hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国新石器時代における家畜・家禽の起源と、東アジアへの拡散の動物考古学的研究

本年度は、昨年10月に浙江省文物考古研究所にて開催した、共同研究の成果報告会の内容をもとに、日本語と中国語併記による成果報告書を刊行した。内容は、おおよそ以下の4点にまとめられる。1河姆渡文化期の田螺山遺跡出土動物遺存体の分析では、哺乳類のほか、これまで整理が進んでいなかった魚類、鳥類と爬虫類について初歩的な分析検討をおこなった。魚類は、カムルチー科、コイ科、ナマズ目などの淡水魚が中心であり、汽水域にも進入するスズキ属やボラ科などが含まれ、構成魚種は河姆渡遺跡と類似する。鳥類では、主に陸水域や湿地に生息する種で構成され、その大半がカモ科とクイナ科であった。爬虫類では、大量に出土していたカメ類の同定から、クサガメが確認された。良渚文化期の良渚遺跡群美人地遺跡では、イノシシ/ブタを分析するなかで、新石器時代の飼養環境はいまだ野生状態に近い環境にあり、現代でもイノシシとブタは容易に交配して雑種が生まれることから、野生であるイノシシと家畜ブタの混血が日常的に進んでいたと推察するに至った。2田螺山遺跡の各層より出土した木柱列の放射性炭素年代測定をおこない、遺跡形成年代の検証をすすめた。3美人地遺跡出土の古人骨の初歩的分析では、人為的損傷と思われる痕跡なども確認され、当時を考える貴重な事例を提示した。4炭素・窒素同位体分析による食性分析では、長江下流域における新石器時代の変遷を検討した結果、同位体生態学的状況が極めて複雑であることが明らかとなった。そのため、今後、大陸独自の同位体生態学マップを作成する必要性が提唱された。このほか報告書には、三次元計測を利用した人骨骨格図譜(改訂版)を公開するとともに、奈良文化財研究所のデータベース上では、ウシ、ウマ、イノシシ、ニホンジカ、イヌ、ヒトの三次元計測による、3D骨格図譜「3D Bone Atlas Database」を公開した。研究代表者:松井章は、2014年5月に中国浙江省田螺山遺跡を訪問し、一部の動物遺存体のを持ち帰り、研究分担者や連携研究者らの協力も得て種の同定に努めた。その成果は、10月に浙江省文物考古研究所において内部研究会を実施し、中国側にも成果の共有をはかり、現在、中国語と日本語とで松井の本科研の成果報告として編集中である。1)出土した魚類の多くは、淡水魚カムルチーのもので、淡水魚では他にコイ、ナマズ、ギギ科が加わり、汽水・海水魚ではボラ科、ニベ科などが含まれる。2)出土した動物遺存体の中で最多数を占める淡水産のカメ類は、ほぼすべてがクサガメのもので、23歳の年齢が多いことが連携研究者の平山廉早大教授の分析により明らかにできた。淡水産のカメは、どの出土地点をとっても膨大な量の骨、甲羅が出土しており、田螺山遺跡で住民によって摂取された動物性タンパク質のうち、3/4以上を占めるのではないかと思われ、これまで重要性が等閑視されてきたと言えよう。3)2014年10月、浙江省文物考古研究所において、共同研究の到達点として、菊地大樹による総説、米田穣による安定同位体から見た家畜・野性種の判別、江田真毅による鳥類の同定、出土主要種の検討、茂原信生による人骨の特徴、中村俊夫によるAMS年代測定をもちいた高精度年代測定による、各文化層の絶対年代の決定などの成果が得られ、現在、中国語と日本語とで成果報告書の編集中である。

このほか報告書には、三次元計測を利用した人骨骨格図譜(改訂版)を公開するとともに、奈良文化財研究所のデータベース上では、ウシ、ウマ、イノシシ、ニホンジカ、イヌ、ヒトの三次元計測による、3D骨格図譜「3D Bone Atlas Database」を公開した。中国側の全面的協力を得ることができ、特に田螺山遺跡での成果が相次いでいる。この遺跡を足がかりに、これまで動物考古学的な研究が欠けていた、中国新石器時代初期における家畜導入の動物考古学的な証拠を求め、古環境変遷との関係を明らかにしたいものである。2014年5月に実施した標本採集の成果について、10月に成果概要として発表できたことは、浙江省文物考古研究所でも高い評価を受けた。2015年6月にも追加資料の再検討と、日本に持ち帰る資料の選別を実施する予定である。日本国内でも中世、なかでも戦国時代のブタの類例を福岡城、黒崎城で検出し、形質を明らかにしたい。牛馬骨も畿内の遺跡から類例を増加させ、従来からの主張通り、5世紀に馬が、6世紀に牛が渡来したことは、ますます確固とした事実となりつつある。以上のように中国南部での田螺山遺跡を中心とした新石器時代前期の初期農耕・家畜文化と、その日本への移入の年代に関する研究は順調に推移していると言える。これまで通り、中国浙江省での調査を中心として、ベトナム、タイへも調査の範囲を拡げ、中国南部から東アジアだけでなく、東南アジアへの拡散の道も明らかにしたい。かって報告書の作成に加わった、韓国金海貝塚の動物遺存体の再検討を実施し、ニワトリ、ブタの有無を再度、検証する。ネコとニワトリを同定した長崎県壱岐市カラカミ遺跡の再検討を行い、弥生時代中期から後期にかけての層から出土している年代が、弥生時代前期に遡らないか検討したい。長崎県壱岐カラカミ遺跡から出土したネコの系譜を中国南部にも求めたい。田螺山遺跡からネコの出土はまだ報告されていないが、「水稲稲作農耕の開始=ネズミによる食害を防ぐためネコを導入」という図式が当てはまるなら、中国南部こそ東アジアでネコの家畜化、もしくは伝播が行われた場所であるはずなので、膨大な田螺山遺跡から出土した動物遺存体のなかから、ネコが出土していないか検討したい。
エナメル上皮腫による骨破壊に関わる分子メカニズムの解明

