hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サルマラリア原虫が感染したヒト赤血球の微細構造と接着能の解析

サルマラリア原虫Plasmodium knowlesiが感染したサル及びヒト赤血球の微細構造を解析した結果、それぞれのP. knowlesi感染赤血球において原虫や赤血球内に形成される膜状構造の形態は類似しており、構造の相違は見られないことが分かった。また、P. knowlesi感染のサル赤血球とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)との結合アッセイにより強い接着反応を示すP. knowlesi原虫集団を選択することができたため、トランスクリプトーム解析により非接着性原虫集団との比較を行ったところ、接着性原虫集団において特異的な発現を示すSICAvar遺伝子断片を同定することができた。本研究の目的は、本来サルに感染するサルマラリア原虫Plasmodium knowlesiがヒトにも自然感染し重篤化して死亡する例が報告されていることから、P. knowlesiが感染したヒト赤血球の構造と原虫分子の局在、接着能の有無を明らかにし、サルマラリア原虫がヒト赤血球においても接着現象を起こしうるのか否かを解明することである。本研究の交付決定は平成27年10月であったため、交付決定以降の平成27年度の約五ヶ月間の研究は当初の実施計画の一つであるP. knowlesi感染赤血球の微細構造の観察について行うものとした。まず初めに、P. knowlesiについてサル赤血球及びヒト赤血球を用いてin vitroで培養し、実際にP. knowlesiがサル赤血球と同様にヒト赤血球においても感染・増殖できることを確認した。そこで、P. knowlesiが感染したサル赤血球及びヒト赤血球を材料として固定・脱水・樹脂包埋を行い、透過型電子顕微鏡(TEM)観察用の試料ブロックを作製した。そしてTEMを用いてそれぞれの二次元の微細構造を観察した結果、P. knowlesi原虫や赤血球内部に形成される原虫由来の膜構造について形態は類似しており、サル赤血球及びヒト赤血球の間で構造の相違は見られないことが分かった。また、P. knowlesiが感染したサル赤血球表面には原虫由来のカベオラと呼ばれる特徴的な凹状構造が形成されるが、ヒト赤血球においても同様の構造が形成されていることが明らかとなった。これらの結果から、光学顕微鏡観察の結果と同様にTEM観察においても、P. knowlesiが感染したサル赤血球及びヒト赤血球の間に形態的な相違は見られないことが分かった。平成27年度では約五か月間の研究実施となったため、当初の実施計画の一つを行うのみとなった。そのため、同年度の計画として挙げていたもう一つの内容であるP. knowlesi感染赤血球表面の発現リガンドに対する抗体作製が実施できなかった。また、その発現リガンド候補である接着分子SICAvarには多数のコピーが存在し、どの分子が接着能を有するのか明らかではない。そこで、SICAvarに対する抗体を作製する前にまず血管内皮細胞に対するP. knowlesi感染赤血球の結合アッセイを行い、接着現象に関与する分子を特定することとした。本研究の目的は、本来サルを宿主とするサルマラリア原虫Plasmodium knowlesiがヒトにも自然感染し重篤化して死亡する例が近年東南アジアの広範囲で報告されていることから、P. knowlesiが感染したヒト赤血球の構造と原虫分子の局在、接着能の有無を明らかにし、サルマラリア原虫がヒト赤血球においても接着現象を起こしうるのか否かを解明することである。P. knowlesi感染赤血球の接着現象に関与し接着能を有すると考えられるSICAvar分子は多数のコピーが存在するため、当該年度では接着現象に直接関与するSICAvar分子を特定することを目的として、血管内皮細胞に対するP. knowlesi感染赤血球の結合アッセイを行った。まずクローン化したP. knowlesiがサル赤血球に感染した状態で、その感染赤血球を用いてヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と共に混合培養し繰り返し結合アッセイを行ったところ、結合アッセイ6,7回目で約1,100感染赤血球/100HUVECsという接着反応が認められた。そこで、結合アッセイ前の非接着性原虫クローンと結合アッセイ後の接着性原虫クローンについて遺伝子発現を比較し接着に関わるSICAvar分子あるいは他の候補分子を特定するため、RNA-seq解析を目的としてまず非接着性原虫クローンについて同調させ大量培養した後細胞を回収しRNAの精製をした。そしてmRNAを取得後ライブラリを作製し、次世代シーケンサーを用いて遺伝子配列の決定を行った。また、従来のヒト赤血球に感染可能なP. knowlesiは長期培養が困難であったが、培地の組成を改良することにより数か月の継続的な培養が可能となった。クローン化したP. knowlesiが感染したサル赤血球とHUVECの結合アッセイを繰り返し行った結果、接着反応を確認することができた。そして、P. knowlesiの培養に関しては時々細胞が不安定な状態になり増殖できずに死滅してしまう現象が見られたものの、現在は安定しており細胞同調や大量培養も可能となっているため、RNA-seq解析を行える状態となっている。また、不安定だったヒト赤血球に感染可能なP. knowlesiの培養方法も改善がなされ、安定した長期培養を行うことができるようになっている。本研究の目的は、東南アジアに生息するマカク属サルを自然宿主とするサルマラリア原虫Plasmodium knowlesiがヒトにも自然感染し重篤化して死亡する例が同範囲内で報告されていることから、P. knowlesiが感染したヒト赤血球の微細構造とヒト血管内皮細胞に対する感染赤血球の接着能の有無を明らかにすることである。

