hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATRX/DRXX遺伝子変異による神経芽腫のテロメア伸長機序と臨床応用

神経芽腫組織及び細胞株のうち、テロメアが伸長しているALT (Alternative Length of Telomere)の活性化では、FISHにてテロメアシグナルはヘテロな構造であった。これらの腫瘍は、ATRXの変異16例、欠失6例、DAXX変異2例で全例に変異または欠失を認め、DAXX/ATRXタンパク発現が抑制されていた。DAXX/ATRX遺伝子変異・欠失を認める腫瘍は年長時の進行例が多く、MYCN増幅は1例を除いて認められなかったが、化学療法抵抗性で有意に予後不良であった。ALT活性化した神経芽腫は、頻度が少ないが予後不良な特異な群であることが示された。約500の神経芽腫症例の凍結組織と正常体細胞のペアと約20の細胞株を対象とした。本年度は、テロメア長を測定し、テロメアが明らかに正常範囲以上(>15kb)に伸長している11検体を中心に以下の検討を行った。サザンブロット法による二本鎖テロメア長の測定に加え、オリゴプローブを用いた液相ハイブリによる一本鎖突出長測定を行ったところ、一本鎖長の伸長は認められなかった。テロメアFISH法でのテロメアシグナルは強く、再構成を認める細胞があった。これらの症例の、DAXXとATRX遺伝子検索を次世代シーケンサー行った、ATRX遺伝子のエクソン上の変異を9例、DAXX遺伝子変異を1例(2塩基の欠失)に認めた。上これらの遺伝子に対して見出された変異をサンガー法にて確認するとともに、その他の部位の多型については、それぞれの遺伝子で30、20箇所程度認められ、多型についてもその関与も検討した。ついで、DAXX/ATRX遺伝子発現、DAXX/ATRXタンパクに対する抗体を用いて免疫組織染色を行い、テロメアが伸長した腫瘍とそれ以外の腫瘍の発現レベルと遺伝子変異・欠失、テロメア長との関連を検索したところ、これらの変異を認めた腫瘍では、これらの淡白の発現をみとめなかった。臨床病理因子との関連を検討として、DAXX/ATRX遺伝子変化やこれらの関連遺伝子の異常の有無、さらに、DAXX/ATRX発現の有無と臨床病理学的因子との関連を検討したところ、年長時発症例、進行例、MYCN非増幅例にDAXX/ATRX変異や発現低下が認められ、さらに生存期間は2年以上であるが、その後に再発あるいは進行し死亡にいたった症例も少なくなく、長期予後は不良であった。現在、ATRX遺伝子の欠失についてMLPA(multiple ligation probe assay)等で検討しており、より詳細な検討を進めている。予後が判明している800余りの神経芽腫凍結検体と正常体細胞のペアと26の神経芽腫細胞株のうち、テロメアが正常範囲以上(>15kb)に伸長しているALT (Alternative Length of Telomere)の活性化した24検体を中心に以下の検討を行った。テロメア相補鎖配列オリゴプローブを用いた液相ハイブリによる一本鎖突出長測定を行ったが明らかに伸長はなかった。また、FISHにてテロメアシグナルはヘテロな構造で一部は巨大化し、PML bodyのシグナルと一部がマージした。これらの腫瘍のDAXX/ATRX遺伝子の変異を次世代シークエンサーで、欠失をMultiplex ligation probe amplification (MLPA)法にて検索したところ、ATRXの変異16例,欠失6例、DAXX変異2例で全例に変異または欠失を認めた。DAXX/ATRX遺伝子の変異・欠失のスクリーニング法として、DAXX/ATRXタンパクに対する抗体を用いて免疫組織染色を行い、テロメアが伸長した腫瘍とそれ以外の腫瘍の発現レベルと遺伝子変異・欠失、テロメア長との関連を検索すると、それぞれの変異あるいは欠失を認めた腫瘍では発現が抑制されていた。臨床病理因子との関連を検討すると、DAXX/ATRX遺伝子変異・欠失を認める腫瘍は年長時の進行例が多く、MYCN増幅は1例を除いて認められなかったが、化学療法抵抗性で有意に予後不良であった。これらから、ALTやこれらの関連遺伝子の異常の有無、さらに、DAXX/ATRX発現の有無と臨床病理学的因子との関連を検討した。DAXX/ATRX変異や発現低下によるALT活性化した神経芽腫は、頻度が少ないが神経芽腫の中で特異な群であることが示され、、細胞分裂はさほど高くないが、悪性度は高い腫瘍と考えられた。小児外科学計画時は約800例を対象として行うこととしていたが、正常と腫瘍がペアで存在する症例が約500例であったため、これらを対象として行った。ATRX遺伝子には同様の遺伝子配列がゲノム上に存在し、次世代シークエンサー解析での変異解析で変異のデータが得られなかったがソフトを改変して対応した。

また、ATRA遺伝子では、最近、大きな欠失が報告され、次世代シークエンスでは検出できない可能性も示唆され、MLPA法を新たに取り入れて検討することとなり、一部当初との異なった方向で検討を進めている。また、テロメアが短縮、正常長の症例に対する検討が一部残ってはいるが、上記の判定をした。テロメア長とDAXX/ATRX遺伝子変異、遺伝発現の関連の検討について、テロメア長から短縮、正常範囲、伸長の3群に分類して検討を加える。DAXX/ATRX遺伝子発現の検討:リアルタイムPCRで両遺伝子のmRNA発現レベルを、免疫組織染色でタンパク発現を測定し、3群間の差を検討する。さらに、テロメア長について腫瘍内ヘテロ性の検討を行う。特に、テロメアFISH法で個々の細胞のテロメア長を、現有の共焦点顕微鏡とインセルアナライザーを用いて測定する。DAXX/ATRX遺伝子変異や欠失が見出された症例を、デジタルPCRにて変異・欠失を有している細胞を見出し、その比率を算定する。DAXX/ATRX抗体を用いた免疫組織染色で、腫瘍内のheterogeneityを検索し、現有のレーザーマイクロディセクション装置で、発現のない腫瘍細胞と発現細胞を分取し、これらの2遺伝子の変異の有無とタンパク発現量について検討する。また、正常細胞からクローニングしたDAXX/ATRX遺伝子テロメアを伸長した細胞株または遺伝子変異のある細胞株に導入し、変化を観察する。一方、DAXX/ATRX遺伝子変異がない細胞株にsiRNAを導入して、DAXX/ATRX遺伝子とテロメア長の変化あるいは腫瘍細胞の変化を検討する。以上から、DAXX/ATRX遺伝子変化や発現の有無とテロメラーゼ非依存性テロメア伸長反応(ALT)、悪性度、臨床病理学的因子との関連を検討し、ALT活性化腫瘍の特徴を明らかにする。さらに、神経芽腫におけるテロメア伸長機序とくにそのメカニズムとしてのDAXX/ATRX遺伝子の関与について検討し、これらに対する分子標的療法の可能性を検討する。今回目的としているATRX遺伝子は35個のエクソンを有し300Kbを超える巨大な遺伝子であり、通常のシークエンスではなく次世代シークエンサーにての解析を計画したが、ゲノム上に同様の遺伝子配列が偽遺伝子として存在することから、次世代シークエンサーでの異常の検出に支障をきたし、偽遺伝子部位を除くためにソフトの改変を行った。また、ATRX遺伝子は広範囲な欠失を認める症例があることが見出され、新たにMLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法を導入し、欠失範囲の同定を行うことに変更した。そのためにATRX遺伝子解析の実施が予定より遅れ、それらの関連の研究を次年度に持ち越した。ATRX遺伝子変異の検索は、解析用ソフトの改変を行い、解析が可能となった時点で、次世代シークエンサーにて解析を再開する。異常が見出された部位については従来のサンガー法によるシークエンスを併用してそれらの異常について確証を得る。また、新たにMLPA法を導入して、広範囲欠失を同定し、上記の次世代シーケンサーの結果と照合して、ATRX遺伝子の変異や欠失について把握する。
走化性シグナル伝達における複数の興奮性経路の研究

