hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌ならびに痴呆の超早期診断を目指したMAPキナーゼ活性診断用新規放射性薬剤の開発

Mitogenactivated protein kinase (MAPキナーゼ)カスケードは各種成長因子による細胞の分化、増殖といった細胞内シグナル伝達機構の下流に位置し、シグナル伝達の中心的な役割を果たしている。また、アポトーシスに関与すること、アルツハイマー型痴呆の原因タンパクの一つと考えられているタウタンパクを過剰にリン酸化することも報告され、その機能の多様性が指摘されている。MAPキナーゼカスケードの機能は種々の病態に深く関与しており、その活性の変動の把握は疾患の診断が可能なだけでなく、発症直前の超早期診断への展開が期待される。申請者は、MAPキナーゼに親和性を有する選択的阻害剤に着目し、その放射性ヨウ素誘導体が癌ならびにアルツハイマー型痴呆の超早期診断が可能な放射性薬剤になりうると考えた。構造活性相関に基づき、MAPキナーゼ阻害剤のヨウ素誘導体のドラッグデザインとその合成を計画し、効率良く合成することができた。合成したこれらの化合物についてインビトロにおけるMAPキナーゼ阻害活性を測定した結果、高いp38MAPキナーゼ阻害活性が認められた。次いで、放射性ヨウ素標識化合物を合成をトリブチルスズ基を有する前駆体から合成した。標識体は高収率かつ無坦体で得られた。得られた標識体はインビトロで高いp38MAPキナーゼ選択性を示した。続いて、新規放射性化合物の体内分布を調べた結果、本標識体は各臓器に速やかに取り込まれた後、速やかに各臓器から排出された。目的臓器である脳への移行性は低いものであったが、心臓への取込みは高く、血液-心臓比も良好な値を示したことから心臓の診断、特に心筋梗塞の診断の可能性が示唆された。この様に新しく合成した標識体は所期の目的の達成には至らなかったが、心臓診断薬として可能性が認められた。Mitogenactivated protein kinase(MAPキナーゼ)カスケードは各種成長因子による細胞の分化、増殖といった細胞内シグナル伝達機構の下流に位置し、シグナル伝達の中心的な役割を果たしている。合成したこれらの化合物についてインビトロにおけるMAPキナーゼ阻害活性を測定した結果、高いP38MAPキナーゼ阻害活性が認められた。続いて、新規放射性化合物の体内分布を調べた。本標識体は各臓器に速やかに取り込まれた後、その後ゆっくりと排出された。しかし、脳の移行性は低いものであった。今後、脳の移行性の改善を行うとともに新規化合物を用いたインビトロ、インビボで各種疾患との関わりについて検討する予定である。
インビトロ選択法とコンビケム法による超分子認識素子の開発

近年、遺伝子の機能を迅速かつ簡便に解明する手法である、DNAチップ法が注目を集めている。これは、相補的な核酸同士が互いに"認識"することを利用した技術である。しかしながら、"機能"を有するDNAチップの開発は未だなされていない。一方、核酸の未知の機能が次々と発見され、生体系の共有結合の切断に対して触媒機能を有するデオキシリボサイムが注目されている。このデオキシリボサイムは、金属イオンの助けを借りながら遺伝子を"認識"し、さらに切断するという"機能"を有する分子である。このような機能性分子をチップ上に固定化できれば、相補鎖認識だけでなく機能も併せ持つ機能性DNAチップとして活用できるという期待が高まっている。本研究では、短鎖デオキシリボサイムを機能性分子として捉え、核酸の"認識"と切断の"機能"を併せ持つ超分子認識素子(デオキシリボサイム素子)の開発について検討した。インビトロ選択法により見いだされたオリジナル・デオキシリボザイムの活性部位のダウンサイジングを行い、ループ内の塩基配列及び金属イオンの種類の両方により、RNA切断反応性を制御できるCa2+依存型短鎖デオキシリボサイムを開発した。この短鎖デオキシリボサイムを利用した超分子認識素子を創製するために、短鎖デオキシリボザイムの5'末端をアビジン-ビオチン相互作用を利用してAvidin Gelに固定化した。このデオキシリボザイム素子を用いてCa2+存在下でRNA(rGAAGACA_UGCCAGCG;_はRNA切断部位を示す)切断反応を行った結果、RNA切断部位はrAU間の1ヶ所を特異的に切断することがわかった。
東チベット三江地域はソバ、ダッタンソバの起原地か-その遺伝学的研究

中国南西部の四川省、雲南省、チベット自治区にまたがる三江地域に平成15、16年の秋に2度訪れ、これまで明らかにされていなかった、この地域における栽培及び野生ソバの分布を明らかにした。特に、ソバの野生祖先種Fagopyrum esculentum ssp.ancestraleが蘭倉江の谷、及び金沙江の谷に自生しているが、サルウィン河の上流である怒江の谷には自生していないという事実の発見はこの地域が栽培ソバの起原地であるという仮説の根幹をなすものである。この栽培ソバの三江地域起原説は栽培ソバ集団とソバ野生祖先種の集団に関するアロザイム変異の研究と16のプライマー組み合わせを用いたAFLP分析により確かめられた。つまり、この三江地域に分布するソバ野生祖先種の集団が他の地域(例えば、四川省木里県、塩源県など)に分布するソバ野生祖先種集団よりもより栽培集団に近縁であることが判明した。これは、この三江地域に自生していたソバ野生祖先種の集団が栽培化された故に栽培ソバと三江地域のソバ野生祖先種集団は近縁であると説明される。ついで、これら実験結果および結論をより精密に分子レベルで検証する目的でSSRRマーカーの開発に取り組んだ。決定した塩基配列に基づき、153のマイクロサテライト遺伝子座についてプライマーを設計した。このうち64対のプライマーは予期された大きさのDNA断片を1個増幅した。またこのうち48は栽培ソバにおいて多型を示し、有効なマーカーであると思われる。これらプライマーのあるものははダッタンソバ、ソバ野生祖先種でも有効であることが確かめられた。現在これらSSRマーカーを用いて、栽培ソバの起原に関して研究をすすめている。科研報告書研究の要約野生ソバ7標本、野生ダッタンソバ20標本が採集されていた。また栽培ソバ、栽培ダッタンソバもそれぞれ6,10標本に達した。これらの標本を用いて、アロザイム変異およびAFLP変異の分析を行い、栽培ソバと野生ソバ集団間の系統樹を作成した。その結果によるとアロザイム、AFLPいずれを用いても栽培ソバの各地集団は互いに非常に近縁であり、三江地域の野生ソバが栽培ソバにもっとも近縁であるという結果を得た(小西・大西未発表)。ダッタンソバについてはすでにTsuji and Ohnishi (2000,2001)がAFLPを用いて、またOhnishi (2000,2002)がアロザイムを用いて、三江地域の野生種において始めて栽培ダッタンソバと同じ遺伝子型が出現していることを示した。これらの実験結果は三江地域が栽培ソバ、栽培ダッタンソバの起原地ではないかということを示唆している。しかしながら、もし栽培ソバと野生ソバの間で遺伝子交流があるとすると、上記の結果は遺伝子交流の結果をしめすものであり、必ずしも起原地であることを意味しない。そこで、野生ソバと栽培ソバの系統関係を遺伝子交流も考慮に入れて分析できる遺伝的マーカーとしてソバのマイクロサテライト(SSR)の開発に取り組んだ。これまでに開発されていた5つのSSRマーカーに26のマーカーを付け加えることができた。各々のマーカーのために設定したプライマーはPCRにより1本のバンドに対応するDNAを増幅し、このバンド(SSR遺伝子座)は栽培ソバ集団間で変異が著しいことが判明している(Konishi et al.,2004)。来年度において、このSSRマーカーを用いて栽培ソバ、野生ソバの分析を行い、それらの間の系統関係を詳しく分析する。中国南西部の四川省、雲南省、チベット自治区にまたがる三江地域に平成

