hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「共生日本語」教育構築の試み―「共生日本語」による教室実践モデル開発

本研究の目的は、以上の四点に集約されている。(1)「共生日本語」の理論的精緻化(2)クレオール語圏の言語教育実態の調査(3)日本語学習者の言語意識の調査(4)「共生日本語」実践モデルの開発理論的な構築に関しては、2007-2009年度を通して、「共生日本語」およびクレオール理論をめぐって、ポストモダン・社会構成主義に関わる文献を研究会の形で定期的に実施してきた。とくに2008年度は、研究代表者の在外経験を機軸として、ヨーロッパ言語共通参照枠(以下、CEFR)での複言語複文化主義によるフランス語圏をはじめとした諸外国の言語教育の実態調査により、「共生言語」教育の実践に必要なものとは何かを明らかにすることに焦点を置いた。2009年度は、これらの知見を踏まえ、日本語教育における実践モデルの構築を試みた。訂正を行わない「共生日本語」の立場にたった実践として研究者らが長年早稲田大学で実践を続けている「総合活動型日本語教育」に、研究の成果を加えた、新しい実践モデルをプロトタイプとして実践し、その分析・改善を重ね、現在の段階では、ポストモダンおよび社会構成主義的立場からのパブリック・カンヴァセーションという理論にたどり着いた。とくに、2009年度は、このパブリック・カンヴァセーションの理論をもとに、「討論会プロジェクト」を立ち上げた他、「考えるための日本語」として「個人と社会を結ぶ」の実践活動を行った。この理論は、具体的な活動として組織され、新しい「共生日本語」の理論と実践として、次の研究課題(アイデンティティに関わる、ことばの活動研究)へと集約されることになる。(1)「共生日本語」の理論的精緻化/(2)クレオール語圏の言語教育実態の調査(3)日本語学習者の言語意識の調査/(4)「共生日本語」実践モデルの開発(1)に関して、「共生日本語」の理論確立のための研究プロジェクトを、言語文化教育研究会の名称にて毎月継続開催し、「共生日本語」をめぐる理論的研究を行った。この経緯については、ホームページにて議事録等を公開し、さらに、文献調査等は、データベース化し、共有化できるようにした。また、研究会のホームページ、プログを作成し、研究会の議論を情報として発信するシステムを作成し、本研究活動の母体として、さまざまな発信を行いつつ、インターネット上で稼動を始めた(URL参照)。(2)(3)に関して、実態調査としては、韓国における学習者調査およびフランスにおけるクレオール研究等の実態調査も行った。とくに研究代表者が、9月より交換研究により渡仏したため、この機会を利用して、さまざまな言語教育関係者と交渉を持ち、研究発表の形で公開した(一部は、ホームページ上にデータ等を掲載)。あわせて、(4)に関して、「共生日本語」を一つの理念とした実践モデルの開発のために、初級段階からの学習者を交えた実践クラスを設計し、ビデオカメラ、ICレコーダーによる録音により、基礎資料を作成した。現在、順次その設計をインターネット上で公開するための準備を進めている(URL参照)。平成20年度は、とくに(4)に関する研究を推し進め、「共生日本語」をめぐる教室活動の実際について、その実践モデルの開発をめざす。(1)「共生日本語」の理論的精緻化(2)クレオール語圏の言語教育実態の調査(3)日本語学習者の言語意識の調査(4)「共生日本語」実践モデルの開発理論的な構築に関しては、2007-2008年度を通して、「共生日本語」およびクレオール理論をめぐって、ポストモダン・社会構成主義に関わる文献を研究会の形で定期的に実施してきた。とくに今年度は、2007-2008年度の研究代表者の在外経験を機軸として、ヨーロッパ言語共通参照枠(以下、CEFR)での複言語複文化主義によるフランス語圏をはじめとした諸外国の言語教育の実態調査により、「共生言語」教育の実践に必要なものとは何かを明らかにすることに焦点を置いた。ヨーロッパの複言語複文化主義は理論的に導きだされた概念であるが、実践モデルを考える以上、現実の学習者の言語使用状況や、言語意識からみた「共生日本語」の課題を把握する必要がある。従って、そのための実践モデルを日本語教育として示す必要があるからである。これらの知見を踏まえ、日本語教育における実践モデルの構築を試みようとしたのが、今年度の試みである。2009年度の萌芽研究の最終年度に向けて、この理論を具体的な活動として組織し、新しい「共生日本語」の理論と実践へと第一歩を踏み出すこととする。

とくに2008年度は、研究代表者の在外経験を機軸として、ヨーロッパ言語共通参照枠(以下、CEFR)での複言語複文化主義によるフランス語圏をはじめとした諸外国の言語教育の実態調査により、「共生言語」教育の実践に必要なものとは何かを明らかにすることに焦点を置いた。2009年度は、これらの知見を踏まえ、日本語教育における実践モデルの構築を試みた。訂正を行わない「共生日本語」の立場にたった実践として研究者らが長年早稲田大学で実践を続けている「総合活動型日本語教育」に、研究の成果を加えた、新しい実践モデルをプロトタイプとして実践し、その分析・改善を重ね、現在の段階では、ポストモダンおよび社会構成主義的立場からのパブリック・カンヴァセーションという理論にたどり着いた。とくに、2009年度は、このパブリック・カンヴァセーションの理論をもとに、「討論会プロジェクト」を立ち上げた他、「考えるための日本語」として「個人と社会を結ぶ」の実践活動を行った。この理論は、具体的な活動として組織され、新しい「共生日本語」の理論と実践として、次の研究課題(アイデンティティに関わる、ことばの活動研究)へと集約されることになる。
GTRAP3-18による神経細胞のグルタチオン濃度決定機構の解析

