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バイオマテリアルの生体内劣化とマクロファージ

本年度は,生体内のin vivoにおける腐食メカニズムを解明することを目的として研究を行った.生体内における腐食挙動を模擬するため,U937細胞から分化させたマクロファージ(Mφ)を培養し,これを含む培養液中においてステンレス鋼の腐食試験を行った.培養液中における腐食反応速度は交流インピーダンス法により測定し,浸漬時間の経過にともなう腐食速度の変化を調べた.また,異物を貧食したMφ活性化の影響を調べるため,ポリエチレン粒子を貧食したMφを培養し,同様な腐食試験を行った.さらに,試験後の試料表面を走査型電子顕微鏡,原子間力顕微鏡および走査型電子顕微鏡により詳細に分析し,その腐食挙動について検討・考察を加えた.得られた結論を以下に示す.(1)Mφを含む培養液中に浸漬した試料は,試料表面には極微細な凹凸が多数形成され,時間経過とともに粗さと腐食反応速度が増加することが明らかとなった.このことは,Mφの存在が生体材料の腐食に大きな影響を及ぼすことを示すものである.(2)ポリエチレン粒子を貧食させることにより,免疫反応を活性化させたMφを含む培養液中の試料の場合,その表面粗さ,腐食反応速度ともにそれを貧食していない場合と比較して大となることが明らかとなった.このことは,Mφの活性化が金属材料の腐食を促進させることを示すものである.(3)Mφおよび活性化したMφを含む培養液の場合,試料表面より金属イオン(Fe,Ni,Mo)の溶出が増加することが明らかとなった.このことは,Mφの貧食反応が生体材料の金属溶出に多大な影響を及ぼすことを示すものである.(4)生体内に金属材料がインプラントされた場合,その表面に形成された腐食生成物や摩耗紛を貧食することによりMφが活性化し,その影響によりインプラント材の腐食が加速されるとする,金属系生体材料のin vivo腐食モデルを提案した.生体硬組織の代価や捕綴を目的として使用される金属系生体材料は,in vitroでは高い耐食性を有するが,in vivoでは比較的容易に腐食が生じ,その安全性が問題視されている.本研究では,生体内のin vivoにおける腐食メカニズムを解明することを目的として行われたものである.生体内における腐食挙動を模擬するため,U937細胞を分化することにより得たマクロファージを培養し,これを含む培養液中においてステンレス鋼の腐食試験を行っている.また,培養液中における腐食反応速度は交流インピーダンス法により測定し,浸漬時間の経過にともなう腐食速度の変化を調べた.その結果以下の事柄があきらかになった.(1)マクロファージを含む培養液中に浸漬した試料は,試料表面には極微細な凹凸が多数形成され,時間経過とともに粗さと腐食反応速度が増加することが明らかとなった.このことは,マクロファージの存在が生体材料の腐食に大きな影響を及ぼすことを示すものである.(2)ポリエチレン粒子を貪食させることにより,免疫反応を活性化させたマクロファージを含む培養液中の試料の場合,その表面粗さ,腐食反応速度ともにそれを貪食していない場合と比較して大となることが明らかとなった.このことは,マクロファージの活性化が金属材料の腐食を促進させることを示唆するものである.(3)マクロファージおよび活性化したマクロファージを含む培養液の場合,試料表面より金属イオン(Fe,Ni,,Mo)の溶出が増加することが明らかとなった.このことは,マクロファージの貪食反応が生体材料の金属溶出に多大な影響を及ぼすことを示すものであり,(1),(2)で述べた腐食反応速度の変化と定性的には一致している.これらの研究結果を基礎として,生体材料のin vivo腐食モデルを提案し,それにより一連の実験結果が矛盾なく説明できることを示した.本年度は,生体内のin vivoにおける腐食メカニズムを解明することを目的として研究を行った.生体内における腐食挙動を模擬するため,U937細胞から分化させたマクロファージ(Mφ)を培養し,これを含む培養液中においてステンレス鋼の腐食試験を行った.培養液中における腐食反応速度は交流インピーダンス法により測定し,浸漬時間の経過にともなう腐食速度の変化を調べた.また,異物を貧食したMφ活性化の影響を調べるため,ポリエチレン粒子を貧食したMφを培養し,同様な腐食試験を行った.さらに,試験後の試料表面を走査型電子顕微鏡,原子間力顕微鏡および走査型電子顕微鏡により詳細に分析し,その腐食挙動について検討・考察を加えた.得られた結論を以下に示す.(1)Mφを含む培養液中に浸漬した試料は,試料表面には極微細な凹凸が多数形成され,時間経過とともに粗さと腐食反応速度が増加することが明らかとなった.このことは,Mφの存在が生体材料の腐食に大きな影響を及ぼすことを示すものである.(2)ポリエチレン粒子を貧食させることにより,免疫反応を活性化させたMφを含む培養液中の試料の場合,その表面粗さ,腐食反応速度ともにそれを貧食していない場合と比較して大となることが明らかとなった.このことは,Mφの活性化が金属材料の腐食を促進させることを示すものである.(3)Mφおよび活性化したMφを含む培養液の場合,試料表面より金属イオン(Fe,Ni,Mo)の溶出が増加することが明らかとなった.このことは,Mφの貧食反応が生体材料の金属溶出に多大な影響を及ぼすことを示すものである.

(4)生体内に金属材料がインプラントされた場合,その表面に形成された腐食生成物や摩耗紛を貧食することによりMφが活性化し,その影響によりインプラント材の腐食が加速されるとする,金属系生体材料のin vivo腐食モデルを提案した.
ESD推進のための効果的な地域ネットワーク構築要件の研究

