hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母HOG経路のシグナル特異性決定に関わるPbs2MAPKKの足場機能の研究

生物は絶えず生活環境の変化にさらされており、こうした環境ストレスに迅速に適応するために、ストレス応答MAPキナーゼ(MAPK)情報伝達経路が存在する。この経路は出芽酵母からヒトにいたるまでよく保存されており、出芽酵母では高浸透圧に対するHOG経路が存在する。HOG経路にはMAPKキナーゼ(MAPKK)であると同時に足場蛋白質でもあるPbs2が存在し、HOG経路を構成する複数の因子と結合しシグナル伝達の足場となることで、迅速かつ正確なシグナル伝達を可能にしている。Pbs2の足場機能を分子レベルで明らかにするため、相互作用する因子との結合の分子様式について詳細に解析した。1.私は昨年度Pbs2MAPKKのN末領域がSte11 MAPKKKと結合することを見いだした(Tatebayashi et al.;EMBO.J.2003)。本研究ではPbs2のN末に系統的な欠失を導入し、共沈実験によりSte11との結合領域を詳しく解析した。Ste11結合領域はPbs2のN末に2カ所存在し、どちらか一方だけでもSte11との結合は保持され、両者を同時に欠失させてはじめて結合がなくなることがわかった。この領域は私が昨年度発見したPbs2のSsk2/Ssk22 MAPKKKとのドッキング・サイトとは異なっており、Pbs2は複数のMAPKKKに対して異なるドッキング・サイトを有していることがわかった。2.Ste11結合蛋白質のSte50がSte11を介することなしにPbs2と結合することがわかった。Pbs2内のSte50結合部位を調べたところ、Ste11に対するPbs2の2カ所の結合部位がSte50との結合にも関与することが明らかになった。Pbs2、とSte50の結合はこれまで報告されておらず、HOG経路の活性化や特異性決定の分子機構を解明する大きな手がかりになると考えられた。生物は環境ストレスに迅速に適応するために、ストレス応答MAPK情報伝達経路(SAPK経路)を備えている。この経路は酵母からヒトまでよく保存されており、出芽酵母では高浸透圧に対するHOG経路が存在する。HOG経路のPbs2MAPKKはN末の長い非キナーゼ領域で他のシグナル因子と結合し、シグナル伝達の足場としても働いている。我々は上流のSsk2/Ssk22MAPKKKのキナーゼ・ドメインがPbs2のN末領域と特異的に結合するのを見いだし、Pbs2におけるSsk2との特異的ドッキング部位についてはアミノ酸レベルで同定することに成功した。また、このドッキング・サイトがシグナル伝達の効率を上げるのに加え、MAPKKK-MAPKK間の特異性の決定・維持に必須であり、複数存在するMAPK経路においてシグナルの混線を防ぎ正確なシグナル伝達を可能にすることを明らかにした(Tatebayashi et al.;EMBO.J.2003)。さらにPbs2が活性化の有無にかかわらず、核と細胞質の間をシャトルしており、それにはN末の核外移行シグナルとC末の核移行に必須なドメインが必要であることも見いだした。これらの知見は、いずれも、SAPK経路におけるMAPKKの活性化及びその制御メカニズムを理解する上で極めて重要であり、とりわけ、これまで明らかにされていなかったMAPKKK-MAPKKの特異的結合を担うドッキング・サイトを見いだしたことは、SAPK経路の特異性決定機構を理解する上で大変意義深いと考えられる。
目標とする復興像実現のために有効な支援方策の検討

近年発生した自然災害からの復旧・復興プロセスを調査し,その際実施された各種の独自施策とその影響について整理を行った.結果,被害認定手続きから仮設住宅団地の計画,その後の復興計画策定にいたるそれぞれのプロセスにおいて,その前の施策意図が大きく影響を及ぼす可能性があることを指摘した.それらの成果に基づき東日本大震災の被災地における災害対応において実際の支援活動としても展開しいくつかの知見を得ることができた.近年発生した自然災害からの復旧・復興プロセスを調査し,その際実施された各種の独自施策とその影響について整理を行った.結果,被害認定手続きから仮設住宅団地の計画,その後の復興計画策定にいたるそれぞれのプロセスにおいて,その前の施策意図が大きく影響を及ぼす可能性があることを指摘した.それらの成果に基づき東日本大震災の被災地における災害対応において実際の支援活動としても展開しいくつかの知見を得ることができた.H22年度は近年の地方都市や農山漁村集落における災害復興事例の調査を一部実施した。中越地震の被災地である新潟県十日町市や小千谷市の集落の現状調査およびヒアリングを実施するとともに、行政や復興支援員からのヒアリングも実施し、新潟県中越大震災復興基金が集落再生チームを編成し、各地域の復興塾度を見定めながら各種メニューを構築し、地域の自律的な取り組みを誘導してきた経緯とその効果について実証的に検証することができた。このことは、支援メニューを地域の状況を配慮せずに提示した中越沖地震の復興基金でさほどの効果が上がっていない状況を説明する上でも重要な視点であることが確認できたといえる。また平成5年に発生した北海道南西沖地震の被災地奥尻島での復興調査及びヒアリングを行い、復興には直後の金銭的な支援が短期的な建物再建には機能するものの、その後のまちづくりには負の影響を与える可能性があることが明らかとなった。具体的にはより密度の薄い市街地の形成や、ハード整備による将来的なメンテナンス費用増大の懸念などである。加えて漁業の視点を排除した建物構造が事業の継続性に大きな影響を与えている現状も明らかにした。さらには小千谷市東山地区での人口変化と今後に向けた取り組みについての分析もすすめ、多角的な視点から最終成果を構築するための基礎的な知見を得ることとなった。なお、これらの成果は各種シンポジウムや学会等での口頭発表を通じて、その方向性に誤りがないかを確認しながらより精緻なものにするための作業を並行して実施している。H23年度は平成23年3月11日に発生した東日本大震災の被災地で実践的な調査及び実践を行った.中越地震を始め,北海道南西沖地震や雲仙普賢岳噴火災害の復興状況調査とそこから得られた知見を元に,甚大かつ面的被害を受けた津波浸水被災地において,復興ビジョン,復興計画の策定に直接関与した.岩手県大船渡市では,市の復興計画策定委員会に参画しつつ,行政担当者や委員会委員に対して将来を見据えた復興計画の重要性を提示し,ビジョンの位置づけを共有した.また,福島県双葉郡楢葉町においても復興計画検討委員会に参画し,長期化する被災者の避難生活および原子力発電所の事故に伴う汚染地域での生活再建にたいして,従来は危険回避もしくはその制度を運用することで条件有利地への移転を促してきた集団移転事業等の地域再建手法だけでなく,一時的に自治体の外に地域住民が支え合って生活ができる環境の構築を提案し,それを計画に盛り込むこととなった.実際に震災以降沿岸部の被災地を中心に人口流出に伴う地域人口の縮小傾向が加速している.復興計画を策定,それにもとづく事業の推進をする場合,そのことを前提とした上で,暮らしの豊かさを持続的なものとできるような施策の展開が重要であり,それは直接的な被害に対する防災対策の改良復旧にとどまらないことを,具体的に大船渡市末崎地区における住民との協働の場などで議論,計画策定支援を行っている.前年度までに得られた成果を具体的な実践へ展開し,その有効性を実際に一定程度確認できたことは今後の研究発展が期待されるものとなった.さらには,学会発表等を通じ,東日本大震災被災地における復興のあり方等について,他の専門家等々の議論を深めている.
学齢生徒減少期における政令指定都市立高等学校のあり方に関する調査的研究

