hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト脂肪由来幹細胞の経動脈的投与による脳梗塞治療効果と安全性の検討

脂肪幹細胞培移植による脳梗塞治療法の開発(1)臨床応用のためのヒト脂肪由来間葉系幹細胞の分離培養法確立.添加する血清の検討:自己血清・無血清培養にて細胞培養を開始した.自己血清培養では培養効率は良好であったが,静脈投与に必要な細胞数の確保のために必要な血清量が多量となるため,現実的には自己血清培地での培養は困難であった.無血清培地では56継代にて,静脈内投与に必要な細胞数の確保が可能であった.この結果より,本研究では無血清培地を使用することに決定した.分離酵素の検討:リベラーゼ,コラゲナーゼを使用したそれぞれの分離・培養効率の検討ではリベラーゼの効率が優れていた.よって,分離酵素にはリベラーゼを採用した.上記検討を加味し,ヒト脂肪由来幹細胞の培養プロトコルを完成した.脂肪由来幹細胞であることの確認:細胞マーカーの確認,及び骨,軟骨,脂肪への3分化を確認し,脂肪組織由来幹細胞が間葉系幹細胞であることを確認した.一部神経への分化も確認した.凍結・解凍による細胞生存率の確認:凍結による細胞保存が可能であることを確認した.GMP基準に準拠するため,今後はCPCでの分離培養を開始する予定である.(2)前臨床試験にて安全性と有効性の確認を行った.永久閉塞脳梗塞モデルマウス(CB17♂8±1週)に対して,ヒト脂肪由来幹細胞の静脈内投与を行った.行動学的評価ではオープンフィールドテスト(活動性・衝動性・記憶),オープンスペーススイミングテスト(活動性),テールサスペンションテスト(活動性)の改善を認めたが,ワイヤハングテスト(運動機能)については傾向を認めるものの,有効性を示すまでには至っていないため,今後個体数を増やし,評価予定である.脂肪幹細胞培移植による脳梗塞治療法の開発(1)臨床応用のためのヒト脂肪由来間葉系幹細胞の分離培養法確立.添加する血清の検討:自己血清・無血清培養にて細胞培養を開始した.自己血清培養では培養効率は良好であったが,静脈投与に必要な細胞数の確保のために必要な血清量が多量となるため,現実的には自己血清培地での培養は困難であった.無血清培地では56継代にて,静脈内投与に必要な細胞数の確保が可能であった.この結果より,本研究では無血清培地を使用することに決定した.分離酵素の検討:リベラーゼ,コラゲナーゼを使用したそれぞれの分離・培養効率の検討ではリベラーゼの効率が優れていた.よって,分離酵素にはリベラーゼを採用した.上記検討を加味し,ヒト脂肪由来幹細胞の培養プロトコルを完成した.脂肪由来幹細胞であることの確認:細胞マーカーの確認,及び骨,軟骨,脂肪への3分化を確認し,脂肪組織由来幹細胞が間葉系幹細胞であることを確認した.一部神経への分化も確認した.凍結・解凍による細胞生存率の確認:凍結による細胞保存が可能であることを確認した.GMP基準に準拠するため,今後はCPCでの分離培養を開始する予定である.(2)前臨床試験にて安全性と有効性の確認を行った.永久閉塞脳梗塞モデルマウス(CB17♂8±1週)に対して,ヒト脂肪由来幹細胞の静脈内投与を行った.行動学的評価ではオープンフィールドテスト(活動性・衝動性・記憶),オープンスペーススイミングテスト(活動性),テールサスペンションテスト(活動性)の改善を認めたが,ワイヤハングテスト(運動機能)については傾向を認めるものの,有効性を示すまでには至っていないため,今後個体数を増やし,評価予定である.
GIS-GPSを利用したリアルタイム被害データ取得システムと被害復興データベース

1)リアルタイム災害データ現地取得システムの開発モバイルパソコンで現゚地収集したデータは、PHSを通して遠隔地転送し、奈良大学のサーバーでキャプチャリングするシステムの実験を実施した。使用した電子地図データは、国土地理院の「数値地図2500」で、トリンプル社のGPSを使用し、GISソフトはパスコ社のarc/viewを利用した。パソコンはシャープの携帯型mebiusとソニーのvaioを使用し、当初計画したデータ転送は成功した。2)現地調査とGISデータベース作成被災地での定期的現地調査の実施奈良大地理学科防災調査団による第19回(4月)と第20回(10月)の現地調査を行った。このデータに関しては、入力を終了し、兵庫県震災復興本部町づくり推進課に提供した。調査したデータ項目は、震災でガレキが撤去された後に建築された建物(仮設の建物と新築の恒久的な建物を区別)の構造、業種、棟数、世帯数、その他である。現地調査の効率化を図るために、上記のGPS-GISを使用したが、屋外での液晶画面が見にくく、また、重量が重く、バッテリー時間が短いなどハード的な問題点が多かった。3)インターネットでの公開のためのシステム設計インターネット上で奈良大のホームページからこれらの震災関連のデータベースが誰にでも容易に取得され、簡単な地図化処理も可能なシステムの開発中である。大学のネットワークに直接リンクすることが物理的に不可能なため、外部のプロバイダーで提供する準備をしている。
「分裂破局死」を癌細胞に誘導する分子創薬へ向けたアプローチ

