hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粘性解理論とその材料科学分野への応用

非線形偏微分方程式、特に材料科学の分野に現れる、物質の異なる二相を隔てる曲面である界面の運動を記述する方程式を、微分方程式の弱解の概念の一つである粘性解の理論を用いて調べている。解の一意性や存在性、また解の漸近挙動などの諸性質を調べることで、それらの方程式に数学的基礎付けを与えることを目的としている。平成26年度の主な研究内容は以下の通りである。1:非強圧なハミルトン・ヤコビ方程式に対する均質化問題を考える際に現れる、セル問題の可解性について調べた。均質化とはマクロな問題をミクロな問題の極限として理解する手法であり、数学的には微分方程式に対するある種の特異極限問題として記述される。古典的にはハミルトニアンが強圧的ならばセル問題の可解性が知られているが、非強圧な場合は一般に可解ではない。そこで本研究では、非強圧なハミルトニアンに対する適当な近似を考えることで、一般化された実効ハミルトニアンの概念を導入し、それを用いてセル問題の可解性を特徴付けた。また均質化が起きるための十分条件をいくつか与えた。2:グラフで表すことができない界面の運動を追跡するための手法として知られる、等高面法の改良について研究した。従来の等高面法では、時間が経つにつれて解の傾きが小さくなる場合があり、計算機では等高面を取り出すことが困難になるという実用上の問題がある。この解決のため、元の等高面方程式にパラメータを含む修正項を加えた新しい方程式を導入し、パラメータの極限を取ったときの解の挙動、特に界面への(符号付き)距離関数への収束を調べた。距離関数が連続な場合は、解が時空の両変数に関して距離関数に局所一様収束していくことを、緩和極限の手法を用いて証明した。一方で距離関数が連続でない場合は、局所一様収束は期待できないが、時間変数に関する極限を前の時間からだけ取れば、解が距離関数に収束することを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。
視細胞変性へのカルパインの関与とその制御による新しい視細胞保護治療法の可能性

カルシウム結合性タンパク分解酵素であるカルパインが網膜色素変性モデル動物における視細胞変性進行過程でどのように視細胞死に関与するかを研究した。Royal College Surgeon's (RCS)ラットの変性初期にミトコンドリアカルパインが細胞質カルパインの活性上昇に先立って活性が上昇することを発見した。さらに変性初期にカルパイン阻害薬をRCSラット硝子体中に投与すると視細胞死が特異的に阻害されることを見いだした。遺伝性網膜変性疾患の代表疾患である網膜色素変性は進行性の視細胞変性を主体とする難病である。本疾患は原因遺伝子異常にともなう視細胞のアポトーシスないしネクローシスがその本体であると考えられている。治療法開発においてアポトーシスやネクローシスによる視細胞死の抑制による視細胞保護はひとつの有力な候補となりうる。本研究はその点に着目し、視細胞アポトーシスに関係していると考えられるカルシウム結合性タンパク分解酵素であるカルパインの視細胞死における役割とその抑制が視細胞保護におよぼす効果について、網膜色素変性モデル動物のひとつであるRCS(Royal College of Surgeons)ラットを用いて実験的に検討した。まず、RCSラット網膜から細胞分画法により細胞質画分とミトコンドリア画分を調整し、それぞれの画分に含まれるカルパインをウェスタンブロット法と酵素活性測定法により定量的ないし定性的に測定した。その結果、網膜細胞の細胞質ならびにミトコンドリア画分それぞれにカルパインが存在していることが明らかになった。RCSラットの網膜変性の進行とカルパインの酵素活性ならびにタンパク質発現との関係を調べてみると、網膜変性の進行にともなってカルパイン活性が増大していることが明らかになった。それぞれの画分での活性上昇時期を比較してみると生後4週目でミトコンドリア画分のカルパインが活性上昇を示すのに対して、細胞質画分は生後5週目で活性上昇を示した。この結果はRCSラット網膜変性では細胞質カルパインに先駆けてミトコンドリアカルパインがまず最初に活性上昇を示し、視細胞変性に重要な働きを担っている可能性が示唆された。今年度の結果から、ミトコンドリアカルパインがアポトーシス誘導因子を活性化し、アポトーシス誘導を引き起こしている可能性が考えられ、その点を明らかにするために次年度においてはRCSラットの眼内にカルパイン阻害剤を注射することによる網膜変性阻止効果についてさらに解析する予定とした。カルパインはタンパク質分解酵素で細胞質とミトコンドリアに存在する。本研究において申請者はRCSラット網膜変性においてミトコンドリアカルパインの活性が生後3週から4週齢にかけて細胞質カルパイン活性の上昇に先んじて上昇することを突き止めた。さらにミトコンドリアカルパインが細胞死の際に働くアポトーシス誘導因子をミトコンドリア内で活性化しミトコンドリアから核内への移行に関与することを明らかにした。これらの事実からミトコンドリアカルパインがRCSラット網膜変性の進行に関わっていることを予想し、カルパイン阻害剤によってカルパイン活性を抑制した時に網膜変性が抑制されるか否かを検討した。カルパイン阻害剤を生後25日と32日齢とに別々のRCSラット硝子体に注射したところ、ミトコンドリアカルパインの活性上昇が起きる生後25日齢の段階で硝子体注射を行った場合にのみ、ラット視細胞アポトーシスが有意に抑制され視細胞が保護されたのに対し、生後32日齢で注射した場合には有意な視細胞アポトーシスの抑制はみられなかった。この実験結果から、ミトコンドリアカルパインの活性上昇が始まる時点でカルパインを抑制した場合に視細胞アポトーシスが抑制され、細胞質カルパイン活性上昇が始まる時点でのカルパイン阻害剤注射は効果がなかったことが分かった。これらの結果は将来、カルパイン抑制を網膜色素変性の治療ターゲットとする場合に参考になる所見であると思われる。
コヒーレント偏極電子プローブを活用した次世代スピン分析法の開発

