hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢心不全患者の歩行機能と筋機能に関する研究

都市型医療圏の新潟南病院、信楽園病院、地域型医療圏の佐渡総合病院の3施設の協力を得て、DPC病名に"心不全"が当てはまる65歳以上の全患者を登録し、心臓リハビリの適応となる対象者は疾患背景データのほかに、身体機能、QOL、介護度を評価を行う。登録期間は2017年2月から2018年3月までとし、登録後2年間(6カ月毎)の追跡調査を行う。主要評価項目は質調整生存年(Quality Adjusted Life Year:QALY)で、副次評価項目として生命予後、心血管イベント、総医療・介護イベント、早期介護に関わる要因、歩行能力(独歩)に関わる要因を解析する。基礎的な検討としては、追跡経過4ポイントで採取した血液、尿から筋力低下や向上と関連するバイオマーカー探索を行う。2017年3月31日までの期間に3医療施設から合計124症例が登録された(佐渡総合病院34例、信楽園病院63例、新潟南病院27例)。登録された124例の平均年齢は84.8±±8.0歳で、男性が64例(52%)、女性が60例(48%)であった。計画に沿った評価、解析を行い成果を発表する。これまでの成果から高齢患者においても簡素な運動療法プログラムが身体機能を改善しうることが示された。今後は、要因解析に基づいたプログラムの洗練化を行うとともに、1筋力やバランス機能への介入が有効性の検証、2高齢心不全患者の身体機能低下をアウトカムとした予後調査、3介護や医療負担の調査を行うため、申請者らが佐渡島において行ってきた佐渡心不全研究のコホートと、新潟市内の心臓リハビリ施行施設の協力を得て、これらの心不全を併発する高齢患者(DPC病名が心不全である患者を対象とする)に対する運動療法の効果を多施設前向き研究によって研究する。すでに、該当する施設と研究計画について検討の最終段階である。この研究により、新潟市(都市型)・佐渡市(地域型)を中心としたそれぞれの医療圏で、高齢心不全患者の疾病管理方法を構築し、先進的活動の展開につながると考える。さらに基礎的な研究展開として、本年度の研究で明らかとなった末梢組織における骨格筋と骨、脂肪組織の連関についても、前述の前向き研究の協力施設の中で全身DEXAの施行可能な施設においては、体組成の継時的な変化、介入の有無における変化を検討し、組織の連関をさらに明らかにする。また同時に、筋組織、脂肪組織からのサイトカインを前後評価し、筋力低下や筋力向上と相関するバイオマーカーの探索や、スポット尿を用いたプロテオーム解析を行い機能改善に関する機序の解明に関する検討を行う。血漿と尿を用いたバイオマーカー研究の一部が次年度に持ち越しとなったため。筋組織、脂肪組織からのサイトカインの介入前後評価、筋力低下や筋力向上と相関するバイオマーカーの探索や、スポット尿を用いたプロテオーム解析の試薬や解析費用に使用する予定。
介護支援専門員のワーク・ライフ・バランスとその推進方策に関する実証的研究

本研究の目的は、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランス(以下、WLB)について、量的調査に基づく実証的研究から検証したうえで、その推進方策を検討することである。30年度の研究実績の概要を以下に記す。調査に関しては、全国の居宅介護支援事業所に勤務する介護支援専門員を対象に、自記式調査質問紙を用いた無記名の郵送調査を実施した。30年度の目的は、量的調査により得られたデータを分析することであった。調査では、全国の居宅介護支援事業所から1000ヵ所を無作為に抽出したうえで、各事業所につき1名、計1000名の介護支援専門員を対象とした。調査票の回収数は380通であり、有効回収率は38.0%であった。分析においては、介護支援専門員のWLBの現状について、WLBに関する満足度から検討を行った。また介護支援専門員のWLBの構成要素について、ワーク(仕事に対する充足感)とライフ(家庭生活、娯楽、趣味、健康等に対する充足感)の多角的側面から検討を行った。そのうえで、介護支援専門員のWLBの満足度に影響を及ぼす要因については、職場環境などから検討を行った。さらに、WLBが介護支援専門員に及ぼす効果として、介護支援専門員の仕事満足度や生活満足度等との関連についても検討を行った。これら実証的研究に基づく検証は、今後、介護支援専門員のWLBの具現化に関する方策を検討する際において、データに基づく議論が可能となる点で、一定の意義があると考える。なお、分析結果の詳細は、研究成果報告書でまとめるとともに、今後においては、論文等で報告していく予定である。本研究の目的は、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランス(以下、WLB)を推進すべく方策について、実証的研究から検討することである。初年度の研究実績の概要を以下に記す。初年度は、国内外を含めたWLBの先行研究および介護支援専門員の業務実態に焦点を当てた先行研究や文献を整理することで、介護支援専門員のWLBを捉えるにあたっての分析枠組みについて整理を行った。その際、分析枠組みにおいては、WLBに影響を与える要因、およびWLBが及ぼす効果等などの側面から検討を行った。次年度は、初年度に検討を行った分析枠組みをもとに、調査票を作成し、量的調査を行う予定である。初年度の研究計画を比較的達成しており、順調に研究計画が進んでいると考える。初年度の研究計画は、介護支援専門員のWLBを捉えるにあたっての分析枠組みの検討であり、進捗状況は、研究実績の概要に記したとおりである。28年度の研究実績の概要を以下に記す。28年度の目的は、研究初年度に行った国内外を含めたWLBの先行研究および介護支援専門員の業務実態に焦点を当てた先行研究の整理をもとに、量的調査における分析枠組みを検討し、調査票を作成することであった。しかし、介護支援専門員に対するWLB研究の検討を進める中で、再度の分析枠組みの精査が必要であると判断した。具体的には、介護支援専門員のWLBに影響を及ぼす職場環境の検討、WLB概念の多様性を捉えるにあたって妥当となる尺度の精査、WLBに影響を与える介護支援専門員の個人特性要因の整理などを、再度行うこととした。上記の点は、現在も継続して検討しており、これらの整理をもとに、新たに分析枠組みを作り上げて行く予定である。次年度は、これまで検討を行った分析枠組みをもとに、調査票を作成し、量的調査を行う予定である。当初、28年度に調査を実施する予定であり、現在までの進捗状況は、遅れている状態にある。その理由として、研究実績の概要にも記したように、量的調査を実施するにあたって、分析枠組みの再検討を行ったことが挙げられる。具体的な進捗状況は、研究実績の概要に記したとおりである。2017年度は、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランスに関する量的調査を実施するために、まず分析枠組みの検討および調査票の作成を行った。調査票には、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランスを捉えるために、ワーク・ライフ・バランスの満足度といった質問項目や、ワーク・ライフ・バランスに影響を与える可能性がある要因として、職場環境などの質問項目を設定した。また、ワーク・ライフ・バランスが介護支援専門員に及ぼす効果として仕事満足度などの質問項目を設定した。次に、作成した調査票をもとに、介護支援専門員を対象とした自記式郵送調査を実施した。具体的な調査対象および調査対象の選定方法は、以下である。調査対象は、全国の居宅介護支援事業所に勤務する介護支援専門員を対象とした。調査対象の選定方法は、全国の都道府県に所在する居宅介護支援事業所を無作為に抽出した。次に、抽出した各事業所につき1名、計1000名の介護支援専門員を調査対象とした。郵送調査の実施に際しては、調査票とともに調査依頼書を同封した。調査依頼書には、本調査の趣旨、および個人や事業者が特定されることがないよう個人情報の保護に努めることを説明した。また、調査票は無記名とした。調査票の回収数は381通(回収率38.1%)であった。今後においては、回収された調査票のデータを分析することにより、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランスの現状やその関連要因について検証を行っていく予定である。

