hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
角膜上皮幹細胞発生の由来に関する形態学的解析

本年度は,角膜上皮の分化過程のうち生後の開瞼(Eye opening)による角膜上皮細胞の分化過程について,生後5日から成体に至るまでのマウス眼組織を用い,免疫組織化学的検索および電子顕微鏡的観察を行った。Hematoxylin-Eosin標本では,開瞼前の生後10日までは角膜上皮は2層の扁平な上皮細胞のみにより構成されているのに対し,生後12日の開瞼時には上皮の多層化が起こり,上皮層全体の厚みが顕著に増大するのが観察され,開瞼前に扁平な細胞2層によって構成されていた上皮は,開瞼と同時に立方状の形態を示す基底細胞による層と,それより表層側の扁平な細胞による多層化した細胞層とに分化していることが明らかとなった。角膜上皮に特異的なK12及び重層扁平上皮の基底細胞に特異的なK14に対する免疫染色では,開瞼後立方状の形態を示す基底細胞はK12,K14双方に陽性である一方,それより表層側の多層化した細胞層はK12にのみ陽性であることから,開瞼と同時に起こる角膜上皮の厚みの増大は,(1)基底細胞の立方状の形態への形態変化,および(2)それよりも表層に位置する細胞層の多層化によることが明らかとなり,開瞼と同時に角膜上皮細胞の分化,即ち基底細胞から翼細胞,表層細胞への分化が始まることが示唆された。更に,上皮に発現する細胞接着装置に着目して行った免疫組織化学的検索および電子顕微鏡による微細構造解析から,開瞼後の角膜上皮では,最表層におけるtight junctionの分布がより複雑な網目構造として観察され,開瞼と共に角膜上皮のバリア機能が発達することが明らかとなった。次に,通常の開瞼過程よりも前の時期の生後8日に眼瞼を外科的に強制開瞼し,その2日後の生後10日に組織を摘出,同様の組織化学的手法により検討した結果から,通常の発生過程では開瞼の起こらない時期に強制的に開瞼した場合にも,通常の開瞼後の生後14日と同様の観察結果,即ち,基底細胞の形態変化と表層側の細胞層の多層化による角膜上皮の厚みの増大とkeratin発現における上皮細胞の分化,更にtight junctionの形成によるバリア機能の発達が起こることが判明し,このことから,開瞼による角膜上皮細胞の分化は,発生過程での時間的プログラムとは別に,大気に曝されることによって進行することが示唆された。以上の結果から角膜上皮の分化過程には,胎生期の眼瞼融合時に起こる表皮外胚葉から角膜上皮として分化する過程と,生後の開瞼に伴い,角膜上皮基底細胞から翼細胞,表層細胞へと分化が進行する過程の2つの相の分化過程が存在することが明らかとなり,前者は組み込まれている発生のプログラムにより起こる一方,後者は発生のプログラムとは別に,外界からの大気による刺激によって起こることが示唆された。本研究は、角膜上皮の発生分化機構ならびに角膜上皮幹細胞の発生学的由来の解明を目的としている。本年度は,発生過程での角膜上皮の分化様態を明らかにするため,マウスの胎生期から成体へ至る発生の諸段階における眼組織標本を作製し.特に発生過程で起こる眼瞼の融合および再開の過程と上皮分化の関わりについて着目し,免疫組織化学的解析を行った。胎生期標本では、肺生12.5日に形成の始まった眼瞼が胎生17.5日に融合することが観察され、この眼瞼の融合と共に結膜、角膜.皮膚の各上皮は各々に特異的なkeratin(K)分子,即ちK4,K12,K10を発現する連続的な細胞層として観察された。眼瞼融合以前には、胎生14.5日にK4発現細胞,胎生16.5日にK12発現細胞が散在性に観察されたが、K10を発現する細胞は観察されなかった。これらの結果から,眼表面を構成する上皮組織は,結膜上皮,角膜上皮、眼瞼皮膚表皮の順に分化が始まり、胎生17.5日での上下眼瞼の融合に同期して各々連続的な上皮組織として分化を遂げることが明らかとなった。次に生後標本では,生後12日から14日にかけて開瞼が起こり,開瞼と同時に角膜上皮の厚さが顕著に増大することが観察された。更に電子顕微鏡的観察から、開瞼と同時に角膜上皮基底細胞から翼細胞,表層細胞への分化が起こることが明らかとなった。以上の結果から,角膜上卑の分化には表皮外胚葉から角膜上皮へと分化する過程と,上皮を構成する各々の上皮細胞が分化する過程が存在し,各々の過程には眼瞼の融合と再開が密接に関わっていることが明らかとなった。今後は,上皮の分化過程における細胞接着装置や細胞外マトリックスの分布動態について検索すると共に、角膜上皮幹細胞の分子マーカーに関する検索を行い、角膜上皮の分化における諸因子の役割,角膜上皮幹細胞の形成過程について更に考察を深めたいと考えている。Hematoxylin-Eosin

標本では,開瞼前の生後10日までは角膜上皮は2層の扁平な上皮細胞のみにより構成されているのに対し,生後12日の開瞼時には上皮の多層化が起こり,上皮層全体の厚みが顕著に増大するのが観察され,開瞼前に扁平な細胞2層によって構成されていた上皮は,開瞼と同時に立方状の形態を示す基底細胞による層と,それより表層側の扁平な細胞による多層化した細胞層とに分化していることが明らかとなった。角膜上皮に特異的なK12及び重層扁平上皮の基底細胞に特異的なK14に対する免疫染色では,開瞼後立方状の形態を示す基底細胞はK12,K14双方に陽性である一方,それより表層側の多層化した細胞層はK12にのみ陽性であることから,開瞼と同時に起こる角膜上皮の厚みの増大は,(1)基底細胞の立方状の形態への形態変化,および(2)それよりも表層に位置する細胞層の多層化によることが明らかとなり,開瞼と同時に角膜上皮細胞の分化,即ち基底細胞から翼細胞,表層細胞への分化が始まることが示唆された。更に,上皮に発現する細胞接着装置に着目して行った免疫組織化学的検索および電子顕微鏡による微細構造解析から,開瞼後の角膜上皮では,最表層におけるtight junctionの分布がより複雑な網目構造として観察され,開瞼と共に角膜上皮のバリア機能が発達することが明らかとなった。次に,通常の開瞼過程よりも前の時期の生後8日に眼瞼を外科的に強制開瞼し,その2日後の生後10日に組織を摘出,同様の組織化学的手法により検討した結果から,通常の発生過程では開瞼の起こらない時期に強制的に開瞼した場合にも,通常の開瞼後の生後14日と同様の観察結果,即ち,基底細胞の形態変化と表層側の細胞層の多層化による角膜上皮の厚みの増大とkeratin発現における上皮細胞の分化,更にtight junctionの形成によるバリア機能の発達が起こることが判明し,このことから,開瞼による角膜上皮細胞の分化は,発生過程での時間的プログラムとは別に,大気に曝されることによって進行することが示唆された。以上の結果から角膜上皮の分化過程には,胎生期の眼瞼融合時に起こる表皮外胚葉から角膜上皮として分化する過程と,生後の開瞼に伴い,角膜上皮基底細胞から翼細胞,表層細胞へと分化が進行する過程の2つの相の分化過程が存在することが明らかとなり,前者は組み込まれている発生のプログラムにより起こる一方,後者は発生のプログラムとは別に,外界からの大気による刺激によって起こることが示唆された。
トリプルジャンクションにおける電子放出箇所の微視的観測

