hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小集団で一文を読む学習活動の開発と読解力向上効果の検証に関する研究

動作を表す言葉(動詞やそれを修飾する言葉)と話者の判断を表す言葉(副詞,副助詞,終助詞,助動詞)に注目する一文を読む解釈法を開発した。小学校での実験的な授業の結果,小集団で動作を表す言葉に着目することで言語化できない登場人物の心情を実感的に理解できる働きが分かった。中高生,教師への調査から約57%の読者が特定の一文に集中して関心を寄せる一方約43%の読者が他の読者の選ばない文に注目するという分散の傾向を指摘できた。中学校での実験的な授業の結果,自己評価で96%,教師による評価で95%の学習者が目標に到達していることが分かった。小集団で一文を読む学習が読解力向上に寄与することを解明した。平成25年度は解釈法の開発と読解力向上効果の検証とともに読解力向上のためのカリキュラムを検討した。まず話者の判断や評価の表れる言葉に着目することで登場人物の言動を理解する方法について,中学生,高校生,教師へのアンケート調査によって効果を検討した。調査からは「走れメロス」(太宰治)の読者が特定の一文に集中して関心を寄せることが分かった。同時に集団の中の約半数の読者が他の読者の選ばない文に注目するという分散の傾向も指摘できた。話者の判断や評価を表す言葉は,述語の終助詞,助動詞,副助詞,副詞に顕著に表れる。読者の関心が集中する一文を理解するために,話者の判断や評価を表す言葉に注目することが有効であることを明らかにした。次に京都市立上鳥羽小学校4年生に行った「世界一美しいぼくの村」(小林豊)の授業の分析を行い,話し合い記録の考察を行った。書かれてあることを書かれてある通りに理解することは教師の介在しない話し合いでは学習者にとって難しい挑戦となる。動作を表す言葉に着目して,人物の動きを考えることで,言語化できない登場人物の心情を実感的に理解できるようになるとともに,教師の介在しない学習者同士の話し合いの中で理解を深めることができることが分かった。さらに読解力向上のためのカリキュラムを検討するために,京都教育大学附属桃山中学校2年生に行った「タオル」(重松清)の授業を分析した。学習記録と話し合い記録の評価および学習者の自己評価を分析し,話者の判断や評価の表れる言葉に注目し一文を読む活動が中学2年生段階で有効な方法であることがわかった。その上で「行動描写に着目する方法」「情景描写に着目する方法」「話者の判断の表れた言葉に着目する方法」「会話の含みに着目する方法」「語り手の判断の表れた言葉に着目する方法」の5種類の読み方を検討し,登場人物の気持ちを理解する方法の系統図を作成した。本研究は,国語科「読むこと」の学習において,一文の意味を考えるという解釈法と小集団討議という学習活動とを用いた指導法を開発し,その読解力向上効果について検証するものである。平成24年度は,まず一文を読む解釈法の開発を行った。話者の判断や評価を表す言葉に注目すること,具体的には副詞,副助詞,終助詞,助動詞に注目することで,解釈が深まることを明らかにした。また,注目した言葉から解釈を紡ぎ出す方法として,四つのコツ(A言葉の削除による意味の変化,B類義語への置き換えによる意味の変化,C動作化・映像化による意味理解,D自分の経験との関連づけによる意味づけ)を検討し,妥当性を検証した。次に米国ミネソタ大学リー・ガルダ教授を訪問し,小集団による読書プログラムの現状についてインタビューを行った。ガルダ教授によると,ブッククラブやリテラチャーサークルなど,様々なプログラムが存在するが,いずれもホールランゲージ教育に位置づくものである。ガルダ教授は,読書プログラムを推進するために,児童図書専門の図書室の必要性を強調しており,訪問時にミネソタ大学の児童図書室を見学した。さらに,読解力向上効果の検証のため,京都教育大学附属桃山中学校2年生および京都市立上鳥羽小学校4年生に授業の試行的実施を行った。附属桃山中学校では,話者の判断や評価の表れる言葉に注目し一文を読む活動を中心として,「タオル」(重松清)を教材とした2年生3クラス各4時間の授業を行った。上鳥羽小学校では,動作の表れた言葉に注目し一文を読む活動を中心として,「世界一美しいぼくの村」(小林豊)を教材とした4年生1クラス2時間の授業を行った。現在話し合い記録を分析しているところであり,成果を次年度に報告する予定である。平成26年度は読解力向上のためのカリキュラムを検討するとともに学会発表や論文投稿を通じて成果の公表を行った。話者の判断の表れる言葉に着目することで登場人物の言動を理解する方法について,「高瀬舟」の教材分析を行った。「高瀬舟」の教科書掲載を巡る

「漱石・鴎外の消えた『国語』教科書」「教科書から消える文豪」といった論調の影響に注目し,何を教えるかとどう教えるかとの関係が逆転している事実を明らかにした。先行研究を検討する中で「高瀬舟」の主題の分裂の問題から,主題という読みの一貫性形成の収束点として使われる作者鴎外について考察した。教室で「高瀬舟」の特徴を生かした学習を成功させるためには,部分の解釈ができる力を学習者が獲得していることが前提となることが明らかになった。また本研究で開発した解釈法を応用した教材研究の事例として『文学教材の解釈2014』を作成し,冊子で配布するとともに大学HPで公開した。重点を置いたのが叙述の考察である。一文単位で本文を引用し,その一文から読み取れる意味を記述した。解釈が分かれる箇所を明らかにし,それぞれの解釈の言語的な根拠を検討した。とくに動作を表す言葉(動詞やそれを修飾する言葉)や話者の判断が表れた言葉(助動詞,終助詞,副詞,副助詞)に注目した。前年度に研究を進めた「走れメロス」における話者の判断や評価の表れる言葉に着目する文学教材の解釈については,論文として公開した。合理的な解釈法の開発を目的として,中学生,高校生,教師へのアンケート調査の結果を考察した。「走れメロス」の読者が特定の一文に集中して関心を寄せることが分かった。同時に集団の中の約半数の読者が他の読者の選ばない文に注目するという分散の傾向も指摘できた。解釈をめぐって対話を成立させるためには言葉の意味を論拠とした解釈を行うことが大切であることを明らかにした。国語教育学本研究の目的は,国語科「読むこと」の学習において,一文の意味を考えるという解釈法と小集団討議という学習活動とを用いた指導法を開発し,その読解力向上効果について検証することである。計画では,平成25年度は,1小集団による読書プログラムの検討,2読解力向上効果の検証を行うとともに,3成果の公表を行う予定であった。本年度は,12とも計画通りの進捗であり,あわせて3についても学会発表や論文の執筆によって成果を公表することができた。1については,前年度の文献調査やインタビュー調査を踏まえ,読解力向上のためのカリキュラムを作成した。あわせてカリキュラムの妥当性を検証するために,実験的に授業を行い,記録や学習者の自己評価を検討した。2については,前年度に行った二つの実験的な授業の話し合い記録を詳細に分析するとともに,中学生,高校生,教師に実施したアンケート調査の結果を分析することによって,開発した解釈法の有効性を検討した。3については,研究成果を論文と学会発表によって公表した。とくに作成したカリキュラムについては,学会の課題研究に指定され,パネルディスカッションの形で発表した。本研究の目的は,国語科「読むこと」の学習において,一文の意味を考えるという解釈法と小集団討議という学習活動とを用いた指導法を開発し,その読解力向上効果について検証することである。計画では,平成24年度は1一文を読む解釈法の開発,2小集団による読書プログラムの検討,3読解力向上効果の検証を行う予定であった。本年度は,1については計画通りの進捗であるが,2と3については計画以上に研究が進展した。2については,文献で考察することを予定していたが,文献での考察に加え,読者反応理論家のミネソタ大学リー・ガルダ教授にインタビューを行う機会が得られた。
ライティング教授法とその効果:ジャンル・アプローチ