2005年に世界で初めて認定された仙台広域圏と岡山のESD地域拠点(RCEs)について現地ヒアリング調査を行うとともに、RCE北九州等の文献調査等を行った。また、その後に設けられたESDコンソーシアムやESD推進ネットワーク等について分析し、RCEがこれまで果たしてきた役割を明らかにするとともに、その役割の変化について考察した。ヒアリング結果から、それらの仕組みの整備に至る基盤としてのRCEの役割を明らかにするとともに、RCEが今後果たすべき役割として、世界のRCEとの経験の交流のような、他のESD推進の仕組みが持たない機能を重視するよう見直しを行う必要性が提案された。平成27年度においては、仙台広域圏地域、岡山地域についてヒアリング調査を行い、詳細な分析を行うとともに、平成26年度に新たにコンソーシアムを立ち上げた北陸地域、三重地域、奈良地域、大牟田地域について調査を行い、それらの設立の背景、推進主体、主な活動に関する比較分析を行った。それらの検討を行うため、専門家からなる委員会を立ち上げ、2回の会合を開催した。仙台広域圏地域では、平成17年のRCE(国連大学が認定するESD地域拠点)設立時には、仙台市、気仙沼市、大崎地区が中心であったが、その後、宮城県内他地区、一部他県へと活動が拡がった。さらに、平成26年度には、東北全体を対象とするようになり、いくつかの中核的な拠点の活動を推進する拠点方式を進めるようになった。仙台広域圏の特徴は、中核的ESD推進主体が様々である点である。宮城教育大学が全体の推進役になりつつも、仙台市環境局(仙台市)、気仙沼市教育委員会(気仙沼市)等、それぞれの地域の特性に応じた中核的主体が形成されている。岡山地域は、平成15年頃から岡山ユネスコ協会、岡山市が中心になってESDに取り組み、平成17年にRCEに認定された。RCE認定当初は、岡山市の環境部局が中心になって取り組んでいたが、岡山大学環境学研究科、教育学研究科が順次、積極的に活動するようになった。また、岡山市教育委員会も徐々にESD活動への関与を深めていった。RCE立ち上げに伴い、岡山市は、ESD推進連絡協議会を発足させ、広範なマルチステークホルダーの参加を呼び掛けた。岡山の際立った特徴の一つが公民館によるESD推進であり、世界的な影響を及ぼした。これらの地域と北陸地域、三重地域、奈良地域、大牟田地域との比較分析からESD地域拠点形成にかかわるいくつかの特徴が明らかになった。現在までのところ、特に大きな障害は生じていない。我が国で最初に2005年にESD推進のための地域拠点(RCE)になったRCE仙台広域圏とRCE岡山を対象に、ヒアリングを中心に、その設立以来の10数年における中核的ESD推進主体の役割の変化を分析した。RCE仙台広域圏では、当初は仙台市がRCEの中核を担うことが想定されたが、行政区域の制約が勘案された結果、宮城教育大学がRCEの中核を担うように変更された。宮城教育大学は、気仙沼島の宮県内の遠隔地の学校、教育委員会に対するESD支援を推進した。RCE仙台広域圏は、当初仙台市、気仙沼市、大崎・田尻地区の3地区の連合体として構成され、後日徐々に対象地域を拡大していった。RCE仙台広域圏、その3つの中核的地区は、それぞれESD推進協議会を立ち上げ、RCE等のガバナンスをそれら協議会に委ねている点が特徴的である。RCE仙台広域圏は、約10年余にわたり、地域のESD推進に大きな役割を果たしたが、文科省主導による東北コンソーシアムを2016年に立ち上げたことから、東北全域におけるESD推進の仕組みと一部として機能するように変質した。RCE岡山は、もともと岡山市長のイニシアチブで始められたRCEであり、岡山市環境部局がその推進責任を担った。こちらも協議会を立ち上げているが、大きな特徴は、岡山市内で活動する団体を協議会のメンバーとしている点である。行政が中核的な主体になったRCEとして、RCE仙台広域圏と好対照をなしている。RCE岡山がRCE仙台広域圏と大きく異なる特徴は、京山地区という中学校区(公民館区)での活動から進めたことに起因し、公民館がESD推進に大きな役割を果たしたことである。ESD活動の周辺市町村への波及効果は限定的であり、また、公民館を中心とするESDが大規模に展開したのに対し、学校でのESDは、ユネスコスクール世界会議を誘致する10年後までそれほど活発ではなかった。RCE仙台広域圏、RCE岡山の詳細な分析に時間をかけたため、他の新しい地域の分析が文献検索等限定的にしか行われておらず、ヒアリング等の調査が行われていない。持続可能な開発のための教育(ESD)推進のための効果的な地域ネットワーク形成のための要件を明らかにするため、2005年に世界で初めて認定された仙台広域圏と岡山のESD地域拠点(Regional Centres of Expertise: RCEs)について現地ヒアリング調査を行うとともに、RCE北九州等の文献調査等を行った。また、その後に設けられた文部科学省ESDコンソーシアムや環境省、文科省が主導して設けられたESD推進ネットワーク等について分析し、RCEがこれまで果たしてきた役割を明らかにするとともに、その役割の変化について考察した。RCEは、国連大学が提唱し、2005年6月に世界で初めて認定された地域におけるESD推進のための仕組みであり、大学や学校、地方自治体、企業、市民団体等のESDに関わる地域のステークホルダーが知識や情報・経験を交流するための場を形成することを目的としている。

このような仕組みは、2005年時点では世界的にも存在しなかったため、ESD推進のための革新的な仕組みとして世界的に普及が進んだ。日本では、その後2008年にユネスコスクール制度、ユネスコスクールを支援するためのユネスコスクール支援大学間ネットワーク制度が設立され、また、2014年からは地域におけるESDを推進するためのESDコンソーシアム制度が、2016年度からはESD活動支援センター、地域ESD推進拠点等からなるESD推進ネットワーク制度が導入された。そのため、当初ESD推進に大きな役割を果たしたRCEの意義が薄れていった。ヒアリング結果からは、それらの仕組みの整備に至る基盤としてのRCEの役割を明らかにするとともに、RCEが今後果たすべき役割として、160に及ぶ世界のRCEとの経験の交流のような、他のESD推進の仕組みが持たない機能を重視するよう見直しを行う必要性が提案された。2005年に世界で初めて認定された仙台広域圏と岡山のESD地域拠点(RCEs)について現地ヒアリング調査を行うとともに、RCE北九州等の文献調査等を行った。また、その後に設けられたESDコンソーシアムやESD推進ネットワーク等について分析し、RCEがこれまで果たしてきた役割を明らかにするとともに、その役割の変化について考察した。ヒアリング結果から、それらの仕組みの整備に至る基盤としてのRCEの役割を明らかにするとともに、RCEが今後果たすべき役割として、世界のRCEとの経験の交流のような、他のESD推進の仕組みが持たない機能を重視するよう見直しを行う必要性が提案された。平成28年度においては、平成27年度に新たにコンソーシアムとなった千葉地域、福島地域、中部地域、岡山地域、新居浜地域を中心に調査を行う。これらの地域の中には、千葉地域や福島地域のように、これまでのRCEやコンソーシアムとはタイプが異なる地域がある一方、新居浜地域のように大牟田地域と同様に市の教育委員会が中核となっている地域、岡山地域のようにこれまでの活動の延長線上で新たに岡山市教育委員会が中心となった活動を展開しようとしている地域があり、平成27年度調査地域との比較分析には大きな意義がある。平成28年度に新たにコンソーシアムとなった地域の中には、RCEで実績を積んだ横浜地域がある一方、静岡地域や広島地域のように、ユネスコスクール支援大学が中心になって活動を展開しようとする地域が含まれる。それらの地域拠点が、ユネスコスクールを中心とした活動になるのか、より広範なステークホルダーを巻き込んだものになるのかは、今後の地域拠点の整備に影響する大きなポイントになると考えられる。最終年度である平成29年度には、研究に費やすエフォートを増やすこととし、年度の早い時期に前年度に予定していた出張を行うことによりこれまでに生じていた若干の遅れを取り戻し、速やかにとりまとめ作業に着手する。環境政策、ESD仙台広域圏地域の調査に際し、東北コンソーシアムの総会、気仙沼ESD・RCE推進協議会に別途の経費で出席する機会があり、その期間中に調査を行うことができた。同様に、奈良地域、大牟田地域についても別途の経費を調査に活用することができた。そのため、旅費の節約が可能になった。職場が変わり年度末にかけて多忙であったため、当初予定していたヒアリングのための出張が予定通り実施できなかったため。
統計教育用デジタル教科書の研究

