hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経因性疼痛モデルにおいて、疼痛が骨格筋に及ぼす影響

神経性疼痛の動物モデルとして,Bennettらはラットを用いて絞扼性神経損傷(chronic constriction injury;以下CCI)モデルを作成し,その病態を報告している。本研究では,Bennett変法を用いてマウスを対象としたCCIモデル作成を試み,熱刺激と触刺激に対する行動観察を行った。また,骨の組織学的な観察を行った。対象は,C57BL/6NCrj系雄性マウス26匹(体重23±1.7g,週齢11週)とした。C57BL/6NCrjマウスを対象としてBennett変法を用いてCCIモデル作成を試み,その行動観察および破骨細胞数の測定を行った。1.D.S.は術前と比較して術後8週まで有意に減少していた。2.術側において,術後3週まで触刺激による逃避反応回数は有意に増加していた。3.破骨細胞数は非術側を比較して術側において増加が観察された。以上より,C57BL/6NCrjマウスにおいてもCCIモデルの作成が可能であった。今後,破骨細胞の観察の際の切片作成や染色の方法に関して,その方法の見直しと技術の向上が必要である。また,CCIモデルにおける破骨細胞数の変化や骨萎縮に関して,今後CCIモデル以外のモデルとの比較検討が必要であると考えられ,その基礎研究として本研究によって得られた正常マウスでのCCIモデルに関する知見は有用であると考えられる。また,CCIモデルにおける筋萎縮が神経原性であるか,廃用性であるかについて組織学的に検討しているものは少ない。そこで次研究では,CCI術,不動処置を行い,それらに生じる筋萎縮に不動が影響しているか,その他の因子が存在するかについて,形態学的に観察・比較し,さらに酵素組織化学的に検討した。対象は,C57BL/6N系雄性マウス62匹(体重21.70±1.29,10週齢)を使用した。実験群は1)CCI術のみを行ったCCI群23匹,2)固定のみを施した不動(immobilized;以下IM)群17匹,3)CCIに固定を施したCCI+IM群22匹とした。結果としてD.S.は,各群で術前と比較して術後全ての週で負の値を示し,術前の逃避反応時間は有意に短縮した。筋湿重量の左右比較は,術後2,3週で各群全ての筋において術則のMWが有意に減少した。群間比較について,3週のTAはIM群>CCI+IM群>CCI群,GCはIM群>CCI群>CCI+IM群の順でMWが減少し,有意差がみられた。本研究でCCI群およびCCI+IM群は,IM群と比較して筋萎縮程度が高い傾向を示したことから,CCIモデルにおける筋萎縮には不動以外の因子も含まれていることが示唆された。不動以外の因子としてまず,緩結紮部の炎症のために運動神経の部分損傷が生じている可能性が考えられる。また,神経の炎症が痛覚伝達路を刺激,神経ペプチドや発痛物質が組織中に出現することで,筋組織に影響を及ぼしている可能性も考えられる。今後,組織学的に筋萎縮の病態について観察していく必要がある。

筋湿重量の左右比較は,術後2,3週で各群全ての筋において術則のMWが有意に減少した。群間比較について,3週のTAはIM群>CCI+IM群>CCI群,GCはIM群>CCI群>CCI+IM群の順でMWが減少し,有意差がみられた。本研究でCCI群およびCCI+IM群は,IM群と比較して筋萎縮程度が高い傾向を示したことから,CCIモデルにおける筋萎縮には不動以外の因子も含まれていることが示唆された。不動以外の因子としてまず,緩結紮部の炎症のために運動神経の部分損傷が生じている可能性が考えられる。また,神経の炎症が痛覚伝達路を刺激,神経ペプチドや発痛物質が組織中に出現することで,筋組織に影響を及ぼしている可能性も考えられる。今後,組織学的に筋萎縮の病態について観察していく必要がある。神経因性疼痛の代表的モデルであるCCIモデル(chronic constriction in jury model)において筋萎縮が報告されているが、影響する因子について報告したものは少ない。そこで、CCIモデル群(CCI群)、CCIモデルに固定による不動(inmobilized)を施した群(CCI+IM群)、固定のみの不動モデル群(IM群)を比較検討することで、CCIモデルに生じた筋萎縮に不動以外の因子が関与しているかどうかを検討した。C57BL/6N系雄性マウス(10適齢)63匹に対して、CCI群(n=23)の左側後肢にCCI術を施行し、CCI+IM群(n=19)にはCCI術後1日で股関節、膝関節、足関節を固定し、IM群(n=21)は同様の固定のみを行った。CCI群およびCCI+IM群は、術前及び術後1週毎に熱刺激に対する逃避反応時間の測定を両側後肢足底で行い、痛覚過敏の有無を確認した。各群を術後1、2、3週で屠殺し、前脛骨筋(TA)、腓腹筋(GC)を採取し筋湿重量を測定した。筋湿重量/体重(MW)を求め、左右比較と群間比較を行った。結果として、術側の逃避反応時間は有意に短縮した。筋湿重量の左右比較は、術後2、3週で各群全ての筋において術側のMWが有意に減少した。群間比較について、3週のTAはIM群>CCI+IM群>CCI群、GCはIM群>CCI群>CCI+IM群の順でMWが減少し有意差がみられた。本研究でCCI群およびCCI+IM群は、IM群と比較して筋萎縮度が高い傾向を示したことから、CCIモデルにおける筋萎縮には不動以外の因子も含まれていることが示唆された。不動以外の因子として1)運動神経の部分損傷、2)神経の炎症が痛覚伝達路を刺激し神経ペプチドや発痛物質の影響などが考えられる。今後は、免疫組織学的な筋線維やCGRP陽性線維分布の検討を予定している。なおこの結果は、第39回日本理学療法学術大会において発表する予定である。神経因性疼痛の病態として,末梢神経レベル,中枢神経レベルで諸説言われており,その中の一つとして,末梢経での炎症が考えられている.その炎症では,マクロファージが損傷部位へ浸潤し,炎症性サイトカイン(IL-1、TNF-αなど)を放出すると言われている.この炎症性サイトカインと疼痛反応との関係については,様々な検討がなされているが,疼痛反応とマクロファージとの関係について検討したものは少ない.
極性転換を鍵とする連続環化反応の開発とアンギュサイクリノン類合成への展開

