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閉塞性脳血管障害急性期におけるアルカリ化剤、特にTHAMの治療効果の基礎的研究

【目的】ラット急性硬膜下血腫モデルを用いて、軽度低体温下でのアルカリ化剤であるTHAMの投与が脳浮腫および脳梗塞に対してどのような影響を及ぼすかを評価し、さらに脳血管関門透過性(BBB permeability)を測定して検討を加えた。【方法】雄S-Dラットを、常温群(37°C)、軽度低体温群(35°C)、THAM投与群、軽度低体温+THAM群の4群に分けた。血腫注入4時間後にラットを断頭し、左右大脳皮質の脳水分量・脳梗塞体積およびBBB permeabilityを測定した。【結果】血腫下大脳皮質の脳水分量は、常温群(80.2±0.2%)に比し、軽度低体温群(79.5±0.2%)では有意差を認めなかったがTHAM投与群(79.0±0.1%;p<0.05)で有意な低下を示した。また軽度低体温群に比し、軽度低体温+THAM群(78.7±0.0%;p<0.05)で有意な脳水分量の低下を認めた。脳梗塞巣体積は常温群(59±4mm^3)に比し、軽度低体温群(46±4mm^3;p<0.05)・THAM投与群(44±4mm^3;p<0.05)・軽度低体温+THAM群(40±2mm^3;p<0.01)の3群とも有意に低値を示した。特に軽度低体温+THAM群でより強い減少傾向を認めた。またBBB permeabilityは常温群(63±7ng/g wet tissue)に比し、両者併用群(35±7ng/g wet tissue;p>0.05)でのみ有意なBBB破綻の抑制を認めた。【総括】合併症の少ないとされる軽度の低体温療法下にアルカリ化剤投与を加えることによって、より強力な脳浮腫および脳梗塞抑制効果を認めた。その機序の一つとしてBBB破綻の抑制が関与していることが示唆された。急性硬幕下血腫は重症頭部外傷における最も代表的な疾患で,それによる二次的な脳損傷進展のメカニズムには脳虚血が強く関与している。さらに脳虚血時に発生する脳内アシドーシスは神経細胞障害を増悪させる重要な要因である。我々はこれまでに脳虚血急性期におけるアルカリ化剤(THAM)の有効性を局所脳虚血モデルにて確認し既に研究成果として報告している。また本年までの実験でラット急性硬膜下血腫モデルにおいて脳低温療法の脳浮腫軽減効果(常温群:81.65%,脳低温群:80.88%)と脳梗塞巣減少効果(常温群:87mm^3,脳低温群:59mm^3)も確認している。今回は同ラット急性硬膜下血腫モデルにおいて脳低温療法下にアルカリ化剤を投与することによって、脳浮腫および脳虚血に対し更なる保護効果を有しているかどうかを検討する。具体的には,急性硬膜下血腫モデルを作成後にラットを(1)常温群,(2)脳低温群,(3)脳低温+アルカリ化剤(THAM)投与群の3群に分け,モデル作成4時間後に脳組織を摘出し脳浮腫は乾燥重量法で脳梗塞巣はH&E染色を行いその効果を検討中である。

現在までの検討では,アルカリ化剤の投与により脳低温療法のみ以上保護効果が認められる傾向が認められるが,脳低温療法の程度やアルカリ化剤の投与量等を変えて更に検討中する予定である。【目的】ラット急性硬膜下血腫モデルを用いて、軽度低体温下でのアルカリ化剤であるTHAMの投与が脳浮腫および脳梗塞に対してどのような影響を及ぼすかを評価し、さらに脳血管関門透過性(BBB permeability)を測定して検討を加えた。【方法】雄S-Dラットを、常温群(37°C)、軽度低体温群(35°C)、THAM投与群、軽度低体温+THAM群の4群に分けた。血腫注入4時間後にラットを断頭し、左右大脳皮質の脳水分量・脳梗塞体積およびBBB permeabilityを測定した。【結果】血腫下大脳皮質の脳水分量は、常温群(80.2±0.2%)に比し、軽度低体温群(79.5±0.2%)では有意差を認めなかったがTHAM投与群(79.0±0.1%;p<0.05)で有意な低下を示した。また軽度低体温群に比し、軽度低体温+THAM群(78.7±0.0%;p<0.05)で有意な脳水分量の低下を認めた。脳梗塞巣体積は常温群(59±4mm^3)に比し、軽度低体温群(46±4mm^3;p<0.05)・THAM投与群(44±4mm^3;p<0.05)・軽度低体温+THAM群(40±2mm^3;p<0.01)の3群とも有意に低値を示した。特に軽度低体温+THAM群でより強い減少傾向を認めた。またBBB permeabilityは常温群(63±7ng/g wet tissue)に比し、両者併用群(35±7ng/g wet tissue;p>0.05)でのみ有意なBBB破綻の抑制を認めた。【総括】合併症の少ないとされる軽度の低体温療法下にアルカリ化剤投与を加えることによって、より強力な脳浮腫および脳梗塞抑制効果を認めた。その機序の一つとしてBBB破綻の抑制が関与していることが示唆された。
骨の再生医学的治療戦略の分子生物学的基盤の研究

本申請研究は重度の骨粗鬆症や広範骨欠損に対する骨の再生医学的治療戦略の確立に向けた基盤研究を行うことにある。すなわち骨組織の再生に向けて3つの目標をもって研究を行った。第1の目標は骨芽細胞の多段階的な制御のメカニズムの検討であり、第2は破骨細胞の分化と制御のメカニズムの解明、そして第3に骨ならびに軟骨の機能分子の解析に基づく骨あるいは軟骨の破壊の防止や骨組織の維持のメカニズム上の研究である。この目的に従って、第1項目の骨の形成のメカニズムについては2005年にBMPのアンタゴニストとしてのCIZの機能を解明した。さらにこの骨芽細胞の機能が破骨細胞に対する交感神経系の抑制とともに抑止されることを明らかにし、骨芽細胞の分化の下流においてはRUNX2の関与がメカニカルストレスのシグナルの下流にあることを明らかにした。これに加えて骨芽細胞の分化に関わるBMPのメカニズムとしてSostの役割や、HLHタンパクの機能、さらにPTHの下流におけるオステオポンチンの機能とともにBMPの抑止分子としてのCIZの役割を明らかにした。第2項目の破骨細胞の解析の検討として、破骨細胞の分化におけるオステオポンチンの悪性黒色腫に対する役割を解明し、またクロトタンパクがその制御の過程においてオステオプロテグリンとの相互作用を持つことを明らかにした。さらにTobが卵巣摘除における骨吸収に伴う骨量低下に対しその骨量低下の一助を担っていることを発見した。また、破骨細胞の転写因子であるMitf-Dの役割を見出した。第3の再生の項目について軟骨の観点からはOPNが関節量の軟骨の異化に直接かかわることを見出し、軟骨細胞における転写因子Sox9の役割を解明し、また腱におけるステムセルの細胞の存在を見出した。これに加えて間葉系のステムセルの細胞株であるC1におけるBMPの機能を解明した。以上のごとく3つの観点の研究の申請により骨・軟骨の再生研究の基盤として有意義な知見が確立された。(839文字)本申請研究は重度の骨粗鬆症や広範骨欠損に対する骨の再生医学的治療戦略の確立に向けた基盤研究を行うことにある。(839文字)骨の粗鬆化は閉経後において急速に進行し、エストロジェンの消退がその原因となっていることは知られているが、骨量減少のメカニズムならびに低レベルの定常状態の骨量に平衡が移行する機序は現在なお明らかとなっていない。骨の組織は骨量のレベルが正常な場合にもまた低下した場合にもそれぞれ一定の平衡状態に達すると考えられている。この平衡状態を決定するプラスとマイナスの両方の因子が閉経後骨粗鬆症においても低骨量の決定を行うとするならば、低骨量状態においても骨を常に増やす方向の活性が存在する可能性が考えられ、もしこれが在るならばその活性を活かすことが骨粗鬆症に対する治療の鍵となる可能性がある。我々は既にBMPのシグナル分子であるSmadと結合し、これと共に核内に移行してSmadの働きを抑制する分子TobがBMPがin vivoにおける直接的な骨形成作用を抑制することを観察した。本研究においてはBMPの頭蓋骨に対する直接投与により形成される骨の形態計測を行い、Toの存在下、非存在下において起こる骨形成を評価した。この結果Tobの存在下、ならびに非存在下でいずれもBMPの直接の頭蓋骨への投与は骨形成を引き起こすが、Tobの非存在下で引き起こされる新しい骨形成は形成された骨の高さおよび横の広がりをマイクロCTで評価した結果、いずれのパラメーターにおいても有意の増加が観察された。興味深いことにこれらの骨の新生は頭頂骨の骨膜から直接は連続しておらず、いったん頭頂骨骨膜を介して分離して形成されることが明らかとなった。

