hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスジェニック鳥類よる抗アレルギー卵の創製

花粉症や食物アレルギーの治療法として、エピトープペプチドの投与による減感作療法が有効であるとの報告がなされている。これはアレルゲンタンパク質のうち、T細胞が認識するアミノ酸配列(エピトープ)を取り出し、ペプチド(エピトープペプチド)として投与すると、この物質に対するアレルギー反応が中断されるというものである。本研究では、スギ花粉エピトープペプチドをニワトリで生産させ、エピトープペプチドを含有した卵を食べることでスギ花粉症の減感作療法に使うことを目的とした。そのためにまず、スギ花粉アレルゲンCry-j1およびCry-j2の7つの主要エピトープを1つにまとめたペプチド(7Crp)をコードする遺伝子配列をニワトリで繁用されるコドンで設計し、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子配列とともに全合成した。次に、この遺伝子配列を抗体定常領域(Fc)やリゾチームとの融合タンパク質として発現するように組み込んだレトロウイルスベクター生産用プラスミドを作製した。293FT細胞を用いてレトロウイルスベクターを生産したところ、10^7-9IU/mlの高力価のウイルス溶液を得ることができた。このウイルスベクターによる遺伝子導入でエピトープペプチドの生産が行えるかを検討するために、293細胞やCHO細胞へ遺伝子導入したのち、ウェスタンブロット法によってエピトープペプチドを検出したところ、これらの動物細胞でエピトープペプチドの生産を確認することができた。次に、このウイルスベクターを使ってニワトリ胚へ遺伝子導入することによって、エピトープペプチドを生産するニワトリの作製を試みた。9個の胚へ遺伝子導入処理を行い、胚培養によって4羽のヒナを孵化させることができた。3週齢の時点で採血し血中にエピトープペプチドが生産されているかについて検討したところ、エピトープペプチドの生産を確認することができた。これはアレルゲンタンパク質のアミノ酸配列(エピトープ)を取り出し、ペプチド(エピトープペプチド)として投与すると、この物質に対するアレルギー反応が中断されるというものである。本研究では、スギ花粉症の減感作療法のために、まずエピトープペプチドを発現するためのレトロウイルスベクターを作製し、鳥類胚への遺伝子導入によって、エピトープペプチドを卵に生産するトランスジェニック鳥類を作製することが目的である。本年度は、エピトープペプチドをコードする遺伝子の設計・合成と、同遺伝子を発現させるためのウイルスベクター生成用プラスミドの作製、および同ベクターによって動物細胞への遺伝子導入を行い、エピトープペプチドの生産が行えるかについて検討した。スギ花粉アレルゲンとしてCry-j1およびCry-j2があり、この中にある7つの主要なエピトープが知られている。このエピトープを1つにまとめたペプチドをコードする遺伝子配列をニワトリで頻用されるコドンで設計し、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子配列とともに全合成した。次に、この遺伝子を発現ユニットに組み込んだレトロウイルスベクター生産用プラスミドを作製し、293FT細胞を用いてレトロウイルスベクターを生産したところ、10^6-7IU/mlの高力価のウイルス溶液を得ることができた。得られたウイルス溶液を使ってCHO細胞へ遺伝子導入処理したのち、限界希釈法によってクローニングし、スギ花粉エピトープペプチドを高生産していると思われるクローンを樹立することができた。来年度は、このウイルスベクターを用いてニワトリやウズラ胚へ遺伝子導入することで、スギ花粉エピトープペプチドを卵中に生産するトランスジェニック鳥類の作製を試みる。
ポストムーア時代を支える100ギガヘルツ級時空間超伝導コンピューティング

本研究では,1空間計算型SFQプロセッサ技術の確立,2時間計算型SFQプロセッサ技術の確立,3100 GHz級SFQ回路を対象とする設計自動化技術の確立,4時空間超伝導コンピューティング法の確立,の4つの研究課題を設定する.これらを遂行することにより,単一磁束量子回路を用いた100 GHz級超高速ビット並列型プロセッサを世界に先駆けて実現する.汎用空間方向処理とレースロジック方式による時間方向処理を融合した新しい超伝導コンピューティング・アーキテクチャ技術を確立し,ポストムーア時代を支えるコンピューティング基盤へとつなげる.本研究は、単一磁束量子回路を用いた100GHz級超高速ビット並列型プロセッサを開発することを目的とするものであり、本研究での取り組みを通して、従来では成し得なかった超高速動作を可能にする新しい超伝導汎用コンピューティング法を確立しようとするものである。限界に達しつつある高性能プロセッサの開発におけるブレークスルーになり得る研究提案であり、本研究が遂行された際の学術的意義は大きい。非常に高い目標を掲げる研究提案であるが、多様な技術的課題に対し、これまでの研究成果に立脚した研究計画が提案されており、学術的貢献が期待できる。本研究では,1空間計算型SFQプロセッサ技術の確立,2時間計算型SFQプロセッサ技術の確立,3100 GHz級SFQ回路を対象とする設計自動化技術の確立,4時空間超伝導コンピューティング法の確立,の4つの研究課題を設定する.これらを遂行することにより,単一磁束量子回路を用いた100 GHz級超高速ビット並列型プロセッサを世界に先駆けて実現する.汎用空間方向処理とレースロジック方式による時間方向処理を融合した新しい超伝導コンピューティング・アーキテクチャ技術を確立し,ポストムーア時代を支えるコンピューティング基盤へとつなげる.
N末端が保護された蛋白質の高感度アミノ酸配列分析法の開発