1.政令指定都市の高等学校設置・管理の現状と歴史について(1)指定都市と道府県との間の教育に関する権限関係は、法令に規定されているものは、法令にそって実際に行われているが、指定都市立高等学校の学校組織、教育過程、施設設備等のあり方等をめぐる指定都市と道府県との関係は、市によって実際上の違いがある。具体的には、両者が「相互に競合しないようにする」(地方自治法2条7項)ための協議の行われ方に違いが見られる。(2)その違いは、高等学校設備等の事務はまず都道府県が行うものだという一般的通念に影響されるところが大きいが、都市の性質による違いもある。すなわち、都市が大都市圏中心都市(本調査では大阪市と名古屋市)の場合(<疎遠=安定>型)と、大都市圏域内都市(京都市と神戸市)の場合(<疎遠=不安定>型)と、地方中心都市(仙台市と広島市)の場合(<調和=安定>型)とでは府県と市の関係は上記括弧内のように異なり、その関係は高校改編においても同様である。2.高等学校改編の視点・具体的施策・実施状況について(1)いずれの市においても、第14期中央教育審議会答申が提言した改革の視点を基礎に具体的施策がまとめられ、高校教育に関しては特色ある学校・学科・コース等の設置に重点が置かれているが、取組みの時期や力点の置き方などは市によって違いがあり、総じて言えば、市民の教育関心や学校政策・行政のあり方、市立高等学校の前史などに規定されるところが少なくない。(2)総合学科や単位制の導入などの改革は府県が先行しており、市では手がつけられていない。(3)今後の長期にわたる学齢生徒減少期に対応した高等学校改編を検討している市は少ない。3.なお詳細な年表・文献目録を作成した。1.政令指定都市の高等学校管理の現状と歴史について(1)政令指定都市と都道府県との間の教育に関する権限関係は、法令に規定されているものについて法令にもとづき実際に行われている。例えば、a.県費負担教職員の任免、給与の決定、休職、懲戒に関する事務は地教行法58条1項にもとづき、また、研修に関しては同条2項にもとづき、市教育委員会が実施している。b.高等学校入学者選抜の学力検査は学校教育法施行規則59条4項にもとづき両者の教育委員会の協力で行い、通学区の指定は地教行法50条にもとづき市教育委員会の意見を聴き都道府県教育委員会が決定している。(2)政令指定都市立高等学校の学校組織、教育課程、施設設備等のあり方等をめぐる両者の関係は、市によって違いがある。すなわち、a.市と府県とが「相互に競合しないようにする」(地方自治法2条7項)ための協議において、両者の現実的関係には違いが見られる。b.その違いは、現段階での仮説では、市のタイプ(大都市圏中心都市型か、大都市圏域内都市型か、地方中心都市型か)と市の歴史に依存するところが大きいと考えられる。2.1に述べたこと以外の市立高等学校教育の現状、歴史および改革の方向について(1)教育委員会と学校の両方から調査をすすめ、関係者の意見を聴き、関連資料を収集し、分析を行っている。(2)高等教育改革に関する詳細なる文献目録を作成中である。1.政令指定都市の高等学校設置・管理について(1)高等学校の設置等の事務はまず都道府県が行うものだという一般的通念と、県市は相互に競合しないようにとの法規定の下で、指定都市は道府県と対等な立場で高等学校の設置等を行うことが難しい実情にある。(2)ただ、その実情は都市により幾分違いがある。

大都市圏中心都市(本調査では大阪市と名古屋市)の場合は、市の区域内における市の力は大きいので、高校改編の場合も府県と市の関係は<疎遠=安定>型であるが、大都市圏域内都市(京都市と神戸市)は、市の力は強いが大都市圏域の拡大にともない府県と市の関係は<疎遠=不安定>型となり、高校改編の具体的施策に両者の協議調整を要することがある。地方中心都市(仙台市と広島市)は、最近都市としての力をつけてきたものの依然として県の応援を必要としているため、県と市の関係は<調和=安定>型であり、高校改編でも同様である。2.高等学校改編の視点・具体的施策・実施状況について(1)いずれの市においても、第14期中央教育審議会答申が提言した改革の視点を基礎に具体的施策がまとめられ、高校教育に関しては特色ある学校・学科・コース等の設置に重点が置かれているが、取組みの時期や力点の置き型などは市によって違いがあり、総じて言えば、市民の教育関心や学校政策・行政のあり方、市立高等学校の前史などに規定されるところが少なくない。(2)総合学科や単位制の導入などの改革は府県が先行しており、市では手がつけられていない。(3)今後の長期にわたる学齢生徒減少期に対応した高等学校改編を検討している市は少ない。
コミュニティ自治を支える拠点機能・事務局機能の重要性とその成立要件に関する研究

