hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個体群・個体・個葉光合成の同時測定によるリンゴ樹の気象反応と物質生産機能の解明

リンゴ樹の光合成・呼吸速度を個体群、個体および個葉レベルで総合的に観測・解析した。個体群レベルでは、CO2フラックスを複数の地点で同時に観測し、昼間のCO2吸収量が下草刈取り直後に毎回激減することを見いだした。また観測精度向上のためフラックスの空間的非一様性、熱収支充足率や土壌呼吸速度を解析した。個体レベルでは、成木用同化箱を制作して光合成速度を長期間測定し、晴天日に光合成の日中低下がおこること、日々の光合成量は日射量に強く依存すること、少着果年より多着果年の方が光合成速度が高いことを見いだした。個葉レベルでは、光合成の日中低下が気孔閉鎖を伴う場合と伴わない場合があることを見いだした。本研究は、個体群レベル、個体レベル、個葉レベルの光合成・呼吸速度測定を、同一のリンゴ園で気象環境をモニタリングしながら統一的に実施する中で、リンゴの物質生産機能に関する有用な知見を得ることをねらいとしている。個体群レベルの観測は、平成18年度から実施されてきたが、資金不足等から一部の測器に不具合が生じていた。平成23年度は、まず観測を完全に中断して全ての測器を実験室で入念に修理調整しつつ、借用資材の炭酸ガス・水蒸気変動計と老朽化した超音波風速温度計については本研究予算で購入・更新した。その後屋外で機器の相互検定を実施し、7月からボーエン比法での、10月から渦相関法での観測を再開した。ボーエン比法では、光合成・呼吸速度を算出する際、融雪熱量ならびに群落内貯熱量を推定の上考慮できるよう計算過程を改良したため、観測結果の信頼性が一層高まり、研究成果の一部を学会で報告した。渦相関法では、樹列間(メインタワー)に加えて樹列上(サブタワー)でも同時に観測を実施し、1011月で主風向が樹列に概ね平行な昼間の時間帯に絞って、2地点の顕熱輸送量、潜熱輸送量ならびに対流構造を比較した。その結果、樹列上で下降して縦列間で上昇する継続時間数十秒の対流が時折見られたものの、より長い時間スケールで見ると下降気流と上昇気流の発生頻度、顕熱・潜熱輸送量のいずれにも地点間差は認められなかった。この結果は、渦相関法の観測結果がタワー設置位置に依存しないことを示唆するが、夏季の強日射条件下や主風向が異なる場合についても解析する必要がある。個体レベルの計測は、供試樹の近傍まで電源を敷設し、観測小屋を設置するとともに、チャンバーの設計を行って必要な諸資材を購入したが、圃場にチャンバーを制作・設置して試運転するには至らなかった。なお、個葉レベルの計測は平成24年度からの実施予定である。個体群の二酸化炭素フラックスは、渦相関法により樹列間(メインタワー)の高さ9mと7mならびに樹列上(サブタワー)の高さ9mの計3地点で、ボーエン比法により樹列間(メインタワー)の1地点で観測した。大気が不安定でかつ樹列に沿って風が吹く事例を選んで、渦相関法による樹列間と樹列上の観測を比較・解析したところ、二酸化炭素フラックスは樹列上においてより大きく計算され、その傾向は大気の不安定度が強いほど顕著であった。このことから、日中においては1鉛直に二酸化炭素を輸送する乱流は樹列間より樹列上で顕著に発達する、2このような対流構造の非一様性は風向に応じて観測精度に影響する、と考察した。更に、供試圃場で過去に計測した土壌呼吸速度について、地温、土壌水分との関わりを解析して学会発表した。個体レベルの光合成速度は、5月中旬から11月中旬まで3週間おきに、それぞれ約5日間計測した。計測結果を個体群の二酸化炭素フラックスと比較することにより、草刈り実施直後の刈草からの二酸化炭素放出量に関する知見などを得つつある。また、本年は供試個体の摘果強度を昨年と大きく変えた上で、光合成速度の日中低下現象について詳しく解析した。その結果、日中低下は晴天・快晴日だけに、土壌乾燥の有無に関係なく見られ、強摘果されるとより顕著になることを見いだした。このことから、日中低下の原因として水ストレスより摘果によるシンク制限が重要であると考え、学会で発表した。個葉レベルの光合成の測定は、個体レベルの光合成の計測に特に力を注いだこともあり、残念ながら実施できなかった。

個体群レベルの研究は、二酸化炭素フラックスの計測を、平成23年に引き続き、渦相関法により樹列間(メインタワー)および樹列上(サブタワー)の2カ所で、ボーエン比法により樹列間(メインタワー)で実施し、観測結果の蓄積を図った。なお、ボーエン比法による二酸化炭素フラックスの算出には日射量や気温、湿度が必須であるが、平成24年はこれらの観測結果ならびに降水量、風速の観測結果を利用して、土壌水分張力(pF)を推定する研究を行った。考案したモデルは簡易なものであるが、日々のpF値を上述の気象要素から相応の精度で推定することが出来、研究成果を学会ならびに学会誌で公表した。個体レベルの研究では、昨年購入した諸資材を用いて圃場に個体用チャンバーを8月までに制作・設置し、910月に延べ14日間の予備的測定を行って性能を検証した。測定期間中の供試個体の光合成速度ならびに蒸散速度は、日射量に追随する妥当な日変化を示したが、光合成速度は個体群レベルの二酸化炭素フラックスより大きく、蒸散速度は個体群レベルの蒸発散速度より小さくなる傾向があり、原因の一つとしてチャンバーへの給気量不足が考えられた。研究成果は学会でポスター発表した。個葉レベルの研究では、携帯型の光合成・蒸散測定装置を購入し、予備的な計測を実施した。しかし、装置の納品が9月末となったため、本格的な実験に着手することはできなかった。本研究は、個体群レベル、個体レベル、個葉レベルの光合成・呼吸速度測定を、同一のリンゴ園で気象環境をモニタリングしながら統一的に実施する中で、リンゴの物質生産機能に関する有用な知見を得ることをねらいとしている。個体群レベルの研究では、平成25年度に使用した3台の二酸化炭素・水蒸気変動計のうち1台を返却せざるを得なくなった。そのため、渦相関法による二酸化炭素フラックス観測は樹列間(メインタワー)と樹列上(サブタワー)の2地点(共に高さ9m)に限定して実施した。ボーエン比法による観測は昨年同様、メインタワー1地点で実施した。風向に応じ、樹列上と樹列間でフラックスの計算値にどのような差異が見られるのか、今後解析を進める。個体レベルの光合成速度は、5月上旬から11月中旬まで3週間おきに、それぞれ約5日間計測した。平成26年度は供試個体に前年度より果実を多く結実させて実験した。その結果、光合成速度の日中低下現象は前年同様に見られるものの低下程度は前年より弱く、前年より光合成能力が高まっていることが確認された。また、3年間の測定を通して、リンゴ個体の1日の光合成量は年次毎に当該日の積算日射量でほぼ決定されることを見いだし、学会で発表した。個葉レベルの光合成速度は、5枚のリンゴ葉を選定の上、5月、6月、7月、10月の各1日、早朝から夕刻まで継続して測定を実施して、飽和光下光合成速度、光飽和点の季節変化や日中低下現象の有無・程度について解析した。5月の測定では、16時頃に多くの葉で光合成速度がゼロを示し、数十分間の強光照射によって突然能力を回復する興味深い現象が見られた。光合成停止中は蒸散も停止していたことから、気孔の閉鎖によるものと考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。農業気象学、果樹園芸学26年度が最終年度であるため、記入しない。個体群レベルの研究は、既存の気象機器の故障や、新規気象測器の購入遅延などのため、観測期間が当初予定より短くなったものの、現在は順調に観測されている。
数値化環境技術を用いた鋼構造物の長期間の力学性能評価シミュレーションに関する研究