ジャンル・アプローチを取り入れた1年間のライティング授業で,学習者のライティング能力および言語能力がどう変化するかについて縦断的に調査した.本研究におけるジャンル・アプローチとは選択体系機能言語学に基づくもので,社会的コンテクストに応じた構成やスタイル,語彙や語形に対する認識を高めながら書く力を育成することを目指す.縦断的に収集したデータを分析した結果,学習者のレトリカル認識には大きな変化が見られ,またその認識の変化が学習者が産出する文章の変化にも反映されていることが分かった.ジャンル・アプローチを取り入れた1年間のライティング授業で,学習者のライティング能力および言語能力がどう変化するかについて縦断的に調査した.本研究におけるジャンル・アプローチとは選択体系機能言語学に基づくもので,社会的コンテクストに応じた構成やスタイル,語彙や語形に対する認識を高めながら書く力を育成することを目指す.縦断的に収集したデータを分析した結果,学習者のレトリカル認識には大きな変化が見られ,またその認識の変化が学習者が産出する文章の変化にも反映されていることが分かった.ジャンル・アプローチを取り入れたライティング授業(2009年度前期,後期)で,学習者のライティング能力および言語能力が1年間でどう変化するかについて調査した.授業で扱うジャンルは,Eメール文(前期)と要約文(後期)である.以下に,その教育効果について述べる.授業開始前と開始後の学習者のEメール文を比較し,次の5項目に関して伸びが見られたかについて分析した.(1)タスクの正確さ,(2)構成,(3)文法,(4)流暢さ,(5)語彙の豊富さである.(1)(2)(3)については,評価の信頼性を高めるため,本研究と無関係な二人の英語教員に採点を依頼した.(4)(5)については,学習者コーパスを作成し,テキスト解析ツール(Text-Stat)を用いて使用言語の変化について分析した.これらの量的データに加えて,授業開始前と開始後に実施したアンケートにより,学習者のジャンルに対する認識やビリーフがどう変化かしたかについて質的データも収集した.尚,後期の要約文についても同様の手順でデータ収集と分析を行った.得られた結果は次の通りである.(1)多変量分散分析で検定を行った結果,(1)(2)(3)(4)に関して,授業前と授業後のライティングに有意な差が見られた,(2)(5)に関しては有意な差が見られなかった,(3)有意な差が見られた(1)(2)(3)(4)の中でも特に(1)の伸びが顕著であった,(4)アンケート結果から,授業開始前と比べると授業後の学習者はより読み手や目的を意識して語彙や構成を選択するようになった.以上の結果から,ジャンル・アプローチは学習者のライティング能力を高める効果があるかもしれない(ただし語彙力全般を高めるには1年間の指導では十分ではない)という可能性を引き出した.この結果を受けて,2010年度は,異なるライティング指導を受ける統制群を作ることにより,ジャンル・アプローチの効果についてさらに調査を続ける予定である.ジャンル・アプローチに基づく英語ライティング授業の効果を1年間に渡り縦断的に調査した.授業で扱うジャンルは,前期がEメール文,後期が要約文である.平成22年度実績報告書では主にEメール文の変化について報告したため,この平成23年度報告書では要約文の変化に焦点を当てる.学期初めと学期末に学習者が産出した要約文を次の5項目に焦点を当て比較した.(1)流暢さ,(2)文の複雑さ,(3)パラフレイズ率,(4)文法的比喩(節の名詞化=情報の凝縮),(5)要約文総合的評価である.尚,言語能力と要約力の関係についてさらに詳細なデータを得るために,学習者を言語能力に基づいて2グループ(上級・初級)に分けた.得られた結果を以下にまとめる.1.「流暢さ」は,両グループともに有意な伸びが見られた.2.「文の複雑さ」は,上級グループに関しては有意な伸びが見られたが,初級グループでは数値が下がる傾向が見られた.3。「パラフレイズ率」は,両グループともに伸びが見られたが,有意な伸びが見られたのは上級グループのみだった.4.「文法的比喩」は,上級グループに関しては有意な伸びが見られたが,初級グループでは数値が下がる傾向が見られた.5.「要約文総合的評価」は,両グループともに伸びが見られたが,有意な伸びが見られたのは上級グループのみだった.以上の結果から考察できることは次の通りである.1.ジャンル・アプローチは言語力の高い学習者層を指導する際に有効となる.2.文の複雑性やパラフレイズ率を高めるには高い言語能力が必要となる.3.文法的比喩は,学習者のリテラシー能力の発達と共に使用頻度が上がることが先行研究で報告されており(e. g, Schleppegrell, 2004),アカデミック・ライティングで最も重要な要素であると言われているが,同じことが要約文についても言える読んだり聞いたりした情報を自分の言葉で要約する力は学業のみならず社会に出た後も様々な場面で必要となるが,要約の仕方を明示的に学ぶ機会は決して多くはない.選択体系機能言語学に基づくジャンル・アプローチは,その力を育成する重要な指導法となる可能性が高い.
与件変革下における果樹産地マーケティング体系の解明

