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国際金融市場における国際的なセイフティ・ネットの構築についての理論的実証的研究

本研究は、1997年以降のアジア通貨・金融危機の背景と要因を、1990年代の国際通貨体制の変容との関連において検討することを課題にして行われた。研究実績については、社会労働研究に掲載する予定であるが、その結論を以下のようにまとめられる。アジア諸国の通貨危機に関しては、各国固有の金融市場の問題点が存在することは言うまでもないが、発展途上国が意識的に工業化政策(産業政策)を遂行する場合、必然的に価格体系の相違(国際市場からみて)、または非市場的な資本配分を必要としており、そこだけに通貨危機の要因を求めることは正しくないことである。他方で、国際通貨体制については、アメリカの経常収支赤字の拡大とその赤字額の累積のもとで、アメリカが追求したドル中心の国際金融市場の一体化が、各国ごとの対応や従来のIMFと先進諸国の国際協力による安定のメカニズムを彫り崩してきたことにある。特に、92.93年の欧州通貨危機、94年のメキシコ通貨危機をバネにして拡大した通貨投機のメカニズムが、主に資本流入に依存する形で工業化を図ってきたアジア諸国を中心に、金融市場の改革が国際金融市場の変化に遅れている国をターゲットにして発生したということができる。したがって、国際通貨体制の安定化と途上国に対する安定的な資本移動を実現していくためには、IMFの強化に加えて短期的な資本移動の監視(規制も含む)が必要である。そのセイフティ・ネットのあり方については、投資家のモラル・ハザードを防止するために、IMFの融資の条件に投資家への課税をつけ加えることが不可欠である。新しい型の通貨危機に対応するために、国際通過体制におけるセイフティ・ネットの研究を進めるというこの研究は、当初の予定よりも早く、アジア各国で通貨危機として顕在化したために、研究計画の変更が余儀なくされた。特に、タイの通貨危機について発生したインドネシア、韓国にたいする国際的な金融支援は、従来の枠組みを大きく変更するものであった。また、アジアの通貨危機の発生は各国ごとに異なっており、単純に、国際金融システムの変化と投機的な短期資金移動の問題にとどまらない大きな問題を含んでいる。したがって、本年度の研究は、IMFや他の国際機関をはじめとして、緊急の事後的対策としてとられた救済策の内容と評価、そして、各国の通貨危機の発生に至る経済データの収集と分類化に重点をおいて行った。その中でも、特にIMFに焦点をおいて、事前的規制の強化のあり方と事後的な対策として創設されたNABについて検討を行った。IMFの事前的規制は、実際には、アジアの通貨危機を未然に防止できなかったという点で、多くの改善点が残っていると考えることもできるが、本研究の中では、本質的に未然防止は不可能であるという結果が指摘されている。また、事後的な救済策とパニックの防止策においても、多くの改善点があることが明らかにされている。しかし、アジアの通貨危機は、未だ進行途上に有り、多くの教訓をわれわれに与えるものとして様々な材料を提供している。特に、アジア各国の変動相場制度への移行は、アジア地域におけるドル離れの問題という側面も有しており、アジア域内経済の発展と円の国際化とも密接に関係している。さらに、日本の金融システムの不安定化の問題は、本研究の当初の予想を超えて深刻化しており、アジアの通貨危機の連鎖に大きな影響を与えている。これらの点については、1998年度において研究を進めていくことにする。
骨形成蛋白添加による骨誘導能を有する人工骨の開発とその臨床応用に関する基礎的研究

1.BMPの抽出と精製:牛脱灰骨より塩酸グアニジンにて抽出した画分をゲル濾過クロマトカラム(Sephacryl Sー200HR)、次いで陽イオン交換クロマトカラム(SーSepharose Fast Flow)によって分画した。更にこの画分をヘパリンアフィニティークロマトカラム(Shodex AFーPack HRー894)によって分画した。得られたBMP画分についてSDSポリアクリルアミド電気泳動を行った結果、分子量2030Kにスメアなバンドが認められ、分子量の確定はできなかった。現在、逆相高速液体クロマトを用い最終精製を検討中である。2.BMPと複合のための材料の検索:BHPは収量が微量であるためその作用を増強する担体をラット胸部皮下移植実験によって検索した。現在のところアテロコラーゲンが工業的にも大量生産可能であり臨床応用に際して有効な担体と考えられた。3.BMPと複合のための混合形態の検索:アテロコラーゲンーBMP複合体あるいはハイドロキシアパタイトーアテロコラーゲンーBMP複合体をラット胸部皮下に移植する際、それら複合体を凍結乾燥圧縮処理することによって最も優れた骨誘導能が得られ、かつ移植材料の形態付与も可能であった。4.ディフュージョンチャンバーを用いた実験:BMPを骨髄とともにチャンバー内に封入し腹腔内に移植すると軟骨・骨形成が観察された。更に骨髄を倍養したときに得られる骨髄間質由来の細胞を用いた場合でも軟骨・骨形成が観察され、骨髄におけるBMPの標的細胞は血球由来ではなく間質由来の細胞と考えられた。5.In vitroにおける作用:BMP活性の高い画分をアガロースゲル内に包埋培養した筋組織由来の未分化問葉系細胞に作用させたところ軟骨細胞様のコロニー形成が誘導された。同様の軟骨誘導活性は象牙基質にも存在した。しかしゲル内で軟骨を誘導する因子とBMPとの異同には議論があり、今後BMPの精製と付随させて軟骨誘導因子との違いを検索する予定である。1.ウィスター系ラット長管骨よりReddiらの方法に準じて,骨形成蛋白を含む4M塩酸グアニジン可溶性画分(crude BMP)を調整した.この画分をハイドロキシアパタイト顆粒(HA)あるいは三リン酸カルシウム顆粒(TCP),さらに医療用アテロコラーゲン(AC)と混合し,凍結乾燥処理後,同系ラッとの頭蓋骨欠損部及び皮下に移植し,組織学的検索を行った.その結果,以下の知見が得られた. (1)骨欠損部移植において,HA単独移植に比べ,BMPとHAの2者混合移植,さらにそれにACをも添加した3者混合移植の方が,HA顆粒間にも骨形成が著明に促進され,移植後6週までに欠損部の閉鎖が観察された.(2)TCPを用いた場合も同様の所見が得られた.(3)皮下移植においては,HAあるいはTCP単独移植では,移植顆粒は線維性結合組織に被包され,骨形成は認められなかった.(4)一方,BMPとACを添加した3者混合移植では,骨形成が著明に認められた.2.BMPの精製においては,ウシ脱灰骨より,crude BMPを調整し,Sephacryl Sー200,CMーCellvloseにより精製を行った.結果,(1)Sephacryl Sー200で精製した活性画分では,精製度7.1倍,回収率58.7%であった.

