hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体ー金属接触構造のヘリウム準安定原子と吸着キセノン光電子による微視的研究

金属ー半導体界面構造を決めている電子論的因子を探る目的で,半導体表面上へ金属原子が単原子層レベルで吸着していく過程に沿って,最表面領域の原子構造と局所電子状態を並行して追跡する研究を進めた.電子状態のモニタ-には準安定原子脱励起分光(MDS)を用い,He*原子がオ-ジェ脱励起される系として,半導体表面上のアルカリ金属吸着系を選んだ.本年度は,予め酸化させた表面上吸着したアルカリ金属原子の振舞いの研究,及び入射He*原子の速度制御を可能にした新しい電子分光装置の試作を行った.最表面の原子構造をモニタ-するため,吸着キセノン原子の見る静電ポテンシャルを測定する方法の開発を進めているが,まだデ-タを得る段階に至っていない.本年度,イオン散乱分光(ISS)を用いて,上記と同じSi(100)表面上のアルカリ金属吸着過程を対象に,原子構造の解析を行った.以下,得られた結果を列挙する.1.酸化Si(100)表面へのCsと酸素を共吸着させたときのMDSスペクトルより,吸着Csの6s電子は,Siと結合しているOに影響されず,清浄Siに吸着したときとほゞ同じ電子状態を保つことが分かった.この6s電子は,気相から飛来した酸素分子に直接移行することにより,酸素の解離を促進させる.2.He^+イオンとアルカリ金属(Na)原子の電荷移行衝突を利用した準安定原子源から100ー200eVのHe^*ビ-ムを得て,これをK吸着層に照射した.得られたMDSーK4sピ-ク位置は,熱速度He*ビ-ムによるものより約0.5eV高結合エネルギ-側にシフトした.3.Si(100)表面へのアルカリ金属吸着過程に沿ってISSの散乱イオン強度を測定した結果,吸着原子が,2つの異なるサイトに2段過程で吸着して行くことが判明した.金属ー半導体界面構造を決めている電子論的因子を探る目的で,半導体表面上へ金属原子が単原子層レベルで吸着していく過程に沿って,最表面領域の原子構造と局所電子状態を並行して追跡する研究を進めた.電子状態のモニタ-には準安定原子脱励起分光(MDS)を用い,He*原子がオ-ジェ脱励起される系として,半導体表面上のアルカリ金属吸着系を選んだ.本年度は,予め酸化させた表面上吸着したアルカリ金属原子の振舞いの研究,及び入射He*原子の速度制御を可能にした新しい電子分光装置の試作を行った.最表面の原子構造をモニタ-するため,吸着キセノン原子の見る静電ポテンシャルを測定する方法の開発を進めているが,まだデ-タを得る段階に至っていない.本年度,イオン散乱分光(ISS)を用いて,上記と同じSi(100)表面上のアルカリ金属吸着過程を対象に,原子構造の解析を行った.以下,得られた結果を列挙する.1.酸化Si(100)表面へのCsと酸素を共吸着させたときのMDSスペクトルより,吸着Csの6s電子は,Siと結合しているOに影響されず,清浄Siに吸着したときとほゞ同じ電子状態を保つことが分かった.この6s電子は,気相から飛来した酸素分子に直接移行することにより,酸素の解離を促進させる.2.He^+イオンとアルカリ金属(Na)原子の電荷移行衝突を利用した準安定原子源から100ー200eVのHe^*ビ-ムを得て,これをK吸着層に照射した.得られたMDSーK4sピ-ク位置は,熱速度He*ビ-ムによるものより約0.5eV高結合エネルギ-側にシフトした.3.Si(100)表面へのアルカリ金属吸着過程に沿ってISSの散乱イオン強度を測定した結果,吸着原子が,2つの異なるサイトに2段過程で吸着して行くことが判明した.
口腔癌細胞におけるPTHrP遺伝子の活性型ビタミンDによる転写調節の機構

Northern blot解析により、all trans-retinoic acid(tRA)は、口腔癌細胞HSC-3のPTHrP mRNA発現を用量依存的に抑制することが明らかとなった。さらに、HSC-3細胞から培地へのPThrP分泌もtRAにより用量依存的に抑制された。また、HSC-3細胞をtRA(10^<-7>M)で24h処理し、DRBを添加した後のPTHrP mRNA発現量の経時変化を調べたところ、コントロール群と比較して有意な差異はみられなかった。これより、tRAはPTHrP mRNAの安定性には影響を与えないことが判った。次に、ヒトPTHrP遺伝子の下流側プロモーター(P2/P3)の領域を含む1368bpの遺伝子フラグメント(P3の転写開始点を+1として-1353+15bp)をルシフェラーゼベクター(PGV-B2)の上流に組み込んだレポータープラスミドを作成し、リポフェクション法によりHSC-3細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼアッセイの結果、1,25-dihydroxyvitamin D_3(1,25(OH)_2D_3)(10^<-8>M)を48h作用させた細胞では転写活性の有意な低下が認められた。また、プロモーターの上流側の領域を欠失させた3種類のdeletion construct(-937+15,-773+15,-476+15)を作成した。現在、これらのconstructを用いて、1,25(OH)_2D_3による負の応答領域の検索を行っている。Northern blot解析により、all trans-retinoic acid(tRA)は、口腔癌細胞HSC-3のPTHrPmRNA発現を用量依存的に抑制することが明らかとなった。また、10^<-9>10^<-7>において、tRAと9-cis-retinoic acidの作用を比較したところ、同程度の抑制効果を示した。さらに、tRAの作用のtime course(024h)を検討したところ、1hからPTHrPmRNA発現量の有意な低下がみられ、12hで発現抑制は最大となり、24hにおいても同様な抑制が持続していた。次に、ヒトPTHrP遺伝子に存在するプロモーターのうち、HSC-3細胞において最も使用頻度の高いプロモーターであることが判明した下流プロモーター(P3)の領域を含む1.37kbの遺伝子フラグメントを、HSC-3細胞から調製したゲノムDNAを用いて、proofreading機能を有するDNAポリメラーゼを使用したPCRにより増幅した。増幅した遺伝子フラグメントを、A-tail付加を施した後、pCR2.1vectorを用いてクローニングした。dideoxy chain-termination法により、塩基配列を確認した。そして、クローニングした遺伝子フラグメントをluciferase vectorの上流に組み込んだ。
せん断型疲労き裂の進展特性に及ぼすき裂面相互干渉の影響の定量的評価に関する研究

