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家族性筋萎縮性側索硬化症タイプ6の発症分子機構

200字家族性筋萎縮性側索硬化症タイプ6の患者のRNA結合タンパク質TLSの遺伝子上には特異的な点変異が存在する。これらの点変異体は、正常TLSとも凝集しやすく、また、TLSのノックアウト胎児脳ではいくつかのRNAのスプライシング阻害が起こる。今回TLS蛋白質の会合体のプロテオミクス解析やTLSノックアウトマウス脳のiCLIP解析の結果などから、TLSの機能欠損がミトコンドリアのストレス応答とRNA代謝異常を誘導する可能性が示唆された。RNA結合タンパクTLSは家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)タイプ6の原因遺伝子である。FALSの主病変は運動ニューロンにおける異常タンパクの細胞質内凝集であり,TLS遺伝子の点変異体が発現する場合にもこの細胞内病変が顕著に現われる。そこで本年度は,特にTLS遺伝子点変異体発現による"細胞内輸送"及び"蛋白分解経路"の阻害によるFALSの発症機序を検討することにした。変異TLS蛋白が細胞内輸送系へ及ぼす影響に関しては,脊髄ニューロンのin vitroモデルであるNSC-34細胞を用いて検討した。家族性ALSタイプ6で報告されているTLSの点変異体[優性遺伝性の521番目のアルギニン残基の変異(R521G)や劣性遺伝性の517番目のヒスチジン残基の変異を持つ変異TLS蛋白(例H517Q)等]のコンストラクトを各種作製し,これらにタグ蛋白(Flag, Myc,およびGFP)を付加してNSC-34細胞に発現させた後,蛍光顕微鏡と生化学的手法を用いてその細胞内局在を解析した。従来の報告どおり,NSC-34細胞においてもR521G, H517QおよびR518Kは,細胞内に凝集しやすい傾向がみられた。またこれらの変異体は,代表的な細胞内輸送蛋白であるダイニンやミオシンVaとも会合した。さらにR521Gは細胞内だけでなく神経突起内でも凝集していたことから,R521GとミオシンVIとの会合についても検討した。複数の抗ミオシンVI抗体を用いて免疫沈降を行ったところ,免疫沈降物中の正常TLSとR521Gは,truncated form(部分的蛋白分解物)として検出され,さらにR521Gはfull lengthの状態でもミオシンVIと会合することがわかった。このことは,R521GがミオシンVIの輸送会合体の阻害剤として機能している可能性を示唆しており,「長期的にR521Gが発現することによって,ミオシンVIを介したオートファゴソームの輸送阻害により蛋白凝集が起こりALSを誘導する」というFALSタイプ6の発症モデルとよく合致する。しかしながら,正常TLSと変異TLSの間でのユビキチン化とオートファジー耐性については,現在までの実験では有意差が認められていない。"家族性筋萎縮性側索硬化症(以下FALS)タイプ6"の患者のRNA結合タンパクTLS遺伝子上には特異的な点変異が存在する。本研究は、'mRNA-蛋白輸送複合体'の構成蛋白であるRNA結合タンパクTLSに着目し、FALSの発症における「脊髄運動ニューロン変性の分子機構」を解明することを目的とする。本年度は、主に以下のような結果を得た。(1)TLSの細胞内蛋白分解ユビキチン-プロテアソーム系あるいはオートファジーにおける役割TLS点変異体のユビキチン化の状態やオートファゴソームへの取り込みを調べるため、TLS変異体を脊髄運動ニューロン由来細胞に強制発現させたのち、ユビキチン化抗体FK1、およびオートファゴソームマーカー蛋白であるp62と同活性化マーカーLC3に対する抗体を用いて検討した。一時的な変異体発現では、変異体の過剰発現によるTLS蛋白のユビキチン化による顕著なシフト差は見られず、またオートファゴソームの活性化も認められなかった。(2)脊髄運動ニューロンのショットガンプロテオミクス解析N末側にFLAGタグを付加した正常TLSのRNA結合領域およびFALS type6特異的な点変異をもつTLS等を発現した脊髄ニューロン培養細胞の蛋白抽出液を、抗FLAG抗体ビーズで免疫沈降し、免疫沈降蛋白会合体の"プロテオミクス解析"を、ナノフロー2D-LC-MS/WSを用いて行った。本プロテオミクスの結果から、細胞内タンパク異常凝集を起こしやすく、また、ALSの発症に関係する変異TLS蛋白(R521G)に、特異的・選択的に会合している蛋白分子をいくつか同定することができた。特にRNAの核-細胞質シャトリングに関与する因子、RNAスプライシングに関与する因子などがTLSの標的たんぱく質として同定されたことは、FALS type6の発症段階初期において、RNA代謝異常やRNA輸送阻害が関与することを強く示唆しており、さらに詳細な検討を進めている。本研究は`mRNA-蛋白輸送複合体'の構成蛋白であるTLSの機能に着目し、家族性萎縮性側索硬化症(FALS)タイプ6の発症における『脊髄運動ニューロン変性の分子機構』を明らかにしようとするものである。本研究の最終年度にあたる平成24年度は、以下のような結果が得られた。(1)“TLSノックアウトマウスの大脳皮質では高Ca2+

透過性を呈するNR1スプライスバリアントNR1-4の発現量が上昇すること"を見出した。(藤井ら、2012)。一方、NR2サブユニットのスプライスバリアントのmRNA発現量は、TLSノックアウトマウス脳では減少していた。この結果は“TLSが神経活動依存的にNR1スプライスバリアントmRNAの発現を制御することによってNMDARからのCa2+透過量を調節して神経細胞のCa2+恒常性を維持している"ことを示唆しており、TLSが細胞毒性を誘発する蛋白質の発現を転写物が翻訳される過程で選択的に制御する一例と考えている。(2)TLSノックアウトマウス脳のiCLIP解析により、TLSに特異的に結合するRNAの詳細なプロファイルを得た(Rogeljら、2012)。TLSの特異的標的RNAには、ミトコンドリアの機能活性に関わるものもあり、TLSがストレス応答によるたんぱく質分解経路に関係している可能性が示唆された。(3)TLS蛋白会合体のプロテオミクス解析から、TLSのRNA結合領域は、TLSの凝集体形成を抑制することで知られるNucleolin(Nucleoporin, Nup107)とも会合することを明らかにした(藤井ら、2012)。実際に、TLSノックアウトマウス由来の神経細胞ではNucleolinの顕著な細胞質内局在変化がみられた。NMDAR1のAlternativesplicingに関与する因子とともに、TLSのノックアウト胎児脳ではいくつかのmRNAのスプライシング変異や阻害が起こっていることを明らかにした(論文投稿準備中、3件)。in vivoでの検証が必要だが、共同研究機関先と共に進めている「TLSの点変異をもつALS type6の病態モデルマウスの作製」において、表現型解析までには未だ至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。FALStype6の発症機序中、細胞内凝集体形成のイニシエーション過程では、RNAの核-細胞質シャトリングに関与する因子やRNAスプライシングに関与する因子などの輸送阻害や細胞質内貯留がRNA代謝異常が主要な原因となっている可能性が高いことを示唆する結果が得られた。この結果は、TLS自体が、RNA輸送やRNAスプライシングたんぱく質であることからも妥当であるが、さらにin vivoでの解析が必要であることは否めない。TLS点変異体を発現する本疾患の病態モデルマウスの発現型解析には、今後さらに12年を要すると考えられ、時間的なネックとなっている。FALS type6の発症段階におけるRNA代謝異常やRNA輸送阻害が関与については、FALS type6の罹患者のiPS細胞を用いた解析も検討中である。
血管内皮-白血球接着現象におけるセレクチン分子を介する信号伝達、細胞骨格連結機構の解明

