hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聴覚障害児及び視覚障害児のダンス表現に現れる運動のダイナミクス

結果を12月17日日本教育大学協会全国保健体育・保健部門全国創作舞踊研究発表会で報告した。18年1月にはラバンセンター・ロンドンの2教官による比較、評定を得た。対象に内在するダイナミクスに関してもディスカッションできた。2.合同ダンス作品『砂の世界』共通の原体験として「砂丘」へ出かけ、聾学校中高等部生、盲学校中学部生、鳥取大学生の合同でのダンス作品創作を指導した。共通の体験によって、運動のダイナミクスが共有された作品ができた。作品は、11月23日鳥取市内で開催したダンス発表会「こころとからだのharmonyみんなのダンス発表会」で発表した。1月、ラバンセンターの教官にDVDに納めたものを検証して頂いた。「障害にかかわらず表現を共有できている」と、創作指導の方向性について評価を得た。聴覚障害児のダンス表現が豊かなリズムを伴い、視覚障害児のダンスも空間の変化を伴って現れる。そのダンスは、障害の種類や有無に関わらず誰とでも共有できる。この共有できるものは、対象から得たイメージ、すなわち対象が持つ質的特性、であり、ダンスでは運動のダイナミクス(ルドルフ・ラバンは力、時間、空間、流れに分析し、運動の質的解析を行っている)を通して現される。本研究ではこの表現の対象が放つ質的特性(ダイナミクス)を、聴覚障害児、視覚障害児がどのようにとらえ、運動のダイナミクスとしてダンス表現しているのかを探ろうとした。まず、共に5年のダンス学習経験を持つ聾学校と盲学校中学部3年生女子の、原体験を共にした即興表現を比較した。即興表現『花火』を鑑賞したダンス経験の少ない大学生は、どちらも花火に見えると評価した。コミュニティーダンス指導者の観察では聴覚障害児の表現が、「よりクリアな」と評され、ラバノーテーション指導者は、視覚障害児の表現は「身体の中心からの」動きと指摘した。ラバンの運動解析専門家は、花火の即興表現における聴覚障害児の動きのダイナミクスは、空間と時間、流れに由来し、視覚障害児の運動のダイナミクスは力、時間、流れに由来すると評定した。「クリア」なと評された聴覚障害児の表現は、見えたままを指先まで使って表現し、身体支配空間も広いものだった。これに対し、視覚障害児では、腕の動きは肘までで終わっており、身体支配空間も小さい特徴があった。これについて視覚障害のある表現者自身も、動きは身体の中から次々出てくるが「手にまでは伝わらん」としている。「身体の中から」と評されたことが表現者自身にも自覚され、その結果として動きが形を持ったと考えられる。時間、流れの要素が、両障害者に共通しており、これがの共感の手がかりといえる。聴覚障害児、視覚障害児、障害のない大学生が砂丘をテーマに創作した合同作品『砂の世界』では見える者がとらえた風紋や、聞こえる者がとらえた波にさらわれる砂、一緒に体験した砂があたっていたい足、砂丘を登る時の動きのダイナミクス等が共有され、作品全体のダイナミクスの変化も共有された。聾学校生だけで創った翌年の作品では、「聞こえない」ことをテーマに「見えない」こと照らしながら作品『音と光』を創った。合同でダンス作品を創り、発表した経験が障害者同士も理解し合う手がかりとなれることもわかった。
天然断裂系の高精度検出法の研究

本研究では、地熱開発可能地域の天然の断層、断裂を高精度で求めることを目標に、衛星画像、レーダ画像、空中写真の画像解析、野外地質調査、放射能探査を組合せた方法を検討した。主な研究地は秋田県南部秋の宮である。本年度は室内での衛星画像・レーダー画像・カラー空中写真観察によるリニアメント抽出と野外での放射能探査が主要な作業となった。ランドサットTM画像およびレーダー画像については、エッジ処理を加え、画像中に含まれる線成分および境界部の抽出を試みた。エッジ抽出の処理は、画像に平滑化処理を施し、各方向の画像を合成し、エッジ抽出を行った。その結果、断裂の方向、密度、フラクタル次元が求められた。その特徴は、南部の火山帯と一致する基盤隆起地域でリニアメント密度、フラクタル次元が高くなっている。また、断裂の方向は、どの地域も東西及び南北に近い値を持っている。この結果から、火山帯地域では、天然断裂系の評価を入れた人工断裂形成法が必要であることが示唆された。放射能探査は、地下からのラドンガスに注目するもので、高い感度と放射線核種を同定できることから、断裂系の検出ばかりでなく地層の種類も決定できる利点がある。放射線探査の結果からは、空中写真から抽出されたリニアメント位置が地質調査から決定された断層位置より高い確度で異常を示すことが確認された。また、地層の種類の同定はできなかったが、カリウムの溶脱や付加が著しい変質帯の位置検出には有効に利用された。画像解析による断裂解析は、位置が正確で効率も良い。しかし、空中写真・衛星画像等から抽出された線状構造が実際の地質の上で何を表しているかということの確認である。そのための手法としてはかなり限られているが、現地における精密地質調査を23測線で行い、実体の把握に務める予定である。
胚性幹細胞由来肝様組織のリアルタイムバイオイメージング及び単離法の開発

我々がすでに樹立したES細胞由来肝細胞への効率的な分化誘導法(肝組織・臓器及びその製造方法:田川陽一、小川真一郎他特許出願2005-199459受付番号5050125294)を用いて肝細胞と肝非実質細胞である類洞内皮細胞等が混在する肝様組織を遺伝子工学的手法で選別するため、選別ベクターを作成した。現在このベクターを用いてリクローンES細胞に電気穿孔法による遺伝子導入を行い肝様組織のみ標識遺伝子が発現する系を樹立している。各クローンの遺伝子導入効率を数値化しより肝様組織に分化誘導が可能な条件を検討中である。またこの実験に加えてこの肝様組織における肝機能評価も併せておこなっている。我々が樹立したin vitro肝様組織では、培養後期にかけて時間経過ともにアルブミン産生能及びアンモニア代謝能も増加しているのが確認できた。また薬剤活性についても同様に検討した。薬剤代謝に重要なCYP遺伝子の発現を検討し、肝細胞特異的なCYP遺伝子であるCYP7a1などが発現しているのも確認できた。また各種CYP遺伝子の発現が培養継続しても維持されていることが確認され、我々の肝様組織において肝非実質細胞が混在することで肝細胞特有の機能が維持されていることが証明された。また各種CYP遺伝子の活性をテストステロン添加後の水酸化産物をHPLCにて測定し検討を行うと肝細胞特有の活性パターンを認め、胎児肝の活性パターンに類似していることも証明された。この結果は論文及び学会発表(2006 DDW Japan消化器疾患と再生医療、2007再生医療学会肝臓発生学からみたES細胞と体性幹細胞による肝臓構築-医療・産業化への道-の各シンポジウムにパネリストとして発表した)を行い報告した。
脂肪細胞の小型化におけるp38MAPKの関与-変異ノックインマウスを用いた検討-

