hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝機能障害時の腎Na輸送蛋白の調節

肝機能をあらわすaminopyrine beath testから算出したABT-k値は,術前sham群2.10±0.07,2/3肝切除群2.03±0.04から,術後一日目にそれぞれ2.01±0.07,1.22±0.05と2/3肝切除群で有意に低下し,Naバランスは,sham群0.29±0.10,2/3切除群0.42±0.04mmol/dayから,術後1日目にそれぞれ0.62±0.05、1.33±0.09mmol/dayへと2/3肝切除群で有意に増加した.また,FENaは2/3切除群で0.38±0.02から0.23±0.03と有意に低下し,Naバランスの増加が,尿細管でのNa再吸収増加に起因することが示された,このことは,肝薬物代謝酵素活性の指標であるABT-kが一定の閾値を下回ると,腎尿細管でのNa貯留が生じるといういわゆるCriticalfunction threshold theoryに一致する結果であった,仮説に掲げたNa輸送蛋白は腎皮質に存在するため,metabolicstudyでNa retentionが生じた当日(2/3部分肝切除術後翌日)の腎を摘出,皮質部分のみを切除し,液体窒素で急速冷凍したのちNa-K ATPase subunitの発現が変化しているかを検討した.2.腎Na輸送蛋白の検討肝機能をあらわすaminopyrine beath testから算出したABT-k値は、術前sham群2.10±0.07、2/3肝切除群2.03±0.04から、術後一日目にそれぞれ2.01±0.07、1.22±0.05と2/3切除群で有意に低下し、同日測定した尿中な排泄量と、低塩飼料と胃管により塩水投与により一定した摂取Naとの差であるNaバランスは、sham群0.29±0.10、2/3切除群0.42±0.04mmol/dayから、術後1日目にそれぞれ0.62±0.05、1.33±0.09mmol/dayへと2/3肝切除群で有意に増加した。また、FENaは2/3切除群で0.38±0.02から0.23±0.03と有意に低下し、Naバランスの増加が、尿細管でのNa再吸収増加に起因することが示された(n=23in each group)。このことは、肝薬物代謝酵素活性の指標であるABT-kが一定の閾値を下回ると、腎尿細管でのNa貯留が生じるといういわゆるCritical function threshold theoryに一致する結果であった。仮説に挙げたNa輸送蛋白は腎皮質に存在するため、metabolic studyでNa retentionが生じた当日(2/3部分肝切除術後翌日)の腎を摘出し直ちに皮質部分のみを切除し、液体窒素で急速冷凍し、plasma membraneの作成およびNa-K ATPase subunitの定量化実験への準備段階を終了した。肝機能をあらわすaminopyrine beath testから算出したABT-k値は,術前sham群2.10±0.07,2/3肝切除群2.03±0.04から,術後一日目にそれぞれ2.01±0.07,1.22±0.05と2/3肝切除群で有意に低下し,Naバランスは,sham群0.29±0.10,2/3切除群0.42±0.04mmol/dayから,術後1日目にそれぞれ0.62±0.05、1.33±0.09mmol/dayへと2/3肝切除群で有意に増加した.また,FENaは2/3切除群で0.38±0.02から0.23±0.03と有意に低下し,Naバランスの増加が,尿細管でのNa再吸収増加に起因することが示された,このことは,肝薬物代謝酵素活性の指標であるABT-kが一定の閾値を下回ると,腎尿細管でのNa貯留が生じるといういわゆるCriticalfunction threshold theoryに一致する結果であった,仮説に掲げたNa輸送蛋白は腎皮質に存在するため,metabolicstudyでNa retentionが生じた当日(2/3部分肝切除術後翌日)の腎を摘出,皮質部分のみを切除し,液体窒素で急速冷凍したのちNa-K ATPase subunitの発現が変化しているかを検討した.2.腎Na輸送蛋白の検討
細胞死を起点とする生体制御ネットワークの解明

5年間の新学術領域の終了にあたり、研究成果および活動をとりまとめることにより、研究活動全体の総括と、今後の細胞死研究の発展に資する資料を提供する。具体的には、研究成果、総括班活動、シンポジウム、若手支援、広報活動等についてまとめた冊子を作成する。冊子の形式、内容については、専門家を対象とした学術的な報告書か、一般の方向けのパンフレットを検討しており、班員の意見を聴取した上で決定する。
軸糸微小管翻訳後修飾による軸糸ダイニンの運動活性変化

研究の目的である「軸糸ダイニンの運動様式や力発生に対する足場あるいはレールとなる微小管上の翻訳後修飾の影響の探求」に取り組むべく、前年度はマウス気管の表面に生えている繊毛から集めた軸糸を用いたグライディングアッセイでは好ましい結果が得られなかったことを踏まえ、精製微小管を用いた軸糸ダイニン活性の評価を行った。評価では最も簡便な方法として、繊毛虫のテトラヒメナから精製した軸糸ダイニン複合体をガラス表面に付着させ、その上をATP依存的に微小管を滑らせるグライディングアッセイを採用した。精製微小管はブタの脳から精製した微小管を用いた。ブタ脳由来精製微小管を用いたグライディングアッセイでは、軸糸ダイニン複合体はモーター活性を示さず、微小管は動かなかった。この原因は、基部と頭部が逆向きにガラス表面に結合した精製軸糸ダイニン複合体に含まれる微小管付着部位が、正しい向きにガラス表面に配置したダイニン複合体のモーター活性を阻害しているためであると考察できた。さらに、脳の微小管ではポリグルタミン酸化修飾が軸糸微小管よりも少なく、軸糸ダイニンによる微小管グライディング力が阻害要因を上回るには不十分であると考察できた。これらの結果を踏まえ、前年度にポリグルタミン酸化修飾酵素欠損マウスを用いた実験から発見した「軸糸ダイニンの運動活性に与える精子鞭毛軸糸ポリグルタミン酸化修飾の影響」をまとめた軸糸ダイニン活性のスイッチング異常に関する知見を英文学術雑誌に論文として発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は当初計画していたマウス気管上皮から単離した繊毛軸糸を用いた軸糸ダイニン分子によるグライディングアッセイが計画どおりに進まず、ポリグリシン化修飾の有無による軸糸ダイニン活性の変化を解析できなかった。この遅れについては、次年度の研究計画を見直して対応する。一方で、鞭毛軸糸ポリグルタミン酸化修飾の変化による鞭毛運動の変化を発見した。鞭毛軸糸のポリグルタミン酸化修飾が50%程度低下する酵素ノックアウトマウスを解析し、9本存在する軸糸外周微小管のうち特定の微小管で顕著にポリグルタミン酸化修飾が低下することを見出した。この特定の微小管におけるポリグルタミン酸化修飾の低下と符合するように、鞭毛の運動が当該微小管の位置でストールすることを見出した。これらの発見から、ポリグルタミン酸化修飾の低下により軸糸ダイニン活性のスイッチングが阻害されることが示唆された。この成果は、他の生物種で示唆された知見とは異なる現象を示すものであり、軸糸微小管の翻訳後修飾の変化により軸糸ダイニンの動作に多様性を生み出すことを研究対象とする本研究にとって、非常に重要なものとなった。研究実施計画で挙げたマウス気管上皮から単離した繊毛軸糸を用いた軸糸ダイニン分子によるグライディングアッセイが予想外に難航し、研究の核心部分であるポリグリシン化修飾の有無による軸糸ダイニン活性の変化を解析できなかった。この点では当初計画から遅れいていることになるが、一方で、ポリグルタミン酸化修飾の減少による軸糸ダイニン活性のスイッチング阻害を見出したことで、総合的には「やや遅れている」と評価した。本年度の計画で難航した点を改善し、in vitroでポリグリシン化した精製微小管を材料に実験系を組みなおす。具体的には以下の2点を実施する。1)成体マウスの脳よりチューブリンを精製し、特殊なベクターを用いて哺乳類培養細胞で大量に発現させ精製したポリグリシン化修飾酵素とin vitroで反応させ、純粋なポリグリシン化微小管を調製する。対照には、酵素と反応させていない未修飾微小管を用いる。ガラス表面を繊毛虫Tetrahymenaより精製したnative軸糸ダイニン複合体、あるいは、TtBCCPと融合させた組換え軸糸ダイニン複合体でコートし、その上を上述の精製微小管を滑らせるグライディングアッセイを行う。

