hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深層学習を用いた細粒度な三次元形状類似検索・自動注釈付与技術の研究

2年目の成果として、(1)部分検索に関する新たな手法を開発し、その論文が国際会議で採択され口頭発表を行ったこと、(2) 3D形状オブジェクトの膨大な集合体である3Dシーン分類ならびに検索手法を開発し、その論文が国際会議で採択され口頭発表を行ったこ。また、3Dシーンにおける3D物体検出にも適用可能な、リアルタイム性のある物体認識の新手法を開発し、新たに特許出願を行った。また過去に出願していた3D形状類似検索に関する3件の特許を、2018年度にいずれも特許号として取得することができた。【項目1:深層学習に基づく細粒度3D形状類似検索の特徴量抽出】2018年度は細粒度の形状特徴量として、TVS (Tri-projection Voxel Splatting)法を開発した。TVS法は、多数の3D形状からなる個々の3Dシーンに対して、中心から投影スクリーンに全3Dデータを複数方向に投影して生成される投影画像の重ね合わせを特徴量とし、100層以上の層からなる深層学習を用いて学習する細粒度で高性能な分類検索手法である。【項目2:アセンブリ形状ベンチマークデータ構築】アセンブリ形状ベンチマークとして、2018年度では、34クラスの3D CAD機械部品アセンブリモデル、合計約4000個のデータからなるベンチマークデータを構築した。また、このベンチマークデータを用いて【項目1】で述べたTVS法で98%程度の分類精度が出ることを確認した。【項目3:マルチビューのレンダリングに基づく部分形状抽出】前年度では、【項目1】で述べたTVS法を開発する過程で、部分形状を含む3Dシーンを正確に認識することに成功した。2018年度では、深層学習の中でも自動運転技術に利用されている画素ごとにラベリングを行う「セマンティック・セグメンテーション」を3D形状の部分形状抽出に適用する新技術の開発に着手した。以下の項目を達成できたため。(1)深層学習を内包するTVS法を開発し、これを3Dシーン分類だけでなく、アセンブリ形状の分類にも応用できたこと、(2) TVS法に関する論文を国際会議に投稿し、採択され口頭発表できたこと、(3)新しい深層学習を利用する部分検索手法を開発国際会議に投稿し、採択され口頭発表できたこと、(4)リアルタイム性のある新しい物体認識手法を開発し、特許出願できたこと(特願2018-236091 (出願日:2018年12月18日))、(5)3D機械部品アセンブリ形状のベンチマークの第一版を完成し、アセンブリされた複合体での深層学習を用いた分類・検索の研究に着手できたこと、(6) 3Dの自動注釈付与の第一歩として、画像のセマンティック・セグメンテーション技術を用いた新手法の開発に着手できたこと当初の目標は1件のジャーナル、1件の特許であり、これらは、予定通り達成できた。一方、昨年度は研究成果の製品化に代表される研究成果の社会への目に見える還元を達成できたが、社会へのアピールが前年度に比べると相対的に少なかった。一方で、新しい技術の芽を幾つか提案でき、今後の展開に期待できるので総じて「おおむね順調に進展している」と判断した。3D形状モデルによる深層学習は、データが少ない場合、きわめて挑戦的であると感じてきたが、今年度作成してきたベンチマークデータ、ならびにそれを用いた分類・検索手法の開発を進める中で、少ないデータ状況下でも深層学習を巧妙に利用可能な新しい技術の芽が生まれた。一方、TVS法のように、元来3Dシーン分類・検索のために開発した技術も、データ表現な符号化を工夫することで、部分検索に応用できる目星をつけることができた。今後、ベンチマークデータを充実させるとともに、これらの技術の芽を伸ばし、国際会議やジャーナルなどで発表できる技術レベルまで到達させ、更に当該分野での研究推進をしていく予定である。また、3年目以降に予定していた3D形モデルへの自動注釈付与に関して、部分検索技術、ならびに画像で適用されてきたセマンティック・セグメンテーション技術を応用し、3D形状モデルへの自動注釈付与に着手することを予定している。1年目の成果として、(1)3Dの部分検索に関する論文がスプリンガー社の国際ジャーナルで採択されたこと、(2)3D検索での利用可能な畳み込み形式の深層学習のプーリング手法で端数型のプーリング手法を開発し、こちらもスプリンガー社の国際ジャーナルで採択されたことがあげられる。また、3Dの部品がアゼンブリされた、いわゆる3Dシーンに対する精度な分類・検索を可能とする手法を開発し、特許出願を行った。【項目1:深層学習に基づく細粒度3D形状類似検索の特徴量抽出】1年目は細粒度の形状特徴量として、スーパーベクトルに基づく特徴量を構成し、深度バッファ法とグローシェーディング法の2つのレンダリング法で生成された画像をもとに、高精度な3D部分検索手法を開発した。この成果はSpringerのMultimedia Tools and Applicationsで発表した。また、3D形状特徴量を「ボクセルが時間軸方向にスライスされた形状」として、3D CNNとLSTMを混合した深層学習アーキテクチャで高精度に検索する手法も開発し、国際会議で発表した。更に、多重解像度特徴量とCNN特徴量を混合した特徴量も開発した。【項目2:アセンブリ形状ベンチマークデータ構築】アセンブリ形状として、椅子、ソファ、テーブル等からなる3Dシーンデータの構築を開始した。