本研究では,1サブミクロンオーダのすべりを実現し,き裂面における摩擦特性を明らかにする実験,2せん断型疲労き裂の基礎的な進展特性を理解するためのねじり疲労試験,3単純ねじり負荷に重畳してき裂面に対し垂直な応力を負荷し,摩擦抵抗がき裂の進展下限界条件に及ぼす影響を明らかにする実験を行う.最終的には上記の実験で得られた知見を統括し,き裂面の摩擦抵抗を考慮したき裂の力学モデルの構築を行い,定量的な評価手法を確立する.本研究では,1サブミクロンオーダのすべりを実現し,き裂面における摩擦特性を明らかにする実験,2せん断型疲労き裂の基礎的な進展特性を理解するためのねじり疲労試験,3単純ねじり負荷に重畳してき裂面に対し垂直な応力を負荷し,摩擦抵抗がき裂の進展下限界条件に及ぼす影響を明らかにする実験を行う.最終的には上記の実験で得られた知見を統括し,き裂面の摩擦抵抗を考慮したき裂の力学モデルの構築を行い,定量的な評価手法を確立する.
細胞が産生する浸透圧調節分子と人工高分子化合物を用いた細胞モデル実験系の構築

生体分子の機能に影響を及ぼす因子の一つに、周辺の分子環境がある。細胞内は生体分子が非常に混み合った分子クラウディング状態にあるに対し、生化学的な実験が行われる試験管内環境は分子濃度が極めて希薄である。そのため、試験管内での実験結果をもとにして、細胞での生体分子の物性を解明することが困難であることが明らかになりつつある。そこで本研究では、1細胞核の化学環境を模倣するために、領域内の共同研究者が設計した負電荷高分子を用いて核内に高濃度に存在するゲノムを模倣した。また、2細胞質を化学模倣するために、細胞質に数百mMから数M程度も存在する浸透圧調節分子を用いて細胞を化学模倣した実験系を構築した。これらの分子環境において、核酸の構造安定性を定量解析したところ、核酸の非標準構造が特異的に安定化されることが明らかとなった。3さらにこれらの知見をもとにして、四重らせん構造リガンドを細胞内で放出するシステムを構築した。これらの成果の一部は、掲載論文誌の表紙として取り上げられ、新聞報道もされた。これらのことから、研究の最終年度として、科学的・社会的にインパクトのある成果が得られたといえる。また、本研究課題を発展させた成果も得られつつあることから、研究開始当初に設定した目標を十分に達成したといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内環境として最も特徴的な因子である分子クラウディングを誘起するものとして重要なのが、細胞内に高濃度に存在する浸透圧調節分子である。また細胞核内では、正電荷をもったヒストンタンパク質が高濃度に存在している。そこで本研究では細胞モデル系の構築に向けて、(1)細胞核内と(2)細胞質内の分子環境の精密化学模倣、およびその核酸構造に対する効果を検討した。(1)細胞核内環境の化学模倣:領域内共同研究としてLysを主鎖骨格としてもち、デキストランを側鎖にグラフと重合したポリマー(PLL-g-Dex)の提供を受け、核酸構造に対する効果を定量的に検討した。その結果、PLL-g-Dexは、核酸の非標準構造であるパラレル型二重らせん構造や三重らせん構造を特異的に安定化することが示された。さらに、二重らせん構造と三重らせん構造のスイッチングを制御することにも成功した。これらの成果は、細胞核内で核酸の非標準構造が安定に存在することを示唆している。(2)細胞質内環境の化学模倣:細胞質に高濃度に存在する浸透圧調節分子や細胞膜の親水性部位には、両性イオンのものが多い。そこで、両性イオンの浸透圧調節分子と、領域内共同研究者から提供をうけたホスホリルコリン基(細胞膜の親水性部位)を含むMPCを用いて分子クラウディング環境を惹起し、核酸構造に対する効果を定量した。その結果、両性イオンによる分子クラウディングは、核酸の標準構造である二重らせん構造を不安定化した。一方、両性イオンは、核酸の非標準構造である四重らせん構造を安定化させた。特にMPCは、モル濃度当たりの四重らせん構造に対する安定化効果が極めて高いことが示された。これらの成果は、四重らせん構造の安定化によるバイオテクノロジーやナノテクノロジーに展開できる。細胞内の生体分子反応の化学的理解には、細胞内の分子環境を化学的に解明し、生体分子反応パラメータと細胞内分子環境パラメータの相関を解明する必要がある。本研究では、二か年のうちに、次の目標を掲げて検討を進めている。(1)天然の浸透圧調節分子と共に様々な官能基をもつ合成高分子を組み合わせて細胞質内の分子環境パラメータを系統的に変化できる実験系を構築する。(2)この実験系において、RNAの高次構造安定性と分子間反応性(分子間相互作用)を定量化する。(3)さらに本細胞モデル実験系での測定結果と、領域内の共同研究等による細胞内の測定結果を比較することで、細胞内での生体分子反応パラメータと細胞内環境パラメータの相関を解明する。

特に、研究初年度においては、上記課題(1)を中心に検討を進め、細胞質内と細胞核内の分子環境の精密模倣を達成した。さらに本模倣系を用いて、核酸構造の熱力学的安定性を定量評価することで、課題(2)の生体分子反応パラメータと細胞内環境パラメータの相関に関する知見も得られた。以上のように、本研究課題は、当初の研究計画に従い遂行され、おおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究初年度においては、研究計画の基礎となる、細胞環境の模倣系が構築できた。そこで平成27年度においては、当初の計画通りに、複雑な核酸構造に対する浸透圧調節分子やカチオン性ポリマーの効果を定量化する。。同時に、細胞モデル実験系を活用することで、細胞内でがん関連遺伝子やmRNAの発現と高次構造を同時に検出できるシステムを構築し、DNAやmRNAが形成する高次構造の生物学的役割を解明することを試みる。平成26年度に開始した領域内の共同研究に関しても、すでに多くの学会発表などを行っている。へ一斉27年度には、このような共同研究も積極的に遂行し、「細胞内での生体分子反応パラメータと細胞内環境パラメータの相関を解明する」という最終目標の達成を試みる。研究成果の内容や論文発表、学会発表などについて発信しています。本課題をはじめとする研究室で得られた成果の公開や告知を行っている。
口腔インプラント治療を受けた介護高齢者の問題点の抽出ならびにリカバリー法の開発