15、16年の秋に2度訪れ、これまで明らかにされていなかった、この地域における栽培及び野生ソバの分布を明らかにした。特に、ソバの野生祖先種Fagopyrum esculentum ssp.ancestraleがメコン河の上流である蘭倉江の谷、及び揚子江上流である金沙江の谷に自生しているが、サルウィン河の上流である怒江の谷には自生していないという事実の発見はこの地域が栽培ソバの起原地であるという仮説の根幹をなすものである。この栽培ソバの三江地域起原説は栽培ソバ集団とソバ野生祖先種の集団に関する10種の酵素の18遺伝子座におけるアロザイム変異の研究と16のプライマー組み合わせを用いたAFLP分析により確かめられた。つまり、この三江地域に分布するソバ野生祖先種の集団が他の地域(例えば、四川省木里県、塩源県など)に分布するソバ野生祖先種集団よりもより栽培集団に近縁であることが判明した。これは、この三江地域に自生していたソバ野生祖先種の集団が栽培化された故に栽培ソバと三江地域のソバ野生祖先種集団は近縁であると説明される。ついで、これら実験結果および結論を分子レベルで検証する目的でSSRマーカーの開発に取り組んだ。決定した塩基配列に基づき、153のマイクロサテライト遺伝子座についてプライマーを設計した。このうち26対のプライマーは予期された大きさのDNA断片を1個増幅した。これらプライマーはダッタンソバ、ソバ野生祖先種でも有効であることが確かめられた。現在これらSSRマーカーを用いて、栽培ソバ集団と各地のソバ野生祖先種の集団の類縁関係、及び栽培ソバとソバ野生祖先種集団との自然界での交雑の可能性などについて研究をすすめている。
ヘパラナーゼによる糖鎖プロセシングの可視化と免疫細胞の機能調節における役割の解明

本研究課題ではヘパラン硫酸・ヘパリンという硫酸化多糖を対象として、エンド型グリコシダーゼによるこの多糖の限定切断や低分子化を可視化すること、硫酸化多糖と相互作用する分子や細胞の機能が限定切断に伴い調節を受ける機構を解明すること、の2点について、免疫細胞を対象に検討を行ってきた。マスト細胞で生じるヘパリン低分子化は穎粒内物質の生理活性変化を伴う「プロセシング」と考えられることを平成19年度に報告した。20年度はこれをふまえ、ヘパリン低分子化に伴うマスト細胞の機能変化を広く検討した。顆粒内にヘパリンを蓄積し、かつヘパラナーゼを微弱に発現するマスト細胞株MSTにヘパラナーゼ遺伝子を導入することにより、生体内の結合組織型マスト細胞と同レベルのヘパラナーゼを発現する遺伝子導入株の作製に成功した。この細胞は脱顆粒の閾値、ヒスタミン、ヘキソサミニダーゼの放出量についてモック細胞との間に明確な差を示さなかった。一方、可溶化物が示す高分子基質(フィブロネクチン)の切断活性はペパラナーゼ遺伝子導入株で亢進した。脱顆粒時に放出されるヘパリンを顆粒内蓄積量と考え、これを2つの方法で測定した。代謝標識したヘパリンの放射活性による定量ではヘパラナーゼ遺伝子導入株の方が20%程度高かったが、ウロン酸総量の定量では逆に30%程度少ないという予想外の結果を得た。ヘパラナーゼ遺伝子導入株の顆粒内では生合成されて間もないヘパリンの割合が多い、すなわち顆粒内ヘパリンのターンオーバーが早いものと解釈される。ヘパリン以外の顆粒内生理活性物質について、その細胞内局在と寿命を変化させる可能性がある。本研究課題では、ヘパラン硫酸・ヘパリンという硫酸化多糖を対象として、この多糖の限定切断や低分子化の現場を可視化すること、このような「糖鎖プロセシング」の結果として分子や細胞の機能が調節される場合の分子機構を明確にすること、の2点を解明すべき点として、免疫細胞を対象に検討を行っている。平成19年度には上記の解析を進める上で必要な実験ツールの作製に着手した。切断を受けていないヘパラン硫酸・ヘパリンを選択的に認識する物質として、切断酵素自身であるヘパラナーゼの改変体を利用することができる。検出感度の上昇や多量体化にはプローブとなるこの分子のビオチン化が有用である。酵素によるビオチン化が可能なタグ配列を付加した組換え体タンパク質の発現ベクターを構築した。現在、その大量調製を試みている。また、化学的な方法によるビオチン化も試みたが、現在までに活性を保った状態での標識に成功していない。多糖の限定切断や低分子化が生じると考えられる細胞の浸潤先端をリアルタイム観察を目的に、ヘパラナーゼのGFP融合体遺伝子を導入したマクロファージ細胞株のクローン取得を進めている。また、ヘパリンの低分子化に伴って観察される細胞レベルの現象として、マスト細胞顆粒内酵素の活性が増強される可能性に着目している。ヘパラナーゼを発現しないマスト細胞株MSTを用い、外因性の組換え体タンパク質を細胞内に効率よく導入する方法を確立した。この方法を用い、酵素タンパク質の発現量に変化のない状態で顆粒内酵素トリプターゼの高分子基質(フィブロネクチン)に対する切断活性がヘパリンの低分子化に伴って上昇することを見出した。このマスト細胞株にヘパラナーゼ遺伝子を導入したトランスフェクタントの作製を同時進行中である。
特殊な代謝系を有する酢酸菌のゲノム解析とバイオマスの糖化における応用

