hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA結合能を有する微小管モーター蛋白質(Kid)の細胞分裂及び増殖における機能

KidはDNA結合能を持つキネシン様モーター蛋白質で細胞分裂期(細胞周期M期)で重要な役割を果たしていることが示唆されている。今年度は、昨年度までに見出したKid会合蛋白質の解析と、Kidのリン酸化による機能制御に関する解析を主として行った。1. yeast two-hybrid法により、Kid会合蛋白質の候補として見出したFAFl,UBC9各蛋白質の全長cDNAを得た。このうちFAF1とUBC9cDNAについてはFLAGTagをつけて発現ベクターpMEI8Sに組み込んだ。これをKidと共に293T細胞に共発現させ、その細胞抽出液を用いた免疫共沈実験を行った。その結果、293T細胞内でもKidはFAF1やUBC9と会合しうることが分かった。2. HeLa細胞をS期で同調させ、細胞周期依存的Kid蛋白質のリン酸化を調べた。その結果、M期でKid蛋白質がよりリン酸化されていることが示唆された。Kid蛋白質はcdc2キナーゼによりリン酸化されうる配列TPKRERを有しており、事実カエル卵から精製したcyclinB/cdc2キナーゼによってin vitroでリン酸化された。又、M期の進行に重要であることが報告されているPLKキナーゼについても、そのcDNAにmyc Tagをつけた発現プラズミドを導入した細胞の抽出液を用い、その中の抗myc抗体による沈降物がGST Kidをin vitroでリン酸化することを示した。次いでcdc2キナーゼによりリン酸化を受けると予測された配列(TPKRER)の、リン酸化型を特異的に認識する抗体を作成した。3.米国UCSFのグループとの共同研究により、カエル卵抽出液中に抗Kid抗体と反応する約61kDa蛋白質の存在が確認された。おそらくこれは、カエルKid蛋白質と考えられ、cDNAクローニングを試みている。KidはDNA結合能を持つキネシン様モーター蛋白質で665アミノ酸残基からなっている。今年度はKidのDNA結合能、Kid結合DNA配列について検討を加え、さらにKidDNA結合ドメインをCOS細胞に発現させ細胞分裂に対する影響を調べた。ZhangらはEBウイルスの複製開始配列oriPに結合しうる蛋白質の部分cDNA配列をクローニングした。我々はこれがKidのカルボキシル端側の配列に相当することに気づき、フットプリント法でKidがoriP配列内の2価対称配列(DS)(112-bp)に結合することを確認した。さらにoriP内の30-bpを単位とする20回の重複配列(FR)にも結合することをゲルシフトアッセイで明かにした。このDSやFR配列内の配列は、元々KidcDNAクローンを得るためにプローブとして用いた配列と類似していた。またこれらの配列は、哺乳類染色体のセントロメアにあるアルフォイドDNA中の配列とも類似しており、これはKidがセントロメアに分布するという知見と矛盾しない。昨年度に引き続きKidカルボキシ端の様々な領域をGSTとつなげた融合蛋白質を新たに作成し、上記知見に基づいて、EBウイルスのoriPの一部(FR配列)を使ったゲルシフトアッセイで、KidのDNA結合領域をアミノ酸配列548-590に同定した。3.DNA結合領域のドミナントネガティブ効果Kid蛋白質のDNA結合領域を含むカルボキシル端側半分の配列をCOS細胞の強制発現させた。その結果、核分裂が不均等に起こりM期の進行が停止した。このことはKidが染色体の分配に重要であることを示唆している。今年度はKid結合DNA配列を明かにし、さらにKidに会合する分子の探索を行った。Degeneratedrondomオリゴヌクレオチド配列を利用したPCR-BSS(binding site selection)法により、Kid蛋白質と結合する配列を決定した。その結果次のような規則性を有する2種類のコンセンサス配列にKidが選択的に結合することが分かった。これらの配列は、哺乳類染色体のセントロメアにあるアルフォイドDNA中の配列とも類似しており、これはKidがセントロメアに分布するという知見と矛盾しない。酵母two-hybrid法を用いてKidのカルボキシル側半分(DNA結合領域を含む)と会合する蛋白質を探索した。これまでに細胞分裂前期に起こる核膜崩壊に関与するラミンB、細胞死に関与するFasと会合することが知られているFAF1蛋白質、ユビキチン依存性蛋白質分解酵素系に含まれるUBC9蛋白質等を候補として見い出している。Kid蛋白質はcdc

2キナーゼによりリン酸化されうる配列TPKRERを有しており、事実カエル卵から精製したcyclinB/cdc2キナーゼによってin vitroでリン酸化された。又、M期の進行に重要であることが報告されているPLKキナーゼについても、そのcDNAにmyc Tagをつけた発現プラズミドを導入した細胞の抽出液を用い、その中の抗myc抗体による沈降物がGST Kidをin vitroでリン酸化することを示した。次いでcdc2キナーゼによりリン酸化を受けると予測された配列(TPKRER)の、リン酸化型を特異的に認識する抗体を作成した。3.米国UCSFのグループとの共同研究により、カエル卵抽出液中に抗Kid抗体と反応する約61kDa蛋白質の存在が確認された。おそらくこれは、カエルKid蛋白質と考えられ、cDNAクローニングを試みている。
人身事故の国際化に伴う法的諸問題の研究

国際的な人身事故の法的処理をめぐっては、国際裁判管轄がまず問題となる。わが国判例は、従来の民訴法管轄規定の画一的適用(いわゆる逆推知)から、事件毎の多様なファクターを総合判断する「特段の事情」論に移行している。しかし、そこで具体的にどのようなファクターが考慮されているかは、従来あまり明らかにはされてこなかった。そこで、国際訴訟競合や主観的併合の問題を含め、判例が極めて柔軟に内国牽連性を基軸とした判断を行う傾向にある、との結果を得た上で、これを福岡での「国際民事訴訟法に関するドイツ・スイス・日本国際シンポジウム」においてドイツ語で報告した。また、特に財産所在地管轄の問題については、ドイツ、オーストリアにおいて、内国牽連性を要件とする新たな動きが見られたため、日本の民訴法8条との比較研究を行い、わが国においても同様の解釈が必要となることを神戸法学所掲論文において示した。なお、これらは財産関係事件の国際裁判管轄の問題であるが、身分関係事件の国際裁判管轄の規律と必ずしも整合的でない点が今後問題になるものと考え、後者につき、日本の親子関係裁判例を中心としてドイツ語論文を執筆し、ドイツで公表した。財産関係事件について判例が行っているような「特段の事情」判断は、身分関係事件においても今後必要になるものと思われる。次に、国際人身事故の規律を考える場合、その準拠法決定ならびに国際運送・保険法をも視野に入れておく必要があるが、これについては、1994年公刊予定の概説書、コンメンタール(共著)の中で一般的な形で論じ得たに過ぎず、掘り下げた研究論文にはできなかった。また、とりわけ外国人被害者の逸失利益算定の問題につき、東京で貴重な資料を収集する機会に恵まれたが、これをどのように分析し研究としてまとめるかも、残念ながら今後の課題とせざるを得ない。
組換えヒト血清アルブミンを用いた機能蛋白質の創製