口腔インプラント治療を受けた高齢者では,認知症や悪性腫瘍,脳血管障害といった全身状態の変化により定期検診に応じられなくなり,予後を追跡できなくなる患者が少なくないことが明らかとなった.また,良好な予後を呈する高齢者も多い一方で,全身状態が悪化し追跡不能となった患者の中には,インプラント義歯の破折やセルフケアの悪化によるインプラント体周囲の炎症所見が観察された.昨年度に行った過去20年間に当科で口腔インプラント治療を受けた現在年齢65歳以上の全高齢者の診療録調査にて抽出された,リコールできていない61名の高齢者の追跡調査を行った.このうち10名(平均年齢79.5歳,男性6名,女性4名)は体調不良を理由に来院していなかった.そして10名のうち3名は死亡していた.生存していた7名のうち,アルツハイマー型認知症を有していた1名は,脳梗塞後に右側片麻痺および高次機能障害を生じ,セルフケアは困難となっていた.しかし,インプラント体は著名な骨吸収もなく機能していた.一方,残りの6名のうち悪性腫瘍の既往歴を有する1名(82歳,女性)はインプラント体が脱落し,欠損のままとなっていた.また,1名(82歳,男性)はインプラント体周囲の骨吸収が著しく,動揺は無いもののスレッドが大きく露出し,プラークが多量に付着し,炎症を起こしていた.さらに,2名(83歳,82歳,男性)はインプラント体に問題は無いものの,上部構造の前装部分は破折していた.これらの患者は全員がなんらかの専門的な口腔ケアを受けてはいたものの,プラークコントロールは悪く,Plaque control recordは平均72%であった.これらの結果および診査に携わった歯科医師からの意見を元に,口腔内診査用紙,インプラント体の評価シートおよびアンケートのブラッシュアップを行い,要介護高齢者を対象としたインプラント評価シートを完成させた.追跡調査によって,全身状態が悪化した高齢者にインプラント体の脱落,骨吸収や炎症,前装破折といった問題が起こり得ることが明らかとなった.今後は完成した評価シートを用いて,介護施設に協力を呼びかけ,さらに多くの高齢インプラント患者の予後調査を行う予定である.平成24年度に作成した口腔内診査用紙,インプラント体の評価シートおよびアンケートの評価プロトコルを用いて,引き続き当科で口腔インプラント治療を受けた高齢者の追跡調査を行った.調査対象61名のうち,13名(平均年齢71.4歳,男性7名,女性6名)が体調不良を理由に来院していなかった.13名のうち,平成25年度に新たに来院が途絶えた3名は,男性1名,女性2名であった.このうち追跡調査ができたのは69歳の女性1名で,認知機能の低下によって来院困難となっていた.口腔内の清掃状態は悪く,Plaque control recordは57%であったが,インプラント体周囲には著明な炎症は無かった.また,岡山市内の要介護高齢者施設にて全数調査を行った.対象は,平成25年7月に要介護高齢者施設の通所サービスを利用した要支援・要介護高齢者および要介護高齢者施設に入所している要介護高齢者のうち,研究参加に同意が得られたものとした.解析対象は216名(平均年齢:82.9±9.4歳,男/女:63/153名)となり,これらを対象に,口腔内診査,介護・医療記録調査(全身疾患,Barthel Index,臨床的認知症尺度[CDR-J],摂食量,口腔ケアの自立度)を行った.対象の平均残存歯数は,9.7±10.0本,平均機能歯数は24.7±6.9本であった.また,216名の内うち105名が認知症と判定され,軽度が51名,中等度が20名,重度が34名であった.口腔内にインプラント体を有する高齢者は1名しかおらず,過去に下顎無歯顎にブレードタイプのインプラント義歯を装着していたが,脳梗塞の後遺症で要介護状態となった後に除去したとのことであった.現在は下顎右側第一大臼歯部にブレードタイプのインプラント体が1歯分残存し,義歯の支台歯となっていた.インプラント体周囲にはプラークが付着し,インプラント体が一部歯肉から露出していたものの,動揺は無かった.今後,これらの成果を論文発表する予定である.口腔インプラント治療を受けた高齢者では,認知症や悪性腫瘍,脳血管障害といった全身状態の変化により定期検診に応じられなくなり,予後を追跡できなくなる患者が少なくないことが明らかとなった.また,良好な予後を呈する高齢者も多い一方で,全身状態が悪化し追跡不能となった患者の中には,インプラント義歯の破折やセルフケアの悪化によるインプラント体周囲の炎症所見が観察された.口腔インプラント治療を受けた高齢者に起こる問題点を抽出するため,過去20年間に当科で口腔インプラント治療を受けた高齢者の診療録調査を行った.口腔インプラント治療を受けた全患者のリストから,現在年齢65歳以上の高齢者を抽出したところ,334名(平均年齢71.9歳,男性128名,女性206名)であった.これらの対象患者のうち,61名(18.3%)の患者は2011年12月31日の時点で1年以上来院しておらず,リコールできていないことが明らかとなった.そして,それらの患者のうち3名は,診療録から認知症を有していることがわかった.また,2名が悪性腫瘍で入院中または自宅療養中であることがわかった.

さらに1名がパーキンソン病を発症しており,1名が脳出血後の後遺症を有していた.3名が体調不良を原因に来院できなくなったのちに,連絡がつかなくなっており,3名が死亡していた.すなわち,現在追跡ができない高齢インプラント患者のうち,約21%が何らかの全身状態の変化が原因で追跡できないという結果であった.診療録調査によって,高齢者では認知症や悪性腫瘍,脳血管障害といった全身状態の変化によりリコールに応じられなくなり,その後予後を追跡できなくなる患者が少なくないことが明らかとなった.今後は,加齢に伴い全身疾患を患った患者や要介護の状態になった高齢者の在宅,施設訪問による予後調査を行い,高齢インプラント患者の問題点をさらに明確にし,その対応策に関しても模索していく予定である.当科で口腔インプラント治療を受けた現在年齢65歳以上の全高齢患者の診療録調査によって,追跡不能患者の約2割が,何らかの全身状態の変化が原因で追跡できないということがわかった.今年度はこれらの高齢者の口腔内診査および全身状態の診査を行い,インプラント義歯に生じる問題点の詳細が明らかになった.申請時の予定では,平成24年度内に介護施設におけるサンプリングを開始する予定であったが,対象高齢者は転居や入院中,施設入所などの理由で調査開始までに時間を要する者が多かったため,今年度は実施できなかった.しかし,インプラント評価シートのブラッシュアップは終了しているうえ,協力いただける介護施設が決まっており,平成25年6月頃から介護施設でのサンプリングを実施する予定で,計画は概ね達成していると考える.当科で口腔インプラント治療を受けた現在年齢65歳以上の高齢患者の全数調査によって,追跡不能患者の約2割が,何らかの全身状態の変化が原因で追跡できないということがわかった.現在,これらの患者の現状を追跡調査し,インプラント体やインプラント義歯の予後を把握するプロトコルのブラッシュアップを行っている.このプロトコルには,現在の全身疾患やADL,認知症の程度,食形態,栄養状態など,全身状態を把握する診査を含める必要があるため,過去の文献から示唆を得るとともに,実際に介護施設で歯科治療にあたっている歯科医師の意見を集約しながら,作成を進めている.申請時の予定では,追跡調査も平成23年度内に行う予定であったが,包含基準に該当する対象数が多く,診療録調査に時間を要したため,今年度は実施できなかった.しかし,ブラッシュアップしたプロトコルを用いた診査は,平成24年度9月頃に実施できる予定であり,計画は概ね達成していると考える.1.岡山県下の老人介護施設ならびに歯科診療所に研究参加の依頼平成24年度に追跡調査を行った当科の高齢患者のみでは,インプラント義歯を装着している要介護者の数は十分ではなかった.そこで,対象者数を増やして介護現場におけるインプラント義歯装着高齢者の実態を把握するため,岡山老人施設協会所属の介護施設および岡山県下の当科関連歯科診療所に対し,本研究への参加を依頼する.2.研究参加に同意していただいた要介護高齢者に対し,当科の口腔インプラント患者の追跡予後調査によってブラッシュアップされたインプラント評価シートを用いて臨床診査を行う.さらに,口腔衛生管理者へ介護負担度に関するアンケートを実施する.そして,インプラント義歯装着患者と可撤性床義歯装着患者ならびに義歯非装着患者の問題点を抽出し,比較する.さらに,これらの全高齢者を対象に,インプラント体の有無が臨床診査結果や口腔衛生管理者の負担度にどのような影響を与えるかを,多変量解析を用いて明らかにする.1.平成23年度に抽出した,口腔インプラント治療を受けた追跡不能
神経細胞におけるＥｒｂＢ４受容体の切断機構の解明

ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)は、視床下部のGnRHニューロンから分泌される。GnRHニューロンの機能を解明するために、GT1-7細胞を用いてGnRH受容体刺激によるERKの活性化およびErbB4切断の分子機構を検討した。その結果、GnRH受容体刺激によるERKの活性化にはGq/11タンパク質、PKC、PKD、PYK2そしてFynが関与することが示された。一方で、ErbB4の切断にはPKD、PYK2、Fynは関与しないことが明らかになった。これらの結果は、両反応が異なる分子機構により起こることを示している。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)は、視床下部に存在するGnRHニューロンによって産生・分泌される。GnRHの産生・分泌の調節は、正常な性成熟にとって非常に重要な役割を担っており、GnRHニューロンの機能を統合的に理解することは重要である。本研究ではGnRHニューロンの細胞培養株であるGT1-7細胞を用いて、GnRH受容体刺激による細胞内のシグナル伝達機構について研究を行い、GnRH受容体の刺激によってERKの活性化およびErbB4が切断されることを明らかにした。それら機構を詳細に解析した結果、(1)Cキナーゼのダウンレギュレーション実験では、ErbB4の切断が抑制されたことから、ErbB4の切断にCキナーゼが関与することが分かった。また、GnRH刺激によるERKの活性化では、PKCδがPKDを活性化することが明らかとなった。これらCキナーゼはGnRH刺激によって膜に局在し、活性化されることが示唆された。(2)GnRHおよびPMAの刺激によって、速やかにPKDがダウンレギュレーションされることを見出した。(3)免疫沈降実験によって、PYK2と相互作用するSrcファミリーのアイソフォームがFynであることを示す結果が得られた。(4)昨年度、DNAマイクロアレイによる網羅的な発現解析によって、GnRH刺激後に発現の変動する遺伝子群を同定した。今年度は、それら遺伝子の発現をRT-PCR法およびウエスタンブロッティングにて確認した。MAPキナーゼの脱リン酸化酵素(DUSPs)のうち、少なくとも2種類のアイソフォームの発現がGnRH刺激後3060分で増加していることが分かった。これら研究によって、GT1-7細胞ではGnRH受容体の刺激によってERKが活性化され、その後ERKの脱リン酸化酵素の発現が上昇することが示唆された。神経細胞に存在する神経伝達物質とその受容体の役割を明らかにすることは、精神神経疾患の発症機構を解明するためにも重要である。そこで、視床下部神経細胞由来のGT1-7細胞を用いて、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の刺激による細胞内シグナル伝達機構を詳細に解析した。(1)ERKの活性化に関与する因子: GT1-7細胞では、GPCRのひとつであるゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)受容体の短時間の刺激によってMAPキナーゼの中のERKが活性化される。阻害剤とsiRNAを用いた解析によって、この機構にはGタンパク質のGqあるいはG11が関与し、PKCα、PKCδ、PKD、PYK2、そしてSrcファミリーの関与も明らかとなった。(2)ErbB4の切断に関与する因子: GnRH受容体の長時間の刺激では、ErbB4が切断されて細胞質側には80k断片が蓄積する。この機構にもGq/11とPKCが関与することが分かった。一方で、PKD、PYK2、Srcファミリーは関与しないことが分かった。(3)網羅的な発現解析: DNAマイクロアレイによる網羅的な発現解析によって、GnRH受容体の刺激によって、MAPKカスケードに関与する遺伝子の発現が顕著に変動することが明らかとなった。興味深いことに、MAPKの脱リン酸化酵素(MKPs)の発現も上昇していた。以上の結果から、GnRH刺激によってErbB4はトランスに活性化されて、ERKを活性化する。また、ErbB4の切断によってリガンドのひとつであるNRG1との結合が阻害され、NRG1-ErbB4シグナル伝達が抑制されると考えている。NRG1とErbB4は統合失調症の候補遺伝子として知られているが、疾患発症に関する詳細は分かっていない。ErbB4の切断機構の解明によって、発症機序を解明する新たな切り口になると考えている。GnRH受容体刺激によるERKの活性化およびErbB4の切断機構には、Gタンパク質のGqあるいはG11が関与すること見出した。阻害剤およびsiRNAを用いた実験によって、ERKの活性化には、PKC、PKD、PYK2が活性化されることが分かった。また、SrcファミリーはGnRHの刺激に関わらず活性化しているが、その阻害剤であるダサチニブで細胞を処理した場合、GnRH刺激によるERKの活性化は顕著に抑制された。

