hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成熟脳神経細胞の分裂、増殖に関与する因子の究明-実験的脳虚血モデルを用いた検討-

脳神経細胞はヒトを含む成熟動物脳では一般に高度に分化した細胞であり、かつ虚血に極めて脆弱な細胞であるため、脳血管障害をはじめとした脳損傷時に広範に脱落し重篤な神経後遺症を残す場合が多い。しかし、脳組織は虚血侵襲を受けた際に神経細胞に保護的な対応や、組織再生、修復に向けた各種の応答を示すことが近年明らかになってきている。申請者らは従来より、虚血に対する神経細胞の保護的な応答現象としての虚血耐性現象を世界に先駆けて報告してきているが、本研究期間中にあらたに砂ネズミ一過性前脳虚血モデルにおいて損傷部位の隣接部位の神経細胞は、虚血に対する抵抗性が2週間以上にわたって増強されることを明らかにした。神経細胞自身の虚血に対するストレス応答は1週間以内に消失することから、損傷部位の隣接部でみられる神経細胞に対する保護効果には反応性アストロサイトから分泌される神経栄養因子の関与が想定され、あらたな内因的な脳保護機構の関与が示唆された。また一旦発症した虚血性脳損傷を補うための修復機構の関与として神経細胞新生(Neurogenesis)の関与について砂ネズミ脳虚血モデル、ラット脳虚血モデルを用いて検討を行ってきた。神経幹細胞が存在することが知られている海馬歯状回subgranular zoneでの虚血侵襲後の細胞増殖の動態を、Bromodeoxyuridine(BrdU)の投与、もしくはProliferating cell nuclear antigen(PCNA)を指標として検討した結果、虚血侵襲後4日から2週間にわたって神経幹細胞の増殖が促進されること、増殖した神経幹細胞が4週間後に神経細胞に分化する事を明らかにした。現在さらに研究を進め、虚血侵襲後の神経細胞新生を制御する因子や、他の虚血モデル(中大脳動脈閉塞モデル)での神経細胞新生の動態に関して検討を行っている。また遺伝子変異マウスを用いて、虚血侵襲後の神経細胞神経新生に関与する因子の検討を行うために必要な再現性良好なマウス一過性重度脳虚血モデルの開発に成功した。ラットの4血管閉塞による一過性重度前脳虚血モデルを用いて、短期間虚血再潅流後に海馬歯状回の神経precursor細胞の存在が報告されている領域での細胞増殖の程度を評価した。あらかじめ前日にネンブタ-ル麻酔下に両側椎骨動脈を電気焼却した動物の両側総頚動脈を軽エ-テル麻酔下に剥離、10分間クリップしたのち、血管閉塞を解除した。非虚血動物、虚血1-28日後のラットに、チミジンのanalogueであるbromodeoxyuridine(BrdU)を腹腔内投与したのち、深ネンブタ-ル麻酔下に4%パラフォルムアルデヒド液にて潅流固定し、脳を取り出し後固定後、ビブラト-ムにて海馬を含む切片を作成し、抗BrdU抗体を用いた免疫組織化学染色に供した。非虚血動物でも、海馬歯状回にBrdU陽性細胞の存在が確認されたが、虚血再潅流4-14日後まで同領域でのBrdU陽性細胞のclusterの出現とその細胞数の増加が観察された。また砂ネズミ両側総頚動脈5分間閉塞による一過性重度前脳虚血モデルでも、細胞増殖のマ-カ-であるproliferatingcell nuclear antigen(PCNA)の存在を海馬歯状回で検討したところ、虚血再潅流7日後をピ-クとしたPCNA陽性細胞の出現が観察された。以上の結果から、成熟動物脳でも、虚血再潅流後、神経precursor細胞が分裂、増殖することが強く示唆された。

今後、分裂増殖したpresursor細胞が神経細胞に分化するかどうかを明らかにするとともに、神経precursor細胞の分裂、増殖を規定する因子について薬理学的に検討していく予定である。脳神経細胞はヒトを含む成熟動物脳では一般に高度に分化した細胞であり、かつ虚血に極めて脆弱な細胞であるため、脳血管障害をはじめとした脳損傷時に広範に脱落し重篤な神経後遺症を残す場合が多い。しかし、脳組織は虚血侵襲を受けた際に神経細胞に保護的な応答や、組織再生、修復に向けた各種の応答を示すことが近年明らかになってきている。申請者らは従来より、虚血に対する神経細胞の保護的な応答現象としての虚血耐性現象を世界に先駆けて報告してきているが、本研究期間中にあらたに砂ネズミ一過性前脳虚血モデルにおいて損傷部位の隣接部位の神経細胞は、虚血に対する抵抗性が2週間以上にわたって増強されることを明らかにした。神経細胞自身の虚血に対するストレス応答は1週間以内に消失することから、損傷部位の隣接部でみられる神経細胞に対する保護効果には反応性アストロサイトから分泌される神経栄養因子の関与が想定され、あらたな内因的な脳保護機構の関与が示唆された。また一旦発症した虚血性脳損傷を補うための修復機構の関与として神経細胞新生(Neurogenesis)の関与について砂ネズミ脳虚血モデル、ラット脳虚血モデルを用いて検討を行ってきた。神経幹細胞が存在することが知られている海馬歯状回subgranular zoneでの虚血侵襲後の細胞増殖の動態を、Bromodeoxyuridine(BrdU)の投与、もしくはProliferating cell nuclear antigen(PCNA)を指標として検討した結果、虚血侵襲後4日から2週間にわたって神経幹細胞の増殖が促進されること、増殖した神経幹細胞が4週間後に神経細胞に分化することを明らかにした。現在さらに研究を進め、虚血侵襲後の神経細胞新生を制御する因子や、他の虚血モデル(中大脳動脈閉塞モデル)での神経細胞新生の動態に関して検討を行っている。また遺伝子変異マウスを用いて、虚血侵襲後の神経細胞新生に関与する因子の検討を行うために必要な再現性良好なマウス一過性重度脳虚血モデルの開発に成功した。
ゲノム情報を利用した魚類Ｃ群レンサ球菌の病原因子の探索およびワクチン開発への応用

