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感染・炎症関連発がんの分子機構の解明とがん予防

生物学的・物理化学的要因により生じる慢性炎症はがんの重要なリスクファクターである。感染・炎症関連発がんにおいて、炎症関連分子COX-2の発現が上昇し、その核内移行が幹細胞の増殖・分化に寄与する可能性を示した。慢性炎症下でNF-κB活性化を介したiNOS発現上昇によりニトロ化遺伝子損傷である8-ニトログアニンが幹細胞マーカー陽性細胞に蓄積し、幹細胞の遺伝子変異に至る分子機構が発がん機序の一端を担うと推定された。感染症および慢性炎症が全世界の発がん要因の約25%を占める。我々はこれまでに感染・炎症によって生じた活性酸素/窒素種を介したDNA損傷、特に変異誘発性DNA損傷塩基8-ニトログアニンおよび8-oxodGが発がんやその進展に重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。近年、感染・炎症によるエピゲノム異常(DNAメチル化、ヒストン修飾、microRNA等)が明らかになりつつある。さらに慢性炎症で組織再生のために増殖する幹細胞の発がんへの関与も注目される。感染やアスベスト曝露により、発がん好発部位に8-ニトログアニンが生成することを示した(Hiraku et al.Ann.NY Acad.Sci.,2010)。また、炎症関連酸化ストレスの遺伝子発現影響について検討した。ヒト前骨髄球性白血病由来HL-60細胞およびその過酸化水素耐性株を用いて過酸化水素を反応させ、遺伝子発現およびmicroRNAレベルを解析した。その結果、過酸化水素を介した酸化的DNA損傷とCYP1A1等の代謝酵素の発現上昇が認められた。また、当該遺伝子の3'UTRに相補性を有するmicroRNAが減少した。酸化ストレスが直接的にDNA損傷を引き起すことに加えて代謝酵素が発現上昇することで種々の発がん物質を代謝活性化し、DNA損傷、ひいては発がんのリスクを高める可能性が示された。また、種々の発がん性アリルアミンが代謝活性化を受け、DNA付加体形成のみならず、酸化的にDNAを損傷し、発がんに寄与するが、それにはN-hydroxy体をはじめとする化学構造が重要であることを明らかにした(Murata and Kawanishi, Front Biosci., 2011)。炎症がゲノム・エピゲノムへの異常を誘発し(突然変異や染色体不安定化、DNAメチル化、等)発がんに寄与する機構が明らかになりつつある(J Biomed Biotechnol, 2012 in press)。我々は寄生虫感染(Schistosoma haematobium)膀胱炎および癌において、nuclear factor-κB(NF-κB)やinducible nitric oxide synthase(iNOS)の発現上昇を認め、ニトロ化DNA損傷塩基である8-ニトログアニンの生成を確認し、また、膀胱炎・膀胱癌で幹細胞マーカーOct3/4陽性細胞が有意に増加していることを明らかにした(BBRC,2011)。さらに、炎症関連分子であるCOX-2の核内移行が膀胱発がんに重要であり、S.haematobium感染膀胱癌ではOct3/4が、散発性(非S.haematobium感染)膀胱癌においてはCD44v6が幹細胞マーカーとして有用であることが示唆された(Mediators Inflamm. 2012 in press)。また、タイ肝吸虫関連胆管癌においては、炎症によりトランスフェリンのタンパク酸化修飾がおこり、鉄の蓄積・放出により、更なる酸化ストレスが生じることを明らかにした(Free Radic Biol Med, 2012 in press)。一方、工業素材として注目されるカーボンナノチューブについて、ヒト肺上皮細胞を用いて生体影響を検討した。カーボンナノチューブによりiNOS発現及び一酸化窒素生成量が有意に上昇し、8-ニトログアニンが生成した。エンドサイトーシス阻害剤により8-ニトログアニン生成等が抑制され、電子顕微鏡によりカーボンナノチューブの細胞内取り込み量が減少したことから、エンドサイトーシスが作用機構の一つとして重要であることが明らかになった(Toxicol Appl Pharmacol, 2012 in press)。工業素材である多層カーボンナノチューブはエンドサイトーシスによりヒト肺上皮細胞に取り込まれ、DNAに酸化・ニトロ化損傷を引き起すことを見いだし、8-ニトログアニンが炎症起因物質の曝露マーカーとして有用な候補分子であることを明らかにした(Toxicol Appl Pharmacol, 2012)。また、タイ肝吸虫感染によるタンパクの酸化が胆管癌の発症および進展に重要な役割を果たすことを明らかにした。すなわち、鉄結合タンパクであるトランスフェリンの酸化損傷により鉄イオンが放出され、更なる酸化ストレスの要因となること、また、α1-アンチトリプシンやHSP70の酸化損傷が患者の予後と関連した(Free Radic Biol Med, 2012)。さらに、胆管癌におけるDNA損傷性が幹細胞マーカー陽性例と陰性例で有意に異なることを見いだした(論文投稿中)。胆管癌組織よりDNAを抽出し、メチル化DNAを収集し、次世代シークエンサーを用いたゲノムワイド解析を行っている。

ビルハルツ住血吸虫感染膀胱癌において幹細胞マーカーOct3/4の発現が高いのに対し、非感染膀胱癌ではCD44v6が高い発現を示し、COX-2の核内移行がこれらの幹細胞増殖に寄与する可能性が示唆された(Mediators Inflamm, 2012)。逆流性食道炎においてプロトンポンプ阻害剤を使用することで抗酸化酵素Mn-SODの発現が増強され、変異原性のあるニトログアニンの生成が抑制されることを明らかにした(Biochem. Biophys. Res. Commun, 2012)。以上より、感染・炎症関連発がんにおいて、酸化・ニトロ化ストレスが重要な役割を果たし、幹細胞における遺伝子損傷が発がんの分子機構の一端を担うことが示唆された。炎症特異的DNA損傷マーカーと幹細胞の関与を感染・炎症関連発がんにおいて検討を行い、膀胱癌においてがん予防に有用なバイオマーカーとして炎症マーカーCOX2と、幹細胞マーカーOct3/4あるいはCD44v6が利用できる可能性を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、タイ肝吸虫感染胆管癌についても幹細胞マーカー陽性細胞と炎症特異的DNA損傷、COX2の関連性を検討中である。また、Epstein-Barr virus感染上咽頭癌でのエピゲノム異常について次世代シークエンサーを用いて解析中であり、ゲノム・エピゲノム両面でのアプローチも順調に進行している。
寒冷地における家畜糞尿メタン発酵処理に関する研究