また、ワーク・ライフ・バランスが介護支援専門員に及ぼす効果などに関しても明らかにしていくことを検討している。当初は2017年度において、調査の実施および調査結果の分析、調査結果をもとにした論文の執筆等を行う予定であった。しかし、調査を行うにあたっての分析枠組みの検討や質問項目の設定等に時間を要し、2017年度は調査の実施のみに留まった。そのため、調査結果の分析および論文の執筆等はできておらず、当初の予定より遅れている状況にある。本研究の目的は、介護支援専門員のワーク・ライフ・バランス(以下、WLB)について、量的調査に基づく実証的研究から検証したうえで、その推進方策を検討することである。30年度の研究実績の概要を以下に記す。調査に関しては、全国の居宅介護支援事業所に勤務する介護支援専門員を対象に、自記式調査質問紙を用いた無記名の郵送調査を実施した。30年度の目的は、量的調査により得られたデータを分析することであった。調査では、全国の居宅介護支援事業所から1000ヵ所を無作為に抽出したうえで、各事業所につき1名、計1000名の介護支援専門員を対象とした。調査票の回収数は380通であり、有効回収率は38.0%であった。分析においては、介護支援専門員のWLBの現状について、WLBに関する満足度から検討を行った。また介護支援専門員のWLBの構成要素について、ワーク(仕事に対する充足感)とライフ(家庭生活、娯楽、趣味、健康等に対する充足感)の多角的側面から検討を行った。そのうえで、介護支援専門員のWLBの満足度に影響を及ぼす要因については、職場環境などから検討を行った。さらに、WLBが介護支援専門員に及ぼす効果として、介護支援専門員の仕事満足度や生活満足度等との関連についても検討を行った。これら実証的研究に基づく検証は、今後、介護支援専門員のWLBの具現化に関する方策を検討する際において、データに基づく議論が可能となる点で、一定の意義があると考える。なお、分析結果の詳細は、研究成果報告書でまとめるとともに、今後においては、論文等で報告していく予定である。今後は、初年度において検討を行った介護支援専門員のWLBに関する分析枠組みに基づき、調査票を作成することを計画している。研究の推進方策として、調査票の原案作成段階で高齢者福祉学領域の研究者によるエキスパートレビューを受け、最終案を作成することを予定している。また、調査項目の内容に関しては、現職の介護支援専門員から、適宜、助言を得ることを計画している。今後は、現在、精査中の分析枠組みに基づき調査票を作成し、量的調査を実施することを計画している。今後の研究の推進方策としては、調査により得られたデータの分析を早急に行い、調査結果を整理することで研究を進めていくことを検討している。また、調査結果を論文等にまとめ、発表していく予定である。当初の使用計画では、学会への参加等を計画していた。しかし、初年度は、先行研究の整理等の活動が中心となり、旅費等の費用がかからなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額が生じた理由として、当初、28年度に実施予定であったアンケート調査ができなかったことが挙げられる。
慢性関節リウマチ患者と他の疾患患者におけるHLA-DRB1対立遺伝子頻度の比較

この3年間に我々は、慢性関節リウマチ(以下、RA)と変形性関節症(以下、OA)などのRA関連疾患の病態にHLA-DRB1遺伝子型の及ぼす影響について検討した。(1)RA患者(n=329)の骨破壊進行度とHLA-DRB1遺伝子型を比較した。その結果、HLA-DRB1*0101,もしくは0405を両方の相同染色体(対立遺伝子)に有する患者では、それらの遺伝子を一方の対立遺伝子にのみ有する患者や、それらを全く有しない患者より急速に骨破壊が進行していた。(3)RAにおいて炎症を惹起するインターロイキン-6(以下、IL-1、IL-6)の分泌に遺伝的要因がどのように関与したかを観察した。その結果、HLA-DRB1*0405遺伝子を有する症例(n=45)では平均27.4pg/dlであるのに対して、その遺伝子を有さない群(n=39)では僅か11.9pg/dlと、有意にHLA-DRB1*0405を有する群で高値を示した。このように、HLA-DRB1遺伝子型はRA患者の血清中サイトカイン濃度とも関連すると考えた。(4)HLA-DRB1遺伝子型によってRAの治療効果に差が生じるか否かを検証する目的で、HLA-DRB1遺伝子とII型コラーゲン経口療法の治療効果をHLA-DRB1遺伝子型別に比較した。その結果、HLA-DRB1*0405遺伝子を有するRA患者(n=22)ではその遺伝子を有さないRA患者(n=16)に比べて、腫脹関節数が有意に低下した。以上より、HLA-DRB1*0405を有するRA患者ではII型コラーゲンによる経口トレランスが成立しやすいのではないかと考えた。(5)膝OAの骨破壊進行度においては、HLA-DRB1遺伝子型といった先天的要因のみならず、肥満などの後天的要因が深く関与する。そこで、肥満した変形性膝関節症患者に対するダイエット療法の効果を評価した。その結果、4.6±1.0kgの体重減少を示したダイエット群では、非ダイエット群では認めなかった起床後動作開始時、30分立位継続、階段昇り時に疼痛を訴える患者の割合が有意に改善した。以上より膝OAの諸症状にはHLA-DRB1遺伝子型といった先天的要因のみならず肥満といった後天的要因も重要であると考えた。慢性関節リウマチ(以下、RA)以外の変形性関節症(以下、OA)や通風性関節炎(以下、GA)などのRA関連疾患においてもHLA-DRB1対立遺伝子型が骨破壊進行に関するrisk factorとなるのか、また、確認実験のためHLA-DRB1遺伝子型が骨破壊進行度に関与するための中間生成物質の一つと考えられるサイトカイン(インターロイキン-1,-6)産生量を調べた。本助成金によって検査された症例数は、HLA-DRB1遺伝子検査73例(RA:10例、OA:45例、GA:12例、その他の関節炎:6例)、インターロイキン-1 24例(RA:16例、OA:5例、GA:1例、その他の関節炎:2例)、インターロイキン-6 103例(RA:81例、OA:20例、GA:1例、その他の関節炎:1例)であった。上記、検査結果から、OAやGAの症例においては、RA症例に比べて有意にHLA-DRB1*0405まどのRAのsusceptible alleleの遺伝子頻度が少なかった。また、インターロイキン-1の平均値(pg/dl)はRA群では85.4であるのに対してRA以外の疾患では10.27であり、インターロイキン-6の平均値(pg/dl)はRA群では20.2であるのに対してRA以外の疾患では5.1と、いずれのインターロイキンもRA群で有意に高値を示した。以上の結果は第86回中部整形災害学会をはじめとする学会で発表予定である。

