hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
樹状細胞サブセットによる免疫制御機構の解明

これまでCTB自身が炎症性サイトカイン産生誘導能を持つかどうか、組織に常在する細胞に作用するかどうかよくわかっていなかったが、本研究により、CTB自身が生理的に存在するマクロファージに作用して免疫アジュバント活性を示すことが明らかになった。いくつか新たに遺伝子改変マウスを作成する必要が生じたが、それらの作成、解析も順調に進めることができた。コレラ毒素に対する樹状細胞、マクロファージの応答機構を解析する過程で新たな知見が得られたことも今後の発展につながることが期待される。これまでに得られた遺伝子改変マウスはユニークな実験系であり、国内、国外で様々な共同研究のリクエストに応じ、その成果が蓄積されつつあり、当研究室での知見との相乗効果が期待される状況にある。XCR1+DCが制御する腸管免疫の制御機構の解明を進める。XCR1+DC優位に発現する機能分子群の選別を進め、遺伝子改変マウスの作成、解析を進める。また、XCR1+DCを誘導的あるいは恒常的に欠失するマウスを用いて、腸炎モデルばかりでなく、様々な発がんモデルの解析を進め、XCR1+DCの新たな機能的意義の解明を進める。得られた知見の解析を進め、学会発表、論文発表、メディア発表などにより成果を広く発信する。XCR1+DC優位に発現する機能分子群の選別を進め、遺伝子改変マウスを作成、解析を進める。これらのマウス、および、XCR1+DCを誘導的あるいは恒常的に欠失するマウスを用いて、様々な疾患モデルの解析を行い、XCR1+DCの機能的意義、XCR1+DCによる免疫制御機構を明らかにする。また、コレラ毒素によるIL-1β産生誘導機構に関して興味深い知見が得られており、今後その機構の詳細に関しても解析を進める。
異種分散データベース環境におけるエージェント機構の研究

異種分散データベース、特に、半構造データベースに対する検索についての研究は各種行われているが、実際に運用するための検討が少なかった。本研究では、主に分子生物学分野のデータベースを素材として、エージェントを用いた通信方式や、実際の利用環境についての研究を行った。分子生物学のデータベースとして、利用頻度の高い4つのデータベース(Genbank, Prosite, PIR,およびPDB)を対象として選び、それぞれのファイルを研究部門内の複数の計算機上に配置して、各データベースに専用のエージェントを置き、これまでに作成してきたプログラムを利用して、XML形式のインターフェイスを持つエージェントを作成した。これらのデータベースにアクセスするエージェントはJavaアプレットで作成し、利用者はWebを用いて検索できるようにしている。エージェント間のオブジェクト通信には、HORBオブジェクトを用いている。また、エージェントが各データベースを移動しながら、必要な情報を効率的に得るための仕組みとして、IBM社によって開発されたエージェントシステムであるagletsについて検討を進めた。さらに、この基本メカニズムの応用として、教育環境において各ノートPCに存在する学習データを収集して、教育のために利用する基礎検討を進めた。分子生物学分野のデータベースとして利用頻度の高い4つのデータベース(Genbank,Swiss-Prot,PIR,PDB)を対象として選び、それぞれのファイルを研究室の複数の計算機に分散配置している。各ファイルの検索には、それぞれ専用のエージェントを置き、エージェント間の通信の形式はHTML形式を用いるよう設計しているところである。通信内容としては、一部のデータに記録されているデータベース間のクロスレファレンス情報だけでなく、データの内容としてエージェント同士の振る舞いを記録するデータを持たせるように考えている。現在、エージェントの制御方式について検討しているところであり、制御のための簡易言語も合わせて設計を進めている。一方、エージェントはクライアント側とサーバ側に分けているので、それらの間の通信プロトコルに関して各種の実装例の調査を進めてきた。サーバエージェントには、データベースの検索系との通信をする必要があるが、検索系の実装およびその通信プロトコルの実装についてはまだ作業途中であり、平成13年度に継続して進める予定である。
新規リン脂質輸送タンパク質の分子機構の解明とその破綻と疾患

ミトコンドリアはホスファチジルコリン(PC)を主要成分とするリン脂質二重膜で区画化されている。しかし、ミトコンドリアにはPCを合成する酵素が存在していないため、PCは脂質合成器官である小胞体から供給されなければならない。これまで申請者はミトコンドリアにPCを輸送すると考えられる新規輸送タンパク質STARD7を見出し、ミトコンドリアのPC保持や健全性維持に必須であることを報告した。今年度は骨格筋分化におけるSTARD7の役割を解明するため、マウス筋芽細胞株C2C12細胞やヒト初代筋芽細胞のSTARD7を欠損し、筋分化が受ける影響を解析した。STARD7の細胞内局在を免疫蛍光染色で解析したところ、細胞質、ミトコンドリア内部、ミトコンドリア外膜外葉に局在していた。STARD7を欠損したC2C12細胞(KO細胞)をゲノム編集で樹立し、さらにSTARD7を再発現したレスキュー細胞(RES細胞)を樹立した。パーコール/ナイコデンツの密度勾配によりミトコンドリアを単離し、LC-MS/MSで解析した結果、KO細胞では野生型と比べてPCの量が有意に低下していた。ミトコンドリアの酸素消費速度をフラックスアナライザーを用いて解析したところ、KO細胞では野生型よりも有意に低下していた。以上の結果から、以前報告したHEPA-1細胞と同様に、C2C12細胞においてもSTARD7はミトコンドリアの恒常性に重要であることがわかった。筋分化を誘導したところ、KO細胞では筋管繊維の形成が著しく阻害された。同時にMHCやMyogeninなどの分化マーカーの発現が有意に低下していた。これら筋分化障害は、RES細胞ではほぼ完全に回復されていた。ヒト初代筋芽細胞のSTARD7をノックダウンしても同様な筋分化障害が見られた。以上からSTARD7は骨格筋分化において必須の役割を有することが示唆された。昨年度、共同研究の申し込みがあり、そちらを優先させる必要があったので予定よりも研究が遅れた。しかし、上記の様にSTARD7を欠損した筋芽細胞を樹立し、この細胞を用いて筋分化における役割を明らかに出来ている。現在、論文投稿の準備中を進めているとともに、マウスを用いた実験の準備を進めている。これまでの培養細胞を用いた研究により、STARD7は骨格筋分化において重要であることがわかってきた。今後はマウスを用いた個体レベルでの解析を進める。具体的には、IMPCからfloxマウス、ジャクソン研究所からCreマウスの凍結胚または凍結精子を取り寄せ、個体作製後、両者を掛け合わせて骨格筋特異的なSTARD7のノックアウトマウスを作製する予定である。また、STARD7のミトコンドリアにおける輸送機構をさらに詳細に解析するために、先端バイオイメージング支援プラットフォーム(ABiS)による研究支援のもと免疫電子顕微鏡でSTARD7のミトコンドリアにおける詳細な分布について共同研究を進めている。ミトコンドリアはリン脂質を主成分とする膜構造によってコンパートメント化されている。ミトコンドリアの膜リン脂質でもっとも含量が多いのはホスファチジルコリン(PC)である。しかし、ミトコンドリア自身はPCを生合成できないため、小胞体などのリン脂質合成器官からPCが供給される必要がある。これまで申請者は、PCをミトコンドリアへ輸送する新規タンパク質StarD7を先駆けて発見し、本タンパク質がミトコンドリアの正常な機能や形態形成に必須であることを見いだしてきた。しかし、StarD7によるPC輸送の分子機構についてはほとんど分かっていない。本年度ではこの課題について研究を行った。以前、マウス肝臓から単離したミトコンドリアにおいてStarD7の局在をプロテアーゼ感受性試験で解析したところ、ミトコンドリア外膜にあることが示唆されていた。今回、マウス肝癌由来の細胞株Hepa-1細胞を用い、プロテアーゼ感受性試験、アルカリ抽出試験、膜貫通領域を欠いた変異StarD7等を用い、ミトコンドリアにおける本タンパク質の局在を解析した。その結果、本タンパク質はN末端側に存在する膜貫通領域を介してミトコンドリアの外膜に局在することが示唆された。さらにミトコンドリアと小胞体の接触部位に局在するとされるmitofusin-2とも一部局在が重なることが蛍光免疫細胞染色で示された。以上から、StarD7はミトコンドリアと小胞体との接触領域においてPCを両オルガネラ間で交換輸送している可能性が示唆された。上記の様に今年度はミトコンドリアにおけるStarD7の局在を明らかにし、本タンパク質よるPC輸送の分子機構についての一端を解明できた。以上の成果は論文に掲載されたので、概ね順調に進んでいると言える。また次年度での解析で用いるStarD7をノックアウトした幾つかの細胞株も樹立できている。今後はこれらの細胞を用い、本タンパク質の細胞機能について明らかにして行きたい。