次にTobのこのようなBMPに対する作用の特異性を観察するため長管骨骨髄の物理的な抜去により(Ablation)その回復過程に観察される急激な骨形成について観察した。この骨形成モデルでは内軟骨骨化過程をとらず、骨芽細胞の前駆細胞から直接分化した細胞が海綿骨を形成する。この過程においてはTobの存在下、非存在下ともにほぼ同様の骨の新生が観察されTobの存在、非存在の骨形成に対する影響はBMPに対する特異的な作用であることが推察された。以上のことからBMPに対する抑制が常に働く状態から解除することが骨量の低値の定常状態を改善し、骨粗鬆症からの骨量の増加をもたらしうることが推測される。即ち、Tobの抑制を可能とする薬剤の開発が骨量の増加をもたらず可能性が推察された。骨量の低下は閉経後の骨粗鬆症をはじめとして急速に起こり、骨折の危険を高め国民のQOLの低下のみならず医療経済学的な大きな問題となっている。これまでの治療薬は骨の吸収の阻害を行う薬剤が主であったが、この薬剤による骨折率の低下は約50%にとどまる。そこで骨量の増加をもたらす薬剤が必要とされるが現在米国で用いられている副甲状腺ホルモン(PTH)はその用量によっては副作用が懸念されている。そこで骨形成の作用が明らかなPTHのような薬剤の作用メカニズムを明らかにすることによりこの薬剤の効果を用量の増加をせずに増強する方策を検討することが重要である。オステオポンチン(OPN)は骨基質に存在するマトリックス分子であり、PTHによってその発現が促進され、細胞接着ドメインとカルシウムに対する高親和性を持つドメインを持つことから骨形成に対するその作用が推察されている。そこで、このOPNのPTHの作用に対する修飾の可能性を検討した。野生型の129系統のマウスにおいては80μg/kg/dayのPTHを4週間投与する実験系において大腿骨の骨皮質を主体とする骨塩量を示すBMDは野生型では影響を受けなかったが、OPNの欠失マウスにおいてはBMDの増加が大腿骨ならびに脛骨の両方において見られた。一方、海綿骨については既に報告されているようにPTHでの骨量の増加が明らかであり、一方、OPNの欠失の場合にもほぼ同様の骨量の増加が観察された。それに対して、皮質骨の水平断面を用いた皮質骨量の検討の結果、皮質骨量はBMDの結果と同様に野生型ではPTH投与により殆ど変化せず、一方OPNの欠失マウスにおいては皮質骨量がPTHにより明らかに上昇した。骨形成と骨吸収のパラメーターの解析からは外骨膜においてPTHは骨の形成速度(BFR)ならびに石灰化速度(MAR)をそれぞれ低下させたが、OPNが欠失するとPTHの作用は逆転し、促進作用が観察された。これに対して内骨膜(Endosteal)の骨形成速度(BFR)はPTHの投与により野生型で促進される一方OPNの欠失状態ではPTHで全く変化が見られなかった。さらに海綿骨においては野生型では既に報告されたようにPTHによる骨形成速度ならびに石灰化速度の促進が見られたが、OPNの欠失状態ではその作用がさらに高められた。以上の検討の結果、PTHが骨形成を促進する際、骨の別々のコンパートメントにおいて異なる骨形成の制御機能を持つこと、ならびにOPNがPTHの骨形成に対する修飾機能を持つことが明らかになった。
珪藻の酸素発生光化学系II複合体の精製とその特性解析