2)上記1)が順調に進んだ場合、ガラス表面に散布した精製微小管(未修飾、ポリグリシン化修飾)上でGFP融合組換軸糸ダイニン、あるいは、TtBCCP融合組換え軸糸ダイニンを移動させ、一分子の軸糸ダイニンの運動活性に対するポリグリシン化修飾の効果を検証する。これらと並行し、前年度に得られたポリグルタミン酸化修飾による軸糸ダイニン活性のスイッチング制御に関する知見を学術雑誌に公表する。また、ポリグリシン化修飾によるダイニン活性の制御についても、本研究着想の基となったポリグリシン化修飾の消失による繊毛および鞭毛運動の亢進に関する知見を学術雑誌に公表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ＨＢp17／ＦＧＦＢＰを制御するエクソソーム由来ｍｉＲＮＡによる口腔癌治療の開発

活性型ビタミンD3の異性体であるED-71が、転写因子NF-κBシグナル伝達経路を抑制することにより,扁平上皮癌(SCC)/細胞口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞のHBp17/FGFBP発現が抑制された。さらに、in vitroおよびin vivoにおけるSCC/OSCC細胞の増殖抑制効果が認められた。ED-71添加群および非添加群のA431細胞の培養上清より、exosomeを分離した。miRNAマイクロアレイ法を用いて、exosomal miRNAs発現の網羅的解析を行った結果、ED-71により発現量が2倍以上増加する12種類のexosomal miRNAsを同定した。
企業統治構造・人的資源管理と生産性に関する実証研究

1日本企業の経営戦略・企業統治等に関する分析を行い、従業員や顧客・取引先が重要なステークホルダーであること、経営悪化時の雇用調整の難しさ等は変わらない日本企業の特徴である一方、合併・買収、不採算事業の売却といった形の事業再編を活発に行うようになってきたことを明らかにした。2企業パネルデータを使用し、無形資産投資における資金制約、ストックオプションの採用と生産性、本社機能部門の規模と生産性、サービス貿易と生産性の関係を解明した。3サービス産業におけるイノベーション活動の実態、特許及び営業秘密がイノベーションに及ぼす影響、日本企業における女性・外国人取締役登用の決定要因を実証的に解明した。まず、企業の統治構造、人的資源管理と生産性の関係についての内外の理論・実証研究の進展について、内外の研究の進展をサーベイした。アンケート調査の調査票設計を行い、政府統計である「企業活動基本調査」でカバーされない企業の経営目標、ステークホルダー、利益処分、株主構成、役員構成、メインバンク、労働組合の有無、成果報酬、従業員持株制度等を主な設問とする「企業経営と経済政策に関するアンケート調査」を作成した。これを日本企業約15,000社に対して送付し、年度末までに約3,400社からの回答を得た。また、経済産業省に対して「企業活動基本調査」の個票データの使用承認手続きを行い、必要なデータを入手した。調査実施と並行して、「企業活動基本調査」の個票データのみを用いて実施可能な分析として、ストックオプションと生産性の関係について計量分析を行い、ストックオプションの採用が企業のリスクテーキングを促し、生産性を高めることを示す結果を得た。この結果をベースに、経済産業研究所の内部セミナーで報告した上で「ストックオプションと生産性」というディスカッション・ペーパー(12-J-002)として公表した。また、加筆修正を加えた上で、英語版の論文Stock Options and Productivity: An empirical analysis of Japanese firmsとしディスカッション・ペーパー(12-E-011)として公表した。24年度には、経済の先行きとともに企業統治や労使関係に関連する会社法制・労働市場制度を含む各種制度・政策が企業経営に与える影響について実態を把握することを目的として、繰越金の一部を使用して補足的な企業アンケート調査(「日本経済の展望と経済政策に関するアンケート調査」)を実施した。昨年度に実施した「企業経営と経済政策に関するアンケート調査」では、約3,400社から、経営目標、利益処分、株主構成、役員構成、労働組合、成果報酬、従業員持株制度、経営に影響を与える経済政策等についての回答が得られた。本年度は、このデータを使用して、まず、1990年代に実施した同種の調査との比較を通じて過去十数年間の日本企業の経営の変化について観察事実を整理し、「日本企業の構造変化:経営戦略・内部組織・企業行動」と題する論文を執筆した。同論文は、経済産業研究所の内部セミナーで報告し、ディスカッション・ペーパー(12-J-017)として公表した。また、同調査の結果の一部を用いて、「東日本大震災の影響と経済成長政策:企業アンケート調査から」と題する論文を執筆し、内部セミナーで報告した上でポリシー・ディスカッション・ペーパー(12-P-010)として公表した。本年度は、企業統治構造・人的資源管理と生産性について、政府統計個票データを用いた分析、企業に対する独自のサーベイに基づく分析、政府統計個票データと企業サーベイをリンクさせたデータに基づく分析を引き続き行い、12本の論文、邦文書籍1冊、英文書籍の1章を執筆した。1政府統計ミクロデータを使用した論文(ディスカッション・ペーパー)は、「本社機能と生産性」、「サービス貿易と生産性」、「無形資産投資のファイナンス」、2企業サーベイに基づく論文は、「政策の不確実性と企業経営」、3企業サーベイと政府統計個票データをリンクさせた分析としては、「サービス産業のイノベーションと特許・営業秘密」、「女性・外国人取締役はどのような企業にいるのか?」であり、最近関心が高まっている企業のダイバーシティ、無形資産投資と生産性といったイシューについてミクロデータに基づく新たな知見を提供している。前年度以前の研究成果を含めて、これらを修正した上で英語版にした論文のいくつかは学術誌に投稿し、査読中となっている。26年度が最終年度であるため、記入しない。経済政策、産業構造26年度が最終年度であるため、記入しない。日本企業に対するアンケート調査のスケジュールは、東北地方所在企業における震災の影響や全国各地の企業の廃業に伴う調査サンプルの再設計等の事情によりやや遅れたものの、23年度内に調査票の回収が完了した。24年度には補足的なアンケート調査を実施することができた。すでに論文の執筆・公表も始めており、総合的に見て「おおむね順調に進展している」と判断している。