蛋白質のアミノ酸配列分析は、蛋白質の立体構造や機能を明らかにするためだけでなく、蛋白質をコードする遺伝子を単離したり、その特性を解明する上で不可欠である。蛋白質の中には、N末端がアセチル化等によって保護されているものがあるが、こうした蛋白質の数は全蛋白質の5080%を占めている。これらの蛋白質についてはN末端配列をエドマン分解では決定することができないので、N末端保護基または保護されたアミノ酸を除去した後、エドマン分解によりアミノ酸配列を決定できる簡便で迅速、かつ感度の高い分析技術を開発することが重要である。前年度、PyrococcusアミノペプチダーゼによりN末端が保護された蛋白質をN末端からプロリンの1残基前のN末端ペプチド結合まで切断できることがわかった。本年度は電気泳動で分離した蛋白質をPVDF膜に転写した後、効率的に溶出し、Pyrococusアミノペプチダーゼで確実に消化する条件を検討した。その結果、PVDF膜を70%酢酸で30分処理することにより、転写された蛋白質を比較的効率的に溶出でき、溶出された蛋白質を凍結乾燥後、基質/酵素比1:1、pH10、50°Cで48時間で処理すると効果的に消化できることがわかった。一方、本年度は、蛋白質の分離精製に用いる二次元電気泳動の一次元目、固定化pH勾配等電点電気泳動のためのディスクゲルを作製する装置を開発した(実用新案出願実願平10-8968)。ディスクゲルを用いることによりN末端が保護された蛋白質を脱保護してシーケンスするのに十分な量、分離精製できるようになった。さらに、PVDF膜に転写された蛋白質のN末端が保護されているかどうかをPVDF膜上で検出する方法を検討した。その結果、PVDF膜上の蛋白質をPITCで処理した後、N末端に遊離のアミノ基を持つ蛋白質のN末端アミノ酸を切断し、新たに生じるN末端アミノ基にDABITCまたはDNSAPITCをカップリングさせれば、保護されていない蛋白質を有色または蛍光のスポットとして検出できる可能性が生まれてきた。この方法で保護された蛋白質のみリシル-N-エンドペプチダーゼで消化し、生じたペプチドの中からN末端ペプチドをDITCポリマービーズを用いて単離すれば、質量分析法を用いて保護基を同定したり、そのアミノ酸配列を決めることができると考えられた。蛋白質のアミノ酸配列分析は、蛋白質の立体構造や機能を明らかにするためだけでなく、蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしたり、その特性を解明する上で不可欠である。蛋白質の中には、N末端がアセチル化やホルミル化等によって保護されているものがあるが、こうした蛋白質の数は全蛋白質の5080%を占めている。これらの蛋白質についてはN末端アミノ酸配列をエドマン分解では決定することができない。そのため、N末端保護基または保護されたアミノ酸を除去した後、エドマン分解によりアミノ酸配列を決定できる簡便で迅速、かつ感度の高い分析技術を開発することが重要である。本年度は、超好熱古細菌Pyrococcus furiosus由来のアミノペプチダーゼを用い、ゲル電気泳動で分離した蛋白質のN末端ピログルタミル基、アセチル基等を除去する新しい技術の開発を目指した。まず、Pyrococcusアミノペプチダーゼ遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込み、この酵素を大量発現させた。産生されたPyrococcusアミノペプチダーゼをゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよびフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。Pyrococcusアミノペプチダーゼはこれまで知られているアミノペプチダーゼとは異なり蛋白質のN末端が保護されている場合でもN末端からペプチド結合を順次切断する活性を有するが、プロリン(Pro)のペプチド結合を切断しない。本年度、このPyrococcusアミノペプチダーゼの性質を利用することによりPVDF膜から溶出された蛋白質の内部アミノ酸配列を分析できることがわかった。一方、この酵素がN末端の保護基を切断した直後に遊離の状態になるN末端アミノ基を、あとで容易に除去できる修飾試薬によって化学的に修飾し、脱保護された蛋白質を得ようとした。この際、フェニルイソチオシアネートとBoc-Pro-Pro-NCSをアミノペプチダーゼ消化後の化学的修飾試薬として用いたが、いずれの試薬も消化後の修飾試薬として機能しないことが明らかになった。

その結果、PVDF膜を70%酢酸で30分処理することにより、転写された蛋白質を比較的効率的に溶出でき、溶出された蛋白質を凍結乾燥後、基質/酵素比1:1、pH10、50°Cで48時間で処理すると効果的に消化できることがわかった。一方、本年度は、蛋白質の分離精製に用いる二次元電気泳動の一次元目、固定化pH勾配等電点電気泳動のためのディスクゲルを作製する装置を開発した(実用新案出願実願平10-8968)。ディスクゲルを用いることによりN末端が保護された蛋白質を脱保護してシーケンスするのに十分な量、分離精製できるようになった。さらに、PVDF膜に転写された蛋白質のN末端が保護されているかどうかをPVDF膜上で検出する方法を検討した。その結果、PVDF膜上の蛋白質をPITCで処理した後、N末端に遊離のアミノ基を持つ蛋白質のN末端アミノ酸を切断し、新たに生じるN末端アミノ基にDABITCまたはDNSAPITCをカップリングさせれば、保護されていない蛋白質を有色または蛍光のスポットとして検出できる可能性が生まれてきた。この方法で保護された蛋白質のみリシル-N-エンドペプチダーゼで消化し、生じたペプチドの中からN末端ペプチドをDITCポリマービーズを用いて単離すれば、質量分析法を用いて保護基を同定したり、そのアミノ酸配列を決めることができると考えられた。
動的電場・磁場を用いた新規結晶育成方法の創製

動的電場・磁場を用いた新規結晶育成方法を提案し、この方法を実験的に実証した。特に、SiC単結晶成長に関して、液相成長と昇華法について新規な結晶成長法を提案した。昇華法に関しては、炉内圧力を制御することにより、結晶成長速度を増加させることが可能であることを明らかにした。液相成長法に関しては、高周波電磁場の周波数を変化させることにより、液相へ印加される電磁力の大きさを明らかにした。水平磁場印加法を用いたシリコンの結晶育成法は、LSI用のみならず太陽電池の結晶育成にも応用されている。この、横磁場印加法は、広くシリコンの結晶成長に利用されているにもかかわらず、その幾何学的非対称性から、結晶育成炉内のシリコン結晶および融液の温度分布や流速分布を解析的に求めることは従来行われてはこなかった。本研究では、結晶育成炉内の熱と物質の移動現象を3次元で解析可能なアルゴリズムの開発と、それを使用した解析を行った。従来、結晶育成炉内の解析を3次元で行うことは、計算機のメモリーや演算速度との関係から、その実現がほぼ不可能とされてきた。しかし、必要な部分のみ3次元で解析し、2次元の解析で十分機能する領域は2次元で解析するという新しいアルゴリズムの開発を行った。これにより、従来不可能であった結晶育成炉内の温度分布、速度分布を定量的に解析することが可能となった。具体的には、結晶成長炉内の結晶、融液、坩堝、サセプターの部分を3次元で解析し、他のヒータ、熱遮蔽対等は2次元で解析している。ここで、2次元の解析と3次元の解析を連携させるところが本研究で開発した新規アルゴリズムの重要なポイントである。すなわち、結晶育成炉の形状は軸対象であるが、実際に生じている現象は3次元構造を有する。そこで、この性質を利用して、輻射計算に必要なview factorの2次元性と3次元性を考慮することにより、効率的に2次元格子と3次元格子の間の輻射熱の交換を計算することが可能となった。このために、融液対流の3次元構造や結晶中の温度分布を3次元で求めることが可能となった。さらに、融液と結晶との界面の形状を3次元で表現することが可能となり、各位置における結晶成長速度の分布を求めることが可能となってきている。これらの結果は、従来実験で観測されている結果と、ほぼ定量的に一致しており、計算制度に関する検討も行っている。また、この結晶成長速度を用いて、固液界面における不純物の偏析現象を記述することが可能となり、不純物の結晶中における分布を3次元で解析することが可能となってきている。ここで得られた結晶中の温度分布を用いて結晶中の応力分布を求めることも可能となってきている。また、これらの結果も、従来結晶成長実験より得られた不純物分布を、ほぼ定量的に表現することが可能となってきている。このように、本研究で開発した3次元総合伝熱解析コードは、必要な部分のみを3次元で解析し、残りは2次元で解析することにより、従来不可能であった結晶育成装置の3次元解析を、適当な計算機メモリーサイズで、しかも許容できる解析時間内で可能なものとした。そして、局所の結晶育成速度は、結晶の回転数にかかわらず類似の分布をしていることが明らかとなってきている。これは、水平磁場により融液対流が整流され、結果として結晶回転数が変化足手も、融液と結晶の温度分布は大きく変化しないために、このような結果が導き出されていることが判明している。本研究で対象としている水平磁場印加法を用いたシリコン単結晶の結晶育成法は、LSI用のみならず太陽電池の結晶育成にも応用されている場合がある。この、横磁場印加結晶育成法は、広くシリコンの結晶成長に利用されているにもかかわらず、その配置の幾何学的非対称性から、結晶育成炉内のシリコン結晶および融液の温度分布や流速分布を解析的に求めることは従来行われてはこなかったのが現状である。本研究では、結晶育成炉内の熱と物質の移動現象を3次元で解析可能なアルゴリズムの開発と、それを使用した解析を行っている。

