hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Rh式血液型遺伝子の塩基配列決定とその法医学的応用に関する研究

1.各Rh表現型におけるRhポリペプチドの遺伝子解析Rhシステムの各種表現型を有する健常者由来の赤血球系培養細胞および網状赤血球から得られたRhポリペプチド-cDNAクローンを分析し、RhPIおよびRhPIIクローンに加え、RhPIクローンに7個そしてRhPIIクローンに5個のvariantクローンを同定した。一部のvariantクローンについては、家計調査によりその遺伝を確認した。2.Rhポリペプチド・アイソフォームの解析1)スプライシング・マップの作成RhPI cDNAには12種類のアイソフォームが見いだされ、10個のエキソンのうち第4-9の6つのエキソンに選択的スプライシングを認めた。一方、RhPII cDNAには6種類のアイソフォームがあり、10個のエキソンのうち第7、8、9エキソンに選択的スプライシングを認めた。これらの成績をもとに、スプライシング・マップを作成した。2)赤血球分化とRhポリペプチド・アイソフォームRhPIおよびRhPII mRNAは、BFU-Eから網状赤血球に至る全ステージに同定された。また、赤血球分化の初期にはRhPI-α、βmRNAを認めたが、分化とともに減少し同定できなくなった。一方、RhPI-T3、RhPII-T3 mRNAは赤血球分化の後期にはじめて同定された。これらのRh関連mRNAは,RhPI、RhPII mRNAのスプライシング・アイソフォームであり、赤血球分化、赤血球膜の構造、機能に重要な役割を果たしていることも予想される。3)白血球におけるRhポリペプチドの発現PCR-サザン法により、各種白血球におけるRhポリペプチドの発現をmRNAレベルで検討したところ、ミエロ系、Tリンパ球、Bリンパ球、単球のすべての細胞において複数のバンドが得られ、しかもそのバンドの組合わせは各細胞に特異的なスプライシング・アイソフォームで構成されていることが推測された。Rhシステムの分子遺伝子学的解析を進め、いくつかの新知見が得られた。1.Rhポリペプチド-cDNAのクローニング2種類のRhポリペプチドをコードするcDNA(RhPI,RhPII)をクローニングした。RhPIcDNAは、Dherif-Zaharらの報告したRhポリペプチド-cDNAと比較し1塩基置換を有し、一方RhRII cDNAには41塩基置換を認めた。RhPI,RhPII cDNAクローンはいずれも1251塩基のオープンリーディングフレームを有し、この2つのクローンにコードされている417個のアミノ酸からなるポリペプチドには、疎水性解析の結果、12個の膜貫通ドメインの存在が推測された。2.各種Rhシステム表現型における遺伝子解析RhPI,RhPII cDNAクローンは、RhD陽性者のみならず陰性者にも検出され、RhD以外の抗原をコードしていると考えられた。これらのクローンは、Rhnull、-D-などのドナーにおいても見いだされた。以上の結果は、Rhシステムの3遺伝子説を強く支持し、さらにRh抗原の細胞膜上へ発現には、何らかの結合分子の存在を予測させた。Rhシステムの各種表現型におけるRhPIならびにRhPII cDNAを解析し、いずれにも複数のvariantが同定され、各抗原系との対応を検討した結果、RhPI cDNAはRhE/e抗原をコードしていると推測された。3.Rh遺伝子のスプライシング機構Rh遺伝子のスプライシング機構の系統的解析を試み、RhPI,RhPII mRNAに多数のスプライシング・アイソフォームを分離し、Rhシステムの複雑な抗原系を解明する糸口を見いだした。4.白血球系細胞におけるRh遺伝子の発現白血系球細胞におけるRh遺伝子の発現を検討し、RhポリペプチドはmRNAレベルでは、骨髄球系、単球系、T細胞系、B細胞系にも存在するとを見いだした。

1.各Rh表現型におけるRhポリペプチドの遺伝子解析Rhシステムの各種表現型を有する健常者由来の赤血球系培養細胞および網状赤血球から得られたRhポリペプチド-cDNAクローンを分析し、RhPIおよびRhPIIクローンに加え、RhPIクローンに7個、そしてRhPIIクローンに5個のvariantoクローンを同定した。一部のvariantクローンについては、家系調査によりその遺伝を確認した。2.Rhポリペプチド・アイソフォームの解析1)スプライシング・マップの作成RhPI cDNAには12種類のアイソフォームが見いだされ、10個のエキソンのうち第4-9の6つのエキソンに選択的スプライシングを認めた。一方、RhPII cDNAには6種類のアイソフォームがあり、10個のエキソンのうち第7、8、9エキソンに選択的スプライシングを認めた。これらの成績をもとに、スプライシング・マップを作成した。2)赤血球分化とRhポリペプチド・アイソフォームRhPIおよびRhPII mRNAは、BFU-Eから網状赤血球に至る全ステージに同定された。また、赤血球分化の初期にはRhPI-α、βmRNAを認めたが、分化とともに減少し同定できなくなった。一方、RhPI-T3、RhPII-T3 mRNAは、赤血球分化の後期にはじめて同定された。これらのRh関連mRNAは、RhPI、RhPII mRNAのスプライシング・アイソフォームであり、赤血球分化、赤血球膜の構造、機能に重要な役割を果していることも予想される。3)白血球におけるRhポリペプチドの発現PCR-サザン法により、各種白血球におけるRhポリペプチドの発現をmRNAレベルで検討したところ、ミエロ系、Tリンパ球、Bリンパ球、単球のすべての細胞において複数のバンドが得られ、しかもそのバンドの組み合わせは各細胞に特異的なスプライシング・アイソフォームで構成されていることが推測された。
ヒト正常上皮細胞におけるp53-Notch1経路の破綻とがん化

