hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
界面に沿っての包接水和物成長を考慮した包接水和物連続製造装置の性能予測法の試み

HFC-32/水界面上およびHFC-134a/水界面上を成長するHFC-32水和物結晶およびHFC-134a水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度を実験的に測定した.HFC-32水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は,その核生成直後から減速し,数秒後に約5mm/sに漸近することを明らかにした(圧力P=617kPa,サブクール度ΔT=10.9K:ΔT=該当圧力における水和物生成温度-バルク温度).一方,HFC-134a水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は約0.4mm/sに漸近する様に減速することを明らかにした(P=246kPa,ΔT=6.0K).また,上述のHFC-32水和物結晶に関する実験結果と本研究で作成したクラスレート水和物結晶(包接水和物結晶)の物理モデル(熱移動モデル)の計算結果とを比較・検討した結果,成長中のHFC-32水和物結晶の厚さは1μm程度であることが明らかになった(P=617kPa,ΔT=10.9K).他研究者(Ho et al.(2002) Proc.4th Int.Conf.Gas Hydrate, 2,850-855)によるHFC-32水和物結晶の厚さの測定結果によると生成数時間後に110μmになることから(P=617kPa,ΔT=8.8K), HFC-32水和物結晶の厚さ方向への見かけの成長速度は10^<-2>μm/s程度であると考えられ,界面方向への速度(5mm/s)に比べて著しく遅いことが明らかになった.上記に加え,本研究の知見を基にした「クラスレート水和物連続生成装置の性能予測法の開発」を行う際の検討対象として,既知の界面面積を持つクラスレート水和物連続装置の設計・開発を行った.HFC-32/水界面上およびHFC-134a/水界面上を成長するHFC-32水和物結晶およびHFC-134a水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度を実験的に測定した.HFC-32水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は,その核生成直後から減速し,数秒後に約5mm/sに漸近することを明らかにした(圧力P=617kPa,サブクール度ΔT=10.9K:ΔT=該当圧力における水和物生成温度-バルク温度).一方,HFC-134a水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は約0.4mm/sに漸近する様に減速することを明らかにした(P=246kPa,ΔT=6.0K).また,上述のHFC-32水和物結晶に関する実験結果と本研究で作成したクラスレート水和物結晶(包接水和物結晶)の物理モデル(熱移動モデル)の計算結果とを比較・検討した結果,成長中のHFC-32水和物結晶の厚さは1μm程度であることが明らかになった(P=617kPa,ΔT=10.9K).他研究者(Ho et al.(2002) Proc.4th Int.Conf.Gas Hydrate, 2,850-855)によるHFC-32水和物結晶の厚さの測定結果によると生成数時間後に110μmになることから(P=617kPa,ΔT=8.8K), HFC-32水和物結晶の厚さ方向への見かけの成長速度は10^<-2>μm/s程度であると考えられ,界面方向への速度(5mm/s)に比べて著しく遅いことが明らかになった.上記に加え,本研究の知見を基にした「クラスレート水和物連続生成装置の性能予測法の開発」を行う際の検討対象として,既知の界面面積を持つクラスレート水和物連続装置の設計・開発を行った.ゲスト物質流体/水界面を覆うように成長する包接水和物結晶膜の成長挙動予測に関して以下2点の検討を行った.(1)包接水和物膜成長に関する物理モデルの検討:ゲスト物質流体/水界面上において同界面に沿って成長する包接水和物膜に関し,その2次元的な物理モデルの製作・検討を行った.本研究においては,包接水和物膜の先端のみが包接水和物生成箇所である物理モデル,つまり,同膜が界面に沿った方向へのみ成長する(膜の厚み方向には成長しない)物理モデルを考えている.本物理モデルにおいては,膜先端における温度が「想定圧力における包接水和物生成温度」であると仮定すると共に,同先端からゲスト物質流体中および水中への熱伝導による熱移動のみを考えており,同先端からの熱移動量と等しい生成熱量分の包接水和物生成により同膜が成長するとしている.本研究においては,上述の物理モデルを作成すると共にその計算結果と他研究者による実験結果との比較・検討を行った.その結果,ゲスト物質の水への溶解度と包接水和物膜の厚さとの間に反比例の関係があることを明らかにした.また,本物理モデルが妥当か否かを検討するためには,今後,成長速度と膜厚の同時計測が必要であることを明らかにした.(2)包接水和物膜成長速度の実験的

測定:境界条件が明らかな下での包接水和物膜成長速度計測実験を行うことを目的として圧力容器の設計・製作を行った(実験装置の形状・寸法・機能等を発案し,実際の設計・製作は圧力容器製作の専門会社に依頼した).同実験装置は,類似研究を行っている他研究者のものとは異なり,水を膜状の形で流動させることが可能であり,それにより実験時の境界条件を明らかにし易くなっている.同装置の製作後,「水流動系の動作確認」および「水膜の流動状況の観察」を行った.ゲスト物質/水界面を覆うように成長する包接水和物結晶の膜の成長挙動予測に関して以下の2点の検討を行った.(1)包接水和物膜成長に関する物理モデルの検討:昨年度に引き続き,ゲスト物質/水界面に沿って成長する包接水和物膜に関し,その2次元的な物理モデルの検討を行った.本研究においては,包接水和物膜の先端のみが包接水和物生成siteであり,同膜が界面に沿った方向へのみ成長する(膜の厚み方向には成長しない)物理モデルを考えている.成長する包接水和物膜の先端形状については殆ど知られていないため,その形状には仮定を置かなければならない.本年度の物理モデルにおいては,半円形の先端形状を仮定した.検討の結果,矩形の先端を持つ物理モデル(昨年度)に比べて半円形の先端を持つ物理モデルでは,包接水和物膜内を介して水およびゲスト物質相へと移動する熱量が著しく減少することが判明した.この結果,同じ膜厚を仮定した場合,半円形状先端を持つ物理モデルは矩形先端を持つ物理モデルに比べ約1.5倍の生成site面積を持つにもかかわらず,その成長速度は遅くなると言う結論に至った.(2)包接水和物膜成長速度の測定:上述のモデルを検証するためには"包接水和物膜の界面に沿った方向への成長速度"および"膜厚"の両者の実験結果との比較が必要となる.検討の結果,同膜の膜厚は直接測定する以外の手段が無く,その測定はかなり困難であることが判明した.そこで,既に光学干渉計を用いた膜厚の測定例が存在するHFC-32およびHFC-134aについて,界面に沿った方向への成長速度を測定することとした.この目的を達成するため,本年度は,実験装置本体を冷却するための装置の設計・製作,実験装置本体と付属装置の接続,実験系の耐圧試験等を実施すると共に,HFC-134aを用いた予備検討を行った.HFC-32/水界面上およびHFC-134a/水界面上を成長するHFC-32水和物結晶およびHFC-134a水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度を実験的に測定した.HFC-32水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は,その核生成直後から減速し,数秒後に約5mm/sに漸近することを明らかにした(圧力P=617kPa,サブクール度ΔT=10.9K:ΔT=該当圧力における水和物生成温度-バルク温度).一方,HFC-134a水和物結晶に関する検討の結果,同水和物結晶の界面に沿った方向への成長速度は約0.4mm/sに漸近する様に減速することを明らかにした(p=246kPa,ΔT=6.0K).また,上述のHFC-32水和物結晶に関する実験結果と本研究で作成したクラスレート水和物結晶(包接水和物結晶)の物理モデル(熱移動モデル)の計算結果とを比較・検討した結果,成長中のHFC-32水和物結晶の厚さは1μm程度であることが明らかになった(P=617kPa,ΔT=10.9K).他研究者(Ho et al.(2002)Proc.4th Int.Conf.Gas Hydrate,2,850-855)によるHFC-32水和物結晶の厚さの測定結果によると生成数時間後に110μmになることから(P=617kPa,ΔT=8.8K),HFC-32水和物結晶の厚さ方向への見かけの成長速度は10^<-2>μm/s程度であると考えられ,界面方向への速度(5mm/s)に比べて著しく遅いことが明らかになった.上記に加え,本研究の知見を基にした「クラスレート水和物連続生成装置の性能予測法の開発」を行う際の検討対象として,既知の界面面積を持つクラスレート水和物連続装置の設計・開発を行った.
標的ＤＮＡ検索機構の理解に向けた核内環境のライブセルイメージング