E-セレクチンは血管内皮細胞に発現する接着因子で急性および慢性炎症において重要な働きをしていることが近年明らかになってきた。我々はすでに白血球がE-セレクチンを介して血管内皮細胞に接着する際に、細胞表面のE-セレクチンが細胞骨格と結合することを示し、E-セレクチンのシグナル伝達への関与の可能性を世界に先駆けて報告した。今回、アデノウイルスベクターシステムを利用してE-セレクチンの過剰発現系を構築し、培養内皮細胞での発現を確認し、ラット大動脈への遺伝子導入に成功した。ラット大動脈に導入されたE-セレクチンは流速存在下で白血球の接着を誘導することが解明された。モデルによってが可能となった。今後は、この新しいモデルを使って血管レベルでのE-セレクチンの機能の詳細にあきらかにしていく。
細胞分化における細胞表層構造の力学的最適化

植物の体は個々の細胞の力学特性の集積によって支えられている。植物細胞の力学特性は細胞を囲む細胞壁に大きく依存している。細胞が分化する過程で獲得する細胞壁の力学特性の解明は、植物体全体の力学特性の理解に不可欠である。本研究では研究代表者の細胞分化誘導技術を用いて細胞分化に伴う細胞壁の力学特性の変化を精密かつ定量的に解析する。さらに、細胞壁の沈着を制御している表層微小管の配列構造の力学特性を明らかにする。これにより分化細胞の細胞壁および表層微小管の力学特性とその分子基盤を明らかにする。
金属イオン錯体を用いたリン酸基転移酵素モデルの構築

リン酸化反応は生体反応として極めて重要であり、リン酸基転位酵素の多くは補欠因子として金属イオンを必要とする。基質認識部位と金属イオン配位部位を有する配位子を合成し、水酸基を有する基質との親和力を利用して、温和な条件下で分子認識により捕捉された基質へのリン酸基転位反応について検討することが可能であると考えた。ここで重要なことは如何なる相互作用を基質認識部位に用いるかである。本研究においては水素結合と疎水相互作用を基質認識に用いた。m-キシレンをスペーサーとしたビスメラミン誘導体は6点の水素結合でバルビツール酸誘導体を捕捉する。そこで、2,2'・ビピリジル基を有するビスメラミン誘導体と水酸基を有するバルビツール酸を用い、活性化されたリン酸ジエステルをリン酸ドナーとして用いリン酸基転移反応を試みた。意外なことにバルビツール酸誘導体非存在下においてもビスメラミン誘導体はリン酸ジエステルの加水分解を加速することを見出した。速度論的解析などから、リン酸ジエステルの加水分解においてメラミンのNHが水素結合ドナーとして働き遷移状態を安定化しているためであると結論付けた。水素結合と金属イオンの二つの要素を用いたリン酸エステルの加水分解については殆ど報告が無く、酵素の活性中心における機構を知る上で重要な知見であると考えられる。また、β-シクロデキストリン(β-CD)と基質の疎水相互作用を基質認識部位として用いた系についても検討を行った。すなわち、2,2'・ビピリジル基を有するβ-CDを合成し、基質として水酸基を有する芳香族化合物を基質として用いた。その結果β-CD誘導体: Zn(II) :基質=1 : 1 : 1の三元錯体をスペクトル的に同定した。現在、リン酸基の転移反応について検討を行っている。本研究では金属イオン配位部位と基質認識部位を有する配位子を設計し合成して,外部基質に対するリン酸基の転移を行うことを目的として検討を行った.基質認識部位としてm-キシリレンをスペーサーとしたビスメラミン誘導体を合成し,これに金属配位部位として2,2'-ビピリジル基を導入した.上記のビスメラミン誘導体は有機溶媒中でバルビツール酸誘導体と強く会合することをこれまでに報告している.別途水酸基を5位にメチレンスペーサーを介して導入したバルビツール酸を合成し,これを基質とし,また金属配位部位を有するビスメラミン誘導体をアポ酵素モデルとして活性化されたリン酸ジエステルであるビス(2,4-ジニトロフェニル)リン酸からのリン酸基転移反応についてZn(II)存在下で検討を行った.非常に興味深いことに,バルビツール酸誘導体非存在下においても反応は速やかに進行し,金属イオンのみでの条件と比較してその反応速度は最大10^4倍加速することを明らかとした.その後,詳細な検討を行ったところ,ビスメラミンに由来する4点の水素結合が,金属イオン上の配位水のリン酸エステルへの求核攻撃における遷移状態を強力に安定化することを見出した.これまでに金属イオンと水素結合との協同効果により,リン酸エステルを加水分解した報告例は1例のみであり,酵素の活性中心における水素結合の役割を考察する上で,大変興味深い反応系であると言える.現在,種々の類縁体を合成し,そのリン酸ジエステルの加水分解における効果について系統的に検討をしている.また,他の基質認識部位を導入した配位子についても検討を行っている.リン酸化反応は生体反応として極めて重要であり、リン酸基転位酵素の多くは補欠因子として金属イオンを必要とする。
糖尿病性腎症の成因解明と新しい治療法の開発を目指した探索的研究