西日本のブリ属魚類養殖場において、Lancefield C群のStreptococcus dysgalactiae (GCSD)による疾病が大きな問題となっている。本研究における当該年度の目的は、GCSDの保有する病原因子の探索および同定、更に同定した病原遺伝子をもとに組み換えタンパク質を作製し、リコンビナントワクチンとしての利用を検討することであった。ヒトの代表的な病原細菌であるS. pyogenesなどを含むレンサ球菌には多くの病原因子が存在している。前年度の研究により、GCSDについて他の病原性レンサ球菌と共通の病原遺伝子が見出された。しかしながら、これらの内どのような病原遺伝子がGCSDの魚類に対する病原性に貢献しているか不明である。そこで当該年度では、GCSDのゲノム情報から得た病原候補遺伝子の内、遺伝子の発現・保有率等を考慮して選定したいくつかの病原遺伝子について遺伝子破壊株を作製した。作製した遺伝子破壊株を用いた人為感染試験を行ったところ、血清白濁因子(SOF)破壊株について、顕著な病原性の低下が確認された。また、sof遺伝子破壊株について発現ベクターを用いた相補株を作製し、カンパチ血液を用いた血中増殖能試験を行った。その結果、sof遺伝子破壊株は親株および相補株に比べて増殖能が有意に低かった。以上の結果から、SOFがGCSDの魚類に対する病原性について強く関係していることを明らかにした。次に、病原性に深く関わることが示されたSOFについて大腸菌での異種発現を行い、組み換えタンパクを多量に作製した。組み換えSOFは、アジュバントと混合し、カンパチに腹腔内注射した。免疫2週間後に同等量の組み換えSOFを接種してブースト免疫を行い、ブースト免疫から2週間後に攻撃を行った。攻撃試験の結果、ワクチン接種区では90%以上が生存したが、対照区では約70%が死亡した。以上の結果から、組み換えSOFがワクチンとして有効であることが示唆された。本研究における最大の目的は組み換えタンパク質を用いた魚類病原性GCSDに対するワクチン開発であった。当該年度の研究成果により、血清白濁因子がGCSDの重要な病原因子であることを明らかにし、その組み換えタンパク質がワクチン抗原として有効であることが示唆された。これらの結果から、本研究の目的が達成されたといえる。しかし、より信頼性のあるデータを得るため、ワクチン試験については再現性試験を行う必要がある。SOFがGCSDの魚類に対する病原性に貢献することは実験結果からも明らかであるが、具体的にどのようなメカニズムで宿主と相互作用するかは不明である。従って、今後はsof遺伝子破壊株と相補株を用いた細胞付着・侵入能試験や抗食食活性試験などを行い、SOFの機能について更に詳細な知見を得ることを目指す。組み換えSOFのワクチン抗原としての有効性について再現性試験を行うとともに、最少有効量、持続性試験、アジュバント添加の必要性の有無、経口ワクチンへの利用、中和抗体の検出等の課題がある。また、組み換えSOFを固相化抗原としたELISA法により、組み換えSOF接種カンパチの抗体価を測定し、ワクチンの有効性と合わせたデータを取得予定である。本研究ではゲノム情報を利用した魚類由来Group C Streptococcus dysgalactiae(GCSD)の病原性因子に関する知見の蓄積とそれらの知見をGCSD感染症に対するワクチン開発へと結びつけることを目的とした。当該年度に実施した研究として、まず魚類由来GCSDの病原性候補遺伝子をゲノムDNA中から発掘し、それらの遺伝子の全塩基配列をインバースPCR等により決定した。続いて、弱毒株と強毒株に対して、決定した病原候補遺伝子についてQ-PCRによる発現解析を行った。その結果、血清白濁因子(SOF)をコードする遺伝子の発現量について、強毒株が弱毒株に比べて極めて高いことを明らかにした。SOFはヒトの病原細菌であるS.pyogenesやブタの病原細菌であるS.suisにおいても重要な病原因子であると報告されている。GCSDのSOFが魚類に対する病原性に貢献しているかを調べるため、sof遺伝子破壊株の作製を試みた。結果、S.suisで開発されたノックアウトベクターpSET4Sを用いることで破壊株の作製に成功した。現在、遺伝子破壊株と野生株を使用した感染試験による病原性検査を準備中である。ゲノム情報から得た病原候補因子の一つとして、GCSD表層免疫原性タンパク(Sd-Sip)を見出した。GCSDに感染したカンパチ血清を用いた免疫染色の結果、Sd-Sipはカンパチに対して強い免疫原性があることを明らかにした。続いて、Sd-Sipの組み換えタンパクを作製しELISA抗原としての利用を試みた。その結果、組み換えSd-Sipに対するカンパチ血清の抗体価測定が可能であることを明らかにした。また、組み換えSd-Sipをラテックスビーズに吸着させ、GCSD感染魚血清と反応させたところ、顕著な凝集が確認された。この抗原吸着ラテックスビーズを用いた凝集反応による血清診断方法は、現場レベルで適用可能な迅速で簡便な方法である。

前年度の研究により、GCSDについて他の病原性レンサ球菌と共通の病原遺伝子が見出された。しかしながら、これらの内どのような病原遺伝子がGCSDの魚類に対する病原性に貢献しているか不明である。そこで当該年度では、GCSDのゲノム情報から得た病原候補遺伝子の内、遺伝子の発現・保有率等を考慮して選定したいくつかの病原遺伝子について遺伝子破壊株を作製した。作製した遺伝子破壊株を用いた人為感染試験を行ったところ、血清白濁因子(SOF)破壊株について、顕著な病原性の低下が確認された。また、sof遺伝子破壊株について発現ベクターを用いた相補株を作製し、カンパチ血液を用いた血中増殖能試験を行った。その結果、sof遺伝子破壊株は親株および相補株に比べて増殖能が有意に低かった。以上の結果から、SOFがGCSDの魚類に対する病原性について強く関係していることを明らかにした。次に、病原性に深く関わることが示されたSOFについて大腸菌での異種発現を行い、組み換えタンパクを多量に作製した。組み換えSOFは、アジュバントと混合し、カンパチに腹腔内注射した。免疫2週間後に同等量の組み換えSOFを接種してブースト免疫を行い、ブースト免疫から2週間後に攻撃を行った。攻撃試験の結果、ワクチン接種区では90%以上が生存したが、対照区では約70%が死亡した。以上の結果から、組み換えSOFがワクチンとして有効であることが示唆された。ゲノム情報を利用したGCSDの病原候補遺伝子のスクリーニングおよび遺伝子の転写解析については研究計画通りに完了した。また、複数の病原候補遺伝子について遺伝子破壊株の作製が既に完成している。病原候補因子の組み換えタンパクの作製も行っており、作製した組み換えタンパクを利用したGCSD感染症の簡易診断方法を開発することに成功した。本研究における最大の目的は組み換えタンパク質を用いた魚類病原性GCSDに対するワクチン開発であった。当該年度の研究成果により、血清白濁因子がGCSDの重要な病原因子であることを明らかにし、その組み換えタンパク質がワクチン抗原として有効であることが示唆された。これらの結果から、本研究の目的が達成されたといえる。しかし、より信頼性のあるデータを得るため、ワクチン試験については再現性試験を行う必要がある。GCSDの感染試験には人工種苗のカンパチを用いることでより正確なデータを得ることができるが、実験感染に適したサイズの魚はいつでも入手出来る訳ではない。従って、今後行う予定である感染試験およびワクチン試験に用いる遺伝子破壊株およびリコンビナントワクチン抗原について、供試魚が入手できるまでにまだ作製していない遺伝子破壊株および組み換えタンパクの作出を行う。供試魚が入手出来次第、遺伝子破壊株を用いた感染試験を行い破壊株の病原性の変化を精査する。また、作製した組み換えタンパクをワクチン液として魚類に接種し、その効果を検討する。
ディープラーニングに基づく音声認識の音響モデル適応の研究