昨年度までに、サル赤血球に感染したP. knowlesi原虫クローンのヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する結合アッセイを繰り返し行い、結合アッセイ6,7回目で約1,100感染赤血球/100 HUVECsという高い接着反応が認められ、接着性原虫クローンを選択することができた。しかし今年度に入り、その接着性原虫クローンを凍結保存後に再び解凍して培養したところHUVECに対する接着反応の再現が得られなかったため、今度はP. knowlesi原虫集団を対象としてHUVECに対する結合アッセイを再度繰り返し行い、新たに高い接着反応を示す原虫集団を選択することができた。そこで、結合アッセイ前の非接着原虫集団と結合アッセイ後の接着性原虫集団について遺伝子発現を比較し接着に関与する可能性のある原虫分子を同定するため、それぞれの原虫集団を同調した後大量培養し、各発育ステージにおいて細胞を回収しRNAを精製した。そしてmRNAを取得後ライブラリを精製し、RNA-seqによる解析を行った。その結果、非接着性の原虫集団と比較して接着性原虫集団において約200-500倍に転写量が増えているSICAvar遺伝子断片を同定することができた。サルマラリア原虫Plasmodium knowlesiが感染したサル及びヒト赤血球の微細構造を解析した結果、それぞれのP. knowlesi感染赤血球において原虫や赤血球内に形成される膜状構造の形態は類似しており、構造の相違は見られないことが分かった。また、P. knowlesi感染のサル赤血球とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)との結合アッセイにより強い接着反応を示すP. knowlesi原虫集団を選択することができたため、トランスクリプトーム解析により非接着性原虫集団との比較を行ったところ、接着性原虫集団において特異的な発現を示すSICAvar遺伝子断片を同定することができた。今後の研究計画として、P. knowlesi感染赤血球の接着現象に関与し接着能を有すると考えられるSICAvar分子を特定するため、まず血管内皮細胞に対するP. knowlesi感染赤血球の結合アッセイを行う。P. knowlesi感染赤血球と共に血管内皮細胞を培養してその内皮細胞に接着した感染赤血球を集め、このような結合アッセイを繰り返して内皮細胞に接着するタイプのP. knowlesi原虫を選択していく。そして、トランスクリプトーム解析によりそのような接着タイプの原虫において発現しているSICAvarを特定した後、この分子にエピトープタグやGFPなどを付与した組換え原虫を作製する。さらに、付与したエピトープタグやGFPに対する抗体を用いてP. knowlesi感染赤血球の免疫染色を行い、光学顕微鏡及びTEM観察により標的分子の輸送について解析する。HUVECに対するアッセイ前の非接着性原虫クローン及びアッセイ後の接着性原虫クローンについて遺伝子発現を比較するためのRNA-seqを引き続き行い、P. knowlesi感染赤血球の接着現象に関与し接着能を有すると考えられるSICAvar分子を特定する。
家族性アルドステロン産生腫瘍の遺伝子検索

同朋3名(姉妹)にアルドステロン産生副腎腫瘍が発生した。これは偶然とは考えにくく共通の遺伝要因があるものと推定された。そこでその遺伝要因の検索を行った。まず染色体の欠失や転座などの異常がないか検討した。このような大きな異常があれば遺伝的要因の検索の的を絞ることが可能となる。患者白血球を培養しGバンディングで染色して検討したが異常はみつからなかった。次に候補となる遺伝子の異常を検討した。TSH受容体では突然変異により腫瘍化することが知られているが同じG蛋白カップリング受容体であるアンギオテンシン受容体Iaは最も有力な効補である。最近その遺伝子構造が明らかにされ、塩基配列も決定したので、この遺伝子に的を絞り検討した。アンギオテンシンII受容体Iaは、5つのExonからなるがこのうちアミノ酸をコードしているのはExon5たけである。そこでExon5と,発現に重要なExon1の5'上流部分を患者白血球から抽出したDNAを用いPCR法にて増幅しDideoxy法にてシースエスした。しかしここには異常はみられなかった。ACTH受容体など他の候補は可能性が低く、さらによい高い可能性の候補遺伝子を今後検討してゆく。
下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチドの生理機能の解析

下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)に関してつぎの検討を行った。1、ラジオイムノアッセイと免疫染色にて褐色細胞腫、神経芽細胞腫、神経節芽腫の腫瘍組織中のPACAPの検討。2、ヒト脳における存在、特に視床下部における局在とバゾプレッシン産生細胞との関係。3、ラット褐色細胞腫の培養細胞であるPC12に対する効果。以上の検討により、PACAPは脳や副腎に高濃度存在し、神経伝達物質、修飾因子、下垂体ホルモン制御因子として働いているとともに、神経成長因子として働く可能性が示唆された。
小中連携を視野に入れた英語の文字指導の最適時期とその指導法に関する研究

独自の語彙習得モデルを定式化し、その枠組みを用いて小学校英語における文字指導は、音声にたっぷりなれ親しんだ後に始める必要があることを統計を用いて明らかとし、また語に関する技能は互いに関連し合っていることを明らかとした。さらに学習段階の初期において、文字は「話す」助けにはなるが、「聞く」助けにはならないことも明らかとした。平成18年度は,(i)参考文献を通して,早期英語教育における文字指導の有効性と,文字がその後の英語学習に及ぼす影響に関して,先行研究を整理し直すこと,(ii)小学校英語における文字導入の実態と,児童がどの程度の文字能力をすでに獲得しているかを多角的語彙習得モデルに基づき徹底的に調査すること,という2点について重点的に行う年と位置づけた。(i)については,必要な文献を購入したり,取り寄せたりしたものを通して資料を収集した。(ii)については,岐阜県内の小学校2校(1校は小学校英語教育特区に属する小学校),長野県内の小学校1校,計3校の協力を賜り,多角的語彙習得モデルに基づいた語彙と文宇導入に関するアンケート,及び英語活動の実施状況に関する聞き取り調査を実施した。また,同様のアンケートと聞き取り調査を,韓国慶州市内の3小学校(そのうち一つは私立小学校)にも実際に出向いて実施し,日韓あわせて,約1800枚のアンケートを収集した。その結果については現在鋭意解析中であるが,今のところ各小学校間で文字能力の較差があること,韓国の小学校の方が文字に関する能力が高いこと,などがわかってきている。また,今後の資料収集に活用できる,音声認識エンジンを搭載したソフトウェアを,(株)アドバンスト・メディアの協力により作成した。すでに夏休みに本学で行った小学生対象の英語講座などで,約150名の児童が本ソフトウェアを使用し,若干の資料も収集できたが,今後修正すべき部分もみつかり,来年度以降も検討を続けていく予定である。これまでの文字導入・文字指導に関する研究の一部については,10月に開拓杜より刊行された「小学校英語への文字導入についての考察」(『言葉の絆』(卯城祐司・太田一昭・太田聡・滝沢直宏・田中伸一・西田光一・山田英二編))にまとめ,発表した。平成19年度は18年度の研究で得られた知見を踏まえ,引き続き調査・資料収集を継続しながら,その収集した資料の整理と分析を行った。まず、18年度に日本国内と韓国の小学校で収集した語彙調査のデータを吟味し、(1)日本の学校間で語彙習得に関して格差があるかどうか、(2)日本と韓国における小学生の語彙習得の傾向の差異があるかどうか、についてまとめあげた。(1)については、指導方針や授業時間数によって、学校間に少なからず語彙習得に関する格差が生じていることがわかり、(2)に関しては日本と韓国では圧倒的に韓国の方が語彙習得がすすんでいること、文字に関する技能習得は韓国では小学校の早い段階からすすむこと、などが明らかとなった。この研究成果の一部については外国語教育メディア学会、小学校英語教育学会などで学会発表、論文発表を行った。また、平成18年度に引き続き,小学校英語を積極的に行っている某小学校の全児童を対象として独自の語彙習得モデルに基づいた語彙アンケート調査を行った。その結果については鋭意分析中であるが、文字に関する技能の習得順序を明らかにするための有用な資料が収集できたと考えている。また、平成18年度に作成した資料収集用のソフトウェアについて、若干の手直しを行った。実際にこのソフトウェアを用いて、資料を収集することに関して、いくつかの学校や教育委員会に協力打診し、平成20年度には実現できる目処が立った。小学校英語には文字を導入しないという方針がとられてきた。しかし世の中にはアルファベットが氾濫しており、児童を文字から隔離することは不可能である。以上を鑑みると、音声中心であるということを前提に、適期教育の観点から文字をどのような形で導入・指導していけば、その後の英語学習に好影響を及ぼすか、ということを明らかにすることが、今後の英語教育の発展に重要である。本年度は以上を念頭に、以下のような研究を行った。1.平成1819年度に引き続き、参考文献を通じて、早期英語教育における文字指導の有効性と、文字がその後の英語学習に及ぼす影響や、ローマ字教育と英語教育の関係に係わる資料を収集した。2.平成19年度に収集し、まだ整理が終わっていない語彙アンケートのデータをパソコンに打ち込み、それを整理し統計処理した。3.平成1819年度に引き続き、文字導入・文字指導のさらに広範・かつ詳細な資料を、実際に小中学校に赴き収集した。4.平成20年度に得られた資料をパソコンに打ち込み、それを整理し統計処理した。5.多角的語彙習得モデルに基づき、児童の文字能力が、音声中心の小学校英語教育及ぼす影響の一面を明らかにした。以上の結果、以下のことが明らかとなった。1.文字が語の習得に貢献するのは英単語を「聞く」よりも「話す」ことに対してである。極論すれば、英語を「聞く」という作業を行う際には文字は必要なく、英語を「話す」という作業を行う際には文字は必要である。