本年度は、走化性シグナル伝達を独立に調節するPI3K(PIP3)経路とsGC経路の分子局在が、細胞の走化性にどのように寄与しているか明らかにした。興奮系であることが示された2つの分子局在を生細胞で同時に観察し、同じ入力信号に対して2つの興奮性経路の応答に違いがあるのか調べた。するとPIP3経路と比べて不応期の短いsGC経路の分子局在が高頻度に観察された。不応期の長さという興奮系のパラメータが細胞の走化性制御で重要であるという、新たな知見を得ることが出来た。更に、sGC局在の短い不応期がsGCの酵素反応生成物であるcGMPによって制御されている事を明らかにした。sGCは細胞の前側に局在して仮足を安定化するという機能とは別に細胞内セカンドメッセンジャーであるcGMPを合成する。細胞内のcGMP濃度が低い変異株ではsGC局在が持続的に観察される一方で、cGMP濃度が高い変異株ではsGC局在は稀にしか観察されなくなった。これらの変異株では細胞内のF-アクチン局在の頻度も同じように変化していたことから、細胞内cGMP濃度が細胞のF-アクチン局在制御にも関わっており、細胞運動をうまく調節している事が明らかとなった。本年度の研究により、細胞が持つ複数の興奮性シグナル伝達経路は不応期という特徴量において異なる特性を有しており、外部刺激に対して単一経路だけの応答よりももっと柔軟な応答を可能にしている事が示唆された。現在は、細胞性粘菌だけの知見にとどまっているが、白血球やがん細胞のようなヒトの細胞で同じ性質が保存されているか調べることで、走化性研究の新たな分野が拓けると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞性粘菌の走化性ではPI3K経路をはじめ、TorC経路やsGC経路など複数のシグナル伝達経路によって調節されていることが知られている。一般に真核生物の走化性は、複数のシグナル伝達分子の局在によって調節されているが、その生物学的意義は分かっていない。本研究ではPI3K経路とsGC経路を同時観察して、その分子局在の時空間的性質を比較することで経路ごとの機能を明らかにする。それとともに数理解析を通して、複数経路があることで走化性にどのような利点が生まれるのか明らかにすることを目的としている。ライブイメージングによって、細胞が仮足を形成するときのsGC経路とPI3K経路のシグナル分子局在は、時間的・空間的に異なることが明らかになった。時間的な性質としては、PI3K経路に比べてsGC経路の方がより速いダイナミクスをもっており、頻度の高い局在を示した。空間的には同じ仮足に2つの分子が局在した時でも、PI3K経路の分子の方がより仮足前端に局在しておりsGC経路の分子は少し後ろに局在を示した。また、統計的な解析により細胞が形成する仮足は、sGC経路の分子のみが局在を示す仮足と、sGC経路とPI3K経路の分子が両方局在する仮足の2パターンに分類できることが分かった。2種類の仮足では伸長距離が異なっており、sGC経路とPI3K経路両方の分子が局在した仮足が2倍ほど大きく伸長した。これらの結果は、sGC経路とPI3K経路では仮足形成への寄与が異なっている事を示唆している。sGC経路は頻繁な仮足形成を促進し、PI3K経路が限定された仮足のみを大きく伸長させることで効率の良い走化性が果たされているかもしれない。今後、結合振動子として複数経路を数理モデル化し、効率の良い走化性を果たすために重要な反応を推定していく計画である。sGC経路とPI3K経路の分子局在に関するパラメータ測定を予定通りに行った。その結果、sGC経路とPI3K経路では分子局在の時空間的性質が異なっている事が明らかとなり、2つの経路では役割が異なる事も示唆された。研究当初は、sGC経路とPI3K経路のそれぞれの経路の遺伝子破壊株を用いることで経路間の相互作用について詳しく解析できると考えていたが、劇的な変化は見られておらず、相互作用の推定には至っていない。しかし、蛍の集団発行などを表した結合振動子モデルでは振動子間の相互作用が小さい場合に生物らしい現象をよく表現できている。よって、より詳細な計測・解析を行って弱い相互作用があるかどうか明らかにしていく。本年度は、走化性を独立に調節するsGCとPIP3という複数のシグナル伝達経路を結合振動子系として数理モデル化することを試した。結合振動子は、単一の振動子にはない性質を生み出すことが知られており、複数の興奮系が走化性の調節にどのような利点を生むことができるか確かめることを計画していた。振動子間の相互作用を定量するため、遺伝子操作や薬剤添加によって片方の経路を阻害したときにもう片方の分子のふるまいに影響がでないか調べた。しかし、2つの分子はF-アクチンからの正のフィードバックを介した相互作用のみ明らかとなった。相互作用の形式が想定していたものと異なるため数理モデルも再検討したが、F-アクチンの反応を入れることによってパラメータ数が多くなってしまい、実験結果に合致するようなシンプルなモデルを構築することができなかった。そこで数理モデル化を一度諦め、実験的なアプローチを再開した。本研究では、PIP3とsGCの2つの興奮系では不応期の性質が異なっていることを明らかとしている。