(2)この活性画分をさらにCMーCellvloseにより精製すると,精製度40倍,回収率6.2%の活性画分が得られた.(3)この精製物はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で,分子置18,000の蛋白質をメインバンドとするものであった.以上より,主にラットを用いた動物実験において,骨伝導能のみ有する従来の人工骨に対して,BMPとACを添加することにより,骨伝導能と同時に骨誘導能を有する人工骨の開発が可能であることが,明らかとなった.今後は,BMP,HA,ACの3者の混合条件,処理方法を再検討し,微量のBMPを有効に使用するための条件設定を行う共に,BMPの精製を行う予定である.1.BMPの精製:昨年度の本報告において、ゲル濾過および陽イオン交換クロマトによって分子量18Kを中心とするBMP画分を得たことを報告したが、この蛋白質のアミノ酸配列を決定したところミオグロビンであることがわかった。この画分をヘパリンアフィニティークロマトによって分画することにより、ミオグロビンとBMP画分とを分離することが可能であった。得られた画分はSDS電気泳動で分子量2030Kにスメアなバンドを認め、BMPの分子量の確定はできなかった。現在、逆相高速液体クロマトを用い最終精製を検討中である。2.BMPと複合のための混合形態の検索:ハイドロキシアパタイト-アテロコラーゲン-BMP複合体が優れた骨誘導能を有することはすでに報告したが、この複合体の骨誘導能を凍結乾燥あるいは圧縮処理の有無により比較した。その結果、凍結乾燥圧縮処理をすることによって最も優れた骨誘導能が得られ、かつ移植材料の形態付与も可能であった。3.ディフュージョンチャンバーを用いた実験:BMPを骨髄細胞とともにチャンバー内に封入し腹腔内に移植すると再現性よく軟骨・骨形成が観察された。更に骨髄を培養したときに得られる骨髄間質由来の線維芽細胞様の細胞を用いた場合でも軟骨・骨形成が観察され、骨髄におけるBMPの標的細胞は骨髄血球系由来ではなく骨髄間質由来の細胞と考えられた。骨髄細胞はBMPの標的細胞の1つであり、臨床的にBMPと骨髄との混合移植の有用性が示唆された。
大腸癌の癌性質に基づいた治療法の開発

以下の3点につき検討した。Adenovirusdominant negative TCFを作成した。このウイルス液は効率よく各種大腸癌細胞のTCF転写活性、およびその下流遺伝子であるcyclin D1,MMP7,c-mycなどのプロモーターの転写活性を抑制した。このウイルス液はin vitro、in vivoヌードマウス皮下腫瘍の増殖を抑制した。また肝転移モデルもよく抑制した。・Type1 collagen上で培養すると、Ad-dnTCFの細胞増殖抑制効果は著明となり、単に増殖を抑制するよりも、浸潤抑制効果が強いと判った。・Ad-dnTCFにより前処理した大腸癌細胞株DLD1はヌードマウス皮下腫瘍における著しい増殖抑制効果示した。・Ad-dnTCFにより前処理した大腸癌高肝転移株KM12smを脾注し、肝転移形成能を検討した結果、著しい転移抑制能を示した。・18mer TCF decoyを用いて,複数の大腸癌細胞株で,単層培養による細胞増殖,足場非依存性細胞増殖についての抑制効果を認めた。
量子情報時代の新暗号基礎:量子状態識別問題の暗号論的性質解明とその応用

今年度では量子状態識別問題に関す基礎的研究から応用プロトコルまでの研究を行くった。特に基礎研究では隠れ部分群問題と呼ばれる量子アルゴリズム分野において非常に重要な問題を量子状態式別問題に帰着し,その計算量を量子情報理論的手法により特徴付けることに成功した.この成果により,本プロジェクトで以前提案していた量子状態を利用した公開鍵暗号プロトコルの情報理論的観点からの安全性証明を与えることができた.また新しい量子状態を利用した公開鍵暗号系も構成でき,ある条件下での最適性を証明することができた.このプロトコルもあるモデルの下で情報理論的な安全性を保証することができる.別の応用プロトコルでは量子アルゴリズムに対しても現在のところ耐性を持っている整数格子問題と呼ばれる計算困難問題に基づいた公開鍵暗号系の改良に成功した.この問題は直接的には量子状態識別問題を利用はしていないが,その古典版である確率分布識別問題を利用しており,量子状態識別問題の研究で得られた知見を応用することができた.本研究課題における今年度の主な研究成果は(1)ある特殊な2種類の量子状態の識別問題が暗号論的性質を満たすことの理論的証明、(2)その識別問題に基づいた量子公開鍵暗号系の提案と理論的安全性評価、の2点である。まず成果(1)に関して、本研究ではある二つの量子状態の識別問題が(i)落とし戸を持つ、(ii)平均時の困難性が最悪時の困難性と等価である、(iii)最悪時の困難性が少なくともグラフ自己同型性判定問題の最悪時困難性と同等かそれ以上である、という三つの暗号論的性質を満たすことを証明した。例えばこの問題を公開鍵暗号系に利用することを考えた場合、敵対者には暗号文が区別できないが、正しい秘密情報を持つ受信者には暗号文を正しく解読できるという性質が必要となる。性質(i)はこの機能を提供するものである。また、ある計算困難な問題を暗号に利用した場合、実際にはランダムに問題生成を行うため、その問題の最悪時困難性が保証されているだけでは不十分である。性質(ii)はこの識別問題の平均時困難性が最悪時困難性によって保証されることを示している。さらにその最悪時困難性は性質(iii)により保証されている。なお、このグラフ自己同型性判定問題は量子計算機を用いても効率良く解けるかどうか判明しておらず、少なくとも現在のいくつかの量子計算機上のアルゴリズムの設計手法では解けないという否定的な結果もいくつか知られている。この三つの性質を利用することで成果(2)の量子公開鍵暗号系を構成することが可能となった。この公開鍵暗号系における暗号の解読は少なくともグラフ自己同型性判定問題を解くことと同等かそれ以上に難しいことが証明可能であるため、現在知られている量子計算機上のアルゴリズムでは解読困難であるといえる。今回の研究により,量子公開鍵暗号の安全性についての量子情報理論的な見地からの知見を得ることができ,その結果として,新たな量子公開鍵暗号系の構成及びその安全性評価を行うことができた.今回新たに得られた量子公開鍵暗号系(以下,新暗号系)は本研究課題において昨年度得られた暗号系(以下,旧暗号系)に比べて以下の二つの観点から優れている.・情報理論的安全性:林・河内・小林による量子状態識別問題に対する情報理論的評価により旧暗号系の情報理論的安全性の評価が可能となった.その評価の結果,セキュリティパラメータをnとしたときに,平文長1ビット,暗号文長n log nビットの旧暗号系で,n個までの公開鍵を配布しても安全であることが明らかとなった.それに対して,新暗号系では暗号文長・配布可能公開鍵数を保持したまま,平文長をl0g nビットに伸ばしても安全であることが証明できた.つまり,新暗号系は旧暗号系と同じ安全を達成しつつ,より多くの情報を送ることが可能である.・安全性概念:旧暗号系で満たすことが分かっていた安全性概念は,識別不可能性と呼ばれるもので,二つの異なる平文を暗号化したときに得られる二つの暗号文は復号鍵を知らなければ区別がつかない,というものであった.一方,様々な古典や量子鍵配送プロトコルに対してはより強力な汎用結合可能安全性と呼ばれる安全性概念が広く知られている.この汎用結合可能安全性は暗号プロトコル単体での安全性ではなく。他の暗号プロトコルと組み合わせて構成された複雑な暗号プロトコルでも全体として安全性を満たす事ができる安全性概念である.今回の研究では新たに量子公開鍵暗号系の情報理論的安全性に対して拡張を行い,新暗号系がそれを満たすことを証明した.またこの量子公開鍵暗号系の他に,計算量的な仮定に基づくハードコア関数の量子的安全性帰着の技法を開発した.ハードコア関数は擬似乱数生成器などに利用される非常に基本的な暗号の構成部品である.この結果により量子計算機を持つ敵対者に対しても安全なハードコア関数の構成が可能となった.今年度では量子状態識別問題に関す基礎的研究から応用プロトコルまでの研究を行くった。特に基礎研究では隠れ部分群問題と呼ばれる量子アルゴリズム分野において非常に重要な問題を量子状態式別問題に帰着し,その計算量を量子情報理論的手法により特徴付けることに成功した.この成果により,本プロジェクトで以前提案していた量子状態を利用した公開鍵暗号プロトコルの情報理論的観点からの安全性証明を与えることができた.また新しい量子状態を利用した公開鍵暗号系も構成でき,ある条件下での最適性を証明することができた.このプロトコルもあるモデルの下で情報理論的な安全性を保証することができる.別の応用プロトコルでは量子アルゴリズムに対しても現在のところ耐性を持っている整数格子問題と呼ばれる計算困難問題に基づいた公開鍵暗号系の改良に成功した.