本研究の目的は,細胞内において標的DNAがどのように検索されるかという機構の理解を進めることである.2016年度と2017年度には,生細胞クロマチンの超解像イメージングと,転写因子1分子イメージングの開発を進め,クロマチンとタンパク質によるDNA情報検索に関する理解を深めてきた.それらの観察の結果,クロマチンの密な構造(クロマチンドメイン)が,核空間における転写因子による検索可能領域の限定に重要であることが示唆された.2018年度は,さらに踏み込んだ標的DNA検索の研究を行うため,ハーバード大学のNancy Klecknerラボに滞在し,減数分裂期における相同染色体検索の研究を行ってきた.1減数分裂期で,「いつ」「どのように」相同染色体が相互作用し,2「どのように」相同配列を検索するかについて明らかにすることを解くべき問題として設定した.この問題にアプローチするために,出芽酵母において,減数分裂期におけるプログラムDSB(DNA二本鎖切断)が比較的高い頻度で起きるホットスポット周辺のクロマチンを蛍光タンパク質によって染色し,その領域がお互いをどのように検索しているのかについて2色ライブセルイメージを行なった.様々な試行錯誤を繰り返した結果,減数分裂期中のDSBホットスポットの動きを追跡することが可能となった.その結果,相同染色体間の減数分裂前後における相互作用を観察することができた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,クロマチン環境によってタンパク質による標的DNAへのアクセスが制御される仕組みを理解することである.そこで本研究では,クロマチンの超解像イメージングと,転写因子の1分子イメージングを基軸とし,それらの関係性についての研究を進めている.採用1年目である2016年度は,本研究の基盤技術となる生細胞におけるクロマチン構造の超解像イメージングと転写因子の1分子イメージングに関する技術の確立に注力した.まず,クロマチン環境と転写因子のアクセス制御の関係性を明らかにするためには,生細胞におけるクロマチン超解像イメージングが必須となる.回折限界を超えたクロマチンの超解像イメージングを実現するために,ヌクレオソームの1分子イメージングを確立し,それを基にしたPALM (photoactivated localization microscopy)の確立を行い,生細胞におけるクロマチンの超解像イメージを作成することに成功した.生細胞の核内における転写因子の動態を観察するために,真核生物における転写制御因子の一つであるc-junに着目し, c-junの1分子イメージングを行うことが可能な細胞の作成と観察を行った.その結果,核内におけるc-junは自由拡散によって非常に速く移動している成分と,DNA上に結合し非常に遅く移動している成分の2成分から構成されていることが明らかとなった.自由拡散によって移動しているタンパク質とDNA上に結合しているタンパク質の拡散係数と比較した結果,それぞれ類似していることが示された.計画していたクロマチン超解像ライブセルイメージングの確立と転写因子1分子ライブセルイメージングの確立を達成することができた.さらに、1分子ライブセルイメージングのデータを解析するためのパイプラインを確立し,転写因子の動態から性質を明らかにすることができた.本研究の目的は,タンパク質による標的DNAへのアクセスがクロマチン環境により制御される仕組みを理解することである.そこで本研究では,クロマチンの超解像イメージングと,転写因子の1分子イメージングを基軸とし,それらの関係性についての研究を進めている.採用2年目である2017年度は,2016年度に確立したイメージングの技術を用いて,生細胞におけるクロマチン構造の超解像イメージングと転写因子の1分子イメージングを実際に行い,そのデータを解析した.2017年度に得られた主な成果は以下の3点である.1TSAの投与やクロマチン関連タンパク質であるコヒーシンののノックダウンにより,生細胞においてクロマチン構造が変化することが観られた.一方で過去の研究でその機能性が示唆されていたCTCFはノックダウンを行っても,クロマチン構造の変化は観られなかった.2細胞におけるRNAポリメラーゼII/転写因子のイメージングをクロマチン超解像イメージングと組み合わせて行った結果,RNAポリメーラゼや転写因子はクロマチンドメインの中に侵入せず,主に表面上に結合することが示された.この結果は,クロマチンドメインという構造は,DNAに対するタンパク質によるアクセスを制限し,検索空間を縮小することで転写検索の効率化に寄与していることを示唆している.3クロマチンドメインとその内部のヒストンを観察する方法を確立し,クロマチンドメインが非常に密に詰まった物理的構造を持つことを示した.これらの成果の一部は論文誌Molecular Cellにおいて発表を行った.クロマチンの超解像イメージングと転写因子やRNAポリメラーゼのイメージングを基に,転写因子とクロマチンドメインの関係性を示すことができた.これらの成果により,クロマチンドメインは核内において転写因子が検索可能なDNA領域を制限することにより,転写の効率化に寄与していることが示唆された.これらの成果は,本研究課題で提案したクロマチンと転写因子の標的DNA検索の問題におけるモデルの一つとなる.本研究の目的は,細胞内において標的DNAがどのように検索されるかという機構の理解を進めることである.2016年度と2017年度には,生細胞クロマチンの超解像イメージングと,転写因子1分子イメージングの開発を進め,クロマチンとタンパク質によるDNA情報検索に関する理解を深めてきた.それらの観察の結果,クロマチンの密な構造(クロマチンドメイン)が,核空間における転写因子による検索可能領域の限定に重要であることが示唆された.

