hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳ペリサイト産生シクロフィリンＡによる脳インスリン抵抗性形成と糖尿病進展

2型糖尿病における脳血管障害や認知機能障害などの中枢機能障害として血糖調節機能不全が発現すると考えられる。糖尿病病態下では、脳微小血管およびその構成細胞である脳ペリサイトのシクロフィリンA (CypA)の産生量が増加した。このCypAは糖尿病病態下で脳神経のインスリン抵抗性を惹起した。これらの結果は、脳ペリサイトは脳神経血管機構の基幹細胞として糖尿病病態の進展に関与する可能性を示唆する。本研究は、脳ペリサイトおよびCypAを糖尿病治療における新たな治療標的として提示するものである。本研究は、血液脳関門(BBB)および視床下部・海馬機能を調節する「脳神経血管機構」の基幹細胞として「脳ペリサイト」を捉え、本細胞が高血糖状態を感知し、シクロフィリンA (CypA)などの液性因子を介してBBB・脳神経のインスリン抵抗性を惹起することにより、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求する。前年度にCypAのBBB機能に対する作用を明らかにした。一方、視床下部神経におけるインスリン抵抗性発現機序については不明な点が多い。そこで、平成24年度はCypAによる脳神経のインスリン抵抗性発現機序を調べるための基礎検討として、高血糖状態下で血液中および脳内で増加するメチルグリオキサール(MG)をモデル化合物として用い、視床下部神経のインスリン抵抗性発現について検討した。マウス視床下部神経細胞株GT1-7にMGを負荷した後、インスリンを添加し、リン酸化Akt量を指標にインスリン感受性を評価した。(1)MGは細胞傷害を惹き起こさない濃度でインスリンによるリン酸化Aktの増加を抑制した。(2)MGはGT1-7のNF-kB活性化を惹き起こさなかった。(3)MG負荷後のGT1-7のインスリン受容体発現量を検討した。インスリン受容体はMG負荷後においても細胞膜分画に発現が認められ、MGによってその発現量は変化しなかった。(4)MGはインスリン受容体が局在するとされる脂質ラフトの構成成分であるflotillin-1を減少させた。以上、MGは視床下部神経においてインスリン抵抗性を惹起する。これはMGがインスリン受容体の局在部位である脂質ラフトを破壊することに起因するかもしれない。本知見は、CypAのインスリン抵抗性発現において標的となる膜微小領域及び分子を提示するものとして意義深い。本研究の主眼は、脳内環境を制御する「脳神経血管機構(neurovascular unit)」の基幹細胞として「脳ペリサイト」を捉え、本細胞がシクロフィリンA (CypA)などの液性因子を介して脳神経のインスリン抵抗性を惹起し、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求することにある。肥満誘発性糖尿病モデル動物におけるCypAおよびその受容体CD147発現量の変化;高脂肪食を8週間摂食させ肥満誘発性糖尿病モデルマウスを作製した。このモデルマウスでは、脳内CypAおよびCD147発現量の有意な増加、また、ペリサイトを含む脳微小血管のそれら発現量の軽度増加が認められた。従って、肥満誘発性糖尿病病態下では、脳内CypA-CD147シグナルが活性化している可能性があり、この活性化にペリサイトのCypA産生量およびCD147発現量の増加が寄与する可能性が示唆された。糖尿病病態時における視床下部神経インスリン感受性に対するCypAの作用;糖尿病病態時に脳内および血液中で増加する炎症性サイトカインTNF-aおよび糖化産生物質メチルグリオキサール(MG)をマウス視床下部神経細胞GT1-7に負荷し、糖尿病病態時における視床下部神経モデルを作製した。このモデルを用いて糖尿病病態下での視床下部神経のインスリン感受性に対するCypAの作用について検討した。その結果、CypAはMGによるインスリン感受性低下作用に対しては影響しなかったが、TNF-a存在下ではインスリン感受性低下を増悪させることが判った。以上、糖尿病病態下では、脳ペリサイト/脳微小血管組織のCypA産生増加およびその受容体CD147発現増加に伴うCypA-CD147シグナル活性化が、視床下部神経のインスリン感受性低下を惹起する可能性が示唆された。この脳神経血管機構の異常が糖尿病病態の形成・進展に寄与するものと推測される。本研究は、血液脳関門(BBB)および視床下部・海馬機能を調節する「脳神経血管機構(neurovascular unit)」の基幹細胞として「脳ペリサイト」を捉え、本細胞が高血糖状態を感知し、シクロフィリンA (CypA)などの液性因子を介してBBB・脳神経のインスリン抵抗性を惹起することにより、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求する。本研究は糖尿病治療における新たな治療標的を提示しようとするものである。平成23年度はCypAによるBBB機能調節作用について検討した。BBB構成細胞におけるCypAおよびCD147発現量の比較;BBBを構成する脳血管内皮細胞、ペリサイトおよびアストロサイトにおいてCypA受容体であるCD147の発現が認められた。

これら細胞からのCypA分泌量を比較すると、ペリサイトからのそれが最も多かった。これらの結果は、ペリサイト由来CypAが血液脳関門構成細胞間cross talkの伝達因子である可能性を示唆する。BBB機能に対するCypAの作用;CypAのBBB機能に対する作用を明らかにするため、in vitro BBBモデルにCypAを負荷し、tight junction機能をTEERおよびNa-F透過性を用いて評価した。血液側にCypAを処理すると濃度依存的にNa-F透過性は減少したが、TEERは変化しなかった。脳実質側への負荷では、TEERおよびNa-F透過性は変化しなかった。これらの結果から、血液中のCypAは脳血管内皮細胞の密着結合能を亢進すること、また、脳実質側のCypAはその密着結合能に直接的に関与する可能性が低いこと、が考えられる。以上、CypAがBBB機能を担う内因性物質である可能性を提起した。ペリサイト由来CypAの役割については今後明らかにしていく必要がある。糖尿病病態下での視床下部インスリン抵抗性形成過程におけるCypAの役割を明らかにするため、まず視床下部インスリン抵抗性形成機序として、flotillin-1発現量の減少を明らかにした。本年度はCypAによる脳神経インスリン抵抗性発現機序における標的を明らかにした点で、研究の進捗状況としてはおおむね順調と評価できる。糖尿病病態下での血液脳関門のインスリン抵抗性形成過程におけるCypAの役割を明らかにするため、CypAの血液脳関門機能に対する影響を検討した。本年度は、CypAによる血液脳関門機能の強化について明らかにした点を考慮し、研究の進捗状況としておおむね順調と評価できる。CypAによる血液脳関門機能の病態依存的調節についてさらに追究するとともに、摂食中枢を担う視床下部神経に着目し、そのインスリン感受性に対する脳ペリサイト由来液性因子(CypAを含む)の影響を、特にインスリン受容体およびflotillin-1発現量の点から明らかにする。また糖尿病モデル動物の脳切片を用いてCD147発現量の変化についても検討する。これらの成果は「脳神経血管機構」の糖尿病病態における脳ペリサイトの役割の解明に繋がる「糸口」となる。CypAによる血液脳関門機能の病態依存的調節についてさらに追究するとともに、摂食中枢を担う視床下部神経に着目し、そのインスリン感受性に対する脳ペリサイト由来液性因子(CypAを含む)の影響を明らかにする。実験用動物:脳血管内皮細胞および脳ペリサイトは初代培養細胞を用いるため、実験用動物購入のため、20万円必要となる。培養関連試薬:初代培養細胞を採取する為の試薬や培養細胞の培養・維持に培地、血清などの試薬を使用するため、25万円必要となる。培養器具:In vitro BBBモデル作製にCostar社12 well Transwell(1箱約2万5千円)が必要である。
ゼオライトおよびハイドロタルサイトの複合化によるリンおよび窒素同時除去材の開発