こちらは、【項目3】の特許での実施例として利用した【項目3:マルチビューのレンダリングに基づく部分形状抽出】1年目は、いろいろな3Dオブジェクトが混合する3Dシーンに対して複数のビューからのレンダリングとして、ボクセルとスプラッティングを組合わせ、微小な部分形状であっても、それを抽出することに成功した。この成果に関しては、特許出願を行った。以下の項目を達成できたため。(1) 3種類以上の3D形状特徴量を開発できたこと、(2) CNN型の深層学習で新規なプーリング手法を開発し国際ジャーナルで発表できたこと、(3) (1)の特徴量のひとつが、企業のソフトウェア製品に採用され、実用性を証明できたこと、(4) (1)の(3)とは別の特徴量に基づく内容で国際会議で採択され発表できたこと、(5)複数の3Dモデルが統合された3Dシーンでの細粒度な物体検索、ならびに物体検出で2件特許出願できたこと、(6) (1)と(2)に関して、国際ジャーナル(インパクトファクタ1.5)で2件採択され、出版できたこと当初の目標は1件のジャーナル、1件の特許だったので、それぞれ2件以上あり、研究成果のソフトウェアの企業製品への採用まで達成できたので、当初の予想以上の成果であり、当初の計画以上に進展したと判断した。2年目の成果として、(1)部分検索に関する新たな手法を開発し、その論文が国際会議で採択され口頭発表を行ったこと、(2) 3D形状オブジェクトの膨大な集合体である3Dシーン分類ならびに検索手法を開発し、その論文が国際会議で採択され口頭発表を行ったこ。また、3Dシーンにおける3D物体検出にも適用可能な、リアルタイム性のある物体認識の新手法を開発し、新たに特許出願を行った。また過去に出願していた3D形状類似検索に関する3件の特許を、2018年度にいずれも特許号として取得することができた。【項目1:深層学習に基づく細粒度3D形状類似検索の特徴量抽出】2018年度は細粒度の形状特徴量として、TVS (Tri-projection Voxel Splatting)法を開発した。TVS法は、多数の3D形状からなる個々の3Dシーンに対して、中心から投影スクリーンに全3Dデータを複数方向に投影して生成される投影画像の重ね合わせを特徴量とし、100層以上の層からなる深層学習を用いて学習する細粒度で高性能な分類検索手法である。【項目2:アセンブリ形状ベンチマークデータ構築】アセンブリ形状ベンチマークとして、2018年度では、34クラスの3D CAD機械部品アセンブリモデル、合計約4000個のデータからなるベンチマークデータを構築した。また、このベンチマークデータを用いて【項目1】で述べたTVS法で98%程度の分類精度が出ることを確認した。【項目3:マルチビューのレンダリングに基づく部分形状抽出】前年度では、【項目1】で述べたTVS法を開発する過程で、部分形状を含む3Dシーンを正確に認識することに成功した。2018年度では、深層学習の中でも自動運転技術に利用されている画素ごとにラベリングを行う「セマンティック・セグメンテーション」を3D形状の部分形状抽出に適用する新技術の開発に着手した。(1)深層学習を内包するTVS法を開発し、これを3Dシーン分類だけでなく、アセンブリ形状の分類にも応用できたこと、
超音波に反応する人工プロモーターの構築とその利用

人工プロモーターは新規な性質の付与も可能であり、遺伝子治療ペクター用に適している。特に刺激応答型のものは治療の効果の増大、安全性の向上のために有用であり応用範囲が広い。プロモーターは基本転写因子が結合するTATAボックスなどの配列と、活性化した転写因子が結合する配列(シスエレメント)からなる。プロモーターの活性化を担うシスエレメントを適切に選択してランダムに組み合わせ、TATAボックス配列に結合して目的の性質を持ったプロモーターの構築を試みた。広範な組織で活性化する転写因子、NF-kB、NF-Y、AP-I、CBF-Aのシスエレメントを利用して構築した11種類のプロモーターのうち高い活性を示したプロモーターは、多くの種類の細胞でSV40やCMVのプロモーターと同等の強力なプロモーターであった。これら11種類のプロモーターのうちX線に対して最も反応性の高いプロモーターに変異導入型PCRで点変異を導入したものは10GyのX線照射に対して20倍以上の増強を示した。超音波照射により細胞内酸化ストレスが誘起され、放射線を照射した時と似た細胞内環境が作られる。そこで、上記X線反応性プロモーターを細胞に導入し、1MHzの超音波を1W/cm^2で照射したところ、最大で約2倍の増強を示し、さらに、点変異導入で改良したものは約6倍の反応性を示した。これをゲノム中に導入した細胞をマウスに移植し腫瘍形成後超音波を照射したが、有意な増強は認められなかった。そこで、同じ転写因子のシスエレメントを利用して62種類の人工プロモーターを作成し、同様に超音波に対する反応性を調べたところ、10倍以上の反応性を示すものが得られた。さらに変異導入型PCR法により最大で20倍以上の増強を示すプロモーターを取得した。今後はこのプロモーターの生体での反応性や、治療遺伝子発現の効果などについて調べる。昨年度構築した超音波照射により約6倍活性が増強するロモーターでルシフェラーゼ遺伝子を発現する遺伝子カセットを安定に導入したHeLa細胞を構築した。これをヌードマウスの両背部に移植し、直径が約0.5cmとなったところで超音波照射を行いin vivoでのプロモーターの反応性を調べた。In vitroと同じ条件(1MHz、1W/cm^2、Duty Factor (DF) 10%、60秒間照射)で片側の腫瘍のみを照射したが、ルシフェラーゼの増強は認められなかった。そこで、より強い照射(1MHz、2W/cm^2、DF 10%、120秒間照射)を行ったところ、何匹かのマウスで反応が見られたが、平均では超音波に反応しないSV40プロモーターの値と統計的な差は認められなかった。さらに反応性の高いプロモーターを構築するため昨年度構築したプロモーターと同様の方法で新たに超音波応答性プロモーターの構築を行った。4種類のシスエレメントをランダムに組み合わせて構築した61プロモーターの反応性を調べ、昨年取得したプロモーターよりも高い反応性を示すものを7種類見いだした。そのうち特に活性が強いクロン31について調べた。遺伝子導入細胞に照射したところ、ルシフェラーゼ活性は照射後6時間でピークに達し、また、0.5W/cm^2で、また、120-180秒の照射でピークに達した。ピーク後に再度照射しても再び活性化することから、複数回の発現制御が期待できる。また、抗酸化剤の添加で超音波による活性化が抑制されるため、活性化は酸化ストレスを介していると考えられた。塩基配列分析の結果、ほとんどのシスエレメントがNF-κBであることが判明した。今後は、変異導入型PCRにより改良を行い、超音波による治療遺伝子発現制御が可能な組み換えウイルスベクターの作成を行う。
体外式膜型人工肺施行患者におけるカルバペネム系抗菌薬の薬物動態の検討

本研究は、体外式膜型人工肺(ECMO)施行患者のカルバペネム系抗菌薬の血中濃度を測定することにより、カルバペネム系抗菌薬の血中動態と効果との関係性を評価することを目的とし、以下の研究実施計画をもって申請された。まず、ECMO施行患者の内、カルバペネム系抗菌薬を投与する患者を対象とし、抗菌薬投与前(トラフ値)、投与後1、3、6時間後に採血を行う。血中濃度はHPLCを用いて測定する。血漿400μLを限外濾過し、20μLを逆相C18カラムで分離し、300nmの吸光度を測定する。患者背景として、性別、年齢、体重、身長、血清クレアチニン値、ECMO施行の理由、感染症起因菌、最少発育阻止濃度を調査する。抗菌薬の治療効果はC反応性タンパク質、患者予後はECMO施行からの生存日数により評価する。患者予後に及ぼす薬物動態以外の因子についてはロジスティック回帰分析により評価する。現在、本研究はサンプル収集を継続している。血中濃度測定法は超高圧液体クロマトグラフィー紫外吸光検出法を用いたメロペネム測定系を構築しており、サンプルサイズが揃い次第解析を行い、得られた結果については学会発表や論文発表の形で公表する。また、本研究についてミーティングを重ねた結果、カルバペネム系抗菌薬以外にもニューキノロン系抗菌薬、セフェム系抗菌薬、βラクタマーゼ含有ペニシリン系抗菌薬の中にも検討が必要な薬剤があるとの見解があり、体外循環の種類についてもECMOだけでなく、血漿交換、ビリルビン吸着もしくはエンドトキシン吸着についても検討が必要である。抗菌薬の種類および体外循環の種類に関しては改めて評価を進めている。
タキサンの微小管関連蛋白質およびMAPキナーゼに対する作用と癌細胞増殖抑制の検討

