hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
並列コイルを用いた衝撃電磁シーム圧接

衝撃電磁シーム溶接法は「アルミニウム薄板や銅薄板を特性の大きく異なる鋼板など異種金属材を容易に溶接できる」「厚さ3 mmの薄板から厚さ6.5 μmの金属箔のシーム溶接が可能である」など様々な利点を持つ.これまでの実験において,「接合部には2カ所の溶接部とその間の非溶接部が存在すること」「シーム溶接された部分は,面でなく2本の線状に溶接されること」が明らかになっている.しかしながら,本接合に関する最適な接合条件に関しては,経験的にしか得られていないのが現状である.本研究の目的は,衝撃電磁シーム溶接法における最適な接合条件について明らかにすることにある.平成29年度に(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて,板材の接合を試みた.その結果,予測したより供試材が変形せず接合できなかった.この原因として,本電磁成形装置の残留インダクタンスが予測より大きかったことがあげられる.この影響で,コイルに大電流が流れず,大きな磁界が発生しなかったため,磁気圧力が小さくなり板材が変形せず接合できなかった考えられる.そこで,平成30年度は,この結果を踏まえてコイルのターン数を増やし,コイルそのもののインダクタンスを上げる改良を行った.コイルの設計・製作に時間がかかり,コイルは完成したものの実験までには至らなかったが,これまでの結果をまとめ,平成31年3月にインドで行われたSixth International Symposium on Explosion, Shock wave and High-strain-ratePhenomena(ESHP2019)で発表した.そこで,平成31年度(令和元年度)については,最適な接合条件を明らかにするために,これまでに変形シミュレーションの結果を踏まえて,実験と変形シミュレーションを行い最適接合条件について明らかにする.研究初年度に得られた変形シミュレーションの結果を基に(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて板材の接合を試みる予定であったが,改良コイルの設計・製作に時間がかかり,実験までには至らなかったためである.改良コイルが完成しているため,直ちに実験を行うとともに,併せての接合界面状態と衝突パラメーターとの相関について明らかにするために引き続き変形シミュレーションも行う.衝撃電磁シーム溶接法は「アルミニウム薄板や銅薄板を特性の大きく異なる鋼板など異種金属材を容易に溶接できる」「厚さ3 mmの薄板から厚さ6.5 μmの金属箔のシーム溶接が可能である」など様々な利点を持つ.これまでの実験において,「接合部には2カ所の溶接部とその間の非溶接部が存在すること」「シーム溶接された部分は,面でなく2本の線状に溶接されること」が明らかになっている.しかしながら,本接合に関する最適な接合条件に関しては,経験的にしか得られていないのが現状である.本研究の目的は,衝撃電磁シーム溶接法における最適な接合条件について明らかにすることにある.そこで研究の初年度(平成28年度)は,最適な接合条件を明らかにするために構造解析用コンピューターを導入し,並列コイルを利用しアルミニウム薄板同士を接合する場合の変形シミュレーションを行った.ここで検討した項目は,「薄板衝突時の変形挙動」「接合部近傍の変形の状態」「薄板衝突時の速度」「衝突後の速度変化」「薄板衝突時の角度変化」などの衝突パラメーターである.また,翌年以降の解析との比較のために,X線分光装置を用いて接合界面の材料組織や接合界面の成分分析も併せて行った.その結果,コイル間隔を狭くすると板材同士が接触していない箇所が小さくなり,コイル間隔2.0 mmでは板材同士が完全に接触すること,コイル間隔2.0 mmでは,コイル同士の内側の相当塑性応力は初期衝突点から2.3 mm離れた位置で急激に減少することが明らかになった.当初,実験の方はやや遅れているが,翌年度以降に予定していた並列コイルを用いた接合シミュレーションに着手できたことから,概ね予定通りに進展していると考える.衝撃電磁シーム溶接法は「アルミニウム薄板や銅薄板を特性の大きく異なる鋼板など異種金属材を容易に溶接できる」「厚さ3 mmの薄板から厚さ6.5 μmの金属箔のシーム溶接が可能である」など様々な利点を持つ.これまでの実験において,「接合部には2カ所の溶接部とその間の非溶接部が存在すること」「シーム溶接された部分は,面でなく2本の線状に溶接されること」が明らかになっている.しかしながら,本接合に関する最適な接合条件に関しては,経験的にしか得られていないのが現状である.本研究の目的は,衝撃電磁シーム溶接法における最適な接合条件について明らかにすることにある.そこで平成29年度については,最適な接合条件を明らかにするために,前年度に行った変形シミュレーションの結果を踏まえて,(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて,板材の接合を試みた.その結果,予測したより供試材が変形せず接合できなかったため,原因を検討しコイルの検討を行っている.この原因として,本電磁成形装置の残留インダクタンスが予測より大きかったことがあげられる.この影響で,コイルに大電流が流れず,大きな磁界が発生しなかったため,磁気圧力が小さくなり板材が変形せず接合できなかった考えられる.昨年度,出席した国際会議で得られた知見や実験で得られた電流波形や供試材の変形状態を基にコイルの改良を行っている.

残留インダクタンスの大きい装置で接合ができれば,本接合法の利用拡大が期待される.研究初年度に得られた変形シミュレーションの結果を基に(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて板材の接合を試みたが,予測したより供試材が変形せず接合できなかったため,当初計画より遅れが生じている.その原因として,本装置のもつ残留インダクタンスが予測以上に大きく,効率的に成形用コイルへ電流が流れず,成形用コイルに大きな磁界が発生しなかったためだと考えられる.衝撃電磁シーム溶接法は「アルミニウム薄板や銅薄板を特性の大きく異なる鋼板など異種金属材を容易に溶接できる」「厚さ3 mmの薄板から厚さ6.5 μmの金属箔のシーム溶接が可能である」など様々な利点を持つ.これまでの実験において,「接合部には2カ所の溶接部とその間の非溶接部が存在すること」「シーム溶接された部分は,面でなく2本の線状に溶接されること」が明らかになっている.しかしながら,本接合に関する最適な接合条件に関しては,経験的にしか得られていないのが現状である.本研究の目的は,衝撃電磁シーム溶接法における最適な接合条件について明らかにすることにある.平成29年度に(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて,板材の接合を試みた.その結果,予測したより供試材が変形せず接合できなかった.この原因として,本電磁成形装置の残留インダクタンスが予測より大きかったことがあげられる.この影響で,コイルに大電流が流れず,大きな磁界が発生しなかったため,磁気圧力が小さくなり板材が変形せず接合できなかった考えられる.そこで,平成30年度は,この結果を踏まえてコイルのターン数を増やし,コイルそのもののインダクタンスを上げる改良を行った.コイルの設計・製作に時間がかかり,コイルは完成したものの実験までには至らなかったが,これまでの結果をまとめ,平成31年3月にインドで行われたSixth International Symposium on Explosion, Shock wave and High-strain-ratePhenomena(ESHP2019)で発表した.そこで,平成31年度(令和元年度)については,最適な接合条件を明らかにするために,これまでに変形シミュレーションの結果を踏まえて,実験と変形シミュレーションを行い最適接合条件について明らかにする.研究初年度に得られた変形シミュレーションの結果を基に(国研)産業技術総合研究所に設置されている電磁成形装置を用いて板材の接合を試みる予定であったが,改良コイルの設計・製作に時間がかかり,実験までには至らなかったためである.平成29年度に得られた結果を基にして,接合シミュレーションを行うとともにアルミニウム薄板同士の接合実験を行う.アルミニウム薄板同士を接合する場合の接合界面状態と衝突パラメーターとの相関については平成29年度中頃を目標に明らかにする.上記研究とともに,ここまで得られた結果をもとに接合面積を増やすための検討にも着手する.方法については平成28年度と同様である.現在,実験で得られた電流波形や供試材の変形状態を基にコイルの改良を行っている.改良コイルは6月中に完成する見込みである.遅れを取り戻すためにコイル完成後,直ちに実験を行う予定である.
マイクロＲＮＡセンサーベクターを用いた新規ヒト造血幹細胞分画の同定と機能解析