近年多くの自治体が取り組みつつある「制度化された地域自治組織」の仕組みや実践事例の調査研究を通して、地域自治組織が自由に使える「拠点」と、地域組織の運営を下支えする「事務局機能」の存在が、コミュニティ自治力の向上(コミュニティ活動の活性化・地域運営力の向上)のために重要であることを明らかにした。調査対象事例は主に、神戸市の真野地区まちづくり推進会、福岡県下の自治協議会組織、京都市本能学区のまちづくり活動である。所期の研究目的を遂行するため、研究実施計画に沿ってにH25年度に行った主な調査・研究活動は以下の通り。1.包括的地域自治組織の先駆事例と位置付けられる神戸市の真野地区において、地域活動に継続的に関わりながら地域拠点、および事務局機能の役割について参与観察を継続中。昨年度末には地域住民組織との協力で、地域活動や地域拠点、地域組織の認知度や地域課題を明らかにするための全戸アンケート調査を行い、現在データの集計作業を行っている。2.8月には福岡市に滞在し、福岡市の自治協議会の活動状況、および拠点(公民館)の利用状況や自治協議会の事務局機能についての調査、および宗像市、北九州市における包括的地域自治組織についての調査を行った。具体的には、福岡市コミュニティ推進課ヒアリング、および片江校区・南片江校区・城南校区・金山校区・堤校区・壱岐南校区において、自治協議会長、公民館長に対するヒアリングおよび拠点(公民館)使用状況調査を行い、あわせて、宗像市の赤間コミュニティセンター、北九州市の西小倉市民センターの活動実態調査も行った。現在、この調査で得られたデータを整理し、本年度調査に活かす準備を進めている。3.上記調査と並行して、7月に開催されたコミュニティ政策学会福岡大会のシンポジウム(コーディネーター:乾)において、福岡市・北九州市・宗像市の包括的地域自治組織の比較検証を行い、そのなかで、事務局機能や活動拠点の重要性についての議論を進めた。4.京都においては、学区地域活動が盛んな本能学区(中京区)において、学区拠点「本能館」を活用した地域活動の展開について、地域活動に関わりながら、継続的参与型観察を継続。以上の一連の調査によって、地域運営の要としての事務局機能の重要性、活動を活発化させるうえでの拠点の重要性や備えるべき要件を多角的に把握できた。所期の研究目的を遂行するため、H25年度の研究成果を継承しつつH26年度に行った主な調査・研究活動は以下の通り。1.協議会型住民自治組織(「包括的地域自治組織」という呼称を改訂)の先駆事例である神戸市の「真野地区まちづくり推進会」の参与観察を継続中。本年度は、全世帯アンケート調査(H25実施)の分析作業を行い、その結果をもとに、今後のコミュニティ組織活性化について地域住民とともに討議し方向性を探る「参加型研究」に取組んだ。また、コミュニティ活動における場所の有効性検証のため、地域福祉センターとまちづくり会館の活用状況調査も行った。2.H25に引き続き、福岡の自治協議会(自治協)活動と公民館の事務局機能の関連についての調査を行った。具体的には、1自治協サミット(8月26日)での事例収集、2公民館と自治協の連携事例調査(小田部公民館・脇山公民館・野芥公民館・金山公民館、8月27日30日)。3.真野地区まちづくり推進会及び福岡の自治協との比較検証のため、全国複数の協議会型住民自治組織のヒアリング調査を行った。具体的には、大阪市「地域活動協議会」(市役所+緑地区協議会)・長野市「住民自治協議会」(市役所+コミュニティわかつき)、佐賀市「まちづくり協議会」(市役所)。うち、大阪と長野については「都市自治体とコミュニティの協働による地域運営に関する研究会(日本都市センター)」の一員として調査。4.以上に加え、京都の本能学区における、地域拠点「本能館」を活用したコミュニティ活性化活動についても参与観察を継続中。以上、一連の調査により、地域拠点(ハード)とコミュニティ活動(ソフト)の相互応答関係、事務局機能(人的側面・場所的側面)の重要性や成立要件がかなり明らかになってきた。ただ、日程の関係上、予定していた海外調査(イタリアの社会センター)は行えなかった。研究目的を達成するため、前年度の成果を継承しつつH27年度に行った主な研究活動は以下の通り。1.協議会型住民自治組織の先駆的事例である神戸市の「真野地区まちづくり推進会」の参与型観察調査を継続中。本年度は、補助事業期間延長承認申請の事由2にも記したように、'65年以降、真野まちづくりを担ってきた「尻池南部地区自治連合協議会」が解散し、地区の宿願であった自治連合会一本化(真野地区自治連合会)が果たされたこと、またそれを契機にあらためて地域活動の基盤である町自治会の強化に取り組み始めたことにより、推進会事務局の役割がより重要化・活発化していることに注目している。2.福岡県筑紫野市、久留米市、うきは市、大牟田市において、協議会型住民自治組織に関する市制度、公民館など拠点施設の有無や活用状況、事務局体制などについて調査を行った。この調査の過程で、協議会型住民自治組織の仕組みや地域コミュニティのなかでの位置づけが旧来の自治組織の型や市政との関わりに左右されていることが明らかになった。とりわけ、大牟田市の旧組織とそれを継承する協議会の形態および活動性はこれまで調査してきた他都市と異なる点が多く、H28年度に追加調査を行なう予定である(延長承認申請の事由1)。3.京都の本能学区における地域拠点「本能館」活用による地域コミュニティ活動についても参与観察を継続した。

以上、一連の調査により、地域活動の活性化、コミュニティ形成において、地域拠点と地域住民組織の仕組みと事務局機能の充実の重要性と、その備えるべき要件が明らかになりつつある。なお、日程の関係上、予定していた海外調査(イタリアの社会センター)は行えなかった。当初の計画通り、真野地区まちづくり推進会を中心とする「真野まちづくり」や京都の本能学区の地域活動についての参与観察と福岡市および周辺都市での協議会型住民自治組織について、組織の仕組みや拠点機能、事務局機能についての調査を重ねることで、制度化されたコミュニティ組織の可能性を論証するためのデータ蓄積を重ね一定の成果を得てきたし、得られた知見を論考として公表することで、一定程度、地域コミュニティの活性化に実践的貢献も行いえた。とはいえ、補助事業期間延長承認申請に記したように、主たる調査対象の一つである真野まちづくりにおける地域組織の改革があったため、その影響について参与観察を深める必要性が生じたこと、福岡調査において新しい型の地域活動が見いだされたことで追加調査の必要性が生じたことの事由により、成果をまとめる時期が遅れることとなった。研究目的を達成するためH28年度に行った主な研究活動は以下の通り。1.神戸市の「真野地区まちづくり推進会(以下「推進会」)」において参与観察を継続した。本年度は、昨年度後半に地区内の自治会が一本化し「推進会」の構成母体が強化されたことにより、若い子育て世代の動きの支援活動やまちづくり拠点の地域開放に向けての動き、空家悉皆調査、住宅供給状況調査に基づく開発業者との協議など、ソフト・ハード両面において地域活動が活発化する等、地域組織の形やまちづくり拠点の存在が地域活動の在り方に影響を及ぼす状況を観察することができた。2.夏期福岡調査において、大牟田市のコミュニティ推進課職員および4校区の地域組織代表の方にヒアリング調査を行い、当市に特有の強固なコミュニティ組織である「校区公民館」の仕組みや成立要因などを把握するとともに、現在、進みつつある「まちづくり協議会」との関係(既存コミュニティ組織との関係)などについての知見を得た。また、福岡市の小田部校区では、校区自治協議会と距離を置きつつ連携する若い親世代の組織「だいこんの会」の活動内容や協議会組織の関係などについてヒアリング調査を行ったほか、多々良校区では、旧の組織である自治連合会と新しい仕組みである自治協議会との関係について調査を行った。3.京都の本能学区において、地域活動拠点「本能館」活用によるコミュニティ活動活性化の状況について参与観察を継続した。以上一連の調査を通じて、地域活動の活性化やコミュニティ形成状況と、地域組織の形・事務局機能の有無・活動拠点の質などとの関係、および、戦後現在に至るコミュニティ組織と市政との関係による影響などが明らかになった。研究成果は現在執筆中。次年度内に東信堂より出版予定。なお、研究の焦点を我が国のコミュニティ政策に絞ることとしたため、海外調査(イタリアの社会センター)は行わなかった。
シナプス伝達におけるシンタキシン１Ｂ特異的な生理機能の解明