近年ディープラーニングにもとづく音声認識が大きな成果を挙げているが,話し言葉についてはまだ十分な結果は得られていない.認識性能の低下の大きな原因として話者の個人性,多様な音響環境,多様な発話スタイルなどが挙げられる.これらを解決するために適応技術を中心とした手法を開発し話し言葉の認識性能の向上を図ることが本研究の目的である.この目標を達成するため1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の性能向上,3)感情音声認識の性能向上,について検討した.1)について我々は異なる適応手法を組み合わせることによる相補的な効果を狙ったクロス適応法を提案している.しかしながら高精度な認識結果をベースラインとした場合については検討していなかった.そこで,現時点で最高性能が得られている手法をベースラインとしてクロス適応の検討を行ない有効性を示した.最終的には単語誤り率10.38%を得た.2)について雑音下音声認識において,音声区間検出(VAD)の精度が重要となる.そこでDNNを使用したVAD性能の向上について検討した.本研究では特に雑音クラスを設定しVADを行なった.評価は映画音声からの音声検出タスクを使用しクラスモデルの有効性を示した.3)について,まずは基礎的な検討として感情音声認識に関してDNN-HMMを利用することの有効性を示した.次に更なる性能向上を目指し,音響モデル,言語モデルの適応を行った.音響モデルの適応では話者適応,コーパス適応,感情適応,話者+感情適応の4種類について比較実験を行なった.いずれも効果があるが,特に話者適応で良好な結果が得られた.また最終年度は言語モデル適応の検討を行った.Twitterは口語的表現が多く含まれるが,その中から感情表現を含むテキストを選択し適応に利用した.約2000文を使用した適応実験の結果,言語モデル適応の有効性を示した.近年ディープラーニングにもとづく音声認識が大きな成果を挙げているが,話し言葉についてはまだ十分な結果は得られていない.認識性能の低下の大きな原因として話者の個人性,多様な音響環境,多様な発話スタイルなどが挙げられる.これらを解決するために適応技術を中心とした手法を開発し話し言葉の認識性能の向上を図ることが本研究の目的である.今年度はまず以下の3点について検討した.すなわち1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の性能向上,3)感情音声認識の検討,である.1)について既に我々は異なる適応手法を組み合わせることによる相補的な効果を狙ったクロス適応法を提案している.しかしながら、高精度な認識結果をベースラインとした場合については検討していなかった.そこで,現時点で最高性能が得られている手法をベースラインとしてクロス適応の検討を行なった.その結果,このようなベースラインを使用した場合でも適応は有効であり,最終的に日本語話し言葉コーパスにおいて単語誤り率10.38%を得た.2)について雑音下音声認識において,音声区間検出(VAD)の精度が重要となる.そこでDNNを使用したVAD性能の向上について検討した.我々は従来DNN-HMMにおける話者適応について話者クラスモデルの有効性を示してきた.本研究ではそれを踏まえ,雑音クラスを設定しVADを行なった.評価は映画音声からの音声検出タスクを使用した.実験の結果EER(Equal Error Rate)で約5.4%と高い性能が得られた.以上よりクラスモデルの有効性を示した.3)について,まずは基礎的な検討として感情音声認識に関して,従来のGMM-HMMによる認識とDNN-HMMを用いた認識結果の比較検討を行なった.その結果前者で音素誤り率が23.32%に対し後者では15.95%と大幅に性能向上することを確認した.本年度は上記に示すように1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の検討,3)感情音声認識の検討,の3つの検討を行ない,いずれも評価実験の結果有効性が示されている.当初は話者クラスモデルを使用した話者適応を第一に着手することを想定していたが,事前検討により方針の変更を行ない上記3点の課題を優先させた.いずれも有効であり,おおむね順調に進捗していると考えられる.ただしDNN-HMMの話者適応に関しては,話者ベクトルを使った話者適応について開発および内部評価を進めているが,外部発表はまだとなっている.今後はこの方法の検討も進めて行きたい.近年ディープラーニングにもとづく音声認識が大きな成功を収めている.既に短いフレーズの音声認識は実用レベルに達しており,スマートスピーカーなどへ応用されている.一方,よりくだけた発話を行なう話し言葉についてはまだ十分な結果は得られていない.話し言葉の音声認識が実用化されれば,会議,講演,授業などの自動書き起こし,音声対話システムの応用など様々な面での応用が期待される.話し言葉における認識性能の低下の大きな原因として,話者の個人性,多様な音響環境,多様な発話スタイルなどが挙げられる.これらを解決するために適応技術を中心とした手法を開発し話し言葉の認識性能の向上を図ることが本研究の目的である.今年度は昨年度からの継続で以下の3点について検討した.すなわち1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の性能向上,3)感情音声認識の検討,である.1)について既に我々は異なる適応手法を組み合わせることによる相補的な効果を狙ったクロス適応法を提案している.しかしながら,従来法と比較しての詳細な評価や認識結果等の分析を十分行なっていなかったため,これらの検討を行なった.2)について雑音下音声認識において,音声区間検出(VAD)の精度が重要となる.

