hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
青斑核アストロサイトに着目した慢性痛病態の機序と治療法に関する研究

慢性痛が抱える問題は痛みだけでなく、注意、記憶、判断など前頭葉が関連する脳機能を障害することによっても患者の生活の質を低下させている。本研究は、痛みに対するブレーキシステムである内因性鎮痛と脳機能に重要な役割を持つ青斑核(LC)に着目し、慢性痛病態のさらなる理解と共に、その治療戦略の提案を目的とする。H30年度は以下の結果を得た。1)発症6週以降の慢性神経障害性疼痛動物モデルにおいて、グルタミン酸(Neurosci Lett 2018; 676: 41-45)及びニコチン受容体刺激(J Pain Res 2018: 11: 2453-62)によってLCが興奮することを論文報告した。この結果は、慢性化した神経障害性疼痛状態においてもLC神経細胞は刺激への反応性を維持していることを示している。2)社会的精神ストレスは術後痛からの回復を遅延させ、その影響は少なくとも4週間以上続くことを論文報告した(Neuroscience 2018:382:35-47)。この結果は、精神ストレスは慢性痛の原因になることを示している。3)本研究の中で考案した新規疼痛関連行動解析装置Shuttle mazeの特許を取得し、現在論文投稿中である。本装置は、絶食条件なしで動物が好む餌(甘いシリアル)を行動の動機として、痛み刺激の存在する短路または刺激の存在しない長路のどちらかを通る、あるいは行動しないことを自由に選択させ、疼痛関連行動を客観的に測定できる。Shuttle mazeは、動物への精神的肉体的ストレスを軽減できることで動物実験倫理の面でも画期的な方法である。研究計画は概ね予定通りに推移したが、故障した電気生理実験用の新たな機器納入が遅れたため、予定した期間内に実験を終了できず延長申請した。今年度は予定していた電気生理実験を終了し、これまでの結果と合わせ学会及び論文報告を行う。また、本研究の中で考案し、特許を取得した新規疼痛関連行動解析装置についての学会及び論文報告を行う。H28年度は以下の結果を得た。<1>末梢神経障害後の内因性疼痛減弱と前頭葉機能低下が同様な時間経過(術後4週以降)で起き、これはLCのグルタミン酸トランスポーター発現減少と相関した。また、前頭葉におけるノルアドレナリン基礎放出量の増加が前頭葉機能低下に関与し、痛み刺激に対して脊髄ノルアドレナリン放出が起きなくなることが末梢神経障害後の内因性鎮痛減弱のメカニズムの一つである可能性が示唆された。また、精神的ストレスが末梢神経障害と同様に青斑核グルタミン酸トランスポーター発現減少を起こす事を観察した。<2>本研究の行動実験中に考案した新規疼痛関連行動評価系Shuttle mazeを特許出願した(特願2017-062629)。本評価系は、実験者が動物に直接接触することなく、痛み刺激の存在する短路もしくは刺激の存在しない長路のどちらかを動物に自由に選択させることで、実験者の主観を排除し、疼痛関連行動を客観的に測定できる。また、本評価系は、絶食条件なしで動物が好む餌を行動の動機とするため、肉体的精神的ストレスを動物に付加することなく実施可能で、動物実験倫理の面でも画期的な手法である。今年度の実施項目として計画した内容をおおむね順調に遂行することができた。H29年度は以下の結果を得た。<1>神経障害性疼痛が慢性化したラット青斑核において、基礎神経活動は増加するが、前肢への痛み刺激による反応がほぼ消失することを細胞外記録法で観察した。この結果は、これまで我々が報告した内因性鎮痛機能の行動試験及びマイクロダイアライシス法を用いたノルアドレナリン放出測定の結果と一致した。これらの結果は、慢性痛時の青斑核が痛み刺激に反応できなくなったことにより内因性鎮痛機構が減弱するという我々の仮説を支持する。<2>神経障害性疼痛が慢性化したラット青斑核において、α2アドレナリン受容体拮抗によりグルタミン酸放出が起きることを論文報告した。この結果から、ノルアドレナリンは青斑核ノルアドレナリン神経細胞だけでなく、グルタミン酸神経終末も抑制し、結果として青斑核神経活動を抑制していることが示唆された。<3>リオデジャネイロ大学と共同開発中の新規α2アドレナリン受容体作動薬PT-31の鎮痛作用について論文報告した。クロニジンなど既存のα2アドレナリン受容体作動薬と異なり、PT-31は血圧低下や鎮静を起こしにくい化合物で、下行性ノルアドレナリン神経系による鎮痛メカニズム研究のツールとして興味深い。<4>社会的ストレスを負荷したラットにおいて、慢性痛と同様に内因性鎮痛機能が減弱し、術後痛からの回復が遅延する事を論文報告した。このメカニズムについて、青斑核アストロサイトの役割について現在検証中である。

今年度の実施項目として計画した内容をおおむね順調に遂行することができた。慢性痛が抱える問題は痛みだけでなく、注意、記憶、判断など前頭葉が関連する脳機能を障害することによっても患者の生活の質を低下させている。本研究は、痛みに対するブレーキシステムである内因性鎮痛と脳機能に重要な役割を持つ青斑核(LC)に着目し、慢性痛病態のさらなる理解と共に、その治療戦略の提案を目的とする。H30年度は以下の結果を得た。1)発症6週以降の慢性神経障害性疼痛動物モデルにおいて、グルタミン酸(Neurosci Lett 2018; 676: 41-45)及びニコチン受容体刺激(J Pain Res 2018: 11: 2453-62)によってLCが興奮することを論文報告した。この結果は、慢性化した神経障害性疼痛状態においてもLC神経細胞は刺激への反応性を維持していることを示している。2)社会的精神ストレスは術後痛からの回復を遅延させ、その影響は少なくとも4週間以上続くことを論文報告した(Neuroscience 2018:382:35-47)。この結果は、精神ストレスは慢性痛の原因になることを示している。3)本研究の中で考案した新規疼痛関連行動解析装置Shuttle mazeの特許を取得し、現在論文投稿中である。本装置は、絶食条件なしで動物が好む餌(甘いシリアル)を行動の動機として、痛み刺激の存在する短路または刺激の存在しない長路のどちらかを通る、あるいは行動しないことを自由に選択させ、疼痛関連行動を客観的に測定できる。Shuttle mazeは、動物への精神的肉体的ストレスを軽減できることで動物実験倫理の面でも画期的な方法である。研究計画は概ね予定通りに推移したが、故障した電気生理実験用の新たな機器納入が遅れたため、予定した期間内に実験を終了できず延長申請した。平成29年度に計画している各項目に従って順次予定通り進め、研究結果を学会発表及び論文投稿していくための準備を行う。さらに慢性痛に対する精神的ストレスの影響も加えて検討する。平成30年度に計画している各項目に従って順次予定通り進め、研究結果を学会発表及び論文投稿していくための準備を行う。今年度は予定していた電気生理実験を終了し、これまでの結果と合わせ学会及び論文報告を行う。また、本研究の中で考案し、特許を取得した新規疼痛関連行動解析装置についての学会及び論文報告を行う。動物実験予定の変更により、H29年度に行うため。実験動物購入及び飼育費用に使用予定。青斑核神経活動記録するための電気生理実験機器が壊れたため、新たな機器を注文したが、受注生産のために納入に時間がかかり、本年度中に予定していた実験が終了できなかったため。
多剤耐性がんに有効な海洋産ピロールアルカロイドの化学合成