本研究は、含窒素複素環式カルベン(NHC)触媒を用いる極性転換を活用したアンギュサイクリノン類の短段階合成法の開発を目的とする。これらは比較的コンパクトであるにも関わらず、その独特で複雑な構造によって合成が阻まれてきたチャレンジングな標的化合物群である。前年度までのモデル基質を用いた検討を踏まえ、平成27年度は、抗生物質WP 3688-2の全合成研究に着手した。すなわち、まずアントラルフィンから7工程の変換により三環性ビニルブロミドを合成した。続いて、このものから発生させたビニルリチウム種を光学活性エポキシドに付加させた後、オゾン分解によってベンゾイン環化の前駆体であるケトアルデヒドへと変換した。得られた環化前駆体に対して光学活性トリアゾリウム塩を用いたジアステレオ選択的なベンゾイン環化反応を試みたところ、反応は高ジアステレオ選択的に進行し、目的のケトールが収率良く得られた。現在、標的化合物の全合成を目指し、検討中である。以上のように、研究期間内に標的化合物の合成を達成することはできなかったものの、本研究を通じ、NHC触媒を活用した独自の合成アプローチが標的化合物群の合成に有用であることを示すことができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。すなわち、アルデヒドーケトン間のベンゾイン環化反応を2回行うことにより、標的化合物に特徴的な高度に酸化されたベンズ[a]アントラキノン骨格の迅速構築を行う。研究実施計画に記載した通り、平成26年度は、(1)NHC触媒を用いる連続環化反応による骨格構築、ならびに(2)共通中間体の立体選択的合成、の2点について、重点的に検討した。(1)NHC触媒を用いるベンゾイン環化反応による骨格構築2回の環化反応を連続的に行うアプローチと段階的に行うアプローチとについて、いずれもモデル基質を用いて検討した。前者のアプローチでは化学選択性、立体選択性ともに重要であるが、検討を通じ、一度目の環化は期待通り芳香族アルデヒドから進行すること、ならびに、連続する核間水酸基が互いにcis配置であるジアステレオマーのみ得られること、の2点を明らかにした。これを踏まえて後者のアプローチも検討したところ、工程数は増えるものの各工程の収率は改善され、より効率的であることが分った。(2)共通中間体の立体選択的合成標的化合物の網羅的合成を指向した共通中間体の立体選択的合成を検討した。具体的には、上述の段階的アプローチを活用し、一度目の環化反応において光学活性触媒を、二度目の環化ではアキラルな触媒を用いることによって、共通骨格であるベンズ[a]アントラキノン骨格の構築に成功した。概要で述べた通り、当初提示した2つの課題に関し、期待通りの結果が得られた。すなわち、平成26年度の研究を通じ、標的化合物の合成において効率的な骨格構築を行うための指針を定めることができた。平成26年度の知見を踏まえ、平成27年度は(1)ケトジアルデヒドに対する連続的なベンゾイン環化反応による迅速な骨格構築法の開発、ならびに(2)脱芳香化されたアンギュサイクリノン型天然物WP 3688-2、ならびにアクアヤマイシノンの全合成、を目指す。(1)骨格構築を迅速に行うためには、2回のベンゾイン環化反応を一挙に行うことが望ましい。平成27年度は、基質設計や反応条件を検討し、この骨格構築の可否について詳細に調べる。(2)類縁体・誘導体の網羅的合成を念頭に、より官能基化された共通中間体の合成を検討する。このとき、C3位不斉中心に関するジアステレオマーをいずれも簡便に合成できる方法を実践するとともに、その中間体から様々なアンギュサイクリノンへ繋がる柔軟な合成経路の開拓を検討する。
単離大腸粘液細胞培養系を用いた粘液生合成の生理的役割とその病態に関する検討

モルモットおよびヒト大腸摘出新鮮標本から粘膜上皮のみを鈍的に剥離し、酵素処理により粘膜細胞を分離後対向流遠心分離法を用いて大腸粘液細胞のみを単離した。単離細胞は組織化学的染色法により胞体内に粘液を含む粘液細胞と確認された。24時間培養後の単離培養細胞生存率は80%以上であり、^3Hでラベルしたチミジンおよびグルコサミンを添加し、さらに3時間培養したところ、経時的にDNA合成や粘液生合成活性の増加が確認された。この大腸単離粘液細胞浮遊培養系を用いて、各種薬剤を同時添加して3時間培養後に粘液生合成活性を測定した。非ステロイド系消炎鎮痛剤であるインドメサシン添加では、細胞生存率(Trypan blue色素排泄法)・細胞障害性(LDH放出量測定法)は低濃度では変化なかったが、高濃度では生存率低下・障害性増強がみられたことから、高濃度インドメサシンには大腸粘液細胞に対する細胞障害性が示唆された。一方、増殖因子の一つであるECF添加により細胞生存率は上昇し、細胞障害性は低下がみられることから、EGFには細胞保護作用があることが示唆された。粘液生合成活性は、全ての濃度のインドメサシンで低下しており、EGF添加では全ての濃度で有意な変化はみられなかった。このことから、大腸粘液細胞の保護・障害に対する粘液合成の増減の意義は、胃粘膜における胃粘液の粘液細胞保護作用機序とは異なっている可能性が示唆された。そこで、大腸粘液細胞内の粘液糖蛋白質の糖鎖構造を、レクチン組織化学的方法と、レクチンプレートアッセイ法による生化学方法で検討した。その結果、各種薬剤添加による粘液細胞粘液生合成活性の増減にかかわらず、細胞内粘液糖蛋白質の糖鎖末端糖残基に変化はみられず、粘液組成にも変化は来していないものと推察された。モルモット大腸粘膜から粘液細胞を単離するために、新鮮大腸標本から粘膜のみを鈍的に剥離し、コラゲナーゼやEDTAにより酵素処理して細胞を分離し、ベックマン社製エルトリエーターを用いた対抗流遠心分離法により大腸上皮細胞を単離した。単離細胞の大部分はPAS染色やレクチン染色により胞体内に粘液を含む粘液細胞と確認された。単離細胞は24時間浮遊培養が可能で、viabilityは80%以上であった。単離培養細胞の粘液生合成活性を測定するために、3Hでラベルしたglucosamineを培養液中に添加し、24時間培養後培養細胞を超音波破砕、超遠心して上清を採取した。セファロース4Bカラムにより粘液糖蛋白質豊富な分画を抽出し、経時的に粘液糖蛋白質分画を測定すると、そのピークは時間とともに上昇しており、培養細胞を粘液を新たに生合成していることが確認された。3Hチミジン取り込みによるDNA合成も増加していた。一方、単離大腸粘液細胞単層培養系の作製を継続して行っているが、完全な単層培養系の作製にはさらに方法・技術の改善を必要とする。細菌の混入は細胞単離過程や培養期間中の清潔操作や抗生物質添加によりほぼ妨げるようになった。しかし、単離細胞の培養期間延長に比例して線維芽細胞の増殖がみられるため、その増殖を抑制する方法を検討中である。【目的】NSAIDsによる大腸粘膜障害の病態発生機序を大腸単離粘液細胞培養系を用いた細胞レベルで、細胞自体の抵抗性および粘液産生能に及ぼす影響の面から基礎的検討を行った。【方法】大腸摘出標本から粘液細胞を単離し浮遊培養系を作製した。