わが国の二大果実である柑橘とリンゴにおける産地マーケティングの実態と課題について、実態調査などにより調査分析した。その結果、柑橘では産地の自然的・社会的立地特性に基づいた産地棲み分け戦略が展開するとともに、園地流動化などの産地再編戦略にも積極的であるのに対し、リンゴでは生産規模による産地序列に規定されながら、量販店などとの関係性マーケティングが指向されていることが明らかになった。1.ミカンおよびリンゴの市場ごとの産地別入荷量と価格を日園連の柑橘販売年報と農林水産省の青果物産地別卸売統計より分析した。ミカンでは市場ごとに主要な入荷産地に違いがあり,産地ごとの市場棲み分けがなされているが,リンゴでは市場ごとの主要入荷産地に大きな違いがなく,市場棲み分けは観察させなかった。ミカンの市場棲み分けは関西市場で和歌山県,名古屋市場で静岡県,三重県,愛知県というような近隣産地との結びつきが強く,またその傾向は年ごとに強まっている。2.柑橘産地の実態調査を静岡県,和歌山県,愛媛県,熊本県,三重県の10カ所で行った。販売面では光センサーを活用しながら,商品差別化を図るとともに,主力市場を絞り込みながら,卸売市場流通主体の販売対応を行っていることが特徴点として指摘できる。特に市場競争力の高い産地ほど卸売市場流通の比重が高いことが特徴的である。生産面では,一部の産地の中で園地基盤整備による生産条件の整備と園地の流動化によって規模拡大が進みつつある状況が確認できた。3.リンゴでは,青森県,岩手県,山形県の5カ所において,農協担当者を対象に,産地マーケティング戦略についての調査を実施した。青森県はリンゴ専作で通年販売を行う大産地の多い県,岩手県はリンゴ専作で,中小規模産地の多い県,山形県は,果樹複合地帯で,さくらんぼ,西洋なしにっいて独占的立場にある県である。各産地は,大規模化する量販店の対応に苦慮しながらも,需要に対して一定の独占的性格をもっ商材を軸に,販売戦略を構築していた。1.柑橘産地の中でも、規模は小さいながら、独自のマーケティング戦略によって市場で優位なポジションを獲得している事例として、和歌山県有田市のK共選と三重県南伊勢町のG共選を選び、そのマーケティング戦略導入の経過と背景、戦略の特長、成果などについて実態調査を行い、多様な条件下にある柑橘産地の発展可能性について検証した。2.今後の果樹産地マーケティング戦略として果実加工について実態調査などから検討した。生食用で有利販売できない品質の果実の利用や労働力が弱体な産地の戦略として果実加工の導入が期待されているが、加工商品開発とともに、ブランド戦略などの販売戦略、加工業者、流通業者などとの農商工連携が成功の重要な鍵であることが明らかになった。3.産地内部に対する戦略として、生産基盤の整備と担い手形成を狙いとした果樹園の地域的な流動化システムと園地基盤整備について実態調査を行った。園地の流動化、園地基盤整備ともに、単に園地の集積や基盤整備を行えばいいのではなく、その優位な条件を活かした営農体系全体の再編が重要であること、また機械化の進展によって、その条件が広がっていることが明らかになった。4.リンゴでは、早出し産地として特徴のある長野県の農協共販と、農協とは異なる流通ルートを担う産地商人及び産地市場における量販店対応について調査した。特に後者では従来個別的に展開してきた産地商人が、集団的に量販店対応しているなど注目される取り組みがあった。柑橘産地については、以下の調査分析を行った。(1)地場市場に絞り込んだ出荷戦略によって、当該市場で優位なポジションを獲得している小規模産地の実態調査により、産地の実態や戦略の特徴について明らかにするとともに、その導入条件や効果について分析を進めた。(2)果実供給力を維持・発展されるための産地内部条件の整備として、地域的な園地流動化システムを確立している産地において、その形成過程や効果などを、水田地帯で発展している同様なシステムと比較しながら、果樹産地における地域的な園地流動化システムの特質について明らかにした。(3)商品差別化戦略の一つであるブランド化戦略について、昨年度に引き続き、主要産地の実態調査を実施し、産地の置かれた条件とブランド化戦略との関係について分析を進めた。リンゴ産地については、これまでの実態調査結果及びリンゴの旬別市場入荷量の分析の結果、地球温暖化および有袋栽培減少など生産条件の変化により、後期出荷産地である青森県の出荷が早期化し、従来の時期別の棲み分けが崩れて年内市場の競合が激化したこと、市場競争においてリーダー的産地である青森県では量販店との結合が進んだが、それ以外の中小産地ではほとんど進んでいないことから、市場競争条件と量販店対応には関連性が見られることを明らかにした。これまでの調査分析結果に基づいて、柑橘とリンゴの市場競争条件の特質と動向を、量販店や卸売業者などとの関係を中心として整理し、それに対応した産地のマーケティング戦略の特徴と今後の課題について取りまとめた。
モンテカルロシミュレーションによるSRAMの動作限界見極めに関する研究