そこで、この性質を利用して、輻射計算に必要なview factorの2次元性と3次元性を考慮することにより、効率的に2次元格子と3次元格子の間の輻射熱の交換を計算することが可能となった。このために、融液対流の3次元構造や結晶中の温度分布を3次元で求めることが可能となった。さらに、融液と結晶との界面の形状を3次元で表現することが可能となり、各位置における結晶成長速度の分布を求めることが可能となってきている。これらの結果は、従来実験で観測されている結果と、ほぼ定量的に一致しており、計算制度に関する検討も行っている。また、この結晶成長速度を用いて、固液界面における不純物の偏析現象を記述することが可能となり、不純物の結晶中における分布を3次元で解析することが可能となってきている。ここで得られた結晶中の温度分布を用いて結晶中の応力分布を求めることも可能となってきている。また、これらの結果も、従来結晶成長実験より得られた不純物分布を、ほぼ定量的に表現することが可能となってきている。このように、本研究で開発した3次元総合伝熱解析コードは、必要な部分のみを3次元で解析し、残りは2次元で解析することにより、従来不可能であった結晶育成装置の3次元解析を、適当な計算機メモリーサイズで、しかも許容できる解析時間内で可能なものとした。そして、局所の結晶育成速度は、結晶の回転数にかかわらず類似の分布をしていることが明らかとなってきている。これは、水平磁場により融液対流が整流され、結果として結晶回転数が変化しても、融液と結晶の温度分布は大きく変化しないために、このような結果が導き出されていることが判明している。以上の結果より、外場印加下における結晶育成プロセス中の3次元解析が可能となってきていることがわかる。本年度は、前年度までに開発した電磁場を用いた加熱方法によるSiCバルク単結晶の昇華法に焦点を当て研究を行った。とくに、SiCバルク単結晶の成長速度、化学量論的組成等の炉構造依存性について今までに報告が無く、しかも結晶特性の見地から重要な知見を得ることが可能となった。今年度新たに開発した計算コードは、結晶表面と原料表面におけるSi,SiC2,Si2Cの平衡蒸気圧を考慮し、しかも両表面におけるKnudsen層を考慮することにより、SiCバルク単結晶表面の成長速度の2次元分布を世界で初めて解析することに成功した。さらに、SiCバルク単結晶の結晶成長には必須であるExtra box中の多結晶の成長速度等の解析にも成功した。本研究結果から、1Torrの場合は重力場におけるアルゴンガスの対流を考慮する必要はないが、10Torrの学の圧力になるとアルゴンガスの対流を考慮する必要があることが明らかになった。従来の解析では、アルゴンガスの対流の効果は考慮されてはいなかったが、本研究の結果、この効果を考慮する必要があることが明らかになった。とくに4,6インチのSiCバルク単結晶の育成時には、顕著となることが分かった。さらに、SiCバルク単結晶の周辺の組成は、化学量論的組成に近い結晶が成長していること、また、炉内のアルゴンガス圧力を増加すると結晶成長速度は低下するとともに、化学量論的組成に近い結晶が育成されていることが明らかとなった。さらに、Extra boxの炉内の位置に対してSiCバルク単結晶の結晶成長が変化し、最適な位置が存在することを明らかにした。
調和解析と函数空間の研究

本研究の目的は、ユ-クリッド空間上の調和解析を様々な角度から研究すると共に、その応用、多様体の上への調和解析の発展を期するものであった。ユ-クリッド空間上のフ-リエ解析において、重要な問題は、しばしば平行移動不変な作用素の研究、特にその有界性に帰着される。その非自明な最も単純な例は、円盤マルチプライヤ-であるが、そのルベ-グ空間における有界性は、特種な場合しかしられていない。ある種の混合ノルム空間については、特別な場合になりたつ事を既に示したが、極座標についての混合ノルム空間について、ルビオ・デ・フランシア-コルドバが得た円盤マルチプライヤ-についての結果を一般化すこと試みた(猪狩)。その結果は、n次調和関数で定義される空間でのノルム評価を下げる事ができたものの、十分ではなく今後の研究によらねばならない。立沢は、正のポテンシャルをもつシュレジンガ-作用素の固有値の漸近分布について、C.フェファ-マンが用いた調和解析的な手法ー関数の分解と荷重の応用ーを発展させ、固有値の変分原理とジリクレ-ノイマン法を用いて、研究した。その結果、非常に一般的なポテンシャルについて、すなわち非古典的な場合の一部も込めて固有値の漸近分布を記述することができた。新井は、C^n内の滑らかな有界狭義擬凸領域Dをバ-グマン計量gによる完備ケ-ラ-多様体とみなし、この多様体上の調和解析を試みた。主な結果は、L_gのマルチン境界は、Dの位相的境界と同相であり、極小マルチン境界点からなる。これはテイラ-の問題の肯定的解答を与えるものである。また、L_g調和測度と境界上のルベ-グ測度は互いに連続であることを示した。この結果の今後の応用が期待される。
神経計算学に関する総合的調査研究

