hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス腎癌を用いたミニ移植のモデルの作成と抗腫瘍効果の免疫学的検討

特異的な抗腫瘍免疫の獲得が認められ、脾細胞をRenca細胞と培養したところ、腎癌特異的なIFN-γの産生を認めた。以上の結果はCancer Res. 65:10032,2005に掲載された。2.我々はマウス腎癌ミニ移植モデルにおけるmixed chimerismの意義についてさらなる検討を進めるために、同じマウスの組み合わせで致死量以下の放射線と骨髄移植を用いたマウス腎癌治療モデルも作成し、抗腫瘍効果とchimerismの相関を検討した。放射線照射を用いた系では照射線量に応じて混合完全chimeraまで誘導されるものの、いずれにおいても抗腫瘍効果は認められなかった。600Gy照射群について詳細に解析したところ、末梢血にて早期より完全chimeraが認められたが、放射線照射後2週間経っても腸間膜リンパ節細胞細胞数はコントロールと比して著明に減少していた。同時期に行った腫瘍の病理学的検索でもリンパ球の浸潤の程度は軽度であった。一方CP群では末梢におけるリンパ系の回復は早く、腫瘍内にも著明なリンパ球浸潤を認めた。以上の結果はマウス腎癌治療において、必ずしも完全chimeraの誘導が必須ではないことを示すとともに・抗腫瘍効果を得るには、前処置からのリンパ系の早期の回復が重要であることを示した。この結果については投稿準備中である。白血病に対する骨髄移植で、Graft-versus-leukemia効果(GVL効果)が注目され、固形腫瘍に対しても同様の免疫反応が期待されることから、より広範に移植片対腫瘍効果(Graft-versus-tumor効果:GVT効果)と称されている。このGVT効果を前面に出し、移植の安全性も高めた治療法が、骨髄非破壊的同種移植(ミニ移植)であり、NIHのChildらが転移性進行腎癌患者に行ったミニ移植で50%以上の奏効率を報告して現在非常に注目されている。しかし、GVHDとGVT効果は背中合わせで、時として致死的な合併症を引き起こすこともあり、臨床的に両者をいかにコントロールするかは極めて重要であるが、現状では確立された方法はない。上述のごとく、ミニ移植は臨床の現場で考案されてきた治療であるため、基礎的研究は少なく、特に腎癌については我々が調べ得た限りでは皆無であった。腎癌に対するミニ移植の動物モデルを作成すれば、臨床の現場での問題点について試行錯誤することができ、臨床へのフィードバックが期待できると考え、マウス腎癌を用いて安全かつ確実なミニ移植のモデルを作成した。我々のモデルでは抗腫瘍効果の誘導にドナーリンパ球輸注(DLI)は必須であったが、ドナー由来細胞の完全キメラは誘導されていなかった。さらにミニ移植を行って腎癌を拒絶したマウスにおいては腎癌特異的な抗腫瘍免疫が獲得されていた(Cancer Res.65:10032-10040,2005)。今年度は我々が確立したマウス腎癌に対するミニ移植の系を用いて、DLIのタイミングを遅らせることで、抗腫瘍効果を維持しつつ、GVHDのみを軽減させることに成功した(Clin Cancer Res.13:1029-1035,2007)。この概念がヒト腎癌に対するミニ移植の現場へ応用されることが期待される。
肝癌特異的に発現するGST-Pの転写因子GPEI結合因子の精製及びcDNAの単離

われわれは、GPEIに結合する因子の解析を行い、肝癌細胞AH66と正常肝で比較検討したところ複数の因子がGPEIに結合することを見いだした。フットプリント法の結果より、1)GPEIのTRE-like配列に結合する因子、2)GPEIのTRE-like配列の20-50bp上流に結合する複数の因子を同定した。1)の因子は肝癌と正常肝でフットプリント上では差が認められないが、2)の因子は両者の間でフットプリント上で明らかな差が認められる。1)の因子はさらにDEAE-Sepharoseに結合するものとそうでないものに分かれる。これらの結果、GPEIに結合する因子は少なくとも4種類はあることが明らかとなった。我々の目的とする因子を同定するためには、それぞれの因子がGST-Pの転写活性化に関与しているかを明らかにする必要がある。まず、これらの因子の精製を進めるために、GST-Pを高発現しているAH66細胞をラット腹腔内で培養し、ラット120匹より600mlの核抽出液を調製した。次に、それぞれの因子を分離するために、幾つかのカラムクロマトグラフィーでの結合活性の挙動を検討した。我々の同定した因子の多くは、陰イオン交換樹脂とヘパリンに結合し、これらを用いて部分精製できることが明らかになった。さらに、このように分離した因子の転写活性を調べるために、ラット正常肝より再構成in vitro転写系を構築中である。基本転写因子は、組み換え体TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIAを大腸菌またはバキュロウイルスの系を用いて精製した。現在これら以外の因子(Pol II,TFIIH,TFIID)をラット肝より精製しており、これらを用いることによって、精製した各の転写活性を検討することができる。
酸性雨原因物質の発生源対策と酸性雨による陸上生態系被害の制御

中国に適した事前脱硫プロセスを検討するためには、山元での選炭に直結した形の処理法の検討が必要と考え、急速熱分解における重液分離炭の脱硫特性の検討を行った結果、比重の小さな試料炭は、硫黄濃度が最も高いに関らず、脱硫が最も良く進行していることが分かった。又、水素の代わりに窒素気流中で急速熱分解を行ったところ、最終脱硫率は、窒素処理でも水素処理に近い値を示している事が分かった。微生物による石炭の脱硫法は省エネルギー的かつ経済的な脱硫法となると期待されるため、特に中国をはじめ発展途上国に適した石炭の事前脱硫法であると言われている。そこで、微生物脱硫法の研究を新たに加え、特に途上国における微生物脱硫法の開発および工業化を目的として、鉄酸化細菌や耐熱性細菌を脱硫菌とした実験室レベルでの解析を進め、脱硫速度に関係する培養条件や石炭の性状などの影響について検討を行った。更に、石炭中の硫黄分、特に有機態硫黄を効率よく除去可能な脱硫菌を得るために、新たに天然界よりスクリーニングを試みた。その結果、顕著に高い活性を示す菌株は得られなかったが、最大で脱硫率42.0%(菌自体の効果7.7%)の菌が得られた。大型火力発電ボイラー用の新しい乾式排煙脱硫法として、超微粒子カルシウムによる高速高効率脱硫の要因を調べた。その結果、通常の1050μの粒子では、粒子比表面積が超微粒子と同一でも、反応の進行に伴って粒子表面の細孔入口が反応で生成したCaSO_4によって閉塞するため細孔内表面が反応に関与しないのに対して、超微粒子カルシウムでは、粒子比表面積の大部分を占める粒子表面積がほとんど反応に関与できるため、反応速度が増大することが分かった。
細胞外マトリックスのバックボーンとなっているヒアルロン酸の量的・質的コントロール