以上より、HLA-DRB1*0405を有するRA患者ではII型コラーゲンによる経口トレランスが成立しやすいのではないかと考えた。(5)膝OAの骨破壊進行度においては、HLA-DRB1遺伝子型といった先天的要因のみならず、肥満などの後天的要因が深く関与する。そこで、肥満した変形性膝関節症患者に対するダイエット療法の効果を評価した。その結果、4.6±1.0kgの体重減少を示したダイエット群では、非ダイエット群では認めなかった起床後動作開始時、30分立位継続、階段昇り時に疼痛を訴える患者の割合が有意に改善した。以上より膝OAの諸症状にはHLA-DRB1遺伝子型といった先天的要因のみならず肥満といった後天的要因も重要であると考えた。自験例の264例の慢性関節リウマチ(以下、RA)患者と52例の変形性膝関節症(以下、OA)患者のHLA-DRB1遺伝子頻度を他施設から報告された493例の健常日本人のHLA-DRB1遺伝子頻度と比較した。結果として、遺伝子頻度においてOA群や健常人群に比しRA群で有意に高かったのはHLA-DRB1*0405遺伝子であり、RAに比べてOA群で有意に遺伝子頻度が高かったのはHLA-DRB1*1302遺伝子、RA群とOA群ともに健常人群より有意に高頻度であったのはHLA-DRB1*0101遺伝子であった(p<0.05)。日本人RA患者の代表的susceptible alleleはHLA-DRB1*0405と0101遺伝子であるという報告は既になされているが、それらは単に健常人との比較であり、RAの疾患特異性を明確にした結果ではかいかもしれないと、我々は考えていた。今回の研究では、RAの類縁の関節炎の一種であるOAを対象に調査を行った結果、OA群と比較してもRA群ではHLA-DRB1*0405遺伝子は高頻度であったが、HLA-DRB1*0101遺伝子はOA群でも健常人群に比べて高頻度であった。このため、我々はHLA-DRB1*0101遺伝子は関節炎疾患に関連した遺伝子であり、RAに特徴的な遺伝子ではないと、考察した。平成7年および8年度に我々は変形性膝関節症(以下、膝OA)と慢性関節リウマチ(以下、RA)の臨床症状に与えるHLA-DRB1遺伝子型の影響を明らかにしてきた。平成9年度は38例のRA患者を対象にHLA-DRB1遺伝子型別II型コーラゲン経口療法の効果と、118例の膝OA患者を対象に先天的要因であるHLA-DRB1遺伝子型と後天的要因である肥満が膝OAの臨床症状に与える影響を評価した。まず、RAに関する研究では、日本人RA集団の感受性遺伝子であるHLA-DRB1*0405遺伝子を有するRA患者ではその遺伝子を有さないRA患者に比べて、32mgの鶏II型コラーゲンをス-プとして摂取すると、各種動物の坑II型コラーゲンIgG抗体値が有意に低下し、坑II型コラーゲンIgA抗体値が有意に上昇し、腫脹関節数が有意に低下していた。次いで膝OAに関する研究では、膝OA患者を肥満群(48例)と非肥満群(70例)に分類し、さらに、肥満群をダイエット群(20例)と非ダイエット群(21例)に分け、疼痛誘発動作で疼痛を訴える患者の割合を比較した。肥満群では非肥満群に比べて、30分以上立位継続やしゃがみ込み動作によって疼痛を訴える患者の割合が有意に高かった。4.6±1.0kgの体重減少を示したダイエット群では、非ダイエット群では認めなかった起床後動作開始時、30分立位継続、階段昇り時に疼痛を訴える患者の割合が有意に減少した。
IL-22BP依存性制御性B細胞がアブスコパル効果に及ぼす影響の検討

IL-22BPノックアウトマウスを用い、脾臓におけるB細胞の成熟について検討を行ったところ、制御性B細胞とおぼしき集団の増加を認めていたが、検討をすすめていくに従い、結果の再現性が乏しく、当初の実験計画の遂行は困難な可能性が考えられた。そこで、マウスを用いたvivoの実験系の後に、検討を予定していた、ヒト末梢血を用いた検討をすすめることとした。当院の倫理委員会にて許可を得たプロトコールに則り、放射線療法を施行した患者の照射前および、照射中、照射後の血液を採取し、血しょうおよび、末梢血単核球(PBMC)を抽出した。疾患や、病態、併用療法などによる患者選択は行わず、43例の検体を採取した。アブスコパル効果の発現の機序のひとつに、CD8陽性T細胞による、非照射部への免疫学的抗腫瘍効果があげられるため、検討項目のひとつとして、末梢血におけるT細胞の成熟について、PBMCを用い細胞表面マーカー(CD8,CD27,CD57,CD279等)にて染色を行い、フローサイトメトリーを用い検討を行った。症例において、照射回数を重ねるにつて、末梢血中のT細胞の成熟度が増したものもあった。今後、線量や臨床学的経過、症例などの選択を行い、さらなる動態の検討をすすめたい。また、既存の報告のように、stageIVなど、臨床学的に末期の状態である患者検体においては、末梢血中のT細胞におけるCD279の発現上昇を伴う症例を認め、放射線療法の介入により、それらが減少する傾向も認めた。その挙動についても検討をすすめたい。また、PBMCや血しょうサンプルの確保もすすんでおり、今後、臨床経過などにより、サンプルを選択し、他の実験手法を用いた、解析も検討していく予定である。当初予定していた細胞群が、再現性に乏しい細胞集団であったため、実験計画の変更を余儀なくされたためである。そこで、当初の計画では、実験が順調にすすみ、可能であれば後半に施行予定であったヒトサンプルを用いた、検討を行っているところである。また、業務形態も、臨床業務のしめる比率が多くなり、実験に用いることのできる時間も少ないことも原因である。ヒトサンプルの集積をすすめる。また、症例の病態や臨床経過などをもとに、サンプルの選択を行い、PBMCや血しょうを用いた、網羅的な解析も検討する。それにおけるIL-22、IL-22BP、またB細胞群との関連性を検討したい。それらにより得られた、知見の検証実験として、細胞や動物モデルを用いた実験計画を再度、計画することも考える。PBMCを用いたフローサイメーターを用いた検討における、表面抗原マーカーの追加を検討する。CD279の発現の経過をはじめ、ほかの細胞集団の推移と、症例の経過との相関関係など、委細な検討を行う。遠隔転移巣のみの放射線照射が、原発巣に効果を発揮するといった、アブスコパル効果は、以前より報告されていたが,その機序は未だ不明である。最近では、免疫チェックポイント阻害剤と放射線療法の併用における、制御性T細胞(Treg)が関与したアブスコパル効果の発現増強も報告されている。一方、近年、制御性B細胞(Breg)がTregの活性化に関与することが示唆されている。また、IL-22は生態防御に寄与するサイトカインの一種であり、放射線により誘導される。しかし、我々の生体にはIL-22の作用部位であるIL-22 Receptor1に共通して作用するIL-22BPが存在している。我々は、IL-22BP欠失マウスを樹立し、IL-22BPがBregの誘導を抑制する可能性を見出した。そこで、IL-22BP依存性Bregとアブスコパル効果の関係性を解明し、新規がん治療戦略への足掛かりを模索する事を本研究の目的とする。本年度は,1)マウスにおける放射線照射プロトコールの確立2)IL-22BP欠失マウスとB6マウスの放射線照射による死亡率の相違:両者に優位な差は認められていない.3)放射線に伴う免疫細胞動態4)IL-22BPのB細胞への影響:実験を進めていくにあたり当初の知見とは異なり,IL-22BPに伴い変化をきたすB細胞群はBregではない可能性が考えられてきている.5)IL-22BPの基礎的解析:IL-22BPの関係する各種KOマウスの腸内細菌叢の解析,IL-22の産生源である腸管上皮細胞のDNAマイクロアレイによる網羅的解析の実施5)ヒト臨床検体取得のための倫理委員会での承認を施行した。当初の計画ではマウスによる実験が先行予定であったが、後述の如く動物飼育施設の移動等で動物実験の遂行が困難な時期が生じた為、のちに予定していたヒトサンプルでの検討の手続きを優先してすすめた。当動物実験施設において、当講座が関与する一部飼育施設において感染症(Pasteurella pneumotropica)が発覚した。当病原体は,特に隔離等の必要がない微生物カテゴリーDに分類は可能とされているが,当施設の規定においてはカテゴリーCに分類されている。そのため,動物飼育施設の移動の必要性が生じた。よって、その間、飼育動物を使用した実験の遂行が困難な時期が生じた。そこで、当初は後年度に予定していた、ヒトサンプルでの検討の手続きを優先してすすめた。次年度は、動物実験も遂行可能な状況であり、本年度に予定していた各種検討が実施できるものと考える。