本年度は、真空中における絶縁物上の帯電分布測定の高度化を行った。トリプルジャンクションにおける電子放出箇所の微視的観測においては、帯電の測定精度の向上が必要であり、これまで問題となっていた帯電測定時における光学的ノイズの原因を調査した。その結果、ノイズの原因は、主に真空チャンバのガラス窓における多重反射が原因であることが判明した。真空チャンバのガラス窓を反射防止膜付きのものと交換することで、より一層の帯電測定の高精度化を図る予定である。また、トリプルジャンクションの微視的構造観測と帯電の同時観測においては、電子顕微鏡のレンズ系の調整中であり、現段階では未だ同時測定までには至っておらず、実験装置の改良中である。真空中における沿面放電時の帯電測定においては、正極性から電圧を印加した場合において、真空沿面放電の発生とその時の帯電分布の様子が明らかになり、更にその後、逆放電(バックディスチャージ)の観測にも成功した。また、負極性の沿面放電後の帯電分布を測定したところ、沿面放電直後(電圧印加時)の帯電分布とその後数msec経た後の帯電分布に違いが現れた。沿面放電直後においては、針電極周辺が負極性に帯電していたが、その後数msec経つと、何らかの原因により帯電の緩和が発生し、針電極の極近傍にのみ負極性の帯電が残り、その周辺に正極性の帯電が現れた。このような帯電分布は、これまで研究により発表されてきた帯電分布に酷似している。よって、本研究の結果がこれまでの研究の再現性を得ていること、更にこれまで不明であった放電直後の帯電分布が測定できるようになったことで、沿面放電後においても絶縁体上に帯電した電荷が変化していることが明らかになった。これらの結果は、真空中の沿面放電が発生する要因に帯電が密接に関係していることの裏付けであり、重要な知見であると思われる。本年度は,真空中においてトリプルジャンクションの微視的観測を実施するための環境の整備を行った。具体的には,電子顕微鏡(ELIONIX社製:EBE-302)の準備,および微視的観測を行えるよう真空チャンバの設計と準備,試料台の整備を行った。また,真空排気システムの準備も同時に行った。これにより電気光学効果による絶縁物上の2次元帯電分布の測定環境(平成13,14年度科学研究費補助金若手研究B,課題番号:13750241により整備)と試料の移動を伴わない同一環境下で電子顕微鏡により,実験前後に電子放出箇所の構造を微視的に解明できるようになる。現段階では,未だ帯電測定と微視的観察の同時測定までには至っておらず,実験装置の調整中である。また,電気光学効果を利用した真空中における絶縁物上の帯電測定環境の整備により,本年度は,真空中で交流電圧印加時の絶縁物上の帯電分布変化を測定した。その結果として,真空中沿面放電の直前,直後の絶縁物上帯電の測定に成功し,特にトリプルジャンクション近傍での帯電分布を測定できるようになった。この結果は,平成16年9月末に開催される"ISDEIV2004: International Symposium on Discharges and Electrical Insulation in Vacuum 2004"で発表予定(受付済み)である。来年度は,先ずトリプルジャンクションにおける真空環境下での絶縁物上帯電測定と,SEMによるその微視的構造観測を実施する。トリプルジャンクションにおける電子放出箇所の同定には,更なる帯電測定の高感度化と空間分解能の高度化が必要である。現段階では,最小帯電電荷密度の感度は9.7μC/m^2であり,帯電測定の空間分解能は75μm×75μmである。来年度は,レンズ系の改良により空間分解能の向上を行う。また,ロックイン処理による定常的な光学的なノイズの除去を行うことで帯電測定の高精度化を行う。
好中球の細胞膜表面上の遊走および活性酸素産生担当分子の分子生物学的解析

マウス腹腔内に,ヒト顆粒球を注入した後、脾細胞を取り出し、腫瘍細胞と反応させ触合細胞を作製した。次いで、蛍光抗体法を用いて顆粒球に特異的な抗体を産生する細胞を選び出し、大量のモノクロ-ナルな抗ヒト顆粒球抗体を得た。その中から顆粒球の遊走能または、活性酸素産生能を抑制するモノクロ-ナル抗体(mAb)TM316、及びTM2を得た。TM316は顆粒球機能において遊走能のみを特異的に抑制する抗体で、3種類の遊走因子に対する遊走能を抗体濃度依存性に抑制し、各遊走因子に対する抑制において、同程度の抑制率を示した。しかし、TM316は顆粒球の自動能は抑制しなかった。このことからTM316は遊走能に関連する膜表面抗原を認識する抗体であることが示唆された。一方、TM2と名付けた抗体は、顆粒球の遊走能抑制に加え、活性酸素産生能を抑制した。これらの抗体と反応する膜表面抗原の精製は、不平衡PH勾配電気泳動(non-equilibrium PH gradient electrophoresis,NEPHGE)法を用いた、2次元電気泳動や、CNBr-activated sepharose 4BにmAbをコ-トしこれに、ヒト顆粒球膜成分を反応させることにより行った。得られた精製蛋白(TM316対応抗原)をウサギに繰り返し免疫し、ポリクロ-ナル抗体を得た。フロ-サイトメトリ-解析の結果このポリクロ-ナル抗体は、顆粒球と反応し、さらに、ヒト顆粒球の3種類の遊走因子に対する遊走能を抑制した。また顆粒球膜蛋白をニトロセルロ-ス膜に転写し、ウサギ抗血清をプロ-ブとしたWestern Blottingにおいて、mAbTM316と同じ分子量の場所に発色を認めた。現在は、この抗原分子の超微量アミノ酸配列解析機によりアミノ酸配列を決定中である。今後はこのアミノ酸配列に基づき、これを規定する核酸のオリゴヌクレオチドを合成する。さらに顆粒球を大量に集め、mRNAを精製した後、これからcDNAを合成して顆粒球のcDNAライブラリ-を作製する。TM2対応抗原については現在精製中である。
ニュートリノ振動におけるレプトン数の破れとそれの模型への示唆

