hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重篤な遺伝病に対する周産期遺伝子治療

ArylsulfataseA(ASA)の遺伝的欠損症である異染性白質ジストロフィー(MLD)はスルファチドが神経系細胞に蓄積し脱髄をきたす重篤な遺伝性神経疾患である。通常の酵素補充療法は、脳血液関門(BBB)のため神経症状の改善には効果がない。BBBの幼若性を期待して新生児期のMLDモデルマウスへのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの全身投与を行った。ベクター及びASAタンパク質は肝臓や筋肉だけでなくBBBを越えて脳や脊髄でも検出された。又、ASAに対する免疫寛容が誘導され、ASAが長期間血中に分泌されていた。18ヶ月後の治療マウスは未治療マウスと比較して運動機能が著明に改善していた。脳や脊髄ではASAタンパク質の持続発現とサルファチドの減少が確認された。TNALP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)の欠損症である低フォスファターゼ症(HPP)は骨形成不全、成長障害、痙攣発作を主症状とする遺伝性骨系統疾患である。我々は、これまでにハイドロキシアパタイトに親和性をもつ酸性アミノ酸を付加した骨親和性TNALP(TNALP-D10)を発現するレンチウイルスベクター或いはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを新生児期のHPPモデルマウスに静注することで臨床症状の改善と救命が可能であることを報告している。本研究では最も重篤な致死性周産期型HPPの治療法としての胎児遺伝子治療の有効性と安全性を検討した。TNALP-D10発現AAVベクターを妊娠15日目のマウス胎児の腹腔内に注射した。治療後、自然分娩で娩出したHPPマウスでは痙攣は完全に抑制され、骨の形成、体重増加も改善し著明な延命効果が確認できた。血中ALP活性は持続的に高値であった。技術的に困難な新生児への遺伝子導入法を確立し、劇的な治療効果が確認できた。AAVベクターの全身投与は最近、ヒトの血友病の遺伝子治療でも使われており実用的な手技となっている。HPPの新生児遺伝子治療の実用化を急ぎたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。HPPの新生時遺伝子治療の動物実験に成功した。重篤なHPPは胎児期に発見されることも多く、胎児治療が重要な選択肢となる。現在、HPPモデルマウスの胎児遺伝子治療の可能性を検討している。更に、新生児未熟児医療を担当している小児科医や患者家族とも協力して倫理的問題も考慮した周産期治療体制の構築を進めていきたい。
遺伝子異常に基づいた新しい神経膠腫の分類と臨床像

(1)神経膠腫における遺伝子異常と生命予後本研究においては,まず第10染色体に遺伝子座をもつ,Ret,PTEN,Mxi,FGFR2,DMBT1遺伝子に注目した。それらに加えてp53遺伝子やp16遺伝子の異常と,glioblastomaの臨床的悪性度との関連について解析した.その結果,glioblastomaの生命予後に悪影響を与えているのは,p53遺伝子が正常であることと,FGFR2遺伝子が欠失していることであった.他施設からの報告では,PTEN遺伝子異常は予後不良因子であるとの報告がみられるが,我々の解析では生命予後の有意差はみられなかった.また,PTEN遺伝子異常は,p53遺伝子正常群,異常群に同じ頻度で検出され,p53遺伝子異常とPTEN遺伝子異常は独立した予後規定因子であると考えられた.(2)神経膠腫組織におけるSV40 virusの検出高齢者のglioblastomaの組織の解析では,PCRをもちいてSV40ウィルスゲノムの一部を検出するとともに,in situ hybridizationによりウィルスRNAを検出した.免疫組織学的にT抗原を検出することは困難であった.このことより,glioblastomaの組織中には,T抗原を短時間に不活化する機構が存在するか,あるいは,T抗原の発現を必要とせずにウィルスが生存しうる環境が存在することが考えられた.今回,glioblastoma組織よりSV40 virus RNAを検出したことは,ウィルス感染が発癌過程に関与している可能性を強く支持するものであった.glioblastomaの遺伝子異常が詳細に解明されるにともなって,遺伝子型に基づいた分類が少しづつ可能となってきている.遺伝子型に基づいた分類は,より腫瘍の細胞生物学的特性を反映することができるものと思われる.(1)神経膠腫における遺伝子異常と生命予後本研究においては,まず第10染色体に遺伝子座をもつ,Ret,PTEN,Mxi,FGFR2,DMBT1遺伝子に注目した。それらに加えてp53遺伝子やp16遺伝子の異常と,glioblastomaの臨床的悪性度との関連について解析した.その結果,glioblastomaの生命予後に悪影響を与えているのは,p53遺伝子が正常であることと,FGFR2遺伝子が欠失していることであった.他施設からの報告では,PTEN遺伝子異常は予後不良因子であるとの報告がみられるが,我々の解析では生命予後の有意差はみられなかった.また,PTEN遺伝子異常は,p53遺伝子正常群,異常群に同じ頻度で検出され,p53遺伝子異常とPTEN遺伝子異常は独立した予後規定因子であると考えられた.(2)神経膠腫組織におけるSV40 virusの検出高齢者のglioblastomaの組織の解析では,PCRをもちいてSV40ウィルスゲノムの一部を検出するとともに,in situ hybridizationによりウィルスRNAを検出した.免疫組織学的にT抗原を検出することは困難であった.このことより,glioblastomaの組織中には,T抗原を短時間に不活化する機構が存在するか,あるいは,T抗原の発現を必要とせずにウィルスが生存しうる環境が存在することが考えられた.今回,glioblastoma組織よりSV40 virus RNAを検出したことは,ウィルス感染が発癌過程に関与している可能性を強く支持するものであった.glioblastomaの遺伝子異常が詳細に解明されるにともなって,遺伝子型に基づいた分類が少しづつ可能となってきている.遺伝子型に基づいた分類は,より腫瘍の細胞生物学的特性を反映することができるものと思われる.49例のglioblastoma(GBM)を対象とし、p53遺伝子(17p13.1)、p16遺伝子(9p21)、第10染色体長腕上のPTEN、Mxiー1、FGFR2遺伝子について、遺伝子異常の有無を解析し、また遺伝子発現を免疫組織学的に解析した。同時に各症例の形態学的特徴、細胞生物学的特徴、臨床的特徴と比較した。GBMには、p53遺伝子の異常が発がん早期から関与するprogression typeと、p53遺伝子の異常が関与しないde novo typeとが存在する。我々が経験した49例のGBMの解析では、progression type GBMは、de novo GBMに比較して、発症年齢が比較的若いこと、生存期間がやや長いことなどが判明した。つまり、de novo GBMでは、p53遺伝子以外の、より悪性の遺伝子異常が関わっていると考えられた。bFGFは、一般にヒト神経膠腫で発現が増加している強力な血管新生因子の一つで、そのレセプターにはFGFRー1、2、3、4が存在する。FGFR1/flg遺伝子は神経膠腫の悪性化とともに発現が増強するが、逆にFGFR2/bek(10q25)遺伝子の発現は低下する。de novo type glioblastomaでは、15/49において発現の低下が認められ、4/11にLOHが検出された。FGFRー2の発現が低下している症例の臨床経過は、FGFRー2の発現している症例と比較して、有意差を以て不良であることが判明した。FGFR-2の発現の低下やLOHを認める15例の内訳は、p53遺伝子の異常を伴う31例中10例、p53遺伝子が正常である17例中5例であった。FGFR-2の異常は、p53遺伝子異常とは無関係に同じ頻度で起こっていると考えられた。つまり、progression type、de novo typeの双方の発生に関与するものと考えMxiー1られた。Mxiー1遺伝子はMyc、Maxの阻害因子として細胞増殖を負に調節すると考えられている。

