hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜作動性生理活性物質の作用機序解明のためのスラブ光導波路蛍光顕微鏡システムの開発

本研究代表者がこれまで開発を手掛けてきたスラブ光導波路蛍光顕微鏡システム(SOWG-FM)を用いた、膜作動性抗菌剤(グラミシジンS)による脂質膜破壊作用の観察を行った。同手法は、界面選択性が極めて高く、平面脂質膜の観察に最適な手法である。環境応答性蛍光色素の分配を利用した、独自の脂質膜の可視化技術により、脂質膜の状態を選択的・高感度に観察した。装置面の改良、実験方法の最適化を行い脂質膜観察の手法として確立した。グラミシジンS類による膜破壊作用が観察でき、細菌を用いた抗菌活性との相関も得られた。最終年度(24年度)には、平面脂質膜に添加するコレステロール量の変化と、作製した平面脂質膜に対する3種類のグラミシジンS改変体による膜破壊作用の観察を行った。これらを含め、本研究期間(23、24年度)を通した研究成果を以下に示す。1顕微鏡観察用フローセルの改良検討・・・液漏れ防止を最優先にした測定セルの改良が出来、再現性の高い実験が行える様になった。2コレステロールを含む平面リン脂質膜(構成リン脂質:DMPC)を、ベシクルフュージョン法によりガラス表面に作製した。コレステロール濃度を050mol%まで変化させた膜の作製に成功した(それ以上の高濃度では膜を形成しなかった)。3細胞膜を破壊することで効果を発揮する“膜作動性抗菌剤"として知られているグラミシジンS(GS)と、その2つあるフェニルアラニン残基をチロシンに置き換えた水溶性改変体(TyrGS)、同じくアラニンに置き換えた改変体(AlaGS)を用いて、上述2の平面脂質膜が破壊される様子を蛍光顕微鏡下で観察した。なお、膜の可視化には、疎水性環境下でのみ蛍光発光を行う環境応答性蛍光色素であるNBD(nitrobenzofurazan)誘導体を用いた。すなわち、脂質膜形成時には、色素が脂質膜内に分配し蛍光発光が観察されるが、膜の破壊に伴い蛍光強度の減衰が観察される。GSとTyrGSは、共に強い膜破壊活性を示し、膜破壊を起こす事が知られる界面活性剤であるTritonX-100と同等の結果が得られた。一方で、AlaGSでは、その様な膜破壊はほとんど観察されず、ブランク溶液送液時とほぼ同等の傾向を示した。以上の結果は、大腸菌などを用いた細菌生存試験で得られた傾向と一致する。また、50mol%程度のコレステロール添加において膜破壊が阻害される傾向を示し、コレステロールが膜の形状維持に作用していることが確認できた。本研究は、ガラス薄板上にリン脂質膜を固定化し、その脂質膜のみを光励起・蛍光観察する事が出来る光導波路蛍光顕微鏡システムを開発することを目的としている。昨年度は、(1)従来型セルの改良検討(ハード面)、(2)コレステロールを含む平面リン脂質膜(構成リン脂質:1,2-Dimyristoylphosphatidylcholine, DMPC, C14の飽和脂肪酸をもつ中性リン脂質)の作製(ソフト面)、さらには、(3)抗菌剤によるリン脂質膜の破壊反応の観察を行った。以下にその詳細を示す。(1)従来から使用してきた測定セルは、送液に伴い若干の液漏れがみられ、1時間を超える長時間の測定で乱れが観察される、特に送液時に膜が乱れるなどの問題があり、再現性よく繰り返し実験を行うことが困難であった。そのため液漏れをより起こしにくいセル構造を考え、その作製を行った。液漏れ防止を最優先にしたセル構造を検討した結果、20倍を超える高倍率の対物レンズでは観察が出来ない構造ではあるが、液漏れが起こらないものが完成した。(2)これまでDMPCのみで構成された膜の作製を行ってきたが、コレステロールを添加した膜の作製を行った。一般的にコレステロールはリン脂質膜の構造をより強固にすることが知られており、本研究においても膜の構造をより安定に保持するのに重要な役割を果たすと考えられる。(3)作製できたリン脂質膜に対して、膜作動性抗菌剤として作用するグラミシジンS改変体(3種類)を添加し、リン脂質膜が破壊される反応の観察を行った。一般的な中性界面活性剤を含むコントロール実験の結果も合わせて、大腸菌などを用いた細菌生存試験で得られたデータと一致する結果が得られ、手法の正当性が確認出来たと考えている。以下に上述の概要に示した3項目、(1)セルの改良、(2)脂質膜の作製、(3)抗菌剤の活性評価について、その達成度を記す。(1)液漏れを起こさないことを最優先にした測定セルの作製が出来、今後より再現性の高い実験が行える準備が出来た。(2)コレステロールを含むリン脂質(DMPC)ベシクルを超音波法にて作製した。そのベシクル溶液をベシクルフュージョン法によりガラス薄板(導波層)上に展開した。

この方法にてガラス薄板上に平面リン脂質膜を作製することが出来た。(3)細胞膜を破壊することで効果を発揮する"膜作動性抗菌剤"として知られているグラミシジンSとその改変体(2種類)を用いて、ガラス薄板上に作製したリン脂質膜の破壊作用を観察した。その結果は、大腸菌などを用いた細菌生存試験で得られたデータと一致する結果であった。以上の結果から、本研究システムを用いた脂質膜観察の有用性が示されたと考えている。昨年度、脂質膜にコレステロールを添加することに成功したが、当初の予定の通り、負電荷を持つ酸性リン脂質であるDPPS(1,2-dipalmitoylphosphatidylserine)や、正電荷を持つ塩基性リン脂質であるホスファチジルグリセロールなどを用いて、脂質膜自身に電荷を持たせる実験を行っていく予定である。グラミシジン誘導体と脂質膜との間の静電相互作用が、膜破壊に及ぼす効果を評価することが目的である。脂質構成分子を変えることで、ベシクル作製の条件(超音波ホモジナイザの運転条件)や、ベシクルフュージョンにより作製した膜の安定性が変わってくることが容易に予想され、その条件最適化を行っていく必要がある。昨年度行ったセルの改良により実験結果の再現性が向上することが期待され、これまで以上に繰り返し実験の回数を増やして、実験結果の精度を高めていく。緑色レーザーを購入する予定である。それ以外では、リン脂質や蛍光色素などの試薬類の購入、ガラス器具、光学部品などの消耗品の購入が中心である。
SMVE分析法の開発研究