脳内において、酸化ストレスに対する防御機構が低下すると神経変性をはじめとする多くの疾患が惹起される。本研究により、あるタンパク質が酸化ストレスに対する防御機構の調節に強く関わることを示すことができた。これは、単に学術的新規性が高いばかりでなく、そのタンパク質を標的として開発された化合物が、酸化ストレスに対する防御機構を増加させる可能性を示すものであり、神経変性疾患の治療に貢献できるという新しい可能性を提示することができ、工業的にも高い価値を有するものである。グルタミン酸トランスポーターファミリーはこれまでに5種類の存在が示されており、それらが共存するin vivoの実験系ではGTRAP3-18との相互作用に影響する可能性もあるため、EAAC1のみを発現している培養細胞HEK293細胞を用いて、GTRAP3-18がEAAC1によるシステインの取り込みを制御する因子であるか否かについて検討を行った。グルタミン酸トランスポーターの阻害剤を用いた結果、HEK293細胞内のグルタチオンの濃度はEAAC1のみに依存していることが確認された。次に、GTRAP3-18が実際に細胞膜上でEAAC1と結合して機能していることを、EAAC1とGTRAP3-18に対する特異抗体および蛍光標識抗体を用いた免疫細胞化学的解析を行った結果、形態学的にGTRAP3-18は細胞膜上でEAAC1と結合していることが確認された。さらに、細胞膜表面タンパク質のビオチン化法を用いて細胞膜表面タンパク質画分を調製した結果、生化学的にもGTRAP3-18が細胞膜上でEAAC1と結合していることが確認された。そして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、GTRAP3-18の発現を抑制したときのグルタチオン濃度を定量した結果、GTRAP3-18は細胞内グルタチオン濃度を負に制御していることを明らかにすることができた。以上のごとく平成19年度はGTRAP3-18がEAAC1によるシステインの取り込みを制御する因子であることを明確にすることができた。昨年までに、グルタミン酸トランスポーターファミリーの中で、EAAC1のみを発現している培養細胞HEK293細胞を用いて、GTRAP3-18がEAAC1によるシステインの取り込みを制御する因子であることを明確にすることができた。そこで本年は、実際の神経細胞においてもGTRAP3-18がEAAC1によるシステインの取り込みを制御する因子であるか否かについて、初代神経培養細胞系およびマウス脳室内投与系を用いて検討を行った。グルタミン酸トランスポーターの阻害剤を用いた結果、初代神経培養細胞内のグルタチオン濃度はEAAC1のみに依存していることが確認された。次に、GTRAP3-18が実際に細胞膜上でEAAC1と結合して機能していることを、EAAC1とGTRAP3-18に対する特異抗体および蛍光標識抗体を用いた免疫細胞化学的解析を行った結果、形態学的にGTRAP3-18は神経細胞膜上でEAAC1と結合していることが確認された。そして、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAを用いて、GTRAP3-18の発現を抑制したときのグルタチオン濃度を調べた結果、GTRAP3-18は初代神経培養細胞内およびマウス脳内グルタチオン濃度を負に制御していることを明らかにすることができた。以上のごとく平成20年度は神経細胞においてGTRAP3-18がEAAC1によるシステインの取り込みを制御する因子であることを明確にすることができた。
日本語あいさつ表現に関する変化モデル構築の研究

申請者はこれまでに、日本語の出会いのあいさつ表現について、選ばれたいくつかの地点で待遇的観点での調査・記述を行い、変化の動態を考察することで、使用実態の在り方を説明する日本語あいさつ表現の変化モデルを得た。本研究では、調査対象の地域と場面を拡大して記述調査を行い、これまでの研究で得た日本語あいさつ表現の変化モデルを検証し、必要に応じて修正を図り、日本語あいさつ表現の変化モデルを確立することを目的とする。本事業の研究実施計画では、平成30年度は、これまでに調査データが十分に得られていない地域のデータを収集し、あいさつ表現の変化モデルを完成させることを予定していた。その点については、九州及び南琉球諸島で面接を行い、データを補充することができた。また、場面間の定型性の検証のためのデータについては、定型非定型中間地域である東北地方での使用実態の調査を追加で行い、様々な場面間の使用表現の定型化の度合いの差の検証を行った。さらに、あいさつ談話データの考察により、あいさつの談話展開を詳しく見ることで、あいさつ表現の定型化の過程を精緻化する研究視点を得ることもできた。これらの調査結果とこれまでに得た知見の考察結果を総合し、地域間のあいさつ表現使用実態の多様性を生む要因として、これまでに明らかにしていた1地理的中心性、2世代差、3待遇的場面差、4都市化度に加え、5あいさつ場面差、6言語的発想法の地域差が、あいさつ表現の定型化の地域差に関わることを明らかにし、あいさつ表現の変化モデルの確度を高めることができた。一方で、あいさつ場面差による定型化の差については、研究課題の進展に伴って得た着想をもとに精緻化した調査のデータをもとにしているため、限られた地域のデータから得た結論とも言える。そのため、今後出会いの場面のみならない多様なあいさつ場面の全国的な記述データをもとにした検証が必要となる。本研究では、これまでの研究成果に加え、調査対象の地域と場面を拡大して記述調査を行い、そのデータをもとに、これまでの研究で得た日本語あいさつ表現の変化モデルを検証し、必要に応じて修正を図り、日本語あいさつ表現の変化モデルを確立することを目的とする。このモデルを確立することで、日本語あいさつ表現の変遷過程や、あいさつ表現使用実態の地域差が生じる理由を解明できるのは勿論、日本語との対比で、他言語のあいさつ表現の在り方を説明したり、その変遷を扱うことも容易になり、言語普遍的なあいさつ表現変化の研究への挑戦が可能となる。本事業の研究実施計画では、平成26年度は、本研究の目的であるあいさつ表現変化モデルの検証に必要な、使用実態の調査を実施することを予定していた。まず、本研究が注目する東西の違いについて、調査内容の重心を見極めるために、大阪と東京それぞれの地域で、多人数アンケート調査を行った。それにより、あいさつの先後、動作の有無などの今後の調査に必要な観点を見出した。また、定型非定型中間地域である宮城県で使用実態調査を行い、様々な場面間の使用表現の定型化の度合いの差の検証を行った。さらに、当初予定していた定型的表現使用地域の調査について、近畿地方の定型的表現使用地域(豊岡市)で得た多人数調査の使用実態のデータを整理・分析した。これらの調査結果と、これまでに得た知見の考察結果を総合し、地域間のあいさつ表現使用実態の多様性を生む要因として、西日本と東日本、ひいては、日本全国を視野に入れたことばの様々な側面の地域差を生む、言語的発想法の地域差がある可能性がある、という知見を得るに至った。本研究は、これまでの研究成果に加え、調査対象の地域と場面を拡大して記述調査を行い、そのデータをもとに、これまでの研究で得た日本語あいさつ表現の変化モデルを検証し、必要に応じて修正を図り、日本語あいさつ表現の変化モデルを確立することを目的とする。本事業の研究実施計画では、平成27年度は、本研究の目的であるあいさつ表現変化モデルの検証に必要ないくつかの地域の使用実態の調査を実施することを予定していた。ただし、近年の研究の進展と蓄積に伴い、地域ごとのあいさつ表現の等質性の度合いの検証や、地域内での場面間の定型性の検証が必要だと判断するに至った。そこで、前年度に実施した多人数アンケート調査の結果を考慮に入れ、地域ごとの差と等質性を検証する調査を拡大して実施し、これまでに大阪と東京、東北地方(山形・宮城)で、多人数アンケート調査を行った。それにより、今後の調査に必要な観点の考察を深化させ、等質性の検証を一定程度行うことができた。また、場面間の定型性の検証については、定型非定型中間地域である宮城県で使用実態の追加調査を行い、東北大学方言研究センターが行った多場面のあいさつ表現談話収集調査の結果と比較することで、様々な場面間の使用表現の定型化の度合いの差の検証を行った。さらに、当初予定していた非定型表現使用地域の検証については、場面間の表現の定型化の度合いの差を検証するために、すでに資料の蓄積がある沖縄を対象にし、東北大学方言研究センターの談話収集調査の手法を参考にしながら、多場面のあいさつ表現談話の収集を行う調査を実施した。これらの調査結果と、これまでに得た知見の考察結果を総合し、地域間のあいさつ