細胞骨格の構成蛋白質である微小管に作用するタキサン化合物は固形癌に対する化学療法の中心的抗癌剤の一つとなりつつある。タキサン化合物の一つであるpaclitaxelの微小管関連蛋白質(microtubule associated proteins,MAPs)に対する作用を、細胞周期を同調したヒト培養肺癌細胞株を用いて検討し、以下の結果を得た。1.MAPsの一つであるMAP2蛋白質とα-、β-チュブリン蛋白質の親和性がpaclitaxel接触により増強した。2.MAP2蛋白質をリン酸化するMAPキナーゼ活性をmyelin basicproteinを基質として測定し、paclitaxelを添加した細胞のMAPキナーゼ活性が抑制されることを明らかにした。本抑制作用は、細胞周期特異的(G2/M期)で濃度依存的であった。また、paclitaxel耐性細胞においては、その抑制は認められなかった。3.G2/M期におけるcdc2キナーゼの活性化はpaclitaxel添加細胞において抑制された。4.paclitaxelは粗精製微小管蛋白質中のMAPキナーゼ活性に対して、直接的な抑制作用は示さなかった。これらの成績はpaclitaxelが微小管関連蛋白質および、その細胞内情報伝達機構に作用する可能性を示唆する。本研究で明らかにしたpaclitaxelの作用は当該薬物のMAP2キナーゼ阻害剤との併用による作用増強や他の抗癌剤との併用による抗癌効果の増強の可能性を検討する上で意義があると考えられた。
医療データベースからの感染症発生予測規則の抽出

本研究の目的は、病院に蓄積されている医療検査データより感染症発生規則の発見手法を確立し,院内感染症予防のための支援システムを構築することである。本研究では,具体的には次の課題について取り組んだ。1.院内感染発生予測のための規則発見,2.Web対応院内感染予防支援システム,前者は,データマイニング手法を用いた「原因Xの下でYが成り立つ(X⇒Y)」という感染症発生規則を,決定木を構築する方法と相関規則抽出アルゴリズムの2手法を用いて抽出した。特に,院内感染で深刻な問題となっているMRSA(メチシリン黄色ブドウ球菌)の発生予測に関する相関規則の抽出を行った。さらに,治療と院内感染などの関係を知るためには,投薬による耐性菌への変化といった医療データ特有の時系列データとしての分析を行うことが重要である。そのため,時系列データマイニングについての研究も合わせて行った。データとしては,1994年から1999年までの提供戴いた病院の検査データ(8MB)を用いた。得られた結果は,医療関係者に検討して貰い,大半は予測可能なものであるが興味深いものが含まれているとの評価を得た。後者については,データウェアハウス的な観点から,医療従事者のための院内感染症予測支援システムの開発を行った。システムは,ネットワーク環境で使用可能なようにJava言語を用いてサーバー・クライアント方式で構築した。開発システムは規則発見ツールと検証ツールを備えている。規則発見ツールはSQLでの規則抽出が可能である。検証ツールは,相関規則を指定したときその規則に有意性があるかどうかなどの判定が行える。また,注目する項目の統計的な結果や経時変化を視覚的に表示する機能を備えており(統計処理,経時変化)医療従事者がいろいろな角度から状況を分析することができる。本研究の目的は,これまで蓄積されている膨大な医療検査データから,感染症発生に関する予測規則の抽出手法を人工知能的手法を用いて確立し,現在問題になっている院内感染予防支援システムを開発することである。今年度実施した研究課題と研究成果は概略以下の通りである。(1)医療検査データの洗練処理:医療検査データはExce1で提供されており,直接データマイニングのデータとして用いるのには適していない。また,検査項目やデータの構造が医療独特の形式になっている。そのため,感染症発生予測に重要な項目への再編成や計算機処理に適したデータ構造への洗練・変換を行った。(2)データマイニング手法を用いた感染症発生予測規則発見エンジンの開発:C4. 5と呼ばれる決定木を構築する方法によって感染症発生予測規則の抽出実験を行った。特に,薬剤耐性の観点から再構築したデータベースに対してMRSA(メチシリン黄色ブドウ球菌)の発生に関する相関規則などを抽出して興味ある結果を得た。そのほか,処方に注目した耐性菌情報の抽出なども行った。(3)院内感染予防支援システムの基本設計:院内感染の予防や院内感染の発生予測を医者が容易に行うためのエキスパートシステムのモデルを設計し一部実現した。今後のネットワーク環境での使用を考慮し,プログラミング言語としてはJavaを用いており,柔軟なデータ処理が可能となるように医療データはXML化している。現在,注目する項目に沿って原因を検索したり,相関規則を指定したときその規則に有意性があるかどうかなどの判定が行えるようになっている。今後はより洗練されたデータに感染症予測に特化した機能を追加して実用的なシステム構築へ向けての研究を行っていく計画である。本研究の目的は、膨大に蓄積された医療検査データを利用して,感染症発生規則の発見手法を確立し,院内感染症の早期発見のための院内感染予防支援システムを構築することである。

