hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオ分子結合型細胞内分子輸送デバイス

細胞内にナノ粒子を輸送する際、細胞膜の透過およびエンドソームは障害となる。まず、イメージング性能の向上を目指し、量子ドット(QD)をリン脂質ポリマーで内包する手法を確立し、高輝度化を実現した。さらに表面に結合させるバイオ分子の種類と組成に関して検討し、最適な条件を確立し、細胞に対して高い親和性、低い侵襲性を持ちながらも、細胞膜を透過するナノ粒子系を創製した。また、pH応答性のMPCポリマーの構造制御と機能化を、リビングラジカル重合を適用して実施し、これを利用したナノ粒子系を実現した。細胞内に取り込ませることで、細胞内pH環境を解析することに成功した。これは今後の薬物動体の解析などに重要である。本研究は、「細胞を対象とした細胞外からの物質輸送、細胞内での移動を、細胞内の特殊環境を考慮しながら追跡し、その速度定数を明確にする細胞内分子輸送プローブを創製する。さらに、このプローブを利用して未解明な点の多い、細胞膜からの分子の取り込み過程を、細胞膜への分配、細胞膜中での拡散、細胞膜から細胞質内への脱離に分けて定量的に考察する。ナノ粒子を溶媒蒸発法にて作製するために、水中で安定な会合体を形成し、その内部に疎水性の核ポリマー溶液を可溶化できる両親媒性のMPCポリマーを合成した。核の安定性を高め、量子ドットを担持するためにも疎水性のアルキルメタクリレート中心に検討した。さらに、バイオ分子を温和な条件で反応させ、ナノ粒子表面に結合させるために活性エステル基を導入した。得られたMPCポリマーを溶解した水溶液中に、ポリ乳酸の有機溶媒溶液を滴下して、超音波照射による乳化分散後、加熱、減圧することでMPCポリマー被覆型ナノ粒子を作製した。このプロセスを、MPCポリマーの種類、濃度などをパラメーターとして変化させて、粒径8-250nmの範囲で精密に制御する条件を決定した。表面に結合させる生理活性分子についても検討し、細胞膜を透過させることのできるオリゴペプチドの構造、結合密度についての情報を得た。細胞膜を透過させるためのオリゴペプチド構造としては、グリシン(G)は全く不活性であり、カチオン性のアルギニン(R)が効果的であることがわかった。さらにRがGに対して80モル%以上必要であるとともに、密度の効果についても全体の80%がオリゴアルギニンであることが必要であった。一方、これらのナノ粒子は細胞に対して影響することなく、細胞は通常の増殖挙動を示した。細胞内の粒子の拡散性については、共同研究を開始することができた。細胞内の任意の場所にナノ粒子を輸送する際、細胞膜の透過およびエンドソームへの捕捉は障害となる。今年度は、イメージング性能の向上を目指し、多数の量子ドット(QD)を一つの2ーメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマーナノ粒子に内包する手法を確立し、高輝度化を実現した。さらに表面に結合させるオリゴペプチドの種類と組成を変化させることで、細胞内器官への分布を調節する試みを行った。活性エステル基を有するMPCポリマーでQDを被覆したナノ粒子(PMBN/PLA/QD)を作製した。さらに、その作製条件の検討により高輝度化を実現した。細胞機能として特定分子の核輸送に着目し、核輸送に必要な特性をキャリアーに付与するバイオ分子の化学構造と動態の関係を定量的に評価した。細胞膜透過性ペプチドであるR8と核移行シグナルペプチドであるNLSを用いて、細胞膜透過性および核移行性をPMBN/PLA/QDナノ粒子に付与した。核まで達するには、途中段階の細胞膜透過および細胞質移行を効率よく行うことが重要ため、NLSとR8の組み合わせおよびポリエチレンイミン(PEI)を用いて細胞膜透過および細胞質移行の効率化を評価した。R8の割合の増加によりエンドソームからの脱出効率が高まることがわかった。また、PEIの共固定も有効であった。核への物質送達には細胞内においてNLSの機能発現が必要である。NLSに加えR8を固定化することで、核輸送に必要な細胞膜透過性および細胞質移行能をキャリアーに付与することが可能であることが示唆される。また、新たに水溶性両親媒性MPCポリマーに分子ビーコンを結合した分子捕捉キャリアーを合成し、細胞内への拡散現象による取り込みと、細胞内でのmRNAの選択的捕捉特性に対するポリマー分子構造の影響について評価した。水溶性で両親媒性のMPCポリマーは、水溶液中で会合体を形成し、内部に疎水性化合物を包含することを報告してきた。この特性を利用すると、ポリマーナノ粒子の表面被覆が可能であり、表面にリン脂質極性基を高密度に有し、様々なバイオ分子を固定化した粒子を創製した。さらに、ナノ粒子の内部に量子ドットを内包した蛍光ナノ粒子は、表面に細胞膜透過ペプチド(R8)を結合することで、細胞内にマクロピノサイトーシス機構で導入できることを見出した。蛍光強度を高めるためのQD内包型ポリマーナノ粒子の調製条件の詳細な検討と、新たに両親媒性MPCポリマー自体が細胞膜を拡散する特徴を活かして、新しい分子プローブを創製した。すなわち、MPCポリマーに細胞内で生成するタンパク質のmRNAを結合するサイトを分子ビーコン(MB)として結合させ、細胞内での反応追跡をおこなった。(1)ポリマーナノ粒子にQDを内包させる際のQD/ポリマー比、超音波照射時間を調整することで、量子収率が30%程度(未処理のQDでは50%程度)のこれまでにない蛍光特性に優れたナノ粒子が得られている。