特に短いsGC局在の不応期が何によって決定されているのか調べた。sGCは細胞の前側に局在して仮足を安定化するという機能とは別に細胞内セカンドメッセンジャーであるcGMPを合成する。sGC局在にcGMPがどのような影響を与えるか調べたところ、cGMPを合成できない変異型sGCは野生型より仮足に強く局在を示した。cGMPによるsGC局在抑制には、cGMP結合タンパク質の1つであるGbpCが必要であることから、cGMP-GbpCシグナル伝達がsGC局在の不応期を決めていることが示唆される。そこで、細胞内cGMP濃度が変化する変異株を用いて不応期を計測したところ、cGMP量と不応期の長さに創刊が見られ、cGMP-GbpCシグナルはsGC局在の不応期決定に関わっていることが明らかとなった。計画していたように、数理モデル化のためのパタメータ定量において想定と異なる結果がでてしまい、2つの興奮系の結合振動子としての数理モデル化は現在できていない。しかし、2つの興奮系で不応期という特性が異なっており、sGCの不応期を決めている分子を実験的に同定できた事は大きな成果であると考えられる。本年度は、走化性シグナル伝達を独立に調節するPI3K(PIP3)経路とsGC経路の分子局在が、細胞の走化性にどのように寄与しているか明らかにした。興奮系であることが示された2つの分子局在を生細胞で同時に観察し、同じ入力信号に対して2つの興奮性経路の応答に違いがあるのか調べた。するとPIP3経路と比べて不応期の短いsGC経路の分子局在が高頻度に観察された。不応期の長さという興奮系のパラメータが細胞の走化性制御で重要であるという、新たな知見を得ることが出来た。更に、sGC局在の短い不応期がsGCの酵素反応生成物であるcGMPによって制御されている事を明らかにした。細胞内のcGMP濃度が低い変異株ではsGC局在が持続的に観察される一方で、cGMP濃度が高い変異株ではsGC局在は稀にしか観察されなくなった。これらの変異株では細胞内のF-アクチン局在の頻度も同じように変化していたことから、細胞内cGMP濃度が細胞のF-アクチン局在制御にも関わっており、細胞運動をうまく調節している事が明らかとなった。本年度の研究により、細胞が持つ複数の興奮性シグナル伝達経路は不応期という特徴量において異なる特性を有しており、外部刺激に対して単一経路だけの応答よりももっと柔軟な応答を可能にしている事が示唆された。現在は、細胞性粘菌だけの知見にとどまっているが、白血球やがん細胞のようなヒトの細胞で同じ性質が保存されているか調べることで、走化性研究の新たな分野が拓けると考えられる。上述した通り、今後は複数経路の分子局在を結合振動子として数理モデル化を行う予定である。実験的には相互作用の推定と並行して、数理モデルではまず相互作用のない場合のシミュレーションを行う。相互作用の大きさが求められたら、モデルに組み込んでパラメータの細かい調整を行っていく予定である。実験的に明らかになった現象の再現を行うとともに、いくつかのパラメータを野生型の値から変更したときの走化性効率を評価することで、効率の良い走化性に重要な反応を推定できると考えている。数理モデル化については今後も検討していく予定である。
貝形虫殻中の同位体比・化学組成分析を用いた沿岸域の人為的環境変化の定量的評価

過去の環境変化を定量的に評価するため,初年度は実海域での調査を行い,貝形虫殻中の酸素同位体比および化学組成(Mg/Ca, Sr/Ca,重金属元素など)と水質データとの関係を検討した.人為的改変が幾度も行われてきた島根県中海で3定点を設定し,月1回底質堆積物および底層水を採取し,表層・底層の水質データを記録した.また,底質堆積物から得られた貝形虫殻および底層水中の酸素同位体比・化学組成(Mg/Ca, Sr/Ca,重金属元素など)を測定した.貝形虫殻中の酸素同位体比およびMg/Caは底層水中のそれらと相関を示し,貝形虫殻中の酸素同位体比およびMg/Caは周囲の水の情報を反映していることが明らかになった.しかし,Sr/Caについては相関が認められなかった.また,殻中の酸素同位体比およびMg/Caは塩分と弱い相関を示し,Sr/Caは水質データとの相関が認められなかった.以上のことから,貝形虫殻の分析データがさらに必要であるが,本研究は中海における過去の塩分を定量的に復元できる可能性を示唆した.さらに,Mn/CaおよびFe/Caは周囲の水に比べ貝形虫殻中で高い値を示し,重金属元素の貝形虫殻中への取り込みは,元素によってその割合に違いがあることが明らかになった.底質堆積物に含まれる貝形虫殻の雌雄・成長段階・生体の割合など個体群動態を調べ,本研究で着目した貝形虫Bicornucythere bisanensisの大人の生体は夏秋にかけて最も多く,大人の一段階前(A-1)の生体は3月に最も多いことが明らかになった.また3地点の水質データおよび底層水の同位体比・化学組成の季節変動が明らかになり,大まかではあるが中海の水塊の動きが把握できた.現在,定温条件下で大人の一段階前の貝形虫を飼育しており,脱皮後殻の酸素同位体比および化学組成を測定する予定である.過去の環境変化を定量的に評価するため,初年度は実海域での調査を行い,貝形虫殻中の酸素同位体比および化学組成(Mg/Ca, Sr/Ca,重金属元素など)と水質データとの関係を検討した.人為的改変が幾度も行われてきた島根県中海で3定点を設定し,月1回底質堆積物および底層水を採取し,表層・底層の水質データを記録した.また,底質堆積物から得られた貝形虫殻および底層水中の酸素同位体比・化学組成(Mg/Ca, Sr/Ca,重金属元素など)を測定した.貝形虫殻中の酸素同位体比およびMg/Caは底層水中のそれらと相関を示し,貝形虫殻中の酸素同位体比およびMg/Caは周囲の水の情報を反映していることが明らかになった.しかし,Sr/Caについては相関が認められなかった.また,殻中の酸素同位体比およびMg/Caは塩分と弱い相関を示し,Sr/Caは水質データとの相関が認められなかった.以上のことから,貝形虫殻の分析データがさらに必要であるが,本研究は中海における過去の塩分を定量的に復元できる可能性を示唆した.さらに,Mn/CaおよびFe/Caは周囲の水に比べ貝形虫殻中で高い値を示し,重金属元素の貝形虫殻中への取り込みは,元素によってその割合に違いがあることが明らかになった.底質堆積物に含まれる貝形虫殻の雌雄・成長段階・生体の割合など個体群動態を調べ,本研究で着目した貝形虫Bicornucythere bisanensisの大人の生体は夏秋にかけて最も多く,大人の一段階前(A-1)の生体は3月に最も多いことが明らかになった.また3地点の水質データおよび底層水の同位体比・化学組成の季節変動が明らかになり,大まかではあるが中海の水塊の動きが把握できた.現在,定温条件下で大人の一段階前の貝形虫を飼育しており,脱皮後殻の酸素同位体比および化学組成を測定する予定である.
全ゲノム情報を用いたヤギの起源と伝播、環境適応形質の包括的解明に向けた先駆的研究

ヤギは強健性と環境適応性から世界の大部分の地域で飼育され、地域環境に適応した極めて多様性に富む形質を有するが、これらの遺伝様式や特性は明らかではなく、その起源伝播に関しても完全解明されていない。本研究ではこれらアジア在来ヤギ個体に対する全ゲノム解析による大規模DNAデータを用いて、遺伝的類縁関係と遺伝構造解析を実施し、アジア在来ヤギの伝播経路の全貌と新たな起源地の仮説を検証すること、ヤギの数十におよぶ環境適応形質に対する候補染色体領域・遺伝子をゲノムワイド相関解析(GWAS)を通じて明らかにすることを目的とする。
体節形成における分節化開始機構の解析