ヒトの正常な細胞には、細胞の無秩序な増殖を防ぐためのブレーキ役となる様々な安全機構が備わっています。私の研究はこの安全機構の一つとして"p53-Notch1"という新規の分子経路を見出し、これがどのようにして破壊され細胞のがん化につながるのかを明らかにしました。特に、p53のファミリー分子であるp63がNotch1がん抑制遺伝子に直接作用して、p53によるNotch1発現およびp53によらないNotch1発現のいずれも阻害し、細胞増殖能の維持に働くことを突き止めました。Notch1による細胞増殖抑制効果は、子宮頸がん以外でも肝細胞がん、小細胞肺がん、前立腺がん等においても報告されている。本研究より、子宮頸部や皮膚に由来する角化細胞、細気管支上皮細胞、気管支上皮細胞など種々のヒト正常上皮細胞に活性型Notch1を外来導入した場合、顕著な細胞増殖抑制が引き起こされた。また、p53温度感受性変異体を種々の正常上皮細胞に導入し解析したところ、p53の活性に依存してNotch1の発現が観察された。子宮頸部や皮膚に由来する角化細胞においてRNA干渉法を用いて内在性p53をノックダウンしたところ、Notch1の発現低下が観察された。このp53によるNotch1の発現制御は転写レベルで行われており、Notch1プロモーターのリポーターアッセイ並びにクロマチン免疫沈降法を用いた解析により、Notch1プロモーター内にp53応答配列を同定しNotch1がp53の標的遺伝子であることを見出した。正常上皮細胞において、ゲノム傷害時の細胞増殖抑制がNotch1の発現誘導に依存しているか否か検討するため、p53ノックダウン細胞、Notch1ノックダウン細胞を作製し比較検討を行った。その結果、Notch1のノックダウンによりp53の活性化を介した細胞増殖抑制が有意に回避されることが判明した。さらにゲノム傷害時に活性化したp53がNotch1の発現誘導により文化を促進することを見出した。以上の結果から、異なる複数のヒト正常上皮細胞においてp53-Notch1経路が保存されており、ゲノム傷害時に分化誘導を介した細胞増殖抑制を引き起こすことを明らかにした。本研究は、申請者の見出した新規がん抑制経路であるp53-Notchl経路の活性化に対して、p53の不活化やΔNp63の過剰発現がもたらす影響を解析し、ヒト正常上皮細胞におけるp53-Notchl経路の生理学的意義と上皮がん抑制における機能的役割を明らかにする事を目的としている。p63は重層扁平上皮組織の発生・維持に必須のマスター遺伝子であり、N末の転写活性化ドメインを欠いたΔNp63アイソフォームが特異的に基底細胞で発現している。p53とは対照的にp63遺伝子の変異はがんにおいてほとんど報告されていないが、ΔNp63の高発現が多くの扁平上皮がんにおいて高頻度に観察されている。しかしながら、その発がんにおける意義は明らかにされていない。これまで、ゲノム傷害が引き金となるNotchlの発現誘導時に、NotchlプロモーターからΔNp63が解離しp53と置き換わることを見出している。またp53-Notchl経路の活性化によって角化細胞の分化が促進されること、並びに分化に伴いΔNp63蛋白レベルが下方調節されることを明らかにしている。今回、RNA干渉法を用いてΔNp63をノックダウンしたところNotchlの発現充進と分化誘導が観察された。このNotchlの発現上昇は転写レベルで起きており、Notchlプロモーターの活性化を伴うことを明らかにした。さらに、Notchlの発現抑制によってΔNp63ノックダウンによる表現型が有意にレスキューされたことから、ΔNp63発現低下による分化誘導は少なくとも部分的にはNotchlの機能を介したものであることが示唆された。対して、ΔNp63を過剰発現させたところNotchlの発現低下と分化抵抗性が認められた。これらの結果から、ΔNp63がNotchl遺伝子に対してリプレッサーとして機能し、細胞分化を負に制御することが明らかとなった。p53ファミリーの一員であるp63は重層扁平上皮組織のマスター遺伝子であり、成体組織ではN末の転写活性化ドメインを欠いたΔNp63αアイソフォームが独占的に発現し、基底層における幹細胞性の維持に役割を持つことが示されている。p53とは対照的にp63の変異はがんにおいてほとんど見つかっていないが、ΔNp63の高発現は皮膚がん・子宮頸がん・肺がん・頭頸部がんなどの扁平上皮がんの約50%以上の症例で認められており、p53変異との共存も報告されている。しかしながら、その発がんにおける意義は明らかではない。研究代表者らはウイルス性がん蛋白の分子生物学的解析を糸口にp53の新規標的遺伝子としてNotch1遺伝子を同定し、正常角化細胞ではp53-Notch1経路の活性化によって細胞分化が誘導されることを報告した。

昨年度までに、ΔNp63αがNotch1遺伝子に対して転写抑制因子として機能することを明らかにし、ゲノム傷害または血清暴露によるヒト正常角化細胞の分化誘導系において、ΔNp63αの過剰発現はp53依存性並びに非依存性のNotch1発現誘導を阻害し、細胞分化を抑制することを示した。当該年度において、ΔNp63αを異なるプロモーターや分解部分耐性変異体を用いて正常角化細胞に導入したところその発現レベルに相関して細胞増殖能が亢進すること、及びヒトパピローマウイルスE7及びHras変異体と同時にΔNp63αを過剰発現した場合、足場非依存性増殖能とヌードマウス皮下における腫瘍原性が付与されることを明らかにした。また、正常角化細胞と同様にΔNp63αを過剰発現する子宮頸がん細胞においても、ΔNp63αのノックダウンに伴うクローン性増殖能の欠損がNotch1の同時ノックダウンによって部分的に回避されることを見出し、ΔNp63αはNotch1の発現抑制を介して細胞増殖能の維持に働くことを明らかにした。以上の結果から、p53-Notch1経路は分化誘導を介してがん抑制に機能しており、p53の不活化とΔNp63αの過剰発現はNotch1の構成的な発現抑制を介して発がんを促進している可能性が示唆された。
低炭素社会に向けた地域材活用による長期耐用型木造住宅の開発及びライフサイクル評価

