hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光励起三重項電子を用いた動的核偏極によるNMR分光高感度化の汎用性向上

光励起三重項状態の電子スピンを用いる動的核偏極(トリプレットDNP)法は、極低温を用いる従来法と同程度のNMR感度向上を達成できる。この手法で様々な分子を高感度化可能にし、高感度液体が生成できるようにし、NMR分析やMRIへの道を拓くことが本研究の目的であった。本研究では、水溶性である安息香酸固体の室温下での高感度化について研究を行い、高感度化後に溶解し、高感度液体生成に成功した。また、トリプレットDNP法で様々な分子が高偏極化できるホスト物質と光励起物質の組み合わせを考案した。NMR分光やMRIの感度を向上させる方法として極低温を用いる動的核偏極が注目されており、申請者らは光励起三重項状態にある電子スピンを偏極源に用いる動的核偏極(triplet-DNP)によって、サンプルを室温に保ったまま極低温を用いる方法と同程度の核スピン高偏極化ならびにNMR感度向上を達成した。本研究の目的は、triplet-DNPで得られる感度をさらに向上できること、多くの物質に汎用性があることを示すことであり、この方法により高感度化した液状物質を人体に投与することで可能になる高感度MRIへの道を拓くことである。より高磁場ではスピン格子緩和時間が長くなるためさらなる高偏極率が期待できるため、平成26年度では、より高磁場でtriplet-DNPが可能となる実験装置を開発した。また、偏極移動のための振動磁場パルスを数値的に設計するための方法を明らかにし、NMR実験によってその効果を実証した。これまでtriplet-DNPによって高偏極化に成功したホスト物質としてはナフタレン、ターフェニル、ベンゾフェノンしかなく、これらは全て水に不溶な物質であった。平成26年度では安息香酸単結晶の水素核スピンを高偏極化することに成功した。さらに、安息香酸のカルボキシル基の水素を重水素に置換することで、水素核スピンのスピン格子緩和時間をのばして、さらなる高偏極化に成功した。安息香酸は水溶性であり、今後はこれを用いて高感度液体NMRの実現、高感度MRIの実現を目指していく。また、光励起三重項状態を持つ分子とホスト物質の様々な組み合わせを試し、多くの物質を溶かし込むことが可能な組み合わせを見出した。代表者らは、NMR分光やMRIの感度を決める核スピン偏極率の向上法である光励起三重項状態にある電子スピンを偏極源に用いる動的核偏極(triplet-DNP)法の研究を進めてきた。熱平衡状態にある不対電子スピンを偏極源に用いる従来のDNP法は、数十%の核スピン偏極率を得るために極低温を用いてきたが、triplet-DNP法はサンプルを室温に保ったまま同程度の高偏極化が実現できる。しかしこれまで本方法で高効率に高偏極化できる物質は限られた分子の固体のみであった。本研究によってさまざまな分子や液体の高効率での高感度化を実現することで、triplet-DNPの高感度汎用測定、高感度MRIへの応用の道を拓く。Triplet-DNPのために与える振動磁場パルスの最適化を行えば、さらなる高効率の高偏極化が期待できる。平成27年度では、数値最適化法に関する理論の論文を改良して再投稿し、NMR実験によって数値最適化パルスの性能が従来のパルスよりも優れていることを示した。より高磁場では核スピン格子緩和時間が長くなるためさらなる高偏極率が期待されていた。平成27年度では、これまでよりも高磁場の0.6テスラでtriplet-DNP実験を行い、より高効率に高偏極化が可能であることを示した。また、0.6テスラで三重項電子スピンのパルス磁気共鳴のための装置を開発した。多くの物質を溶かし込むことが可能となるホスト物質でのtriplet-DNP技術に関する論文を作成した。水溶性の物質の高効率での高偏極化に成功し、高偏極液体のNMRの実現にも成功した。多くの物質を溶かし込むことが可能となるホスト物質でのTriplet-DNPに関する論文を作成し、さらなる高偏極化を実現するためのパルスの数値設計法のNMRでのデモンストレーションを行った。また、より高磁場でtriplet-DNP実験を行い、より高効率な高偏極化が可能であることを示した。本研究はNMR分光やMRIの感度を向上する方法である光励起三重項状態にある電子スピンを偏極源に用いる動的核偏極(トリプレットDNP)法の実用化に向けた研究を進めてきた。本研究以前は非常に限られた固体試料しか高感度化に成功していなかった。本研究ではトリプレットDNP法でさまざまな分子や液体の高効率での高感度化を実現することを目的とした。平成27年度では初めて水溶性の安息香酸の高効率での高感度化に成功した。さらに高感度化後に水に溶解させて、高偏極液体を生成し、この液体の高感度なNMR測定も実現した。平成28年度では高偏極物質の入った試料管に水を投入した後のNMR信号の変化をリアルタイムに測定し、高偏極物質が少しずつ溶解していく様子を分析した。高偏極液体を用いてさまざまな分子を高感度化する方法とさまざまな高偏極液体を生成する方法を発明した。

また、この方法が非常に低コストかつ省スペースで実現できる装置を開発した。本研究により、トリプレットDNPの汎用化学分析や医療診断への応用が今後大きく拓かれるであろう。光励起三重項状態の電子スピンを用いる動的核偏極(トリプレットDNP)法は、極低温を用いる従来法と同程度のNMR感度向上を達成できる。この手法で様々な分子を高感度化可能にし、高感度液体が生成できるようにし、NMR分析やMRIへの道を拓くことが本研究の目的であった。本研究では、水溶性である安息香酸固体の室温下での高感度化について研究を行い、高感度化後に溶解し、高感度液体生成に成功した。また、トリプレットDNP法で様々な分子が高偏極化できるホスト物質と光励起物質の組み合わせを考案した。当初目指していた多くの物質を溶かし込むことが可能な分子の組み合わせを見出し、さらなる高偏極化を実現するためのパルスの数値設計法の実証を行い、より高磁場での実験装置を開発した。当初、固体から液体への偏極転写によって高偏極液体の生成を目指していたが、直接水溶性の物質の高偏極化に成功したため、平成27年度はこれにより高感度な液体NMRの実現を目指す。平成28年度は、数値設計法で偏極移動のパルスを設計しその性能評価を行う。水溶性物質の重水素化などを駆使してさらなる高偏極率の実現を目指す。また、生物学や医学への応用を目指して、高偏極液体を使った化学反応のリアルタイム測定の実現を目指す。磁気共鳴平成27年度は、これまでに見出した光励起三重項状態を持つ分子とホスト物質の組み合わせに対し、第三の物質を溶かして、それが高偏極化可能であることを示す。作成した高磁場用実験装置、数値的に設計したパルスを用いて、さらなる高偏極化が可能であることを示す。さらに様々な実験、温度環境での実験を行い、最適な環境を探索する。可変してまた、計画を変更して高偏極化した固体試料を水に溶かして高感度液体NMRの実現を目指す。平成28年度に寒剤を利用する実験の必要性が生じたため、その分の予算を繰り越した。平成27年度に寒剤を使用する実験の必要性が生じたため、その分の予算を繰り越した。寒剤費用として使う。寒剤費用として使う。
熱帯雨林樹木の乾燥ストレス応答に関する研究

