hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チーム基盤型学習ＴＢＬを取り入れたＰＢＬ教育ストラテジーの研究

また米国のTBL教育のパイオニアが参加するメイリングリストの交流にも加わるなど、研究を進める上での準備を整えてきた。このほか、看護教育系学会にてTBL教育に関するワークショップを開催するなど、国内の看護教育においてTBL教育を紹介することを通して、TBL教育の看護教育のへの導入への期待などを把握することができた。研究2:看護教育に適するTBL教育プログラム教材の作成については、プログラム案を作成・実施し、その成果を分析中である。この評価結果をもとに、さらに学習教材を開発する過程にあり、さらに教育プログラムを洗練させていく予定である。教育機材として「双方向型教育スターターキットLENON」を購入し、その活用に関しても試行を行い、効果的な活用方法についても検討を始めたところである。教育方法の検討を進めることができ、研究の進捗としては順調に進められていると言える。研究1国内のTBL教育を導入している教育施設の視察調査は秋に予定しており、国外の視察は年度末の3月頃で調整をして実施する予定である。教育運営および学習プログラムについて情報収集を行う予定である。研究2看護教育に適するTBL教育プログラム教材の作成に関しては、前年度の成人看護学分野の学習教材を公表できるように整理する。また、TBLとPBLを併用した混合型教育プログラムについては、今年度も同様な調査を実施して、その学習効果を批判的思考力の育成の視点から分析し、研究成果をまとめていく。研究成果の一部は学会等で報告していく。研究1:TBL教育を導入している教育施設の視察調査として、国外の教育機関での視察を計画中である。看護教育分野での教育実践を視察、そして意見交換するための視察先として、カナダ、台湾の看護大学を候補としている。この視察では、教授方法のキーとなる学生とのディスカッションの意義や設定する学習到達目標と評価方法について調査を進める予定である。研究2:看護教育に適するTBL教育プログラム教材の作成に関しては、昨年度作成した成人看護学分野の学習教材を見直し、さらに検討を加えてプログラムを作成する。そして、比較検証実験のための準備を進める。具体的には実験のための研究計画書を作成、とくに開発したTBL教育プログラムの検証を調査するために使用する尺度の検討、倫理審査を受けることを予定している。前年度に助成金に残高が生じた理由は、研究代表者および分担研究者のスケジュールが調整困難であったことから海外視察が延期となったからである。前年度の残った助成金は、今年度の国外視察費用として活用する計画である。
マントルプルュームの起源に関する研究

1.昭和60年度の結果をふまえて、引きつづきハワイを含む北西大平洋下の回折SH波を解析した。バンダ海から台湾南方の深発地震9個を北米WWSSNの観測点で記條したデータをもちい、20°N70°N,150°E180°Eの領域の回折S波の減衰係数からマントル最下部のS波速度勾配を求めた。その結果55°Nを境に南東側でS波速度勾配がー(1020)×【10^(-4)】【sec^(-1)】の負,北西側が(-11)×【10^(-4)】【sec^(-1)】のわずかに正又は負の値を得た。前年度の結果と合せると赤道からシベリア東部にかけての北大平洋下のD′′層に波長数4kmの不均質性の存在が明かになった。そしてこれらの広い領域下ではD′′層は熱境界層になっているものと推定された。2.Dziwonskii(1984)の下部マントルP波速度3次元不均質データをもらい、萩原の方法によって地球上の5度毎のグリッド点に於てゾーナル成分【{S(^°-n)^2+(C(^°-n))^2}^(1/2)】の値をもとめそのパターンを解析した。低次(n=2)の場合、最大値はハワイ南西及びアフリカ大陸南西域を中心に美しい分布を示す、又下部マントルの慣性モーメントの最大軸も同様な位置にくることが求まった。すなわちこれらの位置はハワイ及びアフリカのホットスポットのごく近傍に中心をもち、傘を広げたようなゾーナルパターンの存在を示すもので、予想されるマントルプルュームの形状とも一致する。3.以上の結果は前年度の結果を支持するものであり、ハワイ及びアフリカニイラゴンゴの両ホットスポットがペアで存在し、その起源は共通のものがあることを示すもので、ホットスポットの研究に新知見を加えたものといえる。
内分泌攪乱物質のヒト胎盤ホルモン産生系への影響を考慮した内分泌攪乱作用の検討

本研究では、内分泌撹乱物質の標的臓器として胎盤に注目し、化学物質によって任意の胎盤機能が変化した場合に、胎児へどのような影響が及ぶのかを検討することを試みた。まずヒト胎盤内分泌機能に対する化学物質の影響を検討するために、ヒト絨毛細胞株を用い、ステロイドホルモン合成関連酵素の遺伝子発現変動について検討を行ったところ、トリブチルスズ、トリフェニルスズを初めとする有機スズ化合物が、アロマターゼと17β-hydroxysteroid dehydrogenase Iの活性をmRNAの発現を伴って上昇させることが確認された。また、この結果を反映してこれらの有機スズ化合物は、ヒト絨毛細胞株のエストラジオール産生を促進した。さらに有機スズ化合物は、核内受容体であるretinoid X receptor(RXR)とperoxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γのデュアルリガンドとして作用することを見いだし、ヒト胎盤の内分泌機能に対する影響はRXRを介したものであることを確認した。しかしながら、実験動物として汎用されている齧歯類の胎盤には元来アロマターゼが存在せず、エストロゲン合成能がないため、先述のようなヒト胎盤に対して認められた有機スズ化合物の影響をin vivoで評価することが出来ない。そこで、マウスの胎盤に特異的にアロマターゼを発現させたトランスジェニックマウス(Tgマウス)を用いる方法と、RGDファイバーミュータントアデノウイルスベクター(ファイバー部分にRGD配列を持たせたもの)を用いて外来的に胎盤でアロマターゼを発現させるという2通りの手法を用い、胎児に対してエストロゲンが過剰供給された場合の影響をin vivoで評価できるモデルの作成を試みた。その結果、アロマターゼを胎盤特異的に発現するTgマウスを作成することに成功した。本研究では、ヒトと齧歯類の胎盤由来細胞を用いて内分泌撹乱物質としての疑いのある化学物質が、ヒトとラットの胎盤ホルモン産生系および代謝酵素系に与える影響について検討し、胎盤の内分泌機能のなかでも、発生毒性に重要な候補を絞りこむことで、それがin vivoにどのように反映されるかについて検討することを最終目標としている。ヒトとラットの絨毛細胞株を用いてin vitroにおけるステロイドホルモン合成・代謝系に対する影響を検討したところ、ラットおよびヒトの胎盤のP450sccに対しては、DESを始め、17βエストラジオール(E2)、エチニルエストラジオール(EE)において発現を上昇させることが明らかとなった。しかし3β-HSDについては、ヒトではDESで発現が上昇することが確認されたが、ラットでは特に影響が認められなかった。また、ラットおよびヒトにしか存在しないそれぞれの内分泌機能についても、各化学物質により影響が認められた。ヒトにおいては、E2、DES、EE、プロゲステロン(P4)によってアロマターゼの発現が顕著に上昇した。ヒト胎盤から産生される性腺刺激ホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピンについてもアロマターゼの場合と同様の傾向が認められた。ラット胎盤から産生される性腺刺激ホルモンであるプロラクチン様蛋白(PLP)についても検討を行ったところ、E2やEEでは発現は胎盤性ラクトーゲンIIとPLP-A上昇するが、DESでは影響が認められなかった。さらにラット胎盤の3β-HSDについても、E2やEEでは発現は上昇するが、DESでは影響が認められなかったり、CYP17についてはE2やEEでは発現は上昇するが、DESでは逆に抑制傾向が認められるなど、エストロジェンレセプターを介した作用が予想されるエストロジェン様化学物質についても、同じ細胞に対して作用が異なることが確認された。