2.文字指導の際、文字と音声との関係に係わる技能(たとえばフォニックスのような)の指導に偏りすぎると、意味がおろそかとなり、その後の学習によからぬ影響を及ぼす可能性がある。
心血管ストレス応答におけるミトコンドリア活性酸素シグナル制御

ミトコンドリアの生体維持機能は、ミトコンドリアDNA(mtDNA)によって動的に制御されている。近年、mtDNAの酸化損傷およびそれに起因する活性酸素の過剰産生が、種々の疾病の発症、さらには老化にも関与することがあきらかにされ、疾病発症の共通基盤としてのミトコンドリア機能不全が注目されている。本研究では、心血管ストレス応答におけるミトコンドリア転写因子およびミトコンドリア酸化ストレスの役割をあきらかにした。近年、mtDNAの酸化損傷およびそれに起因する活性酸素の過剰産生が、ガン、糖尿病、神経変性疾患など種々の疾病の発症に関与することがあきらかにされ、『疾病発症の共通基盤としてのミトコンドリア機能不全』が注目されている。mtDNAおよびミトコンドリア機能を制御する「Key molecule」は、ミトコンドリア転写因子(mitochondrial transcription factor ; TFAM)やその上流に存在しミトコンドリア転写因子コアクチベーターであるPPAR-gamma coactivator-1(PGC-1)を含む『ミトコンドリア転写因子ファミリー』である。本研究は、心血管ストレス応答におけるミトコンドリア転写因子ファミリータンパクの発現を制御する分子基盤を解明するとともに、心血管病の形成・進展におけるミトコンドリア活性酸素シグナル制御の役割をあきらかにし、ミトコンドリア転写因子の機能制御という新たなパラダイムに基づく心血管病の治療法の開発を目指すものである。我々は、ミトコンドリア転写因子Mitochondrial transcription factor A (TFAM)が、ミトコンドリアにおけるmitochondrial DNA (mtDNA)の転写、維持、コピー数の増加に関与することを明らかにしてきた。本年度は、TFAMの心筋細胞保護効果が抗酸化作用を介するかどうかin vivoとin vitroで検討した。in vivo研究:ヒトTFAM遺伝子過剰発現マウス(TG)に心筋梗塞(MI)を作成し、28日後の心筋におけるROS産生をin vivo電子スピン共鳴法(ESR)で測定したところ、TFAM遺伝子過剰発現は梗塞サイズには影響せずに、組織学的心筋肥大と心エコーで評価した左室収縮不全を抑制した。さらに、in vivo ESRで測定した心筋酸化ストレスはWT-MIで増加したが、これはTG-MIで抑制された。さらに、心筋DNA microarrayで、核DNAでコードされたMthfd2やAdh1などの抗酸化酵素が増加したが、ミトコンドリア呼吸酵素は不変であった。in vitro研究: HeLa細胞を用いて複合体I阻害薬のロテノン存在下のスーパーオキサイド産生をDihydroethidiumで測定すると、TFAM過剰発現によりsuperoxide産生は有意に低下した。以上よりTFAM過剰発現はROSを抑制することが明らかとなり、TFAMのこのような抗酸化作用が、心筋リモデリング・心不全に対する抑制作用に関与すると結論した。このような研究成果は、TFAMがmtDNAの維持作用ばかりでなく、抗酸化作用を有することを、in vitroとin vivoの双方で明確に証明したという点で、意義が大きいと考えられた。このようなTFAMの抗酸化作用が、mtDNAの維持によりミトコンドリアでのROS産生を抑制したことによるのか、直接的に酸化ストレスを軽減するのかを含め、さらに詳細なメカニズムの解明が必要である。我々は、ミトコンドリア転写因子Mitochondrial transcription factor A(TFAM)が、ミトコンドリアにおけるmitochondrialDNA(mtDNA)の転写や維持、さらに酸化ストレスの制御に関与することを明らかにしてきた。本年度は、従来からの研究成果をさらに進展させ、心血管系のストレス応答におけるミトコンドリア酸化ストレスの役割について検討した。マウスを高脂肪食で飼育すると、肥満・高血糖・高インスリン血症を呈し、2型糖尿病が誘発される。このマウスに心筋梗塞を作成すると、通常食で飼育したマウスより死亡率が高く、左室リモデリング(心筋細胞肥大、アポトーシスおよび間質線維化)および収縮不全が増悪した。高脂肪食飼育マウスでは、心筋における活性酸素産生が、さらに増加したが、それには心筋NAD(P)H oxidaseの活性化が関与した。一方、高脂肪食投与は、心筋のみならず骨格筋においても、NAD(P)H oxidaseの活性化を引き起こし、NAD(P)Hoxidase由来の活性酸素は、ミトコンドリア電子伝達系複合体の酵素活性の低下、ミトコンドリア呼吸能の障害とともに運動能力の低下を引き起こした。さらに、同様のミトコンドリア機能障害および運動機能の低下は、磁気共鳴スペクトロスコピーを用いた解析によりメタボリックシンドローム患者の骨格筋においてもみとめられることが確認された。以上よりミトコンドリア酸化ストレスは、心血管系に対するストレス応答として幅広い病態の形成・進展に関与していると考えられた。ミトコンドリア酸化ストレスの制御の分子基盤の解明とそれに基づく新たな治療法の開発が必要である。