本研究は、血漿蛋白質の約60%を占めるヒト血清アルブミン(分子量:66.5kDa)にC_<60>フラーレン誘導体を包接させた新しいアルブミン-機能分子錯体を創製し、その特徴と分子物性を明らかにすることを第一の目的としている。また、鋳型内交互積層法を利用して、アルブミンからなるナノチューブを合成し、電子顕微鏡観察から微細構造を解明することを第二の目標としている。得られたナノチューブの一次元内孔空間に所望の分子を包接させたバイオ超分子の構築へと研究を展開する。1.アルブミンナノチューブへの分子包接鋳型交互積層法により合成したアルブミンナノチューブ(平成20年度成果)の内孔空間に蛍光標識ナノビーズを取り込ませ、溶液の蛍光強度変化、透過型電子顕微鏡観察から、その捕捉能を定量的に評価した。内孔径よりも小さなビーズは効率よく取り込まれるが、大きなビーズは全く捕捉されないことを明らかにした。2.蛋白質ナノチューブの酵素活性最内層に酵素(α-グルコシダーゼ)を配置した蛋白質ナノチューブを合成し、一次元内孔空間で生起する糖の加水分解反応を詳細に解析した。蛋白質ナノチューブの酵素活性とその特徴を初めて明らかにした。アルブミンを用いた機能蛋白質の構築およびナノチューブの合成・構造・機能発現について総括し、学会発表さらには論文発表により広く公開した。本研究で得られた成果は、新しいバイオ超分子の創製に留まることなく、ドラッグデリバリー、ナノリアクターなど、次世代医療に新しい指針を示すものと考えている。本研究は、血漿蛋白質の約60%を占めるヒト血清アルブミン(Mw:66.5kDa)にC_<60>フラーレン誘導体を包接させた新しいアルブミン-機能分子錯体を創製し、その特徴と分子物性を明らかにすることを第一の目的としている。また、鋳型内交互積層法を利用して、それら機能蛋白質からなるナノチューブを合成、電子顕微鏡観察から微細構造を解明することを第二の目標としている。さらに、得られたナノチューブの一次元内孔空間に所望の生体高分子を包接させたバイオ超分子の構築へと研究を展開させる。本年度は、アルブミン-フラーレン錯体の合成と光機能の解明に集約した展開。ヒト血清アルブミン(HSA)にカルボキシフラーレン(CF)を1/1(mol/mol)で包接させることにより、アルブミン-フラーレン(HSA-CF)錯体を調製し、CFがHSAに定量的に包接されていることをHPLC、紫外・可視吸収スペクトルから明らかにした。HSA、CF各成分の吸収スペクトルの和がHSA-CF錯体のスペクトルと一致したことにより、CFがHSA内に均一に取り込まれていることがわかった。また、表面電荷状態を等電点電気泳動、小角X線散乱測定から解析した。ナノ秒レーザーフラッシュホトリシス分光法を用いて光励起三重項状態の特徴を解明。フラーレンがHSA内部で凝集または会合している場合などは、励起三重項寿命は短くなることを見出した。異なる酸素濃度下で、励起三重項寿命を測定、Stern-Volmerプロットを作成し、酸素分子へのエネルギー移動反応速度定数(kq)を算出。さらに、一重項酸素の生成能をその発光スペクトル測定から定量的に評価した。本物質は、腫瘍細胞に対する光線力学療法の増感剤として機能すると考えられる。得られた成果は、迅速に取りまとめ、米国化学会誌に投稿中である。1.アルブミン-フラーレン錯体の細胞毒性アルブミン-フラーレン錯体の構造と光物性を解明したので(一年次成果)、二年次はその分子が光線力学療法の増感剤として機能することを明らかにするため、光照射下における細胞毒性について検討した。腫瘍細胞(LY80)にアルブミン-フラーレン錯体を混合し、まず暗所下で細胞毒性がないことを確認、その後可視光照射を行うと、細胞数が著しく減少することを見出した(慶応大学医学部、堀之内宏久准教授との共同研究)。2.アルブミンナノチューブの合成と形態観察鋳型内交互積層法を利用して、アルブミンとポリカチオン(ポリ-L-アルギニン)からなるナノチューブを合成、その形態と微細構造を電子顕微鏡(FE-SEM、TEM)観察から明らかにした。詳細な調製条件の検討から、ナノチューブの合成法・単離法を最適化することができた。さらに、アルブミンナノチューブ内孔へ色素分子が効率よく取り込まれることを蛍光発光スペクトル測定から明らかにした。また、鋳型内

交互積層法を利用して、アルブミンからなるナノチューブを合成し、電子顕微鏡観察から微細構造を解明することを第二の目標としている。得られたナノチューブの一次元内孔空間に所望の分子を包接させたバイオ超分子の構築へと研究を展開する。1.アルブミンナノチューブへの分子包接鋳型交互積層法により合成したアルブミンナノチューブ(平成20年度成果)の内孔空間に蛍光標識ナノビーズを取り込ませ、溶液の蛍光強度変化、透過型電子顕微鏡観察から、その捕捉能を定量的に評価した。内孔径よりも小さなビーズは効率よく取り込まれるが、大きなビーズは全く捕捉されないことを明らかにした。2.蛋白質ナノチューブの酵素活性最内層に酵素(α-グルコシダーゼ)を配置した蛋白質ナノチューブを合成し、一次元内孔空間で生起する糖の加水分解反応を詳細に解析した。蛋白質ナノチューブの酵素活性とその特徴を初めて明らかにした。アルブミンを用いた機能蛋白質の構築およびナノチューブの合成・構造・機能発現について総括し、学会発表さらには論文発表により広く公開した。本研究で得られた成果は、新しいバイオ超分子の創製に留まることなく、ドラッグデリバリー、ナノリアクターなど、次世代医療に新しい指針を示すものと考えている。
発生・形態形式の個体レベルにおける分子生物学的研究

