hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
染色体凝縮因子コンデンシンによる遺伝子発現制御

ChIPアッセイから、二つのタイプのコンデンシン(I, II)は、間期で核小体のrDNAに結合することが分かった。また、コンデンシンをノックダウンしたとこころ、rRNAのヒストンのアセチル化が上昇し、コンデンシンが間期においてもクロマチン状態を抑制している可能性が示唆された。また、PP1とPP2Aの2種類のホスファターゼによる脱リン酸化が、M期終了の際のコンデンシンの局在制御に重要な役割を持つことを見出した。本研究では、分裂期(M期)染色体凝縮因子であるコンデンシン(コンデンシンI、及びコンデンシンII)が、分裂間期(間期)においてクロマチンの構造と遺伝子発現をいかに制御するか解析することを目的とした。M期と比較して、間期におけるコンデぞシンの機能はほとんど知られていない。ヒトHeLa細胞を用いた細胞分画の実験から、コンデンシン(I、II)が核小体に高濃度に存在することから、核小体に焦点を絞り解析を行った。まず、核小体に存在するタンパク質がコンデンシンと協調して、核小体クロマチンを制御する可能性を想定し、核小体に存在する約600種類のタンパク質に対するsiRNAライブラリーを作製した。HeLa細胞にトランスフェクションして解析を行ったところ、約10%の核小体タンパク質がM期の進行に関与することを見出した。また、これらの因子がPP1やAurora Bを制御することにより、M期の染色体の整列や、姉妹染色体分体の接着に関与することを見出した。現在、間期における核小体因子の役割を解析するために、核小体領域のクロマチン構造、rRNAの転写に対するノックダウウンの影響を解析中である。さらに、これらの因子とコンデンシン(I、II)を共にノックダウンする実験により、核小体因子とコンデンシンがいかに協調して間期のクロマチンの構造と遺伝子発現を制御しているかを解析している。候補因子が得られたら、それらの因子とコンデンシンがどのように相互作用してクロマチン構造を制御するかを解析する予定である。本研究では、染色体凝縮タンパク質であるコンデンシン(コンデンシンI及びII)の間期での機能を、特に核小体領域のクロマチン状態と転写レベルに着目して解析することを目標とした。コンデンシンをノックダウンしたところ、コンデンシンIとIIのどちらのタイプをノックダウンした場合にも、核小体のrDNA領域のrRNAの転写量を上昇し、その領域のヒストンのアセチル化も上昇した。従って、分裂期に染色体を凝縮因子であるコンデンシンが、間期においてもクロマチンの状態を抑制する方向に制御している可能性が示唆された。さらに、代表者らは、コンデンシン以外にも、核小体に存在するタンパク質が、間期核小体のクロマチン状態や分裂期の染色体の動態を制御していることを見出した。核小体に存在する595種類のタンパク質に対するsiRNAライブラリーを構築し、網羅的な機能解析を行ったところ、58種類のタンパク質が細胞周期の進行に影響を与えていることを見出した。それらの因子のうちで、機能未知な因子Nucleolar protein 11 (NOL11)に着目し解析を進めたところ、NOL11がrRNAを足場として、核小体や染色体に結合することを見出した。NOL11は分裂期においては、Aurora Bのコネとコアへの局在を制御することにより、分裂期の進行や正常な染色体動態を制御していることを見出した。また、NOL11が間期においてはrRNA転写やプロセシングの制御に寄与していることも見出している。さらに、NOL11が他にいくつかのタンパク質と複合体を形成し、RNAタンパク質ネットワークを形成していることを見出した。本研究では、分裂期(M期)染色体凝縮因子であるコンデンシンの機能を、核小体での役割を中心に解析することを目的にした。真核生物には2種類のコンデンシン(コンデンシンIとコンデンシンII)が存在しており、2つのタイプともに核小体に高濃度に存在している。コンデンシンは、M期には染色体に局在し、M期終了時にPP1とPP2Aの二つのタイプのホスファターゼにより脱リン酸化しM期染色体から解離し局在を変化させる。このホスファターゼでのコンデンシンの脱リン酸化がコンデンシンの間期における局在変化、及びにその機能発言に重要な役割を重要であると考えられる。申請者らは、コンデンシンの制御因子であるPP1のアイソフォームのうちで、核小体に存在するPP1-gammaが、核小体因子であるNOL11と相互作用することを見出した。また、NOL11は他のいくつかのタンパク質と複合体を形成すること、核小体RNAを足場として、間期では核小体にM期には染色体に結合することを見出した。この結果は、いくつかの核小体因子がRNAを足場としたRNA-タンパク質ネットワークを形成することを示している。NOL11を含んだタンパク質複合体が、間期核小体でpre-rRNAの転写とプロセシングに機能することが報告されている。

申請者は、この複合体がM期には、Aurora Bキナーゼの動原体への局在制御を介して、正常なM期染色体動態制御にも機能することを見出した。(理由)二つのタイプのコンデンシンが、核小体領域のrDNAのエピジェネティックな状態を制御している可能性を見出した。その詳細な制御メカニズムの解析は進んでいない一方で、コンデンシン以外のいくつかの核小体因子が、クロマチン状態や染色体動態を制御していることを見出しており、コンデンシンとそれらの因子を統合的に解析することにより、研究目的の解明に繋げることができると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。代表者らは、核小体に存在する58種類の因子が細胞周期の進行に関係し、そのうちでNOL11が、核小体rRNAの転写、プロセシング、分裂期染色体動態に重要な役割を持つことを見出した。さらに、NOL11がいくつかのタンパク質と複合体を形成していることを見出した。また、核小体RNAがNOL11を含めたいくつかの因子の核小体局在や染色体局在の足場になっていることを見出した。今後は、二つのタイプのコンデンシン、及びNOL11複合体、他の核小体タンパク質、核小体RNAのネットワークを解析することにより、コンデンシンを中心とした因子による、間期クロマチン制御の機構について解明したい。
複合炭素繊維補強コンクリートシェル構造の耐力評価に関する研究