2018年度は,さらに踏み込んだ標的DNA検索の研究を行うため,ハーバード大学のNancy Klecknerラボに滞在し,減数分裂期における相同染色体検索の研究を行ってきた.1減数分裂期で,「いつ」「どのように」相同染色体が相互作用し,2「どのように」相同配列を検索するかについて明らかにすることを解くべき問題として設定した.この問題にアプローチするために,出芽酵母において,減数分裂期におけるプログラムDSB(DNA二本鎖切断)が比較的高い頻度で起きるホットスポット周辺のクロマチンを蛍光タンパク質によって染色し,その領域がお互いをどのように検索しているのかについて2色ライブセルイメージを行なった.様々な試行錯誤を繰り返した結果,減数分裂期中のDSBホットスポットの動きを追跡することが可能となった.その結果,相同染色体間の減数分裂前後における相互作用を観察することができた.これまでに確立したクロマチン構造の超解像ライブセルイメージングと,c-junの1分子ライブセルイメージングを統合し,同時にそれらの観察・解析を行うことで,クロマチン環境と転写因子の動態の関係性を明らかにする.また,クロマチンの修飾状態を変化させるTrichostatin A (TSA)やクロマチン関連タンパク質のノックダウンを用いることで,クロマチン環境が変化したときに,転写因子の動態がどのように変化するかについても解析を行う予定である.2017年度に得られたそれぞれの成果をさらに発展させ,クロマチン環境の変化と転写因子動態の変化を明らかにする.クロマチンドメインの物理的性質と転写因子の関係性について,それぞれ論文にまとめ発表する.昨年度末からハーバード大学で始めた減数分裂期における相同染色体検索に関する問題についてもライブセルイメージングを中心に研究を進める.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ミス・ゴルジ・マトリックス蛋白質GM130のゴルジ槽局在機構及びその機能解析

(1)GM130のゴルジ体膜への局在化を、パルスチェイス細胞分画による実験、培養細胞へのタンパク質の微細注入法を用いた小胞体-ゴルジ体間輸送の阻害実験、試験管内転写翻訳系を用いたのゴルジ膜への組み込み実験によって解析した。その結果、GM130が細胞質で合成された後、すみやかにかつ小胞体などを経由する事なく直接ゴルジ体に局在する事を明らかにした(第52回、日本細胞生物学会大会発表)。(2)トランス・ゴルジに局在し、GM130と非常に良く似た構造を取るgolgin97に着目し、ラットのgolgin97のcDNAをクローニングし抗体を作成してその局在を解析した現在までにgolgin97がゴルジ体膜に塩感受性で結合している表在性の膜タンパク質であること、分子のC末端部分が局在に十分である事を明らかにした(第72回、日本生化学会大会発表)。これらの結果は現在論文発表の準備を進めている。(3)ゴルジ体の構造タンパク質を濃縮した分画に多く含まれる4種のタンパク質の同定を行ったところ、これらが、ERGIC53、MG160、GPP130、clathrin heavy chainであることが明らかとなった。現在、これらのタンパク質とGM130の相互作用を探っている。本研究はシス・ゴルジ・マトリックスタンパク質GM130のゴルジ槽への局在機構を明らかにする事を第一の目的としている。ゴルジ槽を含めて小胞輸送の経路のほとんどの貫通膜タンパク質は、小胞体で膜に組み込まれた後、小胞輸送によって目的地へ運ばれる事がわかっている。表在性膜タンパク質であるGM130が、一般の膜貫通タンパク質と同様に小胞体を介してゴルジ槽に局在するのか、直接ゴルジ槽に局在するのかを培養細胞を用いて解析した。Normal Rat Kidney細胞を5分間^<35>S標識されたメチオニンでパルスラベルした後、ただちに細胞分画し、ラベルされたGM130の分布を免疫沈降で調べたところ、ゴルジ槽の画分に分布していた。また、この分布は30分のチェイスでも変化がなかった。すなわち、細胞質で新たに合成されたGM130はすみやかにゴルジ槽の膜表面に組み込まれ、その後安定してゴルジ槽の膜上に存在する事が示唆された(未発表データ)。次にGM130がどのようにして、ゴルジ膜へ組み込まれるのかを探るためにGM130結合タンパク質の解析を行った。ラット肝臓よりゴルジ膜を精製し、さらにこれを材料として、界面活性剤による抽出、イオン交換クロマトグラフィーを用いてGM130を含むゴルジ・マトリックッス画分を精製した。このゴルジ・マトリックッス画分をゲルろ過クロマトグラフィーで詳しく解析したところ、GM130とともに分子量100万あたりに溶出するタンパク質を数種類検出した(未発表データ)。なかでも、分子量6万のタンパク質はGM130結合タンパク質として再有力候補であり、現在そのアミノ酸配列の決定を行っている。その他のタンパク質に関しても現在同定を進めており、今後はこれらのタンパク質とGM130の複合体形成等を解析する予定である。
ｃＩＴＰ法を用いたリポ蛋白分析から脂質異常症の病態・生理・機能を解明する