本年度は腫瘍細胞と間質細胞との相互作用がエナメル上皮腫の骨破壊や浸潤能に及ぼす影響についてより詳細な情報を得るための研究を行い、エナメル上皮腫の分泌するIL-1αはオートクライン的に働き、腫瘍細胞のMMP(マトリクスメタロプロテイナーゼ)-9の分泌制御に大きく関わっていることを見出した。MMPは骨基質であるI型コラーゲンを消化し、骨浸潤に深く関わると考えられる。さらに、エナメル上皮腫細胞株AM-1,AM-3を加圧環境下で培養するとMMP-9の発現が著明に亢進することが明らかとなった。さらに、線維芽細胞の存在下ではAM-1,AM-3はIL-1αの発現を著明に亢進し、腫瘍細胞自身のMMP-9発現をより亢進させることを見出した。以上の内容は現在投稿準備中である。また、エナメル上皮腫の腫瘍細胞と間質細胞の相互作用が本腫瘍の浸潤発育様式にどのような影響を及ぼすかについて評価するために、Double-Layeredコラーゲンゲル半球培養法(DL-CGH法)による三次元培養実験の構築を行った。DL-CGH法は真庭らによって報告された三次元培養法であり(Cell Commun Adhes, 2007)、集団的な細胞浸潤を評価するのに優れた方法である。我々は、AM-1およびAM-3に緑色蛍光蛋白質(GFP)を、線維芽細胞株HFF-2に赤色蛍光蛋白質(DsRED)を遺伝子導入し、DL-CGH法で共培養することで、腫瘍細胞と間質細胞の相互作用が腫瘍細胞の集団的な動態にどのような影響を与えるのかについて評価することを可能とした。予備実験では、線維芽細胞の存在下ではAM-1,AM-3は細胞が細胞接着を保ったまま集団的に浸潤突起を多数形成し、より顕著な浸潤形態を示すことが分かった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、エナメル上皮腫細胞が分泌する液性因子が周囲の細胞に影響を与え、本疾患の骨浸潤能に関わる分子機構を解明することである。平成26年度は、我々が樹立したエナメル上皮腫不死化細胞株であるAM-3、破骨細胞前駆細胞RAW264.7、ヒト線維芽細胞株HFF-2および病変部より採取し培養した線維芽細胞を用いて実験した。マイクロアレイによる各細胞の遺伝子発現解析をはじめ、細胞の培養上清を用いて細胞間の相互作用による遺伝子・蛋白発現の変化、破骨細胞分化や細胞遊走能・増殖能の変化を解析した。その結果、AM-3細胞はHFF-2細胞に比べ、IL-1α、IL-1β、IL-8、TNF-αなどのサイトカインの遺伝子やMMP-3といった骨吸収に関わる因子を高発現していた。また、病変部嚢胞腔の内容液はIL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αを高濃度に含んでいた。AM-3の培養上清で刺激した線維芽細胞では、IL-6とIL-8の遺伝子発現が著明に亢進した。さらに、AM-3細胞の培養上清刺激の際に、抗IL-1α抗体またはIL-1Ra(レセプターアンタゴニスト)を加えたところ、この反応は中和可能であった。タンパク分泌について評価したところ遺伝子発現の変化と同様の傾向であった。また、AM-3細胞の培養上清で刺激された線維芽細胞の培養上清は、AM-3細胞の細胞遊走能を有意に亢進した。また、その反応は抗IL-6抗体、抗IL-8抗体により中和することが可能であった。また、IL-6、IL-8で刺激したAM-3細胞の細胞遊走能および細胞増殖能は有意に亢進した。これらの知見は、エナメル上皮腫細胞はIL-1α分泌を介して間質線維芽細胞と相互的に働き、腫瘍の浸潤発育に有利な微小環境を形成する可能性を示す。これらの成果は論文として英文雑誌に採択済みである。

我々は、AM-1およびAM-3に緑色蛍光蛋白質(GFP)を、線維芽細胞株HFF-2に赤色蛍光蛋白質(DsRED)を遺伝子導入し、DL-CGH法で共培養することで、腫瘍細胞と間質細胞の相互作用が腫瘍細胞の集団的な動態にどのような影響を与えるのかについて評価することを可能とした。予備実験では、線維芽細胞の存在下ではAM-1,AM-3は細胞が細胞接着を保ったまま集団的に浸潤突起を多数形成し、より顕著な浸潤形態を示すことが分かった。平成26年度の研究成果は英論文雑誌に採択済であり、その研究成果は今後の研究進展において非常に有意義であるため、今後の研究促進が期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、腫瘍細胞と腫瘍周囲のの相互作用が、エナメル上皮腫における骨破壊のきっかけになるであろう破骨細胞分化に対してどのような影響を持つのかについて研究を進める予定である。破骨細胞の前駆細胞であるマクロファージ株RAW264.7細胞を用い、腫瘍細胞の刺激を受けた線維芽細胞が破骨細胞分化に与える影響をTRAP染色やオステオアッセイにて評価する。また、マイクロアレイにて明らかとなった本腫瘍に特異的に発現する因子が、本疾患の骨浸潤能に与える影響について解析を進めていく。
家蚕における倍数体の誘発とその細胞遺伝学的研究

倍数体の誘発:産下直後の卵を高温、低温処理することによって3倍体,4倍体及び6倍体を誘発した。3倍体は不還元分裂型の卵核と精核の接合にって生じたZZW型であった。6倍体はZZW型の3倍体の核が倍加したZZZZWW型であった。4倍体は雌核発生や接合核の倍加によって誘発された。染色体の行動:不還元分裂型の卵核が倍加したZZWW型の4倍体が雌核発生により誘発された。この4倍体に2倍体を交配し、次代(3倍体)を得た。この次代で形質分離を調査した結果、染色体の不分離と考えられる性比や血色の分離比に異常が見られた。この染色体の不分離は倍数体の誘発時に染色体の対合、付着が生じた結果、起こると考えられた。倍数体の計量形質:倍数体の繭重や繊維特性を調査した。その結果、4倍体では計量形質の増加は期待できないが、4倍体を雄親とする3倍体では繭量の著しい増加がみられた。混数体と胚致死:還元分裂型の単為発生卵やモザイク卵の胚子のDNA量をフローサイトメトリーにより測定した結果、多くが混数体であり、前者がn+2n+3n型、後者はn+2n+3n,n+2n+4n型の混数体が多く出現していた。孵化蚕には半数体細胞を持った個体はあらわれなかったことから、半数体細胞を持つ胚子はすべて卵期に致死すると結論された。3倍体雌に2倍体雄を交尾、産卵させると次代胚を得ることができるが、孵化するものはなく、すべて胚致死した。この次代の胚子の倍数性は2.5nであり、胚子を組織学的観察した結果、外胚葉系の組織の肥大しているのに対して内胚葉系の組織が未発達であった。温湯処理、冷蔵処理および氷水処理により倍数体蚕の誘発を行った。マーカー遺伝子の発現、染色体数、性クロマチン数、妊性および次代における形質の分離から倍数体および性染色電構成を判定した。産下直後の卵に46°C、18分の温湯に浸漬、0°C、2日冷蔵および0°C、2日氷水に浸漬することにより、不還元型卵核が形成され、高率に精核(n)と受精が起き、ZZW型の3倍体雌蚕を誘発することができた。また、受精が起こらなかった場合は、雌核発生蚕となり、この雌核発生蚕にはZZWW型の4倍体が出現した。正常2倍体雄と交尾したZZW型3倍体雌蚕は潰れ卵や不整形卵を混在していたが、受精卵も多く出現した。この受精卵は約70本の染色体(2.5n)を有し、様々な発育段階で胚致死していた。3倍体の卵巣卵は単為発生し、孵化することから、3倍体雌の形成する卵には正常な機能が備わった卵が存在しており、3倍体雌の不妊は卵に以上があるためではなく、その次代の胚子に原因があることが明らかとなった。正常2倍体雄と交尾したZZW型3倍体の産下直後の卵に温湯処理することによりZZZW型の4倍体を誘発することもできた。ZZWW型の雌核発生4倍体の次代において雌雄や血色の形質分離に異常が観察された。同様の現象は単為発生蚕に出現したZZWW型4倍体の次代においてもみられた。