[1]ヒアルロン酸代謝に細胞表面ヘパラン硫酸が影響を与えている可能性が示唆された。すなわち、線維芽細胞表面をヘパリチナーゼ処理したものと処理しないものを高分子ヒアルロン酸を含む培地中で培養したところ、ヘパリチナーゼ処理した細胞でヒアルロン酸の低分子化がより進行した。また、ヘパリチナーゼ存在下で線維芽細胞を[^3H]グルコサミンとともに培養し、合成されたヒアルロン酸のサイズ及び量をHPLCにより調べたところ、ヘパリチナーゼを含まない培地で培養したものと比較して低分子のヒアルロン酸が合成された。これらの結果から、ヒアルロン酸の合成や分解に細胞表面のヘパラン硫酸が影響を与えていることが考えられた。[2]ヒアルロン酸合成阻害剤・4-メチルウンベリフェロンの存在下に細胞を培養して得られるヒアルロン酸欠損細胞外マトリックスにおいては、細胞層のCD44やフィブロネクチンが減少していた。細胞層のタイプIコラーゲンの量には変化がなかったものの、その培地中の濃度は増加していた。したがって、ヒアルロン酸の減少がこれらの構造タンパク質の細胞外マトリックスにおける量的変化を誘導することが知られた。[3]ヒアルロン酸は線維芽細胞によるストロムライシン-1の分泌を抑制した。すなわち、組織破壊をともなう炎症部位においてプロテアーゼの亢進とヒアルロン酸の低分子化が同時に観察される場合が多いことから、培養細胞を用いてヒアルロン酸のマトリックスメタロプロテアーゼ活性への影響を調べたところ、特に高分子ヒアルロン酸によりストロムライシン-1の分泌が強く抑制されることが知られた。研究代表者らは、蛍光物質である4-メチルウンベリフェロンが、培養細胞系でヒアルロン酸合成を阻害することを初めて報告し、これにより細胞外マトリックスの構造が形態学的に変化することを明らかにしてきた。本年度は、この4-メチルウンベリフェロン存在下に培養した細胞の、主に細胞層におけるヒアルロン酸をはじめとするマトリックス構成成分の生化学的検討を行った。細胞層におけるヒアルロン酸量は、すでに報告した培地のそれと同じように、0.5mMの4-メチルウンベリフェロンにより最大阻害を受け、さらに高濃度の4-メチルウンベリフェロンを加えてもそれ以上大きく阻害されることはなかった。この時、細胞表面ヒアルロン酸レセプターであるCD44もその発現量が減少していることが、酵素抗体法により知られた。次に、マトリックスタンパク質であるフィブロネクチン、タイプIコラーゲン、およびラミニン合成量への4-メチルウンベリフェロンの影響についても検討したところ、培地のフィブロネクチン量は変化がなかったのに対し、細胞層では明らかに減少していた。また、培地のタイプIコラーゲンは増加し、一方ラミニンは減少していたのに対し、細胞層ではいずれも変化がなかった。しかし細胞層では、タイプIコラーゲン、ラミニンいずれも変化がなかった。これらのマトリックス成分の変化が、4-メチルウンベリフェロンによる直接的な影響なのか、あるいは、4-メチルウンベリフェロンによりヒアルロン酸合成が阻害されたことによる二次的なものなのかは今後の検討を待つところである。(1)ヒアルロン酸低分子化酵素活性への細胞表面グリコサミノグリカンの影響ヒアルロン酸を分子量4万のフラグメントに低分子化するヒアルロン酸低分子化酵素が、細胞表面に存在する可能性が示唆されてきた。また、一般にヒアルロニダーゼ類がヘパリンなどのポリ硫酸により阻害される性質があることから、細胞表面グリコサミノグリカンとヒアルロン酸低分子化酵素活性との関連性を調べた。すなわち、培養ヒト皮膚線維芽細胞を特異性の異なる種々のグリコサミノグリカン分解酵素単独、または組み合わせて処理した後、基質として高分子ヒアルロン酸を培地に添加して、その低分子化をHPLCにより比較検討した。

その結果、ヒアルロン酸低分子化酵素の活性が,細胞表面ヘパラン硫酸により抑制されていることが知られた。(2)分子量の異なるヒアルロン酸のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性への影響生体内においてヒアルロン酸が量的あるいは質的に変化している部位では、コラーゲンなどのタンパク質の合成や分解を伴うことが極めて多いことから、分子量の異なるヒアルロン酸のMMP活性への影響を調べた。すなわち、培養ヒト皮膚線維芽細胞を種々の分子量(120万、80万、30万、10万、4万)のヒアルロン酸を含む無血清培地で培養した後、培地中のMMP活性をゼラチンまたはカゼインを基質としたザイモグラフィーにより検討した。その結果、分子量80万以上の高分子ヒアルロン酸によりゼラチナーゼA(MMP-2)及び分子量47kのMMP活性が、また、分子量10万以下の低分子ヒアルロン酸により分子量65kのMMP活性がそれぞれ亢進した。一方、分子量59kのMMP活性はいずれの分子量のヒアルロン酸によっても抑制された。これらより、ヒアルロン酸はヒアルロン酸低分子化酵素などにより分子量が変化することにより、MMP活性の調節を行っていることが知られた。(1)細胞表面のヘパラン硫酸がヒアルロン酸代謝に及ぼす影響これまで、ヒアルロン酸を分子量4万のフラグメントに低分子化するヒアルロン酸低分子化酵素がおそらく細胞表面に存在すること、そして、その活性が細胞表面ヘパラン硫酸により抑制されることが知られた。一方、ヒアルロン酸合成酵素も細胞膜上に存在しているため、ヒアルロン酸合成への細胞表面ヘパラン硫酸の影響を検討した。ヘパリチナーゼ添加または非添加の培地中で[^3H]グルコサミン存在下に線維芽細胞を培養し、培地に分泌されたヒアルロン酸を比較した。その結果、各々の分泌量には大きな差は認められなかったものの、ヒアルロン酸のサイズはヘパリチナーゼの濃度に依存して小さくなった。このことは、細胞表面のヘパラン硫酸がヒアルロン酸の低分子化だけでなく、その合成にも影響を与えている可能性を示唆した。(2)分子量の異なるヒアルロン酸のストロムライシン-1(MMP-3)活性への影響昨年度はヒアルロン酸低分子化酵素などによりヒアルロン酸の分子量が変化することで、ヒアルロン酸がマトリックスメタロプロテアーゼ(以下MMP)活性の調節を行っている可能性が、ザイモグラフィー等を用いた分析により示された。そこで今年度は、このヒアルロン酸により影響を受けるMMPについてさらに検討した。線維芽細胞を、種々の分子量(120万4万)および濃度(10μg/ml2mg/ml)のヒアルロン酸を含む無血清培地で培養した後、培地中のMMP活性をゼラチンまたはカゼインを基質としたザイモグラフィーにより検討した。その結果、特に高分子のヒアルロン酸により分子量47kのMMP産生量が抑制されることが知られた。この抑制は、ヒアルロン酸濃度1mg/ml以上の高濃度で観察され、ウェスタンブロットの結果、このMMPはストロムライシン-1(MMP-3)と同定された。
膀胱粘膜再構築培養モデルでの癌浸潤における血管新生の証明