すべての血液細胞を生み出すことが出来るヒト造血幹細胞の性質については未だ不明な点が多く、その生物学的特徴を明らかにすることで、骨髄移植など造血幹細胞治療をより効率的に行うことが出来るようになると考えられる。造血幹細胞表面には特徴的なマーカーが発現しているが、我々は近年、造血幹細胞において重要な働きを担っているマイクロRNA-126という遺伝子を可視化できるシステムを開発し、従来、造血幹細胞が存在しないと考えられている細胞分画にマイクロRNA-126が強く発現している細胞群を見いだした。この細胞群は新たなヒト造血幹細胞ソースになる可能性を秘めており、生物学的特徴につきさらに研究を進めている。昨年度に続いてmiR-126 sensing lentivirusを安定的に高タイターで産生できる系の立ち上げを行った。品質上の問題から、レンチウイルスシステムの開発元であるLuigi Naldini Labより各種プラスミドを入手し直す必要があったが、最終的にそれぞれのプラスミドを安定的に大腸菌へ導入することができ、それぞれ大量培養して十分量のプラスミドを精製した。続いて、それらプラスミドを同時に293T細胞へトランスフェクションして感染性ウイルス粒子を産生した。ウイルス回収のタイミングなどを最適化することでHeLa cellを用いた検討では1x10^9 particle/ ml以上の極めて高タイターのウイルス上清を得ることに成功した。次に同ウイルスを、ヒト臍帯血より分化抗原陽性細胞を除去した造血幹細胞分画(Lin-CB)に感染させ、in vitroで経時的にGFPの発現を追跡したところ、分化によってGFP発現が亢進(つまりmiR-126発現の低下)することを観察し、同レンチウイルスが問題なく機能していることを確認した。また同時に、NOGマウスにLin-CBを移植し、マウス骨髄から磁気ビーズを用いてヒト造血細胞を選択的に濃縮してヒト造血幹細胞分画をフローサイトメトリーにより解析できる実験系の立ち上げを行い、本研究の目的であるmiR-126 sensing lentivirusが導入されたヒト造血細胞をNOGマウスより分取して細胞レベルで解析できる準備が整った。本研究はmiR-126 sensing lentivirusを用いてmiR-126の発現を指標とした新たな造血幹細胞分画の同定を目的としているが、今年度は高力価ウイルス粒子の作成にむけた準備とP2実験室内での実験系の立ち上げを行った。このレンチウイルスシステムを独占的に使用している開発元のLuigi Naldini LabよりMTAを交わし必要な各種プラスミドを入手した。感染性ウイルス粒子の産生にはmiR-126 sensing partを持つバックボーンプラスミドの他、Rev, Rre, VSVGのパッケージング用プラスミド、さらにウイルスの産生効率を高めるpAdvantageプラスミドの計4種類のプラスミドを293T細胞に同時にトランスフェクションする必要があるが、十分量のウイルス粒子を産生するにはそれぞれのプラスミドをミリグラム単位で精製する必要がある。京都大学内のP2実験施設において実験を始める準備を整え、同プラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションしてプラスミドの回収を開始した。当初は、トランスフォーメーションの効率が悪く、またトランスフォーマントを用いたプラスミドの回収効率が悪いため、供与を受けたプラスミドを一旦諦めざるを得ず、改めて新しいプラスミドを入手することとした。同様の問題が発生し、再々度プラスミドを入手することになってしまったが、ようやく効率の良いトランスフォーメーションに成功し、それぞれのプラスミドが組み込まれたトランスフォーマントを得ることが出来た。現在、ウイルス産生に向けて大腸菌の大量培養の段階に入っている。本年度はmiR-126 sensing lentiviursの作成を安定的に行うことができる系が確立したが、特筆すべき点としてウイルスタイターが、89 x10^8/mlという当初目指していたタイターの倍以上の極めて高タイターのウイルス上清を安定的に得ることに成功した。このウイルスを使用して、分化抗原を磁気ビーズで除いた臍帯血由来単核球細胞(Lin-CB)にmiR-126 sensing lentivirusを感染させ、NOGマウスに順次、骨髄内細胞移植を行った。ウイルスに感染したヒト造血幹細胞はマウス体内でさまざまな細胞に分化し、予想されたとおり、CD34陽性細胞など造血幹細胞が濃縮されている分画ではGFPの発現が強く抑制されていることを確認した。当初の目的である、CD34陰性分画におけるGFP低発現細胞群(miR-126高発現分画)を同定することに成功した。この分画は、本手法を用いる以外に同定することは出来ない細胞集団であり、CD34陰性分画における造血幹細胞の存在が強く予想される。

