hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオンチャネルを形成するヘテロ二量体型多環性天然有機化合物の合成と機能制御

アントラキノンとキサントンとから構成された複合型天然物には、自己集積することによって独特なイオンチャネルを形成し、様々な生物活性を発現するものが存在する。本研究では、将来的な活性発現機構の解明や構造活性相関研究をを念頭に、こうした天然物の化学合成を検討した。すなわち、アクレモキサントンAを標的化合物とする合成研究を進めた結果、このもののABCDEG環に相当する8環性化合物の合成に成功した。また、この合成研究を通じ、橋頭位に生じたカチオン種やアニオン種を活用した新しい化学反応の開発にも成功した。テンサイ褐斑病は、生育期のテンサイの葉や葉柄に褐色の病班が発生する病害であり、世界中のテンサイ栽培地域において深刻な経済的影響を及ぼしている。本研究では、テンサイ褐斑病の原因物質の一種であるアントラキノン-キサントン二量体天然物の合成と機能制御とを目的とする。具体的には、全合成を基盤とした系統的な構造活性相関研究を行う。平成26年度は標的化合物の全合成に向け、(1)架橋鎖に芳香環が縮環したビシクロ[3.2.2]ノナジエン骨格の構築、ならびに(2)ひずみ化合物を利用したアントラキノン部の構築に関するモデル実験、の2点を検討した。(1)アリールパラジウムのエノンに対する分子内共役付加反応を活用したビシクロ骨格の構築を行った。つづいてジエンの構築、ならびに橋頭位におけるSN1反応によるハロゲンの導入により、鍵となる橋頭位ハライドを合成した。(2)分子内に親双極子を有するベンゾシクロブテノンオキシムに酸化剤を作用させると、酸化的なベックマン開裂反応によりアリールニトリルオキシドが発生した後、つづけて1,3-双極子付加環化反応が進行し、対応するイソオキサゾリンを与えることを見出した。本研究は、特徴的な架橋構造を有するアントラキノン-キサントン複合型芳香族ポリケチドの合成を目的とする。合成の焦点は、(1)ビシクロ[3.2.2]ノナジエン構造の構築、(2)核間位の第4級炭素構築、(3)特異な7環性骨格(AG環)の構築、である。昨年度までの検討において、標的化合物群のビシクロ構造部分に相当するモデル化合物の合成に成功していた。本年度は、橋頭位アニオンを利用した第4級炭素の構築、ならびにアリールニトリルオキシドの分子内付加環化反応を活用した骨格構築、について重点的に検討した。まず、前者の変換では、ハロゲンー金属交換反応によって発生させた橋頭位アニオンのアルデヒドに対する付加反応が首尾良く進行することを明らかにした。さらに得られた付加体から付加環化反応の前駆体となるオキシムを合成した後、酸化剤を作用させることによってアントラキノン部位に相当する部分構造を構築し、標的化合物のAE環部に相当するモデル化合物の合成に成功した。概要で述べた通り、標的化合物の骨格構築に関するモデル検討において進展が得られた。すなわち、昨年度までに合成した標的化合物のCE環部に相当する三環性ユニットを活用し、今年度はこのものからAB環部の構築に成功した。天然に存在するアントラキノン-キサントン複合型天然物の中には、二量化と集積化を経て高次構造体を形成し、細胞膜貫通型イオンチャネルとして働くものが存在する。本研究では、こうした化合物を有する機能と構造とに興味を持ち、その合成研究を検討した。昨年度に引き続き、特異なアントラキノン-キサントン複合構造を有するアクレモキサントンAの合成を検討した。合成上の課題は、架橋鎖に芳香環が縮環したビシクロ[3.2.2]ノナジエン構造の構築、および核間位の第4級炭素の構築、である。これらの課題に対し、H28年度までに、1パラジウム触媒を用いたビシクロ骨格の構築、および2ハロゲン-金属交換反応によって発生させた橋頭位アニオンの求核付加反応、に関連し、モデル化合物を用いた検討によって有望な知見を得ていた。これを踏まえ、H28年度は、必要な官能基を備えた中間体を用い、上記1の求核付加反応を検討した。その結果、反応の成否は温度条件の厳密な制御にかかっていることが判明し、高収率で再現性良く付加体を与える条件を見出すことに成功した。次に、得られたアルコールを用い、B環の構築とG環単位の導入を検討した。すなわち、まず、1段階でオキシムへと変換した後、適切な酸化剤を作用させることによって、発生したニトリルオキシドがC1-9a位アルケンと分子内1,3-双極付加環化反応を起こし、対応するイソオキサゾリンを与えた。その後、C10位カルボニル基のジアステレオ選択的還元、C環の脱芳香化、そして分子間1,3-双極付加環化反応を経、ABCDEG環に相当する8環性化合物の合成に成功した。現在、全合成に向け、F環の構築について検討中である。

概要で述べた通り、平成26年度の研究を通じ、標的化合物の骨格構築に関する進捗があった。標的化合物はこれまでに前例のない独特で複雑な構造を有しており、合成の可否が最大の課題であることから、その足掛かりが得られたことは期待通りの成果であるといえる。昨年度までのモデル化合物を用いた検討を踏まえ、平成28年度は(1)芳香族求核置換反応を活用したキサントン部位の構築、(2)各ユニットの連結、について重点的に検討し、標的化合物やその類縁体の全合成に向けた収束型合成経路の開拓を目指す。有機合成化学今後の研究は(1)標的化合物の全合成、(2)類縁体や誘導体の合成と生物活性評価、に主眼を置く。具体的には、平成26年度の研究で得られた知見を集約させ、標的化合物の全合成に向けた収束型合成経路の開拓を目指す。すなわち、ビシクロ構造を有する中央ユニットに対し、まずは標的化合物の7環性骨格のうち、アントラキノン部を含む5環性骨格を構築し、その後キサントン部の構築を検討する。さらに類縁体や誘導体を合成し、阻害剤の探索を指向した構造活性相関研究へと展開する。本学の発注・納品システムが大幅に変更され(2015年1月より試行、4月より実施)、研究費使用のプロセスが煩雑になったことが主たる原因である。一方、平成27年度の研究は既存の設備や試薬、器具を活用することによっておおむね順調に進捗し、当初想定していたほど物品費がかからなかったことや、本研究の成果発表を行うための学会が近郊で開催され、旅費が抑えられたことも一因として考えられる。一方、今年度の研究は既存の設備や試薬、器具を活用することによっておおむね順調に進捗し、当初想定していたほど物品費がかからなかったことや、本研究の成果発表を行うための学会が近郊で開催され、旅費や宿泊費に関わる出費が抑えられたことも一因として考えられる。本年度はさらに研究を推進させるべく、年度前半の早い時期に器具、試薬などの充実を図る。また、学会発表や論文投稿など、研究成果の外部発信についても積極的に取り組む予定である。本年度はさらに研究を推進させるべく、年度前半の早い時期(45月中)に、装置、器具、試薬の充実を図る。
時間がリズムに変わる瞬間の脳内反応を捉える：言語知覚との共通基盤