われわれが開発した三次元再構築細胞培養法を用いて、膀胱癌において新生血管が癌浸潤に及ぼす影響を組織学的におよび経時的に証明しようと試みた。まず、ブタ膀胱から線推芽細胞と移行上皮細胞を分離し、コラーゲンゲル内に線維芽細胞を包理後その上で移行上皮細胞を単層培養した。この結果、移行上皮は重層化し、基底層、中間層、被蓋層と層分化も良好であった。この再構築した粘膜固有層上で、ヒト膀胱癌株(HT-1197.HT-4,T24)細胞を単層培養したHT-1197細胞は再構築した粘膜固有層に浸潤増殖していたRT-4,T24細胞は粘膜固有層上に増殖していた。次に血管内皮細胞を線維芽細胞と共にコラーゲンゲル内に包理して再構築培養したところ、線維芽細胞だけの培養結果と同様であった。EGFを添加してみたが増殖は見られず、in vitro上で血管新生を再現することは出来なかった。そこで、三次元培養で作製した膀胱癌上皮シートをラットに移植してin vivoにおける血管新生を組織学的に検討した。しかし移植後数日でマウスが死亡し、剖検しても癌細胞の生着は認められなかった。再度in vitroにて再構築した粘膜固有層上でヒト膜脱癌株細胞の培養を行い、VEGF蛋白の発現を検討したが、VEGF蛋白の発現を証明できなかった。また、各膀胱癌細胞VEGF分泌量を測定したが、コントロール群と比較して有意差はみられなかった。各癌細胞蛋白中のHif-1α、thymidine phosphorylaseの発現をwestern blotting法で同定したが、発現はみられなかった。今回の実験系では膀胱癌の癌浸潤における血管新生を証明することは出来なかったため、新たな実験系の開発が必要と思われた。平成13年度は、in vitro膀胱粘膜再構築培養法で膀胱癌細胞を三次元的に培養した。ブタ膀胱から得られた線維芽細胞をコラーゲンゲルの中に包埋する方法で粘膜固有層を再構築した。この培養粘膜固有層上で、ヒト膀胱癌株(HT-1197,RT-4,T24)細胞を通常の単層培養を行ない、培養7日目、14日目にホルマリン固定をして通常の組織学的観察を行った。結果は、HT-1197細胞は再構築した粘膜固有層に数mmの深さまで浸潤増殖していた。それに対して、RT-4、T24細胞は粘膜固有層の上に数層に配列して増殖していたが、コラーゲンゲル内すなわち粘膜固有層へは浸潤しなかった。現在、癌細胞を識別できるサイトケラチン抗体を用いて免疫組織化学染色で確認している。今後は基底膜の破壊酵素であるurokinase Plasminogen activatorやmatrix metalloproteaseの発現を調べる。次に再構築培養法で血管内皮細胞がどのような増殖分化を示すか調べる目的で、ヒト血管内皮の細胞株であるHUVEC、LME、MVE細胞の培養を行った。いずれも正常細胞なので増殖率が低く、三次元培養法に用いるまでの細胞数が得られるような培養法を確立中である。初期実験としては、癌浸潤増殖に血管新生の関与がin vitro上で組織学的に証明する目的で線維芽細胞と血管内皮細胞をコラーゲンゲルに包埋して粘膜再構築培養を行った。結果は血管内皮細胞が少なく、線維芽細胞だけの培養条件時と同様で変化はみられなかった。また、癌細胞株による浸潤性の有無が、血管内皮細胞増殖因子の分泌能と関連があるかどうか調べる目的で、現在各膀胱癌細胞の培養液中のVEGF分泌量を測定している。

また、蛋白分解酵素溶液を作成し、この溶液で各膀胱癌株細胞をhomogenizeして蛋白を抽出した。この蛋白を利用してHif-1αの発現をWestern blotting法で同定する予定である。【要約】研究の最終段階として、膀胱癌の浸潤と血管新生をin vitro上で再現し、各種膀胱癌細胞株の血管増生因子との相関を調べた。【実験方法・経過】昨年度から引き続き、ヒト血管内皮細胞株であるHUVEC、LME、MVEをコラーゲンゲルに包埋した三次元再構築培養を行ったが、いずれも正常細胞なので増殖率が低く、in vitro上で血管新生を再現することは不可能であった。そこで、1.新生血管を組織学的に調べる目的として、三次元培養で形成した膀胱癌上皮シートをラットで膀胱拡大術の方法で移植した。ラット膀胱を酵素処理で無細胞化し(acellular matrix)、この上でヒト膀胱癌株(HT-1197,RT-4,T24,EJ, UMUC3)細胞とコラーゲンゲルによる再構築人工膀胱シートを作成した。移植7日目、14日目に組織学的検討を行い、免疫組織化学染色で各細胞の同定を行った。2.癌細胞株による浸潤性の有無が、血管内皮細胞増殖因子の分泌能と関連があるかどうか調べる目的で、各膀胱癌細胞VEGF分泌量、基底膜の破壊酵素であるurokinase plasminogen activator分泌量を測定した。また、各癌細胞蛋白中のHif-1α、thymidine phosphorylaseの発現をWestern blotting法で同定した。【結果】移植7日目では、癌細胞の生着が不良であったが、線維芽細胞は生着していた。現在、移植14日目での検討を行っている。【平成15年度の予定】引き続き、移植実験を行い癌細胞の浸潤、血管新生を組織学的に検討して、サイトケラチン、CD34、などの抗体を用いた免疫染色を行う。昨年度までの実験ではin vitro膀胱粘膜再構築培養法で膀胱癌細胞を三次元的に培養し、膀胱癌細胞が粘膜固有層に浸潤増殖していたのを組織学的に証明した。血管内皮細胞単独の培養では増殖率が低かったため、本年度は癌浸潤における血管新生を組織学的に証明する目的で、三次元培養で作製した膀胱癌上皮シートをラットに移植し、組織学的検討を行った。移植7日目、14日目に組織学的検討を行いさらに免疫組織学的染色で各細胞の同定を行う予定であったが、マウスが移植術後数日で死亡し、剖検して組織学的検討を行ったが、癌細胞の生着は認められず、in vivoで癌浸潤を組織学的に証明することはできなかった。今回の実験系では再構築した膀胱粘膜上で膀胱癌の癌浸潤を証明できたが、癌浸潤における血管新生を証明することは出来なかった。今後新たな実験系の開発が必要と思われた。
評定尺度法に対する回答の個人差と集団差を同時補正するための新たな方法の開発と評価