これまでの細胞適合性に加えて、蛍光量子収率の高いQDを多数内包することに成功している。(2) MBを結合させるMPCポリマーとしてPMBSを合成した。PMBSにヒトGAPDHに特異的なMBを固定化することができた。このPMBS-MBは、GAPDHと反応して蛍光が発現することが確認された。また、MB単独では生体内に存在する酵素により容易に分解されるが、PMBS-MBは安定に存在し、細胞膜を透過できることを見いだした。細胞内でPMBN-MBの機能を評価した結果、PMBS-MBは細胞内に存在するバイオ分子の影響を受けることなく、特異的に標的となるmRNAに結合した。細胞内分子反応プローブとしてのPMBS-MBの有効性を結論した。1)ナノ粒子表面修飾ポリマーの精密合成を、長鎖アルキル基を末端に有する可逆的付加-開裂連鎖移動剤によるリビングラジカル重合により実施した。モノマーとしてMPC、DEAEMA、およびMEONPを選択しPDbNbMを合成した。これを用いて粒径20-30 nmのナノ粒子QD/PDbNbMを調製した。周辺のpH変化によりpoly(DEAEMA)セグメントが伸長・収縮することを見いだした。QDと有機蛍光色素Alexaとの間のFRET現象を利用し、蛍光スペクトルのpH依存性およびそのFRET効率との関連を明らかにした。Alexaを結合したナノ粒子の蛍光スペクトルは、pHに応答して変化することを確認した。ナノ粒子表面に細胞膜透過性ペプチドであるオクタアルギニン(R8)を固定化したR8-QD/PDbNbM-Alexaナノ粒子のエンドサイトーシス経路による細胞内移行、エンドソーム内での移動、さらにエンドソームから脱出する一連の過程を、FRET現象の変化として捉えた。これは、エンドソーム内のpH低下と、その後のエンドソーム破壊を連続的に観察した初めての事例である。2)光反応性タンパク質キャリアーとしてMPCと、光照射により解離するユニットを利用して、光反応性リン脂質ポリマー(PMB-PL)を合成した。PMB-PLを水溶液への分散剤として利用しナノ粒子を調製した。タンパク質をPLユニットに固定化し、光照射すると1分間で固定されたタンパク質の90%以上がナノ粒子から放出された。細胞透過性ペプチド、R8を固定することにより、ナノ粒子は細胞に取り込まれた。この状態で、光照射するとタンパク質は細胞の中で脱離し、細胞質内全体に拡散することがわかった。すなわち、R8を固定化した光反応性MPCポリマーに覆われたナノ粒子は、細胞質内へタンパク質を送達し、その場でタンパク質を放出できるキャリアーとして有用である。細胞内にナノ粒子を輸送する際、細胞膜の透過およびエンドソームは障害となる。まず、イメージング性能の向上を目指し、量子ドット(QD)をリン脂質ポリマーで内包する手法を確立し、高輝度化を実現した。さらに表面に結合させるバイオ分子の種類と組成に関して検討し、最適な条件を確立し、細胞に対して高い親和性、低い侵襲性を持ちながらも、細胞膜を透過するナノ粒子系を創製した。また、pH応答性のMPCポリマーの構造制御と機能化を、リビングラジカル重合を適用して実施し、これを利用したナノ粒子系を実現した。
低温プロセス高アスペクト比Ｃｕ－ＴＳＶによるチップ内低応力化

本年度は環境対応型グリオキシル酸還元無電解銅めっきの300mmウエハ上での試験、およびその電気特性評価を検討した。機械、電気特性評価に使用したTSVの開口径は3μm、深さは50μmと従来のスパッタ法では達成困難なアスペクト比を有している。さらにCoもしくはRuを下地膜とし無電解めっきによりCu膜を堆積する手法は半導体配線では例のない形成手法である。グリオキシル酸のRu上での還元反応は溶存酸素共存下では反応が開始されるまでに数分の誘導時間があることを電気化学的に解明し、窒素環境下ではその誘導時間が大幅に低減されることを見出した。さらに昨年度Ru上のめっき反応はRu最表面の状態に強く依存することを解明したが、本年度はRu表面で触媒活性となる還元剤型めっき前処理液を見出し、前処理を含めてウエットプロセスのみによるRu上の無電解銅めっき堆積手法を構築した。年度後半はこれらの最適化した無電解めっきプロセスを300mmSiウエハ無電解めっき装置に移管し、より実プロセスに近い環境での試験を行った。300mmウエハ上のRuを触媒とする無電解めっきの堆積速度はビーカーでのSiピース上の実験結果と同程度であった。まためっき膜の膜厚はばらつき2%以下と高いウエハ面内均一性を示した。この無電解めっきシード層を用いて形成したTSVはCuの余剰堆積が従来のPVDと比較し6倍程度低減され大幅なCMPのコスト低減が見込まれる。また今回使用した無電解Cu/Ru/ALD-TiN膜の電気特性およびバックサイドSIMSにより評価したCu拡散バリア性はPVD-Cu/PVD-Taと比較し遜色ない結果であった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は機械、電気特性評価に使用する高アスペクト比TSVへの無電解めっき法の応用を検討した。ALD-RuもしくはCVD-Co上で形成された無電解Cuめっき膜は高アスペクト比TSV内壁に均一な膜厚で堆積することを見出した。このTSVの開口径は3μm、深さは50μmと従来のスパッタ法では達成困難なアスペクト比を有している。CoもしくはRuを下地膜とする無電解Cuめっきの応用は世界で例のない半導体配線形成手法である。無電解Cuめっきの還元剤は従来人体及び環境に有害であるホルムアルデヒドが使用されてきた。しかし本研究では毒性のないグリオキシル酸を還元剤とする無電解めっきの膜特性評価、Co、Ru上での反応機構解明、TSVへの応用を検討した。電気化学測定によりCu核生成反応は触媒反応であり、ホルムアルデヒドと比較し遜色のないめっき堆積レートが得られた。Co上ではホルムアルデヒドは陽極酸化反応を示さなかったが、グリオキシル酸ではその反応がみられた。堆積した膜の表面粗さは安定剤の添加量に比例し平坦化し、またこの安定剤を添加し成膜された無電解銅めっき膜は膜中不純物が非常に少なく、今後そのメカニズム解析を進めていく。300mmSiウエハ上での無電解めっきの実験もベルギーIMECにて平行し行い、ウエハ内の面内膜厚分布や無電解めっき装置でのめっき堆積レートを得た。めっきおよび無電解銅めっきの300mm装置上での実験を行うために、添加剤による無電解めっき浴長寿命化を検討し、ホルムアルデヒドを還元剤とする安定剤がグリオキシル酸でも有効であることを証明した。

26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り高アスペクト比TSV形成、及び300mmSiウエハでの実験に移行。300mmウエハレベルでの無電解めっきを用いて作成した高アスペクト比TSVの機械的、電気的特性評価。またそのデータを元にした更なる低温プロセスの開発、評価。
Genetic Analysisによる象牙質劣化における個体差の解明