24年度には補足的なアンケート調査を実施することができた。「企業活動基本調査」の個票データを用いた分析とあわせて2年間で6本の論文(ディスカッション・ペーパー及び査読付きJournal論文)を公表することができ、総合的に見て「おおむね順調に進展している」と判断している。以上のほか、邦文の論文(ディスカッション・ペーパー)数本があり、RIETIのウェブサイトに全文を掲載している。23年度中に実施したアンケート調査及び24年度に補足的に実施した調査の回収が終了し、データが利用可能となったため、25度以降はこの結果を用いてミクロ計量分析を行う。分析を通じて、企業統治構造・人的資源管理といった「経営の質」に関連する各種企業特性と生産性をはじめとする経営成果の関係を定量的に分析し、何本かの論文にまとめる予定である。
ニワトリ胚における中脳の形成・分化の分子機構の解析

発生中の中脳で発現しているEngrailed(En)遺伝子をin ovo electroporationにより異所的に間脳で発現させると、間脳細胞が中脳細胞に変わり、中脳-間脳境界が前方へ移動することを昨年度発見した。今年度は異所的なEnの発現により発現が影響を受ける遺伝子群の経時的変化を詳細に解析した。その結果、(1)間脳においてEnはelectroporation後3時間でPax-6を抑制すること、(2)この抑制は9時間後に起こるWnt-1の誘導や、18時間後に起こるFgf8,Pax-2,Pax-5,Ephrin A2の誘導に先立つことが明らかになった。また、in vitroにおいてEnの転写抑制活性に必要であると考えられている部分に点突然変異を入れた改変Enは、間脳を中脳に転換する能力を持たないことを昨年度示したが、本年度はEnが発生中の脳で転写抑制因子として働いていることをさらに裏付けるためVP16蛋白質の転写活性化ドメインをEnのホメオドメインと結合したキメラ蛋白質を発現させたところ、Pax-6の中脳における異所的な発現や中脳-間脳境界の後方への移動が誘導された。以上の実験結果はEnの発生中の間脳-中脳領域での主な役割は(1)間脳の運命を抑制することにより中脳の前端の位置を決めること、(2)Fgf8やPax-2などの中脳関連遺伝子の負の調節因子の発現を抑制することにより中脳関連遺伝子の発現を誘導、維持すること、の2点であることを示している。これらの実験結果に関する論文を現在投稿中である。発生中の中脳で勾配を成して発現(後ろで高い)しているEngrailed(En)遺伝子は、レトロウイルスなどを用いた強制発現実験より、中脳の前後極性の形成に重要な役割を果たしていることが示されている。即ち、Enを異所的に発生中の間脳-中脳領域で発現させると、中脳で同様の勾配を成して発現しているEphrin A2,A5の発現が誘導される。しかし形態的な変化については、中脳の前部の層構造が後部のそれに変わったという報告があるのみであった。最近我々は、in ovo electroporationを用いて、より発生の早い時期にEnを予定間脳-中脳領域で異所的に発現させると、予定間脳領域の形態が中脳のそれに変わることを明らかにした。このことは、正常胚で初期のEnの発現が予定中脳領域全体にわたることと併せ、Enは予定間脳-中脳領域で中脳となる部分を規定していることを示している。遺伝子レベルでこの発現型について解析を行ったところ、Wnt1や中脳のマーカーであるEphrin A2,Pax3,7の異所的な発現が見られた。一方、間脳のマーカーであるPax6の発現は抑制された。また、突然変異を導入したEnの強制発現実験から、Enが発生中の脳に於いて転写抑制因子として働いていることが示唆された。現在、細胞レベルで何が起こっているかを解析中であるが、Enによる予定間脳の中脳への転換には少なくとも細胞死は関与していない。
頭頚部腫瘍に対する温熱療法用の頚部専用アプリケータの試作とファントム実験