15/49例のGBMにおいて、Mxi-1遺伝子の発現の欠失を認め、3/11にLOHが検出された。Mxi-1遺伝子の発現の低下している15例は、p53遺伝子の異常を伴う31例中8例、p53遺伝子が正常である17例中7例であった。Mxiー1遺伝子の異常は、de novo GBMにやや多く検出され、Mxiー1遺伝子異常はde novo GBMの原因遺伝子の一つであることが示唆された。しかし、Mxiー1遺伝子の発現が欠失している症例の臨床経過は、そうでない症例と有意差は見られなかった。p16遺伝子の異常は38/49のGBMにおいて検出されたが、症例の臨床経過は、p16遺伝子の異常の有無では有意差は見られなかった。しかし、p16遺伝子の異常群ではMIB-1陽性率はやや低い傾向が見られた。p16遺伝子が正常のGBMでは、Rb遺伝子の異常やCDK4遺伝子、MDM2遺伝子の増幅を見ることが多く、それらは細胞周期により直接的に関与しているのではないかと考えられた。今後は、CGH法やFISH法を用いて、これらの遺伝子異常をより敏速、且つ簡便に検出する方法を確立してゆく必要があると考えられた。(1)神経膠腫における遺伝子異常と生命予後本研究においては,まず第10染色体に遺伝子座をもつ,Ret,PTEN,Mxi,FGFR2,DMBT1遺伝子に注目し,それらに加えてp53遺伝子やp16遺伝子の異常と,glioblastomaの臨床的悪性度との関連について解析した.その結果,glioblastomaの生命予後に悪影響を与えているのは,p53遺伝子が正常であることと,FGFR2遺伝子が欠失していることであった.他施設からの報告では,PTEN遺伝子異常は予後不良因子であるとの報告がみられるが,我々の解析では生命予後の有意差はみられなかった.また,PTEN遺伝子異常は,p53遺伝子正常群,異常群に同じ頻度で検出され,p53遺伝子異常とPTEN遺伝子異常は独立した予後規定因子であると考えられた.(2)神経膠腫組織におけるSV40 virusの検出高齢者のglioblastomaの組織の解析では,PCRをもちいてSV40ウィルスゲノムの一部を検出するとともに,in situ hybridizationによりウィルスRNAを検出した.免疫組織学的にT抗原を検出することは困難であった.このことより,glioblastomaの組織中には,T抗原を短時間に不活化する機構が存在するか,あるいは,T抗原の発現を必要とせずにウィルスが生存しうる環境が存在することが考えられた.今回,glioblastoma組織よりSV40 virus RNAを検出したことは,ウィルス感染が発癌過程に関与している可能性を強く支持するものであった.glioblastomaの遺伝子異常が詳細に解明されるにともなって,遺伝子型に基づいた分類が少しづつ可能となってきている.遺伝子型に基づいた分類は,より腫瘍の細胞生物学的特性を反映することができるものと思われる.
発話中のポーズと呼吸・嚥下の関係の音響的・生理的解析

発話中のポーズにおける呼吸や嚥下の特徴を明らかにするために、日本語話者10名の読み上げ発話と自発発話について、音声信号および呼吸・嚥下に伴う身体運動信号を同時収録し、それぞれの信号の特徴や相互の関連を解析した。その結果、発話中の嚥下間隔はすでに報告のある黙読時の嚥下間隔に比べて短いこと、水などの嚥下では嚥下後に呼気が続くのが基本的であると報告されているが発話中の嚥下では吸気が続くのが特徴的であること、読み上げ発話では基本的に文末ポーズで嚥下が起こるが自発発話では文中ポーズでも起こること、そして、話の展開がある発話では話題の転換点で嚥下が起こる割合が大きいことなど、多くの新しい知見が得られた。本研究の目的は、発話中のポーズ挿入に、呼吸や嚥下という生理的要因がどのように関与しているかを、音響的・生理的な解析を通して明らかにすることである。初年度である本年度は、データ収録・解析の準備として以下を実施した。(1)吸気・嚥下の予備観測を行った。データ収録で使用を予定しているテキスト「北風と太陽」(8文、283音節からなるパラグラフ)を話者1名が複数回読み上げ、吸気は音響分析により、嚥下は話者の報告により記録し、ポーズとの関連を調べた。その結果、吸気は文末に加えて文中の顕著な韻律境界でも起こりやすいこと、また嚥下はパラグラフ内の話題が展開する前の文末で起こりやすいことなどが明らかになった。(2)吸気・嚥下の予備観測の結果にもとづき、発話テキストの文数や文長を再検討し、話者が吸気・嚥下を無理なく、かつ効果的に挿入できるようなテキストに改定した。(3)音声・嚥下音・呼吸の3種類の信号を同時検出するためのデータ収録システムの立ち上げの準備を行った。特に、呼吸信号の検出に用いる圧電素子付きの胸部・腹部ベルトについて、感度や比例性が最も良くなる装着の仕方や位置などの検討を行った。データ収録・解析の諸準備(吸気・嚥下の予備観測、発話テキストの改良、データ収録システムの立ち上げの準備)に、予定した以上に時間を要し、計画していたデータ収録および解析の一部が次年度に繰り越された。昨年度(初年度)は、データ収録・解析の諸準備に予定以上の時間を要したため、計画していたデータ収録および解析の一部を実施することができなかったが、2年目の本年度は、データ収録を完了し、解析を進めることができた。データ収録は、学内公募に応募した学部生および院生を話者として実施した。3種類の発話スタイル(リストの読み上げ、短いパラグラフの読み上げ、自発発話)について、音声信号・嚥下の音響信号、および呼吸に伴う身体運動信号を同時に収録した上で、音声・嚥下音・呼吸のそれぞれの信号について解析を行った。その結果、(1)嚥下に関しては、ポーズ区間の中程で起こり、吸気が続き、その後で次の発話が始まるというパタンが多いこと、(2)呼吸に関しては、読み上げ発話の吸気は比較的規則的であるのに対して自発発話では規則性が低くなることや、嚥下の後の吸気は大きくなる傾向があること、などの基礎的な知見が得られた。また、(3)嚥下が含まれるポーズは、そうでないポーズに比べて1秒前後長く、パラグラフの読み上げにおいては、話の内容・構成に即した小分割(サブパラグラフ)の後に挿入されることが多いことも明らかになった。データ収録は予定どおり実施でき、十分な発話データを得ることができたが、収録の準備(特に呼吸信号収録用センサーの調整)に時間を要したため、本年度に計画されていた解析の一部が次年度に繰り越された。最終年度である本年度は、ポーズ挿入における言語的な要因(文法や発話の内容など)と生理的な要因(呼吸および嚥下)の関わり合いや制御に関する包括的な考察を目指して解析を行った。具体的には、日本語話者10名のデータをもとに、3種類の連続発話(リストの読み上げ、短いパラグラフの読み上げ、自発発話)を比較しながら、ポーズの時間長・挿入箇所、嚥下および吸気のタイミングなどについて詳細に解析した。複数の文が連なる連続発話では、呼吸や嚥下という生理的な制約が重要な要素となる。このうち呼吸については多くの研究がなされているが、嚥下については、医療的な観点からの研究は多いものの、発話との関連でその特徴を体系的に明らかにした研究報告は今のところ見当たらない。本研究では、連続発話における嚥下に関して、いくつかの新しい知見を得ることができた。

