hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線回折法による希土類元素を含む結晶中の電子密度解析

研究代表者は軌道間の規格直交条件を満足する最小二乗法を開発し、X線回折実験から原子軌道(AO)を求める方法(X線原子軌道・分子軌道解析法)を提案した。前年度に、この方法を対称心のみを有する低対称場中の遷移金属錯体に適用し、Cu(diazaoctane)_2(NO_3)_2中のCu^<2+>3d軌道を求めることに成功し、X線原子軌道解析法は一般的に行うことができるようになった。本重点領域研究では、X線原子軌道解析法の適用対象を希土類元素等を含む結晶広げるための研究を行った。その結果、従来注目されていなかった多重反射効果が、重原子結晶の精密解析においては無視できないことが明らかになった。そこで多重反射を避ける、4軸回折計による強度測定法を確立した。この方法を使用して、PtP_2及びNiP_2のX線原子軌道解析を行い、各5d,3d軌道関数を決定した(発表予定)。しかし、PtP_2では、残渣密度図のPt原子上に大きな谷が存在する。これは使用した内殻電子の原子軌道関数に相対論効果がとりこまれていないことによると考えられるので、相対論効果を考慮した原子軌道関数に基づく解析を更に行う予定である。また、希土類元素結晶のX線原子軌道解析の最初の系として、立方晶CeB_6を選んだ。前記の多重反射を避ける強度測定法を使用して、室温で精密強度測定を行った後、X線原子軌道解析を行ったところ、4f電子と思われる山を変形密度図上に見つけた。4f電子による変形密度図上の山や谷は、原子核の近傍に位置するので、非調和熱振動による山と区別するのがむつかしいといわれている。事実、X線原子軌道解析を行っても、非調和熱振動解析を行っても、この山は有意な影響を受ける。そこで両者を実験的に区別するため現在、100K,165K,230K298Kで、X線精密強度測定を行っている。その結果、4f電子の山をX線回折法で見ることができることを世界で初めて、明示できるのではないかと考えている。
FGF21遺伝子に注目した肝臓におけるエピジェネティックメモリーの解析

周産期の母獣にPPARα人工リガンド(Wy)を投与し、産仔(Wy群)と対照群の肝臓におけるFGF21遺伝子発現、血中濃度およびFGF21遺伝子のDNAメチル化状態を解析した。Wy群では対照群と比較して乳仔期におけるFGF21遺伝子のDNA脱メチル化促進が認められ、この状態は成獣期まで維持された。さらに成獣期に高脂肪食を摂餌すると、Wy群では対照群と比較してFGF21遺伝子発現および血中濃度が有意に増加し、体重減少が認められた。乳仔期までに確立したFGF21遺伝子のDNAメチル化状態がエピゲノム記憶され、DNA脱メチル化促進により産生が亢進したFGF21が肥満改善に寄与する可能性が示唆された。胎生期から乳児期の栄養環境が将来の生活習慣病の易罹患性を規定することが示唆されており、その分子機構として遺伝子発現のエピゲノム制御が注目されている。糖脂質代謝の鍵分子Fibroblast Growth Factor 21(FGF21)は核内受容体peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)αの標的遺伝子である。しかし、その遺伝子発現のエピゲノム制御の有無やエピゲノム変化が長期に維持されるか否かは未だ不明である。本研究は胎仔期から成獣期のマウス肝臓におけるFGF21遺伝子発現のDNAメチル化制御機構を明らかにし、そのエピゲノム変化が長期に維持されるかを検証することを目的としている。平成26年度は、周産期の母獣(野生型)にPPARα人工リガンド(Wy)を投与し、生後2日、16日、4週、14週齡の産仔(Wy群)の肝臓におけるFGF21遺伝子のDNAメチル化、遺伝子発現、血清FGF21濃度を解析した。またPPARαノックアウト(KO)マウスを用いて同様の解析を行った。乳仔期ではWy非投与群と比較して、Wy群においてFGF21遺伝子のDNA脱メチル化が亢進していた。このDNAメチル化状態は成獣期(14週齡)まで維持され、Wy群ではFGF21遺伝子発現と血清FGF21濃度の増加が認められた。PPARαKOマウスではFGF21遺伝子のDNA脱メチル化は乳仔期から成獣期を通して認められなかった。これらの結果よりFGF21遺伝子では、胎児期から乳児期におけるPPARα活性化を介したDNA脱メチル化状態が成人期まで維持される「エピゲノム記憶」が存在する可能性が示唆された。本研究成果は、周産期の栄養介入による、将来の生活習慣病に対する「先制医療」の手掛かりとなることが期待される。胎生期から乳児期の栄養などの環境が成人期の疾病罹患性を規定するというDevelopmental Origins of Health and Disease(DOHaD)仮説が提唱されている。このDOHaD仮説の分子機構として、遺伝子発現のエピゲノム制御、特にDNAメチル化による制御が注目されている。我々は最近、マウス乳仔期において核内受容体であるperoxisome proliferator activated receptor (PPAR)αの母乳を介した活性化が仔の肝臓の脂肪酸β酸化関連遺伝子のDNA脱メチル化を導き遺伝子発現が増加することを示した(Diabetes 2015)。Fibroblast growthfactor(FGF)21は糖脂質代謝の鍵分子であり、その遺伝子発現はPPARαによって正に制御されている。平成26年度は周産期の母獣マウスにPPARα人工リガンド(Wy)を投与し、産仔マウスの肝臓におけるFgf21のDNAメチル化の経時変化を解析した。PPARα欠損(KO)マウスを用いて同様に解析した。Wy群では対照群と比較して乳仔期におけるFgf21のDNA脱メチル化の亢進が認められ、これは成獣期まで維持された。一方、乳仔期から成獣期を通してPPARαKOマウスではDNAメチル化の変化は認められなかった。成獣期においてWy群と対照群の間ではFgf21発現と血中濃度に有意差はなかった。このため平成27年度には、Wy単回投与や絶食により一過性にPPARαを活性化させたところ、DNA脱メチル化の程度と相関してFgf21発現と血清濃度の有意な増加が認められた。乳仔期までにPPARα依存的に確立したDNAメチル化状態がエピゲノム記憶されることにより、成獣期の環境変化に対するFgf21発現の応答性が決定されることが初めて明らかとなった。平成26年度の研究で、マウス胎仔期から乳仔期までに形成されたPPARαを介したFGF21遺伝子のDNA脱メチル化状態が成獣期まで維持される「エピゲノム記憶」が存在することが明らかとなった。また平成27年度の研究で、成獣期におけるFgf21のDNAメチル化状態の差は、絶食などの環境変化に対するFgf21発現応答の差として反映されることが明らかになった。これはDNAメチル化による遺伝子発現制御機構の生理的意義を初めて明らかにしたもので、極めて新奇性が高い。その後の成獣期マウス代謝表現型の解析も順調に進んでいる。胎生期から乳児期の環境変化により、成人期の疾病罹患性を規定するというDevelopmental Origins of Health and Disease(DOHaD)仮説が提唱されている。このDOHaD仮説の分子機構として、遺伝子発現のエピゲノム制御のなかでも、特にDNAメチル化による制御が注目されている。

