hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真菌の分泌物質を大気中で検出するための可搬型イオンモビリティー分析法の開発

文化財保存等においてカビによる損傷が問題となっている。本研究では、イオンモビリティースペクトロメトリーによるポータブルで簡易なカビ臭検出システムを開発するため、(1)固相マイクロ抽出法を応用したカビ臭(MVOC)のサンプリングと濃縮システムを試作し、カビ臭検出に必要な濃度の試料濃縮が可能にした。さらに(2)カビ種に特有のカビ臭物質を同定し、これを利用してIMSソフトウェアを作成し、90%以上の正答率でカビ種を同定できた。カビの微生物揮発性有機化合物(MVOC)を利用してポータブルで簡易なカビ臭検出装置開発の基礎技術を研究している。既存のイオンモビリティースペクトロメーター(IMS装置)は小型であるが、カビ発生の初期段階でカビ臭物質を検出できるほどの感度がない。また、カビのIMSスペクトルを解析するソフトウェアがない。平成21年度は次のような成果を得た。1. IMS装置の検出感度向上のための極微量のニオイ分子捕集技術開発固相マイクロ抽出(SPME)は微量物質の捕集方法として優れているが、既存のSPMEは長さと吸着材の塗布量が限定され、吸着効率や加熱機構との組み合わせの設計自由度が小さい。基材として128mmの長さの塗布部分を持つタングステンとレニウムを検討した。その結果、タングステンは直接通電により200°Cまで加熱しても変形が無く、寿命と吸着素材との密着性において優れていることがわかった。また、通電可能で、揮発性物質(分子量が60から200程度)に適する固相吸着剤としてはポリジメチルシロキサン(PDMS)が適することがわかった。シリコーン樹脂を溶媒で溶かした後タングステンフィラメントに塗布し、吸着材として成形した。1.2Wの直流通電により、200°Cまで加熱可能で、繰り返し使用可能な吸着材を作製することができた。2.カビ臭のデータベース作成既存のIMS装置は主に爆薬の検出のために開発され、カビ臭のIMSスペクトルデータベースはない。本研究のポータブル検出装置を用いたスペクトルから未知のカビ臭物質を推定するには、カビ臭のIMSスペクトルデータペースが必要である。H21年度においては、機知のカビの23株を培養し、カビ培養器の揮発性物質のGC/MSおよびIMSのデータベースを作成した。また、カビのMALDIMS測定のためのマトリックスとなる物質を検討した。文化財保存においてカビ(真菌類)による損傷が問題となっており、カビの発生を早期に検出できるシステムの開発が求められている。カビが目視できる段階では、10万100個の胞子が生成しており、カビの制御は困難である。カビは光や風のない古墳の中でも成長・活動し、カビ特有のカビ臭、すなわち微生物由来揮発性有機化合物(MVOC)を生成する。MVOCは揮発性であるため、MVOCを検出することは遠隔操作でカビの成長を確認するのに適している。本研究の目的は、イオンモビリティースペクトロメトリー(IMS)を利用して、ポータブルで簡易なカビ臭検出システムを開発するための基礎技術を確立することである。カビ生育初期段階においてはカビ臭濃度がpptppbレベルの低濃度であるため、平成22年度においては、固相マイクロ抽出(SPME)法を利用したカビ臭濃縮装置を制作した。渦巻き状のタングステンフィラメントにポリジメチルシロキサン(PDMS)を塗布して試料ガス抽出部を作成した。消費電力は100°Cにしたとき0.17Wで乾電池での使用が可能であることがわかった。さらに市販のSPMEファイバーDVB/CAR/PDMS(50/30μm、1cm)(SPELCO社製)を用いて、その加熱脱着部を作成し、その抽出・脱着の性能が十分であることを確認した。IMS装置は、元々テロ対策として開発され、常温常圧下で利用出来るガス分析装置であるため小型化でき、またガスの検出感度が高い特徴を持っているが、分解能の低さや温度湿度によるドリフト時間の変位などが現状では問題である。テロなどの目的で利用される場合はサンプル中に含まれる成分の数は一つであることが多く、事実、製品では、得られた単一ピークの成分の可能性を示すソフトウェアが付属されている程度である。本研究のカビのMVOCでは、多成分のガスを検出、同定することが必要である。平成22年度においては市販のIMS-MINI(ドイツIUT社製)を用いて4種のカビから放出されるMVOCのIMSスペクトルを測定し、ドリフトグラムの波形を解析し、波形分離に適当な関数を見出した。カビが目視できる段階では、10万100万個の胞子が生成しており、カビの制御は困難である。

MVOCは揮発性であるため、MVOCを検出することは遠隔操作でカビの成長を確認するのに適している.本研究の目的は、イオンモビリティースペクトロメトリー(IMS)を利用して、ポータブルで簡易なカビ臭検出システムを開発するための基礎技術を確立することである。(1)MVOCのサンプリングと濃縮方法の開発:カビ生育初期段階においてはカビ臭濃度がpptppbレベルの低濃度であるため、固相マイクロ抽出(SPME)法を利用したカビ臭濃縮装置を制作した。渦巻き状のタングステンフィラメントにポリジメチルシロキサン(PDMS)を塗布して試料ガス抽出部を作成した。消費電力は100°Cにしたとき0.17Wで乾電池での使用が可能であることがわかった。さらに市販のSPMEファイバーDVB/CAR/PDMS(50/30μm、1cm)(SPELCO社製)を用いて、その加熱脱着部を作成し、その抽出・脱着の性能が十分であることを確認した。(2)IMSソフトウェア開発:IMS装置は、元々テロ対策として開発され、常温常圧下で利用出来るガス分析装置であるため小型化でき、またガスの検出感度が高い特徴を持っているが、テロなどの目的で利用される場合はサンプル中に含まれる成分の数は一つであることが多く、事実、製品では、得られた単一ピークの成分の可能性を示すソフトウェアが付属されている程度である。カビのMVOCでは、多成分のガスを検出、同定することが必要である。市販のIMS-MINI(ドイツIUT社製)を用いて、洞窟や文化財などで多く発生する4種のカビから放出されたMVOCのIMS計測データからカビ種を同定する方法を開発した。その結果、90%以上の正答率でカビ種を同定できた。
海馬でのグルタミン酸受容体刺激によるシナプス伝達長期増強の分子機構