我々は既に、Mesp2ノックアウト(KO)マウスを作製し、このマウスでは、体節の前部の特徴が失われている(後方化している)ことを明らかにしてきた。一方、古関らによって作成された、PS-1KOマウスは、分節が起こらないといった点では、Mesp2KOマウスと類似した表現形を示すが、その前後極性に関して、対照的な前方化の表現形を示す。ここで重要な事実として注目したのがDelta-1の発現パターンである。野生型におけるDelta-1の発現は、未分節中胚葉の最も尾部側で非常に強い発現を示すが、分節の直前で発現が低下するとともにその発現領域が体節の後半部分に局在しストライプパターンを示す。そしてDelta-1KOマウスは前方化の形質を示すのである。Mesp2KOマウスではDelta-1の尾芽部分の強い発現が持続し、ストライプも形成されない。すなわち、Mesp2は、Delta-1の発現を抑制するように働く。一方、PS-1KOマウスでは尾芽部分の発現は全く変わらないが、ストライプ部分での発現が完全に失われる。すなわち、PS-1は体節の後方部におけるDelta-1の発現を誘導にかかわる。すなわち、ストライプ部分におけるDelta-1の発現量及びパターンがその後の脊椎骨の前後極性とよく一致していることが分かった。しかし、Mesp2KOマウスでは、Notch1の発現が減少しており、その下流にNotchシグナル系が働くことが示唆されていたが、Notchシグナル系に直接関与すると考えられるPS-1のKOマススが全く逆の形質を示すのは驚きであり、さらに遺伝学的解析の必要性を示唆していた。そこでMeas2およびPS-1のダブルKOマウスを作成し解析した。その結果、ダブルKOマウスはMesp2と全く同様の形質を示すことが判明した。この結果は、単純なカスケードの上下関係では説明できない。そこで、この遺伝子学的相互作用がどのような、分子機構によるのかを解析するため、以前作成したMesp2遺伝子座にNotch1をノックインしたマウスを利用してさらに解析を行った。Notch1ノックインマウスは一見Mesp2KOマウスと同様の表現形を示すが、Delta-1の発現は減少していることが判明しており、少なくとも、導入したNotch1はDelta-1の発現が減少し、脊椎骨にも一部前方部の形質が現れたのである。すなわち、Delta-1の誘導にかかわるPS-1を介したNotchシグナル系を遮断する事により、さらにDelta-1の発現が低下し、その結果、細胞は、前方の性質を示すようになったと考えられた。Mesp2の発現は体節形成期に特異的に観察されるが、Mesp1は体節形成期に加えて、原腸陥入期にも、発現する。我々はすでにMesp1遺伝子をMesp2遺伝子座にノックインすることにより、Mesp2の欠損がレスキューされMesp1も体節形成期にMesp2と同様の機能をもつことを明らかにしている。

そこでこれらの遺伝子の機能を明らかにするためには両者を体節形成期にのみ特異的に欠損させる必要がある。そのためにcre-1oxを用いた系を利用する。まず、Mesp1(十/-)のES細胞のMesp2遺伝子座にcre遺伝子を導入したマウス、及びMesp2(十/-)のES細胞のMesp1遺伝子座に1oxを導入したマウスの作製を試みた。これはこの2つの遺伝子が同じ染色体に隣同士にならんでいるため、このような工夫が必要となる。今年度はこれらのES細胞を形成し、同じ染色体上の遺伝子に変異が導入されたことを、FISH解析により確認した。現在これらのES細胞から作製されたキメラマウスを多数得ており、これらの動物の掛け合わせにより、目的とする、体節形成期にのみ両方の遺伝子が欠損したマウスが得られる予定である。このマウスの解析により、これらの遺伝子の体節の分節化における機能がさらにあきらかにできると考えている。またMesP2遺伝子の異所的発現による機能解析も試みている。体節形成直前で発現を開始し、分節化と同時に発現が失われるMesP2を持続的にまたは異所的に発現させるために、同じ体節中胚葉で分節前から持続的に発現するMox-1,および分節直後から持続的に発現するMox-2遺伝子座に、Mesp2をノックインしたES細胞を作製した。現在Mox-2にノックインしたマウスが形成されており、解析を開始したところであるが、興味深いことに、ヘテロのノックインマウスの数が異常に少ないことがわかってきた。現在その異常がどこに現れているのかを解析中である。またMox-1にMesp2をノックインしたES細胞を用いてキメラマウスの作製をこころみているが、今の所、まだ1匹もキメラマウスが得られておらず、耐性致死になっている可能性が高い。現在別のES細胞クローンを用いて確認の実験をすすめている。われわれはすでに、Mesp2ノックアウト(KO)マウスを作製し、このマウスでは、体節の前部の特徴が失われている(後方化している)ことを明らかにしてきた。一方、古関らによって作成された、PS-1KOマウスは、分節が起こらないといった点では、Mesp2KOマウスと類似した表現形を示すが、その前後極性に関して、対照的な前方化の表現形をしめす。ここで重要な事実として注目したのがDelta-1の発現パターンである。野生型におけるDelta-1の発現は、未分節中胚葉の最も尾部側で非常に強い発現を示すが、分節の直前で発現が低下するとともにその発現領域が体節の後半部分に局在しストライプパターンを示す。そしてDelta-1KOマウスは前方化の形質を示すのである。Mesp2KOマウスではDelta-1の尾芽部分の強い発現が持続し、ストライプも形成されない。すなわち、Mesp2は、Delta-1の発現を抑制するように働く。一方、PS-1KOマウスでは尾芽部分の発現は全く変わらないが、ストライプ部分での発現が完全に失われる。すなわち、*-1は体節の後方部におけるDe1ta-1の発現を誘導にかかわる。すなわち、ストライプ部分におけるDelta-1の発現量及びパターンがその後の脊椎骨の前後極性とよく一致していることがわかった。
減数分裂前期特異的遺伝子群の解析

本研究は、高等生物の減数分裂前期に特異的に発現される遺伝情報を明らかにし、それらをこれまで蓄積してきた生化学的、細胞学的知見と反応させることによりここで起こる生化学的反応をより総体的に理解することを目的としている。ユリ(Lilium)花粉形成時の減数分裂は進行速度が遅く同調性も高いため、減数分裂前期の様々なステ-ジにある細胞を大量に調整することができる。そこで、減数分裂前期のレプトテン期、ザイゴテン期、パキテン期、ディプロテン期及び前減数分裂期にある細胞をステ-ジ別に調製し、各々からpolyA'RNAを抽出後、これらをもとにcDNAライブリ-を作製した。クロ-ン化のベクタ-としては、λgL10,λgL11及びλZAPIIを用いた。cDNAの合成に際しては、XhoI認識配列を結合したオリゴdTをプライマ-として用い、5'側にΕcoRIアダプタ-を結合させることにより、ベクタ-のlacZ領域と方向がそろった組替え体のみが得られるようにした。また、これと平行して、ランダムプライマ-を用いて合成したcDNAのクロ-ン化も行った。これまでに減数分裂前期各ステ-ジについてλZAPIIをベクタ-とするcDNAライブラリ-作製が完了した。プラ-ク形成効率は約10^5pfu/μgRNAで、その90%以上が数百bp以上の長さのcDNA挿入配列を含んでいた。現在、これらのライブラリ-を用いて、各ステ-ジで転写量が特異的に増加する遺伝情報の選択を行いつつある。
保健科教育におけるメンタルヘルスプログラムの開発とその有効性を量的・質的に分析