電子書籍の一つの分野としての「電子教科書」がある。通常の紙の書籍としての教科書と電子教科書との間にどんな差異があるのか、大学の初年度対象の「統計学入門」を例として電子教科書を試作した。教科書の場合、通常のテキスト中心の文学書等とは異なり、図表・数式が多いのが特徴であり、その再現性は電子書籍を読む(表示する)ためのビュアソフトによって異なることがわかった。現時点でのビュアソフトの問題点を避ける方法とともに、将来の望ましいスタイルについての提案を行った。平成24年度は電子書籍ビュアのハードとして、楽天のkobo、アマゾンのKidleFireが発表、発売され、また電子書籍ビュアとしても使えるタブレット端末として、GoogleのNexus7やAppleのiPad mini等も発表され、電子教科書・電子書籍を使える環境が整ってきた。さらに電子書籍の販売サイトも次々オープンとなり、文字を中心とする小説等の本や、画像を中心とするコミック本等を中心に普及し始めている。販売サイトにより使用できる電子書籍フォーマット等は微妙に異なるが、ePub3で作成しておけば、変換か、簡単な修正でどのサイトでも取り扱えるようになっている。残念ながらePub3の規格で作成しても数式を表すMathMLのように、規格をフルにサポートしているビュアソフトは少ない状況であり、多くの機器・ソフトで読んでもらうためには、数式をMathMLで書くことをあきらめ、画像として貼り付けように、妥協しなければならない所もあった。1年目(平成23年度)に立てた開発方針に従い、ePub3フォーマットを基本とし、数式は画像で大学初年次教育程度の「統計学入門」の電子教科書の試作を行い、次のサイトでURLを知っている関係者に公開している。https://www.box.com/s/c75923b9a448b3a30fdfこれらの開発方針、試作版の紹介は国内の関係する学会等で3回発表するとともに、計算機統計関連の大きな国際集会であるCOMPSTAT(キプロス)でも発表し、国内外の関係者と意見交換を行った。さらに次年度のために、動的表示のためHTML5、JavaScriptの各機器・各ビュアソフトでのサポート状況を調べた。この機能を利用することにより、演習問題のリアルタイム添削が可能となり、自習モードでの利便性が高まると期待される。理工系の教科書を電子書籍化する場合の問題点を探るために、統計学入門用電子教科書の試作を行った。電子書籍のフォーマットとしてはEPUB3が標準的なフォーマットとして使用されることが多い。文字(文章)中心の小説・論評類では文字の拡大・縮小や文書の読み上げや、日本語の縦書き、ルビにも対応しており、広く利用されている。理工系の書籍としては数式、図表が多いという特徴があるが、EPUB3の仕様では対応していることになっているものの、それらの機能をフルにサポートしているビュア機器、ビュアソフトが少なく、現時点で多くの機器での利用を考えると対策が必要になることが多い。平成25年度は電子教科書の標準的なフォーマットであるEPUB3を利用した場合の問題点の一つである頁建てがビュア機器、選択した表示文字の大きさによりダイナミックに変化する「リフロー」について解決策を探った。リフローは見やすい文字の大きさで教科書を表示することができる長所とともに、文字の大きさと図表の大きさの関係や、使用するビュア機器によって表示される頁が変わり、教室での授業時に生徒・学生に該当する頁番号を指示できないというデメリットがあげられる。これについては現在、弱視者用に準備されている拡大教科書のように、標準的なビュア機器、文字サイズで標準的な頁建てをベースに指示することで解決を図る(ビュアソフトに機能追加)ことが可能となることがわかった。電子書籍のフォーマットとしては、平成23年11月に規格化された「ePub3」を使うことにし、その規格化を睨みながら研究を始めた。ePub3は日本語対応の縦書き、ルビ等が注目されているが、理工系の書籍としてはそれらの機能の必要性は薄く、それよりも音声、ビデオ等のマルチメディア機能が追加されたことが注目に値する。「統計学入門」の講義の資料(パワーポイント、演習問題)、講義の音声ファイルの整理・編集を行い、電子教科書化を目指している。一般に電子書籍としてはPDFファイルに代表されるような「紙の本」を単純に電子化したものもあるが、それでは不十分であり、音声、ビデオ等の「マルチメディア教材」を含んだ「教科書」となって初めて「電子教科書」という名に値する。音声、映像を含んだマルチメディア教材の場合、紙ベースの教科書と異なり、音声・映像の流れる時間に従って学習する必要があり、長い時間、学習者を拘束することは難しい。このため、90分の授業を5分から10分程度のトピックに分割して1つの教材とする必要があり、試作を始めている。統計学の教科書として必要となる「数式」についてはePubがサポートしている「MathML」で記述することにしていたが、調査の結果、実際にMathMLで書いた数式が表示できるビュア(読書装置、ソフト)が殆どないことが分かった。