D40遺伝子に特異的な合成二重鎖RNA(D40 siRNA)を用いて複数のヒト培養がん細胞株にRNA干渉を惹起させD40蛋白の発現を特異的に抑制することで、その増殖を抑制することに成功した。D40 siRNAはがん細胞にp53非依存的な細胞死「分裂破局死」を誘導することを明らかにした。さらに、D40 siRNAは実験動物に移植されたがん細胞に対しても増殖抑制効果を示した。D40分子に対するRNA干渉を利用した分子標的療法は将来のがんの治療に有望である。研究代表者はヒトゲノム中に新しいヒト遺伝子D40を見出し、その遺伝子・蛋白質の性状と機能について研究を重ねている。培養ヒト子宮頚癌HeLa細胞内のD40蛋白質の発現を抑制すると、HeLa細胞に分裂異常と細胞死が起こり増殖が著明に抑えられる。HeLa細胞ではヒトパピローマウイルスのE6蛋白質によりp53が不活性化していることから、観察された細胞死はp53非依存的な「分裂破局死」であることが予想された。そこで、本研究では、以下の点を明らかにする。(1)D40分子に対するRNA干渉(D40 RNAi)により、D40分子の発現を抑制することで、多くのヒト培養がん細胞に「細胞死」を誘導し、その増殖を抑制できること。特p53の発現が全く認められない癌細胞(p53 null細胞)においても、D40 RNAiが細胞死と増殖抑制効果を示すか否か。(2)坦癌動物を用いた個体レベルの実験においても、D40 RNAiが抗腫瘍効果を明らかにする。D40遺伝子に対するRNA干渉(RNA interference ; RNAi)を用いて癌細胞内のD40蛋白質の発現を抑制することにより、ヒト培養癌細胞の増殖が抑制され、細胞死が起こることを明らかにすることを試みた。この目的のため、ヒト培養子宮頸細胞株であるHeLaを用い、D40遺伝子に対する合成RNA(D40 siRNA)を用いたRNA干渉により検討した。細胞増殖抑制効果の検討のために、D40遺伝子の塩基配列に対する合成二重鎖RNA(D40 siRNA)をリポフェクション法により、HeLa細胞にtransfectionした。その後経時的にtrypan bluedyeexclusion法により生細胞数を算定し、コントロールの合成二重鎖RNA(control siRNA)を導入されたHeLa細胞と比較し、それぞれの増殖曲線を求めた。その結果、D40 siRNAを導入されたHeLa細胞では、コントロールに比べ、明らかな細胞増殖の抑制が認められた。細胞死のassayには、まずtrypan bluedyeexclusion法により死細胞数を算定した。D40 siRNAを導入されたHeLa細胞では、コントロールの合成二重鎖RNA(control siRNA)を導入されたHeLa細胞に比べ、明らかな死細胞の増加が認められた。また、Hoechst33342により核染色を行い、核の凝縮、断片化を検討したところ、D40 siRNAを導入された細胞では、control siRNAを導入された細胞に比べ、核の凝縮、断片化した細胞の増加を認めた。さらに、Propidiudm Iodine核染色によりFACSを用いた定量的な細胞周期解析を行ったところ、D40 siRNAを導入されたHeLa細胞ではcontrol siRNAを導入された細胞に比べ、subG1期の細胞の著明な増加を認めた。昨年度に引き続き、D40遺伝子に対するRNA干渉(RNA interference ; RNAi)を用いて癌細胞内のD40蛋白質の発現を抑制することにより、ヒト培養癌細胞の増殖が抑制され、細胞死が起こることを明らかにすることを明らかにすることを試みた。特に、ヒト培養子宮頸細胞株であるHeLaに対し、より簡易でより効率良く、D40遺伝子に対するRNA干渉(RNA interference ; RNAi)が起こる条件を検討した。また、さらにHeLa以外の細胞株、特に癌抑制遺伝子産物p53が全く発現していない細胞株(p53null細胞)においても、細胞の増殖が抑制され、細胞死が起こることを明らかにすることを試みた。昨年度、D40遺伝子の塩基配列に対する化学合成した二重鎖RNA(D40 siRNA)をHeLa細胞に導入するリポフェクション法として、前日に細胞をplatingし,当日Oligofectoamineを用いて血清の非存在化でtransfectionしていた。今年度は、細胞のplatingとtransfectionを同時に行うことができ、且つ、transfection中も血清存在化で行うことができるLipotrustを用いた。これにより、二重鎖RNAをより簡便に細胞に導入することができた。また、D40蛋白質の発現抑制の程度も前年度に比べ同等またはそれ以上の成績であった。D40 siRNAによる細胞死がp53に依存しないか否かを検討するため、ヒト癌培養株の中でも、p53遺伝子の両Alleleが変異欠失を起こしたためp53蛋白の発現が全く認められないp53 null細胞(ヒト培養前立腺癌株PC-3M)を用いて実験を試みた。

Preliminaryな結果であるが、D40 siRNAを導入されたPC-3M細胞では、コントロールに比べ、細胞増殖が抑制される傾向が認められた。RM干渉(RNA interference ; RNAi)を用いてがん細胞内のD40蛋白質の発現を抑制することにより、ヒト培養がん細胞に細胞死が起こり、細胞増殖が抑制されることを明らかにすることを目的として研究をすすめた。特に、がん抑制遺伝子p53がwild typeであるヒト培養子官頸がん細胞株であるHeLa、及びp53が全く発現していない細胞株(p53nu 11細胞)であるヒト前立腺がん細胞株PC-3Mに対し、検討した。方法として、D40遺伝子に対するRNA (D40 siRNA)として、昨年度同様に化学合成した21塩基対二重鎖のRNAを試薬としてLipotrustを用いたリボフェクション法により細胞に導入した。特にLipotrustでは、血清存在下で、細胞のplatingとtransfectionを同時に行なうことができることを昨年度から今年度にかけて確立し、これにより実験効率を高めることができた。D40 siRNAによる細胞死がp53に依存しないか否かを検討するため、後者の細胞を用いた実験は重要である。その結果、D405iRNAを導入されたPC-3M細胞では、コントロールに比べ、細胞増殖が抑制されるという大凡の実験結果を得ることができた。また、動物レベルの実験においてもD40 siRNAががん細胞の増殖を抑制できるか検討を開始した。ヌードマウスにPC-3Mを移植(静注)し、D40 siRMを同じく全身投与することで、PC-3M細胞の増殖(転移}を抑制できるか、検討中である。昨年度までD40遺伝子に対るshort inhibitory RNA (D40siRNA)を用いたRAM干渉により、ヒト培養がん細胞内のD40蛋白質の発現を抑制することで、がん細胞に細胞死が起こりその増殖が抑制されることを明らかにした。今年度は、D40siRNAががん細胞に細胞死を誘導するメカニズムと動物実験におけるD40siRNAのがん細胞増殖抑制効果を明らかにすることを目的として研究をすすめた。多くの原発ヒトがんではがん抑制遺伝子p53が不活性化している。D40siRNAが、p53が全く発現していない細胞株(p53 null細胞)であるヒト前立腺がん細胞株PC-3Mに対しても増殖抑制効果を示すか否か、及びD40 siRNAが細胞死を誘導するか否かを検討した。その結果、p53null細胞においても、D40 siRNAを導入することで、細胞増殖が抑制されるという実験結果を得ることができた。また、PC-3M細胞にはD40si RNAにより細胞死が誘導されていることを明らかにした。この細胞死がミトコンドリアを介する経路を利用するか否かについて検討した。方法として、D40siRNAをPC-3M細胞に導入した後ミトコンドリアからcytochrome cが細胞質内に放出されるかをELISA法により定量的に検討した。
簡易抽出カラムと金属メッシュセンサを用いた簡便な細菌計測技術の開発