10^<-6>M10^<-3>M濃度のIndomethacin(IND)、EGF(10ng/ml、100ng/ml濃度)等を培養液中に添加して24時間培養した。細胞生存率をTripan blue色素排泄法、細胞障害をLDH放出量測定、細胞内粘液生合成活性を^3H-glucosamine取込、細胞内粘液糖蛋白質糖鎖末端糖残基をEnzyme-Linked Lectin Plate Assayで測定した。【成績】大腸粘液細胞では、10^<-6>M10^<-4>M濃度のINDでは細胞生存率は対照と比べて有意な差はなく、10^<-3>MINDは74.8%と有意に低下していた。LDH放出量は10^<-6>M10^<-5>M濃度のINDでは対照に比して有意差はみられなかったが、10^<-4>M10^<-3>M濃度のINDでは有意な増加を示した。粘液生合成活性は全てのIND濃度で有意に低下(63.173.5%)していた。EGF添加群では対照に比べて細胞生存率は上昇し、LDH放出量は低下していたが、細胞内粘液生合成活性は、対照に比べて増加しなかった。【結論】単離培養大腸粘液細胞に対するNSAIDs(IND)の細胞障害には細胞内粘液量の増減のみではなく、その他の因子の存在が示唆された。モルモットおよびヒト大腸摘出新鮮標本から、既報にしたがって粘液細胞のみを単離し、24時間培養した。培養細胞の生存率は80%以上であり、^3Hでラベルしたチミジンおよびグルコサミンを添加し、さらに3時間培養したところ、経時的にDNA合成や粘液生合成活性の増加が確認された。各種薬剤を同時添加して3時間培養後、粘液生合成活性を測定した。非ステロイド系消炎鎮痛剤であるインドメサシン添加では、細胞生存率・細胞障害性は低濃度では変化なかったが、高濃度では生存率低下・障害性増強がみられたことから、高濃度インドメサシンには大腸粘液細胞に対する細胞障害性が示唆された。一方、増殖因子の一つであるEGF添加により細胞生存率は上昇し、細胞障害性は低下がみられることから、EGFには細胞保護作用があることが示唆された。粘液生合成活性は、全ての濃度のインドメサシンで低下しており、EGF添加では全ての濃度で有意な変化はみられなかった。このことから、大腸粘液細胞の保護・障害に対する粘液合成の増減の意義は、胃粘膜における胃粘液の粘液細胞保護作用機序とは異なっている可能性が示唆された。そこで、大腸粘液細胞内の粘液糖蛋白質の糖鎮構造を、レクチン組織化学的方法と、レクチンプレートアッセイ法による生化学方法で検討した。その結果、各種薬剤添加による粘液細胞粘液生合成活性の増減にもかかわらず、細胞内粘液糖蛋白質の糖鎖末端糖残基に変化はみられず、粘液組成にも変化は来していないものと推察された。なお、予定していた癌関連遺伝子発現の有無は本実験系の条件設定の都合で、今後引き続き検討していく予定である。
セネカの悲劇の劇作技法に関する研究

セネカの悲劇作品について,その科白が登場人物の所作よりも内面的な心の動きの表現に結びついている点に劇作の特色を認め,その技法を研究することを目的とし,(1)関係研究文献の収集・整理;(2)CD-ROM検索によるテキスト分析;(3)(1),(2)を踏まえ,個々の文脈に即した解釈に基づくセネカの劇作技法の抽出,という研究手順をとった.(3)ではとくに,(a)伝統的様式を引き継ぐ要素について,その役割や用法の違いの明確化;(b)独白や傍白に注目,その技法的由来と,その劇的効果を検証;(c)劇以外のジャンルからの影響として,とくにウェルギリウス『アエネイス』とオウィディウス『変身物語』との関係の考察,という三点に留意した.その結果,(1)に関しては,所期の図書・文献の購入をほぼ達成し,(2)に関しては,パソコンの設置に加えて,新たな検索ソフトも導入,謝金による学生の研究補助・資料収集を得て,効率的データ集積を進めた.(3)については,裏面の研究発表の項に記載の論文および図書に成果を発表した.このうち,「ケパルスの物語」は(c)の留意点,とくに,セネカの登場人物の人物造形の手法の源泉を探る観点のもとに,『変身物語』の詩人が登場人物が登場人物に物語を語らせることで,その人物自身の性格づけや動機づけを表現している例を論じた.「『プセウドルス』の策略と芝居」は(b)の留意点,とくに,独白や傍白が多用される喜劇と比較し,また,劇についてのローマ人の意識を探る観点から,プラウトゥスの作品中の劇中劇と,その見立ての手法に論及した,セネカ『悲劇集』では『トロイアの女たち』を担当し,とくに(a)の点に留意して,邦訳に詳細な訳注を付し,解説にその特色を示した.以上,本年度の計画はほぼ予定どおり達成できたと考えるが,この成果を踏まえ,セネカの哲学的背景,あるいは,ギリシア・ローマ演劇全般へのより広い視野の中で問題を掘り下げることが今後の課題である.セネカの悲劇作品について,その科白が登場人物の所作よりも内面的な心の動きの表現に結びついている点に劇作の特色を認め,その技法を研究することを目的とし,(1)関係研究文献の収集・整理;(2)CD-ROM検索によるテキスト分析;(3)(1),(2)を踏まえ,個々の文脈に即した解釈に基づくセネカの劇作技法の抽出,という研究手順をとった.(3)ではとくに,(a)伝統的様式を引き継ぐ要素について,その役割や用法の違いの明確化;(b)独白や傍白に注目,その技法的由来と,その劇的効果を検証;(c)劇以外のジャンルからの影響として,とくにウェルギリウス『アエネイス』とオウィディウス『変身物語』との関係の考察,という三点に留意した.その結果,(1)に関しては,所期の図書・文献の購入をほぼ達成し,(2)に関しては,パソコンの設置に加えて,新たな検索ソフトも導入,謝金による学生の研究補助・資料収集を得て,効率的データ集積を進めた.(3)については,裏面の研究発表の項に記載の論文および図書に成果を発表した.このうち,「ケパルスの物語」は(c)の留意点,とくに,セネカの登場人物の人物造形の手法の源泉を探る観点のもとに,『変身物語』の詩人が登場人物が登場人物に物語を語らせることで,その人物自身の性格づけや動機づけを表現している例を論じた.「『プセウドルス』の策略と芝居」は(b)の留意点,とくに,独白や傍白が多用される喜劇と比較し,また,劇についてのローマ人の意識を探る観点から,プラウトゥスの作品中の劇中劇と,その見立ての手法に論及した,セネカ『悲劇集』では『トロイアの女たち』を担当し,とくに(a)の点に留意して,邦訳に詳細な訳注を付し,解説にその特色を示した.以上,本年度の計画はほぼ予定どおり達成できたと考えるが,この成果を踏まえ,セネカの哲学的背景,あるいは,ギリシア・ローマ演劇全般へのより広い視野の中で問題を掘り下げることが今後の課題である.
p53機能解析からみた口腔癌の抗癌剤感受性の検索