神経計算学は神経回路網が従来のノイマン型計算機の直列情報処理に代わって、学習と自己組織によって知識構造を構築していくシステムを有していることから、これらの神経回路網の高度な情報処理の動作原理を明らかにする新しい学問体系である。本年度は以下の研究を行った。1.脳の知的情報処理様式について究明するため、神経生理学、認知心理学研究者と一緒に研究討論を行って来た。内容として、感覚情報と運動情報の統合野の働き、大脳における図形情報の分析と統合、視覚記憶部と海馬との結合、側頭溝における視覚情報処理、さらに視覚系における神経回路の形成の研究等が近年の脳の情報処理の先端的研究として、目ざましいものがあり、本研究課題の推進にきわめて重要な役割を果す。2.神経回路網の並列情報処理を担う視覚情報処理モデル、聴覚情報処理モデルの研究は神経情報処理モデルの基礎として大切である。今まで位置によらないパターン照合を行う神経回路、時変パターンに対する特徴検出回路の自己組織化、さらに動物軌道を生成する神経回路モデルと連続音声認識の可能性、視覚野での画像再構成等の研究成果を発表し討論を行った。またパタン認識過程のモデル化として、ネオコグニトロンのボトムアップおよびトップダウンの同時処理により新しい情報処理機能を有することが明らかとなった。3.並列学習処理方式の研究が神経計算学の基礎的な原理を担っている。本研究グループは代表者を中心に統計力学、神経場の理論解析を押し進め、新しい体系を作りあげて来た。学習方式として相互フィードバックの状態と結合係数の相補関係に基づく学習、並列多重分散記憶モデル、神経回路における動的パターンの記憶モデル等の研究成果をあげて来た。4.第1世代から第5世代に至る直列処理型コンピュータの限界を突破する道として、神経計算学の新しい体系の構築が重要な緊急課題である。
アクチン系細胞骨格を介したシグナル伝達とアポトーシス : ERM蛋白質の役割

本研究では、モエシンをノックアウトしたマウスを作製することに成功し、そのフェノタイプを詳細に調べた。モエシン遺伝子はX染色体上にのっていたが、その遺伝子を破壊したES細胞からのキメラマウスは無事に生まれ、生殖細胞系列に通った。そして、最終的にモエシンを全く発現していないマウスを得ることに成功した。このマウスは全く正常に生まれ、正常に成長した。生殖能力にも異常がなく、特別な行動異常も見られなかった。各組織のERMの発現と分布を、ウェスタンブロッティングと蛍光抗体法で詳細に検討したが、モエシンだけが正常の細胞から欠落しているだけで、エズリンとラディキシンの発現にも何の変化もなかった。組織学的にも形態異常は全く見られなかった。そこで、これまでERMが関与していると言われてきた細胞レベルでの現象について詳細な検討を行った。まず、ERMはRhoの下流でストレスファイバーの形成などに重要な役割があると報告されているが、オクルディン欠失マウスから培養した線維芽細胞は立派に発達したストレスファイバーを形成していた。また、モエシンが-なくても微絨毛に形態異常はみられないことも培養肥満細胞のレべルで明らかになった。さらに血小板ではERMのうちモエシンが圧倒的に多く、これが血小板の凝集に重要な役割を果たしていることが報告されていたが、モエシンを欠く血小板も遜色なく凝集することが分かった。以上の事実は、想像されていた以上に、ERMは個体レベルでも機能的に重複していることを示している。さらに、全体としての発現量もその機能から考えればかなり余裕があり、発現量のごく一部だけが機能していることも示唆された。本年度は、ERM蛋白質の活性をRhoがどのように制御するかについて、詳細な解析を行った。Rhoの直接のターゲット分子として、最近いくつかのセリン・スレオニンキナーゼが同定され、その中でもRhoキナーゼと呼ばれる酵素の重要性が明らかになってきた。我々は、このRhoキナーゼによってERM蛋白質が直接リン酸化されるか、また、もしリン酸化されるとするとERMの活性がどのように制御されるかを検討した。そのためにまず、ラディキシンの全長(F-rad)とC末半分(C-rad)をバキュロウイルスベクターを用いてSf9細胞で作り、精製した。さらにRhoキナーゼの構成的活性型(RhoKc)をやはりバキュロウイルスベクターを用いてSf9細胞で作り、精製した。F-radまたはC-radをRhoKcとインキュベートしたところ、すべてのC-rad分子がリン酸化された。さらにC末端よりのスレオニンがリン酸化されていることも明らかになった。そこでこのスレオニン残基のリン酸化が細胞内で起きているかを調べるために、この残基がリン酸化されたERMのみを特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した。血清を除去した培養液中のSwiss3T3細胞をLPA刺激することによりRhoを活性化させ、このモノクローナル抗体でイムノブロットすると、確かに細胞内でもERMのC末端のスレオニン残基がRho依存性にリン酸化されていることが明らかになった。このスレオニン残基のあたりの配列は、ERMのアクチン結合能、および、N末端との結合によるERM活性の不活化、という2つの機能を担っている部分であることが知られていたので、リン酸化のこれら2つの機能に対する影響を次に調べた。その結果、C末端のスレオニン残基のリン酸化は、ERMのアクチン結合能には影響しないが、不活化を抑制してERMを活性化状態に維持することが分かった。

Rhoの直接ターゲットであるキナーゼによるERM蛋白質のリン酸化の検討:これまでに、ERMとCD44の結合がRhoによって制御されていることを証明した。一方、Rhoの直接のターゲットとしていくつかのセリン・スレオニンリン酸化酸素が同定されている。また、ERMはそのセリン・スレオニン残基がよくリン酸化されることが知られている。そこで、Rhoの直接のターゲットであるキナーゼによってEMR蛋白質がリン酸化され、その機能が変化してしてCD44との結合能を獲得するという仮説が考えられる。この仮説を検討する第一歩として、貝渕ら(奈良先端大)により同定されたRHOのターゲットキナーゼであるRhoキナーゼとPKNによって、ERMがin vitroでリン酸化されるかどうかを検討した。リン酸化型ERM蛋白質の機能解析:リン酸化型特異抗体の作製:もし、上記の仮説が正しければ、活性化型RhoによってRhoキナーゼが活性化し、ERMがリン酸化され、リン酸化ERMがCD44などの膜蛋白質と結合して膜に移る筈である。そこで、実際にリン酸化型ERMが細胞膜に移行するかどうかを、細胞レベルで調べてみる必要性がある。この目的のために、リン酸化型ERMを特異的に認識するモノクローナル抗体を作製した。具体的には、上述の解析により、リン酸化部位を決め、その部分のリン酸化ペプチドを合成し、これを抗原にして、モノクローナル抗体を作製し、その中からリン酸化ERMを特異的に認識するクローンを選択した。活性型(リン酸化型)ERM蛋白質の作製:以上の考え方が正しく、それが証明されたので、次に構成的に活性な(constitutively activeな)ERMを作製することを目的とした。すなわち、安定にリン酸化型として振る舞うERMの作製を試みた。
子供の虐待が脳発達に及ぼす影響について、脳の形態からエピジェネティクスを含む検討