このような形質分離の異常は4倍体の減数分裂時に染色体の不分離が起きたためと考えた。誘発された倍数体は2倍体と比べてほとんど形態的に差が見られないが、形成する卵の形態には特徴が見られた。ZZW型の3倍体は潰れ卵や不整形卵を多く含み、ZZWW型4倍体は大卵を、ZZZW型4倍体は長径が短く、短径が長い球形を呈していた。温湯処理及び過冷却処理により倍数体の誘発実験を幅広く行い、マーカー遺伝子の発現、妊性、核当りの性クロマチン数及びDNA量から倍数性を判定した。その結果、産下直後の卵に46°C、18分温湯処理することにより、不還元型卵核(2n,ZW)が形成され、これと精核(n,Z)の受精によりZZW型3倍体が高率に誘発することができることを昨年、明らかにしたが、本年は、3倍体だけでなく、僅かであるが6倍体も誘発されることを明らかにした。産下直後の卵に46°C、18分温湯処理することにより、ZZW型3倍体だけでなくZZZZWW型6倍体を誘発することができた。この6倍体個体は、幼虫形質はZZW型3倍体となんら変ることがなかった。しかし、産下卵の形状が異なり、3倍体は大小不規則な卵を産下するが、この個体は大卵を産下した。産下卵はわずかであるが孵化した。この次代蚕の倍数性は核当りのDNA量から4倍体であることが確認された。このことより大卵を産下した個体を6倍体個体と判定した。また、核当りの性クロマチン数が2個であったことより、性染色体構成はZZZZWW型と判定した。3n(+/+/re)×2n(re/re)の次代における形質分離は+:re=5:1であるが、6n×2n(re/re)の次代においてはre個体は出現しなかった。このことから6倍体は+/+/+/+/re/re型または+/+/+/+/+/re型であると考えられた。以上の結果より、温湯処理により、不還元型卵核と精核の受精により、ZZW型3倍体が形成されるが、この3倍体核がさらに倍加することによって、6倍体が誘発されたと推察された。カイコの卵巣卵および産下直後の卵に温湯処理や過冷却処理を施すことにより倍数体の誘発実験を幅広く行った。誘発率やマーカー遺伝子の発現,妊性,核当りの性クロマチン数及び核当りのDNA量から倍数性を判定した。その結果,産下直後の卵に46°C,18分温湯処理することにより,不還元分裂型の卵核(2n,ZW)が形成され,これと精核(n,Z)の受精によりZZW型3倍体が高率に誘発することができること,また,3倍体だけでなく,僅かであるが6倍体も誘発されることを昨年まで明らかにした。本年は単為発生による倍数体の誘発を試み,ZZWW型の4倍体およびn+2n+3n型の混数体が誘発されることを明かとした。卵巣卵に46°C,18分温湯処理を施すことにより,不還元分裂型の卵核(2n,ZW)が形成され,この卵核がさらに倍加することによってZZWW型の4倍体が誘発された。この4倍体の次代では性比や形質の分離比が理論比から大きく外れており,4倍体の形成時に染色体の癒着がおき,減数分裂時に不分離が起こると結論された。また,卵巣卵に46°C,2分の温湯処理を施すことによって還元分裂型の単為発生卵を得た。この単為発生卵の胚子のDNA量を調査した結果,ほとんがn+2n+3n型の混数体であった。また,催青したが孵化歩合は極めて低く,3%を超えることは無かった。胚致死の原因を解明するために,胚子の発育を組織学的に検討した結果,反転した個体はみられず,中腸形成に異常があると考えられた。
がんのAKT経路解析によるEGFR分子標的薬の効果予測およびその増強

EGF受容体(EGFR)はチロシンキナーゼ活性を持つ膜貫通型蛋白(RTK)で、EGF、TGFαやneuregulinなどのリガンドが結合すると、Ras、PI3キナーゼやAktの活性化を起こす。その結果、細胞増殖が促進されるため、EGFRの過剰発現は多くの癌種で予後不良因子となっている。本研究では、EGFRに対する分子標的療法の効果増強を目的とし、その分解調節機構を解析した。大腸癌細胞株LS180とSW480を、血清飢餓後EGF刺激し、Akt経路の活性化とEGFRの発現をウエスタンブロッティングで調べた。その結果、EGF刺激でAkt経路が活性化し、EGFRの発現は低下した。また、PI3キナーゼをLY294002で阻害すると、EGFRの発現が増強した。さらに、EGFRの発現がEGF以外の刺激による調節を受けているか否かを検討するため、SW480をインスリン、VEGFあるいはHGFで刺激したが、EGFRの発現量に変化を認めなかった。また、AktをsiRNAでノックダウンし、EGFRの発現をEGF刺激前後で調べたところ、EGFRの発現量はAktのそれに左右されなかった。以上の結果は、EGFRの発現量が、EGFRの持つ自己リン酸化活性と、その下流のPI3キナーゼ活性の両者により調節されていることを示唆していた。また、EGFRの発現低下はEGF刺激に特異的であり、インスリン、VEGFあるいはHGFなど、他の刺激因子の影響を受けないことが明らになった。EGF受容体(EGFR)はチロシンキナーゼ活性を持つ膜貫通型蛋白で、EGF、TGFαやneuregulinなどのリガンドが結合すると、Ras、PI3キナーゼやAktの活性化が起こる。結果的に、細胞増殖が促進されるため、EGFRの過剰発現は、多くの癌種で予後不良因子となっている。最近我々は、EGFRの発現レベルと、リン酸化Aktを指標とするPI3キナーゼ/Akt経路の活性化との間に、逆相関関係があることを見出した。本研究では、PI3キナーゼ/Akt経路によるEGFRの発現調節機構を解明し、癌治療の効果増強への応用を目指す。本年度は、大腸癌細胞株CaCo2、Colo320、DLD-1、HCT116、HT29、LS180、SW480およびSW620を用い、血清飢餓後にEGF刺激し、Akt経路の活性化とEGFRの発現をウエスタンブロッティングで解析した。その結果、HCT116、LS180およびSW480で、EGF刺激によりAkt経路が活性化し、EGFRの発現が低下した。また、PI3キナーゼ活性をLY294002で阻害すると、EGFRの発現量が増加した。さらに、EGFRの発現が、PI3キナーゼ/Akt経路の活性化以外のシグナルによる調節も受けているか否かを検討するため、HCT116、HT29およびSW480を、インスリン、VEGFあるいはHGFで刺激したが、変化はみられなかった。すなわち、PI3キナーゼの活性化により、EGFRの発現が低下することが示唆された。また、EGFRの低下はEGF刺激に特異的であり、インスリン、VEGFあるいはHGFの影響を受けないことも明らかとなった。今後は、PI3キナーゼ下流にあるEGFR発現調節分子の同定と、癌治療の効果増強への応用を目指す。

