hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再生医療のための部位特異的遺伝子組込み法の開発: 発生工学的手法を用いた基盤研究

アデノ随伴ウイルス(AAV)が第19番染色体のAAVS1領域に組み込まれる性質を利用し、挿入変異発癌のない遺伝子操作法を開発した。ヒトAAVS1領域を持つトランスジェニックマウス由来のiPS細胞のAAVS1領域にGFPプラスミドの導入を試み、約100個のクローンを分離したが、AAVS1にGFP遺伝子が組み込まれているのは1クローンのみであった。この低率を改善するためトランスフェクション法、プラスミドの構築の再検討が必要と考えられた。血友病Aの新規治療戦略として、患者由来iPS細胞に正常第VIII因子遺伝子を組み込ませた後、肝細胞に分化させ患者に移植することが考えられる。導入遺伝子がランダムに組み込まれることによる挿入変異発癌を極力抑えることが、増殖の旺盛なiPS細胞の遺伝子操作には求められる。病原性のない野生型アデノ随伴ウイルス(adeno-associated virus: AAV)が第19番染色体のAAVS1領域に特異的に組み込まれる性質に着目し、同領域に外来遺伝子を効率良く組み込ませる方法をiPS細胞で確立することを目指した。昨年度はモデル実験を行う準備としてヒトAAVS1領域を持つトランスジェニックマウスを作出し、皮膚線維芽細胞を分離した。またAAVS1特異的組込みに必須の配列の解析を進め、AAVのRep蛋白質の発現を制御するp5プロモーター内の配列が導入遺伝子のAAVS1への組込みの向きを規定できることが分かった。本年度は分離培養した皮膚線維芽細胞にOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycを発現するリプログラミング用センダイウイルスベクターを感染させ、iPS細胞の樹立した(nanog、SSEA-1に対する免疫蛍光抗体染色、及びアルカリホスファターゼ染色でいずれも陽性)。次にiPS細胞にRep発現プラスミドとp5プロモーター配列を搭載したGFP発現プラスミドをトランスフェクションし、ヒトAAVS1領域へのGFP遺伝子の組込み頻度を調べたところ、約100クローンの解析で1クローンがAAVS1領域に組み込まれていることが分かった。これまでの我々の研究によるとヒト由来の細胞株HEK293細胞、HeLa細胞でのAAVS1特異的組込み頻度は約10%程度であるので、マウスiPS細胞では極めて低いことになる。プラスミドのデザイン、トランスフェクション法などの最適化が必要と考えられた。血友病Aの新たな治療戦略として、iPS細胞に血液凝固第VIII因子遺伝子を導入し肝細胞に分化させ移植する治療法が可能か検討するため、iPS細胞の遺伝子操作に主眼を置き研究を進めた。遺伝子導入には、非病原性の野生型アデノ随伴ウイルス(AAV: adeno-associated virus)が第19番染色体長腕AAVS1領域に組み込まれる性質を利用した部位特異的遺伝子組込み法を応用する。この方法は、AAVゲノムのAAVS1特異的組込みを介在する配列と非構造蛋白質のRep蛋白質を利用するもので、比較的高頻度で目的遺伝子が安全と考えられるAAVS1領域に組み込まれる。本年度はモデル実験をマウスの系で行うために、すでに作出したヒトAAVS1領域を持つトランスジェニックマウス13系統から、シングルコピーのAAVS1領域を持ち安定に次世代に継代できる2系統を選び出した。また、導入遺伝子として当初GFP発現ユニット(IRES配列でさらにブラストサイジン耐性遺伝子(bsr)を連結したもの)をAAVのITR (inverted terminal repeat)配列で挟んだプラスミドを予定していたが、汎用性を持たせるためbsrの代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子(Hpt)に置き換えた。またITR配列以外に、Rep蛋白質の発現をドライブするp5プロモーター内にITRと同様の組込み介在配列(p5内配列)が存在するが、我々の最近の研究によりp5内配列は遺伝子組込みの方向性を規定できることが分かってきておりITRをp5内配列に置き換えたものを作製した。当初の計画を変更し薬剤耐性遺伝子をHpt遺伝子に、ITR配列をp5内配列変更しGFP遺伝子導入用プラスミドの再構築などを行ったため、予定より遅れ気味である。しかしながら遺伝子導入後のiPS細胞クローン化のスクリーニングで、iPS細胞では汎用されているハイグロマイシンを利用できるメリットは大きく、遅れを挽回できると考えている。また、ITR配列をp5内配列に置き換えたプラスミドの構築に関しても、AAVS1への組込み後のGFPもしくは第VIII因子遺伝子の長期間の発現安定性の検討においては組込み方向が規定されるp5内配列の方が比較しやすいと考えられる。iPS細胞の作成に関しては2系統のトランスジェニックマウスの皮膚組織から線維芽細胞を分離、培養に着手し、リプログラミング遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター(MBL社)を感染させる予備実験を開始しており、こちらは順調に推移している。本年度は当初の計画ではGFP遺伝子をAAVS

1領域に組み込んだiPS細胞を樹立し、その肝細胞への分化誘導実験まで行う予定であったが遅滞気味である。今後はまずシングルコピーのヒトAAVS1を持つ2系統のトランスジェニックマウスから質の良いiPS細胞の樹立を第一の目的として研究を行う。iPS細胞が樹立されれば、未分化状態に維持され、かつ各種細胞へ分化できるか解析し、良いiPS細胞を選び出す。iPS細胞におけるAAVS1特異的遺伝子組込み操作に関しては、遅れを挽回するために、GFP/Hpt遺伝子プラスミドと第VIII因子/Hpt発現プラスミドのトランスフェクション以後のステップを並行して行う。各々クローン化しAAVS1領域にGFPもしくは第VIII因子が組み込まれたものを選び出す。発現の良好なクローンを更に選別し、未分化状態であることを確認するとともに、多能性幹細胞の性質が維持されているかを検討し、AAVS1に外来遺伝子が組み込まれてもiPS細胞の形質、機能に変化が生じないか解析する。次のステップとして肝細胞へ分化誘導実験を行い、GFP、第VIII因子の発現が維持され、肝細胞にも分化誘導できるか検討する。次年度は本年度に引き続き、1)トランスジェニックマウスからの線維芽細胞の分離培養、2)センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞の樹立、3)iPS細胞への遺伝子導入、4)導入後のiPS細胞のクローン化、選別、5)クローン化iPS細胞の解析遂行する予定である。したがって、当初の予定通り、遺伝子工学関連試薬、組換えセンダイウイルスベクター、細胞培養関連製品などの消耗品の物品費として700,000円を計上している。また、成果の発表のための学会出張の旅費として300,000円を計上している。
下垂体ホルモンによる精子幹細胞制御機構の解明