本研究では低炭素社会の実現に向け、長期耐用化、地域材活用およびCO2排出量削減をのための技術を整理し、それらを有効に活用した長期耐用型木造住宅のプロトタイプを検討した。さらに検討された住宅について、地域材生産に伴う環境負荷を踏まえインベントリ分析を行い、長寿命化による効果を明らかにすると共に、秋田県の森林資源循環サイクルに調和しつつCO2排出削減効果を効果的に発揮する住宅の生産システムを検討した。本研究では、低炭素社会の実現に向け、地域材およびCO2排出削減技術を有効に活用した長期耐用型木造住宅のプロトタイプを開発し、さらには秋田県の森林資源循環サイクルに調和しつつCO2排出削減効果を最大限に発揮するライフサイクルモデルを構築することを目的とする。これを実現するには木造住宅の生産時におけるエネルギー消費の削減、木材使用量の増大、運用時における消費エネルギーの削減、長期耐用化などの技術を有効に取り入れ、さらにはそれらのライフサイクルを効率的にマネジメントする必要がある。また森林の資源循環サイクルに調和した生産システムを構築することが重要である。本年度は、住宅の長期耐用化、生産時および運用時の低環境負荷化、地域木材の活用のための技術を整理し、それらを合理的に取り入れるための構法、仕様をまとめた。○住宅の長期耐用化技術の検討平成20年度より国土交通省が実施している長期優良住宅先導的モデル事業における提案課題をレビューし、長期耐用化のために求められる技術の傾向等にについて整理した。また、現在までに取り組んできた木質ラーメン構造の軸組み架構を、スケルトン-インフィル(SI)型住宅として適用し、それらに組合わせるインフィルを検討した。○地域木材の活用のための技術の検討地域木材の主体となるスギ材を中心として、住宅部材として多用する方法として、厚板を用いたパネル化のとしての活用を検討した。○木造住宅運用時の低環境負荷化技術の検討既往の研究に基づき、住宅運用時の低環境負荷化につながるシェルター性能や設備を整理し、長期耐用住宅に適用する方法を検討した。また、モデル住宅の壁、床における断熱性能の改変による省エネルギー効果を解析的に検討した。本年度は、昨年度実施した、住宅の長期耐用化、生産時および運用時の低環境負荷化、地域木材の活用のための技術の整理結果を基に、長期耐用型木造住宅のプロトタイプの試設計に取り組んだ。また、昨年度実施できなかった集成材製造過程における環境負荷について調査し、インベントリ分析のためのデータの作成を行った。一方、森林の生育状況を分析し、森林資源循環サイクルのモデルを検討した。○長期耐用型木造住宅のプロトタイプの試設計昨年度の検討により長期耐用型木造住宅に取り入れるべき構法、仕様に基づき、プロトタイプとなる住宅を試設計した。また、これを基にして、長期優良住宅における長期耐用化技術のシステムの導入を検討した。○集成材製造過程における環境負荷の調査集成材製造過程について、使用エネルギー消費量の実測調査を行い、既往のエネルギー消費量およびCO_2排出量原単位を検証した。その際に、大断面集成材と住宅を中心とした中小断面集成材の生産形態・規模が異なる集成材メーカーを調査し、両者での環境負荷の違いなどについて明らかとした。また、生産過程における低環境負荷化のポイントを整理した。○森林の生育状況の分析および資源循環サイクルモデルの設定<飯島>秋田のスギを中心とした森林資源について、林業統計データやヒアリングにより調査し、林令と蓄積量の関係を把握した。さらにそれらに今後の生産状況などを想定し、将来的な森林資源蓄積量についてシミュレートした。それらの結果から、資源を持続的に活用すると共に炭素吸収を効率的に行うための植樹、育成、伐採(生産)のサイクルを検討した。本年度は、最終年度として、昨年度検討した長期耐用型木造住宅のプロトタイプをベースに、昨年度実施した集成材製造過程における環境負荷調査結果等に基づいた、建設段階までのインベントリ分析を行った。さらに、森林資源循環サイクルに調和する住宅のライフサイクルのモデルを検討し、CO2排出量を削減すると共に森林および環境の保全、地域資源の有効かつ持続的活用を実現するような住宅の生産システムを検討した。○建設段階までのインベントリ分析昨年度実施した集成材製造過程における環境負荷調査結果および既往の木材および木造住宅施工における事例調査の結果を活用し、長期耐用型木造住宅のプロトタイプにおける消費エネルギー、CO2排出量等について、インベントリ分析を行った。また比較対象として、同一住宅について在来工法で建設した場合を想定した建物についてもインベントリ分析を行って比較した。分析の結果、在来構法に比べ長期耐用型は230.69kg- CO2/m2、100年後は486.36kg- CO2/m2削減出来る結果となった。また、断熱仕様をI地域仕様に変更する場合、イニシャル部分でのCO2排出量が若干増加するが、運用エネルギーの削減により、6年経過後はI地域仕様の方がCO2排出量が低くなることが明らかとなった。○森林の資源循環サイクルに調和した住宅ライフサイクルの設定と生産システムの提案

秋田のスギを中心とした森林資源のデータに基づき、資源を持続的に活用しつつ炭素吸収を効率的に行うための、植樹、育成、伐採(生産)のサイクルを検討した。現状での県産スギ材の消費量は成長量の1/6程度であり、その蓄積および固定量を効果的にする森林の資源循環サイクルに調和しつつ、住宅の消費エネルギー、CO2排出量、廃棄物を削減するような、長期耐用型住宅のライフサイクルおよび生産計画を検討した。当初、研究分担者として参加予定であった、川鍋准教授が産休、育休のため参加できず、木材・木造住宅生産時の環境負荷調査などを板垣が併せて行う事となったため、それらの進行についてはやや遅れている。しかしながら昨年度は、集成材の製造工程における環境負荷調査を十分に行い、貴重なデータを得ることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度が最終年度となるため、まずやや遅れている長期耐用型木造住宅のインベントリ分析を、昨年度実施した集成材製造過程における環境負荷調査結果等に基づき行う。さらに、昨年度検討した森林資源状況を踏まえた森林の循環サイクルに調和する住宅のライフサイクルのモデルを検討し、運用から最終的な解体・廃棄までを含めたライフサイクル評価を行う。この結果を基に、CO2排出量を削減すると共に森林および環境の保全、地域資源の有効かつ持続的活用を実現するような住宅の生産システムを提案する。
中心性漿液性脈絡網膜症の網膜色素上皮異常の病態解明

初年度に、Spectralis HRA+OCT(ハイデルベルグエンジニアリング社)を用いて、フルオレセイン蛍光造影、インドシアニングリーン蛍光造影、近赤外自発蛍光、短波長自発蛍光、光干渉断層画像を取得する。情報収集のため、いくつかの学会に出席する予定である。次年度は、論文化に向け、情報収集を引き続き行いつつ、画像解析や統計処理などを行い、学会発表を行う予定である。
肺悪性腫瘍に対する肺凍結療法の新たな開発応用

過去の研究では肺のラジオ波焼却術では気管支・肺動脈を閉塞することにより焼却範囲が拡大することが確認されている。しかしながら、凍結療法において気管支・肺動脈を閉塞することにより温度の変化と焼却範囲がどの程度拡がるのかについては明らかになっていない。本研究は肺の凍結療法におけるheat-sink effectを軽減するため、動脈閉塞にて血流を減少させ、気管支閉塞も併用することにより熱伝導性を高める検討を目的としている。I.適切な動脈閉塞法の検討:正常豚を用いて下記の基礎実験を行う(N=4)、1)全身麻酔下に開胸し、左気管支バルーン閉塞下に左肺動脈本幹(N=2)または分枝(N=2)を結紮する。続いて結紮肺動脈領域および正常肺実質の凍結療法を開胸下に行う。凍結時には温度モニタリングを行い、温度分布を評価する。II.臨床応用に近い適切な動脈閉塞法の検討:正常豚を用いて下記の基礎実験を行う(N=4)。1)全身麻酔下、左気管支バルーン閉塞下に大腿静脈からカテーテルを挿入し左肺動脈本幹(N=2)または分枝(N=2)をバルーンカテーテルにて閉塞する。続いて肺動脈バルーン閉塞領域および正常肺実質の凍結療法を開胸下に行う。I・IIともに凍結療法の数時間後に肺を摘出し病理学的標本を作製する。病理学的検討として1凍結療法による壊死範囲、2大きな血管周囲の壊死の程度、3凍結部位周囲の虚血性障害の程度と範囲、これら病理組織所見と凍結療法時の画像所見と併せて、安全かつ有効な方法を検討する。生体豚での凍結療法は肋骨が障害となり温度モニタリングがむずかしかった。よって摘出ブタ肺を喚起・血流環流させ生体疑似モデルによる凍結療法を行うこととしたため、当初の計画より遅れが生じた。摘出ブタ肺を喚起・血流環流させ生体疑似モデルを作成し、凍結療法の至適な肺動脈と気管支閉塞の方法と部位の実験を行う予定である。実験がうまく進まなかったため、消耗品などの出費が少なかった。
新規TALEホメオドメイン転写因子Prep2の脊椎動物の発生における機能解析