そこでこれまでDNNを使用したVAD性能の向上について検討を行なってきた.本年度は特にこれまで十分な性能が得られていない楽器音や歌声環境でのVADについて検討した.3)について,感情音声認識に関して,DNN-HMMを用いた認識を検討してきたが,本年度は学習データの検討や適応について検討した.本年度は昨年から継続して1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の検討,3)感情音声認識の検討,の3つの検討を行なった.1)については詳細な評価をして十分に結果が揃ったため,研究のまとめとして査読付き論文に投稿している.2)については多クラス分類におけるクラス設定方法の検討や新たな特徴量などの検討を行ない様々な知見が得られた.結果として環境音を含む学習データの増加は性能向上に大きく貢献することが分かった.またクラス分類については,どのような特徴の信号を分類するかにより,最適な分類方法が異なることが分かった.3)については,学習データの検討として新たな感情音声コーパスを追加して検討を行なった.さらにDNNの適応法の検討,言語モデルの検討を行なった.適応については話者適応,コーパス適応,感情適応,話者+感情適応の4種類について比較実験を行なった.いずれも効果があるが,特に話者適応で良好な結果が得られた.一方話者+感情適応の場合,十分な適応性能が得られなかったが,これは適応データが不足したことによると考えられる.いずれも良好な結果が出ており,順調に進捗していると考えられる.特に3)の感情音声認識における話者適応において,適応前の単語誤り率38.1%に対し,適応後は23.05%と高い効果が得られることが分かった.近年ディープラーニングにもとづく音声認識が大きな成果を挙げているが,話し言葉についてはまだ十分な結果は得られていない.認識性能の低下の大きな原因として話者の個人性,多様な音響環境,多様な発話スタイルなどが挙げられる.これらを解決するために適応技術を中心とした手法を開発し話し言葉の認識性能の向上を図ることが本研究の目的である.この目標を達成するため1)クロス適応の高精度化,2)雑音下における音声区間検出の性能向上,3)感情音声認識の性能向上,について検討した.1)について我々は異なる適応手法を組み合わせることによる相補的な効果を狙ったクロス適応法を提案している.しかしながら高精度な認識結果をベースラインとした場合については検討していなかった.そこで,現時点で最高性能が得られている手法をベースラインとしてクロス適応の検討を行ない有効性を示した.最終的には単語誤り率10.38%を得た.2)について雑音下音声認識において,音声区間検出(VAD)の精度が重要となる.そこでDNNを使用したVAD性能の向上について検討した.本研究では特に雑音クラスを設定しVADを行なった.評価は映画音声からの音声検出タスクを使用しクラスモデルの有効性を示した.3)について,まずは基礎的な検討として感情音声認識に関してDNN-HMMを利用することの有効性を示した.
三次元培養ヒト皮膚モデルの細胞機能と形態形成に及ぼすGSK-3制御薬剤の作用

皮膚細胞機能や皮膚再生への作用が明らかになりつつあるWnt/ss-cateninシグナルが、三次元培養ヒト皮膚モデルの細胞機能と形態にどのように影響するかを明らかにすることを目的とする。Wnt/ss-cateninシグナルを促進するGSK-3阻害剤を作用させると、表皮ケラチノサイトは増殖促進のみならず分化も促進され、また、線維芽細胞は増殖促進されることがわかった。さらに、三次元培養ヒト皮膚モデルの表皮重層化が維持され、基底膜タンパク質の分泌促進と基底膜構造が維持されるために皮膚モデルの課題であった長期間培養の可能性が示された。平成19年度は、単層培養系と三次元培養系を用い、ヒト新生児皮膚ケラチノサイト(HK)とヒト新生児皮膚線維芽細胞(HF)の細胞活性に及ぼすWnt/β-cateninシグナルを促進するGSK-3阻害剤(6-bromoindirubin-3'-oxime(BIO))の作用について検討した。(1)HKの増殖性、分化への影響:BIOはHKの増殖を濃度依存的に促進することを見出した。0.1μMが至適濃度であった(1.4倍促進)。0.5μMでは増殖抑制された。HKの分化状態を分化特異マーカーの遺伝子発現で解析するために、ケラチン1,5,10,14、インボルクリン、フィラグリン発現アッセイ系を構築した。予備実験ではCa^<2+>添加によるHK分化の抑制は明確でなかった。(2)HFの増殖性への影響:BIOはHFの増殖を濃度依存的に促進することを見出した。0.1μMで1.25倍、0.5μMで1.6倍促進された。至適濃度の0.5μMで、細胞外マトリックス関連遺伝子発現への影響をオリゴアレイでの解析中である。(3)三次元培養ヒト皮膚モデルへの影響:HK、HFともに増殖促進される0.1μMのBIOを用いて、我々の開発した方法で三次元培養ヒト皮膚モデルを作製し、第1回目の実験として皮膚モデルへの影響を組織学的に解析した。BIOを添加した皮膚モデル系では、表皮重層化は変化ないが、表皮分化マーカーの発現領域が拡大していた。一方、表皮一真皮結合部への基底膜成分の沈着が減少していた。電子顕微鏡での微細構造解析から、基底表皮細胞の基底面に厚さ30nmほどのラミナデンサがほぼ全域にわたって観察されたが、その電子密度は低かった。また、基底膜側のHKの細胞膜周辺にはいくつもの小胞が連なって観察され、さらに小胞内には顯粒の存在も確認できた。このことは、タンパク質分泌の盛んな状態を示していると考えられた。以上の結果から、BIOの添加により、HKの増殖活性が促進され、さらに基底膜側への基底膜成分等の分泌が促進されていると推察される。平成20年度は、ヒト表皮角化細胞(HK)、ヒト真皮線維芽細胞(HF)ならびに三次元培養ヒト皮膚モデルにWnt/β-cateninシグナルを促進するGSK-3阻害剤(BIO)を作用させ、細胞増殖と分化、三次元培養ヒト皮膚モデル構造への影響を検討した。(1)細胞増殖促進:昨年度見出したHF, HKへの増殖促進の作用機序を明らかにするためにCyclinD1発現解析を行ったが、両細胞の増殖促進との関係を決定付ける結果は得られなかった。(2)表皮角化細胞分化: HKの分化マーカー遺伝子発現解析から、BIOの分化促進作用が明らかとなった。一方、BIOは高濃度Ca^<2+>や接触阻害で分化誘導されたHKにはほとんど影響しなかった。このように、低濃度Ca^<2+>の培養系でBIOによるGSK-3阻害により、HKは増殖も分化も促進される結果が得られたことから、HKの細胞ステージによりBIOの作用が異なり、表皮幹細胞やTransit Amplyfying(TA)細胞には増殖促進に作用し、TA細胞の分化細胞への移行に対しては促進作用を示す可能性が考えられた。(3)三次元培養ヒト皮膚モデル: BIO添加後、培養14日目と28日目の皮膚モデルを解析した。28日目で角層は肥厚するが数層の表皮生細胞層が存在し、4週間以上の培養が可能となった。微細構造解析により、基底細胞直下にラミナデンサがほぼ全域にわたって観察されたが、14日目で特徴的だった基底膜側のHKの細胞膜周辺の分泌小胞様の構造は存在しなかった。以上の結果から、Wnt/β-cateninシグナルを促進するGSK-3阻害剤(BIO)の添加により、HK、HFが増殖促進され、さらにHKのTA細胞から分化細胞への移行が促進され、表皮重層構造、基底膜構造を維持した三次元培養皮膚モデルの長期培養の可能性が示された。
結晶場を利用した立体選択的反応の設計