(1)データマイニング手法を用いた感染症発生予測規則発見エンジンに関する研究:病院で蓄えられている医療データのデータマイニングのための洗練を行い,それを用いて,決定木を構築する方法と相関規則抽出アルゴリズムの2手法を用いて感染症発生予測規則の抽出を行った。特に,院内感染で深刻な問題となっているMRSA(メチシリン黄色ブドウ球菌)の発生に関する相関規則について詳細な実験を行った。得られた実験結果については研究会などで報告を行っている。(2)院内感染予防支援システムに関する研究:院内感染の発生予測を行い,院内感染の予防を支援するための医療従事者の意思決定支援システムの研究を行った。まず,種々の感染症発生要因に基づいてデータを分析してその統計量や経時変化を視覚化し,医療従事者の現状認識を支援するシステムを構築した。また,注目する項目に沿って原因を検索したり,相関規則を指定したときその規則に有意性があるかどうかなどの判定が行えるシステムを開発した。今後のネットワーク環境での使用を考慮し,プログラミング言語としてはJavaを用いており,柔軟なデータ処理が可能となるように医療データはXML化している。今後は,データウェアハウス的な観点から,データに感染症予測に特化した検査ツール(統計処理,経時変化,視覚化)機能,医療データベースを解析する多次元データ解析機能,および,発見ツール(データマイニング)について研究を行い,実用的なシステムの構築を行う計画である。本研究の目的は、膨大に蓄積された医療検査データを利用して,感染症発生規則の発見手法を確立し,院内感染症の早期発見のための院内感染予防支援システムを構築することである。平成15年度に実施した研究内容と研究成果は概略以下の通りである。(1)院内感染発生予測のための規則発見に関する研究:病院で蓄えられている医療データを基に,原因Xの下でYが成り立つ(X⇒Y)という規則のデータマイニング手法を用いた発見システムの開発を行った。特に,院内感染で深刻な問題となっているMRSA(メチシリン黄色ブドウ球菌)の発生に関する相関規則を,決定木を構築する方法と相関規則抽出アルゴリズムの2手法を用いて抽出するシステムを構築した。また,医療データベースの検索項目の階層化や分類といったデータ洗練を行い,処理の効率化に関する研究を行った。(2)院内感染予防支援システムに関する研究:データウェアハウス的な観点から,院内感染症予測に特化した検査ツール(統計処理,経時変化),医療データベースを解析する多次元データ解析機能,および医療従事者の予測支援のための情報の視覚化についての研究を行った。開発したシステムは,期間,注目する項目(投薬情報,病名,病棟,など)に沿って原因を検索したり,相関規則を指定したときその規則に有意性があるかどうかなどの判定が行え,注目する項目の統計的な結果や経時変化を視覚的に表示する機能を備えている。また,ネットワーク環境で使用可能なようにJava言語を用いてサーバー・クライアント方式で構築した。
グローバリゼーション下の食の安全と食料輸入自由化問題

日本の食料の安定的な供給のためには、食料自給を目指すのではなく、一定量の輸入に依存すべきであることが東南アジアや中東の事例から明らかとなった。農林水産省が採用しているカロリーベースの食料自給率指標の不適切さも解明できた。日本の食の安全を確立するためには、検疫制度や農地制度を抜本的に改革する必要があることも明らかとなった。本研究は、経済工学の立場から食料問題にアプローチするものである。グローバル化の進展によって、食料自給率を低下させることはむしろ自然な発想ともいえるが、これに相反する近年の輸入食料規制の動きや、食料自給率を上げようという動きが、グローバル化された社会にどのような影響を与えるのかを明らかにするのが、本研究の第1の目的である。そもそも自給率とは何なのか、すでに1年目の研究でほぼ解明された。日本の農林水産省の定式化している自給率概念は、日本の農産物が輸出される際や、輸入肥料の存在などを考慮した場合、食料の安定的供給の指標として極めて不適当であることが解明された。それに代わる概念として国産化率があることが分かった。2年に当たる平成22年度はさらに研究を進め、日本以外の国々の食料安全保障政策と食の安全に関する考え方をレビューし、日本にとっての教訓を導く。それは、来年度到達すべき日本への政策提言に直接つながるものである。具体的には、下記の研究会における討論を通じてアジア、中東の食料問題をレビューし、輸入食料の検疫制度、食糧備蓄のあり方などを経済工学の立場から評価することになろう。1年目には、一般の人々を啓蒙するための食の安全と食料輸入自由化問題に関する書物を刊行する予定であったが、企画していた出版社の経営が悪化し、出版までには至らなかった。そのため、研究計画の順序が前後したが、平成22年度には当初の予定通り正常化するものと見込まれている。研究ベースのみならず、経済政策に直接関連するテーマなので、研究成果を幅広く知っていただくことも本研究の意義と認識している。1年目には、一般の人々を啓蒙するための食の安全と食料輸入自由化問題に関する書物を刊行する予定であったが、企画していた出版社が事実上倒産し、出版までには至らなかった。平成22年度は改めて出版社も決まり、平成23年度中には刊行される予定である。平成23年3月に発生した東日本大震災によって、食の安全と食料輸入自由化問題は新たな局面を迎えた。その変化をも取り込んで、最終報告書をまとめたい。研究代表者及び研究分担者はすべて、日本マクロエンジニアリング学会の中の経済工学研究会の有志メンバーであり、研究は、経済工学の視点からなされた。また、研究分担者以外の研究会の他のメンバー3名の協力も得た。本研究では、各国のマクロ経済が相互依存の度合いを高めることをグローバリゼーションととらえ、それが進展する中で食料・農業貿易がどのように変化するか、食料・農業分野での直接投資などの企業活動の国際的展開がどのように進展するかを分析した。これは、研究代表者である吉野の環太平洋経済連携(TPP)や自由貿易協定(FTA)を巡る論稿にまとめられた。また、産業連関分析を用いて、藤川、渡邉が取り組んだ、自給と国産概念についてのいくつかの試算は日本の農林水産省が公表しているカロリーベースの自給率が食料の安定的供給を論じるには不適切であることを明らかにした。秋吉の研究は、土地制度から農業を論じるもので、工学的な意味での食の安全を確保する条件を明示した。政策という立場からは農地制度の見直しを提言するものであり、諸外国の事例をもとに、代替的な選択肢を示した。木村の研究は農業貿易に理論的にアプローチすることで、静学的な安定供給の条件を導こうとするものであった。研究分担者の立花亨は、サウジアラビアなどの自然条件から食料をほぼ全量輸入に依存する国の農業政策を通じて、食料需給予測力弐どのように行われているかを探ることを目的としていた。それぞれに研究成果を出したが、農業貿易への理論的な分析、食料需給予測については、まだ十分な成果が出たとはいえない状況である。一方で、一般市民向けの成果報告会を東京、名古屋、四日市の3都市で開催、多くの聴衆を集めた。
甲殻類の性分化を制御する造雄腺ホルモンの精製と構造解析

