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古典的自由主義から現代自由主義への変容を評価する枠組の構築のための研究

いわゆる「古典的自由主義」が民主政と福祉国家を擁護する「現代自由主義」に変容する過程において、自由主義思想の内部で生じた多様な議論を分析し、またこれらの議論を近年の自由主義をめぐる論争と比較することによって、現代自由主義思想の意義とその脆弱性を評価する枠組の構築の可能性について検討し以下の知見を得た。19世紀末から20世紀初頭の時期は、認識論、道徳的志向、政治・社会制度の諸次元において、人間存在の共同体的契機が問題化された時期であった。これらの議論の諸次元は一括されて全体化され、認識論から社会制度に至る包括的な道徳的・政治的ヴィジョンとして主張されることが多く、これが異なるヴィジョンの相互比較の可能性を見えにくくしている。しかし実際には、これらの主張の諸次元を相対的に切り離すことは可能であり、適切な仕方で再構成されれば当時の多様な主張の中には、独特な思惟要素(たとえば独特な観念論的主張)と独立に評価・比較の可能な要素が多いことがわかった。また生産的な比較のためには、当時の、「自由」、「平等」、「社会」の定義をめぐる論争やこれらを用いた抽象的レベルの議論から一歩距離をとり、これらの議論によって主張される具体的な価値やニーズの次元に焦点を当てることが有用であることがわかった。このような議論の諸次元の相対的独立性と、抽象的概念の背後で主張される具体的な価値・ニーズの特定とその個別的検討の重要性は、近年類似のトピックをめぐって展開された「リベラル・コミュニタリアン論争」の推移の検討からも得られる知見であり、両者を通じた「共同体的価値」をめぐる通史的検討に高い有用性が存在することが明らかになった。研究の一年目にあたる本年は、次の二つの作業を行った。第一に、本研究の対象を取り巻く思想的脈絡の再構成のために、古典的自由主義の代表的な理論家ハーバート・スベンサーおよびイギリス観念論の中心人物であるT・H・グリーンの思想に分析をくわえ、「新自由主義」との重なりおよび相互の比較可能性を検討した。スベンサーについては、一般に社会制度論における個人主義的性格が強調される傾向が強いが、彼の思想は、多様な次元における共同体ないし有機体の観念を含んでおり、これが個人主義的契機と統合される態様が、新自由主義の評価にとって有用な比較の視座を提供することがわかった。またグリーンの思想については、彼独特の観念論の評価が問題になるが、一方で、道徳的志向および社会制度をめぐる彼の思想には、彼の観念論から独立に、評価・比較が可能な要素が多いことがわかった。同時に、観念論によって、これらの次元の思想が拘束される側面も存在することから、新自由主義との比較において、この両面の検討が重要であることが明らかになった。第二に、この時期の思想の焦点である、「共同体」をめぐる議論を分析する枠組みの洗練のために、「共同体」をめぐる近年の諸理論を検討し、共同体の概念によって行われる主張の多義性を分析した。いわゆる「リベラル・コミュニタリアン論争」以降、「共同体」は現代政治哲学の焦点となってきたが、近年は、この論争の過程で提起された多様なトピックをめぐって、議論が多方面に分岐している。そこで、これらの論争の分岐をあとづけることによって、「共同体の重視」という表面的な類似性をこえて、そのもとに主張される具体的な諸価値のレベルで、様々な差異を同定することが可能になる。この作業により、より厳密・具体的なレベルで諸思想を評価するための分析枠組みの手がかりを得た。
高脂血症誘発型脂質と組織蓄積型脂質の生体内再配分に関する研究

ラットにおける食餌性脂肪の吸収と生体内再配分のあり方と血清および組織蓄積脂質の脂肪酸組成を調査した。また、食餌性脂肪のこのような生体内再配分に及ぼすβ3ーアゴニスト治検薬の効果について調査した。糞中に残る食餌性脂肪について調査した結果は、牛脂の残留量は植物油よりも少なかった。その残留する脂肪酸組成はいずれの油脂でもパルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の三種が主要な脂肪酸であった。吸収された脂質の生体内での再配分のあり方については、オリーブ油は腹腔内脂肪(腎臓周囲脂肪)および肝臓のいずれの組織においても牛脂よりも有意に多く蓄積した。その脂肪酸組成は腹腔内脂肪で食餌性脂肪のそれと最もよく類似していた。筋肉や肝臓に蓄積した脂質の脂肪酸組成も食餌性脂質のそれと類似していた。β3作働薬であるBRL35,135を餌に混入させて投与すると、植物油を給餌した場合に生体内脂質蓄積量を減少させた。特に、不飽和脂肪酸の蓄積阻害に対して有意な効果が認められた。CGP12,177の投与は食餌性脂肪の生体内蓄積に対しては有意な効果を認めるには至らなかった。糞中に残留する脂質及び生体内に再配分・蓄積された脂質の過酸化脂質活性(Lipid Hydroperoxide Activity)は、牛脂を摂取した場合には肝臓脂肪、腹腔内脂肪の何れにおいても植物油を摂取したラットのそれらよりも低い値を示した。このことからも、牛脂摂取が生体に有害ならざることが示唆された。他方、糞中に残留する脂質の被過酸化性は牛脂を摂取したラットでの方がそうでないラットよりも高い傾向を示したが、有意差は認められなかった。本研究の目的はその構成脂肪酸に大きな違いのある家畜由来の動物性脂肪と植物油とでは摂取のされ方、さらには、摂取後の生体内での蓄積のされ方にどのような違い乃至特徴があるか、を調査することにある。先ず、肝臓1g当たりに含有される脂質重量という指標で見ると餌重量ベースで12%(日本人の平均脂肪摂取割合)の紅花を含む餌を摂取したラットのグループで他の脂質を摂取したラットグループよりも高い値を示した。腹腔内への脂質の蓄積について見ると、今回テストした4種類の脂質、即ち、牛脂、カノーラ油、オリーブ油及び紅花油の間では有意な違いは見られなかった。但し、血清トリグリセリド濃度は牛脂、オリーブ油を摂取させたラットグループで有意に高い値を示した。糞中の脂質重量については有意さは見られなかったが、過酸化脂質は植物油を摂取したラットのそれで高い傾向を示した。さて、生体内に蓄積した脂質の脂肪酸組成について調査したところ、腹腔内脂肪のそれは摂取した餌に含まれる脂質の脂肪酸組成のそれと極めて類似していた。次いで、筋肉や肝臓に蓄積する脂質のそれが餌のそれを良く反映したものであった。血清脂質の脂肪酸組成は摂取した脂質のそれをあまり反映せず、比較的類似した組成を示した。しかし、植物油を摂取したラットグループではアラキドシ酸の割合が高かった。これらの蓄積脂質の過酸化脂質は牛脂を摂取したラットグループで相対的に低い値を示したが統計的に有意な違いにまでは至らなかった。ラットにおける食餌性脂肪の吸収と生体内再配分のあり方と血清および組織蓄積脂肪の脂肪酸組成を調査した。また、食餌性脂肪のこのような生体内再配分に及ぼすβ3-アゴニスト治検薬の効果について調査した。