全ゲノムDNA配列を決定した酢酸菌Acetobacter pasteurianusの代謝組織図をゲノム情報に基づく細菌の代謝経路ごとのデータを導入し、網羅的にかつ俯瞰できる代謝全体像を描き出した。その代謝経路図を用いて、ゲノム情報を解読したGluconacetobacter xylinusなど合計で25菌種の酢酸菌のゲノム情報を利用可能な酢酸菌類縁菌の代謝を一瞥で比較できる比較代謝経路図を自動的に作成するシステムを完成させた。A.pasteurianusはグリセロールを唯一の炭素源として増殖し、酵母の増殖を促す分子量180の中和糖を生産する。この酢酸菌を用いて、粗グリセロールを用いたバイオエタノールの生産のための複合発酵系を構築した。グリセロール代謝や有用代謝経路の発掘とともに、酢酸菌の有用形質の融合法に関して特許申請した。(1)全ゲノムDNA配列を決定した酢酸菌Acetobacter pasteurianusの代謝組織図を、豊富に存在する細菌の代謝に関する教科書や酢酸菌の代謝に関する文献を参考に、さらにKEGG2 (Kanehisa, NAR, 2008)やBioCyc (Caspi, NAR, 2006)のゲノム情報に基づく細菌の代謝経路ごとのデータを導入し、網羅的にかつ俯瞰できる代謝全体像を描き出した。トランスポーターなどの膜タンパク質の同定はSOSUIやP-SORTを用い、基質に関しては既知の酵素との比較に基づき同定した。(2)完成させたA. pasteurianusの代謝経路図を用いて、さらにゲノム情報を解読したGluconacetobacterxylinusなどゲノム情報を利用可能な酢酸菌類縁菌の代謝を一瞥で比較できる比較代謝経路図を自動的に作成するシステムを完成させた。ただし、特定の酢酸菌が有する特殊な代謝経路(たとえばバクテリア・セルロースの生産経路や高濃度グリセロール代謝経路)および複雑に交差する反応経路の描写方法については、未だ手作業で代謝マップへ導入しており改良が必要である。(3)A. pasteurianus 3283-01株は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖し、酵母の増殖を促す分子量180の中和糖を生産する。この酢酸菌を用いて、粗グリセロールを炭素源として培養したところ、正常に増殖し糖を蓄積することが明らかとなった。粗グリセロールを用いたバイオエタノールの生産のための複合発酵系を構築することをめざし、筑野食品工業株式会社の協力を得て開発を進めている。(1)全ゲノムDNA配列を決定した酢酸菌Acetobacter pasteurianusの代謝組織図を、豊富に存在する細菌の代謝に関する教科書や酢酸菌の代謝に関する文献を参考に、さらにKEGG2(Kanehisa,NAR,2008)やBioCyc(Caspi,NAR,2006)のゲノム情報に基づく細菌の代謝経路ごとのデータを導入し、網羅的にかつ俯瞰できる代謝全体像を描き出した。(2)完成させたA.pasteurianusの代謝経路図を用いて、さらにゲノム情報を解読したGluconacetobacterxylinusなどゲノム情報を利用可能な酢酸菌類縁菌の代謝を一瞥で比較できる比較代謝経路図を自動的に作成するシステムを完成させた。ただし、特定の酢酸菌が有する特殊な代謝経路(たとえばバクテリア・セルロースの生産経路や高濃度グリセロール代謝経路)および複雑に交差する反応経路の描写方法については、基本的な代謝マップ作成法は完成したが、実際の代謝との関連・相関性を確認中である。(3)A.pasteurianus 3283-01株は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖し、酵母の増殖を促す分子量180の中和糖を生産する。また、高濃度グリセロール代謝能を有する酢酸菌の育種を進めている。既に得られた育種株については、次年度ゲノム解析を進める予定である。全ゲノムDNA配列を決定した酢酸菌Acetobacter pasteurianusに関して、教科書や酢酸菌の代謝に関する文献を参考にして、さらにKEGG2やBioCycのゲノム情報に基づく細菌の代謝経路ごとのデータを導入し、網羅的にかつ俯瞰できる代謝全体像を描き出した。

完成させたA. pasteurianusの代謝経路図を用いて、さらにゲノム情報を解読したGluconacetobacter xylinusなどゲノム情報を利用可能な酢酸菌類縁菌の代謝を一瞥で比較できる比較代謝経路図を自動的に作成するシステムを完成させた。ただし、特定の酢酸菌が有する特殊な代謝経路(たとえばバクテリア・セルロースの生産経路や高濃度グリセロール代謝経路)および複雑に交差する反応経路の描写方法については、基本的な代謝マップ作成法は完成したが、実際の代謝との関連・相関性を確認中である。A. pasteurianus 3283-01株は、グリセロールを唯一の炭素源として増殖し、酵母の増殖を促す分子量180の中和糖を生産する。この酢酸菌を用いて、粗グリセロールを炭素源として培養したところ、正常に増殖し糖を蓄積することが明らかとなった。粗グリセロールを用いたバイオエタノールの生産のための複合発酵系を構築することをめざし、筑野食品工業株式会社の協力を得て開発を進めている。また、高濃度グリセロール代謝能を有する酢酸菌の育種を進めている。既に得られた育種株については、次年度ゲノム解析を進める予定である。合計で25菌種の酢酸菌のゲノムDNA配列を決定し、遺伝子を抽出しDDBJに登録した。グリセロール代謝や有用代謝経路の発掘とともに、酢酸菌の有用形質の融合法に関して特許申請した。酢酸菌のゲノム情報解析および代謝マップ解析方法の開発は順調である。ただし、酢酸菌に特有な代謝経路は、遺伝子を有するが機能していないもしくは形質を発現させていない場合が多く、遺伝子発現解析を進める必要が称した。一方で、グリセロール代謝に関しても外部企業の協力を得て順調に解析を進めることが出来ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子と代謝能の関係は、少なくとも酢酸菌においては、機能もしくは発現しない遺伝子が数多く存在することが明らかとなった。たとえば、ゲノム解析を実施した酢酸菌26菌種では、8菌種においてセルロース合成に十分だと考えれる遺伝子が存在した。しかし、実際にセルロースを合成する菌種は1種のみである。これらの知見から、ゲノム情報だけではなく、全遺伝子発現解析の実施が必要であることが明らかとなり、来年度実施を検討している。
高速・低速ネットワークが混在する環境下に適したマルチメディア通信手法の検討