室内実験において乳牛糞尿を対象に多孔体を固定床とした高負荷運転槽と長期貯留型発酵槽の連日投入試験を行った。1.高負荷運転槽発酵容積101のステンレス製実験用発酵槽を5基試作し、ポリウレタンとポリエステルを固定床とし発酵温度を40°Cとして高負荷連続運転を行った。その結果、有機物負荷8kg/m^3以上でこれら多孔体の効果が認められた。これについては平成7年度の農業施設学会で発表を予定している。2.長期貯留型発酵槽3.バイオガス発電実験北見市の実用規模メタン発酵施設にガスエンジンを設置し、発電を行い、バイオガスによる発電が可能であることを実証した。4.実用施設の熱収支の試算と施設設計今後、これらの成果をもとに実用施設の設計を行う。
都市温暖化に伴う降雨形態の変遷の解明の将来予測の評価及び河川計画への応用

本研究では、近年の都市温暖化と降雨形態の変化傾向の相関の実態を地上気象観測のデータから把握し、実際に降雨形態がどのように変遷してきたかを解明した。その中でいくつかの典型的な事例を抽出し、気象モデルによる数値シミュレーションを実施し、異なった気候状態から計算を開始することで都市域での降雨形態がどのように変化するかの将来予測を行った。調査対象は大阪都市圏とした。本研究は大きく分けて次の3段階に分けて実施した。1)地上気象観測データによる近年の都市温暖化傾向と降雨形態の実態の把握2)高解像度雲モデルを用いた現象,特に過去に甚大な洪水被害をもたらした降雨現象の再現実験3)都市気候変化の降雨現象に及ぼす影響予測のための数値シミュレーション約30年間の地上気象データにより大阪都市圏における夏季の降雨形態の変遷過程の実態を都市温暖化との関連に注目して解析し、その結果に基づき、気象予報モデルにより大阪都市圏における夏季の局地循環の再現数値シミュレーションを行った。都市気候変化の降雨現象に及ぼす影響を検討するため、地上気象データの解析から明らかになったこれまでの気温上昇傾向を加味するとともに、現時点での降水時の特徴的な条件を付加することで仮想的な将来の都市大気環境を作成した。現在状態と将来状態との数値シミュレーションを行い、その差異から都市化が降雨に及ぼす影響を評価した。想定される都市化の度合いの様々なシナリオに基づき感度実験を行った。本年度は,これまでの都市温暖化の傾向と降雨形態の相関の実態を地上気象観測のデータから把握し,実際に降雨形態がどのように変遷してきたかを解明することを目的とした.そのために,気象庁所管の各地の気象台やアメダス観測点での地上気象データを収集した.1976年から2002年の長期にわたるデータを揃え,最近30年近くの都市温暖化の傾向と降雨形態の変遷過程について調査を実施した.対象地域は大阪平野部の都市圏を中心とした近畿地方とした.大阪を対象とした理由は,既往の研究では東京を中心とする首都圏での都市気象・降水現象の解析が多く,大阪圏を対象とした研究例が極めて少なかったためである.日本で2番目の都市圏である大阪では,平野部が首都圏よりもかなり狭く,その周囲には山地が取り囲み,さらに近郊には神戸や京都といった大都市を控えており,首都圏に比較して極めて地域性の大きさが顕著であると考えられる.都市温暖化の問題(いわゆるヒートアイランド現象)は,近年においては夏季における暑熱化が大きく取り上げられており,エネルギー需要の問題とあいまって,大きな環境問題のひとつになっている.アメダスのデータにより,大阪都市圏における夏季の気温の変化傾向を調べた結果,大阪平野部におけるすべての観測点において,日本の平均的な気温上昇率を上回っていることが分かった.特に,豊中・枚方といった大阪の衛星都市部での気温の上昇率が極めて高いことがわかった.同時に,夏季の降水量の変化傾向を調べた結果,大阪・神戸・堺といった古くからの大都市においては顕著な傾向は認められなかったものの,一方,豊中・枚方・箕面といった周辺都市部では1日に1mmの降水という微雨の頻度が増加していることがわかった.また,強雨の傾向を調べたところ,主要な観測点においては増加や減少といった傾向は明瞭ではなかった.成果は国内・国外の学会で発表した.昨年度実施した30年近くに及ぶ長期間の気象データの分析により、大阪平野部の都市圏での降雨は微雨の頻度が増加する傾向にあり、一方集中豪雨といった強雨の頻度には明瞭な傾向はなかったことが示された。本年度は、都市温暖化(ヒートアイランド化)の影響が支配的な条件(晴天日)での降雨形態の変遷過程を引き続き気象データの解析により調べた。その結果、微雨の増減傾向は必ずしも明確ではないことがわかった。一方、都市ヒートアイランド化の強化に伴い日照時間が減少傾向にあることがわかった。すなわち雨が降るには至らなくても雲の発生が多くなっていると考えられる。この解析と同時にメソスケール気象モデルMM5を用いて大阪都市圏を対象領域とした数値シミュレーションを行った。最初に夏季晴天日の局地循環を再現し、モデルで設定可能な様々なパラメータに対する依存性を調べた。

再現性を確認した上で、大阪平野部の都市化が現在よりさらに進んだ状態(ここでは建築構造物の高層化が進むものと仮定)をモデルの下端境界条件として与え、局地循環や雲・降雨の出現パターンの違いについて調べた。その結果、都市化が進んだ状態では都市中心部に流入する海風が強まり、同時に風の収束も強まることが分かった。さらに雲量が若干増加することが分かった。一方、計算対象とした期間は降雨がもともとなかった期間であるが、将来状態においても降雨の発生は見られなかった。これには大気の安定度の違いも関連している。特に水蒸気量に対する感度が高いものと考えられる。そのため、水蒸気量の鉛直分布の違いによってどのような形態の降水システムが発達するのかという観点から、より簡単な条件設定のもとでの仮想的な数値実験を行った。以上の研究の成果は国内・国外の学会で発表をした。本研究では、近年の都市温暖化と降雨形態の変化傾向の相関の実態を地上気象観測のデータから把握し、実際に降雨形態がどのように変遷してきたかを解明した。その中でいくつかの典型的な事例を抽出し、気象モデルによる数値シミュレーションを実施し、異なった気候状態から計算を開始することで都市域での降雨形態がどのように変化するかの将来予測を行った。調査対象は大阪都市圏とした。本研究は大きく分けて次の3段階に分けて実施した。1)地上気象観測データによる近年の都市温暖化傾向と降雨形態の実態の把握2)高解像度雲モデルを用いた現象,特に過去に甚大な洪水被害をもたらした降雨現象の再現実験3)都市気候変化の降雨現象に及ぼす影響予測のための数値シミュレーション過去2年間において、約30年間の地上気象データにより大阪都市圏における夏季の降雨形態の変遷過程の実態を都市温暖化との関連に注目して解析し、その結果に基づき、気象予報モデルにより大阪都市圏における夏季の局地循環の再現数値シミュレーションを行った。平成17年度では、その数値シミュレーションを引き続き行なった。都市気候変化の降雨現象に及ぼす影響を検討するため、地上気象データの解析から明らかになったこれまでの気温上昇傾向を加味するとともに、現時点での降水時の特徴的な条件を付加することで仮想的な将来の都市大気環境を作成した。現在状態と将来状態との数値シミュレーションを行い、その差異から都市化が降雨に及ぼす影響を評価した。数値シミュレーションにおいては、想定される都市化の度合いの様々なシナリオに基づき感度実験を行った。本研究で得られた成果は、関連学会で発表し、論文としてまとめて関連学会誌に投稿した。
single digit ナノスケール場の破壊力学

