hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エキソソーム構成成分の網羅的解析によるスフィンゴ脂質の新たな栄養機能の実証

スフィンゴ脂質の新たな栄養機能を明らかにすることを目的として研究を実施した。その結果、培地に添加されたスフィンゴミエリンが、ヒト肝癌細胞から分泌されるエキソソームのmRNA量、miRNA含量を変化させ、その変化を介してオートクラインに肝癌細胞の増殖を調節している可能性を見出した。さらにスフィンゴミエリンを8日間経口投与したラット血中より調製したエキソソームが骨格筋におけるグルコース取り込みを促進することを見出した。以上の結果はスフィンゴミエリンが細胞に取り込まれ、その細胞が分泌するエキソソームを質的に変化させることで、生理作用を発揮するという新たな栄養機能の一端を見出したものと考えられる。前年に引き続きスフィンゴミエリン添加時に分泌されるエキソソームの量的、質的変動を主として肝癌細胞において検討した。ヒト肝癌細胞HepG2にスフィンゴミエリンを取り込ませ、培地中に分泌されたエキソソーム中のHSP70をWestern blot分析により定量したところ、スフィンゴミエリン未添加群と比較して、大きな差は見られなかった。HSP70はエキソソームマーカーとして知られている膜タンパク質であり、この結果はスフィンゴミエリン添加肝癌細胞から分泌されるエキソソームには量的な変化は生じにくいことを示唆している。一方で、スフィンゴミエリン添加時に分泌されるエキソソームに細胞増殖抑制作用があることをすでに見出しているため、エキソソームの質的変動を解析することを目的とし、エキソソーム中のmiRNAの網羅的解析をマイクロアレイ法により行った。対照群およびスフィンゴミエリン添加群のエキソソームよりtotal RNAを調製し、マイクロアレイ解析に供した。約15000種のmiRNAの発現を測定した結果、ほとんどのmiRNA量には差が見られなかったが、発現が上昇したmiRNAが4種、低下したものが2種見出された。そのうち、最も発現が上昇したものはhas-miR-4708-3pであり、このmiRNAは細胞増殖を促進させるタンパク質のmRNAを標的とし、それらを分解、もしくは翻訳を阻害して細胞増殖を抑制することが報告されている。この結果より、昨年見出したスフィンゴミエリン添加時に分泌されるエキソソームの細胞増殖抑制作用は、エキソソームに含まれているmiRNAを介した作用である可能性が示された。またエキソソーム中のtotal RNA中にはmiRNA以外にも、Asn-tRNA, U1 RNAなどが含まれていることも明らかにした。本研究はエキソソームの網羅的解析を行うことで、スフィンゴミエリンの新たな栄養機能を見出すことを目的として実施した。昨年度までの研究により、肝癌細胞にスフィンゴミエリンを添加することで分泌されるエキソソーム中のmiRNA構成が変化し、変化したmiRNAを介して、スフィンゴミエリンの癌細胞増殖抑制作用が発揮されることを見出した。また分泌されるエキソソームには、スフィンゴミエリンによる量的な変動は起きていないことも確認された。最終年度にはスフィンゴミエリンを経口摂取した際に血中エキソソームにどのような変化が起きるかを検討した。その結果、スフィンゴミエリンを体重1 kgあたり100μgの用量で、8日間経口摂取させたラットの血液より調製したエキソソームをL6筋管細胞に添加したところ、筋管細胞によるグルコース消費が対照群と比べて有意に増加することを見出した。その際の対照群としてはスフィンゴミエリンを懸濁させた緩衝液を同様に経口投与したラット血液より調製したエキソソームを用いた。この結果はスフィンゴミエリンを経口摂取することにより血中エキソソームの生理作用が変化したことを意味している。スフィンゴミエリンを高濃度に含有するミルク由来脂質画分をラットに摂取させることで糖代謝が改善することを報告した例があるが、本研究で得られた結果はその作用の一部がエキソソームを介したものである可能性を示唆するものであり、スフィンゴミエリンの新たな栄養機能を示唆するものと考えている。血中エキソソームの構成に関する網羅的解析は期間内に実施することはできなかったが、含有されるmiRNAの変動などに関してさらに検討することで、詳細な分子機構が明らかになることが期待される。スフィンゴ脂質がエキソソーム分泌への影響を介してその生理作用を発揮している可能性を明らかにするため、本年度は主としてヒト肝癌細胞(HepG2)を用いた解析を実施した。スフィンゴミエリンを培地に添加し、あらかじめ肝癌細胞に取り込ませるとHepG2の増殖が抑制され、細胞死が誘導されることを見出している。誘導される細胞死はアポトーシスではなくネクローシスであることも見出した。

またスフィンゴミエリン添加後の細胞を無血清培地で培養した馴らし培地を無処理の肝癌細胞に添加するとやはり増殖が抑制されることを確認し、スフィンゴミエリンを取りこませた細胞が培地にエキソソームを分泌し、そのエキソソームを介した作用が観察されるうることも確認できた。現在、馴らし培地より市販のエキソソーム調製試薬を用いてエキソソームを分離し、その分析を進めている。エキソソームマーカーであるテトラスパニンタンパク質CD9は検出されているが、その他の膜たんぱく質を検出するためにはより多くのエキソソームを調製する必要があるため、現在その準備を行っている。同様にエキソソームに含まれるmiRNAの網羅的分析についても十分な量の材料を調製した後に実施する計画である。Caco-2細胞に関する検討は未実施であり、次年度の検討課題となっている。もう一つのスフィンゴ脂質であるガングリオシドについては、メラノーマ細胞を用いた検討を進めた。当初はメラノーマの使用は想定していなかったが、ガングリオシドがメラノーマに対してより顕著な生理作用を発揮したため、こちらの解析を進めた。その結果、GM3およびGD3を取りこませた細胞の馴らし培地に細胞増殖抑制作用があることを見出した。分泌されたエキソソーム中のmiRNAによる作用が予想されるため、現在分析用のエキソソームを大量調製している段階である。本年度は当初の目的の一つであったエキソソーム中に含まれているmiRNAの網羅的解析を予定通り実施し、一定の成果を挙げることができた。実績の欄にも記載したようにスフィンゴミエリンを添加したヒト肝癌細胞より分泌されるエキソソーム中のmiRNA組成が対照群と比較して変化していること、変動したmiRNAの標的が細胞増殖関連タンパク質であることが明らかになったことなどから、スフィンゴミエリンが細胞に取り込まれ、エキソソーム生成、分泌過程を変化させ、分泌されたエキソソームを介して、その生理作用を発揮している可能性を明らかにすることができた。ここで得られた知見はスフィンゴミエリンの新たな生理作用発揮機構の一つであり、当初の目的の一部を達成できたと考える。しかし、エキソソーム中にはmiRNA以外にも多数のRNA分子が含まれていることも確認されており、それらを網羅的に解析することにはまだ成功していない。また本年度は肝癌細胞での検討に注力したため他の細胞系での網羅的解析は進んでいない。それらの点からおおむね順調に進展していると評価した。さらに食事として摂取したスフィンゴミエリンが血中エキソソームの構成を変化させ、その生理作用を発揮するという新たな栄養機能を証明することが本研究の最終目的である。そのためには食事成分摂取後の小腸からの分泌物を採取する手法が必要となる。そこで上記研究と並行して小腸潅流法の習得を行った。具体的な成果は得られていないため研究実績には記載していないが、年度中に小腸潅流系の実験手技を確立しており、次年度にはスフィンゴミエリンを摂取させたラットより血液および小腸潅流液を調製し、食事性のスフィンゴミエリンが小腸から分泌されるエキソソームにどのような影響を与えるかを検討する計画である。実績概要に記載のように、肝癌細胞においてスフィンゴミエリンがエキソソーム分泌への作用を介して、その生理作用を発揮している可能性を明らかにし、その作用の詳細の解析は実施済みである。しかし、当初計画していた分泌されたエキソソームの網羅的分析は未実施である。
電界効果MOCVDによるナイトライド半導体の結晶成長