屋根形式の複合炭素短繊維補強コンクリートシェル構造を対象として,シェル耐力および破壊形態を検証するため小型実験供試体を作製し破壊実験を行った。併せて,供試体を忠実に再現した数値モデルを構築し,シェル耐力の検証を行った。数値解析に於いては,薄肉モデルの扱いに特に注意が必要となり,シェルの板厚変動の影響を忠実に反映した数値解析を実施した。繊維補強コンクリートシェル構造に於いては小型実験供試体を作製する際に,板厚変動を最小限に抑制しようとする意図と,コンクリートの流動性を増大し炭素短繊維の均一な分散を促す作用とは,相互に相異なる手段を要する。従って,通常の鉄筋コンクリートシェルの供試体製作とは異なる特別の配慮が要求されるが,適切なコンクリートシェル耐力評価の立場からは,シェル板厚に比較的大きな変動分布が検出された場合に於いても,その影響を的確に考慮した耐力評価法を提案し,精度の高い数値解析の実施を目指した。一般にシェルの設計に於いて,構造耐力を大きく作用する因子として,上記に加えて,境界条件及び荷重条件を適切に考慮しなければならない。本研究に於いては,境界条件として,シェルの剛性と力の流れを明確に評価し,破壊実験と非線形数値解析の対応において明快な処理を行うことができるように,モデル化を行った。当該年度の破壊実験において,鉄筋コンクリート造,炭素短繊維補強コンクリート造,炭素繊維シート補強による鉄筋コンクリート造,並びに複合炭素繊維補強コンクリート造の4種を対象として,シェル中央部1点集中荷重による載荷実験を行った。以上の実験資料による検討を考慮して,複合炭素繊維補強コンクリートシェル構造の耐力を実験的及び数値解析的に明らかにし,総合的に判断し,複合炭素繊維補強における,炭素繊維シート及び炭素短繊維補強の相互作用効果を明確にした。平成15年度は,特に、炭素繊維シート補強時に,通常の鉄筋補強によるコンクリートシェル構造を対象として、力の流れが単純で明快である静的荷重載荷を中心として,破壊実験及び数値解析による検証を加えた。数値解析に於いて,板厚変動の大きい場合の解析方法を検討し,板厚変動を考慮した高精度数値モデル解析及び簡便耐力評価法の検証を行った。

数値解析に於いては,薄肉モデルの扱いに特に注意が必要となり,シェルの板厚変動の影響を忠実に反映した数値解析を実施した。繊維補強コンクリートシェル構造に於いては小型実験供試体を作製する際に,板厚変動を最小限に抑制しようとする意図と,コンクリートの流動性を増大し炭素短繊維の均一な分散を促す作用とは,相互に相異なる手段を要する。従って,通常の鉄筋コンクリートシェルの供試体製作とは異なる特別の配慮が要求されるが,適切なコンクリートシェル耐力評価の立場からは,シェル板厚に比較的大きな変動分布が検出された場合に於いても,その影響を的確に考慮した耐力評価法を提案し,精度の高い数値解析の実施を目指した。一般にシェルの設計に於いて,構造耐力を大きく作用する因子として,上記に加えて,境界条件及び荷重条件を適切に考慮しなければならない。本研究に於いては,境界条件として,シェルの剛性と力の流れを明確に評価し,破壊実験と非線形数値解析の対応において明快な処理を行うことができるように,モデル化を行った。平成16年度は,昨年度に引き続き、炭素繊維シート補強のシェルにおいて,炭素短繊維補強コンリートシェル構造に炭素繊維シート補強を施した複合炭素繊維補強コンクリート構造を対象として、静的荷重載荷を中心に,破壊実験及び数値解析による検証を加えた。数値解析に於いて,板厚変動の大きい場合の解析方法を検討し,板厚変動を考慮した高精度数値モデル解析の検証を行った。平成17年度は,シェル中央部に点荷重を静的に加え,破壊状態に至るまで載荷を行う従来の破壊実験に加えて,実験前の健全な状態を有する完全モデルの自由振動実験を行い,シェルモデルの振動特性を把握した.その後,破壊実験により得た損傷モデルの自由振動実験を行い損傷状況と対応した振動特性を実験的に求めた.以上の一連の実験結果に基づきコンクリートシェル構造の破壊形態とこれに対応した振動特性の変化との相互関係を求めるための基礎資料を得ることが可能となった.この資料に基づき,鉄筋コンクリートシェル構造、炭素短繊維補強コンクリートシェル構造,炭素繊維シート補強によるコンクリートシェル構造及び複合炭素繊維補強コンクリートシェル構造の破壊形態と振動特性の関係を整理し,補強面の効果も含めて,シェルの破壊形態と振動特性の変動の相互作用を明らかにしていく準備が整ってきた.今年度の研究手法としては,破壊実験及び上述の自由振動実験に加えて,供試体を忠実に再現した数値モデルを構築し,シェル耐力の検証を行った.数値解析に於いては,薄肉モデルの扱いに特に注意が必要となり,シェルの板厚変動の影響を忠実に反映した数値解析を実施した.対象としたモデルの中で代表的なタイプに関しては,衝撃荷重によるコンクリートシェル構造の破壊実験を行い破壊形態の確認を行った.ここでは,衝撃荷重規模が破壊形態に及ぼす影響を確認し,静荷重による破壊形態との相違及び類似性の比較検討を加えた.なお,今年度の実験においては,板厚変動量を抑えるために,アクリル型枠による二重型枠を採用し,既往のモデルと比較して,板厚精度を向上を目指した.
キノコ・海草類の食物繊維の理化学的特性と糞便の特性・腸内移動速度

食物繊維としてセルロースを与えたものに比べキノコを与えたものでは、キノコの種類による差はなく、腸内移動速度が約1.6倍に長くなった。一方、キノコを与えた方が糞の水分量が増えた。キクラゲよりもアラキクラゲの方が糞の水分量を増加させた。これは蓚酸塩-蓚酸可溶性食物繊維(OOSS)の効果によるものと考えられる。大腸を刺激し便秘を予防する効果は、不溶性のセルロースなどによるものであるということが言われている。しかし、ペクチンやOOSSのような水溶性食物繊維は糞便の腸内移動速度を促進する効果はセルロースより小さいが、糞便量と水分量を増加させ、便秘を防ぎ、種々の食物繊維の生理効果を発揮するものと予想される。調べたキノコ類は抗酸化力および還元力も有していた。日本人も韓国人も多くの者がキクラゲを知っていた。日本人はアラキクラゲをキクラゲとして認識する者が多かったが、アラキクラゲをキクラゲと認識する韓国人の割合は少なかった。両キクラゲに対する嗜好性は日本人では大差がなかったが、韓国人は外観と総合評価でアラキクラゲに低い評価をした。小学生から高校生まで、食物繊維という言葉を知っている者は多いが、キノコや海草を食物繊維の多い食品としてはとらえていなかった。日本も韓国も大部分の大学生が家庭科の授業を通して食物繊維を知った。両国の大学生もキノコ・海草を食物繊維供給食品として認識する者は少なかった。食物繊維を摂取する理由は特に無いという者が日本人高校生で多かった。日本・韓国の女子学生は便秘予防のため食物繊維を摂取するの割合が高かった。食物繊維の生理的役割、食物繊維摂取の重要性などを小学校・中学校あるいは高校で教えることが必要である。また、キノコ・海草を食物繊維供給食品として再認識しなければならない。総食物繊維はキクラゲ55%、アラキクラゲ94%、シロキクラゲ78%、シイタケ65%、マイタケ60%、コンブ48%、ワカメ72%、ヒジキ89%、テングサ61%、粉末テングサ寒天92%を占めていた。一方、血中コレステロール濃度上昇抑制作用があり、生理的に重要であると考えられる水溶性食物繊維を0.25%蓚酸アンモニウム-蓚酸で抽出すると、キクラゲ5%、アラキクラゲ18%、シロキクラゲ44%、シイタケ8%、マイタケ5%、コンブ31%、ワカメ47%、ヒジキ36%、テングサ30%の抽出物が得られた。水での水中沈降量(ml/g)はキクラゲ30、アラキクラゲ14、シロキクラゲ25、シイタケ18、マイタケ19、コンブ17、ワカメ46、ヒジキ15、テングサ12、粉末テングサ寒天17であった。保水量(g/g)はキクラゲ12、アラキクラゲ11、コンブ11、ワカメ24、テングサ5であった。水中沈降量、保水量は測定すると溶媒のpHにより変化した。キクラゲとアラキクラゲの粘弾性(V型プランンジャー使用)は、硬さ(kg)1.64と2.79、凝集性0.71と0.64、弾力性7.76と9.04、咀嚼性903と1614であった。日常消費されているキノコや海草の中には0.25%蓚酸アンモニウム-蓚酸可溶の水溶性食物繊維に富むものがあり、糞便を柔らかくし、便秘改善の効果が期待できる。キノコ・海草類の食物繊維の重要性を再認識し、生活習慣病の予防、健全な食習慣育成のために、幼児・児童期から食物教育を導入し、同時に家庭科の授業における食物教育の充実のために、キノコ・海草類を用いた教材開発などの工夫が必要である。