single digitナノスケール(1nm 10nm)の応力特異場を有する材料に対するその場観察破壊実験方法を開発し、シリコン単結晶の実験より特異場寸法4nmであっても破壊靭性値は不変であることを明らかにした。また、第一原理解析と実験が一致することを示すとともに、応力特異場が2nm以下の場合に従来の破壊力学基準が破綻する(連続体破壊力学の適用下限)ことを明らかにした。H25年度の研究実績は、以下のように纏めることができる。(1)ナノ構造体中の原子位置を正確に特定するために、走査型透過型電子顕微鏡(Scanning Transmission Eleetron Microscope : STEM)を導入した。当該電子顕微鏡については、明瞭な観察が出来るよう高傾斜角仕様とし、single digitナノスケール場のひずみ量を正確に特定・解析するために特注サイズの制限視野絞り(φ1μm)を具備させた。シリコン(Si)に対して観察を行い、原子レベルの像を取得できることを確認した。(2)トップダウン型手法である集束イオンビーム(Focused IonBeam : FIB)加工によりSi模擬試験体を作製してき裂を導入し、STEMを用いてき裂先端近傍の原子位置の観察を行った。(3)微小構造体への負荷、および、single digitナノひずみ集中場で不安定なイベント(局所破壊の発生)が発生した際の荷重変化の検知が可能な微小負荷装置を開発した。当該ホルダは、二軸傾斜機構を有することから、観察に最適な方向に試験片を配向して試験を実施できる。また、これらの負荷装置を制御するためのソフトウェア開発を行い、プログラム荷重への対応と分解能の向上を行った。この微小負荷装置をTEM用ホルダの先端に組み込み、STEMと併せてその場観察負荷試験システムを構築した。(4)FIBにより作製したSi試験体および現有の微小負荷装置を用いて、single digitナノ領域における破壊実験を達成するための実験手法について検討を行い、微小構造体に対するき裂導入手法を考案した。(5)連続体解析と原子系解析より不均一変形場における破壊力学量について検討を実施した。(6)加工仕上げ条件の工夫と現有の超低エネルギーイオンミリング装置を用いて、加工層を2nm以下にまで低減させることに成功した。(7)連続体力学解析および原子系解析によってナノ構造体に対する変形集中場に関する解析を実施し、次年度以降の試験体の形状(切欠きの位置や形状)や負荷様式等、最適の実験条件を検討した。H26年度の研究実績は、以下のように纏めることができる。1.表面損傷層のないナノひずみ集中場をトップダウン型手法によって作製する手法を開発した。対象材料であるシリコン(Si)単結晶ナノ構造体に集束イオンビーム(Focused Ion Beam : FIB)加工で予めナノサイズの切り欠きを形成し、ある特定の条件下での高真空・高温環境中熱処理を実施することで、FIB加工によって導入されたガリウムイオンが消失し、アモルファスとなっていた表面損傷層が単結晶に復元することを明らかにした。実際に力学負荷用試験片を作製して熱処理を施し、表面損傷層のないsingle digitナノスケールのひずみ集中場を実現できることを電子線回折像を用いて確認した。2.専用の微小負荷装置を用いて、トップダウン型手法によって作製したナノ構造体に対して負荷実験を実施した。single digitナノひずみ場に適用した場合に必要と考えられる実験諸条件(負荷様式や観察方法)を抽出し、次年度以降実施予定の実験に必要な負荷装置の精密な調整を行った。3.次年度作製予定の分子線エピタキシー(Molecular Beam Epitaxy : MBE)を利用したボトムアップ型ナノ構造体作製装置に関する基本仕様の決定を行い、設計を実施した。4.原子系解析について検討を行い、ナノ構造体の変形集中場解析のための諸条件を抽出した。さらに、ナノ構造体の変形集中場における理論的予測を実施した。これらの研究内容は国外からも高い評価を受け、北村(研究代表者)が破壊に関して世界的に権威のある国際学会“20th European Conference on Fracture"から基調講演(Plenary Talk)を依頼された。また、澄川(研究分担者)が国際誌「Engineering Fracture Mechanics」における特集号「Nanoscale Fracture_ECF20」のゲストエディターに選出され、嶋田(研究分担者)が若手科学者賞(科学技術分野の文部科学大臣表彰)を受賞した。H27年度の研究実績は、以下のように纏めることができる。1.形状・寸法を力学的にデザインしたシリコン(Si)微小試験体にナノサイズの切り欠きを設けて真空高温熱処理を行い、制御されたナノレベルの微小開口変位を与えて切り欠き底からき裂を発生させることで、single digitナノスケールの応力特異場を有する無加工層試験体の作製に成功した。2.平成25年度に開発した微小負荷装置を用いて走査型透過型電子顕微鏡(STEM)内その場観察き裂伝ぱ試験を実施し、その挙動をその場観察した。応力特異場の寸法が異なる複数の試験体を用いて同様の試験を実施し、特異場寸法4nmの大きさであっても破壊じん性値は不変であることを明らかにした。3.応力集中場の特異性がき裂とは異なる切り欠きについてもその先端にsingle digitナノスケールの応力集中場を実現することに成功した。STEM内で切り欠き底からの破壊発生試験を実施し、破壊時の強度を得た。