甲殻類における性分化は内分泌的に制御されていることがわかっている。すなわち,雄においては造雄腺という独特の器官が発達し,ここから造雄腺ホルモンが分泌され,雄の性特徴を発達させる。このホルモンを若い雌に注射すると雄へ性転換させることができる。オカダンゴムシを材料にしてその造雄腺を集め,緩衝液を用いて抽出した。粗精製物を用いた実験から,造雄腺ホルモンは熱に安定であり,分子内にジスルフィド結合を含む分子量11,000-13,000のタンパク性物質であることがわかった。この抽出液についてイオン交換HPLC,それに続く2回の逆相HPLCによって,約2万匹の造雄腺から最終的に38pgで活性を示す画分を得た。N末端アミノ酸配列分析の結果,各サイクルで2つずつのPTH-アミノ酸が同定されたが,SDS-PAGEや質量分析では高純度であるという証拠は得られなかった。別のロットから精製した同程度の純度を有する精製画分について還元カルボキシメチル化し,回収されたペプチドについて配列を解析したところ,先に解析した未処理のペプチドの一方の鎖である可能性が示された。さらに別のロットからの精製物の配列解析は最初の解析とほとんど同様の結果となった。以上の結果から,造雄腺ホルモンは2本鎖のペプチドである可能性が極めて高いと考えられた。現在,部分ペプチドを合成し,抗体を作りつつあり,この抗体が活性を吸収できることを期待している。一方,cDNAのクローニングも進行中であり,PCRによって造雄腺ホルモンcDNAの一部と考えられる断片を増幅することに成功している。近い将来,塩基配列からホルモンの全アミノ酸配列が推定できるものと考えている。また,遺伝子発現の系でこのホルモンを人工合成し,活性を確かめたい。まだ,構造が確定したわけではないが,ホルモンの存在が最初に示されて以来45年でようやくホルモンの本体が見えてきたと考えている。オカダンゴムシ(Armadillidium vulgare)の雄から造雄腺のみを摘出し,これを造雄腺ホルモン(androgenic gland hormone)の抽出材料とした.造雄腺ホルモン活性は試料を若い雌に注射した後,その雌が脱皮したときに雄の性特徴である生殖内肢が認められるかどうかで判断する従来の方法を用いた.約2000匹由来の造雄腺をトリス塩酸緩衝液中でホモジナイズし,得られた抽出液を直接,ODP-50を用いた逆相HPLCに流し,0.05%トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの濃度勾配溶出を行った.その結果,活性はアセトニトリル濃度約30%で溶出される画分のみに回収された.これを濃縮した後,μBondasphereカラムに流し,ほぼ同様の条件で溶出したところ,活性はアセトニトリル濃度約28%で溶出される画分にのみ回収された.この画分をさらにOPDカラムを用い,溶媒を0.05%ヘプタフルオロ酪酸中でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行ったところ,活性はアセトニトリル濃度約35%で溶出された1つのUVピークに回収された.この3段階の逆相HPLCによる活性画分のタンパク量はわずか0.16μgであり,その38pgを注射したとき,雌の雄性化を促した.この値はこれまで得られた最も少ない量であり,精製がかなり進んでいることを示唆した.現在,さらに精製方法を検討している.

一方,粗精製品を用いて,活性を指標にして造雄腺ホルモンの物理化学的性状を調べたところ,熱に対して安定であるが,トリプシン消化,SH試薬による還元により失活したことからジスルフィド結合を含むタンパク質と考えられた.また,ゲルろ過の溶出位置から,分子量は約12,000であることが推定された.甲殻類における性分化は内分泌的に制御されていることがわかっている。すなわち,雄においては造雄腺という独特の器官が発達し,ここから造雄腺ホルモンが分泌され,雄の性特徴を発達させる。このホルモンを若い雌に注射すると雄へ性転換させることができる。オカダンゴムシを材料にしてその造雄腺を集め,緩衝液を用いて抽出した。この抽出液についてイオン交換HPLC,それに続く2回の逆相HPLCによって,約2万匹の造雄腺から最終的に38pgで活性を示す画分を得た。N末端アミノ酸配列分析の結果,各サイクルで2つずつのPTH-アミノ酸が同定されたが,SDS-PAGEや質量分析では高純度であるという証拠は得られなかった。今回は別のロットから精製した同程度の純度を有する精製画分について還元カルボキシメチル化し,回収されたペプチドについて配列を解析したところ,先に解析した未処理のペプチドの一方の鎖である可能性が示された。さらに別のロットから得られた精製物の配列解析は最初の解析とほとんど同様の結果となった。以上の結果を総合すると,造雄腺ホルモンは2本鎖のペプチドである可能性が極めて高いと考えられた。現在,部分ペプチドを合成し,抗体を作りつつあり,この抗体が活性を吸収できることを期待している。一方,cDNAのクローニングも進行中であり,PCRによって造雄腺ホルモンcDNAの一部と考えられる断片を増幅することに成功している。近い将来,塩基配列からホルモンの全アミノ酸配列が推定できるものと考えている。また,遺伝子発現の系でこのホルモンを人工合成し,活性を確かめたいと考えている。
19世紀フランス小説における男性へのまなざしとジェンダー構造

近代社会の草創期にあった19世紀のフランスにおいて、「男らしさのモデル」がどのように形成され、変化したかを明らかにすると同時に、小説に多く描かれた「理想的モデルから逸脱する男性像」(「アンチヒーロー」、「世紀病の青年たち」、「母親と癒着する青年たち」など)の表象を、シャトーブリアン、コンスタン、ミュッセ、バルザック、スタンダール、モーパッサン、サンド、コレットらの作品を通して分析した。本研究は19世紀フランスの小説における男性像の具体的な造形例を、当時の男性作家が書いた作品から抽出し、「男性→男性」へのまなざしの特質を検証すると同時に、女性作家が描いた作品における男性像と比較することにより、ジェンダーの非対称性の容態を明らかにすると共に、それを生み出す磁場のありかを探究することを目的とする。具体的に、本研究が問いかけようとする内容は、次の3点である。1. 19世紀フランス小説に読み取ることのできる「男性性」とはどのようなものか。2.男性が男性に投げかけていたまなざしは、どのような性質を持っていたと考えられるか。3.女性作家か描いた男性像に、一定の類型はあるか。あるとしたらどのようなものか。初年度にあたる平成21年度は、当初の計画では、項目1の完遂を目標として掲げていたが、むしろ、項目2から着手し、19世紀西欧における「男らしさ」のジェンダー規範を概観しておく必要があると考え、順序を入れ替えた。フランスにおける近代的男性像の研究は、現在まさに途上にある段階で、小説作品を題材とした本研究は、その一助となることは間違いがない。また、来年度からの研究推進のために必要な図書およびビジュアル資料に関しては、夏季休業期間中にパリにて不足分を収集した。本研究は、19世紀フランスの小説における男性像の具体的な造形例を、当時の男性作家が書いた作品から抽出し、「男性→男性」へのまなざしの特質を検証すると同時に、女性作家が描いた作品における男性像と比較することにより、ジェンダーの非対称性の容態を明らかにすると共に、それを生み出す磁場のありかを探求することを目的とする。1.19世紀フランス小説に読み取ることのできる「男性性」とはどのようなものか。3.女性作家が描いた男性像に、一定の類型はあるか。研究の2年目にあたる平成22年度は、19世紀フランスに固有の現象であるフランス革命やナポレオン帝政時代といった社会事象を念頭におきながら、それが「男らしさモデル」の変遷にどのように影響したかということを中心に検討した。研究対象として、女性作家のジョルジュ・サンドはもちろん、シャトーブリアン、コンスタン、スタンダール、バルザック、ミュッセ、モーパッサンなどの男性作家の小説作品から、特徴のある男性登場人物を抽出した。その際、特に、男性にとって手本となるべき存在のみならず、理想的な「男らしさモデル」からはずれていく男性登場人物を抽出することにより、19世紀フランス小説の新しい読み方を提示した。本研究は、19世紀フランスの小説における男性像の具体的な造形例を、当時の男性作家が書いた作品から抽出し、「男性→男性」へのまなざしの特質を検証すると同時に、女性作家が描いた作品における男性像と比較することにより、ジェンダーの非対称性の容態を明らかにすると共に、それを生み出す磁場のありかを探求することを目的として行ってきた。具体的に、本研究が問いかけた内容は次の3点である。研究の最終年度にあたる平成23年度は、19世紀フランスに固有の現象であるフランス革命やナポレオン帝政時代といった社会事象を念頭におきながら、それが「男らしさモデル」の変遷にどのように影響したかということを中心に検討した。研究対象として、女性作家のジョルジュ・サンドやコレットはもちろん、シャトーブリアン、コンスタン、スタンダール、バルザック、ミュッセ、モーパッサンなどの男性作家の小説作品から、「世紀病」など特徴のある男性登場人物を抽出した。また、荒々しさが「男らしさ」と認識されなくなった時代において、青年たちがいかにして女性たちの側に入り込み、自らのアイデンティティを書き換えていったかを、サンドやコレットの作品も使用して明らかにした。今年度まで3年の研究成果は、冊子体の報告書としてまとめ、公開した。
異なるタウイメージングトレーサーの同一被験者における直接比較と画像病理検証

