hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
体位変換時の循環応答とその調節の発達過程と加齢変化

血管内圧は重力による静水圧が関与し体位変換と姿勢で血管の圧勾配が変化する。その変化に対して主に動脈圧受容器反射(BR)が働き、一般に血圧と呼ぶ血液還流圧(体血圧Systemic Arterial Pressure: SAP)は適切に保たれる。若齢から老齢のラットで立ち上がり姿勢の90°Head-up Tilt(HUT)の体位変換を行って30分維持した。その結果、HUT直後とその姿勢を保った時の頭側への血流、SAP,心拍数の変化は、若齢と老齢群で不安定でHUT中のSAPの維持能は弱く、加齢によって血管コンプライアンスが変わることも示唆され、BRが働く時のHR変化も小さく循環調節は悪くなる。本年度は生後8週齢から約1年6カ月齢までのラットを用い、立ち上がり姿勢(Head-up tilt:HDT)での実験を遂行できた。それにより、8週齢ラット群、30週齢から約12か月齢群のそれぞれのHUT時の循環動態(血圧、総頸動脈流量、心拍数)の変化を明らかにし、比較できた。生後から老齢期に至るまでの発達と加齢変化を調べるには、異なる週齢で実験群の幅を狭めて実験を進めることが必要で、平成27年度以降も動物実験で基礎的データを得ることに研究を修正を加えて、循環因子の日齢曲線・経時的変化の詳細を明らかにする。その実験計画の基盤となる幼弱、成熟、老齢期ラット3群のデータを得られた。主な結果は次の通りである。成熟群の結果(SDラット, ♂, 13-19週齢, 420-595g,13匹)は、HUT開始後、BPの平均血圧はHUT前のcontrol値87.4±16.3 mmHg (mean±SD, n=12)から⊿14.7±6.8(-16.4%)、BFは5.57±1.96ml/minから⊿1.61±0.96 (-28.3%)、何れも有意に減少した(p< 0.001, paired t-test)。その後、各値は増加に転じて一定値となりBPはcontrol値に近づく(⊿BP -2.5±9.2 mmHg, -2.2%, ⊿BF -1.10±1.04ml/min, -19.9%)。その時、HRはcontrolの385±45.4 bpmから⊿11.3±13.5 bpm(+ 3.1%)増加し(p<0.05)、SAD後では、その増加は見られなかった。また、HUT状態が長くなるとBPは保たれるがBFは有意に低下し、SAD後では両者の減少率が大きくなった。BFのHUT時間の差は明瞭ではないが、30分ではBP変化率は大きく、BRによる僅かなHR減少がSAD後では見られなかった。加齢過程ラット(SDラット, ♂, 3190週齢、590-764g,5匹)では、上記の成熟ラットの結果と比較すると、血圧はHUTの状態で減少し、その後増加に転じて一定値へ達する過程は同じだが、それら変化点へと達する時間は老齢ラットで極めて長かった(92.6 ±56.4sec)6か月齢以上のSDラットにおける90°Head-up Tilt(HDT、仰臥位より立位)実験を、さらに積み重ね、循環機能の発達と、特に加齢過程にある個体の体血圧(BP)、心拍数ほか各日齢(週齢)の基礎値を得、HUTによる姿勢変換時のそれ循環因子の変化が発達・加齢に伴ってどのような経過を辿るか、その概要は明らかにになった。今後は各因子と個体の組織臓器の発達と老化、HUT時の減少変化それら相互関係の詳細を追求し、より深く掘り下げるべく新知見を得ることが出きた(動脈血管の肉眼的加齢変化がげっ歯類でもある等新たな知見は平成29年度科研費へ継続的研究計画として新改めて応募準備へと繋がる。本年度の成果は主に老齢ラットのHUT時、特に30分のHUTでは血圧が徐々に低下して血圧維持能が成熟群に比して弱いことを明らかにした。その際、頭側への供血量はHUT前値に対する%変化量で見ると成熟と比べて基礎BPが低い分、その変化量は大きい。このことは灌流圧が低いため頭蓋外供血を減らしAutoregulationを基本に脳循持が働いている可能性が高い:脳乏血反応などで供血を維持するなど。HUTの持続時間を5,15,30,60分と種々行ってHUT後の水平位の回復過程の循環動態の観察で、HUT調節機構、体液シフトの状況などを追求を始めた:平成28年度前期に集中行、10月国際学会報告。その予備結果ではHUT時間の違いが水平位でのBPレベルと安定になるまでの変化が、血管のコンプライアンス(動静脈)等の影響、体位変換による体液シフトの程度によるHUT時の管内液から管外液への水の移動も関わる複雑な変化を示し、性成熟頃には循環調節系が不安定であることも示唆された(個体差大)。老齢群ではHUTが長いとHUT中の循環動態は良いとはいえず起立耐性能は低下する。ヒトを対象とした実験は、を変更して、動物実験の結果を踏まえて立案(どのような起立テスト、息こらえテスト)するまでとし、倫理審査受けてその経過をみて予備実験を行うこととする。