下垂体ホルモンFSH,LHが精子幹細胞ニッシェに必須であるか明らかにするため移植実験により下垂体ホルモン欠損マウスの精子幹細胞数を調べた。また、下垂体ホルモン欠損マウスの精子幹細胞ニッシェについてもFSH,LHの影響を調べた。精子幹細胞は生後の精巣の発達と共に増加してくることから、5ー10日齢の未成熟期と2か月齢の成熟期の二つの異なったステージの欠損マウスをドナーとして用いて、精子幹細胞移植アッセイを行った。FSHホルモンFshb遺伝子、LHホルモン受容体Lhr遺伝子について調べると、どちらの遺伝子欠損マウスでも野生型と同レベルの精子幹細胞数を保持していることが分かった。FSHは精子幹細胞の自己複製を促進すると考えられていたが、本研究では結果が異なったので、これは大変意外な成果であった。FSH、LHが精子幹細胞ニッシェの数を制御しているかどうか調べるため、Fshb. Lhr遺伝子欠損マウスが保持する精子幹細胞ニッシェの数を移植実験で調べた。野生型の精巣から採取した精子幹細胞を移植する実験で、どちらの遺伝子欠損マウスでもニッシェの数は変わらなかった。しかし精子幹細胞ニッシェにおける増殖能を継代移植で調べると、Fshb欠損は影響しないがLhr欠損が精子幹細胞の増殖を亢進する意外な結果が示された。以上の実験により、Lhr欠損により精子幹細胞増殖を促す遺伝子がはたらくと考えられた。そこでLhr欠損マウス精巣を利用して精子幹細胞増殖を促す遺伝子を調べた。マイクロアレイ実験によりトランスクリプトーム解析を行い、Sfrp1, Wnt5a, Dlk1を候補遺伝子として得た。これら候補遺伝子の中から培養精子幹細胞の増殖を亢進させる遺伝子を調べた結果、Wnt5aが精子幹細胞の増殖を促進することを示した。さらに生体内でも、Wnt5aが精子幹細胞増殖亢進を担うことが示された。下垂体ホルモンFSH, LHが精子幹細胞ニッシェに必須であるか明らかにするため移植実験により下垂体ホルモン欠損マウスの精子幹細胞の数を調べた。また下垂体ホルモン欠損マウスの精子幹細胞ニッシェについてもFSH, LHの影響を調べた。精子幹細胞は生後の精巣の発達と共に増加してくることから、5-10日齢の未成熟期と2ヶ月齢の成熟期の二つの異なったステージの欠損マウスをドナーとして用いて、精子幹細胞移植アッセイを行った。FSHホルモンFshb遺伝子, LH受容体Lhr遺伝子について調べると、どちらの遺伝子欠損マウスでも野生型と同レベルの精子幹細胞数を保持していることが分かった。FSHは精子幹細胞の自己複製を促進すると考えられていたのでこれは大変意外な結果であった。FSH, LHが精子幹細胞ニッシェの数を制御しているかどうか調べるため、Fshb, Lhr欠損マウスが保持する精子幹細胞ニッシェの数を移植実験で調べた。どちらの遺伝子欠損マウスでもニッシェの数は変わらなかった。しかし精子幹細胞ニッシェにおける増殖能を継代移植により調べると、Fshb欠損では影響はなかったがLhr欠損により精子幹細胞増殖が亢進することが示された。以上の実験により、Lhr欠損により精子幹細胞増殖を促す遺伝子がはたらいていると考えられる。そこで予定していたin vitroの解析を変更し、このLhr欠損マウス精巣を利用して下垂体ホルモンの標的遺伝子を調べた。マイクロアレイ解析用にサンプルを調整してトランスクリプトーム解析を行い、候補遺伝子を得た。本年度では1下垂体ホルモンによる精子幹細胞制御機能の理解のため下垂体ホルモンFSH, LH欠損マウスの精子幹細胞移植実験の実施を計画していたが、予定より進展したため平成28年度に計画していた解析も終えることができた。また2下垂体ホルモンの標的遺伝子の解明についても、本年度で予定していたサンプル調整に加え、平成28年度に予定していたトランスクリプトーム解析も実施することができた。

これら候補遺伝子の中から培養精子幹細胞の増殖を亢進させる遺伝子を調べた結果、Wnt5aが精子幹細胞の増殖を促進することを示した。さらに生体内でも、Wnt5aが精子幹細胞増殖亢進を担うことが示された。本年度の研究でLhr欠損が精子幹細胞増殖を促すことが明らかになったため、この現象のメカニズムについて更に研究を進め、精子幹細胞活性を亢進させる因子の同定を目指す。
フォトニックIPルーチングの研究

従来の電気的ルータでは、宛先検索のスピードが遅いことがネックとなり、処理能力に限界が見えつつあった。本研究の目的は、宛先検索を光領城で行うことにより、超高速IPルータの実現を図ることにある。まず、フォトニックバッファを含めたフォトニックルータのアーキテクチャを提案した。本アーキテクチャは光符号ラベルプロセッサ部、光スイッチ部、バッファスケジューリング部、光化バッファ部からなる。光バッファをWDM技術の導入により多波長化し、パケットの棄却率の低減を図ったのが特徴である。また、WDMの導入にともなって、光バッファ入力部には波長変換機能を持たせている。アドレス照合方法については、新たにアドレスの照合部分のビット数を任意に設定し、部分的な照合を実行するLongest prefix matchを提案した。アドレスを光符号にマッピングした光符号ラベルを用いることによって、アドレスの検索を光相関という光領域の演算によって行うことが可能となる。実験では、ビットレート10Gb/sで、アドレスのレプリカの生成を光増幅で行い、全ラベルに対してラベルエントリーとの光相関を同時・並列的に実行した。その結果、相関関数値が最大となるアドレスをLongest prefix matchのアドレスとして同定できることが確認できた。次に、光ファイバ遅延線を用いた周回制御型フォトニックバッファの原理確認実験を行った。その結果、2波WDMで40Gb/s-100周回でパケットのエラーフリーの読み出しに成功した。最後に、総合的なパフォーマンスを数値シミュレーションによって明らかにした。その結果、バッファについては最適な波長数は8程度、バッファのユニット長は平均パケット長の30%という値を得、スケジューリングについても「空き空間」の低減方法の効果を明らかにし、所期の目標である超高速フォトニックIPルーチングの実現の可能性を示すことができた。フォトニックラベルスイッチングルータは、IPパケットの転送を光/電気変換を介さずに超高速に行うものである。近未来的な研究課題とされている波長ルーチングはビットストリームに対する回線交換的な転送技術であるため、データの粒度が細かいパケット転送にこれを用いると帯域の利用効率が極端に低下するという問題があった。パケット毎に転送処理を行うパケットスイッチングはこの問題を解決するための技術であるが、従来の電気ルータではヘッダのアドレスを識別しルーチングテーブルをもとに転送先を決定するという宛先検索のスピードが遅いことがネックとなり、処理能力に限界が見えつつあった。本研究は宛先検索を光領域で行うことにより、超高速IPルータの実現を図ることが目的である。具体的には、入力アドレスは経路テーブルのラベルのエントリー数分だけコピーしラベルのレプリカが生成し、各レプリカは経路テーブルのアドレスと照合する。このレプリカの生成は光増幅、照合は光相関演算に基づき、全ラベルに対して同時・並列的に実行する。その出力を閾値処理することによって自己相関関数値が得られたアドレスを完全一致のアドレスとして同定するのである。今回従来の完全一致(Exact Matching)のアドレス照合以外に、新たにアドレスに対して照合部分のビット数を任意に変化しLongestprefix matchも実行できる時間ゲートを用いた光相関方法を提案し、10Gb/sにおいて実験的に検証した。これによって、IPルーチングのアルゴリズムに依存しない光領域のアドレス照合方法を確立したといえる。今後ルータのアーキテクチャの検討を行い、光バッファを含めたパケット競合回避を光領域において実現する方法について検討し、ルータ全体の設計に進む予定である。フォトニックラベルスイッチングルータは、IPパケットの転送を光/電気変換を介さずに超高遠に行うものである。