本研究では、シンタキシン1B(STX1B)のシナプス伝達における生理機能を解明するため、STX1Bノックアウトマウスと、STX1AとSTX1Bのダブルノックアウトマウスを用いたシナプス伝達機能の解析を行った。STX1Bノックアウトマウスには頻回刺激に対するシナプス応答の減衰に有意な低下がみられ、STX1Bがシナプス小胞のリサイクリングや細胞内輸送に関与することが示唆された。ダブルノックアウトマウスのシナプス伝達では、Ca2+依存性のシナプス応答の低下や、非同期的なシナプス小胞の放出が観察された。以上の結果から、STX1はCa2+流入に同期したシナプス小胞の放出に重要な事が示唆された。本研究は、SNARE蛋白質として開口放出に関与するシンタキシン1(STX1)のシナプス伝達における生理機能を解明することを目的としている。STX1には二種のアイソフォーム(STX1Aと1B)があるが、STX1Aの欠損では基本的なシナプス伝達機能に変化はみられない。そこでシナプス伝達機能において重要なのはSTX1Bであると仮定し、STX1Bノックアウトマウスのシナプス伝達機能を解析した。まず、Ca2+依存的なシナプス小胞の誘発性放出に対するSTX1Bの機能をシナプス小胞のターンオーバーに注目して解析した。2つの近接した培養海馬神経細胞から同時にホールセル記録を行い20Hzの高頻度頻回刺激を加え、興奮性・抑制性の誘発性シナプス後電流を観察した。その結果、STX1Bノックアウトマウスでは頻回刺激に対するシナプス応答の減衰が有意に低下していた。一方、即時放出可能なシナプス小胞のプールサイズに有意差は見られなかった。これらのことからSTX1Bがシナプス小胞のリサイクリングや細胞内輸送に関与していることが示唆される。このようなシナプス応答の異常はSTX1Aノックアウトマウスにはみられず、STX1BがCa2+非依存的なシナプス小胞の放出に強く機能している可能性が示された。次にSTX1AとSTX1Bのダブルノックアウトマウスを作成し、シナプス機能の変化を解析することを試みた。その結果、ダブルノックアウトマウスは胎生致死であり、神経細胞は培養開始10日目には99%以上が死滅することが判った。しかし、生き残った神経細胞はCa2+依存性および非依存性のシナプス応答を示した。特にCa2+依存性のシナプス応答は野生型ニューロンのシナプス応答に比べて振幅が小さく非同期的なシナプス小胞の放出が見られた。以上のことから、STX1はCa2+流入に同期したシナプス小胞の放出に深く関わっている事が示唆された。本研究では、主要な開口放出機構関連蛋白質であるシンタキシン1(STX1)のシナプス伝達における生理機能を解明することを目的としている。そこでシナプス伝達機能において重要なのはSTX1Bであると仮定し、STX1B欠損マウスの神経表現型を解析する。Ca2+非依存的なシナプス小胞の自発性放出に対するSTX1Bの機能を解析するために海馬初代分散培養系を用いて微小シナプス後電流の波形や頻度・振幅等を観察したところ、興奮性・抑制性の微小シナプス後電流の頻度が有意に低下していた。また、高浸透圧刺激を用いて即時放出可能なシナプス小胞のプールサイズを測定したところ有意に減少していた。次に、Ca2+依存的なシナプス小胞の誘発性放出に対するSTX1Bの機能を解析した。2つの神経細胞から同時にホールセル記録を行い、興奮性・抑制性の誘発性シナプス後電流を観察した。その結果、誘発性シナプス後電流の波形や振幅に変化はみられなかったが、ペアドパルス比の上昇、頻回刺激時のシナプス応答の減衰パターンに変化がみられた。上記のようにSTX1A欠損マウスでは異常はみられなかったのに対し、STX1Bの欠損マウスのシナプス応答に複数の異常が見られたことから、STX1Bがシナプス伝達機能においてより重要なアイソフォームであると考えられる。特にSTX1BがCa2+非依存的なシナプス小胞の放出に強く機能している可能性が示された。一方、Ca2+依存的なシナプス小胞の放出には大きな変化がみられずSTX1Aとの機能差が少ないと考えられる。本研究は、シンタキシン1(STX1)のシナプス伝達における生理機能を解明することを目的としている。STX1はSNARE蛋白質として開口放出に関与する形質膜蛋白質で、二種のアイソフォーム(STX1Aと1B)があるが、STX1Aの欠損では基本的なシナプス伝達機能に変化はみられない。