3音によって区切られる2つの隣接する時間間隔のうち,先行(標準)時間間隔を繰り返して呈示すると後続(比較)時間間隔との弁別が容易になる。この時間知覚の多観察効果(multiple look effect)について以下の実験を行った。(1)多観察効果は,標準時間の繰り返しによって等間隔リズムが形成され,それによって同じ時間間隔が続くという予測が生じ,それゆえに比較時間でのずれに対して検知が鋭敏化した結果であると考えられる。この考えを支持するように,比較時間の後に標準時間を繰り返す場合,すなわち等間隔リズムを予測に利用することができない場合では,多観察効果が減弱することが従来の研究によって示されている。しかし,本研究では,通常の多観察効果のように標準時間を繰り返した後に比較時間を呈示するのではなく,標準時間を前後に置くパターン中央の位置で比較時間を呈示したときに,弁別精度が最大になることがわかった。このことは予測以外の要因が複数連なる時間間隔の弁別に寄与していることを示唆している。(2)上述したように,多観察効果は比較時間の後で標準時間を繰り返したときにはほとんど生じない。このとき,比較時間とその直後の標準時間とを時間的に切り離して呈示すると,弁別精度が改善しないどころか悪化することがわかった。つまり,標準時間の繰り返し呈示は,従来知られている多観察効果のように弁別精度を向上するだけではなく,悪化を引き起こすことが明らかになった。以上の結果を動的注意理論に基づいて説明することを検討している。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ゼブラフィッシュを活用した第2相異物代謝酵素誘導機構の解明

第2相異物代謝酵素群は、親電子性物質や酸化ストレスの刺激により転写レベルで発現誘導される。本研究では、この制御に関与する未知因子の単離同定を目的に、ゼブラフィッシュを用いた突然変異体スクリーニングを試みた。突然変異はエチルニトロソ尿素により導入し、スクリーニングは3世代交配法を用いて行った。突然変異体の探索は、5日幼魚の段階で、親電子性物質ジエチルマレイン酸及び金製剤オーラノフィン処理時のGstp遺伝子の発現誘導をin situハイブリダイゼーション法により観察する方法を用いた。これまで、125のF2ファミリーを解析し、形態形成異常を示す突然変異系統を70単離した。第2相誘導が異常となる系統の候補もでてきており、現在確認中である。一方、スクリーニングの迅速化・簡便化を目指し、誘導剤に応答して発光するトランスジェニックフィッシュの系統化を計画した。Gstpプロモーターの転写制御機構を初期胚を用いたGFPレポーター法により解析したところ、転写因子Nrf2がその発現誘導を司ることがわかった。欠失及び点変異レポーター構築を解析した結果、Nrf2による活性化には転写開始点上流約50bpに存在する配列(PARE配列と命名)が必要十分であることが明らかとなった。ゲルシフト解析の結果、Nrf2はPARE配列に直接結合することが明らかとなった。初期胚をジエチルマレイン酸で処理したところ、Gstp-GFPレポーター遺伝子由来のGFP発光が誘導された。この構築をゲノムに安定してもつトランスジェニックフィッシュの系統化を目指した。その結果、3系統得られたので、現在これらの系統の胚を用いた薬剤誘導実験を開始したところである。本研究では、この制御に関与する未知因子の単離同定を目的に、ゼブラフィッシュを用いた突然変異体スクリーニングを試みることにした。具体的な突然変異体の探索は、4日幼魚の段階での、親電子性物質ジエチルマレイン酸処理時のGstp遺伝子の発現誘導をin situハイブリダイゼーション法により観察する方法を用いた。解析ファミリー数が少ないため、これまでのところ、Gstp遺伝子の発現が異常になった系統は得られていない。しかし、心臓形成異常や腹側化変異体など、形態形成異常が観察された突然変異系統を10系統以上単離しており、突然変異導入は成功していると判断できた。今後さらに解析数を増やし、目的の突然変異体の単離を目指す予定である。一方、スクリーニングの迅速化・簡便化を目指し、誘導剤に応答して発光するトランスジェニックフィッシュの系統化を計画している。これを目的に、Gstpプロモーターの転写制御機構を初期胚を用いたGFPレポーター法により解析したところ、転写因子Nrf2がその発現誘導を司ることがわかった。PARE配列に点変異を導入した構築ではこの誘導が観察されなくなったことから、親電子性物質の標的はPARE配列であることが明らかとなった。

突然変異体の探索は、5日幼魚の段階で、親電子性物質ジエチルマレイン酸及び金製剤オーラノフィン処理時のGstp遺伝子の発現誘導をin situハイブリダイゼーション法により観察する方法を用いた。これまで、125のF2ファミリーを解析し、形態形成異常を示す突然変異系統を70単離した。第2相誘導が異常となる系統の候補もでてきており、現在確認中である。一方、スクリーニングの迅速化・簡便化を目指し、誘導剤に応答して発光するトランスジェニックフィッシュの系統化を計画した。Gstpプロモーターの転写制御機構を初期胚を用いたGFPレポーター法により解析したところ、転写因子Nrf2がその発現誘導を司ることがわかった。欠失及び点変異レポーター構築を解析した結果、Nrf2による活性化には転写開始点上流約50bpに存在する配列(PARE配列と命名)が必要十分であることが明らかとなった。ゲルシフト解析の結果、Nrf2はPARE配列に直接結合することが明らかとなった。初期胚をジエチルマレイン酸で処理したところ、Gstp-GFPレポーター遺伝子由来のGFP発光が誘導された。この構築をゲノムに安定してもつトランスジェニックフィッシュの系統化を目指した結果、3系統を得ることができた。
顎顔面骨再建に向けた完全連通孔を有する高機能型人工骨の創製