心理学・社会学・教育学・社会疫学・マーケティング科学などの数多くの研究分野において,個人差や集団差を評価するための調査・観察研究はそのほとんどにおいて,当事者自身の内観や第三者が当事者の内観や行動の意図を数値で推測する評定尺度法を用いて行われてきた。使い勝手がよくシンプルでありながらも一軸上の数値だけの人間の認知行動を推し量るのみに頼る質問紙法をデザインするには多くの留意点があり,そのいずれもが重要な事項である。しかしながら,それらに十分に配慮しながら調査を構成したとしても,被調査者側に内在する回答傾向の影響に対して明示的に向き合わなければ,より的確な結果は得ることはできないので,本研究計画はこの点を最重要課題としている。本研究計画の最終年度である平成30年度は,昨年度からの課題であったウェブ調査を用いて取得した縦断データおよびOECD PISA公開個票データに基づいた分析をさらに推進し,それらの成果報告を論文誌2編,学会発表5件において行った。たとえば,研究代表者の高橋は,論文分担執筆において評定が比較的困難とされる創造性の個人差についてまとめ,分担研究者である岡田は大学院生と共同しつつ,評定尺度法に対して係留寸描を用いた統計数理モデルの検証および複数の実データ分析に対する応用研究を行い,それらを国際学会において口頭報告した。本研究計画全体を通じては,まだ新たに投稿中の原稿が残っているため,それらを出来る限り十分な形で研究業績として報告することの出来るまで研究活動を完遂することに努める。また,評定尺度法の回答バイアス除去のための方法論およびそのためのRパッケージの実装も引き続き公開可能な状態に到達できるまで研究を継続する。心理学をはじめとする諸研究分野において人間の高次精神機能について調査を行う際,最も広く最も簡便に最も安価に用いられる方法が質問紙調査であり,その質問紙調査において一般的に用いられるのが評定尺度法である。評定尺度法は,あらかじめ設定された明確な評価段階に従って,ある特定の事物や事象を被調査者に判断させる方法であるが,回答傾向に個人差が存在するという欠点がある。この問題点を解決可能なデータ取得方法として係留寸描法が挙げられるが,これまでは集団差や文化差にのみ着目した分析しか行われてこなかった。評定尺度への回答傾向は文化や集団に依存して異なり,さらに個人ごとにも異なりうる。それにも関わらず,既存のほとんどの国際比較調査においては,こうした回答バイアスの存在が無視されてきた。本課題ではこの問題を重要視し,回答傾向の個人差を評価し補正する統計手法を開発・適用し,補正前後や集団間での差異を議論する。とりわけ,平成28年度においては,まず,OECD PISA2012のデータを取得して重点的に分析し,これに関する成果発表を国内論文誌(1本),国内学会発表(3件),国内招待講演(5件)において行った。当初予定していた論文出版計画よりも,若干の遅れがあるものの,投稿中の論文原稿は複数あるため,これらについて,できる限り早く適切に研究業績としてまとめることができるように努力する。また,平成28年度の調査においては,1,000人規模のオンライン調査を実施し,OECD PISA2012の結果を追試可能かどうか検証を進めている。心理学・社会学・教育学・社会疫学・マーケティング科学などの数多くの研究分野において,個人差や集団差を評価するための調査・観察研究はそのほとんどにおいて評定尺度法を用いて行われてきた。質問紙法をデザインするには多くの留意点があり,そのいずれもが重要な事項である。平成29年度は,ウェブ調査を用いて取得した縦断データおよびOECD PISA 2015公開データに基づいた分析を進め,それらの成果報告を書籍の分担執筆1件,論文誌2編,学会発表2件,招待講演4件において行った。たとえば,研究代表者の高橋は,分担執筆において教育に関する個人差についてまとめ,分担研究者である岡田は大学院生と共同しつつ,評定尺度法に対して係留寸描を用いた統計数理モデルの検証および複数の実データ分析に対する応用研究を行い,それらを誌面発表した。当初予定していた研究計画よりも若干の遅れは見られるものの,新たに英文誌へ投稿中の原稿があるので,それらを出来る限り早く適切に研究業績として報告できるように研究活動を遂行する。また,PISA 2015公開データの分析結果もおおむねまとめることができたため,それに関する研究報告も進めていく。

本研究計画の最終年度である平成30年度は,昨年度からの課題であったウェブ調査を用いて取得した縦断データおよびOECD PISA公開個票データに基づいた分析をさらに推進し,それらの成果報告を論文誌2編,学会発表5件において行った。たとえば,研究代表者の高橋は,論文分担執筆において評定が比較的困難とされる創造性の個人差についてまとめ,分担研究者である岡田は大学院生と共同しつつ,評定尺度法に対して係留寸描を用いた統計数理モデルの検証および複数の実データ分析に対する応用研究を行い,それらを国際学会において口頭報告した。本研究計画全体を通じては,まだ新たに投稿中の原稿が残っているため,それらを出来る限り十分な形で研究業績として報告することの出来るまで研究活動を完遂することに努める。また,評定尺度法の回答バイアス除去のための方法論およびそのためのRパッケージの実装も引き続き公開可能な状態に到達できるまで研究を継続する。現状において,本研究計画については,後ろ向きな計画変更の予定は無い。ただし,これまでに取得したデータの分析から,本研究計画に記したものにそぐわない結果が得られた場合には,ターゲットとする変数を適切に限定したり年齢層を制限したりするなどして,研究の効率的な遂行を妨げることのないように工夫・配慮を行う。現状において,本研究計画について関する後ろ向きな計画変更の予定は無い。ただし,議論の拡散を回避するために,ターゲットとする変数を適切に限定したり年齢層を制限したりするなどして,研究の効率的な遂行を妨げることのないように工夫・配慮を行い,場合によってはリサーチアシスタントを雇用す,研究活動をさらに円滑に遂行していく。校務に伴う出張取り止めが数件あったため,若干の余剰額が発生した。論文誌投稿の若干の遅れと年度末に予定されていた研究打ち合わせが次年度へと繰り延べされたことの2点が原因で余剰が発生したが,これらは平成30年度前半において既に活用の予定が明確である。次年度においては,実施予定の調査における被調査者数を増やすなどの対応をして,本年度余剰分をそれに充当したい。
ルイス酸型人工酵素の設計と精密有機合成への応用

分子カプセル内に閉じ込められた分子はカプセル外から隔離され著しく異なった環境にあるため、通常不安定である化学種が存在したり特殊な反応性を示すことがあり、このような視点からの分子カプセルの構築とその有機化学及び物理化学的応用が近年注目を集めている。今回私は、半球型の反応場を有するルイス酸型レセプター、アルミニウムトリス2.6-ジフェニルフェノキシド(ATPH)をホスト分子として用い、ATPH二分子が適当なジカルボニル化合物の二つのカルボニル基に同時に配位することで、ルイス酸-塩基相互作用を介した今までに無い形式による安定な分子カプセルを形成することを^<13>CNMR測定により明らかにした。さらにこの分子カプセル形式の利点を活かし、選択的合成反応への応用を検討した。その結果アルキルリチウムを用いたアルキル化反応において、内包分子として1,4-シクロヘキサンジオンを用いた場合、この基質はホスト分子のATPHによってほぼ完全に保護され求核剤の攻撃を受けず、また他のカルボニル化合物が共存した系においても低温ではこれらと置き換わることなく分子カプセルが安定であることを見い出した。また別のアプローチとして、このカプセル形成をp-キシロキノンとジエン化合物のディールズ・アルダー反応に適用したところ、カプセル形成の際、基質二分子をうまくカプセル内に取り込んだ場合には反応が円滑に進行し、カプセル形成によって反応が促進されることを見い出した。言い換えれば、今回設計した分子カプセルが有機合成変換反応において反応保護、あるいは反応促進として二重の能力を有することを示し、ATPHの新たな機能性を引き出すことに成功した。
酸化的修飾がシグナルとなるユビキチン依存性蛋白分解の細胞機能制御における役割