珪藻は、世界中の熱帯雨林が吸収する二酸化炭素量と同程度の量を吸収する水域圏で最も重要な植物プランクトンである。私はこれまでに、海産の中心目珪藻Chaetoceros gracilisから酸素発生光化学系II複合体(系II)を単離し、珪藻の系IIの特性について明らかにしてきた。一方、系IIタンパク質のほとんどが、室温・暗所という条件で分解することを見いだした。本年度は、(1)結晶化に向けた系II標品の更なる精製、(2)高分解活性をもつプロテアーゼの検出、の2点に着目し研究を進めた。(1)精製された系IIには、ルビスコや若干のアンテナタンパク質FCPが残っているため、イオン交換クロマトグラフィーによる更なる精製を試みた。しかし、精製の過程で表在性タンパク質が容易に外れてしまうため、界面活性剤の濃度や塩濃度などの更なる条件見当が必要である。(2)チラコイド膜を材料とし、プロテアーゼの検出と局在解析を試みた。チラコイド膜タンパク質の分解が、EDTAやPMSFで抑制されたことから、金属型とセリン型のプロテアーゼが作用していると考えられる。カゼインタンパク質を含んだゲルで電気泳動を行いプロテアーゼ活性を検出するzymography法により、3種の金属型プロテアーゼと1種のセリン型プロテアーゼがチラコイド膜から検出された。チラコイド膜を可溶化後、ショ糖密度勾配遠心やNative PAGEにより、プロテアーゼがFCPに結合していることが示唆された。現在、プロテアーゼの同定を進めている。系II標品の精製が不十分なこと、タンパク質量の不足が理由として挙がる。今後は、系II精製の条件検討が必要となる。具体的には、界面活性剤の種類や濃度、塩濃度、そしてクロマトグラフィーのプログラムを変えることで、適した条件を模索する。珪藻は世界中の熱帯雨林が吸収する総量と同程度の二酸化炭素を吸収する水域圏で、最も重要な植物プランクトンの一種であるため、地球温暖化の防止に大いに貢献しているといわれている。しかしその重要性にもかかわらず、光合成機構、特に光化学系II複合体(PSII)に関する知見は皆無であった。これまでに、海水産の中心目珪藻Chaetoceros gracilisから酸素発生活性を保持した状態のPSII(crude PSII)の単離に成功しており、その標品を用いて様々な生化学的解析を試みてきたが、crude PSIIは非常に失活しやすく不安定であるということが明らかになった。そこで本年度は、(1)このcrudePSIIをさらに精製し珪藻から安定なPSII標品(pure PSII)を調製すること、(2)得られたcrudePSIIとpure PSIIとを比較することでcrude PSIIがどのように不安定であるか、という2点に着目し研究を進めた。まず、crude PSIIをTriton X-100で可溶化後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけpure PSIIの調製を試みた。精製されたpure PSIIは集光性色素タンパク質の大部分が除去されており、酸素発生活性はcrude PSIIの約2.5倍もの数値を示す標品であった。次に、得られたpure PSIIとcrude PSIIを25°C,暗所でインキュベートし、5,10,20,30,60,180,360分後のそれぞれで酸素発生活性と吸収スペクトルの測定、およびポリペプチド組成の分析を行った。その結果、crude PSIIでは、暗所でインキュベートすることにより酸素発生活性の失活、クロロフィルやカロテノイドの消失、PSII subunitの分解などの現象が確認され、これは珪藻特異的なものであった。現在、crude PSIIでみられた失活要因を調査中である。これまでに、海産の中心目珪藻Chaetoceros gracilisから酸素発生活性を保持したPSII (crude PSII)の単離(Nagao et al.2007 BBA)、さらにcrude PSIIからアンテナタンパク質を除去した標品(purified PSII)の調製にも成功している(Nagao et al.2010 BBA)。前年度までに、珪藻PSIIに結合した5種類の表在性タンパク質PsbO, PsbQ', PsbV, Psb31, PsbUの単離精製に成功していたため、今年度は再構成実験によりそれらの結合様式と機能解析を試みた。purifiedPSIIから表在性タンパク質を除去し、精製した表在性タンパク質を様々な組み合わせで再構成した。その結果、PsbO, PsbQ', Psb31はPSII膜タンパク質に対し、直接結合することが明らかとなった。一方、PsbV, PsbUは他の4種の存在下で結合することが明らかとなった。興味深いことに、PsbOが結合していなくともPsb31さえ結合していれば、酸素発生することが明らかとなった。他の光合成生物では、PsbOが結合していなければ酸素発生しないことがすでにわかっており、この結果は珪藻PSIIが他種と異なる可能性を示唆している。以上を論文として纏めた(Nagao et al.2010

The Journal of Biological Chemistry 285 : 29191-29199)。珪藻は、世界中の熱帯雨林が吸収する二酸化炭素量と同程度の量を吸収する水域圏で最も重要な植物プランクトンである。私はこれまでに、海産の中心目珪藻Chaetoceros gracilisから酸素発生光化学系II複合体(系II)を単離し、珪藻の系IIの特性について明らかにしてきた。一方、系IIタンパク質のほとんどが、室温・暗所という条件で分解することを見いだした。本年度は、(1)結晶化に向けた系II標品の更なる精製、(2)高分解活性をもつプロテアーゼの検出、の2点に着目し研究を進めた。(1)精製された系IIには、ルビスコや若干のアンテナタンパク質FCPが残っているため、イオン交換クロマトグラフィーによる更なる精製を試みた。しかし、精製の過程で表在性タンパク質が容易に外れてしまうため、界面活性剤の濃度や塩濃度などの更なる条件見当が必要である。(2)チラコイド膜を材料とし、プロテアーゼの検出と局在解析を試みた。チラコイド膜タンパク質の分解が、EDTAやPMSFで抑制されたことから、金属型とセリン型のプロテアーゼが作用していると考えられる。カゼインタンパク質を含んだゲルで電気泳動を行いプロテアーゼ活性を検出するzymography法により、3種の金属型プロテアーゼと1種のセリン型プロテアーゼがチラコイド膜から検出された。チラコイド膜を可溶化後、ショ糖密度勾配遠心やNative PAGEにより、プロテアーゼがFCPに結合していることが示唆された。現在、プロテアーゼの同定を進めている。系II標品の精製が不十分なこと、タンパク質量の不足が理由として挙がる。今後は、系II精製の条件検討が必要となる。具体的には、界面活性剤の種類や濃度、塩濃度、そしてクロマトグラフィーのプログラムを変えることで、適した条件を模索する。
金属アレルギーを起因とした口腔扁平苔癬の病態研究

口腔扁平苔癬は、原因究明が困難であり治療に苦慮することが多い。一方、本症発症因子の一つとして歯科金属が起因と考えられた症例が多く報告されたが、これらの症例は、lichenoid reactionとしてlichen planusと区別されてきた。これらの所見の違いを検討することは、本症鑑別の一助となると思われる。今回私たちは、金属アレルギーが原因と考えられた症例とその他が原因と考えられた症例を免疫組織学的に細胞死(Apoptosis)をテーマの中心として検討した。まず、扁平上皮癌を材料としApoptosisの関連因子の性質を検討した。そして、扁平苔癬について検討した。1.扁平上皮癌Apoptosis(TUNEL法) :(1)リンパ節転移陽性症例でApoptosis陽性症例は62.5%(2)リンパ節転移陰性症例でApoptosis陽性症例は90.0%(3)リンパ節転移陽性症例でApoptosis陽性率は3.7±7.2%(4)リンパ節転移陰性症例でApotosis陽性率は10.9±16.6%(5)高分化型79.2%、中分化71.4%、低分化66.7%(6)Apoptosis陽性率、高分化型9.3±15.4%、中分化3.6±6.1%、低分化2.2±3.6%2.扁平上皮癌p53 :(1)リンパ節転移陽性症例でp53陽性症例は40.0%(2)リンパ節転移陰性症例でp53陽性症例は66.7%(3)リンパ節転移陽性症例でp53陽性率は12.1±15.0%(4)リンパ節転移陰性症例でp53陽性率は3.2±7.5%(5)p53発症、高分化型14.3%、中分化48.1%、低分化66.7%(6)p53陽性率、高分化型1.8±13.2%、中分化9.3±13.2%、低分化10.7±18.4%3.扁平上皮癌Fas :(1)リンパ節転移陽性症例でFas陽性症例は50.0%(2)リンパ節転移陰性症例でFas陽性症例は85.0%(3)Fas発症、高分化型70.4%、中分化42.8%、低分化0%4.扁平上皮癌bc1-2 :(1)リンパ節転移陽性症例でbc1-2陽性症例は75.0%(2)リンパ節転移陰性症例でbc1-2陽性症例は55.0%(3)bc1-2発症、高分化型51.9%、中分化64.3%、低分化100%5.口腔扁平苔癬Apoptosis(TUNEL法) :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例60.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例37.5%6.口腔扁平苔癬p53 :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例80.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例18.8%7.口腔扁平苔癬Fas :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例60.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例37.5%8.口腔扁平苔癬bc1-2 :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例20.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例62.5%結論:扁平上皮癌のApoptosisの関連因子とリンパ節転位の関係を考察すると、Apoptosis、Fasの発現陽性もしくは、陽性率が高度の場合、リンパ節転位は、陰性の症例が多い。p53、Fasの発現陽性もしくは、陽性率が高度の場合、リンパ節転位は、陽性の症例が多い。この結果からApoptosisの発現および誘発因子の発現は腫瘍増殖能を遅らせる可能性を示唆する所見がえられた。金属アレルギーが原因と考えられた口腔扁平苔癬は、その他が原因と考えられた症例と比較検討すると、Apoptosisおよび誘発因子Apoptosis、p53、Fasの発現が多かった。この結果から、細胞死の観点から本症の原因鑑別の一助になる可能性を示唆する所見がえられた。1.扁平上皮癌Apoptosis(TUNEL法) :(1)リンパ節転移陽性症例でApoptosis陽性症例は62.5%(2)リンパ節転移陰性症例でApoptosis陽性症例は90.0%(3)リンパ節転移陽性症例でApoptosis陽性率は3.7±7.2%(4)リンパ節転移陰性症例でApotosis陽性率は10.9±16.6%(5)高分化型79.2%、中分化71.4%、低分化66.7%(6)Apoptosis