高比重リポ蛋白(HDL)は抗動脈硬化作用を有する。キャピラリー等速電気泳動(cITP)法によるリポ蛋白分析法は、HDLとLDLの亜分画を分離し、定量することができる。本研究では、まず、cITP法によるリポ蛋白分析が、低HDL-C血症の鑑別診断に有用であることを示した。次に、家族性高コレステロール血症の動物モデルであるWHHLウサギにおいて、合成HDL(アポA-I模倣ペプチドとリン脂質の複合体)の動脈硬化進展抑制機序のひとつとしてLDL亜分画へのリモデリング効果であることを示した。さらに、内臓肥満女性において、腹部皮下脂肪量がHDL代謝と関連することを示した。腹部脂肪組織分布と血漿高密度リポ蛋白(HDL)亜分画の関係肥満症は耐糖能異常、脂質異常症に合併することが多く、虚血性心疾患の危険因子である。生体内の脂肪組織分布[内臓脂肪組織(VAT)と皮下脂肪組織(SAT)]は、糖代謝・脂質代謝と関連する。従って、本研究は、腹部脂肪分布とHDL亜分画の関係を検討することを目的とした。研究対象は、腹部コンピューター断層撮影(CT)による腹部VAT面積が100 cm2以上の男性12名(平均年齢:47.5歳)及び女性36名(平均年齢:62.0歳)。SATの量(面積)と腹部周囲経(CW)も同時に計測した。空腹時血漿HDL亜分画はキャピラリー等速電気泳動(cITP)によって分析した。HDLは電気泳動移動度の遅い順に、速移動性HDL(fHDL)、中間移動性HDL(iHDL)と、遅移動性HDL(sHDL)に分画された。女性は、男性に比して、内臓脂肪量が低く、体脂肪率と皮下脂肪量が有意に高かった。女性において、VATは空腹時血糖及びHbA1cと正に相関し、SATはレプチン、C反応性蛋白(CRP)、cITP sHDLと正に相関した。男性と女性において、cITP fHDL・iHDLとsHDLは、血清脂質と異なる関係を示した、つまり、fHDL・iHDLはトリグリセリド(TG)と負に相関し、HDL-コレステロール(C)とアポA-Iと正に相関したが、sHDLはTG、HDL-CとアポA-Iと相関しなかった。多変量解析では、女性において、年齢、VAT、レプチン、CRPで補正しても、SATとsHDLの間に有意な関連を示した。以上の結果により、男性と女性は腹部脂肪組織の分布が異なり、女性の腹部皮下脂肪はキャピラリー等速電気泳動による遅移動性HDL亜分画と関連した。以上より、内臓脂肪組織量が多い場合は、腹部皮下脂肪組織量は、HDLの組成(亜分画)に影響する可能性がある。心不全重症度とキャピラリー等速電気泳動によるリポ蛋白プルフィールとの関連及びスタチンの効果低比重リポ蛋白コレステロール(LDL-C)高値と高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-C)低値は虚血性心疾患(CHD)の危険因子として確立されている。慢性心不全(CHF)も同様なリスクを有する可能性があるが、確かに重症CHFにおいて、血中総コレステロール値が低い方が予後が悪いことが報告されている。様々な仮説が呈示されているが、血中リポ蛋白が、細菌リポ多糖(lipopolysaccharide, LPS)と結合して、LPSによる炎症反応を軽減する報告もある。LDLとHDLは、血中において様々な修飾を受けて質的に変化する。小粒子LDL、酸化LDL、糖化LDL、陰性荷電LDLなどの変性LDLは、動脈硬化惹起性リポ蛋白である。CHD患者においてHDLの組成変化によりHDLの抗酸化・抗炎症作用が低下したことが報告されている。本研究は、CHF患者でのHDLとLDLの亜分画の特徴及びコレステロール低下薬スタチンの効果を検討することを目的とした。心不全患者を対照群とスタチン投与群を2群に分け、ベースラインと3ヶ月後の血清を採取し、血清脂質、キャピラリー等速電気泳動(cITP)法によるリポ蛋白プロフィール(亜分画)を測定した。中性脂肪リポ蛋白リッチ(TLR)除去分画と小粒子LDL分画は、超遠心法によって分離した。cITPリポ蛋白プロフィールは画像データとして、解析を行うための画像データベースは構築中である。アポリポ蛋白A-I模倣ペプチドとリン脂質複合体の低比重リポ蛋白亜分画に及ぼす効果血中低比重リポ蛋白(LDL)コレステロール高値と高比重リポ蛋白(HDL)コレステロール低値は虚血心疾患の独立した危険因子である。

酸化LDL、糖化LDL、小粒子LDLなどの変性LDLは動脈硬化惹起性リポ蛋白であり、電気泳動移動度が増加するという共通の特徴がある。HDL粒子の中、主にリン脂質とアポA-Iからなるpre-βHDLは高いコレステロールの引き抜き能を持つ。本研究は家族性コレステロール血症の動物モデルであるWHHLウサギにおいて、22個のアミノ酸からなるアポリポ蛋白A-I模倣ペプチドとリン脂質の複合体(ETC-642)である合成HDLのLDL亜分画に対する影響を検討した。WHHLウサギ21匹を対照群(n=8)、ETC-642低用量群(n=5)と高用量群(n=8)に分け、ETC-642投与前、投与後1、2、3ヶ月に採血した。LDLの荷電及びサイズによる亜分画は、それぞれキャピラリー等速電気泳動(cITP)法及び定量超遠心法によって分析した。WHHLウサギでは、電気泳動移動度の速いLDLと小粒子LDLが著明に増加するという特徴的なLDL亜分画分布を示した。速移動性LDL(fLDL)、超速移動性LDL(vfLDL)と超超速移動性LDL(vvfLDL)の順に高い値を示した。ETC-642投与はvvfLDLと小粒子LDLを減少し、vfLDLと大粒子LDLを増加した。このことから、ETC-642はLDLをリモデリングし、LDLの質を改善したことが示された。その機序は不明だが、血中酸化脂質が減少した可能性がある。LDL亜分画の変化は、血管内超音波により計測したWHHLウサギ大腿動脈プラーク体積と相関した。LDLの質的改善は、合成HDLの抗動脈硬化作用の新しい機序として考えられた。心不全重症度とキャピラリー等速電気泳動によるリポ蛋白プルフィールとの関連及びスタチンの効果低比重リポ蛋白コレステロール(LDL-C)高値と高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-C)低値は虚血性心疾患(CHD)の危険因子として確立されている。慢性心不全(CHF)も同様なリスクを有する可能性があるが、確かに重症CHFにおいて、血中総コレステロール値が低い方が予後が悪いことが報告されている。様々な仮説が呈示されているが、血中リポ蛋白が、細菌リポ多糖(lipopolysaccharide, LPS)と結合して、LPSによる炎症反応を軽減する報告もある。LDLとHDLは、血中において様々な修飾を受けて質的に変化する。小粒子LDL、酸化LDL、糖化LDL、陰性荷電LDLなどの変性LDLは、動脈硬化惹起性リポ蛋白である。CHD患者においてHDLの組成変化によりHDLの抗酸化・抗炎症作用が低下したことが報告されている。本研究は、CHF患者でのHDLとLDLの亜分画の特徴及びコレステロール低下薬スタチンの効果を検討することを目的とした。心不全患者を対照群とスタチン投与群を2群に分け、ベースラインと3ヶ月後の血清を採取し、血清脂質、キャピラリー等速電気泳動(cITP)法によるリポ蛋白プロフィール(亜分画)を測定した。中性脂肪リポ蛋白リッチ(TLR)除去分画と小粒子LDL分画は、超遠心法によって分離した。cITPリポ蛋白プロフィールは画像データとして、解析を行うための画像データベースをSQL Server 2014とMicrosoft Visual Studio 2010を用いて構築した。ベースラインでのHDL, TRL, LDL亜分画のパターンと心不全患者のアウトカムとの関連は解析中である。リポ蛋白質代謝と動脈硬化H24年度に計画した“メタボリックシンドローム(MetS)患者におけるcITPリポ蛋白亜分画と内臓脂肪量との関連の検討"は予定通りに終了した。
糖代謝異常疾患における医療用漢方製剤の有用性に関する研究