すなわち、大腸癌細胞株HCT116、LS180およびSW480を、血清飢餓後EGF刺激し、Akt経路の活性化とEGFRの発現をウエスタンブロッティングで解析した。その結果、EGF刺激でAkt経路が活性化し、EGFRの発現が低下した。また、PI3キナーゼをLY294002で阻害すると、EGFRの発現量が増加した。さらに、EGFRの発現がEGF以外の刺激による調節を受けているか否か検討するため、HCT116、HT29およびSW480を、インスリン、VEGFあるいはHGFで刺激したが、EGFRの発現量に変化を認めなかった。また、AktをsiRNAでノックダウンし、EGFRの発現をEGF刺激前後で比較したが、変化はみられなかった。以上の結果は、EGFRの発現量が、EGFRの持つ自己リン酸化活性と、その下流のPI3キナーゼ活性の両者により調節されていることが示唆していた。また、EGFRの低下はEGF刺激に特異的であり、インスリン、VEGFあるいはHGFなど、他のRTKの影響を受けないことが明らかになった。
髄外造血における新しい造血ニッシェ細胞の同定と未分解時機構の解析

造血幹細胞の未分化性・多分化能の維持はニッチという微小環境によって制御されており、骨髄内では骨梁領域の骨芽細胞が様々な機能を担っていると考えられている。しかし、骨髄以外での造血幹細胞の未分化性の維持機構については不明な点が多い。そこで、本研究では髄外造血時のニッチ機構を明らかにする事を目的とした。まず、我々は大理石病モデルマウスで、恒常的に髄外造血を示すc-Fosノックアウトマウスにおける造血幹細胞の局在を調べた結果、Tie2、SCL/tal1、Sca-1陽性の造血幹細胞の一部が巨核球様細胞(MLCs ; Megakaryocyte-like cells)近辺に存在している事が明らかとなった。また、致死性X線照射後の骨髄移植による一過性の脾臓での造血(CFU-S)においても同様の現象が認められMLCが多数クラスターを形成して存在していた。MLCsをFCMによって分取し遺伝子発現解析を行った結果、通常の巨核球とは異なり、ニッチ分子であるN-cadherin、β-Catenin、Spp1、Jagged-1やSDF-1αを高発現していた。また、移植実験から、これらのMLCの7080%がドナー細胞由来である事が明らかとなった。さらにクラスターを形成しているMLCをLaser Capture Micro-dissection法を用いて単離し、遺伝子レベルで解析した結果、通常の巨核球とは異なる遺伝子発現プロファイルを認めた。またMLCを単離し、造血幹細胞(KSL)と共培養する事で有意な細胞増殖を認め、我々の単離したMLCが脾臓等におけるニッチの役割を果たしている事が示唆された。また、脾臓に腫瘍を形成するATLのモデルマウスであるHTLV-Taxトランスジェニックマウスを用い、同様の解析を行った結果、腫瘍幹細胞の同定に成功し、脾臓および骨髄のニッチを同定することに成功した。本研究により随外造血等にMLCが関与している事が初めて明らかとなった。MLCを用いることで造血幹細胞の体外増幅等に応用可能であると考えられる。まず、我々は大理石病モデルマウスで、恒常的に髄外造血を示すc-Fosノックアウトマウスにおける造血幹細胞の局在を調べた結果、Tie2、SCL/tall、Sca-1陽性の造血幹細胞の一部が巨核球様細胞(MLCs ; Megakaryocyte- like cells)近辺に存在している事が明らかとなった。

また、移植実験から、これらのMLCの7080%がドナー細胞由来である事が明らかとなった。さらにクラスターを形成しているMLCをLaser Capture Micro-dissection法を用いて単離し、遺伝子レベルで解析した結果、通常の巨核球とは異なる遺伝子発現プロファイルを認めた。またMLCを単離し、造血幹細胞(KSL)と共培養する事で有意な細胞増殖を認め、我々の単離したMLCが脾臓等におけるニッチの役割を果たしている事が示唆された。本研究により随外造血等にMLCが関与している事が初めて明らかとなった。MLCを用いることで造血幹細胞の体外増幅等に応用可能であると考えられる。
尿排出時の仙髄反射活性測定を用いた痴呆症例における機能性尿失禁の鑑別診断

本研究では仙髄反射活性(主に球海綿体反射)を応用した排尿時の尿道括約筋弛緩に関する新しい客観的検査法の確立と、本検査法を尿失禁が合併する意志疎通困難な痴呆症例に臨床応用して、これまで困難であった無抑制括約筋弛緩による尿失禁と機能性尿失禁の鑑別診断を行うことを目的とした。その結果、以下検討を行いその成果を得ることができた。1)簡便で非侵襲的な排尿中の仙髄反射活性測定法の確立通常正常排尿において、括約筋は弛緩し、仙髄反射活性(球海綿体反射)排尿中抑制されることが知られている。しかし、無抑制括約筋弛緩の患者では反射の抑制が不十分で筋電図上括約筋の活動が記録される。我々は、この反応を尿流動態検査中に亀頭部または陰核を刺激することにより表面筋電図においても観察されることを明らかとした。(日泌尿会誌.91,641-644,2000.)2)1)による無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁の鑑別1)の結果をふまえて、無抑制括約筋弛緩症例と、機能的尿失禁症例(痴呆症例以外)の鑑別を行った。筋電図記録における条件設定により、表面筋電図上においても両者の違いを描出することが可能であった。この検査法により無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁は鑑別可能と考えられた。3)痴呆症例への応用痴呆症例に対しこの検査法を応用したところ、ほとんどの症例が機能的尿失禁と診断され、無抑制括約筋弛緩と診断された症例はごく少数例であった。無抑制括約筋弛緩が少数例であったため、統計学的有意差は得られなかったが、無抑制括約筋弛緩症例においては通常の尿失禁に対する治療(薬物療法・トイレへの定時誘導など)はほとんど無効であった。この結果からこの検査法により痴呆老人への尿失禁治療法選択の一助になる可能性が示唆された。本研究は、仙髄反射活性(主に球海綿体反射)を応用した排尿時の尿道括約筋弛緩に関する新しい客観的検査法の確立と、本検査法を尿失禁を伴う意志疎通困難な痴呆症例に臨床応用して、これまで困難であった無抑制括約筋弛緩による尿失禁と機能性尿失禁の客観的鑑別診断を行うことを目的としている。本年度の具体的な到達目標は、以下の通りであった。簡便で非侵襲的な排尿中の仙髄反射活性測定法の確立を目指す。このため、神経学的正常例と無抑制括約筋弛緩を呈する意志疎通可能な臨床例を対象として、精度の高い侵襲的検査法と簡便な非侵襲的検査の比較を行い、精度が担保される最も簡便な非侵襲的検査法の手順を確定する。また、排尿中のみならず蓄尿時における仙髄反射活性測定を同時に行い、蓄尿時の両者の相違についても吟味する。その成果として、正常11例と脊髄損傷13例を対象に、膀胱空虚時と充満時における仙髄反射活性について、球海綿体反射の誘発電位反応を用いて検討した。