本研究ては異なるタウPETイメージングトレーサー、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の集積特性や分布の違いを検討し、タウイメージングの診断的意義を検証することを目的としている。両タウPET診断薬による画像データを集積し、横断的画像情報から両トレーサーの集積特性を明らかにすること、また、可能な限り剖検症例を蓄積し、生前のPET画像と病理所見の対比を行う。平成30年度末まで[F-18]THK5351について98件、[C-11]PBB3については125例の画像を集積した。これらの内、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の両者を実施できた症例は18例である。内訳は認知機能正常者6例、AD2例、進行性核上性麻痺(PSP)5例、大脳皮質基底核変性症(CBD)2例、前頭側頭葉変性症:進行性非流暢性失語症(FTLD:PNFA)1例、嗜銀顆粒性疾患(AGD)1例、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1例、である。[C-11]PBB3実施例の内8例、[F-18]THK5351実施例の内5例で剖検が得られ、うち3例は[C-11]PBB3と[F-18]THK5351を実施しており、画像病理の両者で直接比較が可能である。[F-18]THK5351はmonoamineoxidaze-B(MAO-B)への結合性によりgliosisを感度良く描出できることがわかり、脳血管障害後のWaller変性や神経膠芽腫への集積があることを明らかにし、報告した。[C-11]PBB3ではアミロイド陰性(A-)例でPBB3集積陽性(T+)があるものの、アミロイド陽性(A+)例ではPBB3陰性(T-)例は存在せず、全てA+T+であった。このことから、[C-11]PBB3はアミロイドへのクロス集積が疑われる。次年度は更に詳細な解析を進める。研究開始から2年間で、延べ200例余りのタウPETを実施、両検査をhead to headで比較できるデータも18例集積した。剖検例は10例あり、うち3例は生前に両タウPETを実施している。これらのデータを解析し、画像病理相関に関する論文と、症例報告を英文で発表した。[C-11]PBB3と[F-18]THK5351はそれぞれに非特異的結合(off-target binding)が存在し、タウ標識診断薬としての限界も明らかとなったが、健常者データベースに基づいて統計学的手法により、非特異集積と特異集積を分け、特異集積部分を評価する解析ツールを開発中であり、最終年度にその有用性の検証も合わせて行う。本研究では異なるタウPETイメージングトレーサー、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の集積特性や分布の違いを検討し、タウイメージングの診断的意義を検証することを目的としている。そのため、同一被験者において2つのタウPETイメージングを実施し、直接比較するとともに、両タウPET診断薬による画像データを集積し、横断的画像情報から健常者における加齢変化をそれぞれ推定し、特にprimary age related tauopathy (PART)とアルツハイマー病(AD)やAD以外のタウオパチーの関係を明らかにすること、また、可能な限り剖検症例を蓄積し、生前のPET画像と病理所見の対比を行い、集積の意義を確認することが目的である。平成29年度は[C-11]THK5351の臨床撮像を立ち上げ、年度末までに総計61件の画像を集積した。[C-11]PBB3については113例の画像を集積した。これらの内、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の両者を実施できた症例は11例である。内訳は認知機能正常者4例、AD1例、進行性核上性麻痺(PSP)5例、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1例である。更にその内3例については経過観察中に死亡し、剖検が得られた。今後病理所見と生前の画像の対比を進める。[C-11]PBB3は健常者において線条体、脈絡叢に非特異的集積を認め、水溶性代謝物を反映した血管内の放射能が高かった。一方[F-18]THK5351は視床、基底核、黒質、中脳水道周辺、脳幹の一部に非特異的集積が認められた。疾患例における両トレーサーの集積分布はやや異なり、[C-11]PBB3はアミロイドβの集積の影響を受け、[F-18]THK5351は変性に伴うgliosisへの集積の影響を受けているためと考えられた。次年度は更に症例を蓄積して詳細な解析を進める。[C-11]PBB3の臨床研究は既に開始し、既に100例近い症例の蓄積を有していたが、[F-18]THK5351は本研究のために薬剤合成と撮像体制を立ち上げた。平成29年度中に臨床検査を開始し、順調に症例を蓄積することができた。また、既に3例の剖検例も得られており、本研究の目標を達するためのデータの蓄積は順調に進んでいる。また、[F-18]

