hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高非線形光ファイバを用いた超高速光信号処理に関する研究

さらに,光時分割多重伝送用受信器においては,ベースクロック抽出回路および時間多重分離回路が主要な機能となる。2出力ポート型ニオブ酸リチュウム光位相変調器を用いた160Gbit/sから4チャンネルの40Gbit/sトリビュータリへのDEMux回路を設計・試作した。4つのトリビュータリが並列に展開可能であり,極めて高い長時間安定性を示した。以上により,160Gbit/s送受信器技術の開発を予定通り完了しだ。本研究で開発した160Gbit/s送受信器技術を用いて,各種の非線形信号処理技術の有効性を,長距離伝送システム上で実証することが今後の課題である。
未熟児網膜症におけるアドレナリンα１受容体の役割解明と制御による治療法の開発

本研究では未熟児網膜症(ROP)の発生におけるアドレナリンα1受容体の働きを解明するために、α1受容体ノックアウトマウスを用いたROPモデル(酸素誘発網膜症)を作成する計画を立てた。当初α1A、α1B、α1D各受容体のダブルノックアウトおよびトリプルノックアウトマウスの作成を試みたが、遺伝子欠損による生殖機能あるいは仔マウスの保育機能不全のため上記ノックアウトマウスの作成は極めて困難であった。そのため研究計画を修正してシングルノックアウトマウスの作成を行う事とし、α1A、α1B、α1D各シングルノックアウトマウスの作成には成功した。本研究期間後もさらに研究を継続する予定である。本研究の目的は1)α1受容体ノックアウトマウスを用いたROPモデルを作成し、野生型マウスにおけるROPモデルとの間で網膜血管発育の様子を比較する。2)それによってα1受容体ノックアウトが異常血管の発育を抑制できるかどうかを検討することにある。1.昨年度に引き続きα1受容体サブタイプ(α1A、α1B、α1D)のダブルノックアウトマウスおよびトリプルノックアウトマウスからシングルノックアウトマウスの作成を試み、現在までに各α1受容体サブタイプのシングルノックアウトマウスの系を作成することにほぼ成功した。作成の過程でα1Bノックアウトマウスの出産、生育が他のサブタイプノックアウトマウスに比べて不良であることが分かった。2.各α1受容体サブタイプのシングルノックアウトマウスの眼球を摘出し、凍結切片を作成した。免疫組織染色によって各α1受容体サブタイプの発現を検索し、各ノックアウトが成功していることを確認した。3.現在、上記の各シングルノックアウトマウスに高酸素負荷を行う準備を進めている段階である。1.昨年度に引き続きα1受容体サブタイプ(α1A、α1B、α1D)のダブルノックアウトマウスおよびトリプルノックアウトマウスからシングルノックアウトマウスの作成を試み、各α1受容体サブタイプのシングルノックアウトマウスの系を作成することにほぼ成功した。2.しかしながらα1Aおよびα1Bノックアウトマウスは出産、生育がα1Dノックアウトマウスに比べて不良であることから、同系統の維持、繁殖は困難を極めた。3.その中で、α1Aノックアウトマウスはヘテロ型同士の交配では仔の誕生、生育が可能であるものの、ホモ型同士の場合、様々な条件で交配を試みても成功が難しく、ホモ型の安定した系統維持は本研究期間内では不可能であった。4.特にα1Bノックアウトマウスはノックアウトヘテロ型同士でも交配が成功しづらく、ノックアウトホモ型の作成が不可能となったため、現在はヘテロ型の個体で系統維持を行っている。1.上記の目的からα1受容体を完全に欠損させるため、成育医療センターからα1A、α1B、α1D各受容体サブタイプのノックアウトマウスを譲り受け、当科でダブルノックアウトマウスおよびトリプルノックアウトマウスの作成を試みた。その内、ダブルノックアウトマウスの作成には成功したが、ダブルノックアウトマウス同士を交配した場合、遺伝子欠損による生殖機能あるいは仔マウスの保育機能不全のためかトリプルノックアウトの作成には現時点で未成功である。(元々、α1ノックアウトマウスは親マウスによる仔マウスの保育に難があるとされている)2.また、α1Aとα1B、α1Aとα1Dダブルノックアウトマウスの系にて酸素誘発網膜症を発生させるために、生直後から高酸素(75%)下での飼育を行ったところ、母マウスの保育機能不全(あるいは過ストレス)によると思われる仔マウスの生育不能という事態が生じた。3.現在、研究計画を修正して、まず各シングルノックアウトマウスでの酸素誘発網膜症の作成を試みるとともに、ダブルノックアウトマウスにおいて高酸素負荷時の飼育親マウスを野生型に入れ替える案を検討中である。初年度の研究計画においてα1A、α1B、α1D受容体のトリプルノックアウトマウスの作成を試みたが、実際の作成は困難であった。そのため翌年度より研究計画を見直し、α1受容体各サブタイプのシングルノックアウトマウスの作成に切り替えた。初年度の計画に遅れを生じた分、全体の研究計画がやや後ろ倒しになっている。α1受容体の働きをできる限り抑制させる目的で、計画の初期段階でα1A、α1B、α1D受容体のトリプルノックアウトマウスの作成を試みたが、元来α1ノックアウトマウスは親マウスによる仔マウスの保育に難があるとされているため、ダブルノックアウトマウスの作成には成功したもののトリプルノックアウトの作成は困難であった。トリプルノックアウトマウスの作成には元々かなりの期間を要するため初年度の計画に遅れを生じた。

現在は研究計画を修正して、α1A、α1B、α1D受容体各シングルノックアウトマウスの系の作成に成功している。今後は当初の計画通り、各ノックアウトマウスにおいて酸素誘発網膜症の作成を行い、組織学的あるいは分子生物学的解析を行う。α1受容体の各サブタイプが高酸素ストレスに対して相補的に働くかどうかは不明であるが、仮にα1各サブタイプのノックアウトマウス間に網膜症の差が生じれば、より特異的な関連分子の同定につながる可能性もあり、興味が持たれる。現在は研究計画を修正して、まず各シングルノックアウトマウスでの酸素誘発網膜症の作成を試みるとともに、ダブルノックアウトマウスにおいて高酸素負荷時の飼育親マウスを野生型に入れ替える案を検討、実行中である。α1受容体の各サブタイプが高酸素ストレスに対して相補的に働くかどうかは不明であるが、仮に各α1サブタイプのノックアウトマウスに網膜症の差が生じれば、より特異的な関連分子の同定につながる可能性もある。該当なし前記の理由により研究計画の遅れが生じたため、本年度の研究経費に未使用分が生じた。これらは平成24年度の研究費と合わせて使用する。研究費は主に動物の飼育料、免疫染色用抗体、リアルタイムPCR用プローブ・プライマーに使用する。また、研究成果発表のための学会旅費、論文投稿料などにも使用する計画である。
英語学習における動機減退・動機向上の関係モデル構築と動機減退プロセスの検討