抜去歯の歯髄と象牙質からの抽出方法の検討を行い、9.8ng/μlと、5.8 ng/μlのDNAを得ることが出来た。また、MMP9におけるrs17576の遺伝子多型をHigh Resolution Melt解析法分析法を検討し、またその遺伝子多型の頻度について分析を行った。NCBIのデータベースで10004サンプルのデータからrs17576のアリル比率ではA/A, A/G, G/Gの頻度は36.7%、44,6%、18,7%であり、HRMAによる分析でも同様に3群に分類された。自動pHサイクル装置を用いた負荷試験と組み合わせることによって、象牙質劣化を遺伝子多型によって分析する方法が確立された。MMP多型と接着材料の象牙質接着強さの関連を分析するため、微小引っ張り接着強さ試験を行う歯牙象牙質からのDNA抽出方法の確立をめざした。微小引っ張り強さ試験には歯冠部象牙質を用いるため、根尖部象牙質からのDNA抽出方法を検討した。根尖部を切断したのち微小引っ張り強さ試験をおこなうため、根尖部の切断によって象牙質厚さが接着強さに影響がないかどうかについて検討をおこない、根尖部の切断は微少接着強さに影響が無いことが確認された。また、得られた根尖部歯質の根管内象牙質からの象牙質を切削して得られる象牙質切削片をEDTAで溶解してDNAの抽出を試みた。十分な量を採取する方法の確立まではまだ至っていない。抜去歯牙を用いた遺伝子解析についてはすでに、歯科材料の開発及び評価のためのヒト抜去歯を用いたin vitroにおける研究の倫理申請に基づいて得られた抜去歯牙を既存試料・情報の利用の例外規定を適用して研究を行うよう倫理申請を申請中である。抜去歯牙をラウンドバーで切削し、象牙質、歯随、歯根膜を試料として、DNA抽出キットを用いてDNA抽出を行った。得られたDNAはハウスキーピングジーンであるglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)とbeta-actin (ACTB)に特異的なプライマーとSYBR greenによるリアルタイムPCRによって定量し、ヒトゲノムのDNAであることを確認した。フッ素は歯質の耐酸性の向上だけでなく、MMP阻害剤としても機能する。フッ素含有の歯面コーティング剤による耐酸性の向上と、フッ素の取り込みについて、自動pHサイクルを用いて検討を行った。Transversal Microradiography (TMR)方によるミネラルプロファイルを用いて脱灰抑制効果を分析した。またmicro-particle-induced gamma / X-ray emission (Micro-PIGE/PIXE)を用いて歯質へのフッ素の取り込みを分析、検討した。フッ化物含有コーティングによって脱灰抑制効果が認められた。歯質表面にフッ素の膜が認められたが、その分布はやや不均一であり、コーティング剤の塗布条件によってフッ素の分布にばらつきが出来ることが示唆された。高濃度にフッ素が局在している領域は3000ppm程度で、MMPの活性を阻害するのに十分な濃度であった。フッ素含有塗布剤の塗布により、う蝕抑制効果と合わせてMMP活性阻害による象牙質の劣化抑制が期待される事が示唆された。本年度では抜去歯からのDNA抽出方法では更にDNAの回収率の改善の効率化を行った。象牙質の分析を行うこと考慮し、1)象牙質分析試料作成時の象牙質粉、2)根尖を切断した切断片、3)歯髄腔内の歯髄および象牙質粉を試料として、それぞれの試料をEDTAで溶解したのちQiagenのQIAmp DNA Mini kitを用いてDNAの抽出を行った。象牙質粉試料(500mg)から1.0(0.7)ng/μl、根尖試料(300mg)および、歯髄腔内切削試料からは、それぞれ9.8(1.8)ng/μlおよび5.8(1.7)ng/μlのDNAが得られた。MMP2におけるSNPのrs520640を対象に, HRM分析のためのプライマー設計と増幅領域のSNPの頻度について分析を行った。NCBIのデータベースを元にして138017サンプルのrs520640のアリル比率分析を行った。A/GのアリルでAとGの比率がそれぞれ43.42%と56.58%であった。今回設計したPCRの増幅領域には他にもSNPが存在している。その内の1つがrs646910の比率はAが20.67%,Tは79.33%であるがAAのホモタイプは7.79%であり、ATヘテロを含むT alleleの比率は92.21%であった。その他のいくつかのSNPは確認されているがその割合は1%未満であった。したがって我々の設計したプライマーを用いることによりrs520640のSNPを迅速に識別出来る可能性が示唆された。

NCBIのデータベースで10004サンプルのデータからrs17576のアリル比率ではA/A, A/G, G/Gの頻度は36.7%、44,6%、18,7%であり、HRMAによる分析でも同様に3群に分類された。自動pHサイクル装置を用いた負荷試験と組み合わせることによって、象牙質劣化を遺伝子多型によって分析する方法が確立された。MMPのSNPと象牙質の劣化の関連性を検証するために必要な、クオリティが近い歯牙収集を十分な数を確保することが困難となっており研究の進行がややおくれている。保存修復MMPのSNPをノックアウトしたマウスを用いて研究の遂行を行うことも検討している。得られた根尖部歯質の根管内象牙質からの象牙質を切削して得られる象牙質切削片をEDTAで溶解してDNAの抽出を試みているが、十分な量のDNAを効率的に抽出する方法のかくりつまではいたっておらず、その後のSNP解析まで進めることができていないため。DNA抽出とPCRの試薬の購入を検討していたが、使用状況と使用期限を考慮し、次年度に購入することとしたため。今後の実験の方法の確立のため、歯根象牙質からのDNA抽出方法の確立を最優先におこなってゆく。また、MMP2のSNP:ー735C>T (rs2285053)の解析のためのプライマーの設計を行う。プライマーの設計はHRMAによる分析方法による分析などを考慮し、MMP2に特異的なだけでは無くrs2285053のSNPを含み他のいくつかのSNPを含む様に設計する。DNAシークエンスによる解析へと推進してゆく。DNA抽出とPCRの試薬の購入し研究を遂行する予定である。
網膜グリアによる神経保護と再生能に関する研究

本研究では網膜Mullerグリア細胞あるいは周囲の神経細胞から、神経栄養因子受容体であるTrkBが欠損する領域特異的ノックアウトマウスを作製した。それらの解析を通して、グリア細胞における神経栄養因子のシグナル伝達が神経保護と再生の両面において重要な役割を持つことを示した。さらに今後の研究にも応用可能な領域特異的マウスの作製と利用に道筋をつけることができた。網膜は中枢神経組織の中でも細胞系譜がほぼ解明され、解析ツールが整ったモデル器官といえる。網膜では内在性神経前駆細胞としてMullerグリア細胞の機能が注目されつつあるが、本研究ではglial fibrillary acidic protein(GFAP)の発現に着目し、GFAP陽性および陰性Haller細胞の神経前駆細胞としてのpotentialを解析する。またGFAP陽性Muller細胞を発生過程の網膜および変性網膜において可視化して追跡することにより、in vivoにおける脱分化過程を検討するとともに,Mnller細胞特異的な遺伝子欠損マウスを活用し、Muller細胞がもつ神経保護・再生能の全体像を解明することを目的とする。本年度は以下の事項を中心に研究を進めた。GFAP-cre/ROSA mouseにおけるMuller細胞の発生を、X-gal染色とGLASTを含む種々のMuller細胞マーカーを用いた免疫組織化学的手法によって経時的に調べ、各々のマーカーのGFAP陽性・陰性細胞における陽性率を比較した。BrdU陽性細胞中のβgal陽性細胞比率を定量化し、GFAP陽性Muller細胞のin vivoにおける再生能を検討した。GFAP-cre/ROSA mouse由来の培養Muller細胞に対し成長因子、グルタミン酸、レチノイン酸、Wntなどを添加して、神経細胞への分化誘導を試みることにより、Muller細胞のサブタイプ毎に神経前駆細胞としての効率を検討中である。今後はNR1またはTrkBがMuller細胞から欠損したCKOマウスや低親和性神経栄養因子受容体p75NTRノックアウトマウスからMuller細胞を単離し、それぞれの分化・再生能を野生型マウスのMuller細胞と比較することにより、Maller細胞の細胞運命決定における外因性因子の重要度を明らかにしていく。本研究では網膜Mullerグリア細胞にcreが発現するhuman GFAP-cre mouseを活用した(Zhu et al. Development, 2005)。そして網膜における主要な神経栄養因子であるBDNFの受容体であるTrkBに注目し、TrkB flox/flox : GFAP-Cre mouseを完成させた。一方で網膜神経節細胞とアマクリン細胞から神経特異的にTrkBが欠損するTrkB flox/flox :ckit-Cre mouseを作成し、両者の神経保護能の違いをin vivoで検討した。その結果意外なことに、これら2種類のKOマウスでは、グルタミン酸毒性による網膜神経節細胞死は同程度であることがわかった(Harada et al., Nature Communications, 2011)。またTrkB flox/flox : GFAP-Cre mouseにおいては、BDNFが薬物投与による視細胞変性を抑制できないだけでなく、野生型マウスでは観察されるMuller細胞の増殖や視細胞マーカーの発現(Muller細胞から視細胞への分化転換)も観察されなかった。これらの結果は、Muller細胞におけるBDNFシグナル伝達が神経保護と再生の両面において、重要な役割を持つことを示している。またこの遺伝学的モデルは、中枢神経系組織のグリアとニューロンで特異的に働く遺伝子の機能を、in vivoで調べられる系を提供している。以上のように本研究ではグリアと神経栄養因子の機能の新たな側面について、今後の参考となる大きな知見を得ただけでなく、今後の研究で使用する重要なKOマウスの作成と利用に道筋をつけることができた。特に大きな障害はなく研究を遂行中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究を遂行する上での問題点は特にない。
microRNAを介した全身麻酔作用機序の検討