○研究目的保健科教育におけるメンタルヘルスプログラムを開発し、そのプログラムの有効性を量的・質的に分析することを目的とする。○研究方法(1)対象沖縄県内のA高等学校(偏差値約35)の1年生、2年生211名を解析対象とした。(2)調査期間事前テスト平成25年11月12日21日、事後テスト2月19日2月27口介入期間事前テスト1週間後事後テスト1週間前(8時間)。(3)メンタルヘルスプログラム第一時心身相関脳の三重構造発想によるホルモンの分泌第二時自己実現星野氏の事例第三時難病と闘い夢を実現した少女遺伝子(エピジェネティクス)第四時人間の悩みと人間関係の原理第五時自己理解(エゴグラム)第六時自尊感情(良い所さがし、短所を長所に変える、心からの贈り物)第七時認知を変える(考え方と病気、うつ病)第八時ストレスと発散法(行動療法)(4)調査内容と手続き1自尊感情尺度(ローゼンバーグ)4件法(14)。2お茶大式メンタルヘルス尺度5件法(15)。3日常ストレス対処行動尺度(辻ら)4件法(14)。4中学生用コーピング測定尺度(三浦)4件法(14)。5授業に対する主観的評価(5件法と自由記述)。(5)介入群104名とコントロール群107名に分けた。一方は開発したメンタルヘルスプログラムを実施し、一方は講義形式の通常の心の健康のプログラムとした。(6)分析方法と評価繰り返しのある2元配置分散分析により介入クラスの教育効果を評価した。○研究成果自尊感情尺度、お茶大式メンタルヘルス尺度、日常ストレス対処行動尺度(問題へ対応、自己統制の対応、外的資源の活用対応、積極的気分転換の対応、陰性感情発散の対応)、中学生用コーピング測定尺度(積極的対処、サポート希求、逃避・回避的対処)とも交互作用が有意でなかった。しかし、自尊感情においてコントロール群は0.3ポイント下がったにも関わらず、介入群は、0.7ポイント上がった。統計的な有意さが生じなかったが、僅かな効果が見て取れた。メンタルヘルスにおいて、両群とも上昇したが、介入群の上昇幅が低かった(上昇は課題を抱えている)。高校1年、2年の年度後半について、生徒が心の課題を抱えていることが分かる。また、介入プログラムで僅かばかりの対処法を身に付けたことが分かる。日常ストレス対処(問題への対応)において、群間で5%水準での主効果があった。日常ストレス対処(積極的気分転換の対応)において、群間で10%水準での主効果があった。
SeaQuest実験における陽子内の反クォーク分布量の絶対値の測定

アメリカフェルミ国立加速器研究所にて陽子ビームと液体水素・重水素標的を用い、陽子+陽子と陽子+重陽子で生じるドレル・ヤン反応を測定した。測定量から陽子内の反uと反dの分布量の非対称度および各分布量の絶対値を導出する事を目指している。平成25年11月から平成28年7月(予定)まで3期間に分けて物理データ収集を行ない、その前半にビーム強度の絶対値の測定器を開発・導入した。収集した物理データを解析し、反uと反dの分布量の非対称度(反d/反u)のpreliminaryな結果を求めた。平成25年11月にフェルミ国立加速器研究所(FNAL)からSeaQuest実験へ陽子ビームが供給され始め、SeaQuest実験は物理データを収集する為のビーム実験を開始した。先ず強度の低いビームを用いて検出器の各部分(トリガー,データ収集系,ホドスコープ,ワイヤーチェンバー)を調整した。これは、本研究を含むSeaQuest実験の全ての研究目的にとって必要なステップである。本研究を遂行する上で特に重要なのはビーム強度の精密測定である。平成24年3-4月のテスト実験に基づいて検討を重ね、2台の装置を組み合わせてビーム強度を測定する事にした。一つはビーム強度の相対値を高速(20 nsecごとの時間変動)に測定する装置であり、もう一つは絶対値を低速(5 sec内の積分値)に測定する装置である。相対値測定器の製作を平成25年11月に完了し、実験全体のデータ収集システムと連動したデータ読出を平成26年1月に実装した。絶対値測定器の設計を平成25年10月に完了し、主要部分(ビーム電流検知部,信号増幅器)を平成26年1月までに製作した。フェルミ国立加速器研究所(FNAL)からSeaQuest実験へ平成25年11月平成26年8月に陽子ビームが供給され、SeaQuest実験は物理データを収集した。加速器のメンテナンス期間を経て、平成26年11月から現在まで物理データ収集を継続している。最終的に必要なデータ量の約10%を収集した。収集したデータを解析し、ドレル-ヤン反応とJ/psi生成反応が実験設計通りに検出できている事を確認した。これは、SeaQuest実験の検出器が設計通りに稼働している事を示す重要な結果である。ビーム強度の相対値を測定する装置は前年度から順調に動作している。絶対値を測定する装置を前年度1月に製作完了したが、本年度5月にこれをビームラインへインストールした。8月に測定条件(装置の読出パラメータ)の調整を行ない、12月から定常的なデータ読出を開始した。フェルミ国立加速器研究所(FNAL)の加速器施設(Main Injector)からSeaQuest実験へ平成26年11月平成27年6月および平成27年10月平成28年7月(予定)に陽子ビームが供給され、SeaQuest実験は物理データを収集した。平成27年6月までに収集したデータ量は目標値の約1/4である。ビーム強度が大きい時にドレル-ヤン反応の検出効率が低下することを前年度に発見しており、本研究の目指す測定精度を達成するには、この検出効率のビーム強度依存性を理解する必要が有る。測定データとシミュレーションを用いて検出効率のビーム強度依存性を定量的に評価し、測定データに対する補正手法を開発した。また、荷電粒子(ミューオン)の飛跡再構成のアルゴリズムなどを改良して、検出効率のビーム強度依存性を低減させた。陽子内における反クォーク分布のフレーバー非対称性(d-bar/u-bar:反ダウンクォークと反アップクォークの分布量の比)を測定データから抽出し、そのpreliminaryな結果を平成28年4月に公開した。d-bar/u-barの測定はSeaQuest実験の第一の目的であり、その測定結果を得たことは重要な研究成果である。今後は収集中のデータも用いて高精度な結果を求めると共に、その解析手法を更に発展させて反クォーク分布量の絶対値を抽出する。前年度より引き続き、ビーム強度の時間変動を小さくする様にビーム性能の改善を進めた。その上で収集したデータを解析したところ、ビーム強度が大きい時にドレル-ヤン反応の検出効率が下がっている事を確認した。これは本研究の測定精度に影響を与える可能性が有るので、検出効率の詳しい解析と改善を行っている。素粒子・原子核物理学実験ビーム強度の絶対値の測定器は稼働中である。その測定絶対値の較正を行なう。同時に、ドレル-ヤン反応の検出効率を一定にする事も本研究にとって重要であり、データ解析手法(荷電粒子の飛跡再構成のアルゴリズムなど)を改良していく。ほぼ計画通りに進展している。