本課題研究は被虐待児の脳を形態学的及びエピジェネティクな変化を調べることを目的とした。被虐待児の脳とコントロールの脳において明らかな形態学的相異は認められなかった。また、DNAメチル化を調べるための予備実験を行い、脳組織のパラフィン包埋切片からDNAを抽出し、メチル化特異的PCR法によりメチル化DNAを検出することが可能であることを示せた。しかし、この方法は量的な評価には不適当であるため、MBD1ドリップ法を確立するための予備実験を行った。本年度は子どもの虐待死亡事件解剖例はなかったため、症例数を増やすことはできなかった。ところで、遺伝子は加齢に伴いDNAメチル化を受けることが明らかとなってきた。そのため、虐待死亡例のDNAメチル化の程度が、有意なDNAメチル化の増加であるか否かを判断するためには、発育や加齢に伴うDNAメチル化の程度を調べる必要性が生じてきた。そのために、解剖時に脳組織を収集してきたが、その試料は0歳から100歳の脳組織である。解剖時に摘出した脳をホルマリン固定後、前頭葉上前頭回、扁桃体、海馬、小脳等の各部位からパラフィン包埋切片を作製した。また、本研究を実行するための準備として、各組織切片からDNAを抽出し、Bisulfite処理を行い、PP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域に対する塩基配列特異的なプライマーを用いてPCR反応を行い、増幅産物を得た。PP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域のメチル化を評価するのに最も適した方法を確立するため、Bisulfite genomic sequencing法、COBRA法、メチル化特異的PCR法、メチル化感受性PCR法、Pyrosequencing法を行い、比較検討を行ったところ、Pyrosequencing法が最も簡便であることが判った。その方法でプロトコールを作成し、対象とする遺伝子数を増やしてゆき、加齢に伴うDNAメチル化の程度を調査しすることが可能となった。研究期間は子どもの虐待死亡事件解剖例はなかったため、症例数を増やすことはできなかったが、虐待死亡例以外の多くの収集された試料につき、解析を行った。試料は0歳から100歳の脳組織であり、解剖時に摘出した脳をホルマリン固定後、前頭葉上前頭回、扁桃体、海馬、小脳からパラフィン包埋切片を作製した。本研究を実行するための準備として、各組織切片の大脳皮質からキットを用いてDNAを抽出し、Bisulfite処理を行った。メチル化解析については、これまでに、行ってきたPP1遺伝子やREELIN遺伝子の上流域に対する塩基配列特異的なプライマーを用いて行ってきた。そのため、虐待死亡例のDNAメチル化が異常なDNAメチル化の増加であるか否かを判断するために、発育や加齢に伴うDNAメチル化の程度を調べる必要性が生じてきた。そこで、新たに年齢に依存してメチル化の程度が変わることが報告されている、06-Methylguanine DNAtransferase(MGMT)遺伝子の上流域に対する特異的なプライマーも用いてPCRを行い、これらの領域について検討を行った。実際のメチル化解析の方法は、Bisulfite genomic sequencing法、COBRA法、メチル化特異的PCR法、メチル化感受性PCR法、Pyrosequencing法等が挙げられるが、これまでの予備実験で一番簡便かつ効率的であると判明しているPyrosequencing法を用いて遺伝子の上流域のメチル化を評価した。この他にも、メチル化解析の対象となる遺伝子は多数あることから、対象となる領域の数を増やしていき、加齢に伴うDNAメチル化の程度を調査し、虐待や恐怖体験において特異的にメチル化される遺伝子領域を同定したい。1)脳の形態学的検討:研究開始時点においては研究期間3年間で子どもの虐待死亡例10例程度を予想していたが、実際は1例のみであった。そのため、虐待脳に関するデータの集積を十分に行うことは出来なかった。但し、コントロールに用いる、乳幼児突然死例は35例があり、その脳CTイメージや組織標本を収集することができた。2)脳の組織学的検索:コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)の増加は視床下部-下垂体-副腎システムに悪影響を及ぼし、精神的な問題を惹起する。CRHの遺伝子発現調節に転写因子CREBやCREMが関わっていることから、抗CREB抗体や抗CREM抗体を用いて免疫組織染色を行うための条件検討を行った。いずれも1次抗体20倍希釈で良好な染色が得られた。しかし、コントロールにおいても染色の程度に個体差があり、その解釈方法については改良の余地がある。3)脳のエピジェネティクスによる遺伝子発現の検索:左右前頭回、左右扁桃体、左右海馬回、小脳から採取されたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片からキアゲン社QIAamp^[○!13]DNA FFPE Tissueを用いて、DNAを精製した。組織切片3枚から約4μgのDNAを採取できた。

次いで、キアゲン社EpiTect^[○!14]Bisulfiteを用いて、バイサルファイト処理を行ったところ約70%から90%の回収率を得られた。予備実験として年齢依存的にメチル化率が増加するO^6-methylguanine DNA transferase(MGMT)遺伝子に着目してPCRを行った。用いたメチル化特異的なプライマーMGMT1F及びMGMT1Rの塩基配列は5'-CTAACGTATAACGAAAATCGTAACAACC-3'、5'-AGTATGAAGGGTAGGAAGAATTCGG-3'であった。PCR産物はバイサルファイト処理DNA30ngでも得られた。以上の予備実験からホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いてメチル化DNAの検出が可能であることが分かった。また、1回のPCRに必要とする組織量は2mm×2mm程度であることが分かった。一方、メチル化DNAを検出するだけではなく、それがどのように変化するかを調べるには、メチル化特異的PCR法が適切であるとは言えない。新たな方法の導入が必要であると考えられた。
最適化問題の集合並列計算方式に関する研究