このため、過渡的な措置として、数式を画像として教科書に埋め込む必要があることも分かった。これらの開発方針は平成24年3月に行われた「第8回統計教育の方法論ワークショップ」で発表し、国内の統計関係者と意見交換を行った。統計学入門の電子教科書の試作を行い、次のサイトでURLを知っている関係者に公開している。統計学入門全15回の講義用パワーポイント、および対応する講義時の音声録音は完成しており、以前の特定研究で作成したシミュレーション教材、アニメーション教材もあり、個々の教材バンクは準備できている。数式の取り扱いの決定が遅れていたが、とりあえず画像として埋め込む方針を決め、MathMLが代表的なビュア機器(ソフト)で扱えるようになったときには、早急に画像からMathMLへ復帰することにした。平成25年度は次の2つを行う。1.ePub版統計学入門の演習問題、練習問題の正解・不正解がリアルタイムにわかる機能を付加する。2.昨年度講義音声の収録を行った「Rを利用した多変量分析」をベースにePub化して電子教科書として提供する。さらに全体的な利用説明書、電子書籍化の手順等をまとめた手引書を完成する。平成24年度は講義の再録音とともに、23年度に試作した部分のチェック・評価を行い、改良を行うとともに、1コマ90分の講義を510分程度のトピックに分割して、トピックを選択して利用できるように改良を進める。これと並行して、統計学入門以外の講義、特にRを利用した多変量分析の収録、教材化を図ることにしている。8月に香港で開催される国際統計学会ISI、および関連するワークショップ、さらに国内の各種学会での成果発表のための旅費・参加費とともに、Microsoft WindowsタブレットSurfaceでの動作確認のための費用が必要となる。さらに研究の最終年度として、これまでの成果や、利用説明書、電子書籍化の手順をまとめた報告書を作成する。電子教科書(書籍)ビュアとして世界的に普及しているものにアップル社の「iPad」とアマゾン社の「Kindle」があり、これらの機種で開発した電子教科書が使えるか否かをチェックすることは必須である。iPadの新型機種の発売が平成24年3月となり、平成23年度中の会計処理が難しくなったこと、およびKindleの国内発表が次年度になったことにより、一部研究費を次年度に送ることにした。繰り越した研究費は次年度、この2つのビュアの購入費に充てる計画である。
ヒト臍帯血幹細胞の機能解析と脳性麻痺治療への臨床応用

小児脳性麻痺児を対象とした自己臍帯血幹細胞輸血治療の治療メカニズムの解明を目的として、臍帯血中の幹細胞集団の同定とその出現率を解析し、治療効果の高い細胞集団の特定を行った。結果、臍帯血には未分化マーカー(Oct3/4, Nanog, Sox2, Tra-1-60, SSEA4など)を発現する特有の幹細胞が存在することが明らかとなった。また、未分化性維持培養を行うことで、未分化マーカー遺伝子の発現上昇を促し、造血幹細胞のみならず、臍帯血特有の幹細胞数を増加させることが可能となった。小児脳性麻痺は一旦発症すると、生涯にわたり身体・精神の機能およびQOL(生活の質)を著しく損なう疾患である。しかし、脳症に対する根本的な療法はなく、リハビリテーション等の対症療法を行っているのが現状である。現在、我々は、小児脳性麻痺の発生確率が高い在胎週数33週未満児を対象に、自己臍帯血幹細胞輸血による臨床研究を進めているが、このような早産児から採取された臍帯血については、治療効果の高い幹細胞の含有数や機能など明らかにされていない。25年度は、治療効果の高いと考えられる幹細胞の未分化性を維持したまま増殖させる新たな培養方法の検討を行った。これまでに報告されてきた培養方法に倣い、臍帯血幹細胞の培養を行った。結果、幹細胞の増殖は認められず、従来の方法では臍帯血幹細胞の培養を行うことはできなかった。そこで、ヒトES細胞などの多能性幹細胞で用いられているフィーダーフリー培養方法に倣い、臍帯血幹細胞の培養を行った。結果、多数の細胞塊の出現が認められた。また、この細胞塊を未分化細胞マーカー抗体(SSEA-4)で染色した結果、陽性であることが明らかとなった。さらに、qPCRを用いて未分化遺伝子マーカー発現解析を行った結果、Sox2の高い発現が認められた。フィーダーフリー培養法を用いることで、未分化性を維持したまま臍帯血幹細胞の培養を行うことが可能となった。更に、フィーダーフリー培養による細胞癌化への影響を明らかにするため、qPCRを用いてガン遺伝子発現解析を行った。結果、培養後の臍帯血幹細胞について、ガン遺伝子発現の誘導は認められなかった。フィーダーフリー培養によって得られた臍帯血幹細胞は、癌化する可能性は低く、極めて安全性の高い細胞材料であることが示唆された。小児脳性麻痺は一旦発症すると,生涯にわたり身体・精神の機能およびQOL(生活の質)を著しく損なう難治性の疾患である。しかし、脳症に対する根本的な療法はなく,リハビリテーション等の対症療法を行っているのが現状である。現在、高知大学では、小児脳性麻痺の発生確率が高い在胎週数33週未満児を対象に、自己臍帯血幹細胞輸血による臨床研究が進められているが、このような早産児から採取された臍帯血については、治癒効果の高い幹細胞の含有数や機能など明らかにされていない。そこで今年度は、高知大学医学部附属病院で分娩時に採取された在胎週数の異なる臍帯血を用いて、細胞表面マーカー解析、遺伝子マーカー発現解析、増殖能試験を行った。また、臍帯血幹細胞数の変動について、出生体重や在胎週数等との相関分析を行った。細胞表面マーカー解析の結果、臍帯血には、CD34陽性細胞および、CD34/CD45陰性細胞集団が多く含まれていた。CD34/CD45陰性細胞集団の出現率は、出生体重と相関性があり、胎児の発育度合いに関連する可能性が示唆された。一方、CD34陽性細胞数は出生体重とは相関性がなかった。CD34陽性細胞数については、胎児の発育度合だけでなく、母体からの外的要因など、他の因子によってその数が変化するものと考えられた。増殖能試験では、造血コロニー形成はCD34陽性細胞数と相関がみられたが、CD34/CD45陰性細胞集団とは相関はみられなかった。さらに、遺伝子マーカー発現解析では、Oct3/4の発現が認められ、臍帯血細胞特有の多能性幹細胞が存在する可能性が示唆された。今後は、より詳細に臍帯血幹細胞の同定を行い、その数や出現率についてデータベース化することで、自己臍帯血幹細胞輸血治療の有効性や安全性を明らかにしていく必要がある。