特に、リストの読み上げと自発発話(どちらも、あらかじめ設定されたパラグラフ構造を持たないため、嚥下箇所に関する制約が小さいという共通点をもつ)における嚥下を比較した場合、例えば、平均的な嚥下間隔はリストの読み上げでは約40秒であるのに対して自発発話では約50秒と、自発発話の方が間隔が広くなることや、嚥下間隔の話者間のばらつきも自発発話の方が大きいなどの点が明らかになった。また、リストの読み上げにおける嚥下箇所は100%が文間(2文の間)であるのに対して、自発発話では25%が文中(主部と述部の間など)であることも明らかになった。現在、これらの知見を含めこれまでに得られた結果および考察をまとめて、成果報告書を準備中である。発話中のポーズにおける呼吸や嚥下の特徴を明らかにするために、日本語話者10名の読み上げ発話と自発発話について、音声信号および呼吸・嚥下に伴う身体運動信号を同時収録し、それぞれの信号の特徴や相互の関連を解析した。その結果、発話中の嚥下間隔はすでに報告のある黙読時の嚥下間隔に比べて短いこと、水などの嚥下では嚥下後に呼気が続くのが基本的であると報告されているが発話中の嚥下では吸気が続くのが特徴的であること、読み上げ発話では基本的に文末ポーズで嚥下が起こるが自発発話では文中ポーズでも起こること、そして、話の展開がある発話では話題の転換点で嚥下が起こる割合が大きいことなど、多くの新しい知見が得られた。初年度の予備調査で明らかになった点に留意しながらデータ収録を行い、続けてデータ解析を行う。データ収録は、5名前後の日本語母語話者の「読み上げ発話」および「自発発話」について行い、発話中の音声信号・嚥下の音響信号、および呼吸に伴う身体運動信号を同時に収録する。データ解析は、「読み上げ発話」および「自発発話」のそれぞれについて行う。音声に関しては、音声区間の時間長やポーズの時間長・挿入箇所など、嚥下に関しては、嚥下のタイミング、および音声・ポーズ・吸気との関係など、呼吸に関しては、吸気のタイミング、および音声・嚥下とポーズとの関係などについて、相互に解析を行う。その上で、結果を発話の文法的・意味的な構造に照らして考察する。なお、「読み上げ発話」と「自発発話」に関する結果の比較や、言語的要因(文法、意味など)と生理的要因(呼吸および嚥下)の統合的な制御についての考察は、最終年度に行う予定である。「読み上げ発話」および「自発発話」のそれぞれについて詳細な解析を行う。音声に関しては、音声区間の時間長やポーズの時間長・挿入箇所など、嚥下に関しては、嚥下のタイミング、および音声・ポーズ・吸気との関係など、呼吸に関しては、吸気のタイミング、および音声・嚥下とポーズとの関係などについて相互に解析を行い、結果を発話の文法的・意味的な構造に照らして考察する。さらに、「読み上げ発話」および「自発発話」について得られた音声・呼吸・嚥下の解析結果を比較し、共通点と相違点を明らかにした後、ポーズ挿入に際して、言語的要因(文法および意味など)と生理的要因(呼吸および嚥下)がどのように統合的に制御されるのかについて、包括的な考察を行う。音声言語科学データ収録および解析の一部ができなかったため、話者への謝金やデータ整理のための人件費の支出がなかった。消耗品購入のために、念のため残しておいたが、さしあたって購入の必要がなかった。前年度未使用額は、話者への謝金およびデータ整理のための人件費として支出する。次年度の研究費は、研究実施計画に従って、研究打ち合わせ、国際会議での発表、資料整理のための人件費等として支出する予定である。本年度未使用額は、次年度の消耗品費として支出する。
暗示的なトポロジー記述をベースとする地理情報システムの構造に関する研究