TALEホメオドメインを持つ転写因子の中でもHth/Meis/Prepのメンバーは、やはり同ファミリーの転写因子であるExd/Pbxとの相互作用を介してHox転写因子の機能調節を行っている。本研究では脊椎動物の新規Prepファミリー遺伝子Prep2を単離し、この遺伝子の機能解析を行った。Prep2のアミノ酸配列はPrep1と高い相同性があるが、TAしEホメオドメインの下流に酸性アミノ酸が連続して続く領域については、各動物種のPrep2に共通した特性である。この領域はゼブラフィッシュを用いた実験結果から、Prep2の持つ転写抑制機能をマスクする機能を持つことが推測された。ニワトリ初期胚では前方の中胚葉層で特異的に発現し、これはMeisと相補的であった。初期胚でのMeis発現はレチノイン酸によって誘導されるが、Meis発現はこの作用は受けず、Meisとは異なる発現調節を受けていることが明らかとなった。胚肢芽でもMeisと部分的に相補的な発現を示し、肢芽でMeis発現ドメインより遠位側の特定領域でPbx1の核局在に関わっていることが示唆された。Prep2はMeis, Prep1同様Pbxと結合して二量体を生ずる。Prep1とは異なりPrep2は単独で核移行を行うが、Pbxと複合体を形成した場合Pbxの核移行を行うことが判った。一方単独あるいはPbxと複合体を形成しても、標的遺伝子の転写活性は引き起こさないことが判った。ゼブラフィッシュ胚にPrep2 mRNAを単独で注入しても胚に変化は見られないが、Pbx4 mRNAと共導入すると胚の前方部分での形態変化が観察された。このことから胚の中でもPbx4と複合体を作って機能していることが判った。マウスPrep1,2の標的遺伝子破壊系統を作成して機能解析を試みた。Prep1ホモ胚は8-9dpcで発生が停止するが、形態的な異常は観察されなかった。Prep2ホモ個体は形態的には正常に発生し、生殖も可能であった。Prep1は胚全体で必要とされる生理機能との関連性が示唆される。個体発生におけるPrep2の機能を探るために、マウスの系を用いて標的遺伝子破壊を行うこととした。マウスゲノムBACクローンを用いて遺伝子構造を決定し、これに基づいてターゲッティングベクターを作成し、ES細胞で相同組換えを行った。得られたES細胞を用いてキメラマウスを作成し交配を行い、現在のところ破壊した遺伝子座をヘテロに持つ個体が得られている。今後はこれらを繁殖しホモ接合体個体の出生を吟味し、ホモ接合胚の表現型について解析を行う。ゼブラフィッシュ胚へのmRNA微量注入による異所性過剰発現実験を行ったところ、正常型mRNA単独では表現型は観察されないが、コファクターとして機能するPbx4を共注入したところ、中脳と眼の形成に異常が生じた。このような表現型はPrep2にengrailedの恒常的転写抑制ドメインを付加したmRNAを単独注入した場合、あるいは既に報告されているMeis3とPbx4を用いた場合と同様であった。このことからPrep2/Pbxは異所的発現場所の中脳では共同して内在性の転写に対して抑制因子として機能する可能性が示された。Prep2タンパク質のカルボキシル末端にある酸性アミノ酸クラスターを除去したところ単独で機能欠損型の表現型が得られた。

更に改変を加えたPrep2を用いることにより、Prep2の機能及び機能ドメインの解析を行ってゆく。レトロウィルスベクターを用いてニワトリ胚肢芽でのPrep2の異所性強制発現実験を行ったが、特徴的な表現型は得られなかったためこの系での研究の展開は断念した。TALEホメオドメインタンパク質Prep2の発生過程における機能を解析するために、ES細胞を用いた標的遺伝子破壊法によりPrep2欠損マウスを作成した。ヘテロ個体同士の交配を行ったところ、ホモ接合マウスは生存可能でしかも稔性が保たれていることが判明した。これはほとんどの組織で低レベルに発現している同じファミリーに属する遺伝子であるPrep1による機能保証の結果である可能性が高いと考えられる。これを検証しさらにPrep2の機能を解析するためPrep1欠損マウスの作成に着手し、標的遺伝子破壊ES細胞の調製を終了し、現在マウスの作成中である。Prepタンパク質は同じくTALEホメオドメインタンパク質ファミリーに属するPbxを介してHoxタンパク質と複合体を形成することが知られている。Emxタンパク質はPbxと相互作用しうるモチーフYPWMに酷似したYPWL配列を持つが、Pbxとの相互作用の報告はいまだない。またHoxタンパク質のYPWMをYPWLに改変するとPbxとの相互作用が失われることが報告されている。しかしEmx2欠損マウスの表現型が一部Pbx欠損マウスの表現型と一致することから、相互作用の可能性が推測される。In vitroにおいてこの可能性の検証を試みたところ、明らかに二者の結合が観察され、さらにPrep/Pbx/Emxの複合体をも形成しうることが示された。Hoxタンパク質は標的配列との強固で安定な結合にPbxを要求することが知られているが、Emx2は単独で標的配列に強固に結合し、Pbxはこれを促進せず、結合部位の塩基配列によっては逆にEmx2のDNA結合を抑制することが判明した。このようにEmx2はHoxとは異なる特徴的なPbxとの相互作用様式を持つことが明らかとなり、Pbxを軸とした相互作用ネットワークの多様性が浮かび上がってきた。Hoxタンパク質と共同作用する新規TALEホメオドメインタンパク質Prep2の個体発生過程での機能を探るために標的遺伝子破壊個体を初年度に作成したが、ホモ個体が生存可能であるため、本年度は遺伝的バックグラウンドを均一にする操作を野生型マウスC57B6とのバッククロス系で継続して行い、現在8代目を得た。遺伝的バックグラウンドが均一化できたと考えられる12代までバッククロスを継続するとともに、8代目でホモ個体が出生するかどうかについても検討している。Prep2と機能的に冗長性があると推測されるPrep1の標的遺伝子破壊操作を施したES細胞を用いてのキメラ個体の作成を昨年度より継続した。キメラ個体作成は困難を極めたが、本年度にようやく一匹の個体を得ることができ、この個体と野生型マウスC57B6の交配によりPrep1標的遺伝子破壊ヘテロ接合個体を得ることができた。C57B6を用いてバッククロスを進行させると同時に、2代目のPrep1KOヘテロ
生活習慣病予防、疾病再発予防目的の運動習慣獲得と維持に効果的な指導法の開発