ニワトリ及びマウス初期胚において発現する新しいカドヘリンを複数同定し発現を調べた。そのうちあるものは、神経冠の一部の細胞だけが発現し、しかも、その細胞は特定の限られた組織に分化した。これは、神経冠細胞群が分化方向に応じて異なるカドヘリンを発現し、その行動制御に関わることを示唆している。また、他のカドヘリンは、神経管の融合部位のみ、あるいは特定の神経核のみで発現されるなど、形態形成上興味深い多くの発現パターンが明らかになった。一方、ショウジョウバエのカドヘリンを同定することに成功し、無脊椎動物にもカドヘリンが存在することを初めて示した。ニワトリalphaAクリスタリン遺伝子のエンハンサーalphaCE1領域に結合する因子のcDNAクローンを得た。この因子は、ショウジョウバエ転写因子Elflと相同性があった。またalphaCE2結合因子はc-mafであることが判明した。さらに、deltaクリスタリン発現抑制因子deltaEF1がE2boxに対して抑制因子として働くこと、deltaEF2がSoxファミリーに属することが明らかになった。deltaEF2の強制発現はdeltaクリスタリンエンハンサーを活性化した。さらに、deltaEF1欠損マウスの作製に成功した。始原生殖細胞特異的なレセプター型キナーゼ遺伝子を4種類分離した。このうちGCK3はPolo様キナーゼで、精原細胞、精母細胞、卵母細胞で発現されていた。遺伝子トラップにより得られたAyul遺伝子は大脳皮質後頭葉や十二指腸神経節で発現され、その遺伝子座の近傍にlethal spottingという遺伝子変異が存在することが明らかになった。ショウジョウバエrepo遺伝子を解析し、グリア細胞特異的に発現され、神経遊走のguidance cueとしての役割を持つことを示唆した。また、ショウジョウバエ神経得意的RNA結合因子musashiのマウス相同遺伝子の単離に成功した。ショウジョウバエにおいて特定の筋肉のみで発現するコネクチンcDNAをTollのエンハンサーにつなぎ他の筋肉で異所的に発現させると、運動神経の遊走異常が起きることを発見した。この結果は、コネクチンが神経、筋肉認識因子として作用することを初めて示したものである。消化管の領域特異的な分化と、Hox遺伝子群の発現パターンの関係を調べた。その結果、Hoxa-4、Hoxa-5、Hoxa-6の前方発現境界は、それぞれ、前胃と食堂、前胃と左嚢、砂嚢と十二指腸の境界にあった。これは、消化管の領域特異的分化にHox遺伝子群が関与していることを示唆している。チロシンキナーゼsrm、Fakの欠損マウスを作製した。後者は体幹部に形成異常があったが頭部は正常であった。また、前年度作製したCsk欠損マウスの神経上皮は培養下では正常に増殖分化することを明らかにした。

チロシンキナーゼsrm、Fakの欠損マウスを作製した。後者は体幹部に形成異常があったが頭部は正常であった。また、前年度作製したCsk欠損マウスの神経上皮は培養下では正常に増殖分化することを明らかにした。
ナノ力学プローブ顕微鏡による結合組織の形成過程における力学的制御機構の解明

前年度に開発した広域走査が可能な新型の走査型プローブ顕微鏡(WR-SPM)を用いて、上皮細胞が増殖し上皮組織を形成するまでの過程を力学的な見地から観察を行った。これまで市販のSPMでは100ミクロン程度の走査範囲が限界であったが、新たに開発したWR-SPMでは400ミクロンのエリアを走査することが可能となっている。現在までに、数百の細胞からなる上皮細胞のコロニー全体に対する弾性率分布の経時変化測定に成功している。さらに、一細胞レベルにおける細胞内張力のダイナミクスについてのSPM観察を行った。その結果、ストレスファイバーを構成するII型ミオシン調節軽鎖(MRLC)のリン酸化が細胞内張力の発生起源であり、伸長もしくは収縮といった外力が細胞に加わっても、細胞はMRLCのリン酸化レベルを変化させることで、細胞の形態や細胞内張力を安定化させていることが明らかとなった。また、保温装置付きの位相差顕微鏡を用いて、コラーゲンゲル基盤上で培養した上皮細胞が上皮コロニーを形成しながら集団で運動する過程を長時間観察した。その結果、(1)コラーゲン線維の配向性が上皮細胞の集団運動の方向を決定する。(2)ゲル基盤上の上皮細胞には、amoeboid型運動をするfollower細胞と、mesenchymal型運動をするleader細胞が存在し、それらの細胞の役割分担が空間的に制御されることで、上皮細胞は集団で一定方向に効率良く運動し、結合組織の形成を行う。ことなどが明らかとなった。以上、SPMで得られた結果と位相差顕微鏡による長時間観察の結果を比較すると、上皮細胞は組織を形成する過程において上皮コロニー周辺部のleader細胞が牽引力を発生し、その力がコロニー中心部に伝わることでコロニー全体が協調して一定方向に運動することが明らかとなった。まず、走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いた力学測定法の一つであるフォースモジュレーション法による弾性率と粘性係数の絶対値測定を可能にした。これまでフォースモジュレーション法は、短時間で高解像度の粘弾性測定が可能である反面、相対値しか得られないという欠点があった。そこで、弾性接触理論から導かれるHertzモデルを複素弾性率に拡張し、試料の粘弾性と溶液の粘性の両方を考慮に入れた1次元振動方程式を数値解析することで、弾性率と粘性係数の絶対値を導く手法を確立した。これにより、フォースモジュレーション法による弾性率と粘性係数の絶対値測定が可能となった。次に、「基盤のかたさ」という物理的な因子が組織の形成にどのような影響を与えるのかを調べる目的で、やわらかいゲル基盤とかたいガラス基盤の上に上皮細胞を培養し、増殖・運動する様子を位相差顕微鏡で長時間観察し、その運動の様子を定量的に解析した。その結果、ガラス基盤上の細胞は大きなコロニーを作らずにランダムな運動を行うのに対して、コラーゲンゲル上の細胞は数百から数千個の集団で、一軸方向への協調的な集団運動を示すことを発見した。また、コロニーの形態を詳細に観察した結果、ゲル基盤上でコロニーを形成している細胞集団はガラス上の細胞よりも底面積が10倍以上小さいことがわかった。細胞の体積を一定と仮定するとゲル上の細胞の方が基盤に対し垂直方向に高くなっていることがわかる。つまり、ゲル上の細胞は集団化すると軟らかいゲル基盤を自らの収縮力で変形させ、垂直方向に高くなることで細胞間接着を強固にする。その結果、物理的・化学的な細胞間のコミュニケーションが緊密になり、協調的な集団運動が引き起こされたのではないかと考えることができる。組織の形成過程において、基質の硬さという物理的因子が与える影響を調べる目的で、上皮細胞が増殖・移動・膜形成を行う様子を長時間観察した。位相差顕微鏡に顕微鏡保温装置を取り付けて、上皮細胞が生体内の結合組織に近い環境で上皮シートを形成する過程を数日間にわたり観察した。その結果、軟らかいコラーゲンゲル基盤上で培養した上皮細胞は、数百から数千個の集団で一方向に運動することが明らかとなった。この集団運動の時間発展を定量的に解析するために、個々の細胞の運動速度に関して平均自乗変位、自己相関、空間相関の時間変化を調べた。その結果、あらかじめコラーゲン線維が強く配向したゲル上で培養した細胞は、個々の細胞が線維の配向にそった運動を示すのに対し、線維の配向が弱いゲル上においては、細胞数が増加することで初めてゲルの配向方向に沿った集団運動を示すことが明らかとなった。さらに、上皮細胞が組織を形成する過程を力学的な見地から調べる目的で、広域走査が可能な新しい力学走査型プローブ顕微鏡(WR-SPM)の開発を行った。これまで市販のSPMでは100ミクロン程度の走査範囲が限界であったが、今回開発したWR-SPMによって400ミクロンのエリアを走査することが可能となった。これによって、数百の細胞からなる上皮細胞のコロニー全体を捉えることに成功した。弾性率分布の経時測定を行った結果、上皮細胞はコロニーを形成すると、コロニー周辺部の一部の細胞が牽引力を発生し、その力がコロニー中心部に伝わることで、コロニー全体が協調して運動することが明らかとなった。