理想的な骨再生治療法を確立するため、生体吸収材料であるリン酸三カルシウムを原料として3Dインクジェットプリンターを用いて三次元形態を忠実に再現すること、力学特性・細胞親和性を向上させるために完全連通孔を作製すること、さらに生理活性物質を完全連通孔内にプリントし骨再生を促進すること、で高機能人工骨を創製した。イヌ頭蓋骨欠損モデルにおいて、bFGFを連通孔内にプリントした人工骨は骨再生に有効であることが示された。ヒトへの顎顔面再建の臨床応用に向けて、3Dインクジェットプリンターを用いたリン酸三カルシウム人工骨(IPCAB)の完全連通孔を設計し、さらにこの完全連通孔にbFGFをプリントしたIPCABを造形し、本年度は、in vitroにおける評価を行った。I完全連通孔の力学的評価直径20mmの円盤状に対し、直径2mmの完全連通孔を0-5本、三次元CAD上で設計し、TCP粉体を3Dインクジェットプリンターで造形することで、完全連通孔を有するIPCABを作製した。まず、圧縮試験機を用いてIPCABの力学的評価を行った。連通孔が増えれば増えるほど圧縮強度は低くなり、連通孔0本に対して、5本のものは1/3程度の圧縮強度であった。次に、有限解析方法を用いて、シミュレーションによる力学解析を行い、剛性値を比較した。剛性値は連通孔が増えれば増えるほど低くなり、連通孔が0本に対して、5本のものは、1/2程度であった。シミュレーションの剛性値と実際の圧縮強度は相関していた。連通孔0に対して60%以上の圧縮強度をもつのは、連通孔3本以下のもの、また、連通孔0に対して、60%以上の剛性値をもつのは連通孔3本以下のものであり、直径20mmの円盤形状に対する最適連通孔は3本と考えられた。IIbFGFをプリントした完全連通孔の生物学的評価0-5本の完全連通孔をもつIPCAB上で、マウス由来の骨芽細胞であるMC3T3-E1細胞を20,000cells/wellで6ウェルに播種し、CO2インキュベータ内で24時間前培養、Cell Counting Kit-8キット(同人化学)を用いて呈色反応を行いマイクロプレートリーダーにより吸光度450nmを測定し、細胞増殖能を評価したところ、連通孔による有意差は認められなかった。ヒトへの顎顔面再建の臨床応用に向けて、3Dインクジェットプリンターを用いたリン酸三カルシウム人工骨(IPCAB)の完全連通孔を設計し、さらにこの完全連通孔にbFGFをプリントしたIPCABを造形し、本年度は、in vitro, in vivoにおける評価を行った。まず、直径20mmの円盤状に対し、直径2mmの完全連通孔を0-5本三次元CAD状で設計し、TCP粉体を3Dインクジェットプリンターで造形することで、完全連通孔を有するIPCABを作製した。完全連通孔内にbFGFを添加した場合としない場合の細胞生存率を測定したところ、連通孔の数にかかわらず、bFGFを添加したIPACABにおいて、細胞生存率が有意に高かった。また、ビシンコニン酸アッセイを用いて完全連通孔内にタンパク質をプリントした場合の徐放量を測定したところ、bFGFの徐放は7日間以上続き、7日間で60%以上徐放されていることが確認された。IIIビーグル犬の頭蓋骨欠損モデルにおける完全連通孔の有効性と安全性の評価ビーグル犬の頭蓋骨のCTデータより、最適化された完全連通孔3本を設計しTCP粉体を3Dインクジェットプリンターを用いて、完全連通孔を有するIPCABを作製した。ビーグル犬の頭蓋骨に左右2つずつの直径20mmの骨欠損を形成し、実験群として完全連通孔を有するIPCABを、コントロール群として完全連通孔のないIPCABを移植した。4カ月後のCT値による解析と組織形態学的評価により完全連通孔内に新生骨が認められた。移植4カ月における有限要素解析から完全連通孔の有無による有意差は認められなかった。完全連通孔の付与、bFGFの添加したIPCABは、生体内において初期強度が安定するため、臨床応用において重要な意義があると考えられる。ヒトへの顎顔面再建の臨床応用に向けて、3Dインクジェットプリンターを用いたリン酸三カルシウム人工骨(IPCAB)の完全連通孔を設計し、さらにこの完全連通孔にbFGFをプリントしたIPCABを造形し、本年度は、動物移植試験における評価を行った。IIIビーグル犬の頭蓋骨欠損モデルにおけるbFGFをプリントした完全連通孔の有効性と安全性の評価ビーグル犬の頭蓋骨のCTデータより、最適化された完全連通孔3本を設計し、3Dインクジェットプリンターを用いて、完全連通孔を有するIPCABを作製した。ビーグル犬の頭蓋骨に左右に直径20mmの骨欠損を形成した。実験群としてbFGFを添加した完全連通孔を有するIPCABを、コントロール群としてbFGFを添加しない完全連通孔を有するIPCABを移植した。

移植1か月後、組織形態学的計測、CT値による骨形態計側により、両群ともに新生骨が認められた。組織形態学的計測において、Bone defect areaは、コントロール群(0.49±0.068)に対して実験群(0.26±0.025)、Contact Bone Areaは、コントロール群(0.53±0.018)に対して実験群(0.37±0.034)であり、ともに有意差(P<0.01)を認めた。完全連通孔にbFGFを添加することで骨再生を促進すると考えられた。骨形態計測による新生骨に関しては両群ともに有意差は認められなかった。bFGFをプリントした完全連通孔は、複雑な骨形態を有する顎顔面部骨再建において重要な意義があると考えられる。
複数ファン制御乱流風洞の試作研究