本研究では、細菌検査の前処理用のツールとして、高性能な分離・反応担体として知られるモノリス型ポリマーを用い、細菌の簡易抽出カラムの製作を目指す。前年度までに、モノリス型ポリマー充填カラムの作製ならびに内部の化学修飾により目的の細菌を特異的に捕捉する機能の付与を行うプロトコルの検証を行ってきた。平成30年度は、異なる菌濃度での大腸菌抽出能と夾雑物の影響評価を行った。抗体修飾を行ったモノリスに細菌懸濁液0.1mLを流して反応させ、ストリッピング剤で剥離して回収し菌数を定量した。細菌数を10^4から10^6 cellsに調製したところ、回収率(抗体からストリッピング剤により回収した菌数/投入総菌数)はそれぞれ、16.3%から0.2%となり、菌数としては十分に確認できたが、菌数が増えるほど回収率が下がる結果となった。大腸菌を蛍光染色してモノリスの断面を観察したところ、壁面近くに多く残留しており、菌数が多いと洗浄やストリッピングでも除去しきれない菌が残ることが確かめられた。一方で、検出用のツールとして金属メッシュセンサの高感度化の検討を行った。上記ツールと組み合わせれば、対象の細菌がカラムで選択的に抽出されるため、通り抜けてくる菌体をそのまま検出すればよい。しかし、金属メッシュの構造スケールに対して細菌のサイズが小さく、センサの感度の良い場所に被測定物を配置する必要があった。そこで、金属メッシュの開口部分に多孔質モノリス型ポリマーを固相化することで、電界が局在してセンサとして感度の高い部位に被測定物を固定することを試みた。ビオチンーストレプトアビジン結合の検出を行ったところ、金属表面に被測定物を直接固定する場合と比べて8.5倍の感度向上が認められた。前年度までから、細菌を再回収する際にポリマーが壊れやすいことが判明し、耐久性の高いポリマー素材の検討が課題であった。本年度、プロトコルの改良によって強度の確保もできたうえで、大腸菌抽出能評価を行った。次年度は、本研究課題の最終目標として、実際の食品中の細菌抽出能の評価を行う予定である。これまで別個で検討してきた金属メッシュセンサと簡易抽出カラムを組み合わせ、実際に細菌の菌種判定ならびに定量の可能性を明らかにすることを目指す。特に最終目標として、牛乳をモデル試料として用い、夾雑物混在下での抽出性能を評価したうえで、センサを用いた検出可能性を評価する予定である。食の安心・安全への関心が高まるのに伴い,食品の細菌検査への需要がますます高まっている。通常の細菌検査では公定法として、多くは培地により数日間培養を要する。また公定法の他にも、DNAを増幅する方法や蛍光標識を添加して検出する方法等が開発され、高精度に定量することが可能になってきているものの、手間や熟練を要するという問題があるため、迅速かつ簡便な技術が切望されている。そこで本研究では、これまで手間や時間を要してきた「前処理」も含めた簡便化、迅速化を検証するとともに、報告者がこれまで携わってきた金属周期構造を用いた簡易センサと組み合わせ、細菌検査への実用可能性を明らかにすることを目指す。前処理用のツールとして、高性能な分離・反応担体として知られるモノリス型ポリマーを用い、細菌の簡易抽出カラムの製作を目指す。研究の初年度であるH28年度では、まずモノリス型ポリマー充填カラムの作製法を検討するとともに、ポリマー骨格を化学修飾し、抗原抗体反応を介して目的の細菌を特異的に捕捉する機能の付与を行った。ピペットチップの中にポリマーを充填し、抗体修飾を行ったうえで、10^7 cell/mLを0.5 mL注入したところ、77.6 %の菌を捕集できた。さらに、ストリッピングバッファー(抗体の剥離剤)を用いることで50.5 %の菌を回収することに成功した。また検出用ツールとして金属メッシュセンサの選定を行うため、電磁界解析を用いて最適な構造の検証を行った。初年度の目標としていた、モノリス型ポリマーの作成方法ならびに充填方法の検討を行い、実際にカラムに安定して充填し、化学修飾が行えていることが確認できたことから、研究は概ね順調に進展していると言える。ただし、まだポリマーの作成条件の最適化が十分とは言えず、細菌の回収率が高くないことが課題であり、次年度に検証・改善を行う予定である。また検出用ツールとして用いる金属メッシュセンサについて、従来は電磁波の透過測定を行うことを前提としていたが、本研究の成果により反射測定でも検出が行える可能性が明らかとなりつつある。これにより、従来は必須であった乾燥過程を省くことができる可能性があり、ターゲットをより迅速・簡便に検出することに貢献できるものと期待できる。初年度はモノリス型ポリマー充填カラムの作製法を検討するとともに、ポリマー骨格を化学修飾し、抗原抗体反応を介して目的の細菌を特異的に捕捉する機能の付与を行った。しかし、ポリマー形成プロトコルの最適化ができていなかったため、29年度は実際にポリマー充填カラムを作製し、ポリマー形成時の温度や試薬配分の条件を変え、作成プロトコルの検討を行った。