これまで市販のSPMでは100ミクロン程度の走査範囲が限界であったが、新たに開発したWR-SPMでは400ミクロンのエリアを走査することが可能となっている。現在までに、数百の細胞からなる上皮細胞のコロニー全体に対する弾性率分布の経時変化測定に成功している。さらに、一細胞レベルにおける細胞内張力のダイナミクスについてのSPM観察を行った。その結果、ストレスファイバーを構成するII型ミオシン調節軽鎖(MRLC)のリン酸化が細胞内張力の発生起源であり、伸長もしくは収縮といった外力が細胞に加わっても、細胞はMRLCのリン酸化レベルを変化させることで、細胞の形態や細胞内張力を安定化させていることが明らかとなった。また、保温装置付きの位相差顕微鏡を用いて、コラーゲンゲル基盤上で培養した上皮細胞が上皮コロニーを形成しながら集団で運動する過程を長時間観察した。その結果、(1)コラーゲン線維の配向性が上皮細胞の集団運動の方向を決定する。(2)ゲル基盤上の上皮細胞には、amoeboid型運動をするfollower細胞と、mesenchymal型運動をするleader細胞が存在し、それらの細胞の役割分担が空間的に制御されることで、上皮細胞は集団で一定方向に効率良く運動し、結合組織の形成を行う。ことなどが明らかとなった。以上、SPMで得られた結果と位相差顕微鏡による長時間観察の結果を比較すると、上皮細胞は組織を形成する過程において上皮コロニー周辺部のleader細胞が牽引力を発生し、その力がコロニー中心部に伝わることでコロニー全体が協調して一定方向に運動することが明らかとなった。
Notchシグナルによる抗寄生虫応答機構の解明

我々のこれまでの研究からCD4+Tリンパ球のNotch 3と樹状細胞上のDelta 1が相互作用することで、Th1分化が著明に促進することを明らかになっている。一方で、CD8陽性Tリンパ球のエフェクター機能獲得におけるNotchシグナルの役割は不明であった。さらに、NK細胞の活性化機構にNotchシグナルがどのように寄与しているかも明らかになっていない。本研究から、Notch 2欠損CD8陽性Tリンパ球では細胞傷害性Tリンパ球(CTL)分化が著明に障害されていることが明らかになった。トリパノソーマ原虫感染のコントロールにはCTLが必須であるが、Notch 2遺伝子破壊マウスではトリパノソーマ原虫感染の抵抗性が著明に減弱していた。以上の結果から、Notch 2シグナルはCTL分化を調節し、原虫感染のコントロールに必須に近い役割を持っていることが解明された。Notch2シグナルと相互作用するNotchリガンドとしては、Delta-like 1およびDelta-like 4がその候補として考えられた。実際に、Delta-like 1を過剰発現させた樹状細胞では強力なCTL分化誘導能力があることをマウス個体内で実証することに成功した。以上の結果かから、Notch 2シグナルはCTL分化誘導に非常に重要な役割を担うシグナル系であることが明らかになり、原虫をはじめとするCTLが感染コントロールに必須の感染症のコントロールにもNotchシグナルが寄与していることが推測された。今後は、Notch 2と相互作用するNotchリガンドが何であるかを個体レベルで解明すること、感染体の中に宿主Notchシグナルに影響を与える分子の存在の有無について検討することが課題である。寄生虫感染に抗する免疫システムの制御機構および寄生虫の免疫回避機構を明らかにすることは、ワクチンをはじめとした抗寄生虫予防法・治療法を開発するためには必須事項である。本研究では原虫感染に対する獲得免疫応答におけるNotchシグナルの関与を明らかにし、Notchシグナルを制御することによる免疫制御法・ワクチン補助療法の開発を研究目的とする。また、寄生虫側のNotchリガンド様分子よる宿主免疫系の撹乱による免疫回避機構についても検討することを目的とした。本年度は細胞傷害性Tリンパ球の活性化にNotchシグナルが寄与するか否かについて検討し、Notch2シグナルが細胞傷害性Tリンパ球のエフェクター機能に必須の役割を担うことをトリパノソーマ原虫感染モデルを用いて明らかにした。特に、トリパノソーマ原虫感染をNotch2欠損Tリンパ球では制御不能であることを見いだした。また、Notch2シグナルがPKAのシグナル系とクロストークしてエフェクター機能分子の発現を制御していることも解明した。まさらに、NotchリガンドであるJagged2がNK細胞の活性化に重要な役割を担っていることを個体レベルで解明した。本結果から、Notchシグナルは獲得免疫系および自然免疫系の両者に作用し、感染免疫応答に寄与していることが明らかになった。また、原虫あるいは線虫由来のNotchリガンド用分子の単離を試み、そのうちのいくつかについては全長遺伝子をクローニングすることに成功した。来年度は、クローニングした遺伝子を用いて、宿主Notchとどのように相互作用するかについての検討を行うことを計画している。
局所的GABAシステム仮説に立脚した三叉神経痛発生メカニズムへのアプローチ