全身麻酔はその使用経験、臨床研究の結果に基づき使用されているが、分子生物学的検討が行われることは少なく、その機序は不明な点が多い。麻酔薬による各臓器、癌への影響を検討することは、周術期管理の安全だけではなく長期予後の改善につながり、未だ詳細が不明な麻酔薬の機序を明らかにする一助になると考えた。microRNA(miRNA)はmessenger RNA(mRNA)の翻訳制御など遺伝子発現を調整する機能を有する。これまで我々はmiRNA発現に関して、肝臓、肺、脳および血液において包括的に測定し、吸入麻酔薬セボフルランや静脈麻酔薬プロポフォールによる影響をそれぞれの臓器において検討した。すべての臓器において、麻酔薬により5080%のmiRNAに発現変化を認めた。また、血液試料では筋肉特異的miRNA発現が減少し、一方で、骨格筋や心筋では増加し、骨格筋障害や心筋障害時のパラメータへの応用およびの機序解明の一助となることも推察された。これら結果より、各miRNAの発現変化がもたらす生物学的な影響の検討、さらに、臓器障害、癌など疾患に対する影響の検討が新たな課題となった。本研究では、悪性高熱症、プロポフォール注入症候群など麻酔薬が障害を与える可能性のある筋組織への影響や、臓器障害時に麻酔薬がどのように作用するのか分子生物学的に検討する。本研究においては、1臨床応用に向けた血液中変動miRNAと筋障害機序解明、2腎虚血再灌流障害に対する麻酔薬作用の解明、3癌細胞に対する麻酔薬作用の解明をテーマとしている。本年度において麻酔薬の筋障害の機序解明、腎虚血再灌流障害における作用解明について検討した。筋障害の解明については、サンプルを採取後に遺伝子プロファイリングを実施。現在、発現変化を認めたmiRNAを探索している。腎虚血再灌流モデルにおいてはモデルを確立しサンプルの採取を終えた。現在は遺伝子プロファイリングを進めている。今後の予定としては筋障害、腎虚血再灌流モデルともに遺伝子プロファイリングを進め、それぞれに関与するmiRNAを明らかにする。その他、病理学的検討あるいはタンパク発現など他の手法を用いて、麻酔薬の作用へのmiRNAの関与を明らかにする。
撞球問題の総合的研究の企画

1900年4月27日に、Kelvin卿が大英帝国科学アカデミーで「熱と光りの力学理論を覆う19世紀の双叢の雲」と言う演説を行い、来るべき相対論、量子論の幕開けへの警鐘とし、そこで「撞球系でエルゴード仮説を検証すべき」ことを提唱してから、丁度百年が経過した。それを機会に、撞球系の総合的研究の企画を意図した。まず、百年記念のシンポジュウムを開催して、この百年の研究の歴史を概観し、最近の研究の報告を行った。日本における最近の研究は、バーコフの問題に関連したビリヤード軌道による層化あるいは共役点と幾何学的構造の関係について、散逸的撞球系の閉軌道、特にそのゼータ関数の詳細な研究、撞球系に現れる量子カオス、スペクトル、量子輸送の研究等である。井上は、アメリカ合衆国での国際会議に参加し、ブニモヴィチ等、世界的な撞球問題の権威者と連絡を取り打ち合わせを行った。また、ヨーロッパからルドラピエ教授、アメリカからワイス教授を招き、最新のカオス・フラクタルの研究の成果を得ると同時に、撞球問題の総合的研究の企画に関し討論を行った。さらに、国内の力学系関連のシンポジュウムの機会を捉えて、分担者が会合し、他の研究者も加えて、企画について議論した。そのような結果、撞球問題は現在非常に重要な局面を迎えていることが判明した。すなわち、本来のエルゴード仮説が充分満足のいく形で証明される段階に到達しようとしている。もともと国際会議の企画を考えていたが、それは少し時期を遅らせることとし、撞球系においてエルゴード仮説を検証することを主目的としたプロジェクトを発足させる方針を固め、基盤研究(B)(1)を申請することとした。盛田は、散逸的撞球系の閉軌道のゼータ関数について詳細な研究を既に開始し、その収束領域の確定とそれを利用して、ゼータ関数から撞球系の特性量を決定することなどに成果をあげつつある。印南は、多様体上の凸領域内のビリアード軌道の大域解析的研究に取り組み、バーコフの問題の解決を目指して、層化性・共役点などの観点から、既に成果をあげつつある。
筋の収縮弛緩の調節の多様性