本研究では、1英語学習における学習者の動機減退(demotivation)と動機向上の関係モデルの構築、2そのモデルを基に教室授業における英語活動(ライティング、または文法・構文学習等)が動機減退に与える影響とそのプロセスを検討(+どのような指導をすることが動機減退を和らげることになるかも含む)する。平成31年度平成32年度中ごろでは、本研究の最初の研究課題として、学習者の動機減退、動機向上と英語学習の関係について、分析に基づきモデル構築を行う。平成32年度中ごろ平成33年度は、教室授業における英語活動がどのように動機減退に影響を与えるかとそのプロセスを検討する。
Aeromonas菌のセリンプロテアーゼに特異的なシャペロンに関する研究

今回申請者らは、Aeromonas sobriaセリンプロテアーゼがいかなる機構で成熟化するのかについて研究を進めた。本プロテアーゼの成熟化機構の特徴は、プロテアーゼ遺伝子と同一オペロン内にコードされるシャペロン(ORF2)がプロテアーゼの成熟化に必須であることである。今年度はこのシャペロンのC末端領域の作用の解明を目的として研究を行い、その結果得られた成果を以下に示す。(1)in vitrotranscription-translationの実験系でセリンプロテアーゼ及びORF2の合成に成功し、さらにセリンプロテアーゼの活性構造構築に成功した。このアッセイ系を利用することでORF2のシャペロン作用を直接的に評価することが可能となった。(2)変異ORF2産生株の解析から、ORF2のシャペロン作用発揮にはORF2のC末端領域、特にC末端のアミノ酸のリジンがシャペロン作用発揮に重要な役割を演じていることが明らかとなった。(4)セリンプロテアーゼ欠損株を用いた解析より、ORF2はAeromonasのペリプラスムに局在するタンパクであることが明らかとなった。以上の結果より、菌から生合成された未成熟セリンプロテアーゼはペリプラスムでORF2のC末端の作用を受け活性構造構築が促進されると考えられる。プロテアーゼの成熟化に関与するシャペロンとしてORF2のようなタイプのたん白質は他に例がなく、めずらしい。従って、本研究により明らかとなった知見はプロテアーゼの成熟化の解明だけでなく、その他のシャペロンの作用機構の解明にも有用な情報をもたらすと考えている。Aeromonas sobriaのセリンプロテアーゼは菌体外へ分泌される外毒素である。本プロテアーゼが毒素として機能するためには活性を有する成熟体として産生されなければならず、本菌の病原性を理解する上で、セリンプロテアーゼの成熟化の過程を理解することは重要である。申請者らは、セリンプロテアーゼが成熟化の過程で、プロテアーゼ遺伝子の下流に存在するORFにコードされるタンパク(ORF2)の作用を受けることを見いだした。さらなる検討から、ORF2はペリプラスムで機能するタンパクであること、及びORF2は未成熟なセリンプロテアーゼを成熟体へと変換する非常にめずらしいタイプのシャペロンタンパクであることが明らかとなった。しかしながら、このシャペロンタンパクがいかなる作用機序でその機能を発揮するのかはまだ不明であり、さらにシャペロン作用を測定するためのアッセイ系も確立されていない。そこで本年度はシャペロン作用を解析するためにin vitrotranscription-translationを利用したアッセイ系を確立し、さらにこれを利用してORF2タンパクのC末端領域の機能の解析を試みた。得られた成果を以下に示す。1)in vitrotranscription-translationの系でセリンプロテアーゼ及びORF2タンパクの合成に成功し、さらにセリンプロテアーゼの活性構造構築に成功した。このアッセイ系を利用することでORF2タンパクのシャペロン作用を直接的に評価することが可能となった。2)変異ORF2産生株の解析から、ORF2のシャペロン作用発揮にはORF2タンパクのC末端領域、特にC末端のアミノ酸のリジンがシャペロン作用発揮に重要な役割を演じていることが明らかとなった。このC末端領域のシャペロン作用への関与の分子機構を明らかにするために、現在1)で確立した系を用いて解析中である。
妊娠ラットへの覚醒剤投与における胎仔心毒性の研究

妊娠ラットに覚醒剤(methamphetamine以下MA)を投与し、胎仔に対する影響、特に心臓に対する毒性を調べるために、目的である心病変の出現を生じ、しかも全身に対しては重度な奇形を生じることなく心病変が起こり得る投与方法を検索した。その結果、Feinらの方法を基に以下の実験方法を確立した。10週令のWistar系ラットを1週間予備飼育の後、雌性ラット2匹と雄性ラット1匹を一晩同一ゲージ内にいれ、翌朝膣栓を確認したものを妊娠0日とした。妊娠8日、9日にMAを10mg/ml腹腔内投与し、対照群として生食のみを腹腔内投与した。妊娠20日(出産予定の1日前)にエーテル麻酔下に胎仔を摘出、各臓器を採取した。これら組織はDNA用として一部凍結保存し、光顕、電顕用試料を作成した。18匹の雌性ラットを用いて、MA投与群6匹、対照群3匹が妊娠した。胎仔数は、対照群43匹、MA群72匹で個体あたりではMA群は稍少なく、体重はMA群が稍大なる傾向があった。又、胎仔死亡数は対照群は0、MA群は4で、合指症等の奇形をMA群に4匹認めたが、肉眼的に明らかな心奇形はなかった。心臓を心室の半分の高さで水平断し、HE染色にて観察した光顕所見は以下の如くであった:対照群では、ほとんど異常は認められなかったが、MA群では、左心室、中隔は軽度に肥大し、心筋細胞は核は大きく細胞質はしばしば好酸性に染まり、むしろ横紋等は明らかである。又、時に心筋細胞内には空胞を認め、時に融解状を呈し、間質は軽度浮腫状であり、リンパ球の浸潤を軽度認める。又、いわゆるtriangle regionにおいて錯綜配列を示すものもあった。これらの所見は概ねMA群の半数に見られ、母体へのMA投与により胎仔に心病変が出現することが示された。電顕では、光顕で異常の見られたMA投与群において、核の消失、凝縮、筋原繊維の融解(myolysis)、均質化、ミトコンドリアの腫脹、クリステの消失などがよく見られた。また、一部心筋は変性、壊死に陥り、間質の増大、小円形球の浸潤などが見られた。一方、凍結保存した心筋については、Chelex法でDNAを抽出後AP-PCR-SSCP法により、MAによるDNA損傷を検討した。即ち、法医学の分野でよく用いられるSTRのうち、TH01及びY染色体上のSTRであるDYS390のプライマーを利用した2種類のAP-PCRを行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってSSCP法を実施した。対照群9匹、MA群10匹について検討したところ、両プライマーでそれぞれMA投与群のほぼ半数に、対照群と比してバンドの消失や過剰のバンドが複数ヵ所で観察された。Feinらはマウスを用いて、D-methamphetamineを妊娠第9日、11日に投与し、胎仔の心臓の奇形の形態学的観察やECGを検索し、D-methamphetamine心毒性があると報告している。我々はこれを基に以下の実験方法を確立した。現在迄のところ、18匹の雌性ラットを用いて、MA投与群6匹、対照群3匹が妊娠した。又、胎仔死亡数は対照群はO、MA群は4で、合指症等の奇形をMA群に4匹認めたが、肉眼的に明らかな心奇形はなかった。現在は更に詳細に心病変を観察するために電顕観察を行っている。一方、凍結保存した心筋については、DNAを抽出しPCR-SSCP法により、MAによるDNA損傷を検討中である。