ライフサイクルコストを考慮した鋼構造物の性能設計では初期の建設時の力学性能のみならず維持管理コストの評価のために長期間の劣化や補修が力学性能の変化に及ぼす影響を予測する必要がある.とくに,長期間の腐食による劣化の影響を予測することは困難な問題である.この問題を扱うには,(1)腐食に作用する環境の評価,(2)与えられた環境下での腐食の進行,および(3)腐食による鋼構造物の力学的性能の劣化を論じる必要がある.(2)の点についての研究データの蓄積が進んでいるのに対し,(1)と(3)についてのシミュレーション技術の導入の必要性は高く,この点について検討した.(1)鋼構造,特に橋梁では腐食に影響する直接の要因は水分や塩分などの汚染物質の付着である.これを数値的に検討するために数値熱流体解析を行った.具体的には空気中の湿度の箱桁内への流入,箱桁本体を通じての熱の移動について数値解析を行い,現地観測結果との比較検討を行った.その結果,箱桁内の温度については外気温との関連性をほぼ数値的に再現できることがあきらかになった.また,自然環境の中では問題となる初期境界条件については,周辺の気象条件との整合性を持たせるために,メソスケール気象解析プログラムとの連携をはかった.現地観測結果との比較によれば,周辺のアメダスデータ等から内挿するよりも妥当なデータが得られることを確認した.さらに,空気中に浮遊する汚染物質の橋梁面への付着のシミュレーションも行ったところ,数値シミュレーションにより予測される付着量と,観測されている腐食量に一応の相関関係が見られた.(3)長期間の力学性能を評価するシミュレーションとして,腐食による耐力低下の過程および補修による耐力復元の過程等の履歴を正確に考慮し,建設の初期状態から将来に至るまで構造物の力学性能の変化を時系列的に追跡しうる部材体積の変化量を新たなパラメータとしたシミュレーションを行った.保有する汎用流体解析プログラムSTAR-CDをもとに必要なユーザーサブルーチンを追加開発することで計算機内に構造物周辺の腐食環境を再現する方法について検討するとともに,申請者らがすでに開発した腐食欠損履歴を考慮した耐力低下を時系列的に予測する構造解析システムとの統合方法を検討した.さらに,現有の腐食環境センサーACMセンサーなどを用い実際の腐食環境を測定し構築した数値腐食環境の妥当性を検証する方法についても検討した.具体的には以下の検討を行った1.水蒸気の結露および飛来塩分の付着の問題に対し汎用流体解析プログラムSTAR-CDを用いる数値シミュレーションを試みる.そのためにまず,2主桁を対象に一定風速下での水蒸気の分布の検討.2.腐食欠損履歴を考慮した力学性能低下を評価する構造解析法の精度確認を行うために実験を実施しと1.との統合法の検討.3.2.での統合に必要な環境要因と鋼材の腐食欠損の関係を定量化.数値環境空間の精度を実測により検証する方法について検討.ライフサイクルを考慮した鋼構造物の性能設計では初期の建設時の力学性能のみならず維持管理コストの評価のために長期間の劣化や補修が力学性能の変化に及ぼす影響を予測する必要がある.とくに,長期間の腐食による劣化の影響を予測することは現在非常に困難である.そこで,今年度は前年度検討した数値環境空間の妥当性を飛来塩分量,湿度,温度に対して実験,実測により検証した.つぎに,数値環境空間と腐食欠損履歴による力学性能を評価する構造解析とを環境要因と腐食欠損量を予測するモデルを介して統合し,鋼構造物のライフサイクルにおける腐食欠損履歴による力学性能変化の評価システムの構築を試みた.また,将来の高速計算機環境での問題点や拡張可能性などについて検討した.1.環境空間の妥当性を閉じた人工環境での実験と実環境での実測により検証した.実験は名古屋工業大学の環境実験室,実測は日本海に面した福井県を行った.福井県での実測は継続中である.2.数値環境空間を腐食欠損予測モデルを介し構造解析に統合し,鋼構造物のライフサイクルにおける腐食による時系列的な力学性能変化の評価システムを構築した.3.完成されたパイロットシステムをもとにその妥当性を検証し,高速計算機環境での問題点や拡張可能性などについて検討した.4.汎用流体解析プログラムSTAR-CDを用いた腐食環境シミュレーションおよびメソスケール気象モデルMM5による数値環境空間の実現を行い,実測結果と比較しそれらの妥当性について検討した.ライフサイクルコストを考慮した鋼構造物の性能設計では初期の建設時の力学性能のみならず維持管理コストの評価のために長期間の劣化や補修が力学性能の変化に及ぼす影響を予測する必要がある.とくに,長期間の腐食による劣化の影響を予測することは困難な問題である.この問題を扱うには,(1)腐食に作用する環境の評価,(2)与えられた環境下での腐食の進行,および(3)腐食による鋼構造物の力学的性能の劣化を論じる必要がある.(2)の点についての研究データの蓄積が進んでいるのに対し,(1)と(3)についてのシミュレーション技術の導入の必要性は高く,この点について検討した.(1)鋼構造,特に橋梁では腐食に影響する直接の要因は水分や塩分などの汚染物質の付着である.これを数値的に検討するために数値熱流体解析を行った.具体的には空気中の湿度の箱桁内への流入,箱桁本体を通じての熱の移動について数値解析を行い,現地観測結果との比較検討を行った.その結果,箱桁内の温度については外気温との関連性をほぼ数値的に再現できることがあきらかになった.