我々は最近、マウス乳仔期において核内受容体であるperoxisome proliferator activated receptor (PPAR)αの母乳を介した活性化が仔の肝臓の脂肪酸β酸化関連遺伝子のDNA脱メチル化を導き、遺伝子発現が増加することを示した(Diabetes 2015)。Fibroblast growthfactor(FGF)21は糖脂質代謝の鍵分子であり、その遺伝子発現はPPARαによって正に制御されている。周産期の母獣マウスにPPARα人工リガンド(Wy)を投与し、産仔マウス(Wy群)の肝臓におけるFgf21のDNAメチル化の経時変化を解析したところ、対照群と比較して、乳仔期におけるFgf21のDNA脱メチル化の亢進が認められ、これは成獣期まで維持された。平成28年度は、Wy群、対照群の両群に高脂肪食(脂質60%)を生後4週目より10週間負荷し、DNAメチル化状態の差異が成獣期の糖脂質代謝表現型に与える影響を評価した。その結果、10週間の高脂肪食負荷によってFgf21のDNAメチル化状態の差異に変化は認めなかったが、負荷後10週間におけるFgf21発現および血中濃度は対照群と比較して、Wy群で有意に増加していた。さらにWy群では対照群と比較して、有意な体重減少、白色脂肪組織重量の減少を認めた。また耐糖能もWy群では対照群と比較して有意に改善し、寒冷曝露による体温も有意に高値を示し、エネルギー代謝の亢進を認めた。周産期の母獣にPPARα人工リガンド(Wy)を投与し、産仔(Wy群)と対照群の肝臓におけるFGF21遺伝子発現、血中濃度およびFGF21遺伝子のDNAメチル化状態を解析した。Wy群では対照群と比較して乳仔期におけるFGF21遺伝子のDNA脱メチル化促進が認められ、この状態は成獣期まで維持された。さらに成獣期に高脂肪食を摂餌すると、Wy群では対照群と比較してFGF21遺伝子発現および血中濃度が有意に増加し、体重減少が認められた。乳仔期までに確立したFGF21遺伝子のDNAメチル化状態がエピゲノム記憶され、DNA脱メチル化促進により産生が亢進したFGF21が肥満改善に寄与する可能性が示唆された。平成26年度の研究で、マウス胎仔期から乳仔期に形成されたPPARαを介したFGF21遺伝子のDNA脱メチル化状態が成獣期まで維持される「エピゲノム記憶」が存在することが明らかとなり、現在その代謝表現型に与える影響も解析中である。解析は順調に進んでおり、今年度中には研究成果をまとめた論文を発表できる見込みである。1PPARαによるマウスFgf21のDNA脱メチル化の分子機構の解明2Fgf21のエピジェネティックメモリーの分子機構と成獣期の糖脂質代謝への影響の解析我々はマウス母獣の妊娠期から授乳期にPPARαの人工リガンド(Wy)を投与すると、その産仔(Wy群)のFgf21のDNA脱メチル化が対照群の産仔と比較して有意に誘導され、またそのDNAメチル化状態の差異は成獣期まで維持されること、および成獣期におけるFgf21のDNAメチル化状態の差は、絶食などの環境変化に対するFgf21発現応答の差として反映されることを昨年度までの研究で明らかにした。平成28年度はWy群、対照群の両群に高脂肪食を生後4週目より10週間負荷し、DNAメチル化状態の差異が成獣期の糖脂質代謝表現型に与える影響を評価する。応用健康科学PPAR
G‐rich反復配列での複製フォーク進行阻害のUP1蛋白質による解徐に関する研究

SV40の複製起点と(CAGGG)_nリピートを持つ鋳型プラスミドに、293細胞抽出液とSV40T抗原を加えた無細胞DNA合成系ではリピート配列内での合成停止は観察されなかった。293細胞抽出液中に含まれるUP1蛋白質、RecQ helicase family蛋白質あるいはその他の因子により合成停止が解消されることが示唆された。今後、これらの因子を欠損またはノックダウンした細胞の抽出液で同様の実験を行う予定である。UP1をノックダウンしたHeLa細胞で、(GGC)_nトリプレット等のリピート数の変化や染色体切断の数を調べたが、コントロール細胞との有意差は認められなかった。ノックダウン後も僅かに発現しているUP1蛋白質又は類縁の蛋白質がUP1の発現低下を補完している可能性が考えられた。大腸菌のin vivo DNA複製を2次元電気泳動法によりモニターすることにより、プラスミド上のPc-1リピート(CAGGG)n部位において複製フォークの進行が阻害されることを示したが、G-richな方のDNA鎖を鋳型とするDNA合成がリーディング鎖合成の場合あるいはラギング鎖合成の場合による阻害の程度に差は見られなかった。UP1を発現させた大腸菌で同リピート部位での複製フォークの進行阻害が解消されるか調べるための系を現在作製中である。SV40の複製起点と(CAGGG)リピートとを持つプラスミドDNA鋳型と動物細胞抽出液を用いたin vitroDNA複製系を使って、UP1蛋白質が鋳型DNA上のG-riChリピートの複製に及ぼす影響についても調べる予定である。そのために必要なSV40 T-antigenの特異的モノクローナル抗体の精製を進めている。細胞中でUP1蛋白質が実際に結合しているDNA配列を同定するために、UP1およびhnRNPA1のFlagタグ付き蛋白質を発現したHeLa細胞を作製し、抗Flag抗体によるChip法により結合配列を幾つかクローニングした。現在、これらの配列が疑陽性でないことの確認作業中である。HeLa細胞でのUP1(hnRNPA1)の発現をRNAiにより抑制する系をつくり、この系で(GGC)トリプレットリピートのリピート数の変化をPCRで調べたが、現在のところ、発現量が正常のコントロールとの差異が認められていない。染色体切断の数についても同様に有意差は認められていない。今後さらに条件検討を行うと同時に、類似の蛋白質とのダブル・ノックダウンによる効果についても調べる予定である。UP1と同時に(CAGGG)_n結合蛋白質として同定された類縁のhnRNPA3蛋白質の幾能を明らかにするため、組換え蛋白質を大腸菌で発現後精製し、DNAに対する結合の配列特異性を調べた。hnRNP A3蛋白質は(CAGGG)_nに高い親和性を示したが、テロメアリピート(TTAGGG)_nに対してさらに強い親和性を持つことが明らかとなった。(CAGGG)_n又は(TTAGGG)_nリピートを持つ1本鎖鋳型DNAと精製DNA polymeraseを用いたin vitroDNA合成系においてhnRNP A3の効果を調べると、UP1で認められた合成停止の解消は観察されず、阻害的に働くことが示された。またhnRNP A3は(TAGGG)_nリピートに結合してヌクレアーゼの攻撃からこのリピートを保護する働きがあることがわかった。次にhnRNP A3の発現を薬剤の添加により誘導できるtet-on HeLa細胞株を樹立した。この細胞株を用いてhnRNPA3の過剰発現の影響を調べると、テロメア長の伸長が認められた。
MRL/lprマウスにおける肺病変発症機序の解明