我々はこれまでの一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因には、軽微な慢性炎症(microinflammation)が関与しており、種々のケモカインや炎症性サイトカインとともに、cholecystokinin (CCK)が、腎症の病因に関連している可能性があることを報告した。本研究では、糖尿病性腎症の進展におけるCCKの役割を明らかにするために、CCK type A receptorとtype B receptorの単独ノックアウトマウスと両者のダブルノックアウトマウス(CCK-AB KOマウス)およびwild typeマウスに糖尿病を発症させることにより、CCKが糖尿病性腎症の進展に対して保護的に働く因子であることを明らかにした。さらに、CCK peptideが培養マクロファージからの炎症性サイトカイン産生を抑制すること、糖尿病ラットの腎障害の進行を抑制することを示し、この結果よりCCKが糖尿病性腎症の予防・治療に応用できる可能性があることが示唆された。糖尿病性腎症は、わが国における慢性血液透析導入の最大の原因疾患であり、腎症の成因を解明して新しい治療手段を開発することが重要な課題となっている。我々はこれまでに、炎症が動脈硬化と糖尿病性腎症の共通の進展メカニズムの一つであることを明らかにした。本研究の目的は、糖尿病性腎症の成因に関与する炎症関連分子を探索し、microinflammationを標的とした腎症の新しい治療法を開発することである。本研究において、糖尿病を発症したICAM-1ノックアウト(KO)マウスと野生型マウスの腎臓からRNAを抽出してDNAマイクロアレイで遺伝子発現プロファイルを比較することにより、糖尿病性腎症の成因に関わる遺伝子の一つとしてcholecystokinin(CCK)を見出した。CCKは消化管ホルモンや神経伝達物質としてよく知られた分子であるが、腎臓における発現について記述した論文は殆ど無く、腎臓における作用も知られていない。また、CCK receptorにはA rceptor、B receptorの2種類があるが、いずれも腎臓やマクロファージに発現していることが知られている。従って、腎組織障害に伴って腎臓に発現が増加したCCKが、マクロファージに対して何らかの作用を及ぼす可能性が考えられる。本年度は、CCK A receptor KOマウス,CCK B receptor KOマウスとCCK AB receptorダブルKOマウスに5/6腎摘出を行うことにより、CCKが糸球体硬化の進展に対して抑制的に働くことを明らかにした。これに続いて、同じ3種類のKOマウスに糖尿病を発症させて腎症の変化を検討する予定である。糖尿病性腎症は、わが国における末期腎不全の最大の原因疾患であり、腎症の成因を解明して新しい治療手段を開発することが危急の課題である。我々はこれまでの一連の研究によって、糖尿病性腎症の成因には、軽微な慢性炎症(microinflammation)が関与しており、これは動脈硬化の成因と共通したメカニズムであることを明らかにした。さらに、我々の最近の研究の結果、osteopontin、RANTESやIP-10などのケモカイン・サイトカインやcholecystokinin(CCK)などの炎症関連分子が、腎症の病因に関連している可能性があることが示された。CCKは腎臓の尿細管上皮細胞に、CCK type A receptor,type B receptorは尿細管とマクロファージに発現している。そこで、糖尿病性腎症の進展におけるCCKの役割を明らかにするために、CCK type A receptorとtype B receptorの単独ノックアウトマウスと両者のダブルノックアウトマウス(CCK-AB KOマウス)およびwild typeマウスに糖尿病を発症させ、腎障害の進展を比較した。その結果、CCK-AB KOマウスでは、他の系統のマウスに比較して、糖尿病発症後の腎障害の進展が著明に加速していることが明らかとなった。DNAマイクロアレイでは、CCK-AB KOマウスではwild typeマウスに比較して、腎臓における炎症性遺伝子群の発現が亢進していることが明らかとなった。これらの結果から、CCKは糖尿病性腎症の進展に対して保護的に働く因子であることが示唆された。次に、CCKpeptideを用いて、in vitroとin vivoにおけるCCKの作用を検討した、その結果、CCKが培養マクロファージからの炎症性サイトカイン産生を抑制すること、糖尿病ラットの腎障害の進行を抑制する効果を示すことが明らかとなり、治療への応用が可能であることが示唆された。
遠心流動層によるディーゼル機関排ガスの同時脱塵・脱硝システムの開発

ディーゼルエンジン排ガス中には、10%前後のO2と浮遊粒子状物質(ススとタール状物質)が含まれているため通常の三元触媒ではNOx低減が困難であり、現状ではディーゼル排ガスに対して有効な排ガス浄化方法がない。このためディーゼル排ガス処理装置の開発は社会的に緊急の課題となっている。そこで、本研究では遠心流動層を用いたディーゼル排ガス中のNOxとススの同時除去装置の開発を目的として研究を行った。最終年度である本年度は、遠心流動層によるススの補集機構を解明するため、ナノサイズの超微粒子を遠心流動層で流動化させる実験を行いその流動挙動を調べた。その結果、ナノサイズ粒子が、遠心流動層によって、飛び出さずに大きな凝集塊を作ることなく流動化できることを示し、凝集体径がGによらずほぼ一定となることを見いだした。また、固定層を用いたNOxとカーボンの反応実験を行い、ススによるNOxの還元機構を明らかにした。近年、大都市を中心にディーゼル車から排出されるNOxおよびばいじんによる大気汚染が深刻化している。ディーゼルエンジン排ガス中には、10%前後のO_2と浮遊粒子状物質(ススとタール状物質)が含まれているため通常の三元触媒ではNOx低減が困難であり、現状ではディーゼル排ガスに対して有効な排ガス浄化方法がない。本年度は、ススとNOxの反応機構および触媒作用の解明のついて実験を行った。これまでの実験からディーゼル排ガス中のススが過剰の酸素で燃焼しつつNOの還元剤として作用したと考えられる。しかし、ススのような微粒子とNOxの反応に関する研究例は少ない。そこで、固定層反応装置を用いて活性炭(6080mesh)に平均粒径3μmのCu-ZSN5ゼオライト触媒をまぶし、NOおよびO2を所定の濃度で流通させ、温度、NO濃度、O2濃度、触媒量および活性炭の量を変化させて、出口ガス中のO2、N2、CO、CO2、N2O濃度は高速ガスクロで、NOx濃度はNOx計で測定した。反応解析を効率よく行うために、ニューラルネットワークを利用してバーチャル反応系を構築し、バーチャル反応実験を行う手法を考え、その手法が可能であることを確認した。本年度は、遠心流動層によるススの補集機構を解明するため、ナノサイズの超微粒子を遠心流動層で流動化させる実験を行った。その結果、ナノサイズ粒子が、遠心流動層によって、飛び出さずに大きな凝集塊を作ることなく流動化できることを初めて明らかにした。実験結果は、遠心流動層がディーゼルエンジン排ガス中のパティキュレートを補修するとともに、これによりNOxが還元剤されるという、これまでの仮説を裏付けるものである。
ヒト子宮内膜癌細胞におけるステロイドレセプターの機能と構造