よって、SrcファミリーはGT1-7細胞では常に活性化された状態で存在し、PYK2の活性化に働いていることが示唆された。さらに、DNAマイクロアレイを用いてGnRH刺激後の遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、発現が有意に変動している遺伝子群には、MAPKカスケードに含まれる遺伝子が顕著に見られた。また、興味深いことに、MAPキナーゼの脱リン酸化酵素(MKPs)遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなった。つまり、GnRH受容体刺激によって、MAPキナーゼの活性化と同時にその脱リン酸化酵素の発現が上昇しているという新しい知見が得られた。GnRH受容体刺激によるMKPsの制御については、ほとんど分かっていないため、今後の進展が期待される結果である。実験の進捗状況として、DNAマイクロアレイの実験を優先に行ったため、24年度に予定していた分泌型NRG1とHB-EGFの定量は今後進める方針である。免疫沈降実験による因子間の相互作用の解析は進行中である。GnRH受容体の刺激によって、Gタンパク質が活性化され、PKCを経てERKの活性化とErbB4の切断が生じることが分かってきた。これら二つの機構には異なる因子が関わっていることも明らかとなった。ERKの活性化機構には、GnRH受容体を介したErbB4のトランスな活性化が関与すると考えられるが、ErbB4の活性化因子は分かっていない。今後は、以下の4点に着目して研究を進展させる。(1)GT1-7細胞では、ErbB4のリガンドであるHB-EGFとNRG1が発現していることから、そのいずれかがErbB4の活性化に働くと考えられる。そのため、HB-EGFあるいはNRG1のELISAキットを用いて、GnRH刺激によって細胞外へ分泌型として生成される因子を同定する。(2)マイクロアレイの発現解析によって得られた遺伝子群について、定量RT-PCRおよびウエスタンブロッティング法によって、発現が上昇していることを確認する。(3)これまでの研究によって、GnRH刺激によるERKの活性化機構へPKCα、PKCδ、PKD、PYK2およびSrcファミリーの関与が明らかとなった。そこで、これら因子の相互作用を免疫沈降実験によって明らかにする。(4)ErbB4とNRG1は統合失調症との関わりが知られているが、発症機構における役割は分かっていない。ErbB4の切断によるNRG1のシグナル伝達の破綻が疾患の引き金となる可能性を検討するために、弧発性の統合失調症での機能異常が報告されているドパミンやグルタミン酸受容体の刺激によってErbB4が切断されるか検討する。ErbB4のトランスな活性化および切断機構に関与することが明らかとなった因子について、それらの相互作用を検討するために、ErbB4、EGFR、PYK2、PKD、Srcファミリーに対する抗体を用いて免疫沈降実験を行う。そのための一次抗体および検出試薬などの一般試薬が必要となる。ErbB4のトランスな活性化に関わるリガンドを明らかにするために、市販のマウスHB-EGFおよびNRG1のELISAのキットを購入する。
機能性small RNAの転写後調節機構と相互発現調節機構の解明

Vibrio alginolyticusが保有する4つのsmall RNA(sRNA1、sRNA2、sRNA3、sRNA4)の新規の発現調節機構を明らかとするため、sRNAの転写を調節するタンパク質の同定を試みた。sRNA遺伝子の上流領域のDNA断片に結合するタンパク質をプルダウンした結果、用いたsRNAの上流領域DNAによって特異的にプルダウンされるタンパク質のバンドが見出された。それらのバンドに含まれるタンパク質を質量分析法により同定した。その結果、sRNA1の上流領域DNAに特異的にプルダウンされたバンドは、ArcA/ArcB二成分制御系のレスポンスレギュレーターであるArcAと同定された。そこで、大腸菌発現系を用いてArcAを生産し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。得られたArcAの4つのsRNAの上流領域のDNA断片の結合をゲルシフト法によって調べた。その結果、ArcAはsRNA1の上流領域のDNA断片にのみ結合し、その他のsRNAの上流領域のDNA断片には結合しなかった。さらにsRNA1の上流の種々の領域のDNA断片を合成し、ArcAとの結合をゲルシフト法により調べた結果、ArcAはsRNA1の転写開始点の-88から-64の領域に結合した。この領域の塩基配列を解析した結果、他の細菌で報告されているArcA結合配列に類似の配列が保存されていることが明らかになった。その他のsRNAの上流領域には、ArcA結合配列と予想される配列は存在しなかった。arcA遺伝子破壊株を作製し、sRNA1の発現量を親株と比較した。その結果、長時間培養した際にarcA欠失株中のsRNA1の発現量は、親株よりも約15倍増加した。以上の結果よりArcAは、sRNA1の上流領域のArcA結合配列に結合し、sRNA1の発現を調節すると考えられる。V. alginolyticusが保有するVarS/VarA二成分制御系および他の細菌におけるそのorthologueは、sRNAの転写調節を介して、制御下の遺伝子の発現を調節する。細菌は、VarS/VarA系のorthologueが調節するsRNAを複数保有するが、これまでに報告されている全てのsRNAの発現は、VarS/VarA系のorthologueによって正に調節されており、それらは単純なコピー(redundant)と考えられている。V. alginolyticusはVarS/VarA系が調節するsRNAを4つ保有するが、それらの発現を調べた結果、VarS/VarA系によってsRNA2の発現のみが正に調節され、その他の3つのsRNAの発現は負に調節されると明らかとなった。この結果は、本菌の4つのsRNAの発現がそれぞれ異なった調節を受けることを示しており、これまでに報告のない発現調節を受けると示唆された。そこで、sRNAの上流領域に結合し、その発現を直接調節するタンパク質の同定を試みたところ、各sRNAの上流領域に特異的に結合すると考えられるタンパク質が同定された。まず初めに、ArcAについて解析した結果、sRNA1の発現がArcAによって調節されることが明らかとなった。これまでにVarS/VarA系のorthologueが調節するsRNAの発現がVarS/VarA系以外によって調節されることを示した報告はない。本研究の結果は、VarS/VarA-sRNA系がVarS/VarA系からのシグナルのみでなく、他の種々の系からのシグナルによっても調節されることを示す初めての結果であり、その全容解明に向け研究が大きく展開している。他の細菌において、VarS/VarA二成分制御系のorthologueが調節する複数のsRNAは、これまで単純なコピー(redundant)と考えられてきた。我々は、V. alginolyticusのVarS/VarA系が調節する4つのsRNAの発現がVarS/VarA系によって異なる発現調節を受けることを見出したのを端緒として、4つのsRNAの発現調節機構の全容解明を目指した研究を開始した。これまでにArcAがsRNA1の発現調節に関わることを明らかとした。ArcAは、ArcA/ArcB二成分制御系のレスポンスレギュレーターであるが、センサーキナーゼArcBもsRNA1の発現調節に関わるか明らかとする。また、両タンパク質を精製してin vitroリン酸化実験を行い、両者がリン酸基の転移を介したシグナル伝達を行うか明らかとする。ArcA/ArcB系は、嫌気状態での遺伝子発現を調節する系であることから、sRNA1の嫌気状態での発現を調節する可能性がある。そこで、本菌を嫌気条件で培養し、ArcA/ArcB系のsRNA1の発現量への影響を調べる。sRNAの発現調節に関わるタンパク質の同定を目的としたプルダウン実験の結果、sRNA3とsRNA4の上流領域のDNA断片で特異的にプルダウンされたバンドに含まれるタンパク質を質量分析法によって解析した結果、これまでに機能未知のタンパク質(N646_3492)が同定された。そこで、N646_3492を大腸菌生産系を用いて生産し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。得られたN646_3492を用いてゲルシフトを行い、sRNA3とsRNA4の上流領域のDNA断片に結合するか確認する。さらに、N646_3492をコードする遺伝子を欠失させた変異株を作製し、N646_3492のsRNA3およびsRNA4の発現への関与を調べる。Vibrio alginolyticusのVarS/VarA二成分制御系は、small RNA(Csr)の発現調節を介して制御下の遺伝子の発現を翻訳レベルで調節する。