ナイトライド半導体AlNとInNの結晶作成時と降温時に結晶c-軸方向に高電界を印加して結晶の分極方向を制御することを試みた。MOCVD装置内に設置した石英製インナー管の基板上部3ミリの位置に上部Mo電極を配し、結晶を成長させるMoサセプタを下部電極としてこの両電極間に1kV/cmの電界を印加した。AlNでは明確な電界効果が観測され、電界の方向にそろった単一ドメイン構造結晶を得たが、InNについては明確な効果は観測されなかった。[1]電界効果MOCVDを可能とする装置の作成:ナイトライド半導体の結晶構造の分極反転を制御するには、作成時と降温時に高電界を印加して分極方向を揃える必要がある。今回の助成を得て、本装置を改造し、結晶成長方向に1kV/cmの高電界を印加する機構を作成した。我々の装置は横型であり、MOCVD装置に適合した石英製インナー管を作成し、基板上部3ミリの位置に上部Mo電極を設置し、Moサセプタをヒーターと絶縁することで、下部電極とした。基板は焼結体BNの抵抗加熱によりMoサセプタを介して最大1150°Cに加熱することが可能となった。[2]重界効果の検証:分極反転に伴う結晶構造の変化を検証するため、Sic上にAINを電界効果MOCVDでヘテロエピ成長させ、そのMIS構造の誘電率を測定した。AINは大きなピエゾ係数を持っているので、1軸性圧力と静水圧下でのピエゾ係数の比較を行った。AINの作成には20トール程度の減圧下で成長させるが、電界を印加するとプラズマが発生し、正確な電界効果MOCVDとはならなかった。したがって、誘電率、ピエゾ係数ともに、明確な電界効果を見ることは出来なかった。[3]電界効果MOCVDによる半導体InNの作成: InNの分極方向を一方向に揃えるためc-軸方向に電界を印加して500トールにて結晶成長を行なった。プラズマは発生しなかった。評価はX線回折や、光学測定、超伝導特性、TEM,ラマン散乱の評価で実施した。この成果の一部を2008年春の応用物理学会で報告した。[1]電界効果MOCVD装置を用いたAIN結晶作成:AIN結晶成長における電界印加効果を検証するため、結晶成長方向に正負1kV/cmの高電界を印加する機構をもちいて実験を行った。使用した装置は横型であり、MOCVD装置に適合した石英製インナー管を作成し、基板上部3ミリの位置に上部Mo電極を設置し、Moサセプタをヒーターと絶縁することで、下部電極とした。[2]電界効果の検証:電界印加による結晶構造の変化を検証するため、サファイア上にAINを電界効果MOCVDでヘテロエピ成長させ、その結晶分域構造をSEMで観測した。AINは大きな自発分極を持っているので、Al極性とN極性の選別が成長時の電界方向により極性の制御が可能であった。AINの作成には20トール程度の減圧下で成長させるが、電界を印加してもプラズマが発生しない工夫を施し、成長を行った。成長した面の極性をKOHによるエッチングにより確認した。[3]電界効果MOCVDによる半導体AINの作成:AINのu-parameterは0.381であり、分極方向はN原子からAl原子に向かっている。成長時にN原子からAl原子に向かって電界を印加すると、N極性のAINが成長し、成長時にAl原子からN原子に向かって電界を印加するとAl極性の結晶が成長することを確認した。更に総合的な評価をX線回折や、光学測定、TEM,ラマン散乱測定で実施した。この成果の一部を2009年春の応用物理学会(筑波大学)で報告した。
不溶性フィブロイン膜固定化発光細菌を用いた微生物実験