スピン偏極電子銃の電子顕微鏡への搭載を実現した。電子銃、差動排気チャンバーそれぞれの超高真空状態を維持できることを確認し、特殊な表面状態を有する電子線発生部の安定動作を実現した。次に、電子線発生ならびに電子顕微鏡SEMへの輸送を行い、電子顕微鏡像の取得に成功し、電子線がもつエネルギー線幅が非常に狭いことによる分解能向上が確認された。最も困難とされる光励起電子源を用いた電子顕微鏡像の取得に成功しており、この点は当初計画よりも大きく進んでいると言える。一方、スピン計測用試料としてナノ構造パターニングした磁性体試料作成を進めた。EBリソグラフィーを用いて数百ナノメートルサイズの磁性金属多層膜の作製に成功し、その構造から起因する磁壁構造の変化の観察に成功した。さらにスキルミオンの発現が期待されるPt/Co/Ta多層膜の作製には膜厚精度をサブナノメートルまで必要とするため、パルスレーザー蒸着(PLD)法を用いて重金属蒸着の高精度制御の確立を進めた。この結果、1層ごとの重金属または磁性金属の厚み精度をナノメートルまで制御することに成功し、ネールタイプスキルミオンが観察される試料の作製に成功した。また、コヒーレントなスピン偏極電子線光路上に空間位相変調絞りを挿入し、空間位相変調を生じることをスピン偏極透過電子顕微鏡(SPTEM)にて確認する。その後、TEMに搭載している電子線バイプリズムを用いて干渉縞を生成し、その一次干渉項から空間的に位相が変調していることを確認した。H30年度の研究内容は、1)スピン偏極電子銃の電子顕微鏡への搭載と空間分解能の検証、2)ナノパターニングされた強磁性体材料の作成と観察、3)空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の生成の3つである。これら3項目ともに当初計画通り進んでおり、次年度に控える研究に遅延などの影響を及ぼすことなく進行している。さらに、最も困難とされる光励起電子源を用いた電子顕微鏡像の取得に成功しており、この点は当初計画よりも進んでいるところとなる。これにより、次年度以降に計画されるスピン依存性の計測、空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の応用などが計画通り進められる見通しとなる。平成30年度に作成した装置をもちいてスピン依存性の計測に挑む。まず、電子顕微鏡像を用いて、各電子線エネルギー、収束角に対する空間分解能を計測する。これにより、低加速条件においても、色収差低減効果による空間分解能の向上が実現されることを確認する。その後、BSE検出強度におけるスピン依存性の計測を実現する。これに必要となる試料として、低真空環境下でも観察可能な強磁性酸化物を準備し、その後方散乱電子の入射スピン方向に対する検出強度依存を実施する。この信号処理については自動的に差分強度マッピングが表示される計測制御システムを構築し、スピン依存性を最大化するエネルギー条件を見出す。散乱断面積のスピン依存性を物質のフェルミレベル近傍の電子スピン状態と合わせて明らかにする。また、逆光電子分光が可能となるよう光検出についても検討を進める。スピン検出に最適な試料の作製についても引き続き進め、前述のスピン計測としての効果が十分に引き出せる条件を見出し、局所スピン状態の緩和過程の学理的解明を目指す。スピン偏極したコヒーレント電子線の生成が可能なスピン偏極電子銃を、走査電子顕微鏡に搭載するため、電子光学設計を行い、最適なレンズ位置と絞り位置を決定した。これを元に、電子銃とSEM本体を接続する超高真空チャンバーを設計・作成し、イオンポンプ、NEGポンプ、コリメーターレンズおよび固定・可動絞りを含む差動排気システムを完成させた。さらに、電子顕微鏡本体と電子銃との接続確認を実施した。これと並行してスピン偏極BSE検出器の設計を実施した。これにより、後方散乱電子の入射スピン方向に対する検出強度依存を測定が可能となる、検出器感度、検出器設置空間の制限を考慮した最適な検出方法を検討した。一方、スピン計測用試料としてマルチフェロイック物質合成を進めた。焼結法によるバルク材の作製とPLD蒸着法を用いた多層薄膜構造材料の作製の両面で進め、組成比、温度、雰囲気条件などの条件出しを実施した。これにより、バルク材において転移温度が室温付近に存在する組成比を見出すことに成功した。また、ローレンツTEM像によりスキルミオン状態が発現する印加磁場とスキルミオン格子サイズを確認した。さらに、空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の生成をじつげんするため、コヒーレントなスピン偏極電子線を用いて軌道角運動量を付加したスピン偏極-電子らせん波の生成を目指した。このため、既存のスピン偏極透過電子顕微鏡(SPTEM)に、試料照射前位置にフォークマスク型絞りからなる空間位相変調絞りを挿入し、軌道角運動量を付加した電子線を生成し、回折図形を取得することに成功した。H29年度の研究内容は、1)スピン偏極電子銃の低加速SEMへの搭載のための電子光学設計と連結用差動排気室作成、それを検出する2)スピン偏極BSE検出器の設計、3)空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の生成、4)スピン計測用測定試料の作成の4つに分けられる。これら4項目ともに当初計画通り進んでおり、次年度に控える研究に遅延などの影響を及ぼすことなく進行している。これにより、次年度以降の装置組立、BSE検出強度におけるスピン依存性の計測、空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の生成などが計画通り進められる見通しが立っている。

電子銃、差動排気チャンバーそれぞれの超高真空状態を維持できることを確認し、特殊な表面状態を有する電子線発生部の安定動作を実現した。次に、電子線発生ならびに電子顕微鏡SEMへの輸送を行い、電子顕微鏡像の取得に成功し、電子線がもつエネルギー線幅が非常に狭いことによる分解能向上が確認された。最も困難とされる光励起電子源を用いた電子顕微鏡像の取得に成功しており、この点は当初計画よりも大きく進んでいると言える。一方、スピン計測用試料としてナノ構造パターニングした磁性体試料作成を進めた。EBリソグラフィーを用いて数百ナノメートルサイズの磁性金属多層膜の作製に成功し、その構造から起因する磁壁構造の変化の観察に成功した。さらにスキルミオンの発現が期待されるPt/Co/Ta多層膜の作製には膜厚精度をサブナノメートルまで必要とするため、パルスレーザー蒸着(PLD)法を用いて重金属蒸着の高精度制御の確立を進めた。この結果、1層ごとの重金属または磁性金属の厚み精度をナノメートルまで制御することに成功し、ネールタイプスキルミオンが観察される試料の作製に成功した。また、コヒーレントなスピン偏極電子線光路上に空間位相変調絞りを挿入し、空間位相変調を生じることをスピン偏極透過電子顕微鏡(SPTEM)にて確認する。その後、TEMに搭載している電子線バイプリズムを用いて干渉縞を生成し、その一次干渉項から空間的に位相が変調していることを確認した。H30年度の研究内容は、1)スピン偏極電子銃の電子顕微鏡への搭載と空間分解能の検証、2)ナノパターニングされた強磁性体材料の作成と観察、3)空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の生成の3つである。これら3項目ともに当初計画通り進んでおり、次年度に控える研究に遅延などの影響を及ぼすことなく進行している。さらに、最も困難とされる光励起電子源を用いた電子顕微鏡像の取得に成功しており、この点は当初計画よりも進んでいるところとなる。これにより、次年度以降に計画されるスピン依存性の計測、空間位相変調したコヒーレントスピン偏極電子線の応用などが計画通り進められる見通しとなる。平成29年度に作成した装置群を接続し、電子銃、差動排気チャンバーそれぞれの真空状態が維持されることを確認する。その後、スピン偏極電子線をSEM本体に通し、二次電子(SE)像を取得する。このSE像を用いて、各電子線エネルギー、収束角に対する空間分解能を計測する。これにより、低加速SEMにおいて色収差低減効果による空間分解能の向上が実現されることを確認する。また、BSE検出強度におけるスピン依存性の計測を実現するため、低真空環境下でも観察可能な強磁性酸化物を試料とし、その後方散乱電子の入射スピン方向に対する検出強度依存を測定する。スピンアップ・ダウンの2信号の差分BSE像の取得を実施し、そのスピン差分BSE像における入射電子エネルギー依存を解析する。信号処理についてはコンピューター上に自動的に差分強度マッピングが表示される信号処理系を構築し、スピン依存性を最大化した検出条件を探し、散乱断面積のスピン依存性を物質のフェルミレベル近傍の電子スピン状態と合わせて明らかにする。
高齢者の健康寿命延伸をめざす第一次・二次予防での歯槽骨再生法の開発