行動変容のtranstheoretical model (TTM)を運動の分野に応用し、個々人の運動習慣維持に効果的な指導法開発の前段階として、TTMのステージと運動習慣の有無、気分尺度、健康関連QOL、日本的タイプA行動評価尺度、虚血性心疾患患者に特異的な血液指標との関連を見ることを目的とした。また、TTMのステージの関連因子に年齢による違いが見られるかについても検討した。全対象者(51名、平均年齢64.6歳)のうち、TTMの前熟考ステージと準備ステージに分類された人は約半数であった。前熟考ステージ、熟考ステージの人の中には運動習慣ありに分類された人が見られた。また、実行ステージ、維持ステージの人において運動習慣なしに分類される人がいることが明らかとなった。ステージの分類が主観的に行われていること、ステージ分類時に運動習慣の定義を満たすかという判断が必要であることが要因であると考えられる。このことから、対象者の正確な変容ステージを評価するためには、面接法により、実際の運動頻度、内容、運動時間をあわせて調査する必要があることが考えられた。TTMの変容ステージを上昇させる規定因子は年齢によって異なることが示された。低年齢者は高年齢者と比較して身体機能が平均的に高いため、運動習慣保持には身体機能よりも精神的な因子がより関与しているためであると考えられた。また、高年齢者は身体機能の低下に個人差が大きいため、運動習慣保持には精神的要因よりも実質的な身体機能の状態がより強く関与していること、運動と健康に関する情動的経験を持つ人は身体機能が低下している状況でも、病気を予防することの重大さを認識しているため運動習慣を保持していることが示唆された。従って、効果的な運動習慣の保持には、以上の要因を高めるためのプログラムを開発し、年齢別に運動指導を行うことが必要である。
疼痛性循環反応の可塑的変化に関する神経性機序の解明

肩こりや腰痛など筋骨格系の慢性症状は、多くの国民が抱える諸症状のひとつである。慢性痛患者は、起立性低血圧などの循環機能障害も抱えうることが報告されているが、慢性痛と循環機能障害との関連については明らかにされていない。本研究課題では痛みの慢性化に関わる炎症に着目し、骨格筋の炎症性疼痛により誘発される循環反応の可塑的変化とその神経性機序を解明することを目的とする。前年度に骨格筋への押圧刺激で生じる心臓交感神経活動および心拍数の変化が、急性炎症を起こした筋への刺激で増大することが明らかにされたことを基に、平成30年度はその神経性機序を明らかにすることを試みた。具体的には、骨格筋からの感覚情報を伝える求心路の神経活動が、急性炎症により増大するかどうか検討した。実験はイソフルラン麻酔下で行った。ラットを人工呼吸し、赤外線ランプおよび保温パッドを使用して、呼吸および体温を生理的範囲内に維持して実験を行った。心拍数は頸動脈に留置したカテーテルより記録した血圧波形をもとに算出した。求心路における神経活動の指標として、レーザースペックル血流画像化装置で脊髄血流を経時的に計測した。押圧刺激は、直径6mmの刺激棒でラットの下腿を10N/cm2の強度で30秒間持続的に与えた。下腿筋に急性炎症を誘発する目的で、ラットの一側下腿に起炎物質であるλ-カラギーナン溶液を実験前日に投与した。対側下腿には対照として生理食塩水を注射した。その結果、下腿への押圧刺激に伴い脊髄血流は増加することが分かった。一方、血流増加の程度について、炎症側下腿刺激時と非炎症側下腿刺激時とで違いは認められなかった。本年度は神経性機序を解明する目的で、求心路の機能解析を試みたが、炎症による影響を明らかにするに至らなかった。レーザースペックル血流計は、血流情報を画像化するため、同じ画面上で脊髄の左右および頭尾側で血流情報を比較することができるという利点がある。そのため実験で用いた。一方同装置は、比較的浅部(表面から300μmまで)の血流を主に計測するとされるため、脊髄の深部で機能変化については捉えることは困難であった可能性がある。求心路の機能解析について、手法の再検討を行う必要があると思われる。測定方法を変更して、引き続き求心路の機能解析を実施する。より深部の血流情報を得られる機器を用いたり、電気生理学的手法を用いて求心路の機能変化を解明する。平成28年度は、麻酔ラットを用いて骨格筋への押圧刺激により生じる心拍数の変化に対する炎症の影響を検討した。具体的には、ラットの下腿に起炎物質であるλ-カラギーナン溶液を実験前日に投与し、急性炎症を誘発した。炎症を起こした下腿への押圧刺激により、心拍数は増加または減少した。下腿刺激前の心拍数が低い時に下腿を刺激すると心拍数が増加し、刺激前心拍数が高い時では心拍数が減少した。刺激前心拍数と押圧刺激による心拍数の変化との間には、負の相関が認められた。さらに炎症を起こしていない筋への刺激による心拍数の変化と比較すると、炎症筋への刺激で生じる心拍数の増加は増大していた。心拍数変化に寄与する心臓自律神経についても検討した。心臓交感神経活動を外科的・薬理的に遮断したところ、下腿への押圧刺激で生じる心拍数の変化はほぼ消失した。一方、迷走神経を外科的に遮断した場合は、心拍数の変化が残存した。以上の結果より、炎症を起こした骨格筋への押圧刺激で生じる心拍数増加の増大は、心臓交感神経活動の増加が増強したために生じたと考えられる。本研究課題では、骨格筋の炎症性疼痛により誘発される循環反応の可塑的変化とその神経性機序を解明することを目的とする。平成28年度はまず、筋刺激により誘発される循環機能の変化が急性炎症により変化することを明らかにした。具体的には、起炎物質で炎症を誘発した下腿への押圧刺激で生じる心拍数増加が、非炎症下腿刺激による変化よりも大きいことを見出した。さらに、骨格筋刺激による心拍数変化に対する心臓自律神経の寄与を検討した。その結果、炎症を起こした下腿への刺激では、心臓交感神経活動の増加が増強するために、心拍数増加が増大することを示唆する結果を得られた。

慢性痛患者は、起立性低血圧などの循環機能障害も抱えうることが報告されているが、慢性痛と循環機能障害との関連については明らかにされていない。本研究課題では痛みの慢性化に関わる炎症に着目し、骨格筋の炎症性疼痛により誘発される循環反応の可塑的変化とその神経性機序を解明することを目的とする。平成29年度は、麻酔ラットを用いて骨格筋への押圧刺激により生じる心臓交感神経活動および心拍数の変化に対する筋の急性炎症の影響を検討した。実験はイソフルラン麻酔下で行った。ラットを人工呼吸し、赤外線ランプおよび保温パッドを使用して、呼吸および体温を生理的範囲内に維持して実験を行った。心拍数は頸動脈に留置したカテーテルより記録した血圧波形をもとに算出した。心臓交感神経活動は、ラットの右下心臓交感神経を双極フック電極に載せ、多放電活動を記録した。押圧刺激は、直径6mmの刺激棒でラットの下腿を10N/cm2の強度で30秒間持続的に与えた。下腿筋に急性炎症を誘発する目的で、ラットの一側下腿に起炎物質であるλ-カラギーナン溶液を実験前日に投与した。対側下腿には対照として生理食塩水を注射した。下腿への押圧刺激により、心臓交感神経活動および心拍数は増加または減少した。刺激前の心臓交感神経活動のレベルと、押圧刺激による心臓交感神経活動および心拍数の変化との間には負の相関関係が認められた。この負の相関関係は、炎症側、非炎症側への刺激で認められた。なお、押圧刺激で生じる心臓交感神経活動および心拍数の変化は、炎症側下腿への刺激時でより大きかった。以上の結果より、骨格筋への押圧刺激で生じる心臓交感神経活動および心拍数の変化は、急性炎症を起こした筋への刺激で増大すると考えられる。電気生理学的手法を用いて心臓交感神経活動を直接記録し、骨格筋の急性炎症により心臓交感神経活動および心拍数の変化が増大することを実証することができた。また、同一個体で炎症側・非炎症側下腿をそれぞれ刺激し、反応の変化を比較することで、使用する実験動物の数を最小限に留めることができた。肩こりや腰痛など筋骨格系の慢性症状は、多くの国民が抱える諸症状のひとつである。前年度に骨格筋への押圧刺激で生じる心臓交感神経活動および心拍数の変化が、急性炎症を起こした筋への刺激で増大することが明らかにされたことを基に、平成30年度はその神経性機序を明らかにすることを試みた。具体的には、骨格筋からの感覚情報を伝える求心路の神経活動が、急性炎症により増大するかどうか検討した。求心路における神経活動の指標として、レーザースペックル血流画像化装置で脊髄血流を経時的に計測した。その結果、下腿への押圧刺激に伴い脊髄血流は増加することが分かった。
デンタルインプラント支持機構の咬合圧負担能力についての研究