ラットの動物実験については、おおむね順調に進み、平成27年度中に老齢ラット飼育のための動物導入を行い、更には、現在リタイアラット(6月齢前後±24週)の動物で賄うようにしているが、飼育条件の課題を検討する(僅かな飼育条件も加齢に影響するとみているため)。組織解析は老齢群の血管摘出と標本作製(パラフィン)を27年度後半から開始した。現在、連携研究者らとともに光学顕微鏡観察の準備を進めている。更には、老齢ラット組織の有効利用を検討する(脳の解析など)。当該年度は代表研究者の都合(後述)により研究期間を延長し、動物実験の結果を総括して投稿すること、平成30年度の科研費申請課題の基盤データの蓄積を目的に研究を推進した(不慮の事故で11月以降研究の纏めが不可能となったため)。ラットでのHead-up tilting(HUT)実験で異なるHUT継続時間:5,15,30分でtrialをアトランダムに行いHUTから水平位に体位変換時の循環動態はどのように異なるかを調べ、これ迄の結果に加えて考察した。即ち、HUT体位変換時の循環因子、特に血圧と頭側への血流量の変化と、その変化における動脈圧受容器反射(BR)の働き、また、それらへ加齢が及ぼす影響を調べた結果、(前年度に引き続き)加齢に従って立位時の循環機能の維持能(特に血圧維持)は悪くなって、BRの血圧変動に対する求心性神経興奮が弱まることが示唆された。1)HUT姿勢から戻して水平位になった際、血圧、頭側の血流が安定するまで、姿勢変換直後に短い周期のFluctuation(3点以上)が観察される。このFluctuationはHUT時間ならびにBRの機能に依存して量的質的に異なることが分かった(老齢期には減弱)。このことは静脈還流量との関連も示唆されたため、平成29年度は「ヒト」の予備実験の遂行よりは新規申請のための結果を得るべく動物実験を優先した。2)比較的長めのHUT実験では20-30分経過時に、特にBRの求心性神経の役割が重要で、頸動脈洞と大動脈のそれら神経を切断・破壊後では、HUT30分経過後でも安定していた血圧は維持できすに低下していくことが分かった(7匹)6カ月齢以上1.5年齢のラットでは、これ迄の報告の通り、HUT時の血圧維持能が低いことがより強く支持する結果となった:なお、老齢ラットではHUT直後の血圧減少から増加に転じて一定値に達するまでに時間を要する。但し、平成28年度付与の事故の後遺症が悪化したため、下期にまとめができなかった。連携協力者(日頃の共同研究者連携)により実験は細々と継続し、現在1年延長(5月)し、最終年度のラットの実験計画を再立案して、6月から集中的な実験遂行とデータのまとめ論文投稿を行う予定である。生後8週齢以上の発達と老化過程にあるSDラットを目的の週齢まで育て、麻酔下で体血圧(BP)、頭側への血流(BF)(脳への血液供給の一部を反映)及び心拍数(HR)を計測し、一部は急性の受容器反射求心路の切断処置を行って、90°Head-up tilting(HUT)による体位変換時とHUT中のそれら変化を追求し、それら循環指標の基礎値とHUT体位変換による変化が発達と加齢で、どのように異なるかを追求した。昨年度より老齢ラットでの実験例数は増え、生後から約2年齢までの体重変化と麻酔下のBP,BF,HRの基礎値ならびに水平仰臥位からHUT開始時、30分のHUT中、HURから水平に戻したときの各値と体位変換時時の変化の詳細を明らかにした。HUによる体位変換はは体軸方向の静水圧勾配は変わり動脈圧も変化することを確かめ、その後、短期調節として瞬時に働く圧所容器反射が幼弱で機能が確立していない、あるいは加齢で気に追うが減弱していると働きが弱いと血圧変動が大きい。後者の場合、結果は血管系の機能、即ち血管構造が成熟と異なってくることに起因することも含まれることを示唆した。
流体構造連成解析のための特殊格子移動法

本年度は流体場内で物体同士が接触するFSI解析の実現に向けて,埋め込み境界法による生体弁のFSI解析で得られた生体弁の動きに対して流体解析を行った.FSI解析によって導き出された動作は複雑である.複雑な変形をする弁の形状に合わせた格子全体の自動生成は難しく,一度生成した格子を自動で移動することが望ましい.そこで,本研究では複雑な形状,動作に対して自動での格子移動を実現した.物体同士の接触がある流体解析では,物体同士が自由な位置で接触したり,滑り合う動きを実現するために基底関数が不連続なスリップ面を接触する物体同士の間に設ける.これまでの流体解析ではスリップ面の形状が変化することはなかった.しかし, FSI解析で得られる弁動作は,弁尖同士が閉じたまま押し合い,滑り合うため,スリップ面をその動作に合わせて変形させる必要がある.さらには,接触時には解析格子の接触部の格子点同士を重ね,要素を押しつぶす必要がある.従来の格子を弾性体と見立てた格子移動手法では,このような制御を必要とする格子移動は難しい.そこで,本研究では格子全体をスリップ面を含む部位と含まない部位の2つに分け,それぞれを別の手法で変形させることで解決した.スリップ面を含む部位に関しては,まず生体弁の中央を通るスリップ面を作成した後,生体弁表面を含むスリップ面に向かう面を作成し,間補完することで格子を生成した.それ以外の部位に関しては従来の格子移動手法を用いた.解析により弁同士が接触する瞬間のジェットを捉えることに成功し,弁先端に強い力がかかることも確認できた.以上の結果をまとめ,アメリカ合衆国オースティンで開催されたIGA2018にて発表した.本年度は埋め込み境界法によるFSI解析で得られた動作に合わせた自動での格子移動を実現させ,流体解析を行った.物体同士の接触がある流体解析では,物体同士が自由な位置で接触したり,滑り合う動きを実現するために基底関数が不連続なスリップ面を接触する物体同士の間に設けている.昨年度までの研究ではスリップ面上の格子点が移動することはあっても,スリップ面の形状が変化することはなく,形状も平面であった.しかしながら, FSIによって導き出された動作は弁同士が押し合い,滑り合うものであるため,スリップ面をその動作に合わせて変形させる必要がある.さらには,接触時には解析格子の接触部の格子点同士を重ね,要素を押しつぶす必要がある.本研究ではこの問題に対して,格子全体をスリップ面を含む部位と含まない部位の2つに分け,それぞれを別の手法で変形させることで解決した.スリップ面を含む部位に関しては,まず生体弁の中央を通るスリップ面を作成した後,生体弁表面を含むスリップ面に向かう面を作成し,間補完することで格子を生成した.それ以外の部位に関しては従来の格子を弾性体と見立てた格子移動手法を用いた.このようにして,複雑な形状,変形に対しても格子制御を可能とした.また,本解析では埋め込み境界法のFSI解析では無視されていた弁の厚みを考慮し,弁に厚みを持たせ,弁の先端部には丸みをつけた.実際の心臓弁は厚みを持っており,これにより弁の先端部で発生する細かい渦を捉えることができる.解析結果からはせん断応力を計算した.厚みのない弁の解析では弁先端部で大きなせん断応力が発生していたが,なめらかな形状を再現したことでその傾向が小さくなることが確認でき,計算上の収束性も向上した.以上より当初の計画以上に進展してると言える.これまでに,埋め込み境界法を用いたFSI解析で得られた解析結果をもとに格子の自動制御を行った.これにより流体と構造物の相互作用による複雑な動作に対しても,境界適合格子の自動制御を実現し,それにより流体解析ができた.今後は実際の現象に対する直接FSI解析を通して,手法のアップデートを行う.接触を伴うFSI解析では,物体同士の間に基底関数が不連続なスライド面を設けているが現実には無いもので,このスライド面は移動・変形を自由にさせることができる.そのため,スライド面を適正に配置し,品質の高い格子を保つような格子移動を実現する.このスライド面がどのような状態にあるのが良いのかを調査し,スライド面を制御する手法の構築を行う.このスライド面の制御は簡易化のため二次元のFSI解析からはじめ,三次元のFSI解析へと発展させる.解析対象として,接触を伴う心臓弁を含む左心室内流れを扱う.まず二次元のFSI解析では,直管の内部に対となる二枚の弁尖を配置し,スライド面は弁尖間に一本となる.二枚の弁尖の位置,形状を入力としてスライド面を制御する手法を構築する.この際時間刻み幅のとり方や必要な格子解像度についても明らかにする.次に三次元のFSI解析では左心室を扱う.左心室には二つの心臓弁がある.一つは三枚の弁尖から成る大動脈弁であり,これまでに解析を行ってきた.もう一つは大きさの異なる二枚の弁尖から成る僧帽弁である.僧帽弁は大動脈弁に比べ,柔軟であるため大きく動きやすく,動きを制限するための紐状の腱索が左心室壁とつながっている.そのため,スライド面も大きく動くことが考えられ,より精密な制御が求められる.さらには,二次元の場合とは異なり,スライド面が複数面必要となるため,スライド面同士の影響を考慮する必要がある.流体場内で物体同士が接触する流体構造連成解析の実現に向けて,大動脈弁の構造解析結果を用いた流体解析を行った.これまでの流体解析では用意した弁動作を用いていたため,流体の解析格子や接触の含む流体解析に必要となる格子点同士の接続情報を比較的容易に生成することができた.