本研究はp38a^<sem>マウスを用いて、小型化脂肪細胞の制御に関わるシグナル伝達機構を解明することを目的とする。脂肪重量及び脂肪サイズの減少を見い出しているp38a^<sem>マウスは、p38aが制御分子や基質と結合するのに重要なcommon docking(CD)領域に、sevenmaker(sem)型と呼ばれる点突然変異を導入(p38a^<sem>)したノックインマウスである。p38aはCD領域を介して転写因子やキナーゼなど様々な基質と結合する。p38a^<sem>は転写因子型の基質と結合したが、調べた複数のキナーゼ型基質とは結合できず、対応するシグナル伝達系に欠損を生じている。p38aノックアウトマウスは胎盤形成不全で胎生致死となるが、p38a^<sem>マウスの胎盤形成は正常で生存し、交配も可能である。しかし、p38a^<sem>マウスの体重あたりの脂肪組織重量は、1-2年令の雄で同腹の野生型マウスの約10-40%(部位により異なる)と驚くべき減少であり、脂肪細胞の小型化も認められた。p38a^<sem>ノックインマウスの60-90%と顕著な脂肪重量の減少が、生体内における糖質の利用以上に脂質の利用を活性化することにより脂肪細胞の小型化を誘導していることをマイクロアレイ及びリアルタイムPCR解析から明らかにした。また、マウスの代謝測定において、老化したp38a^<sem>マウスは、老化した野生型マウスと比べ、遥かに熱産生量が高いことが明らかとなった。しかし、その差は、若いマウスでは見られなかった。脂肪細胞の代謝制御におけるp38αMAPキナーゼ(MAPK)の役割について、生体レベルで解析する目的で、p38αにsem型の点突然変異を導入したマウス(p38a^<sem>ノックインマウス)を作成した。p38α^<sem>マウスはp38αの部分的な機能欠損を生じ、興味深いことにsem型マウスは野生型マウスの20%の成長障害を生じた。体重における性差の比較では、雌マウスよりも雄マウスの方が顕著であることを認めた。sem型マウスが2年齢に達すると野生型マウスの26%の体重低下を示した。その時の組織重量を野生型マウスと比較したところ、sem型マウスの体重当たりの精巣、腎臓、腸管周囲の脂肪重量が60%以上の低下、及び脂肪細胞の小型化を示した。これは、MAPKがマウスの成長に関わることを示すとともに、脂肪代謝に深く関わっていることを示唆している。高脂肪食を与えたsem型マウスの体重当たりの精巣、腎臓、腸管周囲の脂肪重量は、普通食を与えたsem型マウスとほとんど変わらなかった。また、sem型マウスの脂肪組織では,糖新生系が抑制される一方,肝臓での脂肪酸β酸化の促進に伴って脂肪酸を積極的に消費していることが示唆された。HFD負荷を行ったsem型マウスでは,脂質代謝系が活性化し,脂肪組織における脂肪酸産生も促進されていた。HFD負荷を行うとアディポネクチンの分泌が高まり,インスリン感受性低下の抑制に関与していると考えられた。また,脂肪細胞分化に関わる転写因子のmRNA発現量が増加しており,脂肪細胞分化機構の制御,アポトーシスによる脂肪細胞小型化が考えられた。
siRNA医薬品の創製を指向した新規オリゴ核酸修飾法の開発

次世代創薬ターゲットとして注目されているsiRNA医薬品の創製を目指し、従来siRNAの問題となっている遺伝子発現抑制能、分解酵素耐性、細胞膜透過性などの改善が期待できるsiRNA合成のための新規オリゴ核酸修飾用担体ならびに種々の化学修飾核酸の簡便合成法を開発した。近年、疾病治療の目的として、DNAやRNAなどのオリゴ核酸をヒトの体内に投与する「核酸医薬」が期待されている。しかし、オリゴ核酸は一般に水溶性であるため、医薬品として血中に投与した場合、単独では細胞膜透過性が低く、また酵素によって容易に分解されるため、十分な治療効果が得られないのが現状である。研究代表者は最近、同研究室の上野准教授らとともにsiRNA(相補的な配列を含む標的mRNAの遺伝子発現を抑制する20塩基程度の二本鎖RNA)の3'末端2塩基突出部分の糖部あるいは糖-塩基部を芳香族化合物に置換すると、分解酵素に対する耐性が向上することを見出した。そこで本研究では、疎水性の増大による細胞膜透過性の改善を目指し、芳香族化合物の3'末端水酸基を欠損させたsiRNAの合成に着手した。この水酸基欠損型siRNAは標的とする遺伝子の発現をより強力に抑制することも期待できる。従来の固相合成法では3'末端水酸基の除去は困難であることから、目的のsiRNAを合成するにあたり、新規修飾法を開発する必要があった。研究代表者は、ボロン酸エステルあるいはスルホン酸エステルを連結した固相担体を用いてオリゴ核酸を構築後、脱ボロン酸化や脱スルホン酸化を伴った反応により目的のsiRNAに変換することとした。種々の担体を調製し、鋭意検討を行った結果、スルホン酸エステル連結型担体を用いることにより、目的のsiRNAを合成する上で鍵となる末端にスルホン酸エステルを導入したオリゴ核酸を合成することに成功した。本研究の達成によって、siRNAを静注あるいは経口投与可能な医薬品として創製する上でこれまで障壁となっていた課題、すなわち細胞膜透過性、酵素耐性、化学修飾によるRNAi効果の低下を解決できると期待される。また、開発した手法を用いることによりsiRNAの体内動態を評価する上で有用な放射性同位元素や陽電子放出元素、あるいは蛍光性物質を導入したプローブ合成も可能となる。研究代表者は最近、同研究室の上野准教授らとともにsiRNA(相補的な配列を含む標的RNAの遺伝子発現を抑制する20塩基程度の二本鎖RNA)の3'末端2塩基突出部分の糖部あるいは糖-塩基部を芳香族化合物に置換すると、分解酵素に対する耐性が向上することを見出した。また、3'末端2塩基のヌクレオシド塩基部を欠損させることにより、分解酵素耐性の獲得や塩基部の意義解明に繋がると考えられたことから、該当する塩基部を欠損させたsiRNAの合成も行った。平成22年度、目的のsiRNAを合成する上で鍵となる末端にスルホン酸エステルを連結した担体を開発し、対応するオリゴ核酸を合成することに成功した。そこで、目的の3'末端水酸基欠損オリゴ核酸合成を目指し、脱スルホン酸化を伴う置換基の導入を検討した。現在も鋭意検討中である。3'末端塩基部を欠損させたsiRNAの合成にあたり、塩基部欠損型ヌクレオシドを連結した担体ならびに対応するホスホロアミダイトの合成を行った。本研究では、効率的な塩基部欠損型ヌクレオシド合成法を開発し、目的の塩基部欠損型siRNAの合成に成功した。本siRNAは予想通り酵素耐性を有しており、また興味深いことに天然型siRNAや芳香族化合物置換型siRNAと比較して優れた遺伝子発現抑制効果を示した。研究代表者は最近、上野准教授らとともにsiRNA(相補的な配列を含む標的mRNAの遺伝子発現を抑制する20塩基程度の二本鎖RNA)の3'末端2塩基突出部分の糖部あるいは糖-塩基部を芳香族化合物に置換すると、分解酵素に対する耐性が向上することを見出した。