不溶性フィブロインフィルム(以下、IFFという)を作製し、発光細菌をIFFに固定化したチューブを用いて毒性試験を行う実験教材の作成を試みた。硫黄源要求性を示すV.fischeri(ATCC 49387)は、界面活性剤である直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)に対して発光増加を示すため、LASを含む洗濯用合成洗剤に対して低濃度では発光増加を示し、LASの検出が可能であることが示唆された。発光細菌をIFFに固定化した場合、溶液中における感受性試験よりも鋭敏な反応を示すことが明らかとなった。IFFに発光細菌を固定化した毒性試験は、環境教育の新たな実験教材として有効であることが示唆された。本研究では、蚕繭からフィブロインを抽出し、塩化カルシウム溶液で加水分解することにより得たフィブロイン溶液にグリセロールを添加し、不溶性フィブロイン膜(以下「IFF」という)を作製した。IFFを接着させたガラスチューブに海洋性発光細菌V.fischeriの培養液を加え、一定時間経過後、IFFに付着していないV.fischeriの洗浄除去を行い、IFFへの発光細菌の固定の評価を行った。また、IFFに付着したV.fischeriがPolysaccharaideを分泌することが確認されているため、IFFに多糖であるアルギン酸を添加したIFFを作製した。アルギン酸を添加したIFFを水溶液に浸漬した場合、タンパク質であるフィブロインは溶出しないが、膜自体が溶液中で脆弱化することが明らかとなった。現在、IFFに比べさらに細菌の付着率が高く、発光量を増大する担持膜の改良を試みている。発光細菌の重金属に対する毒性試験では、海洋性発光細菌であるVibrio fischeri、および淡水性発光細菌であるPhotorhabdus luminescensを供試生物として、各種重金属に対する感受性の検討を行った。V.fischeriを供試生物とした場合は、水銀Hg濃度5.0mg/L以上で発光阻害率がほぼ100%であった。さらに、他の金属混合条件下においても発光阻害率を示し、水銀Hgに対して高い感受性を有することが明らかとなった。一方、淡水性発光細菌P. luminescensを供試生物とした場合は水銀HgとカドミウムCdに対して金属濃度5.0mg/L以上で発光阻害率が90%以上の結果を示した。海水性と淡水性の発光細菌では、それぞれ毒性を示す毒物の種類と発光阻害率が異なることが示唆された。発光細菌Vibrio fischeri(以下,V.fischeri)(ATCC49387)はグラム陰性桿菌で,青緑色の光を発する.その発光量の変化を指標に,環境中の毒物センサーの供試生物として用いられている.平成25年,環境基本法の基準に界面活性剤の一種である直鎖アルキルベンゼンスルホン酸およびその塩(LAS)が追加された.本研究では,V.fischeriにLASならびに市販洗濯洗剤を曝露させ,発光量の変化から水質汚染の評価方法について検討を行った.また,比較対象として淡水性発光細菌Photorhabdus luminescens(以下,P.luminescens)にも同様の実験を行った.発光細菌の培養液にLASを曝露したところ,LAS濃度0.05mg/L以上に対して発光が増加し,濃度が高いほど発光量が増加する傾向があることが確認できた.さらに,LASを含む市販の洗濯洗剤に対しても発光増加が確認された.市販の洗剤には,LAS以外の化学物質が含まれているが,そのような夾雑な条件下においてもLASの感受性を確認できたことは重要である.P.luminescensはLAS,市販洗剤のどちらに対しても発光阻害を示した.また,フィブロインにアルギン酸塩を添加して作製した膜を用いて,海洋性発光細菌V.fischeriの固定化を行った.発光細菌を固定化した膜はー80°Cで,30日間冷凍保存し,その間における発光細菌の発光量と生菌数を求めた.フィブロインーアルギン酸膜に固定化したV. fischeriの発光強度が高い値を示し,菌数の付着率も高い結果が得られた.また,凍結保存したストックを解凍した後についても,細菌の回収率が向上したことから,フィブロインーアルギン酸膜は,V. fischeriの保存環境として有効であることが示唆された.平成27年度は、発光細菌の固定化担体である不溶性フィブロインフィルムにアルギン酸を添加した場合、発光細菌の付着率が有意であることが明らかとなった。保存方法について、超低温(-80°C)では保存化が可能であるが、家電製品の冷凍庫(-20°C)での長期保存は実現していないため、培地条件などの保存条件を検討する必要がある。海洋性発光細菌V.fischeri(ATCC49387)ならびに淡水性発光細菌P.luminescensは、LASと市販の洗濯用洗剤の5種類に対して感受性試験の結果を得ることが出来た。V.fischeriは硫黄源要求性の発光細菌である。そのため、硫黄を含むLASが界面活性剤として使用されている洗濯用洗剤には、発光増加を示すことが明らかとなった。ただし、高濃度では細菌が死滅するため発光阻害を。以上の結果から、V.fischeriを用いた毒性試験は、合成洗剤のような夾雑な条件下の場合においても、低濃度のLASの検出が可能であることが示唆された。また、農作物の防カビ剤として用いられるイマザリルIMZとチアベンダゾールTBZ、オルトフェニルフェノールOPPならびにオルトフェニル

フェノール塩OPPNaに対する感受性試験を行った。供試生物としてV.fischeriと同じ海洋性発光細菌Allivibrio fischeri(ATCC7744)を用いた。毒物に対する感受性は、供試生物や培養条件によって異なるため、同じ毒物に対してV.fischeriとA.fischeriの発光挙動が同じとは限らないため、いくつかの生物モデルを並行して用いながら、毒性試験の指標とする必要があると考えられる。また、不溶性フィブロイン膜(IFF)ならびにフィブロインにアルギン酸添加したフィブロイン膜(IFAF)を作成し、発光細菌の付着実験を行なった。発光細菌の発光強度は再現性が高いが、生菌数の結果にはバラつきが大きいため、担持膜と保存条件についてさらなる改良が必要である。しかしながら、IFFに発光細菌を固定化したチューブを用いて毒性試験を行ったところ、感受性試験よりも鋭敏な反応を示すことが明らかとなった。申請者は平成27年12月に開腹手術を行い、その後の回復が思わしくなく体調不良が続いた。そのため研究がやや遅れる状況となった。また、勤務校の業務が過重であることも研究が遅れた理由の一つである。重金属に対する感受性試験では、金属単体の場合と金属混合条件下において発光細菌の発光阻害率に違いが生じることが明らかとなった。硫黄源要求性を示すV.fischeriは、界面活性剤である直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)に対して発光増加を示すため、市販の洗濯用合成洗剤を暴露させ、発光量の増減による水質汚染の評価方法を試みた。LASを含む洗濯用合成洗剤に対して、低濃度において発光増加を示し、LASの検出が可能であることが示唆された。V.fischeriとA.fischeriを用いて農作物の防カビ剤として用いられるイマザリルIMZとチアベンダゾールTBZ、オルトフェニルフェノールOPPならびにオルトフェニルフェノール塩OPPNaに対する感受性試験を行った。同じ毒物であっても供試生物の種類によって挙動が異なるため、数種の生物モデルを並行に用いながら毒性評価する必要がある。IFFに発光細菌を固定化した場合、溶液中における感受性試験よりも鋭敏な反応を示すことが明らかとなった。IFFに発光細菌を固定化した毒性試験は、重金属だけでなく、合成洗剤に含まれるLASの検出、防カビ剤に対しても有効であり、環境教育の新たな実験教材として有効であることが示唆された。不溶性フィブロインフィルム(以下、IFFという)を作製し、発光細菌をIFFに固定化したチューブを用いて毒性試験を行う実験教材の作成を試みた。硫黄源要求性を示すV.fischeri(ATCC 49387)は、界面活性剤である直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)に対して発光増加を示すため、LASを含む洗濯用合成洗剤に対して低濃度では発光増加を示し、LASの検出が可能であることが示唆された。発光細菌をIFFに固定化した場合、溶液中における感受性試験よりも鋭敏な反応を示すことが明らかとなった。IFFに発光細菌を固定化した毒性試験は、環境教育の新たな実験教材として有効であることが示唆された。本研究の目的は、簡便性・迅速性を有した微生物実験の教材化である。
専門士業の「専門性」形成のモデル構築：社会保険労務士を手がかりとして