本研究の目的は、MRL/lprマウスにおけるCD28/CTLA4-B7補助シグナル非依存性の肺病変について、遺伝背景の異なるマウスを用いることで病変形成に関わる原因遺伝子を探索すること、さらに、肺病変発症機序を解明するために、免疫組織化学的および臨床病理学的に詳細に解析して、病変に関わるサイトカインを同定し、抗サイトカイン抗体の投与実験によってその関わりを証明することである。まず、MRL/lprに加えて、遺伝背景の異なるC57BL6/lprおよびC3H/He/lprマウスにもCTLA4IgGを生後24時間以内から1回100μg、週3回腹腔内に投与し、20週齢で肺の病理組織学的検索を行った。その結果、MRL/lprではCTLA4IgG投与の有無に関わらず強い肺病変が認められた。C57BL6/lprではCTLA4IgG投与により肺病変が有意に抑制され、C3H/He/lprでは対照と同程度の軽度の単核球浸潤が認められた。以上のことから、CD28/CTLA4-B7補助シグナル非依存性に生じる肺病変は、MRL遺伝背景とともにlpr遺伝子つまり、Fas分子の異常によって誘導されることが示唆された。次に、MRL/lprマウスの肺病変発症機序の解明を目的として、MRL/lprマウスの肺組織から単核球を分離し、フローサイトメトリーによる解析を行った。表面抗原の解析から、CTLA4IgG投与によってT細胞の活性化は抑制されたが、マクロファージの活性化は抑制されないことが判明した。また、細胞内サイトカインの解析から、マクロファージからのインターフェロンガンマの産生が抑制されないことが明らかとなった。以上の事から、MRL/lprマウスにおけるCD28/CTLA4-B7補助シグナル非依存性に生じる肺病変の形成には、マクロファージから産生されるインターフェロンガンマが関わっていることが示唆された。本研究の目的は、MRL/lprマウスにおけるCD28/CTLA4-B7補助シグナル非依存症の肺病変について、遺伝背景の異なるマウスを用いることで病変形成に関わる原因遺伝子を探索すること、さらに、肺病変発症機序を解明するために、免疫組織化学的および臨床病理学的に詳細に解析して、病変形成に関わるサイトカインを同定し、抗サイトカイン抗体の投与実験によってその関わりを証明することである。MRL/lprに加え遺伝背景の異なるC57BL6/1prおよびC3H/He/lprマウスにもCTLA4IgGを生後24時間以内から1回100μg、週3回腹腔内に投与し、20週齢で肺の病理組織学的検索を行った。C57BL6/lprではCTLA4IgG投与により肺病変が有意に抑制され、C3H/He/1prでは対照と同程度の軽度の単核球浸潤が認められた。以上のことから、CD28/CTLA4-B7補助シグナル非依存症に生じる肺病変はMRL遺伝背景とともにlpr遺伝子つまり、Fas分子の異常によって誘導されることが示唆された。今後、MRL/lprマウスの肺病変発症機序の解明を目的として、MRL/lprマウスの加齢に伴う肺への浸潤細胞を免疫組織化学的手法を用いて同定するとともに、肺組織から単核球を分離し、フローサイトメトリーにより解析を行う予定である。
強塩基性キラルブレンステッド塩基触媒の創成と不斉触媒反応の開拓

ブレンステッド塩基を触媒として用いた、プロ求核剤の脱プロトン化を起点とする分子変換反応は、有機化学における最も基本的な触媒反応であり、古くから精力的に研究が行なわれてきた。特に近年においては、キラルブレンステッド塩基触媒の開発およびそれらを用いた不斉触媒反応の開発が盛んに行なわれている。しかしながら、キラル第3級アミンに代表される従来の触媒においてもなおその塩基性は低く、反応に適用可能なプロ求核剤は、pKaの値が20以下の酸性度が高い化合物に限られている。従ってプロ求核剤の適用範囲を拡充し、さらなる不斉触媒反応を開発するためには、新たな分子設計に基づく強塩基性キラルブレンステッド塩基触媒の開発が必要不可欠である。このような背景のもと今回我々は、水素結合供与体として知られるウレアのN-Hを脱プロトン化することで生じるウレエートを強塩基性部位として利用した、新たなキラルブレンステッド塩基触媒の設計・開発を行なった。具体的には、側鎖にシッフ塩基部位とアミド部位を導入した光学活性N,N'-ジアルキルウレエートを開発した。本触媒の機能評価を目的として、比較的酸性度が低いα-チオアセトアミドをプロ求核剤として用いた、ビニルスルホンへの触媒的不斉付加反応を行なった。その結果、高収率かつ高エナンチオ選択性で目的の付加生成物が得られた。従って、我々が設計した光学活性N,N'-ジアルキルウレエートは、強塩基性キラルブレンステッド塩基触媒として機能することが明らかとなった。またビニルスルホンのみならず、その他の求電子剤を用いた場合においても、高収率かつ高エナンチオ選択性で目的の付加生成物が得られることを見出した。当初計画していた、側鎖にヒドロキシ基を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートの開発は現在検討段階にある。その一方で我々は、側鎖にシッフ塩基部位とアミド部位を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートを新たに設計し、その触媒ライブラリーの構築を行なった。また1年目のうちに、触媒ライブラリーを活用して反応探索を行ない、実際に酸性度の低いプロ求核剤を用いた高収率かつ高立体選択的な不斉触媒反応の開発を達成した。このように、我々が設計した光学活性N,N'-ジアルキルウレエートが、強塩基性キラルブレンステッド塩基触媒として機能することを明らかにし、今後さらなる反応開発への展開が期待できることから、「研究の進捗状況」として「おおむね順調に進展している」と判断した。当初計画していた、側鎖にヒドロキシ基を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートの開発は引き続き検討していく。その一方で、新たに設計・開発した、側鎖にシッフ塩基部位とアミド部位を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートの触媒ライブラリーを活用して、さらなる不斉触媒反応の開発を進める。。具体的には、エステルやスルホン、リン酸エステルなど、α位のプロトンの酸性度が低く従来のキラルブレンステッド塩基触媒反応系では適用が困難であったプロ求核剤を対象とし、種々の求電子剤への触媒的不斉付加反応を検討する。また3年目に計画した、生物活性物質の基本骨格に含まれる含窒素ヘテロ環化合物の直接的かつ触媒的な不斉官能基化などの検討も併せて行なう。これらの検討により、精密有機合成化学や創薬分野等へ新たな知見を提供することを目指す。