絶対値測定器をビームラインに取り付けてデータ読出を実装するという作業が未完了である。これは、ビーム強度の安定性および実験ホールの放射線量に関する問題を対処していた為である。相対値測定器を用いてビーム強度を測定したところ、ビーム強度の時間変動が想定よりも大きいという問題が明らかになった。変動が大きいと物理データ収集自体が困難になるので、加速器運転グループと協力してビーム強度の安定化を行なった。相対値測定器をビームラインに取り付けた時に、実験ホールの放射線量が想定以上に増加するという問題が発生した。相対値測定器の一部が放射線量増加の原因である事を特定し、取り付け位置を調整する事で解決した。ビーム強度絶対値測定器の較正を次年度に行なう事としたため。平成26年5月中に絶対値測定器をビームラインに取り付ける。放射線量が増加するという問題を再発させない様に取り付け位置を検討中である。取り付け位置が決まったら、そこでの温度変化、残留磁場、読出回路ノイズを実測し、それを遮蔽・監視するシステムを測定器に組み込む。平成27年7月から加速器メンテナンスでビーム実験を休止し、その期間にビーム強度絶対値測定器の較正を行なう。絶対値測定器のビームライン取り付け位置が未定のため、温度変化、残留磁場、読出回路ノイズを遮蔽・監視するシステムを製作できない。平成26年5月までに取り付け位置を決定し、システムの設計と製作を開始する。
分子標的を応用した新たな静脈血栓塞栓症治療

本研究では、ラット下大静脈に静脈血栓を作成した後、血栓溶解後に遺伝子導入を行い、血栓の予防効果を検討することを目的としている.遺伝子組換えアデノウイルスの作製後、生体内外での評価を行った.生体内ではSDラットの下大静脈を露出し、結紮下で下大静脈に形成される静脈血栓の質的評価を行った。同部に対して血栓溶解の後、組換えアデノウイルスを用いて遺伝子導入を行った.この結果、血栓溶解を組み合わせた評価が期待され、今後は薬剤との関連検討を更に進める予定である.本研究の目的は、これまでの臨床経験および研究を組み合わせることにより、新たな静脈血栓症の治療、管理を確立することである.カテーテルによる局所投与はいわゆる究極のドラッグデリバリーシステムであり、この手技と遺伝子過剰発現を組み合わせることにより、これまでにない治療法の確立が可能となる.局所遺伝子発現は局所の血栓形成を抑制可能であり、かつ全身の合併症発生を抑制可能であることをこれまでの検討により示すことができたが、これまでは正常血管壁に抗血栓因子を過剰発現させた後に血栓形成を惹起して検討してきた.より臨床応用を目指すためには、血栓溶解術後に抗血栓因子を過剰発現させ、静脈血栓形成を抑制する検討が必要である.本研究ではラット血栓形成モデルにて血栓溶解を行った後、抗血栓因子の分子を標的としてこれらの遺伝子を過剰発現させることにより、局所での静脈血栓形成を抑制することを検討する.平成24年度には、初年度としての実験計画に基づき、目的遺伝子の発現プラスミドおよびこれらの遺伝子組換えアデノウイルスを作製、精製、力価確認を行った.また、生体外実験として培養細胞を用いた遺伝子導入による蛋白の発現量および活性の評価、細胞機能への影響評価を行った.蛋白発現はRT-PCRによるRNA評価、ウエスタンブロットによる蛋白評価で確認した.活性は採取血液を用いた血小板凝集実験にて評価した.作製が確認されたものに関しては良好な結果が得られた.平成25年度には、この生体外での実験結果および実験計画に基づき、まずラットでの静脈血栓モデル作製、血栓評価を行った.SDラットの下大静脈を麻酔下で露出し、結紮により静脈血栓モデルの作製を行った.また、一部に対して組換えアデノウイルスを用いて遺伝子導入を行った.静脈血栓に関しては、血管結紮により今後の実験で評価可能なレベルで静脈血栓が形成されることが確認された.本研究では、ラット下大静脈に静脈血栓を作成した後、血栓溶解後に遺伝子導入を行い、血栓の予防効果を検討することを目的としている.遺伝子組換えアデノウイルスの作製後、生体内外での評価を行った.生体内ではSDラットの下大静脈を露出し、結紮下で下大静脈に形成される静脈血栓の質的評価を行った。同部に対して血栓溶解の後、組換えアデノウイルスを用いて遺伝子導入を行った.この結果、血栓溶解を組み合わせた評価が期待され、今後は薬剤との関連検討を更に進める予定である.本研究の目的は、これまでの臨床経験および研究を組み合わせることにより、新たな静脈血栓症の治療、管理を確立することである.カテーテルによる局所投与はいわゆる究極のドラッグデリバリーシステムであり、この手技と遺伝子過剰発現を組み合わせることにより、これまでにない治療法の確立が可能となる.局所遺伝子発現は局所の血栓形成を抑制可能であり、かつ全身の合併症発生を抑制可能であることをこれまでの検討により示すことができたが、これまでは正常血管壁に抗血栓因子を過剰発現させた後に血栓形成を惹起して検討してきた.より臨床応用を目指すためには、血栓溶解術後に抗血栓因子を過剰発現させ、静脈血栓形成を抑制する検討が必要である.本研究ではラット血栓形成モデルにて血栓溶解を行った後、抗血栓因子の分子を標的としてこれらの遺伝子を過剰発現させることにより、局所での静脈血栓形成を抑制することを検討する.平成24年度には、初年度としての実験計画に基づき、目的遺伝子の発現プラスミドおよびこれらの遺伝子組換えアデノウイルスを作製、精製、力価確認を行った.また、生体外実験として培養細胞を用いた遺伝子導入による蛋白の発現量および活性の評価、細胞機能への影響評価を行った.蛋白発現はRT-PCRによるRNA評価、ウエスタンブロットによる蛋白評価で確認した.活性は採取血液を用いた血小板凝集実験にて評価した.作製が確認されたものに関しては良好な結果が得られた.局所遺伝子発現は局所の血栓形成を抑制可能であり、かつ全身の合併症発生を抑制可能であることをこれまでの検討により示してきたが、これまでは正常血管壁に抗血栓因子を過剰発現させた後に血栓形成を惹起して検討してきた.より臨床応用を目指すために、血栓溶解後などに抗血栓因子を過剰発現させ、静脈血栓形成を抑制する検討も必要である.本研究ではラット血栓形成モデルにて血栓溶解を行った後、抗血栓因子の分子を標的としてこれらの遺伝子を過剰発現させることにより、局所での静脈血栓形成を抑制することを検討する.平成24年度には、初年度としての実験計画に基づき、目的遺伝子の発現プラスミドおよびこれらの遺伝子組換えアデノウイルスを作製、精製、力価確認を行った.また、生体外実験として培養細胞を用いた遺伝子導入による蛋白の発現量および活性の評価、細胞機能への影響評価を行った.蛋白発現はRT-PCRによるRNA評価、ウエスタンブロットによる蛋白評価で確認した.活性は採取血液を用いた血小板凝集実験にて評価した.