本研究では、内分泌撹乱物質の標的臓器として胎盤に注目し、内分泌撹乱物質によってどのような胎盤機能が変化した場合に、いかなる胎児への影響が及ぶのかを加in vitroおよびin vivo双方について検討を行うことで、そのin vitroの結果から発生毒性の予測が可能な評価系の構築を最終目標としている。本年度は、1)内分泌撹乱物質の妊娠動物における胎盤移行性の検討、2)有機スズ化合物などの内分泌撹乱物質のin vivoにおける胎盤ホルモン産生系および代謝酵素系に与える影響についての検討、3)さらに胎盤機能の変動による胎児への影響をin vivoで検討するために胎盤特異的な遺伝子発現系の構築、について検討を行った。その結果、1)については、[^3H]-ジエチルスチルベステロールおよび有機スズ化合物である[^<14>C]-トリフェニルスズが、妊娠マウスの胎盤や胎児に移行することを明らかにした。また2)については、トリブチルスズを投与した妊娠マウスの胎盤においては、昨年度に行ったin vitroにおける検討結果を反映して、3β-hydroxysteroid dehydrogenase type IのmRNA発現量が上昇していた。さらに3)については、胎盤特異的にアロマターゼ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作成を行うとともに、RGDファイバーミュータントアデノウイルスベクターを用いることで、胎盤指向性を有した遺伝子導入系による内分泌撹乱モデルの作成が可能であることが示唆された。本研究では、内分泌撹乱物質の標的臓器として胎盤に注目し、化学物質によって任意の胎盤機能が変化した場合に、胎児へどのような影響が及ぶのかをin vivoにおいて検討を行い、将来的にin vitroにおける遺伝子発現変動の解析結果から発生毒性の予測が可能となる評価系の構築を最終目標としている。本年度は、その一里塚として、マウス胎盤特異的発現プロモーターを用いて、胎盤特異的にアロマターゼ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス(Tgマウス)を作成し、その解析を行うことで、アロマターゼの過剰発現による胎児への影響の検討を試みた。また胎盤への感染効率を大幅に改善したRGDファイバーミュータントアデノウイルスベクター(ファイバー部分にRGD配列を持たせたもの;RGDmAd)と、マウス胎盤特異的発現プロモーター(PL)を用いて、胎盤特異的に外来遺伝子を発現させることで、胎盤での内分泌撹乱作用を再現したモデル動物の作成も試みた。PLを搭載したRGDmAdは、in vitroにおいては、胎盤細胞特異的な発現を示したが、妊娠マウスを用いたin vivoでの検討では、胎盤でのレポーター遺伝子の発現は確認できなかった。RGBmAdを用いた評価系においては、プロモーターの活性が弱い上、RGDmAdを用いた胎盤での遺伝子導入も十分とは言えない結果となった。Tgマウスの検討においては、founderマウスを出産し、それぞれTG738とTG739の2系統を得た。ジェノタイピングの結果TG738マウスにおいては、雄39匹中5匹、雌31匹中10匹の陽性マウスがそれぞれ確認できた。一方でTG739マウスにおいては、雄50匹中11匹、雌56匹中8匹の陽性マウスがそれぞれ確認できた。
面内規則配列を有する自己組織化ナノ構造薄膜の作製とスピンデバイスへの適用

エピタキシャルAlternate Monatomic Layered (AML)磁性体/非磁性体界面のスピン依存界面抵抗に着目し、中間層材料を変えたCPP(Current Perpendicular to Plane) GMR素子を試作し、Ag中間層を用いた場合に、0.84の大きなγ値が得られること、またそのMR特性は、AML膜厚5nmで面積抵抗変化量△RAが3mΩμm2以上、MR比>5%が得られることを見出した。また、アンドレーフ反射法によってAML Fe/Co薄膜のスピン分極率が0.60であることを実験的に検証し、規則度の増加によるスピン分極率の増加を確認した。これらの結果から高MRを有するナノコンタクトMR素子に対する材料設計指針を得た。平成22年度はエピタキシャル強磁性薄膜上の自己組織化ナノパターニング技術を検討し、NOL(Nano-Oxide Layer)のConductive-AFMとTEM観察による構造評価を行い、ナノ接点の形成技術の確立を目指して実験を行った。まず、エピタキシャルAlternate Monatomic Layered(AML)磁性体/非磁性体界面のスピン依存界面抵抗に着目し、中間層材料を変えたCPP(Current Perpendicular to Plane)GMR素子を試作し、Ag中間層を用いた場合に、0.84の大きなγ値が得られること、またそのMR特性は、AML膜厚5nmで面積抵抗変化量ΔRAが3mΩμm^2以上、MR比5%が得られることを見出した。このΔRA値は従来報告されているFeCo合金系CPPGMR特性をはるかに上まわる特性である。しかし、理論計算により予測されている高い界面抵抗は得られなかったため、さらに界面でのミキシングを考慮してFeを厚め(1nm)に積層してAgとFeの界面を増加させた結果、界面抵抗が増加することを確認した。これらの結果からAML[Fe/Co]/Ag/AML[Fe/Co]エピタキシャル薄膜が電流狭窄型のMR薄膜素子に適していることを明らかにした。また、縞状エピタキシャル成長をマスクとしNOL(Nano-Oxide Layer)の作製を行うために新規購入設備AFM装置による表面観察およびTEM観察などから縞状のAg初期成長層の直接観察を行った。その結果、AML[Fe/Co]上のAgが縞状成長することを確認した。この縞状のAg初期成長層をマスクとして表面に露出した[Fe/Co]を選択酸化する足掛かりを得た。本研究課題では、極薄(1nm)の酸化物層中に、12nmφのナノ接点サイズの金属導電チャネルを面内に規則的に配列したNOL(Nano-Oxide Layer)を高スピン伝導非対称性を有する単原子積層[Fe/Co]。エピタキシャル単結晶薄膜で挟み込んだスピンバルブ薄膜を作製し、その接点領域(ナノ狭窄部)に閉じ込められるナノ狭窄磁壁によるMR比<100%を有する低抵抗磁気抵抗素子を実現することを目標としている。本研究の要は、エピタキシャル成長、選択酸化、選択ミリング等の自己組織化手法を駆使して、微細加工などのトップダウンプロセスでは現状不可能である絶縁体中に12nmφの金属導電チャネルを面内に規則的に配列した極薄酸化物薄膜を単結晶薄膜上に作製することである。平成23年度はエピタキシャル強磁性薄膜上の自己組織化ナノパターニング技術を検討し、NOL(Nano-Oxide Layer)のConductive-AFMとTEM観察による構造評価を行い、ナノ接点の形成技術の確立を目指して実験を行った。さらに金属/酸化物/金属の3層膜に於いて微細加工によるドット形状の作製を行い、素子化への設計指針を得た。本研究課題では、極薄(1nm)の酸化物層中に、12nmφのナノ接点サイズの金属導電チャネルを面内に規則的に配列したNOL(Nano-Oxide Layer)を高スピン伝導非対称性を有する単原子積層[Fe/Co]nエピタキシャル単結晶薄膜で挟み込んだスピンバルブ薄膜を作製し、その接点領域(ナノ狭窄部)に閉じ込められるナノ狭窄磁壁によるMR比<100%を有する低抵抗磁気抵抗素子を実現することを目標としている。