サーボモーターを動力とする小型ファンを6段1列に組み込んだ測定洞で幅200mm、高さ600mmの風洞を用いて、一般の風洞では作成困難な時間スケールの大きな乱れを有する気流や2次元的に相関のある風速場を再現した。その結果以下の事が明らかになった。(1)目標とするパワースペクトルを設定し、入力となるモーターの電圧時刻歴を熱線による風速測定値のパワースペクトルと目標値との比によって修正する制御方法によって周波数帯域0.03.5Hzで、平均2乗根誤差23.6%で目標の気流が作成された。(2)パワースペクトルと高さ方向のココヒーレンスを設定し、それらを満足する気流を、パワースペクトルは(1)の方法で制御し、ココヒーレンスは熱線による風速測定時刻歴のフーリエ位相によりモーターの電圧時刻歴の位相を制御する方法で、平均2乗根誤差が15%で作成できた。(3)閉塞比10%の正方形断面模型を(1)、(2)の気流中に設置し、風圧実験を行った結果、変動風圧のパワースペクトルが、低周波数帯域において特徴があることが明らかになった。(4)風洞寸法を超える大きな乱れのスケールを持つ気流も作成できた。(5)本研究で作成したシステムは、その制御方法も含めて3次元的な風速場の再現に容易に拡張され得る。これらの結果を踏まえて、制御可能な周波数帯域の拡大、上下端部に近い位置でのパワースペクトル改良や取り扱わなかった種々のパワースペクトルとココヒーレンスを有する気流作成へも適用できる本研究で提案した制御方法の一般化等、将来、解決されるべき問題もある。本年度の研究テーマは、大きく2つ設定されている。第一のテーマは、現有のエッフェル型小型境界層風洞をゲッチンゲン型に改良し、これらの風洞の特性評価を行うことである。風路抵抗や送風機の効率等による風量と風速の関係から、効率的にはあまり改良されなかったが、一様流において、静圧分布や風のプロファイルには顕著な相違が認められた。また、格子、スパイア-やラフネスブロックを追加し作製された境界層流においては、静圧分布、風のプロファイルを始め角柱風圧実験による風方向及び風直角方向の風圧係数、変動風圧のパワースペクトル特性、また2点間の風圧のコ・コヒーレンスや位相についても顕著な相違のないことが認められた。第二のテーマは、現有の風洞の断面を分割し複数の小型ファンを設置して、緩やかではあるが乱れの大きい気流を作製することであったが、作業性や現在の送風機と小型ファンとの性能比較により、将来は適用するにしても各ファンと気流の関係を検討する基本的な研究には現有の風洞内に設置することは適していないことがわかった。そこで、より簡便な小型風路を作製して行う事の方が複数ファンの制御を含めた気流作製に関する基礎的研究には適していると考えた。そこで、(株)荏原製作所から寄付された複数ファン小型風洞を用いて各ファンを独立に制御できるシステムを完成させた。今年度の計画は、小型送風機システムを拡張すること、制御方法の確立が主な目的であったが、システムの拡張については、基本となる6個のファンシステムでの制御方法が解決されれば拡張されたシステムにも容易に適用される事からその必要性が薄れるので今年度は取り扱わなかった。そこで、(株)荏原製作所から寄付された6個のファンを独立に制御する小型風洞を用いて所定の風を再現する実験を行い、以下の項目について検討した。1.5個のファンの回転数を固定し(バックグランド)、1個のファンの回転数の変化と風速値(平均値と乱れの強さ)との関係2.矩形のパワースペクトルを有するファン回転数の時刻歴で全てのファンを制御した場合の風速値の変化3.自然風の変動風速のシミュレーションその結果は以下の通りである。

1.風速値は、測定点と同じ高さにあるファンの回転数とバックグランドとの差によって大きく影響されるが、バックグランドの回転数や測定点の位置によって異なる非線形の複雑な関係となるため定量的評価までには至らなかった。2.周波数帯域幅を0.5Hzにした場合で行った結果、1.5Hzまでは制御可能であり、また長周期ほど良い関係がある3.一般に目的のスペクトルを満足する入力波のシミュレーションに用いられるフーリエ成分の振幅の修正方法、矩形スペクトルに分割して修正する方法や帯域毎に修正方法を変える等を用いて行った結果、帯域によっては若干誤差があるものの満足する風をシミュレーションできた。今年度は、本研究の最終年度にあたり、昨年度までの結果を踏まえて6個のファンを縦に並べた乱流風洞内に所定の気流を作製する方法を確立することを主眼に進めた結果以下の成果が得られた。1 6つのファンを同一回転制御をして、カルマン型パワースペクトル形状を持つが卓越周期が長周期のものと短周期のものの2種類の気流を作製し、ファン回転制御方法を確立した。ただし、短周期が卓越する場合はファン制御の電圧範囲を0.0V5.0Vにおさめるため平均風速を小さく設定する必要がある。2空間相関を有する気流のパワースペクトルをファン回転制御時刻歴のパワースペクトルで、空間相関を回転制御時刻歴の位相でコントロールする手法を提案し、実際に風洞内に作製した。熱線風速計により多点での風速を計測し解析した結果、パワースペクトルは上部や下部の境界層の影響を受けると思われる点においては若干形状がくずれるものの全体として満足されるものであり、相関については十分満足するものであった。3空間相関のある気流内に角柱を設置し、風方向の前面と後面の風圧測定を行い2点間の風圧の相関を求め、従来の短い乱れの気流内とは異なった興味ある結果が得られた。4風洞上部や下部の境界層の影響を受ける高さをも含めたより精度の良いパワースペクトルを満足する気流の作製や2HZ以上の高周波数部分でも満足される相関のある気流の作製方法の確立等将来の問題点を整理し、本研究の総括を行った。
創始者原理の視点から見たアメリカ英語の影響力と言語変化

本研究は日本のアングロフォン(英語母語話者)コミュニティで観察される英語の言語変化と新たな方言形成を調査し、日本の政治経済や教育面において強い影響力を持ち、かつ国内の英語母語話者の数では圧倒的多数を占めるアメリカの英語バラエティが、言語レベルにおいてどのような影響力を持つか考察する。方言接触状況下で新方言が形成される過程の一般的な原則とされる「創始者原理」(Mufwene 1996, 2001)の観点から、日本のアングロフォンコミュニティ内の言語変化を検証することを目的とする。本研究では言語変化を調べるため異なる時期に収集した2つのデータを比較する「実時間調査」方法を採用する。申請者が2000年に英語母語話者から来日直後に収集した自然談話の言語コーパス【第1データ】と、来日後10年以上経過した英語母語話者から収集した自然談話の言語コーパス【第2データ】の言語的特徴を比較し、言語変化の進み具合や方向を明らかにする。2018年度は後者の調査対象者から言語データ収集を行うにあたり、まず「研究の趣旨と協力要請」の文書、「研究参加の同意書」、「録音時のインストラクション」、「単語読み上げリスト」、調査対象者に関する「質問票」を作成した。その後、来日後10年以上経過した複数のアメリカ人とイギリス人から出身国の同じ話者同士の自然談話を録音した。同時に単語リスト読み上げの録音データも各話者から収集した。収集済みの自然談話については分析作業に着手する前に会話の書き起こし作業を行い、現在言語コーパスを作成中である。言語データ収集は来年度も継続する。言語データ収集件数が当初の予定数を下回っているが、他の予定はほぼ研究計画通りである。2019年度は引き続きアングロフォンコミュニティ内の英語母語話者から言語データの収集、自然談話の書き起こし作業、言語コーパス作成を行う【第2データ】。さらに作成された言語コーパスより分析対象使用例を抽出し、言語内的要因、話者の社会的要因をすべてコード化し、全使用例とともに統計解析ソフトSPSSのデータファイルに入力する。2020年度は【第1データ】と【第2データ】から抽出・入力されたデータをもとに統計用ソフトを利用して統計解析を行い、日本在住アメリカ人の英語のバリエーションと変化を検証する予定である。言語データ収集の件数が当初の予定数を下回ったことで、被験者への謝金、自然談話の書き起こし費用、研究補助者に対する謝金の支払い分が予定金額に達しなかった。2018年度未使用分は2019年度のデータ収集・整理関連費用に使用予定である。
機械加工を併用した大規模・高精度異方性エッチング