陽性率、高分化型9.3±15.4%、中分化3.6±6.1%、低分化2.2±3.6%2.扁平上皮癌p53 :(1)リンパ節転移陽性症例でp53陽性症例は40.0%(2)リンパ節転移陰性症例でp53陽性症例は66.7%(3)リンパ節転移陽性症例でp53陽性率は12.1±15.0%(4)リンパ節転移陰性症例でp53陽性率は3.2±7.5%(5)p53発症、高分化型14.3%、中分化48.1%、低分化66.7%(6)p53陽性率、高分化型1.8±13.2%、中分化9.3±13.2%、低分化10.7±18.4%3.扁平上皮癌Fas :(1)リンパ節転移陽性症例でFas陽性症例は50.0%(2)リンパ節転移陰性症例でFas陽性症例は85.0%(3)Fas発症、高分化型70.4%、中分化42.8%、低分化0%4.扁平上皮癌bc1-2 :(1)リンパ節転移陽性症例でbc1-2陽性症例は75.0%(2)リンパ節転移陰性症例でbc1-2陽性症例は55.0%(3)bc1-2発症、高分化型51.9%、中分化64.3%、低分化100%5.口腔扁平苔癬Apoptosis(TUNEL法) :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例60.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例37.5%6.口腔扁平苔癬p53 :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例80.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例18.8%7.口腔扁平苔癬Fas :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例60.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例37.5%8.口腔扁平苔癬bc1-2 :(1)金属アレルギーが原因と考えられた症例20.0%(2)金属アレルギー以外が原因と考えられた症例62.5%結論:扁平上皮癌のApoptosisの関連因子とリンパ節転位の関係を考察すると、Apoptosis、Fasの発現陽性もしくは、陽性率が高度の場合、リンパ節転位は、陰性の症例が多い。p53、Fasの発現陽性もしくは、陽性率が高度の場合、リンパ節転位は、陽性の症例が多い。この結果からApoptosisの発現および誘発因子の発現は腫瘍増殖能を遅らせる可能性を示唆する所見がえられた。金属アレルギーが原因と考えられた口腔扁平苔癬は、その他が原因と考えられた症例と比較検討すると、Apoptosisおよび誘発因子Apoptosis、p53、Fasの発現が多かった。この結果から、細胞死の観点から本症の原因鑑別の一助になる可能性を示唆する所見がえられた。
スウェーデンにおける児童青少年と舞台芸術との関わりから見る芸術文化政策の実効性

スウェーデンにおけるこどものための舞台芸術においては、国・地方自治体の文化政策、舞台芸術を支える制度・支援、児童青少年向けの取り組み等が充実しており、質の高い作品が実際にこどもたちに届く環境が整備されている。制作側は新たなテーマやスタイルに挑戦しやすい状況にあり、観客との距離が近い小規模公演が中心であることも手伝って、こどもたちの日常の中にある「難しい」テーマに取り組みやすいことが明らかになった。本研究では、児童青少年演劇の質の高さが国際的にも評価されているスウェーデンの状況を検証し、児童青少年と舞台芸術との関わり方と、その背景にある制度・政策を明らかにすることを目的とする。平成26年度は、現地調査として、スウェーデン児童・青少年舞台芸術ビエンナーレbibu.seに参加した。このビエンナーレは2年に一度スウェーデン全土の児童青少年演劇関係者が一堂に会する場であり、ここでのセミナー受講・作品鑑賞を通して、スウェーデンにおける子どものための舞台芸術の最新動向に関する情報・資料収集を行なった。開催地ヘルシンボリが児童青少年に関わる文化政策に力を入れているスコーネ地方に属することもあり、特に、スコーネ地方の地方自治体や学校における演劇関連の取り組みや、公共劇場(ヘルシンボリ市立劇場・マルメ市立劇場)における児童青少年部門の強化に関する情報収集を行なった。一部の自治体・学校がかなり戦略的に文化関連の政策を推し進めている状況が鮮明に見て取れると同時に、一方で、教育現場において教員の教育活動の中にいかにして演劇などの芸術文化活動を組み入れるかについては、スウェーデンにおいても様々な障壁が見られるなど、問題点も明らかとなった。また、スウェーデン・デンマーク・ノルウェーにおける舞台芸術のプロモーション方法・助成制度等の比較に関するセミナーおよび資料からは、スウェーデンにおいては、基本的に地方自治体ごとに異なる方法・制度をとっていることが明らかになった。そのため、今後は、国全体の大きな方針とは別に、複数の自治体の例を取り上げ、具体的な取り組みを見ていく必要がある。現地調査で得られた情報などをもとに、地方自治体の取り組み、および、近年の舞台芸術活動の動向(作品のジャンル・公演数・全体における児童青少年を対象とした作品の割合など)に関して、インターネット・書面調査を進めている。本研究では、児童青少年演劇の質の高さが国際的にも評価されているスウェーデンの状況を検証し、児童青少年と舞台芸術との関わり方と、その背景にある制度・政策とその実効性を明らかにすることを目的とする。平成27年度は、スウェーデンの文化予算における舞台芸術分野の扱い、および、舞台芸術活動全体における児童青少年向け作品の割合・位置付けに関する資料・情報収集を中心に進めた。近年の文化予算の推移・内訳や地方自治体間での差異に関わる資料、および、近年の舞台芸術公演数に関わる統計資料を収集し、その分析を進めた。資料から、スウェーデンの舞台芸術活動において児童青少年向け公演の占める割合が、実際に決して小さなものではないことが確認できたが、今後さらに詳しく調査分析を進める必要がある。舞台芸術分野において、児童青少年を対象とした作品・公演が幅広いジャンルで数多く見られることの背景として、公共劇場のあり方や、地方自治体の文化活動への取り組み・戦略の中での舞台芸術の位置付けなどについて見ていき、その関連性を検証していく。平成27年度当初に妊娠が判明し、10月半ばより産休・育休を取得した。年度前半は妊娠に伴う体調不良が続き、十分な研究活動を行なうことは困難な状況であった。現地調査も実施できなかったため、当初の研究計画からずれが生じている。本研究では、児童青少年を対象とする舞台芸術の質の高さが国際的にも評価されているスウェーデンの状況を検証し、児童青少年と舞台芸術との関わり方と、その背景にある制度・政策とその実効性を明らかにすることを目的とする。平成28年度は、スウェーデンにおける児童青少年向け舞台芸術に実際に携わる関係者への聞き取り調査および資料収集のため、平成29年2月・3月に現地調査を実施した。まず2月の調査ではストックホルムを訪問し、この分野の関係者の中心的組織であるアシテジ(国際児童青少年演劇協会)スウェーデンのNiclas Malmcrona氏と面会した。Malmcrona氏には、インタビューを行なうとともに、その他の関係組織とのネットワーク構築に協力いただいた。全国各地で巡回公演を行なっているRiksteatern(国立巡回劇場)の児童青少年部門芸術監督や、国際演劇協会スウェーデンセンターの関係者とも面会し、それぞれの組織の活動に関する情報を得た。3月の調査では、ヨーテボリおよびその近郊都市において、フリーランスのシアターメーカー、州立・市立の公共劇場、行政の文化部門担当者等を訪問、ストックホルムでは、複数のフリーグループ、フリーの劇団・ダンスグループの組合関係者、スウェーデン文化庁、ストックホルム市の文化部門担当者などと面会し、制度面と実際の運用面の両方について有益な情報を得ることができた。両調査を通じて、行政の担当者と現場の舞台芸術関係者のいずれも、現在の国・地方自治体の文化政策、舞台芸術を支える制度・支援、児童青少年向けの取り組み等に対して、概ね満足している状況が伺えた。しかしながら、州ごとに制度が異なっているため、全体像を把握することはアシテジであっても困難であること、近年においては児童青少年の舞台芸術鑑賞に関する正確な統計は厳密には把握されていない状況なども確認された。第二子出産に伴い、2015年10月から2016年7月まで産休・育休を取得した。2016年8月より復職したが、10月末までは次男が定期利用の保育を受けることができなかったこともあり、校務と並行して十分な研究活動を進めることは困難な状況であった。校務との兼ね合いもあり、現地調査の実施が年度末となったことから、成果をまとめる作業に遅れが出ている状況である。