しかし,構造解析を用いた解析の際には,構造解析で得た形状を基にこれらを生成する必要がある.構造解析では血管の解析に用いられる超弾性体ファングモデルの非圧縮性薄肉モデルを用いた.また,弁の面全域で滑らかさを担保するため空間の基底関数にT-splineを用いた. T-splineはNURBSの上位互換の曲面理論で,複雑な形状に対しても曲面全体でC^2連続を保持できる.また,局所的な格子の細分化も可能となる.境界条件として面全域に一心拍で時間変化する圧力差を与えた.流体解析では計算を効率よく行うため, T-splineではなく空間の基底関数にNURBSを用いた.構造解析で得た形状に対して弁の表面及び,周囲の流体場領域に解析格子を生成した.この時弁同士が触れていない状態の格子は一度理想的な解析格子を生成した後で,格子自体を弾性体とみなした構造解析により得た.また,弁同士が触れている状態の格子は毎時間ごとにプログラムで直接生成した.ここで,物体が接触する流体解析では,接触を表現するために要素を押しつぶし,重なり合う格子点の未知数を同値とみなす.この時,どの格子点同士が接続するかという情報が必要となる.そこで,得た解析格子の要素ごとの体積を算出し,要素体積がある値以下の部分では接触とみなし該当する格子点に接続情報を与えた.境界条件として脈動流を表現する時間変化する流速を流入面に与えた.解析結果より,弁同士が接触する直前の速い流れまで捉えることができた.本研究は物体同士の接触を含む流体構造連成問題の数値解析手法の開発を目的としている.本年度は目的の実現に向け,大動脈弁の構造解析を行った後,得た形状を基に流体解析を行った.まず構造解析ではT-splineという複雑な形状に対しても滑らかさを担保できる基底関数を利用した.さらに,超弾性体ファングモデルの非圧縮性薄肉モデルを用い,簡易的に,弁同士の接触を考慮した解析を行った.こうして構造解析に基づく弁動作を抽出することに成功した.次に流体解析では計算コストを抑えるため, T-splineではなくNURBSを基底関数に選択した.そのため,構造と流体で離散化が異なることからそのあいだのマッピングが必要であったがこれの対応を行った.マッピング後は,弁の形状をインプットとして解析格子を半自動で生成することに成功した.これは,弁同士の接触のない部分では従来手法である格子自体を弾性体と見立てた構造解析により,弁同士の接触のない部分ではプログラムにより自動生成することで実現した.さらに,物体同士の接触がある流体解析では,格子点同士を重ね,要素を押しつぶすことで接触を表現している.この時どの点同士を重ねるかという情報が必要になる.これまでは自分で弁および,格子の動作を決めていたため,この情報も手動で生成していた.今回は格子を自動生成したため,どの格子点同士が重なっているか分からなかった.そこで,要素体積に注目し,押しつぶされている要素に属する格子点に格子点接続情報を自動的に与えることでこれを自動生成した.計算結果からは,より現実に近い弁動作に基づいた流れを得ることができた.本年度は流体場内で物体同士が接触するFSI解析の実現に向けて,埋め込み境界法による生体弁のFSI解析で得られた生体弁の動きに対して流体解析を行った.
膜の品質管理機構の解明を目指す－細胞膜上の異常膜ドメインの解消機構の解析

本研究では、出芽酵母のリン脂質ホスファチジルセリン(PS)合成酵素欠損株において発生する、膜タンパク質が分布できない巨大膜ドメイン"void zone"についての解析を行っている。void zoneの発生機構やその構造、液胞を介した解消機構といった動態に関わる分子の同定を目標としている。本年度における解析で分かってきた主な知見を以下に述べる。1「PS欠損株では細胞内のステロール量が増えている」:ステロール特異的に結合するfilipinによる染色結果から、他の細胞膜領域に比べてvoid zoneにステロールがより豊富に存在することが示唆されていた。そこでTLCによる脂質分析を行ったところ、PS欠損株では野生株よりもエルゴステロールが増加してることが分かった。しかしながら、void zoneがあまり多く発生しない30°Cで培養したPS欠損株においてもこの増加は認められ、void zoneの発生率と細胞内ステロール量に直接的な相関は無いようであった。2「エルゴステロールとスフィンゴ脂質の合成がvoid zone形成に必要である」:上記の結果からも予想されていたが、エルゴステロールの合成経路の遺伝子欠損をPS欠損株に加えると、void zoneの発生が顕著に減少することが分かった。またスフィンゴ脂質の合成に関わる遺伝子のいくつかの欠損変異もまたvoid zoneの発生に必要であることが分かった。3「void zoneと接触する液胞膜領域の特殊性」:細胞膜上に発生するvoid zoneにリソソームに相当するオルガネラである液胞が接触している様子が観察されていた。接触時の液胞について液胞膜タンパクの分布を観察したところ、void zoneと接触している領域には液胞膜タンパクが存在していないことが示唆され、特殊な膜ドメイン同士が接触しているという新たな可能性が見出された。PS欠損株で発生する膜ドメインvoid zoneについて、その発生や消失に係る分子や実験条件に新たな発見があり、これらの解析に時間を費やしているため、当初予定していた野生株やin vitroの系へ、解析を進展させるには更に時間を要することが予想される。しかしながら、得られてきた結果はvoid zoneの基本的な性質として興味深いものであるため、推進方策を少し変更して解析を引き続き行っていく。PS欠損株での解析結果を基に、野生株での異常膜ドメインやin vitroでの再構成までを視野に入れていたが、void zoneの基本的な発生・消失に関わる部分や、液胞との相互作用に興味深い性質が見出されてきたため、これらの基本的な性質の解析に注力し論文発表を目指す。次年度使用額は旅費申請額と支出額の差にほぼ等しく、物品費に関しては適切に使用できたと思われる。翌年度は学会発表に加え、論文投稿も予定しているため次年度使用額の一部はこれらの費用に充てて研究を遂行していく。
高齢者医療と介護の経済分析-保険と地域の視点