【目的】RF容量結合型加温方式では、体表面においてアプリケータの電極端や密着不良によるホットスポットが生じやすい.頭頚部領域は体表面が複雑で,アプリケータを固定しにくく,ホットスポットを生ぜずに充分な深部加温をするのは難しい.そこでわれわれは,ファントム表面を部分的に遮蔽することで選択的深部加温が可能かどうか温度分布を計測したが,遮蔽により有効な電極径も減少した状態となり,その分だけ浅部しか加温されない結果となった.つぎに,アプリケータが複雑な構造の頚部に密着するようなOverlay Bolus(以下Bolus)を試作しファントム表面及び、内部の温度分布を計測したが,Bolusを使用すれば,電極端のホットスポットは減少したが、電極間の距離が大きくなるため,同一径のアプリケータでは浅部しか加温されない結果となった.そこでedge効果の軽減をねらって電極板をU字型に屈曲させ,ビニール製のwater padを付けてU-型アプリケータ(以下U-型)を試作し,加温状況をFlat型(従来型)と比較した.【方法】U型は15cm径厚さ1mmの電極板を電極の両端で約3cm程持ち上がるようなめらかに曲げて制作した.ファントムはJSHOのQA委員会による筋肉等価寒天ファントムを使用,U型とFlat型にて加温を行い加温状況を比較した.計測は三菱社製サーマルイメージャIR-M300,及び熱電対温度計にて行った.【結果】加温後の温度分布は,Flat型では高温域が中心部より偏位し瓢箪型の分布を呈したが,U型では高温域が中心部に集まった,【まとめ】U型では電極端でのQAファントムまでの距離が遠くなりエッジ効果が減少し,また電極の最短距離がFlat型に比較して近くなるため高温域を中心部に集めることができたと考えられた.尚,U型は頚部に密着しやすく,臨床応用でも良好な加温結果が得られた.【目的】RF容量結合型加温方式では、体表面においてアプリケータの電極端や密着不良によるホットスポットが生じやすい.頭頚部領域は体表面が複雑で,アプリケータを固定しにくく,ホットスポットを生ぜずに充分な深部加温をするのは難しい.そこでわれわれは,ファントム表面を部分的に遮蔽することで選択的深部加温が可能かどうか温度分布を計測したが,遮蔽により有効な電極径も減少した状態となり,その分だけ浅部しか加温されない結果となった.つぎに,アプリケータが複雑な構造の頚部に密着するようなOverlay Bolus(以下Bolus)を試作しファントム表面及び、内部の温度分布を計測したが,Bolusを使用すれば,電極端のホットスポットは減少したが、電極間の距離が大きくなるため,同一径のアプリケータでは浅部しか加温されない結果となった.そこでedge効果の軽減をねらって電極板をU字型に屈曲させ,ビニール製のwater padを付けてU-型アプリケータ(以下U-型)を試作し,加温状況をFlat型(従来型)と比較した.【方法】U型は15cm径厚さ1mmの電極板を電極の両端で約3cm程持ち上がるようなめらかに曲げて制作した.ファントムはJSHOのQA委員会による筋肉等価寒天ファントムを使用,U型とFlat型にて加温を行い加温状況を比較した.計測は三菱社製サーマルイメージャIR-M300,及び熱電対温度計にて行った.【結果】加温後の温度分布は,Flat型では高温域が中心部より偏位し瓢箪型の分布を呈したが,U型では高温域が中心部に集まった,【まとめ】U型では電極端でのQAファントムまでの距離が遠くなりエッジ効果が減少し,また電極の最短距離がFlat型に比較して近くなるため高温域を中心部に集めることができたと考えられた.尚,U型は頚部に密着しやすく,臨床応用でも良好な加温結果が得られた.【目的】RF容量結合型加温方式では、体表面においてアプリケータの電極端や密着不良によるホットスポットが生じやすい。頭頚部領域は解剖学的に複雑な構造の為、選択的に標的領域だけを充分に加温をするのが難しい。そこで、われわれは、1.ファントム表面の高SAR領域を遮蔽することにより選択的深部加温を試み、温度分布を計測した。2.アプリケータが複雑な構造の頚部に密着するようなOverlay Bolusを試作しファントム表面及び、内部の温度分布を計測した。【検討事項】1.遮蔽板の材質、形状を変えてRF波遮蔽効果をSARで比較した。2.Overlay Bolusの形状によるSARの変化を比較した。3.1、2の加温特性をサーモグラフィー装置により検証した。【結果】1.電極端を遮蔽することによりファントム表面の高SAR領域が減少するが、有効な電極径も減少し、その分だけ深部加温が困難となり、深部加温の為には使用するアプリケータの径を大きくする必要がある。2.遮蔽板の材質としては導電率が筋肉等価食塩水より高い金属板と、低いゴム板とで比較したが、金属板では、横先端近傍及び、深部ではホットスポットが解消できるが、金属板自体の加熱が問題となる。一方ゴム板では、深部ではホットスポットが解消できるが、横先端近傍にホットスポットが出現した。3.Overlay Bolusを使用すると、ホットスポットは減少したが、Bolusの分だけ電極間の距離が大きくなるため、使用するアプリケータの径を大きくする必要がある。

また、Bolusによるエネルギー損の分、高出力が必要であった。〔目的〕RF容量結合型加温方式では、体表面においてアプリケータの電極端や密着不良によるホットスポットが生じやすい.頭頚部領域は体表面が複雑で,アプリケータを固定しにくく,ホットスポットを生ぜずに充分な深部加温をするのは難しい.そこでわれわれは,ファントム表面を部分的に遮蔽することで選択的深部加温が可能かどうか温度分布を計測したが,遮蔽により有効な電極径も減少した状態となり,その分だけ浅部しか加温されない結果となった.つぎに,アプリケータが複雑な構造の頚部に密着するようなOverlay Bolus(以下Bolus)を試作しファントム表面及び、内部の温度分布を計測したが,Bolusを使用すれば,電極端のホットスポットは減少したが、電極間の距離が大きくなるため,同一径のアプリケータでは浅部しか加温されない結果となった.そこでedge効果の軽減をねらって電極板をU字型に屈曲させ,ビニール製のwater padを付けてU-型アプリケータ(以下U-型)を試作し.加温状況をFlat型(従来型)と比較した.[方法]U型は15cm径厚さ1mmの電極板を電極の両端で約3cm程持ち上がるようなめらかに曲げて制作した.ファントムはJSHOのQA委員会による筋肉等価寒天ファントムを使用,U型とFlat型にて加温を行い加温状況を比較した.計測は三菱社製サーマルイメージャIR-M300,及び熱電対温度計にて行った.[結果]加温後の温度分布は,Flat型では高温域が中心部より偏位し瓢箪型の分布を呈したが,U型では高温域が中心部に集まった,[まとめ]U型では電極端でのQAファントムまでの距離が遠くなりエッジ効果が減少し,また電極の最短距離がFlat型に比較して近くなるため高温域を中心部に集めることができたと考えられた.尚,U型は頚部に密着しやすく,臨床応用でも良好な加温結果が得られた.
金属錯体反応場の精密構築に向けたキラル多座有機配位子の開発