(1)集合並列計算(collective computation)が従来他の方法では解きにくかった組合せ最適化問題に応用されつつある。その典型例はシミュレ-テッド・アニ-リング、ボルツマン・マシン、ニュ-ラルネットワ-クなどであるが、それらはネットワ-ク表現された組合せ最適化問題の並列分散的計算方法を指向している。それらの原理はネットワ-ク要素(ノ-ド)間の複雑かつ大規模な結合関係に依存しているとは云え、その実現段階では結合複雑性上の点から限界がおきる筈である。この困難を克服するには何らかのシステム構造を必要とすると考えられる。例えば階層化ネットワ-クや部分目的間の協調競合メカニズムなど。本研究において我々は、確率化した組合せ最適化問題における目的関数の分解を考え、それにもとづく並列直列計算システム(階層化ネットワ-ク、並列ネットワ-ク)を提案した。これによってシステムの実現に際して結合複雑性を大巾におさえることが出来る。この方式の妥当性を、巡回セ-ルスマン問題に対する計算機実験にもとづいてたしかめることが出来た。(2)シミュレ-テッド・アニ-リングは大局的最適化問題を解くのに有効な方法として知られているが、本研究では、組合せ最適化問題より情報量が多いと考えられる連続系の最適化問題にこれを適用した。元の問題は非線形回路設計の問題で、これを最適化問題に定式化している。これには大局的最小点の近傍に多数の局所的極小点が存在する。この実験によって、組合せ的最適化問題へのシミュレ-テッドアニ-リングの応用に際しての多くの情報が得られた。(1)多くの最適化問題は多目的的であるが、各目的関数は、より分散的(疎)、より集中的(密)といった特徴をもっていて、それらを一括して扱うよりは、夫々別途にネットワーク表現を行って、並列もしくは直列にオーバーラップさせる方法を、確率的最適化のアルゴリズムの枠内で実現した。これは特徴ある情報構造をもったサブ・オプティマイザーを並列に働かせて全体の最適化を行う方法で、分散アルゴリズムの一般化と言える。(2)集合並列計算の高速化、デッドロック・フリーのための分散同期、集中-分散の組合わせについては、分散同期はほとんどすべての様相が隣接関係にある完全グラフ構造に対応し、大規模な問題ではかえって能率がよくないことがわかった。部分的な分散同期や分散・集中の適当な組合わせがのぞましいが、それも適応的な方法が重要と思われる。目下検討中である。(3)大局的な最適化を実施するためのアニーリング法については、VLSIの配置、配線問題など組合わせ的最適化問題に従来用いてきたが、更にその有効性を立証するために、より情報度の高い連続系の最適化問題の適用を試みた。連続系の問題として非線形抵抗回路網の解析問題を取り上げ、一応の結果を得たが、更によいアルゴリズムを得る様目下研究続行中である。(1)複雑大規模な最適化問題では通常の定式化では変数の数が多く、その結合複雑性が最大になりうる。たとえばホップフィ-ルド型のTSP(巡回セ-ルスマン問題)においてそのことが顕著である。それは問題のサイズが大きくなるにつれて計算上大きな障害となる。これに対し目的関数を分解し、分解された部分目的関数に対するサブ・オプティマイザを直列並列に接続して全体の最適化を実現する方法を、確立的アルゴリズムの範囲内で理論的に検討し、種々の可能な方式を得た。これらによって結合複雑性を低くおさえることが出来、計算機構実現上大きな障害をとりのぞくことができる。(2)(1)の方式はTSPに適用し、その妥当性について実験的検討を行った。それはアニ-リングを伴う確率的アルゴリズムにもとづいて行う方法で、よい結果が得られる場合と、必ずしも満足できない結果を与える場合とがあり、今後の研究に待つべき点が残されている。

(3)集合並列計算の1つの実現として、MIMD型並列、計算機上で動作するプログラムを作成し、プロセッサ台数と計算時間、通信時間の関係を実測し、集中一分散同期の問題を検討した。その結果、転送デ-タ量、デ-タ交換方式などの具体的な問題点が発生したが、並列アルゴリズムの開発やプログラムの実装において、有効な方式がいくつか見出せた。
ミストを原料とするマイクロ波プラズマCVD法による超伝導薄膜の作製

科学気相堆積法(Chemical Vapor Deposition;CVD法)は良質な薄膜結晶が容易に得られるところから、多くの機能性薄膜の作製に用いられている。しかしながら、不幸なことに酸化物超伝導体のCVDに用いることのできる適当な蒸気圧を持ち、しかも安定である原料がない。このため、不安定な有機金属錯体を原料に用いているのが現状である。先に、申請者はこのような問題点を解決するために、1.原料供給が容易で、2.高純度で、3.安価な原料を用いることができる金属塩の水溶液ミストを用いるマイクロ波プラズマCVD法を独自に開発し、as-grown状態で高い臨界温度(T_<c-zero>)を持つ良質なY系、Bi系、Tl系の超伝導薄膜の作製を行ってきた。そこで、本研究では、この方法を用いてAg添加YBaCuO超伝導薄膜のas-grown作製を試みた。原料には、金属原子比として1:2:3:としたY(NO_3)・6H_2、Ba(NO_3)_2、Cu(NO_3)・3H_2O水溶液を用いた。Ag添加にはAgNO_3を用いた。超音波振動子により霧化された原料ミストは、O_2またはArキャリアーガスを用いて成長装置中の酸素プラズマの中心に置かれたMgO基板上に供給された。得られたAg添加YBaCuO薄膜は、従来のYBaCuO超伝導薄膜に比べ、凹凸の少ない表面であり、T_<c-zero>は80Kから85Kへと増加した。Agの添加によるこのような物性の向上は、X線回折や室温抵抗の測定結果より、YBaCuO薄膜の結晶性の向上に起因することが明らかとなった。このように、as-grownでのAg添加YBaCuO超伝導薄膜の作製に成功した例は国内外ともなく、大きな成果といえる。
磁場構造形成において静電ポテンシャルが果たす役割の解明