表現使用実態の多様性を生む要因として、西日本と東日本、ひいては、日本全国を視野に入れたことばの様々な側面の地域差を生む、言語的発想法の地域差がある、という知見への確証を強めるに至った。本研究では、いまだ実態解明が十分でない、いくつかの選ばれた地域の出会いのあいさつ表現の使用実態を、待遇的観点を重視して記述し、その記述資料をもとにしてあいさつ表現変化のモデルを検証することを目的としている。本研究の目的である、あいさつ表現変化のモデルの検証には、これまで調査データの少なかった西日本を中心に、あいさつ表現使用実態の性格が異なる、a定型的表現使用地域、b非定型表現使用地域、c定型非定型中間地域の使用実態の把握及び変化の方向を見極める必要がある。これまでにa定型的表現使用地域の近畿地方の使用実態のデータによる検証を行い、本年度は、b非定型表現使用地域、c定型非定型中間地域の使用実態の調査・検証を進める予定であった。bの非定型表現使用地域については沖縄地方、cの定型非定型中間地域については宮城県の調査資料を得て、本研究遂行のためのあいさつ表現の等質性の度合いの検証や、地域内での場面間の定型性の検証を行うことが出来たが、その分、b非定型表現使用地域、c定型非定型中間地域について、新たな地域(西日本)の使用実態の調査は、未着手となっている。その点で、やや遅れていると判断するに至った。その遅れの理由として、多人数アンケートの拡大や、場面間の比較を念頭に置いた使用実態の調査による検証を行ったことが挙げられる。しかし、この検証は、今後、変化モデルの検証に必要な使用実態把握の観点を得、変化モデルの検証を正確に行うために必要で、妥当な過程だったと捉えている。申請者はこれまでに、日本語の出会いのあいさつ表現について、選ばれたいくつかの地点で待遇的観点での調査・記述を行い、変化の動態を考察することで、使用実態の在り方を説明する日本語あいさつ表現の変化モデルを得た。本研究では、これまでの研究成果に加え、調査対象の地域と場面を拡大して記述調査を行い、そのデータをもとに、これまでの研究で得た日本語あいさつ表現の変化モデルを検証し、必要に応じて修正を図り、日本語あいさつ表現の変化モデルを確立することを目的とする。本事業の研究実施計画では、平成28年度は、1、2年目に明らかにした使用実態をもとに、各地域の変化の動態の考察を行うことを予定していた。しかし、前年度にあいさつ表現の等質性判断のために実施した、大阪と東京、東北地方(山形・宮城)の多人数アンケート調査が、変化の動態考察のためのデータ収得にも有効な手法だと判断したため、アンケートを拡大して実施し、兵庫、岡山、徳島、福岡、宮崎で多人数アンケート調査を行った。それにより、今後の考察を深化させるためのデータを取得できた。また、場面間の定型性の検証については、予定していた定型表現使用地域の大阪、定型非定型中間地域である隠岐の島で使用実態の追加調査を行い、様々な場面間の使用表現の定型化の度合いの差の検証を行った。さらに、東北大学方言研究センターの談話収集調査に参加し、動画によるあいさつ場面記録の手法を参考にしながら、多場面のあいさつ表現談話の収集を行う調査を実施した。これらの調査結果と、これまでに得た知見の考察結果を総合し、地域間のあいさつ
世界初の高血圧性誘発モデルによる大動脈解離の分子病態解明と病態マーカーの開発

B型大動脈解離症例では、入院1週後の血清テネイシンC(TN-C)値がhs-CRP、D-ダイマー、FDP、解離部位の最大動脈径と正相関し、死亡例は有意に高値であり、血清TN-C値が、B型大動脈解離の短期予後を予測する有用なバイオマーカーであることが判明した。マウス解離モデルにおいてTN-Cはマクロファージ浸潤とVSMCs減少・エラスチン破壊が起こっている解離の移行部位で発現亢進し、主にVSMCsと重複していた。LacZをノックインしたTN-Cレポーターマウスでは、β-gal染色にて中膜が染色され、さらにαSMAとの二重染色を行うとαSMA陽性細胞が同時にβ-galも陽性となり、マウス大動脈解離壁のTN-C産生細胞はVSMCsであることが判明した。B型大動脈解離における血清TN-C値:平成22年度から筑波大学関連病院参加施設に入院となったB型大動脈解離症例の登録を開始し、発症直後から1週間、1ヶ月、6ヶ月、以後6ヶ月毎に、血清TN-C、hs-CRP、D-ダイマー、FDP、MMP-2,9を測定し、CTによる解離評価を実施している。マウス解離モデルの分子病態:TN-Cノックアウトマウスの腹部大動脈周囲に高濃度CaCl_2を塗布することで炎症と壁の硬化を誘発すると同時にアンジオテンシンIIを持続投与すると4週間以内に下行大動脈に解離を生ずる。摘出大動脈の病理組織、電顕により、解離に伴う組織学的変化を解析している。摘出大動脈のトランスクリプトーム解析から、解離前後の経過で発現が変化する「解離関連分子群」の同定を行なっている。同時にTN-CノックアウトマウスではTN-C遺伝子座にLacZ(βガラクトシダーゼ遺伝子)が組み込まれていることを利用し、βガラクトシダーゼ染色により、解離発症前後の大動脈において、侵害応答の局在と程度を解析している。(1)B型大動脈解離における血清TN-C値:平成22年度から筑波大学関連病院参加施設に入院となったB型大動脈解離症例の登録を開始し、発症直後から1週間、1ヶ月、6ヶ月、以後6ヶ月毎に、血清TN-C、hs-CRP、D-ダイマー、FDP、mm-2,9を測定し、CTによる解離評価を実施している。現在のところ、42症例の登録を行い、必要なデータ、サンプル検体収集にあっている。(2)ヒト解離組織の分子病態:登録された症例のうち、病態進行のため外科的手術の止むなきに至った症例から、本人の了承を得て大動脈組織を採取する。採取された大動脈組織の解離部、解離先進部、非解離部でTN-Cを始めとする遺伝子発現を解析して、さらにマウス実験で同定される解離関連遺伝子群と比較検討する予定であるが、ヒト大動脈組織の検体が得られていない。(3)マウス解離モデルの分子病態:TN-Cノックアウトマウスの腹部大動脈周囲に高濃度CaCl_2を塗布することで炎症と壁の硬化を誘発すると同時にアンジオテンシンIIを持続投与すると4週間以内に下行大動脈に解離を生ずる。B型大動脈解離における血清テネイシンC値: B型大動脈解離42症例に対して、入院時、1週間、2週間、1ヶ月毎に、血清テネイシンC値、hs-CRP、D-ダイマー、FDPを測定し、CTによる解離評価を行なった。大動脈解離症例では、血清テネイシンC値が有意に上昇し、1週目がピークとなり、1ヶ月後に正常域に戻った。また、1週後の血清テネイシンC値は、hs-CRP、D-ダイマー、FDP、解離部位の最大動脈径と正相関し、死亡例は有意に高値であった。血清テネイシンC値が、B型大動脈解離の短期予後を予測する有用なバイオマーカーであることを論文印刷中である。マウス解離モデルの分子病態:TN-Cノックアウトマウスの腹部大動脈周囲(腎動脈下)に高濃度CaCl2を塗布し、アンジオテンシンIIを持続投与すると4週間以内に腎動脈上部の下行大動脈に解離を生じた。TN-Cは正常部位ではほとんど発現せず、マクロファージ浸潤とVSMCs減少