1.調節タンパクの分子特性と機能(1)免疫蛍光抗体法を用いて培養細胞中の筋蛋白コフィリンの分布を調べた(大日方)。(2)平滑筋のミオシン軽鎖キナーゼの特異的阻害剤ワルトマンニンを用いて、ミオシン・アクチン系が関与する種々の細胞の種々の機能をスクリーニングした(野々村)。(3)Caイオンによるコネクチン(α、β)の分子内切断の分子特性を調べた(丸山、高橋)。(4)ワルトマンニンを用いて、平滑筋のライオトニン成分の精製を行い、そのCa調節を解析した(江橋)。(5)LMMの種々のフラグメントを用いて、ミオシンフィラメントの会合に重要な分子内周期構造を解析した(大井)。(6)M-タンパクの分子特性と遺伝情報発現を解析した(真崎、大日方)2.アクチン・ミオシン・ATP系の反応の調節のキネティックス(1)脊椎動物、軟体動物、甲殻類からトロポニンCを調製し、CDTA処理したグリセリン筋単一繊維に再結合させ、Ca張力の回復を調べた(大槻)。(2)Caged-ATP、Caged-Caを用いたラピッド・キネティックスにより筋の弛緩過程の時定数を決めた(山田)。(3)ATPとGTPを混合した系で「in vitro motility assay」を行い、アクトミオシンの滑り速度はそれぞれ単独の場合よりも速くなることを見つけた(御橋)。上記2-(3)の結果は、3年間の本研究組織の成果として特筆すべきであり、若干補足すると、この実験結果は、GTP単独では無駄になる自由エネルギーが、ATPを結合したミオシンによって滑り速度に変換されることを示唆しており、ハックスレ-などによるこれまでの筋収縮のモデルでは説明できない。<調節タンパクの分子特性とアクチン反応性>___ー(1)コフィリンとADF(アクチン脱重合因子)とは一次構造の相同性が頗る高いが、相同性の低い領域がそれぞれの機能部位になっている可能性が示唆された(大日方)。(2)骨格筋の萎縮に伴ってαークリスタリンと95%の相同性をもつタンパク分子の発現が強く抑制されている(野々村)。(3)骨格筋αーアクチニンのcDNAを培養細胞に導入発現させ機能部位の解析をし、N端側からアクチン結合部位、ダイマ-形成部位、Ca結合部位の順に配列している構造を明らかにした(眞崎)。(4)高いCaイオン濃度にして筋を熟成させるとコネクチンの切断(約1000kD)が起きていること(高橋)、αーコネクチンは二本鎖の構造をとっており容易に一本鎖のβーコネクチンに分解することが電子顕微鏡観察から明らかになった(丸山)。(5)アクチン・ゲルゾリン(1:1)複合体の形成過程をBPM光架橋試薬を用いて調べCa依存と非依存のル-トがあることを示した(大井)。(6)平滑筋のライオトニンとMLCKの収縮抑制効果の比較から両者のISOFORMの可能性が示唆された(江橋)。(7)ジストロフィンの単離にDMSO分画が画期的に有効であることが示された(江橋)。(8)脱感作した筋原繊維にトロポニンCを再導入し張力の回復程度を調べた(大槻)。<アクチン・ミオシン・ATP系の反応>___ー(1)グリセリン処理筋のクロスブリッジとアクチンをEDC架橋し両端を約10nm引き伸ばすと張力が発生するが、この時cagedーATPを加えておきFLASHすると分子変形に伴うと思われる張力低下が観測された(山田)。

(2)ピレンを蛍光ラベルしたアクチンを顕微鏡観察しフィラメントにそってB端からP端に向かって分子内構造の勾配に対応した蛍光強度分布があり、ミオシンATP系による「滑り運動」の最中にはこの強度分布が揺らぐことを見いだした(御橋)。1.調節タンパクの分子特性と機能(1)アクチン結合蛋白コフィリンについて免疫細胞化学的に調べIーフィラメントに局在することを明らかにした(大日方)。Mー蛋白質の全一次構造を決定した。フィブロネクチン、免疫グロブリン類似の構造がみられ同一ファミリ-に属するものと推定された。(眞崎)。心筋にはMー蛋白質類似(あるいは同一)の蛋白が見いだされている(眞崎)。平滑筋のミオシン重鎖を抗原にして、平滑筋と非筋共に反応する抗体、平滑筋のみに反応する抗体の非常に特異性の高いものがとれた(野々村)。(2)アクチンフィラメントの形成核になるαーアクチニンがCa^<2+>によりβーコネクチンと1200kDaの断片に開裂し後者はZ線寄りの特定の位置に局在することを確認した(高橋)。(3)休止時のサルコメア長が10μmもあるザリガニのはさみの筋肉(特に開筋)には3000kDaのコネクチン様タンパク質があることを抗体法により確認した(丸山)。(4)平滑筋のアクチン結合タンパク群および骨格筋のCa依存調節タンパク、トロポニンの分子内組成の詳細な分析を行った(江橋、大槻、大井)。2.アクチン・ミオシン・ATP系の反応の調節のキネティックス(1)CDTA処理脱トロポニンC筋原繊維を用いて、脊椎動物二種(ウサギ骨格筋、ウシ心筋)、無脊椎動物二種(ロブスタ-、ザリガニ)の交叉実験を行い、脊椎動物間あるいは無脊椎動物間では各々互換性があり、脊椎動物と無脊椎動物の間ではないことを明かにした(大槻)。(2)ウサギ骨格筋に少量のCaged-ATPを導入し予め活性化した後でさらに大量のcagedーATPで濃度をジャンプさせ筋の短縮を誘導しその短縮過程を解析し、収縮サイクルには強縮に相当するステップが含まれない可能性を見いだした(山田)。(3)ピレン・ラベルしたアクチンフィラメントの蛍光顕微鏡像を画像解析し長さ方向に沿って構造の不均一性(勾配)があることを明かにした(御橋)。(4)ミオシンの規則的会合部位がLMMにあること、さらにCー末端側の限定された領域のアミノ酸配列が重合に必須であることを明らかにした(大井)。1.調節タンパクの分子持性と機能(1)免疫蛍光抗体法を用いて培養細胞中の筋蛋白コフィリンの分布を調べた(大日方)。(2)平滑筋のミオシン軽鎖キナーゼの特異的阻害剤ワルトマンニンを用いて、ミオシン・アクチン系が関与する種々の細胞の種々の機能をスクリーニングし、これまで予想もされなかった程に多様性を見いだした(野々村)。(3)Caイオンによるコネクチン(αβ)の分子内切断によって生じたペプチド断片の分子持性を調べち(丸山、高橋)。(4)平滑筋のミオシン軽鎖キナーゼの特異的阻害剤のワルトマンニンを用いて、平滑筋のライオトニン成分の精製を行い、平滑筋アクトミオシンのCa調節を解析した(江橋)。(5)ミオシンフィラメントの会合に重要な分子内周期構造の基本的パターンを探索するためにLMMの種々のフラグメントについて、水和、温度効果、圧力などの影響を実験と理論により解析した(大井)。(6)Mータンパクの分子持性と遺伝情報発現の解析(真崎、大日方)2.アクチン・ミオシン・ATP系の反応の調節のキネティックス(1)脊椎動物、軟体動物、甲殻類からトロポニンCを調製し、CDTA処理したグリセリン筋単一繊維に再結合させ、Ca張力の回復を調べた(大槻)。
表現促進現象を有する家族性もやもや病のCNV解析