き裂とは異なり、切り欠きの場合には応力集中場の寸法が減少するとともにその破断強度が上昇し、Siの理想強度に漸近することを明らかにした。一方、その先端で応力が無限大に発散するき裂の場合には、き裂先端からほぼ原子一個分の距離の応力値がSiの理想強度に達した際に破壊が進行することを明らかにした。4.原子レベル解析に基づいて破壊基準に関する検討を実施し、実験結果との比較を行うことで、ナノスケールの応力集中場における一般化された力学的支配法則に関する検討を行った。き裂先端における応力特異場の大きさが2nm以下になる場合には、原子の離散性により連続体仮定に基づく破壊力学的基準が破綻することを明らかにした。さらに、き裂先端の離散場と原子結合が切断される際のエネルギー収支を考慮した新しい破壊基準を提案し、これによつて従来の破壊力学基準が破たんする場合にも、その破壊挙動を記述できることを示した。5.分子線エピタキシー(MBE)法に基づくナノ構造体作製装置を作製し、無加工層ナノ要素作製のための条件の抽出を実施した。また、無損傷ナノ構造体作製装置を応用し、次年度(平成28年度)の研究対象である異材界面を有するナノ構造体の作製検討を実施した。6.線形弾性変形を示すSi微小試験体を用いた議論に加えて、非線形弾性変形を示すグラフェンを対象としてその場観察引張破壊試験を実施し、その破壊じん性を得ることに成功した。これらの研究内容は国外からも高い評価を受け、Pan Stanford Publishing社からの依頼により「Fracture nanomechanics 2nd edition」を執筆し、出版に至った。H27年度の計画は、1. “制御されたsingle digitナノひずみ場を有するナノ試験体の創製"、2. “その場観察微小負荷試験"および3. “原子レベル解析を実行"である。申請時の予定に沿って、分子線エピタキシー(MBE)法に基づくナノ構造体作製装置を開発した。また、ナノ構造体に微小な切り欠きを導入し、開口変位を与えて切り欠き底からき裂を発生させることでsingle digitナノひずみ場を有する試験体の作製を行った。このとき、開口変位量の調整や試験片寸法の縮小のみでは目的とするsingle digitナノひずみ場を取得することに限界があった。そこで、試験片形状を力学的にデザインすることで、制御されたsingle digitナノひずみ場を実現することに成功した。平成25年度に構築した試験システム(走査透過型電子顕微鏡(STEM)+微小負荷装置)を用いて、試験体に対するその場観察微小負荷試験を実施し、single digitナノひずみ場から破壊が進行する様子を観察するとともに、その強度を特定した。試験片と同様の力学状態を有するモデルを作成して原子レベル解析を実施し、実験結果との比較および破壊を支配する力学因子についての検討を行った。特に、き裂先端における離散的な破壊挙動は、一般に厳密な特定が困難であるが、原子系の不安定性を評価する独自手法を用いることでこれを明らかにした。
農作業における労働負担の計測法の研究

半導体素子を用い、センサにより変換された電流または電圧を、長時間、簡便に記録する方法が開発され、商品化されたので、これを活用し、農作業における労働負担の有効な計測法を確立することを研究目的とする。研究方法は、携帯用記憶装置(VAIN)により、市販または試作した各種センサの情報を記憶させ、読取装置によってデータを処理した。メモリ容量は4096×8bitで、情報間隔は3段階に調節できる。試作したものを含めて使用したセンサは、心拍数、皮ふ温、歩数である。別に、周囲騒音及びエネルギ代謝量も測定している。耕うん作業、刈拂作業及び技打作業について、これら計測法とタイムスタディにより労働負担状況を調査した。心拍数計測の結果は、タイムスタディの結果とほぼ符合する。心拍数は個人差が大きいが、心拍数計測の評価方法として、次式の心拍増加率(R)を用いるのが適当と考えられる。R=〔(作業時心拍数)-(安靜時心拍数)〕/(安靜時心拍数)心拍増加率からみると、耕うん作業は刈拂作業よりも労働負荷が大きい結果となり、RMRのの計測結果とも符合した。圃場における農作業の解析ということからは、皮ふ温測定はその効果に問題がある。試作した歩数測定は、データ処理の方法を検討する必要はあるが農作業の解析とくにモーションスタディの面からみて有効な手段になると考えられる。携帯用記憶装置は、読取装置を必要とするが、計測は比較的簡便であり、各種作業の評価比較に活用される可能性が大きく、使用目的に応じたセンサの利用により、農作業の計測に活用されることが期待される。
糸球体内皮細胞“孔”を構成する蛋白質の特定

腎不全とは糸球体濾過量の低下であり、その糸球体濾過は糸球体基底膜、上皮細胞スリット膜、そして糸球体内皮細胞(GEnC)に存在する“孔"の三因子によって構成される。今回の我々の研究は、この『“孔"を構成する蛋白質を特定すること』を目的とした。まずはIgA腎症を対象とし、「孔」を含めた内皮細胞の微細構造を電子顕微鏡を用いて検討した。またマウスの腎臓から糸球体内皮細胞を分離するため、Immortomouseより糸球体内皮細胞を単離培養し、さらに抗CD31抗体を用いて糸球体内皮細胞の純度をあげ、FACSで解析した。糸球体内皮細胞のカベオラをキットを用いて単離し、今後は質量分析を行う。腎糸球体内皮細胞(GEnC)における「孔」については不明な点が多いが、疾患発症に重要な「孔」の構成蛋白を検討するため、ヒトHomologue検討の下地となる研究から着手した。血尿や蛋白尿の出現する腎炎では形態学的な変化が予想される。そこで成人で最も多い糸球体腎炎であるIgA腎症を対象とし、感染を契機に肉眼的血尿のみられる群と肉眼的血尿のないIgA腎症を対比することで、「孔」などの微細構造を検討する事から始めた。初年度は、1999年から2009年までに当院で腎生検を行いIgA腎症と診断された患者(通常診断に必要な電子顕微鏡所見の得られているもの)23名につき検討を始めた。IgA腎症の組織障害の程度については、日本腎臓学会の重症度分類およびOxford分類を用いた。具体的には、腎生検を施行する半年以内に肉眼的血尿を認めた10名と認めない13名の腎生検組織に対し、超微形態研究部門の透過型電子顕微鏡を用いて糸球体毛細血管係蹄の拡大像を分割撮像した。その後画像ソフトphotoshopを用いて画像を合成し、血管の内径(cap)と血管内皮細胞のfenestration(F)といわれる「孔」の長さを計測し、F+NF/capを計算(NFとはfenestrationがない部分の長さを示す)することで、「孔」の状態を検討した。腎糸球体内皮細胞(GEnC)における「孔」については不明な点が多いが、疾患発症に重要な「孔」の構成蛋白を検討するため、H26年度はヒトHomologue検討の下地となる研究から着手した。そこで成人で最も多い糸球体腎炎であるIgA腎症を対象とし、感染を契機に肉眼的血尿のみられる群と肉眼的血尿のないIgA腎症を対比することで、「孔」などの微細構造を検討をした。H27年度はH26年度の研究結果に基づいて、マウスの腎臓からGEnCを分離するため様々な角度から検討を重ねた。幾つかの論文で示されているマウスGEnCの分離方法をそれぞれ試してみたが、細胞株樹立には至っていない。また、マウスGEnCを分離したとする研究室に細胞株の分譲を依頼したが連絡なく、若干の遅れが生じている。腎不全とは糸球体濾過量の低下であり、その糸球体濾過は糸球体基底膜、上皮細胞スリット膜、そして糸球体内皮細胞に存在する“孔" (窓、fenestra)の三因子によって構成される。上皮細胞スリット膜に関する研究は、スリット膜を構成する蛋白質(ポドシン・ネフリン)が発見されたことにより、最近10年間で飛躍的に進歩し、治療法にも大きな影響を与えた。一方、孔を構成する蛋白質は未だに発見されていない。今回の我々の研究の最終目標は、この『“孔"を構成する蛋白質を特定すること』をであり、また未知となっている糸球体内皮細胞に存在する孔の機能を解析することである。H26年度はヒトHomologue検討の下地となる研究から着手した。Immortomouseより糸球体内皮細胞を単離培養し、さらに抗CD31抗体を用いて糸球体内皮細胞の純度をあげ、FACSで解析した。糸球体内皮細胞のカベオラをキットを用いて単離し、質量分析を行う。