本研究の目的は,今後の高齢者社会保障において所得保障とともにますます重要な意味を持ってくる実物サービスの提供すなわち高齢者医療・介護の問題について,次の2つの視点から考察することである。すなわち,第1は高齢者社会保険の経済分析である。保険によるモラル・ハザードの問題とともに,わが国の高齢者保障の予算,制度,運用の実態などを検討することである。第2の分析は地域からみた高齢者の医療と介護である。とくに,いくつかの地域を選び,国と地方の財政関係の実態を明らかにし,国と地方の機能分配について考察する。2カ年にわたる研究期間においては既存研究の理論的検討とともに,県・市町村の医療・介護の第一線の担当者および民間の高齢者サービス提供者からヒアリングを行い,地域から見た社会保障の実態,問題の把握に努めた。研究成果は2つの論文にまとめられている。第2の問題については,地域の医療保険である国民健康保険と老人保健制度の連結収支表の作成を通して,医療保険財政の実態を明らかにした。とくに市町村間格差に注目してある県下の5市町村の事例研究を行い,医療保険財政としては,本来,苦しいはずの小規模の町村ほど,手厚い制度的な財政支援により「健全」であるという,わが国医療保険財政の実態と制度上の問題を明らかにした。これは今後の制度改革に重要な示唆を与えるものであり,さらに対象市町村を拡大して分析を補強したうえで論文にまとめ発表する予定である。研究の初年度として,既存の基本文献の収集・分析ならびに統計データについての基本的な情報の収集に努めるとともに,実地調査を通して問題の所在の確認に全力を注いだ。とくに実地調査に際しては,県庁(3カ所),市町村役場(9カ所),病院,老人福祉施設等(民間施設を含め十数カ所)を訪問し,高齢者医療と地方財政との関係とくに国民健康保険制度,介護保険制度と市町村財政について,現場の担当者からのヒアリングを行った。それぞれの調査箇所は,人口規模,人口高齢化率,1人当りの医療費の水準もまちまちであり,また抱えている問題も様々であったが,問題の広がりを把握するには有意義な調査であった。われわれの主たる関心である高齢者医療・介護保険と市町村財政との関係を明らかにするために,今年度の調査のまとめとして,市町村が同じく保険者あるいは運営の主体となっている国民健康保健制度と老人保険制度ならびに退職者医療制度の間の資金の流れの解明につとめた。国庫からの補助を見ても,国民健康保険に対する国庫補助などに加え,地方交付税制度を通じる補助なども行われている。さらに,組合健保等から多額の資金が国民健康保険に移転される仕組みが設けられており,各制度間の資金の流れは複雑多岐にわたる。この流れが各市町村のおかれている状況によってどのように変化するのかを明らかにすることによって,地域の視点から見た現行制度の問題点を摘出することができる。来年度にはさらに実地調査を行ってこの分析結果を補強するともに,保険理論に基づく高齢者医療・介護保険制度の分析を加え,その研究成果を財政学会等で報告するとともに,論文として発表する予定である。

とくに市町村間格差に注目してある県下の5市町村の事例研究を行い,医療保険財政としては,本来,苦しいはずの小規模の町村ほど,手厚い制度的な財政支援により「健全」であるという,わが国医療保険財政の実態と制度上の問題を明らかにした。これは今後の制度改革に重要な示唆を与えるものであり,さらに対象市町村を拡大して分析を補強したうえで論文にまとめ発表する予定である。
プロスタグランジンE2による生理作用の発現機構に関する神経科学的研究

発熱は脳内で産生されたプロスタグランジン(PG)E2が視索前野と呼ばれる神経核に作用し、それが引き金となって交感神経系が賦活化されることによって起こる。研究代表者はこれまでに、視索前野で生じた発熱シグナルが延髄の淡蒼縫線核吻側部(rRPa)を介して交感神経系の出力神経細胞(交感神経節前神経細胞:SPN)に伝えられることを明らかにした。しかし、発熱シグナルをSPNに伝達するrRPaの神経細胞については存在が想定されているのみで、未だ同定されていない。このrRPaの神経細胞は交感神経の出力を調節する上で重要な役割を果たす、sympathetic premotor neuronであると考えられ、その神経細胞を同定し、特徴を調べることは生体のホメオスタシスを理解する上で重要な知見をもたらすと考えられる。昨年度までに、このsympathetic premotor neuronの投射先と考えられ、SPNが存在する、胸髄の中間外側細胞柱(IML)での興奮性(グルタミン酸作動性)神経終末の分布を調べ、小胞性グルタミン酸輸送体(VGLUT)2とVGLUT3陽性の神経終末がそれぞれ延髄の異なる神経細胞集団からの投射に由来して存在していることを示した。VGLUT2は吻側延髄腹外側野(RVLM)の心臓・血管運動調節性のsympathetic premotor neuronに発現していることが知られていることから、VGLUT2陽性神経終末はRVLMからの投射に由来し、循環機能調節に関与するものと考えられる。一方、VGLUT3陽性神経終末はrRPaを含めた延髄縫線核に起始し、発熱誘発などに関与する可能性が示唆された。そこで今年度はラット延髄縫線核におけるVGLUT3の発現を調べた。その結果、VGLUT3発現神経細胞がrRPaを中心とする延髄縫線核に多数見つかり、PGE2の脳内投与や動物を寒冷暴露することによって、このVGLUT3発現神経細胞が興奮した。神経投射トレーサーを用いた実験から、これらのVGLUT3発現神経細胞がSPNに直接投射していることと、さらにこの経路を介して、褐色脂肪組織や尻尾といった、体温調節器官の制御を行っていることが分かった。さらに、rRPaの神経細胞を興奮させると褐色脂肪組織での熱産生が亢進し、この反応はグルタミン酸受容体のアンタゴニストをIMLに投与することによって消失した。これらの結果から、rRPaを含めた延髄縫線核に存在するVGLUT3発現神経細胞はグルタミン酸作動性であり、SPNを直接調節することで、熱産生や熱放散に関わる交感神経効果器を制御していることが示された。このVGLUT3発現神経細胞は、古くからよく知られてきた循環調節に関わるRVLMのsympathetic premotor neuronとは違い、発熱誘発や体温調節に関わる新規のsympathetic premotor neuronに分類されるものであった。以上の研究成果は、古代からの謎であった発熱の誘発機構を明らかにしただけでなく、生体の基本的な機能である、体温調節の機構購解明にまで寄与するものである。さらには、発熱症状や自律神経失調症状を伴う様々な疾患に対する医薬品や治療法の開発にもつながるものである。発熱は古代より知られた生体防御反応であるが、中枢神経系を介したその誘発メカニズムは現代においても未だブラックボックスに入ったままである。本研究では発熱誘発に機能する中枢神経システムを明らかにすべく、解剖学的・生理学的手法を組み合わせて実験を行った。感染などが起こると脳内で産生されるプロスタグランジン(PG)E_2は発熱メディエーターとして知られ、脳内の視索前野に存在するPGE受容体EP3サブタイプに作用する。これが引き金となって、未知の下行性中枢神経経路を介して交感神経系が亢進し、褐色脂肪組織(BAT)などの効果器の作用によって全身の体温上昇(発熱)を引き起こす。今回、視索前野から交感神経系に至る未知の発熱誘発神経経路を中継する中枢神経核を同定するために、ラット視索前野にPGE_2を投与し、Fos蛋白質の発現を指標に神経細胞の活性化を観察した。すると、延髄淡蒼縫線核吻側部の非セロトニン神経細胞群でFos発現細胞数が顕著に上昇した。次に、GABA_A受容体アゴニストを淡蒼縫線核吻側部に注入し、淡蒼縫線核吻側部の神経細胞群の活性化を抑えると、視索前野へのPGE_2投与で引き起こされたBAT熱産生及び直腸温上昇(発熱)をほぼ完全に遮断した。さらに、視索前野から淡蒼縫線核吻側部への神経投射を調べたところ、視索前野のEP3発現神経細胞群の一部が淡蒼縫線核吻側部へ直接投射していることが分かった。また、視索前野における組織化学的解析から、視索前野のEP3発現神経細胞群の多くはGABA作動性であることも確認された。以上の結果から、淡蒼縫線核吻側部の非セロトニン神経細胞群が脳内PGE_2受容から交感神経効果器に至る神経経路を中継していることが明らかとなった。