成人発症もやもや病の親から、小児もやもや病の子が生まれた場合(臨床的表現促進現象)、子はより顕著なもやもや病の遺伝的素因を保有している可能性がある。もやもや病親子例を対象として、全ゲノム網羅的マイクロアレイ遺伝子コピー数多型(CNV)解析を実施した。もやもや病親子15組中、表現促進を認めた10組では、16番染色体短腕上(16p13.3)の410kbpの領域にCNVを認める頻度が高く、遺伝子コピー数が、親世代より子世代で増幅している傾向を認めた。遺伝子コピー数の世代を超えた増幅が臨床的表現促進現象の背景となりうることが示唆され、次世代シーケンス解析による、より詳細な検証が必要である。平成25年度は、本研究資金(2013年度基盤研究(C))の獲得を受けて、北海道大学医学部医の倫理委員会に研究実施申請を行い、倫理審査で承認をうけた。これを受けて、平成25年8月30日から北海道大学において本研究を開始した。第一に、診療録に基づき家族性もやもや病患者の家系調査を実施した。その結果、1980年から2014年3月までに、北海道大学病院脳神経外科で診療したもやもや病全306症例のうち、親より子の発症年齢が若い臨床的表現促進現象が確認されたのは、39症例(12.7 %;17家系・21親子)であり、本研究の対象症例と考えられた。その内訳は、母-娘10組、母-息子7組、父-娘3組、父-息子1組であった。発症時の平均年齢は、親世代41.6歳(29 - 61歳、N = 18)、子世代13.0歳(1-34歳、N = 20)であった。39症例のうち、成人発症もやもや病(発症年齢18歳以上)が24例、小児発症もやもや病(発症年齢18歳未満)15例であった。また、発症年齢の組み合わせ(親世代-子世代)は、成人発症-成人発症が5親子、成人発症-小児発症が16組であった。第二に、ヒト末梢血白血球からゲノムDNA抽出とコピー数多型(CNV)アレイ解析を実施した。2014年3月末現在の進捗状況は、対象39症例のうち15名の被験者から文書による同意のうえ、末梢血採血を実施し、白血球の分離・ゲノムDNAの抽出と精製および品質チェックを終了した。現在までに8例分の試料についてCNVアレイ解析を終えた。日本人健常対照データ(N=43, Affymetrix社提供)としてCNVを検出した結果、全体で38カ所のCNV変異領域が同定された。今年度もさらに既に判明している対象症例に加え、新規に診療を開始する症例でも対象に当てはまれば加えて、症例数を増やしていく予定である。前年度までに判明した、表現促進現象を有するもやもや病親子例で特異的なCNV領域(16番染色体上の410kbpの範囲(chr16:1026093-1419291)について、今年度さらに詳細に検討した。今回検討に用いたマイクロアレイでは、もやもや病感受性遺伝子RNF213をコードするDNA配列内にCNV probeが含まれていないが、少なくともRNF213遺伝子を含む17番染色体の既報の感受性遺伝子座(17q25.3や、17q25-ter)には、特異的なCNVは検出されなかった。当該CNV領域に含まれる既知の遺伝子配列は、NCBI (National Center for Biotechnology Information)などを利用して精査した結果、14遺伝子であった。含まれる遺伝子には、血管平滑筋機能に関わる電位依存性カルシウムチャンネルのサブユニットをコードする遺伝子(CACNA1H)も含まれていた。これらの遺伝子機能そのものがもやもや病に関連しなくても、CNVそのものの遺伝子構造多型が近接する遺伝子機能に影響を及ぼして、もやもや病の発病素因に関わっている可能性もあるため、遺伝子機能自体や関わるパスウェイは考慮せず、この範囲のDNA配列の中の、どの部分のコピー数が変異しているのか、対象のもやもや病患者と、脳血管疾患をふくめた神経疾患罹病歴・家族歴のない健常対照者のゲノムDNAを用いて、本領域のDNA配列のシーケンス解析(アンプリコンシーケンス)を実施した。結果の詳細は研究成果報告書(Fー19)にて報告するが、マイクロアレイの結果がシーケンス解析によりさらに詳細に確認された。脳血管障害学平成25年度計画のうち、家族性もやもや病患者の家系調査については、現在までに北海道大学病院脳神経外科で診療したもやもや病全症例の中から、対象となる臨床的表現促進現象を呈するもやもや病親子例を抽出し、すべての家系調査を終了している。

ヒト末梢血からのゲノムDNA抽出とCNVアレイ解析については、外来受診される対象被験者から順次、採血による試料収集とCNVアレイ実験を進めており、現在全対象予定患者39例中15例(38%)の試料収集とCNVアレイ実験が終了している。総合的に、平成25年度の研究計画は、おおむね計画通りに進捗していると考えられる。現在までに当科診療中の対象者の家系調査は既に終了しているので、順次本年度も採血試料の収集とCNVアレイ解析を進め、本年度中にはすでに判明している全対象者からの試料収集解析は終えることが可能と思われる。新規に診療を開始する症例でも対象条件に当てはまれば加えて症例数を増やす。さらにデータが揃った時点でCNVアレイ結果の解析を行う予定である。データ解析料が当初見込んでいた金額より、安くなったため。データ解析料として使用予定。
中等教育における新しい関数指導のための理科・数学を融合した教材の開発とその評価

大学生にこれまで習ってきた数学について聞くと,次のような学習像が浮かび上がる:教員から与えられた問題を教員から教えられた解き方で,生徒が解答し,その答えを教員が評価する。ところが,実際の科学研究の流れは,問題の発見→モデル化→数学的処理→一応の解決→新たな問題の発見→...と続いていく。つまり,生徒は上の図式の一部である,数学的処理だけを練習していることになる。しかし,創造性,論理性の涵養,そして,理数科目への学習意欲を持たせるためには,上記の科学研究の流れを経験することが重要であるとの観点から,中等教育における教材の開発を目指した。そのためには身近にある問題の発見から出発するのが,適当であると考え,理科・数学を融合した教材の開発に着手した。[実践の記録](1)滋賀県立彦根東高校SSクラス,2006/9/6,13,20(2)滋賀県立虎姫高校招聘講座,2006/12/20(3)滋賀大学教育学部附属中学大学訪問学習,1年生,2006/8/31(4)守山市立守山中学校3年数学集中選択,2006/9/14,2007/1/17実践の内容,評価を,研究成果報告書として作成した。◎円錐曲線を題材にして,高校の理科と数学を融合した授業のための教材を作成しました。円錐曲線は,古代ギリシアの時代に発見され,準線,焦点,離心率などの基本的な性質はその時代に得られています。その後,ガリレオによる放射体の軌跡が,parabolaになること,その後,ケプラー,ニュートンによる惑星,彗星の軌道としての楕円,双曲線の再発見などがあり,科学史の上からも興味深い対象であります。それと同時に円錐曲線は,懐中電灯で出来る光の形,噴水の形,そして,地面に立てた棒の影の先端の動きなど身近に発見できる曲線でもあります。さらに,デカルトの座標平面の発明以後は,解析幾何学の2次曲線として研究されてきました。このようにいろいろな面を持つ円錐曲線を題材にすることで,例えば,楕円の持つさまざまな面,相互の表現の関係などに気づき,理解し,楽しむことが出来る教材を目指しました。更に,実際の活動として,懐中電灯で照らしてみる,地面に立てた棒の影の動きを観察する,ビー玉を落としてみる,ガリレオの実験を再現してみるなどを盛り込み,いくつかの性質の証明には,Cabri, Functionviewなどの図形ソフト,グラフソフトを用いることで証明のアイデアの理解が進むようにしてあります。◎中学校の平方根の発展学習として,平方根の近似値を求める授業案を作成し,実施しました。そこでは,2つの方法,開平計算とニュートンの近似法を原理とする方法を紹介しました。開平計算は割り算の筆算の仕組みを再確認することで導入できます。また,ニュートンの近似法は,長方形の等積変形により正方形を近似することに翻訳できます。そして,反比例のグラフも等積変形の中で見えてきます。このように,平方根の近似値を求める中でそれまで学んだ割り算の筆算,反比例のグラフなどが顔を出す,面白さを目指した授業にしました。◎中学校で,比例のグラフを活用する教材を作成中。◎「自然界の最大・最小問題」「正多面体と結晶」をテーマに高校のテキストを作成中。
主要諸外国の体育・スポーツ指導者専門養成に関する比較研究