本研究は糖代謝異常疾患の分子標的を用いて全ての経口用医療用漢方製剤に対して網羅的評価を行った。その結果、インスリン抵抗性糖尿病の分子標的であるプロティンチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)に対して大黄甘草湯、麻子仁丸、桃核承気湯、桂麻各半湯および調胃承気湯に高い阻害活性を示した。糖尿病性合併症の分子標的advancedglycation end products (AGEs)およびaldose reductase(AR)に対して、辛夷清肺湯と治打撲一方にそれぞれ高い生成阻害活性を示した。更に、抗酸化試験においては、通導散、大柴胡湯および麻子仁丸には最も高い活性を示した。本研究は医療用漢方製剤の糖代謝異常疾患の分子標的に対する作用を指標として、活性成分および作用機序の解明により、医療用漢方製剤の糖代謝異常疾患への有用性を基礎科学的に明らかにすることを研究目的とする。平成27年度においては、インスリン抵抗性糖尿病の創薬分子標的であるプロティンチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)のHigh-throughputアッセイ系を用い、経口医療用漢方製剤147処方についてPTP1B阻害活性を評価した。その結果、大黄甘草湯、麻子仁丸、桃核承気湯、桂麻各半湯および調胃承気湯に高い阻害活性を示した。詳細なPTP1B阻害活性評価、作用機序解析および漢方学的考察により、麻子仁丸が最も優れた結果を示した。麻子仁丸の活性成分については、bioassay-guided fractionation法を用いてPTP1B阻害活性成分を単離し、更にスペクトル解析により構造決定した結果、麻子仁丸のPTP1B阻害活性成分は厚朴由来のmagnololおよび大黄由来のchrysophanolと同定した。一方、経口医療用漢方製剤147処方について、糖尿病性合併症の創薬分子標的advancedglycation end products (AGEs)生成阻害活性およびaldose reductase(AR)阻害活性を評価した。その結果、辛夷清肺湯に高いAGEs生成阻害活性、治打撲一方に高いAR阻害活性が認められた。活性成分の詳細については、現在検討中である。経口医療用漢方製剤147処方について糖代謝異常疾患の分子標的3種に対する作用を評価して、それぞれ高い阻害活性を示す処方をヒットした。さらに、PTP1B阻害活性を示す麻子仁丸の活性成分を同定できた。本研究は医療用漢方製剤の糖代謝異常疾患の分子標的に対しての作用を指標として、活性成分および作用機序の解明により、医療用漢方製剤の糖代謝異常疾患への有用性を基礎科学的に明らかにすることを研究目的とする。前年度に引き続き、抗酸化活性を指標として、内服用医療漢方製剤147処方について、活性酸素吸収能評価試験(ORAC法)、スーパーオキシドアニオンラジカル捕捉活性測定試験(SOD法)、およびDPPHラジカル捕捉活性測定試験(DPPH法)を用いて評価した。ORAC法においては、通導散、麻子仁丸、および大柴胡湯が最も高いORAC値を示した。SOD法においては大柴胡湯、治打撲一方、および通導散が最も高いスーパーオキシドアニオンラジカル捕捉活性を示した。DPPH法においては、麻子仁丸、通導散、および大柴胡湯が、最も高いDPPHラジカル捕捉活性を示した。さらに、上記抗酸化活性試験において、高い抗酸化活性を示す3処方:通導散、大柴胡湯および麻子仁丸について、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞を用いて、ROS蛍光プローブであるDCFH-DAを用いた細胞内イメージングにより抗酸化活性を検討した。各漢方製剤は共焦点顕微鏡を用い、H2O2刺激によるDCFH-DA前処理HepG2細胞内のROS産生の解析を行った結果、いずれも最終濃度10 microUnit/mLにて経時的な蛍光の増強を有意に抑えた。経口医療用漢方製剤147処方について、糖代謝異常疾患の起因である酸化ストレスを考慮して、抗酸化活性を評価した。その結果、3種の漢方製剤:通導散、大柴胡湯および麻子仁丸が高い抗酸化活性を有することを明らかにした。生体内に産生される活性酸素(ROS)による酸化ストレスは糖代謝疾患をはじめ、様々な疾患に関与している。過剰なROSの除去はこれら疾患の予防および治療に重要なアプローチである。既に、先行研究において医療用漢方製剤147種類の抗酸化活性の網羅的in vitro評価により、大柴胡湯、治打撲一方、麻子仁丸、および通導散の4剤が高い抗酸化活性を示すことを明らかにした。今回、大柴胡湯および治打撲一方2剤について、四塩化炭素誘発急性肝障害モデルマウスを用いて、in vivoにおける抗酸化作用を評価した。In vivo抗酸化作用の評価は、薬物代謝系を介して発生するフリーラジカルにより肝障害が誘発される四塩化炭素誘発急性肝障害モデルを用い、また使用動物としてはICR系6週齢雄マウスを用いた。本研究では、大柴胡湯および治打撲一方について、肝障害の指標である血清トランスアミナーゼASTおよびALT値を評価した。ポジティブコントロールとしてはsilymarinを用いた。その結果、四塩化炭素を腹部投与しない正常マウスに水または大柴胡湯(2.5 g/kg(体重))を経口投与した結果、AST/ALT値に差は認められなかった。肝障害モデルマウスに大柴胡湯(2.5 g/kg(体重))を経口投与したところ、ASTおよびALT値の有意な低下(p<0.01)が認められた。

さらに大柴胡湯および治打撲一方を0.25、1.0、および2.5 g/kg(体重)の3濃度で投与したところ、いずれの漢方薬においても投与濃度1.0 g/kg(体重)において、ASTおよびALT値の有意な低下(p<0.05)が認められた。本研究は糖代謝異常疾患の分子標的を用いて全ての経口用医療用漢方製剤に対して網羅的評価を行った。その結果、インスリン抵抗性糖尿病の分子標的であるプロティンチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)に対して大黄甘草湯、麻子仁丸、桃核承気湯、桂麻各半湯および調胃承気湯に高い阻害活性を示した。糖尿病性合併症の分子標的advancedglycation end products (AGEs)およびaldose reductase(AR)に対して、辛夷清肺湯と治打撲一方にそれぞれ高い生成阻害活性を示した。更に、抗酸化試験においては、通導散、大柴胡湯および麻子仁丸には最も高い活性を示した。高いAGEs生成阻害活性を示す辛夷清肺湯、および高いAR阻害活性を示す治打撲一方の活性成分を明らかにする。漢方薬の多成分系による多作用標的の特性を考慮して、麻子仁丸の全成分解析を行い、他の糖代謝異常疾患の分子標的への作用も検討する。糖代謝異常疾患に有用な医療用漢方製剤について、病態モデルを用いて薬効を評価していく予定である。生薬学おおむね研究計画の通り研究を進めているが、学会参加の旅費を使用しなかったため、残額が生じた。次年度のAGEs生成抑制活性測定およびAR阻害活性測定の試薬購入に使用する予定である。28年度に生じた残額は29年度の研究費と合わせて、in vivo実験に使用する物品費、動物購入費、試薬購入費に使用する予定である。
大正自由教育期における公民教育実践の研究