また,自然環境の中では問題となる初期境界条件については,周辺の気象条件との整合性を持たせるために,メソスケール気象解析プログラムとの連携をはかった.現地観測結果との比較によれば,周辺のアメダスデータ等から内挿するよりも妥当なデータが得られることを確認した.さらに,空気中に浮遊する汚染物質の橋梁面への付着のシミュレーションも行ったところ,数値シミュレーションにより予測される付着量と,観測されている腐食量に一応の相関関係が見られた.(3)長期間の力学性能を評価するシミュレーションとして,腐食による耐力低下の過程および補修による耐力復元の過程等の履歴を正確に考慮し,建設の初期状態から将来に至るまで構造物の力学性能の変化を時系列的に追跡しうる部材体積の変化量を新たなパラメータとしたシミュレーションを行った.
転写因子によるヒト口腔扁平上皮癌の浸潤・転移機構の総合的解析

われわれの研究は浸潤・転移関連分子の発現に関与する転写因子の共通性に着目し,転写因子(AP-1,AP-2,SP-1,NF-Kappa B)と浸潤・転移能の獲得の関係を解明しようとするものである。われわれが樹立したヒト扁平上皮癌細胞株SQUU(同所性移植法にて,SQUU-Aは膨張性発育を示すが,脈管内浸潤や頚部リンパ節転移はなく(0/13匹),SQUU-Bは筋組織や脈管内浸潤を示し,頚部リンパ節転移を(86.7%,13/15匹)示す。)を用い検討した。In vitroの浸潤能の評価(無刺激)にて,両癌細胞株には相違を認めたが,共に転写因子AP-1,AP-2,SP-1の転写活性を認め,NF-Kappa Bの転写活性はなかった。増殖因子(TNF-α,HGF,TGF-α,TGF-β,bFGF)やサイトカイン(IL-1α,IL-1β,IL-8,IL-12)の刺激により各癌細胞株の浸潤能が1番高かったのはTGF-αで,非転移性癌細胞株は0.92%,転移性癌細胞株は48.4%であり,刺激後両癌細胞の浸潤能の差がさらに大きくなった。興味深いことに,転移性癌細胞株では,刺激により細胞外マトリックス分解酵素(MMP)の転写因子であるAP-1の転写活性が高くなる増殖因子やサイトカインが多く,刺激後MMP-2の活性型が転移性癌細胞株には出現したが,転移能のない癌細胞株には認められなかった。また,転移性癌細胞株をTGF-βにて刺激した場合,MMP-2の産生量の増大とMMP-2の転写因子であるAP-2の転写活性の増大が認められた。これらより,AP-1やAP-2の転写活性の増大がMMPの産生や活性を促し,浸潤能を増強した可能性が考えられた。ただし,無刺激時にもAP-1やAP-2の転写活性はあったが浸潤能に差があったことを考えると,これだけでは不十分である。TNF-α,IL-1α,IL-1βの刺激によって,両癌細胞株に浸潤能やMMP-9の産生量およびMMP-9の転写因子であるNF-Kappa Bの転写活性が認められ,両癌細胞間には相違はなかった。以上より他の転写因子の解析が必要であると考え,解析を行っている。)を用い検討した。同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のあるヒト口腔扁平上皮癌細胞株(本研究者樹立)において,浸潤・転移関連因子の発現と転写因子について解析を行った。<発現の相違が得られた浸潤・転移関連因子>細胞外基質分解酵素MMP-9(ゼラチンザイモグラフィー)および血管新生因子VEGFのisoform189(RT-PCR法)が高転移性クローンには発現していたが,転移能のないクローンには発現していなかった。接着分子インテグリンVLA-2(FACS法)は高転移性クローンでは強発現していたが,転移能のないクローンでは発現が弱かった。

サイトケラチン14は高転移性クローンでは発現していなかったが,転移能のないクローンでは発現していた。<発現の相違がなかった浸潤・転移関連因子>細胞外基質分解酵素MMP-2(ゼラチンザイモグラフィー)およびラミニン,カドヘリン(免疫染色,westernblottong法)は両クローンに発現していた。また,RT-PCR法にて,血管新生因子VEGFのisoform121と165,細胞外基質分解酵素MMP-1,MMP-7,MT1-MMP,MT2-MMP,MT3-MMPは両クローンとも発現していた。<転写因子の活性の検討>ゲルシフトアッセイにて,転写因子NF-kappaBは高転移性クローンに活性を認めたが,転移能のないクローンでは認められなかった。転写因子SP-1はともに活性を認めたが,タンパク質の分子量に相違がある可能性があり,現在検討中である。転写因子AP2はさもに活性を認めた。両クローン間での転写因子の活性と浸潤・転移関連因子の発現に相関性があるので,転写因子による浸潤・転移機構の解明のため,さらに解析を行っている。<Smadの検討>TGF-βのシグナル伝達物質Smadの変異はPCR法とシークエンス法にてDNAのexon1,2,10,11に両クローンの共通性の変異は認めたが,相違はなかった。exon3から9に対しては,現在検討中である。癌の浸潤・転移は細胞骨格の変化,細胞外マトリックスの消失,細胞外マトリックス分解酵素(各種MMP)や血管新生因子の産生,細胞接着分子の発現と消失など色々な因子により成立すると言われている。われわれの研究はこれらの分子の発現制御に関連する転写因子の共通性に着目し,転写因子と浸潤・転移能の獲得の関係を解明しようとするものである。われわれは,同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のあるヒト口腔扁平上皮癌細胞株(ヌードマウスの頚部リンパ節転移率:SQUU-Aは0%,SQUU-Bは86.7%,本研究者樹立)を用いて,転写活性および浸潤・転移関連分子(各種MMP,Timp,接着分子,細胞骨格,血管新生因子)の発現の解析を行った。ゲルシフトアッセイにて,未刺激の状態では,転写因子AP-1,AP-2,SP-1の活性が両クローンともに認められ,NF-kappaBはほとんど認められなかったが,増殖因子やサイトカイン(TNF-α,HGF,TGF-α,TGF-β,bFGF,IL-1α,IL-1β,IL-8,IL-12)の刺激にて両クローン間の相違で特に興味を引いたのは,TGF-αの刺激にて高転移性クローンSQUU-BにAP-2の活性の増強を認めたことである。さらにin vitroの浸潤能の評価(ケモインベージョンアッセイ)を行うと,TGF-αにより,高転移性クローンSQUU-Bの浸潤能の著明な増大を認めた。また,TGF-αの刺激にて細胞外マトリックス分解酵素MMP-2の増強や活性が,SQUU-Bでは認められたが,転移能のないSQUU-Aでは認められなかった。われわれの癌細胞は異所性移植では浸潤・転移能を示さず,同所性移植により浸潤・転移能を獲得する。MMP-2はAP-2により転写制御を受けており,われわれの系における浸潤・転移能の獲得にAP-2による一連の反応が関与している可能性があるのでさらなる解析を行っている。TNF-α,IL-1α,IL-1βによりMMP-9の転写因子であるNF-kappaBの転写活性およびMMP-9の増大を両クローンに認とめ,両者間には差はなかった。
歩行運動の計算理論と小脳・脊髄神経系のダイナミクス