平常時、これらの神経細胞は視索前野のEP3発現神経細胞群からのGABA入力により抑制されているが、PGE_2が視索前野に作用すると、抑制性受容体であるEP3の働きによって、このGABA入力が減少して淡蒼縫線核吻側部の非セロトニン神経細胞群が脱抑制状態になり、交感神経系の活性化を起こしてBAT熱産生などを促す、という発熱誘発機構が示唆された。さらに、出産時には感染などが起こっても母体では発熱が起こらないということが知られているが、出産時の視床下部ではEP3ではなく、PG合成酵素が一過性に減少することを最近見いだし、これが出産時における発熱反応の消失現象の原因であることを明らかにした。発熱は脳内で産生されたプロスタグランジンE_2が視索前野と呼ばれる神経核に作用し、それが引き金となって交感神経系が賦活化されることによって起こる。研究代表者はこれまでに、視索前野で生じた発熱誘発シグナルが延髄の淡蒼縫線核吻側部(rRPa)を介して交感神経系の出力神経に伝えられることを明らかにした。しかし、発熱誘発シグナルを交感神経系の出力神経に伝達するrRPaの神経細胞については存在が想定されているのみで、未だ同定されていない。この神経細胞は交感神経の出力を調節する上で重要な役割を果たす、興奮性のsympathetic premotor neuronであると考えられ、その神経細胞を同定し、特徴を調べることは生体のホメオスタシスを理解する上で重要な知見をもたらすと考えられる。そこで今年度は、rRPaのsympathetic premotor neuronの投射先と考えられ、交感神経系の出力神経細胞(交感神経節前神経細胞)が存在する、胸髄の中間外側細胞柱(IML)での興奮性(グルタミン酸作動性)神経終末の分布を調べた。近年cDNAクローニングされた3種類のvesicular glutamatetransporter (VGLUT)サブタイプに対する抗体をグルタミン酸作動性神経終末のマーカーとして用い、IMLを免疫組織染色法で解析すると、VGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末の存在が確認され、VGLUT1に対する免疫活性は見られなかった。電子顕微鏡でVGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末を観察すると、共に非対称性構造を持つシナプスの前部の小胞構造に免疫活性を認めた。このことは、VGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末が興奮性のシナプスを形成していることを示唆する。また、VGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末は交感神経節前神経細胞の樹状突起に接触しており、さらに、VGLUT2とVGLUT3の免疫活性の分布は共存しなかったことから、VGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末はそれぞれが独立した形で交感神経系の出力神経細胞に興奮性入力していることが考えられる。このことは、VGLUT2とVGLUT3陽性の神経終末が延髄のそれぞれ異なる神経細胞集団からの投射に由来することを示唆する。VGLUT2陽性神経終末は一部が(ノル)アドレナリン作動性神経マーカー陽性であったことや、アドレナリン作動性神経細胞が存在する吻側延髄腹外側野(RVLM)の心臓・血管運動調節神経細胞にVGLUT2が発現していることが報告されていることから、IMLのVGLUT2陽性神経終末はRVLMからの投射に由来し、心臓・循環機能調節に関与するものと考えられる。VGLUT3陽性神経終末は少数ではあるがセロトニン免疫陽性であったことから、rRPaを含めた延髄縫線核に起始し、発熱誘発や交感神経性の体温調節に関与する可能性が示された。以上の結果は、発熱誘発や体温調節を行う、新規のsympathetic premotor neuronの発見にもつながるものであり、自律神経系の制御機構の理解に向けて重要な知見であると考えられる。
好塩性・好熱性酵素サーモライシンの活性発現機構の分子論、蛋白質工学および応用

サーモライシン(T)のチロシン(Y)、カルボキシル基(D+E)、リジン(K)を化学修飾し、活性と好塩性に対する効果を評価した。YとKの修飾では活性は低下したが、(D+E)修飾では変化がなかった。T分子表面の電荷の減少につれて、好塩性が低下した。Kをポリエチレングリコール(PEG)で修飾し、PEG-Tを調製した。Tの活性はPEG化につれ増大し、6個のKが修飾されると6倍増大した。Tの熱安定性(Tm)はPEG化により87°Cから91°Cに上昇した。PEG化の効果は高濃度塩類添加効果に対応しており、塩の効果をPEG化で再現できる可能性がある。活性部位残基を標的に変異導入を検討した。T産生菌の変異体から変異酵素(T1,T2)を得た。T1ではTのVal-140がAlaに、T2ではAla-73がValに変換されていた。T1はTに比べ、蛋白質分解活性が150%に増大したが、低分子ペプチドFAGLA分解活性は35%に減少した。逆に、T2では蛋白質活性は10%に減少し、FAGLA活性は1200%に増大した。Val-140,Ala-73の部位特異的変異導入から、Ala-73とVal-140は、Tの基質特異性決定に大きい影響をもつことが示され、Ala-73へのかさ高い側鎖の導入により、蛋白質分解活性を抑制し、高いペプチド特異性を持つ酵素を創出できた。A73Vは人工甘味剤前駆体合成活性もTに比べて10倍高く、ペプチド合成における有用性が示された。Tの活性部位ZnをCoに置換した。Co-TではTに比べペプチド分解活性が4-5倍増大した。遷移状態アナログによる阻害活性も5倍増大したことから、Co-EではTに比べて遷移状態が安定化されることにより、活性が増大すると考えられた。Co-Tは4M NaClにより15倍活性化された。塩による活性化は、Co-置換による活性化と相乗的であり、通常の条件下におけるTに比べ、4M NaCl存在下のCo-T活性は70倍も高い。ヒトMMP-7(M)の好塩性、安定性、阻害剤の効果を検討し、Tと比較した。MはTの活性ドメインと構造的に類似している。M活性はT活性同様、塩濃度に依存して増大した。Tでは活性化がkcatのみに依存したが、MではKmのみに依存した。Tmは85°C。MとT活性ドメインとの高い類似性が示された。Tmは85°C。我々は、好熱性プロテイナーゼであるサーモライシン(TLN)の活性が高濃度の塩類の添加につれて指数関数的に増大し、飽和濃度のNaClの存在下に数十倍も増大することを報告した。