そこでシナプス伝達機能において重要なのはSTX1Bであると仮定し、STX1Bノックアウトマウスのシナプス伝達機能を解析した。STX1Bノックアウトマウスの海馬初代分散培養系を用いてCa2+非依存的なシナプス小胞の自発性放出とCa2+依存的なシナプス小胞の誘発性放出の解析を行った。その結果、興奮性・抑制性の微小シナプス後電流の頻度が有意に低下していた。また、シナプスを形成している、2つの近接した神経細胞間の誘発性シナプス応答では、頻回刺激に対するシナプス応答の減衰率が有意に低下していた。一方、即時放出可能なシナプス小胞のプールサイズに有意差は見られなかったことから、STX1Bがシナプス小胞のリサイクリングや細胞内輸送に関与していることが示唆された。また、上記のようなシナプス応答の異常はSTX1Aノックアウトマウスにはみられず、STX1BがCa2+非依存的なシナプス小胞の放出に強く機能している可能性が示された。次にSTX1AとSTX1Bのダブルノックアウトマウスを作成し、シナプス機能の変化の解析を試みた。その結果、ダブルノックアウトマウスは胎生致死であり、神経細胞は培養開始10日目には99%以上が死滅した。しかし、残存した神経細胞はCa2+依存性および非依存性のシナプス応答を示したが、Ca2+依存性のシナプス応答は野生型ニューロンのシナプス応答に比べて振幅が小さく非同期的なシナプス小胞の放出が見られた。以上のことから、STX1はCa2+流入に同期したシナプス小胞の放出に深く関わっている事が示唆された。神経科学今年度は研究の目的である、「STX1Bのシナプス伝達における機能解析」を達成するために当初の計画通り次の二点について研究を進めた。(1)シナプス小胞のターンオーバーに対するSTX1Bの機能解析。(2)STX1AとSTX 1Bのダブルノックアウトマウスの作成およびシナプス機能の解析。一部を除き必要とするデータを得ることができ、概ね想定通りの結果を得ることができた。今年度は当初の計画通り次の二点についてSTX1Bのシナプス伝達における機能解析を行った。(1)シナプス小胞のCa2+-independentな自発性放出に対するSTX1Bの機能解析。(2)シナプス小胞のCa2+-dependentな誘発性放出に対するSTX1Bの機能解析。一部を除き必要とするデータを得ることができ、概ね想定通りの結果であった。これまでの研究の結果、STX1Bがシナプス小胞の放出過程だけでなく小胞のターンオーバーにも関与していることが示唆された。開口放出によって形質膜に融合した小胞がエンドサイトーシスされて再使用されるまでには複数の過程を経るため、今後の研究ではSTX1Bがどこに関与するのかを詳細に解析する。電気生理学的手法を用いてシナプス小胞のプールサイズを測定するほかFM-dyeを用いたライブイメージング手法も用いる予定であり、実験系の確立にある程度(数ヶ月程度)の時間が掛かるものと考えられる。また、STX1Bの欠損がCa2+非依存的なシナプス小胞の自発性放出と、Ca2+依存的なシナプス小胞の誘発性放出に対して異なる作用を示したことから、その機序の解明を試みる。培養海馬神経のシナプス活動を薬理的に阻害するとCa2+非依存的・Ca2+依存的なシナプス小胞の放出量が可塑的に変化する。
シリカアルミナ系光触媒によるメタン低温カップリング反応

光触媒は光という高いエネルギーを吸収し分子を活性化するため,通常の触媒になかった新しい化学反応をひきおこす可能性を秘めている。従来,光触媒として研究されてきたのは酸化チタンをはじめとする半導体光触媒であるが,我々は半導体ではないシリカアルミナを光触媒として用いて常温で酸化剤を必要としないメタンカップリング反応が進行する事を見いだした。この反応ではエタン・エチレン等のカップリング生成物および水素が高い選択性で生じることもわかった。さらに,チタンを第3元素として添加すると活性が向上することを見いだした。また、結晶性のシリカアルミナであるゼオライトを用いても反応は進行することがわかった。本研究ではこれらの系の、活性サイトの同定・定量,光励起機構,反応機構を検討することを目的とした。シリカアルミナの場合、酸素4配位のアルミ種がシリカ中に高分散しているとエタンを選択的にかつ高効率に与えることがわかった。また、チタンを導入した場合に、チタンとアルミ種の相乗的効果が認められると共に新しい光吸収サイトが生成していることを確認した。この時、チタニア種はやはり酸素4配位であることが必要であることが示唆された。ゼオライトにおいては、アルミ種は基本的に酸素4配位であるが、それらが互いに遠くにある場合に活性を示すこと、交換サイトにナトリウムイオンが存在すると反応は進行せずプロトン型のサイトで反応が進行することがわかった。反応はこれらの表面活性サイトが光を吸収し、メタンをラジカル化させて進行することが提案された。
校庭のチョウを題材とした"地域密着型"環境教育プログラムの開発

本研究では、小学校の校庭を訪れるチョウ類やその寄主植物、吸蜜植物などの観察を通して、子どもたちへの環境教育の実践と、地域の自然環境の保全・再生とを同時並行的に進めることができるような"地域密着型"の環境教育プログラムを開発した。また、その普及を図るために、Webページ『校庭にチョウを呼ぼう!宮城教育大学バタフライガーデン(http://mizotalab.miyakyo-u.ac.jp/butterflygarden)』を作成し、インターネット上で公開を行った。本研究の目的は、小学校の校庭を訪れるチョウやその寄主植物などの観察を通して、子どもたちへの「環境教育の実践」と「地域の自然環境の保全・再生」とが一体となって進めることができるような"地域密着型"の環境教育プログラムを開発し、その普及を図ることである。平成19年度は、平成20年度に実施予定である『インターネット「みんなで調べよう!チョウの調査」』に向けた準備を、宮城教育大学附属環境教育実践研究センター・鵜川義弘教授の協力を得ながら行った。具体的な研究内容と成果は以下の通りである。1『インターネット「みんなで調べよう!チョウの調査」』のwebページ開設4携帯電話(QRコード)を活用した教師の事前学習用教材、翅のラミネート標本教材、などの教材開発5宮城教育大学に設置されたバタフライガーデンのチョウ類の生態調査以上より、全国の小学校の校庭を主なフィールドとした『インターネット「みんなで調べよう!チョウの調査」』を平成20年度に実施できる体制が完全に整った。インターネットを活用した全国一斉調査の実施により、全国のチョウ類に関する貴重なモニタリングのデータが蓄積されるばかりでなく、地域のチョウ類を題材とした環境教育活動の実践に新たな可能性を与えることが期待される。平成20年度は、宮城教育大学バタフライガーデンおよび隣接する仙台市青葉山市有林において定期的にチョウ類のルートセンサス調査を実施し、バタフライガーデンに飛来するチョウ類群集の群集構造の特性を明らかにした。それらの成果をもとに、身近なチョウ類を題材とした児童・生徒への体験的環境教育ならびに地域の自然環境の保全・再生とを同時並行的に進めることができる"地域密着型"の環境教育プログラムを開発した。さらに、宮城教育大学バタフライガーデンを活用した小学生向けの体験的環境学習イベント、教員を志望する大学生への体験学習、現職轍員向けの公開講座、一般市民向けの体験講座などを開催し、身近なチョウ類を題材とした環境教育の実践にも大きな成果を挙げた。以上の成果を総合的にまとめ、webページ『校庭にチョウを呼ぼう!宮城教育大学バタフライガーデン(http://mizotalab.miyakyo-u.ac.jp/butterflygarden)』を作成した。このwebページでは、1.これまでに開発したチョウ類を題材とした環境教育コンテンツ(日本産チョウ類の種名検索システム、校庭のチョウ・食草図鑑、インターネット「みんなで調べよう!チョウの調査」など)、2.バタフライガーデンの作り方・維持・管理方法、3.生態系の仕組みについて学習するための施設(雨水を利用したビオトープ池・落ち葉を堆肥にかえるリサイクル箱・チョウの吸蜜植物を利用したニホンミツバチの飼育箱など)の設置方法、4.授業や環境学習へのバタフライガーデンの活用法などに関する情報提供を行った。
債務免除益に対する所得課税の理論的根拠の検討