目的の3'末端水酸基欠損オリゴ核酸合成を目指して脱スルホン酸化や脱窒素による脱水酸基化が可能な官能基を導入した担体を開発し、対応する前駆体を含むオリゴ核酸を合成することに成功した。また、平成23年度に合成した3'末端2塩基のリボヌクレオシドの塩基部を欠損させたsiRNAが対応する天然型ヌクレオシドを導入したsiRNAと比較して、優れた遺伝子発現抑制能ならびに分解酵素耐性を有し、3'末端突出2塩基の塩基部を欠損させても遺伝子発現抑制活性が低下しないことが判明した。そこで、突出2塩基を疎水性残基に置換したsiRNAライブラリー構築のために、ヌクレオシドの塩基部をエチニル基に置換した1-デオキシ-1-エチニル-β-D-リボフラノースの立体選択的合成を検討した。市販のD-リボフラノース誘導体から1-デオキシ-1-エチニル-β-D-リボフラノースを立体選択的に合成することに成功した。銅存在下での1-デオキシ-1-エチニル-β-D-リボフラノースとアジド化合物との環化付加反応は効率的に進行した。本研究で検討している脱スルホン酸化を伴った3'末端水酸基欠損オリゴ核酸合成は、申請者の知る限り世界で初の試みである。オリゴ核酸、特にRNAは、安定性に乏しく、液性や温度など使用可能な反応条件が非常に限られているため、想定した化学変換が困難な場合には再度新規担体を設計し、合成し直す必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。目的の3'末端水酸基欠損オリゴ核酸合成を目指し、引き続き脱スルホン酸化を伴う置換基の導入を検討する。達成が困難な場合には、新規担体を設計する。塩基部欠損型ヌクレオシドアナログを導入したsiRNAが天然型siRNAや芳香族化合物置換型siRNAと比較して優れた遺伝子発現抑制効果を示したことから、塩基部欠損型ヌクレオシドを基盤としたオリゴ核酸の新規化学修飾に向けても検討を行う予定である。
分子生態学的アプローチによるワカサギにおける生活史分岐の実態解明

青森県小川原湖におけるワカサギの生活史分岐(遡河回遊型と滞留型)の実態を解明するため、他の地域個体群との比較の上で、DNA分析を行った結果、1)各地域個体群は固有の遺伝子型を持ち、高い遺伝的分化を示した。この結果は、移殖に頼ることなく各個体群を保全・管理する必要があることを示している。2)耳石の微量元素で分けた小川原湖の2型の間には、遺伝的な違いはなかった。したがって、これらは同じジーンプール内で生じていると考えられた。本研究は、ワカサギの生活史分岐(滞留型と遡河回遊型)の実態解明を分子生態学的アプローチにより解明することを目的としている。初年度である19年度は、以下の成果を得た。1)マイクロサテライトDNAの開発を試み、集団解析のマーカー候補として40個のマイクロサテライト領域を単離した。2)ミトコンドリアDNAの解析マーカーとしてシトクロームbおよび調節領域が適当と考えられた。シトクロームbのダイレクトシーケンス分析により、日本沿岸の主な海跡湖のワカサギ集団はそれぞれ地域特有のハプロタイプを有しており、大きな遺伝的分化が生じていることが明らかとなった。特に、北海道沿岸におけるワカサギ集団についてはAFLP法も併用して詳しく調査を行い、これまで人為移殖に由来すると考えられてきた太平洋沿岸の集団(風蓮湖と別寒辺牛川)が、他の石狩川や網走湖と同様に地域特有の遺伝的組成を有していることが明らかとなった。4)それぞれ異なる産卵場において採集された小川原湖の滞留型と遡河回遊型のワカサギについて、耳石の形態観察ならびに微量元素の測定を行い、生活史型の耳石レベルでの判別について解析を行ったところ、形態では75%、微量元素では95%の正答率を示した。5)耳石分析に基づいて、小川原湖における滞留型と遡河回遊型の個体を分類し、シトクロームbのダイレクトシーケンスによって系統解析および集団解析を行った結果、相互に近縁なハプロタイプを保有しており、ハプロタイプ頻度に有意な差異は検出されなかった。このことは、少なくとも小川原湖におけるワカサギの生活史2型は、同一のミトコンドリアDNA系統を共有しており、2型間の系統分岐が生じているわけではないことを示唆している。19年度にワカサギで開発したマイクロサテライトプライマーは、集団遺伝学的解析に対して充分な多型性を示さなかった。そのため今年度(20年度)の交付金額の一部を21年度に繰り越し、新たなマーカー開発ならびに近縁種(Delta Smelt)で開発された24のマイクロサテライトプライマー(Fisch et al., 2009)を適用することを試みた。その結果、新たに開発したプライマーセットにおいても充分な多型性がみられなかったが、近縁種のプライマーセットでは24セット中、12セットで変異が検出され、アリル数は2-32個(平均:14.2個)、平均ヘテロ接合体率(He)は0.098-0.942(0.668)と集団遺伝学的解析に対して充分な多型性を示した。我々とFisch et al (2009)の開発手法では対象としたマイクロサテライトの繰り返しモチーフが異なっており、ワカサギに対しても彼らと同様のモチーフを対象とすればもっと効率的良く多型性の高いマーカーを得られたのかもしれない。しかし、近縁種のマーカーであっても有用であることは確実なので、今後はこれらのマーカーを用いて湖内におけるワカサギの生活史分岐および地理的な遺伝的分化について検討を行うこととした。前年度までに準備できたマイクロサテライトDNAおよびmtDNAマーカーにより、小川原湖におけるワカサギの遡河回遊型84個体(2008年2月に高瀬川に遡上した0+個体)と滞留型48個体(湖内南部の産卵場所に2008年3月に蝟集した0+個体)について、各個体の耳石のSr:Ca比から生活史型の確認を行った上で、そのハプロタイプ組成ならびにアリル頻度を比較した。その結果、遡河回遊型と滞留型間にはmtDNAのハプロタイプ頻度に有意差はみられなかったが。マイクロサテライトDNAでは有意な遺伝的差異がみられた。しかし、その程度はF_<ST>=0.01と微弱なものであった。STRUCTUREソフトウェアを用いたベイズ法によるクラスター解析の結果、小川原湖の個体群全体が2つの集団(K=2)に由来する遺伝子型から構成されていることが示された。しかし、これらの遺伝子型と生活史型の区分とは一致せず、いずれの生活史型にも2つの集団(AとB)に由来する遺伝子型がほぼ同程度で含まれていた。この結果は、小川原湖のワカサギ個体群全体は、過去に存在した2つの集団の混合によって形成されているが、生活史型分岐とは関連しておらず、生活史型間に明確な遺伝的差異は生じていないことを意味している。