近未来的な研究課題とされている波長ルーチングはビットストリームに対する回線交換的な転送技術でおるため、データの粒度が細かいパケット転送にこれを用いると帯域の利用効率が極端に低下するという問題があった。パケット毎に転送処理を行うパケットスイッチングはこの問題を解決するための技術であるが、従来の電気ルータではヘッダのアドレスを識別しルーチングテーブルをもとに転送先を決定するという宛先検索のスビードが遅いことがネックとなり、処理能力に限界が見えつつあった。本研究は宛先検索を光領域で行うことにより、超高速IPルータの実現を図ることが目的である。今年度もほぼ当初の計画通りに進捗した。先ず、フォトニックバッファを含めたフォトニックルーターのアーキテクチャを提案した。本アーキテクチャはスイッチング部、スケジュールリング部、バッファリング部からなり、WDMべースで波長変換とフォトニックバッファの導入により、波長数10程度でもパケットの棄却率を従来よりも3桁程度低減できることをシミュレーションにより明らかにした。次に、光ファイバ遅延線を用いた周回制御型フォトニックバッファの原理確認実験を遂行中であり、この結果をもって、キーとなる要素技術の検討を終えることが出来る。フォトニックラベルスイッチングルータは、IPパケットの転送を光/電気変換を介さずに超高速に行うものである。近未来的な研究課題とされている波長ルーチングはビットストリームに対する回線交換的な転送技術であるため、データの粒度が細かいパケット転送にこれを用いると帯域の利用効率が極端に低下するという問題があった。パケット毎に転送処理を行うパケットスイッチングはこの問題を解決するための技術であるが、従来の電気ルータではヘッダのアドレスを識別しルーチングテーブルをもとに転送先を決定するという宛先検索のスピードが遅いことがネックとなり、処理能力に限界が見えつつあった。昨年度はフォトニックバッファを含めたフォトニックルーターのアーキテクチャを提案した。本アーキテクチャはスイッチング部、スケジュールリング部、バッファリング部からなり、WDMベースで波長変換とフォトニックバッファの導入により、波長数10程度でもパケットの棄却率を従来よりも3桁程度低減できることをシミュレーションにより明らかにした。次に、光ファイバ遅延線を用いた周回制御型フォトニックバッファの原理確認実験を行い、2波WDMで40Gb/s-100周回でパケットのエラーフリーの読み出しに成功した。最終年度にあたる今年度は、昨年度提案したフォトニックルーターのアーキテクチャについて、これまで個々に検討してきたフォトニックラベルプロセッシング部、フォトニックスイッチング部、バッファスケジュールリング部、フォトニックバッファリング部を統合した総合的なパーフォーマンスを、数値シミュレーションによって明らかにした。
アジア太平洋地域における法の役割

環太平洋の5外国大学の協力を得て繰り広げた本研究は、折からのアジア金融危機の真っ只中にあったということもあり、構造調整と経済法改革に焦点を合わせた形で、しかし地域における法の役割の探求という大前提を崩すことなく、3年の計画を締めくくることができた。タイのチュラロンコン大学およびタマサート大学の研究からわかるように、植民地支配のなかったアジア地域においては、伝統社会の中に西欧法を取り込むという19世紀以来日本も経験したことと同様な作業を今日も行うことによって、いわゆる「グローバル化」に対処していこうとする姿勢がはっきりとうかがわれる。3回にわたって行われたタマサート大学との国際研究集会では、法制史、憲法、国際法、商法、民法、刑法、知的財産権法、民事訴訟法、などかなりの法領域についての比較研究が行われ、比較的歴史状況が同じアジアの国同士、共通項が多いことが確認された。カナダ、ニュージーランドの協力校からのインプットによっては、これらの地域が完成したコモンロー体系の法技術をアジア諸国の法制度改革に導入することによりアジア諸国への接近を目指していることがわかった。中国は市場経済への移行という大きな国家目標の下で、経済法を中心に精力的な法制度改革が行われており、本研究で特に焦点をあてた商法についての特別共同研究において法による国家構造改革がきわめて重要であることが明らかになった。香港大学の研究においては、香港という特殊な状況下で基本的にはイギリス法の影響が強いことは当然ではあるが、コモンローでは律しきれない慣習法的部分が多く残っていることが指摘された。日本は、自らも司法改革をしながら、同時にアジア地域への法制度改革支援に取りかかったばかりであるが、その過程で本研究の一部は実践に移されているとともに、今後も成果が利用され、アジアにおける法の支配にむけた発展に寄与すると思われる。初年度は研究目的を正確に達成するための基礎作業が行われることに主眼点が置かれていた。研究協力機関がタイ、香港、カナダ、ニュージーランドに分散しているので、意思統一と計画の有効な実施を確保することが必要であった。そのために、研究分担者が平成10年7月、9月に分けて4カ国をまわり、研究分担者と綿密な打ち合わせを行った。その結果、本研究においてはいろいろな条件から、タイのタマサート大学との協力が鍵になることがわかり、初期の一人に加えて数人研究分担者を追加した。また植田教授による北京での調査の結果、中国の研究機関の参加が必要であることもわかったため、平成11年度には北京大学法学部の教授数名が研究分担者に加わる計画を立てた。平成3年3月に研究分担者全員(やむを得ない事情によりカナダからの参加1名が確保できなかった)が九州大学の集合し、いままでの研究報告と、これからの具体的な計画遂行について意思統一がなされた。「アジアにおける法律制度の発展」という広い枠組みの中で、いくつかの個別テーマを選び、それに従った取り組みを、研究分担者だけにとどまらず各機関に所属する他の研究者の協力も得ながら直ちに開始することが決定された。アジアの経済危機という事態に直面し、法律制度についての理論的研究は緊急性すら感じられ、「商品売買における危険負担の法理」、「家族法」、「労働市場の変容に伴う労使関係法の変革」、「知的財産法の国際的調和」、「地方分権と憲法」、「各国における法学研究及び法律体系への国際公法の役割」、「法制史」、などの個別テーマについての研究が当面推進されることになった。なお、危険負担概念についての比較法的研究、養子縁組制度、商標法その他若干のテーマについては、3月の会合を利用してつっこんだ議論がなされた。初年度の基礎作業を背景にして2年度は実質的な研究が遂行された。