本研究は,大正自由教育期に様々に展開された初等教育段階での公民教育実践の試みを,具体的な史資料の発掘と分析にもとづいて,授業レベルで考察しようとするものである。今年度は,主に,当時の社会系教科と新たに実践が試みられていた公民教育実践との関係性に焦点をあてて,大正自由教育期において先進的な取り組みを実施していた小学校を中心に,現地訪問調査による史資料収集と,聞き取りに基づいた授業レベルでの検討を進めた。訪問調査を実施して有効な成果が得られた小学校は,信州大学教育学部附属長野小学校と奈良女子大学附属小学校である。両小学校は,大正自由教育期においては,それぞれ長野師範学校附属小学校と奈良女子高等師範学校附属小学校との校名で,当時としては先進的な公民教育実践を推し進めていた小学校である。長野師範学校附属小学校では,大正自由教育期に特別な研究のための学級である研究学級が設置されて先進的な実践が展開されていた。この実践では,公民教育的な内容や方法だけでなく,全ての教育活動を総合的に実践する授業が試行されており,このような実践では公民教育的な要素も含み込んだ総合的社会研究が成立していたことが明らかとなった。奈良女子高等師範学校附属小学校では,修身授業の改革を,子どもたちの日常経験や教科書内容だけでなく,社会のあらゆる事象や現象を広く取り扱うことを主眼にした調べ学習と、その成果をもとにした議論などを軸とした実践研究として展開させていた。それにより,幅広く現実的な教材の活用と議論で,なぜ様々な規範がそのように存在するのか,を追究する規範の意味学習が,授業の中で実現していた。奈良女子高等師範学校附属小学校では,このような修身授業改革の積み重ねによって,国定修身教科書とは一線を画した新たなカリキュラムを創造した。それは,全ての学年段階にわたるような完全なものではなかったが,修身という教科の枠組みには収まらない内容の集積として結実しており,より幅広く社会認識教育的な性格を持ち合わせた公民教育カリキュラムとなっていたことが明らかとなった。以上のような分析結果の一部は,平成16年10月10日に開催された全国社会科教育学会第53回全国研究大会(鹿児島大学教育学部)において,「大正自由教育期における社会系教科授業改革-初等教育段階の場合-」との主題で発表を行った。本研究は,大正自由教育期に様々に展開された初等教育段階での公民教育実践の試みを,具体的な史料(資料)の発掘と分析にもとづいて,授業レベルで考察しようとするものである。今年度は,主に,修身科での改革の延長線上に出現した「修身教育の公民教育化」に焦点をあてて,授業レベルでの検討を進めた。その結果,当時において「修身教育の公民教育化」の研究と実践を,実践の立場から進めていた広島高等師範附属小学校(広島高師附小)と奈良女子高等師範附属小学校(奈良女高師附小)では,そのあり方が全く異なることが明らかとなった。広島高師附小での公民教育化とは,従来の修身教育の目的を更に強化することであり,その手だては,従来の修身授業のように高いところから国定教科書内容を教え込むのではなく,子どもたちの目線で追究できるような内容の取り扱いを図ることにあった。しかし,そこで追究される内容は,国定教科書内容に織り込まれた内実を,更に踏み込むものとなっていた。一方,奈良女高師附小での公民教育化には,従来の修身教育の目的だけに縛れず,子どもたちを現実の公共生活へと開放させようとする方向性が認められる。授業レベルにおいては,修身教科書の内容を参考とはするものの,基本的には,子どもたちの生活題材を授業の題材として取り上げ,子どもたちや教師による質疑や議論を通して,現実の公共生活の反省を行い,新たなる実践「意志」の形成が目指されていた。そして,形成が目指された子どもたち個々人の「意志」は,何者かにまとめられ,整理されることはなく,子どもたち自らが反省整理し,自覚に到達することが保障されたのである。また,当校で作成された公民教育指導計画案は,当時の時代状況のため,従来の修身教育の目的にかかわる内容も織り込まれてはいるが,子どもたちの実践「意志」が保障されるような内容となる政治・経済・社会の三方面の実際生活にかかわる内容も,意識的に配列されたことは,従来の修身科とは異なる性質の公民教育構想を提示したものとして,その意義を評価できる。今年度は,平成15年10月26日に開催された全国社会科教育学会第52回全国研究大会(鳴門教育大学学校教育学部)において,上記のような分析結果の一部を「大正自由教育期における社会系教科再編の模索-初等教育段階の場合-」との主題で発表を行った。

長野師範学校附属小学校では,大正自由教育期に特別な研究のための学級である研究学級が設置されて先進的な実践が展開されていた。この実践では,公民教育的な内容や方法だけでなく,全ての教育活動を総合的に実践する授業が試行されており,このような実践では公民教育的な要素も含み込んだ総合的社会研究が成立していたことが明らかとなった。奈良女子高等師範学校附属小学校では,修身授業の改革を,子どもたちの日常経験や教科書内容だけでなく,社会のあらゆる事象や現象を広く取り扱うことを主眼にした調べ学習と、その成果をもとにした議論などを軸とした実践研究として展開させていた。それにより,幅広く現実的な教材の活用と議論で,なぜ様々な規範がそのように存在するのか,を追究する規範の意味学習が,授業の中で実現していた。奈良女子高等師範学校附属小学校では,このような修身授業改革の積み重ねによって,国定修身教科書とは一線を画した新たなカリキュラムを創造した。それは,全ての学年段階にわたるような完全なものではなかったが,修身という教科の枠組みには収まらない内容の集積として結実しており,より幅広く社会認識教育的な性格を持ち合わせた公民教育カリキュラムとなっていたことが明らかとなった。以上のような分析結果の一部は,平成16年10月10日に開催された全国社会科教育学会第53回全国研究大会(鹿児島大学教育学部)において,「大正自由教育期における社会系教科授業改革-初等教育段階の場合-」との主題で発表を行った。
好酸球遊走性によるアトピー性皮膚炎の病型分類