研究代表者は従来からの研究で、静的並びに動的荷重に対する植立した骨内インプラントと天然歯の生物力学的挙動を比較した結果、前者では弾性的要素には富むものの粘性的な応答に欠けることから、インプラントを負担過重から開放し、顎骨に掛かる咬合力を緩和する様な緩圧的構造を付与する必要性を明らかにした。現在いろいろな緩衝方法を検討中であるが、IMZインプラントは内部可動機構を有し、IMEおよびIMCが天然歯の歯根膜の生理的可動性を模倣し、咬合応力を緩衝・分散すると言われており、その緩衝効果を検討した。上部構造(上面一辺8mm、高さ9mm金合金タイプIIIで作製)に、一定荷重(約1Kg)を負荷したときの変位量と、除重後のrecovery curveのモード(荷重ー変位曲線)を非接触型渦電流変位測定器にて記録した。インプラントと上部構造の間に介在させるものとして、IMEを介在させた場合をA、IMCをB、技工用IMEをCとする。A(35μm)・C(20μm)ともB(10μm)より変位量が大きく、除重後のモードも弾性的な様相を示し、粘性的様相はほとんど見られなかった。しかし、AのTIEを除去したときには天然菌に類似した粘弾性的な様相を示した。衝撃試験装置を用い、落球(重さ0.5gの鋼球を高さ23cmから自由落下させる)による瞬間的impulseによって誘起される振動波形を、加速度計にて測定した。振幅スペクトラムではA・B・Cとも0.78KHzと4.88KHzにピークがあった。前者は試験装置の、後者は鋼球と上部構造の金属との衝撃振動によるものである。A・Bでは4.88KHzに第一ピーク、0.78KHzに第二ピークがあった。A・Bとも第一ピークの振幅の大きさは変わらなかった。AのTIEを除去すると第一と第二のピークが入れ替わり第二ピークの振幅が減少した。Cではどちらも振幅の大きさは変わらなかった。0.78KHzでの振幅はCが大きかった。
レ-ザ-・スペックル歪計の実用化の研究

第1年度に完成した高速相関計を利用して、各種の実用化試験を行ない、良好な結果を得た。イメ-ジ・センサ-はピッチ15μm、幅300μm、素子数1024である。相関の計算速度は毎秒1000フレ-ム、点数は48点である。レ-ザ-には出力10mW半導体レ-ザ-、または160mWのYAGレ-ザ-を使った。まず抵抗線歪ゲ-ジを装着できない高分子材料のテ-プを周期的に引張った時の歪を測定した。中心部を測定した時のスペクトル歪計の出力が、引張り端の変位から求めた平均歪と良く一致した。引張りの周波数をDCから100Hzまで変えた時の、両者の関係を調べ、十分な応答性を確認した。次に二つの歪計を直交させて配置し、二軸方向の歪を同時に測定した。サンプルの引張り方向の歪とそれに直交する方向の歪の比をとることにより材料のポアソン比を高精度で自動測定した。これらの実験を実用の引張り試験機で行い、ゲ-ジ長1mm、最小感度33μstrain、最大は200%程度までを測定できた。引張り試験機の振動の影響は無視できることがわかった。同じイメ-ジ・センサ-と相関計を1組だけ使い、面内の平行移動量および円筒の回転角の高感度測定を行った。ピッチ15μm、素子数1024のイメ-ジ・センサ-で面内移動に対して0.5μm、回転に対して1/500°の最小感度が得られた。赤外線加熱装置と真空排気槽を組み合わせた熱歪測定装置を試作し、自由熱膨張の測定を行った。加熱や測温方法の検討を行い、各種金属材料の熱膨張係数を求めた。真空中で加熱することによって表面の酸化や空気ゆらぎが除去され、従来は300°C程度以下であった金属の熱膨張の測定が600°Cまで向上した。以上の結果から本歪計の実用化への見通しが十分に明らかとなった。本研究の目的は、研究代表者の発明したレーザー・スペックル歪計の機能性、特に測定の安定性と精度を向上させ、実用化をはかることにある。まず光源としての従来のHeーNeレーザー(出力5mW)の代わりに、同出力の半導体レーザーを使い、イメージ・センサーをピッチ(15μm)と素子数(1024)が同じで、幅が300μmの高感度形のものに代えた。半導体レーザーには特有の波長変動および非点収差の影響が心配されたが、測定結果はHeーNeレーザーと何か変わらなかった。これにより装置の大幅な小型化と信号雑音比の向上が達成された。次にスペックル移動の検出を確実にするため、高速度相関計を製作した。これは以前に使っていた空間フィルター検出器ではスペックルの変形効果のために一定の確率で移動が検出できなくなる欠点を解決するためである。手持ちの相関計では、イメージ・センサーの常に一つ前のフレームを参照信号として相関ピークを検出するため、物体の変形が遅い場合にはスペックル移動を検出できない難点があった。しかし新たに参照信号を常に入れ替えることをせず相関ピークが一定以下に低下した時にだけ入れ替える方式を採用したため、その欠点が完全に取り除かれた。また演算時間も従来の相関計の1/300秒から1/2000秒に短縮できた。これらの新しいシステムを使い、高分子フィルムの引っ張り歪を測定し、良好な安定性と精度が得られた。歪感度は20マイクロストレイン(2×10^<-5>)程度である。2直交方向の歪を同時に測定して、材料のポアソン比も容易に得られた。これにより表面に対して完全に非接触で直接的に表面の歪を100Hz以下では安定に測定できることが立証された。今後は、半導体レーザーのパルス変調による高速歪の測定と高温歪(500°C以上)の測定を試みる予定である。