この問題は直接的には量子状態識別問題を利用はしていないが,その古典版である確率分布識別問題を利用しており,量子状態識別問題の研究で得られた知見を応用することができた.
摘葉処理と遮光処理がニホンスモモ‘貴陽’の『味なし果』発生に及ぼす影響

ニホンスモモ`貴陽'では『味なし果』と呼ばれる低品質果実(糖度10度程度)の発生が問題となっている。これまでに、正常な果実と比べて、ソルビトール含量が少ないことや下垂枝や内向枝で『味なし果』が多発することが報告されているが、その発生要因はわかっていない。そこで本研究ではソース器官として光合成により同化産物を生成する葉に着目し、光合成産物の転流と『味なし果』発生との関係を明らかにするために摘葉時期と遮光時期の違いが`貴陽'の果実品質に及ぼす影響について調査した。満開後10週と14週にそれぞれ摘葉処理と遮光(75%)処理を行った。果実の成熟期である満開後16週以降に収穫し、果実品質を調査した。その結果、摘葉処理区の果実糖度は無処理区(19.2%)と比較して、満開後10週摘葉区(20.5%)と満開後14週摘葉区(19.8%)ともに有意差はなかった。一方、遮光処理を行った果実の糖度は、無処理区(21.5%)と満開後14週遮光区(20.5%)に差はなかったものの、満開後10週遮光区では14.9%と著しく低く、すなわち、味なし果が多く発生した。これらの結果から、硬核期(満開後8週頃)以降の早期の遮光処理は『味なし果』の発生を助長させることがわかった。また、今年度の試験では差はなかったものの、摘葉処理によって『味なし果』が多発したという報告もある。摘葉や遮光処理によって、ソース機能を低下させることで『味なし果』の発生が増加した。このことから、`貴陽'における『味なし果』の発生には同化産物の転流が関係していることが示唆された。今後は、葉の光合成能と果実品質との関係や、同化産物であるソルビトールの各器官への分配などを調査し、`貴陽'における『味なし果』の発生要因を検討していく予定である。
要介助者の個人的特性に応じたオーダーメイド水中運動プログラムの開発

水中運動によるADL能力の改善に影響を及ぼすと考えられる性別や年齢,運動習慣,運動経験,心身機能などの個人的特性を調査し,それぞれの個人的特性がどの程度水中運動の効果に影響を及ぼすかを検証した.その結果,水中運動によるADL能力の改善には,要介助者の移乗動作能力及び職業(日常生活での役割)といった個人的特性が関係している可能性があることが明らかとなった.水中運動によるADL能力の改善に影響を及ぼすと考えられる性別や年齢,運動習慣,運動経験,心身機能などの個人的特性を調査し,それぞれの個人的特性がどの程度水中運動の効果に影響を及ぼすかを検証した.その結果,水中運動によるADL能力の改善には,要介助者の移乗動作能力及び職業(日常生活での役割)といった個人的特性が関係している可能性があることが明らかとなった.本研究では,水中運動によるADL能力の改善に影響を及ぼすと考えられる性別や年齢運動習慣,運動経験,心身機能などの個人的特性を調査し,それぞれの特性がどの程度水中運動の効果に影響を及ぼすかを検証することで,水中運動がADL能力の改善に対して有用である対象者の特性を明らかにする.本年度は,53名の要介助者を対象として,1回60分,週1回もしくは週2回,6ヶ月間の水中運動教室を実施した.水中運動教室前後に,形態・生活環境(性別,年齢,運動習慣,過去の運動経験,月経の有無,既往歴,家族構成,体の痛み,収入,身長,体重,体脂肪率,BMI,血圧)及び心身機能調査(ADL能力,下肢筋力,柔軟性,バランス能力,敏捷性)を実施し,ADL能力の変化とその他の個人的特性との関連性を,重回帰分析を用いて検討した.その結果,水中運動によるADL能力の変化と介入前の移乗移動能力及び職業の有無との間に有意な相関関係が認められた.これらのことから要支援,要介護1レベルの軽度な要介護者においては,移乗動作能力が低い者ほど水中運動によるADL能力の改善が期待できると考えられる.また,職業など日常生活での役割を有する者は活力が高いため,運動に対して積極的に取り組んだ可能性がある.これらのことから,水中運動によるADL能力の改善には,要介助者の移乗動作能力及び職業(日常生活での役割)といった個人的特性が関係している可能性がある.しかしながら,サンプル数が少なかったことからR2値が低く,信頼性を高めるためには被験者数を増加することが必要であった.本研究では,水中運動が軽度要介護認定者のADL能力の改善に対して有用である対象者の特性を明らかにする.平成21年度には,53名の軽度要介護認定者を対象として調査を行ったが,サンプル数が少なかったことからR2値が低いという問題点が浮き彫りとなった.そこで本年度は,新たに30名の被験者を対象に1回60分,週1回もしくは週2回,6ヶ月間の水中運動教室を実施した.平成21年度同様,水中運動教室前後に,形態・生活環境及び心身機能調査を実施し,ADL能力の変化とその他の個人的特性との関連性を,重回帰分析を用いて検討した.その結果,平成21年度同様に水中運動によるADL能力の変化と介入前の移乗移動能力及び職業の有無との間に有意な相関関係が認められた.これらのことから要支援,要介護1レベルの軽度な要介護者においては,移乗動作能力が低い者ほど水中運動によるADL能力の改善が期待できると考えられる.また,職業など日常生活での役割を有する者は活力が高いため,運動に対して積極的に取り組んだ可能性がある.これらのことから,水中運動によるADL能力の改善には,要介助者の移乗動作能力及び職業(日常生活での役割)といった個人的特性が関係している可能性がある.二年間の調査の結果,水中運動が移乗能力の低下した要介護認定者に対するAD上能力改善トレーニングとして有用であることについて一定の知見を示すことはできたものの,依然として重回帰分析におけるR2値が0.456と低いことから今後更なる検討が必要である.
もやもや病の環境および遺伝因子の特定と早期診断法の確立