動物実験に関しては,動物実験施設建て替え等の事由により,遂行が滞った側面が有り,本年度は,細胞実験および,ヒト末梢血の臨床検体サンプルを用いた検討を優先し施行した。また,IL-22BP依存性の制御性B細胞については,放射線照射下においては存在が定かでなく,研究の方向性をシフトする必要性が生じた。そこで,既存のアブスコパル効果の増強剤として報告されているCTLA-4およびPD-1,PD-L1の抗体,また高線量率以外のfactorについて,検討を行うこととした。そして,それらとIl-22とIL-22BPの関与や,制御性B細胞の関連について検討を行うこととした。そこで,O2同素体を用い、正常細胞および,腫瘍細胞への影響を観察した。上皮系の正常細胞の変化について,DNAマイクロアレイ法を用い,検討を行った。その結果から細胞周期へ多大な影響を及ぼすことがうかがえた。そこで,腫瘍細胞株(Hela細胞)を用い,抗腫瘍効果および正常細胞への障害度について評価を行った。(アラマブルー法,光顕観察,FIB-SEM,N-acetyl cysteinを用いた反証実験等)その結果,用量依存的にミトコンドリアに関与した抗腫瘍効果を示すことがわかった。また,細胞内酸素化の改善にも寄与する事も示唆され,放射線の抗腫瘍効果の増感剤としての機能,しいては,アブスコパル効果へ関与についても考慮された。また,放射線療法施行中の患者のヒト末梢血サンプルの蓄積については,本学倫理委員会承認のもと遂行している。当初の計画に比較し,動物実験の進行が,施設の建て替え等に伴い,遂行が滞っている側面もある。標題のIL-22BP依存性の制御性B細胞の存在が定かでなくなったことにより,研究方向のシフトがせまられたため。ヒトサンプルの蓄積については,担癌および放射線療法施行中であり,血球減少が認められる症例も多く,委細な検討をすすめるには不十分なPBMCである場合もあり,現在,採取できる血液量の増大を倫理委員会に変更申請を検討している。IL-22BPノックアウトマウスを用い、脾臓におけるB細胞の成熟について検討を行ったところ、制御性B細胞とおぼしき集団の増加を認めていたが、検討をすすめていくに従い、結果の再現性が乏しく、当初の実験計画の遂行は困難な可能性が考えられた。そこで、マウスを用いたvivoの実験系の後に、検討を予定していた、ヒト末梢血を用いた検討をすすめることとした。当院の倫理委員会にて許可を得たプロトコールに則り、放射線療法を施行した患者の照射前および、照射中、照射後の血液を採取し、血しょうおよび、末梢血単核球(PBMC)を抽出した。疾患や、病態、併用療法などによる患者選択は行わず、43例の検体を採取した。アブスコパル効果の発現の機序のひとつに、CD8陽性T細胞による、非照射部への免疫学的抗腫瘍効果があげられるため、検討項目のひとつとして、末梢血におけるT細胞の成熟について、PBMCを用い細胞表面マーカー(CD8,CD27,CD57,CD279等)にて染色を行い、フローサイトメトリーを用い検討を行った。症例において、照射回数を重ねるにつて、末梢血中のT細胞の成熟度が増したものもあった。今後、線量や臨床学的経過、症例などの選択を行い、さらなる動態の検討をすすめたい。
未利用遺伝資源を利用した耐塩性日本シバの作出