本研究では、こども(18歳未満)を対象とする舞台芸術の質の高さが国際的にも評価されているスウェーデンの状況を検証し、こどもと舞台芸術との関わり方と、その背景にある制度・政策とその実効性を明らかにすることを目的としてきた。平成29年度は、これまでの成果を整理する作業を中心に行なった。12月には北ヨーロッパ学会にて「北欧社会における「こども」」という複合領域分科会を企画し、コーディネーターおよび報告者として参加した。この分科会では、「スウェーデンにおける舞台芸術と子どもの権利」という題での報告を行ない、実際の演劇作品が描く現代スウェーデン社会の家族とこどもの姿を取り上げた上で、こどものための舞台芸術が扱う現実的で「難しい」テーマと、そういった作品が実際にこどもの元に届きやすい制度・環境との関係について論じた。2018年2月には東海大学地域連携センターにて「子供・演劇・民主主義ー社会の支えとなるスウェーデンの芸術文化政策ー」と題した講座の開催を企画したが、残念ながら最小開講人数に達しなかったため、不開講となった。2018年3月には、東海大学総合研究機構2017年度「プロジェクト研究」成果発表会において、「スウェーデンにおけるこどもと舞台芸術との関わり」と題したポスター発表を行ない、本研究での成果および今後の展望について整理した。なお、資料情報収集の補完作業を行なうため、2018年3月にスウェーデンでの現地調査を実施している。また、研究代表者は2018年度より「北欧のこどもと文化」という新規開講科目を担当しており、その授業内容に本研究を通して得られた知見を反映させている。スウェーデンにおけるこどものための舞台芸術においては、国・地方自治体の文化政策、舞台芸術を支える制度・支援、児童青少年向けの取り組み等が充実しており、質の高い作品が実際にこどもたちに届く環境が整備されている。制作側は新たなテーマやスタイルに挑戦しやすい状況にあり、観客との距離が近い小規模公演が中心であることも手伝って、こどもたちの日常の中にある「難しい」テーマに取り組みやすいことが明らかになった。育休取得の関係で研究開始年度がずれたことから、現地調査の内容などに当初計画とのずれが生じたものの、最新の動向を把握できる場での現地調査によって、今後のより詳しい調査対象とする地方自治体および制度・取り組みに関して見通しが得られた。現地調査・資料収集により基礎的な情報の収集は進捗しているが、特にアート・カウンセラー設置に関する資料・情報など、不十分なものもあり、今後さらに調査を進める必要がある。平成28年度は、平成27年度に収集した文化予算および舞台芸術活動に関する資料の分析を進めるとともに、不足している資料の収集を行なう。それらの資料調査の結果をもとに、現地でのインタビュー調査を実施する。進捗状況に遅れがあり、平成28年度も7月末まで育休のため、研究期間の延長を希望する予定である。
大脳基底核回路機能およびその再構築に関する多次元的解析

大脳基底核関連疾患の治療法として、神経幹細胞移植法が期待されているが、移植後の神経回路再構成や機能改善に関する基礎的データは少ない。本研究では、胎生初期中脳由来神経上皮型幹細胞を、パーキンソン病モデルラットの線条体に移植して、移植後の機能改善およびニューロン、シナプスの再生について、行動学的および電気生理学的検討を行なった。今回は、ドナーとしてラットとミニブタの両方を用い、パーキンソン病モデルラットに対する同種移植および異種移植の効果を、移植4-12週後において比較検討した。アンフェタミン投与による回転運動を指標にした行動学的解析では、ラット由来、ミニブタ由来の神経上皮型幹細胞いずれの移植によっても機能改善を示したが、同種移植の方が効果発現までの時間が短く、かつ効果が大きかった。薬物による治療では、逆回転を示すことが散見され、過剰な効果、副作用と考えられるが、本研究では、同種移植、異種移植のいずれにおいても逆回転は認められなかった。移植後のラット脳スライスを用いたホールセル記録では、同種移植、異種移植いずれの場合も、移植後4週以降、ドナー細胞は複数種のニューロンおよびグリアに分化し、また、移植部位外(宿主領域)からグルタミン酸性およびGABA性のシナプス入力を受けていることが示された。電気生理学的には同種移植と異種移植との間に差異は認められなかった。以上の結果から、神経上皮型幹細胞移植が、パーキンソン病モデルラットの機能改善に有効であることが示唆され、将来的にはヒトの大脳基底核関連疾患や脳血管障害に対する治療法へと発展することも期待される。
公共文化の胎動:建国後の合衆国における植民地社会諸規範の継承と断絶に関する研究