不均質なネットワーク環境下で,映像・音声によるマルチメディア通信を行う場合には,優先度の低いパケットを積極的に廃棄することによって,網リソースの過負荷を回避することができる.本研究では映像と音声という異なるメディア間に渡るパケットの優先度の総合的な取扱い方を新たに導出し,その特性について主観的・客観的評価を行っている.本研究では,研究テーマの基礎的な問題を中心に検討を進めた結果,以下の成果を得た.画像メディアについて,階層性を有しかつ可逆性をもつ革新的な符号化方式を同出し,その方式の符号化効率等の基本的特性を明らかにすることにより従来方式と比べた優位性を立証した.また,可逆性をもたない階層的な符号化方式についても従来方式より特性の優れた手法をsub band符号化の枠組みの中より見い出し,優位性をコンピュータシミュレーションにより解明した.また,ネットワークのふくそう状況をできる限り動的に検出し,フロー制御を行うための新たなプロトコルの枠組みを理論的に検討し,コンピュータシミュレーションによって提案手法の妥当性を明らかにした.本プロトコルはATMのABRサービスに機能追加することによって実現した.また提案手法の妥当性を示すために,MPEG動画像のQ値を動的に変更することによりふくそうが素早く回避できることをシミュレーションによって示した.また本制御手法を実ネットワーク環境にて実現し,手法の有効性を検証した.不均質なネットワーク環境下で,映像・音声によるマルチメディア通信を行う場合には,優先度の低いパケットを積極的に廃棄することによって,網リソースの過負荷を回避することができる.本研究では映像と音声という異なるメディア間に渡るパケットの優先度の総合的な取扱い方を新たに導出し,その特性について主観的・客観的評価を行っている.本研究では,研究テーマの基礎的な問題を中心に検討を進めた結果,以下の成果を得た.画像メディアについて,階層性を有しかつ可逆性をもつ革新的な符号化方式を同出し,その方式の符号化効率等の基本的特性を明らかにすることにより従来方式と比べた優位性を立証した.また,可逆性をもたない階層的な符号化方式についても従来方式より特性の優れた手法をsub band符号化の枠組みの中より見い出し,優位性をコンピュータシミュレーションにより解明した.また,ネットワークのふくそう状況をできる限り動的に検出し,フロー制御を行うための新たなプロトコルの枠組みを理論的に検討し,コンピュータシミュレーションによって提案手法の妥当性を明らかにした.本プロトコルはATMのABRサービスに機能追加することによって実現した.また提案手法の妥当性を示すために,MPEG動画像のQ値を動的に変更することによりふくそうが素早く回避できることをシミュレーションによって示した.また本制御手法を実ネットワーク環境にて実現し,手法の有効性を検証した.不均質なネットワーク環境下で,映像・音声によるマルチメディア通信を行う場合には,優先度の低いパケットを積極的に廃棄することによって,網リソースの過負荷を回避することができる.本研究では映像と音声という異なるメディア間に渡るパケットの優先度の総合的な取扱い方を新たに導出し,その特性について主観的・客観的評価を行っている.本年度は,研究テーマの基礎的な問題を中心に検討を進めた結果,以下の成果を得た.画像メディアについて,階層性を有しかつ可逆性をもつ革新的な符号化方式を同出し,その方式の符号化効率等の基本的特性を明らかにすることにより従来方式と比べた優位性を立証した.また,可逆性をもたない階層的な符号化方式についても従来方式より特性の優れた手法をsub band符号化の枠組みの中より見い出し,優位性をコンピュータシミュレーションにより解明した.標準化されているMPEGストリームの一部に階層性を持たせるための方策を考え,これを用いてATMネットワーク上でマルチメディア伝送を行う場合の適切な上位プロトコルの選択とパラメータのチューニング方法に関する机上考察を行った.また,この方式を実際のATM実験網に実装・評価するための準備を現在行っている.ネットワークのふくそう状況をできる限り動的に検出し,フロー制御を行うための新たなプロトコルの枠組みを理論的に検討した.現在,コンピュータシミュレーションによって提案手法の妥当性を検討している段階である.不均質なネットワーク環境下で,映像・音声によるマルチメディア通信を行う場合には,優先度の低いパケットを積極的に廃棄することによって,網リソースの過負荷を回避することができる.本研究では映像と音声という異なるメディア間に渡るパケットの優先度の総合的な取扱い方を新たに導出し,その特性について主観的・客観的評価を行っている.本年度は,研究テーマの基礎的な問題を中心に検討を進めた結果,以下の成果を得た.画像メディアについて,階層性を有しかつ可逆性をもつ革新的な符号化方式を同出し,その方式の符号化効率等の基本的特性を明らかにすることにより従来方式と比べた優位性を立証した.また,可逆性をもたない階層的な符号化方式についても従来方式より特性の優れた手法をサブバンド符号化の枠組みの中より見い出し,優位性をコンピュータシミュレーションにより解明した.また,ネットワークのふくそう状況をできる限り動的に検出し,フロー制御を行うための新たなプロトコルの枠組みを理論的に検討し,コンピュータシミュレーションによって提案手法の妥当性を明らかにした.本プロトコルはATMのABRサービスに機能追加することによって実現した.また提案手法の妥当性を示すために,MPEG動画像のQ値を動的に変更することによりふくそうが素早く回避できることをシミュレーションによって示した。
オーダーメイド医療を目指した大動脈瘤発生に関する弾性繊維形成異常の研究