現在、高知大学では、小児脳性麻痺の発生確率が高い在胎週数33週未満児を対象に、自己臍帯血幹細胞輸血による臨床研究が進められているが、その治療メカニズムについては明らかにされていない。26年度は、基礎研究として、フィーダーフリー培養法で得られた幹細胞の特性解析をFlow cytometryを用いて行った。臍帯血中に多く含まれることが知られている造血幹細胞(CD34陽性/CD45弱陽性)については、培養前は212±30.2細胞であったのに対し、培養後は3,579±802.4細胞(p<0.01)に増加していた。また、より未分化性の高い細胞群が含まれる幹細胞集団(CD45陰性/Lineage陰性)の含有率については、培養前は1.89±0.37%であったのに対し、培養後は11.04±3.82%(p<0.05)に増加していた。さらに、幹細胞集団中の間葉系幹細胞マーカー(CD44、CD73、CD90、CD105)や、未分化細胞マーカー(Tra-1-60、Tra-1-81)の発現について解析したところ、培養後、有意に上昇していることが明らかとなった。以上の結果より、在胎週数33週未満児など臍帯血量が少ない場合であっても、フィーダーフリー培養によって、未分化性の高い有用な幹細胞群を増殖させることで、より効果的な臍帯血幹細胞治療へ発展させることが可能と考えられる。臨床研究としては、脳性麻痺の発症が疑われる子からの自己臍帯血細胞の採取については順調に行われたが、現在のところ細胞治療には至っていない。生殖医学平成24年度と25年度の2年間で臍帯血幹細胞に関する基礎的研究の実施を計画した。24年度に明らかにした臍帯血幹細胞について、25年度は、未分化維持培養を行うことに成功し、再生医療にも応用可能な安全性の高い培養法であることを示すことができた。平成24年度と25年度の2年間で臍帯血幹細胞に関する基礎的研究の実施を計画している。2年間で、臍帯血に含まれる治癒効果の高い幹細胞集団の選定を行った上で、種々の臍帯血幹細胞の含有数および細胞機能について解析を行う予定である。本年度は、臍帯血に含まれる幹細胞集団(CD34/CD45陰性細胞集団)の選定を行うことができた。また、当初の予定を上回る、年間60検体以上の臍帯血の分析を行うことができたので、統計学上、信頼性の高い結果を得ることができた。さらに、臍帯血特有の幹細胞の同定に向けて、質量分析法を用いた臍帯血幹細胞特異的分子の網羅的解析に着手しており、研究は順調に進展している。25年度年度にできなかった、単一の臍帯血特有の幹細胞の単離およびクローン化を目指す。さらに、未分化維持培養の結果得られた幹細胞の機能解析として、試験管内での分化能評価を行う。臨床権研究としては、現在、高知大学医学部において、脳性麻痺の発症が疑われる子からは自己臍帯血幹細胞の採取が行われている。実際に脳性麻痺を発症した子に対し自己臍帯血幹細胞による細胞治療が実施された場合においては、包括的評価を行っていく予定である。今後は、複数の細胞が含まれるCD34/CD45陰性細胞集団の中から、単一の臍帯血特有の幹細胞の単離およびクローン化を目指す。また、既存の種々の幹細胞(造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞など)についても、在胎週数の違いによってその数や出現率に変動がみられるのか、また、その要因はなんであるのかについて解析を進めていく。さらに、幹細胞の機能解析として、試験管内での分化能評価(血液細胞、神経細胞、グリア細胞、軟骨細胞など)を行う。脳性麻痺児を対象とした臨床試験に向けて、前臨床試験として、低酸素性虚血性脳症モデルマウスを用いた臍帯血幹細胞の神経再生能の解析についても着手する。該当なし
音環境評価システムの構築

現実の音環境では多くの音が混在するがその全ての音が知覚されるわけでなく,ある特定の音が背景から抜け出して知覚される。そのためにはその音が他の音とは異なる軌跡を描いてより顕著な存在になる必要がある。この法則の追求を目指したものとしてBregmanの聴覚的情景分析に関する一連の研究があるが,音の軌跡を測定する方法論を確立していない。本研究では音の流れをトラック・ボールを操作することによって追跡しその結果をコンピュータに取り込むことによって音の流れを測定する連続線分記録法を考案し,種々の音源について実験を行った。まず種々のパターンを人工的に発生させ,その内の特定パターンを時間軸に沿って追跡する作業が被験者に求め,この手法が種々の音が混在する条件下で特定パターンの軌跡を測定する適当な方法であることを確認した。さらに種々の音の軌跡の高さが類似している場合(近接の要因),音色が類似している場合(類同の要因),動く方向が類似している場合(共通運命の法則)など,いわゆるゲシュタルトの法則によって特定の音の軌跡が他の音の軌跡から図として分離する現象が明らかになった。次に,現実の環境における種々の音源をダミ-ヘッドを用いて録音し,この音源について同じ手法により音の軌跡が図として浮き立つ要因について検討を続けている。実験は目下続行中であるが,上述の要因以外に空間的要因すなわち音源の空間的分離が音源の変化に追随する上で大きな手掛かりを与えることが明らかになった。目下この要因の定量化についても検討を続けている。
20世紀初頭の中国における軍制の変遷と政治統合

20世紀初頭の中国政治史を、軍事をめぐる制度と観念に着目しながら、また長い歴史の文脈の中で、再検討することをめざした。具体的には、辛亥革命前後の軍隊をめぐる制度と観念について、基礎史料を収集して分析する作業を進めた。東京において入手できる史料をしっかり把握するとともに、台湾において関係史料の調査を進めた。発表に至った論考としては「危機のなかの清朝」において、19世紀後半の清朝が如何なる軍事的なインパクトを受け、どのような改革を迫られていたのかについて論じた。そのなかで、曽国藩の軍事思想に注目した。曽国藩は、李鴻章との議論の中で、兵器の改良よりもまず、理念によって統率された軍隊の創出をめざしていた。これは必ずしも保守的な精神論ではなく、20世紀初頭の軍制改革において参照されるような近代軍の精神的基盤を模索したものと理解されうることを指摘した。軍事史においては、とかく技術の近代化ばかりに注目することが多いが、蔡鍔といった20世紀初頭の軍人は、曽国藩の精神論の中に近代軍の特質を見出していたのであった。また、やはり公刊に至った「近代世界のなかの日本と清朝」では、清朝の歴史的性格を長い射程のなかに位置づけ、両者の統治構造や政治意識について整理した。そのうえで、19世紀末における日本の軍事的擡頭が清朝に何をもたらしたのか、その模倣と反撥の作用の一環として軍事の分野も重要な役割を果たしていたことを考慮しながら、考察を進めることができた。初年度には校務繁多のため、研究の進行にやや遅れが生じた。第二年目は、所定の計画を進めるべく研究に傾注することができ、史料収集とその分析を進めると同時に論文作成を進めてきて一定の成果を得ることができた。とはいえ、依然として初年度の遅れを完全に取り戻すに至っていない。研究費について、次年度使用額が発生したのは、そのためである。最終年度にあたる今年度は、ひきつづき研究に傾注し、また予定された英国における史料調査も進めたい。その分析を経て、論文執筆に邁進していく。20世紀初頭の中国政治史を、軍事をめぐる制度と観念に着目しながら再検討することをめざした。主に、東京において入手できる史料をしっかり把握することに注力した。その成果の一部は、日本西洋史学会において「辛亥革命にみる軍人の忠誠と反逆」として発表を行った。この報告は、軍人による革命や蜂起という現象を忠誠心との関係から考察したものであり、また当該時期の中国の軍事を国際的な文脈の中で理解していくことをめざした。新軍の蜂起は、指揮系統に忠実であるべき軍隊が、清朝を裏切ったということを意味している。少なくとも清朝政権から見て裏切りと理解するのは、ごく自然なことであろう。とくに問題となるのは、清朝は彼らの忠誠心を確保するためにどのような措置をとりえたのかという点である。そこで、軍紀を維持するための措置や、功績に対する報奨などの制度の整備について考察し、「忠誠と反逆」の問題の実態に迫ろうとした。また、中華民国の初期大総統の就任儀礼に関する論考を発表することができた。これによれば、孫文が臨時大総統に就任した式典は、軍事的な色彩が強かった。孫文は軍服のように仕立てられたカーキ色のスーツを着て式典に臨んでおり、式次第においても軍人が不可欠の役割を果たしていた。また袁世凱の正式大総統就任式典には閲兵式が付随しており、軍を統率する者としての立場を明確にする意味も込められていたのである。現在までに、史料収集とその分析を進めると同時に学会報告や論文発表を進めてきており、一定の成果を得ることができた。とはいえ、校務の繁忙や家族の事情などにより、予定したほどに研究を進めることができなかったと考えざるを得ない。次年度使用額が発生したのは、そのためである。