CFにて得れたピーク分画をPD-10によってbuffer交換し、その100μを使用してHPSECを行った。標準蛋白として、Thyrogloburin Ferritin,Catalase,Aldolaseを用いた。Kavをみると、Moでは子宮筋腫内膜(0,538、0.5576)、子宮内膜癌内膜(0.5576、0.538)であり、標準蛋白曲線と比較してほぼ1112×104であった。U_6では子宮筋腫内膜(0.599、0.599)子宮体癌(0.599、0.618)であり、ほぼ1718×104であった(n=2)。MoからU_6bufferに変換すると分子量の減少がみられた。解離定数では子宮看守内膜は4.6×10^<-10>より3.42×10^<-12>までに分布した(2.85±2.47×10^<-11>:n=6)。4.6×10^<-10>を示した症例は41才であり、以後47才までが順次減少した。子宮体癌内膜ではGradeIが7.8×10^<-10>を示し、GradeIIは2.04×10^<-11>より9.2×10^<-11>までに分布した。子宮体癌全体で2.36±3.66×10^<-10>であった。以上kd、分子量変化に於ては著変がないのに、そのPH表面電荷には条件によって、良性子宮内膜と癌内膜には有意の差が存在することが示唆された。
LCA的アプローチによるハスクレイを利用したバイオ水素精製技術の検討

本年度は、主に1実験によるHAS-Clayによる吸着試験性能の把握、及び2各吸着物質のLCAのインパクト指標の開発とBio-H2に対するLCA指標の開発を実施した。まず、1については、既設の試験装置をを用いて、HClやNH3の吸着試験を実施した。ここで対象としている吸着剤は、アロフェンを含む人工合成物のHAS-Clayと天然物の鹿沼土とし、吸着温度を100°C200°C及び常圧の条件で吸着試験をを行った。この結果、鹿沼土では、2.07.2g-Cl/100g-adsorbentとなり、吸着温度の上昇と共に吸着能力も向上するという知見を得た。また、HAS-Clayについては、7.11.7g-Cl/100g-adsorbentとなり、温度上昇に伴い吸着性能が低下するという知見を得た。また、NH3については、HAS-Clayのみ試験を行った。この結果、30°C90°Cで試験を行った結果、低温の方が有利であり、1.51.0g-Cl/100g-adsorbentとなり、Zeolite A5(文献値)と比較しても優れていることが分かった。次に、LCAによる環境影響指標による設計を行うことを目的に、吸着剤のインパクト指標について分析を行った。この結果、例えば、温暖化指数であるGWPについては、HAS-Clay、Zeolite及び鹿沼土は、17.142、2.352、0.004kg-CO2eq./kg-adsorbentとなった。この結果から、吸着性能が高い、あるいは物理吸着のように複数回使用できる方がGWPの影響が少なくなることが示唆された。これをもとに予備試験を行い、HClについては再生可能であるという可能性があることが示唆されたが、NH3については再生可能ができない可能性があるという知見が得られている。このことについては、次年度に吸着能力について検討を行うこととしたい。まず、基礎データ取得のための吸着試験については、既設の試験装置があり、研究実施においては、標準ガス等の購入が主なものである。また、次年度以降についても、既設の試験装置を改良のもと、不純物を含む合成ガス(標準ガス)を利用し、水素精製まで行うことを行う予定であるが、改良についてはほぼ終了し、現在、ブランクテストを実施している。なお、標準ガスの消費量が予想以上に大きいもののおおむね購入スケジュールを勘案し吸着試験が実施できてる見通しが立っている。またソフト面においては、研究実施内容の吸着試験をベースにした水素精製シミュレーションの開発を行う体制が整っており、吸着シミュレーションを組み合わせたバイオマスガス化プラントによる性能評価についても、定常状態における分析は既に実施している。次に、各吸着物質のLCAのインパクト指標の開発とBio-H2に対するLCA指標の開発は既に修了しており、及びアプリケーションを想定してエクセルギー単位におけるLCA評価についても、ほぼ検討方法は確立している。本年度については、LCA指標の結果、HAS-Clayの吸着性能が優れるものの影響が大きいため、再生可能の可能性について吸着試験を検討する。また、吸着剤の使用量削減を目的に、H2SやHCl及びNH3の同時吸着の可能性を検討する。一方、水素精製システムの定常性能を把握するため、静的プロセスシミュレータAspenPlusによるモデル化は終了している。これをもとに、動的な性能を把握するため、動的プロセスシミュレータgPROMsを利用したモデル開発を行う。また、最終的には合成ガス(標準ガス)から吸着剤による除去を行い、水素貯蔵までの一連のシステムによる試験を行い、シミュレータによる結果と比較検討を行いたいため、引き続き、実験装置の整備を行うこととしたい。但し、複数の不純物のサンプルガスについては、費用面及び安全面から困難なため、各不純物の試験結果、あるいは影響のある不純物に焦点を当てた試験創始の整備を行うととしたい。

この結果から、吸着性能が高い、あるいは物理吸着のように複数回使用できる方がGWPの影響が少なくなることが示唆された。これをもとに予備試験を行い、HClについては再生可能であるという可能性があることが示唆されたが、NH3については再生可能ができない可能性があるという知見が得られている。このことについては、次年度に吸着能力について検討を行うこととしたい。まず、基礎データ取得のための吸着試験については、既設の試験装置があり、研究実施においては、標準ガス等の購入が主なものである。また、次年度以降についても、既設の試験装置を改良のもと、不純物を含む合成ガス(標準ガス)を利用し、水素精製まで行うことを行う予定であるが、改良についてはほぼ終了し、現在、ブランクテストを実施している。なお、標準ガスの消費量が予想以上に大きいもののおおむね購入スケジュールを勘案し吸着試験が実施できてる見通しが立っている。またソフト面においては、研究実施内容の吸着試験をベースにした水素精製シミュレーションの開発を行う体制が整っており、吸着シミュレーションを組み合わせたバイオマスガス化プラントによる性能評価についても、定常状態における分析は既に実施している。次に、各吸着物質のLCAのインパクト指標の開発とBio-H2に対するLCA指標の開発は既に修了しており、及びアプリケーションを想定してエクセルギー単位におけるLCA評価についても、ほぼ検討方法は確立している。本年度については、LCA指標の結果、HAS-Clayの吸着性能が優れるものの影響が大きいため、再生可能の可能性について吸着試験を検討する。また、吸着剤の使用量削減を目的に、H2SやHCl及びNH3の同時吸着の可能性を検討する。一方、水素精製システムの定常性能を把握するため、静的プロセスシミュレータAspenPlusによるモデル化は終了している。これをもとに、動的な性能を把握するため、動的プロセスシミュレータgPROMsを利用したモデル開発を行う。また、最終的には合成ガス(標準ガス)から吸着剤による除去を行い、水素貯蔵までの一連のシステムによる試験を行い、シミュレータによる結果と比較検討を行いたいため、引き続き、実験装置の整備を行うこととしたい。但し、複数の不純物のサンプルガスについては、費用面及び安全面から困難なため、各不純物の試験結果、あるいは影響のある不純物に焦点を当てた試験創始の整備を行うととしたい。当初は実験整備費不足を懸念し、論文投稿や学会発表については、学内予算で充当していたが、吸着剤のサンプルが無償で提供があったことに加え、実験装置については、当初の想定よりも安価で部品等が整備することができたため余剰が生じた。なお、次年度については、実験用サンプルガスが比較的多く使うことが想定されるため、繰り越し分については、その費用に充てる予定である。
多胎児家庭における障害児の発生状況からみたファミリーケアの検討:多胎児家庭2000例のコホート調査