ヒトの二足歩行運動は,ヒトの筋骨格系を脳神経系による制御と床反力を介した外界との相互作用により,動的安定性を確保している.このとき脳神経系がどのような方略で動的安定性を維持しているかを2つの視点から検討した.1つ目は,定常歩行中の被験者に転倒を引き起こすようなインパルス状外乱を加え,それに対する運動応答,特に歩行リズムの変調(位相リセット)が転倒を回避するのにどのような役割を果たしているかを,歩行の非線形力学系モデルのダイナミクスと実験結果の比較から明らかにした.特に,実験的に計測された外乱のタイミング依存的な応答は,非線形力学系のダイナミクスの意味でも動的に安定な歩行状態を維持する目的にとって最適化されたものである可能性を示唆した.もう1つは,パーキンソン病患者を被験者とした自転車漕ぎ実験における左右脚のペダリングリズムと運動パターンを生成する神経回路の数理モデルのダイナミクスの比較研究である.ここでは左右のペダルが独立に回転する特殊な自転車を用いているが,健常被験者は通常の自転車と同様な左右逆相の周期的ペダリングを行う.しかし協調運動に失調が現れるパーキンソン病患者では,左右のペダリングパターンが逆相からズレて非定常で不規則になる.この現象を上位中枢からトニックな入力を受ける相互抑制型非線形結合2振動子モデルで再現し,上位中枢からの入力の大きさや2つの振動子への入力の大きさの非対称性に依存して,健常者では動的に安定な逆相振動が不安定化して発生しうることを示した.以上の結果は,ヒトの歩行運動の動的安定性を維持するためには,脳が身体および脊髄神経系が示す自律的ダイナミクスを考慮した高度な制御を行わなければならいことを示唆している.ヒトの二足歩行運動は,ヒトの筋骨格系を脳神経系による制御と床反力を介した外界との相互作用により,動的安定性を確保している.このとき脳神経系がどのような方略で動的安定性を維持しているかを2つの視点から検討した.1つ目は,定常歩行中の被験者に転倒を引き起こすようなインパルス状外乱を加え,それに対する運動応答,特に歩行リズムの変調(位相リセット)が転倒を回避するのにどのような役割を果たしているかを,歩行の非線形力学系モデルのダイナミクスと実験結果の比較から明らかにした.特に,実験的に計測された外乱のタイミング依存的な応答は,非線形力学系のダイナミクスの意味でも動的に安定な歩行状態を維持する目的にとって最適化されたものである可能性を示唆した.もう1つは,パーキンソン病患者を被験者とした自転車漕ぎ実験における左右脚のペダリングリズムと運動パターンを生成する神経回路の数理モデルのダイナミクスの比較研究である.ここでは左右のペダルが独立に回転する特殊な自転車を用いているが,健常被験者は通常の自転車と同様な左右逆相の周期的ペダリングを行う.しかし協調運動に失調が現れるパーキンソン病患者では,左右のペダリングパターンが逆相からズレて非定常で不規則になる.この現象を上位中枢からトニックな入力を受ける相互抑制型非線形結合2振動子モデルで再現し,上位中枢からの入力の大きさや2つの振動子への入力の大きさの非対称性に依存して,健常者では動的に安定な逆相振動が不安定化して発生しうることを示した.以上の結果は,ヒトの歩行運動の動的安定性を維持するためには,脳が身体および脊髄神経系が示す自律的ダイナミクスを考慮した高度な制御を行わなければならいことを示唆している.ヒトの二足歩行のダイナミクスをいくつかの側面から検討した.これらは(1)歩行中の姿勢制御,(2)歩行中の下肢関節のスティッフネス,(3)歩行リズム生成,(4)外乱を受けたときの歩行リズム制御を含む.これらの研究の大部分はヒトのバイオメカニクスまたは神経生理学、またはその双方の力学系モデルをあつかっている。前者は筋骨格系のモデルであり、後者は神経系のモデルである。(1)では,ヒトの身体と環境との相互作用を考慮した歩行運動軌道の生成規範を検討した.(2)では、詳細な筋-骨格系モデルに基づいて歩行中の下肢の関節スティッフネスを推定した.推定したスティッフネス(剛性行列)は,筋由来のスティッフネスであり,歩行中の脊髄運動ニューロンの活動度とそれに依存した筋のスティッフネスを反映している.推定したスティッフネスは,それだけでは安定に二足歩行運動をまったく達成できないほどの小さな値であった.(3)では,脊髄CPGと小脳・大脳基底核が相互作用する系を単純な力学系でモデル化し,左右脚の安定な協調の創発とその崩壊を解析した.このモデルのダイナミクスは,いくつかの神経疾患に見られる協調運動失調をよく再現した.これは,これらの疾患が高次運動脳と脊髄CPGからしステムのダイナミクスを通じて創発する動的疾患である可能性を示唆している.(4)では,未知外乱に対する歩行運動リズム(位相)の最適制御に関する規範を実験・理論的に考察し、歩行運動の動的安定に基づく運動制御規範を提案した.(3)と(4)の結果は,現在国際誌に投稿中である.ヒトの二足歩行運動は,ヒトの筋骨格系を脳神経系による制御と床反力を介した外界との相互作用により,動的安定性を確保している.このとき脳神経系がどのような方略で動的安定性を維持しているかを2つの視点から検討した.

1つ目は,定常歩行中の被験者に転倒を引き起こすようなインパルス状外乱を加え,それに対する運動応答,特に歩行リズムの変調(位相リセット)が転倒を回避するのにどのような役割を果たしているかを,歩行の非線形力学系モデルのダイナミクスと実験結果の比較から明らかにした.特に,実験的に計測された外乱のタイミング依存的な応答は,非線形力学系のダイナミクスの意味でも動的に安定な歩行状態を維持する目的にとって最適化されたものである可能性を示唆した.もう1つは,パーキンソン病患者を被験者とした自転車漕ぎ実験における左右脚のペダリングリズムと運動パターンを生成する神経回路の数理モデルのダイナミクスの比較研究である.ここでは左右のペダルが独立に回転する特殊な自転車を用いているが,健常被験者は通常の自転車と同様な左右逆相の周期的ペダリングを行う.しかし協調運動に失調が現れるパーキンソン病患者では.左右のペダリングパターンが逆相からズレて非定常で不規則になる.この現象を上位中枢からトニックな入力を受ける相互抑制型非線形結合2振動子モデルで再現し,上位中枢からの入力の大きさや2つの振動子への入力の大きさの非対称性に依存して,健常者では動的に安定な逆相振動が不安定化して発生しうることを示した.以上の結果は,ヒトの歩行運動の動的安定性を維持するためには,脳が身体および脊髄神経系が示す自律的ダイナミクスを考慮した高度な制御を行わなければならいことを示唆している.
単層上皮特異的中間径フィラメント蛋白質ケラチン8・18制御機構の解析