本研究では、暗示的なトポロジー記述をベースとする地理情報システム(GIS)に関して研究を行った。暗示的なトポロジー記述によるGISは、(1)時空間管理に適している、(2)差分ファイルによるデータ更新が容易である、(3)分散配置された地図データを融合して空間演算を行うことが容易である、などの特徴を持つ方式である。平成12年度は、暗示的なトポロジー記述によるGISに関する基礎研究を行った。その成果を元に、STIMS(Spatio-Temporal Information Management System)と名づけたソフトウエアのプロトタイプを構築し、埼玉大学のWeb上でフリーソフトとして公開した。平成13年度は、トポロジー暗示型の欠点である処理速度向上に関する研究を行った。空間演算により、一度復元したトポロジー情報をキャッシュしておくことにより、次にそのトポロジー情報が必要になった際に高速に利用できる方式に関して研究を行った。また、STIMSに関してはシステムのコンポーネント化を進め、Delphiを用いて独自のGISシステムを容易に構築可能とした。平成14年度は、(株)電源開発、(株)昭文社、(株)明電舎の協力を得て、各種自治体業務にSTIMSを適用し、トポロジー暗示型GISが実用に耐えることを実証した。また、ディジタルフォトアルバムなどの家庭応用アプリケーションも開発し、それらをフリーソフトとして公開した。地理情報システム(GIS)においては、図形の位置形状とともに図形同士の相互関係の情報、即ちトポロジー情報が重要である。従来のGISでは、このトポロジーをデータとして記述・管理する方式が主流であった。しかし、過去の世界にさかのぼっての検索のように時間管理を行う際や、分散配置される地理情報を融合して利用する場合などにおいて、トポロジー記述が極めて複雑になったり、記述困難になる状況が生じる。本研究では、このトポロジーをデータとしてではなく、定義の形で記述し、必要に応じてトポロジーを算出する方式、トポロジー暗示方式をベースとする地理情報システムについて研究を行っている。初年度は、以下の各テーマについて研究を行った。(1)明示的なトポロジー記述モデルから、演算により復元可能なもの,およびその際に最低限必要な付加情報について整理することにより、本研究全体を通じて使用するデータフォーマットを制定した。(2)空間データ管理構造として、現在多次元データ管理に広く用いられているR木や、申請者が以前に開発したGBD木を用いて、トポロジーの高効率復元アルゴリズムを実現した。(3)地理的なトランザクション管理のための構造、分散環境における差分ファイルの提供方式、差分ファイルとデータベースとを併用する空間演算に関する基本方式を確立した。(4)空間演算の際に一度復元したトポロジー情報を次の利用の際に再利用する方式、いわばトポロジー情報のキャッシュの為の方式を構築し、実験を通じて約10倍の演算速度向上が達成できることを確認した。本研究ではSTIMSと名づけた時空間情報管理システムを開発している。本年度は昨年度の研究成果を冊子にとりまとめ、6月に発表会を開催しWeb上でシステムを公開した。また、本年度はSTIMSの機能の拡張と性能向上について研究をおこなった。STIMSは、(1)時空間データ管理を行い得るシステム、(2)良好な操作性の提供、(3)公開型データ構造の採用、(4)フリーソフトとしての配布、を目指して、本研究の初年度(平成12年度)から開発を行ってきたシステムである。(3)としてはSTIM-DFと呼ぶフォーマットを策定し、公開している。上記を実現するために、「トポロジー暗示方式」を採用している。トポロジー暗示方式とは、トポロジーを定義とその復元のための手続きで持つ方式であり、これにより(1)定義の変更で自由な主題を設定できる、(2)異種地図データの融合が容易、(3)時間管理を単純化できる、などの利点が生じる。今年度は以下の各点に重点を置き研究を行った。1.空間管理と基礎的な時空間解析機能の充実:昨年度の最短経路探査に加えて、Voronoiダイアグラム、バッファ機能の実現、文字表示、マルチメディアオブジェクト管理・表示などの機能を追加した。2.DDI研究所で開発されたJaMaPSをクライアントとして、WebGISを実現した:

昨年実現したSTIMSはWindows上でのみ動作が可能であったが、これをLinux上でも動作するよう改良した。WebGISサーバの2種類のプラットフォームへの対応が可能になった。3.属性情報管理を行うDBMSとの連携演算を強化した。4.トポロジー暗示方式の問題点であった、空間演算時間短縮のためにトポロジー情報のキャッシュ機能を実現し、高速化を図った。本研究では暗示的なトポロジー記述をベースとした地理情報システムにおける、データ構造やアルゴリズムなどの基礎的考察及び、その実応用のシステムの開発を行った。本年度は、平成12年及び13年度で開発したプロトタイプをベースに、ネットワーク機能の実現、時空間検索機能の強化、トポロジー情報キャッシュの方式の開発による演算時間の大幅な短縮、図形編集機能の強化、属性データベースとの協調、マルチメディアオブジェクトの地図上での管理などの課題について、新しい方式を開発し、それを実際の時空間情報管理システム(STIMS)上に実現した。併せて、自治体や家庭・教育応用を念頭に置いたシステムの開発を行った。自治体応用では、長崎県の協力を得て森林の地籍(林班)管理システムのプロトタイプを作成した。また家庭・教育応用のシステムとしてはディジタル写真などのマルチメディアオブジェクトを地図上に関連付けて、かつ時系列情報で管理できるシステムの開発を民間企業と共同で行った。更に、日本地図センター発行のディジタル地図(JMCマップ)、数値地図2500、国土空間データ基盤数値地図25000などのディジタル地図をSTIMS上にインポートする変換プログラムを開発した。本研究で開発したシステムを、埼玉大学のWebサイトにおいてフリーソフトとして公開してきた。平成13年6月に初期バージョン(STIMS1.0β)を公開し、平成14年6月には次バージョン(STIMS1.0)を公開した。更に、完成度の高いシステムを平成15年6月を目途に公開する準備を進めている。
アストロサイトの分化におけるアリルハイドロカーボン受容体の役割

神経系グリア細胞の一つであるアストロサイトは、脳の恒常性の維持に重要な役割を果たす細胞である。アストロサイトの分化は、様々な細胞外因子による刺激で促進されることが報告されているが、その中でもインターロイキン6(IL-6)サイトカインファミリーによる分化促進機構が最もよく研究されている。IL-6ファミリーによる分化では、リガンドの受容体への結合に伴う転写因子STAT3の活性化が、アストロサイトマーカーGFAP(グリア線維性酸性蛋白質)の転写を引き起こす。一方アストロサイトの分化は、細胞内cAMPレベルを上昇させる因子によっても促進されるが、cAMP依存的な分化機構は明らかになっていない。ラットC6グリオーマ細胞では、細胞内cAMPレベルの上昇により、アストロサイトマーカー発現誘導や細胞形態変化などのアストロサイト様分化が観察される。そこで我々は、cAMP依存的なアストロサイト分化機構を明らかにするために、C6細胞をモデルとして研究を行なった。その結果、刺激に伴う細胞内cAMP濃度の上昇に伴い、短時間でIL-6の発現が上昇し、その後IL-6蛋白質が培養液中に分泌されることを見出した。さらに、IL-6分泌によってSTAT3が活性化し、その後のGFAPI発現誘導が引き起こされた。つまり、C6細胞におけるcAMP依存的な分化は、IL-6自己分泌によって引き起こされることが明らかになった。また最近、アリルハイドロカーボン受容体(AhR)が、ニューロンの細胞運命決定に重要であることが報告されたが、我々は、AhRリガンドがcAMP依存的なIL-6誘導を阻害することで、C6細胞分化を阻害する機構を明らかにした。これらの結果は、アストロサイト分化調節機構の一部を明らかにするとともに、ダイオキシン類のような神経毒性を持つAhRリガンドが、神経系細胞の分化を撹乱する機構を示すものである。ラットグリオーマC6細胞は、細胞内cyclic AMP(cAMP)濃度の上昇に伴い、アストロサイトマーカーのグリア線維性蛋白質(GFAP)の発現誘導とアストロサイト様の形態変化が観察される細胞である。申請者はこれまでに、ダイオキシン類の受容体として知られるアリルハイドロカーボン受容体(以下AhR)が、cAMP依存的なC6細胞分化を抑制することを発見した。本申請では、AhRによるC6細胞分化の抑制メカニズムを明らかにするために、C6細胞分化に関わる転写因子に着目して研究を進めている。細胞の分化に応じてどのような転写因子が活性化されるかをスクリーニングしたところ、CREB(cAMP response element binding protein)がcAMP依存的に活性化され、またこの活性がAhRによって阻害されることが明らかになった。また、GFAPプロモーター活性を正に制御することで知られるSTAT3(signal transducers and activators of transcription)に関しては、活性化に必要なリン酸化部位であるSer727とTyr705両残基のリン酸化と、STAT3のDNA結合能を調べた。その結果、STAT3のcAMP依存的なリン酸化とDNA結合能が、AhR活性化によって抑制されることが明らかとなった。GFAPプロモーターは、STAT3とCREB両方の認識配列を持っていることから、AhRはSTAT3とCREBの転写活性を阻害することで、GFAPプロモーターの活性化を抑制している可能性が考えられる。現在は、これらの転写因子活性化の系時的変化と、それに関わる因子についての研究を行っている。
PAX3-FOXO1陽性横紋筋肉腫に対するアルキル化PIポリアミドの抗腫瘍効果