THK5351の非特異的集積に関する研究も合わせて進めることができた。剖検脳標本を用いた結合実験により、[F-18]THK5351がメラニンに集積することを確認し、論文投稿中である。黒質への[F-18]THK5351集積はメラニン含有細胞への集積であることを明らかにすることができた。本研究ては異なるタウPETイメージングトレーサー、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の集積特性や分布の違いを検討し、タウイメージングの診断的意義を検証することを目的としている。両タウPET診断薬による画像データを集積し、横断的画像情報から両トレーサーの集積特性を明らかにすること、また、可能な限り剖検症例を蓄積し、生前のPET画像と病理所見の対比を行う。平成30年度末まで[F-18]THK5351について98件、[C-11]PBB3については125例の画像を集積した。これらの内、[C-11]PBB3と[F-18]THK5351の両者を実施できた症例は18例である。内訳は認知機能正常者6例、AD2例、進行性核上性麻痺(PSP)5例、大脳皮質基底核変性症(CBD)2例、前頭側頭葉変性症:進行性非流暢性失語症(FTLD:PNFA)1例、嗜銀顆粒性疾患(AGD)1例、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1例、である。[C-11]PBB3実施例の内8例、[F-18]THK5351実施例の内5例で剖検が得られ、うち3例は[C-11]PBB3と[F-18]THK5351を実施しており、画像病理の両者で直接比較が可能である。[F-18]THK5351はmonoamineoxidaze-B(MAO-B)への結合性によりgliosisを感度良く描出できることがわかり、脳血管障害後のWaller変性や神経膠芽腫への集積があることを明らかにし、報告した。[C-11]PBB3ではアミロイド陰性(A-)例でPBB3集積陽性(T+)があるものの、アミロイド陽性(A+)例ではPBB3陰性(T-)例は存在せず、全てA+T+であった。このことから、[C-11]PBB3はアミロイドへのクロス集積が疑われる。次年度は更に詳細な解析を進める。研究開始から2年間で、延べ200例余りのタウPETを実施、両検査をhead to headで比較できるデータも18例集積した。剖検例は10例あり、うち3例は生前に両タウPETを実施している。これらのデータを解析し、画像病理相関に関する論文と、症例報告を英文で発表した。今後更に症例を追加し、加齢に伴う変化であるPARTを両トレーサーで検出可能かどうかを検討する。また、同一被験者における比較症例を更に加え、アミロイド病理、タウ病理、非アミロイド非タウ病理と両トレーサーの集積の関係を明らかにしてゆきたい。また、脳梗塞による錐体路障害によりワーラー変性を伴う症例で、[F-18]THK-5351が変性した錐体路に沿って集積することを発見した。これはワーラー変性に伴うgliosisを反映した集積と考えられ、glia細胞に特異的に発現しているMAO-Bへの集積によるものと考えられた。このことより、[F-18]THK5351は変性の局在を示すグリアマーカーとしても有望であると考えられた。今後、非AD型変性疾患の症例を蓄積し、検討を進める。[C-11]PBB3と[F-18]
目無経下絵の研究

今年度は、東京国立博物館、京都国立博物館、東京芸術大学芸術資料館の作品調査及び関連諸作品の調査を行ない、調査の際に撮影したフィルムから約500枚の焼付写真を作成した。全図は写真用台紙に貼り、ファイルボックスに納め、部分図は写真用アルバムに整理した。これらの資料と調査時の記録から、「目無経下絵」の描線、横図、人物表現の特徴、主題について考察した。1.描線:下絵は、極めて薄い紙に雲母引きを施した上に、淡墨の線で描かれている。経文は、ほとんどが下絵の上に直接書かれているが、下絵に白色顔料を塗りその上に書かれたものもあり、書写の態度に違いが認められる。2.横図:画面に描かれた建物は、間口と奥行を表わす2本の直線を斜めに引く構成法を採用している。しかも、間口と奥行の直線のおりなす角度は「葉月物語絵巻」に近似している。3.人物表現の特徴:鼻の隆起を描いたちぢれ毛の下人など、卑しい相貌の人物が比較的多く描かれているところが特徴的である。貴族の男女は、「源氏物語絵巻」や「扇面法華経冊子」「葉月物語絵巻」に描かれた人物と相似しており、いくつかの決まったポ-ズに分類することが可能である。当時の型(パターン)を用いた人物の表現法をうかがうことができる。4.主題:男女の逢瀬や宴の様子、文をしたためる男、絵を描く女房、出産、加持祈祷など、平安貴族の日常生活を描いた場面が多い。しかし、蓑のような特異な被り者をした男が何度も登場するところから、特定の物語を絵画化した絵巻であった可能性が考えられる。この他、三本指の鬼や化現童子が描かれるが、これらの異形のモチーフの意味をさらに検討する必要がある。来年度は、五島美術館及び京都・個人蔵の作品の調査を行なう予定である。また、調査と平行して、本下絵の様式、主題、制作年代ついても考察をすすめ、論文としてまとめる予定である。
皮膚病変形成におけるサイトカインネットワークとその制御

近年の分子生物学の進歩により、新たなサイトカインが次々とクローニングされその生物学的な意義が明らかにされつつある。従来紫外線や化学物質、細菌などに対して受動的な防御機構のみに関与すると考えられていた皮膚組織が多様な生理活性物質を産生する巨大な臓器であることが明らかにされた。このような観点より、皮膚疾患においては様々なサイトカインが病変形成に関与していると考えられており、その制御により、皮膚疾患の根本的治療も可能と考えられる。本年度は炎症反応時における皮膚でのサイトカインの動態を明らかにする目的でヒト皮膚器官培養系を樹立し、TNCBなどの皮膚感作性物質、レチノイン酸、ラウリル硫酸などの皮膚刺激性物質、ブドウ球菌由来スーパー抗原などを用い、経時的に皮膚より産生されるサイトカイン、細胞接着因子を抗サイトカイン、細胞接着因子抗体、In situ hybridizationによりその局在を、RT-PCR法によりmRNAの発現を検討した。今回得られた成果としてスーパー抗原や、TNCBなどの皮膚感作性物質の添加により、ケラチノサイトより1時間以内の早期にTNF-α,IL1などの発現が見られ、漸次ICAM-1、VCAM-1などの細胞接着因子がケラチノサイト、血管内皮細胞などに発現してくることを明らかになった。Enk等はTNCB塗布マウスを用い同様の実験を行なっているが、彼等の系では、一次刺激性物質ではTNFα,IFNγ,GMCSFが、感作性物質では上記に加え、IL1α,IL1β,MIP-2,IP10などが誘導されることが報告されている。器官培養と動物の差があるが、我々の系ではより、皮膚に限局したサイトカインメッセージの発現を検討することが可能であり現在、FK506,活性型ビタミンD3などのImmunomodulatorを用いた制御機構の検討を行ない、細胞接着因子の発現抑制を誘導することが可能であった。今後この抑制に関与するケラチノサイトにおけるシグナル、転写因子の阻害機序を検討する予定である。
新規光受容タンパク質による鞭毛繊毛機能の光制御