本研究では,2000組の多胎児とその家族を対象とした実態調査の分析から,障害児のいる多胎児家庭がかかえる問題点を明らかにし、効果的なファミリーケアの具体的方策を検討した。本研究結果から,以下の知見が得られた。1)障害児のいる双子の母親は,障害児のいない双子の母親に比べ有意に健康状態が悪化しており,かつ身体面で重度の疲労感と睡眠不足を訴えていた。さらに,障害児のいない双子の母親は,双子が3歳以上になると疲労感や睡眠状態が改善するのに対し,障害児をかかえている双子の母親では双子が3歳以上になっても疲労感および睡眠状態は改善しないことが明らかとなった。したがって,このような障害児かかえる多胎児家庭に対しては3歳未満の乳幼児期だけのサポートでは不十分であり,保健婦による訪問,ヘルパーの派遣,ボランティアの斡旋,および児へのデイケアなどのサービスを長期的に実施する必要があることが示唆された。2)障害児をかかえている多胎児の母親でもストレス解消法をもっている母親は,ストレス解消法をもたない母親よりも心身両面で疲労感が軽減していた。これらのストレス解消法があると回答した障害児をかかえる母親は,特別なことをしているのではなく,友人と話をしたり,電話するなど人とコミュニケーションをとることでストレスを解消していた。また,多胎児の育児サークルの活動に参加することや同じ境遇の親と交流をもつこともストレス解消法として挙げていた。これより,障害児をかかえる双子の母親に対しては,保健所などで障害児をかかえる双子の母親同士の交流会を実施することや障害をもつ多胎児の育児サークル等の自助グループを育成することにより、障害児をかかえる母親のストレス解消,さらには疲労感をも軽減する効果が期待できることが示された。過去10年来,多胎児の出産率は不妊治療の影響により激増している。多胎出産は児の数が多いのみでなく,低出生体重児および障害児の割合の増加,発達遅滞の多発等多胎特有の問題を複数同時に抱えている。特に,障害児の問題は深刻で,双子や三つ子以上の多胎児は障害児の発生率が高い上,1組中に複数の障害児が発生する危険も高く,これら障害のある多胎児をもつ母親の負担が懸念される。本研究では,2000組の多胎児とその家族を対象とした実態調査の分析から,障害をもつ多胎児をかかえる家庭へのファミリーケアの効果的な具体的方策を検討するものである。今年度実施した研究では,双子家庭における障害児の発生状況,母親の健康状態,および育児環境を調査・分析し,以下の知見が得られた。1)障害児のいる双子の母親は障害児のいない双子の母親に比べ有意に健康状態が悪化しており,かつ身体面で重度の疲労感を訴えていた。また,障害児のいる母親は障害児のいない母親に比べ有意に睡眠時間が短く,重度の睡眠不足を訴えていた。2)障害児の有無別に母親の医療機関への受療状況を分析すると,障害児のいる双子家庭では容易に医療機関へ受診できない母親の比率が有意に高かった。また,障害児双子家庭の約6%,おおよそ16人に1人の母親には育児協力者がなく,障害児の療養を含めた育児全てを母親だけが担っていた。3)双子1組中の障害児の人数別で母親の健康状態,疲労状態,ならびに睡眠状態を分析すると,健康状態,および睡眠状態には差異は認められなかった。しかし,疲労状態において有意な差異が認められ,双方とも障害をもつ双子の母親は,片方が障害児の母親に比べ精神面で重度の疲労感を訴えていた。

本研究では,2000組の多胎児とその家族を対象とした実態調査の分析から,障害児のいる多胎児家庭がかかえる問題点を明らかにし,効果的なファミリーケアの具体的方策を検討した。本研究結果から,以下の知見が得られた。1)障害児のいる双子の母親は,障害児のいない双子の母親に比べ有意に健康状態が悪化しており,かつ身体面で重度の疲労感と睡眠不足を訴えていた。さらに,障害児のいない双子の母親は,双子が3歳以上になると疲労感や睡眠状態が改善するのに対し,障害児をかかえている双子の母親では双子が3歳以上になっても疲労感および睡眠状態は改善しないことが明らかとなった。したがって,このような障害児をかかえる多胎児家庭に対しては3歳未満の乳幼児期だけのサポートでは不十分であり,保健婦による訪問,ヘルパーの派遣,ボランティアの斡施,および児へのデイケアなどのサービスを長期的に実施する必要があることが示唆された。2)障害児をかかえている多胎児の母親でもストレス解消法をもってる母親は,ストレス解消法をもたない母親よりも心身両面で疲労感が軽減していた。これらのストレス解消法があると回答した障害児をかかえる母親は,特別なことをしているのではなく,友人と話をしたり,電話するなど人とコミュニケーションをとることでストレスを解消していた。また,多胎児の育児サークルの活動に参加することや同じ境遇の親と交流をもつこともストレス解消法として挙げていた。これより,障害児をかかえる双子の母親に対しては,保健所などで障害児をかかえる双子の母親同士の交流会を実施することや障害をもつ多胎児の育児サークル等の自助グループを育成することにより,障害児をかかえる母親のストレス解消,さらには疲労感をも軽減する効果が期待できることが示された。
新しいヒトiPS細胞由来心筋特異的前駆細胞を用いた心臓再生治療戦略の開発