前年度に小川原湖起源であることが判明した十和田湖個体群についても同様の解析を行ったところ、十和田湖個体群にはA集団に由来する遺伝子型が卓越していたが、創始者効果をはじめとするドリフトによるものなのか、それとも適応の結果によるものなのかを判断することはできなかった。
無水フッ化水素菌体処理法の酵母および糸状菌遺伝子クロ-ニングへの応用

1)酵母や糸状菌から緩和な条件下(0°C、5min)で、無水フッ化水素菌体処理法により選択的に細胞壁のみを破壊し、酵素タンパクのみならず、RNAやDNAが、生物活性を保持した状態で抽出できた。a.本法により糸状菌C.gracileからintactなデキストラナ-ゼが抽出できた。b.本法により抽出されたC.gracile RNAの翻訳活性は反応時間およびRNA濃度に依存性であり、その翻訳産物のimmuno-blotからintactなデキストラナ-ゼが検出された。2)本法によりC.gracileやC.albicansから抽出されたDNAは20ー40Kbの分子量を持ち、制限酵素にsensitiveであり、T4ligaseによりligationされた。3)本抽出法によりDNAキラ-プラスミドやselective markerをもつプラスミドで形質転換したS.cerevisiaeからDNAを抽出し、proplast法で抽出したDNAと形質転換能を比較すると全く差が認められず、この事は、本法で抽出されたDNAプラスミドは、E.coliのtransformationに適用でき、chromosomalDNAより低分子のプラスミドDNAもintactな状態で抽出できることを示している。13)の結果から本法は、酵母や糸状菌の遺伝子クロ-ニングおよび未知のプラスミドベクタ-のscreeningに応用でき、これまで菌外破壊が困難であり、敬遠されてきた糸状菌の研究に貢献できると同時に微生物菌体からの有用物質の工業的生産にも適用できる斬新な菌体処理法と考えられる。現在、本抽出法の応用として糸状菌C.graeileデキストラナ-ゼのcDNAのクロ-ニングを重点的行っており、デキストラナ-ゼのN未端アミノ酸配列を参考にして合成プロ-ブを、またC.grocile mRNAからcDNAライブラリ-を作製している所である。無水フッ化水素菌体処理法が酵母や糸状菌の細胞壁のみを選択的に破壊し、細胞内容物のDNAやRNAおよび酵素タンパクをintactに、生物活性を保持した状態で抽出できるかどうか検討を加えた。細胞壁溶解酵素に対して非感受性の酵母Candida albicansおよび糸状菌Chaetomium gracileおよび形質転換酵母Saccharomyces cerevisiae F102、同AH22およびlinear DNA killer plasmidで形質転換したkluyveromyces lactisなどを用い、本法によって、DNAを抽出した所、いずれも40kb以上のDNAが抽出できることが判明した。このDNAは制限酵素に対して感受性であり、T4リガーゼによりligationされた。常法によって得られたDNAをcontrolとして比較すると同じ泳動パターンを示した。RNAについては、messenger acted paperによりmRNAをC.gracileから部分精製した後、無細胞タンパク合成系によってタンパクを発現させ、また他方、溶菌液から可溶性タンパクを部分精製して、抗体を作製した後、イムノブロッティングを試みた所、多数の高分子タンパクが検出された。そのタンパクの中にはデキストラナーゼに相当するバンドも見出された。また、細胞壁溶解酵素に対して非感受性の酵母や糸状菌からプラスミドのスクリーニングを行っているが、未知のプラスミドベクターは未だ見出されていない。現在、新しく考案されたパワーミキサー法と併せてスクリーニングを継続している。これまでに本抽出法が酵母や糸状菌の細胞壁のみを選択的に破壊し、この方法によってDNAやRNA、酵素タンパク等をintactに生物活性を保持した状態で抽出できることがわかっているので、本年度は本法を用いて糸状菌Chaetomium gracileからデキストラナ-ゼを精製し、そのCDNAのクロ-ニングを試みた。(1)messengeracted paper

法によってpoly(A)RNAを抽出し、immuno-blotによって翻訳産物中にデキストラナ-ゼを見出したので、現在このpoly(A)mRNAを用いてCDNAライブラリ-を作製している所である。(2)デキストラナ-ゼを精製し、N末端アミノ酸配列の一次構造を検討しているが、その結果、Gly-Val-Gly--であることが判明しているが、特徴的な配列が決定された時点で、この配列を参考にして合成プロ-ブの作成を試みる予定である。(3)プロトプラスト法が無効な酵母や糸状菌から未知のプラスミドベクタ-のスクリ-ニングを行っているが、未だ見出されておらず、新しく考案されたパワ-ミキサ-抽出法と併せてスクリ-ニングを継続している。
インクジェット印刷による有機光検出器と有機トランジスタの集積化

軽さ、柔らかさ、生体適合性を併せ持つデバイスは、幅広い分野で応用が模索されている。特に医療・ヘルスケア分野では、ウェアラブル化を進めることで、日常的な健康モニタリングが期待できる。このようなデバイスには、皮膚に張り付け型や、体内埋め込み型がある。理想的には、軽量・可撓・非侵襲といった多くの特性を併せ持つことが好ましく、技術的な課題となっており、有機半導体を用いたフレキシブルデバイスはこれらをすべてクリアする有力な手段とされている。低侵襲な生体モニタリング手段として赤外線やX線は頻繁に利用されているが、ウェアラブルデバイスを用いたヘルスケアにおいては、フレキシブルな有機フォトディテクタが重要な要素となりうる。有機フォトディテクタは二系統に大別される。一つは有機フォトダイオードと呼ばれる二端子素子で、線形で速い応答と暗電流が特徴だが、増幅機構を持たないため大きな電流ゲインが得られない。もう一方の有機フォトトランジスタは三端子素子であり、内在する電気的な増幅機構により高いゲインが得られるものの、大きな暗電流と応答の遅さによって応用が制限される問題があった。そのためフォトダイオードとフォトトランジスタの集積化は、高ゲイン・線形応答・高速応答を同時に実現する有力な手法である。本プロジェクトでは、フォトダイオードとフォトトランジスタを集積化した新しいデバイスのコンセプトを提案した。デュアルゲート構造の単層トランジスタをベースとしたデバイスによって、従来のフォトトランジスタでは不可能だった高ゲインと線形光応答が両立された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
時系列点群データからの動的形状表現の構築および描画に関する研究