平成30年度は、モンテカルロシミュレーション(MC)によってスタティックRAM(SRAM)の動作限界を効率よく見極めるために、MCの回数を削減する手法の確立に注力した。まず、多数回のMCを可能とするために、高性能ワークステーション(HP社Z8/G4)を1台導入するとともに、回路シミュレータとしてHSPICE(Synopsys社製)を導入することにより、高速かつ高精度の回路シミュレーション環境を整えた。本研究は、MOSトランジスタの閾値電圧のばらつきを意図的に増加させて不良を出やすくすることで、MCの回数を削減しようとするものであり、MC回数10万回以下を目標として、最適なばらつきの加速方法を検討した。具体的には、メモリセル回路の書き込み動作について閾値電圧のばらつきとMCの回数を様々に変化させた実験を行い、書き込み不良数を観測することで、必要最小限のMC回数によって許容範囲の誤差で不良率を求める手法を模索した。その結果、閾値の標準偏差(ばらつき)を10mVずつ増加させながら100回のMCを行い、不良が出始めた点から前後2点ずつ合計5点で10,000回のMCを行い、5点の不良率から実際のばらつきにおける不良率を求める数式を見出した。さらに、得られた不良率の妥当性を検証するために1,000万回のMCを行うことにより、1MbitのSRAMに対して1桁以内の誤差で不良率が正しく推定できていることを確認した。これにより、10万回以下のMCでメガビット規模のSRAMの書き込み不良率を十分な精度で推定する方法を確立することができた。また、この手法を用いて様々な閾値の仕上がり条件における書き込み不良率を求め、メガビット規模SRAMの動作限界を明らかにした。以上の研究から得られた成果2件を、2018年度電気関係学会関西連合大会および2019年度電子情報通信学会総合大会にて発表した。SRAMの書き込み動作について、当初予定していたモンテカルロシミュレーションの回数削減による動作限界推定方法を確立することができた。SRAM全体としての動作限界を見極めるためには、書き込み動作に加えて読み出し動作における不良率の推定が必要であるが、開発した手法はSRAMの読み出し動作にも適用可能と考えられ、当初の目的はほぼ達成できたと考えられる。また、種々の閾値条件で書き込み時の不良率を明らかにすることで、書き込み動作の限界を求めることができたことは、当初の計画よりも進んだ成果である。ただし、今後の課題としてSRAMの読み出し動作における本手法の確立が必要であり、読み出し動作においても本手法がそのまま適用できるかどうかについて今後見極めていく必要がある。また、これと並行して不良率推定のさらなる高精度化も検討する必要がある。以上の観点から、やや課題が残されているものの、一部進んだ成果も得られており、概ね予定通りに進捗していると考えられる。平成31年度は、前年度に確立したMCの回数削減手法をSRAMの読み出し動作に適用して、読み出し動作においても10万回以下のシミュレーション回数でメガビット規模のSRAMの不良率を推定できる手法の確立に注力する。ただし、読み出し動作時にはメモリセルのデータ保持に対する安定性が低下するため、不良率の推定には読み出し動作の不良と、データ保持の不安定性による不良を区別する必要があり、前年度に実施した書き込み動作に比べるとやや難易度が高いことが予想される。そこで、まず上記二種類の不良を区別する方法について検討を行い、種々の条件によるMC結果から得られる出力波形の観測などを通じて、適切な区別の基準を設ける。その上で、ばらつきを意図的に増大させたMCを行い、前年度の手法を適用して読み出し動作における不良率の推定を行う。さらに推定値の妥当性を検証するために、1,000万回程度のMCを実施して推定精度の確認を行う。精度が低い場合は、上記の区別の基準を見直すことも含めて、高精度化の検討を行い、読み出し時と同程度の精度を得るまでこの検討を継続する。これによって、メガビット規模のSRAMの読み出し動作における不良率の推定を10万回以下のMCで行うことが可能となるとともに、昨年度の成果と合わせてSRAM全体としての動作限界の見極めが可能となる。研究遂行に当たっては、前年度以上に多数回の回路シミュレーションが必要となるため、ワークステーションを1台増強するとともに、引き続き回路シミュレータHSPICEを導入する。

さらに、得られた不良率の妥当性を検証するために1,000万回のMCを行うことにより、1MbitのSRAMに対して1桁以内の誤差で不良率が正しく推定できていることを確認した。これにより、10万回以下のMCでメガビット規模のSRAMの書き込み不良率を十分な精度で推定する方法を確立することができた。また、この手法を用いて様々な閾値の仕上がり条件における書き込み不良率を求め、メガビット規模SRAMの動作限界を明らかにした。以上の研究から得られた成果2件を、2018年度電気関係学会関西連合大会および2019年度電子情報通信学会総合大会にて発表した。SRAMの書き込み動作について、当初予定していたモンテカルロシミュレーションの回数削減による動作限界推定方法を確立することができた。SRAM全体としての動作限界を見極めるためには、書き込み動作に加えて読み出し動作における不良率の推定が必要であるが、開発した手法はSRAMの読み出し動作にも適用可能と考えられ、当初の目的はほぼ達成できたと考えられる。また、種々の閾値条件で書き込み時の不良率を明らかにすることで、書き込み動作の限界を求めることができたことは、当初の計画よりも進んだ成果である。ただし、今後の課題としてSRAMの読み出し動作における本手法の確立が必要であり、読み出し動作においても本手法がそのまま適用できるかどうかについて今後見極めていく必要がある。また、これと並行して不良率推定のさらなる高精度化も検討する必要がある。以上の観点から、やや課題が残されているものの、一部進んだ成果も得られており、概ね予定通りに進捗していると考えられる。平成31年度は、前年度に確立したMCの回数削減手法をSRAMの読み出し動作に適用して、読み出し動作においても10万回以下のシミュレーション回数でメガビット規模のSRAMの不良率を推定できる手法の確立に注力する。ただし、読み出し動作時にはメモリセルのデータ保持に対する安定性が低下するため、不良率の推定には読み出し動作の不良と、データ保持の不安定性による不良を区別する必要があり、前年度に実施した書き込み動作に比べるとやや難易度が高いことが予想される。そこで、まず上記二種類の不良を区別する方法について検討を行い、種々の条件によるMC結果から得られる出力波形の観測などを通じて、適切な区別の基準を設ける。その上で、ばらつきを意図的に増大させたMCを行い、前年度の手法を適用して読み出し動作における不良率の推定を行う。さらに推定値の妥当性を検証するために、1,000万回程度のMCを実施して推定精度の確認を行う。精度が低い場合は、上記の区別の基準を見直すことも含めて、高精度化の検討を行い、読み出し時と同程度の精度を得るまでこの検討を継続する。これによって、メガビット規模のSRAMの読み出し動作における不良率の推定を10万回以下のMCで行うことが可能となるとともに、昨年度の成果と合わせてSRAM全体としての動作限界の見極めが可能となる。研究遂行に当たっては、前年度以上に多数回の回路シミュレーションが必要となるため、ワークステーションを1台増強するとともに、引き続き回路シミュレータHSPICEを導入する。
子孫の疾患リスクと関連する精子DNAメチル化異常の成立機構