本研究は、もやもや病の遺伝因子と環境因子の全容を解明することを目的とし、1RNF213遺伝子のR4810K変異の臨床的意義の検討、2RNF213以外の遺伝因子の特定、3環境因子の特定を課題として掲げた。RNF213のR4810K変異については、Down症候群などの基礎疾患を背景にしてもやもや病と同様の血管狭窄を示す類もやもや病においても関連することを示し(Morimoto et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2016)、冠動脈疾患においても関連があることを示した(Morimoto et al. PLoS One 2017)。また、もやもや病家族において、RNF213のR4810K変異を用いることで、家族の脳血管狭窄の発症を予測できる可能性があることを示した。具体的にはR4810K保因者の4人に1人が脳血管狭窄を発症することを明らかにした(Matsuda et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2017)。RNF213以外の遺伝因子については、RNF213のR4810K変異を持たない患者14名について、全ゲノムシークエンス解析を行い、関連する候補遺伝子群を同定した(未発表データ)。また、一卵性双生児において表現型不一致を示す2姉妹を含む6組のsib pairで全ゲノムメチル化解析を行い、遺伝子変異以外の要因についても検索を進め、候補となる遺伝因子を特定し、現在その裏付けとなる解析を進めている。ゲノム情報とエピゲノム情報を統合することで、病態の解明に近づけると考えている。環境因子の特定については、片側もやもや病の進行に関わる環境因子を特定した(未発表データ)。その他の環境因子については、当初の研究計画では血液のみを対象としていたが、複数の生体試料を解析することで特定に近づけられると考え、現在生体試料の収集を継続している。もやもや病患者の家族に対して、RNF213遺伝子のp.R4810K多型と病歴、MRA画像を調べて、脳血管障害のリスクを評価した。その結果、リスクアレルを持つ人は、有意に脳血管狭窄や閉塞に罹患するリスクが高いことを明らかにした。また、追跡期間中にも血管狭窄が進行することがあり、リスクアレルを持つひとの定期的な画像検査が必要である。逆に、リスクアレルを持たない人は、脳血管狭窄の発症リスクが極めて低く、MRAスクリーニングの必要性が低いことが分かった。現在論文が査読中である。もやもや病と同じ血管撮影像を示すが、NF1やDown症候群などの背景疾患がある場合は、もやもや症候群として区別される。もやもや症候群とRNF213の関連については、関係ないという報告が認められた。今回我々はその検証を行った。その結果、ほとんどの疾患において、RNF213の関与が認められた。もやもや症候群においても、RNF213が大きく影響することが明らかとなった。論文はrevisionで採択される見込みとなっている。もやもや病患者において、頭蓋内血管以外に、冠動脈や腎動脈に狭窄が見つかるケースが認められる。そこで、RNF213のp.R4810K多型と冠動脈疾患の関連について解析を行った。その結果、リスク多型は冠動脈疾患と有意な相関を示し、オッズ比が2倍以上(環境因子を補正して、オッズ比が2.9倍ほど)になることを示した。RNF213が脳血管のみならず、頭蓋外の血管にも影響を及ぼすことが明らかとなり、脳・心血管疾患の予防に向けて、RNF213関連の病態を明らかにする意義が示された。もやもや患者からの血清と血液の採取を行い、順調にサンプルが集まっている。サイトカインの変化や外来生物由来DNAの検出を行い、環境因子を明らかにする予定としている。解析に必要なサンプルが集まってきいている。今後、外来生物由来のDNA検出などを行う予定で、計画通りに進んでいる。論文を既に3報作成し、査読中の状態である。Down症候群などの基礎疾患を背景とするもやもや症候群においても、RNF213 R4810Kが有意に相関していることを示した。基礎疾患の発症に関わる遺伝因子がRNF213と相互作用を持ち、もやもや病の発症を促進している可能性が示唆された。本研究の成果は原著論文として、J Stroke Cerebrovasc Dis 2016に掲載された。もやもや病患者の家族に対して、RNF213 R4810K変異のスクリーニングをする意義について検討した。変異陰性で頭蓋内血管病変を持つ者はなく、6年間のフォロー期間でも新規発症は認めなかった。変異保有者は変異非保有者に比べて有意に脳血管狭窄のリスクが高かった。このことから、R4810Kをもやもや病患者家族のスクリーニングに利用する意義があることが示された。そのほかの明らかな環境因子は明らかにならなかった。これらの結果は、J Stroke Cerebrovasc Disに投稿し、revised versionを提出して査読の結果を待っているところである。頭蓋外血管狭窄におけるRNF213 R4810K変異の関与についても検討した。冠動脈狭窄においてR4810K変異がリスク因子となっていることが示された。オッズ比は3-4倍でこれまでに特定された遺伝因子のなかでも非常に高い数値を示している。この結果は、PLoS One 2017に原著論文として採択された。