三叉神経節での細胞外GABAリリースをイメージングすることによりsatellite cell-神経細胞の神経伝達制御の可能性を検討した。その結果、分散培養下でニューロンとSGの両方からGABAが放出されており、GAT阻害剤(nipecotic acid)によりニューロンからのGABAリリースが阻害され、アニオンチャネル阻害剤(DNDS)によりSGからのGABAリリースが阻害された。また三叉神経節組織においても神経周囲からのGABAリリースが確認された。これらの結果は三叉神経節におけるGABAを介した神経伝達制御の存在を示唆する。「研究の目的」シナプスが存在しない三叉神経節内における抑制性神経伝達物質GABAの生理的役割はよく解っていない。三叉神経痛発症メカニズムに三叉神経節でのGABA受容体とGABAの機能が重要な役割を担っている可能性を明らかにすることを、電気生理、免疫組織化学、薬理学的に検討する。「今年度の研究実績」末梢刺激興奮による三叉神経節細胞の活動電位のイメージングとNa channelの発現について検討した。三叉神経節組織にCa2+感受性蛍光色素を導入し、Ca2+イメージングを行い電位依存的なCa2+を誘発した。また、電位依存的なNav1.1とNav1.8の発現を免疫染色学的に確認した。その発現は神経細胞によって異なっており、三叉神経節神経細胞の機能は一様ではないと推測される。またパッチクランプ法においても、三叉神経細胞のスパイクが確認された。そのスパイクはGABAB受容体のアゴニストであるbaclofenで増減し、その作用はGABAB受容体のアンタゴニストで抑制された。また、三叉神経節組織での神経細胞膜上にGABAB受容体が発現している事を免疫組織学的に明らかにした。上記の結果は、末梢での刺激が三叉神経節に伝わり、三叉神経節でGABAが放出され、細胞膜上に発現しているGABA受容体に作用する可能性を示唆する。これらの事はシナプスの無い三叉神経節でのGABAを介した、神経伝達制御の可能性を示唆する結果である。目的:シナプスが存在しない三叉神経節(TG)内における抑制性神経伝達物質GABAの生理的役割はよく解っていない。我々は、これまで三叉神経節の神経細胞体(NC)とサテライト細胞(SC)にGABAが存在し、分散培養の神経細胞体ではGABA受容体が機能発現していることを報告し、三叉神経節内におけるNC-SC間のGABAを介した神経伝達制御機構の存在の可能性を報告した。今回、我々はこの新しいGABA介在性神経伝達制御明らかにする目的で、画像解析と免疫染色法にて三叉神経節での細胞外GABAの放出の可能性を検討した。結果:スライスされたTG組織において、NC周囲に持続的なGABA放出が観察された。この自発的GABA放出は、細胞外高K+条件およびアニオンチャネル阻害剤(DNDS)それぞれ単独投与によって増加したが、興味深いことに高K+刺激により増加したGABA放出はDNDS投与することにより抑制された。また、細胞外の低Ca2+状態はGABA放出に影響を与えなかった。GABAfreeにおける分散培養24時間後のTGにおいては、NCからのGABA放出は認められたが、SCからのGABA放出は観察できなかった。しかしながら、100μM GABA添加1時間後においては、NCのみならずSCからもGABA放出が観察された。このとき、NCからのGABA放出は、DNDSでは抑制されず、GABA輸送体(GAT)阻害剤(ニペコ酸)によって抑制された。一方、SCからのGABA放出はニペコ酸で抑制されず、DNDSによって抑制された。これらの結果から、神経細胞体はGATを介してGABAを放出し、サテライト細胞はアニオンチャネルを介してGABAの可逆的な取り込み・放出を行なっていると考えられた。我々は、三叉神経節内において局所的なGABA作動性システムが神経細胞体とサテライト細胞の間に形成されて、神経伝達に重要な役割を果たしていると推測している。平成23年度における研究計画は、正常ラットにおける三叉神経節でのGABAリリースについてのデーター解析と追加実験、三叉神経痛モデル動物の動態行動とその病態を免疫組織化学、薬理学的に解明する、三叉神経痛モデル動物での末梢刺激興奮による三叉神経節細胞の活動電位のイメージングであった。今年度はラット三叉神経節におけるGABAリリースの神経のpathwayとなるGAT3の発現とGABAの合成であるGAD65/67の発現をWestern blotting法にて確認した。この結果は免疫細胞学的、また免疫組織学的な結果と一致する。三叉神経痛モデル動物に関する検討は動態行動がうまく確認出来ていない状況である。三叉神経痛モデル作成手技を検討する必要性があると思われるので今後の研究の課題として検討したい。脳のGABAB受容体と補助サブユニット形成するKCTD12,16が最近発見された。

KCTD12,16は脳のGABAB受容体によるK+とCa2+イオンの動態を制御す事から三叉神経節に置いてもKCTD12,16とGABAB受容体との関係を明らかにすることは重要である。そこで平成23年度新たにKCTD12,16についてラット三叉神経節で検討した。その結果、Western blotting法にてラット三叉神経節での発現が認められた。また三叉神経細胞レベルに置いて免疫組織学的方法にてGABAB1とGABAB2サブユニットの発現比は相関性が無く、KCTD12は細胞膜上に強い発現をみとめた。加えて、GABAB2サブユニットがKCTD16と相関するとわかった。
暗黒エネルギーとエキゾチックＲ４

暗黒エネルギーおよび宇宙の加速膨脹の数理的解析には,非コンパクト空間(有限の大きさではない空間)上のローレンツ幾何,リーマン幾何,非線形楕円型偏微分方程式,特にそれらの無限遠における挙動に関する新しい問題意識,枠組みが必要になる.本研究では,この問題への第一歩として,共形場理論による代数的・複素解析的アプローチを取り,コンパクト・リーマン面のモジュライ空間の無限遠における,共形ブロックと呼ばれるベクトル空間の挙動を詳細に調べ,そのために必要な作用素の代数のスペクトル解析の理論を整備した.平成25年度におこなったのは主に次の3点である.(1)ソボレフ空間論.本研究の目的である非コンパクト4次元多様体上のゲージ理論を展開するために,ソボレフ空間論を改めて見直すことが必要になってきた.ソボレフ空間とは,関数のなすベクトル空間であって,関数とその導関数の大きさが制御されているようなものである.従来のソボレフ空間論の大域解析への応用においては,コンパクト多様体の場合,あるいは非コンパクト多様体でも無限遠の挙動が制御しやすい場合が主であった.本研究では,宇宙の加速膨脹や暗黒エネルギーの理解を目標としているため,非コンパクト多様体であって無限遠での増大度が大きい場合を扱う必要がある,その場合,無限遠での増大度の設定によってソボレフ空間が大きく変わってくるというデリケートさがある.そのため,ソボレフ空間論の構成における微妙なポイントにも注意を払う必要がある,そこで,ソボレフ空間論の基礎的部分の一つ一つにおいて何が本質的に効いているのかを整理する作業をおこなった.(2)非コンパクト多様体の微分幾何.非コンパクト多様体上の大域解析をおこなう上で,宇宙の加速膨脹や暗黒エネルギーの研究に応用できるような出発点となる適切な設定が何であるかを明確化することが重要な課題である.適切な設定が何かを知るためには,非コンパクト・リーマン多様体,非コンパクト・ローレンツ多様体の良い例,その上での諸不変量が計算可能な例を参考にする必要がある.現在そのような良い例を多く扱っている分野として,超曲面の非等方的エネルギーと非等方的平均曲率一定超曲面の理論がある.この理論の観点から膨脹宇宙モデルを見直す作業をおこなった.(3)多様体の退化.共形場理論における曲面の退化の研究を進めた.これはAGT予想により4次元ゲージ理論にも関係している.暗黒エネルギーおよび宇宙の加速膨脹の数理的解析には,非コンパクト空間(有限の大きさではない空間)上のローレンツ幾何,リーマン幾何,非線形楕円型偏微分方程式,特にそれらの無限遠における挙動に関する新しい問題意識,枠組みが必要になる.本研究では,この問題への第一歩として,共形場理論による代数的・複素解析的アプローチを取り,コンパクト・リーマン面のモジュライ空間の無限遠における,共形ブロックと呼ばれるベクトル空間の挙動を詳細に調べ,そのために必要な作用素の代数のスペクトル解析の理論を整備した.4次元多様体のエキゾチック微分構造の研究に応用される4次元N=2超ヤン・ミルズ理論は,6次元理論を介して2次元共形場理論に関係づけられる,本年度は,土屋昭博氏(IPMU)と共同で2次元共形場理論の研究を行った.現在その成果を論文にまとめている.4次元N=2超ヤン・ミルズ理論におけるインスタントンのモジュライ空間のコホモロジーに,2次元共形場理論におけるW代数の表現が構成されることが予想されているが,W代数の表現論についてはまだよくわかっていないことが多い.特に,W代数の表現のテンソル積(フュージョン・テンソル積とよばれる)の定義を与えることが重要な問題である.本年度の研究で,頂点作用素代数の普遍展開環の稠密な両側イデアルを用いて,3点つき射影直線上の余真空ベクトル空間として,フュージョン・テンソル積が定義できる,というアイデアに向けて,基本的諸概念の整備,基本的な諸補題の定式化と証明を与えることができた.フュージョン・テンソル積の結合則や,普遍展開環上の左加群の圏と両側加群の圏の間のテンソル積を保つ圏同値は,4点つき射影直線上の余真空層の因子化として定式化される.この因子化定理は,左加群の圏が半単純である場合には知られているが,半単純でない対数的共形場理論においては,普遍展開環の稠密な両側イデアルを用いることにより,やや弱い形の因子化定理(リーマン面が退化するところのまわりでの余真空層の局所自由性は主張しない)が成立することが予想される.余真空層の双対である共形ブロック層の因子化の場合は,中山の補題を適用することができ,退化したリーマン面に対する因子化が,そのまわりで共形ブロック層が局所自由であることを導くことがわかった.暗黒エネルギーをもつ時空,およびエキゾチックR4の幾何学は,非コンパクト4次元多様体,特に『コンパクトから遠い多様体』を扱う.コンパクトから遠い多様体は,そもそもそれについて何を知りたいのか,という動機づけが問題であり,自然な動機づけから出発しなければ,自明なことしか言えない結果に終わる危険性が高い.そこで暗黒エネルギーとエキゾチックR4が自然な動機づけとなりうるか,というのが問題提起であった.エキゾチックR4の判別に応用されている4次元ゲージ理論の解析は,多様体上のソボレフ空間の理論と楕円型作用素の理論に基づいているが,これは通常コンパクト多様体あるいはコンパクトに近い多様体上で展開されていて,エキゾチックR4上の大域解析そのものではない.空間の無限遠と退化は双対的である.