頭頸部癌でp53その関連遺伝子の異常が多いことはよく知られており,それらの異常と抗癌剤感受性との関連も多く報告されている.しかしながら,従来の検索はp53遺伝子の検索も,その標的分子の検索も,生検時の静的な状態を評価しているに過ぎない.そこで,抗癌剤に対する腫瘍の動的な反応を分子レベルで評価できるシステムの構築が必要である.本研究の目的は,生検材料で得られた頭頸部癌組織から初代焙養を行い,p53標的遺伝子プロモーターを含むアデノウイルスベクターを導入し,治療に使用予定の抗癌剤で処理することにより,p53標的遺伝子の転写活性化能を指標にした抗癌剤感受性検索システムの構築を行うことである.まず,頭頸部癌の生検材料の腫瘍部から初代培養を行った.予備実験で,Keratinocyte-SFM (GIBCO)を用いることにより,上皮綴胞を選択的に培養でき,その上皮細胞はほとんどが腫瘍細胞であることは確認済みである.生検材料の組織の一部(0.5mm3程度)を組織診断の障害にならないように切除し,培養を行う.初代培養した細胞を6ウェルプレート(35mm径)に播種し,細胞がサブコンフルエント(5×105個)になった状態で,レポーター遺伝子を導入する.現在すでにプラスミドルシフェラーゼレポーター(p21waf1,BAX, MDM2,p53AIP1,PUMA)は構築しており,抗癌剤処理で,ルシフェラーゼ活性が上昇することは確認している.本研究では,臨床へ情報を速やか(1-2週間以内)に返す事を目標にしている.アデノウイルスGFPレポーターを構築し,遺伝子導入効率の改善を試みているが,今後も研究を継続して行っていく予定である.我々は,ヒト口腔癌培養細胞を用いてp53標的遺伝子の転写活性化能を指標にした抗癌剤感受性検索システムを構築した(Int J Oncol 22,383-389,2003).このシステムを臨床応用するにはいくつかの問題点がある.臨床応用するのには,治療前の患者より採取した腫瘍細胞を短期間に遺伝子解析に必要な数まで増やさなければならない。また,トランスフェクション効率の問題もあるがアデノウイルスベクターを用いることによって,この点は解決できる。以上の点を解決できれば,臨床応用可能と考えられる.本研究の特色・独創的な点は,動的にp53経路の異常を検索することにより,個々の腫瘍に対し簡便でかつ精度の高い抗癌剤感受性の診断システムを構築するところにある.その結果は直接臨床に還元でき,個々の症例でのp53経路の異常を知ることができ,抗癌剤選択あるいは抗癌剤治療の可否の決定にも示唆を与えることができる.そこで,我々は,生検材料で得られた頭頸部癌組織から初代培養細胞を行い,p53標的遺伝子プロモーターを導入し,治療に使用予定の抗癌剤で処理することにより,p53標的遺伝子の転写活性化能を指標にした抗癌剤感受性検索システムの構築を試みている.現在アデノウイルスベクターの作製を行っている.頭頸部癌でp53とその関連遺伝子の異常が多いことはよく知られており,それらの異常と抗癌剤感受性との関連も多く報告されている.しかしながら,従来の検索はp53遺伝子の検索も,その標的分子の検索も,生検時の静的な状態を評価しているに過ぎない.そこで,抗癌剤に対する腫瘍の動的な反応を分子レベルで評価できるシステムの構築が必要である,これまでに腫瘍の抗癌剤に対する反応を増殖能の変化,細胞の生存率などで評価する方法の報告はあるが,反応の中心的な役割を担う遺伝子を中心とした,その下流の分子の動きを評価しようとした試みはない.本研究の目的は,生検材料で得られた頭頸部癌組織から初代培養細胞を行い,p53標的遺伝子プロモーターを導入し,治療に使用予定の抗癌剤で処理することにより,p53標的遺伝子の転写活性化能を指標にした抗癌剤感受性検索システムを構築することである.まず,頭頸部癌の生検材料の腫瘍部から初代培養を行った.予備実験で,Keratinocyte-SFM(GIBCO)を用いることにより,上皮細胞を選択的に培養でき,その上皮細胞はほとんどが腫瘍細胞であることは確認済みである.生検材料の組織の一部(0.5mm3程度)を組織診断の障害にならないように切除し,培養を行う.初代培養した細胞を6ウェルプレート(35mm径)に播種し,細胞がサブコンフルエント(5×105個)になった状態で,レポーター遺伝子を導入する.現在すでにプラスミドルシフェラーゼレポーター(p21waf1,BAX,MDM2,p53AIP1,PUMA)は構築しており,抗癌剤処理で,ルシフェラーゼ活性が上昇することは確認している.本研究では,臨床へ情報を速やか(1-2週間以内)に返す事を目標にしている.現在,アデノウイルスGFPレポーターを構築し,遺伝子導入効率の改善を試みているところである.頭頸部癌でp53その関連遺伝子の異常が多いことはよく知られており,それらの異常と抗癌剤感受性との関連も多く報告されている.しかしながら,従来の検索はp53遺伝子の検索も,その標的分子の検索も,生検時の静的な状態を評価しているに過ぎない.そこで,抗癌剤に対する腫瘍の動的な反応を分子レベルで評価できるシステムの構築が必要である.

本研究の目的は,生検材料で得られた頭頸部癌組織から初代焙養を行い,p53標的遺伝子プロモーターを含むアデノウイルスベクターを導入し,治療に使用予定の抗癌剤で処理することにより,p53標的遺伝子の転写活性化能を指標にした抗癌剤感受性検索システムの構築を行うことである.まず,頭頸部癌の生検材料の腫瘍部から初代培養を行った.予備実験で,Keratinocyte-SFM (GIBCO)を用いることにより,上皮綴胞を選択的に培養でき,その上皮細胞はほとんどが腫瘍細胞であることは確認済みである.生検材料の組織の一部(0.5mm3程度)を組織診断の障害にならないように切除し,培養を行う.初代培養した細胞を6ウェルプレート(35mm径)に播種し,細胞がサブコンフルエント(5×105個)になった状態で,レポーター遺伝子を導入する.現在すでにプラスミドルシフェラーゼレポーター(p21waf1,BAX, MDM2,p53AIP1,PUMA)は構築しており,抗癌剤処理で,ルシフェラーゼ活性が上昇することは確認している.本研究では,臨床へ情報を速やか(1-2週間以内)に返す事を目標にしている.アデノウイルスGFPレポーターを構築し,遺伝子導入効率の改善を試みているが,今後も研究を継続して行っていく予定である.
臨床応用を考慮した実用的な放射線感受性予測法の開発