マウス施設における感染など、予想外に移植後のマウスの死亡があったため実験に時間を要してはいるものの、CD34陰性分画中のmiR-126高発現細胞群ををソーティングにより分取し、コロニーアッセイやさらにNOGマウスへの二次移植を通して造血幹細胞活性を詳細に検討を行っている。小児血液本年度はウイルス産生が順調に行われ、すべての基礎実験をほぼ修了することが出来たため。入手したプラスミドの品質が何らかの理由で十分でなく、大腸菌を安定してトランスフォームできなかった。そのため、条件検討などに時間を費やし、また新たにプラスミドを入手せざるを得ない状況に陥ったため、予定よりもやや時間がかかってしまった。新鮮臍帯血を随時処理してLi-CBを十分量用意し、miR-126 sensing lentivirusもしくはcontrol lentivirusを感染させ、一実験あたりおおむね5ー8匹のNOGマウスへそれぞれ骨髄内移植を行う。生着が安定する移植後三ヶ月程度の時期に、マウスの骨髄より磁気ビーズを用いてヒト細胞を濃縮し、さらに分化抗原陽性の成熟細胞を除去しする。残ったヒト幹/前駆細胞分画をCD34, 38, 45RA, 90などの抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて未分化な造血細胞集団を同定する。GFPが最も低い(miR-126発現が高い)細胞集団を探索し、特に従来造血幹細胞活性が知られていなかったCD34陰性集団のなかでmiR-126が高発現している細胞群を分取して、コロニーアッセイやNOGマウスへの移植を通じて造血幹細胞活性があるかどうかを検証する。造血幹細胞活性が確認できれば、マイクロアレイを用いて新たな造血幹細胞マーカーとなり得る表面抗原や転写因子など候補をリストアップし、特に表面抗原については前方視的に造血幹細胞を純化することに利用できないか検討する高力価のウイルス粒子を作成するため、各プラスミドをもった大腸菌を大量培養して十分量のプラスミド精製を行い、ウイルス粒子を十分量作成することを第一の目標とする。今年度はプラスミドの精製を行うと同時にスモールスケールでのウイルスの産生実験を開始し、品質のチェックを行う予定である。さらに計画に従って、さい帯血より磁気ビーズを用いて造血幹細胞分画を濃縮してウイルスを感染させたうえでこれをマウスへ移植して生着させる。マウス体内で安定してヒト造血がみられる2-3ヶ月をめどに骨髄細胞を採取し、磁気ビーズを用いてヒト細胞を濃縮してフローサイトメトリーでmiR-126を高発現している細胞の性質につき解析を行う。ウイルス粒子作成の際に大量のプラスミド精製と293T細胞へのトランスフェクションが必要となりそのための試薬やさい帯血より造血幹細胞分画を濃縮するための細胞分取用の磁気ビーズ、効率良く臍帯血へ感染を起こすために必要な培養液や各種サイトカイン、さらには移植に必要な免疫不全マウス(NOGマウス)の維持、移植後マウスから骨髄細胞を回収してヒト細胞へ濃縮するために必要な磁気ビーズ、フローサイトメトリー用の抗体などが必要となる。
水溶性ナノマテリアルの定量法の開発と下水から取込んだ有機汚染物質との複合影響評価

本研究では、水溶性ナノマテリアル(HNMs)を対象に、生活排水や産業排水の公共用水域への経路である下水処理場に着目し、下水および下流水環境中の動態と生物への毒性影響の把握を目的として、(1)(3)を実施した。(1)HNMsの1種として化粧品や顔料に含まれ水環境への流出が懸念される酸化チタン(TiO2)に着目し、下水処理場の24時間通日調査を実施した。流入下水、放流水、各下水処理過程の試料を2時間毎に採取してコンポジット試料を作成し、孔径100 nmのPVDF膜でろ過をしてICP-OESによりナノTiO2を測定した。その結果、放流水中の全チタン濃度は3.14 μg-Ti/L(流入水に対する除去率91.3%)であったのに対してTiO2濃度は1.77 μg-Ti/L(流入水に対する除去率57.2%)であり、TiO2は処理水中に残存しやすい傾向が示唆された。(2)HNMsとの比較データとして、通常のフラーレン(C60)の水環境中存在実態調査を実施した。琵琶湖・淀川流域の湖水、河川水、下水処理水21試料を採取し、LC-MS/MSによりC60を測定した。その結果、11試料からC60が定量下限値(1.26 ng/L)以上で検出され(検出率:52%)、最大濃度は612 ng/L(河川水)であった。下水処理水からの検出率は低く(調査した7処理場中2ヵ所で検出)、最初沈殿池汚泥や活性汚泥への吸着による除去が示唆された。今後は、水溶性フラーレンについても同様の調査を実施し、挙動を比較する予定である。(3)水溶性フラーレンとして、水酸化フラーレン(C60(OH)n・mH2O)に着目し、分析法の開発に着手した。分子量が一定ではないために複数の化合物(群)を包括的に定量する必要がある。そこで、試料に化学処理を施して全てC60に変換し、処理前後の濃度変化を算出することによる定量手法を検討した。3つの課題を遂行することができた。(1)研究開始直後から24時間通日下水処理場調査を実施することができた。特に、TiO2の通日調査データの獲得に成功し、1件の学会発表を行った。(2)比較対象としてのC60の分析方法についても試行錯誤の上に確立でき、下水処理水および下流の水環境を調査することで、流域中の種々の水媒体中の存在実態データを蓄積することができた。(3)水酸化フラーレンの分析方法について、確立にまでは至らなかったものの、定量化に繋がるアイデアを練ることができ、検討実験を実施することができた。2019年度は、(1)(3)の課題の実施を予定している。(1)2018年度に得られたTiO2(金属系の水溶性HNMs)の下水処理場での挙動データを踏まえ、放流先の水環境中における生物への影響の検討を目的として、水生生物への暴露試験を行う予定である。(2)有機系HNMsとして水酸化フラーレンの存在実態調査の実施を目的として、分析方法の開発を推進する。具体的には、熱分解GC-MSの導入等を検討することにより、定量化を目指す。(3)水中の有機汚染物質に対する有機系HNMsの吸脱着特性の把握を目的として、従来の下水処理では除去が不十分であるPFOS等を対象に、水酸化フラーレンや、同様に水溶性となる官能基が修飾されているカーボンナノチューブ等への吸脱着試験を実施する予定である。

(3)水溶性フラーレンとして、水酸化フラーレン(C60(OH)n・mH2O)に着目し、分析法の開発に着手した。分子量が一定ではないために複数の化合物(群)を包括的に定量する必要がある。そこで、試料に化学処理を施して全てC60に変換し、処理前後の濃度変化を算出することによる定量手法を検討した。3つの課題を遂行することができた。(1)研究開始直後から24時間通日下水処理場調査を実施することができた。特に、TiO2の通日調査データの獲得に成功し、1件の学会発表を行った。(2)比較対象としてのC60の分析方法についても試行錯誤の上に確立でき、下水処理水および下流の水環境を調査することで、流域中の種々の水媒体中の存在実態データを蓄積することができた。(3)水酸化フラーレンの分析方法について、確立にまでは至らなかったものの、定量化に繋がるアイデアを練ることができ、検討実験を実施することができた。2019年度は、(1)(3)の課題の実施を予定している。(1)2018年度に得られたTiO2(金属系の水溶性HNMs)の下水処理場での挙動データを踏まえ、放流先の水環境中における生物への影響の検討を目的として、水生生物への暴露試験を行う予定である。(2)有機系HNMsとして水酸化フラーレンの存在実態調査の実施を目的として、分析方法の開発を推進する。具体的には、熱分解GC-MSの導入等を検討することにより、定量化を目指す。(3)水中の有機汚染物質に対する有機系HNMsの吸脱着特性の把握を目的として、従来の下水処理では除去が不十分であるPFOS等を対象に、水酸化フラーレンや、同様に水溶性となる官能基が修飾されているカーボンナノチューブ等への吸脱着試験を実施する予定である。当初2018年度の実施を計画していた室内実験研究等を次年度に行うこととしたため、その実験に関わる物品費の使用額分を次年度に繰り越すことととした。また、打合せに要する旅費についても、当初計画よりも実施回数が減少したために打合せに関わる旅費の使用額分を次年度に繰り越すことととした。
超高効率ノックインシステムの開発