本研究は、心血管ストレス応答におけるミトコンドリア転写因子ファミリータンパクの発現を制御する分子基盤を解明するとともに、心血管病の形成・進展におけるミトコンドリア活性酸素シグナル制御の役割をあきらかにし、ミトコンドリア転写因子の機能制御という新たなパラダイムに基づく心血管病の治療法の開発を目指すものである。高脂肪食投与は、インスリン抵抗性を惹起するが、同時に心筋のみならず骨格筋において活性酸素スーパーオキサイドの主要な産生源であるNAD(P)Hoxidaseの活性化を引き起こし、NAD(P)Hoxidase由来スーパーオキサイドが、ミトコンドリア電子伝達系複合体の酵素活性の低下、ミトコンドリア呼吸能の障害とともに運動能力の低下を引き起こすことをあきらかにした。さらに、磁気共鳴スペクトロスコピー(MRS)を用いた骨格筋代謝の解析によりメタボリックシンドローム患者の骨格筋においては、ミトコンドリア機能障害がみとめられ、運動機能の低下と相関することもあきらかにし、さらに心筋梗塞後マウスでも、心筋ばかりでなく骨格筋における酸化ストレスが亢進しており、インスリンシグナル経路のうちAktのリン酸化およびGLUT-4の膜へのtranslocationが傷害されており、インスリン抵抗性が惹起されることを見出した。また、磁気共鳴スペクトロスコピー(MRS)を用いた骨格筋代謝の解析により拡張型心筋症患者の骨格筋において、ミトコンドリア機能障害がみとめられ、運動機能の低下と相関することもあきらかとなった。したがって、心不全とメタボリックシンドロームには、ミトコンドリア機能制御異常という共通の病態基盤が存在することが示唆された。本研究は、心血管ストレス応答におけるミトコンドリア転写因子ファミリータンパクの発現を制御する分子基盤を解明するとともに、心血管病の形成・進展におけるミトコンドリア活性酸素シグナル制御の役割をあきらかにし、ミトコンドリア機能制御という新たなパラダイムに基づく心血管病の治療法の開発を目指すものである。本年度は、従来からの研究成果をさらに進展させ、心血管系のストレス応答におけるミトコンドリア酸化ストレスの役割について検討した。心筋梗塞後心不全モデルマウスでは、高脂肪食投与糖尿病モデルマウスと同様に、心筋のみならず骨格筋においてNAD(P)Hoxidase由来スーパーオキサイドの産生が亢進し、ミトコンドリア電子伝達系複合体の酵素活性の低下、ミトコンドリア呼吸能の障害、すなわちミトコンドリア酸化ストレスが引き起こされることを見出した。重要なことに、ミトコンドリア酸化ストレスは、骨格筋機能を障害し、運動能力を低下させるばかりでなく、インスリンシグナルを傷害し、インスリン抵抗性を惹起した。すなわち、インスリン抵抗性・糖尿病は心不全の重要なリスクであるが、骨格筋ミトコンドリア酸化ストレスを介して、心不全自体がインスリン抵抗性を惹起し、さらに心不全を悪化させるという悪循環を形成していることを見出した。
ゲノム編集による四肢再生特異的発現遺伝子の機能解析とツメガエル成体の再生能回復

アフリカツメガエルは高い再生能力をもっており、幼生期に四肢を切断しても完全に再生することができる。このアフリカツメガエル幼生の四肢再生・発生過程における形態形成期についてRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った結果、再生領域特異的に発現上昇する遺伝子10個が同定された。この10個のうち最も発現量の差が大きい2つの候補遺伝子(X1, X2)について、Crispr-Cas9系を利用したゲノム編集による機能解析(Loss of Function)を2倍体であるネッタイツメガエルに対して行った。Founder個体(F0)は高いモザイク性を示したため次世代(F1)による解析を行ったところ、遺伝子X2の変異個体(幼生)について四肢再生が異常になる表現系が得られた。この時、四肢再生異常を示した個体は左後肢のみを切断し、右後肢はそのまま発生過程を進めていたのだが、四肢発生に関しては全く異常が見られなかった。この様な「四肢発生には影響せず四肢再生だけで働く遺伝子」はこれまでに知られていない。次に、熱ショック応答により遺伝子X1, X2発現を誘導できるTransgenicアフリカツメガエル個体を作製し、四肢再生領域でX1, X2を過剰発現させることによってこれら遺伝子の機能解析(Gain of Function)を行った。野生型のアフリカツメガエルでは、変態後の個体は幼生よりも再生能力が低く、四肢切断を行った場合には1本の棒状軟骨をもつ「スパイク」が再生するのみで指などのパターンは再生しない。ところが、熱ショックにより遺伝子X1を再生領域で過剰発現させたTg個体(変態後の幼若個体)について後肢切断を行い再生させたところ、先端が23本に分岐した軟骨をもつ器官が再生するという表現系が得られた。研究計画の通りに実験を遂行できた。得られた結果に関しては、細かい部分では予想と異なっていたが、さらなる実験を行うことにより、実際に得られた結果が正しいことを確認できている。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。ネッタイツメガエルにおける遺伝子X1のゲノム編集F1個体(幼生)の四肢発生・再生を解析し、遺伝子X2と同様に四肢再生異常が見られること・四肢発生異常は見られないことを確認する。さらに遺伝子X1とX2の両方に変異をもつ個体を作製し、遺伝子X1やX2単独で見られた再生異常よりもシビアな異常が見られるかを確認する。そして遺伝子X1, X2それぞれ単独のゲノム編集個体、またはX1/X2ゲノム編集個体の再生部位における形態形成遺伝子発現を確認し、野生型と比べたときに四肢再生における形態形成プログラムのどこに異常が生じているかを明らかにする。次に、熱ショック応答により遺伝子X2発現を誘導するTransgenicアフリカツメガエル個体(変態後の幼若個体)について後肢切断を行って再生させ、どの様な軟骨パターンをもつ器官が再生するかを確認する。また、遺伝子X1,またはX2を過剰発現させたTg個体の再生部位における形態形成遺伝子発現を確認し、野生型と比べたときの四肢再生における形態形成プログラムにおける変化を確認する。