低アスペクト比トーラス実験装置LATEにおいては、弱い垂直磁場をトロイダル磁場に重畳して電子サイクロトロン(EC)共鳴プラズマを生成した時、トロイダル電流の急激な増加により開磁場構造から閉磁気面構造へと自発的に構造変化が起こる新しい現象が観測されている。この磁場構造変化に伴う静電ポテンシャルの変化を調べるために、重イオンビームプローブシステムを構築し静電ポテンシャルの計測を行った。閉じた磁気面が形成されている時、赤道面のEC共鳴層付近の空間電位は-20-30Vの負の値になっており、開いた磁場構造時の正の静電ポテンシャル分布が磁場構造変化に伴って大きく変化している事が初めて観測された。本研究の目的は、LATE装置で電子サイクロトロン共鳴加熱・電流駆動によって引き起こされる自発的磁気面形成過程において、静電ポテンシャルが果たす役割を実験的に解明することにある。本研究遂行のためにはプラズマに擾乱を与えること無く静電ポテンシャルを測定できるイオンビームプローブ計測装置を設計・製作することが一番の要である。今年度は、これまでの準備研究を更に進め、以下のようにイオンビームプローブ計測装置の構築を行なった。(1)Naゼオライトを母材とし、水溶液置換法によりK+およびRb+イオンソースを製作した。テストベンチにて、18kVの加速電圧の時、それぞれ90μA、15μAのビーム電流を引き出すことができた。(2)LATE10B下部ポートに検出ビームラインを設置した。このビームラインの終端に取り付けるエネルギー分析器のスリットまでイオンビームを導くために、ビームラインにトロイダルおよびポロイダルデフレクターを取り付けた。(2)LATE装置赤道面に可動式ビーム位置検出器、エネルギー分析器スリット位置に3x8マトリクス型位置検出器を設置し、トロイダルおよびポロイダルスイーパー電圧、ならびにトロイダルおよびポロイダルデフレクター電圧を制御することにより1次ビームをエネルギー分析器スリット位置にある3x8マトリクス型位置検出器まで導くことができた。これにより、トロイダルおよびポロイダルスイーパー、ならびにトロイダルおよびポロイダルデフレクターが正常に機能していることが確認できた。(3)ビーム軌道計算コードの計算結果と(2)の実験結果を比較し、計算コードを改良して軌道計算精度の向上を行なった。(4)検出ビームライン側でビームがトロイダル方向に数cmも広がってしまうことがわかった。原因は入射ビームのトロイダル方向速度成分がゼロで無いことに起因すると考えられる。トロイダル方向速度成分を低減するために四重極レンズを使用することとし、その動作テストをテストベンチにて行ない、ビーム集束特性を確認した。(5)30°入射型平行平板電極と分割板電極を用いたエネルギー分析器、真空容器、回転機構付き架台の設計、製作を行なった。本年度は以下のように、エネルギー分析器の調整、LATE装置への取り付け、LATEプラズマでの2次ビームの検出と静電ポテンシャルの計測を行い、電子サイクロトロン加熱・電流駆動のみで形成・維持されたマイクロ波球状トカマクにおけて静電ポテンシャルの計測に初めて成功した。(1)テストベンチにおいて、回転式架台にエネルギー分析器の入った真空容器を設置し、エネルギー較正試験を行った。その後、固定式架台に置き換え、LATE装置の検出ビームラインに設置した。(2) LATE装置において、エネルギー分析器スリット前面に設置した可動式ビーム位置検出器により1次ビームの位置および形状を確認しながら、四重極レンズでビーム収束性を調整し、到達電流を4.6倍まで高めることができた。(3) LATE装置では電子サイクロトロン共鳴層がほぼ容器中心(大半径20cm)に位置する時、電子バーンスタイン波加熱により電子温度および電子密度の高いマイクロ波球状トカマクプラズマが形成される。このプラズマをターゲットとして2次ビームの検出ならびに静電ポテンシャルの計測を試みた。1ショットの放電中にトロイダルおよびポロイダルスイーパー電圧ならびにトロイダルおよびポロイダルデフレクター電圧を制御することにより電子サイクロトロン共鳴層付近で発生した2次ビームを検出する事ができた。そして、そこの静電ポテンシャルが-20 -30Vの負の値になっていることがわかった。閉じた磁気面が形成される前ではラングミュアプローブにより30Vの正の値になっていることがわかったので、これと比較すると閉じた磁気面形成により静電ポテンシャルの極性が反転することがわかった。今年度は昨年度に引き続き、以下のようにイオンビームプローブ計測装置の構築を進めた。

(1)検出ビームライン側でビームがトロイダル方向に広がってビーム輝度が減少するのを防ぐために導入を決めた四重極レンズをテストベンチで4種類のイオンソースに対して特性を評価した。その結果、イオンソースによって電極電圧を微調整する必要があることがわかった。(1)、四重極レンズをLATE装置の入射ビームラインに取り付け、四重極レンズ電圧を変えて1次ビームの位置と形状をワイヤープローブとエネルギー分析器スリット位置にあるマトリックス型検出器とで測定した。その結果、調整は非常に微妙であり、位置検出精度も高める必要があることがわかった。(2)静電ポテンシャルの計測点は、トロイダルおよびポロイダルスイーパー電圧V_TS、V_PSならびにトロイダルおよびポロイダルデフレクター電圧V_TD、V_PDの組み合わせにより決まる。イオン軌道計算に基づき、エネルギー分析器まで2次ビームをガイドできる電圧の組み合わせを求めた。また、1次ビームの場合についても計算し、1次ビームを用いたビーム位置・形状計測実験で活用した。(3)昨年度設計・製作した30°入射型平行平板電極と分割板電極を用いたエネルギー分析器を真空容器内に固定する作業を行った。LATE装置に入射ビームラインおよび検出ビームラインを取り付け、ビーム偏向を行なうトロイダルおよびポロイダルスイーパー、ならびにトロイダルおよびポロイダルデフレクターが正常に機能していることが確認できたことと、エネルギー分析器部分の設計が完了し、製作までこぎつけたことは予定通りである。ただ、ビームがトロイダル方向に予想以上に広がってしまっていたため、急遽四重極レンズを使用して対処することとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。エネルギー分析器の組み立てと真空容器への取り付け、ならびにイオン軌道計算コードの開発は順調に進んでいる。一方、ビーム集束のための四重極レンズ電圧を変えた時のビーム位置・形状調整は非常に微妙であり、現在のワイヤープローブとマトリックス型位置検出器では位置検出領域と精度が不足することがわかった。これらの実験調整に時間がかかり、今年度予定していたエネルギー分析器のエネルギー較正試験が来年度にずれこむこととなった。来年度はエネルギー分析器の調整・較正を行なった後、LATE装置に取り付け、ビームプロファイルを確認し、プラズマをつけて2次ビームの検出を試みる予定である。これらはすべて予定通りであり、現状より達成可能であると考えられる。エネルギー分析器を検出ビームラインに設置するに当たっては、エネルギー分析器スリット前面に到達するビームの位置と広がりを精度良く検出する必要がある。そこで、位置検出器を作製・取り付け、四重極レンズ電圧を調整してビーム輝度の向上をめざす。そのため、予算の一部を来年度に繰り越し、この位置検出器製作費に当てる。
流動層石炭ガス化炉内の局所的反応の解析と制御

本研究の目的はノズルからジェット状で送入し局所的に高温に達せしめ、装置全体のガス化効率を高めるとともに、凝集灰を生じさせるタイプの流動層ガス化炉を想定したうえで,装置全体のガス化反応の進行を把握するため酸素(空気)吹き込み口近傍の局所的現象を実験的に解明し,反応・熱効率上昇に必要な因子の抽出と制御法を確立することにある。本年度は種々の形状のガス送入口を用いて,層内の温度分布、生成ガス組成およびそれらの経時変化を測定し,生成ガス組成に及ぼすガス吹き込み法の影響を検討した。さらに、層内の局所的な反応の進行を解析するための基礎的検討を行なった。内径43mmの小型流動層に石炭チャ-を充填し、バッチ式反応器内におけるガス生成量,酸素送入部における局所的温度分布およびその時間的変化を測定した。平板型のガス送入口形状を用いた場合と比べ、コ-ン型分散板から水蒸気を送入し,分散板中央に設けたノズルより酸素を送入した場合には一酸化炭素に富む良好な組成が得られることがわかった。定常状態における炉内の局所的ガス化剤,生成ガス濃度を実測するため、石炭をアルミナで、ガス化剤を不活性ガスで希釈し,トレ-サ-としてヘリウムを炉内に送入することにより,ガス化剤,生成ガスの移動現象を解析した。その結果ジェット-アニュラス間のガス交換の様子が明らかとなった。ジェット、アニュラスにおけるガス濃度の違いは顕著であり、層内の局所的な反応の進行の解析が可能であることが示された。またアニュラス部における層高方向のガス化反応の進行も明らかであった。特にノズルより送入された酸素は主にジェット-アニュラスの境界付近にて石炭し,一酸化炭素を生成することが明らかとなった。
神経栄養因子活性を有する天然物の生物有機化学的研究