近年、アトピー性皮膚炎は増加傾向にあり、成人例、難治例の増加も目立ってきている。アトピー性皮膚炎の病因、病態については、種々の要因の関与が示唆されているが、いまだ解明されていないのが現状である。現在、多方面よりの研究がなされている。好酸球はアトピー性皮膚炎の成因に重要な役割を果たしていると予想され、今までにT細胞由来の遊走因子をはじめ、種々の好酸球遊走因子も発見されている。成人のアトピー性皮膚炎患者を気道アトピー合併の有無皮疹の状態などにより分類し、T細胞株、STO-2由来好酸球遊走因子(PI5,PI6,PI7,PI8,PI9)や既知のGM-CSF,IL-3,IL-5,RANTESなど各種の好酸球遊走因子に対する末梢血好酸球の遊走能の比較実験を行った。気道アトピー合併の有無,皮疹の状態(安定期,活動期)において好酸球遊走性が異なることが明らかになった。気道アトピー合併群が非合併群に比べすべての遊走因子に対して高い遊走率を示した。皮疹の活動期では、安定期よりも有意にPI5,PI6の遊走率が上昇し、遊走パターンが異なることがわかった。これらの好酸球の遊走反応からアトピー性皮膚炎の皮疹活動期における特有の好酸球出現の可能性が示唆される。今後、さらに例数を増やし、また、PI5,PI6に遊走する好酸球はどのような好酸球であるかを検討するために表面マーカーやレセプター発現の違いについての解明も行いたい。
住民自治組織の比較研究

1研究目的本研究の目的は、住民組織の厳密な定義に基づいて多国間にわたる住民組織の比較研究を行うことによって、各国の住民組織の共通性と異質性を明らかにすることである。とりわけ住民組織が担っている共通の社会的機能を析出することによって、住民による地域資源の自治的管理が普遍的に見いだしうるものであることを明らかにしたいと考えた。2住民組織の国際比較研究の意義国際化のもとでの地域復権・再生のなかで、地域分権を団体自治の枠を超えて実質化しようという動きが、各国で見られるが、自治の担い手のひとつとして、地域住民組織がクローズアップされるようになっている。このような「草の根」からの地域民主主義の建設への関心の高まりを背景として、従来、「特殊日本的」あるいは「保守的」と評価されることの多かった日本の住民組織を、各国の住民組織と比較することで、第一に、日本の住民組織のなかの、地域民主主義の建設に貢献しうる要素を析出することが可能となり、第二に、歴史的・文化的多様性を示しつつも、住民組織が共通に担う普遍的な機能が何であるかを明らかにすることができる。以上が、本研究の意義である。3比較研究の対象の定義と範囲本研究では、対象とする住民組織を、(1)一定の区画を排他的に占有し、(2)地域住民に共通する地域の諸問題の処理にあたり、(3)その地域と住民を代表することを住民および行政によって認められている組織、と定義した。調査対象は、中国、韓国、タイ、フィリピン、アメリカ、イギリス、フランス、ドイツ、イタリア、スウェーデンの10カ国である。4調査研究から得られた知見現地調査を行った結果、上で定義したような住民組織が存在すること、そして住民組織が地域資源の管理という地域共同管理機能を共通に有していることを、調査対象の10カ国において確認することができた。しかし、当該国家の政治システムにおいて住民自治がどのように位置づけられているかが異なること、その結果として地方行政制度が国によってきわめて多様であることから、住民組織もまた多様な形態をとることが確認された。言い換えれば、地域共同管理機能の点で共通性があるにも関わらず、規模、行政機関との関係、合議・執行・紛争処理に関する権限、住民の包摂の度合い等の点で、各国の住民組織の間でかなりの差異が存在することが明らかとなった。国家行政機構を軸として、住民組織を類型化するために、組織類型と主な機能特質という2つの変数を組み合わせた。組織累計については、大きく(1)結社型、(2)代議型、という2つの類型に分かれるが、このうち結社型は、下位類型として、公共団体型、地域共同団体型、任意団体型という3つのタイプを持つ。主な機能特質については、(1)審議機能のみ、(2)執行機能も持つ、(3)司法機能も持つ、という3つのタイプが設定可能である。以上から、ドイツ=代議型で執行機能のみ、タイと韓国=公共団体型で執行機能ももつ、中国とフィリピン=公共団体型で司法機能も持つ、フランスとスウェーデン=地域共同団体型で執行機能も持つ、アメリカとイギリス=任意団体型で執行機能も持つ、という類型化を行った。このなかで日本は、フランスとアメリカの中間的な位置を占めるものと位置づけられる。5課題今後の研究課題としては、第一に対象諸国の住民組織の多様性の把握、第二に各国における住民組織と行政制度の組織・機能上の変化の追跡、第三に今回対象とした国家以外の地域における住民組織の実態(有無の確認を含めて)、である。

言い換えれば、地域共同管理機能の点で共通性があるにも関わらず、規模、行政機関との関係、合議・執行・紛争処理に関する権限、住民の包摂の度合い等の点で、各国の住民組織の間でかなりの差異が存在することが明らかとなった。国家行政機構を軸として、住民組織を類型化するために、組織類型と主な機能特質という2つの変数を組み合わせた。組織累計については、大きく(1)結社型、(2)代議型、という2つの類型に分かれるが、このうち結社型は、下位類型として、公共団体型、地域共同団体型、任意団体型という3つのタイプを持つ。主な機能特質については、(1)審議機能のみ、(2)執行機能も持つ、(3)司法機能も持つ、という3つのタイプが設定可能である。以上から、ドイツ=代議型で執行機能のみ、タイと韓国=公共団体型で執行機能ももつ、中国とフィリピン=公共団体型で司法機能も持つ、フランスとスウェーデン=地域共同団体型で執行機能も持つ、アメリカとイギリス=任意団体型で執行機能も持つ、という類型化を行った。このなかで日本は、フランスとアメリカの中間的な位置を占めるものと位置づけられる。5課題今後の研究課題としては、第一に対象諸国の住民組織の多様性の把握、第二に各国における住民組織と行政制度の組織・機能上の変化の追跡、第三に今回対象とした国家以外の地域における住民組織の実態(有無の確認を含めて)、である。本研究の目的は、住民組織の厳密な定義に基づいて多国間にわたる住民組織の比較研究を行うことによって、各国の住民組織の共通性と異質性を明らかにすることである。とりわけ住民組織が担っている共通の社会的機能を析出することによって、住民による地域資源の自治的管理が普遍的に見いだしうるものであることを明らかにしたいと考えた。本研究では、対象とする住民組織を、(1)一定の区画を排他的に占有し、(2)その地域と住民を代表することを住民および行政によって認められているもの、と定義した。調査対象は、中国、韓国、タイ、フィリピン、アメリカ、イギリス、フランス、ドイツ、イタリア、スウェーデンの10カ国である。現地調査を行った結果、上で定義したような住民組織が存在すること、そして住民組織が地域資源の管理という社会的機能を共通に有していることを、調査対象の10カ国において確認することができた。しかし、当該国家の政治システムにおいて住民自治がどのように位置づけられているかが異なること、その結果として地方行政制度が国によってきわめて多様であることから、住民組織もまた多様な形態をとることが確認された。当初の作業仮説は、住民組織は(1)結社型、(2)代議型、(3)協同組合(ないし教会)型という3つの類型に分かれるというものであった。今年度の調査から判断するかぎり、当初の仮説はほぼ支持された。しかし、今年度の調査だけで最終的な結論を出すのは危険なので、来年度の調査の後に判断を下そうと思う。また地域共同管理機能の点で共通性があるにも関わらず、規模、行政機関との関係、合議・執行・紛争処理に関する権限、住民の包摂の度合い等の点で、各国の住民組織の間でかなりの差異が存在することが明らかとなった。その差異が何に由来するのかを来年度の調査で追求したい。
M2マクロファージ転換技術を応用した新規歯周組織再生療法の開発