・エラスチン破壊が起こっている解離の移行部位で発現亢進していた。一方で最大拡張部位ではVSMCsを中心とする細胞成分や、エラスチン線維はほとんどなく、血管組織の正常構造が破壊され、TN-C発現が逆に低下していた。移行部ではMMP-9も発現が亢進していたが、TN-C発現亢進部位は主にVSMCsと重複し、一方でMMP-9発現亢進部位は主にマクロファージ浸潤と重複していた。LacZをノックインしたTN-Cレポーターマウスでは、6週間後の解離径、組織変化は、野生型マウスと同等であった。無処置コントロール群と比較して、EVG染色で中膜エラスチン構造の破壊、TN-C染色で中膜のTN-C発現を認めた。β-gal染色にて中膜が染色され、さらにαSMAとの二重染色を行うとαSMA陽性細胞が同時にβ-galも陽性となり、マウス大動脈解離壁のTN-C産生細胞はVSMCsであることが分かった。B型大動脈解離症例の登録が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)筑波大学関連病院参加施設に入院となったB型大動脈解離症例の登録を促すようにする。
床反力視聴覚フィードバック型歩行訓練システムの実用化を目指した改良と機能向上

研究代表者らが提案・開発した床反力可視聴化歩行訓練システムを用いて,足荷重および歩行リズムをフィードバックする訓練手法が,患者にどのような影響を及ぼし,歩行リハビリテーションの効果を向上させるかについて明らかにする。さらに,システムの実用化を目指し,歩行解析に基づいた評価システムを構築し組み込むと共に,装置のコストを低減させるため,床反力を測定する歩行路の計測システムの改良に取り組む。脳卒中片麻痺患者の歩行訓練では、麻痺側下肢にも十分な荷重をかける必要があるが、本システムは訓練中の足荷重のリアルタイム計測・提示を可能とし、より効果的かつ安全な歩行訓練を提供することが期待できる。
日本産古第三紀内湾性貝類化石群の時代的変遷

日本産古第三紀内湾性貝類化石群について、分類学的・古生態学および古生物地理学的観点から再検討を行うとともに、群集組成の時代的変遷について研究を行った。その結果、北海道の始新世の内湾性貝類化石群集はそれ以南の地域のものとは群集組成が異なること、時代的相同群集が中期始新世の中頃まで遡れること,および,前期漸新世後期には現在の温帯域の干潟群集とほぼ同じ属構成の群集が出現していたことが明らかとなった。また、腹足綱8種、二枚貝綱4種が新種であった。平成22年度は九州および本州西部の古第三紀内湾性貝類化石群を対象として、以下の調査・研究を行った。(1)熊本県天草上島地域九州の海成古第三系のうち、最も地質年代の古い熊本県天草上島の千巌山層(せんがんさんそう;中期始新世最前期)から産する内湾性貝類化石群集の産出層準と特性を明らかとするため、地質調査を行うとともに貝類化石ブロック試料5点を採取した。(2)長崎県佐世保地域と佐賀県玄海地域九州の海成古第三系で最も地質年代の新しい長崎県佐世保地域の漸新統佐世保層群福井層および加勢層と,これらよりも下位に位置する佐賀県玄海地域の漸新統入野層の貝類化石群の特性を明らかとすることを目的として地質調査を行うとともに、貝類化石ブロック試料各1点を採取した。また、佐世保層群上部の年代を明らかとするため、フィッション・トラック年代測定用の凝灰岩2試料を採取した。(3)山口県特牛(こっとい)地域佐世保層群に対比される山口県特牛地域の日置層群の貝類化石群の特性を明らかとするため、地質調査を行うとともに、貝類化石ブロック試料2点を採取した。各地域から採取した試料については兵庫県立人と自然の博物館でクリーニング作業を行うとともに、分類学・古生態学・古生物地理学的検討をすすめている。また、フィッション・トラック年代を測定した結果、漸新世を示す年代値(26.4±1,7 Ma ; 31.1±1.4 Ma)が得られた。この結果により、佐世保層群上部の貝類化石群の年代的位置づけが明確となった。平成23年度は、北海道の古第三紀内湾性貝類化石群を主な対象として以下の調査・研究を行った。(1)北海道釧路地域浦幌層群舌辛層(中-上部始新統)を対象に野外調査を行い、貝類化石ブロック試料3点を採取した。(2)北海道夕張および岩見沢地域石狩層群若鍋層(中部始新統)を対象に野外調査を行い、貝類化石ブロック試料3点を採取した。(3)佐賀県玄海地域昨年度採取した資料をクリーニングした結果、追加資料が必要であることが明らかとなった佐賀県玄海地域の佐世保層群入野層(漸新世)の貝類化石ブロック試料2点を採取した。採取した試料については前年度までに採取した試料と合わせて兵庫県立人と自然の博物館でクリーニングならびに分類学的検討を進めている。これまでの研究の結果、(1)北海道の中-上部始新世内湾性貝類化石群に含まれるカキ類はOstreaイタボガキ属のみで、本州西部・九州の同時代のものに含まれるCrassostrea属は認められないこと、および(2)佐賀県玄海地域の佐世保層群入野層の貝類化石群はMeretrixハマグリ属を主体とし、Ruditapesアサリ属やCrassostreaマガキ属を伴うなど、属レベルで中新世以降の内湾性貝類化石群に類似した組成を有することが明らかとなった。平成24年度は、北海道空知地域の石狩層群若鍋層・赤平層(中部始新統)および福島県・茨城県常磐地域の白水層群石城層(上部始新統)・湯長谷層群“滝層"(“下部中新統")を対象に野外調査を行うとともに,ブロック試料の採取ならびに前年度までに採取した試料も合わせてクリーニング作業を行った.クリーニングの終わった標本について,分類学的・古生態学的・古生物地理学的検討を行い,最新の年代尺度に基づき日本産古第三紀内湾性貝類化石群の時代的変遷について総括を行った.その結果は以下のとおりである:(1)九州の中期始新世前期(約46 Ma)の内湾性貝類化石群集の属組成はそれ以後のものとは異なる;(2)北海道の中期始新世内湾性貝類化石群集はOstreaイタボガキ属の多産により特徴づけられる.本属はサハリン・カムチャッカ半島の古第三系からも多産し,瀬戸内海東部沿岸地域の始新統からも産する.しかしながら,九州の古第三系からの産出は確認できなかった;(3)九州東北地方南部の内湾干潟群集を特徴づけるオニツノガイ超科は時代により属構成が大きく異なる.北海道の古第三系からは本超科の産出は確認できなかった;