その結果、膀胱空虚時と充満時の比較では、正常例および脊髄損傷例ともに充満時に振幅は増大した。さらに、脊髄損傷例は正常例に比し、膀胱充満による振幅の増大が顕著であった。また、脊髄損傷例における膀胱充満による顕著な振幅増大は、上位中枢からの下行性経路の障害によるものと思われた。排尿時のみならず、膀胱充満時の仙髄反射活性を膀胱空虚時と比較することで、仙髄と上位排尿中枢との連続性をよ客観的に評価できると考えられた。仙髄反射活性(主に球海綿体反射)を応用した排尿時の尿道括約筋弛緩に関する新しい客観的検査法の確立と、本検査法を意志疎通困難な痴呆症例に応用して無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁との客観的鑑別診断を行うことを目的とした本研究において、これまでわれわれは、客観的検査法の確立を主に研究を進めてきた。この結果、Bulbocavernosus reflex during the micturition cycle (British Journal of Urology, in press)に示すように簡便で、非侵襲的な検査法の開発に成功した。この検査法は、尿排出時に陰茎(陰核)背神経を電気刺激することにより仙髄反射(球海綿体反射)を誘発し、括約筋筋電図の変化を検出するものである。無抑制括約筋弛緩症例においては仙髄反射が抑制されず残存するため、尿道括約筋が筋電図上収縮し、そのほかの症例においては仙髄反射が抑制され筋電図上検出されにくくなることを利用して無抑制括約筋弛緩による尿失禁であるか否かを明らかにする。この方法を利用することにより、意志疎通が困難である痴呆症例における尿失禁の鑑別診断(機能的尿失禁、無抑制括約筋弛緩、無抑制収縮、腹圧性尿失禁など)を非侵襲的に行うことが可能となり、その後の治療方法を選択する上で有用と考えられる。現在この検査法により痴呆症例(特に脳血管性痴呆)において無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁との鑑別、さらに鑑別の結果選択した治療法による治療効果について症例を重ね検討中である。本研究では仙髄反射活性(主に球海綿体反射)を応用した排尿時の尿道括約筋弛緩に関する新しい客観的検査法の確立と、本検査法を尿失禁が合併する意志疎通困難な痴呆症例に臨床応用して、これまで困難であった無抑制括約筋弛緩による尿失禁と機能性尿失禁の鑑別診断を行うことを目的とした。その結果、以下検討を行いその成果を得ることができた。1)簡便で非侵襲的な排尿中の仙髄反射活性測定法の確立通常正常排尿において、括約筋は弛緩し、仙髄反射活性(球海綿体反射)排尿中抑制されることが知られている。しかし、無抑制括約筋弛緩の患者では反射の抑制が不十分で筋電図上括約筋の活動が記録される。我々は、この反応を尿流動態検査中に亀頭部または陰核を刺激することにより表面筋電図においても観察されることを明らかとした。(日泌尿会誌.91,641-644,2000.)2)1)による無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁の鑑別1)の結果をふまえて、無抑制括約筋弛緩症例と、機能的尿失禁症例(痴呆症例以外)の鑑別を行った。筋電図記録における条件設定により、表面筋電図上においても両者の違いを描出することが可能であった。この検査法により無抑制括約筋弛緩と機能的尿失禁は鑑別可能と考えられた。3)痴呆症例への応用痴呆症例に対しこの検査法を応用したところ、ほとんどの症例が機能的尿失禁と診断され、無抑制括約筋弛緩と診断された症例はごく少数例であった。無抑制括約筋弛緩が少数例であったため、統計学的有意差は得られなかったが、無抑制括約筋弛緩症例においては通常の尿失禁に対する治療(薬物療法・トイレへの定時誘導など)はほとんど無効であった。この結果からこの検査法により痴呆老人への尿失禁治療法選択の一助になる可能性が示唆された。
畜産・酪農におけるふん尿の組織的な活用システムに関する研究

今日、日本の畜産・酪農の存在それ自体がふん尿の排出から地域の環境汚染問題につながってきているという大きな問題がある。それは畜産・酪農が排出するふん尿が「過剰」、あるいは活用が十分でないことから起こる。ふん尿の活用が畜産・酪農の展開にとって不可決になっている。にもかかわらず、その実態及び活用のシステム・仕組みが十分に検討されているとはいえない。そこで本研究では、畜産・酪農のふん尿を地域資源ととらえ、この有効活用の仕組み・システムを明らかにすることを目的として取り組んできた。つまり、畜産・酪農におけるふん尿の組織的な活用システム形成の可能性・方向性を明確にしてきた。研究の進め方としては、特に畜産・酪農地帯におけるふん尿の地域的・組織的な活用の仕組みが形成されている事例の幾つかを取り上げ調査・考察をし、次のような結論に達した。第一に、個別的な処理・活用から地域的・組織的な処理・活用への移行には、外的な条件が必要である。例えば、国・県・市町村などの補助事業、あるいは関係機関・団体の支援が必要である。第二に、組織的な活用システムを形成・展開させるには、組織内的な条件の整備が必要である。つまり、その組織体自体の経営採算、及びその形成が農家や地域住民にとっても、公益的な要件を満たすものにしなければならない。第三に、それらの活用システムを維持・発展させえる推進する主体・事務局(農協や農業法人等)が必要である。さらに、デンマークの環境保全対策の取組みや、共同バイオガスプラント事業の取組みについても検討した。表記のテーマに沿って、本年度は実態調査と資料収集を実施した。この調査から確認された点は、畜産・酪農におけるふん尿の組織的活用方式には大きく2つの形態があることである。1つは、個別管理・処理を基軸にしながら地域的な支援サポート・販売システムを形成している方法であり、個別で固液分離機やハウス乾燥施設等の諸設備を整備し、その利用方式において地域的に考え実行している。もうひとつは、ふん尿の活用組織・システムそれ自体が地域組織のなかに位置付けられる方式であり、ふん尿を個別で処理、一時乾燥したもの等を組織・グループ(任意団体、農業法人や、農協)が集め、共同施設で発酵処理し地域農家や周辺農家等に流通・販売する方法である(府県・道内網走・十勝の事例)。つまり、ふん尿の組織的な活用といった場合、多くの地域で取り入れられているのは、個別で処理し、「余った」ふん尿について地域的に処理、あるいは販売・交換する方式である(府県・熊本等、網走・十勝)。これには、地域の諸組織・団体も大きく関与している。後者のもうひとつの方法も一定の地域で取り入れられつつある。とくに異種経営が周辺に展開しているところでは取り入れやすい方式である(北海道、熊本県等)。すなわち、熊本や十勝等でみられる農協や地域営農集団や農業法人、任意集団が事業主体となってふん尿を集め農家等への還元・販売する堆肥センターシステム(請負・コントラクターシステム)である。しかし大きな問題は、経営経済的にみると、その事業体が経営採算がとれていないということであり、これへの運営等に対する財政的な面や関係施設(堆肥センター)への補助・助成なども一層必要となっている。これらへの深い分析が次年度の大きな研究課題である。表記の研究テーマに沿って、昨年度の調査結果も踏まえ、本年度は次の点に重点を絞ってボーリング及び定点調査研究を行った。組織的な活用方式を三つに分類し、それぞれの代表事例の調査検討を行った。第一に酪農家が幾つか集まって、集団的なふん尿の処理・活用を行うもの(九州の事例)である。できたものは、個別の農地・畑地に還元する。あるいは、周辺に販売する。販売量が多いのは、府県や酪農家の密度の高いところである。第二に酪農家が1ないし数戸集まり、同時に耕種農家も数戸集まって、互いにふん尿活用を行うもの(静岡県富士宮市等)である。