(1)共著による実務書の執筆に携わった。中村芳昭=三木義一監修『典型契約の税法務』(日本加除出版,2018年)のうち,研究領域と関連する消費貸借契約に係る課税関係についての部分を担当した(183220頁)。(2)本研究の理論の裏付けとして,米国税法における「租税利益の原則(Tax Benefit Rule)」についての議論を整理したうえで,日本法について得られる示唆を論じた。この成果については,「租税利益の原則(Tax Benefit Rule)」として公表した(青山社会科学紀要47巻1号(2018年) 45頁)。(3)昨年度の日本租税理論学会第29回大会における学会報告をもとに,「企業再生税制と事業再生税制の差異」を公表した(日本租税理論学会編『租税理論研究叢書28所得概念の再検討』(財経詳報社,2018年)153頁)。(4)博士論文を執筆した。2017年度に公表した「債務免除益課税の基礎理論」青山ビジネスロー・レビュー6巻1号(2016年)および同2号(2017年)をもとに第一章を,(2)の「租税利益の原則(Tax Benefit Rule)」をもとに第二章を,2017年度に公表した「債務免除益の年度帰属」『第13回「税に関する論文」入選論文集』(納税協会連合会,2017年)1頁をもとに第三章を,2016年度に公表した「ノンリコース債務免除益の所得分類」青山社会科学紀要45巻1号(2016年)59頁を素材として第四章を,(3)の学会報告をもとに第五章を執筆した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,債務免除益に対する所得課税(日本の国税で言えば,法人税および所得税の課税)につき,その理論的な根拠を米国法との比較法的見地から探求し,あるべき課税関係を模索するものである。2016年度は,以下のような研究を行った。(1)債務免除益課税の理論的根拠を探求するとともに,その理論的根拠と資力喪失者が得た債務免除益に対する課税問題(事業再生税制の適用要件の解釈論)の関わりを論じた。日本および米国の債務免除益課税についての判例理論および学説を検討し,一般的な債務免除益課税の問題と事業再生税制の解釈論を整合的に議論する理論がないことを指摘したうえで,独自の理論(債務控除アプローチ)を構築した。また,この成果について,論稿として発表した(「債務免除益課税の基礎理論」青山ビジネスロー・レビュー6巻1号(2016年)71頁および同巻2号(2017年)29頁。(2)債務免除益課税の問題の1つの類型として,ノンリコース債務の免除益の所得分類が争われた裁判例について論じた。所得分類とは,本来ならばその所得が得られた事実関係を総合考慮して判断されるべきものである。しかし,当該裁判例についての従前の議論は,本研究が行っているような債務免除益課税の理論的根拠,「なぜ,どのような事実に着目して債務免除益は課税されるのか」という点を考慮せずに議論を行っていることを指摘した。この成果については,当該裁判例の第一審判決(東京地判平成27年5月21日裁判所ウェブサイト)の判例研究として発表したほか(「ノンリコース債務の所得分類」青山社会科学紀要45巻1号(2016年)59頁),その後出された控訴審判決(東京高判平成28年2月17日裁判所ウェブサイト)の検討という形で,研究会においても口頭で発表を行った。2016年度の研究においては,(1)本研究の核となる独自の理論(債務控除アプローチ)を構築したうえで,(2)その理論を実際の課税問題(ノンリコース債務免除益の所得分類)の考察に用いた場合に,どのような結論が得られるかを考察した。具体的には,(1)債務免除益課税の理論について,債務免除益に対する所得課税は債務額分の所得額の控除を取り戻すものであることを論じた。また,(2)(1)の成果を前提とすれば,債務免除益に対する課税は債務の発生から消滅までを通じて生じるものであることから,所得分類の判断にあたっても債務の消滅時のみに着目すべきでないことを論じた。いずれの成果も,高い新規性および客観的意義を持ったものであると評価できる一方,従来の成果を応用したものであり,本研究自体の進捗としては順調とはいえないものと評価している。本来の計画ならば,2016年度は本研究が提唱する理論を裏付ける米国税法の議論について整理する予定であったが,このような検討については現在のところ行えていない。もっとも,2016年度に行った研究は,当該年度に行わないにせよ,いずれ行うべきものではあった(当初の計画では2018年度に行う予定であった)。したがって,自己評価としては「やや遅れている」ものと評価している。本研究は,債務免除益に対する所得課税(日本の国税で言えば法人税および所得税の課税)につきその理論的な根拠を米国法との比較法的見地から探求し,あるべき課税関係を模索するものである。2017年度は,以下のような研究を行った。(1)奨学金問題と債務免除益課税の問題の関わりを論じた。現在実務において取られている解釈論には問題があることを指摘したうえで,米国法との比較法的見地から,あるべき立法的解決策について検討した。

この成果については,「貸与型奨学金と債務免除益課税」として公表した(青山ローフォーラム6巻2号(2018年) 153頁)。(2)債務免除益の年度帰属の問題を論じた。日本の裁判例で示されている考え方には一般的妥当性等の点について問題点があることを指摘したうえで,米国法との比較法的見地から,あるべき解釈論について議論した。この成果については,「債務免除益の年度帰属」という論文としてまとめたうえで第13回「税に関する論文」に応募し,専門家の部奨励賞を受賞した。論文の内容は,同賞の入選論文集において公表されている(『第13回「税に関する論文」入選論文集』(納税協会連合会, 2017年) 1頁)。(3)昨年度研究を行った所得税における事業再生税制の解釈論を前提としたうえで,法人税法上の企業再生税制を絡めて,総合的な検討を行った。事業再生税制と企業再生税制および企業再生税制内の3種類の方式には多くの差異があるが,これらの差異は所得税と法人税の差異や事業再生手法の差異からは正当化できないと論じた。そのうえで,統一的な立法的解決策を債務免除益の課税理論の観点から探った。この成果については,租税理論学会第29回大会において「広義の事業再生税制に現在する2つの差異」という題で報告した。同学会の研究叢書に報告の一部が掲載予定である。2017年度の研究においては,本研究において各論となる3つのテーマについて研究を行った。具体的には,(1)貸与型奨学金の返済減免により所得税が課されるのか,(2)債務免除益はいつ課税されるのか(年度帰属の問題),(3)事業再生局面における債務免除益課税には不整合があるか,あるならばどう是正すべきか(事業再生税制の立法論)を論じた。(3)については,昨年度から継続して研究を行っているテーマである(ただし,昨年度検討した解釈論を前提とした立法論へと,検討の方向性は変わっている)。(1)(2)については,いずれも実務上重要かつ新規性を持ったテーマであると評価している。懸賞論文を受賞するなど第三者による評価もいただいており,全体として,順調に研究は進展している。もっとも,2017年度において行う予定であった本研究の理論的基底についての議論については,研究計画の都合上,2018年度へと積み残すこととなった。したがって,自己評価としては「おおむね順調に進展している」ものと評価している。(1)共著による実務書の執筆に携わった。中村芳昭=三木義一監修『典型契約の税法務』(日本加除出版,2018年)のうち,研究領域と関連する消費貸借契約に係る課税関係についての部分を担当した(183220頁)。(2)本研究の理論の裏付けとして,米国税法における「租税利益の原則(Tax Benefit Rule)」についての議論を整理したうえで,日本法について得られる示唆を論じた。この成果については,「租税利益の原則(Tax Benefit Rule)」として公表した(青山社会科学紀要47巻1号(2018年) 45頁)。(3)昨年度の日本租税理論学会第29回大会における学会報告をもとに,「企業再生税制と事業再生税制の差異」を公表した(日本租税理論学会編『租税理論研究叢書28所得概念の再検討』(財経詳報社,2018年)153頁)。(4)博士論文を執筆した。
立体視アニメーションと電子線制御による時間領域を含む電磁気学３次元可視的教育