また1年目のうちに、触媒ライブラリーを活用して反応探索を行ない、実際に酸性度の低いプロ求核剤を用いた高収率かつ高立体選択的な不斉触媒反応の開発を達成した。このように、我々が設計した光学活性N,N'-ジアルキルウレエートが、強塩基性キラルブレンステッド塩基触媒として機能することを明らかにし、今後さらなる反応開発への展開が期待できることから、「研究の進捗状況」として「おおむね順調に進展している」と判断した。当初計画していた、側鎖にヒドロキシ基を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートの開発は引き続き検討していく。その一方で、新たに設計・開発した、側鎖にシッフ塩基部位とアミド部位を有する光学活性N,N'-ジアルキルウレエートの触媒ライブラリーを活用して、さらなる不斉触媒反応の開発を進める。。具体的には、エステルやスルホン、リン酸エステルなど、α位のプロトンの酸性度が低く従来のキラルブレンステッド塩基触媒反応系では適用が困難であったプロ求核剤を対象とし、種々の求電子剤への触媒的不斉付加反応を検討する。また3年目に計画した、生物活性物質の基本骨格に含まれる含窒素ヘテロ環化合物の直接的かつ触媒的な不斉官能基化などの検討も併せて行なう。これらの検討により、精密有機合成化学や創薬分野等へ新たな知見を提供することを目指す。
地方都市郊外戸建住宅地における居住の継続と開発抑制に関する研究

本研究では、地方都市郊外住宅地におけるこれまでの開発状況の現状把握を行うと共に、居住の継続と乱開発抑制のために必要な物的・質的課題について検討を行うことを目的とする。具体的には、福井県鯖江市郊外の田園地帯(白地地域)における小規模住宅開発が点在する地域を対象に、主に以下の点について明らかにした。・住宅地の開発は1990年代後半以降活発化しており、また団地の規模も小規模化の傾向にある。・住宅団地の多くは、周辺の集落など既存の住宅地と連携することなく、団地独自で自治会を形成している。・団地の規模や住宅の規模共に小規模で、田園に孤立して立地する住宅に住む居住世帯の多くは、定住意識が低く、周辺地域の居住者との交流がほとんど見られない。さらに、居住者組織代表者へのヒアリングなどを通して、主に以下の2点が明らかになった。・土地所有者の多くは、高齢化などにより農業を自ら行うことが難しく、土地を売却あるいは賃貸することにより現金収入を得たいと考えている。・一方、既存の郊外住宅地に居住する世帯の多くは、地区が田園から市街化していくことを地区の「発展」として捉え、また地区内に新規の住宅地が開発されることは、若年層の流入による活気や自治会費の増加などが期待されることから歓迎すべきこととして捉えている。以上ことから、今後の地球環境の問題や高齢化などが予想される中で、コミュニティの育成などを促し長期的にも持続可能な居住地とするため、既存の住宅地や集落に調和し隣接するような形で配置していくことが望まれる。また、土地所有者や居住者自身に対し、散発的な郊外開発の問題点を自覚させるよう、自治体などが中心となって情報提供や教育の機会を設けたり、既存の環境資源を活かした土地利用に誘導するような支援策を行うことが重要である。福井県嶺北地域におきてこれまでに開発された住宅地の開発時期、立地、規模などについて整理し、福井市郊外住宅地の開発経緯と現状の把握を行った。そして、現地での目視調査を行い、典型的・特徴的事例を複数抽出し、居住者の自治組織の代表である区長などへ、各団地の概要についての聞き取り調査を実施。なお、本年度は、空地や区画の統合が目立つ住宅地3地区を対象として、居住者へのヒアリング及びアンケート調査を実施した。調査の結果、主に下記のような内容が明らかとなった。・間口方向に同時取得した世帯は見られるものの奥行方向を同時取得した世帯は見られず、奥行き方向に拡張した世帯では、当初北側の土地を取得しその後日照確保などのために南側の土地を取得するケースが存在すること。・土地取得の動機としては、「住宅の拡張」、「畑や駐車場の確保」、「将来の親族居住地としての先行的土地確保」などで、入手方法としては、「不動産業者を通して」が多いものの、自ら役所へ土地所有者を問い合わせたり、現地で所有者と直接交渉をし、草むしりなどの管理をする代わりに無料で利用する世帯も複数見られること。・複数宅地所有者の中には、3区画以上所有する世帯や、隣接しない土地でも所有している世帯も複数存在し、空地の存在が多様な居住ニーズへの対応に寄与していること。・居住者にとっての団地内空地は、雑草などで放置状態になっていることを改善すべきと考えている世帯も見られる一方で、「広々としていて良い」、「現状のままでよい」と捉えている世帯も多く、空地に対して必ずしも否定的に捉えている訳ではないこと。本研究では、郊外部での戸建住宅地開発が継続的に行われている福井市周縁の郊外部を対象に、既に開発された住宅地における自律的な住環境形成と、これ以上の不必要な開発抑制のために必要な物的・質的課題について検討を行うことを目的としている。これまでの主な研究実績としては、以下の3点が挙げられる。1)福井市周縁の郊外部において、これまでに開発された住宅地の把握・整理。2)福井県坂井市春江町において数十年前に開発され「空区画」及び「区画の統合化」が活発な住宅地を対象に、複数区画利用プロセスの実態について明らかにすると共に、空区画の利用実態や土地所有関係について調査を行ってきた。ここから、区画統合など複数区画利用を行った動機としては「駐車場を設けるため」や「2世帯住居とするため」、「畑や花壇にするため」であることが明らかとなった。また連続する空区画では以前ゲートボール場として利用され、これには自治体から固定資産税などを優遇する措置がとられたり、コミュニティーガーデンとして追加で買い足した区画を地域に開放する世帯が見られるなど、空区画がコミュニティ形成の場になっている実態が明らかと成った。3)未利用地の多くは不在地主が所有しており、不在地主を対象としたアンケート調査では、「子供の居住地として確保」や「資産として購入」したものの、実際には、子供が居住地とすることも無く、思うような価格で土地が売れないために、未利用地化している実態が明らかとなった。そして、団地居住者に草刈などをしてもらう代わりに無料で貸すことについて、不在地主は必ずしも否定的に捉えておらず、賃貸による暫定利用の可能性があることが明らかと成った。なお、2006年度後半からは、近年、団地規模や住戸規模が小規模な住宅地の散発的開発が継続的に行われている福井県鯖江市西部地域を対象に、実態調査を進めつつある。