大動脈瘤は高齢者において致死的な疾患であるが、有効な内科治療は現在のところ存在しない。プロスタグランジンE2の活性化がMMP(matrix metalloproteinase)の発現を上昇することが知られており、これが腹部大動脈瘤化に関与すると考えられている。本研究で、EP4 antagonistがMMPの活性化を防止し、大動脈壁の弾性繊維の変性を抑制することで、大動脈瘤に対する内科治療として新しい方法となりうる可能性について報告した。本研究では大動脈の瘤化や解離発生に関連する可能性が高い大動脈壁の弾性線維形成異常の機序を明らかにする。動脈瘤、大動脈解離などの血管疾患は弾性線維の異常に基づくことが、弾性線維の主な構成蛋白であるエラスチン欠損マウスの実験や遺伝子解析の結果より示唆されている。分担研究者・横山は、野生型マウスの胎児期の血管である動脈管では隣接する大動脈や肺動脈主幹部に比べ、プロスタグランディンE受容体の1つであるEP4が特異的に発現し、かつ弾性線維の産生が著しく低下し、血管平滑筋の肥厚が認められることを発見した。また、EP4欠損マウスの動脈管では、大動脈や肺動脈と同程度の豊富な弾性線維産生が認められたことから、EP4シグナルは弾性線維産生を抑制的に制御し、血管の肥厚を誘導していると考えた。さらに、ヒト大動脈壁の数例の検討では、本来成人の大動脈には発現の少ないEP4受容体が病的に過大発現していることをすでに確認しており、これは大動脈瘤形成にEP4シグナルが関与しているという仮説を強く支持するものである。また本研究によりプロスタグランディンE受容体EP4シグナルにより弾性線維が制御される事が明らかになれば、すでに開発されているEP4のアンタゴニストが弾性線維の異常に起因する多岐にわたる疾患の治療薬として使用できる可能性が出てくる。これにより本研究は学術的意義のみならず臨床的にも非常に大きな意義をもつと考えられる。近年増加の一途をたどる大動脈手術は、胸部大動脈疾患は9,326例(2006年日本胸部外科学会統計)、腹部大動脈疾患は6,904例(2007年日本血管外科学会統計)であり、胸部・腹部をあわせると年間約1万5千例に達している。この後天性血管病変は、生命予後を左右する極めて重要な病態であり、これらには共通して弾性線維形成の異常が認められる。手術によって摘出される大動脈瘤壁、解離した大動脈壁をサンプルとし、弾性線維形成異常に対するメカニズムを解明し、大動脈瘤化や大動脈解離発生の原因を明らかとし、この予防的治療を開発することを、本研究の目的とする。研究計画実施I:症例集積横浜市立大学附属病院および横浜市立大学附属市民総合医療センター心臓血管センターで症例集積を継続する。II:研究体制と研究者間の連携・役割先端医科学研究センター・バイオバンクを介して円滑な症例の検体の集積を継続する。初年度と同様、症例は横浜市立大学附属病院(益田、鈴木)、横浜市立大学附属市民総合医療センター心臓血管センター(井元)の協力を得て集積される。全ての症例の臨床情報は臓器病態治療医学教室(益田、鈴木)が評価し、それぞれの臨床情報を管理する。集積された検体は循環制御医学教室(横山)で解析、検討される。さらに最終的に予防を含めた管理・治療方針決定システム確立をめざす(オーダーメード医療)。近年増加の一途をたどる大動脈手術は、胸部大動脈疾患は11,956例(2009年日本胸部外科学会統計)、腹部大動脈疾患は8,610例(2010年日本血管外科学会統計)であり、胸部・腹部をあわせると年間約2万例に達している。I:症例集積横浜市立大学附属病院および横浜市立大学附属市民総合医療センター心臓血管センターで約30例/年の症例集積が見込まれる。3年で約100例の集積が達成可能である。初年度から最終年度まで積極的に集積していく。II:研究体制と研究者間の連携・役割当大学では、平成18年10月に新たに先端医科学研究センターが開設され先端基礎医学研究とその成果を医学・医療に役立てるためのトランスレーショナルリサーチを目的とし、さらに横浜市大の詳細な臨床情報が付帯した臨床検体を医学研究に円滑に利用するための包括的リサーチリソースとしてのバイオバンクが付設される。この先端医科学研究センターと連携して行われる研究である。研究体制であるが、症例は横浜市立大学附属病院(益田、鈴木)、横浜市立大学附属市民総合医療センター心臓血管センター(井元、内田)で集積される。全ての症例の臨床情報は外科治療学教室(益田、鈴木)が評価し、それぞれの臨床情報を管理する。

集積された検体は循環制御科教室(横山)において検討される。この研究の内容を2012年4月日本血管外科学会総会(秋田)と、2012年4月New York Aortic Symposium(アメリカ合衆国、NY)で共同研究者が発表しました。また2012年に研究内容が英論文となり掲載されました。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在の研究方法で順調に結果が得られており、上記のごとく業績を積み重ねております。今後も更にこの方向で研究を推進してゆく予定です。
地盤振動予測のための地盤定数簡易予測法と簡易距離減衰式の適用に関する研究

研究を行なった項目は,1)簡易加振装置の製作と検討,2)推定システムの構築と適用,3)推定システム改良の検討,4)距離減衰式の適用性の検討,5)卓越振動数の測定と検討の5項目である.項目1):総質量が30kg程度の重錘-ばね方式の加振装置を製作した.サージ波が問題となったため,ばねの固有振動数が十分大きな値になるように設計し,ローパスフィルタでサージ波を取り除いた.加振装置を用いた現場測定を行ない,概ね設計通りの加振力波形が得られることを確認した.項目2):項目1)で得た実測の加振力波形を用いて,実地盤を半無限粘弾性体に模擬したときの地盤定数を推定するニューラルネットワークを構築した.推定システムは実務に応用できる可能性を有することを確かめた.また,学習範囲について検討し,適当な範囲の設定が必要であることが分かった.項目3):ニューラルネットワークの改良について検討した.項目2)では3点の鉛直変位とピーク時間差を入力パラメータとしているが,時間差の代わりに水平変位を用いることを調べた.種々の地層構成に対する検討の結果時間差をパラメータから除くことは推定システムの改善に繋がらないことが分かった.項目4):推定地盤定数を用いて半無限粘弾性体の距離減衰を計算し,Bornitz式の幾何減衰の指数n,内部減衰の係数αに結び付けるための検討を行なった.また,簡易距離減衰式としてBornitz式を利用するため,数値シミュレーションにより層状地盤への適用性を調べた.項目5):簡易予測の立場から,昼間に行なう簡単な測定で観測点の卓越振動数を抽出できるか,また得られた卓越振動数は利用できる可能性を有するかなどについて基礎的な検討を行なった.卓越振動数は極浅層の地盤情報を得るのには有用でない可能性があることが分かった.研究を行なった項目は,1)簡易加振装置の製作と検討,2)推定システムの構築と適用,3)推定システム改良の検討,4)距離減衰式の適用性の検討,5)卓越振動数の測定と検討の5項目である.項目1):総質量が30kg程度の重錘-ばね方式の加振装置を製作した.サージ波が問題となったため,ばねの固有振動数が十分大きな値になるように設計し,ローパスフィルタでサージ波を取り除いた.加振装置を用いた現場測定を行ない,概ね設計通りの加振力波形が得られることを確認した.項目2):項目1)で得た実測の加振力波形を用いて,実地盤を半無限粘弾性体に模擬したときの地盤定数を推定するニューラルネットワークを構築した.推定システムは実務に応用できる可能性を有することを確かめた.また,学習範囲について検討し,適当な範囲の設定が必要であることが分かった.項目3):ニューラルネットワークの改良について検討した.項目2)では3点の鉛直変位とピーク時間差を入力パラメータとしているが,時間差の代わりに水平変位を用いることを調べた.種々の地層構成に対する検討の結果時間差をパラメータから除くことは推定システムの改善に繋がらないことが分かった.項目4):推定地盤定数を用いて半無限粘弾性体の距離減衰を計算し,Bornitz式の幾何減衰の指数n,内部減衰の係数αに結び付けるための検討を行なった.また,簡易距離減衰式としてBornitz式を利用するため,数値シミュレーションにより層状地盤への適用性を調べた.項目5):簡易予測の立場から,昼間に行なう簡単な測定で観測点の卓越振動数を抽出できるか,また得られた卓越振動数は利用できる可能性を有するかなどについて基礎的な検討を行なった.卓越振動数は極浅層の地盤情報を得るのには有用でない可能性があることが分かった.研究実施計画に基づき,以下の研究を遂行した.1.簡易加振装置の試作総質量が30kg程度の重錘-バネ方式の加振装置を試作した.この場合,サージ波の発生が問題となるため,種々の検討の結果,バネの固有振動数が十分大きな値となるように設計し,さらに所要の振動数範囲外の成分をフィルター・カットして,サージ波現象を取り除いた.校内のグラウンドおよび神戸港内のポートアイランドにおいて,加振装置を用いた現場測定を行った.加振力はロードセルで,地盤振動は4,8,12mの3測点で同時測定した.概ね設計通りの加振力波形が得られた.2.ニューラルネットワークの構築と適用実測の加振力波形を用いて,実地盤を半無限粘弾性体に模擬したときの地盤定数を推定するニューラルネットワークを構築した.地盤振動の実測波形と推定した地盤定数を用いて計算した波形は概ね良好に一致した.本研究のシステムが実地盤にも適用できる可能性を有していることを示したが,今後地盤条件が異なる測定地で検証を続ける必要がある.3.Bornitz式に表れる定数の評価推定した地盤定数を用いて半無限粘弾性体の距離減衰を計算し,Bornitz式の幾何減衰の指数n、内部減衰の係数αに結び付けるための数値計算ソフトを作成した.推定した地盤定数の妥当性を確かめるため,板叩きによるS波震源で反射法探査を行ったが,極浅層の情報が得難かったので,検証方法について今後の検討が必要である.本年度得られた成果の一部は学術講演会で発表済で,残る成果も学術講演会へ投稿した.研究計画に基づき,以下の研究を遂行した.1.推定システム改良の検討前年度のニューラルネットワーク・システムは3点の鉛直変位とピーク時間差を入力パラメータとした.