東南アジア熱帯地域で今後予想される降水量の減少や短期的な乾燥頻度の増加が、熱帯雨林樹木に及ぼす影響を評価することを目的として研究を行った。林冠構成種の形態的特性と水利用には密接な関係があり、高い光合成・蒸散能力を持つ樹種は、大径の道管を持つが、日中大きな水ストレスを受け、大乾燥時の死亡率も高くなることが分かった。また、人工的に土壌を乾燥させる操作実験により、フタバガキ科巨大高木は、乾燥に対して葉の吸水能力を改善して耐乾性を高め、水消費を節約して対応していると考えられた。この研究は、東南アジア熱帯雨林地域で今後予想される降水量の減少や短期的な乾燥頻度の増加が、熱帯雨林樹木の生理生態に及ぼす影響を評価することを目的とする。今年度は、研究の開始年度として、(1)熱帯雨林樹木の水分利用と形態的特性との関係、(2)熱帯雨林における過去の降水量変動と樹木の展葉・繁殖・肥大成長の相互パターン解析、(3)操作実験による強度乾燥が樹木の形態や生理に与える影響評価を行った。主な研究成果を以下に示す。(1)マレーシア・ランビル国立公園において、林冠構成種20種の葉の形態と水利用との関係を調査したところ、異圧葉樹種(13種)は大径の道管を持ち、多量の水供給を可能にすることで高い光合成・蒸散能力を実現していた。一方、等圧葉樹種(7種)は小径の道管を持ち、光合成・蒸散能力は低いが、日中の水ストレスを低く抑えるという葉の形態に応じた水利用様式を持っていることがわかった。(2)ランビル国立公園の樹木の肥大成長のタイミングと展葉や繁殖、降水量の関係を調べたところ、熱帯雨林の樹木の多くが、多雨期に当たる11月や12月には肥大成長速度が低下することがわかった。(3)操作実験による土壌水分の低下に伴い、フタバガキ科巨大高木の夜明け前の水ポテンシャルは対照個体よりも有意に低下し、土壌乾燥により水ストレスを受けていることが示された。また、植物の吸水力限界を示す指標となる膨圧損失時の水ポテンシャルも降水遮断期間中に有意に低下し、その値は日中の水ポテンシャルの最低値よりも常に低い値を示すなど、土壌水分の低下に対して、フタバガキ科巨大高木は葉の吸水能力を改善して耐乾性を高め、水消費を節約して対応していることが考えられた。この研究では、東南アジア熱帯雨林地域で今後予想される降水量の減少や短期的な乾燥頻度の増加が、熱帯雨林樹木の生理生態に及ぼす影響を評価することを目的としている。今年度は、(1)熱帯雨林の林内の光環境と樹木の形態的可塑性との関係、(2)熱帯雨林樹木の繁殖に及ぼす乾燥と樹体内貯蔵養分の影響、について評価を行った。(1)マレーシア・ランビル国立公園において、主要な林冠構成種であるフタバガキ科の4樹種について、異なる成育段階や樹冠位置での葉の形態的特性について調査した。その結果、いずれの樹木でも稚樹と成木では明らかに異なった形態をもち、同じ光環境でも成木の方が葉厚、LMA、気孔密度、トリコーム密度が高かった。しかし、成木と稚樹それぞれの生育段階では、各葉の受光量と気孔密度やトリコーム密度の間に明瞭な関係は見出せなかった。特に、成木では樹冠位置もしくは葉ごとに受光量が大きく異なるものの、全ての調査項目で樹冠位置や受光量での有意な違いは見られなかった。つまり、フタバガキ科の林冠構成種は、稚樹から成木に至る成育段階では大きく葉の形態が変化するものの、成木では樹冠位置や個葉レベルで例え光環境が大きく異なっていても、葉の形態的な可塑性はそれほど高くないと考えられた。(2)フタバガキ科の巨大高木Dryobalanops aromaticaについて、成木約30個体の繁殖時期と降水量、及び各個体の樹体内貯蔵資源量の関係を調査したところ、多くの個体が同調的に繁殖を行う時期には常に短期間の少雨期間が観察されるものの、一部の個体は繁殖に参加しなかった。また、これら繁殖しなかった個体の幹のリン濃度は、繁殖を行った個体のリン濃度に比べ有意に低かった。つまり、この樹種の繁殖にはまず樹体内への貯蔵資源の蓄積が必要で、その後の乾燥による水分ストレスをトリガーとして繁殖を行っていることが考えられた。この研究では、熱帯雨林地域で今後予想される降水量の減少や短期的な乾燥頻度の増加が、熱帯雨林樹木の生理生態に及ぼす影響を評価することを目的としている。今年度は、熱帯雨林樹本の耐乾性、及び繁殖頻度に及ぼす環境条件の影響、について評価を行った。(1)シンガポール・ブキティマ保護林において、主要な林冠構成種であるフタバガキ科の2樹種について、稚樹の葉の形態的・生理的特製について調査した。

その結果、Shorea curtisiiは乾燥に強く硬い葉を持ち、光合成能力は低く、水利用効率は高い傾向を示した。逆に、S.leprosulaは柔らかく乾燥に弱い葉を持ち、光合成能力は高いが低い水利用効率を示した。また、濯水を止めて人工的に土壌を乾燥させる操作実験を行ったところ、S.curtisiiは乾燥処理によって耐乾性を高め、光合成能力の低下の抑えていたのに対し、S.leprosulaは他の種に比べて耐乾性が低く、乾燥処理によって光合成能力の低下が見られた。つまり、今後熱帯雨林の乾燥化や降水パターンが変化すれば、耐乾性の低いS.leprosulaは生存確率が低下する恐れかおることが考えられた。(2)マレーシア・ランビル国立公園の主要な林冠構成種であるフタバガキ科のDryobalanops aromaticaについて、生育環境や個体サイズと、樹体内への貯蔵養分の蓄積速度との関係を調査した。その結果、D.aromaticaの樹体内へのリンの蓄積速度に最も大きな影響を与えていたのは土性であることがわかった。各個体のリン蓄積速度は、土壌中の細粒質含量と有意な正の相関関係を示し、逆に土壌中の砂の含量と有意な負の相関関係を示した。これは、保水能力の高い土壌条件においてD.aromaticaのリン吸収速度や成長速度が高くなることを意味している。
血管新生阻害剤の創製を指向した海洋天然物の合成研究

