hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規機能性薬物の分子設計と合成

生体関連機能物質及び関連するリ-ド化合物に焦点を当て、分子設計と合成及び生物活性評価を通して構造活性相関を明らかにし、創薬の種を発見することにある。平成78年度で得られた研究成果を以下に要約する。1)有機鉛試薬を利用して確立したa-アルキニルケトンの汎用性ある合成法をイソカルバサイクリン類縁体のw-鎖に三重結合を導入した類縁体である13,14-ジデヒドロイソカルバサイクリンの合成を完成させた。この類縁体は興味ある生物活性を示した。2)プロスタサイクリン受容体研究に新たな展開を意図して、アゴニスト活性の低い6-イソカルバサイクリンを光学活性体で合成した。残念なことに、イロプロスト受容体との結合能はイソカルバサイクリンに比して余り高くなかった。3)循環器疾患治療薬の開発に対しては血液凝固の後期段階である腺溶系阻止因子としてトロンボモジュリンの生産増加を促す薬物の創製を目的として9-シスを環で固定したレチノイン酸類縁体を数種合成し、固定環が5員環の高活性新物質を発見した。4)グリコシル化の新しい方法論を確立するための試みとして、ドナーとアクセプターをカルボナ-トとして連結するための合成法がほぼ確立できた。次は各種プロモタ-を用いて脱炭酸によるグリコシル化反応を選択性を含めて検討し、興味ある知見を得た。5)新規グリコシル化反応開発の一環として、1-デヒドロ糖と他の糖の間で形成されるオルトエステルの合成と還元剤による還元的開裂によるグリコシル結合の形成を検討し、特徴的グリコシル化反応を見出した。6)合成中間体として汎用性の高い多置換シクロヘキサン環の構築を、Ferrier反応の遷移金属塩を用いる触媒的糖変換による実践的合成法として改良した。この変換がほぼ達成され、しかも、グルコースのみならずガラクトースやマンノースへも適用できることが判明した。PGに代表される生体機能に深く関連する内因性及び外因性物質や近年その生理的機能が解明されて注目されてきた複合糖質をリ-ド化合物として、新たな生物活性物質の探索を意図し、分子設計と合成を検討し、実用に供する物質の開発を目的とした。これらの合成研究途上、新たに開発した合成素反応、即ち、位置および立体を制御したα-1-アルキニルケトン合成法やRhカルベノイドのC-H挿入反応に用いる新規不斉触媒の創製とそれを利用したキラル分子の合成反応の開発等についても検討した。1)我々が発見したイソカルバサイクリンは種々の生物活性がプロスタサイクリンと類似した類縁体である。この類縁体を基本として、関連化合物の構造活性相関を知るため新たに分子設計を行い、13,14-ジデヒドロ類縁体の合成を完成した。2)PG合成に応用可能な反応として開発した鉛試薬を利用したω鎖の直接導入法を、更に一般的な合成素反応としてその有用性を高めるため、反応の改良や拡大を計ると共にα-アルキニルケトンの汎用性合成法を確立し、上記類縁体合成に応用した。3)イソカルバサイクリン合成における合成中間体の効率良い製法に利用したα-ジアゾβ-ケトエステル体のRh(II)塩触媒下でのRh-カルベノイドのC-H挿入反応を更に展開するため、新規ロジウム不斉触媒の創製とそれを用いてのキラル分子合成へ応用を拡大した。4)糖は生体の恒常性維持に不可欠の物質である。

また、植物や細菌の生産する物質に生物活性上興味ある糖が多い。糖類の合成研究を展開するため、更に一般性のある全く異なる発想から新規高選択的グリコシル化反応の開発を行った。生体関連機能物質及び関連するリ-ド化合物に焦点を当て、分子設計と合成及び生物活性評価を通して構造活性相関を明らかにし、創薬の種を発見することにある。平成78年度で得られた研究成果を以下に要約する。1)有機鉛試薬を利用して確立したa-アルキニルケトンの汎用性ある合成法をイソカルバサイグリン類縁体のw-鎖に三重結合を導入した類縁体である13,14-ジデヒドロイソカルバサイクリンの合成を完成させた。この類縁体は興味ある生物活性を示した。2)プロスタサイクリン受容体研究に新たな展開を意図して、アゴニスト活性の低い6-イソカルバサイクリンを光学活性体で合成した。残念なことに、イロプロスト受容体との結合能はイソカルバサイクリンに比して余り高くなかった。3)循環器疾患治療薬の開発に対しては血液凝固の後期段階である腺溶系阻止因子としてトロンボモジュリンの生産増加を促す薬物の創製を目的として9-シスを環で固定したレチノイン酸類縁体を数種合成し、固定環が5員環の高活性新物質を発見した。4)グリコシル化の新しい方法論を確立するための試みとして、ドナーとアクセプターをカルボナ-トとして連結するための合成法がほぼ確立できた。次は各種プロモタ-を用いて脱炭酸によるグリコシル化反応を選択性を含めて検討し、興味ある知見を得た。5)新規グリコシル化反応開発の一環として、1-デヒドロ糖と他の糖の間で形成されるオルトエステルの合成と還元剤による還元的開裂によるグリコシル結合の形成を検討し、特徴的グリコシル化反応を見い出した。6)合成中間体として汎用性の高い多置換シクロヘキサン環の構築を、Ferrier反応の遷移金属塩を用いる触媒的糖変換による実践的合成法として改良した。この変換がほぼ達成され、しかも、グルコースのみならずガラクトースやマンノースへも適用できることが判明した。
大深度地下実験室における中性子束の長期測定及び稀事象探索に与える影響の定量評価