本研究では、配列特異的にDNAに結合する性質を持つピロール・イミダゾール・ポリアミド(PIP)を用いて、胞巣型横紋筋肉腫(ARMS)特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1を認識する薬剤の開発を試みた。解析の結果、融合遺伝子配列を認識するPIPにアルキル化剤クロラムブシル(ChB)を付加した化合物Rhab-ChB1が、培養腫瘍細胞に対して強い増殖抑制効果を持つ事を確認した。この作用は標的特異的ではなく、Rhab-ChB1は融合遺伝子陰性の細胞に対しても増殖抑制効果を示したが、ChB単体よりも100倍以上低い濃度で作用することから、新規のアルキル化剤として応用できる可能性が考えられた。本年度は、横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1の融合部位を認識するPyrrole-Imidazole Polyamide(PIP)にアルキル化剤Chlorambucil(ChB)を付加したChB-PIP-1を合成し、その機能解析を行った。ペプチド合成機PMMS8を用いて、融合部位特異的なPIPを合成し、脱水縮重反応によりChBを付加後、HPLCにより精製した。HPLC及び質量分析機を用いた解析により、ChB-PIP-1が合成できていることを確認した後、Gel Shift Assayにて標的配列特異的なDNA結合能を検討したところ、ChB-PIP-1はPAX3-FOXO1の融合領域の配列に特異的に結合できることがわかった。そこで、ChB-PIP-1の培養系における抗腫瘍効果について検討を行うために、PAX3-FOXO1融合遺伝子を持つ横紋筋肉腫細胞株CRL2016、NRS-1と融合遺伝子陰性の横紋筋肉腫細胞株RMS-YMおよび肺癌細胞株NCI H460に対しChB-PIP-1を投与し、その生存率の変化をWST8アッセイにより調べた。その結果、ChB-PIP-1は予想に反し、PAX3-FOXO1の有無にかかわらず、細胞の生存率を有意に低下させた。いずれの細胞株においても0.01μMより効果を示し始め、1μMでほぼ完全に細胞を死滅させた。PIPの付加されていないChB単独では10 μM以上で効果を示し始めることから、ChB-PIP-1はChB単独と比較して100倍以上の強い殺細胞効果を示したと言える。フローサイトメトリーを用いた細胞周期解析の結果、ChB-PIP-1の投与によりG2/Mフェーズにおける細胞周期の停止が生じている事が確認できた。ChB-PIP-1を計画通り合成し、純度も実験を行う上で十分であることが確認できた。また、標的DNAへの特異的な結合能があることも確認できた。培養系においては、予想と異なりPAX3-FOXO1融合遺伝子の有無に関係なく殺細胞効果を示すことが判ったが、その効果はChBと比べて非常に強力であり、新規の抗腫瘍薬として期待ができるため、今後解析していく意味があると考える。昨年度は、横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1の融合部位を認識するピロール・イミダゾール・ポリアミド(PIP)にアルキル化剤クロラムブシル(ChB)を付加したChB-PIP-1を合成し、この分子が標的配列特異的なDNA結合能と、細胞増殖抑制能を持つ事を確認したが、PAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞のみならず、融合遺伝子を持たない陰性細胞に対しても増殖抑制能を示したことから、今年度はDNA認識領域を少しずらしたChB-PIP-24の3種類および、融合遺伝子を認識しないChB-Mismatch-PIPを合成しその機能解析を試みた。ペプチド合成機PMMS8を用いたPIP配列の合成、脱水縮重反応によるChBの付加、HPLCによる精製を経て完成した各PIPにつき、HPLC及び質量分析機を用いた解析により品質と純度の確認を行い、Gel Shift Assayにて標的配列特異的なDNA結合能を検討した。ChB-PIP-24のうち、ChB-PIP2および3はPAX3-FOXO1の融合領域の配列に特異的に結合できること、ChB-PIP-4およびChB-Mismatch-PIPは標的DNA配列への結合能が無いことが判った。これらのPIPの抗腫瘍効果を検討するために培養細胞に対し各PIPを投与し、その生存率の変化をWST8アッセイにより調べたところ、ChB-PIP-1同様、ChB-PIP-2,4およびChB-Mismatch-PIPはPAX3-FOXO1の有無にかかわらず、調べた全ての細胞の生存率を有意に低下させた。いずれのPIPも1μMでほぼ完全に細胞の増殖を抑制した。ChB-PIP-3には顕著な細胞増殖抑制能が見られなかった。いずれの細胞においてもG2/Mフェーズにおける細胞周期の停止が生じることをフローサイトメトリーで確認した。今年度合成したChB-PIP4種類のうち3つは、昨年解析したChB-PIP-1同様、ChB単体と比較して顕著な細胞増殖抑制能を示したものの、その効果は横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1陽性細胞のみならず、陰性細胞に対しても発揮された。既存の抗癌剤であるChBと比べて非常に強力であり、新規の抗腫瘍薬として期待できる薬剤ではあるが、当初の目的としていた融合遺伝子陽性細胞特異的な抗がん剤の開発は成功していないことから、若干遅れていると評価した。