我々が海洋生物の二次代謝産物より見いだした、血管新生阻害活性を示す二種の生物活性天然物について合成研究を行った。イソキノリン側鎖を有する新規ステロイドアルカロイドcortistatin Aについては全合成の鍵となるCD環フラグメントの立体選択的な合成に成功するとともに、構造を単純化した活性リード化合物の設計・合成を行った。また、イソマラバリカン型トリテルペンglobostellatic acid X methyl esterの合成研究の一環として、活性発現に重要な共役オレフィン側鎖を含むBC環モデル化合物の合成に成功した。本研究では、我々が海洋生物の二次代謝産物より見いだした、強力かつ選択的な血管新生阻害活性を示す二種の生物活性天然物について全合成研究を行い、効率的かつ実用的な合成手法の確立を目指すとともに、その構造をモチーフとして、より短工程で合成可能な活性リード化合物を設計・合成するなど、血管新生を標的とする新規な抗がん剤シーズの創製を指向した創薬化学的研究を目的としている。今年度は以下の成果を得た。(1)イソキノリン側鎖を有する新規ステロイドアルカロイドcortistatin Aの全合成研究に着手し、(-)-キナ酸を出発物質としてA環フラグメントを短工程で合成することに成功した。また、Johnson-Claisen転位反応による不斉転写および分子内Michael-aldol反応を鍵としてイソキノリン側鎖を有するCD環フラグメントの立体選択的な合成に成功した。これらの成果は、cortistatin Aの全合成につながる重要な知見である。(2)Cortistatin Aをシーズとする活性リード化合物の創製を目指し、活性発現に重要なA環部とイソキノリン側鎖をリンカーで結合した化合物を設計・合成した。(3)Globostellatic acid X methyl esterの合成研究の一環として、活性発現に重要な共役オレフィン側鎖を含むBC環モデル化合物の合成を行い、イノラートアニオンによる立体選択的オレフィン導入を鍵工程とした効率的な合成法を開発した。また、合成した化合物が血管内皮細胞に対して選択的増殖抑制作用を示すことを見いだした。(1)イソキノリン側鎖を有する新規ステロイドアルカロイドcortistatin Aの全合成研究に着手し、Johnson-Claisen転位反応による不斉転写および分子内Michael-aldol反応を鍵としてイソキノリン側鎖を有するCD環フラグメントの立体選択的な合成に成功した。また、(-)-キナ酸を出発物質として合成したA環フラグメントとのカップリングに成功するとともに、鍵となるB環構築を検討し、全合成達成に向けた知見を得た。(2)Cortistatin Aをシーズとする活性リード化合物の創製を目指し、単純なステロイド骨格にイソキノリン側鎖を導入したアナログ化合物を設計・合成した。また、得られた化合物が良好な血管新生阻害作用を示すことを明らかにした。(3)Globostenatic acid X methyl esterの合成研究の一環として、活性発現に重要な共役オレフィン側鎖を含むBC環モデル化合物の合成を行い、イノラートアニオンによる立体選択的オレフィン導入を鍵工程とした効率的な合成法を開発した。合成した数種の化合物の活性評価によって、共役オレフィン側鎖だけでなく、母核部分も活性発現に関与していることを明らかにした。
クームス陰性自己免疫性溶血性貧血の網羅的診断システムの確立

平成30年度は111例の精査を行った。内訳は、年齢は6ヶ月から92歳で、男女比は44%/56%、直接クームス試験陰性例は92%であった。赤血球結合IgG定量値としては1-1550 IgG分子/赤血球で、抗IgAクームス試験陽性は7例、抗IgMクームス試験陽性は6例であった。また、カラム法抗IgGクームス試験は34例で陽性となり、赤血球洗浄後に7例が陰性化した(低親和性IgG自己抗体の疑い)。検査の1年後に主治医に対して臨床診断と経過についてのアンケート調査を行い、最終診断とする予定であり、治療反応性や短期予後についても明らかにする予定である。精査結果を基にした2件の症例報告論文の共著者ならびに4件の学会発表の共同演者となった。また、AIHAに関する論文を1報執筆した。1冊の書籍の共同執筆者となった。8編のAIHAに関連した総説を執筆した。日本検査血液学会学術集会でAIHAに関する講演を行った。平成27年度から平成29年度の3年間に、322例の精査を行った。その内訳は、年齢は0.1歳から94歳で、男女比43%/57%、直接クームス試験陰性例は297例(92%)であった。赤血球結合IgG定量値としては1-1091 IgG分子/赤血球で、クームス感度以下の症例が162例(55%)、抗IgAクームス試験陽性は29例(10%)、抗IgMクームス試験陽性は31例(10%)であった。また、カラム法抗IgGクームス試験は88例で陽性となり、赤血球洗浄後に55例で陰性化した(低親和性IgG自己抗体の疑い:19%)。1年後臨床アンケート回答は、153例(48%)、無回答168例(52%)。男女比は回答群男/女45%/55%、未回答群42%/58%であり、両群で有意差は認めなかった(p=0.54)。また、年齢はぞれぞれ、57±45歳、56±24歳で両群で有意差は認めなかった(p=0.91)。アンケート結果を最終診断として解析し、クームス陰性AIHAの網羅的診断システムの検証を行う予定である。稀少疾患であるクームス陰性自己免疫性溶血性貧血(AIHA)症例を全国レベルで集積し、3病態(クームス試験感度以下の赤血球結合IgG、IgA/IgM型自己抗体、低親和性自己抗体)を網羅したデータベースの構築を目的に、全国から原因不明溶血性貧血患者の精査を受け付け、平成27年度は111例の精査を行った。111例の内訳は、年齢は0.5歳から94歳で、男女比45%/55%、直接クームス試験陰性例は89%であった。赤血球結合IgG定量値としては1-885 IgG分子/赤血球で、抗IgAクームス試験陽性は10例、抗IgMクームス試験陽性は6例であった。また、カラム法抗IgGクームス試験は34例で陽性となり、赤血球洗浄後に24例で陰性化した(低親和性IgG自己抗体の疑い)。検査の1年後に主治医に対して臨床診断と経過についてのアンケート調査をおこない、最終診断とする予定であり、治療反応性や短期の予後についても明らかにする予定である。平成27年度は例年通りの100件以上の依頼があった。通常は4割程度がAIHAと診断されていることから、順調な症例の蓄積が行われていると考えられる。平成28年度以降も同様なスピードで症例を蓄積し、3病態の頻度・治療反応性・予後について明らかにしたい。精査結果を基にした2件の症例報告論文の共著者ならびに2件の学会発表の共同演者となった。また、AIHAに関する6冊の書籍の共同執筆者となり、5編のAIHAの関する総説の執筆を行った。血液学会と輸血細胞治療学会において、AIHAに関する講演を行った。平成27年度は、全国から原因不明溶血性貧血患者111例の精査を行った。直接クームス試験陰性例は89%であった。赤血球結合IgG定量でクームス感度以下の症例が35例、抗IgAクームス試験陽性は10例、抗IgMクームス試験陽性は6例であった。平成27年度は例年通りの100件以上の依頼があり、通常は4割程度がAIHAと診断されていることから、順調な症例の蓄積が行われていると考えられ、おおむね順調に進展していると判断した。稀少疾患であるクームス陰性自己免疫性溶血性貧血(AIHA)症例を全国レベルで集積し、3病態(クームス試験感度以下の赤血球結合IgG、IgA/IgM型自己抗体、低親和性自己抗体)を網羅したデータベースの構築を目的に、全国から原因不明溶血性貧血患者の精査を受け付け、平成28年度は120例の精査を行った。