既存の資源を有効利用しながら液体シンチレータ、光電子増倍管、及びデータ収集系からなる中性子束モニターシステムを安価に構築し、水深2700m相当の神岡地下実験室において150日以上に渡る環境中性子束の長期連続測定を遂行した。この測定結果をもとに、同じく神岡地下実験室において稼働中であった暗黒物質の直接探索実験であるXMASS実験の背景事象として中性子が与える影響の詳細な見積もりを、モンテカルロ・シミュレーションを用いて行った。この結果、従来の中性子以外の背景事象の詳細定量に加えて中性子による寄与も考慮することで、暗黒物質信号に対する感度をより高感度化することが可能になった。平成27年度は、液体シンチレータ(BICRON社BC-501A)を新規に購入し、既存のチェンバーを有効利用して中性子検出器を製作した。製作した中性子検出器を用いて、まずは地上において中性子線源からの中性子事象及びガンマ線源からのガンマ事象の測定、環境中性子束の測定を行った。中性子線源としては、Cf-252及びY-88/Be線源を、ガンマ線源としてはCo-60を用いた。中性子により発生したシンチレーション光は、検出器の両側に取り付けた2本の3インチ光電子増倍管でパイレックス窓を通して読みだされトリガーの生成が行われるとともに信号の波形情報が1GHzのフラッシュADC(FADC)にてディスクに記録される。Cf-252からの中性子により反跳を受けた陽子は、運動エネルギーが約1MeVの場合にBC-501A中で約200keVの信号として観測される。現在のところ、FADCによる波形データの取得が順調に行われ、詳細なデータ解析、波形弁別によるガンマ線事象との分離能力の評価等の研究が進められている。一方で、モンテカルロ・シミュレーションによる中性子事象に対する検出器の応答研究も順調に進められている。平成27年度の主目標は、液体シンチレータと光電子増倍管を用いて中性子検出器を製作しデータ収集を行うことと、モンテカルロ・シミュレーションを用いて検出器の中性子応答を詳しく調べることであった。当初の予定通り、中性子検出器の製作が行われ、地上の実験室にて中性子線源及びガンマ線源等を用いた測定が行われた。1GHzの高速フラッシュADC(FADC)での波形情報の取得が行われ、波形情報を用いた中性子事象とガンマ事象との弁別の研究も予定通り順調に進んでいる。また、今後推進してゆく地下実験室での環境中性子束の測定では、フラックスが地上に比べて3桁近く減少することから、検出器中に微量に含まれている天然の放射性不純物からのアルファ線吸収反応や自発核分裂により発生する中性子が主要なバックグラウンド源となることが予想されたため、それらの影響がシミュレーションにより詳細に調べられた。平成28年度は主に以下の研究を行った。(1)中性子検出器の性能評価:中性子検出器に、ガンマ線源であるコバルト60、中性子線源であるカリフォルニウム252、イットリウム/ベリリウムを照射して、検出器の性能評価を行った。中性子検出器は、約1.5リットルの液体シンチレータ(BC-501A)と2本の2インチ光電子増増管(PMT)からなり、2本のPMTからの信号はサンプリングレート1GHzのフラッシュADC(FADC)によって波形情報が記録される。コバルト60によるガンマ線事象と中性子線源による中性子班跳事象が、FADCで取得した波形データからどの程度弁別されるかの研究を行った。(2)モンテカルロシミュレーションを用いた、中性子が暗黒物質探索検出器に与える影響の評価:液体キセノンシンチレータを用いた暗黒物質探索検出器においては光検出器として特別に開発された低バックグラウンド仕様のPMTが用いられる事が多いが、PMT内にわずかに残っている放射性不純物のU/Th系列から出されるアルファ線が(α,n)反応によって生成する中性子の影響の評価が重要となる。そこで、暗黒物質探索検出器としてXMASS検出器を想定し、XMASS検出器で使用されている2インチPMT(HAMAMATSU R10789)内の放射性不純物から生成される中性子の影響を詳細に見積もった。この結果は、日本物理学会第72回年次大会にて報告された。また、宇宙線ミューオン起源の中性子や水シールドの外部を取り巻く岩石中の放射性不純物からのアルファが(α,n)反応を起こして生成される中性子による影響についても詳細な評価を行った。当初の目標である、中性子検出器セットアップを完成させて、検出器の性能評価を行い、環境中性子のフラックス測定を開始することができた。また、シミュレーションによって、さまざまな種類の環境中性子(検出器部材中に含まれる放射性不純物、特にU/Th系列のアルファ線が(α,n)反応によって生成する中性子も含む)が暗黒物質探索実験に及ぼす影響を詳細に評価することができた。特にシミュレーションでは、PMTに含まれる放射性不純物をゲルマニウム検出器、ICP-MS、GDMS等による実測値をもとに(α,n)シミュレータSOURCES-4A (NIM A 595 (2008) 431-438)を用いて発生する中性子のエネルギースペクトラムを各部材ごとに求め、Geant4ベースのシミュレータを用いて求めた中性子のスペクトラムをPMTの各部材の位置から発生させることで暗黒物質探索実験に及ぼす影響を、目標通り評価することができた。平成29年度は、液体シンチレータ検出器を神岡地下実験室に設置し、中性子束の長期測定を行った。

検出器の設置場所は、当該研究代表者も共同研究者になっている中性子測定コンソーシアムが測定を行っている液体シンチレータ検出器群のすぐ横とし、互いに測定結果を比較できるようにした。測定に先立ち、検出器のエネルギースケールをCs-137線源のバックスキャッターピークを用いて電子反跳エネルギー(keVee)に規格化をすることにより求めた。また、Cf-252線源を用いて、波形弁別による中性子/ガンマ事象の分離能を求めた。神岡地下実験室の測定で、700 keVee以上のエネルギー領域において環境中性子によると思われる事象をとらえることに成功し、地上で測定した中性子束の約1/1000という結果を得た。ただし、700 keVeeより下のエネルギー領域では、検出器を構成する部材に含まれるウランやトリウム系列の放射性不純物からのα線が背景事象になることが明らかになった。また、本測定で得られた高速中性子束が、同じ神岡地下で暗黒物質探索実験中のXMASS検出器のバックグラウンドに与える影響をモンテカルロ・シミュレーションで詳細に評価し、その影響は事象率にして1e-5 /day/keVee/kg以下(2-5keVee領域での平均)だとする結論を得た。この結果を取り入れた原子核反跳事象を引き起こす検出器有効体積内での暗黒物質探索の結果が、当該研究代表者によって日本物理学会2017年秋季大会(15aT11-3)及び、カナダのサドバリーで開かれた国際会議Topics in Astroparticle and Underground Physics (TAUP2017)にて発表された。既存の資源を有効利用しながら液体シンチレータ、光電子増倍管、及びデータ収集系からなる中性子束モニターシステムを安価に構築し、水深2700m相当の神岡地下実験室において150日以上に渡る環境中性子束の長期連続測定を遂行した。この測定結果をもとに、同じく神岡地下実験室において稼働中であった暗黒物質の直接探索実験であるXMASS実験の背景事象として中性子が与える影響の詳細な見積もりを、モンテカルロ・シミュレーションを用いて行った。この結果、従来の中性子以外の背景事象の詳細定量に加えて中性子による寄与も考慮することで、暗黒物質信号に対する感度をより高感度化することが可能になった。平成28年度は、中性子検出器を神岡地下実験室(2,700m水深相当)にもってゆき、環境中性子束の連続長期測定システムを確立し、同じ場所で現在稼働中の暗黒物質探索実験(XMASS実験)において暗黒物質の候補信号に占められる中性子事象の割合の定量評価をモンテカルロ・シミュレーションを駆使しながら遂行する。地下では、検出器中の微量放射性不純物の影響が無視できなくなるため、それらの影響の定量や低減の研究も合わせて行う。また、液体シンチレータで測定された環境中性子による陽子の反跳エネルギースペクトルから、もとになる中性子束のエネルギー分布をアンフォールディングにより求める手法の確立や、環境中性子束の季節変動測定も行ってゆく。性能評価が遂行された中性子検出器を用いて、暗黒物質探索が行われている神岡地下実験室にて環境中性子フラックスの連続測定を行う。その際に、水シールドによる中性子フラックスの低減効果についても評価を行う。一方で、シミュレーションを用いて、測定された中性子束の起源の理解と、暗黒物質探索実験に及ぼす影響の評価をさらに高精度に行う。
妊娠母体中に存在する胎児細胞の生理機能の解明