STARD7の細胞内局在を免疫蛍光染色で解析したところ、細胞質、ミトコンドリア内部、ミトコンドリア外膜外葉に局在していた。STARD7を欠損したC2C12細胞(KO細胞)をゲノム編集で樹立し、さらにSTARD7を再発現したレスキュー細胞(RES細胞)を樹立した。パーコール/ナイコデンツの密度勾配によりミトコンドリアを単離し、LC-MS/MSで解析した結果、KO細胞では野生型と比べてPCの量が有意に低下していた。ミトコンドリアの酸素消費速度をフラックスアナライザーを用いて解析したところ、KO細胞では野生型よりも有意に低下していた。以上の結果から、以前報告したHEPA-1細胞と同様に、C2C12細胞においてもSTARD7はミトコンドリアの恒常性に重要であることがわかった。筋分化を誘導したところ、KO細胞では筋管繊維の形成が著しく阻害された。同時にMHCやMyogeninなどの分化マーカーの発現が有意に低下していた。これら筋分化障害は、RES細胞ではほぼ完全に回復されていた。ヒト初代筋芽細胞のSTARD7をノックダウンしても同様な筋分化障害が見られた。以上からSTARD7は骨格筋分化において必須の役割を有することが示唆された。昨年度、共同研究の申し込みがあり、そちらを優先させる必要があったので予定よりも研究が遅れた。しかし、上記の様にSTARD7を欠損した筋芽細胞を樹立し、この細胞を用いて筋分化における役割を明らかに出来ている。現在、論文投稿の準備中を進めているとともに、マウスを用いた実験の準備を進めている。平成30年度は、当初の研究計画通りに骨格筋または脳神経系でのStarD7の機能解析について取り掛かる予定である。一方、以下のように研究計画当初にはなかった新しい課題が生じており、これも並行して行う予定である。最近、HEK293細胞において本タンパク質はミトコンドリア内膜のプロテアーゼでプロセシングを受け、外膜と内膜の間に局在することが他のグループから報告された。さらに同グループは本タンパク質が両膜間でPCを交換輸送するというモデルを提案した。現在、この報告の再現性を解析し、Hepa-1細胞の結果と比較しているが、HEK293とHepa-1細胞では本タンパク質のミトコンドリアでの局在が異なることがわかりつつある。この点についてさらに検討する予定である。これまでの培養細胞を用いた研究により、STARD7は骨格筋分化において重要であることがわかってきた。今後はマウスを用いた個体レベルでの解析を進める。具体的には、IMPCからfloxマウス、ジャクソン研究所からCreマウスの凍結胚または凍結精子を取り寄せ、個体作製後、両者を掛け合わせて骨格筋特異的なSTARD7のノックアウトマウスを作製する予定である。また、STARD7のミトコンドリアにおける輸送機構をさらに詳細に解析するために、先端バイオイメージング支援プラットフォーム(ABiS)による研究支援のもと免疫電子顕微鏡でSTARD7のミトコンドリアにおける詳細な分布について共同研究を進めている。
間葉系幹細胞を応用した新規免疫学的口腔がん治療法の開発

近年のがん治療は「手術療法」「化学療法」「放射線療法」に加えて、免疫細胞の制御を応用した「免疫療法」が目覚ましい発展をとげている。がんの形成・進展には免疫細胞・間質細胞など周囲微小環境が重要である。間葉系幹細胞(MSCs)は優れた免疫調節能を発揮し、腫瘍集積性や低免疫原性の特徴を有している。本研究ではMSCsの免疫調節能とがん組織の免疫抑制機構に着目し、「MSCsを基盤とした新しい抗腫瘍治療の開発」を目的とする。
スマート眼底画像解析システムの総合的実証研究と実用化

網膜は「人体の中で唯一,外部から直接生体内をうかがうことのできる窓」である.また,眼と脳は発生学的には同一器官であり,網膜血管の状態から脳内血管の状態を推測することができる.本研究では,脳内の血管障害を早期に発見,診断を可能とするスクリーニング・システムとして,網膜血管に対する動脈硬化の診断支援システムの実用化を図る.実用化に当たり,核となる要素技術は既に我々自身で独自に開発済であり,本研究課題では,それらの統合と実用化に向けた実証研究を行う.網膜は「人体の中で唯一,外部から直接生体内をうかがうことのできる窓」である.また,眼と脳は発生学的には同一器官であり,網膜血管の状態から脳内血管の状態を推測することができる.本研究では,脳内の血管障害を早期に発見,診断を可能とするスクリーニング・システムとして,網膜血管に対する動脈硬化の診断支援システムの実用化を図る.実用化に当たり,核となる要素技術は既に我々自身で独自に開発済であり,本研究課題では,それらの統合と実用化に向けた実証研究を行う.
核ゲノム及び葉緑体ゲノムにコードされたタンパク質の協調したチラコイド移行の解析