金属蒸気を直接分離でき,複雑なmatrixを有する試料を精度よく,化学干渉が無く,しかも超微量元素を高感度で分析することができるSMVE分析法の開発を目的に2年間にわたり研究を行ってきた。これらの成果は9の報文に報文にまとめ,国際雑誌に報告してきた。また学会での口頭発表も6回以上に及んだ。これらの成果を以下に概説する。◎SMVE分析法に関する基礎的な開発研究これまでの研究により、モリブデン管(カラム)中における各種元素の原子化・蒸気化特性は明らかであったが、SMVE分析法のカラムとしてのタングステン管中での特性は不明であった。従って、以下の研究を行った。○W箔吸着-タングステン管原子吸光法によるニッケルの定量,○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法によるロジウムの定量,○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法による金,アンチモン,テルル及びタリウムの定量,○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法によるビスマスの定量,○タングステン管原子吸光法によるコバルトの定量,○黒鉛管原子吸光法によるオスミウムの定量・・・これらの研究によりタングステン管又は黒鉛管中でのNi,Rh,Au,Sb,Te,Co,Osなどの原子化特性を明らかにした。◎SMVE分析法の応用研究○SMVE(Sequential Metal Vapor Elution)分析法による固体試料の直接分析;キャリヤ-ガスとしてAr1.8ml/minを流し、Moカラム(長さ250mm)温度1480°C,蒸気化温度910°CでCdとZnの金属蒸気を他の元素(Al,Ca,Cu,Fe,K,Mg,Na,Pb)と分離するのに成功した。これを生体試料中のCdとZnの定量に応用し、新しい分析法の確立に成功した。○SMVE分析法による環境試料中のCuとMnの定量;銅とモリブデンは比較的蒸気化・原子化しにくい金属であるが,アルミナ管をつけたMoカラムを開発したことによりこれらの元素も直接分離分析できるようになった。生体試料及び河川水中のCuとMnの直接定量法を創案した。○改良モルブデンカラムを用いたSMVE分析法による銅合金の分析;アルミナ管装着改良Moカラムを用いて、銅合金中のPbとZnの定量を検討した。カラム温度1260°C,蒸気化温度1470°CでPbとZnの金属蒸気が他の元素(Al,Cd,Cr,Cu,Fe,Ti,Zr)と分離することが分かった。以上の研究から、SMVE分析法による生体試料、環境試料及び金属地金中の超微量金属元素の高精度分析法が確立できた。従来の機器分析法では不可能であった各種金属元素蒸気の直接分離を可能にした。この結果,本SMVEシステムの利点は1)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明2)金属蒸気の直接分離分析3)化学的前処理の不要->汚染の抑制,簡便化,低コスト4)光学・化学干渉の低減金属蒸気を直接分離でき,複雑なmatrixを有する試料を精度よく,化学干渉が無く,しかも超微量元素を高感度で分析することができるSMVE分析法の開発を目的に2年間にわたり研究を行ってきた。

カラム温度1260°C,蒸気化温度1470°CでPbとZnの金属蒸気が他の元素(Al,Cd,Cr,Cu,Fe,Ti,Zr)と分離することが分かった。以上の研究から、SMVE分析法による生体試料、環境試料及び金属地金中の超微量金属元素の高精度分析法が確立できた。従来の機器分析法では不可能であった各種金属元素蒸気の直接分離を可能にした。この結果,本SMVEシステムの利点は1)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明2)金属蒸気の直接分離分析3)化学的前処理の不要->汚染の抑制,簡便化,低コスト4)光学・化学干渉の低減SMVE Analysis(金属蒸気分離分析法)は超高温(1000°C以上)のカラム中で金属蒸気を直接分離する方法である。本SMVEシステムの利点は1)金属蒸気の直接分離分析2)化学的前処理の不要->汚染の抑制,簡便化,低コスト3)光学・化学干渉の低減4)高温金属蒸気の物理的・化学的性質の解明である.しかし,超高温のカラムが必要な事もあって、システム化の困難性という大欠点があった。平成10年度は○金属蒸気分離システムの設計,○適切な分離カラムの開発(耐熱窒化物,耐熱酸化物,炭化物,モリブデン.タングステン等高融点カラム素材の検討)及びカラムの設計,○製作した金属管分離カラムを直流電源装置(PAD 35-200LT)に繋いで加熱性能調査,○基礎実験として加熱したモリブデン金属管よりの、ロジウム、ニッケル、オスミウム、金、鉛、カドミウム、銅およびマンガンの原子化(蒸気化)の状態を調べ、環境試料及び生体試料の分析に応用した。これらの金属の内前4者はモリブデン管アトマイザーから約2000°C以上で安定して蒸気化するが、モリブデンカラムを常に2000°C以上に保ちつつ分離することは困難であった。後4者は寒験条件を整えることによりSMVEA法で分離分析が可能であった。前4者については原子吸光法による分析法の開発に成功し、雑誌に発表した.後4者金属は一部SMVEA法として確立することが出来、雑誌に成果を発表することが出来た。金属蒸気を直接分離でき,複雑なmatrixを有する試料を精度よく,化学干渉が無く,しかも超微量元素を高感度で分析することができるSMVE分析法の開発を目的に2年間にわたり研究を行ってきた。これらの成果は9の報文にまとめ,国際雑誌に報告してきた。また学会での口頭発表も6回以上に及んだ。これらの成果を以下に概説する。◎SMVE分析法に関する基礎的な開発研究これまでの研究により、モリブデン管(カラム)中における各種元素の原子化・蒸気化特性は明らかであったが、SMVE分析法のカラムとしてのタングステン管中での特性は不明であった。従って、以下の研究を行った。○W箔吸着-タングステン管原子吸光法によるニッケルの定量,○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法によるロジウムの定量○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法による金,アンチモン,テルル及びタリウムの定量,○Mg-W Cell吸着-タングステン管原子吸光法によるビスマスの定量,○タングステン管原子吸光法によるコバルトの定量,○黒鉛管原子吸光法によるオスミウムの定量・・・これらの研究によりタングステン管又は黒鉛管中でのNi,Rh,Au,Sb,Te,Co,Osなどの原子化特性を明らかにした。◎SMVE分析法の応用研究
フラビウイルス複製オルガネラ形成に関与する宿主因子の解析