樹脂マトリックス中にゼオライトおよびハイドロタルサイトが分散した複合体の作製において,複合体を試験溶液に浸漬した場合,pHが上昇し,アンモニウムイオンがアンモニアガスとして脱離し,アンモニウムイオンの除去はゼオライトのイオン交換によるものではないことが判明した.そのため,以後,除去対象の陽イオン種を鉛イオンに変更した.しかし,ゼオライト,ハイドロタルサイトを樹脂中に分散させる手法では,高い除去率を得るために極端に樹脂量を減らす必要があり,複合体の強度が低く実際の水質浄化材としての利用には不向きであることが判明したため,この手法は断念するに至った.以上のことから,ゼオライト-ハイドロタルサイトの複合硬化体での陽イオン・陰イオン同時除去材に絞って検討した.ここでは,安定した複合硬化体を得るために,シリカフューム,アルミン酸ナトリウムを用いたゼオライトの作製を行った.ゼオライト/ハイドロタルサイトの体積比が5/5,6/4,7/3,1/0となるような複合硬化体を作成した.得られた複合硬化体を3.0-2.0mm,2.0-1.0mm,1.0-0.5mmに分級し,リン酸イオンおよび鉛イオンの除去能を検討した.試験溶液のリン濃度および鉛イオン濃度を50ppmおよび40ppmとして除去実験を行ったところ,リン酸イオンは24時間浸漬で60-70%の除去率が得られた.一方,鉛イオンでは,1時間の浸漬で約100%の除去率となったが,水酸化鉛の沈殿の析出が確認できた.そこで,硬化体を所定の時間試験溶液に浸漬後,溶液のpHを2まで下げることにより水酸化鉛の沈殿を完全に溶解した後,溶液中の鉛イオン濃度を測定し,ゼオライトのイオン交換のみによる除去率を算出した.その結果,60-80%の鉛イオンが除去できることが分かった.また,リン,鉛イオン共に,硬化体の粒径が小さいほど除去率が高くなった.本年度は,平成28年度研究計画の内,樹脂マトリックス中にゼオライトおよびハイドロタルサイトの作製を目指して,樹脂の種類,ハイドロタルサイトの組成およびゼオライトとの配合比率について検討した.ゼオライトについては,市販の合成ゼオライト(A-3,粉末状,75 μm)を用いた.層間に塩化物イオン,酢酸イオンまたは安息香酸イオンを含むハイドロタルサイトについて単独でのリン酸イオン除去特性を検討した結果,層間に酢酸イオンを含む場合が最も高いリン酸イオン除去能を示したため,樹脂への混合は酢酸イオン含むものについて検討した.今回検討した樹脂には,市販のエポキシ樹脂および型取用シリコンゴムを用いた.今回は,ゼオライトとハイドロタルサイトの混合粉末の体積割合を40 %に固定し,樹脂と混合,硬化させた.ゼオライトとハイドロタルサイトの混合比率(Z/H比)は,1/0,0.75/0.25,0.5/0.5,0.25/0.75,0/1とした.リン酸イオン,アンモニウムイオンの除去特性は,リン酸二アンモニウムの0.01 mol/L水溶液(NH4+:34 ppm,HPO4-:98 ppm)に1時間浸漬後,溶液中のアンモニウムイオン濃度およびリン酸イオン濃度を測定した.今回用いた試験溶液は,リン酸イオン濃度がアンモニウムイオン濃度に比較して高いため,Z/H比が0.5/0.5以上の時に,アンモニウムイオン,リン酸イオン除去率はそれぞれ,40%および60%程度となった.無機粉体を樹脂と混合する場合,樹脂により表面が被覆され,リン酸イオン,アンモニウムイオンの除去に対して悪影響を及ぼしたものと考えれれる.特にアンモニウムイオンの除去率が低いのはゼオライトの粒子径が大きいためであると考えられる.今後,樹脂との混合割合および無機粉体の粒子径の影響について詳細に検討する必要がある.平成28年4月に研究開始予定で申請し,4月の採択決定時には不採択であったが,追加で10月(平成28年10月平成30年3月,初年度研究費配分:12月9日)に採択された課題であり.平成28年は実質6か月の研究期間であった.また,4月採択時のエフォートを20%と見積もっていたが,他の研究テーマは4月から始まっており,エフォートを最大でも10%確保するのが限界であった.また,平成28年には,ゼオライトおよびハイドロタルサイトが均一に分散した複合体の作製に対して,樹脂の種類およびハイドロタルサイトの組成の決定および分散性の改善,ゼオライトおよびハイドロタルサイト粉末の粒子径および配合割合の検討,ゼオライトおよびハイドロタルサイト粉末ー樹脂複合物の複雑形状体への展開を予定していたが,樹脂とゼオライト,ハイドロタルサイト粉末の混合方法の決定に予想以上に手間取り,リン酸イオン除去能,アンモニアイオン除去能を評価出来る複合体の作製に多くの日数を要した.特に,ゼオライトの粒子径については,市販の試薬をそのまま使用したため,ハイドロタルサイト粒子との粒子径差が大きく,樹脂との均一混合が難しく,余計に時間を消費した大きな原因であると考えられる.