そのうえで、19世紀末における日本の軍事的擡頭が清朝に何をもたらしたのか、その模倣と反撥の作用の一環として軍事の分野も重要な役割を果たしていたことを考慮しながら、考察を進めることができた。初年度には校務繁多のため、研究の進行にやや遅れが生じた。第二年目は、所定の計画を進めるべく研究に傾注することができ、史料収集とその分析を進めると同時に論文作成を進めてきて一定の成果を得ることができた。とはいえ、依然として初年度の遅れを完全に取り戻すに至っていない。研究費について、次年度使用額が発生したのは、そのためである。今年度は、勤務先より特別研究期間を認められており、本研究に専念できる予定である。予定していた英国・米国における史料調査を進め、その分析を経て、論文執筆に邁進していく。最終年度にあたる今年度は、ひきつづき研究に傾注し、また予定された英国における史料調査も進めたい。その分析を経て、論文執筆に邁進していく。(理由)校務の繁忙などのため、予定された海外史料調査ができなかったため、次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度は、本務校より特別研究期間を承認されたので、本研究に専念できる。前年に行うはずであった海外出張を実施するつもりである。(理由)初年度の校務の繁忙などのため、計画の実施に遅れが生じ、二年目ではだいぶ予定に追いついたが、まだ完全に追いつけていないので、次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度は、最終年度であるから本研究に注力し、所定の計画の達成をめざすつもりである。
網膜錐体サイクリックGMP依存性(CNG)チャネルの機能的解析

網膜錐体のイオンチャネルの異常は杆体一色覚(生まれつき錐体が働いていない)に関係する。同チャネルの既報告の68種のミスセンス変異(アミノ酸が変わる変異)を機能的に調べたところ、16種は膜電流が記録できたが他は記録できなかった。後者の中には低温処理などにより電流を記録できるようになったものがあり、これらについては変異チャネルを膜発現へと向かわせる方法をさらに工夫し杆体一色覚の治療に結びつけたい。1.GFPとの融合タンパク質の解析CNGA3サブユニットによるcGMP依存性の膜電流は、今までco-transfectionしたGFPベクターによって蛍光を発する細胞について調べてきた。しかし野生型CNGA3においても光ってはいるが膜電流を記録できない細胞が数十%あり、効率の悪さが問題であった。そこで、野生型CNGA3のcDNAをGFPベクターにクローニングし、CNGA3-GFP融合タンパク質が機能するかどうか調べた。その結果、光っている細胞は100%膜電流を記録できることが判明した。cGMPに対するK_<1/2>はGFPがないものと同等であり、チャネルの機能はC端に存在するGFPの影響を受けないと考えられた。光っている細胞は必ずCNGA3を発現しているわけであり、発現はあるが機能していない変異型CNGA3の解析が容易になった。2.タンデムに繋いだCNGAの解析錐体CNGチャネルは2個ずつのCNGA3サブユニットとCNGB3サブユニットから成るが、CNGA3サブユニットだけでもチャネルはできあがる。前項1.の結果を受け、野生型CNGA3-野生型CNGA3-GFPの融合タンパク質がチャネル機能を発揮できるか調べたところ、cGMPによって活性化される膜電流が記録できた。杆体一色型色覚の保因者においては、野生型CNGA3と変異型CNGA3の両サブユニットを含むチャネルが発現しているものと考えられるが、タンデムに繋いだCNGA3の片方を変異型とした場合のチャネルの性質を解析する系ができた。3.ループへのタグの挿入CNGA3サブユニットの細胞膜発現の検討のため、野生型CNGA3のループ1/2、ループ3/4、ループ5/6(=ポア領域)などの細胞外領域にFLAGタグ、mycタグ、Hisタグを導入したが、タンパク質発現はみられる(GFPタグを付けているので蛍光でわかる)もののチャネル機能は検出されなかった。そこで、CNGA3のN端に別のタンパク質の細胞外領域+膜貫通ドメインを導入し、7回膜貫通型チャネルとして調べたところ電流が記録できた。細胞外領域に対する抗体を用いて膜発現を検討する系ができた。本研究は、網膜錐体cGMP依存性カチオンチャネル(=CNGチャネル)の構造-機能相関を明らかにすることと、細胞膜での発現誘導を試みることにより、同種の遺伝性疾患(CNGチャネルの場合は杆体1色覚)の治療法を探ることを目的としている。今年度の研究実施計画にそって成果を以下に記す。(1)CNGαサブユニットの膜発現の検討-1:細胞外領域にHAタグとID4タグを導入したが、前者はタンパク質発現はみられるもののチャネル機能が検出されず、また後者は導入自体ができず、いずれも所期の目的を果たせなかった。(2)CNGαサブユニットの膜発現の検討-2:昨年度に、CNGαサブユニットのN端にロドプシンの膜貫通ドメインを導入して7回膜貫通型としたチャネルが機能することをパッチクランプ法で確認していた。今年度はこれを受け、細胞膜での発現を抗ロドプシン抗体で検出する試みを行ったが、うまく検出できなかった。(3)ミスセンス変異を持ったCNGαサブユニットの細胞膜発現の検討:前回の報告時(Muraki-Odaら、BBRC(2007))から後に、αサブユニット(CNGA3)で19種のミスセンス変異が報告された。これらをそれぞれ野生型cDNAへ導入しパッチクランプ法を適用した。cGMPによって活性化される膜電流が記録できる変異(P95L、G228K、T245M、A469T、V540I、R563C、G590K、A619V、L633P)と、記録できない変異(F249S、D252N、Y263D、V266M、R274S、G397V、S401P、L433W、R439W、G548R)とに分類することができた。(4)細胞膜発現誘導の検討:transientな発現-パッチクランプの系では結果を定量的に示すことが難しいことが分かったため、stableな発現-カルシウムセンサーの系を構築中である。1.エピゾーム型ベクターpEBMulti-Neoに、mycタグがついたCNGA3及びFLAGタグがついたCNGB3のcDNAをクローニングし、HEK293細胞にトランスフェクションした。G418で選択した細胞についてウェスタンを行い、いずれもcDNAの産物を発現していることを確認した。CNGA