四種の神経栄養因子活性化合物の生物有機化学的研究を行った。ネオビブサニンの形式不斉合成は完了し、活性発現に必要な構造最小単位を明らかにできた。一方、(〓)〓タアラアミデインの構造異性体7種全てが合成でき、THP上の四個の置換基がダウンの異性体が最も強い活性を示した。さらに、神経変性モデルに対してネオビブサニン、タアラアミデイン、フェニルブタノイドダイマーは海馬領域の神経新生を促すことが明らかにできた。ネオビブサニン活性誘導体の蛍光および光親和性分子プローブの作成に成功した。本年度は,四種の活性化合物ネオビブサニン(1),メリラクトンA(2),タアラアミデイン(3)ならびにフェニルブタノイドダイマー(8)の合成法の開発と構造活性相関研究,それらと平行して各種阻害剤を用いた薬理学的手法ならびに免疫組織学的手法を駆使して細胞内シグナル伝達系リン酸化亢進タンパクの同定により,主に1と3の活性化合物の作用機序を解析した。1.化合物3はテトラヒドロフラン環上に連続した4個の不斉中心を持ち,8個のジアステロ立体異性体が存在する。Evansアルドール反応と立体選択的ヒドロホウ素化反応および位置選択的光延反応を駆使し全ての立体異性体の合成に成功した。今後、それらの神経栄養因子活性を評価することで,活性発現に必要な立体化学を明にする。さらに、タアラアミデインの作用機構解明も順調に進み、AKT細胞内シグナル伝達系リン酸化亢進への関与が明らかにできた。2.以前から続けているネオビブサニン(1)の不斉合成は順調に進んでいる。以前に開発した不斉1,4付加反応による四級炭素構築と新たに開発した連続一酸化炭素挿入とStille-Heck反応を組み合わせることで、世界で初めて1の不斉合成に成功した。この合成法を用いることで、ネオビブサニンの部分構造を合成し、活性に必要な最小構造単位を明らかにできた。現在、この構造の蛍光プローブ化によって神経細胞内の標的分子を探索している。3.インドネシア産ショウガ科バングル(Zingiber purpureum Roxb)から見出した神経栄養因子活性物質フェニルブタノイドダイマー(8)は、Diels-Alder反応で一段階で合成できるようになり、動物実験に供試できる体制が整った。現在、嗅球摘出マウスに経口投与し学習障害改善効果および脳内移行濃度を検討中である。本年度は,四種の活性化合物ネオビブサニン(1),メリラクトンA(2),タアラアミデイン(3)ならびにフェニルブタノイドダイマー(8)の合成研究が順調に進み、特に、ネオビブサニン(1)、タアラアミデイン(3)ならびにフェニルブタノイドダイマー(8)の全合成を完了した。さらに、構造活性相関ならびに各種阻害剤を用いた薬理学的手法ならびに免疫組織学的手法を駆使して細胞内シグナル伝達系リン酸化亢進タンパクの同定により,1と3の活性化合物の作用機序を解析した。また、8の神経変性疾患モデルマウスに対する有効性も検討した。1.ネオビブサニン(1)のラセミ体が合成できたので、両鏡像体の活性を評価した。ラセミ体での神経栄養因子活性に差が認められなかった。さらに、ネオビブサニン(1)の活性発現に必須のファーマコファーを明らかにし、それを基に蛍光分子プローブが調製できた。この蛍光分子プローブを用いてPC12細胞内の作用部位および標的分子を検討した。2.タアラアミデイン(3)の8種の異性体の合成が終了したので、PC12細胞とラット大脳皮質初代培養神経細胞を用いて異性体の構造活性相関を実施した。最も活性の強い異性体は全ての置換基がシス配置であることがわかった。また、この化合物の大量合成法も確立できた。各種阻害剤を用いた薬理学的手法ならびに免疫組織学的手法により、タアラアミデインはAKT細胞内シグナル伝達系を活性化していることも明らかにできた。3.フェニルブタノイドダイマー(8)のマウス嗅球摘出学習障害モデル対する作用を検討した結果、海馬領域の神経細胞の新生ならびに学習改善効果が認めら、神経変性動物モデルに対しても効果があることが証明できた。我々が見いだした新規天然物ネオビブサニン(1)、タアラアミデイン(2)ならびにフェニルブテノイドダイマー(3)は,強力な神経突起伸展活性を共通として持つが,三種の神経培養系(初代神経培養,PC12細胞,RGC細胞)に対する神経栄養因子活性の活性プロフィールが大きく異なることから,これらの神経栄養因子活性発現に関与する作用機序の解明は,難治性神経変性疾患の治療と予薬物開発に重要な指針を与えるはずである。

三種の活性化合物1, 2,と3の効率的合成の開発は終了し構造活性相関および薬理的手法による活性機序の解析,急性痴呆モデルOBXマウスに対する海馬領域の神経再生を検討した。1)合成が完了したネオビブサニン(1)の不斉合成に成功した。さらに、活性発現に必要な最小構造単位を明らかにし、その構造の最適化を行った。最適化された化合物は天然物と同等の強力な神経突起伸展活性を有することが明らかにできた。本化合物の標的細胞部位および標的分子を単離同定するため、蛍光プローブを結合した誘導体を合成し、PC12細胞に対する細胞内動態を蛍光顕微鏡および共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した結果、蛍光プローブは樹状突起根本部に集積することがわかった。2)フェニルブテノイドダイマー(3)は、急性痴呆モデルOBXマウスに経口投与した結果、コントロール群に比べて海馬領域の神経再生が有意に認められた。3)合成されたタアラアミデイン(2)の立体異性体7種の神経栄養因子活性を評価し、THP環上の全ての置換基がシスの立体化学を有する化合物が天然型より強力な活性を示した。この立体異性体を大量合成し、マウスに投与すると、物理的に傷害したマウス視神経細胞を再生する画期的な作用が発見された。本タアラアミデイン誘導体は緑内症等の視神経細胞変性疾患の治療薬への展開が期待される。四種の神経栄養因子活性化合物の一つメリラクトンA(2)の全合成に問題が生じ、この化合物のみ当初の計画通り進んでいない。24年度が最終年度であるため、記入しない。メリラクトンA(2)の全合成で問題になっているPd触媒Tuji-Trost反応を再検討することで、全合成を達成する。他の3種の活性化合物の合成は完了しているので、各種培養神経細胞を用いて各化合物の作用機序を解明し、我々が見出した構造が異なる4種の神経栄養因子活性化合物の活性発現機構を比較する本研究の申請目的を達成する。