平成25年度には、生体外での実験結果および実験計画に基づき、ラットでの静脈血栓モデル作製、血栓評価を行った.SDラットの下大静脈を麻酔下で露出し、結紮により静脈血栓モデルの作製を行った.また、一部に対して組換えアデノウイルスを用いて遺伝子導入を行った.静脈血栓に関しては、血管結紮により今回の実験で評価可能なレベルで静脈血栓が形成されることが確認された.平成26年度には、並行して血栓溶解剤を用いた実験を行った.ラット下大静脈に血栓形成を行った後、薬剤を投与して血栓量への影響を検討した.また、薬剤投与後に遺伝子導入を行い検討を行った.この結果をもとに血栓形成への影響を評価中である.血管内治療静脈血栓モデルに関しては評価可能な状況と確認された.この静脈血栓モデルにおいて、吸引あるいは薬剤による血栓溶解にて一定評価が得られる状況を現在確認中である.また、遺伝子導入による目的蛋白の発現を評価中である.発現プラスミドに関しては目的蛋白の発現を確認することができた.遺伝子組換えアデノウイルスに関しては蛋白発現が確認できないものもあり,100%達成とは言えなかった.蛋白発現が確認できたものに関しては,PCR等にて力価確認を行い,目的のものが作製されたものと判断している.次年度は平成25年度までの実験計画で遅延している実験内容を鑑み、手技および遺伝子組換えの継続あるいは変更を考慮しつつ更に実験を進める予定である.遺伝子組換えに関しては,現在使用しているアデノウイルス作製キットが適当でない可能性もあり,その点を再評価する.次年度は平成24年度の実験計画で達成不可であった事項を鑑み,遺伝子組換えの継続あるいは変更を考慮しつつ更に実験を進める予定である.平成25年度には、平成24年度の結果を踏まえ、生体での実験を行う予定としており,ラットの下大静脈に静脈血栓モデルを作成する.同部に対して遺伝子投与を行い、検討を行う予定である.研究費は,ラットの購入や飼育費および試薬に使用予定である.また,遺伝子組換えアデノウイルスに関しては随時増幅,精製,力価確認を行う必要があり,その試薬関連にも研究費を使用する予定である
高温融体の過冷却凝固・組織形成プロセス解析システムの創製

溶融Cu80Co20合金の過冷却域における相分離構造に及ぼす融体内対流の影響を明らかにするために,ハイスピードカメラによる電磁浮遊試料表面の速度分布のその場観察及び凝固試料のSEM観察を行った。ここで,融体内対流は試料に静磁場を印加することにより制御した。結果として,静磁場強度1.5 Tを境に相分離構造が大きく変化すること,またこの構造変化は試料内対流の乱流-層流遷移に起因することを明らかにした。加えて,同装置を使用し,溶融Cu-Co合金の垂直分光放射率及び表面張力を測定し,各物性に及ぼすCu組成の影響を明らかにした。本研究では,合金の過冷却凝固プロセスの最適操作条件や設計指針の探索を援用する,静磁場重畳電磁浮遊技術とマルチスケールシミュレーション技術からなる“高温融体の過冷却凝固・組織形成プロセス解析システム"を構築し,さらに当該システムを利用することにより,CuCo等の過冷却融体の凝固プロセスを対象として,“プロセスー凝固組織構造の相関"を明らかにすることを目的とする。本年度は以下の項目を実施した。(1)申請者らが以前に開発した静磁場重畳電磁浮遊技術を利用した"超高温熱物性計測システム“に,新規購入した高速度ビデオカメラを設置し,過冷却凝固プロセスのその場観察機能も付与したシステムとした。また,電磁浮遊した溶融CuCo液滴等の過冷却凝固実験を通して,当該システムにより凝固速度・凝固界面モルフォロジー(過冷却域における相分離挙動も含む)の測定ができることを確認した。(2) (1)のシステムを利用し,溶融CuCoの放射率測定を行い,放射率の温度及び組成依存性を明らかにした。(3) (1)のシステムを利用し,種々の静磁場強度における溶融CuCoの過冷却凝固実験を行い,過冷却域で発現する相分離構造に及ぼす試料内対流の影響について検討した。結果として,静磁場強度の増加に伴う試料内対流の乱流-層流遷移が相分離・凝固組織構造に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。(4)マルチスケールシミュレーション技術の構築に当たり,Cahn-Hilliard方程式に基づく相分離シミュレーションコードの開発を行った。(1)当該システムに設置された高速度ビデオカメラを利用して,Cu80Co20合金融体からなる電磁浮遊液滴試料の過冷却凝固過程のin-situ観察を行った。結果として,過冷却域で相分離したCo-rich相の凝固に伴うリカレッセンスが観察でき,その様相は静磁場強度1.5T付近を境に大きく異なることが分かった。以上の観察結果は,静磁場強度1.5T付近を境に相分離構造が大きく変化することを示唆している。また,相分離Co-rich相液滴をトレーサーとして測定した浮遊液滴試料の表面流速測定結果及び浮遊液滴内対流の数値シミュレーション結果を,Hyersら(2003)の電磁浮遊液滴内MHD対流に関する乱流-層流遷移Re数と比較したところ,1.5T付近で試料内対流が乱流から層流に遷移することが分かり,この流動状態の遷移により相分離構造が大きく変化することが明らかになった。(2)当該システムを利用し,CuCo合金融体の垂直分光放射率に及ぼす温度及びCu組成の影響を測定した。結果として,Cu組成が2080at%のとき,垂直分光放射率の組成依存性は小さいが,Cu組成が80at%を超えると急激に減少することがわかった。また,これらの組成依存性は,自由電子の光学応答に関する古典的モデルであるDrude modelによりある程度説明できることが示された。今年度は,当該システムを利用し,CuCo合金の過冷却融体凝固プロセス解析の入力データとなる溶融CuCoの表面張力,比熱及び熱伝導率に及ぼす温度及び組成依存性の測定を試みた。結果として,以下の結論を得た。(1)表面張力:液滴振動法に従い,溶融Cu90Co10及びCu80Co20の表面張力の温度依存性を測定した。いずれの組成の表面張力も負の温度依存性を示し,後者の表面張力の方が大きい。また,測定値をButlerの推算式と比較したところ,両組成とも概ね一致した。(2)比熱:レーザー周期加熱カロリメトリ法に従い,溶融Cu80Co20及びCu20Co80の比熱の温度依存性を測定した。いずれの組成の比熱もほとんど温度依存性が無いことが分かった。(3)熱伝導率:レーザー周期加熱カロリメトリ法に従い,溶融Cu90Co10, Cu80Co20, Cu60Co40の熱伝導率を測定した。