日本シバ(Zoysia属)の未利用遺伝資源,特にZ.sinicaを利用した高耐塩性系統作出を試みた結果,耐塩性と塩類腺との関連性が明らかになり,7%塩水灌水後も生存する系統を作出した.また,分子マーカーにより遺伝的多様性を評価したところ,対馬採集系統は特異的な集団であった.さらに,種子繁殖を検討した結果,自殖による種子生産が可能であり,分離および近交弱勢程度が少ない系統を選抜することができた.日本シバ(Zoysia属)の未利用遺伝資源,特にZ.sinicaを利用した高耐塩性系統作出を試みた結果,耐塩性と塩類腺との関連性が明らかになり,7%塩水灌水後も生存する系統を作出した.また,分子マーカーにより遺伝的多様性を評価したところ,対馬採集系統は特異的な集団であった.さらに,種子繁殖を検討した結果,自殖による種子生産が可能であり,分離および近交弱勢程度が少ない系統を選抜することができた.Z.sinicaの外部形態を、熊本・韓国・対馬・宮崎から採集した計20系統を用いて調査した。その結果、韓国系統・宮崎系統は草型が小型であるために、匍匐系の系統を育種する場合には優良な母本となることが示された。次に葉耳周辺部および葉表面の綿毛を観察した結果、葉耳周辺の綿毛は全ての系統で観察されたが、葉表面の綿毛は韓国1系統でのみ観察された。さらに、直立茎に対する第2葉の角度を測定したところ、対馬系統が、他の採集地域の系統と有意に異なる事が示された。またZ.sinicaの遺伝的類縁関係を明らかにするため、RAPDおよびSSR分析の結果、RAPDではOPIの2種類、OPSの5種類で再現性が高く鮮明なバンドが得られ、計35の多型バンドが検出された。次にZ.sinica(9系統)およびZ.matrella(8系統)を交配親として作出された種間雑種個体14系統を対象に3、5、7%濃度の塩水で処理し、2週間後の生存状況によって耐塩性を評価した。塩水処理後に各塩処理濃度区における生存率を比較したところ、Z.sinicaおよびZ.matrellaでは5%処理区から生存率が低下し、7%処理区ではそれぞれ44.4%、33.3%となった。これに対し、これら2種間の交配により得られた雑種は5%処理区で94.9%、7%処理区でも56.4%の生存率を示し、耐塩性の向上が認められた。さらに、各個体の葉の表裏面における単位面積あたりの塩類腺数を調査した結果、本研究で供試した雑種系統はいずれもZ.sinicaと同様に塩類腺が少なく、日本シバ3種で認められた塩類腺数の増加と耐塩性の関係を見出すことはできなかった。1.RAPDおよびSSRなどのDNAマーカーを用いた遺伝的類縁関係および地理的分布の解析韓国・九州(対馬(長崎)・天草・水俣(熊本))から採集した20系統のZoysia sinicaを材料とし,RAPDおよびSSRマーカーを用いてクラスター分析を実施した.その結果,対馬集団はいずれの分子マーカーでも特異的なクラススター手段に分類されたのに対し,韓国,熊本採集集団は混在し,地理的分布との関係性は示されなかった.Z.sinicaと日本芝と総称される3種の組合せで交配し,高耐塩性系統の作出を試みた.花粉発芽および花粉管伸長を観察したところ,これらの種における正逆組合せのいずれにおいても交配親和性が示された.その後の種子稔性も確認できており,現在同種子に由来する個体の育成を図っている.3.耐塩性系統の選抜と種苗特性の調査これまでに作出した種間雑種系統および交配親を材料とし,NaCl溶液処理に対する耐性並びに耐塩性に関連すると形質とされている塩類腺の分布を調査した.1ヶ月間に渡る0,3,5,7%のNaCl溶液処理後,全ての濃度区で雑種系統における緑色喪失度が小さく,交配親とした種よりも耐塩性が向上していることが明らかとなった.また塩類腺の分布はZ.sinicaに類似していた.各器官におけるNa含有量を比較したところ,雑種の葉におけるNa含有量が低く,雑種系統の耐塩性向上は,葉からの塩排出能に関連していると推測された.雑種自殖後代作出による耐塩性系統の形態的改良日本シバ3種とZoysia sinicaを交配親として正逆交雑を行い,種間交雑種を獲得した.得られた雑種系統(F_1)の多くで母本とした日本シバを上回る耐塩性が示され,7%濃度の塩処理灌水後でも生育しているものも認められた.しかしその形態はZ.sinicaに類似しており,葡匐茎の伸長が遅く,地上部の直立茎が長いために,一般的な芝草として利用するには被覆性の点で課題が残った.そこで形態的な改良を目的として,被覆性に優れたZ.japonicaを交配親として得られたF_1個体群から高耐塩性を示した系統(H7)を選抜し,この自殖系統を作出するとともに,同集団の耐塩性,塩類腺分布パターンおよび形態を調査した.その結果,F_1雑種(H7)の自殖によって32系統の後代が得られた.

これらの自殖後代群の一部で耐塩性の低下が認められたが,多くの個体が1ヶ月に渡る7%塩処理後でも生存し,F_1系統と同程度の耐塩性を維持していた.また,塩類腺分布を調査したところ,F_1の交配親であるZ.japonicaの分布パターンに類似する傾向が認められ,これまでに著者らによって報告されているような耐塩性程度と塩類腺の相関関係が認められなかった.そのため本自殖後代群では,塩類腺による耐塩性程度の推測が不可能であった.形態的には,F_1世代に比べ草丈が短く,葡匐茎の伸長が良好となった系統も認められ,自殖による形態的な改良が可能であることが示唆された.以上のように,種間雑種を育種母本として利用した耐塩性付与が可能であることが明らかとなり,得られた雑種個体は育種母本として非常に有用であることが明らかとなった.
第2次大戦期 興亜院の日本語教育に関する調査研究

1.昭和10年代は、国家の膨張策に伴い、日本語教育が海外に進展した時期であり、外務省系の主導による活動(国際学友会・バンコク日本文化研究所設置等)、文部省の主導による活動(国語課設置、日本語教育振興会の文部省内移転等)が知られていた。2.興亜院(1938設置)の日本語教育活動については資料を欠き、そこで日本語教育活動がたわれていたことすら知られていなかった。3.本研究では、同院で日本語教育を管轄していた故大志万準治氏所有の興亜院の第1次資料を整理・分析し、以下の日本語教育活動を確かめた。4.興亜院の日本語教育活動は、対中国文化工作の一貫として行われ、中国華北華南政府の下に「支那派遣教員」「支那派遣宗教家教師」の日本語教育要員約千名を派遣した。5.対中国文化工作は、東亜新秩序建設すなわち、西欧の影響を排除し、アジア的な精神とりわけ「日本精神」を行動の拠り所として東アジアブロックを形成するための施策であった。その中で日本語は「日本精神」を伝達するための手段であり、その教育は最重視された。6.「支那派遣宗教家教師」は、西欧精神キリスト教を克服し「日本精神」を普及させるために派遣された要員で、日本語を広める役割を負った。7.興亜院の活動以前に、軍宣撫班の日本語普及・国策会社の企業内訓練としての日本語教育の存在が判明してきた。今後の研究課題としたい。8.興亜院は、日本精神の「錬成」を中核とする日本語教員養成を行い、また文部省の日本語教育活動にも影響力を及ぼした。「日本精神」を謳う興亜院と、「国語学、外国語教授法」を重視する専門家との葛藤も新たに浮かび上がってきた観点であり、今後研究を継続していく必要がある。本研究の目的は、第2次大戦時に満州を除いた中国諸地域における文化事業を統括していた興亜院の行っていた日本語教育関係の活動を解明することにある。興亜院の原資料は終戦の際に破棄されたが、興亜院文化部に勤務していた故大志万準治氏はその原資料を個人的に保管しておられ、長谷川・柳沢はご遺族から故人所蔵の資料整理の委託を受けた。本研究は、大志万資料の整理・分析を通し、興亜院の日本語教育活動を研究することとし、第1年目の本年度は、国立国語研究所に仮保管の大志万資料の整理を研究活動の中核とした。本年度の研究活動は、資料整理にエネルギーをとられすぎたが、その原因は資料整理の困難性に起因する。例えば「日本語振興会」設立時の役員構成案メモが出てきたが、それは日本語教育史の資料としての重要性・注目度の高さは認められるが、資料整理の面からは題も日付もない原稿用紙1枚という「紙っぺら」であり、膨大な資料の中から価値の認められる資料として選定するにはどのような注意が必要か、それをどのようにデータベース化していったらよいか等について苦悩させられ、結果として資料整理の渋滞が繰り返された。しかしもう一方では、「教育関係」と書かれた原稿の中から、日本語普及計画を年代別/華北・華中といった地域別に記述した資料が発見されており、第2次大戦期における言語政策が、それなりの計画性を持っていたことが判明した等の成果もあがっている。当初計画では、重要資料のデジタル化が企画していたが、大志万資料の整理に予算と時間の大半をとられ、充分な結果を残せず媒体をDVDあるいはCDとするかその考察のための機材をそろえた段階で終わってしまい、この課題は第2年次に回すこととなってしまった。第2次大戦期の中国(旧満州を除く)の日本語教育は研究上未開拓の地域であった。