【背景】HPV陽性中咽頭癌は、放射線治療に対する反応が良好である。これには、腫瘍免疫の関与の可能性がある。照射前の生検標本を用い、p16蛋白や腫瘍免疫関連蛋白の免疫染色を行い、予後との関連を解析した。【方法】2005年から2014年に放射線治療を行った中咽頭扁平上皮癌92例を対象とした。p16陽性は45例、p16陰性は47例であった。放射線治療前の生検標本を用い、PD-L1(Programmed cell Death 1- Ligand 1)抗体、細胞障害性T細胞のマーカーであるCD8抗体を使用して免疫染色を行った。PD-L1の発現は、腫瘍細胞の発現(PD-L1 TC)と腫瘍周囲のマクロファージや樹状細胞などの免疫細胞(immune cells)の発現(PD-L1 IC)に分けて評価した。CD8は腫瘍浸潤リンパ球をカウントし、CD8陽性リンパ球の割合とした。【結果】p16陽性群は、p16陰性群と比較して全生存率、無再発生存率、いずれも有意に良好であった。また、p16陽性群はp16陰性群と比較して、PD-L1 TCの発現及びCD8リンパ球数が有意に高く、PD-L1 ICも発現が高い傾向であった。PD-L1 TC、PD-L1 IC、CD8いずれにおいても高発現群が低発現群より、全生存率が有意に予後良好であった。p16陽性でPD-L1 IC高発現群の5年全生存率は95.5%、p16陰性でPD-L1 IC低発現群は50%未満であった。一方、p16陰性でPD-L1 IC高発現群の全生存率(65.9%)は、p16陽性でPD-L1 IC低発現群と同等であった。多変量解析では、PD-L1 ICが、Charlson's index、併用療法の有無とともに予後因子であった。【考察、結論】細胞傷害性T細胞はインターフェロンγを分泌し、腫瘍細胞を攻撃するが、腫瘍細胞や腫瘍浸潤免疫細胞はインターフェロンγによりPD-L1の発現が誘導される。よって、PD-L1 TCやPD-L1 ICの高発現は、抗腫瘍免疫応答の活性化の指標と考えられる。中咽頭癌の放射線治療において、免疫細胞による抗腫瘍効果は、中咽頭癌の放射線治療成績に、有意に影響すると考えられる。研究目的に、生検標本を使用した免疫組織化学染色により、放射線治療成績の予測があるが、これに関して、有望な結果が得られたため。中咽頭癌以外の癌でも、同様の研究を行う。特に、DNA2重差切断の修復能や腫瘍免疫能と放射線治療成績の解析を進める。

特に、DNA2重差切断の修復能や腫瘍免疫能と放射線治療成績の解析を進める。【理由】すでに研究室にあった消耗品を使用して研究を行ったため、残額が生じた。【使用計画】30年度の残額と次年度の直接経費を使用して免疫組織染色、DNA-PK活性測定、in vitroの研究を行う。これらの研究における消耗品購入、成果発表のための学会参加の費用などに使用する予定である。
ADHD児行動特性の個性表出を目指したfNIRS脳機能検査の早期適用化

本研究は、「右前頭前野の脳活動をバイオマーカーとしたfNIRSによるADHD診断法の開発」というシーズ研究を発展させて展開した。ADHDの中核症状である抑制機能を計測するために、これまではGo/Nogo課題を用いていたが、これらは6歳以上の就学児におけるfNIRS脳機能画像解析用に最適化されたものであった。一方で、6歳未満の未就学児での実行には最適化されていなかった。現行課題の検討を詳細におこなったところ、課題の遂行時間を短くすることによって、より効率的に脳機能を評価できることがわかり、就学前の遂行可能性が高まった。一方で、ADHD児の病態によって、脳活動のパターンが異なる可能性も探索的に検討した。この結果、ADHD児においてASD(自閉症スペクトラム症)の併存によって脳活動のパターンが異なることが明らかとなった。ADHD単独発症型の場合、Go/Nogo課題遂行時に右前頭前野の賦活は低下しているが、メチルフェニデート徐放剤投薬によって賦活が上がることが分かった。一方で、ASD併存型の場合、Go/Nogo課題遂行時に右前頭前野の過活動があり、メチルフェニデート徐放剤投薬によって賦活が収まることが分かった。同じADHD児であっても、ADHD単独発症型とASD併存型では、性格や行動特性は異なるが、抑制機能の遂行や薬物応答の面でも脳活動パターンが異なる異なることが明らかになった。さらに、右前頭前野に加え、頭頂葉の活動パターンを考慮することによって、ADHD単独発症型とASD併存型の判別が個人レベルでも高い精度で行えることがわかった。これらの研究によって、ADHD児において、個性の一翼を担う個人特性と脳内表象の可視化が実現できたと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。注意欠如多動症(ADHD)は、不注意、多動・衝動性を中核症状とする発達障害とされているが、その行動特性の中には、疾患の症状ではなく、個性として表出すべきものもある。ADHD児の「症状」が「個性」として発揮されるためには、早期診断と早期治療が必須である。我々は、6歳以上の児童について、fNIRS脳機能画像検査を用い、右前頭前野の脳活動をバイオマーカーとして、1ADHD児と定型発達児を判別、2投薬による治療効果を判断することに成功した。そこで本研究では、これらの成果を発展させ、未就学児のfNIRS脳機能画像検査によるADHDの病態把握を実現する。そのために検査課題にゲーミフィケーションの要素を導入し、低年齢からでも安定的に脳機能検査を行なえる検査課題を作成し、その実効性を現行課題との比較によって、定量的に明らかにすることを目的とした。当初、未就学児でも実行可能にするために、当初はゲーミフィケーションの要素を導入し、低年齢での対応をする予定であった。特に、低年齢の児童でも理解しやすいエピソディックな内容を課題に導入する計画であった。一方で、現行課題の検討を詳細に行なったところ、課題の遂行時間を短くすることによって、より効率的に脳機能を評価できる可能性が見いだされた。また、長い課題に対する「飽き」を軽減することによって、低年齢での実施の可能性も高まった。そこで、現行課題に対してシミュレーションを行なったところ、定型発達児においては、現行の6回繰り返しを、低減しても検出力の低下はないということがわかった。さらに、現状での検査離脱率を加味し、検査自体の成立可能性を加味した検討を実施した。その結果、実際の低減は現実的であることが判明した。これらの結果を踏まえ、ADHD児の薬物治療効果の検討にも、試行回数の軽減が適切であるか否かを実証していく。当初は、新たな実験課題の開発を行なうことによって、検査の低年齢化を試みていたが、既存課題の見直しによって、その目的は実現可能であることが分かりつつある。このため、昨年度は、目標の実現を優先させて、課題短縮の効果を検討した。また、当初予定されていなかった、ADHDのサブタイプによる脳活動の変化が明らかになった。ADHDのサブタイプは個性の表出型でもある。そこで、個性を反映する脳活動の探索も行ない、個性の脳内表象と行動特性の関係性可視化するという着想を新たに得た。これらの進展を踏まえると、全体的には概ね順調な進行状況と考えられる。