結晶格子中の分子が、光・熱・放射線等によって反応する場合、その分子の結晶構造は極めて特異であり、またその反応は高度に立体選択的である。本研究では、結晶場を利用して立体選択的な反応を行わせることにより新しい化学反応を見出すことを目的とし、そのために必要な方法論の開発を進めるための研究を行った。具体的研究成果は以下の通りである。1)一連のジエチニルベンゼン誘導体の放射線固相重合において、重合治性と結晶構造の相関についての系統的研究を行った。2)トポケミカル〔2+2〕光反応を行う種々のジオレフィン化合物について、トポケミカル誘導の機構、結晶構造ー反応挙動の関係を明らかにした。3)有機硫黄化合物において硫黄原子が関与する特定の分子間の短かい距離とパッキングの関係を、分子間力の面から定量化した。4)一連のアゾベンゼン化合物の結晶構造解析の結果をもとに、膜構造決定の一般的要因について考察した。5)液晶を異方的反応場とする光二量化反応及び熱環化反応について一連の研究を行い、高選択的高効率反応のための要因を検討した。6)ジアセチレンの液晶相重合の中間体オリゴマ-のπー電子構造に関する研究を行い、その特異な重合反応機構を明らかにした。7)一連のトリアリ-ルクロメニル、ベンゾフラノニル等について、ピエゾクロミズム現象の機構についての考察を行った。8)双環オキサラクタムを固相反応により立体規則的に合成するための要因について検討した。9)放射線固相重合の重合開始機構について検討し、結晶構造から得られた結果と良い相関を見た。
配位不飽和低原子価貴金属イミドおよびホスフィニデンクラスターの創製と反応性

金属-配位原子間に容易に多重結合を形成し、かつ中心金属の電子状態に呼応して供与する電子密度を柔軟に変化させ得るイミド及びホスフィニデン配位子を導入したルテニウム、コバルト、白金などから成る金属クラスター反応場を新たに構築した。さらにそれらの金属クラスター上でCO、イソニトリル、アルキンなどの基質分子の変換反応(炭素-炭素結合形成、炭素-窒素結合形成、炭素-水素結合切断など)が穏和な条件下で選択的・効率的に進行することを明らかにした。本研究では、金属-配位原子間に容易に多重結合を形成し、かつ中心金属の電子状態に呼応して供与する電子密度を柔軟に変化させ得るというイミド及びホスフィニデン配位子の特長と、複数の金属中心が隣接することで基質分子の多中心的な活性化が可能であり、かつ多電子の出入りを伴うプロセスが容易であるという金属クラスター反応場の特長とを融合させた新しい化学反応場を構築してその機能を解明することをめざして検討を行った結果、平成22年度においては2つの(η^5-C_5Me_5)_2Ruフラグメント間を反応性イミド配位子と有機配位子とが架橋した一連の2核錯体[(η^5-C_5Me_5)_2Ru_2(μ-NPh)(μ-L)](1;L=CO, CNBu^t, CH_2, C=CH_2, CR(R=H, CH_3))を選択的・効率的に合成できることを見出し、それらの構造と化学反応性を明らかにした。X線解析の結果、1はRu-N間、Ru-C(架橋配位子)間、およびRu-Ru間に多重結合性を有する異種多重結合集積型構造を有する分子であり、これらにより配位不飽和構造が安定化されていることが判明した。1は配位不飽和性を反映してCO, CNBu^t, PMe_3等の基質分子を容易に2核サイト上にとりこむばかりでなく、架橋イミド配位子、架橋有機配位子およびアルキンなどの基質分子との間での選択的な炭素-炭素および炭素-窒素結合形成反応が2核サイト上で穏和な条件下で進行し、新たな含窒素有機配位子を有する2核ルテニウム錯体が得られることも明らかになった。これらはRu-N間、Ru-C(架橋配位子)間のいずれもに多重結合性を有する分子構造に起因する特異な反応性であると理解できる。本研究では、金属-配位原子間に容易に多重結合を形成し、かつ中心金属の電子状態に呼応して供与する電子密度を柔軟に変化させ得るというイミド及びホスフィニデン配位子の特長と、複数の金属中心が隣接することで基質分子の多中心的な活性化が可能であり、かつ多電子の出入りを伴うプロセスが容易であるという金属クラスター反応場の特長とを融合させた新しい化学反応場を構築してその機能を解明することをめざして検討を行った結果、平成23年度においては、ヒドリド配位子を有する新規な2核ルテニウムイミド錯体Cp*Ru(μ_2-NAr)-(μ_2-H)_2RuCp*(2a,Ar=Ph;2b,Ar=C_6H_4OMe-4;2c,Ar=C_6H_3Me_2-2,6;Cp*=η^5-C_5Me_5)を合成し、これらの錯体がN-H結合の還元的脱離により、アミド・ヒドリド錯体という新たな2核配位不飽和種を与えることも明らかにした。2a、2bはトルエン中で容易にN-H結合の還元的脱離を起こし、アミド・ヒドリド錯体Cp*Ru(μ_2-NHAr)(μ_2-H)(μ_2-C_6H_5Me)RuCp*(3a,Ar=Ph;3b,Ar=C_6H_4OMe-4)を与えた。本反応は配位不飽和中間体Cp*Ru(μ_2-NAr)(μ_2-H)_2-RuCp*(A)を経由して進行することが速度論的実験により示唆された。3aは容易にトルエンを解離して、Aの2量体である4核錯体を可逆的に与える。さらに、Aの2核サイトにCO、アルケン、アルキンなどの不飽和分子を取り込んだ一連の錯体を単離・同定した。一方3aとPh_3SnHとの反応では、Sn-H結合およびSn-C結合の切断反応が進行し、スタニレン配位子を有する新規なイミド錯体が得られることも明らかにした。
歯科用ポ-セレンの破壊機構と寿命に関する研究