この場合は、集まった農家内の農地・耕地・草地への還元を基本においている(余ったものは周辺農家・農地への還元もする)。第三に、地域的・広域的なふん尿活用方法がある。例えば、酪農家や和牛農家が多数、及びその還元方法も周辺耕種農家多数が集まったもの。これは,一般的に農協等が事業主体になって形成している堆肥センターやコントラクターシステムである。そのふん尿については、ふんと尿を分離して活用するものと(九州の例)、混合したものをそのままスラリーとして活用する方法とがある(十勝等の例)。広域的な活用の例としてのデンマークの例では、共同バイオガスとして電力利用を国レベルで行っている。これらいずれも、ふん尿の処理・活用を進める調整主体が重要なキーワードを握っていること明らかになった。さらに、時間・年月がかかるが、ふん尿活用の地域的、広域的な環境システムが確立されていくことが大切であることも確認された。表記のデーマに沿って、下記のような方法で最終年度の調査研究を行なった。畜産・酪農のふん尿が地域複合化のなかに位置付けられていると考えられる道内十勝・網走等の畜産・酪農地帯と、広域的な範囲で組織的に活用していると考えられる静岡県・京都府などの都市近郊畜産・酪農地帯、及びその両方を含む中間的な展開をしていると考えられる福岡県・熊本県などの畜産・酪農地帯に類型化し、調査すると同時に、西欧・デンマークの研究情報収集・整理と検討を行い、ふん尿の組織的な活用システムの形成上のポイント・在り方と問題点の摘出、さらに応用方式を検討した。その結果、第一に個別的な処理・活用から地域的・組織的な処理・活用への移行には、外的な条件が必要である。例えば、国・県・市町村などの補助事業があること、あるいは関係機関・団体の要請や支援があるなどである。第二に組織的な活用システムを形成・展開させるには、組織内的な条件の整備が必要である。その活用組織体自体の経営採算、さらに、農家や地域住民にとっても、そのことが公益的にも成り立つものにしなければならない。ふん尿を活用できる販売ルートの確立も必要である。第三に、それらの組織体・活用システムを維持・発展させえる主体の形成が必要である。さらに、それらの意義を明確にし、推進する主体・事務局(農協や農業法人、第三セクター等)が必要であるなどの結論を得た。三年目でも、これらを形成しつつある事例として、道内の十勝管内中札内村や上川管内美深町、根釧管内別海町、及び京都府八木町、九州等を中心に補充調査し、組織的な活用組織・堆肥(液肥)センターなどにおいて経営採算がとれる方法・展開条件などを検討し、明らかにした。
肺胞上皮細胞の変移の分子機構の解明

肺胞上皮細胞を試験管内で培養すると、時間と共に、II型上皮細胞がI型上皮細胞に変移する。生体内でも肺が傷害を受け、回復する際には、II型上皮細胞からI型上皮細胞への変移がおこると考えられている。したがって、肺胞上皮細胞の変移の分子機構を解明することは臨床的にも重要と考えられる。肺胞上皮細胞の変移は、細胞密度や培養するプレートが細胞間基質によりコートされているか否かに影響される。このことは、II型上皮細胞からI型上皮細胞への変移が、細胞間の相互作用や、細胞間基質への接着によって制御されていることを示唆している。そこで、私どもは、肺胞上皮細胞の変移の分子機構を解明するに当たり、とくに細胞表面の接着分子に着目した。今年度は、イムノグロブリンスーパーファミリーに属するRAGEという膜貫通型蛋白質に着目して研究を推進し、以下のことを明らかにした。RAGEはイムノグロブリンルーブを2つもつがホモフィリックな接着能はなく、肺ではI型上皮細胞の基底膜面に特異的に発現している。肺胞上皮の培養系では、I型上皮細胞への変移に伴って発現する。肺の発生においても、I型上皮細胞が出現する胎生19日目から発現を認め、それ以前には発現が確認されない。以上の知見を踏まえて、RAGEが発現し細胞間基質と接着することが、II型上皮細胞からI型上皮細胞への変移に重要であるという仮説をたて、現在、検証を進めている。また、RAGEと細胞間基質との接着を阻害することにより、I型上皮細胞にどのような変化が生じるかを解明しようとしている。肺胞上皮細胞を培養すると、時間と共に、II型上皮細胞がI型上皮細胞に変移する。肺が傷害を受け、回復する際には、II型上皮細胞からI型上皮細胞への変移がおこる。肺胞上皮細胞の変移は、細胞密度や培養するプレートが細胞外基質によりコートされているか否かに影響される。このことは、II型上皮細胞からI型上皮細胞への変移が、細胞間の相互作用や、細胞外基質への接着によって制御されていることを示唆している。そこで、私どもは、.肺胞上皮細胞の変移の分子機構を解明するに当たり、とくに細胞表面の接着分子に着目した。第一はI型上皮細胞に特異的に発現されるといわれているT1αという膜貫通型接着因子である。このT1αに結合する分子を探索してC2PA:というPDZ領域をもつ分子を得た。.しかしながら、C2PAは核内蛋白質であることが後に明らかになり、T1αとは生理的に相互作用しないと考えられた。第ニの接着分子は、カドヘリンファミリーに属するT-cadherinである。この分子は、GPlアンカー型の接着分子で、MDCK細胞に人為的に導入するとE-cadherinなどとは異なり、頂端面に局在する。T-cadherinは、II型上皮細胞でのサーファクタント産生に関与すると報告されている。私共はT-cadherinに結合する分子を探索して、複数の候補分子を得ている。とくに注目しているのは、2種類の膜貫通型の接着分子と、3種類の細胞外に分泌されると想定される分子であり、これらの解析を平成14年度に進行する予定である。
真空紫外光で生成した活性種による革新的医療プロセスの開発