領土の拡大と大量移民の流入を規定条件に建国後の国民構成が多元性を増したアメリカ合衆国においては、社会文化的に様々の背景を持つ新たな国民を公民に束ねる公共規範の必要性が高まり、政治・宗教・経済・ジェンダーなどの植民地時代以来の社会諸規範が、汎用性を高める方向にその内実を変えた。18世紀と19世紀を架橋するそうした新たな視野から、合衆国における市民社会涵養の歴史を研究する必要性が強調されねばならない。(1)18世紀植民地時代から独立革命を経て19世紀アンティベラム時代へと続く合衆国史を、一つの包括的視点から捉え、独立革命で分断される歴史像を修正する。(2)公共文化の醸成という視点から、合衆国史を、ヨーロッパ史、アジア史との比較史的視野から相対化する。プロジェクト初年度の本年は,基本図書資料の購入を進めるかたわら,全体会議において参加者相互の知見を交換するとともに,来年度以降プロジェクトで招聘する海外研究者と,ボストン,ニューヨークにおいて研究打ち合わせを行った。このほか5回の研究会を主催し,9月29日にはアメリカ太平洋地域研究センターにおける公開シンポジウム『反米:その歴史と構造』を共催した。本年の研究会を通して浮かび上がった問題の一っに,公共の空間と排除,暴力の問題があったことを記しておく。旧聞に属すことながら改めて指摘すれば,合衆国建国の理念的支柱の一つに古典的共和主義がある。ただその流れは19世紀転換期以降,個々人のイニシアティブに基づく富の集積をも「公共」の善とみなす,近代的共和主義,あるいは自由主義の伝統にとって換わられたとされる。その伝統が合衆国を長く貫いたからこそ,"ヤンキーの父"とされるベンジャミン・フランクリン像が人々の間に流布することにもなったと近年の歴史家は議論している。しかしそうした新たな「公共」が対象とする範囲は自ずと限られたものであり,アクターとしてよりは,スペクテーターとしての役割を甘受させられた移民や婦女子,奴隷,先住民を含む,別の言葉でいえば,「公共」の縁に存在する人が想定されて初めてその「公共」は意味を持つものでもあった。そうした自由主義的な思潮を縁取りした政治的,文化的排除と暴力の存在を含めた「公共」創出の議論が,18,19両世紀を跨ぐ形でどのように展開しうるのか,この後の課題として一つ浮かび上がっている。「公共」空間への参加を約束する文字や読書の社会史をより詳しく学ぶ必要がもっとあるかもしれない。その特権と人種や性の規範,プロテスタント信仰との関わりはまだ詳しく論じ尽くされていないのではないだろうか。そうした諸問題を念頭におきながら2008年度以降も研究を継続する。平成20年度はプロジェクトの2年次にあたり、海外の研究者を招聘したものを含め、計8回の研究会を開催し、研究分担者の研究関心を広げることに努めた。まず08年5月10にパリ政治学院デニス・ラコルヌ教授の研究会「The Rise and Fall of American Secularism」を共催、同年3月11日に本科研が共催したイェール大学ジョン・バトラー教授の講演会「Religion in Modern America」と合わせ、現在のアメリカにおいて「公共」と「宗教」がいかほどの距離を保ちえているのか議論を交わした。その過程で欧米各国において国教の分離等によって担保される「公共」の意味には様々の違いがあり、今後は比較研究の視野に立って合衆国建国後の「公共」の意味を探る必要が明らかとなった。11月15日に愛知県立大学大野誠教授を招き開催した研究会「近代イギリス史と公共圏概念」では、家庭(オイコス)から分離した国家(ポリス)での活動だけでは満足ができなくなった近代西洋市民にとっての「公共」の意味を再び問い直したが、「公共」の語の地域横断的な定義は難しく、当面は、政治・宗教・人種等の分野でいかなる「公共」が模索されていたのか、個別事例研究を深める必要性を確認した。一方、初期アメリカ史における「公共」に関しては、9月12日、18日にUC/Davis校のアラン・テイラー教授を招いた研究会を開催し、近代西洋政治思想の継承とは別に、植民地社会の人種混交の現場で醸成されたアメリカの公共概念を検討した。この研究会では、結論として欧米の彼我の差が強く確認された。また2009年1月27日ハーヴァード大学デイヴィッド・ホール教授を招き行った研究会では、印刷文化と公共概念との間の関係が、オーソドクシーが強力であったニューイングランド植民地社会などの場合、西洋近代とは別の形をとった可能性が指摘された。これらの成果は東京大学アメリカ太平洋地域研究センター『ニューズレター』等でその詳細を報告した。研究分担者はその成果を次年度の研究に引き継ぐことになる。2009年度の研究活動は、2009年10年米国歴史学会(American Historical Association)会長でありハーヴァード大学教授であるローレル・T・ウルリック教授をお迎えして始まった。

女性史と宗教史を交錯させた初期米国社会文化史を、マテリアル史料を駆使して切り開く教授の歴史観は、5月22日"Weil-Behaved Women Seldom Make History,"、23日"Mud and Fire : Mormon Diarists on the Iowa Prairie"に詳しく披瀝され、公共の政治空間と家族空間、市民概念と女性性などの問題が討議された。個人の活動を重きに置く市場経済への不安がポリガミーを基盤とする共同主義への傾斜を生んだ経緯を、モルモン教の日記を史料に詳しく検討した23日の報告は、公共の価値観とセクトの価値観が表層的には反発しつつ、深層で補強しあう逆説的な関係を示唆し、プロジェクトに新たな視角を提供した。ウルリック教授が提示した宗教と公共の問題は秋以降の数次の研究会でいっそう深められることとなった。まず12月21日に南山大学宗教文化研究所の奥山明倫教授が報告「戦後アメリカ宗教と公共性」を行った。そこで、自国の価値観、主張をも相対化する力を有する超越的側面をアメリカの「市民宗教」が失いつつある現状に注意を促した。「公共」の概念は文字通り「公」と「共」に分かれ、その二つの公共に「私」のいかなる側面が対峙するかを考えることからアメリカ宗教の公共性の再考を氏は提唱した。2010年1月9日同志社大学肥後本芳男教授の報告「初期アメリカ共和国の印刷文化と公共性」は、対抗的な公共を生み出す媒体としての印刷文化の可能性を議論しつつ、ハバマスらの提唱した公共概念が米国建国史に適応可能か否かの問題を提唱した。この点は2010年1月22日、同じく同志社大学特任研究員藤本龍児が、アメリカにおける宗教と公共性の問題を報告で取り上げた際にも問題化した。ハバマスやアレントらの公共性の概念が広大の国土と民族的多様性を有する米国の公共性研究にどこまで有効か、最終年次への課題として残っている。最終年度となる本年は、成果のまとめを行う合同討議の機会を増やした。研究分担者はその討議をとおし、各自が分担する課題の位置づけを再考することができた。本研究を進めていく中で研究分担者の注意を最も強く惹いた問題の一つは、領土の拡大と大量移民の流入を規定条件に建国後の国民構成が多元性を増すなか、植民地時代の社会諸規範のうちいかなる側面が継承され、いかなる側面が断絶されるに及んだかという問題であった。例えば政治規範に関して言えば、古典共和主義から近代共和主義への変遷において、徳や公共善などの言葉を継承しつつも、市場経済の成長に沿った個人利益の追求を是認する必要が建国期に起きた。経済活動における私益と社会全体の公益との調和をどうもたらすかは、建国期アメリカが公民の育成に際し説明に最も腐心した問題で、アンティベラムの文化全般にその所産を指摘することができる。例えば、プロテスタンティズムの聖書主義から生まれたプロテスタント・ヴァナキュラーの文化は、厳格な神学論の領域を超えた日常説教や文学の領域にも浸透し、公共の涵養こそが文芸の使命であると考えるような文学潮流すらも生み出すこととなった。この視点は「感傷小説」と呼ばれた文学全般のプロットを理解する上で不可欠である。領土の拡張に伴う公共性の意味の拡大も、英帝国全体を視野におさめた帝国経営の論理と西部開拓者の利益を最優先とする現場の論理との間で、継承と断絶のせめぎ合いが続いた。それが建国後の西部における空間秩序の形成に影響を与えた可能性が本研究では明らかになっている。
様式の異なる運動(動的及び静的)負荷に対する発汗応答