この場合,時間差の読み取りは個人差が入り易い,また振動レベル計の利用を想定すれば水平変位を用いる方が取り扱い易い.これらに関する詳細な検討の結果,時間差をパラメータから除くことは推定システムの改善に繋がらないことが分かった.ニューラルネットワークの学習範囲についても検討を行った.学習範囲は学習時間に係わるため,適当な範囲の設定が必要であることが分かった.2.距離減衰簡易式の検討簡易距離減衰式としてBornitz式を利用することを考えているが,層状地盤への適応性を調べた.成層構造によっては必ずしもよい近似化とはならないが,道路交通振動程度の周波数範囲を想定する場合,Bornitz式は適用の可能性を有することが分かった.3.卓越振動数測定と検討卓越振動数を調べるための常時微動測定は深夜等の静穏な時間帯に行う必要があるが,本研究は簡易予測を目的にしているため,昼間に行う測定で観測点の卓越振動数を抽出できるか,観測方法を検討するとともに,評価法についても基礎的検討を行った.本年度も基礎的な検討を実施したことより,研究計画にあった実測調査数の追加等には対処できなかった.本研究課題に対する補助金は終了するが,本年度の成果も踏まえて,継続して実測調査を実施する必要があると考えている.本研究課題に対する研究成果の一部は,学術講演会および国際セミナーにおいて発表した.
顆粒球系分化誘導に伴う核分葉における細胞骨格蛋白ミオシンIIの役割

白血病細胞株NB-4を用いてレチノイン酸(ATRA)による顆粒球系細胞分化に伴うミオシンIIAおよびIIB、ミオシンホスファターゼ、Rho-キナーゼの変動をそれぞれの特異抗体を用いてWestern blot法により検討した。HL-60細胞同様ミオシンIIA及びIIBはともにNB-4細胞に発現しているが、IIAの発現がより豊富に存在していた。ミオシンIIAの発現は顆粒球系分化誘導に伴い増加したがミオシンIIBの発現は殆んど変化しなかった。ミオシンホスファターゼ酵素はPP1δ触媒サブユニット、ミオシン結合サブユニット(MBS)と20Kサブユニット(M20)より成っていることが平滑筋や血小板で報告されているが、NB-4細胞にはPP1δおよびMBSは存在していた。ATRAによる分化誘導によるMBSの発現変動は殆んど認められなかった。一方、Bho-キナーゼは漸増する傾向が認められた。ATRAによるNB-4細胞の分化誘導に伴うミオシンIIやアクチンの局在の変化を核の形態変化と関係づけながら共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。線維芽細胞ではアクチンはストレスファイバーとして認められるが、HL-60細胞同様NB-4細胞ではストレスファイバーは観察されなかった。分裂間期のNB-4細胞ではアクチンやミオシンIIAは核近傍に局在する傾向が認められたが、細胞分裂期には収縮輪を形成している分裂溝に濃縮することが認められた。また、リン酸化(Ser19)ミオシン軽鎖MLC_<20>およびRho-キナーゼの細胞内分布も分裂溝付近に濃縮していた。一方、ATRAで顆粒球系細胞に分化誘導すると、アクチンやミオシンIIAは細胞辺縁部と分葉核の橋部に高密度に分布することが確認された。さらに、顆粒球系分化誘導に伴うリン酸化ミオシン軽鎖MLC_<20>の分布も分葉核の橋部に局在化する傾向が認められた。以上のことから、NB-4細胞の増殖期においてはミオシンIIAは細胞質分裂(cytokinesis)に関与すると共に、ATRAによるNB-4細胞の顆粒球系分化誘導に伴う核分葉化過程にもアクチン系モーター蛋白ミオシンIIAが関与している可能性が示唆された。白血病細胞株HL-60およびNB-4を用いてレチノイン酸(ATRA)による顆粒球系細胞分化に伴うミオシンIIAおよびIIB、ミオシンホスファターゼRho-キナーゼの変動をそれぞれの特異抗体を用いてWestern blot法により検討した。ミオシンIIA及びIIBはともにHL-60細胞に発現しているが、IIAの発現がより豊富に存在していた。ミオシンIIAの発現は既報にあるが如く顆粒球系分化誘導に伴い増加したがミオシンIIBの発現は殆んど変化しなかった。ミオシンホスファターゼ酵素はPP1δ触媒サブユニット、ミオシン結合サブユニット(MBS)と20Kサブユニット(M20)より成っていることが平滑筋や血小板で報告されている。いずれのサブユニットもHL-60細胞に存在していた。ATRAによる分化誘導によるMBSの発現変動は殆ど認められなかった。一方、Rho-キナーゼは漸増する傾向が認められた。