金属焼付用陶材の寿命と生存確立および安全行動応力を予測し,疲労破壊のメカニズムを探るために,37°Cの蒸留水中での動疲労試験と,Arガス(乾燥雰囲気)中での4点曲が強さおよびSEPB法による臨界応力拡大係数の測定を行った。また,破壊エネルギ-の算出に必要な弾性定数を直方体共振法で測定し,走査電子顕微鏡による破断面の観察を行った。その結果次のような結論を得た。1)動疲労試験から疲労パラメ-タは35.3±0.8と求められ,この結果からSPか線図(StrengthーProbabilityーTime diagram)を描くと,水中においては例えば,20年間の寿命と99.9%の生存確率を保証する安全作動応力は約21MPaとなる。2)Arガス中での4点曲げ強さの平均値は蒸留水中よりも約23%増加していた。ワイブルプロットによるとArガス中の方がワイブル係数は小さく,強度のばらつきが大きいことを示していた。また,臨界応力拡大係数を使って,蒸留水中とArガス中での破壊直前のクラックの長さの比を求めると,1.32.1という値を得た。すなわち,蒸留水中では試験中にクラック成長を起こしていることを示している。3)ヤング率と臨界応力拡大係数とから6600erg/cm^2という破壊エネルギ-が得られた。これは破壊に対する抵抗の尺度であるが,アルミナと比較すると1/9,窒素ガス中で測定されたソ-ダ石灰ガラスと比較しても小さい。ここでの値は臨界応力拡大係数を使って求めてあるので限界破壊エネルギ-と考えられるため,水が豊富に存在する環境下ではかなり小さくなると考えられる。4)破断面に金属の疲労に特有な縞模様が確察された。これは興味ある知見であり,陶材の疲労破壊を金属と同様な観点から研究できる可能性がある。1.陶材の曲げ強さの測定において,四点曲げ強さの歪速度依存性から疲労パラメ-タの推定と寿命の予測を試みた。金属焼付用陶材の寿命と生存確立および安全作動応力を予測するには,強さの歪速度依存性を求める必要があり,37°Cの水中で0.005,0.05,0.5,5mm/minのクロスヘッドスピ-ドで四点曲げ強さを測定した。各歪速度で得られた破壊応力をワイブル統計処理した結果,いずれの歪速度も単一モ-ドのワイブル分布に従い,ワイブル係数は1317の値であった。使労パラメ-タは破壊応力の平均値と歪速度の両対数プロットの傾きから約36と求められ,これを用いて動的破壊時間を静荷重による静的破壊時間に変換した。静的破壊時間を1秒に規格化した時の破壊応力をワイブル統計処理すると,いずれの歪速度の場合もほぼ同一の直線で表されることがわかった。この結果をもとにSPT線図(StrengthーProbabilityーTime diagram)を描くと,約20MPaというかなり大きな静荷重であっても,20年間の寿命と99.9%の生存確率を保証するという結果を得ている。ここで問題になるのは陶材にもある応力以下ではクラックが成長しない応力腐食限界が存在するかどうかである。これを確かめるためには当初計画していたDouble Torsion法によるクラックの成長速度を測定する必要がある。2.平成2年度の計画のうち最も困難な問題は,大きな均質な板状試料(3cmx7cmx12mm)を作製するためのポ-セレンの焼成条件と切断研磨の方法であった。現在,均一な厚みに研磨することに弱冠の問題はあるが,試料作製の問題は一応解決できそうである。

このため平成3年度はDouble Torsion法によるクラックの成長速度の測定を通して応力腐食限界,疲労パラメ-タ,臨界応力拡大係数の測定,さらに,さきに求めた疲労寿命の妥当性の確認と,破壊機構の解明に重点を置く。前年度,金属焼付用陶材の4点曲げ強さの歪速度依存性を37°Cの蒸留水中で測定し,疲労パラメ-タを求めて寿命の予測を試みた結果を報告した。この結果は金属焼付用陶材が水中でSubcriticalcrack growthを起こすことを示すものであった。そこで,疲労破壊のメカニズムに及ぼす水の影響を調べるために,Arガス(乾燥雰囲気)中での4点曲げ強さをクロスヘッドスピ-ド0.005mm/minで測定した。また,臨界応力拡大係数をSEPB法で,破壊エネルギ-の算出に必要な弾性定数を直方体共振法で測定し,次のような結果から金属焼付用陶材も水によって疲労が進行するという結論を得た。1)Arガス中での4点曲げ強さの平均値は蒸留水中よりも約23%増加していた。これらをワイブルプロットした結果,Arガス中の方がワイブル係数は小さく,強度のばらつきが大きいことを示していた。また,蒸留水中では強度の大きいものほど,破壊に至るまでにクラック成長を起こしていることを示していた。そこで,臨界応力拡大係数を使って,蒸留水中とArガス中での破壊直前のクラックの長さの比を求めると,1.32.1という値を得た。すなわち,Arガス中ではクラックの成長はほとんど起こらないと考えられるので,蒸留水中での強度の低下は試験中に起きたクラック成長によるものである。2)ヤング率と臨界応力拡大係数とから6600 erg/cm^2という破壊エネルギ-が得られた。これは破壊に対する抵抗の尺度と見なされる。アルミナと比較すると1/9,窒素ガス中で測定されたソ-ダ石灰ガラスと比較しても少し小さい。ここでの値は臨界応力拡大係数を使って求めてあるので限界破壊エネルギ-と考えられるため,水が豊富に存在する環境下ではかなり小さくなると考えられる。
産後うつ病の発症脆弱性に関わる脳内分子神経基盤の解明

産後うつ病は患者本人のみならず子の心身の発達に対する影響も大きいため、その病態解明は喫緊の課題となっているものの、産後うつ病の分子基盤研究は圧倒的に不足しているのが現状である。産後うつ病の病態を忠実に再現する動物モデル開発も十分行われていない。本研究の第一の目的は、産後うつ病発症の分子機序を明らかにすることである。ストレスはうつ病発症の周知の危険因子であり、ストレスの有害な影響およびうつ状態の発症を評価するため、ストレス負荷されたげっ歯類動物はうつ病のモデルとして考えられている。しかしながら、既存のうつ病モデル動物は主に肉体的ストレッサーへの曝露に依存しており、肉体的ストレスによる影響が排除できず、また、妊娠中のマウスに肉体的に強度のストレスをかけることができないということが産後うつ病のモデルを作成する上での課題となっている。そこで本研究では、肉体的なストレスはかけず、情動的なストレス(Emotional Stress)を加えるという方法を用い、新たなモデルがうつ病モデルマウスとして使用可能かどうかを検討した。ストレス脆弱性を有するBALB/c雄マウスを用いて、Stress群、Control群の2群に分け、ストレス群には視覚・聴覚情報を利用した情動的ストレス負荷を1日5分間、7日間連続で行い、対照群はストレスを受けずに飼育した。ストレス実験後、Social Interaction試験、Open Field試験、Forced Swim試験でうつ様行動を評価した。Emotional Stress群ではControl群と比較してうつ様行動を示した。産後うつ病の作成準備として、肉体的なストレスはかけず、情動的なストレス(Emotional Stress)を加えることでうつ病モデルを作るという方法を用い、新たなモデルがうつ病モデルマウスとして使用可能であることをSocial Interaction試験、Open Field試験、Forced Swim試験などのうつ様行動を評価することで確かめることが出来た。これにより、妊娠マウスにストレス負荷を行い、出産後のうつ様行動を調べるための準備が整った。妊娠マウスに情動的ストレス負荷を行い、ストレス実験後、Social Interaction試験、Open Field試験、Forced Swim試験などのうつ様行動評価を行う。併せて、巣作りや児に対する養育行動の評価を行い、うつ様行動や養育行動との相関、各行動の変化と妊娠との関連性などについて解析を行う。産後うつ病モデルマウスの作成後、各脳部位の遺伝子変化や神経細胞活性化の指標であるc-fosの発現などを調べる。産後うつ病のモデルマウスの作成後は、モデルマウスの養育下で育った児の発達やストレス脆弱性についても解析を行い、児への影響も明らかにしていく。うつ病モデルマウスの脳サンプルの遺伝子発現変化などを解析する予定であったが、条件を揃えて解析を同時に行った方が測定誤差が小さくなるため、脳サンプルはディープフリーザーに保管し、次年度にまとめて解析を行うこととした。
観光地域づくり組織を支えるガバナンスとファイナンス：国際比較を通じて