様々なニュートリノ振動を見る実験を通して、ニュートリノに質量があることが分かってきた。また、それに伴いレプトン間の混合があることも確定してきた。そして、それらの実験が示唆する混合や質量パターンはこれまでクオークで培ってきた知識が全く使えない異質のものである。この研究では、それらの質量パターンを説明するため、ニュートリノ質量が量子力学的な輻射補正について生成されるとしてどのような模型が作れるかを研究した。単に輻射補正の範疇で模型を作るのであれば自由度が多いので、その粋組みとして特に超対称性を持つ大統一理論を念頭に置いた。こうすると自由度がきつすぎて陽子崩壊などと抵触しやすくなるのであるが、それを回避するための対称性を考え、それに基づいて模型を構築することで、ちょうど実験の制限を回避する、逆に言えば近い将来の実験で当否がはっきりする模型を構築することに成功した。また一般論として、ニュートリノの性質を説明する模型であれば、レプトンフレーバー数を破る相互作用が必ず導入されているはずなので、それが逆に将来の高精度ニュートリノ振動実験に影響を与えるかを調べた。本研究では、レプトンフレーバーの破れがニュートリノ振動実験に与える影響を考え、その効果がどう実験で見えるかを論じた。一般に、神岡やその他の実験で見つかっている大気ニュートリノ異常や太陽ニュートリノ欠損をニュートリノ振動で説明するためには、レプトンフレーバー数を破る必要がある。したがってそのための模型を考えると、レプトンフレーバーを破るような相互作用が必要になる。ある種の模型ではその効果が、タウ粒子やミューオンなどの荷電レプトンが崩壊する過程においてレプトンフレーバーを破る稀崩壊として現れることが知られていて、それを見るための様々な実験が動こうとしている。同じような効果がニュートリノ振動実験でも現れると考え、まずその効果がどのように振動現象の中に入ってくるかを考察することで、実験でどのようにパラメタ化すればいいのかを論じた。そこに現れるパラメタに対して、次世代のニュートリノ振動実験がどれくらいの感度を持っているかを調べた。その際に現在別の形でついているそれらのパラメタの制限を考慮しても、それらの実験でその新しい物理の影響が見える場合が非常に多くあることを見た。さらに、現在考えられている模型ではタウ粒子数とミュー粒子数の混合を大きくする必要があるので、これらのフレーバー間の遷移は一般に大きくなりうる。このことを考慮すると、ミュー型タウ型問の遷移が大きくなる可能性が高いことがわかる。丁度運良く、その遷移を見るために近い将来行われることが確定しているICARUS実験などで、現在の模型で期待されている破れがどれくらいの大きさであれば、観測できるのかを調べた。その結果として、現在タウ粒子の崩壊過程からついている制限と同程度の大きさの新しい物理の影響には感度があることを見た。
関節リウマチ骨粗鬆症の骨関節三次元評価を用いた治療薬予後予測サポートツールの開発

粗鬆症を呈する関節リウマチ(Rheumatoid arthritis :以下RA)患者で、新規にテリパラチド製剤(骨形成促進剤)を導入した患者40名(平均69.0歳、女性37名)を対象都市、テリパラチド開始時、投与6、12ヶ月における骨密度(DXA)、CT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を測定し、経時的に平均値を算出した。さらに対応のあるt検定を行い、開始時と投与6、12ヶ月をそれぞれ検定した。p<0.05を有意とした。開始時、投与後6、12ヶ月の腰椎骨密度は0.88、0.92、0.93 g/cm2(p=0.01)開始時からの平均変化率は5.0、6.8%であった。股関節頚部骨密度は0.63、0.63、0.64 g/cm2(p=0.08)、開始時からの平均変化率は0.3、1.5%であった。一方、CT/有限要素解析による予測骨折荷重は開始時、投与6、12ヶ月それぞれにおいて、腰椎は3433、3782、3864 N(p=0.03)であり、開始時からの平均変化率は11.0、15.4%であった。大腿骨近位部立位条件は4042、4124、4059 N(P=0.8)であり、開始時からの平均変化率は3.4、1.0%であった。大腿骨近位部転倒条件は1479、1479、1478 N(p=0.9)であった。開始時からの平均変化率は0.4、0.1%であった。腰椎において、骨密度・骨強度解析ともに投与6、12ヶ月は開始時と比較し有意に上昇した。さらに平均変化率は骨強度が骨密度を上回った。大腿骨近位部においては骨密度、骨強度解析ともに開始時と比較し、6、12ヶ月は有意差はなかった。CT/有限要素解析による予測骨折荷重を用いた骨強度評価は特に腰椎において効果的にテリパラチド製剤の治療効果を捉えられる可能性がある。今後、18ヶ月における骨強度を評価する予定である。平成29年度は関節リウマチ患者に対し、テリパラチド製剤を投与し、投与前と投与6、12ヶ月における骨密度とCT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を行い、特に腰椎において、CT/有限要素解析による変化率が骨密度変化率を上回り、より効果的にテリパラチドの薬剤治療効果を反映したことが示された。平成30年度以降、テリパラチド18ヶ月の解析を行い、最終目的である本システムを用い、骨量域抽出を自動化するシステムを構築する予定である。骨粗鬆症を呈する関節リウマチ(Rheumatoid Arthritis:以下RA)患者で、新規にテリパラチド製剤(骨形成促進剤)を導入した患者40名(平均年齢67.3歳,女性37名)を対象とし,テリパラチド開始時,投与後6ヶ月における骨密度(DXA),CT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を測定し経時的に平均値を測定した。さらに対応のあるt検定を用い、開始時、投与後6か月を検定した。P<0.05を有意とした。開始時,投与後6ヶ月の腰椎骨密度は0.89, 0.92 g /cm2 (p=0.01),増加率4.9%,大腿骨頚部骨密度は0.62,0.63g/cm2(p=0.08),増加率0.9%,一方開始時,投与6ヶ月のCT/有限要素解析による予測骨折荷重は腰椎3491,3807 N(p=0.03),増加率10.5%,大腿骨立位条件4078,4130N(p=0.6),増加率2.5%であった。腰椎において、骨密度・骨強度解析ともに投与後6か月は開始時と比較し有意に上昇した。さらに増加率は骨強度が骨密度を上回った。大腿骨近位部においては骨密度、骨強度解析ともに有意差はなかったものの、骨強度の増加率は骨密度の増加率を上回った。CT/有限要素解析による予測骨折荷重を用いた骨強度評価はDXAによる骨密度評価より鋭敏にテリパラチドの治療効果を捉えられる可能性がある。また本有限要素解析ソフトによる大腿骨近位部表面骨密度分布をみると特に頚部が投与後6ヶ月において上昇した。大腿骨頸部内側骨密度分布が予測骨折荷重増加につながることが報告されており,テリパラチドが特に骨強度に影響する部位の骨密度を上昇させている可能性が本法を用いて示唆された.今後、12ヶ月,18ヶ月における骨強度を評価する予定である.平成28年度は関節リウマチ患者に対し、テリパラチドを投与し、投与前と投与後6か月における骨密度とCT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を行い、CT/有限要素法による増加率が骨密度増加率を上回り、既存の骨密度測定より鋭敏に薬剤治療効果を反映することが示された。