本研究において私共は、ケラチン18と結合する蛋白質として、Mrj蛋白質およびTNF receptor 1-associated death domain protein (TRADD)を同定した。MrjはDnaJ/Hsp40ファミリーに属する蛋白質で、ケラチン18に特異的に結合するco-chaperoneとしてHsp/c70をリクルートし、ケラチン8・18フィラメント構築を制御していることを明らかにし、Mrjが細胞運動時のケラチン8・18フィラメント構築のダイナミックなリモデリングに関与している可能性を認めた。TRADDは、TNFがTNF rcccptor1に結合すると、TNF receptor1の細胞内ドメインに結合し、TNFのシグナルを下流に伝えていく分子であるが、私共は、単層上皮細胞において、TRADDとケラチン18が結合することを見出した。そして、単層上皮細胞では、TRADDがケラチン細胞骨格と結合しているためにTNFによるアポトーシス誘導が減弱していることを認め、TRADDを介するケラチン8・18細胞骨格とTNFシグナリングとのクロストークがある可能性を見出した。また、ケラチン8と結合しうる分子としてこれまでに、(a)核膜孔の構成分子であるnucleoporin p62、(b)転写因子ATF5/ATFx、および(c)トリコヒアリン・プレクチンに相同性を有する新規蛋白質を同定し、現在、その結合の生理学的意義を解析している。ケラチン18と結合する蛋白質としてDnaJ/Heat shock protein 40(Hsp40)familyに属するMrj蛋白質およびTNF receptor 1-associated death domain protein(TRADD)を同定した。MrjはそのN末端側のJ domainを介してHeat shock protein 70(Hsp70)と、そしてそのC末端側でケラチン18と結合し、co-chapcroneとしてケラチン8・18フィラメント構築の制御に関与していることを見出した。Wound healing assayにおいて、Mrjは細胞のleading edgeに濃縮し、ケラチン8・18フィラメントのダイナミックなリモデリングを行っている可能性を認めた。中間径フィラメントの構築は、これまで私共が解析を進めてきたリン酸化・脱リン酸化によってgeneralに制御されているが、新しく見出されたMrj-Hsp70による制御は、ケラチン8・18に特異的な制御システムであると考えられた。TRADDはケラチンが発現している上皮細胞では、Type1ケラチンに特異的に結合していることを見出した。ケラチンやビメンチンなどの中間径フィラメントを発現していないSW13細胞にケラチン8・18やケラチン18のN末端(TRADD結合部位)を強制発現させ、TNFによるアポトーシス誘導への影響を観察すると、コントロールベクターに比してケラチン8・18やケラチン18のN末端(TRADD結合部位)をトランスフェクションしたものでは、TNFによるアポトーシス誘導が有意に減弱していた。これらのことより、上皮細胞では、ケラチンは、TRADDとの結合を介して、TNFreceptor1シグナル経路に影響を与えていることが示唆された。MrjはDnaJ/Hsp40ファミリーに属する蛋白質で、ケラチン18に特異的に結合するco-chaperoneとしてHsp/c70をリクルートし、ケラチン8・18フィラメント構築を制御していることを明らかにした。TRADDは、TNFがTNF receptor 1に結合すると、TNF receptor 1の細胞内ドメインに結合し、TNFのシグナルを下流に伝えていく分子であるが、私共は、単層上皮細胞において、TRADDとケラチン18が結合していることを見出した。そして、単層上皮細胞では、TRADDがケラチン細胞骨格と結合しているために、TNFがTNF receptor 1に結合した時に、TRADDがTNF receptor 1にリクルートされるのが阻害されていることを観察し、このために、INFによるcaspase 8の活性化が阻害され、アポトーシス誘導が減弱していることを認めた。

これらの結果は、単層上皮細胞がTNF刺激によるアポトーシスに対して抵抗性を示すことの分子メカニズムのひとつを明らかにし、TRADDを介するケラチン8・18細胞骨格とTNFシグナリングとのクロストークがある可能性を示唆するものである。また私共は、ケラチン8と結合しうる分子としてこれまでに、(1)核膜孔の構成分子であるnucleoporin p62、(2)転写因子ATF5/ATFx、および(3)トリコヒアリン・プレクチンに相同性を有する新規蛋白質、を同定し、現在、その結合の生理学意義を解析している。
グリコ-ゲン・ロ-デイング効果にもたらす高脂肪食と高炭水化物食の食歴の影響

試合前の数日間にわたってトレ-ニングを軽減しながら炭水化物を多く摂り筋肉グリ-コ-ゲンを高めようとする運動と栄養の処方をグリコ-ゲン(炭水化物)・ロ-ディングと呼ぶが、普段摂っている食事が高脂肪食か高炭水化物食か(食歴)が運動前のグリコ-ゲン・ロ-ディングに影響するか否か、また運動後数時間内の回復初期の急速グリコ-ゲン・ロ-ディングに影響するか否かについてラットで検討した。その結果、以下のことがわかった。(1)トレ-ニングを3日間にわたって軽減した場合、高炭水化物食歴ラットが引き続き高炭水化物食を摂ることに比べて、高脂肪食歴ラットが引き続き高脂肪食を摂ることは肝蔵と筋肉グリコ-ゲン蓄積に劣るが、高脂肪食から高炭水化物へ切り替えることで改善できた。(2)運動後2時間以内の急速グリコ-ゲン・ロ-ディングは、高炭水化物食歴ラットに比べて高脂肪食歴ラットで劣るが、高脂肪食歴ラットが高脂肪食から高炭水化物食に切り替えた場合、筋肉の急速グリコ-ゲン・ロ-ディング効果は高炭水化物食歴ラットに比べて変わらないよりもむしろ高かった。(3)運動直後から6時間後までの急速グリコ-ゲン・ロ-ディング効果は高脂肪食歴ラットでも変わらなかった。また、グリコ-ゲンの超過回復は高脂肪食歴ラットのみに認められた。これらの結果から、普段の食事が高炭水化物食の場合に比べて、普段の食事が高脂肪食である場合グリコ-ゲン・ロ-ディング効果に劣るが、ごく短期間高脂肪食から高炭水化物食に切り替えることで改善できることがわかった。Sprague-Dawley系の雌雄ラットを5週齢で購入し、高脂肪食(脂肪/炭水化物/たん白質=40/35/25%カロリ-)か高炭水化物食(5/70/25)で12週齢まで飼育し、それらを交配して得られた仔ラット(F)を親ラットと同じように飼育・交配してF2ラットを得た。実験(1):このF2雄らっとを用いて、1日2食制に慣らした後、親と同じ食餌をと摂る群とそれぞれの逆の食餌を摂る群とに分けてさらに25日間飼育した。食餌切り替え後、3週間遊泳訓練を行った。実験最終日には、各食餌群のラット疲労困憊に持久性運動を負荷した。運動直後にグルコ-スとクエン酸を経口投与し、その2時間後に屠殺して肝臓と筋肉のグリコ-ゲン含量を測定した。運動の前後にも一群のラットを屠殺した。結果は、運動前の肝臓と筋肉のグリコ-ゲン含量は親ラットの食歴に係わらず高脂肪食を摂取した群に比べて、高炭水化物食を摂取した群で高かった。運動直後のグルコ-ス+クエン酸の投与により肝臓と筋肉のグリコ-ゲン含量は運動直後より上昇したが、その程度は高炭水化物食を摂取した群で高く、また筋肉グリコ-ゲン含量は高脂肪食から高炭水化物食に切り替えた群で高い傾向にあった。実験(2):実験1とほぼ同様に飼育してえたF2雌ラットを用いて、高脂肪食から高炭水化物食に切り替える日数を3、7、および14日間にしたときの、運動直後のグルコ-ス+クエン酸投与後の筋肉グリコ-ゲン回復速度を検討した。結果は、高脂肪食を摂取した群に比べて高炭水化物食を摂取した群で筋肉グリコ-ゲンの回復が速かったが、高脂肪食から高炭水化物食に切り替えて3、および7日目の群ではそれ以上にその回復が大きかった。これらの結果を総合すると、高炭水化物食歴を与えてさらに高炭水化物食を与えるよりも、高脂肪食歴を与えた後ごく短期間だけ高炭水化物食に切り替えるのが、運動後のグリコ-ゲン再補充に有効であると思われる。実験(1):