3発現細胞に関してはパッチクランプ法において、cGMP感受性の膜電流が記録できた。CNGB3発現細胞に関しては、GFPタグのついたCNGA3のcDNAをトランスフェクションし、cGMPに対する感受性がやや低下した膜電流を記録できた。2.CNGA3では新たに10種のミスセンス変異が見いだされ、知られていた変異と合わせると68種となった。これらの10種の変異をcDNAに導入し、GFPベクターにクローニング、HEK293細胞にトランスフェクションし、パッチクランプ法によりcGMP依存性の膜電流の有無を調べた。その結果、N276S、G329C、Y357C、L363P、G367V、E376K、D514V、L527M、L527R、S570IのいずれにおいてもcGMP依存性の膜電流は記録されなかった。低温培養(28°Cでの培養)や、培地へのタウロウルソデオキシコール酸ナトリウム(1mM)や4-フェニル酪酸(1mM)の添加を行っても膜電流を記録することはできなかった。3.SulfoLinkMIS-LC-biotinによる細胞膜発現タンパク質の標識は以前に行ったがうまく標識できていなかった。すなわち、抗GFP抗体によるプルダウン→SDS-PAGE→ブロッティング→アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンによる発色、を行ったがタンパク質の泳動レーン全体が染まっていた。今回、標識温度と細胞の洗いを工夫しCNGA3-GFP融合タンパク質のバンドを検出できるようになった。
大震災を契機とした地域・学校の復興・再生と人口減少社会への対応に関する研究

2017年7月に短期集中型の大雨による水害に見舞われた福岡県朝倉市・東峰村を訪問し、元東峰村立東峰学園校長と元朝倉市立松末小学校長及び松末地域コミュニティ協議会局長から聴き取りを行った。当時の水害発生時の状況とともに、その後の学校での避難状況、救出状況、そして水害後の学校の、現在までの状況について整理した。水害の発生が予想されない中で混乱が見られたが、教職員の適切な対応によって、子どもたちには大きな被害が及ばなかった。また、学校再開後も子どもたちのケアが適切に配慮されていた。地域で家が被災した子どもたちもいたが、就学に大きな影響が及ぶようなことはなかったようである。被災を契機として、避難訓練や、地域との関連の見直しが行われていた。この成果については、教育科学研究会の機関誌である雑誌「教育」に発表した。そこでは、宮城県の状況と福島県の状況についても分析を行った。震災後8年を過ぎ、なお復興が進まない状況の中で、子どもたちを支える取り組みが行われていることを分析した。10月には、秋田県東成瀬村を訪問し、教育委員会及び東成瀬小学校、東成瀬中学校において、教育長、小学校長、中学校長からの話を伺った。人口減少が進む中で、東成瀬村が取り組む学力向上策とともに、地域と一体となった教育の展開について状況を知ることができた。また、岩手県陸前高田市立高田小学校では、校長から被災後の現在の子どもたちと学校の状況について話を伺った。さらに、大槌町と陸前高田において、語り部ボランティアの方から町の現在の状況について現地案内を含めて聞くことができた。東日本大震災で被災した岩手、宮城、福島を中心としながらも、温暖化などにより想定外の水害等が各地で発生している。それらの災害が学校や地域に与える影響について今後も調査する予定にしており、今年度はその第一歩として2017年度の九州北部豪雨の被災地を訪問調査した。また、東日本大震災の被災地への訪問調査も継続している。今後、2018年の西日本豪雨の被災地への訪問調査を予定しており、おおむね順調に進展していると考えている。2019年度は西日本豪雨の被災地である岡山県倉敷市の真備地区への訪問調査を行う。その結果については、教育科学研究会の大会において発表を行う予定である。また、今年度は東日本大震災の宮城の被災地での取り組みについても調査を行う予定である。また、日本教育政策学会において、地域と学校との関係性に関するシンポジウムを開催するなどして、研究を深めることとしている。2018年度については、研究調査の第一段階であり、調査対象を検討することも同時並行で行っていた。そのために残額が発生した。2019年度においては残額分も含めて、調査対象先を広げる予定であり、有効に使用することとしている。
日独労働市場法改革に関する比較研究