そして遺伝子X1, X2それぞれ単独のゲノム編集個体、またはX1/X2ゲノム編集個体の再生部位における形態形成遺伝子発現を確認し、野生型と比べたときに四肢再生における形態形成プログラムのどこに異常が生じているかを明らかにする。次に、熱ショック応答により遺伝子X2発現を誘導するTransgenicアフリカツメガエル個体(変態後の幼若個体)について後肢切断を行って再生させ、どの様な軟骨パターンをもつ器官が再生するかを確認する。また、遺伝子X1,またはX2を過剰発現させたTg個体の再生部位における形態形成遺伝子発現を確認し、野生型と比べたときの四肢再生における形態形成プログラムにおける変化を確認する。
血管樹脂鋳型標本の観察による前眼部虚血の検討

外眼筋の切腱による前眼部の虚血現象を微小血管構築の変化で捉えるという試みはこれまでなされておらず,この研究では家兎を対象に外眼筋切腱眼と長後毛様動脈の閉塞眼の2種類の手術モデルを作成し,mcthylmcthacrylateを用いて血管樹脂鋳型標本を作成して微小血管構築の変化を観察することによりこれらの手術操作の前眼部虚血に与える影響を検討した.外眼筋切断眼の術後1週の鋳型標本では前眼部の虚血現象を確認することはできなかた.しかし筋切断眼の術後2週の鋳型標本では,前眼部の虚血が原因と思われる新生血管の発生を虹彩に確認した.同じ手術モデルの術後7週の鋳型標本では輪部周囲の血管網から角膜の中心に向かう著しい新生血管を確認した.一方,長後毛様動脈の閉塞眼では,術後2週の鋳型標本で虹彩,前房隅角,角膜における新生血管の発生を確認した.これらの結果は,家兎の切腱は長後毛様動脈の閉塞と類似の微小血管構築の変化,つまり前眼部の虚血をきたすことを意味しており,これまで報告されてきた以上に家兎の前毛様血管は前眼部の血液の供給に関係しており,前毛様血管と長後毛様血管の間に強い連絡のあることが推察される.外眼筋の切腱による前眼部の虚血現象を微小血管構築の変化で捉えるという試みはこれまでなされておらず,この研究では家兎を対象に外眼筋切腱眼と長後毛様動脈の閉塞眼の2種類の手術モデルを作成し,mcthylmcthacrylateを用いて血管樹脂鋳型標本を作成して微小血管構築の変化を観察することによりこれらの手術操作の前眼部虚血に与える影響を検討した.外眼筋切断眼の術後1週の鋳型標本では前眼部の虚血現象を確認することはできなかた.しかし筋切断眼の術後2週の鋳型標本では,前眼部の虚血が原因と思われる新生血管の発生を虹彩に確認した.同じ手術モデルの術後7週の鋳型標本では輪部周囲の血管網から角膜の中心に向かう著しい新生血管を確認した.一方,長後毛様動脈の閉塞眼では,術後2週の鋳型標本で虹彩,前房隅角,角膜における新生血管の発生を確認した.これらの結果は,家兎の切腱は長後毛様動脈の閉塞と類似の微小血管構築の変化,つまり前眼部の虚血をきたすことを意味しており,これまで報告されてきた以上に家兎の前毛様血管は前眼部の血液の供給に関係しており,前毛様血管と長後毛様血管の間に強い連絡のあることが推察される.眼筋手術では34直筋を一度に眼球から切り離すことによって前毛様動脉に循障害が生じ,虹彩実質の萎縮.瞳孔の変化といった虹彩に虚血性の病変が発生することが報告されている。今回,うさぎを用いて.一眼の上直筋と下直筋の2つの筋を同時に眼球から切離し.手術後1週に血管樹脂鋳型標本を作成し,上強膜,外眼筋内虹彩,および毛様体筋における長後毛様動脉と前毛様動脉の吻合や側副血管の経時点変化を未処置のコントロール眼のそれと比較した。その結果,上,下直筋の血行支配領域に相当すると思われる虹彩の表層毛細血管網の脱落を認めた。すなわち耳側と鼻側のlong posterior ciliary arteryで構成されるmajor iridic cireleは眼筋手術眼でも確認できたが,この眼では上直筋と下直筋を貫通するmuscle arteryの消失と、これらの動脉系によって支配される上と下側の虹彩表層の毛細血管網の消失が認められた。一方,long posterior ciliary arteryから派生する放射状に規則正しく配列した虹彩後面の毛細血管網は障害されずに虹彩の全周に認められた。外眼筋手術の前部ブドウ膜に対する循環の影響を検討するために、白色ウサギ10羽を対象に外眼筋を切腱することにより前毛様血管(外眼筋血管)を障害させ、一定期間ののち前眼部血管の樹脂鋳型標本を作成して走査型顕微鏡で前眼部の虚血の徴候をしめす角膜の新生血管の有無を観察した。さらに長後毛様動脈を閉塞させ、この2種類の手術モデルによる前眼部虚血への影響を比較した。外眼筋切腱における術後5日目のモデルでは虹彩の毛細血管網の著しい減少がみられたが角膜には新生血管は観察されなかった。しかし術後2週では虹彩毛細血管網の再形成と角膜輪部に血管新生の徴候がみられ、7週では上方の角膜輪部血管網からの著しい新生血管が認められた。他方、長後毛様動脈の閉塞モデルではすでに術後2週の時点で全周の角膜輪部からの著しい新生血管が観察できた。この結果は前毛様血管(外眼筋血管)の前眼部ブドウ膜の循環に対する影響は少ないとする従来の説、つまりウサギでは前眼部のブドウ膜の循環はほとんどが長後毛様動脈で供給されるという報告と異なることを示しており、ヒトやサルで観察されるようにウサギにあっても前毛様血管は少なからず前眼部の循環に関与することを示しており、この血管の循環障害への影響は徐々に進行するものと推察される。
二相自励振動型熱輸送管に関する数値解析