当初はマウスからヒトへ検討を進める予定であったが、これまで「孔」について着目した検討が少なく、研究対象となる「孔」構成蛋白を絞ることが困難で時間を要した。そこでヒト検体の検討から始め、効果的な選択の根拠とすることにしたため、若干達成度が落ちたと考えられる。Immorto mouseを用いたマウスGEnC分離や、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた内皮細胞機能の検討を試みる。腎臓内科学今後、F+NF/capの測定結果と個々の患者の臨床データ、治療薬(特にレニン・アンジオテンシン系阻害薬)との関連を明らかにし、「孔」の研究意義と研究の効率化を図る。「孔」の病的意義を明らかにしたうえで、糸球体血管内皮細胞の微細構造の検討を推進し、「孔」を構成する重要な蛋白の同定へ進む。さらに同定された蛋白の検討をヒト腎生検組織の検討にフィードバックし、臨床的意義を確認する。研究成果発表のための学会参加をしていないため、旅費が余剰分として算出されている。使用額については、臨床検体の検討に終始し、糸球体内皮細胞の「孔」を構成するタンパク質質の検討が進まなかったため、試薬などの購入が少なかった。研究成果を発表するため、学会・講演などに積極的に参加する。糸球体内皮細胞の微細構造の検討を推進し、「孔」を構成する重要な蛋白の同定へ進む。これには内皮細胞の培養、「孔」の構造解明、さらに病因的に重要な同蛋白の同定が含まれる。絞り込まれた蛋白がヒト腎生検組織にどのように発現検討しているかを検討し、その臨床的意義を確認する。
破骨細胞分化制御因子の統合的解析-RANK/NFkBとc-fosとの相互作用-

1.ヒト前骨髄球性白血病細胞株であるHL-60を活性型ビタミンDおよびTPAで刺激することにより破骨細胞/マクロファージ系への分化を誘導すると、RANK mRNAの発現が著明に誘導された。2.上記のRANK発現誘導は機能的なRANKタンパクの細胞膜への発現を伴うことがMBP-RANKLを用いたin vitro結合アッセイにより確認された。3.この分化誘導刺激の際、gel shift assayでみたAP-1結合能の活性化がRANKの発現にやや先立って起こった。4.上記のAP-1の活性化はc-fosの発現そのものの上昇をも伴っていた。5.上記の如くRANKの発現を誘導したHL-60細胞をRANKLで刺激すると、AP-1およびNF-kB活性が上昇することがgel shift assayにより確認された。6.分化誘導によりRANKを発現したHL60-細胞をRANKLで刺激するとRANK自身の発現がmRNAおよびタンパクレベルで増加した。7.c-fos遺伝子ノックアウトマウスの脾細胞をM-CSF存在下で培養すると、RANK陽性の破骨細胞前駆細胞が得られた。これをRANKLで刺激すると程度は弱いものの、AP-1、NF-kBの活性化が認められた。以上の検討により、c-fosはRANKの発現そのものやRANKによるAP-1,NF-kBの活性化には必須でないことが明らかとなった。また、RANKLがRANK自身の発現を誘導するpositive feedbackにより破骨細胞分化が進行していく可能性が示された。RANKLの直接の標的遺伝子は他には知られておらず、RANKプロモーターはRANKLシグナルおよびこれにおけるc-fosの特異性を解析する有力なtoolとなり得るものと考えられた。研究初年度の本年は、破骨細胞分化の基本制御因子RANKLおよびその受容体RANKの発現調節機構とその下流シグナルの基礎的な解析を以下の如く行った。1)ヒト前骨髄球性白血病細胞株であるHL-60を活性型ビタミンDおよびTPAで刺激することにより破骨細胞/マクロファージ系への分化を誘導すると、RANK mRNAの発現が著明に誘導された。2)上記のRANK発現誘導は機能的なRANKタンパクの細胞膜への発現を伴うことがMBP-RANKLを用いたin vitro結合アッセイにより確認された。3)この分化誘導刺激の際、gel shift assayでみたAP-1結合能の活性化がRANKの発現にやや先立って起こった。4)上記のAP-1の活性化はc-fosの発現そのものの上昇をも伴っていた。一方、RANKの下流シグナルに関しては、5)上記の如くRANKの発現を誘導したHL-60細胞をRANKLで刺激すると、AP-1およびNF-kB活性が上昇することがgel shift assayにより確認された。6)RANKLの直接の標的遺伝子についてはほとんど知られていないが、上記のRANKを発現したHL-60細胞をRANKLで刺激すると、RANKの発現が上昇することが明らかとなった。これはRANKのシグナルが破骨細胞分化を促進するとともに、分化段階が進むにつれてRANKそのものの発現も高まるというpositive feedback機構の存在を示唆する。これらの知見をもとに、破骨細胞分化、あるいはRANKLの直接刺激に伴うRANKの発現誘導がc-fos自身に依存するか否か、さらにNF-kBの活性化そのものにc-fosが関与するか否かを明らかにするため、現在、c-fosノックアウトマウスを用いた検討を進めている。
モンゴル帝国治下中国における宗教の様態とモンゴル政権の文化政策