現在、ATRAによるHL-60の分化誘導に伴うミオシンIIやアクチンの局在の変化を核の形態変化と関係づけながら共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討を行っている。線維芽細胞ではアクチンはストレスファイバーとして認められるが、白血病細胞株であるHL-60やNB-4ではストレスファイバーは観察されなかった。HL-60やNB-4細胞ではアクチンやミオシンIIAは核近傍により局在することが明らかとなった。また、ホルボールエステルで単球系細胞に分化誘導すると、アクチンやミオシンIIAが接着班などと考えられる細胞周囲に局在するようになることが判明した。今後、顆粒球系細胞分化に伴う核の分葉とミオシンIIAやIIBの局在、Rho-キナーゼ阻害剤など作用を検討する予定である。白血病細胞株NB-4を用いてレチノイン酸(ATRA)による顆粒球系細胞分化に伴うミオシンIIAおよびIIB、ミオシンホスファターゼ、Rho-キナーゼの変動をそれぞれの特異抗体を用いてWestern blot法により検討した。HL-60細胞同様ミオシンIIA及びIIBはともにNB-4細胞に発現しているが、IIAの発現がより豊富に存在していた。ミオシンIIAの発現は顆粒球系分化誘導に伴い増加したがミオシンIIBの発現は殆んど変化しなかった。ミオシンホスファターゼ酵素はPP1δ触媒サブユニット、ミオシン結合サブユニット(MBS)と20Kサブユニット(M20)より成っていることが平滑筋や血小板で報告されているが、NB-4細胞にはPP1δおよびMBSは存在していた。ATRAによる分化誘導によるMBSの発現変動は殆んど認められなかった。一方、Rho-キナーゼは漸増する傾向が認められた。ATRAによるNB-4細胞の分化誘導に伴うミオシンIIやアクチンの局在の変化を核の形態変化と関係づけながら共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。線維芽細胞ではアクチンはストレスファイバーとして認められるが、HL-60細胞同様NB-4細胞ではストレスファイバーは観察されなかった。NB-4細胞ではアクチンやミオシンIIAは核近傍に局在する傾向が明らかとなった。また、ATRAで顆粒球系細胞に分化誘導すると、アクチンやミオシンIIAは細胞辺縁部と分葉核の橋部に高密度に分布することが確認された。さらに、顆粒球系分化誘導に伴うリン酸化(Ser19)ミオシン軽鎖MLC_<20>の分布も分葉核の橋部に局在化する傾向が認められた。以上のことから、ATRAによるNB-4細胞の顆粒球系分化誘導に伴う核分葉化過程にもアクチン系モーター蛋白ミオシンIIAが関与している可能性が示唆された。
救急隊搬送時の心肺蘇生法実施状況の調査と対象傷病者の予後調査

【本年度の研究の内容】1998年度中に以下の二つの研究を行った。1)1996年の名古屋市での院外心停止傷病者に関して1年後まで予後を検討した。2)1998年1ヶ月にわたって院外心停止患者の救急隊が現地で記録した心電図を集め、その初期調律を検討した。【研究結果】1)1996年に搬送した心肺停止傷病者1190例のうち、1年後生存が確認されたのは44例(3.7%)であった。院外心停止の予後調査の国際規格であるUtstein templateに準じて集計を行うと、心原性で目撃者ありと判断された319例のうちでは4例(1.3%)、社会復帰と判断されたのは3例(0.9%)であった。2)1998年4月の1ヶ月の間に記録された心電図74件のうち、除細動の対象になる心室細動または心室頻拍はわずか5件(7%)であった。【考察と今後の展開】1997年度の研究結果でも示されたが、院外心停止患者の予後は過去の海外の報告に比して決して優れてはいなかった。米国でもニューヨークなどの都市部では地方都市に比べて悪いことが知られている。また、今回の心電図の検討でも示されたように、最も蘇生の対象になると考えられている心室細動などの除細動の適応となる患者が名古屋市では少ないことも蘇生率を引き下げる原因と考えられた。今後はこの結果をふまえ、心室細動の時点で救急隊が傷病者にアクセスできるように、救急司令センターからの蘇生法の指導などの発見者の蘇生施行率向上への取り組み、救急隊の特定行為の指示の簡略化・迅速化、さらに救急隊の特定行為の拡充などを考慮する必要性があるものと思われた。この調査結果は、厚生省の研究班報告、名古屋市救急指導会議の報告などに利用され、上記の対策も名古屋市では具体化されつつある。さらに、名古屋市救急対策室の協力を得て今後も継続的な調査・評価体制を維持することが確認されている。【研究の方法と結果】1996年の名古屋市の各救急隊の搬送記録をもとに、心肺停止傷病者に関してUtsteinに基づく集計を行い、退院時生存率まで検討した。この結果、1996年に搬送した心肺停止傷病者は1190例であった。そのうち、51%(607/1190)が心原性であった。心原性心肺停止のうち、目撃された心肺停止症例は68%(412/607)であった。このうち、心電図上心室細動と判定されたものは9%(39/412)であった。全体の退院時生存者は79/1190(6.6%)であった。心原性の退院時生存症例は30/607(4.9%)であった。心原性で目撃された心肺停止症例では生存者は25/412(6.1%)であった。心原性/目撃/心室細動の3条件を満たす39例のうち退院時生存例は4例(10%)であった。【考察と今後の研究の展開】欧米の報告では生存率が高いとされていた心原性/目撃/心室細動の3条件を満たす症例は全体の3%(39/1190)しかなく、退院時生存率も全体に比べて統計学的な有意差はなかった。また、心電図電送による心電図の確認が行われたのは心原性心肺停止症例の43%(181/412)であり、心室細動と判断され、実際に除細動が施行されたのは74%(29/39)で、退院時生存者の4例はすべて除細動がなされていた。今後は心肺停止傷病者の心電図記録を確実にし、除細動も指示の簡略化などの対策が必要である。この研究成果に基づき、名古屋市消防局救急隊の協力を得て、平成10年3月から、心電図記録の徹底と除細動の指示の簡略化を行い、このことが心肺停止症例の予後の改善につながるかどうか検討することとした。なお、この研究成果は、平成10年6月の第1回日本臨床救急医学会で発表する。【考察と今後の展開】