ピッチ15μm、素子数1024のイメ-ジ・センサ-で面内移動に対して0.5μm、回転に対して1/500°の最小感度が得られた。赤外線加熱装置と真空排気槽を組み合わせた熱歪測定装置を試作し、自由熱膨張の測定を行った。加熱や測温方法の検討を行い、各種金属材料の熱膨張係数を求めた。真空中で加熱することによって表面の酸化や空気ゆらぎが除去され、従来は300°C程度以下であった金属の熱膨張の測定が600°Cまで向上した。以上の結果から本歪計の実用化への見通しが十分に明らかとなった。
軟骨肉腫の浸潤・転移における転写因子KLF5の役割の解明

【軟骨肉腫症例におけるKLF5及びMMP-9発現と臨床像との相関の検討】昨年度に引き続き、これまでに蓄積された軟骨肉腫症例材料及び新規受診症例のデータベースを作成した。【KLF5強制発現およびノックダウン軟骨肉腫細胞株の樹立】東京大学医学部附属病院の倫理委員会からの許可および患者様からの文書による研究協力へのインフォームドコンセントを得た上で、軟骨肉腫症例の切開生検、広範切除術あるいは肺転移切除の実施時に採取される組織を用いて、独自の細胞株の樹立中である。現在は継代中でクローニングまでは至っていない。【KLF5発現レベルと局所浸潤能の相関の検討】(担当:門野、大隈)上記により作製した、KLF5発現レベルの異なる、複数のKLF5過剰発現軟骨肉腫細胞株と、KLF5ノックダウン軟骨肉腫細胞株を用いて、局所浸潤能を検討中である。現在レチノイン酸レセプターアゴニストであるAm80及び、アンタゴニストであるLE135を投与し、これらにより軟骨肉腫の浸潤能のコントロールが可能であるかを検討するための条件設定を行っている。【軟骨肉腫症例におけるKLF5及びMMP-9発現と臨床像との相関の検討】これまでに蓄積された軟骨肉腫症例材料及び新規受診症例からの凍結保存組織、パラフィン包埋ブロックあるいは組織切片(プレパラート)を用いて、免疫組織学的手法およびRT-PCR,in situ hybridizationによってKLF5及びMMP-9発現レベルをmRNAレベル、蛋白レベルで定量化し評価をしている。また、症例毎に組織採取時の臨床情報(1.年齢、性別2.病期3.組織学的悪性度4.生命予後5.局所再発の有無6.転移の有無)を記録している。現在の所、KLF5及びMMP-9発現レベルと、軟骨肉腫の局所浸潤・転移との相関関係は明らかではない。【KLF5強制発現およびノックダウン軟骨肉腫細胞株の樹立】東京大学医学部附属病院の倫理委員会からの許可および患者様からの文書による研究協力へのインフォームドコンセントを得た上で、軟骨肉腫症例の切開生検、広範切除術あるいは肺転移切除の実施時に採取される組織を用いて、不死化能獲得細胞を選別する方法である3T3 methodを使用して、独自の細胞株の樹立を試みている。得られた細胞株が腫瘍としての性質を維持していることを細胞形態、増殖能(不死化)、足場依存性喪失の評価を行って確認しているが、現在のところ、細胞株の樹立には成功していない。細胞株の樹立に成功したら、今後、市販されている軟骨肉腫由来の細胞株とともに、細胞培養系の研究材料として用いるほか、ヌードマウスへの移植を試み、生体内における機能解析の材料として使用する予定である。
海洋性細菌が産生する特異な有機分子の構造解析：海水中CO2から有機物生産へ

本研究では、現在の海洋環境中で行われている「生育に伴う有機高分子生産」という微生物機能に着目し、海水中の二酸化炭素を利用した物質生産の可能性、つまり光合成に依存しない海水からのCO2除去にも繋がるCO2資源化システムの構築・提案を目指した。本研究の実施によって、鉄を唯一のエネルギー源とし、海水中のCO2固定により生育する海洋性鉄酸化細菌の大量培養手法の構築、新種の鉄酸化細菌の単離、そしてそれら細菌が菌体外に産生する有機高分子の組成・構造を明らかにすることに成功した。これらの結果から、微生物機能を用いて海水中のCO2から有機物質の生産(CO2の資源化)システム構築への知見を得ることができた。本研究の目的は、鉄を唯一のエネルギー源とし、海水中のCO2固定により生育する海洋性鉄酸化細菌がその菌体外に産生する有機高分子の特異な構造および有用性を明らかにすることである。本年度は菌体外有機高分子試料の大量取得を目指し、種々の培養手法を用いた大量培養系の構築(スケールアップ)を検討した。スケールアップの評価方法は、培養によって得られる菌体数および菌体外物質と鉄酸化物の複合体である沈殿物の重量とそれら沈殿物中の有機炭素含量の比較により行った。さらに、エネルギー源である二価鉄(塩化鉄溶液)の培地中の濃度および添加のタイミングを検討し、増殖傾向や沈殿物量、有機物量への影響を調べた。これらの検討により、6 Lの培養系までスケールアップすることに成功し、また500 mLの系においては多量の(10 mLの系と比較して約60倍)沈殿物を回収できる事が示された。しかし、培養スケールが大きくなるにつれて、沈殿物中の有機炭素含量は減少してしまった。このことは、培養に用いる培養槽を大きくしたことにより、増殖(代謝)の過程で生じる鉄酸化物よりも、培地気相中の酸素によって無機的に酸化されることで生じる鉄酸化物の方が増加してしまうためだと考えられた。そこで、鉄源となる塩化鉄溶液を分割し添加する培養法によって、より有機物含量の高い沈殿物が得られるか検討を行った。その結果、鉄源の分割添加を行った系において無機的な鉄酸化物の少ない沈殿物が得られることが明らかとなった。また、大量培養の検討の際に得られた沈殿物を機器分析に供し、構造解析のための初検討を行うことができた。本研究の目的は、鉄を唯一のエネルギー源とし、海水中のCO2固定により生育する海洋性鉄酸化細菌が、その菌体外に産生する有機高分子の特異な構造および有用性を明らかにすることである。平成27年度は、平成26年度までに検討していた培養手法を用いて、菌体外有機高分子の大量取得を行い、集めた試料の構造解析法の検討を行うこととした。培養によって集められた試料には、菌体外高分子の他に菌体細胞と多量の鉄酸化物が含まれている。菌体外高分子の分析にあたり問題となるのが、高分子を覆う鉄酸化物の存在である。鉄酸化物は、比色定量法での反応やHPLC分析を行う際の標識化を阻害する。したがって、できる限り鉄酸化物を除去することが必要である。そこで、まず酸や還元剤などの化学的な手法を用いた鉄の除去方法を検討した。作用させる反応溶液(酸、還元剤)の種類、濃度、反応時間、温度などを変化させ、培養によって集めた試料中の鉄の溶解を試みた。なお、反応溶液に作用させた後の菌体および有機高分子の様子は、電子顕微鏡により確認した。検討の結果、鉄除去のための最適な反応溶液組成および条件を導き出すことができた。現在、これらの手法を用いて、分析に足る量の試料を収集中である。さらに、鉄を除去した状態および鉄を除去しない状態での有機高分子の分析手法についても検討を行うことができた。平成27年度の研究目的である鉄酸化菌の菌体高分子の分析方法の検討について、試料の調製方法や新しい分析手法の構築など、目的の分析手法についての知見を十分に得る事ができた。さらに鉄酸化細菌が産生した有機高分子試料を機器分析に供し、初検討を行うことができたため、達成区分を「おおむね順調に進展している」とした。本年度は、昨年度までに構築した大量培養系にて準備した菌体外有機高分子試料の分析を実施した。当初、有機高分子の分析には培養の過程で生成される酸化鉄の除去が必須と考えていた。しかしながら、酸化鉄を除去するために酸や還元剤を用いて酸化鉄を除去すると、特徴的な構造物を顕微鏡下で確認することが困難となる。また、還元剤や酸の残存が分析に影響することが明らかとなった。そこで、酸化鉄を含む状態で、有機高分子の分析を試みた。その結果、顕微質量分析などの質量分析法を用いることで、部分的な構造を明らかにすることに成功した。また本研究で構築した培養手法を用いることで、深海底より新種の独立栄養化学合成鉄酸化細菌(ET2株)を単離することに成功した。これまでに海洋から単離され生化学的な性状が明らかとなっている鉄酸化細菌は1種しか報告がなく、本細菌が世界で2例目である。新たに単離された鉄酸化細菌も、既知の鉄酸化細菌と同様に菌体外に多量の有機高分子を産生することが明らかとなった。さらに、本培養手法を用いることで、深海環境から混合栄養性の鉄酸化細菌の単離や、浅海からは鉄酸化細菌と鉄還元細菌が共役する培養系を構築することにも成功した。