高齢化社会が進む我が国において、口腔顎機能低下や歯牙喪失から国民を守り、健康寿命の延伸を図ることは喫緊の課題である。その中で、55-64歳における有病率が80%を超える歯周疾患、なかでも歯槽骨欠損からの回復が可能となれば、高齢者のQOL向上のみならず、国民医療の大幅な改善が見込める。実際の歯周組織再生では、骨欠損形態の中でも3壁性の骨欠損は比較的治癒の可能性が高いが、観血手術を行っても歯槽骨の完全再生は難しい。ましてや、発症前に定期受診で発見される歯槽骨欠損、すなわち第一次・二次予防レベルでの再生は更に難しい。そこで我々は様々な歯牙関連組織から採取した細胞を使って硬組織再生能を検討した。細胞はヒト歯髄細胞、ヒト歯肉上皮細胞、ヒト歯肉線維芽細胞を使用し、石灰化の誘導を図るため、Micromass culture法と単層培養でそれぞれ播種した。2ー3日培養後、アスコルビン酸とβ-GPを添加した培養液(石灰化培地)に切り替え、3日ごとに培養液を換えながら、3週間培養した。石灰化の評価は、アルカリフォスファターゼ染色とフォンコッサ染色で行った。染色後、それぞれ顕微鏡下で観察の後、写真を撮り、画像解析ソフトを使用して染色されたエリアの解析を行った。Micromass culture法下での培養では、各細胞とも有意な石灰化能の上昇は確認されなかった。単層培養においてもヒト歯髄細胞、ヒト歯肉上皮細胞では有意な差がみられなかったが、ヒト歯肉線維芽細胞ではALP活性と石灰化物の析出において石灰化培地群で有意な上昇がみられた。ヒト歯肉線維芽細胞において単独で骨形成能を持つ細胞への分化への可能性が示唆された。これにより、新たな歯周治療法の開発、すなわち、第二次予防での歯周炎の初期治療への貢献が期待される。本年度は、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)からの石灰化誘導法の確立を目指して行った。HGFを播種し、24時間後にウェル表面を覆うように培養液を追加し、中心部がコンフルエントになるまで2ー3日培養する。その後、アスコルビン酸とβ-グリセロフォスフェイトを添加した培養液に切り替え、2日ごとに培養液を換えながら、3ー4週間培養する。この手法の特徴は、培養皿の中心部に高濃度に細胞を播くことで、早期に高密度な培養状態を作り出し、骨系の細胞への分化の促進をはかろうとするものである。石灰化の評価は、まず4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、洗浄後、骨芽細胞のマーカーであるALP染色を行い、その後、析出した石灰化物の評価としてフォンコッサ染色を行う。現在、HGFでは安定的に石灰化が起きないため、細胞をヒト歯髄幹細胞やHGFから間葉系幹細胞マーカーであるCD90やCD45で選択された細胞で再実験を行っている。これは難しい歯槽骨再生に道を拓く。本研究では、この石灰化現象を生じる歯肉線維芽細胞集団の機能を解明し、これをエピタキシーとし、新たな侵襲がほとんど無い歯槽骨再生法を開発し、高齢者の健康寿命の延伸を図ることを目的とする。現在、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)を異所性石灰化の誘導を図るため、Micromass culture法により24結のマルチウェルプレート上に5x104cells/150uMのドロップになるように播き、24時間後にウェル表面を覆うように培養液を追加し、中心部がコンフルエントになるまで2ー3日培養。その後、アスコルビン酸とβ-グリセロフォスフェイトを添加した培養液に切り替え、2日ごとに培養液を換えながら、3ー4週間培養しているが、染色後の石灰化度の差が大きく出ており。結果が安定してこない。理由としては採取した組織の個体差が考えられる。分離した細胞には未成熟なものが含まれており、石灰化が起きるときはそれらから骨系の細胞へ分化しているものと考えられる。高齢化が進む我が国において、歯牙喪失を始めとする口腔機能低下から国民を守り、健康寿命の延伸を図ることは喫緊の課題である。その中で、5564歳における有病率が80%を超える歯周疾患、なかでも歯肉炎、歯周炎の悪化によって生じる歯槽骨欠損状態からの機能回復が可能となれば高齢者のQOL向上のみならず、増加の一方をたどる国民医療費の大幅な改善が見込める。本年度はヒト線維芽細胞で安定的な石灰化現象が確認されないため、細胞種・播種法等を変更して再実験を行った。

染色後、それぞれ顕微鏡下で観察の後、写真を撮り、画像解析ソフトを使用して染色されたエリアの解析を行った。Micromass culture法下での培養では、各細胞とも有意な石灰化能の上昇は確認されなかった。単層培養においてもヒト歯髄細胞、ヒト歯肉上皮細胞では有意な差がみられなかったが、ヒト歯肉線維芽細胞ではALP活性と石灰化物の析出において石灰化培地群で有意な上昇がみられた。ヒト歯肉線維芽細胞において単独で骨形成能を持つ細胞への分化の可能性が示唆された。これにより、新たな歯周治療法の開発、すなわち、第二次予防での歯周炎の初期治療への貢献が期待される。本年度は前年度においてヒト線維芽細胞で安定的な石灰化現象が確認されなかったことを受け、細胞種・播種法等を変更して再実験を行った。細胞はヒト歯髄細胞、ヒト歯肉上皮細胞、ヒト歯肉線維芽細胞を使用し、石灰化の誘導を図るため、Micromass culture法と単層培養でそれぞれ播種した。2ー3日培養後、アスコルビン酸とβ-GPを添加した培養液(石灰化培地)に切り替え、3日ごとに培養液を換えながら、3週間培養した。石灰化の評価は、アルカリフォスファターゼ染色とフォンコッサ染色で行った。播種条件を変えたことで、比較的安定して石灰化現象がみられるようになったと考えられる。高齢化社会が進む我が国において、口腔顎機能低下や歯牙喪失から国民を守り、健康寿命の延伸を図ることは喫緊の課題である。その中で、55-64歳における有病率が80%を超える歯周疾患、なかでも歯槽骨欠損からの回復が可能となれば、高齢者のQOL向上のみならず、国民医療の大幅な改善が見込める。実際の歯周組織再生では、骨欠損形態の中でも3壁性の骨欠損は比較的治癒の可能性が高いが、観血手術を行っても歯槽骨の完全再生は難しい。ましてや、発症前に定期受診で発見される歯槽骨欠損、すなわち第一次・二次予防レベルでの再生は更に難しい。そこで我々は様々な歯牙関連組織から採取した細胞を使って硬組織再生能を検討した。ヒト歯肉線維芽細胞において単独で骨形成能を持つ細胞への分化への可能性が示唆された。
真菌のエネルギー獲得機構のなりたちと分子進化