今回は,このような樹脂-無機粉体の複合体が水質浄化材としての可能性を有するかどうかを早急に判断する必要がありそれに時間を消費したため,ゼオライトおよびハイドロタルサイトの粒子径の最適化,無機粉末-樹脂複合体の複雑形状への展開までに至らず,当初予定よりやや進捗が遅れた状態である.本年度は,樹脂マトリックス中にゼオライトおよびハイドロタルサイトが分散した複合体の作製において,(1)樹脂中へのゼオライト,ハイドロタルサイト粉末の分散性の改善,(2)ゼオライト,ハイドロタルサイトの粒子径の最適化について検討した.混合方法に超音波分散および撹拌型ミキサーを用いて比較した結果,撹拌型ミキサーを用いた場合に混合に均一性の向上が見られ,リン酸イオンの除去率は60%から75%まで向上したが,アンモニウムイオンの除去率は40%から45%までの向上であった.そこで,市販のゼオライト(粒子径:75μm)を遊星ミルで30μm,10μm,5μmまで粉砕した結果,5μmではアンモニウムイオンの除去率が65%まで向上した.水酸化アルミニウムあるいはメタカオリンおよび水ガラスを主原料とするゼオライトAの固化体の作製において,ハイドロタルサイトを添加した複合固化体の作製条件を検討した.ゼオライト前駆体スラリーとハイドロタルサイト粉末との混合条件が非常に重要になるため,撹拌型ミキサーでの混合を検討した.ハイドロタルサイトの組成については,ゼオライト前駆体スラリーのpHが高くなるため,市販のMg-Al系を選択し,層間に塩素イオンを含むものについて検討した.なお,ハイドロタルサイトの混合割合は,Z/H比が1/0,0.75/0.25,0.5/0.5,0.25/0.75,0/1とし,最適比率を調査した.その結果,Z/H比が0.5/0.5までは安定した固化体が調製できたが,それ以上にハイドロタルサイトの含有量が多くなると固化体の強度が極端に低下した. Z/H比が0.5/0.5の場合,アンモニウムイオンおよびリン酸イオンの除去率は75%および70%であった.なお,硬化体には過剰のNaOHが含まれるため,洗浄が必要であることが明らかになった.28年度のからの継続項目である,樹脂中にゼオライトおよびハイドロタルサイトが分散した複合体の作製において,分散方法,ゼオライトの粒子径の影響についてはほぼ確認が終わり,基本的な配合割合,原料粉末の粒子径および混合方法を決定することが出来た.樹脂を用いた複合体の作製においては,層間に塩化物イオンを含むハイドロタルサイトを用いたが,ゼオライトおよびハイドロタルサイトの陽イオン,陰イオン除去後の再生条件の決定,複雑形状への展開へまでは至らなかったため次年度の課題として持ち越すことになった.ゼオライト-ハイドロタルサイトの複合固化体の作製条件の検討においては,水酸化アルミニウムあるいはメタカオリンを出発原料として検討したが,水酸化アルミニウムを用いる場合には,ジオポリマー反応を促進させるための前処理(メカノケミカル処理)を安定して行うことが出来ず,試料作製条件の決定に多くの時間を費やす結果となった.したがって,安定した複合硬化体を得るために,水酸化アルミニウムを出発原料として用いる手法は断念し,メタカオリンあるいはシリカフュームを用いたゼオライトの作製を検討し直したため,本年度は,ハイドロタルサイトの配合比率の決定までしか行うことが出来なかった.また,ゼオライト作成時の過剰なアルカリ成分の溶出が,アンモニウムイオン,リン酸イオンの除去率に大きな影響を及ぼすことが明らかになった.そのため,複合硬化体作成後にアルカリを除去するための洗浄が必要となることが明らかになり,洗浄条件とリン酸イオンおよびアンモニウムイオンの除去能の関連性を詳細に検討し,最適な洗浄条件の決定は出来た.さらに,複合固化体作成に用いた市販のハイドロタルサイト層間の炭酸イオンを除去する必要があり,熱処理温度とリン酸イオンの除去率の関連性を検討し,最適熱処理条件を決定することが出来た.
急性骨髄性白血病抗原に対する網羅的探索と新規抗体療法開発のための基礎的研究

A:急性骨髄性白血病(AML)抗原スクリーニング:AML(M4)初診患者検体をサンプルにしてファージライブラリーからスクリーニングを行った。190クローンをピックアップし、153個の遺伝子配列を調べた。78個の独立したクローンが得られた。その内32クローンの塩基配列は3種類からなるALCAM/CD166に対する抗体、5クローンがであったMCP/CD46であった。癌腫別細胞株を用いた組織特異性の検討から10種類が汎細胞株特異的、10種類が血液細胞特異的、13種類がAML細胞株特異的に結合することをELISA、FACSで確認した。結合力の高い抗体について抗原を調べるために順次、免疫沈降法により抗原の精製、ペプチドシークエンスによる蛋白同定を行った。83-176,73-16はCD93(ClqRp/AA4)が抗原であることをCD93強制発現系にて確認した。CD93は骨髄球、単球、血管内皮、造血幹細胞で発現していることが知られているが、このCD93scFv抗体でも末梢血の顆粒球、単球が陽性になることを確認した。また精製したCD93scFv抗体はmonomerであるが単球系AML細胞株を分化は起こさないものの細胞を凝集させ、軽度ではあるが増殖を抑えたがアポトーシスの誘導は見られなかった。AML患者検体での発現をFACS解析で検討したところMO(0/2),M1(0/4),M2(5/13),M3(2/5),M4(4/6),M5(1/1)で陽性であり分化した病型に多いことが確認された。B:受容体型チロシンキナーゼFLT3抗体作製:293T細胞で高発現するベクターを用いてAIMSライブラリーからFLT3発現細胞を使いスクリーニングを行っている。現在、2種類の抗体クローンを単離した。更に多くのクローンの種類を取得するとともに抗体によるFLT3リガンド刺激の中和活性検討する。A:急性骨髄性白血病(AML)抗原スクリーニング:AML(M4)初診患者検体をサンプルにしてAIMSライブラリーからスクリーニングを行った。83-176,73-16はCD93(C1qRp/AA4)が抗原であることをCD93強制発現系にて確認した。また精製したCD93scFv抗体はmonomerであるが単球系AML細胞株を分化は起こさないものの細胞を凝集させ、軽度ではあるが増殖を抑えた。(株)抗体研にIgG型モノクローナル抗体作製を依頼しており今後、生理的活性(増殖抑制、アポトーシス、補体依存型細胞障害、細胞依存型細胞障害)があることを検討する。白血病など血液疾患での発現レベルを検討し治療に向けた分子標的の候補となりうるかを検討する。83-73はAML細胞株、末梢血白血球特異的に結合することを確認し免疫沈降を行ったがラダー状になり特定が困難であった。このため免疫沈降の条件を検討中である。B: CD44抗体は白血病細胞株を分化させ、増殖を抑えることが知られている。肺がんよりCD44scFv抗体が得られたため白血病細胞株での分化、増殖に対する影響を検討したが明らかな効果は認められなかった。IgG型モノクローナル抗体作製後に再検討する。C:受容体型チロシンキナーゼFLT3抗体作製:293T細胞で高発現するベクターとFLT3細胞外ドメイン分泌型ベクターを作製した。これを用いてAIMSライブラリーからスクリーニングを行っている。FLT3シグナル依存性細胞を用いて増殖抑制、MAPK, STAT系などのシグナル伝達の変化、分化抑制、アポトーシス抑制を解析する。