さらに、高濃度の塩類の存在下に安定性も増大することを見出し、TLNは好塩性酵素であることを示した。本研究では、チロシン残基、リジン残基、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を対象にして、化学修飾と部位特異的変位導入法により、電荷を付加、消去、反転させることを試み、活性と安定性に及ぼす効果を検討した。チロシン残基のニトロ化やアミノ化、リジン残基のTNBSによる修飾およびマレイミド化、またリジン残基にポリエチレングリコール(PEG)を付加した。一方、6個のセリン残基をアスパラギン酸に変換した。このような修飾と変異導入により、TLNの高度な好塩性が分子表面の静電的環境に依存することを見出した。PEGの付加により酵素活性が顕著に上昇した。これはPEGの付加により、またPEGに対する水和によりTLNの自由度が抑制されることに起因すると判断した。すなわち、あたかも高塩濃度存在下で、TLNの分子表面が静電場を失い、しかも自由度が抑制された状態に類似している。部位特異的導入により、活性部位S2サブサイトに存在するTrp-115を種々のアミノ酸残基に変換した。チロシンとフェニルアラニンに変換した変異型TLNでは、天然型酵素に比べ、活性がわずかに低下するものの80%以上の残存活性を維持した。一方、これら芳香族アミノ酸以外のアミノ酸に変換した変異酵素では全く活性を消失した。このことから、Trp-115は活性発現に重要な寄与をすることが示唆された。サーモライシン(TLN)産生菌のニトロソグアニジン処理により、2種の変異酵素(T1,T2)を得た。T1では、TLNのVal-140がAlaに、T2ではAla-73がValに変換されていた。T1はTLNに比べ、カゼイン分解活性が150%に増大したが、低分子ペプチド分解活性は35%に減少した。一方、T2ではカゼイン活性は10%に減少したのに対し、FAGLA活性は1200%に増大した。Val-140,Ala-73に対して、部位特異的変異導入を試みた。A73Vは人工甘味剤前胚体Z-Asp-Phe-OMe合成活性がTLNに比べて10倍増大し、ペプチド合成における有用性が示された。Ala-73とVal-140は、基質特異性の決定に大きい影響をもつことが示され、Ala-73へのかさ高い側鎖の導入により、蛋白質分解活性を抑制し、高いペプチド特異性を持つ酵素を創出できた。TLNの活性部位亜鉛をコバルトに置換した。本酵素の安定性はTLNと差異がないが、活性は5倍増大した。一方、遷移状態アナログによる阻害活性も5倍増大した。Co-TLNでは遷移状態の安定化により、活性が増大すると考えられた。Co-TLNはTLNと同様に高濃度の塩により顕著な活性化をうけた。塩による活性化は、Co-置換による活性化と相乗的であり、4M NaCl存在下のCo-TLNの活性はTLNより70倍も高い。ヒトマトリライシン(MLN)とTLNを比較した。MLN活性は塩濃度に依存して指数関数的に増大したが、TLNでは活性化がkcatのみに依存するのに対し、MLNではKmのみに依存した。MLNは高い熱安定性を示した(Tm=85°C)。4M尿素では完全失活したモルテングロビュル構造を取ることが示され、TLN活性ドメインと類似性を持つことが示唆された。
獲得免疫系起源の研究

獲得免疫系は、外界から侵入してくる病原体を特異的に認識・排除するために脊椎動物が持つ高度なシステムであり、軟骨魚類からヒトに至るまでの生物では、多様なイムノグロブリン型の抗原受容体を用いている。一方、軟骨魚類より下等な脊椎動物であるヤツメウナギやヌタウナギなどの無顎類の抗原受容体は、Ig型ではなく、LRR(leucine-rich repeat)からなるVLRである。VLRは3種類が見出されており、VLRA+/VLRC+細胞は哺乳類などのαβT/γδT細胞に、VLRB+細胞はB細胞に相当すると考えられている。VLR遺伝子も、遺伝子再編成により極めて大きな多様性を創出しているが、この遺伝子再編成の仕組みは、V(D)J組み換えとは極めて異なったものである。われわれは、この遺伝子再編成に、複製の際にDNA polymeraseが短い繰り返し配列間で基質をswitchする、"copy choice"または"template switching"と呼ばれる遣伝子再編成機構が関与している可能性を指摘してきた。この仕組みをさらに解析するため、われわれは、ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)のVLR遺伝子に関し、遺伝子再編成が途中で停止したと考えられる部分再編成体を多数単離し、その構造を解析した。その結果、VLRA/VLRC遺伝子の部分編成体の中に、LRR遺伝子セグメントの挿入に伴い、定常領域の配列が重複しているものを多数見いだした。これらは、LRR遺伝子セグメントが定常領域にトランスポーズしたような構造になっていた。今回、これらの構造がリンパ細胞特異的に生じているのかを確認するため、赤血球のDNAを用いて検討したところ、頻度は低いものの、同様の構造の遺伝子が検出された。他の細胞でも同じような現象が存在するのかについて、今後検討する必要がある。獲得免疫系は、脊椎動物が持つ高度な生体防御システムであり、ゲノム再編成により多様化される抗原受容体が重要な役割を果たしている。軟骨魚類からヒトに至るまでの生物は、イムノグロブリン(Ig)型の抗原受容体の遺伝子を、DNAトランスポゾン由来であるV(D)J組み換えにより再編成し、多様な抗原受容体を創り出している。一方、軟骨魚類より下等なヤツメウナギやヌタウナギなどの無顎類では、leucine rich repeat(LRR)からなる抗原受容体VLRの遺伝子を、V(D)J組み換えとは異なるゲノム再編成システムによって多様化している。本研究課題では、VLR遺伝子の再編成がトランスポジションの反応を利用している可能性を検討している。まず、ヌタウナギのVLRCおよびVLRAの遺伝子再編成を解析する過程で、LRRセグメントの挿入に伴い、定常領域の配列が重複した部分再編成体を多数見いだした。これらの部分再編成体では、挿入されたLRRセグメントの両端に重複配列が存在しており、まさにLRRセグメントがターゲットサイトにトランスポーズした構造になっていた。一方ヌタウナギのVLRB遺伝子再編成では、このような定常領域の配列が重複した部分再編成体は得られなかった。この理由については現時点では不明である。また、ヤツメウナギに関しては、1次リンパ組織が完成していない孵化直後のstage 24から幼生となるstage 30まで、複数の発生段階において、各個体からそれぞれDNAを抽出し、VLR遺伝子(VLRA、VLRB、VLRC)をPCRで増幅し、解析したが、現時点では、発生過程における各VLR遺伝子再編成の開始時期、多様性などに関しては明らかになっていない。論文査読者からの指摘に従い、追加の実験を行った。実験結果の解析、および論文の改訂に時間がかかっている。獲得免疫系は、外界から侵入してくる病原体を特異的に認識・排除するために脊椎動物が持つ高度なシステムであり、軟骨魚類からヒトに至るまでの生物では、多様なイムノグロブリン型の抗原受容体遺伝子をDNAトランスポゾンを起源とするV(D)J組み換えにより創出している。VLRは3種類が見出されており、VLRA+ /VLRC+細胞は哺乳類などのαβT/γδT細胞に、VLRB+細胞はB細胞に相当すると考えられている。この仕組みをさらに解析するため、われわれは、ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)のVLR遺伝子に関し、遺伝子再編成が途中で停止したと考えられる部分再編成体を多数単離し、その構造を解析している。その結果、VLRA /VLRC遺伝子の部分編成体の中に、LRR遺伝子セグメントの挿入に伴い、定常領域の配列が重複しているものを多数見いだした。これらは、挿入されたLRR遺伝子セグメントの両端にdirect repeatsが存在する形になっており、LRR遺伝子セグメントが定常領域にトランスポーズしたような構造になっていた。これらの結果を基に、VLR遺伝子の再編成の仕組みの全体像についてのモデルを作成した。投稿した論文がrejectされた。コメントに従って実験を追加し、論文を書き直しているため。