カビや酵母などの真菌は、醸造・発酵産業に利用され我々の生活に利益をもたらすとともに、動植物の病原菌として厄介な存在でもある。本研究では、真菌の生命の維持に必要なエネルギー代謝に注目し、これを解明することによって、真菌の生育(繁殖)の制御に関する知見を得ることを試みている。また、得られた知見を他の生物のそれと比較・検証することにより、真菌のエネルギー獲得機構のなりたちと分子進化を考察することを目指した。糸状菌F.oxysporumのniaD変異株の脱窒能の低下、これにniaDを導入することによる脱窒能の回復から、niaDが硝酸の同化だけでなく脱窒に寄与する可能性を見出した。さらに、NiaD、P450nor両遺伝子のプロモーター領域にβ-galactosidase(β-gal)遺伝子を連結したレポーター解析を行い、嫌気的な脱窒条件下の細胞内β-gal活性が好気条件下のものと比較して数倍上昇することを見出し、これらの遺伝子の発現が転写レベルで調節されることを解明した。酵素活性の発現の上昇も脱窒による亜酸化窒素の生成と相関しており、NiaDが脱窒に寄与している可能性が示された。一方、NADH依存的にS-0をH_2Sに還元するSRの活性がミトコンドリア画分および細胞質画分に見出されることを示した。その活性は呼吸鎖電子伝達系の阻害剤に感受性であった。また、ミトコンドリア画分内にNADHとS^0に依存したATP生成活性が見出され、呼吸差阻害剤の添加によってSR活性とともにこのATP生成活性が阻害された。これらの結果から、SR活性が呼吸鎖電子伝達系を介したATPの生産に寄与(硫黄呼吸)すると考えられた。Aspergillus nidulansにA.nidulansの染色体DNAライブラリーを導入し、亜硝酸耐性の表現型を賦与する遺伝子ANO121を取得することに成功した。亜硝酸を添加した培地を用いて野生型株とANO121導入株を培養したところ、前者の菌糸は分岐の多い異常な形態を示したが、後者の菌糸は正常であった。また、同じ培地を用いた場合、前者に比べ、後者の分生子の発芽率は高く菌糸の生長が速かった。これらの結果から、ANO121は、亜硝酸が菌糸の正常な生長や胞子の発芽に与える傷害を防ぐ機能を持っことが明らかとなった。ANO121は、ヘムの生合成に関わるポルホビリノーゲンデアミナーゼをコードする遺伝子に対応することから、細胞内のヘム濃度の上昇と亜硝酸耐性の関与が初めて明らかとなった。糸状菌F.oxysportumのniaD変異株の脱窒能の低下、これniaDを導入することによる脱窒能の回復から、niaDが硝酸の同化だけでなく脱窒に寄与する可能性を見出した。さらに、NiaD、P450nor両遺伝子のプロモーター領域にβ-galactosidase(β-gal)遺伝子を連結したレポーター解析を行い、嫌気的な脱窒条件下の細胞内β-gal括性が好気条件下のものと比較して数倍上昇することを見出し、これらの遺伝子の発現が転写レベルで調節されることを解明した。一方、NADH依存的にS^oをH_2Sに還元するSRの活性がミトコンドリア画分および細胞質画分に見出されることを示した。また、ミトコンドリア画分内にNADHとS^<o>に依存したATP生成活性が見出され、呼吸差阻害剤の添加によってSR活牲とともにこのATP生成活性が阻害された。これらの結果から、SR活性が呼吸鎖電子伝達系を介しだATPの生産に寄与(硫黄呼吸)すると考えられた。Aspergillus nidulansにA.nidulansの染色体DNAライブラリーを導入し、亜硝酸耐性の表現型を賦与する遺伝子AN0121を取得することに成功した。亜硝酸を添加した培地を用い七野生型株とANO121導入株を培養したところ、前者の菌糸は分岐の多い異常な形態を示したが、後者の菌糸は正常であった。これらの結果から、AN0121は、亜硝酸が菌糸の正常な生長や胞子の発芽に与える傷害を防ぐ機能を持つことが明らかとなった。AN0121は、ヘムの生合成に関わるポルホビリノーゲンデアミナーゼをコードする遺伝子に対応することから、細胞内のヘム濃度の上昇と亜硝酸耐性の関与が初めて明らかとなった。申請者らの研究などから、真菌(カビ)などの真核生物があたかも原核生物(細菌)のように、多様な無機・有機物を最終的な酸化剤として発酵や呼吸をすることが明らかとなってきた。

1996年に本邦の研究グループにより、カビFusarium oxysporumが硝酸呼吸(脱窒)を行い嫌気的条件下で生育することが、真核生物としては初めて報告された。本研究では、この詳細を解明すると共に、新規な発酵・呼吸系を見いだした。これにより、真核生物が酸素呼吸に依存せずに生育できること、真核生物の嫌気的エネルギー獲得機構が多様性をもつこと、カビが低酸素条件下への適応機構をもつことが明らかとなった。本研究の成果の要点は、(1)カビF.oxysporumとAspergillus nidulansをモデルとして、これらの多様な嫌気代謝系(硝酸呼吸、アンモニア発酵、異化的硫黄還元)の未同定の構成成分を明らかとしたこと、(2)これらの代謝系の相互関係、発現制御機構を多面的に解析し、カビの嫌気的エネルギー代謝の「なりたち」の一部を解明したことである。この成果は、真核生物のエネルギー代謝の多様性を示す例として科学的意義が高い。一方、一連の研究がなされる以前には、これらの嫌気的なエネルギー獲得機構は原核生物固有のものであり、進化的に古い代謝であると考えられていた。本研究により、将来、原核生物から高等真核生物に至る「エネルギー獲得機構の変遷・分子進化」を考察する上で重要な手がかりを得ることができた。即ち、最も下等な真核生物の一つであるカビがこのような嫌気代謝を行うことは、原核生物から真核生物に到る過程でのエネルギー獲得機構の進化に対する知見を知る上でも重要となるであろう。
上気道通気障害小児の過大吸気陰圧は下顎を後退させる －流体構造連成解析を用いて－