日本・韓国の女子学生は便秘予防のため食物繊維を摂取するの割合が高かった。食物繊維の生理的役割、食物繊維摂取の重要性などを小学校・中学校あるいは高校で教えることが必要である。また、キノコ・海草を食物繊維供給食品として再認識しなければならない。食物繊維としてセルロースを与えたものに比べキノコを与えたものでは、キノコの種類による差はなく、腸内移動速度が約1.6倍に長くなった。一方、キノコを与えた方が糞の水分量が増えた。キクラゲよりもアラキクラゲの方が糞の水分量を増加させた。これは蓚酸塩-蓚酸可溶性食物繊維(OOSS)の効果によるものと考えられる。大腸を刺激し便秘を予防する効果は、不溶性のセルロースなどによるものであるということが言われている。しかし、ペクチンやOOSSのような水溶性食物繊維は糞便の腸内移動速度を促進する効果はセルロースより小さいが、糞便量と水分量を増加させ、便秘を防ぎ、種々の食物繊維の生理効果を発揮するものと予想される。調べたキノコ類は抗酸化力および還元力も有していた。日本人も韓国人も多くの者がキクラゲを知っていた。日本人はアラキクラゲをキクラゲとして認識する者が多かったが、アラキクラゲをキクラゲと認識する韓国人の割合は少なかった。両キクラゲに対する嗜好性は日本人では大差がなかったが、韓国人は外観と総合評価でアラキクラゲに低い評価をした。小学生から高校生まで、食物繊維という言葉を知っている者は多いが、キノコや海草を食物繊維の多い食品としてはとらえていなかった。日本も韓国も大部分の大学生が家庭科の授業を通して食物繊維を知った。両国の大学生もキノコ・海草を食物繊維供給食品として認識する者は少なかった。食物繊維を摂取する理由は特に無いという者が日本人高校生で多かった。
軟骨石灰化を制御するホルモンと成長因子の同定

軟骨は石灰化しないかぎり骨に置換しない。したがって、成長板での軟骨の石灰化は骨の成長に不可欠である。一方、永久軟骨では石灰化は抑制されている。しかし、軟骨石灰化を制御する因子については未だ不明である。そこで本研究では、我々が開発した遠心管内軟骨細胞培養系およびII型コラ-ゲン・ゲル上での高密度培養系を用いて、石灰化促進因子および石灰化抑制因子の同定を試みた。さらにホルモンの影響を検討した。さらに、ホルモン受容体と軟骨細胞の石灰化誘導能との関係を追求した。「成果」2、FGF受容体は増殖期に最も多く最終分化期にはなくなった(J. Biol. Chem. 1991)。PTHおよびIGFーI受容体は基質形成期に最も多く最終分化期に1/5に減少した(日本骨代謝学会誌、1990)。すなわちホルモン受容体の変動が石灰化誘導能の発揮に不可欠であることが判明した。したがって、軟骨の石灰化は骨の成長に不可欠である。本研究では、軟骨細胞培養系を用いて軟骨石灰化を制御するホルモンと成長因子を同定する。1.遠心管軟骨細胞培養系で、副甲状腺ホルモンはアルカリホスファタ-ゼの誘導、45Caの取り込み、およびカルシウム含量の増加を抑制した。この抑制は、濃度および分化時期に依存していた。しかも培養液より副甲状腺ホルモンを除くことにより完全に回復した。2.一方、カルシトニンは逆にアルカリホスファタ-ゼの誘導、45Caの取り込み、およびカルシウム含量を増加させた。(Y.Kato et al.Endocrinology,in press 1990)3.ヘパリンの添加はアルカリホスファタ-ゼの誘導を3倍に増加したにもかかわらず、石灰化を抑制した。4.コラ-ゲンにてコ-トした培養シャ-レ上で軟骨細胞を高密度培養することによって、新しい軟骨石灰化モデルを開発した。5.血液中に存在する石灰化促進因子は血小板に濃縮されていることが判明した。6.永久軟骨に存在する石灰化抑制因子を部分精製した。(日本生化学会発表、1989)軟骨は石灰化しないかぎり骨に置換しない。そこで本年度は、我々が開発した遠心管内軟骨細胞培養系およびII型コラ-ゲン・ゲル上での高密度培養系を用いて、各種の成長因子およびホルモンの影響を検討した。「結果」1、副甲状腺ホルモン(PTH)の活性fragment[1ー34]は濃度依存性(ED_<50>,10^<ー9>M)に軟骨細胞の最終分化と石灰化を抑制することが判明した(Endocrinology,1990)。しかしPTH[3ー34],PTH[7ー34],PTH[13ー34]およびPTH[39ー68]は最終分化にも石灰化にも10^<ー10>ー10^<ー6>Mの濃度範囲で影響しなかった。このことは、PTH[3ー34]が軟骨細胞の増殖を促進するという報告とは対照的である。3、FGF受容体は増殖期に最も多く最終分化期にはなくなった(J.Biol.Chem.1991)。「結論」ホルモン受容体の変動が石灰化誘導能の発揮に不可欠であることが判明した。さらに、PTHの作用機構にcAMP系が重要な役割を果していることが示唆された。
高原子価金属錯体による窒素分子の活性化とアンモニア合成法の開発