本研究の要は、エピタキシャル成長、選択酸化、選択ミリング等の自己組織化手法を駆使して、微細加工などのトップダウンプロセスでは現状不可能である絶縁体中に12nmφの金属導電チャネルを面内に規則的に配列した極薄酸化物薄膜を単結晶薄膜上に作製することである。平成23年度はエピタキシャル強磁性薄膜上の自己組織化ナノパターニング技術を検討し、NOL(Nano-Oxide Layer)のConductive-AFMとTEM観察による構造評価を行い、ナノ接点の形成技術の確立を目指して実験を行った。まず、エピタキシャルAlternate Monatomic Layered (AML)磁性体/非磁性体界面のスピン依存界面抵抗に着目し、中間層材料を変えたCPP(Current Perpendicular to Plane)GMR素子を試作し、Ag中間層を用いた場合に、0.84の大きなγ値が得られること、またそのMR特性は、AML膜厚5nmで面積抵抗変化量⊿RAが3mΩμm2以上、MR比>10%が得られることを見出した。また、アンドレーフ反射法によってAML Fe/Co薄膜のスピン分極率が0.60であることを実験的に検証し、規則度の増加によるスピン分極率の増加を確認した。さらに金属/酸化物/金属の3層膜に於いて微細加工によるドット形状の作製を行い、素子化への設計指針を得た。アンドレーフ反射法によってAML Fe/Co薄膜のスピン分極率が0.60であることを実験的に検証し、規則度の増加によるスピン分極率の増加を確認した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、エピタキシャル成長、選択酸化、選択ミリング等の自己組織化手法を駆使してチャネル径の制御されたエピタキシャルFe/Co NOLを作製し、AML/NOL/AML薄膜において素子化および評価を行う。実験結果を理論計算の結界と比較・検討し、研究目標の達成に向けて研究を推進させる。
ニトロ基を含む新しい型の芳香族基底三重項状態分子種の研究

(1)2ーニトロビフェニル(2ーNBP)の単結晶を作成し,X線結晶解析を行って、結晶中における分子の空間的配置を決定した。次に、77Kで紫外線照射した2ーNBP単結晶中に生じた三重項分子種について、単結晶法による電子スピン共鳴(ESR)の実験を行った。なお,これまでに行った研究結果から、この三重項分子種については、ニトロ基の結合していないフェニル基のオルト位の水素がニトロ基の酸素に引き抜かれた構造を推定している。本実験で、そのゼロ磁場分離(ZFS)テンソルの主軸と結晶軸との関係を求めた結果、上記の構造における不対電子の密度の最大点を結ぶ方向が、ZFSテンソルの最大主値を与える主軸の方向に非常に近いことが判った。それゆえ,この三重項分子種の構造として,上記の構造が妥当なことが判明した。(2)2ーNBPのメチル,メトキシ,カルボキシ,ヒドロキシメチル,フッ素の2'ー,3'ー,および4'ー置換体を合成し,77K剛体溶媒中で紫外線照射してESRの測定を行った。その結果,これらのうち,4'ーメチルーおよび4'ーフツ化ー2ーNBPと,3'ーカルボキシー2ーNBP以外の3'ー置換体、並びにすべての2'ー置換体から、77Kで安定な三重項分子種の生成が確められた。これらのZFS定数は,被照射2ーNBPの値に非常に近いため、これらのラジカルの構造は2ーNBPの場合に類似していると考えられる。また、二個の2ーNBP基をメチレンまたは酸素で架橋した分子を合成し、77K剛体溶媒中で紫外線照射してESRの測定を行った結果、フェニル基のオルト位またはメタ位&架橋した分子からは、2ーNBPの場合に非常に近いZFS定数の三重項分子種が生成することが判った。さらに,ポリ(4'ービニルー2ーNBP)を合成し、同様な実験を行った結果、77Kで安定な三重項分子種が生成することを確めたが、詳細は検討中である。我々の研究室において、2-ニトロビフェニル(2-NBP)を77Kで紫外線照射すると、90K以下の剛体溶媒中で安定な、新しい型の基底三重項状態分子種が生成することが見出された。しかし、その構造については不明な点が多いため、2-NBPの単結晶を紫外線照射して生成する三重項状態の分子種を、結晶軸の周りに回転して電子スピン共鳴(ESR)の測定を行い、その立体構造について検討した。また、類似の光化学反応を起す2,2′-ジニトロビフェニルをエタノ-ル剛体溶媒中で紫外線照射し、5Kから50Kの間でESRスペクトルの強度変化の測定を行い、生成した分子種の基底状態が三重項状態であることを明らかにした。さらに、2-NBPの2′-,3′-,および4′-メチル置換体を合成し、これらの分子についても紫外線照射により77Kで安定な三重項状態の分子種が生成することを明らかにした。また、2-NBP基を分子内に二個含むビス((2-ニトロビフェニル)-n′-メチル)エ-テル[n′=2′,3′,4′]を合成し、それらの紫外線照射により生成する分子種の磁気的性質を検べるため、これらの分子を合成する際の中間生成物である2-NBPのカルボキシ、ヒドロキシメチル、メトキシメチル等の置換体についても同様の実験を行った。その結果、これらの2′-および3′-置換体からは、77Kで安定な三重状態の中間体が生成することが確認されたが、4′-置換体からは三重項状態の分子種の生成は認められなかった。立体障害の少い4′-置換体とは異り、2′-置換体から三重項状態の分子種が生成する点については、2′-置換体における置換基が立体障害のため2-NBP基の電子構造にわずかしか影響をおよぼさないためと考えられる。