獲得免疫系は、外界から侵入してくる病原体を特異的に認識・排除するために脊椎動物が持つ高度なシステムであり、軟骨魚類からヒトに至るまでの生物では、多様なイムノグロブリン型の抗原受容体を用いている。一方、軟骨魚類より下等な脊椎動物であるヤツメウナギやヌタウナギなどの無顎類の抗原受容体は、Ig型ではなく、LRR(leucine-rich repeat)からなるVLRである。VLRは3種類が見出されており、VLRA+/VLRC+細胞は哺乳類などのαβT/γδT細胞に、VLRB+細胞はB細胞に相当すると考えられている。VLR遺伝子も、遺伝子再編成により極めて大きな多様性を創出しているが、この遺伝子再編成の仕組みは、V(D)J組み換えとは極めて異なったものである。われわれは、この遺伝子再編成に、複製の際にDNA polymeraseが短い繰り返し配列間で基質をswitchする、"copy choice"または"template switching"と呼ばれる遣伝子再編成機構が関与している可能性を指摘してきた。この仕組みをさらに解析するため、われわれは、ヌタウナギ(Eptatretus burgeri)のVLR遺伝子に関し、遺伝子再編成が途中で停止したと考えられる部分再編成体を多数単離し、その構造を解析した。その結果、VLRA/VLRC遺伝子の部分編成体の中に、LRR遺伝子セグメントの挿入に伴い、定常領域の配列が重複しているものを多数見いだした。これらは、LRR遺伝子セグメントが定常領域にトランスポーズしたような構造になっていた。今回、これらの構造がリンパ細胞特異的に生じているのかを確認するため、赤血球のDNAを用いて検討したところ、頻度は低いものの、同様の構造の遺伝子が検出された。他の細胞でも同じような現象が存在するのかについて、今後検討する必要がある。(a)未熟リンパ細胞におけるgermlineLRRセグメント転写ヤツメウナギの幼生の1次リンパ組織からリンパ細胞を取り出し、sortingによりsingle cellを多数単離する。各single cellから全cRNAを増幅し、ライブラリーを作製する。それぞれのライブラリーに関して、未熟リンパ細胞で発現していると考えられているCDA1/CDA2の発現と、germline LRRセグメントの発現をPCRにより確認する。CDA1/CDA2を発現する細胞でgermline LRRセグメントが同時に転写されていれば、モデルを支持するデータとなる。(b)未熟リンパ細胞に特異的に発現する遺伝子の同定また、上記ライブラリーを用いて、DA1/CDA2を発現する細胞と発現していない細胞におけるcDNAを比較することにより、DA1/CDA2を発現する未熟リンパ細胞で特異的に発現している遺伝子を同定することが可能になる。この中には、VLR遺伝子再編成に関与する新規遺伝子が含まれている可能性がある。論文の改訂が終わり、現在、共同研究者がチェックしている段階である。チェック終了後、英文校正を行い、再投稿する。その後、実験を再開する予定である。
q-space imaging法による筋線維タイプ識別法の確立