ポリマー形成時の温度が低いほどモノリス内部の空洞が大きくなり,60 °Cで加熱した場合510μm程度,100 °Cでは5μm以下のサイズの貫通孔が形成されることが確認できた.、また硬化剤の割合を減らすと,空隙部分の割合が減少した.大腸菌のサイズが23μmであることを考慮し、最適なプロトコルを選定すれば、対象物の大きさに適したポリマーの形成が可能である。一方で、金属メッシュセンサによる検出能の検証を行った。上記ツールと組み合わせれば、カラムで選択的に抽出されるため、通り抜けてくる菌体をそのまま検出すればよい。メンブレンフィルタ表面で大腸菌を捕集し、金属メッシュセンサに押し付けて透過測定を行ったところ、菌数に応じた周波数特性のシフトが確認できた。モノリスポリマー自体の透過特性を測定したところ、テラヘルツ帯で吸収と屈折率がともに小さいことが確認できた。すなわち、予め金属メッシュにポリマーを融合して透過測定することも可能であることを意味し、さらに簡便なツールになる可能性が確かめられた。前年度の課題であったモノリス型ポリマーの作成方法ならびに充填方法の最適化を行い、実際にカラムに安定して充填し、化学修飾が行えていることが確認できているものの、ストリッピングバッファーを用いて、細菌を再回収する際に、ポリマーが壊れやすいことが判明した。次年度、耐久性の高いポリマー素材の検討を行う予定である。本研究では、細菌検査の前処理用のツールとして、高性能な分離・反応担体として知られるモノリス型ポリマーを用い、細菌の簡易抽出カラムの製作を目指す。前年度までに、モノリス型ポリマー充填カラムの作製ならびに内部の化学修飾により目的の細菌を特異的に捕捉する機能の付与を行うプロトコルの検証を行ってきた。平成30年度は、異なる菌濃度での大腸菌抽出能と夾雑物の影響評価を行った。抗体修飾を行ったモノリスに細菌懸濁液0.1mLを流して反応させ、ストリッピング剤で剥離して回収し菌数を定量した。細菌数を10^4から10^6 cellsに調製したところ、回収率(抗体からストリッピング剤により回収した菌数/投入総菌数)はそれぞれ、16.3%から0.2%となり、菌数としては十分に確認できたが、菌数が増えるほど回収率が下がる結果となった。大腸菌を蛍光染色してモノリスの断面を観察したところ、壁面近くに多く残留しており、菌数が多いと洗浄やストリッピングでも除去しきれない菌が残ることが確かめられた。一方で、検出用のツールとして金属メッシュセンサの高感度化の検討を行った。上記ツールと組み合わせれば、対象の細菌がカラムで選択的に抽出されるため、通り抜けてくる菌体をそのまま検出すればよい。しかし、金属メッシュの構造スケールに対して細菌のサイズが小さく、センサの感度の良い場所に被測定物を配置する必要があった。そこで、金属メッシュの開口部分に多孔質モノリス型ポリマーを固相化することで、電界が局在してセンサとして感度の高い部位に被測定物を固定することを試みた。ビオチンーストレプトアビジン結合の検出を行ったところ、金属表面に被測定物を直接固定する場合と比べて8.5倍の感度向上が認められた。前年度までから、細菌を再回収する際にポリマーが壊れやすいことが判明し、耐久性の高いポリマー素材の検討が課題であった。本年度、プロトコルの改良によって強度の確保もできたうえで、大腸菌抽出能評価を行った。次年度は、本研究課題の最終目標として、実際の食品中の細菌抽出能の評価を行う予定である。
2次元アンチドット型光格子中の量子気体のダイナミクス

ポテンシャル障壁が規則的に配列し、エネルギー極小が多重連結しあった、新しいタイプの光格子である2次元アンチドット型光格子を構築し、その中へ位相空間密度の高い冷却原子気体を誘導し、アンチドット型光格子の中で非平衡過程の生成と観測を目指した実験を行った。アンチドット光格子を高速で揺らした場合、揺らす速度に明瞭な閾値は見られなかったものの、運動量分布の広がりを観測し、エネルギー散逸が引き起こされていることを明らかにした。本研究の目的は、ポテンシャル障壁が規則的に配列し、エネルギー極小が多重連結しあった、新しいタイプの光格子「2次元アンチドット型光格子」内へ量子気体を流し込み、非定常状態やより一般には熱的に非平衡な物理状態を生成させ、量子渦生成や量子輸送現象の詳細を解明することである。H20年度は、本研究の基盤となる量子気体であるボーズ・アインシュタイン凝縮(BEC)を生成し、それをアンチドット型光格子内に誘導する技術を確立することを目標に取り組んだ。まず、原子ビーム生成用のオーブンチェンバーと原子捕獲用の光学セルを連結して超高真空システムを完成し、光学セル内で研究遂行に必要となる10のマイナス11乗台の真空度を得た。また、アナログとデジタル信号、合計64チャンネルを独立して制御できる実験シーケンスの制御プログラムを完成させ、時間分解能、チャンネル間の同期、出力の分解能などの性能を確認した。次に、冷却に必要となる半導体レーザー光源とその出力を最大1.5Wにまで増幅するための高出力半導体レーザーを製作し、発振周波数線幅が1MHz以下に狭窄化されていることを確認した。H21年度4月の時点ではまだBEC達成には至っていないが、BEC生成に必要な基盤は完成しており、すでに原子の冷却実験を開始している。アンチドット型光格子は、H20年度に購入したリングチタンサファイアレーザーにより形成される。レーザー光出力(1.8W)、発振周波数線幅(500kHz未満)ともに目標値をみたしており、夏ごろ実現予定のBECの後に備えて、ビームラインの構築も並行して行っている。H20年度に学内で開催された研究会や幾つかの招待講演において、本研究のアンチドット型光格子が、量子渦の生成・崩壊過程や最初から渦を含んでいた気体内で量子渦から量子乱流への遷移過程などが研究できる大変興味深い実験系であるとの指摘を受けた。これから本格化する研究の進展に資する貴重な示唆となった。本研究の目的は、ポテンシャル障壁が規則的に配列し、エネルギー極小が多重連結しあった、2次元アンチドット型光格子内へ量子気体を流し込み、非定常状態やより一般には熱的に非平衡な物理状態を生成させ、量子渦生成や量子輸送現象の詳細を解明することである。H21年度より原子の冷却実験を開始した。オーブン内の細管によりコリメートされた^<87>Rb原子ビームを生成し、ドップラー冷却法で減速させながら光学セルに誘導し、同時に3軸方向からのトラップ光と磁場勾配を組み合わせた磁気光学トラップ(MOT)により原子を捕獲した。各種パラメーターを最適化させ、原子の誘導レートとして5X10^<8>個/s、MOT内に50μK程度の10^<8>個の原子数を得ることができた。次に、瞬間的に磁場勾配を2倍にあげ、同時にレーザーの離調を大きくし、かつ光強度を下げてMOTを圧縮し、圧縮開始から25ms後、8X10^<11>個/cm^<3>の密度を達成した。密度がピークに達した瞬間に3次元光格子を印加し、その中で偏光勾配冷却を行う。現在、この冷却の最適化に取り組んでいる。1本あたり350mW、ビーム径500μmの青方離調した光格子ビームは高出力のテーパーアンプ2台から生成し、光ポンピングを行った後、断熱冷却により原子集団を1μK程度に冷却できると考えている。この後、原子を光双極子トラップへと移行し、全光学的手法によるBECを実現して、本研究提案の中核部分であるアンチドット型光格子内での物性研究へと進む計画である。本研究の光格子は従来にはないタイプであり、量子渦の生成や量子乱流への遷移、低次元化の影響なども研究できる非常に興味深い系であり、先駆的な実験結果を出せるよう取り組む予定である。本研究の目的は、2次元アンチドット型光格子内へ量子気体を流し込み、非定常状態や熱的に非平衡な物理状態を生成させ、量子渦生成や量子輸送現象の詳細を解明することである。超高真空の光学セル内で磁気光学トラップを生成・圧縮後、青方に離調した3次元光格子へ5×10^8個の原子集団を誘導した。さらに偏光勾配冷却と光ポンピングを行い、特定の磁気副準位にある4×10^8個の原子気体を生成、7×10^<-4>の位相空間密度を得た。そして、波長1064nmのレーザーによる交差型光双極子トラップへ、10^7個の原子をローディングすることができた。