本研究プロジェクトではこれまでに外来遺伝子ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウスの高効率な作出手法を相次いで開発してきた。医学生物学分野で残る重要な遺伝子改変マウスは、ヒト疾患変異を時期・臓器・細胞種特異に発現誘導または抑制可能なコンディショナルノックインマウスである。いくつかのコンディショナルノックイン戦略が考案されてきたものの、スプライシング異常とnonsense-mediated decayによる遺伝子ノックアウトが誘導されてしまう事、あるいは遺伝子発現の不完全制御による発現量減少等の根本的な問題を抱えていた。最終年度はこれらの問題を克服するコンディショナルノックイン戦略と、これを実装したコンディショナルノックインマウス作製のための強力なノックイン手法を開発した。新たなコンディショナルノックイン戦略は発現誘導後もそれ以前と同等の遺伝子発現レベルを実現するが、そのために5-10kb程度の複雑な長鎖DNAのノックインを必要とする。CRISPRによる受精卵直接改変でこのような長鎖DNAノックインを作出することは極めて困難である。本研究では遺伝子スクリーニングから得られたノックインエンハンサーを用いることにより、これを極めて高効率に実現した。さらに3系統のヒト疾患コンディショナルノックインマウスを作出し、in vivoで任意の時期に任意の臓器・細胞種でヒト疾患変異を正常な遺伝子発現レベルで誘導可能であることを明らかにした。この新たなコンディショナルノックイン戦略と強力なノックイン手法は、ヒト疾患の忠実なモデルマウスの作出とその分子細胞基盤の解明のための強力なツールとなる。本研究成果は現在論文投稿中であるCRISPRを用いた長い遺伝子カセットのノックインは、特にマウス等の生物個体では依然困難である。ノックインには通常、相同組換え機構が用いられるが、その頻度は一般に極めて低い。平成28年度は、マウス受精卵でのDNA修復機構のおよそ半数を占めるマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)を応用したノックイン方法を開発した。この高頻度のMMEJに基づくノックインシステム・PITChは、受精卵内でCRISPRによりドナーDNAを切断して損傷修復反応を誘導すると共に、遺伝子カセット両末端にゲノムDNAに相同な40塩基マイクロホモロジーを付加して正確なノックインを促進する。現在困難とされる5000塩基の遺伝子のノックインをモデルとして、PITChによるノックインマウス作製を行ったところ、およそ10%の効率でノックインマウスを得ることに成功した。しかしながらその効率は、世界的な平均値に比べて相当高いものの、申請者の従来法に比べると1/3程度であった。そこで培養細胞系でのスクリーニング系を構築・探索し、多くのMMEJエンハンサーを同定、MMEJの分子機構の全貌を明らかした。これらのMMEJエンハンサーのうち、Exo1に着目してその後の実験を行なった。Exo1の過剰発現により、ヒト培養細胞でのノックイン効率は中程度に高まった。次にExo1を加えて、上記の5000塩基の遺伝子のノックインマウス作製を行ったところ、そのノックイン効率を、30%を越えるまでに高まることに成功した。さらにこの手法を用いて、現在最も困難とされるfloxマウスの作製を行ったところ、同様に30%を越えるノックイン効率でfloxマウスを得ることに成功した。以上から、Exo1で増強したMMEJに基づくPITCh法により、ヒト細胞及びマウス受精卵で高効率なノックインが実現された。本研究成果は論文発表した。研究は順調に進展している。特にMMEJエンハンサー分子群の同定と、これを用いたPITCh法の高効率化、そしてそのノックインマウス作製への応用が実現し、論文発表に至った。Cre- loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスは、現代生物学に欠かすことのできない重要なツールである。このシステムには、Creリコンビナーゼを発現するマウス(ノックインマウス)と、標的遺伝子が二つのloxP配列で挟まれているfloxノックインマウスの二つの遺伝子改変マウスが必要である。CRISPRの登場により単純なノックアウトマウスの作製は、従来のES細胞を用いることなく、受精卵の直接改変により、極めて容易に迅速に実現可能になった。一方で、CRISPRを用いたCreリコンビナーゼやfloxノックインマウスの受精卵直接改変による作製は、その基盤となる相同組換えの効率が極めて低いため、依然困難である。平成29年度は、Creリコンビナーゼやflox遺伝子を標的ゲノムに導入するために従来用いられて来た二本鎖DNAドナーに代わり長鎖一本鎖DNAドナーを開発した。さらに長鎖一本鎖DNAドナーと、我々がこれまでに開発してきた高効率CRISPRシステム・クローニングフリーCRISPRを組みわせる事で、マウス受精卵において極めて高いノックイン効率を実現可能であることを示した。様々なCreリコンビナーゼノックインマウス及びfloxノックインマウスを最大100%の極めて高い効率で作出する事に成功した。合計13遺伝子において、Creリコンビナーゼノックインマウス及びfloxノックインマウスを作出し、この手法が極めて頑強であることを示した。そのノックイン効率は、ほとんどの遺伝子座で数十%のレンジであり、3遺伝子においては最大100%に達した。本手法は極めて簡便で、ノックイン効率は極めて高く、様々な遺伝子で同様の効果を発揮し、最短1ヶ月で完了する事から、今後の遺伝子改変マウス作製の標準手法となることが期待される。この本研究成果は論文発表した。