(4)常磐地域の“滝層"下部は貝類化石群集の種構成から石城層に含められる;(5)西南日本の漸新世内湾性貝類化石群集はCrassostreaマガキ属,“Batillaria" “ウミニナ属",Meretrixハマグリ属の多産により特徴づけられる;(6)内湾性貝類化石群集にCyclinaオキシジミ属が加わるのは北海道・九州ともに中期中新世の中頃(約44 Ma)である.(7)内湾性貝類化石群集にRuditapesアサリ属が加わるのは前期漸新世後期(約28 Ma)である.以上の結果により,日本における始新世漸新世内湾浅海性貝類化石群集の種構成と時代的変遷が明らかとなった.九州産古第三紀貝類化石標本を含む母岩に非常に硬く、クリーニング作業が難航していること、および福島第1原子力発電所事故により、福島県常磐地域の調査が延期となったことによる。24年度が最終年度であるため、記入しない。野外調査が未了となっている福島県常磐地域の上部始新統-下部漸新統石城層、および追加試料が必要であることが明らかとなった石狩層群舌辛層を対象に早期に野外調査を実施する。また、クリーニング作業については昨年度後半に導入したエアツールや超硬刃カッターを用いて速やかに完了させ、分類学的・古生態学的・古生物地理学的検討を進める。
疼痛のメカニズム

疼痛伝達に関与するペプチドに関し、家兎腰髄後角の局所潅流法を用い、Substance P(SP)の遊離に対して下行性Noradrenaline神経系がTonicに抑制をかけ、Morphineにより、その抑制が増強されることを示した。ラットの摘出脊髄一尾標本にて、Capsaicinによる電位の記録と、これに対する薬物の影響を調べ、この電位発生にSPが関与している可能性を示した。歯痛伝達における下行性抑制系は主として5-HT系であり、脊髄後角において、この系とSPが疼痛制御を行っている可能性を示した。室傍核の、CRF/PRF分泌細胞が侵害受容器と循環系受容器より興奮性シナプス入力を受けているらしいことを示した。疼痛の求心路として侵害刺激伝導路のサルの視床内分布を調べ、被殻領域に侵害受容及び広作動域ニューロンが整然として分布しており、さらにこれらにおける内臓求心性線維と侵害受容性皮膚神経線維の収束を示した。ラット脊髄において肢刺激により下行性に駆動される抑制性電位の生成に関与する伝導経路について調べた。視床痛の患者の臨床像、CT.PET及び視床の電気的活動を調べ、この疼痛が視床腹外後側部の小さな病変と関連し、かつ視床に機能低下があることを示した。頑痛症に対する後部視床下部手術法の治療成績を調べた。髄液中のβ-endorphinの測定を行い、除痛効果との関連を調べた。ラットの脊髄後根切断後の疼痛の発現の観察と脊髄後角細胞の活動を調べ、これに対する中枢及び脊髄刺激の影響について検討した。各種ニューロパチー、スモンに伴う疼痛について、弾性ストッキングの効果を調べた。大径神経刺激による脊髄レベルでの抑制が示唆された。スモンの疼痛について他症状との関連を調べた。キノホルム中毒ラットの中枢神経各部のモノアミンやペプチドの変化を調べた。痛みの測定に関し、一次痛刺激のための皮膚刺激電極の研究と、痛みの定量的記述のための研究を行った。
西洋近代観念説の自然主義的論理とその解体過程についての研究

近代の西洋では、日常慣れ親しんだ知覚可能な世界のほかに、理論上想定される別の世界(例えば原子と空虚からなる)を本当の世界として想定するという一種の二重存在説が顕著となった。そして、慣れ親しんだ知覚世界は、想定された真の世界からわれわれの感覚器官に刺激が与えられた結果としてわれわれが心の中で知覚するもの、つまり「心の内なる観念」からなるものとして位置づけられることとなった。こうした「観念説」は、明らかに科学のある考え方に基づくものであり、その意味で本来「自然主義的」である。本研究は、この観念説の自然主義的論理がバークリやカントらによってどのように歪められ解体されていったかを、明らかにした。本年度前期は、ロックの「知覚表象説」的契機と「直接実在論」的契機との関係を再検討することによって、観念本来の自然主義的論理空間の重層構造を再確認することから研究を開始した。日常的に「物」と見なされているもの(経験的対象)の向こう側に新たな粒子仮説的な「物そのもの」を措定することによって、経験的対象は、心の内なる「観念」として、他のすでに「内的」とされてきたものとともに「心の中」に位置づけ直され、それによって、物そのもの/観念/心からなる三項関係的枠組みが構成される。この基本的な見方をより明確にするため、日常的にすでに「内的」とされているもの、例えば痛みの感覚や狭義の心像と、経験的対象が身分を代えて観念とみなされるようになったものとの関係を、明確に示すよう努めた。(これは、プラハのCharles大学James Hill教授の要請でもあった)。本年度後期は、上の作業をさらに進めるとともに、研究代表者の見解を理解する上で一般の研究者にとってしばしば躓きの石となっているものーすなわち、日常的な「物」を構成する要素的観念のうちからあるものを選んでそれらから新たな粒子仮説的「物そのもの」の「観念」を作るという研究代表者の言い回しが、物そのものと観念とを峻別するロックの基本的立場とどう整合するかという問題ーについて、その答えを明晰に示す方途を探った。ロックが「観念」を広狭二義に用い、「物そのもの」ですら「観念」とする場合があることをどのように捉えるかという、これまで指摘されながらも十分に検討されてこなかった問題が、ここではとりわけ重要な問題となり、「志向性」の概念をも念頭に置いて、この問題の解明に努めた。平成22年度前期は、バークリの自然科学に関する考え方について再検討を行った。バークリは、ロック的な「物そのもの」を否定しながら、直接的知覚の対象となるものとしての「物」、つまりロック的な「経験的対象」に関しては、その在り方と諸観念の生起との関係を、「自然法則」として捉える視点を有する。もとより、バークリにとっても、ロック同様、「経験的対象」は観念の集合体にほかならず、したがってバークリがここで言う「自然法則」は、観念間に認められる記号的規則性にほかならない。ヒュームを想起させるこうした自然法則の捉え方を解明し、それをロックの場合と比較することによって、バークリの観念説の論理のなお一層の明確化を図ることが、前期の課題となった。平成22年度後期は、バークリが物質に代えて持ち出す「神」が、どのような論理空間を持っているかを明らかにするよう試みた。ロックの観念説でも神は重要な役割を果たすが、バークリは物質ないし物そのものを拒否することと引き替えに、神に対してより重大な役割を担わせる。バークリにおけるこの神の役割に十分な検討を加え、物質否定によって空白になった論理空間がその神への役割付与によって十全に満たされたと言えるかどうかを、ここで考察した。彼が行う神の存在証明、および、それと他者存在の記号論的証明との関わりについても、併せて検討した。平成22年度のこうした一連の作業によって、かつてIan Tipton教授(前国際バークリ協会会長)から要請されていた申請者の視点からするバークリ理解の全体像に近いものを、用意することができた。なお当初執行が予定されていた「旅費」および「その他」を、研究の遂行状況に合わせてすべて「物品費」に移すことになったが、これによって所期の成果をより十全に得ることができた。本研究は、西洋近代認識論の基盤となった観念説と自然学との関係を再考することにより、近代認識論が自然主義的観念説の枠内で本来機能していたことを確認するとともに、それがどのような仕方で変質・解体して行ったかを解明しようとするものである。その研究の要の一つとして、平成23年度では、まず、「物」(経験的対象)の「外在性」の認知に関するバークリの見解を検討した。ここでとりわけ重要になるのは、『新たな視覚理論のための試論』における彼の議論である。