sp3P/sp3NH/sp2N混合系の直線性3座配位子(R)-PN(H)NのRu錯体AはDMSOの存在下,キレート性・非キレート性を問わず立体的要請度の高いケトンを効率的に不斉水素化することができる,本研究では,構造的観点から反応機構の解明を目指した.ピリジン部sp2N原子を15N標識したPN(H)15N配位子とPh-PN(H)Nを用いて,本触媒反応に関連する錯体を合成し,15N-31P・1H-31Pの結合定数,PyC(6)H化学シフト,PyCHSHRNH部の結合型式,DMSOジメチル基の化学シフト差,nOeを指標にその詳細なNMR構造解析を実施した.Aはfac構造を有し.sp3P-trans dmso,sp2N-trans dmso,sp3N-trans dmsoの解離速度定数比は>50:1.7:1であることを明らかにした.AをCH3OH/DMSO中,2当量のt-BuOKで処理すると,定量的にメトキシヒドリド錯体Bが生成する.BはCH3OH中でのみ存在することができ,濃縮するとアミド錯体Cに移行する.BはCH3OH中,水素処理しても塩基の有無にかかわらずジヒドリド体Cは生成しない.ケトン基質が共存してはじめて触媒サイクルが回転する.THF中で1当量のt-BuOK存在下,Bを水素処理して、ジヒドリド錯体Dを得ることができた.塩基がないとDは生じない.sp3N-trans dmsoの酸素原子はPyC(6)Hと水素結合して空間配座が固定される.ここにキラルな環境が構築され高いエナンチオ選択性が発現する.これらのRu種の構造および生成条件は想定機構を強く支持する.全貌解明に向けて基盤となる重要な情報を得ることができた.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。sp3P/sp3N/sp2N混合系直線性3座配位子H-PN(H)NのRu錯体(fac-[Ru(PN(H)N)(dmso)3](BF4)2)はキレート性・非キレート性を問わず立体要制度の高い多様なケトンを効率的に不斉水素化できるはじめての成功例である。DMSOを反応系に共存させることにより、柔軟なPN(H)N配位子の配位構造をfacへと収斂させる。このことが高活性、高選択性獲得の鍵である。本年度では、すでに確立しているH-PN(H)N配位子合成を、10グラム規模で実施した。また、3位にフェニル基をもつPh-PN(H)N配位子の合成法を確立した。この配位子を用いてルテニウム錯体の合成を試みた結果、DMSOを過剰に添加することなくfac錯体を選択的に形成することを明らかとした。予備的に不斉水素化においても同様のエナンチオ選択性で反応が進行することを確認している。さらに、H-PN(H)N-Ru錯体触媒を用いるt-アルキルケトン類の不斉水素化の機構解明に向けて、その構造化学的調査を行なった。機構解明の理解を深めるべく、fac-[Ru(PN(H)N)(dmso)3](BF4)2の静的・動的な構造調査をおこなった結果、想定される活性種であるジヒドリド錯体fac-RuH2(PN(H)N)(dmso)および休止状態あるいはoff- loopのヒドリドアルコキシド錯体fac-RuH(CH3O)(PN(H)N)(dmso)、ヒドリドアミド錯体fac-RuH(PNN)(dmso)2を観測し、それらの立体構造を明確とした。いずれの錯体もfac構造を維持している。さらに、配位子のNH部は塩基性条件下NKないしNLiへと変換され、対応するアミドルテネート錯体が合成できることも明らかとした。目標としていたfac選択的配位子の合成に成功した。また、懸案の課題であった不斉水素化反応の機構解明に向けて重要な構造化学的情報を得るに至った。おおむね計画通りに進行しているとしてよい。sp3P/sp3NH/sp2N混合系の直線性3座配位子(R)-PN(H)NのRu錯体AはDMSOの存在下,キレート性・非キレート性を問わず立体的要請度の高いケトンを効率的に不斉水素化することができる,本研究では,構造的観点から反応機構の解明を目指した.ピリジン部sp2N原子を15N標識したPN(H)15N配位子とPh-PN(H)Nを用いて,本触媒反応に関連する錯体を合成し,15N-31P・1H-31Pの結合定数,PyC(6)H化学シフト,PyCHSHRNH部の結合型式,DMSOジメチル基の化学シフト差,nOeを指標にその詳細なNMR構造解析を実施した.Aはfac構造を有し.sp3P-trans dmso,sp2N-trans dmso,sp

3N-trans dmsoの解離速度定数比は>50:1.7:1であることを明らかにした.AをCH3OH/DMSO中,2当量のt-BuOKで処理すると,定量的にメトキシヒドリド錯体Bが生成する.BはCH3OH中でのみ存在することができ,濃縮するとアミド錯体Cに移行する.BはCH3OH中,水素処理しても塩基の有無にかかわらずジヒドリド体Cは生成しない.ケトン基質が共存してはじめて触媒サイクルが回転する.THF中で1当量のt-BuOK存在下,Bを水素処理して、ジヒドリド錯体Dを得ることができた.塩基がないとDは生じない.sp3N-trans dmsoの酸素原子はPyC(6)Hと水素結合して空間配座が固定される.ここにキラルな環境が構築され高いエナンチオ選択性が発現する.これらのRu種の構造および生成条件は想定機構を強く支持する.全貌解明に向けて基盤となる重要な情報を得ることができた.今後は、これまでに得られた情報をもとに、不斉水素化反応の想定触媒サイクルの完全明確化を目指す。特に、先に示したRu-NH種およびRu-NK種の触媒反応への関与に興味が持たれる。これまでにBINAP-Ru-diamine錯体触媒系において、同様の検証がなされており、NK種の存在も示唆されている。塩基濃度、基質の種類と反応性との関係をそれらのpKaとともに議論することによって重要な知見が得られると期待している。加えて、新規立体選択的多座配位子の合成に着手する。1-(2-アルキル-1H-インデン-3-イル)ナフタレンをキラル炭素骨格とし、ナフチル基の2位にLH (L: sp3S, sp3O, sp3NR)を組み入れる。反応場構築には、すでに実績のある「DACat」を指導原理とし、結合組み換え型(Metathesis)とレドックス型(Redox)の反応に分類して錯体への不斉触媒機能の賦与を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
PARP阻害剤の 新しい合成致死性標的の確立：BRCA・相同末端修復の枠を超えて