多剤耐性がんに有効な海洋産3,4-ジアリールピロールアルカロイド類の効率的な化学合成法の開発研究を行った。まずイミノジ酢酸エステル類とシュウ酸ジメチルとのHinsberg型縮合により、3,4-ジヒドロキシルピロール-2,5-ジカルボン酸エステル類を合成した。その後、水酸基を無水トリフルオロメタンスルホン酸と反応させ、3,4-ビストリフラート誘導体へと変換した。その後、各種アリールボロン酸類とのパラジウム触媒クロスカップリングにより、3,4-ジアリールピロール-2,5-ジカルボン酸エステル類を高収率で合成した。この段階で、同種のアリール基を一挙に二つ導入することも、また異種のアリール基を段階的に導入することも可能であることが判った。さらに、上記手法で合成した、3,4-ジアリールピロール-2,5-ジカルボン酸ジエステルのラクトン化、加水分解、脱炭酸、PIFAによる酸化的環化を順次行うことにより3,4-ジアリールピロールアルカロイド類の中で最も複雑かつ高活性な多環縮合ラメラリン類への変換ルートの開発にも成功した。このようにして合成した化合物の一つは、多剤耐性克服作用を有するpermethyl stroniamideA合成の鍵中間体であった。さらに、上記手法で合成した、3,4-ジアリールピロール-2,5-ジカルボン酸ジエステルの限定加水分解、ラクトン化、加水分解、脱炭酸、PIFAによる酸化的環化により3,4-ジアリールピロールアルカロイド類の中で最も複雑かつ高活性な多環縮合ラメラリン類への変換ルートの開発にも成功した。また、最終の多環構造を構築するために、ピロールカルボン酸を、酢酸パラジウムの存在下アセトニトリル中で還流すると脱炭酸を伴う閉環が起こり、ラメラリン骨格が一挙に生成するという興味ある新反応を見いだすことができた。これらの手法を用いることによりlamellarin G trimethyl etherの全合成を達成した。また、ningalin Bの形式全合成も達成することができた。これらの成果につては、第32回複素環化学討論会において報告した(要旨集:p.221-222)。3,4-ジアリールピロールを基本構造として持つラメラリン、ニンガリン等の海洋アルカロイドは、薬剤排出タンパクが発現した多剤耐性ガン細胞に対して強い細胞毒性を示す。従ってこれらの天然物は難治性多剤耐性ガン治療薬のリードとして注目されている。我々は、Hinsberg型ピロール合成反応とPd触媒クロスカップリング反応を組み合わせた効率的で柔軟性に富んだ3,4-ジアリールピロール型海洋アルカロイドの化学合成法の開発に成功した。また、この手法を用いてラメラリンGトリメチルエーテル、ニンガリンBヘキサメチルエーテル、パーメチルストルニアミドA等の全合成または形式合成を達成した。具体的には、N-アリールエチルイミノジ酢酸メチルとシュウ酸ジメチルとのHinsberg反応で3,4-ジヒドロキシピロール誘導体を合成した後、無水トリフルオロメタンスルホン酸無水物と処理し3,4-ビストリフラート誘導体に変換した。この化合物と種々のアリールボロン酸とのPd触媒クロスカップリングを行った所、3,チジアリールピロール誘導体が高収率で得られた。また、2種の異なるアリールボロン酸を段階的に反応させると非対称の3,4-ジアリールピロール誘導体も良好な収率で得ることができた。このようにして得られた3,4-ジアリールピロール-2,5-

ジカルボン酸エステル誘導体の一つは、多剤耐性逆転作用(MDR reversal activity)を示すパーメチルストルニアミドA合成の鍵中間体であった。さらにジエステルから誘導されるラクトン-エステルの加水分解、脱炭酸によりニンガリンBヘキサメチルエーテルを合成した。またニンガリンBヘキサメチルエーテルは、PIFA-BF_3と処理すると酸化的閉環が進行しラメラリンGトリメチルエーテルが高収率で得られた。これまでにヒンスバーグ型ピロール合成並びに鈴木・宮浦カップリングを鍵反応とする3,4-ジアリールピロールアルカロイドの一般的な合成法を開発した(Tetrahedron Letters,2003,44,4443)。本年度はこの手法をもとにラメラリンD,ラメラリンL,ラメラリンNの全合成を行った。まず、鈴木・宮浦カップリングに必要な3,4-ビストリフラート誘導体は常法に従い合成した。またアリールボロン酸類に関して、ラメラリンのベンゾピラン部の構築に必要な4-イソプロキシ-5-メトキシ-2-メトキシメチルオキシフェニルほう酸はイソバニリンから、またラメラリン1位の構築に必要な4-イソプロポキシ-3-メトキシフェニルほう酸および3-イソプロポキシ-4-メトキシフェニルほう酸はグアヤコールから合成した。その後、4-イソプロポキシ-3-メトキシフェニルほう酸および4-イソプロポキシ-5-メトキシ-2-メトキシメチルオキシフェニルほう酸と3,4-ビストリフラート誘導体とのパラジウム触媒クロスカップリングにより3,4-ジアリールピロール-2,5-ジカルボン酸エステルを合成した。さらにジエステルの限定加水分解、ラクトン化、加水分解、脱炭酸、PIFAによる酸化的環化、DDQによる脱水素、BCl_3によるイソプロピル基の選択的脱保護を順次行うことにより、ラメラリンDの全合成を達成した。またラメラリンNの合成は4-イソプロポキシ-3-メトキシフェニルほう酸の代りに3-イソプロポキシ-4-メトキシフェニルほう酸を使用し、ラメラリンDと同様の合成手法を使用することにより達成した。ラメラリンLに関してはラメラリンNの合成経路からDDQによる脱水素の工程を省略することにより同様に達成した。これらの成果については、第34回複素環化学討論会において報告した(要旨集:p.313-314)。
アパレル企業のブランド戦略に見られる現代中国の社会変動-中国におけるブランド意識と高度消費文化-