時系列情報を含む3次元データのモデリングを行う研究課題であり,1年度目は,モデリング手法と描画手法を開発する事が目標であった.本研究課題においては、測定機によって得られた時系列情報を含む3次元の点群情報を扱うが,得られた点群は多くのノイズを含んでいる.まず,このノイズを取り除く手法の開発を行った.ノイズはMoving Least Square Surfaceと呼ばれる点群から曲面を表する事できる手法を基本とした.この手法では,点群を滑らかな曲面に点を投影する事が可能である.しかし、outlierのようなノイズが含まれている場合には,良い結果を得ることができない.このため,outlierのようなノイズを含む場合においてもメディアン値を使用する事で取り扱いが可能となるように改良を行った.また,時系列情報を含むモデリング手法の開発は,形状の特徴となる情報を使用する事により,各時聞における3次元の点群において対応する個所をつなぎ合わせる手法を開発する事にした.この手法は,各時間における3次元点群から特徴となる点を探し,それぞれ次の時間の3次元の点群と対応する個所を探すことにより動きの情報を得る.対応関係が得られていない特徴となる点以外の点は,補間することによって動きの情報を与えるという手法である.しかし,曲率情報を基本とした特徴の表現では対応付けが困難な事が分かり,改良が必要であることが分かった.描画処理においては,モデリング手法の開発が遅れていることから開発する事ができていない状況にある。
1965～1975年における日本人のヴェトナム戦争観

1、ウェトナム戦争報道前史の研究日本のヴェトナム報道が本格化する1965年以前の報道として、1963年に起こったヴェトナム仏教徒の焼身事件を例に、同事件が日本でどのように報じられたかを分析した。その結果、その後の記憶とは異なり、当時、焼身事件がほとんど注目されておらず、後になって記憶が改変されたことを実証した。2、大森実のヴェトナム報道毎日新聞外信部長として日本のヴェトナム戦争報道を率いた大森実について、彼のヴェトナム報道、ヴェトナム戦争観などを考察。日本のマスメディアによるヴェトナム報道全体とも関連付けながら、彼のヴェトナム戦争理解の変遷について明らかにし、その論理構造を浮き彫りにすることができた。3、開高健のヴェトナム報道小説家の開高健は、日本のヴェトナム報道の中でも特異な位置にあった。また、ヴェトナム戦争の現場を見た数少ない文化人としてべ平連運動にも影響を与えた人物である。その開高がヴェトナムについて何を見、何を書いたかは、これまで開高の文学論や作家論でのみしか考察されてこなかった。本研究ではこれをジャーナリズム史研究の観点から分析し、開高のヴェトナム報道の特性とその姿勢について同時代的な意味を論じた。4、岡村昭彦のヴェトナム報道岡村昭彦はヴェトナム報道を最も早く継続的に行った日本人ジャーナリストであるが、大手メディアの記者ではなく、その経歴は全く独自なものであった。本研究では岡村が当時契約していたPANA通信社の関係者や、当時サイゴンで岡村と共に仕事をしていた元ジャーナリストたちに聞き取り調査を実施し、そうしたオーラルヒストリーから岡村の実際の足取りや思想について検討した。当時の岡村の足取りを裏付ける貴重な写真も人手することができ、日本のヴェトナム報道の実態を明らかにする上で貴重な研究成果を上げることができた。今年度は、4月から6月まで主にヴェトナム関連書籍・雑誌の収集と分析を行った。その中でも主にニュースやルポルタージュなどの報道を分析の対象とし、また報道を行った日本人記者の経歴や戦争体験なども合わせてリサーチした。その成果を日韓次世代学術フォーラム第5回大会(於ソウル大学)で発表。並行して、5、6月には戦後日本の思想形成に重要な影響力をもたらした総合誌『中央公論』の元編集長、粕谷一希氏について調査し、7月にインタビューを行った。この成果は『アリーナ』(第6号、風媒社、2009)で発表し、戦後言論界の証言を残す貴重な資料とすることができた。10月には自身が実行委員としてかかわっている第6回国際平和博物館会議(於立命館大学平和ミュージアム)が開催され、平和博物館とメディアについての分科会をコーディネートする。11月にはハノイ、フエ、ホーチミンでの現地調査を実施。特に各地にある戦争博物館を訪れ、展示内容の傾向や日本人ジャーナリストによる写真の展示がいかなる位置を占めているかを調査した。これは、博物館における戦場写真の表象という、日本ではあまりなされていない研究課題であり、同研究に有益な成果を与える調査となった。1月から3月にかけては、多文化共生社会についてのあり方を調査するプロジェクトに加わり、自ら韓国の安山市と神奈川県の川崎市をフィールド調査。この成果を第5回先端国際コンファレンス「多文化主義と社会的正義」(立命館大学、2009年3月23日)において共同発表したほか、各種報告書を執筆。この調査によって、異なる者同士の共生に関する理論的視座を得ることができ、またその国際的な連関についても注目する画期的な研究を構築することができた。
「関係性のビジネス」としての地域ビジネスのビジネスモデルデザインに関する研究

今日,地域の再生・活性化のためにビジネスをデザインし実現することが求められている。本研究は,地域ビジネス,とくに都市におけるビジネスを実際にデザインすることによって,ビジネスモデルデザインの方法論(モデルとプロセス)について検討し提案する。本研究では,地域ビジネスを,地域のリソースを存分に活用し,さまざま主体間の関係をつくり価値をつくり出すビジネス(「関係性のビジネス」)と捉えており,従来の事業性を目的とするビジネスとは異なる視点に立つ必要があると考えている。一方,「関係性のビジネス」によって,地域におけるビジネスの基盤やコミュニティがつくり出されると考えられる。
下部消化管粘膜における化学受容体の局在と発現調節

短鎖脂肪酸受容体の発現は、腸内分泌細胞、免疫細胞、脂肪組織における発現が報告されていたが、神経系における発現については詳細な検討がなされていない。昨年度、受入れ研究室で作製した抗FFA3抗体を用いた免疫染色によって、FFA3が腸管各部位の粘膜固有層における神経線維上および、粘膜下・筋層間神経叢に発現していることが見出された。二重染色法によりFFA3の陽性反応は神経細胞の指標であるPGP9.5と重なり、グリア細胞の指標であるS-100とは重ならなかったことから、末梢の神経線維にFFA3が発現していると考えられる。外来性神経の寄与を検討するため、受入れ研究室と同講座(解剖発生学分野)の今野博士の指導のもと、逆行性神経トレーサーの一つである蛍光標識コレラトキシンBを近位結腸または十二指腸に投与したところ、迷走神経下神経節および延髄背側運動核でトレーサーが検出された。下神経節におけるほとんど全ての神経細胞がFFA3陽性反応を示した一方、背側運動核では一部のトレーサー陽性神経細胞がFFA3の免疫組織化学反応と重なった。また、背側運動核に細胞体を持つ神経を取り囲む神経終末に強いFFA3の免疫反応が検出された。以上の結果から、遠心性および求心性とも、腸管に分布する迷走神経の節前線維がFFA3を発現している可能性が見出された。短鎖脂肪酸は速やかにTCA回路に取り込まれるエネルギー源である一方、口腔や腸粘膜に常在する細菌の主要代謝産物でもあり、生体内の様々な細胞に発現する受容体によって認識され生理的あるいは非生理的応答を誘発する。本研究では、これまで知られていなかった、腸管機能を支配する神経細胞での短鎖脂肪酸受容体発現が見出された。これにより、神経系を介する新たな短鎖脂肪酸の機能が示唆される。(抄録なし)大腸菌リコンビナントおよび合成ペプチド抗原を用い、ウサギおよびモルモット血清より、G蛋白質共役型短鎖脂肪酸受容体FFA2およびFFA3に対する抗体を各々4種類ずつ得た。免疫組織化学法により、FFA2はこれまで報告されていた大腸L型内分泌細胞の他に、水分泌を担うと考えられている表層の上皮細胞の細胞膜に検出できた。また、胃、上部小腸ではL細胞にFFA2発現はなく、EC細胞に発現していることを明らかにした。消化管の機能調節および内臓感覚に関与する迷走神経の下神経節においてもFFA2が発現していたが、内臓神経を構成する後根神経節には発現がなかった。一方、FFA3は腸管各部のL細胞および粘膜固有層の神経線維に発現が見られ、下神経節および後根神経節も陽性であった。これらの所見はRT-PCRの結果と一致し、大腸だけでなく上部消化管においても短鎖脂肪酸受容体が機能していることが示唆された。そこで、上部消化管における短鎖脂肪酸受容体の機能的発現を確認するため、麻酔下のラット十二指腸を潅流し、管腔への重炭酸分泌および血中への消化管ホルモン分泌量を測定する技術を習得した。灌流液中の短鎖脂肪酸は、重炭酸分泌およびGLP-2放出を促進した。重炭酸分泌はセロトニン受容体拮抗薬で一部抑制されることから、L型およびEC型腸内分泌細胞が短鎖脂肪酸を感知している可能性が示唆された。以上の結果は、免疫組織の所見とよく一致している。また、モノカルボン酸輸送体阻害薬またはカプサイシン前投与によっても反応が抑制されることから、短鎖脂肪酸の吸収経路の存在が示唆された。これらの知見は、腸内細菌の過増殖と機能性ディスペプシアとの関連を明らかにするための重要な基盤となると考えられる。