吸収された脂質の生体内での再配分のあり方については、オリーブ油は腹腔内脂肪(腎臓周囲脂肪)および肝臓のいずれの組織においても牛脂よりも有意に多く蓄積した。その脂肪酸組成は腹腔内脂肪で食餌性脂肪のそれと最もよく類似していた。筋肉や肝臓に蓄積した脂質の脂肪酸組成も食餌性脂質のそれと類似していた。β3作働薬であるBRL35,135を餌に混入させて投与すると、植物油を給餌した場合に生体内脂肪蓄積量を減少させた。特に、不飽和脂肪酸の蓄積阻害に対して有意な効果が認められた。CGP12,177の投与は食餌性脂肪の生体内蓄積に対しては有意な効果を認めるには至らなかった。糞中に残留する脂質及び生体内に再配分・蓄積された脂質の過酸化脂質活性(Lipid Hydroperoxide Activity)は、牛脂を摂取した場合には肝臓脂肪、腹腔内脂肪の何れにおいても植物油を摂取したラットのそれらよりも低い値を示した。このことからも、牛脂摂取が生体に有害ならざることが示唆された。他方、糞中に残留する脂質の被酸化性は牛脂を摂取したラットでの方がそうでないラットよりも高い傾向を示したが、有意差は認められなかった。
陽子線治療に対する体内線量測定法の開発と高精度陽子線治療計画への応用

MOSFET検出器による陽子線の線量測定において、MOSFET検出器はLET依存性を有する。それゆえ、in-vivo dosimetryを実施するためには、感度劣化が大きな問題であり、MOSFET検出器をそのまま利用することは難しい。そこで今回、190MeVの陽子線を用いて、MOSFET検出器(TN-252RD)と電離箱によりブラッグカーブを測定し、電離箱に対するMOSFET検出器の感度補正量を深さの関数として求め、この補正関数を組み込んだペンシルビーム線量計算法を用いて、測定点における感度補正量を算出し、得られた感度補正量を測定値に乗じることで、MOSFET検出器による測定線量値を算出する方法を開発した。開発した感度補正法を検証するために、モノエネルギービームを使って、L型ボーラス通過後の陽子線線量分布測定を実施した。L型ボーラスでは、厚いボーラスを通過した陽子線と薄いボーラスを通過した陽子線により、様々な飛程を有した陽子線が混じり合って、線量分布を形成しており、その様子が測定位置に依存した感度劣化量の違いとなって現れていることがわかった。すなわち、測定位置により複雑に感度変化しているので、測定位置に応じて感度補正量を算出する必要がある。結果として、MOSFET検出器により得られた線量値は、測定位置により複雑に感度変化しているが、それにも関わらず、感度補正されたMSOFET線量値は、電離箱による測定値と3%程度の誤差で良く一致し、正確に補正されていることが明らかになった。以上より、本手法を用いることで、MOSFET検出器による陽子線に対するin-vivo dosimetryが実現できることを実証できた。さらに、ホットスポットやコールドスポットが形成される不均質媒質中でも正確な感度補正ができる手法へと開発を進め、高精度in-vivo dosimetryの実現を目指す。陽子線治療における体内線量測定を目指し、体内不均質中でも高精度に線量計算可能な高速モンテカルロ法を開発した。不均質効果が顕著な領域でも、高速モンテカルロ法による計算結果は、実測値と良く一致し、懸念された不均質媒質中の線量分布でも高精度に予測することがわかった。しかしながら、依然としてブラッグピーク付近では電離箱による線量測定値に比べ、30%程度の感度劣化を生じることから、MOSFET検出器による線量測定のためには、それらの感度劣化に対して補正する必要がある。そこで、ペンシルビーム線量計算法を利用したり、高速モンテカルロ法を利用した2種類の感度補正法を開発した。均質媒質中での検証では、ペンシルビーム線量計算法を利用した補正法の有用性が確認された。さらに、体内不均質を有する人体ファントムにおける検証では、高速モンテカルロ法による線量計算結果と比較したところ、測定誤差内で一致することがわかり、世界で初めて、体内不均質を有する人体ファントムにおけるMOSFET検出器による線量測定に成功した。このように、MOSFET検出器による陽子線線量測定法を確立し、MOSFET検出器による高精度かつ有意義な体内線量測定の実現の可能性を示すことができた。
フオーカルアドヒジヨンとして破骨細胞に出現する動的ポドゾーム構造の解析

破骨細胞は骨吸収をその機能とする多核細胞で、in vitro下ではガラス面上で培養された破骨細胞には膜面の分化形態としてフォーカルアドヒジョンの一変形である動的ポドゾームやアクチンリングが出現するが刷子縁形成はされない。しかし骨や人工アパタイト上で培養したときにはin vivoと同様にポドゾーム、アクチンリングが形成されるとともにガラスなどの人工基質では形成されない吸収窩と刷子縁が出現しより生体に近い破骨細胞の動態が解析できる。そこで超音波により細胞剥離しアパタイト面上で培養した破骨細胞の接着および吸収窩上の刷子縁膜面を露出させ急速凍結、回転蒸着レプリカを作製し超微細構造解析を行なった。その結果、刷子縁膜ではクラスリン被覆小胞小窩による細胞外からの取り込み、また平滑な膜面をもつ小胞と膜面の融合像が観察され、刷子縁膜面領域が物質の吸収、分泌の場であることを示している。また接着膜面ではガラス面上で培養した場合と基本的には同じアクチンリングやポドゾーム構造が出現し、アクチン細胞骨格を主体とした構造をステレオペア、トモグラフィー三次元構造解析できた。そのような構造ではアクチン細胞骨格が接着膜面に膜面粒子を介して結合し、アクチンリングやポドゾーム構造は従来考えられていた単なるアクチン線維が束ねられたものではなくその構造の中で複雑に分岐し、重合、脱重合してアクチン線維の構築、再構築が動的に行なわれている構造であることが一連の研究で明らかとなった。さらに他の細胞骨格との関連を追及するため、細胞剥離とは別の界面活性処理すると膜は溶失するが細胞骨格は細胞剥離法より残存させることが判明した。これら手法は現在求めうる最良の時間、空間分解能での膜と細胞構造をナノメーターレベルで可視化できる手法であり、これらの手法は破骨細胞の接着装置の動的構造を解析するにあたって有効な形態的手段であった。培養破骨細胞に出現するポドゾームを解析するため塩化亜鉛液で処理するか又は超音波処理して背側細胞膜を剥離し、細胞質、核などの小器官を除去することで接着側の細胞膜面を露出させそれに強固に付着する細胞骨格要素を残存させた。急速凍結、凍結乾燥後に2nm厚の白金と20nm厚のカーボンを回転蒸着してレプリカ膜を作製し電子顕微鏡でステレオペア撮影又はトモグラフィーにより三次元解析を行った。レプリカから接着側細胞膜面を細胞質側から解析することが可能となった。破骨細胞ではストレスファイバーが出現することがなく典型的なストレスファイバーを備える細胞での接着装置としてのフォーカルアドヒジョンとはポドゾームと多くの点で異なっていた。短いアクチンフィラメントが収束し接着膜面と膜面上の粒子構造を介して結合していた。ポドゾームの細胞骨格は背側膜面とも結合し接着膜面と背側膜面とは連動して細胞形態を変化させていると考えられた。接着側細胞膜面には多数のクラスリンシートが出現したがアクチン細胞骨格からなるポドゾームの領域とは明らかに区別されていた。一方、ストレスファイバーを有する細胞での接着装置としてのフォーカルアドヒジョンにもクラスリンが出現するがアクチン線維の収束様式で大きく異なるとともにアクチン関連タンパク(ゲルゾリン、G-アクチンなど)の三次元局在が異なりポドゾームが動的構造であるのに対してフォーカルアドヒジョンは静的構造であることを反映していると考えられる。初年度で得られた研究成果の一部は第110回解剖学会(3月開催)と第61回日本顕微鏡学会(5月開催)のシンポジウムで発表することになっている。