本年度の研究においては、中国に進出しているアパレル企業の対中戦略について考察し、企業側が分析した中国の高度消費文化の現状を明らかにするために、これまでに収集したデータをコンピュータに入力しデータベース化すると同時に、中国との合併企業(北京・上海・広東)に10万ドル以上の出資をしている企業66社に対して、アンケート調査を実施し、14社から回答を得た。この14社の内、中国国内で販売しているのは4社であった。4社の内、積極的に事業展開を行っているのは(株)オンワード樫山と(株)ボブソンの2社であった。ブランド名ではICBとBOBSONである。ICBについては、中国を含めた8ヵ国で世界同一価格(\19,000-\59,000)・同時発売という形で1995年より展開されており、当然、中国では高所得者をターゲットとなっている。BOBSONはボトムスだけの展開で、290550元という価格帯で販売。国営百貨店での同タイプのものが190元前後なので、BOBSONの場合は中高の価格帯と言える。ICB、BOBSONともに日系の百貨店で販売されている(ICBは百貨店ショップに卸し、BOBSONは百貨店平場)。残り2社は基本的には100%日本へ輸出しており、中国国内での販売はごくわずかである。以上のことから分かったことは、中国は生産地からマーケットとしてとらえ始められているという先行研究が多かったが、いまだ中国で生産されているアパレル製品のほとんどは日本へ輸出されており、中国国内で販売されるケースはごく少数である。しかし、これは消費文化が高度化していないことを表しているのではなく、代金回収の不安、インフラの未発達、労働意欲の欠如といった合併事業の難しさそのものが原因である。アンケートで回答を得られなかった企業の中でも、ワールドやベネトンジャパン、ダーバンなどが中国国内でブランド展開を行っており、このようなケースから、中国における消費文化の高度化が伺える。今年度は、調査内容の検討、資料の収集を中心に以下のように実施した。1まず、アパレル企業に限定せずに、関連する領域を含めて、日系企業の中国進出についての概要に関する資料を収集した。2日本に限定せず、世界の有名アパレル企業が、どのような国に、どのような形で進出しているのかについての資料を収集した。3日系アパレル企業、あるいは海外のアパレル企業が日本に設立しているアパレル企業が、いつ頃からどのような形で、どのような組織で中国への進出をはかっていったかについての詳細なデータをデータベース等で収集した。4日系企業の中国進出に関連する先行研究を整理、分析をおこなった。5中国の消費文化の現状に関する資料の収集をおこなった。6上の1,2、3で得たデータを、中国に進出している日系企業の対中戦略、とくに中国の消費文化理解、日本での販売戦略との違いという観点から整理した。7本研究内容に詳しい中国の研究者からレビューを受けた。
悪性腫瘍化学療法による神経因性疼痛の神経科学基盤の解明

パクリタキセルは,がんの化学医療法にしばしば用いられる抗がん剤であるが,痛みを伴った末梢神経障害を惹起しやすい薬剤としても知られている.しかしながらその発生機序は不明であり,治療に難渋する事も多い.われわれはパクリタキセルによる末梢神経障害発現機序におけるL-セリンを目的として研究した.その結果,パクリタキセルによる末梢神経障害は後根神経節細胞でのL-serineの産生低下が原因となっており,L-セリンによりその発症を予防することが可能であることが明らかとなった.この発見により新たな治療戦略が可能となる可能性がある.パクリタキセルは,がんの化学医療法にしばしば用いられる抗がん剤であるが,痛みを伴った末梢神経障害を惹起しやすい薬剤としても知られている.しかしながらその発生機序は不明であり,治療に難渋する事も多い.われわれはパクリタキセルによる末梢神経障害発現機序におけるL-セリンを目的として研究した.その結果,パクリタキセルによる末梢神経障害は後根神経節細胞でのL-serineの産生低下が原因となっており,L-セリンによりその発症を予防することが可能であることが明らかとなった.この発見により新たな治療戦略が可能となる可能性がある.雄性SDラットにパクリタキセル2mg/kgを隔日投与し化学療法誘起末梢神経障害モデルを作成した.対照ラットには溶媒のみ投与した1.行動学的評価パクリタキセル投与終了8日目に冷覚アロディニアを呈し,投与終了27日目には回復した,Von Freyフィラメントによる機械刺激性痛覚過敏はパクリタキセル投与終了8日目に発現し,投与終了27日目にも持続していた.熱性痛覚は出現しなかった.2.TRPM8の後根神経節での発現変化冷感受容体であるTRPM8の後根神経節での発現変化を免疫組織化学的に検討した.正常マウス後根神経節ではTRPM8は小型細胞に発現し,痛覚受容体であるTRPV1との共存はほとんど認められなかった.パクリタキセル投与終了8日目にはTRPM8陽性小型細胞の数が増加し,一部の細胞でTRPV1との共存が認められた.一方で,TRPV1陽性細胞数は変化なかった.また,TRPM8発現細胞数の推移は冷覚アロディアの時間経過と一致したが,機械刺激性痛覚過敏発現の時間経過とは一致しなかった.3.メンソール足底投与の反応性パクリタキセル投与ラットと対照ラットの足底皮膚にTRPM8作動薬であるメンソールを塗布し行動学的評価を行った.対照ラットではメンソール塗布により行動学的異常は認められなかったが,パクリタキセル投与ラットではメンソール塗布により自発痛関連行動が認められた.以上により,パクリタキセル誘起末梢神経障害においてTRPM8活性化が関与していることが示唆された.雄性SDラットにパクリタキセル2mg/kgを隔日投与し化学療法誘起末梢神経障害モデルを作成した.対照ラットには溶媒のみ投与した1.行動学的評価パクリタキセル投与終了8日目に冷覚アロディニアを呈し,投与終了27日目には回復した.Von Freyフィラメントによる機械刺激性痛覚過敏はパクリタキセル投与終了8日目に発現し,投与終了27日目にも持続していた.熱性痛覚は出現しなかった.2.尾部の感覚神経伝達速度測定機械的痛覚過敏発現と一致して尾部の感覚神経伝達速度遅延が観察された.伝達速度遅延は終了後27日目まで持続した.しかしながら痛覚過敏の経時変化と異なり,27日目以降徐々に回復した.HPLCシステムを用いて後根神経節,脊髄,末梢神経軸策でのL-serine含有量を測定した.その結果,痛覚過敏および感覚神経伝達速度遅延の時間経過と一致して後根神経節でL-serine含有量の低下が観察された.脊髄,末梢神経軸策ではL-serine含有量の低下は認められなかった.4. 3PGDH測定L-serine合成酵素である3PGDH発現をウエスタンブロット法を用いて後根神経節で検討した.その結果,L-serine含有量低下に先立って3PGDH発現が低下することが明らかとなった.化学療法に伴う末梢神経障害は有効な治療法が確立しておらず,用量規制因子の一つとなっており,化学療法の減量や中止の原因となることも少なくない.また,近年,非必須アミノ酸であるL-serineは神経細胞の成長・生存に不可欠な物質であることが報告されている.そこで,抗がん剤パクリタキセルによる誘起末梢神経障害動物モデルを用いて,抗がん剤による末梢神経障害発現機序におけるL-serineの関与およびL-serine投与による末梢神経障害の改善について研究を行った雄性SDラットにパクリタキセル2mg/kgを隔日投与し,化学療法誘起末梢神経障害モデルを作成した.投与前,投与後1週間間隔で投与開始6週後まで行動学的評価,神経伝導速度の測定,およびHPLCシステムを用いて後根神経節(dorsal root ganglion;DRG)・脊髄・坐骨神経におけるL-serineの含有量を測定した.また,DRGにおいてはL-serineの合成酵素である3-phosphoglycerate dehydrogenase (3PGDH)の発現もウエスタンブロット法を用いて測定したパクリタキセル投与により痛覚刺激に対する閾値の低下および神経伝導速度の低下が認められた.