【結果】GFPトランスジェニック雄と交配した妊娠18-20日の雌マウス42匹の組織を解析した。解析に用いた臓器は末梢血、骨髄、胸腺、肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、脳の9臓器で、それぞれを単核球の浮遊細胞としたのちに免疫染色を行った。42匹は9グループに分け、それぞれの各臓器をCD34,CD11b,CD31,CD45,CD44,CD29,CD105,CD150,CD184でシングルカラー免染し、FACSでGFP陽性である胎児細胞における陽性頻度を解析した。最も胎児細胞が多く認められたのは母獣肺組織であり、次いで末梢血、脾臓、肝臓、骨髄に認められた。胸腺や腎臓、脳にはわずかにしか存在しなかった。肺組織に存在している胎児細胞の表面抗原の解析では、10から20%の細胞がCD11b,CD29,CD31,CD44,CD45,CD105に陽性であり、また20%の細胞が血液幹細胞マーカーとされるCD34陽性であった。一方末梢血に存在する胎仔細胞はCD29,CD44,CD45陽性のものが主体であり、多様な細胞が集積している肺と異なり血液系の細胞が選択的に分布していることが示された。これは骨髄で顕著であり、胎児細胞の80%はCD45陽性の血液系細胞であった。脾臓に認められる胎児細胞も同様の傾向を示し、主としてCD11b,CD31,CD44,CD45陽性細胞が多くを占めた。【考察と重要性】胎仔から母体に侵入した胎仔細胞が、単に胎仔から「漏れ出て」いるだけなのか、何らかの目的を持って「移動」しているのかについて、従来まったく知られていなかった。本結果は、母体の肺組織については胎児細胞は多様性を呈しておりランダムな集積を、末梢血や骨髄、脾臓といった組織には胎仔血液系細胞が選択的に集積していることを示している。胎仔から母体内に胎盤を介して移行した胎児細胞はいったん肺というフィルターに補足され、その後分化した細胞はその適切な場に再分布している可能性が初めて示された。
農林産資源から得たリグニンを炭素源とするアルコール醗酵に関する基礎的研究

1.n-ブチルアミンによるリグニン抽出効果稲ワラの脱リグニン化度は1%w/wn-ブチルアミンで121°C, 1hの処理により約60%であった.この処理によりhardwoodも稲ワラも末処理試料に比べてホロセルロースの酵素可溶化率が非常に高まるが,その処理効果は稲ワラに対して特に著しい.処理により遊離したリグニンを連続的に処理系外に取り除くことで,処理効果をより高めることができる. n-ブチルアミン処理の効果は試料への試薬の拡散の難易に依存する.他方,爆砕処理の効果は稲ワラよりもhardwoodに対して効果的である.これはhardwoodが稲ワラよりも多孔性が低いことに依る.2.リグニンの化学的低分子化稲ワラより抽出したリグニンの分子量は大別して数万のものと,約1100のものとであった.1%w/wn-ブチルアミンでは, 121°Cでの処理時間が長くなるにつれて,分解と共に再重合も起こる.他方, 1%w/vカセイソーダでは, 121°Cでの処理時間が長くなるにつれて,約1100の分子量のものが約350の分子量のものへと低分子化する.数万の分子量のものは180°Cで約20分間の処理により約350の分子量のものとなった.しかしながら,上記の処理では更なる低分子化は不可能であった.3.抽出リグニンの微生物的低分子化n-ブチルアミンで抽出し,カセイソーダで低分子化されたリグニンを炭素源としてカワラタケによる低分子化リグニン生産の可能性を検討した.リグニン成分は培養8日目では完全に消費された.逆に低分子(末同定)の生産が確認された.4.抽出リグニンの酵素的低分子化上記の培養に用いたリグニンと同じものをカワラタケの培養濾液を用いて分解を行い,リグニンのカワラタケ細胞外酵素による分解の可能なことが推察された.今後,得られた低分子化リグニンを炭素源として,細菌(Clostridium sp.)を用いた嫌気培養によりアルコールの生産について検討を進める.1.n-ブチルアミンによるリグニン抽出効果稲ワラの脱リグニン化度は1%w/wn-ブチルアミンで121°C, 1hの処理により約60%であった.この処理によりhardwoodも稲ワラも末処理試料に比べてホロセルロースの酵素可溶化率が非常に高まるが,その処理効果は稲ワラに対して特に著しい.処理により遊離したリグニンを連続的に処理系外に取り除くことで,処理効果をより高めることができる. n-ブチルアミン処理の効果は試料への試薬の拡散の難易に依存する.他方,爆砕処理の効果は稲ワラよりもhardwoodに対して効果的である.これはhardwoodが稲ワラよりも多孔性が低いことに依る.2.リグニンの化学的低分子化稲ワラより抽出したリグニンの分子量は大別して数万のものと,約1100のものとであった.1%w/wn-ブチルアミンでは, 121°Cでの処理時間が長くなるにつれて,分解と共に再重合も起こる.他方, 1%w/vカセイソーダでは, 121°Cでの処理時間が長くなるにつれて,約1100の分子量のものが約350の分子量のものへと低分子化する.数万の分子量のものは180°Cで約20分間の処理により約350の分子量のものとなった.しかしながら,上記の処理では更なる低分子化は不可能であった.3.抽出リグニンの微生物的低分子化n-ブチルアミンで抽出し,カセイソーダで低分子化されたリグニンを炭素源としてカワラタケによる低分子化リグニン生産の可能性を検討した.リグニン成分は培養8日目では完全に消費された.逆に低分子(末同定)の生産が確認された.4.抽出リグニンの酵素的低分子化上記の培養に用いたリグニンと同じものをカワラタケの培養濾液を用いて分解を行い,リグニンのカワラタケ細胞外酵素による分解の可能なことが推察された.今後,得られた低分子化リグニンを炭素源として,細菌(Clostridium sp.)を用いた嫌気培養によりアルコールの生産について検討を進める.
Alzheimer病の病態発現におけるAstrocytesの病態生理学的役割の解析