電子機器の高速化、高性能化に伴い発熱密度の増大が問題視となっている。特にノートブックPCなどの小型化を伴う場合には、放熱の問題は非常に厳しい問題となってきている。その問題に対処するには熱輸送デバイス自体の小型化が必要である。このような中、既存の熱輸送デバイスの弱点(小型化は困難)を補うものとして液体の振動(Oscillation)を利用した振動流型Heat Pipeが注目されている。本研究は、相変化による液体の自励振動を基本機構とすると思われるSelf-Exciting Mode Oscillating-Flow Heat Pipe(SEMOS-HPと略記)と対象としている。具体的には、数値解析に基づき、実験とあわせ、SEMOS-HP管内流動の基本的メカニズム及び熱輸送特性を解明することを目的としている。(i)現象を深く理解するため、SEMOS-HPの動作限界について、実験を行った。その結果,以下のことが分かった:(1)これまでの研究で採用していた恒温水加熱と、今回新たに採用したワイヤーで電気加熱とでは,実験値に大きな相違は無く,電気加熱でも信頼性の高い結果を得られることが分かった。(2)内径1.5mm、1.2mm、0.9mm銅パイプで調べた結果,管径の減少に従い熱輸送密度が増大することから,SEMOS HPは細径化に適した熱輸送デバイスであると言える.(3)R141b,エタノール,水の順に沸点が上昇することから,その駆動開始の加熱部温度もこの順に上昇している.そのため,各作動流体で適用範囲が大きく異なる.(4)駆動開始後の熱輸送量/温度差の傾きは,R141b,エタノール,水の順に大きくなる.つまり,加熱部の温度上昇に伴い,R141b,エタノール,水の順に熱輸送量が増大することから,実用時には比熱および蒸発潜熱が大きい作動流体を選択することでより高い熱輸送能力を得ることが可能であると言える.(ii)数値計算:従来の多くの研究では均質モデルにより、気液二相流の数値解析を行っている。今回相間の相対運動にドリフト速度の概念を導入したドリフトフラックスモデルを用いた。パイプは非常に細長いため、一次元で表すことが可能と判断している。伝熱特性に影響する最も重要なパラメータである径方向の液膜の厚さは理論解析によっている。計算結果と実験結果を比べてみると、熱輸送量と液体の温度など、よく一致している。蒸発部の圧力と凝縮部の圧力の差はパイプの中の流体の駆動力になる。また潜熱より、顕熱のほうが支配していると明らかにしている。簡単に言うと、このモデルで、幾何寸法を入れると、熱輸送管の熱輸送能力をすぐ予測出来る。生産設計の指針になる。本研究は、相変化による液体の自励振動を基本機構とすると思われるSelf-Exciting Mode Oscillating-Flow Heat Pipe (SEMOS-HPと略記)と対象としている。(2)内径1.5mm、1.2mm、0.9mm銅パイプで調べた結果,管径の減少に従い熱輸送密度が増大することから,SEMOS HPは細径化に適した熱輸送デバイスであると言える.(3)R141b,エタノール,水の順に沸点が上昇することから,その駆動開始の加熱部温度もこの順に上昇している.そのため,各作動流体で適用範囲が大きく異なる.(4)駆動開始後の熱輸送量/温度差の傾きは,R141b,エタノール,水の順に大きくなる.つまり,加熱部の温度上昇に伴い,R141b,エタノール,水の順に熱輸送量が増大することから,実用時には比熱および蒸発潜熱が大きい作動流体を選択することでより高い熱輸送能力を得ることが可能であると言える.2、数値計算の試みにおける現状と今後の予定従来の多くの研究では均質モデルにより、気液二相流の数値解析を行っている。均質モデルは単相流からの類推で理解しやすく、その基礎式が非常に簡素であるので、数値解析における経済的なメリットも大きく、ある程度成功を収めている。ただし、二相流は本来均質的なものではなく、気体と液体が重力、慣性力などの場の中でそれぞれがお互いに干渉し、複雑なメカニズムで異なる運動を行う。そこで、今回相間の相対運動にドリフト速度の概念を導入したドリフトフラックスモデルを用いた。今後は、二次元、三次元に拡張し、それによって、SEMOS-HP管内流動の基本的メカニズム及び熱輸送特性を解明することと期待される。

特にノートブックPCなどの小型化を伴う場合には、放熱の問題は非常に厳しい問題となってきている。その問題に対処するには熱輸送デバイス自体の小型化が必要である。このような中、既存の熱輸送デバイスの弱点(小型化は困難)を補うものとして液体の振動(Oscillation)を利用した振動流型Heat Pipeが注目されている。本研究は、相変化による液体の自励振動を基本機構とすると思われるSelf-Exciting Mode Oscillating-Flow Heat Pipe(SEMOS-HPと略記)と対象としている。具体的には、数値解析に基づき、実験とあわせ、SEMOS-HP管内流動の基本的メカニズム及び熱輸送特性を解明することを目的としている。(i)現象を深く理解するため、SEMOS-HPの動作限界について、実験を行った。その結果,以下のことが分かった:(1)これまでの研究で採用していた恒温水加熱と、今回新たに採用したワイヤーで電気加熱とでは,実験値に大きな相違は無く,電気加熱でも信頼性の高い結果を得られることが分かった。(2)内径1.5mm、1.2mm、0.9mm銅パイプで調べた結果,管径の減少に従い熱輸送密度が増大することから,SEMOS HPは細径化に適した熱輸送デバイスであると言える.(3)R141b,エタノール,水の順に沸点が上昇することから,その駆動開始の加熱部温度もこの順に上昇している.そのため,各作動流体で適用範囲が大きく異なる.(4)駆動開始後の熱輸送量/温度差の傾きは,R141b,エタノール,水の順に大きくなる.つまり,加熱部の温度上昇に伴い,R141b,エタノール,水の順に熱輸送量が増大することから,実用時には比熱および蒸発潜熱が大きい作動流体を選択することでより高い熱輸送能力を得ることが可能であると言える.(ii)数値計算:従来の多くの研究では均質モデルにより、気液二相流の数値解析を行っている。今回相間の相対運動にドリフト速度の概念を導入したドリフトフラックスモデルを用いた。パイプは非常に細長いため、一次元で表すことが可能と判断している。伝熱特性に影響する最も重要なパラメータである径方向の液膜の厚さは理論解析によっている。計算結果と実験結果を比べてみると、熱輸送量と液体の温度など、よく一致している。蒸発部の圧力と凝縮部の圧力の差はパイプの中の流体の駆動力になる。また潜熱より、顕熱のほうが支配していると明らかにしている。簡単に言うと、このモデルで、幾何寸法を入れると、熱輸送管の熱輸送能力をすぐ予測出来る。生産設計の指針になる。
ユビキチン修飾系による膜タンパク質の輸送制御機構