2018年度には、アンケート調査結果の分析を行うとともに、その分析結果を携えて、「社労士の将来に関する検討会」を主要地域の社労士会で実施し、調査結果についての社労士の様々な意見を聴取した。「検討会」は全国社会保険労務士会連合会および社会保険労務士総合研究機構の支援を受けて行われた。「検討会」では、現状どのような業務が増えているか、外国人労働者の急増やテレワーク対応など新しい労務課題と社労士の役割はどうなっているのか、そして、これからの社労士の進むべき方向性(より高い「法的専門性」を目指すべきか、「高度ジェネラリスト」を目指すべきか)といった論題について、かなり踏み込んだ意見交換を行った。「検討会」では、社労士の多くが、社労士法1号・2号業務(社会保険や労災保険等の書類作成代行・提出といった手続業務)になお収入の多くを依存しつつも、労務に関わる経営課題にますます大きく関わるようになってきており、特に、就業規則の整備やアップデート作業を行うことを通じて、社労士法3号業務の比重を増やしてきていることは、どの地域でも見られる一般的傾向であることが窺われた。また、技能実習生をはじめとする外国人労働問題、メンタルヘルス疾患の問題や職場のハラスメント問題、労働条件審査の課題、ジェンダー・LGBT問題、職場のAI化による勤務形態の多様化、病後の職場復帰の問題などに積極的に関わっていることが理解された。アンケート調査結果の概要は全国社会保険労務士会連合会の会報『月刊社労士』で公表したほか、調査結果詳細と「検討会」での議論の反訳(編集済み)は研究成果報告書(冊子とPDF)にまとめて公表した。平成29年度は、アンケート調査を中心として研究を行った。採択・交付決定を得た7月からアンケート調査の準備を始め、8月下旬に科研メンバーによる会合をもち、9月に東京都社会保険労務士会を訪問、10月に全国社会保険労務士会連合会を訪問して準備のための意見交換を行った。これらの意見交換を通じて、アンケート調査の方針を確定するとともに、全国社労士会連合会等とのWin-Winな協力関係を構築することができた。社労士を対象とするアンケート調査は、全国社会保険労務士会連合会および社会保険労務士総合研究機構の協力をえて、3000通の郵送法調査と、ウェブアンケートを併用する形で実施した。調査期間は2月10日から3月31日までの約1ヶ月半である。アンケートでは、全国の社労士に対して、社労士を志した経緯、これまで行ってきた業務とこれから行いたい業務、新しい職域への関心、職業倫理、自身の性格傾向などについて質問した。現時点ではまだ整理段階であるが、1000通を超える有効回答を得ることができた。さらに、自由記述から、こちらが想定していた以外の新しい業務についてのデータも得ることができた。現在、業者に依頼して調査票のデータ入力作業を進めるとともに、自由記述等の整理を行っているところである。調査結果は冊子にまとめ、平成30年度に実施する「社労士職域開拓セミナー」(全国の主要都道府県の社会保険労務士会の協力を得て調査結果をたたき台に討議型意見聴取を行う)の基本資料とする。平成29年度の事業の中核となるアンケート調査を年度内に実施し、多角的な統計分析を行うのに十分な回答数を得ることができた。アンケートから、社労士を志した経緯、これまで行ってきた業務とこれから行いたい業務、新しい職域への関心、職業倫理、自身の性格傾向についての基礎的データを得ることができ、また、自由記述からこちらの想定していなかった新しい業務についてのデータが多数得られたことは大きな成果であった。アンケート調査の結果を分析し、さらに掘り下げていくのが平成30年度の課題である。また、準備の過程で東京都社会保険労務士会、愛知県社会保険労務士会、全国社会保険労務士会との公式の協力関係を構築することもできた。社会保険労務士団体の協力のもとに、さらに踏み込んだ調査を実施していく。

アンケート調査結果の概要は全国社会保険労務士会連合会の会報『月刊社労士』で公表したほか、調査結果詳細と「検討会」での議論の反訳(編集済み)は研究成果報告書(冊子とPDF)にまとめて公表した。平成30年度は、アンケート調査の結果の分析を進めるとともに、夏から秋にかけて「社労士職域開拓セミナー」を全国の主要都道府県の社会保険労務士会の協力を得て実施し、調査結果をたたき台に討議型意見聴取を行う。このセミナーは、全国社会保険労務士会連合会を通じて、東京都社会保険労務士会、大阪社会保険労務士会、愛知県社会保険労務士会、宮城県社会保険労務士会、北海道社会保険労務士会、福岡県社会保険労務士会(実施場所は全国会を通じた調整段階で変更の可能性あり)で実施する計画であり、社会保険労務士の職域動向と地域性との関連性について質的な検討を行う予定である。以上の調査結果は12月(もしくは1月)に行うシンポジウムでの検討を経た上で、研究成果報告書の形にまとめてウェブ等で公開する予定である。アンケート調査の料金後納3月分がまだ未払いであり、これは平成29年度予算で支払われるべき金額である。調査票データの入力もまた昨年度から継続する作業なのであり、これも平成29年度予算と平成30年度予算とを合わせて支払を行う予定である。平成30年度は全国主要都市の社会保険労務士会を訪問して「討議型意見聴取」を行うが、そのたたき台となるのが、アンケート調査の単純集計結果の分析であり、残額はその整理作業ですべて使う予定である。
多核錯体 低次元錯体など集合構造をもつ新しい錯体の合成.および集合の化学的効果