この議論は、知覚に関するロックの見解をさらに発展させたものとして捉えられるが、その議論においてバークリが行う外在的認知の説明が、外界を心の中にある観念からなるものとする彼の見解とどのようにかみ合っているかを、いわゆる「モリニュー問題」の諸議論をも念頭に置きながら、明らかにした。この試みは、観念を「心の中」なるものとするロックとバークリにおいて、その「心の中」という言葉が真に何を意味しているかを明確にしようとするものであり、これによって、故John W. Yolton教授との間で続けられてきた「心の中」の意味をめぐる議論に、一定の結論を得ることができた。また、そうした作業と並行して、近年強調されているヒュームの中のカント的な面を再考し、ヒュームの観念説が持つ〈自然主義的論理の解体〉と〈カント的表象説の先取り〉の二面の関係を再確認することにより、続けて試みられるカント研究への準備を進めた。本研究は、デカルトとともに近代観念説の原型を提示したとされるロックについて、観念説が本来持っていた自然主義的論理を再確認し、次いでバークリとヒュームおよびカントを取り上げ、その論理の解体過程の解明をさらに進めるとともに、基礎づけ主義的哲学観の妥当性を再考しようとするものである。平成24年度は、本研究の最終年度であり、カントの観念説(表象説)の読み直しを進めた。その基本は、すでに`Locke's “Things Themselves" and Kant's “Things in Themselves"' (2008)に示したが、ここではさらに、独断的観念論や懐疑論的観念論に対するカントの批判の真意を考察するとともに、「心の中」の意味を再度明らかにするよう試みた。これによって、ロックの遺産の継承とその論理の変質過程の実際が、より明確になった。また、そうした作業と並行して、本研究の結果が基礎づけ主義、自然主義、表象主義をめぐる今日の論争にどのような光を投じるかについても考察を進めた。特に、前年度に続けて、自然主義を肯定するクワインの見解を再度取り上げ、「二つのドグマ」や「二つのドグマを回顧して」の読み直しとともに、『指示のルーツ』等に見られる彼の自然主義を再考し、また、自然主義を受け入れないフッサールの読み直しも併せて進めた。これらの作業によって、この研究が今後どのように継続されるかについての知見を得ることができた。本研究が平成23年度に進めようとしていたバークリとヒュームの読み直しとともに、その基盤となる自然主義的論理そのものの検討を、自然主義を肯定するクワインのそれに戻って進めることができた。その点で、平成23年度の研究は、当初の計画以上に進展したと言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究は順調に進んでおり、当初の計画通り進めるのみである。
老年期の心理的諸特性及び社会的・教育的働きかけに関する実証的研究

3年間の研究のまとめとして、「老いることの意味に関する心理学的研究」という冊子を刊行した。「老年期における時間評価の特徴に関する研究」の研究では、高齢者と大学生の人生の発達時期の長さやその心理的評価、また時間語の長さの評価の比較から、人生の発達時期の評価では物理的に評価が必ずしもなされないこと、高齢者は幼いころの時期が過大視されること、また人生の時期の評価では大学生は現在を唯一重要な時期とするが、老年期では人生の各時期を多様に評価するといった違いが見られた。「中年期から老年期への移行」の研究では、中年期には危機が数多くあるが、それまでの経験によってうまく乗り越えるていること、一般に中年期は安定していることなどが主張された。また、「老年期の人生適応について」の研究では、老年期の適応的姿として自分の人生の肯定的評価、を持ち、規則的で目的を持ち、活動的でしかも無理をしないといったことが示された。「高齢者の感情表出行動の特徴」の研究では、喜び、怒り、困惑、軽べつ、失望、恐れ、悲しみ、驚き、という感情を種々の状況を設定してどのように表出するかを大学生から高齢者までの各年齢段階で比較してみたところ感情の種類による表出の違いより状況による違いが大きく、感情表示規則のが重要であること、また、この表示規則が世代や性別で異なることが示された。「老いを生きることの意味について」の研究では、生育誌的アプローチにより老いの肯定的側面がとりだされた。「介護の抵抗に関する心理学的研究」では、介護をする側とされる側の介護場面や介護の種類により抵抗度に違いのあることが示された。その他、「高齢者と居住環境に関する一考察」、「老年期と犯罪問題に関する一考察」、「高齢者の交通事故」といったテーマで研究された。認知班では、感情表出の在り方について様々な年齢の自分との関係に違いのある人に対するコミュニケーション場面で様々な感情の表出の世代による違いをみた。また、顔の記憶や感情表出の自己評価についても行った。世代や性差、また自分と相手との関係などによって感情表出に違いがあることが示唆された。また、自伝的記憶を用いた老人の生涯での強く思い出に残った出来事、重要な出来事、各発達段階での重要な出来事、あるいは各発達段階でのしておけばよかったこと、発達段階のどの時期が重要であったか、人生を変える出来事などについての調査を行った。その結果、例えば自伝的記憶として強く思い出に残っていることとして想起されることがらと他の文脈で重要であることとして想起されることがらとに必ずしも対応があるわけでなく、自伝的記憶でみられるものの意味について問う必要性が示唆された。また、男女で人生の評価の違いが示唆されている。これは、職業生活や子供との関係、他の人とのネットワークの在り方などの男女差を示唆するものであり、検討を要する問題が示唆された。社会心理班では、例えば老人の交通事故の分析から歩行者事故、自転車事故が大きな特徴であることがあきらかとなり、老人の歩行行動や自転車の行動、歩道の条件などビデオによる解析の必要性が示唆され、同時に老人の交通教育に対する貴重な情報がえられた。臨床、パーソナリティー班では、個人の生涯に関する自伝的な資料を分析することから、人間の生涯の自我へのもつ意味を検討し、さらに老年期の人生における意味についても検討した。さらに、方法論としての自伝的資料の分析の特定の個人の生涯から個人の特徴を浮き彫りにするという方法の問題点についても検討した。また、人生における役割受容、ライフスタイルと職業(労働)価値尺度の対応の年齢による変化、ストレッサーに対する対処行動の老年期における特徴についてみた。1認知班;