葉緑体の光合成機能発現の中心的プロセスは,核あるいは葉緑体ゲノムにコードされた光合成に関わるタンパク質の協調したチラコイド移行である。本研究では,まずタンパク質のチラコイド移行経路のうち,Sec依存型経路とΔpH依存型経路が,共通の膜透過チャネルを利用している可能性について検討した。チラコイド膜をスパンする形で膜透過反応が停止した中間体を生成することによりΔpH依存型経路を飽和したところ,ΔpH依存型経路の基質であるi23Kのチラコイドへの取り込みは阻害されたが,Sec依存型経路の基質であるi33Kのチラコイドへの取り込みは,全く阻害されなかった。したがってSec依存型経路とΔpH依存型経路は,異なる膜透過チャネルを使用しているものと考えられる。チラコイドへのタンパク質移行に関わるSec依存型経路とΔpH依存型経路は完全に独立しているのか,あるいは膜透過チャネルは共通して利用しているのかが,大きな問題であったが,今回の結果はこの問題に決着をつけるものである。大腸菌のSecYの場合と同様,葉緑体SecYもSecAやSecEなどとチラコイド膜上で膜透過装置複合体を形成していることが期待されるが,この仮想的SecY複合体の実体は明らかでない。そこで,シロイヌナズナSecE遺伝子をクローニングし,塩基配列を決定した。in vitroで合成したSecE前駆体は,単離葉緑体に効率よく取り込まれ、葉緑体内でプロセシングを受けて成熟体となった。オルガネラ分画等の結果,成熟体SecEはチラコイド膜に内在性膜タンパク質として組込まれたことが分かった。シロイヌナズナSecEに対する抗体を用いた抗体染色により、エンドウ葉緑体のチラコイドにもSecEが存在することが明らかになった。
アルコール・脂肪代謝とイオン輸送障害からみたアルコール性膵炎の発症機序の研究

1.慢性膵炎患者のCFTR遺伝子変異および多型(TG repeats、poly T、M470V、Q1352H、R1453W)を解析した。嚢胞線維症原因遺伝子変異は見られなかった。アルコール性慢性膵炎では、CFTRの蛋白量が減少する(TG)12ホモ接合体の頻度が高かった。特発性慢性膵炎では、CFTR機能が低下するV470ホモ接合体にQ1352HまたはR1453W多型を合併する頻度が高かった。2.CFTRのCl^-チャネル機能を測定するために、汗中Cl^-濃度の測定法を開発した。片側の拇指球の自然発汗率をデジタル発汗計で測定し、対側の拇指球より100μlの蒸留水中に溶け出た汗を採取した。汗のCl^-量を、キャピラリー電気泳動法あるいは精密Cl^-電極により測定し、対側の発汗量で除して、汗のCl^-濃度を求めた。慢性膵炎患者では汗のCl^-濃度が有意に高かった。3.嚢胞線維症のモデル動物であるΔFマウスの膵臓から小葉間膵管を単離し、膵液のpH(HCO_3^-濃度)に影響を与える可能性のある管腔膜上のNa^+-H^+ exchange(NHE)活性を測定した。ΔFマウスでは、NHE活性が高まっていることがわかった。膵液のpH低下に関与している可能性がある。4.モルモットの膵臓から単離した小葉間膵管を用いて、溶液分泌と細胞内Ca^<2+>濃度に対するethanolの影響を調べ、他の短鎖アルコール(methanol、propanol、butanol)と比較した。methanolとethanolは、セクレチン刺激下で細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、溶液分泌を増加させた。propanolとbutanolは、逆に、細胞内Ca^<2+>濃度を低下させ、溶液分泌を抑制した。"cut-off effect"が見られたことから、アルコールは膵導管細胞のイオンチャネルに直接作用する可能性が高いことがわかった。日本人の慢性膵炎患者における遺伝的背景を調べるために、CFTR遺伝子変異および多型(TG repeats、poly T、M470V、Q1352H、R1453W)を解析した。健常人162人、アルコール性慢性膵炎患者51人、特発性慢性膵炎患者14人を対象とし、インフォームドコンセントを得た後、末梢血からDNAを抽出した。欧米および日本で報告されている29の嚢胞線維症原因遺伝子変異は見られなかった。poly Tの分布に有意な差は認められなかった。アルコール性慢性膵炎では、CFTRの蛋白量が減少する(TG)12ホモ接合体の頻度が健常群に比べて有意に高かった。日本人の慢性膵炎の発症にCFTR遺伝子の多型が関与している可能性が示された。また、アルコールが膵導管細胞のイオン・水輸送に影響を及ぼすのではないかとの仮説をもとに、モルモット単離小葉間膵管からの水分泌に及ぼすエタノールの影響を検討した。

エタノールは1mM(ビール150ml程度の飲酒後の血中濃度に相当)という低濃度で、セクレチン刺激下の水分泌を可逆的に約70%増加させた。神経細胞以外で低濃度のアルコールの生理機能への影響をとらえた初めての研究である。通常の飲酒によって膵液の過分泌が起こっていることを示唆しており、何らかの膵液の流出障害がある場合には膵管内圧の上昇をまねき、膵障害を引き起こす可能性があることを示した。慢性膵炎患者のCFTR遺伝子変異および多型(TG repeats、polyT、M470V、Q1352H、R1453W)を解析した。欧米および日本で報告されている29の嚢胞線維症原因遺伝子変異は見られなかった。アルコール性慢性膵炎では、CFTRの蛋白量が減少する(TG)12ホモ接合体の頻度が健常群に比べて有意に高かった。特発性慢性膵炎では、CFTR機能が低下するV470ホモ接合体にQl352HまたはRl453W多型を合併する頻度が高かった。CFTRのCl^-チャネル機能を測定するために、汗中Cl^-濃度の簡便な測定法を開発した。片側の拇指球の自然発汗率をデジタル発汗計で測定し、対側の拇指球より100μlの蒸留水中に溶け出た汗を採取した。溶液中の汗の測定のCl^-量をキャピラリー電気泳動法により測定し、対側の発汗量で除して、汗のCl^-濃度を求めた。慢性膵炎患者では健常人に比べて汗のCl^-濃度が有意に高かった。日本人の慢性膵炎の発症にCFTR遺伝子の多型が関与している可能性が示された。アルコールが膵導管細胞機能に与える影響を検討するために、モルモットの膵臓から単離した小葉間膵管を用いて、溶液分泌と細胞内Ca^<2+>濃度に対するethanolの影響を調べ、他の短鎖アルコール(methanol、propanol、butanol)と比較した。methanolとethanolは、セクレチン刺激下で細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、溶液分泌を増加させた。propanolとbutanolは、逆に、細胞内Ca^<2+>濃度を低下させ、溶液分泌を抑制した。このように、"cut-off effect"が見られたことから、アルコールは膵導管細胞のイオンチャネルに直接作用する可能性が高いことがわかった。1.cystic fibrosisは日本人では非常に稀な疾患であるが、その原因遺伝子であるCFTRの変異・多型は日本人の慢性膵炎の発症に関与している。CFTRのCl^-チャネル機能は、汗中Cl^-濃度を測定することにより評価することができる。すでに、拇指球より採取した汗のCl^-含量をキャピラリー電気泳動法により測定する方法を発表しているが、本年度は、精密Cl^-電極を用いてより安価に測定する方法を考案した。3.アルコールが膵導管細胞機能に与える影響を検討するために、モルモットの膵臓から単離した小葉間膵管を用いて、溶液分泌と細胞内Ca^<2+>濃度に対するethanolの影響を調べ、他の短鎖アルコール(methanol、propanol、butanol)と比較した。
フォトクロミックスピンカップラーの複合化による多機能スピンシステムの創製