本課題では、健康な成人男子を対象に、運動様式の違い(動的運動及び静的運動)が発汗反応に及ぼす影響について、代謝量、心拍数や皮膚血管反応との関連に置いて調べることを目的とした。被検者30分以上の座位安静状態を保った後、体温が定常で軽度の発汗状態のもとで、-側下肢の膝関節伸展運動を40回-分のテンポで3分間続ける動的運動、及び3分間にわたって-側下肢の等尺性膝関節伸展運動を続ける静的運動を2、3、4及び5kgの負荷強度で行った。運動中及びその前後で両側前腕及び手掌の発汗量、鼓膜温、皮膚温、指尖血流量、心拍数及び代謝量を連続測定し、その相互関係について解析を行った。実験は、被験者毎に運動の種類及び強度について解析に必要なデータ数がえられるよう実験を繰り返し、併せて再現性の検討も行った。その結果、ほとんど場合で、いずれの様式でも前腕及び手掌の発汗量、心拍数及び代謝量は運動にともなって増加した。指尖血流量は、運動開始とともに一過性に減少した。鼓膜温は、実験中若干のふらつきを見せたが、運動の開始及び終了に際しての特定の変動ではなかった。運動中の代謝量は、運動負荷強度の増加にともなって増加した。前腕及び手掌の発汗量と心拍数についても、負荷強度の増加にともなって増加する傾向にあったが、代謝量増加度あたりで、前腕発汗量を比較すると、静的運動において動的運動よりも増加度が大きかった。同様の傾向は、ばらつきは大きいものの手掌の発汗反応においても認められ、様式の違いによる発汗反応の差には、様式の異なる運動の実施に際しての、運動遂行に対する努力や環境及び精神性の影響が強いものと考えられた。
結合組織乳頭構造をもつ培養口腔粘膜の開発と義歯装着インビトロ加齢モデルへの応用

本研究は、結合組織に相当する足場材の上皮界面に凹凸形状の乳頭様構造を付与し、機械的強度が高く生体組織に近い応答が得られるin vitroモデル〔培養口腔粘膜(3D oral mucosa model,3DOMM)〕を開発した上で、継代数の違う細胞を足場材に播種して培養口腔粘膜モデルを作成し、若い細胞とそうでない細胞で若年者と高齢者の3DOMMに見立てて、その組織学的特徴を始め、老化や床下粘膜モデルとして発展利用しようと実験を計画した。本実験では、半導体技術を用いてDEJ(上皮ー結合組織接合)を生体模倣した幾つかのマイクロパターン化した足場材を作成し、3DOMMの作成を試みた。作製したマイクロパターンの形状は、格子状、柱状の2種類に、マイクロパターンの断面形状として矩形、波形も設定し、計4種類とした。陰性モデル(鋳型)に1%魚うろこコラーゲン溶液を填入し足場材を作成し、申請者が以前に用いたプロトコールで口腔ケラチノサイトを播種することにより、3DOMMは完成する。組織学的検討により、平坦なコラーゲンゲル上に形成された上皮よりも、マイクロパターン化したコラーゲン足場材を使用した3DOMMでは、厚い上皮が形成されていることを確認し、また、上皮の特徴をより詳細に検討するために免疫染色を行ったところ、Integrin α6、Integrin β1、Ki-67、p63、Involucrinがそれぞれ特徴的に上皮細胞層特異的に染色され、正常な分化が起こっていることも証明できた。当初の予定通り口腔粘膜にとってのマイクロパターンの至適サイズを探索するため、いくつかのサイズを作成し組織学的観察と、継代数の異なる細胞を播種することで老化モデルの作成を併行して実施した。高齢化により義歯需要が増大する一方、加齢変化が義歯床下組織に与える影響は解明されていない。本研究は義歯装着における顎骨吸収のメカニズムを解析することを最終目的としており、過去に培養口腔粘膜(3D oral mucosa model,3DOMM)を応用し義歯装着を想定した圧刺激を加えた義歯装着モデルを作製したが、上皮接着が弱く、過酷な実験条件で上皮が剥離する欠点があることが分かっている。このため、結合組織に相当する足場材の上皮界面に凹凸形状の乳頭用構造を付与し、機械的強度が高く生体組織に近い応答が得られるin vitroモデルを開発することが必要となった。乳頭様構造を持つ培養口腔粘膜の3次元微小環境が上皮接着に有効であることを明らかにするため、上皮細胞の播種面であるコラーゲンゲルに不織布を押圧して口腔粘膜結合組織乳頭に類似した凹凸形態を付与した3DOMMを作成したところ、組織学的、免疫組織化学検討より重層扁平上皮が形成されることがわかった。また、本研究をより発展させるために、最新ナノテクノロジー技術の応用がより本課題を推進することが推測されたので、現在は不織布の圧接でなく、より安定した形状をコラーゲンゲルに付与するためにPDMSモールドを作製し、凹凸の形状を操作することにした。これにより得られた3DOMMの重層扁平上皮は凹凸のない平らなコラーゲンゲル上に形成された上皮よりも厚い上皮が形成されていることを確認した。3次元乳頭様構造の至適サイズを探索するため、いくつかのサイズの乳頭様構造による組織学的観察を実施中である。当初の計画どおり、平成29年度に(1)乳頭様構造をもつ3DOMMの作成、(3)組織学的検討、(4)免疫組織化学的検討(上皮接着、基底膜構成分子、上皮増殖、前駆細胞マーカー)を実施し、口腔粘膜上皮の3次元モデルは、乳頭様構造があることで、より生物学的活性の高い上皮構造を持つことを明らかにした。(2)走査型電子顕微鏡による観察、(5)透過型電子顕微鏡による観察については、実施していないものの、口腔粘膜結合組織乳頭に類似した凹凸形態を付与する方法として、不織布の圧接でなく、ナノテクノロジー技術を本課題に応用することが可能であることがわかり、現在、PDMSモールドを使用して口腔粘膜結合組織のもつ乳頭様構造を付与して、インビトロモデルを作成することとし、その結果、より厚く分化した重層扁平上皮が形成されることを明らかにすることができたので、計画通りに研究を遂行出来る見込みである。