もやもや病およびその類縁疾患や頭蓋外血管狭窄病変におけるRNF213 R4810K変異の影響について明らかにすることができた。環境因子の特定には至らないが、別の遺伝因子が強く働いている可能性を示すことができた。この結果をもとに、第2の遺伝因子特定に向けた実験を今年中に施行可能な状態となっている。研究期間中に当初の目的を到達できる見込みである。本研究は、もやもや病の遺伝因子と環境因子の全容を解明することを目的とし、1RNF213遺伝子のR4810K変異の臨床的意義の検討、2RNF213以外の遺伝因子の特定、3環境因子の特定を課題として掲げている。RNF213のR4810K変異については、Down症候群などの基礎疾患を背景にしてもやもや病と同様の血管狭窄を示す類もやもや病においても関連することを示し、冠動脈疾患においても関連があることを示した。また、もやもや病家族において、RNF213のR4810K変異を用いることで、家族の脳血管狭窄の発症を予測できる可能性があることを示した。R4810K保因者の4人に1人が脳血管狭窄を発症することを示した。RNF213以外の遺伝因子については、RNF213のR4810K変異を持たない患者14名について、全ゲノムシークエンス解析を行い、現在関連する遺伝因子の特定を進めている。また、一卵性双生児において表現型不一致を示す2姉妹を含む6組のsib pairで全ゲノムメチル化解析を行い、遺伝子変異以外の要因についても検索を進めている。ゲノム情報とエピゲノム情報を統合することで、病態の解明に近づけると考えている。もやもや病におけるRNF213以外の遺伝因子の解析を進めている。RNF213 R4810K変異のない患者の全ゲノムシークエンスが終了し、現在解析を進めているところである。今年度内に別の遺伝因子の特定ができると考えている。本研究は、もやもや病の遺伝因子と環境因子の全容を解明することを目的とし、1RNF213遺伝子のR4810K変異の臨床的意義の検討、2RNF213以外の遺伝因子の特定、3環境因子の特定を課題として掲げた。RNF213のR4810K変異については、Down症候群などの基礎疾患を背景にしてもやもや病と同様の血管狭窄を示す類もやもや病においても関連することを示し(Morimoto et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2016)、冠動脈疾患においても関連があることを示した(Morimoto et al. PLoS One 2017)。具体的にはR4810K保因者の4人に1人が脳血管狭窄を発症することを明らかにした(Matsuda et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2017)。RNF213以外の遺伝因子については、RNF213のR4810K変異を持たない患者14名について、全ゲノムシークエンス解析を行い、関連する候補遺伝子群を同定した(未発表データ)。
腰椎部発育性脊柱管狭窄の概念確立を目指す地域住民コホート研究

本研究の目的は、未だ疾患概念の確立がなされていない腰部脊柱管狭窄症の原因の一つである発育性脊柱管狭窄に着目し、疫学データを用いて、脊柱管前後経の標準値を明らかにするとともに、腰部脊柱管狭窄症発症リスクに関する発育性狭窄のカットオフ値を求めることであった。平成27年度には平成25年度に和歌山県T町でおこなった疫学調査(第2次The Wakayama Spine Study)のデータを元に、797名の一般地域住民の腰椎MRI画像を解析し、MRI横断像における脊柱管前後径の標準値を明らかにした。脊柱管前後径はL2: 23.1±2.1、L3: 22.7±2.4、L4:21.6±2.7、L5:18.8±2.9(mm)と下位腰椎ほど狭いという結果であった。L4高位での脊柱管前後径の性別・年代別変化では男性より女性の方が有意に広く、男女とも年齢と共に狭くなっていた。腰部脊柱管狭窄症による下肢症状と脊柱管前後径の関連性を多変量回帰分析で検討した結果、L4脊柱管前後径は下肢神経症状と有意に関連していた。殿部・下肢痛に対するL4脊柱管前後径のカットオフ値をROC解析で求め、21.15mm未満を骨性狭窄ありとしロジスティック回帰を行うと、オッズ比1.79[95%CI:1.17-2.75]となった。また、平成27年10月から12月にかけては和歌山県H町で第3次The Wakayama Spine Studyの検診を行ない、約800名の一般地域住民を対象に、全脊柱MRI、レントゲン、整形外科医による診察所見を含む、脊椎データを収集した。今後、縦断的に疫学データを解析していくことにより、発育成脊柱狭窄と、腰部脊柱管狭窄症による下肢神経症状との原因結果関係を明らかにしていく方針である。
拡散強調MRIテンソル解析による中枢神経発達を見据えた小児短腸患者新規栄養法開発

新生児医療における重要なアウトカムである正常な発育発達を獲得してそれを評価するには、長期フォローが必要だが、乳児期以降の環境要因によるバイアスも大きく、新生児期の外科的医療介入との相関を直接的に評価する方法は少ない。新生児期の栄養が脳の発達に大きな影響を与えることは知られているが、新生児外科疾患では消化器疾患を中心に長期絶食・完全静脈栄養に頼らざるを得ない状況も多く、栄養管理方法とそれらが神経学的発達に与える影響についての研究が望まれる。本研究では、短腸症候群・完全静脈栄養モデルラットを用い、中枢神経の発育発達を見据えた新たな栄養管理方法の開発を目的とする。
ビラジカル項間交差を利用した重原子フリー増感剤の設計合成と光線力学治療への応用

本研究では、新しい低分子量光増感剤を開発し、癌の光線力学治療(PDT)への応用を目指す。医薬品の高組織移行性と低免疫原性を保つためには、分子量500以下であることが望ましい。PDTの光増感剤も低分子であることが望まれるが、既知の増感剤は分子量が比較的大きい。いっぽう、我々の固体室温燐光物質の研究により、電荷移動(CT)光励起で生成するビラジカルを利用すれば低分子でも増感作用に必要な励起三重項(T1)を効率的に生成できることがわかった。本研究では、ベンゼン環が単結合で共有結合してつながったビフェニル(BP)を骨格として、分子内CTを経由してT1を容易にする分子の探索を行い、両端にニトロ基とメトキシ基を持つビフェニルが一重項酸素生成に対する高い光増感能を持つことを明らかにしてきた。このように低分子量(229.2)の化合物が光増感能を持つことは稀であり、実用的なPDTの増感剤として開発する価値がある。本研究は、この新しい増感機構を検証し、癌選択性を付与することをさらなる目的とする。増感機構の検証においては、光物性測定と分子軌道計算により、分子内CTに続くBPのツイストによるスピン軌道結合が関与した項間交差が最有力であることを確かめた。また、癌においてグルコース輸送体の発現が亢進することを利用し、グルコース(Glc)などの糖が付加したビフェニル誘導体(分子量約410)の合成を行った。このGlc-BP複合体はHeLa細胞などの癌細胞に取り込まれ、PDT作用を示すこともわかった。今後、Glc-BPが体内グリコシダーゼで切断されないようにチオグリコシドの合成を行うとともに、リンカーの最適化についても検討する。本研究は、癌の光線力学治療(PDT)への応用を目指し、分子量500以下の新しい低分子量光増感剤の開発を行っている。前年度までに、分子量229のビフェニル誘導体(BP)が優れた増感能を示すこと、このBPが癌細胞取り込みとPDT作用を持つ事を明らかにしている。さらにBPにグルコースを付加したGlc-BPも同様の癌細胞取り込みとPDT作用を持つ事を明らかにしている。いっぽうで、BPの増感機構の検証も順調に進んだ。当初は、BPの2つのベンゼン環に分子内CTによるビラジカルが生じ、これがハイパーファイン相互作用により項間交差を起こし三重項を生じるメカニズムが考えられたが、この機構に特有と考えられる磁場効果が一切観測されないことなどから、2つのベンゼン環を架橋した化合物の増感作用などの検証を行い、分子内CTに続く、2つベンゼンπ軌道間のねじれとそれに伴うスピン軌道結合による新しい機構を提唱するに至った。新しい増感機構の提唱については当初計画以上の進展であり、また、BPのような小さな分子が実際に増感能を示し、癌細胞のPDT効果を明らかにしたことも、当初の計画通りであり、論文化することができた。さらに二光子励起により近赤外線で一重項酸素を生成することにも成功しており、結果的に世界最小の実用的増感剤開発に成功し、今後これを人工核酸に取り込むことにより、RNA編集へ応用するという道筋ができた。以上の進展は計画当初にないものである。「現在までの進捗状況」で記したように、当初の計画から研究の方向性に多少の変更が加えられ、ビフェニル(BP)誘導体の分子内CTに続くねじれに伴うスピン軌道結合による項間交差とその結果生じる三重項励起状態による光増感作用と光線力学治療法(PDT)の開発が目的となっている。癌細胞選択性は、グルコース輸送体を標的とし、グルコース(Glc)を光増感剤に付加させることで達成した。BPの励起に必要な光の波長は365 nmであり、組織深達性が低く、光毒性を示す可能性がある。そこで近赤外光の二光子励起による増感作用を検討しこれを確認した。今後は、これを利用し実用的なPDTを目指す。いっぽう、低分子増感剤は生体分子へ結合した際に生体分子の本来の機能を邪魔しにくい利点がある。これを応用し、BPを人工DNAに取り込み、塩基部位選択的にGをoxoGに変換するRNA編集を検討する。医薬品の高組織移行性と低免疫原性を保つためには、分子量500以下であることが望ましいとされている。PDTで用いる光増感剤も同様の分子量であることが望まれるが、これまでわかっている増感機構による分子設計では分子量が大きくなりがちであった。一方、我々の固体室温燐光物質の研究により、電荷移動(CT)光励起で生成するビラジカルを使えば低分子でも増感作用に必要な励起三重項(T1)を効率的に生成できることが明らかになっている。本研究では、ベンゼン環が単結合で共有結合してつながったターフェニルやビフェニルを骨格として、分子内でCTを起こすことによりT1を容易に生成できる分子の探索を行った。その結果、両端にニトロ基とメトキシ基を持つビフェニルがCT吸収を示すとともに、T1由来の過渡吸収も示し、さらに三重項酸素から一重項酸素を生成する光増感能を持つ事を明らかにした。この増感能は、同じく低分子量の増感剤であるベンゾフェノンより2倍以上大きいものであった。CT吸収については分子軌道計算でも裏付けられた。