これまでに、横紋筋肉腫特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1の融合部位を認識するピロール・イミダゾール・ポリアミド(PIP)にアルキル化剤クロラムブシル(ChB)を付加したChB-PIPを複数合成し、これらの分子のいくつかが標的配列特異的なDNA結合能と、細胞増殖抑制能を持つ事を確認した。しかしながら、そのいずれもPAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞のみならず、融合遺伝子を持たない陰性細胞に対しても増殖抑制能を示したことから、今年度はChBと異なるアルキル化剤1,2,9,9atetrahydrocyclopropa[1,2-c]benz[1,2-e]indol-4-one (CBI)を付加したPIPの合成と機能解析を試みた。ペプチド合成機PMMS8を用いたPIP配列の合成、脱水縮重反応によるCBIの付加、HPLCによる精製を経て得られた分子につき、HPLC及び質量分析機を用いた解析により品質と純度の確認を行った。しかしながら、現時点では未だに目的の分子が得られておらず、引き続き合成を試みている。また、昨年度まで得られていた、ChB-PIPについて、その作用機序を検討するために、横紋筋肉腫を含む複数の細胞株に対する殺細胞効果を検討した。解析の結果、細胞株の持つ各種遺伝的変異に関係なく、ChB-PIPが強い殺細胞効果を持つ事がわかった。PAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞特異的な効果は見られないものの、ChB-PIPはChBと比べ100倍薄い濃度でも効果を示すことから、今後一般的な抗腫瘍薬として開発されることが期待できる。本研究では、配列特異的にDNAに結合する性質を持つピロール・イミダゾール・ポリアミド(PIP)を用いて、胞巣型横紋筋肉腫(ARMS)特異的融合遺伝子PAX3-FOXO1を認識する薬剤の開発を試みた。解析の結果、融合遺伝子配列を認識するPIPにアルキル化剤クロラムブシル(ChB)を付加した化合物Rhab-ChB1が、培養腫瘍細胞に対して強い増殖抑制効果を持つ事を確認した。この作用は標的特異的ではなく、Rhab-ChB1は融合遺伝子陰性の細胞に対しても増殖抑制効果を示したが、ChB単体よりも100倍以上低い濃度で作用することから、新規のアルキル化剤として応用できる可能性が考えられた。ChB-PIP-1は特異的DNA結合能を持つにも拘らず、PAX3-FOXO1融合遺伝子陽性細胞、陰性細胞ともに殺細胞効果を示したことから、今年度はDNA認識領域を少しずらしたChB-PIP-2を合成、精製し、ChB-PIP-1と同様に標的DNA結合能および細胞死誘導効果を検討する。なお、ChB-PIP-1はPAX3-FOXO1陽性細胞特異的な殺細胞効果は見られなかったものの、ChBと比べて100倍以上の効果を示したことから、ChB-PIP-2の解析と並行して研究を続けていく。前年度までにChB-PIP-1がG2/M arrestを誘導することが確認できたことから、本年度はその分子メカニズムについて検討し、ChB-PIP-1がどのような遺伝子を標的としてG2/M arrestを誘導し、その後細胞死を誘導するのかを解明する。2年間にわたり、PAX3-FOXO1融合遺伝子を標的とするChB-PIPの開発を試みてきたが、今年度合成したChB-PIPも前年度合成したChB-PIP-1同様、配列特異的DNA結合能を示すものの、PAX3-FOXO
ポリコームタンパクによる精子幹細胞制御機構の全容解明

生殖細胞のなかでも、オスの精子幹細胞は唯一in vitroで増殖することができるほど自己複製能が高く、非常に安定に精子形成を支えることが知られている。しかし、「種の保存」という重大の役割を担うために必須であるこの自己複製がどのように制御されているのか、その機構は明らかとされていない。近年、造血幹細胞や神経幹細胞の自己複製に、ポリコームタンパクが関与していることが報告された。我々は精子幹細胞の自己複製にもポリコームタンパクが関与しているのではないかと考え、ポリコームタンパクによる精子幹細胞の自己複製(増殖)制御機構の解明及び標的遺伝子を同定することを目的とした。本年度の研究により、我々は正常ヒト胎児線維芽細胞を用いて、長鎖ノンコーディングRNAであるANRILが細胞増殖に重要な役割を果たすINK4遺伝子座の転写を抑制することを明らかとした。そのメカニズムとして、1)ANRILはポリコームタンパクと結合すること、2)ANRILはINK4遺伝子座へのポリコームリクルートメントを促進することを明らかとした。さらにANRILは、細胞老化を抑制することを見出した。また,p53がポリコームタンパクをINK4遺伝子座内にあるARF遺伝子のプロモータ上にリクルートすることを明らかとした。これらの結果から、ポリコームタンパクは精子幹細胞においても、長鎖ノンコーディングRNAやp53を介してINK4遺伝子座を抑制することにより、増殖を正に制御している可能性が考えられた。しかし、「種の保存」という重大な役割を担うために必須であるこの自己複製(増殖)がどのように制御されているのか、その機構は明らかとされていない。そこで本研究は、ポリコームタンパクによる精子幹細胞の自己複製(増殖)調節機構に注目し、その全容解明と生理的意義の追求を目的として行っている。本年度は、(1)ポリコームタンパクによるINK4遺伝子座(CDK阻害タンパクp16, p15及びp53活性化タンパクARFをコード)の転写抑制機構の解明として、ポリコームリクルートメントに関与する非コードRNAを探索し、その同定に成功した。我々が見出した非コードRNAは、INK4遺伝子座を抑制していること、またポリコームタンパクと結合し、INK4遺伝子座へのポリコームリクルートメントに関与する事を明らかとした。(2)さらに同定した非コードRNAが細胞増殖を制御していることを明らかとした。(3)ポリコームタンパクbmi1コンディショナルノックアウトマウスを作成するため、ターゲッティングベクターを作成した。今後、定法に従ってbmi1コンディショナルノックアウトマウスを作成して、ポリコームタンパクが精子幹細胞の自己複製及び精子形成に関与しているかを個体レベルで解析する予定である。
活性変異型Ｒａｓによる細胞老化を克服するがん進展機構の解明