本研究は、小児の鼻閉が下顎の後退におよぼす影響について影響を調べた。62人の小児は、ClassI、IIとIII群に分けられた。鼻腔抵抗と吸気と呼気圧は流体解析によって求められた。クラスII群の鼻抵抗はその他の2つの群のそれより有意に高かった、そして、Class II群の吸気圧はClass IとIII群のそれより大きかった。気道吸気と呼気圧差はClass II群(ー27.38Pa)は、Class I群(ー5.17Pa)とIII群(0.68Pa)のそれより大きかった。Class II小児における鼻閉による大きい気道吸気と呼気圧差は下顎後退に関連があった。下顎後退咬合の原因因子として上気道通気障害児の咽頭気道吸気時過大陰圧の影響を明らかにすることを目的に、CTデータを用いた上気道の流体構造連成解析から呼吸時の顎顔面に生じる圧力を算出し、上気道通気障害と顎顔面形態との関連について検討を行った。その結果、上気道通気障害に起因する呼吸圧力が下顎後退咬合を引き起こす可能性があることが示され、今後の歯列咬合管理上、予防・治療に貢献できる情報になると考えた。下顎後退咬合の原因因子として上気道通気障害児の咽頭気道吸気時陰圧の影響を明らかにすることを目的に、CTデータを用いた上気道の流体構造連成解析から顎顔面に生じる圧力を算出し、上気道通気障害と顎顔面形態との関連について検討を行った。その結果、上気道通気障害に起因する呼吸圧力が下顎後退咬合を引き起こす可能性があることが示唆され、今後の歯列咬合管理上、予防・治療に貢献できる情報になると考えた。予定通りの進行状況である。小児歯科学さらに対象年齢を変えて、因果関係だけでなく、原因についても明らかにしていきたい。研究は順調に進んでいるものの、その途中さらに必要な解析が考えられるようになった。そのため、その解析の方法論を検討しているうちに時間が経過してしまい、次年度にその計画を持ち越すことになった。新たな解析のためのソフトの購入を考えている。
舌後方1/3電気刺激による舌咽神経誘発電位の研究

Penthobarbital麻酔下の雑種成犬を用いて、昨年度の研究から明らかとなった舌咽神経知覚枝の示適刺激部位(舌の正中線から10mm外側で有郭乳頭後縁から15mm後方)を0.2msec幅の矩形波で双極電気刺激した。両側後頭下開頭と両側前頭頭頂開頭を行い、大脳皮質上に複数個の銀ボール電極を設置して、舌後方を電気刺激した際に大脳皮質上から再現性のある電位が記録できるかどうか検討した。刺激対側のcoronal gyrus上から頂点潜時が20.1±3.7と35.7±8.2msec(n=6)の再現性のある二相性電位が記録された。刺激同側のcoronal gyrus上からも振幅は小さいが二相性電位が記録された。この電位が記録された部位は、口唇の電気刺激により誘発された三叉神経誘発電位が記録された範囲よりも後方で狭い範囲に限局していた。またこの電位は、頸部で露出させた舌咽神経を直接電気刺激した際に大脳皮質上から記録された電位とほぼ同じ波形と潜時であった。刺激側小脳橋角部で三叉、顔面、迷走、副、舌下の各脳神経を切断しても電位の波形に変化は認めなかったが、舌咽神経に1%Lidocaineを塗布すると電位は消失し、時間経過に従い電位の振幅が回復した。舌咽神経の切断でこの電位は消失した。以上の結果から、舌後方を電気刺激することで主に刺激対側の大脳皮質上からされた電位は、舌咽神経誘発電位と考えられた。雑種成犬を用いて、舌咽神経知覚枝の分布領域である舌後方1/3を電気刺激し、舌咽神経の神経活動電位の記録を試みた。Pentobarbital麻酔下に、舌咽神経知覚枝の分布領域である有郭乳頭より後方の舌に2本のステンレス針電極を刺入し0.2msec幅の矩形波で双極電気刺激を加えた。両側後頭開頭とC1-laminectomyを行い、舌咽神経上に銀ボール電極を設置して複合神経活動電位を記録した。銀ボール電極を、三叉、顔面、迷走、副、舌下の各脳神経上において電位の記録を試みた。また小脳橋角部の硬膜上や開頭部近傍の筋肉上にもおいて電位の波及を検討した。刺激側の舌咽神経上から、再現性のある多相性の電位が記録された。舌の刺激部位を5mm間隔で移動させたところ、正中から10mm外側で有郭乳頭後縁から15mm後方の部位の刺激で最も振幅の大きな電位が記録され、このときの波形の潜時は2.76±0.63(mean±SD : n=17)であった。刺激強度を漸増させていくと2mAから電位が記録され、10mAでほぼ一定となった。このとき三叉、顔面、迷走、副、舌下の各脳神経上からは再現性のある電位は記録されなかった。筋弛緩薬の投与前後で電位に変化はみられず、また呼吸・血圧・心拍数にも変化を認めなかった。記録部位遠位側の舌咽神経に1% Lidocaineを塗布すると舌咽神経上で記録された電位は消失し、時間経過に従い電位は回復した。以上の結果から、有郭乳頭より後方の舌を電気刺激することで小脳橋角部の舌咽神経上から記録された電位は、舌咽神経を経由した複合活動電位であると考えられた。舌を電気刺激することで、大脳皮質から舌咽神経誘発電位が記録される可能性が示唆された。
自然言語における省略可能な統語範疇に関する通言語的研究