このように低分子量(229.2)の化合物が光増感能を持つことは稀であり、実用的なPDTの増感剤として開発する価値がある。本研究では、この新しい増感機構を確かめるとともに、癌選択性を付与することをさらなる目的とする。現在、癌においてグルコース輸送体の発現が亢進することを利用し、グルコースが付加したビフェニル誘導体(分子量約410)の合成を検討している。この新しい増感剤の励起波長は360 nm付近であり、組織深達性が非常に低い波長の光となる。そこで、組織深達性が100倍以上大きい980 nmのレーザー照射で360 nmのアップコンバージョン発光を示すランタニドナノ粒子を併用することでこの問題の解決を図る。当初計画においては、ターフェニル化合物の合成を種々行い、これを増感剤としてランタニドナノ粒子の表面に修飾し、光線力学治療(PDT)効果を検証することが初年度の目的となっていた。実際は、ターフェニル化合物よりも低分子量で構造がシンプルなビフェニルの方がターフェニルより増感能が大きいことを見出したために、研究方針を変更した。すなわち、粒子径が200 nm程度ととてもサイズが大きいLNPに低分子量増感剤を修飾する方法は、「研究実績の概要」で解説したように、医療目的としては適切ではなく、LNPと低分子量増感剤を別に投与し、LNPの癌組織選択性と低分子量増感剤の癌細胞選択性をダブルに働かせて効率的に癌選択性を起こすことにした。したがって、LNPの癌織選択性研究と低分子量増感剤の癌細胞選択性を平行して行う計画となり、それぞれおおむね順調に進行している。当初の初年度計画には載せていなかったが、ビフェニル化合物の構造と分光学的特性、増感能、その他についての相関関連研究については予想以上に進展しており、ビラジカル機構によるT1生成メカニズムが確立しつつあり、新しい理論に基づく光増感剤開発に拍車がかかりつつある。本研究では、新しい低分子量光増感剤を開発し、癌の光線力学治療(PDT)への応用を目指す。医薬品の高組織移行性と低免疫原性を保つためには、分子量500以下であることが望ましい。PDTの光増感剤も低分子であることが望まれるが、既知の増感剤は分子量が比較的大きい。いっぽう、我々の固体室温燐光物質の研究により、電荷移動(CT)光励起で生成するビラジカルを利用すれば低分子でも増感作用に必要な励起三重項(T1)を効率的に生成できることがわかった。本研究では、ベンゼン環が単結合で共有結合してつながったターフェニルやビフェニル(BP)を骨格として、分子内CTを経由してT1を容易にする分子の探索を行い、両端にニトロ基とメトキシ基を持つビフェニルが一重項酸素生成に対する高い光増感能を持つことを前年度までに明らかにした。本研究は、この新しい増感機構を検証し、癌選択性を付与することをさらなる目的とする。増感機構の検証においては、光物性測定と分子軌道計算により、分子内CTに続くBPのツイストによるスピン軌道結合が関与した項間交差が最有力であることを確かめた。また、癌においてグルコース輸送体の発現が亢進することを利用し、グルコース(Glc)などの糖が付加したビフェニル誘導体(分子量約410)の合成を行った。このGlc-BP複合体はHeLa細胞などの癌細胞に取り込まれ、PDT作用を示すこともわかった。しかし、Glcを付加していないBPも同様の作用を示した。
共焦点レーザー走査顕微鏡を応用した細動脈の動脈硬化病変の診断・治療システムの開発