モンゴル帝国治下中国における文化政策の様相について、主に中国の他時代の岳涜祭祀に対する政権の態度と比較検討することによって、岳涜祭祀の盛況さの原因を探った。その結果、四方の山川神を祭る岳涜祭祀を行う背景には、「領域概念」・「天下概念」とも呼ぶべき領域支配への意識があり、モンゴル帝国の支配によって中国が一つの王朝下に支配された時代となった点が、岳涜祭祀の盛況さの一因となったと結論づけた。また、道教教団と政権の関係を中心に時代的な特色が強調されてきた、この時代の文化政策の理念やあり方は、中国王朝の統治手法を踏襲する側面も大きかった点も明らかになった。本年度は、昨年度に引き続き、『元代史研究文献目録1971-1988』(立正大学東洋史研究室、1991)の凡例に沿って、1989年以降に発行されたモンゴル帝国治下中国の祭祀・宗教・文化政策、及び政治・社会など本研究課題の対象となる研究文献の収集・整理とデータベース化を、大学院生を雇用して進めた。特に中国大陸・台湾の書籍収集とその調査、データベース構築を中心に進め、併せて、日本国内での関連研究を収集した。これらの作業・調査を通じて、中国の宗教・祭祀の研究においては、社会や民衆個々の問題と絡めて論じられることは多いが、政治や文化政策との関係を論じるものは多くなく、言及しているものでも近年の歴史研究の成果が十分に生かされていないということがわかった。ただ、その研究成果には、政治や政策研究に有用なデータや主張もあったので、それらを歴史研究に生かすことが今後必要になると考えられる。また、本課題研究開始以前からの研究成果と、本年度の資料講読の成果を併せて、河南省済源県の済涜廟に現存するモンゴル時代の碑刻資料「皇太子燕王嗣香碑」について、済涜廟管理処の副主任姚永霞氏と共著で、その研究成果を発表した。その論文ではモンゴル時代の済涜祭祀の特徴を論じるとともに、当時の中央の政治状況が地方社会や地方の宗教・祭祀に如何に関わるのかという点を明らかにできた。また、この論文の作成・発表を通じて、済涜廟など現地機関との共同調査や資料公開促進への道筋もできたと考える。さらに、本課題研究の対象とするモンゴル時代の祭祀・宗教のうち、他の岳涜祭祀について詳細に検討する道筋もつけられたと思う。本年度は、最終年度にあたるため、モンゴル政府による祭祀活動の研究成果を公にすることを第一の目標とした。昨年度公刊予定だった中国語による論文「元代的岳涜祭祀:以済涜廟祭祀為中心」は、編集の都合から公刊が本年度になった。これに加え、「モンゴル時代の済涜祭祀ー唐代以来の岳涜祭祀の位置づけの中でー」を発表した。これらを通じて、岳涜祭祀が持つ政治的な重要性、とりわけ、モンゴル時代における「領域概念」・「天下概念」との関わりについて、中国の他時代の研究と比較しながら明らかにすることできた。モンゴル帝国の支配によって中国が一つの王朝下に支配された時代となった点が、岳涜祭祀の盛況さと関係があったと結論づけた。また、道教教団と政権の関係を中心に時代的な特色が明らかになっていたモンゴル時代の宗教・文化政策のあり方が、実は、中国の伝統的な王朝の統治政策を踏襲する側面も大きく、特に、理念としては、中国歴代王朝の様態との比較が有効であることもわかった。このような分析方法は、新出・新公刊資料を駆使して、今後も活発になっていくと思われる。モンゴル帝国治下中国の祭祀・宗教・文化政策などと関連する研究文献の収集・整理とデータベース化(1989年以降)は、外国語文献の収集整理を完了することが叶わなかった。しかし、本課題研究終了後も引き続き整理を続け早期に公刊する予定である。本課題研究を通じて、済涜廟との学術的な交流も軌道に乗ってきた。外国史の研究では現地との地道な交流が不可欠であり、今後につながる礎を築けたと考える。同時に、本課題で明らかになった成果をホームページで公開した。その内容は現時点では直接的な成果(論文等)の提示に止まっているが、今後、利用者視点の情報を採り入れ、現地のサイトや旅行情報のページと有機的なリンクをはかることで、歴史的な学術成果を広く利用してもらえるように更新を行っていく。本年度は、これまで同様、『元代史研究文献目録1971-1988』(立正大学東洋史研究室)の凡例に沿って、1989年以降のモンゴル帝国治下中国の祭祀・宗教・文化政策、及び政治・社会などと関連する研究文献の収集・整理とデータベース化を進めた。

中国大陸における近年の出版物増加にともない、新出著作の収集に力を入れた。日本国内では、他の時代における本項目との関連課題(礼楽祭祀・教育・仏教研究)でめざましい進展が見られたため、その内容を理解してモンゴル帝国時期との比較をしたり、方法的応用が可能かについて考察を加えたりした。夏期休業中には、所属大学の国外学会参加費の補助を受けて本項目の成果を報告するとともに、その学会の前後を利用して、北京・天津の教育施設・宗教施設の現地踏査を行った。この学会参加を通じて得られた情報については、関連する科学研究費の研究項目の成果として、渡辺健哉氏と共著で学会参加記録を公刊した。この学会発表と現地踏査を通じて、本課題に関わる関連施設の保存の現状及び最新の研究成果を知ることができ、近年の中国における研究の数的・質的上昇を痛感するとともに、本課題におけるデータベース作成の価値を再認識することができた。上記の学会で報告した「元代の岳涜祭祀ー済涜廟祭祀を中心としてー」(邦訳名)は、モンゴルの五岳四涜に対する祭祀活動が持つ意味について、モンゴル時代特有の領域概念・天下意識などと結びつき、またそれを探る糸口となることについて提起したもので、『元史論叢』第14輯へ投稿し、平成25年度中に公刊される予定である。これまで続けてきた済涜廟との学術的な意見のやりとりも継続させている。本年度までに作成を分担した放送大学のテレビ科目「歴史からみる中国」の第6・7回講義及びその教科書(吉澤誠一郎編著、放送大学教育振興会)にも、本研究の成果が反映されていることを付記しておく。研究費を節約すべく学内外における「中国知識資源総庫(CNKI)整備の推移を見守っていたため、中国語論文の収集に若干の遅れが出た。代わりに、中国語著作の収集を一気に進めることで、次年度以降に繋げた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究論文の準備作成については当初の計画通り進めているが、所属大学で検討されていた「中国知識資源総庫(CNKI)の購入が正式に見送られたため、データベース作成のための中国語論文の収集遅れが大きくなってきた。概ね当初の計画どおりに作業を進めているが、新出資料の整理に、今後、当初予測以上の時間が必要になることも予想されるため、研究成果公開の方法についてウェブ上以外での公開方法も検討する。平成25年後は最終年度にあたるため、考察の成果については具体的な論文として発表する。データベースの構築と、一般向けの中国祭祀施設関連マップの作成については、謝金や業務委託では予算の不足が明らかであるため公開方法の変更も検討するほか、平成24年度、海外学会での報告や外国語論文の校閲という本研究課題の成果公刊を所属機関内の研究補助予算で行ったように、学内の補助が得られないかどうかも検討していく。
学び続ける専門職としての体育・スポーツ指導者養成における「わざ言語」の活用