スイッチングユニットをオリゴマーの中央に配置し、外側にスイッチ部分をつなげる設計をとった新しいON-OFF逆転系の分子について検討を行った。これらの分子では、開環体では共役がつながっているためにラジカル間の磁気的相互作用の強いON状態を取っているが、閉環することにより共役がsp3炭素により切れ、相互作用の弱いOFF状態を取ることが期待される。フォトクロミック反応に伴うESRスペクトル変化を測定したところ、開環体では2つのイミノニトロキシド間に超微細構造定数より大きい交換相互作用が観測されたのに対して、閉環体ではsp3炭素によってπ共役が切断されているために、交換相互作用は観測されずに、孤立した2つのイミノニトロキシドのESRスペクトルを示した。線形のシミュレーションから見積もったスイッング効率は150倍以上であった。次に、ジアリールエテンと金微粒子からなるネットワークにおける光反応性および電気伝導性の光スイッチングについて検討した。両方にチオール基が付いた分子で金微粒子ネットワークを形成させ、櫛型電極の上において電導性の光スイッチングを試みた。その結果、電導性は紫外光の照射とともに増加し、可視光の照射で減少した。可視光での電導性の現象は非常に遅いという問題があることも分かった。この際のスイッチングは5倍程度であった。可視光での開環反応の効率を上げるために、開環反応量子収率が以前のものと比べて20倍大きい分子を選び、同様の実験を行った。その結果、完全に可逆なスイッチング挙動が確認された。また25倍のスイッチングが確認された。これは、磁性交換相互作用のスイッチングに中心的な役割を果たしたπ共役系の組み換えが電気伝導にも有効に働いていることを示しており、情報伝達のスイッチングとして一般性を有していることを意味する。ジアリールエテンは熱不可逆、高い繰り返し耐久性などの特徴を持つフォトクロミック化合物である。ジアリールエテンは光異性化反応により、吸収スペクトルのみでなく様々な物理的、化学的物性が変化する。これまでに我々はジアリールエテンの開環体と閉環体とでのπ共役の結合様式の違いを利用した、ジアリールエテンの両端に配置した2つの有機ラジカル間の磁気的相互作用の光スイッチングについて報告してきた。有機ラジカルとしてニトロニルニトロキシドを、金属への配位結合サイトとして1,10-フェナントロリンを分子の両端にそれぞれ1つずつ有するジアリールエテン誘導体1aを合成した。1aとヘキサフルオロアセチルアセトナト銅とを混合し、錯体を合成した。トルエン中での紫外/可視吸収およびESRスペクトルの光応答挙動を調べた。錯体はトルエン溶液中において366nm光と578nm光によって可逆なフォトクロミズムを示した。室温、トルエン溶液におけるESR測定を行なった結果、開環体ではニトロキシドラジカルと2価の銅のシグナルが独立に存在しているシグナルが得られたのに対し、紫外光照射して得られた閉環体ではラジカルと2価の銅の相互作用を示すシグナルが得られた。このことは開環体では、交換相互作用が超微細構造定数より小さく、閉環体では交換相互作用が、g値の差より大きいことを意味する。この錯体分子ではラジカルと銅の間のスピン交換相互作用の大きさが光により160倍以上可逆に変化する事が明らかとなった。

これらの分子では、開環体では共役がつながっているためにラジカル間の磁気的相互作用の強いON状態を取っているが、閉環することにより共役がsp^3炭素により切れ、相互作用の弱いOFF状態を取ることが期待される。合成した分子の光反応性について調べたところ、これらの光反応性は分子構造によって顕著な違いを示すことが明らかとなった。2つのニトロニルニトロキシドを両端のベンゼン環のパラ位で置換したものでは、紫外光照射時の変換率が非常に低かったのに対してベンゼン環のメタ位に置換したものでは58%であった。反応点のメチル基をメトキシ基で置き換えたものでは変換率は82%まで向上した。これは、メトキシ置換することで、開環反応の量子収率が抑えられたために変換率が高くなったためと考えられる。フォトクロミック反応に伴うESRスペクトル変化を測定した。開環体では2つのイミノニトロキシド間に超微細構造定数より大きい交換相互作用が観測されたのに対して、閉環体ではsp^3炭素によってπ共役が切断されているために、交換相互作用は観測されずに、孤立した2つのイミノニトロキシドのESRスペクトルを示した。線形のシミュレーションから見積もったスイッチング効率は150倍以上であった。ジアリールエテンの光反応性については数多くの研究例があるが、その電気化学的挙動についてはいくつかの例があるに過ぎなかった。最近、我々はある種のジアリールエテンが電気化学的な酸化により異性化反応することを見出し、その反応機構の検討をすすめた。電気化学的および化学的酸化により閉環反応が進行する化合物と、電気化学的酸化により開環反応が進行する化合物があり、同時に両方の性質を持つものはないことが明らかとなった。また、開環反応は連鎖的に進行することも明らかとなった。これらの反応性の違いを明らかにする目的で、カチオンラジカル状態の開環体と閉環体のエネルギー差をDFT計算(B3LYP/6-31G*)により求めたところ、カチオンラジカル状態で、開環体の方が安定な場合は電気化学的開環反応が、閉環体の方が安定な場合には電気化学的閉環反応が進行することが明らかとなった。また、このことは以前に報告されていた分子においても成り立つことが明らかとなった。このことは、電気化学開環反応と電気化学的閉環反応が、一般的に起こり、さらにこの2つが相補的であることを示唆している。得られたエネルギーダイヤグラムにより、開環反応は連鎖的に進むことが合理的に説明できる。酸化による開環、閉環反応は回折限界による制限を受ける光反応に比べて微小領域で反応を進行させることが出来るため、スイッチング分子を分子エレクトロニクスへ応用することを考えた場合、理想的な反応であると言える。ジアリールエテンと金微粒子からなるネットワークにおける光反応性および電気伝導性の光スイッチングについて検討した。アルキル基のスペーサーを持つジアリールエテンで被覆された金微粒子でのフォトクロミック反応は以前に確かめていたが、本研究では、余分な抵抗をなくすためにπ共役部分に直接チオール基の付いた化合物を合成した。片方だけにチオール基が付いた分子で被覆された金微粒子では、アルキル基のスペーサーがある分子に比べて反応速度の低下は認められたが、フォトクロミック反応は進行した。また、その際に閉環体の吸収極大波長は、フリーなジアリールエテンに比べて30nm程度の長波長化が認められた。
興奮性アミノ酸による神経細胞壊死の分子機構