小胞体(ER)近傍に形成されるフラビウイルス複製オルガネラには、多くの宿主因子が集積すると考えられている。本研究では、ウイルス感染細胞から精製した複製オルガネラに対して網羅的プロテオミクス解析を行い、複製オルガネラ画分にリクルートされる宿主因子群を多数同定した。その中には複数のESCRT因子が含まれていた。種々のドミナントネガティブ変異体発現及びsiRNAによるノックダウンの影響を調べたところTSG101、CHMP2、CHMP3、CHMP4がウイルス複製に関与することが示された。これらの結果は、ESCRT経路が、フラビウイルス複製において重要な役割を担っていることを示している。フラビウイルスの増殖に必要な宿主因子のスクリーニングによって同定されたESCRT因子群について、単独または複数のsiRNAの組み合わせによるノックダウンのスクリーニングを行い、ウイルスの増殖に必須なESCRTサブユニットの同定と、各サブユニットの機能相補性について検討した。その結果、TSG101単独でのノックダウン、CHMP4A/CHMP4B/CHMP4C又はCHMP2A/CHMP2B/ CHMP3を同時にノックダウンした細胞においてのみ、著しいウイルス増殖能の低下を確認した。また、光電子相関顕微鏡観察、免疫電子顕微鏡観察を行いノックダウンした細胞にみられる複製オルガネラ近辺の膜形態の変化、及びESCRT因子の局在について解析したところ、ESCRT因子群が複製オルガネラ辺縁部に局在することを確認し、さらに、ESCRTをノックダウンした細胞の小胞体上に数多くの不完全なウイルス粒子様像を検出した。さらに、増殖が著しく抑えられたノックダウンの組み合わせに対して、各種変異体の入れ戻し実験を行い、ウイルスの増殖に必要な宿主因子間相互作用を調べたところ、TSG101-PTAP、CHMP2-CHMP4、CHMP-生体膜の相互作用の重要性は確認できたものの、TSG101-Ub、CHMP4-ALIX、CHMP2-VPS4などの相互作用の重要性は確認できなかった。本実験より、フラビウイルスの増殖において、一部のESCRT因子群が極めて重要な役割を担っていること、また、その機能の一端は小胞体近辺の複製オルガネラでみられるウイルス粒子形成にあることが明らかになった。これまでにレトロウイルス粒子形成、MVB形成、細胞質分裂などESCRTが関与する様々な膜動態が報告されているが、フラビウイルスの粒子形成に必要なESCRT因子群はそれらとは異なったメカニズムにおいて機能している可能性が示された。フラビウイルスの感染細胞内に形成されるウイルス増殖に特化した特殊なオルガネラ:ウイルス複製オルガネラに感染特異的にリクルートされる宿主因子のスクリーニングによって同定されたオートファジー(ATG)因子群について、日本脳炎ウイルスとデングウイルス感染系を用いてフラビウイルス増殖における役割について解析を行った。まず、ウイルス感染細胞内におけるオートファジーのアダプター分子であるp62及びp62に結合し尚且つp62が関与する選択的オートファジーのターゲット因子として知られるユビキチンの局在について調べたところ、p62及びユビキチン共にウイルス複製オルガネラを取り囲むように局在していることが明らかとなった。また、オートファジー及びp62のウイルス感染における生理的役割を検討する為に、各種遺伝子欠損マウス由来の繊維芽細胞でのウイルスの増殖能について調べた。オートファゴソーム形成分子機構の上流で作用するFIP200と、下流で作用するATG16L1の欠損細胞を用いて調べたところ、どちらの細胞を用いた場合でもそれぞれの野生型細胞に比べ著しくウイルスの増殖能が低下していた。また、p62欠損細胞においても、野生型細胞に比べ著しくウイルスの増殖能が低下していた。これらの結果から、ウイルス感染細胞内に形成された複製オルガネラは、その周囲に存在する何らかの因子がユビキチン化され、p62によって認識されており、また、オートファジー機構及びp62にはフラビウイルスの増殖を亢進する役割があることが示された。また、ユビキチン化またはp62、及びそれによってリクルートされるオートファゴソームの二重膜は、ウイルス複製オルガネラの形成に何らかの重要な役割を担っている可能性が示唆された。網羅的なオルガネラのプロテオミクス解析によって同定されたオートファジー因子群がフラビウイルス複製オルガネラ形成及びウイルスの増殖に関与するか、各種ATG因子の局在変化や、日本脳炎ウイルスやデングウイルス感染に対するATG因子変異体発現の影響、ATG遺伝子破壊細胞の作成と遺伝子欠損の影響などを調べ、その分子機構を明らかにし、創薬の標的となりうる分子間相互作用の生化学的特徴を明らかにするというのが、H26-H27年度にかけての計画である。これまでに、フラビウイルスの増殖に必要なATG因子の同定や、感染細胞内におけるこれら因子の挙動を明らかにしている。まだ、感染に伴うどのような現象がきっかけでATG因子がウイルス複製オルガネラにリクルートされるのか、その分子機構は明らかになっていないが、おおむね研究計画通り順調に進行している。フラビウイルスの感染細胞内に形成されるウイルス増殖に特化した特殊なオルガネラ:ウイルス複製オルガネラに感染特異的にリクルートされる宿主因子のスクリーニングによって同定されたVCP複合体について、日本脳炎ウイルスとデングウイルス感染系を用いてフラビウイルス増殖における役割について解析を行った。VCPはAAA+ ATPaseであり、細胞内で6量体を形成し、種々のコファクターと結合することで細胞内にて様々な機能を示す。

Yeast Two Hibrid法と共免疫沈降法、共免疫染色法によって、ウイルス側非構造(Non-structural: NS)蛋白質NS4BとVCPコファクターNpl4との間に直接的な相互作用があることを確認した。また、siRNAに抵抗性を示すサイレンス変異導入ベクターを用いた機能回復実験により、VCPに存在する2つのATPaseドメインのうち、C末側ドメインのATPase活性がウイルス増殖に重要であることがわかった。また、VCPの機能阻害剤Eer1,MDBN, DBeQ処理細胞にて、ウイルス増殖抑制が確認された。さらに、近年明らかになったVCPのストレス顆粒(Stress Granule: SG)解消能に着目し、フラビウイルス感染に伴うSG形成にVCP機能阻害がどのような影響を示すか検証したところ、DBeQ処理感染細胞において、SG形成細胞数が著しく増加することが明らかとなった。さらに、DBeQ処理感染細胞内の複製オルガネラ近傍にはSGマーカー:リン酸化eIF2αが蓄積していることも確認した。これらの結果から、ウイルスはNS4Bを介してVCPを複製オルガネラにリクルートすることで、SG形成を伴う宿主の翻訳系シャットダウンなどのストレス応答を回避する機構を備えているのではないかと考えられる。小胞体(ER)近傍に形成されるフラビウイルス複製オルガネラには、多くの宿主因子が集積すると考えられている。本研究では、ウイルス感染細胞から精製した複製オルガネラに対して網羅的プロテオミクス解析を行い、複製オルガネラ画分にリクルートされる宿主因子群を多数同定した。その中には複数のESCRT因子が含まれていた。種々のドミナントネガティブ変異体発現及びsiRNAによるノックダウンの影響を調べたところTSG101、CHMP2、CHMP3、CHMP4がウイルス複製に関与することが示された。これらの結果は、ESCRT経路が、フラビウイルス複製において重要な役割を担っていることを示している。定量プロテオミクス解析によって同定されたESCRT蛋白質がウイルス複製複合体形成時の膜動態にどのように関与するか、優勢変異体発現や、siRNAによるノックダウンがデングウイルス、及び日本脳炎ウイルスの増殖に影響するかどうか調べ、その分子機構を明らかにし、また、ESCRT蛋白質とウイルス蛋白質との相互作用部位を明らかにし、創薬の標的となりうる分子間相互作用の生化学的特徴を明らかにするというのが、H26年度までの当初の計画であり、これまでに、ノックダウンによるウイルス増殖に必要なESCRT因子の同定、また、ESCRT因子群のウイルス粒子形成時における膜変形での役割、そして、必要な分子間相互作用を明らかしており、おおむね研究計画通り順調に進行している。今後、研究計画どおり、申請者らがこれまでに行ってきた網羅的プロテオミクス解析によってフラビウイルス感染特異的に複製オルガネラにリクルートされるその他の小胞体関連因子の解析を進める。今後は、小胞体関連分解に関わるVCP複合体が複製オルガネラにリクルートされるという現象に焦点を当て解析を進める。
非侵襲的インプラント術前骨増生法の開発-臨床応用に向けた研究-