本菌は、VarS/VarA系によって調節されるCsrを4つ(Csr1、Csr2、Csr3、Csr4)持つ。これまでの研究結果から、それらCsrの発現が転写後に調節を受けると示唆された。Csrの転写後調節機構として、Csrのsmall RNA結合タンパク質(CsrA)の結合力の差による可能性が考えられた。そこで、ゲルシフト法を用いて各CsrとCsrAとの結合力を調べた。大腸菌発現系を用いてHis-tag融合タンパク質としてCsrAを生産した。Ni-NTAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によりCsrAを精製した。In vitro transcriptionにより各Csrを作製した。得られたCsrAとCsrを用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、いずれのCsrも反応系に添加したCsrAの量に依存して同様のシフトパターンを示した。この結果から4つのCsrは、同等のCsrA結合力を持つと考えられた。したがってCsrの発現量の転写後の調節は、CsrAの結合力の差によるものではないと考えられる。Csrの発現量は、CsrA結合によるCsrの安定化の他に、Csrの分解によっても調節される。他のVibrio属細菌においてCsrの分解は、CsrDが結合することにより促進されることが分かっている。以上より、CsrとCsrDの結合力の差がCsrの発現量を調節している可能性がある。本研究課題の目的は、Vibrio alginolyticusのVarS/VarA二成分制御系が調節する4つのsmall RNA(Csr)の転写発現調節機構を明らかにすることである。Csrの転写後発現調節機構の作業仮説として、1)Csrの安定化に関るRNA結合タンパク質(CsrA)の結合力の差による転写後のCsr量の調節、2)Csrの分解に関るCsrDの結合力の差による転写後のCsr量の調節が考えられる。これまでの研究の結果、4つのCsrがCsrAに同様に結合することを明らかにした。これより、Csrの転写後調節機構の作業仮説は、1ではないことが明らかとなった。今後は、作業仮説2について検討する予定である。以上より、4つのCsrの発現量の転写後調機構解明に向けて、着実に進展している。Vibrio alginolyticusが保有する4つのsmall RNA(sRNA1、sRNA2、sRNA3、sRNA4)の新規の発現調節機構を明らかとするため、sRNAの転写を調節するタンパク質の同定を試みた。sRNA遺伝子の上流領域のDNA断片に結合するタンパク質をプルダウンした結果、用いたsRNAの上流領域DNAによって特異的にプルダウンされるタンパク質のバンドが見出された。それらのバンドに含まれるタンパク質を質量分析法により同定した。その結果、sRNA1の上流領域DNAに特異的にプルダウンされたバンドは、ArcA/ArcB二成分制御系のレスポンスレギュレーターであるArcAと同定された。そこで、大腸菌発現系を用いてArcAを生産し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
異常妊娠早期診断のための妊婦血漿中のマイクロRNAに関するプロファイリング解析

今回、全く新しい異常妊娠早期診断・治療につながる萌芽的研究として、妊娠および胎盤特異的miRNAの同定、さらには異常妊娠特異的miRNAを同定することを目的に、妊婦さんの血漿と胎盤組織中のmicroRNA(miRNA)大量クローニングとシークエンス解析を行った。正常胎盤絨毛組織(初期、満期)と異常胎盤(妊娠高血圧症候群)から万単位のmiRNA大量クローニング解析を行い、胎盤におけるmiRNAのプロファイリング、および、胎盤特異的miRNAの同定に成功した。一部は解析を進め、in situ hybridization解析により、胎盤特異的miRNA(miR-517等)が胎盤絨毛栄養膜に局在していることを突き止めた。この解析結果が、臨床応用展開が可能か、"胎盤は直接母体血に接触しており、胎盤から母体血中に放出される情報は、母体血を通して胎盤や胎児の状態を知り得ることができるのではないか"という仮説を立て、妊婦血液中のmiRNAの解析を行った。この解析により、血液の血漿中のmiRNA発現プロファイルを明らかにするとともに、妊婦血漿からの胎盤特異的miRNAの検出に成功し、分娩後には、血中胎盤特異的miRNAが速やかに一掃される新規知見を得た。このことは胎盤より胎盤特異的miRNAが母体血中に放出され、母親の血液検査で検出可能であることを示しており、妊娠、および異常妊娠の全く新しい診断法の開発につながる成果を得た。成果は投稿準備中である。
糖尿病性網膜症における硝子体中血管新生制御因子の発現プロテオミクス

目的糖尿病性網膜症患者の硝子体可溶化画分中に発現した蛋白質を網羅的に解析し、網膜の血管新生を制御する因子を同定することを目的に、1)硝子体可溶化画分中の発現蛋白のカタログ作成→データベース化2)網膜の血管新生制御に関与する蛋白を同定する3)発現蛋白の質的・量的変化を明らかにする(対象疾患:網膜血管の異常新生が認められない黄斑円孔)→多数症例の定量的解析→新たな血管新生制御に関与する因子を見出す結果電気泳動(1次元/2次元)/質量分析法/データベース検索により、糖尿病性網膜症患者の硝子体より、約120種類のタンパク質を同定した。その内、三分の一は血漿中にも存在する種類で他は硝子体独特であり、血管新生抑制因子、促進因子が7種類同定された。定性的分析ではあるが、これら因子が硝子体では優位に高濃度で含まれている。また糖尿病網膜症では血管増殖が盛んであるので、抑制因子が減少しているのではないかと予想されたが。実際には単に因子のバランスが崩れていることが血管増殖の原因ではないことが示唆された。[目的]ヒト硝子体可溶性蛋白質のカタログ作成と同時に糖尿病性網膜症患者硝子体中に発現している血管新生制御因子の同定と非糖尿病性疾患(黄斑円孔)との量的変動を比較する。[方法]ヒト硝子体を一晩透析後、凍結乾燥し分析試料とした。試料(0.1mg蛋白量)を2D-PAGE(1次元目:IPGゲル3-10NL、アマシャムファルマシア社製;2次元目:自家製)、SDS-PAGE(10/20:第一化学社製)及び強陽イオン交換HPLC(PL-SAX : CyPress社製)にて発現蛋白を分離・精製した。一方SDS-PAGE後、短時間固定-未染色ゲルを1.2mm間隔で短冊状に切断し、還元アルキル化後ゲル内トリプシン消化し、断片ペプチドを溶媒抽出し解析した(一般講演にて発表)。イオントラップ型タンデム質量分析(IT/MSMS)法は、ピコチップ(FS360-50-15-CE : New Objective社製)をカラム先端側に装着し、MagicC18カラム(Michrom Bio Resources社製)をLCQ^<DECA>(ThermoQuest社製)に連結させ、断片化ペプチドの構造解析を行った。MALDI/TOFMS法は、Voyger DE-PRO(PE Biosystems社製:α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid)を用いた。得られたCIDスペクトル、MH^+イオン(マス・フィンガープリント)をデータベース検索し、目的蛋白質を同定した。血管新生制御因子の定量は、ウエスタンブロット(WB)法及びIsotope Coded-Avidin Tag(ICAT:アマシャムファルマシア社製)法にて実施した。[総括]短時間固定-未染色ゲルの方が断片化ペプチドの回収率が向上した。我々のWBでの定量データでは、糖尿病患者硝子体中のPEDFの発現は低下しておらず、むしろ亢進していると考えられた目的糖尿病性網膜症患者の硝子体可溶化画分中に発現した蛋白質を網羅的に解析し、網膜の血管新生を制御する因子を同定することを目的に、1)硝子体可溶化画分中の発現蛋白のカタログ作成→データベース化2)網膜の血管新生制御に関与する蛋白を同定する3)発現蛋白の質的・量的変化を明らかにする(対象疾患:網膜血管の異常新生が認められない黄斑円孔)→多数症例の定量的解析→新たな血管新生制御に関与する因子を見出す結果電気泳動(1次元/2次元)/質量分析法/データベース検索により、糖尿病性網膜症患者の硝子体より、約120種類のタンパク質を同定した。また糖尿病網膜症では血管増殖が盛んであるので、抑制因子が減少しているのではないかと予想されたが、実際には単に因子のバランスが崩れていることが血管増殖の原因ではないことが示唆された。
代数幾何学を応用した表現論手法によるカルタン問題を中心とした多元環の研究