破骨細胞は骨吸収をその機能とする多核細胞で、in vitro下ではガラス面上で培養された破骨細胞には膜面の分化形態としてフォーカルアドビジョンの一変形である動的ポドゾームやアクチンリングが出現するが刷子縁形成はされない。しかし骨や人工アパタイト上で培養したときにはin vivoと同様にポドゾーム、アクチンリングが形成されるとともにガラスなどの人工基質では形成されない吸収窩と刷子縁が出現しより生体に近い破骨細胞の動態が解析できる。そこで平成16年度の研究実績報告書にあるような超音波により細胞剥離しアパタイト面上で培養した破骨細胞の接着および吸収窩上の刷子縁膜面を露出させ急速凍結、回転蒸着レプリカを作製し超微細構造解析を行なった。その結果、刷子縁膜ではクラスリン被覆小胞小窩による細胞外からの取り込み、また平滑な膜面をもつ小胞と膜面の融合像が観察され、刷子縁膜面領域が物質の吸収、分泌の場であることを示している。また接着膜面ではガラス面上で培養した場合と基本的には同じアクチンリングやポドゾーム構造が出現し、アクチン細胞骨格を主体とした構造をステレオペア、トモグラフィー三次元構造解析できた。そのような構造ではアクチン細胞骨格が接着膜面に膜面粒子を介して結合し、アクチンリングやポドゾーム構造は従来考えられていた単なるアクチン線維が束ねられたものではなくその構造の中で複雑に分岐し、重合、脱重合してアクチン線維の構築、再構築が動的に行なわれている構造であることが一連の研究で明らかとなった。さらに他の細胞骨格との関連を追及するため、細胞剥離とは別の界面活性処理すると膜は溶失するが細胞骨格は細胞剥離法より残存させることが判明した。これら手法は現在求めうる最良の時間、空間分解能での膜と細胞構造をナノメーターレベルで可視化できる手法であり、この手法を有効に駆使して破骨細胞の接着装置の動的構造を解析することにより破骨細胞性骨吸収に関する生物学的理解を深める今後の研究を目指したいと考えている。
MRI造影機能を有し酸化ストレス誘導を作用機序とした新規ナノ粒子化抗がん剤の開発

本研究では、過酸化水素の過剰生成により抗腫瘍効果を示し、MRIにより体内分布を可視化できるビタミンK誘導体結合ナノ粒子の作成を行う。スーパーオキシドラジカルを産生するビタミンK誘導体とMRI造影効果を持つレドックスプローブを高分子化合物に結合させて1つのナノ粒子とする。ビタミンKが産生するスーパーオキシドラジカルをレドックスプローブのSOD活性で過酸化水素に変換し、がん細胞のアポトーシスを誘導する。腫瘍組織には高分子化合物が集積しやすいため、ナノ粒子化することでビタミンK誘導体を腫瘍組織に集積させ副作用の軽減を図る。また、MRI画像によりナノ粒子の腫瘍組織への送達を確認できるようにする。
一体感のある合同学習を可能にする遠隔双方向教育システムのための音響系の開発

得られた成果を大別して以下に述べる.(1)システム概要:(i)収音系:空間分割収音には,アレイマイクロホンの指向性をおよそ30°以下とする。最適設置位置は集中配置では教壇後ろ壁面,分散配置では4隅の壁面である.(ii)拡声系:全面同相駆動型平面振動板スピーカをおよそA2サイズかそれ以上の面積にして壁面に設置する。(iii)一体化:平面スピーカの辺縁部にアレイマイクロホンを配置すれば一体化する際の音響帰還が少なく,信号処理による指向性制御もできる。(iv)伝送チャンネル:3ないし4チャンネルの独立な伝送が必要である.(v)信号処理:収音した音声の残響を信号処理で低減し,明瞭度を向上させることができる.(vi)話者画像:話者画像が提示されると音声明瞭度が向上する.(2)システム評価基準:これまでの音声明瞭度の他に新たに「聞き取りやすさ」を指標として導入したところ,システム設計・評価に有効であることを示した。複数話者同時発声という評価条件を提案し,これまでの単独話者による評価では得られない性能の差を示した.また,教室らしさに関連する「広さ」感と対応する音響特性とその阻害要因を明らかにした.(3)仮想現実技術の応用:仮想現実技術導入のための検討として,[1]音響帰還低減に有効な,音響伝達特性変化を推定する手法を見いだした。[2]仮想音空間生成に用いる両耳インパルス応答の関数近似方法を導いた.[3]「癒し」感を仮想音空間で表現する方法を明らかにした。(4)特許:画像ディスプレイ一体型パネルスピーカを用い,受聴者の横方向まで音像定位する方式を考案し特許出願した。本発明はNECのパーソナルコンピュータに「オーセンサラウンド」の名称で採用されている。以上より,一体感のある遠隔合同授業のための音響システムの姿を心理的裏付けのある評価を加えて提示できた。遠隔合同授業における学童の音声収音を想定した場合のマイクロホンの配置、マイクロホンの指向性、音源位置と音声明瞭度の関係を実験的に調査した。千葉工業大学ゼミ室で小型スピーカを音源にして、各方式の音声収音マイクロホンへのインパルス応答の計測を行った。求めたインパルス応答を用い、音声明瞭度指標STIの算出と無意味3連音節音声を畳み込んでの音声明瞭度試験を行った。その結果、マイクロホンの指向性が鋭いほど、またスピーカの指向性の主軸とマイクロホンの指向性の主軸が対向しているほど音声明瞭度、STI共に良いことを数量的に明らかにした。小学校と病院内の学級を実際に結んで試行されている遠隔合同授業システムでは,複数マイクロホンにより収音した学童の音声をモノラルにミクシングして伝送している。その際生じる明瞭度の低下要因について大学会議室で実験的に検討したところ、各マイクロホンへの音声の直接音の到達時間差を補正すると数%STIが改善されるが、それ以上は反射音の影響を対策する必要があることがわかった。以上の成果を平成14年日本音響学会秋季大会で報告した。さらに大学内の教室、パソコン実習室などで明瞭度に関する計測を行い、到達時間差補正の効果の度合いを確認した。また天井に分散配置されたスピーカによる再生では、スピーカ直下でも明瞭度が60%以下となる場合があることを明らかにした。本成果を平成14年度電子情報通信学会教育工学研究会にて報告した。