活性型Rasは、正常細胞で細胞内空胞形成を介した細胞老化により抑制されるが、癌細胞では浸潤・転移等の癌進展に関与する事が示唆されている。しかし、細胞老化を克服し癌が進展する機構の詳細は不明であった。本研究により、CDCP1蛋白質が活性型Rasを介した細胞内空胞化を抑制し細胞死を抑制する事を発見した。また、CDCP1の発現亢進には活性型Ras-ERKシグナルが関与する事を明らかにした。さらに、CDCP1が細胞外基質分解酵素のMMP(MT1-MMP, MMP-2, 9)の制御にも関与する事を見出した。これらの発見により、細胞老化を克服する癌進展にはCDCP1が重要である事が示唆された。CDCP1がRasにより発現誘導を受けていること、癌細胞における局在が脂質ラフトであることまた、細胞外基質分解酵素であるMT1-MMPと結合することから、CDCP1がMT1-MMPを介した癌細胞の浸潤機構の関わることが示唆されていたので、CDCP1とMT1-MMPに焦点を当て癌細胞の浸潤機構の解析をおこなった。結果、CDCP1発現を抑制すると浸潤の要であるMT1-MMPが浸潤突起といわれる浸潤装置へ輸送されなくなることが明らかとなり、蛍光ゼラチン基質を用いた基質分解解析では、浸潤突起における分解が抑制されることが明らかとなった。つまり、Rasによる癌細胞の浸潤機構への寄与を示しており、Rasが初期の癌化のみならず、癌の悪性化にも関与する機構を明らかにした。CDCP1の細胞外ドメインは切断されることが知られており、切断がCDCP1シグナルの活性化に関与するとの報告があるが、切断されたドメインに関しては報告がほとんどない。切断された細胞外ドメインのリコンビナント蛋白質の処理による細胞への影響を調べたが肺癌細胞株に関しては影響が確認できなかった。しかし今回、肺癌細胞株、膵癌細胞株においてCDCP1の切断された細胞外ドメインを検出するサンドウィッチELISAの系の樹立に成功した。ドキシサイクリン(Dox)により活性型Rasによって細胞老化を起こす正常不死化細胞は、空胞化を伴った細胞死を誘導する。しかし、細胞の形状的変化観察で、細胞死を起こさない細胞が存在することを発見した。その時、膜型タンパク質CDCP1のリン酸化と蛋白質発現の上昇が確認された。その後、活性型Rasによる空胞化耐性細胞株を樹立し、元細胞株と比較するとCDCP1発現が上昇していることを発見した。さらに耐性細胞株に対してCDCP1発現抑制をかけると、耐性細胞株に再度空胞化が起こり、細胞死が起こることが明らかとなった。以上の結果から、活性型Rasを介した細胞の空胞化及び細胞死にはCDCP1が関与することが明らかとなった。CDCP1抑制による細胞死には、Caspaseを介した細胞死ではなく、autophagyを介した細胞死が関与することを明らかにし、空胞化において、CDCP1を介したautophagyに重要であることを明らかにした。CDCP1シグナルの1因子であるPKCδに結合する因子を同定するためにPKCδのC末端にFLAG-tagを発現する細胞株を樹立し、FLAGによる免疫沈降で結合タンパク質を回収を試みたが、結合因子を見つけるに至っていない。PKCδは細胞の核内での機能をつかさどる因子と細胞膜直下で働く因子があるが、現方法では、結合因子の同定は難しい。よって現在FLAG, HAのタンデムでtagを付加し、さらに、膜局在配列を付加し、膜でのPKCδ結合因子の同定に着手している。切断されたCDCP1細胞外ドメインを発現するベクターを作成し、細胞に導入したのちにその培養液を他の細胞に添加したが、細胞骨格等に変化は見られなかった。CDCP1の局在に関して、細胞の資質ラフトに局在することを明らかにした。その際、細胞外基質分解酵素であるMT1-MMPと結合することを発見した。CDCP1のRasによる発現誘導の下流シグナルが明らかになっていなかったが、代表的な下流シグナルであるAKT及びERKの阻害剤等を使用した研究の結果、ERKを介したシグナルであることを証明した。さらに、RasによるCDCP1の発現上昇は、細胞老化による空洞化を抑制するだけではなく、細胞外基質分解に主要な働きを示すマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)群の中のMMP-2の活性化制御及びMMP-9の細胞外への輸送制御に関与している事が明らかとなり、活性変異型Rasの癌進展機構への機序の一端を明らかにした。腫瘍生物学平成25年10月に所属機関の移転があった。

新規の所属機関では、新しい生命科学系の研究分野の新設であり、その立ち上げのための手続等の事務作業をおこなっていたために研究時間を削減せざるを得ず、当初の研究計画よりは遅れが出てしまった。しかし、切断されたCDCP1を認識するサンドウィッチELISAの系の樹立に成功したこと、CDCP1が脂質ラフトにおいて細胞外基質分解酵素であるMT1-MMPと結合していること及び、CDCP1によりがん細胞の浸潤突起へのMT1-MMPの局在が制御されがん細胞の浸潤部位での細胞外基質分解能を制御していることを明らかにできたことは計画通りであり、平成25年度に進展が遅れたものに関しては、平成26年度に重点的に進めなければならない。1.ドキシサイクリン(Dox)により活性型Rasによって細胞老化を起こす正常不死化細胞を作成し、さらにRasによる空胞化と細胞死に耐性を示す赤部の樹立に成功した。2.活性型Rasによる空胞化の耐性にCDCP1が重要であることを蛋白質発現の検討とsiRNAによる抑制実験おける空胞化の再構築で明らかにした。4.CDCP1下流のPKCδ結合因子に関しては、まだ同定出来ず1回の精製では結合因子を取得することは困難と判断した。現在改良法で検討中である。5.切断されたCDCP1細胞外ドメインは、作成できており、切断ドメインの濃度による最適条件の検討に入っている。6.CDCP1が細胞外基質分解酵素であるMT1-MMPと資質ラフトで局在することを明らかにした。活性型Rasによる細胞の空洞化を抑制するCDCP1を介したAutophagy関連因子の変化、細胞老化因子の変化をCDCP1siRNA等により検証をおこない細胞老化とAutophagyの関連性を検証する。また、CDCP1シグナル下流(PKCδを含む)因子の同定をおこなう。CDCP1の発現誘導に関しては、Ras下流のどのシグナルが重要かを明らかにするとともに、癌細胞の特性にRas-CDCP1シグナルの経路がどのような制御機構を持っているかを検証する。1.CDCP1が活性型Rasによる空胞化に関与することが明らかになったので、CDCP1を介したAutophagy関連因子の変化、細胞老化因子の変化をCDCP1siRNA等を用いて経時的に検証をおこない、細胞老化とAutophagyとの関連について明らかにする。2.PKCδ下流因子の同定に関しては、現在FLAG, HAのタンデムでtagを付加し、さらに、膜局在配列を付加し、膜でのPKCδ結合因子の同定に着手している。結合因子を同定し次第、抗体作成および購入をして、結合因子の性状に関して検討を進める。3.切断されたCDCP1細胞外ドメインによる機能に関する細胞添加の至適条件の検討。4.CDCP1の脂質ラフト局在における複合体の検証、細胞内での輸送系の検討および、細胞外基質分解酵素MT1-MMPとの関連性に関して検討する。平成25年10月に所属機関の移転があり、科研費に対する移管手続及び新規所属機関の手続上の都合により該当研究費を使用できる期間が短かったこと、また、新規所属機関における研究体制を構築するために必要な施設・備品の調査をし、早期に元の研究体制を構築するための調査に時間がかかり使用できなかったため。
マイクロプロ-ブ・オ-ジェ電子回折法による金属/半導体多層膜の研究