妊娠ラットに覚醒剤(methamphetamine以下MA)を投与し、胎仔に対する影響、特に心臓に対する毒性を調べるために、目的である心病変の出現を生じ、しかも全身に対しては重度な奇形を生じることなく心病変が起こり得る投与方法を検索した。その結果、Feinらの方法を基に以下の実験方法を確立した。10週令のWistar系ラットを1週間予備飼育の後、雌性ラット2匹と雄性ラット1匹を一晩同一ゲージ内にいれ、翌朝膣栓を確認したものを妊娠0日とした。妊娠8日、9日にMAを10mg/ml腹腔内投与し、対照群として生食のみを腹腔内投与した。妊娠20日(出産予定の1日前)にエーテル麻酔下に胎仔を摘出、各臓器を採取した。これら組織はDNA用として一部凍結保存し、光顕、電顕用試料を作成した。18匹の雌性ラットを用いて、MA投与群6匹、対照群3匹が妊娠した。胎仔数は、対照群43匹、MA群72匹で個体あたりではMA群は稍少なく、体重はMA群が稍大なる傾向があった。又、胎仔死亡数は対照群は0、MA群は4で、合指症等の奇形をMA群に4匹認めたが、肉眼的に明らかな心奇形はなかった。心臓を心室の半分の高さで水平断し、HE染色にて観察した光顕所見は以下の如くであった:対照群では、ほとんど異常は認められなかったが、MA群では、左心室、中隔は軽度に肥大し、心筋細胞は核は大きく細胞質はしばしば好酸性に染まり、むしろ横紋等は明らかである。又、時に心筋細胞内には空胞を認め、時に融解状を呈し、間質は軽度浮腫状であり、リンパ球の浸潤を軽度認める。又、いわゆるtriangle regionにおいて錯綜配列を示すものもあった。これらの所見は概ねMA群の半数に見られ、母体へのMA投与により胎仔に心病変が出現することが示された。電顕では、光顕で異常の見られたMA投与群において、核の消失、凝縮、筋原繊維の融解(myolysis)、均質化、ミトコンドリアの腫脹、クリステの消失などがよく見られた。また、一部心筋は変性、壊死に陥り、間質の増大、小円形球の浸潤などが見られた。一方、凍結保存した心筋については、Chelex法でDNAを抽出後AP-PCR-SSCP法により、MAによるDNA損傷を検討した。即ち、法医学の分野でよく用いられるSTRのうち、TH01及びY染色体上のSTRであるDYS390のプライマーを利用した2種類のAP-PCRを行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってSSCP法を実施した。対照群9匹、MA群10匹について検討したところ、両プライマーでそれぞれMA投与群のほぼ半数に、対照群と比してバンドの消失や過剰のバンドが複数ヵ所で観察された。
分子可視化解析:受信から送信への細胞情報フロー

以下の(1)(2)(3)の企画調査研究を目的として申請研究メンバーが相互に各研究室を訪問し、また、企画会議を開いた。(1)最先端細胞計測法の検討(2)分子可視化解析を適用した、副腎皮質細胞のステロイドホルモン合成反応の調査研究(3)分子可視化解析を適用した、肝臓細胞の薬物代謝反応の調査研究行った公開企画会議の主なものは以下の通りである。平成7年9月24日北海道大学工学部「細胞情報変換の分子可視化解析:21世紀の細胞生物学に向けて」平成8年1月9日11日中央大学駿河台記念館「細胞情報変換の分子可視化解析」これらの企画会議では、従来の静的な細胞内蛋白分析実験から大きく前進して、動的な情報のフローと蛋白間相互作用の可視化を目指して新しい研究法の検討を行った。特に、共焦点レーザー顕微鏡を用いたホルモン合成を駆動するCa信号やDAN導入の可視化、単一細胞の複数の機能を同時に観測する多重機能イメージング、細胞表面のレセプター分布を1分子レベルで捉える無蛍光ビデオ顕微鏡や近視野原子間力顕微鏡など最先端の技術を用いた研究に関する発表・討論がその中心になった。
農本思想の現代的意義に関する研究