申請者らが新規で発見したDYBLUP(Dynein-associated BLUF protein)の性状と機能を知るために、本研究ではホヤなどの動物や緑藻類クラミドモナスを用いて研究を進めた。本年度の実績と進捗状況は以下の通りである。(1)組換えDYBLUPの精製と結晶化を試みたが、可溶化が予想通りに行かず、成功には至っていない。研究手法を変え、クライオ電子線トモグラフィーによる結合部位の決定を試みた結果、DYBLUPは内腕ダイニンの1種であるf/I1ダイニンに結合しているtetherと呼ばれる構造に局在することが明らかになった。このことは、抗体とネガティブ染色法を用いた以前の我々の結果とも一致し、DYBLUPが内腕を介して光によるダイニン・鞭毛運動制御を行なっていることを示唆する。(2)DYBLUPを欠損したクラミドモナスの変異体を用いた結果、鞭毛の形成は正常に起き、その長さも電子顕微鏡レベルでの内部構造は正常なものと区別がつかなかった。運動速度や鞭毛の振動数も正常のクラミドモナスと大きな違いは見られなかった。次年度に詳細な運動解析を行い、DYBLUPの機能を考察する予定である。(3)DYBLUPの機能に関しては本年度に明らかにすることができなかった。これに関しては、クラミドモナス変異体を用いて次年度に行う。また、進化的に動物の起源に近い海産動物であるクラゲを用いて、DYBLUPの機能解析を次年度に行う。なお、上記(1)の進行に時間がかかったしまったため、ノックアウトマウスの表現型解析に関しては次年度に行うこととした。DYBLUPの軸糸内局在がわかり、内腕ダイニンの調節と関連づけられたことは大きな成果であった。また、DYBLUPを欠損したクラミドモナス変異体でも鞭毛形成、内部構造構築に異常がないことがわかった。今後、光による運動調節を調べることにより、DYBLUPの機能が明らかになると期待される。なお、上記研究実績(1)の進行に時間がかかったしまったため、ノックアウトマウスの表現型解析に関しては次年度に行うこととした。次年度にはノックアウトマウスの表現型解析、クラミドモナス変異体の運動解析を優先して行い、DYBLUPが鞭毛繊毛運動、ひいては光による生物の高次機能調節において果たしている役割を解明する予定である。
Thermodynamic formalism for conformal semigroup actions

私は、等角半群作用の力学系的性質と幾何学的性質の相互作用を中心に研究しました。主な研究結果の内の2つは以下の通りです。1)私はマルチフラクタル解析をランダム複素力学系の研究に応用しました。とくに、ランダム複素力学系における初期値の長時間挙動のHoelder条件の指数を研究しました(J. Jaerisch,H. Sumi,Adv.Math.2017)。28年度が最終年度であるため、記入しない。
生活習慣病関連プロテオーム解析

22週齢の雄性ラットSHR/NDmcr-cp/cpおよびWKY/Izmの膵臓を摘出し、破砕後超遠心分離にかけ、得られた可溶性画分の二次元電気泳動(2-DE)を行った。次に2-DEゲル上でSHR/NDmcr-cp/cpとWKY/Izm問で変動のあったタンパク質スポットを切り出し、脱染色、トリプシン処理、ペプチド抽出およびzipTipによるペプチド濃縮後、MALDI-TOFMSにより質量スペクトルを得た。主要質量ピークのリストを作成し、Mascot(Swiss-Prot)を用いてデータベース検索を行い、生活習慣病関連タンパク質の検索および網羅的解析を行った。現在、これら疾患関連タンパク質の変動を解析するとともに、検出されたタンパク質と病態との関連およびバイオマーカーとしての可能性を検討する予定である。1.高脂血症、高血圧、糖尿病、肥満に代表される生活習慣病を併せ持つ、メタボリックシンドロームのモデルラット(SHR/NDmc-cp/cp)とその起源ラット(WKY/Izm)より摘出した肝臓、膵臓および腎臓を20mM HEPES-KOH緩衝液(pH8.0),10mM酢酸カリウム、2mM EGTA,1mM phenylsulfonyl fluorideおよび0.2Mショ糖を含む緩衝液中に加え、そのホモジネートを遠心および超遠心することにより、可溶性画分を得た。2.この粗抽出液を一次元目に等電点電気泳動(pH310および47)、二次元目にドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる2-DEにより分離した。3.泳動後C.B.B.で染色し、モデルラットの2-DEのみに見られる可視化したタンパク質のスポットを切り出し、4.ゲル内でトリプシン消化を行なった。5.ゲルからペプチドを抽出し、6.分取した画分のタンパク質試料をZipTip_<c18 μ-18>により精製および濃縮した。α-シアノ4-ヒドロキシシンナミン酸をマトリックスとして加え、還元アルキル化された病態発現ペプチドについてMALDI-TOF MSを用いて質量を決定し、それらのペプチドのアミノ酸配列分析などプロテオーム解析を行った。また、ペプチド混合物を分離しながら多価イオンが検出でき、ペプチドマスフィンガープリンティングが可能となった。22過齢のメタボリックシンドロームモデルラット(SHR/NDmc-cp/cp)およびその起源ラット(WKY/Izm)の肝臓、腎臓および膵臓を摘出した。それらの臓器をホモジナイザーで破砕し,ホモジネートを超遠心することにより可溶性画分を得た。各試料は、可溶性画分に8M urea,2%CHAPS,0.5%immobilized pHgradient buffer,40mMdithiothreitol,0.002%brome phenol blueを含む膨潤液を加えて調製し、固定化pH勾配ゲル(pH310)を用いて一次元目の等電点電気泳動を行った。次に、泳動したゲルストリップを12.5%SDS-RACEを用いて、二次元電気泳動(2-DE)に処した。さらに、2-DEゲル上で変動のあった多くの疾患関連タンパク質スポットを切り出し、ゲル中でトリプシンにより消化しペプチド断片とした。その後、MALDI-TOF MS装置(AXIMA-CFR plus)を用いて、疾患関連タンパク質の分子量を測定し、SWISS PROTまたはMASCOTにより、疾患関連タンパク質を検索・解析した。その結果、数種(α-enolase, phosphoglycerate kinase, farnesyl pyrophosphate synthetase, chymotrypsinogen B precursor, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, nucleosidediphosphate kinase B)の疾患関連タンパク質を同定した。これらの同定されたタンパク質のスコア値は高く、また、それらの分子量は2-DEより求めた分子量とほぼ一致しており、疾患関連タンパク質であるのではないかと予測された。一方、同様に処理した可溶性画分をPD-10カラムで脱塩後、一次元目にクロマトフォーカシングカラム、二次元目に逆相クロマトグラフィー用カラムを組合わせた2-DLCによりタンパク質を各フラクションに分画した。これらの各フラクションをディファレンシャルディスプレイ法により比較した結果、分離パターンの異なる7種の分画画分を得ており、現在MALDI-TOF MSおよびデータベース検索により、これらの疾患関連タンパク質を解析中である。

次に2-DEゲル上でSHR/NDmcr-cp/cpとWKY/Izm間で変動のあったタンパク質スポットを切り出し、脱染色、トリプシン処理、ペプチド抽出およびZipTipによるペプチド濃縮後、MALDI-TOF Msにより質量スペクトルを得た。主要質量ピークのリストを作成し、Mascot(Swiss-Prot)を用いてデータベース検索を行い、生活習慣病関連タンパク質の検索および解析を行った。