カルモデュリン(CaM)キナーゼIIはCa^<2+>/カルモデュリンによる活性化に伴って自己燐酸化される。自己燐酸化された酵素はCa^<2+>非依存型となり活性化を持続する。中枢シナプスでの記録情報の貯蔵機構にCaMキナーゼIIのこの持続的活性化が関与するという仮説を、私達は支持している。これまでに海馬神経細胞においてNMDA受容体の活性化が酵素のCa^<2+>非依存性活性上昇の引き金となること(J.Biol.Chem.,1992)、記憶モデルと考えられる海馬シナプス長期増強(LTP)においてCAl領域でこのCa^<2+>非依存性活性が上昇することを明らかにした(J.Biol.Chem.,1993)。本研究ではあらかじめ海馬切片を^<32>P-燐酸でATPプールをラベルした後in situでの燐酸化反応を解析した。シナプス前終末、シナプス後部におけるCaMキナーゼIIの基質と考えられるシナプシンI、microtubule-associated protein 2(MAP2)のin vivoにおける燐酸化反応が亢進した(J.Biol.Chem.,1995)。NMDA受容体阻害剤でLTPの発現を阻害するとこれらの燐酸化反応の亢進は完全に抑制された。カルモデュリン阻害剤、カルミダゾリウムの存在化でもこれらの燐酸化反応は抑制され、同時にLTPの発現も阻害された。CA1領域でのLTPではCa^<2+>非依存性活性のみならず、全活性も優位に上昇することを報告した(J.Biol.Chem.,1993)。今回、このCaMキナーゼIIの全活性の上昇に酵素蛋白の増加が部分的に関与することを明らかにした。これらの結果は海馬におけるLTPの発現にCaMキナーゼIIがシナプス前部、後部の両方において関与すること、さらに、蛋白質合成を介したシナプス部位でのCaMキナーゼIIの再構成が長期のLTPの繊維機構にも関与することを示唆している。
自動車販売流通システムの革新に関する国際比較研究

論文「日本的経営のグロ-バリゼ-ションと日米構造協議の意味するもの」においては、自動車産業の国際化に関連して日米構造協議で取り上げられた日本的経営特殊論とこれに関連する条列取引関題を論じ、条列取引の中にも部品系列取引のように欧米でも新たに見直され効率的普遍的なネットワ-ク組織として評価され新しい試みが進行している分野と、系列販売のようにともすると硬直化し流通効率を低下させる恐れのある分野を区別して考える必要があること、そしてまた系列販売においてもアフタ-サ-ビスなどサ-ビスシステムの問題が系列を開放した場合の大きな課題として残ることを論じている。論文「日本的生産システムの歴史的背景とその現代的意義においては、広い意味でのト-タル流通システムの効率化につながるフレキシブルな日本的生産システムの歴史的原点がむしろマスプロ大量生産システムを完成させる以前の形成期のフォ-ドシステムのライン同期化実験の中に状在しており、アメリカガマの原点をト-タルシステム的ハイボリュ-ムマスプロシステムの目ざましい量産効果に目を奪われてかえってこれを見失ったこと、日本的生産システムではこの原点を従業員全員参加型の生産の平準化の追求という形で継承し、今やF4自動化やCIM化の原則の中にも生かしていることを明らかにした。著書『マ-ケティング歴史と国際比較』では、アメリカがなぜマ-ケティングの母国となったかを明らかにするとともに、流通産業と自動車産業のマ-ケティングの日米比較を試みた。近刊予定の『系列取引の国際比較』では共著の形で日本の系列取引の特徴と歴史を比較しつつ今後の系列取引のあるべき姿を論じている。
PROLOG言語を用いた地震前・中・後の一連の情報処理判断システムの開発

阪神大震災の例を挙げるまでもなく,地震後の混乱期において,多くの情報を如何に管理,使用し,最適とまではいかないにしても妥当な判断を下すかは,被害の程度を大きく決定する重要な問題である。大地震に際し,地震前に得られる情報に基づき,地震直後に刻々と得られる膨大で断片的かつ不正確な被害の情報を最大限利用し,素人の人が極限的に最悪な健康・精神状態の下で最適な判断を下すためには,計算機を利用し,システムを平常時に作成しておくことが考えられる。地震前に得られる情報は平常時に入力しておき,地震中・直後の情報を整理することなく次々に入力される必要がある。そして,平常時には地震被害想定のプログラムとして機能した同一のシステムが,地震中にはリアルタイム対応システムとなり,地震後には応急復旧,恒久復旧のためのシステムというように,一連として使用できることを目的としている。そして,地震後の緊急対応に際してのすべての判断を自動化することを考えた。本年度は昨年度の研究に引き続き,大地震に際し,地震前に得られる情報である(1)平常時の状態を表す情報,(2)過去の地震被害に関する知見,(3)地震前に行った被害の想定結果,(4)自治体・事業体などによる防災計画・準備の状況に関する情報と,(5)地震直後に刻々と得られる膨大で断片的かつ不正確な被害の情報とのそれぞれに対して,情報の種類の分類し,知識データベースとしてフォーマット化を行った。一方,交通管理システム(交通実態の把握と交通規制),病院の患者の把握と患者の輸送問題,火災の発生状況の把握と消防車・人の配置,役所の各部局またはライフライン事業者の対応,ボランティアの人と仕事とのマッチングなど,各立場から推論規則の開発を行った。阪神大震災の例を挙げるまでもなく、大地震後には、消火、救助および救急などの救援活動が妨害されることは明らかである。地震が発生した後に、実際状況に応じてこれらの活動を管理するのは困難であり、そのため応急対応も不充分となることは阪神大震災の教訓でもある。一般に防災計画では、震災状態を仮定して、公共機関の間の情報管理および情報伝送システムの構造を想定する。しかし、定性的な想定だけであることが多く、被害程度の定量的な想定および定量分析を行うことは非常に困難である。もし、定量想定を可能にし、それをもとに対策を立てることができれば、より有効に、確実に、速く応急対応を行うことができると考えた。本研究では、地震後の被害および救援活動を定量的に想定するためのプログラムを、プロローグ言語を用いて開発した。そして、平常時には地震被害想定のプログラムとして機能したシステムが、地震中にはリアルタイム対応システムとなり、地震後には応急復旧のために役立つことを考えている。本年度作成したプログラムの機能は以下の通りである。1)応急対策活動を行う上で必要となる交通状態の想定を行った。地震後の道路の不通箇所を想定し、不通箇所が発生した状況の中で、使用できる交通路線を検討する。2)火災、倒壊家屋および死傷者の発生など各種の地震後の状態を想定した地域を対象に、消防車、救急車、重機および消防員、警察官、救助員の救援活動の想定を行った。救援された人は、治療を受ける必要がある場合には、病院へ運んで治療を受けること、また消防員、救助員、警察官たちが互いに協力することも考えている。地域間の協力についても想定している。
脂肪分化におけるRNAスプライシングが制御する遺伝子発現調節機構の解明