本研究の目的はq-space imagingにて骨格筋線維のタイプを選別する手法を確立することである.QSIは生体組織のマイクロ構造情報を取得することが可能である.これを基に骨格筋線維のタイプを非侵襲的かつ簡便に識別可能とする手法を確立することが目的である.結果、水分子の微細構造における変位量を解析することが可能となり,生体組織のマイクロサイズの構造情報を取得することができた.また,マウス下腿部骨格筋の染色像と比較し、マウス下腿部骨格筋のAxial断面像内の筋タイプ分布との比較、その筋細胞径との比較を行い有意な相関が得られた。筋線維タイプの識別法として新規性に富んだ手法として確認された。本研究は磁気共鳴画像法(MRI)を用いて骨格筋線維のタイプを選別する手法を確立することである.骨格筋線維タイプの選別にはq-space imaging法を用い手法確立を目指す.この手法は水分子の変位量解析を行うことで組織の微細構造を計測することが可能となる.この目的を達成するために本年度は,生体組織のマイクロ構造情報を取得することが可能はq-space imaging法の設計を行った.動物実験用7テスラMRI装置に設計開発したパルスシーケンスシステムプログラムの実装を行い,各種条件設定や調整を行った.また,q-space解析を行うためには独自の画像解析用プログラムの開発が必要不可欠である.このため,実装したパルスシーケンスのテストデータを用い,解析プログラムの開発も同時に行った.本研究では動物を対象とし手法の確立を目的としている.このため,マウス下腿部に対しMRI計測が可能となるような実験台の作成,体位保持用補助具の開発を行った.また,それを用いた動物固定法,麻酔管理法の確立を行った.MRIでは対象にあったコイルの選定が大事である.このため,ボリュームコイル,サーフェスコイル,クライオシステムコイルと比較し最適なコイルをクライオシステムコイルと選定した.MRI計測の後に,切片画像の確認も行うが,非常に多くの手技を伴う.このため,切片を作成するための液体窒素,イソペンタンによる凍結ブロック作成手技,クライオスタットを用いた切片作成手技,染色法手技の習得を行った.上記のシステム構築,動物手技の習得をもとにテストスキャンを行い.画像データを取得できることを確認した.(JSMRM 2014)今後は対象数を増やし,健常マウスによる本手法の妥当性を確立していく.本研究は磁気共鳴画像法(MRI)を用いて骨格筋線維のタイプを選別する手法を確立することである.骨格筋線維タイプの選別にはq-space imaging法を用い手法確立を目指す.この手法は水分子の変位量解析を行うことで組織の微細構造を計測することが可能となる.この目的を達成するために本年度は,生体組織のマイクロ構造情報を取得することが可能はq-space imaging法の設計を行った.動物実験用7テスラMRI装置に設計開発したパルスシーケンスシステムプログラムの実装を行い,各種条件設定や調整を行った.また,q-space解析を行うためには独自の画像解析用プログラムの開発が必要不可欠である.このため,実装したパルスシーケンスのテストデータを用い,解析プログラムの開発も同時に行った.本研究では動物を対象とし手法の確立を目的としている.このため,前年度マウス下腿部に対しMRI計測が可能となるような実験系,システムの構築をはかった.またMRI計測の後に,切片画像等を用いて比較を行うため,それにともなう手技の確立も行った.本年度は健常マウスを用い,テストスキャン,データの取得を行い,画像データを取得できることを確認した.(JSMRM 2014, 2015)今後は対象数を増やし,健常マウスを対象とした本手法の妥当性を確立していく.本年度の研究計画として,大きく分けると1前年度作成したパルスシーケンスプログラミングによるq-space imagingの評価,2マウス下腿を対象としたMRI実験データの取得,これらの2項目が主となる.前者に関しては,前年度開発を行ったプログラムが正常に動作していることを確認でき,順調に進み,終了した.このため,当初の計画通り達成している.また後者に関しては,実際にマウス下腿に対しMRI計測を行い,データを取得した.こちらも予定通り進んでいる.このため,現在までの達成度としてはおおむな順調に進展しているといえる.本研究は磁気共鳴画像法(MRI)を用いて骨格筋線維のタイプを選別する手法を確立することである。骨格筋線維タイプの選別にはq-space imaging(QSI)法を用い手法確立を目指す。この手法は水分子の変位量解析を行うことで組織の微細構造を計測することが可能となる。この目的を達成するために本年度は、昨年度までに確立したMRI技術を用いて、データ数の追加、得られたデータを解析し妥当性の評価、発表・公表を行った。結果として、QSIを用いることで水分子の微細構造における変位量を解析することが可能となり,生体組織のマイクロサイズの構造情報を取得することができた。また、マウス下腿部骨格筋の染色像(速筋染色:SC-71と遅筋染色:BA-D5)と比較し、マウス下腿部骨格筋のAxial断面像内の筋タイプ分布との比較、その筋細胞径との比較を行い有意な相関が得られた。このように本研究で開発を行った手法の妥当性を評価することで、筋線維タイプの識別法として新規性に富んだ手法として確認された。

主に新規性がある点としては、(1)組織切片を必要としないため非侵襲的,(2)MRI装置内にて安静にしているのみのため簡便,(3)断面のみでなく3次元的に評価可能といった点が挙げられる。本法が今後臨床にて確立されることにより、骨格筋疾患の画像診断や機序解明において新しい基準をもたらす可能性が考えられる。また,アスリートのスポーツ選手の場合、スプリンターは速筋線維が多く、マラソン選手は遅筋線維が多い。さらに、これらの割合は練習によりある程度変化するが、筋線維タイプ構成比が非侵襲かつ筋全体にて計測可能となるとスポーツ医学の発展も大いに期待できる。本研究の目的はq-space imagingにて骨格筋線維のタイプを選別する手法を確立することである.QSIは生体組織のマイクロ構造情報を取得することが可能である.これを基に骨格筋線維のタイプを非侵襲的かつ簡便に識別可能とする手法を確立することが目的である.結果、水分子の微細構造における変位量を解析することが可能となり,生体組織のマイクロサイズの構造情報を取得することができた.また,マウス下腿部骨格筋の染色像と比較し、マウス下腿部骨格筋のAxial断面像内の筋タイプ分布との比較、その筋細胞径との比較を行い有意な相関が得られた。筋線維タイプの識別法として新規性に富んだ手法として確認された。本年度の研究計画として,大きく分けると1パルスシーケンスプログラミングによるq-space imagingの設計開発,実装,2マウス下腿を対象としたMRI実験系の確立,これらの2項目が主となる.前者に関しては,設計開発,そして実装と順調に進み,終了している.このため,当初の計画通り達成している.また後者に関しては,計測環境の構築,切片作成に関する手技と予定通り進んでいる.このため,現在までの達成度としてはおおむな順調に進展しているといえる.現状では計画通り順調に進んでいる.このため,今後は当初の計画通りデータ数の追加,得られたデータを解析し妥当性の評価,発表・公表を行う.また,健常マウスの進展度に応じモデルマウスへの展開を進めていく.本研究ではQSI技術を用いた筋線維タイプ識別法の確立,骨格筋評価の前臨床展開である.上記の様,データ取得のための礎は確立した.今後は,QSIは水分子の微細構造における変位量を解析する手法であり,生体組織のマイクロサイズの構造情報を取得することが可能となる.よって,筋細胞直径を評価できる可能性を秘めている.マウスを対象としたQSIによる解析に加え,筋生検やATPase染色法後,顕微鏡にて観察し,比較することで確立を図っていく.特にこの点に焦点を充て今後の研究を進めていく.磁気共鳴医学現状では計画通り順調に進んでいる.
3μm光によるサブkeV領域のアト秒パルスの発生とその応用

物質中の電子の動きを捉えることができるアト秒パルスレーザーは、物理学、化学、生物・医科学等の基礎科学分野のみならず、超高速電子デバイス等ならびに高性能触媒や人工光合成等の化学・材料等の産業分野においても今後必須のツールとなるとものと期待されている。しかし、未だに利用できる波長域は光子エネルギーにして100eV以下の極端紫外(XUV)領域に制限されており、今、その波長域の拡大が切望されている。本課題では、独自に開発した高エネルギー中赤外レーザー光源とルーズフォーカス法を用いることにより、その波長域をサブkeV領域にまで拡張しアト秒科学の新たな展開を図る。物質中の電子の挙動を観測する上で重要なツールとなるアト秒パルスレーザーの波長領域を革新的に拡大し、かつこれを物質のミクロ分析に展開しようとする提案である。研究代表者の高い研究実績を基にして、励起光源となるフェムト秒赤外レーザの高出力化や高調波発生効率の向上を進め、波長3μm帯の励起光を用いてサブkeV領域で高出力のアト秒パルスを得ることを目的としている。サブkeV領域のアト秒パルスレーザは未踏領域への挑戦であり、レーザ光パルスの極限的な圧縮や希ガスセルを用いた高次高調波の発生など、実績に裏打ちされた学術的アプローチに意義がある。また、その実現により物質の原子レベル分析の新たな展開も期待される。