「商品売買における危険負担の法理」、「家族法」、「労働市場の変容に伴う労使関係法の変革」、「知的財産法の国際的調和」、「地方分権と憲法」、「各国における法学研究及び法律体系への国際公法の役割」、「法制史」、などの個別テーマについての研究が行われた。新たに共同研究組識に加わったチュラロンコン大学の海外共同研究者は「法と宗教」の関係の研究を遂行することになった。E-mailで大体の事柄は伝達できるが、意思疎通を補完し、理解の徹底を図る目的で研究代表者は12月にタイ、香港、ニュージーランドを訪問し、それぞれの研究協力組識で研究内容の確認をした。またニュージーランドに行ったついでにオーストラリアに立ち寄り、追加的共同研究組識として可能性のあるメルボルン大学アジア法研究所を訪れ情報を収集するとともに、共同研究参加を依頼した。本研究開始初年度に最高潮を迎えたアジアの経済・通貨危機という事態に直面し、法制度支援が国際的関心事となったが、本研究もそれに関わる研究テーマを追加した。その結果、最終年度のタイに関する研究については、経済危機と法制度改革に焦点を当て、経済法中心の共同研究をすることにした。特定されたテーマは「通貨危機下での契約法」「破産法」「新しいビジネス環境での法律家の役割」「コーポレト・ガバナンス」である。最終年度の平成12年度は、中国法とタイ法に特に着目して計画を締めくくった。タイのチュラロンコン大学およびタマサート大学との共同研究からわかったことは、植民地支配のなかったアジア地域においては、伝統社会の中に西欧法をそれぞれの社会に適合する工夫をした上で取り込むという19世紀以来日本も経験したことと同様な作業を今日も行っているということであった。とりわけ経済法に特化した最終年度での研究は消費者保護法、知的財産法、会社法、情報公開法など、両国が抱えている法制度改革問題を比較検討することによって、植民地化されなかったという意味において比較的同一の歴史状況を共有する両国にとって、グローバル化した現代における法律問題に多くの共通項があることが確認された。中国との共同研究でも、やはり経済法の領域を抽出し、どのような姿勢で法制度改革に臨んでいるかを研究した。中国では市場経済への移行という大きな国家目標の下で、経済法を中心に精力的な法制度改革が行われており、本研究で特に焦点をあてた商法についての特別共同研究において法による国家構造改革がきわめて重要であることが明らかになった。日本法がおかれている問題関心とは異なる部分もあったが、新鮮な視点を見出すこともできた。太平洋地域、すなわちカナダとニュージーランドの協力校のインプットは最終年度では最小限になったが、これは、「アジア法」を考える場合、基本的にコモンローを中心に西欧法そのものを実践している両国の経験は、本研究の主題にとって、必ずしも大きな影響をもつものではないことがわかってきたためである。成果報告書の付録に収録したいくつかの論文は、本研究の具体的な成果であるとともに、将来のアジア法研究にとっての土台となるものである。
ナラティブアプローチによる新人日本語教師の主体性に関する基礎研究

「留学生30万人計画」の達成目標年を2020年にひかえ、国内大学のグローバル化戦略の一環として留学生誘致が盛んになるなど、今後、日本語教育に期待される役割は増大していくことが予想される。その中で日本語教師に求められる主体性とは何か。本研究では、新人日本語教師の経験に注目し、日本語教師が教師になる経験を二つの質的データ分析法を用いて検討し、今後、現場の日本語教師が日本社会において新たな役割を構想するための理論モデルについて検討した。2013年度は、以前から調査を実施している新人日本語教師3名に加え、2名に対するフィールド調査と16名に対するインタビュー調査を平行して実施した。3名のデータからは、新人日本語教師の教師としての主体性の発露と教育機関への参加が、同時平行的になされるものであることが示された。その一方で、教育機関への参加が「日本語教師の仕事とはこういうものである」という職業理解を超えない場合、与えられた枠組みの中で仕事をこなし再生産するという可能性も示された。このことから、日本語教師にとって「教育機関の移動」が成長に繋がることの背景には、日本語教育の枠組みそのものが問われる経験において、教師が自身が日本語を教える意味そのものに向き合う経験をしているかが重要な要素になってくると考えた。このことから、教師の教育機関への参加をより構造的に捉えるために、16名の新人教師の教育機関への参加における問題点についてM-GTA(修正版グラウンデッドセオリー)を用いて分析を行った。その結果、授業について問題を感じている教師たちは、教育機関において授業を自由に見ることが許されておらず、自力で教授技術を身につけることが求められる一方で、チームティーチングで授業にかかわることにより、割り当てをこなすことが求められるという、個体主義的・同調主義的な環境におかれていることが示された。その一方で、3年目以上の教師からは、教育機関の制約を自己流にアレンジしている教師との出会いや大学院での学びによって「そうじゃなくてもいい」ことに気づき、自身の指針をとらえ直していることも示された。今後、フィールド調査とインタビュー調査を継続することで「日本語を教える意味に向き合う経験」の有無からデータを再検討し、日本語教師の主体性と日本語教育理解のあり方との関連性について検討する予定である。前年度から引き続き、新人日本語教師のインタビュー調査を実施するとともに、現在までの研究調査によって得られた知見を中間報告としてまとめ、研究集会や学会、また、出版物として公開した。当初の計画では、新人教師をめぐる問題のみを検討する予定であったが、調査によって見えてきた、日本語教師がおかれた教師環境をより大きな問題状況としてとらえることの必要性から、新人教師に限定された問題としてではなく、現職教師全体にかかわる問題として教師の主体性についての考察を進めている。また、現職教師が自身の主体性を発揮する場の構築を意図して、現職教師を対象とした研究会を新たに立ち上げ運営することで、理論で見いだされたことの実践的なアプローチとしての可能性を探っているところである。研究会は、前年度に関東で立ち上げたものと同様、拘束性を生み出すものから教師の関係性を逸脱させる契機(=同僚性コミュニティへの契機)として、教師のナラティブを位置づけることを志向し、関西で立ち上げたものであり、現職の教師の学びのあり方という実際的な課題から、教師の主体性にアプローチすることを可能にするものである。今後の方針として、まず、この研究会に参加している教師の学びと意識変容のプロセスを解明し、関東の研究会におけるものと比較検討することによって、今までの研究成果から導き出された理論モデルを、より汎用性の高いものへと精緻化していくことがある。さらに、研究開始時から継続的に調査に協力していただいている3名の日本語教師の語りについて、新たにデータを収集し、分析を重ねることによって、新人から経験者へと教師が自己認識を変容させる契機を明らかにできると考えており、自己認識の変遷からも、教師の主体性にアプローチする予定である。最終年度は、調査協力者の新人教師に対して、継続的なインタビュー調査を行うと同時に、現職教師を対象に同僚性についての調査を実施し、新人教師の主体性について、主に教師環境の観点から検討した。また研究成果を公開するため、原稿の執筆を行った。新人教師のインタビューからは、新人教師が一人前になり、授業外の仕事を引き受けるようになることによって、授業についての研鑽の機会をもてなくなる一方で、後進の初任教師の指導を行わなければならない状況の中で、それまでに培った自身の教育実践観を知識として、固定化し供与せざるを得ない環境におかれていることも見えてきた。このことが示すのは、養成機関で習得した典型的な授業方法や教育実践観が、時間的制約があり研修の機会ももてない中で、かつての新人教師自身によって、再生産されている可能性である。一方で、継続的に調査に協力していただいた教師たちからは、調査によって定期的に自分の考えを語り、以前の考えとの相違を問われることで、教師としての自分を振り返るいい機会になっているという声が、同様に聞かれた。このことは、先行研究で指摘されているように、ナラティブを生成する(語る)行為そのものが、リフレクション(省察)の機会をもたらしている可能性を示しており、教師が自身の考えを語る機会を確保していくことが、教師研修において重要であることを示している。