本研究では、脂肪分化の過程で惹起される選択的スプライシングに着目した。スプライシングの変動が脂肪分化を成立させる必須の現象であることを示し、RNAスプライシングを中心とした分化誘導機構の解明を目指した。オープンアクセスのRNA-seqデータを利用し、分化に伴ってスプライシングパターンが変動すると予測される遺伝子を絞り込んだ。続いて、発現パターンのクラスター分類、各クラスターに含まれる遺伝子の機能分類などを行い、分化に関連すると予測される遺伝子を抽出した。これら遺伝子のisoform発現をRT-PCRで検証し、脂肪分化に伴いスプライシングアイソフォームの発現割合が変動する遺伝子を幾つか得た。脂肪細胞への分化・成熟過程における選択的スプライシングの経時変化を捉えるため、分化前、分化開始直後、初期、中期、後期、成熟過程の各ステップにおける細胞内のスプライシングパターンを網羅的に解析し、脂肪分化の過程で選択的スプライシングが変動する遺伝子を同定するため、脂肪分化に伴う選択的スプライシング動態変化の解析に取り組んだ。初手として、分化前、分化開始直後、初期、中期、後期、成熟過程の各ステップの中から、最も脂肪分化への運命決定がなされる初期段階までのプロセスに焦点を当て、細胞内のスプライシングパターンを網羅的に解析した。その得られたスプライシングアイソフォームの変動パターンを20のクラスターに分類し、網羅的解析から脂肪分化に伴う選択的スプライシングを捉えることができた。変動パターンをクラスター分類することで、特定のスプライシングアイソフォームの発現が、分化に伴って上昇するものか、減少するものか、さらに、上昇した後に減少するものなのか等、様々なパターンから抽出することが可能となった。現在、スプライシングの変動と協調して発現変化するRNA結合タンパク質の同定を試みており、その解析結果をスプライシングパターンの変動と照合することにより、分化プロセスに付随するスプライシング変化、及び、それらのスプライシング反応を制御するRNA結合タンパク質を中心とした脂肪分化制御機構の解明に大きく迫れると期待される。研究目的達成の律速段階となるのは、脂肪分化に伴う選択的スプライシングの変動パターンを捉えることであるが、これについては、上述したように20パターンの群に分類してクリアに得ることができた。これを起点に、計画に従って、種々の解析を行う。「分化」とは、生体を構成・維持するために細胞が特殊化するプロセスであり、分化誘導過程では、細胞の形状、代謝活性、遺伝子発現パターンなどに大きな変化がもたらされる。現在までに細胞の分化を制御する分子の同定やその機能解析を中心とした研究が盛んに行われてきたが、本研究では、脂肪分化をモデルに用い、分化に伴うスプライシング変化を見出し、そのスプライシング反応を調節することで分化を制御できるかという、スプライシング制御を中心とした脂肪分化のメカニズムの解明を目的とした。昨年度はオープンアクセスになっているRNA-seqデータを用い、最も脂肪分化への運命決定がなされる初期段階に焦点を当て、細胞内の遺伝子発現を網羅的に解析した。その得られたデータより、スプライシングアイソフォームの変動パターンをクラスター分類し、脂肪分化に伴う選択的スプライシングの変化を捉えようと試みた。今年度はこの大規模解析から得られた知見に基づき、RT-PCRによる検証を行った。さらに、研究過程において、スプライシングアイソフォームの発現割合に変化をもたらすには、転写と協調することが必要であると示唆される結果が得られた。そこで、前述のRNA-seqデータを用いて、分化過程の遺伝子の発現制御に関与する転写因子の推定を行い、423個の転写因子に絞り込むことができた。今後、これらの転写因子の発現パターンが標的遺伝子のスプライシング変化と相関しているかを検証し、脂肪分化におけるスプライシング変化の生理的意義を解明していきたい。脂肪分化に伴う選択的スプライシングの変動を捉えることができたので、それらの変動と協調して発現変化するRNA結合タンパク質とスプライシングの関連性について検証する。また、それらの知見をもとに、スプライシングの変化が脂肪分化を成立させる必須の現象であることを検証したい。分子生物学物品購入に際し、キャンペーン期間での購入や、相見積もりを取るなど、節約して予算執行することを心がけた結果、若干の繰越し金が出現した。次年度の消耗品・物品購入に充当する。
自己組織化機能を有するヒト由来iPS細胞を用いた歯髄組織再生の具現

本年度は前臨床試験としての大型動物実験(イヌ、ミニブタ)におけるセルデリバリーシステム(細胞移植療法)の確立を目指した。すなわちScaffold内で分化誘導させた3次元培養した象牙芽細胞を歯髄露出部へ移植し、方向性のある高次構造を有する細管象牙質新生促進効果について細胞の組織内局在性、分化成熟度および硬組織基質形成度を免疫組織化学的に証明する段階であった。前臨床試験としての実験動物への細胞移植免疫抑制マウスを用い下顎骨表面より骨削合し、切歯歯根表面に露髄面を形成後、三次元象牙芽細胞ーFCP坦体複合体を移植留置し、経時的な(移植後124週を目安)露髄面での細管性新生象牙質形成度について50kv、0.75mAの条件下で当大学既設の実験動物用マイクロCTの使用協力を得て時系列的な画像解析を行うと共に、ALP, Osteocalcin,BMP-2およびBSPやDSPをマーカーとしたin situ hybridization法にて組織内の移植象牙芽細胞の局在性および新生象牙質基質を病理組織学的に検討した。また形態学的にもCa親和性のカルセインを用い当教室既設の共焦点レーザー顕微鏡にて硬組織形成度を定量評価し、実際の臨床応用におけるタイミングの良い移植時期を検討したところ、大型動物における細胞移植時期としては創面の一次治癒が完了するタイミング(受傷後35日目)が最適であることが示唆された。1986年に英国で初めて報告されて以来、世界的に猛威を振るい、大きな社会的問題になったBSEや口蹄疫を含む人畜共通感染症の流行により、医療薬品の原材料について再考を要する事となった。それ以来人畜共通感染症の対象でない魚類などの皮、鱗や骨から抽出したコラーゲンは安全な生体材料となるため、今後は医療分野に様々な応用の可能性を秘めている。さらにコラーゲンの水解物であるコラーゲンペプチドはコラーゲンと比較して分子量が小さいため生体内での吸収が容易である。またこのペプチドは部分的に変化を受けずに消化器官で吸収され腸管のバリアを通過でき脈管系へ移動した後、体内へ分布していくものと考えられる。そこで魚の皮から抽出したコラーゲンをプロテアーゼ処理により低分子化した魚コラーゲンペプチド(FCP)をラットを用いた動物実験系において下顎骨の骨欠損部へ直接充填し、創傷治癒状況を観察しFCPの骨再生剤としての有用性を検討している。その結果中間報告としては、術後1週間目では炎症性細胞浸潤はほぼ消失し、脈管系の新生が旺盛で線維芽細胞の増殖が認められた。4週目では骨欠損周辺部および深部において骨芽細胞の増殖がみられた。また欠損部入口では島状の新生骨の形成が認められた。8週目では骨性修復が進行し欠損部の閉鎖傾向が確認できた。12週目では層板骨により完全に閉鎖していた。FCPは早期に骨欠損部の骨性修復再生を促進させることが明らかとなった。BSEなどの感染の危険性がなく安価であるFCPは、骨再生剤として今後臨床応用の可能性を十分有する有用な材料であることが示唆された。最近多能性幹細胞を浮遊培養することで三次元的な立体構造を有する細胞凝集塊、すなわち胚様体形成させることで各種組織幹細胞へ分化可能となる誘導法(胚様体形成法)を形成させる試みが報告されており(Nat Neurosci 8:288-96,2005)、レチノイン酸(RA)添加によるES細胞の分化誘導に準じて、大学既設のセルソーターを用いて細胞表面マーカーとしてCD105陽性かつCD31陰性の分画となる細胞を分取し、幹細胞マーカーであるCD29、CD44、CD73およびCD90が陽性となることをフローサイトメトリック解析し、血管新生能および神経再生能を有する歯髄幹細胞であることを確認できているため。超高齢社会において歯の健康はQOL向上のために必須である。歯を長持ちさせるために、深いウ蝕や歯髄炎で一旦歯髄を完全に除去しても、もう一度歯髄を再生させ元通りにする新しいウ蝕・歯髄炎治療法の開発を行ってきた。まず本研究では、本法を用いてGMPに準拠した施設内(アイソレーター内)でヒト中高齢歯髄幹細胞を分取し、老化誘導機構を解明することにより老化回避法を開発し、安全で安定的に高効率に増幅する方法を確立する。また、非臨床研究において、中高齢のイヌ全部性歯髄炎あるいは根尖性歯周炎モデルで、根管拡大清掃後、再生根管充填材(遊走因子およびscaffold)および自家歯髄幹細胞を移植し、歯髄再生の安全性および有効性を確定する。また、歯髄再生に最適な、安全で高効率な根管内無菌化法とその薬剤を開発する。ついで、非臨床研究の結果を基に歯髄再生の臨床研究を行う。これにより、歯の根管を人工物により充填する従来の歯内治療技術を新規の歯髄再生法により高性能化することを目指すものでる。本年度はヒト中高齢歯髄幹細胞の安全性・安定性が確認でき、非臨床試験での中高齢の抜髄後および感染根管治療後の歯髄再生の安全性・有効性が確認できた。さらに、ヒト中高齢抜髄後の歯髄再生の臨床研究が開始できる。また、動物に由来しないアテロ化魚コラーゲンが試作することができた。歯髄再生に必須の、最適な根管内無菌化法とその薬剤として超音波ナノバブル薬剤導入法が検討中である。