代数閉体上の有限表現型遺伝多元環上の直既約加群はディンキン図形の正のルートと対応している。負のルートについては、加群上では、何を意味しているのか全く不明であった。本研究により、導来圏の対象と対応させていくことで、加群の複体のホモトー同値類、即ち導来圏の対象と代数的構造も含めて対応していることがわかった。また、カルタン行列は、導来圏に対する不変量であり、カルタン行列から作られるコクセター行列が、導来圏の対象において、アウスランダー・ライテン変換を与えるものであることがわかった。本研究は非可換代数幾何と多元環の表現論を融合して研究をすすめ、新しい手法を開拓し環論の諸問題に適用することを目的にしている。このために多くの研究成果を集め研究者とのアイデアの交換を行いながら、これらの内容を本研究へ役立てることを行った。最初に、ポーランドで開催される、ICRA12(第12回環論および表現論国際シンポジューム)に研究代表者を派遣し、多元環の表現論の最新成果を聴き成果について議論を行った。次に、研究代表者が東京で日本学術振興会国際研究集会・第5回日中韓環論国際シンポジュームを開催し、日中韓を中心に16ケ国から研究者を集め、環論の最新成果を集め、それらの成果について議論を行い、本研究の方向性と手法の精密化を図った。この国際会議で、分担者の毛利出が、非可換代数幾何について基調講演を行い、本研究の意義を内外に示した。会議後、非可換代数幾何研究の第一人者である中国・腹担大学の昊教授および姚教授を甲府に招聘し本研究について研究会を行い種々の情報の提供を受けた。同様な趣旨で、代数幾何および環論に関連が深い可換環論の会議であ、第29回可換環論シンポジューム(名古屋)に参加し、代数幾何と環論の手法の違いに注目し、それぞれの特徴を本研究に取り入れる検討を行った。上記の成果を取り入れ、また独自の研究を推進するため、研究代表者と分担者相互で研究会を常時開催し、代数幾何と表現論の両者の方法論を融合することに務め、これらを今後重要な道具として利用し、本研究の目的とする諸問題への応用について道筋を描いた。本研究は非可換代数幾何と多元環の表現論を統一的な手法のもとで研究をすすめることが出来るようにし、そのための新しい手法を開拓し環論の諸問題にその成果を適用することを目的にしている。このために多くの研究成果を取り入れ、多くの研究者との研究成果や手法の議論を行いながら、これらの内容を本研究へ取り入れることを行った。海外では、ブラジルで行われた第13回表現論および多元環国際シンポジューム(ICRA13)に研究代表者を派遣して、ここで発表される成果と本研究と関係がある内容について討論や研究を行い、本研究の手法の開拓を行った。また、2010年に第14回を東京で開催することの要請があり、日本での研究に一定の評価が得られた。更に、代表者が中国・南京と上海に行き、表現論および非可換代数幾何研究者との交流を行い、講義や研究会を通じて、非可換代数幾何の第一人者である腹担大学の〓教授とMutationの表現論における役割や非可換代数幾何の中でこの概念がどの様な役目を担うか、について考察がなされた。国内では、第41回環論および表現論シンポジューム(静岡大学)を、研究代表者が運営委員長として、分担者の毛利出がプログラム責任者として、100名近い参加者を集めて開催され、多くの成果が発表された。また、分担者の中本和典が、ここで研究成果の一つを発表し、代数幾何と非可換代数幾何の接点を提示した。これらを研究の成果に取り入れるべく、甲府(山梨大学)で代表者・分担者で研究集会を行い、種々の結果を整理し理論の進展を図った。本研究は非可換代数幾何と多元環の表現論を統一的な手法のもとで研究をすすめ、両分野を融合して研究するための新しい手法を開拓し、環論の諸問題にその成果を適用することを目的にしている。研究代表者は、第42回環論および表現論シンポジュームを運営委員長として大阪教育大学で開催した。100名以上の参加者のもと、多くの成果の交流が図られた。研究代表者が、中国・北京師範大学からXi Changchang氏を、ポーランド・ニコラスコペルニクス大学からBogumila Kelmp氏を招聘し、本研究と関係がある内容について、甲府(山梨大学)および他大学で分担者を交えて討論や研究を行い、本研究の手法の開拓を行った。

分担者の毛利は、京都大学数理解析研究所で研究集会を主催し、世界の主立った非可換代数幾何研究者を招聘し、講義や研究発表を通じて、非可換代数幾何を日本に普及させ、他分野との積極的な研究交流を行い、多岐にわたって手法を広め或いは他の分野の手法を吸収することに務め、将来の組織的研究による更なる発展の土壌を築いた。研究会には100名近い参加者が集まり、多くの成果がえられた。更に、これらの成果を進展させるべく、信州大学で非可換代数幾何と位相幾何学の専門家を交えて研究集会を開催した。代数学シンポジュームでは、佐藤がカルタン行列に関連した招待講演を、日本数学会では、毛利が非可換代数幾何関連の招待講演を行い、代数学の研究者にその成果を発表した。
マウス唾液腺発癌における上皮増殖因子の役割