農本思想とは、農に特別の価値を認め、その価値を社会の中で追求・実現しようとする思想である。本研究を通して以下のことを明らかにした。1)農本思想は1945年で終息したのではなく、戦後の農村教育や農政にその一部が継承され、帰農や地域づくりにおいて現代にもその影響がみられる。2)日本固有の思考様式だったのではなく、中国の村治運動やアメリカのアグラリアニズムにも認められるように、一種の普遍性をもつ哲学であった。また「社稷」概念は現代においてこそ再評価されるべきである。本研究はこれまで農本思想に関わってきた研究者を可能な限り糾合して学際的にその現代的意義を究明しようという目的をもって出発した。しかし代表者・分担者および協力者の専門分野が異なり分析視角も多様なため、まずは研究を進めるにあたっての基本的な合意を得るための研究会を今年度は2回実施した。1回目は2008年6月に山形県庄内地方においてゲストスピーカー(弘前大学:武田共治氏)を含む10名が参集し、農本主義運動が盛んだった庄内地方の事例も含めて各々の農本思想論を発表しあった。その結果農本思想の定義を明確にすべきであるということで合意した。2回目は2009年2月に京都において8名が参集し、なおかつ現代農的生活の実践家(半農半X研究所:塩見直紀氏)をお招きして勉強会を開催した。農本思想を「農を基軸とする社会思想(微温的な社会改良から急進的な革命構想までも含む)」と対象規定し、その特質として「対抗思想」性を設定した。対抗思想としての表われ方の相違が農本思想の多様性を意味するため、戦前・戦中の史的農本思想と戦後から現代に至る対抗思想としての農的な思想・運動・取組み・政策等との相関関係を今後明らかにする必要があり、各々の問題意識と絡めて次年度はその具体化を図ることで合意した。なお塩見氏の実践から現代の農的生活(帰農生活)に共鳴する世代や共鳴軸の方向性と史的農本思想との異同に関して種々の議論があり、現代の一種の農への回帰現象も含めてその意味するところを注意深く分析しなければならないという課題が与えられることになった。当該年度は代表者と分担者2名の合計3名で日本農業経済学会の特別セッションにて研究報告を行った(「農本主義の戦前と戦後」)。研究実施計画で記載した「史的農本思想と戦後から現代の農的な思想・運動・取り組み・政策との関連を明確にすることを課題とする」という計画の成果報告という意義づけをもつ学会報告であったが、戦前・戦後との連続性と分断に関しては多少なりとも見通しをもてたが、高度経済成長以降現代に至るまでの「農的な思想・運動・取り組み・政策」にまではまだ研究を進めることはできなかった。改めてそれは2010年度の課題となる。また同じく申請書に記載した長野県泰阜村での調査合宿も実施し、「土地」との関係で生じる行為としての移民、あるいは開発をめぐる問題は、同村での調査が重要な示唆を与えるものとなった。研究会も申請書に記載した通り、2回開催した(泰阜村、東京)。協力者の研究報告も進められており、6月の調査を兼ねた合宿では、農本思想の現代的意義という観点から参加者より問題意識と研究の進捗状況の報告をいただいた。また第2回目の研究会(3月、東京)では、代表の岩崎、分担者の舩戸、伊藤の3名より学会報告に向けた発表をし、参加者との間で質疑応答を行った。またもう一人の分担者の三原からは研究実施計画の通り、庄内地方の加藤完治グループを中心とする農村運動の報告(「加藤完治と庄内の農村運動」)があり意見交換を行った。総じて、昨年度「対抗思想」としての農本思想研究という共通認識をもったことを受けて、当該年度は戦後との連続性と断絶を意識した研究を実施した。当該年度は研究成果を最終報告書として取りまとめた(『農本思想の現代的意義に関する研究』として印刷製本)。農本思想の定義-農(農業・農村・農民)に特別の価値を認め、その価値を追求・実現しようとする思想-を踏まえ、その多様性(理念・運動・政策)、戦後との断絶と連続、現代の状況への示唆を、「対抗性」(市場経済への対抗理念としての農)という視角から明らかにした。

その結果、1)農本思想は1945年で終息したわけではないこと、2)戦後も農村教育や農政の一部に、また人的にも継承がみられること、3)日本国内だけの特殊な思想だったわけではなく、中国の村治運動やアメリカのアグラリアニズム(agrarianism)との関連で農本思想の広がりを確認できること、4)地域づくりや帰農(有機農業)において現代でも農本思想の理念がみられること、5)人間社会の根源を問う「社稷」理念は現代においてこそ再評価されるべきこと、などが明らかとなった。本研究は従来の農本思想研究史を踏まえ、1945年で終わっていた研究史の限界を乗り越え、現代の農業・農村問題と接続することを研究目的に掲げていた(ただし現代農業・農村問題への直接的・具体的な提言自体を目的としていたわけではない)。戦前から戦後を経て現代に至る長期的な時間軸の中で農本思想のもつ意義を考察することはできたと思われるが、以下の点が課題として残った。1)海外との比較研究(例えば稲作・米食文化圏のアジアの中の農本思想)、2)神道に根ざした日本人の心性・自然観との関連、さらには、3)いわゆる多面的機能論にとどまらない農の存在論の提示、などである。
変性タンパク質の可溶化技術を活用した細胞内イメージング技術の開発

(1) N末端特異的な蛍光標識による高精細な細胞内イメージング平成20年度に細胞内イメージングのモデルタンパク質としてN末端特異的に蛍光基を標識したβアクチンタンパク質を可逆的変性カチオン化法により高い水溶性を保持した蛍光標識プローブを調製することに成功していた。本年度はマイクロインジェクション法で細胞内への注入を試みたが、培地中で蛍光標識プローブが重合しやすく極めて困難であった。そこで蛍光標識プローブの溶解度向上に向けた諸条件を検討した結果、新規カチオン化試薬:TAP3S-Sulfonateの利用で高い溶解性が得られた。また、逆相HPLCで高純度に精製することで、純水および生理食塩水中で高い溶解度を維持できることを見出し、本手法に適した蛍光標識プローブの調製方法を確立した。(2)細胞内分泌経路のイメージングに関する技術開発可逆的変性カチオン化により可溶化した分泌シグナル付きの前駆体の酵素タンパク質を生細胞内に導入すると、一部が培養上清中に活性構造の成熟型の酵素タンパク質が再分泌されることを酵素活性レベルで確認していたが、その収量はごく微量であった。この効率を改善するため、エンドソームから細胞質内への放出を促進する両親媒性ペプチドの併用条件を検討し、再分泌量が大幅に向上する条件を得た。さらにこの手法で回収された成熟型タンパク質を逆相HPLCを用いて高度に精製し、N末端配列を確認したところ、正しくプロセッシングを受けていることが確認され、翻訳系を伴わないpost-translational経路によるタンパク質の成熟化が可能なことを立証できた。本研究は、可逆的変成カチオン化法により水溶性を大幅に向上させた変性タンパク質を材料として、分子細胞生物学的な応用や細胞内イメージング技術として活用することを目的として以下の研究成果を得た。(1)N末端特異的な蛍光標識による高精細な細胞内イメージング細胞内イメージングのモデルタンパク質として、βアクチンを材料とした可溶性蛍光標識プローブの調製に取り組んだ。大腸菌の菌体内で不溶性のインクルージョンボディとして発現したβアクチンを材料として、イメージングの際に立体障害が問題とならないように、N末端のαアミノ基に特異的に蛍光標識導入することとした。種々の条件検討の結果、N末端に特異的に蛍光基が標識されたβアクチンの単離・精製条件の確立と、システイン残基を利用した可逆的変性カチオン化法により高い水溶性を保持した蛍光標識プローブの調製に成功した。(2)細胞内分泌経路のイメージングに関する技術開発分泌シグナル付きの前駆体タンパク質を生細胞内に導入することで、翻訳系を伴わないpost-translational経路によるタンパク質の成熟化が可能なことを立証するための各種の検討を行った。分泌シグナル付きの前駆体の酵素タンパク質を大腸菌で大量発現し、可逆的変性カチオン化法で可溶化して細胞内に導入したところ、培養上清に活性構造の成熟型の酵素タンパク質が再分泌されることが確認された。この結果から、可逆的変性力チオン化法を用いたin cell folding法が、前駆体タンパク質の成熟化を伴うような系にも活用できることが証明できた。
腸内細菌科におけるqnrと基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ遺伝子の関連