Alzheimer病の病態発現における起因物質の同定を行ない、かつアストログリアの本疾患における病態生理学的意義を検討するための研究を行なった。1)Alzheimer病の起因物質を同定するために、まず無血清条件下で神経細胞の初代倍養を行なった。これらの神経細胞においても、血清使用の条件下と同様に、GABA代謝系、GABA_A及びベンゾジアゼピン受容体数が細胞の発育に伴い増大し、またこれらの両受容体が機能的に共軛していること、同様な現象はβ受容体とこれと共軛するcyclic AMP生成系及びムスカリン受容体とこれに共軛するcyclic AMP生成抑制系、あるいはイノシト-ルリン脂質代謝系においても認められることを確認した。2)アストログリアに関しても、無血清条件下で初代培養を行ない得ることを確認した。3)初代培養神経細胞において、Alzheimeス病患者脳からの粗抽出物は、DNA、RNAおよび蛋白合成能、GABAおよびアセチルコリン合成酵素活性、コリン取り込み能、GABA受容体に何らの変化を与えなかった。4)アストログリアに同様の抽出物を添加して検討したところ、DNA合成能のみが著明に低下し、RNAおよび蛋白合成能、諸種の酵素活性、GABA取り込み能などには変化が認められなかった。以上の結果から、Alzheimer病患者脳粗抽出物中には、アストログリアのDNA合成阻害物質が存在するものと考えられ、今後この阻害物質の精製および同定を行うとともに、精製阻害物質の生理的役割についてより詳細に検討を行う予定にしている。
マルチモーダル非侵襲脳機能測定を用いた鍼灸鎮痛機構の解明

本研究の目的は、磁気共鳴法によるマルチモーダル非侵襲脳機能計測を用いて、鍼治療効果の個人差に関連する定常的脳活動を解析することである。鍼治療による鎮痛効果には個人差があることが知られており、個人差の要因を明らかにすることは鍼治療の臨床効果を高める上で、非常に重要な課題である。本年度は、昨年度報告した有毛部への触覚刺激に伴う脳活動の個人差に関連する感覚感受性を調べるためアンケートを実施した。また、腰痛症状を感じる被験者の例数追加を行った。さらに、鍼刺激の刺激特性を調べるため、健常被験者に対して皮下に刺入した鍼を撚ることで刺激を加える手技(撚鍼)に伴う経時的な脳活動変化を従来よりも時間分解能を高めて測定を行った。その結果、15秒間の撚鍼に伴う脳活動は、同じく15秒間手掌部をスポンジによる擦過刺激が刺激中のみ脳活動の上昇が観察されたのに比べ、刺激中の他に刺激終了後にも脳活動の上昇が観察される領域が確認された。本研究の目的は、磁気共鳴法によるマルチモーダ非侵襲脳機能計測を用いて、鍼治療効果の個人差に関連する定常的脳活動を解析することである。本年度は、健常被験者を対象として、撮像シーケンスの調整および鍼刺激前後の安静時脳活動変化の経時変化の検証を行った。鍼刺激前後の安静時脳活動の変化を調べるために健康成人13名に対して、鍼刺激前後のresting state(rs)-fMRIの測定を実施した。その結果、鍼刺激前後のrs-fMRIを独立成分分析方(ICA)を行った後、dual regression解析を行った処、複数の安静時脳活動ネットワークRSNの中でデフォルトモードネットワーク(DMN)のみで鍼刺激前後に有意な変化が認められた。今年度はヒトを対象として、rs-fMRIの方法論に関する予備的実験が終了した。鍼刺激前後での安静時脳活動の変化を捉えることができ、安静時脳活動に関する解析方法の方策がたった。腰痛症状をもった被験者の例数が不足しているため、平成28年度も例数の追加を行っていく。本年度は、昨年度に引き続き腰痛症状をもった被験者の安静時脳活動のデータを収集すると共に、臨床用MRI装置で脳内代謝物を計測するMRSの撮像シーケンスの調整および解析環境の構築を行った。脳内代謝物として観測されるクレアチンやN-アスパラギン酸、神経伝達物質であるグルタミン酸の良好なピークが生体脳の組成と類似したファントムや健常者の脳で観測した。また、抑制性の神経伝達物質であるGABAの信号波形を分離観測できることを確認した。腰痛症状をもった被験者の例数が不足しているため、平成29年度も継続して例数の追加を行っていく。本研究の目的は、磁気共鳴法によるマルチモーダ非侵襲脳機能計測を用いて、鍼治療効果の個人差に関連する定常的脳活動を解明することである。本年度は鍼刺激が誘起する触覚や痛覚などの体性感覚に伴うfMRI測定時に観察される一次体性感覚野の脳活動について、個人差が生じる有毛部への擦過刺激のfMRIについて検討を行った。健常被験者13名に対して、人差し指と親指の間の手掌部と手背部に対するスポンジ擦過刺激に伴うfMRI測定を行ったところ、手掌部は13人全員で一次体性感覚野をはじめとする体性感覚野に賦活が観察されたが、手背部は8人に体性感覚野の賦活が観察された。また、手背部については、同一被験者に対して擦過刺激の刺激強度を高めるため、より硬い緩衝材による擦過刺激も行ったが、体性感覚野の脳賦活が観察されたのは13人中5例であり、手背部のスポンジ擦過で賦活が見られなかった人では観察されなかった。この結果より、有毛部への体性感覚刺激は刺激に伴う脳活動の個人差を観察できると考えられる。

その結果、15秒間の撚鍼に伴う脳活動は、同じく15秒間手掌部をスポンジによる擦過刺激が刺激中のみ脳活動の上昇が観察されたのに比べ、刺激中の他に刺激終了後にも脳活動の上昇が観察される領域が確認された。不足している腰痛症状を持った被験者の例数追加を行いつつ、今後も当初の計画に沿って研究を推進する。また来年度は研究成果の論文化を進めていく。また研究成果の論文化を進めていく。当初計画していた国際学会での成果発表を事情により取り消し、次年度に成果発表を海外で行うこととした。また、条件を満たす被験者を十分に確保できず、被験者数が予定数を下回った。条件に合致した被験者が集まらず、被験者や協力者への謝金支出が発生しなかった。条件に合致する被験者を対象としてfMRI実験を行うための被験者謝金に必要な経費として使用する予定である。1)昨年度予定していた海外での成果発表及び情報収集を行う。2)条件に合致する被験者を対象としてfMRI実験を行うための被験者謝金に必要な経費として、1)、2)共に平成28年度請求額と合わせて使用する予定である。条件に合致する被験者を対象としてfMRI実験を行うための被験者謝金に必要な経費として、平成29年度請求額と合わせて使用する予定である。
老化促進モデルマウスを用いた機械的刺激の骨量増加作用の機序についての実験的研究