本研究では、真空紫外光(100200nm)の光化学反応を用いてO2やH2OからOやOHなどの活性種を生成し、これら活性種の生体反応を利用して癌治療や創傷治癒を行う新しい医療プロセスを提案した。装置を作製して活性種計測を行い、シミュレーションで予想した通りの活性種が生成されていることを確認した。本手法でOHを生成して菌に照射し、創傷治癒で重要とされる殺菌を行えるだけのOHを照射できることを示した。本手法は、現在盛んに研究されているプラズマ医療で、各活性種の治療効果を定量的に測定する手段としても有用であることも示し、プラズマ医療の発展にも大きく貢献できることを示した。今年度は、Xeエキシマランプの作成に取り組み、石英セルを真空引きしてXeを大気圧まで充填し、バリア放電を発生させてランプを点灯させることに成功した。また、Xeエキシマランプの172nm真空紫外光をH2O/HeやO2/Heのガス流に照射したときの、活性種生成および反応に関するシミュレーションを作成した。このシミュレーションの計算結果は、次年度にレーザー計測する活性種密度と比較検証し、測定結果をフィードバックしてブラッシュアップする予定である。これと並行して、エキシマランプより頻繁に紫外光源として利用される低圧水銀ランプの光化学反応シミュレーションを作成し、低圧水銀ランプ照射下で生成されるオゾン濃度を測定結果と比較することで、我々がエキシマランプのシミュレーションにも用いている紫外光の光化学反応モデルが妥当かどうかを検証した。その結果、シミュレーションと計測結果はよい一致を示し、光化学反応モデルが妥当であることを示した。この研究成果は、Journal of Photochemistry and Photobiology Aに掲載された。本研究は、プラズマ医療と密接に関係している。本手法とプラズマ医療の比較も重要な課題である。そこで、プラズマ医療の実験も行った。医療用プラズマで生成される活性種のレーザー計測や、癌細胞への照射実験を行った。その結果、培養液中のマウス皮膚がん細胞の不活化にはOラジカルよりもH2O由来の活性種、たとえばOHラジカルなどが重要であるとの知見を得た。また、プラズマのシミュレーションも行った。これらプラズマ医療の結果を、本研究の提案手法で次年度以降に行う細胞不活化実験と比較することで、プラズマ医療に対する本手法の長所と短所を示すことができるとともに、本手法による医療原理の解明の一助とすることができる。前年度に引き続き高輝度VUVランプの製作に取り組んだが、技術的に難しくうまくいかなかったため、代替品として輝度が当初予定の40%程度である安価なXe2エキシマランプを購入して実験を行った。最初に、本研究で提案する真空紫外法で予想通りの活性種を生成できるかどうかを計測とシミュレーションで検証した。石英管に加湿ヘリウムあるいは酸素ーヘリウム混合気を流してVUVランプを照射し、光解離反応で生成したO3およびOHラジカル密度を計測したところ、シミュレーションで予測した密度とそれぞれ20%および34倍の誤差が生じた。O3は紫外吸収法で計測し、OHはレーザー誘起蛍光法で測定した。O3については計測とシミュレーションで非常に良い一致を示したが、OHは誤差が比較的大きかった。しかし諸々の誤差要因を検討した結果、OH密度の誤差も許容範囲内であるとの結論を得た。この結果はJournal of Physics Dに掲載された。次に、光解離で発生する準安定O2(a)密度を計測するため、最初に実験が容易な低圧水銀UVランプの光解離で生成したO2(a)密度を赤外発光分光法で計測した。その結果、計測値はシミュレーションと2倍の誤差で一致し、O2(a)密度計測法の確立に成功した。この結果はJournal of Photochemistry and Photobiology Aに掲載された。本手法が実際に医療に使えるかどうかを検討するため、患部の殺菌を模擬した寒天培地上の殺菌実験を行った。その結果、加湿ヘリウムを使った実験での殺菌に成功した。OH, H, Oの3つの活性種のいずれかが殺菌に効いているところまでは判明したが、3つのうちのどれが効いているかまではまだ絞り込めていない。この他、本研究はプラズマ医療とも密接に関係しているため、プラズマ医療の実験もいくつか行った。最終年度である今年度は、これまでの研究成果をもとにして、真空紫外エキシマランプを用いた活性種生成装置を作製した。これを用いてOH, O3, H2O2を測定し、自作の反応シミュレーションとの結果を比較し、良い一致を示すことを確認した。その結果、本手法が簡易なシミュレーションで活性種密度を予測でき、かつ活性種密度を容易に制御できる手法であることを示すことができた。このエキシマランプを用いた本手法は、医療効果の高い活性種であるOH, O3, H2O2, O2(a)などを生成できるが、O原子を生成できない欠点があった。今年度はこのO原子を生成する手法も新たに開発した。O3/He混合気を波長248nmのエキシマレーザーで照射して、O3をレーザーパルスで瞬時にO原子に解離する手法である。本手法の実証実験を行い、本手法が実現可能であることを示した。本研究の最終目的である本手法の医療への適用について、本手法で生成したOHラジカルを寒天培地上の芽胞菌に照射して、OHラジカルで殺菌することに成功した。この成果により、本手法が医療に適用できる可能性を示すことができた。

さらに、これまで前例のない「OHのような短寿命ラジカルによる医療効果の定量的な計測」を行い、OHラジカルをどれだけのフラックスでどれだけの時間菌に照射すると、どの程度殺菌できるかを測定する実験に成功し、活性種を用いた医療の原理解明に向けて大きく前進することができた。この結果は、現在Journal of Physics Dに投稿中である。本研究では、真空紫外光(100200nm)の光化学反応を用いてO2やH2OからOやOHなどの活性種を生成し、これら活性種の生体反応を利用して癌治療や創傷治癒を行う新しい医療プロセスを提案した。装置を作製して活性種計測を行い、シミュレーションで予想した通りの活性種が生成されていることを確認した。本手法でOHを生成して菌に照射し、創傷治癒で重要とされる殺菌を行えるだけのOHを照射できることを示した。本手法は、現在盛んに研究されているプラズマ医療で、各活性種の治療効果を定量的に測定する手段としても有用であることも示し、プラズマ医療の発展にも大きく貢献できることを示した。初年度から真空紫外光源の製作に手間取り時間がかかってしまったものの、これまでに(i)真空紫外法による活性種生成装置の作成、(ii)真空紫外法のシミュレーションの作成、(iii)真空紫外法により生成した代表的な活性種、O3とOHの密度計測とシミュレーション結果の比較、(iv)殺菌実験の成功の4点を達成することができた。特に最後の(iv)は、本手法が実際の医療に利用できる可能性を示すことができた点で大きな成果である。本手法はまったく初めての試みであるため、医療効果があるかどうかは実験をやってみなやければ分からない状況であった。したがってこの(iv)は、本研究全体を通して最も困難かつ最も大きなステップであり、これに成功したことは本研究を大幅に進展させたといえる。また、シミュレーションの開発も順調に進んでおり、活性種密度の計測値とシミュレーション結果に数倍の誤差はあるものの、おおまかな密度を計算することはすでに可能である。これは反応が複雑なプラズマ医療では困難なことであり、本手法の特に医療原理解明の容易さを実際に示すことができた大きな成果である。比較対象であるプラズマ医療の研究も含めると英文ジャーナルの投稿論文は7つあり、順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。プラズマ工学本研究で開発した真空紫外法が、患部の殺菌に有効であることを前年度までの研究で示すことに成功した。そして、OH, H, Oのいずれかの活性種が殺菌に寄与していることを示した。しかし活性種密度のレーザー計測結果とシミュレーション結果が精度よく一致せず、どの活性種をどの程度投与すると殺菌効果が得られるかという、治療原理の定量的な評価がてきていない。今後は、この真空紫外法の殺菌への適用をさらに進め、治療原理の定量的な評価まで踏み込んだ研究を行う。そのために殺菌実験を進めるとともに、活性種密度のシミュレーションと計測をさらに推し進める。
遷移金属のオキソ・パーオキソ・ハイドロパーオキソ錯体の合成と酸素酸化反応への応用