これまでの解析により、精子DNAメチル化異常の成立には精子形成過程におけるNRSF/RESTの関与が示唆された。精巣におけるNRSF/RESTの発現についてはmRNAレベルでの確認ができたため、タンパク質の局在を明らかにするために免疫組織染色による解析を試みたが、複数の抗体を用いた検討の結果、現在入手可能な抗体では十分な特異性が確保できないことが明らかとなった。そこで、NRSF/RESTにエピトープタグを付与することにより、内在性のNRSF/RESTの局在を解析することを試みた。本研究では、学外の研究者と協力してPAタグを内在性のNRSF/RESTのC末にノックインした。PAタグのノックインが確認されたF1世代の精巣におけるNRSF/RESTの発現を、PAタグを特異的に認識するラットモノクローナル抗体(NZ-1)を用いて検出した。その結果、NRSF/RESTの発現はPlzf陽性の精原細胞およびSox9陽性のセルトリ細胞に特異的な発現が確認された。特に、精原細胞におけるNRSF/RESTの発現は全てのPlzf陽性細胞ではなく一部の亜集団にのみ発現しており、精母細胞や精子細胞での発現は認められなかった。この結果から、加齢に伴う精子DNAメチル化異常はNRSF/RESTを発現する精原細胞の亜集団において成立する可能性が示唆された。父親の高齢は子どもの自閉症や統合失調症などのリスク因子として報告されている。これまでに申請者らは、高齢マウスの精子において多数の遺伝子座にDNAメチル化の異常が生じることを見出し、これが仔マウスにおける精神疾患様の行動異常や脳の遺伝子発現異常と関連することを見出した。そこで本研究では、雄の加齢に伴い精子DNAメチル化異常が生じる分子機構について明らかにすることを目的とした。精子DNAメチル化異常の生じた領域には転写抑制因子NRSF/RESTの結合モチーフが濃縮していたことより、精子形成過程におけるNRSF/RESTの関与が示唆された。そこで精巣におけるNRSF/RESTの発現を確認し、若齢および高齢雄の精巣全体における発現レベルの定量を行ったが、mRNAおよびタンパク質の発現量に有意な変化は認められなかった。次に、精子形成過程の特定の分化段階に着目してNRSF/RESTの発現量を比較するために、免疫組織染色による解析を試みた。市販されている複数の抗NRSF/REST抗体を用いて特異性の確認を行ったが、十分な特異性が確認されず、免疫組織染色による解析には適さないことが明らかとなった。アルツハイマー病やハンチントン病などの神経変性疾患は加齢により発症が増加するが、その原因の一つとして、加齢に伴うNRSF/RESTの細胞内局在変化が挙げられている。そこでNRSF/RESTの細胞内局在を制御することが報告されているHttに着目して発現量を比較したところ、高齢雄の精巣全体において発現量が増加していることが明らかとなった。したがって、精巣においても加齢に伴いNRSF/RESTの局在変化が生じる可能性が示唆された。抗体の特異性が確保出来ず、NRSF/RESTの局在解析が遅れているため。抗体の特異性の問題を解決するために、学外の研究者と協力してNRSF/REST自体にエピトープタグを付与したノックインマウスを現在作成中である。また、精巣の各種細胞を分画分取して分化段階ごとの解析を行う。
口腔がん可視化による早期診断のための光イメージング法に関する基礎的研究

視診による口腔扁平上皮がん(OSCC)の診断は時として困難である。近年、蛍光可視化技術を応用した簡易携行型の装置を用いて、口腔がんの非侵襲的なスクリーニングが行われている。このような目的に開発された装置はいくつかあるが、VELscope®が多く使用されている。しかし作用機序に関する基礎的研究は少なく、本研究では、口腔がんの蛍光イメージングに関する有用性について検討した。24年度はヒト口腔がん細胞株(舌癌由来の角化型SCC細胞株(HSC-2)および低分化型細胞株(HSC-3))を用いLuciferaseなどのリポーター遺伝子を導入した細胞株を樹立し、ヌードマウスの舌、腹腔内に移植、発光イメージングが可能な舌がんの原発および腹膜転移モデルを確立した。25年度は別の2株のヒト口腔がん培養細胞(UMSCC81B, Ca9-22)をヌードマウスおよびヌードラットの舌ならびに皮内(皮下)に移植し、遺伝子導入なしで蛍光イメージングが可能な舌がんモデルを確立した。これら舌がんモデルを用いて以下の2つの方法でイメージングを行い、その特異性と感度を比較検討した。1)簡易型口腔がん蛍光診断装置(Velscope)を用いて皮内腫瘍、皮下腫瘍、舌腫瘍に青色光(436 nm)を照射し、イメージングを試みた。以上のことから、ICG標識Podoplanin抗体をプローブとして用いた蛍光イメージングは特異性に優れるが、発現の弱い癌の検出感度が低い可能性が示唆された。一方,Velscopeなどの特殊光イメージング装置は皮内や舌腫瘍など粘膜表面に露出した腫瘍に対しては比較的高い感度が見られたが、Marginなどは必ずしも明瞭ではなく、癌特異性も高くはない傾向が見られた。1分化度や悪精度の異なる複数のヒト口腔がん細胞株(舌癌由来の角化型SCC細胞株(HSC-2)および低分化型細胞株(HSC-3))を用いLuciferase遺伝子を導入し、安定発現細胞株を樹立し、ヌードマウス舌、腹腔内に移植し、発光イメージングが可能な舌がん原発および腹膜転移モデルを確立した。2上記、舌がんモデルに対して既存の口腔がん光蛍光診断装置(Velscope)を用いて青色光(436 nm)を照射し、感度、特異性を評価した。正常組織の緑色の自家蛍光に対して腫瘍部では若干蛍光が弱い傾向は見られたが、Marginは明瞭ではなく、診断精度は不充分と言わざるを得なかった。今回は2種類の腫瘍モデルの結果に過ぎないので今後さらに多数の腫瘍について検討する必要がある。3上記に比べて,より腫瘍特異性が高いと考えられる5ALA(5-Aminolevulinic acid)を用いて舌がんモデル、腹膜転移モデルに対して405 nmの励起光照射、420 nm以下をカットするフィルターを用いて蛍光イメージングを試みた。癌の蛍光イメージングは早期発見と確実な外科的切除のために有効な方法であるが、癌細胞のみを特異的に標識してコントラストのよい像を得ることが難しい。5ALAは天然アミノ酸だが、癌細胞特異的に蛍光物質に代謝されるプロドラッグであり、蛍光診断薬としてさまざまな領域で応用されている。しかし、非腫瘍部でのマウス皮膚の赤色の非特異蛍光が強く、舌腫瘍,皮下腫瘍,腹膜転移モデルのいづれも腫瘍部の蛍光と明瞭に区別できなかった。Velscope同様、今回は2種類の腫瘍モデルの結果に過ぎないので今後,文献的情報のみならず至適条件、光増感剤の使用などさらに検討する必要がある。平成24年度はヒト口腔がん細胞株(舌癌由来の角化型SCC細胞株(HSC-2)および低分化型細胞株(HSC-3)を用いLuciferaseなどのリポーター遺伝子を導入した細胞株を樹立し、ヌードマウスの舌、腹腔内に移植し、発光イメージングが可能な舌がんの原発および腹膜転移モデルを確立した。平成25年度は別の2株のヒト口腔がん培養細胞(UMSCC81B,Ca9-22)をヌードマウスおよびラットの舌ならびに皮内、皮下に移植をし、遺伝子導入なしで蛍光イメージングが可能な舌がんモデルを確立した。これら舌がんモデルを用いて以下の2つの方法でイメージングを行い、その特異性と感度を比較した。1)簡易型口腔がん蛍光診断装置(Velscope)を用いて皮内腫瘍、皮下腫瘍、舌腫瘍に青色光(432nm)を照射し、イメージングを試みた。その結果、ICG標識Podoplanin抗体をプローブとして用いた蛍光イメージングは特異性に優れるが、癌の検出感度が低い可能性が示唆された。一方、Velscopeなどの特殊光イメージング装置は、皮内や舌腫瘍など粘膜表面に露出した腫瘍に対しては比較的高い感度を認めたが、Marginなどは必ずしも明瞭ではなく、癌特異性も高くない傾向が見られた。平成26年度は、上記の実験系について継続をし、実験結果について海外英文誌に投稿するために、データの取りまとめと解析を行い論文作成を行った。近々、投稿予定である。口腔外科学研究計画の最終年度であるので、年度内に論文投稿できるように計画している。分化度や悪精度の異なる複数のヒト