以上のように、本研究では鉄を唯一のエネルギー源とし、海水中のCO2固定により生育する海洋性鉄酸化細菌の培養手法を構築し、鉄酸化細菌の大量培養および新種の鉄酸化細菌の単離、そしてそれら細菌が菌体外に産生する有機高分子の組成・構造を明らかすることに成功した。これらの結果から微生物機能を用いて海水中のCO2から有機物質を生産(CO2を資源化)するシステム構築への知見を得ることが出来た。本研究では、現在の海洋環境中で行われている「生育に伴う有機高分子生産」という微生物機能に着目し、海水中の二酸化炭素を利用した物質生産の可能性、つまり光合成に依存しない海水からのCO2除去にも繋がるCO2資源化システムの構築・提案を目指した。本研究の実施によって、鉄を唯一のエネルギー源とし、海水中のCO2固定により生育する海洋性鉄酸化細菌の大量培養手法の構築、新種の鉄酸化細菌の単離、そしてそれら細菌が菌体外に産生する有機高分子の組成・構造を明らかにすることに成功した。これらの結果から、微生物機能を用いて海水中のCO2から有機物質の生産(CO2の資源化)システム構築への知見を得ることができた。今年度の研究目的である鉄酸化細菌の大量培養系の確立について十分検討を行うことができ、目的の菌体外有機高分子を得るための知見を得ることができた。さらに大量培養で得られた有機高分子試料を機器分析に供し、初検討を行うことができたため、達成区分を「当初の計画以上に進展している」とした。平成26年度までに得た培養手法や解析手法を用いて、鉄酸化細菌が産生する菌体外有機高分子の構造解析を実施する。分析にあたり重要となるのが、有機高分子の分子量や繰り返し単位である。高分子を構成する糖残基(あるいはアミノ酸残基)の種類が多いほど、構造決定を行うことが難しくなる。まずは有機高分子の大きさや性質(親水性/疎水性の程度、各pH下での挙動など)をHPLC等を使用して明らかにする。得られたサイズや性質の情報をふまえて比色定量法、GC、LC、MS分析などを駆使して組成の詳細を明らかにする。組成分析を行った後、部分的な加水分解を施したサンプルを用いて、MS/MS分析により配列を決定する。また平行して、金属吸着能などの有用性の評価を行う予定である。微生物生態学今後は、より有機物濃度の高い試料を得るためにさらなる培養手法を検討する。また、本年度確立した大量培養手法を用いて分析に足る量の試料を集め、鉄を含む有機物の構造解析手法を検討する。購入予定だった試料調製用の大型装置について、より研究に適した機種を選定するため、分析方法の見直しと再検討を行った。その結果新しい分析手法を構築することができたが、想定していたよりも分析手法の検討に時間がかかってしまったために大型装置購入予算の一部を次年度に繰越すこととなった。本年度は購入予定だった大型機器の代わりに、大量培養の検討において得られた試料を用いて来年度の研究計画の中で実施する予定であった菌体外有機高分子の初検討を行うこととした。なお、この初検討は培養の妥当性を確認するために必要な分析であったため実施した。そのため大型機器購入予算の一部を次年度に繰越すこととなった。平成27年度購入予定であった大型機器の購入に使用する予定である。具体的には冷却機能のついたインキュベーターや分析試料を調製するためのエバポレーターなどである。本年度購入予定であった大型機器の購入に使用する予定である。
細菌鞭毛に特異的なアンチシグマ因子の活性制御機構に関する分子遺伝学的研究

サルモネラの鞭毛レギュロンの発現は鞭毛形態形成過程と共役している。この共役は、特異的シグマ因子であるFliAとそれに対するアンチ・シグマ因子であるFlgMの細胞内濃度の調節によって行われている。FlgMは鞭毛基部構造が完成するとその構造体内を通って細胞外へ分泌されその細胞内濃度が低下し、FliAが活性化されてFliA支配下にある鞭毛形態形成の後期過程に関与する遺伝子群が発現されるようになる。したがって、この共役過程ではFlgMの細胞外輸送制御機構が重要な役割を果たしている。本研究では、FlgMの細胞外輸送の制御系として、鞭毛基部形成の完成をモニターしてFlgMの細胞外輸送を開始させる過程(輸送スイッチ機構)とFlgMの細胞外分泌量を制御する過程(輸送量制御機構)の2つがあることを明らかにし、それぞれの過程に関わる因子を遺伝学的解析法により同定することに成功した。1.輸送スイッチ機構:この過程に関与する遺伝子として、flhBとrflHの2つを同定した。これら2つの遺伝子の産物は、それぞれ独立に鞭毛基部形成完成のシグナルに呼応し、FlgM輸送のゲートを開閉する。FlhBゲートの開門にはFliK蛋白質が必要であるが、RflHゲートの開門には必要でない。2.輸送量制御機構:この過程に関与する遺伝子として、fliD、fliS、fliTの3つを同定した。これらの遺伝子の産物のいずれの1つが失われても、FlgMの輸送制御が完全に失われることから、これら3つは共同して1つの輸送制御装置を構成しているものと考えられる。3.2つの機構間の関係:輸送スイッチ機構は鞭毛基部構造完成前のFlgMの輸送の負の制御系であり、輸送量制御機構は鞭毛基部構造完成後のFlgMの輸送の負の制御系であると考えられる。