近年、腸内細菌科の菌の接合伝達性プラスミド上に、キノロン系薬によるDNA gyrase阻害を抑制しうる蛋白質をコードする遺伝子(キノロン耐性遺伝子:qnr)が存在し、それを保有するプラスミドは基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ(ESBL)遺伝子を保有すること、及びインテグロン全体がトランスポゾン様構造を持つことが報告されている。本研究では、2005年11月から2006年10月に東大病院にて臨床分離され、薬剤感受性試験にてESBL産生菌と確認されたEscherichia coli(n=46)及びKlebsiella oxytoca(n=27)を用い、qnr遺伝子保有率を調査した。ESBL及びqnr遺伝子はPCR法にて検出し、陽性サンプルはダイレクトシーケンス法にて塩基配列を決定した。また、RFP耐性E coliをレシピエントとした伝達試験を行い、キノロン系薬及びβ-ラクタム系薬以外の交差薬剤耐性の割合を解析した。最後に、qnr遺伝子が存在するプラスミドを抽出し、PCR〓appingにてインテグロン構造を決定した。ESBL遺伝子型は、E.coliの23株(71.7%)、K.oxytocaの全株(100%:その中で48%はSHV型とCTX-M型の両方を保有)でCTX-M型が認められた。qnr遺伝子はE.coliの3株(6.5%)、K.oxytocaの5株(18.5%)で認められ、全てがqnrAlであった。伝達試験において6株(E.coli:3株、K.oxytoca:3株)のqurAl陽性トランスコンジュガントが得られ、全ての株においてキノロン系薬、β-ラクタム系薬及びアミノグリコシド系薬の耐性が認められた。それらのqnrAlが存在するプラスミドは、約140kbのclass1インテグロン構造を有するものであった。qnrAl陽性K.oxytocaの1株において、aac(6')-IIc-aadA2を有する珍しいclass1インテグロンが認められた。qnr遺伝子のみでは臨床上キノロン系薬剤耐性を示さないが、それを保有するプラスミドはインテグロン構造を有すること、qnr遺伝子陽性ESBL産生菌においては、キノロン系薬とβ-ラクタム系薬以外にもアミノグリコシド系薬の耐性を同時に伝播することが確認されたため、多剤耐性化のリスク要因として監視する必要があると考えられた。
生命金属動態解析を可能とするin-cell NMRによる金属タンパク質研究

細胞内は多種多様な分子が高密度で存在する「分子クラウディング」状態である.金属結合タンパク質の動態についても,細胞内では,クラウディング環境特有の相互作用(排除体積効果・非特異的相互作用)に加え,様々な「生命金属」イオンとの結合や,機能発現に関わる他の因子との特異的相互作用により強い影響を受けていると予想される.細胞試料を直接NMR測定するin-cell NMRは,生細胞中タンパク質の動態を原子分解能で解析可能な現存する唯一の手法である.本研究は,in-cell NMRを用いて,金属結合タンパク質が関与する生命現象のin situ解析を行うものである.細胞内は多種多様な分子が高密度で存在する「分子クラウディング」状態である.金属結合タンパク質の動態についても,細胞内では,クラウディング環境特有の相互作用(排除体積効果・非特異的相互作用)に加え,様々な「生命金属」イオンとの結合や,機能発現に関わる他の因子との特異的相互作用により強い影響を受けていると予想される.細胞試料を直接NMR測定するin-cell NMRは,生細胞中タンパク質の動態を原子分解能で解析可能な現存する唯一の手法である.本研究は,in-cell NMRを用いて,金属結合タンパク質が関与する生命現象のin situ解析を行うものである.
女性医療専門職における生涯継続教育の方法論開発―キャリアヒストリー法の構築と活用

本研究は、現代の女性医療専門職の生涯にわたる職業継続教育(生涯教育)の課題、特に女性医師・女性看護師のキャリア形成継続をめぐる実践的課題に注目し、Iキャリア変遷分析の方法論、II課題克服に向けた自己省察の手段、の両機能をもつキャリアヒストリー法の新たな構築、および研究・実践上の活用方法の提起を目指すものである。本年度は、学会研究大会などの機会を活用しつつ、計6回の研究会を開催した。前年に引き続き、「キャリアヒストリー研究法」の方法論開発に実践的に取り組み、看護師対象に2回のトライアルを実施した。その上で、計8回のトライアルの振り返りを踏まえた考察・検討を行い、後述のような研究成果を取りまとめた。さらに、フォーマットを記入しながら互いのキャリアについて話し合う「キャリアヒストリー実践法」に向けて、2019年23月に計2回の看護学生グループインタビューを実施した。これらと並行して、カナダマクマスター大学での医師のキャリアや学部教育に関わるヒアリングを行い、またカナダ女性医師会の年次大会への再度の参加を通して、海外女性医師との交流・議論を深めた。研究成果の公表としては、全国学会での2件の口頭報告(日本教育学会ラウンドテーブルと日本社会教育学会自由研究発表)を行い、研究論文5本(個人3本、共同2本)、2019年3月にはこれらの報告資料をも所収した本科研の最終報告書を刊行している。今後はさらに、2019年度からの新科研「女性医療専門職におけるキャリアヒストリー理論の実践的構築および適用に関する研究」(基盤B・代表者渡邊洋子)において、研究法のブラッシュアップを経た定式化と理論化の作業、実践法のトライアルの領域・対象者・年代別実施、実践結果の分析・考察を踏まえた定式化・一般化の作業に加え、研究成果を再吟味して取りまとめ、総合的な考察・検討を加えて書籍として公刊することを目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、医学専門領域(主に医学、看護、理学療法、薬学など)における女性医療専門職の生涯キャリアに向けた研究/支援実践に寄与すべく、研究・実践の両側面を備えた「キャリアヒストリー法」の開発構築に、共同で取り組むものである。初年度は7回の研究会を開催した。研究メンバーの問題関心や実践経験を踏まえ、医師・看護師・薬学・管理栄養士・言語聴覚士など各領域のキャリア形成・キャリア支援に関わる内外の調査研究の動向を各々が調査して報告し合い、キャリアヒストリー研究の共通基盤となる研究課題と論点の抽出に努めた。また来年度に取り組むインタビュー調査に向けて、基本的な研究枠組と調査方法、調査対象などについて議論し、大枠の調査計画を作成することができた。海外調査では、イギリスの医師養成プログラム(Queen Mary University of London)、看護師研修プログラム(NHS, London)、医師キャリア悉皆調査(医療系キャリア研究所UKMCRG、Oxford University)、および、専門職のキャリアに関わる研究・実践の蓄積が顕著なカナダの医療者教育の現場(Ontario看護カレッジなど)に赴き、情報収集と実態把握を行った。これらを通して本研究に関わる文化的要因が明確化され、日本の医療専門職のキャリアの実際を相対化してとらえる視点がを得られ、またインタビュー調査に向けての留意事項が明確になった。研究成果としては、以上の作業の記録をもとに、複数の調査報告・研究ノートを準備中である。来年度は以上を踏まえ、実地のインタビュー調査を実施する予定である。7回の研究会を通して、医師、看護師、管理栄養士などの養成・教育に携わり、教育学研究においても専門分野が異なるメンバーが、各々の領域に関連する先行研究や調査の動向、実践的課題などに関わる共通認識を培い、多面的に検討できる体制、および、相互の関係性を構築することができた。合わせて、海外文献や海外調査を踏まえ、日本の医療専門職におけるキャリアの現状と諸課題が浮き彫りになったため、調査計画の骨子が明確になったことが指摘できる。さらに、今後のキャリアヒストリー研究の遂行にあたって、内外の有用なリソースを見出すことができ、次年度のインタビュー調査の実施に向けての基盤形成が一定程度なされたと考えられる。本研究は、現代の女性医療専門職の生涯にわたる職業継続教育(生涯教育)の課題、特に女性医師のキャリア形成・継続をめぐる実践的課題に注目し、1キャリア変遷分析の方法論、2課題克服に向けた自己省察の手段、の両機能をもつキャリアヒストリー法を新たに構築するとともに、その活用方法の提起を目指して行うものである。研究活動は、渡邊の呼びかけにより、研究代表者・分担者・補助者で組織される「キャリアヒストリー研究会」の活動として展開されてきた。同研究会は当初は京都大学を足場に関西の研究者で組織されたが、2017年4月に渡邊と分担者犬塚が関東周辺に異動したため、以後は月一回、主に京都に集まって研究会を開催する活動形態を取っている。研究活動は、平成28年度は、医学専門諸領域における女性専門職の生涯キャリアに注目し、研究メンバーの問題関心や実践経験を共有した。医師・看護師・管理栄養士・言語聴覚士など各領域のキャリア形成・キャリア支援に関わる内外の調査研究の動向を報告し合い、研究課題と論点の抽出に努めた。またイギリスとカナダの医学・医療者教育の場に赴き、情報収集と実態把握を行った。これを受けた平成29年度は、前年度の成果と議論を踏まえ、キャリアヒストリー調査法の方法論的開発に力を注ぎ、事前文書からインタビューガイド、複数のワークシートなどに至るフォーマットと具体的段取りの策定・検討を行った。