一方で、ASD併存型の場合、Go/Nogo課題遂行時に右前頭前野の過活動があり、メチルフェニデート徐放剤投薬によって賦活が収まることが分かった。同じADHD児であっても、ADHD単独発症型とASD併存型では、性格や行動特性は異なるが、抑制機能の遂行や薬物応答の面でも脳活動パターンが異なる異なることが明らかになった。さらに、右前頭前野に加え、頭頂葉の活動パターンを考慮することによって、ADHD単独発症型とASD併存型の判別が個人レベルでも高い精度で行えることがわかった。これらの研究によって、ADHD児において、個性の一翼を担う個人特性と脳内表象の可視化が実現できたと考えられる。本研究は、「右前頭前野の脳活動をバイオマーカーとしたfNIRSによるADHD診断法の開発」というシーズ研究を発展させて展開する。ADHDの中核症状である抑制機能を計測するために、これまではGo/Nogo課題を用いていたが、これらは6歳以上の就学児におけるfNIRS脳機能画像解析用に最適化されたものであった。一方で、6歳未満の未就学児での実行には最適化されていなかった。そこで、未就学児でも実行可能にするために、当初はゲーミフィケーションの要素を導入し、低年齢での対応をする予定であった。特に、低年齢の児童でも理解しやすいエピソディックな内容を課題に導入する計画であった。一方で、現行課題の検討を詳細に行なったところ、課題の遂行時間を短くすることによって、より効率的に脳機能を評価できる可能性が見いだされた。また、長い課題に対する「飽き」を軽減することによって、低年齢での実施の可能性も高まった。そこで、現行課題に対してシミュレーションを行なったところ、定型発達児では現行の6回繰り返しを、大幅に低減しても検出力の低下はないということがわかった。本年度は、この成果を発展させ、ADHD児の薬物治療効果の検討にも、試行回数の軽減が適切であるか否かを実証する。また、ADHD児の病態や、年齢、知能によって、脳活動のパターンが異なる可能性も探索的に検討していく。さらに、ADHD児ついては、病態と投薬効果の関係性も解析していく。これらの研究によって、個性の一翼を担う個人特性と脳内表象の可視化を試みる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
下垂体より精製した新しい生理活性因子、腎成長因子の特異活性と構造の検討

腎成長因子は多様な電荷を有する黄体化ホルモン(LH)の特殊なイソ体であることを明らかにした。腎成長因子/LHを豚下垂体より精製し、最終段階で等電点電気泳動をおこなったところ、豚LHは4つの画分にわかれたが、ex vivoのアッセイ糸で腎成長促進作用を示したのは1EF-fr2 (pI=10.2810.18)のみであった。この等電点電気泳動で得られた4つの画分を逆相HPLCで展開すると、いづれも同一の溶出パターンを示した。これはこれらの画分の電荷の差がアミノ酸構造の差によるものではなく、糖鎖構造の差によることを示唆しているものと我々は結論した。In vitroでの腎成長因子アッセイではpIのひくいLHイソ体ほど活性が低い傾向があり、これは糖鎖構造(特に末端のheterogeneity)と関連が示唆された。一方、ex vivoのアッセイ系でIEF-fr2のみ腎成長促進作用を示したが、その蛋白質一次構造、糖鎖構造が他の画分のものと特に異なるとの所見は得られなかった。EX vivoでの活性については生体内での代謝が活性の強弱に大きく影響する因子となり得る。今後各イソ体の代謝率について検討する必要があると考えている。豚下垂体より腎成長因子(レノトロピン)を精製した.方法は羊腎成長因子を精製すると同じ方法でおこなった(既報).これを分取用等電点電気泳動にて展開したところ5つのピークに分離した.各々のピークのpIはFr, 1, 10.4;Fr, 2, 10.2;Fr, 3, 10.0;Fr, 4,9.8;Fr, 5, 9.4であった.以上の1EF各分画を逆相HPLCで展開すると3種のαサブユニット, 3種のβサブユニットの溶出が認められた.これはαサブユニットではそのN末端, βサブユニットではそのC末端の相異に由来することを明らかにした.しかしIEF各分画間でHPLC溶出パターンには大きな違いは認められず, IEFでの溶出はアミノ酸構造の差によるものではなく,糖鎖の違いによるものと推察された.次に各IEF分画の生物活性について検討した.まずインビボのアッセイ系でのレノトロピン活性はFr, 2, Fr, 4, Fr, 5に認められた.一方インビトロのアッセイ系ではすべての分画に活性が認められたもののその力価には違いがあり, Fr, 2>Fr, 1>Fr, 3>Fr, 4>Fr, 5の順であった.腎成長因子はLHの特殊アイソホルモンと考えられるのでIEF各分画のゴナドトロピン活性(インビトロのアッセイ系)を検討した.その力価はFr, 2>Fr, 1>Fr, 3>Fr, 4であり, Fr, 5の活性は僅かであった.以上よりレノトロピン活性はその糖鎖構造の違いによって活性が左右されることが強く示唆された.この構造はゴナドトロピン活性にも影響するがレノトロピン活性とは解離がみられた.レノトロピン活性もインビボとインビトロでは異なることより糖鎖末端の硫酸基,シアル酸の有無によって代謝が影響されることも示唆された.豚下垂体より黄体化ホルモン(LH)を精製し、等電点電気泳動(IEF)で更に4つめのイソ体に分離した。Ex vivoの腎成長因子アツセイで活性を示すのはIEF-fr.2である。この各IEF分画の糖鎖構造の分析をおこなった。各IEF分画をα、βサブユニットにわけ、ヒドラジノリーシスで糖鎖を切断し、それを還元、標識した。この標識オリゴ糖をイオン交換カラムで展開すると中性画分と4種の酸性画分(N-1、S-1、S-N、S-2)に分離できた。N-1はシアル酸が1個あり、S-1、S-2は硫酸基が1個又は2個あるものであり、S-Nはシアル酸、硫酸基が各1個あるものを示す。αサブユニットの糖鎖末端は中性画分とS-1が主であるが、pIの低いイソ体由来のα

サブユニットではS-1、S-2の割合が増え、中性糖の割合が低下する傾向を示した。βサブユニットのオリゴ糖末端は主としてS-2が主であるが、pIの低いイソ体由来のβサブユニットではS-2の割合がさらに多くなり、中性画分、S-1が少なくなる傾向を示した。更にConAカラムクロマト、塩酸メタノール処理による硫酸基の除去、各種グリコシダーゼによる逐次分解をおこないS-1、S-2、S-Nは末端のheterogeneityを有する複合であることを明らかにした。In vitroのアツセイではpIの低いイソ体ほど腎成長因子活性が低い傾向を示した。これは糖鎖構造との関連が推測された。しかし、ex vivoでの活性との相関ははっきりしなかった。In vivoでの活性発現にはイソ体の代謝率が問題となる可能性がある。
肺がん患者の脳転移抑制と副作用軽減によるQOL向上のための戦略的薬物療法の構築