本研究は、1)動脈硬化病変を確認し、2)細胞レベルで選択的に病変を破壊し、3)病変除去後の血管内腔面に、細胞外マトリックス、あるいは内皮細胞を接着させて、血管を再構築させる治療法を開発することを目的として計画された.1)において、自動蛍光波長による構築物質の判別は、特にコラーゲンとエラスチンの判別について、精度不足であり実用化にはいたらなかった。光感受性物質投与による病変の認識については、光感受性物質として、塩酸ドキシサイクリン(DOXY)が適していること、動脈硬化病変の泡沫化細胞に選択的に取り込まれ、検出可能であることが明らかとなった.2)においては、DOXY投与後にNd:YAGレーザーの照射により、選択的に内膜細胞が破壊され、動脈硬化病変が退縮することが判明した.3)においては、レーザー蒸散後の血管内面でも、タイプ1コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを接着されることが可能で、内皮細胞の良好な増殖が得られることが明らかとなった.本研究は、1)動脈硬化病変を確認し、2)細胞レベルで選択的に病変を破壊し、3)病変除去後の血管内腔面に、細胞外マトリックス、あるいは内皮細胞を接着させて、血管を再構築させる治療法を開発することを目的として計画された.1)において、自動蛍光波長による構築物質の判別は、特にコラーゲンとエラスチンの判別について、精度不足であり実用化にはいたらなかった。光感受性物質投与による病変の認識については、光感受性物質として、塩酸ドキシサイクリン(DOXY)が適していること、動脈硬化病変の泡沫化細胞に選択的に取り込まれ、検出可能であることが明らかとなった.2)においては、DOXY投与後にNd:YAGレーザーの照射により、選択的に内膜細胞が破壊され、動脈硬化病変が退縮することが判明した.3)においては、レーザー蒸散後の血管内面でも、タイプ1コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを接着されることが可能で、内皮細胞の良好な増殖が得られることが明らかとなった.動脈硬化の構築・細胞の認識を血管内腔面から、内膜肥厚部位の観察し、紫外領域のレーザーを照射することで得られる物質の自動蛍光をとらえ、膠原線維・弾性線維あるいは粥状物質を判別して認識する事を試みた。各組織の波長解析により各構成成分を明らかに認識判別するためには、更に今後の画像処理装置の改良が必要である。光感受性物質を投与しての内膜肥厚部位の観察は、各成分の光感受性物質の保持力の相違を利用し、構成各細胞の認識を試みる訳であるが、各細胞の感受性物質保持時間には明らかな相違を認めるに至らず、現在光感受性物質投与量・投与方法等の再検討を行っているところである。動脈硬化の構築構造の認識は、共焦点レーザー走査顕微鏡によって得られる一定深度での連続的画像をコンピューターにて高速画像処理し、3次元的構築を試みた。しかし、現在使用している画像処理装置では画像処理にかなりの時間を要する事、また構築された画像が微細な構造を表現不可能な事から、更なる装置の改良が必要と考える。レーザーにて蒸散された血管内腔の再構築についての実験は、各細胞外マトリックスで蒸散部位を被覆し、内皮細胞を接着させる事を目的としているが、マニュピュレーターでのマトリックスの被覆を均一に行うことに苦慮しており、現在装置の改良を考慮中である。本年度の研究成果は上記の通りである。自動蛍光による動脈硬化構築物質の認識について、既存の紫外領域のレーザー装置を用い、構成物質から得られる自動蛍光波長の解析を行っている。コラーゲンのタイプ判別や、内膜肥厚部と中膜の弾性線維の判別など、微細な精度を要するものについては、蛍光波長解析装置の高精度化が必要である。光感受性物質投与による内膜肥厚部の細胞成分の認識について、その投与方法と投与量について検討してきた。病変部位一般には一定の傾向がみられるものの、動脈硬化の進行度や生体内の環境による固体差があり、今後はこれらを総括し条件をそろえてゆく必要があると考えられる。これらを共焦点走査顕微鏡にて画像解析し、動脈硬化病変の立体画像を構築する試みについては、画像処理装置の性能に問題があったが、最近の高性能な製品の入手により実現できると考えている。現在は立体画像の構成要素である連続断層像の高精度化(蛍光波長解析および細胞成分の構築をより正確に捉えること)が肝要であると思われる。またレーザーによる動脈硬化病変への細胞単位での破壊と、蒸散面の血管再構築の実験では、病変部位の構造の正確な把握と、マイクロマニュピレーターによる蒸散面への細胞外マトリックス付着操作が問題点である。前者については画像解析装置を、後者についてはマニュピレーター装置の改善を試み、高成功率と安定性を目標にして実験を行ってゆく。
真菌ワクチンが誘導する肺常在性記憶型T細胞は感染制御に寄与するか？

本研究では、病原性真菌Cryptococcus gattiiに対する感染制御機構を解明する目的で、樹状細胞(DC)ワクチンを独自に開発し、その作用機序を解析した。DCワクチンは、長寿命性の肺常在性記憶型Th17細胞“Lung TRM17"を誘導し、感染後の肺内菌数や生存率を有意に改善することが明らかになった。この感染制御効果は、肺内のIL-17Aの産生を伴い、FTY720投薬下でも同様に観察されたが、IL-17A欠損マウスではDCワクチン投与群でも感染後の好中球集積が乏しく、感染制御効果は有意に減弱した。これらの結果は、Lung TRM17が本菌の感染制御に必要であることを示唆している。病原性真菌Cryptococcusgattiiによるクリプトコックス症は、近年北米を中心に集団感染が報告され、非免疫不全者の死亡例も報告されている。北米流行型C.gattiiは、感染時に殆ど免疫応答を誘導しないために感染後に得られる情報が少なく、感染制御機構は不明であった。本研究では、本菌に対する感染制御機構を明らかにする目的で、樹状細胞(DC)ワクチンを開発し、その感染制御効果と作用機序を検討した。DCワクチン投与群では感染後の臓器内菌数や生存率は有意に改善した。DCワクチン投与群の肺では、IFNγ, IL-17A, TNFαの産生が有意に増加し、病理解析の結果、菌体を封入する多核巨細胞の形成も認めた(Ueno et al., InfectImmun, 2015, Ueno et al., Meth in Mol Biol, 2016,in press)。その後の解析で、サイトカイン産生を伴う感染制御効果は、DCワクチン投与2-7ヶ月経過後に感染させた場合も同様に観察され、この感染制御効果の持続性は、感染前の肺で長期間観察される組織常在性CD4+記憶型T細胞(Lung CD4 TRM)の増加と相関しているように見えた。Lung CD4 TRMは、近年特定された新規サブセットであり、生理学的機能は十分に理解されていない。2015年度は、Lung CD4 TRMの特徴的なマーカープロファイル/サイトカイン産生性を明らかにし、分化制御・長期維持を理解する上で重要な知見を得た。また、末梢循環型T細胞を枯渇させる免疫抑制剤FTY720の投与では、Lung CD4 TRMは減少しないことが示され、DCワクチンによる感染制御効果もFTY720の投薬では減弱しないことも明らかになった。この結果は、Lung CD4 TRMが感染制御に関与することを示唆している。(1) Lung CD4 TRMに発現する特徴的な核内因子・転写調節因子・ケモカイン受容体・サイトカイン受容体・共刺激因子を明らかにし、分化制御・長期維持を理解する上で重要な知見を得た。(2) DCワクチンによる感染制御効果が、免疫抑制剤FTY720の投与で減弱しなかったことから、Lung CD4 TRMが感染制御効果に関与することが推察された。以上の結果から、Lung CD4 TRMの分化制御機構や感染応答機構が明らかになりつつあり、解析は順調に進行していると判断した。高度病原性真菌Cryptococcus gattiiは、クリプトコックス症の原因菌である。本菌に対する生体防御機構は十分に理解されていない。本研究では、本菌に対する感染制御機構を解明する目的で、樹状細胞(DC)ワクチンを独自に開発し、その感染制御効果と作用機序を解析した。マウス骨髄由来のDCにC. gattii莢膜欠損株の熱処理死菌を取り込ませてDCワクチンとし、感染前に14日間隔でマウスに2回静脈内投与した。次いでこのマウスに北米流行株R265を経気道感染させ、感染マウスの生存率や臓器内菌数を評価した。感染前後にける各種白血球のプロファイルは、フローサイトメトリーにて解析した。移入したDCは肺に集積し、肺常在性記憶型Th17細胞(Lung TRM17)を誘導した。Lung TRM17は免疫抑制剤FTY720で枯渇しない血管内染色陰性の集団であり、抗原再刺激に応答してIL-17Aを産生した。DCワクチン投与群では感染後の肺内菌数や生存率は有意に改善し、肺内におけるIL-17A産生も有意に増加した。この感染制御効果には持続性があり、Lung TRM17の長期維持と相関していた。さらに、FTY720投薬下でもDCワクチンによる感染制御効果は同様に観察されたが、IL-17A欠損マウスではその効果は有意に減弱した。感染7日目において、野生型マウスではDCワクチンの投与により好中球の有意な増加を認め、感染14日目の肺病理像では、菌体増殖を抑制するような多核巨細胞の形成が観察された。IL-17A欠損マウスでは、DCワクチンによる好中球の増加を認めなかった。性状解析の結果は、Lung TRM17が新規記憶型T細胞であることを示唆している。また感染実験の結果は、高病原性肺クリプトコックス症の感染制御にLung TRM17が寄与することを示唆している。