粗鬆症を呈する関節リウマチ(Rheumatoid arthritis :以下RA)患者で、新規にテリパラチド製剤(骨形成促進剤)を導入した患者40名(平均69.0歳、女性37名)を対象都市、テリパラチド開始時、投与6、12ヶ月における骨密度(DXA)、CT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を測定し、経時的に平均値を算出した。さらに対応のあるt検定を行い、開始時と投与6、12ヶ月をそれぞれ検定した。p<0.05を有意とした。開始時、投与後6、12ヶ月の腰椎骨密度は0.88、0.92、0.93 g/cm2(p=0.01)開始時からの平均変化率は5.0、6.8%であった。股関節頚部骨密度は0.63、0.63、0.64 g/cm2(p=0.08)、開始時からの平均変化率は0.3、1.5%であった。一方、CT/有限要素解析による予測骨折荷重は開始時、投与6、12ヶ月それぞれにおいて、腰椎は3433、3782、3864 N(p=0.03)であり、開始時からの平均変化率は11.0、15.4%であった。大腿骨近位部立位条件は4042、4124、4059 N(P=0.8)であり、開始時からの平均変化率は3.4、1.0%であった。大腿骨近位部転倒条件は1479、1479、1478 N(p=0.9)であった。開始時からの平均変化率は0.4、0.1%であった。腰椎において、骨密度・骨強度解析ともに投与6、12ヶ月は開始時と比較し有意に上昇した。さらに平均変化率は骨強度が骨密度を上回った。大腿骨近位部においては骨密度、骨強度解析ともに開始時と比較し、6、12ヶ月は有意差はなかった。CT/有限要素解析による予測骨折荷重を用いた骨強度評価は特に腰椎において効果的にテリパラチド製剤の治療効果を捉えられる可能性がある。今後、18ヶ月における骨強度を評価する予定である。平成29年度は関節リウマチ患者に対し、テリパラチド製剤を投与し、投与前と投与6、12ヶ月における骨密度とCT/有限要素解析による椎体・大腿骨近位部骨強度解析を行い、特に腰椎において、CT/有限要素解析による変化率が骨密度変化率を上回り、より効果的にテリパラチドの薬剤治療効果を反映したことが示された。平成29年度以降、テリパラチド投与12、18か月後と継時的観察を行い、最終目的の一つである本システムを用いた薬剤の治療予後予測に有用な因子を見つける予定である。また、本骨強度測定システム内の骨領域抽出を自動化するシステムを構築する予定である。平成30年度以降、テリパラチド18ヶ月の解析を行い、最終目的である本システムを用い、骨量域抽出を自動化するシステムを構築する予定である。おおむね研究が順調に進んだために必要以上の支出がなかった(理由)おおむね研究が順調にすすみ必要以上の支出がなかった。(使用計画)骨強度システム内の骨領域抽出を自動化するシステムを構築するためにかかる費用骨強度システム内の骨領域抽出を自動化するシステムを構築するためにかかる費用
急性腎障害の病態における ミトコンドリア機能とマイトファジーの意義の解明

我々は、急性腎障害において、オートファジーとアポトーシスが病態に関与することを報告してきたが、腎臓病の病態におけるオートファジー/マイトファジーの役割については、十分に明らかにされていない。近位尿細管はミコトンドリアの含有量が高く、オートファジー/マイトファジーによりアポトーシスを回避し生存した尿細管は脱分化、再生に関与する可能性は高い。我々は、オートファジーをin vivoで検出できるGFP-LC3-TGマウスを使用した急性腎障害モデルにおいて、p53関連遺伝子であるSestrinが虚血により近位尿細管細胞で誘導されアポトーシスを抑制し、オートファジーを促進する事を報告した。現在、透析療法に至っている患者数は、全国で30万人を越え、特に急性腎障害は、患者の高齢化などにより発症頻度は高まっており、全入院患者の5%、IUC入院患者の20%で発症するといわれている。急性腎障害をおこした場合長期的な腎機能低下と生命予後の悪化が起こる。本研究では、尿細管細胞のミトコンドリア機能の保持およびミトコンドリアのオートファジー(マイトファジー/Mitophagy, mitochondrial autophagy)の調整することにより、腎機能の保護、回復・再生を目標とする。具体的には、1)尿細管細胞におけるマイトファジー系の腎保護への関与、2)急性腎障害におけるミトコンドリアの機能保持の薬物による調整3)急性腎障害腎生検検体でのオートファジー/マイトファジー検出とその意義の検討である。現在、透析療法に至っている患者数は、全国で30万人を超え、特に急性腎障害は患者の高齢化などにより発症頻度は高まっており、全入院患者の5%、ICU入院患者の20%で発症すると言われている。急性腎障害を起こした場合長期的な腎機能低下と生命予後の悪化が起こる。本研究では、尿細管細胞のミトコンドリア機能の保持およびミトコンドリアのオートファジーの調整をすることにより、腎機能の保護、回復・再生を目標とする。具体的には、1)尿細管細胞におけるマイトファジー系の腎保護への関与、2)急性腎障害におけるミトコンドリアの機能保持の薬物による調整、3)急性腎障害腎生検検体でのオートファジー/マイトファジー検出とその意義の検討である。現在、透析慮法に至っている患者数は全国で30万人を越え、特に急性腎障害は患者の高齢化などにより発症頻度は高まっており、全入院患者の5%、ICU入院患者の20%で発症すると言われている。急性腎障害を起こした場合、長期的な腎機能低下と生命予後の悪化が生じる。本研究では、尿細管障害のミトコンドリア機能の保持及びミトコンドリアのオートファジーを調整することにより、腎機能の保護、回復再生を目標とした。具体的には、1)尿細管細胞におけるマイトファジーの系の腎保護への関与、2)急性腎障害におけるミトコンドリアの機能保持の薬物による調節、3)急性腎障害腎生検検体でのオートファジー/マイトファジー検出とその意義の検討を加え、論文(Matsumoto et al.)を発表した。申請者は尿細管細胞におけるマイトファジー系の腎保護への関与や急性腎障害におけるミトコンドリアの機能保持の薬物による調整に加え、可溶性プロレニン受容体やWntシグナル阻害タンパクであるDkk-1との関連も併せて、現在も継続して研究中である。腎臓病学可溶性プロレニン受容体やWntシグナル阻害タンパクであるDkk-1との関連も併せて、現在も継続して研究中である。申請者は、尿細管細胞におけるマイトファジー系の腎保護への関与や急性腎障害におけるミトコンドリアの機能保持の薬物による調整についてある程度の機序を解明し、現在研究継続中である。現在検体を収集中であり、一定数まとまった検体数になった時点で、同条件での測定を予定している。急性腎障害腎生検検体でのオートファジー/マイトファジー検出とその意義の検討を行っていく。試薬をまとめて購入予定である。検体の収集が予定より遅くなったため。検体数を増やして対応中である。
無脊椎動物(カブトガニ)血球細胞のリポ多糖による脱顆粒機構の解明