上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異陽性の非小細胞性肺癌においてEGFRチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)は第一選択薬であり優れた治療効果を示す一方、重篤な下痢などの副作用発現頻度も高く、患者QOLを低下させ治療中断の原因となる。また、この副作用発現の個人差の原因に関する情報は殆どない。本研究では、EGFR-TKIの体内動態および関連遺伝子多型と副作用との関連を明らかにし、さらに脳転移発症のリスク因子を明らかにすることを目的としている。現在までに、第2世代EGFR-TKIであるアファチニブが投与された33症例を対象として中間解析を行った。血漿中濃度は定常状態に到達する内服9日目(投与初期)および投与量が1カ月以上安定している時期(維持期)のトラフ血漿中濃度を測定した。アファチニブの体内動態関連遺伝子としてABCB1、ABCG2、FMO3におけるSNPsを解析した。下痢およびざ瘡様皮疹の発現率はともに80%以上であった。投与初期の血漿中濃度と下痢重症度との間に相関が認められた。また、薬物動態関連の遺伝子多型が下痢重症化に影響する可能性が示され、特に、ABCG2 C421AのAアレル保持者ではアファチニブ血漿中濃度が高く、下痢が重症化することが示唆された。維持期での下痢や投与初期と維持期でのざ瘡様皮疹の発症と遺伝子多型との関連は認められなかった。アファチニブ投与初期に出現する下痢の重症化は血漿中濃度の影響を受け、その血漿中濃度は、薬物動態関連の遺伝子多型の影響を受けていることから、アファチニブ投与前に遺伝子多型を評価し患者毎に投与量を調節することで、副作用を回避してQOLの維持・改善と、さらなる治療成績の向上が期待できると考えられる。現在、さらに症例を積み重ね、また、他のEGFR-TKIについても調査を行っている。現在まで概ね順調に患者登録が進んでいる。また脳脊髄液中のEGFR-TKIの測定法の構築もほぼ完了している。EGFR-TKIのうち第2世代のアファチニブに関しては、中間解析の結果、すでに投与初期の血漿中濃度に対する薬物トランスポーター遺伝子の多型の影響も明らかしており、血漿中濃度と副作用との相関も明らかとなった。現在、生存率や無増悪生存期間との関係も解析しており、副作用のみならず薬効との関連も明らかになることが予想される。また、現在、中枢移行に関する検討の準備も進んでおり、EGFR-TKIの脳内動態の解析も順調に結果が得られると予測される。前年度に引続き同様な研究体制で、非小細胞肺癌患者について文書によるICを取得後、遺伝子多型解析を行い、血中薬物濃度を測定し、治療経過を調査する。これらの解析、調査が終了次第、遺伝子多型情報および血中薬物濃度と治療経過について多変量解析を行い総合的に評価する。また、EGFR-TKIsの中枢移行性の解析についての検討を引き続き実施する。患者の遺伝子多型および薬物投与量と血中薬物濃度等について、それぞれ単変量解析ならびに多変量解析を行い、これらの因子によるEGFR-TKIsの投与量や臨床経過への寄与率、脳転移のリスク因子を検討する。また、これらの遺伝子多型解析と血中薬物濃度測定および臨床経過により得られるEGFR-TKIs毎の投与法を検討する。現在までの登録患者は50症例であり概ね順調に患者登録が進んでいる。

また脳脊髄液中のEGFR-TKIの測定法の構築もほぼ完了している。EGFR-TKIのうち第2世代のアファチニブに関しては、中間解析の結果、すでに投与初期の血漿中濃度に対する薬物トランスポーター遺伝子の多型の影響も明らかしており、血漿中濃度と副作用との相関も明らかとなった。このまま順調に経過すれば、他のEGFR-TKIについても同様の結果が得られると予測される。また、現在、脳転移患者も20例以上登録済みである。中枢移行に関する動物実験の準備も進んでおり、脳組織中のEGFR-TKI測定法の構築もほぼ完了している。人および動物におけるEGFR-TKIの脳内動態の解析も順調に結果が得られると予測される。上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子変異陽性の非小細胞性肺癌においてEGFRチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)は第一選択薬であり優れた治療効果を示す一方、重篤な下痢などの副作用発現頻度も高く、患者QOLを低下させ治療中断の原因となる。また、この副作用発現の個人差の原因に関する情報は殆どない。本研究では、EGFR-TKIの体内動態および関連遺伝子多型と副作用との関連を明らかにし、さらに脳転移発症のリスク因子を明らかにすることを目的としている。現在までに、第2世代EGFR-TKIであるアファチニブが投与された33症例を対象として中間解析を行った。血漿中濃度は定常状態に到達する内服9日目(投与初期)および投与量が1カ月以上安定している時期(維持期)のトラフ血漿中濃度を測定した。アファチニブの体内動態関連遺伝子としてABCB1、ABCG2、FMO3におけるSNPsを解析した。下痢およびざ瘡様皮疹の発現率はともに80%以上であった。投与初期の血漿中濃度と下痢重症度との間に相関が認められた。また、薬物動態関連の遺伝子多型が下痢重症化に影響する可能性が示され、特に、ABCG2 C421AのAアレル保持者ではアファチニブ血漿中濃度が高く、下痢が重症化することが示唆された。維持期での下痢や投与初期と維持期でのざ瘡様皮疹の発症と遺伝子多型との関連は認められなかった。アファチニブ投与初期に出現する下痢の重症化は血漿中濃度の影響を受け、その血漿中濃度は、薬物動態関連の遺伝子多型の影響を受けていることから、アファチニブ投与前に遺伝子多型を評価し患者毎に投与量を調節することで、副作用を回避してQOLの維持・改善と、さらなる治療成績の向上が期待できると考えられる。現在、さらに症例を積み重ね、また、他のEGFR-TKIについても調査を行っている。現在まで概ね順調に患者登録が進んでいる。現在、生存率や無増悪生存期間との関係も解析しており、副作用のみならず薬効との関連も明らかになることが予想される。また、現在、中枢移行に関する検討の準備も進んでおり、EGFR-TKIの脳内動態の解析も順調に結果が得られると予測される。前年度に引続き同様な研究体制で、非小細胞肺癌患者について文書によるICを取得後、遺伝子多型解析を行い、血中薬物濃度を測定し、治療経過を調査する。これらの解析、調査が終了次第、遺伝子多型情報および血中薬物濃度と治療経過について多変量解析を行い
海馬場所細胞の可塑性と樹状突起活動の因果関係の解析