特に長鎖一本鎖DNAドナーの開発と、これにクローニングフリーCRISPRを組みわせる事によるノックインの超高効率化、そして従来困難であったCreリコンビナーゼ及びfloxノックインマウス作製への応用を実現し、論文発表に至った。本研究プロジェクトではこれまでに外来遺伝子ノックインマウス、コンディショナルノックアウトマウスの高効率な作出手法を相次いで開発してきた。医学生物学分野で残る重要な遺伝子改変マウスは、ヒト疾患変異を時期・臓器・細胞種特異に発現誘導または抑制可能なコンディショナルノックインマウスである。いくつかのコンディショナルノックイン戦略が考案されてきたものの、スプライシング異常とnonsense-mediated decayによる遺伝子ノックアウトが誘導されてしまう事、あるいは遺伝子発現の不完全制御による発現量減少等の根本的な問題を抱えていた。最終年度はこれらの問題を克服するコンディショナルノックイン戦略と、これを実装したコンディショナルノックインマウス作製のための強力なノックイン手法を開発した。新たなコンディショナルノックイン戦略は発現誘導後もそれ以前と同等の遺伝子発現レベルを実現するが、そのために5-10kb程度の複雑な長鎖DNAのノックインを必要とする。CRISPRによる受精卵直接改変でこのような長鎖DNAノックインを作出することは極めて困難である。本研究では遺伝子スクリーニングから得られたノックインエンハンサーを用いることにより、これを極めて高効率に実現した。さらに3系統のヒト疾患コンディショナルノックインマウスを作出し、in vivoで任意の時期に任意の臓器・細胞種でヒト疾患変異を正常な遺伝子発現レベルで誘導可能であることを明らかにした。この新たなコンディショナルノックイン戦略と強力なノックイン手法は、ヒト疾患の忠実なモデルマウスの作出とその分子細胞基盤の解明のための強力なツールとなる。本研究成果は現在論文投稿中であるExo1増強PITCh法は高効率ノックインを実現したが、その効率はマウスでは依然30%強であり、さらなる高効率化が必要である。MMEJの最適化、CRISPR活性化の最大化を進め、これらの組み合わせにより高効率化を実現していく。これまでに様々な高効率ノックイン手法を開発してきた。最終年度はそれらのさらなる改良に加え、生物学研究推進のための応用を進めて行く。研究の進展により平成28年度の計画を効率的に完了したため、次年度使用額が生じた。研究の進展により平成29年度の計画を効率的に終了したため、少額の次年度使用額が生じた。次年度の研究計画の効率的な推進に活用する。平成29年度の研究計画促進のため、次年度使用額はそれら研究の物品費に用いる。
キラルケイ素テクノロジーの開拓

H30年度の研究では生物活性を有するキラルケイ素分子の不斉合成を指向して,生物活性天然物に広く見受けられるキラルテトラヒドロピランやキラルヒドロキシ酸などの不斉炭素を不斉ケイ素に置き換えた分子の合成について検討した.また,キラルケイ素ラジカル種の立体選択的な調製とその反応について検討した.1)環拡大型1,2-Brook転位によるキラルシラテトラヒドロピランの立体選択的合成先に不斉合成に成功している2-ヒドロキシシラシクロペンタン類に対して塩基を作用させることで生じる金属アルコキシドの1,2-Brook転位について検討した.種々の強塩基を用いて反応を行なった結果,塩基の対カチオンとしてリチウムを選択することでテトラヒドロピラン骨格を有するキラルケイ素分子を立体特異的に得ることに成功した.2)シラノール誘導体の求核置換反応によるキラルシラヒドロキシ酸の合成ケイ素不斉を有するキラルヒドロキシ酸の合成を目的として脱離基を有するシラノールとアシルアニオン等価体の求核置換反応について検討した.その結果,ビニルエーテルから調製したアニオン種を求核剤として用いる反応を鍵反応として用いることで,光学活性シラノールから立体特異的にキラルヒドロキシ酸を合成することに成功した.3)キラルケイ素ラジカルの調製とその立体制御キラルケイ素分子の基礎化学と全く新しい不斉合成法の開発を目的として,キラルケイ素ラジカルの反応性を活用した立体選択的ケイ素ー炭素結合性性反応の開発について検討した.その結果,ある種のヒドロシラン類から生じるシリルラジカルとアルケン類の付加反応が効率的に進行することを見出した.しかしながら,その立体化学制御は達成していない.現在までの検討の結果,多様なキラルケイ素分子を不斉合成することに成功し,その精密合成化学の基礎を確立した.また,それらの合成手法を応用することで新たな生理活性キラルケイ素分子を見出し,その研究意義を明確にした.これらの成果は,本研究が目指すキラルケイ素テクノロジーの核心であり,当初の予想を上回っている.一方,ケイ素カチオンやケイ素ラジカルの立体化学制御などのごく基礎的かつ挑戦的な研究領域の開拓には至っていないことから,更なる検討が必要である.これまでに合成したキラルシラシクロペンタン類やキラルシラヒドロピラン,キラルシラヒドロキシ酸を合成素子として活用することで,重要キラル天然物の不斉炭素を不斉ケイ素に置き換えた擬似キラル天然物の不斉合成に展開する計画である.また,キラルケイ素カチオンやキラルケイ素ラジカルの反応について検討を進め,実用的な不斉合成法としての開発を目指す.さらに,これまでに生物活性を明らかにしているシラシクロペンタン類の構造活性相関研究を進めるとともにそれらの動態解析を行い,キラルケイ素分子が生体内でどのような代謝を受けるのかを明らかにする.H29年度の研究では,先に我々が不斉合成法を確立したシラシクロペンテノールを不斉合成素子として用いることで,多様なシラシクロペンタン類を高立体選択的に不斉合成することに成功した.その鍵となるのはシラシクロペンテノールC4位ヒドロキシ基の置換反応であり,光延反応と辻-Trost反応を相補的に用いることで,立体化学が反転した,あるいは立体化学が保持された置換反応性生成物をそれぞれほぼ単一の立体異性体として得た.さらに,求核置換反応生成物を変換することで,シラシクロペンタントリオールの新規立体異性体を不斉合成した.今回不斉合成したシラシクロペンタントリオールと,これまでに合成している関連分子のセロトニン受容タンパクへの結合活性を比較することで,その活性の発現の鍵となる重要構造に関する知見を得た.さらに,本研究の過程において,生化学上重要なノルアドレナリン受容体やナトリウムチャネルに対して強い活性を示すシラシクロペンタン類を新たに見出すことに成功した.これらの結果は,キラルケイ素分子が特異な生理活性を発現することを意味しており,キラルケイ素分子の精密合成化学が新しい創薬研究の基盤技術となりうることを強く支持するものである.これらの研究成果の一部を国際学術誌(Synlett, 2017, 28, 2445-2448)に報告するとともに,生理活性シラシクロペンタン類の物質と製造法に関する特許を出願した(特願2018-032202).本研究課題の主目的の一つである,生理活性キラルケイ素分子の開発に関して大きな研究の進展が見られた.これらの研究成果は,キラルケイ素分子が特異な生理活性を発現することを意味しており,キラルケイ素分子の精密合成化学が新しい創薬研究の基盤技術となりうることを強く示唆している.さらに,多様なキラルシラシクロペンタン類の不斉合成法を開発することに成功したことから,それらの新手法を応用することで,生理活性キラル天然物の不斉炭素を不斉ケイ素に置き換えた,天然物型キラルケイ素分子の不斉合成研究を推進中である.また,キラルケイ素分子の基礎科学として,キラルケイ素ラジカルの立体化学的安定性やその合成化学的応用について研究を実施するとともに,不斉ケイ素上における求核置換反応の立体化学経路について多くの新知見を得た.その研究過程において,ビニルシラノールを鍵中間体とするキラルケイ素分子の新たな絶対立体化学決定法を開発することに成功した.これらの研究成果は,キラルケイ素テクノロジーの開拓における基礎的かつ重要なものであり,当初の研究計画以上に進展していると言える.