そこで,退化ファイバーをもつ空間の族の上の大域解析学が課題となる.退化ファイバーをもつ空間の族の上の大域解析学に関しては,安定曲線上の共形場理論が非自明かつ接近可能なモデルを与えている.共形場理論は,リーマン面の変形族において,局所的には頂点作用素代数という構造によって場=作用素や相関関数が統御される.中でも頂点作用素代数の表現の圏が半単純ではない場合に対して,曲線の退化における挙動は,表現の圏のテンソル構造を誘導する.それを調べるのに用いられる,カレント代数の正則双加群の理論を,より一般的な設定で展開できるようにした.また,安定曲線上の共形ブロック上の可積分接続の構成の理論を整理した.また,種数が一般かつ曲線の退化を含む場合の相関関数の理論を,層の言語によって大域化した.また,頂点作用素代数がC2有限である場合に,種数0の場合の因子化について,座標をとって具体的に書き下し,中山の補題がそこで果たす役割を明らかにした.トポロジー幾何学的観点からのソボレフ空間論の理解について進展があった.また,非コンパクト・リーマン多様体,非コンパクト・ローレンツ多様体については,非等方的エネルギーの概念と非等方的平均曲率一定超曲面の豊富な例に出会えたことにより,方向性を絞ることができた.共形場理論における曲面の退化の研究も難点をクリアしつつある.理論の要である非半単純型共形場理論の因子化定理と,その応用としてのフュージョン・テンソル積,左加群/両側加群対応について,技術的課題が明確になり,基本的補題の定式化と証明を与えることができた.非等方的エネルギーの概念に基づいた,非コンパクト・リーマン多様体,非コンパクト・ローレンツ多様体上のソボレフ空間の理論の基礎を,その問題意識とともに明確化し提示したい.その際,基本的な非コンパクト多様体の例に対する計算をおこないたい.そのために,非等方的平均曲率一定超曲面の研究者とも交流していきたい.共形場理論における曲面の退化の研究も完成に向けて進めていく.まず現在作成中の論文を完成させる.因子化定理におけるズー代数の役割を明確化する.フュージョン・テンソル積の理論により,量子群の1のべき根における表現論との関係を確立し,3次元多様体の不変量に応用する.特に,4次元多様体のエキゾチック微分構造を判定する不変量への応用が目標になる.具体的な問題としては,結び目のスライス種数に関連する不変量に関する知見を得たい.東大IPMU,京大RIMS,大阪市立大学数学研究所などへ出張し,研究者と議論し,専門的知識の提供を受ける.論文作成のためソフトウェア,プリンタ用紙,トナー等を購入する.関連する書籍を購入する.
経験度による推定可否判断を付した水域メガリスク解析