120例の内訳は、年齢は0.1歳から92歳で、男女比は37%/63%、直接クームス試験陰性例は93%であった。赤血球結合IgG定量値としては1-680IgG分子/赤血球で、抗IgAクームス試験陽性は12例、抗IgMクームス試験陽性は15例であった。また、カラム法抗IgGクームス試験は31例で陽性となり、赤血球洗浄後に18例が陰性化した(低親和性IgG自己抗体の疑い)。検査の1年後に主治医に対して臨床診断と経過についてのアンケート調査を行い、最終診断とする予定であり、治療反応性や短期予後についても明らかにする予定である。平成28年度は例年通りの100件以上の依頼があった。通常4割程度がAIHAと診断されていることから、順調な症例の蓄積が行われていると考えられる。平成29年度にはこれまでの症例をまとめて、3病態の頻度・治療反応性・予後についての論文の作成を行う予定である。精査結果を基にした1件の症例報告論文の共著者ならびに1件の学会発表の共同演者となった。現在までの結果を輸血学会で発表した。また、AIHAに関する4冊の書籍の共同執筆者となり、2編のAIHAに関する総説の執筆を行った。東北地方ならびに長崎県の血液科医師の勉強会においてAIHAに関する講演を行った。平成28年度は、全国から原因不明溶血性貧血患者120例の精査を行った。直接クームス試験陰性例は93%であった。赤血球結合IgG定量でクームス感度以下の症例が38例、抗IgAクームス試験陽性は12例、抗IgMクームス試験陽性は15例であった。通常4割程度がAIHAと診断されていることから、順調な症例の蓄積が行われていると考えられ、おおむね順調に進展していると判断した。稀少疾患であるクームス陰性自己免疫性溶血性貧血(AIHA)症例を全国レベルで集積し、3病態(クームス試験感度以下の赤血球結合IgG、IgA/IgM型自己抗体、低親和性自己抗体)を網羅したデータベースの構築を目的に、全国から原因不明溶血性貧血患者の精査を受け付け、平成29年度は92例の精査を行った。92例の内訳は、年齢は6ヶ月から94歳で、男女比は49%/51%、直接クームス試験陰性例は95%であった。赤血球結合IgG定量値としては1-1091 IgG分子/赤血球で、抗IgAクームス試験陽性は7例、抗IgMクームス試験陽性は10例であった。また、カラム法抗IgGクームス試験は23例で陽性となり、赤血球洗浄後に13例が陰性化した(低親和性IgG自己抗体の疑い)。平成29年度は例年通りの100件弱の依頼があった。平成30年度にはこれまでの症例をまとめて、3病態の頻度・治療反応性・予後についての論文の作成を行う予定である。精査結果を基にした1件の症例報告論文の共著者ならび2件の学会発表の共同演者となった。また、AIHAに関する3冊の書籍の共同執筆者となり、1冊の書籍の執筆を行った。4編のAIHAに関連した総説を執筆した。輸血学会セミナーと血液事業学会シンポジウムでAIHAに関する講演を行った。平成29年度は、全国から原因不明溶血性貧血患者92例の精査を行った。直接クームス試験陰性例は95%であった。
シナプス形成を引き起こす逆行性因子の産生機構と細胞膜結合蛋白質の役割

神経細胞はその標的細胞の方に軸策を伸ばし、正しい標的を認識して、そこにシナプスと呼ばれる構造を形成する。この、神経細胞が情報を伝え合う場となる、シナプスが、どのようにして出来上がっていくのか、その分子機構を明らかにすることを目的として、研究を進めている。近年、シナプス形成過程を調節する因子として、標的細胞由来の因子が重要な働きをしている可能性が示されている。標的細胞内でどのようなシグナル伝達系が働いて、シナプス形成を調節する因子が産生されるのか、また、シナプス形成を調節する因子のひとつの候補として細胞膜結合タンパク質の可能性を考え研究を開始した。実験系としては、比較的単純で、かつ、豊富な分子生物学的手法が利用できるショウジョウバエ胚・幼虫の神経・筋接合系を使用した。標的細胞内の分子を操作して、その影響を見る良い実験系として、同じ神経細胞がシナプスを作っている、隣り合う二つの筋肉細胞の一方のみ、遺伝子発現を容易に操作できる実験系を確立し、標的由来因子によるシナプス形成への影響を検討した。まず、標的細胞内のCaMKIIの活性化により、シナプス形成がどのように変化するか検討した。後シナプス電流をパッチクランプ法により測定し、シナプス伝達の変化を指標にした。その結果、艀化後3時間以内の幼虫ではCaMKII活性化により、シナプス伝達の促進が見られた。シナプス後部の受容体とシナプス前部の神経終末の形態的観察より、シナプス伝達の促進はシナプス部の増大によることが示唆された。すなわちシナプス後部の受容体の増加とともに、なんらかの逆行性因子を介した、シナプス前部の増大が認められた。さらに、この、メカニズムについて検討している。
インフラマソーム構成タンパクを介した新たな感染防御機構の発見およびその機序の解明