洗浄したカブトガニ血球細胞を用いてLPS刺激を行い、顕微鏡下で観察したところ、顕著な脱顆粒反応が見られた。従って、この脱顆粒反応には血漿成分は必要でないことが明らかになった。この細胞はCa^<2+>イオノフォアによって脱顆粒が誘導されるが、EDTAを含む溶液中でも、LPS刺激にともなう脱顆粒反応が観察された。つまり、この脱顆粒反応には、細胞外からのCa^<2+>流入は必要でなく、細胞内Ca^<2+>プールからのCa^<2+>の放出によって惹起されることが示唆された。次に、血球細胞表面のLSP結合能について、FITCあるいはbiotin標識したLPSを用いたflow cytometryによって解析した。結果、カブトガニ血球細胞は、LPS応答性の哺乳動物細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことが明らかになった。この結合は、過剰量の無標識LPSによって拮抗がかかり、血球細胞をprotease処理することによって減少した。また、Salmonella minnesotaR595株由来のLPSでも結合が見られた。以上の結果より、血球細胞表面に、LPSの生物活性の中心を担うlipid Aを直接特異的に認識し、結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子のcDNA cloningのため、哺乳動物細胞を用いてexpression cloningを進めたが、これまで、偽陽性シグナルしか得られていない。現在、血球細胞膜に対してmonoclonal抗体を作成し、脱顆粒阻害能、あるいは亢進能を指標にこの因子に対する抗体をスクリーニングすることを試みつつある。現在までに、数種類の血球細胞膜に対するmonoclonal抗体が得られており、そのうち、いくつかは細胞表面のLPS結合を阻害することが明らかとなった。現在、この阻害が特異的なものか、さらに、脱顆粒反応に対しても阻害的に作用するかについて検討しつつある。FITCラベルしたLPSを用いたflow cytometryによる解析の結果、固定したカブトガニ血球細胞はLPS応答性の哺乳類細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことが明らかになった。細胞表面への結合にはhemolymphplasma成分は要求されず、過剰量の無標識LPSによって拮抗が見られた。さらにprotease処理によって結合の減少がみられることから、血球細胞表面に、LPSを直接特異的に認識し、結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子のcloningのため、カブトガニ血球細胞のcDNAを哺乳動物細胞上で発現させ、flow cytometryを用いてexpression cloningを進めたが、これまで、偽陽性シグナルしか得られていない。この因子が複数の遺伝子産物によって構成されている場合、あるいは、カブトガニ血球細胞特異的な翻訳後修飾を受けている場合、この方法ではcloningは困難であると考えられる。現在、血球細胞膜に対してmonoclonal抗体を作成しつつあり、脱顆粒阻害能、あるいは亢進能を指標にこの因子に対する抗体をスクリーニングすることを計画している。また、これと並行して、哺乳動物細胞との反応性を比較するため、monocyte、macrophageのLPS受容体と考えられるCD14の発現を試みている。現在までに、C末端の細胞膜へのanchorに関与するpeptide部分を除去した可溶性のCD14の酵母の一種であるPichia pastorisを用いた発現に成功し、精製を行った。精製CD14は、CD14を発現していない哺乳動物細胞に対し、LPS応答反応を仲介することが示され、生物活性を保持していることが明らかになった。

現在、さらに生物活性を保持したより短い型のCD14、N型糖鎖の結合部位に変異を導入したCD14などの発現を試みつつある。洗浄したカブトガニ血球細胞を用いてLPS刺激を行い、顕微鏡下で観察したところ、顕著な脱顆粒反応が見られた。従って、この脱顆粒反応には血漿成分は必要でないことが明らかになった。この細胞はCa^<2+>イオノフォアによって脱顆粒が誘導されるが、EDTAを含む溶液中でも、LPS刺激にともなう脱顆粒反応が観察された。つまり、この脱顆粒反応には、細胞外からのCa^<2+>流入は必要でなく、細胞内Ca^<2+>プールからのCa^<2+>の放出によって惹起されることが示唆された。次に、血球細胞表面のLPS結合能について、FITCあるいはbiotin標識したLPSを用いたflow cytometryによって解析した。結果、カブトガニ血球細胞は、LPS応答性の哺乳動物細胞と比較して非常に強いLPS結合能をもつことが明らかになった。この結合は、過剰量の無標識LPSによって拮抗がかかり、血球細胞をprotease処理することによって減少した。また、Salmonella minnesota R595株由来のLPSでも結合が見られた。以上の結果より、血球細胞表面に、LPSの生物活性の中心を担うlipid Aを直接特異的に認識し、結合するタンパク質性因子の存在が示唆された。この因子のcDNA cloningのため、哺乳動物細胞を用いてexpression cloningを進めたが、これまで、偽陽性シグナルしか得られていない。現在、血球細胞膜に対してmonoclonal抗体を作成し、脱顆粒阻害能、あるいは亢進能を指標にこの因子に対する抗体をスクリーニングすることを試みつつある。現在までに、数種類の血球細胞膜に対するmonoclonal抗休が得られており、そのうち、いくつかは細胞表面のLPS結合を阻害することが明らかとなった。現在、この阻害が特異的なものが、さらに、脱顆粒反応に対しても阻害的に作用するかについて検討しつつある。
中性粒子計測における超伝導転移端検出器の安定動作に向けた基盤構築

超伝導遷移端マイクロカロリメータ(TES)は,非分散でありながら回折格子に匹敵する高いエネルギー分解能を実現するX線検出器である.遮蔽窓に穴を開けて安定に動作させることができれば,中性粒子計測を含め応用範囲が格段に広がることが期待される.本研究では,3次元の電磁界・熱シミュレーション計算と実測を駆使して最適なシールド環境を実現し,最終的には遮蔽窓なしでTESを安定動作させる方法論の確立を目指す.これによりTES応用の基盤を強化し,TESカロリメータを中性粒子計測を含む他の分野での最先端計測に生せるようにする.これはまた,初期宇宙観測等,天文観測のブレークスルーにも繋がることが期待される.超伝導遷移端マイクロカロリメータ(TES)は,非分散でありながら回折格子に匹敵する高いエネルギー分解能を実現するX線検出器である.遮蔽窓に穴を開けて安定に動作させることができれば,中性粒子計測を含め応用範囲が格段に広がることが期待される.本研究では,3次元の電磁界・熱シミュレーション計算と実測を駆使して最適なシールド環境を実現し,最終的には遮蔽窓なしでTESを安定動作させる方法論の確立を目指す.これによりTES応用の基盤を強化し,TESカロリメータを中性粒子計測を含む他の分野での最先端計測に生せるようにする.これはまた,初期宇宙観測等,天文観測のブレークスルーにも繋がることが期待される.
輻射磁気流体力学計算に基づく降着円盤の熱平衡曲線