単結晶シリコンの異方性エッチングを用いると,特定結晶面から成る形状が容易に得られるため,高精度な加工が行える.しかし,マスクもエッチング液に侵されてしまうため,本加工法はミクロンオーダの微細形状加工に限って適用されている.本研究では,機械加工で予め所望の形状に加工してからエッチングを行うことで大規模かつ高精度な形状を創成する方法を検討した.エッチングに先だって,へき開を利用した加工を行った場合の形状精度評価を行った.(110)シリコンウェハをへき開すると,へき開面である(111)面は,基板に対して垂直の側壁を構成する.(111)面はウェハ面内で70.5度で交わるような2方向に存在するため,平行四辺形が容易に得られる.実験の結果,数mmの範囲では特定結晶面からなる高精度形状が得られることがわかった.また,異方性エッチングで得られる形状の精度評価も十分に行えていないことから,エッチングのみの結果について評価を行った.その結果,(100)ウェハに加工したV溝は理論どおりの70.5でありことがわかり,結晶軸に対するマスク方位誤差が0.5度以下であれば,表面粗さ20nm程度が容易に得られることがわかった.次いで,厚さ10mmの(100)シリコンを準備し,これに成形砥石で70.5度のV溝(深さ4mm)を加工した.これをエッチングして大規模な単一結晶面創成を試みた.エッチング時間が長くなることから,一般的な酸化膜ではなく,タングステン薄膜をマスクとして用いた.しかし,このマスクがエッチング中に剥離してしまい,十分なエッチングが行えなかった.しかし,仕上げ面をSEM観察したところ,砥石による加工痕がエッチングの進行に伴って滑らかになっていく様子がわかり,マスクを工夫することで高精度な形状が得られる見込みを得た.単結晶シリコンの異方性エッチングを用いると,特定結晶面から成る形状が容易に得られるため,高精度な加工が行える.しかし,マスクもエッチング液に侵されてしまうため,本加工法はミクロンオーダの微細形状加工に限って適用されている.本研究では,機械加工で予め所望の形状に加工してからエッチングを行うことで大規模かつ高精度な形状を創成する方法を検討した.エッチングに先だって,へき開を利用した加工を行った場合の形状精度評価を行った.(110)シリコンウェハをへき開すると,へき開面である(111)面は,基板に対して垂直の側壁を構成する.(111)面はウェハ面内で70.5度で交わるような2方向に存在するため,平行四辺形が容易に得られる.実験の結果,数mmの範囲では特定結晶面からなる高精度形状が得られることがわかった.また,異方性エッチングで得られる形状の精度評価も十分に行えていないことから,エッチングのみの結果について評価を行った.その結果,(100)ウェハに加工したV溝は理論どおりの70.5でありことがわかり,結晶軸に対するマスク方位誤差が0.5度以下であれば,表面粗さ20nm程度が容易に得られることがわかった.次いで,厚さ10mmの(100)シリコンを準備し,これに成形砥石で70.5度のV溝(深さ4mm)を加工した.これをエッチングして大規模な単一結晶面創成を試みた.エッチング時間が長くなることから,一般的な酸化膜ではなく,タングステン薄膜をマスクとして用いた.しかし,このマスクがエッチング中に剥離してしまい,十分なエッチングが行えなかった.しかし,仕上げ面をSEM観察したところ,砥石による加工痕がエッチングの進行に伴って滑らかになっていく様子がわかり,マスクを工夫することで高精度な形状が得られる見込みを得た.機械加工の高能率性と,結晶の規則性を利用した異方性エッチングの高精度特性を兼ね備えた加工方法の確立を目指し,以下の研究を進めた.(1)エッチング形状精度の評価シリコンの異方性エッチングは仕上がり形状が(111)結晶面のみで構成されることから高精度加工が期待できるものの,これまで精度的な評価はあまりなされていなかった.そこで(100)ウェハに円形マスクと矩形マスクを製作し,仕上がり形状の直角度や平行度等を調べた.角度測定には万能測定顕微鏡(分解能0.017度)を用いた.その結果,円形マスクでは理想的に(111)面から成るピラミッド形状ができ,精度の高い直角が得られることがわかった.しかし,多用される矩形パターンではマスクと基板のアライメント誤差が仕上がり形状精度に大きく影響し,0.4度程度の直角度誤差が生じることがわかった.また,マスクのアライメント誤差は表面粗さにも影響し,例えばこの大きさが0.8度以上になると,(111)結晶面の段差が連続的に現れた縞模様が観察されるようになり,表面粗さは0.2um(Ra)程度であることがわかった.(2)へき開面のエッチング特性評価機械加工に先立ち,へき開面のエッチング実験を行った.面積が小さい場合,へき開により特定結晶面からなる平滑面を得ることができる.しかし大規模な寸法では単一の結晶面からなる平滑面を得ることは難しく,荒れた形状になりやすい.

本研究では,へき開後にエッチング加工を併用することで形状精度を高めることを試み,実際に得られる精度(真直度等)を評価した.評価した寸法は厚さ0.5mm,長さ50mm程度と小さいが,厚さ10mmウェハの準備が完了したため,次年度には機械加工とエッチングを併用した大規模平滑面の加工にとりかかる.単結晶シリコンの異方性エッチングを用いると,特定結晶面から成る形状が容易に得られるため,高精度な加工が行える.しかし,マスクもエッチング液に侵されてしまうため,本加工法はミクロンオーダの微細形状加工に限って適用されている.本研究では,機械加工で予め所望の形状に加工してからエッチングを行うことで大規模かつ高精度な形状を創成する方法を検討した.エッチングに先だって,へき開を利用した加工を行った場合の形状精度評価を行った.(110)シリコンウェハをへき開すると,へき開面である(111)面は,基板に対して垂直の側壁を構成する.(111)面はウェハ面内で70.5度で交わるような2方向に存在するため,例えば平行四辺形が容易に得られる.実験の結果,数mmの範囲では特定結晶面からなる高精度形状が得られることがわかった.また,異方性エッチングで得られる形状の精度評価も十分に行えていないことから,エッチングのみの結果について評価を行った.その結果,(100)ウェハに加工したV溝は理論どおりの70.5でありことがわかり,結晶軸に対するマスク方位誤差が0.5度以下であれば,表面粗さ20nm程度が容易に得られることがわかった.次いで,厚さ10mmの(100)シリコンを準備し,これに成形砥石で70.5度のV溝(深さ4mm)を加工した.これをエッチングして大規模な単一結晶面創成を試みた.エッチング時間が長くなることから,一般的な酸化膜ではなく,タングステン薄膜をマスクとして用いた.しかし,このマスクがエッチング中に剥離してしまい,十分なエッチングが行えなかった.しかし,仕上げ面をSEM観察したところ,砥石による加工痕がエッチングの進行に伴って滑らかになっていく様子がわかり,マスクを工夫することで高精度な形状が得られる見込みを得た
光応答性遺伝子群の転写制御ネットワークに関する研究