本研究の目的は、高原子価二核窒素錯体と高原子価ニトリド錯体を合成し、さらにアンモニアへ変換する手法を開発することである。この目的に対し、これまで我々はバナジウムとクロムを中心金属とする窒素錯体の合成を行い、配位子の基本骨格であるtren (tris(2-aminoethyl)amine)の末端N原子上にイソブチル基、エチルブチル基、ネオペンチル基を導入した配位子と、バナジウム(III)とクロム(III)を用いて窒素錯体の合成に成功している。特に、クロムの系では、クロムイオンの空気中で最も安定な酸化数であるクロム(III)を用いており、これはクロム(III)を用いた窒素錯体の初めての例である。本年度、我々は、trenの末端N原子上にベンジル基を導入した配位子を新たに合成し、それを用いてクロム-窒素錯体の合成を行った。その結果、これまでと同様に二核クロム中心を架橋する形で窒素分子を配位することを、単結晶X線結晶構造解析の結果から明らかにした。また、合成した新規クロム-窒素錯体を用いて架橋窒素配位子のプロトン化を行なったところ、同様の配位子を用いたバナジウム-窒素錯体に比べて低収率であることがわかった。一方、これまでに当研究室で合成しているバナジウム-窒素錯体を用いて、金属ナトリウムや金属カリウムと反応させることによって、ニトリド錯体の合成を試みた。しかし、今回行った条件下では目的のニトリド錯体の生成を示す結果を得ることはできず、予想に反してバナジウム(II,III)の混合原子価およびバナジウム(II, II)の二核窒素が生成していることを単結晶X線結晶構造解析から明らかにした。本研究の3年目の目標は(1)4種類のクロム-窒素錯体の合成、(2)1種類以上のクロム-ニトリド錯体、およびバナジウム-ニトリド錯体の合成である。(1)について、今回新たに新規のクロム-窒素錯体の合成に成功した。その結果、今回新たに合成されたクロム-窒素錯体はこれまで当研究室にて合成したクロム-窒素錯体の中で、もっとも架橋窒素のN-N結合距離が短く、窒素配位子の活性化の度合いが小さいことがわかった。これまでに合成したクロム-窒素錯体の数は4つとなり、本研究の目標を達成することができた。(2)について、クロム-およびバナジウム-ニトリド錯体の合成については現在のところ、計画通りに進んでいない。合成したクロム-窒素錯体を用いて、今年度はまず加熱によるニトリド錯体への変換を試みたが、錯体の溶液をいくつかの反応条件下で加熱したところ、反応は起こらなかった。また、バナジウム-ニトリド錯体の合成をバナジウム-窒素錯体から変換できるか試みた。しかし、こちらの方でも現在までにニトリド錯体の合成を確認することができていない。一方、バナジウムの系では、目的錯体とは異なるものの、還元剤として用いた金属ナトリウムや金属カリウムがそれぞれ酸化されて架橋窒素配位子に一つ、または二つ配位した新規錯体の結晶構造を得ることができた。アルカリ金属イオンが配位する数については、配位子の末端置換基がイソブチル基では一つ、エチルブチル基では二つであり、これらは置換基の種類によって作り分けることが可能であることがわかった。これらの錯体は、当研究室にて合成しているバナジウム-窒素錯体の架橋窒素配位子がプロトン化される際の中間体の一つではないかと考えることができるため、予想外の結果を得ることができた。さらに、これまでに合成しているバナジウム-窒素錯体についての学術論文を投稿し、発表した。研究最終年度の本年度では、まず昨年度に続き、クロム-およびバナジウム-ニトリド錯体の合成を検討し、どちらか一つでも単離、結晶化を成功させ、X線結晶構造解析により結晶構造を決定するとともに、SQUID、ESR、NMR、IR、ラマンの各種スペクトル測定を行い、ニトリド錯体の構造的、電子的性質を中心とした化学的諸性質を明らかにする。振動スペクトルでは、15Nで同位体ラベリングした実験も必要になるため、適宜ラベリングされたニトリド錯体の合成も行う。合成されたニトリド錯体を用いてプロトン化反応を行い、アンモニアの生成と収率について、NMRを中心とした測定により明らかにする。ただし、これまでに試みたニトリド錯体の合成法では、現在までにニトリド錯体の合成に至っていないため、強い還元剤の選択と加熱などの反応条件について再度検討する。目的とするニトリド錯体が熱に不安定な可能性も考えられるため、ニトリド錯体の合成がどうしてもうまく行かない場合には、当研究室にて合成されているバナジウム-およびクロム-窒素錯体を、還元剤存在下、プロトン源である酸と反応させながら、低温での紫外可視吸収スペクトルを用いて反応を追跡し、反応中間体の検出を試みる。また、同時に生成物の同定を行う。さらに、昨年度合成に成功したクロム-窒素錯体について、ESR、SQUID、ラマンなどの他の分光学的測定を行い、化学的諸性質を明らかにする。一方で、予想外の結果となったバナジウム-窒素錯体へのアルカリ金属イオン付加体について、架橋窒素配位子のプロトン化を行い、こちらでもアンモニアの収率を検討する。最後に、窒素錯体からニトリド錯体を合成するにあたり問題点を整理し、解決策を提示する。

本研究の目的は、高原子価二核窒素錯体と高原子価ニトリド錯体を合成し、さらにアンモニアへ変換する手法を開発することである。この目的に対し、今回我々は、配位子の基本骨格であるtren (tris(2-aminoethyl)amine)の末端N原子上にイソブチル基を導入した配位子を用いて、新規の高原子価クロム窒素錯体の合成に成功し、その結晶構造を決定することができた。その構造は、すでに合成に成功しているtrenの末端置換基にエチルブチル基を有するクロム-窒素錯体と同様に、1つの窒素分子がEnd-on型に架橋配位した二核構造であった。配位子の二級アミンは全て脱プロトン化しており、その結果、配位している2つのクロムイオンはそれぞれIV価であった。したがって、この錯体も高原子価クロム窒素錯体であることが明らかとなった。また、架橋している窒素分子のN-N結合距離は0.117ナノメートルで、これまで報告されている同タイプの二核架橋窒素錯体におけるN-N結合距離と比較するとかなり短くなっていることが明らかとなった。すでに我々が見出している末端置換基にエチルブチル基を有する高原子価クロム-窒素錯体については、再結晶時に用いる溶媒量と静置温度を調節することによって、その収率を10%から42%まで増加させることができた。また、この錯体について、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルを用いてさらに分光学的な同定を行った。ニトリド錯体の合成に関しては、バナジウム-窒素錯体と還元剤との反応から合成しようと試みたが、その結果、架橋窒素にシリル基が結合したと考えられる化合物をNMRスペクトルから観測した。スペクトルでは副生生物が多く、架橋窒素にシリル基が結合した物質の単離と同定には至っていない。本研究計画の初年度目標は、(1)すでに合成に成功している高原子価クロム-窒素錯体の合成収率を10%から30%以上にする(2)2種類の新規高原子価クロム-窒素錯体の合成である。以下に各目的番号に即して具体的な進捗状況を記載する。(1)すでに合成に成功している高原子価クロム-窒素錯体のこれまでの合成方法では、これまでに我々が見出しているバナジウム-窒素錯体と同様に、室温で長期間静置することにより析出してきた結晶を採取していた。しかし、今回我々は、合成したクロム-窒素錯体が熱的に弱いと考え、-35度で静置することを行なった。その結果、目的収率である30%を超え、40%程度まで収率を向上させることができた。また、この結果に付随して、電子吸収スペクトル、赤外吸収スペクトル、1H NMRスペクトルの測定を行なうことができた。(2)今回、配位子の基本骨格であるtrenの末端置換基にイソブチル基を導入した配位子を用いて、1種類の新規高原子価クロム-窒素錯体の合成に成功した。また、得られた新規のクロム-窒素錯体は、単結晶X線結晶構造解析によってその結晶構造を決定することに成功した。さらに、他の配位子を用いた錯体についても現在合成を行っている最中であり、次年度の早いうちに新規錯体の合成に成功できると考えている。従って、研究所年度の目的に対し、新規錯体の数は一つ足りないものの概ね目標通りに研究を進行させることができたと考えている。
報酬制度と賃金手番の内生的決定及びその経済厚生に与える効果に関する理論的研究