表題の研究課題について総勢19名の班員により緊密な討論や意見交換を行ないながら3年間にわたって研究を行なった。この間,毎年1回研究成果報告会を公開シンポジウムの形で開催したほか,初年度には錯体合成化学者と物性化学者との交流を深めるためにワークショップを開催した。詳しい研究成果は研究成果報告書(225ページ)に記載したが,主な成果としてつぎのようなものを挙げることができるであろう。イオウを架橋原子とする新規多核錯体がルテニウム,ロジュームなど多くの金属イオンについて合成された。多核化配位子の設計に基づく錯体合成においても大きな成果が得られ,その中には二酸素錯体を形成する興味深い系も実現している。遷移金属イオンの集合効果としては,固体状態の磁性,伝導性などの物性研究に加え,溶液中の多電子酸化還元挙動が研究され,ルテニウム多核錯体が示す多彩な酸化還元性について興味深い成果が得られている。従来比較的乏しかった錯体合成化学者と物性化学者との交流を,ワークショップや公開シンポジウムにおける討論,共同実験を通じて深めることができ,この点も本研究の意義深い成果と感じている。1.平成2年6月9日,分子科学研究所において,当総合(A)班の班員会議を行い,研究方針,予算の使い方を打ち合せた.また,当研究班活動として,平成2年11月に,“錯体集合体と物性化学"という題のワ-クショップの開催,平成3年3月に班員の研究報告を目的とした公開シンポジュウムの開催が取り決められた.2.当研究班の活動目的の一つは,錯体化学者ーとりわけ合成錯体化学者の,固体化学,物性化学分野の進出である.歴史的事情もあり,錯体化学者にはなじみがうすく,我が国の基礎錯体化学が,欧米に比べて立ち遅れている分野である.このような事情のもとに,上記ワ-クショップ“錯体集合体と物性化学"を平成2年11月29ー30日に開催した.10名の講師による講演,参加者50余名による活発な討論が行われた.講演要旨集150部を印刷し,参会者等へ配布した.3.当初の研究計画に基づき,班員の小グル-プ研究会を開催するなど班員間の緊密な討論を行いながら研究を進めている.九大理木田班員グル-プによる金属錯体分子強磁性体の合成研究,金沢大理上原班員グル-プによるMn四核錯体の合成,東北大理伊藤グル-プによるRu三核錯体二量体における三核ユニット間の相互作用など興味深い成果が得られはじめている.4.本年度の研究成果報告会を,公開シンポジュウムの形で平成3年3月18ー19日,分子研において開催した.50余名の参会者があり,活発な質疑討論が行われた.講演要旨集を650部印刷し,関係者に配布した.この後,班会議を開催し,本年度の研究,班活動の総括を行い,来年度の研究計画,班活動について打ち合せた.1.昨年度末の班会議において積極参加が打ち合わされた“金属クラスタ-錯体の化学に関する日中セミナ-"(平成3年7月15ー18日,分子科学研究所)に当研究班から10名が参加した。当研究班員の研究成果,Mo_3骨格を持つカルコゲニドクラスタ-(斎藤班員),4核および8核白金ブル-の構造と電子移動(松本班員),Ru三核骨格をユニットとする多段酸化還元系(佐々木班員),Pt複核および4核クラスタ-(伊藤班員),ハイパ-バレントMo,Wを含む有機金属硫化物クラスタ-(磯辺班員),Cp^*Taユニットを含む硫化物クラスタ-(中村班員),ほか2件が,このセミナ-で講演発表された。2.小グル-プの班員による共同実験,研究会を適宜行ったほか,平成3年10月9日,岡山大学において,全班員による打ち合せ会議を行った。3.本年度の研究成果報告会を,公開シンポジウムの形で平成3年12月2ー3日,分子科学研究所において開催した。45名の参加者があり,12税の講演が行われ質疑討論がなされた。講演要旨集を650部印刷し,関係者に配布した。

この後,班会議を開催し,本年度の研究,班活動を総括し,来年度の研究計画,班活動について打ち合せた。1.本年度は,3年間にわたって研究活動を進めてきた当総合研究(A)班の研究最終年度あたる。3年間の研究成果の報告会を,公開シンポジウムの形で平成4年11月12-13日の二日間,岡崎国立共同研究機構・分子科学研究所において開催した。全国から50名の参加者があり,19名の班員全員が研究成果について講演を行い活発な討論がなされた。講演要旨集を500部作成し参会者に配布したほか、関係する全国の研究者に配布した。2.研究成果の具体的内容については,冊子体の研究成果報告書に詳しく述べたのでここでは省略するが、多核錯体の化学に加え錯体集合体の化学について著しい研究の進展がみられた。また,分子研大瀧班員から,ポルフィリン錯体の溶液内反応における反応中間体をstopped-flowEXAFS法により直接検出できたというきわめて興味深い最新の研究結果が上記の公開シンポジウムで報告された。3.班会議においてこの研究分野の基礎化学における重要性が議論され,′′重点領域研究′′への申請や国際会議の開催などについて意見交換が行なわれた。
アテロコラーゲン素材の生体吸収性液状血管閉鎖栓の開発

本研究は三段階の実施計画に基づく。第一段階はアテロコラーゲン液状血管閉鎖栓の作製、第二段階は血管内注入・留置システムの考案・作製および改良、第三段階は対象動物(ウサギ)を用いた動物実験である。H28年度、H29年度は当初の計画では第1段階、第2段階および第3段階に入り、数匹の動物実験が終了している予定であった。しかし後述する動物実験室、動物実験室のあるビル施設の改修工事がH29年度に計画され、H29年度末から工事が着工開始されたことから、計画の研究計画の変更が必要となった。H29年度までにin vitroでの検討として高研(株)より既に市販されているアテロコラーゲンを素材とする製品であるアテロコラーゲンインプラントと非イオン性造影剤とを様々な割合で混和させ、X線の非透過性とゲル化の有無を検討し、実験に適した混合割合の液体状血管閉塞栓を作製した。続いて血管を想定したビニールチューブに液体状血管閉塞栓を注入し37°Cの温度下でゲル化および血管閉塞ができることを確認した。それをもとにin vivoでの検討に入り、2羽のウサギに対しそれぞれ片側の腎動脈に経カテーテル的に血管閉塞栓を注入し腎動脈を閉塞させた。1羽は実験後5時間程度で死亡した。外部動物飼育委託施設での死亡であったため死因は不明であった。もう1羽については予定通り閉塞術施行1か月後に再造影を行った。しかし閉塞栓は腎動脈から脱落していた模様で血管閉塞は得られていなかった。この原因として閉塞栓と血管内皮の接着が不十分であった可能性が示唆された。H29年度末からは実験施設改修工事のためX線透視下での検証が不可能となったことから、H30年度一杯、上記の点を修正・改善すべくin vitroでの実験を繰り返し行った。また1年間の研究期間延長申請をし、H31年3月20日付で承認を受けた。本研究は動物実験である。アテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の作成と、デリバリーシステムの作成、in vitroでの実験に引き続き、ウサギを用いたin vivoでの閉鎖栓留置実験が中心である。この動物実験は大学内動物実験室で行うが、動物実験室のあるビル自体の改修工事、リニューアル化が大学事業として開始されることとなった。結果的に工事期間は平成29年度30年度一杯(平成30年末31年3月一杯)であった。このため実験施設のX線透視下での検証をはじめ動物実験そのものが不可能となり、対象動物の保育・管理さえも不可能となったため、動物実験計画は1年間以上の延期とせざるを得なくなった。本研究の動物実験は、閉鎖栓留置後に一定期間後の血管閉塞状況確認と組織学的検討が必要であるため、閉鎖栓留置後の対象動物は保育が必要である。他施設での実験も検討したが、その際の動物は本学動物実験室には搬入出来ない(感染症持ち込み防御のため)ことから、同一動物実験室での動物実験が可能となるまで、ウサギを用いたin vivoでの閉鎖栓留置実験は延期せざるを得ない状況となった。なお、動物実験室ビルの改修工事状況をみて、1年間の研究期間延長申請をし、H31年3月20日付で承認を受けた。平成31年4月中旬から動物実験施設の改修工事が終了し、施設使用が可能となったことを受け、動物実験を早々に再開する。動物実験室使用停止中の1年3か月間に行ったin vitroでの実験および2羽のウサギに対して行なったin vivoにおける実験で明らかとなった問題点、課題に対して、様々な方向から検討して得られた解決案が、実際のin vivoでの動物実験で妥当であるかを検証していく。またより実際的、安定的で確実性の高いものに仕上げたアテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓とデリバリーシステムの実用性を併せて動物実験で確認していく。動物実験再開とともに、実験動物であるウサギを購入・搬入し、標的血管へのアテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の留置を次々に行い、期間に応じて順次造影検査、解剖後に閉鎖栓留置血管の摘出し、組織学的検討を進めていく。繰り返しになるが、本研究は1年間の研究期間延長申請をしH31年3月20日付で承認を受けたため、本年度一杯の研究実験継続が可能となっている。◆乳幼児・小児の有害異常血管へのコイル塞栓術において、金属コイル血管内留置の生体へ及ぼす影響・予後を懸念しアテロコラーゲンコイル開発を計画したが、現在アテロコラーゲン製品作製工場でのコイル作成が不可能となったため、H28年度新たにコラーゲン溶液を用いた液体状血管閉塞栓の開発を立案した。◆その資材は(株)高研から発売されている「アテロコラーゲンインプラント:以下ACI」である。冷所では液体状に、37°C以上で弾性に富むゲル状に変化する性質を持つ。眼科領域では涙腺閉鎖栓として、皮膚科領域では皮膚陥没充填剤として実用化されており、安全性は実証されている。◆H28年度は、このACIを経カテーテル的に異常血管へ留置するデリバリーシステムの開発と、適正濃度選択をin vitroに繰り返し実験した。◆デリバリーシステムは後方血流遮断目的である先孔式バルーンカテーテル内のマイクロカテーテルにACIを注入する方式を考案。またX線透視下での視認性と操作性を課題とした。