「研究経過」1.GTR-1およびGTR-2と命名した新規GTボックス結合タンパク質の完全長cDNAを単離、各クローンの発現パターンの解析を行った。2.GTR-1とGTR-2の大腸菌組換えタンパク質あるいはin vitroの翻訳産物を用いたゲルシフトアッセイによるDNA結合特異性の解析、GFP融合タンパク質を用いた核移行活性の解析を行った。3.遺伝子銃を用いた一過性発現による遺伝子発現解析系について検討し、それを用いてGTR-1、GTR-2およびGT-1の転写制御因子としての性状解析を試みた。4.新規なtrihelix型のGTボックス結合タンパク質を探索し、シロイヌナズナから新たに2種類を見いだした。「結果・考察」1.ゲノムDNA配列情報と、5'RACE法および3'RACE法により、シロイヌナズナcDNAからGTR-1GTR-2の完全長のcDNAを単離した。両タンパク質ともGT-2などの2カ所のtrihelix領域をもつタイプのGTボックス結合タンパク質とは異なりDNA結合領域は1カ所で、GTR-1の予想されるアミノ酸配列はGT-1と高い相同性を示した。特にtrihelix領域の相同性が高いことから、GT-1と類似したDNA配列を認識結合する可能性が示唆された。一方、GTR-2はアミノ酸配列の相同性がGT-1、GT-2のどちらもそれほど高い相同性は示さず、1ヶ所のtrihelix領域をもつ新たなGTボックス結合タンパク質のサブグループを形成するものと考えられた。2.シロイヌナズナのデータベースから検索した2種類の塩基配列情報にもとづき、2種類のGT-1に類似するDNA結合ドメインを持つタンパク質をコードするcDNAをクローン化し、それぞれGTR1、GTR2と命名した。組織特異性をGT-1と比較するためにRT-PCR法を用いて調べたところ、GTR1とGTR2は調査した全ての組織から検出されたが、それぞれ花芽と花でmRNAの蓄積が多かった。GT-1は花器官でのmRNAの発現が低いことが明らかとなった。3.GTR2については組換えタンパク質を用いてDNA結合活性について検討し、エンドウRBCS-3AプロモーターのBoxIIおよびBoxIII、タバコPrlaプロモーター等を用いたゲルシフトアッセイで、GT-1と異なる結合特異性を示すことを明らかにした。
経験依存的に海馬左右差が誘導される分子メカニズム

脳の左右差にあることは非常によく知られているが、ヒトでは分子基盤や神経回路基盤はほとんど分かっていない。我々が研究を行っている齧歯類の海馬は、シナプス形態を含む神経回路・脳波などの神経活動・動物の記憶と、多くの点で左右差が研究されており、左右差の起こるメカニズムについては最も良く分かっている脳の部位である。私は生理学と解剖学を組み合わせてなぜ脳の左右差が生じるのか・生体にとってどのようなメリットがあるのかを解明したいと考えている。この海馬の左右差は発生期の遺伝プログラムで決まっていることは既に分かっている。しかし、動物の生後の環境も左右差に形成に影響をもたらすことも知られており、ラットでは生後ラットを豊かな環境に入れることで右側CA1の海馬γ波が左海馬より顕著に増大し、右側のシナプス数も左側より多いと言う現象が我々の研究で発見された(Shinohara et al., Nat Commun (2013))。しかし、なぜ右海馬が経験依存的に優位になるのか、脳の情報処理にとってどのような意義があるのか、についてはほとんど分かっていない。そのために引き続き豊かな環境でラットを飼育し、その結果生じる海馬の左右差について、その原因を検証する。左右差の発達にアストロサイトのカルシウム活動が関与する可能性を考え、アストロサイトのカルシウム活動が生じないマウスを使って実験を行った。このデータについては、論文で結果を報告した(Tanaka et al., J Physiol. (2017))。当研究課題がちょうど始まった平成29年4月に、私は理化学研究所神経グリア回路研究室から名古屋市立大学医学研究科・統合解剖学講座に異動した。さらに、平成31年4月に自治医科大学・組織学部門に異動した。そのため、新たに脳波測定及び電子顕微鏡を含む形態学の実験系を組む必要があった。名古屋市大で取ったデータの解析環境を整えている。右優位性をもたらす可能性があると考えている要因(候補)を阻害することで、1経験依存的な右優位のメカニズムを探る。2豊かな環境下で、右に強く誘導される遺伝子を検出する。の2つのアプローチを取る。マウスを用いたin vivoの実験は引き続き名古屋市立大学の統合解剖学分野で行い、データ解析を自治医科大学で行えるようにできるだけ早急にセットアップする。まだ研究課題の1年目であるため、現時点で報告できるデータは乏しいが、研究期間中に結果を報告したい。なお、左右差の発達にアストロサイトのカルシウム活動が関与する可能性を考え、アストロサイトのカルシウム活動が生じないマウスを使って実験を行った。この実験系の構築にほぼ1年かかったため、当初予定していたより実験の進捗は遅れている。しかし、現時点でようやく実験環境が一通り整ってきた。

左右差の発達にアストロサイトのカルシウム活動が関与する可能性を考え、アストロサイトのカルシウム活動が生じないマウスを使って実験を行った。このデータについては、論文で結果を報告した(Tanaka et al., J Physiol. (2017))。当研究課題がちょうど始まった平成29年4月に、私は理化学研究所神経グリア回路研究室から名古屋市立大学医学研究科・統合解剖学講座に異動した。さらに、平成31年4月に自治医科大学・組織学部門に異動した。そのため、新たに脳波測定及び電子顕微鏡を含む形態学の実験系を組む必要があった。名古屋市大で取ったデータの解析環境を整えている。1右優位性をもたらす可能性があると考えている要因(候補)を阻害することで経験依存的な右優位のメカニズムを探る。2豊かな環境下で、右に強く誘導される遺伝子を検出する。の2つのアプローチを取る。私の研究結果では、シナプス数、γ波、双方とも右優位を示すが、右優位を簡便に判定する方法としては、脳波の方が早い。そこで、豊かな環境でラットを飼育し、ラットの両側に多電極シリコンプローブを挿入し、麻酔下の動物からθ波に随伴するγ波を測定する。さらに、同様にラットを豊かな環境で飼育した後、分子を用いて右優位性を阻害することで、該当する分子が海馬の右優位性を惹起することを示す。右優位性をもたらす可能性があると考えている要因(候補)を阻害することで、1経験依存的な右優位のメカニズムを探る。マウスを用いたin vivoの実験は引き続き名古屋市立大学の統合解剖学分野で行い、データ解析を自治医科大学で行えるようにできるだけ早急にセットアップする。
西洋古代における習俗・文化と社会意識