2017年秋以降、これらを用いた試行的調査(女性医師・女性看護師を対象に、インタビュー調査の形態でモニター協力していただく試み)に取り組んでいる。同調査法は、当事者が現時点に至るまで、どんなキャリア・ライフプロセスと転換点を経てキャリアを継続・発展させ、ライフを生き抜いてきたかを構造化することによって、キャリアヒストリーの視覚化とその研究的・実践的活用の方途を探るものである。平成29年度は、1地域的に離れた研究メンバーとはいえ、全9回のキャリアヒストリー研究会を実施できたこと、2暫定版Iのキャリアヒストリー調査フォーマットを作成し、それを用いて計6名(女性医師5名・女性助産師1名)のモニターインタビューが実施できたこと、3中間年ながらも、平成28年・29年に蓄積した研究成果をまとめて『研究成果中間報告書「女性医療専門職における生涯継続教育の方法論開発ーキャリアヒストリー法の構築と活用』(全87頁)を編集・刊行できたこと、などにおいて多くの成果が得られた。なお、インタビューについては4月6日にも看護師対象のインタビューを追加実施しており、さらに数名の実施を見込んでいる。本研究は、現代の女性医療専門職の生涯にわたる職業継続教育(生涯教育)の課題、特に女性医師・女性看護師のキャリア形成継続をめぐる実践的課題に注目し、Iキャリア変遷分析の方法論、II課題克服に向けた自己省察の手段、の両機能をもつキャリアヒストリー法の新たな構築、および研究・実践上の活用方法の提起を目指すものである。本年度は、学会研究大会などの機会を活用しつつ、計6回の研究会を開催した。前年に引き続き、「キャリアヒストリー研究法」の方法論開発に実践的に取り組み、看護師対象に2回のトライアルを実施した。その上で、計8回のトライアルの振り返りを踏まえた考察・検討を行い、後述のような研究成果を取りまとめた。さらに、フォーマットを記入しながら互いのキャリアについて話し合う「キャリアヒストリー実践法」に向けて、2019年23月に計2回の看護学生グループインタビューを実施した。これらと並行して、カナダマクマスター大学での医師のキャリアや学部教育に関わるヒアリングを行い、またカナダ女性医師会の年次大会への再度の参加を通して、海外女性医師との交流・議論を深めた。研究成果の公表としては、全国学会での2件の口頭報告(日本教育学会ラウンドテーブルと日本社会教育学会自由研究発表)を行い、研究論文5本(個人3本、共同2本)、2019年3月にはこれらの報告資料をも所収した本科研の最終報告書を刊行している。今後はさらに、2019年度からの新科研「女性医療専門職におけるキャリアヒストリー理論の実践的構築および適用に関する研究」(基盤B・代表者渡邊洋子)において、研究法のブラッシュアップを経た定式化と理論化の作業、実践法のトライアルの領域・対象者・年代別実施、実践結果の分析・考察を踏まえた定式化・一般化の作業に加え、研究成果を再吟味して取りまとめ、総合的な考察・検討を加えて書籍として公刊することを目指す。今年度は、昨年度の先行研究の動向や論点に関わる研究ノートの取りまとめからスタートし、当初の予定通り、女性医師と女性看護師を対象にインタビュー調査を行う。
アピコンプレックス原虫の細胞内増殖と宿主細胞操作に関する研究