また、二個の2ーNBP基をメチレンまたは酸素で架橋した分子を合成し、77K剛体溶媒中で紫外線照射してESRの測定を行った結果、フェニル基のオルト位またはメタ位&架橋した分子からは、2ーNBPの場合に非常に近いZFS定数の三重項分子種が生成することが判った。さらに,ポリ(4'ービニルー2ーNBP)を合成し、同様な実験を行った結果、77Kで安定な三重項分子種が生成することを確めたが、詳細は検討中である。
人為的高体温の腸管代謝機能におよぼす影響(アミノ酸粘膜内組織pHからの検討)

ショック状態において腸管は重要な機能を果たしている。今回、人為的高体温下において腸管血流と、組織代謝を反映するとされる粘膜内pHを測定して腸管に対する影響を検討した。【対象・方法】15頭のブタを使用し、心拍数、血圧、中心静脈圧、肺動脈圧、心拍出量、胃および小腸血流、消化管粘膜pH(pHim)を測定した。コントロール値を得た後、各測定は40°C、42.5°C、42.5°C3時間後および39°C復温後1時間の5点で行った。【結果】コントロール値と比較して体温を42.5度を維持している間、心拍出量や、腸管の血流は有意に増加または変化しなかった。また全身の酸塩基平衡をを示す動脈血pHは、高体温中に低下していくが有意な変化は示さなかった。これに対してpHimは、7.30から徐々に低下していき42.5度の3時間維持で7.03と最低となり、クーリング後の7.11とやや上昇した。【考察】コントロールのpHim値は、何等侵襲を受けていないときの数値として、従来の報告と比べ同等である。その後、体温の上昇と共に、血流が腸管を含め増加または、変化なく、全身のpHも有意な変動を認めなかった。しかし、pHimは、高体温の早期より有意に低下を示した。このことから、高体温刺激の、初期から心拍出量や各種臓器血流の増加を認め、いわゆるhyperdynamic stateの状態であるが、この早期より腸管の組織虚血が始まっておりpHimのレベルから判断すると重篤な組織障害または、組織虚血が起こっていると考えられた。
作物の形態形成制御による有用器官の誘導に関する研究

長期間貯蔵したイネ種子をABAで処理しジベレリンとNAAを含む培地で培養し,健全な植物体が得られた. 2, 4-D培地で茎頂由来カルスから茎葉を分化させた.13年令のイネ老化種子のブラシノライドの低濃度処理により81パーセントの植物体を得た.バミューダグラス穎果起源培養組織の7.5パーセントで緑色組織を形成した.リンゴの台木から果実を採り,胚珠および珠心を培養し,不定胚を形成した.また葉片をIBAとBAを添加した培地で,高頻度の不定胚を得た.ブルーベリー葉片でもIBA・2iP培地で不定芽が生じた.維管束鞘葉緑体が求心的配列を示すシュクビエで,葉の成熟に伴いミトコンドリアやミクロボディとともに,葉緑体が明暗いぶれの条件でも求心的に移動した.オーキシン・高浸透圧条件,シクロヘキシミドなどが,この移動を阻害または抑制した.従って維管束鞘葉緑体の求心的配列は,オーキシンに基づく葉の伸長後に行われる蛋白合成によって制御される.この求心的配列移動はコルヒチンで影響されなかったが,サイトカラシンBで抑制された.ミクロフィラメントが葉緑体を維管束側へ引き寄せると考えた.イネ種子細胞が脱分化するとき, ADH活性が上昇しエタノールが生産される.再分化培地で緑色斑点が出現すると, ADH活性が低下する.ADHが亜鉛酵素であることから培地中の亜鉛濃度を下げたところ,カルスの増殖が抑制されADH活性が低下し緑色斑点数が増加した.培地にココナッツミルクを添加したとき,斑点の出現が早くなり数が増加した.二倍地法を用いたイネの分離根培養において, IAA・フィガロン・カイネチン・ジベレリン・ブラシノライドなどの生長調節物質が,種子根と側根の伸長に効果を示した.胚盤細胞は3ケ月後でも正常で,上皮細胞の先端部に多層の粗面小胞体が観察された.以上の結果から,組織培養による有用器官の形態制御と化学調節の基礎が得られた.長期間貯蔵したイネ種子をABAで処理しジベレリンとNAAを含む培地で培養し,健全な植物体が得られた. 2, 4-D培地で茎頂由来カルスから茎葉を分化させた.13年令のイネ老化種子のブラシノライドの低濃度処理により81パーセントの植物体を得た.バミューダグラス穎果起源培養組織の7.5パーセントで緑色組織を形成した.リンゴの台木から果実を採り,胚珠および珠心を培養し,不定胚を形成した.また葉片をIBAとBAを添加した培地で,高頻度の不定胚を得た.ブルーベリー葉片でもIBA・2iP培地で不定芽が生じた.維管束鞘葉緑体が求心的配列を示すシュクビエで,葉の成熟に伴いミトコンドリアやミクロボディとともに,葉緑体が明暗いぶれの条件でも求心的に移動した.オーキシン・高浸透圧条件,シクロヘキシミドなどが,この移動を阻害または抑制した.従って維管束鞘葉緑体の求心的配列は,オーキシンに基づく葉の伸長後に行われる蛋白合成によって制御される.この求心的配列移動はコルヒチンで影響されなかったが,サイトカラシンBで抑制された.ミクロフィラメントが葉緑体を維管束側へ引き寄せると考えた.イネ種子細胞が脱分化するとき, ADH活性が上昇しエタノールが生産される.再分化培地で緑色斑点が出現すると, ADH活性が低下する.ADHが亜鉛酵素であることから培地中の亜鉛濃度を下げたところ,カルスの増殖が抑制されADH活性が低下し緑色斑点数が増加した.培地にココナッツミルクを添加したとき,斑点の出現が早くなり数が増加した.二倍地法を用いたイネの分離根培養において, IAA・フィガロン・カイネチン・ジベレリン・ブラシノライドなどの生長調節物質が,種子根と側根の伸長に効果を示した.胚盤細胞は3ケ月後でも正常で,上皮細胞の先端部に多層の粗面小胞体が観察された.以上の結果から,組織培養による有用器官の形態制御と化学調節の基礎が得られた.茎葉・根及び不定胚等の器官誘導に関し形態形成の側面から、次の成果が得られた。(1)13年令のイネ老化種子に種々のホルモン処理を行って、ブラシノライドの極低濃度処理より81%もの植物体を得た。バミューダグラス頴果起源培養組織の7.5%で緑色組織を形成した。また白色で表皮系を持つ胚様体組織の梟塊にも生じた。緑色組織及び胚様体組織は継代後、オーキシンフリー培地で植物体に分化した。(2)ナシの果実を低温処理後、胚珠及び珠心を暗所で培養した結果、不定胚を形成した。リンゴの台木から種々の時期に花蕾を採取し、明所で葯培養を行ったところ不定胚形成を認めた。モモの胚乳から誘導したカルスに胚様体の形成を認めた。(3)シコクビエ維管束鞘葉緑体の求心的配列移動はコルヒチンで影響されなかったが、サイトカラシンBで抑制された。葉緑体の移動過程で、オーキシンはその初期のみ阻害作用を示し、シクロヘキシイミド、サイトカラシンBの順で、より後期に阻害作用が現れた。