本総合研究は、古代ギリシア・ローマにおいて展開された日常生活の実態と、その実態の背後にあった古代の人々の意識・心性を究明し、西洋古代の習俗・文化と社会構造の関連、およびその地理的・時間的差異の考察を通して、従来とは異なる新しい視点から西洋古代社会を据え直すことを目的として始められた。ただし、習俗・文化の網羅的把握は期間の制的や研究担者の陣容から言って無理であるので、「家族と社会生活」、「宗教生活」、「異文化接触・文化変容」を中心に、まず個別具体例の検証を各研究分担者が遂行することとした。各研究分担者がそれぞれの専門領域において個別に研究を深めて得られた成果は、研究報告書に掲載されているが、総合的成果としては、一言で西洋古代と呼んでも、その社会は地域により時代により極めて多様であった点を、具体的に確認することができた。その結果、古代ギリシアと古代ローマとを類似の理論的枠組みの中に据えつつ西洋古代史の再構成をはかることが果たして有効であるのか、問い直さねばならないとの認識を得るに至った。古代ギリシアと古代ローマとは同じ印欧語系の民族が形成した社会として理解されているが、その前提の上に立ち、「古典古代」の名のもとに、両社会が少なくともローマ帝国成立以前については類似の発展を遂げたと想定することが妥当であるのか否か。ギリシア・ローマと周辺世界の関わりについては、前者を支配文化として専ら「ギリシア化・ローマ化」の観点から語ることの偏向性が認識できた。また、「私」と「公」の一体感あるいは距離感が人々の心性や行動に及ぼす影響も指摘され、この観点からの両社会の再検討も必要となろう。2年間の研究では西洋古代史再構成のための新たな理論構築にまでは至らなかったが、その足掛かりは得られたと考える。今後、本総合研究の成果せ踏まえて、さらに地域毎・時期毎の検証と総合を深めていきたい。1.「家族と社会生活」という柱に関しては、本年度は主に家族の面での研究史の整理が進められた。欧米では1970年代以降、西洋古代の家族に関する研究がとみに盛んになっている。それはケンブリッジ・グル-プやアナ-ル派の研究により、従来の「時代を遡るにつれ家族形態は大きくなる」という進化論的家族変遷モデルが否定され、西洋中世初期におていも「核家族」が主流を占めていたことが明らかになったことに触発されてのことであり、ギリシアについてもロ-マについても、個別具体例の考証を通して、主として法制史的に構築されてきた通説と、実態との齟齬を指摘する輩出している。我々としては、それらを踏まえた上で各人の個別研究を進め、そこから西洋古代における家族形態の変遷を吟味し直し、同時に、「家」の構造や「家」の構成員相互の関係、さらには「家」と「家」とのつながりについて得られた新たな知見から、いかなる社会、そして政治の実態が浮かび上がってくるかを、パトロネ-ジ論も視野に入れつつ考察する必要があろう。2.「宗教生活」については、ギリシア・ロ-マの宗教でも特に民衆の日常生活に深く関わっている側面(葬儀や「四辻を守護する神々」の祭儀等)を通して伝統的習俗・宗教と政治との関わりの検証を進めている。3.「異文化接触・文化変容」の問題については、中心文化と周縁文化の相互影響、支配文化への同化の問題:強制か自発的受容か、といった観点から具体例についての検証を進めると同時に、ロ-マ帝国のキリスト教化の問題もこの観点から、即ち、従来のような古典的異教世界とキリスト教の衝突・抗争と後者の勝利という

二項対立的な捉え方ではなく、両者の相互影響と自己変容という観点から捉え直し、実態の検証に努めている。今年度も昨年度と同様に、「家族と社会生活」、「宗教生活」、「異文化接触・文化変容」という3本の柱を立てて研究は続行された。まず、昨年度の研究実績を踏まえつつ、個別具体例の検証をそれぞれが遂行し、全体研究会においては、その成果を持ち寄って、相互に比較検討し意見交換することにより、研究の現状分析と問題把握を行った。さらに、今後の研究への展望を確認することで、本総合研究は終了した。各研究分担者がそれぞれの専門領域において個別に研究を深めて得られた研究成果は、研究報告書に掲載されているが、総合的成果としては、一言で西代古代と呼んでも、その社会は地域により時代により極めて多様であった点を、具体的に明示することができた。その結果、古代ギリシアと共和政期ローマとを類似の理論的枠組みの中に提えつつ西洋古代史の再構成をはかることが、果たして有効であるのか、問い直さねばならないとの認識を得ることができた。古代ギリシアと古代ローマとは、同じインド・ヨーロッパ語系の民族が形成した社会として理解されているが、その前提の上に立ち、両社会が少なくともローマ帝国成立以前については類似の発展を遂げたと想定することが、妥当であるのか否か。昨年刊行された『古典古代とパトロネジ』(長谷川博隆編、名古屋大学出版会)では、ギリシアとローマの類似よりも相違のほうが、むしろ鮮明になった。西洋古代史研究について言うならば、19世紀の学の伝統を継承して進められてきた今世紀の知の営みは、今ここに到って、独自の学を打ち立てるべき時期に差しかかっている。西洋古代史再構成のための新たなる理論構築に向けて、本総合研究の成果を出発点として、今後さらに研究を進めなければならない。
プラナリアの再生組織構築を決定する位置情報システムの解明