具体的には、福井県鯖江市郊外の田園地帯(白地地域)における小規模住宅開発が点在する地域を対象に、主に以下の点について明らかにした。・住宅地の開発は1990年代後半以降活発化しており、また団地の規模も小規模化の傾向にある。・住宅団地の多くは、周辺の集落など既存の住宅地と連携することなく、団地独自で自治会を形成している。・団地の規模や住宅の規模共に小規模で、田園に孤立して立地する住宅に住む居住世帯の多くは、定住意識が低く、周辺地域の居住者との交流がほとんど見られない。さらに、居住者組織代表者へのヒアリングなどを通して、主に以下の2点が明らかになった。・土地所有者の多くは、高齢化などにより農業を自ら行うことが難しく、土地を売却あるいは賃貸することにより現金収入を得たいと考えている。・一方、既存の郊外住宅地に居住する世帯の多くは、地区が田園から市街化していくことを地区の「発展」として捉え、また地区内に新規の住宅地が開発されることは、若年層の流入による活気や自治会費の増加などが期待されることから歓迎すべきこととして捉えている。以上ことから、今後の地球環境の問題や高齢化などが予想される中で、コミュニティの育成などを促し長期的にも持続可能な居住地とするため、既存の住宅地や集落に調和し隣接するような形で配置していくことが望まれる。また、土地所有者や居住者自身に対し、散発的な郊外開発の問題点を自覚させるよう、自治体などが中心となって情報提供や教育の機会を設けたり、既存の環境資源を活かした土地利用に誘導するような支援策を行うことが重要である。
感情的文脈を利用した言語理解の脳内機構

人間は様々な文脈を利用しながら,その場の状況に応じてことばを理解する.その一つが感情的文脈である.本研究では,感情的文脈を利用してことばを理解するときの脳内処理を明らかにするために,非侵襲的脳機能計測実験を行った.実験結果から,感情的文脈を利用した言語理解には両半球の下前頭部の活動が重要であることが明らかになった.右前頭部で感情的な文脈が構築され,左前頭部で感情的文脈と言語情報とが統合され,感情的文脈に応じてことばが解釈されることが示唆された.人間は様々な文脈を利用しながら,その場の状況に応じてことばを理解する.その一つが感情的文脈である.本研究では,感情的文脈を利用してことばを理解するときの脳内処理を明らかにするために,非侵襲的脳機能計測実験を行った.実験結果から,感情的文脈を利用した言語理解には両半球の下前頭部の活動が重要であることが明らかになった.右前頭部で感情的な文脈が構築され,左前頭部で感情的文脈と言語情報とが統合され,感情的文脈に応じてことばが解釈されることが示唆された.人間は様々な文脈を利用しながら、その場の状況に応じて言語を理解する。その一つが感情的文脈である。円滑なコミュニケーションにとって、感情的情報まで含んだ言語理解は重要であるが、「言語理解の過程で、感情的文脈がどのように利用されて解釈の違いを生じているのか」という問題に着目した研究はほとんどない。本研究は、「感情的文脈を利用した言語理解の脳内機構」の解明を目的とする。感情的特徴を含む音声(プライム)の後に、感情的にニュートラルな言語刺激(ターゲット)を視覚呈示するクロスモダルプライミングパラダイムを用いた脳磁場計測実験を行った。プライムは、人の名前(例、あらいさん)を、「楽しい」(Happy条件)、「平静」(Neutral条件)、「悲しい」(Sad条件)の3種類の感情的プロソディで発せられた音声を用いた。ターゲットには、動詞(例、歩く)または擬似動詞(発音可能であるが単語として存在しない;例、風ぶ)から成る一語疑問文を用いた。その結果、1)ターゲット呈示後300ミリ秒後に右中・下前頭部において、感情的条件(Happy・Sad)とNeutral条件で脳活動差が認められ、2)ターゲット呈示後400ミリ秒後に左下前頭部において、HappyとSad条件で脳活動差が認められた。以上の結果から、感情的文脈を利用した言語理解には両半球の下前頭部の活動が重要であることが明らかになった。また、感情的文脈は右中・下前頭部にて形成・保持され、その情報は、左下前頭部でボトムアップ的意味処理による語彙情報と統合されることにより、感情的文脈情報に応じた言語理解が行われていることが示唆された。さらに、本年度末には、非侵襲的脳刺激手法である経頭蓋直流刺激を用いた実験の準備を行った。同じことばであっても、楽しそうに言われた場合と悲しそうに言われた場合では聞き手の受け取り万は異なるように、ことばの解釈は表情やプロソディなど感情情報の影響を受ける。本研究では、言語理解の過程において感情情報が利用され、異なる解釈を生みだすときの脳内プロセスを明らかにするために、脳磁場計測実験を行った。「楽しい」、「悲しい」、「ニュートラル」のいずれかの感情的音声を聞かせた直後に、感情的にニュートラルな単語を視覚的に呈示して、単語処理の脳活動における感情情報の影響を検討した。左右半球の下前頭部の活動が、直前に与えられた感情的音声によって異なるという結果から、これらの部位が感情情報と言語情報の統合理解に重要であることを明らかにした。一方、先行研究により、単語の視覚形態処理に関わると考えられる左後頭側頭部、音韻処理に関わると考えられる左上側頭後部・下頭頂部、語彙的意味処理に関わると考えられる左側頭前部の活動は条件差が認められないことから、これらの処理は感情情報の影響を受けない言語の中心的意味を理解するために働いていることを示唆する。また、感情的音声そのものに対する脳活動を解析したところ、右側頭部の活動において感情の種類による違い(楽しい、悲しい>ニュートラル)が認められたことから、この部位が感情的プロソディの処理に関与することを示した。これらの結果から、感情情報を利用しながらことばを解釈する脳内プロセスでは、左右半球に渡る広範囲の部位間の連携と役割分担が本質的な役割を果たしていることがわかった。本研究の成果はNeuroscience Research(2012)に掲載された。さらに、本家成果を社会に発信するためにプレスリリースを行い、日経産業新聞等6誌に記事が掲載された。
テレビ暴力番組が子供の非社会的行動に与える効果についての研究