様々な神経疾患に認められる神経細胞の変性、壊死の原因の一つとして、グルタミン酸受容体の異常興奮が考えられている。なかでも高いカルシウムイオンの透過性と電位依存性のマグネシウムイオンによる閉塞という特性を持つNMDA受容体チャネルは、神経細胞壊死の鍵を握る分子と注目されている。我々は、神経細胞壊死の分子機構を明らかにする目的で、このNMDA受容体チャネルを構成し、その機能的多様性を決めるεサブユニットを標的遺伝子組換えによって欠失したマウスを作成し解析をおこなってきた。本年度は、発現が発生初期からから認められ、生後その発現が前脳に限定されてくるε2サブユニットのノックアウトマウスの作成に成功した。この変異マウスは、哺乳反射が消失しており生後すぐに死亡した。しかし、強制栄養による飼育を試みた結果、生後3日以上生存し身体的にも発育するることが明らかになった。ε2サブユニットの欠失により、形態学的に大きな変化は認められなかったが、脳幹三叉神経核に存在するバレレッテ構造が消失していた。さらにこの変異マウス海馬CA1錐体細胞では、生後3日目までNMDA受容体チャネルを介する電流成分が検出されなっかた。また、この領域で生後2-3日頃から低頻度刺激でおこる長期抑圧(LTD)も認められなかった。これらのことから、ε2サブユニットは、生存に必須な分子であること。さらに、幼若期海馬でのNMDA受容体チャネルの構成成分であり、シナプスの可塑性に関係する分子であることが明らかになった。また、ある種の神経細胞終末のシナプス形成に関与することが示唆された。今後、すでに作成しているε1サブユニットのノックアウトおよびε2サブユニットのノックアウトマウスを用いて、NMDA受容体チャネルが神経細胞壊死にはたす役割の解析を個体レベルでおこなう。
生体適合システムを応用した骨トランスポート法による関節形成術の開発

緒言:われわれは、骨延長法の1つである骨トランスポート法を用いて新たな顎関節形成術の動物実験モデルを作成し、形態学的および組織学的な検討を加えた。42羽の白色家兎を用い、顎関節部を除去した後に再度関節機能を有する顎関節を再生させるモデルを開発した。方法:家兎の下顎骨上行枝に水平骨切り術を行い、それより上方の顎関節部分を完全に除去した。そしてその下方でL字型骨切り術を施行し、トランスポートディスクとした。このディスクに開発した骨延長装置を装着した。その後、関節窩に向けて12時間毎に0.45mmの割合で骨トランスポートを行った。組織学的には延長後2週目より24週目まで経時的に、延長部およびトランスポートディスク先端部で関節面を形成する部分の組織を脱灰標本および非脱灰研磨標本を用いて観察した。結果・考察:1.形態学的検討;骨トランスポートにより可動性を有し、元の顎関節の形態に類似した新顎関節が形成された。延長部には軟X線上、延長終了後8週目以降に周囲と同様に骨陰影が認められた。また、移動した骨ディスクの先端には延長終了後2週目より新生骨の不規則な骨陰影が認められた。8週目以降ではこの新生骨は丸みを帯び、元の下顎頭の形態に類似するような形態を呈していた。顎関節部の切除のみで顎関節形成術を施行しなかったコントロール群では、開口障害と下顎の偏位を認めたが、実験群ではこれらは軽度であった。2.組織学的検討;延長部には延長終了後2週目および4週目において、広範囲に軟骨様細胞が認められた。これらは8週目には骨に置換されていた。またトランスポートディスクの先端には骨新生が認められたが、軟骨細胞は出現しなかった。骨の先端部分は膠原線維の被膜により被覆されているのが観察された。以上、骨トランスポート法により可動性を有する顎関節の再建が期待されると考えられた。緒言:本年度われわれは、骨延長法の1つである骨トランスポート法を用いて新たな顎関節形成術の動物実験モデルを作成し、形態学的および組織学的な検討を加えた。方法:家兎の下顎骨上行枝に2cmの水平骨切り術を行い、それより上方の顎関節部分を完全に除去した。そして下方の上行枝および下顎体部にかけL字型骨切り術をさらに施行し、トランスポートディスクとした。このディスクに開発した口腔内埋入型骨延長装置を装着した。結果・考察形態学的検討:同方法により可動性を有し、元の顎関節の形態に類似した新顎関節が形成された。

これらより、今回用いた方法により、可動性を有する顎関節の再建が期待されると示唆された。組織学的検討:現在、延長部およびトランスポートディスク先端部で関節面を形成する部分の組織標本を作製し、検討中である。緒言:われわれは、骨延長法の1つである骨トランスポート法を用いて新たな顎関節形成術の動物実験モデルを作成し、形態学的および組織学的な検討を加えた。42羽の白色家兎を用い、顎関節部を除去した後に再度関節機能を有する顎関節を再生させるモデルを開発した。方法:家兎の下顎骨上行枝に水平骨切り術を行い、それより上方の顎関節部分を完全に除去した。そしてその下方でL字型骨切り術を施行し、トランスポートディスクとした。このディスクに開発した骨延長装置を装着した。その後、関節窩に向けて12時間毎に0.45mmの割合で骨トランスポートを行った。組織学的には延長後2週間目より24週目まで経時的に、延長部およびトランスポートディスク先端部で関節面を形成する部分の組織を脱灰標本および非脱灰研磨標本を用いて観察した。結果・考察:1.形態学的検討;骨トランスポートにより可動性を有し、元の顎関節の形態に類似した新顎関節が形成された。延長部には軟X線上、延長終了後8週目以降に周囲と同様に骨陰影が認められた。また、移動した骨ディスクの先端には延長終了後2週目より新生骨の不規則な骨陰影が認められた。8週目以降ではこの新生骨は丸みを帯び、元の下顎頭の形態に類似するような形態を呈していた。顎関節部の切除のみで顎関節形成術を施行しなかったコントロール群では、開口障害と下顎の偏位を認めたが、実験群ではこれらは軽度であった。2.組織学的検討;延長部には延長終了後2週目および4週目において、広範囲に軟骨様細胞が認められた。これらは8週目には骨に置換されていた。またトランスポートディスクの先端には骨新生が認められたが、軟骨細胞は出現しなかった。骨の先端部分は膠原線維の被膜により被覆されているのが観察された。以上、骨トランスポート法により可動性を有する顎関節の再建が期待されると考えられた。
脳の中の顔プローブ:非言語性コミュニケーションの神経基盤