本研究では、新人日本語教師の経験に注目し、日本語教師が教師になる経験を二つの質的データ分析法を用いて検討し、今後、現場の日本語教師が日本社会において新たな役割を構想するための理論モデルについて検討した。研究年度途中で、研究代表者が研究機関を異動することになったため、新たに調査協力者を募らなければならないこととなり、データ収集が遅れた。その一方で、新たな教育機関において、同様の課題を見出し、教師を対象とした研究会を立ち上げることで、実践において、理論を再検討する機会をもつことができた。すでに収集したデータと分析をもとに、成果公開は行っているが、より汎用性の高い理論モデルを構築するべく、今後、データ収集とさらなる分析をすすめる予定である。日本語教育学実績概要部分での記述と重複するが、当初、新人教師を対象とし、調査分析をすすめていたものの、分析から導き出された「個体主義性」「同調性」に支えられた「こなしていけば終わるシステム」の存在は、日本語教育で広く受容されている「教師の自己成長」論とも符合するものであり、日本語教師の主体性があらかじめ「枠組みの中での教授方法の工夫」に限定されることを示すものであった。その結果を受けて、現職教師を含めた全体的な教師論として、教師の主体性を検討する必要があると判断したことから、議論の射程を拡大している。その一方で、新人日本語教師に特有の問題も存在するはずであり、今後は、新人教師が経験者となるプロセスをより詳細に検討することで、新人から経験者へというプロセスにおける主体性のあり方について検討していきたい。当初、10名の新人教師に対するフィールド調査のみを実施し、結果をSCATを用いて理論化する予定であったが、調査前段階で実施した新人教師に対するインタビュー調査から、多くの新人教師が自身の授業に問題を感じながら、その一方で教育機関の中でサポートを受けられないまま、日本語授業を担当しているという問題が見えてきた。そのため、より多くの新人教師の声を捉えるために、インタビュー調査の実施とその分析に時間をかけた。10名の予定であった、フィールド調査は現段階では5名にとどまっているが、M-GTAを用いて、授業に問題を感じている教師たちの環境を分析することで、フィールド調査での観点が定まり、今後、調査を有効に進めていくことができると感じている。当初の計画とは異なるアプローチをとることになったが、フィールド調査を進め、3年以上の経験をもつ教師の語りを集めることで、今年度中に葛藤とその解消までのプロセスの一つのあり方を示せるのではないかと考えている。研究代表者の研究機関異動により、調査協力者とのやりとりに影響が生じ、新たな調査協力者を選ばざるを得なくなった。また、理論化の方法を変更したため、データ処理・分析に時間がかかっていることから、未使用額が生じた。今後、5名の教師に対するフィールド調査を継続しながら、3年以上の経験をもつ教師に対するインタビュー調査を実施する予定である。研究計画にあげた、ナラティブアプローチを用いた事例研究を行いながら、それを理論にまとめるために横断的に分析するという手法で、全体をまとめる予定である。
ミスト冷却における表面熱抵抗層による急冷促進効果

(1)実験パラメータとして水の過冷度(82K),平均粒径(2766μm),質量速度(0.040.78kg/m^2s),空気の流速(37m/s)を変化させて,ミスト冷却実験を行ったが,本年度は,前年度不十分であった実験パラメータ,とくに,水滴の平均粒径,空気の流速が金属裸面における熱伝達特性に及ぼす影響について重点的に調べた。電気炉で所定の温度(750°C)まで加熱された銀製試験体(直径30mm,厚さ10mmの円盤)を2流体ノズルから噴出する水・空気二相噴流(ミスト流)により急冷した。急冷中の試験体の温度変化は,熱電対からの電気信号をAD変換ボードを通して記録計に連続収録した。また,水滴間の相互干渉を高速度ビデオカメラで撮影し,パーソナルコンピュータを用いて画像処理して粒径分布を詳細に解析した。(2)次に,試験体に熱伝導性の悪い耐熱塗料を焼き付けることによって表面熱抵抗層を設け,これを用いて上記(1)の裸面の場合と同様に実験を行い,熱伝達の促進に及ぼす熱抵抗層の厚さ(338μm)の影響を明らかにした。本年度は,前年度より厚い耐熱塗料を焼き付けた試験体を用いた実験を重点的に行った。熱抵抗層を設けることにより,ミスト冷却熱伝達が大幅に促進されること,熱抵抗層が厚いほど伝熱促進効果が大きくなることが明らかになった。この傾向は,先に報告した浸漬冷却と同じであって,膜沸騰状態でも液体が伝熱表面の一部に間欠的に接触することにより,膜沸騰から遷移沸騰へ早期に移行するためであるとする間欠性固液接触モデルの妥当性が確認された。(1)まず,金属裸面における熱伝達特性を調べるため,電気炉で所定の温度(750°C)まで加熱された銀製円盤(直径30mm,厚さ10mm)を2流体ノズルから噴出する水・空気二相噴流(ミスト流)により急冷した。急冷中の試験体の温度変化は,熱電対からの電気信号をAD変換ボードを通してパーソナルコンピュータによって制御されたMDディスクドライバに転送することによって連続収録するとともに,プリンタに出力して常時モニタした。実験パラメータとして,水過冷度(82K),平均粒径(2766μm),質量速度(0.040.78kg/m^2s),空気の流速(37m/s)を変化させて,熱伝達特性に及ぼす影響を明らかにした。(2)次に,試験体に熱伝導性の悪い耐熱塗料を焼き付けることによて表面熱抵抗層を設け,これを用いて上記(1)の裸面の場合と同様に実験を行い,熱伝達特性に及ぼす熱抵抗層の厚さ(338μm)の影響を調べた。この傾向は,先に報告した浸漬冷却と同じであって,膜沸騰状態でも液体が伝熱表面の一部に間欠的に接触するとにより,膜沸騰から遷移沸騰へ早期に移行するためであるとする間欠性固液接触モデルの妥当性が確認された。(3)今後,熱抵抗層を有する試験体を用いて,水の過冷度,平均粒径,質量速度,空気の流速などの実験パラメータを広範囲に変化させた実験を行うことによりミスト冷却の制御技術を確立する予定である。また,先に浸漬冷却を対象として開発した間欠性固液接触モデルをミスト冷却へ拡張し,上記の実験で得られた結果と比較,検討する。