しかし、興亜院文化部に所属し、中国の日本語教育を担当していた故大志万準治氏が在任当時の資料を大量に保管していたことが判明した。本研究は大志万資料の整理と、興亜院の日本語教育施策の解明を目的としている。本年度の研究は、以下の点を中心に活動を行った。(1)大志万資料の整理・分析a)国立国語研究所に仮保管中の大志万資料のデータベース化の継続と、国研への資料寄贈手続き準備(2)遠隔地間の共同研究体制の確立a)FMV-MG75Gをコンピュータの標準機種に設定し、研究分担者に配布b)大志万資料のCDROM化により、資料を各人が個別に使用可能にすると同時に、標準機種の下で共同利用なデータを作成する方向付けをした(3)興亜院の対中国日本語教育施策についての研究発表a)「興亜院の日本語教育施策-派遣要員の事前研修をめぐって-」(日本語と日本語教育32号)b)「第2次大戦期興亜院の対中国日本語教育施策」(2004年度日本語教育学会春季大会予稿集)本年度の研究で得られた知見は、以下のようであった。(1)中国の日本語教育は、興亜院が活動を始める以前に、軍特務部宣撫班が行っていた(2)興亜院は1938年末「対支中央機関」として設立され、対中国文化工作の一部として日本語教育を管轄し、大志万はその責任者の地位にあった(3)興亜院の日本語教育要員は1939年から中国に派遣されており、大きく「教員派遣」と「宗教家教師」から成り立っていた(4)日本語教育要員としての「宗教家教師」は、一般には知られていない存在であった。この存在の認知により研究の深化が期待できる(5)大志万は、「宗教教師」の事前研修において中心的な役割を果たしており、(4)との関連において大志万資料の価値の高さが証明されよう(6)派遣要員の派遣前研修における「日本語教授法」は主として松宮弥平が担当したが、その授業時間数は十分なものではなかった1.昭和10年代は、国家の膨張策に伴い、日本語教育が海外に進展した時期であり、外務省系の主導による活動(国際学友会・バンコク日本文化研究所設置等)、文部省の主導による活動(国語課設置、日本語教育振興会の文部省内移転等)が知られていた。2.興亜院(1938設置)の日本語教育活動については資料を欠き、そこで日本語教育活動が行われていたことすら知られていなかった。3.本研究では、同院で日本語教育を管轄していた故大志万準治氏所有の興亜院の第1次資料を整理・分析し、以下の日本語教育活動を確かめた。4.興亜院の日本語教育活動は、対中国文化工作の一貫として行われ、中国華北華南政府の下に「支那派遣教員」「支那派遣宗教家教師」の日本語教育要員を千名以上派遣した。5.対中国文化工作は、東亜新秩序建設すなわち、西欧の影響を排除し、アジア的な精神とりわけ「日本精神」を行動の拠り所として東アジアブロックを形成するための施策であった。その中で日本語は「日本精神」を伝達するための手段であり、その教育は最重視された。6.「支那派遣宗教家教師」は、西欧精神キリスト教を克服し「日本精神」を普及させるために派遣された要員で、日本語を広める役割を負った。7.興亜院の活動以前に、軍宣撫班の日本語普及・国策会社の企業内訓練としての日本語教育の存在が判明してきた。今後の研究課題としたい。8.興亜院は、日本精神の「錬成」を中核とする日本語教員養成を行い、また文部省の日本語教育活動にも影響力を及ぼした。
イネの根系育種の基礎となる根系の形質変異の解明と「根型」の品種分類マップの作成