本研究はタイレリア原虫のリンパ球感染に伴う宿主細胞無限増殖機構の解明を目的とし、本年度はTheileria parvaおよび近縁種であるTheileria annulata原虫のリンパ球感染後のアポトーシス経路の変化を、MDM2-p53経路を中心に解析を行った。P53経路は本来腫瘍性増殖に反応して誘導され細胞周期静止もしくは細胞死を導く経路であり、タイレリア原虫がいかにこのp53経路を抑制しているのかを明らかにすることは、タイレリア原虫による宿主細胞無限増殖機構の解明および治療薬開発にとって必須の命題である。我々は前年度までに、p53を分解する分子であるMDM2に対する阻害薬(TIBL)がT.parva感染リンパ球の増殖を阻害し、細胞死を誘導すること、および感染細胞内においてMDM2蛋白の過剰発現や異常転写産物の転写が起こっていることを明らかにしてきた。本年度はこれら事象をより詳細に、特に他T.parva感染細胞株および近縁T.annulata原虫において同様の現象が観察されるか否か、またMDM2阻害薬添加時におけるp53分子動態を中心に解析を行った。その結果、他T.parva株およびT.annulataにおいても同様にMDM2の異常発現やMDM2阻害剤に対する感受性を示したが、その程度には株および種により差異があることを示した。また、DNA障害性の刺激を示したときのp53応答がこれら細胞株では正常に起こっていない事、しかしMDM2阻害剤添加によりp53応答が回復する事を示し、すなわちT.parva感染およびT.annulata感染細胞はMDM2の異常発現により正常な細胞死経路であるp53経路が抑制されており、このことがタイレリア感染細胞で見られる宿主細胞死抑制および無限増殖に密接に関与している可能性が強く示唆された。本研究ではタイレリア原虫のリンパ球感染に伴う細胞無限増殖機構の解明を目的とし、今年度は以下の二つのテーマを中心に研究を進めた。1.タイレリア感染細胞におけるmdm2の過剰発現とp53動態解析我々は、抗癌作用を有する化合物のタイレリア感染リンパ球の増殖に与える影響についてスクリーニングを行い、MDM2に対する阻害剤(TIBL)がT.parva感染リンパ球の増殖を阻害することを明らかにした。さらにタイレリア感染細胞ではMDM2分子の転写の亢進と過剰発現が観察された。MDM2蛋白質は癌抑制蛋白質であるp53の抑制因子であり、腫瘍化の原因の一分子であるとされている。そこで次にT.parva感染細胞にDNA障害によるp53依存性のアポトーシスを誘導したところ、p53は低濃度のままで推移し正常なp53経路が障害されている事が示された。この時のp53のmRNA転写量の減少は認められなかったことから、p53蛋白質が過剰発現しているMDM2により分解されている可能性が示唆された。すなわちタイレリア感染細胞ではMDM2の異常発現によりp53によるアポトーシス経路が障害されており、このことが感染細胞の不死化機序の一因となっている可能性が示唆された。今後タイレリア感染が宿主mdm2の過剰発現を引き起こす機構を明らかにする事で、新規治療薬やワクチンの開発の足がかりとなることが期待される。2.ゲノム情報を利用した癌遺伝子候補の探索タイレリア原虫には、リンパ球の癌化を引き起こす悪性種であるT.parvaおよびT.annulataと、癌化を引き起こさない良性種であるT.orientalisがある。私はこれらゲノム比較解析を行うなかで、悪性種T.parva/T.annulataにのみ存在し、良性種のT.orientalisゲノムでは欠損している遺伝子領域を数ヶ所同定した。これらのゲノム領域のコードする遺伝子の局在予測は分泌蛋白質または表面蛋白質であり、T.parva/T.annulataによる細胞癌化操作に関与している可能性がある。そこで現在は本候補遺伝子の機能解析、特に細胞増殖およびアポトーシス経路への関与について解析を行う準備を進めている段階である。1.シゾント由来蛋白質TpSCOPによるリンパ球アポトーシス抑制およびNFκB経路の活性化:TpSCOPはT.parvaの近縁種であるT.ortentalisの細胞骨格結合蛋白質ToMRPのオーソログ分子である。我々はこのTpSCOPに対する抗血清を作製しT.parvaのシゾント期で原虫膜表面に発現されている事を確認した。またTpSCOPはアクチン分子との結合能を示す事、TpSCOPを強制発現させたマウスT細胞株はNF-κB経路の活性化およびアポトーシスに対して抵抗性を示すことを示した。これらの結果はTpSCOP分子がTheileria感染細胞内のNFκB経路の活性化およびアポトーシス抑制過程に密接に関与している可能性を示唆する結果であり、タイレリア原虫感染・増殖における生命現象を解明する上で重要な発見であると考える。2.ゲノム情報を利用した癌化遺伝子候補の探索:T.parvaおよびT.annulataは宿主細胞の癌化をひきおこす悪性種であるが、日本にも広く分布するT.orientalisは宿主細胞癌化を引き起こさない。我々はT.orienalisのゲノム配列解読を進め3種タイレリアゲノムの比較解析を行っている。そこで悪性種のみに存在しT.orietalisゲノムでは欠損し、さらに原虫膜表面に局在または分泌蛋白質をコードしている遺伝子であると予測されるもの、という二つの条件で腫瘍化の原因となる遺伝子候補を絞り込んだ。

うち3遺伝子については大腸菌発現系により組み換え蛋白質を作製し、免疫して得た抗血清による原虫感染細胞内における発現の確認と局在解析を行った。これら遺伝子については今後哺乳類細胞系における細胞増殖や細胞死に与える影響について解析を行う予定である。本研究はタイレリア原虫のリンパ球感染に伴う宿主細胞無限増殖機構の解明を目的とし、本年度はTheileria parvaおよび近縁種であるTheileria annulata原虫のリンパ球感染後のアポトーシス経路の変化を、MDM2-p53経路を中心に解析を行った。P53経路は本来腫瘍性増殖に反応して誘導され細胞周期静止もしくは細胞死を導く経路であり、タイレリア原虫がいかにこのp53経路を抑制しているのかを明らかにすることは、タイレリア原虫による宿主細胞無限増殖機構の解明および治療薬開発にとって必須の命題である。我々は前年度までに、p53を分解する分子であるMDM2に対する阻害薬(TIBL)がT.parva感染リンパ球の増殖を阻害し、細胞死を誘導すること、および感染細胞内においてMDM2蛋白の過剰発現や異常転写産物の転写が起こっていることを明らかにしてきた。本年度はこれら事象をより詳細に、特に他T.parva感染細胞株および近縁T.annulata原虫において同様の現象が観察されるか否か、またMDM2阻害薬添加時におけるp53分子動態を中心に解析を行った。その結果、他T.parva株およびT.annulataにおいても同様にMDM2の異常発現やMDM2阻害剤に対する感受性を示したが、その程度には株および種により差異があることを示した。また、DNA障害性の刺激を示したときのp53応答がこれら細胞株では正常に起こっていない事、しかしMDM2阻害剤添加によりp53応答が回復する事を示し、すなわちT.parva感染およびT.annulata感染細胞はMDM2の異常発現により正常な細胞死経路であるp53経路が抑制されており、このことがタイレリア感染細胞で見られる宿主細胞死抑制および無限増殖に密接に関与している可能性が強く示唆された。
新規S100受容体による原発巣転移前がん微小環境構築とがん転移動力獲得の分子機構