設計外力の算定に用いられる極値統計解析は, 50年に平均的に1回生起することが, 1年に0. 02回の割合に等しいとする比例関係を用いて,過去に生起した観測記録を外挿することにより,将来に来襲するであろう巨大外力を合理的に算定できる唯一の方法である.ただし,従来法では,再現レベルに対する信頼区間を付せば,原理的には,いくらでも外挿が可能であると扱われてきたことに問題がある.本研究では,研究代表者が提案する経験度という新たな概念を用いて,外挿による推定の限界を示し,さらに,地球温暖化に伴う外力変化の可能性があるモデルにおいても,経験度を拡張した耐久性により,実時間軸上にある未来への外挿の限界も示した.設計外力の算定に用いられる極値統計解析は, 50年に平均的に1回生起することが, 1年に0. 02回の割合に等しいとする比例関係を用いて,過去に生起した観測記録を外挿することにより,将来に来襲するであろう巨大外力を合理的に算定できる唯一の方法である.ただし,従来法では,再現レベルに対する信頼区間を付せば,原理的には,いくらでも外挿が可能であると扱われてきたことに問題がある.本研究では,研究代表者が提案する経験度という新たな概念を用いて,外挿による推定の限界を示し,さらに,地球温暖化に伴う外力変化の可能性があるモデルにおいても,経験度を拡張した耐久性により,実時間軸上にある未来への外挿の限界も示した.希少頻度で生起するメガリスクの統計解析は,水域防災施設の設計外力を定める上で,不可欠である.しかしながら,30年程度の観測記録に対して,1度来襲しているか否かのレベル(既往最大外力あるいはそれ以上)にある設計外力を「外挿により」決定する.そのため,推定量の信頼性の指標が必要となる.経験度は,1)推定誤差の表現として,確率外力の信頼区間に変わるものであり,データの外挿がどこまで可能かを検討するものである.また,既往最大値は,しばしば,外れ値となる.そのため,経験度は,2)母分布の母数推定に与える外れ値の影響の度合いを計るものにもなりうる.このような指標を表す経験度について,時間に依存する極値モデルに組み込んだ検討を行った.その結果,1)経年変化が無い場合でも,観測期間の中央年から遠ざかるにつれて,経験度が低下(すなわち,推定精度が低下)することが明らかとなった.2)非定常な極値モデルに対して,少なくとも2種類以上の定義できる再現期間(瞬間超過確率仁よる定義Aと平均超過確率による定義B)に対応した経験度が定義できる.推定計算に用いることのできる1年あたりのデータ数が少なくなれば,定義Aによる経験度の低下が急激である.その一方,対象とする再現期間が長くなれば,定義Bによる経験度の向上が急激であることがわかった.規則的に変化するトレンドのみならず,不規則に変動する気候変動指標(SOIなど)を共変量とする検討も行った.既往最大値のように,頻度として稀な場合は,その経験度が低くても,極値解析の際に,対象データとして含めた上で,推定結果を否として検討を保留すべきであることに対し,気候変動指標の値が稀となるために経験度が低下する場合には,同種のデータが絶対的に少ないことを意味するため,極値解析の際に,対象データとして含めることさえ控える必要があると解釈できることを示した(一部の極値データを使用しない判断の根拠を与える).気候変動に伴う潮位や高波の極大値について,経年のトレンドに加え,SOI(南方振動指数)やAOI(北極振動指数)のような気象指数を共変量とした極値統計モデルに基づいた解析法の提案である.1)我々の研究で提案する「経験度」を用いることにより,共変量が外れることで,特異な条件が統計モデルを歪ませるような問題が生じていないか,感度分析ができることが新たにわかった.また,年最大値や極大値は本質的にデータ数が少ないため,経年のトレンドの検出は難しいという宿命がある.共変量を伴う極値モデルに対しては,経験度(の逆数)は,共変量のてこ比と,極値の確率変動(純粋な経験度の逆数)に分解される(これら2項の和で表される).このことを利用すれば,トレンドが検出されにくい場合も,時間の経過とともに,信頼区間の幅が増えて,検出されないトレンドを代用した推定結果を得ることが可能となる.このことを言葉を変えて言えば,「データの鮮度」が低下することに伴う回折効果として表される.2)従来法では,再現レベルに対して,対称な信頼区間として与えられていたが,本研究では,発生強度を陰リンク関数とするプラグイン推定を行い,上方に長く,下方に短い非対称な信頼区間を作成することができる.このような非対称性は,従来の応用統計学分野では,プロファイル尤度を用いた信頼区間を作成することにより,実現できる場合もあるが,最適化の計算が必ずしも成功するとは限らず,一度に信頼区間を多量に必要とする場合(信頼区間の経年変化など)には,現実的な計算に不利であるのに対し,我々の提案する「経験度」を用いたプラグイン推定では容易に計算可能である.3)モデルの適合性に経験度を用いて,「窓枠」を設けることにより,確率モデルで扱える領域と,もはや確率モデルでは扱えない領域(そのような巨大外力に対しては,特別な対策を講じる必要がある)に分けられることを示した.

後者の領域は「想定外も想定する」議論に密接に関係し,災害の原因となる来襲外力の対策について,今後の検討を要する.極値統計解析で不可欠な概念である再現期間は,将来に来襲するであろう巨大外力の予測のために,現在から近い将来までの時間として,土木工学をはじめとする応用分野では用いられてきた.しかしながら,過去の観測記録にもとづいて推測される超過確率(もしくは,生起率)の逆数が,再現期間の定義であり,過去,現在,未来へと経過する時間軸上で定義されるものではない.本年度の研究は,応用する上で必要となる将来に生起すると予想される極値の検討をするためには,現在から将来への経過時間と再現期間を区別して取り扱えるような理論の枠組み(超過確率に対する外挿と時間の延伸に対する外挿;それら2種類の外挿を取り扱う理論)を提示するものである.観測結果に定常モデルを適用して得られる情報が,過去から将来への時間の経過とともに低下していく(データの鮮度が低下する)ことを定量化した.このように定常モデルの経験度に,経過時間に伴う影響を加えたものを,耐久性(モデルの耐久性)と名づけ,経験度と同様に,その値が2未満となる場合の推定を保留する.耐久性を用いれば,推定結果を将来に向けて延伸する場合に,徐々に増大していく信頼区間を容易に与えることができるだけでなく,推定結果の将来への延伸が打ち切られることも表現できる.耐久性へと拡張する際に,定常の経験度に付与される時間変数を含む項を回折項と名づけ,耐久性により得られる信頼区間の幅が広がる様子を推定誤差の回折効果とよぶ.土木工学などの応用分野で,将来に来襲するであろう巨大外力の予測として,極値統計解析を用いて,再現期間に対する再現レベルの推定を行う際には,経験度を拡張して,経過時間に伴う推定誤差の回折効果も考慮することが重要であると言える.
リンパ球活性酸素による全身性エリテマトーデスの活動性と免疫異常の評価

2.SLEリンパ球の活性酸素は全てのサブセットで健常人より高く、特に活性化されたT細胞やB細胞が高かった。その直接の原因は、血漿サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IFN-γ)による刺激や、細胞接着分子(CD11a,CD29)を介した刺激によるものと推測される。3.リンパ球活性酸素とアポトーシス間には正の相関が、また末梢血リンパ球数との間には負の相関がみられた。さらに健常人リンパ球を刺激し活性酸素を高めると、アポトーシスも高くなった。したがって、SLEのリンパ球減少は活性酸素が関与したアポトーシスによるものと考えられる。4.SLEリンパ球のFas陽性率は全てのサブセットで健常人より高く、また活性酸素と正の相関があった。またBcl-2は健常人より高かった。したがってSLEリンパ球はアポトーシス感受性が高く、bcl-2が低い場合はin vivoでアポトーシスにより除去されるが、bcl-2が高いとアポトーシスを免れるものと考えられる。リンパ球を抗CD3抗体と抗Fas抗体で刺激し培養すると、リンパ球Fas陽性率はSLEが健常人より高くなり、bcl-2量はSLEリンパ球の方が健常人リンパ球より低下した。アポトーシスはSLEリンパ球より健常人リンパ球の方が高くなった。この結果は、SLEにはアポトーシス抵抗性リンパ球が存在することを示唆している。SLEリンパ球の活性酸素はSLEの臨床的活動性の評価には適さないが、むしろ生体の疾患抵抗性の指標となる可能性がある。1.リンパ球の活性酸素産生能健常人リンパ球をPMA刺激し、FlowCytometry(FCM)法でサブセット毎に活性酸素を測定すると、T細胞、B細胞、NK細胞の全てが活性酸素を産生した。2.生体内でのリンパ球の活性酸素産生状態健常人リンパ球の場合、CD4+T細胞とB細胞の活性酸素がリンパ球全体と比較して有意に高く、NK細胞が有意に低かった。SLEリンパ球の場合、健常人よりも全体的に産生は高かったが、中でもB細胞の高値が目立った。T細胞、B細胞の活性化抗原(CD25、CD80)の発現に伴う変化では、健常人ではT細胞、B細胞ともに活性酸素は有意に高くなった。しかしSLEの場合はT細胞は高くなったが、B細胞はさらに高くなることはなかった。3.リンパ球の活性酸素と細胞接着分子との関係細胞接着分子CD11aとCD29の細胞表面の発現量は、健常人とSLEとで差はなかった。しかしCD11a+リンパ球およびCD29+リンパ球の活性酸素量についてみると、健常人よりもSLEが有意に高かった。またCD29の発現量と活性酸素量に有意の相関がみられた。4.サイトカインのリンパ球活性酸素産生に対する効果IL-1β、TNF-α、IFN-γをリンパ球に加えると、いずれも無刺激に比べて約1.5倍の活性酸素の産生亢進がみられた。健常人リンパ球を血清で刺激した場合、健常人血清よりもSLE血清が有意の活性酸素産生亢進を示した。このSLE血清の刺激効果は抗IL-1β抗体、抗TNF-α抗体、抗IFN-γ抗体のいずれによっても抑制された。リンパ球活性酸素への単球の影響健常人リンパ球に単球を加えTNF-αで刺激した場合、健常人単球とSLE単球でリンパ球の活性酸素量に差はみられなかった。SLEリンパ球を用いた場合も同様の結果であった。1.リンパ球サブセットのFas発現率リンパ球のFasは、陽性率も抗原量も、すべてのサブセットでSLEが健常人よりも有意に高かった。