機械的刺激がどのように骨量を増加させるのかをin vitroとin vivoの両方の系を用いて実験を行った。平成9年度はMC3T3-E1細胞と呼ばれるマウス骨芽細胞様細胞を用いてin vitroの系を中心に実験を行い、機械的刺激がプロスタグランジン合成酵素-2(COX-2)、オステオポンチン、c-fos mRNAの発現量を増加させること、インドメタシンを添加するとCOX-2、オステオポンチンmRNAの発現量が抑制されること、老化促進マウスSAM-P/6や正常マウスSAM-R/1由来の骨芽細胞でも同様な所見が認められるが、SAM-R/1由来の骨芽細胞でその発現量は大きいことを確認した。平成10、11年度において老化促進マウスSAM-P/6や正常マウスSAM-R/1の右脛骨に4点曲げによる機械的刺激を加え、左右の脛骨を採取し、骨幹部横断面の硬組織標本を作製した。骨形態計測の手法を用いて脛骨骨内臓面における骨形成率を測定したが、有意な差は認められなかった。また老化促進マウスSAM-P/6や正常マウスSAM-R/1由来の骨芽細胞を用いて、機械的刺激によってSAM-R/1で発現され、SAM-P/6で発現されない遺伝子の存在を検索したが、このような遺伝子の存在をまだ確認し得ていない。SAM-P/6とSAM-R/1の骨強度を比較し、SAM-P/6の骨強度が低下していることを確認後、同様な実験を今後も行っていく予定である。1マウス骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)を用いた実験により以下の知見を得た。1) 2週間以上の培養によりプロスタグランディン合成酵素ー2(COX-2)mRNAの発現量が増加したが、これはアスコルビン酸とβ-グリセロリン酸の添加によって増強された。2)機械的刺激はCOX-2、オステオポンチン、c-fos mRNAの発現量を大幅に増加させた。3)インドメタシン添加によって機械的刺激によるCOX-2およびオステオポンチンmRNAの発現が抑制された。以上によりプロスタグランディンが機械的刺激の伝達、作用発現に重要な役割を果たしていることが示唆された。現在さらにインドメタシン添加によってMC3T3-E1の石灰化が抑制されないか、老化促進マウスSAM-P/6と正常マウスSAM-R/1由来の骨芽細胞でも長期培養や機械的刺激によりCOX-2 mRNAの発現量が増加するか実験中である。2 12週齢のSAM-P/6とSAM-R/1の右脛骨に4点曲げによる機械的刺激を加えた後に、左右の脛骨を採取しプラスチックに包埋した。現在硬組織標本を作製中である。骨形態計測の手法を用いて、骨幹部横断面の標本作製後に骨内膜面における骨形成率を測定する予定である。12週齢のSAM-P/6とSAM-R/1の右脛骨に4点助けによる機械的刺激を加え、左右の脛骨を採取し、骨幹部横断面の硬組織標本を作製した。骨形態計測の手法を用いて脛骨骨内膜面における骨形成率を測定したが、コントロールである左脛骨の骨形成率のばらつきが大きく有意差が得られなかった。現在、週齢を変えて再実験を計画中である。2日齢のSAM-P/6とSAM-R/lの頭頂骨から骨芽細胞を分離し、培養液中でプラスチックに付着、増殖させ、confluentに達した後にプラスチックを4点曲げで弯曲させることによって細胞に機械的刺激を加えた。どちらの細胞も機械的刺激によってCOX-2mRNAの発現量を増加させたが、正常マウスSAM-R/1由来の骨芽細胞での発現量が老化促進マウスSAM-P/6由来の骨芽細胞での発現量よりも大きかった。蛋白レベルでも同様な結果が得られるか検討中である。

4点曲げによる機械的刺激によってSAM-R/lで発現され、かつSAM-P/6では発現されない遺伝子が存在しないかDifferential Displayの手法を用いて検討中であるが、現在のところポジティブな結果は得られていない。24週齢のSAM-P/6とSAM-R/1の右脛骨に4点曲げによる機械的刺激を加え、左右の脛骨を採取し、骨幹部横断面の硬組織標本を作製した。骨形態計測の手法を用いて、脛骨骨内膜面における相対的骨形成率(右脛骨の骨形成率-左の値)を測定したところ、SAM-P/6とSAM-R/1の両方で骨形成率の増加を認めたが、SAM-P/6よりもSAM-R/1で増加の度合いが大きかった。2日齢のSAM-P/6とSAM-R/1の頭頂骨から骨芽細胞を分離し、培養液中でプラスチックに付着、増殖させ、confluentに達した後にプラスチックを4点曲げで弯曲させることによって細胞に機械的刺激を加えた。4点曲げによる機械的刺激によってSAM-R/1で発現され、かつSAM-P/6では発現されない遺伝子が存在しないかDifferential Displayの手法を用いて検討したが、このような遺伝子を確認することができなかった。(3)まとめin vivoでの実験結果は、SAM-R/1はSAM-P/6よりも機械的刺激に反応しやすいことを示唆している。これがどのような理由によるのか現在のところ不明であるが、老化促進マウスでは遺伝子のレベルで問題が生じている可能性が大きいと考えている。上記(2)と同様な実験をさらに行い、この点を解明したいと考えている。
EGFR遺伝子変異検査方法の精度向上を図り肺癌の個別化治療を樹立する