代表的成果として、脱ユビキチン化酵素USP8をCushing病の原因遺伝子として世界に先駆けて発見し、タンパク質ユビキチン化による細胞機能調節の破綻によるその発症の分子機構を解明した。Cushing病は脳下垂体の腫瘍によりひき起こされる内分泌疾患であるが、これまで発症機構が不明であったために有効な治療薬がなく、厚生労働省の特定疾患に指定されている。したがって、この成果はCushing病治療薬の開発に向け、その分子標的を初めて提示したものであり、毎日新聞やYahoo!ニュースでも報道された。1)ユビキチン結合モチーフUIMをもつ脱ユビキチン化酵素USP37において、UIMが基質となるユビキチン鎖に結合してそれを酵素活性中心の近傍に保持することにより、USP37のユビキチンイソペプチダーゼ活性を上昇させるために機能することを見出した(Tanno et al. 2014)。2)あるヒト腫瘍のゲノムDNAのエクソーム解析により、その腫瘍において脱ユビキチン化酵素USP8の特定の部位に高頻度で遺伝子変異が入っていることを見出した。そして、その変異によりUSP8が特定の部位で分子内切断をうけて高い酵素活性を獲得し、活性化された上皮細胞増殖因子(EGF)受容体を過度に脱ユビキチン化してそのリソソーム輸送/分解を抑制することを見出した(投稿準備中)。3)ユビキチン結合モチーフUIMをもち、ユビキチン依存的な様々な細胞機能を制御するAAA-type ATPaseであるVCP/p97と結合するタンパク質Ankrd13が、細胞膜カベオラの主要構成膜タンパク質であるカベオリン1の多量体にそのユビキチン化依存的に結合すること、そしてカベオリン1のリソソーム輸送/分解を制御することを示唆するデータを得た(未発表)4)ユビキチンリガーゼMARCH8によるユビキチン化によって結合する分子の同定と機能解析を行い、UIMをもつ新たな分子群を同定した。これらの分子をsiRNAで機能阻害した細胞において、エンドサイトーシス制御に関与する可能性のある分子を同定した。さらに、MHC class IIがユビキチン化されないマウスを用い、MHC class IIのユビキチン化消失が免疫制御に関与していることを明らかにした(Ishikawa et al. 2013)。クッシング病をひき起こす脳下垂体腫瘍において、脱ユビキチン化酵素USP8の14-3-3タンパク質結合モチーフRSYSSPに体細胞ホットスポット変異を見出した。USP8変異体の機能解析を行った結果、変異体は14-3-3タンパク質結合能を喪失しており、その結果、14-3-3結合モチーフのN末端側で分子切断を受けやすくなっていた。切断により生じたC末端側の40-kDa領域(C40)はほぼ酵素活性ドメインのみからなり、全長型USP8に比べ高い酵素活性を獲得していた。C40は、上皮細胞増殖因子(EGF)刺激した細胞においてユビキチン化されたEGF受容体を過度に脱ユビキチン化することにより、活性化されたEGF受容体のリソソーム輸送/分解(ダウンレギュレーション)を阻害した。その結果、活性化EGF受容体が細胞膜上に残存して細胞増殖シグナルを持続的に発信することで、脳下垂体細胞の腫瘍形成を誘導することが明らかとなった。また、免疫応答におけるMHC class II(MHC-II)のユビキチン化の消失意義を検討する目的で、MHC-IIが恒常的にユビキチン化されているマウスを作成した。このマウスではMHC-IIによる免疫応答が低下していた。さらに、このマウスの定常状態の末梢血中にB細胞数の低下を認めた。このB細胞数の低下はMHC-II欠損マウスでは顕著に見られなかった。これらの結果から、MHC-IIのユビキチン化消失が適正な免疫応答に必須であることが明らとなり、さらに定常状態における末梢でのB細胞数の維持にも重要であることが明らかとなった。1.脱ユビキチン化酵素USP8の変異によるCushing病の発症機構:変異USP8を切断・活性化するプロテアーゼの各種阻害剤に対する感受性と、その活性を検出する簡便なin vitroアッセイ系を確立した。また、USP8が脱ユビキチン化する新規の基質タンパク質の探索を行い、その候補として脳下垂体で特異的に発現する細胞膜タンパク質を同定した。2.カベオリンのリソソーム輸送の制御機構:ユビキチン結合タンパク質Ankrd13によるユビキチン化依存的なカベオリンのリソソーム輸送の制御機構を理解するため、カベオリンに付加されるユビキチン鎖のタイプとAnkrd13が認識するユビキチン鎖のタイプを質量分析法により解析し、いずれもLys63連結型のユビキチン鎖であることを明らかにした。3. MHC class II分子のリソソーム輸送の制御機構:MHC class IIのユビキチン・リガーゼMARCH-I欠損細胞を用い、MHC class IIのユビキチン化がその細胞膜へのサイクリングを抑制することによりMHC class IIの分解を促進していることを明らかにした。さらに、インターロイキン-10が樹状細胞ではなくマクロファージにおけるMARCH-Iの発現を亢進させることにより免疫抑制機能を発揮することを明らかにした。また、B細胞におけるMHC class IIのユビキチン化による制御がその抗体産生形質細胞への分化に必要であることも明らかにした。