(1)老年期の対人行動および対人認知の特性に関して、65才以上の高齢者101名を含む20代以上の成人511名を対象に、1種々の感情が喚起される社会的状況での感情表出の程度、2対人認知、情動表出に対する自己評価、態度、3異なる世代の人物に対する発話の形式の3部構成の調査の結果、1の感情表出の程度では、幸福、怒り、軽蔑の感情は高齢者ほど表出が抑制され、恐怖、驚きの感情は高齢者のほうが表出する度合が強い事、また、対人認知では、人の識別や顔の記憶、顔や名前の想起の認識能力ではっきりした世代差がみられ、老年期に近づくほど自分の認識能力の衰えを強く意識するようになる事が分かった。(2)1介護;大学生と高齢者に入浴、排泄、食事場面での介護、被介護の抵抗度を種々の人物で調べた結果、女性が被介護に、高齢者は機械介護に抵抗が高い事、高齢女性は配偶者・息子より同性の施設の人の被介護に抵抗が少ない、被介護で排泄が高い抵抗で、また排泄は施設の人の介護に抵抗が少ない事が分かった。2思いやり行動;大学生と高齢者を対象にいたわられた事態といたわった事態の特徴をみた結果、思いやりを受けた人、施した人とも大学生は友人、高齢者は家族が多い。また両場面とも内容は大学生で精神的援助、高齢者は物質的援助が多い。思いやりを受けたときの感情は喜びが多く、次に大学生は相手への評価が、高齢者は感謝が高い。3生活意識調査;頻繁に合う友達の数でも生活の満足度も高齢者の方が高く、他の項目でも高齢者が充実感や満足感をより味わっていることが分かった。2社会心理班;高齢者の交通行動の中から、道路横断時の行動をビデオ録画から分析したが道路横断開始のタイミング、横断後半での自動車とのコンフリクトの問題性が明らかとなった。本年度は、3年間の最終年度であることからこれまでの補足のデータの収集とまとめを行った。認知班での研究では、高齢者と大学生の人生の発達時期の長さやその心理的評価、また時間語の長さの評価をしてもらったところ、人生の発達時間の評価出は物理的に評価が必ずしもなされないこと、高齢者は幼いころの時期が過大視されること、また人生の時期の評価では大学生は現在を唯一重要な時期とするが、老年期では人生の各時期を多様に評価するといった違いが見られたこと、また大学生の方が未来を評価することなどが示された「老年期の時間評価の研究」、喜び、怒り、困惑、軽べつ、失望、恐れ、悲しみ、驚き、という感情を種々の状況を設定してどのように表出するかを大学生から高齢者までの各年齢段階で比較してみたところ感情の種類による表出の違いより状況による違いが大きく、感情表示規側のが重要であること、また、この表示規則が世代や性別で異なることが示された「高齢者の感情表出行動の研究」、そして高齢者の居住環境に関する研究、介護される場合と介護する場合について排泄、食事、入浴事態で大学生と高齢者との性別の比較を行った介護の意識の研究をまとめた。
教育用ソフトウェア作成支援のためのソフトウェア部品開発とその活用に関する研究

近年、小中高はもとより高等教育機関、企業、官庁等における教育においてもeラーニングは重要な教育手段となってきており、多くの教育用ソフトウェアが開発されている。しかし、これらの教育用ソフトウェはエンドユーザグループを対象としたものであり、現場のニーズに合わせてカスタマイズすることは容易でない。本研究は、現場でのニーズに合わせたソフトウェア開発環境の整備を目的として着手したものであり、その手法としてソフトウェアの部品化を取り入れた。ソフトウェ部品化の手法を用いることにより、例えば、初級プログラマでも中・上級プログラマが開発した教育用ソフトウェア部品を自分のプログラムに組み入れて、高度な教育用ソフトウェアの開発が可能となり、教育現場のニーズに合わせたカスタマイズも容易となることが期待される。本研究では、これまでマルチメディアの利用がもっとも進んでいる語学教育での活用を念頭にソフトウェア部品の開発を行ってきた。平成14年度までに、TOEFL問題作成部品をはじめとする部品群、また、それらの部品を組み合わせた英語読解力支援ソフトウェアの試作を行った。平成15年度は、前年度までに開発した英語読解力支援ソフトウェアの評価作業、各ソフトウェア部品の改良・開発を中心に研究を行ってきた。英語読解力支援ソフトウェアについては、熊本大学文学部英語教師の協力を得て、評価作業を行った結果、コンピュータ初心者の利用時に若干混乱することが分かり、現在改良中である。また、同時にマルチメディアデータベースの改良も行い、英語発音練習ソフトウェア作成の部品として提供できるようにした。本研究の思想は他の教科でも有効であり、E-Learn2003にて物理教育のためのソフトウェア部品について報告を行った。今後さらに、この開発手法による体系化についての研究を進めていきたい。マルチメディア教材の教室における利用はますます重要となりつつある.しかし,現在,マルチメディア教材がそれほど利用されているとはいえない.これには,次のような問題点がある.(1)コンピュータを学習指導等に活用できる教員の数が少ない,(2)ソフトウェアが高価である,(3)市販のソフトウェアは汎用性がなく,現場の状況に合わない,(4)マルチメディア技術の進歩が速すぎ,ソフトウェアならびに作成したマルチメディア教材もすぐ古くなってしまう.我々は前述の諸問題点を解決するために教育分野の中でもコンピュータに対する需要が高い語学教育に的を絞りソフトウェア部品化の手法を用いた教育用ソフトウェア開発法について研究を行ってきた.本研究ではこれらの成果を基に以下の開発研究を行った.(1)語学教育用ソフトウェア部品の拡充・・・小テスト作成部品、TOEFL問題作成部品をはじめとするソフトウェア部品の開発及び機能拡張を行った.この部品の使用によりプログラミング初心者でも手軽に独自のソフトウェアや教材を作成可能である.(2)ソフトウェア部品を活用した英書法、英読解学習支援用ソフトウェアの開発・・・大学の専門課程を対象とした英語学習支援システムである.平成15年度から熊本大学文学部英語教師Gilbertの英語クラスにおいて使用する予定である.この他に、マルチメディアデータベースも試作中であるが、これについてはまだ拡充の必要がある.今後の課題としては、(1)語学教育用ソフトウェア部品のさらなる拡充を行うこと、(2)英書法、英読解学習支援用のクラスでの使用による評価作業、その評価を基にした改良作業、(3)マルチメディアデータベースの機能充実を行うこと、さらに、それを発展させ、他の教科でも利用可能なソフトウェア部品の開発とそれらのソフトウェア部品を用いた教育用アプリケーシヨンの開発手法について研究を行うことが挙げられる.近年、小中高はもとより高等教育機関・企業、官庁等における教育においてもeラーニングは重要な教育手段となってきており、多くの教育用ソフトウェアが開発されている。しかし、これらの教育用ソフトウェアはエンドユーザグループを対象としたものであり、現場のニーズに合わせてカスタマイズすることは容易でない。