mixed-type肺腺癌の病理亜型に従ってマイクロダイセクションを行い、病理亜型毎にEGFR遺伝子の変異解析を行った。その結果、EGFR遺伝子変異陽性症例38例中9例に組織亜型に沿って遺伝子変異のheterogeneityが指摘できた。Heterogeneityの認められた症例は喫煙歴との相関が高かった。同一症例におけるEGFR-TKIに対する治療効果の病変毎のばらつきの理由が示されたと考える。平成22年度において、上皮増殖因子受容体の遺伝子変異多型を有している可能性が高い症例群を絞り込み、解析対象を明らかにした。具体的には、長崎大学病院で根治切除を受けた病理病期IA期またはIB期の症例の中で、予後比較可能なmixed type adenocarcinomaの症例を確定する作業を行った。2002年から2005年までの間で、長崎大学病院で根治切除術を受げた病理病期IA期またはIB期の肺癌患者は241名だった。このうち、181名がadenocarcinomaであった。181名中、lobectomyを受けた症例は145名であった。この145名を対象として、病理医とともにこのadenocarcinomaがmixed typeか否かの判定を行ったところ、54名がmixed type adenocarcinomaであったが、さらにその54名中10名が高齢やじん肺、同一肺葉内多発肺腺癌など予後比較に影響を与える因子を持っていたために解析対象から除外しだ。その結果、44名が解析対象に決定した。この44名の切除検体を病理医とともに詳しく解析し、papillary、acinar、BACの各サブタイプごとに分布領域の境界を決定した。現在、これらの検体をマイクロダイセクション用に薄切しでいる最中である。来年度以降ほごの薄切標本にマイクロダイセクションを行い、各サブタイプ別にDNAを抽出してDNA解析を行う予定である。平成22年度において、上皮増殖因子受容体(EGFR)の遺伝子変異多型を有している可能性が高い症例群を絞り込み、解析対象を明らかにした。2002年から2005年までの間で、長崎大学病院で根治切除術を受けた病理病期IA期またはIB期の肺癌患者は241名だった。この145名を対象として、病理医とともにこのadenocarcinomaがmixed typeか否かの判定を行ったところ、54名がmixed type adenocarcinomaであったが、さらにその54名中10名が高齢やじん肺、同一肺葉内多発肺腺癌など予後比較に影響を与える因子を持っていたために解析対象から除外した。この44名の検体をmicro-dissectionを用いて病理亜型別に切除分離し、その各々からDNAの抽出をおこなった。その結果、38名から十分量のDNAを抽出できたため遺伝子変異の解析を行った。38名中19名にEGFRの感受性遺伝子変異を認めた。さらに19名中9名に、同一腫瘍内での遺伝子変異の分布に不均等を認めた。これら不均等のある症例とない症例について、背景因子を多変量解析した結果、喫煙歴について有為な相関が認められた。長崎大学病院で2002年から2005年に手術が施行された病理病期がstageIA,IBの原発性肺癌241例を対象とした。そのうち肺腺癌は181例であった。その中で肺葉切除の対象となった145例の病理型を検討した結果、54例が組織学的な多型を有する混合型腺癌(mixed type adenocarcinoma)と診断された。54例中10例を、85歳以上、アスベストーシス合併、未分化領域が存在するなどの理由で除外した。44例を対象として解析を行ったが、44例中6例から十分量のDNAを抽出することができなかったために、最終的に38例を解析対象とした。38例に関して、パラフィン包埋標本で異なる病理亜型(BAC, Papillary, Acinar)が存在する部位を顕微鏡的に確認し、その部位に沿ってマイクロダイセクションを行った。病理亜型毎の検体より別々にDNAを抽出し、EGF受容体遺伝子変異解析を行った。38例中19例にEGF受容体遺伝子変異を認めた。遺伝子変異の検出について患者背景別に関連解析を行ったが、年齢、性別、病期、喫煙歴で相関のあるものは認めなかった。次に、腫瘍内におけるEGF受容体遺伝子変異のheterogeneityについて解析を行った。その結果、9例において腫瘍内におけるEGF受容体遺伝子変異の体遺伝子のheterogeneityが見つかった。

遺伝子変異はPapillaryやAcinarと比較してBACにやや多く認められたが、統計学的な有意差は無かった。一方で腫瘍内のheterogeneityは喫煙歴を有する症例に有意に多く認められた(P=0.043)。Progression-freesurvival, Overall survivalとEGF遺伝子変異陽性および変異のheterogeneityとの統計学的な相関は認めなかった。現在、解析作業は終了し、論文化して専門誌に投稿中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、専門誌への掲載をめざしている。査読者より追加実験を指示された場合は、それに従って追加実験に取り組む。
ダイレクトシミュレーション法による表面波を伴う凝縮液膜流の解析

表面波を伴いながら壁面を流下する凝縮液膜流においては、表面波によって熱伝達が促進されることが多くの実験的研究から良く知られている。表面波を伴わない層流液膜の場合はNusseltの理論により流動および熱伝達がほぼ正確に説明できる。しかし、表面波が発生した場合については、表面波の挙動が非線型的であること、液膜の厚さが1mm以下と非常に薄いために流れ場や温度場の測定が非常に困難であることなどの理由から、波の発生から成長のメカニズム、また波による液膜内の流れへの影響や熱伝達促進のメカニズムなどは解析的にも実験的にも解明できないままである。数値計算を用いて液膜流表面波の挙動と液膜内の流れ場を解析しようとする研究はいくつかあるが、気液界面条件の取扱い方法に関しては十分な検討がなされていない。また、温度場の解析や熱伝達特性の検討を行った研究は報告されていない。本研究では、物理空間に固定した計算格子上で基礎式および境界条件を離散化して計算を行う場合に関して、気液界面条件の新しい計算スキームを提案し、その妥当性を検討するとともに、他の研究者によって測定された結果との比較を行い、定性的にも定量的にも良く一致することを示した。また、計算結果から以下のことを明らかにした。表面波は、擾乱周波数が小さい場合にはロールウェーブとキャピラリーウェーブからなる構造の波に成長し、ロールウェーブ中には大きな循環流が発生する。擾乱周波数が小さい場合には隣接した波の相互干渉により、波形が複雑に変形し、キャピラリーウェーブは観察されない。液膜内の温度場は、液膜厚さの変動と液膜内の対流の影響で歪み、層流液膜とは異なった特性を示す。また、その影響はプラントル数が大きい場合に大きくなる。表面波による熱伝達促進には液膜厚さの変動と対流の両方の効果が影響しており、いずれが支配的であるかはプラントル数の値に依存する。
バルク高温超電導体レンズ(ス-パ-トロン)の動作機構解明

バルク高温超電導体の応用として、ス-パ-トロン(バルク高温超伝導体レンズ)を4年前に提案して以来、その実証と動物機構の解明に努めてきた。本研究では、ビスマス系とタリウム系超伝導体のテ-パ-付き円箇レンズを試作して、その電子ビ-ム集束性能を実験的に調べた。更に、その結果を性能指数によって評価した。使用した電子ビ-ムは340keV,1KA,10nsの相対論的電子ビ-ムである。(1)電子ビ-ムの集束性能は臨界温度の高い材料ほど高い値を示した。即ち、ビスマス系(臨界温度120K)が最高性能を示し、ついでビスマス系(115K)、イットリウム系(92K)の順であった。(2)上記の結果の得られた理由は、レンズの動作温度(液体窒素で冷却、85ー90K)に対して超伝導となる温度マ-ジンの大きい材料が、より高い臨界遮蔽電流値を有するものと思われる。(3)タリウム系材料は有毒であるので、総合的に考えてビスマス系が最も適した材料であろう。(4)本研究では粉体をプレスしたバルク材を使用している。最近、新しい材料(例えば、急冷溶融法によるQMG材料)が開発されているので、それらも今後検討する予定である。(5)ス-パ-トロンの動作は、ダスト・コア(フェライトなど)と同様に、微粒子内の遮蔽電流が有効であろうと我々は考えている。上記(4)の実験をすることによって、本モデルの妥当性が明らかになると期待している。
不飽和土の保水・透水特性および蒸発特性に関する室内土質試験法の提案と数値モデル化

研究代表者は,降雨時および降雨後の表層すべり型崩壊に対する斜面安定度評価システムの確立に取り組み,斜面内の不飽和浸透挙動に着目した現地斜面計測や数値解析(不飽和浸透解析+斜面安定解析)などに取り組んできた。その中で,不飽和土の保水・透水特性,蒸発特性などを把握することが重要であることから,本研究課題では,不飽和土の水分特性曲線・不飽和透水係数・蒸発効率を同一供試体から得ることのできる室内土質試験法の提案,含水比,土の密度,粒径加積曲線から不飽和土の水分特性曲線・不飽和透水係数・蒸発効率を推定するための概念モデルの改良とその妥当性評価に取り組む。
パプア諸語の記録言語学的研究―三地域の諸言語の直示表現を中心に―