心臓再生は再生医療の主要なターゲットです。本研究では、移植後にも効率よく心筋細胞に分化し、移植された心臓に貢献しうる新しい心筋の前駆細胞(心筋の前段階の細胞)の探索を行いました。ヒトiPS細胞の分化過程においてCD82と呼ばれる分子を発現する細胞は、ラットやマウスへの移植後もほぼ全て(>95%)の細胞が心筋細胞へと分化することを確認し、論文として発表しました(Takeda, Cell Reports, 2018)。現在心筋梗塞モデルなどにおいて治療効果があるかを検討しています。新しい心臓再生治療の可能性を拓くものとして期待されます。心臓移植を代替しうる細胞移植再生治療として、従来の「分化心筋細胞を補充する」のではなく、心臓の幹細胞システムを部分再構成し、「組織内で心筋を生成する」新しい心筋前駆細胞治療が次世代戦略として期待される。研究代表者は、多能性幹細胞からの心血管細胞分化・再生における種々の成果を上げてきた。研究代表者は最近、ヒトiPS細胞分化途上において高効率且つ選択的に心筋細胞に分化する新しい心筋特異的前駆細胞分画を細胞表面マーカーにより世界に先駆けて同定した。同細胞を用いて新しい心臓再生治療戦略を開拓することを目的とし、同細胞の基本的性状解析から細胞治療応用法まで、同心筋前駆細胞を幅広く臨床応用するための礎を築く。本年度は、以下の1)ー3)の3項目のうち、1)2)に関して検討した。1)CCP+心筋前駆細胞の性状解析。2)CCP+心筋前駆細胞の心臓への移植法の開発。3)種々の動物モデルを用いた有効性安全性の検討。その結果、CCP+心筋前駆細胞が血清存在下などの非特異的分化条件においても、高率に心筋細胞に分化すること。免疫不全マウス腎被膜下及び心筋梗塞モデルへの移植においても90%以上の高率で心筋細胞になることを確認した。これらの結果より、CCP+心筋前駆細胞は、細胞自律的に心筋細胞に分化する細胞であり、心筋細胞への分化運命がすでに決定された心筋にコミットした新しい心筋特異的前駆細胞であることが示された。CCP+細胞が、心筋特異的な新しい前駆細胞であることをin vitroに加えて、in vivoにおいても示すことができている。今後種々の動物モデルへ展開することも可能となった。最近、ヒトiPS細胞分化途上において高効率且つ選択的に心筋細胞に分化する新しい心筋特異的前駆細胞分画を細胞表面マーカーにより世界に先駆けて同定した。1)ー3)の3項目に関して検討し、新規心臓再生治療戦略を開発する。i)CCP+心筋前駆細胞の分化増殖特性の解析。CCP+細胞が非特異的培養条件においても高率に心筋細胞に分化することを明らかにした。ii)CCP+心筋前駆細胞の分化運命決定機構の解析。CCPの発現により、細胞内のWntシグナルが抑制されることにより、心筋への分化が促進されることを明らかにした。iii)CCPの機能的意義の解析。CCPが核内のβカテニンを低下させることにより、Wnt阻害に働いていることを明らかにした。直接的に針注射を行っても細胞は残存し、高率に心筋細胞として心臓に生着した。CCP+心筋前駆細胞の特性、機能、などの解明に成功した。心臓への移植後においても特異的心筋に分化することを証明した。同細胞を用いて新しい心臓再生治療戦略を開拓することを目的と、同細胞の基本的性状解析から細胞治療応用法まで、同心筋前駆細胞を幅広く臨床応用するための礎を築く。以下の1)ー3)の3項目に関して検討し、新規心臓再生治療戦略を開発する。1)心筋前駆細胞の性状解析:i)心筋前駆細胞の分化増殖特性の解析, ii)心筋前駆細胞の分化運命決定機構の解析, iii)標的分子の機能的意義の解析2)心筋前駆細胞の心臓への移植法の開発、3)種々の動物モデルを用いた有効性安全性の検討1)に関して、ヒトiPS細胞分化途上において心筋分化直前の時期に特異的に発現する細胞表面分子CD82が、心筋特異的前駆細胞のマーカーとなりうることを示した。CD82陽性細胞は、心筋分化とは関係ない非特異的な培養条件や生体への移植後においても高い効率で心筋細胞に分化した。

CD82はエクソソームに発現する分子であり、CD82の発現によりエクソソーム数が増加し、心筋分化を阻害するbeta-cateninをエクソソームとともに細胞外に排出することにより心筋分化を促進することを明らかにした。1)に関しては完全に達成し、同成果を論文発表した(Takeda, Cell Reports, 2018)。2)3)に関しては解析を進めており、ラット心筋梗塞モデルにおいてCD82陽性細胞移植により機能改善が認められる予備的結果を得ている。上記のように順調に研究は進捗し論文発表に至った。心臓再生は再生医療の主要なターゲットです。本研究では、移植後にも効率よく心筋細胞に分化し、移植された心臓に貢献しうる新しい心筋の前駆細胞(心筋の前段階の細胞)の探索を行いました。ヒトiPS細胞の分化過程においてCD82と呼ばれる分子を発現する細胞は、ラットやマウスへの移植後もほぼ全て(>95%)の細胞が心筋細胞へと分化することを確認し、論文として発表しました(Takeda, Cell Reports, 2018)。現在心筋梗塞モデルなどにおいて治療効果があるかを検討しています。新しい心臓再生治療の可能性を拓くものとして期待されます。今後は、1)CCP+心筋前駆細胞の性状解析のうち、ii)CCP+心筋前駆細胞の分化運命決定機構の解析。iii)CCPの機能的意義の解析2)CCP+心筋前駆細胞の心臓への移植法の開発においては、iii)経カテーテル移植法3)種々の動物モデルを用いた有効性安全性の検討においては、ii)心筋症ハムスターモデル。iii)ブタ慢性期心筋梗塞モデルに関する解析を中心に行い、臨床応用に向けた研究を進めていく予定である。心臓への移植法の改善を行い、ラット心筋梗塞モデルへの移植において、機能改善効果があることを明らかにしていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。幹細胞生物学・再生医学・循環器内科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ラット膵移植における、脾臓合併移植を用いたドナー特異的免疫寛容の誘導

(目的)膵臓移植におけるドナー特異的免疫寛容の誘導を目指し、脾臓合併移植による膵グラフトの生着延長効果とその機序について検討した。(方法)動物はDAラットをドナー、Lewisラットをレシピエントとし、レシピエントには術前ストレプトゾシンを静注し糖尿病を誘発した。ドナーから膵脾十二指腸を摘出後、レシピエントの腹腔内に移植した。膵単独移植群(P群)と膵脾移植群(S/P群)を作成し、それぞれにFK506を術後4日間投与した群(FK4d群)と無投与群(FK0d群)を作り、計4群に分けた。術後は血糖が300mg/dlを超えた時点を拒絶と判定した。またS/P群について術後5日目に脾グラフトを採取し、RTPCR、FACS、免疫染色を用いて調節性T細胞を観察した。(結語)脾臓合併移植と短期免疫抑制により調節性T細胞が誘導され、膵グラフトの免疫不応答が獲得できる可能性が示唆された。(目的)膵脾合併移植の際に、脾臓の容量を変え、拒絶・GVHD共に発生しない至適な条件を明らかにし、臨床応用が可能なドナー特異的免疫寛容の誘導法を開発する。(方法)動物は、DAラットをドナーとしLewisラットをレシピエントとした。Lewisには移植手術の4日以上前にストレプトゾトシンを静注し随時血糖が350mg/dl以上であることを確認し、糖尿病とした。マイクロサージャリーの技術を用いてDAより全膵・十二指腸を摘出後、Lewisに移植した。グラフトの腹部大動脈、門脈をそれぞれレシピエントの腹部大動脈、下大静脈に端側吻合し、十二指腸はレシピエントの十二指腸に側々吻合した。脾合併移植を行う群と行わない群を作成し、術後の生存日数、グラフト生着日数を観察した。術後は体重、血糖値を測定し随時血糖が300mg/dlを超えた時点を拒絶と判定した。(結果)(1)DAラットとLewisラットのhigh responder combinationで膵移植を行うと、膵グラフトの拒絶、機能廃絶が術後平均13.0±3.6日で起こる事が分かった。(2)膵脾合併移植群では、21匹中3匹で術後20日を超えても血糖の上昇のしないラットを確認し、このグラフト生着延長効果は膵単独移植群では認められなかった。脾臓により膵グラフトの免疫不応答が誘導された可能性が示唆された。(3)レシピエントの生存期間は膵単独移植群で平均159.4日、膵脾合併移植群では73.2日と短い傾向にあった。膵脾合併移植群ではGVHDなどの発症が、レシピエントの生存期間を短縮させた可能性が考えられた。(結語)脾臓合併移植によりグラフト生着は延長し、免疫不応答の誘導の可能性が示されたが、生存期間は短縮した。今後脾グラフトの容量を減少させ、膵グラフトの長期生着に必要充分、かつ安全な容量を明らかにする。またS/P群について術後5日目に脾グラフトを採取し、RT-PCR、FACS、免疫染色を用いて調節性T細胞を観察した。
ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ζ活性阻害によるインスリン抵抗性解除機構