既測定の純溶融Cu及びCoの熱伝導率を考慮すると,溶融CuCoの熱伝導率は,Cu濃度の減少とともに急激に減少することが分かった。なお,熱伝導率の測定に先立ち,測定値の静磁場強度依存性を検討し,対流の影響が小さい条件で測定した。溶融Cu80Co20合金の過冷却域における相分離構造に及ぼす融体内対流の影響を明らかにするために,ハイスピードカメラによる電磁浮遊試料表面の速度分布のその場観察及び凝固試料のSEM観察を行った。ここで,融体内対流は試料に静磁場を印加することにより制御した。結果として,静磁場強度1.5 Tを境に相分離構造が大きく変化すること,またこの構造変化は試料内対流の乱流-層流遷移に起因することを明らかにした。加えて,同装置を使用し,溶融Cu-Co合金の垂直分光放射率及び表面張力を測定し,各物性に及ぼすCu組成の影響を明らかにした。研究実績で述べたように,システムのハードの部分の整備,及びこれを利用した各種測定については順調に進み,予想以上の成果が得られていると判断するが,マルチスケールシミュレーション技術の各要素モデルの開発が遅れていることを考慮し,全体としての評価を(2)とした。27年度が最終年度であるため、記入しない。化学工学今後は以下の点を重点的に検討する予定である。(1)高温融体の粘性率測定に関し,磁場存在下での浮遊試料の表面振動挙動を数値シミュレーションにより検討し,得られた知見に基づき測定手法の開発を進める。(2)前年度に引き続き,マルチスケールシミュレーション技術の構成要素モデルである融体内熱流動シミュレーションモデル,相分離・凝固組織形成シミュレーションモデル,及び両者を繋ぐ"橋渡し"モデルの精緻化を行う。(3)前年度に引き続き,溶融CuCoを対象として,(a)熱物性値の測定及び(b)印加静磁場強度(試料内対流の強度及び構造)を変化させて,過冷却凝固過程及び凝固組織構造を観察するとともに,(2)のモデルを利用した数値シミュレーションを実施し,実験と解析結果の比較から,プロセスと凝固組織構造との相関を検討する。研究実績で述べたように,既存のシステムに高速度ビデオカメラを導入し過冷却凝固プロセスの観察を可能にしたことに加え,当該システムを利用し溶融CuCoの熱物性値測定を実施したこと,さらにCuCoの相分離・凝固組織構造と試料内対流との相関を明らかにしたことなどは,予想以上の成果と判断するが,マルチスケールシミュレーション技術の各要素モデルの開発が若干遅れていることを考慮し,全体としての評価を(2)とした。今後は以下の点を重点的に検討する予定である。(1)高温融体の測定対象熱物性値の一つである粘性率に関して,磁場存在下での浮遊試料の表面振動から求める手法の開発を進める。(2)前年度に引き続き,マルチスケールシミュレーション技術の構成要素モデルである融体内熱流動シミュレーションモデル,相分離・凝固組織形成シミュレーションモデル,及び両者をつなぐ"橋渡し"モデルの精緻化を行う。(3)前年度に引き続き,溶融CuCoを対象として,(a)熱物性値の測定及び(b)印加静磁場
再生修復または臓器線維化を誘導する細胞外マトリックス糖タンパク質の糖鎖調節機構

細胞外マトリックス分子の糖鎖が分子の活性を調節して組織修復に与える影響を、フィブロネクチンに続いて、プラスミン生成を抑制するPAI-1の生体内唯一の安定化因子として知られているビトロネクチン(VN)を対象に、肝再生過程における組織溶解系因子との相互作用の変化に注目して解析した。70%肝切除(H)ラットに対し、非手術(NO)ラット、および偽手術(S)ラットを作成し、糖鎖およびタンパク質部分の構造変化と活性の変化を測定した。PAI-1との結合活性は、NO-VNと比較してSでは約2/3、Hでは約1/3に各々減少した。一方、シアリダーゼ処理、N-グリカナーゼ処理VNのPAHI-1結合活性はいずれも約2倍に増強し、H-VNのシアル酸を含む糖鎖減少と相関する活性変化ではなかった。糖鎖の内部構造の影響を調べるため、NO-,S-,H-VNの糖鎖の逐次消化を行い、PAI-1結合活性を比較したところ、NO-VNはいずれも段階でも未処理の場合より結合活性が増強したのに対して、S-,H-VNは糖鎖の除去が進むにつれて結合活性が減少する傾向を示した。プラスミン生成を促進するウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)とVN脳との結合活性は、NO-VNと比較してS,Hで約2倍に増強し、酵素による脱グリコシル化処理でもわずかな増強が確認された。これらの結合活性変化がプラスミン産生に及ぼす影響を調べるため、糖鎖変化VNとPAI-1共存下でのuPA有効活性を測定したところ、NO<S<Hの傾向が観察され、PH-VNのPAI-1結合活性の減衰およびuPA結合活性の増強と相関した。これらの結果から、S-,H-VN存在下におけるプラスミン産生の増加とそれに続く組織溶解の促進が推測された。各血漿のプラスミン活性は、大部分のVNが血中で不活性であるため、S, Hのいずれも、活性がNOより低下しており、リガンド結合によるVNの活性化によって、プラスミン活性が著しく増強されることが示唆された。糖鎖による組織修復の制御機構を解明する基礎として、細胞外マトリックスを構成する主要成分の一つであるフィブロネクチン(FN)を対象にとりあげた。ヒトを含む哺乳類の血漿FNは肝臓で産生され、N-結合糖鎖が分子に8カ所以上に存在する。これら糖鎖が分子の活性を調節して組織修復に与える影響を、肝再生過程における変化に重点をおいて解析した。70%肝切除(H)ラットに対し、非手術(NO)ラット、および手術による影響のコントロールとして偽手術(S)ラットを作成し、手術による糖鎖およびタンパク質部分での構造変化と活性の変化を測定した。ELISA法により、血漿中のFN濃度は手術後も一定に維持されることが示されたが、ゼラチンアフィニティ-クロマトグラフィーによるFNの精製量は、NOに比べSで約2倍,Hで約1.4倍と増加した。各精製FNのリガンドに対する結合活性は、ゼラチンおよびヘパリンに対しては差がなかったが、I, II型コラーゲンに対してはHのみ増強した。一方、BHK細胞に対する細胞接着伸展活性がNOに比べHとSで増強することが見出された。またHで選択的スプライシングによるEDA(+)型の産生が起こることが特異抗体によって見出されたが、細胞接着伸展活性の増強は、Sにも共通な別の原因によると考えられた。そこで、糖鎖の変化をレクチン反応性により解析したところ、ラット血漿FNの主要糖鎖構造は、末端にシアル酸が付加したN-結合複合型糖鎖であり、肝切除手術によりCon A反応性が顕著に増強したことから二本鎖複合型の増加が示唆された。さらに複数のレクチンとの反応性から、HとSにおけるシアリル化と基幹のフコシル化の増加、およびO-型糖鎖の増加も示唆された。以上の結果から、肝再生初期におけるFNにおいては量的変動によらず、糖鎖合成の変動や選択的スプライシングなどによる構造変化によって、リガンド結合活性が調節されることが見出された。またFNでは同じ肝産生のビトロネクチン(VN)とは異なる活性および構造の変化が示され、組織修復過程において両者が異なる役割を果たす可能性が示唆された。