本研究は、病原性細菌と宿主間の相互作用による病態形成機序の解明を目的とし、リステリア感染および肺炎球菌感染おける自然機構インフラマソームの役割を検討した。インフラマソームを構成するASCが致死性リステリア感染モデルにおいてIL-18依存的に感染を増悪化させることを発見し、その機序を明らかにした。また、肺炎球菌肺炎において、ASCがインフラマソーム非依存的にSTAT6活性化を持続させることで粘膜防御因子の発現低下を抑制し、宿主防御に寄与することを見出した。さらに、肺炎球菌がpneumolysinを産生することで肺炎増悪化因子IL-1αの産生をインフラマソーム非依存的に誘導することを報告した。肺炎球菌感染の経鼻感染モデルにおけるインフラマソーム関連タンパクの役割について解析した。その結果、インフラマソームを構成するNLRP3とASCがカスパーゼ-1非依存的に感染防御に貢献することがわかった。NLRP3とASCは複数の気道粘膜抗菌タンパクの遺伝子発現に関わることが明らかになった。それらのタンパクのうち、TFF2が肺炎球菌に対して防御的に働くことが示唆された。また、NLRP3とASCの下流でTFF2およびその他の発現を制御する転写因子(未発表)が同定された。この研究によって新たな気道粘膜防御のメカニズムが示された。本研究は、細菌感染におけるインフラマソームの活性化誘導機序および病態形成における役割の解明を目指して実施されている。マウスのリステリア感染モデルにおいて、感染マウスをアンピシリンで治療する際、インフラマソームが菌の排除を促進していることを新たに明らかにした。In vitroのリステリア感染マクロファージを用いた解析結果から、AIM2インフラマソームを介したパイロトーシスがアンピシリン処理による菌の排除を促進することがわかった。これまで解析を進めてきた肺炎球菌感染の経鼻感染モデルにおいて、前回までにインフラマソーム構成タンパクであるNLRP3とASCが複数の粘膜防御タンパクの発現を促進して宿主防御に貢献することが明らかになっていたが、今回、それら粘膜防御タンパクの発現を正に制御するSTAT6の活性化がNLRP3とASCによって促進される可能性を示した。今年度、肺炎球菌感染の経鼻感染モデルにおいてNLRP3とASCが粘膜防御タンパクの発現を促進する機序の解明を目的にしていた。NLRP3とASCがSTAT6の活性化に関わることが明らかになり、その機序解明に大きく前進した。また、新たにリステリア感染の抗菌薬治療におけるインフラマソームの役割を発見することができ、予想外の新たな研究課題を見出した。マウスのリステリア感染モデルにおいてインフラマソームがアンピシリンによる菌の排除を亢進することをこれまでに明らかにしてきたが、本年度、この機序としてGSDMDが関与することを明らかにした。GSDMDは計画的細胞死の一種であるパイロトーシスのメディエーターであり、インフラマソームがパイロトーシスの誘導を介して抗生物質治療の菌排除の亢進に働くことが強く示唆された。さらに、インフラマソーム-パイロトーシス経路がアンピシリンによるリステリアの排除を亢進する機序として、GSDMDが細胞膜を傷害して抗生物質の細胞内への透過を促進すること、およびアンピシリンへの抵抗性を示すLAMP-1陽性小胞内の菌がパイロトーシス誘導後に小胞外に出されることも今年度の研究結果から示唆された。また、これまでにNLRP3とASCが肺において複数の粘膜防御タンパクの発現を上昇させることで肺炎球菌に対する宿主防御に貢献することを明らかにしてきたが、この防御機構にはIL-33受容体であるST2が寄与しないことが明らかになった。NLRP3とASCによる粘膜防御タンパクの発現上昇にはSTAT6の関与が示唆されており、IL-33は粘膜におけるSTAT6関連応答の誘導に重要なサイトカインであるが、予想外なことにST2の寄与がみとめられなかったことから別の機序の存在が示唆された。計画していた実験を遂行し、論文としてまとめるにほぼ十分な結果を得ることができた。病原性細菌を含む多様な炎症誘導因子がカスパーゼ-1の活性化を誘導する。この自然免疫応答の中心的役割を担うのがインフラマソームと呼ばれるタンパク複合体である。インフラマソームは自然免疫受容体、カスパーゼ-1前駆体、アダプタータンパクASCによって構成され、カスパーゼ-1活性化の場として働く。しかしながら、我々は肺炎球菌の経鼻感染モデルにおいて自然免疫受容体(NLRP3)およびASCが宿主防御に寄与するがカスパーゼ-1は必須ではないことを見出した。これは、インフラマソーム構成タンパクがカスパーゼ-1活性化以外の経路を介して防御的に働く可能性を示唆しているため、その分子機序の解明を目指した。その結果、カスパーゼ-1下流のエフェクターであるIL-1やIL-18の産生ではNLRP3の防御的役割を説明できないことがわかった。そこで、DNAマイクロアレイを用い、肺炎球菌感染時の肺においてNLRP3およびASCに依存的且つカスパーゼ-1非依存的に発現する遺伝子を探索したところ、複数の粘膜防御因子の発現がこの条件と一致することがわかった。

それらの粘膜防御因子のうち、TFF2が肺炎球菌感染で防御的に働くこと、およびintelectin-1が肺炎球菌に結合することが示唆された。これらの粘膜防御因子の発現がNLRP3およびASCに依存する機序を調べたところ、NLRP3とASCが転写因子STAT6の活性化を延長させることでSTAT6依存的に発現する転写因子SPDEFの発現を維持し、SPDEFが直接的あるいは杯細胞の分化を介して粘膜防御因子の発現維持に寄与する可能性が示唆された。本研究は、病原性細菌と宿主間の相互作用による病態形成機序の解明を目的とし、リステリア感染および肺炎球菌感染おける自然機構インフラマソームの役割を検討した。インフラマソームを構成するASCが致死性リステリア感染モデルにおいてIL-18依存的に感染を増悪化させることを発見し、その機序を明らかにした。また、肺炎球菌肺炎において、ASCがインフラマソーム非依存的にSTAT6活性化を持続させることで粘膜防御因子の発現低下を抑制し、宿主防御に寄与することを見出した。さらに、肺炎球菌がpneumolysinを産生することで肺炎増悪化因子IL-1αの産生をインフラマソーム非依存的に誘導することを報告した。今年度の研究目的として、肺炎球菌感染においてNLRP3とASCによって発現が維持される気道粘膜抗菌タンパクの機能解析や発現誘導機序の解明を予定していた。リコンビナントタンパクや経鼻トランスフェクションの実験を行った結果、これらのタンパクのうちTFF2が肺炎球菌に対して防御的に働くことを示すことができた。また、定量的RT-PCRおよびウエスタンブロット法にてTFF2およびその他の気道粘膜抗菌タンパクの発現がASCおよびNLRP3によって正に制御されることを確認した。さらに、その機序としてTFF2およびその他の発現を制御する転写因子(未発表)の発現維持にASCとNLRP3が重要な役割を果たすことを見出した。以上の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。NLRP3とASCがどのような機序でSTAT6を活性化させるか解明する。強制発現系を用いたレポーターアッセイでNLRP3とASCがcell-autonomousにSTAT6を活性化するか否かを判断する。Cell-autonomouである場合はNLRP3とASCがSTAT6と複合体を形成する可能性などを検討する。一方、Cell-autonomouではない場合、NLRP3とASCが何らかのサイトカインの産生を介してSTAT6の活性化を亢進すると考えらえる。そのようなサイトカインの候補としてIL-33に注目しており、その受容体であるST2の欠損マウスを用いて関与を調べる。前年までにAIM2インフラマソームがアンピシリンを用いたリステリア感染マクロファージから菌の除去に関わることを直接的証拠で示すことができた。しかし、パイロトーシスの関与は間接的な証拠に依存している。最近、GSDMDがパイロトーシスの主要なメディエーターであることが報告されたため、GSDMD欠損マクロファーを用いてパイロトーシスの関与を検討する。これまでの結果を論文としてまとめて投稿する。
モンゴル.オホーツク海は存在したか?-ユーラシア大陸形成論に関して-