申請者らは鉄イオン代謝のマスター遺伝子であるRNA結合蛋白、IRP2(iron regulatory protein 2)が鉄イオン存在下でのみプロテアソームで分解されること、分解に先立ち鉄結合部位近傍のアミノ酸残基がmetal catalyzed oxidationと呼ばれる機構で酸化修飾を受けること、ユビキチン修飾を受けることを示してきた。本研究によりin vitro oxidation/ubiquitinationアッセイを樹立し、酸化的変化がユビキチン修飾のシグナルとなることを示した(PNAS95:4925-29,1998)。酸化的修飾は多くの細胞内機能分子を失活させることはよく知られた事実であり、失活した機能分子を選択的に分解する蛋白分解系は酸化ストレスに対する防御系として重要であるといえる。ユビキチン修飾に関与する酵素群はE1(ubiquitin activating emzymes)、E2(ubiquitin conjugating enzymes)、E3(ubiquitin protein ligases)の3群からなり、そのうちE2とE3とりわけE3が基質特異性を決定している。現在、IRP2をモデル系として酸化的修飾がシグナルとなるユビキチン修飾を触媒する酵素群の同定をin vitro ubiquitinationの実験系を用いて進めている。これまでに、UBCH5a,b,cがIRP2のユビキチン修飾を触媒するE2であることを示し、E3がFraction ΙIaに存在すること、IRP2-E3はl50kDであることを明らかにしている。予備的実験の段階ではあるが、IRP2のユビキチン修飾が大腸菌で発現させた73アミノ酸からなるIRP2特異的ドメインの添加により阻害されること、cullin-2がIRP2と細胞内で結合していることを確認しており、各種のクロマトグラフィーとIRP2特異的ドメインを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いてE3の精製を進めている。また、IκBαのユビキチン修飾を触媒するE2、E3の同定を進め、UBCH5b,cがE2であり、F-box蛋白であるTrCPがリン酸化IκBαを認識することすなわち、SCF-TrCP複合体がE3であることを示した。
電子励起分子の構造とダイナミックスにおける外部電場および磁場効果の研究

多原子分子の励起一重項状態(Si)におけるダイナミックスが外部磁場によりどう影響をうけるかをピリミジン、Sートリアジン,重ピラジンについて調べた。これらの分子のけい光の強度,減衰曲線,偏光特性に対する外部磁場効果が観測され,これらが励起される振動,回転準位に著しく依存することがわかった。例えば磁場によるけい光強度の減少,即ち磁場消光の効率は,過剰振動エネルギ-が大きい程,又回転量子数J^1が大きい程よいことがわかった。これらはS_1と相互作用する三重項状態の準位密度(9_T)が6E(過剰振動エネルギ-)およびJ^1が大きい程,高く,かつ外部磁場により増すことを意味している。一方,けい光減衰曲線も、例えばピリミジンでは,△EおよびJ^1が小さい時には小分子極限に特有な量子ビ-トののっかった単一指数関数的減衰を示すが,外部磁場をかけると二つの指数関数の和で表わされる減衰曲線を示し、9_Tが外部磁場により増すことを示している。但し顕著な磁場消光を示すのは,励起されるS_1準位から直接発するけい光の場合であり,分子内振動再分配により他の振動準位に緩和がおこりその準位から発するブロ-ドなけい光に対しては,外部磁場効果があまりないことも明らかとなった。ヌピリミジンのけい光特性に対する外部電場効果の実験も行なった。その結果,けい光が電場により消光されることやけい光寿命が電場により長なることがあることを実験的に初めて観測した。又外部電場により誘起されるシュタルクビ-トが観測され,この量子ビ-トの観測からS_1状態におけるピリミジンの双極子モ-メントは約0.55デバイトと求められた。
脳脊髄液接触ニューロンにおける光情報と時間情報の統合メカニズム

本研究では研究計画調書に記載した研究計画に従い、光受容体キナーゼの分子解析を行った。脊椎動物の二種類の視細胞(桿体と錐体)は、各々の生理的役割に応じて異なる光応答特性を示す。脳脊髄液接触ニューロンには、桿体型・錐体型サブタイプの混成からなる一群の光情報伝達蛋白質が発現していることから、視細胞の光応答特性を規定する分子基盤の理解を通して、脳脊髄液接触ニューロンの光応答特性を推定できると考えられる。そこで光受容蛋白質の不活性化を司るキナーゼの解析を行った。ゼブラフィッシュのGRK1(桿体型)とGRK7(錐体型)のcDNAを単離したところ、それぞれに二種類のサブタイプが存在することを見出した。分子系統解析の結果をもとに、それぞれGRK1A、1BおよびGRK7-1、7-2と命名した。眼球におけるmRNA量の比較解析より、GRK1Aは1Bに比べて5.4倍多く、またGRK7-2は7-1に比べて7.8倍多く発現していることを明らかにした。さらに、脳内光受容器官である松果体について同様の解析を行ったところ、興味深いことにGRK1およびGRK7共に発現量比が眼球の場合とは逆転していた。これらの結果は四種類のキナーゼがそれぞれ組織特異的な発現調節を受けていることを強く示唆しており、それぞれが異なる生理機能を担う可能性が考えられた。さらに、眼球切片に対して免疫組織化学的解析を行ったところ、GRK1Aと7-1は桿体と錐体の外節にそれぞれ局在していたが、予想に反してGRK1Bは錐体外節に局在していることが判明した。錐体外節には複数のGRKサブタイプが存在していることから、光情報伝達過程に対する不活性化作用がより強く働いていると推定できる。このことは、錐体の光応答特性とよく一致する。したがって、光受容細胞の光応答特性には、GRKのサブタイプや蛋白質分子数が強く影響していると推測された。脊椎動物の二種類の視細胞(桿体と錐体)は、各々の生理的役割に応じて異なる光応答特性を示すが、これは光情報の伝達・遮断に関わる蛋白質の違いに起因すると考えられる。脳脊髄液接触ニューロンには、桿体型・錐体型サブタイプの混成からなる一群の光情報伝達蛋白質が発現しており、視細胞に類似した光応答性を示すと推測できる。そこで、視細胞の光応答特性を規定する分子基盤の理解を通して、脳脊髄液接触ニューロンの光応答性を推定できると考え、光受容蛋白質の不活性化を司るキナーゼの解析に着手した。ゼブラフィッシュのGRK1(桿体型)とGRK7(錐体型)のcDNAを単離したところ、それぞれ2種類のサブタイプが存在することを見出した(それぞれGRK1a・1b, GRK7a・7bと略)。眼球におけるGRK1aと1bの発現量をmRNAレベルにおいて比較したところ、GRK1bは1aに比べて5.4倍多く発現していることが明らかになった。同様に、GRK7aと7bを比較したところ、7bは7aに比べて7.8倍多く発現していた。さらに脳内光受容器官である松果体についてそれぞれの発現量を比較したところ、興味深いことに、GRK1、GRK7共に眼球の場合とは逆の結果を得た。すなわち、松果体においてはGRK1aが1bよりも多く発現しており、またGRK7aは7bよりも発現量が少ないという結果を得た。これらの結果は、GRK1aと1b、またGRK7aと7bはそれぞれ組織特異的な発現調節を受けていることを示している。さらにこれら4種類のキナーゼは、それぞれ異なった生理機能を担う可能性も考えられる。今後、これらのキナーゼの発現細胞や活性に関する詳細な解析を通して、視細胞や脳内光受容細胞の光応答特性の分子基盤に迫ることができると考えている。