先述の、マイクロボンの配置および指向性の実験についても解析し、モノラルにミクシングしたときの明瞭度およびSTIの変化を到達時間差補正の有無で調べたところ、STIでは変化ない場合でも音声明瞭度試験では数%の向上があることが確認され、結果を平成15年日本音響学会春季大会で報告した。以上、収音音声の明瞭度について複数マイクロホン使用時の問題と改善の一方法を求めることができた。特に、音声のように指向性のある音源収音ではマイクロホン位置に留意する必要があることも判明した。本年度は教室の音空間を収音再生する手法だけでなく,仮想現実的に生成する手法について検討の範囲を広げた.(1)マイクロホンの指向性あるいはマイクロホンおよびスピーカ配置を変え,マルチチャンネル収音再生方式の実験を行った.複数話者同時発声という想定のもと,話者の分離,臨場感の相違などを心理実験により明らかにした.平面スピーカの辺縁部にマイクロホンを設置すれば,音響的にハウリングを軽減した拡声が可能であることが分かった.(2)収音音声の狭帯域包絡線に逆フイルタを施すことにより,残響が軽減し狭帯域間の相関係数が0.7から0.9に向上した.これにより話者の個人性復元が可能となった.(3)話者画像の有無が音声明瞭度に与える影響を調べた.話者画像がある場合は,無い場合と比べて明らかに明瞭度が向上するが,異なる発声の画像の場合はマガーク効果により低下することなどが判明した.(4)耳への到達時間差の補正により,スムースな移動音像を生成する頭部伝達関数の補間方法を見いだした.(5)(a)教室音響の心理解析:16部屋の音場を因子分析し,表現語「広さ」などが属する容積性因子と同「明るい」などが属する音色性因子が主要なことを明らかにした.反射音による音像定位の乱れを予測するため,音声の狭帯域包絡線と先行音効果の関係を明らかにした.(b)教室音響の物理解析:ドアや窓の開閉,学童の移動など音源受聴点間の伝達関数が時間変化する,時変システムの伝達関数の推定方法を開発した.音場の教室らしさの物理要因を調べ,対向壁面間の周期性反射音が教室らしい音空間の生成に寄与することを見いだした.(6)アレイマイクロホンの検討は,単純なアレイ出力の加算で指向性が鋭くなることの確認のみ行った.その他関連研究として,インターネットを介して教材を提供,遠隔からアクセスして学習できるシステムの検討も行った.本年度は(1)音響システム設計のつめ、(2)新たな性能評価手法の導入、(3)仮想現実技術の応用、(4)一人対教室を想定した個人向け端末の開発、などを行った。(1)システム概要:(i)収音系:複数話者同時発生時に選択受聴するための空間分割収音には、アレイマイクロホンの指向性はおよそ30°以下とする。最適設定位置は教壇後ろ壁面である。(ii)拡声系:振動部分が全面同相駆動される平面振動板スピーカをおよそA2サイズあるいはそれ以上の面積にして壁面に設置すると、従来のスピーカより聞き取り易い。(iii)音響帰還:平面スピーカの辺縁部にアレイマイクロホンを設置すれば一体化する際の音響帰還が少ない。(2)システム評価指標:収音再生システムの評価基準に新たに「聞き取りやすさ」を導入したところ、その心理量を尺度値として規定できシステム設計・評価に有効であることを示した。
皮膚における老化細胞の運命と動態の解明

多くの組織において固有の幹細胞が機能細胞を供給することにより恒常性が維持され、何らかの原因による恒常性維持システムの破綻は個体の死へ繋がる。その過程で各組織は老化形質を獲得するが、老化システムや実体はほとんど理解されていない。申請者らは最近、加齢毛包では毛包幹細胞や色素幹細胞は自己複製を行わず異所性に分化細胞へと運命転換することで脱毛や白髪に至ることを明らかにし、「幹細胞の制御機構の破綻」が老化形質獲得の一端であることを示した。本研究では、マウス毛包・皮膚をモデルとして老化形質獲得の要因とそのメカニズムの理解を目的とする。
バセドウ病眼症皮膚症におけるHSP70:異常遺伝子転写機構とその修復

バセドウ病眼症におけるHSP70遺伝子の異常発現機構を検討するためバセドウ病眼症の手術時に得られた組織より線維芽細胞の培養を行った。まず、正常ヒト線維芽細胞との比較において患部より採取した線維芽細胞は42度1時間という弱いHeat shockに対してのHSP70 mRNAの増加率が大きいことが判明した。このようなHSP70の過剰発現の機構を解明するため非刺激時の転写レベルをrun on assayにて検討したが転写の基礎レヴェルは低く両者に特に差は認められなかった。よって、刺激時の反応を規定するHSP70の転写因子であるHeat shock factor-1のmRNAをNorthern blotを用いて検討したが両者差が認められなっかた。よって弱いheat shockに対する病変部線維芽細胞の反応性を規定するものはいわゆる転写促進因子以外の機構によることが示唆された。最近不活化されたHSEにKu-antigenが結合し、negative regulatorとして作用していることが示唆されたため、Ku-antigenのmRNAを測定したところ患部の線維芽細胞で低値を示し、以前の検討でバセドウ病患者においてはKuに対する抗体が高頻度に認められることより、何らかの自己免疫機構によりKu抗原の発現および活性化が抑制されている可能性が示唆された。このことは転写促進因子であるHSF-1の遺伝子発現をAntisense oligonucleotideで抑制しても弱い刺激に対するHSP70遺伝子発現が抑制されなかったことよりも示唆された。
標準治療抵抗性口腔扁平上皮癌における標的可能遺伝子変異の同定と個別化治療の確立

現在のがん治療は臓器特異的であり、いまだ多くの領域で、腫瘍の性質ではなく発生部位で治療法が決まっている。悪性度の違いによる治療法の選択基準がなく、特に低分化癌において予後不良となることが問題となっている。申請者らは、癌の悪性度及び治療抵抗性に関わるEMT/癌幹細胞マーカーCD44vの口腔扁平上皮癌における機能的役割の解析を進めてきた。また癌間質に着目し、間葉細胞を標的とした治療の可能性について検討してきた。そこで本研究では、低分化癌を中心とした口腔扁平上皮癌において遺伝子パネル検査および分子レベルでの解析を加え、CD44vの発現と新規マーカーによる悪性度に基づいた個別化治療の確立を目指す。
慢性肺疾患において宿主生来の免疫が果たす役割についての分子生物学的解析