降着円盤はブラックホールや中性子星、原始星など様々な天体の周囲に形成される回転ガス円盤であり、円盤ガスの持つ重力エネルギーによって輝いている。恒星において質量と光度の間にある一定の関係が成り立つように、降着円盤でもその回転角速度に応じて(単位面積あたりの)質量と光度の間に一定の関係=熱平衡曲線が成り立つ。この質量と光度の関係は、定常状態にある天体の熱力学を表す基本的かつ重要な関係式である。本研究では、(典型的ガス温度が10Kのものから1e7Kのものに至るまで)様々なタイプの降着円盤に対して、単一の輻射磁気流体力学シミュレーションコードを用いて、その熱平衡曲線を系統立てて求めることに成功した。本研究は、降着円盤の基本関係式である熱平衡曲線を「第一原理」に基いて求めることにより、多様な降着円盤の内部構造と熱力学的性質を体系化して理解することを目的とする。ここで「第一原理」とは、降着円盤を駆動するシアストレスの起源である流体力学乱流を、「パラメタリゼーション」を用いずに、直接数値計算を用いて取り扱うことを意味する。平成27年度は、磁気乱流が駆動する降着円盤と自己重力乱流が駆動する降着円盤について、それぞれ研究を進めた。前者(磁気乱流が駆動する降着円盤)については、矮新星降着円盤の熱平衡曲線の角速度依存性を計算し、それを矮新星の円盤不安定モデルに組み込むことで、光度曲線を得ることに成功した。得られた「第一原理」光度曲線は、観測される矮新星の光度曲線の基本的な特徴を再現する。この結果は、これまで提案されていた「パラメタリゼーション」を用いた円盤不安定モデルとの比較を行った上で、Monthly Notices of Royal Astronomical Society誌に投稿した。後者(自己重力乱流が駆動する降着円盤)については、自己重力乱流を取り扱うために必要なシミュレーションコードの改良・開発を、以下の3点について行った:1.降着円盤の差動回転成分とそれからのずれ成分(乱流成分)を分離して、乱流成分を精度よく解くためのコードの改良、2.高速フーリエ変換を用いて、自己重力ポテンシャルの方程式(ポアソン方程式)を効率よく解くコードの開発、3.(自己重力乱流円盤では主要な加熱源となる)中心星からの可視光照射を、レイトレーシングを用いて計算するコードの開発。最後に、テスト計算を行い、これらの新しいシミュレーションコードが想定通り機能することを確認した。本研究における研究対象は、大別すると、磁気乱流が駆動する降着円盤と、自己重力乱流が駆動する降着円盤の2つである。後者については、平成27年度は、研究実施計画の通り、研究を進めることができた。前者については、共同研究者の研究の進捗を鑑みて、平成28年度に行う予定であった課題を先に前倒しで行った。したがって、全体として、現在までの進捗状況は、おおむね順調に進展している。本研究は、降着円盤の基本方程式の解を「第一原理」から求め、多様な降着円盤の熱力学的性質を「熱平衡曲線」によって体系化して理解することを目的とする。ここで「第一原理」とは、降着円盤を駆動するシアストレスの起源である流体力学不安定と、主要な冷却過程である輻射輸送を、「パラメタリゼーション」を用いずに、直接数値計算を用いて取り扱うことを意味する。平成28年度は、重力不安定が駆動する降着円盤について、特に、中心星からの可視光照射を受ける原始惑星系円盤を対象として研究を進めた。具体的には、中心星からの距離を50天文単位に設定し、面密度と中心星からの可視光照射角度の2つをパラメータとして、重力不安定の非線形発展を調べた。その結果、ある特定の面密度範囲で、重力不安定が駆動する密度波の散逸と輻射冷却の釣り合いがとれた「重力乱流」状態が維持されることがわかった。その面密度範囲の上限値は、(降着円盤での重力不安定を規定する)Toomreパラメータが0.7に相当しており、Toomreパラメータが0.7以下での重力乱流状態は維持されないことを意味している。一方、先行研究で、重力乱流状態と円盤分裂の境界を決めるパラメータとして議論されてきた冷却時間については、本研究では、面密度に依存せずにほぼ一定値をとり、上記の面密度範囲の上限値とは無関係であることが示唆される。また、可視光照射角度に関しては、0.32ラジアンを超えると、赤道面近傍のガス温度が可視光照射による加熱の影響を受けて上昇することにより、重力乱流は弱められることがわかった。これらの結果をまとめた論文は、査読付き学術誌であるMonthly Notices of the Royal Astronomical Society誌に投稿し、受理された。本研究における研究対象は、大別すると、(A)磁気乱流が駆動する降着円盤と、(B)自己重力乱流が駆動する降着円盤の2つである。(B)については、平成29年度に研究を行う予定であったが、平成27年度に行ったテスト計算の結果が順調であり、また競合する研究が複数あり出来るだけ早く出版する必要も出てきたため、平成28年度に前倒しで研究を進めている。一方、(A)の残りの課題(活動銀河核降着円盤と原始惑星系円盤)についても、平成29年度に研究を行うために必要な予備計算を並行して進めている。

ここで「第一原理」とは、降着円盤を駆動するシアストレスの起源である流体力学不安定と、主要な冷却過程である輻射輸送を、「パラメタリゼーション」を用いずに、直接数値計算を用いて取り扱うことを意味する。平成29年度は、平成28年度に引き続き、重力不安定が駆動する降着円盤について、特に、中心星からの可視光照射を受ける原始惑星系円盤を対象として研究を進めた。具体的には、中心星からの距離と面密度の2つをパラメータとして、重力不安定の非線形発展を調べ、特に、滑らかな円盤が密度塊に分裂する条件に着目した。計算結果から、(イ)中心星からの距離がおよそ60AU以下の場合、ある特定の面密度を超えると分裂が起こること、(ロ)中心星からの距離がおよそ90AU以上の場合、面密度にかかわらず、常に分裂が起こること、がわかった。これら異なる条件における分裂に共通する物理機構を探ったところ、初期の軸対称重力不安定の非線形発展として成長する密度波における自己重力と外部重力の比が鍵となっていることが判明した。すなわち、(ハ)面密度が大きいほど、あるいは中心星からの距離が大きいほど、密度波における自己重力が(外部重力に対して相対的に)強い傾向があり、(ニ)そういった密度波がさらに自己重力によって方位角方向に分裂すると、その強い自己重力によって密度塊が形成されやすい、のである。また、(ホ)中心星からの距離が大きいほど自己重力が(相対的に)強い傾向になるのは、回転がより遅くなっていることが主な原因であることもわかった。これらの結果をまとめた論文は現在投稿準備中である。降着円盤はブラックホールや中性子星、原始星など様々な天体の周囲に形成される回転ガス円盤であり、円盤ガスの持つ重力エネルギーによって輝いている。恒星において質量と光度の間にある一定の関係が成り立つように、降着円盤でもその回転角速度に応じて(単位面積あたりの)質量と光度の間に一定の関係=熱平衡曲線が成り立つ。この質量と光度の関係は、定常状態にある天体の熱力学を表す基本的かつ重要な関係式である。本研究では、(典型的ガス温度が10Kのものから1e7Kのものに至るまで)様々なタイプの降着円盤に対して、単一の輻射磁気流体力学シミュレーションコードを用いて、その熱平衡曲線を系統立てて求めることに成功した。本研究における研究対象は、大別すると、磁気乱流が駆動する降着円盤と、自己重力乱流が駆動する降着円盤の2つである。現在までの進捗状況で述べたとおり、前者については平成28年度に行う予定であった課題を前倒しで行ったため、平成27年度に計画していた課題を、平成28年度以降、順次行っていく予定である。一方、後者については、主に平成29年度に研究を進める予定であったが、平成27年度に行ったテスト計算の結果が順調であり、また競合する研究が複数あって出来るだけ早く出版する必要も出てきたため、平成28年度に前倒しで研究を進める予定である。本研究における研究対象は、大別すると、(A)磁気乱流が駆動する降着円盤と、(B)自己重力乱流が駆動する降着円盤の2つである。最終年度である平成29年度は、平成28年度に行った(A)の研究をさらに推し進めて完成させる(すでに主な計算は終わっているので、出版論文としてまとめる)、とともに、(A)の残りの課題(活動銀河核降着円盤と原始惑星系円盤)について、平成28年度に行った予備計算をもとに、研究を進める。
CD204陽性腫瘍随伴マクロファージによる腫瘍増殖促進の機能解析