ソフトウェア部品化の手法を用いることにより、例えば、初級プログラマでも中・上級プログラマが開発した教育用ソフトウェア部品を自分のプログラムに組み入れることにより、高度な教育用ソフトウェアの開発が可能となり、教育現場のニーズに合わせたカスタマイズも容易となることが期待される。本研究では、これまでマルチメディアの利用がもっとも進んでいる語学教育での活用を念頭にソフトウェア部品の開発を行ってきた。平成14年度までに、TOEFL問題作成部品をはじめとする部品群、また、それらの部品を組み合わせた英語読解力支援ソフトウェアの試作を行った。平成15年度は、前年度までに開発した英語読解力支援ソフトウェアの評価作業、各ソフトウェア部品の改良・開発を中心に研究を行ってきた。英語読解力支援ソフトウェアについては、熊本大学文学部英語教師の協力を得て、評価作業を行った結果、コンピュータ初心者の利用時に若干混乱することが分かり、現在改良中である。また、同時にマルチメディアデータベースの改良も行い、英語発音練習ソフトウェア作成の部品として提供できるようにした。さらに、他の教科でも本研究の思想は有効であり、E-Learn2003にて物理教育のためのソフトウェア部品について報告を行った。今後さらに、この開発手法による体系化についての研究を進めていきたい。
ヘッジホッグシグナルによる骨格系細胞運命決定におけるエピゲノム・転写ダイナミクス

ヘッジホッグ(Hedgehog-Hh)-Gli誘導性の骨形成性細胞への運命決定機構を、エピゲノム・転写ダイナミクス・遺伝子制御ネットワークの観点から理解することが本研究の目的である。マウス胚性幹細胞の骨芽細胞分化誘導系を用いて、Hh-Gli誘導性の運命決定期の細胞の同定と分子特性の解析を行い、この細胞集団におけるクロマチン免疫沈降ーシークエンス(ChIP-seq)と遺伝子発現プロファイリングを通じて、Hh刺激による骨芽細胞への運命決定の背景にある分子メカニズムに関する知見を得た。これらは、Hhシグナルを骨再生療法の標的分子とする際に、有効性と安全性を保障する強力な分子基盤となる。1. Hh-Gli誘導性の骨形成性細胞への運命決定期の細胞の同定・取得・分子特性の解析標記の運命決定がなされる段階の細胞においてChIP-seq・RNA-seq解析を行うために、この細胞集団を同定・単離し、その分子特性を解析することが目的である。マウス胎仔からの単離を目指したが、解析可能な量の取得が困難であることも予想されたため、多能性幹細胞からのHh誘導性骨分化誘導系の利用も試みた。A)マウスにおける標的細胞の同定・取得:Hh-Gli誘導性に骨形成性細胞への運命決定が行われている細胞集団を時期特異的に取得するために、タモキシフェン(Tam)投与に応じてHh受容細胞がレポーター蛋白を発現するノックインマウスに対して、胎生10.5ー11.5日齢でTamを投与し、24時間後にレポーター蛋白発現細胞を酵素処理により軟骨膜から採取することを試みた。しかしながら、十分な量の細胞の採取が困難であった。B)胚性幹細胞(ES細胞)の骨芽細胞分化系における標的細胞の同定・取得と分子特性の解析:無血清培地下で低分子化合物のみを用い、中胚葉分化を経由してマウスES細胞からHh誘導性に骨芽細胞へと分化させる培養法の開発に成功した。この分化系において、骨形成性転写因子Runx2とHh-Gli経路の標的遺伝子Gli1のmRNA発現を定量的RT-PCR法により時系列で解析した結果、Runx2とGli1の発現上昇期が存在することが判明した。マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルにおいても、この所見は支持されたことから、この時期をHh-Gli誘導性の骨形成性細胞への運命決定期として、ChIP-seq・RNA-seq解析に使用できることが示唆された。前年度までに開発したマウス胚性幹細胞(ES細胞)から、中胚葉分化を経由してHh誘導性に骨芽細胞へと分化させる培養系において、Gliに対するChIP-seqと遺伝子発現プロファイルを得るためのRNA-seqを試みた。ChIP-seqのための予備検討として、Rosa26-Gli1-FLAG、Gli2-Biotin-FLAG、FLAG-Biotin-Gli3ノックインES細胞を上記の骨芽細胞分化系で培養し、Hhシグナル誘導性に骨形成性細胞への運命決定が起こるポイントにおいてクロマチンを回収して、FLAG抗体を用いたChIPを行った。Hhシグナルの標的遺伝子であるPtch1とGli1遺伝子周辺における既知のGli結合領域へのエンリッチメントをPCRにより判定したところ、各Gliの結合が確認された。しかしながら、次世代シーケンサーを用いて精度の高いデータを得るためには、より効率の高い分化系とChIPプロトコールの最適化が必要であると考えられた。そのため、再度分化系の最適化を行うと同時に、ChIPプロトコールの最適化も行った。最適化された培養系において、複数のタイムポイントにおいてRNA-seqを行い、時系列で遺伝子発現プロファイルを取得することに成功した。RNA-seqデータの一次解析により、高品質なデータを取得したことが確認された。また、発現遺伝子の解析から、継時的に骨分化が進行していることが示唆され、骨芽細胞分化の各段階を反映したデータとして以後の解析に使用できることが確認された。ChIPプロトコールの最適化も終了し、Gliおよび各種ヒストン修飾に対するChIP-seqについても予備検討が終了しつつある。H27年度までに、生理的な骨形成を反映した胚性幹細胞からの骨芽細胞分化系を確立し、この分化系においてChIP-seqおよびRNA-seqを試みた。培養系の確立に当初の計画よりも時間がかかっているものの、RNA-seqのデータ取得は完了し、ChIP-seqの予備検討まで終了していることから、進捗に大きな遅れはないと考えられる。本年度は、ヘッジホッグ(Hedgehog-Hh)シグナル誘導性の骨形成性細胞への運命決定における、Hhシグナル下流の転写因子Gliのゲノム標的を明らかにすることを目指した。マウス胚性幹細胞(ES細胞)の骨芽細胞分化系(Stem Cell Reports, 2014)を用いて、Gli-Biotin-FLAGノックインES細胞を培養し、骨芽細胞への分化を誘導した。本培養系では、まず5日間の培養で中胚葉系へ分化させ、その後骨芽細胞前駆細胞を誘導する。上記のノックインES細胞の培養においても培養5日目までに中胚葉への分化が認められ、培養12日目に骨形成性転写因子Runx2とHhシグナル標的遺伝子Ptch1の発現上昇を確認できたことから、培養12日目がHh誘導性の運命決定が起こるポイントであると考えられた。そこで、まずGli-Biotin-FLAGノックインES細胞の培養系において、培養12日目においてクロマチンを回収し、FLAG抗体を用いたChIPと次世代シーケンサーを用いたChIP DNAの配列解析(ChIP-seq)を行った。