マウス唾液腺発癌機構ならびに、マウス顎下腺で多量に産生される上皮増殖因子(EGF)の発癌に対する作用は明らかにされていない。本研究では、顎下腺発癌実験系を用いたEGFの腫瘍形成に及ぼす影響と顎下腺組織でのEGFレセプター(EGFR)の発現につき研究を行った。8週齡ICRマウスの左顎下腺内にジメチルベンズアントラセン(DMBA)1mgを投与し、2週後より実験群1にはEGF2ugを、実験群2には基剤を週2回8週間皮下投与した。実験群3はEGFのみ投与、実験群4は処理を行わなかった。12週後、腫瘍はDMBA投与の左顎下腺でのみ認められ、実験群1,2での癌の発生頻度は32%と58%であった。実験群1から4での左顎下腺重量はそれぞれ69mg,220mg,100mg,99mgであり、左顎下腺重量は未処理の実験群4と比較して、基剤投与(2群)では増加、EGF投与(1群)では減少した。顎下腺内のEGF量を測定した結果、左顎下腺EGFレベルはDMBA投与を受けた実験群1,2でいずれも未処理群より低下していた。以上より、顎下腺発癌系において、EGFにはマウス乳癌で報告されているような発癌の促進作用は認められず、むしろEGF投与は顎下腺腫瘍形成に対して抑制的に作用することが明らかとなった。マウス顎下腺における蛋白レベルでのEGFRの発現を免疫組織染色で検索したところ、正常の顎下腺組織と比較して前癌性病変と考えられる管腔様病変の構成細胞、癌細胞にEGFRの発現が強く認められた。mRNAレベルに関しては、マウスEGFRのチロシンキナーゼドメインにプライマーを設定しRT-PCRを行った結果、正常組織と比較して転写レベルでも腫瘍組織でEGFR発現の亢進が認められた。今後、EGFの顎下腺癌細胞に対する分化・増殖抑制作用と他のエピレギュリン、アンフィレギュリンなどEGFファミリーの増殖促進作用につきマウス顎下腺癌由来の培養細胞とn vivo両面での検索が必要と考えられる。
精子形成に至る生殖細胞の選択と競合の解明

マウス精巣において、均一と考えられている前駆細胞集団だけが含まれる出生時から、幹細胞と分化細胞が恒常的に共存して安定した精子形成が起こる定常状態が作られるまでの数週間のプロセスの解析を、生殖細胞の不均一性と系譜に注目して推進した。この時、幹細胞(自身を維持したまま精子となる分化細胞を作り続ける細胞)だけではなく、幹細胞とならずに直接分化過程に入る細胞(いわゆるfirst wave)が生まれる(Yoshida et al., 2006)が、出生後初期にはこの運命の方向づけがすでに起こっていることを示唆する結果が得られている。そこで、蛍光免疫染色法を用いて、出生後初期の幼若精巣において、前駆細胞の示す遺伝子(タンパク質)発現の不均一性を解析した。その結果、幾つかの重要な遺伝子が、成体の定常状態にある成熟精巣と出生直後の未熟な発達段階の精巣で異なるパターンで発現することが明らかとなった。精子形成の形成期を、成熟期から外挿して理解することの限界を示すもので興味深い。さらに、これらの遺伝子のうちの一つに注目し、それを発現する細胞を幼若精巣でパルス標識して運命を追跡したところ、発達期の精巣で最初に分化する細胞に高率で寄与することが分かった。この、いわゆるfirst waveの細胞は、生後最初の精子を作るものの、その後に続く長期間の精子形成(幹細胞になった細胞に由来する)には寄与せず、次世代を生み出す確率は非常に低い。したがって、この結果は、次世代を生む細胞が選択される上で重要な知見であると考えている。「6.研究実績の概要」に記載のように、未熟な発達期精巣において、幹細胞とならず次世代への寄与が大変小さい細胞集団をプロスペクティブに同定することができた。このことから、本研究は順調に進捗していると判断する。発達期精巣において幹細胞システムが構築されるプロセスの解析を進める。特に、前駆細胞から幹細胞を生み出す細胞集団をプロスペクティブに同定することを目指して、細胞の不均一性を詳細に検討していきたい。ほ乳類において、精子となって次世代に遺伝情報を伝える生殖細胞(雄性生殖細胞)は、胚発生過程、生後の生殖腺発達過程、さらに成体の精巣内で起こる定常状態の精子形成過程を通して、選択と競合を繰り返している。これは生物学的に重要なプロセスだが、そのメカニズムや、勝ち残る細胞の特性は不明である。本研究では、雄性マウス精巣における精子形成を対象に、生殖細胞の選択と競合のメカニズムを解析している。出生直後のオスマウスの精巣では、ゴノサイトと呼ばれる前駆細胞が多数存在し、そこから成体期に長期間にわたって精子形成を支える精子幹細胞が生じる。その一方で、ゴノサイトの中には、精子幹細胞にならずに分化過程に直接入り、生後初めての精子形成に寄与するもののその後の精子形成には預からない細胞(first wave)も多数存在する(研究代表者ら、Development 2006)。本研究の第一の目的は、精子幹細胞となって多くの精子を作り出す細胞とfirst waveとして次世代にはほとんど寄与しない細胞が、ゴノサイトから選択される機構を解明することである。現在、ゴノサイトの段階ですでに細胞運命が方向付けられていることを示唆する結果を得ている。一方成体精巣では、定常状態精子形成を支える精子幹細胞同士がお互いに競合関係にある(研究代表者ら、Cell Stem Cell 2010, Cell Stem Cell 2014)。本研究では、そのメカニズムを特に分子レベルで解明することを第二の目標としている。現在、幹細胞同士が競合する分子実態についての新規の知見を得ている。また、競合を優位に勝ち残る細胞の性質を解明するために、そのような細胞を導入する実験系の作出を進めている。精子幹細胞の成立プロセスの解析については、まず、出生後のオスマウス精巣における細胞分化プロセスを遺伝子発現と形態の両面から詳細に解析した。その結果、成体精巣には見られないタイプの生殖細胞が一時的に出現し、数日の間に成体型の細胞に変遷することが分かった。さらに、ゴノサイトの運命を単一細胞レベルで解析する実験系を構築した。具体的には、ゴノサイト集団の全体あるいは部分集団でタモキシフェン依存的Creリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウスを用いて、出生直後のオスマウスのゴノサイトを標識する実験系を構築した。このマウスを用いることで、個々のゴノサイトの運命を詳細に解析することを可能とした。予備的な結果は、ゴノサイトの段階ですでに、高い確率で幹細胞になるものとfirst waveに進む確率が高い細胞が存在していることを示唆する結果を得ている。成体の精子幹細胞間の競合の分子メカニズムについては、変異マウスを用いた遺伝学的解析と数理モデルを組み合わせることで、競合の対象となる分子実態と競合メカニズムについての新規の知見を見出した。これに基づき、競合を優位に勝ち残ると予想される変異を精子幹細胞に導入するマウスを作出した。