この結果から維管束鞘葉緑体の移動は、オーキシンの作用に基づく葉の伸長生長が終了した後に、細胞質中で蛋白合成が進行することによって引き起こされ、ミクロフィラメントが葉緑体を維管束側へ引き寄せると考えた。(4)培地中の亜鉛を制限して培養したイネカルス細胞では、シアン非感受性の呼吸量が著しく低下した。前培地と再分化培地の亜鉛濃度を下げたところ、分化しないカルス細胞の増殖が低下して、緑色斑点を持つカルスが増加した。培地にココナッツミルクを添加したとき、斑点の出現が早くなった。カルス細胞と再分化した幼植物間で、グルタミンやアスパラギンのアミドや、プロリン・アラニン含量に差が見られた。(5)イネの胚盤を二培地法で培養した。胚盤細胞は三ケ月後でも正常であり、核・プラスチド・ミトコンドリア・脂質粒・小胞体・等を含んでいた。上皮細胞の先端に多層の粗面小胞体が観察された。
多次元同時計測システムの開発

平成6年度は主として次の2点に研究目的を絞って実施した。1.2次元同時計測システムの改良平成5年度には多価イオンと物質との相互作用に関する実験的研究に使用する目的で2次元同時計測システムの開発を行い、多価イオン原子衝突における多電子移行過程の実験的研究に適用することによってその有用性を確認した。平成6年度では他の研究グループへの成果提供の際に最も問題となっていた移植性を改善する目的でシステムの基本OSの変更を行った。また同時に、ユーザーインターフェースの改良を行い、操作性を高めた。本システムはここ数年関心を集めている2次元検出器を用いた新しいタイプのエネルギー分析器の為のデータ収集にも用いることが可能なこともあって、そのような実験法を準備している多価イオン・電子衝突実験を含む6つの研究グループからシステムの提供依頼があり、本システムを提供した。2.2次元検出器を使用する多次元同時計測システムの開発いくつかの研究グループでは、さらに2次元検出器を用いた新しいタイプのエネルギー分析器を使って同時計測を行うような計画がなされている。平成6年度ではこの種の実験をサパートすべく、次世代の多次元同時計測システムの開発に着手した。前半には、前述の2次元同時計測システムの開発の経験を踏まえ、数回の会合をもって新システムのアーキテクチャア、使用するデバイス、開発環境などを検討し、基本仕様を決定した。更なる多次元化に向けて新システムでは扱うべきデータ量が飛躍的に増加する。信号処理の若干研究者を共同研究者に迎え、新システムに適したデータのダイナミック圧縮法の開発に着手し、シミュレーションにより基本原理を確認した。後半には開発環境の整備も整い、ゲートアレイの設計に着手し、現在シミュレーションによって論理回路の設計や、デバイスドライバーの開発を行っている。次年度早々には新システムの試作を行う。
キュービック相を有する新規脂質微粒子薬物担体の開発と機能評価