モンゴル国ハンガイ.ヘンテイ帯東部について,"石炭系"整然層の大部分は付加体の一部であることが判明した.また調査の結果,同帯東部には,以下の3つの剪断帯が存在することが明らかとなった.(1)北部に分布する, top-to theNorthセンスの低角剪断帯.(2)北部に分布する,北東トレンドの右ズレ高角剪断帯.(3)南部に分布する,北東トレンドの左ズレ高角剪断帯.年代測定の結果,(1)の剪断帯はシルル紀以前(1a)と,前期ペルム紀以降(1b)の2回剪断変形を受け,(3)の剪断帯は,後期石炭紀の運動の結果形成されたことが判明した.ユーラシア大陸は、大小様々の数10の小大陸が集合して形成された“超大陸"であり、東アジアでは5ないし6つの大陸ブロック(過去の小大陸)が識別されている。従来、中・古生代において、シベリアと北中国の間には大洋が存在したと推定されており、その大洋("モンゴル-オホーツク海")の閉鎖プロセスは、ユーラシア大陸形成論上、極めて重要である。しかし、一方、シベリアと北中国の間の地域の調査は極めて不十分であり、"モンゴル-オホーツク海"の存在を示唆する地質学的証拠はこれまで発見されていなかった。大洋が縮小・閉鎖する際には、大陸縁において海洋プレートが大陸の下に沈み込み、その痕跡は付加体として残される。したがって、"モンゴル-オホーツク海"の存在を立証する上では、「シベリアと北中国の間に付加体が存在するのかどうか?」が一つの鍵となる。申請者らはこれまで、上記の観点よりモンゴル中央部のハンガイ-ヘンテイ帯の調査を行ってきた。同帯は従来、デボン石炭紀の浅海成陸棚層と考えられていたが、調査の結果、「ハンガイ-ヘンテイ帯の少なくとも一部は付加体である」ことが明らかとなり、現在、"モンゴル-オホーツク海"の存在が立証されつつある。また申請者らの予察的研究によると、ハンガイ-ヘンテイ帯に分布する玄武岩の化学組成は、この"モンゴル-オホーツク海"がスーパープリューム活動によって形成された可能性を強く示唆する。このことは、"モンゴル-オホーツク海"成因論に関してだけではなく、古生代における全地球テクトニクスを考える上でも極めて重要である。本研究では、これまでの研究をさらに進め、"モンゴル-オホーツク海"の実体と、その形成-閉鎖史の解明を目指す。モンゴル国ハンガイ.ヘンテイ帯東部について,"石炭系"整然層の大部分は付加体の一部であることが判明した.また調査の結果,同帯東部には,以下の3つの剪断帯が存在することが明らかとなった.(1)北部に分布する, top-to theNorthセンスの低角剪断帯.(2)北部に分布する,北東トレンドの右ズレ高角剪断帯.(3)南部に分布する,北東トレンドの左ズレ高角剪断帯.年代測定の結果,(1)の剪断帯はシルル紀以前(1a)と,前期ペルム紀以降(1b)の2回剪断変形を受け,(3)の剪断帯は,後期石炭紀の運動の結果形成されたことが判明した.【野外調査】当年度は,夏と秋にモンゴルのハンガイーヘンテイ帯(後期古生代付加体)における野外調査を実施した.それぞれのメンバーは以下の通りである.夏(7月22日8月12日):束田,大藤(富山大学),栗原(新潟大学),セルスマ(モンゴル科学技術大学),上久保(名古屋大学),大音(富山大学)秋(10月15日22日):足立,セルスマ,ミンジン(モンゴル科学技術大学)当初は全員で調査を行う予定であったが,夏調査直前に勃発した暴動騒ぎのため,調査を2回に分けざるを得なかった.夏隊は,ハラホリン地域でエルデンツォグト層の地質構造解析と微化石解析用試料の採取を行い,さらにバヤンホンゴル・ウランバートル両地域で同位体年代測定用花崗岩試料の採取を行った.秋隊はウランバートル地域で石炭系アルタンオボー層の堆積学的調査を実施した.【室内実験】モンゴルで採取したデータと試料を日本に帰国後に解析した結果,以下のようなことが判明した.従来,モンゴル中央部に位置するハンガイーヘンテイ帯(東西1200km,南北600km)は,東西方向の軸を持つ大褶曲構造をなす可能性(褶曲モデル)が指摘されていたが,少なくともハラホリン地域のエルデンツォグト層の地質構造は,褶曲モデルと調和的ではないことが明らかとなった.ハラホリン地域のエルデンツォグト層について微化石の検討を行ったところ,デボン紀の放散虫化石を得た.この地域から微化石が見つかったのは初めてであり,ハラホリン地域のエルデンツォグト層がゴルヒ層に対比される強い根拠となる.バヤンホンゴル・ウランバートル両地域の花崗岩類について年代測定を行ったところ,従来知られていないオルドビス紀の花崗岩を発見した.後期古生代付加体(ハンガイーヘンテイ帯)に付随してオルドビス紀の花崗岩が分布することは,ユーラシアのテクトニクスを考える上で非常に重要な知見である.本研究では,これまでの研究をさらに進め,"モンゴル-オホーツク海"の実体と,その形成-閉鎖史の解明を目指す.本目的に資するため,平成21年度は8月9月にかけて延べ40日間,モンゴルでの現地調査を実施し,その後日本国内で採取試料の解析を行った.