脱ユビキチン化酵素USP8の変異によるCushing病の発症機構に関し、その切断・活性化を担うプロテアーゼを同定するための実験準備が整った。また、Cushing病の発症に重要な役割を果たす可能性のあるUSP8の新たな基質タンパク質の候補が同定され、Cushing病の発症機構の解明にさらに一歩近づいたと言える状況である。また、カベオリンのリソソーム輸送の制御機構に関し、VCPとAnkrd13タンパク質がエンドソーム上で協調してユビキチン化されたカベオリン多量体を単量体に解離することにより、多量体を形成する細胞膜タンパク質を効率よくリソソームに輸送する新たな制御機構を解明した。MHC class II分子のリソソーム輸送の制御機構に関しては、MARCH-I欠損マウスの解析から、腸管粘膜固有層において制御性T細胞が増加していることを見出した。この現象はMHC class IIのユビキチン化部位を欠失したマウスにおいても認められたことから、MARCH-IによるMHC class IIのユビキチン化による制御が腸管における免疫恒常性に関与していることが示唆された。さらに、ユビキチン化された膜タンパク質に特異的に結合する分子群を同定し、それら分子の機能阻害実験から、ユビキチン化による膜タンパク質輸送の制御に関与する新規候補分子を見出している。1)脱ユビキチン化酵素USP25が、そのユビキチン結合モチーフUIMを介してLys48連結ユビキチン鎖に選択的に結合することにより、Lys48連結ユビキチン鎖に対する切断特異性を獲得することを解明した。さらに、UIMの結合特異性をLys63連結ユビキチン鎖に改変することで、USP25の基質特異性をLys63連結ユビキチン鎖に改変することに成功した(Sci. Rep. 2017、科学新聞で報道)。2)上皮細胞増殖因子EGF依存的なEGF受容体のユビキチン化について、新たに開発したユビキチン鎖の鎖長決定法と質量分析を組み合わせ、その修飾が主にユビキチン46個のつながったLys63連結ポリユビキチン化修飾であることを解明した(東京都医学総合研究所との共同研究、投稿中)。3)脱ユビキチン化酵素USP5が熱ストレスにより誘導されるストレス顆粒に局在化し、そこで遊離ユビキチン鎖を切断することにより、細胞が熱ストレスから解放された時のストレス顆粒の解消に重要な役割を果たすことを解明した(投稿準備中)。4)Cushing病で見られる変異USP8がインポーチンと結合して核に局在化し、副腎皮質刺激ホルモンの前駆体タンパク質プロオピオメラノコルチンの遺伝子の転写活性化因子を安定化すること、またグルココルチコイドによるフィードバック抑制を制御する転写コリプレッサーNCoR2の発現量を低下させることを解明した(未発表)。5)胸腺皮質上皮細胞においてユビキチンリガーゼMARCH-VIIIがMHCクラスII分子をユビキチン化して制御すること、その制御をCD83が抑制することを解明した。また、MHCクラスII分子の恒常的なユビキチン化により樹状細胞のサイトカイン産生能に異常をきたすことから、そのユビキチン化によるプロテオスタシス制御が抗原提示細胞の機能制御に重要であることを解明した。
糖尿病患者へのがん化学療法レジメン提案に向けた基礎・臨床での有効性・安全性評価

実際に治療が行われた患者の情報を用いた実態調査と、細胞や動物を用いた実験を行う。実態調査では、過去の診療情報(カルテ)を用いて、臨床現場で頻用されている抗がん剤であるフルオロウラシルを含むがん化学療法を施行された患者を対象として、糖尿病の有無による、副作用や生存期間の違いを調査する。細胞や動物を用いた実験では、糖尿病モデルを作製し、抗がん剤投与によるがん細胞数や腫瘍の大きさを比較する。
癌細胞におけるＧ２チェックポイント機構の解明と新規治療法の開発

本研究では、上記研究課題に対して網羅的なリン酸化プロテオーム解析を行い、細胞周期G2期およびM期においてLATS1によりリン酸化を受ける新規基質の同定を試みた。その結果、APC/Cのcomponentの一つであるCDC26を同定した。リン酸化部位の同定を試みたところ、リン酸化部位は複数個所存在することが明らかとなった。さらにリン酸化部位それぞれの機能解析を行ったところ、CDC26 T7は分裂期においてLATS1によるリン酸化を受けること、CDC26 T7のリン酸化によってAPC6との結合に変化が生じ、APC/Cの会合に影響することを示した。LATS1/2が直接APC/Cに作用するメカニズムの存在を初めて明らかにすることができたため、論文発表を行った。(Masuda K, et al. PLoSOne. 2015)さらにCDC26のカルボキシル末端に存在するリン酸化部位に着目したところ、同部位にはBRCT binding motifを有しており、LATS1によるリン酸化を受けることで、BRCT domainを有する蛋白質との結合が変化することが示された。現在は、DNA損傷時におけるCDC26と同定した蛋白質との関連を解析し、論文投稿を予定している。27年度が最終年度であるため、記入しない。LATS1(Large tumor suppressor)は癌抑制遺伝子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼである。LATS1と相同性をもつDbf2キナーゼは、分裂酵母においてDbf2-Cdc14伝達系によりユビキチンリガーゼであるAPC/Cを介して、分裂期脱出(Mitotic Exit Network: MEN)を制御することが知られている。一方でLATS1の細胞周期分裂期における詳細な制御機構については不明な点も多い。そこで本研究では、LATS1による細胞周期における新たな機能を解明するため、網羅的なリン酸化プロテオーム解析を行った。LATS1によりリン酸化されるタンパク質を探索したところ、APC/Cのcomponentの一つであるCDC26を同定した。続いてリン酸化部位を同定するために、in vitro kinase assay解析を行った結果、CDC26 T7のリン酸化部位を同定した。CDC26 T7に対するリン酸化抗体を作成し解析したところ、分裂期でCDC26 T7のリン酸化が増強し、LATS1およびLATS2のノックダウンにより減少することから、LATS1/2がCDC26のリン酸化に関与していることが明らかになった。CDC26はAPC/C内においてTPR(tetratricopeptide repeat)モチーフを有するAPC6と直接結合しているが、T7をアスパラギン酸(D)に変異したタンパク質(CDC26 T7D)ではAPC6との結合が低下した。さらに内在性のCDC26をCDC26 T7Dに置換し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより解析を行うと、APC/Cの会合が変化した。本研究により、APC/Cをリン酸化するキナーゼとしてLATS1/2が同定され、LATS1/2が直接APC/Cに作用するメカニズムが存在することが明らかとなった。今回、LATS1の新規基質としてCDC26を同定することができた。CDC26は、ユビキチンリガーゼAPC/Cを構成するタンパク質の一つである。解析対象がタンパク質の複合体であるために、タンパク質間の結合やAPC/Cの機能解析を証明するために非常に苦労したが、他施設との共同研究を行うことにより、ゲル濾過クロマトグラフィー及び分子動力学的シミュレーション解析による多角的なアプローチを行うことができた。その結果、論文発表に至ることができたため当初の計画以上の進展があったと評価したいと考えている。今回、LATS1によりリン酸化されるタンパク質としてCDC26を同定し、CDC26 T7がリン酸化部位であることを発表した。研究の段階で、CDC26のカルボキシル末端にはBRCT bindingmotifを有し、LATS1によるリン酸化を受けるセリン/スレオニンが存在することを得ている。今後はさらにカルボキシル末端のリン酸化部位の意義について解析を行い、LATS1による分裂期制御機構を解明したいと考えている。