医薬品有効成分は,溶解し体に吸収されることで初めて治療効果が現れる。キューボソームと呼ばれる微粒子に有効成分を封入させると,簡便に水に良く溶け,有効成分が分解されて効果がなくなることを防ぐようになるとともに,有効成分が効率よく吸収されるようになることを明らかにした。水に溶けにくい有効成分でも,キューボソームを利用することで,治療効果の高い「くすり」とすることができると考えられる。平成26年度は,難溶性薬物を含有したキューボソーム製剤処方と製造方法の確立,および性状解析を進めた。難溶性モデル薬物として,複数の芳香環を有する抗腫瘍薬および天然物由来生理活性フラボノイドの二種を用い,またキューボソーム薬物担体の基剤として二種の脂質を用いた。抗腫瘍薬の場合,添加剤としてイオン性界面活性剤を添加すると,抗腫瘍薬の溶解度が10倍以上,フラボノイドを用いた場合では,溶解度が6倍以上に向上させることができ,薬物内封率は共に約90%と高い値を示した。キュービック相は,抗腫瘍薬のキュービック製剤の場合は空間群Pn3m,フラボノイドの場合は空間群Im3mを維持していていることがX線小角散乱法により確認された。動的光散乱法により,どちらのキュービック製剤も,粒子径は約90 nmの単分散状態であることが明らかとなり,その状態は抗腫瘍薬のキュービック製剤の場合は少なくとも4日間,フラボノイドのキューボソーム製剤の場合は2週間以上安定であった。モデル薬物として用いた抗腫瘍薬は,生理的条件下であるpH7.4では平衡反応により加水分解して不活性型の割合が90%以上となってしまう問題点があったが,抗腫瘍薬の溶解度を向上させる効果のある添加剤を加えたキューボソームに内封して製剤化したものでは,活性型の割合を90%以上に安定的に保たれることが明らかとなり,添加剤を用いた場合でもキューボソーム製剤化により薬物の安定性を向上させることができることが確認された。平成27年度は,高難溶性薬物を含有したキューボソーム製剤の処方最適化を進めた。高難溶性モデル薬物として,複数の芳香環を有する抗腫瘍薬を用い,またキューボソーム薬物担体の基剤としてフィタントリオールを用いた。フィタントリオールを用いたキューボソームは,添加剤として陽イオン性界面活性剤を添加すると,抗腫瘍薬の溶解度が向上させることができたが,1週間以内に粒子が凝集するなど,安定性が非常に低い問題点があることが明らかとなった。そこで,新しい添加剤として脂肪酸モノグリセリドを用いた新しいキューボソーム製剤処方を系統的に検索した。その結果,脂肪酸鎖の炭素数が8から18の6種のものを添加剤として利用すると,陽イオン性界面活性剤を添加した場合と同様にキューボソームへの薬物封入量を増大することが明らかとなった。薬物内封率はすべて約90%と高い値であり,X線小角散乱法によりキュービック相は空間群はPn3mであること,動的光散乱法により粒子径は約90 nmの単分散状態であることを確認した。キューボソームの粒子径および単分散状態は,25°Cで少なくとも12日間は変化しなかったことから,粒子安定性が大幅に向上したキューボソーム処方を確立できたと考えている。この成果は国際専門誌での論文発表として公表している(Preparation and characterizationofSN-38-encapsulated phytantriolcubosomes containing alpha-monoglyceride additives. Chem. Pharm. Bull., in press.)。また,高難溶性のモデル薬物として用いている柑橘類由来フラボノイドの結晶学的性状解析も行った。キューボソーム製剤の処方と製造方法について,高難溶性モデル薬物の溶解度を向上させると共に,内封率も非常に高く,粒子安定性も大幅に向上した処方を確立することができた。また,再現性も高い。以上のことから,当初の目的を達成できたと判断している。高難溶性薬物の溶解性向上を簡便に図ることができる新規薬物担体として,キュービック相(立法液晶相)をもつキューボソーム製剤の評価を進めた。高難溶性モデル薬物として,複数の芳香環を有する抗腫瘍薬SN-38を,基剤としてフィタントリオールを用いた場合,添加剤として陽イオン性界面活性剤を添加すると,SN-38のみかけの溶解度が14-15倍向上することが明らかとなった。薬物内封率は約90%と高い値であり,X線小角散乱法によりキュービック相の空間群はPn3mであること,動的光散乱法により粒子径は約100-150 nmの単分散状態であることも明らかとなった。このことから,EPR効果による腫瘍細胞特異的な薬物送達にも応用できる可能性が考えられた。SN-38は生理的条件のpHでは溶液中でラクトン環部分が数時間以内に加水分解されて不活性型になる不安定性が大きな問題であったが,キューボソーム製剤化することで,加水分解反応を10%程度以下に抑制でき,キューボソーム製剤は医薬品有効成分の安定化も図れることが明らかとなった。さらに,キューボソーム製剤の添加剤として疎水性直鎖炭素鎖の長さが異なる種々のα-モノグリセリドを用いた処方で製剤物性を検討したところ,キュービック相が維持されたまま溶解性向上能が変化していた。また,基剤として生体親和性の高いモノオレインを用いたキューボソーム製剤の検討も行った。

難溶性のモデル医薬品としてスピロノラクトンとニフェジピンを用いた場合,溶解性が向上すると共に,経口投与した場合のAUCが従来製剤よりも数倍以上に向上した。以上の結果より,キューボソーム製剤は,難溶性薬物の可溶性と安定性を向上させ,吸収も高められ,また処方に種々の添加剤を用いることで様々な種類の難溶性薬物の溶解性向上を図れる薬物担体として,広く応用できることが示唆された。医薬品有効成分は,溶解し体に吸収されることで初めて治療効果が現れる。キューボソームと呼ばれる微粒子に有効成分を封入させると,簡便に水に良く溶け,有効成分が分解されて効果がなくなることを防ぐようになるとともに,有効成分が効率よく吸収されるようになることを明らかにした。水に溶けにくい有効成分でも,キューボソームを利用することで,治療効果の高い「くすり」とすることができると考えられる。キューボソーム製剤の処方と製造方法の確立については,二種の高難溶性モデル薬物の溶解度をともに従来報告されている製剤処方よりも高い値まで向上させることができており,内封率も非常に高く,再現性も良いことから,当初の目的を達成できたと判断している。キューボソーム製剤の性状解析については,薬物および添加剤を内封した場合でも,粒子径や多分散度,キュービック相の空間群は変化しないことを,X線小角散乱法と動的光散乱法により定量的に明らかにしているため,当初の目的を達成できたと判断している。製造方法を確立したキューボソーム製剤については,製造後の安定性の評価まで本年度内に一部進めることができ,今後のin vivo実験を進める上で,キューボソーム製剤は充分安定であることが示唆された。また,添加剤を用いたキューボソーム製剤化により不安定なモデル薬物の安定化を図ることができることも明らかにした。これらの点については,当初の計画以上に進展していると判断している。平成28年度は,in vivoおけるキューボソーム製剤の動態の解明を進める。実験動物としてはラットを用い,経口投与あるいは静脈内投与を行うことで,薬物動態の各種パラメーターを決定し,キューボソーム製剤の評価を行う。物理薬剤学平成27年度は,キューボソーム製剤の処方最適化を引き続き進める。特に添加剤に着目し,より多様な化学構造を持つ添加剤を利用することでキューボソーム製剤の高難溶性薬物可溶化能をさらに高められる処方を検索し,同製剤の構造物性解析を行う。また,当初の予定通り,生体内を想定した条件下におけるキューボソーム製剤の安定性評価を行い,さらに,キューボソーム製剤をラットなどの実験動物に投与しin vivoの薬物動態評価を開始する。
高濃度酸素による肺障害に対する水素吸入の効果