2.リンパ球サブセットのアポトーシス発生率末梢血リンパ球を無血清培地で1日培養すると、健常人で6.2%、SLEで11.3%がアポトーシスをおこした。サブセット別のアポトーシスは、CD19、CD56でSLEが有意に高くなっていた。また活性酸素、アポトーシス、リンパ球数との間には相関がみられた。3.活性酸素亢進因子によるアポトーシス誘導健常人リンパ球を種々の刺激剤で刺激し活性酸素を高め1日培養すると、活性酸素とアポトーシスの間に正の相関がみられた。4.抗Fas抗体によるアポトーシス誘導とリンパ球サブセットリンパ球を抗CD3抗体で7日間刺激培養後、抗Fas抗体とさらに1日培養すると、Fas陽性率は健常人リンパ球がSLEリンパ球より高くなり、bcl-2量はSLEリンパ球の方が健常人リンパ球より低下した。しかしアポトーシスはSLEリンパ球より健常人リンパ球の方が高くなった。この結果は、SLEにはアポトーシス抵抗性リンパ球が存在することを示唆している。5.SLEの活動性とリンパ球活性酸素SLEリンパ球の活性酸素量と臨床症状、検査、治療、疾患活動性指数との間には有意の相関はみられず、リンパ球活性酸素はSLEの臨床的活動性の評価には適さないと思われる。しかし活性酸素が高くなるとリンパ球減少および抗DNA抗体の低下がみられ、活性酸素が自己抗体産生細胞の減少に関与していることが示唆され、生体の防御反応の強さの指標となりえるかもしれない。
閉塞性脳血管障害に対する光力学的療法の開発に関する研究 光増感色素を使用した血管内レーザー照射による選択的非侵襲的治療

動脈硬化病変にたいする光力学的治療の臨床応用を目指し、平成3年度より光増感剤としてテトラサイクリン誘導体の塩酸ドキシサイクリン(DC),塩酸ロリテトラサイクリン(PRMTC),塩酸ミノサイクリン(MINO),硝酸ロリテトラサイクリン(PRMTC),塩酸オキシテトラサイクリン(OTC),を検討した。動脈硬化病変としては家兎動脈硬化モデルを用いて,動脈硬化巣への各種光増感剤の選択的集積性を検討したところ、DC>PRMTC>NPRMTC>OTC>MINOの順であり薬剤(抗生物質)として入手可能なテトラサイクリン誘導体のうち、DCが最も強い動脈硬化巣への選択的集積性を示した。また、そのDCの選択的集積性を用いた動脈硬化病変の蛍光診断についての検討では、動脈硬化病変の程度とその蛍光強度比がよく相関し,泡沫細胞の有無あるいは繊維化の程度をよく反映することが示され、動脈硬化病変の質的診断の可能性を示した。一方、各種光増感剤のレーザー照射増強効果を動脈硬化病変の蒸散能で検討したところ、DC>PRMTC>OTC>NPRMTC>MINOの順に増強効果が強かった。次に、蒸散能の検討結果をもとに急性変化を示さない程度のレーザー照射により、各種薬剤を用いて家兎動脈硬化モデルに対して光力学的治療を施行し、その治療効果を経時的に検討したところ、DCにおいては全例で2ヶ月後には動脈硬化巣の退縮、消失を認めた。また、経時的な治療効果を組織学的にみると、その効果は照射1週間目に動脈硬化巣の細胞成分が減少することに始まり、緩徐な変化で動脈硬化巣が減じるものであることが示され、安全性の高い治療法と考えられた。現在、臨床応用を考え、経皮経管的な治療とすべくファイバー導光により光拡散物質を使用したバルーンカテーテル法による管腔内照射実験を行っており、この結果を考慮し臨床応用に着手する予定である。動脈硬化病変に起因する閉塞性脳血管障害に対する光力学的療法の基礎実験として、摘出ヒト動脈硬化病変及び家兎動脈硬化モデルを用いて、光増感色素の動脈硬化部位への選択的取り込みをレ-ザ-励起蛍光測定により検討するとともにレ-ザ-励起蛍光顕微鏡により集積部位について病理組織学的にも検討した。光増感色素としてテトラサイクリン系薬剤の一種であるドキシサイクリンを使用し、摘出標本に光増感色素を投与し、検討したところ動脈硬化部位に選択的集積性を示すことを証明し、さらに点滴静注により投与した場合は投与後6時間から12時間において光増感色素が動脈硬化部位への優れた選択的集積性を示すことを確認した。また、光増感剤は動脈硬化病変の主に泡沫細胞に集積していることが得られた。一方、光増感色素を投与後の摘出標本を用いて血管内腔よりのレ-ザ-励起蛍光測定とその部位の病理組織学的所見を対比することにより動脈硬化病変の質的診断を試みた。血管内腔より測定された励起蛍光スペクトルを光増感色素固有の蛍光波長と血管壁の自動蛍光波長の蛍光強度比で数値化し検討したところ、正常血管壁では0.30.4と均一性を示したが動脈硬化部位では0.62.3と幅が見られた。さらに、動脈硬化部位の組織所見より、内膜肥厚は見られるが中膜平滑筋細胞遊走のほとんどない初期病変では0.61.0であり、一方、著明な中膜平滑筋細胞の遊走及び筋層破壊が見られると共に硬化内膜に壊死・泡沫細胞の集積・組織化を様々な程度で含む高度動脈硬化病変では1.62.3と明瞭な差を認めた。