PARP阻害剤が、epigeneticな作用点を持つ抗がん剤として効果を発揮すること、その機構を探索する上で、昨年度はPARP阻害剤(Olaparib)により発現低下が誘導されるDNMTfamily member (DNMT Fm)を同定し、さらにそのfamily memberを同時にノックダウンすることで、PARP阻害剤を使用せずにA549の増殖低下を誘導されることを明らかにした。加えてBRCA欠損細胞株3株を含むがん細胞株15種類を用いて、Olaparibの感受性を検討したところ、各細胞株における上記のDNMT Fmの発現量と、Olaparibの感受性の間に負の相関が認められることを見出し、上記のDNMT Fmの高発現が、Olararibの新しいpredictive markerとなり得る可能性を示した。今年度は、まず昨年度に見出されたhomologus recombination proficientでDNMT Fm高発現のがん細胞株Aを用いてxenograftを作成し、Olaparibの制がん効果を検討すると、50 mg/kgの腹腔内投与により、Olaparibは統計的有意に腫瘍増大を抑制した。加えて、PARP阻害剤による制がん効果をより深く理解するため、がん細胞株Aを用いて、Olaparib処理下と上記のDNMT Fmノックダウン下で遺伝子発現変動を網羅的に解析した。その結果、OlaparibまたはDNMTノックダウンにより発現上昇するがん抑制遺伝子が同定され、このときOlaparib処理によってがん抑制遺伝子のpromoterのメチル化が低下することも見出された。よって、PARP阻害剤は、DNMTの発現低下を介してepigeneticに不活性化されているがん抑制遺伝子を再活性化して、制がん効果を発揮している可能性が示された。DNMTfamilyはDNMT1, 2, 3からなり、DNMT1は細胞分裂時の親鎖のCpGメチル化状態の娘鎖へのコピーを担い、DNMT3family memberは親鎖情報に依存しない新規CpGメチル化を担う。PARP阻害によりどのfamily memberの発現が低下するかA549細胞細胞株をOlaparib, Rucaparibで処理することで検討すると、全てではなく特定複数のfamily memberの発現低下が認められた。また、これらのfamily memberを同時にノックダウンすることによりA549の増殖低下が誘導されることも明らかになった。次に、様々な程度でDNMTfamilyを発現するがん細胞株約15種類を用いて、in vitroでOlaparib, Rucaparibに対する感受性試験を行った。その結果、過去の報告通りBRCA, PTEN変異等相同末端修復経路(HR)に異常を持つがん細胞株は低いIC50を示したものの、それ以外の細胞株でも低いIC50を示すものが同定された。次に使用した細胞株15種類からtotal RNAを回収してDNMTfamily memberの発現量を相対的に定量すると、HR proficientな細胞株でPARP阻害剤の感受性が高いものは上記の特定のDNMTfamily memberの発現が高いことが統計的に明らかになった。PARP阻害剤は放射線増感剤としても知られているが、PARP阻害による増感効果がDNMT familyの抑制をも介している可能性を考え、PARP阻害によって発現が低下するDNMTfamily memberの一つをノックダウンして放射線感受性を調べたところ、放射線増感が誘導されることが明らかになった。研究計画における平成27年度の目標は、PARP阻害剤が抑制するDNMTfamily memberの決定・抑制メカニズムの解明であった。平成27年度における我々の研究進行状況は、二種類のclinical studyレベルのPARP阻害剤を使用し、PARP阻害により抑制されるDNMTfamily memberを特定した。また本来は平成28-29年度の目標である、統計的に特定のDNMTfamily memberの発現が高いとPARP阻害剤への感受性が高いことをも示した。加えて、PARP阻害下で発現低下するDNMTfamilyが細胞の放射線抵抗性にも関与していることも示した。本来、平成27年度中に明らかにすべきであったPARP阻害剤が抑制するDNMTfamily memberの決定・抑制メカニズムの解明は未達成であったものの、総合的には予定以上の達成度であると考えている。

よって、PARP阻害剤は、DNMTの発現低下を介してepigeneticに不活性化されているがん抑制遺伝子を再活性化して、制がん効果を発揮している可能性が示された。現在、研究遂行を妨げる問題は存在しないため、引き続き研究計画に従ってPARP阻害剤の適用拡大のための研究を進めていく。交付額が請求額に満たず、申請時に予定していた備品購入を一時保留したため、次年度使用額が生じた。研究申請時、研究が予定通りに進行しない状況を考え、様々な追加実験用の資金の必要性を考えていたが、引き続き研究進行状況を鑑み、予定していた備品購入が研究費収支上可能であるか検討する。
ＤＮＡの自己組織能を高分子材料のナノ構造の精密な制御・機能化に活かす

DNAの持つ高度な自己組織化能によるナノ構造形成体の高度化および機能化の検討を行った。機能性有機高分子をDNAに連結させた。2つのDNA鎖内におけるウラシル塩基部位の5位にπ共役系高分子を連結させる合成法を確立し、それを利用していくつかのDNAの構造体を作成した。1つは、DNAをベースとして高分子を軸とした分子ローターである。また、固定されたローターも作成した。それらをPAGE解析、およびFRETを利用することで目的どおりの構造を形成していることを確認した。機能性を有し、DNAの空間配置に適したπ共役系化合物からなるリンカー部位の分子設計および合成を行いDNAと連結させることに成功した。具体的には次のように実行した。化学的に硬く、自由に動きにくく固定しやすい化合物をリンカーとして利用することで、2つのDNA鎖を正確に配置することを、まず初めの目標として研究を遂行した。当初の目的であったDNAのウラシル塩基の5位に、アセチレンを介してポリフェニレンエチニレン化合物などのπ共役系化合物を連結させることに成功した。この修飾DNAの合成法として、DNAの固相合成と固相上でのグラーゼルカップリング反応を組み合わせることが重要であることが分かった。短いポリフェニレンエチニレン化合物でDNAを連結させることは成功した後、π共役系化合物から構成させるリンカーの長さを伸ばすことで、2つのDNA間の空間をコントロールすると考え、この点はナノ構造体の作成には重要であると考えた。実際に、剛直で機能性を示すと期待されるリンカー部位の長さを変えることを試みた。具体的には、固相上でグラーゼルカップリング反応を行う際に、長さの異なるリンカーが結合したウラシルの誘導体を利用することで、リンカーの長さを調整することが可能であることが分かった。合成した、剛直なリンカーを持つDNAが実際に予想したような自己相補的なDNAとの2本鎖形成能を調べた。PAGE解析により、合成したリンカーを持つDNAが2本鎖形成がおこることを確認した。π共役系化合物は材料化学などで合成が多数報告されているが、DNAナノテクノロジーの分野への応用はほとんど行われておらず、今回得られたDNA誘導体はナノテクノロジー分野における応用性、発展性が高く、今後とも利用していきたいと考えている。本研究では、π共役系化合物連結型DNAの合成を初年度に確立することを当初の目的としており、実際に次のような合成手法により、この目標を達成することができた。修飾DNAであるウラシルに修飾を施したDNAと、ポリフェニレンエチニレン化合物などのπ共役系化合物とを薗頭カップリングを利用して連結させるという手法で研究を遂行した。初年度の研究で分かったことは、DNAの固相上でのカップリング反応が、この合成に有用であることが分かった。また、今回合成したπ共役系化合物ーDNA複合体は青色の蛍光を発することが分かった。蛍光強度による電子移動の観測や、電極表面へ固定化することで直接的な電子移動の観測について検討を行う予定である。この反応によりDNA塩基とπ共役系化合物とがアセチレンで直接接続したDNAの合成が可能となり、今後はπ共役系化合物ーDNA間で電子の授受、立体的にπ共役系化合物を配位させることを次年度の目標とする。今回は、π共役系化合物空間配置およびπ共役系化合物ーDNAによるナノネットワークの設計可能な長さをもつπ共役系化合物連結型DNAが合成できた。初年度は、π共役系化合物連結型DNAの合成を、まず確立した。芳香族をアセチレン基で結合したポリフェニレンエチニレン化合物などのπ共役系化合物をDNAのウラシル部分に連結させたDNAを合成した。具体的には、ポリフェニレンエチニレン化合物とDNAオリゴマーを、それぞれ薗頭カップリングを利用することで合成を行った。修飾DNAであるヨードウラシルを原料とし、DNAの配列で、リンカーとなるアセチレンと連結できるようあらかじめアセチレンをDNA鎖に導入しておくことが重要であることが分かった。DNAは固相合成法により合成を行い、カラスビーズから切り出す前に修飾DNA部位に連結しているπ共役系化合物間をグラーゼルカップリングにより、連結させる手法を開発した。反応後に問題なくガラスビーズからπ共役系化合物連結型DNAを切り出すことができた。この化合物は、申請者が合成するまでに報告されておらず新規化合物あり、その特性を詳細に検討していきたい。合成したπ共役系化合物連結型DNAを用いて、DNAデバイスの機能化への応用について検討を行う予定である。π共役系化合物ーDNAを用いて、特殊なナノ構造を形成させる。π共役系化合物ーDNAのナノ構造が設計したとおりに形成されるのかを、DNAのTm(融解温度)を調べることで熱力学的な観測結果から判断する。