上記メラノーマの動物実験では、ヒト細胞と異なり免疫排除がないためマウスメラノーマが重宝されるが、マウスメラノサイトは、培養し実験使用が非常に困難な上、国内外で未販売であった。そこでマウスメラノサイトの簡便な単離、培養法を試行錯誤から確立し、マウスメラノーマでは、マウス正常メラノサイトに比較してMCAMが顕著に高発現していることが判明した。これは、人の細胞、組織で認められていた結果をきちんと反映していた(Tomonobu & Sakaguchi et al. Biochem Biophys Rep 2019)。未解明であった受容体MCAMの下流における転移動力供給の信号伝達を明らかにすることに成功した。成果は、2つの論文(Chen & Sakaguchi et al. Cancer Lett 2019; Chen & Sakaguchi et al. Neoplasia 2019)にアクセプトされるに至った。さらに、もう1つの受容体NPTNβに関しても、本受容体の下流信号伝達を明らかにすることに成功し、転移への重要な機能的意義を報告することができた(Sumardika & Sakaguchi et al. Mol Carcinog 2019)。現在、受容体群のがん微小環境構築に関わるメカニズムに着手しているが、その成果は良好で当年度での論文発表を目指している。さらに、本計画以外にも、面白い成果が得られつつある。各受容体から誘導されてくる分子群の次世代シークエンサーを用いた遺伝子発現網羅的解析からも多くのがんに関係する情報を得ることができており、今後の解析から当研究がさらに発展していくことが期待された。以上、当初の計画以上に計画が進展しているものと判断した。1.In vivoでの検討:臓器指向性転移過程を、ライブイメージングを取り入れて検討する。同所性移植による自然転移モデルが確立できているメラノーマ細胞株B16-BL6(皮下→肺)と乳がん細胞株MDA-MB231(乳腺皮下→肺)を使用する。2.イメージングと評価:上記細胞群を、マウスに移植した場合、その状態経過(移植による模倣原発巣形成→転移巣形成)をイメージングすることが可能である(細胞-Luc; pH-pHセンサー蛍光試薬;独自のマウスS100A8/A9イメージング抗体-近赤外光)。当生体イメージングには、本学内に既に設置され、使用に慣れている生体個体内高感度発光検出システムIVISを利用する。各移植細胞が時間経過を追って移植部位から肺に移動して動員される、あるいはそうならない様子について、上記3項目(細胞、pH、S100A8/A9)を生きた状態でモニタリングする。モニタリング終了時に発明届を、組織(移植部位と肺)を摘出し、移植部位に関しては、乳酸含量を、移植部位と肺転移部位に関しては、S100A8/A9と炎症性サイトカイン、ケモカインの誘導について、免疫組織染色、Q-PCR解析、ELISAを駆使し検討する。比較検討として、脳と肝臓も採取し同様の解析を行う。本年度では、臓器指向性転移を誘導する新規S100A8/A9受容体群(S100 Soil Sensor Receptors: SSSRs)の作動原理のまだ未解明な点の解明を目指した。未解明な点としては、SSSRsの内、MCAMとNPTNβに関する転移動力供給のシグナル伝達メカニズムが不明であった。そこで、MCAMとNPTNβの下流活性化Mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK)、責任転写因子、そしてその転写因子によって活性化される重要遺伝子の同定を行い、各々の下流信号伝達解明のための研究を行った。論文投稿準備中であるため分子の名前は明かせないが、解析の結果、MCAMとNPTNβのそれぞれにおいて活性化される重要MAPKKK、その下流に位置する重要転写因子、そしてさらにその転写因子によって活性化される重要遺伝子群を明らかにすることに成功した。この明らかになった信号伝達からMCAMとNPTNβによる転移動力供給の分子機構の詳細が明らかとなった。上記成果は、3つの論文として現在投稿準備中である。特にMCAMの最下流で誘導されてくることが明らかとなった1つの分子は、がん細胞の浸潤、走化性を顕著に上昇させる性質を持つ形質膜表面露出性タンパク質であることから、新しい分子標的としても非常に魅力的であった。そのことから、現在それを標的化した追加研究にも発展を遂げている。また、各受容体から誘導されてくる分子群の次世代シークエンサーを用いた遺伝子発現網羅的解析からも予想以上の多くの転移に関係する情報を得ることができており、今後の解析から当研究が大きく発展することが期待されている。MCAMの最下流で誘導されてくることが明らかとなった1つの分子は、分子標的としても非常に魅力的であることから、それを標的化した新たな研究に発展を遂げている。また、各受容体から誘導されてくる分子群の網羅的解析からも予想以上の多くの転移に関係する情報を得ることができており、今後の解析から当研究が大きく発展することが期待された。

これは、人の細胞、組織で認められていた結果をきちんと反映していた(Tomonobu & Sakaguchi et al. Biochem Biophys Rep 2019)。未解明であった受容体MCAMの下流における転移動力供給の信号伝達を明らかにすることに成功した。成果は、2つの論文(Chen & Sakaguchi et al. Cancer Lett 2019; Chen & Sakaguchi et al. Neoplasia 2019)にアクセプトされるに至った。さらに、もう1つの受容体NPTNβに関しても、本受容体の下流信号伝達を明らかにすることに成功し、転移への重要な機能的意義を報告することができた(Sumardika & Sakaguchi et al. Mol Carcinog 2019)。現在、受容体群のがん微小環境構築に関わるメカニズムに着手しているが、その成果は良好で当年度での論文発表を目指している。さらに、本計画以外にも、面白い成果が得られつつある。各受容体から誘導されてくる分子群の次世代シークエンサーを用いた遺伝子発現網羅的解析からも多くのがんに関係する情報を得ることができており、今後の解析から当研究がさらに発展していくことが期待された。以上、当初の計画以上に計画が進展しているものと判断した。1.新規SSSRsによるがん微小環境構築誘導の作動原理を解明する。1.In vivoでの検討:臓器指向性転移過程を、ライブイメージングを取り入れて検討する。同所性移植による自然転移モデルが確立できているメラノーマ細胞株B16-BL6(皮下→肺)と乳がん細胞株MDA-MB231(乳腺皮下→肺)を使用する。2.イメージングと評価:上記細胞群を、マウスに移植した場合、その状態経過(移植による模倣原発巣形成→転移巣形成)をイメージングすることが可能である(細胞-Luc; pH-pHセンサー蛍光試薬;独自のマウスS100A8/A9イメージング抗体-近赤外光)。当生体イメージングには、本学内に既に設置され、使用に慣れている生体個体内高感度発光検出システムIVISを利用する。各移植細胞が時間経過を追って移植部位から肺に移動して動員される、あるいはそうならない様子について、上記3項目(細胞、pH、S100A8/A9)を生きた状態でモニタリングする。モニタリング終了時に発明届を、組織(移植部位と肺)を摘出し、移植部位に関しては、乳酸含量を、移植部位と肺転移部位に関しては、S100A8/A9と炎症性サイトカイン、ケモカインの誘導について、免疫組織染色、Q-PCR解析、ELISAを駆使し検討する。比較検討として、脳と肝臓も採取し同様の解析を行う。