また,DRGではL-serine含有量の低下が観察されたが,脊髄,末梢神経軸策ではL-serine含有量の低下は認められなかった.DRGにおいてはL-serine含有量低下に先立って3PGDH発現も低下することが明らかとなった.そこでパクリタキセルと同時にL-serineを投与したところ0.1mmol/kgの投与で末梢神経障害の発症を抑制した.DRGは他の神経組織の血液脳関門や血液神経関門と違い,血液バリアが脆弱であり,また,3PGDHはグリア細胞に局在していることから,パクリタキセルによる神経障害はDRGのグリア細胞の障害により発症すると推測された以上の結果よりパクリタキセルによる末梢神経障害はDRGでのL-serineの産生低下が原因となっており,L-serineの投与によりその発症を予防することが可能であった
脱細胞化組織を用いた膝前十字靭帯再建大動物実験による生体内靭帯化に関する研究

再建組織としてヒトで用いられている腱組織と、ヒトでは採取できない靭帯組織を用い、脱細胞化した細胞外マトリクスの構造の違いが生体内での細胞浸潤、血管新生、生体内組織再構築に及ぼす影響を検証し、生体内で靭帯組織に置き換わっていく『靭帯化』が起きるかを解明することが本研究の目的である。具体的に本年度は、研究代表者が開発した方法で脱細胞化して滅菌処理したウシ由来腱組織および靭帯組織が、負荷が作用する膝前十字靭帯の治療部位で機能し、生体内で細胞が浸潤して組織が体内で生成するかを検証するため、ヒツジを用いて膝前十字靭帯再建実験を行い、術後3ヶ月および12ヶ月における再建組織への細胞浸潤、コラーゲン線維の径、および組織の破断強度を検証した。再建組織のコラーゲン束の直径は透過型電子顕微鏡を用いて計測した。また、再建組織の破断強度は、開発して特許申請済みの大腿骨および脛骨を固定する治具を用いて引張試験を行い、破断荷重で評価した。本研究から、術後3ヶ月において脱細胞化腱組織および脱細胞化靭帯組織ともに組織全域に細胞が浸潤し、血管も新生することがわかった。また、脱細胞化腱組織および靭帯組織ともに、術後3ヶ月の組織のコラーゲン線維の直径は、再建前の組織と比較して小さくり、コラーゲン線維の密度も再建前の組織と比較して低くなる一方、術後1年での再建組織のコラーゲン線維の径は3ヶ月と比較して大きくなり、コラーゲン線維の密度は顕著に増すことが明らかとなった。また、脱細胞化腱組織と靭帯組織は、再建術後13週と比較して52週において再建組織の破断強度は高くなる傾向にあり、脱細胞化腱組織においては統計的に有意に破断強度が増した。これらの結果から、脱細胞化腱組織および靭帯組織は生体内で一時的に分解され、その後、経時的に組織が生体内で生成され組織再構築が起こる特長を有することを実証することができた。脱細胞化処理して滅菌した腱および靭帯組織について、ヒツジを用いて3ヶ月および1年の膝前十字靭帯再建実験を行い、再建した脱細胞化組織への細胞浸潤、コラーゲン線維の径、および破断強度を検証でき、順調に進んでいるといえる。本研究から、脱細胞化組織は生体内で一時的に分解され、その後、経時的に組織が生体内で生成され組織再構築が起こる特長を有することを世界に先駆けて実証することができた。脱細胞化処理および滅菌処理を施したウシ腱および靭帯組織を用いて行っているヒツジ膝前十字靭帯再建実験において、3ヶ月および1年間再建時の生体内での細胞浸潤数、新生血管の数、破断強度等を多面的に分析し、生体内で靭帯組織に置き換わっていく『靭帯化』が起きるかを解明していく。スポーツで発生することの多い膝前十字靭帯損傷の治療においては、本来採る必要のない健常な自家腱を術中に採取して再建組織として用いており、自家組織の採取を必要としない人工靭帯の開発が求められている。本研究では、研究代表者が開発した厚さ10mm以上の腱および靭帯組織を損傷なく脱細胞化して抵抗原化する技術と、生体組織の強度保持を実現する滅菌技術を用い、臨床で再建組織として用いられる腱組織とヒトでは運動機能の低下の点から採取できない靭帯組織を用い、脱細胞化した細胞外マトリクスの構造の違いが生体内での細胞浸潤に影響を及ぼすか、また、生体内で脱細胞化した組織が再構築されるかを解明することを目的とした。脱細胞化処理して滅菌処理したウシ腱およびウシ靭帯組織を用いてヒツジの膝前十字靭帯再建実験を行い、3ヶ月後に組織を摘出し、細胞浸潤を組織学的染色により調べた。また、脱細胞化処理したコラーゲン組織自体が生体内で再生するかを検証することを目指し、脱細胞化した腱および靭帯、そしてヒツジ膝前十字靭帯再建3ヶ月後に摘出した組織について、透過型電子顕微鏡を用いてコラーゲンの径を計測して比較した。その結果、再建3ヶ月後の脱細胞化ウシ腱およびウシ靭帯組織のどちらにおいてもヒツジ自家細胞が浸潤し、微小血管が多く形成されることが明らかとなった。再建前の脱細胞化処理した腱および靭帯のコラーゲン線維の径は0380nmの範囲で分布し、腱組織の方が太いコラーゲン線維で構成されていた。再建3ヶ月後には、腱組織、靭帯組織のどちらの組織においても40nm80nmの径のコラーゲン線維がほとんどを占め、生体内で組織が再構築されることが、より人に近い力学的負荷が膝に作用する大動物実験で明らかとなった。今後、1年の期間の動物実験を行い、生体内でコラーゲン径が太くなり、自己組織化が起きていくのかを検証していく。脱細胞化ウシ腱および靭帯組織を用いてヒツジ膝前十字靭帯再建術を行い、再建3ヶ月後の摘出組織について透過型電子顕微鏡を用いてコラーゲン線維の径を詳細に分析し、脱細胞化した組織が生体内で再構築されることを初めて明らかにすることができた。研究は計画通り進んでいる。