◆ACIゲル化の観察では、極細径のカテーテル内を押し出すには高粘調性で抵抗が強く押し出し注入は困難であった。濃度調整を試みたが解決に至らず、直径の異なるカテーテルを各々試した結果、径5Fr以上ではゲル化が始まっても押し出し可能であることが確認された。そこで先孔式カテーテル内に直接ACIを注入する方式にデリバリーシステムを修正した。◆ACIはX線透視下で視認されず血管内注入に際しては何らかのマーカーが必要となるため、選択的造影の際に注入する造影剤をマーカーとした。◆現在までin vitroにおける実験モデルキットを作成し、液状コラーゲン閉鎖栓およびデリバリーシステムの完成度を高めるべく検討を重ねている。今後、当初の計画通りに完成した液状コラーゲン閉鎖栓を用いた動物実験をいよいよ進めていく予定である。適正かつ実用的なアテロコラーゲン液状血管閉鎖栓のin vitroにおける開発段階で、濃度、性質、X線非透過性など多くの部分で想定していたものと異なった結果を示したため、その都度やり直す必要があった。これにより当初の予定より大幅な時間を要した。また動物実験に関して、当施設の動物実験舎の大幅な改築工事が予定されたため、現時点での動物を用いた実験開始を避けた。工事に際して使用した動物が全て使用出来なくなるためである。本研究は三段階の実施計画に基づく。第一段階はアテロコラーゲン液状血管閉鎖栓の作製、第二段階は血管内注入・留置システムの考案・作製および改良、第三段階は対象動物(ウサギ)を用いた動物実験である。H28年度、H29年度は当初の計画では第1段階、第2段階および第3段階に入り、数匹の動物実験が終了している予定であった。しかし後述する動物実験室、動物実験室のあるビル施設の改修工事がH29年度に計画され、H29年度末から工事が着工開始されたことから、計画の研究計画の変更が必要となった。H29年度までにin vitroでの検討として高研(株)より既に市販されているアテロコラーゲンを素材とする製品であるアテロコラーゲンインプラントと非イオン性造影剤とを様々な割合で混和させ、X線の非透過性とゲル化の有無を検討し、実験に適した混合割合の液体状血管閉塞栓を作製した。続いて血管を想定したビニールチューブに液体状血管閉塞栓を注入し37°Cの温度下でゲル化および血管閉塞ができることを確認した。それをもとにin vivoでの検討に入り、2羽のウサギに対しそれぞれ片側の腎動脈に経カテーテル的に血管閉塞栓を注入し腎動脈を閉塞させた。1羽は実験後5時間程度で死亡した。外部動物飼育委託施設での死亡であったため死因は不明であった。もう1羽については予定通り閉塞術施行1か月後に再造影を行った。しかし閉塞栓は腎動脈から脱落していた模様で血管閉塞は得られていなかった。この原因として閉塞栓と血管内皮の接着が不十分であった可能性が示唆された。次年度は実験施設改修工事のためX線透視下での検証が不可能となることから、上記の点を修正・改善すべくin vitroでの実験を行っていく予定である。本研究は動物実験である。アテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の作成と、デリバリーシステムの作成、in vitroでの実験に引き続き、ウサギを用いたin vivoでの閉鎖栓留置実験が中心である。この動物実験は大学内動物実験室で行うが、動物実験室のあるビル自体の改修工事、リニューアル化が大学事業として開始されることとなった。
微生物を介した土壌の炭素代謝に対する無機物質の影響