市販のSpragueーDawley系の雌雄ラットを購入し、高脂肪食(脂肪/炭水化物/たん白質=40/35/25%カロリ-)か高炭水化物食(5/70/25)で飼育し、それらを交配して得られた仔ラット(F)を親ラットと同じように飼育・交配してF2ラットを得た。このラットを1日2食制で飼育し、この間各群半数のラットに遊泳トレ-ニングを3週間負荷した。残りのラットはトレ-ニングをしなかった。実験最終日には1800ー1830hに給餌し、その2時間後にすべてのラットを屠殺した。肝と筋のグリコ-ゲン含量と筋グリコ-ゲン合成酵素活性を測定した。結果は、高炭水化物食を摂取した群で肝と骨格筋赤筋部および心筋のグリコ-ゲン含量がトレ-ニングにより高くなり、筋グリコ-ゲン合成酵素活性も高くなった。しかし、高脂肪食群ではこのようなトレ-ニングの影響は見られなかった。実験(2):実験1とほぼ同様に飼育して得たF4雄ラットを用いて、(1)高脂肪食から高炭水化物食に切り替えるグリコ-ゲン・ロ-ディングを3日間にした時の肝と筋のグリコ-ゲン含量の変化を食餌を切り替えないラットと比較した。(2)また、このようにして飼育したラットに疲労困憊に至る持久性運動を負荷し、その直後にグルコ-ス+クエン酸を投与し、さらに運動から2時間後に高炭水化物食を摂取させた場合の肝と筋のグリコ-ゲン回復速度を食餌を切り替えないラットと比較した。結果は、(1)筋グリコ-ゲン含量は高脂肪食から高炭水化物食に切り替えた群では、1日目には高炭水化物食を摂取し続けた群と同じレベルになり、次ぎの2日間で約10ー20%増加した。(2)運動直後のグルコ-ス+クエン酸投与による筋グリコ-ゲン回復速度は、高脂肪食を摂取し続けた群に比べて高脂肪食から高炭水化物食に切り替えた群と高炭水化物食を摂取し続けた群で有意に高かった。しかし、高炭水化物食摂取4時間後の筋グリコ-ゲン回復速度はいずれの群も同じであった。
新規同期イメージング法の開発

高度なレーザー分光法は様々な物理・化学情報を得ることができるが、イメージング法との相性は必ずしもよくない。その一因は、画像化装置と信号処理を同時に実現することが困難だからである。本研究では、CCDをはじめとしたイメージセンサを検出器としたダウンコンバージョン法の提案・実証・応用と、その手法の感度や測定簡便性を大幅に改善できるアナログCMOS装置設計のための基礎検討を目的として研究を進めた。12bitのCCDを用いた光熱変換画像化の原理検証に成功した。また、増幅回路を組み込んだCMOS画像化素子実現のための基礎検討を行った。具体的には、光ダイオードと自作アナログ回路により、ダウンコンバージョン法の実現可能性を検討した。高度なレーザー分光法は様々な化学情報を得ることができるが、イメージング法との相性は必ずしもよくない。その一因は、画像化と信号処理を同時に実現することの困難さにある。前年度までに、12 bitのCCDを用いた光熱変換画像化の原理検証に成功した。本年度は、当初の計画に従い、増幅回路を組み込んだCMOS画像化素子実現のための基礎検討を行った。回路シミュレーションを用いて、光ダイオードに、バンドパスフィルター、増幅器、ハイパスフィルター、整流器を順に接続する回路を設計した。方針としては、光ダイオードに入力するバックグラウンドの直流成分、信号成分である交流成分のうち、直流成分をフィルターで除去後、信号を増幅することとした。実際の回路では、増幅率の最適値は交流成分の大きさに依存して変わる。ここでは、前年度測定した吸光度10の-5乗の色素溶液を光熱変換検出するよう増幅率を250倍に設定した。吸光度10の-4付近の測定では、検量線はよい直線性を示し、期待通りの感度が得られた。しかし、吸光度10の-5乗付近の測定では、検量線の傾きがなくなる現象が見られた。原因を調べたところ、整流器によるカットオフが影響していることが判明した。最終的な回路では、整流器前後にオフセット調整器を設置して、設定通り吸光度10の-5乗の色素溶液を検出できた。本研究では、光熱変換画像化を例に同期画像化を実現したが、この方法は蛍光・ラマン画像化、各種スペクトル測定にも応用できる有用な方法になると考えられる。CCDを検出器として用いた光熱変換分光法について検討した。波長532 nmの励起光と波長633 nmのプローブ光を、それぞれ音響光学素子で変調し、同軸にした後、顕微鏡ステージ上のガラス製マイクロ流体チップ中の液体試料に照射した。励起光を除去した後、プローブ光をCCD(12bit、プログラム可能)に導入した。励起光の変調周波数を1743 Hz、プローブ光の変調周波数を1748 Hzと5 Hzの差をつけ、CCDを20 Hzで動作させた。励起光による光熱変換現象と、プローブ光照射に5 Hzのうなりが生じ、うなりの一周期中に四枚のCCD画像が得られる。この四枚の画像の四則演算および積算により光熱変換画像を得た。幅220マイクロメートル、深さ100マイクロメートルの流路をもつガラス製マイクロ流路チップを用いた。試料には、色素Sudan IVのトルエン溶液を用いた。励起光強度が数mWの条件で、1.0×10-6 Mの溶液を問題なく検出できることがわかった。CCDを検出器として用いる場合、光強度を電気信号に変換してすぐに、アナログ/デジタル(A/D)変換するため、計測の感度はA/D変換のbit数に制限される。12bitのCCDを用いる場合、4096階調であり、光強度の10,000分1の信号強度を取得することは原理上できず、本手法の感度上の制約となる。この問題を解決するためには、A/D変換前にアナログ信号処理をする必要があり、光電変換する素子ごとに信号処理回路を集積化することを考えるとアナログCMOS回路を用いることが適切である。CMOS回路設計の前段階として、光ダイオードを用いた予備実験を始めた。バンドパスフィルター、増幅器、ハイパスフィルター、整流器を光ダイオードに接続した。この回路により、光熱変換信号が増幅可能であり、信号強度が直流成分として得られることを確認した。計画通り、CCD画像検出法により実験条件を検討した。