我々が開発したフルバスタチン-コラーゲン-αリン酸三カルシウムの複合体は、ラット頭蓋骨上に経皮的に注射することにより、新生骨が既存骨上に添加され、既存骨の厚みが増す。新規インプラント埋入術前骨増生法として臨床応用するために実験計画を立て、研究を行った。イヌ及びラットの口腔内における骨添加を目指したが、研究期間中に新生骨添加を実現することができなかった。今後、フルバスタチンの試適濃度の探索及び複合体の再検討が必要である。本研究では、我々が開発した新術式(単回のスタチン注射投与による無切開・非侵襲的インプラント術前骨増生)の早期臨床応用が目的である。スタチンとは、高脂血症治療薬の第一選択薬である。スタチンの骨芽細胞分化促進能が報告されて以来(Mundy et al, 1999)、スタチンと骨形成に関連する多数の報告がなされている。骨形成に有効であることが示唆されたスタチンを徐放させることにより、さらに効果的に骨形成を促進することができると考え、予備実験において我々が考案したαTCP-コラーゲンゲル-スタチン複合体をラット頭蓋骨上に経皮的に注射投与し、複合体周囲への新生骨の添加を確認した。我々が開発した骨増生法の有用性を実証するために、(1)骨添加のメカニズムの解明、(2)増生された骨の長期的予後、(3)大動物の顎骨における骨増生効果の検討、(4)増生された骨に対するインプラント体埋入の妥当性の研究、の4点を目標として研究を計画した。平成21年度に得られた知見について報告する。(1)骨添加のメカニズムの解明PCR Array法を用いて、骨形成・吸収に関わる遺伝子の発現を網羅的に検討する計画を立てていたが形成された新生骨が少量であり採取が困難でありそのため解析ができなかった。そこで、血中の骨形成マーカー、骨吸収マーカーの測定を行った。アルカリフォスファターゼ、酒石酸耐性酸性フォスファターゼの変化は認められなかったが、オステオカルシン濃度が有意に上昇していた。(2)増生された骨の長期的予後ラットを用いた予備実験において、観察期間は1、2、4週間である。臨床応用を行う上で、増生された骨の長期的安定が重要であるということで、8週間の追加実験を行った。8週においても添加された薪生骨は吸収することなく維持されておりより成熟した骨となっていた。本研究では、我々が開発した新術式(単回のスタチン投与による無切開・非侵襲的インプラント術前増生)の早期臨床応用が目的である。スタチンの骨芽細胞分化促進能が報告されて以来(Mundy et al.1999)、スタチンと骨形成に関連する多数の報告がなされている。骨形成に有効であることが示唆されたスタチンを徐放させることにより、さらに効果的に骨形成を促進できると考え、予備実験において我々が考案したαTCP-コラーゲン-スタチン複合体をラット頭蓋骨上に経皮的に注射投与し、複合体周囲への新生骨の添加を確認した。平成22年度に得られた知見について報告する。前半((1)、(2))に関しては、平成21年度に研究を行い、すでに報告済みである。(3)大動物の顎骨における骨増生効果の検討ビーグル犬の抜歯後の歯槽骨(下顎)および、鼻腔近傍の歯槽骨(上顎)に複合体を経皮的に注射し1カ月後に屠殺し、組織学的検討を行ったが、新生骨の添加は認められなかった。ラットの口腔内でも同様の実験をおこなったが、新生骨の添加は認められなかった。(4)増生された骨に対するインプラント体埋入の妥当性の研究(3)で新生骨の添加が認められなかったため、研究を行うことができなかった。今後、スタチンの至適濃度を含めさらなる検討が必要である。
犬脂肪由来間葉系幹細胞が分泌するエクソソームの免疫調節機能に関する解析

犬の脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)から分泌されるエクソソームが免疫調節機能に与える影響を解析することを目的に平成30年度は下記の内容について検討を行った。1犬AT-MSCの培養上清より精製したエクソソームが犬の末梢血単核球(PBMC)に与える影響:密度勾配遠心法によって分離したPBMCをエクソソーム存在下で培養し、エクソソームの有無による免疫担当細胞(CD3+CD4+, CD8+)の発現割合を比較した。発現割合の比較検討にはフローサイトメーターを用いて行い、エクソソームの濃度による発現割合の変化についても解析した。2エクソソームがCD4+ Tcellのサイトカイン産生能に与える影響:分離したPBMCからマグネットビーズを用いてCD4+ Tcellを分離精製し、エクソソームの有無によるサイトカイン産生量(IL-1, IL-6, TNFa)をELISAによって測定した。3エクソソームの二次元電気泳動解析:炎症状態下のAT-MSCより分離したエクソソームの組成が異なるのかを検討するための方法として二次元電気泳動によるタンパク発現解析を予定している。そのため、二次元電気泳動によって明瞭なスポット分離を得るための条件を検討した。また、エクソソームを分泌するAT-MSCの炎症惹起の方法についてもサイトカイン産生や生存率の測定を利用して検討を行った。本研究ではエクソソームの分離精製はPSアフィニティー法を利用しているため、エクソソームの表面抗原を利用した確認も実施する予定である。本研究課題計画で立案した予定で計画が概ね進行しており、技術的な課題など研究計画の大きな変更が必要な問題点は生じていないから。当初の研究計画に従って研究を実施する予定である。今後はエクソソームの解析を中心に進める予定であり、具体的には二次元電気泳動を用いたタンパク解析とmiRNAのアレイ解析を予定している。また、免疫担当細胞に与える影響については、PBMCから分離精製する細胞をより細分化し、詳細な検討を行う予定である。また、エクソソームの分離精製に用いているPSアフィニティー法についてはエクソソームの表面抗原を利用した方法によって検討する。エクソソームに含まれるたんぱく質やmiRNAの同定解析において必要な蛍光測定装置の購入を行っていないため、次年度使用額が生じた。平成31年度は蛍光測定装置の必要性が高いことから、本機器の購入に使用する予定である。
精神障碍者に対する意思決定の共有（SDM）に関する看護専門職の認識についての研究