土壌微生物に対する鉄の影響を調べる目的で、溶存態二価鉄の酸化析出過程に細菌株を共存させ、鉄と細菌の凝集体を形成させた上で、培養液中での微生物活性を測定した。その結果、培養初期の二酸化炭素発生量が低下した。また、土壌に鉄溶解処理を施すことにより、培地上でコロニーを形成する細菌数が増加した。このことから、一部の細菌は、土壌中では鉄の影響を受け、増殖できない状態にあることが考えられた。本研究は、鉄、アルミニウム、マンガンなどを含む無機物質が、土壌微生物を介した有機物代謝に与える影響を明らかにすることを目的としている。本年は、1:無機物質付着処理を施した遺体有機物の無機化速度に関する検討、ならびに、2:土壌分離株への無機物質付着処理方法、について検討した。1:遺体有機物の無機化速度に及ぼす無機物質処理の影響:久保田ら(1986)の方法に準じて、各種アルミニウムによる処理を施した植物遺体を調製し、土壌に混合した。畑状態水分条件で土壌を培養した際の二酸化炭素発生量を測定したところ、アルミニウム処理により二酸化炭素発生量の低下が認められる場合があった。また、処理の過程で植物遺体を乾燥させることによって二酸化炭素の発生がさらに抑制される結果が得られた。以上の結果は、易分解性成分を含む生物遺体有機物にある種の形態あるいはある強度でアルミニウムが付着した場合、土壌中での有機物滞留時間が増すことを示唆するものと思われる。2:無機物質付着処理方法の検討:微酸性から中性の条件下で溶存態Fe (II)を含む溶液を調製する方法を検討した。その結果、脱酸素処理を施した緩衝溶液に第一鉄塩を溶解させ、Fe (II)により残存溶存酸素を除去する方法が簡便であった。現在、この方法で調製した含Fe (II)液による微生物細胞の付着処理を試験している。3:日本土壌肥料学会名古屋大会(9月)ならびに日本腐植物質学会講演会(11月)に参加し、関連専門分野の情報を収集した。本研究は、非晶質無機物質が、土壌微生物を介した有機物代謝に与える影響を明らかにすることを目的とする。本年は、1:供試微生物を土壌から分離し、2:分離株への無機物質付着処理方法を検討することによって、本研究での実験方法を確立した後に、3:無機物質付着により微生物が被る影響に関する予備的実験を行う計画とした。あわせて4:関連情報の収集も予定した。1:菌株分離:一般従属栄養微生物を黄色土より分離した。一部の分離株は16Sリボソーム遺伝子塩基配列を解析し、Pseudomonas属細菌と推定した。2(1):pH変化に伴う溶存無機物質の析出と菌体への付着:菌体をpH6緩衝溶液に懸濁させ、塩化アルミニウム水溶液ならびに硫酸第一鉄アンモニウム水溶液を滴下した。観察の結果、菌体はアルミ、鉄の析出物と接触しているが付着には至らないと判断した。(2)Eh変化に伴う溶存鉄の析出と菌体への付着:水田土壌を還元状態とし、得られる土壌水を第一鉄溶解液として供試した。これを菌懸濁液に加えて第二鉄を析出させたところ、一部の菌株では、菌体が析出した鉄凝集体に取り込まれたと考えられた。他の菌株では凝集体の形成は観察されなかった。3:前項で凝集体の形成が考えられた菌株について、密閉容器中、YG液体培地で培養し、二酸化炭素発生量を測定した。有意差は認められないものの、3反復の試験により、培養1.5-2日における二酸化炭素発生量が対照よりも低い値を示した。凝集体の形成を認めなかった菌株のデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、一部の菌株で第一鉄により活性が低下した。第二鉄として析出させた後に菌体と接触させた場合にも活性が低下する菌株が見られた。以上の結果は、土壌中でしばしば生じる溶存態第一鉄の酸化析出によって、微生物の種類によっては活性が低下することを示しており、今後の詳細な解析の必要性を示す点で重要と思われる。本研究は、鉄、アルミニウム、マンガンなどを含む土壌中の無機物質が、微生物による有機物分解と有機物を介した土壌中における炭素代謝に与える影響を明らかにすることを目的としている。本年は、土壌中の鉄が微生物の活動や微生物を介した土壌中の炭素代謝に及ぼす影響について、鉄溶解処理による細菌生菌数を調べることにより検討した。まず、溶解処理液として、クエン酸、EDTA、マロン酸、グリコール酸、HIDSの水溶液を、濃度10 mM, 50 mM,または100 mM、pH 6.5にて調製し、土壌(水田)に対して25倍量(v/w)加え、最長120分の振盪処理を行い、抽出された鉄の量を測定した。得られた結果を基に、鉄溶解処理条件を検討し、濃度50 mM、振盪時間560分とした。上記の条件で鉄溶解処理を行った土壌について、希釈平板培養法(R2A培地)により細菌数を計数した。

その結果、脱イオン水で振盪処理した土壌と比べて、EDTA処理により最大10%程度、HIDS処理により最大30%程度、細菌コロニー計数値が増加した。この結果から、EDTA処理ならびにHIDS処理では、土壌中の細菌表面に付着していた鉄が溶解除去され、培地上で増殖可能な細菌の数が増えた可能性が考えられた。すなわち、土壌中の細菌は、その表面を鉄で覆われるあるいは鉄が付着した状態で存在することにより、生きているが増殖できない状態にある可能性を示しているものと考えられた。既往の研究では、非晶質鉄と土壌有機物の量的相関が報告されているが、本研究で示された増殖できない微生物が、蓄積する有機物となるのかもしれない。また、土壌中における、生きているが培養できない微生物(viable but non-culturable; VBNC)の一部は、このような理由によるものかもしれない。土壌圏科学交付申請書に記載した「研究の目的:非晶質無機物質が土壌微生物を介した有機物代謝に与える影響について解明する」に対して、現状では、影響が観察される事例が見出された状況である。今後、さらに影響観察の事例を増やすとともに、その条件の詳細、影響が生じる機構などに関する解明が必要である。25年度実施計画に掲げた項目のうち、生細胞の活性に及ぼす影響については、今後、実験結果を蓄積する必要があることから、十分な進展状況とは言いがたい。また、同項目のうち、生細胞の生残性に及ぼす影響、微生物遺体の被分解性に及ぼす影響については、次年度より着手の予定である。以上の進捗状況から、上記の自己点検評価とした。研究の目的である「影響について解明する」は達成されていない。また、本年度の実施計画に限定した場合も、無機物質との相互作用に関係すると予想される供試菌株表面の特徴付け、無機物質・菌体間の関係(付着状況)の詳細な観察と評価、ガス分析計を用いた微生物活性・有機物代謝の実験系の確立において、十分な進展状況とは言いがたい。ただし、本年度に示した「非晶質無機物質が土壌微生物を介した有機物代謝に影響を与える場合がある」という結果は、今後の研究の遂行を意義づけるものとして評価できると思われる。これらの理由により、上の自己点検評価とした。1:鉄、アルミニウムとともに、土壌中での溶解、析出、微生物との相互作用の程度が著しいと考えられるマンガンも含め、共存・付着処理が微生物活性に与える影響を調べる。この際、供試微生物の菌株数を増やし、普遍的に、無機物質が及ぼす影響を見出せるよう実験計画立案の際、留意する。2:上の三元素を中心に、処理微生物の生残性を検討する。3:上の三元素を中心に、微生物遺体の被分解性を検討する。1:土壌中での溶解、析出、微生物との相互作用の程度が著しいと考えられる鉄をまず中心に、微生物活性・有機物代謝に与える影響を解析する。この際、供試微生物の菌株数を増やし、菌株の特徴的性質を重点的に調べ、無機物質による影響との関連性の解析を試みる。2:鉄以外の無機元素について、菌体への付着、影響評価に関する実験条件の検討を引き続きおこなう。アルミニウム、マンガン、ケイ素について検討する。3:無機物処理微生物の生残性に関する実験を開始する。得られる結果から、土壌中での微生物バイオマス態炭素の代謝に及ぼす無機物の影響について解析を試みる。4:ガス分析計を活用した実験系の確立を進める。
細胞周期制御因子p27KiP1の発現、代謝調節による肺癌遺伝子治療の開発