シンブー州、ブーゲンビル自治州、サンダウン州の三地域のパプア諸語の多様な資料を対象に、オーストラリアの記録言語学・パプア諸語の記述研究を専門とする研究者たちの協力のもと、テキストコーパスを構築し、それらのテキストに見られる統語・談話レベルの文法現象の記述と対照言語学的分析を進める。直示表現の面で共通点と相違点をもつパプア諸語の直示表現の振る舞いに着目して研究を進める。データを共同で編集・分析し、アーカイブに長期保存する。
下垂体前葉細胞内ホルモン遺伝子転写調節因子の組織化学的検索

各遺伝子にはDNA上に特異的塩基配列をからなる転写調節エレメントとそれと特異的に結合する蛋白性の転写調節因子がある。遺伝子の活性化あるい不活性化には両者間で安定した複合体を形成する事が必須であると考えられている。我々はこの調節エレメントと調節因子間の特異的結合反応を利用して、調節因子の組織内局在を証明するの組織化学的検出法(Southwestern Histochemistry,SWH)を開発した。多くの下垂体前葉ホルモンの調節エレメントと調節因子は既に同定されていて、成長ホルモン(GH)遺伝子の上流の調節エレメント(GHE-1)とDNA結合蛋白(Pit-1/GHF-1)が結合するとGH遺伝子の転写が活性化されるが、調節エレメント(PRE)とDNA結合蛋白が結合する(PREBP)と転写を不活性化される。また乳腺刺激ホルモン(PRL)遺伝子では、調節エレメント(P-1)とDNA結合蛋白(Pit-1/GHF-1)が結合するとその転写が活性化されることが知られている。そこで、Biotin-チミン2量体標識-GHE-1、Biotin-チミン2量体標識-mutated GHE-1、Dig-チミン2量体標識-PREとDig-チミン2量体標識-mutated PREを使用して、SWHを施行した。これらに免疫組織化学的に、GHあるいはPRLの分布を二重染色法により同定したところ、ラット下垂体前葉及びGH3細胞においては、GH細胞ではPit-1/GHF-1は陽性でPREBPは陰性であり、PRL細胞はPit-1/GHF-1及びPREBPが共に陽性であった。mutated GHE-1及びmutated PREは何れの細胞とも反応しなかった。GH細胞とPRL細胞が単一の幹細胞から機能的に分化をするには、GH細胞には陽性でPRL細胞では陰性の少なくとももう一系のDNA調節エレメントと調節因子の存在が必要であるとの結論に達した。これらの結果は下垂体細胞の機能的分化機構の解明に新しい視野を与える。遺伝子の活性化あるい不活性化にはDNA調節エレメントと蛋白質性の転写調節因子間で安定した複合体を形成する事がDNAレベルでは必須な反応であると考えられている。我々はこの調節因子の局在を証明する組織化学的検出法(South-Western Histochemistry,SWH)を開発した。この方法を利用して、成長ホルモン(GH)遺伝子転写を活性化する調節因子(Pit-1/GHF-1)とそれが結合する調節エレメント(GHE-1)、不活性化する調節因子(PREBP)とそれが結合する調節エレメント(PRE)の四者が既に解明されているGH遺伝子系を利用して、ホルモン遺伝子転写調節因子の細胞ならびに組織内分布を同定する。GHE-1,mutated GHE-1,PRE,mutated PREのプラス鎖4種とこれらに相補的な塩基配列をもつマイナス鎖4種、計8種のオリゴヌクレオチドの合成が終了した。各々、相補的なプラス鎖とマイナス鎖を混合して2本鎖オリゴヌクレオチドを形成させプローブとした。それらのプローブの特異性の同定している。これには下垂体細胞の核から抽出した蛋白を電気泳動して、フィルターに転写して合成プローブと結合させ、抗T-Tダイマー抗体を利用した酵素抗体法を施行している。これらプローブの検出および定量には今回、購入したジーンクホントが使用されている。すべての組み合わせは完了していないが、現在のところ予想と矛盾する結果は出ていない。

組織レベルのSOUTH-WESTERN法の手法はほぼ確立されたので、上記の一部の合成プローブ(特に対象プローブ)と下垂体前葉組織との非特異的結合の有無を確認しつつある。また、細胞培養の設備がほぼ完成したので、下垂体前葉ガン細胞の培養を開始した。遺伝子の活性化あるいは不活性化にはDNA調節エレメントと蛋白質性の転写調節因子間で安定した複合体を形成する事が必須であると考えられている。成長ホルモン(GH)遺伝子は、その転写を活性化するDNA結合蛋白(Pit-1/GHF-1)とそれが結合する調節エレメント(GHE-1)、その転写を不活性化するDNA結合蛋白(PREBP)とそれが結合する調節エレメント(PRE)が既に解明されている。また乳腺刺激ホルモン(PRL)遺伝子では、その転写を活性化するDNA結合蛋白(Pit-1/GHF-1)とそれが結合する調節エレメント(P-1)が知られている。そこで、Biotin-チミン2量体標識-GHE-1、Biotin-チミン2量体標識-mutated GHE-1、Dig-チミン2量体標識-PREとDig-チミン2量体標識-mutated PREを使用して、我々により開発されたSouthwestern Histochemistryを施行した。これらに免疫組織化学的に、GHあるいはPRLの分布を二重染色法により同定したところ、ラット下垂体前葉及びGH3細胞においては、GH細胞ではPit-1/GHF-1は陽性でPREBPは陰性であり、PRL細胞はPit-1/GHF-1及びPREBPが共に陽性であった。mutated GHE-1及びmutated PREは何れの細胞とも反応しなかった。GH細胞とPRL細胞が単一の幹細胞から機能的に分化をするには、GH細胞には陽性でPRL細胞では陰性の少なくとももう一系のDNA結合蛋白とそれが結合する調節エレメントの存在が必須であるとの結論に達した。
ヒト固形癌の休眠型癌幹細胞とそのニッチ特性の解明