具体的に本年度は、研究代表者が開発した方法で脱細胞化して滅菌処理したウシ由来腱組織および靭帯組織が、負荷が作用する膝前十字靭帯の治療部位で機能し、生体内で細胞が浸潤して組織が体内で生成するかを検証するため、ヒツジを用いて膝前十字靭帯再建実験を行い、術後3ヶ月および12ヶ月における再建組織への細胞浸潤、コラーゲン線維の径、および組織の破断強度を検証した。再建組織のコラーゲン束の直径は透過型電子顕微鏡を用いて計測した。また、再建組織の破断強度は、開発して特許申請済みの大腿骨および脛骨を固定する治具を用いて引張試験を行い、破断荷重で評価した。本研究から、術後3ヶ月において脱細胞化腱組織および脱細胞化靭帯組織ともに組織全域に細胞が浸潤し、血管も新生することがわかった。また、脱細胞化腱組織および靭帯組織ともに、術後3ヶ月の組織のコラーゲン線維の直径は、再建前の組織と比較して小さくり、コラーゲン線維の密度も再建前の組織と比較して低くなる一方、術後1年での再建組織のコラーゲン線維の径は3ヶ月と比較して大きくなり、コラーゲン線維の密度は顕著に増すことが明らかとなった。また、脱細胞化腱組織と靭帯組織は、再建術後13週と比較して52週において再建組織の破断強度は高くなる傾向にあり、脱細胞化腱組織においては統計的に有意に破断強度が増した。これらの結果から、脱細胞化腱組織および靭帯組織は生体内で一時的に分解され、その後、経時的に組織が生体内で生成され組織再構築が起こる特長を有することを実証することができた。脱細胞化処理して滅菌した腱および靭帯組織について、ヒツジを用いて3ヶ月および1年の膝前十字靭帯再建実験を行い、再建した脱細胞化組織への細胞浸潤、コラーゲン線維の径、および破断強度を検証でき、順調に進んでいるといえる。本研究から、脱細胞化組織は生体内で一時的に分解され、その後、経時的に組織が生体内で生成され組織再構築が起こる特長を有することを世界に先駆けて実証することができた。組織から細胞成分を除去した脱細胞化組織は、生体本来の組織構造を兼備しているという、人工的に合成、製造する方法では成し得ない特徴を有している。平成29年度は、ウシ組織を対象とし、研究代表者が開発した厚さ10mm以上の腱および靭帯組織を損傷なく脱細胞化して抵抗原化する技術と、生体組織の強度保持を実現する滅菌技術を用い、臨床で再建組織として用いられる腱組織とヒトでは運動機能の低下の点から採取できない靭帯組織を用いてヒツジ膝前十字靭帯再建実験を行い、脱細胞化したウシ腱組織および靭帯組織のどちらも生体内でヒツジ自家細胞が浸潤し、微小血管が形成されることを明らかにした。また、脱細胞化した組織は生体内で組織再構築が起こることを、より人に近い力学的負荷が膝に作用する大動物実験で明らにした。平成30年度は、1年の期間の動物実験を行い、生体内でコラーゲン径が太くなり、自己組織化が起きていくのかを検証していく。脱細胞化処理および滅菌処理を施したウシ腱および靭帯組織を用いて行っているヒツジ膝前十字靭帯再建実験において、3ヶ月および1年間再建時の生体内での細胞浸潤数、新生血管の数、破断強度等を多面的に分析し、生体内で靭帯組織に置き換わっていく『靭帯化』が起きるかを解明していく。(1)日本機械学会若手優秀講演フェロー賞を受賞:奥田慶也,伊藤匡史,岡村昭慶,八木優大,梅津光生,加藤善治,岡崎賢,岩﨑清隆,ヒツジ膝前十字靭帯再建に3ヶ月使用した脱細胞化ウシ組織のコラーゲン線維の生体内リモデリングの解明に向けた研究, 2017年12月14日(2)本研究が,井上達彦,大きな「飛躍」をもたらす着実なサイクル,一橋ビジネスレビュー(2017.WIN), 178-194で紹介
乳幼児期から学齢期の睡眠パターンとその遷移が認知発達に与える影響

乳幼児期の睡眠は、後の肥満や情緒的・認知的発達等の様々なアウトカムとの関連が報告されている。乳幼児期は特に、睡眠時間や就寝時刻、昼寝等の各側面からみる睡眠パターンは様々であるが、個人の睡眠パターンとその遷移を特定した研究は見当たらない。本研究ではまず、乳児期、幼児期、学齢期の3つの時点において、それぞれ睡眠パターンは何通りに分けられるか、各個人はどのような睡眠パターンに遷移していくのか、またそれらを特徴づける要因にはどのようなものがあるかをlatent transition analysis (LTA)を用いて検討する。さらにそれらは、学齢期の認知発達とどのように関連するかを特定する。
ムチン型糖鎖糖転移酵素欠損患者にみられる家族性腫瘍性石灰化沈着症の発症機構

本研究ではGALNT3変異による家族性腫瘍性石灰化沈着症発症機構を解明するため、FGF23の糖鎖修飾に着目した。前年度で解析したGALNT3の発現とFGF23の分子安定性の関連をさらに解析するため、Po1 II系プロモーターを持つRNAi発現ベクターを用いてGALNT3を含む複数のGALNTアイソフォームに対して特異的RNAiコンストラクトを作製しHEK293細胞に一過性あるいは恒常的に発現させた。このRNAi発現細胞にC末端にV5およびHisタグ配列を付加したFGF23をHEK293細胞に一過性に発現させた。解析の結果、GALNT3を特異的に抑制したHEK293細胞で培養上清中のFGF23分子の顕著な減少を確認した。次に分解前の状態のFGF23の糖鎖修飾を解析するため、FGF23分子のプロテアーゼ切断部位をアミノ酸置換したR176QおよびR179Q変異型FGF23をHEK293細胞に導入した。ウェスタンブロット解析から、完全長FGF23の分子サイズに複数のバンドを確認した。分子サイズの変化は糖鎖修飾によるものと考えられた。さらに、糖鎖修飾部位を解析するため、プロテアーゼ切断部位にあるT178スレオニン残基をアラニンに置換したR176Q T178A変異型FGF23コンストラクトを作製し同様に解析したところ、糖鎖修飾による複数のバンドは消失し、1本の完全長FGF23を示すバンドのみを確認した。この結果から、HEK293細胞においてFGF23のムチン型糖鎖修飾部位はT178であり、この部位のムチン型糖鎖修飾にバリエーションがあることが明らかとなった。野生型FGF23とR176Q T178A変異型FGF23の比較解析から、T178への糖鎖修飾はFGF23の分子安定性に重要であり、GALNT3はその部位への糖鎖修飾によりFGF23の分子安定性に寄与していると考えられた。家族性腫瘍性石灰化沈着症(FTC)は血中リンおよびビタミンD濃度上昇、皮膚および皮下組織の石灰化の病状を呈する家族性遺伝性疾患であり、原因遺伝子の一つとしてムチン型糖鎖修飾を開始するポリペプチドN-アセチルガラクトサミン転移酵素(GALNT)の一つであるGALNT3が同定されている。本研究では血中リン濃度を調節するFGF23に着目した。FGF23はアミノ酸配列上の176番目から始まるRHTR(RXXRモチーフ)のC末側で酵素的切断を受け失活する。そこでGALNT3による糖鎖修飾とそのFGF23分子安定性への影響について解析した。RTPCR法により、HEK293細胞にFGF23およびGALNT1,2,3,4,6,7,8,10,12,13,14,15のmRNA発現を確認したので、この細胞を解析モデルとした。Pol II系プロモーターを持つRNAi発現ベクターを用いてGALNT3特異的RNAiコンストラクトを作製し、HEK293細胞に遺伝子導入後、RNAi安定発現株を樹立した。RealtimePCR法により、RNAi安定発現株では常にGALNT3の発現が特異的に約80%抑制されていることを確認した。FGF23のC末端にmycタグ配列を付加したコンストラクトを作製し、RNAi安定発現株に一過性に発現させ培養上清をウェスタンプロット解析したところ、FGF23分子断片の増加を確認した。これによりGALNT3がFGF23分子の安定性に寄与することがわかった。合成ペプチドとリコンビナントGALNT3を反応させた実験だが、FGF23のRXXRモチーフ内のTがGALNT3により糖鎖修飾を受け、furinプロテーゼによる切断に耐性を示すことが報告された。現在、GALNT3の発現を抑制したときに変化するFGF23分子上の糖鎖修飾部位の解析を進めている。