本研究の最終的な目的は、自然言語の文において、省略することができる要素にはどのようなものがあり、省略することができない要素にはどのようなものがあるのかを明らかにすることである。この最終目標を達成するための足がかりとなるような基礎的な研究を、この2年間で行った。その結果、様々な言語の研究に応用できる可能性のある極めて一般性の高い方法論を確立することができた。今後は、この方法論に基づいて研究の射程範囲を広げていきたい。平成27年度は、日本語の項省略及びそれに関連する省略現象であるVP省略の研究を中心的に行った。その成果の一部は、日本英文学会関西支部第十回大会シンポジウム(「付加詞脱落と擬似空所化」2015年12月20日、武庫川女子大学)及び第138回NINJALサロン(「日本語の動詞句省略と付加詞脱落」2016年3月15日、国立国語研究所)において口頭発表を行った。さらに、この成果をまとめた論文("Verb-stranding verb phrase ellipsis in Japanese")を国際誌Journal of East Asian Linguisticsに投稿し採択された(2016年5月に出版)。日本語における(動詞残留型)VP省略の可能性は、Otani and Whitman (1991)で初めて議論された。しかしHoji (1998)やOku (1998)などでその存在が否定されて以降、日本語にVP省略はないというのが定説であった。したがって、日本語の省略現象の研究において、VP省略が議論の俎上に上ることはほとんどなかった。本研究は、この定説に疑問を投げかけ、日本語の省略現象を研究する際にVP省略の可能性を考慮に入れるべきであることを示した。日本語にVP省略が存在するという本研究の結論が正しいとすると、項省略やCP省略の研究に影響を及ぼす。なぜなら、これらの省略現象の一部はVP省略によっても実現可能だからである。したがって、項省略やCP省略の性質を研究する場合、あるいはそもそも日本語にこれらの省略が存在するのかを議論する場合には、VP省略の可能性を慎重に排除した上で議論する必要がある。当初の予定では平成27年度は、VP省略の通言語的研究を行う予定であった。しかし、通言語的研究を行うための足がかりとなる日本語のVP省略の存在を実証するためには、当初考えていたよりも、より複雑な議論が必要であることが分かり、日本語の研究に多くの労力を割かざるを得なかった。そのため、日本語に関しては当初予定していたよりも多くの成果を得ることができたが、その一方で日本語以外の言語に着手することができなかった。最終年度は、項省略の関連現象である動詞残留型VP省略の前提条件になっている動詞移動(述語移動)現象の研究を中心的に行った。その成果の一部は日本言語学会第152回大会ワークショップ(「動詞残余型動詞句削除分析」2016年6月26日、慶應義塾大学)および国立国語研究所領域指定型共同研究プロジェクト「日本語から生成文法理論へ:統語理論と言語獲得」第1回共同研究発表会(「日本語の動詞移動に関して」2016年12月26日ー27日、国立国語研究所)にて口頭発表を行った。関連する論文である"Verb-stranding verb phrase ellipsis in Japanese"が国際誌Journal of East Asian Linguisticsから出版された(Volume 25, Issue2, pp.113-142, 2016年5月)。また、省略現象一般に関する学問史的研究である"Ellipsis in transformational grammar"が論文集the Oxford Handbook of Ellipsisに掲載予定である(Maryland大学Howard Lasnik教授との共著、Oxford University Press)。日本語のような主要部後置型の言語において動詞移動の存在を示すためには、語順が手がかりにならないため、より抽象的で高度な統語的議論が必要になる。本研究では、VP前置という目に見える現象を手がかりにして、日本語に動詞移動が存在することを経験的に示した。日本語に動詞移動が存在するという本研究の主張が正しいとすると、前年度の研究から得られた結論である日本語ではVP省略が許されているという主張を補強することになる。なぜなら日本語のVP省略は動詞移動の存在を前提にしているからである。平成28年度は、前年度にやり残したVP省略の通言語的研究を行いつつ、日本語の疑問節縮約(IP省略)の研究に取り組みたい。言語学2015年10月16日から18日にかけてカナダのConcordia Universityで開催されたアメリカ北東部言語学会への参加を計画していたが、配偶者の病気による手術及び入院と重なったため参加を断念した。そのために外国旅費を支出しなかった。また、今年度は通言語的研究を行う予定であったが、「現在までの進捗状況」で書いたように、結果的に日本語の研究に集中することになった。その結果、通言語的研究に必要であった記述文法書を購入することなく、十分な研究を行うことができために次年度使用額が生じた。

次年度使用額が生じた結果得られた助成金の一部は、通言語研究において網羅する言語の数を増やすために、記述文法書(Routledge社のthe Descriptive Grammarsシリーズ全20巻)の購入にあてたい。また、一部は米国ペンシルバニア大学で開催されるPenn Linguistic Conferenceに参加するための旅費にあてたい。
電気化学処理法によるバラスト水処理に関する研究

本研究は,船舶のバラスト水を効果的に処理する電気化学処理用の電源装置,および,その処理システムを開発することを目的としており,初年度の平成15年度は,プランクトンを効果的に処理するための電源条件の実験的に検討し,電流・電圧・周波数等の電源条件,電極材料,電極の配置等と水質変化,プランクトンの除去効果の関係等を明らかにし,最終年度の平成16年度は海水温や多種のイオン濃度の計測結果をフィードバックして電源電圧・電流を自動制御する電源システムを構築することを予定していた.2年間の研究の結果,以下のことを明らかにした.・平成16年度:前年度の成果を基に,より高電流を流すことのできる電源装置により,処理効果について検証を行った.この結果,アルミニウム電極を用いた直流電気分解において,発生する水酸化物と気体を撹拌することにより,沈殿することなく水面近くに分離できることを示した.また,電気分解処理において,水温,水質といった項目よりも,濁度を基準として処理条件を設定した方が効果的に処理できることが判明したので,分光光度計と光ファイバーを用いた簡易型の濁度測定装置を開発し,電解処理中に処理水の状況をモニタリングすることに成功した.これにより,電解処理状況に応じた処理装置を構成することが可能となった.以上の研究で,実海域での実験は実施することができなかったが,電気分解によるバラスト水処理の可能性について,基礎的な検討を完了したと言える.本研究は,船舶のバラスト水を効果的に処理する電気化学処理用の電源装置,および,その処理システムを開発することを目的としており,初年度の平成15年度は,プランクトンを効果的に処理するための交流電源条件の実験的に検討し,電流・電圧・周波数等の電源条件,電極材料,電極の配置等と水質変化,プランクトンの除去効果の関係等を明らかにすることを予定していた.本年度は,金属電極を用いた電気分解によって,細菌等によって汚濁した海水を,細菌類を含めて海水から分離除去することを研究目的とし,電気化学処理による水質変化について実験を主体として検討した.電極材料としては,鉄,アルミニウム,ステンレス鋼,チタン合金等の主種の材質を用い,定電流電源によって海水あるいは人工海水の電気分解を行った.なお,本年度は,処理対象を微細な植物プランクトンおよび細菌類としており,これらに対する処理効果を検討するため海水を酵母菌によって汚濁させたものを用いた.研究の結果,金属電極を用いた電気分解処理により,細菌類によって白濁した海水の濁度を減少させて透明にし,リン酸を減少させることが可能であることを示した.以下に詳細を示す.・金属電極を用いて海水を電気分解することにより,金属電極から金属が溶出して水酸化物が形成され,これによる凝集効果で菌類や汚濁物質が吸着沈殿され,処理水の濁度を数十分の一以下に減少し,リン酸は十分の一程度に減少することを明らかにした.・金属電極としては,アルミニウム電極あるいは鉄電極が有効である.ただし,鉄電極でアルミニウム電極と同等に濁度を減少させるためには電流値を2倍以上に上昇させるか,数倍長時間の電気分解処理を必要とする.・電気分解の処理電流は大きいほど,濁度等の減少効果が高く,低周波0.5Hz程度の交流を用いて電気分解を行った場合,処理水のpH変化は少ない.本研究は,船舶のバラスト水を効果的に処理する電気化学処理用の電源装置,および,その処理システムを開発することを目的としており,初年度の平成15年度は,プランクトンを効果的に処理するための電源条件の実験的に検討し,電流・電圧・周波数等の電源条件,電極材料,電極の配置等と水質変化,プランクトンの除去効果の関係等を明らかにし,最終年度の平成16年度は海水温や多種のイオン濃度の計測結果をフィードバックして電源電圧・電流を自動制御する電源システムを構築することを予定していた.2年間の研究の結果,以下のことを明らかにした.・平成16年度:前年度の成果を基に,より高電流を流すことのできる電源装置により,処理効果について検証を行った.この結果,アルミニウム電極を用いた直流電気分解において,発生する水酸化物と気体を撹拌することにより,沈殿することなく水面近くに分離できることを示した.また,電気分解処理において,水温,水質といった項目よりも,濁度を基準として処理条件を設定した方が効果的に処理できることが判明したので,分光光度計と光ファイバーを用いた簡易型の濁度測定装置を開発し,電解処理中に処理水の状況をモニタリングすることに成功した.これにより,電解処理状況に応じた処理装置を構成することが可能となった.以上の研究で,実海域での実験は実施することができなかったが,電気分解によるバラスト水処理の可能性について,基礎的な検討を完了したと言える.
シロイヌナズナの葉の形成におけるＡＳ２のエピジェネティックな遺伝子抑制機構の解明

