichloe festucaeから植物との共生に不可欠な遺伝子としてPROAを同定した。PROAは転写制御因子をコードし、その変異株は、宿主内での菌糸生育が野生株に比べ著しく促進され、接種植物に生育阻害や枯死を引き起こす。植物病原菌の植物感染におけるPROA相同遺伝子の機能を解析するために、本年度は、イネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)とイネばか苗病菌(Gibberella fujikuroi)からPROA相同遺伝子を単離し、各病原菌の病原性における機能を解析した。その結果、イネいもち病菌のPROA破壊株は、野生株と同様な病原性を示し、PROAが病原性に関与しないことが明らかとなった。一方、イネばか苗病菌のPROA破壊株は、野生株に比べ病原性が顕著に低下し、PROAが病原性に重要な役割を果たすことが明らかとなった。以上の結果は、PROAが、植物共生菌では宿主植物内での菌糸生育を抑制する役割を持つのに対し、一部の植物病原菌では、宿主植物中で生育を促進し病原性を発揮するために必須であることを示唆した。2.PROAが発現を制御する遺伝子の同定腐生的糸状菌Sordaria macrosporaのPRO1(PROA相同遺伝子)破壊株では、ステロール結合ドメインを持つタンパク質をコードするesdCの発現レベルが顕著に低下する。

E.festucaeのPROA破壊株においても野生株と比較してesdCの転写レベルが顕著に低下していることが明らかとなり、esdCがPROAの下流遺伝子であると推定された。また、esdCはAspergillus nidulansではPROAと同様に有性生殖に必須であることが知られている。そこで、植物共生におけるesdCの機能を解析するために、E.festucaeからesdC相同遺伝子を単離し、その破壊株を作出した。esdC破壊株を宿主ペレニアルライグラスに接種したところ、破壊株は野生株と同様な共生能力を保持しており、esdCが植物共生には関与しないことが示唆された。今後、PROAに制御される共生に関与する遺伝子を同定するためには、下流遺伝子群の網羅的同定が必要である。1.ProAのEfESDCプロモーターへの結合性先に,牧草共生菌Epichloe festucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須なZn(II)2Cys6タイプの転写制御因子をコードするEfPROAを同定した。さらに、EfPROA破壊株において、Aspergillus nidulansの有性生殖に必須なesdCの相同遺伝子EfESDCの転写レベルが顕著に低下し、EfESDCがPROAの下流遺伝子であると推定された。マルトース結合タンパク(MBP)とProAの融合タンパク(MBP-ProA)を大腸菌で発現し、精製した。ゲルシフトアッセイ法を用いて、MBP-ProAのEJESDCのプロモーター配列への結合活性を調査したところ、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから631bP上流の配列GCGCCGに結合することが明らかとなった。本年度は、MBP-ProAが、EfESDC開始コドンから1140bp上流の配列GGCGCにも結合することを明らかにし左。さらに、EfESDCのプロモーター制御下の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を調査し、GFPの高発現には、140bp上流の配列GGCGCが必須であることが明らかとなった。2.クロマチン免疫沈降(ChIP)法を用いたE.festucaeのProAに制御される遺伝子群の解析ProAとGFPとの融合タンパク(ProA-GFP)発現ベクターを構築し、E.festucae野生株に導入した。得られた形質転換体においてProA-GFPが核に局在していることをGFP蛍光の観察により確認した。転写因子をクロマチンに固定した形質転換体から免疫沈降によってProA-GFPとともに結合したDNA断片を抽出した。リアルタイムPCR法により、抽出したDNA断片中にEfESDCプロモーターを含む複数のプロモーター配列が高濃度で存在することが明らかとなった。