このトラップ中で原子気体の圧縮と蒸発冷却を繰り返し行い、現在、BECの直前、位相空間密度が0.1近くまで増大した原子気体を得ている。アンチドット用の光格子(X、Y方向)のビーム系と、これらとは別に、相対位相の観測専用のビームを各光格子ビームのわずか下に構築した。2本のビームを干渉させて相対位相を測定、折り返しミラーに附置したピエゾ素子に帰還し、YビームはXビームとの位相差を常に維持するよう制御した。この2次元光格子系に、BEC前ではあるが、位相空間密度がかなり高い原子気体を誘導、トラップから解放して原子気体の運動量分布を観測した。相対位相を維持したまま、Xビームを意図的に高速で揺らしたところ、散逸による運動量分布の広がりを観測したが、揺らす速度に明瞭な閾値は見られなかった。また、原子気体の干渉パターンも明瞭ではなく、再現性にもとぼしい。これらは、まだBEC前なので原子気体中にマクロなコヒーレンスが確立していないこと、光格子の相対位相の値が正しくないためと考えられる。後者は、BECが達成されれば明確に定めることができ、現在、全力でBEC生成を目指している。光子系はすでに出来上がっており、BECが生成できれば本研究提案を精力的に進めることができると考えている。
資産評価理論を中心とするファイナンス論の理論および政策的研究

具体的実績としては,平成11年10月23日(土)、滋賀大学経済学部に於ける日本経営財務経営学会・第23回全国大会報告「資産評価と効用理論」がある。そこでの主な論点は、1.文献研究(レビュー)、(1)独立性の公理を緩和する流れとして、ノイマン=モルゲンシュテルン型効用(von Neumann-Morgenstern)から非期待効用(non-expected utility preference)へと拡張する方向をとらえた。(2)心理学との関係。2.ファイナンス論における効用理論の意味と考え方をとらえた。(1)資産評価理論(asset pricing theory)において、効用関数の果たす意味を検討するかを見た。その端緒として、公理体系のなかの独立性(independence axiom)の意味をとりあげ、ここに視点をしぼって考察をはじめた。その一つの方法として、喜怒哀楽という人間という人間の感情、リスクに対する態度、リスクに対する態度、実用性(プラグマティズム)などを、どのように考えるかという点で、心理学との連関を調べている。(2)ポートフォリオを分散することの意味を考え直すことが大事である。3.功利主義について、定義づけにさかのぼって考える必要があることが分かった。このことは、近代経済学において、主に「理論と実証」、「規範と現実」という観点から、つねに意識されつづけてきたが、最近急速に、マクロ的観点から、問題を問い直す姿勢が提起され、この2年間の研究成果を糧として、これからの本格的研究につなげたい。研究の目的の一つであるAPT周辺の諸問題の考察において、Eddie Dekel(1989)における考察を精密化する方向で、一定の検討を行った。投資家の選好が、期待効用の表現をとらないとき、危険回避とポートフォリオ分散化との関係が一つである。両者が必要十分条件になるための前提と、それ以外の場合の状態を分析した。来年度は、これを一般化して、効用理論の問題で、独立性と連続性の公理の問題を扱う。次に、APTにおいて、均衡と無裁定の条件の考察を行った。技術的問題が、まず、重要であり、それに加えて、経済学的解釈に踏み込んだ。ここから、Harsanyiの定理との対応で、無裁定条件の形式的特徴を社会選択の問題に応用するとき、どのような意味を持った社会厚生関数が導かれるかについて、来年度も継続して検討する。さらに、これに関連して、功利主義をめぐっての論点について、一定の分析を行った。Senの指摘している、功利主義の特徴としての帰結主義をどう位置づけるかという点が中心となっている。来年度も、倫理へのアプローチに経済学的考察や知見がどこまで貢献できるかの長期的目標において、政策的観点もふくめて、研究を続ける計画である。以上、大きく三つの論点は、資産評価理論においても、効用理論においても、相互に関連しており、全体的体系を分析する目的を背後においている。
肺腺癌における遺伝子異常に因らないＥＧＦＲ阻害薬抵抗性機構の解明

EGFR mutant肺腺癌がEGFR阻害薬抵抗性を示す際の新たな分子機構を2つ見出した。(1)3次元培養されたEGFR mutant肺腺癌細胞は浮遊状態の癌細胞と比較するとEGFR阻害薬に抵抗性であった。3次元環境ではNF-κBが活性化しており、NF-κBを抑制するとEGFR mutant肺腺癌細胞のEGFR TKI感受性が有意に回復した。(2) EGFR変異陽性でありながらEGFR非依存性に生存可能な細胞が2種類のEGFR mutant肺腺癌細胞株に内在していることを見出しGR cellと命名した。GR cellsは上皮間葉転換を起こし、autophagy依存性に生存していた。日本人に生じる肺腺癌の約半数には受容体型チロシンキナーゼepidermalgrowthfactor receptor (EGFR)をコードするEGFR遺伝子に機能獲得性突然変異が認められる。EGFR遺伝子変異陽性(EGFR mutant)肺腺癌の多くは、gefitinib等のEGFR阻害薬に一旦は高感受性を示すものの最終的には、ほぼ全例が薬剤耐性を獲得することが知られている。この根本的な原因の一つとしてEGFR変異陽性でありながらEGFR非依存性に生存可能な細胞が2つのEGFR mutant肺腺癌細胞株(HCC827, HCC4006)に内在していることを見出しgefitinib resistant (GR)cellと命名した。GR cellは上皮間葉転換(epithelial to mesenchymal transition, EMT)を起こしており、癌幹細胞マーカーCD44を高発現していた。さらにGR cellはautophagy依存性に生存していることも明らかにした。EMT phenotypeとautophagy亢進には密接な関係があると推測される。Epidermal growth factor receptor (EGFR)遺伝子変異陽性(以下EGFR mutant)肺腺癌細胞は、浮遊培養系(脈管内や胸水中に浮遊する癌細胞のin vitro model)ではEGFR阻害薬に対して高感受性を示し容易にapoptosisに陥るのに対し、通常の単層接着培養系で維持された場合、その癌細胞が発現するEGFRの自己リン酸化(活性化)は浮遊状態と同様にEGFR阻害薬によりほぼ完全に抑制されるにもかかわらず、EGFR阻害薬が誘導するapoptosisに顕著に抵抗性を示すという興味深い現象を以前に見出していた。生体内においても周囲の細胞外基質と接着するEGFR mutant肺腺癌細胞が浮遊細胞よりもEGFR阻害薬治療に抵抗性を示すか否かを検証するために、我々はin vivoの環境により近いと想定されるMatrigel(EHS肉腫細胞が産生する細胞外基質)を用いた3次元培養系を導入した。結果として3次元培養系で維持されたEGFR mutant肺腺癌細胞も浮遊培養された癌細胞と比較するとEGFR阻害薬が誘導するapoptosisに抵抗性であることが確認された。その原因を探索したところ、浮遊状態から3次元環境にEGFR mutant肺腺癌細胞を移すと僅か6時間でNF-κB signalingを抑制するIκBの発現が激減し、NF-κB signalingが亢進することを見出した。よって3次元培養系で維持されたEGFR mutant肺腺癌細胞が示すapoptosis抵抗性には、3次元培養状態でのみで確認されるNF-κB signalingの亢進が一定の役割を果たしていると推察された。この研究成果は既に論文として発表した(Sakuma et al. Biochem Biophys Res Commun 2012)。1.を解明するため我々はin vivoの環境により近いと想定されるMatrigelを用いた3次元培養系を導入した。よって3次元培養系で維持されたEGFR mutant肺腺癌細胞が示すapoptosis抵抗性には、3次元培養状態でのみで確認されるNF-κB signalingの亢進が一定の役割を果たしていると推定された。2.に関してはEGFR変異陽性でありながらEGFR非依存性に生存可能な細胞が2種類のEGFR mutant肺腺癌細胞株(HCC827, HCC4006)に内在していることを見出しgefitinib resistant (GR)cellと命名した。GR cellsは上皮間葉転換を起こし、癌幹細胞マーカーCD44を発現していた。さらにGR cellsにはautophagyが活発に生じていることを見出した。腫瘍病理学EMTという癌細胞の表現型がEGFR阻害薬抵抗性と有意に相関することは以前から知られていたが、その分子機構の1つとしてEMTを起こした癌細胞では低ストレス環境下でもautophagyが亢進していることを明らかにできたためである。