CD93は骨髄球、単球、血管内皮、造血幹細胞で発現していることが知られているが、このCD93scFv抗体でも末梢血の顆粒球、単球が陽性になることを確認した。また精製したCD93scFv抗体はmonomerであるが単球系AML細胞株を分化は起こさないものの細胞を凝集させ、軽度ではあるが増殖を抑えたがアポトーシスの誘導は見られなかった。AML患者検体での発現をFACS解析で検討したところMO(0/2),M1(0/4),M2(5/13),M3(2/5),M4(4/6),M5(1/1)で陽性であり分化した病型に多いことが確認された。B:受容体型チロシンキナーゼFLT3抗体作製:293T細胞で高発現するベクターを用いてAIMSライブラリーからFLT3発現細胞を使いスクリーニングを行っている。現在、2種類の抗体クローンを単離した。更に多くのクローンの種類を取得するとともに抗体によるFLT3リガンド刺激の中和活性検討する。
パラメトリック音源を用いた新しい水中情報検探査装置の開発

音波の非線形現象を利用した低周波指向性パラメトリック音源を試作し、これを用いたパルス・エコー法による高性能海底面及び海底下情報収集の実験を行った。試作音源は理論計算を踏まえて、共振周波数88kHz、直径80mmの円形圧電型振動子7個を円面状に配列したものである。このときの外寸直径は28cm、等価音源としての直径は23cm、Qはおよそ15.5となった。海底下深くまでの情報を得るには2次周波数(差周波数)は低い方が得策であるものの、1次波より2次波への変換効率、距離分解能、海中雑音を考えて7kHzとした。なお1次波変調はAMとしている。水槽実験による2次音圧は6kW入力で180dBrelμPa・m、-3dB全指向角は7°程度となった。土砂が廃棄されている海底50m程度までの海域で実験を行い、次のことが判明した。1.1次周波数では海底面のプロファイルのみしか得られないのに対し、2次周波数7kHz成分を用いると海底面のみならず海底下30m程度までのプロファイルが鮮明に記録される。2.パラメトリック音源の鋭い指向性によりマルチパスによるエコーグラムのSN比劣化が見られない。3.第2高調波176kHz成分は1次波より鮮明に海底面プロファイルを呈示する。4.従来からサブボトムプロファイラとして海底下の情報を得る装置はあるものの、それに比べると今回はおよそ1/4の寸法(音源の大きさ)で同程度以上のエコーグラムのSN比を得ることができる。以上、本研究結果よりパラメトリック音源を用いた海底探査システムは浅海において十分実用的であることが実証された。
初期太陽系史の完成を目指して

26Alの太陽系の分布を知る目的で、Al-Mg年代とMn-Cr年代を比較するのが一番です。このMn-Cr年代を求めるために標準試料を作成し、Mn/Crの相対感度決定し、CVコンドライトの鉄に富むオリビンの年代を求めました。これらはCV母天体の集積は遅い時期に起きたことを示唆します。しかしここで得られた年代は精度が十分ではなく26Alの太陽系における一様分布を確認することはできませんでした。一方、26Alが一様に分布していると考えると、隕石母天体の集積時期と54Crの同位体異常に相関が見られます。これは簡単な太陽系進化モデルで説明でき、従って26Alの一様な分布を示唆します。初期太陽系の歴史を解明するために、消滅核種26Alが太陽系に一様に分布していたことを確認し、初期太陽系の歴史を完成させることが本研究の目的です。26Alの分布の一様性を確かめるためには、(1)ほかの年代測定系(たとえばMnーCr系)の年代をAlーMg系の年代と直接比較する、(2)26Alを熱源と考え、隕石母天体の熱史(これも主にMnーCr系年代で解明される)をとおして、間接的に比較する、の2つの方法があります。後者の方法については最近、論文がin pressになっています。この様にMnーCr系の年代は重要なのですが、2次イオン質量分析計を使って測定をする場合にはMn+とCr+の相対感度を正確に決める必要があり、そのためには、良い標準試料が必要です。この良い標準試料の作成が難しいために、世界的に見ても、研究が滞っていました。幸い、実用的な標準試料の作成に成功し、炭素質隕石中の鉄に富むオリビンの年代測定ができました。この結果は、26Alが一様に分布していたという考えを支持しています。今後は、測定がより困難なエイコンドライトの測定を行うことになります。現在、鉄に富んだオリビンを含む、3個のエイコンドライトを準備しています。小さなものでは5ミクロン程度の粒子サイズしかないので、測定は簡単ではありませんが、うまくできることが確認されれば、さらに多くのエイコンドライトを測定することができます。これらのエイコンドライトは、長石が共存しているので、AlーMg年代とMnーCr年代を直接比較することができます。以上のような測定をまとめることにより、太陽系における26Alの分布の一様性を確認できれば初期太陽系の歴史はほぼ解明されたことになります。本研究計画では隕石物質中のAl-Mg年代とMn-Cr年代を比較して26Alが太陽系に一様に分布していたかどうかを確かめることを主目的とし、最終的には初期太陽系の歴史の完成を目指しています。今年度の主な実績は、Mn-Cr年代測定の標準試料を作成したことです。上述の目的のために、本研究ではエイコンドライトの年代測定を行いますが、その測定対象は鉄に富んだオリビンです。このオリビン中のMn/Cr比と、Crの同位体比を二次イオン質量分析計で測定することにより、年代を決定します。その際Mn/Cr比の測定にはこの比がきちんとわかった標準試料が必要です。この標準試料の作成は困難な作業で、これにほとんどの時間を費やしました。困難な理由は鉄にとんだオリビンを作るには酸化的環境が必要ですが、あまり酸化的すぎると酸化鉄が析出するし、Crが入りにくくなる傾向があるからです。本研究では、適切なフラックスを使用することにより、比較的低温で組成の均一な、大きなオリビン結晶が得られることを確認しました。これは他の方法では得られない長所です。また、測定対象のエイコンドライトとしてNWA6693というエイコンドライトを準備しました。この中にはFa#が最大で66程度の鉄にとんだオリビンがあり、そこにはCrは検出できない程度しか入っておらず、Mn/Cr比が大きく年代測定に適していることを確認しました。また長石も存在しておりAl-Mg系の年代測定も原理的に可能であることが解っています。またPb-Pb年代は4563Ma程度と報告されており、Mn-Cr年代を求めるのに十分なほど古い年代を持っていることが解っていますので、本研究の目的達成のために最適の試料を得られたと考えています。本研究の目的は、消滅核種26Alが太陽系に一様に分布していたことを確認し、初期太陽系の歴史を完成させることでした。一様分布を確かめるためには(1)Mn-Cr系の年代をAl-Mg系の年代と比較する、(2)26Alを熱源と考え