また、π共役系化合物ーDNAによるナノ構造形成はAFMなどを利用して、直接的に観測する。疎水的なπ共役系化合物を凝集せずにネットワーク化することが重要であり、そのためにπ共役系化合物の側鎖に親水性の官能基の導入をも検討していきたい。また、本研究において必要な電子移動の観測する実験系の確立についても同時に行う予定である。電子供与体と電子受容体をπ共役系化合物ーDNAに導入し、電子移動の結果起こる蛍光の変化などを観測する。また、電極の表面に作成したナノ構造体を固定し、電子移動を直接的に観測することなども検討したい。異なるDNAの二次構造内では、塩基の重なりも著しく異なる場合が多いため、DNA構造の転移と共に高分子の空間配置も変化させることが可能となると考えられる。この際に、電子移動能に著しい違いが示されるのであれば、電子輸送の効率を変えるスイッチとして利用する。塩基の重なりが乱れると電子移動の効率が下がるので、タンパクなどの結合により起こるDNAの折れ曲がり構造により電子移動能を低下させることができると思われる。π共役化合物連結DNAを利用し、さまざまなDNAナノ構造体を合成するために、π共役化合物を修飾したDNAが大量に必要となる。特に、DNAの固相合成では収率を向上させるため、試薬を過剰に使用する必要が生じてくる。このため、材料を合成するためにDNA合成を中心とした試薬類の購入のために科研費を使用する。また、合成したDNAや化合物の精製にHPLCを使用する必要があるので、HPLCのカラムやHPLC観測のための流出溶媒(主にアセトニトリル)などの消耗品も必要となるため、これに予算を使用する予定である。初年度はDNAの固相合成のための試薬を購入したが、これらも十分であるとはいえないことが分かったので追加購入する。また、25年度にはゲル電気泳動のための試薬類が必要になる。これは、DNAのナノ構造体形成の確認をするために必要である。そこで、電気泳動に必要な装置一式と試薬類などを購入する予定である。また、25年度には、DNA切断酵素などの分析に必要な蛋白・酵素類を購入する。
中世後期イギリスにおける民間信仰のテクストと図像による総合的研究

1.15-16世紀の写本と印刷の時祷書(計3冊)をはじめとする、慶應義塾図書館所蔵の初期印刷本および西洋中世写本の撮影および全ページのデジタル・ファクシミリ(CD-ROM)の制作をおこなった。また、撮影した資料については、過去においていずれも十分な調査がなされていなかったため、詳細な書誌学、書物学的な記述をおこなった。2.研究対象のひとつである大英図書館所蔵、Additional 37049写本(15世紀後半、イングランド)について、テクストと挿絵の相互関係に関する調査をおこない、その成果を国際学会で発表した。3.研究期間中に調査しデジタル化した全ての中世写本および初期印刷本の個別ページと関連中世美術資料とについて、ネットワーク公開が可能なかたちで図像データベース化し、その一部をウェブサイトとして公開した。4.中世後期教会美術、写本のミニアチュール、初期印刷本の挿絵などのモチーフを分析を通じて、同時代の民間信仰の諸相を、中世後期の幻視文学、時祷書写本、16世紀の寓意図像集など、14-16世紀において広く伝播していたテクストを対象として具体的に明らかにした。また、その過程においては、デジタル化しデータベース管理された一次資料を用いた。13世紀から16世紀にかけてイギリスおよび北フランスで製作されるか、あるいは流通していた写本、初期印刷本、教会美術、壁画などに関して、一次資料と関連文献を収集し、データベース化を進めた。さらに、主要な研究対象のひとつである慶應義塾図書館所蔵の15世紀時祷書写本(書架番号120X680 1)に関して、全ページのデジタル化をおこない、研究素材としてのデジタル・ファクシミリを製作した。また同写本の挿絵にかんする美術史的調査をロンドン大学のワールブルク研究所の資料を用いておこない、写本の暦部分に糊付けされている17世紀の月歴図の版画について、具体的な典拠を同定した。以上の一次資料調査の結果、中世後期の一般信徒のキリスト教信仰の実態を具体的に検証するための一次資料の絞り込みに成功し、分析のための基盤が完成した。14-16世紀前半を中心に、パリや北フランスのルーアンなどの都市で数多く作成された写本および印刷本の時祷書やミサ典書は、当時のイングランドでも数多く流通していた。これらを比較研究してゆくことで民間信仰における書物の役割、および教義的な力点の置き方が明確になることが明らかとなった。13世紀から16世紀にかけてイギリスおよび北フランスで製作されるか、あるいは流通していた写本、初期印刷本、教会美術、壁画などに関して、さらに一次資料と関連文献を収集し、データベース化を進めた。さらに、主要な研究対象のひとつである慶應義塾図書館所蔵の16世紀に印刷された時祷書(パリ、1515年)に関して、全ページのデジタル化をおこない、研究素材としてのデジタル・ファクシミリを製作した。また同写本の挿絵に関しては図像学的なリストを作成し、昨年度にデジタル化が完成した15世紀の写本の時祷書との比較研究のための素材を完成した。また、関連する12世紀以降の宗教的写本(時祷書、聖務日課書、ミサ典書、聖書など)および16世紀の典礼書(印刷による時祷書など)についても、資料のデジタル化とデータベース化を進め、またデータベースの記述を標準化し、将来的により柔軟な検索を可能とするために、それぞれの図像について、国際的に使用されているアイコンクラス(lconclass)による図像学的ノーテーションの併記を開始した。複数の未刊行一次資料について、全ページのデジタル・ファクシミリが完成したことで、中世後期の時祷書に関して比較研究が可能となった。中世後期の一般信徒のキリスト教信仰の実態を具体的に検証するための、ひとつの具体的な方法論が確立したことにより、中世後期のイングランドの民間信仰と書物生産の関係を、北フランスの出版文化の影響、読者層の同定、ディヴォーションと挿絵の関係などの視点で具体的に検証することが可能となり、その分析を始めた結果、一口に一般信徒のキリスト教信仰といっても、その媒体となるイメージにおいてかなりの多様性が看取されることが明らかとなった。1.2001年6月に慶應義塾図書館所蔵の初期印刷本および西洋中世写本の撮影および全ページのデジタル・ファクシミリ(CD-ROM)の制作をおこなった。今年度の対象は印刷による時祷書1冊(Paris,1503)および15世紀の典礼用詩篇写本、写本時祷書零葉である。また、撮影した資料については、詳細な書誌学、書物学的な記述をおこなった。