1ドイツ労働市場改革立法の動向に関する研究を進め、(1)ドイツ労働市場の現況、(2)伝統的規制システムとその批判、(3)90年代における法政策の展開を検討した上で、ハルツ第一次法第四次法の4つの法律、及び労働市場改革法を詳細に分析し、その意義、機能、問題点などを明らかにし、ドイツ労働市場法政策はどのように変容するかを検討した。2ドイツでの聞き取り調査を実施し、上記労働市場改革立法施行後の動きなどについてインタービューを行った。そこで明らかになったのは以下の諸点である。(1)全般的な評価は分かれており、政府は「成功している」と見ているが、使用者団体は一致せず、労働組合は批判的である。(2)従来、失業者への金銭的援助としては、失業手当、失業扶助手当、そして公的扶助の3種があったが、重なり合う部分があったので、これを失業手当、失業手当II、そして公的扶助として整理統合したのには、おおむね評価されている。但し、従来よりも給付額が低下する層が少なくない点には、特に労働組合サイドから批判が加えられている。IAB(労働職業研究所は、失業者本人だけではなく、家族も含めた生活保障との観点から、分析する必要性があるとする。(3)IABは、今回の改正は、流動化を促す点で評価している。(4)低賃金で就労を促すミニジョブは、失業者救済との立法目的を達成できず、むしろ主婦等の就労が増えて、「小遣い稼ぎ」となっている。(5)ドイツの労働市場は必ずしも「硬直的」ではなく、ダイナミックな動きがある。(6)新政府の労働市場政策は、従来と変わっていない。3日独の労働市場法を比較して得られる示唆は以下の通りである。(1)日本の労働市場政策は、中長期的は展望が欠けており、この点の是正が必要である。(2)ドイツの労働市場政策は日本に近づいているが、大きな相違は、重要な点での規制強化がなされていることである。具体的には、パートタイマーや派遣労働者に対する均等待遇原則、有期雇用の制限などである。(3)日本での失業率は改善しつつあるが、これは、景気回復のみならず、こうした不安定雇用労働者の増加も一因であり、抜本的な労働市場の改善にはつながっていないと考えられる。(4)日本では、職業教育・訓練などを重視すべきであり、実習などを積極的に取り入れた「デュアル・システム」の日本版を検討すべきである。(5)ドイツのように、失業者に対する金銭的助成ととも就労を促す方策が求められる、(6)若年者に対する雇用政策は緊急を要し、ドイツで実施されているのも参考にして、早急に実効性ある政策が講じられる必要がある。

本年度は、ドイツ労働市場法改革の動向・内容について、ドイツでのシンポの議論等を踏まえて研究を進めるととともに、日本の労働市場法制に関しても検討を行った。1最近のドイツにおける労働市場法政策転換の状況について文献研究を進めた。具体的には、「ハルツ委員会報告」(2002年8月)に基づき、ハルツ四法律が相次いで制定され、また「アジェンダ2010」(連邦政府提案、2003年3月)によって解雇制限法の規制緩和等が断行された。これらの一連の法政策において特徴的なのは、以下の点である。第一に、失業手当金の減額、給付期間の短縮、紹介された職業を拒否した場合の制裁等を通じて、就労強制の程度が高められた。第二に、就労促進策が充実され、きめこまかな支援がなされることになった。第三に、雇用創出に向けて、従来厳しく規制されていた解雇制限法や労働者派遣法が大幅に緩和された。第四に、職業紹介機能を向上させるために大幅な機構改革がなされた。さらに、日独及び独日両労働法協会主催のベルリンシンポ(「日本及びドイツにおける労働市場改革の展開」、2004年9月30日・10月1日)に参加したが、ここでの報告及び議論、さらに使用者団体、労働組合、連邦労働裁判所等でのインタービューも踏まえた論文をほぼ完成させた。2日本の労働市場法制についても研究を進め、その成果を、上記ベルリンシンポで報告した(「日本における雇用政策の展開と課題」。本報告は、ドイツの雑誌<Arbeit und Recht>に掲載予定)。ここでは、(1)外部労働市場と労働者個人を重視した雇用政策への転換、(2)雇用創出施策、(3)若年者に対する施策、(4)職業紹介事業の主体の多様化、(5)失業中の生活保障等について検討を行い、課題を提起した。3本年度は、計画通り、ドイツ労働市場法制改革の研究を進めることができた。さらに、計画にはなかったが、シンポでの報告を機会に、日本の労働市場法制についても、一定程度の研究を行うことができた。1昨年度から、ドイツ労働市場改革立法の動向に関する研究を進めてきたが、それが完成し、金沢法学に掲載した。そこでは、(1)ドイツ労働市場の現況、(2)伝統的規制システムとその批判、(3)90年代における法政策の展開を検討した上で、ハルツ第一次法第四次法の4つの法律、及び労働市場改革法を詳細に分析し、その意義、機能、問題点などを明らかにし、ドイツ労働市場法政策はどのように変容するかを検討した。2ドイツでの聞き取り調査では、上記労働市場改革立法施行後の動きなどについてインタービューを行った。そこで明らかになったのは以下の諸点である。(1)全般的な評価は分かれており、政府は「成功している」と見ているが、使用者団体は一致せず、労働組合は批判的である。(2)従来、失業者への金銭的援助としては、失業手当、失業扶助手当、そして公的扶助の3種があったが、重なり合う部分があったので、これを失業手当、失業手当II、そして公的扶助として整理統合したのには、おおむね評価されている。但し、従来よりも給付額が低下する層が少なくない点には、特に労働組合サイドから批判が加えられている。IAB(労働職業研究所は、失業者本人だけではなく、家族も含めた生活保障との観点から、分析する必要性があるとする。(3)IABは、今回の改正は、流動化を促す点で評価している。
レトロウイルスの遺伝子発現制御に関わる宿主因子の解析

我々はこれまでにMLVをはじめとするレトロウイルスの発現維持に関わる宿主因子を解析して、「レトロウイルスの発現はこれを正に制御するBrm型SWI/SNFクロマチン構造変換因子複合体(trithorax--G)と負に制御するYY1を含むPRC2複合体(Polycomb-G)との競合によりLTR近傍のクロマチン構造やヒストンの修飾を介して維持されている」ことを示してきた。本年度の研究から、この競合反応にはDNAメチル化は関与しないが、ヒストンH4のLys5、Lys8の脱アセチル化と共に、ヒストンH3のLys9もしくはLys27のトリメチル化が関与することが明らかとなった。トリメチル化の反応はPRC2複合体の構成成分であるEZH2の持つヒストンメチルトランスフェラーゼ活性により担われていると考えられる。また、ウイルスLTR中のYY1結合配列のみを破壊したΔYY1ベクターを作製したところ、これは野生型に比べ、胚性癌細胞をはじめとするBrm発現欠失細胞株でgene silencingを著しく受けにくくなり、今後、再生医療において長期間発現が可能で、有用なベクターになりうると考えられた。宿主細胞におけるBrmの発現の有無がレトロウイルスの発現制御に決定的であることから、Brm発現欠失細胞株の数株についてrun-on転写法で解析した結果、ヒト胚性癌細胞、マウス胚性幹細胞を含め、これらの細胞中にはいずれも機能的なBrm遺伝子が存在し、恒常的に高レベルで転写が開始され全長に及んで伸長するが、成熟mRNAが検出されないことが示された。この転写後レベルでの抑制の解除を誘導する薬剤を検索した結果、CHAP31等のヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)、の阻害剤で一過的に処理するだけで、その後は阻害剤非存在下でも内在性のBrmタンパク質を恒常的に発現させ、レトロウイルスの発現を維持することが可能であることをつきとめた。