1.研究の背景テレビ暴力の効果理論には、観察学習、脱感作、カルティベーションがある。3つの理論の効果が現れる条件を明らかにするため、本研究はテレビ暴力番組への接触行動に着目し、接触行動を空想志向と現実志向の2側面から捉えて、3つの理論との対応を検討する。2.問題の設定非社会的行動の概念と3つの理論の効果との対応を検討し、観察学習の効果を非社会的正当化、脱感作の効果を非社会的馴化、カルティベーションの効果を非社会的対人不信に再概念化した。またテレビ接触行動には、空想志向が強い接触行動と現実志向が強い接触行動、さらに2つの志向が共に強くアンビバレンスが伴う接触行動があり、それらと3つの理論との対応が得られた。仮説1:テレビ暴力番組接触において空想志向の強い者は他の者と比べ非社会的馴化度が高い仮説2:テレビ暴力番組接触において現実志向の強い者は他の者と比べ非社会的対人不信度が高い仮説3:テレビ暴力番組接触において空想志向と現実志向とが共に強い者は他の者と比べ非社会的正当化度が高い3.調査中高生を対象とした調査を実施し、1000名分の有効回答を得た。分析の結果、本研究の全ての仮説が支持された。4.考察・結論仮説が支持されたことにより、テレビ暴力の効果を非社会的行動の側面から捉え、接触行動を志向の側面から捉えることによって、3つの効果理論を総合的に捉えられることが示された。本研究は、子供の暴力番組への接触行動を類型化し、カタルシス理論、観察学習理論、脱感作理論、カルテイベーション理論の4つのテレビ暴力理論との対応関係を明らかにし、その上でそれぞれの類型に属する視聴者に、対応する理論の効果が表れるか否かを検証することを目的とした。接触行動を類型化するにあたっては、「空想志向的接触」、「現実志向的接触」の概念、及びアンビバレンスの概念を用いることとした。また、効果を測定する尺度としては、それぞれの理論の概念に基づき、対応すると考えられる非社会的行動の尺度を用いることとした。そのために、本年度は、テレビ暴力、テレビ接触の志向、アンビバレンス、非社会的行動に関する文献を収集、検討した。さらにコンピュータに入力、データベース化の準備を行った。次に、テレビ暴力番組の基準設定と選定を行った。テレビ暴力番組の基準は、基本的に佐々木(1991)による「人間、生物、または無生物の対象に、物理的、心理的危害を直接的、間接的に与える行為の描写を含む、テレビによって放映される劇、長編特作物語、マンガなどの、虚構的物語番組及びコメディー番組」(p.7)を用いることが、収集した文献等に基づき、妥当性があると考えられた。さらにこの基準の「コメディー番組」について、この番組への接触が、自分よりも他人の方が大きい影響があるとする第三者効果を支持すれば、基準の妥当性が実証されたと考えられる。そこで、仮説「人は暴力番組の影響が自分よりも他人に大きいと認知する」が設定され、大学1年生423名を調査対象にして、「コメディー番組」としての笑い中心型暴力番組11番組について、自分自身と他人の影響が測定された。自分の影響が最小と認知したグループのみが仮説を支持した。この結果より、コメディー番組を暴力番組とするには、接触者が暴力番組と認知するかどうかの視点も必要であると考えられた。本年度は、昨年度に引き続き、新たなテレビ暴力、テレビ接触の志向、アンビバレンス、非社会的行動に関する文献を収集して、検討を行った。次に、テレビ暴力番組の基準として佐々木輝美(1991)による「人間、生物、または無生物の対象に、物理的、心理的危害を直接的、間接的に与える行為の描写を含む、テレビによって放映される劇、長編特作物語、マンガなどの、虚構的物語番組及びコメディー番組」(p.7)を用いた。

この基準の「コメディー番組」について、昨年度の研究よりコメディー番組を暴力番組とするには、接触者が暴力番組と認知するかどうかの視点も必要であると考えられ、研究の結果、接触者がコメディー番組に接触するほど暴力番組と認知する程度が少なくなり、暴力番組への影響に対する規制に反対することを明らかにした。さらに昨年度に設定した番組接触行動と非社会的行動の測定尺度を用いて、子供の暴力番組への接触行動を類型化して、その類型化された暴力番組への接触行動が、カタルシス理論、観察学習理論、脱感作理論、カルティベーション理論の4つのテレビ暴力理論に結びついた非社会的行動とどのように対応するかについて検証を行なった。その結果、テレビ暴力番組接触において空想志向の強い者には脱感作が起こり、現実志向の強い者はカルティベーションが起こり、また、空想志向と現実志向とが共に強い者には観察学習が起こることが明らかになった。このことから、テレビ暴力の効果を非社会的行動の側面から捉え、接触行動を志向の側面から捉えることによって、観察学習理論、脱感作理論、カルティベーション理論の3つの効果理論を総合的に捉えられることが示された。
プロテアーゼ活性を持つOprDポーリンの分子構造とOprDと相同なポーリンの発見

近年、多くの抗生剤に耐性な病原細菌が出現し、大きな問題となっている。緑膿菌もその一つで、院内感染の主要起因菌となっている。緑膿菌の多剤耐性は外膜の薬剤に対する透過障壁と薬剤排出の共同作用の結果である。外膜の障壁性はポーリンのサイズが小さいこと、またポーリン蛋白の一つであるOprDはプロテアーゼ活性を持つことを明らかにしてきた。本研究期間中、以下の研究を行い成果を得た。(1) OprDタンパクとセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の相同性を調べた結果、OprDのH156,D208,S296が触媒残基と推定された。そこで部位特異的変異導入法を用いてこれらアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異タンパクを作製し、それらのプロテアーゼ活性を調べた。その結果変異によって活性が失われることが明らかとなった。(2)上記以外のアミノ酸に変異を導入しても、プロテアーゼ活性に変化は見られなかった。これらの結果からOprDポーリンはプロテアーゼ活性を持つ多機能タンパクであることが示された。(3) OprDに特異的なモノクローナル抗体が交叉反応を示す外膜タンパクの存在が示された。このタンパクを調べた結果、OprE3であることがわかった。(4) OprE3を精製し、リポソームに再構成して調べた結果、OprE3はポーリンであることがわかった。(5) OprE3遺伝子をクローニングし、その構造遺伝子の全塩基配列を決定した。推定アミノ酸配列から、OprE3とOprDは高い相同性を持つことが明らかとなった。(6) X線結晶解析法によりOprDの三次構造を解明し、OprDタンパクのチャンネルとプロテアーゼ部分の原子構造を明らかにするため、まずOprDタンパクの結晶化を行った。タンパクの結晶化を種々の条件下で行った結果、ある程度の結晶を得ることには成功した。しかし高分解能の回析像にはまだ不十分であるので、さらなる条件検討が必要と考えられる。日和見感染症の主要起因菌である緑膿菌は抗生剤に高度多剤耐性を示す。この要因の一つは緑膿菌外膜にあるポーリンの孔サイズが小さいことに由来する。緑膿菌のOprDタンパクはポーリンであることを明らかにしてきた。更に我々はOprDはプロテアーゼ活性も併せ持つという興味深い発見をした。そこで本年度は以下の実験を行い成果を得た。(1)セリンプロテアーゼとOprDのアミノ酸配列を比較した結果、OprDプロテアーゼの触媒基はHis156,Asp208,Ser296であることが推定できた。そこでこれらアミノ酸が実際に触媒基として機能しているかを明らかにするため、これらアミノ酸を特異的に置換した変異タンパクの作製を試み、His156,Asp208,Ser296のアミノ酸をそれぞれGln,Asn,Alaに置換した三種類の変異タンパクの作製に成功した。次に変異タンパクのプロテアーゼ活性を測定した結果、その活性は全て野生型OprDの0.1%以下にまで減少しているのがわかった。これはこれら三つのアミノ酸残基がOprDプロテアーゼの触媒基であることを明瞭に示している。このようにしてOprDプロテアーゼの触媒基を同定することができた。