双子葉類の葉は茎頂メリステムから分化し、表裏のある左右相称的で扁平な形をもつ。表裏の決定がその後の扁平な葉の形成に重要であることが示唆されているがその分子機構は不明であった。我々はこれまでに、シロイヌナズナの葉の表側分化の鍵遺伝子AS2による、裏側化因子ARF3の二重の制御機構を明らかにした。本研究では、AS2と共にトポイソメラーゼIαがARF3の発現抑制に関わる事、AS2はARF3のコード領域のDNAメチル化レベルの維持に関わる事、AS2がARF3を介してKRP(CDKインヒビター)を抑制する事が明らかになった。AS2ーARF3-KRP経路を介した葉の横方向の分裂制御の可能性が示唆された。植物の発生分化では全能性を保持した分化スイッチがおこると考えられている。分化スイッチにおいては、植物に特徴的なエピジェネティックな抑制制御が働いている可能性があるが、その仕組みは明らかになっていない。葉は茎頂メリステムから分化する地上部の主要な器官であり、表裏(向背軸性)のある左右相称的で扁平な形態的特徴をもつ。葉の発生初期には、裏側的性質をもつ棒状の形態をしているが、発生の進行に伴い、表側の細胞が分化すると、表裏の境界面で細胞分裂が誘発され側方方向への葉の拡大が起こり扁平になると考えられている。これまで葉の分化に関わる遺伝子が多数同定されたものの、分化スイッチの鍵となる遺伝子は明確にはなっていなかった。我々は、シロイヌナズナのASYMMETRIC LEAVES1(AS1)とAS2が葉の表側分化の鍵遺伝子であり、AUXIN RESPONSE FACTOR3(ARF3)/ETTIN(ETT)を直接制御する事を明らかにした(Iwasaki et al., Development 2013)。さらに、複数のマイクロアレイ解析により、ARF3が細胞分裂に関わるCDKinhibitorとサイトカイニン合成に関わる因子を制御することを明らかにした(Takahashi et al., PCP 2013)。25年度は、第一に、CDKインヒビターであるKRP5がARF3の下流で働くこと、AS1-AS2がARF3を通してKRP5を抑制することが、表側細胞の分化と側方方向の細胞増殖において重要であることを明らかにした。第二に、DNAメチル化阻害剤を用いた研究から、AS1-AS2がARF3のexon6のCG配列のメチル化に関わること、この領域のメチル化レベルは、葉の表側分化と側方方向の細胞増殖と相関があることを示した。このことは、ARF3が分化スイッチの鍵因子であることを示唆している。植物の発生分化においては、全能性を保持した分化スイッチが起ると考えられている。しかしながらその仕組みは、未だ明らかになっていない。葉は、茎頂メリステムから分化する地上部の主要な器官である。葉の発生初期には、裏側的性質をもつ細胞からなる棒状の葉原基が形成され、発生の進行に伴い表側の細胞が分化すると、表裏の境界面で細胞分裂が誘発され側方方向への葉の拡大が起こり扁平になると考えられている。我々は、すでにシロイヌナズナの葉の表側化の鍵遺伝子であるASYMMERIC LEAVES1(AS1)がAS2とともにAUXIN RESPONSE FACTOR3(ARF3)遺伝子の5'上流に結合し、転写を抑制すること、低分子RNAを介してARF3とARF4の抑制制御にも関わっていることを明らかにした。このような制御が正確に行われることで葉の表側の細胞分化が起こり、扁平で左右相称的な葉が形成される。本年度は、AS1とAS2がARF3のコード領域のメチル化にも関わること、このメチル化レベルと葉の形態、およびARF3の発現に明らかな相関があることを示した(Iwasaki et al., Development 2013)。葉の発生後期には、AS1とAS2が発現していなくても、このようなエピジェネティックな制御機構が働くことにより、ARF3の発現が抑制され、扁平で左右相称的な葉の形成がなされると考えられた。この結果は、Gene body methylationが遺伝子発現抑制、さらには形態形成に関わっていることを明らかにした初めての例である。さらに、このような葉の発生初期には、DNA複製とその後のクロマチン構造の複製が重要である事を示唆する結果を得た。葉の初期発生過程に関わる因子とその分子機能を明らかにする事は、全能性を保持した分化スイッチのしくみの解明において重要である。植物の発生分化過程では全能性を保持した分化スイッチが起ると考えられている。