“癌細胞と細胞外基質との接着"がもたらすEGFR TKIs治療抵抗性機構の解明を目指して研究を行ってきたが、3次元培養系で維持されたEGFR mutant肺腺癌細胞が示すapoptosis抵抗性には、NF-κBという特定の分子の活性化が一定の役割を果たしていることをin vitroの実験系で示すことができたためである。EMTを起こしたGR cellは癌幹細胞様の細胞と考えている。GR cellにはEMTを促進する転写因子でありZEB1が高発現していることを見出している。ZEB1の発現を抑制できれば、EMTという表現型、EGFR阻害薬抵抗性、といったGR cellの特徴を解除することが可能と仮説を立てており、それを実証したい。今年度以降は“癌細胞の上皮間葉転換(EMT)"がもたらすEGFR阻害薬抵抗性機構の解明を目標とする。我々は既にEGFR mutantの複数の肺腺癌細胞株にはEMTを起こしEGFR阻害薬抵抗性を示すminor populationが存在することを見出している。興味深いことに、このような治療抵抗性細胞は、親株ではWestern Blot上検出感度以下だったCD44(癌幹細胞マーカーの一つ)を強発現している。このような癌幹細胞的性質を有するEGFR mutant癌細胞がどのような分子機構を用いて治療抵抗性を示すのかを解明することを目指す。今年度(平成25年度)の支出はおおむね想定した金額であったが、平成24年度に行う予定であった研究(癌細胞と細胞外基質との接着がもたらすアポトーシス抵抗性の研究)が想定以上に順調に進んだため、平成23年度の神奈川県立がんセンター(臨床研究所)の経常研究費から物品費などを捻出したためである。補助金は主として、消耗品費として使用させていただく予定である。具体的には、Western Blotでの蛋白発現解析に要する抗体、遺伝子発現を抑制するためのsiRNA, shRNA関連試薬、小分子治療薬、Caspase活性測定試薬、動物実験に必要なマウスの購入費、および免疫組織化学染色用抗体等である。また、本研究の成果を学会報告や研究論文として公表することが、研究者として行うことのできる最大の社会貢献と考えており、消耗品費を除いた経費は、学会発表と論文報告を滞りなく行うために使用させていただく予定である。補助金は主として、主として消耗品費として使用させていただく予定である。具体的には、Western Blotでの蛋白発現解析に要する抗体、定量RT-PCR関連試薬、遺伝子発現を抑制するためのsiRNA, shRNA関連試薬、小分子治療薬、Caspase活性測定試薬および免疫組織化学染色用抗体等である。
多項式緩和による大規模な分数和計画に対するアルゴリズムとそのモチーフ抽出への応用

生体生命における情報の中に共通配列(モチーフ)を探し出すことを研究の目的である.モチーフを評価するため,情報量に基き,ある種の分数和を最大化することが必要である.本研究はこのような既存の分数和を最大にする計算方法(アルゴリズム)を研究し, 2005に発表されたモチーフ抽出アルゴリズムを大幅改良した.数値実験の結果では,計算速度を2900倍に速くすることに成功した.生体生命における情報の中に共通配列(モチーフ)を探し出すことを研究の目的である.モチーフを評価するため,情報量に基き,ある種の分数和を最大化することが必要である.本研究はこのような既存の分数和を最大にする計算方法(アルゴリズム)を研究し, 2005に発表されたモチーフ抽出アルゴリズムを大幅改良した.数値実験の結果では,計算速度を2900倍に速くすることに成功した.分数計画に対する幾つかのアルゴリズムを比較し、その効率性を分析した。その上、効率のよいアルゴリズムを選択し、そのアルゴリズムの拡張を試みた。具体的には、探索領域の上、目的関数の線形緩和問題を作り、非線形分数計画問題にも適用できるアルゴリズムを開発した。開発したアルゴリズムに対して、計算機実験を行い、その性能を確認した。また、連続変数と離散変数の扱いなどについての研究もし、モチーフ抽出問題を分数和最大化問題としての定式化を研究した。また、heuristic的な方法で解モチーフ抽出問題の解を求め、これからの解法比較の土台を作った。それらの成果を国内外の会議で発表した。分数計画に対する研究は特に以下の点について注意を払った:分数の個数が増えても,計算時間が分数の個数に対して指数オーダで増えないこと.まず,線形関数の分数和を重点的に研究すること,それから,問題に対する線形緩和を研究し,より変数の少ない緩和式の定式化を目指すことである.分枝限定法を用いる場合,導入した変数の個数が多すぎると,効率的なアルゴリズムを設計することが難しくなるためである.このような方針の下で,分数和計画に対するコンパクな線形緩和ができた.計算機実験を行った結果,提案するアルゴリズムは従来の線形緩和を用いた分枝限定法より効率がよいことが確認された.モチーフ抽出の研究に関しては, ACSを用いたアルゴリズムを開発し,マルチポルシークエンスアライメントに適用した.計算機実験では,人工的なデータと実際の肝炎シークエンスなど5種類を使用した.どのデータについても,改良したアルゴリズムは従来のACS方法に比べ,最大2900倍速い(従来方法の1/2900の時間しか要しない)結果を得た.速度はかなり改善されたと思われる. Bioinformatics分野ではよく使われているGibbs Sampling法との比較も行った.Gibbs Sampling法よりも開発したアルゴリズムの方は計算速度がやや速い結果を得た.ArocもGibbs Sampling法よりいい結果も得た(約[0.6-0.72]対[0.75-0.87]).分数和計画問題対する研究結果を直接にモチーフ抽出への応用することが至ってない.その一因はモチーフ抽出問題で現れる分数計和計画の変数が整数であり,モチーフ抽出問題に対するより効率的なアルゴリズムを開発することには更なる研究が必要であると思われる.
iPS細胞を用いたDMD遺伝子エクソン3-9スキップ治療の開発

Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)は、DMD遺伝子変異によりジストロフィンが欠損するために全身の骨格筋・心筋の変性・壊死が起こり、呼吸不全や心不全で死亡する重篤な筋疾患である。現在のところ根本的治療は開発されていないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド(核酸医薬品)によりアミノ酸の読み取り枠を修正するエクソン・スキップ治療の臨床応用が進んでいる。最近、我々はエクソン3ー9欠失を有したBecker型筋ジストロフィー(BMD)患者の骨格筋症状が極めて軽微であることを報告した。DMD遺伝子変異の約10%がエクソン37の領域に集積しているため、この領域に変異を有するDMD患者に対しエクソン3ー9スキップ治療を行うことができれば、極めて有望な治療法になり得ると考えた。本研究では、エクソン4ー7欠失を有するDMD患者の末梢血リンパ球からiPS細胞を樹立し、そのiPS細胞から分化誘導した骨格筋と心筋細胞に対してアンチセンス核酸(モルフォリノ)およびCRISPER/Cas9によるゲノム編集の両手法によって、エクソン3ー9欠失型に変換する治療の基盤研究を行うことを目的としている。これまでに、DMD遺伝子エクソン4ー7欠失を有するDMD患者、エクソン3ー9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子の導入を行ってiPS細胞の樹立、および骨格筋・心筋細胞への分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの遺伝子発現解析の結果から各細胞の遺伝学的バックグラウンドが異なることで、治療効果や解析結果に大きな影響を与える可能性があることが判明した。そこで、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4ー7欠失iPS細胞、エクソン3ー9欠失iPS細胞を作製を試みている。計画通り、DMD遺伝子エクソン4ー7欠失を有するDMD患者、エクソン3ー9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子を導入することでiPS細胞の樹立と心筋細胞などへの分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの解析から提供元の遺伝学的バックグラウンドなどが異なることから、治療効果や解析結果に大きな影響出てしまう可能性があることが分かってきた。そこで、現在、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4ー7欠失iPS細胞、エクソン3ー9欠失iPS細胞の作製して、その細胞に対してアンチセンス核酸およびゲノム編集による治療実験を行う方針としている。本年度の計画として、1)正常iPS細胞、ゲノム編集により作製したエクソン4ー7欠失iPS細胞およびエクソン3ー9欠失iPS細胞に対して、MyoD導入により骨格筋細胞へ、CHIR、Activin A、MG、BMP4、Xavを導入により心筋細胞への分化誘導を行い、ジストロフィンの発現の有無の確認とマイクロアレイによる遺伝子の網羅的発現解析を行う。2)エクソン4ー7欠失iPS細胞より分化誘導した心筋、骨格筋細胞に対して、アンチセンス核酸モルフォリノによるエクソン3、8、9スキップを行い、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認をする。細胞機能についてカルシムイメージングによるカルシウム動態の検討を行う。3)エクソン4ー7欠失iPS細胞に対しては、新たに設計したguide RNAとCRISPR/Cas9コンポーネントを発現ベクターで導入し、エクソン3、8、9をスキップするようにゲノム編集を行う。ゲノム編集を受けたiPS細胞を心筋、骨格筋に分化誘導し、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認する。4)エクソン3ー9スキップ治療におけるアンチセンス核酸モルフォリノとゲノム編集の治療効果等について比較検討を行う。

これまでに、DMD遺伝子エクソン4ー7欠失を有するDMD患者、エクソン3ー9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子の導入を行ってiPS細胞の樹立、および骨格筋・心筋細胞への分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの遺伝子発現解析の結果から各細胞の遺伝学的バックグラウンドが異なることで、治療効果や解析結果に大きな影響を与える可能性があることが判明した。そこで、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4ー7欠失iPS細胞、エクソン3ー9欠失iPS細胞を作製を試みている。計画通り、DMD遺伝子エクソン4ー7欠失を有するDMD患者、エクソン3ー9欠失を有するBMD患者、および健常者から末梢血リンパ球を採取・分離し、OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc遺伝子を導入することでiPS細胞の樹立と心筋細胞などへの分化誘導を検討してきた。しかしながら、マイクロアレイなどの解析から提供元の遺伝学的バックグラウンドなどが異なることから、治療効果や解析結果に大きな影響出てしまう可能性があることが分かってきた。そこで、現在、正常者の末梢リンパ球から誘導したiPS細胞に対してゲノム編集によりエクソン4ー7欠失iPS細胞、エクソン3ー9欠失iPS細胞の作製して、その細胞に対してアンチセンス核酸およびゲノム編集による治療実験を行う方針としている。本年度の計画として、1)正常iPS細胞、ゲノム編集により作製したエクソン4ー7欠失iPS細胞およびエクソン3ー9欠失iPS細胞に対して、MyoD導入により骨格筋細胞へ、CHIR、Activin A、MG、BMP4、Xavを導入により心筋細胞への分化誘導を行い、ジストロフィンの発現の有無の確認とマイクロアレイによる遺伝子の網羅的発現解析を行う。2)エクソン4ー7欠失iPS細胞より分化誘導した心筋、骨格筋細胞に対して、アンチセンス核酸モルフォリノによるエクソン3、8、9スキップを行い、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認をする。細胞機能についてカルシムイメージングによるカルシウム動態の検討を行う。3)エクソン4ー7欠失iPS細胞に対しては、新たに設計したguide RNAとCRISPR/Cas9コンポーネントを発現ベクターで導入し、エクソン3、8、9をスキップするようにゲノム編集を行う。ゲノム編集を受けたiPS細胞を心筋、骨格筋に分化誘導し、ジストロフィンタンパク質の発現回復および治療前後におけるジストロフィン関連タンパク質の発現を検討する。治療前後の各細胞についてマイクロアレイを用いた遺伝子網羅的発現解析を行い、発現に有意差のある分子については定量的PCRおよびウエスタンブロットで確認する。4)エクソン3ー9スキップ治療におけるアンチセンス核酸モルフォリノとゲノム編集の治療効果等について比較検討を行う。
ニューロン・グリア間のシグナリングの実体とその生理的役割の解明