さらに、眼球切片に対して免疫組織化学的解析を行ったところ、GRK1Aと7-1は桿体と錐体の外節にそれぞれ局在していたが、予想に反してGRK1Bは錐体外節に局在していることが判明した。錐体外節には複数のGRKサブタイプが存在していることから、光情報伝達過程に対する不活性化作用がより強く働いていると推定できる。このことは、錐体の光応答特性とよく一致する。したがって、光受容細胞の光応答特性には、GRKのサブタイプや蛋白質分子数が強く影響していると推測された。
建築文化財における外観塗装材料の変遷と新塗料開発に関する研究

建築文化財の外観塗装材料や色調は、建造物自体のイメージを大きく左右する。そのため、この基礎調査は塗装修理を行う際にも大切である。本研究では、(1)個々の建造物の外観塗装材料の性質や色相、変遷に関する調査を行った。その結果、多用されたベンガラ塗装や漆塗装では時と場所に応じた塗装材料の使い分けが行われていたことが明確になった。そして、伝統的材料や技法を生かした新塗料開発の可能性も手板作成などを通してわかってきた。建造物は常に白木のままであったわけではなく、多くの場合は部材の表面保護や装飾のために何らかの外観塗装が施されていた。しかし建築文化財の外観塗装材料は、常に紫外線や雨風の劣化にさらされるため、建物の保存修復作業時に従来の塗装材料をある程度除去してから新たに塗り替え作業を行う場合が多く、その修復記録もほとんど現存しない。そのため、現存の建築文化財では創建当初の状況やその後の修復履歴を確認することはきわめて困難である。ところが、それぞれの建造物に使用された外観塗装材料の色調は、それぞれの建造物自体のイメージを大きく左右するため大切である。しかし「外観塗装材料の歴史的変遷や創建当初の色調、さらには当時の顔料などの塗装材料を復元製作するとともに、耐候性があり、かつ安定した塗料である新素材とを併せて実用に応用しうる材料としての新塗料開発のための実践的研究」はほとんど見られない。このことを念頭に置いた基礎研究として、まず各年代の建築文化財における外観塗装材料の分析調査を行い、基本的な材料の変遷過程を解明する。さらに分析調査によって得られた知見をもとに、各種の手板サンプルを作成して劣化促進実験を行い、伝統を生かしたより新塗料開発へ向けた基礎資料の蓄積を図る。部材の表面保護や装飾のために施されていた建築文化財の外観塗装材料は、常に紫外線や風雨の劣化に晒されるため、修復作業時に従来の塗装材料をある程度除去してから新たに塗り替え作業する場合が多く、その修復記録もほとんど現存しない。しかし、「外観塗装材料の歴史的変遷や創建当時の色調、さらには当時の顔料などの塗装材料を復元製作するとともに、耐候性があり、かつ安定した塗料である新素材とを併せて、実務に応用しうる新材料としての新塗料開発のための実践的研究」はほとんどみられない。本研究ではこの点に注目した基礎研究を行うが、平成19年度はこの初年度として、天然赤鉄鉱起源の赤土ベンガラや、鉄バクテリアを原材料とするパイプ状ベンガラの製法と性状に関する基礎研究を行い、それぞれ査読有の学会誌にその成果を公表した。次、に調査する機会に恵まれた(1)元興寺極楽坊、(2)元興寺五重小塔、(3)海龍王寺五重小塔、(4)浄瑠璃寺本堂、(5)蓮華王院三十三間堂、(6)海住山寺、(7)興福寺、(8)石山寺などの建築文化財の部材に塗装された主に赤色顔料の変遷に関する調査を実施した。調査の結果、まず元興寺五重小塔取り外し部材では、創建期塗装はパイプ状ベンガラ、中世期は赤土ベンガラ、近世期は鉛丹+ベンガラ、近代は人造ベンガラへと、外観塗装材料は明確に変遷した点が確認された。一方、海龍王寺五重小塔・海住山寺三重塔は、創建期塗装には朱顔料が確認され一般的にはベンガラ顔料による塗装が多い建築文化財のなかでは工芸的性格が強い点が示唆された。なお、浄瑠璃寺本堂の外観塗装および蓮華王院三十三問堂内部外陣背面は、現状では外観塗装はされていない古木の木肌の色調であるために、塗装が施されていないと認識されていたが、今回新にこれらを精査した結果、それぞれ明治期修理の新補部材は古色塗が観察されたものの、それぞれ創建期には赤土ベンガラが塗装されていた点が観察された。以上のように、本研究で採用した調査方法は、建造物の外観塗装材料の変遷を知る上で有効であると考える。そのため、現存の建築文化財では創建当初の状況や、その後の修復履歴を確認することはきわめて困難である。しかし、「外観塗装材料の歴史的変遷や創建当初の色調、さらには当時の顔料などの塗装材料を復元製作するとともに、耐候性があり、かつ安定した塗料である新素材とを併せて。実用に応用しうる材料としての新塗料開発のための実践的研究」はほとんど見られない。

本年度は、4年計画の第2年目として、昨年度の第1年目に引き続き、海龍王寺五重小塔、島田神社本殿、三十三間堂、石山寺本堂、浅草寺二天門などの建造物(建築文化財)の外観塗装材料の性質や色相、年代的塗装材料の変遷などに関する基礎調査を行うとともに、そのまとめを行なった。なお、この中でいくつかの建造物(建築文化財)は、現在、建造物の解体修理作業および塗装塗り直し作業が進行している。そのため、今回新たに得られた知見や成果を踏まえて、新たな塗装材料の構築を目指した赤色顔料の作成実験や漆塗装手板サンプルの作成作業も並行して行った。とりわけ、浅草寺二天門の創建期(慶安年間)塗装に使用された赤色顔料が天然赤鉄鉱を粉砕した赤土ベンガラであり乾性油と澱粉質を多く混和した漆塗料であることが判明したため、各種手板サンプルを作成して来年度の劣化促進実験に備えた。建造物は常に白木のままであったわけではなく、多くの場合は部材の表面保護や装飾のために何らかの外観塗装が施されていた。しかし建築文化財の外観塗装材料は、常に紫外線や雨風の劣化にさらされるため、建物の保存修復作業時に従来の塗装材料をある程度除去してから新たに塗り替え作業を行う場合が多く、その修復記録もほとんど現存しない。そのため、現存の建築文化財では創建当初の状況やその後の修復履歴を確認することはきわめて困難である。ところが、それぞれの建造物に使用された外観塗装材料の色調は、それぞれの建造物自体のイメージを大きく左右するため大切である。しかし「外観塗装材料の歴史的変遷や創建当初の色調、さらには当時の顔料などの塗装材料を復元製作するとともに、耐候性があり、かつ安定した塗料である新素材とを併せて、実用に応用しうる材料としての新塗料開発のための実践的研究」はほとんど見られない。本年度は、4年計画の第3年目として昨年度に引き続き、いくつかの個々の建造物(建築文化財)の外観塗装および彩色材料の性質や色相、年代的塗装材料の変遷などに関する基礎調査を行うとともに、そのまとめを行うことを主目的とした。特に今年度の赤色塗装顔料の分析結果からは、使用顔料は同じ天然赤鉄鉱である赤土ベンガラであっても、固着材料は漆塗料、乾性油、澱粉糊、膠などさまざまな材質であること、また銀閣寺の外観塗装材料として漆の上に塗装された白色顔料からは白土と明礬が検出された。そのため、今回新たに得られた知見や成果を踏まえて新たな塗装材料の構築を目指した白色顔料の作成実験や漆塗装手板サンプルの作成作業も並行して行った。本年度は、4年計画の第4年目(最終年度)として、I:これまでに引き続きいくつかの個々の建造物(建築文化財)の外観塗装および彩色材料の性質や色相、年代的塗装材料の変遷などに関する基礎的調査を行うとともに、そのまとめを行った。II:特に、今年度はこれまで行ってきた歴史的な木造建造物のベンガラ塗装に関する基礎的調査の成果を纏めて一冊の報告書を作成した。主な研究成果は以下の通りである。I:平成22年度は、法勝寺塔跡出土の軒平瓦付着赤色顔料、銀閣寺観音殿(国宝)、大元神社本殿(重文)、厳島神社社殿(国宝)部材、瑞巌寺本堂(国宝)、都久夫須麻神社本殿(国宝)、広島東照宮唐門(県指定文化財)に関する調査とまとめを行った。II:研究調査報告書『歴史的な木造建造物のベンガラ塗装に関する基礎的調査-基礎編-』170p.を作成した。
酵母のビタミンB_1代謝に関わる2つの酵素の精製と生化学的解明