看護師等専門職、当事者からなる、研究コアチームを形成し、精神科救急医療において、当事者とのShared Decision Making(以下SDM)を実現するために、どのような構造、ケア要因が必要なのか討議を継続的に実施した。討議の結果、また当事者中心の精神科医療を実現している海外視察、文献検討から、1990年代からUSAを中心に実施されているTrauma Informed Care(以下TIC)が有効であることを確認し、日本への導入を意図して、精神科臨床スタッフ対象に研修を実施した。研修前後の参加者のTICに対する知識・態度の変化を自記式アンケートを用いて調査し研修の効果を解析中である。今年度は、精神保健領域における病院から地域への移行期支援および、SDMについての文献検討を中心に実施し、以下のことが明らかになった。<移行期支援におけるSDMの重要性>移行期支援は、再入院や再発の防止、ケアの継続性に効果がある(Vigot et al. 2013)。中でもユーザーと支援専門職との信頼関係の構築服薬や治療へのアドヒアランスは重要であり、移行期支援の中核には、ユーザーと支援専門職が対等な立場で対話を行い、当事者の気持ちや選択を尊重し、治療や支援方法の決定を行うプロセスである、意思決定の共有(SDM)を置くことが不可欠である。<SDMの定義およびプロセス>Charles (1999)は、SDMの特徴として、1意思決定のプロセス全てについて医師と患者が共有する2医師と患者の2方向で情報の交換が行われる3医師と患者の両者が方針に対する自分の好みを表明する4検討の結果に対して両者が合意している、を挙げている。精神保健領域におけるSDM研究においては、支援専門職だけでなく、ユーザーやケアラーからの協力や評価を得ながら実施していくことが求められ、ユーザーのリクルートなど研究体制の構築に時間をかける必要性があると考えたため。<研究枠組みとインタビューガイドの検討・専門職インタビューの実施>当事者、看護職、医師、心理士、PSWなど、多職種を含めた研究チームを立ち上げ、今年度前半は、研究枠組みおよび、インタビューガイドの検討を中心に行った。具体的には、精神科救急場面における当事者との意思決定の共有(Shared decision making: SDM)の重要性と課題についてディスカッションを深めた。結果、SDMにおいては、当事者と専門職の対等性が重要視されているが、実際の精神科救急の入院に至るプロセスでは、当事者との対等性が必ずしも保たれているとは言えない状況を確認し、精神科救急病棟への入院前後の出来事に焦点を当てたインタビューガイドを作成した。当事者、看護職、医師、PSWなど多職種を対象にフォーカスグループインタビューを3回実施した。<海外優良実践の視察>英国リバプールの精神保健事業所マージーケアトラスト(Mersey Care Trust)で行われている優良実践について、研究チームで視察を行った。トラストの管理者、当事者スタッフ、専門職スタッフなどから取り組みについて聴取し、また、実際の救急病棟などの見学を行った。リカバリー概念を基盤とし、当事者スタッフが精神科救急場面や、その他の臨床場面に専門職スタッフと同等の立場で参画していた。またその背景にある、組織のトップのリーダシップ、継続的なスタッフと当事者とのミーティングの場の確保、教育システムなど、組織全体での取り組みが非常に重要であることを確認した。精神保健領域におけるSDM研究においては、支援専門職だけでなく、当事者やケアラーからの協力や評価を得ながら実施していくことが重要である。したがって、インタビュー実施前に当事者の研究チームへのリクルートや信頼関係構築など研究体制づくりに時間をかける必要性があったため進行がやや遅れ気味である。最終年度は、当事者、看護職、医師、精神保健福祉士などからなる、研究コアチームを中心に、これまでに行ったフォーカスグループインタビューでのディスカッションの内容、英国リバプールへのメンタルヘルストラストの視察、また文献検討などから、精神科急性期病棟において、当事者とのShared Decision Making(以下SDM)に基づいたケアを実現するために適切なケアプログラムを検討した。その結果、1990年代からUSAを中心に実施されている、当事者がそれまで受けていたトラウマに配慮し、かつケアの場での再トラウマ体験を予防することを意図する、トラウマインフォームドケアに焦点を当て、日本での導入を試みることとした。すでに、トラウマインドームドケアについて、精神科への導入と普及を先駆的に行っている研究者らの協力を得て、精神科臨床スタッフへの、トラウマインフォームドケアの研修プログラムを試験的に実施した。研修の主な参加者は、東京近郊の精神科病院スタッフ約60名であった。研修の内容はトラウマインフォームドケアの定義や概念、実践への応用などについての講義とグループワークとした。トラウマインフォームドケアのスタッフへの効果的な教育方法の確立に向けて、研修前後での、参加者のトラウマインフォームドケアに対する知識やケアへの態度/認識についての変化を測定する自記式アンケート調査を実施した。現在、研修の効果について結果を解析中である。

次年度は、ユーザーの協力を得て、フォーカスグループおよび個別のインタビューガイドや進め方の検討を行ったうえで、看護職を中心とした支援専門職、ユーザー、ケアラーへのフォーカスグループ、必要に応じて個別のインタビューを実施する。また、国内・海外でのSDMの先進事例について、積極的に情報収取を行うこととする。次年度は、今年度末に実施した優良実践のまとめを行い、今後の専門職のフォーカスグループおよび当事者へのインタビューに活用していく。国内・国外の優良実践については今後も積極的に情報収集を行う。公益財団法人東京都医学総合研究所心の健康プロジェクトHP地域精神保健精神保健領域のSDMについての研究の実施にあたっては、支援専門職だけではなく、ユーザーやケアラーと意見交換や評価を得ながら研究を進めていく必要性があり、協力の得られるユーザーのリクルートなど研究体制の構築に時間をかけることが求められたため、今年度はフォーカスグループやインタビューの実施に至ることができなかった。今年度は、他職種・当事者も含めた研究体制の構築に時間をかける必要があったため、研究の進行が遅れ、個別のインタビューが未実施である。また、専門職のフォーカスグループについては、当初予想していたよりも謝金が発生していないため。次年度は、支援専門職、ユーザー、ケアラーへのフォーカスグループおよびインタビューの実施を行うため、参加者への謝礼や、逐語録の作成、また、先進事例の情報収取のための費用が発生する予定である。次年度は、支援専門職、当事者などへのフォーカスグループおよび個別インタビューの実施、国内の優良実践についての視察などを行うための謝金、交通費などの費用、また、論文作成のための費用などが発生する予定である。
高圧化でのスパッタ製膜法の開発