体育・スポーツの学問的研究分野の内容概念を学校や社会における実際の指導の目的・内容・対象の見方・考え方は,1960年代の後半以来,本研究の対象諸国(英,米,カナダ,西独,オーストラリア,日本等)において変化してきている。学問的には,英国では人間運動学(HUMAN MOVEMENT STUDY),西独ではスポーツ科学(SPORTWISSENSCHAFT)そして米国では,この2つの考え方を統合するような人間身体運動科学(SCIENCE OF HUMAN MOVEMENT KINESIOLOGY)の概念・名称が定着するかのようにみえる。しかし,高等教育機関(大学)におけるこの学問研究分野は,それぞれの対象国において,まだ必ずしも確立していないようである。学校や社会における体育・スポーツの実際の指導に関しては,脱工業化社会,都市化社会,出生率の低下等の影響をうけて,健康・体力づくり,レクリエーション・スポーツ競技力向上等の目的が主張され,指導者の専門養成におけるこれらの目的に対応するカリキュラム内容や方法や資格の認定等が立ち遅れている感じがみられる。専門養成過程のカリキュラムの内容や方法や資格の認定は,各国あるいは各大学で多様であるが,米国では1970年以来スポーツ科学・医学の分野の発展と社会的必要性を反映して,いくつかの個別大学で独自にスポーツ医科学の分野に属する専門家(トレーナー,コーチなど)を養成する努力がみられている。わが国では戦後新制大学設立以来の制度・内容を踏襲してきているようであるが,新しい学問分野の発展と社会の必要性に応じて,体育・スポーツ指導者養成を再検討することが急務である。
車輪式農用車両の傾斜地における横滑り発生機構の解明と動的横滑り防止制御

近年日本の農業は耕地面積の減少や農業従事者の減少と高齢化,食料自給率の低迷などの多くの課題を抱えている.その中でも労働力不足は深刻化しており,近年では解決策として人に代わって作業を自律的に実行する機械の導入が進められている.ロボットトラクタは高効率化・省力化で期待され,近年普及が進んでいる.しかしながら,ロボットトラクタは平地の地域では多く普及が進んでいるが,丘陵地帯では普及が進んでないのが現状である.傾斜地走行では両駆動輪の荷重差より推進力の差が起こり,差動装置による旋回作用が生じる.また,両駆動輪には斜面による下方向分力によって横滑り作用も生じる.そして,傾斜地でのトラクタ作業は,トラクタ・作業機の傾斜に伴い,走行性能の低下はもとより,転倒の危険性も伴う.本研究では車両にかかる斜面の下方向分力と力学的平衡を保たせるため前輪に適切な偏角をもたせて走行させる制御アルゴリズムを構築し,傾斜地走行での安定化を開発目標とする.本年度傾斜地・平地で自動走行実験を北見市旧競馬場で実施し,開発した自動操舵システムの性能を検証した.次年度から偏角をもたせて走行させる制御アルゴリズムを実現する実験を行う予定である.本年度の実験は順調に平地と傾斜地で実行した.傾斜地での実験結果は予測と同じように片側の誤差が大きい現象が発生したことを実験で確認できた.原因としては以下の二つと考えられる.一つ目は傾斜地走行では両駆動輪の荷重差より推進力の差が起こり,差動装置による旋回作用.二つ目は傾斜方向へ重力の分力の影響で横滑り力が発生し,車両が傾斜方向へ旋回する.この二つの原因による影響が大きいことをこれから実験で確認することが必要である.平成31年度に動的補償制御法を用い横滑り防止の有効性を明らかにする.動的補償制御法は一段階にトラクタを滑る可能性がある反対方向へ走行経路を修正する(大範囲制御),二段階に横滑り距離を推定し,ハンドルの偏差操舵により自動的に制御する(補償制御).横滑りが発生しても,トラクタと作業機が作物列に沿って高精度な自動走行を実現する.近年日本の農業は耕地面積の減少や農業従事者の減少と高齢化,食料自給率の低迷などの多くの課題を抱えている.その中でも労働力不足は深刻化しており,近年では解決策として人に代わって作業を自律的に実行する機械の導入が進められている.ロボットトラクタは高効率化・省力化で期待され,近年普及が進んでいる.しかしながら,ロボットトラクタは平地の地域では多く普及が進んでいるが,丘陵地帯では普及が進んでないのが現状である.傾斜地走行では両駆動輪の荷重差より推進力の差が起こり,差動装置による旋回作用が生じる.また,両駆動輪には斜面による下方向分力によって横滑り作用も生じる.そして,傾斜地でのトラクタ作業は,トラクタ・作業機の傾斜に伴い,走行性能の低下はもとより,転倒の危険性も伴う.本研究では車両にかかる斜面の下方向分力と力学的平衡を保たせるため前輪に適切な偏角をもたせて走行させる制御アルゴリズムを構築し,傾斜地走行での安定化を開発目標とする.本年度傾斜地・平地で自動走行実験を北見市旧競馬場で実施し,開発した自動操舵システムの性能を検証した.次年度から偏角をもたせて走行させる制御アルゴリズムを実現する実験を行う予定である.本年度の実験は順調に平地と傾斜地で実行した.傾斜地での実験結果は予測と同じように片側の誤差が大きい現象が発生したことを実験で確認できた.原因としては以下の二つと考えられる.一つ目は傾斜地走行では両駆動輪の荷重差より推進力の差が起こり,差動装置による旋回作用.二つ目は傾斜方向へ重力の分力の影響で横滑り力が発生し,車両が傾斜方向へ旋回する.この二つの原因による影響が大きいことをこれから実験で確認することが必要である.平成31年度に動的補償制御法を用い横滑り防止の有効性を明らかにする.動的補償制御法は一段階にトラクタを滑る可能性がある反対方向へ走行経路を修正する(大範囲制御),二段階に横滑り距離を推定し,ハンドルの偏差操舵により自動的に制御する(補償制御).横滑りが発生しても,トラクタと作業機が作物列に沿って高精度な自動走行を実現する.平成30年度の実験地の条件が良くて433MHz測位ビーコンを使用せずに,車両の横滑り量が計測できた.平成31年度にこのビーコンシステムを導入する経費として使用する予定である.
マルチ銅酵素と基質として働く低分子錯体との電子移動反応機構の解明