酵母の増殖はビタミンB_1生合成を阻害する2-アミノヒドロキシエチルチアゾール(NH_2-Th)により阻害される。このNH_2-Thに対する耐性変異株(ATR4)を分離したところ、その粗抽出液中のThキナーゼ(EC2.7.1.50)とチアミン-リン酸ピロホスホリラーゼ(TMP-PPase,EC2.5.1.3)の活性が共に著しく低下しており、遺伝解析により本変異が単一の核性遺伝子の劣性変異であることを確認した。そこで、両酵素の同一性を検討するため親株(IFO 10483)より精製を試みた結果、DEAE、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過クロマトグラフィーの各段階にわたって両酵素が共精製され、最終標品の比活精度はThキナーゼで1445倍、TMP-PPaseで1890倍に上昇した。精製酵素はSDS-PAGE上ほぼ均一のバンド(60kDa)を示し、ゲル濾過法による分子質量(470kDa)より同一のサブユニットから成る8量体の機能酵素であることが推定された。酵母のTMP-PPaseの精製はすでになされているが(Leder,1970)、Thキナーゼについては今回が初めての報告となる。本精製酵母の至適pHはThキナーゼで9.1、TMP-PPaseで7.7であった。Thキナーゼ活性のKm値はThに対して5.7muM、ATPに対して0.79mM、NH_2-Thに対するKi値は2.1muMと測定された。Thキナーゼ反応のヌクレオチドおよび2価金属イオンに対する要求性は、それぞれ比較的広い特異性を示したものの、生理的条件下においてはATPとMg^<2+>が反応に関わっていることが推定された。また本精製酵素の安定性については、pH7.5で50°C30分の過熱処理により両酵素活性の失活の程度に差はみられなかった。
骨系細胞が歯根膜再生におよぼす影響に関するラット皮下移植歯根を用いた基礎的研究

本研究の目的は、ラットの歯根の背部皮下埋入モデルを用いて、歯根と共に粉砕した歯槽骨を皮下移植し、骨系細胞の存在下で歯根吸収、結合組織線維の再付着や硬組織の添加の有無に変化が見られるかどうかを病理組織学的に検討することである。ラットの第3臼歯を抜歯し、歯冠と近心根を切断した後、歯髄を除去し、得られた遠心根を実験に用いた。また、ラットの下顎骨に付着している筋肉や上皮および歯牙を取り除いた後に、ボーンミルを用いて歯槽骨を破砕し、骨顆粒を作製した。次のような4つの実験群を作製した。(1)歯根膜を保存した歯根と骨顆粒を可溶性ゼラチンカプセルに入れたもの。(2)歯根膜を除去した歯根と骨顆粒をゼラチンカプセルに入れたもの。(3)歯根膜を保存した歯根のみをゼラチンカプセルに入れたもの。(4)歯根膜を除去した歯根のみをゼラチンカプセルに入れたもの。ラットの背部皮下に切開を入れ、皮下結合組織をポーチ状に剥離し、それぞれの可溶性ゼラチンカプセルを皮下に挿入して縫合した。6週および10週後に歯根を周囲組織とともに採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定、10%EDTAで脱灰し、AMeX法にてパラフィン包埋を行った。得られたパラフィンブロックから厚さ約4μmの連続切片を作製し、HE染色およびアルカリフォスファターゼ(ALP)染色を行った。破歯細胞の出現と歯根吸収が、歯根膜を保存した歯根に多く観察されたが歯根はかなりの部分が吸収されずに残存していた。また骨顆粒とともに移植した歯根周囲には、骨顆粒が散在し、破骨細胞の出現と骨吸収が認められたが、歯根と同様に完全に吸収されずに残っていた。歯根膜を保存した歯根において、歯根表面に存在する核の大きな細胞にALP活性が観察されたが、その活性は骨顆粒が存在するものの方が強かった。また、歯根表面に垂直な結合組織線維の付着およびセメント質の添加が認められる部位もあったが、骨顆粒の存在する実験群の方が多かった。歯根膜を除去した歯根では、骨顆粒の有無に関わらず、ALP活性は認められず、歯根は被包化され、歯根表面への結合組織線維の付着やセメント質の添加はみられなかった。これらの結果をもとにして、今後、ALP活性陽性細胞の同定や結合組織付着や硬組織添加を促進する環境についての研究が必要と思われる。また、ラットの下顎骨に付着している筋肉や上皮を除去し、歯牙を取り除いた後に、ボーンミルを用いて歯槽骨を破砕し、骨顆粒を作製した。次にラットの背部皮下に切開を入れ、皮下結合組織をポーチ状に剥離し、可溶性ゼラチンカプセルに歯根と骨顆粒を入れ、皮下に挿入して縫合した。6週後に歯根を周囲組織とともに採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定、10%EDTAで脱灰し、AMeX法にてパラフィン包埋を行った。得られたパラフィンブロックから厚さ約4μmの連続切片を作製しHE染色およびTRAP染色を行った。全ての切片で、破歯細胞の出現と歯根吸収が観察されたが歯根はかなりの部分が吸収されずに残存していた。また歯根周囲には、骨顆粒が散在し、破骨細胞の出現と骨吸収が認められたが、歯根と同様に完全に吸収されずに残っていた。また歯根表面には、核の大きい細胞が存在し、結合組織線維の付着が認められる部位もあったが、これらの細胞の種類は現段階では特定できず、明らかなセメント質形成はみられなかった。また、歯髄腔側にも硬組織の添加と結合組織線維の付着が認められるものもあった。今後、移植期間を延長した試料と歯根膜を除去した歯根と骨顆粒を一緒に移植した試料を作製し、比較検討して行く予定である。これらの結果について検討後に、rhBMP2などの成長因子を添加する実験を予定している。