口腔がん細胞株(舌癌由来の角化型SCC細胞株(HSC-2)および低分化型細胞株(HSC-3))を用い、発光イメージングが可能な舌がん原発および腹膜転移モデルを確立した。本舌がんモデルに対して口腔がん光蛍光診断装置(Velscope)を用いて青色光(436 nm)を照射し、感度、特異性を評価した。しかし、正常組織の緑色の自家蛍光に対して腫瘍部では若干蛍光が弱い傾向は見られたが、Marginは明瞭ではなく、当初の予想よりも診断精度は不充分と言わざるを得なかった。今回は2種類の腫瘍モデルの結果に過ぎないので今後さらに多数の腫瘍について検討する必要がある。これまでの計画どうり進める予定である。平成25年度はがん特異プローブとしてICG(indocyanine green)等の各種蛍光色素で口腔がんで高発現するEGFRやPodoplaninに対する抗体等を標識し、これをマウス尾静脈から静注し、発光イメージングを行い、がんに対する特異性と感度を今年度の結果と比較検討する予定である。また平成24年度の研究実施は、2種類の腫瘍モデルの結果に過ぎないので平成25年度においては、さらに多数の腫瘍について検討する予定である。分担研究機関に於いて繰り越し金が発生したため。平成26年度中に全て使用する。繰越金額の分を本年度に十分な経費をかけて研究を行う予定である。
経口トレランスの誘導機序の解析と免疫病修復への応用

抗原の経口投与により誘導される末梢トレランス「経口トレランス」は、アレルギー、自己免疫疾患に対する予防、治療法として期待される。しかしながら、経口トレランスの機序についてはまだ十分解明されておらず、臨床応用のための知見も十分ではない。そこで本研究では以下のように経口トレランスの誘導機構について解析し、自己免疫疾患を効果的に抑制する抗原の形態、構造について検討した。(1)SCIDマウス移入系を用いた経口トレランス誘導細胞群の解析正常マウスの脾臓細胞からリンパ球サブセットを分離してSCIDマウスに移入し、レシピエントSCIDマウスにおける経口トレランス誘導を解析した。その結果、BALB/cマウス脾臓細胞、脾臓T細胞、CD8^+細胞除去細胞いずれを移入したマウスにおいても経口トレランスが誘導された。これより経口トレランスの誘導にはCD8^+T細胞、B細胞は必要ないことが示された。(2)抗原の経口投与により誘導されるTh2様サイトカイン産生を持つT細胞の機能の解析OVA特異的T細胞抗原レセプタートランスジェニックマウスにOVAを飼料中の成分として経口投与した場合、膵臓中にTh2様サイトカイン産生パターンのT細胞が誘導された。そこで、この細胞の性質と機能を典型的なTh2型細胞と比較した。その結果、この細胞は十分に抗体産生に対するヘルパー機能を持たないなど典型的Th2細胞とは異なると考えられた。このような細胞が抗体産生レベルでの経口トレランスの誘導に関与することが示唆された。(3)II型コラーゲンの経口、経鼻投与によりコラーゲン誘導性関節炎(CIA)の抑制DBA/lマウスに様々な形態のII型コラーゲンを経口、経鼻投与し、その後のCII免疫によるCIA誘導への効果を検討した。その結果、熱変成CII、断片化したCIIでもCIAが抑制された。さらに、CII由来合成部分ペプチドの投与によってもCIAが抑制された。
周産期の母体低栄養がおよぼす子供の不妊症への影響

低体重症を対象としたマウスモデルの先行研究によって、周産期(妊娠期・授乳期)に低タンパク質を与えられたマウス(Low Protein Diet: LPD)の仔は、コントロール(Control Diet; CD)と比較して、低体重となり、離乳後に普通食を与え続けても代謝異常のため低体重の症状は回復しなかったことを見出している。本研究では、「仔の正常な発育に周産期の適切な母体栄養が欠かせない」可能性があると考え、その検証に着手した。LPD給与マウスの仔は、CD給与の仔と比較して生殖器の発育の指標とされる肛門と生殖器の間の距離(肛門-生殖突起間距離)が異常であることを発見した。そして、LPD給与マウスの仔(オス)は、精巣重量が軽く、離乳後からCD給与に戻しても精巣が小さいまま回復しないという結果を得た。精巣の重量は、男性ホルモンであるテストステロン濃度や精子産生組織の発達を反映するため、精巣発育の指標となっており、周産期の栄養が仔(オス)の繁殖能力に影響する可能性が示唆された。生後2ヶ月目の各グループのオスの仔から精巣を採取、組織切片を作製し組織学的な評価を行ったところ、精巣内組織構造に影響は見られなかった。また、精巣上体に溜まっている精液を回収し、精子の運動率や奇形率を調べたところ、LPD給与マウスの仔の精子運動性および奇形率に影響が見られた。現在、マウス生殖細胞を用いたIVF実験によって、精子の受精のタイミングと胚発生率への影響について調べている。本研究は、ヒトの不妊症に関する研究をマウスモデルを用いて研究を行う予定のみであったが、申請者が所属する帯広畜産大学の研究環境で、他の家畜(ヒツジおよびブタ)の母畜に、タンパク質給与を制限あるいは強化した場合、その仔の生殖器の発達および母親の行動に影響が出ることが見出された。本申請が、他の応用研究にも役立つ知見が得られ、研究の進捗状況は予想以上に進展していると判断した。マウスモデルの実験は、共同研究者と研究のまとめおよび追加実験をしているところである。また、家畜でも実験を進めているので、データを解析し、学会さらには学術雑誌にて報告を予定している。計画的な実験により、経費を抑えることができたため次年度使用額が生じた。
成層圏オゾン破壊ハロゲンサイクルでのリザーバの光分解による再活性化の影響力評価