最近,超高真空中で半導体ウエハ-表面上に金属超薄膜の微小な領域を意識的に作り,半導体ウエハ-両端に電圧を加えることによって,この微小金属超薄膜が移動することが見いだされ,半導体表面の金属の電気移動(Electro-migration)の基礎的研究がにわかに活発になっている。このような現象はマイクロエレクトロニクス技術において見逃すことのできない現象であると同時に,金属/Si超格子多層膜の実現においても見過ごすことのできない現象である。本研究ではSi(111)表面上に形成された微小In金属超薄膜の電気移動の様子をマイクロ電子ビ-ムを用いた観察手段を用いて観察した。Si(111)4×1-In表面は,Si(111)表面上のInの電気移動のための中間層と考えられている。あらかじめ4×1-In表面上にIn超薄膜片(厚さ4原子層:ML)を蒸着しておき,下地Siウエハ-に典型的に1.6 A/cm^2,38V/cmの電流・電圧を数十秒から数分間印加した。この後の表面をμ-probe RHEED,UHVーSEM,μーAED等の手段で調べ,次の様なことが分かった。即ち,(1)下地Siウエハ-の抵抗値を変えて電気移動の観察を行うことにより,電気移動の駆動力は電流ではなく電界であることが強く示唆されたこと,(2)電気移動を起こす部分を詳細に観察すると,移動部は全体としては移動せず,消滅と生成を繰り返すことによって物質移動が起きていること,(3)移動部先端に発生するIn-Islandにおいても同様に,消滅と生成を繰り返すことによって物質移動が起きていること,(4)上記を説明する電気移動のメカニズムについて考察したことなどである。また,この研究の後,Si/In/Si(111)超格子膜形成の予備実験を行ったが,確定的な結果は得られていない。
乳腺炎の発症に係わる食事因子のモデル動物による解明

有用な母乳哺育を阻害する要因の一つとして乳腺炎が挙げられる。このうち、乳のうっ滞に起因する乳腺炎は、スクロースを摂食することで炎症が重篤化する事を見いだした。これは、我々の知りうる限り食品成分が乳腺炎発症あるいは重篤化と関連ある事を実験的に確認した最初の例である。乳腺炎の発症は、母乳育児を困難にする。発症危険因子として経験的に食事が挙げられているが、科学的根拠は全く解明されていない。そこで本課題では、乳腺炎発症と食事成分との関係を世界で初めて実験的に解明することを目的とした。平成21年度は、食品成分の乳腺炎に与える影響の評価を行った。先ず、授乳を行っている母マウスから仔マウスを強制離乳させ、母マウスにうっ滞を誘導する動物実験系を構築した。次いで、特定の糖質を摂食させておくと有意に乳腺組織内に好中球が遊走し炎症が重篤化することを見いだした。このことは、乳腺炎発症と食事成分との関係を実験的に初めて確認したものであり意義深い。また、当該の糖質は授乳婦にとっての禁忌食品に多く含まれるものであった事から、従来からの言い伝えが正しい事も併せて確認できた。今後、授乳婦に対するガイドライン策定の一助になると期待される。一方で、煩雑な組織染色を伴わない方法で食事成分評価系を構築するために、マウスの乳腺組織からmRNAを抽出し、乳腺炎発症マーカーの探索を試みた。DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析から、炎症、イオントランスポート、筋収縮等に関連する遺伝子に、その可能性が考えられた。次いで、リアルタイムPCRにて一部の遺伝子発現の確認を行ったところ、炎症に関連する複数の遺伝子発現が、当該の糖質を摂食した場合に上昇する事が確認できた。今後、当該遺伝子と乳腺炎との関連を詳細に解析し、マーカーとなり得るかどうか検討する。平成22年度は、特定の食品成分を摂食した場合の濃度依存性を確認し、現実的な食事組成における炎症の程度を確認したい。前年度、スクロースを過剰に摂取したマウスは、その乳腺組織内に好中球が遊走し炎症が重篤化することを見いだしていた。しかし、本実験は極端な食餌組成によるモデル実験であったため現実的な食事組成で同様の炎症が誘発されるかどうか、不明であった。平成22年度は、この点を主に検証した。米国人出産適齢期の女性が平均的に摂取するスクロース量(エネルギー摂取量の約20%)は勿論、WHOが推奨するスクロースの摂取量(エネルギー摂取量の約10%)においても乳腺組織に炎症が発症することを見いだした。この炎症は、スクロース濃度依存的に高まることも確認できた。上記の結果は、「スクロースの摂食」条件以外に「乳のうっ滞」条件が加えられた結果であったので、後者の条件無しに、すなわち「スクロースの摂食」のみで乳腺組織の炎症の度合いを検討した。その結果、弱い炎症が誘導されることが明らかとなった。以上の結果は授乳婦の栄養摂取に関するガイドラインに影響を及ぼすものと思われ意義深い。平成23年度は、乳腺組織中の炎症、イオントランスポート、筋収縮等に関連する遺伝子が乳腺炎マーカーとなり得るかどうか検討する。また、肝臓組織に対する炎症と乳腺組織に対する炎症の関連を解析する。前年度、スクロースを摂食させ且つ乳汁をうっ滞させると、乳腺組織に炎症が発症する事を見いだしていた。今年度は、乳汁をうっ滞させずに食事組成の違いのみで乳腺に炎症が生じるのか確認したところ、ショ糖摂食群はマルトース摂食群と比較して、乳腺組織に好中球が有意に存在することを明らかにした。しかし、その程度は非常に低く、重篤な炎症ではなかった。このことは、乳腺炎の原因を食事組成のみには求められないことを示唆している。母乳育児を支持する医療機関の指導にも拘わらず、児の飲み残しを搾乳していない授乳婦は多い。こうした授乳婦が、特定の食事成分を多量に摂ることで、乳腺炎を誘発しているという仮説が導かれた。次に、より多くの食事成分とその摂取量について、乳腺組織における炎症発症との関係を簡便に確認可能な乳腺炎簡易検出系を開発すべく、乳腺炎に関連する乳腺組織中のマーカー遺伝子の探索を行った。仔マウスを強制離乳した場合と、授乳を継続した場合で、親マウスの乳腺組織の遺伝子発現を比較したところ、前者でMAPキナーゼ経路に関連したものが多く高発現していた。

次いで、食事成分の違いを検討したところ、マルトース摂食群よりもスクロース摂食群で、MAPキナーゼ経路および炎症反応に関わる遺伝子の高発現が認められた。一部の炎症関連遺伝子発現量の検出により乳腺炎の程度を評価可能であることが示唆された。なお、動物実験を開始する前の授乳婦に対する意識調査がまとまったので、論文報告した。