マウスは高濃度酸素下で水素吸入により生存率が延長し、好中球の肺内浸潤も軽減していた。培養ヒト肺胞上皮細胞で、アンチマイシンAによる酸化ストレスに対して水素は細胞保護効果が見られた。ミトコンドリアから発生するスーパーオキシドも、水素付加群ではコントロール群に比べて有意に低く、また、アンチマイシンAを添加した後の産生量の増加も小さくなっていた。水素は高濃度酸素による肺障害に対して保護効果が認められた。水素吸入で水酸化ラジカルを消去することにより、高濃度酸素吸入による肺障害を予防できる可能性が高いと着想し、in vivoの動物実験ではマウスを用い、in vitroの細胞実験では肺血管内皮の培養細胞(A549)を用いて肺障害の水素による予防効果を検証した。なお、安全のため動物実験の吸入水素濃度は0.4%にとどめた。動物実験では生存曲線を求めた。実験1:高濃度酸素+抗生物質有無(腸内細菌による水素ガスの影響を検討するため)。実験2:高濃度酸素+水素吸入+抗生物質有無(水素ガス吸入の効果を調べるため)。その結果、酸素濃度90%、水素濃度0.4%の条件下では、水素吸入により生存曲線は改善しなかった。細胞実験では、水素付加群と水素非付加群の2群に分け、96穴プレートに播種して常酸素(21%)下で12時間前培養した。その後水素付加群を、酸素21%・窒素75%、水素濃度が2%以上になるよう調整したインキュベータで培養した。水素非付加群は常酸素下で培養を続けた。それぞれ1時間培養した後、両群に活性酸素種を発生する試薬(10μl)を加え、24時間後にWST-8を用いて吸光度を測定した。加える試薬は、O_2^-を発生させるキサンチンとキサンチンオキシダーゼ、細胞内でフリーラジカルを生成するメナジオン、Fenton反応により・OHを生成する過塩素酸第二鉄と過酸化水素水、過酸化水素水とした。。キサンチン0.01mM-キサンチンオキシダーゼ1mU/ml、メナジオン2.8μMを付加した群において、水素を付加することによりヒト肺胞上皮細胞数の低下が抑制された。この結果および、APFによる蛍光観察の結果から、細胞内に発生した細胞障害性の強い活性酸素種は、水素により減少したと考えられた。C57BL/6J雄性マウスを使用し、高濃度酸素吸入群(O_2 80%)、高濃度酸素+ヘリウム吸入群(O_2 80%,He 20%)、高濃度酸素+水素吸入群(O_2 80%,H_2 2%,N_2 18%)の3群にて実験を行った。高濃度酸素+ヘリウム吸入群、高濃度酸素+水素吸入群では、高濃度酸素吸入群と比較すると生存率が有意に延長したが、高濃度酸素+ヘリウム吸入群と高濃度酸素+水素吸入群の生存率には有意差はなかった。また、肺の乾湿重量比も高濃度酸素群では有意に増加し、それと較べて、ヘリウム吸入群、水素吸入群では、有意に低下していた。ヒト肺胞上皮細胞(A549)を用い、水素付加群と水素非付加群の2群に分け、常酸素(21%)下で12時間前培養した。その後水素付加群を、酸素21%、二酸化炭素5%、窒素72%、水素濃度が2%になるよう調整したチャンバー内で培養した。酸化剤として、mPTPを開口させ・O_2-を生成させるメナジオン、mPTPを開口させず電子伝達系を阻害するアンチマイシンA、細胞内でHOを生成させるフェントン反応を起こす硫酸銅(II)+アスコルビン酸を使用した。mPTPを開口させるメナジオンを加えた群に関して水素非付加群よりも水素付加群のほうが、有意に生細胞数が少なく、アンチマイシンAを加えた群に関して水素非付加群よりも水素付加群のほうが、有意に生細胞数が多かった。フェントン反応を起こした群は差がなかったまた、水素はミトコンドリアの呼吸抑制により産生されるスーパオキシドアニオンに対しては、細胞を保護した。C57BL/6J雄性マウスを使用し、control(O_2 21%)、高濃度酸素(O_2 80%,)、水素(O_2 80%,H_2 2%)、NO(O_2 80%,NO 80ppm)、NO+水素(O_280%,NO 80ppm,H_2 2%)の5吸入群(いずれもN_2 Balance)にて実験を行い、生存時間解析を行った。肺障害の程度を肺乾湿重量比とMPO(myeloperoxidase)活性で6日目に調べた。水素群、NO群およびNO+水素群では、高濃度酸素群に比べ生存率が延長した。高濃度酸素吸入ではcontrol群に比べ肺乾湿重量比が有意に高値を示し、水素群、NO群、NO+水素群では高濃度酸素群と比べ、乾湿重量比の増加が有意に抑制された。

control群と高濃度酸素群を比較すると、MPO活性値が有意に上昇し(P<0.01)、高濃度酸素群と水素群を比較するとMPO活性値が有意に低下した(P<0.01)。つまり、水素の吸入が好中球集積を抑制していた。ヒト肺胞上皮細胞(A549)に酸化ストレスを与え、水素付加有無による細胞数および細胞内活性酸素種(ROS)量を比較検討した。水素による細胞の生存率はメナジオンで減少し、アンチマイシンAで増加し、フェントン反応で変化なかった。メナジオンでは水素付加によりROSの生成が増加し、mPTPを開口させOHラジカルを生成させる酸化ストレスに対しては、細胞保護効果が見られなかったが、アンチマイシンAのようなmPTPを開口させない酸化ストレスに対してはROS生成を抑制し、細胞保護効果があった。マウス肝からミトコンドリアを単離し、蛍光試薬MitoSOXを用いてスーパーオキシド濃度を測定した。ミトコンドリアから出ているベースラインのスーパーオキシドは、水素付加群ではコントロール群に比べて有意に低く、また、アンチマイシンAを添加した後の産生量の増加も小さくなっていた。
鳥類ゲノムマニピュレーションエンジニアリング技術の創製