1997年度の研究結果でも示されたが、院外心停止患者の予後は過去の海外の報告に比して決して優れてはいなかった。米国でもニューヨークなどの都市部では地方都市に比べて悪いことが知られている。また、今回の心電図の検討でも示されたように、最も蘇生の対象になると考えられている心室細動などの除細動の適応となる患者が名古屋市では少ないことも蘇生率を引き下げる原因と考えられた。今後はこの結果をふまえ、心室細動の時点で救急隊が傷病者にアクセスできるように、救急司令センターからの蘇生法の指導などの発見者の蘇生施行率向上への取り組み、救急隊の特定行為の指示の簡略化・迅速化、さらに救急隊の特定行為の拡充などを考慮する必要性があるものと思われた。この調査結果は、厚生省の研究班報告、名古屋市救急指導会議の報告などに利用され、上記の対策も名古屋市では具体化されつつある。さらに、名古屋市救急対策室の協力を得て今後も継続的な調査・評価体制を維持することが確認されている。
悪性神経膠腫に対する新たな分子標的治療の開発

1.神経膠芽腫の増殖、生存、放射線抵抗性などの生物学的特性へのAkt/PKBの関与をさらに明らかにしようと試みた。Akt/PKBにはAkt1,Akt2,Akt3のisoformが存在する。ヒト悪性神経膠腫細胞であるU251MG,U87MG,GB1細胞におけるAkt isofromのタンパク発現パターンについて、ウェスタンブロティングを行い評価した。その結果、Akt1,Akt2の発現が高いことが判明した。このAkt1,Akt2に対するshort interference RNA(siAkt1,siAkt2)をU251MG,U87MG,GB1細胞に導入した。ウェスタンブロッティングにてAkt1,Akt2の特異的ノックダウンを確認した。細胞増殖について、細胞数をカウントして検討した。コントロールsiRNAを導入した細胞と比較し、siAkt1あるいはsiAkt2を単独で導入した細胞では、放射線照射後の細胞増殖がわずかに抑制された。siAkt1とsiAkt2をcointroductionし放射線照射を行うと著明に細胞増殖が抑制された。フローサイトメトリーを行い細胞周期のプロファイルを調べると、siAkt1,siAkt2を導入し放射線照射を行った細胞ではコントロールsiRNA導入後放射線照射を行った細胞と比較しsub G1 populationの増加を認めた。同時にタネルアッセイを行い、タネル陽性細胞の増加を認め、神経膠腫細胞においてAkt/PKBが抗アポトーシスに働いていることが示唆された。siAkt1,siAkt2導入細胞ではリン酸化Akt、リン酸化Badのタンパク発現レベルの低下がウェスタンブロッティングにて認められた。以上よりAkt1,Akt2ノックダウンによりAktを介した生存シグナルが抑制され悪性神経膠腫細胞の放射線感受性が増すことが示唆された。このシグナル伝達経路のどの下流分子が神経膠芽腫の生存に最も関与するか同定することが今後の課題である。神経膠腫組織からmRNAを抽出し逆転写PCR、免疫組織染色を行い評価した。その結果、神経膠芽腫ではPML遺伝子、PMLタンパク質の発現量がlow grade astrocytoma、正常脳組織と比較し優位に低下していた。PML発現低下と腫瘍悪性度との相関がみられた。今後、PMLの発現量低下の機構とPMLの悪性神経膠腫における役割の解明が必要である。上記の結果は現在、投稿準備中である。悪性神経膠腫においてPTEN遺伝子の欠失、EGFR, VEGFR遺伝子の増幅が報告されていることから神経膠腫手術標本においてAkt/PKBの活性化を評価した。Akt/PKBはリン酸化されることにより活性化されるので、その評価にはリン酸化Akt/PKBに対する特異的抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、神経膠芽腫では非腫瘍組織に比較して、リン酸化Akt/PKBの発現が上昇しており、Akt/PKBが活性化されていることが示された。また、PML (promyerocytic leukemia)の発現を神経膠芽腫手術摘出標本において抗PML抗体を用いた免疫染色を行い評価したところ、その発現の低下を認めた。

PML遺伝子の発現について、神経膠芽腫手術摘出標本からmRNAを抽出し、cDNAを合成した後に定量的PCRを行い検討した.その結果、非腫瘍組織に比較し、腫瘍ではPML遺伝子の発現が低下していた。これらの所見をもとにヒト神経膠腫培養細胞にて、Akt/PKB, PMLの腫瘍生物学的重要性を検討した。Akt/PKBをRNA interfrenceの手法を用いて、Akt/PKBに対するshRNA(Akt-shRNA)をヒト神経膠腫培養細胞に導入した。ウエスタンブロッティングにてAkt/PKBのタンパク発現レベルの低下を確認した.細胞増殖について、細胞数をカウントして検討した。コントロールshRNAを導入した細胞に比較し、Akt-shRNAを導入した細胞では、放射線照射後の細胞増殖が抑制された。また、エタノールでDNA断片を抽出後、ヨウ化プロピジウム(PI : propidium iodide)にて染色し、フローサイトメトリーを行った。放射線照射後のアポトーシスの誘導をフローサイトメトリーのsub G1 populationの割合で評価した。Akt-shRNA導入細胞では、コントロールと比較して、sub G1 populationの増加を認めた。神経膠腫細胞においてAkt/PKBが抗アポトーシスに働いていることが示唆された。また、PMLタンパク、PML遺伝子の発現を免疫染色、定量的PCRを用いて、複数の神経膠腫細胞間でその発現を評価した。PMLの発現が低い細胞では、細胞増殖能が高いという結果が得られた.神経膠芽腫の増殖、生存、放射線抵抗性などの生物学的特性へのAkt/PKBの関与をさらに明らかにしようと試みた。Akt/PKBにはAkt1,Akt2,Akt3のisoformが存在する。ヒト悪性神経膠腫細胞であるU251MG,U87MG,GB1細胞におけるAkt isofromのタンパク発現パターンについて、ウェスタンブロティングを行い評価した。その結果、Akt1,Akt2の発現が高いことが判明した。このAkt1,Akt2に対するisoformshortinterference RNA(siAkt1,siAkt2)をU251MG,U87MG,GB1細胞に導入した。ウェスタンブロッティングにてAkt1,Akt2の特異的ノックダウンを確認した。細胞増殖について、細胞数をカウントして検討した。コントロールsiRNAを導入した細胞と比較し、siAkt1あるいはsiAkt2を単独で導入した細胞では、放射線照射後の細胞増殖がわずかに抑制された。siAkt1とsiAkt2をcointroductionし放射線照射を行うと著明に細胞増殖が抑制された。フローサイトメトリーを行い細胞周期のプロファイルを調べると、siAkt1,siAkt2を導入し放射線照射を行った細胞ではコントロールsiRNA導入後放射線照射を行った細胞と比較しsub G1 populationの増加を認めた。同時にタネルアッセイを行い、タネル陽性細胞の増加を認めた。