1)アイソレーター内(GMPに準拠)で、ヒト中高齢者の抜去歯歯髄をコラーゲナーゼ処理により分散させ、H28年度に確立したイヌ中高齢歯髄幹細胞分取・増幅法のSOPに従って、DMEMと自己血清にて培養させ、2代目で膜遊走分離法にて歯髄幹細胞を分取し、さらに増幅させることができた。2)ヒト中高齢歯髄幹細胞の安全性の確認:1)の培養各段階において、形態観察、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験を行い、感染症の否定や細胞の形態変化、生存率を検討したところ、特に問題となることはなかった。またヒト中高齢歯髄幹細胞の有効性の確認:幹細胞表面抗原、歯髄分子マーカー発現、老化マーカー発現、細胞遊走能、血管・神経誘導能、神経栄養因子・血管誘導因子発現などの解析により、品質を評価中である。ヒト中高齢歯髄幹細胞のガン化リスク評価:免疫不全動物への移植後16週まで病理組織学的検討を行ったところ、ガン化に対する問題点はみられなかった。3)再生根管充填材に適したアテロ化魚コラーゲンの開発:キトサンの生体親和性、生分解能に関する弱点を改善することを目的に、魚コラーゲンについて、再生足場材としての細胞・組織への影響および組織内での吸収状況を検討したところ、十分有用性が確認できた。超音波ナノバブル薬剤導入法による根管無菌化の証明法の確立:イヌ抜去歯あるいはin vivoにてイヌ感染根管モデル歯を用いて、象牙細管内あるいは副根管・側枝に深く感染させ、抗生剤と超音波ナノバブル導入前後の根管側壁の象牙質削片を用いた細菌培養検査法を検討中である。本年度は前臨床試験としての大型動物実験(イヌ、ミニブタ)におけるセルデリバリーシステム(細胞移植療法)の確立を目指した。すなわちScaffold内で分化誘導させた3次元培養した象牙芽細胞を歯髄露出部へ移植し、方向性のある高次構造を有する細管象牙質新生促進効果について細胞の組織内局在性、分化成熟度および硬組織基質形成度を免疫組織化学的に証明する段階であった。前臨床試験としての実験動物への細胞移植免疫抑制マウスを用い下顎骨表面より骨削合し、切歯歯根表面に露髄面を形成後、三次元象牙芽細胞ーFCP坦体複合体を移植留置し、経時的な(移植後124週を目安)露髄面での細管性新生象牙質形成度について50kv、0.75mAの条件下で当大学既設の実験動物用マイクロCTの使用協力を得て時系列的な画像解析を行うと共に、ALP, Osteocalcin,BMP-2およびBSPやDSPをマーカーとしたin situ hybridization法にて組織内の移植象牙芽細胞の局在性および新生象牙質基質を病理組織学的に検討した。また形態学的にもCa親和性のカルセインを用い当教室既設の共焦点レーザー顕微鏡にて硬組織形成度を定量評価し、実際の臨床応用におけるタイミングの良い移植時期を検討したところ、大型動物における細胞移植時期としては創面の一次治癒が完了するタイミング(受傷後35日目)が最適であることが示唆された。今後のiPS細胞を利用した移植療法を展開するにあたり、細胞間接着分子E-カドヘリンのモデル分子である固定型E-cad-Fcキメラタンパク質を用いた単一細胞レベルで分散させ、未分化状態を維持させながら増殖させ、iPS細胞の均質化ならびに大量増幅を目指すことになる。次いでSDF-1-CXCR4(リガンド-受容体ペア)を利用した歯髄幹細胞遊走分離法を用い、硬組織誘導培養系へのFCP添加により象牙芽細胞への分化誘導促進化を確認・評価する。
4量体H/K-ATPaseの構造機能連関〜4量体構造の生理的意義の解明〜