このような過程では、植物に特徴的なエピジェネティックな抑制制御が働いている可能性があるが、その仕組みは明らかになっていない。葉は茎頂メリステムから分化する地上部の主要な器官であり、表裏のある左右相称で扁平な形態的特徴をもつ。葉の発生初期には、裏側的性質をもつ棒状の形態をしているが、発生の進行に伴い、表側の細胞が分化すると、側方方向への葉の細胞増殖がおこり扁平になると考えられている。本研究の目的は、葉の分化をモデルとして、植物の分化に特徴的なエピジェネティックな抑制の仕組みを解明する事である。我々は、シロイヌナズナの葉の表側分化に関わる因子であるAS1とAS2に着目して研究を進めた結果、AS1-AS2複合体は裏側化因子ARF3を直接抑制制御すること、ARF3とARF4をsmall RNAを介して間接的にも制御する二重の制御を明らかにした。トポイソメラーゼIαやクロマチン再構成因子等がAS1-AS2と共にARF3の発現抑制に関わること、AS1とAS2は、ARF3のgenebody DNAメチル化レベルの維持に関わることを示唆した。26年度は、トポイソメラーゼIαの阻害剤カンプトテシンを投与したシロイヌナズナを用いて、新奇なアルゴリズム(KB-FuzzyART)によるマイクロアレイ解析を行い、ARF3の下流因子候補を抽出し、遺伝学的解析を行い、細部周期進行制御に関わるKRP5(CDKインヒビター)とサイトカイニン合成に関わる因子(IPT3)を同定した。さらに、カンプトテシンを投与した場合のARF3遺伝子座のDNAメチル化レベルの解析を進行中である。以上の結果から、AS1-AS2はARF3のエピジェネティックな制御に関わり、ARF3の制御を介して、KRP5とIPT3を抑制し、葉の表側分化と側方方向の細胞増殖を制御している可能性が考えられる。生物学低分子化合物である9ーヒドロキシカンプトテシンをas2変異体に投与し、マイクロアレイを行い、我々が開発したクラスタリング法であるKB-FuzzyAR法を用いて解析しすることにより、AS1-AS2の下流因子候補としてCDKinhibitorであるKRP5を抽出した。さらに、遺伝学的解析により、AS1-AS2がARF3を介してKRP5を制御していることを明らかにした(論文投稿準備中)。サイトカイニン合成に関わる因子(IPT3)の制御系については解析中である。当初の目的である、AS1-AS2によって直接制御されているARF3の下流因子候補として細胞周期制御因子であるKRP5を抽出することができ、さらに、遺伝学的にも、AS1-AS2の下流であることを証明した。このことは、ARF3が分化スイッチの鍵因子である可能性を支持している。2種の異なるDNAメチル化阻害剤を用いて解析した結果、ARF3のexon6のCG配列のメチル化と、葉の表側分化と側方方向の細胞増殖との間に相関があることを示した。ARF3のexon6の領域のメチル化レベルは、葉の表側分化と側方方向の細胞増殖に関わると考えられた。これらの結果を含めて、論文として公表することができた(Iwasaki et al., Development 2013)。さらに、他のコード領域についても解析を進行中であり、さらに新しい結果が期待できる。1、すでに我々は、as1又は、as2変異体に9-ヒドロキシカンプトテシンを加えた時に、葉の表側の細胞分化が強く阻害されて棒状の葉を形成することを示している。
微量分析用ポータブル液体クロマトグラフの開発と応用

本研究は、ミクロカラムを用いる液体クロマトグラフィーにおいてカラムの特性を十分に発揮できるポータブル装置の開発と実用化及び基礎研究への応用を目的とする。重量約8.5Kgのポータブル装置について評価と改良を行った。検出には、水銀放電管による254及び280nmと共により汎用性のある高感度検出法として亜鉛放電管による214nmの輝線の利用を可能とした。この装置では、0.05AUFSレンジで安定したベースラインが得られ、安息香酸エステルに対して検出下限は、数ナノグラムであった。放電管は1年間の使用に耐え十分な実用性を示した。新たに開発したポンプにより高圧勾配(グラディエント)溶出を可能とした。溶媒の混合に特別のミキサーやダンパーを必要としない平滑な送液が可能である。記録計を除く総重量は、約11kgであり、移動が簡単であり、現場における分析がより精密に行える。勾配溶出は分離効率と分析時間の短縮に効果的である。例として、内径1.0mmカラムで還元リゾチームをキモトリプシンで処理して得たペプチド、あるいはデキストリンの部分酸水解物のオリゴ糖の2PMP(1フェニル-2-メチル-5-ピラゾロン)誘導体について、本装置が従来型の装置と4.6mm径カラムに勝るとも劣らない分離能を有することを示した。溶質の保持機構の解明に2ポンプシステムとミクロカラムとを用いて、亜硝酸が逆相分配カラム上、酸性アルコール溶離液で特異的に保持される機構を検討した結果、溶液中で亜硝酸とエステルの間の平衡が成立し、疎水性のエステルが保持されることが分かった。カラム内での平衡式を導き、それぞれの平衡定数をクロマトグラフィーの結果から推定する方法を見出した。2PMP誘導体を用い、糖の転移酵素や加水分解酵素の生成物の分析による速度論的解析を行った。さらに2PMP誘導体の保持挙動に糖の2位および3位の水酸基の立体配置が重要であることをコンピューター解析により示した。本研究は、液体クロマトグラフにおいて内径の小さいミクロカラムの特性を十分に発揮できる小型かつ高性能の一体型ポ-タブル装置の開発と実用化を目的とする。本年度は重量約8.5Kgの試作機について、評価と改良を行った。装置の小型化のために小型水銀放電管による254nmおよび280nmの輝線を利用した単波長の検出器による一般的な芳香族化合物の検出の性能を評価した。さらに広範囲の対象化合物の検出法として、例えば不飽和結合等を有する化合物にはより短波長側の吸収の測定が要求されることから、新たに亜鉛放電管を採用することにより214nmの輝線を利用し、波長選択の可能な紫外吸収計を完成し、本装置の性能を、安定性、検出感度の点から評価した。この結果0.05AUFSのレンジで、ベースラインはよく安定して254nmで安息香酸エステルを、214nmでは硝酸を標品とすると、検出下限は数ナノグラムであった。この結果より本装置は実用域に達したといえる。クロマトグラフィーにおいてカラムの性能は最も重要な問題とひとつである。従来より、カラムの調製には密度均衡法と圧力勾配法を組み合わせた精密な充填法が必要とされる、このためには有害な含ハロゲン溶媒と特殊な大流量の充填機が用いられている。我々は、小径カラムの充填には大流量のポンプは不要であることにより精密な制御のできる小型ポンプを用い、溶離液として通常用いられるアセトニトリル-水混合溶媒に充填剤を分散し、40- 50MPaの定圧で充填することで良好なカラムが調整できることをみいだした。次に、本装置は移動実験室として野外においても運転できることを目的とするので、溶離液および廃液が万一の事故により装置外へ拡散しても環境を汚染することがないように、通常用いられる有害なアセトニトリルに代わり比較的安全性の高いエタノールを用いてビタミン、合成甘味料あるいは食品保存料等の分析に優れた溶離液系を改良した。