本研究の目的は、「わざ言語」を活用しながら、学び続ける専門職としての体育・スポーツ指導者を養成するカリキュラムの開発であった。次の3点について明らかにした。(1)教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにした。(2)「指導ことば」に着目し、それに対する視点の育成を意図した教科教育法の模擬授業における成果を検証した。(3)体育の教科専門科目における器械運動の実技実習的な授業の中で、実際の授業の結果を対象にして事例的に記述した。本研究の目的は,「わざ言語」を活用しながら,学び続ける専門職としての体育・スポーツ指導者を養成するカリキュラムの開発である。初年度である平成26年度は,次の研究を実施した。1.日本や諸外国における教員・指導者養成に関する文献・資料を収集した。そして,「わざ言語」や「指導ことば」に着目して,体育科教員及びスポーツ指導者養成に関連する記述がある箇所の抽出を行った。2.体育授業において,子どもが運動を感覚的に理解したり,運動課題を解決するためのイメージを膨らませたりすることができる「指導ことば」に着目し,教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにした。受講生に考案させた具体的な言葉かけの内容を分析した結果,以下のことが明らかになった。1)映像を視聴して言葉かけを行うといった課題を繰り返し遂行することは,「指導ことば」に対する視点を育むにあたって有効に機能していた。2)物や道具を扱う運動では,擬音語を用いた「指導ことば」を用いる傾向がみられた。3)動きの達成度を高めていく運動では,動きを随伴的に引き出す「指導ことば」を用いる傾向がみられた。4)新たな動きを獲得・形成する運動では,比喩による「指導ことば」を用いる傾向がみられた。5)運動観察の対象となりやすい主要局面に着目した「指導ことば」言葉かけが多いという特徴がみられた。3.本研究課題に関連して,次の研究発表を行った。「教員養成段階の保健体育専攻学生が用いる指導ことばの特徴ーe-Learningによる模擬授業のリフレクション課題を通してー」平成26年度第4回日本科学教育学会研究会.本研究の目的は,「わざ言語」を活用しながら,学び続ける専門職としての体育・スポーツ指導者を養成するカリキュラムの開発である。2年度めである平成27年度は,次の研究を実施した。1.日本や諸外国における教員・指導者養成に関する文献・資料の収集を継続した。そして,「わざ言語」や「指導ことば」に着目して,体育科教員及びスポーツ指導者養成に関連する記述がある箇所の抽出を継続して行った。2.「指導ことば」を用いることが可能な教科指導の力量形成を意図する教員養成カリキュラムの開発に向けた基礎的研究として,教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにした。模擬授業において,運動技能に改善が必要であると思われる受講生が活動している場面を中心として抽出した「言葉かけチャレンジ映像」を視聴させ,運動技能の向上を促すオリジナルの言葉かけを考案させることを課題とし,時間的経過に伴う言葉かけの変容と運動領域別にみた言葉かけの特徴について考察を行った。3.中学校保健体育科の器械運動領域・マット運動において,演技中の頭・腰・足の位置や動く早さに着目し,課題となる技の動きに応じて,技を行うための「コツ」を使ってアドバイスをし合いながら演習する活動を位置づけた授業を実践した。動きを修正するために必要な「コツ」を付箋紙に記入して「『コツ』こつシート」に貼付し,それを使ってアドバイスし合いながら練習を行う活動を位置づけた。その結果,ある生徒は,「『コツ』こつシート」に貼付された友の「コツ」を使いながら練習を行うことで,開脚前転で起き上がる自らの「コツ」を見つけることができたことから,動作の行い方を理解し,自己の体の動きを感じる力を高め,回転スピードを上げて膝を伸ばした開脚前転を行うことに有効であることが示唆された。2年度めである平成27年度は,教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにすることができた。その結果,「指導ことば」を用いることが可能な教科指導の力量形成を意図する教員養成カリキュラムの開発に向けた基礎的研究となった。この研究成果について,『信州大学教育学部研究論集』に研究報告として掲載することができた。また,「わざ言語」や「指導ことば」を用いた指導を行う前段階として,子どもが「コツ」を共有する授業実践を行った。この研究成果について,信州大学教育学部附属長野中学校の研究紀要にまとめる指導を行った。このように,研究目的の達成に向けて研究および実践を蓄積してきていることから,おおむね順調に進展していると考えられる。最終年度である平成28年度は,次の研究を実施した。1.小学校教員免許取得希望者を対象とした体育の教科専門科目における器械運動の実技実習的な授業の中で,(1)受講学生の実技能力に対応して,授業の中での習得率の高い技は何か(授業において新たに達成できる傾向の高い技は何か),(2)受講生にとって指導言語の有効性を実感しやすい技は何か,という2つの観点から,実際の授業の結果を対象にして事例的に記述した。その結果,