本研究は、オゾン破壊サイクルにおいて重要な役割を果たす活性なハロゲンの生成過程を解明し、影響力をようとしているものである。特に本研究においては、一酸化ヨウ素ラジカル(IO)やヨウ素(I)原子などの生成過程について研究を行った。IOラジカルやI原子などの反応性ヨウ素化合物は、オゾン破壊サイクルに効率的な酸化剤としてかかわることが知られている。そのため、反応性ヨウ素化合物の生成過程やその反応速度、生成量などは、モデル計算によってオゾンの量の見積もりを行うために必要不可欠なデータである。そこで、大気中における反応性ヨウ素化合物の新たな生成過程の解明を目的に、時間分解型キャビティーリングダウン分光法を用いてヨウ化アルキル類の反応の測定を行った。このヨウ化アルキル類は海洋中の藻類などによって生成され大気中に放出されており、大気中でのさまざまな段階的な反応から反応性ヨウ素化合物を形成すると考えられている。具体的には、時間分解型キャビティーリングダウン分光法を用いて、硝酸ラジカル(NO_3)とヨードメタン(CH_3I)との反応測定を行った。この反応が大気中において起こると、反応生成物であるCH_2Iラジカルが大気中の酸素との反応により反応性ヨウ素化合物を生成させる。本研究の結果、得られたNO_3ラジカルとCH_3Iの反応速度定数の値より、NO_3ラジカルとCH_3Iの反応が大気中の反応性ヨウ素化合物の生成や濃度に重要な影響を与えている可能性を示唆することができた。特に夜間は太陽光が存在しないためヨウ化アルキル類の光分解が行われないため、この反応は反応性ヨウ素化合物の生成に対しては非常に重要であることがわかった。一酸化ヨウ素(IO)ラジカルのような反応性ヨウ素合成物は、地球大気中のオゾン破壊サイクルやヨウ素サイクルに関係するため、地球大気全体の酸化力に影響する重要な化学種である。通常、IOラジカルはヨウ化メチル(CH_3I)やジヨウ化メチル(CH_2I_2)等の太陽光分解により生成すると考えられているため、夜間には大気中に存在しないと考えられてきた。しかし、最近のフィールド観測の研究により、夜間においてもIOラジカルが存在するということが示唆されたが、その発生源に対して明確な回答は出されていない。そこで本研究においては、夜間にIOラジカルを生成する可能性があり、IOラジカル生成に対する影響力が大きいと予測されるが、これまで測定されることのなかった反応である硝酸(NO_3)ラジカルとCH_3Iの反応をキャビティーリングダウン分光法により測定した。その結果、この反応の速度定数がk=(4.3±0.4)×10^<-13>cm^3 molecule^<-1> s^<-1>であると決定することができた。NO_3ラジカルとCH_3Iの反応による大気中のCH_3Iの寿命は、この研究で決定されたNO_3とCH_3Iの反応の速度定数と大気中のNO_3の濃度を組み合わせることにより計算することができる。NO_3は夜間において、大気中の濃度が2×10^8molecules cm^<-3>まで上昇すると報告されている。以上の値より、寿命は約3時間であると見積もることができた。この約3時間という寿命は、大気において最も重要なものであると考えられる太陽光分解による大気中のCH_3Iの寿命(数日間)より早いものであった。したがって、NO_3ラジカルとCH_3Iの反応は、大気における反応性ヨウ素合成物の生成に対して重要な役割を果たしているということがわかった。
キラルアジリジンを用いる生理活性天然物の合成

報告者は光学活性な1(>95% ee)の簡便な合成法を既に開発している。今回、1およびその誘導体の開環反応を鍵工程とする生理活性物質の合成を検討した。1は潜在的対称性を持つため保護基の付け替え操作、引き続く位置選択的な開環により、お互いエナンチオマーの関係にあるキラルシントン2および3に導けると予想できる。この考えに基づき1を出発物質とする4および5の合成を実施した。4は抗腫瘍性ジペプチド、ベスタチンの、また5は強力なペプシン阻害作用を持つペプチドの鍵合成中間体である。また5の構造を持つ異常アミノ酸は強力なレニン阻害剤であるアパチニンGの構成成分であることも知られている。4の合成はアジリジン環の酸素求核剤によるS_N2型開環反応を鍵工程として、1から12工程、総収率35%で達成した。一方、5はアジリジン環のβ-アミノエポキシドへの変換、さらにエポキシドのシアニドアニオンによる開環反応を経て、1から13工程、総収率18%で得た。またアジリジン環を酸素求核剤のみならず、窒素求核剤によっても位置および立体選択的に開環することができた。これにより1を出発物質とするトレオ-1,2-ジアミン誘導体のenantiodivergent合成法も開発することができた。
近代産業技術史における陸軍工廠に関する実証的研究

1.文献・資料調査研究,産技技術史関係の遺跡・遺物調査,聞き取り調査の補充調査を行った。(1)文献・資料調査の補充調査では、国内の国公立図書館が所蔵する資料及び学協会誌(火兵学会誌、造兵彙報等を調査し、外国技術との対応関係を明らかにした。(2)産業技術史関係の遺跡・遺物調査の補充調査では、陸軍工廠関係の残存する建築物、製作機械,試験機器類の所在及び現況を明らかにすることができた。(3)聞き取り調査の補充調査では、かつて陸軍工廠に勤務されていた技術者・職工諸氏から技術水準、労働状態、技能者養成等に関して新知見が得られた。2.全体のまとめを行った。1.文献・資料調査研究,産業技術史関係の遺跡・遺物調査,聞きとり調査は計画通り進展させることが出来た。2.新たに得られた知見:(1).文献・資料調査では、国・公立の図書館,文書館,資料館等が所藏している陸軍工廠関係のこれまで知られていない資料,欧米諸国の軍事技術と日本側のものとの対応関係を記す新資料を発見した。(2).遺跡・遺物調査では,東京,神奈川,名古屋,大阪,小倉を中心とする陸軍工廠関係の残存する建築物,製作機械,試験機器類の所在とその現況を新たに確認した.(3).聞きとり調査では、陸軍工廠に勤務されていた職員,技術者,職工,動員学徒諸氏から当時の勤務状況,労働条件,衛生間題,技能者養成等に関し,これまでよりもくわしい知見が得られた。1.文献・資料調査研究,産業技術史関係の遺跡・遺物調査,聞き取り調査は計画通りに進展させることが出来た。2.新たに得られた知見:(1)文献・資料調査研究では,国立国会図書館,国立公文書館,防衛研究所図書館等が所蔵している陸軍工廠関係のこれまで公表されていない資料,欧米各国の軍事技術と日本側のそれとの対応間係を示す文献・資料を新たに発見した。(2)産業技術史関係の遺跡・遺物調査では,東京,神奈川,大阪を中心とする陸軍工廠関係の残存する建築物、製作機械、試験機器類の所在とその現況を新たに確認した。(3)聞きとり調査では,陸軍工廠に勤務されていた職員,技術者,職工,動員学徒諸氏から当持の勤務状況,労働条件,衛生問題,技能者養成等に関し,これまで知られていたよりもくわしい知見が得られた。3.まとめとして:(1)(2)(3)を通して陸軍工廠についての,これまでごく断片的なことしか知られていなかったことより精確で,新しい多くのことが知り得た。特にこれまでほとんど知られることのなかった朝鮮人の強制連行とその就労について全く新しい知見も得られた。
Trp合成酵素αおよびαβ複合体のX線解析による高次構造構築原理の解明