普通スパッタリングは0.02Torr以下のイオンをターゲットに衝突させターゲットから原子を飛散させる方法で行われてきた。イオン窒化では、10-1Torr程度の高圧下でも鋼はスパッタリングされることがわかった。そこで、二硫化モリブデン、クロム等をターゲットとして用い、窒素と水素の混合ガス雰囲気中でSCM435鋼をイオン窒化すると同時に、ターゲットをスパッタさせ、鋼を浸硫窒化層を形成させた。また、二硫化モリブデンをと鋼を陰極上に平行の置き、ホローカソード放電を利用してイオン窒化すると同時に二硫化モリブデンをスパッタさせて鋼を浸硫窒化層を形成させた。その結果、次の結論をえた。(1)試料温度823Kで3、6から18ksイオン窒化すると、4μmの化合物層と400μmの拡散層が形成され、500Vの放電電圧で表面に硫化物FeSその下に窒化物層が形成された。また、表面をXMA表面分析した結果、硫黄とモリブデン、クロム等が検出されたので、高圧下でも二硫化モリブデン等のスパッタリングが行われていることが証明された。(2)鋼と二硫化モリブデンを3-10mmの間をあけて平行に設置しホローカソード放電を利用して浸硫窒化処理をすると、鋼の表面に8-15μmの化合物層と400μmの窒素拡散層ができ、化合物層はFeS層と窒化物層よりなることがわかった。通常スパッタリングは0.02とTorr以下の高真空中でイオンを種々な様式でターゲットに衝突させターゲットから原子を飛散させる方式で行われてきた。本研究では,10-1Torr程度の高圧ガス雰囲気下でイオン窒化すると鋼はスパッタリングされることがわたったので,鋼の表面にターゲットよりスパッタされた物質が到達することを利用して鋼材を浸硫窒化することを目的としている。そこで,二硫化モリブデンをターゲットとして用い、窒素と水素の混合ガスの雰囲気中で鋼を窒化すると同時に,ターゲットより硫黄をスパッタさせ,鋼を浸硫窒化した。用いた鋼はSCM435を1123Kより焼入れご873Kで3.6k焼き戻しした。実験の結果,次のような結論をえた。1.試料温度823Kにて処理時間3.6から18ksでイオン窒化のみを行った試料では,4umの化合物層と400umの拡散層が形成された。2.同条件で二硫化モリブデンをスパッタ用ターゲットとして500Vno放電電圧で鋼を浸硫窒化すると,鋼の表面に硫化物FeSとその下に窒化物Fe NとFe Ngからなる化合物層が形成された。この結果から,ターゲットの硫黄が鋼の表面に到達したいることがわっかった。3.最表面の組成を微小部X線分析装置で分析した結果,硫黄のほかモリブデンが検出されたので,このような高圧下においてでも二硫化モリブデンのスッパッタリングが行われていることが証明された。窒素と水素の混合ガス雰囲気中で鋼板と二硫化モリブデンを対向して平行に置き,ホローカソード放電を利用して,鋼板をプラズマ窒化すると同時に,二硫化モリブデンをスパッタリングにより付け,鋼板を浸硫窒化した。断面の組織の観察,X線分析,硬度測定により調べた結果,550°C,3hの処理で400μmの窒素拡散層ち4μmの硫化物層が表面に形成していることがわかった。また,表面から測定した硬さは鋼板と二硫化モリブデンの間隔によって異なるが,640から830の間であった。プラズマ浸硫窒化した鋼板の表面硬さが従来の溶融塩法により浸硫窒化した低炭素鋼の表面硬さより高くなっている。これは,窒化鉄層が薄く,かつ窒化鉄そうにモリブデンが含まれるためとかんがえられる。

スパッタリングについてのはこれまでの研究より、10-1Torr程度の高圧下でも鋼やターゲットはスパッタリングされることがわかった。そこで、二硫化モリブデンおよびクロム等をターゲットとして用い、窒素と水素の混合ガス雰囲気中でSCM435鋼をイオン窒化すると同時に、ターゲットをスパンzツタさせ、鋼を浸硫窒化したり、クロムの影響を調べたりした。得られた表面改質層についてSEMによる観察、RDXおよびESCAによる分析、硬さの測定等を行なった。その結果、このような高圧下でもスパッタはおこり、ターゲットに用いた元素が対向する試料に到達し、試料の表面に10μm程度の化合物層と数100μm程度の拡散層をつくることがわかった。
細菌性感染症を対象とした生体内ESRイメージングの基盤研究

近年、細菌性感染症の蔓延は極めて深刻であり、国際社会に甚大な影響と不安を与えている。日本における薬剤耐性菌対策は、免疫力が低下した患者に対する「抗菌薬の適切な使用」に重点が置かれている。しかし、臨床現場では、抗菌スペクトルの広い抗菌剤を用いることが多く、薬剤耐性菌を引き起こす原因となっている。従って、本研究課題は、細菌性感染症における、迅速な病原菌の確定診断の手法を提案する。細菌の細胞壁構成成分の違いを利用した代謝標識技術に着想を得、非侵襲的なイメージングである生体内ESRイメージングへの応用を行うこととした。本手法が確立すれば、両者の生体応用を実証する初めての例となり、学術的意義がある。本研究課題は、二つの技術より構成される。1代謝標識法は、生菌が有する酵素と細胞壁構成分子を活用して、細胞壁の主な成分であるペプチドグリカンに蛍光プローブを取り込む。そのため、生きた菌をリアルタイムで可視化する画期的な手法である。次に、2電子スピン共鳴(ESR: Electron Spin Resonance)は、安定に存在するラジカル種を対象測定とした手法である。観測対象がラジカル種であることから、放射性化合物を用いるPETと異なり、非侵襲性イメージング手法の一つとして、生命科学研究や医療への応用が期待されている。初年度では、蛍光分子に代わりスピンラベル化した化合物を合成し、本化合物を用いて、腸球菌に対し代謝標識法を行った。その結果、短時間で腸球菌の細胞壁にスピンラベル化剤が導入されたことを確認できた。本課題研究の目的は、最新の代謝標識法で染色した細菌を生体内ESRイメージングによって迅速に検出することである。初年度では、代謝標識法として報告されているFDAA(Fluorescein D-Amino Acid)法が、ESRイメージングに応用可能か検討することとした。FDAA法は、細菌の細胞壁の構成成分にD-アミノ酸が存在することを利用し、細菌の細胞壁合成をリアルタイムで可視化する方法である。この方法は、蛍光標識したD-アミノ酸を増殖対数期の細菌に取り込ませることで、現在進行している細胞壁合成を直接染色することができる。本研究課題では、D-アラニンに対して、蛍光分子の代わりにスピンラベル化し、腸球菌への投与を試みた。観察には、蛍光顕微鏡を用いるため、スピンプローブ導入の有無は、蛍光分子を指標に確認した。すなわち、ラジカルと蛍光分子では近接化による消光が生じるため、スピンプローブが導入された細胞壁には蛍光が観測されない。具体的には、対数増殖期の腸球菌に、FDAA法によってスピンプローブを導入し、細菌表層に親和性を持つ蛍光分子を投与する。実験結果として、スピンプローブが導入された細胞壁には蛍光が観測されなかった。その後、自然にスピンプローブは生体内還元を受け、ラジカルを有さないサイレント状態となったため、細菌全体に蛍光が観測された。従って、初年度では、代謝標識法は、ESRスピンプローブを用いることによっても実施可能であることを実証することができた。また、今後の研究展開を見据え、高感度シグナルが期待できる重水素置換されたスピンラベル体の合成を進めている。次年度においては、次に述べる三点を中心に研究を展開させたい。すなわち、1感染モデルマウスを用いた生体内ESRイメージング、2生体内還元を受けにくいスピンプローブの創製、3ニトロキシラジカルが有する窒素原子を14N体と15N体として、二種の化合物を同時に観測する生体内ESRイメージングである。これらを基に、定量的なpH計測による炎症モニタリングや、抗生物質の効果を計測する感染症治療モニタリングへと応用させていきたい。