顔はヒトにとって特別な存在なので特化した顔中枢ができたのか(domain specific)、それとも顔はいつも見慣れているから中枢ができたのか(expertise)、結論は出ていない。以下の3つの実験課題を用いてsubliminal(識閾下)からvisual awareness(視覚的気付き)に関連した脳の中の顔プローブ(顔の特殊性を指し示す手がかり)を検討した。解析には128ch高密度脳波計を用い、時空間的な顔認知機構の流れを検討した。1)両眼視野闘争:「ヒトの顔と家」、「ヒトの顔とサル」、「サルの顔と家」を呈示し、「ヒトの顔」、「サルの顔」、「家」の「見え」に気付いた時の反応特性の違いを誘発α振動で検討した。心理実験では「ヒトの顔」>「サルの顔」=「家」という「ヒトの顔」の特殊性が示された。誘発α振動の観察では、「ヒトの顔」に気付いた時に事象関連脱同期を認めた。2)モルフィング顔画像:「サル→ヒトの顔」へのモルフィング画像観察中に「ヒトの顔」の「見え」に気付いた時の脳波γ振動あるいは顔が見えた時点でのERP(N170)を用いて脳内プローブを検討した。N170振幅は、「ヒトの顔」>「モルフィング画像」>「サル」であり、顔の倒立効果は「サル」で認めなかった。以上より、「ヒトの顔」の特殊性が窺えた。3)マスク刺激による先行視覚刺激(識閾下、閾上)の効果:識閾下では、N170は出現しないが、後頭部のN150成分が顔<物体であり、倒立顔ではその効果が消失した。意識に上らなくても、顔認知をしている可能性が示唆され、論文にまとめて報告した。以上より、「ヒトの顔」の特殊性が示されたので、domain specificかどうか更に検討する。顔がヒトにとって特別な刺激であるために特化した顔中枢ができたのか、それとも日常見慣れているために顔中枢ができたのかは結論が出ていない。そこで、種々の実験課題を用いてsubliminal(識閾下)からvisual awareness(視覚的気付き)に関連した脳の中の顔プローブを明らかにする。今年度は両眼視野闘争と顔多義図形に対するプライミング効果を検討した。(1)両眼視野闘争:2つの眼に全く異なるパターンが提示されたとき、通常の立体視のような融像は起こらず、2つのパターンが数秒ごとに交互に知覚される。本研究では、「ヒトの顔と家」、「ヒトの顔とサル」、「サルの顔と家」を呈示し、「ヒトの顔」、「サルの顔」、「家」の「見え」に気付いた時の反応特性の違いを誘発γ振動で検討した。心理実験では、「ヒトの顔」が「サルの顔」、「家」の「見え」よりも多く知覚された。128ch脳波計でγ振動を計測すると左中心部から頭頂部にかけて「ヒトの顔」に対してγ振動が優位に観察された。以上より、「ヒトの顔」の特殊性が示唆された。(2)顔多義図形に対する正と負のプライミング効果:顔と顔以外の身体部位の多義図形(男と女)に対するプライミング効果を検討した。多義図形知覚時には、この解釈可能な複数の見えの状態が時間とともに交替する。この多義図形知覚に対する先行視覚刺激(識閾下、閾上)の効果をERPで検討した。心理実験では、明らかなプライミング効果を認めた。現在、脳波計測のための実験プロトコルを作成中である。
チキソトロピー性セルロースナノファイバーゲルを基盤とした生体組織作製系の創成

標準試料のCNFゲルについて、さまざまな濃度でのレオメーターによるずり応力および粘度の測定を行い、チキソトロピー性を発現しつつ細胞担持能に優れる条件を最適化した。また超音波処理を施しその条件を最適化することで、CNFの凝集抑制と細胞の安定的な分散化を実現した。これら成果により、後述の組織作製の再現性が顕著に向上した。続いて、CNFゲルに導入する細胞密度を最適化し、再現性良くゲルファイバー中で筋管組織および血管組織を作製した。培養21日で形成された筋組織のミオシン重鎖を染色し、全長が少なくとも1.6 cm以上である筋組織の形成が見出された。また、筋管組織が同一方向に配向して束構造を形成していることも確認し、筋管の平均サイズ(長さ、直径、密度)を定量的に算出した。一方で、繊維長が短いCNFの3次元培養場では筋管の形成はほとんど起こらず、CNF分子の長さが組織形成に大きな影響を与えるとの知見を得た。この機構解析のため、ゲルファイバー中のCNFの状態を走査型電子顕微鏡(SEM)により直接観察する手法を開発し、CNFはゲルファイバーの長軸方向に配向した構造となっており、一部は束状構造を形成していることが解明できた。これらの結果より、細胞がCNFの配向を認識して配向・融合し筋管形成していることが強く示唆された。血管組織についても、血管内皮細胞と間葉系幹細胞(MSC)を混合して、21日間の培養により組織全長が少なくとも2.0 cm以上である血管の組織構築を達成した。また、顕微鏡画像の解析から、血管の直径が約100 μmであり、血管壁は単層の細胞層からなることを明らかにした。MSCがないと組織が構築されず、MSCが組織形成に重要なことが示された。以上のように、ゲルファイバー3次元培養場の作製方法を概ね確立し、筋および血管の長大な組織構築を達成した。CNFゲルの濃度・粘度の最適化ならびに超音波前処理の実施手法および条件の確立、さらにゲルに導入する細胞密度の最適化を実現し、本研究の第一の目標である「CNFゲルファイバー培養場の作製法の確立」を達成した。これらの成果により、チキソトロピー性を発現しつつ細胞担持能と安定的な細胞分散化が可能なCNFゲルの作製が可能となり、細胞からの生体組織作製の効率が顕著に向上した。第二の目標である「配向化したCNFに沿って細胞も配向し、効率的な組織誘導がなされる」との推定機構の実証に向けても、有用な知見が得られた。CNFには酸化(カルボキシル基の導入)の度合をはじめ繊維径や繊維長が異なる種類の材料が存在するが、標準型CNFは、マイクロ流体デバイスに導入して作製する際の流れストレスにより、ゲルファイバーの長軸方向に配向することを走査型電子顕微鏡の観察で明らかにした。また、配向度も低いと考えられる線維長の短いCNFでは、組織の形成能が低いことを示した。第三の目標である「骨格筋組織・血管組織の構築と機能評価」についても、マウス筋芽細胞から筋管組織の作製を達成している。また、ウシ大動脈内皮細胞から、管腔化した毛細血管組織の作製も実現した。この際、成熟・管腔化を促す生理活性物質を産出する間葉系幹細胞との共培養が必須であることも明らかにし、管腔化組織の作製条件を確立した。組織の実用時に不必要なゲルファイバー培養場外層のアルギン酸ゲルの除去についても、当初計画していたアルギナーゼによる分解など追加的な試薬の添加は不要との知見が得られた。具体的には、組織形成誘導にCa2+不含の培養液中を用いて長期培養することで徐々に脆くなり、培養液の緩やかな撹拌などのずり応力を僅かに加えることで除去し得るとの予備的な結果を得た。このように、研究計画の全体にわたり、大きな成果が得られている。さまざまな種類のCNF(線維短、酸化度低、酸化度低・繊維径太)ゲル培養足場について、筋組織および血管組織の形成能を評価する。特に、「線維短CNFゲルファイバーでは組織形成能が低い」、との初年度に得られた実験結果の再現性を検証する。これらCNFについて、濃度条件等を最適化してレオメーターでずり応力及び粘度を測定し、チキソトロピー性の大小を評価する。また、ゲルファイバー内のCNFについて、SEM像での配向性の観察と高速フーリエ変換による配向度の定量的な算出を行う。これら、CNFの物性と微細構造が織形成能に与える影響を明らかにする。続いて、初年度に作製法を確立した標準型CNFゲルを用いての長大な筋と血管のそれぞれの組織について、構造と機能解析をさらに進める。まず両組織内の細胞の生存率を、生死細胞を染め分ける試薬で定量的に評価する。筋組織については、電気刺激およびアセチルコリン添加による収縮機能を測定し、組織の成熟度を評価する。血管組織については、作製に用いる血管内皮細胞と間葉系幹細胞(MSC)をそれぞれCD31、CD90などで染色し、特にMSCが内皮細胞に分化しているかを検証する。また、血管内皮細胞の細胞間結合を特異的に担うVEカドヘリンなどの発現を蛍光免疫染色などで解析して、血管組織としての成熟度を評価する。