豚胃より精製したH^+,K^+-ATPaseを用いて二次元結晶を作成し、極低温電子顕微鏡による構造解析を行った。幾つかの異なる反応中間体での結晶を得ることに成功し、このうち二つの状態(E1,E1P-ADP)での構造を比較した。トリプシン限定消化による構造の類推と合わせて、これまでP型ATPaseで考えられていた、細胞質ドメインの大きな構造変化は、H^+,K^+-ATPaseにおいては起こらないことを示した。この結果は雑誌論文に掲載予定である(Nishiawa,T., et. al.2008 J.Struct.Biol., in press)。また、E2P状態での構造に関して、8Å分解能での立体構造解析に成功した。この構造から、αβサブユニットの相互作用や、阻害剤が結合すると考えられるキャビティーの存在を見出した。特にβサブユニットとαサブユニットの相互作用はE2P状態を安定化させるのに寄与しており、長年の疑問であったH^+,K^+-ATPaseの強いE2P嗜好性を説明する相互作用であると考えられる。このことは、H^+,K^+-ATPaseのイオン輸送サイクルにおける逆反応が進行しにくいことを示しており、このイオンポンプが作り出す真核生物で最大の濃度勾配(100万倍以上)を達成するための逆止弁としての働きがあると考えられる。変異体の解析結果と合わせて、現在論文準備中である。以上本研究によって、H^+,K^+-ATPaseが分子内に備えるH^+逆流防止の為の構造基盤を示すことができた。豚胃より大量にH/K-ATPaseを精製し、得られた精製膜標品を用いて、2次元結晶の作成を試みました。界面活性剤としてn-octyl glucosideを用い、ATP等の基質を共存させることで、酵素活性を保持した状態での可溶化に成功しました。この可溶化標品を用いて透析法による二次元結晶の作成を行ったところ、pH4付近でチューブ状の二次元結晶が得られました。この条件においては、基質は特に添加されておらず、酵素はH^+を結合したE1状態にあると考えられます。得られた結晶の酢酸ウランによる負染色の投影像から、p2の対称性を持ち、ユニットセルがa=128.88Å,b=112.36Å,γ=90°、1つのユニットセルに4っのαβ-protomerを含むことが推定されました。さらに、透析外液に基質アナログであるAl^<3+>,F^-,ADPを含む条件でも結晶が生成しました。この条件下で、酵素はATP結合EP形成の遷移状態であるE1PADP状態にあると推定されます。これらの結晶は基質非存在下での結晶とは異なる結晶系を与え(p22_12_1,a=127.23Å,b=112.11Å,γ=90°)異なる構造をとっていることが示唆されました。比較的生理的条件に近い、脂質二分子膜中での結晶化であるので、今回示した2つの中間体の他にも、基質や阻害剤の添加によって、別の反応中間体の構造を明らかにできる可能性があります。極低温電子顕微鏡によって撮影されたこれらの結晶から、分解能が約10Åの投影図を得ることに成功しました。これによって、明らかにされていなかったβ-subunitのα-subunitとの位置関係を推定することが出来ました。豚胃より大量生成したH/K-ATPase(プロトンポンプ)を対象として、二次元結晶を作製、立体構造の解明を目指している。以前報告したn-octyl glucoside可溶化標品による二次元結晶化の検討では、基質アナログAlFxADP存在下、非存在下において異なる今フォメーションの結晶が得られ、極低温電子顕微鏡により分解能約10Åの投影像を得ることが出来た。(a=127.23Å,b=112.11Å,γ=90^0,p22_12_1symmetry)。更なる分解能の向上を検討した結果、decyl maltosideを用い、以前より酵素活性の安定な可溶化条件を見出し、AlFxATP存在下においてより分解能の高い(8Å)結晶を得ることが出来た(a=133.00Å,b=110.00Å,γ=90^0,p22_12_1symmetry)。また異なる種類の基質アナログ(BeF)や阻害剤(SCH28080)の添加によって得られた二次元結晶は、AlFxADP存在下の結晶とは異なる結晶系を示すことから、それぞれの二次元結晶が異なる反応中間体の構造を模倣していることが示唆される。プロトンポンプの行うATP加水分解と共役したイオン輸送は、大きな構造変化を伴うとされている。異なる反応中間体での構造が得られたことは、構造変化仮説を強く裏付ける証拠であると同時にポンプ作動のメカニズムを理解する為に非常に重要である。今後それぞれの反応中間体の立体構造の解明が急がれる。

トリプシン限定消化による構造の類推と合わせて、これまでP型ATPaseで考えられていた、細胞質ドメインの大きな構造変化は、H^+,K^+-ATPaseにおいては起こらないことを示した。この結果は雑誌論文に掲載予定である(Nishiawa,T., et. al.2008 J.Struct.Biol., in press)。また、E2P状態での構造に関して、8Å分解能での立体構造解析に成功した。この構造から、αβサブユニットの相互作用や、阻害剤が結合すると考えられるキャビティーの存在を見出した。特にβサブユニットとαサブユニットの相互作用はE2P状態を安定化させるのに寄与しており、長年の疑問であったH^+,K^+-ATPaseの強いE2P嗜好性を説明する相互作用であると考えられる。このことは、H^+,K^+-ATPaseのイオン輸送サイクルにおける逆反応が進行しにくいことを示しており、このイオンポンプが作り出す真核生物で最大の濃度勾配(100万倍以上)を達成するための逆止弁としての働きがあると考えられる。変異体の解析結果と合わせて、現在論文準備中である。以上本研究によって、H^+,K^+-ATPaseが分子内に備えるH^+逆流防止の為の構造基盤を示すことができた。
咀嚼運動パタ-ン形成に関する大脳基底核ならびに視床の役割

モルモットの皮質咀嚼野は、無顆粒皮質である前部および不全顆粒皮質である後部の、細胞構築学的に異なった2つの領域から構成されている。これらの領域の連続電気刺激によって誘発されるリズミカルな顎運動に対応する顎二腹筋筋電図のリズミカルな群発活動は、後部刺激の場合には皮質電気刺激の各パルスに短潜時で誘発される一連の筋電図活動の振幅が増大ついで減少することによって出現するが、前部刺激の場合の群発活動は始めから終わりまで連続して全体として紡錘状を呈し、皮質刺激の各パルスに短潜時で引き続く誘発活動は認められない。そこで、これらの形態学的、生理学的相違と関連させて、皮質咀嚼野前部と後部から脳幹への投射様式でWGA-HRPを用いて比較した。(1)前部および後部注入例とも、HRP陽性軸索終末が、尾状核、被殻、intertigeminal regionを含む三叉神経運動核周囲ならびに結合腕内、およびその周囲領域に両側性に見出された。(2)前部注入例では、同側中脳網様体ならびに巨大細胞網様核の尾側レベルの反対側の延髄網様体背外側部に、HRP陽性終末の密な集団が見いだされた。(3)後部注入例では、HRP陽性終末が橋錐体路の背側に隣接する網様体領域に両側性で同側優位に見いだされた。また、反対側の三叉神経威覚核群の内側に隣接した領域に、橋および延髄吻側部にHRP陽性線維および軸索終末が豊富に見出されたが、延髄尾側部には見られなかった。(4)視床との連絡は、皮質咀嚼野前方部と内側核群、後方部と外側核群において見られた。以上のように、皮質咀嚼野の前部と後部との間で、視床ならびに脳幹への投射様式に著しい相違があることが明らかにされ、咀嚼運動のパタン発生器と大脳皮質との関連を知る基礎となる所見が得られた。
根治性と機能温存を両立する新規脳動脈解離治療用ステントの開発