本研究ではIRSと結合するDGKζ活性がGlut4の細胞膜移行を阻害するメカニズムを解明し、インスリン抵抗性の発生とIRS-1結合性DGKζとの関連を明らかにすることを目的としている。3T3-L1 adipocytesにおいて、siRNAによってDKGζをノックダウンすると、インスリン非依存的な糖取り込み量に変化は認められないが、インスリン依存的な糖取り込み量が有意に減少すること、さらにインスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化には全く影響しないことを明らかにした。続いて、阻害剤を用いて、DGKの活性を阻害したところ、インスリン依存的な糖取り込みが促進されることが明らかとなった。しかし、インスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化には全く影響を与えなかった。一方で、糖取り込み担体であるGLUT4の細胞膜移行はインスリン非依存的に促進されており、DGK活性はGLUT4の細胞膜移行を阻害していることが明らかとなった。これらの結果から、DGKζは、複雑な機構によってこれまでに知られているインスリンシグナルとは異なる新規シグナルを介して、インスリン依存的な糖取り込みを制御していることが明らかとなった。1)IRSとDGKζとの結合様式の解明IRS-1、IRS-2の種々のdeletion seriesを作製し、全長DGKζとともにHEK293細胞に共発現させ、免疫沈降法によってDGKζとの結合を検出した。その結果、DGKζはIRS-1の443a.a.から662a.a.の領域と結合することが明らかとなった。一方で、IRS-2との結合は確認できなかった。この結果からIRS-1とIRS-2では異なる機構で結合していることが明らかとなった。また、IRS-1とはインスリン刺激なしでも結合していたため、IRSのチロシンリン酸化を介さない機構で結合していることが明らかとなった。2)DGKζノックダウンによるインスリンシグナル、糖取り込み量に及ぼす影響の解析3T3-L1 adipocytesにおいて、electroporationによりDKGζをノックダウンした。まず初めに、糖取り込み量に及ぼすDGKζノックダウンの影響を調べたところ、インスリン非依存的な糖取り込み量に変化は認められないが、インスリン依存的な糖取り込み量が有意に減少していた。そこでDGKζのノックダウンがインスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化に及ぼす影響を調べた。その結果、DGKζをノックダウンしてもインスリン依存的なIRS-1、IRS-2のチロシンリン酸化量、IRS-1、IRS-2と結合するp85量、Aktの活性化、Erkの活性化、GLUT4の細胞膜移行に必須と考えられているAS160のリン酸化量に変化が認められなかった。AS160リン酸化量を反映して、GLUT4の細胞膜移行量にも変化が見られなかった。このことから、DGKζのノックダウンはGLUT4の細胞膜移行には変化を与えず、GLUT4の細胞膜上での活性化を阻害していることが示唆された。また、DGKζのノックダウンはインスリンシグナルに影響を与えなかったことから、DGKζはGLUT4の活性化に関わる新たなインスリンシグナルを伝達している可能性が強く示唆された。1)IRSとDGKζとの結合様式の解明IRS-1、IRS-2の種々のdeletion seriesとGSTとの融合タンパク質を大腸菌内で発現・精製した。それとは別に全長DGKζを293T内で発現させ、pull-down assayによってDGKζとの結合を検出した。その結果、DGKζはIRS-1の224-861a.a.と結合することが明らかとなった。さらに逆にDGKζをGSTと融合させたタンパク質を大腸菌内で発現・精製し、IRS-1を293T内で発現させ、同様にpull-down assayを行うと、結合が全く検出できなかった。両方のタンパク質を293Tで発現させた、共免疫沈降では二つのタンパク質の結合は検出されたことから、DGKζが大腸菌では行われない翻訳後修飾が細胞内でなされ、その修飾が結合に必須であることが示唆された。

2)DGKζノックダウンによるインスリンシグナル、糖取り込み量に及ぼす影響の解析昨年までに3T3-L1 adipocytesにおいて、electroporationによりDKGζをノックダウンすると、インスリン非依存的な糖取り込み量に変化は認められないが、インスリン依存的な糖取り込み量が有意に減少すること、さらにインスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化には全く影響しないことを明らかにした。そこで本年度はDGKζの活性を阻害する阻害剤を用いて、インスリン依存的な糖取り込み量、インスリンシグナルの活性化に与える影響を調べた。その結果、DGKζの活性阻害によってインスリン依存的な糖取り込みが促進されることが明らかとなった。また、DGKζ活性を阻害してもインスリン依存的なIRS-1、IRS-2のチロシンリン酸化量、IRS-1、IRS-2と結合するp85量、Aktの活性化、Erkの活性化に変化が認められなかった。一方で、糖取り込み担体であるGLUT4の細胞膜移行はイシスリン非依存的に促進されており、DGK活性はGLUT4の細胞膜移行を阻害していることが明らかとなった。このように複雑な機構によってこれまでに知られているインスリンシグナルとは関係ない新規シグナルを介してDGKζはインスリン依存的な糖取り込みを制御していることが明らかとなった。
2波長発振レーザーは、齲蝕治療に有効か?