労働市場の理論的分析において,企業間または産業間における賃金決定の順番は従来与件として扱われてきた。現実には,例えば春闘において鉄鋼や自動車などのリーディング産業や大企業が先に賃金相場を形成した後,中小企業が賃金を設定している。本研究では,このように日本の春闘において見られるような賃金決定の時間差について,どのような条件の下でそのような時間差が生じるかを複占市揚の枠組みを用いて理論分析を行なった。その結果,以下のようなことが明らかになった。1賃金交渉の時期の決定権を企業と労働組合のいずれがもっているかに関わらず,extended game of observabledelaysにおいて,Profit-sharing企業が先手となり,伝統的利潤最大化企業が後手となるシュタッケルベルク均衡のみが内生的に生じる。2大企業,中小企業を生産性の大小で差別化した場合,報酬制度としてProfit-sharing制度を採用している企業を生産性が高い大企業とし,最大化企業を生産性の低い中小企業とみなして分析を行なった。この場合,Profit-sharing企業を先手,利潤最大化企業を後手として賃金決定が行なわれていると想定した分析では,(1)需要ショックの雇用への影響は,逐次的な賃金交渉の場合,Profit-sharing企業の雇用を利潤最大化企業の雇用よりも安定化することが分かった。また,(2)Profit-sharing企業への生産性ショックは,利潤最大化企業の雇用をより安定化することが確認された。3報酬制度が異なることによる特徴を明確にするために,国際複占市場での分析に枠組みを適用した場合,利潤最大化企業の存在する国の政府はつねに輸出税(負の輸出補助金)を採用するのに対し,Profit sharing企業の存在する国の政府は輸出補助金政策を採用する可能性がある。労働市場の理論分析において,企業間または産業間における賃金決定の順番は従来与件として扱われてきた。しかし,現実には,例えば春闘において鉄鋼や自動車などのリーディング産業や大企業が先に賃金相場を形成した後,中小企業が賃金を設定している。本研究では,このような賃金決定の時間差が生じる状況について,企業別組合をもつ企業において報酬制度のみが異なる同質的複占モデルを構築して理論的な分析を進めてきた。大分や山口での定期的な研究打合わせや,東京,山口,長崎での資料収集を通じて研究を進めた。そして,Hamilton and Slutsky(1990)のObservable Delays Gameを援用して得られた暫定的な結論として,企業が雇用量の決定を裁量的に行なえる状況での労使交渉モデルにおいて、以下のようなことが明らかになった。(1)Profit-Sharing制度をもつ企業と利潤最大化企業が競争している複占市場では、賃金決定においてProfit-Sharing企業が先行者利益、利潤最大化企業が追随者利益を各々有している。(2)それゆえ、賃金決定の手番が内生的に決定される場合、Profit-Sharing企業が先手に,利潤最大化企業が後手になるシュタッケルベルク均衡のみが現れる。(3)また,Profit-Sharing企業を大企業(先手),利潤最大化企業を中小企業(後手)とみなした場合,正の需要ショックは,大企業(先手)の雇用を安定的にし,中小企業(後手)の雇用をより不安定にする。地方労働市場を分析対象とし,大企業が都市部に存在し,中小企業が地方に存在しているという状況を考慮すれば,この分析結果は,現実に観察される結果と整合的である。上記(1)(2)(3)の分析結果については査読付学術誌及び大分大学とドイツ・パダボーン大学との地域経済に関する共同研究論文集に投稿中である。

しかし,現実には,例えば春闘において鉄鋼や自動車などのリーディング産業や大企業が先に賃金相場を形成した後,中小企業が賃金を設定している。本研究では,このような賃金決定の時間差が生じる状況について,報酬制度の違いに注目し,同質的複占モデルを構築して理論的な分析を進めてきた。大分や神戸での定期的な研究打合わせや,東京,山口,福岡での資料収集を通じて研究を進めた。そして,Hamiltonl and Slutsky(1990)のObservable Delays Gameを援用して得られた暫定的な結論として,企業が雇用量の決定を裁量的に行なえる状況での独占的組合モデルにおいて、以下のようなことが明らかになった。(1)Profit-Sharing制度をもつ企業と利潤最大化企業が競争している複占市場において生産性を考慮した場合,Profit-Sharing企業を大企業,利潤最大化企業を中小企業とみなして,前者が後者よりも生産性が高い状況を想定した分析から,Profit-Sharing企業のみが先行者利益を有する可能性がある。(2)上記(1)の可能性は,報酬制度を考慮せず,生産性のみで大企業・中小企業を区別した場合には発生しない。(3)また,報酬制度が異なることによる特徴を明確にするために,国際複占市場での分析に適用した場合,利潤最大化企業の存在する国の政府はつねに輸出税(負の輸出補助金)を採用するのに対し、profit-sharing企業の存在する国の政府は輸出補助金政策を採用する可能性がある。上記(1)(2)(3)の分析結果は,各企業・各国政府の反応曲線の位置に依存して得られる。そして,上記(3)の内容については,大分大学経済論集にまとめられている。労働市場の理論分析において,企業間または産業間における賃金決定の順番は従来与件として扱われてきた。本研究では,このような賃金決定の時間差が生じる状況について,企業別組合をもつ企業において報酬制度のみが異なる同質的複占モデルを構築して理論的な分析を進めてきた。研究協力者(神戸大学大学院経済学研究科中村保教授)との研究打合せや,山口,福岡,神戸,大阪,彦根,名古屋での資料収集を通じて研究を進めた。そして,Hamilton and Slutsky (1990)のObservable Delays Gameを援用して得られた暫定的な結論として,企業が雇用量の決定を裁量的に行なえる状況での独占的組合モデルにおいて、以下のようなことが明らかになった。大企業,中小企業を生産性の大小で差別化した場合,報酬制度としてProfit-sharing制度を採用している企業を生産性が高い大企業とし,伝統的な利潤最大化企業を生産性の低い中小企業とみなして分析を行なった。この場合,Profit-
タイ東部臨海地域における工業化・地域社会の変容と健康の社会的決定要因に関する研究