研究期間中に出血性椎骨動脈解離は計15例来院した.全例に脳血管撮影を行い,解離部の解剖学的特徴を検討し,解離周囲からの穿通枝の起始を確認した.血管撮影のデータを基に,computational fluid dynamicsの解析を行い,流体工学的に血流阻害効果の得られる条件を検討し,停滞する流れ環境下においても血流停止が生じず,分枝細血管の開存が維持される条件を検討した.シミュレーションでは新規ステントデザインを作成可能であったが,患者毎の解離部の形状バリエーションが多いこと,穿通枝を血管撮影で視認不可能な場合も多いこと,などから実際に臨床応用可能な新規ステントを開発するには至らなかった.現在の治療方法として、解離部を閉塞する親動脈閉塞という方法がある。当院で2006年から2011年までに親動脈閉塞を用いて治療を行った38例の治療成績をまとめてみると、18例(47%)に穿通枝梗塞が生じていることが明らかとなった。そこで、2012年以降は、脳血管撮影で穿通枝を同定し、これを温存しつつ親動脈閉塞を行っている。そのような治療方法で16例を治療し、穿通枝梗塞が3例(19%)まで減らすことができた。これにより、6ヶ月後の臨床転帰良好例が60%から94%に増加した(p=0.021)。従って、出血性脳動脈解離に適した新規ステントの作成においては、ステントによる再出血予防効果に加えて、解離部から分岐する穿通枝を温存しうるかどうかが問題となる。穿通枝は非常に細く、脳血管撮影で同定することが困難な場合があることから、従来の治療方法では未だに完全に温存することは困難であることが多い。現在は新たに来院した患者に血管撮影を行い、情報収集を行っている。さらに、computational fluid dynamicsの解析を行い、流体工学的に血流阻害効果の得られる条件、停滞するながれ環境下においても血流停止が生じない分枝細血管の開存が維持される条件を明らかにする予定である。椎骨動脈解離に対する治療方法として,解離部全体を閉塞する親動脈閉塞という方法がある.当院で2006年から2011年までに親動脈閉塞を用いて治療を行った38例の治療成績をまとめてみると,18例(47%)に穿通枝梗塞が生じていることが明らかとなった.そこで,2012年以降は,脳血管撮影で穿通枝を同定し,これを温存しつつ親動脈閉塞を行っている.そのような治療方法で16例を治療し,穿通枝梗塞が3例(19%)まで減らすことができた.これにより,6ヶ月後の臨床転帰良好例が60%から94%に増加した(p=0.021).しかし,親動脈閉塞では,閉塞範囲に穿通枝が含まれなくとも,周囲に血栓形成が及ぶことで穿通枝閉塞を起こす可能性がある.また,穿通枝は非常に細く,脳血管撮影で同定することが困難な場合も考えられる.従って,ステントを使用することで親動脈を温存しつつ解離を治癒することが出来れば穿通枝閉塞も回避できる可能性が高い.現在は新たに来院した患者に血管撮影を行い,解離の形態的評価とともに解離周囲からの穿通枝の起始を確認し,穿通枝起始部の解剖学的なバリエーションを検討している.さらに,解離部におけるcomputational fluid dynamicsの解析を行い,流体工学的に血流阻害効果の得られる条件、停滞する流れ環境下においても血流停止が生じない分枝細血管の開存が維持される条件を明らかにしている.2014年度以降に来院した出血性椎骨動脈解離の症例が9例にとどまり,前向きの情報収集が進まなかった。今後は以前の治療症例も含めて後方視的解析を行う予定である。理論解析については計画通り解析を実施できているので、今後、さらに症例のリクルートを推進し、当初予定していた工程に復帰する。現在の治療方法として,解離部を閉塞する親動脈閉塞という方法がある.当院で2006年から2011年までに親動脈閉塞を用いて治療を行った38例の治療成績をまとめてみると,18例(47%)に穿通枝梗塞が生じていることが明らかとなった.そこで,2012年以降は,脳血管撮影で穿通枝を同定し,これを温存しつつ親動脈閉塞を行っている.そのような治療方法で16例を治療し,穿通枝梗塞が3例(19%)まで減らすことができた.これにより,6ヶ月後の臨床転帰良好例が60%から94%に増加した(p=0.021).しかし,親動脈閉塞では,閉塞範囲に穿通枝が含まれなくとも,周囲に血栓形成が及ぶことで穿通枝閉塞を起こす可能性がある.また,穿通枝は非常に細く,脳血管撮影で同定することが困難な場合も考えられる.従って,ステントを使用することで親動脈を温存しつつ解離を治癒することが出来れば穿通枝閉塞も回避できる可能性が高い.最近では,実際の臨床例において脳動脈瘤塞栓用ステントを使用した治療を行い,転帰改善を得ている症例も報告されている.しかし,解離部の形状は個々の患者で異なるため,個々の患者に適した形状のステントを使用する必要がある.本研究では,新規に来院した患者に脳血管撮影を行い,解離部の解剖学的特徴を検討し,解離周囲からの穿通枝の起始を確認した.

さらに,血管撮影のデータを基に,computational fluid dynamicsの解析を行い,流体工学的に血流阻害効果の得られる条件を検討し,停滞する流れ環境下においても血流停止が生じず,分枝細血管の開存が維持される条件を検討した.シミュレーションでは新規ステントデザインを作成可能であった.しかし,患者毎の解離部の形状バリエーションが多いこと,穿通枝を血管撮影で視認不可能な場合も多いこと,などから実際に臨床応用可能な新規ステントを開発するには至らなかった.研究期間中に出血性椎骨動脈解離は計15例来院した.全例に脳血管撮影を行い,解離部の解剖学的特徴を検討し,解離周囲からの穿通枝の起始を確認した.血管撮影のデータを基に,computational fluid dynamicsの解析を行い,流体工学的に血流阻害効果の得られる条件を検討し,停滞する流れ環境下においても血流停止が生じず,分枝細血管の開存が維持される条件を検討した.シミュレーションでは新規ステントデザインを作成可能であったが,患者毎の解離部の形状バリエーションが多いこと,穿通枝を血管撮影で視認不可能な場合も多いこと,などから実際に臨床応用可能な新規ステントを開発するには至らなかった.2014年度に来院した出血性椎骨動脈解離の症例が3例しかいなかったことから、前向きの情報収集が進まなかったことが原因であると思われる。今後は以前の治療症例も含めて後方視的解析を行う予定である。脳神経外科学平成27年度に金属材料的に生体適合性に優れ、理論解析も踏まえたステントに関してのプロトタイプ案は作成したものの、症例数が少ないため、十分なvalidationに至らず、動物実験で実証するところまで至っていないため、動物実験で計上していた予算が残額となった。computer fluid dynamics解析のデータを保存するためのハードディスクを,データ量を考慮して購入を延期したために繰越金が発生した。今年度は検討症例数を増やし、validationを行ったうえで、試作を行い、非臨床試験の実施を早急に行うため、その部分に予算を使用する。来期の研究の進行具合に合わせてハードディスクを追加購入する予定である。
アルツハイマー型痴呆に於けるAPP遺伝子変異-地域悉皆調査に基づく発生頻度の検討