自然免疫系の免疫細胞であるマクロファージは、病原体や死細胞貪食を介して体内の恒常性を保つ重要な役割を担っている。近年、マクロファージは免疫反応の促進もしくは抑制を担う2つの亜集団に大別されることがin vitroの研究より提唱されている。前者はM1マクロファージと呼ばれ、IL-1b, IL-6, TNFαなどの炎症性サイトカインの産生を介して病原体の排除に関与し、後者はM2マクロファージと呼ばれ、IL-10, TGF-βなどの産生を介して免疫反応の抑制に寄与していると考えられている。しかしながら、in vivoにおけるM1、M2マクロファージの存在および機能については明らかになっていない。In vivoにおけるM1、M2マクロファージの存在および機能を明らかにするため、我々は以前の研究においてM2マクロファージのマーカー遺伝子であるCD204陽性マクロファージを特異的に消去できるマウスを作製した。さらに慢性炎症モデルであるがんにおいて、CD204陽性マクロファージを消去することで放射線治療後の腫瘍の再増殖が抑制されることを見出した。次にCD204陽性マクロファージの機能を詳細に解析するため、急性炎症モデルである敗血性ショックにおけるCD204陽性マクロファージの機能を調べた。敗血性ショック誘導時CD204陽性マクロファージを消去することにより、炎症性サイトカインの異常な上昇および抑制性サイトカインの減少を伴う個体死が見られた。以上の結果より、CD204陽性マクロファージは腫瘍に対する炎症反応を抑制し腫瘍の増殖を助ける一方、敗血性ショックにおいては過度な炎症を抑制し、個体を守る働きを持つことが明らかになった。このことは、CD204陽性マクロファージがin vivoにおけるM2マクロファージであることを強く示唆している。
低次元強相関超伝導系における不純物周りの電子状態

バルクに導入された磁性或いは非磁性不純物の効果を考える場合、バルクの電子状態を知ることが不可欠であるが、電子相関が強い銅酸化物系に対しては、理論的に確立した知見がほとんど無い。そこで、今年度は、2次元ハバードモデルに対し、相互作用U/tや電子密度nに依存したバルクの性質を、変分モンテカルロ法によって調べ、以下の成果を得た。その際、波動関数としては、定性的にも不都合のあるGutzwiller射影(0次)を超えた、強相関展開の2次及び4次の一部の効果を取り入れた改良型射影演算子を用い、0次の短所を克服した。次近接ホッピングt'を入れない基本的な場合の場合をまずまとめる。(a)ハーフフィリング(n=1,非ドーピング)の場合は、U/tの全領域で反強磁性秩序が現れる。最低エネルギー状態ではないが、d波超伝導状態も常磁性状態よりは安定で、u=Usi6.5tで超伝導-絶縁体転移を起こす。(b)ドープされた場合(n<1)、反強磁性状態はそれ自身不安定で、相分離を起こし、d波超伝導状態が安定な領域が広がる。d波超伝導状態は、U=Uco12tでその性質がBCS型から強相関型へとクロスオーバーする。U<Usiでは超伝導の安定化は微小だが、U>Usiでは十分に安定化する。ポテンシャルエネルギーの低下が超伝導を引き起こすBCS型とは異なり、強相関型の領域では運動エネルギーが超伝導の起因となっている。最近の銅酸化物の光学伝導度の実験は、運動エネルギーの低下を示唆しており、我々の結果と比較して、強相関型の超伝導だと考えられる。次にt'を導入した場合を述べる。(a)t'/t<0の場合は、d波超伝導状態が安定化される一方、反強磁性状態は著しく抑制される。(b)t'/t>0の場合は、その逆である。(c)銅酸化物との比較ではt'/t<0はホールドープ系、t'/t<0は電子-ホール変換によって電子系と対応するが、いずれもARPESなどの実験やバンド計算と一致した結果である。高温超伝導体で見出された擬ギャップ現象や超伝導転移機構の変化(クーパーペアリングからボーズ凝縮への変化)を念頭に置いて、同様の現象が出現する典型的な模型である引力ハバードモデルを、変分モンテカルロ法を用いて調べた。試行関数としては、最も単純なグッツヴィラー型関数を用いると、エネルギーが高いばかりでなく、様々な物理量が正しく記述できない。そこで特に強相関極限での摂動展開2次に対応する補正項を波動関数に導入し、その問題点を解決した。その結果、正常状態は引力相互作用がほぼバンド幅の値で、通常のフェルミ液体からスピン自由度にギャップを持つ非金属状態へと相転移することがわかった。後者は正に擬ギャップの特性を持っている。次に超伝導状態を調べると、超伝導機構の変化は正常状態のこの転移に対応して起こり、凝縮エネルギーの最大値もその付近で起こることが解った。この結果を基に現在、斥力ハバード模型を調べており、直接高温超伝導体との比較をする予定である。斥力ハバードモデルの超伝導の研究は、FLEX摂動計算などでは超伝導を支持しているが、量子モンテカルロシミュレーションでは否定的である。

変分計算は相関が強いところまで行えるメリットがある。これまで用いられてきたGutzwillerの変分関数を拡張した方法を作れているのでこれまで以上に信頼される結果がえられるとおもわれる。現在の計算結果によれば超伝導の可能性が十分にありそうである。また次近接ホッピング項を導入した計算も始めていて、電子ドープ、ホールドープ系における物質の違いを識別することが可能になりつつある。バルクに導入された磁性或いは非磁性不純物の効果を考える場合、バルクの電子状態を知ることが不可欠であるが、電子相関が強い銅酸化物系に対しては、理論的に確立した知見がほとんど無い。そこで、今年度は、2次元ハバードモデルに対し、相互作用U/tや電子密度nに依存したバルクの性質を、変分モンテカルロ法によって調べ、以下の成果を得た。その際、波動関数としては、定性的にも不都合のあるGutzwiller射影(0次)を超えた、強相関展開の2次及び4次の一部の効果を取り入れた改良型射影演算子を用い、0次の短所を克服した。次近接ホッピングt'を入れない基本的な場合の場合をまずまとめる。(a)ハーフフィリング(n=1,非ドーピング)の場合は、U/tの全領域で反強磁性秩序が現れる。最低エネルギー状態ではないが、d波超伝導状態も常磁性状態よりは安定で、U=Usi6.5tで超伝導-絶縁体転移を起こす。(b)ドープされた場合(n<1)、反強磁性状態はそれ自身不安定で、相分離を起こし、d波超伝導状態が安定な領域が広がる。d波超伝導状態は、U=Uco12tでその性質がBCS型から強相関型へとクロスオーバーする。U<Usiでは超伝導の安定化は微小だが、U>Usiでは十分に安定化する。ポテンシャルエネルギーの低下が超伝導を引き起こすBCS型とは異なり、強相関型の領域では運動エネルギーが超伝導の起因となっている。最近の銅酸化物の光学伝導度の実験は、運動エネルギーの低下を示唆しており、我々の結果と比較して、強相関型の超伝導だと考えられる。次にt'を導入した場合を述べる。(a)t'/t<0の場合は、d波超伝導状態が安定化される一方、反強磁性状態は著しく抑制される。(b)t'/t>0の場合は、その逆である。(c)銅酸化物との比較ではt'/t<0はホールドープ系、t'/t<0は電子・ホール変換によって電子系と対応するが、いずれもARPESなどの実験やバンド計算と一致した結果である。
小児悪性腫瘍患者における水痘・帯状疱疹ウイルスによるサイトカインmRNAの検討