H30年度の研究では生物活性を有するキラルケイ素分子の不斉合成を指向して,生物活性天然物に広く見受けられるキラルテトラヒドロピランやキラルヒドロキシ酸などの不斉炭素を不斉ケイ素に置き換えた分子の合成について検討した.また,キラルケイ素ラジカル種の立体選択的な調製とその反応について検討した.1)環拡大型1,2-Brook転位によるキラルシラテトラヒドロピランの立体選択的合成先に不斉合成に成功している2-ヒドロキシシラシクロペンタン類に対して塩基を作用させることで生じる金属アルコキシドの1,2-Brook転位について検討した.種々の強塩基を用いて反応を行なった結果,塩基の対カチオンとしてリチウムを選択することでテトラヒドロピラン骨格を有するキラルケイ素分子を立体特異的に得ることに成功した.2)シラノール誘導体の求核置換反応によるキラルシラヒドロキシ酸の合成ケイ素不斉を有するキラルヒドロキシ酸の合成を目的として脱離基を有するシラノールとアシルアニオン等価体の求核置換反応について検討した.その結果,ビニルエーテルから調製したアニオン種を求核剤として用いる反応を鍵反応として用いることで,光学活性シラノールから立体特異的にキラルヒドロキシ酸を合成することに成功した.3)キラルケイ素ラジカルの調製とその立体制御キラルケイ素分子の基礎化学と全く新しい不斉合成法の開発を目的として,キラルケイ素ラジカルの反応性を活用した立体選択的ケイ素ー炭素結合性性反応の開発について検討した.その結果,ある種のヒドロシラン類から生じるシリルラジカルとアルケン類の付加反応が効率的に進行することを見出した.しかしながら,その立体化学制御は達成していない.現在までの検討の結果,多様なキラルケイ素分子を不斉合成することに成功し,その精密合成化学の基礎を確立した.また,それらの合成手法を応用することで新たな生理活性キラルケイ素分子を見出し,その研究意義を明確にした.これらの成果は,本研究が目指すキラルケイ素テクノロジーの核心であり,当初の予想を上回っている.一方,ケイ素カチオンやケイ素ラジカルの立体化学制御などのごく基礎的かつ挑戦的な研究領域の開拓には至っていないことから,更なる検討が必要である.これまでに生理活性を見出しているキラルシラシクロペンタン類の活性の発現機構について精査するとともに,その代謝動態について精査する.すでに,ノルアドレナリン受容体に対する結合活性を有する新規シラシクロペンタンに関しては動物実験を実施しており,循環器系への影響について初期的な知見が得られるとともに,ICP-MSやMALDI-TOFMSなどを利用して,ケイ素を含む代謝物の探索と構造同定を進めている.また,天然物型のキラルケイ素分を不斉合成して,その活性と代謝動態を明らかにする.具体的には,ペプチドや多糖,プロスタグランジンなどのキラルケイ素アナログを合成する計画である.また,基礎的な知見が得られているキラルケイ素ラジカルの反応や不斉ケイ素上での求核置換反応を合成反応として積極的に応用して,キラルケイ素分子の精密不斉合成化学の確立を目指す.さらに,キラルケイ素分子を集積したキラル材料の合成と分析についても実施する計画である.
協同・協調的な学習活動場面におけるこどもの認知とストレスの関連

本研究の目的は,社会的自己保存理論を基盤として,子どもの自尊心の傷つきや恥の感覚が生じやすいと考えられる学習場面ストレスについて,心理的・生理的指標(唾液中αアミラーゼ活性値:sAA,等)を用いて実験的に検証することである。実験の結果,課題成績の優劣や社会的文脈の捉え方(競争場面で他者に自らの能力を低く評価される,協同作業場面で他者に迷惑を掛けてしまう,等の懸念),課題に対する志向性,作業環境,などの要因が学習者の心理的・生理的ストレス(sAA値)の変化に影響している可能性が示唆され,学校現場における子どものための教育環境デザインの構築に資する知見が得られた。今年度は,学習者の社会的スキルに着目して,「他者の存在」を意識する学習活動場面でのストレス状況を生理的指標から検討する実験を行った.健常な大学生83名(男22名,女61名)を対象に,2種類の学習環境(open条件:課題タスクの成績開示有,close条件:開示無)を設定した,社会的スキルの測定にはKiSS-18(菊池,1988),ストレス指標には唾液中αアミラーゼ活性(AMY値)をもちいた.<結果1>課題タスクの[正答率]はclose条件においてopen条件より高い有意傾向が示され,[反応時間]はopen条件ではclose条件よりも有意に速い傾向が示された.[生理指標]ではopen条件において実験直後のAMY値が10分後,20分後よりも有意に高い傾向が認められたのに対して,close条件ではどの段階も有意ではなかった.<結果2>学習者を社会的スキル高低の2群に分けて分析した結果,[正答率]では高群は低群よりも有意に好成績であり,[反応時間]では高群は低群よりも回答が速かった.[生理指標]では,close条件において交互作用が有意となり,低群においてのみ実験直後が20分後よりも有意に高かった.これらの結果より,課題タスクの遂行において,(1)他者に成績を開示されるopen条件ではストレスが高く,(2)社会的スキルの低い学習者は,成績が開示されないclose条件であってもグループでの学習活動場面に心理的負荷を感じ,「他者の存在」を意識することによってパフォーマンスが影響される可能性が示唆された.[目的]社会的自己保存理論を基盤として,個人の社会的自己が脅かされる状況と唾液中アミラーゼ活性の関連を検証する実験を行った。[方法]実験参加者(日本人大学生77人)は,次の2つの条件下でコンピュータに表示される暗算課題で満点をめざす挑戦を要求された。条件Aでは,参加者は複数の観察者に計算成績をモニターされる状況で計算タスクを行った(社会評価脅威文脈、SET)。条件Bでは,観察者は同じ位置に着席するが,参加者の計算成績をモニターする代わりにアニメーション映画を鑑賞した(非SET)。実験中,心理尺度を用いて主観的ストレスも同時に測定した。[結果]結果は,社会的自己保存理論を支持した。まず,[1]実験参加者の生理的および主観的ストレスレベルは,A条件(SET)において課題遂行直後に有意に上昇した。一方,B条件(非SET)では、生理的・主観的いずれもストレス値の増加は示されなかった。つぎに,[2]計算課題の好成績群では、A条件(SET)においてのみ,生理的・主観的ストレスレベルの上昇が確認され,社会評価脅威の影響が強いことが示唆された。一方,低成績群では、A・B条件いずれにおいても生理的・主観的ストレスの増加が確認され,計算課題そのもののストレスの大きさが示唆された。[結論]実験結果は仮説を支持した。特に,課題成績の良好群において社会的自己保存理論が支持された。平成25年度は,協同・協調的な学習場面を想定したストレス実験を継続して実施した。ストレス測定には,質問紙と面接調査による心理的ストレス評価,および生理的指標として,脳血流量,視線追尾,唾液中αアミラーゼ活性(sAA値)等をもちいた。今年度は,これまでの実験結果を踏まえて,ストレス場面にコンピュータが出題する精神作業課題(暗算課題)の遂行を同室内で他者に直接観察される条件と,モニター画面を通して別室から映像と音声を観察される条件の設定を加えた。追加した両条件は,いずれも他者に課題遂行の様子や成績をリアルタイムで観察される場面であり,実験参加者の社会的自己が脅かされるSET(社会評価脅威文脈)条件であったが,分析の結果,同室で直接観察される条件において,より心理的・生理的ストレスが高まる傾向が示された。このことから,学習場面の社会的文脈だけでなく物理的な作業環境そのものの影響について議論した。