DCワクチンは、長寿命性の肺常在性記憶型Th17細胞“Lung TRM17"を誘導し、感染後の肺内菌数や生存率を有意に改善することが明らかになった。この感染制御効果は、肺内のIL-17Aの産生を伴い、FTY720投薬下でも同様に観察されたが、IL-17A欠損マウスではDCワクチン投与群でも感染後の好中球集積が乏しく、感染制御効果は有意に減弱した。これらの結果は、Lung TRM17が本菌の感染制御に必要であることを示唆している。(1) Lung CD4 TRMは再感染に応答してどのような働きをするのか?これを明らかにする目的で、感染後の肺に集積する白血球集団・多核巨細胞形成を評価する。これまでの解析から、DCワクチンの効果が消失するKOマウスも明らかになったことから、そのKOマウスをコントロールとして解析を進める。(2) LungCD4 TRMの長期維持は、抗原非存在下における恒常性増殖(homeostatic proliferation)に支えられているのか?それともアポトーシス抑制や別の機序に支えられているのか?これを明らかにする目的で、いくつかのアプローチを組み合わせて解析を進める。特に、恒常性増殖については、ワクチン投与2ヶ月経過した個体にEdUを連日投与しLung CD4 TRMにEdUが取り込まれるかを検証する。感染免疫学下記3点の理由から、次年度使用額が生じた;(1)謝金の支出が無かったこと、(2)前年度から持越した試薬や実験器具などで消耗品やその他経費の支出が抑えられたこと、(3)論文掲載料・英文校閲などの雑費が無かったこと。研究の進展に伴い、消耗品や謝金の使用が2015年度分よりも多くなる可能性がある。実験補助に対する謝金の支出や消耗品(実験動物,抗体,汎用試薬,汎用器具)に充当する。
D-アミノ酸を含むペプチドの生体内動態に関する研究

DADLEのD-ロイシン残基4,5位を三重水素標識した標識体,[^3H-D-Leu^5]DADLEをラットに静脈内投与しDADLEおよびそのC末端側フラグメントの血中濃度時間推移を求め,DADLEのラットにおける代謝様式を明らかにした.DADLEはTyr-D-Ala,Gly-Phe,Phe-D-Leu結合の順に切断され分解した.さらにD-[^3H]ロイシン由来の揮発性化合物に代謝されることが示唆された.2.安定同位体トレーサー法によるD-ロイシンのラットにおれう生態内動態研究法の開発(1)GC-MSによるDL-ロイシンの分別定量法の開発DL-ロイシンのCOOH基をメチルエステルとしたのち,NH_2基を種々な光学活性カルボン酸を用いアミド化し,得られたジアステレオマ-アミドをGC-MS分析した.その結果,アミド化剤として(-)-α-メトキシ-α-トリフルオロメチルフェニル酢酸を用いることにより,GCにおいてD-およびL-ロイシン由来のアミドはベースライン分離した.さらにCI-MSにおいてそれぞれの分子イオンピークが基準ピークとして検出された.(2)D-ロイシンの^<13>Cおよび重水素標識体の合成ヨードメタンおよびマロン酸の^<13>C標識体および重水素標識体からD-[4,5,5′-^<13>C_3]ロイシン,D-[4-^<13>C,^2H]ロイシンおよびD-[5,5′-^2H_6]ロイシンを合成することを目的として,非標識体を用い合成ルートの確立を試みた.その結果,9工程でD-ロイシンを合成したが,全収率が数%であった.現在,収率向上を目指し,キラル素子を用いた不斉合成法によるD-ロイシンの合成を試みている.DADLEのD-ロイシン残基4,5位を三重水素標識した標識体,[^3H-D-Leu^5]DADLEをラットに静脈内投与しDADLEおよびそのC末端側フラグメントの血中濃度時間推移を求め,DADLEのラットにおける代謝様式を明らかにした.DADLEはTyr-D-Ala,Gly-Phe,Phe-D-Leu結合の順に切断され分解した.さらにD-[^3H]ロイシン由来の揮発性化合物に代謝されることが示唆された.2.安定同位体トレーサー法によるD-ロイシンのラットにおれう生態内動態研究法の開発(1)GC-MSによるDL-ロイシンの分別定量法の開発DL-ロイシンのCOOH基をメチルエステルとしたのち,NH_2基を種々な光学活性カルボン酸を用いアミド化し,得られたジアステレオマ-アミドをGC-MS分析した.その結果,アミド化剤として(-)-α-メトキシ-α-トリフルオロメチルフェニル酢酸を用いることにより,GCにおいてD-およびL-ロイシン由来のアミドはベースライン分離した.さらにCI-MSにおいてそれぞれの分子イオンピークが基準ピークとして検出された.(2)D-ロイシンの^<13>Cおよび重水素標識体の合成ヨードメタンおよびマロン酸の^<13>C標識体および重水素標識体からD-[4,5,5′-^<13>C_3]ロイシン,D-[4-^<13>C,^2H]ロイシンおよびD-[5,5′-^2H_6]ロイシンを合成することを目的として,非標識体を用い合成ルートの確立を試みた.その結果,9工程でD-ロイシンを合成したが,全収率が数%であった.現在,収率向上を目指し,キラル素子を用いた不斉合成法によるD-ロイシンの合成を試みている.