2.研究対象のひとつである大英図書館所蔵、Additional37049写本について、その挿絵の役割を論じた研究論文をまとめ、「中世における翻訳の理論と実践」に関する第6回国際学会(2001.7スペイン、サンティアゴ・デ・コンポステラ大学)にて発表した。3.研究期間中に調査しデジタル化した中世イギリスの写本および初期印刷本にについて、デジタル化した全ページをネットワーク公開が可能なかたちでデータベース化した。本研究は、中世後期のベストセラーである時祷書と宗教文学アンソロジーの写本を主たる研究対象として遂行されたが、これらの書物における挿絵の機能の分析を通じて、挿絵やダイヤグラムがキリスト教教理に関するテクスト内容を視覚的に解題してゆくという、テクストと挿絵の相互補完的な関係を、具体的に跡づけることができた。これらの挿絵入りの書物は、キリスト教の教義を広く一般信徒へと浸透させ、中世後期の民間信仰の基盤を形成する上で主要なメディアとして機能している。テクスト内容と挿絵の図像に注目して書物の機能と読者層を分析することで、巡礼の手引書や物語文学など他のジャンルのテクストにおいても、民間信仰的要素を個別に抽出することができた。テクストの直接の媒体である書物を対象とした本研究が、様々なジャンルのテクストにおける民間信仰の分析に有効であることが明らかとなったと言える。また、特に未刊行資料をめぐって、書物のデジタル化とネットワーク公開が可能な形での図像データベース化を実現したが、こうした研究手段が、稀覯資料の可動性を高めるだけでなく、写本の解読や図像資料の相互比較において有効であることを実例を通じて示すことができた。その意味で本研究は、中世後期の民間信仰の具体的な分析と、デジタル化を利用したそのための方法手段の確立との両面で成果をあげることができたと言える。
生体膜上におけるアミロイド性タンパク質の結晶多形現象の解明と制御方法の確立

アミロイド線維形成は結晶化現象との類似性がある。事前に形成したアミロイドを超音波処理して得た断片は種晶(seeds)の役割を担う.seedsはモデル生体膜であるリポソームの共存条件において多様な伸長挙動を示した.特に,酸化ストレスやそれによって生成する酸化脂質が共存する場合,星状の球状アミロイド(スフェルライト)が形成されることが分かった.したがって,リポソーム膜がアミロイドの多形を決めていることが示唆された.アミロイド線維形成は結晶化現象との類似性がある。事前に形成したアミロイドを超音波処理して得た断片は種晶(seeds)の役割を担う.seedsはモデル生体膜であるリポソームの共存条件において多様な伸長挙動を示した.特に,酸化ストレスやそれによって生成する酸化脂質が共存する場合,星状の球状アミロイド(スフェルライト)が形成されることが分かった.したがって,リポソーム膜がアミロイドの多形を決めていることが示唆された.本研究課題の目的は、(i)生体膜によるAβの多形性の発現機構の解明と(ii)(モデル)生体膜(メンブレン)による多形制御方法の確立である。そのために、アミロイド形成課程(ものマー→プロトフィブリル→アミロイドという逐次反応)において、生体膜がプロトフィブリルの構造変化や多形性を制御する機構を検討する。そこで、研究課題を【I段階】プロトフィブリルの基礎検討、【II段階】結晶多形を生み出す機構の解明とその制御方法の確立、に分けた。初年度では【I段階】に関して、以下の項目について検討した。(1)プトロフィブリルの調製:分子量75,000300,000程度のオリゴマー凝集体であることが示唆された。(2)プロトフィブリルの表面特性の解析:モノマーやアミロイドに比べて、顕著に大きな局所的疎水性と不安定な水素結合安定性を示し、プロテアーゼ抵抗性や可視化実験などにより、アミロイドよりもflexibleかつ不安定な構造であることが示唆された。(3)プロトフィブリルの(モデル)生体膜への分配特性:固定化リポソームセンサを用いた実験により、プロトフィブリルが強い膜配向性を示すことが分かった。さらに、モノマーやアミロイドと比べ、強い膜かく乱効果を有することが示唆された。(4)プロトフィブリルを起点とする線維伸長反応(結晶化)機構の解析:項目(1)より得た分子量既知のプロトフィブリルを用いたアミロイド伸長実験では、プロトフィブリルがアミロイドの核として作用することが示唆された。本研究課題の目的は、(i)生体膜によるAβの多形性の発現機構の解明と(ii)(モデル)生体膜(メンブレン)による多形制御方法の確立である。2年目では【I段階】に関して、以下の項目について検討した。(1)リポソーム共存下におけるプロトフィブリルの安定性の評価水性二相分配法・プローブ標識実験・固定化リポソームクロマトグラフィーなどを併用して多面的にプロトフィブリルの構造変化(表面/局所的疎水性,ゆらぎ,剛直性など)を評価した.(2)プロトフィブリルの起点のアミロイド多形現象に関する条件検討脂質膜による多形性制御として,固体基板上に脂質膜を固定化し,プロトフィブリル起点のアミロイド形成現象を整理・検討した.(3)アミロイドの結晶多形と生体膜のストレス劣化との関係の検討種々の多形を細胞に添加し,細胞の生存率(MTT活性:ミトコンドリア機能を指標とした細胞活性)の測定から,アミロイド多形と生体膜のストレス劣化の対応関係を評価した.その結果,多形と細胞毒性に関連性を見出した.