隕石母天体の熱史(これも主にMn-Cr系年代で解明される)をとおして、間接的に比較する、の2つの方法があります。今年度の成果Mn-Cr年代を正確に得るには、Mn/Crの相対感度を正確に知る必要があります。昨年度に使用した標準試料はMn/Cr比の一様性に問題が残されており、またその組成も限られていました。今年度は一様性のより良い、より広い組成の標準試料を準備しました。これによって、組成に起因する不確実性は減少しました。しかしこれ伴って他の要因による不確実性が露呈しました。すなわち装置の分析条件によって相対感度が変化するという問題があり、信頼できる年代を得るためには、標準試料と隕石試料を交互に測定することが必要になりました。このため、2個のCVコンドライトの鉄に富むオリビンの年代だけが得られ、これはCM,CIと似た値でした。全体の成果26Alが一様に分布していた場合に、エイコンドライト母天体が速い時期に集積し、次に普通コンドライト、最後に炭素質コンドライト母天体が集積したと考えると、すべてが整合的に説明できます(Sugiura and Fujiya, 2014)。しかし、現在でも不均質な26Alの分布を提唱している人はいて、エイコンドライトの場合にも26Alは少量しか含まれていなかったと主張しています。しかしこの場合、エイコンドライトの古い年代を説明するには、母天体が非常に小さいことが必要で、全体としてのモデルの整合性は均質な分布を考えた方が良いと思います。将来的には、より精度の高い年代測定によって決着がつけられるはずです。惑星科学今年度は懸案となっていた標準試料の作成に成功しました。まだ試料の一様性に多少の問題がありますが、1020ミクロンの大きさのオリビンで、2次イオン質量分析に適したMnおよびCrの濃度ものを作成することができました。これを使って測定をおこなったところ、まずMn+/Cr+の相対感度にクレーターの深さ依存性があることを見出しました。これは炭酸塩の場合にはすでに知られたことではありますが、測定は標準試料と隕石試料で同じ時間行うことが重要であることが確認されました。また小さな領域の測定を可能にするために、1次イオンビームの大きさをアパーチャーを使って絞ったところ、Mn+/Cr+の相対感度がイオンビームの大きさに強く依存することが判明しました。これは、Mn+/Cr+の相対感度の変化は、2次イオンビームの広がりがMnとCrで異なるために生じていることを示唆しています。これまで謎だった、相対感度を決定するメカニズムを理解できたのは大きな進歩です。この知見に基づいて、まず比較的大きなオリビンを含み、測定のやりやすい炭素質隕石中のオリビン試料の年代測定を行いました。その結果、CVというグループの鉄に富んだオリビン(母天体中の水質変成で作られる)の形成年代が解りました。これに基づいて求めた母天体の形成年代は、26Alが太陽系に一様に分布していたと仮定して、天体の熱変成時の最高到達温度から求めた母天体の形成年代と矛盾しません。これはCVという隕石について、本研究の目的が達成されたことになります。今後はよりエイコンドライトを対象として、小さな領域の分析(より難しい分析)を行うことになります。目的の達成度は60%程度です。その理由としてはまず、オリビンの標準試料の作成は1つはできたのですが、鉄含有量の異なるものをそろえる必要があり、それは次年度の課題として残ってしまいました。
骨肉腫細胞の浸潤・転移機構におけるケモカインの意義の解明

骨肉腫は最も発生頻度の高い代表的な原発性悪性骨腫瘍である。骨肉腫の増殖や浸潤・転移など悪性形質発現には、腫瘍自身の性質のみならず、周辺微小環境が大きく影響することが知られており、骨肉腫細胞が周辺細胞の性質を変化させ利用していると考えられている。この現象には細胞間の直接接触が重要とされているが、本研究において我々は、細胞接触が不要な液性因子による相互作用が大きな役割を担うという仮説に基づき、その分子機構について解析する。我々は、骨肉腫細胞がより効率的に微小環境さらには遠隔転移先の状態を好腫瘍性に改変するために、液性因子が中心的に使われているという着想のもと、我々はヒト骨肉腫細胞株MG63とヒト間葉系幹細胞hMSCsおよびヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの共培養モデルを作成した。即ち本研究の目的は、骨肉腫の悪性形質発現における液性因子を介した微小環境内のsignal cross-talkの意義を解明することである。これらの細胞株を単独培養した場合と共培養した場合のmicroRNAおよびmRNA発現の変化をマイクロアレイ法により網羅的に解析し次のようなデータが得られた。1MG63において、単独培養と比較してhMSCと共培養した場合に2倍以上・1/2以下の発現異常を示すmicroRNAを2150個、mRNAを7378個、同定した。2hMSCsにおいて、単独培養と比較してMG63と共培養した場合に2倍以上・1/2以下の発現異常を示すmicroRNAを1881個、mRNAを6903個、同定した。3MG63において、単独培養と比較してHUVECと共培養した場合に2倍以上・1/2以下の発現異常を示すmicroRNAを3064個、mRNAを5307個、同定した。4HUVECにおいて、単独培養と比較してMG63と共培養した場合に2倍以上・1/2以下の発現異常を示すmicroRNAを836個、mRNAを707個、同定した。本研究では、これらの発現変化を示す遺伝子の中から液性因子であるケモカインに焦点を絞り、骨肉腫細胞と間葉系幹細胞および血管内皮細胞の間でsignal cross-talkを形成している因子を同定した。すでに重要なケモカインを候補因子として同定しており、予備的実験から骨肉腫細胞は正常細胞を自らのサポート役となるように変化させる因子を放出し、その刺激により周辺細胞から放出される因子を受け取るsignal cross-talkのループを構築している可能性が示唆されている。昨年度行った上記の研究成果をもとに、本研究は骨肉腫とその微小環境内における液性因子を介したsignal cross-talkのメカニズム解明と臨床応用に展開するための基礎となる研究を行う。具体的には研究期間内に以下のことを明らかにする。1網羅的解析により抽出した液性因子のリコンビナント蛋白質および中和抗体を用い単独培養および共培養でsignal cross-talkループを形成している因子を同定する。2同定した液性因子が細胞増殖に影響しているか、骨肉腫細胞にリコンビナント蛋白質および中和抗体を投与することで検証する。3抗体の有無による浸潤能の変化をmotility assay, invasion assayで評価する。