さらに、移植医療応用を目指し、作製した組織の齧歯類実験動物への移植時の挙動解析(残存性、移植したホスト動物からの血管組織の導入や結合)について、新たに研究を展開する予定である。特に、血管組織については、ホスト動物の血管に接続されれば、動物血管への墨汁注入などで移植組織の管腔構造の開存性などが容易に評価できる。生体内での組織の構造維持や機能の最大化を実現するように、CNFゲル足場の種類・濃度・前処理、細胞の密度、MSCと血管内皮細胞の組合せ比率などを最適化する。標準試料のCNFゲルについて、さまざまな濃度でのレオメーターによるずり応力および粘度の測定を行い、チキソトロピー性を発現しつつ細胞担持能に優れる条件を最適化した。また超音波処理を施しその条件を最適化することで、CNFの凝集抑制と細胞の安定的な分散化を実現した。これら成果により、後述の組織作製の再現性が顕著に向上した。続いて、CNFゲルに導入する細胞密度を最適化し、再現性良くゲルファイバー中で筋管組織および血管組織を作製した。培養21日で形成された筋組織のミオシン重鎖を染色し、全長が少なくとも1.6 cm以上である筋組織の形成が見出された。また、筋管組織が同一方向に配向して束構造を形成していることも確認し、筋管の平均サイズ(長さ、直径、密度)を定量的に算出した。一方で、繊維長が短いCNFの3次元培養場では筋管の形成はほとんど起こらず、CNF分子の長さが組織形成に大きな影響を与えるとの知見を得た。この機構解析のため、ゲルファイバー中のCNFの状態を走査型電子顕微鏡(SEM)により直接観察する手法を開発し、CNFはゲルファイバーの長軸方向に配向した構造となっており、一部は束状構造を形成していることが解明できた。これらの結果より、細胞がCNFの配向を認識して配向・融合し筋管形成していることが強く示唆された。血管組織についても、血管内皮細胞と間葉系幹細胞(MSC)を混合して、21日間の培養により組織全長が少なくとも2.0 cm以上である血管の組織構築を達成した。また、顕微鏡画像の解析から、血管の直径が約100 μmであり、血管壁は単層の細胞層からなることを明らかにした。MSCがないと組織が構築されず、MSCが組織形成に重要なことが示された。以上のように、ゲルファイバー3次元培養場の作製方法を概ね確立し、筋および血管の長大な組織構築を達成した。CNFゲルの濃度・粘度の最適化ならびに超音波前処理の実施手法および条件の確立、さらにゲルに導入する細胞密度の最適化を実現し、本研究の第一の目標である「CNFゲルファイバー培養場の作製法の確立」を達成した。これらの成果により、チキソトロピー性を発現しつつ細胞担持能と安定的な細胞分散化が可能なCNFゲルの作製が可能となり、細胞からの生体組織作製の効率が顕著に向上した。第二の目標である「配向化したCNFに沿って細胞も配向し、効率的な組織誘導がなされる」との推定機構の実証に向けても、有用な知見が得られた。CNFには酸化(カルボキシル基の導入)の度合をはじめ繊維径や繊維長が異なる種類の材料が存在するが、標準型CNFは、マイクロ流体デバイスに導入して作製する際の流れストレスにより、ゲルファイバーの長軸方向に配向することを走査型電子顕微鏡の観察で明らかにした。また、配向度も低いと考えられる線維長の短いCNFでは、組織の形成能が低いことを示した。第三の目標である「骨格筋組織・血管組織の構築と機能評価」についても、マウス筋芽細胞から筋管組織の作製を達成している。また、ウシ大動脈内皮細胞から、管腔化した毛細血管組織の作製も実現した。
腰痛解明への分子生物学的アプローチと新しい治療法の確立