これにより、神経系を介する新たな短鎖脂肪酸の機能が示唆される。解析に必要な特異抗体の作製、消化管ホルモン分泌量を測定する技術の習得、蛍光in situ hybridization(FISH)法の確立といった研究方法を習得し、短鎖脂肪酸受容体の機能と発現について、生理実験による所見と形態学的所見を比較することができた。本年度に得られた技術と知見をもとに、食事や病態が引き起こす消化管管腔内環境の変化が粘膜における短鎖脂肪酸受容体の発現様式に影響するかどうかについて検討する。また、今回得られた特異抗体を用い、免疫電顕によっても受容体発現を解析したい。(抄録なし)
分化細胞に含まれる未分化ヒトiPS細胞の除去方法の確立

再生医療はこれまで治すことの出来なかった病気を治せる新しい治療方法として期待されている。再生医療の中でも山中伸弥教授によって発明されたiPS細胞を用いた再生医療は全身の多くの病気に対して治療が出来ると期待されている。しかし、iPS細胞には体の中で腫瘍を作る危険性があった。その危険性は、治療用の細胞からiPS細胞をほとんど除去することで防ぐことが出来る。この研究では、治療用細胞からiPS細胞をほとんど除去できる薬剤を発見する成果が得られた。そして、その薬剤は体の細胞には毒性が無いことも分かった。この研究成果を世の中に役立てることで、iPS細胞を使った新しい治療を安全に行うことが出来る様になる。本研究では、分化組織に混在する未分化iPS細胞の除去を目的とする。始めに、未分化iPS細胞のみで培養を行いiPS細胞の除去効果を確認した手法と同じ方法を用いて、分化組織に混在する未分化iPS細胞の除去を試みる。(1) HIF-1 α阻害剤の効果を調べた。HIF-1 α阻害剤は、ヒトiPS細胞に対する除去効果を持つ。ヒトiPS細胞専用培地へHIF-1 α阻害剤を添加48時間後に未分化iPS細胞のコロニー面積は有意に減少した。ヒトiPS細胞に対する除去効果を持つ化合物(HIF-1 α阻害剤)を発見した。(2) HIF-1 α阻害剤の作用を分化細胞に最適な培養条件下に調べた。ヒト角膜上皮細胞とヒトiPS細胞を混ぜて培養し、HIF-1 α阻害剤の効果を調べた。ヒトiPS細胞単独と比べて約4倍の培地添加濃度にて、HIF-1 α阻害剤がヒトiPS細胞に対する除去効果を持つことが分かった(通常の細胞培養培地であるFBS10%含有DMEM培地に、ヒト角膜上皮細胞とヒトiPS細胞を混合培養し、HIF-1 α阻害剤を添加した。培養48時間後に未分化iPS細胞のコロニー面積は有意に減少した)。HIF-1 α阻害剤はヒト角膜上皮細胞に最適な培養条件下においてもヒトiPS細胞に対する除去効果を持つことが分かった。(3)角膜上皮細胞を用いて細胞毒性を評価した。ヒト角膜上皮細胞に対するHIF-1 α阻害剤の細胞毒性を調べた(通常の細胞培養培地であるFBS10%含有DMEM培地に、HIF-1 α阻害剤を任意の濃度で添加しヒト角膜上皮細胞を培養した。培養48時間後に生細胞活性測定法であるWST-8アッセイを行うと、HIF-1 α阻害剤には高濃度でも生細胞活性の低下は無く、細胞毒性はみられなかった。→HIF-1 α阻害剤に、ヒト角膜上皮細胞に対する細胞毒性は無いと考えられた。本申請ではヒトiPS細胞から心筋細胞、神経細胞、肝臓細胞、脂肪細胞、膵臓細胞を分化誘導し、その分化細胞の培養フラスコ内に残存する未分化なヒトiPS細胞の除去効果を検出する実験が計画されていた。しかし、分化誘導に必要となる試薬が高価である点、および、キットとして市販された分化誘導試薬よりもさらに新しい論文に記載された分化誘導方法が優れている点から、分化誘導実験の予算が不足する可能性が生じた。そのため、本研究では限られた予算を無駄にしないために、初年度はまずは申請者の実験環境において比較的入手の容易であったヒト角膜上皮細胞を用いた先行研究を行った。具体的には、未分化iPS細胞のみで培養を行いiPS細胞の除去効果を確認した薬剤( HIF-1 α阻害剤)を用いて、ヒト角膜上皮細胞に最適な培養条件下にフラスコ内に混合培養した未分化ヒトiPS細胞を除去する効果を調べた。その結果、未分化iPS細胞のみで培養を行った条件に比べて4倍濃度の薬剤量が必要であることが分かった。又、同条件において、未分化ヒトiPS細胞の除去効果は確認された。次年度は予算が限られるため、外胚葉(神経細胞),中胚葉(心筋細胞)、および内胚葉(内胚葉細胞)に細胞種を限定し、当初の実験計画書に沿い実験を実施する予定である。すでに、外胚葉(神経細胞),中胚葉(心筋細胞)、および内胚葉(内胚葉細胞)への分化誘導試薬は初年度に購入済みであるため、資金面での問題は無いと考えられる。本研究では、分化組織に混在するヒト未分化iPS細胞の除去を目的とする。<1年度目の研究成果>(1)ヒトiPS細胞に対して除去効果を持つ化合物(HIF-1α阻害剤)を発見した。(2)HIF-1α阻害剤は胎児ウシ血清(FBS)含有培養条件下ではヒトiPS細胞に対する除去効果が1/4に減弱した。