また,今年度は最終年度となるため,これまでの研究総括を行い,EDAR42(Hirata, Ishikawa, & Mazumdar, 2011)およびICIRE(Hirata & Ishikawa, 2012)の発表データについて,実験参加者の認知や個人属性によるストレス反応の差異について追加分析を行って検証した。その結果,課題成績の優劣や文脈の捉え方(競争場面で他者に自らの能力を低く評価される,協同作業場面で他者に迷惑を掛けてしまう,等の懸念)や課題に対する志向性等が学習者のストレスに影響する可能性が示唆された。[目的]社会的自己保存理論を基盤として,社会的自己が脅かされる文脈での生理・心理的ストレスの測定を試みる。[方法]精神作業(コンピュータ画面に提示される四則演算の暗算課題)の遂行時,単独で対面する相手と競争するIC条件,二人一組で協調して他ペアと競争するCC条件,の実験デザインを計画して,実験参加者43名を対象に,課題遂行中の社会的文脈が心理的ストレス評価と唾液中α-アミラーゼ活性(sAA)に与える影響を検証した。[結果]作業条件とAMY値変化の2要因分散分析が有意でなかったため,暗算課題の成績(正答率)別の分析をおこなった.正答率の高かった成績達成群・中間群では,IC・CC両条件においてsAA変化はなかった。それに対して,成績不振群では,CC条件においてのみsAAの有意な上昇が認められた。[考察]本実験結果より,計算課題成績不振時の唾液αアミラーゼ値は単独より協同での競争場面で上昇したことが検証され,協同作業で他者に迷惑を掛けることが社会的自己を脅かすストレスとなる可能性について議論した。本研究の主眼である「作業負荷が高まりやすい文脈とそれに対する遂行者本人の状況理解が,心理的・生理的ストレス指標におよぼす影響」について,平成22年度は唾液中αアミラーゼ活性平常値の高低と社会的スキル,平成23年度は課題成績の高低,の要因を取り上げ計画通りに実験を進めている。その成果は,国内外で学会発表を行っており,おおむね順調に進展しているものと自己評価する。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の主眼である「作業負荷が高まりやすい文脈とそれに対する遂行者本人の状況理解が,心理的・生理的ストレス指標におよぼす影響」について,平成22年度は唾液中αアミラーゼ活性平常値の高低と社会的スキル,平成23年度は課題成績の高低,平成24年度は協同・協調学習場面特有の作業負荷,の各要因を取り上げ計画通りに実験を進めている。平成24年度以降は,特に生理的・心理的作業負荷が高まりやすい社会的文脈として,「協同・協調学習場面」に焦点化したストレス実験を行う。実験プログラムは,既に連携研究者(上越教育大学大学院石川真氏)により作成・提供されており,本研究遂行上,特に問題はない。平成25年度以降は,生理的・心理的作業負荷が高まりやすい社会的文脈として,「協同・協調学習場面」に焦点化したストレス実験の実施継続とこれまでの総括を行う。
新しい視点による血管新生阻害剤を用いた転移性肝癌に対する化学療法に関する研究

血管新生阻害剤は転移性肝癌の新たな治療法としてひじょうに期待されている。そこで我々は転移性肝癌に対する血管新生阻害剤の臨床応用を可能にするために実験1(投与経路、方法、量、副作用の検討)家兎を用い経門脈的にVX2腫瘍を移植し、血管新生阻害剤を経動脈、経門脈、経静脈的に単回及び持続投与し、2週間後に肝転移数からその効果を、血清生化学、体重などから副作用を検討した。そして(1)15mg/kgの濃度では肝機能に影響する事無く体重変化をきたさずに、肝転移を抑制すること、(2)特に動脈投与でその効果が顕著であること。実験2(血管新生の解析、組織再生に及ぼす影響の検討)血管新生阻害剤投与群とコントロール群に肝切除を行い、2週間後にレーザードップラー血流計による肝血流量、再生肝重量、肝組織Brdu labeling index、皮膚組織の組織学的検討、皮膚張力の検討を行い、肝再生、組織修復への影響を調べた。またその肝臓にシリコンゴムを血管から注入し、鋳型モデルを作成し、実際に腫瘍血管新生が阻害されているかどうか検討した。そして(1)実際に血管新生阻害剤を投与すると腫瘍血管新生が阻害されていること。(2)15mg/kgの濃度では正常な肝再生、組織修復を阻害せずに転移を抑制する事が可能であること。を明らかにし、第45回消化器外科学会に報告した。
環境低負荷型の新しい構造物基礎実現へ向けた実験・解析的検討