FDAA法は、細菌の細胞壁の構成成分にD-アミノ酸が存在することを利用し、細菌の細胞壁合成をリアルタイムで可視化する方法である。この方法は、蛍光標識したD-アミノ酸を増殖対数期の細菌に取り込ませることで、現在進行している細胞壁合成を直接染色することができる。本研究課題では、D-アラニンに対して、蛍光分子の代わりにスピンラベル化し、腸球菌への投与を試みた。観察には、蛍光顕微鏡を用いるため、スピンプローブ導入の有無は、蛍光分子を指標に確認した。すなわち、ラジカルと蛍光分子では近接化による消光が生じるため、スピンプローブが導入された細胞壁には蛍光が観測されない。具体的には、対数増殖期の腸球菌に、FDAA法によってスピンプローブを導入し、細菌表層に親和性を持つ蛍光分子を投与する。実験結果として、スピンプローブが導入された細胞壁には蛍光が観測されなかった。その後、自然にスピンプローブは生体内還元を受け、ラジカルを有さないサイレント状態となったため、細菌全体に蛍光が観測された。従って、初年度では、代謝標識法は、ESRスピンプローブを用いることによっても実施可能であることを実証することができた。また、今後の研究展開を見据え、高感度シグナルが期待できる重水素置換されたスピンラベル体の合成を進めている。次年度においては、次に述べる三点を中心に研究を展開させたい。すなわち、1感染モデルマウスを用いた生体内ESRイメージング、2生体内還元を受けにくいスピンプローブの創製、3ニトロキシラジカルが有する窒素原子を14N体と15N体として、二種の化合物を同時に観測する生体内ESRイメージングである。これらを基に、定量的なpH計測による炎症モニタリングや、抗生物質の効果を計測する感染症治療モニタリングへと応用させていきたい。初年度の実験計画予定であったマウスへの生体内ESRイメージングを次年度で行うため
神経細胞における細胞質mRNA輸送粒子の分子構築と機能解析

中枢神経細胞において、特定のmRNAが樹状突起へ輸送され、これらがシナプス刺激依存的に局所的に翻訳されることが、個々のシナプスの長期増強に必要であり、また記憶や学習に必須のメカニズムであることが明らかになってきた。mRNAの輸送と局所的タンパク合成制御には、RNA granuleが中心的な役割を担っている。これまでに我々は、RNA granuleの新規構成要素としてRNG105(RNA granule protein 105)を同定し、その機能解析をおこなってきた。RNG105が局在するRNA granuleには、シナプス可塑性に必須の役割を果たすCaMキナーゼIIαなどのmRNAが局在していることを明らかにした。また、RNG105は直接mRNAに結合し、in vitroにおいてもin vivoにおいても翻訳を抑制する活性をもつことを明らかにした。この翻訳抑制は、RNA granuleが定常状態において翻訳静止状態にあるという実験結果とよく一致した。シナプス刺激のない条件下ではRNG105はRNA granuleに局在するが、シナプス刺激(BDNF刺激)によってRNA granuleから解離することがわかった。この解離は、RNA granule近傍での局所的タンパク合成の活性化と密接に関連していた。以上の結果から、RNG105はRNA granuleにおけるタンパク合成抑制因子であり、シナプス刺激依存的にRNA granuleから解離し、その結果刺激されたシナプスにおいて局所的タンパク合成が起こる、というメカニズムを考えることができた。中枢神経細胞において,mRNAが樹状突起へ輸送されることが知られている。これらmRNAはシナプス可塑性に関与するタンパク質をコードしており,これらがシナプス刺激依存的に局所的に翻訳されることが,個々のシナプスの長期増強に必要であり,また記憶や学習に必須のメカニズムであることが明らかになってきた。mRNAの樹状突起への輸送と局所的タンパク合成の制御には,RNA granuleと呼ばれるmacromolecularな複合体が中心的な役割を担っている。本年度の研究では,以前我々がRNA granuleの新規構成タンパク質として同定したp105(=RNG105,RNA granule protein 105)の機能解析を主におこなった。まず,RNG105がRNA結合モチーフをもち,直接mRNAに結合する活性をもつことを明らかにした。また,培養細胞での発現実験により,RNG105がin vivoで翻訳を抑制することを見いだした。海馬神経細胞を用いた実験では,シナプス刺激(BDNF刺激)依存的にRNG105がmRNAおよびRNA granuleに対する親和性を低下させることを見いだした。さらにこの親和性の低下が,RNA granule近傍での局所的タンパク合成の活性化と密接に関連していることがわかった。以上の結果から,RNG105は神経樹状突起内を輸送中のRNA granuleにおいてはタンパク合成を抑制し,シナプス付近に到達すると刺激依存的にmRNAおよびRNA granuleから解離し,その結果個々のシナプスにおける局所的タンパク合成が起こる,というモデルが考えられた。
マルコフ環境下におけるシェアリングサービス型並列流体ネットワークの性能評価