(目的)近年子宮内感染と慢性肺疾患(以下BPD)の関連性が注目されている。早期産児胃液中の細菌の存在は、子宮内感染と関連していると考えられているが、BPDとの因果関係は大規模な研究がされていたいため不明である。我々はbacterial 16s rRNA geneの解析で胃液中の細菌を検出し慢性肺疾患との関連性を調べた。(方法)2005年1月から2006年12月にかけて当院で出生した在胎32週未満の早期産児101人を対象とした。これらの児の胃液からDNAを抽出しPCR法でbacterial 16s rRNA geneに特異的な領域を増幅後、クローニング、DNA解析を行い、BLAST searchにより細菌を同定した。またBPDをNICHDの定義に基づきmild,moderate,severeに分類した。(考察)bacterial 16s rRNA geneの解析により嫌気性菌など通常の培養では検出困難な多くの細菌を検出した。その結果胃液中の細菌の存在は子宮内感染、慢性肺疾患と関連性を認めた。これらの疾患と関連する細菌としてUreaplasma属が最も代表的であるが検出菌の50%を占めるに過ぎず、それ以外の細菌も主要な役割を果たしていると考えられる。今後これらの細菌が生体内でどのような役割を果たしているかをさらに詳しく追跡していく予定である。従来未熟児における慢性肺疾患の原因としては酸素障害、人工換気療法による直接的な肺損傷が重要な役割を果たしていると考えられてきたが、近年胎児期における子宮内感染症と慢性肺疾患の関わりが指摘されている。子宮内感染が胎児期に生じると、未熟肺に何らかの影響を与え、出生後の酸素投与や人工換気療法などと協調して肺に損傷を加えるのではないかと考えられている。本研究では未熟児における慢性肺疾患の病因、病態の解明を目的としており、今年はまず子宮内感染症と慢性肺疾患予後との関わりを重点的に調べた。子宮内感染における起因菌としてUreaplasma urealyticum, Mycoplasma hominisが検出される頻度が高い。特にUreaplasma urealyticumは慢性肺疾患患者の気道から検出されることも多く慢性肺疾患と何らかの関わりを持っているのではないかと考えられている。従来、人工換気療法が必要な児のみを対象として呼吸予後の検討はされてきたが、人工換気療法が必要でない児での検討はされていない。そのため出生児全員に対してこれら起因菌が果たす役割の検討を行うことはできていない。それらの問題点を解決するため胃液中から起因菌の採取を試みた。平成17年4月から平成18年3月にかけて患者の胃液からPCR法をもちいてUreaplasma urealytlcum, Mycoplasma hominisの検出を試みた。その結果32週未満で出生した46人の児のうち10人からUreaplasma urealyticum,8人からMycoplasma hominisの検出に成功した。今後はこれらの児の臨床的な呼吸予後を調べるとともに、血清中のKL-6の値を測定しこれらの起因菌が肺を傷害する作用があるか生化学的な検討を行っていく予定である。またこれらの起因菌が肺に与える影響を細胞レベルでも検討していく予定である。本研究では未熟児における慢性肺疾患の病因、病態の解明を目的としており、子宮内感染症と慢性肺疾患予後との関わりを重点的に調べた。まず子宮内感染の指標として、新生児の胃液を採取しmicrobeを検出した(Table1)。胃液中の微生物は45%の新生児から検出された。その内訳としてはUreaplasmaが22%、Mycoplasma hominisが5%、それ以外の細菌は37%であった。これら胃液から微生物が検出された児を感染群とし、検出されなかったコントロール群との比較をおこなった。慢性肺疾患の頻度は、感染群では54%であるのに対して、コントロール群では37%であった。慢性肺疾患の中でも感染群では重症型のものが有意に多くみられた。また感染群ではコントロール群と比べ有意に子宮内感染との相関を認めた。これらの事実は微生物による子宮内感染により、子宮内で感作をうけることにより出生後の慢性肺疾患の呼吸障害が増幅されることを示している。今後は血中、気管支肺胞洗浄液中での各種マーカーを調べることで肺の障害に直接関わっている原因物質を検索していく予定である。

これらの児の胃液からDNAを抽出しPCR法でbacterial 16s rRNA geneに特異的な領域を増幅後、クローニング、DNA解析を行い、BLAST searchにより細菌を同定した。またBPDをNICHDの定義に基づきmild,moderate,severeに分類した。(考察)bacterial 16s rRNA geneの解析により嫌気性菌など通常の培養では検出困難な多くの細菌を検出した。その結果胃液中の細菌の存在は子宮内感染、慢性肺疾患と関連性を認めた。これらの疾患と関連する細菌としてUreaplasma属が最も代表的であるが検出菌の50%を占めるに過ぎず、それ以外の細菌も主要な役割を果たしていると考えられる。今後これらの細菌が生体内でどのような役割を果たしているかをさらに詳しく追跡していく予定である。
Daf2遺伝子のインスリン分泌細胞と標的細胞におよぼす影響について

(インスリン分泌細胞におけるdaf2遺伝子の役割)膵β細胞におけるインスリン遺伝子の発現調節機能に関して、膵臓組織特異的な転写因子群による制御機構が存在することが知られている。本実験はdaf2遺伝子が発現しているINS-1細胞を使って、インスリン遺伝子転写調節系の制御機構を解明した。今回はdaf2遺伝子と協調して働くmeninの影響についても検討した。Daf2発現INS-1細胞においてmeninを遺伝子導入するとコントロール細胞に比較して、インスリン遺伝子の転写が抑制された。Menin発現INS-1細胞においては、インスリン分泌が抑制されており、グルコース刺激によるインスリン分泌も完全に抑制された。Daf2遺伝子の遺伝子異常は、アポトーシスを抑制することが知られており、meninを遺伝子導入するとアポトーシスを促進されることが観察された。このことはDaf2とmeninの機能として、アポトーシスを促進可能性が推定された。(標的細胞、血管構築細胞におけるdaf2遺伝子の役割)血管構築細胞、特に血管内皮細胞および血管平滑筋細胞におけるdaf2遺伝子の細胞増殖、アポトーシスおよびscavcnger receptor遺伝子発現におよぼす影響について検討した。Daf2遺伝子が発現している血管平滑筋細胞株ISS10細胞を実験に用いた。血管平滑筋細胞の増殖因子でありアポトーシスの抑制作用のあるGas6とアポトーシス促進作用のあるdaf2についてscavenger receptorへの影響について検討した。Daf2遺伝子発現ISS10細胞においては、Gas6はコントロール細胞に比較してscavenger receptor遺伝子発現を誘導することが判明した。Daf2はGas6などとの増殖因子と協調して、血管平滑筋細胞の機能を調節することが判明した。1)SDラット膵組織およびラットインスリノーマの細胞株であるINS-1細胞とCOS-7細胞においてdaf2遺伝子発現をRT-PCR法にて検討した結果、INS-1細胞に発現していることが明らかにされたが、他の細胞、組織においての発現は殆ど見られなかった。2)インスリンの標的細胞としてミエロイド系でIL-3依存性の32D細胞と32D-IR細胞においてdaf2遺伝子発現をRT-PCR法にて検討した結果、32D-IR細胞に発現していることが明らかにされた。3)daf2遺伝子が発現しているINS-1細胞において、グルコース依存性インスリン遺伝子転写亢進の機序を検討した結果、Ca/カルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素のひとつであるCaMキナーゼIV(CaM-KIV)とCaMキナーゼ活性化キナーゼ(CaM-KK)の存在がRT-PCR法、Western blot法にて明らかにされた。しかし、daf2遺伝子発現が見られなかったCOS-7細胞においてはCaM-KIVとCaM-KKは見られなかった。4)インスリン様フォスファチジルイノシトール3-OHキナーゼ(PI3'K)活性はINS-1細胞とCOS-7細胞とで差がなく、daf2インスリン受容体様遺伝子がPI3'K活性に及ぼす効果は明らかではなかった。以上よりdaf2インスリン受容体様遺伝子が、INS-1細胞において存在することが明らかにされたが、その機能はいまだ明らかではない。C.elegansよりクローンされたDAF-2のリガンドであるインスリン/IGF様ペプチドをKawanoより提供を受けて、このペプチドがミエロイド系でIL-3依存性の32D細胞と32D-IR細胞に作用するか否かをPI3キナーゼ活性の測定により検討した。その結果、このペプチドがdaf-2遺伝子を介さないでインスリン受容体のみを介してもPI3キナーゼ活性を増加させることを明らかにした。ラットインスリノーマ細胞株であるINS-1細胞にもインスリン受容体とdaf-2遺伝子が存在するが、腫瘍促進遺伝子や腫瘍抑制遺伝子発現がインスリン受容体、daf-2インスリン様受容体と、インスリン発現に及ぼす影響を検討した。INS-1細胞において、多発性内分泌腺腫症1型の責任遺伝子であるMEN-