近年、レーザーは歯科領域において歯質切削、根管内の洗浄、歯石除去、軟組織の疼痛緩和など様々な方法で臨床応用されている。2波長発振レーザーはレーザーダイオードによりNd:YAG(波長1.06μm)を励起して、その後オプティカルパラメトリック発振器(OPO)により波長を変換して2.1μmを境に長波長側、短波長側に同時に波長を可変出来る2波長のレーザーを得る装置である。このことにより1.6から4.0μmの波長域のレーザー光を得ることと、また2波長同時に発生することが可能な装置である。感染象牙質とは齲蝕原因菌から産出される酸によって無機質が脱灰され、コラゲナーゼによって有機質が分解されることにより成立するという科学細菌説によって説明されている。2.94μmは最表層の殺菌効果が期待できる反面、深部への殺菌効果期待できないと考えられ、ある程度の象牙質通過性を有するレーザーが、残存象牙質の殺菌に有効と考えられる。2.94μmの水分子に反応する性質により、水分を多く含んでいる象牙質が切削されると推測される。齲蝕原因菌の残留について、MIの考えでは、最小限の切削で窩洞を形成するあまり切削器具が届かず感染象牙質を取り残すことも危惧されている。切削器具が届きにくい場所に、プローブを使い分けレーザーを照射することで、齲蝕が確実に除去できれば、MIの概念を崩すことなく、残存する齲蝕原因菌の減少効果が期待できる。各照射条件で検討た結果、歯質の脱灰程度とプローブの形状は歯質の切削能に影響することが示唆された。2波長発振レーザーはレーザーダイオードによりNd : YAG(波長1.06μm)を励起して、その後オプティカルパラメトリック発振器(OPO)により波長を変換して2.1μmを境に長波長側、短波長側に同時に波長を可変出来る2波長のレーザーを得る装置である。そこで、齲蝕を想定し人工的に脱灰したウシの象牙質の脱灰象牙質の硬さと2.94μmの切削の関係を検討した。脱灰程度に比例し切削量が増加したが、ある一定の硬さの象牙質は、実験に使用した照射条件で切削に有意な違いが認められなかった。2つの波長が齲蝕原因菌に対する影響を検討した結果、菌数の減少が認められた。その効果は出力などの条件により異なるため、照射条件の検討が必要である。
工学教育における創造性の育成を目的とした学習環境の構築

本研究の成果は以下のようにまとめられる.平成17年度においては,創造性に関する心理学的知見に基づいた授業を,中部大学の創成科目の受講生131名に対して実践した.その実践は,学習者がプログラミングのための環境構築と基礎教育を受ける導入活動,LEGO Mindstormsを用いてグループでロボットを製作し,タイムトライアル競技に取り組む創造活動,そして,グループの創造活動の記録をもとに,創造プロセスをチャートとしてまとめ,自己の創造活動についての評価を行うリフレクション活動の3つから構成された.創成科目の実践後,この教育の学習効果について,アンケートによる主観的評価とデザイン課題を用いた客観的評価を実施した.その結果から,本創成科目で実施した創造性教育によって,学習者の創造活動が向上していることが確認された.特に,後者の客観的評価では,学習者のアイデア産出スキルの変化を客観的に評価した結果,学習者のアイデア産出量が,アイデア数,幅,深さともに,授業の後に増加していることが確認された.また,アイデア産出の系列を分析した結果,創造活動に重要とされるリフレクティブな活動を行った学習者が,授業後増加していることが確認された.平成18年度においては,前述した結果を踏まえて,授業デザインの改善,学習効果の新たな評価方法の考案,授業支援ツールの改良を行った授業が実施された.評価結果からは平成17年度の実践において確認された学習効果が同様に確認され,さらに,リフレクションに関する情報量の増加が確認された.これは,作業報告書の作成,アップロードの義務化等の授業デザインの改善により,学習者が自己の活動を容易かつ詳細に記録することができるようになった効果といえる.以上のように,本研究によって提案された授業のデザインによって,創造性向上のための学習者のスキルに一定の向上が確認されたといえる.本研究の成果は以下のようにまとめられる.平成17年度においては,創造性に関する心理学的知見に基づいた授業を,中部大学の創成科目の受講生131名に対して実践した.その実践は,学習者がプログラミングのための環境構築と基礎教育を受ける導入活動,LEGO Mindstormsを用いてグループでロボットを製作し,タイムトライアル競技に取り組む創造活動,そして,グループの創造活動の記録をもとに,創造プロセスをチャートとしてまとめ,自己の創造活動についての評価を行うリフレクション活動の3つから構成された.創成科目の実践後,この教育の学習効果について,アンケートによる主観的評価とデザイン課題を用いた客観的評価を実施した.その結果から,本創成科目で実施した創造性教育によって,学習者の創造活動が向上していることが確認された.特に,後者の客観的評価では,学習者のアイデア産出スキルの変化を客観的に評価した結果,学習者のアイデア産出量が,アイデア数,幅,深さともに,授業の後に増加していることが確認された.また,アイデア産出の系列を分析した結果,創造活動に重要とされるリフレクティブな活動を行った学習者が,授業後増加していることが確認された.平成18年度においては,前述した結果を踏まえて,授業デザインの改善,学習効果の新たな評価方法の考案,授業支援ツールの改良を行った授業が実施された.評価結果からは平成17年度の実践において確認された学習効果が同様に確認され,さらに,リフレクションに関する情報量の増加が確認された.これは,作業報告書の作成,アップロードの義務化等の授業デザインの改善により,学習者が自己の活動を容易かつ詳細に記録することができるようになった効果といえる.以上のように,本研究によって提案された授業のデザインによって,創造性向上のための学習者のスキルに一定の向上が確認されたといえる.1.創造性に関する心理学的知見に基づいた授業の実践中部大学の創成科目の受講生131名に対して,以下の3つの活動から構成された授業を実施した(週1コマ135分×12回).なお,本実践では,(2)と(3)の活動のサイクルを2回繰り返して実施した.また,学習効果を評価するためのデザイン課題が,学習前と学習後に2回実施された.(1)導入:学習者は,プログラミングのための環境の構築と,基本的なプログラミングに関する講義と演習に参加した.(2)創造活動:学習者はLEGO Mindstormsを用いて,グループでロボットを製作し,タイムトライアル競技に取り組んだ.(3)リフレクション:学習者は,リフレクション(自己の創造活動を振り返って評価するメタ認知的な活動)を行った.具体的には,グループの創造活動の記録をもとに,創造プロセスをチャートとしてまとめ,自己の創造活動についての評価を行った.2.学習効果の評価以下の2点の評価から,本創成科目で実施した創造性教育によって,学習者の創造活動が向上していることが確認された.(1)アンケートによる主観的評価アンケートの結果から,学習者が創意工夫し,トライ・アンド・エラーの姿勢で取り組んだことが確認された.(2)デザイン課題による客観的評価アイデア産出スキルの変化より客観的に評価した結果,学習者のアイデア産出量は,授業後,アイデア数,幅,深さともに増加していることが確認された.また,アイデア産出の系列を分析した結果,創造活動に重要とされるリフレクティブな活動を行った学習者が,授業後増加していることが確認された.3.新たな授業デザインの設計前述した結果を踏まえて,授業デザインの改善と,学習効果の新たな評価方法の考案,授業支援ツールの改良を行った.改善後の授業の実践が行われ,現在,その結果について分析中である.1.創造性に関する心理学的知見に基づいた授業の実践