(2)これら変異タンパクを発現している緑膿菌の薬剤感受性を調べた結果、薬剤感受性には何らの変化も見られなかった。これはこれら三種類のアミノ酸の置換はチャンネル活性に何ら影響しないことを示している。(3)OprDポーリンと相同性をもつOprE3タンパクを精製し、リポソームに再構成してチャンネル活性を調べた。その結果、OprE3はポーリン活性を有しその孔サイズは他のポーリンと同程度であることが明らかとなった。さらに平面脂質二重膜法を用いて調べたところ、OprE3はやはりチャンネルを形成しているということが確かめられた。現在OprE3遺伝子のクローニングを進めている。近年、細菌感染症が再び大きな問題となっている。多くの抗生剤に耐性な病原細菌が数多く出現し、その治療が困難となっているからである。その中に院内感染の主要起因菌である緑膿菌がある。緑膿菌の多剤耐性は、外膜の高い透過障壁性と薬剤排出系の協同作用の結果である。外膜の障壁性は、緑膿菌のポーリン孔のサイズが小さいことに由来することを明らかにして来た。またポーリンタンパクの一つであるOprDは、プロテアーゼ活性も併せもつという事を発見した。このようにユニークなOprDの構造と機能に関して大きな興味が持たれた。そこで以下の研究を行い成果を得た。(1) OprDとセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の比較から、OprDプロテアーゼのHis156、Asp208及びSer296が触媒基と推定された。そこでこれらアミノ酸を変異させ、そのプロテアーゼ活性を調べた。その結果これら変異タンパクで活性が失われていることが明らかとなった。(2)次にこれ以外のアミノ酸に変異を導入し、そのプロテアーゼ活性を調べた。その結果このような変異ではプロテアーゼ活性に変化のないことが分かった。以上の結果はOprDポーリンはプロテアーゼ活性を併せ持つ多機能膜タンパクである事を証明する。(3) X線結晶解析法によりOprDの立体構造を解明するため、タンパクの結晶化を行った。キャピラリー法でタンパクを結晶化できたが、さらに良質の結晶を調製するため、詳細な結晶化条件を検討する。(4) OprDに対するモノクローナル抗体と交叉反応を示す外膜タンパクOprE3を精製し、再構成系を用いて調べた結果、OprE3はポーリンである事が分かった。(5) OprE3遺伝子をクローニングし、その全塩基配列を決定した。その結果OprE3はOprDと高い相同性を有することが明らかとなった。
磁気共鳴による集束超音波治療のためのホットスポット追尾自己参照式温度分布画像計測

肝臓のように呼吸によって動く腹腔臓器に対する集束超音波治療とその際の非侵襲温度モニタリングを行なうために磁気共鳴画像化(MRI)を用いた方法を検討した.肝臓門脈の断面像の変位から肝組織の動き・変形を実測し,加温目標点を追尾する方法を提案した.複素磁気共鳴信号の位相から温度分布を求める際の,画像引き算過程を排除した方法(自己参照法)と組み合わせ,肝のMRIガイド下集束超音波治療の要素技術を確立した肝臓のように呼吸によって動く腹腔臓器に対する集束超音波治療とその際の非侵襲温度モニタリングを行なうために磁気共鳴画像化(MRI)を用いた方法を検討した.肝臓門脈の断面像の変位から肝組織の動き・変形を実測し,加温目標点を追尾する方法を提案した.複素磁気共鳴信号の位相から温度分布を求める際の,画像引き算過程を排除した方法(自己参照法)と組み合わせ,肝のMRIガイド下集束超音波治療の要素技術を確立した本年度は対象を肝臓として,(1)臓器の呼吸性の移動・変形の解明,(2)k空間トラジェクトリの最適化,(3)ステレオスコピックイメージングによるホットスポット位置の計測,(4)ホットスポットの動き予測による撮像位置の切り替え,及び(5)自己参照型温度分布画像化法の最適化,の5項目を進めた.(1)では肝臓内の静脈をランドマークとすれば,臓器の移動・変形量の測定,ならびに加温対象点の決定が可能であることを明らかにした.健常ボランティアに対して矢状面の撮像を行い,最低3本の静脈の断面の重心を求め,それらの位置を追尾した.この結果,肝の呼吸性移動は頭尾及び腹背方向に各々21mm及び6mm程度であるとともに,最大3mm程度の伸縮と,40°程度の回転をしていることがわかった.静脈重心位置から加温目標点を決定した場合の誤差が±2mm程度であることが明らかになった(業績論文4件目).(2)については最近のマルチコイル同時受信による撮像の高速化から平面状の撮像トラジェクトリでも200ms/枚以上の撮像ができ,呼吸性移動に対する追尾能力を有していることが分かった.(5)では加温前の参照画像を必要としない自己参照型温度分布画像化法に関する詳細な検討を行い,加温点を含む関心領域及び関心領域内の加温前信号分布を推定するための領域,の大きさと数の最適値,推定に用いる信号の最適属性,信号分布のモデル関数(有理式)の最適次数などを決定する指針を得た(業績論文1・3件目).その指針を適用することによって,参照画像を使用した場合と同等の温度分布計測能力を有することを明らかにした(業績論文1・2件目).以上を受けて,現在(3)及び(4)に関して,シーケンスプログラムと装置への実装を進めている状況である.ソフトウエア開発環境の整備に時間を要したため結果がまだである,H19年度より重点的に進めてゆく所存である.(1)加温目標点(ホットスポット)予測血管像の重心の相対変位に基づく加温目標点追尾法を拡張した,動き予測法を検討した.加温前に被験者の肝臓の動きを様々な呼吸周期・深度において数分間撮像し,画像セットを得た.ある時点における3つ以上の血管重心から加温目標点を求めると同時に,それら血管の相対位置と最も近い血管分布を有した画像を画像セットから検索し,その後の血管の動きは画像セットにおける当該画像の後の画像における動きと類似すると考えて,1.2秒先までの動きを予測した.3名の健常ボランティアに対して,実験を行なった結果,予測誤差は1-3mmであることがわかった.このことは加温目標点追尾から集束超音波加温装置の焦点位置移動までに時間遅れが存在してもそれを補償しうることを意味し,本研究の成果として重要なものとなった.(2)加温点追尾と温度撮像の切り替えこれまで検討・開発してきた「自己参照型温度分布画像化法」,「血管変位に注目した加温点追尾」に加えて上述の「加温点動き予測」の処理を実施するソフトウエアを作製すると共に,加温点追尾と温度計測を交互に行なうための撮像シーケンスをプログラムした.現在引き続き動作試験を行なっている.(3)脂肪組織の温度分布画像化法メチレン・メチルプロトンの縦ならびに横緩和時間の温度依存性を詳細に検討し,オリーブオイルファントムにおいて縦緩和時間の温度係数が両成分に対して34.0及び73.9[ms/°C],横緩和時間のそれらが23.9及び44.2[ms/°C]のように異なることを見出した.この結果に基づいてシミュレーションを行い,メチレン・メチルの混合信号に基づいて温度を推定すると,メチレンのみを分離検出して温度を推定した場合に較べて,誤差が増大すること,したがって脂肪温度の正確な定量のためには両者を分離しなくてはならないことを見出した.(1)臓器の面外運動への対応:3次元臓器動に対応するため面外変位を捉える方法を開発した.まずBalanced SSFP法により門脈血管構造の3次元分布を撮像した。血管分岐点付近に着目し,局所組織の圧縮・変形が無視できると仮定した上で,矢状面における分岐点付近の血管断面重心の変位が,組織の左右方向への移動に依るものとして動きを定量した.