(1)実験パラメータとして水の過冷度(82K),平均粒径(2766μm),質量速度(0.040.78kg/m^2s),空気の流速(37m/s)を変化させて,ミスト冷却実験を行ったが、本年度は,前年度不十分であった実験パラメータ,とくに,水滴の平均粒径,空気の流速が金属裸面における熱伝達特性に及ぼす影響について重点的に調べた。電気炉で所定の温度(750°C)まで加熱された銀製試験体(直径30mm,厚さ10mmの円盤)を2流体ノズルから噴出する水・空気二相噴流(ミスト流)により急冷した。急冷中の試験体の温度変化は,熱電対からの電気信号をAD変換ボードを通して記録計に連続収録した。また,水滴間の相互干渉を高速度ビデオカメラで撮影し,パーソナルコンピュータを用いて画像処理して粒径分布を詳細に解析した。(2)次に,試験体に熱伝導性の悪い耐熱塗料を焼き付けることによって表面熱抵抗層を設け,これを用いて上記(1)の裸面の場合と同様に実験を行い,熱伝達の促進に及ぼす熱抵抗層の厚さ(338μm)の影響を明らかにした。本年度は、前年度より厚い耐熱塗料を焼き付けた試験体を用いた実験を重点的に行った。熱抵抗層を設けることにより,ミスト冷却熱伝達が大幅に促進されること,熱抵抗層が厚いほど伝熱促進効果が大きくなることが明らかになった。この傾向は,先に報告した浸漬冷却と同じであって,膜沸騰状態でも液体が伝熱表面の一部に間欠的に接触することにより,膜沸騰から遷移沸騰へ早期に移行するためであるとする間欠性固液接触モデルの妥当性が確認された。
大規模疎行列系連立一次方程式の数値解の高速な精度保証法に関する研究

本年度の主な研究成果は以下のとおりである.(1)大規模連立一次方程式のための高速精度保証法の開発(2)連立一次方程式の数値解に対する非常にシャープな精度保証法の開発(3)丸めモードの変更を用いないポータブルな精度保証法の開発(4)実対称行列の各固有値・固有ベクトルに対する精度保証付き数値計算法(1)に関して,連立一次方程式の精度保証付き数値計算を実用レベルで適用するために,より大規模で広いクラスの疎行列の取り扱いについて考えた.その研究成果として,特別な構造を持つクラスの行列のうち,一般化優対角行列,対称正定値行列を係数とするような大規模疎行列系の連立一次方程式に対する高速な精度保証法を考案した.(2)に関して,従来の精度保証を拡張し,これまで誤差の上限のみを求めていたものを,下限も同時に求めることにより,精度保証自体の品質を向上させる方式を提案した.(3)に関して,JavaやFORTRAN77など言語として丸めモードをサポートしていないような計算環境における連立一次方程式の精度保証付き数値計算について研究した.これと高精度内積計算を組み合わせて,丸めモードが利用できない計算環境でも高品質な精度保証が可能となる手法を開発し,それを数値実験で確かめた.(4)に関して,実対称行列の各固有値・固有ベクトルに対する精度保証法について研究した.これは,昨年度までに開発してきた固有値の精度保証をさらに発展させたものであり,計算量をほとんど増加させることなく,固有ベクトルに関しても実用的なレベルの誤差限界を得ることができることを示し,さらにそれを数値実験によって確かめた.本年度の主な研究成果は以下のとおりである,(1)高速な浮動小数点演算を用いた高精度な計算法の考案(2)区間行列乗算の高速化(3)大規模連立一次方程式のための高速精度保証法の開発(1)に関して,IEEE754浮動小数点規格に従うハードウェア上で実行可能な高速かつ高精度な内積計算アルゴリズムを開発した.これは特定のハードウェアに依存しないため多くの現行の計算機に適用可能である.また,内積計算は科学技術計算の基礎のひとつであり,線形問題の広い範囲に応用できる.これを研究成果として論文にまとめ,その結果,応用数学に関する国際的な論文誌であるSIAM Journal on Scientific Computingに採録決定となった.(2)に関して,線形問題の精度保証付き計算では要素が区間であるような行列の積が頻繁に現れることから,その高速化について考察した.これは近年,OishiとRumpによって考案された丸めモードの制御を巧妙に利用した演算方式をさらに高速化したもので,丸めモード制御演算方式を用いるど区間行列同士の積は点行列同士の積の約4倍のコストで計算できたが,これをさらに約2倍のコストにまで抑えることができることを示した.これを研究成果として論文にまとめ,その結果精度保証付き数値計算に関する代表的な論文誌であるReliable Computingに採録された.(3)に関して,大規模で密な係数行列を持つ連立一次方程式の数値解に対する精度保証法を開発した.近年,OishiとRumpによって考案された精度保証法は,数値解を得る手間と同等のコストで実行できるが,それが失敗したときにその結果を再利用してロバストかつ高速(約4倍のコスト)に精度保証ができることを示した.これは情報処理学会論文誌「数理モデル化とその応用」に採録された.本年度の主な研究成果は以下のとおりである.(1)大規模連立一次方程式のための高速精度保証法の開発(2)悪条件連立一次方程式の精度保証付き数値計算法(3)実対称行列の各固有値に対する精度保証付き数値計算法(1)に関して,大規模密行列を係数行列とする連立一次方程式を計算機上で解いた場合に得られる近似解と厳密解との定量的誤差評価について研究した.これにより,小規模な問題を扱っているときには見えなかった従来の精度保証方式の限界を明らかにすると共に,大規模な問題に適応した新しい精度保証方式を提案した.数値実験によって,分散並列計算で100CPUを用いて,密行列で3万次元という大規模な問題に対して提案方式を用いると近似解の計算時間の約3倍以内でその精度保証が可能であることを示した.(2)に関して,任意に条件数が大きい(問題を解くのが難しい)連立一次方程式のための精度保証付き数値計算について研究した.ここでは,Rumpによる条件数が大きい行列の近似逆行列を反復改良的に求める方式を実装し,その中で高精度な内積計算が非常に有効に作用することも示した.すなわち,連立一次方程式の問題の難しさを,内積を高精度に計算する問題に帰着できることを示した.さらに残差反復法と組み合わせることにより,ユーザが指定した精度を持つ数値解を計算することが可能となり,それを数値実験で確かめた.(3)に関して,実対称行列の各固有値に対する精度保証法について研究した.これは,Rumpの方法及びWilkinsonの方法を組み合わせたものである.Rumpの誤差評価定理によって固有値の存在範囲を特定し,そこからWilkinsonの誤差評価を用いることにより,計算量をほとんど増加させることなく,シャープな誤差限界を得ることができることを示し,さらにそれを数値実験によって確かめた.本年度の主な研究成果は以下のとおりである.(1)大規模連立一次方程式のための高速精度保証法の開発(2)連立一次方程式の数値解に対する非常にシャープな精度保証法の開発(3)丸めモードの変更を用いないポータブルな精度保証法の開発(4)実対称行列の各固有値・固有ベクトルに対する精度保証付き数値計算法