通常、マクロファージは歯周病細菌であるP. gingivalisのLPSとIFN-γで刺激するとM1(炎症性)細胞の表現型を示すが、Spry2の抑制により、低分子量Gタンパク質Rac1の活性化を介してefferocytosis (アポトーシス細胞の認識と除去)が促進され、IL-10やbFGF, EGF, VEGF, PDGF等の成長因子を産生するM2(抗炎症性)細胞型に分化誘導されること、さらに、PI3K,AKTの活性化を介してIκBの分解とNF-κBの活性化が抑制されることにより、M1細胞型への分化が抑制されることを解明した。歯周炎を始めとする炎症反応では、収束過程に近づくにつれて組織修復を担うM2マクロファージが主体となるといわれている。一般に再生過程は炎症により強く阻害されるため、歯周組織再生の成功にはこのM2細胞の誘導が不可欠である。一方、申請者らはSpry2という分子を抑制することで、M2細胞への転換・歯肉上皮のダウングロースの防止・強力な骨造成の可能性を見いだしている。本研究の目的は、M2細胞への転換のメカニズムを解明すると共に、Spry2が阻害される作用点をタンパク質構造解析より割り出しSpry2阻害剤を開発することである。最終的に、歯周組織破壊が起きた部位に、創薬されたSpry2阻害剤を局所適用することで、炎症の終焉および速やかな骨造成が開始される新しい歯周組織再生療法を開発し、その有用性を確立したいと考えている。現在までの研究成果は以下の通りである。通常、マクロファージはP. gingivalis LPSとIFN-γ刺激によりM1細胞の表現型を示すが、siRNAにてSpry2を抑制するとJ774.1マクロファージではiNOSの活性が抑制されると同時にArginase1の活性化を示した。また、LPSとIFN-γ刺激によりSpry2抑制マクロファージでは炎症性サイトカインであるIL-12、IL-6の産生が減少、抗炎症性サイトカインであるIL-10の産生亢進が確認された。さらに、アポトーシス細胞の認識と除去(efferocytosis)の効率を検討したところ、Spry2を抑制したマクロファージにおいて、アポトーシス胸腺細胞のefferocytosis促進を確認した。加えて、J774.1マクロファージにおいてSpry2を抑制すると活性型Rac1の亢進が確認された。現在までに以下のことを明らかにした。1.通常、マクロファージはIFN-γ+ Pg LPS刺激によりM1細胞の表現型を示すが、siRNAにてSpry2を抑制するとJ774.1マクロファージではiNOSの発現が抑制されると同時にArginase1の活性化を示した。2.Spry2抑制マクロファージではIFN-γ+ Pg LPS刺激により炎症性サイトカインであるIL-12、IL-6の産生が減少、抗炎症性サイトカインであるIL-10の産生亢進が確認された。3.アポトーシス細胞の認識と除去(efferocytosis)の効率を検討したところ、Spry2を抑制したマクロファージにおいて、アポトーシス胸腺細胞のefferocytosis促進を確認した。4.J774.1マクロファージにおいてSpry2を抑制すると活性型Rac1の亢進が確認された。動物実験と構造解析の成果がやや遅れてはいるが、株化された培養細胞の細胞機能解析において細胞シグナリングの詳細が判明しつつあるため、上記の区分とした。

1.通常、マクロファージは歯周病細菌であるP. gingivalisのLPSとIFN-γで刺激するとM1(炎症性)細胞の表現型を示すが、Spry2の抑制(siRNAによるSpry2抑制)により、低分子量Gタンパク質Rac1の活性化を介してefferocytosis (アポトーシス細胞の認識と除去)が促進された。3.Spry2抑制によってマクロファージはPI3K、AKTの活性化を介してIκBの分解とNF-κBの活性化が抑制されることにより、M1細胞型への分化が抑制された。通常、マクロファージは歯周病細菌であるP. gingivalisのLPSとIFN-γで刺激するとM1(炎症性)細胞の表現型を示すが、Spry2の抑制により、低分子量Gタンパク質Rac1の活性化を介してefferocytosis (アポトーシス細胞の認識と除去)が促進され、IL-10やbFGF, EGF, VEGF, PDGF等の成長因子を産生するM2(抗炎症性)細胞型に分化誘導されること、さらに、PI3K,AKTの活性化を介してIκBの分解とNF-κBの活性化が抑制されることにより、M1細胞型への分化が抑制されることを解明した。動物実験と構造解析の成果がやや遅れてはいるが、培養細胞の細胞機能解析において細胞シグナリングの詳細が判明しつつあるため、上記の区分とした。Spry2の抑制は炎症の収束に関わる可能性があることから、新しい歯周組織再生療法の開発に対して一助を担うことが期待される。また、過去の研究より、マクロファージにおいてRac1が活性されるとM2マクロファージへの分化およびefferocytosisを促進させることと、腸管上皮細胞にてSpry2の強発現が活性型Rac1を抑制することが分かっている。したがって、Spry2抑制によるM2マクロファージへの分化シフトはRac1を介して行われる可能性が示唆された。今後はさらにSpry2の抑制がマクロファージ分化において、どのシグナル伝達分子に作用しているのか、分子生物学的に解明する必要がある。歯周病学Spry2の抑制は炎症の収束に関わる可能性があることから、新しい歯周組織再生療法の開発に対して一助を担うことが期待される。本年度は培養細胞の機能解析実験が主体で、経費がかかると見込まれる動物実験がやや遅れている。動物実験の研究を次年度中心に行うため、これを次年度に繰り越した。本年度は細胞培養実験が中心で、経費のかかる動物実験がやや遅れている。Spry2を阻害する可能性のある分子をプロテオミクス解析により探索し、実験動物の歯周炎部位へ局所投与を行い、Spry2阻害剤のM2転換効率および歯周組織再生効率を測定する。同時に副作用による異常所見や周囲組織の癌化の有無等を経時的に観察する。また、多方面からの検討として、Spry2標的siRNAの局所投与も同時に確認する。