TNF-aは椎間板ヘルニアにおいて主要な炎症賦活を行っている。我々はTNF-aファミリーであるTWEAKの椎間板における作用を検討した。マウス椎間板を用いて、椎間板細胞におけるTWEAKとそのレセプターであるFn14の発現を検討した。次に、顕微鏡下でマウス尾椎椎間板を摘出し、これらの椎間板を用いた器官培養を行い、TWEAKの椎間板内の作用を検討した。TWEAKはマウス椎間板に発現しており、TNF-レセプターを介さずに分解酵素であるMMP-3を時間依存かつ濃度依存性に誘導することを明らかにした。また、TWEAKを椎間板に作用すると、組織学的かつ分子生物学的にアグリカンの産生が抑制され、椎間板変性を誘発することがわかった。これはTWEAKがアグリカンの産生を抑制し、かつ、MMP-3を誘導することによるマトリックス分解促進の2つの作用があることが明らかになった。さらに、このTWEAKによる椎間板変性を予防するには、TWEAKの中和抗体とレセプターであるFn14キメラによって可能であった。これより、関節リウマチで行われている生物製剤による治療が椎間板変性においても応用しうる可能性が示唆された。今後は、椎間板変性には血管新生も重要であり、TWEAK刺激による血管誘導因子の解明、MMP-3と血管誘導因子発現のシグナル伝達経路の解明が必須であり、研究を継続していく予定である。また、MMP-3欠損マウスを用いて、MMPの特異的な作用を検討し、詳細な椎間板変性のメカニズムを明らかにしていきたい。最近、マウスの関節炎モデルで、TNF-aファミリーに属するTWEAK (Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis)が関節内の軟骨を分解するMMPの活性と滑膜内の血管新生を促進し、関節損傷を誘発したと報告した。そこで、我々は腰痛の主な原因となっている椎間板変性とTWEAKとの関連性について検討を行った。その結果、マウス椎間板を顕微鏡下で採取し器官培養を行うと、椎間板内にTWEAKとこのレセプターであるFn14が発現していることを、免疫組織染色とreal time PCR法によって明らかにした。また、マウスリコンビナントTWEAKはマウス椎間板から濃度依存及び時間依存性にMMP-3を誘導し、TWEAK中和抗体とキメラタンパクにてMMP-3の誘導は阻害された。しかし、TNF-aレセプターIあるいはII型欠損マウス由来の椎間板では、マウスリコンビナントTWEAKを投与しても野生型マウス由来の椎間板と同様の反応であった。さらに、マウスリコンビナントTWEAK存在下では椎間板内のアグリカンの発現が時間依存性に低下していた。本研究はマウス椎間板内にTWEAKとそのレセプターであるFn14が発現することを示した最初の報告である。また、TWEAKは椎間板におけるMMP-3発現を誘導し、かつ、アグリカンを分解する作用を有していた。よって、今後詳細な検討を要するが、TWEAKが椎間板変性に重要な役割を果たしている可能性があることを今回の研究で実証しえたと考えている。次に、顕微鏡下でマウス尾椎間板を摘出し、これらの椎間板を用いた器官培養を行い、TWEAKの椎間板内の作用を検討した。

また、TWEAKを椎間板に作用すると、組織学的かつ分子生物学的にアグリカンの産生が抑制され、椎間板変性を誘導することによるマトリックス分解促進の2つの作用があることが明らかになった。さらに、このTWEAKによる椎間板変性を予防するには、TWEAKの中和抗体とレセプターであるFn14キメラによって可能であった。これより、関節リウマチで行われている生物製剤による治療が椎間板変性においても応用しうる可能性が示唆された。今後は,椎間板変性には血管新生も重要であり、TWEAK刺激による血管誘導因子の解明、MMP-3と血管誘導因子発現のシグナル伝達経路の解明が必須であり、研究を継続していく予定である。また、MMP-3欠損マウスを用いて、MMPの特異的な作用を検討し、詳細な椎間板変性のメカニズムを明らかにしていきたい。
小胞型グルタミン酸トランスポーターのシナプス小胞へのターゲッティング機構

小胞型グルタミン酸トランスポーター(vesicular glutamatetransporter, VGLUT)はグルタミン酸による化学伝達の必須因子である。グルタミン酸作動性神経のシナプス小胞に局在しており、グルタミン酸の小胞内濃縮を司っている。神経がグルタミン酸を分泌するためには、VGLUTがシナプス小胞に特異的に組み込まれることが必要である。しかしながら、その機構は全くわかっていない。本研究により、VGLUTのシナプス小胞へのターゲッティングを分子レベルで解明することに成功した。(1)VGLUT2のトポロジーを解明した。Cytoplasm側ならびにLumen側に対する特異抗体を用いる方法で行った。関連論文はBiol Pharm Bullに発表した。(2)精製VGLUTをリポソームに組み込みグルタミン酸輸送活性を再現できた。すなわち、in vitroのVGLUT機能測定系を構築した。この実験系を用いて、様々な変異VGLUTの機能を測定した。これらの変異がターゲッティングに及ぼす影響を現在調べた。輸送機能は維持しているがターゲッティングに変化がある変異体を複数同定した(Juge et al.,投稿中)。さらにVGLUT2のカルボキシル末端近傍(少なくとも20アミノ酸残基)はターゲッティングに関係ないことがわかった。(3)骨におけるグルタミン酸シグナリングを解析した。その結果、VGLUT1がosteoclastのtranscytotic vesicleに局在することを発見した。このため、osteoclastsは骨消化の際、骨消化物質とともにグルタミン酸を分泌する。グルタミン酸シグナリングは骨組織の恒常性を支える新しい制御系であると考えられる(Morimoto et al.,EMBO J改訂中)。(4)小腸のL細胞におけるグルタミン酸シグナル伝達系を解析した。L細胞のGLP-1含有分泌顆粒にVGLUT2が発現している。L細胞は高グルコース刺激によりグルタミン酸とGLP-1を共分泌する。グルタミン酸シグナリングはgastropancreointestinal tractに共通するホルモン制御系である。J.Neurocnmに発表した。構造・機能研究:シナプス小胞型グルタミン酸輸送体(vesicular glutamatetransporter 2,VGLUT2)の昆虫細胞を用いた大量発現・精製系を構築し、トランスポーターの高純度精製品を得た。これを用いて結晶化を試みている。VGLUT2の各部位に対する特異抗体を調製し、これを用いて膜内トポロジーを決定した(投稿中)。VGLUTは膜電位依存性にグルタミン酸を輸送する一方、Na^+と無機リン酸をグルタミン酸と逆方向に輸送する。このいわゆる基質と共役イオンと輸送の方向性に関する多芸性を支えるアミノ酸残基をアミノ酸置換法とCOS細胞ならびにカエル卵の発現系を用い解析している。グルタミン酸輸送活性が低下するアミノ酸残基を一つ同定した。生理的意義に関する研究:VGLUTsがCNS以外に複数の末梢組織(特に内分泌細胞と精原細胞)に発現していることを見出した。特に膵臓のランゲルハンス氏島においてはVGLUTがグルカゴン顆粒に存在し機能していることを実証した。すなわち、ラ氏島においては、グルタミン酸がグルカゴンとともにα細胞より分泌され血糖調節ホルモンの分泌の重要な制御因子となっている。その他の細胞に発現しているVGLUTも機能的であり、グルタミン酸による細胞間のシグナル伝達が神経以外の細胞にも見られる普遍性の高い機構であることを実証しつつある。ラ氏島β細胞におけるVGLUT2ノックインマウスの解析も進めている。

L細胞は高グルコース刺激によりグルタミン酸とGLP-1を共分泌する。グルタミン酸シグナリングはgastropancreointestinal tractに共通するホルモン制御系である。J.Neurocnmに発表した。
高温高圧プロセスによる新材料機能創出

物質・材料研究機構(NIMS)や名大で蓄積されてきた超高圧合成プロセス利用に加え、高圧下パルス通電焼結技術の開発・難合成物質の多成分系への展開と高圧下化学反応(メタテシス)の探索等の様々な高度化要素を高圧合成プロセスに導入し、機能性材料中の機能コアとしての構造欠陥・界面・不純物元素に焦点をあてた研究を領域連携により推進していく。