根径に着目した根系形態の解析方法を新たに考案し,水稲品種の根系形成経過を調査するとともに,出穂期における50品種の根系形態を比較した.解析に当たっては,まず根系の形態を画像化し,そのデータを用いてパイプモデル理論に基づいた根系の'仮想パイプを作成した.次に,その仮想パイプを基にして根径階級毎の根体積分布図を作成し,根体積の分布の中央となる根径値を示す'平均根径指数'を算出した.また,幼穂形成期以降において,同分布図でみた根系が太根群と細根群とに分かれたので,全根体積に占める細根群の体積割合を示す'細根率',ならびに各根群の根体積分布の中央の根径値を示す'太根根径指数'と'細根根径指数'を指標として利用して解析した.その結果,生育に伴う水稲の根体積の増加パターンが明らかとなり,根径と根体積から見た根系構造を捉えることができた.また,根体積の根径階級別分布を特徴づける平均根径指数,太根根径指数と細根根径指数,および細根率は,根系の生育に伴う変化や品種間差異を示す指標となった.一方,水稲の根系形態の特徴をより明確化するために,佐賀平坦に分布する野草・水生植物等の根系形態を上述の根系解析法により比較し,各草種の根系構造の類似と相似点を確認することができた.また,各種の水生植物根系について構造とその土壌保持を比較し,根の細太や分枝状態すなわち根系構造が土壌粒子の保持力と密接な関連と示すことを指摘した.根径に着目した根系形態の解析方法を新たに考案し,水稲品種の根系形成経過を調査するとともに,出穂期における50品種の根系形態を比較した.解析に当たっては,まず根系の形態を画像化し,そのデータを用いてパイプモデル理論に基づいた根系の'仮想パイプを作成した.次に,その仮想パイプを基にして根径階級毎の根体積分布図を作成し,根体積の分布の中央となる根径値を示す'平均根径指数'を算出した.また,幼穂形成期以降において,同分布図でみた根系が太根群と細根群とに分かれたので,全根体積に占める細根群の体積割合を示す'細根率',ならびに各根群の根体積分布の中央の根径値を示す'太根根径指数'と'細根根径指数'を指標として利用して解析した.その結果,生育に伴う水稲の根体積の増加パターンが明らかとなり,根径と根体積から見た根系構造を捉えることができた.また,根体積の根径階級別分布を特徴づける平均根径指数,太根根径指数と細根根径指数,および細根率は,根系の生育に伴う変化や品種間差異を示す指標となった.一方,水稲の根系形態の特徴をより明確化するために,佐賀平坦に分布する野草・水生植物等の根系形態を上述の根系解析法により比較し,各草種の根系構造の類似と相似点を確認することができた.また,各種の水生植物根系について構造とその土壌保持を比較し,根の細太や分枝状態すなわち根系構造が土壌粒子の保持力と密接な関連と示すことを指摘した.イネの根系形態調査をより正確で簡便なものとするためにパソコンによる画像解析を利用し、根系の様相を一括して図示する方法を考案した。すなわち、根系の総量を根径別の根体積の分布として示し、根系全体で見た太さの指標(平均根径指数)ならぴに冠根と側根の各太さを示す指標値(太根根径指数・細根根径指数)、さらに冠根と側根の量的比率(細根率)を算出するのである。本年度は、生態型が異なる水稲50品種の根系形態を上述の手法で解析した。その結果、各品種間で根の太さを示す指標値に明確な品種間差異が認められた。また、冠根と側根の根体積割合にも品種間差異が認められた。そこで、根径および細根率の2視点から品種の分類を試みたところ、根径で7品種群に分けられ、それぞれの品種群内に細根率で25のサブグループが存在した。また、その分類により、供試品種の根系を、冠根型・中間型・側根型に類別した。一方、上述の解析法を用いて実施する水稲根系の形態分類をより明確に位置づけるために、水稲以外の各種植物の根系形態を同様に調査した。植物は佐賀平坦部に自生する野草(22科45種)を供試した。それらの根系は既往の根型分類に照らすと、主根型(24種)、ひげ根型(13種)、地下茎型(8種)に分かれるものであった。今回用いた形態解析手法は、各草種の根系の形態・構造を的確に反映して示し、また、既往の根型の形態的特徴をも類別して示すことができた。水稲は既往の根型分類では、ひげ根型(イネ型)として分類されているが、その形態的特徴を多くの草種の根系と比較することで明確にすることができた。水稲の根系形態の特徴をクローズアップするために,多様な草種間・属間における根系の形態比較を行った.調査草種は2002年に佐賀大学学内、同大附属農場、佐賀市嘉瀬川堤防より採種した22科45種の一年草及び多年草である.根系は画像処理し,根の直径階級別の根体積を求めた.

調査草種は主根型19種、ひげ根型18種、地下茎型8種の3つに大別され,3つの根型の各形態的特長を主根と側根、あるいは不定根の根量として明確に示した。すなわち、主根型根系では主根と側根の太さ毎の根量割合が明示され、ひげ根型根系では1mm径以上のやや太い1次根と一様に細い0.5mm径前後の高次分枝の細根の根量を分けて示すことができた。また、地下茎型根系は直径数ミリの太い地下茎量と1mm径以下の細根量がそれぞれ確認できた。1mm径以上の太根部分は、草種と根型によってその量が異なったが、1mm径以下の細根が全根系の相当量を占めることは鱗茎・塊茎型根系を除くすべての根型の根系に共通して存在した。一方,水稲根系の施肥窒素の化合形態に対する反応の比較を生態型が異なる10品種で行った結果,好アンモニア性と言われる水稲において,アンモニア態窒素で地上部根系共に生育がまさる品種だけでなく,部の品種で硝酸態窒素で地上部・地下部共に生育が優ることが示され,その原因解析と有効利用について検討した.
ヒト脳機能解明への道程としての遺伝子改変ラット作製法の開発

本研究の目的は、脳機能解析に利用できる遺伝子改変ラットを安価かつ容易に作製する方法を開発し、ラットを研究リソースとして利用できる基盤を作ることである。このために、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法の開発おこない、遺伝子改変ラット樹立技術を確立した。さらにラットES細胞を用いて、マウス・ラット異種間キメラ法によりラット精子を作出するために、コンディショナル組換え法により精巣形成不全マウス作出し、高効率でラット精巣組織をマウスで作出することに成功した。本研究により、効率的に遺伝子組換えラットを作る技術が開発された。本研究の目的は、脳機能解析及び病態解明に利用できる遺伝子改変ラットを安価かつ容易に作製する方法を確立し、ノックアウトマウスと同様な感覚でノックアウトラットを研究リソースとして利用できる基盤を作ることである。そのために、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法を確立する。さらに、マウス・ラット異種間キメラを用いたラットES細胞由来生殖細胞(精子及び卵子)の作出法を開発することを計画して研究を進めてきた。今年度は、すでに樹立しているSDラット及びBNラットES細胞から生殖系列遺伝するキメラ作製方法を確立するための基礎的な条件設定を進めてきた。NSE-VenusノックインラットES細胞株及びトランスジェニックラットES細胞株をラット胚に導入し、キメララットを作出した。これらキメララットから生殖系列遺伝をするものを得ることができた。すなわち、これまで樹立したSD系統由来ES細胞株は、多分可能を持っていることが証明できた。さらに、ラット胚盤胞をへラットESを導入して生殖系列キメラを作る基本的条件が明らかになった。さらに引き続きBNラットES細胞を注入したキメララットから生殖細胞へES細胞が分化する個体を検索する。一方、ラット・マウス異種間キメラを用いてラットES細胞由来生殖細胞を得るプロジェクトに関しては、雌の生殖細胞形成能は正常であるが、雄の精子形成のみができないDmrt7遺伝子ノックアウトマウス胚へラットES細胞を導入したキメラマウスを作製してきたが、発生が途中で止まる物が多く、ラットES細胞由来精子は得られていない。これらの動物には、ES細胞由来のトランスジーンを発現する動物は得られたが、生殖系列遺伝はできなかった。引き続きES細胞を注入したキメララットから生殖細胞へES細胞が分化する個体を検索する。一方、ラット・マウス異種間キメラを用いてラットES細胞由来生殖細胞を得るプロジェクトに関しては、精巣及び卵巣形成不全のあるため不妊であるTifp39遺伝子ノックアウトマウスの作製を進め、その樹立に成功した。また、雌の生殖細胞形成能は正常であるが、雄の精子形成のみができないDmrt7遺伝子ノックアウトマウスを東北大学西森克彦教授から分与を受け、ホモ雌の量産をおこなっている。今後ヘテロ雄精子と人口受精をおこない大量のノックアウト胚が得られるように準備ができた。さらに、マウス・ラット異種間キメラを用いたラットES細胞由来生殖細胞(精子及び卵子)の作出法を開発する。ラットはマウスではできない高次な脳機能解析が可能であり、神経科学研究のステージを一段前に進めることができるものである。平成26年度までに、SDラット及びBNラットからES細胞を樹立し、未分化状態を保ったままで単純遺伝子導入や相同組換えによる遺伝子改変をおこなう技術を確立した。さらに、両者のES細胞をラット胚に導入し、生殖系列遺伝するキメラ作製に成功した。本研究計画の一つの柱である、ラットES細胞より安定的に遺伝子改変ラットを樹立する手法は確立した。今ひとつの柱であるラット・マウス異種間キメラを用いたマウスよりラットES細胞由来精子の取得の研究も着実に進展している。これまで、細胞毒遺伝子のDTAをCre依存的に発現するマウスと精巣で選択的にCreに発現するマウスを交配させ、精巣欠損するES細胞移植受容胚の開発を進めてきた。さらに、これらマウスの遺伝子背景を異種間キメラを容認する細胞性免疫欠損のヌードマウスのものにする大規模コロニーの構築を進めている。これまでにヌードマウス胚に蛍光を発現するラットES細胞を導入し、ほぼ全身がラット由来のキメラができることを確認しており、新規開発受容胚は、ラットES細胞由来の精子を作製する事ができると予想している。