酸素・アルキルハイドロパーオキサイドなどを酸化剤に用い、遷移金属の塩あるいは錯体を触媒とする選択的な酸化反応を開発することを目的に、これらの酸化剤と金属触媒の相互作用によって生ずると考えられる【O_2^-】,【O_2^2-】,【RO_2^-】などのアニオン活性種と被酸化物との反応について検討した。本年度に得られた結果を以下に記す。(1)オレフィンを配位子とするルテニウムカチオン錯体の合成。ルテニウム2価錯体,【〔(N^6-C_6H_6)RuCl_2〕_2】,を原料に用いて、58員環ジェニル基を配位子とする配位飽和カチオン錯体を新たに合成した。また、ルテニウム(【II】)ノルボルナジェン錯体をホウフッ化銀で処理することにより、ノルボルナジエンおよび6-メチルフルベンを配位子として有する配位不飽和なカチオン錯体を合成、単離した。(2)オレフィン類を配位子とするカチオン錯体と酸素アニオン種の反応。不飽和炭化水素を配位したパラジウム,ロジウムおよびルテニウムの配位飽和カチオン錯体とスーパーオキサイドアニオン,t-ブチルパーオキサイドアニオンの反応について検討し、上記の酸素アニオン種はオレフィン配位子を求核攻撃することを明らかにした。一方、パラジウム,ロジウム,ルテニウムの配位不飽和カチオン錯体と、t-ブチルパーオキサイドアニオンの反応においては、アニオン種がカチオン錯体の中心金属を直接求核攻撃し、対応するt-ブチルパーオキソ錯体を与えることを明らかにした。6-メチルフルベンを配位子に持つルテニウムt-ブチルパーオキソ錯体の熱分解反応を検討し、t-ブチルパーオキシ基のエチリデン炭素に対する分子内求核攻撃によりフルベン配位子へ酸素移動が起こることを明らかにした。
下垂体腺腫の機能分化・増殖における転写活性因子と各種受容体の相互作用に関する研究

われわれはこれまで下垂体特異的転写活性因子の下垂体腺腫における役割を検討してきた。本研究において、ヒト下垂体腺腫細胞において、特異的ホルモンの転写活性にこれらの転写活性因子がどのように関与しているか、核内レセプターその他の修飾因子との相互作用、転写活性因子が機能分化や腫瘍細胞増殖に関与しているかを明らかにすることを目的とした。RT-PCRにより、Pit-1,Ptx-1,Neuro D1,Estrogen receptor(ER),growth hormone secretagogue receptor(GHSR)について手術時摘出腫瘍組織から抽出したtotal RNAを用いてRT-PCR法にて各種遺伝子の発現を半定量的に分析した。Neuro D1,Ptx-1は全てのタイプの下垂体腺腫に発現が認められた。Pit-1はGH, TSH, PRL腺腫に発現が見られたが、非機能性でも発現が見られるものがあり、αサブユニットとの関係が示唆された。ERはPRL.Gonadotropin産生腫瘍に発現し、Pit-1との協調作用が示唆された。一方、視床下部ホルモンとそのレセプターについては、GHSR, TRHRの発現を検討し、GH産生下垂体腺腫において全例発現が認められ、強く発現していることを証明した。組織切片上で、これらの遺伝子の発現をin situ hybridizationにて証明した。GHSRの内因性リガンドであるGhrelinが最近発見されたが、GhrelinとGHSRtype1aの発現を半定量法にて検討し、有意な相関は認めなかった。Ghrelinが下垂体においてparacrine autocrine作用によって腫瘍の増殖に関与していると考えられた。以上の結果より、転写活性因子は核内レセプター・視床下部ホルモンレセプターとの相互作用によって転写活性や腫瘍の増殖にも関与することが示唆された。下垂体において、特異的ホルモンの転写に対する各種転写活性因子の関与を調べる目的で、ヒト下垂体腺腫摘出組織を対象に各種転写活性因子の遺伝子および蛋白発現を検討した。Pituitary homeobox 1(Ptx-1)はPOMCの転写活性に重要な役割を果たす特異的転写活性因子として近年注目されている。Ptx-1monoclonal抗体を使用し免疫組織化学的手法にてPtx-1蛋白の発現を調べたところ、正常下垂体の60-70%の核に陽性を示した。下垂体腺腫においては73例中63例86.3%に陽性であり、特にPRL産生腫瘍では全例陽性であった。RT-PCR法では正常ヒト下垂体および下垂体腺腫全例においてPtx-1mRNAの発現が確認された。すなわちPtx-1はヒト下垂体において機能特異性は少なく、universalな転写活性作用を有すると考えられた。そこで新たにACTH-POMCの転写活性作用を有すると考えられているNeuroD1の発現を検討した。正常下垂体では主としてACTH細胞に発現が見られた。50例の下垂体腺腫について免疫染色を用いて検討したところ、ACTH産生腺腫では全例に蛋白発現が認められた。すなわちNeuroD1のACTH細胞の機能分化への関与が示唆された。一方、非機能性腺腫でもNeuroD1の発現が見られる症例が存在し、腫瘍の発生を考察する上で興味深い所見と考えられた。本研究において、ヒト下垂体腺腫細胞において、特異的ホルモンの転写活性にこれらの転写因子がどのように関与しているか、核内レセプターその他の修飾因子との相互作用、転写活性因子が機能分化や腫瘍細胞増殖に関与しているかを明らかにすることを目的とした。

本年度はRT-PCRにより、昨年度作成したNeuro D1,Estrogen receptor,RXR,SF-1,Pit-1,Ptx-1について手術時摘出腫瘍組織から抽出したtotal RNAを用いてRT-PCR法にて各種遺伝子の発現を半定量的に分析した。Neuro D1,Ptx-1は全てのタイプの下垂体腺腫に発現が認められた。Pit-1はGH,TSH,PRL腺腫に発現が見られたが、非機能性でも発現が見られるものがあり、αサブユニットとの関係が示唆された。ERはPRL.Gonadotropin産生腫瘍に発現し、Pit-1との協調作用が示唆された。一方、視床下部ホルモンとそのレセプターについては、GHSR,TRHRの発現を検討し、GH産生下垂体腺腫において全例発現が認められ、強く発現していることを証明した。組織切片上で、これらの遺伝子の発現をin situ hybridizationにて証明した。GHSRの内因性リガンドであるGhrelinが最近発見されたが、GhrelinとGHSR1aの発現を半定量法にて検討し、有意な相関は認めなかった。Ghrelinが下垂体においてparacrine autocrine作用によって腫瘍の増殖に関与していると考えられた。以上の結果より、転写活性因子は核内レセプター・視床下部ホルモンレセプターとの相互作用によって転写活性や腫瘍の増殖にも関与することが示唆された。