近い将来問題になると考えられる大口径既存杭の処理に対し,これを積極的に再利用することで工期短縮,コスト削減,さらに資源の有効利用による環境負荷の低減ができる新しい建物基礎(杭頭絶縁基礎)を研究代表者らは提案している。その提案基礎を実現可能とするため,これまで実大に近い実験模型を実地盤に設置し地震観測を行い,提案基礎が他の基礎形式に比べ構造物の地震応答を低減できることを確認した。そして実験模型の計算モデルを作成し弾性領域サブストラクチャー法に基づく3次元有限要素法と薄層法によるシミュレーション解析を行い,そのメカニズムを明らかにした。その提案基礎を実用可能とするため,実大に近い実験模型を実地盤に設置し地震観測を行った。観測記録の分析から提案基礎は従来の基礎に比べ構造物の応答加速度が低減され,地震動入力の低減効果があることが明らかになった。実験模型の数値解析によるシミュレーションを行い,構造物応答低減には,提案基礎の非接合部分によってロッキングが抑制されたことが大きく影響していることが明らかになった。その提案基礎を実現可能とするため,これまで実大に近い実験模型を実地盤に設置し地震観測を行ってきた。地震観測記録から,提案基礎が他の直接基礎や杭基礎に比べ地震時応答が低減できる原因として,構造物のロッキング動が抑制されていることが大きく影響していることが分かっている。そのメカニズムを明らかにするため実験模型の計算モデルを作成しシミュレーション解析を行った。その結果,以下のことが明らかになった。提案基礎を直接基礎と比べた場合,薄層を介して剛性の高い杭が下にあるため構造物のロッキングが抑えられる。杭基礎については杭と構造物が剛結されており地震時には構造物の慣性力の影響を受け杭頭付近は周辺地盤と異なる震動をし,杭と地盤の相対変位が生じる。その結果,地震を経験するたびに杭頭付近では周辺地盤との間に隙間が生じ,杭頭付近は突出杭に近い状態になる。それにより杭基礎の場合の構造物の地震時応答は大きくなる。しかし,提案基礎の場合,杭と構造物が絶縁されており構造物の水平慣性力が杭に伝わらないため,杭は地盤変形に追従する。そのため提案基礎では杭基礎での突出杭のような大きな応答は生じない。数値解析により実験結果をおおむね再現でき,提案基礎の地震時応答低減メカニズムを明らかにすることができた。地震観測記録から,提案基礎が他の直接基礎や杭基礎に比べ地震時応答が低減できる原因として,構造物のロッキング動抑制が大きく影響していることが分かっている。そのメカニズムを明らかにするため実験模型の計算モデルを作成し弾性領域サブストラクチャー法に基づく3次元有限要素法と薄層法によるシミュレーション解析を行った。提案基礎を直接基礎と比べた場合,薄層を介して剛性の高い杭が下にあるため構造物のロッキングが抑えられ,応答も小さくなる。提案基礎の杭直上の薄層部分の剛性等の物性が構造物の応答に与える影響は小さい。杭基礎については,杭と構造物が剛結されており地震時には構造物の慣性力の影響を受け杭頭付近は周辺地盤と異なる震動をし,杭と地盤の相対変位が生じる。一方で,提案基礎の場合,杭と構造物が絶縁されており構造物の水平慣性力が杭に伝わらないため,杭は地盤変形に追従する。地震観測については以前の地盤への基礎の接地問題があったが,再接地工事を行いその後は良好な結果が得られている。数値解析も実験結果をおおむね再現できている。数値解析によりパラメトリックスタディを行い,提案基礎の地震時挙動に与える重要なパラメータを明らかにする。設計への導入を目標に簡易評価モデルの構築を検討する。地盤地震工学

引き続き数値解析による検討を行い,提案基礎の地震動入力低減効果のメカニズムについて詳細に把握し,実験では再現できなかったより現実的な構造物のサイズや杭本数などの条件での特性について検討する。小型の模型により,パラメータ(薄層厚,杭間隔など)を変化させた震動実験を行う。設計への導入を目標に簡易評価モデルの構築を検討する。小型模型実験を行う予定であったが,振動台の価格が予定を上回り購入できなかったため。地震観測において良好な記録が得られ,観測装置(センサ)の追加が不要となったため。繰越金と合わせ小型振動台,または地盤振動を計測するためのセンサを購入する。小さな模型による実験を行い,より多くの条件(薄層厚,杭間隔)での検討をする。
加齢に伴う歯髄歯周組織の形態学的・生理学的研究及び臨床的特発性歯痛の疫学的研究

加齢に伴う変化を各方面から研究し、以下の結果を得た。1.侵害刺激に対する反射性咀嚼筋筋活動の週齢変化ラット上顎第一臼歯歯髄神経にmustard oilを適用する化学刺激により誘発される反射性静的筋活動は、週齢が増加するにつれて減少した。この変化は特に同側咬筋において著明であった。また、筋活動の遅い変化(2次反応)の開始時間が、週齢の増加に伴い遅延した。これらから、疼痛性刺激に対する反射性筋活動の変化に加齢が関与することが示唆された。2.ラット臼歯歯髄の免疫担当細胞の加齢変動加齢と伴に歯髄神経内マイクロファージは密度を減少させる。特にMHC classll陽性細胞が著明に減少していることは重要である。またED1陽性細胞の染色強度低下は、貧食能の低下を示唆している。しかし、各細胞の密度は保持されていることから、高齢ラットもかなりの防禦能を有していると考えられる。3.ヒト歯髄感覚と神経応答の加齢変化動水力学的機序に基づく感覚受容神経線維の比率が減少した。これは伝導速度の大きい線維が機能喪失するか、硬組織添加のために刺激受容能が喪失するためであると考えられる。また、高齢者で感覚に上らない誘発発射あるいは自発発射がみられたことは、空間的、時間的加重不足によると考えられる。4.細胞周期とアルカリフォスファターゼ(ALPase)活性の加齢変化ヒト歯髄細胞の細胞周期に変化は認められなかった。これは、歯髄が硬組織に囲まれた特殊な器官なので、細胞周期変化よりも先に網様萎縮や石灰変性という組織学的変化が生じるためであると考えられる。また、高齢者のALPase活性が若年者より有意に減少したので、歯髄修復能が落ちてくることを示している。歯髄・歯周組織の加齢的変化を形態学的・機能学的に明らかにしようとする基礎的研究と,加齢に伴い発現頻度が増加すると考えられる難治性疼痛の歯科保存学的臨床的研究により,この疾患の解析を試みた.本年度の研究成果ならびに研究の進行状況は,以下の通りである.(1)形態学的研究:当初の目的では,歯髄および歯周組織の加齢に伴う形態学的変化を観察する予定であったが,研究対象とした新鮮抜去歯の入手が困難なため(既に入手済みの材料については,現在標本作成中である),動物実験により以下に記す成果を得た.ラット臼歯歯髄内免疫担当細胞の分布様式を免疫組織化学的手法により解析し,歯冠歯髄でマクロファージは生後24週まで,また形質細胞・リンパ球は生後14週まで増加するが,その後は生後1.5年までは分布に顕著な変動を示すことはなかった.(2)病態生理学的研究:本年度は歯髄神経の慢性刺激法を確立することを研究の第一目的とした.起炎性・疼痛性化学物質をラット臼歯歯髄に適用した際の咀嚼筋筋活動を静的筋電図(sEMG)を指標に観察し,化学物質を投与した臼歯と同側の咬筋を中心にsEMGの増大が生じることを見いだした.これは従来から報告されている開口反射とは異なり,歯髄神経の化学的慢性刺激が三叉神経系のシナプスの可塑的変化をもたらし,その結果として反射的に咀嚼筋静的筋活動を誘発したものと考えられる.第二目的の歯髄血流の観察では,Nd:YAG laserをネコ犬歯歯冠歯質を介して歯髄に照射した際の歯髄血流量は,歯冠部では変性に伴い減少するも,歯頚部より根尖に近い部分では著しく増加した.