ビリルビン酸化酵素は、酸素がビリルビンをビリベルディンに酸化するのを触媒する酵素で、現在臨床検査において、血液中のビリルビンを定量するのに広く用いられている。この酵素は、分子中にタイプ1銅、タイプ2銅、タイプ3銅を1:1:2に含むマルチ銅酵素である。ビリルビン酸化酵素は、ビリルビンの他に種々の化合物を電子供与体即ち基質とすることが出来る。例えば、低分子金属錯体であるフェロシアンイオン(Fe(CN)_6^<4->)も基質となり得る。この性質を利用して、低分子錯体酵素との相互作用を研究した。最初に0.1Mリン酸緩衝液中でFe(CN)_6^<4->を基質として、そのミカエリス定数(Km)とモル活性(k_<cat>)を求めた。Km=4×10^<-3>M、K_<cat>=310sec^<-1>となり、低分子錯体であるFe(CN)_6^<4->は、ビリルビン酸化酵素に対してよい基質となり得る事が判った。そこで、基質であるFe(CN)_6^<4->と構造が類似しているが、電子供与体でないので基質として機能しないCr(CN)_6^<3->を合成し、その阻害反応を調べた。Cr(CN)_6^<3->は基質であるFe(CN)_6^<4->に対して競合的に活性を阻害する事が判った。そして、その阻害定数は3×10^<-3>Mとなり、Fe(CN)_6^<4->のKm値とほぼ同じ値となった。これらの事実はCr(CN)_6^<3->が基質であるFe(CN)_6^<4->の結合部位にほぼ同じ強さで結合していることを示している。Cr(CN)_6^<3->が基質結合部位に結合する事が判明したので、現在400MHzのNMRを用い、Cr(CN)_6^<4->の常磁性によりブロード化するビリルビン酸化酵素中の残基のピークを同定中である。我々は、ビリルビン酸化酵素の遺伝子のクローニングに成功し、塩基配列を決定し、その一次構造を推定した、この一次構造をすでにX線結晶解析より高次構造が明らかにされている西洋カボチヤ由来のアスコルビン酸酸化酵素の一次構造と比較することにより、銅イオン配位部位及び基質結合部位を推定した。我々は、この一次構造から推定された基質結合部位を、NMRのブロ-ディング結果から確かめようとしている。低分子錯体からマルチ銅酵素中のタイプ1銅への電子移動の反応機構研究の一環として、マルチ銅酵素中のタイプ1銅の酸化還元電位を求めた。還元剤としてフェロシアイオンを用い、適用量のフェリシアイオンを加えることにより系内の酸化還元電位を適当に調節し、タイプ1銅に特有な600nmの吸収を分光度計で測定し、ネルンストの式を利用してタイプ1銅の酸化還元電位を求めた。

Acremonium sp.HI-25より得られたアスコルビン酸酸化酵素(AOD(Acr))中のタイプ1銅の酸化還元電位は、pH7.0で352mVであった。またTrachy derma tsinodaeから得られたビリルビン酸化酵素(GBD(Trc))中のタイプ1銅の酸化還元電位はpH7.0で約540mVであった。この様に酵素中の銅イオンの酸化還元電位電位が大きく変化するのは、銅イオンに配位する配位残基の種類の差異(AOD(Acr);His,His,Cys,Met:GBD(Trc);His,His,Cys)によると思われる、AOD(Acr)の酸化還元電位pH5.3以下ではpH依存性を示し、その変曲点はpH5.3であり、関与するプロトンの数は1個であることが判った。pH4.0,pH7.0において、酸化状態で依存するAOD(Acr)の電子スピン共鳴スペクトルと吸収スペクトルを測定したところ、酸化状態ではタイプ1銅の配位構造は変化しない事が判った。それ故、pH5.3以下では銅が還元された際に、配位する残基の一つが銅イオンより離れプロトン化している事が判った。酸化還元電位のpH依存性からその残基はHisであると思われる。ビリルビン酸化酵素は、酸素がビリルビンをビリベルディンに酸化するのを触媒する酵素で、現在臨床検査において、血液中のビリルビンを定量するのに広く用いられている。この酵素は、分子中にタイプ1銅、タイプ2銅、タイプ3銅を1 : 1 : 2に含むマルチ銅酵素である。ビリルビン酸化酵素は、ビリルビンの他に種々の化合物を電子供与体即ち基質とすることが出来る。例えば、低分子金属錯体であるフェロシアンイオン(Fe (CN)_6^<4->)も基質となり得る。この性質を利用して、低分子錯体酵素との相互作用を研究した。最初に0.1Mリン酸緩衝液中でFe (CN)_6^<4->を基質として、そのミカエリス定数(Km)とモル活性(k_<cat>)を求めた。Km=4x10^<-3>M、k_<cat>=310sec^<-1>となり、低分子錯体であるFe (CN)_6^<4->は、ビリルビン酸化酵素に対してよい基質となり得る事が判った。そこで、基質であるFe (CN)_6^<4->と構造が類似しているが、電子供与体でないので基質として機能しないCr (CN)_6^<3->を合成し、その阻害反応を調べた。Cr (CN)_6^<3->は基質であるFe (CN)_6^<4->に対して競合的に活性を阻害する事が判った。そして、その阻害定数は3x10^<-3>Mとなり、Fe (CN)_6^<4->のKm値とほぼ同じ値となった。これらの事実はCr (CN)_6^<3->が、基質であるFe (CN)_6^<4->の結合部位にほぼ同じ強さで結合していることを示している。Cr (CN)_6^<3->が基質結合部位に結合する事が判明したので、現在400MHzのNMRを用い、Cr (CN)_6^<4->の常磁性によりブロード化するビリルビン酸化酵素中の残基のピークを同定中である。我々は、ビリルビン酸化酵素の遺伝子のクローニングに成功し、塩基配列を決定し、その一次構造を推定した、この一次構造をすでにX線結晶解析より高次製造が明らかにされている西洋カボチヤ由来のアスコルビン酸酸化酵素の一次構造と比較することにより、銅イオン配位部位及び基質結合部位を推定した。我々は、この一次構造から推定された基質結合部位を、NMRのブロ-ディング結果から確かめようとしている。