本研究は、ラットが新規な場所情報を獲得する過程で起こる海馬CA1野内の場所細胞の活動に着目し、その可塑的変化に関与する樹状突起逆伝播スパイクの役割について解明することを目指す挑戦的な試みである。それは、独自の電気生理学的記録法とデータ解析法に、光遺伝学を活用した神経刺激法を組み合わせることで、視覚野ニューロンの臨界期に関するヘンシュ貴雄博士(ハーバード大学)の仮説(Hensch, Nature Reviews Neuroscience, 2005)を実証することでもある。同時に本研究は、多様な情報に対応し柔軟に活動するニューロンの実態を実験的に明らかにすることで、既存の情報科学的モデルに新たな神経科学的知見を提供することも目指す。これまでに、マルチニューロン活動記録法、光刺激法、及びデータ解析法を統合し、実際にラットが未経験な場所を認知している際のマルチニューロン活動を記録し解析を進めた。具体的には、ラットが未経験の実験ボックス内で餌を求めて行動している際、マルチニューロン活動を記録し続け、パルス波、チャープパターン、ランダムノイズパターンの3種類の光刺激をChR2を発現させたパルバルブミン陽性細胞へ特異的に与えることで、樹状突起逆伝播スパイクの反応と神経細胞活動の関係性を解析した。本年度は、これまでに実施してきた一定の刺激パターンに加えて、リアルタイムフィードバック刺激を実施した。具体的には、局所脳波上のシータ波、ベータ波、ガンマ波のピーク、トラフなどの位相に合わせて、パルバルブミン陽性細胞や錐体細胞の活動を制御する実験を実施した。本年度は、ラットが未経験の実験ボックス内で餌を求めて行動している際、マルチニューロン活動を記録し続けるとともに、局所脳波の位相に合わせて、パルバルブミン陽性細胞や錐体細胞へリアルタイムフィードバック刺激をする実験を実施することができた。このように本研究が計画通りに進展したため、おおむね順調に進展していると判断した。ラットが未経験の環境を認知する際には、場所細胞が持つ場所情報が数分で可塑的に変化することが知られている(Wilson & McNaughton, Science, 1993)。その可塑的変化の過程と樹状突起逆伝播スパイクの伝播確率との関係について、場所情報量を中心として解析する。また同時に、樹状突起逆伝播スパイクを抑制し制御していることが示唆されている介在細胞のパルバルブミン陽性細胞や錐体細胞自体の活動を局所脳波の特定位相に合わせたフィードバック神経刺激により制御することで、可塑性と樹状突起逆伝播スパイクの因果関係を解析する。それは、独自の電気生理学的記録法とデータ解析法に、光遺伝学を活用した神経刺激法を組み合わせることで、視覚野ニューロンの臨界期に関するヘンシュ貴雄博士(ハーバード大学)の仮説を実証することでもある。本年度は、光遺伝学により抑制性細胞を選択的に神経刺激しながら、マルチニューロン活動を長期間安定して記録する方法を確立した。電極先端近くの全てのニューロンの活動をもれなく検出するため、専用の電極制御装置をPCB技術と3次元プリント技術を応用して、設計・開発した。また、超小型オペアンプ兼フィルタを構成し、耐ノイズ性を極限まで高めた。更に、マルチニューロン活動記録法と光遺伝学による神経刺激法を融合し、データ解析法についても改良を進めた。遺伝子改変技術を活用してパルバルブミン陽性細胞特異的にCreを発現したマウスに対して、アデノ随伴ウイルス(AAV:FLEX:ChR2)を介し光活性化蛋白質チャネルドロプシン2(ChR2)を発現させることで、パルバルブミン陽性細胞だけを選択的に神経刺激した。以上のように、当初の計画通りに研究が進展したため、おおむね順調に進展していると判断した。

本年度は、マルチニューロン活動記録法、光刺激法、及びデータ解析法を統合し、実際にラットが未経験な場所を認知している際のマルチニューロン活動を記録し解析を進めた。具体的には、ラットが未経験の実験ボックス内で餌を求めて行動している際、マルチニューロン活動を記録し続け、パルス波、チャープパターン、ランダムノイズパターンの3種類の光刺激をChR2を発現させたパルバルブミン陽性細胞へ特異的に与えることで、樹状突起逆伝播スパイクの反応と神経細胞活動の関係性を解析した。また、相互相関解析法を用いて、細胞体から樹状突起へ逆伝播するスパイクを検出し、単一ニューロンの細胞体と樹状突起のペアの検出を試みた。本年度は、ラットが未経験の実験ボックス内で餌を求めて行動している際、マルチニューロン活動を記録し続ける実験を着実に遂行することができ、記録したマルチニューロン活動を個々のニューロン活動に選別するなどの試みを実施することができた。また、パルバルブミン陽性細胞への光刺激を様々なパラメータで実施することができた。このように本研究が計画通りに進展したため、おおむね順調に進展していると判断した。本研究は、ラットが新規な場所情報を獲得する過程で起こる海馬CA1野内の場所細胞の活動に着目し、その可塑的変化に関与する樹状突起逆伝播スパイクの役割について解明することを目指す挑戦的な試みである。それは、独自の電気生理学的記録法とデータ解析法に、光遺伝学を活用した神経刺激法を組み合わせることで、視覚野ニューロンの臨界期に関するヘンシュ貴雄博士(ハーバード大学)の仮説(Hensch, Nature Reviews Neuroscience, 2005)を実証することでもある。同時に本研究は、多様な情報に対応し柔軟に活動するニューロンの実態を実験的に明らかにすることで、既存の情報科学的モデルに新たな神経科学的知見を提供することも目指す。これまでに、マルチニューロン活動記録法、光刺激法、及びデータ解析法を統合し、実際にラットが未経験な場所を認知している際のマルチニューロン活動を記録し解析を進めた。本年度は、これまでに実施してきた一定の刺激パターンに加えて、リアルタイムフィードバック刺激を実施した。具体的には、局所脳波上のシータ波、ベータ波、ガンマ波のピーク、トラフなどの位相に合わせて、パルバルブミン陽性細胞や錐体細胞の活動を制御する実験を実施した。本年度は、ラットが未経験の実験ボックス内で餌を求めて行動している際、マルチニューロン活動を記録し続けるとともに、局所脳波の位相に合わせて、パルバルブミン陽性細胞や錐体細胞へリアルタイムフィードバック刺激をする実験を実施することができた。
モバイルエージェントシステム及びコンポーネントの自己反映計算に関する研究

本研究活動における本期間では、主にモバイルエージェントシステムの領域における形式的側面についてさらに調査を行った。本研究の中心モデルであるinteraction spaceは、モバイルエージェントシステムを設計およびreasonするために、幾何学的な特徴化を用いる。Interaction spaceはまだ完全に形式化されていない非常に若い理論である。最近はその理論におけるchannel-passingの新しい特徴化について研究してきた。Channel-passingはモバイル計算の動的構造を非常に簡潔に表現することを可能にするため、非常に重要である。なお、channel-passingは、Cambridge大学のRobin Milnerによって開発されたπ計算の理論によって、計算機科学の世界でよく知られるようになった。本研究で提案するvariant (Cube計算と呼ばれる)は、セマンティクスがトレースモデルを使って定義されるという独自性を持つ。それと比較して、他のπ計算のvariantはラベルつき遷移システムを用いて定義される。両アプローチは利点と不便な点を持つが、本研究はそれらを比較することを可能にする。本研究では、位置の概念を導入することにより、トレースベースとラベルつき遷移システムベースのモデルの両方に対して同じ区別能力を得られる可能性があることを示す。本研究でこれまでに得た重要な結果は、本研究で提案するセマンティクスが、強力な仕様ツールであるrefinement計算をサポートすることである。加えて、本研究で開発した言語は、π計算の大半のvariantとは異なり、fully compositionalである。これらの二つの結果はInternational Conference on Communicating Process Architectures 2004 (CPA2004)に採択された論文の中で詳細に議論されている。