1遺伝子の翻訳蛋白であるmeninの発現を確認した後、menin発現ベクターを作製して、その活性型meninとルシフェラーゼをコードしたインスリンプロモーターをINS-1細胞に共発現させてインスリン発現と分泌に及ぼす影響を検討した。その結果、INS-1細胞にはmeninが存在し、インスリン遺伝子転写およびインスリン分泌を抑制していることを明らかにした。インスリン受容体とdaf-2受容体の発現に関しては現在、検討中である。今後は、腫瘍抑制遺伝子であるヒトPTEN遺伝子とその変異遺伝子を共発現させて、同様に検討する予定である。インスリン受容体とdaf-2遺伝子が存在するラットインスリノーマ細胞株であるINS-1細胞を用いて、グルコース依存性インスリン遺伝子転写亢進の機序を検討した結果、Ca/カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素のひとつであるCaMキナーゼIV(CaM-KIV)とCaMキナーゼ活性化キナーゼ(CaM-KK)の存在が明らかにされた。活性型CaM-KIVのみでインスリンプロモーター活性は上昇するが、CaM-KKを共発現させると活性は相乗効果を示した。グルコース刺激はCaM-KIVCaM-KKを活性化させたが、グルコース刺激で上昇したインスリンプロモーター活性はドミナントネガテイブCaM-KIV共発現で有意に抑制された。グルコース刺激によりグルコキナーゼプロモーター活性が増加し、グルコキナーゼ酵素活性も上昇するが、その機序にCaM-KIVCaM-KKカスケードが関与していることを明らかにした。以上より、CaM-KIV-CaM-KKは、グルコース依存性インスリン遺伝子転写において直接的に遺伝子発現を刺激するだけではなくて、グルコース代謝を司るグルコキナーゼ遺伝子の転写活性および酵素活性の増加を介してインスリン遺伝子発現を調節していることが示された。
大規模津波越流時の海岸堤防裏法被覆ブロックの離脱機構に関する計算力学的研究

大規模な津波が海岸堤防を越流する際には,堤防裏法肩近辺において顕著な圧力低下が生じ,それによって裏法肩部に設置された被覆ブロックが離脱・流出する.これは,海岸堤防裏法面上の多数の被覆ブロック群の流出の引き金となり,海岸堤防崩壊の一因となる.本研究では,流体が複雑に変形する現象や多数の移動物体を流体とともに計算することが容易な粒子法を用いた3Dシミュレーションを実施し,既往の水理実験結果との比較を通じて本シミュレーションモデルの適用性を検討する.今年度は,まず,これまでの研究で開発した鉛直断面二次元シミュレーションモデルを三次元シミュレーションが可能となるように拡張した.このとき,計算時間短縮のためにシミュレーションモデルを見直し,圧力のPoisson方程式の導出において適用している高精度ラプラシアンモデルを修正し,Poisson方程式から作成される連立一次方程式の行列を対角優位となるようにした.これによって計算時間が約7割程度に短縮された.このモデルを用いて,既往の水理実験と同様の条件でシミュレーションを実施し,堤防法肩に設置したブロックが離脱するときの越流水深を調査したところ,水理実験結果では1414.5cmと報告されていたのに対し,本シミュレーションでは,15.516cmとやや大きくなったが,概ね実験結果に対応した結果が得られることがわかった.この差の原因についてはまだ正確には把握できていないが,計算解像度の問題や,今年度の計算では考慮しなかったブロックの下に敷設した砕石の配置のランダム性によるブロックの微小な傾きの効果などが考えられる.これまでに本現象を適切に再現できるシミュレーションモデルは存在しなかったので,この状況を打破できるモデルを開発できたことの意義は非常に大きいと言える.当初の計画通り,三次元シミュレーションモデルを構築し,離脱限界水深に関する既往の実験結果との比較を行い,概ね実験結果と対応した結果が得られた.当初の計画に従い,2年目は,ブロック周りの圧力分布を推定するために,少し解像度を上げたシミュレーションを実施する.さらに,3年目で実施予定のポーラス粒子流出に対応可能なモデルの準備に取り掛かる予定である.大規模な津波が海岸堤防を越流する際には,堤防裏法肩近辺において顕著な圧力低下が生じ,それによって裏法肩部に設置された被覆ブロックが離脱・流出する.これは,海岸堤防裏法面上の多数の被覆ブロック群の流出の引き金となり,海岸堤防崩壊の一因となる.本研究では,流体が複雑に変形する現象や多数の移動物体を流体とともに計算することが容易な粒子法を用いた3Dシミュレーションを実施し,既往の水理実験結果との比較を通じて本シミュレーションモデルの適用性を検討する.今年度は,まず,これまでの研究で開発した鉛直断面二次元シミュレーションモデルを三次元シミュレーションが可能となるように拡張した.このとき,計算時間短縮のためにシミュレーションモデルを見直し,圧力のPoisson方程式の導出において適用している高精度ラプラシアンモデルを修正し,Poisson方程式から作成される連立一次方程式の行列を対角優位となるようにした.これによって計算時間が約7割程度に短縮された.このモデルを用いて,既往の水理実験と同様の条件でシミュレーションを実施し,堤防法肩に設置したブロックが離脱するときの越流水深を調査したところ,水理実験結果では1414.5cmと報告されていたのに対し,本シミュレーションでは,15.516cmとやや大きくなったが,概ね実験結果に対応した結果が得られることがわかった.この差の原因についてはまだ正確には把握できていないが,計算解像度の問題や,今年度の計算では考慮しなかったブロックの下に敷設した砕石の配置のランダム性によるブロックの微小な傾きの効果などが考えられる.これまでに本現象を適切に再現できるシミュレーションモデルは存在しなかったので,この状況を打破できるモデルを開発できたことの意義は非常に大きいと言える.当初の計画通り,三次元シミュレーションモデルを構築し,離脱限界水深に関する既往の実験結果との比較を行い,概ね実験結果と対応した結果が得られた.当初の計画に従い,2年目は,ブロック周りの圧力分布を推定するために,少し解像度を上げたシミュレーションを実施する.さらに,3年目で実施予定のポーラス粒子流出に対応可能なモデルの準備に取り掛かる予定である.今年度に参加した学会に関する旅費が研究代表者の所属する研究グループの研究費によって支払われることになったため,それ見込んで計上していた分が余ることになり,急遽消耗品費等に割り振ったが,当初の使用計画とは異なるために,わずかながら未使用分が残ることになった.次年度は,研究の効率的な遂行のために,経費の大半を京都大学メディアセンターのスパコンの利用料に充てる予定である.
関節炎、関節症の病態と軟骨マトリックス高分子