また、光ダイオードとアナログ回路を用いた実験では、増幅した光熱変換信号が直接得られることを確認した。本年度計画した研究は達成されたと言える。CCD画像化法(ダウンコンバージョン法)の応用可能性を検討する。レーザー分光法としては、準弾性光散乱法によるアレイ型マイクロ構造における光散乱画像化を想定している。また、アナログ回路の最適化を進め、CMOS光イメージセンサー用の回路を設計する。原理検討及び応用のための試薬・実験材料・光学部品などのための物件費として600千円、成果発表のための旅費として400千円、学会参加登録費や投稿論文校閲などのために100千円が必要である。
延髄における痛覚制御機構の研究-カテコラシンによる入力制御を中心として-

痛覚制御機構の研究のうち延髄におけるカテコラミンニューロンからの入力制御に重点をおいて研究を進めている。下行性抑制系の延髄での中枢は大縫線核を中心とした吻側延髄の腹側部に存在するが、同部には濃いカテコラミン線維終末が分布している。このカテコラミンニューロンの起始細胞体の局在をノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミンニューロンに分けてそれぞれのカテコラミン合成酵素を用いた免疫細胞化学法により検索した。結果は主に脳幹腹外側被蓋部のA1,A5,A7のノルアドレナリンとC1アドレナリンニューロン群からの投射が多く認められ、少数背外側の青斑核、subcoeruleusのノルアドレナリンニューロンからの投射も認められた。また中脳、前脳のドーパミンニューロンからの投射は見られなかった。この成果はNeuroscience Letters誌にin press中である。次に末梢神経ホルマリン刺激によるラット急性疼痛モデルを作成し脳幹におけるimmediate early gene(IEG)であるc-fos,zif268の発現を検索してみると、上記の脳幹カテコラミンニューロン群の存在する部位や大縫線核にも発現がみられた。この結果は末梢疼痛刺激によりこれらの下行性抑制系に関わるとされる脳幹の細胞レベルでも応答が起きていることを示している。これらIEGを発現する細胞が、実際にカテコラミンニューロンなのか、また大縫線核ではセロトニンやエンケファリンニューロンなのか検索中である。
エネルギー分散型螢光X線分析装置による歯科材料の異同識別法の開発

本研究は,エネルギー分散型蛍光X線分析装置(EDX900:島津社製)を使用し,歯科修復材料の成分分析による製品識別法を個人識別に役立てる目的で行った。この分析装置は,被検体を破壊せずにそのままの状態で検査することが可能であり,法医学的な証拠保全の立場からも非常に利用価値が高い。最初に,A社の金属焼付け用陶材のうち,表層付近で使用されるトランス・エナメル用陶材14種類の試験体を作製し,EDX900を用いて成分分析を行い,分析に関する方法を確立した。同時に,1製品内での種類別の構成元素ならびに定量値を測定し,製品名識別のための基礎データとした。以上の方法を確立した後,ここ10年間で日本国内で市販されたトランス用およびエナメル用陶材,6社11製品,計76種類についてエネルギー分散型蛍光X線分析装置による成分分析を行い,データを作成した。さらに,実際に模型上で,シェードのみA3に指定して技工所で作製した6製品の陶材焼き付け金属鋳造冠の陶材の製品名による異同識別の可否についても検討した。定性分析により,Na,Al,Si, K,など20種類が検出され,会社間で構成元素に違いが認められ,製品会社の識別はすべて可能であった。つぎに,長石,ガラス系の計16種類の標準物質を用いた検量線法による定量分析を行ったところ,いずれの種類でも元素構成比はSi(5570%),Al(1017%),K(712%)の順に高く,SiおよびZr(0.11.1%)などの元素で製品間に差が認められた。76種類の試験体について定性・定量分析した結果,全6社の会社の識別および11製品中4製品の識別が可能であった。最後に,6製品の陶材で作製した陶材冠について,検出した元素の種類およびエネルギーのピーク位置は,それぞれの製品を使用して作製した試験体の結果と合致し,識別が可能であった。今年度は、簡便かつ迅速な元素分析による歯科修復材料の識別のための手法の確立を目的とした。資料は、国内で大きなシェアーを持つA社の金属焼付け用陶材のなかから、表層付近で使用される材料14種類(エナメル陶材3種類、トランスルーセント陶材11種類)を選択した。分析結果の信頼性を高めるため、各種類ごとに規格化した円筒形の試験体(平均値:直径15.7mm、高さ3.4mm)を5個ずつ、計70個作製した。それぞれの試験体について、定性および定量分析を行ない、構成元素を検索するとともに、各元素の構成比について検討し、基礎データとした。つぎに技工所5ヵ所に今回分析したA社の陶材で陶材焼付け冠をそれぞれ1個ずつ作製を依頼(シェードのみ指定)し、その陶材表面の成分分析により異同識別が可能か否かについて検討した。なお、測定はエネルギー分散型蛍光X線分析装置(EDX900:島津製作所社製)により、電圧50Kv、電流は自動で行った。また、定量分析は検量線法で行い、検量用試料としてR1ソーダ石灰ガラス、R701長石、R802ろう石など5種類の標準試料を用いた。その結果、検出された元素は、Si、Al、Ca、Mg、K、Na、Sb、Zr、Ce、Fe、Ti、S、P、Yの計14種であった。また、検出された元素の種類が異なる陶材は、2種のトランスルーセント陶材のみで、その他は同一であった。

さらに、元素の構成比はSi(6567%)、Al(1415%)、Na、Kの順であり、陶材間で定量値に差が出現した元素はCe、PおよびZrであった。最後に、技工所5ヵ所でA社の陶材を用いて作製された陶材冠試験体の定性・定量分析を行ったところ、検出された元素の種類およびエネルギーのピーク位置はすべて合致し、いずれもA社のトランスルーセントと類似することが確認できた。昨年度は、資料として国内で大きなシェアーを持つA社の金属焼付け用陶材のなかから、特に歯冠部表層付近で使用されるトランス・エナメル用陶材14種類を選択し、エネルギー分散型蛍光X線分析装置(EDX900:島津社製)を用いて成分分析を行い、歯科修復補綴材料の識別のための基礎データを測定するとともに、実際にA社の陶材を使用した陶材冠の作製を依頼し、その陶材表面の成分分析により異同識別が可能か否かについて検討し良好な結果を得た。そこで今年度は、ここ10年間で日本国内で市販されたA社の製品を含む6社11製品におけるトランス・エナメル用陶材を収集し、昨年度と同様な規格化した試験体、計76種類を作製し、構成元素ならびにその定量値について検討し、データベースを構築した。さらに、歯科技工士1名がそれぞれ別々の製品会社の6種類の金属焼付け用陶材を使用して作製した陶材冠、計6個の異同識別の可否についても検討した。まず、試験体について定性分析を行った結果、Na、Al、Si、K、Ca、Ti、Fe、Y、Zr、Sb、Ceなど20種類が検出され、会社間で検出される元素の種類に違いが認められ、製品会社の識別はすべて可能であった。つぎに、標準物質による検量線を用いて定量分析を行ったところ、いずれの種類においても元素の構成比はSi(5570%)、Al(1017%)、K(712%)の順に高く、SiおよびZr(0.11.1%)などの元素で製品間に定量値の差が認められた。76種類の試験体について定性・定量分析した結果、会社の識別および11製品中4製品の識別が可能であった。最後に、歯科技工所で作製された陶材冠6個について検討したところ、検出された元素の種類およびエネルギーのピーク位置は、それぞれの製品を使用して作製した試験体の結果と合致し、識別が可能であった。
深海由来の高圧遺伝子群の開発に関する研究