すでに重要なケモカインを候補因子として同定しており、予備的実験から骨肉腫細胞は正常細胞を自らのサポート役となるように変化させる因子を放出し、その刺激により周辺細胞から放出される因子を受け取るsignal cross-talkのループを構築している可能性が示唆されている。昨年度行った上記の研究成果をもとに、本研究は骨肉腫とその微小環境内における液性因子を介したsignal cross-talkのメカニズム解明と臨床応用に展開するための基礎となる研究を行う。具体的には研究期間内に以下のことを明らかにする。1網羅的解析により抽出した液性因子のリコンビナント蛋白質および中和抗体を用い単独培養および共培養でsignal cross-talkループを形成している因子を同定する。2同定した液性因子が細胞増殖に影響しているか、骨肉腫細胞にリコンビナント蛋白質および中和抗体を投与することで検証する。3抗体の有無による浸潤能の変化をmotility assay, invasion assayで評価する。学会発表するまでのデータが揃わず、旅費と論文発表に至らず、使用額の差が生じたため。2019年度に発表を行うため旅費とその他は予定通り支出する予定である。
軽水炉圧力容器鋼材の照射脆化機構としての微細な点欠陥クラスターに関する研究

軽水炉圧力容器鋼材の中性子照射脆化は、軽水炉の寿命を左右する重要な現象であるが、その機構は複雑で、十分に解明されているとはいえない。特に「マトリクス欠陥」と呼ばれる超微細な欠陥に関しては、その本質について十分な知見が得られていない。本研究では「マトリクス欠陥」として有力なマイクロボイドと格子間原子クラスターの生成に及ぼす化学成分の効果を調べることを目的とし、組成を単純化したモデル合金に対してイオン照射を行い、陽電子消滅法および透過型電子顕微鏡によって欠陥分布に関する情報を得る。試料として鉄をベースに銅含有量を変えたモデル合金を用い、東大原総センター重照射研究設備(HIT)にてニッケルイオンを563Kで照射した。空孔型欠陥検出のための陽電子消滅測定は低速陽電子ビーム測定装置にて、単色の陽電子を照射面に注入し、ドップラー拡がりのSパラメータを注入陽電子エネルギーの関数として測定した。このデータを既存解析コードで解析し、欠陥サイズに対応するS_d(欠陥で対消滅したときのSパラメータ)と、欠陥数密度に比例する捕獲速度から、生成した空孔型欠陥のサイズおよび数密度に関する情報を得る。格子間原子クラスターに関しては透過型電子顕微鏡による組織観察を行った。空孔型欠陥を検出する陽電子消滅測定結果の解析から得たS_d/S_b(S_b:バルクで消滅したときのSパラメータ)の値から、欠陥は10個以下の空孔の集合体と推定される。また、銅の添加は個々の欠陥体積を減少させ、陽電子の捕獲速度を大きく増加させる。この効果は銅-空孔複合体の形成を示している。また、銅の添加は照射による微細な「dot image」の生成を促進したが、そのdot imageを同定するにはサイズが小さく、格子間原子型ループの増大かどうかは確認できなかった。
18F標識カチオン型心筋血流薬剤のトレンスレーショナル研究

虚血性心疾患は、心臓の冠動脈の内径が動脈硬化により狭くなり心筋が虚血状態となることにより発症する疾患であり、その診断と治療にとって心筋血流イメージングは重要な技術である。空間分解能及び定量性に優れているPETによる汎用性の高い心筋血流イメージング剤の実用化が強く望まれている。そこで我々は、心筋血流イメージングに応用可能な18F-標識Mt膜電位プローブに関する合成法の研究に取り組み、独自の実用的合成法を開発した。本応募課題では、その18F-標識合成法を応用し、有用性が高く普及が期待できる実用性の高い18F-標識心筋血流イメージング剤の開発を目的とした研究に取り組む。
酸化ストレスを利用した新規脂肪由来幹細胞産生サイトカインによる分化誘導法の開発

新規ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞に酸化ストレスを与えると、hADMPCの培養上清がPC12の神経伸張を促すことを見いだしたことから、その機序を調べるために本研究を行った。まず、hADMPCからグルタチオンを枯渇させると酸化ストレスが生じ、BMP2とFGF2の発現ならびに分泌が上昇することを見いだした。またこの発現・分泌は抗酸化剤であるN-アセチルシステインを添加すると抑制された。さらに、BMP2とFGF2の発現にはp38MAPキナーゼが関与していることが明らかとなった。本研究より、hADMPCを神経変性部位に移植した際、神経伸張を伴う治療効果が期待出来ると考える。本研究では新規ヒト脂肪由来多系統前駆細胞(hADMPC)に様々なストレスを負荷させることによって、幹細胞からの高効率な三胚葉系由来細胞への分化誘導法を開発し、細胞治療の実用化に資する技術基盤を確立することを目的とした。hADMPCをさまざまなストレス環境下で培養することにより、hADMPCにどのような影響が起こるのか、主に細胞増殖、分化能、サイトカイン分泌に与える影響について検討したところ、それらのストレスのうち、酸化ストレスを与えたhADMPCの培養上清が、PC12細胞の神経伸長を著しく促進することを見出した。そこで、神経伸長に関連すると思われるサイトカインについて解析したところ、酸化ストレス暴露培養下におけるhADMPCでは、BMP2とFGF2の発現量、分泌量ともに増加していることが明らかとなった。そこで、hADMPC内での酸化ストレス負荷によるBMP2、FGF2の発現誘導メカニズムを解明するために、MAPキナーゼシグナルに注目し、解析を行った。すると、hADMPCでは酸化ストレス負荷により、p38とERK1/2MAPキナーゼが上昇することが判明した。そこで、p38MAPキナーゼ阻害剤を添加したところ、酸化ストレス負荷によって上昇したFGF2、BMP2の発現がコントロールレベルまで抑制された。さらに、p38MAPキナーゼの上流因子であるMKK6の恒常的活性化型を導入し、強制的にhADMPCのp38MAPキナーゼを活性化させたところ、FGF2とBMP2の発現、分泌上昇を認めた。一方、ERK1/2MAPキナーゼ阻害剤の添加ではFGF2、BMP2の発現レベルは変化がなかったことから、hADMPCにおけるFGF2、BMP2の発現、分泌上昇は、p38MAPキナーゼを介していることが判明した。以上の結果は酸化ストレスならびにp38MAPキナーゼ活性化が、神経再生医療へ応用できる可能性を示唆するものである。再生医療において幹細胞を利用した臨床プロトコルの設定は必要不可欠である。とりわけ、疾患別に至適化された幹細胞療法は、症状別の治療効果を生み出すことに加え、安全面も担保されることが必須である。我々の研究は、ヒト生体内から分取した、安全で高い分化能を有する新規脂肪由来幹細胞(hADMPC)を用いた真の特定疾患療法を開く研究であり、本プロジェクトにおいては、神経疾患を対象にした幹細胞サイトカイン療法の確立を目指している。そのため、当該年度は、年度計画に記した酸化ストレスを負荷したhADMPCによるBMP2、FGF2の発現誘導メカニズムの解明、およびhADMPCの細胞上清の神経細胞伸長作用メカニズムの解明を行うべく、細胞の増殖制御および経時観察、画像データ保存を厳格に実施し、細胞の形質に起因する種々の形態学的基礎データの取得に成功した。また、細胞の性状解析のために遺伝子解析からたんぱく質解析を実施し、特定の遺伝子の挙動についての知見を得るに至った。これらは、hADMPCでBMP2、FGF2の発現を上昇させる転写因子の同定や、hADMPCの細胞上清に含まれるの神経伸長活性因子の同定に繋がるものである。本年度の研究進捗に係る成果は、脳梗塞、脳溢血、脳血栓などのいわゆる脳卒中に伴う脳神経系障害を迅速に修復する手立てを提供するものとしての意義、また、脳機能障害をできるだけ寛解へ導くための安全な再生医療を提供するために必要不可欠な作用機序を明示するという意義をもった、途中にして、かつ独立した研究成果としても有意義なものである。総じてこの研究成果は、国内に於いて高い罹患率や死因ともなっている神経疾患や脳卒中の治療の一助となる成果としてもたいへん重要なものと位置づけられる。当該年度までに、酸化ストレスを負荷した新規脂肪由来幹細胞(hADMPC)のシグナル伝達経路の一端を明らかにし、酸化ストレスを負荷したhADMPCにおける神経伸張を促す主要サイトカイン(BMP2およびFGF2)の発現を上昇させうる転写因子候補分子の絞り込みを達成した。これらの成果により、(1)酸化ストレスを負荷したhADMPCによるBMP2、FGF2の発現誘導における主要なメカニズムを見い出すに至った。