最終年度である30年度は、スイスでの追加調査と過去2年間における調査結果の総まとめを行った。9月にスイスに出張を行った。ツェルマットのDMO(観光地域マネジメント組織)であるツェルマット観光局(Zermatt Tourismus)を訪問するなど、同地域における観光地域経営の実態について、本研究テーマの主題であるファイナンス(資金調達)の側面から調査を行った。とくに同観光局の財源になっている2つの税、滞在税(宿泊税)と観光促進税について、その性格(法理)や使徒について関係者から聞き取りを行った。合わせて他の地域との相違等についてもヒアリング等を行い、有益な知見を得ることができた。これにより、条文からは容易にはわからない点についても明確になるなど、有益な知見が得られた。なお、これらの税を規定する州法(ヴァリス州観光法)についてはすでに和訳を終えていたが、調査を踏まえて修正作業を行うことができた。さらには、近隣都市であるグリンデルワルトやインターラーケンのDMOを訪問し、ヒアリングを行うとともに関連資料を収集した。出張終了後は、ツェルマットなどスイスの主要観光地域のDMOのアニュアル・レポート(年次報告書)など公表資料を和訳ならびに分析し、観光地域におけるマーケティング戦略について特徴点を明らかにした。また、海外出張を通じて「集積」という観点から観光地域を捉える必要があると考えるに至ったので、集積や産業クラスターに関する先行研究をレビューし、これを観光地域に当てはめて論じる際の論点整理を行った。以上を踏まえて、国際比較の視点から観光地域経営に関する論点整理を行い、それに基づく学会報告を行うなど、研究成果について同じ専門分野の意見交換を行った。近年、日本では、地域観光の司令塔として、Destination Management/MarketingOrganization(以下、DMO)という組織が注目されている。本研究は「日本版DMO」が地方創生において重要な政策的課題として提起されている中で、海外の先行事例となる観光地域づくり組織の諸特徴を、日本における観光協会やその他の観光地域づくり組織との相違に留意しつつ明らかにすることを目的としている。本研究はとくに地域ガバナンスとファイナンスの観点から、観光地域づくり組織に検討を加えようとする点に特徴がある。そこで28年度は、まず手がかりを得るために、欧州とくにスイスの観光協会など団体・組織の年次報告書(決算書)を入手の上、分析・検討を行った。そうした予備的検討を基礎に、実際にスイス・ヴァリス州ツェルマットに訪問し、ツェルマット観光局やブルガーゲマインデ・ツェルマットといった団体の責任者に聞き取り調査を行い、それらの団体・組織が地域づくりや地域マーケティングに果たしている役割などを明らかにした。また、そうした団体がどのようなガバナンス構造の上に存立しているかを明らかにするために、現地の企業経営者にもヒアリングを行った。さらに同地で入手した資料をもとに、宿泊税や観光促進税といった税のしくみについて検討を行った。観光促進税は広域的な観光振興を図るために、宿泊施設等のない地域にも分配を図ろうとするものであり、宿泊税とは目的を異にするものであることがわかった。国内の動向については、先行事例を知るために、千葉県の南房総地域の観光振興団体を訪問し、責任者から設立の経緯や事業の特徴、財政規模さらには課題等についてヒアリングを行い、ケース化を行った。28年4月の地震のために、4月から7月までの約4ヶ月間、実質的な研究活動が行えず、研究計画の遂行に遅れが生じた。内外の事例について比較検討を行うためには、海外だけでなく国内の先行事例を検討する必要があったが、その点の十分な調査・研究ができず、進捗状況の遅れが生じた。近年、海外の主要観光地では、DMO(Destination Management/Marketing Organization)という組織が地域観光の司令塔として重要な役割を果たしている。そうした中、日本でもDMO設立の動きが加速しつつある。そこで本年度は、昨年に引き続いて国内外の先行事例について、ファイナンス(財源)とガバナンスの観点から調査を行った。方法としては先行研究や報告書等による文献調査と現地でのヒアリング調査を主に行った。まず国内については、観光地マネジメント組織の代表者が集まる会議に参加し、何人かの代表者から現状と課題についてヒアリングを行い、国内観光地の一般的傾向について把握を行った。国内の動向に関して当初、計画に入っていた北海道については、関係者とのアポイントメントがとれず実行できなかったため、高知県の地域マネジメント組織を訪問し、取組み実態について視察並びにヒアリングを行い、現状と課題を把握した。海外については秋季に、米国カリフォルニア州ナパバレーのDMOであるVisit Napa Valleyや、サンフランシスコ、ロサンゼルスのエリアマネジメント組織を訪問し、財源である分担金の仕組みを調査した。とくにナパバレーでは、TBID(Tourism Business Improvement District)という仕組みを活用した形での観光地経営の現状についてヒアリングを行った。これらの調査内容についてはケース化した上で、研究会において発表を行い、専門の近い研究者と意見交換を行った。これと並行して、平成28年度にスイス・ツェルマットのDMOで入手した宿泊税および観光促進税など税に関する資料を和訳し、他の国・地域における事例と比較検討を行った。また、東京で行われた宿泊税など法定外目的税に関するセミナーに出席し、国内の動向についても情報収集を行った。論文執筆まで進捗していないことから当初計画よりもやや遅れているという認識に立っている。その理由は次の通りである。第1に、国内外の事例に関する情報収集に追われてしまったことである。国内については日本版DMO設立に向けての各地の動きが非常に流動的であるため、事態の推移を確認してから現地調査を行わなければならなくなったことが大きい。

第2に、スイス・ドイツ語の資料の翻訳に時間を要してしまったことである。これらの理由から、未だ論文の完成にはいたっていない。最終年度である30年度は、スイスでの追加調査と過去2年間における調査結果の総まとめを行った。9月にスイスに出張を行った。ツェルマットのDMO(観光地域マネジメント組織)であるツェルマット観光局(Zermatt Tourismus)を訪問するなど、同地域における観光地域経営の実態について、本研究テーマの主題であるファイナンス(資金調達)の側面から調査を行った。とくに同観光局の財源になっている2つの税、滞在税(宿泊税)と観光促進税について、その性格(法理)や使徒について関係者から聞き取りを行った。合わせて他の地域との相違等についてもヒアリング等を行い、有益な知見を得ることができた。これにより、条文からは容易にはわからない点についても明確になるなど、有益な知見が得られた。なお、これらの税を規定する州法(ヴァリス州観光法)についてはすでに和訳を終えていたが、調査を踏まえて修正作業を行うことができた。さらには、近隣都市であるグリンデルワルトやインターラーケンのDMOを訪問し、ヒアリングを行うとともに関連資料を収集した。出張終了後は、ツェルマットなどスイスの主要観光地域のDMOのアニュアル・レポート(年次報告書)など公表資料を和訳ならびに分析し、観光地域におけるマーケティング戦略について特徴点を明らかにした。また、海外出張を通じて「集積」という観点から観光地域を捉える必要があると考えるに至ったので、集積や産業クラスターに関する先行研究をレビューし、これを観光地域に当てはめて論じる際の論点整理を行った。以上を踏まえて、国際比較の視点から観光地域経営に関する論点整理を行い、それに基づく学会報告を行うなど、研究成果について同じ専門分野の意見交換を行った。29年6月に国内の観光地域づくりに従事している関係者が一同に集うフォーラム「第2回オンパクサミット」に参加する予定であり、その場でヒアリングや意見交換を行うとともに、訪問調査への協力依頼を行う。これにより28年度の進捗の遅れに関しては十分に取り戻すことができる見通しである。夏季には、米国カリフォルニア州ナパバレーの取組みに関して関係者への視察を予定している。とくに前年度に行った欧州との違いに焦点を当てた調査を行うことにする。調査結果については、ケーススタディとしてケース化を行うものとする。さらに学会(観光ビジネス研究学会等)や研究会で調査結果について報告を行う。これを通じて、専門の近い研究者と意見交換を行い、研究計画の一層の進展を図りたい。
ヘルペスウイルス潜伏感染マウスモデルを用いたアルツハイマー型認知症発症機構の解析