1991年,Goateらはアミロイド前駆体蛋白(APP)遺伝子エクソン17上のコドン717バリンがイソロイシンに変異している家族性アルツハイマー病(FAD)家系を報告した。その後,世界で約10家系の同突然変異を有するFAD家系が報告されたが,その中で日本人家系は5家系と多く,日本人におけるこの変異が多い可能性がある。同変異の日本人に於ける頻度を明らかにすることを目的とした。1990年,我々は鳥取県大山町住民7,749人に対し,地域悉皆調査を行い,神経内科医の訪問診察により41人のアルツハイマー型痴呆を認めた。この内,本人および家族のインフォームドコンセントが得られ,採血が可能であった30人を対象とした。予めヘパリン0.5mlを入れたシリンジにて末梢血液を20ml採血した。フェノール・クロロフォルム抽出によりゲノムDNAを精製した。APPエクソン17を鋏むようしてPCR法に用いるプライマー1(5'-CCTCATCCAAATGTCCCCTG-3'),プライマー2(5'-CTTGGAAACATGCAGTCAAG-3')及び直接塩基配列決定法に用いるブライマ-3(5'-CAAGGTGTTCTTTGCAGAAG-3')を作成した。1本鎖DNAを得るためは非対称性PCRを行った。サーマルコントローラーを用いて30サイクル反応をおこなった。PCR産生物は,クロロフォルム抽出をおこない,5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認した。プライマー3を[gamma-^<32>P]ATPにてラベルし,PCR産生物のAPPエクソン17塩基配列をジデオキシ法直接塩基配列決定法により調べた。電気泳動ゲルには8%ポリアクリルアミドゲル(50%尿素)を用いた。地域悉皆調査により認められたアルツハイマー病有病者41人のうち採血が可能であった30人のAPPエクソン17の塩基配列はいずれも異常を認めなかった。日本人に於てもAPPエクソン17遺伝子異常の頻度は非常に多いとは言えないと考えられた。
フォールディング中間体の分子認識から紐解くタンパク質品質管理の分子基盤

真核細胞において小胞体は、新規に合成されたタンパク質にジスルフィド結合の形成を伴った立体構造(酸化的フォールディング)を獲得する場である。小胞体には20種類以上ものProtein Disulfide Isomerase (PDI)ファミリータンパク質が酸化的フォールディングを触媒する。その中でもPDIのみが最も優れたジスルフィドイソメラーゼであることがわかっているが、基質のフォールディング中間体の認識における作用機序は明らかでなかった。フォールディング初期において、PDIは二量体へ会合し、その中央に形成される空間(キャビティ)に基質が取り込まれる様子を観察し、全く新しい基質取り込み機構を2019年に国際誌Nature Chemical Biologyに、筆頭著者、研究責任者として発表した。しかしながら、依然として構造や機能が異なる複数のターゲット分子(基質)のフォールディング中間体を認識するPDIの機能発現機構は不明である。2018年度中に、酸化的フォールディングの基質としてプロウログアニリンを選定し、過渡的に集積されるフォールディング中間体の構造決定を目指し、NMRによって各種スペクトルを収集中した。フォールディング中間体の構造決定は難航しており、今後MDなどを利用した解析アプローチを取り入れる予定である。また、過渡的に集積される幾つかの中間状態のうち、PDIによるジスルフィド結合の交換反応性が高い種があることを見出したため、今後他のPDIファミリーとの相互作用解析により、基質認識に関する普遍的原理を探求する予定である。さらに、他の基質として、b2mやインスリンも採用し、これら酸化的フォールディング解析は順調に進んだ。以上、幅広い基質を認識する各種PDIファミリーの作動原理を更に追求する。その中でもPDIのみが最も優れたジスルフィドイソメラーゼであることがわかっているが、基質のフォールディング中間体の認識における作用機序は明らかでない。そこで本研究では、構造や機能が異なる複数のターゲット分子(基質)のフォールディング中間体を認識するPDIの機能発現機構に関する新たな概念の構築を目指した。酸化的フォールディングの基質としてプロウログアニリンを選定し、フォールディング経路を決定した。結晶構造解析によって最終構造を決定しPDBに登録した。次に、過渡的に集積されるフォールディング中間体の構造決定を目指し、NMRによって各種スペクトルを収集中である。過渡的に集積される幾つかの中間状態のうち、PDIによるジスルフィド結合の交換反応性が高い種があることを見出したため、今後ITCやNMRによる相互作用解析等を目指し、基質認識に関する各論的あるいは普遍的原理を探求することにより、「構造や機能が異なる複数のターゲット基質を認識するPDI酵素の機能的役割と機能発現機構」を明らかにする。基質のフォールディング解析や最終構造決定を終えており、今後NMRを用いた基質フォールディング中間体構造の決定を進め、論文化の目途が立った。一方で、PDIによる各種フォールディング中間体触媒の解析は難航している現状である。本年度中に、基質のフォールディングに関する論文について、国際一流紙への投稿を目指す。PDIによる各種フォールディング中間体触媒の解析は難航しており、CysをAlaに変異した安定なフォールディング中間体の作成などにより、克服する予定である。予想よりも、早く研究が進んだため、現時点までの成果で論文化にシフトした。平成30年度は、フォールディング中間体を用いたPDI酵素の構造解析を中心に行っていき、NMR用ラベル化試薬や人件費が必要と考えられる。また論文化に向けたface to faceの打ち合わせが予測されるため、旅費も必要と考える。以上、本研究課題に関わる効率的な論文化のため、適正な執行である。
肝臓の糖代謝・脂質代謝におけるEpacの役割の解明