高等専門学校・大学の電気電子系の学科において,電磁気学はその根幹をなす学問でありながら,その修得が非常に困難であると言われている.その理由は電磁気学では,その基本法則である「マクスウェルの方程式」が電界と磁界との3次元的な時間領域の相互作用をともなうために,ニュートンの運動方程式のようにある程度の直感的な理解ができないためである.理解を助けるために,ツールとして電磁界シミュレーションがあるが,専用のアプリケーションであることが多い.本研究で,Webブラウザで動作する電磁気学シミュレーションコンテンツを作成し,時間領域を考慮した電磁気学視的教育システムを行い,教育への実践を行った.高等専門学校・大学の電気電子系の学科において,電磁気学は,電気電子系分野における非常に重要な基礎科目の1つとして位置づけられている。特に近年では,電子機器の動作周波数の高周波化や光デバイスの普及にともなって,その振る舞いを記述する電磁気学の重要性が増している。しかし,教授する立場としては現状をながめると,学生が電磁気学を完全に理解するにいたるまでには非常に多くの問題があると判断される。その理由は,電磁気学では,電磁気学の基本法則である「マクスウェルの方程式」が電界と磁界との3次元的な時間領域の相互作用をともなうために,ニュートンの運動方程式のようにある程度の直感的な理解ができない。さらには三次元ベクトル解析や時間をともなった微分方程式などの数学的知識や基礎物理学の知識基盤の上に成立しており,初学者にとって学習困難となっているためである。本研究では,これまでにこうした状況を改善するために,タブレットPCを利用した教育用電磁界シミュレーションプログラムならびに実空間の電磁界現象の検証を目的とした電子線制御システムを構築した。教育用電磁界シミュレーションプログラムは,iPhone, iPadなどiOS搭載機で動作する。現在は2次元の電磁波シミュレーションまで行うことができ,電磁波の干渉,反射,透過,屈折などが自由に観測できるようになっている。実空間の電磁界検証システムとして,ブラウン管型の電磁線制御システムを製作し,電界・磁界による電子線制御を行い,その結果を蛍光板状で確認することができるようになっている。作製した成果物は,工業高等専門学校の2年生に利用させており,良好なアンケート結果を得ている。高等専門学校・大学の電気電子系の学科において,電磁気学はその根幹をなす学問でありながら,その修得が非常に困難であると言われている.その理由は電磁気学では,その基本法則である「マクスウェルの方程式」が電界と磁界との3次元的な時間領域の相互作用をともなうために,ニュートンの運動方程式のようにある程度の直感的な理解ができないためである.理解を助けるために,ツールとして電磁界シミュレーションがあるが,専用のアプリケーションであることが多い.本研究で,Webブラウザで動作する電磁気学シミュレーションコンテンツを作成し,時間領域を考慮した電磁気学視的教育システムを行い,教育への実践を行った.高等専門学校・大学の電気電子系の学科において,電磁気学はその根幹をなす学問でありながら,その修得が非常に困難であるといわれている。その理由は電磁気学では,その基本法則である「マクスウェルの方程式」が電界と磁界との3次元的な時間領域の相互作用をともなうために,ニュートンの運動方程式のようにある程度の直感的な理解ができないためである。本課題は,電磁気学の理解を補助する時間領域を考慮した3次元教育システムであり,タブレットPC上で動作する電磁界シミュレーションシステムと電子線制御システムの2つから構成される。電磁界シミュレーションについては,PC上にてマクスウェル方程式に基づく2次元シミュレーションが行えるようなシステムを構築した。このシステムにより,電波の反射や回折現象のみならず光の屈折現象が可視化できるようになっている。これは単純な光線軌跡解析ではなく,厳密にマクスウェル方程式を解析した結果であり,電波の軌跡のみならず電磁界強度も再現できるものである。このシステムにより,時間領域を考慮した電磁界の挙動が容易に確認できることになり,学生の理解の補助となると考えられる。今後は,実験時に即座にそのシミュレーション結果が確認できるようタブレットPC上で動作するよう移植していく。電子線制御システムについては,波形発生器からの正弦波や三角波などの信号により変調された電界で,出射電子の軌道を制御できるシステムを開発した。出射電子の軌道は蛍光板により観察できるようになっている。さらに電子線すなわち電流と磁界との相互作用が確認できるよう永久磁石を配置し,ローレンツ力が体験できるようになっている。今後は,磁界についても電磁石による変調を可能とするようにし,学生自らが自由に変調信号を作成し,電界および磁界と荷電粒子との相互作用を,より実体験をともなったものとなるよう改善を図っていく。電磁気学は,電気電子系分野における非常に重要な基礎科目の1つとして位置づけられている。特に,近年では電子機器の動作周波数の高周波化や光デバイスの普及にともなって,その振る舞いを記述する電磁気学の重要性が増している。しかし,教授する立場として現状をながめると,学生が電磁気学を完全に理解するにいたるまでには非常に多くの問題があると判断される。