この結果から、HEK293細胞においてFGF23のムチン型糖鎖修飾部位はT178であり、この部位のムチン型糖鎖修飾にバリエーションがあることが明らかとなった。野生型FGF23とR176Q T178A変異型FGF23の比較解析から、T178への糖鎖修飾はFGF23の分子安定性に重要であり、GALNT3はその部位への糖鎖修飾によりFGF23の分子安定性に寄与していると考えられた。
動物における分子育種学の展開-ゲノム解析の戦略

近年の分子生物学の発展は、動物の育種に大きな変革をもたらす可能性を内包している。20世紀後半に発達した量的遺伝学は、動物育種に有効な方法をもたらしたが、分子生物学は、遺伝子DNAの情報に直接アクセスする手段の開発への道をひらいた。そこで、このテクノロジーを動物の育種に活用しようということは当然であり、本研究班はDNAテクノロジーの動物育種への利用について検討を行った。その結果、到達した結論をここに要約する。(1)動物の育種に現在も用いられている表現型の選抜法は、主たる生産形質には有効であり、将来にわたって継続して用いられるであろう。(2)しかしながら、一部の形質については遺伝子DNAの情報に基づく動物の直接の選抜が可能である。(3)さらに、従来あまり注目されていなかったが、異常形質を除去することにより有効な生産能力の発現が期待できるので、異常形質の検出にDNA診断が可能である。このような育種を展開するためには、遺伝子地図が重要な役割を果たすことは認識の共通するところであり、このためにヒト、イネ、実験動物などの遺伝子地図の構築にたいへんな努力が払われている。そこで、家畜における遺伝子地図の現状を実験動物やイネの遺伝子地図の現状とともに検討した。その結果、家畜の遺伝子地図についてはヒトや実験動物、イネに比較すると、遺伝子座位の情報がきわめて不足しているが、この遅れはあまり問題ではない。大学は農林水産省を中心に進められている研究を尊重し、これに協力しつつ、そこから情報の提供を受けつつ、遺伝子の機能を中心とする研究を進めるのが適当であるという点で意見が一致した。今後、さらに検討をかさねて重点領域等の計画に作り上げていくことを確認した。
黒川家旧蔵資料の書誌的調査に基づく古典学の形成と知識流通に関する調査研究

本研究は、江戸後期から明治期にかけての蔵書家であり、国学者であった黒川春村(1799ー1867)・真頼(1829ー1906)・真道(1866ー1925)の三代にわたり蓄積された蔵書群を対象とし、主として、書誌学的調査と奥書・識語、蔵書印集成の作成を通して、書物の流通と収集の過程、及び同時代の蔵書家・学者の交流関係を解明し、よって江戸後期における知識流通と古典学の形成過程を具体的な記述を試みた。本研究は、書籍の流通と蓄積の検討に基づき江戸期における〈知〉の流通の一端を明らかにすることを目的とする。具体的には、ノートルダム清心女子大学、実践女子大学に分蔵される近世後期の国学者・黒川春村(1799-1866)、真頼(1829-1906)、真道の3代により収集された蔵書群(主として物語・和歌とその注釈、享受・研究資料等の文学関係資料)を対象とし、個別の書誌学的調査を行いその奥書・識語と蔵書印の集成の作業を通して、黒川家に蓄積された書物の流通経路の検討を通して、〈知〉の流通の具体相の総体的把握を試みる。当該研究の調査・検討課題項目のうち、「江戸期知識階層のネットワークに関する検討」の課題については、ノートルダム清心女子大学に分蔵される主として文学(和歌・物語)に関わる書物群の調査を行い、併せて奥書の記載事項の集成と蔵書印・伝領識語の記載内容の集成を試みた。具体的には、本研究に前接する科学研究費による研究等により蓄積された調査カードに基づき、紙媒体のデータ1100点の全体を最初に電子化し、それに追記するかたちでデータの再検討と整備を行った。本年度については簡易的な整備を400点、画像データの追記や個別のコメントを含む整理を130点に対して行った。「江戸後期の蔵書形成に関する書誌学的検討」の課題では、書誌学的知見よりデータの蓄積を行った。具体的には、古典籍の表紙と蔵書印の画像データを中心に、書籍の形態に関わるデータの蓄積と分析を試みた。平成25年度においては、ノートルダム清心女子大学所蔵分約1100点のうち200点の作成を達成した。具体的には、ノートルダム清心女子大学、実践女子大学に分蔵される近世後期の国学者・黒川春村(1799-1866)、真頼(1829-1906)、真道の3代により収集された蔵書群(主として物語・和歌とその注釈、享受・研究資料等の文学関係資料)を対象とし、個別の書誌学的調査を行い、その奥書・識語と蔵書印の集成の作業を通して、黒川家に蓄積された書物の流通経路の検討を通して、〈知〉の流通の具体相の総体的把握を試みる。本年度については簡易的な整備を450点、画像データの追記や個別のコメントを含む整理を100点に対して行った。「江戸期知識階層の古典学の形成と流通に関する検討」の課題では、村田春海(1746-1811)、岸本由豆流(1789-1846)等の江戸後期の国学者達の書き入れ注記を持つ伝本の書誌的調査と相互比較を継続し、その記載内容の変遷の検討を行った。平成24年度においては、ノートルダム清心女子大学所蔵分約1100点のうち200点の作成を達成した。前年度より継続してノートルダム清心女子大学所蔵の黒川文庫本の調査と書誌データ・画像データの作成を行った。また、本研究の具体的研究課題である、(1)江戸期知識階層のネットワークに関する検討、(2)江戸期知識階層の古典学の形成と流通に関する検討、(3)江戸後期の蔵書形成に関する書誌学的検討により得られた知見に基づき黒川文庫本のデータを整備を継続した。書誌データについてはほぼ全点の基礎的な書誌データの入力を終了し、再度、原典及びその画像データとの対照により校正を行った(校正については次年度へ継続)。データの公開については、現所蔵者側の分担者の所属移動等があり、事務手続き上の課題で遅延しているが、奥書・書誌情報及び蔵書印関係のデータの公開に備えその環境の整備は継続したい。本研究は、江戸後期から明治期にかけての蔵書家であり、国学者であった黒川春村・真頼・真道の三代にわたり蓄積された蔵書群を対象とし、主として、書誌学的調査と奥書・印記集成の作成を通して、書物の収集と流通過程と同時代の蔵書家・学者の交流関係を解明し、よって江戸後期における知識の流通と古典学の形成過程を具体的に記述しようと試みたものである。本研究は、下記の3点のテーマを核として進めた。