Epacは新しいcAMP結合タンパク質で、細胞内シグナルの重要な分子である。我々は、グルカゴン作用におけるEpacの役割を初代培養肝細胞を用いて解析を行った。肝臓には、Epac2Cが発現する。グルカゴンは肝細胞のEpacシグナルを活性化した。Epac活性化剤は、グリコーゲン蓄積を抑制した。肝臓における糖新生系酵素の遺伝子発現は優位に増加した。さらに、Epac阻害薬ESI-05はグルカゴンによるグリコーゲン蓄積抑制作用をキャンセルしなかったが、糖新生系酵素の遺伝子発現は、抑制された。以上のことから、肝臓におけるEpac経路の活性化は、グルカゴンによる糖代謝に寄与することが示唆させた。EpacにはEpac1とEpac2の2つのアイソフォームが存在するため、まず、肝臓におけるEpacの発現をPCR法を用いて検討した。肝臓には、Epac2のみが検出された。また、ウエスタンブロット法を行い、脳組織にはEpac2Aが、肝臓においてはEpac2Cに一致する発現を確認できた。これらの結果は、既報の結果と一致する。次に、グルカゴンがEpacを活性化するかを活性型Rap1に対するpull-down assayを行い検討した。その結果、グルカゴンは、Rap1を活性化することを示した。これらの結果は、グルカゴンは、細胞内cAMP濃度の上昇を介して、プロテインキナーゼA(以下PKA)のみならず、Epacを活性化することが示唆された。グルカゴンは、肝臓に作用し、グリコーゲンの合成を抑制し、その分解を促進する。次に、これらの作用にEpacが寄与するかを明らかにするために、ラット初代培養肝細胞を用いて、Epacの特異的活性化剤である8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(以下ESCA)の肝グリコーゲン蓄積に対する作用を検討した。ESCAは、0.2 &#61549;M10 &#61549;Mにおいて濃度依存的に肝グリコーゲン含量を抑制した。次に、Epac阻害薬ESI-09存在下にグルカゴンを処置したところ、Rap1の活性化は抑制されたが、グルカゴンによるグリコーゲン抑制効果は全く影響を受けなかった。また、PKAの阻害薬であるKT-5720存在下でグルカゴンを処置しても、ESI-09同様に、グルカゴンによるグリコーゲン抑制効果は影響を受けなかった。これら結果から、Epacは、肝臓におけるグリコーゲン蓄積を調節することを明らかにした。しかしながら、グルカゴンによるグリコーゲン抑制作用には、PKAとEpacとの重複性が示唆された。昨年度、我々は、1)定量PCR法及びウエスタンブロット法を用いて肝臓にEpac2Cが発現すること、2)Rap1のプルダウンアッセイを用いてグルカゴンによってEpacが活性化すること、3)Epacの特異的活性化剤である8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(以下ESCA)を用いた実験からEpacの活性化は、初代培養肝細胞におけるグリコーゲンの蓄積を抑制すること、4)グルカゴンの作用をEpac阻害薬ESI-09はキャンセルしないことを明らかにし、グルカゴンによるグリコーゲン抑制作用には、Protein kinase A経路とEpac経路との重複性が示唆された。これらの結果から、肝臓におけるEpacの活性化は、in vivoにおいて肝糖代謝に寄与する可能性が示唆された。肝臓の糖代謝・脂質代謝におけるEpacの役割を明らかにするために、初代培養ラット肝細胞を用いて、グルコーゲン定量、PAS染色、糖新生系酵素の遺伝子発現について検討した。肝臓には、Epac2Cが発現していることを、PCR法及びウェスタンブロット法にて確認した。Rap1に対するPull-downアッセイを用いて、グルカゴンが肝細胞においてEpacシグナルを活性することを明らかにした。Epacの特異的活性化剤である8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(以下ESCA)を用いた実験から、Epacの活性化は、初代培養肝細胞におけるグリコーゲンの蓄積をグルカゴンと同様に抑制することを明らかにした。糖新生系酵素であるGlucose-6-phosphatase (G6PC)及びphosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)の遺伝子発現も優位に増加させた。このことから、肝臓におけるEpac経路の活性化は、グルカゴンによる糖代謝に寄与することが示唆させた。さらに、Epac阻害薬ESI-05はグルカゴンによるグリコーゲン蓄積抑制作用をキャンセルしないことを明らかにした。一方、糖新生系酵素の発現については、グルカゴンによる発現上昇を部分的に抑制した。以上のことから、グルカゴンの糖産生促進作用には、Protein kinase A経路とEpac経路が異なった役割を担っていることが示唆された。恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを設計及び作成に時間かかったため、研究計画が少し遅れている。

糖尿病学1. ESCAの糖代謝及び脂質代謝関連遺伝子の発現に及ぼす影響を検討する:単離した初代培養肝細胞にESCA処置し、PEPCKやG6PCなどの糖新生系酵素や脂質代謝関連の遺伝子発現を定量PCR法を用いて検討する。2.Epacの下流シグナルの検討:EpacはRap1を活性化することが知られているが、Rap1の肝糖代謝への役割は明らかではない。また、Epacは小胞体に作用して、細胞内カルシウム濃度を上昇させる。そこで、Epacの下流のシグナルを明らかにするために、まずは、カルシウムシグナルの関与について検討する。カルシウムキレート剤BAPTA-AMやIP3受容体阻害薬であるXestopongin CがESCAによるグリコーゲン抑制をキャンセルするかを検討する。3.恒常活性型Epac2Cを発現するアデノウイルス(Ad-Epac2C-CA)を用いて、In vivoにおいて肝臓における遺伝子発現を解析する。:アデノウイルスを発現させた肝臓を用いて、糖新生や脂質代謝に関連する遺伝子の発現を解析すると共に、マイクロアレイを用いた遺伝子解析を行う。作製したアデノウイルスを用いて、以下の実験を行う。1)初代培養肝細胞を用いた実験:優位阻害型Epac2Cアデノウイルスを感染させ、グルカゴン作用について検討する。2)In vivoによる検討:優位阻害型Epac2Cアデノウイルスをマウス頸動脈より投与し、グルカゴンを介した糖代謝、脂質代謝について検討する。本年度は、Epac特異的活性化剤による検討及びEpac2Cに対するshRNAを発現するアデノウイルスベクターを作製し、実験を行う予定であった。現在、恒常活性型Epac2C及び優位阻害型Epac2Cを発現するアデノウイルスを設計及び作成に時間かかったため、研究計画が少し遅れている。恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを設計及び作成に時間かかったため。恒常活性型Epac2C及び優位阻害型Epac2Cを発現するアデノウイルスを用いて、以下の実験を行う。初代培養肝細胞を用いた実験恒常活性型Epac2Cアデノウイルスを初代培養肝細胞に感染させ、グリコーゲン含量や中性脂肪含量への影響について検討する。また、優位阻害型Epac2Cアデノウイルスを感染させ、グルカゴン作用について検討する。グルカゴン作用には、PKAとEpacとの重複性が示唆されたため、恒常活性型Epac2Cアデノウイルスをマウス尾静脈より投与し、糖代謝、脂質代謝について検討する。恒常抑制型Epac2Cを発現するアデノウイルスを作製する費用に充てる。