水痘帯状疱疹ウイルス(Varicella-Zoster Virus,VZV)は小児で最も一般的な疾患の一つである水痘、あるいは帯状疱疹の原因となるウイルスである。白血病、骨髄移植後などの続発性免疫不全状態では、水痘はしばしば重症化し、その原因としては細胞性免疫異常の関与が考えられている。本研究では、急性リンパ性白血病(ALL)患児より末梢血単核球を分離しVZV抗原を加えて培養し、CD4陽性細胞におけるインターロイキン2レセプター(IL2R)の発現と、IL2R及びインターロイキン2(IL2)のメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を検討した。対象としたのは3歳から12歳までの完全寛解中のALL患児10名であり、すべてVZV抗体陽性で、5名は抗癌剤による化学療法中、残り5名は化学療法終了後の患児であった。末梢血単核球は自家血漿入りRPMI1640にてVZV抗原とともに培養した。CD4陽性細胞におけるIL2Rの発現は、CD4,CD25(IL2Ralpha鎖)に対するモノクロナール抗体を用いてFACScanにより分析した。IL2R及びIL2のmRNAの発現はRT-PCR法にて検討した。化学療法終了後の患児では、CD4^+CD25^+細胞の割合は有意に増加した。一方化学療法中の患児では、CD25^+細胞の有意の増加は認められなかった。IL2R-mRNAはすべての患児で発現がみられたのに対して、IL2-mRNAの発現は、CD25^+細胞の増加がない症例では認められなかった。以上のことにより、IL2-mRNA発現の障害は、化学療法中のALL患児におけるVZV抗原に対する免疫異常の原因の一つであると考えられた。
組織再生医療に用いられる間葉系幹細胞の品質保証評価に有効な遺伝子発現の解析

ヒト間葉系幹細胞を用いた再生医療の有効性と安全性を保障する、実用的な「品質保証の指標」の確立を目指して、骨髄および滑膜由来の間葉系幹細胞の様々な遺伝子の発現相違について比較解析した。このような発現相違はマウス由来の同等の細胞においても共通した傾向の見られることが証明され、それらの遺伝子における既知の機能は、滑膜由来細胞の軟骨細胞分化能が高いことに寄与する可能性を推定させた。そこでこれらの複数の遺伝子の発現レベルから培養系における軟骨細胞分化能を推定し、有効な「品質保証」の使用として利用できるか否かについて検討した。また軟骨再生医療に際して望まれない、異所性骨化の可能性についても検討した。<1>ヒト間葉系幹細胞(hMSCs)の由来組織の相違に基づく特徴的発現遺伝子の抽出複数名ドナーの様々な組織から採取されたhMSCsのうち、ドナー1名分について、各由来組織における特徴的な発現遺伝子を正確に比較解析した。また追加5名分の骨髄および滑膜由来の間葉系幹細胞の利用計画をすすめた。間葉系幹細胞における選択的発現遺伝子をデータ解析により抽出し、20種類程度の特徴的遺伝子を選出するための相応しい選択基準について検討した。<2>マウス間葉系前駆細胞の発現解析:滑膜および骨髄由来細胞の比較複数のマウスから骨髄および滑膜、半月板由来の間質細胞を調整し、骨芽細胞および軟骨細胞、脂肪細胞への分化能を評価した。このうち2匹分について網羅的な遺伝子発現の比較解析を行い、ヒト細胞の情報からフィードバックを加えて滑膜由来細胞または半月板由来細胞における発現高値を示す遺伝子群を探索した。抽出された遺伝子群について6匹分以上の検体間の遺伝子発現を比較し、統計学的に有意な発現相違を確認した。以上によりヒトおよびマウスに共通して組織由来別の間葉系前駆細胞の相違を特徴付ける遺伝子群は複数抽出され、特定の分子径路の関与が推定された。ヒト間葉系幹細胞による再生医療を実現するためには、臨床的に実用的な「品質保証」の指標が必要とされる。本研究は、ヒト膝関節周囲の様々な組織に由来する間葉系幹細胞の遺伝子発現プロファイルを比較解析することによって、間葉系幹細胞が潜在した元組織の修復に寄与するための相応しい性質を保有するという仮説を検証するとともに、再生医療に利用される間葉系幹細胞の再生能力を反映する細胞機能評価を可能とする「品質評価基準」の確立を目指した。初年度には、まずマウス骨髄および滑膜由来の間質前駆細胞の網羅的な遺伝子発現の比較解析を行い、ヒト骨髄および滑膜に由来する間葉系幹細胞における比較解析との共通性を検証することによって、骨髄および滑膜に由来する前駆細胞の遺伝子発現様式に、種を超えた共通性が潜在することを明らかにした。このような共通性を示す遺伝子発現を示した遺伝子群の特徴として、(1)「軟骨細胞への分化潜在性」を反映する、軟骨基質構成分子の遺伝子と転写因子群、(2)発生過程における軟骨細胞の分化および増殖制御に重要とされる「ヘッジホックシグナルの伝達制御」に関わる分子群、(3)同様に骨軟骨および関節発生に重要とされる「Wntシグナル制御」に関わる分子群の多数について、ヒトおよびマウスの複数の検体において再現性が証明された。最終年度においては、これらの分子群の発現レベルが、個々の間質前駆細胞の軟骨細胞分化能に、実際に反映されるか否かについて検討した。またこれらの結果を統合して、軟骨細胞への分化能を反映する、軟骨再生医療に望ましい間葉系幹細胞の「品質評価」に利用可能な分子指標の確立を目指した。検討した指標の有効性の判定については、今後の検討がさらに必要であることが明らかとされた。骨代謝学新たに解析すべきヒト由来細胞の手続きが遅れ、マウス由来細胞の解析を優先したが、結果として再現性高い発現相違を示す遺伝子と分子径路を推定することが出来ている。前年度に行えなかった、ヒト由来細胞の解析を進め、分化能との相関解析を行う。