変形性関節症(OA)では、関節軟骨の破壊修復の混在が随所にみられるのが特徴であり、薬物療法、手術療法いずれにおいてもその目的とするところは、破壊を最小限にとどめ修復機序に期待する点である。種々非ステロイド性消炎鎮痛剤は、多くは、関節軟骨プロテオグリカン合成を阻害するが、この点に関し、軟骨スライス、あるいは培養軟骨細胞を用い、^<35>S存在下のパルスラベルにより、プロテオグリカン合成におよぼす薬剤の影響を検討した。結果は多くの薬剤で最高30%までの合成抑制がみられ、それは、蛋白合成阻害であることが明らかであった。昨年確立した骨形成因子(BMP)存在下の未熟間葉系細胞の軟骨細胞への単居培養系にみる細胞分化実験は、OA関節軟骨が、荷重部などほとんどの関節軟骨が消失し、周囲又は軟骨下骨組織からの維持芽細胞で被ふくされ、それが軟骨細胞に分化する臨床例のモデルとも考えられ、種々薬剤のOA関節症の修復に対する影響として検討した。インドメタシン、ジクロフェナックいずれも常用量では、細胞接着、軟骨細胞の分化などには全く影響しなかった。しかしジクロフェナック1×10^<-4>Mでは細胞接着、プロテオグリカン合成阻害もみられた。慢性関節リウマチ(RA)の関節破壊機序の反映が関節液にみられる可能性があり、外来通院中のRA症例の関節液について、コラーゲンの分解系の指標として、ゼラチナーゼ活性を、また蛋白分解酵素活性のインヒビターとしてTIMP(tissue inhibitor metaloproteinase)値を検討、いずれもRAの活動性とともに、局所関節の炎症度を反映して、高値であることがわかった。RA溶膜細胞培養上清からもゼラチナーゼ活性は測定可能で、良き診断マーカーになりうるとの確証を得た。TIMPも同時診断マーカーとして有力である。コラーゲン関節炎はマウスで発症、プロテオグリカン関節炎は、糖質を除去した蛋白コマー部分でマウスで検討中である変形性関節症(OA)では,関節軟骨の破壊,修復の混在が特徴であり,その修復機序においては,末熟間葉系細胞の軟骨細胞への分化も観察される.この修復機序モデルとして,ラット胎仔筋肉由来の間葉細胞あるいは,成熟家兎滑膜細胞が,骨マトリックス中に含まれる生物活性物質である骨形成因子(Bone Morphogenetic Protein BMP)存在下で軟骨細胞に分化する系を確立した. BMPは家兎長管骨を脱灰,4M Gu HClにて抽出,透析し,水不溶性部分を回収,さらに精製,分子量2万前後の粗画〓を用いた.培養は, 2ー3回継代培養後の上記細胞を,培地はHam Fに(+10%FCS),DishはFalc〓24 multi well,BMP coating量は,蛋白として90μg/wellを〓甲し,種々非不剤の軟骨修復に対する影響を,この実験モデル系で検討した.インドメタシン,ジクロフェナック濃度は0,1×10^<-6>M,1×10^<-5>M,1×10^<-4>Mとし,培養液に添加した.培養日数,14日目には,BMPによる間葉系細胞の軟骨細胞への分化が,in vitvoで明らかにされた.この系を変形性関節症軟骨の修復モデルと考える時,インドメタシン,ジクロフェナックいずれも常用量では,細胞接着,軟骨細胞への分化など悪影響はなかった.しかしジクロフェナック1×10^<-4>Mでは細胞接着,プロテオグリカン合成阻害もみられた.一方この系にみる軟骨形成は,プロテオグリカン合成の増大,ならびにタイプIIーコラーゲンの合成もそれぞれの抗血清染色により同定された.その他関節炎〓態追求の一助として,慢性関節リウマチ血漿中に,コラーゲンペプタイド分解酵素活性の上昇,トリプシンインヒビターの増加もみられ,関節破壊追移の結果の反映と考えられた.コラーゲン誘導関節症,プロテオグリカン誘導関節光もそれぞれに特異的なTーcellの存在も確実視されるようになった.変形性関節症(OA)では、関節軟骨の破壊修復の混在が随所にみられるのが特徴であり、薬物療法、手術療法いずれにおいてもその目的とするところは、破壊を最小限にとどめ修復機序に期待する点である。

慢性関節リウマチ(RA)の関節破壊機序の反映が関節液にみられる可能性があり、外来通院中のRA症例の関節液について、コラーゲンの分解系の指標として、ゼラチナーゼ活性を、また蛋白分解酵素活性のインヒビターとしてTIMP(tissue inhibitor metaloproteinase)値を検討、いずれもRAの活動性とともに、局所関節の炎症度を反映して、高値であることがわかった。RA溶膜細胞培養上清からもゼラチナーゼ活性は測定可能で、良き診断マーカーになりうるとの確証を得た。TIMPも同時診断マーカーとして有力である。コラーゲン関節炎はマウスで発症、プロテオグリカン関節炎は、糖質を除去した蛋白コマー部分でマウスで検討中である
ヒト膵組織切片分析による２型糖尿病発症過程の膵島形態学的モデルの構築