最終年度は、前年度までの知見をベースに主として以下の3つに関連する研究を行った。1)前年度までに選出した卵白タンパク質(OVA)遺伝子座におけるgRNAを用いてゲノム編集を行い、ニワトリ体細胞(DF-1細胞)のOVA遺伝子座へ目的遺伝子(GFPおよびZeoR)を有するドナーベクターをノックインした。薬剤選抜後得られた細胞クローンからゲノムDNAを抽出し、5'および3'ジャンクション領域でゲノムPCR解析したところ、解析したすべての細胞クローンで期待通りノックインしていることがわかった。一方、OVAプロモーター領域に様々なgRNAを設計し、CRISPR-dCas9転写活性化システムを用いて遺伝子発現を誘導させた。RT-PCR法で評価したところ、OVA遺伝子転写産物が認められた。同システムをOVA遺伝子座ノックイン細胞に適用したところ、レポーター遺伝子の発現を誘導することができた。2)培養細胞を介さない鳥類初期胚への直接遺伝子導入によるトランスジェニック鳥類作製技術の開発を試みた。エレクトロポレーションで使用する電極や電圧、あるいはパルス幅などを様々に検討したところ、胚発生に影響が少なく、全身へ高効率に遺伝子導入効果が認められる最適な導入条件を決定することができた。3)網羅的遺伝子発現解析から得られた複数の初期化因子を高効率に遺伝子導入するため、2Aペプチドを介して発現可能なトランスポゾンベクターを作製し、ニワトリ体細胞(CEF)へ遺伝子導入した。遺伝子導入試薬を検討することで、LF3000を7.5uL使用した場合、最も遺伝子導入効率が高くなった。薬剤選抜後レポーター遺伝子の発現が強く見られたため、初期化遺伝子のゲノムへの組込みが示唆された。引き続き検討が必要なものの、高効率で高品質な鳥類多能性幹細胞の樹立への指針が定まったといえる。本研究では、これまでに我々が研究を進めてきたゲノム部位特異的遺伝子導入ツールや昨今革新的な技術であるゲノム編集ツールを用いることで、胚レベルでダイレクトにゲノム操作可能な技術の開発と鶏卵バイオリアクターをはじめとする鳥類のバイオテクノロジーへの応用を目指した、鳥類ゲノムマニピュレーションエンジニアリング技術の創製を目的としている。初年度は、特定ゲノム部位におけるゲノム編集のためのへニワトリ細胞への遺伝子導入条件の検討と培養細胞レベルでの評価を集中的に行った。ニワトリ細胞に対してエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を行い評価したところ、導入遺伝子の細胞における発現率や導入細胞の生存率を最大化する条件が決定できた。性決定制御関連遺伝子のエキソン内を編集可能なガイドRNAを発現するベクターをニワトリ細胞へ遺伝子導入し、該当遺伝子座における変異導入を解析した。挿入欠損検出アッセイ(T7EIアッセイ)を行ったところ、編集サイトにおいて30%以上のIndel値が認められた。T7EIアッセイと同様に調製したPCR産物をサブクローニング用プラスミドにてクローニング後、シークエンス解析したところ、同様の効率でクローンに変異導入があり、PAM配列周辺での変異であることが確認できた。このことから、非選択圧下においても編集可能であることがわかり、胚でのゲノム編集に適用可能であることが示唆された。卵白タンパク質遺伝子座において複数のsgRNAを設計し、発現ベクターを構築後、ニワトリ細胞へ導入した。T7EIアッセイを行い、ゲノム編集の候補となる編集部位を同定することができた。ニワトリ初期胚への遺伝子導入を想定して、マイクロインジェクション法によるニワトリ培養細胞への遺伝子導入条件の検討を行い、導入遺伝子発現が最大化する条件を見出した。産業応用上重要な項目のひとつであるニワトリオス・メスの性制御における基礎的知見のため、性決定関連遺伝子におけるゲノム編集可能なガイドRNAの設計を行った。デザインしたgRNAを用いて培養細胞レベルで検討したところ、非選択圧下でも高い効率で編集されていた。このことから、胚レベルでのダイレクトなゲノムマニピュレーションに適用可能であることが示唆された。卵白タンパク質遺伝子座におけるゲノム編集も試み、候補サイトを選抜することができた。また、標的遺伝子座へのノックインとして、動物細胞の既知遺伝子座へのノックインベクターを作製し、組換え抗体遺伝子を効率よくノックインする技術開発を行った。これらの成果の一部を複数の国内学会に報告した、または報告予定である。本年度はおおむね研究計画書どおりに実行することができ、目的を達成することができたと考えている。本年度は、主として以下の3つに関連する研究を行った。1)卵白タンパク質遺伝子座におけるゲノム編集:卵白タンパク質遺伝子座で設計した複数のsgRNAをニワトリ初代細胞および細胞株において評価した。遺伝子導入後、ゲノムDNAを抽出し、T7EIアッセイを行ったところ、セレクションなしで30%以上のIndel値を示したことから、ゲノム編集の候補となる編集部位を同定することができた。ノックイン用ドナーベクターの構築が完成しており、現在ノックイン効率を評価しているところである。2)胚への遺伝子導入:ゲノム編集ベクターの胚への遺伝子導入にあたり、レポーター遺伝子(LacZ)をニワトリ初期胚へマイクロインジェクションした。導入条件をさらに最適化する必要はあるものの、導入部位においてレポーター遺伝子(β-gal)の発現が認められた。今後上記で検討したsgRNAを胚へ導入することで、ゲノム編集効率の評価を行う予定である。3)ニワトリ多能性幹細胞樹立に関する研究:網羅的遺伝子発現解析により得られた複数の転写因子のニワトリホモログを自己切断型2Aペプチドを介して共発現できるように人工遺伝子合成した。これらの遺伝子をトランスポゾンベクターに組込み、ニワトリ体細胞への遺伝子導入実験を行った。

ベクターにおける目的遺伝子サイズが増えたため、遺伝子導入条件をさらに検討する必要があるものの、ニワトリ細胞への遺伝子導入が確認できたことから、今後初期化誘導実験を行う予定である。ニワトリ初代培養細胞ならびに体細胞株ともに卵白タンパク質遺伝子座において非選択圧下で高い効率で編集可能なガイドRNAを見いだすことができた。目的遺伝子を有するノックインベクターの作製も終えており、高い編集効率ならびに遺伝子ノックインが期待できると考えている。ニワトリ初期胚への目的遺伝子導入実験では、導入遺伝子の発現が認められ、胚レベルにおけるゲノム編集導入実験への足がかりを構築することができた。ニワトリ多能性幹細胞樹立にむけた検討では、既知転写因子ファミリーのニワトリホモログを人工遺伝子合成し、複数の遺伝子を共発現可能な発現ユニットとして目的ベクターへと組込んだ。ニワトリ細胞への遺伝子導入もできたことから、今後誘導実験を推進させる予定である。これらの成果の一部を複数の学会に報告した、または報告予定である。本年度は概ね研究計画書に基づいて進展できたと考えている。最終年度は、前年度までの知見をベースに主として以下の3つに関連する研究を行った。1)前年度までに選出した卵白タンパク質(OVA)遺伝子座におけるgRNAを用いてゲノム編集を行い、ニワトリ体細胞(DF-1細胞)のOVA遺伝子座へ目的遺伝子(GFPおよびZeoR)を有するドナーベクターをノックインした。薬剤選抜後得られた細胞クローンからゲノムDNAを抽出し、5'および3'ジャンクション領域でゲノムPCR解析したところ、解析したすべての細胞クローンで期待通りノックインしていることがわかった。一方、OVAプロモーター領域に様々なgRNAを設計し、CRISPR-dCas9転写活性化システムを用いて遺伝子発現を誘導させた。RT-PCR法で評価したところ、OVA遺伝子転写産物が認められた。同システムをOVA遺伝子座ノックイン細胞に適用したところ、レポーター遺伝子の発現を誘導することができた。2)培養細胞を介さない鳥類初期胚への直接遺伝子導入によるトランスジェニック鳥類作製技術の開発を試みた。エレクトロポレーションで使用する電極や電圧、あるいはパルス幅などを様々に検討したところ、胚発生に影響が少なく、全身へ高効率に遺伝子導入効果が認められる最適な導入条件を決定することができた。3)網羅的遺伝子発現解析から得られた複数の初期化因子を高効率に遺伝子導入するため、2Aペプチドを介して発現可能なトランスポゾンベクターを作製し、ニワトリ体細胞(CEF)へ遺伝子導入した。遺伝子導入試薬を検討することで、LF3000を7.5uL使用した場合、最も遺伝子導入効率が高くなった。薬剤選抜後レポーター遺伝子の発現が強く見られたため、初期化遺伝子のゲノムへの組込みが示唆された。