(1)に関して,連立一次方程式の精度保証付き数値計算を実用レベルで適用するために,より大規模で広いクラスの疎行列の取り扱いについて考えた.その研究成果として,特別な構造を持つクラスの行列のうち,一般化優対角行列,対称正定値行列を係数とするような大規模疎行列系の連立一次方程式に対する高速な精度保証法を考案した.(2)に関して,従来の精度保証を拡張し,これまで誤差の上限のみを求めていたものを,下限も同時に求めることにより,精度保証自体の品質を向上させる方式を提案した.(3)に関して,JavaやFORTRAN77など言語として丸めモードをサポートしていないような計算環境における連立一次方程式の精度保証付き数値計算について研究した.これと高精度内積計算を組み合わせて,丸めモードが利用できない計算環境でも高品質な精度保証が可能となる手法を開発し,それを数値実験で確かめた.(4)に関して,実対称行列の各固有値・固有ベクトルに対する精度保証法について研究した.これは,昨年度までに開発してきた固有値の精度保証をさらに発展させたものであり,計算量をほとんど増加させることなく,固有ベクトルに関しても実用的なレベルの誤差限界を得ることができることを示し,さらにそれを数値実験によって確かめた.
分子病態に基づく血球貪食性リンパ組織球症の新規診療基盤開発

家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)に対する包括的診断体制を確立する過程で、従来のNK細胞を用いた解析に比較し、CD57陽性CTL分画を用いた脱顆粒機能解析がスクリーニング検査として優れていることを見出した。又、allogenic LCLに特異的なFHL3患者由来CTLライン、及びHerpesvirus Saimiriを用いて不死化したFHL2・FHL3患者由来CTL細胞株を作成し、これらにPRF1・UNC13D遺伝子の変異cDNAコンストラクトを強制発現させて、蛋白発現・脱顆粒機能・細胞傷害活性に与える影響を解析する系を確立した。血球貪食性リンパ組織球症(HLH)の病態を解明する為、以下の項目について研究・解析を行った。A)機能解析・蛋白発現解析・全既知遺伝子解析による原発性HLHスクリーニング:当科に寄せられたHLH症例に対して、1NK細胞及びCTLの脱顆粒機能解析、2FHL責任分子の蛋白発現解析、3既知の原発性HLHの遺伝子解析(PRF1/UNC13D/STX11/STXBP2/SH2D1A/BIRC4/ITK)による網羅的解析を行った所、本邦に於けるFHLのスクリーニングとしては2のみでほぼ充分である事が判明した。但し、BIRC4欠損症には非常に軽症な症例が存在する為、遺伝子解析が必要であることが判明した。B)既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立:ヒトNK細胞株(KHYG1)及びCTL細胞株(TALL-104)をもとに、UNC13D exon 1の開始コドン近傍の下流に配列特異的な人工DNAヌクレアーゼであるTALEN及びCRISPR/Cas9の標的部位を設定し、それぞれ設計・発現ベクター作成を行った。同時にターゲティングベクターとして同標的部位の両側1kbsの相同配列を持つピューロマイシン耐性遺伝子ユニットのコンストラクトを作成し、Electroporation法を用いた二重鎖切断とターゲティングベクターの共導入によるUNC13D遺伝子ノックアウトと薬剤耐性ユニットの組み込みを行った。但し、TALL-104に関して増殖が悪く欠損細胞株の確立が難しい状況であり、現在はKHYG1細胞株を中心に作成を進めている状況である。D)バイオマーカー解析によるHLH病態解析:HLH症例の凍結保存血漿を用いて蛍光マイクロビーズを用いた網羅的サイトカイン検索を行った。血球貪食性リンパ組織球症(HLH)の病態解明を目的に、以下の項目について研究・解析を行った。A)機能解析・蛋白発現解析・遺伝子解析による原発性HLHスクリーニング:前年度に引き続き、当科に解析依頼のあったHLH症例に対して、1NK細胞及びCTLの脱顆粒機能解析、2家族性HLH(FHL)の責任蛋白発現解析、3既知の原発性HLHの責任遺伝子解析を行い、通常の遺伝子解析では変異を同定出来なかったが12の方法でFHL3型の診断が可能であった症例を経験し、その原因が遺伝子の部分重複である事を解明した。B)FHL遺伝子変異の機能解析系確立:FHL3患者由来のCTLライン作成に成功し、同細胞に変異UNC13DのcDNAコンストラクトを強制発現させて、蛋白発現や脱顆粒機能に与える影響を解析する系の確立にほぼ成功した。C)HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成:FHL3症例由来iPS細胞株は作成済みである。その他のHLH症例由来の細胞を多数保存しており、必要に応じてiPS細胞を樹立する準備を整えている。D)バイオマーカー解析によるHLH病態解析:FHL3に加え、EBV-HLHや原因不明二次性HLH症例のCTLラインを作成しており、これら細胞株を用いたトランスクリプトームやプロテオーム解析の準備を整えている。A)原発性HLHスクリーニングに関しては、通常の遺伝子解析では診断困難である症例に関しても有効であることが示され、症例集積も順調に進んでいる。B)FHL遺伝子変異の機能解析系確立に関しては、FHL3患者由来のCTLライン作成に成功し、同細胞に変異UNC13DのcDNAコンストラクトを強制発現させて、蛋白発現や脱顆粒機能に与える影響を解析する系も確立しつつあり、順調に推移している。C)HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成に関しては、FHL3症例由来のiPS細胞株は既に樹立しており、今後の作成に向けて多数のHLH症例由来の細胞を保存している。D)バイオマーカー解析によるHLH病態解析については、保存血漿サンプルを用いた網羅的なサイトカイン解析は、検体採取時期や保存方法の問題が多く現実的では無い事が判明したため、患者由来CTLラインを用いたトランスクリプトームやプロテオーム解析を行う方法への変更を進めている。これに向けて、FHLやEBV-HLH、原因不明二次性HLH症例のCTLライン作成を進めている所である。総合的に見ると、昨年度の問題点をかなり克服出来ており、ほぼ遅れを取り戻している。A)機能解析・蛋白発現解析・遺伝子解析による原発性HLHスクリーニング:前年度に引き続き、当科に解析依頼のあったHLH症例に対して、1NK細胞及びCTLの脱顆粒機能解析、2家族性HLH(FHL)の責任蛋白発現解析、3既知の原発性HLHの責任遺伝子解析を行い、FHL2(1症例)、FHL3(2症例)、XLP2(1症例)を診断した。二次性症例を含めて順調に症例の集積が進んでいる。B)FHL遺伝子変異の機能解析系確立:FHL2とFHL3患者由来のアロ抗原