(3)HIF-1α阻害剤は分化細胞に対する細胞毒性は無かった。以上の(1-3)が明らかとなった。<2年度目の研究成果>(1)ヒトiPS細胞由来分化組織(心筋細胞)に残存するヒトiPS細胞の生存量を調べるために未分化マーカー遺伝子(Oct3/4)の発現量をリアルタイムPCR法を用いて調べた。分化心筋細胞中に未分化マーカー発現量は約10%残存していることが明らかとなった。(2)HIF-1α阻害剤はヒトiPS細胞の未分化マーカーOct3/4のみならず、C-MYCを除く、SOX2、FLF4、NANOG、GDF3、REX1、DNMT3b、LIN28の発現量を有意に抑制した。このHIF-1α阻害剤の効果は、再生医療で代表的に使われる血清代替品(KSR)の含有培養条件下でも認められた。一方、培養上清を用いた生体の細胞(ヒト角膜上皮細胞など)の分泌物スクリーニング(ヒトiPS細胞の未分化維持因子の探索)では、同様の効果を持つ因子は同定されなかった。しかし、マウス胎児線維芽細胞(MEF)やFBSでは効果を減弱する作用が認められた。この結果は、胎児細胞にヒトiPS細胞に対する未分化維持因子が発現していることを示す。(3)LC/MS/MSタンパク質発現解析を基に実験を進めると、タンパ質XがヒトiPS細胞に対して、生存維持に働くことが明らかとなった。さらに、我々の行ったヒト脂肪由来間葉系幹細胞の分泌物を用いた網羅的タンパク質発現解析においてもタンパク質Xは同定された。初年度の研究成果により、分化細胞に最適な培養条件下にiPS細胞の除去効果を発揮するためには、ヒトiPS細胞に最適な培養条件下にiPS細胞の除去効果を確認した薬剤( HIF-1 α阻害剤)を培地へ4倍濃度添加する必要があることが分かった(この薬剤は4倍量を用いても毒性や副作用の報告は知られていない)。研究予算が限られるため、次年度は、外胚葉(神経細胞),中胚葉(心筋細胞)、および内胚葉(内胚葉細胞)に細胞種を限定し、当初の実験計画書に沿い実験を実施する予定である。すでに、外胚葉(神経細胞),中胚葉(心筋細胞)、および内胚葉(内胚葉細胞)への分化誘導試薬は初年度に購入済みであるため、資金面での問題は無いと考えられる。再生医学29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子導入と超誘発法による内因性インタ-フェロンの誘導と悪性脳腫瘍への治療応用

我々は悪性脳腫瘍細胞内にインタ-フェロンを産生させ、それによって腫瘍細胞に対する増殖抑制ないし殺細胞効果をあげる内因性インタ-フェロン療法に有効性を検討した。初年度はpoly I:C.cycloneximideを用いる超誘導法によりヒトglioma細胞により多量のβ型インタ-フェロンが産生されこのglioma由来内因性インタ-フェロンが各種腫瘍細胞に対し強い殺細胞効果を有することを明らかにした。二年度はヒトglioma細胞に特異的に反応するGー22モノクロ-ナル抗体及び遺伝子導入効率の高い陽性荷電を有するリポソ-ムを用い。β型インタ-フェロン(IFNーβ)遺伝子をヒトglioma細胞に導入すると、細胞内にインタ-フェロンの発現が観察された。又この内因性インタ-フェロンは外因性インタ-フェロンに比べ40倍以上の増殖抑制効果を示した。三年度はこのインタ-フェロン遺伝子療法をより有効な治療法として確立する目的で多くの基礎実験を行った。その結果腫瘍壊死因子(TNFーα)前処置によりIFNーβの細胞内発現が増加するとともに自己増殖抑制効果はさらに増強され、殺細胞効果として観察された。又IFNーβ遺伝子とIFNーα遺伝子を同時にヒトglioma細胞導入すると、やはり強い殺細胞効果が得られた。次いで我々はヒトglioma細胞移植でヌ-ドマウス皮下腫瘍を用いたin vivoの実験を行った。その結果IFNーβ遺伝子包埋リポソ-ムを皮下腫瘍内に注入したとこと腫瘍は完全に消失した。以上の結果より悪性脳腫瘍患者に対し、抗腫瘍性内因性インタ-フェロンを誘導する治療法の有効性が示唆された。glioma自身からβ型interferonが産生される事が報告されている。我々はglioma細胞株を含む24種の各種細胞株を用いて超誘導法を行いすべてのglioma細胞株、2種類のうち1種類のmelanoma細胞株、3種類の肺癌由来の細胞株において、β型interferonが発現していることを明らかにした。又他の培養細胞株ではいずれも発現が認められなかった。この事から超誘導法によるβ型interferonの産生はneuroectodermal tumorに限定される可能性が示唆された。その発現量は細胞株により異なっていたが、どのような発現調節によるものかは未だ明らかにされていない。細胞内のβ型interferonはglioma細胞株にのみ検出され、培養液中の量がgliomaに比べ多いにもかかわらず肺癌由来の細胞株は検出れなかった。このことは分泌機構の差異によるものかもしれない。nothern法により固定されたmRNAの大きさは0.9kbで、報告されているβ型interferonのmRNAの大きさに一致していた。この結果を基に、dot hybridization法を用いて上述した各種培養細胞中でのmRNAの発現を検討すると、培養液中にβ型interferonが発現している株の内、肺癌由来の細胞株であるSBC-3株を除くすべての細胞株でmRNAが発現していた。次いで超誘導法を行ったglioma細胞の培養液をヒトglioma細胞を含む各種の悪性腫瘍細胞株に添加したところ殺細胞効果が得られた。又さらにこの抗腫瘍効果はdibroblast由来、HuIFN-βを添加して得られる効果に比べより強いことが観察された。われわれは悪性脳腫瘍細胞内にインタ-フェロンを生成させ、それによって腫瘍細胞に対する増殖抑制ないし殺細胞の効果をあげ、治療に応用したいと考えて研究を進めている。昨年度は超誘導法により誘導された腫瘍細胞由来のインタ-フェロンが各種の腫瘍細胞に対し強い殺細胞効果を有することを明らかにした。