(3)歯根膜を保存した歯根のみをゼラチンカプセルに入れたもの。(4)歯根膜を除去した歯根のみをゼラチンカプセルに入れたもの。ラットの背部皮下に切開を入れ、皮下結合組織をポーチ状に剥離し、それぞれの可溶性ゼラチンカプセルを皮下に挿入して縫合した。6週および10週後に歯根を周囲組織とともに採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定、10%EDTAで脱灰し、AMeX法にてパラフィン包埋を行った。得られたパラフィンブロックから厚さ約4μmの連続切片を作製し、HE染色およびアルカリフォスファターゼ(ALP)染色を行った。破歯細胞の出現と歯根吸収が、歯根膜を保存した歯根に多く観察されたが歯根はかなりの部分が吸収されずに残存していた。また骨顆粒とともに移植した歯根周囲には、骨顆粒が散在し、破骨細胞の出現と骨吸収が認められたが、歯根と同様に完全に吸収されずに残っていた。歯根膜を保存した歯根において、歯根表面に存在する核の大きな細胞にALP活性が観察されたが、その活性は骨顆粒が存在するものの方が強かった。また、歯根表面に垂直な結合組織線維の付着およびセメント質の添加が認められる部位もあったが、骨顆粒の存在する実験群の方が多かった。歯根膜を除去した歯根では、骨顆粒の有無に関わらず、ALP活性は認められず、歯根は被包化され、歯根表面への結合組織線維の付着やセメント質の添加はみられなかった。これらの結果をもとにして、今後、ALP活性陽性細胞の同定や結合組織付着や硬組織添加を促進する環境についての研究が必要と思われる。
角膜移植後の拒絶反応を回避するキメラ角膜組織の作成および免疫特権の機序の解明

マウスの同所性角膜アログラフト移植モデルにおいて、角膜上皮を除去したドナーアロ角膜の実質表面に、レシピエントと同系の新鮮角膜上皮を被覆してキメラ状に再構築した角膜組織(キメラ角膜と称する)を作成し、移植後の拒絶反応を回避できたことを既に報告した。14年度には、キメラ角膜移植における拒絶反応回避の機序が、active immune suppression(優性抑制)かimmunologic ignorance(免疫学的無視)かを明らかにするための実験を行った。キメラ角膜移植の2週後または8週後の時点で、角膜移植片が透明生着しているレシピエントに、ドナー由来の脾細胞を皮下注射して免疫し、その後の角膜移植片の生着を観察した。その結果、透明生着していた角膜移植片は、脾細胞の皮下注射の後3週以内にほぼ全て拒絶された。したがって、キメラ角膜移植によりactive immune suppressionは誘導されていないことが示された。さらに、透明生着しているキメラ角膜移植片がアロ抗原を発現しており、脾細胞による全身的なアロ抗原感作によって引き起こされた免疫反応の標的となることが示された。以上の結果より、キメラ角膜の拒絶回避の機序が、immunologic ignoranceであることが強く示唆された。また、キメラ角膜作成における同系の角膜上皮の代用組織として、羊膜上皮アログラフトの免疫特権と免疫原性の解析も行った。その結果、羊膜上皮は、種々の免疫抑制因子を発現し、腎被膜下では生着する免疫特権を有していたが、一方、炎症性因子の遺伝子も発現しており、眼表面に移植された羊膜上皮アログラフトは、アロ抗原特異的遅延型過敏反応を誘導し、拒絶反応を生ずることがわかった。角膜移植後の免疫反応を回避する目的で、マウスの同所性角膜アログラフトモデルにおいて、角膜上皮を除去したアロ角膜の実質表面にレシピエントと同系の新鮮角膜上皮を被覆してキメラ状に再構築した角膜組織(キメラ角膜と称する)を作成し、移植後のアロ抗原感作を起こさずに拒絶反応を回避することを既に報告した。13年度には、キメラ角膜移植後のレシピエント抗原提示細胞の遊走を共焦点顕微鏡を用いて免疫組織化学的に検討した。その結果、移植後早期のグラフト接合部における抗原提示細胞密度は、対照の全層角膜アログラフトに比較して、キメラ角膜で有意に減少していた。このようにレシピエント抗原提示細胞の遊走抑制が、キメラ角膜移植後の抗原感作の回避の機序の一つと考えられた。一方、キメラ角膜を臨床応用する場合、同系(臨床上は患者自身)の角膜上皮をキメラ組織作成のために確保することは困難であるため、それを代用する組織として羊膜上皮を候補とし、アログラフトとしての羊膜上皮の免疫原性を検討した。妊娠後期のマウスから採取した羊膜上皮アログラフトを腎被膜下に移植し、臨床所見、組織所見、主要組織適合複合体の発現、アロ抗原特異的遅延型過敏反応、およびActive suppressionの誘導について検討した。その結果、羊膜上皮アログラフトは、骨髄由来細胞を含有せず、移植後にも主要組織適合複合体class I分子の発現は弱く、class II分子は未発現であり、アロ抗原感作を起こさず、拒絶反応を回避した。さらに、羊膜上皮アログラフトと角膜アログラフトを腎被膜下へ共移植すると、角膜由来の遅延型過敏反応の誘導は抑制されて、角膜は拒絶反応を回避した。このように羊膜上皮がアログラフトとして免疫特権組織であることが明らかとなり、前述のキメラ角膜作成の際に、同系角膜上皮の代用として、アロ角膜実質表面を被覆する材料となりうることが示唆された。

その結果、羊膜上皮は、種々の免疫抑制因子を発現し、腎被膜下では生着する免疫特権を有していたが、一方、炎症性因子の遺伝子も発現しており、眼表面に移植された羊膜上皮アログラフトは、アロ抗原特異的遅延型過敏反応を誘導し、拒絶反応を生ずることがわかった。
神経幹細胞形成の時空間的制御機構

本研究では、ショウジョウバエ視覚中枢をモデルとし、神経上皮細胞から神経幹細胞への分化に関与する因子の探索と機能解析を目的としている。本実験系は、神経上皮細胞から神経幹細胞への分化が時空間的に制御された中で進行するため、種々の分子マーカーによる染色や、細胞の形態の観察により、細胞の分化状態を容易に同定できる。そのため、神経分化に関与する因子の網羅的探索に適した系であると考えられる。また、まず上皮細胞が対称分裂により増殖し、次に非対称分裂を行う神経幹細胞が産生される発生様式は、脊椎動物の中枢神経系の神経分化様式と似ているため、本研究の成果は脊椎動物まで応用できる発展性を秘めている。これまで進めてきたRNAi法を用いたスクリーニングから、機能欠失時に視覚中枢形成に異常を示す遺伝子を複数同定している。その中で、特に興味深い表現型を示す遺伝子として、ショウジョウバエEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR)シグナルの構成因子が得られてきた。現在、これらEGFRシグナル経路の因子の機能欠失変異体および過剰発現体を用いて、EGFRシグナルの視覚中枢形成における役割の解明を進めている。また、すでに関与することが知られているJAK/STATシグナル伝達系との相互作用についても解折中である。今後、スクリーニングの継続と、EGFRシグナルの機能解析により、神経幹細胞分化の普遍的なメカニズムの解明が進むことが期待される。