矢状面内の変位の左右方向の変位への射影には対象血管と矢状面のなす角を使った.本法の有用性を示すため1.5T-MRIを用い,人工血管モデルならびに健常ボランティア実験を行なった.これらの結果,面外運動を定量することができると共に,加温目標位置の3次元追尾が可能であることが示された.(2)血管像と温度分布の交互撮像を行なうシーケンスの開発:血管像変位計測にBalancedSSFP法,温度分布計測にはSPGR法を利用し,両者を交互撮像するシーケンスの開発・実装を目指した.設計ならびに効果の数値シミュレーションは行なえたが,施設のMRI装置とコンパイル環境のバージョン整合の問題が生じ,コンパイル環境の整備が遅れたため実装はまだ完成していない.この点については引き続き完成を目指して研究作業を続ける.(3)脂肪組織の温度分布画像化法:(2)の作業が遅れたため,本研究の派生・応用として先に,乳がん集束超音波治療で問題となる組織変形と脂肪組織温度計測技術を検討した.後者に対してはウシならびにブタ摘出脂肪の脂肪酸成分を11T-NMR分光器により分離検出し,プロトン共鳴周波数,振幅,T_1,T_2の温度依存性を調べた.脂肪酸成分のうち,最も大きなメチレン信号におけるT1及びT2の温度係数が,同じく2番目に大きなメチル信号のそれらと著しく異なる(T_1,T_2共に約半分程度)であることを見出し温度分布定量画像化のためにはメチレン信号の分離抽出が有用であることを示した.
NADPHオキシダーゼ活性の可視化による植物免疫機構の解明

急激な活性酸素種(ROS)は、植物免疫応答に重要はシグナルとして機能する。植物のNADPHオキシダーゼであるRBOHのN末端側が、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)により直接リン酸化されて活性化される。本研究では、RBOHのリン酸化動態を可視化するバイオセンサーを作製し、病原菌が感染した細胞でRBOH活性を時空間的に観察することを目的とした。本センサーは、リン酸化に応答して蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように設計されている。センサー構造の最適化を試みたが、FRETに基づく十分な蛍光強度が得られなかった。植物は病原菌の攻撃に応答して急激な活性酸素種(ROS)の生成を引き起こす。この反応はROSバーストと呼ばれ、植物免疫反応において重要な役割を果たすことが知られている。ROSバーストは、原形質膜に存在するNADPHオキシダーゼであるRBOH (respiratory burst oxidase homolog)によって引き起こされる。これまでに、RBOHは、転写レベルに加え、翻訳後修飾により活性調節されることが知られていた。申請者は、RBOHのN末端側領域のセリンが、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)によって直接リン酸化されて活性化されることを発見した。しかし、生体内におけるRBOHの活性化を実際に観察した例はない。本研究では、RBOHの活性化状態の動態を観察できるイメージングシステムを構築し、新たなシグナルネットワークの発掘を可能にする先駆的モデルを提示することを目的とした。本年度は、バイナリーベクターにエフェクターとして恒常活性型変異体CDPK5-CAまたは非活性型のCDPK5-CA-K/Mを35Sプロモーターの下流に挿入した。さらに、RBOHB由来のN末端側断片、RBOHB認識ドメイン、そして2種類の蛍光タンパク質として、mVenus (YFP)とmCerulean (CFP)を連結したコンストラクトをもう一つの35Sプロモーターの下流に挿入した。以上のように、FRETコンストラクトの基本構造を構築した。植物は、病原菌の攻撃に応答して急激な活性酸素種(ROS)の生成を引き起こす。この免疫反応はROSバーストと呼ばれ、過敏感反応において重要な役割を果たすことが知られている。ROSバーストは、主にNADPHオキシダーゼであるRBOH (respiratory burst oxidase homolog)によって引き起こされる。これまでに、RBOHのN末端側が、カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)により直接リン酸化されて活性化されることを見出した。本研究では、RBOHのリン酸化状態の動態を可視化するバイオセンサー(RBOHセンサー)を作製し、病原菌が感染した細胞でRBOH活性を時空間的に観察することで、ROSの新たなシグナルネットワークの発掘を可能にする先駆的モデルを提示することを目的とした。本RBOHセンサーは、CDPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起こるように構成されている。蛍光タンパク質であるmVenus (YFP)とmCerulean (CFP)によるFRETの強度は、YFPとCFP間の距離と角度が重要であり、RBOHのリン酸化に依存して生体内で理想的な配置をとる構造を模索する必要がある。そこで、平成26年度は、サイズの異なる様々なRBOHBのN末端断片を調製し、FRETコンストラクトに導入して蛍光強度の最適化を図った。FRET強度比(ON/OFF)については、1.3以上であることが実用レベルのセンサーの目安とされる。しかしながら、今回この数値を上回る蛍光強度は得られなかった。植物免疫学本年度は、バイナリーベクターにエフェクター、およびFRETコンストラクトを作製し、植物葉に一過的に発現させることによって、FRETコンストラクト内のRBOHBのN末端側断片がリン酸化されることを確認した。この結果は、FRETコンストラクト内のRBOHがCDPK活性によってリン酸化されることを示している。このように、構築したFRETコンストラクトが組織内で機能することが示された。蛍光タンパク質であるmVenus (YFP)とmCerulean (CFP)によるFRETの強度は、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であることが知られている。より安定した高感度な蛍光を得るには、生体内で2種の蛍光タンパク質が理想的な配置をとるパターンを探索する必要がある。そこで、来年度はサイズの異なる様々なRBOHBのN末端断片を調製し、FRETコンストラクトに導入し、蛍光強度の最適化を図る予定である。