また、酸化ストレスを負荷したhADMPCの細胞上清を利用した、神経細胞分化モデル系(ラット_PC12細胞やヒト_SH-SY5Y細胞)でのシグナル伝達経路の概要を提唱し、同時に、それらの神経伸張作用を促すサイトカインや液性因子を機能面から明らかにすることで、最終的な絞り込み(BMP2およびFGF2)に成功し、その下流のシグナル伝達を明らかとした。このことはつまり、(2)酸化ストレス負荷hADMPCの細胞上清が、PC12の神経伸長を誘起する因子同定およびその作用メカニズムが解明されたことを意味する。これら(1)および(2)の成果は、当初より目指していた研究到達目標のマイルストーンを築くものであり、とりもなおさず単年度研究計画による当該年度の当初目的の完了を充足する研究成果である。以上より、当該年度研究計画の進捗はほぼ予定通りなされたとともに、研究全体での達成目標(研究目的)は、達成できたと評せられる。ただし、精緻なデータ取得を余儀なくされた時間的律速が起こったことも事実であり、それらが一部研究費の執行残額として表現された点も否めない。それ故、研究代表者として、概ね順調に進展しているとする評価を付した。しかしながら、この間に得られたデータは、更に研究目的を深めるような偶発的発見(セレンディピティ)に繋がり、研究進行度だけでは測れない成果が得られたことは評価に上乗せできるとも思われる。当該年度の研究成果を受け、次年度への積み残し(研究小項目としての引き継ぎ精査課題)となった(1)酸化ストレスを負荷したhADMPCでBMP2、FGF2の発現を上昇させる転写因子の同定と、ならびにこれらの因子による神経成長モデル系でのシグナル作用点の同定を、正確かつ緻密に完遂することとする。同時に、(2)さまざまな幹細胞、未分化細胞を用いた分化誘導法のin vitroでの開発、酸化ストレスを利用したhADMPCによるin vivoでの高効率分化誘導法開発を実施し、酸化ストレスを負荷したhADMPCを用いた、さまざまな標的細胞(対象疾患を拡大できうる機能性の高い終末細胞)への安全・高効率分化誘導法の開発につなげる。(1)に関しては、概ね順調な成果の蓄積とデータ累積が達成されていることから、それらを統合的に解析するINSILICO解析の構築と合わせ、機能解析を重視し、主要メカニズムの解明を図る。(2)に関しては、本年度までに得られた基礎データを基軸に、酸化ストレス負荷方策の精緻化や臨床応用を鑑みた施策を換算した方策の決定、神経伸張作用や、酸化という現象を用いた高効率なサイトカイン介在/非介在の神経(神経幹細胞)細胞誘導までを視野に入れ、検討を行っていく。これらの種々の知見を参集し、統合的にまとめ、データマイニング手法等を駆使し、症例別の分化誘導適応への展開も目指す。同時に、それらを検証できるモデル系の構築も行っていく予定である。ただし、基本的な対象疾患は脳神経系に関わる疾患であることを念頭におき、研究目標の主眼となった神経系疾患への新規脂肪由来幹細胞(hADMPC)の適応を目指すことは忘却しない。幹細胞の観点からは、このhADMPCを素材にした酸化ストレス等による細胞賦活も期待できる知見も得られているため、(2)の研究目標に充当することも考えている。
新規がん温熱免疫療法"Heat Immunotherapy″の開発