本研究では,こうした状況を改善するために,タブレットPCやスマートフォンから利用可能な教育用電磁界シミュレーションプログラムならびに実空間の電磁界現象の検証を目的とした電子線制御システムを構築した。教育用電磁界シミュレーションプログラムは,HTML5およびJavaScriptにより記述されており,PCはもとより,タブレット端末やスマートフォンで動作する。二次元の電磁波シミュレーションでは,電磁波の干渉や反射,透過,屈折がアニメーションとして表示することができる。さらに実空間の検証システムとして,ブラウン管型の電子線制御システムを制作し,PCから制御を行いながらブラウン管上に電界,磁界により荷電粒子の流れである電子線がどのような影響を受けるかを確認できるようになっている。作製した成果物は,石川工業高等専門学校2年生に利用させており,電磁界を体験する教材として良好なアンケート結果を得ている。電子デバイス本研究で開発するシステムは,実空間での電磁気の理解を目指したブラウン管電子線制御装置とタブレットPCで動作する電磁界シミュレーションアプリケーションである。ブラウン管を用いた電子線制御装置は完成しており,外部からの電界,磁界により電子線が制御できるようになっている。制御された電子線は,蛍光板状で目視で確認できるようになっている。こうした原理を利用した製品として,ブラウン管テレビがあるが,現在の高専生,特に低学年はブラウン管テレビの存在を知らないものも多く,デモ実験は新鮮な体験となっているようである。タブレットPCで動作する電磁界シミュレーションアプリケーションは,iOS搭載機であるiPadとターゲット機種として開発したが,iPhoneでも動作することを確認している。1次元シミュレーションでは,電磁波の振幅と波長を入力することにより,その時間的な振る舞いが確認できる。また,誘電体内に入射した電磁波の透過,反射の現象,さらには,誘電体内での速度の変化を捉えることができるようになっている。2次元シミュレーションでは,平面波,点源からの電磁波などを自由に設定でき,その時間発展が観測できる。複数の電磁波の干渉や誘電体内での電磁波の屈折も観測可能である。ただし,電磁界シミュレーションではシミュレーション領域が大きくなると多量のメモリ消費が発生するために,限られた領域でのみでしかシミュレーションができないことが課題となっている。特に3次元シミュレーションは,限られたリソースしか持たないタブレットPC等小型端末では本質的に解決できない問題であると認識している。3次元電磁界シミュレーションプログラムをPC上にて開発し,電波の反射や回折現象を確認できるようになっている。また誘電率の異なる材質間での反射率や透過率が定性的に評価できるようになっている。現在,タブレットPC上で動作するようプログラムを移植中である。クルックス管を用いた電子制御システムについては,波形発生器からの信号により,出射電子の軌道を制御できるようになっている。
シンクロトロン放射光による病原性および非病原性ポリガラクツロナーゼの立体構造解析

Pichia pastorisにより発現させた白かび病菌の病原性株由来S31PG1および非病原性株由来S63PG1の結晶化を行った。その結果、S31PG1の結晶を得ることに成功し、現在立体構造の解析を行っている。一方、S63PG1は、得られた結晶が小さく、現在マクロシーディング法による結晶の層積を進めている。酵母で発現させる際、発現ベクターに付いているc-mycタグをC末端側にそのまま付けて発現させたPGと、付けずに発現させたPGの酵素活性を調べたところ、S31PG1は、全く活性に変化が無かったものの、S63PG1に関しては、非常に興味深いことに、c-mycが付いた場合、本来無かった病原性が付与されるようになった。この結果は、PGのC末端側の構造に、病原性に関わっている領域があることを示唆している。そこで、S31PG1とS63PG1のN末端側半分とC末端側半分を入れ替えたキメラタンパク質を作成し、酵素活性を調べたところ、予想に反し、S31PG1の病原性は、C末端側ではなく、N末端側の構造が重要であることが分かった。以上の結果から考えられることは、PGが病原性を発揮するためには、基質結合部位であるクレフト構造が、ある特定の部位により決定づけられているわけではなく、クレフト全体で、基質であるプロトペクチンに結合するための構造が決定されており、ある一部が変化した場合、別の部分が変化することで基質の構造に対応し、結合が可能になると考えられる。つまり、S31PG1が病原性を獲得しているのは、クレフト構造が全体的にプロトペクチンに結合できる構奇跡的な造になっており、c-myc付加S63PG1が病原性を獲得したのは、S63PG1のC末端側のクレフト構造が変化したことで、偶然にもS63PG1のN末端側のクレフト構造との組み合わせで、プロトペクチンへの結合が可能となったものと考えられる。平成28年度は、まず既にポリガラクツロナーゼ(PG)の外分泌発現系に成功している酵母を用い、タンパク質の精製を試みた。しかしながら、発現タンパク質の量が少なかったことから、タンパク質の結晶化には適していないことが分かった。そこで、大腸菌を用いた内分泌系によるPG発現系の構築を試みた。大腸菌には、BL21(DE3)を、プラスミドにはpET-23bを用いた。その結果、病原性PG(S31PG1)の発現は可溶性、不溶性共に認められず、非病原性PG(S63PG1)は、封入体の形成が認められた。発現の認められなかったS31PG1については、HisタグをC末端側からN末端側に付け換えたことで、封入体の形成が認められた。いずれのタンパク質も封入体は得られたことから、不溶性タンパク質を用いてリフォールディングを行った。リフォールディングは、不溶性タンパク質に6M塩酸グアニジン水溶液(50mMリン酸緩衝液、50mM DTT、pH7.0)を少量ずつ加え、一晩静置後、リフォールディング緩衝液(L-cysteine or cystine in 50mMリン酸緩衝液, pH7.0)で希釈して行った。その結果、S31PG1は、5mM L-cysteine in 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)と5mM L-cystine in 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて4°C、10倍希釈で活性のあるタンパク質を得ることができた。一方、S63PG1は、0.5mM L-cysteine in 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)と0.5mML-cystine in 50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて、30°C、10倍希釈の条件で活性のあるタンパク質を得ることができた。このように条件が大きくことなることからも、両タンパク質の構造と性質に大きな違いがあることが予想された。病原性PGと非病原性PGの性質が異なるため、それぞれに条件を検討する必要があり、予想以上に活性のあるタンパク質を得るのに時間がかかった。また、本課題が追加採用であったため、実験のスタートが遅くなったことも理由である。これまで、大腸菌を用いたポリガラクツロナーゼ(PG)の発現系により、不溶性タンパク質を得ていたことから、リフォールディングによる可溶性タンパク質の作出を行ってきた。希釈法により、PG活性のあるタンパク質を得ることはできていたものの、一部のタンパク質のみがリフォールディングしており、結晶化するには量が足りない問題があった。そこで、平成29年度は、大腸菌ではなく、メタノール資化酵母であるPichia pastorisを用いた外分泌発現系の構築を目指した。その結果、白かび病菌の病原性株由来S31PG1および非病原性株由来S63PG1の可溶性タンパク質の発現に成功した。P. pastorisの特徴としてネイティブの外分泌タンパク質があまり多くないため、His-tag精製も用意に行えた。また、非常に興味深い現象として、非病原性S63PG1の発現の際、C末端側に、発現ベクター内に存在するc-Mycエピトープを融合させた状態で発現させた場合、本来持ち得ていない病原性(プロトペクチン分解能)を獲得することがわかった。