東部タイ並びに東北タイの急激な工業化/鉱山開発の進む地域において、環境破壊と健康不安に向き合う地域/住民が、地域の自立的な発展に向けて必要とする4つの視点を、水俣学研究の経験を踏まえて提案した。1「予防原則」基づいた初期対応の重要性を確認すること、2「国(中央)」と「地方(周縁部)」という構造の存在の明確化すること、3社会的合意の形成を可能にする新たな民主主義の確立すること、4地域固有の資源を地域のために最大限活用すること。平成25年度は、タイにて、10月、12月、3月に計4回の現地調査、並びに、合同研究会を開催した。また、8月には、チュラロンコン大学で開催されたThe Second Global and Rejional Studies for Sustainable Developmentに参加し発表を行い討論にも参加した。一方、国内では、6月、8月、10月、12月、1月、3月に計8回の研究会を実施した。また、9月に環境被害に関する第2回国際フォーラムを開催し、タイから2名の海外共同研究者を含む5名の参加を得て、情報交換と議論を行った。タイにおける調査研究のフィールドは、ラヨーン県(東部臨海地域の一部)マプタプット工業団地周辺のコミュニティ、並びに、ルーイ県(東北タイ)タンボン・カオルアングの金鉱山に隣接するナ・ノン・ボン村を含む6つのコミュニティである。マプタプットについては、工業団地の拡大に起因する大気汚染問題で、2005年に校舎の移転を余儀なくされたパン・ピタヤカン中高等学校周辺のコミュニテイに焦点を絞り、マプタプット・ヘルスプロモーション・ホスピタルとの連携を視野に入れた協力/信頼関係づくりに取り組み、来年度の連携に向けた基盤整備を行うことができた。ルーイ県の金鉱山開発に向き合うコミュニティにおいては、生活と健康に関する聞き取り調査(水田やゴム林の視察を含む)を、まず6世帯で実施し、健康被害が懸念される3名については、医師による診察を行った。また、一方では、副知事、県公衆衛生部、地元の保健センターなどを訪問し、情報収集と意見交換を行い、金鉱山の開発に伴う環境破壊と健康被害への懸念が、この地域における最大の健康課題であることを確認した。タイにおける調査研究のフィールドは、ラヨーン県(東部臨海地域の一部)マプタプット工業団地周辺のコミュニティ、並びに、ルーイ県(東北タイ)タンボン・カオルアングの金鉱山に隣接するナノンボン村を含む6つのコミュニティである。マプタプットについては、工業団地の拡張に起因する大気汚染問題で移転を余儀なくされた旧パンピタヤカン中高等学校周辺のコミュニティ(かつてのマプタプット村)に焦点を絞り、マプタプット・ヘルスプロモーション病院との連携を視野に入れた協力/信頼関係づくりに取り組んできたところであるが、平成26年度は、上記学校でジュニア環境ガイドとして活動する7名の生徒宅を訪問しての調査(5月)や、マプタプット寺院の住職や地域の古老から工業団地の立地による地域社会の変容についての聞き取り調査など(2月)を行うことができた。東北タイ・ルーイ県における金鉱山問題に関しては、EARTH、並びに、チュラロンコン大学平和と紛争研究センターとの共催で学術セミナーを開催し、コメンテーターとして発言し討論に参加した。また、金鉱山に近接する村の住民10名を対象とする聞き取り調査を行うと共に、金鉱山周辺を踏査し環境被害の状況を確認した(9月)。平成27年度は、タイ及びミャンマーにて、5月、11月、12月、2月に計4回の現地調査、並びに、パートナーであるEARTHのメンバー、チュラロンコン大学平和と紛争研究センター長のスリチャイ氏を含めての合同研究会を開催した。また、11月には、チュラロンコン大学において開催された地域主導の健康影響評価(CHIA)に関する国際セミナー、ナレスワン大学において開催されたTHE FIRST ASEAN CONFERENCE ON IMPACT ASSESSMENT AND MITIGATION、12月には、ノンタブリで開催された第8回国家健康会議に参加すると同時に、タイ国家健康委員会事務局のアンポン事務総長らと今後の共同プロジェクトのあり方について協議を行った。また、ミャンマーのヤンゴンで開催された経済特区と住民の権利侵害に関するシンポジウムに参加すると共に、EARTH RIGHTS INTERNATIONALのメンバーと意見交換を行った。国内では、7月、9月、10月、11月、12月、1月、2月、3月に計8回の研究会を行った。調査・研究のフィールドは、タイ東部ラヨーン県のマプタプット工業団地周辺のコミュニティ、東北タイ・ルーイ県の金鉱山に隣接するナ・ノン・ボン村を含む6つのコミュニティ、並びに、ミャンマーのティラワ経済特区である。マプタプットでは、急激な工業化に伴う地域社会の変容についてのデータ収集とヒアリングを目的として、地元小学校の校長、キャッサバ農家、県保健局長、国立マプタプット病院環境保健研究所医師、地元住民らと面談し、これまでの研究成果をまとめる上で貴重な情報を得ることができた。ルーイ県ナ・ノン・ボン村では、地域の資源を最大限に活用した生活の全容を把握し、内発的なコミュミニティの発展に向けた議論を活性化することを目的として、綿の栽培、糸紡ぎ、機織り、製品化に関わる世帯の抽出と訪問調査を行い、ローカルな知を生かした暮らしの一端を明らかにすることができた。東部タイ