今年度は,決定論的ネットワーク算法によるアプローチによって,FIFO multiplexerを流れる個々のフローの上限解析を行った.このモデルと出力過程の到着曲線については既存研究で2002年に報告されているが,FIFOサービスを表す効率的なサービス曲線が未知であった.その原因の1つとしてFIFOサービスのネットワーク算法に適合する定式化が行われていない.本研究では,注目するフローに対する最悪状況を作るために,離散化された時間区間内でのパケットの入力順序をFIFO規則の範囲内で変更した.無限容量バッファモデル本研究の目的は,サービス曲線の導出である.これまで,サービス曲線やそれを定義するために必要な(min,plus)-代数上の畳み込み演算子が,最大待ち行列長や遅延時間の導出に重要な役割を果たしていた.ところが,本研究によってFIFOサービスではサービス曲面(2変数関数)と二重畳み込みが必要であることがわかった.既存研究では,パラメータ付サービス曲線を用いてこれを記述しようとしているが,式の構造を加味していなかったため,過大評価を与えていた.本研究の結果は,出力到着曲線の一般形式を与えるだけでなく,最大待ち行列長や最大遅延時間等も容易に計算できる.より強い結果として,注目するフローの遅延は全体の遅延で抑えられることが別の視点から証明された.複数閾値モデル前年度の研究では,優先サービスを仮定して解析を行ったが,本年度はFIFOサービスを直接解析できるようになった.閾値モデルでは,サービス曲面ではなくサービス曲線で十分であることがわかった.また,優先サービスとFIFOサービスの比較も行った.競合フローの到着曲線が仮定されていなくても,閾値の制御によってトラフィック量の調節がある程度可能であることも示した.本研究の結果は現時点で論文執筆中のため公刊されていない.(学会発表及び報文集のみ発表済)平成16年度の研究方針は2つ計画していた。背後過程の状態数をn=2に限定した場合と、背後状態数nのモデルに対してLatouche, takineの結果の適用した場合である。後者の研究については、現在文献調査中である。前者については、ネットフロー(入力率-出力率)に関する特殊な条件の下で解の陽表現を求めた。しかし、ネットフローに関する条件は非常に特殊であり、実用的とは言えない。今後状態数を増やしたモデルを解析するためにも、n=2のとき、余計な設定をはずして解析を行う必要がある。(数値的な解析は容易だが今後の拡張で使えない)些細ではあるが、背後状態数が2の場合についてわかったことをまとめる。定常方程式について背後状態数がn個である場合について、適当な安定条件(連続状態マルコフ過程のエルゴード性)の下で、定常方程式を求めた。この問題は、求めたい量が2変数関数のベクトルであり、定常方程式は線形連立偏微分方程式を含む境界値問題である。定常分布の一意性より、1つ非負解を探せばよい。(n=2)ここで得られた境界値問題は、背後状態0と1のネットフローの和が零になる場合(放物型偏微分方程式系)と、そうでないとき(双曲型)で解の構造が(従って、解法も)本質的に異なることが知られている。放物型の場合(容易)定常方程式の解(結合定常分布)は指数関数などの初等関数のみで表現できる。双曲型の場合(難)2変数で2元連立偏微分方程式を1変数の常微分方程式までおとすことが可能。詳しくここで述べないが、技巧的な変形による問題の分解、リーマンの方法が主な手法である。一般に微分方程式の解法は、領域内部の積分を行った後、境界条件や初期条件にあてはめて積分定数などの未知項を決定するが、偏微分方程式の場合、領域内部での積分が難しい。特に本モデルは連立偏微分方程式であり、電信方程式のように積分可能な形へ簡単に変形できない。一方リーマンの方法は、内部領域での積分を境界上のデータ(コーシーデータ)で表現する方法である。しかし、連立偏微分方程式に対応していない。リーマンの方法を適用可能にするために、偏微分方程式系や境界条件の背後状態についての分解を行う。(変数分離は不可)これによって幸運にもリーマンの方法が使用可能な2つの新しい境界値問題を得る。余った条件(積形式ネットワークにおけるトラフィック方程式に相当する条件)を用いて2つの未知関数(1変数)のどちらかを消去することで、常微分方程式を得ることができる。しかし、この微分方程式は02階微分の項と第1種修正ベッセル関数で重みづけされた積分の項を含むため、簡単には解けない。今後の予定として、級数展開による方法と発見的方法の2つの方向から解を類推する予定である。前年度の研究におけるアプローチは,連立偏微分方程式を常微分方程式に帰着すると非線形項が現れ,解くことが非常に難しくなってしまった.この反省を踏まえ,平成17年度の研究では,次の研究を行った.上限確率過程と下限確率過程の導入一般化シェアリングサービスを行う2バッファシステムは,互いに相関がある確率過程のモデルとして考えることができる.優先サービスモデルは双方向の相関ではなく,単方向の相関を持ち,解析を容易にしていた.本研究では,一般化シェアリングサービスモデルを挟み込む上限過程と下限過程を導入した.新たに導入した過程は,(i)元の過程のパラメータで容易に構成ができ,(ii)それぞれの過程はある操作を繰り返すことで元の確率過程に近づくという性質を持つ.

現在,単調性について証明を与えることができたが,収束性はシミュレーションによる確認しか行っていない.分布の解析を行うためには,マルコフ連鎖の他にもう1つの背後過程(マルコフ連鎖にはならない)を与えた下で単一の流体モデルが解析できる必要があるが,これは来年度の課題である.複数の到着流と異なる廃棄閾値を持つ単一待ち行列モデルの解析現在のインターネットは電子メールのように多少の遅延を許すアプリケーションに対しては十分な能力を持つが,TV会議のように多容量で遅延許容量が非常に小さいアプリケーションに対してはまだ不十分である.DiffServは次世代インターネットにはかかせない通信品質保証の枠組みとしてRFC2475で規定された.しかし,品質保証に必要なパラメータ決定方法は,具体的には書かれていない.そこで本研究では,DiffServの数理モデル(3つの到着流とそれらに対応する3つの廃棄レベルをもつ単一バッファ)を与え,Network calculusの議論を用いて最大遅延時間,最大待ち行列長,最悪出力バースト性を評価した.解析を簡単にするために,到着流と廃棄レベルは2つに減らし,サービス方式をFIFOから優先型に置き換えた.Network calculusは,普通の待ち行列理論とは異なり,決定論的な最悪値の評価を与える.その代わり,出力過程が入力過程と同じクラス含まれるため,ネットワークの解析が容易である.本結果は最悪値の評価であるので,そのままネットワークの解析に用いると最悪値の積み上げの影響が強くなり,過剰評価を与えてしまう.これを回避するために,大偏差定理を用いた呼損率に基づく議論と本研究の結果をマージする必要がある.これは今後の課題である.今年度は,決定論的ネットワーク算法によるアプローチによって,FIFO multiplexerを流れる個々のフローの上限解析を行った.このモデルと出力過程の到着曲線については既存研究で2002年に報告されているが,FIFOサービスを表す効率的なサービス曲線が未知であった.その原因の1つとしてFIFOサービスのネットワーク算法に適合する定式化が行われていない.本研究では,注目するフローに対する最悪状況を作るために,離散化された時間区間内でのパケットの入力順序をFIFO規則の範囲内で変更した.無限容量バッファモデル本研究の目的は,サービス曲線の導出である.これまで,サービス曲線やそれを定義するために必要な(min,plus)-代数上の畳み込み演算子が,最大待ち行列長や遅延時間の導出に重要な役割を果たしていた.ところが,本研究によってFIFOサービスではサービス曲面(2変数関数)と二重畳み込みが必要であることがわかった.既存研究では,パラメータ付サービス曲線を用いてこれを記述しようとしているが,式の構造を加味していなかったため,過大評価を与えていた.本研究の結果は,出力到着曲線の一般形式を与えるだけでなく,最大待ち行列長や最大遅延時間等も容易に計算できる.より強い結果として,注目するフローの遅延は全体の遅延で抑えられることが別の視点から証明された.