プラナリアが、どのようにして位置情報を制御しながら、全能性の幹細胞から三次元構造をもつ機能的な脳を再生しているのかを解明し、そこで理解したことをマウスES細胞に適用しながらES細胞からマウスの脳をつくることを試みるプラナリアが、どのようにして位置情報を制御しながら、全能性の幹細胞から三次元構造をもつ機能的な脳を再生しているのかを解明し、そこで理解したことをマウスES細胞に適用しながらES細胞からマウスの脳をつくることを試みる本研究では、再生医学を現実のものにするために、幹細胞そのものの研究から、幹細胞からいかに形と機能をもつ臓器・組織を再生・構築していくか-へと研究を進展させることを目的にしている。そのために、どのようにして細胞と細胞はお互いを認識しながら座標と位置情報を形成して三次元の構造をもつ臓器・組織を形成するのか、その分子システムを明らかにする。具体的には、全身に幹細胞を保持していることによって高い再生能力を示すプラナリアを用いて、幹細胞から単なる細胞塊ではなく、形と機能をもった脳を再生する分子システムを解き明かし、その研究を発展させて、マウスES細胞から形をもつ脳をin vitroで作り出すことをめざす。本年度においては、(1)プラナリアにおける幹細胞システムの分子基盤の中核となる遺伝子を明らかにすることに成功した。(2)幹細胞から脳を形成する場所を規定しているnou-darake遺伝子とそのファミリー遺伝子が、脳の形成場所を規定しているだけでなく、もっとダイナミックに頭部全体の形なども含めてトータルに制御しており、その下流遺伝子の候補をみつけることに成功した。(3)マウスES細胞のニワトリ胚での挙動を調べることにより、プラナリアの全能性幹細胞と同じように位置情報に反応する性質をもつことを示唆することに成功した。本年度は、器官形成に必要な位置情報の解明とそれに応答する幹細胞の同定の両方について大きな進展が得られた。1.先年度までにHiCEP法で新規に同定された候補遺伝子についてRNAi法で機能解析を進めた。その結果、nou-darake遺伝子のRNAiによって、nou-darakeファミリー遺伝子の発現領域が後方にシフトすることが明らかとなり、nou-darakeファミリー遺伝子が体の前後軸の位置情報形成の遺伝子ネットワークを形成していることを明らかにした。また、Patchedホモノグ遺伝子をRNAiすると本来頭部が再生されるところに、尾部が再生してくることを見出し、Shhシグナルが体の極性を決めてる遺伝子ネットワークを形成していることを発見した。2.一方、どの状態の幹細胞がどのような位置情報シグナルに反応するのかについて明らかにするために、幹細胞の時間系列に応じた変化についても詳細な解析を行った。FACSで集めた、幹細胞分画で特異的に発現する遺伝子をHiCEP法で網羅的にクローニングし、それらの詳細な発現解析を行った。その結果、今まで、プラナリアのneoblastとして定義されていた幹細胞は少なくとも3つの状態に分子レベルで分類できることが判明した。3.マウスの全能性幹細胞もプラナリア同様に位置情報によって制御されていることを証明することに成功した。マウスES細胞をニワトリ胚の種々発生段階の胚に移植したところ、いわゆる胞胚の時期に移植した場合にのみ位置情報に反応して正常発生に参加することを発見した。iPS細胞の樹立によって、全能性幹細胞を用いた再生医療は応用に向けて本格的に動き出した。本研究は、全能性幹細胞から立体的な形と機能をもつ器官を作れるように位置情報システムの理解を進めることを課題としている。具体的には、全能性幹細胞から脳を再生しているプラナリアを用いて、位置情報システムの分子機構を明らかにすることを行っている。本年度においては、プラナリアにおける、極性と位置情報システムの分子機構の解読に大きな前進が見られた。位置座標を作るには極性をつくり、その上で細かい位置を作る必要がある。極性については、Shh/WntシグナルがPtc/Fzを介してクロストークしながら極性を作っていること。その下流に、まだ未同定の頭部因子を介した位置情報システムがあり、nou-darakeファミリー遺伝子が細かく位置情報をモジュレーションしていることを明らかにできた。また、位置情報をつくるには、位置情報を提供する細胞の解明が不可欠であり、幹細胞と相互作用しながら位置情報を提供している候補細抱の絞り込みも行った。今後、微絨毛を形成する細胞に絞り込んで、位置情報をつくる細胞システムについても理解していく予定である。本年度においては、プラナリアの脳を作る位置情報システムについてさらに詳細な解析をすすめるとともに、それらの情報を活かしてマウスにおける位置情報システムの解析とマウスES細胞から脳をつくることを開始した。具体的には、プラナリアの位置情報システムについては、(1)切断によって、後方でのWntPの発現が位置情報をつくる分化細胞でスウィッチONになることが座標の極性をつくるプライマリーなシグナルとなる、(2)WntPがONとなるためにはPatchedの活性が不可欠である、(3)それらの極性に応じて頭側ではERKシグナルが尾側ではb-cateninシグナリルが活性化され、(4)nou-darakeファミリー遺伝子がERKシグナルの強度を調整して体の前後軸に応じた領域を形成する、(5)頭部領域内の後方やWntAがONになることで脳の前後軸の座標がつくられること--を明にした。

マウスにおしても、位置情報を作る細胞と幹細胞そのものの応答能の関係を探るために、マウスES細胞からいろいろな分化状態な幹細胞をつくり、これを異なる発生段階のニワトリ胚に入れて脳の形成能を調べた。その結果、stage1のニワトリ胚にはES細胞そのものを、stage9のニワトリ胚にはMEDII培地で7-9日間培養しだものがうまくホストの環境に馴染んで脳形成に参加することを見出した。それ以外の組み合わせにおいてはガン形成がみられた。特に、MEDII培地で7-9日間培養した細胞が、ホスト胚の中でin vivoの脳の立体構造に近い構造が形成されており、最終年度に向けて大きな成果が得られた。器官形成のための位置情報をつくるにあたり、座標軸の方向性(極性:どちら側を頭側にして、どちら側を尾側にするのか)を決める必要がある。今年度には、モーガン以来100年の謎だった極性を作るためのメカニズムを明らかにした。Patched(ヘッジホック受容体)ホモログ遺伝子をRNA干渉法によって遺伝子ノックダウンするとプラナリアが再生する時に体の頭尾軸が逆転することを見いだした。これをきっかけとして極性をつくるメカニズムの解読に成功した。すなわち、Patchedのリガンドであるヘッジホックが頭部で合成され、腹側神経索にそって頭側から尾側の一方向に輸送されているとすると、切断した断片の尾側からヘッジホックが漏れ、それがWntシグナルを活性化することで、必ず元の尾側に尾が作られると理解された。すなわち、プラナリアは神経軸索の輸送の方向性が体の極性を決めていると考えられた。極性の成立に伴い、尾側でWntシグナルが活性されるのに対し、頭側ではERKシグナルが活性化され、頭尾軸にそった位置座標がつくられること。さらにnou-darakeファミリーがERKシグナルをモジュレートすることによって、頭尾軸にそった位置情報の中から、頭・首・咽頭・尾といった体の部位が形成されることを見出した。そして、各部位ごとに脳の原基や咽頭の原基が形成され、各原基の中でも体の極性に応じた位置情報がそれぞれ作られて器官形成がなされることを明らかにした。プラナリアの再生を用いて体全体の位置情報と各器官の位置情報をつくり基本原理を明らかにした。また、これらの位置情報をつくる原理をマウスES細胞にも適用して、マウス脳の一部を作ることに成功し、臓器再生への一歩を踏み出した。