本研究の目的は深海ならびに深海底以深の岩盤層に生息している微生物の分離ならびにそれらがもつ遺伝子を資源として活用することにある。そのためには、種々の深海環境から海水、底泥、岩石、あるいは熱水孔等を採集し、濃縮した後にDNAを抽出し、ライブラリーを作成するところから始まる。11年度では、太平洋南西諸島海域、トカラ列島島小宝、長崎県橘湾、京都大学植物園等から得た試料につき、DIFCO nutrient brothを用いて高圧条件下(40Mpa)、10度Cならびに30度Cで集積培養をおこなった。いずれの試料からも、この条件下で増殖してくる細菌が存在し、培地を白濁させた。このことは、単に深海といった常に高圧条件にある環境以外の一般的には高圧条件下にない環境にも耐圧性の細菌が存在することを示している。現在、このように高圧条件下で増殖してきた細菌を、限界希釈法ならびに塗抹法を用いて分離するとともに、DNAの抽出とライブラリーの作成、16S rRNA遺伝子情報に基づく系統解析が進行中であるが、真正細菌以外に古細菌の仲間も存在している可能性が示唆されている。また、高圧条件は高温条件のアナロジーととらえて、分離されてくる微生物と好熱細菌との類似性についても注目して研究を進めた。この研究費で購入した、高圧培養大型容器は、大量の試料を高圧条件で処理できるので研究に活用することができた。11年度では、太平洋南西諸島海域、トカラ列島小宝、長崎県橘湾、京都大学植物園等から得た試料につき、DIFCO nutritent brothを用いて高圧条件下(40Mpa)、30度Cで集積培養をおこなった。現在、このように高圧条件下で増殖してきた細菌を、限界希釈法ならびに塗抹法を用いて分離するとともに、DNAの抽出とライブラリーの作成、16SrRNA遺伝子情報に基づく系統解析が進行中である。また、高圧条件は高温条件のアナロジーととらえて、分離されてくる細菌と好熱細菌の類似性についても注目して研究を進めた。
NMDA受容体拮抗薬メマンチン誘導体の合成と作用機作の解明

抗アルツハイマー病(AD)治療薬として承認され、欧米で使用されているメマンチン(1-アミノ-3,5-ジメチルアダマンタン)に着目し、アダマンタンの4つの橋頭位にアミノ基と複数のアルキル基を導入する反応を検討し、3つのアルキル基とアミノ基を導入したメマンチン誘導体の一般合成法を確立することができた。併せてアダマンタンの橋頭位にアミノ基、水酸基、ニトロ基などの導入法も検討した。アルツハイマー病の治療薬としてヨーロッパで認可されているメマンチン(1-amino-3,5-dimethyladamantane)およびアマンタジン(1-aminoadamantane)に関して、その誘導体の合成並びに活性評価を行うことを主目的として研究を開始した。まず、アダマンタン骨格1位にメチルアミノ基を導入した化合物を合成し、NMDA受容体リガンド結合測定法により活性を評価したところ、メマンチンの1/20程度の活性、アマンタジンの1/4程度の受容体結合活性があることが明らかとなった。しかしながら、アダマンタン骨格の1位に導入したメチルアミノ基の末端アミノ基を修飾した場合、NMDA受容体リガンド結合測定法による活性は大幅に低下した。また、アダマンタン骨格の2位にメチルアミノ基を導入した場合やその末端アミノ基を修飾した場合には、NMDA受容体リガンド結合測定法による活性が非常に弱くなることも明らかとなった。アダマンタン骨格の一部の結合を開裂させた化合物であるネラメキサンが、欧州において抗アルツハイマー治療薬としてPhaseIIの治験段階であるとの情報を得て、ネラメキサン誘導体の合成並びにその作用機作のメマンチンやアマンタジンとの違いについても検討を行うこととした。まず、3,3,5,5-テトラメチルシクロヘキサノンを出発原料として、ネラメキサンの1位にアミノ基が欠如した誘導体の合成を達成した。現在、ネラメキサン自体の合成を試みると共に、その誘導体の合成も進めている。次年度の早い段階で、これらの合成化合物の活性評価を検討する予定である。まず、アダマンタン骨格の1位にメチルアミノ基を導入した化合物を合成し、NMDA受容体リガンド結合測定法により活性を評価したところ、メマンチンの1/20程度の活性、アマンタジンの1/4程度の受容体結合活性があることを研究初年度に明らかとした。2年目となる昨年度は、20種類ほどのアダマンタン骨格を持つメマンチン誘導体の合成を達成し、その活性評価を行ってきた。アダマンタン骨格の1位に導入したメチルアミノ基の末端アミノ基を修飾した場合はNMDA受容体リガンド結合測定法による活性は大幅に低下し、アダマンタン骨格の2位にメチルアミノ基を導入した場合やその末端アミノ基を修飾した場合にはNMDA受容体リガンド結合測定法による活性が非常に弱くなることも明らかとなった。一方、アダマンチル骨格を持つ化合物誘導体の合成法の確立の点においては、通常、容易には置換されないアダマンタンの橋頭位の置換が、Grignard試薬などを用いる数種の手法により可能となることが明らかとなった。本手法は、今後の誘導体合成に大きく貢献することは間違いなく、その詳細な条件検討を行っている。昨年度は、20種類ほどのアダマンタン骨格を持つメマンチン誘導体の合成を達成し、その活性評価を行ってきた。研究最終年度にあたる昨年度は、Grignard反応を用いたアダマンタン誘導体の合成手法を検討し、確立することに成功した。この手法を用いることで、誘導体合成法を確立できたといえよう。また、メマンチンの作用機序の検討も詳細に検討し、NMDA受容体への結合において、Ca^<2+>イオン濃度が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。新たに得られた知見を利用して、アダマンタン骨格をもつアルツハイマー病治療薬へと展開していきたい。