並びに東北タイの急激な工業化/鉱山開発の進む地域において、環境破壊と健康不安に向き合う地域/住民が、地域の自立的な発展に向けて必要とする4つの視点を、水俣学研究の経験を踏まえて提案した。1「予防原則」基づいた初期対応の重要性を確認すること、2「国(中央)」と「地方(周縁部)」という構造の存在の明確化すること、3社会的合意の形成を可能にする新たな民主主義の確立すること、4地域固有の資源を地域のために最大限活用すること。9月に、チュラロンコン大学において鉱山問題についての学術シンポジウム("Myths and Facts: Gold Mining in Loei Province")を海外共同研究者との共催で開催できたことは、地域資源の活用におけるガバナンスのあり方を考える上で極めて有意義なものであった。しかし、5月15日、金鉱山に近接するコミュニティにおいて起きた住民襲撃事件の直後、タイではクーデターが起き、国家治安維持評議会(NCPO)によって派遣された軍が村に駐留、外部との関係を事実上遮断したことから、9月の聞き取り調査は村外で行うことを余儀なくされた。また、毎年12月に、海外からの招待者を含めて開催されているNational Health Assemblyが、戒厳令下ということもあり、プログラムを縮小して開催された(前年度は政治的混乱から中止)ことから、Healthy Public Policyの形成過程に関するヒアリングが十分に行えず、一部、目的を達成できなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。水俣学海外共同研究者(NGOのEARTH、並びに、チュラロンコン大学紛争と平和研究センター)との連携をさらに深め、この2年間において構築できた東部タイ・ラヨーン県、並びに、東北タイ・ルーイ県をフィールドとする研究基盤を活かして、急激な工業化/開発行為に伴う地域社会の変容に向き合う当事者とステークホルダーを対象としたヒアリング・意見交換を当初の計画に沿って進め、Healthy Public Policyの策定と推進の鍵を握るツールとして重要な意味を持つHealth ImpactAssessment、並びに、National Health Assemblyの意義・成果・課題について明らかにしていきたい。8月にチュラロンコン大学(バンコク)で、9月には熊本学園大学(熊本)にて開催された2つの国際会議での議論を踏まえて、3回の現地フィールド調査を海外共同研究者との連携で実施できたことにより、3年間にわたる調査研究の基盤を確立できた。国家健康委員会事務局を対象としたHealthy Public Policyの形成過程に関するヒアリングについては、不安定な政治状況の中で、12月に開催が予定されていたNational Health Assemblyが年度内に開催されなかったため、一部、目的を達成できなかった。次年度に使用予定があるため27年度が最終年度であるため、記入しない。
種付け−方向凝固（DS）法による2相TiAl合金のラメラ方位制御

少量のTi_3Al相を含む2相TiAl合金は新しい軽量耐熱材料として近年,集中的に研究されている.その凝固組織に現われる二相ラメラ組織は,破壊靭性,高温強度に優れるが,引張延性に劣る.延性,靭性のバランスのとれた機械的性質をTiAl合金に付与するには,ラメラ方位を一方向に制御する必要があり,我々はこれまでにSiを添加したTi-46Al-3Si合金で一方向凝固(DS)法を用いてラメラ方位を一方向に制御することに成功している.しかし,この合金には粗大で脆いシリサイド相が含まれて多量に含まれている.本研究では,ラメラ方位を一方向に制御したTi-46Al-3Si合金を種結晶として,それよりもSi量の少ないTi-(47-X)Al-XSi(X=02)合金を種付け,育成し,ラメラ方位の制御と同時にシリサイド相の体積分率を減少させることを目的とした.Xの減少とともに減少とともに初晶がαからβ相へと変化し,ラメラ方位制御は困難となるが,いずれの合金でも方位制御,結晶の種付け育成とも可能であった.シリサイド相の体積分率は,Xの減少とともに減少する.X=0.5以下ではシリサイド粒子は全く存在しなくなる.引張伸びは,シリサイド相の体積分率の減少とともに増大する.全くシリサイド粒子の存在しないX=0.5及び0の2元系合金では60%を越える大きな引張伸びが得られた.これらの合金の降伏応力は,400450MPaと高く,強度,延性ともに兼ね備えている.すべての柱状晶粒のラメラ方位が凝固方向にそろっていて結晶粒間でラメラ方位が互いに回転したDS材の育成を,同様の種付け法で試みたが,2,3の結晶粒の成長が優先し,成功しなかった.少量のTi_3Al相を含む2相TiAl合金は新しい軽量耐熱材料として近年,集中的に研究されている.その凝固組織に現われる二相ラメラ組織は,破壊靭性,高温強度に優れるが,引張延性に劣る.延性,靭性のバランスのとれた機械的性質をTiAl合金に付与するには,ラメラ方位を一方向に制御する必要があり,我々はこれまでにSiを添加したTi-46Al-3Si合金で一方向凝固(DS)法を用いてラメラ方位を一方向に制御することに成功している.しかし,この合金には粗大で脆いシリサイド相が含まれて多量に含まれている.本研究では,ラメラ方位を一方向に制御したTi-46Al-3Si合金を種結晶として,それよりもSi量の少ないTi-(47-X)Al-XSi(X=02)合金を種付け,育成し,ラメラ方位の制御と同時にシリサイド相の体積分率を減少させることを目的とした.Xの減少とともに減少とともに初晶がαからβ相へと変化し,ラメラ方位制御は困難となるが,いずれの合金でも方位制御,結晶の種付け育成とも可能であった.シリサイド相の体積分率は,Xの減少とともに減少する.X=0.5以下ではシリサイド粒子は全く存在しなくなる.引張伸びは,シリサイド相の体積分率の減少とともに増大する.全くシリサイド粒子の存在しないX=0.5及び0の2元系合金では60%を越える大きな引張伸びが得られた.これらの合金の降伏応力は,400450MPaと高く,強度,延性ともに兼ね備えている.すべての柱状晶粒のラメラ方位が凝固方向にそろっていて結晶粒間でラメラ方位が互いに回転したDS材の育成を,同様の種付け法で試みたが,2,3の結晶粒の成長が優先し,成功しなかった.
膵β細胞におけるTRHの作用解析

甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)遺伝子欠損マウス(TRHKO)では耐糖能障害が観察され、膵ランゲルハンス氏島からのインスリン分泌の低下も認められた。膵臓β細胞におけるTRHによるインスリン分泌に対する作用の詳細は不明であったためTRHKO膵臓より単離したラ氏島を利用しマイクロアレイ解析を行い、有効な発現を示す7827遺伝子が検出された。甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(thyrotropin-releasing hormone ; TRH)は、視床下部の主に室傍核より分泌され、下垂体前葉の下垂体甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生細胞に作用しTSHの合成分泌を刺激する。我々のグループにおいて確立されたTRH遺伝子欠損マウス(TRHKO)の研究により、TRHKOは中枢性甲状腺機能低下症の病態を表すこと、TRHは胎生期のTSH産生細胞の発生分化には必要でなく生後のTSH産生細胞の維持に必須であることなどが明らかとなっている。興味深いことにTRHKOでは軽度の耐糖能障害が観察され、膵ランゲルハンス氏島からのインスリン分泌の低下も認められた。これまでに膵臓β細胞にTRHの存在は知られていたが、インスリン分泌に対する作用の詳細は不明であった。そこで今回、TRHKO膵臓より単離したラ氏島を利用しマイクロアレイ解析を行い、TRH欠損による遺伝子発現への影響を解析する事とした。マイクロアレイの結果、7827遺伝子が検出された。野生型マウスと比較してTRHKOマウスから単離したラ氏島では179遺伝子が2倍以上の発現低下、155遺伝子が2倍以上の発現増加を示した。この中から、我々はfibroblast growth factor 21(FGF21)に注目した。FGF21は、生体において糖、脂質などのエネルギー代謝の重要な調節因子として働いており、膵臓β細胞機能に作用することも報告されている。TRHKOから単離したラ氏島におけるFGF21 mRNAレベルは、野生型マウスのラ氏島でのmRNA発現レベルの約4060%に低下しており、これはTRHKOに甲状腺ホルモンを補充した場合にも変化しなかった。現在、FGF21遺伝子のプロモーター領域をサブクローニングしLuciferase発現レポータープラスミドに導入しプロモーター活性測定、プロモーターの欠失変異コンストラクトを作製し、TRHの活性責任部位の決定、関与する転写因子の同定などを株化細胞であるMIN6やβHC9、βTC6細胞等を利用して行っている。生体において膵臓β細胞の正常な機能維持にTRHは重要であり、その作用機構の1つとしてFGF21を介してパラクリン的に作用している事が示唆された。甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(thyrotropin-releasing hormone ; TRH)は、視床下部より分泌され、下垂体甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生細胞に作用しTSHの合成分泌を刺激する。我々のグループにおいて確立されたTRH遺伝子欠損マウス(TRHKO)の研究により興味深いことにTRHKOでは耐糖能障害が観察され、膵ランゲルハンス氏島からのインスリン分泌の低下も認められた。これまで膵臓β細胞にTRHの存在は知られていたが、インスリン分泌に対する作用の詳細は不明であった。そこで今回、TRHKO膵臓より単離したラ氏島を利用しマイクロアレイ解析を行い、TRH欠損による遺伝子発現への影響を解析した。マイクロアレイの結果、有効な発現を示す7827遺伝子が検出された。この中から、我々はfibroblast growth factor 21 (FGF21)に注目した。TRHKOから単離したラ氏島におけるFGF21 mRNAレベルは、野生型マウスのラ氏島での皿RNA発現レベルの約4060%に低下しており、これはTRHKOに甲状腺ホルモンを補充した場合も同様だった。TRHによるFGF21遺伝子発現のメカニズムを解明するため、FGF21プロモーターをクローニングしLuciferase発現レポータープラスミドに導入しプロモーター活性測定、プロモーターの欠失変異コンストラクトを作製し、TRHの活性責任部位の決定を試みた。β細胞の株化細胞であるβHC9、βTC6細胞等を利用して、プロモーター解析やEMSAの結果、TRH応答部位が判明し、関与する転写因子等の核内蛋白質の存在が示唆された。生体での膵臓β細胞の正常な機能維持にTRHは重要であり、その作用機構の1つとしてFGF21が関与していると考えられた。TRHは膵ラ氏島において遺伝子転写レベルでFGF21発現調節を行っている。
iPS細胞における肺細胞誘導遺伝子同定と肺細胞細分化誘導の試み

マウスiPS細胞をin vitroで肺胞上皮細胞に分化させることを目的に研究を行った。まず、培地にActivin AとWnt3aを加え7日間培養することにより、iPS細胞は内胚葉細胞へと分化し、SOX17とFoxa2の発現が確認された。次に、FGF2を加えて更に5日間培養した。その結果、約8%の細胞にSP-Cの発現を認めた。また、電子顕微鏡での観察でも、肺胞II型上皮細胞に特徴的な微絨毛が観察された。我々は既にCCSPプロモーターでGFPを発現するトランスジェニックマウス(C57BL/6-tgCCSP/GFP)の作成に成功している。本年度はホモのトランスジェニックマウスを作成することができたので、今後は生まれたマウス全てがGFP発現マウスである。また、普通のマウスを使って、脱血・洗浄後、肺を無菌的に摘出し、コラゲナーゼ溶液で単細胞浮遊液を作成する。この細胞浮遊液にCD45抗体とSP-C抗体を加え、それぞれ2次抗体を反応させ細胞ラベルする。肺胞II型上皮細胞の分離にはCD45/SP-C+細胞を、肺幹細胞の分離にはCD45-/SP-C+/GFP+細胞を、それぞれセルソーターを用いて回収する方法に習熟した。(2)マウスiPS細胞の入手と培養まず、弘前大学遺伝子組み換え委員会に実験計画を提出し、承認を得た。次に、理研バイオリソースセンターより、山中らが樹立したマウスiPS細胞を入手し、feeder細胞を用いて培養を行い、iPS細胞の扱いに習熟するよう訓練を開始した。次に、feeder細胞とiPS細胞の培養条件をいろいろ設定し、適切な培養条件を決定した。さらに、この細胞が多能性を維持した幹細胞の機能を維持しているか検討するため、ALP,NANOG,Oct-4の発現をflow cytometerで検討した結果、幹細胞のマーカーであるこれらが発現していることを確認した。現在、様々な培養条件や成長因子を加えて、肺上皮細胞へ分化について検討し始めている。山中らが樹立したマウスiPS細胞(iPS-MEF-Ng-492B-4)を理化学研究所より入手し、feeder細胞(SNL76/7)を用いて継代培養を行い、培養手技の習熟を図った。未分化マーカー(SSEA-1、OCT3/4、Nanog)の発現を免疫染色とフローサイトメーターで確認したところ、30代継代してもiPS細胞の未分化状態を維持できることを確認した。そこで、既報のES細胞から肺上皮細胞へ分化するプロトコールを改良して、invitroでiPS細胞から肺上皮細胞への分化誘導を試みた。まず、iPS細胞の培地にactivinA(20ng/ml)、Wnt3a(10ng/ml)を加えて、6日間の培養を行い、iPS細胞をまず内胚葉細胞へ分化させた。内胚葉分化マーカーとして、SOX17とFoxa2の発現を確認したところ、分化誘導の結果、著しく発現上昇していることを、リアルタイムPCRおよびFCMで確認した。内胚葉に分化したiPS細胞をさらにSABM(smallairwaybasalmedium)にFGF2(50ng/ml)を加えて5日間培養を行い、肺上皮細胞への分化を試みた。その結果、分化開始11日目8%前後の細胞にSP-C蛋白の発現が免疫蛍光染色およびFCMで確認された。また、リアルタイムPCRにおいても、SP-CmRNAの発現上昇が確認された。また、電子顕微鏡検査より、肺胞II型細胞に特徴的なlamellabodyと微絨毛が確認された。以上より、ES細胞と同様、iPS細胞からもinvitroにおいて、肺上皮細胞への誘導が可能であることが確認された。
ビタミンＡとステロイド懸濁羊水注入併用気管支結紮による羊胎仔横隔膜ヘルニア治療

先天性横隔膜ヘルニア(CDH)は年間200例ほどの希少疾患ではあるが死亡率が高率である。死因には肺低形成が関与しており、胎児治療が試みられているが明らかな生存率の改善を示せておらず、標準的な治療にはなっていない。今回我々は効果的な新規胎児治療としてCDH羊胎仔の気管支内に羊水や有用な可能性がある薬剤を注入し肺容量を増加させる治療を考案した。大動物である羊に対して実験を行い、治療評価は我々が以前に示した病理学的な肺胞上皮の評価により行う。本研究は既存の胎児治療を改善、発展したものであり、新たなCDHに対する胎児治療の可能性があると考えている。