1.p27Kip1の発現量の変化による、肺癌細胞のアポトーシス及びネクローシスの制御adenovector及びsiRNA法によりP27Kip1の発現量を制御し、肺腺癌細胞A549におけるP27Kip1の細胞生存能への役割を検討した。P27Kip1の過剰発現は、ウイルス誘導性のアポトーシスを抑制した。逆に、P27Kip1の発現を抑制すると、アポトーシスが誘導された。このp27Kip1のアポトーシスからの防御能は、ウエスタンブロットによる検討から、細胞質局在している同蛋白が有するものと考えられた。2.p27Kip1の細胞内局在の制御機構前述の結果よりP27Kip1の細胞内局在のメカニズムについて検討した。P27Kip1のcDNAにmutagenesisを行い、セリンやチロシンにおけるリン酸化と細胞内局在の関連をA549細胞において調べたところ、S10,T157及びT198の各アミノ酸のリン酸化によりP27Kip1の細胞質内局在が誘導されることが示唆された。3.肺癌細胞におけるp27Kip1の細胞周期制御における役割p27Kip1の発現量をA549細胞において制御し、同蛋白の細胞周期制御における役割を検討した。強制発現ではp27Kip1は細胞周期停止の方向に機能したが、発現抑制は細胞周期の状態に変化を与えなかった。4.低栄養状態における肺癌細胞の生存能とp27Kip1との関連アミノ酸除去、あるいはグルコース除去の培地におけるA549細胞の生存能に対するp27Kip1の役割を検討した。肺非小細胞癌A549細胞において、アミノ酸及びグルコースの除去は異なった形で細胞増殖の停止に働き、またアポトーシス及びネクローシスを誘導していた。この低栄養下での細胞死誘導は、細胞質に存在するp27Kip1により抑えられている可能性が示唆された。RT-PCR法により得られp27Kip1のcDNAについてsense及びantisenseを真核細胞にて発現するplasmid及びadenovectorに挿入し、それぞれをE. coli及びHEK293により増殖、さらに精製し、遺伝子導入の準備を行った。同様に、RT-PCR法によりP27Kip1のdegradationを制御する蛋白をコードするSKP2についてcDNAのクローニングを行い、得られたcDNAについてsense及びantisenseをベクターを構築した。2.p27Kip1の肺癌細胞における蓄積の機序に関する検討、及び細胞への遺伝子導入によるP27Kip1の発現量を制御することによるこれら遺伝子産物の生物学的機能解析p27Kip1,SPK2などのcDNAを順及び逆方向に組み込み作成したplasmid及びadenovectorをA549などの肺癌由来細胞に遺伝子導入を行い、p27Kip1及びp27Kip1のdegradationを制御する蛋白の細胞内蓄積をWestern blottingにて確認し、細胞の生死及びcell cycle statusの変化などをFACS caliberにて解析の予定であり、そのため、まず刺激しない状態において、またp27Kip1をLipofection法にてplasmidを用い遺伝子導入した状態において肺癌細胞A549及び正常成人肺由来線維芽細胞HFL-1におけるp27Kip1の発現について、Western blottingにて検討を行った。またLipofection法における同細胞への遺伝子導入についてはEGFPを発現する別のplasmidを用い、蛍光顕微鏡により確認した。RT-PCR法により得られたp27Kip1のcDNAについて真核細胞にて発現するadenovectorを作成、またp27の発現を抑制するsiRNAを設計し作成した。

実際遺伝子導入を肺癌細胞のcell lineであるA549細胞に導入し、Western blottingにて機能を確認した。同様に、RT-PCR法によりP27Kip1のdegradationを制御する蛋白をコードするSKP2についてcDNAのクローニングを行い、得られたcDNAについて真核細胞にて発現するadenovectorを作成した。2.細胞周期制御因子p27Kip1の肺癌細胞における蓄積の機序に関する検討、及び細胞への遺伝子導入によるP27Kip1の発現量を制御することによるこれら遺伝子産物の生物学的機能解析p27のadenovectorによるA549cell lineへの遺伝子導入により、同遺伝子が細胞周期をA549細胞においても抑制すること、また既報告と異なりアポトーシスの誘導は有意には見られなかったことを、FACS caliberにて解析した。3.p27のリン酸化部位の変異導入による機能の変化p27の細胞増殖抑制能などをつよめた遺伝子を設計するため、p27のリン酸化部位であるS10,T157,T187,T198の変異を導入し、細胞内におけるP27の分布、実際の細胞周期への影響の相違などにつき検討中である。1.p27Kip1の発現量の変化による、肺癌細胞のアポトーシス及びネクローシスの制御adenovector及びsiRNA法によりp27Kip1の発現量を制御し、肺腺癌細胞A549におけるp27Kip1の細胞生存能への役割を検討した。P27Kip1の過剰発現は、ウイルス誘導性のアポトーシスを抑制した。逆に、p27Kip1の発現を抑制すると、アポトーシスが誘導された。このp27Kip1のアポトーシスからの防御能は、ウエスタンブロットによる検討から、細胞質局在している同蛋白が有するものと考えられた。2.p27Kip1の細胞内局在の制御機構前述の結果よりp27Kip1の細胞内局在のメカニズムについて検討した。P27Kip1のcDNAにmutagenesisを行い、セリンやチロシンにおけるリン酸化と細胞内局在の関連をA549細胞において調べたところ、S10,T157及びT198の各アミノ酸のリン酸化によりp27Kip1の細胞質内局在が誘導されることが示唆された。3.肺癌細胞におけるp27Kip1の細胞周期制御における役割p27Kip1の発現量をA549細胞において制御し、同蛋白の細胞周期制御における役割を検討した。強制発現ではp27Kip1は細胞周期停止の方向に機能したが、発現抑制は細胞周期の状態に変化を与えなかった。4.低栄養状態における肺癌細胞の生存能とp27Kip1との関連アミノ酸除去、あるいはグルコース除去の培地におけるA549細胞の生存能に対するp27Kip1の役割を検討した。肺非小細胞癌A549細胞において、アミノ酸及びグルコースの除去は異なった形で細胞増殖の停止に働き、またアポトーシス及びネクローシスを誘導していた。この低栄養下での細胞死誘導は、細胞質に存在するp27Kip1により抑えられている可能性が示唆された。