神経系においては、ニューロン、シナプスはより数多くの保持細胞(グリア、シュワン細胞)こ覆われている。ニューロン・グリア間にシグナリングが存在することは脊椎動物、無脊椎動物の神経系で認められている。イカ巨大神経線維からシュワン細胞を酵素処理によって単離し、ホールセル電位固定法を適用しイオン電流を測定した。2種類の電流が再現性よく記録された。L-型Ca^<2+>電流と、Ca^<2+>-activatedK^+電流である。パッチクランプ法で40pSのカリウムチャネルが同定された。シュワン細胞で認められたL-Ca^<2+>チャネルとCa^<2+>感受性K^+チャネルの存在は細胞膜電位が-40mVであることを合理的に説明する。シュワン細胞質をCa^<2+>感受性蛍光色素Fluo-3でロードし、イオン、物質による細胞内Ca^<2+>濃度変化を調べた。細胞をK^+で脱分極すると蛍光強度は上昇し、細胞内のCa^<2+>濃度の増大が見られた。外液のCa^<2+>をEGTAで取り除き同様の実験を行ったが蛍光強度の上昇はまったく認められない。細胞内Ca^<2+>チャネルを活性化するCaffeineも影響は認められなかった。さらに、仮想的な伝達物質と考えられているL-glu、AChは細胞内Ca^<2+>レベルに対して有為な変化を引き起こさなかった。その原因として、以下の2点が考えられる。一つは、細胞単離の酵素処理過程でこれら伝達物質の受容体分子が機能を失ったこと。もう一つは、L-glu説の根拠となる微小電極の挿入時に刺し口からCa^<2+>が細胞内にリークする可能性である。この解決にはインタクトな神経標本のシュワン細胞をCa^<2+>感受性蛍光色素でロードし、L-gluとAChの効果を調べることである。この実験は適当な測定装置を作ることによって可能となる。シグナリングの実態はまだ不明である。神経系カリウムホメオスタシス維持は、神経細胞自身のカリウム制御機構と保持細胞である、シュワンあるいはグリア細胞によるカリウム取り込みによって保たれる。本研究においてはまず、(1)イカ神経細胞を一層で取り巻くシュワン細胞を単離し、膜を通るイオンの動きとその制御機構の研究を行った。同時に、(2)イカ巨大神経カリウムチャネル不活性化制御機構の研究を開始した。以下にその結果の概要を述べる。(1)シュワン細胞をパッチクランプし、イオンチャネルを同定した。通常、コンダクタンス50pSのカリウムチャネルが記録された。その密度は1/(10μm^2)と低く、活性は膜電位に依存しない。活性化は、細胞内側カルシウムイオン濃度に依存し、0.1-1μMへの上昇で10倍以上の活性化の上昇が認められた。一方、細胞内ATP,ACh、細胞外glutamate添加に対して活性化の上昇は全く認められなかった。このことは膜電位は細胞内カルシウムイオンの制御機構によりコントロールされていることを示唆した。細胞内にカルシウム感受性蛍光色素fluo-3をロードし、細胞外glutamateの効果を調べた。しかし、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は認められなかった。細胞のイオン取り込みと体積制御は、glutamate経路とは無関係な別な、(現在不明な)経路によるものと考えられる。

(2)巨大神経細胞カリウムチャネルのもつ速い不活性化(時定数<10ms)は細胞内に注入したカルシウムイオンで減少し、BAPTAで増大することが確かめられた。Calmodulin阻害剤W-7で不活性化が増大する。これらのことから、カリウムチャネル不活性化ゲートはCa^<2+>-calmodulinを介したリン酸化によって制御されていることが示唆された。カリウムチャネル不活性化は神経末端における神経伝達増強、神経系カリウムホメオスタシス維持に正に作用する。神経系においては、ニューロン、シナプスはより数多くの保持細胞(グリア、シュワン細胞)に覆われている。ニューロン・グリア間にシグナリングが存在することは脊椎動物、無脊椎動物の神経系で認められている。イカ巨大神経線維からシュワン細胞を酵素処理によって単離し、ホールセル電位固定法を適用しイオン電流を測定した。2種類の電流が再現性よく記録された。L-型Ca^<2+>電流と、Ca^<2+>-activated K^+電流である。パッチクランプ法で40pSのカリウムチャネルが同定された。シュワン細胞で認められたL-型Ca^<2+>チャネルとCa^<2+>感受性K^+チャネルの存在は細胞膜電位が-40mVであることを合理的に説明する。シュワン細胞質をCa^<2+>感受性蛍光色素Fluo-3でロードし、イオン、物質による細胞内Ca^<2+>濃度変化を調べた。細胞をK^+で脱分極すると蛍光強度は上昇し、細胞内のCa^<2+>濃度の増大が見られた。外液のCa^<2+>をEGTAで取り除き同様の実験を行ったが蛍光強度の上昇はまったく認められない。細胞内Ca^<2+>チャネルを活性化するCaffeineも影響は認められなかった。さらに、仮想的な伝達物質と考えられているL-glu、AChは細胞内Ca^<2+>レベルに対して有為な変化を引き起こさなかった。その原因として、以下の2点が考えられる。一つは、細胞単離の酵素処理過程でこれら伝達物質の受容体分子が機能を失ったこと。もう一つは、L-glu説の根拠となる微小電極の挿入時に刺し口からCa^<2+>が細胞内にリークする可能性である。この解決にはインタクトな神経標本のシュワン細胞をCa^<2+>感受性蛍光色素でロードし、L-gluとAChの効果を調べることである。この実験は適当な測定装置を作ることによって可能となる。シグナリングの実態はまだ不明である。