本研究の目的は、脳機能解析及び病態解明に利用できる遺伝子改変ラットを安価かつ容易に作製する方法を確立し、ノックアウトマウスと同様にノックアウトラットを研究リソースとして利用できる基盤を作ることである。この目的を達成するために、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法の確立をおこなうこと、さらに当該ラットES細胞を用いてマウス・ラット異種動物間キメラ法によりラット配偶子の作出法を開発することを目指し研究をおこなった。本研究では、SDラット及びBNラットからES細胞を樹立し、相同組換えによる遺伝子改変をおこなう技術を確立した。さらに、両者のES細胞をラット胚に導入し、生殖系列遺伝するキメラ作製に成功した。本研究計画の第一目標である、ラットES細胞より安定的に遺伝子改変ラットを樹立する技術を確立した。もうひとつの柱であるラット・マウス異種間キメラを用いたマウスよりラットES細胞由来精子を取得するために、胚盤胞補完法が効率的に利用できるES細胞移植受容胚の開発をおこなった。キメラ動物の精巣組織が外来のES細胞由来のものになる精巣形成不全マウスをコンディショナルノックアウト法により作出した。この精巣形成不全マウス胚に蛍光タンパク質を発現するラットES細胞を導入したキメラ動物では、蛍光タンパク質を発現する精巣が形成され、この精巣内には精細管組織が認められ、精原細胞が出来ていることが確認された。一方、精巣上体に精子は確認できなかったため、現在伸長精子細胞と思われる細胞を用いて顕微授精をおこないラット個体が出来ることの確認をしている。このように、本研究は、当初予定していたラットES細胞をマウスに移植し、配偶子を作製する事を達成できた。今後、本技術を洗練させ、マウスに近い経費と労力で遺伝子組換えラットを作る技術を完成させたい。本研究の目的は、脳機能解析に利用できる遺伝子改変ラットを安価かつ容易に作製する方法を開発し、ラットを研究リソースとして利用できる基盤を作ることである。このために、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法の開発おこない、遺伝子改変ラット樹立技術を確立した。さらにラットES細胞を用いて、マウス・ラット異種間キメラ法によりラット精子を作出するために、コンディショナル組換え法により精巣形成不全マウス作出し、高効率でラット精巣組織をマウスで作出することに成功した。本研究により、効率的に遺伝子組換えラットを作る技術が開発された。本研究開発では2つの大きな柱がある。第1は、ラットES細胞の培養条件、相同組換えを用いた迅速な遺伝子改変方法、確実に生殖細胞への分化をするキメラ作製法を確立し、遺伝子改変ラット作出の基礎作ることである。第2は、マウス・ラット異種間キメラを用いたラットES細胞由来生殖細胞(精子及び卵子)の作出法を開発することである。
選択的かつ独立に結合情報を発信する多重蛍光標識腫瘍マーカー認識ナノ空間クラスター

本研究では、蛍光標識腫瘍マーカー認識ナノ空間の構築を分子インプリンティングとポストインプリンティング修飾技術を駆使して達成した。達成された方法論はこれまで報告されておらず独創的であると同時に、量産可能であることから産業的にも魅力的で社会的波及効果がある。27年度は、モデル腫瘍マーカーとして前立腺特異抗体(PSA)およびPSAのα1-アンチキモトリプシン複合体(PSA-ACT)を用いた。まず、PSAとPSA-ACTの分子インプリントポリマー(MIP)を表面プラズモン共鳴(SPR)センサ基板上に作製のため、PSAとPSA-ACTを金蒸着SPRセンサ基板上に固定化した。原子移動ラジカル重合(ATRP)の開始基α-ブロモ酪酸を末端にもつアルカンチオールとカルボキシ基を末端にもつアルカンチオールの混合自己組織化膜をセンサ基板上に形成させた。次に、PEGリンカーを介してPSAまたはPSA-ACTを固定化した。まずPSAを認識するMIPが合成可能か検討するために、PSA固定化基板に、PIMのための機能性モノマーMEBA、コモノマーとしてMPC、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミドを添加して膜厚が約20 nmになるように表面開始AGET-ATRPを行った。PSAを固定化してあるリンカーのジスルフィド部位をTCEPにて還元切断してPSAを除去し、PSA-MIPを得た。SPRセンサにてPSAの吸着特性を評価したところ、10 ng/mL程度のPSAが測定可能であることが分かった。PSA-ACTに対するMIPについても、PSAと同様の結果を得た。次に、PEGキャッピング剤でポリマー中のMEBA残基を処理すると親和性が変化したことから、キャッピング処理の効果が確認された。さらに、PSAインプリント空間への蛍光分子の部位特異的標識を行った。PSAを還元除去した後に結合空間内に残された遊離のチオール基に試しに蛍光分子(フルオレセイン)を標識したところ、PSA添加に対して蛍光強度が変化し、結合情報を蛍光変化で読み出せることが分かった。以上のように本研究の要素技術は全て実行可能と確認されたので、今後、予定している研究計画に従い、研究目的を達成する。予定している研究計画に沿ってほぼ予定通り研究は遂行している。27年度に計画していた「PSA/PSA-ACT混合MIPの合成」を唯一行うことができなかったが、要素技術は全て確認できたので、特に大きな遅延に繋がることはない。今後も、研究計画どおり研究を遂行する。27年度に計画していたPSA/PSA-ACT混合MIPの合成が未実行であったが、想定の範囲内であり、今後の計画に大きな影響を及ぼすことはない。分子認識材料調達方法の工夫などにより、当初計画より消耗品購入費、旅費などが節約できたため。標的タンパク質の購入に当てる