当院における膵切除術施行症例を対象として、術前に耐糖能異常の病期分類(正常型、境界型、新規診断2型糖尿病、長期罹病2型糖尿病)、病態評価(インスリン分泌能および抵抗性)を行い、膵島細胞(膵α、β細胞)の形態学的所見との関連を検討した。耐糖能異常進展とともに膵β細胞量の減少がみられ、インスリン分泌能の低下と関連することが明らかとなった。さらに長期罹病2型糖尿病において膵α細胞量の増加がみられ、耐糖能異常の進展に寄与している可能性が明らかとなった。膵α細胞量の増加は増殖亢進により、高血糖状態および膵島細胞の脱分化・分化転換機構の関与が示唆された。本研究は、2型糖尿病の主要な病態であるインスリン分泌不全およびインスリン抵抗性と膵島の形態学的所見との関連を明らかにし、病期・病態に応じた治療戦略構築の組織学的な基盤を形成することである。このため当院外科膵切除症例を対象に耐糖能分類を行ったのち、切除膵切片を用いて膵β細胞とインスリン分泌能、膵α細胞とインスリン抵抗性の関係に焦点をあてて検討を進めていく。平成25年度は対象患者の選定・登録およびこれら患者の耐糖能分類を行い、目標数100例に対してこれまでに70例の患者が登録されている。現時点で切除膵の組織学的検討が行われた32名の解析において、膵β細胞面積がインスリン分泌能の指標と相関すること、なかでもグルカゴン負荷試験による血中Cペプチドの増加分と強く相関することが示された。当研究室ではこれまでに耐糖能悪化過程で膵β細胞量が減少していることも明らかにしており(Yoneda S, et al, J Clin Endocrinol Metab, 2013)、2型糖尿病の発症にかかわる膵β細胞量の変化を簡便な日常臨床検査で予測可能であることを明らかにした。本研究成果については第56回日本糖尿病学会学術総会にて発表しており、現在論文投稿中でもある。現在、さらに登録症例を増やしつつ、膵α細胞を中心とする膵島の形態学的所見を各耐糖能間で比較、および各臨床指標との関連の検討を進めており、その一部は第57回日本糖尿病学会学術総会にて発表予定である。平成25年度は約70名の対象患者の選定・登録およびこれら患者の耐糖能分類を行った。すでに当研究室では2型糖尿病発症過程で膵β細胞面積が減少することを明らかにしており(Yoneda S, et al. J Clin Endocrinol Metab, 2013)、平成26年度には同膵β細胞面積がインスリン分泌能の指標と相関すること、なかでもグルカゴン負荷試験による血中Cペプチドの増加分と強く正相関することを新たに論文報告した(Fujita Y, et al. Endocr J, 2015)。これにより2型糖尿病発症に関わる膵β細胞面積の減少が簡便な日常臨床検査で予測可能であることが明らかとなった。平成26年度はさらに膵α細胞の組織学的解析および病態との関連を検討し、長期経過2型糖尿病では膵α細胞面積が増加し、同面積は血糖コントロール(HbA1c)と関連すること、膵α細胞面積増加の機序の一つに膵α細胞の増殖促進がみられることを明らかにして、第57回日本糖尿病学会学術総会(大阪)にて発表している。現在、膵α、β細胞の組織学的変化の成因解明をさらに進めるため、各種膵島関連転写因子の発現解析を行うとともに、膵α、β細胞株、幹細胞(iPS細胞を含む)を用いた細胞実験系の構築を進めている。1対象患者の選定・登録:膵切除43症例を選定・登録し、術前耐糖能(正常耐糖能、境界型、新規診断2型糖尿病、長期罹病2型糖尿病)および病態指標(インスリン分泌能、インスリン抵抗性)の評価を行った。2膵β細胞の形態学的評価および病態指標との関連の検討:対象症例のうち術前に糖尿病治療をされていない32症例を対象とした。グルカゴン負荷試験における血清Cペプチド増加分が膵β細胞面積を最も予測する因子であることを明らかにした(Fujita Y, et al. Endocr J, 2015)。3膵α細胞の形態学的評価および病態指標との関連の検討:全43症例を対象とした。長期罹病2型糖尿病患者で膵α細胞面積が増加していること、機序として増殖促進があること、膵島細胞の脱分化・分化転換も寄与している可能性があることを見出した。膵α細胞面積は病態指標との関連はみられず、血糖コントロール(HbA1c)と正相関することが明らかとなった(Fujita Y, et al. in submission)。4ヒト2型糖尿病発症過程における膵島形態学的モデルの構築:23の結果から、2型糖尿病発症過程における主要病態の一つであるインスリン分泌能低下が膵β細胞の減少によることが明らかとなった。また2型糖尿病発症による高血糖が膵α細胞の増殖および脱分化・分化転換による膵α細胞面積の増大を来たし、耐糖能異常進展に寄与している可能性が考えられた。5ヒト

由来iPS細胞から膵島細胞への分化誘導法の確立:上記膵島形態学的モデルにおける脱分化・分化転換機構の検討の予備段階として、ヒト由来iPS細胞からインスリン陽性細胞への分化誘導を試みた。手法は既報(Kunisada Y, et al. Stem Cell Res, 2012)にならい、多段階で分化誘導因子を作用させることによるインスリン陽性細胞への分化誘導法の検証を行った。当院における膵切除術施行症例を対象として、術前に耐糖能異常の病期分類(正常型、境界型、新規診断2型糖尿病、長期罹病2型糖尿病)、病態評価(インスリン分泌能および抵抗性)を行い、膵島細胞(膵α、β細胞)の形態学的所見との関連を検討した。耐糖能異常進展とともに膵β細胞量の減少がみられ、インスリン分泌能の低下と関連することが明らかとなった。さらに長期罹病2型糖尿病において膵α細胞量の増加がみられ、耐糖能異常の進展に寄与している可能性が明らかとなった。膵α細胞量の増加は増殖亢進により、高血糖状態および膵島細胞の脱分化・分化転換機構の関与が示唆された。2型糖尿病発症過程における膵α・β細胞の形態学的変化が明らかとなり、本研究の主要目的である膵島形態学的モデル構築の基礎骨格が形成された。さらに膵β細胞の形態学的変化について、糖尿病発症の主要病態の一つであるインスリン分泌能低下との関連が明らかとなり論文化が達成された(Fujita Y, et al. Endocrine Journal, 2015)。膵α細胞の形態学的変化に関する結果については第56、57回日本糖尿病学会学術集会において発表を行い、社会および国民に対して発信している。よって本研究はおおむね順調に進展していると考える。内分泌・代謝2型糖尿病発症過程における膵α細胞の形態学的変化に関わる結果を論文化する。これまで明らかにした膵島の形態学的変化に関わる成因・機序をより詳細に検討するため、各耐糖能の膵α、β細胞における膵島関連転写因子の発現様式を組織学的に検討する。同発現様式に変化をみとめた因子を膵α、β細胞株、幹細胞(iPS細胞含む)に強制発現あるいはノックダウンを行うことで、増殖、アポトーシス、分化誘導がみられるか、in vitroにて検討する。これらの作業は引き続き研究代表者のもと大学院生、ポスドクを組織し計画を推進する。研究成果についても引き続き学会発表、論文掲載などを通じて社会に発信していく。当院消化器外科学との連携のもと、目標登録数100例に対して70例の登録が完了しており、平成26年度には目標数に達すると見込まれる。さらにこれまでの解析で、2型糖尿病の主要な病態指標の一つであるインスリン分泌能と膵島の組織学的所見の関連を既に明らかにし、研究成果を挙げている。同成果については第56回日本糖尿病学会学術総会にて発表し、社会、国民に対して発信、さらには現在論文投稿中である。平成25年度は症例登録が中心であったため形態学的検討のために必要な試薬、抗体など消耗品の購入が当初予定に比べて少なかった。しかしながら平成26年度はこれら検討を中心として行ったため消耗品の購入が予定通り行われている。当院消化器外科との連携を保ちつつ、引き続き対象患者の選定・登録を行い、平成26年度中に目標数である計100例以上の登録を行い、全登録症例における膵島の形態学的検討を開始する。