特異的CTLライン、及び不死化CTL細胞株の作成に成功し、それぞれの細胞株にPRF1及びUNC13DのcDNAコンストラクトを強制発現させて、蛋白発現・脱顆粒機能・細胞傷害活性に与える影響を解析する系の確立に成功した。この系を用いて、これまで疾患原性の不明であった変異の解釈が可能となった。加えて、munc13-4分子の蛋白安定性や構造に関する知見も得られており、細胞傷害性顆粒の放出機構解析に寄与する事が期待される。C)HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成:FHL3症例由来iPS細胞株は作成済みである。その他のHLH症例由来の細胞も多数保存しており、必要に応じてiPS細胞を樹立する準備を整えている。D)バイオマーカー解析によるHLH病態解析:FHL2/FHL3に加え、二次性HLH症例のCTLラインを作成・保存している。一部の検体については、トランスクリプトームやプロテオームを含めたマルチオミックス解析を開始している。家族性血球貪食性リンパ組織球症(FHL)に対する包括的診断体制を確立する過程で、従来のNK細胞を用いた解析に比較し、CD57陽性CTL分画を用いた脱顆粒機能解析がスクリーニング検査として優れていることを見出した。又、allogenic LCLに特異的なFHL3患者由来CTLライン、及びHerpesvirus Saimiriを用いて不死化したFHL2・FHL3患者由来CTL細胞株を作成し、これらにPRF1・UNC13D遺伝子の変異cDNAコンストラクトを強制発現させて、蛋白発現・脱顆粒機能・細胞傷害活性に与える影響を解析する系を確立した。A)原発性HLHスクリーニングに関してはかなり確立した系が構築されており、順調に症例の集積が進んでいる。B)既知FHL遺伝子変異の機能解析系の確立に関しては、DNA編集技術はほぼ確立しているものの、元となる細胞株の増殖が悪く、目的とするFHL責任遺伝子欠損細胞株の確立には至っていない。機能解析対象となる変異UNC13D遺伝子コンストラクトは作成済みであり、細胞株が樹立すれば機能解析はすぐにでも行える状態である。C)HLH患者由来iPS細胞ライブラリーの作成に関しては、FHL3患者由来のiPS細胞株が樹立されているが、そこからCTLやNK細胞への分化系が確立されていない。D)バイオマーカー検索に関しては、保存血漿サンプルを用いて蛍光マイクロビーズによる網羅的サイトカイン検索を行ったが、検体採取の時期や保存方法が統一されておらず充分な解析が行えなかった。上述の通り、一部の項目に問題があり予定通りに進んでいない為、全体として研究予定よりやや遅れている。ただし、各々の問題点を改善・克服する方策を検討中であり、今後の進展が期待できる状況である。平成28年度は計画の最終年度であり、以下の項目別に解析を行う予定である。A)原発性HLHスクリーニングをこのまま継続して症例を集積すると共に、病態解析に使用する検体の採取・保存を行う。B)
子宮頸部HPV陰性腺癌の分子生物学的特徴と新規治療法の開発

本研究は、HPV陰性の子宮頸部腺癌の分子生物学的特徴および免疫学的特徴を明らかとすることを目的とする。本年度は、子宮頸部陰性腺癌の新規症例の集積を行った。また、年度の前半は産後休暇・育児休暇で基礎実験が難しかったため、診療録に基づき臨床病理学的検討を実施した。年度後半は陰性腺癌の狙い組織検体を用いて細胞株の樹立を試みた。(結果)平成30年度にHPV検査を実施した子宮頸部腺癌14例中、新規HPV陰性腺癌の症例は3例(21.4%)であった。組織型は類内膜腺癌1例、通常型2例であった。この3例のうち2例で細胞株の樹立を試みたが、樹立に失敗した。このため、新たな手技が必要と考え、子宮頸癌のオルガノイドによる培養を試みている。HPV検査には時間がかかるため、培養途中でHPV感染の有無が確定する。現在、3例の腺癌についてオルガノイドを作成した。HPVの結果はすべて16型陽性であったが、3週間程度の培養には成功し、同時に腫瘍浸潤リンパ球の抽出にも成功した。今後、陰性腺癌であった場合、陰性腺癌細胞に対する自己リンパ球の反応性の検討が可能と考えられる。年度前半は産休・育休を取得し、基礎実験ができなかった。一方で、HPV陽性腺癌ではあるが、オルガノイドの樹立に成功した。この手法で陰性腺癌細胞に対する自己リンパ球の反応性の検討が可能と考えられる。子宮頸部HPV陰性腺癌のオルガノイドによる細胞培養を行い、自己リンパ球の反応性を検討し、新たな免疫療法の可能性を探究する。本年度は、子宮頸部陰性腺癌の病理学的特徴を免疫組織化学によって検討した。また、新鮮凍結した組織が保存されていた7例について、マイクロアレイを行い、HPV陽性腺癌との遺伝子発現の差を検討した。また、陰性腺癌の狙い組織検体を用いて細胞株の樹立を試みた。(結果)2012年から2014年に子宮頸部腺癌と診断した68例のうち、PGMY-line blot法によって子宮頸部腺癌と診断された症例は20例で全体の29.8%であった。この割合はこれまでの報告とほぼ一致していた。これらの20例について、代表的な子宮頸部腺癌の発現マーカーであるHIK1083、p53、p16、Ki-67、MUC6の免疫組織化学を行った。結果、陽性率はそれぞれ40%(8/20)、p53は40%(8/20)、p16は75%(15/20)、Ki-67は50%(10/20)、MUC-6は60%(12/20)であった。HPV陰性腺癌7例および陽性腺癌6例についてマイクロアレイを行いP値が0,05以下の遺伝子は約4200個あった。MCM2などの細胞分裂に関与する遺伝子が陰性腺癌では有意に低値であった。本年度の陰性腺癌症例が2例のみであり、細胞株樹立を試みたが、1例は樹立に失敗し、現在、1例について樹立を実施中である。この2例については、免疫学的解析を実施するため、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離して保管している。さらに症例を蓄積して、TILの解析を実施する計画である.子宮頸部HPV陰性腺癌症例を20例、集積し、免疫染色によって発現マーカーの検討が終了した。また、新鮮凍結検体を7例所有し、マイクロアレイも予定通り実施できた。子宮頸部HPV陰性腺癌の細胞株を作成し、抗がん剤への感受性、薬剤スクリーニングを実施する予定である。細胞株の樹立ができない場合は、マイクロアレイの結果をもとに、癌シグナルの同定を行い、ターゲットとなる薬剤を検討する。