(1)鉄棒運動系は総じて授業開始時における習得率が低く,授業の中で新たな達成に導く可能性を大いに有していること,(2)特に,鉄棒運動系の前方支持回転は,受講生たちの多くが有している「素朴概念」との関係から,教師の指導言語の有用性を極めて鮮明に,そして印象的に経験しうる可能性が高いこと,の2点が示された。2.子どもが運動を感覚的に理解したり,運動課題を解決するためのイメージを膨らませたりすることができる「指導ことば」に着目し,それに対する視点の育成を意図した教科教育法の模擬授業における成果を検証した。その結果,全6回の模擬授業の前後に実施した「言葉かけ研究会」においては,受講生の言葉かけに質的変容が見られ,また,言葉かけに質的変容が見られた受講生は,運動実施にかかわるつまづきの分析が適確であり,それを学習者に伝達されやすいような言葉に再構成しようと試みていることが明らかになった。3.本研究課題に関連して,次の研究発表を行った。藤田育郎・高山幸一「体育授業における『指導ことば』に対する視点の育成」日本教育メディア学会2016年度第2回研究会(信州大学),など。本研究の目的は、「わざ言語」を活用しながら、学び続ける専門職としての体育・スポーツ指導者を養成するカリキュラムの開発であった。次の3点について明らかにした。(1)教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにした。(2)「指導ことば」に着目し、それに対する視点の育成を意図した教科教育法の模擬授業における成果を検証した。(3)体育の教科専門科目における器械運動の実技実習的な授業の中で、実際の授業の結果を対象にして事例的に記述した。初年度である平成26年度は,体育授業において,子どもが運動を感覚的に理解したり,運動課題を解決するためのイメージを膨らませたりすることができる「指導ことば」に着目し,教員養成段階の保健体育専攻学生が考え得る「指導ことば」の特徴を明らかにした。その結果,「指導ことば」を用いることが可能な教科指導の力量形成を意図する教員養成カリキュラム開発への手がかりを得た。これらの研究成果について,日本科学教育学会研究会において研究発表を行うことができた。最終年度にあたる平成28年度は,2ヶ年度の研究調査および授業実践を踏まえて,教員養成課程でどのような指導をすると「わざ言語」や「指導ことば」を適切に用いることができるかを明らかにしていく。また,国内外の関連学会に参加し,情報収集やそれまでの研究成果発表を進めていく。スポーツ教育学2年度めにあたる平成27年度は,初年度の研究調査を踏まえて,教員養成課程でどのような指導をすると「わざ言語」や「指導ことば」を適切に用いることができるかを検討していく。そして,最終年度である平成28年度は,2ヶ年度の研究成果を踏まえて,「わざ言語」や「指導ことば」を指導する大学の講義(教科指導法/教科専門)の改善を行い,教育実習における児童・生徒の指導の効果の検証を進めていく。また,国内外の関連学会に参加を継続し,情報収集やそれまでの研究成果発表を進めていく。当初計画で見込んだよりも旅費および人件費・謝金の支出が少なかったため,次年度使用額が生じた。
難治性根尖性歯周炎原因細菌によるEpstein-Barrウイルスの再活性化

1.材料と方法および結果1供試試料:根尖病巣組織25例および健常歯肉組織10例を外科的に採取したのち3分割し、パラフィン切片の作製、DNAおよびRNA抽出に供試した。本研究は日本大学歯学部倫理委員会の審査を経て実施の許可を得ており(許認可番号:EP16D026)、試料採取の前に研究内容の概略や試料採取の際に不利益を生じないことなどを説明の上、患者から同意文書への署名を得た。2病理組織学的検索:ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、歯根肉芽腫組織を以後の検索に供試した。3ルシフェラーゼアッセイ:難治性根尖性歯周炎関連細菌7菌種を好気または嫌気培養したのち培養液を回収し、高速液体クロマトグラフィーを用いて酪酸量を定量したところ、Fusobacterium nucleatumが高濃度の酪酸を産生することが確認された。また、少量であるがPrevotella intermediaからも酪酸産生を確認したがCandida albicansやEnterococcus faecalisからは酪酸が産生されないことが明らかとなった。ルシフェラーゼ発現ベクターを遺伝子導入したB細胞(B95-8-221Luc細胞)を用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところ、F. nucleatumの培養液の添加によって明瞭なBZLF-1発現が誘導された。4EBVおよび難治性根尖性歯周炎関連細菌7菌種の定量的検出を行ったところ、歯根肉芽腫および健常歯肉組織から様々な程度で検出されたが、EBVとEnterococcus faecalisのみ健常歯肉組織からは検出されなかった。5免疫染色:歯根肉芽腫中にZEBRAの発現細胞を確認した。2.結論以上のことから、難治性根尖性歯周炎関連細菌の中ではF. nucleatumが最もBZLF-1発現を誘導することが明らかとなり、EBVの再活性化に関与する可能性が示唆された。行った研究方法について熟知しているため、研究条件を決定するための予備実験を行うことで、時間を無駄にすることなく研究を遂行することができた。加えて、研究当初に計画した内容に従って、計画的に研究を行っており、遅滞なくデータを得ることができた。しかし、供試試料数があまり多くないことから、患者からより多くの試料を得ることによってデータの信ぴょう性を高めることが必要であると思われた。平成31年度はさらに供試試料数を増やし、より信頼性の高いデータを得る所存である。供試試料を増やし、データの蓄積をはかる。すなわち、引き続き歯根肉芽腫と健常歯肉組織を採取し、EBVのコピー数および難治性根尖性歯周炎関連細菌7菌種の細菌数を定量的に解析する。また供試試料を用いてreal-time PCR法によるBZLF-1 mRNA発現を検索するとともに、ウェスタンブロット法によりZEBRA発現を検索する。加えて、EBVのコピー数とBZLF-1発現の相関性や難治性根尖性歯周炎関連細菌の数とBZLF-1発現量の相関性などをPerson's correlation coefficientを用いて検索する。再活性化したEBVによりサイトカイン発現が誘導されるかどうかを検索するため、供試試料を用いてインターロイキン1ベータとインターフェロンガンマのmRNA発現をreal-time PCR法で検索する。また、難治性根尖性歯周炎関連細菌の培養液から菌体内毒素(リポポリサッカライド:LPS)を除去したのち、Daudi細胞(EBV感染B細胞cell line)に添加し、サイトカイン発現を定量的に検索する。目的:潜伏感染したEpstein-Barrウイルス(EBV)の再活性化における難治性根尖性歯周炎関連細菌の関与を明らかにすること。1)供試試料:難治性根尖性歯周炎と診断された患者22名から、歯内外科療法の際に根尖病巣組織を摘出した。また、完全埋伏智歯(10例)の抜去の際に切除した健常歯肉組織をコントロールとした。2)病理組織学的検索:病理組織学的検索の結果、根尖病巣組織の18例(81.8%)で幼弱な毛細血管に富み、多数の炎症性細胞浸潤を伴う肉芽組織を認めたため、歯根肉芽腫と診断した。この出現頻度は既知の報告と類似していた。残りの4例には重層扁平上皮とコレステリン結晶を認めたため、歯根嚢胞と診断し、本研究から除外した。3)定量的なEBVおよび難治性根尖性歯周炎病原細菌の検出:1検量線の作製:EBVまたは難治性根尖性歯周炎病原細菌(Fusobacterium nucreatum、Prevotella intermedia)を培養し、DNAを抽出したのち、EBVのコピー数または細菌の細胞数を算出した。それぞれ10倍ずつ段階希釈したのちreal-time PCR法を行い、検量線を作製した。2EBVと細菌の検出:供試試料中のEBVおよび細菌のDNAを、検量線を元にコピー数を算出したところ、健常歯肉では検出できなかったが、歯根肉芽腫全例から標的DNAを検出したため、歯根肉芽腫に浸潤したB細胞にEBVが感染していることが示唆された。4)潜伏感染EBVの再活性化の検討:BZLF-1のルシフェーラーゼアッセイを行うため、BZLF-1発現ベクターを作製した。