アルツハイマー病と単純ヘルペスウイルス感染関連の報告を確認するために豚ヘルペスウイルス(オーエスキー病ウイルス)潜伏感染マウスモデルを用いて研究を行っている。昨年度までに老化促進モデルマウス(SAM)の一系統であるSAMP1マウスを用いてウイルス潜伏感染下における脳内βアミロイドの状態を確認したところ、感染後2ヶ月目にウイルスを再活性化させた群で脳内βアミロイド値が低くなることを示した。また、SAM P8マウスを用いて感染後2ヶ月目にウイルスを再活性化させた群でのみ有意に認知機能低下が抑制されることを報告した。これらも結果を受けて本年度は正常老化のモデルとされるSAMP10マウスを用いて潜伏感染ウイルス再活性化後のアルツハイマー様病態に対する影響について検討した。4週令SAMP10マウスにブタ抗オーエスキー病ウイルス血清を前投与し、30分後に100LD50相当のYS-81で攻撃して2カ月以上生残したマウスを潜伏感染マウスとした。感染後2ヶ月または6ヶ月目にアセチルコリン投与あるいは同居飼育によりウイルス再活性化を誘導し、鼻腔洗浄液からPCR法によってウイルス遺伝子の検出を行った。6ヶ月目の再活性化試験後にY字迷路試験を行い、試験終了後に脳を採取してELISA法によりβアミロイドの検出を行った。SAMP10は他のSAMと比較してウイルス感受性が低く、アセチルコリン感受性が高く見られた。Y字迷路および脳内βアミロイドについては、潜伏感染のみもしくはウイルス感染させなかった群との間に有意な差は認められなかった。以上のことから潜伏ヘルペスウイルスの再活性化に伴うアルツハイマー病の発症にはなんらかの病原因子の存在を必要とする可能性が考えられる。初年度に使用を予定していたダブルトランスジェニックマウスの搬入に時間を要したことが最後まで影響している上にAPP<NL-G-F>マウスの繁殖にも思いの外時間がかかったために、それぞれの実験に取り掛かる時期が後ろ倒しになっている。また、潜伏ウイルスの再活性化抑制法の構築にも手間取っており、今現在、系の評価にまで至っていない。潜伏ウイルスの再活性化抑制のために使用を予定しているワクチン株の構築を急ぎ進め、これまで評価したマウスモデルのうち最も有用と思われるモデルを選抜して最終的な動物モデルの評価まで完了したい。ADモデルマウスであるPS2マウスを用いてPRV潜伏感染を行う。一般的に用いられているADモデルマウスでは生後12ヶ月以降でβアミロイドの沈着が認められるが、PS2マウスは生後24ヶ月で認められるとのことから実験を計画した。しかし実際はTG2576とのダブルTGが必要とのことで計画を変更した。PRV潜伏感染モデル系では潜伏感染確立に2ヶ月を要するためダブルTGの利用は試験期間を短縮するために大変有効である。PS2とTG2576を交配させて産仔を得、ジェノタイピングテストによりダブルTGを選抜してその雄を潜伏感染試験に供した。潜伏感染は2ヶ月令マウスにブタ抗PRV血清を前投与し、30分後にPRV野外株YS-81で攻撃、2カ月以上生残したマウスを潜伏感染マウスとして実験に使用した。潜伏ウイルスの再活性化誘導は塩化アセチルコリン(2.73mg/マウス)を腹腔内接種し、アセチルコリン投与翌日から鼻腔スワブを採取してDNAを抽出、gG遺伝子に対するPCRを行ってウイルス排泄の有無を確認する。なお、試験には一群あたり510匹のマウスを使用する。対照群としてPS2マウスの親系統であるC57BL/B6マウスを用い、以後もダブルTGと同様の試験を行うものとする。対照マウスは一群5匹で試験を行う。現在ダブルTGの潜伏感染群を作製したところであり、引き続き試験を続ける。PRVを潜伏感染させたダブルTGマウスから脳を採取して脳ホモジネートを材料にELISA法によって脳内βアミロイド量を測定した。試験群にはアセチルコリンの代わりにPBS投与群、感染群をアセチルコリン刺激群及び非刺激群に分け、PRV潜伏感染の有無、および潜伏ウイルス再活性化によるβアミロイドの脳内蓄積に対する影響を検討した。一群5匹の潜伏感染マウスを三群作製し、試験群を設定した。ウイルスが潜伏感染しただけではβアミロイドはむしろ低下したが、再活性化を行なうと増加する傾向が認められた。前年度に作出したダブルTGマウスを用いた試験が順調であったので遅れを取り戻すことができた。理化学研究所で開発されたAPPマウスを使用するべく繁殖を行なっているが、いまだ実験に使用可能な数に至っていない。引き続き繁殖作業を進めるほか、生殖工学の応用も視野に入れて検討を行う。SAMP8を用いた試験において潜伏感染マウスを作製中である。ウイルス感染後2ヶ月後と6ヶ月後に再活性化する群を設けて実験を行なっている。近日中に6ヶ月後の再活性化処置を行う予定であり、その後に行動実験と脳内アミロイドβの沈着状態を確認する。これらと並行してCrisper-Cas9による潜伏ウイルスの抑制法を検討しており、プラスミドあるいはアデノ随伴ウイルスを用いたIN VITRO試験において良好な結果を得つつある。これらの結果がまとまり次第、特許を出願する予定である。APPマウスを用いた試験に遅れが生じているが、SAMマウスを用いた試験およびウイルスの再活性化抑制法の検討が順調に推移してるため、総じて順調に進展していると考えて良いと思われる。理化学研究所脳科学総合研究センターから導入したAPP<NL-G-F>