(1)江戸期知識階層のネットワークに関する検討:ノートルダム清心女子大学に所蔵される黒川家旧蔵書の調査を行い、奥書・蔵書印類の入力を行ない、一覧した。(2)江戸期知識階層の古典学の形成と流通に関する検討:村田春海(1746-1811)、岸本由豆流(1789-1846)等の注説を書き入れた資料の筆跡等の検討により、その正否を考察した。(3)江戸後期の蔵書形成に関する書誌学的検討:ノートルダム清心女子大学に所蔵される黒川家旧蔵書の調査を行い、表紙、装丁、書風といった非文字データから流通経路が想定される資料について画像データの蓄積と分析を試みた。本研究は、江戸後期から明治期にかけての蔵書家であり、国学者であった黒川春村(1799ー1867)・真頼(1829ー1906)・真道(1866ー1925)の三代にわたり蓄積された蔵書群を対象とし、主として、書誌学的調査と奥書・識語、蔵書印集成の作成を通して、書物の流通と収集の過程、及び同時代の蔵書家・学者の交流関係を解明し、よって江戸後期における知識流通と古典学の形成過程を具体的な記述を試みた。ノートルダム清心女子大学所蔵の黒川文庫本の書誌データについてはほぼ全点の基礎的な書誌データの入力を終了したが、データの精度にやや差違があることが確認されたことから、原典及びその画像データとの対照により校正を行っている。また、現所蔵者側の分担者の所属移動等があり、事務手続き上の課題で遅延している。日本文学新たな課題となった基礎データの精度を高めるために原典及びその画像データとの対照により校正を行う。当初の計画を一部変更し、初年度に紙媒体のデータ総体を電子化し、調査の便宜を図った。当初計画からは少々の遅れが出ている。本年度の調査成果は下記の通り。当該研究の調査・検討課題項目のうち、「江戸期知識階層のネットワークに関する検討」の課題については、紙媒体のデータ1100点の全体を最初に電子化し、それに追記するかたちでデータの再検討と整備を行った。本年度については簡易的な整備を400点、画像データの追記や個別のコメントを含む整理を130点に対して行った。「江戸後期の蔵書形成に関する書誌学的検討」の課題で、書誌学的知見よりデータの蓄積を行った。具体的には、古典籍の表紙と蔵書印の画像データを中心に、書籍の形態に関わるデータの蓄積と分析を試みた。平成25年度においては、ノートルダム清心女子大学所蔵分約1100点のうち200点の作成を達成した。そのため当初計画からは少々の遅れが出たが、概ね計画通りに進行しているといえる。本年度については簡易的な整備を450点、画像データの追記や個別のコメントを含む整理を100点に対して行った。「江戸期知識階層の古典学の形成と流通に関する検討」の課題では、村田春海(1746-1811)、岸本由豆流(1789-1846)等の江戸後期の国学者達の書き入れ注記を持つ伝本の書誌的調査と相互比較を継続し、その記載内容の変遷の検討を行った。「江戸後期の蔵書形成に関する書誌学的検討」の課題では、書誌学的知見よりデータの蓄積を行った。
分子電気化学スイッチ素子の開発と電気化学バイオイメーイングへの応用

本研究では、マイクロナノ空間内の分子拡散と電気化学反応の制御により、トランジスタのような働きをする“分子電気化学スイッチ素子"を開発した。このスイッチング素子の性能評価とこの素子を組み込んだ電気化学デバイス作製を実施し、胚性幹細胞の分化評価や、ガン細胞の呼吸活性のイメージング(可視化)を実現した。また、この概念を拡張して電気化学センサアレイの特徴を生かした新規の電気化学イメージング手法を提案した。例えば、CMOS技術により作製した電極アレイデバイスと電気化学計測を組み合わせて、複数の物質を同時に電気化学イメージングできるシステムを開発した。これにより、種々の細胞機能の可視化に成功した。本研究では、マイクロナノ空間内の分子拡散と電気化学反応の制御により、トランジスタのような働きをする“分子電気化学スイッチ素子"を開発する。これは、一般的なスイッチ素子であるトランジスタとは異なる概念に基づくスイッチ素子である。このスイッチング素子の性能評価とこの素子を組み込んだ電気化学デバイス作製を実施し、バイオアッセイに向けた新規電気化学イメージングを検討する特に細胞活性を可視することで、創薬研究や再生医療への応用を示す。該当年度では、分子電気化学スイッチ素子の1つであるレドックスサイクルに基づくスイッチング素子を開発した。レドックスサイクルとは、2組の電極間で測定対象物が酸化・還元反応を繰り返す現象であり、シグナル増幅とスイッチングに利用できることを申請者は明らかにしている。レドックスサイクルによるシグナル増幅は電極間距離に大きく依存しており、該当年度では高感度化を目指してナノ流路を介して電極を配置した素子を開発した。これにより、単純なセンサよりも100倍以上のシグナル増幅を達成した。また、スイッチング素子としての機能を確認した。この素子を組み込んだデバイスを作製し、胚性幹細胞の分化評価を達成した。この結果はLab on a Chip誌のinside coverを飾った。また、2組の電極が電気化学反応で物質を消費することを、スイッチオン、オフとして利用することで、スイッチングを実現した素子を開発した。このスイッチング素子では、溶液中の溶存酸素を利用しており、センサ上の溶存酸素を計測できる。開発したスイッチング素子の基礎的評価を実施したところ、スイッチング素子としての機能を有していることを確認した。続いて、この素子を組み込んだデバイスを開発し、ガン細胞塊の呼吸活性評価を実施した。この結果はSensors and Actuators B: Chemical誌に掲載された。該当年度では、「分子電気化学スイッチ素子の開発」と「デバイス開発」、「バイオイメージング」を実施した。開発初期段階では、目的とするバイオサンプルの計測を行うためには感度が不十分であることが判明したため、繰越申請を行ったが、この繰越による研究において、COMSOLによる反応物質の拡散や電気化学反応のシミュレーションを行い、デバイスの改良に成功した。この結果はマイクロナノ化学デバイスにおけるトップジャーナルであるLab ona Chip誌のinside coverを飾っており、このことからインパクトが大きい研究成果を発信できたと言える。したがって、おおむね順調に研究は進展していると言える。このようにデバイス開発は順調に進行しているが、細胞機能評価においては新たな検討が必要になっている。例えば、細胞株のロット間の違いによって、得られる結果の再現性が良くない点である。具体的には、間葉系幹細胞はロット間によって細胞増殖、分化、酵素発現が大きく異なることが判明した。したがって、今後は再現性確保のための実験を大きく実施する必要がある。上記した計測システム以外にも新しい原理に基づく電気化学計測システムを提案した。具体的には電極サイズと2進法に基づくシグナル分離システムである。シグナル分離をスイッチングの1つして見なすことで、多数の電気化学センサを1つの作用電極上に配置できる。この基本的アイディアは該当年度に考案させ、該当年度の次年度にデバイス作製・機能評価を実施した。この結果は次年度の成果であるがElectrochemistry Communications誌に掲載された。このように新しいアイディアに基づくセンサを開発しており、この点からも、おおむね順調に研究は進展していると言える。また、CMOS電極アレイデバイスを開発し、電気化学計測との組み合わせによる新しい電気化学イメージングシステムを考案した。これは複数の物質を同時に計測できる優れた計測システムであり、細胞機能計測を含む様々なバイオ計測への応用が期待できる。該当年度と繰越分の研究では、分子電気化学スイッチ素子を含む電気化学イメージングシステムに関する2報のreviewを報告した(Ino et al., Analyst, 142, 4343-4354, 2017; Ino et al., Curr. Opin. Electrochem., 5, 146-151, 2017)。また、CMOS電極アレイデバイスに関する2報の論文を報告した(Ino et al., Angew. Chem. Int. Ed., 56, 6818-6822, 2017; Kanno et al., Anal. Chem., 89, 12778-12786, 2017)。これにより、複数の対象物質を同時に電気化学イメージングすることが可能にあり、従来法を比べて多くの情報を得られるようになった。