プロテアソーム非依存性の蛍光標識によってヒト癌幹細胞を可視化し、特異的阻害剤の同定により抗癌剤との併用効果を証明し(Gastroenterology 2012)、転移ニッチ形成における特異的マクロファージ集簇の意義を解明した(Hepatology 2013)。さらに同システムのトランスジェニックマウスの作成により発癌メカニズムの解明を進めている。また癌幹細胞の細胞周期静止期にある生物学的特徴を明らかにするため、生体イメージングによる癌幹細胞可視化を行い、G0G1期とG2M期を分けて可視化した。特にG0G1期は治療抵抗性、G2M期は転移浸潤と深く関係することを見出し、革新的医療の基盤を構築した。本計画研究では、癌幹細胞の「休眠」という特殊な機能に焦点を当てin vitro,in vivoにおける特徴を明らかにし、休眠型癌幹細胞とそのニッチ特性に特化したピンポイント治療法の開発を目指して研究を実施した。田中は、休眠機能の指標としてプロテアソーム活性低下を可視化するシステムを構築し、ヒト膵癌細胞に導入した。その結果、数‰に可視化癌幹細胞を認め、非対称性分裂、スフェア形成能、抗癌剤耐性、高腫瘍形成能を示すことを明らかとした。可視化癌幹細胞を用いたマウス膵腫瘍を作成し、腫瘍組織における局在を解析するともに、DNA microarray;gene set enrichment analysisにより特異的遺伝子機能セット、パスウェイの同定を進めている。森は、消化器癌幹細胞の細胞表面マーカーを網羅的に解析し、細胞周期静正期と細胞周期回転期にある細胞を峻別する標識解析した。細胞周期静止期にある細胞は特に活性酸素が低い局所で生存し治療抵抗性の根源である事を明らかにした。さらにその局所で生存する細胞周期静止期にある細胞から他臓器転移現象に関わる分子機構を探索した。この転移機構は固形癌医療のボトムネックであり患者の生存に最も強く相関し重要である。静止期癌幹細胞を特徴付ける分子が活性酸素制御に関わるとともに上皮間質形質転換の制御と悪性細胞の生存に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在、試験管内のコロニー形成能とともに小動物実験により静止期癌幹細胞から転移スイッチの入力に至る機構の解析を進めている。本計画研究では、癌幹細胞の「休眠」という機能に焦点を当てin vitro,in vivoにおける特徴を明らかにし、休眠型癌幹細胞およびニッチ特性を標的とした治療法開発を目指している。田申は、休眠機能の指標としてプロテアソーム活性低下を可視化するシステムを構築し、ヒト膵癌細胞に導入した。その結果、合成致死スクリーニング法により可視化癌幹細胞のみを攻撃する新規分子標的剤を同定し、マウス腫瘍モデルで治療効果を確認した。さらに、この可視化システムを導入したトランスジェニックマウスを作成して、生体内における幹細胞動態の解析を進めている。森は、細胞周期を2色の蛍光プローブ(G1期-赤、S/G2/M期-緑)でリアルタイムに可視化するFucci(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)をヒト大腸癌細胞に導入した。皮下腫瘍を二光子顕微鏡によって観察した結果、G1期-赤(n=310)とS/G2/M期-緑(n=450)の可動性が異なること、後者が有意に速いことを見出した。Imaging guidedFuccimicroarrayによって、S/G2/M期で高発現しRho-GAPでドメインを有する分子celmobilinを抽出した。celmobilinノックダウン株の皮下腫瘍は、細胞の可動速度が有意に低下した。大腸癌切除標本では、celmobilinが癌部で高発現し、癌深達度、無再発生存期間の低下と有意に相関した。本研究では、DNA合成期と細胞可動性を指標としてcelmobilinの同定と機能解析及び臨床病理学的検討を行ない、がん細胞の細胞可動性をターゲットとした次世代分子標的薬の開発・臨床応用へ発展させる基盤を構築した。来年度以降の細胞周期静止期の研究へと展開する。本課題では、幹細胞のプロテアソーム非依存性(田中)と細胞周期特性(森・石井)の二つのアプローチに基づいて癌幹細胞を可視化し、生体内の動態解明と創薬展開を図るのが目的である。平成25年度研究実績として、田中は幹細胞可視化トランスジェニックマウス(Degronマウス)を作成し、膵特異的転写因子Pdx-1を用いた遺伝子改変マウスによる膵再生と前癌病変の解析を進めた。Pdx-1-Cre:LSL-KrasG12DとDegronマウスの掛け合わせによって作成したPdx-1-Cre:LSL-KrasG12D:Degronマウスでは、急性膵炎後の膵再生から膵癌前駆病変PanINが生じ、幹細胞特性が劇的に変化することを見出した。

膵組織マイクロアレイ解析および蛋白解析によって新たな分子標的候補群を同定しており、平成26年度の研究課題として強力に推進している。また森・石井は、細胞周期静止期にある癌幹細胞を同定する目的で、癌の生体イメージングによる新規治療標的の探索を実施した。細胞周期を時期別に色分けして、細胞周期静止期とともにDNA合成期を峻別し、本年度はクラスター解析が比較的順調に進捗したDNA合成期と細胞可動性について検討したので、来年度以降の細胞周期静止期の研究に展開した。細胞周期を2色の蛍光プローブ(G1期-赤、S/G2/M期-緑)でリアルタイムに可視化するFucciをヒト大腸癌細胞株(HCT116)に遺伝子導入し、臨床的に重要な課題である難治性消化器癌の癌幹細胞における細胞周期静止期に分子機構を解明した。G0期の細胞の運命決定はそれより以前のG2M期又はS期のリン酸化シグナルに依存しておりインターフェロンを例としてその詳細を明らかにした。さらに代謝プロファイリングの結果G0期制御は酸化的リン酸化に際立った特徴があることを見出し平成26年に向けて継続的に研究事業を進めている。本課題では、幹細胞のプロテアソーム非依存性(田中)と細胞周期特性(森・石井)の二つのアプローチに基づいて癌幹細胞を可視化し、生体内の動態解明と創薬展開を図るのが目的である。田中は本研究課題によって作成した幹細胞性可視化トランスジェニックマウスを用いて膵発癌メカニズムを解析した。その結果、acinar to ductal metaplasia (ADM)によって一過性に幹細胞性が変化し、かつKRASシグナルが一時的に亢進することを見出した。次に膵特異的KRAS変異マウスPdx-1-Cre:LSL-KrasG12Dと掛け合わせて解析を進めた。KRAS変異マウスではADMによる幹細胞性変化が持続することを見出し、KRASシグナル、Cyclin D1、NF-kBなどが持続的に亢進した結果膵癌前駆病変を生じることを明らかにした。以上により膵発癌における幹細胞性変化とKRASシグナルの重要性を明確にし、その持続性が発癌を惹起するという新規メカニズムを解明した。また森・石井は、癌幹細胞の細胞周期静止期にある生物学的特徴を明らかにする目的で、生体イメージングによる癌幹細胞可視化を行った。細胞周期をG1期-赤、S/G2/M期-緑でリアルタイムに可視化できるFucci(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)をヒト消化器癌幹細胞に導入して解析を行った。その結果G1期ではRFPL4Aをはじめ複数の分子が重要であることを明らかにした。またS/G2/M期の制御に関しては、IFNAR2遺伝子をはじめ複数の遺伝子が重要であることを明らかにした。以上により難治性消化器癌の癌幹細胞の根源である分子機構を解明した。固形癌における癌幹細胞の動態や局在について不明な部分が多く、生体内における幹細胞性の維持機構やニッチ微小環境の研究に大きな妨げとなっている。