現行の温熱療法は、体外からラジオ波をあて、体組織のわずかなラジオ波の吸収の違いを利用して加熱しているため、正常組織も加熱されるなどの問題点があり、癌の治療において第一選択となることはない。我々はこの欠点を克服するため、マグネタイト微粒子を発熱体とする深在性ガン温熱治療を開発した。その研究過程で、単に腫瘍を熱死滅させる効果のみでなく、免疫系の賦活により転移巣の治療の可能性をも含むことが認められた。熱免疫にはHSPが関与しており、これを利用する癌ワクチン療法がアメリカで始まっている。私は温熱療法における免疫賦活効果をさらに効果的に誘導させる事で、癌根治の最大の障壁である転移癌も治療でき、かつ免疫を制御する事で低い副作用と高い腫瘍特異的免疫という特徴を備えた癌治療法として確立する事を目的とする。これまでに、HSPが抗原提示細胞を活性化するという知見が示されてきており、その役割を効果的に行わせるためにその中で最も提示作用の強い樹状細胞(DC)を温熱療法と組み合わせた。B16Melanomaを対象として、高い治療効果が得られ、対象となった癌に対する癌免疫が誘導されていた。また、EL4 T-Lymphomaにも、同様に治療効果が見られた。そのメカニズムとして温熱治療後の腫瘍に未成熟なDCを投与すると、そこで腫瘍抗原やHSPの刺激を受け所属リンパ節へと移行して抗腫瘍免疫が形成される事が分かった。しかし、転移患者においては、免疫細胞が移動するような経路で癌細胞も所属リンパ節に転移してから遠隔地に転移をおこすため、現実的にヒトに上記の方法で治療を行っても、リンパ節が機能せず、十分な効果が発揮されない可能性が考えられる。そこで、人工的に作製したリンパ節を用いて抗腫瘍免疫を十分に発揮させることを考えた。現在までに、この人工リンパ節を用いることで高い抗腫瘍免疫を持続できることが確認できている。温熱免疫にはHSPが関与している。このHSPを利用する癌ワクチン療法がアメリカで始まっている。私は温熱療法における免疫賦活効果をさらに効果的に強力に誘導させる事で、癌根治の最大の障壁である転移癌も治療でき、かつ免疫を制御することで低い副作用と高い腫瘍特異的免疫という特徴を備えた世界でも初めての癌治療法として確立する事を目的とする。これまでに、HSPが専門的抗原帝位細胞を活性化するという知見が示されてきており、その役割を効果的に行わせるために専門的抗原提示細胞の中で最も提示作用の強い樹状細胞(DC)を温熱療法と組み合わせた。これはB16メラノーマを治療対象とし、温熱治療後の腫瘍に未熟DCを投与した。未熟DCは温熱された腫瘍細胞の刺激により成熟することが確認され、温熱+DC治療によって10匹中6匹で腫瘍の完全退縮が見られた。完治したマウスでは腫瘍のRechallengeを行ってもすべてが拒絶し、細胞障害活性の測定によりCTLとNK細胞の活性が高まっていて、これらがeffectorとして関与することが示唆された。これはB16メラノーマを対象として、高い治療効果が得られ、治療対象となった癌に対する癌免疫が誘導されていた。また、別の癌としてEL4T-Lymphomaに対しても、高い治療効果が見られた。さらに、温熱療法における免疫の活性化効果では、癌細胞から放出されるHSPを介した効果だけでなく、熱による免疫細胞への直接的な効果もあることが分かってきた。Microarrayによる解析により、特に免疫細胞の遊走の働きに影響を与えていることが示唆されている。

我々はこの欠点を克服するため、マグネタイト微粒子を発熱体とする深在性ガン温熱治療を開発した。その研究過程で、単に腫瘍を熱死滅させる効果のみでなく、免疫系の賦活により転移巣の治療の可能性をも含むことが認められた。熱免疫にはHSPが関与しており、これを利用する癌ワクチン療法がアメリカで始まっている。私は温熱療法における免疫賦活効果をさらに効果的に誘導させる事で、癌根治の最大の障壁である転移癌も治療でき、かつ免疫を制御する事で低い副作用と高い腫瘍特異的免疫という特徴を備えた癌治療法として確立する事を目的とする。これまでに、HSPが抗原提示細胞を活性化するという知見が示されてきており、その役割を効果的に行わせるためにその中で最も提示作用の強い樹状細胞(DC)を温熱療法と組み合わせた。B16Melanomaを対象として、高い治療効果が得られ、対象となった癌に対する癌免疫が誘導されていた。また、EL4 T-Lymphomaにも、同様に治療効果が見られた。そのメカニズムとして温熱治療後の腫瘍に未成熟なDCを投与すると、そこで腫瘍抗原やHSPの刺激を受け所属リンパ節へと移行して抗腫瘍免疫が形成される事が分かった。しかし、転移患者においては、免疫細胞が移動するような経路で癌細胞も所属リンパ節に転移してから遠隔地に転移をおこすため、現実的にヒトに上記の方法で治療を行っても、リンパ節が機能せず、十分な効果が発揮されない可能性が考えられる。そこで、人工的に作製したリンパ節を用いて抗腫瘍免疫を十分に発揮させることを考えた。現在までに、この人工リンパ節を用いることで高い抗腫瘍免疫を持続できることが確認できている。
トランスジェニックマウスの成熟B細胞を用いた代替軽鎖の機能解析系の構築と応用

本年度は、平成12年度に確立したin vitro代替軽鎖発現系を用いて、トランスジェニックマウスのB細胞での代替軽鎖の発現について検討し、また、発現細胞の由来について野生型マウスを用いて検討して、以下のような成果が得られた。1.B細胞レパトアが限定されたトランスジェニックマウスの脾臓B細胞を単離し、anti-CD40抗体およびIL-7で刺激したところ、λ5およびRAG2の発現がRT-PCR荷よって確認された。したがって、in vitroでの代替軽鎖はRAG2の発現は、マウスの系統やB細胞レパトアの大きさに関係なく起こる現象であり、トランスジェニックマウスを用いたin vitroの解析系は代替軽鎖およびRAGの機能解析に適していることが示された。2.脾臓細胞中において代替軽鎖を発現する細胞集団を同定するため、未熟B細胞に発現する抗原を認識する493抗体でB細胞を分画して、代替軽鎖の発現を検討した。単離細胞中に最初から存在する代替軽鎖発現細胞は、多くが未熟B細胞である可能性が示されたが、それらを除去したB細胞においても、in vitro刺激に依存して代替軽鎖の発現が確認されたことから、末梢成熟B細胞において代替軽鎖が発現していることが示唆された。今後、このトランスジェニックマウスを用いた代替軽鎖解析系を用いて、末梢B細胞における抗体遺伝子再構成の機構について詳細な検討をする予定である。本年度は、トランスジェニックマウスの成熟B細胞における代替軽鎖(λ5,VpreB)のin vitro発現系を確立するために、まず野生型のマウスにおいてin vitro発現系および発現調節について検討し、以下のような成果が得られた。1.in vitroの代替軽鎖発現条件の検討:野生型マウスの脾臓B細胞を単離しanti-CD40抗体およびIL-4またはIL-7存在下で刺激したところ、λ5およびVpreBの転写がRT-PCRにより確認された。特に、anti-CD40抗体/IL-7刺激によってより強い転写がみられたことから、λ5およびVpreBはRAGと同様の条件で末梢B細胞で発現することが明らかになった。2.λ5発現細胞集団の同定:抗λ5抗体でanti-CD40/IL-7刺激したB細胞を細胞内染色しフローサイトメーターで解析した。少数のλ5陽性の細胞集団の増加が見られたことから、in vitroで観察されるλ5の転写はタンパクにまで翻訳されており、その発現集団は少数であることが明らかになった。4.λ5の発現調節の解析:anti-CD40/IL-7刺激よるλ5の発現は、B細胞レセプター(BCR)および補体レセプター(CR)を共架橋すると抑制された。この結果より、末梢B細胞におけるλ5の発現はBCR/CRからのシグナルによって調節を受けており、また、発現しているB細胞はBCR+CR+であり骨髄中でλ5を発現している大型プレB細胞(BCR-CR-)よりは分化したB細胞であることが示唆された。