開発したシステムを用いて、細胞分化と呼吸活性の同時の電気化学イメージング、ドーパミン放出と呼吸活性の同時の電気化学イメージングを達成した。この他にセンサ電極の修飾法に関する検討を行い、検出システムの汎用性を広げることに成功した。様々な種類の電気化学センサを開発し、それを用いたバイオイメージングに成功した。例えば、呼吸活性や微小生物の動体活性の電気化学的な可視化に成功した。また複数物質の同時の電気化学イメージングシステムを世界で初めて報告しており、そのインパクトは大きい。これまでは単一の対象物しか同時に計測できなったが、本成果により多量の情報を取得できる。本研究成果(Analytical Chemistry, 89, 12778-12786, 2017)を図入りで紹介している2報のreviewが他のグループから報告されており、このことから本成果の注目度の高さが窺える。また、本研究成果を含めた2報のreviewを、代表者が報告しており、電気化学イメージングシステム・デバイスの体系化を推進している。これらのことから、本研究は順調に進んでいるといえる。本研究では、マイクロナノ空間内の分子拡散と電気化学反応の制御により、トランジスタのような働きをする“分子電気化学スイッチ素子"を開発する。このスイッチング素子の性能評価とこの素子を組み込んだ電気化学デバイス作製を実施し、細胞機能計測を含むバイオアッセイに向けた新規電気化学イメージングシステムを開発する。また、この概念を拡張して、電気化学センサアレイの特徴を生かした新規の電気化学イメージング手法を提案した。例えば、CMOS技術により作製した電極アレイデバイスと電気化学計測を組み合わせて、複数の物質を同時に電気化学イメージングできるシステムを開発した。これにより、種々の細胞機能の可視化に成功した。該当年度と繰越分の研究では、CMOS型電気化学イメージングデバイスを用いた複数物質の同時電気化学イメージングを実施した。複数物質の活性や分布を可視化できるため、本手法を「電気化学カラーイメージング」と名付けた。本手法を用いて、間葉系幹細胞の呼吸活性と分化活性の可視化を達成した(Ino et al., Electrochim. Acta, 268, 554-561, 2018)。この手法は、種々の細胞機能の相関性の発見や細胞品質管理への応用が期待できる。また、リソグラフィ技術を用いたセンサ電極の局所修飾に関する論文を報告した(Terauchi et al., Chem. Lett., 47, 204-206, 2018)。これにより、選択性を向上させた様々なバイオイメージングが可能になる。
非対称な疎水性配位空間における水クラスター精密合成

本研究では配位結合を基盤とする結晶性多孔体である金属-有機構造体(MOF)の構成要素として未利用の巨大π共役分子を用いることで、水クラスター合成のための一義的な結晶性疎水空間を構築し、それら疎水性空間において、キラルな構造を有する水クラスターをはじめとした特異な水クラスター形成とクラスターが示す特別な現象を研究対象とする。従来のMOF合成では棒状配位子が用いられることが多く、大きな疎水性平面を有する配位子(巨大π共役系分子)は用いられてこなかった。これは配位子合成の手間と配位子の溶解性の低さに依存したMOF合成の難しさのためであった。本研究代表者は、巨大π共役系分子としてヘキサベンゾコロネン(HBC)に着目し、コアにHBCユニットを含む配位子(H2HBCL)合成を行い、配位子H2HBCLを用いたMOF合成を試みた。H2HBCLと硝酸亜鉛六水和物のN,N-diethylformamide (DEF)溶液中で反応させると、オレンジ色のブロック状結晶が得られた。単結晶X線構造解析の結果、得られた結晶はHBCに囲まれた1次元チャネルを有する多孔性結晶であることが明らかとなった。さらに、単結晶試料を加熱することにより、細孔にゲストとして内包されたDEFを除いた単結晶試料についてもX線構造解析に成功した。今回合成したHBC平面を内包した多孔性結晶には構造柔軟性が発現していることがわかった。ゲスト除去に伴う構造変化については以下の通り。(1)亜鉛(Zn2+)の配位環境:4配位から5配位へと変化。(2)2次元シート構造:Zn2+錯体がHBCLのカルボキシレートにより連結された二次元シート構造を維持。(3)細孔構造: Zn2+錯体とHBCLの位置関係が大きく変化し、グリッド構造が縮むような変化を見せた。結果として空隙率が大きく減少した。当初計画していた巨大π共役系物質を用いた結晶性細孔の合成に成功し、その構造を単結晶X線構造解析により明らかにすることに成功した。さらに、ゲスト除去後の大きく構造変化した細孔の様子も同じく単結晶X線構造解析により詳細に調べることが出来た。そこで、巨大π平面に囲まれた1次元細孔への分子吸着特性を調べる目的で、二酸化炭素、ベンゼン、メタノールといった吸着質の吸着等温線測定を行う。さらに、得られた細孔への水分子の導入による水クラスター合成を行う予定である。