蛋白質の立体構造形成および四次構造形成のメカニズムを解明するために、大腸菌トリプトファン合成酵素αサブユニットのX線結晶構造解析を行った。αサブユニットは、αヘリックスβシート構造が繰り返すβバレル構造をとっている。αサブユニット二量体の構造は、このβバレルがほぼ平行に並び、かつ分子1個分ずれたように配置して接触していることがわかった。本来であればこのαサブユニットの接触領域にはβサブユニットが位置し酵素本来の構造をとり機能するのであるが、この位置にαサブユニットがきていることになる。さらに、本来の酵素分子はα2β2の複合体を作るが、そのサブユニットの立体的な配置はαββαの順である。つまり、元々αサブユニットは接触しないような酵素分子である。にもかかわらず、今回の結果は二量体を形成しαサブユニット同士が接触している。これは、この接触領域に酵素活性においても重要な四次構造形成の鍵があるのではないかと考えられる。トリプトファン合成酵素の酵素反応は、インドール3グリセロリン酸からインドールを作るα反応、インドールからトリプトファンを作るβ反応の2段階で行われること、αサブユニット単独でのα反応よりも、α2β2複合体を形成したときの方が活性が50ないし100倍近く増幅されること、などが知られている。このこととサブユニットの立体配置を考えてみると、α反応で生成したインドールがトラップされずに次のβ反応に供給されるαβの組み合わせの方がααの組み合わせよりも反応効率がいいことを示している。αβ複合体の接触領域とα二量体の接触領域を比較してみると、どちらにも共通するのことは芳香環側鎖が接触領域に配置されていることである。どちらも、二つのサブユニットをつなぎ止めるように配置している。このことインドールトラップの関係についてさらに考察を行う必要がある。
効率よい身体運動のトレーニング開始時期決定に対する神経科学的研究

これまでに我々は、中枢神経系における小脳の運動制御機構の加齢変化および効率よい身体運動の開始時期決定への応用の可能性を検討するために、晩成性動物であるネコを用い、種々の皮質層の生後変化を形態学的に検討してきた。本研究では、老化の早期出現を主徴とする老化促進マウス(SAM)を用いて、小脳皮質の生後発達過程の組織学的検索による所見と運動観察の定量的検索結果を比較することによってこのことをより明確に検証することを目的として研究を遂行した。研究材料にはネコ、SAM-P8、SAM-R1を用いた。動物は麻酔後、頚動脈内に生理的食塩水、ついで10%ホルマリンを灌流して固定した。脳を摘出後、原始小脳として小節、古小脳として山頂、および新小脳として係蹄小葉第一脚を選択し、各部位小葉長軸に対して直角の切片を作成した。小脳皮質細胞層の検索は細胞体染色を施し、小脳各部位の小脳皮質の分子層、顆粒層の頂上部、中間部および基底部の厚さをマイクロメータを用いて測定した。その結果、ネコ小脳の重量と皮質層は生後次第に増加、2-3年で一定値に達し、5-8年を境にゆっくり減少した。同様な生後変化は寿命の非常に短い老化促進マウスのR-1タイプにおいて短いtime-courseで観察された。さらに寿命の短いP-8では生後5ケ月から始まった。これらの動物を通して皮質層の減少は、原始小脳で最も大きく、ついで古小脳、新小脳であった。これらの結果は加齢による小脳の萎縮を示しており、それが小脳の関与する身体運動のさまざまな変化に影響しているものと示唆される。従って、本研究から効率よい身体運動の開始時期決定を神経科学的に推定できることが明らかとなった。
組換えの際に生じるDNA構造と蛋白質による識別

本研究の目的はDNAの構造研究という立場から、組換えに必要なDNAの構造上の条件をつめ、さらに組換えに関与する蛋白質によって、どのようにその構造が誘起、識別されるかを明らかにし、組換えの構造化学的な説明を行うことにある。具体的には組換えの中間に生じると言われるHolliday構造を合成DNAで作らせ、その構造をとる条件、その立体構造を明らかにすること、さらにRuvC蛋白質との結合様式の解明を期す。Holliday構造の探索:4本の非等価で、半分ずつ相補的な塩基配列を持つ合成DNAをDNA合成機で作り、加熱徐冷して十字型のHolliday構造をとらせた。後の構造解析に便利な種々の塩基配列を持ち、種々の長さのものを合成して、室温で安定なHolliday構造を形成させた。UV、CD、電気泳動等でその形成を検証した。さらに金属、特にマグネシウムがHolliday構造の安定化に寄与していることがわかった。Holliday構造の立体構造:未だHollidayジャンクションの立体構造は明らかでないので、核磁気共鳴によって立体構造の解析を始めた。しかしNMRでも残基数が30以上になるとまともな方法では解析できない。中央の数残基のみ^<13>C、^<15>N等の安定同位体で標識したDNAを合成し、特に中央部の交叉構造部位のみの構造を調べることを試みた。RuvCによる認識:RuvCはHolliday構造に結合し、homologousな配列があれば切断する。ゲルシフトの実験からhomologousであろうがなかろうがHolliday構造をとるとRuvCは結合できることがわかった。Footprintの実験から中央約12塩基対がRuvCでおおわれることがわかった。また、中央にどのくらいhomologousな配列があればRuvCが切断するか検討したら、中央の4塩基対(各アーム1塩基対)でよいこともわかった。