組織学的検討により、平坦なコラーゲンゲル上に形成された上皮よりも、マイクロパターン化したコラーゲン足場材を使用した3DOMMでは、厚い上皮が形成されていることを確認し、また、上皮の特徴をより詳細に検討するために免疫染色を行ったところ、Integrin α6、Integrin β1、Ki-67、p63、Involucrinがそれぞれ特徴的に上皮細胞層特異的に染色され、正常な分化が起こっていることも証明できた。当初の予定通り口腔粘膜にとってのマイクロパターンの至適サイズを探索するため、いくつかのサイズを作成し組織学的観察と、継代数の異なる細胞を播種することで老化モデルの作成を併行して実施した。PDMSモールドにより3次元乳頭様構造の凹凸の形状及びの至適サイズを決定する。最適な乳頭構造形態を決定した後、意図的に継代した胞を用いたin vitro加齢モデルを作成し、組織学的解析、βガラクトシダーゼ測定による老化解析、免疫組織学的解析、ELISAによる液性因子の解析を行う。さらに、In vitro加齢モデルへの加圧刺激と組織学的解析、免疫組織学的解析とELISAによるモデルから放出される液性因子の解析を行い、義歯装着を想定した、断続的加圧刺激がIn vitro加齢モデルに及ぼす影響を検討する。4月に執行済みである。
クルマエビの経口ワクチン効果をもたらす生体応答因子の特定

クルマエビにエビ病原体ウルスの組換えタンパク質を投与し,ワクチンの筋注接種により発現量が増加するタンパク質を二次元電気泳動により見出し,本応答因子のN末端10残基のアミノ酸配列を決定した。さらに,ワクチン接種後の各組織由来のtotal RNAの網羅的遺伝子発現解析を実施し,本応答因子のN末端アミノ酸残基の遺伝子が認められ、レクチンファミリーに属すると予測された。さらに,本遺伝子の全長塩基配列の決定、各組織別遺伝子発現およびワクチン接種後の経時的遺伝子発現解析により,クルマエビにおけるワクチン効果に類似する免疫様現象の一端を担うと考えられる因子である可能性が示唆された。トウモロコシゼイン等による餌への組換えタンパク質(ワクチン)の展着状況を観察した結果,何れの方法でも海水中に投下30分後に同程度に減少した。今回用いた展着手法は,組換えタンパク質の海水中での損出を防ぐ効果は期待できないことが推察された。これまでに、ワクチンの筋注接種により発現量が増加するタンパク質を二次元電気泳動により見出し,本応答因子のN末端10残基のアミノ酸配列を決定した。これを基とした9種の縮重プライマーによるRace法による標的遺伝子の所得の試みは不調であった。そこで,ワクチン接種後の各組織由来のtotal RNAの網羅的遺伝子発現解析を実施し,本応答因子のN末端アミノ酸残基をコードする遺伝子の部分配列が認められ、Blast検索により,ある免疫関連タンパク質に属する遺伝子の一つであると予測された。現在、本遺伝子配列に特異的なプライマーを設計し,Race法による全長塩基配列の決定、各組織別遺伝子発現およびワクチン接種後の経時的遺伝子発現解析を実施中である。なお,特定された免疫様現象応答因子は,クルマエビ由来では新規のタンパク質であり,特筆すべき成果と考える。抗原投与を行ったクルマエビのリンパ様器官等のRNAから免疫様応答因子の時系列での発現状況の把握い,抗原投与個体群において非投与群に対して,免疫応答関連因子の遺伝子発現が活発に行われている傾向が捉えられた。4つの免疫様応答因子をタンパク質発現ベクターpET28に組込み、大腸菌を形質転換後、組換えタンパク質の合成を行い,得られた各組換えタンパク質のリフォールディング操作を行った。SDS-PAGEにより精製した組換タンパク質の確認を行い,いずれの組換えタンパク質もアミノ酸残基から予測される分子量にシングルバンドが検出された。稚クルマエビを用いたバイオアッセイによるホワイトスポット病原因ウイルスの中和試験の結果,ウイルスの中和活性を有することが示唆された。クルマエビが示す免疫様現象を司ると考えられる応答因子由来の組換えタンパク質の稚クルマエビを用いたバイオアッセイによるホワイトスポット病原因ウイルス(WSSV)の中和試験と受動免疫様現象の有無について検討した。中和については,因子とWSSVを試験管で混合直後と3時間後にWSSVの感染歴のないクルマエビに筋肉注射し,6日間後の死亡状況とWSSV遺伝子量の定量を行った。その結果,3時間反応後に接種した場合,エビからWSSV遺伝子の検出が少なかった。また,組換え因子をエビに投与して,20時間後にWSSVを接種した場合でも同様に因子投与個体群は,WSSV遺伝子の検出が少なかったことから,中和活性あるいは受動免疫活性の存在を示唆した。免疫様現象を司ると考えられる応答因子を特定できた点は,大きな進捗であり,さらに組換えタンパク質の取得まで行えたことから,今後はワクチン応答因子の定量検出系構築により,ワクチンの実用化への一助になる技術の構築に近づくと考えられる。水産増殖学,魚病学得られた組換えタンパク質の抗血清の作製を進める予定である。さらに,得られた組換えワクチン応答因子による受動免疫試験を行う。引き続き,連携研究者として,米加田徹研究員(増養殖研究所病害防除部)が免疫応答因子の組換えタンパク質の作出などを担当する。組換えタンパク質の経口投与による免疫様現象の誘導は成功し,注射投与と同様に血リンパ液中に特異因子の発現が見られるか検証中である。遅れはあるものの当初の目的は達成されつつある。組換えタンパク質投与後に発現した免疫様現象の特異的因子と考えられるタンパク質のアミノ酸シークエンス情報から,免疫様現象を発現したクルマエビ主要臓器のmRNAのトランスクリプトーム解析により,100%一致する配列を特定した。そして,他種の生物にこの配列情報と高い相同性をもつ既知の配列の存在が確認され,因子の特定がほぼ達成されたと考えられる。ワクチン応答因子組換えタンパク質を作製し、抗血清を作製し、ワクチン応答因子の検出の可否を把握する。また、得られた組換えワクチン応答因子によるウイルス中和活性の有無を把握する。