その結果,ウランバートル周辺に広く分布する石炭系整然層の層序について,従来オリゴッチ層の下位層と考えられていたアルタンオボー層が,実はオリゴッチ層の上位層であることが明らかとなった.また詳細な層序解析と岩石の薄片観察を行ったところ,オリゴッチ層堆積時に後背地で起こっていた珪長質火山活動が,アルタンオボー層堆積時には終息し,後背地の環境に大きな変化があったことが判明した.このことはアルタンオボー層堆積時に大陸前縁での海洋プレートの沈み込みが止まった(終了した?)可能性を示唆し,"モンゴル-オホーツク海"の閉鎖史を考える上で非常に興味深い.また,ウランバートル周辺に分布する付加体の構造解析を行ったところ,従来別の地質体と考えられていたウランバートル・ハラホリン両テレーンは一連のものであり,後者は前者の西方延長の地質体であることが明らかとなった.このことはモンゴル中央部に分布する付加体が従来考えられていたものより遙かに大きいことを意味し,"モンゴル-オホーツク海"の規模を推定する上で非常に重要なデータである.また,この付加体中の玄武岩の化学組成を分析したところ,ポリネシア型OIBであることが判明した.本研究では,これまでの研究をさらに進め,"モンゴル-オホーツク海"の実体と,その形成-閉鎖史の解明を目指す.本目的に資するため,平成22年度は8月9月にかけて延べ40日間,モンゴルでの現地調査を実施し,その後日本国内で採取試料の解析を行った.その結果,ウランバートル周辺に広く分布する石炭系整然層について,その分布域の南部約三分の一が付加体のゴルビ層に帰属する可能性が高いことが明らかとなった.このことは,両者(付加体と整然層)関係を考える上で重要な事実である.また,ハンガイ・ヘンテイ帯の付加体に発達する脆性延性剪断帯の構造解析を行ったところ,ハンガイ・ヘンテイ帯の剪断帯は以下の3つに区分できることが明らかとなった.(1)同帯北部のtop-tothe Northセンスの剪断帯.低角ほぼ水平の面構造を持ち,434と462Maのシンテクトニックな深成岩類に貫入されている.また剪断帯には,277Maの花由岩礫が含まれる.この事実は,この剪断帯は,少なくともシルル紀以前とペルム紀以降の2回の剪断運動を経ていることを示唆する.(2)同帯北部のNEトレンド・右横ズレ剪断帯.(3)同帯南部のNEトレンドの左横ずれ剪断帯.この剪断帯は314と278Maの花崗岩類に貫入されており,剪断帯(1)によって切られている.このことより,同帯では以下のような地史が考えられる.【シルル紀】top-to the Northセンスの運動が大陸縁(ハラア層群)に沿っておこった.【デボン紀石炭紀?】大陸下に海洋プレートが沈み込み,付加活動が継続した.【後期石炭紀】左横ズレ運動が付加体(ハンガイ・ヘンテイ帯)の南縁に沿っておこった.【ペルム紀以降】top-to theNorthセンスの剪断運動が付加体北縁に沿っておこり,上記の左横ずれ剪断帯を切った.結果として,ハラホリン断層に沿った「ウランバートルテレーンとツェツェルレグテレーンの重複」がおこった.ウランバートル地域に分布する砕屑岩は,下位よりアルタンオボー層とオリゴッチ層に区分され,"石炭系整然層"と位置づけられている.しかし詳細な岩相・層序については不明な点が多く,時代についても"Viseanの腕足類化石を産する"という記述があるものの化石の記載等はなく,時代考証に疑義があった.
被虐待児の箱庭作品、コラージュ作品の査定の合理性に関する比較研究

箱庭作品においては、箱庭印象評定尺度を用いて箱庭療法実践者と箱庭療法初心者による評価特徴を明らかにし、箱庭療法実践者と箱庭療法初心者における「箱庭の見方」の相互性について検討した。コラージュ作品においては、コラージュ印象評定尺度、判断軸を用いて、コラージュ療法実践者からの印象内容の特徴を把握し、初心者からの評価として「コラージュ・スコアリング・カテゴリー」を用いて評価内容の特徴を明らかにしコラージュ療法実践者と初心者の「コラージュの見方」の相互性について検討した。本研究は、児童養護施設での箱庭技法、コラージュ技法を用いた調査研究を基盤にしている。その中での特色の1つとして、箱庭作品においては、箱庭印象評定尺度を用いて、箱庭療法実践者と箱庭療法初心者による評価特徴を明らかにし、箱庭療法実践者と箱庭療法初心者における「箱庭の見方」の相互性について検討することである。コラージュ作品においては、山上(2010)が簡便で客観的に体系化された解釈基準の必要性からハンドテストの評価システムをコラージュ作品に適用した「コラージュ・スコアリング・カテゴリー」を作成し初心者でも可能なコラージュ作品の査定の試みを行っている。しかし、印象評定尺度や判断軸との関係については論じておらず、コラージュ作品の査定に関する合理性に関しては十分に確立されていない。そこで、コラージュ印象評定尺度、判断軸を用いてコラージュ療法実践者からの印象内容の特徴を把握し、さらにコラージュ・スコアリングカテゴリーを用いた初心者からの評価内容の特徴を明らかにし、コラージュ作品の査定に関する合理性について検討することである。2つ目の特色として、箱庭療法、コラージュ療法を継続的に実施し、児童養護施設での臨床的効果をより確実なものとして「評価」を用いて実証していくことである。以上のように、被虐待児の箱庭作品、コラージュ作品による臨床的特徴と評価について検討することにより、技法が児童養護施設において治療的効果があることや心の傷をいやし心の成長を促進させる予防的意義もあることを明らかにしその有効性について検証することである。27年度は、収集した箱庭作品、コラージュ作品を箱庭印象評定尺度、コラージュ印象評定尺度、判断軸、コラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いて評価し、査定の合理性について検討した。1箱庭内容分析(箱庭表現特徴):収集した作品について、玩具の特徴、初動時間、玩具数、玩具の種類に視点を当て分析し、被虐待児の箱庭表現の特徴を再考した。2箱庭作品の評価に関する分析:箱庭印象評定尺度を用いて、箱庭療法の実践経験のある臨床心理士3名に全作品を対象として評価を行ってもらった。さらに、箱庭療法の実践経験のない初心者50名に全作品を対象として評定を行ってもらい、被虐待児箱庭作品の評価の相互性について検討した。3コラージュ作品分析(形式・内容分析):収集したコラージュ作品について形式・内容分析を行った。形式分析として、タイトルの有無、切片数、余白量など全体表現の特徴と切り方、貼り方などの表現特徴を把握した。また、内容分析として、人間、動物、自然風景などの出現について分析し、すでに収集している作品と合わせたコラージュ作品について被虐待児のコラージュ表現の特徴を再考した。4コラージュ作品の評価に関する分析:コラージュ印象評定尺度、判断軸を用いて、コラージュ療法の実践経験のある臨床心理士3名に全作品を対象として評定を行ってもらった。また、コラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いて、コラージュ療法初心者から全作品を評定してもらい、印象評定尺度、判断軸、コラージュ・スコアリング・カテゴリーの評価から査定の合理性について検証した。27年度は、箱庭作品、コラージュ作品の追加収集を行い(箱庭作品10名、コラージュ作品20名)、今まで収集した箱庭作品、コラージュ作品を箱庭印象評定尺度、コラージュ印象評定尺度、判断軸、コラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いて評価を始め研究に取り組んだ。その中での特色の一つとして、箱庭作品においては、箱庭印象評定尺度を用いて箱庭療法実践者と箱庭療法初心者による評価特徴を明らかにし、箱庭療法実践者と箱庭療法初心者における「箱庭の見方」の相互性について検討することである。そこで、研究全体を通じて、コラージュ印象評定尺度、判断軸を用いて、コラージュ療法実践者からの印象内容の特徴を把握し、さらにコラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いた初心者からの評価内容の特徴を継続的に実施し、児童養護施設での臨床的効果をより確実なものとして「評価」を用いて実証することを試みた。平成28年度は、3つの評価方法を用いて臨床的効果を継続した面接を通して比較検討を試みた。実践数が少なかったが、コラージュ療法を用いた事例を日本心理臨床学会で発表した。