本年度はヒトβ型インタ-フェロン遺伝子を八木らが開発した遺伝子導入効率の高い陽性荷電を有するリポソ-ムを用い、ヒトgliomaのU251ーMG細胞に遺伝子を導入したところ、細胞内にβ型インタ-フェロンが生成し、培養液内に放出された。この場合、著しい細胞増殖抑制作用が認められたが、その作用はβ型インタ-フェロンの抗体で中和されないことから細胞内のインタ-フェロンの作用にもとづくものと思われる。しかも細胞抑制作用は外から作用させた線維芽細胞由来のインタ-フェロンにより有意に高かった。こうした結果は他のグリオ-マ細胞、SKーMGー1、SKーMG4、U251ーMG、U251ーSPおよびT98型細胞についても同様に観察された。さらにわれわれが作製したヒトglioma関連抗原に対するモノクロ-ナル抗体を結合させたリポソ-ムを用いて遺伝子導入を試みたところ、β型インタ-フェロンの発現がヒトglioma細胞に選択的に増加し、当glioma細胞に対し増殖抑制作用がさらに増強された。以上の結果よりβ型インタ-フェロン包埋抗体結合リポソ-ムを用いることにより、ヒトglioma細胞の増殖を選択的に抑制するインタ-フェロン遺伝子療法が悪性脳腫瘍の治療に有効であることが示唆された。昨年度はヒトグリオ-マ細胞に特異的に反応するGー22モノクロ-ナル抗体及び遺伝子導入効果の高い陽性荷電を有するリポソ-ムを用い、β型インタ-フェロン(IFNーβ)遺伝子をヒトグリオ-マ細胞に導入すると、細胞内にインタ-フェロンの発現が観察された。又この内因性インタ-フェロンは外因性インタ-フェロンに比べ40倍以上の増殖抑制効果を示した。そこでこのインタ-フェロン遺伝子療法をより有効な治療法として確立する目的で多くの基礎実験を行った。その結果腫瘍壊死因子(TNFーα)前処置によりIFNーβの細胞内発現が増加するとともに自己増殖抑制効果はさらに増強され、殺細胞効果として観察された。又IFNーβ遺伝子とIFNーα遺伝子を同時にヒトグリオ-マ細胞に導入すると、やはり強い殺細胞効果が得られた。次いで我々はヒトグリオ-マ細胞移植ヌ-ドマウで皮下腫瘍を用いたin vivoでの実験を行った。その結果(1)IFNーβ遺伝子包理リポソ-ムを皮下腫瘍に直接注入したところ有意に腫瘍の増殖が抑制されたが、線維芽細胞由来外因性IFNーβでは増殖抑制は認められなかった。(2)さらにこのリポソ-ムを隔日計8回注入した結果、観察した30日後まで腫瘍は完全に抑制された。(3)腫瘍中心部に形成したシスト内に同じ濃度のリポソ-ムを注入したところIFNーβの発現は投与後48時間でプラト-に達し、その後8日まで400ー500IU/mlの活性が検出された。(4)低濃度のTNFーαを腹腔内に前投与した後IFNーβ遺伝子包理リポソ-ムを皮下腫瘍内に注入したところ腫瘍は完全に消失した。
Y染色体を用いた(In situ hybridization法による)心臓移植後冠動脈硬化症の成立メカニズム解明に関する研究

心移植後の冠動脈硬化症(CGD)は遠隔期の最大の死亡原因である。慢性の拒絶反応であると考えられているCGDの成立メカニズムを検討する上で、ドナー・レシピエント細胞の役割を区別して評価するためにY染色体fragmentによるin situ hybridization法を試みた。マウスのY染色体のfragmentをprimerとして用いラットのfragmentをPCR法で増殖させようとしたが温度その他の条件を調節しても成功しなかった。現在マウスの他のprimerを用いて増殖を検討中である。一方当初の目的であるドナー・レシピエント細胞の区別を組織上で行うという目的を達成するためにACIラット(RT1a)をドナー、Lewisラット(RT1l)をレシピエントとした異所性心移植モデルを用い、RT1aおよびIに特異的なMHC class I抗原に対する抗体を用いた免疫染色を施行しドナー細胞とレシピエント細胞を区別して間質の急性拒絶病変およびCGD病変を実験的に評価した。間質では正常の心臓ではMHCclass I抗原がほとんど提示されていなかったが、移植心の間質ではドナー・レシピエント両方のMHC class I抗原が強く提示されていた。一方ドナーの血管には、ドナーのMHC class I抗原を提示している移植心の内皮細胞にレシピエントの白血球がレシピエントのMHC class I抗原を提示して付着している像が確認され、ここが血管型慢性拒絶病変の免疫学的活性化の部位である可能性が示唆された。また慢性の拒絶反応によって起こった血管内皮の障害に対してレシピエント由来の細胞によってrepopulationが起き、vascularized origanの免疫学的寛容が成立するとの仮説があるが本研究では血管内皮がレシピエント由来の細胞で再生している像は確認できなかった。
培養シュワン細胞を生体に再移植する方法の開発

1.シュワン細胞の培養ラット(生後15日)脊髄後根神経節を使用して培養を行った.まず後根神経節よりのneurite outgrouthを観察し,次のことを確認した.(1)Nerve growthfactorを一定濃度以上を加えるとneurite outgrowthはかえって抑制される.(3)人胎盤血清でなくてもFetal bovine serumで十分である.培養シュワン細胞を増殖させることは困難であった.また線維芽細胞の混入をどうしても伴った.後根神経節には,神経細胞,シュワン細胞,線維芽細胞,外〓細胞が存在する.このため組織学的により単純な坐骨神経を使って,シュワン細胞を培養してみた.この時シュワン細胞の増殖を助ける目的で, Bovine pituitary extract,Cholera toxinを加えてみた.しかし使用濃度が不適合なためかまだはっきりとした効果を確認するに至っていない.2.培養シュワン細胞の確認以下の方法で行っている.(1)倒立顕微鏡による形態学的確認,(2)電子顕微鏡による確認,(3)蛍光抗体法による確認.3.培養シュワン細胞の移植方法培養細胞を移植する時,ゲル状の物質に詰め込んで行うことを考えている.この物質だけをシリコンチューブに詰めて予備実験を行っている.1.シュワン細胞の培養ラット(生後15日)脊髄後根神経節を使用して培養を行った.まず後根神経節よりのneurite outgrouthを観察し,次のことを確認した.(1)Nerve growthfactorを一定濃度以上を加えるとneurite outgrowthはかえって抑制される.(3)人胎盤血清でなくてもFetal bovine serumで十分である.培養シュワン細胞を増殖させることは困難であった.また線維芽細胞の混入をどうしても伴った.後根神経節には,神経細胞,シュワン細胞,線維芽細胞,外〓細胞が存在する.このため組織学的により単純な坐骨神経を使って,シュワン細胞を培養してみた.この時シュワン細胞の増殖を助ける目的で, Bovine pituitary extract,Cholera toxinを加えてみた.しかし使用濃度が不適合なためかまだはっきりとした効果を確認するに至っていない.2.培養シュワン細胞の確認以下の方法で行っている.(1)倒立顕微鏡による形態学的確認,(2)電子顕微鏡による確認,(3)蛍光抗体法による確認.3.培養シュワン細胞の移植方法培養細胞を移植する時,ゲル状の物質に詰め込んで行うことを考えている.この物質だけをシリコンチューブに詰めて予備実験を行っている.1.ラットのシュワン細胞の培養法の確立2.今後の主な計画