以上、3年間実施した、被虐待児の箱庭作品、コラージュ作品による臨床的特徴と評価について検討することにより、技法が児童養護施設において治療的効果があることや心の傷をいやし、心の成長を促進させる予防的意義もあることが明らかになり、その有効性について検証するこが出来たと思われる。箱庭作品においては、箱庭印象評定尺度を用いて箱庭療法実践者と箱庭療法初心者による評価特徴を明らかにし、箱庭療法実践者と箱庭療法初心者における「箱庭の見方」の相互性について検討した。コラージュ作品においては、コラージュ印象評定尺度、判断軸を用いて、コラージュ療法実践者からの印象内容の特徴を把握し、初心者からの評価として「コラージュ・スコアリング・カテゴリー」を用いて評価内容の特徴を明らかにしコラージュ療法実践者と初心者の「コラージュの見方」の相互性について検討した。本研究は、児童養護施設でのコラージュ技法を用いた調査研究を基礎としている。申請者は、すでに平成23年平成25年度科学研究費補助金研究課題「基盤研究(C)研究課題「被虐待児の箱庭技法、コラージュ技法の臨床的特徴」において、80名のコラージュ作品を収集している。そのため26年度は、追加データとして、70名一人一人のコラージュ作品を収集する予定で研究に取り組んだ。対象は、児童養護施設入所児童生徒70名(小学生20名、中学生25名、高校性25名)を予定し調査研究を行ったが、現在のところ50名のデータ収集になっている。実施に当たっては、児童養護施設長に研究目的などを説明する文章を提示し研究への協力を依頼し了解を得て実施した。なお、研究実施に当たっては、倫理的配慮等に関する審査申請書を大学に提出し承認を得て実施した。27年度に引き続き、箱庭、コラージュ作品を箱庭印象評定、コラージュ印象評定尺度、判断軸、コラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いて評価をし検討する予定である。同時に、箱庭技法、コラージュ技法を用いた関わりを申請者が継続して行い、3つの評価方法を用いて、その臨床的効果を比較検討し、箱庭技法、コラージュ技法の有効性について考察する予定である。社会学26年度に引き続き、箱庭、コラージュ作品の収集を収集を行い、コラージュ作品を第3者からの印象内容の特徴を明らかにし、コラージュ療法の効果の違いについて検討する予定である。今村(2006)のコラージュ印象評定尺度(SISS:Collage Impression Scoring Scale)、森谷(1999)の提案している判断軸を使用する。また、コラージュ・スコアリング・カテゴリーを用いて、コラージュ療法初心者からの全作品を評定してもらい、印象評定尺度、判断軸、コラージュ・スコアリングカテゴリーの評価の比較検討を行う予定である。物品費で、26年度はパーソナルコンピューターを購入予定であったが、調査のためにタブレット購入に変更し、また、箱庭用具も購入しなかったため、使用額が少なかったと思われる。旅費に関しては、学会への出席が予定より少なく、研修会もいけなかったことによると思われる。人件費に関しては、調査データの整理が遅れたため、人件費にも影響したと思われる。27年度は、26年度購入予定であった物品や図書関係に使用したい。また、研究がコラージュや箱庭作品を写真に保存し使用するため、プリンターの購入を考えている。
新規電顕三次元再構築法による足細胞の突起形成・退縮過程の解析

足細胞の高度な突起構造は糸球体濾過バリアの形成に重要な役割を果たしている。この突起構造は発生初期の単純な細胞から形成され、病態時には退縮し扁平な突起に再構築されることが知られている。しかし、足細胞の複雑性や培養下で突起構造が再現されない等の理由から、突起の形成・退縮がどういった形態的プロセスを経て進行するのかは不明なままである。本研究では新規の三次元電子顕微鏡技術(ブロック断面SEM観察法)を活用し、足細胞における突起形成・退縮過程を三次元的に明らかにした。本年度は連続SEM断面観察法(FIB/SEM法)を活用し、主として発生期における足細胞の突起形成の形態的プロセスを明らかにした。糸球体発生の初期段階では、足細胞はタイト結合(TJ)やアドヘレンス結合(AJ)で連結された円柱上皮を成している。既にこの段階で、隣接する細胞間で細い突起(原始足突起primitive foot processesと仮称)による噛み合い構造が形成されていた。ただし、前足突起間にはスリット膜を含む細胞間結合装置はほとんど見られなかった。さらに発生が進むと、足細胞は互いに一次突起を伸ばして組み合うようになる。伸び出しつつある一次突起の辺縁からは前足突起が出ているのだが、前足突起間にタイト結合とアドヘレンス結合が新たに形成されることで前足突起は未熟足突起(immature foot processes)となる。未熟足突起間の結合装置は最終的にスリット膜に置き換わることでスリット間隙が形成され、未熟足突起は成熟足突起となる。連続SEM断面観察法による撮影を当初は学外の研究機関で実施することを予定していたが、平成27年5月に本学にHelios NanoLab 610 FIB/SEMが新規に導入され、これを利用することで短期間に極めて効率よくデータを取得できたため。足細胞の突起形成過程に関するデータは現時点で原著論文として投稿中であり、突起退縮過程に関してもデータ取得・解析が効率よく進行している。本年度は連続SEM断面観察法(FIB/SEM法)を活用し、主としてネフローゼ症候群モデル(PAN腎症ラット)の傷害足細胞において、突起構造の消失過程をFIB/SEM法により解析した。正常な足細胞では、細胞体と一次突起の下面に細い畝状隆起が形成されている。足突起は畝状隆起の左右から櫛の歯のように左右に伸び出ており、足細胞は畝状隆起と足突起により基底膜と接着する。傷害の初期では、足突起の又の部分に「水掻き」ができるようにして、畝状隆起が拡大し、細胞体と一次突起が広い面積で基底膜と接着するようになる。また、足突起の根元は水掻きの形成により細胞体や一次突起に取り込まれ、短縮することになる。最終的に一次突起は広いシート状の突起に変化し、辺縁に短い不整な足突起を残すのみとなる。データ取得のさらなる効率化を目指し、撮影方法の改良を順次進めている。解剖学、三次元超微形態解析